"下式Iを有する新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブ。式中、Zは、キナーゼ阻害活性を有する化合物を表わし、Lは、結合、置換されてもよいアミノ基、カルボニル基、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいアルキルカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、スルフィド基、置換されてもよいアルコキシ基を表し、Xは、結合、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドラジノ基、チオカルボニルアミノ基を表し、R1はニトロ基、ジメチルスルファモイル基を表す。Zが、p38MAPK阻害活性を有する化合物である、請求項1に記載の蛍光プローブ。Zが、下式Iaを有する化合物である、請求項1または2に記載の蛍光プローブ。式中、R2は置換されてもよいアルコキシ基を表す。Zが、BTK阻害活性を有する化合物である、請求項1に記載の蛍光プローブ。Zが、下式Ibを有する化合物である、請求項1または4に記載の蛍光プローブ。請求項1から5の何れか1項に記載の蛍光プローブを使用することを特徴とするキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法。不活性型キナーゼを標的とした、請求項6に記載のスクリーニング方法。本発明の目的は、活性型ないし不活性型キナーゼに結合する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることのできる新しいスクリーニング方法、およびその検出を可能にする新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブを提供することにある。本発明者は、前述のとおりベンゾオキサジアゾール誘導体が環境に依存して蛍光強度を変化させる性質に着目し、この性質を利用することにより上述の目的を達成し得る本発明を案出したものである。かくして、本発明に従えば、活性型ないし不活性型キナーゼに結合する薬剤のスクリーニングが簡便に可能となり、キナーゼ阻害剤にベンゾオキサジアゾール誘導体を結合させた蛍光プローブとキナーゼの混合物に被験物質を添加し、その蛍光強度の変化が観察されたときに、被験物質をキナーゼ阻害剤として選択することを特徴とする方法が提供される。本発明のスクリーニング方法および新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブを用いれば、活性型キナーゼのみならず、不活性型キナーゼに結合する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることができ、従来の競合結合測定法において必要だった標的酵素の修飾および2次試薬が不要となる。かくして、本発明は、キナーゼ阻害剤の効率的なスクリーニングを通じて、自己免疫疾患、炎症性疾患、骨疾患、代謝性疾患、神経学的疾患及び神経変性疾患、癌、心臓血管の疾患、アレルギー及び喘息、アルツハイマー病、ならびにホルモン関連の疾患などに対する予防治療薬の開発に資するものである。本発明者らは、酵素活性がない、もしくは非常に弱い不活性型キナーゼを用いて、その基質結合部位に拮抗的に結合する化合物を見つけるために、競合結合測定法に注目して研究を行った。このとき、通常、生化学分野でよく用いられるフルオレセインなどの蛍光色素とは異なる性質を有するベンゾオキサジアゾール誘導体が、キナーゼの結合度に応じて蛍光強度が変化することにより、2次試薬等を必要としない非常に簡便な競合阻害試験に利用できるものと考え、本発明を導き出したものである。本発明は、以下の1~7によって達成される。1下式Iを有する新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブ。式中、Zは、キナーゼ阻害活性を有する化合物を表わし、Lは、結合、置換されてもよいアミノ基、カルボニル基、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいアルキルカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、スルフィド基、置換されてもよいアルコキシ基を表し、Xは、結合、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドラジノ基、チオカルボニルアミノ基を表し、R1はニトロ基、ジメチルスルファモイル基を表す。2Zが、p38MAPK阻害活性を有する化合物である、1に記載の蛍光プローブ。3Zが、下式Iaを有する化合物である、1または2に記載の蛍光プローブ。