"明細書に記載の発明。上記の観点では、DNA配列決定のような、多くの分析および診断の技術は、1容易に入手できる染料に物理化学的に類似のもの、2ゲル上の密に配置されたDNAバンドのような空間的に重なっている標的物質の検出ができるもの、3自動化DNA配列決定の最近の方法によって単一ゲルカラム上で決定することができる塩基の数を広げるもの、および4広範囲の予備および手先のテクニックを用いての使用において影響を受けやすいもの、である新しい蛍光染料の入手容易性によって有意に促進されるであろう。本発明は、次式を有する化合物であって:式中、A’は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり;B’はフルオロ、クロロ、または酸性アニオン基であり;X’は水素、フルオロまたはクロロであり;Z3およびZ4は別々に水素、ハロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり;そしてA’、Z3、およびZ4の少なくとも1個は連結官能体または連結官能体に変換できる基である、化合物、である。好適な実施形態においては、A’は、カルボキシル、スルホニル、イソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、ホスホルアミダイト、またはアミノであり;B’はカルボキシルまたはスルホニルであり;X’は水素であり;Z3およびZ4は別々に水素、ハロ、カルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノである。好適な実施形態においては、A’、Z3、およびZ4の1個のみがカルボキシル、スルホニル、メチルアミノ、またはアミノである。好適な実施形態においては、Z3がメチルアミノである。好適な実施形態においては、Z3がメチルアミノである。好適な実施形態においては、Z3がフルオロである。好適な実施形態においては、Z3がクロロである。好適な実施形態においては、A’が水素である。好適な実施形態においては、A’がフルオロである。好適な実施形態においては、A’がクロロである。好適な実施形態においては、A’がイソチオシアネートである。好適な実施形態においては、A’がスクシンイミジルカルボキシレートである。好適な実施形態においては、A’がホスホルアミダイトである。好適な実施形態においては、A’がカルボキシルである。好適な実施形態においては、A’がスルホニルである。好適な実施形態においては、A’がアミノである。好適な実施形態においては、B’がカルボキシルまたはスルホニルである。好適な実施形態においては、B’がカルボキシルである。好適な実施形態においては、B’がスルホニルである。好適な実施形態においては、上記化合物が、式2’,7’-ジクロロ-5-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセインまたは2’,7’-ジクロロ-6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセインを有する。好適な実施形態においては、上記化合物が、式2’,4’,5’,7’-テトラクロロ-5-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、または2’,4’,5’,7’-テトラクロロ-6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセインである。本発明はまた、上記化合物を含むジデオキシヌクレオチドである。本発明はまた、上記化合物を含むポリヌクレオチドである。発明の概要本発明は4,7-ジクロロフルオレセイン染料を使用して空間的に重なる標的物質を同時に検出する方法、そして特に、4,7-ジクロロフルオレセイン染料を用いるDNA配列決定の方法にある。本発明はまた式1によって定義される2’,7’-ジクロロ-5および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセインを含む。式中、A’は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはアミノであり;好ましくはA’は連結官能体または連結官能体に変換できる基であり;X’は水素、フルオロまたはクロロであり、A’が6個の炭素原子の置換基であるときは必ずX’は5個の炭素原子の置換基であり、そしてA’が5個の炭素原子の置換基であるときは必ずX’は6個の炭素原子の置換基であり;好ましくはX’は水素であり;Z3水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり;好ましくはZ3は水素またはクロロであり;Z4は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり;好ましくはZ4は水素またはクロロであり;B’はフルオロ、クロロ、または酸性アニオン基;好ましくはB’はカルボキシルまたはスルホニル、および最も好ましくはB’はカルボキシルであり;そしてA’、Z3、およびZ4の少なくとも1個は連結官能体または連結官能体に変換できる基である。好ましくはA’、Z3、およびZ4の1個のみは連結官能体または連結官能体に変換できる基である。本発明はまた本発明の方法を実施するためのキットを含む。一般に、キットはDNAフラグメントの電気泳動により分離された複数のクラスを検出するために提供される。