哺乳動物における膵機能障害に関連する疾病又は疾患の治療又は予防方法であって、該方法は、1以上のFoxoタンパク質又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる治療有効量の薬剤を哺乳動物に投与することを含み、該薬剤は、該Foxoタンパク質の1以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスDNARNA、マイクロRNA、及びリボザイム、並びに1以上のFoxoタンパク質に特異的に結合し、それにより該1以上のタンパク質の生物活性を減少させる抗体又はその生物活性のある断片若しくは変異体からなる群から選択される、方法。疾病又は疾患が、1型糖尿病、2型糖尿病、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、高血糖、インスリン感受性の減少、空腹時血糖の増加、食後血糖の増加及び肥満からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。治療有効量が、グルコース耐性の増加、血清中インスリンの増加、インスリン感受性の増加、空腹時血糖の減少、食後血糖の減少、体重増加の減少、体脂肪量の減少、体重減少の増加及びインスリンを産生し分泌する消化管における腸内分泌細胞の生成からなる群から選択される効果を生じさせる量である、請求項2に記載の方法。薬剤が消化管に投与される、請求項1に記載の方法。哺乳動物における膵機能障害に関連する疾病又は疾患の治療又は予防のための医薬製剤であって、該医薬製剤は、1以上のFoxoタンパク質又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる有効量の薬剤を含み、該薬剤は、該Foxoタンパク質の1以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスDNARNA、マイクロRNA、及びリボザイム、並びに1以上のFoxoタンパク質に特異的に結合し、それにより該1以上のタンパク質の生物活性を減少させる抗体又はその生物活性のある断片若しくは変異体からなる群から選択される、医薬製剤。有効量が、グルコース耐性の増加、血清中インスリンの増加、インスリン感受性の増加、空腹時血糖の減少、食後血糖の減少、体重増加の減少、体脂肪量の減少、体重減少の増加及びインスリンを産生し分泌する消化管における腸内分泌細胞の生成からなる群から選択される効果を生じさせる量である、請求項5に記載の医薬組成物。哺乳動物においてインスリンを産生し分泌する腸内分泌細胞の製造方法であって、該方法は、該哺乳動物に1以上のFoxoタンパク質又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる薬剤を投与することを含み、該薬剤は、該Foxoタンパク質の1以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスDNARNA、マイクロRNA、及びリボザイム、並びに1以上のFoxoタンパク質に特異的に結合し、それにより該1以上のタンパク質の生物活性を減少させる抗体又はその生物活性のある断片若しくは変異体からなる群から選択される、方法。インスリン産生腸内分泌細胞が、該薬剤の投与に応答して、グルカゴン、膵ポリペプチド、グルコキナーゼ、及びglut2からなる群から選択される1以上の膵ホルモンを更に産生する、請求項7に記載の方法。インスリン産生腸内分泌細胞が、プロホルモン転換酵素Pc2、Pdx1、MafA、Nkx61、Nkx22、及びPax4からなる群から選択される1以上のタンパク質も産生する、請求項7に記載の方法。哺乳動物においてグルコース耐性を増加させるか又はインスリン感受性を減少させる方法であって、該方法は、該哺乳動物に1以上のFoxoタンパク質又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる治療有効量の薬剤を投与することを含み、該薬剤は、該Foxoタンパク質の1以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスDNARNA、マイクロRNA、及びリボザイム、並びに1以上のFoxoタンパク質に特異的に結合し、それにより該1以上のタンパク質の生物活性を減少させる抗体又はその生物活性のある断片若しくは変異体からなる群から選択される、方法。インスリン産生腸内分泌細胞の作製方法であって、a.非インスリン産生腸内分泌前駆細胞の集団を哺乳動物から得ること、b.該集団を、集団の大部分がインスリンを産生することを可能にする量及び条件下で、1以上のFoxoタンパク質、又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる薬剤と接触させることであって、ここで該薬剤は、該Foxoタンパク質の1以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスDNARNA、マイクロRNA、及びリボザイム、並びに1以上のFoxoタンパク質に特異的に結合し、それにより該1以上のタンパク質の生物活性を減少させる抗体又はその生物活性のある断片若しくは変異体からなる群から選択される、及びc.インスリン産生腸内分泌細胞を回収すること、を含む、方法。集団が、腸又は結腸の区域に含まれるものである、請求項11に記載の方法。区域が、十二指腸又は回腸から取得され、陰窩を含むものである、請求項11に記載の方法。哺乳動物における膵機能障害に関連する疾病又は疾患の治療又は予防方法であって、請求項11のインスリン産生腸内分泌細胞を、疾病又は疾患を治療又は予防するために十分な数で、該哺乳動物へと再導入することを含む、方法。請求項11に記載の方法によって製造されたインスリン産生腸内分泌細胞。該細胞が、グルカゴン、膵ポリペプチド、グルコキナーゼ、及びglut2からなる群から選択される1以上の膵ホルモンを更に産生する、請求項15に記載の細胞。該細胞が、プロホルモン転換酵素Pc2、Pdx1、MafA、Nkx61、Nkx22、及びPax4からなる群から選択される1以上のタンパク質を更に産生する、請求項15に記載の細胞。[請求項17]請求項15に記載のインスリン産生腸内分泌細胞を含む医薬製剤。哺乳動物における膵機能障害に関連する疾病又は疾患を予防するための医薬であって、該医薬は、1以上のFoxoタンパク質又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる薬剤を治療有効量で含み、該薬剤は、該Foxoタンパク質の1以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスDNARNA、マイクロRNA、及びリボザイム、並びに1以上のFoxoタンパク質に特異的に結合し、それにより該1以上のタンパク質の生物活性を減少させる抗体又はその生物活性のある断片若しくは変異体からなる群から選択される、医薬。哺乳動物の腸の非インスリン産生腸内分泌前駆細胞がインスリンを発現することを誘導する薬剤の同定のための、ハイスループットスクリーニング細胞ベースアッセイであって、a.腸の非インスリン産生腸内分泌前駆細胞を含む細胞の集団を単離すること、及びインスリンの産生及び分泌に適した条件下でそれらをインキュベートすること、b.非インスリン産生腸内分泌前駆細胞の対照及び被験集団を提供すること、c.被験集団を被験薬剤と接触させること、d.対照及び被験集団におけるインスリン発現のレベルを決定すること、並びにe.被験集団におけるインスリンのレベルが対照におけるレベルよりも有意に高い場合に該被験薬剤を選択すること、を含むアッセイ。腸の腸内分泌細胞においてインスリンをコードする遺伝子が、視覚化され得るタンパク質又はペプチドに作動可能に連結されている、請求項19に記載の方法。タンパク質又はペプチドが蛍光タンパク質である、請求項20に記載の方法。タンパク質又はペプチドが、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、及びベータガラクトシダーゼからなる群から選択されるメンバーである、請求項20に記載の方法。薬剤が、膵機能障害に関連する不耐性の疾病又は疾患を治療するために治療効果がある、請求項20に記載の方法。腸の腸内分泌細胞が、インスリンを過剰発現するように操作されている、請求項20に記載の方法。薬剤のライブラリーがスクリーニングされる、請求項20に記載の方法。薬剤が、Foxo1、Foxo2、Foxo3若しくはFoxo4又はそれらの組み合わせの発現を減少させるものである、請求項20に記載の方法。非インスリン産生腸内分泌細胞をインスリン産生細胞へと分化させる薬剤の同定方法であって、以下を含む方法:a共に膵機能障害を有する被験動物及び対照動物を提供することb薬剤を被験動物に投与すること、c両方の動物におけるインスリン産生細胞の指標のレベルを決定することであって、該指標は、血清中インスリン、インスリン感受性、及びグルコース耐性からなる群から選択される、並びにd該指標が、対照動物と比較して被験動物において有意に増加している場合、該薬剤を、非インスリン産生腸内分泌細胞をインスリン産生細胞へと分化させる薬剤として同定すること。薬剤が、膵機能障害に関連する疾病又は疾患を治療するために有効なものである、請求項20に記載の方法。膵機能障害に関連する疾病又は状態の治療又は予防に有効である薬剤の同定方法であって、以下を含む方法:a該疾病又は状態を有する動物を提供すること;b該動物から取得された処理前の生体試料におけるFoxo1、Foxo2、Foxo3又はFoxo4の発現量を決定すること;c該動物に薬剤を投与すること;及びd該動物から取得された処理後の生体試料におけるFoxo1、Foxo2、Foxo3又はFoxo4の発現量を決定し、処理後の生体試料における量が処理前の試料における量よりも有意に低い場合、該薬剤を、疾病又は状態の治療又は予防において有効である薬剤として同定すること。生体試料が、血清又は腸内分泌細胞の試料である、請求項29に記載の方法。従って、糖尿病又は膵機能障害に関連する他の疾患の治療、予防、及び/又は発症リスクの低減のための更なる治療計画の必要性が存在する。本発明の実施形態が記載されるのに先立ち、記載された特定の処理、組成物、又は方法論は変化し得るため、本発明はこれらに限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、特定の説明又は実施形態を記載する目的のためだけのものであり、添付の特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することを意図するものでないことも理解されるべきである。