"ヒトα-シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性およびα-シヌクレインモノマーの低結合性を有する抗体またはその断片であって、3種の可変重鎖VHCDR配列VH-CDR-1、VH-CDR-2、およびVH-CDR-3および3種の可変軽鎖VLCDR配列VL-CDR-1、VL-CDR-2、およびVL-CDR-3を有し、該抗体またはその断片の6種のCDR配列は、以下の各群から選択される抗体またはその断片:VH-CDR-1配列番号:22、23、24、25、26または27VH-CDR-2配列番号:28、29、30、31、32、33または34VH-CDR-3配列番号:35、36、37、38、39または40VL-CDR-1配列番号:41、42、43、44、45または46VL-CDR-2配列番号:47、48または49VL-CDR-3配列番号:50、51、52、53、54または55。該抗体またはその断片の6種のCDR配列が、以下の各群から選択される請求項1に記載の抗体またはその断片:VHCDR-1配列番号:23、24、25または26VHCDR-2配列番号:29、30、31または32VHCDR-3配列番号:36、37、38または39VLCDR-1配列番号:42、43、44または45VLCDR-2配列番号:47または48VLCDR-3配列番号:50、51、52または53。以下の組合せから選択されるCDR配列の組合せを有する請求項1に記載の抗体または断片:配列番号:22、28、35、41、47及び50、配列番号:23、29、36、42、47及び50、配列番号:24、30、37、43、48及び51、配列番号:25、31、38、44、47及び52、配列番号:26、32、39、45、47及び53、配列番号:23、33、37、43、48及び54、並びに配列番号:27、34、40、46、49及び55。該抗体またはその断片が、11アミノ酸オーバーラップを有する15量体アルファ-シヌクレインペプチドを含むモデル系における固定化直鎖α-シヌクレインのアミノ酸領域113~140、例えばアミノ酸領域113~131の範囲内のエピトープ、特にエピトープアミノ酸125~131、121~124、121~127、121~131、113~123または136~140に結合する請求項1乃至3のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。ヒトα-シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性およびα-シヌクレインモノマーの低結合性を有する抗体またはその断片であって、3種の可変重鎖VHCDR配列VH-CDR-1、VH-CDR-2、およびVH-CDR-3および3種の可変軽鎖VLCDR配列VL-CDR-1、VL-CDR-2、およびVL-CDR-3を有し、該抗体またはその断片の6種のCDR配列は、以下の各群、および該各群の配列のいずれかと70、80、90、95または98超の類似性を有する配列から選択され:VH-CDR-1配列番号:22、23、24、25、26または27VH-CDR-2配列番号:28、29、30、31、32、33または34VH-CDR-3配列番号:35、36、37、38、39または40VL-CDR-1配列番号:41、42、43、44、45または46VL-CDR-2配列番号:47、48または49VL-CDR-3配列番号:50、51、52、53、54または55、該抗体またはその断片は、11アミノ酸オーバーラップを有する15量体α-シヌクレインペプチドを含むモデル系における固定化直鎖α-シヌクレインのアミノ酸領域113~140、例えばアミノ酸領域113~131の範囲内のエピトープ、特にエピトープアミノ酸125~131、121~124、121~127、121~131、113~123または136~140に結合する抗体またはその断片。請求項1乃至5のいずれか1項に記載の抗体または断片、および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。請求項1乃至5のいずれか1項に記載の抗体または断片を、α-シヌクレインプロトフィブリルを含む、または含む疑いのある生物試料に添加する工程、およびα-シヌクレインプロトフィブリルと該抗体または断片との間で形成された複合体の存在を検出する工程を含むα-シヌクレインプロトフィブリルを検出する方法。請求項1乃至5のいずれか1項に記載の抗体もしくは断片または請求項6に記載の組成物を個体に投与することを含む、個体においてα-シヌクレイン病変を有する神経変性障害を予防する、α-シヌクレイン病変を有する神経変性障害の発症を遅延させる、またはα-シヌクレイン病変を有する神経変性障害を治療する方法。該神経変性障害が、パーキンソン病PD、レビー小体型認知症DLB、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、アルツハイマー病、ダウン症候群、多系統萎縮症、精神病、統合失調症またはクロイツフェルトヤコブ病である、請求項8に記載の方法。α-シヌクレイン病変を有する神経変性障害の治療のための医薬組成物の製造のための請求項1乃至5のいずれか1項に記載の抗体または断片の使用。該神経変性障害が、パーキンソン病PD、レビー小体型認知症DLB、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、アルツハイマー病、ダウン症候群、多系統萎縮症、精神病、統合失調症またはクロイツフェルトヤコブ病である、請求項10に記載の使用。α-シヌクレイン病変を有する神経変性障害の発現の診断またはモニタリングのための請求項1乃至5のいずれか1項に記載の抗体もしくは断片または請求項6に記載の組成物の使用。パーキンソン病PD、レビー小体型認知症DLB、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、ダウン症候群、多系統萎縮症、精神病、統合失調症またはクロイツフェルトヤコブ病の発現の診断またはモニタリングのための請求項12に記載の使用。請求項1乃至5のいずれか1項に記載の抗体もしくは断片または請求項6に記載の組成物を、可溶性α-シヌクレイン種を含む試料に投与することによりα-シヌクレイン凝集を低減させる、または阻害する方法。種々の図面は、以下に説明する実施例を考慮してより十分に理解される。第1の実施形態において、本発明は、ヒトα-シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性およびα-シヌクレインモノマーの低結合性を有する改善された抗体およびその断片を対象とする。具体的な実施形態において、抗体は、IgGクラスまたはこの突然変異の抗体である。本開示の範囲内では、ヒトα-シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性は、抗体または断片がヒトα-シヌクレインプロトフィブリルについて10-7M未満の解離定数Kdを示すことを意味する。当分野において公知のとおり、プロトフィブリルは、α-シヌクレインの可溶性オリゴマーである。典型的なプロトフィブリルは、参照として使用される球状タンパク質を用いるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して適切に計測される約1000から約5000kDaの範囲内の分子量を有するが、本発明はこのような典型的なプロトフィブリルに限定されるものではない。さらに、本開示の範囲内では、α-シヌクレインモノマーの低結合性は、α-シヌクレインモノマーへの本発明による抗体または断片の結合性がα-シヌクレインプロトフィブリルへの結合性よりも少なくとも100倍少ないことを意味する。具体的な実施形態において、これらの結合親和性は、例えば実施例4に記載の競合ELISAに従って計測される。本発明はさらに、限定されるものではないが、パーキンソン病PD、レビー小体型認知症DLB、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、およびクロイツフェルトヤコブ病を含むα-シヌクレイン病変を有する神経変性障害の予防、発症遅延、治療、モニタリングおよび/または診断の改善のための方法ならびにこのような抗体および断片の使用に関する。α-シヌクレイノパチーにおいて、レビー小体およびレビー神経突起として凝集したα-シヌクレインは脳内に蓄積し、一部の兆候においては他の器官内にも蓄積する。