特に、キットはプライマー伸長生成物の少なくとも1つのクラスに4,7-ジクロロフルオレセイン染料で蛍光による標識を付けるDNA配列決定を行うためのものを含む。このようなDNA配列決定キットは染料で標識を付けたプライマーをもつキットを含み、より好ましいものとしては染料で標識を付けたターミネーターをもつキットを含む。全体にわたり、カラーインデックスアソシエーションオブテキスタイルケミスツ、第2版、1971炭素ナンバリング図式を使用する、すなわちプライムを付した数字はキサンテン構造の炭素を指し、プライムを付していない数字は9’-フェニルの炭素を指す。本発明は、4,7-クロロ-5および6-カルボキシフルオレセインおよび関連する染料の蛍光性が分子プローブとしての使用に非常に有利であることを発見したことに一部は基づいている。これらの発光バンド幅は4,7-ジクロロ誘導体を欠く類似体よりも一般に20~30パーセント狭く、これらの発光および吸収の最大値は4,7-ジクロロ誘導体を欠く類似体よりも一般に約10~30nm高く、そしてこれらの蛍光効率は高く、いくつかの場合には4,7-ジクロロ誘導体を欠く類似体のそれのほぼ3倍である。発明の詳細な説明上述のように、本発明は通常長い波長、狭い発光バンド幅および他の有利な蛍光性にて最大の吸収および発光を示すある種のフルオレセイン染料の発見に一部は基づくものである。さらに、本発明はこの種の染料の種類として式Iによって定義される新規のフルオレセイン類似体を含む。これらの染料はスペクトルにより分解できる、自動化DNA配列決定分析に特に利用できる物理化学的に類似の染料の新規なセットのアセンブリを可能にする。ここで使用される染料のセットに関係する語スペクトルにより分解できるは、染料の蛍光発光バンドが充分に明確であり、すなわち充分に重なっておらず、各染料が結合している標的物質、例えばポリヌクレオチドを、例えばバンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシステムを用いる標準光検出システムまたはその類似のシステムによって各染料によって発生した蛍光信号に基づいて区別することができることを意味し、前記システムは米国特許4,230,558号、4,811,218号等、またはホイーレスら、フローシトメトリイ:インストルメンテージョンアンドデータアナリシスアカデミックプレスニューヨーク、1985の21~76頁に記載されたようなシステムが挙げられる。ここで直接にまたはエーテルと関連して使用される低級アルキルの語は、1~6個の炭素原子を含む直鎖および/または分技鎖アルキル基を示し、例えばこの語はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、tert-ブチル、イソブチル等を含む。さらに好ましくは、この低級アルキルの語は、1~3個の炭素原子をもつアルキルを示す。ここで使用されるハロはハロゲン原子、弗素、塩素、臭素、および沃素を示し;さらに好ましくは、この語は弗素または塩素を示し;そして最も好ましくは、この語は塩素を示す。好ましくは、本発明の4,7-ジクロロ-5および6-カルボキシフルオレセイン染料は式IIによって定義されるものを含む。式中、A’、B’およびX’は上記と同じであり;Z1は水素または、Z2と共にとるときは、ベンゾであり;Z2は、単独でとるときは、水素、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、または活性連結官能体に変換できる基、例えば、カルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり、またはZ1と共にとるときは、Z2は活性連結官能体に変換できるメチルアミノであり、またはZ5と共にとるときは、Z6はベンゾであり、好ましくは、単独でとるときは、Z6は水素、メチル、エチル、フルオロ、クロロ、メトキシ、またはエトキシであり;そしてA、Z2、Z3、Z4、およびZ5の少なくとも1個は連結官能体に変換できる基である。好ましくは、A、Z2、Z3、Z4、およびZ5の1個のみが活性連結官能体に変換できる基である。本発明に使用するための多くの染料は市販品として入手できるかまたはこの分野で知られている技術によって合成できる、例えば、ガタクら、ジャーナルオブザインディアンケミカルソサイアティ、第6巻、第465-471真1929;およびカンナら、米国特許4,439,356号。あるいは、フルオレセイン類似体、即ち、A=B=カルボキシルは、実施例に示されるように、置換したレゾルシノールを置換したベンゾフェノンと、または置換したトリメリット酸と、プロピオン酸の存在下に反応させて合成することができる。スルホニルフルオレセイン、即ちAまたはBがスルホニルは、リーら、サイトメトリー、第10巻、第151-164頁1989によって開示された方法に従って合成され、適当な反応体を置換することにより改変して5-または6-カルボキシル-またはスルホニルフルオレセイン生成物を与える。好ましくは、DNA配列決定においてポリヌクレオチドに標識を付けるとき、一般に異性体の混合物を使用する場合バンドの幅が広がるようになる僅かに異なる電気泳動移動性をもつので、染料の5-または6-異性体を別々に使用する。染料の5-または6-異性体は逆相HPLCによって容易に分離される、例えばエドムンドソンら、モレキュラーイムノロジー、第21巻、第561頁1984。