"自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質Xと抗体重鎖定常領域の抗体依存性細胞傷害活性を発揮するフラグメントを含む蛋白質Aとが、1個以上のアミノ酸からなるリンカーペプチドLを介して連結されている融合蛋白質であって、N末端からC末端に向かって、蛋白質X、リンカーペプチドL、蛋白質Aの順にペプチド結合により連結されていることを特徴とする融合蛋白質。リンカーペプチドLが、式Gly-Gly-Gly-Gly-Sern式中、nは1~8の整数であるで表わされるアミノ酸配列または式Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Sern式中、nは1~8の整数であるで表わされるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の融合蛋白質。蛋白質Xが、ニコチン性アセチルコリン受容体nAChRのα1サブユニット、またはその一部であることを特徴とする請求項1または2に記載の融合蛋白質。蛋白質XがヒトnAChRα1サブユニットの配列番号13のアミノ酸配列からなるアイソフォーム1および/または配列番号14のアミノ酸配列からなるアイソフォーム2であるか、またはそれらの一部、またはこれらのアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および/もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項1~3のいずれか一項に記載の融合蛋白質。蛋白質XがヒトnAChRα1サブユニットのアイソフォーム1および/またはアイソフォーム2のN末端細胞外領域のアミノ酸配列からなるか、またはこのアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および/もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項1~4のいずれか一項に記載の融合蛋白質。蛋白質Aが、抗体重鎖のヒンジ領域以下、抗体重鎖CH1領域以下、またはそれらの一部もしくはそれらの一部の組み合わせを含むことを特徴とする請求項1~5のいずれか一項に記載の融合蛋白質。蛋白質Aが、ヒト抗体IgGの重鎖定常領域、またはIgGサブユニットの重鎖定常領域の一部の組み合わせを含むことを特徴とする請求項1~6のいずれか一項に記載の融合蛋白質。蛋白質Aが、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列からなるか、またはこのアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および/もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項1~7のいずれか一項に記載の融合蛋白質。融合蛋白質が配列番号10のアミノ酸配列からなるか、または配列番号10のアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および/もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項1~8のいずれか一項に記載の融合蛋白質。請求項に1~9のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードするDNAを細胞発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることを特徴とする請求項1~9のいずれか一項に記載の融合蛋白質の製造方法。請求項1~9のいずれかに記載の融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防治療用組成物。本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、自己抗体を特異的に抑制することができ、自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防または治療することができ、しかもその発現量が工業的に十分である新しい融合蛋白質およびその製造方法を提供することである。上述の特許文献1の融合蛋白質は、自己抗体の産生阻害、並びに、産生された自己抗体の中和の2点において、重症筋無力症の治療薬として効果を期待できるものである。しかしながら、受容体蛋白質と抗体重鎖定常領域との融合蛋白質では、構造の立体的障害が原因と考えられる、発現量の少なさ、並びに発現蛋白質の純度等が問題であった。そこで、本発明者らは、融合蛋白質の発現量、並びに発現蛋白質の純度向上のため、様々な検討を行ったところ、特許文献1の融合蛋白質では、受容体蛋白質と抗体重鎖定常領域の各々が複雑な構造であるため、それらの立体障害により融合蛋白質発現中に誤ったジスルフィド結合が生じ、結果として十分な純度、および発現量が得られなかったと考えられた。そして、それを解決する手段として、受容体蛋白質と抗体重鎖定常領域との間にフレキシブルなリンカーペプチドを挿入した融合蛋白質を考案した。つまり、フレキシブルなリンカーペプチドを挿入することで、受容体蛋白質と抗体重鎖定常領域の各々の構造が安定な本来の構造を保ったものとなると考えた。