"少なくとも1個のリボ核酸RNA分子を官能化する方法であって、a-イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、-目的の基と、-前記結合分子と前記目的の基とを連結する結合アームとを少なくとも有するステップと、b前記結合分子の無水物官能基と-RNAヌクレオチドの1個のリボースの2’位、ならびに/または-RNAの3’末端のヌクレオチドのリボースの2’および/もしくは3’位の少なくとも1個のヒドロキシル基とを反応させるステップと、c前記結合アームを介して前記RNAを前記目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップとを含む方法。少なくとも1個のリボ核酸RNA分子を標識する方法であって、a-内因性蛍光を有する、イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、-前記結合分子により発せられるシグナルとは異なる内因性蛍光シグナルを有するか、または内因性蛍光シグナルを有さない目的の基と、-前記結合分子を前記目的の基と連結する結合アームとを少なくとも有するステップと、b前記結合分子の無水物官能基を-RNAヌクレオチドの1個のリボースの2’位、ならびに/または-RNAの3’位の末端ヌクレオチドのリボースの2’および/もしくは3’位の少なくとも1個のヒドロキシル基と反応させるステップと、前記結合アームを介して前記RNAを前記目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップとを含む方法。少なくとも1個のリボ核酸RNA分子を捕捉または分離する方法であって、a-イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、-アンチリガンドと相補的なリガンドにより構成される目的の基と、-前記結合分子を前記目的の基と連結する結合アームとを少なくとも有するステップと、b前記結合分子の無水物官能基を-RNAヌクレオチドの1個のリボースの2’位、ならびに/または-RNAの3’位の末端ヌクレオチドのリボースの2’および/もしくは3’位の少なくとも1個のヒドロキシル基と反応させるステップと、c前記結合アームにより前記RNAを前記目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップと、dリガンド-アンチリガンド反応を通してRNAを捕捉または分離するステップとを含む方法。前記結合アームが、前記結合アームが前記目的の基と会合する前に前記結合分子と会合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。前記結合アームが、前記結合アームが前記目的の基と会合した後に前記結合分子と会合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。前記結合分子が事前に前記RNAと会合する、請求項4から5のいずれか一項に記載の方法。少なくとも1個の結合分子と、アンチリガンドと相補的なリガンドにより構成される目的の基と、前記結合分子を前記目的の基と連結する結合アームとを用いて、少なくとも1個のRNA分子を選択的に捕捉する方法であって、前記結合分子が、共有結合を介して-RNAヌクレオチドの1個のリボースの2’位、ならびに/または-RNAの3’位の末端ヌクレオチドのリボースの2’および3’位、ならびに/もしくは-RNAの3’位の前記末端ヌクレオチドのリボースの3’位のヒドロキシル基に付着するイサト酸無水物またはその誘導体により構成されている方法。RNA分子を他の生体構成物、特にDNA分子から分離する方法であって、請求項7に記載の捕捉方法を、区別されていない核酸RNAおよびDNAを含む生体試料に適用するステップであって、前記目的の基が前記生体試料の残りから容易に分離可能な少なくとも1種の固体担体と会合しているステップと、前記RNA分子を有する前記結合分子を前記生体試料の残りから分離するステップとに存する方法。式1:式中、R1はHまたは目的の基を表し、R2はHあるいはa.標識もしくは標識化前駆体、またはb.安定な複合体を形成するために認識分子もしくは表面もしくは粒子等により認識できるリガンドであり得る目的の基を表し、R1がHにより表される場合、R2は目的の基により表され、逆もまた同じであり、Xは前記目的の基を前記結合分子と連結する結合アームであるの官能化試薬。捕捉または分離手段が、磁性もしくは非磁性ポリマーもしくはシリカ粒子またはフィルターなどの固体担体により、あるいは容器の内壁によっても構成される、請求項9に記載の捕捉または分離試薬。前記結合アームXが、-前記結合分子の原子および前記目的の基の原子を連結する単一共有結合、または-おそらく置換されており、少なくとも2個の炭素原子の鎖形成が芳香族構造および/もしくはヘテロ原子酸素、硫黄、窒素等をおそらく含む、有機結合アーム、例えば、前記結合分子と前記目的の基もしくは単一炭素原子との間の単一共有結合である、請求項9に記載の官能化試薬。前記結合アームXが、特定の光、温度、酵素的または化学的条件下で前記結合分子を前記RNAから分離する物理化学的、光化学的、熱的、酵素的および/または化学的手段により切断することができる官能基または結合を含む、請求項11に記載の官能化試薬。請求項1から8のいずれか一項に記載の方法により得ることができる官能化生物学的RNA分子。請求項9から12のいずれか一項に記載の試薬を含む、標的RNA分子を検出するためのキット。官能化する各RNA鎖の3’位の末端一リン酸基を加水分解することからなる、ステップaとbとの間の補足ステップを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の官能化法。目的の基とのコンジュゲーションは、予測することが困難な特性である、イサト酸無水物のアシル化特性および安定性さえ修飾することを伴い得るので、少なくとも2種の異なるスポットまたはDNAチップ上のハイブリダイゼーションのためのmRNAの標識化の用途のためのビオチンまたはCy3とイサト酸無水物分子をコンジュゲートする着想は自明でない。特に、イサト酸無水物の目的の基とのコンジュゲーションは、構造の極めて実質的な不安定化、合成の極めて大きな困難、水への乏しい溶解性、蛍光の減衰による目的の基の物理化学的特性の喪失、RNAとの極めて乏しい反応性、特に過剰な立体障害によるまたは官能化RNA/DNAハイブリッドがもはやポリメラーゼ基質ではないという事実による、標識RNAとDNA捕捉プローブとの間に形成される二本鎖の極めて大きな不安定性を引き起こし得る原子ならびに結合を介して起こらなければならない。さらに、本発明者らは、固体担体が有していてもよくまたは有していなくてもよい認識分子により捕捉されることを可能にするためのイサト酸無水物化合物によるRNAの官能化の重要性を理解した。本発明は、その内因性蛍光のためではなく、以下に定義するように、RNA上に特異的に固定し、目的の基と結合するその能力のために、イサト酸無水物を用いることを提案している。そのため、本発明は、求核試薬第一級もしくは第二級アミン、チオールおよびアルコールと反応して、開環後にCO2、アントラニル酸の誘導体を放出するその能力について長い間知られているJOC1959Staiger241214イサト酸無水物分子を用いることに存する図1参照。求核試薬のイサト酸無水物への攻撃は、治療目的のいくつかの複素環の合成に重要な中間体の直接形成を可能にするので、広く研究されてきた。実際、アントラニル酸の誘導体はその後再配列して多数の製薬目的の複素環をもたらすことができる。したがって、求電子試薬に対する反応性ベンゼン環上の置換と相まって、イサト酸無水物は、多種多様な分野の用途:農芸化学、製薬業、化学および化粧品産業に用いられる極めて多数の類似体および誘導体を入手できる。その極めて特有の性質が、イサト酸無水物を、乾燥貯蔵下および周囲温度で販売することができ、優先的には加熱60~80°Cにより、最も多くの場合塩基の存在下で、求核試薬の存在下でのみ反応する比較的安定な分子にしている。これらの特性、ならびにアルコールに対するイサト酸無水物の反応性についての従来技術上記参照が、本発明者らに特にDNAチップを介してRNAを標識および検出するためにこの分子を用いることを思いつかせた。したがって、基質の大きさおよび配列と全く関係なくRNAを官能化または選択的に標識することを可能にする方法はほとんどない。DNAとRNAとの間の大きな違いは2’位のヒドロキシル基の存在によるものであることが分かっている図2参照。RNAリボースのこの2’-ヒドロキシル基は、DNAチップの用途でも選択的RNA対DNA選別の用途でもRNAを標識するために決して用いられてこなかった。そのため、本発明者らは、発蛍光団もしくはビオチンもしくは目的の分子とのコンジュゲーションにより検出可能にされるまたは官能化されるイサト酸無水物分子を反応させるためにこの官能基を用いた。こうして、RNAがDNAの存在下で選択的に標識される。定義により、目的の基は、特定の条件下例えば、求核試薬のおよび求電子試薬の、アジドを有するアルキンの、チオールを有するマレイミドの、アルケンを有するジエンの等で別の反応性分子または別の反応性基と反応することができる反応性分子または反応性基であり、かつ/または開環イサト酸無水物アントラニル酸エステルのものとは異なるそれ自体の蛍光を有し、かつ/またはビオチン/ストレプトアビジン、疎水性もしくは親水性分子/疎水性もしくは親水性担体、抗原/抗体等の型の安定かつおそらく可逆性の複合体を形成するための、認識分子もしくは表面もしくは粒子等により認識できるリガンドであり、かつ/または以下の分子:-西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素などの、例えば、比色分析、蛍光、発光により検出可能なシグナルを産生する酵素、-着色剤のような発色団、または蛍光、発光化合物、-電子顕微鏡により、または導電率、電流測定、ボルタンメトリー、インピーダンスなどの電気特性により検出可能な電子密度を有する基、-例えば、その分子がその物理的および/または化学的特性の検出可能な修飾を誘導するのに十分な大きさである検出可能な基、ならびに-放射性分子から選択される直接反応のための標識化分子であり、かつ/または以下の型のリガンド/受容体対:-ビオチン/ストレプトアビジン、-ハプテン/抗体、-抗原/抗体、-ペプチド/抗体、-糖/レクチン、-求電子分子/求核分子、-ポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド相補体、-疎水性リガンド/疎水性固相、または-リガンド/配位金属により構成される間接反応のための標識化分子である分子である。結合分子は、イサト酸無水物またはその誘導体を意味すると理解すべきである。イサト酸無水物が求核試薬との反応後に開環すると、アントラニル酸という名称を有することに留意すべきである。イサト酸無水物誘導体は、イサト酸無水物に相当する部分を含み、後者の芳香族部分または複素環部分に少なくとも1種のラジカル、例えば化学または有機基を有する任意の有機化合物を意味すると理解すべきである。官能化という用語は、共有または非共有結合による目的の基の核酸上へのグラフト作用に相当する。結合アームは、結合分子および目的の基を連結することができる有機スペーサーアームとして定義される。これには、物理化学的、光化学的、酵素的、化学的、熱的手段等により切断することができる官能基が含まれ得る。認識もしくは捕捉手段または分子は、目的の基との強い親和性を有する、固体担体上に固定されていてもされていなくてもよい分子として定義される。RNAの定義は、少なくとも2個の修飾もしくは非修飾連続リボヌクレオチド単位から構成される天然または合成ポリマーである。DNAという用語は、少なくとも2個の修飾もしくは非修飾連続デオキシリボヌクレオチド単位から構成される天然または合成ポリマーにより定義される。少なくとも1個のDNAセグメントおよび少なくとも1個のRNAセグメントから構成される単一キメラ鎖を用いることも可能である。阻害とは、イサト酸無水物誘導体により過剰に官能化されたRNAを、遺伝物質を増幅するための技術NASBA、PCR等により増幅することができないことであると理解される。定義により、糖という用語は、リボースまたはデオキシリボース化合物を意味する。本発明は、少なくとも1のリボ核酸RNA分子を官能化する方法であって、a少なくとも-イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、-目的の基と、-結合分子を目的の基と連結する結合アームとを有するステップと、b結合分子の無水物官能基を-RNAヌクレオチドの1個のリボースの2’位、ならびに/または-RNAの3’末端のヌクレオチドのリボースの2’および/もしくは3’位の少なくとも1個のヒドロキシル基と反応させるステップと、c結合アームを介してRNAを目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップとを含む方法に関する。第1の実施形態によると、本方法は、少なくとも1のリボ核酸RNA分子を標識することを伴い、これはa少なくとも-内因性蛍光を有する、イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、-結合分子により発せられるシグナルとは異なる内因性蛍光シグナルを有する、または内因性蛍光シグナルを有さない目的の基と、-結合分子を目的の基と連結する結合アームとを有するステップと、b結合分子の無水物官能基を-RNAヌクレオチドの1個のリボースの2’位、ならびに/または-RNAの3’位の末端ヌクレオチドのリボースの2’および/もしくは3’位の少なくとも1個のヒドロキシル基と反応させるステップと、c結合アームを介してRNAを目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップとを含む。第2の実施形態によると、本方法は、少なくとも1のリボ核酸RNA分子を捕捉または分離することを伴い、これはa少なくとも-イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、-アンチリガンドと相補的なリガンドにより構成される目的の基と、-結合分子を目的の基と連結する結合アームとを有するステップと、b結合分子の無水物官能基を-RNAヌクレオチドの1個のリボースの2’位、ならびに/または-RNAの3’位の末端ヌクレオチドのリボースの2’および/もしくは3’位の少なくとも1個のヒドロキシル基と反応させるステップと、c結合アームによりRNAを目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップと、dリガンド-アンチリガンド反応を通してRNAを捕捉または分離するステップとを含む。本方法の実施形態のどれでも、また1つの実施形態の変形によると、結合アームは、前記結合アームが目的の基と会合する前に結合分子と会合する。本方法の実施形態のどれでも、また別の実施形態の変形によると、結合アームは、前記結合アームが目的の基と会合した後に結合分子と会合する。前記2つのシナリオでは、結合分子は事前にRNAと会合する。