"昆虫の幼虫から得られる単離されたキモトリプシン又はその合成様式。キモトリプシンが図1若しくは図13の配列を有し、又は図1、2若しくは12のDNA配列によってコードされる、請求項1に記載のキモトリプシン。請求項1又は請求項2に記載のキモトリプシンと同じ活性を有するキモトリプシンの断片。キモトリプシンがルシリアセリカータの幼虫から得られる、請求項1から3の何れか一項に記載のキモトリプシン。キモトリプシンがルシリアセリカータの幼虫の排泄物/分泌物から得られる、請求項1から4の何れか一項に記載のキモトリプシン。幼虫が新たに孵化されている、請求項1から5の何れか一項に記載のキモトリプシン。幼虫が初齢である、請求項1から5の何れか一項に記載のキモトリプシン。幼虫が無菌環境中で育てられる、請求項1から7の何れか一項に記載のキモトリプシン。創傷の治療において使用するための、請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む組成物。創傷の治療用医薬の調製における、請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンの使用。キモトリプシンが図1、図2若しくは図13の配列を有し、又は図1、2若しくは12のDNA配列によってコードされる、請求項9又は請求項10に記載の使用。キモトリプシンの活性な断片が使用される、請求項9から11の何れかに記載の使用。キモトリプシンが合成である、請求項9から12の何れか一項に記載の使用。キモトリプシンがルシリアセリカータから得られる、請求項9から13の何れか一項に記載の使用。創傷が、切り傷、刺し傷、術創、潰瘍、褥瘡、やけど熱、凍結、化学物質、電気及び放射線によって引き起こされたやけどを含む。、皮膚の擦過又は暴行、骨髄炎並びに整形外科的創傷を含む群から選択される、請求項9から14の何れか一項に記載の使用。創傷が感染状態である、請求項9から15の何れか一項に記載の使用。創傷が慢性的である、請求項9から16の何れか一項に記載の使用。創傷が繊維芽細胞遊走の促進によって治療される、請求項9から17の何れか一項に記載の使用。創傷がマトリックス再構築の促進によって治療される、請求項9から17の何れか一項に記載の使用。創傷が繊維芽細胞形態の修飾によって治療される、請求項9から17の何れか一項に記載の使用。創傷がキモトリプシンによって郭清される、請求項9から20の何れか一項に記載の使用。請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む、創傷用の包帯。請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む医薬組成物。治療を必要としている創傷に、請求項1から8の何れか一項に記載のキモトリプシンを適用することを含む、創傷を治療する方法。請求項22に記載の包帯、請求項9に記載の組成物又は請求項23に記載の医薬組成物を、治療を必要としている創傷に適用する段階を含む、創傷を治療する方法。実施例1組織の再生繊維芽細胞の接着の促進ルシリアセリカータの幼虫の排泄物/分泌物の収集及び性質決定排泄物/分泌物ESを、以前に記載されているとおりにHorobinetal,2003、孵化した直後の無菌のルシリアセリカータの幼虫LarvETM,ZoobioticLtd,UKから収集した。簡潔に述べると、ES産物を回収するために、無菌のリン酸緩衝化生理的食塩水PBS1mL中において、室温でRT30分間、400個の生きた幼虫を洗浄した。それぞれ、Bio-RadHercules,CAタンパク質アッセイキット及びフルオレセインイソチオシアナートFITC-カゼイン消化アッセイHorobinetal,2003を用いて、ESのタンパク質濃度及びタンパク質分解活性を測定した。ともに、これらは、161.74μg/mLのタンパク質濃度及び6.04×106相対蛍光単位/mgESタンパク質の比活性であることを明らかにした。初代ヒト包皮繊維芽細胞HFF細胞培養ダルベッコの改変イーグル培地D-MEMGibcoTM,InvitrogenLtd,UK、10ウシ胎児血清FCSSigmaR,UK、抗生物質/抗真菌溶液SigmaR100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び0.25μg/mLアムフォテリシンB及び2mML-グルタミンSigmaRを含有するT75フラスコNunc,LifeTechnologiesLtd,UK内で、HFF細胞TCSCellworksR,UKを単層培養した。5CO2を含有する加湿された雰囲気中において、細胞を37°Cに維持した。