式中、R2は置換されてもよいアルコキシ基を表す。4Zが、BTK阻害活性を有する化合物である、1に記載の蛍光プローブ。5Zが、下式Ibを有する化合物である、1または4に記載の蛍光プローブ。61から5の何れか1つに記載の蛍光プローブを使用することを特徴とするキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法。7不活性型キナーゼを標的とした、6に記載のスクリーニング方法。以下、本発明に従うキナーゼ阻害剤のスクリーニング法において用いられる蛍光プローブの作製法、ならびに当該蛍光プローブを用いるスクリーニング法に従って本発明の実施の形態を説明する。但し、以下に示す具体的な実施の形態は例示のためのものであり、本発明の実施の形態はこれに限定されるものではない。本発明の新しいキナーゼ阻害剤のスクリーニング法の実施を可能にする新規なベンゾオキサジアゾール蛍光プローブは、下式Iで示される化合物である。式中、Zは、キナーゼ阻害活性を有する化合物を表わし、Lは、結合、置換されてもよいアミノ基、カルボニル基、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいアルキルカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、スルフィド基、置換されてもよいアルコキシ基を表し、Xは、結合、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいヒドラジノ基、チオカルボニルアミノ基を表し、R1はニトロ基、ジメチルスルファモイル基を表す。尚、上記で結合とは、ZとX、Lとベンゾオキサジアゾール基、あるいはZとベンゾオキサジアゾール基が直接結合した場合を意味する。前記式Iにおいて、キナーゼ阻害活性を有する化合物としては、標的とする活性型あるいは不活性型キナーゼの、触媒ドメインのATP結合部位、基質結合部位もしくはアロステリック部位に可逆的に結合する化合物であれば、新規化合物や公知化合物の何れであってもよいが、このような性質を有する化合物としてはいくつかのものが既に知られており、これらを使用することができる。例えば、ATP結合部位に結合して活性型キナーゼを阻害するものとしては、スタウロスポリン、スニチニブN-2-diethylaminoethyl-5-[Z-5-fluoro-2-oxo-1H-indol-3-ylidenemethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide、ダサチニブN-2-chloro-6-methylphenyl-2-[[6-[4-2-hydroxyethyl-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazolecarboxamidemonohydrateなどのキナーゼ阻害薬もしくはそれらの誘導体などが挙げられる。不活性型キナーゼを標的とする場合は、不活性型キナーゼにより強く結合することが知られている化合物、具体的には、不活性型BTKを阻害するN-[3-[4,5-Dihydro-4-methyl-6-[[4-4-morpholinylcarbonylphenyl]amino]-5-oxo-2-pyrazinyl]-2-methylphenyl]-4-tert-butylbenzamideCGI1746に代表される上記[化3]の部分構造をもつ誘導体、不活性型p38MAPKを阻害するdoramapimodに代表される上記[化2]の部分構造をもつ誘導体、不活性型ABLを阻害するイマチニブ、ニロチニブもしくはそれらの誘導体などが挙げられる。また、アロステリック部位に結合してキナーゼ活性を阻害することが知られているものとしては、MAPKキナーゼのMEKを阻害する2-2-Chloro-4-iodo-phenylamino-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluoro-benzamidePD-184352,CI-1040もしくはそれらの誘導体などが挙げられる。前記式Iにおいて、置換されてもよい炭化水素基の炭化水素部分としては、例えば、a炭素数1から6の直鎖状、あるいは分岐鎖状のアルキル基例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘキシル等、b炭素数1から6の直鎖状、あるいは分岐鎖状のアルケニル基、c炭素数2から6のアルキニル基、d炭素数3から8のシクロアルキル基、e炭素数3から8のシクロアルケニル基、fアラルキル基、アラルキル基のアリール部分としては、炭素数6から14のアリールが挙げられ、アラルキル基のアルキレン部分としては、前記アルキル基から水素原子を1つ除いたものと同義である、などが挙げられる。