特に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似又は同等のあらゆる方法及び材料が、本発明の実施形態の実施又は試験に用いられ得るが、好ましい方法、装置、及び材料がここに記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物は、参照によってそれらの全体が組み込まれる。本明細書中のいかなる箇所も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。詳細な説明本発明の実施形態は、Neurog3Foxo1ノックアウトNKOマウスにおけるFoxo1タンパク質をコードする遺伝子の体細胞性除去が、顕著な割合の腸N3Prog細胞を、インスリン陽性腸内分泌細胞腸Ins細胞生物活性のあるインスリン及びCペプチド、並びに他の膵ホルモン及び転写因子を産生し分泌するへと分化させたことの発見に部分的に基づく。重要なことに、腸Ins細胞は、グルコースに応答して用量依存的な様式でインスリンを分泌し、NKO変異マウスの腸由来の酸-エタノール抽出物は、invivoでグルコース低下効果を有していた。更に、NKOマウスについてのinvivo研究は、膵ベータ細胞毒素ストレプトゾトシンを用いた治療の後、再生しないとは異なり、完全に機能的な腸Ins細胞は、NKOマウスにおいて再生し、ちょうど10日後に高血糖の自発的な逆転をもたらし、92日間の実験を通して未治療の動物よりも有意に低い血中グルコースレベル不断給餌時inadlibitum約250mgdL、又は絶食後で約160mgdLを維持することを示した。重要なことに、未治療の動物インスリン治療なしでは必ず死亡したとは異なり、NKO動物の75は、いかなる追加の治療なしでも生存した。環境中のグルコースの濃度と正比例してインスリンを分泌する腸Ins細胞の能力は、これまで他のグループが再現できていない、膵臓における健康なインスリン産生細胞の重要な特性である。該データは、腸N3Progはインスリンを産生し分泌する細胞へと分化する潜在力を有しているが、この能力はFoxo1遺伝子発現によって抑制されることを示した。いくつかの腸幹細胞もIs細胞へと分化し得ることから、用語腸InsProgは、本明細書中、Ins細胞になることができる任意の腸前駆細胞を含むように使用される。これまでに誰も、インスリン産生細胞へと分化する潜在力を保持する、腸における前駆細胞の存在を記載することも仮説を立てることもしなかった。従って、活性薬剤は、腸Ins細胞への腸InsProg細胞の分化を引き起こす任意の薬剤を広く含む。Foxoタンパク質の発現又は生物活性を減少させる薬剤が好ましい。本明細書中、活性薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイが記載される。レプチン摂食を調節するホルモンを用いた治療が、腸におけるIns細胞の出現をもたらし得るという、当該分野における先例があるが、この方法は、別の腸細胞型であるL細胞腸内分泌細胞であるの部分的な形質転換を必要とする点で、本明細書中に記載される方法とは異なる。従って、腸N3細胞が腸ins細胞を生じ得ることを誰も報告しておらず、レプチン治療後のIns細胞がインスリンを産生することが機能的にできること、ましてやグルコース用量依存的な様式でそれを産生することは、誰も報告していない。動物ヒト及びマウスを含むにおける、種々のFoxoタンパク質Foxo1、3又は4タンパク質をコードする遺伝子の間、及びFoxoタンパク質自体の間で、それぞれ顕著な核酸及びアミノ酸配列相同性がある。Foxo1を減少させることは腸Ins細胞を作り出すために好ましいが、任意の1若しくは1より多くのFoxo遺伝子若しくはmRNAの発現の減少又は1以上のFoxoタンパク質の生物活性の減少は、顕著な割合の腸InsProgを腸Ins細胞へ分化させることが期待される。陰窩に富む腸の区域及び正常マウスからの単離細胞である腸InsProgの培養集団を使用した特定の実験は、腸InsProgのsiRNAマウスFoxo1mRNAに十分に相補的であり、Foxo1発現を減少させるとの接触が、腸Ins細胞を作り出すことを示した。このことは、インスリン産生細胞へと転換する腸腸内分泌前駆細胞の能力が、Foxo1遺伝子即ち、DNAの操作に限定されず、Foxo1mRNAの阻害を介しても影響され得ることを示す。これらの発見に少なくとも部分的に基づき、本発明の特定の実施形態は、腸InsProgを、該細胞を腸Ins細胞にする薬剤と接触させることによる、哺乳動物腸Ins細胞の製造方法を対象にする。好ましい薬剤としては、1以上のFoxoタンパク質をコードする1以上のFoxo遺伝子若しくはmRNAの発現を減少させるか、又は1以上のFoxoタンパク質の生物活性を、腸InsProgが腸Ins細胞表現型を有する細胞へ分化することを可能にするレベルに減少させる薬剤が挙げられる。腸InsProg細胞が、動物においてinsituで薬剤と接触され得、又は腸InsProgの濃縮された集団が腸から単離され得、又は培養した腸の外植片が使用され得る。これらの方法の一部は、実施例10に記載される。特定の他の実施形態は、単離された腸Ins細胞自体、及び腸Ins細胞を含む組織外植片好ましくは腸組織であるが人工組織も含まれるを対象にする。更なる方法は、腸N3progになるようinvitroで再プログラムされた細胞からのIns細胞の作製を含む。換言すれば、他の細胞型の操作を介して間接的に得られた腸N3細胞である。例えば、他のものは、細胞を再プログラムすることにより、皮膚生検からインスリン産生細胞を作製した。著者らはそれを具体的に試験しなかったが、おそらく、これらの細胞は、インスリン産生性となるためにN3prigの段階を経た。これらの方法及び当該分野において公知の他のものは、本発明の実施形態において使用され得る。MaehrRetalProcNatlAcadSciUSA2009Sep151061576873Epub2009Aug31Generationofpluripotentstemcellsfrompatientsswithtype1diabetes本明細書中に記載される治療方法の有効性は、該方法が、治療される疾病の症状のいずれかを寛解させるか否かを決定することにより、観察され得る。或いは、血清中インスリン又はCペプチドインスリン分泌の副産物であり、機能的なIns細胞の指標のレベルを観察することができ、そのレベルは、治療に応答して増加するはずである。或いは、有効性は、糖血症、グルコース耐性、体脂肪量、体重増加、ケトン体、又は治療される対象における列挙された疾病又は疾患の他の兆候を観察することにより測定され得る。インスリン分泌の減少に加えて、膵機能障害としては、1以上の膵臓ペプチドグルカゴン、膵ポリペプチド、ソマトスタチン、又はグレリン等を含む1以上の膵ホルモンを産生及び/又は分泌する能力の変化が挙げられる。周知の膵機能障害に関連する病態としては、1型糖尿病、及び2型糖尿病が挙げられる。他の病態としては、成人潜在性自己免疫性糖尿病と呼ばれることもあるもの、糖尿病前症、空腹時血糖の障害、グルコース耐性の障害、空腹時高血糖、インスリン抵抗性症候群、及び高血糖状態が挙げられる。これらの全ては、糖尿病を治療及び予防することの意味の中に入る。他の実施形態は、例えば被験薬剤のライブラリーを使用する、腸InsProgの腸Ins細胞への分化を誘導するものを同定するための、スクリーニング方法を対象にする。これらの方法の一部は、下記のスクリーニングアッセイと題されたセクションにおいて記載される。スクリーニングは、ハイスループットinvitroアッセイであり得る。invitro系は、試験管内で非インスリン産生腸前駆細胞から腸Ins細胞を作り出すためにも開発されている。実施例10。特定の他の実施形態は、腸Ins細胞が、特定の糖尿病患者又は糖尿病を発症するリスクのある患者からの腸生検由来のインスリン陰性前駆細胞から生物工学により作られること次いで、該細胞は患者へと移植により戻され、自己の腸Ins細胞からの調節されたインスリン分泌の供給源を提供し得るを対象にする。腸Ins細胞によるインスリン分泌が薬物ジアゾキシドを使用して遮断され得ることも発見されており、このことは、低インスリン産生又は膵機能障害に関連する疾病の治療のための治療方法として、腸Ins細胞を産生するよう誘導されたか又は腸Ins細胞を投与することにより治療された動物における、いかなる望ましくないインスリン産生も制御するための重要な安全対策である。本明細書中に記載されるデータは、腸InsProgが、環境中のグルコースの濃度と正比例して生物活性のあるインスリンを分泌する腸Ins細胞へと分化するよう誘導され得ること、及び腸Ins細胞がジアゾキシドにより制御され得ることの、直接的証拠を提供する。従って、本発明の特定の実施形態は、腸InsProgの腸Ins細胞への分化を誘導する薬剤の治療有効量を投与することによる、1型又は2型糖尿病、或いは動物における不適切に低いインスリン又は膵機能障害に関連する、本明細書中で定義された、列挙された疾病又は疾患のうちの別のものの治療又は予防方法を対象にする。そのような薬剤としては、Foxo又はFoxo遺伝子若しくはmRNA発現を減少させるか、或いは1以上のFoxoタンパク質の生物活性を、Ins腸Progが腸Ins細胞になることを可能にするレベルに減少させる薬剤が挙げられる。いくつかの他の実施形態において、これらの疾患は、治療有効量の腸Ins細胞好ましくは自己の又は部分的に自己の細胞を、そのような治療を必要とする動物に投与することにより治療又は予防される。概要再生医学の長年のゴールは、1型糖尿病を有する患者において行われる細胞置換のリストにインスリン産生β細胞を入れることを目的として、該細胞の生成を支配する遺伝的経路、細胞経路、及び生化学的経路を同定することである。原始内胚葉前駆体が内分泌系への運命を採る過程は、詳細に調べられている3。ニューロゲニンは、一般にニューロン分化を指定することに関与するbHLH転写因子の一群である。ニューロゲニン3Neurog3又はN3は、膵臓内分泌系の発達を促進する。膵臓及び腸内分泌細胞は、転写因子Neurog3の一過性発現によって特徴付けられる前駆細胞から生じる。重要なステップは、全ての公知の膵島細胞型へと分化するニューロゲニン3発現細胞の形成であるように見える1、2223。興味深いことに、ニューロゲニン3内分泌系前駆細胞本明細書中N3Progは、膵臓に制限されず、胃及び腸において見出され、そこでそれらは腸内分泌系体内における最大の内分泌系器官における細胞のほとんどを生じる23。しかしながら、それらが共通して内胚葉起源であるにもかかわらず、膵臓及び腸N3前駆細胞は、あるとしてもわずかの特性しか共有せず、それらは、別個のペプチドホルモンを産生し、著しく異なる発生運命及び寿命を有する細胞型を生じる8。