そして、各領域が安定的な構造を形成することにより、細胞外への分泌効果が促進され、結果としてより多くの融合蛋白質を産生でき、また、融合蛋白質自体の安定性が増すことで、分解体の比率を著しく減少させることができ、純度の向上が可能となると考えた。そこで、本発明者らは、このフレキシブルなリンカーペプチドを挿入した融合蛋白質を作製し、この融合蛋白質が、従来のリンカーペプチド無しの融合蛋白質と比較して、発現量が大幅に向上し、且つ発現蛋白質の純度も著しく向上することを見いだした。さらに、フレキシブルなリンカーペプチドを挿入した融合蛋白質は、従来のリンカーペプチド無しの融合蛋白質よりも自己抗体の中和効果が著しく増強し、また自己抗体産生細胞を特異的に抑制する効果も強いことを見出した。また、抗体重鎖定常領域AはN末端側よりC末端側に位置する方が細胞傷害活性がより強く発揮することを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは本発明の完成に至った。即ち、本発明によれば、自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質Xと抗体重鎖定常領域の抗体依存性細胞傷害活性を発揮するフラグメントを含む蛋白質Aとが、1個以上のアミノ酸からなるリンカーペプチドLを介して連結されている融合蛋白質であって、N末端からC末端に向かって、蛋白質X、リンカーペプチドL、蛋白質Aの順にペプチド結合により連結されていることを特徴とする融合蛋白質が提供される。また、本発明によれば、上記融合蛋白質をコードするDNAを細胞発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることを特徴とする上記融合蛋白質の製造方法、及び上記融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防治療用組成物が提供される。本発明の融合蛋白質は、自己抗体性自己免疫疾患の患者の体内に存在する自己抗体を中和し、かつ自己抗体の産生を阻害することによって、自己抗体を特異的に抑制することができる。また、本発明の融合蛋白質は、発現量及び純度が高く、医薬として、実生産規模で提供することができる。従って、本発明の融合蛋白質を使用すれば、重症筋無力症を始めとする種々の自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防治療することができる。本発明の融合蛋白質は、自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質Xと抗体重鎖定常領域の抗体依存性細胞傷害活性を発揮するフラグメントを含む蛋白質Aとが、1個以上のアミノ酸からなるリンカーペプチドLを介して連結された構造を有する。蛋白質Xは、自己抗体に対する自己抗原、またはその一部に相当し、患者の自己抗原の代わりに自己抗体と結合する囮デコイとしての役割を有する。即ち、本発明の融合蛋白質が自己抗体性自己免疫疾患の患者に投与されると、患者の体内の自己抗体は、融合蛋白質のうち蛋白質Xの部分を自己抗原として認識してこの部分に結合する。結合した自己抗体は、患者の体内に本来存在する自己抗原ともはや結合することができないので、この方法によって自己抗体を中和することができ、自己抗体と患者の自己抗原との結合による自己免疫疾患の症状の発生を抑制することができる。自己抗体は、特定の一つの抗体ではなく種々の抗体群から成り立っているが、いずれの抗体も自己抗原を認識する機能を有する点では共通する。従って、自己抗原の囮となる本発明の融合蛋白質を使用すれば、種々の抗体群に対して個別の融合蛋白質を作成しなくても、一つの融合蛋白質で種々の抗体群を中和することができる。ここで定義する抗体とはIgA、IgD、IgE、IgG、IgMの各クラスの抗体、並びに各サブクラスの抗体全てを意味する。また、抗体定常領域とは、各クラスの抗体、または各サブクラスの抗体、または/および、それら抗体重鎖定常領域を組み合わせたものをも意味する。なお、抗体重鎖定常領域に付加する糖鎖構造は特に限定されるものではない。本発明の融合蛋白質は、自己抗体の囮となる蛋白質Xに加えて、抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質Aも含む。この蛋白質Aは、抗体依存性細胞傷害活性ADCC活性を発揮する役割を有する。自己抗体は、血中のB細胞で産生されるが、このB細胞の表面には、自己抗体と同じ抗原結合部位を持つ細胞表面提示型の抗体がB細胞受容体として存在している。従って、本発明の融合蛋白質が患者に投与されると、そのうちの一部は患者の体内の自己抗体と上述のように結合するが、残りは、自己抗体を産生するB細胞の表面の抗体B細胞受容体に結合する。B細胞受容体に本発明の融合蛋白質が結合すると、NK細胞などのエフェクター細胞がそのFc受容体を介して融合蛋白質中の蛋白質Aに結合し、抗体依存性細胞傷害活性ADCC活性を発揮し、融合蛋白質に結合したB細胞を傷害、自己抗体の産生を抑制する。このように、本発明によれば、体内に存在する自己抗体を中和して自己抗体の自己抗原への結合を阻害するのみならず、自己抗体の産生源である特異的B細胞をも選択的に傷害することができる。従って、本発明の融合蛋白質は、自己抗体の産生阻害、および産生された自己抗体の中和という二つの方法で、自己抗体性自己免疫疾患を予防または治療することができる。本発明の融合蛋白質は、1個以上のアミノ酸からなるフレキシブルなリンカーペプチドLを含む。