一般に、最初の溶出ピークは6-異性体および第二の溶出ピークは5-異性体であると信じられている。本発明の染料はこの分野で良く知られている種々の手段によって標的物質に結合することができる。例えば、ハウグランド、ハンドブックオブフルオレセントプローブスアンドリサーチケミカルスモレキュラープローブス,インコーポレイテッド、ユージーン、1989は標的物質に染料を結合するための手段のガイドと例を提供する。置換体Aは、連結基を形成するように標的物質上で相補的官能体と反応できる連結官能体に変換される。次表はAがカルボキシル、スルホニルまたはアミンであるときは必ず形成できる例示の連結官能体、適当な相補的官能体、および本発明に使用するために適している得られた連結基を列挙している。好ましくは連結官能体は、相補的官能体がアミンであるときは必ずイソチオシアネート、塩化スルホニル、4,6-ジクロロトリアジニルアミン、またはスクシンイミジルカルボキシレートである。そして好ましくは連結官能体は相補的官能体がスルフヒドリルであるときは必ずマレイミド、またはヨードアセトアミドである。例えばカンナら、米国特許4,318,846号の実施例6および8、およびカサイら、アナリチカルケミストリー、第47巻、第34~37頁1975に示されているように、スクシンイミジルカルボキシレートは、ジシクロヘキシルカルボジイミドDCCを使用して上記染料の5-および/または6-カルボキシルをN-ヒドロキシスクシンイミドと縮合して形成することができる。従って、これらの文献は参考にここに組み込まれる。染料ホスホルアミダイトはスタインら、ジーン、72巻、333~341頁1988;フングら、米国特許4,757,141号;1989年9月13日に出願されたヨーロッパ特許出願89116946.8号;および1988年8月26日に出願されたヨーロッパ特許出願88307934.5号によって教示されているように生成される。例えばビューケージら、テトラヘドロン、第48巻、第2223~2311頁1992;カルーサースら、ナラング著、DNAとRNAの合成と応用アカデミックプレス、ニューヨーク、1987第47~94頁等によって教示されるように、置換基R1、R2、およびR3は種々の形態をとることができる。好ましくは、R1およびR2は、別々にとるときは、メチル、エチル、またはイソプロピルであり、そしてR1およびR2は、それらが結合している窒素と共にとるときは、4ないし8個の炭素原子、および窒素、酸素、および硫黄からなる群から選ばれる1ないし2個のヘテロ原子を有する複素環である。さらに好ましくは、R1およびR2は、それらが結合している窒素と共にとるときはモルホリノである。好ましくは、R3はメチル、クロロフェニル、β-シアノエチル、メチルスルホニルエチル、およびニトロフェニルエチルからなる群から選ばれる。好ましくは、例えばビューケージら上記;ステクら、PCT出願PCT/US91/01010;ビューケージら、米国特許5,003,097号等によって教示されているように、ホスホルアミダイト-誘導連結基は酸化されてリンV連鎮を形成する。本発明の染料はDNA配列決定のためのジデオキシヌクレオチドに標識を付けるために使用されるとき、好ましくはこれらはピリミジン塩基の5番目の炭素および7-デアザプリン塩基の7番目の炭素に連結される。例えば、いくつかの適当な塩基標識化方法が本発明と共に使用できることが報告された、例えば、ギブソンら、ヌクレイックアシッズリサーチ、第15巻、第6455~6467頁9187;ゲベイエフら、ヌクレイソクアシッズリサーチ、第15巻、第4513~4535頁1987;ハララムビジスら、ヌクレイックアシッズリサーチ、第15巻、第4856~4876頁1987等。好ましくは、染料と塩基の間の連結基はジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ-誘導化塩基と本発明の染料のN-ヒドロキシスクシンイミドNHSを反応させて形成される。好ましくは連結基は3-カルボキシアミノ-1-プロピニルである。このようなアルキニルアミノ-誘導化ジデオキシヌクレオチドの合成は、ここに参考文献として組み込まれるホッブスらのヨーロッパ特許出願番号87305844.0号および米国特許5,047,519号によって教示されている。簡単に述べると、アルキニルアミノ-誘導化ジデオキシヌクレオチドは、適当なハロジデオキシヌクレオシドホッブスら上記によって教示されているように通常は5-ヨードピリミジンおよび7-ヨード-7-デアザプリンジデオキシヌクレオシドおよびCuIをフラスコに入れ、空気を除くようにArを吹き込み、乾燥DMFを添加し、続いてアルキニルアミン、トリエチルアミンおよびPdOを添加して生成される。反応混合物は数時間、または薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオソドの消費を示すまで攪拌することできる。保護されていないアルキニルアミンを使用するときは、アルギニルアミノ-ヌクレオシドは反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生成したハイドロハライドを中和するように水酸化アンモニウムを含む溶出溶媒を使用してシリカゲルのクロマトグラフィーにかけることによって単離することができる。保護されたアルキニルアミンを使用するときは、メタノール/塩化メチレンを反応混合物に続いて強塩基性アニオン交換樹脂で重炭酸塩を形成させることができる。