置換されてもよい炭化水素基の置換基としては、置換されてもよいアミノ基、置換されてもよいアルコキシ基、置換されてよいカルバモイル基、置換されてもよいアシルアミノ基、置換されてもよいスルフィド基等を挙げることができる。置換されてもよいアミノ基としては、置換もしくは非置換の炭素数1から6の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアミノ基または直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアミノ基を表し、具体的にはメチルアミノ基、ピロリジノ基、ピペリジノ基、ピペラジノ基、モルホリノ基、アニリノ基などが挙げられる。置換されてもよいアルキルカルバモイル基としては、置換もしくは非置換の炭素数1から6の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアルキルカルバモイル基又は直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアルキルカルバモイル基を表す。置換されてもよいアシルアミノ基としては、置換もしくは非置換の炭素数1から6の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基又は直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアルキルカルボニルアミノ基を表す。置換されてもよいアルコキシ基としては、置換もしくは非置換の炭素数1から6の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するアルコキシ基又は直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいアルコキシ基を表す。置換されてもよいヒドラジノ基としては、置換もしくは非置換の炭素数1から6の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基を有するヒドラジノ基または直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基の炭素原子がヘテロ原子に置換されていてもよいヒドラジノ基を表す。ベンゾオキサジアゾール基を、キナーゼ阻害活性を有する化合物に結合するためのリンカーである式IのLおよびXとしては、市販で入手可能なベンゾオキサジアゾール誘導体を蛍光標識色素として結合するのに使用し得る当業界で知られているあらゆる基であってもよい。典型的には、この実施態様において、LおよびXは、ベンゾオキサジアゾール誘導体の反応性官能基であるフッ素、塩素などのハロゲンまたはイソチオシアネート基と、キナーゼ阻害活性を有する化合物の適当な位置に導入したアミン性官能基との反応により生成されてもよい。ベンゾオキサジアゾール基は、Zのキナーゼ阻害活性を保持しつつ、キナーゼに結合すると蛍光が変化するように適宜、選ばれたLおよびXを介してZと結合を形成する。本発明の蛍光プローブIは、例えば、置換基の種類によって、異性体が存在する場合がある。本明細書において、それらの異性体の一形態のみの化学構造で記載することがあるが、本発明には、構造上生じ得るすべての異性体幾何異性体、光学異性体、互変異性体なども含有し、異性体単体、またはそれらの混合物も含有する。また、本発明の蛍光プローブは、その水溶性などの物性を調節するために、塩にして用いる場合があり、本発明には、化学性質上、生じ得るすべての塩も含有する。本発明の蛍光プローブIの具体的な化合物としては、以下の化合物が挙げられる。1-3-t‐ブチル-1-4-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノフェニル-1H-ピラゾロ-5-イル-3-ナフタレン-1-イルウレア1-3-t‐ブチル-1-3-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノフェニル-1H-ピラゾロ-5-イル-3-ナフタレン-1-イルウレアN-4-3-t‐ブチル-5-3-ナフタレン-1-イルウレイド-1H-ピラゾロ-1-イルフェニル-3-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノプロパンアミド3-3-t‐ブチル-5-3-ナフタレン-1-イルウレイド-1H-ピラゾロ-1-イル-N-2-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノエチルベンズアミド4-3-t‐ブチル-5-3-ナフタレン-1-イルウレイド-1H-ピラゾロ-1-イル-N-2-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノエチルベンズアミド4-3-t‐ブチル-5-3-4-2-モルホリノエトキシナフタレン-1-イルウレイド-1H-ピラゾロ-1-イル-N-2-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノエチルベンズアミド1-3-t‐ブチル-1-4-4-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノ1‐ブチン-1-イルフェニル-1H-ピラゾロ-5-イル-3-ナフタレン-1-イルウレア1-3-t‐ブチル-1-4-4-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノブチルフェニル-1H-ピラゾロ-5-イル-3-ナフタレン-1-イルウレア4-t‐ブチル-N-2-メチル-3-4-メチル-6-4-4-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルピペラジン-1-カルボニルフェニルアミノ-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-イルフェニルベンズアミド4-t‐ブチル-N-2-メチル-3-4-メチル-6-4-2-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノエチルカルバモイルフェニルアミノ-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-イルフェニルベンズアミド4-t‐ブチル-N-2-メチル-3-4-メチル-6-4-2-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノメチルモルホリン-4-カルボニルフェニルアミノ-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-イルフェニルベンズアミド4-t‐ブチル-N-2-メチル-3-4-メチル-6-4-2-2-2-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノエトキシエトキシエチルカルバモイルフェニルアミノ-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-イルフェニルベンズアミド4-t‐ブチル-N-2-メチル-3-4-メチル-6-4-4-2-メチル7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノアセチルピペラジン-1-カルボニルフェニルアミノ-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-イルフェニルベンズアミド4-t‐ブチル-N-3-6-4-4-7-N,N-ジメチルスルファモイルベンゾ[C][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルピペラジン-1-カルボニルフェニルアミノ-4-メチル-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-イル-2-メチルフェニルベンズアミド本発明の蛍光プローブIは、例えば以下の方法によって製造することができる。なお、以下に示した製造法において、定義した基が実施方法の条件下で変化するか、または方法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で通常用いられる方法、例えば、官能基の保護、脱保護[TWGreene,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis3rdEdition,JohnWileySons,Inc.,1999]等の手段を付すことにより容易に製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。スキーム1スキーム1において、R1、L、XおよびZは先に定義されたとおりであり、ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬IIIは、蛍光ラベル化試薬として種々のAを官能基として有する誘導体が市販されており例えば、東京化成工業株式会社などから入手可能、官能基Aは化合物IIと反応後、Xに変換される。もし、ZがリンカーLもしくはベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬IIIと反応しうる適当な官能基を適当な位置に有しないときには、その前駆体化合物や、有機合成化学で通常用いられる方法を実施することにより、所望の位置に所望の官能基を有する誘導体を合成し、その誘導体を用いてスキーム1の反応を実施してもよい。