哺乳動物メタニューモウイルスのヌクレオチド配列を含んでなる組換えパラインフルエンザウイルス3型であって、該哺乳動物メタニューモウイルスが、パラミクソウイルス科ニューモウイルス亜科に属するネガティブセンス一本鎖RNAウイルスであり、かつ該哺乳動物メタニューモウイルスは、系統発生的に、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスとの近縁性よりも、CNCMパリにI2614として寄託されたウイルス分離株との近縁性が高いことを特徴とする、組換えパラインフルエンザウイルス3型。哺乳動物メタニューモウイルスのヌクレオチド配列が、パラインフルエンザのヌクレオチド配列に取って代わっているか、またはパラインフルエンザウイルスのゲノムに挿入されている、請求項1に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。哺乳動物メタニューモウイルスのヌクレオチド配列が、パラインフルエンザウイルスゲノムの位置1、2、3、4、5または6に挿入されている、請求項1に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。さらにRSVヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。パラインフルエンザウイルスがウシパラインフルエンザウイルスである、請求項1に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。さらにヒトパラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列を1つ以上含む、請求項5に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。前記ヌクレオチド配列が哺乳動物メタニューモウイルスのポリペプチドをコードしている、請求項1に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。前記ポリペプチドが、哺乳動物メタニューモウイルスのFもしくはGタンパク質、またはその断片である、請求項7に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。前記ポリペプチドが、配列番号70もしくはその断片と少なくとも90同一、配列番号78もしくはその断片と少なくとも70同一、配列番号62もしくはその断片と少なくとも90同一、配列番号18もしくはその断片と少なくとも82同一、配列番号42もしくはその断片と少なくとも85同一、配列番号50もしくはその断片と少なくとも60同一、配列番号34もしくはその断片と少なくとも85同一、配列番号26もしくはその断片と少なくとも20同一、または配列番号86もしくはその断片と少なくとも30同一である、請求項7に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。前記ポリペプチドが、配列番号78、配列番号62、配列番号18、配列番号42、配列番号50、配列番号34、配列番号26、配列番号86、配列番号70、配列番号28、配列番号72、配列番号80、配列番号64、配列番号20、配列番号44、配列番号52、配列番号88、配列番号36、配列番号29、配列番号73、配列番号81、配列番号65、配列番号21、配列番号45、配列番号53、配列番号89、配列番号37、配列番号27、配列番号71、配列番号79、配列番号63、配列番号43、配列番号51、配列番号87、配列番号35、またはその断片である、請求項7に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。前記ヌクレオチド配列が、配列番号22~25、配列番号30~33、配列番号38~41、配列番号46~49、配列番号54~61、配列番号66~69、配列番号74~77、配列番号82~85、配列番号90~93、配列番号98~132、配列番号168~247、またはその断片からなる群より選択される、請求項1に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。前記断片が、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも750、または少なくとも1000アミノ酸長である、請求項9または10に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。前記断片が、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも750、または少なくとも1000ヌクレオチド長である、請求項11に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。異種ヌクレオチド配列がヒトメタニューモウイルス由来である、請求項1に記載のウイルス。哺乳動物メタニューモウイルス配列が、Fタンパク質、Gタンパク質、SHタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、M2タンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、Lタンパク質、またはその断片をコードしている、請求項7に記載のウイルス。請求項1~14のいずれか1項に記載のウイルスのゲノムをコードする組換えDNAまたはRNA分子。請求項15に記載のウイルスのゲノムをコードする組換えDNAまたはRNA分子。請求項1~14のいずれか1項に記載の組換えウイルスおよび製薬上許容される添加剤を含有するワクチン製剤。請求項15に記載の組換えウイルスおよび製薬上許容される添加剤を含有するワクチン製剤。請求項18に記載のワクチンを投与することを含んでなる、哺乳動物における呼吸器感染症の処置方法。請求項19に記載のワクチンを投与することを含んでなる、哺乳動物における呼吸器感染症の処置方法。哺乳動物がヒトである、請求項20に記載の方法。哺乳動物がヒトである、請求項21に記載の方法。請求項1~15のいずれか1項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、該ウイルスを感染させた細胞を、該細胞の増殖に最適な温度より低い温度で培養することを含んでなる上記方法。請求項1~15のいずれか1項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、該ウイルスを感染させる前に第1の温度で細胞を培養し、該細胞にウイルスを感染させ、該細胞へのウイルスの感染後に第2の温度で該細胞を培養する、ことを含んでなり、第2の温度が第1の温度より低いことを特徴とする、上記方法。請求項1~15のいずれか1項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、該ウイルスを感染させた細胞を血清の非存在下で培養することを含んでなる上記方法。請求項1~15のいずれか1項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、該ウイルスを感染させる前に血清の存在下で細胞を培養し、該細胞にウイルスを感染させ、該細胞へのウイルスの感染後に血清の非存在下で該細胞を培養する、ことを含んでなる上記方法。請求項1~15のいずれか1項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、該ウイルスを感染させた細胞を、血清の非存在下に、該細胞の増殖に最適な温度より低い温度で培養することを含んでなる上記方法。本発明によれば、組換えウイルスは、内在性つまり天然のゲノム配列または非天然のゲノム配列によりコードされるウシパラインフルエンザウイルスまたはヒトパラインフルエンザウイルスから得られるものである。本発明によれば、非天然配列は、天然のまたは内在性のゲノム配列とは異なるものであるが、それは表現型の変化をもたらしてももたらさなくてもよいゲノム配列に対する点突然変異、再配列、挿入、欠失などを含むがこれらに限定されない1以上の突然変異があるためである。本発明によれば、本発明のキメラウイルスは、1つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えbPIVまたはhPIVである。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているか、あるいはヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列で置き換わっているヌクレオチド配列によりコードされうる。本発明はまた、様々なPIV株、インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス例えば、ヒトメタニューモウイルス、トリニューモウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、その他のウイルス、病原菌、細胞遺伝子、腫瘍抗原、またはこれらの組合せに由来する遺伝子を含むがこれらに限定されない遺伝子の産物をコードする異種配列の組合せをコードしている遺伝子操作された組換えパラインフルエンザウイルスおよびウイルスベクターに関する。さらに本発明は、メタニューモウイルス由来のヌクレオチド配列を、呼吸器多核体ウイルス由来のヌクレオチド配列と共に、さらにはヒトパラインフルエンザウイルス由来のヌクレオチド配列と共に、含む遺伝子操作された組換えパラインフルエンザウイルスに関する。本発明はまた、ヒトPIV3のFおよびHN遺伝子を含めて、様々なパラインフルエンザウイルス種および株由来の遺伝子をコードするように遺伝子操作される組換えパラインフルエンザベクターおよびウイルスを包含する。ある実施形態では、本発明のPIVベクターは、1つ以上の異種配列を発現するように遺伝子操作されるが、その異種配列は好ましくは抗原性の遺伝子産物である遺伝子産物をコードする。好ましい実施形態においては、本発明のPIVベクターは抗原性のポリペプチドおよびペプチドをコードする1、2または3種の異種配列を発現する。いくつかの実施形態では、その異種配列は同一のウイルスに由来しても、異なるウイルスに由来してもよい。好ましい実施形態では、異種配列は、ヒトPIV、突然変異PIV株のような別の種のPIV由来の、あるいは別のネガティブ鎖RNAウイルスインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス例えば、ヒトメタニューモウイルス、およびトリニューモウイルスを含むがこれらに限定されない由来の、抗原性ポリペプチドである異種遺伝子産物をコードしている。一実施形態において、異種配列は異種遺伝子産物の免疫原性およびまたは抗原性断片をコードしている。好ましい実施形態において、組換えPIVは、ウシPIV3型または弱毒化されたヒトPIV3型である。一実施形態では、PIVゲノムの融合タンパク質、ヘマグルチニン糖タンパク質、または他の非必須遺伝子をコードする配列が欠失されて、異種抗原配列により置換される。さらに別の実施形態では、PIVゲノムが、異種ヌクレオチド配列に加えて、突然変異または改変を含みうるが、こうした突然変異または改変は、ワクチン製剤で使用するのに適した表現型例えば、弱毒化表現型または抗原性が増強された表現型をもつキメラウイルスをもたらすものである。特定の実施形態においては、PIVゲノムに挿入される異種ヌクレオチド配列は、Fタンパク質、Gタンパク質またはHNタンパク質をコードするヌクレオチド配列から得られる。いくつかの実施形態では、挿入される異種ヌクレオチド配列は、キメラFタンパク質、キメラGタンパク質またはキメラHNタンパク質をコードする。具体的な実施形態では、Fタンパク質がメタニューモウイルスのFタンパク質の細胞外ドメイン、パラインフルエンザウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメイン、およびパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の内腔ドメインluminaldomainを含む。いくつかの実施形態では、挿入されるヌクレオチド配列が、Fタンパク質の膜貫通ドメインを欠失しているFタンパク質をコードしており、その結果として可溶性のFタンパク質が発現される。別の特定の実施形態においては、本発明は、メタニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列を含むPIVゲノムを含んでなるキメラウイルスを提供する。具体的な実施形態では、PIVウイルスは、カンサス株ウシパラインフルエンザ3型ウイルスである。他の実施形態では、PIVウイルスは、弱毒化された表現型をもつヒトパラインフルエンザウイルスである。さらに別の実施形態では、本発明は、ウシパラインフルエンザ骨格中にヒトパラインフルエンザのFおよびHN遺伝子を含むように遺伝子操作されたキメラなウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザウイルスを提供する。このキメラウイルスは、さらにメタニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列を含んでいてもよく、およびまたは、さらに呼吸器多核体ウイルス由来の異種ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のウイルスは、メタニューモウイルスの少なくとも2つの異なる遺伝子に由来する異種ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、異種配列はメタニューモウイルス、例えば、トリニューモウイルスおよびヒトメタニューモウイルスに由来するものである。さらに特定すると、異種配列はトリニューモウイルス、例えば、トリニューモウイルスA、B、CまたはD型、好ましくはC型に由来するものである。本発明はまた、1種以上の異種抗原配列を発現するキメラPIVを含むワクチン製剤および免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明は、二価および三価のワクチンを含めた多価ワクチンを提供する。本発明の多価ワクチンは、それぞれの異種抗原配列を発現する1つのPIVベクターの形で、または各ベクターが異なる異種抗原配列をコードする2つ以上のPIVベクターの形で投与することができる。一実施形態において、本発明のワクチン製剤は、1、2または3種の異種ポリペプチドを発現するキメラPIVを含むが、その場合、異種ポリペプチドは同一ウイルス株由来の、同一ウイルスの異なる株由来の、または異なるウイルス由来の配列によってコードされていてもよい。好ましくは、異種抗原配列は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス例えば、ヒトメタニューモウイルス、およびトリニューモウイルスを含むがこれらに限定されないネガティブ鎖RNAウイルスから得られるものである。異種抗原配列としては、限定するものではないが、ヒトパラインフルエンザウイルスのFまたはHNタンパク質、RSVのFタンパク質、インフルエンザウイルスA、BおよびC型のHAタンパク質、ならびにヒトMPVおよびトリニューモウイルスのFタンパク質をコードする配列が挙げられる。さらに好ましくは、本発明のワクチン製剤は、生存能があって感染性である弱毒化されたキメラウイルスを含む。好適な実施形態では、組換えPIVがウシPIV3型またはヒトPIVの弱毒株である。ある実施形態においては、ワクチン製剤は、PIVゲノムのF、HNまたは他のいくつかの非必須遺伝子が置換または欠失されている本発明のキメラウイルスを含む。好ましい実施形態では、本発明のワクチン製剤は、意図された宿主内で弱毒化表現型をもつPIV株を遺伝子操作することにより調製される。別の好ましい実施形態では、本発明のワクチン製剤は、PIVの弱毒株を遺伝子操作することにより調製される。別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列が完全なPIVゲノムに付加される。いくつかの実施形態では、PIVゲノムを遺伝子操作することにより、ウイルスゲノムの位置1、2、3、4、5または6に異種配列を挿入して、異種配列がウイルスゲノムの第1、第2、第3、第4、第5または第6遺伝子として発現されるようにする。特定の実施形態では、ウイルスゲノムの位置1、2または3に異種配列を挿入する。いくつかの実施形態では、挿入された異種遺伝子のコード配列の終端と下流遺伝子のコード配列の開始点との間の遺伝子間領域を望ましい長さに変更すると、結果的に、異種配列の発現が増大したり、またはキメラウイルスの増殖が向上したりする。あるいはまた、遺伝子間領域を望ましい長さに変更すると、異種配列の発現または組換えもしくはキメラウイルスの増殖が変化する可能性がある例えば、弱毒化表現型。いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列に隣接する遺伝子間領域の長さと挿入位置の両方を遺伝子操作することにより、異種配列の望ましい発現レベルおよび望ましいウイルス増殖特性を有する組換えまたはキメラウイルスを選別する。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の組換えまたはキメラウイルスおよび製薬上許容される添加剤を含有するワクチン製剤を提供する。特定の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはトリ種などの被験体の免疫応答をモジュレートするために用いられる。さらに特定の実施形態では、ヒト乳幼児または小児の免疫応答をモジュレートするために前記ワクチンを用いる。別の実施形態では、本発明は、獣医用途のワクチン製剤に関する。本発明のワクチン製剤は、単独で投与してもよいし、他のワクチン、予防薬または治療薬と組み合わせて投与してもよい。31慣例および省略形cDNA:相補DNACPE:細胞変性効果L:ラージタンパク質M:基質タンパク質F:融合糖タンパク質HN:ヘマグルチニンノイラミニダーゼ糖タンパク質N、NP、またはNC:核タンパク質P:リンタンパク質MOI:感染多重度NA:ノイラミニダーゼPIV:パラインフルエンザウイルスbPIV:ウシパラインフルエンザウイルスbPIV3:ウシパラインフルエンザウイルス3型hPIV:ヒトパラインフルエンザウイルスhPIV3:ヒトパラインフルエンザウイルス3型bPIVhPIVまたはbhPIV:hPIV配列をもつ組換えbPIVbhPIV3またはbPIV3hPIV3:hPIV3型配列をもつ組換えbPIVnt:ヌクレオチドRNP:リボ核タンパク質rRNP:組換えRNPvRNA:ゲノムウイルスRNAcRNA:アンチゲノムウイルスRNAhMPV:ヒトメタニューモウイルスAPV:トリニューモウイルスdpi:感染後の日数HAI:赤血球凝集阻害hpi:感染後の時間POI:感染時点RSV:呼吸器多核体ウイルスSFM:無血清培地TCID50:50組織培養感染用量位置:ウイルスの遺伝子操作に関して位置を用いる場合、それは転写されるウイルスゲノムの遺伝子の位置をさす。例えば、遺伝子が位置1に存在するとき、それは転写されるウイルスゲノムの第1の遺伝子であり、遺伝子が位置2に存在するとき、それは転写されるウイルスゲノムの第2の遺伝子である;bPIV3、bhPIV3およびその誘導体の位置1:ゲノムのヌクレオチド位置104、あるいは転写されるウイルスゲノムの第1の遺伝子の位置;bPIV3、bhPIV3およびその誘導体の位置2:ゲノムのヌクレオチド位置1774、あるいは天然パラインフルエンザウイルスの第1のオープンリーディングフレームと第2のオープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第2の遺伝子の位置;bPIV3、bhPIV3およびその誘導体の位置3:ゲノムのヌクレオチド位置3724、あるいは天然パラインフルエンザウイルスの第2のオープンリーディングフレームと第3のオープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第3の遺伝子の位置;bPIV3、bhPIV3およびその誘導体の位置4:ゲノムのヌクレオチド位置5042、あるいは天然パラインフルエンザウイルスの第3のオープンリーディングフレームと第4のオープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第4の遺伝子の位置;bPIV3、bhPIV3およびその誘導体の位置5:ゲノムのヌクレオチド位置6790、あるいは天然パラインフルエンザウイルスの第4のオープンリーディングフレームと第5のオープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第5の遺伝子の位置;bPIV3、bhPIV3およびその誘導体の位置6:ゲノムのヌクレオチド位置8631、あるいは天然パラインフルエンザウイルスの第5のオープンリーディングフレームと第6のオープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第6の遺伝子の位置。4図面の説明図1ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質と、異なるトリニューモウイルスの異なるFタンパク質との、アミノ酸配列のペアワイズアライメント。2つの配列間の同一アミノ酸はアミノ酸の一文字表記で示される。2つのアミノ酸配列間の保存アミノ酸の交換は記号で示され、空白は非保存アミノ酸の交換を示す。AヒトメタニューモウイルスのFタンパク質と、マガモMallardDuckから分離されたトリニューモウイルスのFタンパク質とのアライメント細胞外ドメインでは856の同一性。BヒトメタニューモウイルスのFタンパク質と、シチメンチョウから分離されたトリニューモウイルスのFタンパク質とのアライメントサブグループB;細胞外ドメインでは75の同一性。図2bhPIV3キメラウイルスの3つの異なる分離株から得られたnt5255からnt6255までのPCR断片を増幅した。得られた1kbDNA断片をヒトPIV3のF遺伝子に特異的な酵素で消化した。これらの酵素ではウシPIV3の対応する断片は切断されない。1アガロースゲルは、未消化の断片レーン2、5、6およびSaclまたはBglII消化断片それぞれレーン4、6およびレーン9、10、11を示す。レーン10のサンプルは消化されないが、BglII消化を繰り返すと、このサンプルは切断されたデータは示してない。レーン1とレーン8はDNAサイズマーカーを示す。図3bhPIV3キメラウイルスの3つの異なる分離株から得られたnt9075からnt10469までのPCR断片を増幅した。得られた14kbDNA断片をウシPIV3のL遺伝子に特異的な酵素で消化した。これらの酵素ではヒトPIV3の対応する断片は切断されない。1アガロースゲルにより、未消化の14kb断片レーン2、5、8が示される。BamHlおよびPvuII消化により生じたより小さいDNA断片がレーン3、4、6、7、9および10に示される。レーン1はDNAサイズマーカーを示す。図4bPIV3hPIV3ベクターおよびbhPIV3ベクター化RSVFまたはGcDNAを含めた、6つの構築物を示す。ウシPIV3のF遺伝子およびHN遺伝子を欠失させ、それぞれヒトPIV3のF遺伝子およびHN遺伝子で置き換える。RSVのF遺伝子またはG遺伝子を位置1または位置2のいずれかにクローニングする。全てのRSV遺伝子はbPIV3NP遺伝子間領域に連結されるが、ただし、RSVF1はより短いbPIV3のN遺伝子終止配列N遺伝子開始配列があとに続く。図5bhPIV3ベクター化RSVFまたはG遺伝子は位置効果を示した。は、キメラウイルス感染細胞の溶解物のウェスタンブロット分析である。RSVFタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いてFタンパク質を検出し、RSVGタンパク質に対するポリクローナル抗体を用いてGタンパク質を検出した。F1断片に相当する50kDaバンドが、野生型RSV感染細胞と同様に全てのキメラウイルス感染細胞においても検出された。キメラウイルス感染細胞の溶解物には、野生型RSV感染細胞と比較して、26kDaF断片がより多く蓄積していた。この実験は01のMOIで実施したが、レーン1ではbhPIV3ベクター化RSVF1NN感染をより高い10のMOIで繰り返した。約50kDaおよび90kDaで泳動するRSVGタンパク質の未成熟形態とグリコシル化形態の両方が検出された。は、mRNA転写が図5Aに示したタンパク質発現の結果と相関することを示したノーザンブロット分析である。等量の全RNAを、1ホルムアルデヒドを含有する1アガロースゲル上で分離して、ナイロン膜に移行させた。これらのブロットをジゴキシゲニンUTP標識リボプローブとハイブリダイズさせた。該リボプローブはDIGRNAラベリングキットを用いてinvitro転写により合成したものである。およびは、bhPIV3ベクター化RSVFまたはGタンパク質を含むキメラウイルスのVero細胞内での増殖曲線である。Vero細胞を90コンフルエンスに増殖させ、001または01のMOIで感染させた。感染細胞の単層を37°Cでインキュベートした。各回収時点でTCID50アッセイによりウイルス力価を測定した。前記アッセイは、37°Cで6日間のインキュベーション後にCPEを肉眼で精査することにより行なった。図6bhPIV3でベクター化された増強緑色蛍光タンパク質構築物。eGFP遺伝子を、bhPIV3ベクター中の全てのPIV3遺伝子の間に連続して導入するここでは位置1、2、3および4のみを示す。eGFP遺伝子をbPIV3NP遺伝子間領域に連結させた。bhGFP1構築物は、bhPIV3ゲノムの3側に最も近い位置にeGFP遺伝子カセットを保有する。bhGFP2構築物はN遺伝子とP遺伝子の間にeGFP遺伝子カセットを含有する。bhGFP3構築物はP遺伝子とM遺伝子の間にeGFP遺伝子カセットを含有し、bhGFP4構築物はbhPIV3のM遺伝子とF遺伝子の間にeGFP遺伝子を含有する。図7bhPIV3ゲノムへの増強緑色蛍光タンパク質挿入の位置効果。は、Vero細胞にbhPIV3ベクター化eGFP1、2および3をMOI01とMOI001で20時間感染させた後に生じた緑色細胞の量を示す。緑色細胞は蛍光顕微鏡を使って可視化した。は、感染細胞溶解物のウェスタンブロット分析である。これらのブロットは、PIV3PAbだけでなくGFPMAbも用いて検出した。ブロットが同一容量のローディングであることを示すためにPIV3抗体も使用した。は、bhPIV3ベクター化GFP構築物位置1、2および3に挿入されたもののVero細胞内での増殖曲線である。図8異なる遺伝子間領域をもつbhPIV3ベクター化RSVF遺伝子の構築物。3つの構築物RSVF1NN、RSVF2NP、およびRSVF1NPは、それぞれ図4のRSVF、RSVF2、およびRSVF1と同じである。RSVF1NN中のN遺伝子開始配列とN遺伝子翻訳開始コドンの間の距離はたつたの10ヌクレオチド長である。これに対して、RSVF2構築物ではこの距離が86nt長である。また、RSVF1NNでは、RSVF2構築物で用いられるようなP遺伝子開始配列ではなく、N遺伝子開始配列が用いられる。図9挿入したRSV遺伝子の下流の遺伝子間領域の長さおよびまたは性質は、ウイルスの複製に影響を及ぼす。キメラウイルスにおけるRSVFタンパク質発現のウェスタンブロット分析。ブロットは、RSVFタンパク質に対するモノクローナル抗体で検出した。RSVF1構築物により発現されたF1タンパク質のレベルを、感染の24時間後と48時間後に測定したところ、そのF1タンパク質レベルはRSVF2構築物で観察されたレベルに近似していたが、RSVF1NN構築物で観察されたレベルよりもかなり高かった。は、01のMOIでVero細胞に感染させたRSVFl、RSVF1NNおよびRSVF2構築物のウイルス複製の速度論を比較したマルチサイクル増殖曲線である。各回収時点でのウイルス力価をプラークアッセイで測定したが、このアッセイは5日間のインキュベーション後に定量用のRSVポリクローナル抗血清を用いて免疫染色することにより行なった。図10三価のbhPIV3ベクター化RSVFおよびhMPVFの構築物。2つのウイルスゲノムをここに示すが、各ウイルスゲノムはキメラbhPIV3ベクターとメタニューモウイルスF遺伝子由来の第1の異種配列および呼吸器多核体ウイルスF遺伝子由来の第2の異種配列を含む。これらの構築物のいずれか一方を含むウイルスをVero細胞内で増幅させた。記載した遺伝子操作ウイルスは、パラインフルエンザウイルス感染、メタニューモウイルス感染および呼吸器多核体ウイルス感染に対する三価ワクチンとして使用することができる。図112つのRSVF遺伝子を保有する構築物。この構築物はウイルスの増殖速度を測定するため、RSVFタンパク質の産生のため、ならびにハムスターでの複製および免疫原性を測定するために使用することができる。図12キメラbhPIV3ベクター化hMPVF構築物。ヒトメタニューモウイルスのF遺伝子をbhPIV3ゲノムの位置1または位置2に挿入した。hMPVF遺伝子カセットはbPIV3NP遺伝子間領域を保有していた。図13bhPIV3ベクター化hMPVF遺伝子位置2または位置1の免疫沈降および複製アッセイ。は、モルモットまたはヒト抗hMPV抗血清を用いたhMPVFタンパク質の免疫沈降を示す。bhPIV3ベクター化hMPVF2およびhMPVF1の溶解物中に約80kDaで泳動する特異的バンドが観察された。このサイズはF前駆体タンパク質Foに相当する。bhPIV3および擬似対照レーンにはさまざまなサイズの非特異的バンドも観察された。は、増殖曲線を示すが、これは、bhPIV3hMPVF2のウイルス複製の速度論を測定し、それを、01のMOIでVero細胞に感染させたbhPIV3およびbhPIV3RSVF2について観察されたものと比較するために行なった。~は、増殖曲線を示すが、これは、bhPIV3hMPVFlのウイルス複製の速度論を測定し、それを、001または01のMOIでVero細胞に感染させたbhPIV3hMPVF2およびbhPIV3について観察されたものと比較するために行なった。図14および:bhPIV3ベクター化RSVFワクチン候補のウイルスRNAゲノムの模式図。bhPIV3RSVF2は、PIV3ゲノムの位置2に天然RSVF遺伝子を含み、一方bhPIV3solRSVF2は、膜貫通ドメインと細胞質ドメインを欠失している可溶性RSVFを発現した。RSVFタンパク質からの膜貫通ドメインと細胞質テイルの除去は、C末端で50アミノ酸を欠失させることにより行なった。solRSVF遺伝子カセットのPIV3遺伝子終止配列および遺伝子開始配列は変更されなかったので、RSVF2遺伝子カセットとsolRSVF2遺伝子カセットは、50アミノ酸の欠失を除いて同一であった。solRSVFタンパク質はウイルス粒子エンベロープに組み込まれないだろうと予想された。図15免疫染色されたbhPIV3hMPVF1およびbhPIV3hMPVF2。bhPIV3hMPVF1ウイルスを希釈して、サブコンフルエントなVero細胞への感染に用いた。感染細胞をゲンタマイシン含有optiMEM培地でオーバーレイし、35°Cで5日間インキュベートした。細胞を固定し、モルモット抗hMPV血清を用いて免疫染色した。AEC基質系の存在下での特異的発色によりhMPVFの発現を可視化する。bhPIV3hMPVF2ウイルスを希釈して、Vero細胞への感染に用いた。感染細胞をEMEML15培地中の1メチルセルロースでオーバーレイした。細胞をインキュベートして固定した後、抗hMPVモルモット血清を用いて免疫染色した。抗hMPVモルモット血清はhMPV001タンパク質に特異的である。図16ショ糖密度勾配上でのbhPIV3ベクター化RSV遺伝子のビリオン分画。これらの一連の実験では、RSVタンパク質がbhPIV3ビリオンに組み込まれたか否かを検討する。は、遊離RSVFの対照勾配を示す。大部分の遊離RSVFは画分3、4、5および6に存在した。は、最高濃度のRSVビリオンが画分10、11および12に観察されたことを示す。RSV画分はRSVFMAbとRSVポリクローナル抗体を用いて検出した。最大量のRSVビリオンを含んでいた画分はまた、RSVFについて最も強いシグナルを示し、このことはRSVFタンパク質がRSVビリオンと共泳動し、RSVビリオンと結合していることを示唆する。に示した最後の図はまた、画分10、11および12がプラークアッセイで最高のウイルス力価を呈示したことを示している。bhPIV3ビリオンはより多形性であり、そのためbhPIV3ビリオンを含むピーク画分の広がりがより広範であった。bhPIV3RSVF2のショ糖密度勾配画分は、PIVポリクローナル抗血清とRSVFMAbの両方を用いて分析した。大部分のビリオンを含む画分は、PIV3抗血清を用いたウェスタンブロット分析により示されるように、画分11、12、13および14であった。対応して、これらは最高量のRSVFタンパク質を呈示した画分でもあった。若干の遊離RSVFは画分5および6にも存在していた。画分11、12、13および14はピークウイルス力価を示した。bhPIV3RSVG2のビリオンを最も多く含む画分9、10、11および12はまた、RSVGタンパク質について最も強いシグナルを示した。この場合も、これらは最高のウイルス力価を示す画分であった。図1714日目から56日目までのAGM霊長類研究デザインの概略図。示した時点矢印で血清を採取した。1日目の初期ワクチン接種および28日目のRSVチャレンジ投与を示してある。図18感染性ウイルス力価に及ぼすMOIの影響。感染後、培養物を37±1°Cおよび5±1CO2でインキュベートした。図19感染性ウイルス力価に及ぼすPOIおよび感染後温度の影響。Vero培養物に播種後3日目11×107個フラスコまたは播種後5日目33×107個フラスコのいずれかにMOI001でbhPIV3RSVF2ウイルスを感染させた。図20感染性ウイルス力価に及ぼす血清の感染前添加の影響。Vero細胞を以下の条件の一つで感染前に3日間培養した:4mMグルタミンを添加したOPTIPROSFM、4mMグルタミンと05血清を添加したOPTIPROSFM、および4mMグルタミンと2血清を添加したOPTIPROSFM。感染に先だって、使用済み培地を取り除き、細胞をDPBSで洗った。培養物にMOI0001でbhPIV3RSVF2ウイルスを感染させ、33±1°Cおよび5±1CO2でインキュベートした。図21PIV3HNウイルスタンパク質の発現プロファイル。感染後のさまざまな時点で細胞を固定し、マウス由来のPIV3HNモノクローナル抗体と、続いて蛍光標識ヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートした。図22PIV3Fウイルスタンパク質の発現プロファイル。感染後のさまざまな時点で細胞を固定し、マウス由来のPIV3Fモノクローナル抗体と、続いて蛍光標識ヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートした。図23RSVFウイルスタンパク質の発現プロファイル。感染後のさまざまな時点で細胞を固定し、ヒト由来のRSVFモノクローナル抗体と、続いて蛍光標識ヤギ抗ヒト抗体と共にインキュベートした。図24感染性ウイルス力価に及ぼす血清の感染前添加の影響。Vero細胞を以下の条件の一つで感染前に3日間、2通りのセットのローラーボトルで培養した:4mMグルタミンを添加したOPTIPROSFM、4mMグルタミンと05血清を添加したOPTIPROSFM、および4mMグルタミンと2血清を添加したOPTIPROSFM。5発明の説明本発明は、異種配列または非天然配列の発現に使用することができる組換えパラインフルエンザcDNAおよびRNA構築物組換えウシおよびヒトPIVcDNAおよびRNA構築物を含むがこれらに限定されないに関する。本発明によれば、組換えウイルスは、内在性つまり天然のゲノム配列または非天然のゲノム配列によりコードされるウシパラインフルエンザウイルスまたはヒトパラインフルエンザウイルスから得られるものである。本発明によれば、非天然配列は、天然のまたは内在性のゲノム配列とは異なるものであるが、それは表現型の変化をもたらしてももたらさなくてもよいゲノム配列に対する点突然変異、再配列、挿入、欠失などを含むがこれらに限定されない1以上の突然変異があるためである。本発明によれば、本発明のキメラウイルスは、1つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えbPIVまたはhPIVである。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているか、あるいはヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列で置き換わっているヌクレオチド配列によりコードされうる。これらの組換えおよびキメラウイルスならびに発現産物は、ヒトや動物に投与するのに適したワクチンとして使用することができる。例えば、本発明のキメラウイルスは、ニューモウイルス、呼吸器多核体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、またはインフルエンザウイルスによる感染に対する防御を賦与するためのワクチン製剤中で使用される。一実施形態において、本発明は、ヒトまたはウシPIV変異体に由来し、かつ1、2または3種の異種配列好ましくは種々の病原体、細胞遺伝子、腫瘍抗原およびウイルス由来の外来抗原および他の産物をコードする異種遺伝子を発現するように遺伝子操作されるPIVcDNAおよびRNA構築物に関する。特に、異種配列はmorbillivrusまたはネガティブ鎖RNAウイルスに由来するものであり、例えば、インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス例えば、ヒトメタニューモウイルスのAl、A2、BlおよびB2変異株、およびトリニューモウイルスのサブグループA、B、CおよびDに由来するが、これらに限定されない。哺乳動物MPVはAl、A2、B1またはB2変異株でありうる。しかし、本発明の哺乳動物MPVは、まだ同定されていない追加のMPV変異株をも包含し、Al、A2、BlおよびB2変異株に限定されない。本発明の別の実施形態では、異種配列は変異型PIV配列を含めた非天然のPIV配列である。ある実施形態では、異種配列が同じウイルスまたは異なるウイルスに由来するものである。特定の実施形態において、本発明のウイルスは、ヒトメタニューモウイルスまたはトリニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列を含む組換えPIVである。PIVゲノムに挿入される異種配列には、ヒトメタニューモウイルスAl、A2、BlまたはB2変異株のF、GおよびHN遺伝子をコードする配列、トリニューモウイルスA、B、CまたはD型のF、GおよびHN遺伝子をコードする配列、ならびにその免疫原性およびまたは抗原性断片が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列がウイルスゲノムに付加される。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列が内在性のヌクレオチド配列と置き換わる。異種ヌクレオチド配列は、PIVゲノムの様々な位置例えば、位置1、2、3、4、5または6に追加または挿入される。好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列は位置1に追加または挿入される。別の好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列は位置2に追加または挿入される。さらに別の好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列は位置3に追加または挿入される。ウイルスゲノムのより低い番号の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入または付加すると、ウイルスゲノム全体に生じる転写勾配が原因となって、より高い番号の位置に挿入した場合に比べて、異種ヌクレオチド配列の発現がより強くなる。しかし、ウイルス複製の効率も考慮しなければならない。例えば、本発明のbhPIV3キメラウイルスでは、位置1に異種遺伝子を挿入すると、invitroでの複製速度論が遅くなり、invivoでもさらに遅くなる。したがって、より低い番号の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入することは、異種ヌクレオチド配列の強い発現が望まれる場合には本発明の好ましい実施形態である。最も好ましくは、異種配列の強い発現が望まれる場合には、異種配列をbhPIV3ゲノムの位置2に挿入する。いくつかの他の実施形態においては、組換えまたはキメラPIVゲノムは、異種遺伝子のコード配列の終端と下流遺伝子のコード配列の開始点との間の遺伝子間領域を変化させるように遺伝子操作される。さらに他の実施形態では、本発明のウイルスは、位置1、2、3、4、5および6からなる群より選択される位置に異種ヌクレオチド配列を挿入しかつ異種ヌクレオチド配列と次の下流遺伝子との間の遺伝子間領域を変化させるように遺伝子操作された組換えまたはキメラPIVゲノムを含む。適切なアッセイを用いて最良の挿入様式すなわち、挿入位置および遺伝子間領域の長さを決定することにより、適切なレベルの遺伝子発現およびウイルス増殖の特性を達成することができる。詳細については、セクション512を参照されたい。特定の実施形態において、本発明のキメラウイルスは2つの異なる異種ヌクレオチド配列を含有する。異なる異種ヌクレオチド配列はPIVゲノムの様々な位置に挿入することができる。好ましい実施形態では、1つの異種ヌクレオチド配列が位置1に挿入され、別の異種ヌクレオチド配列が位置2または3に付加または挿入される。本発明の他の実施形態では、追加の異種ヌクレオチド配列がPIVゲノムのより高い番号の位置に挿入される。本発明によれば、異種配列の位置は、その配列がウイルスゲノムから転写される順序をさし、例えば、位置1にある異種配列は、ゲノムから転写される最初の遺伝子配列である。本発明の特定の実施形態において、本発明のウイルスのゲノムに挿入される異種ヌクレオチド配列はネガティブ鎖RNAウイルスに由来するものであり、例えば、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス、およびトリニューモウイルスに由来するが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列がヒトメタニューモウイルスに由来する。別の特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列がトリニューモウイルスに由来する。さらに特定すると、異種ヌクレオチド配列がヒトまたはトリメタニューモウイルスのF、GもしくはSH遺伝子またはその部分をコードする。具体的な実施形態では、異種ヌクレオチド配列が配列番号1~配列番号5、配列番号14、および配列番号15のいずれか1つでありうる表16参照。いくつかの特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号6~配列番号13、配列番号16、および配列番号17のいずれか1つのタンパク質をコードする表16参照。いくつかの特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号314~配列番号389のいずれか1つのタンパク質をコードする。本発明の特定の実施形態において、本発明の異種ヌクレオチド配列は、A型トリニューモウイルスに由来する。本発明の他の特定の実施形態では、本発明の異種ヌクレオチド配列は、B型トリニューモウイルスに由来する。本発明のさらに他の特定の実施形態では、本発明の異種ヌクレオチド配列は、C型トリニューモウイルスに由来する。系統発生的分析により、A型とB型は、C型に対してより互いに近縁であることが示されている6772。A型とB型はヨーロッパに見られ、一方C型は米国で最初に分離された。本発明の別の実施形態において、異種ヌクレオチド配列はキメラポリペプチドをコードするものであり、このキメラポリペプチドにおいて、細胞外ドメインはベクター骨格が誘導されるPIV株以外のウイルスに由来する抗原性配列を含み、膜貫通および内腔ドメインはPIV配列から誘導される。得られるキメラウイルスは、選ばれたネガティブ鎖RNAウイルスの抗原性を賦与し、弱毒化された表現型をもつと考えられる。本発明の特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列はキメラFタンパク質をコードするものである。特に、キメラFタンパク質の細胞外ドメインはヒトメタニューモウイルスまたはトリニューモウイルスのようなメタニューモウイルスの細胞外ドメインであり、その膜貫通ドメインおよび内腔ドメインはヒトまたはウシパラインフルエンザウイルスのようなパラインフルエンザウイルスの膜貫通および内腔ドメインである。いかなる理論によっても拘束されないが、キメラFタンパク質の挿入は、意図した宿主内で該ウイルスをさらに弱毒化するものの、その細胞外ドメインに起因するFタンパク質の抗原性は保持している。本発明のキメラウイルスは、各種の感染ニューモウイルス感染、呼吸器多核体ウイルス感染、パラインフルエンザウイルス感染、インフルエンザウイルス感染、またはこれらの組合せを含むが、これらに限定されないから防御することができるワクチン製剤中で使用しうる。本発明は、1種以上の異種抗原配列を発現するキメラPIVを含むワクチン製剤二価および三価のワクチンを含むを提供する。本発明の二価および三価ワクチンは、それぞれの異種抗原配列を発現する1つのPIVベクターの形で、または各ベクターが異なる異種抗原配列をコードする2つ以上のPIVベクターの形で投与することができる。好ましくは、異種抗原配列は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス例えば、ヒトメタニューモウイルス、およびトリニューモウイルスを含むがこれらに限定されないネガティブ鎖RNAウイルスに由来する。こうして、本発明のキメラウイルス粒子を遺伝子操作することにより、例えば、抗ヒトインフルエンザワクチン、抗ヒトパラインフルエンザワクチン、抗ヒトRSVワクチン、および抗ヒトメタニューモウイルスワクチンを作ることができる。好ましくは、本発明のワクチン製剤は、生存能があって感染性である弱毒型キメラウイルスを含有する。本発明のワクチン製剤は、単独で投与してもよいし、他のワクチン、他の予防薬または治療薬と組み合わせて投与してもよい。本発明はまた、広範なウイルスおよびまたは抗原腫瘍抗原を含むに対するワクチンを製剤化するためのウイルスベクターおよびキメラウイルスの使用に関するものである。本発明のウイルスベクターおよびキメラウイルスは、体液性免疫応答、細胞性免疫応答を刺激することによって、または抗原に対する寛容を刺激することによって、被験体の免疫系を調節するために使用される。本明細書中で用いる被験体とは、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはトリ種のメンバーをさす。腫瘍抗原を送達する場合には、本発明は、非固形腫瘍または小さいサイズの固形腫瘍といった、免疫反応介在拒絶反応をおこしやすい疾患を有する被験者の治療に用いられる。また、本明細書に記載のウイルスベクターおよびキメラウイルスによる腫瘍抗原の送達は、大きな固形腫瘍の摘出後の治療に有用であると考えられる。本発明はまた、癌の存在が疑われる被験者の治療にも使用することができる。本発明は、限定ではなく説明のために以下のサブセクションに分けることができる:組換えcDNAおよびRNA鋳型の構築組換えcDNAおよびRNA鋳型を用いた異種遺伝子産物の発現および組換えウイルス粒子中の異種遺伝子のレスキュー。51組換えcDNAおよびRNA鋳型の構築本発明は、ウシパラインフルエンザウイルスと哺乳動物パラインフルエンザウイルスを含めて、パラインフルエンザウイルスのゲノムから誘導されたウイルスベクターによりコードされる組換えまたはキメラウイルスを包含する。本発明によれば、組換えウイルスは、内在性つまり天然のゲノム配列または非天然のゲノム配列によりコードされるウシパラインフルエンザウイルスまたは哺乳動物パラインフルエンザウイルスから誘導されるものである。本発明によれば、非天然配列は天然のまたは内在性のゲノム配列とは異なるものであるが、それは表現型の変化をもたらしてももたらさなくてもよいゲノム配列に対する点突然変異、再配列、挿入、欠失などを含むがこれらに限定されない1以上の突然変異があるためである。本発明の組換えウイルスは、ウシおよび哺乳動物のパラインフルエンザウイルスを含めて、パラインフルエンザウイルスのゲノムから誘導されるウイルスベクターによりコードされるウイルスを包含し、ウイルスゲノムに対して天然ではない核酸を含んでいても含まなくてもよい。本発明によれば、パラインフルエンザウイルスのゲノムから誘導されるウイルスベクターは、パラインフルエンザウイルスの1つのORFの少なくとも一部をコードする核酸配列を含むものである。本発明はまた、ワクチン製剤中での使用により適した表現型例えば、弱毒化表現型または増強された抗原性をもつウイルスをもたらす配列を含むウシおよびまたは哺乳動物PIVゲノムから誘導されたウイルスベクターを含む組換えウイルスを包含する。突然変異および改変はコード領域に、遺伝子間領域に、ウイルスのリーダーおよびトレーラー配列に存在しうる。本発明によれば、本発明のウイルスベクターは、哺乳動物のパラインフルエンザウイルス、特にヒトのパラインフルエンザウイルスhPIVのゲノムから誘導される。本発明の特定の実施形態では、ウイルスベクターはヒトパラインフルエンザウイルス3型のゲノムに由来する。