次にスラリーを約45時間攬拌し、濾過し、そして樹脂を追加のメタノール/塩化メチレンを用いて洗うことできる。一緒に合わせた濾液を濃縮し、メタノール-塩化メチレングラディエントを用いてシリカゲルのフラッシュ-クロマトグラフィーで精製することができる。トリホスフェートが標準技術によって得られる。本発明の標的物質は本発明の染料が結合できるものであれば事実上何でもよい。好ましくは染料は標的物質に共有結合される。標的物質は蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、ポリヌクレオチド、脂質、およびこれらの組合せおよび集合体、例えば染色体、細胞核、生細胞、例えばバクテリア、他の微生物、および哺乳類細胞、組織等を含む。ここに使用されるようにポリヌクレオチドの語は、長さが数塩基から数千塩基の大きさの範囲、例えば6から数十ないし数百または数千までの塩基の長さ一重鎖の場合、または長さが数塩基対ないし数千塩基対の大きさの範囲、例えば6から数十ないし数百までまたは数千までの塩基対の長さ二重鎖の場合でのDNAまたはRNAの一重鎖または二重鎮を意味する。多数の相補的官能体を合成オリゴヌクレオチドおよびボリヌクレオチドの5’または3’末端に、例えばアミノ基、フングら、米国特許4,757,141号およびミヨシら、米国特許4,605,735号;またはスルフヒドリル基、コノリイ、ヌクレイックアシッズリサーチ、第13巻、第4485~4502頁1985、およびスボートら、ヌクレイックアシッズリサーチ、第15巻、4837~4848頁1987、を結合することができる。本発明の染料は、類似の物理化学的な性質、例えば大きさ、配座、電荷、疎水性等を有する標的物質の一連のバンドまたはスポットが線状または二次元の配置に存在する、ゲル電気泳動のような、生物化学的分離方法に委ねられたポリヌクレオチドの種類を同定するために特に良く適している。ここで使用されるように、バンドの語は類似のまたは同一の物理化学的性質に基づいた標的物質の空間的配置または凝集を含む。通常のバンドは電気泳動、特にゲル電気泳動によって染料-ポリヌクレオチドの共役体を分離する際に生じる。ポリヌクレオチドの種類は種々の関係において生じることができる。例えば、それらは制限酵素消化の生成物として、またはポリメラーゼまたはリガーゼ反応の伸長生成物として生じることができる。好ましくは、本発明に従って同定される種類は、対応が4種の可能な末端塩基と1組のスペクトルにより分析できる染料の部分との間に確立されるように末端ヌクレオチドの語において定義される。このような組は、市版品として入手できる分光光度計を用いて発光と吸収のバンド幅を測定して、本発明の染料から容易に集められる。さらに好ましくは、それらの種類はDNA配列の化学的またはチェインターミネーター法の関係において生じ、最も好ましくはチェインターミネーター法の関係において生じる。何れかの方法において染料-ポリヌクレオチドの共役体は標準のゲル電気泳動方法によって分離される、例えばゴールドおよびマシューズ、上述;リックウッドおよびハメス著、核酸のゲル電気泳動:実際のアプローチIRLプレスリミテッド、ロンドン、1981;またはオスターマン、プロテインと核酸の研究方法、第1巻スプリンガー-ベルラク、ベルリン、1984。好ましくはゲルのタイプは約2~20パーセントの間の濃度重量対容量を有するポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、ポリアクリルアミドゲル濃度が約4~8パーセントの間にある。好ましくはゲルはストランド分離または変性剤を含む。このようなゲルを構成するための詳細な方法はマニアチスら、メソッズインエンザイモロジー、第65巻、第299~305頁1980の98ホルムアミドまたは7M尿素を含有するポリアクリルアミドゲルにおける低分子量DNAおよびRNAの分別;マニアチスら、バイオケミストリー、第14巻、第3787~3794頁1975のポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動による小さい二重鎖および一重鎖DNΛ分子の鎖長決定;およびマニアチスら、モレキュラークローニング:実験室手法コールドスプリングハーバーラボラトリイ、ニューヨーク、1982179~185頁によって与えられる。従ってこれらの参照文献は参考のため挙げられる。特別な分離に用いられる最適ゲル濃度、pH、温度、変性剤の濃度等は、分離すべき核酸の大きさの範囲、それらの塩基組成;それらが一重鎖かまたは二重鎖か、情報を電気泳動によって捜すための種類の性質を含めて、多くのファクターに依存する。従って本発明の応用は特定の分離のための条件を最適にするための標準の予備試験を必要とするかも知れない。例として、約20~300塩基の間の範囲の大きさを有するポリヌクレオチドを分離し、次に示すゲル中で本発明に従って検出する:19部対1部のアクリルアミドとビスアクリルアミドから作られ、48パーセント重量/容量尿素を用いて、pH8.325°Cで測定したにてトリス-ボレートEDTA緩衝液に形成した6パーセントポリアクリルアミド。このゲルは約50°Cにて実施された。ゲル上の染料-ポリヌクレオチド共役体は標準手段、例えば高光度水銀蒸気ランプ、レーザー等によって発光される。好ましくは、ゲル上の染料-ポリヌクレオチドはアルゴンイオンレーザーによって発生したレーザー光、特に、アルゴンイオンレーザーの488および514nmの発光ラインによって発光される。