また、リンカーLを介して、ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬IIIでZをラベル化するときは、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基など、ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬IIIとの反応に適当な官能基を適当な位置に有しているL’を、必要であれば官能基の保護、脱保護を繰り返して、当業界で知られている通常の有機合成の条件などを用いてZに導入し、得られた化合物IIを適当なベンゾキサジアゾール誘導体化試薬IIIと反応させることにより、式Iの所望の化合物を得ることができる。ベンゾオキサジアゾール誘導体化試薬IIIは、例えば、アミノ基やメルカプト基のラベル化試薬として、AがFやClなどのハロゲン原子であるNBD-Cl、NBD-F、イソチオシアネート基であるNBD-NCS、カルボキシル基のラベル化試薬として、AがピペラジンであるNBD-PZ、DBD-PZ、2-アミノエチルアミノ基であるDBD-ED、N-ヒドラジノカルボニルメチル-N-メチルアミノ基であるNBD-CO-Hzなどが市販で入手可能である。また、カルボニル基のラベル化には、Aがヒドラジノ基であるNBD-HやDBD-H、水酸基のラベル化としては、AがN-クロロホルミルメチル-N-メチルアミノ基であるDBD-COClなどが市販されている。また、本発明のスクリーニング方法は、上記方法により得られた本発明の蛍光プローブとキナーゼの混合物に被験物質を添加し、その蛍光強度の変化低下が観察されたときに、被験物質をキナーゼ阻害剤として選択することを特徴とする。以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。化合物の同定は水素核磁気共鳴スペクトル1H-NMR及びマススペクトルMSにより行った。1H-NMRは、特に指示のないかぎりは400MHzで測定されたものであり、また化合物及び測定条件によっては交換性水素が明瞭に観測されない場合がある。質量分析は液体クロマトグラフ質量分析計LCMSシステムを用い、以下に示したA法もしくはB法にて測定した。A法:LCMS-2010Aシステム島津製作所を使用し、質量分析はエレクトロスプレーESI法により測定した。分離カラムはCadenzaCD‐C1850×2mmインタクト社製を用いた。溶出には10mMギ酸水溶液A液および10mMギ酸メタノール溶液B液によるグラジェント法を用い、溶出条件は、流速0.5mL/分、0分~0.5分B液:5v/v、0.5分~2.5分B液:5~95v/v直線グラジェント、2.5分~4分B液:95v/vとした。B法:液体クロマトグラフ質量分析計システムmicromassZQマス検出器、日本ウォーターズ社製を使用し、質量分析はエレクトロスプレーESI法により測定した。分離カラムはUnisonUS‐C1850×4.6mmインタクト社製を用いた。溶出には10mMギ酸水溶液A液および10mMギ酸メタノール溶液B液によるグラジェント法を用い、溶出条件は、溶出条件は、流速2mL/分、0分~0.5分B液:5v/v、0.5分~3分B液:10~90v/v直線グラジェント、3分~4分B液:90v/vとした。実施例1から8は、本発明の蛍光プローブIのうち、Zがp38MAPK阻害活性を有する化合物である場合を例として、具体的に説明する。実施例11-3-t‐ブチル-1-4-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルアミノフェニル-1H-ピラゾロ-5-イル-3-ナフタレン-1-イルウレア第1工程4-ニトロフェニルヒドラジン766mg、ピバロイルアセトニトリル626mgをエタノール12mLに溶解し、濃塩酸2.5mLを加え90°Cで24時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた粗生成物をエタノールで懸濁洗浄し、3-t‐ブチル-1-4-ニトロフェニル-1H-ピラゾロ-5-アミン塩酸塩1.31gを得た。第2工程3-t‐ブチル-1-4-ニトロフェニル-1H-ピラゾロ-5-アミン塩酸塩297mgにジクロロメタン10mL、トリエチルアミン167μL、1-ナフチルイソシアネート158μLを加え80°Cで18時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣に水10mLを加え、酢酸エチル50mL×2で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去して1-3-t‐ブチル-1-4-ニトロフェニル-1H-ピラゾロ-5-イル-3-ナフタレン-1-イルウレア145mgを得た。