"器官再生の強化又は開始を必要とする対象における器官再生を強化するか又は開始させる方法であって、該対象の器官再生が望まれる体の領域に、該器官に特異的な内皮細胞又は該器官に特異的な誘導内皮細胞を投与することを含む、器官再生を強化するか又は開始させる、上記方法。前記器官が肝臓であり、かつ前記方法が肝類洞内皮細胞LSEC又は誘導LSECの肝内移植を含む、請求項1に記載の方法。VEGF-Aの投与をさらに含む、請求項2に記載の方法。LSEC又は誘導LSECが、VEGFR2VE-カドヘリンVEGFR3CD34第VIII因子LSECである、請求項2に記載の方法。肝細胞の投与をさらに含む、請求項2に記載の方法。前記器官が肺であり、かつ前記方法が肺毛細血管内皮細胞PCEC又は誘導PCECの静脈内又は気管内移植を含む、請求項1に記載の方法。MMP14、VEGF-A、又はFGFの1つ又はそれ以上の投与をさらに含む、請求項6に記載の方法。前記PCEC又は誘導PCECがMMP14を発現する、請求項6に記載の方法。上皮前駆細胞の投与をさらに含む、請求項6に記載の方法。前記肝細胞を肝類洞内皮細胞と共培養することによって培養中の前記肝細胞を増大させる方法。肺上皮前駆細胞を肺毛細血管内皮細胞と共培養することによって培養中の前記肺上皮前駆細胞を増大させる方法。器官再生の強化又は誘導を必要とする対象における器官再生を強化又は誘導する方法であって、VEGF-A、VEGF-E、FGF-2、MMP14、EGF、又は他のEGF-受容体リガンドの1つ又はそれ以上を、該対象の器官再生の強化又は誘導に十分な量で該対象に投与することを含む、器官再生を強化又は誘導する方法。器官が肝臓である、請求項12に記載の方法。器官が肺である、請求項12に記載の方法。器官再生を必要とする対象に投与するための医薬組成物であって、該器官に特異的な単離された内皮細胞、又は該器官に特異的な単離された誘導内皮細胞を薬学的に許容しうる担体と組み合わせて含む、上記医薬組成物。前記内皮細胞又は誘導内皮細胞が自己細胞である、請求項15に記載の医薬組成物。器官が肝臓であり、かつ細胞がVEGFR2VE-カドヘリンVEGFR3CD34第VIII因子LSECである、請求項15に記載の医薬組成物。VEGF-A、VEGF-E、FGF-2、EGF、又はMMP14の1つ又はそれ以上をさらに含む、請求項15の医薬組成物。器官が肺であり、かつ細胞がVEGFR2VE-カドヘリンCD34CD31FGFR1PCECである、請求項15に記載の医薬組成物。VEGFR2VE-カドヘリンVEGFR3CD34第VIII因子細胞である細胞を単離することを含む、肝特異的内皮細胞を単離する方法。VEGFR2VE-カドヘリンCD34CD31FGFR1細胞である細胞を単離することを含む、肺特異的内皮細胞を単離する方法。本発明の開示は、器官再生の強化又は誘導を必要とする対象subjectにおいて器官再生を強化又は誘導する方法を提供する。一実施態様において、器官再生の強化又は開始を必要とする対象において器官再生を強化するか又は開始させる方法であって、前記対象の器官再生が望まれる体の領域に、前記器官に特異的な内皮細胞又は前記器官に特異的な誘導内皮細胞inductiveendothelialcellsを投与することを含む、器官再生を強化又は誘導する方法を提供する。別の実施態様は、肝再生の強化又は開始を必要とする対象において肝再生を強化するか又は開始させる方法であって、肝類洞内皮細胞LSEC又は誘導LSEC肝内移植を含む、肝再生を強化するか又は開始させる方法を提供する。この実施態様は、VEGF-A又は肝細胞の投与をさらに含むことができる。さらなる実施態様において、LSEC又は誘導LSECは、VEGFR2VE-カドヘリンVEGFR3CD34第VIII因子LSECである。さらに別の実施態様は、肺再生の強化又は開始を必要とする対象において肺再生を強化する又は開始する方法であって、肺毛細血管内皮細胞PCEC又は誘導PCECの静脈内又は気管内移植を含む、肺再生を強化する又は開始する方法を提供する。この実施態様は、上皮前駆細胞、MMP14、VEGF-A及び/又はFGFの投与をさらに含むことができる。さらなる実施態様において、前記PCEC又は誘導PCECは、MMP14を発現する。さらに別の実施態様は、肝細胞を肝類洞内皮細胞と共培養することによって、培養中の当該肝細胞を増大させる方法を提供する。さらなる実施態様は、肺上皮前駆細胞を肺毛細血管内皮細胞と共培養することによって、培養中の前記肺上皮前駆細胞を増大させる方法を提供する。さらなる実施態様は、器官再生の強化又は誘導を必要とする対象において器官再生を強化又は誘導する方法であって、VEGF-A、VEGF-E、FGF-2、MMP14、EGF、又は他のEGF-受容体リガンドの1つ又はそれ以上を、前記対象において器官再生を強化又は誘導するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、器官再生を強化又は誘導する方法を提供する。さらなる実施態様において、器官は、肝臓又は肺である。別の実施態様において、器官再生を必要とする対象への投与に有用な組成物であって、前記器官に特異的な単離された内皮細胞、又は前記器官に特異的な単離された誘導内皮細胞を、場合により薬学的に許容しうる担体と組み合わせて含む、組成物が提供される。さらなる実施態様において、前記内皮細胞又は誘導内皮細胞は、自己細胞である。別の実施態様において、組成物は、VEGF-A、VEGF-E、FGF-2、EGF、又はMMP14の1つ又はそれ以上をさらに含む。別の実施態様において、VEGFR2VE-カドヘリンVEGFR3CD34第VIII因子LSECを含む、肝再生を必要とする対象への投与に有用な組成物を提供する。別の実施態様において、VEGFR2VE-カドヘリンCD34CD31FGFR1PCECを含む、肺再生を必要とする対象への投与に有用な組成物を提供する。さらなる実施態様は、VEGFR2VE-カドヘリンVEGFR3CD34第VIII因子細胞である細胞を単離することを含む、肝特異的内皮細胞の単離方法を提供する。別の実施態様は、VEGFR2VE-カドヘリンCD34CD31FGFR1細胞である細胞を単離することを含む、肺特異的内皮細胞の単離方法を提供する。特許又は出願資料は、カラーで作製された図面を含む。カラー図面付きのこの特許又は特許出願刊行物のコピーは、申請して必要な料金の支払うと、官庁から提供される。本説明を、以下の実施例によってさらに例示するが、それらはなんら制限するものとして解釈すべきではない。すべての引用文献本願に引用された、参照文献、発行された特許、公開された特許出願を含むの内容は、参照により本明細書によって明白に組み込まれる。実施例1肝再生トランスジェニックレポーター及び遺伝子標的化動物C57BL/6Jマウスは、JacksonLaboratoriesから得た。VEGFR2-GFPマウスは、JRossantから入手した。Id1マウスを、以前に記載されたとおりNamCellStemCell5515526生成させ、そしてRBenezraandDLydenから得た。VEGFR2loxPloxPマウスを、TNSatoによって生成させて、内皮特異的誘導性VEGFR2ノックアウトマウスを用いた実験を、以前に記載されたとおり実施したHooperCellStemCell4263274。簡潔には、潜在的Cre介在性毒性を説明するため、VEGFR2loxPloxPマウスと、それからRosaCre-ERT2トランスジェニックマウスとを交配させてRosaCre-ERT2VEGFR2loxPloxP系統及び対照ROSA-CreERT2VEGFR2loxPを確立した。また、VEGFR2の内皮特異的ノックダウンを誘導するため、LIruelaArispaによって提供されたVE-カドヘリン-CreERT2マウスを、VEGFR2loxPloxPマウスと交雑させてVE-カドヘリン-CreERT2VEGFR2loxPloxPマウスを生成させた。VEGFR2遺伝子除去geneablationを誘導するため、6~8週齢の雄マウスを、タモキシフェン250mgkg1ヒマワリ油の用量で6日間、腹腔内処置し、第3の投与thethirddose後、3日間中断した。3日休止後、第4の投与fourthdoseをさらに3日間再開して、両方の対立遺伝子でVEGFR2が欠損したROSA-CreERT2VEGFR2floxfloxVEGFR2flflマウス、内皮細胞特異的VEGFR2ノックダウンを有した、対照ROSA-CreERT2VEGFR2flマウス又はVE-カドヘリン-CreERT2VEGFR2flflマウスを生成させた。すべての動物実験は、動物実験委員会InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeによって設定されたガイドラインの下で実施した。70部分肝切除モデルを用いてマウスの生理学的肝再生を誘導した。肝質量の70を構成する、3つのほとんどの前葉右葉内側、左葉内側及び左葉外側を、尾状葉及び右葉への血液供給を損傷することなく切除した。