本発明による抗体の例は、古典的なハイブリドーマ技術により開発した。抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。具体的な実施形態において、抗体はモノクローナルである。本開示は、多くの例において抗体およびその断片を指す一方、便宜上の目的のため、本開示における用語抗体は、この活性断片、すなわち本発明による抗体の定義に使用される同一の特徴、すなわちα-シヌクレインオリゴマー/プロトフィブリルについての高親和性およびα-シヌクレインモノマーの低結合性を有する断片を意味するその断片を含む。抗体およびその断片は、病原型のα-シヌクレインのクリアランスの高い効率を示す。本発明の抗体は、非修飾またはコンジュゲート化された、例えば4-ヒドロキシ-2-ノネナールHNEもしくは4-オキソ-2-ノネナールONE、または病原性プロトフィブリル/オリゴマーα-シヌクレインエピトープを安定化させる他のα,β-不飽和ヒドロキシアルケナール、またはポリ不飽和脂肪酸にコンジュゲート化されたα-シヌクレインを含む凝集型、特にプロトフィブリルを結合させる。前記1種以上のエピトープは、α-シヌクレイノパチー、例えば、限定されるものではないが、パーキンソン病、DLBなどの患者からのヒト脳内に存在するコンホメーション変化または修飾されたα-シヌクレイン、すなわち、α-シヌクレインプロトフィブリルおよびオリゴマー上に存在する。本発明の抗体は、家族性PDを引き起こすと記載されているα-シヌクレイン突然変異体、例えばA30PおよびA35TKrugeretal1998Polymeropoulosetal1997により形成された病原性プロトフィブリル/オリゴマー構造も結合させる。本発明の抗体についてのこのような標的の別の例は、PDまたはDLBを引き起こす突然変異体α-シヌクレインE46Kにより形成されたプロトフィブリルである。本発明の1つの具体的な実施形態において、限定されるものではないが、例えばパーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、アルツハイマー病、ダウン症候群、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、クロイツフェルトヤコブ病および他の神経変性障害を含むα-シヌクレイノパチー関連障害の区別、診断、発現リスク同定、および/または治療のためのモノクローナル抗体が提供される。本発明の抗体および断片は、PDおよびまたはDLB疾患エピトープを含有する可溶性α-シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性を有する抗体からの可変軽鎖VLおよび可変重鎖VH上のCDR1~3領域の定義されたアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、CDR領域は、Fc領域の修飾部と組み合わせてエフェクター機能、例えば、限定されるものではないが、Fc受容体結合、補体因子C1q結合、実効半減期、補体活性化および炎症過程をモジュレートする。抗体の定常領域は、特にFc受容体および補体因子C1qを結合させる多くの重要な機能を有する。このC1q結合機能を不活性化させて炎症反応を回避することができる。α-シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性およびα-シヌクレインモノマーへの低結合性を有する本発明の抗体および断片は、他の公知の免疫療法治療モダリティと比較すると以下の区別される利点を有する。1本発明の抗体および断片は、疾患を引き起こすα-シヌクレインプロトフィブリルを、例えばオリゴマー化を阻害することにより実施例10を参照のこと、または他の機序により標的とし、不活性化または少なくとも低減させる。2本発明の抗体および断片により示されるα-シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性は、有効な治療に必要とされる臨床用量を低減させる。3本発明の抗体および断片は、活性免疫化方針、例えばワクチンと比較して高齢患者における正確な投与のためのモダリティを提供する。4末梢/全身におけるα-シヌクレインモノマーへの低結合性により、こうしてより多くの抗体/断片が脳内のα-シヌクレインオリゴマー形態の結合および排除に利用可能となる。5抗体および断片は、補体因子C1qへの低結合性または非結合性により炎症副作用、例えば髄膜脳炎のリスクを低減させる。本発明の一態様は、ヒト野性型および突然変異体α-シヌクレインプロトフィブリルの結合について重要な役割を担うCDR領域の抗体アミノ酸配列の発見である。本発明による結合部位CDR領域を有する抗体は、野性型ヒトα-シヌクレインオリゴマー/プロトフィブリルについての高親和性を特徴とし、治療または診断薬として使用される。免疫グロブリンIgG分子の基本構造は、ジスルフィド架橋により一緒に結合している2本の同一の軽鎖および2本の同一の重鎖を含む。軽鎖は、ラムダまたはカッパであるが、それぞれ約110アミノ酸残基の可変領域VLおよび定常領域CLを有する。重鎖は、約110アミノ酸残基の可変領域VHを有するが、CHγ1、CHγ2およびCHγ3領域またはドメインを含む300~400アミノ酸残基のかなり大きい定常領域CHを有する。定常領域Fcは、補体系を活性化させ、感染微生物または外来/非自己抗原を捕食し、破壊するマクロファージ、小膠細胞および好中球上のFc受容体に結合する。この機能は重要である。それというのも、この機能は、抗体の治療原理、すなわち、Fc受容体介在性小膠細胞食作用およびα-シヌクレインプロトフィブリルのクリアランスの一部であるからである。リソソーム分解経路を介するα-シヌクレインオリゴマー中間体のクリアランスが実証されているLeeetal2004。この過程は、抗体/プロトフィブリル複合体の受容体依存性または受容体非依存性エンドサイトーシスに続く、α-シヌクレインプロトフィブリルが分解されるリソソームとの融合を含むMasliahetal2005。この過程を制御することが示唆されている受容体としては、Thy1.1受容体およびリポタンパク質受容体関連タンパク質LPRが挙げられる。他の抗α-シヌクレインクリアランス機序もまた作動する可能性が高い。可溶性α-シヌクレインプロトフィブリルのクリアランスは、本発明による治療の中心的機序である。α-シヌクレインプロトフィブリルは、高度に神経毒性であり、疾患過程を開始させ、進行させるものとみなされる。脳内のα-シヌクレインプロトフィブリルのクリアランスは、臨床的にかなり価値がある。α-シヌクレインプロトフィブリルのクリアランスに加え、α-シヌクレインフィブリルを含む他のα-シヌクレイン凝集形態は、α-シヌクレインフィブリルに対する前駆形態、例えばα-シヌクレインプロトフィブリル、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高級なオリゴマー形態の除去を介して間接的に低減される。プロトフィブリルおよびフィブリルを含む異なるα-シヌクレイン形態は、平衡状態にある。高親和性プロトフィブリル結合抗体を用いる処理および前記抗体によるα-シヌクレインプロトフィブリルのクリアランスは、他の凝集α-シヌクレインまたはオリゴマー形態を間接的に低減させるという利点も有する。抗体の作用のさらに別の機序は、毒性α-シヌクレイン種に結合することによりα-シヌクレイン毒性を遮断または阻害し、ニューロンとのこれらの相互作用を妨げることである。重鎖および軽鎖の各可変領域は、相補性決定領域またはCDRと呼ばれる3種の超可変領域を含有する。CDR領域は、VLおよびVH領域内に局在している約7~23、例えば13~23アミノ酸の短い伸長部である。抗体の1本のアーム上の6種のCDR領域は、抗原を結合させるポケットを形成する。CDR配列のいくつかの定義が文献において使用される。配列番号1~21は、第1の同定系を使用して本発明のCDR配列を定義し、こうして同定されたCDR配列を表1実施例2を参照のことのヒト野性型および突然変異体α-シヌクレインプロトフィブリルに特異的なモノクローナル抗体中のVLおよびVH中に下線領域により示す。配列番号22~55は、公知のKabat系を使用して本発明のCDR配列を同定し、こうして同定されたKabatCDR配列を表2実施例2を参照のことのヒト野性型および突然変異体α-シヌクレインプロトフィブリルに特異的な抗体中のVLおよびVH中に下線領域により示す。Kabatによる本発明のCDR配列の同定配列番号22~55を本開示において使用する。したがって、一実施形態において、本発明による抗体は、CDR配列の以下の各群のそれぞれから任意の組合せで選択される6種のCDR配列VH-CDR-1、VH-CDR-2、VH-CDR-3、VL-CDR-1、VL-CDR-2、およびVL-CDR-3を有することを特徴とする。VHCDR-1GFTFNTYAM配列番号:1GFTFNTYAMN配列番号:22GFTFSNYAM配列番号:2GFTFSNYAMS配列番号:23GFTFSSYAM配列番号:3GFTFSSYAMS配列番号:24GDSFTSGYW配列番号:4GDSFTSGYWN配列番号:25GFSLTSYGVH配列番号:26GFTFTDYYMS配列番号:27VHCDR-2RIRTKSNDYATYYADSVKG配列番号:5RIRTKSNDYATYYADSV配列番号:28TVTSGGSYTYYPDSVRG配列番号:6TVTSGGSYTYYPDSV配列番号:29TISNGGSYTYYPDSVKG配列番号:7TISNGGSYTYYPDSV配列番号:30YIRYSGNTYYNPSLKS配列番号:8YIRYSGNTYYNPSL配列番号:31VIWRGGSTDYSAAF配列番号:32TISTGGSYTYYPDSV配列番号:33FIRNKANGYTTEYSASV配列番号:34VHCDR-3VGYRPYAMDY配列番号:9配列番号:35QNFGSRGWYFDV配列番号:10配列番号:36HSDYSGAWFAY配列番号:11配列番号:37SYYDYDRAWFAY配列番号:12配列番号:38LLRSVGGFAD配列番号:39DYGNYAMDY配列番号:40VLCDR-1RSSQNIVHSNGNTYLE配列番号:13配列番号:41RSSQSIVNSNGNTYLE配列番号:14配列番号:42SASSSVSYMY配列番号:15配列番号:43RSSQSLVHSNGNTYLH配列番号:16配列番号:44RSSQTIVHNNGNTYLE配列番号:45KSSQSLLYSSNQKNYLA配列番号:46VLCDR-2KVSNRFS配列番号:17配列番号:47RTSNLAS配列番号:18配列番号:48WASTRES配列番号:49VLCDR-3FQGSHVPLT配列番号:19配列番号:50QQYHSYPYT配列番号:20配列番号:51SQSTHVPWT配列番号:21配列番号:52FQGSHVPFT配列番号:53QQFHSYPYT配列番号:54QQYYSYPYT配列番号:55ある興味深い特徴について最初に選択された抗体の1種は、排斥した。それというのも、この抗体は本発明による抗体を定義する基準を満たさなかったからである。この排斥についての重要なパラメータは、この抗体により曝露された5アミノ酸を有する比較的短いVHCDR-3配列であった。したがって、VHCDR-3配列は5超のアミノ酸である必要があると結論付けられる。具体的な実施形態において、VHCDR-3配列は9、10、11または12アミノ酸である。具体的な実施形態において、本発明による抗体および断片は、以下の組合せから選択される6種のCDR配列を有する。配列番号:22、28、35、41、47及び50、配列番号:23、29、36、42、47及び50、配列番号:24、30、37、43、48及び51、配列番号:25、31、38、44、47及び52、配列番号:26、32、39、45、47及び53、配列番号:23、33、37、43、48及び54、並びに配列番号:27、34、40、46、49及び55。追加の具体的な実施形態において、α-シヌクレインプロトフィブリルについての所望の特異性を提供する一方、本明細書に定義の他の重要な特徴を満たす抗体は、以下の各群から選択される抗体または断片の6種のCDR配列:VHCDR-1配列番号:23、24、25または26VHCDR-2配列番号:29、30、31または32VHCDR-3配列番号:36VLCDR-1配列番号:42、43、44または45VLCDR-2配列番号:47または48VLCDR-3配列番号:50、51、52または53、または以下の各群から選択される抗体または断片の6種のCDR配列:VHCDR-1配列番号:23、24、25または26VHCDR-2配列番号:29、30、31または32VHCDR-3配列番号:37VLCDR-1配列番号:42、43、44または45VLCDR-2配列番号:47または48VLCDR-3配列番号:50、51、52または53、または以下の各群から選択される抗体または断片の6種のCDR配列:VHCDR-1配列番号:23、24、25または26VHCDR-2配列番号:29、30、31または32VHCDR-3配列番号:38VLCDR-1配列番号:42、43、44または45VLCDR-2配列番号:47または48VLCDR-3配列番号:50、51、52または53、または以下の各群から選択される抗体または断片の6種のCDR配列を有する:VHCDR-1配列番号:23、24、25または26VHCDR-2配列番号:29、30、31または32VHCDR-3配列番号:39VLCDR-1配列番号:42、43、44または45VLCDR-2配列番号:47または48VLCDR-3配列番号:50、51、52または53。上記のとおり、本発明によるα-シヌクレインプロトフィブリル結合抗体および断片は、標的についての高親和性を特徴とする。解離定数Kdとして表現される高親和性は、10-7M未満である。追加の実施形態において、ヒトα-シヌクレインプロトフィブリルについての解離定数Kdは、10-8M未満、10-9M未満、10-10M未満、またはさらには10-11M未満である。これらの抗体および断片は、これらを約10-6M以上の親和性を有する抗体と比較して低い用量において投与することができるという利点を有する。このことは、顕著な臨床的利点を有する。それというのも、これらの高親和性抗体は、注射により投与することができ、皮下的に与えることができる。それというのも、低い量のみの抗体が効力を達成するのに必要とされるからである。投与モダリティは、皮下または静脈内注射に限定されるものではない。さらに、効力に必要とされるより低い用量は、抗体の生成のための物品のコストを低減させる。α-シヌクレインプロトフィブリルについての抗体の高親和性に加え、抗体および断片は、α-シヌクレインモノマーへの低結合性および場合によりα-シヌクレインフィブリルへの低結合性を示す。上記のとおり、α-シヌクレインモノマーへの低結合性は、α-シヌクレインモノマーへの本発明による抗体または断片の結合性がα-シヌクレインプロトフィブリルへの結合性よりも少なくとも100倍小さいことを意味する。より具体的な実施形態において、α-シヌクレインプロトフィブリルへの本発明による抗体または断片の結合性は、α-シヌクレインモノマーへの結合性よりも500倍超またはさらには1000倍超大きい。別の実施形態において、抗体および断片は、α-シヌクレインフィブリルへの低結合性を示す。より具体的な実施形態において、α-シヌクレインプロトフィブリルへの本発明による抗体または断片の結合性は、α-シヌクレインフィブリルへの結合性よりも100倍超、500倍超、またはさらには1000倍超大きい。本発明のさらに別の実施形態において、抗体および断片は、ベータアミロイドAβプロトフィブリル例えば、Kd>10-5Mおよびベータアミロイドモノマー例えば、Kd>10-5Mへの低結合性を示す。本発明のさらに別の実施形態において、抗体および断片は、β-シヌクレインモノマー、γ-シヌクレインモノマー、IAPP膵島アミロイドポリペプチド、および/またはメディンMedinポリペプチドへの低結合性を示し、例えば、これらのペプチド/タンパク質の1種以上への抗体および断片の結合性は、ヒトα-シヌクレインプロトフィブリルへの結合性よりも少なくとも100倍小さい。本発明の別の実施形態によれば、本発明による抗体または断片は、モデル系におけるアミノ酸aa領域113~140、例えばaa領域113~131の範囲内の、具体的なエピトープの例としてaa125~131、121~124、121~127、121~131、113~123および136~140を有するα-シヌクレイン中の直鎖エピトープへの結合性により定義することができる。このモデル系においては、11アミノ酸配列オーバーラップを有する15量体α-シヌクレインペプチドが使用される以下の実施例3を参照のこと。本発明の追加の実施形態によれば、ヒトα-シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性およびα-シヌクレインモノマーの低結合性を有し、配列番号22~27、28~34、35~40、41~46、47~49および50~52の6種のCDR配列群のそれぞれならびにそれぞれの各群の前記配列のいずれかと70、80、90、95または98超の類似性を有する配列から選択される1種のCDR配列の組合せを含む抗体または断片が提供される。