かかるリンカーペプチドを挿入することにより、受容体蛋白質と抗体重鎖定常領域のそれぞれの構造が安定的な構造をとり、融合蛋白質全体が安定的なものとなる。本発明では、受容体蛋白質XとリンカーペプチドL、抗体重鎖定常領域Aは、N末端からC末端に向かって、X-L-Aの順に並ぶことを特徴とする。理論的には、抗体重鎖定常領域AはN末端側、またはC末端側のいずれかの側に位置することが考えられるが、本発明者らは、抗体重鎖定常領域Aの持つ抗体依存性細胞傷害活性ADCC活性をより効果的に発揮するためには、受容体との結合の際に立体的障害の少ないC末端側に抗体重鎖定常領域Aを配置するべきであることを見出している。また、受容体蛋白質XをN末端に位置することでデコイとしての効果も強く発揮できると想定される。本発明の融合蛋白質中の蛋白質Xは、予防または治療対象の自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体に対する自己抗原またはその一部に相当し、予防または治療対象の自己免疫疾患に応じて決まる。例えば、重症筋無力症の予防治療の場合、重症筋無力症は、神経-筋接合部において、神経伝達物質であるアセチルコリンの筋肉側における受け皿であるニコチン性アセチルコリン受容体自己抗原に抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体自己抗体が結合してアセチルコリンの神経筋伝達を阻害することによって生じる疾患であるので、蛋白質Xは、自己抗原であるニコチン性アセチルコリン受容体であることができる。同様に、自己免疫性溶血性貧血の予防治療の場合、蛋白質Xは、赤血球表面マーカーであることができ、特発性血小板減少性紫斑病の予防治療の場合、蛋白質Xは、血小板表面マーカーであることができ、自己免疫性好中球減少症の予防治療の場合、蛋白質Xは、好中球表面マーカーであることができ、抗TSH抗体が原因の甲状腺機能亢進症や原発性甲状腺機能低下症橋本病の予防治療の場合、蛋白質Xは、TSHであることができ、自己抗体性脳炎脳症の予防治療の場合、蛋白質Xは、NMDA受容体、AMPA受容体などであることができる。なお、蛋白質Xは、これらの受容体やマーカー全体である必要はなく、自己抗体の認識部位を含んでさえいればその一部であってもよい。例えば、重症筋無力症の場合、上述のニコチン性アセチルコリン受容体は、4種類のサブユニットからなる5量体蛋白質であり、自己抗体の認識部位は、その中でもα1サブユニットのアイソフォーム1骨格筋でのみ発現されるアイソフォームであり、配列番号13で示される、アイソフォーム2骨格筋、脳、心臓、腎臓、肺臓で発現されるアイソフォームであり、配列番号14で示されるのN末端細胞外領域に存在する。従って、重症筋無力症の場合、蛋白質Xは、ニコチン性アセチルコリン受容体α1nAChRα1サブユニットまたはその一部であることができ、より具体的にはnAChRα1サブユニットのアイソフォーム1および/またはアイソフォーム2、またはそれらの一部であることができ、さらに具体的にはnAChRα1サブユニットのアイソフォーム1および/またはアイソフォーム2のN末端細胞外領域のアミノ酸配列からなることができる。これらのアミノ酸配列には、その相同性が損なわれない範囲で、1個または数個例えば1~20個、好ましくは1~10個、さらに好ましくは1~7個のアミノ酸が欠失、付加、および/または置換されていてもよい。その範囲としては、例えば、70以上、好ましくは80以上、さらに好ましくは90以上の配列の同一性を有するものが挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBIBLASTNationalCenterforBiotechnologyInformationBasicLocalAlignmentSearchToolを用いて、以下の条件期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFFで計算することができる。具体的には、このような欠失、付加、および/または置換が導入されたアミノ酸配列は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキットタカラバイオ製や、QuickChangeSite-DirectedMutagenesisKitSTRATAGENE製等の市販キットを用いて対応するDNA配列を置換することにより容易に得ることができる。また、人工遺伝子合成技術によって直接作製することもできる。本発明の融合蛋白質中の蛋白質Aは、抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質であり、例えば抗体重鎖のヒンジ領域以下Fc領域、抗体重鎖CH1領域以下またはそれらの一部であることができる。抗体とは、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM全てのクラスを含み、更には、全てのサブクラスをも含む。抗体重鎖定常領域とは、上記の各クラス、または各サブクラス、またはそれら重鎖定常領域の組み合わせであっても良い。抗体重鎖のヒンジ領域以下Fc領域としては、具体的には例えばヒト抗体IgG1の場合、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列を挙げることができる。配列番号11、12はいずれもヒト抗体IgG1のFc領域の配列であり、配列番号11は、アジア人に多いタイプ、配列番号12は、欧米人に多いタイプである。