三次元インビトロアッセイ-繊維芽細胞遊走通常の細胞培養上記参照に対して使用した濃度の2倍のD-MEM、抗生物質/抗真菌物質及びL-グルタミンを含有する原液を作製した。冷蔵後、1:1の比で、3mg/mLウシコラーゲンI型ICNBiomedicals,Ohio,USA、60μg/mLウシフィブロネクチンSigmaR及び幼虫のES又はPBSブランクを含有する冷溶液と原溶液を氷上で混合した。1×D-MEM、1.5mg/mLコラーゲン及び30μg/mLフィブロネクチンの最終濃度を得た。幼虫のESの最終タンパク質濃度は、表記されているように、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml又は10μg/mlであった。図3に示されているように、及びここに記載されているように、アッセイを組み立てた。すなわち、上述のように、58mm組織培養皿Nunc,LifeTechnologiesLtdの中に、D-MEM-コラーゲン/フィブロネクチン混合物1000μLを注ぎ、均一な薄い連続層の中に37°Cでゲル化した。HFF細胞継代6をトリプシン処理し、トリプシンを中和するために、10FCSを含有するD-MEM中に懸濁した。次いで、遠心によってそれらを沈降させ、FCSを含まないD-MEM中に再懸濁した。血球計数器を用いた細胞数の推定後に、細胞を再び沈降させ、1×107細胞/mLの密度で、D-MEM/コラーゲン/フィブロネクチンゲル混合物内に再懸濁した。次いで、皿の中のゲル層の上に、それぞれ、この細胞懸濁物2μLを含有する5つの小滴を配置し、ゲル化されるまで、37°Cで温置した。次いで、細胞小滴を完全に覆うために、細胞小滴の上に、D-MEM/コラーゲン/フィブロネクチン混合物をさらに1000μLに注ぎ、ゲル化させるために37°Cで放置した。最後に、上部ゲル層を覆うために、ゲル中と同じ濃度で抗生物質/抗真菌物質、L-グルタミン及びPBSブランク又は幼虫のESを含有する、FCSを含まないD-MEMを添加した。次いで、表記の時間、加湿された5CO2雰囲気中、37°Cで、組み立てられたアッセイを温置した。この間、無菌条件を維持した。各実験を通じて、計48時間の期間にわたって、位相差を用いる倒立LeicaUKDMIRB顕微鏡を通して、細胞を観察した。24時間の温置後に細胞遊走を定量するために、各ゲル内に包埋された各細胞小滴の領域全体を示す低倍率画像を使用した。ここで、24時間の温置後の同じ小滴の画像上に0時間の時点での各細胞小滴の画像を重ね合わせるために、MicrosoftPaintShopPro6を使用した。図4に示されているように、次いで、LeicaQUIPSソフトウェアを用いて、これらの複合画像を分析した。最初に、0時間での、各細胞小滴を取り囲む周囲の距離を計算した。この後、24時間の期間にわたって、元の細胞小滴周囲を横切り、元の細胞小滴周囲から離れるように遊走した細胞の数を計数した。変動する小滴周囲距離を補正するために、遊走する細胞の数は、元の細胞小滴境界のmm周囲長当りの細胞として表された。各細胞が周囲から離れるように遊走した直線距離も測定した。48時間の温置後、4パラホルムアルデヒドTAAB,Aldermaston,UK中に、20分間、完全な状態のゲルを固定した後、1ウシ血清アルブミンBSASigmaRを含有するPBSで3回洗浄した。次いで、20mMN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸;4-2-ヒドロキシエチルピペラジン-1-エタンスルホン酸HEPES、300mMスクロース、50mMNaCl、3mMMgCl2及び0.5TritonX-100全てSigmaRからを含有する氷冷した透過溶液pH7.4を添加し、10分間放置した。再度、1BSAでゲルを洗浄した。エタノール中の0.08FITC-ファロイジンSigmaR溶液を1BSAで1:100希釈し、次いで、ゲルに添加した。30分後、先述のように、ゲルを洗浄した。10μg/mLヨウ化プロピジウムPISigmaRを含有するBSA1を添加し、ゲルを再度洗浄する前に、1分間放置した。FITC-ファロイジン/PI染色後、過剰な液体を除去するために、ゲルを慎重に吸収転移させ、Bio-Rad蛍光搭載培地及びカバーガラスを載せた。LeicaDMRBE直立蛍光顕微鏡を内蔵した共焦点LeicaTCS4Dシステムを用いてゲルを可視化した。遊走している細胞の形態を観察するために、細胞小滴の縁の最大強度画像を撮影した。ゲルの光学的断面のZシリーズも撮影し、組み立て直後に固定及び染色された別のアッセイの撮影された光学的断面0時間温置と比較した。これは、小滴から全ての方向に細胞遊走が起こったことを示すために行われた。