抗体または断片は、11アミノ酸オーバーラップを含む15量体α-シヌクレインペプチドを含むモデル系において固定化された直鎖α-シヌクレインのアミノ酸aa領域113~140、例えばaa領域113~131の範囲内のエピトープ、特にエピトープaa125~131、121~124、121~127、121~131、113~123または136~140に結合する。本発明の別の具体的な実施形態によれば、高親和性α-シヌクレインプロトフィブリル結合抗体は、α-シヌクレイン凝集を低減させ、または阻害し、これにより脳内の可溶性オリゴマーα-シヌクレイン形態のレベルを低減させることができる。本発明の別の具体的な実施形態によれば、高親和性α-シヌクレインプロトフィブリル結合抗体は、CNS外側のα-シヌクレインオリゴマー/プロトフィブリルも結合させ、これにより前記α-シヌクレイン形態のCNSレベルを低下させるように血液脳関門にわたる前記α-シヌクレイン形態の平衡をシフトさせることができるドレナージ。本発明の別の具体的な実施形態によれば、抗体は、血液脳関門を通過することができる治療的使用に好適なIgGクラスの抗体である。高親和性α-シヌクレインプロトフィブリル結合IgG抗体は、IgG1のCH2ドメインに結合する補体因子C1qを低減させ、補体活性化および炎症のリスクを低減させるようにエンジニアリングすることができる。この修飾は、いくつかの異なる手法において行うことができる。1つの手法は、IgG1定常領域のCHγ2ドメインが欠失しており、C1q結合性を付与するIgG4からの対応するドメインまたはこのドメインの一部に交換されたキメラ抗体を作製することである。IgG4がC1qを結合させず、したがって補体カスケードを活性化しないことは十分証明されている。これを達成するため、重鎖の定常領域CHは、IgG1上の高親和性Fc受容体ドメインCHγ3を、補体因子C1qについての結合性を有しないIgG4ドメインCHγ2と組み合わせるようにエンジニアリングされる。キメラ定常重鎖を含有するこの新たな抗体IgG1:CHγ1、CHγ2:IgG4、CHγ3:IgG1は、Fc受容体介在性食作用を介するα-シヌクレインプロトフィブリルの効率的なクリアランスと副作用、すなわち炎症、例えば髄膜脳炎のリスク低減の両方の重要な特性を有する。炎症のリスクを低減させるさらに別の手法は、補体因子C1q結合性および補体活性化を低減させる抗体のオリゴ糖構造を変化させることである。ヒトIgG1のAsn-297における複合二分岐オリゴ糖の30種の異なる構造が記載されている。CH2会合炭水化物の不存在は、抗体のヒンジ領域のコンホメーション変化を引き起こし、エフェクター分子との相互作用効力ならびに補体活性化機能およびC1q結合性の損失を低減させると考えられている。任意の他のアミノ酸へのAsn-297の部位特異的突然変異誘発による高親和性ヒトα-シヌクレインプロトフィブリル結合抗体の修飾は、Fc受容体結合性を保持しつつC1q結合性の低く、したがって特に血液脳関門における炎症リスクが低減する抗体を生成する。抗体上でグリコシル化を修飾する代替例は、酵素N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIが不活化された細胞型内で抗体を発現させることである。このことは、Asn-297の炭水化物構造が変化した抗体を生じさせる。限定されるものではないが、Man5GlcNAc2の構造が形成される。この炭水化物修飾は、補体因子C1q結合性を低減させ、炎症を阻害するものであるWrightetal1998。あるいは、非グリコシル化プロトフィブリル結合抗体は、グリコシル化を阻害するツニカマイシンの存在下で抗体を発現する細胞を培養することにより達成することができる。これらの抗体は、変化した補体活性化活性および変化したFc受容体機能を有するLeatherbarrowetal1985。低い補体活性化および高いFc受容体結合性を有する抗体を発現するクローンのスクリーニングは、α-シヌクレインプロトフィブリルの高いFc介在性クリアランスおよび低いC1q結合性を示すプロトフィブリル結合抗体を生成する。別の実施形態において、高親和性ヒトα-シヌクレインプロトフィブリル結合抗体は、補体因子C1qの結合を低減させ、または阻害するように補体因子C1q結合部位が修飾された、すなわちPro331>Ser331Xuetal1994のIgGサブクラスの抗体、例えばIgG1またはIgG4である。このような抗体は、α-シヌクレイン病変を有する神経変性障害の個体またはこのような障害の発現リスクのある個体、例えば、限定されるものではないが、PDを罹患する個体または発現リスクのある個体における投与、すなわち、α-シヌクレイン病変を有する神経変性障害の治療、予防または発症遅延に特に好適である。ヒトIgG1の331位におけるプロリン残基は、トレオニンまたはグリシンまたは任意の他の極性アミノ酸に変更することもできる。この修飾は、標準的な分子生物学技術、例えば部位特異的突然変異誘発またはDNA欠失により達成することができる。本発明のさらに別の態様は、ヒトまたは動物組織、例えば脳脊髄液CSF、血液、尿、唾液、または脳組織中のプロトフィブリルレベルを特異的に測定するための、α-シヌクレイン病変を有する神経変性障害のための診断ツールまたはバイオマーカーとしての、または該神経変性障害をモニタリングするための高親和性ヒトα-シヌクレインプロトフィブリル結合抗体の使用である。パーキンソン病PD、レビー小体型認知症DLB、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、およびクロイツフェルトヤコブ病は、α-シヌクレイン病変を有するこのような神経変性障害の例示にすぎない。例えば、PD患者のCSFまたは血液中のヒトα-シヌクレインプロトフィブリルのレベルは、パーキンソン病または任意の他のα-シヌクレイノパチーを罹患していない対応高齢者対照群と比較して異なる可能性が高い。パーキンソン病または任意の他のα-シヌクレイノパチーを発現している者は、対照対象と比較してCSFまたは血液中のα-シヌクレインプロトフィブリルレベルの変化したレベルを有する可能性が高い。したがって、CSFまたは血液中のα-シヌクレインプロトフィブリルレベルの測定は、疾患の早期診断を提供することができる。このことは、本発明による新たな高親和性α-シヌクレインプロトフィブリル結合抗体を用いて達成することが可能であり、具体的な実施形態においては、α-シヌクレインプロトフィブリルが9pMレベルに至るまで測定されたサンドイッチELISA法実施例5を参照のこととの組合せにおいて達成することができる。アッセイにおける他のα-シヌクレイン形態、特にα-シヌクレインモノマー、および場合によりα-シヌクレインフィブリルおよびα-シヌクレイン断片の干渉は無視可能である。抗α-シヌクレインプロトフィブリル抗体を使用してこれらの組織中および細胞培養物中のα-シヌクレインプロトフィブリルをアッセイする好適な方法の例は、免疫アッセイ、例えばELISA、RIA、ウエスタンブロッティングまたはドットブロッティングを含む。これらの方法は、臨床試験および/または診断試験におけるプロトフィブリル低減により計測される治療効力を追跡するために好適である。α-シヌクレインプロトフィブリルレベルはCSFおよび血液中で極めて低いので、本発明の高親和性α-シヌクレインプロトフィブリル結合抗体は、例えば低レベルのα-シヌクレインプロトフィブリルの計測を可能とするELISA法に基づく診断試験に有利である。このような方法によれば、本発明による抗体または断片を、α-シヌクレインプロトフィブリルを含み、または含む疑いのある生物試料に添加し、α-シヌクレインプロトフィブリルと抗体または断片との間で形成された複合体の存在を検出する。複合体は、定性的に検出することができ、すなわち、複合体の存在が検出され、または定量的に検出することができ、すなわち、複合体の濃度または複合体の閾値濃度を所望により検出することができる。追加の実施形態において、本発明は、ヒトおよび動物組織中でのα-シヌクレインプロトフィブリルの検出、局在化および定量のためのイメージングにおける高親和性プロトフィブリル特異的抗体および断片の使用を含む。