"TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、1TRAILの円順列変異形および前記円順列変異形のN末端および/またはC末端に位置するオリゴペプチドを含む融合タンパク質であって、前記オリゴペプチドは3~10個のヒスチジン残基からなる繰り返し配列を含有し、TRAILの前記円順列変異形のN末端からC末端までの成分は、aTRAILのアミノ酸135~281、bリンカー、および、cTRAILのアミノ酸121~135もしくはTRAILのアミノ酸114~135もしくはTRAILのアミノ酸95~135、もしくはTRAILのアミノ酸121~135を含有するTRAILのアミノ酸95~135の任意のフラグメントである、または、21と少なくとも80アミノ酸配列同一性を有するTRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号5に示すTRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも20である腫瘍阻害活性を有する、または、31つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、もしくは付加による1のアミノ酸配列に由来するTRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号5に示すTRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも20である腫瘍阻害活性を有する、融合タンパク質。前記N末端および/またはC末端での前記オリゴペプチド内のヒスチジン残基の数は、3~9個である請求項1に記載の融合タンパク質。前記N末端での前記オリゴペプチドは、構造MGa-Hisb式中、aは、0もしくは1である、およびbは、3~9の整数であるを含む請求項1に記載の融合タンパク質。cは、TRAILのアミノ酸121~135である請求項1に記載の融合タンパク質。前記リンカーは、長さが3~15アミノ酸である請求項1に記載の融合タンパク質。前記リンカーのアミノ酸配列は、配列番号41、42および43からなる群から選択される請求項5に記載の融合タンパク質。前記TRAILのアミノ酸135~281は配列番号37であり、前記TRAILのアミノ酸121~135は配列番号38であり、前記TRAILの前記アミノ酸95~135は配列番号39であり、前記TRAILのアミノ酸114~135は配列番号40である請求項1に記載の融合タンパク質。その配列は、配列番号5~11および15~16からなる群から選択される請求項1に記載の融合タンパク質。請求項1に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸。請求項9に記載の核酸を含むベクター。請求項10に記載のベクターを含む宿主細胞。腫瘍を治療するための医薬組成物であって、請求項1に記載の融合タンパク質を含み、任意に腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物をさらに含む医薬組成物。腫瘍を治療するための前記追加の薬物は、メルファラン、デキサメタゾン、サリドマイド、レナリドミド、ベルケード、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、シクロホスファミド、イリノテカン、プレドニゾン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、VP16、5-FUからなる群から選択される請求項12に記載の医薬組成物。腫瘍を治療するためのキットであって、請求項1に記載の融合タンパク質を含み、そして任意に腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物をさらに含むキット。腫瘍を治療するための前記融合タンパク質および前記追加の薬物は、一緒に混合される、または別個に配置される請求項14に記載のキット。腫瘍を治療するための前記追加の薬物は、メルファラン、デキサメタゾン、サリドマイド、レナリドミド、ベルケード、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、シクロホスファミド、イリノテカン、プレドニゾン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、VP16、および5-FUからなる群から選択される、請求項14に記載のキット。腫瘍を治療するための方法であって、被験者に請求項1に記載の融合タンパク質を投与する工程を含む方法。前記腫瘍は、多発性骨髄腫、リンパ腫、脾腫、黒色腫、神経膠腫、縦隔腫瘍、尿管腫瘍、婦人科腫瘍、内分泌系腫瘍、中枢神経系腫瘍、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、腸癌、肝臓癌、膵臓癌、直腸癌、腎腺癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、白血病、肺癌、多発性骨髄腫および結腸癌からなる群から選択される請求項17に記載の方法。腫瘍を治療するために前記被験者に1つ以上の追加の薬物を投与する工程をさらに含む請求項17に記載の方法。腫瘍を治療するための前記追加の薬物は、メルファラン、デキサメタゾン、サリドマイド、レナリドミド、ベルケード、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、シクロホスファミド、イリノテカン、プレドニゾン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、VP16、および5-FUからなる群から選択される請求項19に記載の方法。高活性の変異TRAIL/APO2Lを獲得するために野生型TRAIL/APO2Lの構造を再構築して改変する。本発明は、TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、1TRAILの円順列変異形および前記変異形のN末端および/またはC末端に位置するオリゴペプチドを含む融合タンパク質であって、前記オリゴペプチドは3~10個のヒスチジン残基からなる繰り返し配列を含み、前記TRAILの円順列変異形のN末端からC末端までの成分は、aTRAILのアミノ酸135~281、bリンカー、およびcTRAILのアミノ酸121~135もしくはTRAILのアミノ酸114~135もしくはTRAILのアミノ酸95~135、もしくはTRAILのアミノ酸121~135を含有するTRAILのアミノ酸95~135の任意のフラグメントである、または21と少なくとも80、好ましくは85、90、95、96、97、98、もしくは99アミノ酸配列同一性を有するTRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号5に規定した前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも20、例えば90~110、80~120、70~130、60~140、50~150、40~160、30~170、20~180、若しくはそれ以上である腫瘍阻害活性を有する。同一性は、当該技術分野において周知の方法、例えばBLAST、デフォルトパラメータを用いて計算する。例えば、Altschuletal.,J.Mol.Biol.1990;215:403-410;Altschuletal.,NucleicAcidsRes.1997;25:3389-4021997を参照されたい。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形のアミノ酸配列内にのみ存在する。また別の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形のa、bおよび/またはcのアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形以外のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形内ならびに前記TRAILの該円順列変異形以外のアミノ酸配列内に存在する。31つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加による1のアミノ酸配列に由来するTRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号5に規定した前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも20、例えば90~110、80~120、70~130、60~140、50~150、40~160、30~170、20~180、若しくはそれ以上である腫瘍阻害活性を有する融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形のアミノ酸配列内にのみ存在する。また別の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形のa、bおよび/またはcのアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形以外のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形内ならびに前記TRAILの該円順列変異形以外のアミノ酸配列内に存在する。