統計解析各処理内において各細胞小滴反復のmm周囲当りの遊走する細胞数に相当する値を平方根に変換した。次いで、GraphPadPrismTMソフトウェアを用いて、これらを一元配置の分散分析ANOVA及びダネットの多重比較検定にかけた。各処理内の各小滴反復下で、細胞によって達成された直線遊走距離をまとめた。次いで、正常な分布を確保するために、それらを対数変換し、適切な処理カテゴリー下において、幾何平均を順に並べた。GraphPadPrismTMソフトウェア内で使用できる一元配置のANOVA及びダネットの多重比較検定を用いて、順に並べられた平均を解析した。全ての事例で、各分散を確認し、統計的な有意性をP<0.05と定義した。三次元インビトロアッセイ-繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化I別の実験において、僅かな修飾を加えて、上述のように三次元インビトロアッセイを組み立てた。ここで、3×105細胞/mLのより低い細胞密度を含有する1つの20μL小滴を各アッセイ中に組み込んだ。1μg/mLES、5μg/mLES又はPBSブランク対照の何れかでアッセイを処理した。位相差顕微鏡を用いて、0、24及び48時間の温置後に、細胞の形態を観察した。ゲルマトリックスの外観にも着目した。三次元インビトロアッセイ-繊維芽細胞遊走繊維芽細胞の遊走を調べるために、三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイ組み立て直後0時間又は48時間の温置後48時間に固定されたゲルの共焦点顕微鏡画像は、第一に、0時間の温置の時点で細胞小滴の外側に細胞が全く観察されなかったこと、第二に、48時間にわたって細胞小滴からの細胞の遊走が水平及び垂直の両配向で起こることを確認し、遊走の三次元の性質を確認したHorobinAJPhDthesis,2004。幼虫のESに応答する細胞の遊走を定量する上で、2つの別個の実験を行った。一方の実験は、ESが存在しない対照に対して0.1μg/mLES及び5μg/mLESの効果を比較した。他方の実験は、別の対照と比較した場合の1μg/mLES及び10μg/mLESの効果を調べた。各実験において、同じフラスコ及び継代からの細胞を使用した。各小滴からの細胞遊走を調べるために画像を撮影した。24時間の温置で、5μg/mLのESの存在下での細胞の遊走が最も大規模であるように見受けられることが視覚的観察によって明らかとなった図5a。形態的には、これらの細胞は、対照内の細胞より十分に広がっているようにも見受けられ、周囲のゲル中に、より長く、より多数の伸長突起を突出させていた図6a。48時間の温置までに、5μg/mLESに曝露されたゲルは半透明であり、皿の表面から剥離された状態となった。細胞小滴は収縮し、マトリックスを内側に引っ張り、小滴間のマトリックス内の張力を増加させた。この時点までに、1μg/mLESに曝露された細胞は、それぞれの対照よりさらに遊走するように見受けられ図5b、周囲のゲル中に長い伸長突起を有する十分に広がった形態も採っていた図6b。これに対して、10μg/mLESの存在下の細胞小滴はサイズが低下し、細胞の幾つかの領域は緊密な暗い塊へ収縮していた図5b。これは、予めゲル化された溶液の、この時点で、透明な粘性のある液体状態と関連していた可能性がある。対照と比較すると、10μg/mLESに曝露された細胞の形態は明確に異なっていた。ここでは、24時間の温置において、細胞は多数の細い伸長突起を呈し、それらの幾つかは極めて長かった図6c。48時間の温置では、細胞は収縮して、丸くなるが、長く、細い細胞間伸長突起の突出を通じた他の細胞との直接的な物理的接触を維持していた図6d。各小滴の全体を見ることができる低倍率画像を用いて、各小滴からの細胞遊走の合計を定量した。24時間の温置で、適切な対照と比べて、遊走している細胞の数P<0.01図7及び移動した距離P<0.001図8の両方の観点で、5μg/mLESは細胞の遊走を有意に増強したことが分析によって確認された。1μg/mLのESも、その対照を上回って、細胞遊走を有意に増強した細胞数に関してP<0.01及び移動した距離に関してP<0.05図7、8。これに対して、10μg/mLのESは、その対照と比べて、細胞遊走を有意に阻害した細胞数に関してP<0.01及び移動した距離に関してP<0.001図7、8。0.1μg/mLESへの曝露は、遊走する細胞の数を僅かに阻害するように見受けられた対照に対してP<0.05図7。しかしながら、0.1μg/mLESは、対照と比べて、遊走距離に対して有意な影響を有さずP>0.05図8、細胞の形態にも影響を与えないように見受けられたデータは示さず。