膵臓内分泌系前駆細胞は、胚発生の間に形成され、特別な状況下24を除き、成体器官においては再び生じないが7、腸N3Progは、腸幹細胞から継続的に再生し、ターンオーバーの速い腸内分泌細胞を再配置させることに寄与する3。これら2つの細胞集団の別個の特性は、位置特定positionalspecificationそれにより部分的に運命決定された前駆細胞は、具体的な運命を指示する位置依存的な特性を獲得するの古典的理論とつながり合っている。哺乳動物細胞の分化は、階層的フィードフォワードプロセスとみなされ、そこでは、多能性前駆細胞は、位置の合図によって運命が制限される。従って、ニューロゲニン3陽性内分泌系前駆細胞N3Progは、位置特定の現在の理論に基づき、腸においてではなく、膵臓においてインスリン産生細胞へと分化することが予測される。これまでに、腸におけるFOXO1、3及び/又は4発現細胞の発生、局在、及び機能的な特性について、実質的に何も知られていなかった。転写因子Foxo1は、膵臓ベータ細胞機能の複数の面を調節し4、Neurog3膵臓内分泌系前駆細胞において広く発現している。単離されたヒト胎児膵臓上皮において、FOXO1ノックダウンは、NEUROG3の数を増加させる39。膵臓と同様に、Foxo1は、二重免疫組織化学によって確認されるように、ほとんどのNeurog3腸内分泌前駆細胞において発現している図1a及び5。マウス腸Ins細胞におけるFoxo1の役割が検討され、それが腸N3Progが分化する細胞型の決定において役割を果たすか否かを決定した。腸Ins細胞への腸InsProgの分化におけるFoxo1の役割を説明する実験の詳細、及びFoxo1が腸腸内分泌前駆細胞を非インスリン産生性の表現型に制限するという発見は、腸Ins細胞の特性及びそれらの治療用途を決める実験の記載とともに、実施例において説明される。理論によって制約されることなく、データは、腸N3ProgにおけるFoxo1の生理的機能が、それらを腸内分泌系統に制限することであり、それにより膵臓内分泌系系統を抑制することを示す。FOXO1は、膵臓においてニューロゲニン3と同時発現するが、FOXO1除去は、様々な膵臓内分泌細胞型の生成に影響しない2829。PKO及びNKOマウスの間の類似性は、上皮幹細胞分化におけるより早い段階でのFoxo1発現の減少も、膵臓内分泌系系統のFoxo1依存的抑制を解除することを示す。重要なことに、腸N3Prog細胞は、マウスの生存期間を通じて腸Ins細胞を生み出す。同じことがヒトにおいても当てはまることが期待される。これらの経路は高度に保存されており、ニューロゲニン3をコードする遺伝子におけるヒト変異があり、そこでは腸機能の異常が説明されている。従って、腸N3ProgにおけるFoxoタンパク質の発現又は生物活性を減少させる薬剤は、内分泌系膵臓分化表現型を惹起するために随時投与され得る。このことは、図20においても示され、siRNAによるFoxo1阻害が、正常マウスにおける腸細胞がInsになることを誘導し得ることを実証する。腸の細胞は急速にターンオーバーすることから、治療は、以下に記載されるように、これらの薬剤の定期的な再投与を必要とし得る。ストレプトゾトシンで処理されたNKOマウスが腸においてインスリン産生細胞を再生することができることを示す結果は、表現型が、一細胞世代よりも長い間持続することを示す。FOXOタンパク質FOXO転写因子は、ホルモン及び栄養の合図を細胞の転写応答と統合し、細胞生存、細胞周期進行、DNA修復、及びインスリン感受性を含む、多様な細胞プロセスを調節するTranetal2003に総説されている。それらの代謝機能に加えて、Foxoタンパク質は、複数の細胞型における最終分化を阻害する3132。膵臓において、FOXO1は、重要な機能を果たし、内分泌細胞量を負に調節し2628、ストレスへのベータ細胞応答を促進する2930。FOXO1除去は、様々な膵臓内分泌細胞型の生成に影響しない2829。Nakaeetal2002は、マウスFoxo1が様々な組織において発現し、肝臓、膵ベータ細胞、及び脂肪細胞におけるインスリン感受性の負の調節因子であることを示した。FOXO1へのインスリンシグナル伝達の障害は、2型糖尿病の代謝異常についての統一したメカニズムを提供する。ヒトにおける研究は、FOXO1が、ヒトPKBAktインスリンシグナル伝達カスケードにおいてPI3キナーゼの下流に位置するセリン/スレオニンキナーゼにより負に調節されることを示す。この調節は、3つのPKBAktリン酸化コンセンサス部位におけるFOXO1の急速且つ階層的なリン酸化を含むTranetal2003。Foxoタンパク質の決定的な特性は、フォークヘッドボックス又はモチーフ3つのへリックス及び2つの特徴的な大きなループ、又はウィングwingsからなる約80から100アミノ酸を有するDNA結合ドメインである。これらのタンパク質についての標準化された命名法に従いKaestneretal2000、ヒトについては全て大文字が使用され例、FOXO1、マウスについては最初の文字のみが大文字で書かれる例、Foxo1。GenbankNM0020153において特定されるFOXO1遺伝子以前はFOXO1;FKH1;FKHR;及びFOXO1Aとも表記は、インスリン応答性組織肝細胞、脂肪細胞、及び膵臓細胞等中に最も多いFOXOアイソフォームである。FOXO4別名AFX;AFX1;MLLT7;MGC120490;FOXO4は、GenbankNM0059383において説明される;FOXO3別名、FOXO2;AF6q21;FKHRL1;FOXO3A;FKHRL1P2;MGC12739;MGC31925;DKFZp781A0677はGenbankNM0014553において説明される。全てが参照により本明細書中に組み込まれる。当業者は、この配列に基づき当該分野において公知の方法を使用して、適切なアンチセンスヌクレオチド及びsiRNAを構築することができる。動物ヒト及びマウスを含むにおける種々のFoxoタンパク質をコードする遺伝子及びタンパク質自体の間の顕著な相同性とは、FOXO1mRNA又は該遺伝子を標的とするshRNA、SiRNA及びアンチセンスRNA又はDNAが、FOXO3及びFOXO4に十分に相補的でもあり、それらの発現を減少させ得ることを意味する。同様に、FOXO4又はFOXO3を標的とするように設計されたsiRNA及びアンチセンスは、FOXO1に十分に相補的であり、その発現を減少させ得る。実験をマウスについて行なったことから、全体を通して小文字の命名法を使用したが、しかしながら、本明細書中で使用される場合Foxoとは、任意の種由来の任意のFoxoタンパク質、遺伝子又はmRNAを意味する。本発明の方法及び組成物のために、Foxoタンパク質は、Foxo1及びその生物活性のある断片のようなオーソログ異なる種における類似体を含む。特定の実施形態において、所望の腸Ins表現型は、1以上のFoxoタンパク質好ましくはFoxo1を含むの発現又は活性を減少させることにより作り出される。従って、FOXO2、FOXO4及びFOXO3を含む他のフォークヘッドタンパク質を減少させることも、単独で又はFOXO1の減少とともに、非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞に変えることが期待される。配列相同性に起因して、マウスFoxo1に対して作製されたアンチセンス又はsiRNAは、ヒトを含む他の動物において使用され得、逆もまた同様である。全ての遺伝子ID及びアクセッション番号並びにFoxoタンパク質をコードする対応するヌクレオチド、遺伝子、mRNA及びcDNAは、それらの全体が参照により本明細書中に明確に組み込まれる。HomosapiensforkheadboxO1FOXO1mRNANCBIReferenceSequence:NM0020153MusmusculusforkheadboxO1Foxo1mRNANCBIReferenceSequence:NM0197393RattusnorvegicusforkheadboxO1Foxo1mRNANCBIReferenceSequence:NM0011918461HomosapiensforkheadboxO3FOXO3transcriptvariant1mRNANCBIReferenceSequence:NM0014553HomosapiensforkheadboxO3FOXO3transcriptvariant2mRNANCBIReferenceSequence:NM2015592MusmusculusforkheadboxO3Foxo3mRNANCBIReferenceSequence:NM0197402RattusnorvegicusforkheadboxO3Foxo3mRNANCBIReferenceSequence:NM0011063951HomosapiensforkheadboxO4FOXO4transcriptvariant2mRNANCBIReferenceSequence:NM0011709311HomosapiensforkheadboxO4FOXO4transcriptvariant1mRNANCBIReferenceSequence:NM0059383RattusnorvegicusforkheadboxO4Foxo4mRNANCBIReferenceSequence:NM001106943MusmusculusforkheadboxO4Foxo4mRNANCBIReferenceSequence:NM0187892GenomicRefSeqGeneFOXO1ヒトNG0232441Foxo1MusmusculusstrainC57BL6Jchromosome3MGSCv37C57BL6JNC0000695Foxo1ラット、NC0051012、NW0476252FOXO3ヒト、NC00000611Foxo3マウス、NC0000765Foxo3ラット、NC0051192FOXO4ヒト、NC00002310Foxo4マウス、NC0000866Foxo4ラット、NC0051202forkheadboxO1MusmusculusGenBank:EDL352241ForkheadproteinFKHR1マウスSwissProt:Q9WVH5forkheadboxproteinO1HomosapiensNCBIReferenceSequence:NP0020062forkheadboxproteinO1RattusnorvegicusNCBIReferenceSequence:NP0011787751forkheadboxproteinO3HomosapiensNCBIReferenceSequence:NP9638531forkheadboxproteinO3HomosapiensNCBIReferenceSequence:NP0014461forkheadboxproteinO3RattusnorvegicusNCBIReferenceSequence:NP0010998651forkheadboxproteinO3MusmusculusNCBIReferenceSequence:NP0627141forkheadboxproteinO4RattusnorvegicusNCBIReferenceSequence:NP0011004131forkheadboxproteinO4isoform2HomosapiensNCBIReferenceSequence:NP0011644021forkheadboxproteinO4isoform1HomosapiensNCBIReferenceSequence:NP0059292forkheadboxproteinO4MusmusculusNCBIReferenceSequence:NP0612591Foxoタンパク質の発現を減少させるために使用されるアンチセンス及び低分子干渉RNAが作製され得、それらは、Foxoタンパク質をコードする遺伝子及び/又はmRNAに特異的にハイブリダイズし、且つそれぞれ転写又は翻訳のいずれかを阻害することによりタンパク質発現を阻害するために十分に相補的である。