本発明は、少なくとも1個の結合分子と、アンチリガンドと相補的なリガンドにより構成される目的の基と、結合分子を目的の基と連結する結合アームとを用いて、少なくとも1個のRNA分子を選択的に捕捉する方法であって、結合分子が、共有結合を介して-RNAヌクレオチドの1個のリボースの2’位、ならびに/または-RNAの3’位の末端ヌクレオチドのリボースの2’および3’位、ならびに/もしくは-RNAの3’位の前記末端ヌクレオチドのリボースの3’位のヒドロキシル基に付着するイサト酸無水物またはその誘導体により構成されている方法に関する。本発明はまた、RNA分子を他の生体構成物、特にDNA分子から分離する方法であって上記のような捕捉方法を、区別されていない核酸RNAおよびDNAを含む生体試料に適用するステップであって、目的の基が生体試料の残りから容易に分離可能な少なくとも1種の固体担体と会合しているステップと、RNA分子を有する結合分子を生体試料の残りから分離するステップとに存する方法に関する。本発明は、式1:式中、R1はHまたは目的の基を表し、R2はHあるいはa.標識もしくは標識化前駆体、またはb.安定な複合体を形成するために認識分子もしくは表面もしくは粒子等により認識できるリガンドであり得る目的の基を表し、R1がHにより表される場合、R2は目的の基により表され、逆もまた同じであり、Xは目的の基を結合分子と連結する結合アームであるを有する別の官能化試薬に関する。試薬が上記のような捕捉または分離試薬である場合、捕捉または分離手段は、磁性もしくは非磁性ポリマーもしくはシリカ粒子またはフィルターなどの固体担体により、あるいは容器の内壁によっても構成される。試薬が上記のような官能化試薬である場合、結合アームXは、-結合分子の原子および目的の基の原子を連結する単一共有結合、または-おそらく置換されており、少なくとも2個の炭素原子の鎖形成が芳香族構造および/もしくはヘテロ原子酸素、硫黄、窒素等をおそらく含む、有機結合アーム、例えば、結合分子と目的の基もしくは単一炭素原子との間の単一共有結合である。官能化試薬のこの後者の実施形態では、結合アームXは、特定の光、温度、酵素的もしくは化学的条件下で結合分子をRNAから分離する物理化学的、光化学的、熱的、酵素的および/または化学的手段により切断することができる官能基または結合を含む。本発明はまた、前記のような方法により得ることができる官能化生物学的RNA分子に関する。本発明はまた、前記のような試薬を含む、標的RNA分子を検出するためのキットに関する。本発明は、最後に、官能化する各RNA鎖の3’位の末端一リン酸基を加水分解することからなる、ステップaとbとの間の補足ステップを含む、上に述べた方法による官能化法に関する。本発明は添付の図面に関して以下に述べる詳細な説明によってよりよく理解されるだろう。以下の略語を、以下に記載する実施例に使用する。ACN:アセトニトリル、Ar:芳香族、TLC:薄層クロマトグラフィー、CDCl3:重水素化クロロホルム、d:二重項、DCM:ジクロロメタン、dd:分裂二重項、DMF:ジメチルホルムアミド、DMSO-d6:ジメチルスルホキシド、DMSO-d6:重水素化ジメチルスルホキシド、MilliQ水:超純水Millipore、Molsheim、フランス、Eq:当量、HPLC:高速液体クロマトグラフィー、IA:イサト酸無水物、IVT:インビトロ転写産物、M:多重項、m:クラスター、Me:メチル、MeOH:メタノール、Nbexp:実験反復数、nd:未決定、NMO:N-メチルモルホリン、NP1:ヌクレアーゼP1、ODN:オリゴ-デオキシリボヌクレオチド、ORN:オリゴ-リボヌクレオチド、AP:アルカリホスファターゼ、PBS1x:リン酸緩衝食塩水=0.01MPO4-、0.0027MKCl、0.137MNaCl、25°CでpH=7.4SIGMA参照番号4417、SaintLouis、USA、q:四重項、Yld:収率、RfまたはRT:保持時間、NMR:核磁気共鳴、rpm:毎分回転数、s:一重項、SS:ジスルフィド結合、t:三重項、TEAAc:酢酸トリエチルアンモニウム、Fr:官能化率、AT:周囲温度、UV:紫外線。以下の実施例に用いる化合物の分析および合成のための一般的条件を以下に記載する:LC-MS分析は、30°Cで1ml/分の流れを用いて260nmまたは最大プロットで検出、PDA996Watersダイオードアレイ検出器、ZQ2000Waters質量分析検出器、Empowerバージョン2ソフトウェアおよびWATERSXTerraMSC18カラム4.6×302.5μMを備えるHPLCWATERSAlliance2795chainにより行った。ZQ2000質量分析器はエレクトロスプレーイオン化源を有する。イオン化は、20Vのコーン電圧および3.5kVのキャピラリー電圧を用いてポジティブモードで行った。いくつかの種類の勾配をHPLC分析のために使用した。NMRスペクトルは、Bruker200または500MHz分光計分子13についてのみで記録した。化学シフトδは、内部標準とみなす溶媒ピーク25°CでCDCl3:7.24ppm;DMSO-d6:2.49ppm;D2O:4.80ppmに対するppmで与える。スペクトルは、上記略語:s、d、t、q、qu、mおよびMで記載する。カップリング定数JはヘルツHzで表す。吸光度スペクトルは、UV可視Varian分光光度計、Cary300Bioモデルで記録した。蛍光による分析は、Varian蛍光光度計、CaryEclipseモデルVarian、SantaClara、CA、USAで行った。イオンクロマトグラフィー分析は、IonPacCS12AカラムSunnyvale、CA、USAを用いてカチオンモードで、DIONEXICS1000クロマトグラフSunnyvale、CA、USAで行った。薄層クロマトグラフィー分析は、254nmでのUV検出のALUGRAM登録商標MACHEREY-NAGELSILG/UV254シリカプレート、4×8cm、Duren、ドイツ、または逆相TLCMachereyNagel、Duren、ドイツ、AlugramRP-18W40×80mmで行った。生成物の精製は、FLUKASilicagel6040~63μmでクロマトグラフィーにより行った。フラッシュクロマトグラフィーアルゴン圧力下による分離の条件は、ClarkStillらClarkStill,W.;Kahn,M.;Mitra,A.J.Org.Chem.1978、43、2923~2925により記載されている条件、すなわち、シリカの高さを15cmに固定する、5cm/分の流れで流す、カラムの直径は精製する生成物の量およびRfによる、を厳密に尊重する。特定の親水性生成物の精製は、シリカゲル、MERCKRP-18シリカゲル40~63μmでのクロマトグラフィーにより行った。薄層クロマトグラフィーによる分析は、MERCK18F254シリカプレートで行い、254nmのUV下でまたは肉眼により直接見た。実施例1および2の前書き:実施例1および2に記載する化合物の合成の一般的記載イサト酸無水物またはその誘導体の目的の基とのコンジュゲーションは、反応性官能基を有するイサト酸無水物とやはり反応性官能基を有する目的の分子との間の化学反応を意味する。このカップリング中にイサト酸無水物部分の完全性を保つことが特に重要であることに留意すべきである。当業者は、2つの分子両方に共通の特性を有する新規な分子を得るために、2つの分子をコンジュゲートする多数の方法を知っている。実施例1芳香環が有する目的の基とコンジュゲートしたイサト酸無水物のアルキル化誘導体の合成本発明の特定の実施形態では、イサト酸無水物は、目的の基、例えば、図3に明確に示すように芳香環を介してイサト酸無水物である結合分子と結合するCy3、ビオチン、不安定基を有するビオチンなどの標識とコンジュゲートしている。したがって、本発明者らは、アミド型結合アームにより、イサト酸無水物の芳香族部分を介してイサト酸無水物および目的の分子を連結することを選択した。これは、-化合物6、23または7を得るために、-カップリング試薬クロロギ酸イソブチルにより、-5-アミノIA1Sigma-Aldrich、SaintLouis、USAを-カルボン酸親水性アーム3もしくは化学不安定chemolabileアーム22を有するまたは有さないビオチンあるいはCy3-COOH4と反応させること方法1により行われる。イサト酸無水物の5-アミノ基はあまり求核性ではないので、本発明者らは、-5-アミノIA1と-目的の分子の活性化エステルとの間の反応方法2により直接ペプチドカップリングを行うよりも方法1を用いることを好んだ。方法1は、本発明者らが化合物BiotIA5を入手するために行ったような5-アミノIAとビオチンPFP2の直接カップリング方法2よりもはるかに優れた収率で、イサト酸無水物のコンジュゲートBiotPEG4IA6、Cy3IA7またはBiotPEG4SSIA23の入手を可能にする。蛍光ストレプトアビジン分子により容易に検出可能な親水性化合物であるので、ビオチン化誘導体3を選択した。ストレプトアビジン分子により容易に検出可能な親水性化合物であり、さらに、媒体中で、捕捉されたRNA分子を遊離することを可能にする化学不安定ジスルフィド結合SSを有するので、ビオチン化誘導体22を選択した。その光安定性および特定の生体構成物の自己蛍光からはるかに離れた波長での蛍光特性λ励起=545nmおよびλ発光=570nmのために、生物医学的用途または分子診断用途に一般的に用いられている発蛍光団であるので、シアニン3Cy3-COOH4を目的の基の例として選択した。この分子は、WaggonerらWaggonerA.S.、MujumdarR.B.、ErnstL.A.、MujumdarS.R.、LewisC.J.、CyanineDyeLabelingReagents:SulfoindocyanineSuccinimidylEsters、BioconjugateChemistry、1993、4、105~11により記載されている合成経路に従って合成した。当業者は、芳香環上の種々の位置にある結合および基を介してイサト酸無水物を任意の他の目的の分子にカップリングさせるための他の従来の有機化学反応を用いることを知っていることが理解されることに留意すべきである。そのため、本発明者らは自身を5位に限定しないこと、および他の置換位置を用いることができ、それがイサト酸無水物の求核試薬との反応性を調節するよう作用さえし得ることも理解される。これらの化合物のRNAの2’OHとの反応性を増加させるために、本発明者らは、ハロゲン化合物またはこの位置のアルキル化後に反応性を増加させるこの官能基に反応性の化合物を用いたアルキル化により、イサト酸無水物の環内-NH-上に種々の基を導入した。したがって、化合物5BiotIAMe9、5BiotPEG4Me11、5BiotPEG4SSIAMe24またはCy3-IAMe13は、対応する前駆体化合物とヨウ化メチルの反応により得た。求核試薬との優れた反応性を保持しながら、イサト酸無水物の求核基この場合、RNAのヒドロキシルとの反応性を増加させ、なおまた補足の官能性溶解性、二本鎖の安定性、標識化等を提供するために、他のアルキル化化合物を用いてもよいことに留意すべきである。したがって、化合物5BiotIAS03-10、5BiotPEG4S03-12またはCy3-IAS03-14は、対応する前駆体化合物とスルトン8の反応により得た。したがって、その特性を調節するために、極めて多数の求電子化合物をイサト酸無水物またはその誘導体のNH基と反応させることができることが理解される。多数の反応および試薬によりNH上のイサト酸無水物の誘導体をアルキル化することが可能になることが理解される。実施例1.1:ビオチンおよびペンタフルオロフェノールエステル2の合成ビオチン5g;23.1mmol;1.0eqを無水DMF50mLおよびピリジン2.07mL;25.4mmol;1.1eqに懸濁させる。5分の撹拌後、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニルPFP-TFA:4.621mL、すなわち、7.50g;25.4mmol;1.1eqを添加する。一晩の撹拌後に反応を終結させる。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させる。蒸発残渣をエチルエーテル100mLで溶解して懸濁させ、次いで、焼結ガラス上でスピンドライする。残渣を最小限のエーテルですすぐ。得られる質量=7.106g、すなわち、81の収率。順相TLC溶出液:DCM/MeOH:90/10。MH:411.1g.mol-1NMR1H12~1823~29305400および44062および65。実施例1.2:5-ビオチン-イサト酸無水物5の合成5-アミノ-イサト酸無水物1500mg;2.81mmol;1.0eqをDMF14mLおよびトリエチルアミン3.15mL;22.4mmol;8.0eqの混合物の溶液に入れる。色が暗褐色の得られた溶液を、ビオチンおよびペンタフルオロフェノールエステル21.6125g;3.93mmol;1.4eqを同時に添加する前に、ATで5分間撹拌する。反応を撹拌下で16時間放置する。溶媒を乾燥するまで蒸発させ、次いで、ロータリーエバポレーターで無水アセトニトリルと2回同時蒸発させる。蒸発残渣をDMF21.2mLおよびトリエチルアミン4.80mL;33.92mmol;8.0eqに溶解し、次いで、16時間撹拌する。撹拌し、次いで7000rpmで5分間遠心分離する前に、2°Cの塩酸38mL;1M;15.8eqを混合物に添加する。上清を除去し、沈渣を連続して3回水68mLに溶解し、撹拌し、遠心分離し、上清を再度除去する。上清のpHは7に等しくなければならない。次いで、沈渣を、真空下周囲温度のオーブン中での乾燥を促進するために、連続して数回エチルエーテルで乾燥させる。生成物を最小限のDMFに溶解し、これに1スパーテルのRP18シリカを添加し、この混合物を蒸発させ、次いで、直径3cm×高さ10cmの逆相クロマトグラフィーカラムMerckLiChroprepRP-18シリカ40~63μm参照番号:1.13900.1000上に沈着させる前にアセトニトリルと2回同時蒸発させる。生成物をアセトニトリル/DMF:90/10の混合液で溶出する。得られる質量=557mg、すなわち、32の収率。MH:405.1g.mol-1NMR1H13~182342629315410および440647および639713785830。実施例1.3:1-メチル-5-ビオチン-イサト酸無水物9の合成生成物5522mg;1.29mmol;1.0eqをDMF10mLに溶解する。炭酸カリウム375mg;2.71mmol;2.1eqをこの混合液に懸濁させ、ヨウ化メチル105μl;1.68mmol;1.3eqを添加する前に周囲温度で5分間撹拌する。1時間20分の撹拌後、反応媒体を空隙率3の焼結ガラスに濾過する。乾燥するまで蒸発させ、次いでアセトニトリルと2回同時蒸発させる前に、1スパーテルのRP18シリカを濾液に添加する。得られた粉末を、直径3cmおよび高さ10cmの逆相クロマトグラフィーカラムMerckLiChroprepRP-18シリカ40~63μm参照番号:1.13900.1000上に沈着させる。生成物を2種の混合液、最初に水/ACN/DMF:79/20/1、次いで水/ACN/DMF:69/30/1で溶出する。