実験1の対照図7a中で遊走する細胞の数は実験2の対照図7b中より高いことにも注目し得る。実験間のこのような差は、血球計測器を用いて細胞数を推定する場合に避けることができない誤差水準によってもたらされる細胞小滴内の細胞密度の僅かな差によるものであり得る。しかしながら、このような潜在的な変動源は実験間に存在するに過ぎず、各実験内の各アッセイを組み立てるために、多数の細胞の計数に同じものが使用されたので実験内には存在しない。従って、各実験内で結果を比較することはなお妥当であるが、実験間で結果を比較することは妥当でない。三次元インビトロアッセイ-繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化II繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化を調べるために、繊維芽細胞のより低い密度を含有する三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイを組み立てた直後には、ESの存在下又は不存在下の細胞は同じように見えた図9。しかしながら、24時間の温置までに、1μg/mLES、特に5μg/mLESの存在下の細胞は、ESの不存在下の細胞より、より長い細胞質伸長突起を有するより十分に広がった形態を採った。5μg/mLのESが存在する場合には、細胞間の並列された鎖様結合性マトリックス原繊維が観察された。48時間の温置では、アッセイ間の差はより顕著であった。この時点までに、ESの不存在下では、細胞はより丸い状態となった図9。一方、1μg/mLのES又は5μg/mLのESに曝露された細胞は十分に広がった形態を維持していた。5μg/mLのESに曝露された細胞間で観察された、並列された鎖様結合性原繊維は、より見やすく、数が多かった。さらに、マトリックスはより透明であるように見え、原繊維の無作為な網目構造はより目立たなかった。比較例1本発明者らは、ESキモトリプシンの効果を市販のウシキモトリプシンと比較するためにさらなる実験を行った。従って、フィブロネクチンへの繊維芽細胞の接着に対するESの効果をトリプシン及びキモトリプシンの市販の調製物と比較した。これは、ES、市販のトリプシン又は市販のキモトリプシンの様々な濃度の存在下で、フィブロネクチンで被覆された表面上に繊維芽細胞を播種することによって達成された。最大48時間の温置期間後に、全ての培地から試料を吸引し、穏やかに洗浄して、表面に付着することができなかった細胞を除去した。次いで、検出されたATPの濃度に従って、表面上に残存する細胞の相対数を定量するためにアデノシン三リン酸ATPアッセイを行った。トリプシン特異的な基質に対する活性の同等のレベルを含有するES及びトリプシンの効果を比較すると、ESは、表面への繊維芽細胞の接着を低下させる上でより効果的であった。例えば、24時間の温置後、5μg/mLのESは、対照の16.6まで細胞接着を低下させた図10a。トリプシン特異的な蛍光発生基質トシル-Gly-Pro-Arg-AMCに対するESの活性の103.2を示した市販のトリプシン1.6μg/mLは、対照の34.9まで細胞接着を低下させた。48時間の温置後、5μg/mLESの存在下での細胞接着は対照の9.3まで減少したのに対して、1.6μg/mLの市販のトリプシンは細胞の接着を対照の24.7まで低下させた。キモトリプシン特異的な蛍光発生基質Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMCに対する5μg/mLのESの活性の94.1を示した市販のキモトリプシン0.1μg/mLは、繊維芽細胞の接着を修飾する能力を示さなかった図10b。キモトリプシン特異的な基質に対する5μg/mLのESの活性の204.9を示す0.2μg/mLの市販のキモトリプシンでさえ、繊維芽細胞接着に対して効果を有していなかった。市販のトリプシンと市販のキモトリプシンの両方に曝露された繊維芽細胞は、市販のトリプシンのみの同様の濃度に曝露された細胞を上回る接着の修飾を同時に一切示さなかった。これらの結果は、繊維芽細胞接着を修飾する上で、ES内に存在するキモトリプシンなどの酵素が市販のトリプシン若しくは市販のキモトリプシン単独又は組み合わせより有効であることを示している。ESが繊維芽細胞の接着を修飾する能力が、タンパク質分解を介して、フィブロネクチンで被覆された表面を修飾するその能力と関連していることが以前の研究によって示されているHorobinetal2003、上記。