抗体または断片は、検出可能な標識、例えば放射性リガンド、例えばI131、C14、H3またはガリウム68これらの放射性同位体に限定されるものではないを用いて標識することができ、試料と接触させ、または検出目的のために投与することができる。このような方法は、限定されるものではないが、パーキンソン病、レビー小体型認知症および他のα-シヌクレイン関連神経変性障害を含むα-シヌクレイン病変を有する神経変性障害のための診断ツールとして好適である。具体的な実施形態において、このような方法は、投薬または他の考えられる治療を受けていない、または受けている対象におけるα-シヌクレイン関連疾患の発現をモニタリングするために実施することができる。したがって、本発明の一態様において、抗体は、α-シヌクレインプロトフィブリルを含み、または含む疑いのある生物試料に添加し、前記プロトフィブリルと前記抗体との間で形成された複合体の濃度を試料中のプロトフィブリルの検出および/または定量のために計測する。具体的な実施形態において、検出法は、免疫アッセイおよび近接ライゲーションアッセイを含む。生物試料は、対象から採取されたインビトロ試料およびインビボ液体容量であり得る。本発明のさらに別の態様は、獣医薬において使用される特異的な抗体種を作製することである。概説される診断法は、獣医学的使用にも好適である。本発明の別の態様は、副作用を回避するため、すなわち、前記抗体を治療剤または診断剤として使用した場合にヒトにおける抗体に対する免疫応答を回避するための前記抗体のヒト化である。このようなヒト化技術は、当業者の能力の範囲内である。本発明による医薬組成物は、本明細書に記載の抗体または断片、および医薬的に許容される担体を含む。治療的使用のための具体的な実施形態において、組成物は、治療活性量の本発明による抗体または断片を、ヒトおよび/または動物への投与に好適な生理緩衝液、例えば、限定されるものではないが、PBS中に含む生理学的に許容される配合物である。抗体または断片は、より良好な安定性のために凍結乾燥させることができる。凍結乾燥配合物は、凍結乾燥および/または後続の貯蔵の間および/またはこの後に生成物を保護および/または安定化するための安定剤、リオプロテクタント、緩衝液など、例えば、限定されるものではないが、マンニトールを含む任意の好適な慣用の賦形剤を含有することができる。場合により、抗体配合物は、プロトフィブリル結合抗体または断片の機能または効力を干渉しない抗菌剤または他の保存剤または添加剤を含有することができる。以下の実施例は説明のために提供し、これらの具体的な実施例に本発明を限定するものではない。実施例1α-シヌクレインプロトフィブリル抗体免疫化/ポリクローナル抗体免疫化スキームにおいて、Balb/Cマウスを利用する。抗原として、HNE安定化α-シヌクレインプロトフィブリルを使用する。これらは、既に記載のとおりWO2009/133521、参照により本明細書に組み込まれる生成させ、例外は以下のとおりである:HNEとα-シヌクレインとの60:1の比を使用する。免疫化のため、マウスにHNE安定化α-シヌクレインプロトフィブリルおよびアジュバントを注射する例えば、3~6回。HNE修飾α-シヌクレインプロトフィブリルを含有する1回のブースター注射を実施してからマウスを屠殺した。免疫化マウスからの血液を、α-シヌクレインプロトフィブリルおよびα-シヌクレインモノマーに関する反応性について分析した。ポリクローナル抗体応答の特異性を、ダイレクトELISAにより分析した。典型的な実験において、平底高結合96ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートをモノマーα-シヌクレイン未修飾またはHNEもしくは他のアルデヒドを用いて修飾、プロトフィブリル/オリゴマーα-シヌクレイン未修飾またはHNEもしくは他のアルデヒドを用いて修飾または繊維状α-シヌクレインを400ng/ウェルの最終濃度において用いてコーティングする。ウェルを2BSAを用いてブロッキングし、0.05Tween-20/PBSを用いて洗浄し、調査されるポリクローナル抗体からの細胞培地上清未希釈またはリン酸緩衝生理食塩水を用いて1:1に希釈を一次抗体としてウェルに添加する。アルカリホスファターゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスマウスIgG/IgM抗体PierceBiotechnology,Rockford,IL,USAを二次抗体として1/1000の希釈において使用する。免疫反応性は、p-ニトロフェニルホスフェートSigma-Aldrich,MO,USAを使用して可視化する。血清中で、α-シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマーを特異的に認識する抗体を検出する。さらに、α-シヌクレインモノマーを認識する抗体を見出すことができる。陰性対照は、非免疫化マウスを表す。ハイブリドーマ/モノクローナル抗体モノクローナルα-シヌクレインプロトフィブリル結合抗体を生成させるためにマウスB細胞ハイブリドーマを使用した。脾細胞を単離し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水PBS中で粉砕し、1200xgにおいて10分間遠心分離して細胞リッチペレットを回収する。細胞をPBSを用いてさらに洗浄し、1200xgにおいて10分間遠心分離する。細胞ペレットを、1抗生物質が補給されたダルベッコ最小必須培地DMEM,Invitrogen,LaJolla,CA,USA中で再懸濁させる。脾細胞を1:1の比においてSp2/0細胞マウスミエローマ細胞系とDMEM中で混合する。細胞融合を促進するため、1mlのポリエチレングリコールSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USAを細胞混合物に添加し、反応をDMEMの添加により停止させる。細胞をハーベストし、ペレットを10v/vウシ胎仔血清Cambrex,CharlesCity,IA,USAが補給され、1v/vピルビン酸ナトリウムCambrex,CharlesCity,IA,USA、1v/v抗生物質Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USAおよび1v/vL-グルタミンCambrex,CharlesCity,IA,USAも含有するDMEM、5v/vBM条件培地RocheDiagnosticsScandinavia,Bromma,Swedenおよび2v/vHAT培地サプリメントSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA中で再懸濁させる。細胞を96ウェル細胞培養プレート上でプレーティングし、2週間静置および増殖させる。ハイブリドーマ細胞上清を、ダイレクトELISAにより分析する。典型的な実験において、平底高結合96ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートを、平底高結合96ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートをモノマーα-シヌクレイン未修飾またはHNEもしくは他のアルデヒドを用いて修飾、オリゴマー/プロトフィブリルα-シヌクレイン未修飾またはHNEもしくは他のアルデヒドを用いて修飾または繊維状α-シヌクレインを用いてコーティングする。ウェルを1BSAを用いてブロッキングし、PBS-Tween200.05を用いて洗浄し、調査されるハイブリドーマからの細胞培地上清未希釈またはPBS-Tween200.05を用いて1:2または1:5に希釈を一次抗体としてウェルに添加する。セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化HRP結合ヤギ抗マウスIgSouthernBiotechnology,製品番号1010-05を二次抗体として1/5000の希釈において使用する。免疫反応性は、K-BlueAqueousTMB基質NeogenCorp.製品番号331177を使用して可視化する。実施例2α-シヌクレインプロトフィブリルに特異的な重鎖VHおよび軽鎖VL/Vカッパモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列抗体のCDR領域を含む重鎖VHおよび軽鎖VLの可変領域のアミノ酸配列を、mRNAテンプレートのRTPCRに続くDNAシーケンシングにより決定した。選択される抗体についての可変重鎖領域VHおよび可変軽鎖領域VLのアミノ酸配列を表1に示す。