第3工程1-3-t‐ブチル-1-4-ニトロフェニル-1H-ピラゾロ-5-イル-3-ナフタレン-1-イルウレア145mgをエタノール7mLに溶解し、ギ酸アンモニウム132mg、触媒量の10パラジウム-炭素を加え90°Cで3時間還流した。不溶物をセライトろ過した後、ろ液を減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、1-1-4-アミノフェニル-3-t‐ブチル-1H-ピラゾロ-5-イル-3-ナフタレン-1-イルウレア81mgを得た。第4工程1-1-4-アミノフェニル-3-t‐ブチル-1H-ピラゾロ-5-イル-3-ナフタレン-1-イルウレア21mgをエタノール7mLに溶解し、4‐フルオロ‐7‐ニトロ2,1,3‐ベンゾオキサジアゾール10mgを加え室温で18時間撹拌した。析出した固体をろ取し、ジエチルエーテルで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて表題化合物22mgを得た。LCMS:HPLC保持時間3.53分A法、m/z563MH。1HNMRδppm1316446857477517617627777877988048578909061118下記実施例2から7の化合物は、実施例1に記載の方法もしくは類似の方法に従い、適当な試薬および有機合成化学で通常用いられる方法により製造した。表中のMethodはLCMSの分析方法、RTはLCMSにおけるHPLC保持時間、MSはLCMSにおけるマススペクトル分析データ特に指示のない限りポジティブイオンモードで測定されたMHを示す。また、実施例9から14は、本発明の蛍光プローブIのうち、ZがBTK阻害活性を有する化合物である場合を例として、具体的に説明する。参考例14-6-3-4-t‐ブチルベンズアミド-2-メチルフェニル-4-メチル-3-オキソ-3,4-ジヒドロピラジン-2-イルアミノ安息香酸第1工程文献J.Med.Chem.Vol.48、p.19012005年に記載の方法で調製した3,5-ジブロモ-1-メチルピラジン-21H-オン593mgのジメチルアセトアミド溶液3.7mLに4‐アミノ安息香酸エチル475mgを加え、マイクロウェーブ合成装置を用いて105°Cで20時間反応させた。析出した固体をろ取し、酢酸エチルで洗浄後、乾燥させてエチル4-6-ブロモ-4-メチル-3-オキソ-3,4-ジヒドロピラジン-2-イルアミノベンゾエート620mgを得た。1HNMRδppm139355437683782806845第2工程エチル4-6-ブロモ-4-メチル-3-オキソ-3,4-ジヒドロピラジン-2-イルアミノベンゾエート870mgの1,4-ジオキサン溶液7.6mLに3‐アミノ‐2‐メチルフェニルボロン酸ピナコールエステル749mg、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム0400mg、2.4M炭酸ナトリウム水溶液1.5mLを加え、105°Cで60時間撹拌した。不溶物をセライトろ過した後、ろ液にジクロロメタン50mLを加え、2M塩酸50mLで抽出した。水層に2M水酸化ナトリウム水溶液60mLを加えてアルカリ性にした。析出した固体をろ取し、水で洗浄後、乾燥させてエチル4-6-3-アミノ-2-メチルフェニル-4-メチル-3-オキソ-3,4-ジヒドロピラジン-2-イルアミノベンゾエート588mgを得た。第3工程エチル4-6-3-アミノ-2-メチルフェニル-4-メチル-3-オキソ-3,4-ジヒドロピラジン-2-イルアミノベンゾエート588mgのジクロロメタン溶液溶液7.8mLにピリジン0.14mL、4‐t‐ブチルベンゾイルクロリド0.455mLを加え、室温で4時間撹拌した。反応混合物をクロロホルム100mLで希釈し、1M水酸化ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、エチル4-6-3-4-t‐ブチルベンズアミド-2-メチルフェニル-4-メチル-3-オキソ-3,4-ジヒドロピラジン-2-イルアミノベンゾエート534mgを得た。第4工程エチル4-6-3-4-t‐ブチルベンズアミド-2-メチルフェニル-4-メチル-3-オキソ-3,4-ジヒドロピラジン-2-イルアミノベンゾエート400mgのテトラヒドロフラン溶液7mLに1M水酸化ナトリウム水溶液7mL、エタノール7mLを加え、80°Cで3時間撹拌した。反応混合物に1M塩酸7mL、水50mLを加え、酢酸エチル20mL×3で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去して表題化合物377mgを得た。