100mgkg1の腹腔内ケタミン及び10mgkg1のキシラジンによってマウスに麻酔をかけた。正中線開腹術midlinelaparotomyを、麻酔下のマウスで実施した。上腹部を開いて肝臓を露出させた後、切除する左葉を静かに持ち上げると同時に、5-0絹製縫合糸の結び目silksuturetieRobozを葉の下側に置き、葉の起点のできるだけ近くに配置した。下大静脈近くの葉底部から肝葉の上部にかけて縫合糸の両端を結んだ。3つの結び目をつくり、顕微解剖用はさみmicrodissectingを用いて縫合糸に対してちょうど遠位で結ばれた葉を切断した。この過程を、他の中葉について繰り返して70の部分肝切除を行った。その次に、腹膜を、連続したrunning5-0絹製縫合糸で再接合し、皮膚を連続した4-0絹製縫合糸で閉じた。シャム手術マウスShamoperatedmiceには、肝切除なしに開腹術を行った。肝質量及び機能の再生を特徴づけるため、残存肝葉の質量を測定して、部分肝切除後のさまざまな日数の時点でマウス体重に対して標準化し、そしてそれぞれ、70部分肝切除後の血漿ビリルビンレベルを評価したGenzymeDiagnostics。部分肝切除モデルをCCl4誘導肝損傷モデルと比較するため、以前に記載されたとおりLeCouterScience299890893、CCl4を腹腔内に注射した。VEGF-A又はPlGFによって促進された肝再生を試験するため、マウスを、15μgkg1の組換え型VEGF164Biovision及び同量のPlGFBiovisionで、手術12時間前、そしてその後1日2回処置した。また、Id1マウス及び野生型同腹子にも、手術の前及び後に同様のVEGF164及びPBS処置を施した。肝免疫蛍光検査及びGFPの検出VEGFR2-GFP、VEGFR2flfl、Id1及び同腹子対照マウスを部分肝切除又はシャム手術にかけ、4パラホルムアルデヒドで灌流させ、低温保護しcryoprotected、そしてOCT中で瞬間凍結させた。肝微小血管系の分析のため、以前に記載されたとおりHooperCellStemCell4263274、殺す5分前に、マウスに2mgkg1のGriffoniasimplicifoliaレクチンイソレクチンB4、Invitrogenを静脈注射した。免疫蛍光顕微鏡検査のため、肝切片10μmをブロックし5ロバ血清/0.3トライトンX-100、そして一次抗体:抗VEGFR3モノクローナル抗体mAb、mF4-31C1、10μgml1、ImClone、抗VE-カドヘリンポリクローナルAbpAb、2μgml1、RDSystems、抗CD34mAb553731、5μgml1、BDBiosciences、抗ホスホ-ヒストンH3Millipore及び抗HNF4A抗体Abcam中にインキュベートした。フルオロフォア結合二次抗体2.5μgml1、JacksonImmunoResearch中でインキュベーション後、切片をTOPRO3又はDAPIInvitrogenで対比染色した。invivo肝細胞増殖をBrdU取り込みによって測定した。簡潔には、マウスに、死亡60分前に腹腔内へのBrdUSigmaの単回投与50mgkg1動物体重の用量でを行った。死亡時に、マウスには麻酔がかかっており、血液を下大静脈から採取し、残存する肝葉を取り出し、計量し、そしてさらに処理した。BrdUDetectionSystemBDBiosciences及びフルオロフォア結合二次抗体2.5μgml1、JacksonImmunoResearchを用いて凍結切片を染色した。画像収集及び画像分析オリンパスOlympusBX51顕微鏡OlympusAmericaに装備されたAxioVisionソフトウェアZeissを用いて、肝切片の免疫組織化学画像を得た。免疫蛍光検査画像は、AxioVertLSM510、又は710共焦点顕微鏡Zeissで得た。ImageJNationalInstitutesofHealthを用いて、デジタル画像を内皮マーカーVE-カドヘリン及び機能的灌流血管イソレクチンの密度について分析した。血管密度は、それぞれ強拡大視野×400中の全領域に対する正の成分のパーセンテージによって表した。マウス細胞の単離及び培養変更を伴う二段階コラゲナーゼ灌流技術によって、シャム手術及び部分肝切除を受けたマウスから、肝細胞、LSEC、星細胞及びクッパー細胞を単離したTamNatureMed12793800PassinoScience31518531856KumarJClinInvest116512520WinauImmunity26117129KreamerInVitroCellDevBiol22201211。簡潔には、下大静脈にカニューレを挿入して門脈を切断した後、肝臓に、下大静脈を通してLiverPerfusionMediumInvitrogenを37°C、5ml分1で10分間灌流させ、続いて、LiverDigestMediumInvitrogenを、さらに10分間灌流させた肝臓を、HepatocyteWashmediumInvitrogen中で解離させ、70μmの孔を有するダクロンファブリックを通過させ、そして低速遠心分離50g×5分によって非実質性肝細胞減損画分NPCから分離させ、それを、以前に記載されたとおりKreamerInVitroCellDevBiol22201211、ストックパーコール溶液を用いたパーコール勾配遠心分離によってさらに精製した。NPCを含む上清を集め、50gで5分間、2回洗浄し、350gで7分間沈殿させpelleted、そして以前に記載されたとおりKreamerInVitroCellDevBiol22201211、75ストックパーコール溶液及び35ストックパーコール溶液を用いたパーコール勾配遠心分離900g×20分で分別した。LSECを含む画分を富化し、等量のPBSと混合し、そして900gで7分間遠心分離した。沈殿物をDMEMInvitrogenにより350gで7分間洗浄し、そしてマウスLSEC結合磁気ビーズMiltenyiによってさらに標識した。LSECの精製は、製造者のプロトコールに従って実施した。星細胞及びクッパー細胞の精製は、以前に記載されたとおり実施したPassinoScience31518531856KumarJClinInvest116512520WinauImmunity26117129。LSECのフローサイトメトリー分析、同定及び定量精製されたモノクローナル抗体を、生産者のプロトコールMolecularProbesInvitrogenに従ってAlexaFluor色素又はQdotsに結合させた。精製された肝細胞減損NPChepatocytedepletedNPCをLSRIISORPBDで分析した。データをFACSDiva61ソフトウェアBDで処理した。FSC-W×FSC-H及びSSC-W×SSC-H分析によってダブレットdoubletsを排除し、補正のため単一染色チャネルを用い、フルオロフォアマイナスワンfluorophoreminusone対照をゲーティングgatingに用いた。モノクローナル抗体は、注釈された場合を除いて、BDから購入した:VE-カドヘリンBV13、ImClone;VEGFR3mF4-31C1、ImClone;VEGFR2DC101、ImClone;CD4530-F11、BDBiosciences;CD3414-0341、eBioscience。LSECの定量のため、肝臓を上のように機械的に調製し、VEGFR2、VEGFR3、VE-カドヘリン、CD34に対する結合抗体を用いた共染色によってSEC数を定量した。SEC数は、VEGFR3CD34VEGFR2VE-カドヘリン細胞の数に等しい。VEGFR3CD34VEGFR2VE-カドヘリン細胞を非SECとして評価した。内皮細胞との共培養における肝細胞増殖の測定ヒトLSECは、ScienCellResearchLaboratoriesから得た。LSEC中でId1を選択的にノックダウンするため、Fugene6RocheAppliedScienceによって、293T細胞中に、Id1/スクランブルshRNA、pENV/VSV-G3μg、pRRE5μg及びpRSVRev2.5μgを含むシャトルレンチウイルスベクター15μgを、同時形質移入することによって、Id1/スクランブル低分子ヘアピン型RNAScrambledshorthairpinRNAshRNAを生成させた。ウイルス性の上清を、超遠心分離によって濃縮した。これらの濃縮ウイルス性製剤を用いてLSEC又は肝細胞に形質導入した。共培養研究のため、10,000個の単離された初代肝細胞をI型コラーゲンでコーティングされた100mmの皿中で培養し、それぞれ、500,000個のLSEC、又はId1/スクランブルshRNAレンチウイルスで処理されたLSECを播種した。培養条件は、L-グルタミン2mmoll1、1ウシ胎児血清FBS、血管内皮増殖因子-AVEGF-A1645ngml1、109moll1のデキサメタゾン、ストレプトマイシン100Uml1及びペニシリン100Uml1で補充されたウィリアムズE培地Invitrogenからなる。