従って、これらの結果は、細胞外マトリックスタンパク質を分解する上で、ESは、市販のトリプシン又は市販のキモトリプシンより有効であり得ることを示唆している。これは、ゲル電気泳動を用いて確認される。ここでは、トリプシン特異的又はキモトリプシン特異的な基質に対して類似の活性を有する溶液を得るために、幼虫のES、市販のトリプシン、市販のキモトリプシン又は市販のトリプシンと市販のキモトリプシンの組み合わせの試料を希釈した。次いで、12ポリアクリルアミドゲル上で分離する前に、24時間、ウシフィブロネクチン100μg/mLを、37°Cで、これらの溶液に曝露した。図示されているように、ESは、市販の両酵素と比較した場合に、フィブロネクチンを主により小さな断片へより大規模に分解した図11。さらに、ES内に存在するタンパク質分解性酵素は繊維芽細胞の遊走を強化することが示されたHorobinetal2005上記。これは、繊維芽細胞の接着の変化と関連し得る。創傷の中で、繊維外細胞の遊走の加速は、創傷空間中への肉芽組織増殖を促進し得る。このように、ES由来の酵素は、現在市販されている酵素より有効な創傷郭清因子であることが明らかとなり得るのみならず、創傷治癒応答も同時に増強し得る。実施例2創傷郭清ウジのキモトリプシンの精製L.セリカータES産物のSephacrylS300クロマトグラフィー。ガラスクロマトグラフィーカラム1.5cm×50cmにSephacrylS-300HRを充填し、PBSで平衡化した流速0.33mL/分。幅広い範囲のゲルろ過標準物質200-12.5kDa,Sigmaを用いて、カラムを較正し、空隙容量を求めた。L.セリカータのES産物約2mL0.5mgをカラムにかけ、空隙容量50画分の溶出後2mL/画分を集め、それぞれ、蛍光性基質Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC及びトリス-Gly-Pro-Arg-AMCを用いて、キモトリプシン及びトリプシン活性に関してアッセイを行った。S300ゲルろ過後のキモトリプシン/トリプシン活性を示す図14及び15を参照されたい。典型的には、トリプシンが濃縮された2つのピークT1及びT2と名付けられた。及びキモトリプシン活性が濃縮された1つのピークC1と名付けられた。というタンパク質分解活性の3つのピークが観察された。図15は、ゼラチンSDS-PAGE基質ゲル分析によって測定された活性の各ピークに対して典型的なタンパク質分解特性も示す。蛍光性合成ペプチド基質を用いたキモトリプシン/トリプシン活性のアッセイ7-アミノ-4-メチルクマリンAMCの、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMCキモトリプシン及びトシル-Gly-Pro-Arg-AMCトリプシンからの放出をモニタリングすることによって、キモトリプシン/トリプシン活性を評価した。PBS中に希釈された基質150μL5μMとともに各画分50μLを温置した。37°Cで30分間、試料を温置し、その後、DynexMFXマイクロプレート蛍光光度計を用いて蛍光を測定した励起365nm、発光検出465nm。ゼロ時点の読み取りの推測後、30分にわたって発せられた蛍光単位の数として、タンパク質分解活性を表す。ゼラチン基質SDS-PAGEを用いたキモトリプシン/トリプシン活性のアッセイKumarPritchard1992によって記載された方法を用いて、基質SDS-PAGEを実施した。分離ゲル中に0.1w/vゼラチンを含めて、12w/vSDS-PAGEゲルを調製した。ゼラチンを溶解するために、ゲルを55°Cまで加温した。各画分10μLを非還元試料緩衝液0.5MTris、pH6.8、5SDSw/v、20グリセロールw/v、0.01ブロモフェノールブルーの等容量と混合し、37°Cで30分間温置した。次いで、スタッキングゲル中に形成された各ウェルに画分を適用し、20mAの定常電流で試料を電気泳動した。電気泳動後、LacksSpringhorn1980によって記載されたように酵素を再生するために、室温で20分間、2.5TritonX-100中でゲルを洗浄した。次いで、水の中で20分間、ゲルを洗浄し、最後に、PBS中において、37°Cで一晩温置した。CoomassiebrilliantblueR250でゲルを染色することによって、タンパク分解活性を検出し、青の背景に対する透明なバンドの領域として観察される。大豆トリプシン阻害剤アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるキモトリプシンの精製キモトリプシン活性のC1プールの塩濃度を0.5MNaClに調整し、PBS、0.5MNaClで平衡化された大豆トリプシン阻害剤アガロースカラム3mL流速0.2mL/分にかけた。