生成物9を第2溶出液で回収する。得られる質量=65mg、すなわち、12の収率。MH:419.1g.mol-1NMR1H16~212729~333545および4865および66778288実施例1.4:1-プロピルスルホン-5-ビオチン-イサト酸無水物10の合成生成物550mg;123.6μmol;1.0eqをDMF1.2mL;100mMに溶解する。炭酸カリウム63.6mg;408μmol;3.3eqをこの混合液に懸濁させる。1分当たり1000回転のボルテックスで2分の撹拌後、プロパンスルトン142μl;161μmol;1.3eqを添加する前に装置を4°Cのコールドチャンバーに入れる。22時間の撹拌後、反応媒体を遠心分離し、上清を回収する。沈渣をDMFで再度2回洗浄する。乾燥するまで蒸発させ、次いでアセトニトリルと2回同時蒸発させる前に、1スパーテルのRP18シリカを上清に添加する。得られた粉末を、直径1cmおよび高さ10cmの逆相クロマトグラフィーカラムMerckLiChroprepRP-18シリカ40~63μm参照番号:1.13900.1000上に沈着させる。生成物を2種の混合物、最初にACN/DMF:100/0、次いでACN/DMF:90/10、ACN/DMF:80/20、ACN/DMF:60/40、ACN/DMF:0/100で溶出する。生成物10をACN/DMF溶出液:90/10で回収する。得られる質量=23mg、すなわち、35の収率。MH:527.1g.mol-1NMR1H13~175190231248265285315400および440647および6387647908421022実施例1.5:5-ビオチン-ヘキシルエチレングリコール-イサト酸無水物6の合成5-アミノ-イサト酸無水物1663mg;3.72mmol;1.0eqをDMF18.6mL;200mMに溶解し、乾燥させ、最後にDMF18.6mLに溶解する前に、アセトニトリルと2回同時蒸発させる。次いで、氷浴中で0°Cに冷却した後で、N-メチルモルホリンNMO409μl;3.72μmol;1.0eqおよびクロロギ酸イソブチル482μl;3.72μmol;1.0eqを媒体に添加する。5分後、Biot-EG4-COOH31.831g;3.72mmol;1.0eq、QuantaBiodesign、PowellUSA、参照番号:10199を粉末形態で添加する。反応の収率を増加させるために、試薬の連続添加を、以下の表1に要約するように経時的に添加する。第1段階で、栗茶色粉末を得るために、反応媒体をアセトン中で5回およびエーテル中で2回粉砕する。第2段階で、得られた粉末を、直径4cmおよび高さ11cmの逆相クロマトグラフィーカラムMerckLiChroprepRP-18シリカ40~63μm参照番号:1.13900.1000上に沈着させる。生成物を混合液、水/DMF:50/50で溶出する。最終段階で、目的の溶出液を蒸発させ、エチルエーテル中で粉砕する。得られる質量=447mg、すなわち、18の収率。MH:652.3g.mol-1NMR1H11~1820725~33~3641および4364および64717883102117実施例1.6:1-メチル-5-ビオチン-ヘキシルエチレングリコール-イサト酸無水物11の合成生成物6200mg;307μmol;1.0eqをDMF3.05mLに溶解し、これに炭酸カリウム89.1mg;644μmol;2.1eqを添加する。ヨウ化メチル25μl;400μmol;1.3eqを添加する前に、不均一媒体を周囲温度で5分間撹拌する。90分の撹拌後、反応物を濾紙に濾過し、次いで、DMF500μlに可溶化する前に、乾燥するまで濾液を蒸発させる。溶液を、直径2cmおよび高さ10cmの逆相クロマトグラフィーカラム上に沈着させる。生成物をACN:100で溶出する。分画を乾燥するまで蒸発させ、次いで、得られた固体をエチルエーテル中で粉砕する。得られる質量=240.4mg、すなわち、100の収率。MH:666.3g.mol-1NMR1H11~1720525~33~373941および43638および644747984102実施例1.7:5-Cy3イサト酸無水物7の合成アルゴン下0°C氷浴の10mL丸底フラスコ中で、Cy3-COOH4249mg0.8mmol;1eqを、DMF3mL溶液に入れる。次いで、N-メチルモルホリン87μL0.794mmol;1eqならびにクロロギ酸イソブチル104μL0.798mmol;1eqを添加し、反応を撹拌下0°Cで放置する。15分後、5-アミノイサト酸無水物213.1mg1.196mmol;1.5eqを添加し、反応媒体を周囲温度での撹拌下で放置する。LC-MSモニタリング条件1は、反応が瞬間的であることを示している。20分の反応後、1eqのN-メチルモルホリン/クロロギ酸イソブチルを添加し、5-アミノイサト酸無水物の全体をカルバミン酸エステルに転換するために、反応を撹拌下で10分間放置する。次いで、反応媒体を蒸発させ、エチルエーテルに溶解し、焼結ガラスに濾過し、カルバミン酸エステルに転換した過剰のイサト酸無水物を除去するために最後にアセトン15mLで3回洗浄する。次いで、こうして得られたピンク色固体を溶出液勾配H2O/DMF75:25、次いでH2O、次いでH2O/DMF50:50を用いてC18シリカゲルカラムで精製し、次いで、残渣DMFを除去するために真空下で乾燥させる。最終生成物は、50の収率339mg;0.4mmolでピンク色粉末の形態で得られる。MH=791.9g.mol-1、TLC:H2O/DMF8/2;UV展開Rf=0.5LC/MS:条件1:RT=7.4分;最大吸収λ=266.4;518.4および552.5nm;[MH]:791.5。1HNMRδ13114416617021772323984156527107407687767818298351164。実施例1.8:1-メチル5-Cy3-イサト酸無水物13の合成25mL丸底フラスコ中で、コンジュゲートCy3-IA7500mg0.63mmol;1eqをDMF2.6mL溶液に入れる。次いで、K2CO3175mg1.26mmol;2eqならびにヨードメタン198μL3.16mmol;5eqを添加し、反応を周囲温度での撹拌下で放置する。LC-MSモニタリングは、出発生成物が1時間後には完全に消費されていることを示している。1時間の反応後、乾燥するまで反応媒体を蒸発させ、次いで、溶出液勾配2-プロパノール/DMF95:5、次いで2-プロパノール/DMF50:50を用いてC18シリカゲルカラムで精製し、次いで、残渣DMFを除去するために真空下で乾燥させる。生成物は2-プロパノール/DMF95:5混合物に可溶性ではないので、DMF中で固体沈着物が調製される。最終生成物は、95の収率505mg;0.6mmolでピンク色粉末の形態で得られる。イオンクロマトグラフィー分析は、生成物が一カリウム塩の形態で得られることを示した。MH=843g.mol-1、TLC:H2O/DMF8/2;UV展開Rf=0.1LC/MS:条件1:RT=7.8分;最大吸収λ=267.6;518.4および551.2nm;[MH]:805.6。1HNMRδ1311441681712179234345416666742768776836。実施例1.9:3-2-2-3-ビオチン-dPEG3-プロパンアミドエチルジスルファニルプロパン酸22の合成NHS-S-S-dPEG4-ビオチン1.390g;1.849mmol;QuantaBiodesign、Powell、USA、参照番号:10194をDMF52mM17.56mL溶液に入れ、100mL丸底フラスコに導入する。水17.56mLを添加し、媒体を冷媒下75°Cに置く。この温度で4時間後、LC-MSモニタリングは、NHS-S-S-dPEG4-ビオチンが完全に加水分解されたことを示す。乾燥するまで蒸発後、粘着性の黄色がかった油が得られ、これを残っている水を除去するためにACN/DMF混合液:5mL/3mLと3回同時蒸発させ、次いで、これを乾燥させて残渣DMFを除去するためにエーテルと共に3回粉砕する。生成物をジクロロメタン/メタノール/酢酸混合液:79/20/12mLに溶解し、順相クロマトグラフィーカラムシリカゲル60、Fluka、参照番号:60737上に沈着させる。同じ混合液を用いて溶出を行う。3-2-2-3-ビオチン-dPEG3-プロパンアミドエチルジスルファニルプロパン酸を含む分画を集め、これらから残っている酢酸を除去するためにトルエン/DMF混合液:10mL/5mLと同時蒸発させ、次いで乾燥するまで蒸発させる。得られる質量:1.02g、すなわち、84の収率。MH=655.2g.mol-1実施例1.10:5-3-2-2-ビオチン-dPEG3-プロパンアミドエチルジスルファニルプロパンアミドイサト酸無水物23の合成3-2-2-ビオチン-dPEG3-プロパンアミドエチルジスルファニルプロパン酸22486mg;0.741mmol;1.0eqをDMF7.42mL100mM溶液に溶解し、アルゴン下に置かれている25mL二口丸底フラスコに導入する。丸底フラスコを氷浴中で0°Cに冷却し、次いで、N-メチルモルホリン106μL;0.965mmol;1.3eqおよびクロロギ酸イソブチル126μL;0.965mmol;1.3eqを媒体に添加する。0°Cでの撹拌下で15分後、200mMDMF溶液4.82mL中5-アミノイサト酸無水物1172mg;0.965mmol;1.3eqを周囲温度で導入する。周囲温度で1時間後、丸底フラスコを氷浴に戻し、N-メチルモルホリン106μL;0.965mmol;1.3eqおよびクロロギ酸イソブチル126μL;0.965mmol;1.3eqの第2の添加を行う。0°Cで15分後、氷浴を除去し、DMF86mg;0.482mmol;0.65eq中200mM5-アミノイサト酸無水物ストック溶液2.41mLを添加する。周囲温度での撹拌下さらに20分後、丸底フラスコを氷浴に戻し、N-メチルモルホリン106μL;0.965mmol;1.3eqおよびクロロギ酸イソブチル126μL;0.965mmol;1.3eqの最後の添加を行う。0°Cで15分後、氷浴を除去し、反応をさらに30分間撹拌下で放置する。1スパーテルの逆相シリカRP18シリカ/40~63μm、MerckLiChroprepの添加後、乾燥するまで媒体を蒸発させ、次いで、極めて乾燥した栗茶色粉末が得られるまでアセトニトリル/DMF混合液:50/50と3回同時蒸発させる。次いで、固体を、直径2.5cmおよび高さ15cmの逆相クロマトグラフィーカラムRP18シリカ/40~63μm、MerckLiChroprep上に沈着させ、以下の連続混合液:DMF/水:50/50、次いでDMF/水:60/40、次いで、DMF/水:75/25、最後にDMF/水:80/20で溶出する。最後に、媒体を乾燥するまで蒸発させ、アセトニトリル7mLと3回同時蒸発させる。生成物は、オレンジ色結晶の形態で現れる。得られる質量:220mg、すなわち、36の収率。MH=815.3g.mol-1NMR1H10~175208232275~285286282~298302~344345~355355~36542264380。実施例1.11:N-メチル5-3-2-2-ビオチン-dPEG3-プロパンアミドエチルジスルファニルプロパンアミドイサト酸無水物24の合成5-3-2-2-ビオチン-dPEG3-プロパンアミドエチルジスルファニルプロパンアミドイサト酸無水物2350mg;0.061mmol;1.0eq;DMF中24.2mM溶液2.49mLを氷浴中撹拌下で25mL丸底フラスコに入れる。DMF中懸濁した炭酸カリウム9.3mg;0.067mmol;1.1eqを直ちに添加し、媒体を0°Cで、5分間撹拌下で放置する。次いで、ヨードメタン15.2μL;0.244mmol;4.0eqを媒体に導入し、反応を0°Cで、45分間撹拌下で放置する。得られた生成物から残っている炭酸カリウムを除去するために、これを直径1cmおよび高さ10cmの逆相クロマトグラフィーカラムRP18シリカ/40~63μm、MerckLiChroprep上に沈着させ、100アセトニトリルで溶出する。乾燥するまで媒体を蒸発させた後、生成物をエーテル5mLと共に4回粉砕する。生成物は、黄色薄片の形態で現れる。得られる質量:55.7mg過剰な質量は最終生成物中に捕捉されたDMFの存在のためである。MH:829.3g.mol-1NMR1H12~1752085233825~27275~295305~33033~3720H帰属不明4150および431964187477788779768091836310389。NB:この分子について予測される58個の代わりに、合計95個のプロトンが検出される。余分なプロトンは、3つの主な集団を形成し、それぞれ水およびDMFに相当する。実施例2イサト酸無水物の環内窒素が有する目的の基とコンジュゲートしたイサト酸無水物の誘導体の合成この実施例は、芳香環上にないように思われる別のイサト酸無水物官能化部位の評価を説明する。この目的のため、本発明者らは、前記イサト酸無水物の環内NHのアルキル化反応を用いて、その中に目的の分子をコンジュゲートさせることを選択した。したがって、この位置は、図4に記載するように、ビオチンのハロゲン誘導体などの、目的の化合物の求電子誘導体によりアルキル化することができる。ヨードアセチル-LC-ビオチン17またはビオチン化化合物20を、K2CO3またはDIPEAの存在下でイサト酸無水物1と反応させて、-NH-のアルキル化により、ビオチン化化合物18または21を形成する。この方法は、未置換イサト酸無水物に限定されず、実際、芳香環を適当に置換することにより、イサト酸無水物部分の求核試薬例えば、2’OHヒドロキシルなどとの反応性を調節することが可能である。Weeks2008JACS8884頁の参考文献は、NO2の誘引効果のために、ニトロIAMeがIAMeより約40倍大きい反応性を有することを記載している。したがって、当業者は、イサト酸無水物の反応性を増加または低下させるために用いるべき置換基を極めて正確に発想する。芳香族部分の置換のイサト酸無水物の反応性への影響を説明するために、この実施例は、ヨードアセチル-PEG2-ビオチン17と5-アセトアミドIA165-アミノIA15のアセチル化により合成されるの反応によるNBiotPEG2アセトアミドIA19化合物の合成を記載している。目的の分子とカップリングしたイサト酸無水物を、適当に官能化したアントラニル酸を構成し、次いで、イサト酸無水物を当量のホスゲンで閉環することにより合成することも可能であることに留意すべきである。実施例2.1:1-ビオチン-エチレングリコール-イサト酸無水物18の合成イサト酸無水物1545.1mg;276.6μmol;3.0eqをDMF460μl;600mMに溶解する。炭酸カリウム38.2mg;276.6μmol;3.0eqをこの混合液に懸濁させる。1000rpmのボルテックスで5分の撹拌後、DMF730μl;126mM;1.3eq中溶液のヨードアセチル-PEG2-ビオチン1750mg;92.2μmol;1.0eq、Pierce-Thermoscientific、Whaltham、USAを供給する前に、装置を4°Cのコールドチャンバーに入れる。90分後、ヨードアセチル-PEG2-ビオチンは消失し、反応が終結した。管を遠心分離し、上清を回収する。沈渣をDMF200μLで2回洗浄する。上清を集め、溶媒を乾燥するまで蒸発させる前に1スパーテルのRP18シリカを添加する。