1HNMRδppm1332303587257367407567857968149599881258実施例94-t‐ブチル-N-2-メチル-3-4-メチル-6-4-4-7-ニトロベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルピペラジン-1-カルボニルフェニルアミノ-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-イルフェニルベンズアミド参考例1で得られた化合物50mgのテトラヒドロフラン溶液1.6mLに1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩56mg、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール45mgを加え、室温で1時間撹拌したのち、4‐ニトロ‐7‐ピペラジノ‐2,1,3‐ベンゾオキサジアゾール36.6mgのジメチルホルムアミド0.3mL溶液を加え、室温でさらに18時間撹拌した。反応混合物にクロロホルム50mLを加え、1M塩酸、水、飽和重曹水、及び飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し表題化合物63mgを得た。LCMS:HPLC保持時間3.72分B法、m/z742MH。1HNMRδppm131230358380422660724741744753794812852950989下記実施例10から13に示す化合物は、実施例9に記載の方法もしくは類似の方法に従い、適当な試薬および有機合成化学で通常用いられる方法により製造した。表中のMethodはLCMSの分析方法、RTはLCMSにおけるHPLC保持時間、MSはLCMSにおけるマススペクトル分析データ特に指示のない限りポジティブイオンモードで測定されたMHを示す。実施例144-t‐ブチル-N-3-6-4-4-7-N,N-ジメチルスルファモイルベンゾ[C][1,2,5]オキサジアゾール-4-イルピペラジン-1-カルボニルフェニルアミノ-4-メチル-5-オキソ-4,5-ジヒドロピラジン-2-イル-2-メチルフェニルベンズアミド実施例9に記載の手順に従って、4‐ニトロ‐7‐ピペラジノ‐2,1,3‐ベンゾオキサジアゾールの替わりに4‐N,N‐ジメチルアミノスルホニル‐7‐ピペラジノ‐2,1,3‐ベンゾオキサジアゾール27mgを用い、反応処理することにより表題化合物47mgを得た。LCMS:HPLC保持時間3.72分B法、m/z804MH。1HNMRδppm131230265280358375396660725734738743754786794812950990実施例15リン酸化活性型および脱リン酸化不活性型BTKに対するキナーゼ活性阻害試験リン酸化活性型BTKは、ビオチン化BTK蛋白質BTN-BTKkit、カルナバイオサイエンス社製を用いて行った。キナーゼ反応の基質は、キット付属のFITC標識SRCtideペプチドを用いた。アッセイバッファー[20mMHEPES、0.01TritonX-100商標、2mMdithiothreitol、pH7.5を用い、基質4μM、MgCl220mM、ATP100μM、リン酸化BTK用もしくは200μM、脱リン酸化BTK用となるように調整し、基質混合液を作成した。またキナーゼを0.6nMとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。被験化合物の10mMDMSO溶液から、10濃度0.00003mM、0.0001mM、0.0003mM、0.001mM、0.003mM、0.01mM、0.03mM、0.1mM、0.3mM、1mMにDMSOでさらに希釈し、それぞれをアッセイバッファーで25倍希釈して、薬物溶液を調整した4DMSO溶液。薬物溶液もしくは溶媒溶液コントロール4DMSO-アッセイバッファー5μL、基質混合液5μL、および酵素溶液10μLをポリプロピレン製384穴プレートのウェル中で混合し、1時間室温で反応させた後、60μLのキット付属のターミネーションバッファーを添加し反応を停止させた。反応阻害率は、LabChipEZReaderIIシステムCaliperLifeSciences社製を用い、アッセイキットのプロトコールに従って測定した。FITC標識SRCtideペプチドキナーゼ反応基質:Substrate,及び、そのリン酸化物Productの、蛍光強度のピークの高さをそれぞれSおよびPとし、被験化合物の阻害率を次の式に従って算出した。またブランクとして酵素溶液の代わりにアッセイバッファーを添加したものを測定した。被験化合物のキナーゼ阻害率は、次の式に従って算出した。キナーゼ阻害率=1-C-A/B-A×100ただし、AはブランクのP/PS、BはコントロールのP/PS、Cは被験化合物ウェルのP/PSを示す。また、IC50値は、阻害率と被験化合物濃度対数の回帰分析により算出した。