本発明の融合蛋白質中のペプチドリンカーLは1個以上のアミノ酸からなり、好ましくは5~45個、さらに好ましくは10~20個からなり、最も好ましくは16個のアミノ酸からなる。このペプチドリンカーは、Gly-SerエレメントまたはSer-Glyを含むことができる。ペプチドリンカーLの具体例としては、式Gly-Gly-Gly-Gly-Sern,式Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Sern,式Gly-SerGly-Gly-Gly-Gly-Sern,式Ser-Ser-Ser-Ser-Glyn,または式Ser-Ser-Ser-Ser-Glyn-Ser-Pro式中、nは、1~8の整数であるで表わされるアミノ酸配列を含むものを挙げることができる。これらの中でも、一番目及び二番目の式で表わされるアミノ酸配列が好ましい。また、式中の繰り返し数nは3であることが好ましい。また、ペプチドリンカーLの別の具体例としては、アミノ酸Glyおよび/またはアミノ酸Serを基本とする構造を有する配列を含むペプチドリンカー例えば、Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Gly-Gly、Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly、またはGlu-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Glyを有する配列を含むものを挙げることができる。また、ペプチドリンカーLのさらに別の具体例としては、以下のアミノ酸配列をとるもの、またはこの配列を基本として改良を加えたアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを挙げることができる。AAsp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-LysBAsn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg本発明の融合蛋白質の具体例としては、例えば配列番号10のアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。この融合蛋白質は、N末端側からC末端へ、蛋白質X、リンカーペプチドL、蛋白質Aの順にペプチド結合により連結された融合蛋白質であり、蛋白質XがnAChRα1サブユニットのアイソフォーム1のN末端細胞外領域のアミノ酸配列の第1位~第210位のアミノ酸からなるアミノ酸配列、リンカーペプチドLがPro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser3、蛋白質Aが配列番号11のアミノ酸配列に相当する。この融合蛋白質のアミノ酸配列も、上述の通り、その相同性が損なわれない範囲で、1個または数個例えば1~20個、好ましくは1~10個、さらに好ましくは1~7個、特に好ましくは1~3個のアミノ酸が欠失、付加、または/および置換されていてもよい。本発明の融合蛋白質は、従来公知の遺伝子工学的手法によって製造することができ、例えば、蛋白質XをコードするDNA、リンカーペプチドLおよび蛋白質AをコードするDNAを必要によりそれぞれ増幅しておき、これらのDNAを相互に結合し、得られたDNAを細胞発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることによって製造することができる。DNAの増幅は、例えばPCR法によって行うことができ、増幅したDNAの結合は、例えばOverlapextensionPCR法によって行うことができる。また、発現させようとする融合蛋白質のアミノ酸配列を設計し、人工合成遺伝子を直接作成することもできる。発現ベクターは、発現効率を向上させるためのCMVやSV40等のプロモーターや、発現された融合蛋白質を培養上清より容易に回収するため、抗体重鎖シグナル配列、抗体κ鎖シグナル配列などの分泌シグナル配列を備えていることが好ましい。また、発現蛋白質量を向上させるため、転写開始コドンの上流にkozak配列を挿入することが好ましい。本融合蛋白質の場合、N末端側に膜蛋白質であるnAChRα1サブユニットを備えており、且つ、本膜蛋白質はN末端側に細胞外領域が存在するため、nAChRα1サブユニットのオリジナルのシグナル配列を用いることで、発現蛋白質とシグナル配列の相性が良く、良好な分泌発現がなされる。発現宿主細胞としては、例えば哺乳類細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞大腸菌などなどを使用することができ、その中でも動物細胞、特にCHO細胞、HEK293細胞などが好ましい。また、融合蛋白質を発現させる核酸配列を染色体上に組み換えることで、トランスジェニック動物としての発現も可能である。発現させた融合蛋白質は、常法により採取し、ProteinAカラム等を用いて精製すればよい。次に、本発明の融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防治療用組成物について説明する。かかる組成物の具体的な製剤形態としては、注射剤、粘膜吸収剤等を挙げることができる。注射剤の場合は、上述のようにして得られた本発明の融合蛋白質に糖類、ポリオール、アルブミン、界面活性剤等の安定化剤、塩類等の等張化剤等を添加し、凍結乾燥して保存しておき、使用時に注射用水に溶解して投与すればよい。