一部の実施形態では、置換、欠失もしくは付加を受けたアミノ酸残基の数は、1~20個、1~15個、1~14個、1~13個、1~12個、1~11個、1~10個、1~9個、1~8個、1~7個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、または1個である。前記腫瘍阻害活性は、腫瘍細胞系、例えば肺癌、多発性骨髄腫および/または結腸腫瘍細胞系などに対する阻害活性によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、該腫瘍阻害活性は、腫瘍細胞系への死滅活性IC50によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、該腫瘍阻害活性は、肺癌細胞系に対するその阻害活性によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、腫瘍阻害活性は、肺癌細胞系への死滅活性IC50によって特徴付けることができ、例えば本明細書の実施例6に記載した方法によって測定されるIC50によって特徴付けることができる。前記TRAILのアミノ酸121~135を含有するTRAILのアミノ酸95~135の任意のフラグメントは、そのN末端がTRAILの95~121位のいずれかの位置にあり、C末端がTRAILの135位にあるTRAILのアミノ酸フラグメントを意味する。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のN末端および/またはC末端での該オリゴペプチド内のヒスチジン残基の数は、3~9個、好ましくは6~9個である。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のN末端にあるオリゴペプチドは、構造MGa-HiSb式中、aは0もしくは1である、およびbは3~9の整数、好ましくは6~9の整数であるを含んでいる。本明細書に記載したリンカーは、融合タンパク質分野において一般に使用されるリンカーであり、当業者であればそのようなリンカーを容易に設計および製造することができる。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のリンカーは、長さが3~15アミノ酸、好ましくは3~10アミノ酸、より好ましくは5~7アミノ酸であり、好ましくは、該リンカーのアミノ酸配列は、数個のGからなる、または1つのSが組み入れられた数個の連続するGからなる、およびより好ましくは該リンカーのアミノ酸配列は、配列番号41、42および43からなる群から選択される。本明細書に記載したTRAILには、天然TRAILおよび非天然TRAIL、好ましくは先行技術において開示された野生型ヒトTRAILを含む様々なTRAILが含まれるWileyetal.,1995;Pittietal.,1996。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内では、TRAILのアミノ酸135~281は配列番号37であり、TRAILのアミノ酸121~135は配列番号38であり、TRAILのアミノ酸95~135は配列番号39であり、TRAILのアミノ酸114~135は配列番号40である。本明細書に記載したTRAILのアミノ酸位置は、上記の野生型TRAIL内の位置である、または上記の野生型TRAILと最適にアライメントさせたときに対応する位置である。アライメントは、当該技術分野において周知の方法、例えばBLAST、デフォルトパラメータを用いて実施する。例えば、Altschuletal.,J.Mol.Biol.1990;215:403-410;Altschuletal.,NucleicAcidsRes.1997;25:3389-4021997を参照されたい。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質の配列は、配列番号5~11および15~16からなる群から選択される。本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする単離核酸に関する。本発明はまた、ベクター、好ましくは発現ベクター、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含むに関する。本発明はまた、上記ベクターを含む宿主細胞に関し、該宿主細胞は、細菌、真菌、植物、動物、ヒト由来など、例えば大腸菌由来である。本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含む、任意に、腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物をさらに含む、腫瘍を治療するための医薬組成物に関する。本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含む、および任意に腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物をさらに含む、腫瘍を治療するためのキットに関する。該キット内では、該融合タンパク質および腫瘍を治療するための追加の薬物は、一緒に混合される、または別個に配置される。本発明はまた、被験者に本発明の融合タンパク質を投与する工程を含む、任意に該被験者に腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物を投与する工程をさらに含む腫瘍を治療するための方法であって、該融合タンパク質は該追加の薬物と同時に、または連続的に投与されてよい、方法に関する。本発明はまた、腫瘍を治療するための医薬品の製造における本発明の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む組成物の使用であって、このとき前記医薬品は腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物をさらに含む使用に関する。本発明の一部の実施形態では、本明細書で使用する用語含む/含んでいる、包含する/包含している、有する/有しているは、全て~からなるを含んでいる。本明細書で記載した腫瘍には、多発性骨髄腫、リンパ腫、脾腫、黒色腫、神経膠腫、縦隔腫瘍、尿管腫瘍、婦人科腫瘍、内分泌系腫瘍、中枢神経系腫瘍、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、腸癌、肝臓癌、膵臓癌、直腸癌、腎腺癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、白血病などが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、腫瘍は、肺癌、多発性骨髄腫、および結腸癌から選択される。本明細書に記載した腫瘍を治療するための追加の薬物には、メルファラン、デキサメタゾン、サリドマイド、レナリドミド、ベルケード、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、シクロホスファミド、イリノテカン、プレドニゾン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、VP16、5-FUなどが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、腫瘍を治療するための追加の薬物は、メルファラン、プレドニゾン、パクリタキセル、およびカルボプラチンからなる群から選択される。本発明は、TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、1TRAILの円順列変異形および前記変異形のN末端および/またはC末端に位置するオリゴペプチドを含む融合タンパク質であって、前記オリゴペプチドは3~10個のヒスチジン残基からなる繰り返し配列を含み、前記TRAILの円順列変異形のN末端からC末端までの成分は、aTRAILのアミノ酸135~281、bリンカー、およびcTRAILのアミノ酸121~135もしくはTRAILのアミノ酸114~135もしくはTRAILのアミノ酸95~135、もしくはTRAILのアミノ酸121~135を含有するTRAILのアミノ酸95~135の任意のフラグメントである、または21と少なくとも80、好ましくは85、90、95、96、97、98、もしくは99アミノ酸配列同一性を有するTRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号5に規定した前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも20、例えば90~110、80~120、70~130、60~140、50~150、40~160、30~170、20~180、若しくはそれ以上である腫瘍阻害活性を有する。同一性は、当該技術分野において周知の方法、例えばBLAST、デフォルトパラメータを用いて計算する。