CDR領域1~3の位置に下線を引き、この位置を示す。CDR領域のアミノ酸配列は、α-シヌクレインプロトフィブリルの病原性エピトープを構成するヒト野性型および突然変異体α-シヌクレインプロトフィブリルを結合させるための構造的基礎を形成する。本発明によるプロトフィブリル特異的抗体についての各VLおよびVH鎖のCDR領域1~3のアミノ酸配列を表1に示す。表2に本発明による一連の追加の抗体のCDR配列を含める。VHおよびVL鎖のCDR1~3領域の合わせたアミノ酸配列は、ヒトα-シヌクレイン野性型プロトフィブリルを高親和性および特異性で結合させる分子ポケットを作出する。このポケットは、PD/DLBエピトープの構造的基礎を形成する。CDRアミノ酸配列長のバリエーションがVH鎖とVL鎖の両方において観察され、ヒトα-シヌクレインプロトフィブリルへの結合と適合性である。より短いCDR領域は、抗体の結合ポケットのより制限された3次元構造を提供する一方、より長いCDR領域はよりフレキシブルである。表1および2に示すCDR配列は、本発明の実施形態であり、プロトフィブリル特異的抗体についてのVHおよびVL鎖のマウスフレームワーク領域、すなわちCDR領域外側ならびにヒトVLおよびVHフレームワーク領域におけるアミノ酸配列であるが、これらに限定されるものではない。表1および2に示すもの以外のCDR領域における他のアミノ酸置換は、ヒトα-シヌクレインプロトフィブリルへの高親和性および高特異性結合と適合性である。極性アミノ酸がCDR領域の特定の位置に存在する場合、その特定のアミノ酸は、α-シヌクレインプロトフィブリルへの高親和性および特異性結合を保持または改善しつつ別の極性アミノ酸により置換することができる。同様に、非極性または負もしくは正に荷電したアミノ酸がある位置に存在する場合、そのアミノ酸は同一の極性群からの類似アミノ酸により置換することができる。特定の1種以上のアミノ酸は、α-シヌクレインプロトフィブリルについての親和性に関して実質的に同一の機能および構造を抗体に付与する機能的等価物により、CDR領域の任意の位置において交換することができるので、このような構築物は、無論、本発明の範囲内である。これに関して、本明細書に記載のエピトープ結合性が維持された、各群の上記VHCDRおよびVLCDR配列の1種と70、80、90、95または98超の類似性を有する抗体および断片は本発明の範囲内である。実施例3α-シヌクレインプロトフィブリル特異的モノクローナル抗体のエピトープマッピング抗体のエピトープマッピングを、PepSpots膜上での免疫ブロッティングにより実施した。ヒトα-シヌクレインの配列全体アミノ酸1~140に及ぶ合成ペプチドを、JPTPeptideTechnologiesSigmaAldrichの小会社、UKによりカスタム合成し、PepSpots膜上で固定化した。11アミノ酸配列オーバーラップを有する33種の合成15量体ペプチドを設計した。ペプチドをWhatman50セルロース膜Whatman,EnglandにC末端により共有結合させ、通常、より高い分解安定性に起因するアセチル化N末端を有する。未荷電N-acは、ネイティブ抗原の領域、次いで荷電NH3基をより良好に表す。結果を表3に説明する。あるいは、抗体のエピトープマッピングを、PepSpots膜SigmaAldrich上での免疫ブロッティングにより、以下のとおり実施した:アミノ酸100から140からのヒトα-シヌクレインのC末端配列に及ぶ合成ペプチドをカスタム合成し、PepSpots膜SigmaAldrichに固定化した。9アミノ酸配列オーバーラップを有する30種の合成10量体ペプチドを設計した。結果を表4に示す。したがって、エピトープの長さおよび正確な位置は、決定に使用される方法に依存する。実施例4競合ELISAによる高親和性ヒトα-シヌクレインプロトフィブリル結合モノクローナル抗体の特性決定本実施例は、4種の抗体mAb49/G、mAb38E2/7、mAb38F11/2_8およびmAb48B11/8を示す。これらの抗体は、下記の競合ELISAアッセイにより計測されるとおりα-シヌクレインプロトフィブリルへの高親和性およびα-シヌクレインモノマーへの低交差反応性結合性を示す。手短に述べると、試験すべき抗α-シヌクレイン抗体を溶解状態でα-シヌクレインモノマーまたはプロトフィブリルと相互作用させ、次いで混合物を、α-シヌクレインプロトフィブリルを用いて予備コーティングされたマイクロタイタープレートに添加する。抗体が予備インキュベーション工程において抗原に結合する場合、より少ない抗体がマイクロタイタープレート上に固定化された抗原に結合する。固定化された抗原に結合した抗原は、アルカリホスフェート酵素ALPコンジュゲート化二次抗体により検出する。コンジュゲートは、マイクロタイタープレートリーダー中で405nmにおいて検出することができる黄色を生じさせるALP基質pNPPとインキュベートする。結果的に、低いOD値は、溶解状態の抗原への抗体の高親和性を反映する。具体的には、高結合ELISAマイクロタイタープレートを、1xPBS中で希釈した100μl/ウェルの1μg/mlのα-シヌクレインプロトフィブリルを用いてコーティングし、接着密封剤を用いて密封し、4°Cにおいて一晩インキュベートした。次いで、コーティング溶液を廃棄し、プレートの残留結合能を、200μl/ウェルのPBS-Tween200.05を添加することによりブロッキングした。密封したプレートを、900rpmにおいて振とうさせることにより室温R.T.において60分間インキュベートした。その一方で、ペプチド溶液を1xPBS-Tween200.05中で、α-シヌクレインモノマーまたはプロトフィブリルを140nMの濃度に希釈することにより調製した。α-シヌクレインモノマーおよびプロトフィブリルの10工程3回段階希釈を、丸底低タンパク質結合マイクロタイタープレート中で50μlの容量において実施した。この溶液に、PBS-Tween200.05中で100ng/mlの濃度に希釈した50μlの試験抗体を添加し、900rpmにおいて振とうさせることにより室温において60分間相互作用させた。続いて、これらの予備インキュベートした試料を洗浄3回洗浄したコーティング高結合プレートに添加し、振とうなしで室温において15分間インキュベートさせた。次いで、ELISAプレートを洗浄して未結合抗体を除去した。結合抗体を、900rpmにおいて振とうさせることにより室温において60分間インキュベートしたPBS-Tween200.05中で1/1000希釈した100μlのALP結合抗マウスIgGMabtech,Sweden3310-4を用いて検出した。最後に、ELISAプレートを洗浄して未結合抗体を除去し、100μlのALP基質をそれぞれのウェルに添加した。プレートを、黄色が発色するまで室温におけるインキュベーションの間、暗所で保持した。吸光度値を連続モードで405nmの波長において15分毎に120分まで計測した。計測値を、時間と吸光度との間に線形性が存在する場合にのみIC50決定に使用した。IC50値は、ELISAにおけるシグナルの半分をクエンチするのに必要とされるモノマーまたはプロトフィブリルの濃度として計算した。本方法において使用するα-シヌクレインモノマーまたはプロトフィブリルの濃度は、参照としての市販のα-シヌクレインスタンダードカタログS-1001-1、rPeptide,USA,BCAを用いて決定された0.5mgを使用するUV-SECにより決定した。図1は、上記の競合ELISAにより決定した4種のプロトフィブリル特異的モノクローナル抗体についての450nmにおける吸光度を示す。アッセイは、HNE安定化α-シヌクレインプロトフィブリルを用いて実施した。さらなるELISA実験は、候補抗体がHNEまたはONEにより安定化されたヒトα-シヌクレインプロトフィブリルについての同一の親和性を示すことを示す。抗体は、競合ELISAにより実証されるとおりHNEにより安定化されたA30PまたはA53Tα-シヌクレイン突然変異体から構成されるα-シヌクレインプロトフィブリル/凝集体も結合させる。具体的には、図2Aおよび2Bは、競合ELISAにより分析したプロトフィブリル特異的抗体mAb49/Gの結果を示す。プロトフィブリル特異的モノクローナル抗体mAb49/Gは、HNEまたはONEにより安定化されたヒトα-シヌクレインプロトフィブリルに高親和性で結合する図2A。モノクローナル抗体は、α-シヌクレインのヒト突然変異形態A30PおよびA53TのHNE安定化プロトフィブリルにも高親和性で結合する図2B。