各群からの細胞を2週後に集めた。LSEC及び肝細胞を視覚化するため、上記のように、LSECをmCherryレンチウイルスpCCL主鎖中によって標識し、肝細胞をGFPレンチウイルスで感染させた。また、2週間培養した500,000個のLSECから馴化培地を集め、0.22μmフィルターを通して濾過し、そしてLSEC共培養がない場合、1:2の希釈度で10,000個の肝細胞に加えた。LSEC及び肝細胞の数を、mCherry及びGFPシグナルのフローサイトメトリー分析によって評価した。回収した肝細胞数を、最初に播種した肝細胞数と比較することによって肝細胞増殖を定量した。アフィメトリクス分析及び定量的リアルタイムPCR分析RNeasyQiagenを用いて肝臓からRNAを新たに単離し、SuperscriptIIInvitrogenを用いて相補的DNAに変換した。マイクロアレイは、MouseU13320Affymetrixを用いて実施した。RNA品質、サンプル標識化、ハイブリダイゼーション及び発現分析の方法の詳細は、AffymetrixMicroarrayKitのマニュアルに従った。定量的PCRは、マウスVEGFR2、VEGFR3、Id1、HGF、Wnt2、Wnt9B及びTMAppliedBiosystemsのTaqman遺伝子発現システムを用いて実施した。再生LSECの肝移植野生型Id1マウス並びに週齢及び性別がマッチしたId1マウスにおいて多小葉70の部分肝切除を実施した。部分肝切除の48時間後、LSECを、野生型マウスId1再生LSECから単離し、上記のようにGFPレンチウイルスpCCL主鎖中形質導入によって標識化した。移植方法は、以前に記載されたものから改良したFollenziJClinInvest118935945。簡潔には、部分肝切除の48時間後、Id1マウスに麻酔かけ、右側臥位に配置した。左側腹部をベタジンでスクラブし、皮膚及び腹壁を縦方向に脊椎と並行に切開した。脾臓を体外に出した後、Id1再生LSECを、27ゲージ注射針によって脾実質に注射した。注射後、脾摘出を実施した。また、Id1再生LSECの救済効果を比較するため、Id1及び野生型マウスを、部分肝切除シャム移植shamtransplantの2日後、PBSの脾内注射及び脾摘出にかけた。LSEC中のWnt2及びHGF発現を導入するため、Wnt2及びHGF相補DNAをOpenBiosystemsから購入し、上記のようにレンチウイルスベクターにクローニングした。Wnt2若しくはHGFをコードするウイルス、又は同量の混合型Wnt2及びHGFによるLSECの感染を、GFPレンチウイルス感染により実施した。データ分析すべてのデータは、少なくとも3つの別々の実験の平均±s.e.m.として示した。スチューデントt検定又は分散分析を用いて、統計的有意性について群間の違いを試験した。統計的有意性をP<0.05に設定した。部分肝切除及び肝再生。本発明者らは、肝再生の仲介におけるLSECの指示的役割を解明するため、生理学的に関連した部分肝切除モデルを用いた図1A。LSECの組織化を損ない、組織低酸素、細胞死及び炎症を生じる肝毒性化学物質の投与LeeHepatology45817825;LeCouterScience299890893;FriedmanPhysiolRev88125172と対照的に、部分肝切除モデルにおいて、肝質量の70切除は、残存肝血管系の完全性を乱すことなくGreeneAnnSurg237530535、肝細胞再生を活性化するFaustoHepatology43S45S53MichalopoulosScience2766066GreenbaumJClinInvest1029961007。このように、本モデルは、肝再生の支持における構造的かつ機能的に無傷のLSECの役割を調べるための有益なモデルを提供する。VEGFは、肝再生に関与する。VEGFファミリーが、骨髄SECの再生における役割を果たすためHooperCellStemCell4263274AlitaloNature438946953、本発明者らは、VEGFR2又はVEGFR3を含むVEGF受容体も、またLSEC機能を調節すると仮定した。従って、本発明者らは、VEGFR2及びVEGFR3が、肝内皮細胞中で排他的に発現されることを示すため、緑色蛍光タンパク質GFPの発現がVEGFR2の天然プロモーターnativepromoterによって誘発される、VEGFR2-GFPマウスを用いた。これに対して、本発明者らは、他の肝細胞タイプ、例えば肝細胞核因子4αHNF4A肝細胞では、VEGFR2及びVEGFR3が発現されないことを見いだした図2A。特に、VEGFR3発現の分布は、CD34VEGFR3大血管から分岐したVEGFR2LSECに制限される。VEGFR3発現は、体中に血液を運ぶ動脈及び静脈のようなより大きな血管系を形成するECについては典型的ではない。従って、LSEC中のVEGFR3の発現により、LSECは、器官特異的でないECと区別される図2B。LSECの独特な発現表現型の同定により細胞特異的定量、精製及び分子プロファイリングが可能である。本発明者らは、非造血性VEGFR3VEGFR2CD45LSECでの内皮特異的マーカーVE-カドヘリンの発現を示すため、非実質細胞NPCにおける多変性フローサイトメトリー分析を実施した。本発明者らは、これらの細胞の97.6が、凝固第VIII因子を発現するProx1CD34内皮細胞であることを見いだした図2C、D。Prox1CD34細胞は、非リンパ細胞であるAlitaloNature438946953。これは、VEGFR3CD34VEGFR2VE-カドヘリン第VIII因子Prox-1CD45血管として成体マウスのLSECの独特な表現型の特徴及び操作上の特徴operationalsignatureが、VEGFR3CD34VEGFR2VE-カドヘリンCD45非類洞内皮細胞及びVEGFR3CD34Prox-1第VIII因子CD45リンパ管内皮細胞からのものとは区別されることを示している。VEGFR3CD34としてのLSEC及びVEGFR3CD34としての非類洞内皮細胞の同定は、非類洞ECからLSECの定量、精製、及び分子プロファイリングに十分である。肝細胞とLSECとの間の再生相互作用の同定LSECが肝臓増殖を調節する機構を確定するため、本発明者らは、部分肝切除後の肝細胞及びLSECの再生動態を試験した。本発明者らは、VE-カドヘリン、上皮肝細胞マーカーE-カドヘリン及び有糸分裂マーカーリン酸化ヒストン-3を用いた染色によって示されるように、部分肝切除の2日後、P-H3E-カドヘリン有糸分裂肝細胞が、非増殖LSECの近位にあることを見いだしたP-H3;図2E。これは、LSECが血管新生増殖シグナルを放出して、肝細胞の有糸分裂及び増殖を誘導することを示唆している。本発明者らは、部分肝切除後のLSEC血管新生シグナル伝達の初期段階の後、LSEC増殖が日4で認められ、日8にプラトーに達することを見いだした図2F。LSEC増殖と対照的に、本発明者らは、P-H3HNF4A肝細胞の定量によって示されるように、肝細胞増殖が最初の4日でピークに達し、日8に安定になることを確定した図2G。これらの結果は、肝再構築の仲介におけるLSECの経時的二段階寄与chronologicallybiphasiccontributionを示している。部分肝切除の初期段階部分肝切除の後日1~3で、非増殖LSEC中の誘導血管新生は、例えばアンギオクリン因子の放出によって肝再生を刺激する。肝細胞増殖の初期段階後、このモデルでは部分肝切除の4日後、LSECが増殖して、再生している肝臓のために増加した血液供給の需要を満たす。従って、本発明者らは、部分肝切除後、肝SECLSECが、誘導血管新生の過程により肝細胞増殖を刺激し、すなわち、LSECが、肝細胞増殖因子及びWnt2のアンギオクリン産生を介して肝細胞増殖を促進することを確定した。さらに、本発明者らは、この誘導血管新生後に、LSEC自体が増殖血管新生を受けて、再生している肝組織の血液供給における増加した需要を満たすことを確定した。肝増殖を開始及び維持するためにLSECを刺激するには、Pl-GF/VEGFR1ではなく、VEGF-A/VEGFR2の活性化が重要である。LSEC誘発性肝再生中のVEGF受容体の有意性を研究するため、VEGFR2loxPloxPマウスをROSA-CreERT2マウスと交雑させて条件つきでVEGFR2遺伝子を欠失させ、誘導性VEGFR2欠損VEGFR2floxfloxVEGFR2flflマウスを生成させるように実験を設計した図3JHooperCellStemCell4263274。肝中のVEGFR2の内皮細胞特異的発現のために、VEGFR2flflマウスでは肝内皮細胞だけでなく、非内皮細胞も、また機能的欠陥を呈すると考えられる。対照マウスは、VEGFR2遺伝子VEGFR2flのヘテロ接合欠失を有した。部分肝切除の48時間後、ブロモデオキシウリジン肝細胞増殖BrdUHNF4A細胞数は、VEGFR2flflマウスで67減少した図3A、B。