例えば、Altschuletal.,J.Mol.Biol.1990;215:403-410;Altschuletal.,NucleicAcidsRes.1997;25:3389-4021997を参照されたい。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形のアミノ酸配列内にのみ存在する。また別の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形のa、bおよび/またはcのアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形以外のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形内ならびに前記TRAILの該円順列変異形以外のアミノ酸配列内に存在する。31つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加による1のアミノ酸配列に由来するTRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号5に規定した前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも20、例えば90~110、80~120、70~130、60~140、50~150、40~160、30~170、20~180、若しくはそれ以上である腫瘍阻害活性を有する融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形のアミノ酸配列内にのみ存在する。また別の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形のa、bおよび/またはcのアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形以外のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと1との差は、前記TRAILの円順列変異形内ならびに前記TRAILの該円順列変異形以外のアミノ酸配列内に存在する。一部の実施形態では、置換、欠失もしくは付加を受けたアミノ酸残基の数は、1~20個、1~15個、1~14個、1~13個、1~12個、1~11個、1~10個、1~9個、1~8個、1~7個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、または1個である。前記腫瘍阻害活性は、腫瘍細胞系、例えば肺癌、多発性骨髄腫および/または結腸腫瘍細胞系などに対する阻害活性によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、該腫瘍阻害活性は、腫瘍細胞系への死滅活性IC50によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、該腫瘍阻害活性は、肺癌細胞系に対するその阻害活性によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、腫瘍阻害活性は、肺癌細胞系への死滅活性IC50によって特徴付けることができ、例えば本明細書の実施例6に記載した方法によって測定されるIC50によって特徴付けることができる。前記TRAILのアミノ酸121~135を含有するTRAILのアミノ酸95~135の任意のフラグメントは、そのN末端がTRAILの95~121位のいずれかの位置にあり、C末端がTRAILの135位にあるTRAILのアミノ酸フラグメントを意味する。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のN末端および/またはC末端での該オリゴペプチド内のヒスチジン残基の数は、3~9個、好ましくは6~9個である。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のN末端にあるオリゴペプチドは、構造MGa-HiSb式中、aは0もしくは1である、およびbは3~9の整数、好ましくは6~9の整数であるを含んでいる。本明細書に記載したリンカーは、融合タンパク質分野において一般に使用されるリンカーであり、当業者であればそのようなリンカーを容易に設計および製造することができる。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内のリンカーは、長さが3~15アミノ酸、好ましくは3~10アミノ酸、より好ましくは5~7アミノ酸であり、好ましくは、該リンカーのアミノ酸配列は、数個のGからなる、または1つのSが組み入れられた数個の連続するGからなる、およびより好ましくは該リンカーのアミノ酸配列は、配列番号41、42および43からなる群から選択される。本明細書に記載したTRAILには、天然TRAILおよび非天然TRAIL、好ましくは先行技術において開示された野生型ヒトTRAILを含む様々なTRAILが含まれるWileyetal.,1995;Pittietal.,1996。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質内では、TRAILのアミノ酸135~281は配列番号37であり、TRAILのアミノ酸121~135は配列番号38であり、TRAILのアミノ酸95~135は配列番号39であり、TRAILのアミノ酸114~135は配列番号40である。本明細書に記載したTRAILのアミノ酸位置は、上記の野生型TRAIL内の位置である、または上記の野生型TRAILと最適にアライメントさせたときに対応する位置である。アライメントは、当該技術分野において周知の方法、例えばBLAST、デフォルトパラメータを用いて実施する。例えば、Altschuletal.,J.Mol.Biol.1990;215:403-410;Altschuletal.,NucleicAcidsRes.1997;25:3389-4021997を参照されたい。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質の配列は、配列番号5~11および15~16からなる群から選択される。本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする単離核酸に関する。本発明はまた、ベクター、好ましくは発現ベクター、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含むに関する。本発明はまた、上記ベクターを含む宿主細胞に関し、該宿主細胞は、細菌、真菌、植物、動物、ヒト由来など、例えば大腸菌由来である。本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含む、任意に、腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物をさらに含む、腫瘍を治療するための医薬組成物に関する。本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含む、および任意に腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物をさらに含む、腫瘍を治療するためのキットに関する。該キット内では、該融合タンパク質および腫瘍を治療するための追加の薬物は、一緒に混合される、または別個に配置される。本発明はまた、被験者に本発明の融合タンパク質を投与する工程を含む、任意に該被験者に腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物を投与する工程をさらに含む腫瘍を治療するための方法であって、該融合タンパク質は該追加の薬物と同時に、または連続的に投与されてよい、方法に関する。本発明はまた、腫瘍を治療するための医薬品の製造における本発明の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む組成物の使用であって、このとき前記医薬品は腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物をさらに含む使用に関する。本発明の一部の実施形態では、本明細書で使用する用語含む/含んでいる、包含する/包含している、有する/有しているは、全て~からなるを含んでいる。本明細書で記載した腫瘍には、多発性骨髄腫、リンパ腫、脾腫、黒色腫、神経膠腫、縦隔腫瘍、尿管腫瘍、婦人科腫瘍、内分泌系腫瘍、中枢神経系腫瘍、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、腸癌、肝臓癌、膵臓癌、直腸癌、腎腺癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、白血病などが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、腫瘍は、肺癌、多発性骨髄腫、および結腸癌から選択される。