Foxo1発現を減少させることは、腸Ins細胞の腸Ins細胞への分化を引き起こし、そしてそれは処理前のレベルと比較して上昇したインスリンレベルをもたらす。腸及び膵臓の内分泌細胞においてFoxo遺伝子が遮断されたNKOマウスは、それにもかかわらず、健康に見え、癌を含めて明らかな疾病を有さなかった。同様に、肝臓において全てのFoxo遺伝子1、3、及び4を欠くマウスは、健康であり、極度にインスリン感受性であり、肝臓機能試験又は肝臓病態のいかなる異常も発現しなかったが、これらのことはFoxo阻害が安全であり、望ましくない副作用がないこと示す。従って、糖尿病及び膵臓機能不全に関連する他の疾患を治療又は予防するために膵ホルモン分泌腸腸内分泌細胞を生じさせるために、特に一過性の様式で、ヒト対象においてFOXO1、3及び/又は4の発現或いはその生物活性を減少させることは、有害作用がほとんどないようである。このことは、全てのFoxoタンパク質の発現又は生物活性を劇的に減少させたとしても同じであろう。本発明者らの以前の研究MatsumotoetalTheJournalofClinicalInvestigation、Volume116Number9September2006においては、shRNAが使用され、コントロールsiRNA標的配列として低分子ヘアピン型RNABDBiosciencesからを使用して配列GCACCGACTTTATGAGCAACC配列番号1のFoxo1を標的化することによりFoxo1発現を減少させた。配列相同性に起因して、この配列又はヒトFOXO1において実質的に相同な配列は、良い標的となり得る。Liuら、CancerGeneTherapy14945952December2007も、マウスにおいて骨格筋においてFoxo1の発現を減少させるためにRNA阻害剤を使用することを記載する。本明細書中に記載された実験において使用されたsiRNAは、実施例10において特定される。LabiedSら、MolecularEndocrinology203544は、以下を含む種々のヒトFoxoタンパク質を不活性化するアンチセンス分子の記載を提供する:FOXO1antisenseTTGGGTCAGGCGGTTCA配列番号2;FOXO3asenseCCCAGCCTAACCAGGGAAGT配列番号3及びFOXO3aantisenseAGCGCCCTGGGTTTGG配列番号4;FOXO4senseCCTGCACAGCAAGTTCATCAA配列番号5及びFOXO4antisenseTTCAGCATCCACCAAGAGCTT配列番号6。SStephenら、CancerResearch70367January12010は、ヒト子宮内膜癌細胞株においてFOXO1転写産物の3非翻訳領域UTRに結合し、それによりFOXO1発現を阻害する、いくつかのmiRを特定するために、マイクロRNAmiR標的予測アルゴリズムを使用することを記載する。アンチセンスヌクレオチド及びsiRNA本発明の他の実施形態は、標的Foxoタンパク質の発現、従って生物活性を減少させるか又は阻害するための、アンチセンス核酸又は低分子干渉RNAsiRNA又はshRNAの使用を対象にする。標的Foxoタンパク質及びそれらをコードする遺伝子のこれらの公知の配列に基づき、発現を遮断するか又は減少させるためにそれぞれの遺伝子又はmRNAに十分に相補的であるアンチセンスDNA又はRNAは、当該分野において公知の方法を使用して、容易に設計され、操作され得る。本発明の特定の実施形態において、本発明における使用のためのアンチセンス又はsiRNA分子は、Genbank番号によって特定される1以上のFoxoタンパク質をコードする標的mRNA又は標的遺伝子、或いは1以上のFoxoタンパク質をコードするmRNA又は遺伝子に実質的に相同な変異体又は断片に、ストリンジェントな条件下で結合する分子である。本発明のアンチセンス化合物は、invitroで合成され、生物起源のアンチセンス組成物を含まない。アンチセンス核酸の作製方法は、当該分野において周知である。更に、非インスリン産生性の腸前駆細胞において1以上のFoxo遺伝子及びmRNAの発現を減少させる方法であって、1以上の本発明のアンチセンス化合物又は組成物と、該細胞をinsituで接触させるか、或いは該細胞の単離及び濃縮された集団又は該細胞を含む培養組織外植片を接触させることによる、方法が提供される。本明細書中で使用される場合、用語標的核酸は、1以上のFoxoタンパク質をコードするDNA、及びそのようなDNAから転写されるRNAプレmRNA及びmRNAを含むを包含する。核酸オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、標的核酸の正常な機能を妨げる。標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物によるこの標的核酸の機能の調節は、一般にアンチセンスと呼ばれる。妨げられるべきDNAの機能は、複製及び転写を含む。妨げられるべきRNAの機能は、すべての生体機能例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの輸送、RNAからのタンパク質の翻訳、及びRNAによって行われるか又は促進される触媒活性を含む。そのような標的核酸機能の妨害の全体的効果は、DNA又はRNAによってコードされるタンパク質の発現の調節又は減少である。本発明の文脈の中で調節とは、1以上のFoxoタンパク質の遺伝子又はmRNAの発現における減少又は阻害を意味する。ターゲッティングプロセスは、所望の阻害効果が得られるようにアンチセンス相互作用が起こる、Foxoタンパク質をコードする標的DNA又はRNA内の1つ又は複数の部位の決定を含む。本発明の文脈の中で、好ましい遺伝子内部位は、標的タンパク質のmRNAのオープンリーディングフレームORFの翻訳開始又は終止コドンを包含する領域である。当該分野において公知である通り、翻訳開始コドンは、典型的には5AUG転写されたmRNA分子において;対応するDNA分子においては5ATGであることから、翻訳開始コドンは、AUGコドン、開始コドン又はAUG開始コドンとも称される。少数の遺伝子は、5GUG、5UUG又は5CUGのRNA配列を有する翻訳開始コドンを有し、5AUA、5ACG及び5CUGは、invivoにおいて機能することが示されている。従って、用語翻訳開始コドン及び開始コドンは、各例における開始アミノ酸は真核生物においては典型的にはメチオニンであるが、多くのコドン配列を包含し得る。真核生物の遺伝子は、2つ以上の選択的開始コドンを有し得、それらのいずれかが、特定の細胞型又は組織における、或いは特定の条件下での翻訳開始のために、優先的に利用され得ることも、当該分野において公知である。本発明の文脈において、開始コドン及び翻訳開始コドンとは、遺伝子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始するためにinvivoで使用される1つ又は複数のコドンをいう。通常の実験は、アンチセンス又はsiRNAの最適な配列を決定する。遺伝子の翻訳終止コドンは、3つの配列、すなわち5UAA、5UAG及び5UGA対応するDNA配列は、それぞれ5TAA、5TAG及び5TGAであるのうちの1つを有し得ることも、当該分野において公知である。用語開始コドン領域及び翻訳開始コドン領域とは、翻訳開始コドンからいずれかの方向すなわち5又は3への約25から約50の連続するヌクレオチドを包含するようなmRNA又は遺伝子の一部分をいう。同様に、用語終止コドン領域及び翻訳終止コドン領域とは、翻訳終止コドンからいずれかの方向すなわち5又は3への約25から約50の連続するヌクレオチドを包含するようなmRNA又は遺伝子の一部分をいう。当該分野において翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域をいうことが公知である、オープンリーディングフレーム又はコード領域も、効果的に標的とされ得る領域である。他の標的領域は、当該分野において翻訳開始コドンから5方向にあるmRNAの一部分をいうことが公知である、5非翻訳領域従って5キャップ部位とmRNAの翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを含む、及び当該分野において翻訳終止コドンから3方向にあるmRNAの一部分をいうことが公知である、3非翻訳領域従って翻訳終止コドンとmRNA又は遺伝子上の対応するヌクレオチドの3末端との間のヌクレオチドを含むを含む。変異体は、転写を開始するか又は終止するための選択的シグナルの使用を通じて産生され得、プレmRNA及びmRNAは、1つより多い開始コドン又は終止コドンを有し得ることも、当該分野において公知である。選択的開始コドンを使用するプレmRNA又はmRNA由来の変異体は、そのプレmRNA又はmRNAの選択的開始変異体として公知である。選択的終止コドンを使用するそれらの転写産物は、そのプレmRNA又はmRNAの選択的終止変異体として公知である。選択的終止変異体の特定の1種類は、転写装置によるポリA終止シグナルのうちの1つの代替選択それにより特有なポリA部位で終結する転写産物を産生するから生じる、複数の転写産物が産生されるポリA変異体である。ひとたび1以上の標的部位が同定されると、標的に十分に相補的である核酸が選択される。それは、該核酸が、遺伝子の発現及び転写又はmRNAの翻訳の阻害という所望の効果を得るために、十分に良く、且つ十分な特異性をもってハイブリダイズすることを意味する。