本発明によれば、これらのウイルスベクターはウイルスゲノムに対して天然ではない核酸を含んでいても含まなくてもよい。本発明によれば、本発明のウイルスベクターは、ウシパラインフルエンザウイルスbPIVのゲノムから誘導される。本発明の特定の実施形態では、ウイルスベクターはウシパラインフルエンザウイルス3型のゲノムに由来する。本発明によれば、これらのウイルスベクターはウイルスゲノムに対して天然ではない核酸を含んでいても含まなくてもよい。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えbPIVまたはhPIVである。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているか、または内在性のまたは天然の配列が異種ヌクレオチド配列で置き換わっているヌクレオチド配列によりコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む本発明のウイルスベクターによりコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、ウイルスゲノムに対して天然ではない核酸を含んでいても含まなくてもよいウイルスベクターによりコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列が付加された、挿入された、または天然のもしくは非天然の配列の代わりに使用されたウイルスベクターによりコードされる。キメラウイルスは2種以上のウイルスから防御する組換えワクチンを作るのに特に有用であるTengら2000JVirol7493179321。例えば、別のネガティブ鎖RNAウイルス例えば、MPVの1つ以上のタンパク質を発現するhPIVまたはbPIVウイルスベクター、あるいはMPVの1つ以上のタンパク質を発現するRSVベクターは、かかるベクターでワクチン接種された個体を両方のウイルス感染から防御すると想定される。同様の手法が他のパラミクソウイルスにも考えられる。弱毒型および複製欠損ウイルスは、他のウイルスに関して提案されているような、生ワクチンを用いたワクチン接種のために使用することができる。本発明によれば、本発明の組換えまたはキメラウイルスをコードするウイルスベクターに組み込まれる異種配列には、種々のメタニューモウイルス株、トリニューモウイルス株、その他のネガティブ鎖RNAウイルスRSV、PIV、インフルエンザウイルス、その他のウイルス例えば、麻疹ウイルスを含むがこれらに限定されないから得られるまたは誘導される配列が含まれる。本発明のある実施形態では、本発明のキメラまたは組換えウイルスは、1つ以上の配列、遺伝子間領域、末端配列、あるいは一部または全体のORFが異種配列または非天然配列で置換されているウイルスゲノムから誘導されたウイルスベクターによりコードされる。本発明のある実施形態では、本発明のキメラウイルスは、1つ以上の異種配列がベクターに付加されているウイルスゲノムから誘導されたウイルスベクターによりコードされる。本発明の特定の実施形態は、パラインフルエンザウイルスのゲノム由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスである。好ましい実施形態では、PIVゲノムがウシPIV例えば、bPIV3のKansas株から、またはヒトPIVから誘導される。好ましい実施形態では、PIVゲノムが、ウシパラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列が異種配列で置換されているか、または異種配列が完全なbPIVゲノムに付加されているbPIV3のKansas株から誘導される。本発明のさらに具体的な実施形態は、ヒトパラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列が異種配列で置換されているか、または異種配列が完全なhPIVゲノムに付加されている、ヒトパラインフルエンザウイルス3型ゲノム由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスである。本発明のさらに具体的な実施形態は、ウシパラインフルエンザウイルスのF遺伝子およびHN遺伝子がヒトパラインフルエンザウイルスのF遺伝子およびHN遺伝子で置換されており、かつ異種配列が完全なbPIVゲノムに付加されている、bPIV3のKansas株のようなウシパラインフルエンザウイルスゲノム由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスである。本発明はまた、異種配列に加えて、ワクチン製剤中での使用により適した表現型例えば、弱毒化表現型または増強された抗原性をもつキメラウイルスをもたらす突然変異または改変を含む、bPIV、hPIV、またはbPIVhPIVゲノム由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスを包含する。本発明のこの特定の実施形態によれば、ウシPIV3骨格の状況下での異種配列は、bPIV3に対して異種であれば、どのような配列でもよい。本発明の別の特定の実施形態は、hPIVヌクレオチド配列が異種配列で置換されているか、または異種配列が完全なhPIVゲノムに付加されている、ヒトPIV1、2、または3由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスである。ただし、得られるキメラウイルスは、ヘマグルチニンノイラミニダーゼおよび融合糖タンパク質がhPIV1のもので置き換わっているキメラhPIV3ではない。本発明はまた、異種配列に加えて、ワクチン製剤中での使用により適した表現型例えば、弱毒化表現型または増強された抗原性をもつキメラウイルスをもたらす突然変異または改変を含む、hPIVゲノム由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスを包含する。ウイルスポリメラーゼ結合部位プロモーターの相補体、例えば本発明の3PIVウイルス末端の相補体、または3および5PIVウイルス末端の両方の相補体で挟まれた異種遺伝子コード配列は、当技術分野で公知の技法を用いて構築することができる。得られるRNA鋳型は、ネガティブ極性のものであり、ウイルスRNA合成装置がその鋳型を認識することを可能にする適切な末端配列を含有しうる。あるいはまた、ウイルスRNA合成装置が鋳型を認識することを可能にする適切な末端配列を含有する、ポジティブ極性のRNA鋳型を使用することもできる。これらのハイブリッド配列を含有する組換えDNA分子は、クローニングされ、バクテリオファージT7ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼまたは真核生物ポリメラーゼ例えば、ポリメラーゼIなどの、DNA特異的RNAポリメラーゼによって転写され、それによって、ウイルスポリメラーゼの認識および活性を可能にする適切なウイルス配列をもつ組換えRNA鋳型をinvitroまたはinvivoで生産することができる。一実施形態において、本発明のPIVベクターは、抗原性ポリペプチドおよびペプチドをコードする1、2または3つの異種配列を発現する。ある実施形態では、異種配列は同一のウイルスまたは異なるウイルスに由来するものである。いくつかの実施形態では、2コピー以上の同一の異種ヌクレオチド配列が、ウシパラインフルエンザウイルスのゲノム、ヒトパラインフルエンザウイルスのゲノム、またはbPIVhPIVキメラベクターに挿入される。好ましい実施形態では、2コピーの同一の異種ヌクレオチド配列が本発明のウイルスのゲノムに挿入される。ある実施形態では、異種ヌクレオチド配列はヒトメタニューモウイルスまたはトリニューモウイルスのようなメタニューモウイルスに由来するものである。特定の実施形態では、メタニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列がメタニューモウイルスのF遺伝子である。他の特定の実施形態では、メタニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列がメタニューモウイルスのG遺伝子である。いくつかの他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列が呼吸器多核体ウイルスに由来するものである。特定の実施形態では、呼吸器多核体ウイルス由来の異種ヌクレオチド配列が呼吸器多核体ウイルスのF遺伝子です。他の特定の実施形態では、呼吸器多核体ウイルス由来の異種ヌクレオチド配列が呼吸器多核体ウイルスのG遺伝子です。1つ以上の異種ヌクレオチド配列が挿入される場合には、挿入位置および挿入された各コピーの遺伝子間領域の長さを操作して、以下のセクション512に従って様々なアッセイにより決定することができる。ある実施形態において、キメラウイルスまたは発現産物のレスキューは、宿主細胞がキメラcDNAまたはRNA構築物でトランスフェクトされている宿主細胞系における逆遺伝学的手法により達成することができる。本発明のRNA鋳型は、適当なDNA配列をDNA特異的RNAポリメラーゼにより転写することで調製される。本発明のRNA鋳型は、適当なDNA配列を、バクテリオファージT7ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、または真核生物ポリメラーゼ例えば、ポリメラーゼIなどの、DNA特異的RNAポリメラーゼを用いて転写することにより、invitroまたはinvivoで調製しうる。ある実施形態では、本発明のRNA鋳型は、適当なDNA配列を、Hoffmannら2000ProcNatlAcadSciUSA9761086113に記載されるプラスミドに基づく発現系を用いて、またはHoffmannおよびWebster2000JGenVirol8128432847に記載される一方向RNAポリメラーゼIポリメラーゼII転写系を用いて転写することにより、invitroまたはinvivoで調製しうる。得られるネガティブ極性のRNA鋳型は、ウイルスRNA合成装置がその鋳型を認識することを可能にする適切な末端配列を含むだろう。あるいはまた、ウイルスRNA合成装置が鋳型を認識することを可能にする適切な末端配列を含有する、ポジティブ極性のRNA鋳型を使用することもできる。ポジティブ極性のRNA鋳型からの発現は、DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターをもつプラスミドの転写により達成しうる。例えば、ポジティブRNA鋳型をT7プロモーターの制御下でコードするプラスミドDNAは、ワクシニアウイルスまたは鶏痘T7系と組み合わせて使用される。2シストロン性bicistronicmRNAは、ウイルス配列の翻訳の内部開始が可能になるように、また通常の末端開始部位から外来タンパク質コード配列の発現が可能になるように、構築することができる。あるいはまた、外来タンパク質は、転写単位が開始部位とポリアデニル化部位を有する内部転写単位から発現させることができる。別の実施形態では、得られる発現タンパク質が融合タンパク質となるように、外来遺伝子をPIV遺伝子に挿入する。ある実施形態では、本発明は、本発明のウイルスを含む三価ワクチンに関する。特定の実施形態では、三価ワクチンに使用されるウイルスは、呼吸器多核体ウイルス由来の第1の異種ヌクレオチド配列とメタニューモウイルス例えば、ヒトメタニューモウイルスまたはトリニューモウイルス由来の第2の異種ヌクレオチド配列を含有するキメラなウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザ3型である。例示的な実施形態では、そのような三価ワクチンは、ヒトパラインフルエンザウイルスのF遺伝子およびHN遺伝子の遺伝子産物に、呼吸器多核体ウイルス由来の異種ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に、メタニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に、特異的であるだろう。特定の実施形態では、第1の異種ヌクレオチド配列は、呼吸器多核体ウイルスのF遺伝子であって位置1に挿入され、第2の異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスのF遺伝子であって位置3に挿入される。さらに多くの組合せが本発明に包含され、その一部を例として表1に示す。他の組合せとして、トリニューモウイルスのFまたはG遺伝子を用いることができる。さらに、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を使用することができる。いくつかのそれほど好ましくはない実施形態では、異種ヌクレオチド配列をウイルスゲノムのより高い番号の位置に挿入することができる。いくつかの他の実施形態においては、異種配列と下流遺伝子のコード配列の開始点との間の遺伝子間領域を変化させることができる。例えば、表1に示した各遺伝子は望ましい長さの遺伝子間領域をもっていてよい。代表的な実施形態では、三価ワクチンは、位置1に挿入された呼吸器多核体ウイルスのF遺伝子、177ヌクレオチドの改変された遺伝子間領域もとの75ヌクレオチドから下流N遺伝子の開始コドンAUGまで、および天然の遺伝子間領域をもつ位置3に挿入されたヒトメタニューモウイルスのF遺伝子を含むbhPIV3ベクターを含有する。もっと多くの組合せが本発明に包含され、異種ヌクレオチド配列のそれぞれの挿入を以下のセクション512に従って操作することができる。より広い実施形態においては、本発明の発現産物およびキメラウイルス粒子は、ウイルス抗原、腫瘍抗原、および自己免疫疾患に関わる自己抗原を含めた広範な病原体に対するワクチンを作るために遺伝子操作されうる。この目標を達成する1つの方法は、既存のPIV遺伝子を、それぞれの外部ドメインに外来配列を含むように、改変させることを含む。異種配列が病原体のエピトープまたは抗原である場合、これらのキメラウイルスは、病原体これらの決定基はこの病原体に由来するに対して防御免疫応答を誘発させるのに使用することができる。これらのハイブリッド分子を構築するための1つの手法は、異種ヌクレオチド配列を、hPIV、bPIV、またはbPIVhPIVなどのPIVゲノムのDNA相補体に挿入して、異種配列がウイルスポリメラーゼ活性に必要なウイルス配列、すなわちウイルスポリメラーゼ結合部位プロモーター以後これをウイルスポリメラーゼ結合部位と呼ぶとポリアデニル化部位によって挟まれるようにすることです。好ましい実施形態では、異種コード配列が、5および3末端の複製プロモーター、遺伝子開始配列および遺伝子終止配列、5およびまたは3末端に見出されるパッケージングシグナルを含んだウイルス配列によって挟まれる。代替の手法では、ウイルスポリメラーゼ結合部位をコードするオリゴヌクレオチド、例えばウイルスゲノムセグメントの3末端あるいは両末端の相補体、を異種コード配列にライゲートして、ハイブリッド分子を構築することができる。外来遺伝子または外来遺伝子のセグメントを標的配列内に配置することは、以前には標的配列内に適切な制限酵素部位を存在させることによって行なわれていた。しかし、分子生物学の近年の進歩により、この問題が大幅に解消されている。制限酵素部位は、部位特異的突然変異誘発を用いることによって、標的配列内のどこにでも容易に配置することができる。以下に述べるポリメラーゼ連鎖反応技術の変法によっても、配列の特異的な挿入が可能になり、またハイブリッド分子の容易な構築が可能になる。あるいはまた、PCR反応を使用することにより、クローニングの必要なく組換え鋳型を作製することができる。例えばPCR反応を使用して、DNA特異的RNAポリメラーゼプロモーターと、異種遺伝子およびPIVポリメラーゼ結合部位を含有するハイブリッド配列とを含有する二本鎖DNA分子を作製することができる。次いでこの組換えDNAからRNA鋳型を直接転写することができる。さらに別の実施形態では、RNAリガーゼを使用して、ネガティブ極性の異種遺伝子を特定するRNAとウイルスポリメラーゼ結合部位とをライゲートすることにより、組換えRNA鋳型を作製することができる。さらに、ウイルスのレスキューを成功させるのに重要と考えられる6の法則に従って、1つ以上のヌクレオチドを非翻訳領域にあるHN遺伝子の3末端に付加することができる。6の法則は数多くのパラミクソウイルスに適用され、機能性であるためにはRNAゲノムのヌクレオチド数を6の倍数にすることを必要とする。ヌクレオチドの付加は、QuickChange突然変異誘発キットなどの市販の突然変異誘発キットを使用するなど、当技術分野で公知の技法によって実現することができる。適切な数のヌクレオチドを付加した後、適切な制限酵素による消化およびゲル精製によって、正しいDNA断片例えば、hPIV3FおよびHN遺伝子のDNA断片を単離することができる。本発明により使用することができるウイルスポリメラーゼ活性および構築物に関する配列要件については、以下のサブセクションで述べる。理論によって拘束されるものではないが、いくつかのパラメータが、組換えウイルスの複製速度および異種配列の発現レベルに影響を与える。特に、bPIV、hPIV、bhPIV中の異種配列の位置と、この異種配列に隣接する遺伝子間領域の長さは、複製速度と異種配列の発現レベルを決定する。ある実施形態においては、ウイルスのリーダー配列およびまたはトレーラー配列が野生型ウイルスに対して改変される。いくつかのより具体的な実施形態では、リーダーおよびまたはトレーラーの長さを改変する。他の実施形態では、リーダーおよびまたはトレーラーの配列を野生型ウイルスに対して突然変異させる。本発明の組換えウイルスの作製は、ネガティブセンスウイルスRNAゲノムの部分または完全長コピー、あるいはその相補的コピーの複製を利用する。このvRNAまたはcRNAは、核酸のinvitro転写の際に生成された、または核酸のトランスフェクション後に細胞内で生成された、感染性ウイルスから単離することができる。第二に、組換えネガティブ鎖ウイルスの作製は、機能性ポリメラーゼ複合体を利用する。典型的には、ニューモウイルスのポリメラーゼ複合体は、N、P、LおよびおそらくはM2タンパク質からなるが、必ずしもこれらに限定されない。ポリメラーゼ複合体またはその構成要素は、ウイルス粒子から、または1以上の構成要素を発現する細胞から単離することができ、あるいは特定の発現ベクターのトランスフェクションによって生成することができる。PIVの感染性コピーは、上記vRNA、cRNA、またはこれらのRNAを発現するベクターが上記ポリメラーゼ複合体16によって複製される場合に得ることができる。本発明は、本発明による核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。PIVのポリメラーゼ構成要素を含有するプラスミドまたはウイルスベクターは、適切な細胞型でのその構成要素の発現のために原核細胞内で生成させる。PIVゲノムの完全長または部分コピーを含有するプラスミドまたはウイルスベクターが、invitroまたはinvivoでのウイルス核酸の発現のために原核細胞内で生成される。後者のベクターは、キメラウイルスまたはキメラウイルスタンパク質を生成するために他のウイルス配列を含んでいてもよく、複製欠損ウイルスを生成するためにウイルスゲノムの一部を欠失していてもよく、また、弱毒化ウイルスを生成するために突然変異、欠失、または挿入を含んでいてもよい。PIVの感染性コピーは、上記の公知技術に従ってポリメラーゼ構成要素の共発現により生成することができる。さらに、1つ以上の完全長または部分PIVタンパク質を一過性にまたは安定して発現する真核細胞を使用することができる。そのような細胞は、トランスフェクション、感染、または形質導入によって作製することができ、上記野生型ウイルス、弱毒型ウイルス、複製欠損ウイルス、またはキメラウイルスの補完に役立てることができる。511挿入される異種遺伝子配列本発明は、1つ以上の異種配列異種配列は好ましくは抗原性およびまたは免疫原性である遺伝子産物またはその断片をコードするを発現させるために組換えウシまたはヒトパラインフルエンザウイルスを遺伝子操作することを包含する。本明細書中で用いる抗原性とは、抗体またはMHC分子と結合する分子の能力をさす。免疫原性とは、宿主において免疫応答を引き出す分子の能力をさす。好ましい実施形態において、挿入される異種ヌクレオチド配列は、ネガティブ鎖RNAウイルスインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス、およびトリニューモウイルスを含むが、これらに限らないに由来するものである。好ましい実施形態では、挿入される異種配列には、ヒトPIVのFまたはHN遺伝子、RSVのF遺伝子、インフルエンザウイルスA、BまたはC型のHA遺伝子、ヒトMPVのF遺伝子、トリニューモウイルスのF遺伝子をコードする配列、あるいはそれらの免疫原性およびまたは抗原性断片が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態においては、挿入される異種ヌクレオチド配列がヒトメタニューモウイルスまたはトリニューモウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、挿入される異種ヌクレオチド配列が、ヒトメタニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルス、およびまたはトリニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルスに由来する。本発明のある好ましい実施形態では、挿入される異種ヌクレオチド配列がヒトメタニューモウイルスおよびまたはトリニューモウイルス由来のF遺伝子から得られる。いくつかの実施形態では、F遺伝子は、ヒトメタニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルス、およびまたはトリニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルスに由来する。本発明のある実施形態では、挿入される異種ヌクレオチド配列がヒトメタニューモウイルスおよびまたはトリニューモウイルス由来のG遺伝子である。いくつかの実施形態では、G遺伝子は、ヒトメタニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルス、およびまたはトリニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルスに由来する。ある実施形態においては、ヒトメタニューモウイルス、トリニューモウイルス、および呼吸器多核体ウイルス由来の異なるF遺伝子およびまたは異なるG遺伝子の任意の組合せを本発明のウイルスに挿入することができるが、ただし、全ての実施形態において、ヒトメタニューモウイルスまたはトリニューモウイルスのいずれかに由来する少なくとも1つの異種配列が本発明の組換えパラインフルエンザウイルス中に存在しなければならない。ある実施形態においては、挿入されるヌクレオチド配列はヒトメタニューモウイルス由来のFタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。他の実施形態では、挿入されるヌクレオチド配列はヒトメタニューモウイルス由来のGタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。さらに他の実施形態では、挿入されるヌクレオチド配列はトリニューモウイルス由来のFタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。さらに他の実施形態では、挿入されるヌクレオチド配列はトリニューモウイルス由来のGタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。ただし、本発明の全ての実施形態において、少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列はメタニューモウイルスに由来し、挿入される異種ヌクレオチド配列は呼吸器多核体ウイルスのFタンパク質またはGタンパク質をコードする。ある実施形態において、挿入されるヌクレオチド配列はキメラFタンパク質またはキメラGタンパク質をコードするものである。キメラFタンパク質は、ヒトメタニューモウイルス、トリニューモウイルスおよびまたは呼吸器多核体ウイルスなどの様々なウイルス由来のFタンパク質の一部を含む。キメラGタンパク質は、ヒトメタニューモウイルス、トリニューモウイルスおよびまたは呼吸器多核体ウイルスなどの様々なウイルス由来のGタンパク質の一部を含む。特定の実施形態では、Fタンパク質はメタニューモウイルスのFタンパク質の細胞外ドメイン、パラインフルエンザウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメイン、およびパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の内腔ドメインを含む。ある実施形態では、挿入される核酸は、可溶性Fタンパク質が発現されるようにFタンパク質の膜貫通ドメインが欠失されているFタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、本発明の異種ヌクレオチド配列は、配列番号1~配列番号5、配列番号14および配列番号15のいずれか1つである表16参照。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号6~配列番号13、配列番号16および配列番号17のいずれか1つのタンパク質をコードする表16参照。呼吸器多核体ウイルス由来の異種ヌクレオチド配列に関しては、例えば参照によりその全体を本明細書に組み入れるPCTUS9820230を参照されたい。好ましい実施形態では、本発明の組換えウイルス内で発現させることのできる異種遺伝子配列には、呼吸器疾患をもたらすウイルスの抗原エピトープおよび糖タンパク質、例えばインフルエンザ糖タンパク質、特にヘマグルチニンH5、H7、呼吸器多核体ウイルスのエピトープ、ニューカッスル病ウイルスのエピトープ、センダイウイルスおよび感染性喉頭気管炎ウイルスなどのエピトープをコードするものが含まれるが、これらに限定されない。大部分の好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列はメタニューモウイルス、例えばヒトメタニューモウイルスおよびまたはトリニューモウイルスから得られる。本発明のさらに別の実施形態では、本発明のキメラウイルスに遺伝子操作されうる異種遺伝子配列には、ウイルスエピトープおよびウイルス糖タンパク質、例えばB型肝炎表面抗原、AまたはC型肝炎表面糖タンパク質、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルスの糖タンパク質、シミアンウイルス5または流行性耳下腺炎ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、ヘルペスウイルスの糖タンパク質、ポリオウイルスのVPI、およびヒト免疫不全ウイルス好ましくは1型または2型由来の配列をコードするものが含まれるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、本発明のキメラウイルスに遺伝子操作されうる異種遺伝子配列には、マレック病ウイルスのエピトープ、感染性バーサル病ウイルスのエピトープ、ニワトリ貧血ウイルスのエピトープ、トリインフルエンザウイルス、狂犬病、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、および豚痘ウイルスのエピトープが含まれるが、これらに限定されない、1991FundamentalVirology第2版RavenPress、NewYork参照。本発明のその他の異種配列は、自己免疫疾患に特有の抗原をコードするものを含む。これらの抗原は、典型的な場合、哺乳動物組織の細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリアなどから得られ、糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、悪性貧血、アジソン病、強皮症、自己免疫性萎縮性胃炎、若年性糖尿病、および円板状エリテマトーデスに特有の抗原が含まれる。アレルゲンである抗原は、一般にタンパク質または糖タンパク質を含み、花粉、ダスト、カビ、胞子、フケ、昆虫、および食物由来の抗原が含まれる。さらに、腫瘍抗原に特有の抗原は、典型的な場合、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官などから得られる。その例としては、腫瘍タンパク質に特有の抗原、例えば変異した発癌遺伝子によりコードされたタンパク質、腫瘍に関連したウイルスタンパク質、および糖タンパク質が含まれる。腫瘍には、口唇癌、鼻咽頭癌、咽頭および口腔癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、喉頭癌、肺および気管支癌、皮膚黒色腫、乳癌、子宮頚癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮癌、脳およびその他の神経系部分の腫瘍、甲状腺癌、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、および白血病などの癌のタイプから得られたものが含まれるが、これらに限定されない。本発明の1つの特定の実施形態では、異種配列が、ヒト免疫不全ウイルスのゲノム、好ましくはヒト免疫不全ウイルス1型またはヒト免疫不全ウイルス2型のゲノムから得られる。本発明の別の実施形態では、PIVウイルスタンパク質内に異種ペプチド配列を含有するキメラ遺伝子産物が発現されるように、異種コード配列を、PIV遺伝子コード配列内に挿入することができる。本発明のそのような実施形態では、異種配列を、ヒト免疫不全ウイルス、好ましくはヒト免疫不全ウイルス1型またはヒト免疫不全ウイルス2型のゲノムから得てもよい。異種配列がHIV由来のものである場合、そのような配列には、env遺伝子、pol遺伝子、gag遺伝子、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、およびまたはvpxから得られた配列を含めることができるが、これらに限定されない。別の実施形態では、キメラウイルス内に遺伝子操作されうる異種遺伝子配列は、免疫賦活作用を有するタンパク質をコードするものが含まれる。免疫賦活タンパク質の例には、サイトカイン、インターフェロン1型、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン1、2、4、5、6、12が含まれるが、これらに限定されない。さらに、キメラウイルス内に遺伝子操作されうるその他の異種遺伝子配列には、細菌の表面糖タンパク質などの細菌由来の抗原、真菌由来の抗原、様々な他の病原体および寄生虫由来の抗原が含まれる。細菌性病原体から得られる異種遺伝子配列の例には、以下の属の種に由来する抗原をコードするものが含まれるが、これらに限定されない。すなわちSalmonella、Shigella、Chlamydia、Helicobacter、Yersinia、Bordatella、Pseudomonas、Neisseria、Vibrio、Haemophilus、Mycoplasma、Streptomyces、Treponema、Coxiella、Ehrlichia、Brucella、Streptobacillus、Fusospirocheta、Spirillum、Ureaplasma、Spirochaeta、Myocoplasma、Actinomycetes、Borrelia、Bacteroides、Trichomoras、Branhamella、Pasteurella、Clostridium、Corynebacterium、Listeria、Bacillus、Erysipelothrix、Rhodococcus、Escherichia、Klebsiella、Pseudomanas、Enterobacter、Serratia、Staphylococcus、Streptococcus、Legionella、Mycobacterium、Proteus、Campylobacter、Enterococcus、Acinetobacter、Morganella、Moraxella、Citrobacter、Rickettsia、Rochlimeae、ならびにPaeruginosa、Ecoli、Pcepacia、Sepidermis、Efaecalis、Spneumonias、Saureus、Nmeningitidis、Spyogenes、Pasteurellamultocida、Treponemapallidum、およびPmirabilisなどの細菌種。病原性真菌由来の異種遺伝子配列の例には、CryptococcusneoformansBlastomycesdermatitidisAiellomycesdermatitidisHistoplasmacapsulatumCoccidioidesimmitisCalbicans、Ctropicalis、Cparapsilosis、Cguilliermondii、およびCkruseiを含めたCandida種Afumigatus、Aflavus、およびAnigerを含めたAspergillus種Rhizopus種Rhizomucor種Cunninghammella種Asaksenaea、Amucor、およびAabsidiaを含めたApophysomyces種SporothrixschenckiiParacoccidioidesbrasiliensisPseudallescheriaboydiiTorulopsisglabrataTrichophyton種Microsporum種およびDermatophyres種などの真菌由来の抗原、ならびに病原性であることが現在知られているかまたは後に同定される他の酵母または真菌由来の抗原をコードするものが含まれるが、これらに限定されない。最後に、寄生虫由来の異種遺伝子配列の例には、例えばBabesia、Toxoplasma、Plasmodium、Eimeria、Isospora、Atoxoplasma、Cystoisospora、Hammondia、Besniotia、Sarcocystis、Frenkelia、Haemoproteus、Leucocytozoon、Theileria、Perkinsus、およびGregarina種などのApicomplexaphylumのメンバーPneumocystiscarinii例えばNosema、Enterocytozoon、Encephalitozoon、Septata、Mrazekia、Amblyospora、Ameson、Glugea、Pleistophora、およびMicrosporidium種などのMicrosporaphylumのメンバー例えばHaplosporidium種などのAscetosporaphylumのメンバー、ならびにPlasmodiumfalciparum、Pvivax、Povale、Pmalariaを含めた種ToxoplasmagondiiLeishmaniamexicana、Ltropica、Lmajor、Laethiopica、Ldonovani、Trypanosomacruzi、Tbrucei、Schistosomamansoni、Shaematobium、SjaponiumTrichinellaspiralisWuchereriabancroftiBrugiamalayliEntamoebahistolyticaEnterobiusvermiculoarusTaeniasolium、Tsaginata、Trichomonasvaginatis、Thominis、TtenaxGiardialambliaCryptosporidiumparvumPneumocytiscarinii、Babesiabovis、Bdivergens、Bmicroti、Isosporabelli、LhominisDientamoebafragilisOnchocercavolvulusAscarislumbricoidesNecatoramericanisAncylostomaduodenaleStrongyloidesstercoralisCapillariaphilippinensisAngiostrongyluscantonensisHymenolepisnanaDiphyllobothriumlatumEchinococcusgranulosus、EmultilocularisParagonimuswestermani、PcaliensisChlonorchissinensisOpisthorchisfelineas、GViverini、Fasciolahepatica、Sarcoptesscabiei、PediculushumanusPhthirluspubisおよびDermatobiahominis、ならびに病原性であることが現在知られているかまたは後に同定される他の寄生虫由来の抗原をコードするものが含まれるが、これらに限定されない。512挿入されるメタニューモウイルス配列本発明は、哺乳動物MPVの核酸配列、哺乳動物MPVのタンパク質、および哺乳動物MPVのタンパク質に対する抗体に関する。本発明はさらに、哺乳動物MPVの核酸配列の相同体、および哺乳動物MPVのタンパク質の相同体に関する。本発明はさらに、融合タンパク質をコードする核酸配列に関し、この融合タンパク質は、哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片と、哺乳動物MPV由来ではない1つ以上のペプチドまたはタンパク質を含有するものである。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片とペプチドタグポリヒスチジンタグなどであるが、これに限定されないを含有する。本発明はさらに、哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片と、哺乳動物MPV由来ではない1つ以上のペプチドまたはタンパク質を含有する融合タンパク質に関する。また本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質をコードする核酸の誘導体にも関する。また本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質の誘導体にも関する。誘導体は、付加、欠失、トランケーション、置換、および反転などであるがこれらに限定されないタンパク質の変異形態でありうるが、これらに限定されない。誘導体は、さらに、哺乳動物MPVのタンパク質のキメラ形態であってもよく、そのタンパク質の少なくとも1つのドメインが異なるタンパク質に由来するものである。誘導体は、例えば薬物などの別の分子に共有結合または非共有結合で結合された哺乳動物MPVのタンパク質の形態であってもよい。NL100と呼ばれるウイルス分離株は、変異型A1の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号95に示される。NL1700と呼ばれるウイルス分離株は、変異型A2の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号96に示される。NL199と呼ばれるウイルス分離株は、変異型B1の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号94に示される。NL194と呼ばれるウイルス分離株は、変異型B2の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号97に示される。本願で開示される配列とそれに対応する配列番号のリストを表16に示す。哺乳動物MPVのタンパク質は、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質またはM22タンパク質、あるいはその断片でありうる。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、その長さが、少なくとも25アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも75アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、少なくとも125アミノ酸、少なくとも150アミノ酸、少なくとも175アミノ酸、少なくとも200アミノ酸、少なくとも225アミノ酸、少なくとも250アミノ酸、少なくとも275アミノ酸、少なくとも300アミノ酸、少なくとも325アミノ酸、少なくとも350アミノ酸、少なくとも375アミノ酸、少なくとも400アミノ酸、少なくとも425アミノ酸、少なくとも450アミノ酸、少なくとも475アミノ酸、少なくとも500アミノ酸、少なくとも750アミノ酸、少なくとも1000アミノ酸、少なくとも1250アミノ酸、少なくとも1500アミノ酸、少なくとも1750アミノ酸、少なくとも2000アミノ酸、または少なくとも2250アミノ酸でありうる。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、その長さが、多くとも25アミノ酸、多くとも50アミノ酸、多くとも75アミノ酸、多くとも100アミノ酸、多くとも125アミノ酸、多くとも150アミノ酸、多くとも175アミノ酸、多くとも200アミノ酸、多くとも225アミノ酸、多くとも250アミノ酸、多くとも275アミノ酸、多くとも300アミノ酸、多くとも325アミノ酸、多くとも350アミノ酸、多くとも375アミノ酸、多くとも400アミノ酸、多くとも425アミノ酸、多くとも450アミノ酸、多くとも475アミノ酸、多くとも500アミノ酸、多くとも750アミノ酸、多くとも1000アミノ酸、多くとも1250アミノ酸、多くとも1500アミノ酸、多くとも1750アミノ酸、多くとも2000アミノ酸、または多くとも2250アミノ酸でありうる。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質はNタンパク質であり、このNタンパク質は、系統発生的に、APVC型のNタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたNタンパク質などの、哺乳動物MPVのNタンパク質との近縁性が高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はPタンパク質であり、このPタンパク質は、系統発生的に、APVC型のPタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたPタンパク質などの、哺乳動物MPVのPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はMタンパク質であり、このMタンパク質は、系統発生的に、APVC型のMタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたMタンパク質などの、哺乳動物MPVのMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はFタンパク質であり、このFタンパク質は、系統発生的に、APVC型のFタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたFタンパク質などの、哺乳動物MPVのFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はM21タンパク質であり、このM21タンパク質は、系統発生的に、APVC型のM21タンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたM21タンパク質などの、哺乳動物MPVのM21タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はM22タンパク質であり、このM22タンパク質は、系統発生的に、APVC型のM22タンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたM22タンパク質などの、哺乳動物MPVのM22タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はGタンパク質であり、このGタンパク質は、系統発生的に、APVC型のいずれのタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたGタンパク質などの、哺乳動物MPVのGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はSHタンパク質であり、このSHタンパク質は、系統発生的に、APVC型のいずれのタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたSHタンパク質などの、哺乳動物MPVのSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はLタンパク質であり、このLタンパク質は、系統発生的に、APVC型のいずれのタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたLタンパク質などの、哺乳動物MPVのLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態においては、哺乳動物MPVのタンパク質はNタンパク質であり、このNタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたNタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一である。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はPタンパク質であり、このPタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたPタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一である。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はMタンパク質であり、このMタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたMタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一である。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はFタンパク質であり、このFタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたFタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一である。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はM21タンパク質であり、このM21タンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたM21タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一である。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はM22タンパク質であり、このM22タンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたM22タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一である。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はGタンパク質であり、このGタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたGタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一である。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はSHタンパク質であり、このSHタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたSHタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一である。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はLタンパク質であり、このLタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたLタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一である。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、その断片に相同な該タンパク質の部分わたって、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスによってコードされた同種タンパク質に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一である。特定の例示的な実施形態では、本発明は、Fタンパク質の細胞外ドメインを含有する哺乳動物MPVのFタンパク質の断片およびその相同体を提供する。