凍結乾燥品中の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば0.01~200mg/g、好ましくは0.1~100mg/gである。また、溶解された注射剤中の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば0.01~200mg/mL、好ましくは0.1~100mg/mLである。注射剤の場合の投与方法としては、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等が挙げられる。粘膜吸収剤の場合は、例えば、本発明の融合蛋白質を賦形剤や安定化剤とともに剤型化することで、徐放性の粘膜吸収剤として製剤化し、口腔粘膜、鼻粘膜、眼瞼下等より投与すればよい。粘膜吸収剤の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば0.1~300mg/mL、好ましくは0.5~100mg/mLである。本発明の組成物の投与量は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人一日当たり10μg/kg~50mg/kgである。以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。1α1-Fc融合蛋白質比較例の発現ベクターの構築既知のニコチン性アセチルコリン受容体nAChRα1サブユニットのアイソフォーム1蛋白質配列情報Accession番号:P02708-2をもとにnAChRα1サブユニットシグナル配列からN末端細胞外領域の配列を抽出し、また、ヒト抗体IgG1定常領域の蛋白質配列情報Accession番号:P01857をもとにヒンジ領域以下、即ちFc領域を抽出し、両者を融合した462残基の蛋白質配列を設計した。チャイニーズハムスター卵母細胞CHO細胞を用いて融合蛋白質の発現を行うため、CHO細胞に適した核酸配列への最適化を行った後、5’側に制限酵素認識配列とkozak配列を付加し、一方、3’側には終止コドンと制限酵素認識配列を付加した核酸配列を人工遺伝子合成技術によって作製した配列番号1。得られた人工合成遺伝子を制限酵素によって処理し、動物細胞用の発現ベクターであるpEE12.4のhCMV-MIEプロモーター支配下に挿入し、ヒトnAChRα1サブユニットのアイソフォーム1のN末端細胞外領域とヒト抗体IgG1重鎖Fc領域とからなる融合蛋白質α1-Fc配列番号2を分泌発現させるためのベクターpEE12.4-A1Fcを構築した。蛋白質発現領域の模式図を図1に示す。2α1-L-Fc融合蛋白質本発明例の発現ベクターの構築1で作製した人工合成遺伝子を鋳型に、配列番号1のkozak配列を含むnAChRα1サブユニット領域について、配列番号3のプライマーと、フレキシブルリンカーLPro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser3をコードする核酸配列を付加した配列番号4のプライマーを添加し、DNAポリメラーゼとしてTOYOBO社のKOD-Plus-Neoカタログ番号:KOD-401を用いてPCR法によって核酸増幅を行い、配列番号5の核酸配列を得た。一方、抗体IgG1Fc領域についても配列番号1の人工合成遺伝子を鋳型にフレキシブルリンカー配列をコードする核酸配列を付加した配列番号6のプライマーと、配列番号7のプライマーを添加し、DNAポリメラーゼとしてTOYOBO社のKOD-Plus-Neoを用いてPCR法によって核酸増幅を行い、配列番号8の核酸配列を得た。配列番号5、及び、配列番号8の混合液を鋳型に、配列番号3のプライマーと配列番号7のプライマーを添加し、DNAポリメラーゼとしてTOYOBO社のKOD-Plus-Neoを用いてOverlapextensionPCR法によって核酸増幅を行い、配列番号9の核酸配列を得た。得られた核酸増幅産物を制限酵素によって処理し、動物細胞用の発現ベクターであるpEE12.4のhCMV-MIEプロモーター支配下に挿入し、ヒトnAChRα1サブユニットのアイソフォーム1のN末端細胞外領域とヒト抗体IgG1重鎖Fc領域とをフレキシブルリンカー配列Lによって繋ぎ合わせた融合蛋白質α1-L-Fc配列番号10を分泌発現させるためのベクターpEE12.4-A1LFcを構築した。蛋白質発現領域の模式図を図2に示す。3融合蛋白質α1-Fcおよび融合蛋白質α1-L-Fcの一過性発現の確認1および2で作成した融合蛋白質発現ベクターpEE12.4-A1Fc、pEE12.4-A1LFcをインビトロジェン社の発現系FreeStyleMAX293ExpressionSystemカタログ番号:K9000-10を用い、HEK293細胞に導入して融合蛋白質α1-Fcおよび融合蛋白質α1-L-Fcを発現させ、GEヘルスケア社の精製カラムHiTrapProteinAHPColumnカタログ番号:17-0402-01を用いて精製し、融合蛋白質α1-Fcおよび融合蛋白質α1-L-Fcを得た。各融合蛋白質の発現確認は、SDS-PAGE後、銀染色並びにウェスタンブロッティングにより行った。ウェスタンブロッティングにはHRP標識ヒトIgG抗体を用いた。その結果を図5に示す。図5中の矢印で示すバンドが、融合蛋白質に相当する。