本発明の文脈において、ハイブリダイゼーションとは、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基間の、ワトソン-クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を意味する。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成を通じて対形成する相補的核酸塩基である。相補的とは、本明細書中で使用される場合、2つのヌクレオチドの間の正確な対形成のための能力をいう。例えば、核酸の特定の位置のヌクレオチドが、DNA又はRNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合できる場合、該核酸と該DNA又はRNAは、その位置において互いに相補的であるとみなされる。該核酸と該DNA又はRNAは、各分子における十分な数の対応する位置が、互いに水素結合できるヌクレオチドによって占められる場合に、互いに相補的である。従って、特異的にハイブリダイズできる及び相補的は、該核酸と該DNA又はRNA標的との間に安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な程度の相補性又は正確な対形成を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列が、特異的にハイブリダイズできるその標的核酸の配列に100相補的である必要はないことは、当技術分野において理解される。アンチセンス化合物は、標的DNA又はRNA分子への該化合物の結合が、標的DNA又はRNAの正常な機能を妨害し、機能の喪失を引き起こす場合、並びに特異的な結合が望ましい条件下、即ち、invivoアッセイ又は治療的処置の場合は生理的条件下、及びinvitroアッセイの場合はアッセイが実施される条件下で、アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的な結合を避けるために十分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズできる。アンチセンス核酸は、アンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、他のオリゴマーアンチセンス化合物オリゴヌクレオチド模倣体を含むがそれに限定されないを包含する。本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは約8~約50個の核酸塩基即ち、約8~約50個の連結されたヌクレオシドを含む。特に好ましいアンチセンス化合物は、約12~約30個の核酸塩基を含むアンチセンス核酸である。アンチセンス化合物は、標的核酸にハイブリダイズしてその発現を調節する、リボザイム、外部ガイド配列externalguidesequenceEGS核酸オリゴザイム、及び他の短い触媒性RNA又は触媒性核酸を含む。本発明の文脈における核酸は、オリゴヌクレオチドリボ核酸若しくはデオキシリボ核酸のオリゴマー若しくはポリマー、又はそれらの模倣体をいうを含む。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖及びヌクレオシド間共有結合から構成されるオリゴヌクレオチド、並びに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾されたか又は置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば細胞への増強された取り込み、核酸標的に対する増強された親和性及びヌクレアーゼの存在下での増大した安定性などの望ましい特性から、しばしば天然形態よりも好ましい。アンチセンス核酸は、動物及びヒトにおける疾病状態の治療において治療的部分として用いられてきた。リボザイムを含むアンチセンス核酸薬は、ヒトに安全且つ有効に投与されており、現在多数の臨床試験が進行中である。従って、核酸が、細胞、組織及び動物、特にヒトの治療例えば、1以上のFoxoタンパク質の発現を下方調節することのための治療計画において有用であるように形成され得る有用な治療様式であり得ることは確立されている。本発明のアンチセンス及びsiRNA化合物は、診断、治療、及び予防のため、並びに研究試薬及びキットとして、利用され得る。治療のためには、1以上のFoxoタンパク質の発現を減少させることにより治療され得る疾病又は疾患糖尿病、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、及び/又はインスリンが不適切に低いレベルである肥満などを有すると思われる動物好ましくはヒトは、本発明に従うアンチセンス化合物の投与により治療される。本発明の化合物は、有効量のアンチセンス化合物を適切な医薬上許容される希釈剤又は担体に加えることにより、医薬組成物において利用され得る。本発明のアンチセンス化合物及び方法は、予防的にも、例えば、糖尿病、グルコース不耐性、メタボリックシンドローム又は肥満の出現を予防するか又は遅らせるためにも、有用である。本発明のアンチセンス化合物及び方法は、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、糖尿病、アテローム性動脈硬化症又は肥満の進行を遅らせるためにも有用である。本発明は、本明細書中に記載されるアンチセンス化合物を含む医薬組成物及び製剤も含む。siRNA米国特許出願20040023390その内容全体が、本明細書中に完全に記載されたかのように、参照により本明細書中に組み込まれるは、二本鎖RNAdsRNAが、RNA干渉RNAiとして知られるプロセスにより、多くの生物において配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導し得ることを説明する。しかしながら、哺乳動物細胞において、30塩基対又はより長いdsRNAは、タンパク質合成の停止、及びアポトーシスを介した細胞死さえも引き起こす、配列非特異的な応答を誘導し得る。最近の研究は、RNA断片が、RNAiの配列特異的なメディエーターであることを示すElbashiretal2001。これらの低分子干渉RNAsiRNAによる遺伝子発現の妨害は、現在、Celegans、Drosophila、植物において、並びにマウス胚性幹細胞、卵母細胞及び初期胚において、遺伝子をサイレンシングするための天然に存在する戦略として認識されているCogonietal1994;Baulcombe1996;Kennerdell1998;Timmons1998;Waterhouseetal1998;WiannyandZernickaGoetz2000;Yangetal2001;Svobodaetal2000。哺乳動物細胞培養において、siRNAを介した遺伝子発現の減少は、合成RNA核酸を用いて細胞をトランスフェクトすることにより達成されてきたCaplanetal2001;Elbashiretal2001。20040023390出願その内容全体が、本明細書中に完全に記載されたかのように、参照により本明細書中に組み込まれるは、目的とする遺伝子に対してターゲッティングされた低分子干渉RNA分子siRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結されたpolIIプロモーターを含む発現カセットを含むウイルスベクターを使用する、典型的な方法を提供する。本明細書中で使用される場合、RNAiは、RNA干渉のプロセスである。典型的なmRNAは、およそ5000コピーのタンパク質を産生する。RNAiは、妨害するか、又はmRNAによって作られるタンパク質のコピー数を顕著に減少させるプロセスである。例えば、二本鎖の短い干渉RNAsiRNA分子は、妨害されるべき標的mRNAの、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を相補し、且つ一致するように操作される。細胞内送達の後、siRNA分子は、RNA誘導サイレンシング複合体RNAinducedsilencingcomplexRISCと会合する。siRNAが会合したRISCは、塩基対合相互作用を介して標的に結合し、それを分解する。RISCは、標的mRNAの更なるコピーを分解することができる状態で存続する。短いヘアピン型RNA及びより長いRNA分子などの、他の形態のRNAが使用され得る。より長い分子は、例えば、アポトーシスを起こさせ、インターフェロン応答を誘導することにより、細胞死を引き起こす。30ヌクレオチドよりも長いdsRNAは、防御機構を活性化させ、RNA転写産物の非特異的な分解及び宿主細胞の全般的な機能停止をもたらしたことから、細胞死は、哺乳動物においてRNAiを達成するための主要な障害であった。哺乳動物細胞において遺伝子特異的な抑制を媒介するために約20~約29ヌクレオチドのsiRNAを使用することは、この障害を明らかに克服した。これらのsiRNAは、遺伝子抑制を引き起こすために十分長い。本発明の特定の実施形態は、動物における、FOXO1、3及び/又は4或いはそのオーソログ、類似体及び変異体の発現を阻害するためのshRNA、アンチセンス又はsiRNAの使用を対象にする。アンチセンスヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、Foxoタンパク質をコードするヒトDNA又はmRNAを標的とするために、当該分野における通常の技術を使用して設計され得る。本発明のアンチセンス化合物は、invitroで合成され、生物起源のアンチセンス組成物、又はアンチセンス分子のinvivo合成を指示するよう設計された遺伝子ベクターコンストラクトを含まない。発現を減少させるために1以上のFoxoタンパク質に十分に相補的であるsiRNAを腸細胞に送達するための、種々の実施形態がある。リポソーム又はナノ粒子でsiRNAをコーティングすることなどの、invivoトランスフェクションを達成するための、試験された送達方法がある。トランスキングダムRNA干渉TranskingdomRNAinterferenceと呼ばれる、siRNA送達を腸上皮へ特異的に標的化する新規技術もある。この技術の発明者らは、哺乳動物の遺伝子を標的とする低分子ヘアピン型RNAshRNAを産生することができる非病原性EColi細菌を遺伝子操作したXiangSetal2009InvitroandinvivogenesilencingbyTransKingdomRNAitkRNAiMethodsMolBiol487147160。shRNA導入を促進するために2つの因子が使用された:インベイシンInv及びリステリオリシンOHlyA遺伝子。