細胞外ドメインを含有するFタンパク質の断片の相同体は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスによってコードされたFタンパク質の細胞外ドメインを含有する対応断片に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一である。ある実施形態において、本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのタンパク質およびその断片を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、このNタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたNタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのGタンパク質を提供し、このGタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたGタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのPタンパク質を提供し、このPタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたPタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのMタンパク質を提供し、このMタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたMタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのFタンパク質を提供し、このFタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたFタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM21タンパク質を提供し、このM21タンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたM21タンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたM21タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM22タンパク質を提供し、このM22タンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたM22タンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたM22タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのSHタンパク質を提供し、このSHタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたSHタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのLタンパク質を提供し、このLタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたLタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。その他の実施形態においては、本発明は、サブグループBの哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片を提供する。本発明は、サブグループBの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、このNタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたNタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのGタンパク質を提供し、このGタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたGタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのPタンパク質を提供し、このPタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたPタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのMタンパク質を提供し、このMタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたMタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのFタンパク質を提供し、このFタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたFタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM21タンパク質を提供し、このM21タンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたM21タンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたM21タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM22タンパク質を提供し、このM22タンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたM22タンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたM22タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのSHタンパク質を提供し、このSHタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたSHタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのLタンパク質を提供し、このLタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたLタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のGタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のGタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のGタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のGタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のGタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL199に代表される哺乳動物MPV変異型B1のGタンパク質に対して少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。特定の実施形態では、哺乳動物MPVのGタンパク質は配列番号119~153のアミノ酸配列を有する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のNタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のNタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のNタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のNタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のNタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL199に代表される哺乳動物MPV変異型B1のNタンパク質に対して少なくとも985、または少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のPタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のPタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のPタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のPタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のPタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のPタンパク質であって、そのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL199に代表される哺乳動物MPV変異型B1のPタンパク質に対して少なくとも96、少なくとも98、または少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のMタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のMタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のMタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のMタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のMタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL199に代表される哺乳動物MPV変異型B1のMタンパク質と同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のFタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のFタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のFタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のFタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のFタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL199に代表される哺乳動物MPV変異型B1のFタンパク質に対して少なくとも99同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のM21タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のM21タンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のM21タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のM21タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のM21タンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のM21タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のM21タンパク質であって、そのM21タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL199に代表される哺乳動物MPV変異型B1のM21タンパク質に対して少なくとも98、または少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のM22タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のM22タンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のM22タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のM22タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のM22タンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のM22タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のM22タンパク質であって、そのM22タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL199に代表される哺乳動物MPV変異型B1のM22タンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のSHタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のSHタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のSHタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のSHタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のSHタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL199に代表される哺乳動物MPV変異型B1のSHタンパク質に対して少なくとも83、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、または少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のLタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のLタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のLタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のLタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のLタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL199に代表される哺乳動物MPV変異型B1のLタンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のGタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のGタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のGタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のGタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のGタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL100に代表される哺乳動物MPV変異型A1のGタンパク質に対して少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、または少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のNタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のNタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のNタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のNタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のNタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL100に代表される哺乳動物MPV変異型A1のNタンパク質に対して少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のPタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のPタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のPタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のPタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のPタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のPタンパク質であって、そのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL100に代表される哺乳動物MPV変異型A1のPタンパク質に対して少なくとも96、少なくとも98、または少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のMタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のMタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のMタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のMタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のMタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL100に代表される哺乳動物MPV変異型A1のMタンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のFタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のFタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のFタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のFタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のFタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL100に代表される哺乳動物MPV変異型A1のFタンパク質に対して少なくとも98、または少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のM21タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のM21タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のM21タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のM21タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のM21タンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のM21タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のM21タンパク質であって、そのM21タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL100に代表される哺乳動物MPV変異型A1のM21タンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のM22タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のM22タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のM22タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のM22タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のM22タンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のM22タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のM22タンパク質であって、そのM22タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL100に代表される哺乳動物MPV変異型A1のM22タンパク質に対して少なくとも96、少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のSHタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のSHタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のSHタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のSHタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のSHタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL100に代表される哺乳動物MPV変異型A1のSHタンパク質に対して少なくとも84、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、または少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のLタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のLタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のLタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL1700のLタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のLタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL100のLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL100に代表される哺乳動物MPV変異型A1のウイルスのLタンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のGタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のGタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のGタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のGタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のGタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL1700のGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL1700に代表される哺乳動物MPV変異型A2のGタンパク質に対して少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のNタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のNタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のNタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のNタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のNタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL1700のNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL1700に代表される哺乳動物MPV変異型A2のNタンパク質に対して少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のPタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のPタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のPタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のPタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のPタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL1700のPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のPタンパク質であって、そのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL1700に代表される哺乳動物MPV変異型A2のPタンパク質に対して少なくとも96、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のMタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のMタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のMタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のMタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のMタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL1700のMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL1700に代表される哺乳動物MPV変異型A2のMタンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のFタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のFタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のFタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のFタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のFタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL1700のFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL1700に代表される哺乳動物MPV変異型A2のFタンパク質に対して少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のM21タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のM21タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のM21タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のM21タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のM21タンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL1700のM21タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のM21タンパク質であって、そのM21タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL1700に代表される哺乳動物MPV変異型A2のM21タンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のM22タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のM22タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のM22タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のM22タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のM22タンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL1700のM22タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のM22タンパク質であって、そのM22タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL1700に代表される哺乳動物MPV変異型A2のM22タンパク質に対して少なくとも96、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のSHタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のSHタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のSHタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のSHタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のSHタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL1700のSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL1700に代表される哺乳動物MPV変異型A2のSHタンパク質に対して少なくとも84、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のLタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のLタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のLタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のLタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL194のLタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL1700のLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL1700に代表される哺乳動物MPV変異型A2のLタンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のGタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のGタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のGタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のGタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL1700のGタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL194のGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL194に代表される哺乳動物MPV変異型B2のGタンパク質に対して少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のNタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のNタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のNタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のNタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL1700のNタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL194のNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL194に代表される哺乳動物MPV変異型B2のNタンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のPタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のPタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のPタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のPタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL1700のPタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL194のPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のPタンパク質であって、そのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL194に代表される哺乳動物MPV変異型B2のPタンパク質に対して少なくとも96、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のMタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のMタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のMタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のMタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL1700のMタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL194のMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL194に代表される哺乳動物MPV変異型B2のMタンパク質に対して同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のFタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のFタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のFタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のFタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL1700のFタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL194のFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL194に代表される哺乳動物MPV変異型B2のFタンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のM21タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のM21タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のM21タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のM21タンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL1700のM21タンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL194のM21タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のM21タンパク質であって、そのM21タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL194に代表される哺乳動物MPV変異型B2のM21タンパク質に対して少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のM22タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のM22タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のM22タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のM22タンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL1700のM22タンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL194のM22タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のM22タンパク質であって、アミノ酸配列が、プロトタイプNL194に代表される哺乳動物MPV変異型B2のM22タンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のSHタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のSHタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のSHタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のSHタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL1700のSHタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL194のSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL194に代表される哺乳動物MPV変異型B2のSHタンパク質に対して少なくとも84、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、または少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のLタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のLタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL199のLタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL100のLタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL1700のLタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL194のLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL194に代表される哺乳動物MPV変異型B2のLタンパク質に対して少なくとも99、または少なくとも995同一であるものを提供する。ある実施形態では、配列同一性は完全長タンパク質のアライメントに基づく。その他の実施形態では、配列同一性は、タンパク質の連続したアミノ酸配列のアライメントに基づいており、アミノ酸配列は、その長さが25アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、225アミノ酸、250アミノ酸、275アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、375アミノ酸、400アミノ酸、425アミノ酸、450アミノ酸、475アミノ酸、500アミノ酸、750アミノ酸、1000アミノ酸、1250アミノ酸、1500アミノ酸、1750アミノ酸、2000アミノ酸、または2250アミノ酸でありうる。本発明はさらに、哺乳動物MPV由来の核酸配列を提供する。また本発明は、哺乳動物MPV由来の核酸配列の誘導体も提供する。ある特定の実施形態では、核酸が修飾されている。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVのサブグループAのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVのサブグループBのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変異型A1のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変異型A2のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変異型B1のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変異型B2のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のヌクレオチド配列に対して少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一であるヌクレオチド配列を提供する。ある実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のヌクレオチド配列の断片に対して少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995同一であり、この断片の長さは少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも75ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも750ヌクレオチド、少なくとも1000ヌクレオチド、少なくとも1250ヌクレオチド、少なくとも1500ヌクレオチド、少なくとも1750ヌクレオチド、少なくとも2000ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも3000ヌクレオチド、少なくとも4000ヌクレオチド、少なくとも5000ヌクレオチド、少なくとも7500ヌクレオチド、少なくとも10000ヌクレオチド、少なくとも12500ヌクレオチド、または少なくとも15000ヌクレオチドである。特定の実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号98~132配列番号168~247配列番号22~25配列番号30~33配列番号38~41配列番号46~49配列番号54~57配列番号58~61配列番号66~69配列番号74~77配列番号82~85または配列番号90~93のヌクレオチド配列の1つに対して少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも995、または少なくとも100同一である。本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸配列は、低ストリンジェンシー条件下、または中程度のストリンジェンシー条件下、または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97の核酸配列の1つとハイブリダイズすることが可能である。本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸配列は、低ストリンジェンシー条件下、または中程度のストリンジェンシー条件下、または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号98~132配列番号168~247配列番号22~25配列番号30~33配列番号38~41配列番号46~49配列番号54~57配列番号58~61配列番号66~69配列番号74~77配列番号82~85または配列番号90~93の核酸配列の1つとハイブリダイズすることが可能である。ある実施形態では、核酸は、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも75ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも750ヌクレオチド、少なくとも1000ヌクレオチド、少なくとも1250ヌクレオチド、少なくとも1500ヌクレオチド、少なくとも1750ヌクレオチド、少なくとも2000ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも3000ヌクレオチド、少なくとも4000ヌクレオチド、少なくとも5000ヌクレオチド、少なくとも7500ヌクレオチド、少なくとも10000ヌクレオチド、少なくとも12500ヌクレオチド、または少なくとも15000ヌクレオチドの長さ全体にわたり、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のヌクレオチド配列とハイブリダイズする。本発明はさらに、哺乳動物MPVのタンパク質と特異的に結合する抗体および抗原結合フラグメントを提供する。本発明の抗体は、哺乳動物MPVのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。ある実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループAのウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。その他のある実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループBのウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。より具体的なある実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVの変異型A1のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。その他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループA2のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。