得られた粉末を、直径1cmおよび高さ10cmのカラムで逆相クロマトグラフィーにより精製する。溶出液は水/ACN/DMF混合液:79/20/1とする。得られる質量=11.8mg、すなわち、22の収率約60の純度MH:578.2g.mol-1実施例2.2:5-アセトアミド-イサト酸無水物16の合成5-アミノ-イサト酸無水物740mg;4.15mmol;1.0eqをDMF21ml;200mMに溶解し、無水酢酸395μl;4.15mmol;1.0eqを添加する前に2分間撹拌する。3時間40分後、反応を終結させる。形成した生成物を水210ml中に沈殿させ、次いで、空隙率3の焼結ガラスでスピンドライする。次いで、得られた残渣をオーブンで乾燥する。得られる質量=753mg、すなわち、82.4の収率。MH:221.0g.mol-1実施例2.3:1-ビオチン-ジエチレングリコール-5-アセトアミド-イサト酸無水物19の合成5-アセトアミド-イサト酸無水物49.5mg;224.8μmol;2.5eqを8mlフラスコ中で秤量し、これに炭酸カリウム82.1mg;594μmol;6.6eqを添加する。DMF2.65ml;100mMをこの混合物に添加する。媒体を2分間撹拌し、次いで-25°Cに置く。並行して、ヨードアセチル-PEG2-ビオチンPierce-Thermoscientific、Whaltham、USA48.6mg;89.6μmol;1.0eqの溶液をDMF895μlで調製する。ヨードアセチル-PEG2-ビオチン溶液を反応媒体中に添加し、4°Cのコールドチャンバー中、800rpmで、16時間ボルテックスで撹拌する。反応媒体を紙に濾過し、濾液を固体沈着物と共に逆相クロマトグラフィーにより精製する。カラムは、直径1cmおよび高さ10cmを有する。溶出液は水/ACN混合液:80/20とする。得られる質量=15mg、すなわち、10.5の収率50未満の純度MH:635.2g.mol-1実施例2.4:N-ビオチン-dPEG3-プロピル-6-ブロモヘキサンアミド20の合成50mL丸底フラスコ中、6-ブロモカプロン酸317mg1.624mmol;1.3eqをDMF5mLと連続して2回同時蒸発させる。6-ブロモカプロン酸をDMF81.2mM20mLに溶解し、アルゴン下100mL二口丸底フラスコ中に移す。次いで、氷浴中で0°Cに冷却した後、N-メチルモルホリン316μl;2.873mmol;2.3eqおよびクロロギ酸イソブチル212μl;1.624mmol;1.3eqを媒体に添加する。撹拌下0°Cで5分後、ビオチン-dPEG3-NH3-TFA-0.7g;1.249mmol;1.0eq、QuantaBiodesign、Powell、USA、参照番号:10193のDMF200mM6.235mL中溶液を周囲温度で媒体に添加する。撹拌下で30分後、丸底フラスコの内容物を乾燥するまで蒸発させ、アセトニトリル10mLと2回同時蒸発させる。次いで、ジクロロメタン30mLに溶解した黄色がかった極めて粘着性の油1.332gが得られる。残渣ビオチン-dPEG3-NH3-TFA-を除去するために、有機相を10mMHCl20mLで2回洗浄し、次いで、飽和NaHCO3溶液20mLで2回、最後にNaCl食塩水20mLで2回洗浄する。ジクロロメタンの蒸発後、固体434mgが得られ、これをジクロロメタン3mLに溶解し、直径3cmおよび高さ15cmの順相クロマトグラフィーカラムシリカゲル60、Fluka、参照番号:60737、SaintLouis、USA上に沈着させる。生成物を5cm/分の速度でジクロロメタン/メタノール混合液:80/20で溶出し、これにより、反応中に形成される3種の共生成物coproductのうちの1種を取り除くことが可能になる。乾燥するまで蒸発後、黄色がかった極めて粘着性の油306mgが得られる。これを白色粉末が得られるまで3回エーテルと共に粉砕する。得られる質量:120mg、すなわち、15の収率。MH:623.3g.mol-1NMR1H分析125~1920730~32325~36041~446478。実施例2.5:N-N-ビオチン-dPEG3-プロピル-6-ブロモヘキサンアミドイサト酸無水物21の合成N-ビオチン-dPEG3-プロピル-6-ブロモヘキサンアミド20;280mg;0.449mmol;1.0eqおよびイサト酸無水物15;110mg;0.674mmol;1.5eqをDMFと2回同時蒸発させ、DMF2mLに溶解する。2種の試薬を25mL丸底フラスコに導入し、媒体を乾燥するまで蒸発させる。丸底フラスコを冷媒下に置き、N-エチルジイソプロピルアミン768μL;5.467mmol;12.2eqを添加する前に120°Cに加熱する。媒体は急速に明るい黄色になる。120°Cで45分後、塩基性媒体中で有利なイサト酸無水物の開環を防ぐために、媒体のpHを、0.015NHClの連続添加により9から5~6の間の値にもっていく。次いで、生成物を直径1.5cmおよび高さ15cmの逆相カラムRP18シリカ/40~63μm、MerckLiChroprep上に沈着させる。以下の混合液:ACN/水:10/90、次いでACN/水:25/75、最後にACN/水:50/50で溶出を行う。得られる質量:37mg、すなわち、11.6の収率。MH:706.3g.mol-1実施例3シアニン3とコンジュゲートしたイサト酸無水物誘導体Cy3IAMe、13の27個の塩基を有するモデルオリゴリボヌクレオチドORNとの反応性の実証アシル化の位置特異性および官能化率の測定本発明者らは、イサト酸無水物誘導体のRNAとの反応性を評価し、そのため、27個の塩基を有するモデルORN配列:5’-AAC-CGC-AGU-GAC-ACC-CUC-AUC-AUU-ACA-3’Eurogentec、Liege、ベルギーの選択的官能化を示す。この目的のため、一定量のORNを、種々の温度条件、持続条件、反応媒体条件等の下で、目的の分子とコンジュゲートしたイサト酸無水物誘導体Cy3IAMe13と反応させる。260nmでの反応のHPLCモニタリングにより、初期ORNに相当するピークの消失およびアシル化ORNに相当するピークの出現を検出することが可能になる。これらの生成物は、より長い保持時間を有し、ORNのものと蛍光標識のものの両者に相当する吸収スペクトルを有する。そのため、これらのピークの出現自体がORNの官能化の実証となる。しかしながら、官能化部位についてのより高い精度および官能化率Frを正確に評価するために、ORN集団標識されたものおよび標識されていないものをアセトン/過塩素酸リチウムを用いた沈殿により、またはゲル浸透NAP5商標、GEHealthCareにより過剰の標識から分離する。次いで、こうして得られたORNを、ORNのリン酸ジエステル結合を加水分解するために、ヌクレアーゼP1Aldrich、SaintLouis、USAおよびアルカリホスファターゼAldrich、SaintLouis、USAによる加水分解に供する。この混合物のLC-MS分析質量分析計に結合したクロマトグラフィー鎖により、図5に記載するようないくつかの集団を特徴付けそれを同定することが可能になる:-標識されていないリボヌクレオシド-より長い保持時間ならびに核酸および標識のUVスペクトル特性により極めて明確に異なる標識モノヌクレオシド付加物例えば、Cy3の場合-2’で目的の基により置換されたアントラニル酸基のために、ヌクレアーゼP1により切断することができない2’でアシル化されたジヌクレオチド。多量の基が2’に導入されている場合のリン酸ジエステル結合のヌクレアーゼに対する抵抗性は当業者に周知である。-理論上形成し得るが、統計学的にほとんど十分に見受けられない過アシル化peracylated2’OHトリヌクレオチドまたは四ヌクレオチドその場合、2’OHの2または3連続アシル化があることが必要であるだろうと思われるためは認められない。アシル化5’O誘導体はほとんど十分に見受けられないに過ぎず、ServilloEur.J.Biochem.1993583~589により記載されているようには目に見えないことに留意すべきである。これらの異なる標識ヌクレオシドまたはヌクレオチド付加物の検出により、2’のヒドロキシルおよびORNの末端3’位および2’位上の官能化を示すことが可能になる。ORN官能化率Frは、-4種のリボヌクレオシドに相当するピークの面積と比較して、-末端モノヌクレオシド付加物2’および3’で官能化されているに相当する面積ならびにアシル化ジヌクレオシド2’OHで、内部で官能化されているに相当する面積を測定することにより評価する。アシル化の内部/外部位置特異性を、HPLCにより容易に検出可能な-2’および3’でアシル化された末端モノヌクレオチド-ならびに2’OHで、内部でアシル化されたジヌクレオチドに相当する面積の相対割合を測定することにより評価する。ORN官能化率およびアシル化の外部/内部位置特異性の測定を、図6に記載するグラフA:27個の塩基を有する天然ORN。グラフB:化合物13で官能化し沈殿させたORN。グラフC:前記化合物13で官能化し、沈殿させ、酵素的に加水分解したORN。グラフD:ヌクレオシド付加物または官能化ヌクレオチドの検討でのグラフCの拡大ピーク1はそれぞれアシル化ジヌクレオチド42に相当し、ピーク2および3は2’または3’でアシル化されたヌクレオシド58に相当し、ピーク4は2’および3’でアシル化されたヌクレオシドに相当する。はアントラニル酸Cy3-NMeの分子で官能化されたジヌクレオチドまたはヌクレオシドを表す。ピーク1、2、3および4全体により、官能化率を測定することが可能になる。動作モード:標準的実験では、27個の塩基を有するORN5’-AAC-CGC-AGU-GAC-ACC-CUC-AUC-AUU-ACA-3’Eurogentec、Liege、ベルギー8nmolの当量の水溶液を前もって2mLプラスチックエッペンチューブ中で遠心エバポレーターRCT60、Jouan、StHerblain、フランスで乾燥する。次いで、ORNを可溶化するために水40μLを乾燥残渣に添加し、次いで、緩衝溶液例では、トリエチルアンモニウムアセタート緩衝液、pH7、1MAldrich、StLouis、USA参照番号:09748-100ml20μL、最後に目的の基で官能化したイサト酸無水物誘導体のDMSO中120mM溶液すなわち、この実施例では分子Cy3IAMe1320μLを添加する。混合物を事前に温度を釣り合わせたラック上のオーブン中で、65°Cで60分間インキュベートする。HPLC注入条件3により、図6に記載するように特定の量のアシル化ORNの形成を監視することが可能になる。次いで、塩および過剰な標識を除去するために、混合物をSephadexNAP5ゲルGEHealthCare、Uppsala、スウェーデンで精製し、かつ/または180mMアセトン/LiClO475/25混合液1.2mL中に3回沈殿させる。最後に、沈渣をアセトンで乾燥させ、遠心エバポレーターRCT60、Jouan、StHerblain、フランスで蒸発させる。次いで、残渣をH2O/DMSO85/15溶液33μLに溶解し、標識の適切な除去を確認するためにHPLC注入条件3を行う。その緩衝液:20mM酢酸ナトリウムpH5.5中1U/μl溶液のヌクレアーゼP12μL参照番号:N8630Sigma-Aldrich、StLouis、USA;1mMZnCl2;50mMNaClおよび水中7u/μlアルカリホスファターゼ参照番号P7923-2KUSigma-Aldrich、StLouis、USA1μLを混合物に添加する。媒体を周囲温度で4~6時間放置する。次いで、ORNの完全な加水分解を確認するためならびに上記のことにしたがっておよび図6に記載のように得られる断片の性質を分析するために、これをHPLC条件3に注入する。1-結果:この実施例のクロマトグラム特性のLC-MS分析により、以下に列挙する異なる種類の生成物を同定することが可能になるHPLC条件3:質量分析およびそのUVプロファイルにより容易に同定可能な、アシル化されていないリボヌクレオシドシトシンC、ウラシルU、グアニンGおよびアデニンA1.5~5分のRt。その存在は、ORNをヌクレオシドの全てをアシル化するわけではない制御されたアシル化に供するに過ぎないという事実により説明される。そのため、ヌクレアーゼP1はアシル化されていないヌクレオシド間の結合を切断することができる。2-ヌクレアーゼP1の作用に対して非感受性であり、より長い保持時間11.8~12.5分のRtを有する2’でアシル化されたジヌクレオチド。これらは、質量分析により、ならびにアントラニル酸、ヌクレオシドおよびCy3の吸収バンド特性のおかげでそれぞれ260、360および550nmUVにより同定することができる。モデルとして作用するORN配列が以下:5’-AAC-CGC-AGU-GAC-ACC-CUC-AUC-AUU-ACA-3’であるので、ORNの制御された標識化および加水分解後に、配列に依存する特定の数のみの二量体を得ることができることを理解することが重要である。したがって、ORN配列に沿ってずらすことにより、2’-アシル化二量体:5’-AA、AC、CC、CG、GC、CA、AG、GU、UG、GA、AC、CA、AC、CC、CC、CU、UC、CA、AU、UC、CA、AU、UU、UA、ACおよびCA-3’を検出することが予測可能である。GG塩基対は配列中に見つけることができないので、これは実際、LC-MSで見られないだろう。3-リン酸ジエステル結合を有さないので、さらにより長い保持時間12.7~13.8分のRtを有する、2’、3’または2’と3’の両位置でアシル化されたリボアデニン。これらの付加物は、質量分析により、ならびにヌクレオシド、アントラニル酸およびCy3の吸収バンド特性のおかげでそれぞれ260、360および550nmUVにより同定することができる。1種のみの単一の種類の標識ヌクレオシドrAのみが検出されるという事実は、2’-OH基がイサト酸無水物誘導体によりアシル化される場合にリン酸ジエステル結合が完全に安定であることを示している。実際、これがヌクレアーゼP1による加水分解に対して感受性であったならば、オリゴリボヌクレオチド鎖全体のランダムな標識化により、4種の標識ヌクレオシド付加物が形成されただろう。そのため、アシル化rA付加物の存在は、NP1による加水分解中に鎖の残りから脱離するORNの3’末端に位置するヌクレオシドrAの標識化により説明される。実際、Cy3に連結したアントラニル酸の質量と共にこれらの断片の全ての質量の質量分析による特定の研究により、図6および7に示すようなその形成を実証することが可能となる。官能化率は、4種のリボヌクレオシドに相当する集団に対する、アシル化ジヌクレオチドおよびアシル化ヌクレオシドに相当する集団の積分により、260nmでUVにより評価する。3’末端の官能化の割合を評価するために、アシル化ヌクレオシドの集団に対するアシル化ジヌクレオチドの集団の割合を同様に評価する。コメント:本発明の枠組みの中で提供される官能化率値は、ヌクレオシドの各々の260nmでのモル吸光係数により、およびそれらがヌクレオシドであるかジヌクレオチドであるかにより適用しなければならない補正因子を考慮する。