これらのラインで同時にレーザー光を発する幾つかのアルゴンイオンレーザーは市販品として入手できる、例えばシオニクス社サニイベール、CAモデル2001等。チェインターミネーター法において、本発明の染料はプライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに結合することができる。染料は、例えばここに参考文献として組み込まれるフングらの米国特許4,757,141号の教示に従って、プライマーの5’末端の;例えばワードらの米国特許第4,711,955号の教示に従って、プライマーの塩基の相補的官能基に;ホスホルアミダイト結合官能基を介して5’-ヒドロキシルに直接;またはジデオキシヌクレオチドの塩基に、例えばここに参考文献として組み込まれるホッブスらのヨーロッパ特許出願87305844.0号によって開示されているアルキルアミノ結合基を介して、結合することができる。本発明のキットは種々の形をとることができるが、通常大きさにより分離される多重DNAの蛍光性の検出のための手段を提供する。キットは、DNA配列決定のために、例えば電気泳動によって大きさにより分離される増幅核酸を検出するため等に用いられる。一般に、キットは、4,7-ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けたオリゴヌクレオチド、あるいはDNA配列決定キットの具体例において少なくとも1個の染料-ターミネーターに4,7-ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けた染料-ターミネーター混合物のいずれかを含む。通常、染料-ターミネーターは、上記のように、蛍光染料で標識を付けたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートである。増幅核酸を検出するためのキットは、4,7-ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けた少なくとも1個のオリゴヌクレオチド、核酸ポリメラーゼおよび核酸リガーゼからなる群から選ばれる酵素、および反応緩衝液から成る。キットがDNAポリメラーゼを含む場合は必ず、さらにヌクレオシドトリホスフェート混合物、例えば特定の応用、例えば増幅、配列決定等のために適当な濃度のヌクレオシドトリホスフェートを含有するEDTAの50mM水溶液を含む。キットがDNA配列決定のためにヌクレオシドトリホスフェート混合物を提供する場合、このようなトリホスフェートは、例えばリーらのヌクレイックアシッズリサーチ、第20巻、第2471~2483頁1992によって教示されているようなヌクレオシド-5’-O-1-チオトリホスフェートのような類似体を含むと解される。核酸ポリメラーゼはDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、および逆転写酵素等を含む。好ましくは、キットがPCR増幅用である場合、核酸ポリメラーゼは、例えばゲルファンドらの米国特許4,889,818号によって開示されているようなTaqポリメラーゼである。特定の具体例のためのPCR反応緩衝液およびヌクレオシドトリホスフェート混合物を選択するための手引はインニスら著、PCRプロトコル:アガイドトゥメソッズアンドアプリケイションズアカデミックプレスニューヨーク、1990に見ることができる。代表的な10XPCR反応緩衝液は15mMのMgCl2、500mMのKCl、およびTris-HCl、pH8.3から成る。好ましくは、キットが、例えばランデグレンらの米国特許4,938,617号等によって開示されているようなリガーゼに基づく増幅反応を可能にする場合は必ず、核酸リガーゼは、バラニイのプロシーディングスオブザナショナルアカデミイオブサイエンシーズ、第88巻、第189~193頁1991によって開示されているような熱安定性リガーゼである。リガーゼに基づく反応緩衝液を選択するための手引はランデグレンら上記、ウら、ゲノミクス、第4巻、第560~569頁1989;バラニイ上記、およびニッカーソンら、プロシーディングスオブザナショナルアカデミイオブサイエンシーズ、第87巻、第8923~8927頁1990に見出すことができる。代表的な連結反応緩衝液は20mMのTris-HCl、pH7.6;50mMのKCl;10mMのMgCl2;1mMのEDTA;10mMのNAD、および10mMのジチオトレイトールから成る。キットの染色-標識オリゴヌクレオチドは広範囲の長さをもつことができるが、好ましくはそれらの長さは6ないし60個のヌクレオチドの範囲である。さらに好ましくは、連結キット用のオリゴヌクレオチドは6ないし30個のヌクレオチドの長さの範囲であり、最も好ましくは、連結キット用のオリゴヌクレオチドは16ないし25個のヌクレオチドの長さの範囲である。オリゴヌクレオチドの特定のヌクレオチド配列は勿論、増幅されるように探索される標的配列によって指図される。PCR増幅のための具体例において、PCRプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドの選択は当該分野では、例えばインニスら上記、ヒリアーおよびグリーン、PCRメソッズアンドアプリケーションズ、第1巻、第124~128頁1991等によって良く知られている。