ある実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループB1のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。その他のある実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループB2のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M21タンパク質、M22タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。513異種遺伝子配列の挿入本発明のウイルスベクターへの外来遺伝子配列の挿入は、ウイルスコード領域を異種配列で完全置換することによって、または部分置換することによって、またはウイルスゲノムに異種ヌクレオチド配列を付加することによって行うことができる。完全置換は、PCR誘導型の突然変異誘発を使用することにより、おそらく最良に行われると考えられる。簡単に述べると、PCRプライマーAは、5末端から3末端へ、クラスIIS制限酵素部位などのユニーク制限酵素部位酵素特定の配列を認識するが、その配列の上流または下流でDNAを切断するPIV遺伝子の領域に相補的なヌクレオチドのストレッチおよび異種配列のカルボキシ末端コード部分に相補的なヌクレオチドのストレッチを含有すると考えられる。PCRプライマーBは、5末端から3末端へ、ユニーク制限酵素部位PIV遺伝子に相補的なヌクレオチドのストレッチおよび外来遺伝子の5コード部分に対応するヌクレオチドのストレッチを含有すると考えられる。これらのプライマーを使用して、クローニングした外来遺伝子のコピーについてPCR反応させた後、ユニーク制限部位を使用して生成物を切り出しクローニングすることができる。クラスIIS酵素による消化、および精製したファージポリメラーゼによる転写によって、結果的に外来遺伝子が挿入されたPIV遺伝子の正確な非翻訳末端を含有するRNA分子が生成されると考えられる。別の実施形態では、PCRprimed反応を使用して、バクテリオファージプロモーター配列およびハイブリッド遺伝子配列を含有する二本鎖DNAを調製することができ、その結果、RNA鋳型をクローニングすることなく直接転写できるようになる。異種ヌクレオチド配列は、本発明のウイルスの様々な位置に付加または挿入することができる。一実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置1に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置2に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置3に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置4に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置5に付加または挿入する。さらに別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置6に付加または挿入する。本明細書で使用する位置という用語は、転写されるウイルスゲノム上の異種ヌクレオチド配列の位置を指し、例えば、位置1は、第1の遺伝子が転写されることを意味し、位置2は、第2の遺伝子が転写されることを意味する。ウイルスのより低い番号の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入すると、一般に、より大きい番号の位置に挿入した場合と比べて、異種ヌクレオチド配列の発現が強くなるが、これはウイルスのゲノム全体にわたって生ずる転写勾配が原因である。しかし、この転写勾配はまた、ウイルスmRNAの特定の比率をもたらす。外来遺伝子を挿入するとこの比率が乱れ、その結果、異なる量のウイルスタンパク質が合成されて、ウイルスの複製に影響を及ぼす可能性がある。このように、挿入部位を選択する場合には、転写勾配と複製速度の両方を考慮しなければならない。例えば、bhPIV3ベクターの位置2に異種ヌクレオチド配列を挿入すると、最良の複製速度と異種遺伝子発現レベルが得られる。異種ヌクレオチド配列をより低い番号の位置に挿入することは、異種ヌクレオチド配列の強力な発現が望まれる場合、本発明の好ましい実施形態になる。好ましい実施形態では、異種配列を位置1、2、または3に付加または挿入する。本発明のウイルスに異種ヌクレオチド配列を挿入する場合、所望の効果が実現されるように、異種遺伝子のコード配列の終端と下流遺伝子のコード配列の開始点との間の遺伝子間領域を変化させることができる。本明細書で使用する遺伝子間領域という用語は、1つの遺伝子の終止シグナルと、その隣の下流にあるオープンリーディングフレームのコード配列の開始コドンとの間のヌクレオチド配列を指す。遺伝子間領域は、遺伝子の非コード領域、すなわち遺伝子の転写開始部位とコード配列の開始点との間を含むことができる。この非コード領域は、bPIV3mRNAおよび他のウイルス遺伝子内にもともと存在しており、それを非限定的な例として表2に示す。様々な実施形態において、異種ヌクレオチド配列とその下流の遺伝子との間の遺伝子間領域は、互いに独立して、少なくとも10nt長に、少なくとも20nt長に、少なくとも30nt長に、少なくとも50nt長に、少なくとも75nt長に、少なくとも100nt長に、少なくとも125nt長に、少なくとも150nt長に、少なくとも175nt長に、または少なくとも200nt長になるように操作することができる。ある実施形態では、異種ヌクレオチド配列とその下流の遺伝子との遺伝子間領域は、互いに独立して、最大でも10nt長に、最大でも20nt長に、最大でも30nt長に、最大でも50nt長に、最大でも75nt長に、最大でも100nt長に、最大でも125nt長に、最大でも150nt長に、最大でも175nt長に、または最大でも200nt長になるように操作することができる。様々な実施形態では、ウイルスゲノム内の所望の遺伝子の非コード領域を、互いに独立して、少なくとも10nt長に、少なくとも20nt長に、少なくとも30nt長に、少なくとも50nt長に、少なくとも75nt長に、少なくとも100nt長に、少なくとも125nt長に、少なくとも150nt長に、少なくとも175nt長に、または少なくとも200nt長になるように操作することができる。ある実施形態では、ウイルスゲノム内の所望の遺伝子の非コード領域を、互いに独立して、最大でも10nt長に、最大でも20nt長に、最大でも30nt長に、最大でも50nt長に、最大でも75nt長に、最大でも100nt長に、最大でも125nt長に、最大でも150nt長に、最大でも175nt長に、または最大でも200nt長になるように操作することができる。異種ヌクレオチド配列を挿入する場合、所望の効果を実現するために、位置効果と遺伝子間領域の操作を組み合わせて用いることができる。例えば異種ヌクレオチド配列を、位置1、2、3、4、5、および6からなる群から選択された位置に付加または挿入し、かつ異種ヌクレオチド配列とこれに隣接する下流遺伝子との遺伝子間領域を変化させることができる。代表的な実施形態では、hRSVF遺伝子をbhPIV3ベクターの位置1に挿入し、F遺伝子とN遺伝子すなわち、F遺伝子に隣接する下流遺伝子との遺伝子間領域を177ヌクレオチドに変化させる。本発明に包含される組合せのいくつかを、例として表3に示す。挿入された異種ヌクレオチド配列の目的例えば、強力な免疫原性をもたせるなどに応じて、挿入される異種ヌクレオチド配列の挿入位置と遺伝子間領域の長さとは、以下の非限定的な例のアッセイによって測定される、複製速度およびタンパク質またはmRNAの発現レベルを含むがこれらに限定されない様々な指標によって決定することができる:すなわち、プラークアッセイ、蛍光焦点アッセイ、感染中心アッセイ、形質転換アッセイ、終点希釈アッセイ、平板培養効率、電子顕微鏡法、赤血球凝集、ウイルス酵素活性の測定、ウイルス中和、赤血球凝集阻害、補体結合法、免疫染色、免疫沈降および免疫ブロット法、酵素結合免疫吸着アッセイ、核酸検出、増殖曲線、レポーター遺伝子の使用や増強緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子の使用、またはこれらの組合せ。これらのアッセイを行う手順は、当技術分野で周知であり、非限定的な例を以下の実施例のセクションに示す。例えば、発現レベルは、培養中の細胞を本発明のウイルスに感染させ、その後、例えば異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析やELISAでタンパク質発現レベルを測定することによって、または例えば異種配列に特異的なプローブを使用したノーザンブロット分析でRNA発現レベルを測定することによって決定することができる。同様に、異種配列の発現レベルは、動物モデルに感染させて、動物モデルにおける本発明の組換えウイルスの異種配列から発現したタンパク質のレベルを測定することによって、決定することができる。タンパク質のレベルは、感染した動物から組織サンプルを得、次いでその組織サンプルを、異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用したELISAまたはウェスタンブロット分析にかけることによって、測定することができる。さらに、動物モデルを使用する場合、異種配列の遺伝子産物に対する、動物によって産生された抗体の力価を、ELISAを含むがこれに限定されない当業者に公知の任意の技法によって決定することができる。異種配列は、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列と相同である可能性があるので、プローブおよび抗体が異種配列またはその遺伝子産物に対して確かに特異的になるように注意を払うべきである。ある特定の実施形態では、キメラbhPIV3RSVまたはbhPIV3hMPVまたはbhPIV3RSVFおよびhMPVF由来のhMPVのRSVまたはhMPVのFタンパク質の発現レベルは、当業者に公知の任意の技法によって決定することができる。Fタンパク質の発現レベルは、培養中の細胞に本発明のキメラウイルスを感染させ、例えばhMPVのFタンパク質およびまたはGタンパク質に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析やELISAなどでタンパク質発現レベルを測定することによって、あるいは例えばヒトメタニューモウイルスのF遺伝子およびまたはG遺伝子に特異的なプローブを使用したノーザンブロット分析でRNA発現レベルを測定することによって決定することができる。同様に、異種配列の発現レベルは、動物モデルを使用して、その動物に感染させた後、動物モデルにおけるFタンパク質およびまたはGタンパク質のレベルを測定することにより、決定することができる。タンパク質のレベルは、感染した動物から組織サンプルを得、次いでその組織サンプルを、異種配列のFタンパク質およびまたはGタンパク質に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析またはELISAにかけることによって、測定することができる。さらに、動物モデルを使用する場合、Fタンパク質およびまたはGタンパク質に対する、動物によって産生された抗体の力価を、ELISAを含むがこれに限定されない当業者に公知の任意の技法によって決定することができる。本発明の組換えウイルスの複製速度は、当業者に公知の任意の技法によって決定することができる。ある実施形態において、ウイルスゲノムにおける異種配列の最適な位置と遺伝子間領域の最適な長さの特定を容易にするために、異種配列はレポーター遺伝子をコードする。最適なパラメータを決定したら、そのレポーター遺伝子を、所定の抗原をコードする異種ヌクレオチド配列に置き換える。当業者に公知のレポーター遺伝子はどれも、本発明の方法と共に使用することができる。より詳細に関しては、セクション55を参照されたい。組換えウイルスの複製速度は、当業者に公知の標準的技法により決定することができる。複製速度はウイルスの増殖速度で表され、感染後の時間に対してウイルス力価をプロットすることにより決定することができる。ウイルス力価は、当業者に公知のどのような技法によっても測定することができる。ある実施形態では、ウイルスを含有する懸濁液を、ウイルスに感染し易い細胞と共にインキュベートする。本発明の方法と共に使用することができる細胞型には、Vero細胞、LLCMK2細胞、Hep2細胞、LF1043細胞、MRC5細胞、WI38細胞、293T細胞、QT6細胞、QT35細胞、ニワトリ胚繊維芽細胞、またはtMK細胞が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスを細胞と共にインキュベートした後、感染した細胞の数を決定する。ある特定の実施形態では、ウイルスがレポーター遺伝子を含む。したがって、レポーター遺伝子を発現している細胞の数が感染した細胞の数を表す。特定の実施形態では、ウイルスがeGFPをコードする異種ヌクレオチド配列を含み、eGFPを発現している細胞の数、すなわちウイルスに感染した細胞の数をFACSにより決定する。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、その組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスの複製速度に対し、同じ条件下で最大でもその20である。同じ条件とは、ウイルスの初期力価が同じであり、細胞株が同じであり、インキュベーション温度、増殖培地、細胞数、およびその他の複製速度に影響を及ぼす可能性のある試験条件が同じであることを指す。例えば、位置1にRSVのF遺伝子を含むbhPIV3の複製速度は、最大でもbPIV3の複製速度の20である。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスの複製速度に対し、同じ条件下で多くてもその5、多くても10、多くても20、多くても30、多くても40、多くても50、多くても75、多くても80、多くてもその90である。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスの複製速度に対し、同じ条件下で少なくともその5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも80、少なくともその90である。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスの複製速度に対し、同じ条件下でその5から20の間、10から40の間、25から50の間、40から75の間、50から80の間、または75から90の間である。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルに対し、同じ条件下で最大でもその20である。同じ条件とは、ウイルスの初期力価が同じであり、細胞株が同じであり、インキュベーション温度、増殖培地、細胞数、およびその他の複製速度に影響を及ぼす可能性のある試験条件が同じであることを指す。例えば、bPIV3の位置1にあるMPVのFタンパク質の異種配列の発現レベルは、bPIV3のウシFタンパク質の発現レベルに対して最大でも20である。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルに対し、同じ条件下で多くてもその5、多くても10、多くても20、多くても30、多くても40、多くても50、多くても75、多くても80、多くてもその90である。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルに対し、同じ条件下で少なくともその5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも80、少なくともその90である。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルに対し、同じ条件下でその5から20の間、10から40の間、25から50の間、40から75の間、50から80の間、または75から90の間である。514HN遺伝子への異種遺伝子配列の挿入PIVのヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ活性をもたらすタンパク質は単一の遺伝子HNによってコードされる。HNタンパク質はこのウイルスの主要な表面糖タンパク質である。パラインフルエンザのような種々のウイルスでは、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質がいくつかの抗原部位を含むことがわかっている。その結果として、このタンパク質は感染後の体液性免疫応答の標的になる可能性がある。したがって、HNの抗原部位を外来タンパク質の一部で置き換えると、この外来ペプチドに対して強力な体液性応答が生ずるかもしれない。ある配列がHN分子内に挿入されて、それがHNの外表面に発現されるならば、それは免疫原性があると考えられる。例えば、HNタンパク質の抗原部位をHIVのgp160由来のペプチドと置き換えると、gp160とHNタンパク質の両方の体液性免疫応答が引き出されるだろう。別の方法では、外来ペプチド配列を、いかなるウイルス配列をも欠失させることなく、抗原部位に挿入することができる。このような構築物の発現産物は外来抗原に対するワクチンとして有用であり、また、以前に論じられた問題、すなわちワクチンを接種した宿主での組換えウイルスの繁殖の問題を実際に回避しうる。抗原部位にのみ置換を有するインタクトなHN分子は、HN機能を果たすことができ、それゆえに生存能のあるウイルスの構築を可能にする。したがって、このウイルスは追加のヘルパー機能を必要とすることなく増殖することが可能である。また、このウイルスは、不慮の事故による伝播の危険性を避けるために他の方法で弱毒化することもできる。その他のハイブリッド構築は、細胞表面にタンパク質が発現するように、またはタンパク質が細胞から遊離するように行なうことができる。表面糖タンパク質として、HNは、細胞表面への輸送に必要なアミノ末端の切断可能なシグナル配列と、膜への固着に必要なカルボキシ末端配列を有する。細胞表面にインタクトな外来タンパク質を発現させるためには、これらのHNシグナルを使用してハイブリッドタンパク質を作製することが必要である。この場合には、この融合タンパク質を追加の内部プロモーターから別個の融合タンパク質として発現させることができる。あるいはまた、輸送シグナルだけが存在して、膜固着ドメインが存在しない場合は、このタンパク質を細胞外に分泌させることができる。5152シストロンRNAの構築2シストロン性mRNAは、ウイルス配列の翻訳の内部開始が可能になるように、また通常の末端開始部位から外来タンパク質コード配列の発現が可能になるように、構築することができる。あるいはまた、2シストロン性mRNA配列は、ウイルス配列が通常の末端オープンリーディングフレームから翻訳されるがその一方で外来配列が内部部位から開始されるように、構築することができる。ある特定の内部リボソームエントリー部位配列を利用することができる。選択されるIRES配列は、パラインフルエンザパッケージング制限が妨げられないように、十分短いものにすべきである。したがって、そのような2シストロン的手法を目的として選択されるIRESは、その長さが500ヌクレオチド以下であることが好ましく、250ヌクレオチ未満が理想的な長さである。特定の実施形態では、IRESはピコルナウイルス由来のものであり、いかなる追加のピコルナウイルス配列も含まない。好適なIRESエレメントには、哺乳動物BiPIRESとC型肝炎ウイルスIRESが含まれるが、これらに限定されない。あるいはまた、外来タンパク質を新しい内部転写単位から発現させることができ、この転写単位は開始部位およびポリアデニル化部位を有する。別の実施形態では、得られる発現タンパク質が融合タンパク質になるように、外来遺伝子をPIV遺伝子に挿入する。52組換えcDNAおよびRNA鋳型を使用した異種遺伝子産物の発現上述のように調製された組換え鋳型は、適切な宿主細胞において異種遺伝子産物を発現させるために、または異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスを作製するために、様々な方法で使用することができる。一実施形態では、組換えcDNAを使用して適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができ、その結果生じるRNAは異種遺伝子産物の高レベルでの発現を指令することができる。高レベルの発現をもたらす宿主細胞系は、PIVに重感染した細胞系、PIV機能を補完するように遺伝子操作された細胞系など、ウイルス機能を提供する連続した細胞系を含む。本発明の代替の実施形態では、異種遺伝子産物の発現を実現するために、組換え鋳型を使用してウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系にトランスフェクトすることができる。このためには、Lタンパク質などのポリメラーゼタンパク質を発現する形質転換された細胞系が適切な宿主細胞として利用される。宿主細胞は、同様に、その他のウイルス機能またはHN、NPまたはNなどの追加の機能を与えるように遺伝子操作することもできる。別の実施形態では、異種遺伝子産物の発現を実現するために、ヘルパーウイルスが細胞によって利用されるRNAポリメラーゼタンパク質を提供することができる。さらに別の実施形態では、細胞に、NまたはNP、P、M21およびLタンパク質などのウイルスタンパク質をコードするベクターをトランスフェクトすることができる。異種遺伝子産物の発現を検出するために、様々な技法を用いることができる例えば、FlintらPrinciplesOfVirologyMolecularBiologyPathogenesisAndControl2000ASMPresspp2556を参照のこと;その全内容を参照により本明細書に組み入れる。代表的なアッセイでは、ウイルスに感染した細胞をメタノールまたはアセトンで透過性にして、異種遺伝子産物に対する抗体と共にインキュベートする。次いで第1の抗体を認識する第2の抗体を添加する。この第2の抗体は通常指示薬に結合されており、その結果として異種遺伝子産物の発現を可視化または検出することができる。53組換えウイルス粒子のレスキューキメラウイルスを調製するために、プラスまたはマイナスセンスでPIVゲノムおよびまたは外来タンパク質をコードする改変されたcDNA、ウイルスRNA、またはRNAを使用して、複製およびレスキューに必要なウイルスタンパク質および機能をもたらす細胞にトランスフェクトすることができる。あるいはまた、PIVゲノムおよびまたは外来タンパク質をコードするDNAまたはRNA分子によるトランスフェクションの前、間、または後に、細胞にヘルパーウイルスをトランスフェクトすることができる。合成組換えプラスミドPIVDNAおよびRNAは、以下の特許または特許出願に記載されているような、当技術分野で知られている数多くの技法によって、感染性ウイルス粒子に複製またはレスキューすることができる:1992年11月24日発行の米国特許第5166057号1998年12月29日発行の米国特許第5854037号1996年2月20日公開の欧州特許公開EP0702085A1米国特許出願第09152845号1997年4月3日公開の国際特許公開PCTWO97120321996年11月7日公開のWO9634625欧州特許公開EPA7804751999年1月21日公開のWO99026571998年11月26日公開のWO98530781998年1月22日公開WO98025301999年4月1日公開のWO99156721998年4月2日公開のWO98135011997年2月20日公開のWO9706270および1997年6月25日公開のEPO78047SA1その全体を参照により本明細書に組み入れる。本発明の一実施形態では、ウイルスポリメラーゼによる認識に不可欠でありかつ成熟したウイルス粒子の生成に必要とされるパッケージングシグナルに不可欠な、ネガティブ鎖ウイルスRNAの非コード領域を含有する合成組換えウイルスRNAを調製することができる。逆遺伝学的手法を適用してネガティブ鎖RNAウイルスをレスキューするのに使用することが可能な、いくつかの異なる手法が存在する。まず、組換えRNAを組換えDNA鋳型から合成し、精製ウイルスポリメラーゼ複合体を用いてinvitroで再構成し、それによって、細胞へのトランスフェクションに使用することができる組換えリボ核タンパク質を形成する。別の手法では、invitroまたはinvivoでの合成RNAの転写中にウイルスポリメラーゼタンパク質が存在する場合、より効率的なトランスフェクションが可能である。この手法によれば、合成RNAをcDNAプラスミドから転写することができるが、これは、ポリメラーゼタンパク質をコードするcDNAプラスミドと共にinvitroで同時転写されるか、またはポリメラーゼタンパク質の存在下にinvivoで、すなわちポリメラーゼタンパク質を一過性にまたは構成的に発現する細胞内で、転写されるかのいずれかである。本明細書で述べる追加の手法では、感染性のキメラウイルスの作製は、PIVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する宿主細胞系内で複製され、したがって感染性のキメラウイルスがレスキューされる。この場合には、ヘルパーウイルスを利用する必要がない。なぜなら、この機能は、発現されたウイルスポリメラーゼタンパク質によって提供されるからである。本発明によれば、当業者に公知の技法を使用して、組換えおよびキメラウイルスの複製およびレスキューを達成することができる。ある手法では、宿主細胞にトランスフェクトする前にinvitroでの複製に必要なウイルスタンパク質およびウイルス機能を提供することを伴う。そのような実施形態では、ウイルスタンパク質を、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、精製ウイルスタンパク質、または組換えにより発現されるウイルスタンパク質の形で提供することができる。ウイルスタンパク質は、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの転写前、転写の間、または転写後に提供することができる。宿主細胞にトランスフェクトするには、混合物全体を使用することができる。別の手法では、複製に必要とされるウイルスタンパク質およびウイルスの機能を、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの転写前、または転写の間に提供することができる。そのような実施形態では、複製に必要とされるウイルスタンパク質およびウイルスの機能は、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、ウイルス抽出物、ウイルスタンパク質を発現する合成cDNAまたはRNAの形で提供され、これらが感染またはトランスフェクションによって宿主細胞内に導入される。この感染トランスフェクションは、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAを導入する前、または導入と同時に行なわれる。特に望ましい手法では、本発明の組換えまたはキメラウイルスの全てのウイルス遺伝子を発現するように遺伝子操作された細胞は、所望の遺伝子型を含有する感染性のキメラウイルスの産生をもたらし、したがって選択系を必要としない。理論上、PIVの構造タンパク質をコードする6つの遺伝子のいずれか1つ、またはそのような6つの遺伝子のいずれか1つの一部を、外来配列と置き換えることができる。しかし、このような状況で必要な部分は、欠損ウイルスを増殖させる能力である。この問題を回避するため、いくつかの可能な手法を利用することができる。ある手法では、突然変異タンパク質を有するウイルスを、同じタンパク質の野生型を構成的に発現するように構築された細胞系内で増殖させることができる。この方法により、細胞系は当該ウイルス内の突然変異を補完する。同様の技法を使用して、PIV遺伝子のいずれかを構成的に発現する形質転換細胞系を作製することができる。ウイルスタンパク質を発現するように作製されたこれらの細胞系を使用して、組換えウイルスの欠損を補完し、これによりそれを増殖させることができる。あるいはまた、ある特定の天然の宿主域系を利用して、組換えウイルスを増殖させることができる。さらに別の実施形態では、複製に必要とされるウイルスタンパク質およびウイルスの機能は、合成cDNAまたはRNAの形の遺伝物質として提供することができ、その結果、それらはキメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAと共転写されるようになる。特に望ましい手法では、キメラウイルスおよびウイルスポリメラーゼおよびまたはその他のウイルス機能を発現するプラスミドが、宿主細胞内に同時トランスフェクトされる。例えば、野生型または改変型のいずれかのゲノムまたはアンチゲノムPIVRNAをコードするプラスミドを、PIVウイルスポリメラーゼタンパク質NPまたはN、P、M21もしくはLをコードするプラスミドと共に宿主細胞内に同時トランスフェクトすることができる。あるいはまた、キメラbhPIV3ウイルスのレスキューは、T7RNAポリメラーゼをコードする改変型ワクシニアウイルスAnkaraの使用、またはポリメラーゼタンパク質をコードするプラスミドとMVAの組合せの使用によって達成することができる。例えば、MVAT7またはFowlPoxT7を、Vero細胞、LLCMK2細胞、Hep2細胞、LF1043細胞、tMK細胞、LLCMK2、HUT292、FRHL2、FCL1、WI38、MRC5細胞、293T細胞、QT6細胞、QT35細胞、およびCEF細胞に感染させることができる。MVAT7またはFowlPoxT7を感染させた後、完全長アンチゲノムbhPIV3cDNAを、NP、P、M21およびLをコードする発現プラスミドと共にHeLaまたはVero細胞にトランスフェクトすることができる。あるいはまた、ポリメラーゼをプラスミドのトランスフェクションによって提供してもよい。その後、細胞および細胞上清を回収し、1回の凍結融解サイクルにかける。次いで得られた細胞溶解産物を使用して、ワクシニアウイルスの複製阻害剤である1βDアラビノフラノシルシトシンの存在下で新しいHeLaまたはVero細胞の単層に感染させ、それによってウイルスストックを得ることができる。次いでこれらのプレートからの上清および細胞を回収し、一度凍結融解して、bPIV3ウイルス粒子の存在を、PIV3特異的抗血清を使用するウイルスプラークの免疫染色によって検出することができる。組換えウイルスを増殖させる別の手法は、野生型ウイルスと共培養することを伴う。これは、単に組換えウイルスを取得して、このウイルスと別の野生型ウイルスを細胞に共感染させることにより行われる。野生型ウイルスは、欠損ウイルス遺伝子産物を補完して、野生型ウイルスと組換えウイルスの両方の増殖を可能にするだろう。あるいはまた、ヘルパーウイルスを使用して、組換えウイルスの増殖を助けてもよい。別の手法では、PIVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する組換えウイルスを共感染させた細胞内で、合成鋳型を複製することができる。実際に、この方法を使用して、本発明による組換え感染性ウイルスをレスキューすることができる。このために、ウイルス発現ベクターまたはポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系を含むがこれらに限定されない、任意の発現ベクター宿主細胞系内で、PIVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現させることができる。さらに、6種全てのPIVタンパク質を発現する宿主細胞への感染は、感染性キメラウイルス粒子の作製をもたらす。ウイルスの生存能力を変化させることなく、組換えウイルスを構築することが可能であることに留意すべきである。次いで、これらの変化したウイルスは増殖能力を持ち、複製するのにヘルパー機能を必要としないと考えられる。ある実施形態においては、活発で高収率性の細胞培養例えば、本発明のウイルスワクチン候補を製造するのに有益であると考えられるを得ることを目的として、ウイルスの増殖条件を最適化することができる。重要なパラメーターを確認し、まず、小規模実験で生産プロセスを最適化してスケーラビリティ、頑健性、および再現性を調べこの最適化プロセスの例はセクション36に提示される、その後ウイルスの大規模生産に適合させることができる。ある実施形態では、本発明の方法を用いて増殖されるウイルスがPIVである。ある実施形態では、本発明の方法を用いて増殖されるウイルスが組換えまたはキメラPIVである。ある実施形態では、本発明の方法を用いて増殖されるウイルスが以下のウイルス科のひとつに属するウイルスである:Adenoviridae、Arenaviridae、Astroviridae、Baculoviridae、Bunyaviridae、Caliciviridae、Caulimovirus、Coronaviridae、Cystoviridae、Filoviridae、Flaviviridae、Hepadnaviridae、Herpesviridae、Hypoviridae、Idaeovirus、Inoviridae、Iridoviridae、Leviviridae、Lipothrixviridae、Luteovirus、Machlomovirus、Marafivirus、Microviridae、Myoviridae、Necrovirus、Nodaviridae、Orthomyxoviridae、Papovaviridae、Paramyxoviridae、Partitiviridae、Parvoviridae、Phycodnaviridae、Picornaviridae、Plasmaviridae、Podoviridae、Polydnaviridae、Potyviridae、Poxviridae、Reoviridae、Retroviridae、Rhabdoviridae、Sequiviridae、Siphoviridae、Sobemovirus、Tectiviridae、Tenuivirus、Tetraviridae、Tobamovirus、Tobravirus、Togaviridae、Tombusviridae、Totiviridae、Trichovirus、Mononegavirales。ある実施形態では、本発明の方法を用いて増殖されるウイルスがRNAウイルスである。ある実施形態では、ウイルスがヘルペスウイルス科Herpesviridaeのウイルスではない。ある実施形態では、ウイルスがHSVではない。ある実施形態においては、対象のウイルスまたはウイルス構築物を感染させた細胞培養物を、細胞培養のための標準的なインキュベーション温度より低い感染後インキュベーション温度でインキュベートする。特定の実施形態では、対象のウイルス構築物を感染させた細胞培養物を33°Cまたは約33°C例えば、33±1°Cでインキュベートする。特定の実施形態では、感染後インキュベーション温度を約25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、または37°Cとする。ある実施形態においては、ウイルスを増やすために、ウイルスを感染させる前の細胞を細胞増殖に最適な温度でインキュベートし、その細胞にウイルスを感染させた後、すなわち感染後に、温度をより低い温度に変える。ある実施形態では、温度変化が少なくとも1°C、2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、または少なくとも12°Cである。ある実施形態では、温度変化が多くても1°C、2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、または多くても12°Cである。特定の実施形態では、温度変化が4°Cである。ある実施形態においては、対象のウイルスまたはウイルス構築物を感染させる前には細胞を血清含有培地で培養し、ウイルスまたはウイルス構築物を感染させた後では細胞を無血清培地で培養する。感染細胞を血清の不在下で増殖させることについてのより詳細な説明は、無血清培地でのウイルスのプラスミドのみの再生と題するセクションを参照されたい。特定の実施形態では、血清はウシ胎児血清であり、培養物体積の5、培養物体積の2、または培養物体積の05の濃度で存在する。ある実施形態においては、ウイルスを増やすために、ウイルスを感染させた細胞を血清の不在下でインキュベートする。ある実施形態では、ウイルスを増やすために、ウイルスを感染させた細胞を、5未満の血清、25未満の血清、1未満の血清、01未満の血清、001未満の血清、または0001未満の血清を含む培地でインキュベートする。ある実施形態においては、ウイルスを感染させる前に細胞を血清含有培地でインキュベートする。ある実施形態では、細胞にウイルスを感染させた後で、その細胞を血清の不在下でインキュベートする。他の実施形態では、最初に、細胞を血清含有培地でインキュベートしてから、その細胞を無血清培地に移し、続いてその細胞にウイルスを感染させて、血清の不在下でさらにインキュベートする。ある実施形態においては、細胞から血清含有培地を取り出し、血清を含まない培地を添加することによって、細胞を血清含有培地から血清不含培地に移す。他の実施形態では、細胞を遠心分離して、血清含有培地を取り出し、血清不含培地を加える。ある実施形態では、細胞を血清不含培地で洗浄して、ウイルスに一度感染した細胞が確実に血清の不在下でインキュベートされるようにする。ある、より具体的な実施形態では、細胞を血清不含培地で少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、または少なくとも10回洗浄する。さらに他の実施形態において、ウイルスまたはウイルス構築物を感染させる前には細胞を血清含有培地中で細胞増殖に最適な温度にて培養し、対象のウイルス構築物を感染させた後では対応するウイルスまたはウイルスベクターの標準的なインキュベーション温度と比べてより低い温度で細胞培養物をインキュベートする。具体的な実施形態では、対象のウイルス構築物を感染させる前には細胞を血清含有培地中で37°Cにて細胞を培養し、その細胞培養物を、対象のウイルス構築物を感染させた後には33°Cまたは約33°C例えば、33±1°Cでインキュベートする。さらに他の実施形態において、ウイルスまたはウイルス構築物を感染させる前には細胞を血清含有培地中で細胞増殖に最適な温度にて培養し、その細胞培養物を、対象のウイルス構築物を感染させた後では対応するウイルスまたはウイルスベクターの標準的なインキュベーション温度と比べてより低い温度で血清の不在下にインキュベートする。具体的な実施形態では、対象のウイルス構築物を感染させる前には細胞を血清含有培地中で37°Cにて細胞を培養し、その細胞培養物を、対象のウイルス構築物を感染させた後には33°Cまたは約33°C例えば、33±1°Cで血清の不在下にインキュベートする。本発明のウイルス構築物および方法は、商業上のウイルス生産のために、例えばワクチンの製造のために使用することができる。商業上のワクチン製造の場合、ワクチンは、不活化ウイルスまたはウイルスタンパク質感染性のウイルスまたはウイルス核酸混入物をまったく含まないのみを含有するか、あるいはまた、有毒なものに復帰しない弱毒化生ワクチンを含有することが好適である。製造中に導入される外因性物質によるワクチンの汚染も回避すべきである。本発明のワクチンの商業上の製造には、ウイルスまたはウイルスタンパク質の大規模生産のための当技術分野で公知の方法を使用することができる。ある実施形態においては、本発明のワクチンの商業上の製造のために、細胞をバイオリアクターまたはファーメンター内で培養する。バイオリアクターは1リットル以下から100リットルを越える容量まで利用可能であり、例えば、Cyto3バイオリアクターNBSバイオリアクターおよびBBraunBiotechInternational製の実験室用および商業スケールのバイオリアクターなどがある。別の実施形態では、ウイルスの商業生産の前に、小規模工程最適化実験例えば、実施例31セクション36を参照を行い、最適化された条件をウイルスの商業生産のために選択して使用する。本発明の特定の実施形態では、ウイルスをヘルパーウイルスの不在下で再生することができる。さらに特定すると、ウイルスゲノムをコードするプラスミドと、複製およびレスキューに必要なウイルスタンパク質をコードするプラスミドとを細胞に導入することによって、ウイルスを再生することが可能である。ある実施形態では、細胞を無血清培地で増殖させて、その培地に維持する。ある実施形態では、プラスミドをエレクトロポレーションによって細胞に導入する。具体的な実施形態では、T7プロモーターの制御下でウイルスのアンチゲノムcDNAをコードするプラスミド、T7RNAポリメラーゼをコードするプラスミド、ならびにそれぞれT7プロモーターの制御下でNタンパク質、Pタンパク質およびLタンパク質をコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってSFVero細胞に導入する。Vero細胞をATCCから入手して、以下のステップMikeBerrys研究所によって開発されたに従って無血清培地で増殖するように適合させた。1T25フラスコP121に入れたDMEM5vvFBS中でATCCCCL81バイアルを解凍する2DMEM5vvFBSP126中で5回継代して増やす3FBS増殖細胞をT225フラスコ中のOptiPROに直接移す4OptiPRO中で7回継代して増やす5継代1337でプレマスター細胞バンクストックを凍結させる6OptiPRO中で4回継代して増やす7継代137でマスター細胞バンクストックを凍結させる8OptiPRO中で4回継代して増やす9継代141でワーキング細胞バンクストックを凍結させる10エレクトロポレーションおよびウイルス増幅のために解凍して増やす。ウイルス粒子のレスキュー法については、このセクションにおいて上述されている。特定の実施形態において、ウイルスレスキューのために用いる細胞は、動物またはヒト由来の成分を添加しないで増殖およびまたは維持することができる細胞である。ある実施形態では、ウイルスレスキューのために用いる細胞は、血清を用いない増殖に適応している細胞である。具体的な実施形態では、SFVero細胞をウイルスのレスキューに用いる。特定の実施形態では、4mMLグルタミンを補充したOptiPROSFM中で細胞を増殖させ、およびまたは維持する。特定の実施形態では、血清を補充した培地で細胞を増殖させるが、ウイルス粒子のレスキューのため細胞を無血清培地に移す。具体的な実施形態では、細胞を無血清培地で洗浄して、ウイルスのレスキューが血清フリーの環境で確実に起こるようにする。プラスミドは、細胞に対して使用しうる当業者に公知の方法で細胞に導入されるが、かかる方法として、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリポソーム介在トランスフェクションがあるShortProtocolsinMolecularBiologyAusubelらJohnWileySonsInc1999、第9章を参照のこと。具体的な実施形態では、エレクトロポレーションを用いてプラスミドDNAを細胞に導入する。SFVero細胞はリポフェクション抵抗性である。必要なプラスミドでトランスフェクトされた細胞を選択するために、プラスミドは特定のマーカーを担持しうる。そのようなマーカーとしては、限定するものではないが、ある種の抗生物質例えば、カナマイシン、ブラスチシジン、アンピシリン、ハイグロマイシンB、ピューロマイシンおよびゼオシンに対する耐性、ある種の独立栄養特性を細胞マーカーの不在下ではこの特性を失っているに賦与するマーカーなどが含まれ、あるいはまた、細胞の増殖にとつて必要であるがプラスミドが導入される細胞においては突然変異を起こしている遺伝子をマーカーとしてもよい。ウイルスゲノムおよびまたはウイルス遺伝子の転写は、プロモーターの転写制御下におく。かくして、ウイルスゲノムまたはウイルスタンパク質をコードする配列は、プロモーター配列と機能的に連結させる。当業者に公知のプロモーターRNAポリメラーゼ系はどれも本発明の方法において使用することができる。ある実施形態では、プロモーターは細胞に対して内因性のRNAポリメラーゼによる転写を可能にするプロモーターであり、例えばRNAポリメラーゼIまたはRNAポリメラーゼIIなどの細胞性DNA依存性RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列であってよい。ある実施形態では、プロモーターが誘導性のプロモーターでありうる。ある実施形態では、細胞に対して内在性でないRNAポリメラーゼによる転写を可能にするプロモーターとすることができる。ある具体的な実施形態では、プロモーターがT3プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター、またはCMVプロモーターである。用いるプロモーターのタイプに応じて、そのプロモーターを認識するRNAポリメラーゼをコードするプラスミドも細胞に導入して、適切なRNAポリメラーゼを供給する。具体的な実施形態では、RNAポリメラーゼをがT3RNAポリメラーゼ、T7RNAポリメラーゼ、SP6RNAポリメラーゼ、またはCMVRNAポリメラーゼである。具体的な実施形態では、ウイルス遺伝子とウイルスゲノムがT7プロモーターの制御下で転写され、T7RNAポリメラーゼを与えるためにT7RNAポリメラーゼをコードするプラスミドが導入される。ポリメラーゼの転写は、用いる細胞型内で機能するのであれば、どのようなプロモーターの制御下にあってもよい。具体的な実施形態では、CMVプロモーターを使用する。ウイルスゲノムはプラスまたはマイナス方向でありうる。したがって、ウイルスゲノムは遺伝物質から転写されて、ウイルスゲノムのポジティブセンスコピーアンチゲノムコピーまたはウイルスゲノムのネガティブセンスコピーゲノムコピーのいずれかをもたらすことができる。ある実施形態では、ウイルスゲノムが本発明の組換え、キメラおよびまたは弱毒化ウイルスである。ある実施形態において、ウイルスゲノムがヘキサマーの長さのものである場合、ウイルスの複製およびレスキューの効率が増大されうる。ウイルスゲノムが確実に適切な長さとなるように、リボザイム配列、例えばデルタ肝炎ウイルスリボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、またはリボザイム触媒活性を保持するその断片を用いて5または3末端を規定することができる。ある実施形態において、複製およびレスキューに必要とされるウイルスタンパク質にはN、PおよびL遺伝子が含まれる。より具体的な実施形態では、複製およびレスキューに必要とされるウイルスタンパク質にはN、P、M21およびL遺伝子が含まれる。54組換えウイルスの弱毒化本発明の組換えウイルスはさらに、弱毒表現型を示すように遺伝子操作することができる。特に本発明の組換えウイルスは、ウイルスがワクチンとして投与される被験者において弱毒表現型を示す。弱毒化は、当業者に知られている任意の方法によって実現することができる。理論に拘束されるものではないが、組換えウイルスの弱毒表現型は、例えば以下のようにして引き起こすことができる。すにわち、意図される宿主内では自然な状態で十分に複製されないウイルスを使用するか、または、野生型のウイルス株に比べ、ウイルスゲノムの複製を減少させるか、ウイルスが宿主細胞に感染する能力を低下させるか、ウイルスタンパク質が感染性ウイルス粒子へと構成される能力を低下させる。リーダー配列やトレーラー配列など、ウイルスの特定配列の生存能をミニゲノムアッセイにより試験してもよい。本発明の組換えウイルスの弱毒表現型は、当業者に公知の任意の方法によって試験することができる。候補ウイルスは、例えば、それが宿主に感染する能力について、または細胞培養系での複製速度について試験される。ある実施形態では、変化した遺伝子がN、P、L、M2またはこれらの組合せである場合、ミニゲノム系を使用して弱毒化ウイルスを試験する。ある実施形態では、種々の温度での増殖曲線を使用して、ウイルスの弱毒表現型について試験する。例えば弱毒化ウイルスは35°Cで増殖することができるが、39°Cまたは40°Cでは増殖することができない。ある実施形態では、種々の細胞系を使用して、ウイルスの弱毒表現型を評価することができる。例えば弱毒化ウイルスはサル細胞系でのみ増殖して、ヒト細胞系では増殖することができないか、または様々な細胞系で達成されるウイルス力価が弱毒化ウイルスごとに異なっている。ある実施形態では、ハムスター、コットンラット、マウス、およびモルモットを含むがこれらに限定されない小動物モデルの気道におけるウイルス複製が、ウイルスの弱毒表現型を評価するのに使用される。その他の実施形態では、抗体力価を含むがこれに限定されない、ウイルスによって誘発される免疫応答が、ウイルスの弱毒表現型を評価するのに使用される。具体的な実施形態では、プラーク減少中和アッセイまたはELISAを低用量で実施する。ある実施形態では、組換えウイルスが動物モデルにおいて病理学的症状を誘発させる能力について試験することができる。動物モデルでウイルスが病理学的症状を誘発させる能力の低下は、弱毒表現型であることを示している。特定の実施形態では、候補ウイルスが、粘液産生によって示される鼻感染について、サルのモデルで試験される。本発明のウイルスは、ウイルスの1つ以上の機能的特徴が損なわれるように弱毒化される。ある実施形態では、弱毒化は、弱毒化ウイルスが得られる野生型のウイルス株と比較して測定される。他の実施形態では、弱毒化は、異なる宿主系での弱毒化ウイルスの増殖を比較することによって決定される。