彼らは、組換えEcoliが、血流への細菌の漏出に起因する明らかな全身性の合併症もなく、カテニンb1Ctnnb1に対するshRNA腸上皮細胞においてこの遺伝子の発現を阻害するを送達するために、経口投与され得ることを示した。本発明の特定の実施形態は、1以上のFoxoタンパク質をサイレンシングするsiRNAに適合させたトランスキングダムRNA干渉法を使用することを対象にする。他の者は、この技術を、Abcb1をノックダウンするために使用したKruhnAetal2009DeliveryofshorthairpinRNAsbytranskingdomRNAinterferencemodulatestheclassicalABCB1mediatedmultidrugresistantphenotypeofcancercellsCellCycle8。Foxo1shRNAをコードする細菌は、CequentTechnologiesから購入することができ、特にそれを推奨される濃度で経口経管栄養により投与することができる。用量は、例えば生検中の、又は被験動物中の、腸細胞におけるFoxo1ノックダウンの分析を使用して決定され得る。本発明の文脈において、用語オリゴヌクレオチドとは、リボ核酸若しくはデオキシリボ核酸のオリゴマー若しくはポリマー、又はそれらの模倣体をいう。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖及びヌクレオシド間共有結合から構成されるオリゴヌクレオチド、並びに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾されたか又は置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば細胞への増強された取り込み、核酸標的に対する増強された親和性及びヌクレアーゼの存在下での増大した安定性などの望ましい特性から、しばしば天然形態よりも好ましい。本発明のキメラアンチセンス化合物は、2つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、上記のオリゴヌクレオシド及び/又はオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成され得る。そのような化合物は、当該分野においてハイブリッド又はギャップマーとも称されている。そのようなハイブリッド構造の調製を説明する代表的な米国特許としては、米国特許第5013830号、第5149797号、第5220007号、第5256775号、第5366878号、第5403711号、第5491133号、第5565350号、第5623065号、第5652355号、第5652356号および第5700922号が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアンチセンス核酸分子は、それらが目的のタンパク質をコードする細胞のmRNA及び/又はゲノムDNAに十分にハイブリダイズするか又は結合し、それにより、例えば、転写及び/又は翻訳を減少させることにより、該タンパク質の発現を減少させるように、典型的には対象に投与され、又はinsituで作り出される。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する通常のヌクレオチドの相補性によるか、又は、例えば、DNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的な相互作用を介してなされ得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位における直接注入が挙げられる。或いは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように修飾され、次いで全身性に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞の表面上に発現した受容体又は抗原に特異的に結合するように、例えば、細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体にアンチセンス核酸分子を連結することにより、修飾され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを使用して細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なpolII又はpolIIIプロモーターの制御下に置かれたベクターコンストラクトが好ましい。本発明のアンチセンス核酸分子は、アルファ-アノマー核酸分子であり得る。アルファ-アノマー核酸分子は、相補的RNAと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のベータ-ユニットとは反対に、鎖は互いに平行となるGaultieretal1987NucleicAcidsRes1566256641。アンチセンス核酸分子は、2oメチルリボヌクレオチドInoueetal1987NucleicAcidsRes1561316148又はキメラRNADNAアナログInoueetal1987FEBSLett215327330を含むこともできる。アンチセンス技術に関して上記論文中に記載される全ての方法は、参照により本明細書中に組み込まれる。本発明は、リボザイムも包含する。リボザイムは、相補的な領域を有する一本鎖核酸mRNAなどを切断することができる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。従って、リボザイム例えば、ハンマーヘッドリボザイムHaselhoffandGerlach1988Nature334585591に記載されるは、標的mRNA転写産物を触媒的に切断し、それにより翻訳を阻害するために使用され得る。標的をコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、そのcDNAのヌクレオチド配列に基づき設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が標的mRNA中の切断されるべきヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナL19IVSRNAの誘導体が構築され得る。例えば、CechetalUSPatNo4987071及びCechetalUSPatNo5116742を参照されたい。或いは、標的FOXOmRNAは、RNA分子のプールから、特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択するために使用され得る。例えば、BartelandSzostak1993Science26114111418参照により本明細書中に組み込まれるを参照されたい。本明細書中で使用される場合、用語核酸は、cDNA、ゲノムDNA、及び合成例えば、化学合成されたDNAを含む、RNA及びDNAの両方をいう。核酸は、二本鎖又は一本鎖即ち、センス又はアンチセンス一本鎖であり得る。本明細書中で使用される場合、単離された核酸とは、哺乳動物のゲノム中の核酸の片側又は両側に隣接する核酸例えば、ARPKD遺伝子に隣接する核酸を通常含む、哺乳動物のゲノム中に存在する他の核酸分子から分離された核酸をいう。用語単離されたは、核酸に関して本明細書中で使用される場合、天然に存在しない配列は天然に見出されず、天然に存在するゲノム中に直接隣接する配列を有さないため、任意の天然に存在しない核酸配列も含む。単離された核酸は、例えば、天然に存在するゲノム中で通常はそのDNA分子に直接隣接して見出される核酸配列の1つが除去されるか又は存在しない限り、DNA分子であり得る。従って、単離された核酸としては、他の配列とは独立して異なる分子として存在するDNA分子例えば、化学合成された核酸、又はPCR若しくは制限酵素処理によって生成されるcDNA若しくはゲノムDNA、並びにベクター、自律複製プラスミド、ウイルス例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルスに、或いは原核生物又は真核生物のゲノムDNAに組み込まれたDNAが挙げられるが、これらに限定されない。また、単離された核酸は、ハイブリッド又は融合核酸の一部であるDNA分子などの操作された核酸を含み得る。例えば、cDNAライブラリー又はゲノムライブラリー、或いはゲノムDNA制限酵素消化物を含むゲル切片中の数百~数百万の他の核酸の中に存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。低分子干渉RNARNA干渉以下、RNAiは、多くの真核生物の間で保存されている転写後遺伝子調節の方法である。RNAiは、細胞内に存在する短い即ち、100倍増加を検出した図14。Aesは、発生中及び成体の膵臓において発現し12、異所性Aes発現は、Nkx22及びNkx61ニューロンドメインの増加に関連する13。免疫組織化学により、Aes発現は、腸Ins細胞に局在化された。更に、系統追跡実験は、NKORosa26eGfpマウスにおけるGfp細胞がAes抗体によって修飾されることを示し図14、このことは、Foxo1除去が細胞自律的様式でAes発現を促進することを実証した。これらの知見は、腸Ins細胞と膵ベータ細胞との間の系統の共有の更なる証拠を提供する。実施例7NKO腸は、グルコース用量依存的様式で、インスリン及びCペプチドを分泌する調節されたインスリン分泌は、ES細胞由来インスリン産生細胞において再現するのが難しいことが証明されている、膵ベータ細胞の重要な特性である14。腸Ins細胞が機能的にインスリンを分泌する能力があるか否かを決定するために、本発明者らは、NKOマウスからのIns細胞に富む腸区域及び対照マウスからの解剖学的に合わせた区域を選択するために、DTZ染色を使用して、グルコース及びKATPチャネルモジュレーターに応答するインスリン分泌のexvivoアッセイを実施した。NKO腸は、グルコース用量依存的様式でインスリン及びCペプチドを放出した。即ち、11mMグルコースにおけるインキュベーションは25倍のインスリン分泌の増加をもたらしたのに対し、22mMグルコースにおけるインキュベーションは7倍のインスリン分泌の増加をもたらした。スルホニル尿素グリベンクラミドKATPチャネル遮断剤は、グルコース誘導インスリン放出を増加させ、一方KATPチャネル活性化剤ジアゾキシドはそれを鈍らせた図3ab。グルコース依存性インスリン及びCペプチド分泌アッセイ012mMジチゾンDTZTuttleetalNatMed2001を含有する培地中で成体の腸を染色し、NKOマウスからの5インチ長のDTZ断片又は対照WTマウスからの解剖学的に合わせた断片を選択した。