好ましくは、染色-ターミネーターを提供するDNA配列決定用キットでは、各ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、5-および6-カルボキシフルオレセイン、5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2’,7’-ジメトキシ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロロフルオレセイン、2’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロ-5-および6-カルボキシフルオレセイン、2’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、1’,2’,7’,8’-ジベンゾ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、1’,2’,7’,8’-ジベンゾ-4’,5’-ジクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、2’,7’-ジクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、および2’,4’,5’,7’-テトラクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセインから成る組から選ばれる染料を用いて別々に標識を付けられる。さらに好ましくは、ジデオキシチミジントリホスフェートは6-カルボキシフルオレセイン6-FAMを用いて標識を付けられ、ジデオキシシチジントリホスフェートは2’,4’,5’.7-テトラクロロ-5-カルボキシフルオレセイン5-ZOEを用いて標識を付けられ、ジデオキシアデノシントリホスフェートは2’,4’,5’,7’-テトラクロロ-4,7-ジクロロ-5-カルボキシフルオレセイン5-HEXを用いて標識を付けられ、そしてジデオキシグアノシントリホスフェートは1’,2’,7’,8’-ジベンゾ-4,7-ジクロロ-5-カルボキシフルオレセイン5-NANを用いて標識を付けられる。ジデオキシアデノシンは2’,3’-ジデオキシ-7-デアザアデノシンを含み、そしてジデオキシグアノシンは2’,3’-ジデオキシ-7-デアザグアノシンおよび2’,3’-ジデオキシ-7-デアザイノシンを含み、そしてジデオキシチミジンは2’,3’-ジデオキシウリジンを含むと解される。通常、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは連結基によって標識を付けられる。好ましくは、連結基は2’,3’-ジデオキシシチジンまたは2’,3’-ジデオキシウリジンの5番目の炭素を染料の5または6番目の炭素に連結し、そして連結基は2’,3’-ジデオキシ-7-デアザアデノシンまたは2’,3’-ジデオキシ-7-グアノシン-または2’,3’-ジデオキシ-7-デアザイノシンの7番目の炭素を染料の5または6番目の炭素に結合する。好ましくは、連結基はカルボキシアミノアルキニルであり、そして最も好ましくは、連結基は3-カルボキシアミノ-1-プロビニルである。好ましくは、染料-ターミネーターを提供するDNA配列決定用キットにおいて、核酸ポリメラーゼはSequenase登録商標である。実施例14.7-ジクロロ-5-および6-カルボキシフルオレセインALF0.58gの3,6-ジクロロトリメリット酸、0.72gのレゾルシノール、0.5mlの儂硫酸、および3mlのプロピオン酸をアルゴン下に12時間還流した。反応混合物を150mlの水に注入し、沈澱物を乾燥し、3mlのビリジンに入れ、2mlの無水酢酸塩で1時間アセチル化した。アセチル化混合物は100mlの酢酸エチルに入れ、1Nの塩酸、水で洗浄し、蒸発乾固した。残渣を15gのシリカゲルに置き、50mlの酢酸エチルで、次いで4:1の酢酸エチル:メタノールで溶出した。約0.2のRf4:1の酢酸エチル:メタノール/シリカゲルでUV活性物質を含有する画分を蒸発乾燥させた。この残渣を10mlのメタノールに溶解し、次いで1mlの4N水酸化ナトリウムを添加した。10分後、反応混合物を200mlに水で希釈し、次いで0.5mlの濃塩酸を添加した。全混合物を200mlの酢酸エチルで抽出し、その後酢酸エチルを硫酸ナトリウムで乾燥させ蒸発乾固させて102mgの黄緑色の固体を得た。実施例24,7-ジクロロ-5-および6-カルボキシフルオレセインN-ヒドロキシスクシンイミドNHSエステル実施例1からの13.7mgのフルオレセイン、3.3mgのNHS、6.4mgのDCC、および1mlの酢酸エチルを0.5時間攬拌した。固体を濾過し、そして上澄液を3回1:1のブライン:水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させて15mgのNHSエステルを得た。実施例34,7-ジクロロ-5-および6-カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドの結合実施例2からの5mgのNHSエステルを20μlのDMSOに溶解した;3μlのこの溶液を20μlの1.0mnの5’-アミノヘキシルホスフェートオリゴヌクレオチド18量体水溶液および10μlの1M重炭酸ナトリウム/炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.0から成る溶液に添加した。