したがって、非限定的な例として、ヒト宿主におけるウシPIV3の増殖がウシ宿主におけるウシPIV3の増殖に比べて減少している場合、そのウシPIV3はヒト宿主で増殖させたとき弱毒化されていると言える。ある実施形態においては、本発明の弱毒化ウイルスは宿主に感染することができ、感染性ウイルス粒子が産生されるように宿主内で複製することができる。しかし野生型の株と比較すると、弱毒化した株はより低い力価へと増殖するか、またはよりゆっくりと増殖する。弱毒化ウイルスの増殖曲線を決定し、それを野生型ウイルスの増殖曲線と比較するには、当業者に公知の任意の技法を使用することができる。代表的な方法については、以下の実施例セクションを参照されたい。特定の実施形態では、弱毒化ウイルスは、記載されるような条件下で、Vero細胞内で105pfuml未満、104pfuml未満、103pfuml未満、または102pfuml未満の力価にまで増殖する。ある実施形態では、本発明の弱毒化ウイルスはヒト細胞内で複製することができないが、野生型ウイルスは複製することができる。しかし弱毒化ウイルスは、Vero細胞のようなインターフェロン機能を欠いている細胞系内では十分に複製することができる。その他の実施形態においては、本発明の弱毒化ウイルスは、宿主に感染することができ、宿主内で複製することができ、本発明のウイルスのタンパク質を細胞質膜に挿入することができるが、この弱毒化ウイルスは、宿主に新たな感染性ウイルス粒子を産生させることができない。ある実施形態では、弱毒化ウイルスは、野生型哺乳動物ウイルスと同じ効率で、宿主に感染し、宿主内で複製し、ウイルスタンパク質を宿主の細胞質膜に挿入することができる。その他の実施形態では、弱毒化ウイルスがウイルスタンパク質を宿主細胞内の細胞質膜に挿入する能力は、野生型ウイルスに比べて低下している。ある実施形態では、弱毒化哺乳動物ウイルスが宿主内で複製する能力は、野生型ウイルスに比べて低下している。当業者に知られる任意の技法を使用して、ウイルスが哺乳動物細胞に感染できるかどうか、宿主内で複製できるかどうか、ウイルスタンパク質を宿主の細胞質膜に挿入できるかどうかを調べることができる。例示的な方法に関してはセクション55を参照されたい。ある実施形態においては、本発明の弱毒化ウイルスは宿主に感染することができる。しかし野生型PIVとは対照的に、弱毒化PIVは宿主内で複製することができない。特定の実施形態では、弱毒化ウイルスは宿主に感染することができ、その宿主によってウイルスタンパク質をその細胞質膜に挿入することができるが、弱毒化ウイルスは宿主内で複製する能力がない。弱毒化ウイルスが宿主に感染したかどうか、さらにその宿主によってウイルスタンパク質がその細胞質膜に挿入されたかどうか、当業者に知られている任意の方法を使用して試験することができる。ある実施形態においては、弱毒化哺乳動物ウイルスが宿主に感染する能力は、同じ宿主に野生型ウイルスが感染する能力に比べて低下している。当業者に知られている任意の技法を使用して、ウイルスが宿主に感染可能かどうかを調べることができる。例示的な方法に関してはセクション55を参照されたい。ある実施形態では、突然変異をウイルスゲノムに導入して、弱毒化表現型を持つウイルスを作製する。突然変異は、組換えウイルスのN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M21遺伝子、M22遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子に導入することができる。突然変異は、付加、置換、欠失、またはこれらの組合せでありうる。特定の実施形態では、N、P、L、またはM2タンパク質に対して単一アミノ酸欠失変異を導入し、これを、ミニゲノムアッセイ系で機能性に関してスクリーニングして、ウイルス内で予測される機能性に関して評価することができる。より具体的な実施形態では、ミスセンス突然変異は低温感受性突然変異である。その他の実施形態では、ミスセンス突然変異は熱感受性突然変異である。一実施形態では、ウイルスのPタンパク質の主なリン酸化部位が除去される。別の実施形態では、1つまたは複数の突然変異がウイルスのL遺伝子に導入されると、温度感受性株が生じる。さらに別の実施形態では、F遺伝子の切断部位が、切断が生じないようにまたは切断が非常に低い頻度で生じるように突然変異される。その他の実施形態では、組換えウイルスのゲノムに欠失を導入する。さらに具体的な実施形態では、組換えウイルスのN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M21遺伝子、M22遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子に欠失を導入することができる。特定の実施形態では、欠失は、本発明の組換えウイルスのM2遺伝子にある。その他の具体的な実施形態では、欠失は、本発明の組換えウイルスのSH遺伝子にある。さらに別の具体的な実施形態では、M2遺伝子とSH遺伝子の両方が欠失している。ある実施形態では、組換えウイルスの遺伝子間領域が変化している。一実施形態では、遺伝子間領域の長さが変化している。代表的な例に関してはセクション512を参照されたい。別の実施形態では、遺伝子間領域がウイルスゲノムの5末端から3末端へシャッフルされる。その他の実施形態では、組換えウイルスの1つまたは複数の遺伝子のゲノム位置が変化している。一実施形態では、FまたはG遺伝子がゲノムの3末端に移動している。別の実施形態では、N遺伝子がゲノムの5末端に移動している。ある実施形態では、ウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスの遺伝子を異なる種のウイルスの遺伝子と置き換えることによって実現される。例示的な実施形態では、bPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M21遺伝子、M22遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子を、それぞれhPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M21遺伝子、M22遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子と置き換える。その他の例示的な実施形態では、hPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M21遺伝子、M22遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子を、それぞれbPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M21遺伝子、M22遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子と置き換える。好ましい実施形態では、ウイルスの弱毒化は、1つまたは複数のポリメラーゼ関連遺伝子を異なる種のウイルスの遺伝子と置き換えることで実現される。ある実施形態においては、ウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスのタンパク質の1つまたは複数の特定のドメインを、異なる種のウイルスの対応するタンパク質に由来のドメインと置き換えることによって実現される。例示的な実施形態では、bPIV3のFタンパク質の細胞外ドメインを、メタニューモウイルスのFタンパク質の細胞外ドメインと置き換える。好ましい実施形態では、L、N、またはPタンパク質の1つまたは複数の特定ドメインを、異なる種のウイルスの対応するタンパク質に由来のドメインと置き換える。別の例示的な実施形態では、Fタンパク質の膜貫通ドメインを欠失させて、可溶性のFタンパク質が発現されるようにする。本発明のある実施形態では、本発明の組換えウイルスのリーダー配列およびまたはトレーラー配列を修飾することによって、弱毒化表現型を実現することができる。より具体的な実施形態では、リーダーおよびまたはトレーラー配列の長さを、野生型ウイルスよりも少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、または少なくとも6ヌクレオチドだけ短くする。その他のより具体的な実施形態では、組換えウイルスのリーダーおよびまたはトレーラーの配列を突然変異させる。特定の実施形態では、リーダー配列とトレーラー配列は、互いに100相補的である。その他の実施形態では、1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、または10ヌクレオチドは互いに相補的ではなく、リーダーおよびトレーラー配列の残りのヌクレオチドは互いに相補的である。ある実施形態では、非相補的ヌクレオチドが互いに同一である。その他のある実施形態では、非相補的ヌクレオチドが互いに異なっている。その他の実施形態では、トレーラー内の非相補的ヌクレオチドがプリンである場合、リーダー配列内の対応するヌクレオチドもプリンである。その他の実施形態では、トレーラー内の非相補的ヌクレオチドがピリミジンである場合、リーダー配列内の対応するヌクレオチドもプリンである。弱毒化生ワクチンを使用する場合は、その安全性についても考慮しなければならない。ワクチンは疾患を引き起こしてはならない。本発明では、ワクチンを安全なものにすることができる当技術分野で知られている任意の技法を使用することができる。弱毒化技法に加えて、その他の技法を使用することができる。1つの非限定的な例は、ビリオン膜に組み込むことができない可溶性の異種遺伝子を使用することである。例えば、膜貫通ドメインとサイトゾルドメインを欠いているRSV遺伝子の変異型である、可溶性RSVF遺伝子の単一コピーを使用することができる。それはビリオン膜に組み込まれないので、ウイルスの向性が変化するとは予想されない。ワクチンの安全性について試験をするには、様々なアッセイを使用することができる。以下のセクション55を参照されたい。特に、ショ糖密度勾配アッセイと中和アッセイを使用することができる。異種タンパク質がウイルス粒子に挿入されるかどうかを決定するには、ショ糖密度勾配アッセイを使用することができる。異種タンパク質がビリオンに挿入される場合、そのビリオンは、たとえ親株が症状を引き起こさない場合であっても、症状を引き起こすその能力について試験すべきである。理論に拘束されるものではないが、異種タンパク質がビリオンに組み込まれる場合には、そのウイルスは新しいおそらくは病理学的な性質を獲得している可能性がある。55キメラウイルスのウイルス力価、抗原性配列の発現、免疫原性およびその他の特徴の測定細胞培養系、動物モデル系、または被験者におけるキメラまたは組換えウイルスの増殖速度を測定するために、本発明に従っていくつかのアッセイを用いることができる。ビリオンの感染、複製、またはパッケージングを実現するのに要するキメラおよび組換えウイルスの要件を決定するためにも、本発明に従っていくつかのアッセイを用いることができる。本明細書で述べるアッセイは、経時的にウイルス力価をアッセイしてウイルスの増殖特性を決定するのに使用することができる。特定の実施形態では、ウイルス力価を測定するにあたって、感染した細胞または感染した被験者からサンプルを取得し、そのサンプルの連続希釈液を調製し、単一のプラークを出現させるウイルスの希釈度でウイルスに感染しやすい細胞の単層に感染させる。次いでこのプラークをカウントし、ウイルス力価を、サンプル1ミリリットル当たりのプラーク形成単位として表す。本発明の特定の実施形態では、被験者における本発明のウイルスの増殖速度は、被験者内のウイルスに対する抗体の力価によって評価される。理論によって拘束されるものではないが、被験者の抗体力価は、被験者におけるウイルス力価だけでなく抗原性をも反映している。ウイルスの抗原性が一定である場合、被験者内での抗体力価の増加を使用して、被験者におけるウイルスの増殖曲線を求めることができる。好ましい実施形態において、動物またはヒトにおけるウイルスの増殖速度を最良に試験するには、感染後の複数の時点で宿主の生物学的液体をサンプリングして、ウイルス力価を測定する。細胞培養系または被験者での異種遺伝子配列の発現は、当業者に公知の技法によって確認することができる。ある実施形態では、異種遺伝子の発現を、転写物のレベルを定量することにより測定する。転写物のレベルは、転写物に特異的なプローブまたはプライマーをそれぞれ使用するノーザンブロット分析またはRTPCRによって、測定することができる。ウイルスはアンチセンス方向にあり、一方、転写物はセンス方向にあるので、転写物はウイルスのゲノムと区別することができる。ある実施形態では、異種遺伝子の発現を、異種遺伝子のタンパク質産物のレベルを定量することによって測定する。タンパク質のレベルは、タンパク質に特異的な抗体を使用するウェスタンブロット分析によって、測定することができる。特定の実施形態では、異種遺伝子にペプチドタグを付ける。ペプチドタグは、このペプチドタグに対する抗体を使用して検出することができる。検出されたペプチドタグのレベルは、異種遺伝子から発現されたタンパク質のレベルを表している。あるいはまた、異種遺伝子から発現されたタンパク質をペプチドダグによって単離することができる。精製したタンパク質の量は、異種遺伝子の発現レベルと相関している。そのようなペプチドタグと、そのようなペプチドタグに融合されたタンパク質の単離方法は、当技術分野で周知である。異種遺伝子の修飾には、以下に挙げるような当技術分野で公知の様々なペプチドタグを使用することができる:例えば、免疫グロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列、AusubelFMBrentRKunstonREMooreDDSeidmanJGSmithJAおよびStruhlK編JohnWileyandSonsIncUSAGreenePublishAssocWileyInterscience発行、グルタチオンSトランスフェラーゼ、大腸菌マルトース結合タンパク質、様々なセルロース結合ドメイン、およびFLAGエピトープなどであるが、これらに限定されない。その他のエピトープタグは、特異的な結合パートナーによって認識されるものであり、それゆえ、結合パートナー好ましくは固定化されかつまたは固相支持体上にあるへの親和性結合による単離を容易にする。当業者に理解されるように、上記ペプチドダグのコード領域を得るために、DNAクローニング、DNA増幅、および合成方法を含むがこれらに限定されることのない数多くの方法を使用することができる。いくつかのペプチドタグおよびそれらを検出し単離するための試薬は市販されている。被験者由来のサンプルは、当業者に知られている任意の方法によって得ることができる。ある実施形態では、サンプルは、鼻吸引液、咽頭スワブ、痰、または気管支肺胞洗浄液からなる。551ミニゲノム構築物ミニレプリコン構築物は、アンチセンスレポーター遺伝子を含有するように作製することができる。当業者に公知のレポーター遺伝子はどれも本発明で使用することができる。特定の実施形態では、レポーター遺伝子がCATである。ある実施形態では、レポーター遺伝子は、肝炎デルタリボザイムおよびT7ポリメラーゼ終結シグナルに連結されたネガティブセンスbPIVまたはhPIVリーダーと、T7RNAポリメラーゼプロモーターの後に続くbPIVまたはhPIVトレーラー配列によって挟まれていてもよい。ある実施形態では、ミニレプリコンをコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする。宿主細胞は、T7RNAポリメラーゼ、N遺伝子、P遺伝子、L遺伝子、およびM21遺伝子を発現する。ある実施形態では、T7RNAポリメラーゼ、N遺伝子、P遺伝子、L遺伝子、およびM21遺伝子をコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする。その他の実施形態では、ミニレプリコンをコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし、その宿主細胞にヘルパーウイルスを感染させる。レポーター遺伝子の発現レベルおよびまたはその活性は、セクション556に記載される方法などであるがこれらに限定されない、当業者に公知の方法によってアッセイすることができる。より具体的なある実施形態では、ミニレプリコンは以下のエレメントを、列挙した順番で含む:T7RNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼI、リーダー配列、遺伝子開始点、GFP、トレーラー配列、肝炎デルタリボザイム配列またはRNAポリメラーゼI終結配列。T7をRNAポリメラーゼとして使用する場合は、肝炎デルタリボザイム配列を終結配列として使用すべきである。RNAポリメラーゼIを使用する場合は、RNAポリメラーゼI終結配列を終結シグナルとして使用することができる。レスキュー系に応じて、ミニレプリコンの配列をセンス方向またはアンチセンス方向にすることができる。ある実施形態では、リーダー配列を本発明のウイルスの野生型リーダー配列に対して変化させることができる。リーダー配列の前には、場合によりACを置いてもよい。T7プロモーター配列は、Gダブレットまたはトリプレットがあってもなくてもよく、このGダブレットまたはトリプレットは転写の増加を与える。特定の実施形態では、T0で細胞に本発明のウイルスを感染させる。24時間後、T24で、細胞にミニレプリコン構築物をトランスフェクトする。T0後48時間およびT0後72時間で、細胞を、レポーター遺伝子の発現に関して試験する。蛍光レポーター遺伝子産物を使用する場合、レポーター遺伝子の発現はFACSを使用して調べることができる。別の実施形態では、細胞に、T0時間で6個のプラスミドをトランスフェクトする。次いで細胞をT40時間およびT60時間で回収し、CATまたはGFP発現に関して分析する。別の特定の実施形態では、細胞に、T0でMVAT7を感染させる。1時間後、T1で、細胞にミニレプリコン構築物をトランスフェクトする。T0後24時間で、細胞に本発明のウイルスを感染させる。T0後72時間で、細胞を、レポーター遺伝子の発現に関して試験する。蛍光レポーター遺伝子産物を使用する場合、レポーター遺伝子の発現はFACSを使用して調べることができる。552感染率の測定感染率は、例えば感染の存在についての臨床サンプルの検査を含むがこれに限定されない、当技術分野で周知の方法によって測定することができる。例えば、hMPV、RSV、hPIV、間bPIVhPIV成分は、抗hMPV抗原抗体、抗RSV抗原抗体、抗hPIV抗原抗体、およびまたは異種ヌクレオチド配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用する免疫蛍光アッセイによってそれぞれ検出することができる。ある実施形態では、無傷の細胞を含有するサンプルを直接処理することができるが、無傷の細胞を持たない分離株は、許容細胞系の上でまず培養すべきである。例示的な実施形態では、培養細胞懸濁液を、例えば室温で300×gの遠心分離に5分間かけ、その後、同じ条件下でPBS、pH74で洗浄することによって、清澄にする。細胞ペレットを、少量のPBSに再懸濁して分析にかける。無傷の細胞を含有する一次臨床分離株をPBSと混合し、室温で5分間、300×gの遠心分離にかける。粘液を、滅菌ピペットの先端を用いて境界面から除去し、細胞ペレットを同じ条件下でもう一度PBSで洗浄する。次いでペレットを少量のPBSに再懸濁し、分析にかける。アセトン洗浄した12ウェルHTCスーパーキュアガラススライド上の5mmウェル当たり、5~10マイクロリットルの各細胞懸濁液をスポッティングし、空気乾燥させる。スライドを冷アセトン中で10分間固定する。各ウェルにPBS1BSAを添加し、その後室温で10分間インキュベートすることによって、反応を遮断する。スライドをPBS01Tween20で3回洗浄し、空気乾燥させる。ブロッキング緩衝液中で250ngmlに希釈した各一次抗体試薬10マイクロリットルをウェルごとにスポッティングし、反応物を、加湿した37°Cの環境下で30分間インキュベートする。次いでスライドを、PBS01Tween20を3回交換して十分に洗浄し、空気乾燥させる。ブロッキング緩衝液中で250ngmlに希釈した適切な二次コンジュゲート抗体試薬10マイクロリットルを各ウェルにスポッティングし、反応物を、加湿した37°Cの環境下でさらに30分間インキュベートする。次いでスライドを、PBS01Tween20を3回交換して洗浄する。5マイクロリットルのPBS50グリセロール10mMTrispH801mMEDTAを各反応ウェルにスポッティングし、スライドにカバーガラスを取り付ける。その後、各反応ウェルを、B2Aフィルタを使用して倍率200×で蛍光顕微鏡法により分析する。陽性反応を、染色していない細胞または二次試薬のみで染色した細胞から得られた自己蛍光バックグラウンドに対して評価する。RSV陽性反応は、感染細胞の細胞質内にある小封入体で中断された、明るい蛍光により特徴づけられる。553血清力価の測定抗体血清力価は、当技術分野で周知の方法によって測定することができ、例えば、血清サンプル中の抗体または抗体フラグメントの量をサンドイッチELISAで定量することができるが、これに限定されるものではない。簡単に言うと、ELISAは、血清中の抗体または抗体フラグメントを認識する抗体で、マイクロタイタープレートを4°Cで一晩被覆することからなる。次いでこのプレートを、室温で約30分間、PBSTween05BSAでブロックする。PBSBSABSA中に希釈した精製済みの抗体または抗体フラグメントを使用して標準曲線を作成し、サンプルをPBSBSA中に希釈する。サンプルおよび標準品を、アッセイプレートの重複するウェルに加え、室温で約1時間インキュベートする。次に未結合抗体をPBSTWEENで洗い落とし、結合抗体については、室温で約1時間、標識二次抗体で処理する。標識に特異的な色素産生基質を添加し、例えば分光光度計によって、基質の代謝回転速度を測定することにより、標識抗体の結合を検出する。血清中の抗体または抗体フラグメントレベルの濃度は、サンプルについての基質の代謝回転速度と標準曲線についての基質の代謝回転速度とを比較することによって決定する。554チャレンジ研究このアッセイを使用して、本発明の組換えウイルスおよび本発明のワクチンが、コットンラット、SyrianGoldenハムスター、およびBalbcマウスなどを含むがこれらに限定されない動物モデル系での下部気道ウイルス感染を予防できるかどうかを検討する。組換えウイルスおよびまたはワクチンは、静脈内経路によって、筋肉内経路によって、または鼻腔内経路によって投与することができる。組換えウイルスおよびまたはワクチンは、当業者に周知の技法によって投与することができる。このアッセイはまた、抗体の血清濃度を、抗体が結合するウイルスの肺力価の減少に相関させるために使用される。0日目に、コットンラット、カニクイザル、およびハムスター例えばSyrianGoldenハムスターを含むがこれらに限定されない動物群に、筋肉内注射によって、または静脈内注射によって、または鼻腔内経路によって、問題となっている組換えウイルスもしくはワクチンまたはBSAを接種する。本発明の組換えウイルスまたはワクチンを投与する前に、あるいは投与と同時に、あるいは投与した後に、野生型ウイルスこのウイルスに対してワクチンが生成されたを動物に感染させる。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスおよびまたはワクチンを投与した後、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、または少なくとも4週間経てから、動物に野生型ウイルスを感染させる。好ましい実施形態では、本発明の組換えウイルスおよびまたはワクチンを投与した後、21日経てから動物に野生型ウイルスを感染させる。別の好ましい実施形態では、本発明の組換えウイルスおよびまたはワクチンを投与した後、28日経てから動物に野生型ウイルスを感染させる。感染後、動物を犠牲にし、その鼻甲介組織およびまたは肺組織を採取し、プラークアッセイおよびTCID50アッセイなどの適切なアッセイによってウイルス力価を測定する。ウシ血清アルブミン10mgkgを陰性対照として使用する。チャレンジ時の血清中の抗体濃度をサンドイッチELISAを使用して測定することができる。555臨床試験invitroアッセイおよび動物モデルで試験した本発明のワクチンまたはそのフラグメントは、さらに、あらゆる年齢層を含む健常なヒトボランティア群において、安全性、許容性、免疫原性、感染性、および薬物動態について調べることができる。好ましい実施形態では、健常なヒトボランティアは約6週以上の乳児、子供および成人である。これらのボランティアに、鼻腔内、筋肉内、静脈内経路で、または肺送達系によって、1回用量の本発明の組換えウイルスおよびまたは本発明のワクチンを投与する。年齢が6~60ヵ月の血清陰性の子供では複数回用量の本発明のウイルスおよびまたはワクチンが必要になるかもしれない。また、誕生後最初の6ヵ月では、局所および全身の免疫を刺激しかつ母親由来の抗体による中和を避けるために、複数回用量の本発明のウイルスおよびまたはワクチンが必要になるかもしれない。好ましい実施形態では、2、4および6ヵ月齢で一次投薬を行い、2才の初めに追加免疫を行なう。本発明の組換えウイルスおよびまたは本発明のワクチンは単独で投与してもよいし、対応する年齢で推奨される小児用ワクチンと同時に投与してもよい。好ましい実施形態では、二重盲検ランダム化、プラセボ対照臨床試験を使用する。特定の実施形態では、コンピュータ作成ランダム化スケジュールを採用する。例えば、試験に参加している各被験者を1つの単位として登録し、独自のケース番号を割り当てる。1家族に含まれる複数の被験者は登録目的のために個体として取り扱う。親保護者、被験者、および研究者は、試験期間中、被験者がどの処置群に割り当てられたかを知らされていない。血清学的およびウイルス学的試験は、処置群の割り当てを知らされていない研究室の職員によって行なうこととする。しかしながら、ウイルス学研究室の職員は、ワクチン接種後に得られた鼻洗浄液からのワクチンウイルスの分離によって、おそらくワクチン接種者を識別できると予想される。血清学的試験とウイルス学的試験の職員は分離されており、血清学的試験群には培養結果のいかなる情報も入らないようにする。好ましくは、本発明の組換えウイルスおよびまたは本発明のワクチンを投与する前、少なくとも12時間にわたり各ボランティアをモニターし、また、臨床サイトでその用量を受け取った後少なくとも15分間は各ボランティアをモニターする。その後は、投与後1~14日、21日、28日、35日、42日、49日、および56日目に外来患者として各ボランティアをモニターする。好ましい実施形態では、それぞれのワクチン接種後最初の1月間は外来患者としてボランティアをモニターする。ワクチンに関係した重大な有害事象はすべて、全試験期間を通して記録される。重大な有害事象は、以下のような事象として定義される:1死に至る、2ただちに生命を脅かす、3永久的なまたは重症の身体障害をもたらす、4入院するようになるか、またはすでに入院している患者の入院を長引かせる、5先天性の異常をもたらす、6癌である、または、7研究中のワクチンの過剰投与の結果である。ワクチンとは無関係の重大な有害事象は、最初のワクチン接種日0日目に開始して、最後のワクチン接種後30日間続けて記録する。ワクチンとは無関係の重大な有害事象については、最後のワクチン接種につづく30日の記録期間後、5~8ヶ月間は記録されないだろう。子供が投薬後にワクチンに関係した重大な有害事象を示す場合には、ワクチンプラセボを投与しないようにする。ワクチンに関係するとは考えられないものの、関心がもてる有害事象については、別の用量を投与する決定がなされる前に、臨床試験従事者と医療従事者によって論議されるだろう。血液サンプルは、留置カテーテルまたは直接静脈穿刺例えば、先端が赤い10mlVacutainerチューブ採血管を使用により、以下の間隔で採血する。すなわち、本発明の組換えウイルスおよびまたは本発明のワクチンを投与する前、本発明の組換えウイルスおよびまたは本発明のワクチンを投与している間、本発明の組換えウイルスおよびまたは本発明のワクチンを投与してから5分、10分、15分、20分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、および48時間後、本発明の組換えウイルスおよびまたは本発明のワクチンを投与してから3日、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、および56日後に採血する。特定の実施形態では、全部で5回の採血それぞれ3~5mlを行なうが、それぞれ初回、3回目および追加免疫の直前、ワクチンまたはプラセボの3回目および追加免疫を行なってから約1ヶ月後である。サンプルを室温で凝固させ、遠心分離後に血清を回収する。本発明のウイルスに対する株特異的血清赤血球凝集阻害抗体レベルについて血清を試験する。IgG、IgA、または中和抗体のような他の免疫原性の指標も試験する。同時に投与した1種以上の他のワクチンの血清抗体応答を測定してもよい。患者由来のサンプル中の、本発明の組換えウイルスおよびまたは本発明のワクチンに対して生成された抗体の量は、ELISAによって定量することができる。PBMC中、および肺と鼻の洗浄液中のT細胞免疫性もモニターすることができる。ボランティアの血清中の抗体レベルの濃度は、本発明の組換えウイルスおよびまたは本発明のワクチンを投与した後それぞれの採血間隔での血清レベルから、投与前の血清レベルを差し引くことによって、補正する。各ボランティアごとに、補正された血清抗体または抗体フラグメント濃度から、モデル非依存型手法に従って薬物動態パラメータを算出する。ワクチンプラセボをそれぞれ投与してから約2、3、4、5、6、7または8日後に得られた鼻腔洗浄液を培養して、本発明のワクチンウイルスの消失を検出することができよう。好ましい実施形態では、ワクチンプラセボをそれぞれ投与してから7日後に得られた鼻腔洗浄液を培養する。さらに、試験のいずれかの時点で、鼻咽頭スワブ、喉スワブ、または鼻腔洗浄液を使用して、発熱性疾患直腸温度が102°F以上およびまたはクループ、細気管支炎、または肺炎に罹っているボランティアに他のウイルスが存在するかを調べる。サンプルはドライアイスで冷やしながら指定された研究サイトに輸送する。本発明のワクチンウイルスの分離および定量のためのアッセイ、ならびに本発明のワクチンウイルスを同定するためのMAbを用いる免疫染色アッセイが用いられるこのようなアッセイの例は以下の実施例セクションに示す。鼻腔洗浄液検体を、他のウイルスや免疫応答IgG、IgA、および中和抗体を含むについて試験することができる。556レポーター遺伝子特定の実施形態では、組織培養物または動物モデルにおけるレポーター遺伝子発現を測定するためのアッセイが、本発明の方法とともに使用され得る。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列はbPIV、hPIV、またはbhPIV3などのウイルスにクローニングされ、そこでのiレポーター遺伝子の位置は変化し、iiレポーター遺伝子に隣接している遺伝子間領域の長さは様々である。レポーター遺伝子の最適な発現率およびレポーター遺伝子を含むウイルスの最適な複製率を決定するために、様々な組み合わせが検査される。特定の実施形態では、レポーター遺伝子を含むようにミニゲノム構築物が作製される。ミニゲノム構築物の構築はセクション551に記載される。レポーター遺伝子産物の存在量は、当業者にとって既知の任意の技術によって測定され得る。このような技術は、それぞれレポーター遺伝子に特異的なプローブもしくは抗体を用いたノーザンブロット分析またはウェスタンブロット分析を含むが、それらに限定されない。特定の実施形態では、レポーター遺伝子はFACSで検出され得る蛍光シグナルを発する。FACSはレポーター遺伝子を発現する細胞を検出するために使用され得る。本発明の特定の態様を実施するための技術には、他に指示されない限り、当業者のよって通常実施されている、分子生物学、微生物学、ならびに組換えDNA操作および作製の従来の技術を用いる例えば、Sambrook1989MolecularCloningALaboratoryManual第二版DNACloningIおよびII巻Glover編1985ならびにTranscriptionandTranslationHamesおよびHiggins編1984を参照されたい。レポーター遺伝子産物の生化学的活性は、レポーター遺伝子の発現レベルを表す。レポーター遺伝子活性の総レベルはまた、本発明の組換えウイルスの複製速度に依存する。従って、組換えウイルス由来のレポーター遺伝子の真の発現レベルを測定するために、総発現レベルを細胞培養物または動物モデルにおける組換えウイルスの力価で割るべきである。本発明の方法とともに使用され得るレポーター遺伝子は、下記の表4に記載される遺伝子を含むが、それらに限定されない。レポーター遺伝子の存在量は、特に、ウェスタンブロット分析もしくはノーザンブロット分析、またはヌクレオチド配列の転写の定量化、そのmRNA、そのタンパク質の存在量の定量化のために用いられる他の任意の技術によって測定され得るShortProtocolsinMolecularBiologyAusubelら編、JolmWileySonsInc第四版1999を参照されたい。特定の実施形態では、レポーター遺伝子産物の活性が、組換えウイルス由来のレポーター遺伝子発現の読取値として測定される。レポーター遺伝子産物の活性の定量化のために、レポーター遺伝子産物の生化学的特性を調べることができる表1参照。レポーター遺伝子産物の生化学的活性を測定する方法は、当業者によく知られている。本発明の方法とともに使用され得る例示的なレポーター遺伝子の更に詳細な記述を以下に示す。ルシフェラーゼルシフェラーゼは酸素および基質ルシフェリンの存在下で光を発する酵素であり、細胞培養物、個々の細胞、生物全体、およびトランスジェニック生物における遺伝子発現のリアルタイム低光量イメージングに使用されているGreerおよびSzalay2002Luminescence174374に概説される。本明細書において用いられるルシフェラーゼという用語は、すべてのルシフェラーゼ、またはルシフェラーゼから派生したルシフェラーゼ活性を有する組換え酵素を包含するものである。ホタル由来の、例えばPhotinus種およびLuciola種由来のルシフェラーゼ遺伝子はよく特徴づけられている例えば、Photinuspyralisについては国際特許公開番号WO9525798、LuciolacruciataおよびLuciolalateralisについては欧州特許出願番号EP0524448、ならびにLuciolamingrelicaについてはDevineら、1993BiochimBiophysActa1173121132を参照されたい。他の真核生物のルシフェラーゼ遺伝子は、ウミシイタケRenillareniformis例えば、Lorenzら、1991ProcNatlAcadSciUSA8844384442参照およびツチボタルLampyrisnoctiluca例えばSulaNewbyら、1996BiochemJ313761767参照を含むが、それらに限定されない。細菌のルシフェリンルシフェラーゼ系は、陸生Photorhabdusluminescens例えば、Manukhovら、2000Genetika3632230参照ならびに海洋細菌VibriofischeriおよびVibrioharveyi例えば、それぞれMiyamotoら、1988JBiolChem263133939、およびCohnら、1983ProcNatlAcadSciUSA801203参照の細菌性lux遺伝子を含むが、それらに限定されない。本発明に含まれるルシフェラーゼはまた、Squirrellらの米国特許第6265177号に記載される突然変異ルシフェラーゼを含み、それは参照により本明細書に組み入れられる。緑色蛍光タンパク質緑色蛍光タンパク質GFPは、蛍光を発するために更なる基質または補因子を必要としない発色団の形成に関与するアミノ酸65~67を含む238アミノ酸のタンパク質である例えば、Prasherら、1992Gene111229233Yangら、1996NatureBiotechnol1412521256およびCodyら、1993Biochemistry3212121218を参照されたい。本明細書において用いられる緑色蛍光タンパク質もしくはGFPという用語は、緑色以外の色を呈する様々なGFPを含むすべてのGFP、またはGFPから派生したGFP活性を有する組換え酵素を包含するものである。天然のGFPの遺伝子は、生物発光クラゲAequoreavictoriaからクローニングされた例えば、Morinら、1972JCellPhysiol77313318を参照されたい。野生型GFPは、395nmでの主要な励起ピークおよび470nmでの小さな励起ピークを有する。470nmでの吸収ピークは、標準的なフルオレセインイソチオシアネートFITCフィルターセットを用いたGFPレベルのモニタリングを可能にする。発現を向上させるため、ならびに励起および蛍光発光を改変するために有用な、GFP遺伝子の突然変異体が見いだされている。例えば、65位にセリンの代わりにアラニン、グリシン、イソロイシン、またはトレオニンを有する突然変異GFPは、最大励起のシフトを伴い、488nmで励起した場合、野生型タンパク質より大きい蛍光発光を有する突然変異GFPを生じる例えば、Heimら、1995Nature373663664米国特許第5625048号Delagraveら、1995Biotechnology13151154Cormackら、1996Gene1733338およびCramerら、1996NatureBiotechnol14315319を参照されたい。GFPを488nmで励起する能力は、標準的な蛍光活性化セルソーティングFACS装置によるGFPの使用を可能にする。別の実施形態では、GFPは、限定はされないがウミシイタケRenillareriformisなどのクラゲ以外の生物から単離される。EGFPは、野生型GFP35の赤色にシフトした変異型であり、より明るい蛍光発光および哺乳動物細胞におけるより高い発現のために最適化されている最大励起488nm最大発光507nm。EGFPは、Phe64からLeuおよびSer65からThrへの二重アミノ酸置換を含むGFPmut1変異型をコードする。EGFP遺伝子のコード配列は、ヒトのコドン使用頻度の選好性に対応した190以上のサイレント塩基変化を有する。βガラクトシダーゼβガラクトシダーゼβgalは、ラクトースを含むβガラクトシド、ならびにガラクトシド類似体oニトロフェニルβDガラクトピラノシドONPGおよびクロロフェノールレッドβDガラクトピラノシドCPRGの加水分解を触媒する酵素である例えば、Nielsenら、1983ProcNatlAcadSciUSA8051985202Eusticeら、1991Biotechniques11739742およびHendersonら、1986ClinChem3216371641を参照されたい。そのタンパク質産物は非常に安定であり、細胞溶解液中でのタンパク質分解に耐性があり、容易にアッセイされるので、βgal遺伝子はレポーター遺伝子としてよく機能する。基質としてONPGを用いる場合、βgal活性は分光光度計またはマイクロプレートリーダーを用いて定量され得る。本明細書において用いられるβガラクトシダーゼもしくはβgalという用語は、lacZ遺伝子産物を含むすべてのβgal、またはβgalから派生したβgal活性を有する組換え酵素を包含するものである。そのタンパク質産物は非常に安定であり、細胞溶解液中でのタンパク質分解に耐性があり、容易にアッセイされるので、βgal遺伝子はレポーター遺伝子としてよく機能する。ONPGがその基質である実施形態では、βgal活性は分光光度計またはマイクロプレートリーダーを用いて定量でき、変換されたONPGの量を420nmで測定する。CPRGがその基質である実施形態では、βgal活性は分光光度計またはマイクロプレートリーダーを用いて定量でき、変換されたCPRGの量を570~595nmで測定する。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ哺乳動物細胞は検出可能なレベルのCAT活性を持たないため、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCATは哺乳動物細胞系におけるレポーター遺伝子として一般に使用される。CATのためのアッセイは、細胞抽出物を放射性標識したクロラムフェニコールおよび適切な補因子とともにインキュベートすること、例えば薄層クロマトグラフィーTLCによって出発物質を生成物から分離すること、続いてシンチレーション計測を行うことを含む例えば、参照により本明細書に完全に組み入れられる、米国特許第5726041号を参照されたい。本明細書において用いられるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼもしくはCATという用語は、すべてのCAT、またはCATから派生したCAT活性を有する組換え酵素を包含するものである。レポーター系は、細胞の処理、放射性同位体、およびクロマトグラフ分離を必要とせず、ハイスループットスクリーニングにより適していることが好ましいが、レポーター遺伝子としてのCATは、レポーター遺伝子の安定性が重要である状況において好ましいと思われる。例えば、CATレポータータンパク質はinvivoにおいて約50時間の半減期を持ち、結果の動的な変化に比べて結果の蓄積が望ましい場合に有利である。分泌型アルカリホスファターゼ分泌型アルカリホスファターゼSEAP酵素は、アルカリホスファターゼのトランケート型であり、そのタンパク質の膜貫通ドメインの切断が、細胞から周囲の培地中へのその分泌を可能にする。本明細書において用いられる分泌型アルカリホスファターゼもしくはSEAPという用語は、すべてのSEAP、またはSEAPから派生したアルカリホスファターゼ活性を有する組換え酵素を包含するものである。SEAP活性は、蛍光基質の触媒反応の測定、免疫沈降、HPLC、および放射分析検出を含むがそれらに限定されない様々な方法によって検出され得る。発光法は、その感度の増加のために熱量検出法より好まれる。SEAPを使用することの利点は、SEAPタンパク質が細胞外に分泌されるため、細胞溶解のステップを必要とせず、サンプリングおよびアッセイ法の自動化を容易にすることである。C型肝炎ウイルスプロテアーゼ阻害剤の細胞に基づいた評価において使用するためのSEAPを用いた細胞系アッセイは、Pottsらの米国特許第6280940号に記載され、それは参照により本明細書に組み入れられる。557細胞培養系、孵化卵、および動物モデル当技術分野において既知の細胞培養系は、本発明のウイルスを増殖させるため、または本発明のウイルスの活性を検査するために使用され得る例えば、その全文が参照により本明細書に組み入れられるFlintら、PRINCIPLESOFVIROLOGYMOLECULARBIOLOGYPATHOGENESISANDCONTROL2000ASMPresspp2529を参照されたい。このような細胞培養系の例は、動物組織から調製される初代培養細胞例えば、サルの腎臓、ヒト胎児の羊膜、腎臓、および包皮、ならびにニワトリまたはマウスの胚に由来する細胞培養物単一の種類の均質集団から成り、死ぬ前に最大100回まで分裂できる2倍体細胞株例えば、ヒト胎児の肺に由来するWI38株のような、ヒト胎児に由来する細胞培養物ならびに培養液中で無限に増殖できる単一の細胞型から成る連続継代細胞系例えば、HEp2細胞、Hela細胞、Vero細胞、Lおよび3T3細胞、ならびにBHK21細胞を含むが、それらに限定されない。本発明のウイルスはまた、ニワトリの孵化卵でも増殖され得る。受精後5~14日目に、殻に穴を開けて、ウイルスをその複製に適した部位に注入する。例えば、本発明のワクチンの有効性および安全性を決定するなどの、様々な目的を達成するために、当技術分野において既知の任意の動物モデルが本発明に使用され得る。このような動物モデルの例は、コットンラットSigmodonhispidis、ハムスター、マウス、サル、およびチンパンジーを含むがそれらに限定されない。好ましい実施形態では、SyrianGoldenハムスターが用いられる。558中和アッセイ中和アッセイは、異種表面糖タンパク質がビリオンに取り込まれ、ウイルストロピズム表現型の変化を引き起こしうるかどうかという重要な安全性の問題に対処するために実施され得る。本明細書において用いられる場合、トロピズムという用語は、特定の細胞型に対するウイルスの親和性を表す。トロピズムは通常、ウイルスがその特定の細胞型のみに侵入することを可能にする、特定の細胞上の細胞受容体の存在によって決定される。中和アッセイは、異種表面糖タンパク質非限定的な例はネガティブ鎖RNAウイルスのFタンパク質であるのMAbまたは異種表面糖タンパク質に対する抗体を含むポリクローナル抗血清のいずれかを用いることによって行われる。本発明のキメラウイルスが中和され得るかどうかを調べるために、抗体の様々な希釈が検査される。異種表面糖タンパク質は、抗体結合および中和を引き起こすために十分な量でビリオン表面に存在すべきではない。559ショ糖密度勾配アッセイ異種タンパク質がビリオンに取り込まれるかどうかの問題は、生化学的アッセイの使用によって更に研究され得る。感染細胞溶解液は20~60ショ糖密度勾配で分画することができ、様々な画分が回収され、異種タンパク質およびベクタータンパク質の存在ならびに分布についてウェスタンブロットにより分析される。その画分およびウイルスタンパク質はまた、プラークアッセイによってピークウイルス力価についてもアッセイされ得る。ショ糖密度勾配アッセイの実施例は、下記のセクション23に示される。異種タンパク質がビリオンに付随している場合、それらはビリオンとともに移動するであろう。56キメラウイルスを用いたワクチン製剤本発明は、本発明の組換えネガティブ鎖RNAウイルスを含むワクチン製剤を包含する。本発明の組換えPIVウイルスは、任意の様々な病原体に対する防御応答を誘導する外来エピトープを発現するためのビヒクルとして使用されうる。特定の実施形態では、本発明は、hPIV感染に対する防御を賦与するためのワクチン製剤における、改変された組換えbPIVウイルスまたは弱毒化hPIVの使用を包含する。本発明のワクチン製剤は、二価および三価のワクチン製剤を含む多価ワクチンを含む。本発明の二価および三価のワクチンは、それぞれの異種抗原配列を発現する1つのPIVベクターの形で、またはそれぞれ異なる異種抗原配列をコードする2つ以上のPIVベクターの形で投与されうる。例えば、1つ以上の異種抗原配列を発現する第一のキメラPIVは、1つ以上の異種抗原配列を発現する第二のキメラPIVとともに投与でき、そこでの第二のキメラPIVの異種抗原配列は、第一のキメラPIVの異種抗原配列とは異なる。第一および第二のキメラPIVの異種抗原配列は、同一のウイルスに由来し得るが異なるタンパク質をコードするか、または異なるウイルスに由来する。好ましい実施形態では、第一のキメラPIVの異種抗原配列は呼吸器多核体ウイルスに由来し、第二のキメラPIVの異種抗原配列はヒトメタニューモウイルスに由来する。別の好ましい実施形態では、第一のキメラPIVの異種抗原配列は呼吸器多核体ウイルスに由来し、第二のキメラPIVの異種抗原配列はトリニューモウイルスに由来する。特定の好ましい実施形態では、本発明のワクチン製剤は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、および哺乳動物メタニューモウイルス例えばヒトメタニューモウイルスを含むがそれらに限定されないネガティブ鎖RNAウイルスによる感染を防御するために使用される。より具体的には、本発明のワクチン製剤は、ヒトメタニューモウイルスおよびまたはトリニューモウイルスによる感染を防御するために使用される。特定の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、aヒトメタニューモウイルスおよび呼吸器多核体ウイルスならびにまたはbトリニューモウイルスおよび呼吸器多核体ウイルスによる感染を防御するために使用される。好ましい実施形態では、本発明は、本発明の核酸によってコードされるタンパク質性分子またはメタニューモウイルス特異的なウイルスタンパク質もしくはその機能的断片を提供する。有用なタンパク質性分子は、例えば、本発明のウイルスから誘導できる任意の遺伝子またはゲノム断片に由来する。特に有用なものは、抗原もしくはサブユニット免疫原として含有させるためのF、SHおよびまたはGタンパク質あるいはその抗原性断片であるが、不活化された全ウイルスもまた使用しうる。特に有用なものはまた、系統発生分析のために同定される組換え核酸断片によってコードされるタンパク質性物質であり、当然、invivo例えば予防目的のため、もしくは診断用抗体を提供するためにであろうとinvitro例えばファージディスプレイ法もしくは合成抗体を作製するために有用な別の技術によるであろうと、特にMPV特異的抗体またはT細胞応答を誘導するための、系統発生分析において有用なORFの好ましい外延内にあるものは好適である。本発明のウイルス、核酸、タンパク質性分子もしくはその断片、抗原およびまたは抗体を含む医薬組成物は、例えば個体に本発明の医薬組成物を与えることを含む、MPV感染およびまたは呼吸器疾患の治療あるいは予防のための方法に使用され得る。これは、前記個体がヒトである場合、特に前記ヒトが5歳未満である場合に最も有用であるが、このような幼児および小児は本明細書に記載されるようなヒトMPVに感染する可能性が最も高いからである。通常、急性期では、患者は上部気道症状を患い、他の呼吸器疾患および他の疾患に罹りやすくなる。下部気道疾患も生じる可能性があり、更に他の重篤な症状に罹りやすくなる。本発明の組成物は、癌患者、移植レシピエントおよび高齢者を含む免疫不全個体の治療のために使用することができる。