ONEとのα-シヌクレインモノマーの凝集は、サイズ排除クロマトグラフィーにより定義されるとおり2種の区別される複合体の集団を生じさせる。これらの2種の区別されるピークを別個に溶出させ、FP-ONE_largeおよびFP-ONE_smallと命名した。さらに、図3A~3Cは、競合ELISAにより分析した追加のプロトフィブリル特異的抗体38E2/7、38F11/2_8および48B11/8の結果を示す。これらのプロトフィブリル特異的モノクローナル抗体は、HNEPF-HNEまたはONEPF-ONEにより安定化された野性型ヒトα-シヌクレインプロトフィブリルに高親和性で結合する。これらのモノクローナル抗体は、アルファシヌクレインのヒト突然変異形態A30PA30P-HNEおよびA53TA30P-HNEのHNE安定化プロトフィブリルにも高親和性で結合する。実施例5α-シヌクレインプロトフィブリル特異的サンドイッチELISAの確立生物試料中のα-シヌクレインプロトフィブリルの計測を可能とするため、捕捉抗体と検出抗体の両方としてのmAb49/Gを用いるサンドイッチELISAを確立した。このアッセイは、α-シヌクレインプロトフィブリルを定量限界LOQ=9pMで計測する図4Bを参照のこと。標準曲線において使用するα-シヌクレインプロトフィブリルのサイズに関する不確実性に起因して、pMにおける濃度は1個のα-シヌクレインモノマー14,000g/molの分子量に基づく。プロトフィブリルの分子量はサイズ排除クロマトグラフィーにより少なくとも1,000,000g/molと推定されているので、モル濃度α-シヌクレインプロトフィブリルとして計算される検出限界は、0.13pMほど低くあり得る。HNEにより安定化されたα-シヌクレインプロトフィブリルおよびモノマーα-シヌクレインを使用してELISAのコンホメーション特異性をバリデートした。2個の同一の抗体から構成されるELISAは、シグナルを生成するために少なくともタンパク質のダイマーを要求する。しかしながら、生物試料中に天然に生じ得る大過剰のモノマーα-シヌクレインが、捕捉抗体コートの結合部位を占有することによりα-シヌクレインプロトフィブリル分析を干渉し、こうしてプロトフィブリルの結合を阻害し得る。この問題は、増加過剰のα-シヌクレインモノマーを固定濃度のα-シヌクレインプロトフィブリルモノマー単位として表現して500pMに添加し、これをmAb49/GELISAを用いて分析することにより調査した。α-シヌクレインプロトフィブリル500pMと比較して30000倍モル濃度過剰のα-シヌクレインモノマー15μMは、予想とおりmAb49/GサンドイッチELISAを用いる計測を妨害しなかった。それというのも、α-シヌクレインモノマーは捕捉抗体にほとんど結合しないからである。図4Aは、サンドイッチELISAによるα-シヌクレインプロトフィブリルの定量についてのELISA結合の概略説明を示す。図4Bは、HNE安定化α-シヌクレインプロトフィブリルを用いて作成した標準曲線を示す。アッセイ性能は、定量限界LOQ=9pMに達した。実施例6α-シヌクレインプロトフィブリル特異的サンドイッチELISAを用いる疾患および対照ヒト脳抽出物の分析異なる洗浄剤を使用する脳抽出プロトコルを実施し、3種の異なる抽出物を生じさせた。細胞外および細胞質α-シヌクレイン種を含むTBS抽出物図5、白色のバー;膜会合性α-シヌクレイン種を含むTriton抽出物図5A、縞模様のバーおよびSDS可溶性α-シヌクレイン種を含むSDS抽出物図5B、黒色のバー。α-シヌクレイノパチーのレビー小体型認知症DLBと診断された患者からの脳抽出物を分析した。皮質および黒質からの脳組織を分析した。対照として、検出可能な免疫組織化学レビー小体病変を有しない対照の皮質からの脳組織も分析した。サンドイッチELISAは、捕捉抗体と検出抗体の両方としてのα-シヌクレインプロトフィブリル特異的mAb49/Gに基づいた。図5Aおよび5Bは、α-シヌクレインプロトフィブリル特異的サンドイッチELISAを用いる疾患および対照ヒト脳抽出物の分析の結果を示す。このアッセイは、プロトフィブリルの定量を>9pM定量限界;LOQ=9pMのレベルにおいて可能とする。実施例7PDトランスジェニックマウスモデルからの脳抽出物中のα-シヌクレインプロトフィブリルの計測細胞およびマウスモデル中のα-シヌクレインプロトフィブリルの存在が示唆されているが、生物試料中のα-シヌクレインプロトフィブリルを直接アッセイする方法はこれまで存在しない。したがって、mAb49/GサンドイッチELISAは、生物試料および凝集したα-シヌクレインの蓄積を特徴とするα-シヌクレイノパチーのマウスモデル中のα-シヌクレインプロトフィブリルレベルを計測する最初の機会を提供する。ヒトα-シヌクレインA53T突然変異体を過剰発現するトランスジェニックマウスからの脳抽出物試料を、野性型マウスからの試料と比較した。脳をTBSまたはTBStween中でホモジナイズし、遠心分離してから分析して可溶性α-シヌクレインフラクションを回収した。非トランスジェニックマウス脳ホモジネートのTBS可溶性フラクション中のα-シヌクレインプロトフィブリルレベルの計測を、トランスジェニックマウスKahleモデルと比較した図6。本アッセイにおいて計測される全てのα-シヌクレインが溶解状態であることを確保するため、全ての試料を分析前に16000xgにおいて5分間遠心分離した。α-シヌクレインプロトフィブリルのレベルを、α-シヌクレイン病変を有する5ヵ月齢トランスジェニックマウスからの脳中で計測した。図6は、対照マウスntg、非トランスジェニックおよびKhaleトランスジェニックtgマウスPDモデルからの5ヵ月齢マウスの脳抽出物の分析の結果を示し、y軸はOD450における吸光度を表す。実施例8ヒト脳組織の免疫組織化学IHC分析PDおよびDLB患者からの皮質および黒質を使用して記載のとおりOinasetal2010免疫組織化学IHC分析を実施した。対照として、同齢非疾患患者からの皮質および黒質を使用した。α-シヌクレインについての陽性抗体対照は、マウス抗α-シヌクレインmAbBD610787であった。Aβ斑への結合は、以下のとおり評価した。AD患者の皮質からの2枚の連続するスライドを抗原をディスプレイするように処理し、陽性抗AβmAbmAb158、BioArcticまたは候補抗体のそれぞれの1種とインキュベートした。結合抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼHRPに結合している二次抗種特異的抗体により検出した。次いで、コンジュゲートをHRP基質DABとインキュベートし、発色沈殿物を生じさせ、光学顕微鏡検査により検出した。Aβ斑が陽性対照において発色沈殿により検出される領域を、候補抗体を用いて処理したスライド中の共通の各領域で分析した。発色沈殿の欠損を可視的に評価し、候補抗体によるAβ斑への結合の欠損と解釈した。図7Aは、PD黒質内のレビー小体および神経突起の38E2/7結合性ならびに陽性α-α-シヌクレイン対照を示す。図7Bは、DLB皮質および黒質内のレビー小体および神経突起の38E2/7結合性ならびに陽性α-α-シヌクレイン対照を示す。図7Cは、DLB皮質および黒質内のレビー小体および神経突起を結合させる種々の抗体ならびに陰性対照を示す。図7Dは、PD黒質内のレビー小体および神経突起を結合させる種々の抗体ならびに陰性対照を示す。図7Eは、非疾患関連黒質における38E2/7の非結合性および陽性α-α-シヌクレイン対照を示す。図7Fは、アルツハイマー病患者の皮質における38E2/7結合性および陽性α-Aβ対照の比較を示す。実施例9免疫沈降IPおよびウエスタンブロットを用いるヒト脳抽出物の分析プロトフィブリル結合モノクローナル抗体38E2/7を用いるヒト脳抽出物の免疫沈降を、ウエスタンブロットを使用して実施した。異なる洗浄剤を使用する脳抽出プロトコルを実施し、4種の異なる抽出物を生じさせた。細胞外および細胞質α-シヌクレイン種を含むTBS抽出物;膜会合性α-シヌクレイン種を含むTriton抽出物、SDS可溶性α-シヌクレイン種を含むSDS抽出物および不溶性α-シヌクレインを含むFA抽出物。これらの抽出物を、抗体38E2/7または対照抗体15Pが結合している磁気ビーズを用いて免疫沈降させた。抗体15Pは、α-シヌクレインプロトフィブリルおよびモノマーに十分等しく結合することができ、存在する全ての種をプルダウンすることが予想される。図8AはDLB患者の黒質のSDS抽出物を示す一方、図8BはDLB患者の黒質のTriton抽出物を示す。