暗所で1時間後、溶液を10mlのSephadexG-25mediumカラムに0.1Mの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液、pH7.0を用いて通過させた。排除容量で溶出する着色物質のバンドを収集した。逆相HPLCは、DNAに結合した染料の5-および6-異性体に対応する2本の主要な蛍光ピークを示した。このビークを集め、pH8.0での50尿素における蛍光スペクトルは528nmでの発光最大値と34nmのハーフマックスでの全幅を示した。実施例42’,7’-ジメトキシ-5-および6-カルボキシ4,7-ジクロロフルオレセインBUB次の物質および分量に変えた以外は実施例1の方法に従った:1.47gの4-メトギシレゾルシノール、0.60gの3,6-ジクロロトリメリット酸、0.2mlの濃硫酸、および4mlのプロピオン酸。この方法は0.180gの4,7-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシ-5-および6-カルボキシフルオレセインを生成した。実施例52’,7’-ジメトキシ-5-および6-カルボキシ4,7-ジクロロフルオレセインNHSエステル18mgのこの染料NHSエステルは実施例4からの18mgの染料、3.5mgのNHS、6.4mgのDCC、および2mlの酢酸エチルを用いて実施例2と同様に調製した。実施例64,7-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシ-5-および6-カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドとの結合実施例5の染料NHSエステルを用いて実施例3の方法に従った。逆相HPLCの間に集められた2本のピークの蛍光スペクトルはpH8.2での50尿素において544nmでの発光最大値と37nmのハーフマックスでの全幅を示した。実施例72’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセインLOUこの染料は実施例4の染料および水性水酸化ナトリウムの次亜塩素酸ナトリウム溶液から調製された。実施例84,7-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロ-5-および6-カルボキシフルオレセインNHSエステル1.1mgのこの染料NHSエステルを実施例7からの0.7mgの染料、0.45mgのNHS,0.7mgのDCC、および0.2mlの酢酸エチルから実施例2のように調製した。実施例94,7-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロ-5-および6-カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドとの結合この実施例の染料オリゴヌクレオチド結合体を実施例8からの染料NHSエステルを用いて実施例3と同様に調製した。逆相HPLCの間に集められた2本のピークの蛍光スペクトルはpH8.2での50尿素において558nmでの発光最大値と38nmのハーフマックスでの全幅を示した。実施例101’,2’,7’,8’-ジベンゾ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセインNANまず、3,6-ジクロロトリメトリット酸トリクロリドを調製した:0.5gの3,6-ジクロロトリメリット酸と1.3gの五塩化リンの混合物を130°Cで40分間加熱した。混合物を室温まで冷却し氷に注いだ。次いで混合物を40mlのエーテルで抽出し、有機画分を2回15mlの水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、透明油0.7gまで濃縮した。酸トリクロリドをさらに精製しないで使用した。NANを次のように調製した:2.7gの1,3-ジヒドロキシナフタレン、2.84gの3,6-ジクロロトリメリット酸トリクロリド、および8mlのプロピオン酸の混合物を2時間還流した。水50mlおよび酢酸エチル50mlを添加した。相を分離して、有機相を3回50mlの1MのNaHCO3で抽出した。水溶液を沸点まで加熱して濃HClで酸性にした。得られた赤色固体0.2gを濾過し乾燥した。実施例111’,2’,7’,8-ジベンゾ-4’,5’-ジクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセインDEB20mgのNAN、水酸化ナトリウム15溶液34μl、水1ml、および次亜塩素酸ナトリウム5溶液170μlを一緒にした。逆相HPLCは92の反応を示した。溶液をHClで酸性にして、20mlの酢酸エチルで抽出し、乾燥Na2SO4し、20mgまで濃縮した。固体をシリカゲルカラム径1×高さ2のクロマトグラフィーによって600:60:16の塩化メチレン:メタノール:酢酸で溶出して精製した。染料溶液を濃縮し、希HClおよび酢酸エチルを添加した。有機相を乾燥MgSO4し、20mgのDEBまで濃縮した。実施例121’,2’,7’,8’-ジベンゾ--5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセインNHSエステルの生成NAN10mgを2mlの酢酸エチルに溶解し、NHS10mgとDCC5mgを添加した。20分後、溶液は暗赤色になり、結晶固体が現れた。