本発明はまた、本発明のウイルスを含む細胞培養物または実験動物を樹立すること、前記培養物または動物を抗ウイルス薬候補で処理すること、および前記薬剤が前記ウイルスに及ぼす効果または前記培養物もしくは動物へのその感染に及ぼす効果を測定することを含む、気道疾患の治療に有用な抗ウイルス薬を得るための方法を提供する。本発明はまた、医薬組成物の調製、特に、MPV感染または関連疾患に起因する場合、特に気道疾患の治療のための医薬組成物の調製のための本発明の抗ウイルス薬の使用を提供し、ならびにMPV感染もしくは呼吸器疾患の治療または予防のための方法に有用な、本発明の抗ウイルス薬を含む医薬組成物を提供し、前記方法は個体にこのような医薬組成物を与えることを含む。本発明の特定の実施形態では、本発明のワクチンは哺乳動物メタニューモウイルスを含む。特定の、より特異的な実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである。好ましい実施形態では、ワクチン製剤に使用される哺乳動物メタニューモウイルスは弱毒化表現型を有する。弱毒化表現型を得るための方法については、セクション54を参照されたい。本発明は、PIV、RSV、APV、およびまたはhMPVによる感染の予防ならびに治療のためのワクチン製剤を提供する。特定の実施形態では、本発明のワクチンは、本発明の組換えおよびキメラウイルスを含む。特定の実施形態では、ウイルスは弱毒化される。特定の実施形態では、ワクチンはAPVを含み、そのワクチンはヒトにおけるhMPV感染の予防および治療のために使用される。理論に拘束されるものではないが、hMPVのFタンパク質とAPVのFタンパク質の高度の相同性のために、APVによる感染は、宿主にhMPVと交差反応する抗体の産生を引き起こし、hMPVによる感染および関連疾患から宿主を防御するであろう。別の特定の実施形態では、ワクチンはhMPVを含み、ワクチンは限定されないがシチメンチョウなどのトリ類におけるAPV感染の予防および治療のために使用される。理論に拘束されるものではないが、hMPVのFタンパク質とAPVのFタンパク質の高度の相同性のために、hMPVによる感染は、宿主にAPVと交差反応する抗体の産生を引き起こし、APVによる感染および関連疾患から宿主を防御するであろう。特定の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、aヒトメタニューモウイルスおよびヒトパラインフルエンザウイルスによる感染ならびにまたはbトリニューモウイルスおよびヒトパラインフルエンザウイルスによる感染、ならびに関連疾患から防御するために使用される。特定の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、aヒトメタニューモウイルス、呼吸器多核体ウイルスおよびヒトパラインフルエンザウイルスによる感染ならびにまたはbトリニューモウイルス、呼吸器多核体ウイルスおよびヒトパラインフルエンザウイルスによる感染、ならびに関連疾患から防御するために使用される。特定の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、ヒトメタニューモウイルス、呼吸器多核体ウイルスおよびヒトパラインフルエンザウイルスによる感染から防御するために使用される。特定の他の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、トリニューモウイルス、呼吸器多核体ウイルスおよびヒトパラインフルエンザウイルスによる感染、ならびに関連疾患から防御するために使用される。異なるウイルス種のFタンパク質間の高度の相同性のために典型的なアミノ酸配列比較については図1を参照されたい、本発明のワクチン製剤は、Fタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が得られるウイルスとは異なるウイルスから防御するために使用され得る。特定の例示的な実施形態では、ワクチン製剤は、トリニューモウイルスA型に由来する異種ヌクレオチド配列を含むウイルスを含有し、そのワクチン製剤はトリニューモウイルスA型およびトリニューモウイルスB型による感染から防御するために使用される。別の特定の例示的な実施形態では、ワクチン製剤は、トリニューモウイルスのサブグループCに由来する異種ヌクレオチド配列を含むウイルスを含有し、そのワクチン製剤はトリニューモウイルスのサブグループCおよびトリニューモウイルスのサブグループDによる感染から防御するために使用される。本発明は、ヒトおよび動物に投与されるべき、PIV、hMPV、APVAPVCおよびAPVDを含む、インフルエンザ、RSV、センダイウイルス、ムンプスウイルス、喉頭気管炎ウイルス、シミアンウイルス5、ヒトパピローマウイルス、ならびに他のウイルス、病原体および関連疾患から防御するために有用なワクチン製剤を包含する。本発明は更に、ヒトおよび動物に投与されるべき、ヒトメタニューモウイルス感染、トリニューモウイルス感染、および関連疾患から防御するために有用なワクチン製剤を包含する。1つの実施形態では、本発明は、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルスFLVおよびイヌジステンパーウイルスを含む家畜の病原体に対して有用なワクチン製剤を包含する。更に別の実施形態では、本発明は、家畜を水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、牛疫ウイルス、豚痘ウイルスから防御するため、更にまた、野生動物を狂犬病ウイルスから保護するために有用なワクチン製剤を包含する。逆遺伝学的アプローチによって作製された弱毒化ウイルスは、本明細書に記載されるワクチンおよび医薬製剤に使用され得る。逆遺伝学的技法はまた、ワクチン製造のために重要な他のウイルス遺伝子に付加的な突然変異を導入するためにも使用され得る。例えば、5’非コード領域における突然変異はmRNAの翻訳に影響を与えるかもしれず、キャプシドタンパク質における突然変異はウイルスの組み立てに影響を与えると考えられ、温度感受性および寒冷適応突然変異体は、親ウイルスほど病原性が強くないことが多い例えば、その全文が参照により本明細書に組み入れられる、Flintら、PRINCIPLESOFVIROLOGYMOLECULARBIOLOGYPATHOGENESISANDCONTROL2000ASMPresspp670683を参照されたい。有用なワクチン変異株のエピトープを弱毒化ウイルス内に遺伝子操作することができる。あるいはまた、他のウイルスまたは非ウイルス病原体に由来する抗原を含めて、完全な外来エピトープを弱毒化ウイルス内に遺伝子操作することもできる。例えば、HIVgp160、gp120、gp41のような非関連ウイルスの抗原、寄生虫抗原例えば、マラリア、細菌もしくは真菌の抗原、または腫瘍抗原を弱毒化株内に遺伝子操作してもよい。あるいは、invivoでウイルスの向性を変化させるエピトープを、本発明のキメラ弱毒化株内に遺伝子操作することができる。事実上どのような異種遺伝子配列も、ワクチンとして使用するために本発明のキメラウイルスへと構築することができる。好ましくは、生物学的応答改変物質として作用する成分およびペプチドが、ワクチンとして使用するために本発明のキメラウイルス内に構築される。好ましくは、様々な病原体のいずれかに対する防御免疫応答を誘導するエピトープ、または中和抗体に結合する抗原が、キメラウイルスによって、またはキメラウイルスの一部として発現されうる。例えば、本発明のキメラウイルス内に構築され得る異種遺伝子配列は、インフルエンザおよびパラインフルエンザのヘマグルチニンノイラミニダーゼ、ならびにヒトPIV3のHN遺伝子およびF遺伝子などの融合糖タンパク質を含むが、それらに限定されない。更に別の実施形態では、キメラウイルス内に遺伝子操作されうる異種遺伝子配列は、免疫調節活性を有するタンパク質をコードするものを含む。免疫調節タンパク質の例は、サイトカイン、インターフェロン1型、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン1、2、4、5、6、12およびそれらの物質のアンタゴニストを含むが、それらに限定されない。更に、ワクチンでの使用のために本発明のキメラウイルス内に構築され得る異種遺伝子配列は、ヒト免疫不全ウイルスHIV、好ましくは1型または2型に由来する配列を含むがそれらに限定されない。好ましい実施形態では、抗原の起源となりうる免疫原性HIV由来ペプチドが、キメラPIV内に構築され、その後、脊椎動物の免疫応答を誘導するために使用されうる。このようなHIV由来ペプチドは、env遺伝子すなわち、gpl60、gpl20、およびまたはgp41の全体または一部をコードする配列、pol遺伝子すなわち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、およびまたはインテグラーゼの全体または一部をコードする配列、gag遺伝子すなわち、p7、p6、p55、p1718、p2425の全体または一部をコードする配列、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、およびまたはvpxに由来する配列を含むが、それらに限定されない。他の異種配列は、いくつかを挙げると、B型肝炎ウイルス表面抗原HBsAgA型肝炎ウイルスまたはC型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタインバーウイルスの糖タンパク質ヒトパピローマウイルスの糖タンパク質呼吸器多核体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス5またはムンプスウイルスの糖タンパク質インフルエンザウイルスの糖タンパク質ヘルペスウイルスの糖タンパク質ポリオウイルスのVP1細菌および寄生虫などの非ウイルス病原体の抗原決定基に由来しうる。別の実施形態では、免疫グロブリン遺伝子の全体または一部が発現されうる。例えば、このようなエピトープを模倣する抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域は、本発明のキメラウイルス内に構築されうる。他の異種配列は腫瘍抗原に由来してもよく、その結果生じるキメラウイルスは腫瘍細胞に対する免疫応答を起こすために使用され、invivoにおいて腫瘍の緩解をもたらす。これらのワクチンは、腫瘍の治療のために、化学療法、放射線療法、外科手術、骨髄移植等を含むがそれらに限定されない他の治療計画と併せて使用されうる。本発明に従って、組換えウイルスは、以下のものを含むがそれらに限らない腫瘍関連抗原TAAを発現するように操作されうる:T細胞によって認識されるヒト腫瘍抗原参照により本明細書に完全に組み入れられる、RobbinsおよびKawakami1996CurrOpinImmunol8628636、gp100、MART1MelanA、TRP1gp75、チロシナーゼを含むメラニン細胞系タンパク質腫瘍特異的な広く共有される抗原、MAGE1、MAGE3、BAGE、GAGE1、GAGE1、NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV、p15腫瘍特異的な変異型抗原、βカテニン、MUM1、CDK4乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、および膵臓癌に対する非メラノーマ抗原、HER2neu、ヒトパピローマウイルスE6、E7、MUC1。更に他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスおよびまたはトリニューモウイルスなどのメタニューモウイルスに由来する。更に他の実施形態では、本発明のウイルスは2つの異なる異種ヌクレオチド配列を含み、その1つはヒトメタニューモウイルスおよびまたはトリニューモウイルスなどのメタニューモウイルスに由来し、他の1つは呼吸器多核体ウイルスに由来する。異種ヌクレオチド配列は、それぞれのウイルスのFタンパク質またはGタンパク質をコードする。特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列はキメラFタンパク質をコードし、そのキメラFタンパク質は、メタニューモウイルスのFタンパク質の細胞外ドメインとパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメインならびに内腔ドメインを有する。組換えウイルス生ワクチンまたは組換えウイルス不活化ワクチンのいずれかが処方され得る。生ワクチンは、宿主内での増殖が天然の感染において生じるものと同様の種類および規模の持続した刺激を誘導し、従ってかなり長期性の免疫をもたらすので、好まれる。このような組換えウイルス生ワクチン製剤の製造は、細胞培養物またはニワトリ胚の尿膜でのウイルスの増殖とそれに続く精製を含む、従来の方法を用いて達成されうる。別法として、bPIVはヒトにおいて非病原性であることが実証されているので、このウイルスは生ワクチンとしての使用に非常に適している。これに関して、ワクチンのための遺伝子操作PIVベクターの使用には、これらの株での弱毒化特性の存在が要求されうる。トランスフェクションに用いられる鋳型内への適切な突然変異例えば、欠失の導入は、弱毒化特性を有する新規ウイルスを提供しうる。例えば、温度感受性または寒冷適応に関連する特異的なミスセンス突然変異を行って欠失突然変異としうる。これらの突然変異は、寒冷または温度感受性突然変異体に関連する点突然変異より安定であり、復帰頻度が非常に低いはずである。別法として、自殺特性を有するキメラウイルスが構築されうる。このようなウイルスは、宿主内でわずか1回または2~3回の複製しか行わない。ワクチンとして使用される場合、組換えウイルスは限定された複製サイクルを行い、十分なレベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主内では更には複製を行わず、疾患を引き起こさないだろう。1つ以上のPIV遺伝子を欠損している組換えウイルスまたは突然変異PIV遺伝子を有する組換えウイルスは、連続的な複製を行うことができないだろう。欠損ウイルスは、このような遺伝子を恒常的に発現する細胞株において産生され得る。必須遺伝子を欠損しているウイルスは、これらの細胞株において複製されるが、ヒト宿主に投与された場合、それらは一連の複製を完了することができないだろう。これらの調製物は、免疫応答を誘導するのに十分な数の遺伝子をこの不完全な周期において転写し、翻訳しうる。あるいは、これらの調製物が不活化された死滅したウイルスワクチンとして機能するように、大量の株が投与されうる。不活化ワクチンに関しては、遺伝子産物がビリオンに組み込まれるように、異種遺伝子産物はウイルスの構成要素として発現されることが好ましい。このような調製物の利点は、それらが天然のタンパク質を含み、死滅ウイルスワクチンの作製において使用されるホルマリンまたは他の薬剤での処理による不活化を受けていないことである。あるいは、cDNAから作製された突然変異PIVは、わずか2~3回しか複製しないように、高度に弱毒化されうる。特定の実施形態では、本発明のワクチンは弱毒化ウイルスを含む。理論にとらわれないが、弱毒化ウイルスが細胞に新しい感染性ウイルス粒子を生成させることができなかったとしても、ウイルスタンパク質が宿主の細胞膜に挿入され、免疫応答を活性化するので、弱毒化ウイルスはワクチンとして有効であり得る。本発明のこの態様の別の実施形態では、不活化ワクチン製剤は、キメラウイルスを死滅させるための従来の技術を用いて調製されうる。不活化ワクチンは、それらの感染性が破壊されているという意味において死滅している。理想的には、ウイルスの感染性はその免疫原性に影響を与えることなく破壊される。不活化ワクチンを調製するために、キメラウイルスは細胞培養物またはニワトリ胚の尿膜で培養され、ゾーン超遠心分離法によって精製され、ホルムアルデヒドまたはβプロピオラクトンによって不活化され、プールされうる。その結果生じるワクチンは通常、筋肉内に接種される。不活化ウイルスは、免疫応答を強化するために適切なアジュバントとともに処方されうる。このようなアジュバントは、例えば水酸化アルミニウムのような無機ゲルリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質ペプチド油性エマルジョンならびにBCG、Corynebacteriumparvum、ISCOMS、および人工ウイルス粒子などの潜在的に有用なヒトアジュバントを含みうるが、それらに限定されない。上述のワクチン製剤を導入するために多数の方法が使用され、これらは経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、鼻腔内および吸入経路を含むがそれらに限定されない。病原体ワクチンはこれに対して設計されるの天然の感染経路を介して、キメラウイルスワクチン製剤を導入することが好ましいと思われる。特定の実施形態では、本発明は、免疫原性組成物に関する。その免疫原性組成物はキメラPIVを含む。特定の実施形態では、その免疫原性組成物は弱毒化されたキメラPIVを含む。特定の実施形態では、その免疫原性組成物は更に製薬上許容されうる担体を含む。本発明のワクチンの有効性および安全性を評価するために、様々な技法が使用されうる。有効なワクチンとは、最小限の副作用で、適切な自然免疫応答、細胞性応答および体液性応答を引き起こすことによって、病原体による疾患からワクチン接種個体を防御するワクチンである。ワクチンは疾患を引き起こしてはならない。ウイルスの複製およびワクチンを接種された被験体の免疫応答を測定できる任意の技術は、ワクチンを評価するために使用されうる。例えば、チャレンジ試験および臨床試験が用いられるセクション554および555を参照されたい。非限定的な例はまた、下記の実施例セクションにも示される。561本発明のワクチンまたは免疫原性製剤の用量計画および投与本発明は、1つ以上の異種抗原配列または非天然抗原配列を発現するキメラPIVを含むワクチンおよび免疫原性製剤を提供する。本発明のワクチンおよび免疫原性製剤は、一価のワクチンまたは、二価および三価のワクチンを含む多価ワクチンを包含する。本発明のワクチンおよび免疫原性製剤は、様々なウイルス感染に対する防御を提供するのに有用である。特に、本発明のワクチンおよび免疫原性製剤は、宿主に呼吸器感染症に対する防御を提供する。本発明の組換えウイルスおよびまたはワクチンもしくは免疫原性製剤は、単独であるいは他のワクチンと組み合わせて投与することができる。好ましくは、本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、限定はされないが、呼吸器多核体ウイルスワクチン、インフルエンザワクチン、麻疹ワクチン、おたふく風邪ワクチン、風疹ワクチン、肺炎球菌ワクチン、リケッチアワクチン、ブドウ球菌ワクチン、百日咳ワクチンもしくは気道癌に対するワクチンなどの、気道疾患に対する防御を提供する他のワクチンまたは免疫原性製剤と組み合わせて投与される。好ましい実施形態では、本発明のウイルスおよびまたはワクチンは、対応する年齢で推奨されている小児用ワクチンとともに投与される。例えば、2、4もしくは6ヶ月齢では、本発明のウイルスおよびまたはワクチンは、DtaPIM、HibIM、ポリオIPVもしくはOPVおよびB型肝炎IMとともに投与される。12もしくは15ヶ月齢では、本発明のウイルスおよびまたはワクチンは、HibIM、ポリオIPVもしくはOPV、MMRII登録商標SubQVarivax登録商標SubQ、およびB型肝炎IMとともに投与される。本発明の方法とともに使用され得るワクチンは、例えば、TheJordanReport2000DivisionofMicrobiologyandInfectiousDiseasesNationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseasesNationalInstitutesofHealthUnitedStatesその内容は参照により本明細書に完全に組み入れられるのような様々な出版物に概説される。本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、それ自体または医薬組成物もしくは治療用組成物の形で被験体に投与されうる。アジュバントおよび本発明の免疫原性抗原例えば、ウイルス、キメラウイルス、突然変異ウイルスを含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠形成、粉末化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥方法によって製造されうる。医薬組成物は、従来の方法で、本発明の免疫原性抗原の製薬上使用され得る製剤への加工を容易にする、1つ以上の生理的に許容されうる担体、希釈剤、賦形剤または助剤を用いて処方されうる。適切な製剤化は、特に、選択された投与経路に依存する。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物がアジュバントを含む場合、あるいは1つ以上のアジュバントとともに投与される場合、使用され得るアジュバントは、無機塩アジュバントもしくは無機塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、微粒子状アジュバント、粘膜アジュバント、および免疫賦活アジュバントを含むがそれらに限定されない。アジュバントの例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、スクアレンまたはスクアラン水中油型アジュバント製剤、生分解性および生体適合性ポリエステル、重合リポソーム、トリテルペノイド配糖体またはサポニン例えば、商標STIMULONISCOPREPとしても販売される、QuilAおよびQS21、NアセチルムラミルLトレオニルDイソグルタミン商標TERMURTIDEとしても販売される、トレオニルMDP、LPS、モノホスホリルリピドA商標MPLとして販売される3DMLAを含むがそれらに限定されない。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物が投与される被験体は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトであるが、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよび齧歯類を含むヒト以外の動物であってもよい。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を導入するために、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、鼻腔内および吸入経路を含むがそれらに限定されず、ならびに乱刺法例えば、二股針を用いて皮膚の最上層に傷をつけることによる、多数の方法が使用されうる。局所投与のために、本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、当技術分野においてよく知られているような、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液等として処方されうる。鼻腔内投与あるいは吸入による投与のために、本発明に従って使用される製剤は、加圧容器または噴霧器から、適切な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適切なガスを用いて、エアゾールスプレーの形で有利に送達され得る。加圧エアゾールの場合には、投与単位は、計量用のバルブを備えることによって測定されうる。吸入剤または吸入器での使用のためには、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との混合粉末を含む、例えばゼラチンの、カプセルならびにカートリッジが処方されうる。注射のために、ワクチンまたは免疫原性製剤は、水溶液、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩水バッファーなどの生理的に適合したバッファー中に処方されうる。その溶液は、懸濁剤、安定剤およびまたは分散剤などの処方剤を含みうる。あるいは、そのタンパク質は、使用前に、例えば滅菌した発熱物質フリーの水のような適切なビヒクルで再調製される粉末状でありうる。投与のためのワクチンまたは免疫原性製剤の有効量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示を踏まえた場合、十分に当業者の能力の範囲内である。有効な用量は、最初はinvitroアッセイから評価される。例えば、用量は、動物モデルにおいて免疫応答の誘導を達成するように、当技術分野においてよく知られている技術を用いて、処方され得る。当業者は、本明細書に記載される結果に基づいて、すべての動物種に対して投与を容易に最適化することができるであろう。投与量および投与間隔は個々に調整されうる。例えば、免疫原性組成物として使用される場合、適切な用量は、上述のように投与される場合、抗体応答を誘導することができる組成物の量である。ワクチンとして使用される場合、本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、1~36週間の期間に約1~3回投与されうる。好ましくは、約2週間から約4ヶ月の間隔で、1または2回分が投与され、その後周期的に、追加ワクチン接種が与えられる。代わりの方法が、個々の動物に適しているかもしれない。適切な用量は、上述のように投与された場合、免疫された動物に、その動物を少なくとも4~12ヶ月間感染から防御するのに十分な免疫応答を引き起こすことができるワクチン製剤の量である。通常、1回分の用量中に存在する抗原の量は、約1pg~約100mgkgであり、一般的には約10pg~約1mgkg、好ましくは約100pg~約1μgkgである。適切な用量範囲は注入経路および患者の体重によって異なるが、一般的に約01mL~約5mLの範囲であろう。特定の実施形態では、本発明のウイルスおよびまたはワクチンは、少なくとも103TCID50、少なくとも104TCID50、少なくとも105TCID50、少なくとも106TCID50の開始1回量で投与される。別の特定の実施形態では、本発明のウイルスおよびまたはワクチンは、反復投与で投与される。好ましい実施形態では、2、4、および6ヶ月齢での初回投与ならびに2歳の初めでの追加投与が用いられる。より好ましくは、少なくとも105TCID50、または少なくとも106TCID50の各用量が、反復投与で与えられる。ウイルスの複製速度は、臨床試験におけるワクチンの投与量を調節するための指標として使用される。例えば、ウイルスの複製速度を検査するためのアッセイ例えば、増殖曲線など、利用可能なアッセイについてはセクション55を参照は、本発明のウイルスおよびまたはワクチンの複製速度を、以前の研究で証明されたClementsら、JClinMicrobiol29117582Karronら、JInfectDis171110714Karronら、PedInfDisJ5650654を参照bPIV3のそれと比較するために使用され得る。これらの研究は、ウシPIV3ワクチンが通常安全であり、成人、6~60ヶ月齢の子供、および2~6ヶ月齢の幼児を含む健康なヒトボランティアにおいて許容性良好であることを示した。これらの研究において、被験者は少なくとも1回の103TCID50~106TCID50のbPIV3ワクチンの投与を受けた。12人の子供は、有害な影響なく、1回投与の代わりに105TCID50のPIV3ワクチンの2回投与を受けた。bPIV3と同程度の複製速度は、臨床試験において同程度の投与量を使用しうることを示唆する。bPIV3と比較してより低い複製速度は、より高い投与量を使用できることを示唆する。562標的集団本発明の特定の実施形態では、本発明の治療方法および診断方法のための標的集団は、年齢によって規定される。本発明の特定の実施形態では、本発明の治療方法および診断方法のための標的集団は、呼吸器感染症に加えて疾患または障害によって特徴付けられる。特定の実施形態では、標的集団は2歳以下の幼児を含む。より特定的な実施形態では、その2歳以下の幼児は呼吸器感染症以外の疾患に罹患していない。他の実施形態では、標的集団は5歳以上の患者を含む。より特定的な実施形態では、その5歳以上の患者は、嚢胞性線維症、白血病、および非ホジキンリンパ腫、または最近受けた骨髄移植もしくは腎臓移植を含む、更なる疾患または障害を患ってる。本発明の特定の実施形態では、標的集団はhMPV感染が宿主の免疫抑制と関連している被験者を含む。特定の実施形態では、被験者は免疫無防備状態の個体である。特定の実施形態では、本発明の方法のための標的集団は高齢者を含む。特定の実施形態では、本発明の方法で治療されるべき被験者は、冬期にhMPVに感染したものである。以下の実施例は、本発明の例示となるが、それらに限定されない。実施例において使用される細胞およびウイルスは、以下のように維持する。すなわち、RSVA2株、ウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザ3型bhPIV3ウイルス、ヒトメタニューモウイルスNL100株hMPV、ウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザ3型ウイルスベクター化RSVウイルスbhPIV3RSVウイルス、およびウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザ型ベクター化ヒトメタニューモウイルスbhPIV3hMPVは、ゲンタマイシンの存在下にOptiMEMGibcoBRL中でVero細胞において増殖させた。ファージT7RNAポリメラーゼを発現する改変ワクシニアウイルスAnkaraMVAT7またはFowlpoxT7FPT7は、ニワトリ胚の腎臓細胞SPAFASで増殖させた。Vero、HeLaおよびHep2細胞は、10ウシ胎仔血清FCS、2mMLグルタミン、非必須アミノ酸、および抗生物質を補給したMEMJRHBiosciences中で維持した。6実施例1:キメラなウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3cDNAの構築およびクローニングbPIV3のFおよびHN遺伝子をhPIV3のそれらと置換するために、付加的な制限酵素部位を感染性のbPIV3cDNAに導入した。部位特異的突然変異誘発を用いて、固有のNheI部位をbPIV3cDNAのヌクレオチド位置5041に導入し、SalI部位をnt8529に導入した。改変した完全長bPIV3cDNAをNheIおよびSalI制限酵素で処理し、FおよびHN遺伝子を除くすべてのウイルスbPIV3配列を含む約14kbDNA断片をゲル精製によって単離した。hPIV3のFおよびHN遺伝子配列を得るために、10cmディッシュのコンフルエントなVero細胞にhPIV3株hPIV3Tex120841983を感染させた。37°Cで3日間の培養後、細胞を回収し、全RNAをRNASTATLS50TelTestIncを用いて単離した。hPIV3ゲノムの位置4828にアニーリングするhPIV3特異的オリゴを用いた逆転写によって、ウイルスcDNAを生成させた。hPIV3のFおよびHN遺伝子はTaqポリメラーゼを用いたPCRポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。PCR産物をpTATOPOクローニングベクターInvitrogenにクローニングし、2つのクローン11および14からhPIV3のFおよびHN遺伝子を配列決定した。配列解析により、クローン11については、F遺伝子は正確であるが、HN遺伝子は異常な配列を含み、クローン14については、HN遺伝子は正確であるが、F遺伝子は異常な終止コドンを含むことが明らかにされた。従って、以下の方法で11の正確なF遺伝子を14の正確なHN遺伝子と連結することによって、機能的なhPIV3のFおよびHN遺伝子を含むプラスミドを構築した。両方のhPIV3プラスミド11および14をNhelおよびEcoR1によって消化した。正確なF遺伝子を含む16kb断片をクローン11から単離し、正確なHN遺伝子を含む85kb断片およびプラスミド配列をクローン14から単離した。2つの断片をライゲーションし、完全なhPIV3FおよびHN遺伝子含有プラスミドを作製した。正確な配列をDNA配列解析によって確認した。最後に、6の法則を満たすために、非翻訳領域においてHN遺伝子の3末端に1ヌクレオチドを付加した。1ヌクレオチドの付加は、QuikChange突然変異誘発キットStratageneを用いることによって達成され、DNA配列決定によって確認された。その後、正確なhPIV3FおよびHN遺伝子のDNA断片をNhe1およびSal1での消化によって単離し、35kbDNA断片をゲル精製した。上述のbPIV3配列を含む145kbDNA断片とhPIV3FおよびHN遺伝子を含む35kbDNA断片をライゲーションすることによって、完全長bhPIV3キメラcDNAを構築した図3参照。広範な制限酵素マッピングによって完全長キメラプラスミドDNAを確認した。更に、キメラ構築物のMF遺伝子およびHNL遺伝子の連結部は、それぞれ、両方ともbPIV3およびhPIV3配列ならびにNhe1およびSal1制限酵素部位を含むことをDNA配列決定によって確認した。7実施例2:キメラなウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスFまたはGcDNAの構築およびクローニングbhPIV3ゲノムの位置1または2へのRSV抗原の挿入がウイルスの複製に及ぼす影響を調べるために、呼吸器多核体ウイルスRSVのF遺伝子およびG遺伝子を、キメラウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクターbhPIV3ベクターの異なる位置にクローニングした図4参照。ウシヒトbhPIV3cDNAに外来遺伝子を挿入するために、QuickChangeキットStratageneを用いた部位特異的突然変異誘発によって、bhPIV3cDNAプラスミドHallerら、20002001これは実施例6と同一の構築物であるにAvrII制限酵素部位を導入した。次のオリゴ5GAAATCCTAAGACCCTAGGCATGTTGAGTC3およびその相補体を用いて4個のヌクレオチドを変化させて、1つのAvrII部位をbhPIV3ゲノムのヌクレオチドnt104に導入した。この制限酵素部位を用いて、ウイルスゲノムの第一最も3側の位置にRSV遺伝子を挿入した。次のオリゴ5CCACAACTCAATCAACCTAGGATTCATGGAAGACAATG3およびその相補体を用いて2個のヌクレオチドを変化させて、もう1つのAvrII部位をnt1774のNP遺伝子間領域に導入した。この制限酵素部位を用いて、bhPIV3のN遺伝子とP遺伝子との間の第二の位置にRSV遺伝子を挿入した図4。nt104および1774にAvrII部位を含む完全長bhPIV3cDNAは、逆遺伝学によりウイルスを再生させることによって、機能性について検査した。RSVGカセットNP遺伝子終止開始の構築PCR鋳型としてbhPIV3cDNAを用いて、bPIV3NP遺伝子間領域ならびにRSVG遺伝子の3末端配列を含むDNA断片を作製した。この断片は以下のオリゴを用いたPCRによって生成された。すなわち、5CCCAACACACCACGCCAGTAGTCACAAAGAGATGACCACTATCAC3および5CCCAAGCTTCCTAGGTGAATCTTTGGTTGATTGAGTTGTGG3を用いた。その後、この断片を用いてオーバーラッピングPCRを実施し、bPIV3NP遺伝子間領域をRSVG遺伝子に付加した。第二PCR反応のために、RSVGおよびF遺伝子を含むプラスミドをDNA鋳型として用い、オリゴ5CAGCGGATCCTAGGGGAGAAAAGTGTCGAAGAAAAATGTCC3および上記の短いPCR断片から生じるオリゴをプライマーとして用いた。その結果生じる、bPIV3NP遺伝子間領域に連結されたRSVG遺伝子を含み、かつAvrII制限酵素部位により挟まれているPCR断片を、pGEM3にクローニングした。RSVG遺伝子を配列決定し、完全なオープンリーディングフレームの存在および推定されるアミノ酸配列を確認した。RSVG遺伝子を含むDNA断片を、AvrII制限酵素部位を用いて、AvrIIで直鎖状にしたbPIV315bPIV3ゲノムの最初の5200ヌクレオチドのみを有するサブクローンの第一位置または第二位置に挿入した。本明細書および他の実施例において用いられる場合、15bPIV3とは、ウシPIV3ゲノムのヌクレオチド1から5196または5200を指す。この位置にはBstBl部位が存在する。RSVFカセットNP遺伝子開始終止の構築RSVF遺伝子断片を、完全長bPIV3RSVFGcDNAプラスミドから、RSVF遺伝子の5末端および3末端にAvrII部位を付加したオリゴを用いたPCRによって単離し、bPIV3ゲノムの最初の5200ヌクレオチドを含みnt1774にAvrII部位を有する15bPIV3プラスミドAvrIIで直鎖状にしたに導入した。bPIV3NP遺伝子間領域を、鋳型として15bPIV3RSVG2を用いたPCRによって単離した。オリゴ5GACGCGTCGACCACAAAGAGATGACCACTATCACC3およびbPIV3Fオープンリーディングフレームにアニーリングするオリゴを用いて、bPIV3NP遺伝子間領域、AvrII部位、およびnt5200までのbPIV3配列を含むPCR断片を作製した。PCR断片をSalIおよびNheIによって消化し、SalIおよびNheIで消化された位置2にRSVF遺伝子を含む15bPIV3プラスミドに付加した。NP遺伝子間領域を含むRSVF遺伝子を位置1に導入するために、18kbRSVFカセットをAvrIIにより切り出し、AvrIIで直鎖状にした、nt104にAvrII部位を含む15bPIV3にライゲーションした。短い遺伝子間領域を有するRSVFカセットN終止N開始の構築短いNN遺伝子間領域を有するRSVF遺伝子の作製は、鋳型として15bPIV3RSVF2を用い、オリゴ5GCGCGTCGACCAAGTAAGAAAAACTTAGGATTAAAGAACCCTAGGACTGTA3およびAvrII制限酵素部位を含むRSVF遺伝子の5末端の上流にアニーリングするオリゴを用いたPCR反応を行うことによって達成された。RSVF遺伝子および短いNN遺伝子間領域を含むPCR産物をAvrIIによって消化し、AvrIIで直鎖状にした15bPIV3のnt104に導入した。RSVGおよびRSVF遺伝子カセットを配列決定し、完全なオープンリーディングフレームの存在、推定上のアミノ酸配列を確認し、6の法則を検証した。RSVGおよびRSVFの転写単位を、AvrII制限酵素部位を用いて、AvrIIで直鎖状にしたサブクローン15bPIV3の第一位置または第二位置に挿入した。制限酵素マッピングにより適切な方向性を確認した後、RSV遺伝子を第一位置に含むプラスミドをSphIおよびBssHIIによって消化し、4kb15bPIV3RSVG1または48kb15bPIV3RSVF1DNA断片を単離した。クローニングの第2段階では、残りのbhPIV3ゲノムをSphIBssHII151kbDNA断片として付加し、完全長cDNAを作製した。RSV遺伝子を第二位置に含むbPIV3サブクローンをSphIおよびNheIで切断し、58kbbPIV3RSVG2および65kbbPIV3RSVF2DNA断片を単離した。クローニングの第2段階では、残りのbhPIV3ゲノムを14kbのサイズのNheISphIDNA断片としてライゲーションした。完全長のキメラbhPIV3RSVプラスミドを、高収量の完全長ウイルスcDNAプラスミドをもたらすSTBL2細胞GibcoBRLにおいて増殖させた。8実施例3:ウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスFまたはGは、mRNA産生およびタンパク質発現ならびにinvitroでのウイルス複製に関して位置効果を示した3つの実験を行い、実施例2の構築物におけるRSVFまたはG遺伝子の効果的な発現を確認し、PIV3ゲノムにおける遺伝子挿入の位置効果を測定した。最初に、キメラウイルスによるRSVタンパク質発現を証明するために、キメラウイルス感染細胞溶解液のウェスタンブロットを行い、RSV特異的抗血清を用いてプローブした図5A参照。以下のようにウェスタンブロットを行った。すなわち、キメラウイルスを用いて、サブコンフルエント70~80のVero細胞に01MOIまたは10MOIで感染させた。感染48時間後、培地オーバーレイを除去し、感染した単層を1mlのPBSで一度洗浄した。その後、細胞を005βメルカプトエタノールSigmaを含む400μlのLaemmliバッファーBioRad中で溶解した。15μ1の各サンプルを12TrisHClReadyGelBioRadで分離し、半乾式転写装置BioRadを用いてナイロンメンブレンに転写した。ナイロンメンブレンを05vvTween20Sigmaを含むPBSpH76PBSTで洗浄し、5wv粉乳を含むPBSTPBSTMで20~30分間室温でブロッキングした。メンブレンを、PBSTMで11000希釈したRSVFモノクローナル抗体の混合物WHO1269、1200、1153、1112、1243、1107、参照により本明細書に組み込まれるBeelerおよびCoelinghJVirol63294150を参照または、PBSTMで12000希釈したRSVG10181ポリクローナル抗体Orbigenのいずれかとともに室温で1時間インキュベートした。PBSTで4回洗浄した後、メンブレンをPBSTMで12000希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次ヤギ抗マウス抗体Dakoとともに室温で1時間インキュベートした。メンブレンをPBSTで4回洗浄し、化学発光基質AmershamPharmaciaを用いて発光させ、タンパク質バンドの可視化のためにBiomaxLightFilmKodakに感光させた。Vero細胞でのbhRSVF1NNの複製効率の減少と一致して図5C、下記参照、感染後48時間に検出されるRSVF1の量はbhPIV3RSVF2または野生型RSVA2感染細胞に存在するそれより約10倍少なかった図5Aのレーン2、3および4を比較されたい。RSVF1断片に相当する約50kDaバンドは、野生型RSVと同様にbhPIV3RSVF1およびbhPIV3RSVF2に感染した細胞において検出された。bhPIV3RSVF1は、感染後hpi48時間では、bhPIV3RSVF2で観察されるものと同様のRSVF1タンパク質レベルを発現した。ほんの低レベルのF0がbhPIV3RSVF1およびbhPIV3RSVF2に感染した細胞で検出され、野生型RSV感染においても観察されるようにF0前駆体は感染の間に効果的にプロセッシングされることを示した。予想されるように、bhPIV3感染細胞およびmockウイルスなし感染細胞の溶解液は、RSVFタンパク質のシグナルを生じなかった。約26kDaのより小さいバンドが、bhPIV3RSVF1およびF2溶解液において観察され、野生型RSV溶解液には存在しなかった。このバンドは、野生型RSV感染細胞では産生されないRSVFタンパク質のタンパク質分解性断片を意味する。RSV感染細胞においてタンパク質分解性断片が存在しないのは、完全なセットのRSVタンパク質が存在するためかもしれない。より高い10MOIでbhPIV3RSVF1NN感染をくり返した場合図5A、レーン1、bhPIV3RSVF1感染細胞中のF1断片は感染後48時間で野生型RSVレベルにまで蓄積した。bhPIV3RSVF1またはbhPIV3RSVF2感染細胞での50kDaおよび26kDaF1断片の相対量は、約15であった。01MOIで48時間感染後のbhPIV3RSVG1、bhPIV3RSVG2および野生型RSV感染細胞におけるRSVGの相対発現は図5Aに示される。それぞれ、約50kDaおよび90kDaで移動するRSVGの未成熟型およびグリコシル化型の両方が検出された。bhPIV3RSVG1感染細胞は野生型RSV感染細胞において見られるものと同様のRSVG発現のレベルを示した図5A、レーン1および3。しかし、bhPIV3RSVG2感染細胞では、RSVGの蓄積は、野生型RSV感染細胞に存在するものより約2~3倍多かった図5A、レーン2および3。より高レベルのRSVG発現は、RSVゲノムでのその位置と比較して、PIV3ゲノムではRSVG遺伝子がより3末端に近接した位置にあるためかもしれない。より高いレベルの発現は、位置1でのRSVGについては観察されず、それは減衰したウイルス複製表現型のためかもしれない。RSVG特異的バンドはbhPIV3感染細胞またはmock感染細胞に由来する細胞溶解液では観察されなかった。総合的に、これらのデータは、キメラbhPIV3RSVがRSVタンパク質を位置1または2のいずれかにおいて効果的に発現することを示した。位置2はわずかに高いレベルのRSVGタンパク質を発現すると思われるが、位置1または2のいずれが用いられたかに関わらず、bhPIV3による同等のRSVタンパク質の発現レベルが観察された。PIV3ゲノムの位置1または位置2での抗原発現レベルは同様であったので、いずれの位置も遺伝子挿入に使用され得る。次に、ノーザンブロット分析は、mRNA転写がウェスタンブロットによって証明されたタンパク質発現の結果と相関することを示した図5B参照。以下のようにノーザンブロットを行った。すなわち、全細胞RNAをウイルス感染細胞からTrizolLSLifeTechonologiesを用いて調製した。RNAを1回のフェノールクロロホルム抽出によって更に精製し、エタノールで沈澱させた。RNAペレットをピロ炭酸ジエチルで処理した水に再懸濁し、80°Cで保存した。等量の全RNAを、1ホルムアルデヒドを含む1アガロースゲルで分離し、Turboblotter装置SchleicherSchuellを用いてナイロンメンブレンAmershamPharmaciaBiotechに転写した。DIGRNA標識化キットRocheMolecularBiochemicalsを用いたinvitro転写によって合成されたジゴキシゲニンUTP標識リボプローブによって、ブロットをハイブリダイズした。ExpressHyb溶液Clontech中で12時間68°Cで、ハイブリダイゼーションを行った。ブロットを2XSSC1XSSCは0015Mクエン酸ナトリウムを含む0015MNaClを含有する01ドデシル硫酸ナトリウムSDSによって68°Cで2回洗浄し、続いて05XSSC01SDSによって1回洗浄し、最後に01XSSC01SDSによって洗浄した。ハイブリダイズしたプローブからのシグナルを、DIGルミネッセント検出キットRocheMolecularBiochemicalsを用いて検出し、BioMaxMLフィルムKodakに感光させることによって可視化した。bhPIC3RSVF1NN、bhPIV3RSVF2、bhPIV3RSVG1およびbhPIV3RSVG2のノーザン分析は、RSVFまたはRSVGについてのウイルスmRNAレベルが観察されたRSVタンパク質レベルとよく相関することを示した図5B。最も低いレベルのRSVFmRNAはbhPIV3RSVF1NNで観察され、それはまた最も少量のRSVFタンパク質産生を示した。bhPIV3RSVG1はより少ないRSVGmRNAを産生し、その結果bhPIV3RSVG2で観察されたものよりも低いRSVGタンパク質レベルを生じた。最後に、位置1または位置2のいずれかにRSVFまたはG遺伝子を有する様々なウイルスの増殖は、タンパク質発現およびRNA転写の結果と相関した。図5Cに示した増殖曲線は以下のように得られた。すなわち、Vero細胞を90コンフルエントまで増殖させ、001または01MOIのbhPIV3、bhPIV3RSVF1、bhPIV3RSVG1、bhPIV3RSVF2、およびbhPIV3RSVG2に感染させた。感染した単層を37°Cで培養した。感染0、24、48、72、96および120時間後、細胞および培地をともに回収し、70°Cで保存した。それぞれの回収時点でのウイルス力価をVero細胞でのTCID50アッセイまたはプラークアッセイによって測定した。TCID50アッセイでは、37°Cで6日間培養した後のCPEについて視覚的に検査し、一方、プラークアッセイでは、定量のために培養5日後にRSVポリクローナル抗血清を用いて免疫染色した。Vero細胞において001MOIでは、第一位置にRSVGまたはF遺伝子を含むキメラウイルスbhPIV3RSVG1およびbhPIV3RSVF1NNは、RSV遺伝子を第二位置に含むウイルスより遅い速度で複製し、より低いピーク力価をもたらし、より大きな遅滞期を示した。感染後96時間でのbhPIV3RSVF1NNならびにbhPIV3RSVG1のピーク力価は、それぞれ1067および1055TCID50mlであった図5C。一方、bhPIV3RSVF2ならびにbhPIV3RSVG2のピーク力価は、感染後72時間および96時間でそれぞれ1080および1074であった図5C。bhPIV3対照ウイルスは、それぞれ1080TCID50mlのピーク力価を示した図5C。bhPIV3RSVF2はbhPIV3RSVF1NNより13log10高い力価をもたらした。bhPIV3RSVG2はbhPIV3RSVG1より19log10高い力価で複製した。総合的に、データは、ゲノム位置1または2でRSVタンパク質を発現するbhPIV3がVero細胞において106~108PFUmlのピーク力価で複製することを示した。位置2に抗原挿入を含むウイルスは、組織培養において位置1に外来遺伝子を含むものよりも効率的に複製した。bhPIV3RSVF1NNおよびbhPIV3RSVG1のより高い力価がそもそも達成されるのかどうかを決定するために、より高い01MOIで増殖曲線をくり返した。01MOIでは、bhPIV3RSVF1NNおよびbhPIV3RSVG1のピーク力価は05~13log10ほど増加したデータは示さない。