本結果より、フレキシブルリンカーLを挿入することにより、融合蛋白質の発現量が著しく上昇したことが確認された。4α1-L2-Fc融合蛋白質本発明例の発現ベクターの構築2で作製したα1-L-FcのフレキシブルリンカーLPro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser3をフレキシブルリンカーL2Gly-Gly-Gly-Gly-Ser3に変更した融合蛋白質α1-L2-Fc配列番号15を発現させるためのベクターを作製した。融合蛋白質をコードする遺伝子配列の作成は、人工合成遺伝子配列番号1を鋳型に、2の配列番号4、6のプライマーを配列番号16、17に置き換え、同様のPCR法により作製した配列番号18。得られた核酸増幅産物を制限酵素によって処理し、動物細胞用の発現ベクターであるpEE12.4のhCMV-MIEプロモーター支配下に挿入し、ヒトnAChRα1サブユニットのアイソフォーム1のN末端細胞外領域とヒト抗体IgG1重鎖Fc領域とをフレキシブルリンカー配列L2にて繋ぎ合わせた融合蛋白質α1-L2-Fcを分泌発現させるためのベクターpEE12.4-A1L2Fcを構築した。蛋白質発現領域の模式図を図3に示す。5Fc-L2-α1融合蛋白質比較例の発現ベクターの構築4で作製したα1-L2-FcのnAChRα1サブユニットと抗体重鎖定常領域をフレキシブルリンカーL2を挟んで4とは逆の順番で融合した融合蛋白質Fc-L2-α1配列番号19を発現させるためのベクターを作製した。ベクターの作成は、2や4と同様に、配列番号1の人工合成遺伝子を鋳型にPCR法により行った。得られた核酸増幅産物を制限酵素によって処理し、動物細胞用の発現ベクターであるpEE12.4のhCMV-MIEプロモーター支配下に挿入し、ヒト抗体IgG1重鎖Fc領域とヒトnAChRα1サブユニットのアイソフォーム1のN末端細胞外領域とをフレキシブルリンカー配列L2によって繋ぎ合わせた融合蛋白質Fc-L2-α1を分泌発現させるためのベクターpEE12.4-FcL2A1を構築した。蛋白質発現領域の模式図を図4に示す。6融合蛋白質α1-Fc、α1-L-Fc、α1-L2-Fc、およびFc-L-α1の安定発現株の構築1、2、4、および5で作成した融合蛋白質発現ベクターpEE12.4-A1Fc、pEE12.4-A1LFc、pEE12.4-A1L2Fc、およびpEE12.4-FcL2A1の各々を、エレクトロポーレーション法によりCHO-K1細胞に導入し、メチオニンスルフォキシミンMSX選択下で培養を行い、クローン化することにより、形質転換体を取得した。得られた形質転換体以下、各々α1-Fc発現細胞、α1-L-Fc発現細胞、α1-L2-Fc発現細胞、およびFc-L2-α1発現細胞と略称するを、以下の実験に供した。7融合蛋白質α1-Fc、α1-L-Fc、α1-L2-Fc、およびFc-L2-α1の発現培養6で作成したα1-Fc発現細胞、α1-L-Fc発現細胞、α1-L-2-Fc発現細胞、およびFc-L2-α1発現細胞をインビトロジェン社のCD-CHO培地カタログ番号:12490-0259Lを初発培地として培養し、各々の蛋白質を生産させた。培養条件は、pH:7.1、37°Cとし、培養5日目から9日目にかけてインビトロジェン社のCHOCDEfficientFeedBカタログ番号:A1024-01を50mL/L/Dayで添加し、10日間培養を行った。融合蛋白質発現培養上清は3500G、5分間の遠心により培養細胞を沈殿させ、上清を回収することで得た。8融合蛋白質α1-Fc、α1-L-Fc、α1-L2-Fc、およびFc-L2-α1の精製、ならびに発現量の算出7で得られた各々の融合蛋白質発現培養上清について、0.45μmのフィルターで濾過処理した後の溶液をGEヘルスケア社のMabselectSuReカタログ番号:11-0026-01に負荷し、10カラム容量のPBSにて洗浄した後、2.5カラム容量の20mMクエン酸緩衝液pH=3.0にて溶出させるとともに、溶出液量の1/10の1MTris-HClpH=9.0にて即時中和を行うことで融合蛋白質を精製した。得られた溶出液を日本ミリポア社のAmiconUltra-15,Ultracel-50Kカタログ番号:UFC905024にて濃縮し、PBSへの置換を行った後、0.22μmの無菌濾過膜にて濾過処理を行い、以下の実験に供した。得られた溶出画分の280nmにおける吸光度OD280を測定し、各々の融合蛋白質の吸光係数α1-Fc:0.57mg/mL/OD280、α1-L-Fc:0.59mg/mL/OD280、α1-L2-Fc:0.59mg/mL/OD280、Fc-L2-α1:0.59mg/mL/OD280、溶出液量、培養液量を用いて、各発現株について、培養液1L当たりの融合蛋白質の発現量を算出した。その結果、融合蛋白質の発現量は、α1-Fc発現細胞については72mg/L、α1-L-Fc発現細胞については1587mg/L、α1-L2-Fc発現細胞については1249mg/L、Fc-L2-α1発現細胞については356mg/Lであり、融合蛋白質の結合部位にフレキシブルリンカーペプチドを挿入することにより発現量が格段に向上されることが確認された。中でもPro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser3をフレキシブルペプチドリンカーとして用いた融合蛋白質発現株が優れていた。