本発明者らは、腸のenface調製物を作り、それらを、1時間、種々の濃度のグルコース、05mMジアゾキシドSigma、又は10nMグリベンクラミドTocrisを補充したHEPESクレブスリンガー緩衝液中でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、本発明者らは、ELISAMilliporeにより、培地中のインスリン及びCペプチド2含量を測定した。14週齢WTマウスからのコラゲナーゼ精製膵島を対照としたKitamuraetalMCB2009。成体の腸を使用して、実験を行なったn4。実施例8腸Ins細胞により分泌される腸のインスリンは生物活性である腸Ins細胞によって分泌された腸のインスリンが生物活性であるか否かを調べるために、NKO腸から酸-エタノール抽出物を調製し、WTマウスの腸、膵臓及び肝臓からも抽出物を調製し、新生仔マウスへと注入した。新生仔のNKO腸からの抽出物は、年齢を合わせた対照マウスからの膵臓抽出物又は組換えヒトインスリンと同様に、血中グルコースを約20低下させた図3c。対照的に、対照腸又は肝臓からの抽出物は、影響しなかった。血中グルコースを低下させるNKO腸抽出物の能力腸Ins細胞の存在を反映しているは、対照マウスからの膵臓抽出物及び組換えインスリンがそうであったのと同様に、インスリン中和抗体の添加により阻止された。対照的に、アイソタイプを合わせた対照IgGとNKO腸抽出物をインキュベートすることは、糖血症を下げるそれらの能力に影響せず図3c、このことは、血糖低下効果は、NKO腸抽出物中の他の因子ではなく、インスリンに起因することを示した。これらの結果は、腸Ins細胞によるインスリン分泌がグルコース及びKATPチャネルモジュレーターによって調節され得ること、及び腸由来インスリンが生物活性であること、を示す。実施例9invivoにおけるストレプトゾトシン処理NKOマウスは、正常に近い経口グルコース耐性を示した膵臓内分泌細胞とは異なり、腸の腸内分泌細胞は、生涯を通じてNeurog3前駆細胞から生じる21。従って、腸Ins細胞が、毒素誘導糖尿病モデルにおいて島ベータ細胞よりも高い再生能力を有する可能性がある。これを試験するために、ストレプトゾトシンSTZをNKO及び対照マウスに投与し、それは高血糖をもたらした図4a。対照マウスにおけるグルコースレベルは、28日間毎日のインスリン投与により約500mgdlに維持された。対照的に、NKOマウスはインスリンを受けなかったが、それらのグルコースレベルは、STZの9日後に自発的に減少し始め、給餌状態において約250mgdlで安定した図4a。インスリンを中止すると、100の対照マウスは60日目までに死亡し、一方75のNKOマウスは92日目の実験の終了時まで生存した図4b。STZ処理NKOマウスは、正常に近い経口グルコース耐性を示した図4c。免疫組織学的分析は、STZが、膵臓及び腸の腸Ins細胞のいずれかを除去することを明らかにした図4d。STZ除去への腸Ins細胞の感受性は、それらが膵ベータ細胞と類似していることの更なる証拠を提供する15。STZ後28日目に取得した試料において、腸Ins細胞は、STZ処理前と比較してより高い頻度でNKO腸中に存在し、それらは成熟ベータ細胞のマーカー、Pc2図4d及びAes図14を発現しており、それらの機能的な特性が完全なままであることを示唆した。細胞を系統追跡するためにNKOIns2Gfpノックインマウスを使用して、本発明者らは、STZ後、腸Ins細胞が内因性Pc2発現を活性化することそれは、STZ前に観察した腸Ins細胞と同様であるを決定した図2b。腸とは対照的に、免疫組織化学的調査は、NKOマウスにおける膵臓ベータ細胞再生の証拠は示さず図4d、実験の終了時の膵臓インスリン含量は、ビヒクル処理対照と比較してほぼ検出不能であり01±008μgSTZ後膵臓vs26±225|gSTZ前膵臓、従って観察された表現型への膵臓ベータ細胞再生の寄与は除外された16。対照マウスからの腸又は膵臓においては、いかなる段階においても、Ins細胞はなかった図4d。PKOマウスにおける腸Ins細胞は、STZ処理前と比較してより高い頻度で見出された。実施例10Foxo1とハイブリダイズするsiRNAは、腸インスリンProgを腸Ins細胞へと分化させるsiRNAがFoxoタンパク質の発現を減少させ得るか否かを決定するために、一連の実験では、対照WTマウス及びNeurog3Foxo1ノックアウトNKOマウスそれらの両方とも、Ins2遺伝子座にGFPレポーターを保持するように遺伝子操作したの両方の遠位回腸及び結腸から単離した陰窩を使用した。最初に、細胞を、invitroで培地1中で培養した。培養3日後、正常又はNKOGFPマウスのいずれにおいてもGFPIns細胞は無かった。図16。3日目に細胞を培地2に変え、そして6日目までのライブ蛍光顕微鏡像は、NKOマウスにおけるインスリンProg細胞の一部が、緑色蛍光タンパク質を発現するインスリン細胞に分化/転換したことを示した。図17。記載したように単離した陰窩を培地1中で1日間、培地2中で2日間、次いで培地4b中で3日間インキュベートした場合、インスリン細胞のは、更により高いレベルに増加した。図18。これらの陰窩を分析した場合、緑色細胞は生きており、青色細胞は死んでいると決定された。図19。最後に、正常なWTInsProg細胞をインスリン産生細胞へと分化させるsiRNAと正常なWTInsProg細胞を接触させることにより、正常なWTInsProg細胞がFoxo1の不活性化に応答するか否かを決定するために、実験を行なった。単離された陰窩を、培地1中に1日間、培地2中に2日間維持した。3日目に、細胞を培地4bに交換し、それにはトランスフェクションリポソームMirusによるTransIT中で送達される50nMのsiRNAを含める総最終濃度50nMを細胞に曝露する50nMのsiRNAを添加するのではないFoxo1遺伝子確認CONFIRMに十分に相補的であり、その発現を不活性化する。次いで、陰窩を、siRNAと更に72時間インキュベートした。現在の用量において、既に相当に有毒である図20に示すように、Foxo1発現遺伝子転写のsiRNA阻害は、インスリン細胞の出現をもたらした。このことは、正常WT腸InsProg細胞をFoxo1に対するsiRNAと接触させることは、細胞をインスリン腸内分泌表現型へと転換させることを示す。細胞を単離し、培地1及び2中で3日間、非siRNA実験と同様に増殖させた。15希釈マトリゲルBDbiosciences中、96ウェルプレート中1ウェル当たり100個の陰窩を播種した。siRNAを50nMの終濃度に希釈し、製品TransIt、Mirusに応じたプロトコールを使用して、72時間、4b培地簡潔には、培地20FCS、100ngmlmWnt3a、50ngmlFGF4中でトランスフェクトした。ThermoScientificDharmaconAccellSMARTpool、MouseFOXO1、E041127000010、3UTR並びに陰性対照及びトランスフェクション対照DharmaconAccellMouseControlsiRNAKitRed、K005000R102、4つの対照を使用して、実験を行なった。各条件を四連quadduplicatesで行なった。96ウェルプレート中のウェル毎に表現型変化生きている緑色細胞のについてsiRNAをアッセイし、Foxo1ノックダウンをqPCRにより確認した。Foxo1siRNA処理細胞は、1ウェル当たり2の緑色細胞を生じさせた。AccellSMARTpoolsiRNAA04112713、標的配列:CUAUUAUUGUACAUGAUUGFOXO1配列番号7MolWt135011gmolxtCoeff372198LmolcmAccellSMARTpoolsiRNAA04112714、FOXO1標的配列:CGAUGAUACCUGAUAAUG配列番号8MolWt135214gmolExtCoeff365968LmolcmAccellSMARTpoolsiRNAA04112715、FOXO1標的配列:UCGUAAACCAUUGUAAUUA配列番号9MolWt134893gmolExtCoeff376470LmolcmAccellSMARTpoolsiRNAA04112716、FOXO1標的配列:CCAGGAUAAUUGGUUUUAC配列番号10MolWt135193gmolExtCoeff361874LmolcmカタログアイテムK005000R102AccellMouseControlsiRNAKitRedTheONTARGETplusSMARTpoolsiRNAJ04112705、FOXO1標的配列:GGUGUCAGGCUAAGAGUUA配列番号11MolWt134299gmolExtCoeff371219LmolcmONTARGETplusSMARTpoolsiRNAJ04112706、FOXO1MolWt134148gmolExtCoeff377004Lmolcm標的配列:GUAAUGAUGGGCCCUAAUU配列番号12ONTARGETplusSMARTpoolsiRNAJ04112707、FOXO1MolWt134598gmolExtCoeff357691Lmolcm標的配列:GCAAACGGCUUCGGUCAAC配列番号13ONTARGETplusSMARTpoolsiRNAJ04112708、FOXO1MolWt133849gmolExtCoeff384302Lmolcm標的配列:GGACAACAACAGUAAAUUU配列番号14要約要約すると、腸の腸内分泌前駆細胞における単一の転写因子、Foxo1の体細胞性除去は、膵ベータ細胞と同等のインスリン産生、グルコース応答性細胞図15という系統及び機能的な特性を有する腸Ins細胞の生成をもたらす。プロインスリン導入遺伝子を発現するよう操作された、腸の胃抑制ポリペプチドgastricinhibitorypolypeptideGIP産生細胞17とは異なり、Ins2Gfpノックイン対立遺伝子の活性化により示されるように、腸Ins細胞は内因性ベータ細胞と同じ発生経路をたどるように見える。この特性は、胚性幹細胞由来インスリン産生細胞が移植されたマウス14におけるよりも、NKOマウスにおけるSTZ糖尿病のより急速な回復を説明し得る。グルコース依存性であり且つジアゾキシドで阻害され得る様式でインスリンを分泌する腸Ins細胞の能力は、1型糖尿病に対する細胞置換アプローチを悩ませてきた調節されないインスリン分泌のおそれを鎮める。より広い文脈において、腸の腸内分泌前駆細胞の可塑性は、肥満外科手術後の糖尿病の驚くべき回復19を含む、腸の多方面の代謝機能18において、重要な役割を果たし得る。本発明は、上記の実験によって及び続く実施例によって本明細書中に説明され、それらは限定として解釈されるべきではない。