表3に示すとおり、実施例9から11の本発明の蛍光プローブは、蛍光標識していないCGI1746公知の不活性型キナーゼに結合する化合物と同様に脱リン酸化BTKのキナーゼ活性を強く阻害することが判明した。実施例16標的キナーゼへの結合による蛍光プローブの蛍光強度変化の測定本発明の蛍光プローブ実施例9の1mMDMSO溶液をアッセイバッファー[50mMHEPES、0.01Brij-35商標、1mMEGTA、2mMdithiothreitol、10mMMgCl2、pH7.5]で希釈し、1μMの蛍光プローブ溶液を調整した。同様にして競合化合物CGI1746の1mMDMSO溶液から100μMの競合化合物溶液を調整した。また標的キナーゼとして、脱リン酸化不活性型BTKを0.2、1、3μMとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。ポリスチレン製384穴プレートの各ウェルに、酵素溶液と蛍光プローブ溶液を等量ずつ加え、室温で1時間インキュベートした。ブランクとして、酵素溶液の代わりにアッセイバッファーを添加したものを測定した。また、競合試験として、最終濃度5μMとなるように上記競合化合物溶液を加えて調整した反応溶液も測定した。各ウェルの蛍光強度をSynergyH1マイクロプレートリーダーBiotek社製で測定した測定波長:励起485nm/蛍光550nm。結果を図1に示す。図1に示されるように標的キナーゼである脱リン酸化不活性型BTKの存在により濃度依存的に蛍光プローブの蛍光強度の増加が認められる。また、競合化合物であるキナーゼ阻害剤CGI1746の添加により蛍光強度が低下することから、この系は結合部位特異的に起こり、また可逆的なことが理解される。実施例17脱リン酸化不活性型BTKを用いた蛍光プローブの結合活性測定蛍光プローブ実施例9の10mMDMSO溶液から、2mMを最高濃度として公比2でDMSO希釈した13濃度のDMSO溶液を、さらに実施例16記載のアッセイバッファーで1000倍希釈して、蛍光プローブ溶液を調整した0.1DMSO溶液。同様にして競合化合物CGI1746の1mMDMSO溶液から実施例16記載のアッセイバッファーを用いて40μMの競合化合物溶液を調整した。また脱リン酸化不活性型BTKを120nMとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。蛍光プローブ溶液40μL、コントロール溶液4DMSO-アッセイバッファー20μL、および酵素溶液20μLをポリプロピレン製384穴プレートのウェル中で混合し、1時間室温でインキュベートした後、各ウェルの蛍光強度をSynergyH1マイクロプレートリーダーで測定した測定波長:励起485nm/蛍光550nm。またコントロール溶液の代わりに競合化合物溶液を加えたウェルの蛍光強度も測定し、これをバックグラウンドとして測定値から差し引き、蛍光強度変化量ΔRFUとした。各蛍光プローブ濃度における蛍光強度変化量ΔRFUを蛍光プローブ化合物濃度に対してプロットし、飽和曲線を作成し、GraphPadPrism商標ソフトウェアGraphPadSoftware社製を用いて、蛍光プローブの乖離定数Kdを算出した。図2に測定結果を示す。脱リン酸化不活性型BTKに対する蛍光プローブ実施例9のKd値は63nMと測定された。この結果は、本発明の蛍光プローブが、不活性型BTKから非常に解離し易く、競合する不活性型キナーゼを標的とする候補化合物のスクリーニングに有用であることを示している。実施例18脱リン酸化不活性型BTKを用いた競合結合測定試験本発明の蛍光プローブ実施例9の1mMDMSO溶液を実施例16記載のアッセイバッファーで希釈し、100nMの蛍光プローブ溶液を調整した。また脱リン酸化不活性型BTKを100nMとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。被験化合物CGI1746の10mMDMSO溶液から、20μMを最高濃度として公比2でDMSO希釈した8濃度のDMSO溶液を、さらに実施例16記載のアッセイバッファーで25倍希釈して、薬物溶液を調整した4DMSO溶液。薬物溶液20μLと酵素溶液20μLをポリスチレン製384穴プレートのウェル中で混合し、15分後、蛍光プローブ溶液40μLを添加した。室温で2時間インキュベートした後、各ウェルの蛍光強度をSynergyH1マイクロプレートリーダーで測定した測定波長:励起485nm/蛍光550nm。蛍光強度とキナーゼ阻害剤濃度をプロットしIC50値を算出した。結果を図3に示す。脱リン酸化不活性型BTKと蛍光プローブ実施例9に対するCGI1746の競合阻害活性IC50値は22nMと測定された。つまり、本発明の蛍光プローブを用いて、既知の不活性型BTKを阻害する化合物CGI1746の阻害活性を決定できたことは、本発明の蛍光プローブが、不活性型キナーゼのスクリーニングに有効であることを示している。"