特に、この初期段階でVE-カドヘリンイソレクチン潅流血管の開存性にもかかわらず、VEGFR2flflマウスでは、肝質量の再生が弱められた図3C。従って、肝再生の初期段階部分肝切除日1~3では、VEGFR2を標的設定すると、主に肝細胞再生を誘導する内皮由来のアンギオクリン因子の効果が損なわれるが、血管灌流能力は損なわれない。従って、VEGFR2は、肝再生の初期段階でアンギオクリンシグナルに反応して肝細胞増殖を誘導するのに重要である。さらに、本発明者らは、VEGFが増殖血管新生及び正常な器官機能の修復にも重要であることを確定した。本発明者らは、肝再生の後期段階部分肝切除日4~8で、VEGFR2flflマウスでは増殖血管新生が不完全であり図3C、開存性VE-カドヘリンイソレクチン血管系の構築を妨げ図3D、E、それによって、少なくとも28日間、肝質量の修復を弱めることを見いだした。さらにまた、VEGFR2flflマウスでは、血漿ビリルビンレベルの上昇によって明らかなように、部分肝切除後の肝機能が異常であった。肝再生の仲介における内皮特異的VEGFR2機能を確認するため、VEGFR2loxPloxPマウスをVE-カドヘリン-CreERT2マウスとも交雑させてVEGFR2の内皮選択的欠失を誘導した図3K。VE-カドヘリンCreERT2VEGFR2flflマウスにおける肝質量及び灌流血管の形成は、いずれも、部分肝切除後に低下し、それは肝再生の仲介におけるVEGFR2の有意性を強調している。本発明者らは、VEGF-A/VEGFR2経路が、LSEC誘発性肝再生を促進する場合、VEGF-Aが肝再生を誘導又は強化するはずであると仮定した。本発明者らは、VEGF-Aの投与が、肝再生を促進することを見いだした。本発明者らは、VEGF-A164の効果を、VEGFR1だけを選択的に活性化する胎盤増殖因子Pl-GFと比較したCarmelietNature438932936。部分肝切除後、VEGF164は、肝質量及びVEGFR3CD34LSECの数の両方の再生を促進し、それは少なくとも28日間持続したが、PlGFでは、そうならなかった図3F、G。従って、部分肝切除後、Pl-GF/VEGFR1ではなく、VEGF-A/VEGFR2の活性化が、肝増殖を開始及び維持するためにLSECを刺激するのに重要である。Id1の上方制御によるVEGF-A/VEGFR2経路の活性化は、肝再生を誘発する。肝再生を刺激するアンギオクリンシグナルを同定するためにマイクロアレイ分析を用いた。内皮特異的遺伝子の中で、転写因子Id1は、部分肝切除によって活性化された内皮細胞中で特異的に上方制御されたLydenNature401670677。venus-YFP発現がId1プロモーターによって誘発される、Id1venusYFPレポーターマウスNamCellStemCell5515526を用いて、部分肝切除の48時間後に、LSEC中でId1上方制御が排他的に見いだされ図3H、それは、VEGFR2flflマウスにおいて有意に弱められた図3I。注目すべきことに、部分肝切除後のId1欠損Id1マウスの肝質量回復は、28日間損なわれ、そしてVEGF-A164投与しても変わらなかった図4A、J。さらにまた、部分肝切除後、Id1マウスは、有糸分裂BrdUHNF4A肝細胞数の有意な減少、機能性VE-カドヘリンイソレクチン血管形成の破壊、VEGFR3CD34LSECの増殖の低下、及び血漿ビリルビンレベルの増加によって立証される肝機能異常を示した図4B、C、K。従って、Id1の上方制御によるVEGF-A/VEGFR2経路の活性化は、肝再生を誘発する。LSEC-肝細胞共培養は、肝細胞再生の機能的LSEC誘導にId1が必要であることを示す。また、肝細胞増殖におけるLSECのアンギオクリン機能を仲介する際のId1上方制御の役割を、LSEC-肝細胞共培養系によって試験した。単離された肝細胞と、初代LSECとの共インキュベーションでは、肝細胞数が9倍増加し、これを、LSEC中のId1のノックダウンによって選択的に除去した図4D、E。LSECからの馴化培地は、肝細胞増殖の支持に失敗し、LSECから誘導されたアンギオクリン機能における細胞接触の重要性を強調している。従って、Id1の欠如は、LSECの誘導機能不全を生じ、肝細胞再生を損なう。Id1LSECの移植は、Id1肝臓における肝再生を修復する。Id1LSECのinvivoアンギオクリン効果が、Id1マウスで肝細胞再生を開始できるかどうかを決定するため、部分肝切除後の日2に、脾内移植アプローチを用いてId1肝血管系にLSECを移植した図4FFollenziJClinInvest118935945。GFP標識Id1LSECをVEGFR3類洞血管内腔に選択的に組み込むと、肝質量の再生及びLSEC増大が修復された図4G。対照的に、移植されたId1LSECは、Id1肝臓の再生の修復に失敗した。さらに、Id1肝臓では、部分肝切除後の日2にGFPId1LSECを移植すると、そのすぐ近位で肝細胞の増殖が開始された図4H、I。従って、Id1コンピテントLSECId1competentLSECsの組み込みによってもたらされた部分的血管性キメリズムは、Id1肝臓中の肝増殖を開始するのに十分な内皮細胞由来の誘導シグナルを生成させる。LSEC中のId1上方制御は、Wnt2及びHGF発現の誘導により肝細胞増殖を開始する。肝再生を誘導する内皮由来アンギオクリン因子を同定するため、部分肝切除の48時間後に野生型及びId1マウスから精製されたLSECを分析した。知られている肝トロフォゲンKleinHepatology4710181031HuhProcNatlAcadSciUSA10144774482GoesslingCell13611361147OberNature442688691ThompsonHepatology4512981305と同様に、Id1発現は、正常なLSECでは最小限であるが、部分肝切除後に、VEGFR2の活性化は、血管新生LSEC中のId1の排他的上方制御を誘導する。さらに、部分肝切除後の最初の3日に、VEGFR2Id1経路の活性化により非増殖VEGFR3CD34VEGFR2Id1LSECにおける誘導血管新生プログラムのスイッチが入り、これにより、アンギオクリン因子Wnt2及びHGFの産生を通して、肝増殖が惹起されることが示された。その後、再生している肝臓がさらなる血液供給を必要とするため、LSECのVEGFR2Id1介在性増殖血管新生が、肝血管性質量を再構成する。理論によって拘束されることなく、このデータは、LSECが二相機構を通して肝再生を支持することを示唆している。すなわち、部分肝切除直後の初期段階で、誘導血管新生LSECがアンギオクリン因子の放出を通して、器官形成を促進するのに対して、増殖血管新生LSECは、増大する肝質量を血管新生化して持続させる。本研究は、Id1マウスへのId1Wnt2HGFLSECの移植が、肝再生を誘導及び強化することを示す。この発見、並びにVEGFR2及びId1欠損マウスにおいて肝増殖がひどく弱められるという観察は、LSECには、アンギオクリン因子を合成することによって肝増殖を開始するために誘導血管性ニッチを確立する能力が与えられていることを示している。さらに、別法として、肝再生を開始及び修復するため、肝臓以外の組織から誘導された内皮前駆細胞EPCを、LSECの代わりに代用できる。特に、VEGFR2Id1EPCは、構造的に血管壁に組み込むよりはむしろアンギオクリン因子の放出を通して血管新生を開始できる。このように、EPCの肝内移植は、肝再生を促進する細胞療法の新たな方法を切り開く。本研究に用いる部分肝切除モデルでは、残存肝葉の血管完全性は、最小限の炎症性反応で維持され、それによって、内皮依存性肝再生を研究するための理想的なモデルを確立している。しかし、化学的に誘発された肝損傷において、重度の血管損傷及び細胞死では、肝再生を支持するため、星細胞を含む他の非内皮細胞FriedmanPhysiolRev88125172及び血管新生促進造血細胞proangiogenichaematopoieticcells、例えばCXCR4VEGFR1造血前駆細胞hemangiocytesJinNatureMed12557567の補充が必要となることがある。部分肝切除後の肝臓の迅速な再生には、多くの肝細胞の集合的かつ包括的な増殖が必要である。実際に、各肝細胞がLSECに隣接して存在するため、肝細胞のこの著しく調和のとれた活性化は、部分肝切除後の残存肝臓を通して成熟肝細胞の増殖を誘導するアンギオクリン依存性再生プログラムのスイッチを入れることによって達成される。また、アンギオクリン因子は、成熟肝細胞に加えて、肝前駆細胞の増殖も促進できるZaretScience32214901494。本研究において、Wnt2及びHGFは、肝再生を誘発する肝特異的アンギオクリン因子として認められた。また、本発明は、肝再生を調節するため、Wnt2及びHGFと共同作用できる他のアンギオクリン因子の存在、例えば内皮特異的細胞外マトリックス成分、プロテアーゼ、接着分子及びケモカインを提供する。さらに、本開示は、発生的器官形成及び成体の器官形成の調節における血管系の特異性を解明できる、定義されたアンギオクリン因子の組織特異的発現を提供する。