本明細書に記載した腫瘍を治療するための追加の薬物には、メルファラン、デキサメタゾン、サリドマイド、レナリドミド、ベルケード、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、シクロホスファミド、イリノテカン、プレドニゾン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、VP16、5-FUなどが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、腫瘍を治療するための追加の薬物は、メルファラン、プレドニゾン、パクリタキセル、およびカルボプラチンからなる群から選択される。実施例1野生型ヒトTRAILコーディング遺伝子の構築野生型ヒトTRAILのアミノ酸114~281の配列を発現する遺伝子を含有するプラスミドを構築した。1第1工程PCRPCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてヒト脾臓cDNAライブラリーClontech社ならびに、添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP1、P2を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P1:cgttcatatggtgagagaaagaggtcctcagagag配列番号17P2:cttaggatccttagccaactaaaaaggccccgaaaaaac配列番号182TRAILプラスミドの構築先行工程の結果として生じたPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET42a内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒトTRAIL遺伝子の発現プラスミドはDNAシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをpET42a-TRAIL114-281と命名した。実施例2組み換えヒト円順列変異TRAILを発現する遺伝子の構築組み換えヒト円順列変異TRAIL円順列変異TRAIL、CPTと称するをコードする遺伝子を構築した。N末端からC末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、aTRAILのアミノ酸135~281、bリンカー、およびcTRAILのアミノ酸122~135である。1第1工程PCR増幅PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドpET42a-TRAIL114-281ならびに、添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP3、P4を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P3:catgcatatgacattgtcttctccaaactc配列番号19P4:agttatgtgagctgctacaccaccaccaccaccgccaactaaaaaggccccaaaaaaactg配列番号202第2工程PCRPCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第1工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP3、P5を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P5:cgggatccttatgtgttgcttcttcctctggtcccagttatgtgagctgctacaccaccBamHI制限部位配列番号213CPTプラスミドの構築第2工程のPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET42a内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒト円順列変異TRAILの発現プラスミドはDNAシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをpET42a-CPTと命名した。実施例3様々な組み換えヒト円順列変異TRAILをコードする新規遺伝子の構築1.組み換えヒト新規円順列変異TRAIL-1新規円順列変異TRAIL-1、NCPT-1と称するをコードする遺伝子の構築。N末端からC末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、aTRAILのアミノ酸135~281、bリンカー、およびcTRAILのアミノ酸121~135である。1TRAILのアミノ酸135~281をコードする遺伝子のPCR増幅PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてヒト脾臓cDNAライブラリーClontech社、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P7を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P6:ggaattccatatgacattgtcttctccaaactccaagNdeI制限部位配列番号22P7:cgggatccgccaactaaaaaggccccaaaaaaactggcttcBamHI制限部位配列番号23PCR産物およびプラスミドpET42aNovagen社は、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4DNAリガーゼによってライゲーションした。ライゲーション産物は、コンピテントBL21DE3Invitrogen社細菌内に形質転換させた。形質転換された細菌をプレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。陽性クローンをその後にDNAシーケンシングによって確証した。構築したプラスミドをpET42a-TRAIL135-281と命名した。2第2工程PCRPCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドpET42a-TRAIL135-281、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P8を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P8:agttatgtgagctgctactctaccaccaccaccaccgccaactaaaaaggccccaaaaaaactg配列番号243第3工程PCRPCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第2工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P9を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P9:cgggatccttatgtgttgcttcttcctctggtcccagttatgtgagctgctactctaccaccBamHI制限部位配列番号254NCPT-1プラスミドの構築第3工程のPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET42a内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒトNCPT-1遺伝子の発現プラスミドはDNAシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをpET42a-NCPT-1と命名した。2.組み換えヒト新規円順列変異TRAIL-2新規円順列変異TRAIL-2、NCPT-2と称するをコードする遺伝子の構築。N末端からC末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、aTRAILのアミノ酸135~281、bリンカー、およびcTRAILのアミノ酸95~135である。