9融合蛋白質α1-Fcおよび融合蛋白質α1-L-Fcのα-BTXに対する結合能の確認8で得られた融合蛋白質α1-Fcおよび融合蛋白質α1-L-Fcについて、ELISA法を用いてα-ブンガロトキシン以下、α-BTXとProteinAの結合能について確認を行った。α-BTXは、α1ドメインと結合し、神経伝達を阻害する作用を有する物質である。従って、融合蛋白質のα-BTXに対する結合能を確認することにより、融合蛋白質のα1ドメインの構造が正しく形成されているかどうかを確認することができる。また、ProteinAは、Fcを介して融合蛋白質をプレートへ固定する。従って、この実験の主目的は、上述の通り融合蛋白質のα1ドメイン構造の形成の確認にあるが、この実験では、融合蛋白質のFcとしての構造が保持されているかどうかも確認することができる。ナルジェヌンク社のC8MAXISORPNUNC-IMMUNOMODULEカタログ番号:445101にICNBiochemicals社のProteinAカタログ番号:987015を1μg/mLの濃度で固相化した後、1BSA添加のPBSにてブロッキングを行い、8にて作成した各融合蛋白質を4倍ずつ希釈したものをサンプルとして添加し、更に洗浄後、インビトロジェン社のα-bungarotoxin,biotin-XXカタログ番号:B1196を1μg/mLで添加し、最終的にICNBiochemicals社のPEROXIDASE-AVIDINカタログ番号:191370で反応させた。検出にはフナコシ社のTMBsolutionカタログ番号:N301を基質として反応させ、1硫酸溶液にて反応を停止させた。その後、波長450nmでの吸光度を測定した。その結果を図6に示す。いずれの融合蛋白質についても濃度依存的な反応が認められた。この結果より、各融合蛋白質はα-BTXと結合し、且つ、ProteinAとも結合することが確認された。即ち、融合蛋白質α1-Fc、融合蛋白質α1-L-Fcともに、nAChRα1サブユニット細胞外領域、及び、Fcとしての構造を保持していることが確認された。なお、融合蛋白質の両者を比較すると融合蛋白質α-L-Fcについて、α-BTXとの結合曲線が低濃度側へ著しくシフトしていることから、フレキシブルリンカーペプチドを挿入することにより、蛋白質濃度あたりの結合力が約100倍以上向上されると判断された。この結果は、フレキシブルリンカーペプチドの挿入により、目的の融合蛋白質の構造的安定性が増し、純度が高くなっていることを示唆している。10融合蛋白質α1-Fcおよび融合蛋白質α1-L-Fcの抗nAChR自己抗体に対する結合能の確認ATCCより入手したラット抗nAChRα1サブユニット自己抗体産生ハイブリドーマMab35TIB-175以下、Mab35細胞と略称するをインビトロジェン社のHybridoma-SFMカタログ番号:12045-01で培養し、培養上清をGEヘルスケア社のHiTrapProteinGHPColumnカタログ番号:17-0405-01で処理することにより、抗nAChR自己抗体であるモノクローナル抗体以下、mAb35と略称するを得た。得られたmAb35を1μg/mLの濃度でナルジェヌンク社のC8MAXISORPNUNC-IMMUNOMODULEに固相化し、1BSA添加PBSでブロッキングした後、8で作成した融合蛋白質α1-Fcおよび融合蛋白質α1-L-Fcを4倍希釈系列したものを添加し、最終的にHRP標識抗ヒトIgG1Fc抗体で反応を行った。検出にはフナコシ社のTMBsolutionを基質として反応させ、1硫酸溶液にて反応を停止させた後、波長450nmでの吸光度を測定した。その結果を図7に示す。融合蛋白質α1-Fc、融合蛋白質α1-L-Fcともに濃度依存的な反応が認められた。また、両者を比較すると融合蛋白質α1-L-Fcについて、自己抗体との結合曲線が著しく低濃度側へシフトしていることから、フレキシブルリンカーペプチドを内部挿入することにより、蛋白質濃度あたりの結合力比活性が約100倍以上向上すると判断された。この結果は、フレキシブルリンカーペプチドの挿入により、目的の融合蛋白質の発現量のみならず、構造的安定性も向上し、自己抗体との反応性が著しく向上したことを示唆している。11融合蛋白質α1-Fcおよび融合蛋白質α1-L-Fcの自己抗体産生細胞に対する結合能の確認自己抗体は生体内ではB細胞で産生され、自己抗体産生B細胞の細胞表面には、自己抗体と同じ抗体が細胞膜上にB細胞受容体として提示されている。即ち、10で使用したハイブリドーマMab35細胞膜上には、B細胞と同様にmAb35抗体が提示されていると考えられる。そこで、HBSS/BSAで洗浄した2×105個のMab35細胞に、8で作成した融合蛋白質α1-Fcおよび融合蛋白質α1-L-Fcを10ng/mL~1mg/mLの範囲で10倍希釈したものをサンプルとして反応させた後、検出試薬としてPE標識抗ヒトIgG抗体を添加し、Beckman-Coulter社のCytomicsFC500を用いて検出を行った。その結果を図8Aおよび図8Bに示す。各融合蛋白質ともに濃度依存的に右側にシフトしていることから、Mab35細胞と濃度依存的に結合していることが確認された。なお、融合蛋白質α1-L-Fcはより大きくシフトしていることから、フレキシブルリンカーペプチドを内部挿入することにより、自己抗体産生細胞に対する結合能が約100倍以上向上することが確認された。12融合蛋白質α1-Fcおよび融合蛋白質α1-L-Fcのデコイとしての作用の確認ATCCより入手したヒト神経芽腫細胞TE-671以下、TE671細胞と略称するにはヒト筋肉細胞同様のnAChRα1サブユニットが存在する。