図8Aおよび8Bにおいて把握されるとおり、mAb38E/27はTriton抽出物とSDS抽出物の両方におけるDLB黒質からのα-シヌクレインプロトフィブリルのみを捕捉する一方、mAb15は全ての抽出物中のα-シヌクレインモノマーを捕捉する。実施例10α-シヌクレインオリゴマー化阻害の分析本実施例は、抗体mAb49/Gがα-シヌクレインモノマーのオリゴマー化を阻害することを、GFPのN末端またはC末端断片と融合しているα-シヌクレインaa1~140の1コピーを両方含有する2種のベクターを神経細胞に形質移入させるインビトロ法を使用して示す。α-シヌクレインがオリゴマー化し、GFPの両方の断片を一緒にもたらすこれらの細胞のみ、蛍光顕微鏡検査により検出することができる緑蛍光色を生じさせる。オリゴマー化を阻害および/または妨害することができる抗体の存在は、抗体を添加していない対照と比較してこれらの培養物中の蛍光を比較することにより評価することができる。具体的には、H4神経膠腫細胞に、緑色蛍光タンパク質GFPのN末端断片aa1~155と融合しているα-シヌクレインaa1~140またはGFPのC末端断片aa156~238と融合しているα-シヌクレインaa1~140を含有する等モル比のDNA構築物を、FuGENE6形質移入試薬RocheDiagnostics,Basel,Switzerlandを使用して形質移入した。同時に、対照抗α-シヌクレインモノクローナル抗体mAb5C2,SantaCruzBioおよびmAb49/Gを、1μg/mlの最終濃度で細胞に細胞外で添加した。細胞を37°Cにおいて5CO2中で24時間インキュベートした。24時間後、細胞をGFP蛍光団の完全な再構成のために30°Cに移し、24時間の追加時間インキュベートした。蛍光は、FITC落射蛍光フィルタを備えるAxiovert200顕微鏡を使用して計測した。全てのデータを、100と設定する抗体未処理α-シヌクレイン過剰発現細胞と比較した相対蛍光強度として計算した。図9Aにおいて把握されるとおり、mAb49/Gを用いる処理は、α-シヌクレインオリゴマー化の有意p<0.05な低減未処理細胞と比較して蛍光強度の42減少を示した。図9Bは、100に設定した未処理α-シヌクレイン過剰発現細胞と比較したパーセント蛍光強度としての結果をグラフとして示す。本明細書に記載の具体的な実施例および実施形態は、事実上例示であるにすぎず、特許請求の範囲により定義される本発明を限定するものではない。さらなる実施形態および実施例、ならびにこれらの利点は、本明細書を考慮して当業者に明らかであり、特許請求される本発明の範囲内である。参考文献ChartierHarlinMCetal2004AlphasynucleinlocusduplicationasacauseoffamilialParkinsonsdiseaseLancet136411671169ConwayKetal2000AccelerationofoligomerizationnotfibrillizationisasharedpropertyofbothasynucleinmutationslinkedtoearlyonsetParkinsonsdiseaseImplicationsforpathogenesisandtherapyProcNatlAcadSciUSA97571576CrewsLetal2009RoleofsynucleinsinAlzheimersdiseaseNeurotoxRes16306317DesplatsPetal2009InclusionformationandneuronalcelldeaththroughneurontoneurontransmissionofalphasynucleinProcNatlAcadSciUSA41061301013015ErratuminProcNatlAcadSciUSA200910617606CommentinProcNatlAcadSciUSA20091061257112572ElAgnafOMetal2006DetectionofoligomericformsofasynucleinproteininhumanplasmaasapotentialbiomarkerforParkinsonsdiseaseFasebJ20419425GeorgeJLetal2009TargetingtheprogressionofParkinsonsdiseaseCurrNeuropharmacol7936HansenLetal1990TheLewybodyvariantofAlzheimersdiseaseAclinicalandpathologicentityNeurology4018KluckenJetal2006ClinicalandbiochemicalcorrelatesofinsolubleαsynucleinindementiawithLewybodiesActaNeuropathol111101108KrugerRetal1998Ala30PromutationinthegeneencodingαsynucleininParkinsonsdiseaseNatGenet18106108LeatherbarrowRJetal1985EffectorfunctionsofamonoclonalaglycosylatedmouseIgG2abindingandactivationofcomplementcomponentC1andinteractionwithhumanmonocyteFcreceptorMolImmunol22407415LeeHJetal2004ClearanceofasynucleinoligomericintermediatesviathelysosomaldegradationpathwayJournalofNeuroscience2418881896LiJYetalLietal2008LewybodiesingraftedneuronsinsubjectswithParkinsonsdiseasesuggesthosttograftdiseasepropagationNatureMed14501503MasliahEetal2005EffectsofalphasynucleinimmunizationinamousemodelofParkinsonsdiseaseNeuron46857868OinasMetal2010alphaSynucleinpathologyinthespinalcordautonomicnucleiassociateswithalphasynucleinpathologyinthebrainapopulationbasedVantaa85studyActaNeuropathol119715722PolymeropoulosMHetal1997MutationintheαSynucleinGeneIdentifiedinFamilieswithParkinsonsDiseaseScience27620452047QinZetal2007Effectof4hydroxy2nonenalmodificationonαsynucleinaggregationJBiolChem28258625870SingletonABetal2003alphaSynucleinlocustriplicationcausesParkinsonsdiseaseScience302841WrigthA1998EffectofC2associatedcarbohydratestructureonIgeffectorfunctionstudieswithchimericmousehumanIgGlantibodiesinglycosylationmutantsofChinesehamsterovarycellsJImmunol16033933402XuYetal1994Residueatposition331intheIgGlandIgG4CH2domainscontributestotheirdifferentialabilitytobindandactivatecomplementJBiolChem26934693474YoritakaAetal1996Immunohistochemicaldetectionof4hydroxynonenalproteinadductsinParkinsondiseaseProcNatlAcadSciUSA9326962701ZarranzJetal2004ThenewmutationE46KofαsynucleincausesParkinsonandLewybodydementiaAnnNeurol55164173"