これまで、肝細胞移植による肝再生の試みは、限定的に成功しているFollenziJClinInvest118935945。ここに示された研究は、肝細胞又はその前駆細胞ZaretScience32214901494とVEGFR2Id1LSEC又はEPCとの同時移植は、現在、外傷性又は感染性の肝損傷を負った受療体において乏血管性機能を救うための有効な戦略のデザインをもたらすことを示している。実施例2肺再生トランスジェニックレポーター及び遺伝子標的化動物内皮特異的Vegfr2及びFgfr1誘導性ノックアウトマウスの生成を、記載されたとおりHooperCellstemcell4263274WangNature465483486実施した。簡潔には、Vegfr2loxPloxP及びFgfr1loxPloxPマウスを、VE-カドヘリン-CreERT2トランスジェニックマウスと交配させてVE-カドヘリン-CreERT2Vegfr2LoxPLoxP及びVE-カドヘリン-CreERT2Vegfr2loxPloxPFgfr1loxPマウスを確立した。これらのマウスを、タモキシフェンで腹腔内処置して、Vegfr2及びFgfr1の内皮特異的欠失を導いた。SPC及びCCSPプロモーター誘発性rtTASPC-rtTA、CCSPrtTA及びtetO7CMV誘発性cretetO7-creを有するマウスPerlProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica991048210487を、記載されたようなRosa26R-eYFPマウスRawlinsCellstemcell4525534と交雑させ、テトラサイクリン処置してSPC-YFP及びCCSP-YFPレポーターマウスを得た。すべての実験は、動物実験委員会InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeによって設定されたガイドラインの下で実施した。PNXモデル及び肺機能の生理学的測定PNX法を、記載されたようにNolenWalstonAmJPhysiolLungCellMolPhysiol294L11581165適合させた。簡潔には、麻酔して機械的に通気させたマウスに経口気管内挿管を施した。左肺葉を、門のまわりに結びつけた縫合糸で持ち上げて切除した。シャムマウスには、葉切除することなく開胸術を施した肺質量及び体積を測定し、PNX後の体重に対して標準化した。PCECの単離並びにリン酸化及びVEGFR2及びFGFR1のタンパク質レベルの試験は、実施例1に記載したように、そしてMurakamiTheJournalofclinicalinvestigation121のように実施した。深吸気量は、FlexiventソフトウェアScireqを用いて、肺気量TLCと機能的残気量FRCとのプラトー圧測定値間で決定した。静的コンプライアンスは、圧力-体積曲線から決定した。免疫蛍光検査IF及びフローサイトメトリー分析IF研究を実施するため、低温保存された切片を、VE-カドヘリンRD、CD34BD、E-カドヘリンeBiosciences、及びSPCAbcamを認識する抗体、並びにフルオロフォア結合第二抗体、JacksonImmunoResearch中でインキュベートした。移行細胞増幅transitcellamplificationを、BrdU取り込みによって測定したDingNature468310315。増殖するBASC様細胞を追跡するため、飲用水中にBrdUを入れたNolenWalstonAmJPhysiolLungCellMolPhysiol294L11581165。AxioVertLSM710顕微鏡Zeissで画像をとらえた。肺胞数及び平均肺胞隔壁間距離meanlinearinterceptの形態学的分析を実施したDeLisserTheJournalofbiologicalchemistry28187248731。全肺細胞を単離し、LSRII-SORPBDで分析したDingNature468310315。AEC及びPCECを、それぞれ、SPCEカドヘリン及びVE-カドヘリンCD34に対する結合抗体を用いた染色によって定量した。EGFの薬理学的投与及びMMP14に対するmAbの中和マウスに、PNXの12時間前、そして1日おきに、マウスMMP14に対するmAbMMP14mAb、50mg/kg、Abcam及びIgG対照を注射した。肺胞再生における組換え型のEGFの役割を決定するため、マウスに、PNX後、毎日500μg/kgのEGFAbcamを静脈注射した。マウスに、1日おきに100μg/kgのEGF50μl中を気管内注射してEGFの局所的効果を試験した。初代ECとの共培養におけるAECII及びBASC増殖の測定Akt活性化を維持するため、初代ECをE4ORF1遺伝子と共に形質導入したSeandelProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica1051928893。MAPKinase経路を同時活性化するため、c-Rafを初代E4ORF1ECに導入した。生成したMAPKAktECKobayashiNaturecellbiology1210461056を、SPC及びCCSP-YFPマウスから単離されたAECII及びBASCと共培養したKimCell121823835。Mmp14又はスクランブルshRNAを用いて、MAPKAktEC又はAEC中のMmp14をノックダウンしたDingNature468310315。共培養研究のため、単離されたSPCAECII及びBASCを非付着性の皿中で培養し、10倍多いMAPKAktECを播種した。MAPKAktECからの馴化培地をAECに加えた。共培養後、AECII及びBASCを、フローサイトメトリー分析によって定量した。qPCR、ELISA、及び免疫ブロット分析PNX後、全RNAをマウス肺から単離し、Taqman発現システムAppliedBiosystemsを用いてqPCRを行った。抗HB-EGF抗体SantaCruzを用いて、サンドイッチELISA及びウェスタンブロットによってBALF中のHB-EGF濃度を調べ、そしてγ2鎖に対する抗体SantaCruzを用いてラミニン5γ2鎖の切断を試験した。データ分析すべてのデータを、平均±semとして示した。スチューデントt検定、又は分散分析ANOVAを用いて、統計的有意性について群間の違いを試験した。統計的有意性を、P<0.05に設定した。PNXは、上皮前駆細胞の増大を誘導する。PNX後15日以内に、残存する右肺葉の質量及び体積において劇的な再生があった図6A、B。クラーラ細胞Claracellによって同定されたBASCのサブセットを含む、肺上皮前駆細胞は、タンパク質CCSPpro-サーファクタントプロテインCSPCSca-1CCSPSPCSca1細胞を分泌し、そしてSPCE-カドヘリン細胞によってII型AECAECIIは、肺胞上皮形成に寄与するBeersTheJournalofclinicalinvestigation12120652073を用いた図6D、E。本発明者らは、PNX後、日3に、再生している肺中のすべての単核細胞の多変性フローサイトメトリー分析を実施した。BADJ領域に局在化したCCSPBrdU細胞は、BASCにおいて観察される表現型の特徴、CCSPSPCSca-1VE-カドヘリンCD31細胞であったKimCell121823835。この初期の時点で、本発明者らは、SPCSca-1CCSPAECII又はVE-カドヘリンCD31PCECの増殖を検出しなかった。従って、PNXは、AEC及びPCECの増殖が最小限である場合、肺再生の初期段階で、ゆっくり分裂するslowcyclingCCSPSPCSca-1BASC様細胞の増大を誘導する。PNXは、肺胞毛細血管界面で共存しているPCEC及びAECの増大を誘導する。AEC及びPCECが有意な増殖を受けるときのPNX後の時点を特定するため、本発明者らは、残存する葉における腹腔内に注射されたBrdUの取り込みの動態を調べて、PNX後の日7でピークに達した移行増殖細胞TACの全体的な様相を見いだした図7A。シャム手術されたマウス肺では、BrdUの取り込みが少なかった。PNX後の日7でのTAC中の細胞タイプを特徴づけるため、本発明者らは、SPC-YFPレポーターマウスにおいてPNXを実施した。プロ-サーファクタントタンパク質DSPD及びE-カドヘリン、AECIIを表すマーカーを同時発現するSPC細胞の増殖が増加したBeersTheJournalofbiologicalchemistry2692031820328WhitsettAnnualreviewofmedicine61105119図7B。残存するSPCTACは、CCSP気道クラーラ細胞RawlinsCellstemcell4525534及びVE-カドヘリンPCECの小画分からなる。BrdU取り込みの分析は、PNX後の日7に、増殖しているVE-カドヘリンCD34FGFR1VEGFR2CD45PCECが単核細胞の7を占め図7C、それらがSPCAECII付近に局在化していることを示した図7D。