1第1工程PCRPCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドpET42a-TRAIL135-281、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P10を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P10:agaaatggtttcctcagaggtaccaccaccaccaccgccaactaaaaaggccccaaaaaaactg配列番号262第2工程PCRPCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第1工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P11を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P11:tctcactaggggagaaatattttgttgcttttcttgaactgtagaaatggtttcctcagag配列番号273第3工程PCRPCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第2工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P12を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P12:cagttatgtgagctgctactctctgaggacctctttctctcactaggggagaaatattttg配列番号284第4工程PCRPCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第3工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P13を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P13:cgggatccttatgtgttgcttcttcctctggtcccagttatgtgagctgctac配列番号295NCPT-2プラスミドの構築第4工程の結果として生じたPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET42a内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒト円順列変異TRAILNCPT-2の発現プラスミドはDNAシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをpET42a-NCPT-2と命名した。3.組み換えヒト新規円順列変異TRAIL-3新規円順列変異TRAIL-3、NCPT-3と称するをコードする遺伝子の構築。N末端からC末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、aTRAILのアミノ酸135~281、bリンカー、およびcTRAILのアミノ酸114~135である1第1工程PCRPCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドpET42a-TRAIL135-281、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P14を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P14:gagctgctactctctgaggacctctttctctcacaccaccaccaccaccgccaactaaaaaggccccaaaaaaactg配列番号302第2工程PCRPCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第1工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P15を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P15:cgggatccttatgtgttgcttcttcctctggtcccagttatgtgagctgctactctctgagg配列番号313NCPT-3プラスミドの構築第2工程のPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET42a内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒト円順列変異TRAILNCPT-3の発現プラスミドはDNAシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをpET42a-NCPT-3と命名した。実施例4NCPT-1、NCPT-2、およびNCPT-3の様々な変異体をコードする遺伝子の構築1.NCPT-1.M1をコードする遺伝子の構築Met-Gly-His-His-His-His-His-His遺伝子配列を、NCPT-1をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりMet-Gly-His-His-His-His-His-Hisアミノ酸配列をNCPT-1ポリペプチドのN末端へ融合させたMGHis6NCPT-1。PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドpET42a-NCPT-1、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP16、P9を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P16:catgccatgggccaccaccaccaccaccacacattgtcttctccaaactc配列番号32先行工程の結果として生じたPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET28b内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。その後に陽性クローンをDNAシーケンシングによって確証し、生じたプラスミドをpET28b-NCPT-1.M1と命名した。2.NCPT-1.M2をコードする遺伝子の構築Met-Glyアミノ酸配列をNCPT-1ポリペプチドのN末端に融合させ、His-His-His-His-His-Hisアミノ酸配列をNCPT-1ポリペプチドのC末端に融合させたMGNCPT-1His6。PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてpET42a-NCPT-1、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP18、P17を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P17:cgggatccttagtggtggtggtggtggtgtgtgttgcttcttcctctggtcccagttatgtg配列番号33P18:catgccatgggcacattgtcttctccaaactc配列番号34先行工程の結果として生じたPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET28b内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。その後に陽性クローンをDNAシーケンシングによって確証し、生じたプラスミドをpET28b-NCPT-1.M2と命名した。3.NCPT-1.M3をコードする遺伝子の構築Met-Gly-His-His-Hisアミノ酸配列をNCPT-1ポリペプチド配列のN末端に融合させたMGHis3NCPT-1。PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドpET42a-NCPT-1、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP19、P9を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P19:catgccatgggccaccaccacacattgtcttctccaaactc配列番号35先行工程の結果として生じたPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET28b内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。その後に陽性クローンをDNAシーケンシングによって確証し、生じたプラスミドをpET28b-NCPT-1.M3と命名した。4.NCPT-1.M4をコードする遺伝子の構築His-His-His-His-His-His遺伝子配列を、NCPT-1をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりHis-His-His-His-His-Hisアミノ酸配列をNCPT-1ポリペプチドのN末端へ融合させたHis6NCPT-1。PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドpET42a-NCPT-1、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼInvitrogen社を使用する下流および上流プライマーとしてのP20、P9を用いて実施した。1分間の94°Cでの変性、1分間の55°Cでのアニーリングおよび1分間の68°Cでの伸長の30サイクル、ならびに10分間の68°Cでの伸長の最終サイクル。P20:catgcatatgcaccaccaccaccaccacacattgtcttctccaaactc配列番号36先行工程の結果として生じたPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET42a内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。その後に陽性クローンをDNAシーケンシングによって確証し、生じたプラスミドをpET42a-NCPT-1.M4と命名した。