これらのウイルスの遅滞期は減少し、ピーク力価は増殖サイクルの間により早く達成された。9実施例4:ウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ゲノムへのeGFP挿入がウイルス複製に及ぼす位置効果ウシヒトPIV3ベクター骨格への遺伝子挿入の影響は、eGFP遺伝子を順次PIV3のすべての遺伝子間に導入し、ウイルス複製およびeGFP発現への影響を観察することによって体系的に評価された図6。この種のアッセイは、特定の比率のウイルスmRNAを生じるパラミクソウイルスで観察される転写勾配の重要性を研究する。外来遺伝子の挿入は、これらの比率を撹乱し、異なる量のウイルスタンパク質の合成を引き起こし、ウイルス複製に影響を及ぼすかもしれない。eGFP遺伝子は、ビリオン膜に組み込まれず、従ってパッケージング、出芽、侵入などのウイルス過程を妨害しないと思われるので、このアッセイのために選択された。eGFP遺伝子をbhPIV3ゲノムの4つの位置に挿入し、それらのうち3つについてeGFP発現およびウイルス複製を分析した。eGFP遺伝子カセットをbPIV3NP遺伝子間領域に連結した。bhGFP1はeGFP遺伝子カセットをbhPIV3ゲノムの最も3末端に近接した位置に含有した。bhPIV3GFP2はeGFP遺伝子カセットをbhPIV3ゲノムのN遺伝子とP遺伝子との間に含有した。bhPIV3GFP3はPとMとの間に配置され、bhPIV3GFP4はeGFP遺伝子をbhPIV3のMとFとの間に保持した図6。eGFP遺伝子カセットの構築eGFP遺伝子の鋳型は市販されており、例えば、BDBiosciencespIRES2EGFPまたはClontechpEGFPN1から購入できるHoffmannら、Virology267310317を参照されたい。eGFP遺伝子をPCRによって単離し、bPIV3NP遺伝子間領域を以下のオリゴ、すなわち、5ATTCCTAGGATGGTGAGCAAGGGCG3、5GGACGAGCTGTACAAGTAAAAAAATAGCACCTAATCATG3、および5CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3を用いて、オーバーラッピングPCR法を利用して付加した。eGFPカセットをpCR21に挿入し、配列決定し、6の法則の順守を確認した。その後、eGFPカセットをAvrIIによって消化し、ゲル精製し、下記に記載されるようにbhPIV3の位置1、2、3、および4に挿入した。位置1および2にeGFP遺伝子を含む完全長cDNAの作製eGFP遺伝子カセットを、nts15200までのbPIV3配列を含み、nt104位置1またはnt1774位置2のいずれかにAvrII制限酵素部位を含む15bPIV3プラスミドに挿入した。制限酵素マッピングによる適切な方向性の確認後、第一位置にeGFP遺伝子を含むプラスミドをSphIおよびBssHIIによって消化し、4kbの15eGFPDNA断片を単離した。次に、残りのbhPIV3ゲノムをSphIBssHII151kbDNA断片として付加し、完全長cDNAを作製した。位置2にeGFPを含む完全長cDNAの作製については、第二位置にeGFP遺伝子を含むbPIV3サブクローンをSphIおよびNheIによって切断し、58kbの15eGFP2DNA断片を単離した。次に、残りのbhPIV3ゲノムを14kbのサイズのNheISphIDNA断片として付加した。完全長キメラbhPIV3eGFPプラスミドを、高収量の完全長ウイルスcDNAプラスミドをもたらすSTBL2細胞GibcoBRLで増殖させた。位置3および4にeGFP遺伝子を含む完全長cDNAの作製eGFPカセットをbhPIV3ゲノムの位置3に挿入するために、AvrII制限酵素部位をbPIV3のnts15200を含むサブクローンのPM遺伝子間領域中のnt3730に導入し、2つのヌクレオチドを変化させた。次のオリゴ、すなわち、5GGACTAATCAATCCTAGGAAACAATGAGCATCACC3およびその相補体を、AvrII部位を導入するためのQuickChangePCR反応に使用した。eGFPカセットをAvrIIによって消化し、nt3730にAvrII部位を含むAvrIIで直鎖状にした15bPIV3サブクローンにライゲーションした。SphIからNhelまでの55kbDNA断片をGFP含有サブクローンから単離し、SphIおよびNheIによって消化したbhPIV3cDNAに導入して、完全長プラスミドを作製した。eGFP遺伝子カセットをbhPIV3ゲノムの位置4に付加するために、nts18500のbhPIV3配列を含むサブクローンを作製した。このサブクローンをNheInt5042で直鎖状にし、適合性のあるAvrII末端を含むeGFPカセットを挿入した。その後、eGFPカセットを含むサブクローンをSphIおよびXhoIによって消化し、71kbDNA断片を単離した。bhPIV3プラスミドをSphIおよびXhoIで処理し、11kb断片を生成した。これら二つのDNA断片をライゲーションし、bhPIV3GFP4を作製した。bhPIV3GFP1、2および3によって産生されたeGFP量を、2つの方法で評価した。第一に、bhPIV3GFP1、2、および3を用いて01および001MOIで20時間感染させたVero細胞において生じた緑色細胞の量を、蛍光顕微鏡を用いて測定した図7A。bhPIV3GFP3はbhPIV3GFP1または2より著しく少ない緑色細胞を生じた。第二に、感染細胞についてウェスタン分析を行い、ブロットをGFPMAbならびにPIV3PAbを用いてプローブした。bhPIV3GFP3は著しく少ないeGFPタンパク質を産生するという初めの観察が確認された図7B。bhPIV3GFP1およびGFP2は同様の量のeGFPタンパク質を産生した。ウエスタンブロット法は、PIV3抗体を用いてプローブすることによって、同量の装填について調整した図7B。興味深いことに、3つのウイルスはすべて、同様の量のPIV3タンパク質HNタンパク質は最も顕著なバンドであるの産生を示した。これらの結果は、bhPIV3GFP3が、位置3において位置1および2と比較してより少ないGFPmRNAを転写することを示唆した。このデータは、パラミクソウイルスにおけるウイルスmRNAの転写勾配の存在を支持した。PIV3HNタンパク質の産生レベルは、eGFP遺伝子挿入による影響を受けなかった。GFP遺伝子挿入がbhPIV3GFP1、2、および3のウイルス複製の動態に影響を及ぼすかどうかを決定するために、Vero細胞において複数回の増殖曲線を実施した図7C。増殖曲線は、bhPIV3GFP1が、感染後24時間および48時間でbhPIV3GFP2またはGFP3よりウイルス複製の開始の遅れを有することを示した。しかし、得られた最終的なピーク力価は3つのウイルスすべてについて同様であった。bhPIV3GFP2およびGFP3についての複製の動態はほぼ同一であった図7C。興味深いことに、ウイルスmRNAの比率の変化は、ウイルス複製に有意には影響を与えないように思われた。10実施例5:異なる遺伝子間領域を有する、キメラウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスFの構築およびクローニング遺伝子間領域各mRNA間のヌクレオチド、例えば、F遺伝子とN遺伝子との間のヌクレオチドがタンパク質発現およびウイルス複製に及ぼす影響を調べるために、3つの異なる構築物を使用した図8を参照されたい。第一の構築物は、位置1でのbhPIV3ベクター化RSVF1NNであり、より短いbPIVN遺伝子終止N遺伝子開始配列を持ち図4におけるRSVF1NN、第二の構築物は、位置1でのbhPIV3ベクター化RSVFであり図4におけるRSVF2、最後の構築物は、位置1でのbhPIV3ベクター化RSVであった図4におけるRSVF1。3つの構築物はすべて、セクション7の実施例2に記載されたクローニング戦略に従って作製された。2つのカセット間の最も劇的な差異は、わずか10ntsの長さであるbhPIV3RSVF1NN中のN遺伝子開始配列とN翻訳開始コドンとの間の距離である。対照的に、この距離はbhPIV3RSVF2においては86ntsの長さである。その他の差異は、bhPIV3RSVF2において用いられるようなP遺伝子開始配列よりむしろbhPIV3RSVF1NNにおけるN遺伝子開始配列の使用である。ウイルス転写単位の遺伝子転写開始と翻訳開始との間の距離がウイルス複製に影響を及ぼすかどうかを決定するために、bhPIV3RSVF2のために使用されるものと同一のRSVF遺伝子カセットを含むbhPIV3RSVF1構築物を作製した。11実施例6:呼吸器多核体ウイルス遺伝子の下流の遺伝子間領域の長さおよびまたは性質は、ウイルス複製に影響を及ぼすウイルスタンパク質発現およびウイルス複製に対する遺伝子間領域の影響を決定するために、実施例5の3つの構築物を以下の実験において使用した図9を参照されたい。最初に、bhPIV3RSVF1、bhPIV3RSVF1NN、およびbhPIV3RSVF2でのRSVFタンパク質発現を、Vero細胞における01MOIでの感染後24時間および48時間でウェスタンブロットを用いて比較した。ウェスタンブロットを以下のように行った。すなわち、キメラウイルスを用いて、70~80サブコンフルエントのVero細胞に01MOIで感染させた。感染24時間および48時間後に、培地オーバーレイを除去し、感染した単層を1mlのPBSで一度洗浄した。その後、細胞を005βメルカプトエタノールSigmaを含む400mlのLaemmliバッファーBioRad中で溶解した。15m1の各サンプルを12TrisHClReadyGelBioRadで分離し、半乾式転写装置BioRadを用いてナイロンメンブレンに転写した。ナイロンメンブレンを05vvTween20Sigmaを含むPBSpH76PBSTで洗浄し、5wv粉乳を含むPBSTPBSTMで20~30分間室温でブロッキングした。メンブレンを、PBSTMで11000希釈したRSVFモノクローナル抗体の混合物WHO1269、1200、1153、1112、1243、1107とともに室温で1時間インキュベートした。PBSTで4回洗浄した後、メンブレンをPBSTMで12000希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次ヤギ抗マウス抗体Dakoとともに室温で1時間インキュベートした。メンブレンをPBSTで4回洗浄し、化学発光基質AmershamPharmaciaを用いて発光させ、タンパク質バンドの可視化のためにBiomaxLightFilmKodakに感光させた。bhPIV3RSVF1は、感染24時間および48時間後、bhPIV3RSVF2で観察されるレベルに近いが、bhPIV3RSVF1NNのそれよりずっと高いRSVF1タンパク質レベルを発現した。従って、遺伝子の開始エレメントと翻訳開始コドンとの間の間隔は、ウイルス複製にとって重要でありうる。N遺伝子開始配列をP遺伝子開始配列に変化させたが、この変化はたった1つのヌクレオチドの変更を受けただけであった。これらの要因のいずれかが、RSVFタンパク質の発現表現型のレスキューに関与しうる。次に、Vero細胞において01MOIでのbhPIV3RSVF1、bhPIV3RSVF1NN、およびbhPIV3RSVF2のウイルス複製の動態を比較するために、複数回の増殖曲線を実施した図9Bが、それは以下のように行われた。すなわち、Vero細胞を90コンフルエントまで増殖させ、01MOIのbhPIV3、bhPIV3RSVF1NN、bhPIV3RSVF1、およびbhPIV3RSVF2に感染させた。感染した単層を37°Cで培養した。感染0、24、48、72、および96時間後、細胞および培地をともに回収し、70°Cで保存した。それぞれの回収時点でのウイルス力価をVero細胞でのプラークアッセイによって測定した。プラークアッセイでは、定量のために培養5日後にRSVポリクローナル抗血清を用いて免疫染色した。図9Bに示されるように、bhPIV3RSVF1NNの複製の開始は遅延し、ピーク力価はbhPIV3RSVF2のそれらより低かった。一方、bhPIV3RSVF1はbhPIV3RSVF2で観察されたものとほぼ同一の増殖曲線を示した。12実施例7:三価のウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクター化構築物のクローニング以下の実施例は、単一の弱毒化ウイルス生ワクチンを用いて、子供をRSV、hMPVおよびhPIV3に起因する疾患から防御するための、hPIV3の表面糖タンパク質FおよびHN、RSVF、ならびにhMPVFを含む三価のワクチンの作製に関する。これらの三価のウイルスは逆遺伝学によって再生される。それぞれが2つの付加的な異種配列挿入を有するキメラbhPIV3骨格を含み、1つの異種ヌクレオチド配列はメタニューモウイルスF遺伝子に由来し、もう1つの異種ヌクレオチド配列は呼吸器多核体ウイルスF遺伝子に由来する、2つのウイルスゲノムの構築を以下のように行った図10参照。すなわち、プラスミドbhPIV3RSVF2またはbhPIV3hMPVF2をSphIおよびNheIによって消化し、65kb断片を単離した。bhPIV3RSVF1またはbhPIV3hMPVF1に対する完全長cDNAをSphIおよびNheIによって消化し、148kbDNA断片を単離して、完全長ウイルスcDNAを作製するためにプラスミドbhPIV3RSVF2またはbhPIV3hMPVF2由来の65kbDNA断片にライゲーションした。上述の構築物すなわち、位置1にFRSVを、位置3にFhMPVを有するもの、および位置1にFhMPVを、位置3にFRSVを有するものから作製したウイルスを、Vero細胞において複製し、パッケージングした。レスキューされたウイルス、好ましくは本明細書に記載される第一の構築物を含むウイルスは、パラインフルエンザウイルス感染、メタニューモウイルス感染、および呼吸器多核体ウイルス感染に対する三価のワクチンとして使用され得る。13実施例8:ウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクターへの2つの呼吸器多核体ウイルスFのクローニングキメラウイルスによって産生されるより多くのRSVタンパク質が免疫原性の改善をもたらすかどうかを決定するために、2コピーのRSVF遺伝子を有するキメラウイルスを設計した。このウイルスを逆遺伝学によってレスキューし、生物学的にクローニングし、Vero細胞において増幅して、1x106pfumlの力価を有するウイルスストックを生じた。このウイルス、bhPIV3RSVF1F2は、ウイルスの増殖動態、RSVFタンパク質の産生、ならびに、ハムスターにおける複製および免疫原性について評価するために使用され得る。以下の方法で構築物を作製した図11参照。すなわち、15RSVF2プラスミドをSphIおよびNheIによって消化し、65kb断片を単離した。bhPIV3RSVF1の完全長cDNAをSphIおよびNheIによって消化し、148kbDNA断片を単離して、完全長ウイルスcDNAを作製するために15bPIV3RSVF2由来の65kbDNA断片にライゲーションした。14実施例9:ウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクター化ヒトメタニューモウイルスFcDNAの構築およびクローニングヒトメタニューモウイルスhMPVのF遺伝子をbhPIV3ゲノムの位置1および2に挿入した図12。hMPVF遺伝子カセットはbPIV3NP遺伝子間領域を含有した。hMPVF遺伝子NL100を含むプラスミドpRF515を使用し、hMPVF遺伝子における単一のヌクレオチド突然変異を修正してすなわち、ヌクレオチド3352をCからT野生型に修正して、pRF515M4を作製した。オーバーラッピングPCRを用いて、bPIV3NP遺伝子間領域をhMPVF遺伝子の3末端に付加した。hMPVFのための、オーバーラッピングPCRオリゴは5GGCTTCATACCACATAATTAGAAAAATAGCACCTAATCATGTTCTTACAATGGTCGACC3であった。このクローニングステップの際、AvrII制限酵素部位を含むオリゴを、hMPVF遺伝子カセットの5末端5GCAGCCTAGGCCGCAATAACAATGTCTTGGAAAGTGGTGATC3および3末端5CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3でPCR反応に用いた。6の法則に合わせるため、QuickChange突然変異誘発キットおよび以下のオリゴ5CCTAGGCCGCAATAGACAATGTCTTGG3、5CCAAGACATTGTCTATTGCGGCCTAGG3を用いて、hMPVF遺伝子カセットを調整した。完全長bhPIV3hMPVF1位置1およびF2位置2cDNAプラスミドを、上述のセクション9、実施例4でbhPIV3eGFP1およびeGFP2について記載したものと同様の方法で作製した。hMPVF遺伝子カセットを配列決定し、完全なオープンリーディングフレーム、推定アミノ酸配列の存在を確認し、6の法則を確認した。hMPVF転写単位を、AvrII制限酵素部位を用いて、AvrIIで直鎖状にしたサブクローン15bPIV3の第一位置または第二位置に挿入した。制限酵素マッピングにより適切な方向性を確認した後、hMPV遺伝子を第一位置に含むプラスミドをSphIおよびBssHIIによって消化し、48kb15hMPVF1DNA断片を単離した。残りのbhPIV3ゲノムをSphIBssHII151kbDNA断片としてライゲーションし、完全長cDNAを作製した。第二位置にhMPV遺伝子を含むbPIV3サブクローンをSphIおよびNheIによって切断し、65kbbPIV3hMPVF2DNA断片を単離した。残りのbhPIV3ゲノムを14kbのサイズのNheISphIDNA断片としてライゲーションし、完全長cDNAプラスミドを作製した。15実施例10:ウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクター化ヒトメタニューモウイルスFの免疫沈降および複製アッセイ位置2でのbhPIV3ベクター化ヒトメタニューモウイルスFhMPVF2においてFタンパク質が発現することを確認するために、モルモットまたはヒト抗血清を用いて、hMPVFタンパク質を免疫沈降した図13A参照。bhPIV3hMPVによって発現されるhMPVFタンパク質の免疫沈降のために、Vero細胞を01もしくは005MOIでbhPIV3あるいはbhPIV3hMPVF1またはF2に感染させた。感染24時間後、システインおよびメチオニンを含まないDMEICNで細胞を1回洗浄し、同培地で30分間培養した。培地を除去し、100μCiの35SProMixAmershamを含むシステインおよびメチオニンを含まない05mlのDMEを細胞に添加した。感染細胞を35Sアイソトープの存在下で5時間37°Cにて培養した。培地を除去し、プロテアーゼ阻害剤を含む03MRIPAバッファーに感染細胞を溶解した。細胞溶解液をhMPVに対するモルモットまたはヒトポリクローナル抗血清とともにインキュベートし、IgGアガロースSigmaに結合させた。05MRIPAバッファーで3回洗浄した後、サンプルを10タンパク質ゲルで分画した。ゲルを乾燥させ、X線フィルムに感光させた。bhPIV3hMPVF1およびF2によるhMPVFタンパク質の発現は、モルモットhMPV抗血清を用いた免疫沈降によって示された図13A。興味深いことに、約80kDaに移動した特異的バンドが、bhPIV3hMPVF1およびF2の溶解液において観察された。このサイズはF前駆体タンパク質F0に相当した。異なるサイズの非特異的バンドはまた、bhPIV3およびmockウイルスなし対照レーンにおいても観察された図13。このデータは、bhPIV3hMPVF1およびF2がhMPVFタンパク質を発現することを示唆した。F0前駆体のF1切断産物は観察されなかった。Fタンパク質切断部位の解析は、hMPVFタンパク質切断部位が非荷電アミノ酸残基RQSRFVLから成るのに対して、RSVまたはAPVAのような関連ウイルスはFタンパク質プロセシング部位、それぞれRKRRFLGおよびRRRRFVLに荷電アミノ酸を持つことを示した。切断部位に荷電アミノ酸を有するFタンパク質は効果的にFタンパク質をプロセシングすることができ、有害な表現型を示すことがインフルエンザウイルスから知られているHattaら、Science293184022001。F1およびF2断片は適用した方法では検出不可能な低いレベルでしか存在しないと思われるため、hMPVFタンパク質の弱い切断部位がF0タンパク質のみを検出した原因でありうる。非効率的なFタンパク質切断は組織培養におけるhMPV複製の遅い増殖を引き起こす過程の1つであり、いくつかのhMPV株のトリプシン要求性を説明しうるvandenHoogen2001。しかし、利用可能なhMPV抗体試薬は限定され、これらの抗血清はhMPVFタンパク質の前駆体にのみ相互作用する。また、切断されたF1が不安定であり、そのためにこの方法によって容易には可視化されないという可能性もある。増殖曲線を実施し、bhPIV3hMPVF2のウイルス複製の動態を測定して、それらをVero細胞における01MOIのbhPIV3およびbhPIV3RSVF2で観察されたものと比較した図13B。データは、bhPIV3hMPVF2がbhPIV3RSVF2と比較して感染24時間後に複製開始の遅れを呈することを示した。しかし、感染後48時間以降では、複製における差異はもはや観察されなかった。また、増殖曲線を実施し、bhPIV3hMPVF1のウイルス複製の動態を測定して、それらをVero細胞における001MOIのbhPIV3hMPVF2およびbhPIV3で観察されたものと比較した図13C。セクション8においてbhPIV3RSVキメラウイルスについて記載されたのと同様の方法を用いて、増殖曲線を得た。データは、bhPIVhMPVF1が複製開始の遅れを有し、bhPIV3hMPVF2またはbhPIV3と比較してより低いピーク力価を生じることを示した。bhhMPVF1のプラークの大きさもまた、bhhMPVF2と比較してより小さい。bhPIV3ゲノムの位置2にhMPVF遺伝子を含むキメラウイルスは、bhPIV3で観察されるレベルまで複製した。感染96時間後のbhPIVhMPVF2で観察されるピーク力価は、81log10PFGmlであった。対照的に、位置1からhMPVFタンパク質を発現するPIV3はウイルス複製開始の遅れを示し、ピーク力価は感染96時間後bhPIV3hMPVF2と比較して18log10まで減少した。わずか63log10PFUmlの力価しか、bhPIV3hMPVF1に感染したVero細胞からは得られなかった。bhPIV3hMPVF1によって示されたウイルス複製の欠陥は、bhPIV3RSVG1またはbhPIV3RSVF1のそれより重度であり、挿入物の性質はウイルス複製に影響を及ぼしうることを示唆した。総合的に、データは、ゲノム位置1または位置2においてhMPVタンパク質を発現するbhPIV3がVero細胞において106~108PFUmlのピーク力価で複製することを示した。位置2に抗原の挿入を含むウイルスは、組織培養において位置1に外来遺伝子を含むものより効果的に複製した。また、キメラウイルス、bhPIV3hMPVF1およびF2を、SyrianGoldenハムスターにおけるそれらの感染および複製能力について評価した表5。そのために、キメラウイルス、bhPIV3hMPVF1およびF2を用いて、SyrianGoldenハムスターの鼻腔内に感染させ、気道でのそれらの複製能力を分析した表15。5週齡のSyrianGoldenハムスター1群6匹を、100μl容量中1x106pfuもしくは1x104PFUのbhPIV3、bhPIV3hMPVF1またはF2、あるいはhMPVNL100を用いて鼻腔内から感染させた。異なる群を、別々にマイクロアイソレーターケージで維持した。感染4日後に、動物の鼻甲介および肺を採取し、ホモジェナイズして、70°Cで保存した。組織に存在するウイルスの力価を、Vero細胞におけるTCID50アッセイによって測定した。チャレンジ試験のため、28日目に動物に1x106pfumlのhPIV3またはhMPVNL100を鼻腔内接種した。チャレンジ4日後に、動物の鼻甲介および肺を摘出し、定量のために免疫染色したVero細胞でのプラークアッセイによってチャレンジウイルスの複製についてアッセイした。結果は、bhPIV3hMPVF1およびF2は、ハムスターの鼻甲介においてそれぞれ53および57log10TCID50g組織の高いレベルで複製することを示した。これらの力価はbhPIV3で観察された値48log10TCID50g組織と同様であった。それと比較して、野生型hMPVはハムスターの上気道において53log10TCID50g組織の力価を示した表5。bhPIV3hMPVF1およびF2は、ハムスターの肺では、57および46log10TCID50g組織で複製した表5。これらの力価はbhPIV3で観察された値56log10TCID50g組織と同様であった。野生型hMPVはハムスターの下気道において36log10TCID50g組織の減少した力価を示した表5。これらのデータは、bhPIV3hMPVF1およびF2がSyrianGoldenハムスターの上気道および下気道において効率よく感染することができ、複製できることを証明した。これらの結果は、ハムスターがhMPVならびにhMPVワクチン候補の免疫原性を研究するために適切な小動物モデルであることを示唆した。16実施例11:可溶性の呼吸器多核体ウイルスF遺伝子構築物のクローニングまた、単一コピーの可溶性RSVF遺伝子、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠損したRSVF遺伝子型を含む構築物すなわち、bhPIV3solRSVF2を作製した図14。免疫原性について検査するためにこの構築物を使用することができる可溶性RSVFもやはりRSV特異的免疫応答を誘導すると期待される。その利点は、可溶性RSVFをビリオン膜に組み込むことができないことであろう。従って、このウイルスは、そのウイルストロピズムの変化が期待されないため、より安全なキメラウイルスと考えられうる。bhPIV3solRSVFのcDNAプラスミドは、逆遺伝学によってレスキューされ得る。bhPIV3solRSVF2を以下のように構築した。ウシヒトbhPIV3solRSVF2cDNAは、ヒトPIV3に由来する融合F遺伝子およびヘマグルチニンノイラミニダーゼHN遺伝子を含み、一方、残りのウイルスゲノムはbPIV3に由来した。前述のプラスミド15bPIV3RSVF2をPCRのためのDNA鋳型として使用した。このプラスミドは、ヌクレオチドnt15200のbPIV3配列およびnt1774に挿入されたRSVF遺伝子を含有した。RSVA2ゲノムのF遺伝子中のnt5946にアニーリングするオリゴおよびオリゴ5CGTGGTCGACCATTGTAAGAACATGATTAGGTGCTATTTTTATTTAATTTGTGGTGGATTTACCGGC3を、RSVFの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを除去するために用い、150ヌクレオチドを欠失させた。その結果生じたPCR断片をHpaIおよびSalIによって消化し、プラスミド15bPIV3solRSVF2を作製するためにHpaIおよびSalIで処理した15bPIV3RSVF2に導入した。第二位置にsolRSVF遺伝子を含むbPIV3サブクローンをSphIおよびNheIによって切断し、63kbDNA断片を単離した。残りのウシヒトPIV3ゲノムを14kbのサイズのNheISphIDNA断片としてライゲーションし、完全長bhPIV3solRSVF2cDNAプラスミドを作製した。組換えウイルスを逆遺伝学によって再生した。高力価のウイルスストックを作製し、RSVヤギポリクローナル抗血清を用いて免疫ペルオキシダーゼ染色したVero細胞におけるプラークアッセイによって定量した。ウイルスストックを70°Cで保存した。17実施例12:ウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクター化ヒトメタニューモウイルスFに感染した細胞におけるヒトメタニューモウイルスFの発現bh104hMPVFウイルスストックを連続的に10倍希釈し、サブコンフルエントのVero細胞に感染させるために用いた。感染細胞にゲンタマイシンを含むoptiMEM培地をオーバーレイし、35°Cで5日間培養した。細胞を100メタノールで固定し、11000希釈した抗hMPV001モルモット血清に続いて11000希釈した抗モルモットHRP結合抗体を用いて免疫染色した。hMPVFの発現をAEC基質システムDAKOcorporationの存在下での特異的発色によって可視化する図15A参照。bhNPPhMPVFウイルスストックを連続的に10倍希釈し、サブコンフルエントのVero細胞に感染させるために用いた。感染細胞に、ペニシリンストレプトマイシン、Lグルタミンおよびウシ胎仔血清を含む1xL15MEM培地を補給したEMEML15培地JRHBiosciencesLenexaKS中の1メチルセルロースをオーバーレイした。感染細胞を35°Cで5日間培養し、100メタノールで固定し、11000希釈した抗hMPV001モルモット血清に続いて11000希釈した抗モルモットHRP結合抗体を用いて免疫染色した図15B参照。抗hMPV001モルモット血清はhMPV001タンパク質に特異的であり、bhPIV3タンパク質には結合しない。18実施例13:HeLa細胞およびVero細胞におけるキメラウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザ3型ウイルスのレスキューbPIV3のレスキューと同様の方法を用いて、キメラbhPIV3ウイルスのレスキューを行った。HeLa細胞においてLipofecTACEGibcoBRLを用いて、逆遺伝学によるbhPIV3キメラウイルスのレスキューを行った。80コンフルエントのHeLa細胞、Hep2細胞、またはVero細胞を4MOIのMVAに感染させた。感染1時間後、完全長アンチゲノムbhPIV3cDNA4μgを、NP04μg、P04μg、およびLpCITE02μg発現プラスミドとともに感染HeLa細胞またはVero細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの40時間後、細胞および細胞上清を回収しP0、1回の凍結融解サイクルを行った。その結果生じた細胞溶解液を、その後、ワクシニアウイルスの複製阻害剤である1βDアラビノフラノシルシトシンaraCの存在下で新たなVero細胞単層に感染させるために使用し、P1ウイルスストックを作製した。これらのプレートからの上清および細胞を回収し、一回凍結融解し、bPIV3ウイルス粒子の存在をPIV3特異的抗血清によるウイルスプラークの免疫染色によってアッセイした。P1回収の細胞溶解液はVero細胞単層の完全なCPEを引き起こし、免疫染色は広範なウイルス感染の存在を示した。19実施例14:ウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザ3型ベクター化ヒトメタニューモウイルスFウイルスのレスキュー位置1bh104hMPVFまたは位置2bhNPPhMPVFでhMPVFを発現するbhPIV3ウイルスは以下のように得られた。6ウェルディッシュにおいて80~90コンフルエントのHEp2またはVero細胞を、01~03の感染多重度moiでFowlpoxT7に感染させた。FowlpoxT7による感染後、細胞をPBSで一回洗浄し、以下の量のプラスミドDNA、すなわち、完全長bh104hMPVFまたはbhNPPhMPVFcDNA20μg、pCiteN04μg、pCiteP04μg、pCiteL02μgをトランスフェクトしたpCiteプラスミドは、T7プロモーターに続いて脳心筋炎ウイルスEMCV由来のIRESエレメントを有する。リポフェクタミン2000Invitrogenの存在下でメーカーの使用説明書に従って、トランスフェクションを行った。トランスフェクション反応物を33°Cで5~12時間培養し、続いてリポフェクタミン2000を含む培地を、ゲンタマイシンを含む2mlの新しいOptiMEMに交換した。トランスフェクト細胞を更に33°Cで2日間培養した。細胞をSPGで安定化させ、80°Cで1回の凍結融解サイクルによって溶解した。粗細胞溶解液を用いて、レスキューされたウイルスを増幅するために新たなVero細胞単層に感染させた。キメラウイルスをVero細胞での限界希釈法によって精製し、106~108PFUmlの高力価のウイルスストックを作製した。hMPVFタンパク質の発現を、ポリクローナルhMPVモルモット抗血清を用いた免疫染色によって確認した。20実施例15:ウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザ3型ベクター化呼吸器多核体ウイルス遺伝子の逆遺伝学によるレスキュー前述のトランスフェクション法を用いて、逆遺伝学によりHeLaまたはHEp2細胞において感染性ウイルスを再生した実施例13参照。簡潔には、6ウェルの組織培養ディッシュにおいて80~90コンフルエントのHEp2あるいはVero細胞を、それぞれ01~03もしくは1~5の感染多重度moiでFPT7またはMVAT7に感染させた。FPT7またはMVAT7による感染後、細胞をPBSで一回洗浄し、以下の量のプラスミドDNA20μgの完全長bhPIV3RSVFまたはGcDNA、04μgのpCITEN、04μgのpCITEP、02μgのpCITELをトランスフェクトした。リポフェクタミン2000Invitrogenの存在下でメーカーの使用説明書に従って、トランスフェクションを行った。トランスフェクション反応物を33°Cで5~12時間培養し、続いてリポフェクタミン2000を含む培地を、ゲンタマイシンを含む2mlの新しいOptiMEMに交換した。トランスフェクト細胞を更に33°Cで2日間培養した。細胞をSPGで安定化させ、80°Cで1回の凍結融解サイクルによって溶解した。粗細胞溶解液を用いて、レスキューされたウイルスを増幅するために新たなVero細胞単層を感染させた。キメラウイルスをVero細胞での限界希釈法によって精製し、106~108PFUmlの高力価のウイルスストックを作製した。キメラウイルスのRSV遺伝子をRTPCRによって単離し、配列を確認した。RSVタンパク質の発現を、RSVヤギポリクローナル抗血清Biogenesisを用いた、感染Vero細胞単層の免疫染色によって確認した。21実施例16:キメラウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザ3型ウイルスレスキューのRTPCRによる確認レスキューされたウイルスが実際にキメラであること、すなわち、そのウイルスがbPIV3骨格中にhPIV3のF遺伝子およびHN遺伝子配列を含むことを確認するために、ウイルスRNAゲノムをRTPCRによって更に分析した。3つの独立に由来するbhPIV3の分離株のP1ウイルスストックに感染させたVero細胞を回収し、全RNAを単離した。bPIV3の位置4754にアニーリングするオリゴを用いて、ウイルスRNAを増幅した。nt5255~6255のウイルス領域をPCRによって増幅した。その結果生じる1kbPCR断片はhPIV3配列を含むはずである。これは、hPIV3に特異的で、bPIV3の補完的な領域では切断しない酵素Sac1およびBglIIによる消化によって確認された図2参照。予想されたように、Sac1およびBglIIはPCR断片をより小さい断片に切断し、単離した配列がhPIV3に由来することを確認したレーン3、5、7参照。更に、ポリメラーゼL遺伝子中のnt9075~nt10469の領域をPCRによって増幅した。この領域はbPIV3配列を含むはずである。先と同様に、その結果生じる14kbPCR断片を、bPIV3に特異的で、hPVI3の同等領域では切断しない酵素PvullおよびBamH1によって消化した図3。14kb断片は実際にPvullおよびBamH1の両方によって消化され、ポリメラーゼ遺伝子がbPIV3由来であることを確認した図3のレーン3、4、6、7、9および10参照。要約すると、RTPCR分析は、レスキューされたbhPIV3ウイルスが実際にキメラであることを示した。それはbPIV3の遺伝子骨格中にhPIV3のF遺伝子およびHN遺伝子を含む。22実施例17:ウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザ3型ベクター化呼吸器多核体ウイルスおよびヒトメタニューモウイルス遺伝子の遺伝的安定性bhPIV3RSVおよびbhPIV3hMPVキメラウイルスが遺伝的に安定であり、導入したRSVまたはhMPV遺伝子カセットを維持することを証明するために、感染細胞溶解液をVero細胞中で10回連続的に盲目継代した。T25フラスコ中のサブコンフルエントVero細胞を01MOIのbhPIV3RSVまたはbhPIV3hMPVに感染させ、33°Cで4日間またはCPEが見られるまで培養した。培養期間の最後に感染細胞および培地を回収し、2回凍結融解し、その結果生じた細胞溶解液を新たなT25フラスコのVero細胞に感染させるために使用した。このサイクルを10回くり返した。P1からP10までのすべての細胞溶解液を、RSVまたはhMPVタンパク質の発現およびウイルス力価のためのプラークアッセイならびに免疫染色によって解析した。継代10代目に、RSVF、RSVG、またはhMPVF遺伝子カセットをRTPCRによってP10溶解液から単離し、起こり得るヌクレオチド変化を同定するためにDNA配列解析によって検証した。すべての分離株は、解析された10継代に渡って、RSVまたはhMPV遺伝子カセットおよびRSVまたはhMPVタンパク質発現を維持していた。PIV3ゲノムにおける遺伝子挿入の位置、位置1もしくは2に依存する、RSVまたはhMPV遺伝子を発現するPIV3の挿入安定性の増加は観察されなかった。23実施例18:ウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザ3型ベクター化呼吸器多核体ウイルス遺伝子のショ糖密度勾配でのビリオン分画RSVタンパク質がbhPIV3ビリオンに組み込まれるかどうかという問題を、生化学的アッセイの利用によって更に調査した。Vero細胞に01MOIのそれぞれのキメラbhPIV3RSVウイルスを接種した。最大のCPEが見られた時、感染単層細胞を凍結融解し、2000rpmで10分間遠心分離した。上清を20ショ糖クッションを通して100000xgで90分間遠心した。その後、ペレットをPBSに再懸濁し、2066ショ糖密度勾配の上部に静かに重層した。その勾配を、平衡に達するように100000xgで20時間遠心分離した。勾配の上端から始めて、18個の2ml画分を回収した。各画分の04mlをウイルス力価の測定のために分取した。各画分を2倍容量の20PBSに再懸濁し、100000xgで1時間の遠心分離によって濃縮した。次に、ペレットを005mlのLaemmliバッファーBioRadに再懸濁し、RSVFMAbNuMaxLIFRS28R、RSVBiogenesisおよびbPIV3VMRDポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロットによって、RSVおよびPIV3タンパク質について解析した。バキュロウイルスで発現され、均一に精製したC末端切断型RSVFタンパク質もまたショ糖密度勾配において分析された。それらの画分はまた、ピークウイルス力価についてプラークアッセイによって解析された。バキュロウイルスで産生されたC末端切断型の遊離RSVF、RSVA2、およびbhPIV3の対照勾配を初めに実施した。遊離RSVFの大部分は、勾配の上部の画分3、4、5、および6に存在した図16A。最大濃度のRSVビリオンは、画分10、11および12において観察された図16B。RSV画分は、RSVFMAbだけでなくRSVポリクローナル抗血清によってプローブされた。最大量のRSVビリオンを含む画分はまた、RSVFに対する最も強いシグナルを示し、RSVFタンパク質がRSVビリオンとともに移動し、RSVビリオンに関連していることを示唆した図16B。これらの画分はまた、最も高いウイルス力価を示した図16B。bhPIV3ビリオンはより多形性であるのかもしれず、従ってbhPIV3ビリオンを含むピーク画分の広がりはより広範囲であった。bhPIV3ビリオンは画分9、10、11、12、および13に存在した図16C。先と同様に、ほとんどの量のビリオンを含む画分はまた、プラークアッセイによって最も高いウイルス力価を示した図16C。bhPIV3RSVF2のショ糖密度勾配画分を、PIV3ポリクローナル抗血清とRSVFMAbとの両方で解析した図16D。ビリオンの大部分を含む画分は、PIV3抗血清を用いたウエスタンによって示されるように、画分11、12、13、および14であった。それに相当して、これらはまた最大量のRSVFタンパク質を示す画分であった。しかし、いくらかの遊離RSVFはまた画分5および6に存在した。画分11、12、13および14はピークウイルス力価を示した図16D。同様に、bhPIV3RSVG2のビリオンの大部分を含む画分画分9、10、11、および12はまた、RSVGタンパク質に対する最も強いシグナルを示した図16E。先と同様に、これらは最も高いウイルス力価を有する画分であった図16E。全体として、これらのデータは、RSVFおよびGタンパク質の大部分がbhPIV3ビリオンととともに移動し、bhPIV3ビリオンに関連していることを示唆した。しかし、いくらかの遊離RSVタンパク質はまた、勾配の上部の画分に存在した。24実施例19:キメラウシパラインフルエンザ3型ヒトパラインフルエンザ3型ベクター化呼吸器多核体ウイルスRSVはRSV抗血清によって中和できなかったbhPIV3ビリオンに組み込まれたRSV表面糖タンパク質がウイルストロピズム表現型の変化を引き起こすかどうかという重要な安全性の問題に対処するために、中和アッセイを行った表6および7。bhPIV3、bhPIV3RSVキメラウイルスまたはRSVについてVero細胞を用いて中和アッセイを行った。連続的に2倍希釈したRSVポリクローナル抗血清BiogenesisPooleEngland、DrJudyBeelerおよびWHO試薬バンクから得られたRSVFMab1200MAbBeelerおよびCoelinghJVirol63294150、ならびにhPIV3FC1919MAbおよびHN682MabvanWykeCoelinghおよびTiernyJVirol198963375560vanWykeCoelinghら、1985を、約100PFUのbhPIV3、bhPIV3RSVキメラウイルスまたはRSVのいずれかとともに05mlのOptiMEM中で室温において60分間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルス血清混合物をVero細胞単層に移し、35°Cで1時間培養し、EMEML15培地JRHBiosciencesLenexaKS中の1メチルセルロースをオーバーレイし、35°Cで培養した。接種6日後、感染細胞単層を免疫染色した。中和力価は、ウイルスプラークの50を阻害する最高血清希釈の逆数として表された。RSVFMAbWHO1200MAbは、野生型RSVA2の50を12000希釈で中和した表6。対照的に、125希釈であっても、いずれのキメラbhPIV3RSVも中和しなかった。同様に、1400希釈のポリクローナルRSV抗血清BiogenesisはRSVA2の50を中和したが、1156希釈であっても、bhPIV3RSVを中和しなかった表6。hPIV3FMAbC1919は、bhPIV3ならびにbhPIV3RSVの50を1500希釈で中和した表7。hPIV3HNMAb682は、bhPIV3を116000希釈で、bhPIV3RSVを132000希釈で中和した表7。また、モルモットの補体が存在する以外同一の条件を用いてこれらのアッセイを行ったが、bhPIV3RSVの中和は依然として観察されなかった。RSVポリクローナル抗体ならびにRSVFモノクローナル抗体を用いて得られた結果は、bhPIV3によって発現されるRSVFタンパク質がビリオンエンベロープに組み込まれないことを示唆した。使用したアッセイが、ビリオン表面の少量のRSVFタンパク質を検出するのに十分な感度ではなかったのかもしれない。しかし、たとえ低レベルのRSVFがbhPIV3RSVF2ビリオン表面に存在したとしても、RSVFタンパク質はPIV3Fタンパク質を機能的に置換することができなかった。この問題を更に研究するために、RSVFタンパク質をビリオン膜に挿入できなくさせる、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠損した可溶型のRSVFタンパク質を発現するbhPIV3を作製した図14。膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの除去は、RSVFタンパク質のC末端の50アミノ酸を削除することによって達成された。solRSVF遺伝子カセットのbPIV3遺伝子末端配列および遺伝子開始配列は、完全長RSVF遺伝子カセットのそれと同一のままであった図14。両キメラbhPIV3は、天然型および可溶性のRSVFタンパク質を効率的に発現し、組織培養において107~108PFUmlの高い力価で複製した。これらのデータは更に、RSVタンパク質は機能的ではなかった、すなわち、RSVFタンパク質はhPIV3F抗体によって遮断されるhPIV3Fタンパク質を機能的に置換できなかったことを示した。従って、RSVおよびhMPVに由来する外来抗原を発現するbhPIV3のウイルストロピズムの変化は、考えにくい。25実施例20:キメラウシPIVは、invivo投与した場合、弱毒化表現型を示し、強い防御反応を誘導する5週齡のSyrianGoldenハムスターを5x105pfuの野生型bPIV3、組換えbPIV3、hPIV3、ヒトウシPIV3およびプラセボに感染させた。5つの異なる動物群を別々にマイクロアイソレーターケージで維持した。感染4日後に、動物を屠殺した。動物の鼻甲介および肺をホモジェナイズし、80°Cで保存した。組織中に存在するウイルスをMDBK細胞における37°CでのTCID50アッセイによって測定した。ウイルス感染をモルモット赤血球による赤血球吸着によって確認した。表8は、ハムスターの肺および鼻甲介における様々なPIV3株の複製力価を示す。組換えbPIV3およびbhPIV3キメラウイルスがハムスターの肺において弱毒化していることに注目されたい。更に、感染前および感染21日後にハムスターから採取した血清サンプルを赤血球凝集阻害アッセイで解析した。血清サンプルをレセプター破壊酵素RDEDENKASeikenCoで処置し、非特異的な凝集素をモルモット赤血球とともに氷上で1時間インキュベーションすることによって除去した。野生型のbPIV3およびhPIV3を、連続的に2倍希釈したハムスター血清サンプルに添加した。最後に、モルモット赤血球05を添加し、室温で赤血球凝集を起こさせた。表9は、様々なPIV3株に感染した際にハムスターで生じた抗体応答を示す。bhPIV3キメラウイルスは野生型hPIV3と同様の強さでhPIV3に対する抗体応答を生じ、組換えbPIV3または野生型bPIV3によって生じる応答をはるかに上回ることに注目されたい。これらの結果は、これらの組換え体をワクチン製剤での使用に適切にする本発明のbhPIV3キメラウイルスの特性を実証する。bhPIV3キメラウイルスがinvivo投与された場合、弱毒化表現型を示すだけでなく、それらはまた野生型hPIV3と同様の強い抗体応答を生じる。このように、本発明のキメラウイルスは弱毒化表現型を持ち、野生型hPIVと同様の強い免疫応答を誘導するという独特の組合せを有するため、これらのキメラウイルスは、PIVへの感染を阻害するおよびまたはそれに対して防御するためのヒトでの使用の成功に必要な特性を有する。26実施例21:ウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスGまたはFタンパク質の、ハムスターの上気道および下気道での複製5週齡のSyrianGoldenハムスター1群あたり6匹を、100μlの容量中1x106PFUまたは1x104PFUのbhPIV3、bhPIV3RSV、RSVA2、またはプラセボ培地によって鼻腔内に感染させた。異なる群を、別々にマイクロアイソレーターケージで維持した。感染4日後に、動物の鼻甲介および肺を採取し、ホモジェナイズして、70°Cで保存した。組織に存在するウイルスの力価を、Vero細胞におけるTCID50アッセイによって測定した。チャレンジ試験のため、28日目に動物に1x106pfumlのhPIV3またはRSVA2を鼻腔内接種した。チャレンジ4日後に、動物の鼻甲介および肺を単離し、定量のために免疫染色したVero細胞でのプラークアッセイによってチャレンジウイルスの複製についてアッセイした。表10は、ハムスターの肺および鼻甲介における様々な株の複製力価を示す。SyrianGoldenハムスターは、組換えbPIV3およびhPIV3遺伝子組換えウイルスの複製および免疫原性の評価に適切な小動物モデルにあたる。外来抗原はビリオンに組み込まれないので表6および表7、RSV抗原の導入は、キメラbhPIV3のハムスターに感染し複製する能力を変化させないだろうと期待された。動物を鼻腔内免疫した場合、その結果は、すべてのキメラbhPIV3RSVがハムスターの鼻甲介において42~46log10TCID50g組織で複製することを示した表10。これらの複製レベルは48log10TCID50g組織を示すbhPIV3で観察されたものと同様であった表10。SyrianGoldenハムスターはRSVの感染に対して半許容性なだけである。ハムスターの上気道で観察されるRSVの力価は、bhPIV3のそれらと比較して14log10TCID50g組織ほど減少した表10。位置1にRSV遺伝子を含むbhPIV3RSVは、ハムスターの肺においてbhPIV3と比較して09~15log10減少した力価を示した表10。