AECII及びPCECの操作上のマーカーとして、それぞれSPCE-カドヘリン及びVE-カドヘリンCD34を用いて、本発明者らは、PNX後の日15に、AECII及びPCECの両集団で3倍の増加があることを見いだした図7E。従って、PNX後、肺質量及び体積における増加は、PCEC及び上皮前駆細胞の増殖のためであり、BASC様の細胞が初期の時点日3で増大するのに対して、AECIIは、後期の時点で増殖する。PCEC中のVEGFR2及びFGFR1の逐次的活性化は、機能的肺胞再生に不可欠である。PNXは、PCECの活性化を通して肺再生を開始して上皮活性アンギオクリン因子を産生する。VEGF-Aの主要なチロシンキナーゼ受容体は、VEGFR2として、アンギオクリン因子の誘導において重要な役割を果たしているためDingNature468310315HooperCellstemcell4263274、本発明者らは、PNX後のPCEC中のVEGFR2の活性化を分析した。PCEC中のVEGFR2タンパク質レベルが変わらないにもかかわらず、PNX後、リン酸化されたVEGFR2の範囲は広がり、右葉を再生するEC中のこのVEGF-A受容体の活性化を示している図8A。FGFR1は、PCEC中で発現され、VEGFR2の発現及び活性化状態を相互に調節してMurakamiTheJournalofclinicalinvestigation121WhiteDevelopment13437433752アンギオクリン因子産生を誘発できるため、本発明者らは、PCECによってFGFR1の発現を研究した。PNX後、FGFR1タンパク質は、時間依存的に上方制御された。従って、肺再生の初期段階では、PCEC中のVEGFR2の活性化が肺胞形成を開始するのに対して、後期段階では、FGFR1とVEGFR2との同時活性化が、共同作用して再生上皮形成を持続させると考えられる。肺中のVEGFR2及びFGFR1の内皮特異的機能を解明するため、本発明者らは、VE-カドヘリンプロモーターがタモキシフェン反応性CreVE-Cad-CreERT2の発現を誘発するトランスジェニックマウスWangNature465483486を用いて、成体マウスEC中で選択的にVegfr2遺伝子を欠失させる誘導性ノックアウト戦略を用いた図8B。タモキシフェン処置は、EC中のVegfr2Vegfr2iΔECiΔECマウスを選択的に欠失させる。CreERT2による標的でない毒性を説明するため、本発明者らは、対照としてヘテロ接合Vegfr2欠損マウスVegfr2iΔECを用いた。また、本発明者らは、EC中でVegfr2及びFgfr1が欠失したマウスを生成させた。しかし、これらのマウスは、血管の不安定性のため、外科的処置を許容できなかったので、本発明者らは、EC中の誘導性Vegfr2及び部分的Fgfr1欠失Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスによって、肺胞形成の支持におけるFGFR1及びVEGFR2の同時活性化の役割を研究した。PNX前に、Vegfr2iΔECiΔEC及びVegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスは、肺質量又は機能における変化を示さなかった。対照的に、Vegfr2iΔECiΔECマウスでは、PNX後の日3に、CCSPSca1BASC様細胞の増殖が止まったが図3C、PNX後のVegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスのこれらの細胞の増大には、さらなる阻害がなかった。これらのデータは、肺再生の初期段階での上皮形成の支持におけるVEGFR2活性化の重要な役割を確立している。そこで、本発明者らは、PCEC及びAECIIの増幅におけるVEGFR2及びFGFR1同時活性化の役割を研究した。再生している肺を、日7に、BrdU、VE-カドヘリン及びSPCで同時染色したところ、マウスにおけるVegfr2の内皮特異的ノックダウンVegfr2iΔECiΔECは、PCEC及びAECIIの両方の増殖を抑止することがわかった図8D、E。特に、Vegfr2及びFgfr1Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECの内皮特異的ノックダウンは、この時点でPCEC及びAECIIの増殖をさらに止めており、そのことは、PCECを刺激する際、FGFR1がVEGFR2と共同作用してAECII増幅及び血管新生を支持することを示唆している。PCEC中のVegfr2及びFgfr1の欠失は、肺胞構造及び機能の修復を損なう。VEGFR2及びFGFR1の同時活性化が肺機能の改善において役割を果たすかどうかを決定するため、本発明者らは、PNXの前及び後に、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔEC及び対照マウスにおいて吸気量及び静的コンプライアンスを調べた。これらの肺機能のパラメーターは、呼吸容量respiratorycapacityの生理学的に関連した指数を提供する。Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスでは、対照マウスが完全回復を示した時点で、PNX後の肺機能の修復は、有意に損なわれた図8F。同様に、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスでは、PNX後の肺質量、体積、及び細胞増大の修復が、すべて損なわれた図8G。これらのデータは、PNX後、非増殖VE-カドヘリンECが、VEGFR2活性化を介してBASC様細胞の初期増大を誘導することを示している。PNX後の後期段階で、VEGFR2と連携したFGFR1の上方制御は、PCECを活性化して上皮形成及び血管の発芽vascularsproutingを指示して、呼吸容量を修復する図1B。従って、PCECは、アンギオクリン因子を産生し、機能的呼吸器の肺胞ユニットの生成を促進する血管新生に関与する。PNXは、上皮前駆細胞を増大させるPCECにおいてMMP14の特異的上方制御を誘導する。上皮形成を開始する誘導アンギオクリンのキューcueを同定するため、本発明者らは、再生肺の遺伝子発現プロファイルを比較して、肺胞形成因子の中で、膜タイプ1のマトリックスメタロプロテイナーゼMMP14は、野生型のPCECにおいて特異的に上方制御されるが、Vegfr2iΔECiΔEC又はVegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスは、そうならないことを見いだした図9A。肺切除された肺中のMMP14タンパク質レベルの分析は、その一時的な上方制御が、日7でピークに達し、その後、横ばいになることを示した図10A。免疫染色及びフローサイトメトリー分析は、PNX後のMMP14のPCEC特異的局在化を説明しており、それはVegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔEC肺中で弱められる図10B、C。MMP14は、肝臓、心臓、脾臓、及び腎臓を含む他の血管の豊富な器官では上方制御されず図9B、C、それは、PNX後、MMP14が、VEGFR2及びFGFR1誘導PCEC中で選択的に上方制御されることを示している。MMP14のアンギオクリン発現が上皮前駆細胞の増殖を促進する機構を明確にするため、本発明者らは、SPC-YFP及びCCSP-YFPマウスから、それぞれAECII及びBASCを単離して、初代ECと共培養した。YFP発現を用いて共培養中のその結末fateを追跡した。Akt経路の活性化を通してアンギオクリンの能力を維持するE4ORF1遺伝子を、初代ECに導入したSeandelProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica1051928893KobayashiNaturecellbiology1210461056。MMP14がMAP-キナーゼ活性化EC中で上方制御されたので、本発明者らは、c-Rafも導入してE4ORF1ECMAPKAktEC中のMAP-キナーゼを構成的に刺激したKobayashiNaturecellbiology1210461056。次に、3次元3Dアンギオスフェアアッセイ3dimensionalangiosphereassayにおいて、MAPKAktECを、AECII/BASCと共培養した。MAPKAktECとの共培養は、SPCAECII及びCCSPSca-1CD31BASCの最も有意な増大を導き図10D~G、図9D、E、3Dアンギオスフェアが形成され、ECが、増大する上皮細胞を取り囲んでおり、それは肺胞毛細血管嚢の構造に似ている。MAPKAktEC中のMMP14ノックダウンは、BACS及びAECIIの増大を止める図10D、F。MAPKAktECからの馴化培地CMは、AECII及びBASC増殖の促進におけるごくわずかな効果を示し、ECと上皮細胞との間の細胞間接触の必要性を強調している図10E、G。