したがって、測定される面積を、-アシル化されていないヌクレオシドについてはrC、rU、rGおよびrAの260nmでのモルε、-アシル化ジヌクレオチドについては、5’AA、AC、CC、CG、GC、CA、AG、GU、UG、GA、AC、CA、AC、CC、CC、CU、UC、CA、AU、UC、CA、AU、UU、UA、ACおよびCA3’の260nmでのモルεの平均値、ならびに-アシル化モノヌクレオシドについては、rAの260nmでのモルε表2参照にしたがって補正する。考察および結論:4.5に補正した官能化率およびアシル化の内部/外部位置特異性は、58/42で評価される以降の実施例5の表3の項目7参照。これは、これらの条件では、100塩基ごとに平均して約5個のヌクレオシドが標識されること、すなわち、20塩基ごとに1標識を意味する。これは、優れた検出に十分な標識数と過剰に多数のかさ高い基により影響されないハイブリダイゼーションとの間の折衷を尊重することが推奨されている標識化率と完全に一致する。同様に、58/42の比は、3’末端が2’位よりも36倍反応性であることを示している0.58×1/0.42/26。これは、3’末端のより高い反応性を示す文献NawrotNucleosidesandNucleotides1998815~829のデータと一致している。この実施例により、本発明者らは、イサト酸無水物の蛍光誘導体によるORNの官能化を示している。MALDITof質量分析技術を介した、Cy3IAMe13による27個の塩基を有するORNの官能化の実証目的:本発明者らは、イサト酸無水物誘導体、Cy3IAMe13と反応したORNがいくつかのCy3-アントラニル酸付加物を有するアシル化ORNをもたらすことを示す。動作モード:実施例3と全く同じプロトコルに従うが、それぞれ2.6および4.2の補正官能化率を与えるために、ORNを15mMまたは30mMのCy3IAME13のいずれかで官能化する。官能化し加水分解していないORNの一部を、9/1の割合の3-ヒドロキシピコリン酸およびクエン酸二アンモニウムの混合物と混合し、次いで、MALDITOF質量分析Bruker、Billerica、Massachusetts、USAにより分析する。スペクトル写真の分析により、それぞれORNならびにアントラニル酸-Cy3付加物で1回および2回官能化されたORNに相当する、8519.21;9281.14および10043.07ダルトンでMH付加物を検出することが可能になる図8。数字はダルトンで表す。グラフ1は、ORN単独の分析に相当し、グラフ2および3はそれぞれ15および30mMの化合物13で官能化された同じORNに相当する。結果および結論:このことは、イサト酸無水物誘導体がORNに反応すること、および付加物の数は官能化試薬の濃度に依存することの直接的証拠を提供する。ORNの化学的性質はRNA鎖と厳密に同じであるので、本発明者らは、本発明の出願の実施例9および12でさらに示すように、RNA鎖が同様に官能化されることを確信することができる。実施例5目的の分子とコンジュゲートした他のイサト酸無水物誘導体の、27個の塩基を有するモデルオリゴリボヌクレオチドORNとの反応性の実証官能化率の測定目的:実施例3に記載の標識化プロトコルにしたがって、目的の分子とコンジュゲートした他のイサト酸無水物誘導体、すなわち、-5BiotIA5、-5BiotIAMe9、-5BiotIASO3-10、-5BiotPEG4IA6、-5BiotPEG4IAMe11、-Cy3IA7、-Cy3IAMe13、-NBiotPEG2IA18、-NBiotPEG2アセトアミドIA19、-NBiotPEG4IA21、-5BiotPEG4SSIA23、および-5BiotPEG4SSIAMe24、の、27個の塩基を有するモデルORNとの反応性を示すこと。動作モード:手短に言えば、27個の塩基を有するORN8nmolを、250mMTEAAcpH7および25DMSOの混合物の存在下で、化合物5、9、10、6、11、7、13、18、19、21、23または24のいずれか1種を含む30mM溶液中65°Cで1時間インキュベートする。次いで、標識ORNを実施例3のように精製および処理する。ここから、異なるイサト酸無水物誘導体による官能化率およびアシル化の外部/内部位置特異性を示す以下の表3が作られる。また、これらの化合物のいくつかの溶解度は、本出願人により出願され、番号WO-A-2010/012949で公開されている先行する特許出願と同じプロトコルに従って決定した。結果および結論:実施例3の化合物Cy3IAMe13の場合のように、目的の分子と多様にコンジュゲートした他のイサト酸無水物誘導体はORNと反応して、加水分解後に、アシル化ヌクレオシドまたはジヌクレオチドをもたらすことが示されている。したがって、0.7~4.5の間のFrというORNの官能化が示され、これは、思い出さなければならないように、例えば、100塩基ごとに1~数標識の間を有することが求められるので、標識化用途に極めて十分である。イサト酸無水物の環内窒素のメチル化は、ビオチンの場合項目1および2ならびにCy3の場合項目6および7に官能化収率を二倍にすることが一般的に示されている。他の場合、収率は二倍にならないが、ビオチンPEG4の場合項目4および5には少なくとも改善する。奇妙にも、これは、誘導体5BiotPEG4SSIAおよび5BiotPEG4SSIAMeには当てはまらない。本発明者らは、その反応性に影響を及ぼすように思われるIAが有する目的の基の性質によりこれを説明する。一般的に、またイサト酸無水物誘導体が何でも、標識モノヌクレオシド/標識ジヌクレオチドの比は60/40に近いままである項目1~12ことも示されている。これは、3’末端が内部2’-OH基よりもかなり反応性であること、およびイサト酸無水物とコンジュゲートした目的の分子は位置特異性を修飾しないことを証明している。3’末端の最大反応性は、シス-ジオール2’,3’の存在に起因する。本発明者らはこの計算でε補正を適用していないので、この比は内部標識化のためにわずかに過大評価されていることに留意すべきである。情報としてまた一般的に、60/40の外部/内部アシル化の未補正位置選択性は、ε補正後に70/30に等しくなる。逆に、実施例2に記載されているように、イサト酸無水物の環内-NH-上の目的の分子のコンジュゲーションは、内部標識化の増加を示すように思われる項目8、9および10。そのため、目的の分子のイサト酸無水物とのコンジュゲーションの部位は、アシル化の位置特異性ならびにその大きさおよび電荷本特許出願中で伝えていない結果に基づくに影響を及ぼすように思われるだろう。実施例6目的の基とコンジュゲートしたイサト酸無水物誘導体5-biotIAMe9、Cy3IAMe13または5-BiotPEG4SSIAMeのRNA対DNA化学選択性の実証目的:RNA対DNAの官能化の選択性を示すために、イサト酸無水物誘導体5-biotIAMe9、Cy3IAMe13または5-BiotPEG4SSIAMe24の1つの作用に供した53個の塩基を有するODNと27個の塩基を有するORNとの間で比較試験を行った。動作モード:53個の塩基を有するODN:配列:5’-AAT-TCT-AAT-ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-GTG-CTA-TGT-CAC-TTC-CCC-TTG-TTC-TCT-CA-3’Eurogentec、Liege、ベルギー8nmolまたは27個の塩基を有するORN:配列:5’-AAC-CGC-AGU-GAC-ACC-CUC-AUC-AUU-ACA-3’Eurogentec、Liege、ベルギー8nmolをDMSO/TEAAcの25/75混合物緩衝液250mMpH7中30mMの化合物9または13または24と65°Cで1時間反応させる。アセトンによる沈殿ならびにヌクレアーゼP1およびアルカリホスファターゼによる加水分解の後、加水分解した断片を実施例3に記載するようにLC-MSにより分析する。ODNまたはORNと化合物13の反応を監視するクロマトグラムの例を図9に示す。ここではグラフA、BおよびCはそれぞれ、ORN、化合物13で官能化し沈殿させたORN、および13で官能化し、沈殿させ、加水分解したORNを表す。グラフD、EおよびFは、同じものを表すが、ODNである。結果および結論:ORNの補正官能化率は標識13で4.5、標識9で2.6および標識24で2.8で評価する一方で、ODNの補正官能化率は3つの場合で0.1で評価する。これらの実験条件では、ODNはほとんど官能化されておらず、このことはRNAについてのイサト酸無水物誘導体の官能化の選択性および塩基への反応性の欠如を確認している。実際、塩基がイサト酸無水物誘導体に反応したならば、ODNとの反応後にアントラニル酸ヌクレオシド付加物が形成しただろう。ODNの0.1の官能化は、DNAの5’-OHおよび3’-OH末端の極めて低い反応性に由来するものであることに留意すべきであるこの点に関しては、NawrotNucleosidesandNucleotides1998815~829参照。この実施例は、ODNに対する、ORNについての目的の分子とコンジュゲートしたイサト酸無水物誘導体の化学特異性を示している。ORN上の2’-OH基の存在は、ODN上にはないが、ORNへの化学特異的反応の源である。実施例75BiotIAMe9または5BiotPEG4IAMe11により官能化されたオリゴリボヌクレオチドのAffymetrixDNAチップ上での検出の実証目的:本発明者らは、5BiotIAMe9または5BiotPEG4IAMe11との反応によりビオチン化されたオリゴヌクレオチドが、DNAチップ上で検出可能になることを示しているGeneChipHumanGenomeU133Plus2.0Array、参照番号900470、Affymetrix、StClara、USA。動作モード:それぞれ、U133Plus2.0DNAチップAffymetrix、StClara、USAにより検出されるハウスキーピング遺伝子DAP3_P2、GAPDH_P15、HSA_P12およびLYS3_P7の配列の一部に相当する、30個の塩基を有する4種の合成オリゴリボヌクレオチドEurogentec、Seraing、ベルギーをそれぞれ6μMまで水溶液に入れる合計で24μM。4種のORNの溶液42μlを取り、次いで、リン酸カリウム溶液pH7、1M42μl、超純水42μlおよび化合物5BiotIAMe9もしくは5BiotPEG4IAMe11のDMSO中120mM溶液42μlと混合する。これらを65°Cのオーブン中で60分間、次いで、氷中で5分間放置してインキュベートする。過剰の試薬を除去するために、0.3倍容の3M酢酸ナトリウム、次いで0.7倍容の純粋なイソプロパノールを添加する。ボルテックス撹拌を行い、即時に遠心分離を4°C、14,000rpmで30分間行う。上清を除去し、沈渣を70エタノール50μLですすぐ。遠心分離を4°Cで15分間14,000rpmもう一度行う。上清を除去し、沈渣を加熱することなくロータリーエバポレーターJouan、StHerblain、フランスで5分間乾燥させる。残渣を超純水70μLに溶解する。AffymetrixGeneChipHumanGenomeU133Plus2.0Arrayキット参照番号900470およびマニュアル:GeneChip登録商標ExpressionAnalysis.TechnicalManualWithSpecificProtocolsforUsingtheGeneChip登録商標Hybridization,Wash,andStainKitP/N702232Rev.3に記載されているプロトコルにしたがって、官能化ORNのハイブリダイゼーションおよび検出を行う。官能化し、ハイブリダイゼーション緩衝液と混合したORNを、200μlの容積において7nM~70pMの間で変化する濃度でGenomeU133Plus2.0Arrayチップ上に沈着させる。ハイブリダイゼーションを、FS450fluidicsstationAffymetrix、SantaClara、USA上で45°Cで16時間行う。すすいだ後、フィコエリトリンとカップリングしたストレプトアビジンと複合体を形成させ、引き続いて、GeneChip登録商標Scanner3000およびGeneChip登録商標OperatingSoftwareAffymetrix、SantaClara、USAを用いて検出される蛍光を測定することにより、ビオチン化ORNの検出を行う。5BiotIAMe9による官能化後に収集された蛍光強度RFUを図10に示し、5BiotPEG4IAMe11によるものを図11に示す。結果および結論:2つの分子により誘導される蛍光強度は極めて類似しており、官能化されていないORNにより産生されるバックグラウンドノイズ約30RFU、図10および11では図示せずよりも極めて実質的に大きいことに留意する。4種の遺伝子間の差は、標的に対するORNの親和性の差に由来する。これらの実験は、ORNとビオチン化イサト酸無水物分子との間の反応によりビオチン基をORN上に移すことが可能であることを示している。その結果、ORN上のビオチンの存在により、固体担体上に固定化されている対応する相補的な標的との特異的ハイブリダイゼーションが存在するかどうかを検出することが可能になる。したがって、DNAチップ技術におけるリボ核酸の標識化のためのイサト酸無水物誘導体の有用性および有効性が示されている。実施例85BiotIAMe9によりビオチン化されたRNA転写産物のAffymetrixDNAチップ上での検出の実証目的:本発明者らは、ここで、実施例7と類似の実証を行うことを望むが、今回はDNAチップ上での試験の実態に相当する生体試料を用いる。そのため、インビトロRNA転写産物のパネルを用いる。これらの転写産物は、生体試料に由来する全RNA中に存在するmRNAに相補的なRNAである。次いで、このように得たインビトロ転写産物を、5BiotIAMe9との反応によりビオチン化し、DNAチップGeneChipHumanGenomeU133Plus2.0Array、参照番号900470、Affymetrix、StClara、USA上で検出する。動作モード:インビトロ転写産物を、MessageAmpIIキット参照番号AM1751、AMBION、Austin、Texasを用いて、血液試料から抽出した全RNAのインビトロ転写により産生する。手短に言えば、血液細胞からの全RNAの抽出後、mRNAと相補的なDNA鎖cDNAを産生するために、酵素T7Polymeraseによる第1の逆転写ステップを行う。次いで、DNAポリメラーゼによりcDNAの二本鎖を形成する前に、RNA鎖をRNaseHにより分解する。最後に、転写酵素T7を用いて、cDNAからアンチセンスRNAインビトロ転写産物を得る。前で得られたインビトロRNA転写産物568ng/μlの溶液17.6μL、超純水9.4μLおよび100mMZnOAc2pH6.53μLを混合する。次いで、この溶液を70°Cで15分間インキュベートし、次いで、直ちに氷中に入れる。この溶液30μLをサンプリングし、これにリン酸カリウム溶液pH7、1M30μL、超純水30μLおよび化合物5BiotIAMe9のDMSO中120mM溶液30μlを添加する。これを65°Cのオーブン中で60分間インキュベートし、次いで氷中に5分間入れる。次いで、イソプロパノールによる沈殿により実施例7と同様に過剰の試薬を除去する。AffymetrixチップGeneChipHumanGenomeU133Plus2.0Array、参照番号900470、Affymetrix、StClara、USA上での沈着、蛍光の検出および測定も同様である。