対照的に、位置2に遺伝子挿入を含むbhPIV3RSVは、ハムスターの下気道においてbhPIV3で観察された力価の01log10以内で複製した表10。位置1または位置2に外来遺伝子を含むキメラPIV3は、ハムスターの下気道および上気道においてbhPIV3と同様のレベルまで効率的に複製する能力を有した。bhPIV3ゲノムの位置1または2への付加的な遺伝子の導入は、invivoでのウイルス複製についてウイルスを著しく弱毒化しなかった。27実施例22:ウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスで免疫したハムスターは、ヒトパラインフルエンザ3および呼吸器多核体ウイルスA2によるチャレンジから防御されたbhPIV3RSVで観察される複製レベルがハムスターにおいて防御免疫応答を誘導するのに十分であるかどうかを評価するために、ワクチン接種後28日目に、動物の鼻腔内に動物あたり106PFUのRSVまたはhPIV3をチャレンジした。bhPIV3RSVで免疫した動物はhPIV3およびRSVから完全に防御された表11。ハムスターの上気道および下気道において、RSVチャレンジウイルスは非常に低いレベルで検出され、hPIV3チャレンジウイルスはまったく観察されなかった。プラセボ培地を受けた動物のみが、上気道ならびに下気道において、44および41logl0TCID50g組織のhPIV3、ならびに36および31log10pfug組織のRSVを示した表11。この研究はまた、RSVで免疫された動物がhPIV3によるチャレンジから防御されなかったことを示した。同様に、hPIV3をワクチン接種した動物は、高い力価のRSVチャレンジウイルスを示した表11。28実施例23:ウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスによるハムスターのワクチン接種は、血清HAI抗体および中和抗体を誘導するチャレンジ用量を投与する前、28日目にbhPIV3RSVで免疫した動物から血清サンプルを採取した。RSV中和抗体の存在については50プラーク減少アッセイを用いて、PIV3HAI血清抗体については赤血球凝集阻害HAIアッセイを実施することによって、ハムスター血清を分析した表12。以下のように50プラーク減少アッセイ中和アッセイを行った。すなわち、ハムスター血清を連続的に2倍希釈し、100PFUのRSVA2とともに1時間インキュベートした。その後、ウイルス血清混合物をVero細胞単層に移し、メチルセルロースをオーバーレイした。35°Cで5日間培養した後、定量のためにRSVポリクローナル抗血清を用いて単層を免疫染色した。赤血球凝集阻害HAIアッセイは、連続的に2倍希釈した28日目のハムスター血清を25°Cで30分間hPIV3とともにV底の96ウェルプレート中でインキュベートすることによって行われた。その後、モルモット赤血球を各ウェルに添加し、更に90分間のインキュベーションを続けて、各ウェルにおける赤血球凝集の有無を記録した。力価は赤血球凝集を阻害する最高血清希釈の逆数のlog2の平均として表された。その結果は、ゲノムの位置1または位置2においてRSVFタンパク質を発現するウイルスがそれぞれ55および69log2のRSV中和抗体力価を示すことを示した。これらの力価は、野生型RSVをワクチン接種した動物から得られた血清で観察される抗体力価よりわずかに低かった表12。一方、RSVGタンパク質を発現するウイルスは、約50まで減少したRSV中和抗体力価を示した表12。すべてのキメラbhPIV3RSVハムスター血清は、bhPIV3で観察されるレベルと比較して05~20log2ほど減少したHAI血清抗体のレベルを示した表12。結果は、キメラbhPIV3RSVがハムスターに感染して効率的に複製することができ、hPIV3およびRSVへの防御免疫応答を誘導できることを示した。29実施例24:低用量のウシパラインフルエンザ3ヒトパラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスによるハムスターのワクチン接種は、呼吸器多核体ウイルスA2によるチャレンジからハムスターを防御し、血清HAI抗体および中和抗体を誘導する最良のワクチン候補を同定するために、異なる構築物を含む実施例2参照低用量のウイルスを用いてハムスターを免疫した。チャレンジ試験の結果を表13に要約する。次に、中和抗体の力価を50プラーク減少アッセイ中和アッセイによって測定した。bhPIV3、bhPIV3RSVキメラウイルスまたはRSVについてVero細胞を用いて中和アッセイを行った。連続的に2倍希釈したRSVポリクローナル抗血清BiogenesisPooleEngland、MedImmuneから得られたRSVFMAbWHO1200MAb、またはhPIV3FC1919MAbおよびHN682MAbを、bhPIV3、bhPIV3RSVキメラウイルスもしくはRSVのいずれか約100PFUとともに05mlOptiMEM中で60分間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウイルス血清混合物をVero細胞単層に移し、35°Cで1時間培養し、EMEML15培地JRHBiosciencesLenexaKS中の1メチルセルロースをオーバーレイし、35°Cで培養した。接種6日後、感染細胞単層を免疫染色した。中和力価は、ウイルスプラークの50を阻害する最高血清希釈の逆数として表された。また、感染28日後にbhPIV3、bhPIV3RSVキメラウイルスまたはRSVA2で免疫したハムスターから得られた血清についても、中和アッセイを実施した。ハムスター血清を連続的に2倍希釈し、100PFUのRSVA2とともに1時間インキュベートした。その後、ウイルス血清混合物をVero細胞単層に移し、メチルセルロースをオーバーレイした。35°Cで5日間のインキュベーション後、定量のためにRSVポリクローナル抗血清を用いて単層を免疫染色した。ハムスターの前血清の中和抗体の力価は6log2は、RSVA2に感染した霊長類、またはbhPIV3RSVFワクチンによって免疫された霊長類で観察された。RSVチャレンジに応答したRSV中和力価またはIgG抗体力価のいずれの更なる増加も、bhPIV3RSVFまたはbhPIV3solRSVFによってワクチン接種された動物において観察されなかった。PIV3RSVFワクチンに対して測定されたRSV中和抗体力価はwtRSVに感染した霊長類から得られた血清で観察されたものより低かったので、細胞性免疫応答がこのように効果的なRSVチャレンジからの防御をもたらす役割を担っているのかもしれない。弱毒化PIV3RSV生ワクチンの有効性への細胞免疫系の寄与に取り組むために、更なる研究が行われうる。bhPIV3ベクターは、ウイルスゲノムの大部分が子供において安全であることが証明されているbPIV3に由来するので、ヒトにおいて弱毒化されていることが予想されるKarronら、PediatrInfectDisJ15650654を参照されたい。Skiadopoulosらは、アカゲザル弱毒化モデルを用いて、bPIV3の弱毒化表現型が多遺伝子性の性質であることを明白に示したSkiadopoulosら、JVirol7711411148VanWykeCoelinghら、JInfectDis157655662を参照されたい。bPIV3FおよびHN遺伝子は弱毒化を指定するいくつかの遺伝的決定基を含みうるが、弱毒化表現型への最大の寄与はbPIV3NおよびPタンパク質であるとされた。Schmidtらは、異なるPIV3ゲノム位置からRSV抗原を発現する多数のbhPIV3を、アカゲザルの気道での複製について評価したSchmidtら、JVirol7610891099VanWykeCoelinghら、JInfectDis157655662を参照されたい。RSVタンパク質を発現するすべてのキメラbhPIV3はURTにおいてbhPIV3より低い効率で複製し、アカゲザルのLRTではベクターbhPIV3と比較してごくわずかに高い力価~05log10TCID50mlが観察された。これらのデータは、bhPIV3RSVがヒトにおいて弱毒化されているという予想の正当性を更に立証する。幼児は十分に発達した免疫系を持たず、そのため、長期間持続し防御作用のあるRSVに対する免疫を発達させるために、複数回のワクチン投与が必要でありうる。生後2、4、および6ヶ月の想定ワクチン接種計画が考えられ、理想的には他の通常の幼児期ワクチン接種と同時に計画される。PIV3は高度に免疫原性があり、最初のPIVRSVワクチン接種は高レベルのPIV3抗体を誘導する。これはベクター免疫を誘導して、その後のPIVRSVによる免疫付与が更なる抗体力価の上昇を引き起こさないかもしれない。Karronらによる最近の研究は、投与間隔が十分に離れていれば、PIV3の反復投与はベクター免疫を誘導しないであろうことを示すデータを提示したKarronら、PediatrInfectDisJ22394405を参照されたい。低温で継代した温度感受性ウイルスであるcp45PIV3ワクチンの単回投与は、2回目の投与後のワクチン複製の規模を制限した。しかし、2回目のワクチンの投与による感染の頻度は明らかに投与間隔に影響された。2回目のワクチンの投与が1ヶ月後に行われた場合、幼児のわずか24しかウイルスを排泄しなかった。一方、2回目の投与が1回目の投与の3ヶ月後に行われた場合、幼児の62がウイルスを排泄した。これらの結果は、PIV3ベクター免疫の影響を最小限にするために、ワクチン接種の間隔は1ヶ月以上だが3ヶ月以下にすべきであることを示唆した。AGMのPIV3RSV免疫はhPIV3中和抗体およびHAI血清抗体の産生を引き起こしたbhPIV3RSVワクチンがRSV感染およびhPIV3感染から防御できたかどうかを評価するために、hPIV3中和抗体およびHAI血清抗体の存在について霊長類血清を分析した表21。bhPIV3RSVF2ならびにbhPIV3solRSVF2で免疫した動物からの28および56日目の霊長類血清は、~6log2のhPIV3中和抗体力価を示した。それぞれ、bhPIV3RSVF2ならびにbhPIV3solRSVF2の28および56日目の血清について、128および64のヒトPIV3特異的HAI抗体力価を観察した。28日目の血清を用いてbPIV3抗原を検査した場合、113および160のより低いHAI抗体力価を示した。56日目の血清は80の更に低いbPIV3HAI力価を示した。bhPIV3RSVウイルスの表面糖タンパク質、FおよびHNはヒトPIV3に由来するので、異種bPIV3抗原に対するより、同種抗原hPIV3に対して、より高いHAI血清抗体力価が観察された。hPIV3中和抗体またはPIV3HAI血清抗体は、プラセボ受容動物に由来する血清では検出されなかった。これらの結果は、bhPIV3RSVワクチンがまたhPIV3感染に対しても有効でありうることを示唆した。この研究は、hPIV3血清HAI抗体および中和抗体力価がワクチン接種に応答して産生されたかどうかを決定した。両方の種類のbhPIV3RSVFワクチンで免疫した動物から得られた霊長類血清で観察された、hPIV3HAI抗体および中和抗体のレベルは、bhPIV3を用いてワクチン接種したアカゲザルによって示された力価と同様であった。bhPIV3で免疫したアカゲザルは、野生型hPIV3によるチャレンジから完全に防御された。これらの結果は、bhPIV3ベクター化RSVワクチンが、RSVとhPIV3の両方の感染および疾患から幼児を防御するための二価のワクチンとして有効でありうることを示唆した。34実施例29:アフリカミドリザルにおけるMPVの抗原タンパク質を発現するbhPIV3の有効性および免疫原性の評価見込みのあるMPVワクチン候補、例えば、MPVFのようなMPVの抗原タンパク質を発現するbhPIV3は、アフリカミドリザルのような非ヒト霊長類モデルにおいて有効性および免疫原性について評価される。2mMLグルタミン、非必須アミノ酸NEAA、抗生物質、および10FCSを補給したModifiedEaglesMediumMEMJRHBiosciences中で、Vero細胞を維持する。例えばbhPIV3MPVF2のようなMPVの抗原タンパク質を発現するbhPIV3、および、例えばhMPVNL100のような野生型MPVを、Vero細胞において増殖させる。細胞にウイルスを01PFU細胞の感染多重度MOIで感染させる。感染3~5日後、細胞および上清を回収し、1xの最終濃度になるよう10xSPG10xSPGは218Mショ糖、0038MKH2PO4、0072MK2HP04、0054MLグルタミン酸を添加することによって安定化する。ウイルスストックを70°Cで保存する。ウイルス力価をVero細胞でのプラークアッセイによって測定する。プラークを、PIV3VMRDまたはMPVヤギポリクローナル抗血清Biogenesisを用いた免疫ペルオキシダーゼ染色後に定量する。研究開始日の14日前に採取した霊長類の前血清について、MPVFIgGELISAImmunoBiologicalLaboratoriesおよび赤血球凝集阻害HAIアッセイを用いて、MPVおよびPIV3に対して血清反応陰性のアフリカミドリザルCercopithecusaethiops35~65歳、26~58kgを同定する。MPVFIgGELISAを以下のように行う。すなわち、ワクチン接種した動物からの1、28、および56日目の霊長類の血清を、ELISAキットImmunoBiologicalLaboratoriesHamburgGermanyを用い、メーカーの使用説明書に従って、MPVFIgGの存在について分析する。サルの二次抗血清RocklandIncを11000希釈で使用する。MPVFIgG抗体力価はlog2IgGUmlとして表される。連続的に2倍希釈した霊長類血清を8HAunits005mlのbPIV3またはhPIV3のいずれかとともに25°Cで30分間インキュベートすることによって、HAIアッセイを行う。続いて、モルモット赤血球を各ウェルに加え、90分間インキュベーションを続け、赤血球凝集について各ウェルを観察する。HAI力価は、ウイルスを介した赤血球の凝集を阻害する抗血清の最高希釈の逆数として表される。霊長類を個別のマイクロアイソレーターケージで飼育する。それらのサルをケタミンバリウム混合物で麻酔し、鼻腔内および気管内に例えばbhPIV3MPVF2のようなMPVの抗原タンパク質を発現するbhPIV3、および、例えばhMPVNL100のような野生型MPVを感染させる。経鼻投与量は鼻孔あたり05mlであり、気管内投与量は1mlである。1日目に、各動物は2~3x105PFUのウイルスを含む2mlの投与を受ける。プラセボ動物群は同一の投与量のOptiMEMを受け取る。28日目に、すべての動物に7x105PFUのhMPVNL100各部位に1mlを気管内および鼻腔内チャレンジする。鼻咽頭NPスワブを毎日11日間採取し、気管洗浄TL検体を免疫後およびチャレンジ後1、3、5、7および9日目に採取する。大腿静脈から得られる血液サンプルを血清学的解析のために0、7、14、21、28、35、42、49および56日目に採取する。発熱を示す体温変化、風邪の徴候、鼻水、くしゃみ、食欲不振、および体重について、動物を観察する。霊長類のNPおよびTL検体に存在するウイルスを、MPVヤギポリクローナル抗血清で免疫染色したVero細胞を用いたプラークアッセイによって定量する。平均ピークウイルス力価は、各動物に対して免疫後またはチャレンジ後11日のうちのいずれかにおいて測定されるピークウイルス力価の平均を表す。投与1、28、および56日後に、例えばbhPIV3MPVF2のようなMPVの抗原タンパク質を発現するbhPIV3ベクターを感染させた霊長類から採取した血清について、プラーク減少中和アッセイPRNAを行う。霊長類の血清を連続的に2倍希釈し、100PFUのhMPVNL100とともにモルモットの補体の存在下、4°Cで1時間インキュベートする。ウイルス血清混合物をVero細胞単層に移し、2FBSおよび1抗生物質を含むEMEML15培地JRHBiosciencesLenexaKS中の1メチルセルロースをオーバーレイする。35°Cで6日間培養した後、単層を、定量のためにMPVヤギポリクローナル抗血清を用いて免疫染色する。中和力価はウイルスプラークの50を阻害する最高血清希釈の逆数のlog2として表される。Vero細胞でhPIV3マイクロ中和アッセイを行う。14から開始し、連続的に2倍希釈した霊長類血清を、100TCID50のhPIV3とともに37°Cで60分間インキュベートする。次に、ウイルス血清混合物を96ウェルプレート中の細胞単層に移し、37°Cで6日間培養し、その後すべてのウェルをCPEについて観察する。中和力価はCPEを阻害する最高血清希釈の逆数として表される。<14の中和抗体力価検査される最低血清希釈は2の逆数log2力価とする。MPVワクチン候補の複製効率を研究するために、以下のように実験を計画する。1日目に、MPVおよびPIV3に対して血清反応陰性のアフリカミドリザル、1群4匹の動物を、2~3x105PFUの用量で、MPVワクチン候補、例えばbhPIV3MPVF2によって鼻腔内および気管内免疫する。陽性対照群には野生型MPV、例えばhMPVNL100を感染させ、陰性対照群にはプラセボ培地を投与する。28日目に、すべての動物に7x105PFUの野生型MPV、例えばhMPVNL100を鼻腔内および気管内チャレンジする。この研究期間中、動物をマイクロアイソレーターケージで飼育する。鼻咽頭スワブを免疫後およびチャレンジ後毎日11日間採取し、気管洗浄サンプルを免疫後およびチャレンジ後2、4、6、8および10日目に採取する。抗体解析のための血清サンプルを、研究の期間中7日毎に採取する。MPV感染からの免疫防御を評価するために、ワクチン接種された霊長類に高用量の野生型MPV、例えばhMPVNL100を免疫4週間後にチャレンジする。有効性を、感染した動物のURTおよびLRTにおいて排泄されるMPVチャレンジウイルス力価の減少として測定する。bhPIV3ベクター化MPVワクチン候補の有効性を、免疫4週間後に産生されたMPV中和抗体力価およびMPVFIgG血清抗体力価のレベルによって、更に評価する。50プラーク減少中和アッセイPRNAを用いて、MPV中和抗体力価を測定する。また、MPVワクチン候補によって誘導される免疫応答を、投与前1日目、投与4週間後28日目、およびチャレンジ4週間後56日目でのMPVFタンパク質特異的IgGレベルの測定によって解析する。bhPIV3ベクター化MPVワクチンがMPV感染およびhPIV3感染から防御できるかどうかを評価するために、また、霊長類血清を、hPIV3中和抗体およびHAI血清抗体の存在についても分析する。35実施例30:GFPまたはeGFP遺伝子を含むbhPIV3構築物を用いたマイクロ中和アッセイウイルスを動物に接種した場合、ウイルスに対する一連の抗体が産生される。これらの抗体のいくつかはウイルス粒子に結合し、ウイルスの感染性を中和することができる。抗体を含む希釈血清とともにウイルスをインキュベートした後に残存するウイルスの感染性を解析するために、マイクロ中和アッセイを使用する。マイクロ中和アッセイを以下のように行う。すなわち、血清をOptiMEM培地1xで連続的に希釈する。血清および培地を倒置によって穏やかに混和し、その後氷上に静置する。それぞれの希釈血清を目的のウイルスとともにインキュベートするが、そこではそのウイルスのゲノムが1以上のGFPまたはeGFP遺伝子を有するように操作されているセクション9、実施例4参照。細胞をリン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄する。ウイルス血清混合物を細胞に添加し、1時間35°Cでインキュベートする。ウイルスを含むすべての培地を除去し、細胞をPBSで洗浄する。OptiMEM培地を細胞に添加し、細胞培養物を3日間培養する。残存するウイルスの感染性を、蛍光顕微鏡によって捕らえられる画像上のGFPまたはeGFPの緑色焦点の定量によって測定する。GFPまたはeGFPを持たない対応するウイルス、例えば野生型RSVを用いたプラーク減少アッセイもまた、マイクロ中和アッセイの感度の比較のために行われ得る。36実施例31:ウイルスワクチン候補の製造のための強力で高収量の細胞培養の開発この実施例は、強力で高収量の細胞培養プロセスを記載する。このプロセスは、例えば、本出願に記載されるウイルスワクチンの製造のために使用される。重要なプロセスのパラメーターを最初に特定し、産生プロセスを小規模の実験で最適化した。次に、最適化した操作条件を用いて多数の研究を実施し、産生システムの拡張性、堅牢性、および再現性を決定する。本実施例において記載されるプロセスは、感染性ウイルスの収量を1log10TCID50mL以上に増加させる。材料および方法ウイルス、図4に示されるようなRSVF遺伝子挿入構築物を含むウシヒトPIV3ウイルス以下bhPIV3RSVF2と呼ぶを、4mMLグルタミンを補給したOPTIPROSFMGibcoから成る無血清培地SFMでの培養に適応したVero細胞ATCCを用いて増殖させた。通常、SFM中に5x104細胞mlで播種し、播種3日後に培養物に栄養補給し、播種5日後にフラスコを継代することによって、足場依存性Vero細胞を維持した。50組織培養感染用量TCID50アッセイを用いてウイルス力価を測定し、log10TCID50mLを定量した。結果プロセス最適化Vero細胞をSFM中に175x106細胞フラスコで播種したT75フラスコにおいて、小規模のプロセス最適化研究を実施した。すべての感染前培養物を37±1°C、5±1CO2で培養し、播種3日後または5日後のいずれかに感染させた。播種5日後に感染される培養物については、播種3日目に完全なSFMの交換を行った。感染時に、使用済みの培地をbhPIV3RSVF2ウイルスを含むSFMに置き換えた。培養液を少なくとも1日1回サンプリングし、感染性ウイルスについてTCID50によりアッセイした。図中のエラーバーは2回反復の培養液から得られた標準偏差を表す。感染多重度MOIの影響Vero培養物に、bhPIV3RSVF2ウイルスを01、001、0001、00001、および000001MOIで播種5日後に感染させた。結果は、00001および000001MOIで最も低いウイルス力価が観察されたが、01、001、および0001MOIでは同程度のウイルス力価が観察されたことを示す図18。実験をくり返し、同様の傾向を認めた。感染の時点POIおよび感染後の温度の影響Vero培養物を2つの異なる細胞密度で感染させ、感染後33±1°Cまたは37±1°Cのいずれかで培養した。感染性ウイルス力価はより高い細胞密度での感染によって向上しなかったが、それらはより低い感染後の培養温度を用いて1log10TCID50mL以上に増加した図19。実験をくり返し、同様の傾向を認めた。感染前培地の補給の影響感染前培地に血清を補給することによって、感染性ウイルス力価は更に1log10TCID50mL以上に増加した図20。PIV3HN、PIV3F、およびRSVFウイルスタンパク質の発現プロファイル3つのRSVF2ウイルスタンパク質、PIV3HN、PIV3F、およびRSVFの発現を、Vero細胞培養物における感染の間、免疫蛍光法によって観察した。細胞を複数の96ウェルプレートのSFM中に8x103細胞ウェルで播種した。播種4日後、プレートをDPBSで1回洗浄し、bhPIV3RSVF2ウイルスに0001MOIで感染させ、33±1°C、5±1CO2で培養した。感染後、様々な時間間隔で、96ウェルプレートを免疫染色に先だってパラホルムアルデヒド4で固定した。図21、22、および23は、3つのウイルスタンパク質すべてがSFM中のVero細胞の培養物によって発現されたことを示す。これらの図の画像は5X倍率で撮られた。プロセスのスケールアップ1700cm2ローラーボトルComingに175x107細胞ボトルでVero細胞を播種することによって、培地補給実験をくり返した。感染性ウイルス力価は、感染前に血清を補給した培養物において著しく高かった図24。実験を2回くり返し、同様の傾向を認めた。要約重要なプロセスのパラメーターを特定し、感染プロセスを小規模の実験で最適化することによって、RSVF2感染性ウイルス力価は1log10TCID50mL以上に増加した。bhPIV3RSVF2ウイルス産生プロセスは、一貫した再現性のある結果を持つローラーボトル実験においてスケールアップに成功した。37実施例32:無血清Vero細胞中のPIV3のエレクトロポレーションによるプラスミドのみの再生この実施例において実証されるプロセスは、プラスミドのみを用いた、ヘルパーウイルスの非存在下での、組換えPIV3の再生を可能にする。PIV3の再生は無血清Vero細胞を用いて行われ、それは動物およびヒトに由来する産物の非存在下で増殖された。このプロセスは、ヘルパーウイルスT7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスを用いた以前の方法と同様の効率での組換えPIV3の再生を可能にする。ヘルパーウイルスを再生過程で必要としないため、ワクチンウイルスは夾雑物質を含まず、後続のワクチン製造を簡単にする。ワクチンウイルスの再生に用いられる細胞は、動物またはヒトに由来する産物を含まない培地で培養された。これは、製品の末端消費者の感染性海綿状脳症例えばBSEへの懸念を取り除く。この方法は、動物またはヒトに由来する成分を完全に含まない組換えワクチン種の作製を可能にする。そのワクチン種は、またヘルパーウイルスの混入も含まない。cDNAからウイルスをレスキューするためのプラスミドに基づく発現系は、例えば、RALerchら、WyethVaccinesPearlRiverNYUSAおよびGNeumannら、JVirol76pp406410に記載される。方法および結果bPIV3Nプラスミド4μgマーカーカナマイシン耐性、bPIV3Pプラスミド4μgマーカーカナマイシン耐性、bPIV3Lプラスミド2μgマーカーカナマイシン耐性、PIV3アンチゲノムcDNAをコードするcDNA5μgマーカーカナマイシン耐性およびT7RNAポリメラーゼをコードするpADT7DpT75μgマーカーブラスチシジンを、SFVero細胞に無血清培地でのエレクトロポレーションを用いて導入した。bPIV3N、bPIV3P、およびbPIV3Lは、pCITEベクター内のT7プロモーターの制御下にある。pADT7ΔpT7は、改変されたpcDNA6V5HisCにあり、そこではT7プロモーターはCMVプロモーターのみを残して欠失された。T7ポリメラーゼはCMVプロモーターから発現される。アンチゲノムbPIV3はpUC19にあり、アンチゲノムの転写はT7プロモーターの制御下にある。エレクトロポレーションのためのパルスは220Vおよび950マイクロファラッドであった。エレクトロポレーションあたり55X106個の無血清Vero細胞を用いた。エレクトロポレーションした細胞は、33°CでOptiCGIBCOInvitrogenCorporationからの特注処方の存在下で一晩回復させることができた。回復した細胞を1mLのカルシウムおよびマグネシウムを含むPBSで2回洗浄し、2mLのOptiCをオーバーレイした。エレクトロポレーションした細胞を33°Cで5~7日間更に培養した。培養期間の最後に、細胞を培地中にこすり取り、全細胞溶解液をPIV3の存在について解析した。ウイルスの再生を、RSVまたはhMPV特異的ポリクローナル抗体を用いたプラークアッセイの免疫染色によって確認した。エレクトロポレーションした細胞から再生された力価を表22および表23に示す。表22は、SFVero細胞へのエレクトロポレーションによって再生された様々なウイルスの力価を示す。ウイルスは様々なキメラウシPIV3である。様々なキメラウシPIV3をコードするcDNAを有するプラスミドは、ヒトRSVのF遺伝子を位置2に有するPIV3MEDI534、プラスミド上のマーカーはカナマイシン位置2は天然のウイルスゲノムの第一および第二オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは、転写されるべきウイルスゲノムの第二遺伝子の位置であるヒトRSVの膜貫通ドメインおよび内腔ドメインを欠如するF遺伝子の可溶型を位置2に有するウシPIV3MEDI535、プラスミド上のマーカーはカナマイシンヒトメタニューモウイルスのF遺伝子を位置2に有するウシPIV3MEDI536、プラスミド上のマーカーはカナマイシンヒトRSVのF遺伝子を位置2に有するウシPIV3MEDI534、プラスミド上のマーカーはアンピシリンヒトメタニューモウイルスのF遺伝子を位置2に有するウシPIV3MEDI536、プラスミド上のマーカーはアンピシリン、である。キメラウイルスMEDI534について、様々な条件下でのエレクトロポレーションによるウイルスの再生を、23に示す。Vero細胞を力価測定のために血清の存在下で培養した。異なる培地を用いたウイルス再生の効率を検査するために、MEDI534を、iOptiC、ii1Xゲンタマイシンを含むOptiC、iiiOptiMEMヒトトランスフェリンを含むoptiCを用いてエレクトロポレーションした。同一の条件下で同じSFVero細胞を用いて、エレクトロポレーションを行った。結果は、1Xゲンタマイシンがウイルス再生を完全に阻害し、ヒトトランスフェリンがウイルス再生の効率において役割を持たないことを示した。細菌RNAの存在もまたウイルスの再生を阻害する。RNaseA処理なしで調製されたプラスミドを用いて行われたエレクトロポレーションでは、ウイルスは再生されなかった。表22および表23におけるP0およびP1はウイルスを表す。P0はエレクトロポレーションした細胞から得られたウイルスを指す。P1は、ウシ胎仔血清の存在下で培養したvero細胞で1回増幅されたウイルスを指す。P0ウイルスをSFVero細胞で増幅した場合、同様の力価が得られる。本発明は、本発明の個々の態様の1つの説明を意図する特定の記載された実施形態によって範囲を限定されるべきではなく、機能的な同等の構築物、ウイルスまたは酵素は本発明の範囲内である。実際、本明細書に示され、記載されたものに加えて、様々な本発明の改変は、上述の記載および添付図面から当業者にとって明らかになるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあるものとする。様々な刊行物が本明細書において引用されたが、それらの開示内容は参照によりそのまま本明細書に組み入れられるものとする。表24配列表の説明配列番号1ヒトメタニューモウイルス分離株001のマトリックスタンパク質および融合タンパク質遺伝子配列番号2トリニューモウイルスの融合タンパク質遺伝子、部分cds配列番号3トリニューモウイルス分離株1bの融合タンパク質mRNA、完全cds配列番号4シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスの融合タンパク質遺伝子、完全cds配列番号5トリニューモウイルスのマトリックスタンパク質遺伝子、部分cdsおよびトリニューモウイルスの融合糖タンパク質遺伝子、完全cds配列番号6パラミクソウイルスFタンパク質hRSVB配列番号7パラミクソウイルスFタンパク質hRSVA2配列番号8ヒトメタニューモウイルス0171配列番号9ヒトメタニューモウイルス分離株001のマトリックスタンパク質融合タンパク質遺伝子配列番号10トリニューモウイルスの融合タンパク質遺伝子、部分cds配列番号11トリニューモウイルス分離株lbの融合タンパク質mRNA、完全cds配列番号12シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスの融合タンパク質遺伝子、完全cds配列番号13トリニューモウイルスの融合タンパク質遺伝子、完全cds配列番号14シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスの付着タンパク質mRNA、完全cds配列番号15シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスの付着タンパク質、完全cds配列番号16シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスの付着タンパク質mRNA、完全cds配列番号17シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスの付着タンパク質、完全cds配列番号18HMPV分離株NL100のFタンパク質配列配列番号19HMPV分離株NL1700のFタンパク質配列配列番号20HMPV分離株NLl99のFタンパク質配列配列番号21HMPV分離株NL194のFタンパク質配列配列番号22HMPV分離株NL100のF遺伝子質配列配列番号23HMPV分離株NL1700のF遺伝子質配列配列番号24HMPV分離株NLl99のF遺伝子質配列配列番号25HMPV分離株NL194のF遺伝子質配列配列番号26HMPV分離株NL100のGタンパク質配列配列番号27HMPV分離株NL1700のGタンパク質配列配列番号28HMPV分離株NLl99のGタンパク質配列配列番号29HMPV分離株NL194のGタンパク質配列配列番号30HMPV分離株NL100のG遺伝子配列配列番号31HMPV分離株NL1700のG遺伝子配列配列番号32HMPV分離株NLl99のG遺伝子配列配列番号33HMPV分離株NL194のG遺伝子配列配列番号34HMPV分離株NL100のLタンパク質配列配列番号35HMPV分離株NL1700のLタンパク質配列配列番号36HMPV分離株NLl99のLタンパク質配列配列番号37HMPV分離株NL194のLタンパク質配列配列番号38HMPV分離株NL100のL遺伝子配列配列番号39HMPV分離株NL1700のL遺伝子配列配列番号40HMPV分離株NLl99のL遺伝子配列配列番号41HMPV分離株NL194のL遺伝子配列配列番号42HMPV分離株NL100のM21タンパク質配列配列番号43HMPV分離株NL1700のM21タンパク質配列配列番号44HMPV分離株NLl99のM21タンパク質配列配列番号45HMPV分離株NL194のM21タンパク質配列配列番号46HMPV分離株NL100のM21遺伝子配列配列番号47HMPV分離株NL1700のM21遺伝子配列配列番号48HMPV分離株NL199のM21遺伝子配列配列番号49HMPV分離株NL194のM21遺伝子配列配列番号50HMPV分離株NLl00のM22タンパク質配列配列番号51HMPV分離株NL1700のM22タンパク質配列配列番号52HMPV分離株NLl99のM22タンパク質配列配列番号53HMPV分離株NL194のM22タンパク質配列配列番号54HMPV分離株NLl00のM22遺伝子配列配列番号55HMPV分離株NL1700のM22遺伝子配列配列番号56HMPV分離株NLl99のM22遺伝子配列配列番号57HMPV分離株NL194のM22遺伝子配列配列番号58HMPV分離株NLl00のM2遺伝子配列配列番号59HMPV分離株NL1700のM2遺伝子配列配列番号60HMPV分離株NLl99のM2遺伝子配列配列番号61HMPV分離株NL194のM2遺伝子配列配列番号62HMPV分離株NLl00のMタンパク質配列配列番号63HMPV分離株NL1700のMタンパク質配列配列番号64HMPV分離株NLl99のMタンパク質配列配列番号65HMPV分離株NL194のMタンパク質配列配列番号66HMPV分離株NLl00のM遺伝子配列配列番号67HMPV分離株NL1700のM遺伝子配列配列番号68HMPV分離株NLl99のM遺伝子配列配列番号69HMPV分離株NL194のM遺伝子配列配列番号70HMPV分離株NLl00のNタンパク質配列配列番号71HMPV分離株NL1700のNタンパク質配列配列番号72HMPV分離株NL199のNタンパク質配列配列番号73HMPV分離株NL194のNタンパク質配列配列番号74HMPV分離株NLl00のN遺伝子配列配列番号75HMPV分離株NL1700のN遺伝子配列配列番号76HMPV分離株NL199のN遺伝子配列配列番号77HMPV分離株NL194のN遺伝子配列配列番号78HMPV分離株NL100のPタンパク質配列配列番号79HMPV分離株NL1700のPタンパク質配列配列番号80HMPV分離株NL199のPタンパク質配列配列番号81HMPV分離株NL194のPタンパク質配列配列番号82HMPV分離株NL100のP遺伝子配列配列番号83HMPV分離株NL1700のP遺伝子配列配列番号84HMPV分離株NLl99のP遺伝子配列配列番号85HMPV分離株NL194のP遺伝子配列配列番号86HMPV分離株NL100のSHタンパク質配列配列番号87HMPV分離株NL1700のSHタンパク質配列配列番号88HMPV分離株NLl99のSHタンパク質配列配列番号89HMPV分離株NL194のSHタンパク質配列配列番号90HMPV分離株NL100のSH遺伝子配列配列番号91HMPV分離株NL1700のSH遺伝子配列配列番号92HMPV分離株NLl99のSH遺伝子配列配列番号93HMPV分離株NL194のSH遺伝子配列配列番号94分離株NLl99HMPVcDNA配列配列番号95分離株NL100HMPVcDNA配列配列番号96分離株NL1700HMPVcDNA配列配列番号97分離株NL194HMPVcDNA配列配列番号98分離株NL100のG遺伝子コード配列配列番号99分離株BR201のG遺伝子コード配列配列番号100分離株FL401のG遺伝子コード配列配列番号101分離株FL301のG遺伝子コード配列配列番号102分離株FL801のG遺伝子コード配列配列番号103分離株FL1001のG遺伝子コード配列配列番号104分離株NL1001のG遺伝子コード配列配列番号105分離株NL202のG遺伝子コード配列配列番号106分離株NL1700のG遺伝子コード配列配列番号107分離株NL181のG遺伝子コード配列配列番号108分離株NL193のG遺伝子コード配列配列番号109分離株NL293のG遺伝子コード配列配列番号110分離株NL393のG遺伝子コード配列配列番号111分離株NL195のG遺伝子コード配列配列番号112分離株NL296のG遺伝子コード配列配列番号113分離株NL396のG遺伝子コード配列配列番号114分離株NL2201のG遺伝子コード配列配列番号115分離株NL2401のG遺伝子コード配列配列番号116分離株NL2301のG遺伝子コード配列配列番号117分離株NL2901のG遺伝子コード配列配列番号118分離株NL302のG遺伝子コード配列配列番号119分離株NL199のG遺伝子コード配列配列番号120分離株NL1100のG遺伝子コード配列配列番号121分離株NL1200のG遺伝子コード配列配列番号122分離株NL501のG遺伝子コード配列配列番号123分離株NL901のG遺伝子コード配列配列番号124分離株NL2101のG遺伝子コード配列配列番号125分離株NL194のG遺伝子コード配列配列番号126分離株NL182のG遺伝子コード配列配列番号127分離株NL196のG遺伝子コード配列配列番号128分離株NL697のG遺伝子コード配列配列番号129分離株NL900のG遺伝子コード配列配列番号130分離株NL301のG遺伝子コード配列配列番号131分離株NL401のG遺伝子コード配列配列番号132分離株UK501のG遺伝子コード配列配列番号133分離株NL100のGタンパク質配列配列番号134分離株BR201のGタンパク質配列配列番号135分離株FL401のGタンパク質配列配列番号136分離株FL301のGタンパク質配列配列番号137分離株FL801のGタンパク質配列配列番号138分離株FL1001のGタンパク質配列配列番号139分離株NL1001のGタンパク質配列配列番号140分離株NL202のGタンパク質配列配列番号141分離株NL1700のGタンパク質配列配列番号142分離株NL181のGタンパク質配列配列番号143分離株NL193のGタンパク質配列配列番号144分離株NL293のGタンパク質配列配列番号145分離株NL393のGタンパク質配列配列番号146分離株NL195のGタンパク質配列配列番号147分離株NL296のGタンパク質配列配列番号148分離株NL396のGタンパク質配列配列番号149分離株NL2201のGタンパク質配列配列番号150分離株NL2401のGタンパク質配列配列番号151分離株NL2301のGタンパク質配列配列番号152分離株NL2901のGタンパク質配列配列番号153分離株NL302のGタンパク質配列配列番号154分離株NLl99のGタンパク質配列配列番号155分離株NL1100のGタンパク質配列配列番号156分離株NL1200のGタンパク質配列配列番号157分離株NL501のGタンパク質配列配列番号158分離株NL901のGタンパク質配列配列番号159分離株NL2101のGタンパク質配列配列番号160分離株NL194のGタンパク質配列配列番号161分離株NL182のGタンパク質配列配列番号162分離株NL196のGタンパク質配列配列番号163分離株NL697のGタンパク質配列配列番号164分離株NL900のGタンパク質配列配列番号165分離株NL301のGタンパク質配列配列番号166分離株NL401のGタンパク質配列配列番号167分離株NL501のGタンパク質配列配列番号168分離株NL100のF遺伝子コード配列配列番号169分離株UK100のF遺伝子コード配列配列番号170分離株NL200のF遺伝子コード配列配列番号171分離株NL1300のF遺伝子コード配列配列番号172分離株NL1400のF遺伝子コード配列配列番号173分離株FL301のF遺伝子コード配列配列番号174分離株FL401のF遺伝子コード配列配列番号175分離株FL801のF遺伝子コード配列配列番号176分離株UK101のF遺伝子コード配列配列番号177分離株UK701のF遺伝子コード配列配列番号178分離株FL1001のF遺伝子コード配列配列番号179分離株NL601のF遺伝子コード配列配列番号180分離株NL801のF遺伝子コード配列配列番号181分離株NL1001のF遺伝子コード配列配列番号182分離株NL1401のF遺伝子コード配列配列番号183分離株NL2001のF遺伝子コード配列配列番号184分離株NL2501のF遺伝子コード配列配列番号185分離株NL2601のF遺伝子コード配列配列番号186分離株NL2801のF遺伝子コード配列配列番号187分離株NL3001のF遺伝子コード配列配列番号188分離株BR201のF遺伝子コード配列配列番号189分離株BR301のF遺伝子コード配列配列番号190分離株NL202のF遺伝子コード配列配列番号191分離株NL402のF遺伝子コード配列配列番号192分離株NL502のF遺伝子コード配列配列番号193分離株NL602のF遺伝子コード配列配列番号194分離株NL702のF遺伝子コード配列配列番号195分離株NL902のF遺伝子コード配列配列番号196分離株FL102のF遺伝子コード配列配列番号197分離株NL181のF遺伝子コード配列配列番号198分離株NL193のF遺伝子コード配列配列番号199分離株NL293のF遺伝子コード配列配列番号200分離株NL493のF遺伝子コード配列配列番号201分離株NL195のF遺伝子コード配列配列番号202分離株NL296のF遺伝子コード配列配列番号203分離株NL396のF遺伝子コード配列配列番号204分離株NL198のF遺伝子コード配列配列番号205分離株NL1700のF遺伝子コード配列配列番号206分離株NL2201のF遺伝子コード配列配列番号207分離株NL2901のF遺伝子コード配列配列番号208分離株NL2301のF遺伝子コード配列配列番号209分離株NL1701のF遺伝子コード配列配列番号210分離株NL2401のF遺伝子コード配列配列番号211分離株NL302のF遺伝子コード配列配列番号212分離株NL398のF遺伝子コード配列配列番号213分離株NL199のF遺伝子コード配列配列番号214分離株NL299のF遺伝子コード配列配列番号215分離株NL399のF遺伝子コード配列配列番号216分離株NL1100のF遺伝子コード配列配列番号217分離株NL1200のF遺伝子コード配列配列番号218分離株NL101のF遺伝子コード配列配列番号219分離株NL501のF遺伝子コード配列配列番号220分離株NL901のF遺伝子コード配列配列番号221分離株NL1901のF遺伝子コード配列配列番号222分離株NL2101のF遺伝子コード配列配列番号223分離株UK1101のF遺伝子コード配列配列番号224分離株FL101のF遺伝子コード配列配列番号225分離株FL201のF遺伝子コード配列配列番号226分離株FL501のF遺伝子コード配列配列番号227分離株FL701のF遺伝子コード配列配列番号228分離株FL901のF遺伝子コード配列配列番号229分離株UK1001のF遺伝子コード配列配列番号230分離株NL102のF遺伝子コード配列配列番号231分離株NL194のF遺伝子コード配列配列番号232分離株NL196のF遺伝子コード配列配列番号233分離株NL697のF遺伝子コード配列配列番号234分離株NL700のF遺伝子コード配列配列番号235分離株NL900のF遺伝子コード配列配列番号236分離株NL1900のF遺伝子コード配列配列番号237分離株NL2800のF遺伝子コード配列配列番号238分離株NL301のF遺伝子コード配列配列番号239分離株NL401のF遺伝子コード配列配列番号240分離株NL1101のF遺伝子コード配列配列番号241分離株NL1501のF遺伝子コード配列配列番号242分離株NL1801のF遺伝子コード配列配列番号243分離株FL601のF遺伝子コード配列配列番号244分離株UK501のF遺伝子コード配列配列番号245分離株UK801のF遺伝子コード配列配列番号246分離株NL1202のF遺伝子コード配列配列番号247分離株HK102のF遺伝子コード配列配列番号248分離株NL100のFタンパク質配列配列番号249分離株UK100のFタンパク質配列配列番号250分離株NL200のFタンパク質配列配列番号251分離株NL1300のFタンパク質配列配列番号252分離株NL1400のFタンパク質配列配列番号253分離株FL301のFタンパク質配列配列番号254分離株FL401のFタンパク質配列配列番号255分離株FL801のFタンパク質配列配列番号256分離株UK101のFタンパク質配列配列番号257分離株UK701のFタンパク質配列配列番号258分離株FL1001のFタンパク質配列配列番号259分離株NL601のFタンパク質配列配列番号260分離株NL801のFタンパク質配列配列番号261分離株NL1001のFタンパク質配列配列番号262分離株NL1401のFタンパク質配列配列番号263分離株NL2001のFタンパク質配列配列番号264分離株NL2501のFタンパク質配列配列番号265分離株NL2601のFタンパク質配列配列番号266分離株NL2801のFタンパク質配列配列番号267分離株NL3001のFタンパク質配列配列番号268分離株BR201のFタンパク質配列配列番号269分離株BR301のFタンパク質配列配列番号270分離株NL202のFタンパク質配列配列番号271分離株NL402のFタンパク質配列配列番号272分離株NL502のFタンパク質配列配列番号273分離株NL602のFタンパク質配列配列番号274分離株NL702のFタンパク質配列配列番号275分離株NL902のFタンパク質配列配列番号276分離株FL102のFタンパク質配列配列番号277分離株NL181のFタンパク質配列配列番号278分離株NL193のFタンパク質配列配列番号279分離株NL293のFタンパク質配列配列番号280分離株NL493のFタンパク質配列配列番号281分離株NL195のFタンパク質配列配列番号282分離株NL296のFタンパク質配列配列番号283分離株NL396のFタンパク質配列配列番号284分離株NL198のFタンパク質配列配列番号285分離株NL1700のFタンパク質配列配列番号286分離株NL2201のFタンパク質配列配列番号287分離株NL2901のFタンパク質配列配列番号288分離株NL2301のFタンパク質配列配列番号289分離株NL1701のFタンパク質配列配列番号290分離株NL2401のFタンパク質配列配列番号291分離株NL302のFタンパク質配列配列番号292分離株NL398のFタンパク質配列配列番号293分離株NLl99のFタンパク質配列配列番号294分離株NL299のFタンパク質配列配列番号295分離株NL399のFタンパク質配列配列番号296分離株NL1100のFタンパク質配列配列番号297分離株NL1200のFタンパク質配列配列番号298分離株NL101のFタンパク質配列配列番号299分離株NL501のFタンパク質配列配列番号300分離株NL901のFタンパク質配列配列番号301分離株NL1901のFタンパク質配列配列番号302分離株NL2101のFタンパク質配列配列番号303分離株UK1101のFタンパク質配列配列番号304分離株FL101のFタンパク質配列配列番号305分離株FL201のFタンパク質配列配列番号306分離株FL501のFタンパク質配列配列番号307分離株FL701のFタンパク質配列配列番号308分離株FL901のFタンパク質配列配列番号309分離株UK1001のFタンパク質配列配列番号310分離株NL102のFタンパク質配列配列番号311分離株NL194のFタンパク質配列配列番号312分離株NL196のFタンパク質配列配列番号313分離株NL697のFタンパク質配列配列番号314分離株NL700のFタンパク質配列配列番号315分離株NL900のFタンパク質配列配列番号316分離株NL1900のFタンパク質配列配列番号317分離株NL2800のFタンパク質配列配列番号318分離株NL301のFタンパク質配列配列番号319分離株NL401のFタンパク質配列配列番号320分離株NL1101のFタンパク質配列配列番号321分離株NL1501のFタンパク質配列配列番号322分離株NL1801のFタンパク質配列配列番号323分離株FL601のFタンパク質配列配列番号324分離株UK501のFタンパク質配列配列番号325分離株UK801のFタンパク質配列配列番号326分離株NL1202のFタンパク質配列配列番号327分離株HK102のFタンパク質配列