カラムを通過する緩衝液の280nmでの吸光度がゼロになるまで、PBS、0.5MNaClでカラムを洗浄した。0.7エタノールアミンによって、結合されたタンパク質を溶出し、1mL画分を集め、2MTris-Cl1:1v/vで直ちに中和し、プールし、PBSに対して一晩透析した図16。蛍光性基質及びゼラチンSDS-PAGEを用いるタンパク分解活性に関して、溶出されたタンパク質をアッセイした図17。図17は、C1プールの適用後に大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示している。大豆トリプシン阻害剤アガロースカラムから溶出するタンパク質はキモトリプシンの基質Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Arg-AMCを切断し、PMSFによってのみ阻害され得ることが示された。トリプシンの基質トシル-Gly-Pro-Arg-AMCに対しては、活性が見られなかった。ゼラチン基質SDS-PAGEによって分析すると、タンパク質分解活性の少なくとも3つの異なる領域が観察された矢印が付されている。。大豆トリプシン阻害剤アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるトリプシンの精製同様に、大豆トリプシン阻害剤カラムにトリプシン画分のT2プールを通した。カラムから溶出する画分を直ちに中和し、プールし、PBSに対して一晩透析した図19。図19は、T2プールの適用後に大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示している。大豆トリプシン阻害剤アガロースカラムから溶出するタンパク質はトリプシンの基質トシル-Gly-Pro-Arg-AMCを切断し、PMSF及びAPMSFによって阻害され得ることが示された。キモトリプシンの基質Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Arg-AMCに対しては、活性が見られなかった。ゼラチン基質SDS-PAGEによって分析すると、タンパク質分解活性の少なくとも1つの明瞭な領域が観察された矢印が付されている。。創傷痂皮に対するES産物の効果L.セリカータES産物10μgとともに、創傷痂皮の約1mgを一晩温置した。温置後、Biorad等電点電気泳動再水和緩衝液8M尿素、2CHAPS、50mMDTT、0.2Ampholytes中に処理された痂皮及び処理されていない痂皮を溶解した。Biorad2Dタンパク質クリーンアップキットを用いて、タンパク質をさらに精製し、得られた沈降物を等電点電気泳動再水和緩衝液中に再度可溶化した。次いで、二次元ゲル分析によって、創傷痂皮に対するES産物の効果を調べた。製造業者によって記載された条件下で、ReadyStrip7cmIPG片pH3から10Bioradを用いて、タンパク質約100μgを一次元に集中させた。10トリセンゲルを用いて、二次元SDS-PAGEを実施したSchaggerandVonjagow,1987。CoomassieブルーR250でゲルを染色した。図20。創傷痂皮に対するキモトリプシン/トリプシンプールの効果L.セリカータC1、T1又はT2プール100μLとともに、創傷痂皮の約1mgを一晩温置した。温置後、処理された痂皮及び処理されていない痂皮を上記のように処理した。次いで、二次元ゲル分析によって、創傷痂皮に対するC1、T1又はT2プールの効果を調べた。上記のように、タンパク質約100μgを二次元に集中させた。CoomassieブルーR250でゲルを染色した。図21。L.セリカータのキモトリプシン遺伝子をクローニングするNcoI制限部位5’-CTGCCATGGTCATGAAATTCTTAATAGTT-3’を付加するフォワードプライマー及びNheI部位5’-GACGCTAGCATAAGAAATTCCGGTGTG-3’を付加するリバースプライマーを使用するPCRによって、cDNAライブラリーからL.セリカータキモトリプシノーゲンの完全長翻訳領域ORFを増幅した。生じた断片をpBac-3中のポリヘドリンプロモーターの下流にクローニングさし、配列決定し図12、アミノ酸配列を予想した図13。従って、ルシリアセリカータのESが本明細書に示されているアミノ酸及びDNA配列を有するキモトリプシン酵素を含有し、この酵素は創傷を郭清するとともに、繊維芽細胞の遊走の促進によって、マトリックス再構築の促進によって、及び繊維芽細胞の形態の修飾によって創傷の治癒を促進すると結論付けることができる。"