従って、左肺の切除は、MMP14産生を誘発するPCECにおいてVEGFR2及びFGFR1を活性化し、順に、上皮前駆細胞の増殖を刺激する。PNX後、MMP14阻害は、AECの再構築を抑止するが、PCECの再構築を抑止しない。肺胞形成の調節におけるMMP14の生理学的有意性を決定するため、本発明者らは、MMP14に対する中和モノクローナル抗体mAbをWTマウスに注射した。PNX後、MMP14mAbは、WTマウスの残存肺の質量及び体積の増加を弱めたが、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスでは、そうならず、それは、MMP14が、VEGFR2及びFGFR1誘導PCECから誘導されることを示している図11A。MMP14阻害は、VE-カドヘリンPCECの再構築を損なうことなく、E-カドヘリンAECの増大を阻止する図11B。MMP14阻害後のAEC及びPCECの不適当な増大は、MMP14が、PCEC増殖増殖血管新生を促進するよりむしろAEC誘導血管新生の増殖を誘導することを示している。さらにMMP14中和によるAECの弱められた増大が、フローサイトメトリー分析によって示されたが、PCECでは示されなかった図11C、D。さらにまた、MMP14に対するmAbで注射されるマウスにおいて、形態学的試験は、肺胞数の減少及び平均肺胞隔壁間距離meanalveolarinterceptによって測定された肺胞サイズの増加によって明らかなように、肺胞再増殖の阻害を示した図11E、F。コラーゲン合成は、MMP14に対するmAbで注射されたマウスにおいて変わらないままであった。従って、PCEC由来のMMP14は、新たな肺胞増殖neoalveolarizationを刺激し、正常な成体肺胞に似た肺胞嚢を形成する。MMP14は、潜在性EGF様リガンドcrypticEGFlikeligandのアンマスキングunmaskingを介して肺胞形成を刺激する。次に、本発明者らは、MMP14が再生肺胞増殖を調節する機構を解明しようとした。MMP14は、EGF様増殖因子HB-EGFを結合するヘパリンの外部ドメインを切断することがわかっているKoshikawaCancerresearch7060936103StratmanBlood11647204730。さらに、MMP14は、ラミニン5γ2鎖を切断して上皮増殖因子受容体EGFRを活性化するEGF様のフラグメントを生成させる。本発明者らは、PNX後の日3及び7に、気管支肺胞洗浄液BALF中のHB-EGFが増加したことを見いだした図12A、B。PNX後の日7で、再生している肺中にラミニン5γ2鎖の切断されたフラグメントが現れた図12C。しかし、これらのEGFRリガンドのレベルは、MMP14に対するmAbで処置された対照マウス及びVegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスの両方で低下し、その際、MMP14の発現は、弱められた。また、BASC及びAECと3D内皮共培養におけるMAPKAktEC中のMMP14のノックダウンは、培養上清へのEGFRリガンドの放出を抑止した図12J。従って、PNX後、PCEC中のVEGFR2及びFGFR1の活性化は、MMP14のアンギオクリン産生を導き、それは、次に、肺胞再生を刺激する、潜在性EGFRリガンドをマンマスギングする。EGFは、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスにおいて肺胞形成を修復する。切断されたHB-EGF及び切断されたラミンン5γ2鎖の両方は、上皮形成を誘発するEGFRを活性化する。これらの所見は、PNX後、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスにおける肺の肺胞増殖不全は、EGFRリガンドのバイオアベイラビリティの減少のためであることを示唆しており、EGFの注射が、上皮形成を強化することによって、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスにおける肺胞増殖を修復しうることを意味している。組換え型EGFの静脈注射は、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウス及びMMP14に対するmAbで処置されたマウスにおいて肺質量及び体積を修復した図12D。気管内注射による気管支肺胞上皮へのEGFの直接導入は、肺胞再生の救済における同様の効果を示した図12K。従って、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスにおけるAECの不完全な再生は、EGFRリガンドのバイオアベイラビリティを弱めるPCECによるMMP14産生の減少によって生じる。特に、EGFで注射されたVegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスでは、E-カドヘリンAECとVE-カドヘリンPCECとの細胞結合が強化され図12E、肺機能を修復した図12F。Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスへのEGF注射は、AECの再生を刺激したが、PCECの再生を刺激せず、それは、EGFが、血管新生の誘発効果に乏しく、上皮形成の誘発により有効であることを示唆している。この仮説を試すため、本発明者らは、PNX後の日7で細胞増幅におけるEGF投与の効果を分析した。EGFの注射は、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔEC肺中でEGFRリン酸化を強化した図12G。BrdU取り込み分析は、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスにおいて、EGFが、AECIIの増殖を修復するが、PCECの増殖を修復しないことを示した図12H、I。従って、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスの肺胞形成欠陥は、再生している肺への血管灌流障害よりはむしろ上皮活性なアンギオクリン因子の生成障害のためである。WTPCECの移植は、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスにおける肺胞増殖を修復する。CreERT2のPan-内皮VE-カドヘリンプロモーター誘発性発現は、他の血管床のEC中のVegfr2及びFgfr1を欠失させるはずである。肺再生に対する誘導PCECの特異的寄与を研究するため、本発明者らは、肺EC移植モデルを設計した。肺切除されたWT同腹子マウスの肺又は肝臓のいずれかからECを精製し、Vegfr2iΔECiΔEC及びVegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスの頸静脈に注入した図13A。また、肺切除されたWTマウスから血漿を採取し、レシピエントノックアウトマウスに注射して、肺再生に対する全身の可溶性増殖因子の寄与を調べた。移植されたGFPECを、レシピエントマウスの肺毛細血管の約26中に組み込んだ図13B。重要なことに、肺切除された肺から得た移植ECは、上皮細胞の増幅を修復したが、肝臓からのものは修復しなかった図13C~F。増殖しているBrdUCCSPBASC様細胞及びBrdUSPCAECIIは、移植されたGFPPCECの近位に位置しており、それは、注入されたWTPCECから誘導された誘導シグナルが肺再生を修復することを示している。従って、肺機能は、PCECの移植によって改善されたが、しかし、肺切除されたWTマウスから入手した血漿の注射では、改善されなかった図13G。従って、PNXは、PCECの肺特異的活性化を誘導して、再生肺の肺胞増殖を支持するアンギオクリン因子を生成する図13H。肺切除モデルシステム及び結果成体肺再生に関与する経路を確定するため、本発明者らは、残存する無傷の肺中の再生肺胞増殖を促進する片肺切除PNXモデルを用いた。本発明者らは、片肺切除PNXモデルを用いて肺胞再生の支持におけるPCECの役割を研究した。左肺の外科的切除は、残存する右葉の血管完全性を乱すことなく、これらの残存葉の再増殖を誘導する。本発明者らは、PNXが、VEGFR2及びFGFR1の活性化を通して、残存する右葉のPCECを誘導してアンギオクリンマトリックスメタロプロテアーゼMMP14を産生することを確定した。次に、MMP14は、上皮前駆細胞の増殖を刺激する、潜在性上皮増殖因子EGF様リガンドのアンマスキングによって再生肺胞増殖を促進する。従って、PCECは、肺障害の処置のために治療上活用できる。本研究は、PNXが肺毛細血管内皮細胞PCECを刺激して、肺胞形成を支持する上皮前駆細胞の増殖を誘導するアンギオクリン増殖因子を産生することを示している。