そこで、TE671細胞に対する自己抗体mAb35の結合に対して、8で作製した融合蛋白質α1-Fcおよび融合蛋白質α1-L-Fcの結合阻害活性についての確認を行った。HBSS/BSAで洗浄した2×105個のTE671細胞に、融合蛋白質α1-Fc、またはα1-L-Fcを100μg/mL添加した。なお、コントロールには融合蛋白質不含のHBSS/BSAを添加した。更に、mAb35抗体1μg/mLを添加した後、検出試薬としてPE標識ラットIgG抗体を添加し、CytomicsFC500を用いて検出を行った。その結果を図9に示す。融合蛋白質α1-Fcを用いた場合は100μg/mLの濃度において若干の阻害効果しか認められていないが、融合蛋白質α1-L-Fcを用いた場合は100μg/mLの濃度において十分な阻害活性が認められた。この結果より、フレキシブルリンカーペプチドを内部挿入することにより、著しい阻害活性の向上が確認された。13融合蛋白質α1-Fc、融合蛋白質α1-L-Fc、および融合蛋白質Fc-L2-α1のADCC活性の確認2×105個のMab35細胞をHBSS/BSAで洗浄した後、同仁社の蛍光色素Calcein-AMカタログ番号:C326を10μMとなるように添加したHBSS/BSAで37°C、30分間インキュベーションを行い、細胞内にCalcein-AMを取り込ませた。次に、これらのMab35細胞を96穴プレートに10000個/ウェルとなるように分注し、8で作成した融合蛋白質α1-L-Fcまたはコントロール抗体等アバスチンまたはエンブレルと、ATCCより入手したヒトナチュラルキラー細胞NK92CRL-2407以下、NK92細胞と略称するを様々な濃度で添加し、37°Cで4時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、×300Gで5分間遠心することで細胞を沈殿させ、上清の蛍光を測定Ex=485nm、Em=540nmした。その結果、NK92細胞のみを添加した群抗体等無添加においても極弱い濃度依存的な細胞傷害活性ナチュラルキリングが認められたものの、融合蛋白質α1-L-Fc投与群においては、最大で約73の強い細胞傷害活性が認められ、ターゲット細胞TであるMab35細胞に対しエフェクター細胞EであるNK92細胞を25倍添加したものにおいて強い細胞傷害活性が認められたデータは示さず。以上の予備実験の結果より、E/T比=25の条件で、融合蛋白質α1-Fc、融合蛋白質α1-L-Fc、および融合蛋白質Fc-L2-α1の細胞傷害活性を比較した。その結果、融合蛋白質α1-Fcで51.8、融合蛋白質α1-L-Fcで73.2、融合蛋白質Fc-L2-α1で32.9の細胞傷害活性が認められた。一方、抗体無添加群で17.9、アバスチン添加群で12.5、エンブレル添加群で6.9の細胞傷害活性が認められた。これらの結果より、抗体重鎖定常領域は、N末端側に位置するよりC末端側に位置する方が、高い細胞傷害活性を有することが確認された。また、抗体重鎖定常領域をC末端側に位置したものでも、フレキシブルリンカーペプチドを内部挿入することにより、細胞傷害活性が更に向上することが確認された。4重症筋無力症に対するvivoの確認実験用に11週齢の雌性Lewisラット日本エスエルシー社製を36匹準備した。重症筋無力症の動物モデルとして自己抗体誘発ラットモデルを使用した。全てのラットに対して、ハイブリドーマMab35が産生するラットnAChRに対する自己抗体であるmAb35を1.25mg/kgで腹腔内投与することで病態を誘発した。以下の各物質はmAb35投与の4、12、24及び32時間後に静脈内投与した。対照群にはPBSを1回あたり1mL投与した対照群、6匹。8で調製したα1-L-Fcは1回あたり2.5mg/ラットα1-L-Fc2.5、6匹または10mg/ラットα1-L-Fc10、6匹の用量で投与した。同様に8で調整したα1-Fcは、1回あたり2.5mg/ラットα1-Fc2.5、6匹または10mg/ラットα1-Fc10、6匹の用量で投与した。また、静注用人免疫グロブリン製剤である献血ヴェノグロブリンIH5静注田辺三菱製薬社製を1回あたり80mg/ラットの用量で投与したIVIG、6匹。病態誘発後96時間までの期間、筋症状スコアMGScoreを評価した。筋症状スコアは、0点:異常なし、1点:前肢の握力低下、2点:前肢の握力消失、3点:前肢の握力消失に加えて、後肢の筋力低下歩行障害、4点:前肢の握力消失に加えて、後肢の麻痺とした。筋症状スコアの統計学的解析は、対照群と各物質投与群の比較をSteel検定SAS前臨床パッケージVersion5.00.010720、Windows登録商標版SASシステムリリース8.02TSレベル02M0SASインスティチュートジャパンで行った。結果は平均±標準誤差で示し、危険率5未満を有意差ありと判定した。結果を表1及び図10に示す。図10はmAb35誘発ラット重症筋無力症モデルにおけるα1-L-Fc及びα1-Fcの効果を示すものである。図10に示すとおり、対照群では病態誘発24時間後から筋症状スコアが増加し、56時間で最大となり、その後は減少する変化が観察された。α1-L-Fc及びα1-Fcは筋症状スコアの増加を抑制し、これらの抑制は用量に応じた抑制である傾向が示された。表1には対照群の筋症状スコアが最大となった病態誘発56時間の平均スコアを示す。α1-L-Fc及びα1-Fcはいずれも1回あたり10mg/ラットの投与で筋症状を有意に抑制することが示された。"