得られた結果を図12に示す。結果および結論:対応するビオチン化標的が今回は全部存在するので標識IVT、先行する実施例7と比較して、より多くの遺伝子がこのチップ上で検出される。観察される蛍光強度は官能化されていない標的IVTにより産生されるバックグラウンドノイズ約30RFU、図10では図示せずよりも極めて実質的に大きいことに留意する。異なる遺伝子間の強度差は、試料中のこれらの遺伝子のそれぞれの頻度に由来する。現実の生体試料からのこの実験は、RNA鎖とビオチン化イサト酸無水物分子9との間の反応によりビオチン基をRNA鎖のパネル上に移すことが可能であることを示している。その結果、RNA鎖上のビオチンの存在により、相補的な標的との特異的ハイブリダイゼーションが存在するかどうかを検出することが可能になる。したがって、天然RNA鎖の標識化のためのビオチン化イサト酸無水物誘導体の有用性および有効性が示されている。実施例9Cy3IAMe13との反応により蛍光性にされるRNA転写産物のAgilentDNAチップ上での検出の実証目的:ここでは、本発明者らは、実施例8と類似の実証を行っているが、今回は、蛍光Cy3分子をRNA上に移すために、官能化ステップ用のCy3IAMe13分子を用いる。こうして得られた蛍光転写産物をハイブリダイズし、蛍光ストレプトアビジン分子を用いることなく、AgilentDNAチップStClara、USA上で直接検出する。動作モード:インビトロ転写産物を実施例8に記載するのと同様に産生する。この実施例では、本発明者らは、最も感受性の官能化IVTを検出するために最も適した濃度を決定するために、4種の濃度の官能化分子Cy3IAMe13を用いた。インビトロ転写産物6μgを総容積20μLの10mMZnOAc2溶液pH6.5に溶解する。この溶液を、RNAを部分的に断片化するために、断片の大部分が25~200塩基の間の大きさのもので得られるまで、70°Cで15分間インキュベートする。このインキュベーション後、溶液を直ちに氷中に入れる。次いで、酢酸亜鉛を除去するために、イソプロパノールによる精製を行う。これを行うために、3M酢酸ナトリウム6μLすなわち、30容積およびイソプロパノール14μLすなわち、70容積を添加する。ボルテックス撹拌を行い、遠心分離を4°C、14,000rpm20,800gで30分間行う。上清を除去し、RNA沈渣を70エタノール50μLですすぐ。遠心分離を4°C、14,000rpm20,800gで15分間行い、次いで、上清を除去し、残渣を水11μLに溶解する前に、ロータリーエバポレーターを用いて真空下で乾燥を行う。転写産物溶液11μLを、NaHCO3の500mM溶液4μLpH8~8.5およびCy3IAMe13のDMSO中120、240、360または480mM溶液5μLと混合して、それぞれ30、60、90または120mMの官能化試薬溶液を得る。これらの溶液を65°Cで1時間インキュベートする。過剰の官能化試薬および過剰の異なる塩を、イソプロパノール沈殿、次いで、アセトン沈殿により除去する。これを行うために、3M酢酸ナトリウム6μLすなわち、30容積およびイソプロパノール14μLすなわち、70容積を官能化溶液に添加する。ボルテックス撹拌を行い、遠心分離を4°C、14,000rpm20,800gで30分間行う。上清を除去し、次いで、沈渣を70エタノール50μLですすぐ。遠心分離を再度4°C、14,000rpm20,800gで15分間行い、上清を除去する。水280μL、3MLiClO418μLおよびアセトン900μLを沈渣に添加する。ボルテックス撹拌を行い、遠心分離を行い、上清を除去する。次に、水280μL、3MLiClO418μLおよびアセトン900μLを沈渣に添加する。ボルテックス撹拌を行い、遠心分離を行い、上清を除去する。沈渣を70エタノール50μLですすぎ、次いで、遠心分離を4°C、14,000rpm20,800gで15分間行う。上清を除去し、沈渣を水20μLに溶解する前に、ロータリーエバポレーターを用いて真空下で沈渣を乾燥させるすなわち、[インビトロ転写産物]理論値=625ng/μL。これらの異なる処理後に回収した官能化インビトロ転写産物の量を決定するために、各最終溶液1.2μlを、260nmでのUV分光測定法により分析するNanodrop100、ThermoScientificWaltham、USA。インビトロ転写産物のCy3官能化率100個のヌクレオシド当たりのCy3分子のを知るために、分析を550nmでも行う。この値はまたDoL色素数という名称で知られており、以下の式:DoL=100×340×[Cy3]/1000×[RNA]で計算される。この式の詳細は、KreatechAmsterdam、オランダにより市販されているCy3-ULSキット参照番号EA-023用のプロトコルに記載されている。以下の表4は、異なる濃度の分子Cy3IAMe13によるIVTの官能化後のDoL値を記載している。RNANano6000チップを用いた、BioAnalyzer2100Agilent、SantaClara、USAキャピラリー電気泳動装置による分析により、断片化および蛍光RNAのプロファイルを得ること、ならびに必ず断片の大部分が25~200塩基の間であるようにすることが可能になる。この後、蛍光転写産物のガラススライド上に固定化したプローブとのハイブリダイゼーションを検出するために、特定の量の官能化IVTをAgilentTechnologiesSantaClara、USADNAチップ上に沈着させる。このために、本発明者らは、AgilentTechnologies製のキット:SurePrintG3HumanGE8x60KKit参照番号G4851AまたはWholeHumanGenomeMicroarrayKit、4x44K参照番号G4112Fに記載されているプロトコルに従う。手短に言えば、官能化IVT1.65μgをハイブリダイゼーション緩衝液110μLに溶解し、AgilentBMX1ガラススライドチップ上に沈着させる。このチップは、bioMerieuxのための特別注文製であり、60個の塩基を有するオリゴヌクレオチドの形態で352個の遺伝子に相当する配列を含む。これらの遺伝子は、異なるフォーマットで、Affymetrixにより販売されており、実施例6および7に記載するU133Plus2.0DNAチップ上で見られる遺伝子の選択に相当する。同様に、ここでは、ヒト細胞中での極めて低い、低い、中間のおよび高い発現を有する遺伝子の選択が見られる。ハイブリダイゼーションは、10rpmの回転速度で17時間、65°CでAgilent装置参照番号G2545Aで行った。過剰の官能化されたハイブリダイズしていない転写産物を洗浄した後、Cy3の検出に適したフィルターを備えるTECANLS200スキャナーMannedorf、スイスで蛍光スポットを測定する。得られた原画像は図13で見え、再処理および測定した蛍光強度の遺伝子発現頻度とのマッチング後、図14に見えるヒストグラムをプロットすることが可能である。この後者は、陰性対照ならびにAffymetrixチップ上の強度レベルにより分類される4つのグループの配列極めて低い、低い、中間のおよび高いすなわち、基準法、について観察されるスポットの中央強度に相当する。結果および結論:陰性対照は、官能化されていないインビトロ転写産物について得られた中央強度に相当する。これは、約20RFUである、すなわち、完全に許容できる結果は、基礎に相当する。極めて低い発現クラスの配列のシグナル強度は、基礎に相当するものより大きくない。同じ観察がAffymetrixチップの基準法についても現れるので、これは首尾一貫した結果である。それにもかかわらず、低い存在の配列がよく検出され、他のグループの配列についての結果は実施例8のAffymetrixチップで得られるものに等しい。DoLの増加はシグナル動態を改善しない。そのため、1.6超のDoLでインビトロ転写産物を標識することは有用ではない。結論として、これらの条件下で標識Cy3-IAMe13により得られる0.8のDoLは、チップで優れた結果を得るのに満足なものである。したがって、これらのチップは、化合物Cy3-IAMe13で官能化したインビトロ転写産物の特異的ハイブリダイゼーションを示している。これらはまた、蛍光ストレプトアビジン分子を用いることなく、分子13で官能化したRNA鎖を直接検出することが可能であることを示している。蛍光性にされたRNA鎖のハイブリダイゼーションを検出する際の、目的の分子と結合したイサト酸無水物の有用性および有効性がもう一度示されている。実施例10アルカリホスファターゼの作用に供し、次いで、Cy3-IAMe13と反応させた全RNAのパネルの官能化率の増加の実証目的:本発明者らは、酢酸亜鉛溶液により部分的に断片化したRNA鎖のパネルが、アルカリホスファターゼによる予備的処理があった場合に、Cy3-IAMe13分子との反応性増加に遭遇することを示している。動作モード:RNA鎖のパネルをMAQCRNAStratagene参照番号:74000とする。この全RNAリボソームおよびメッセンジャーは、異なる起源:脳、乳房、Bリンパ球、子宮頸部、肝臓、脂肪肉腫、マクロファージ、皮膚、精巣、Tリンパ球の10系統のヒト細胞から直接抽出する。官能化プロトコルは、実施例9に記載するものと同じとする、すなわち:-MAQC0RNA12μgを、酢酸亜鉛溶液とインキュベートするまたはしない。-混合物をイソプロパノールで沈殿させる。-7単位のアルカリホスファターゼP7923-2KUSigma-Aldrichを混合物に添加し、リン酸化末端の加水分解を周囲温度で4時間進ませる。-次いで、総容積80μlのNaHCO3緩衝液100mM/DMSO75/25pH8~8.5中15mMの分子Cy3-IAMe13を混合物に添加する。この混合物を65°Cで1時間インキュベートする。-DoLを実施例9に記載するように測定する前に、混合物をもう一度イソプロパノールで、次いで、アセトンで2回沈殿させる。得られた値を以下の表5に示す。結果および結論:アルカリホスファターゼによる処理があってもなくても、MAQCRNAが切断されていない場合項目1および2、DoL官能化率に相当するものであるに差はない。産生される3’リン酸末端は反応性ではないのでこれ以上官能化は存在し得ないため、切断のみの後、DoLは確実にさらには増加しない項目3。対照的に、産生された3’リン酸末端の、15分の切断およびアルカリホスファターゼによる加水分解の組合せは、DoLを106増加させる項目4。従って、3’末端はジオール2’,3’の形態であるので、反応性は確実に増加する。そのため、切断されたRNA断片をアルカリホスファターゼで処理することにより、官能化率を増加させることが可能であることが示されている。これはまた、分子内部の2’ヒドロキシルと比較してRNAの末端ジオール2’,3’のはるかに大きい反応性を示す間接的証拠である。実施例11化合物24を介して官能化し、捕捉し、ジスルフィド結合を切断し、27個の塩基を有するODNとの混合物中の27個の塩基を有するORNを溶出する選択的方法の実証目的:本発明者らは、5BiotPEG4SSIAMe24と反応するORN/ODN混合物から出発して、-ORNを選択的に官能化すること、-ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子を用いてORNを捕捉し、他の用途のためにODNを潜在的に回収すること、-固定化ORNと粒子との間のSS結合を切断すること、および-ODNを含まないORNを選択的に溶出することが可能であることを示している。動作モード:本発明者らは、水中650μM溶液の27-merODNEurogentec参照番号21438-DNAバッチ番号2177673、配列:5’-AAC-CGC-AGT-GAC-ACC-CTC-ATC-ATT-ACA-3’および水中952μM溶液の27-merORNEurogentec参照番号21437-RNAバッチ番号2177672、配列:5’-AAC-CGC-AGU-GAC-ACC-CUC-AUC-AUU-ACA-3’を有する。ODN15.4μLおよびORN17.5μLを混合し、超純水67.1μLで満たす。HPLCへの注入後、ORNおよびODNにそれぞれ相当する260nmのUVピークの積分は、混合物が44ORNおよび56ODNを含むことを示している注入1、HPLC条件第4番、図15。官能化ステップ:混合物80μL8nmolを乾燥するまで蒸発させ、水10μL、イサト酸無水物BiotPEG4SSIAMe24;2.4mmolの480mMDMF中溶液5μL、および水中1M溶液のトリエチルアンモニウムアセタート緩衝液5μLに溶解する。媒体を65°Cのオーブンに1時間入れる。沈殿ステップ:次いで、媒体から残渣BiotPEG4SSIAMeを除去するために、媒体を過塩素酸リチウムLiClO4およびアセトンによる3回沈殿に供する:水中3MのLiClO4溶液18μLおよび水262μLを媒体に添加する。ボルテックス撹拌後、アセトン900μLを添加し、次いで、媒体をもう一度撹拌し、遠心分離する周囲温度、13,000rpmで5分間。次いで、上清を注意深く除去し、LiClO4溶液18μLおよび水282μLで同じ方法を2度繰り返す。最後に、媒体を、撹拌および遠心分離する前にアセトン900μLで洗浄する。ロータリーエバポレーター中で乾燥する前に上清の大部分を注意深く除去する。乾燥残渣を水10μLに溶解することから出発して、上記官能化および沈殿ステップを繰り返す。次いで、ORN/ODN混合物を水33μLに溶解し、次いで、この溶液5μLをHPLCに注入する注入2、HPLC条件第4番、図15。以下を250μL管中に連続的に導入する:-事前にPBS緩衝液0.01MPO4-、0.0027MKCl、0.137MNaCl、25°CでpH=7.4、Sigma-Aldrich参照番号、SaintLouis、USA200μLで2回洗浄した、MerckMagPrep-25ストレプトアビジンコーティングした磁性粒子Merck、Darmstadt、ドイツ250μgすなわち、溶液50μL。-化合物BiotPEG4SSIAMe24と反応したPBS10μLおよび沈殿したORN/ODN混合物4.0μL。-媒体を周囲温度で10分間穏やかな撹拌下で放置する。粒子の磁化後、上清を注意深く除去し、分画をHPLCに注入する注入3、HPLC条件第4番、図15。次いで、粒子をPBS200μLで2回洗浄する。次いで、ジチオトレイトールDTTのPBS中100mM溶液20μLを媒体に添加し、これを40°Cで穏やかな撹拌下で1時間放置する。磁化後、上清をHPLCに注入する注入4、HPLC条件第4番、図15。結果および結論:注入1では、44ORNRT=3分および56ODNRT=4分を含む初期混合物を観察することができる。注入2では、9~22分の間に位置する集団のために事実上消失し、アシル化されビオチン化されたORNに相当するので、初期ORNのみがBiotPEG4SSIAMeにより官能化された95ことが観察される。対照的に、ODNはまだ存在しており反応しなかったことに留意する。注入3は、上清がODNを主に含み、官能化RNAはほぼ完全に捕捉されたことを示している。この場合特異的捕捉収率は37と推定されるが、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子のさらなる添加により、このビオチン化RNAの全体を捕捉することが可能になることが明らかである。