さらに、内皮細胞は、MMP14発現を通して、上皮増殖を促進し、肺胞毛細血管嚢に似た3次元アンギオスフェア3Dimensionalangiospheresを形成する。PNX後、マウス中のVegfr2及びFgfr1の内皮特異的誘導性の遺伝子除去geneticablationは、MMP14の産生を阻害し、肺胞増殖を損なった。MMP14は、EGF受容体EGFRを活性化する、潜在性EGF様外部ドメインのアンマスキングによって上皮前駆細胞の増大を促進する。これと一致して、MMP14の中和は、EGFR介在性肺胞再生を損なうが、肺切除されたVegfr2/Fgfr1欠損マウスへのEGFの投与又はMMP14PCECの血管内移植は、肺胞形成及び肺吸気量及びコンプライアンス機能を修復する。従って、PCEC中のVEGFR2及びFGFR1活性化は、EGFRリガンドのMMP14依存性バイオアベイラビリティを高めて肺胞形成を開始して持続させる。PNX後、PCECの活性化は、上皮前駆細胞の増大を支持する。PNXに誘導された肺胞再生モデル、Vegfr2及びFgfr1の内皮特異的ノックダウン、並びに3次元内皮-上皮共培養アンギオスフェアバイオリアクターを用いて、本発明者らは、再生肺胞形成の促進におけるPCECの必須の役割を確立した。本明細書に記載された研究は、HB-EGFの切断及びラミニン5γ2鎖からEGF様フラグメントの生成が、BASC及びAECのサブセットを含む肺上皮前駆細胞の増幅を刺激し、肺胞増殖を支持する、MMP14のアンギオクリン役割を明らかにした。肺胞形成の促進におけるMMP14/EGFR活性化の役割は、PNX後、Vegfr2iΔECiΔECFgfr1iΔECマウスへのEGF投与が肺胞再生を修復する研究で確認された。さらに、本発明者らは、新たな肺胞増殖を行う能力が損なわれたマウスの上皮形成の修復において、機能的に組み込まれたPCECの必須の役割を定義するための肺PCEC移植モデルを確立した。まとめると、本発明者らは、PNX後、PCECが、新たな血管の形成によって及び上皮活性なアンギオクリン因子の指示的産生を通して再生肺胞増殖を組織化することを示した。PNXは、上皮前駆細胞の増幅を介して肺胞再生を誘導する。初期段階日0~3で、PNXは、BADJに局在化されたCCSPSPCSca-1CD31VE-カドヘリンBASC様細胞の増大を誘導する。後期段階日7~15で、SPCE-カドヘリンAECII及びPCECは、増大し、機能性肺胞毛細血管ユニットを再構築する。MMP14阻害すると、立方体様SPCE-カドヘリンだけでなく、また鱗状SPC-E-カドヘリンAECの肺胞被覆率alveolarcoverageの損失は、一時的に増幅されたSPCE-カドヘリンAECIIがSPCE-カドヘリンタイプIAECを潜在的に生成しBeersTheJournalofclinicalinvestigation12120652073MorriseyDevelopmentalcell18823RockAnnualreviewofcellanddevelopmentalbiology、PNX後の肺胞表面の十分な再構築を導くことを意味している。従って、誘導PCECは、機能性肺胞毛細血管嚢をまとめて再構築する、特定の肺上皮細胞の再生を誘発する。PCECは、EGFRリガンドのMMP14介在性放出を通して肺胞形成を開始する。PCEC由来のMMP14は、上皮細胞の増大並びに肺胞構造及び肺機能の修復に必要である。マウス胎児肺では、MMP14は、上皮増殖及び移動の惹起ChunCell125577591HiraokaCell95365377StratmanBlood114237247YanaJournalofcellscience12016071614によって肺胞形成を調節するAtkinsonDevDyn23210791090IrieMedicalmolecularmorphology384346OblanderDevelopmentalbiology277255269。出生後、MMP14欠損マウスは、不完全な肺胞増殖、異常な小嚢形成、及びAECによる血管統合障害impairedvascularintegrationを示し、MMP14が肺胞毛細血管クロストークを仲介することを示唆しているLeeNaturemedicine1010951103LiCell111635646MorrisNature422169173PageMcCawNaturereviews8221233。従って、本発明者らは、PNX後、MMP14の阻害は、肺胞再増殖だけでなく内皮増殖を妨げ、肺胞サイズを拡大することを示した。MMP14は、増殖血管新生に不必要かもしれないが、再生肺胞増殖の誘導において重要な役割を果たす。本研究は、MMP14が肺胞形成を調節する機構には、肺胞腔へのHB-EGFの切断及びラミニン5γ2鎖からのEGF様フラグメントの生成が含まれることを示している。その後、生物学的に利用可能なEGFR-リガンドの増加は、上皮前駆細胞の再生を開始する。これに関して、MMP14は、再生肺胞増殖を誘発するPCEC特異的アンギオクリンキューとして作動する。MMP14のPCEC特異的誘導は、肺血管系の独特な機能的特徴を明らかにする。各器官は、独特な表現型の、機能的及び構造的特質によって同定される、毛細血管ECの特定集団によって血管新生される。骨髄SECButlerCellstemcell6251264HooperCellstemcell4263274と肝SECとは、VEGFR2VEGFR3VE-カドヘリン血管によって区別され、器官再生を誘発するアンギオクリン因子の確定されたセットを発現する。上記のように、部分肝切除後、VEGFR2誘導肝SEC及びId1誘導肝SECは、HGF及びWNT2を産生して肝細胞増殖を誘導する。対照的に、骨髄VEGFR2誘導SECは、Notchリガンド及びIGFBPButlerCellstemcell6251264KobayashiNaturecellbiology1210461056を発現して造血細胞の再構築を誘導する。PCECは、VEGFR2FGFR1CD34VE-カドヘリン血管として同定される明瞭な表現型の特徴を有する。注目すべきことに、PNX後、MMP14の産生は、他の血管の豊富な器官ではなく、VEGFR2活性化PCEC及びFGFR1活性化PCECに制限され、肺胞再生におけるPCECの独特な機能的特徴を強調している。肺胞形成の修復における、肺切除されたWTマウスから得られた血漿のごくわずかな効果は、肺胞形成の仲介における非肺血管系からの全身の可溶性増殖因子の寄与が最小限であることを示した。これらのデータは、PNXがPCEC特異的プログラムを起動して肺胞再生を促進する概念を明確に説明している。VEGFR2及びFGFR1の逐次的活性化は、肺胞再生中にPCECを刺激する。PNXの後、PCECがMMP14の発現を誘導する機構は、VEGFR2及びFGFR1の階層的な活性化及び上方制御によって仲介される。PNXの初期段階で、BASC様細胞の増大は、主にPCEC中のVEGFR2の活性化に依存しており、それは、EC増殖を誘導することなくMMP14の上方制御を生じる。PNX後のVEGFR2の初期の活性化及び安定発現と対照的に、FGFR1発現レベルは、その後に誘導され、日7にピークに達する。FGFR1は、MMP14生成の増大においてVEGFR2と共同作用し、それによって肺胞の再生を持続させる。従って、PCEC中のVEGFR2及びFGFR1の逐次的活性化は、MMP14産生を誘導し、機能的肺胞毛細血管ユニットの再生を促進する。PCEC由来のアンギオクリン因子のPCEC移植及び投与は、呼吸器疾患の処置の新たなアプローチを提供する。肺障害を有する受療体において呼吸容量を修復する治療的な戦略の開発は、肺再生機構があまり理解されてないたま不利な立場に置かれているJiangNaturemedicine1111731179KajsturaTheNewEnglandjournalofmedicine36417951806MatthayAnnualreviewofpathology6147163MorrisNature422169173PetracheNaturemedicine11491498WhitsettAnnualreviewofmedicine61105119。本明細書に記載された本研究は、吸気量及び静的コンプライアンスによって測定されるように、PNX後、誘導PCECが、呼吸容量の修復に有望な役割を果たすことを示している。特に、EGFの投与又は誘導PCECの移植は、マウスの呼吸器の機能を改善した。従って、適当に活性化されたPCECの移植又は肺特異的アンギオクリンメディエーターの注射は、肺障害を有する受療体のサブセットにおいて肺機能を改善できる。実施例2に記載された研究は、PCECは、MMP14のような誘導アンギオクリン増殖シグナルを伝達することによって再生肺胞形成を組織化することを示している。VEGFR2及びFGFR1の選択的活性化、又はMMP14だけでなく、本明細書に記載された他のアンギオクリン因子の産生における増加は、肺の肺胞増殖を促進でき、それによって消耗性肺疾患を有する受療体の低酸素血を改善する。"