他の変異体、つまりNCPT-1.M5、NCPT-1.M6、NCPT-1.M7、NCPT-1.M8、NCPT-1.M9、NCPT-1.M10、NCPT-2.M11、NCPT-3.M12は、上記の方法およびMolecularcloning:alaboratorymanualにしたがって構築できる。NCPT-1.M5の構築:Met-Gly-His-His-His-His-His-Hisアミノ酸配列をNCPT-1ポリペプチドのN末端にGly-Ser-Gly-Gly-Glyのアミノ酸配列を備えるリンカーを使用して融合させたMGHis6NCPT-1_linker:GSGGG。NCPT-1.M6の構築:Met-Gly-His-His-His-His-His-Hisアミノ酸配列をNCPT-1ポリペプチドのN末端にGly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Glyのアミノ酸配列を備えるリンカーを使用して融合させたMGHis6NCPT-1_linker:GGSGGGG。NCPT-1.M7の構築:Met-Gly-His-His-His-His-His-His-His-His-His遺伝子配列をNCPT-1をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりMet-Gly-His-His-His-His-His-His-His-His-Hisアミノ酸配列をNCPT-1ポリペプチドのN末端へ融合させたMGHis9NCPT-1。NCPT-1.M8の構築:Met-GlyおよびTRAILのアミノ酸129-134をNCPT-1ポリペプチドのN末端に融合させたMG129-134NCPT-1。NCPT-1.M9の構築:Met-Gly-Asn-Asn-Asn-Asn-Asn-Asn遺伝子配列を、NCPT-1をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりMet-Gly-Asn-Asn-Asn-Asn-Asn-Asnアミノ酸配列をNCPT-1ポリペプチドのN末端へ融合させたMGAsn6NCPT-1。NCPT-1.M10の構築:Met-Glyアミノ酸配列をNCPT-1ポリペプチドのN末端に融合させ、TRAILのアミノ酸136-141をNCPT-1ポリペプチドのC末端に融合させたMGNCPT-1aa136-141。NCPT-1.M11の構築:Met-Gly-His-His-His-His-His-His遺伝子配列を、NCPT-2をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりMet-Gly-His-His-His-His-His-Hisアミノ酸配列をNCPT-2ポリペプチドのN末端へ融合させたMGHis6NCPT-2。NCPT-1.M12の構築:Met-Gly-His-His-His-His-His-His遺伝子配列を、NCPT-3をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりMet-Gly-His-His-His-His-His-Hisアミノ酸配列をNCPT-3ポリペプチドのN末端へ融合させたMGHis6NCPT-3。実施例5TRAILの組み換えヒト円順列変異形およびその変異体の発現および精製発現プラスミドを大腸菌の菌株BL21DE3内に形質転換させ、形質転換大腸菌を20μg/mLのカナマイシンを含有する10mLのLB液体培地中に植菌し、37°Cで12時間にわたり振盪台上で培養した。次に10mLの培養を20μg/mLのカナマイシンを含有する1LのLB液体培地中に植菌して培養し、OD600値が0.6に達した時点に、タンパク質発現を誘導するために0.2mLの1MのIPTGを1Lの培養に加えた。3時間の誘導後、細胞を遠心により収集し、100mMのTrispH7.9、150mMのNaClを含有する100mLのバッファ中にペレットを懸濁させた。細胞を4°Cでの超音波処理によって溶解させた後、溶解液はBeckmanJA20ロータを備える遠心分離装置で15,000rpmで遠心した。発現したタンパク質は金属キレート樹脂に結合できるので、金属キレートクロマトグラフィによって精製できる。遠心後、上清は樹脂を含有するNiクロマトグラフィカラム内にポンプで供給し、その中の夾雑タンパク質は50mMのTrispH7.9、0.5MのNaClおよび50mMのイミダゾールを含有するバッファを用いてすすぎ、除去した。次に結合したタンパク質は、50mMのTrispH7.9、0.5MNaClおよび200mMのイミダゾールを含有するバッファを用いて溶出させ、溶出したタンパク質はPBSバッファに対して透析した。最後に、タンパク質はAKTAHPLCシステムPharmacia社上に取り付けたイオン交換カラムおよびSuperdex200Pharmacia社ゲルクロマトグラフィによって精製した。当該精製タンパク質を-80°Cで貯蔵し、その後の使用のために分子量およびアミノ酸配列を決定した。実施例6肺癌細胞系へのNCPT-1、NCPT-2、およびNCPT-3の様々な変異体の死滅活性についてのアッセイNCI-H460細胞ATCCを対数増殖期までフラスコ内で培養し、0.25トリプシンAmresco社を用いて消化し、遠心によって収集し1,000rpm、5分間、3ウシ胎児血清FBSを含有するRPMI1640培地Invitrogen社中に再懸濁させ、計数して1.5×105/mLの細胞懸濁液に調製し、96ウエル培養プレートNunc社内に100μL/ウエルで添加し、37°Cで5のCO2インキュベータ内で一晩インキュベートした。試験対象のサンプルは、3のFBSを含有する1640培地を用いて所定の濃度へ希釈し、さらに4倍希釈液8倍希釈液へ希釈した。培養プレート内の上清を廃棄し、試験対象のサンプルの連続希釈液をプレートに陰性コントロールおよび取り置いたブランクコントロールとともに100μL/ウエルで添加し、37°Cの5のCO2下で20~24時間インキュベートした。顕微鏡下の検査の後、上清を廃棄し、各ウエルに50μLの0.05クリスタルバイオレット溶液50mgクリスタルバイオレットを20mLの無水エタノール中に溶解させ、容積が100mLとなるように水を加え、その後室温で貯蔵したを加え、3~5分間染色した。クリスタルバイオレットを流水で注意深く洗浄し、残留水を脱水spindryingによって除去し、脱染溶液50mLの蒸留水、50mLの無水エタノール、および0.1mLの氷酢酸を完全に混合し、室温で貯蔵したを100μL/ウエルで加え、次にOD570での示数をマイクロプレートリーダBio-Rad680上で測定した参照波長:630nm。各サンプルの阻害濃度50IC50は、Sigmaplot10.0ソフトウエアを使用する4-パラメータLogisticfittingによって計算した。CPTならびにNCPT-1、NCPT-2、およびNCPT-3の各変異体についてのIC50を計算し、各変異体の活性変化を各変異体のIC50対CPTのIC50の比率として表示した表1。結果は、様々な変異体の中で、NCPT-1.M1、NCPT-1.M2、NCPT-1.M3、NCPT-1.M4、NCPT-1.M5、NCPT-1.M6、NCPT-1.M7、NCPT-2.M11、およびNCPT-3.M12の活性がCPTの活性より有意に高く、NCPT-1.M8およびNCPT-1.M9の活性はCPTの活性に比較して有意に減少し、そしてNCPT-1.M10の活性はCPTの活性に比較してわずかに減少していることを示している。実施例7NCPT-1.M1によるinvitroでの腫瘍細胞死滅における時間効果関係NCPT-1.M1による肺癌細胞系死滅の時間効果関係。H460細胞ATCCを37°Cで5のCO2インキュベータ内の細胞培養フラスコ中に10のFBSを含有するRPMI1640培地中で対数増殖期へ接着培養した。NCPT-1.M1を50ng/mLの最終濃度に加え、各々1時間、2時間、4時間および6時間培養し、その後に倒立位相差顕微鏡下で細胞の形態学的変化を観察した。ビヒクルvehicleコントロール群では、ビヒクル溶液の添加の6時間後に、細胞傷害の形態学的変化は認められなかった図1A。NCPT-1.M1添加の1時間後に、H460細胞の著明な形態学的変化は認められなかった図1B。NCPT-1.M1添加の2時間後、一部の細胞上では形態学的変化、細胞収縮、細胞膜小胞形成、屈折の減少が生じたが、剥離細胞はまだ希である図1C。NCPT-1.M1添加の4時間後、多数の細胞上で上記の形態学的変化が生じるが、剥離細胞は依然として希である図1D。NCPT-1.M1添加の6時間後、ほぼ全部の細胞が上記の形態学的変化を示し、フラスコ底部から剥離し、浮遊してペレットに凝集し、少数の正常細胞のみが散在した図1F。より高い倍率では、形態学的変化を備える細胞はアポトーシスに典型的な特徴、細胞質収縮、細胞収縮、膜小胞形成、複数のアポトーシス小体を結果として生じる、を示した図1E。結果は、NCPT-1.M1の1~2時間にわたるH460細胞とのインキュベーションは、形態学的アポトーシスの外観を生じさせ、6時間にわたるインキュベーションは最大数の細胞のアポトーシスを生じさせることを示している。NCPT-1.M1による多発性骨髄腫細胞系RPMI8226の死滅における時間効果関係多発性骨髄腫細胞系RPMI8226ATCCを死滅させることにおけるNCPT-1.M1の時間効果関係は、化学発光ATPliteLuminescenceAssaySystem、PerkinElmer社法を使用して測定した。