本出願全体にわたり引用された全ての参考文献、係属中の特許出願及び公開された特許の内容は、参照により本明細書中に明確に組み込まれる。当業者は、本発明が多くの異なる形態で実施され得、本明細書に説明される実施形態に限定されるように解釈されるべきでないことを理解するであろう。むしろ、これらの実施形態は、本開示が本発明を当業者に完全に伝えるために提供される。本発明の多くの改変及び他の実施形態を、先の説明において示される教示の利益を有する、本発明が属する技術分野に精通した者は思い浮かべるであろう。特定の用語が用いられるが、それらは特に明記しない限り当該分野のものとして使用される。参考文献1GGradwohlADierichMLeMeurFGuillemotneurogenin3isrequiredforthedevelopmentofthefourendocrinecelllineagesofthepancreasProcNatlAcadSciUSA9716072CSLeeNPerreaultJEBrestelliKHKaestnerNeurogenin3isessentialfortheproperspecificationofgastricenteroendocrinecellsandthemaintenanceofgastricepithelialcellidentityGenesDev1614883SESchonhoffMGielMoloneyABLeiterNeurogenin3expressingprogenitorcellsinthegastrointestinaltractdifferentiateintobothendocrineandnonendocrinecelltypesDevBiol2704434CTalchaiHVLinTKitamuraDAcciliGeneticandbiochemicalpathwaysofbetacellfailureintype2diabetesDiabetesObesMetab11Suppl4385TKitamuraetalRegulationofpancreaticjuxtaductalendocrinecellformationbyFoxO1MolCellBiol2944176MAlMasrietalEffectofforkheadboxO1onbetacelldevelopmentinthehumanfetalpancreasDiabetologia536997GGuJDubauskaiteDAMeltonDirectevidenceforthepancreaticlineageNGN3cellsareisletprogenitorsandaredistinctfromductprogenitorsDevelopment12924478SESchonhoffMGielMoloneyABLeiterMinireviewDevelopmentanddifferentiationofgutendocrinecellsEndocrinology14526399SRHingoranietalPreinvasiveandinvasiveductalpancreaticcanceranditsearlydetectioninthemouseCancerCell443710RLTuttleetalRegulationofpancreaticbetacellgrowthandsurvivalbytheserinethreonineproteinkinaseAkt1PKBalphaNatMed7113311TNakamuraKTsuchiyaMWatanabeCrosstalkbetweenWntandNotchsignalinginintestinalepithelialcellfatedecisionJGastroenterol4270512BGHoffmanBZavagliaMBeachCDHelgasonExpressionofGrouchoTLEproteinsduringpancreasdevelopmentBMCDevBiol88113JMuhrEAnderssonMPerssonTMJessellJEricsonGrouchomediatedtranscriptionalrepressionestablishesprogenitorcellpatternandneuronalfateintheventralneuraltubeCell10486114EKroonetalPancreaticendodermderivedfromhumanembryonicstemcellsgeneratesglucoseresponsiveinsulinsecretingcellsinvivoNatBiotechnol2644315KNielsenetalBetacellmaturationleadstoinvitrosensitivitytocytotoxinsDiabetes48232416FThoreletalConversionofadultpancreaticalphacellstobetacellsafterextremebetacelllossNature464114917ATCheungetalGlucosedependentinsulinreleasefromgeneticallyengineeredKcellsScience290195918DJDruckerThebiologyofincretinhormonesCellMetab315319JPThalerDECummingsMinireviewHormonalandmetabolicmechanismsofdiabetesremissionaftergastrointestinalsurgeryEndocrinology150251820SupportedbygrantsfromtheNIHtheColumbiaUniversityDiabetesEndocrinologyResearchCenter823‐83522SchwitzgebelVMetalExpressionofneurogenin3revealsanisletcellprecursorpopulationinthepancreasDevelopment1273533‐354223JensenJetalIndependentdevelopmentofpancreaticalpha‐andbeta‐cellsfromneurogenin3‐expressingprecursorsaroleforthenotchpathwayinrepressionofprematuredifferentiationDiabetes49163‐17624XuXetalBetacellscanbegeneratedfromendogenousprogenitorsininjuredadultmousepancreasCell132197‐20725HuntRKJacobsonMDevelopmentandstabilityofpositionalinformationinXenopusretinalganglioncellsProcNatlAcadSciUSA69780‐78326TKitamuraetalTheforkheadtranscriptionfactorFoxo1linksinsulinsignalingtoPdx1regulationofpancreaticbetacellgrowthJClinInvest110183927OkamotoHetalRoleoftheforkheadproteinFoxO1inbetacellcompensationtoinsulinresistanceJClinInvest116775‐78228KitamuraTetalRegulationofpancreaticjuxtaductalendocrinecellformationbyFoxO1MolCellBiol294417‐443029KitamuraYIetalFoxO1protectsagainstpancreaticbetacellfailurethroughNeuroDandMafAinductionCellMetab2153‐16330KawamoriDetalTheforkheadtranscriptionfactorFoxo1bridgestheJNKpathwayandthetranscriptionfactorPDX‐1throughitsintracellulartranslocationJBiolChem2811091‐109831AcciliDArdenKCFoxOsatthecrossroadsofcellularmetabolismdifferentiationandtransformationCell117421‐42632PaikJHetalFoxOsarelineage‐restrictedredundanttumorsuppressorsandregulateendothelialcellhomeostasisCell128309‐32333JHPaiketalFoxOsAreLineageRestrictedRedundantTumorSuppressorsandRegulateEndothelialCellHomeostasisCell12830934HOkamotoetalTransgenicrescueofinsulinreceptordeficientmiceJClinInvest11421435BMShermanPGordenJRothPFreychetCirculatinginsulintheproinsulinlikepropertiesofbiginsulininpatientswithoutisletcelltumorsJClinInvest5084936LGvanderFlierHCleversStemcellsselfrenewalanddifferentiationintheintestinalepitheliumAnnuRevPhysiol7124137NGaoetalFoxa2controlsvesicledockingandinsulinsecretioninmatureBetacellsCellMetab626738ASuzukiHNakauchiHTaniguchiGlucagonlikepeptide1convertsintestinalepithelialcellsintoinsulinproducingcellsProcNatlAcadSciUSA100503439AlMasriMKrishnamurthyMLiJFellowsGFDongHHGoodyerCGWangREffectofforkheadboxO1onbetacelldevelopmentinthehumanfetalpancreasDiabetologia2010Apr53699711