600:60:16の塩化メチレン:メタノール:酢酸を用いたシリカゲルの薄層クロマトグラフィーはNHSエステルに完全に転換したことを示した。酢酸エチル溶液を希HClで洗浄し、乾燥NaSO4して赤色固体15mgまで濃縮した。実施例13DNA配列分析において染料標識プライマーとしてALF-、BUB-、LOU-、およびNAN-オリゴヌクレオチ結合体を使用染料の全フルオレセインセットを使用してアプライドバイオシステムズフォスターシテイ、CAモデル370A自動化DNAシーケンサーを用いてチェインターミネーター法でDNAフラグメントに標識を付けた。製造業者のプロトコル参考文献として組み込まれるユーザーブレタンDNAシーケンサーモデル370、発行第2号、1987年8月2日に従って、M13中の未知のDNAを増幅してゲル電気泳動分離のための別々に標識を付けたDNAフラグメントを調製した。染料標識プライマーは上記実施例に記載されたように調製した。即ち、各染料のNHSエステルを調製し、5’-アミノヘキシル誘導化M13ユニバーサルプライマー5’-TCCCAGTCACGACGTTGT-3’配列番号1と反応させ4つに分かれるジデオキシ反応混合物に対する染色標識プライマーを生成した。次の変更は標準プロトコルでなされた:ジデオキシシチジン反応においてプライマーに標識を付けた5-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、ジデオキシアデノシン反応においてプライマーに標識を付けた2’,7’-ジメトキシ-5-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、ジデオキシグアノシン反応においてプライマーに標識を付けた2’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロ-6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、ジデオキシチミジン反応においてプライマーに標識を付けた1’,2’,7’,8’-ジベンゾ-5-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、各反応からの標識を付けたDNAフラグメントをゲルに装填するために次のモル比で一緒にした:1:4:2ddC反応:ddA反応:ddG反応:ddT反応、そして検出は535、550、565、および580nmに中心がある10-nmバンドパスフィルターを用い改良フィルターホイールで行った。実施例14DNA配列分析において染料-標識プライマーとしてALF-、BUB-、DEB-、およびNAN-オリゴヌクレオチド結合を使用次のことを除いて、実施例13に記載したと同様の方法に従った:iジデオキシグアノシン反応においてプライマーに標識を付けた1’,2’,7’,8’-ジベンゾ-4’,5’-ジクロロ-5-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン、ii各反応からの標識を付けたDNAフラグメントをゲルに装填するために次のモル比で一緒にした:1:1:2:15ddC反応:ddA反応:ddG反応:ddT反応、そしてiii5nmバンドパスフィルターは540、560、580、および610nmに中心があった。実施例152’,7’-ジクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン5-および6-TET4-クロロレゾルシノール10g、4,7-ジクロロトリメリット酸10g、およびメタンスルホン酸30mlの混合物を一緒にして2時間140~150°Cまで加熱した。赤色混合物を水100mlに注ぎ酢酸エチル100mlで抽出した。有機相を2回希塩酸で洗浄し、金褐色固体19gに濃縮した。ピリジン40mlと無水酢酸10mlを固体に添加し混合物を0.5時間還流した。溶液を1時間4°Cで冷却させた。結晶を濾過して分離し、白色固体5.4gを生成した。少部分の加水分解0.02mlの0.1NNaClおよび0.02mlのエタノールを2mgの固体に添加続いて逆相HPLCの分析で固体は92:8の比の異性体6-カルボキシTET:5-カルボキシTETを含有することを示した。2回目の再結晶はジアセテート99:1比としてほぼ純粋な異性体染料を与えた。5-TETは濾液からの5-TETのジアセテートの加水分解、次にアセトニトリルからの再結晶によって回収された。水酸化ナトリウム3gと水10mlを6-TETジアセテート8.6gHPLCカラムから2本のピークの最初のものとして得られたに添加した。追加の水50mlを溶液が均質になるまで添加した。暗赤色溶液に濃HCl15mlを添加した。黄色の沈澱が形成された。混合物を酢酸エチル100mlで抽出した。有機相を淡黄色のほぼ無色の固体7.4gの6-TETに濃縮した。実施例162’,4’,5’,7’-テトラクロロ-5-および6-カルボキシ-4,7-ジクロロフルオレセイン5-および6-HEX磁気攬拌棒を備えた1リットルのエルレンマイヤーフラスコに5-または6-TET6.3gおよび1Mの炭酸塩/重炭酸塩緩衝液pH9.460mlを添加した。家庭用漂白剤次亜塩素酸ナトリウム、50mlを20分かけて滴下した。反応の進行を逆相HPLCでモニターした。全部で67mlの漂白剤を添加した。濃HCl15mlで溶液を酸性にして酢酸エチル100mlで抽出した。有機相を明黄色固体7.3gまで儂縮した。1HNMRDMSO-d6δ8.11H;7.42H。"