対数増殖期にある細胞を遠心によって収集し1,000rpm、5分間、3のFBS-1640培地中に再懸濁させ、計数して2×105/mLの細胞懸濁液へ調整し、50μL/ウエルで96ウエル培養プレート内へ添加した。NCPT-1.M1サンプルは、3のFBS-1640培地を用いて500ng/mL、63ng/mL、7.8ng/mLへ希釈し、上記NCPT-1.M1サンプルを50μL/ウエルで50μLの細胞を含有する培養ウエル内にNCPT-1.M1の最終濃度が250ng/mL、31.5ng/mL、3.9ng/mLとなるように加え、陰性コントロールウエルにはNCPT-1.M1を含まない同一容積の培地を加え、上記全部をさらに37°Cの5のCO2下で培養した。NCPT-1.M1を用いた処理の1、3、6、8、24、48時間後に、細胞溶解バッファを30μL/ウエルでプレート内に加え、3分間振盪した。細胞が完全に溶解された時点で、細胞溶解液を除去し、90μL/ウエルで化学発光プレート内に加えた。化学発光基質溶液をプレート内に30μL/ウエルで加え、3分間振盪し、その後、示数を測定した。細胞におけるNCPT-1.M1の阻害率は、NCPT-1.M1処理細胞およびコントロール細胞の発光強度に基づいて計算する。結果は、RPMI8226細胞と250ng/mL、31.5ng/mL、3.9ng/mLのNCPT-1.M1との1時間のインキュベーションでは、阻害作用は全く観察されない。3時間で、程度の異なる阻害が検出され、正の用量-作用関係にしたがう。6時間で、最大阻害に達し、8、24、48時間後の阻害強度と有意に相違しないことを示している図2。実施例8NCPT-1.M1のinvitroでのアポトーシス誘導活性のアッセイ本実施例ではNCPT-1.M1が様々なヒト腫瘍細胞系に及ぼすアポトーシス誘導活性を検出する。1.ヒト多発性骨髄腫細胞RPMI8226のNCPT-1.M1誘導性アポトーシスに関する形態学的観察RPMI8226細胞ATCCを対数増殖期になるまで細胞培養フラスコ内で培養し、遠心で収集し、1×106/ウエルで完全培地10FBS-RPMI1640を用いて再懸濁させ、6ウエル細胞培養プレートCostar社内に加えた。NCPT-1.M1を完全培地で希釈し、200ng/mLの最終濃度に加え、37°Cで5のCO2インキュベータ内で3時間インキュベートした。細胞を収集し、スメアとして調製し、メタノールを用いて固定し、その後にメイグリュンバルトギムザMay-Gruenwald-Giemsa:MGG、メイグリュンバルト染色:BeijingZhongYeHengYuanChemicals社から市販、ギムザ染色:Solarbio社から市販染色を実施した。NCPT-1.M1と細胞との3時間のインキュベーション後に、アポトーシスの以下の明白な特徴:細胞質凝縮、細胞収縮、クロマチンの濃染、核の周辺でのクロマチン凝集、核凝縮、核崩壊、アポトーシス小体の形成が観察された図3。2.ヒト肺癌細胞系NCI-H460のアポトーシスの誘導を示しているTUNEL染色アポトーシスのプロセス中、ゲノムDNAは、二本鎖の低分子量DNAフラグメントおよび切断端ギャップを備える高分子量一本鎖DNAフラグメントに崩壊する可能性があり、これらDNA鎖のギャップは、酵素標識ヌクレオチド3’末端標識法を用いて同定することができる。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼTdTの触媒作用の場合、FITC標識ヌクレオチドは、テンプレート非依存性様式でフリー3’末端ヌクレオチドに組み込むことができ、それにより標識されたDNA鎖のギャップが作成されるTUNEL法。標識FITCは、ヒツジ由来Fabフラグメントに共役結合したホースラディッシュペルオキシダーゼPODによって認識できる。DAB3,3-ジアミノベンジジンでの顕色後、アポトーシス細胞であった褐色として染色された細胞を光学顕微鏡下で検査した。TUNELの技術は、アポトーシスを検出するための一般的方法である。NCI-H460細胞のNCPT-1.M1とのインキュベーション後のアポトーシスは、TUNEL技術を使用して検査した。対数増殖期にあるNCI-H460細胞10FBS-RPMI1640は、NCPT-1.M115ng/mLとともに4時間インキュベートし、次に全部の接着性および浮遊性細胞を収集し、PBSで2回洗浄し、PBSを用いて細胞懸濁液に調製し、スライドガラス上に塗布し、自然に風乾させ、室温で30分間かけて4パラホルムアルデヒド中で固定した。その他の手順はTUNELアポトーシス検出キットZK-8005、BeijingZhongshanGoldenBridgeBiotechnology社の取扱説明書にしたがって実施した。これらの結果は、NCPT-1.M115ng/mLとの4時間にわたるインキュベーション後に、多数のNCI-H460細胞はアポトーシスを経験し、核凝縮、多数の核フラグメントへのフラグメント化、様々なサイズの濃褐色顆粒を示すことを証明している図4B。陰性コントロール群ではアポトーシス細胞は全く見られない図4A。3.アポトーシス細胞内のヌクレオソーム間DNAフラグメント化の分析対数増殖期にあるNCI-H460細胞をNCPT-1.M1最終濃度、15mg/mLとともに2時間、4時間、6時間にわたりインキュベートし、培地コントロール群にはNCPT-1.M1を加えなかった。全接着性および浮遊性細胞およそ5×106を収集し、DNAを抽出したWenJinkun,Principlesandexperimentaltechniquesofmedicalmolecularbiology,236-2371999。DNAサンプルを除去し、6×ローディングバッファと混合し、1.8アガロースゲル臭化エチジウムの最終濃度、0.5μg/mL電気泳動にかけた。ゲルを紫外線源下で観察して撮影し、DNAフラグメント化について分析した。H460細胞をNCPT-1.M115ng/mLとともに2時間インキュベートすると、そのDNA電気泳動は、アポトーシスの主要な生化学的特徴である明瞭なラダーを示した[Cohen,AdvancesinImmunol.,50:55-851991]。これとは反対に、培地コントロール群のDNA電気泳動では、高分子に対応するバンドはローディングウエルに極めて近く、DNAフラグメント化ラダーは存在しない。NCPT-1.M1とのインキュベーション時間を増加させると、DNAラダーは弱く曖昧になって判読できなくなるが図5、これはおそらくDNAがより小さなフラグメントに分解したためと考えられる。4.カスパーゼ-8阻害剤は、NCPT-1.M1のアポトーシス誘導活性を阻害する。H460細胞は、1.2ng/mLおよび10ng/mLのNCPT-1.Ml培養法は上記と一緒であるとともに24時間インキュベートし、MTTアッセイによって測定した細胞生存率は各々60および16であった。30μmol/Lのカスパーゼ-8阻害剤であるzIETD-fmkSantaCruz社を加え、1時間後に、1.2ng/mLもしくは10ng/mLのNCPT-1.M1を加えて24時間、同時インキュベートし、そうして、結果として細胞生存率は各々100および90であった。結果は、カスパーゼ-8阻害剤がH460細胞へのNCPT-1.M1のアポトーシス活性の誘導を遮断したことを示しており、カスパーゼ-8の活性化がH460細胞上のNCPT-1.M1によって誘導されたアポトーシスのシグナル伝達経路に関係していることを示唆している図6。実施例9NCPT-1.M1のinvivoでのアポトーシス誘導活性のアッセイBalb/cnu無胸腺ヌードマウスBeijingHuafukangBiotechnology社にヒトMMRPMI8226腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍が700~800mm3の容積に増殖した時点で、マウスをコントロール群n=3およびCPT処置群n=3に分け、連続3日間にわたり1日1回、15mg/kgの用量でコントロールもしくはNCPT-1.M1を腹腔内注射した。第4日に、腫瘍容積を測定し上記と同一方法、全動物を致死させ、腫瘍を切除して、10ホルムアルデヒド溶液中で固定した。腫瘍組織は、様式化された方法にしたがってパラフィン中に包埋し、切片に切断してHE染色した。パラフィン包埋組織切片のアポトーシスアッセイは、TUNELアポトーシス検出キットZK-8005、BeijingZhongshanGoldenBridgeBiotechnology社の取扱説明書にしたがって実施した。連続3日間にわたるNCPT-1.M1を用いた処理後に、平均腫瘍容積は投与前の798mm3から286mm3へ有意に減少した。HE染色は、凝縮および破砕した青-黒染色の核、ならびに淡赤色の細胞質を備える多数のアポトーシス細胞を示している図7B。これとは反対に、正常細胞の核は、淡青もしくは青色である図7A。TUNEL染色後、アポトーシス細胞の核は茶色に染色される図7D。結果は、NCPT-1.M1処理により迅速に多数のMM腫瘍細胞のアポトーシスが生じ得ることを示している。実施例10NCPT-1.M1がヌードマウスにおける異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性ヒト結腸癌異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性:4~5週齢のBalb/cnu雄マウスInstituteofExperimentalAnimals、ChineseAcademyofMedicalSciences社にCOLO205ヒト結腸癌組織片を皮下接種した。