最後に、注入4では、ORNおよびODNに相当するピークの完全な消失が観察される。アシル化されビオチン化されたORNに相当する集団RT=9~32分もまた、ジスルフィド結合SSの切断およびそのためビオチン部分の喪失に相当するものに由来する主に4.5~18分の間の保持時間を有する集団により消失した。注入2に関して、集団の幅はORN上のランダム官能化に由来する。これは、異なる保持時間を有する多数の付加物の形成を誘導する。全体で、ORNは、最初に関与する量に対して18の収率で、担体から遊離した。この収率を最適化するために官能化率を調節することが可能である。兆候として、最適化条件では、官能化/捕捉/溶出工程からの収率は約50である。注入4で示されるように、アントラニル酸SH基によるビオチン化RNAの全加水分解を、ヌクレアーゼP1およびアルカリホスファターゼによる完全加水分解に供した。次いで、本発明者らは、4種の天然リボヌクレオシドに加えて、全混合物の5のレベルでヌクレオシド付加物およびヌクレオチドアントラニル酸SHを観察することが可能であることを示した。デオキシリボヌクレオシドまたはヌクレオチドは少しも観察されなかった。この実験は、官能化/捕捉/切断/溶出工程の特異性、およびそれゆえ、ORN/ODN混合物から出発して、これらの化合物に行うべき使用に従ってこれらの化合物のあるものまたは他のものを選択的にふるい分ける可能性を確認している。放出されたアシル化RNAは、全加水分解により示されるように、RNAを含まない。実施例12化合物5BiotPEG4SSIAMe24と反応する1083個のヌクレオチドを有するHIVWT野生型転写産物を官能化、捕捉、切断および溶出する選択的方法の実証目的:この実施例では、本発明者らは、化合物5BiotPEG4SSIAMe24により増幅可能なRNA鎖の集団1083個のヌクレオチドを有するHIVWT転写産物を選択的に官能化すること、ストレプトアビジンコーティングした磁性粒子を用いてこの集団を選択的に捕捉すること、固定化RNAと粒子を接続している結合を化学的かつ特異的に切断すること、図16に記載するような方法に供したHIV転写産物RNAを選択的に溶出することが可能であることを示している。動作モード:本発明者らは、その部分配列挿入pG30がbioMerieuxHIVキットNuclisensEasyQ登録商標HIV-1v2.0、参照番号285033、bioMerieux、Marcyl’Etoile、フランスにある、1083個のヌクレオチドを有するHIV転写産物RNAを有する。3.271012コピー/μL1.94μg/μLのこの転写産物の水溶液を内部で製造する。官能化:以下の試薬を、以下の表6に示すように5本の250μLポリプロピレンPCR管に導入する:表6の実験の各々について、反応混合物の総容積は4μLであり、最終TEAAc濃度は250mMである。実験番号1は対照として働く。充填した管をサーマルサイクラーThermoelectronCorporation、Milford、MA、USAにより65°Cで1時間インキュベートする。NuclisenseasyMAGキットによる過剰の5BiotPEG4SSIAMe24ビオチン化試薬の除去:このステップは、RNAと反応しなかった過剰の5BiotPEG4SSIAMe24を除去することに存する。bioMerieux製のNuclisenseasyMAG抽出キットを用いてこれを行う。インキュベーション後、官能化試料を抽出緩衝液1bioMerieux参照番号:280131、バッチZ012EB1EB100μLに溶解し、事前にオートクレーブした1.5mLポリプロピレン管に移す。次いで、撹拌および軽い遠心分離の前に、800μLの量のこの同じ緩衝液を添加する。次いで、50μLの容積すなわち、1mgのeasyMAG磁性シリカ粒子MagSil、bioMerieux参照番号:280133バッチZ011EA1MSを各試料に添加する。穏やかなボルテックス撹拌下周囲温度で10分間のインキュベーション後、管を磁気ラックに置き、上清を除去する。撹拌、軽い遠心分離、磁化および上清の除去前に、抽出緩衝液1500μLを添加する。次いで、計画的に各添加の間に撹拌、軽い遠心分離、磁化および上清の除去をしながら、抽出緩衝液2参照番号:280131、bioMerieux、Lyon、フランス900μL、抽出緩衝液2500μLおよび抽出緩衝液3参照番号:280132、bioMerieux、Lyon、フランス500μLを連続的に添加する。最後に、抽出緩衝液320μLを添加し、管を70°Cのサーモミキサーに5分間1400rpm撹拌入れる。溶出液をNanodropND-3300NanoDropTechnologiesInc、Wilmington、DE、USAで測定し、BioAnalyzerによりAgilentRNANano6000チップAgilent、SantaClara、USA上に注入してその電気泳動プロファイルを監視する。捕捉:前もってPBS1×0.01MPO4-、0.0027MKCl、0.137MNaCl、25°CでpH=7.4、SIGMA参照番号4417200μLで2回洗浄したMagPrep-25ストレプトアビジン粒子Merck、Darmdstadt、ドイツ100μg溶液20μLを5本の新たな250μLPCR型ポリプロピレン管に導入する。これに、官能化されていないRNAの非特異的吸着を制限するために、PBS4×0.4SDSドデシル硫酸ナトリウムの溶液5μLおよび次いでeasyMAGシリカによる精製から出る溶出液15μLを添加する。管の各々を周囲温度で10分間低速ボルテックスで撹拌する。管をDynalMPC9600磁化ラックDynal、ノルウェーに置き、上清をNanodropアッセイNanoDropTechnologiesInc.、Wilmington、DE、USAのために、および捕捉率を測定するためのBioAnalyzerNano6000Agilent、SantaClara、USA中への導入のために注意深くサンプリングする。溶出:先行するステップに使用した管の内容物をPBS4×0.4SDS溶液100μLで洗浄し、次いで、PBS1×0.01MPO4-、0.0027MKCl、0.137MNaCl、25°CでpH=7.4、SIGMA参照番号4417の溶液100μLで2回洗浄する。磁化後に上清を注意深く除去し、PBS1×pH7.4SIGMA参照番号4417中100mMジチオトレイトールDTT8μLを管の各々に添加する。次いで、管を分離し、サーモミキサーEppendorf、Hamburg、ドイツに40°Cで1時間300rpm撹拌入れる。最後に、管を磁化ラックに置き、溶出収率を測定するためにBioAnalyzerに注入するために上清をサンプリングする。結果:官能化:異なる濃度のBiotPEG4SSIAMe24によるRNAの官能化後、BioAnalyzerにより与えられる電気泳動図上に、官能化されていない対照RNAと比較して、官能化RNAの右側へのシフトならびにピークの増大が観察される。これは、RNAの質量の増加およびそのため図17または図18に示すようにここでは、ラインLは核酸の大きさのスケールに相当し、ライン1、2、3、4および5はそれぞれ15、30、60、120または180mMの分子24で官能化された転写産物に相当する修飾された移動プロファイルをもたらすアントラニル酸残基の存在により説明される。RNAが官能化されるほど、これはより右または上にシフトし、このことは官能化率の増加を表す。捕捉:異なる濃度のBiotPEG4SSIAMe24による官能化RNA転写産物の補捉後、図19の電気泳動図に示すように、RNAは対照の上清中、および実験番号215mMBiotPEG4SSIAMe24による官能化の上清中に極めて少量で検出されるのみである。これは、RNAが十分にビオチン化されると、RNAが完全に捕捉されることを示している。実験1の対照はビオチン化されていないので、RNAは捕捉されていない。溶出:先行するステップで固定化した転写産物の溶出後、予想通り対照を除いて、試料全てでRNAが有意に検出される。対照は官能化も捕捉もされなかったので、溶出しない。同時に、粒子上に吸着されるビオチン化されていないRNAによる非特異的溶出はないことが示されている。溶出するRNAの量は、図20に示すように官能化率に依存する。こうして溶出したRNAは官能化RNAよりも短い保持時間を有し、これはSS結合の切断のためであり、これにより分子の分子量を減少させることが可能になることに留意する。方法およびその異なるステップの各々のそれぞれの収率を以下の表7に要約する:濃度の全てはBioAnalyzerで得られる蛍光シグナルを積分することにより測定した。捕捉率は、MagPrep-25MerckStreptavidin粒子上に固定化したRNAの量上清中のRNAを分析することにより評価すると官能化および沈殿後に回収されるRNAの量との間の比として定義される。溶出率は、ステップの各々の収率および全体収率から差し引く。異なる濃度のBiotPEG4SSIAMeについて10~18の間の全体収率が得られるが、NuclisenseasyMAGキットでの精製後には30~35の間の物質が回収されることを理解する。30mM以上のBiotPEG4SSIAMe24濃度から出発して、捕捉はMagPrep-25Streptavidin粒子Merck100μgを含む合計である。官能化されていないRNA対照のMagPrep-25Streptavidin粒子上への非特異的吸着は6であるが、このRNAは洗浄中に除去され、DTT100mMによる処理中には溶出しない。類似の結果を有する濃度の各々については、操作を再現した。結論:HIV転写産物RNAは、異なる濃度の化合物BiotPEG4SSIAMe24で官能化され、NuclisenseasyMAG登録商標キットで精製され、MagPrep-25MerckStreptavidin磁性粒子に選択的に捕捉され、ジスルフィド結合を切断することにより溶出した。官能化されたRNAのみがBioAnalyzerAgilentRNA6000Nanoチップで検出される。最大18までの出発RNAがこの方法によりうまく抽出された。これは、RNAの特異的官能化および磁性粒子上への捕捉後の溶出を行うことが可能であることを明確に示している。実施例13化合物BiotPEG4SSIAMe24で選択的に官能化し、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子により捕捉され、100mMDTT溶液で溶出したHIV転写産物のNASBA増幅目的:本発明者らは、実施例12で調製した転写産物をその後増幅反応中に増幅することができることを示している。この場合、これはNASBA増幅技術であるが、これはPCR、TMA、3SRなどの他の技術で行うことができる。本発明者らはまた、RNA上のアントラニル酸残基の存在が増幅を妨げないことを示している。動作モード:先行する実施例12では、WTHIV転写産物4μg1083個のヌクレオチド、内部生産、bioMerieuxバッチ841470301、C=3.27E12コピーμlを異なる濃度の化合物240mM、15mM、30mM、120mM、180mM、すなわち、表6の実験番号1~7でビオチン化した。次いで、図16に示すように、この転写産物をMerckMagPrep25Streptavidin磁性粒子上に捕捉し、次いで、すすいだ後、ジスルフィド結合SSを切断し、-SHアントラニル酸基を有する転写産物を溶出するために、粒子を40°CでPBS1×pH7中100mMDTT処理に1時間供した。本発明者らは、これらの転写産物をNASBA技術により増幅することができることを評価した。この評価は、官能化されていない裸のHIV_WT転写産物範囲との比較として行った。増幅は、NucliSENSEasyQ装置bioMerieux、Lyon、フランスおよびNucliSENSEasyQHIV-1V2.0キットbioMerieux、Lyon、フランス、参照番号285033、バッチ09122106により行う。使用するソフトウェアは、NucliSENSEasyQDirectorとし、プロトコルはQL1-601.0bioMerieux、Lyon、フランスとする。実施例12に記載するような化合物24による官能化、捕捉および100mMDTT8μLへの溶出後、表7の実験番号2~5の転写産物を、AGILENTbioanalyzerSantaClara、USAを用いてRNA6000NANOチップで分析し、以下の濃度:15μl中1000コピー、100コピー、50コピー、10コピー、1コピー、0コピーに希釈した。360コピーに希釈したHIV_IC転写産物WT野生型転写産物と同じ増幅配列の内部対照であるが、別の発蛍光団を保有する分子標識により検出されるを15μl容積まで添加し、増幅が起こるウェルの全てに存在するようにする。この転写産物は、増幅の補正動作を監視するのに役立つ。試験を3回行う。実験番号1は、官能化されなかった0mMの化合物24がそれにもかかわらず、官能化、捕捉および溶出プロトコルの全ステップを受けた転写産物に相当する。そのため、これは、官能化されていない転写産物の非特異的吸着および溶出を制御するものである。この試料に含まれるRNAの量はbioAnalyzerの検出閾値よりも低いので、これをNASBA増幅により分析する。以下の表8は、実験番号1~5の各転写産物の溶出液の分析値を示している総容積=8μl。6個のAccuspheresENZIINucliSENSEasyQHIV-1V2.0キット、参照番号285033、bioMerieux、Lyon、フランスを1.5mlポリプロピレン管中に沈着させる。270μLの容積のENZdilHNucliSENSEasyQHIV-1V2.0キット、参照番号285033、bioMerieux、Lyon、フランスをAccuspheres上に添加し、それらが完全に溶解するよう15分経過させる。12個のAccuspheresPRMHNucliSENSEasyQHIV-1V2.0キット、参照番号285033、bioMerieux、Lyon、フランスを1.5mlポリプロピレン管中に沈着させる。PRMdi1H1080μLNucliSENSEasyQHIV-1V2.0キット、参照番号285033、bioMerieux、Lyon、フランスをこれらのAccuspheres上に添加し、Accuspheresが完全に溶解するまで混合物を直ちにボルテックス撹拌する。2本の管混合ENZIIおよび混合PRMHにおいて完全に溶解した後、これらの混合物をベンチトップ遠心分離機で遠心分離する。栓で密閉した0.2mlの8ウェルのウェルストリップ中でNASBA増幅を行う。各濃度1000~1コピーの間の転写産物の混合物15μL容積を各ウェルの底に沈着させる。PRMH混合物20μLを添加する。栓のないウェルストリップは、NASBARNAプロトコルに従って、65°Cで2分間RNAの変性、次いで41°Cで2分間増幅温度、NucliSENSEasyQIncubatorbioMerieux、Lyon、フランス上に沈着させる。この時間中、ENZII混合物5μLをウェルストリップの栓の中に沈着させる。次いで、ウェルストリップに栓をし、ベンチトップ遠心分離機で遠心分離し、次いで、3秒間撹拌し、NucliSENSEasyQ装置bioMerieux、Lyon、フランスのラック上に沈着させる前に、もう一度ベンチトップ遠心分離機で遠心分離する。