腫瘍が約120mm3の容積まで増殖した時点で、担癌マウスを4つの群n=7/群に分け、生理食塩液陰性コントロール群、NCPT-1.M15mg/kg、NCPT-1.M115mg/kg、およびwtTRAIL15mg/kgを各々1日1回、連続10日間にわたり腹腔内注射した。投薬停止後、マウスを実験終了前にさらに12日間観察した。実験中、腫瘍の長い径aおよび幅広の径bを2日毎にノギスを用いて測定し、腫瘍容積TVを以下の式にしたがって計算した。TV=1/2×a×b2。上記から、相対腫瘍容積RTVは下記の式にしたがって計算した。RTV=Vt/V0。式中、V0は、投与当日であるが投与前つまりd0に測定した腫瘍容積であり、Vtは、各時点で測定した腫瘍容積である。相対腫瘍増殖率T/Cは、評価指数として使用する。評価基準:T/C>40は作用なしを意味する。T/C≦40およびP<0.05の統計的有意性は、有効であることを意味する。T/C=RTVT/RTVC100RTVT:治療群のRTV、RTVc:陰性コントロール群のRTV。表11から明らかなように、NCPT-1.M1およびwtTRAIL群の両方の2つの用量群のT/Cは、全部が<40、コントロール群と比較した場合にP<0.05であり、これはNCPT-1.M1およびwtTRAILの両方の2つの用量群がこの腫瘍モデルにおいて有効であることを証明している。15mg/kgの用量を用いた場合のwtTRAILの有効性は、同一用量を用いたNCPT-1.M1の有効性より有意に弱くP<0.05、5mg/kgの用量を用いたNCPT-1.M1の有効性に匹敵している。ヒト多発性骨髄腫の異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性:無胸腺ヌードマウスBeijingHuafukangBiotechnology社に5×106のRPMI8226腫瘍細胞/マウスを皮下接種した。腫瘍が500mm3の容積まで増殖した時点で、マウスを幾つかの群に分け、生理食塩液陰性コントロール群、NCPT-1.M115mg/kg、およびwtTRAIL15mg/kgまたは45mg/kgを各々1日1回、連続8日間にわたり腹腔内注射した。腫瘍容積は、2日毎にノギスを用いて測定した。用量15mg/kgを用いたNCPT-1.M1群の腫瘍増殖率は45mg/kgを用いたwtTRAIL群の腫瘍増殖率に比較して有意に低く、これはNCPT-1.M1の主要素外活性がRPMI8226に野生型TRAILが及ぼす阻害活性より強力なことを示唆している図8。実施例11化学療法薬と併用したNCPT-1.M1がヒト多発性骨髄腫細胞系に及ぼす阻害活性本実施例では、化学療法薬メルファランGlaxoSmithKline社と併用したNCPT-1.M1がヒト多発性骨髄腫細胞系RPMI8226、H929、U266B1全てATCC由来に及ぼす腫瘍死滅効果を化学発光ATPliteLuminescenceAssaySystem、PerkinElmer社法を用いて測定したが、このときRPMI8226およびH929はどちらもNCPT-1.M1に対して感受性であり、U266B1はNCPT-1.M1に対して非感受性である。対数増殖期にある細胞を遠心によって収集し、10ウシ胎児血清FBSを含有するRPMI1640培地を用いて2×105~3×105/mLの密度で細胞懸濁液に調製し、1×104~1.5×104/ウエルで96ウエル培養プレートNUNC内へ加えた。NCPT-1.M1およびメルファランは上記の培地を用いて2倍または3倍もしくは4倍連続希釈し、メルファランまたはNCPT-1.M1は所定の濃度のNCPT-1.M1溶液もしくはメルファラン溶液を用いて希釈し、上記の培養プレート内に添加し、37°Cの5のCO2インキュベータ内で反応を停止させる前に48時間インキュベートし、その後に化学発光を検出した。細胞生存率を実験ウエルおよびコントロールウエルの発光強度に基づいて計算し、併用治療の結果は、メジアン有効分析ソフトウエアCalcuSynV2BIOSOFT社を使用して分析し、そしてCIは併用係数CombinationIndexを意味する。0.9~1.1のCIは、2種の薬物の相加作用の指標である。CI<0.9は2種の薬物の相乗作用の指標であり、そしてCI>1.1は2種の薬物の拮抗作用の指標である。U266B1は、1μg/mLのNCPT-1.M1との48時間のインキュベーション後にNCPT-1.M1に対して非感受性であり、80の細胞が生存していた。しかし、メルファラン12.5~50μg/mLの共存在下における細胞生存率7.0~62.4はNCPT-1.M1単独85.0またはメルファラン単独11.9~100.9の細胞生存率より有意に低く、それらの併用が増強された死滅活性を有することを示唆した図9。メルファラン12.5μg/mLおよび様々な濃度のNCPT-1.M163~1,000ng/mLをNCPT-1.M1に感受性であるH929細胞に加えたが、その生存率はメルファラン単独およびNCPT-1.M1単独の生存率より有意に低かった。相乗作用が存在した0.563~0.835のCI指数図10。同様に、メルファラン25ng/mLと様々な濃度のNCPT-1.M12~500ng/mLとの併用を、NCPT-1.M1に対して感受性であるRPMI8226細胞に加えると、相乗作用が観察された0.039~0.368のCI指数図11。実施例12化学療法薬と併用したNCPT-1.M1がヌードマウスにおける異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性メルファランおよびプレドニゾンと併用したNCPT-1.M1がヒト多発性骨髄腫異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性雄性Balb/cnu無胸腺ヌードマウスBeijingHuafukangBiotechnology社に5×106個のRPMI8226腫瘍細胞/マウスを皮下接種した。腫瘍が約500mm3~600mm3に増殖した時点で、マウスを生理食塩液コントロール群ip、NCPT-1.M1群15mg/kg、ip、連続10日間にわたり1日1回、プレドニゾン10mg/kg、PO、連続10日間にわたり1日1回と併用したメルファラン群0.75mg/kg、PO、連続5日間にわたり1日1回、メルファランおよびプレドニゾンと併用したNCPT-1.M1群に分けた各薬物の用量、投与方法および投与頻度は上記と同一であった。腫瘍容積は、2日毎にノギスを用いて測定した。実験終了時に、メルファランおよびプレドニゾンと併用したNCPT-1.M1群の腫瘍容積は、NCPT-1.M1単剤療法群およびプレドニゾンと併用したメルファラン群の腫瘍容積より有意に少なかったP<0.05。これら3種の薬物を併用した場合、腫瘍は57のマウスにおいて完全に消失し、NCPT-1.M1単剤療法群では、腫瘍は16のマウスにおいてのみ完全に消失したが、プレドニゾンと併用したメルファラン群では腫瘍は完全には消失しなかった。結果は、NCPT-1.M1、メルファランおよびプレドニゾンの3剤併用がRPMI8226腫瘍に及ぼす腫瘍阻害作用が有意に増強されることを示唆している図12。パクリタキセルおよびカルボプラチンと併用したNCPT-1.M1がヒト肺癌異種移植片腫瘍に及ぼす阻害作用。5~6週齢のBalb/cnu無胸腺雄マウスInstituteofExperimentalAnimals、ChineseAcademyofMedicalSciences社にNCI-H460ヒト肺癌を皮下接種した。腫瘍が約150mm3のサイズに増殖したら、マウスを以下に示す、生理食塩液コントロール群ip、NCPT-1.M1単剤療法群15mg/kg、ip、連続9日間にわたり1日1回、化学療法群PCレジメン:パクリタキセル30mg/kgipおよびカルボプラチン60mg/kgip、第1日に1回投与、NCPT-1.M1併用化学療法群各薬物の投与様式および用量は上記と同一であるに分けて投与した。実験中、腫瘍の長径aおよび幅広の径bを2日毎にノギスを用いて測定し、腫瘍容積TVを以下の式にしたがって計算した。TV=1/2×a×b2。上記から、相対腫瘍容積RTVを下記の式にしたがって計算した。RTV=Vt/V0。式中、V0は、投与当日だが投与前つまりd0に測定した腫瘍容積であり、Vtは、各時点に測定した腫瘍容積である。相対腫瘍増殖率T/Cは、評価指数として使用する。T/C=RTVT/RTVC100RTVT:治療群のRTV、RTVc:陰性コントロール群のRTV。表12から明らかなように、NCPT-1.M1単剤療法群および化学療法群のT/Cは各々43.9および39.8であり、それらの腫瘍阻害作用はコントロール群と比較して有意に改善されるP<0.05。NCPT-1.M1併用化学療法群のT/Cは0.8であり、これはNCPT-1.M1単剤療法群および化学療法群のT/Cより有意に良好であるP<0.001。NCPT-1.M1併用化学療法を用いると、腫瘍はマウスの66.7において完全に消失するが、他の群では腫瘍は完全には消失せず、これはNCPT-1.M1と化学療法薬との併用が臨床的肺癌を患う患者により強力な作用を有することを示唆している図13。"