並行して、同じ操作を1000~1コピーの官能化されていないHIV_WT転写産物の範囲で行う。次いで、増幅を開始する。60分後、結果を.xml形式でエクスポートし、図21で見られるような、T2アルゴリズムによりSpotFireソフトウェアTibcoSoftawareInc.、PaloAlto、USAを用いて分析する。結果および結論:表8に示すように、吸着および非特異的溶出を示す対照試料実験番号1は事実上全く転写産物を含まず、平均して、実験番号2~5に相当する試料よりも100万倍少ない転写産物しか含まないことを留意する。そのため、化合物24と反応しなかったが同じステップに従ったRNA転写産物は100万倍低い濃度で溶出するに過ぎないので、化合物24と反応したHIV転写産物の官能化、捕捉、切断および溶出の方法はRNA特異的方法であると言うことができる。そのため、これは、図21で観察されるNASBA増幅反応が、実施例12に記載の方法により官能化され、捕捉され、溶出したHIV_WT転写産物から起こるのみであり得るという証拠である。本発明者らは、1000~1コピーの転写産物の範囲を行うのに必要な濃度に希釈した溶出緩衝液PBS1×pH7およびDTT100mMがNASBA増幅を阻害しないことを示す、予想による全点における360コピーを有する内部対照の増幅を観察する図示せず。図21は、異なる濃度15、30、120および180mMの分子24で官能化し、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子上に捕捉し、次いで、DTTによる化学的切断により溶出し、NASBAにより増幅したHIV転写産物の範囲1000、100、50、10および1コピーの重ね合わせを示している。ビオチン化されていない転写産物の範囲との比較を行う。15および30mMの濃度については、NASBA増幅は影響を受けていない。対照的に、120mMから本発明者らは増幅の阻害の始まりを観察し、これは増幅の開始のますます多くの実質的な時間停止を有する180mMの標識濃度で確認される。これは、RNAが官能化されるほど、アントラニル酸単位がハイブリダイゼーションおよび/またはポリメラーゼ伸長工程を妨げるという事実により説明される。NASBA増幅法は、一般的に続くが、以下の表9に示すように、官能化試薬24の濃度が増加すると、検出される転写産物の最小量で増加が観察される。そのため、高濃度でさえ官能化が可能であっても、増幅の阻害を避けるためにRNAの官能化を緩和するのがよい。本発明の一実施形態では、50mMの化合物24は、発明者らがこの実施例で有する条件に使用する好ましい上限のままである。これは、RNAを酵素的重合反応により増幅することができるのを維持しながら、官能化、捕捉および溶出の工程に供することができることを示している。さらなる所見として、強力な官能化率も有利であることに留意すべきである。したがって、この状況により、DNAの増幅に影響を及ぼすことなくRNAの増幅を阻害することが可能になる。これは、RNAにより汚染された溶液を除染するためのアプローチに用途を見出すことができる。実施例14HIVRNA転写産物およびゲノムDNAの混合物を含む溶液からのHIVRNA転写産物の選択的抽出目的:本発明者らは、RNAおよびDNAの混合物を含む生物学的溶液のDNA濃縮の概念を示している。本発明者らは、この概念を3種の異なる生物学的RNAモデルで試験しており、本発明者らは、化合物24でRNAを官能化する、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子を用いて選択的に捕捉する、および切断する/溶出する実施例12に記載するように選択的工程により、20/80の初期RNA/DNA比から平均で90/10の最終RNA/DNA比に行くことが可能になることを示している。動作モード:この実施例に用いる核酸は以下の通りである:1150ng/μlの基準全RNAHumanUniversalReferenceRNA、MAQC-ASTRATAGENE参照番号740000SantaClara、USA。1.94μg/μlのHIV転写産物いわゆる野生型またはWT。1.76μg/μlの子ウシ胸腺gDNA、SIGMASaintLouis、USA、参照番号D4764-5UN。実施例12に記載するように、bioMerieuxMarcyl’Etoile、フランス製のNuclisensEasyMag登録商標抽出キットを用いて、血液200μLの抽出後に得られるEasyMag登録商標溶出液12RNA/88DNAを含む437ng/μl。1-官能化:以下の試薬をそれぞれ3本の0.2mlプラスチック管に導入する以下の表10:各場合で、最終TEAAc濃度は250mMであり、化合物24の最終濃度は1.5mMである。3本の管を加熱ラック上65°Cで1時間インキュベートする。2-イソプロパノール/酢酸沈殿による過剰の化合物24の除去:各試験の容積の全体をオートクレーブした1.5mlプラスチック管に移す。各管の容積を超純水で100μlにする。3M酢酸ナトリウム30μLpH=5.6、次いでイソプロパノール70μLSigma参照番号34959StLouis、USAを添加する。管の全てをボルテックス効果により撹拌し、次いで、4°C、14,000RPMで30分間遠心分離を行う。遠心分離の終わりに、テーパーのついたチップを用いて上清を除去する。沈渣を70エタノール50μLですすぎ、次いで、4°C、14,000RPMで15分間遠心分離を行う。遠心分離後、管をひっくり返すことにより上清を除去する。次いで、管に含まれる沈渣をロータリーエバポレーターで10分間乾燥させる。沈渣を超純水20μLに溶解する。各管の上清中の回収された核酸を、Qubit登録商標Fluorometer装置、参照番号Q32857、InvitrogenCarlsbad、Californiaで、Quant-iTRNAAssayKit5~100ng、参照番号Q32855、InvitrogenCarlsbad、CaliforniaおよびQuant-iTdsDNAHSAssayKit0.2~100ng、参照番号Q32854、InvitrogenCarlsbad、Californiaを用いて分析する。これらの分析キットにより、混合物中のRNA/DNA比を決定することが可能になる。3-ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子上への核酸の捕捉:各管中の核酸の実質的な量を考慮して、超純水60μLを添加する。このステップのための最適条件すなわち、磁性粒子40μgが核酸2μgを完全に捕捉することを達成するために、各試験についての核酸の捕捉を5本の異なる管容積を5本の管に分配で行う。各試験について、5本の0.2mlプラスチック管を用い、この中にMagPrepP-25Streptavidin、MERCKDarmstadt、ドイツ8μl40μgに相当するを添加する。テーパーのついたチップおよび磁気分離用のInvitrogenMPC9600Dynal磁石CarlsbadCaliforniaを用いて、粒子をPBS1×SDS0.180μLで2回洗浄する。いったん粒子を洗浄したら、ステップ2で調製した精製核酸15μLおよびPBS4×SDS0.45μLを各沈渣上に添加する。管を周囲温度で穏やかに撹拌しながら最小速度でボルテックススターラー10分間インキュベートする。10分後、磁石およびテーパーのついたチップを用いた磁気分離後に上清を吸い取る。この上清を前のようにQubit登録商標Fluorometerで分析する。4-官能化RNAの溶出:官能化核酸が固定化されているストレプトアビジン磁性粒子の沈渣を65°C加熱ラックで5分間PBS1×/SDS0.180μLで洗浄する。ボルテックス撹拌を行い、5分後、磁石およびテーパーのついたチップを用いた磁気分離後に洗浄緩衝液を吸い取る。この操作を2回繰り返す。沈渣の最後の洗浄をPBS1×20μlで行う。次いで、各試験に相当する5種の沈渣を単一管中で混合する。次いで、各試験について容積をPBS1×100μlとする。ボルテックス撹拌を行い、次いで、磁石およびテーパーのついたチップを用いた磁気分離後に上清を吸い取る。DTT100mM/PBS1×8μlを各沈渣上に添加する。ボルテックス撹拌を行い、40°C、300RPMで1時間インキュベーションを行う。1時間後、磁石およびテーパーのついたチップを用いた磁気分離後に上清を吸い取る。この上清を前のようにQubit登録商標FluorometerInvitrogen、Carlsbad、California装置により分析する。結果および結論:1-結果:溶出液のQubit登録商標Fluorometerによる分析により、前記のような工程の各ステップで存在する核酸を定量化することが可能になる。得られた測定値から、RNAおよびDNA抽出収率、次いで、異なる条件下で行われたいくつかの試験の比較を行うことを可能にするSとして知られている選択指数を計算することが可能である:以下の表11は、得られた測定値および行われた計算から作成される。得られた結果は、3種の生物学的モデルで類似である。11~20のRNAを平均で含むDNAおよびRNAの混合物から、また動作モードに記載する実験条件の下で、混合物を最大86~91までのRNAに濃縮することが可能である。選択性はどの場合にも1よりはるかに大きい。2-結論:化合物24によるRNAの選択的官能化、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子を用いた選択的捕捉、および切断/溶出の工程実施例12に記載するような後のRNA濃縮の概念は、3種の異なる生物学的モデルで示される。どの場合でも、RNA溶液の極めて有意な濃縮が明らかに示される。本発明の出願に記載する技術は、本発明者らの知る限りでは、DNA/RNA混合物中のRNAを選択的に選別するこの動作を行うことを可能にする唯一のものである。実施例15HIVRNA転写産物およびゲノムDNAの混合物を含む溶液からのゲノムDNAの選択的抽出目的:本発明者らは、RNAおよびDNAの混合物を含む生物学的溶液のDNA濃縮の概念を示している。14/86の初期RNA/DNA比がこの工程の後で0/100に等しくなるので、本発明者らは、化合物24でRNAを官能化し、次いで、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子を用いて、官能化されたRNAを選択的に捕捉する選択的工程により、RNAを含まない上清を得ることが可能になることを示している。動作モード:この実施例に用いる核酸は以下の通りである:HIV_WT転写産物、1.94μg/μl。子ウシ胸腺gDNA、SIGMASaintLouis、USA、参照番号D4764-5UN、1.76μg/μl。1-官能化:これら2種の核酸溶液を用いて、14/86RNA/DNA混合物を以下の組成で調製する:HIVRNA転写産物6.2μLすなわち、12μgおよびゲノムDNA27.3μLすなわち、48μg。以下の表12による以下の試薬を0.2mlプラスチック管に導入する。どの場合でも、TEAAcの最終濃度は250mMであり、試験する化合物24の最終濃度は0、1.5、15、30および60mMである。5つの試験は、加熱ラック上65°Cで1時間インキュベートする。2-EasyMAG登録商標磁性シリカ上での精製による過剰の化合物24の除去:各管中の核酸の有意な量を考慮して、各試験のための精製を5本の1.5mlプラスチック管で行う。そのため、実施例12に記載するようにEasyMag登録商標精製プロトコルbioMerieux、Marcyl’Etoile、フランスに従って、各試験のために5回2.2μlすなわち、核酸2μgをサンプリングする。このため、溶解緩衝液900μL抽出緩衝液1、参照番号280130、バッチZ012EB1EB、bioMerieuxを各管に添加する。ボルテックス効果による撹拌および短い遠心分離を行う。磁性シリカ粒子50μL、すなわち、1mgEasyMAGシリカ、参照番号PR333077、バッチZ011MA1MS、bioMerieuxを添加する。ボルテックス効果による撹拌を直ちに行う。管を周囲温度および撹拌なしで10分間インキュベートする。10分後、DYNALInvitrogene磁石Carlsbad、Californiaを用いた磁気分離後に上清を吸い取る。溶解緩衝液500μLを添加し、ボルテックス効果による撹拌、引き続いて、磁化および上清の除去を行う。洗浄緩衝液2抽出緩衝液2、参照番号280131、バッチZ011LD2EB、bioMerieux900μlを添加し、ボルテックス効果による撹拌、引き続いて、磁化および上清の除去を行う。洗浄緩衝液2500μLを添加し、ボルテックス撹拌、引き続いて、磁化および上清の除去を行う。洗浄緩衝液3抽出緩衝液3、参照番号280132、バッチZ011HD3EB、bioMerieux500μlを添加し、ボルテックス撹拌、引き続いて、遠心分離、磁化および上清の除去を行う。洗浄緩衝液320μLを添加し、管を軽くたたくことにより混合を行い、1400rpmで撹拌しながら、70°Cで5分間、加熱ラック中で溶出を行う。遠心分離、磁化および上清の除去を行う。上清中の回収した核酸を、実施例14に記載するように、Qubit登録商標Fluorometerおよび対応するキットにより分析する。3-ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子上への核酸の捕捉:各試験について、5本の0.2mlプラスチック管を用い、この中にMagPrepP-25Streptavidin、バッチFA007950841、MERCKDarmstadt、ドイツ8μl40μgに相当するを添加する。テーパーのついたチップおよび磁気分離用のDynalMPC9600磁石を用いて、粒子をPBS1×SDS0.180μLで2回洗浄する。いったん粒子を洗浄したら、精製ステップ2後に回収した上清15μLおよびPBS4×SDS0.45μLを各沈渣上に添加する。管を周囲温度で穏やかに撹拌しながら最小速度でボルテックス10分間インキュベートする。10分後、磁石およびテーパーのついたチップを用いた磁気分離後に上清を吸い取る。RNA/DNA比を決定するために、この上清をQubit登録商標Fluorometerで分析する。結果および結論:1-結果:Qubit登録商標Fluorometerによる分析により、工程の各ステップで存在する核酸を定量化することが可能になる。得られたこれらの測定値から、各ステップのDNA/RNA比を計算することが可能である。データを以下の表13に記録する。約85のDNAを含む混合物から、また15mMの化合物24の使用から始めて、捕捉上清中のDNAの100を分析することが可能であるビオチン化RNAはストレプトアビジン磁性粒子上に選択的に捕捉されている。2-結論:本発明者らは、この実施例により、イサト酸化合物24により80DNAの存在下でRNAを選択的にビオチン化すること、次いで、100DNAを含む上清を有するために、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子でビオチン化RNAを固定化することが可能であることを示している。この技術は有利にRNAseに取って代わる。"