"試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIを検出するための方法であって、ai1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、1cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子、および2構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体TSHR遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ii甲状腺刺激ホルモンTSH、iiiコントロールサンプル、ならびにiv試験サンプル、を提供するステップ、b前記トランスジェニック細胞および前記TSHを、i該コントロールサンプルと接触させて第1のサンプルを生成し、およびii該試験サンプルと接触させて第2のサンプルを生成するステップであって、該接触が、該キメラTSHRに対する該TSHの結合のための条件下にある、ステップ、ならびにc該第1のサンプルおよび該第2のサンプルにおける該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるTBIの存在を示す、ステップを含む方法。TBIを検出する前記方法が、前記キメラTSHRを発現する前記トランスジェニック細胞を、野生型TSHRを発現する細胞で置換するステップを含む前記方法においてTBIを検出する場合のTBIIC50の5~15分の一の該TBIIC50を有する、請求項1に記載の方法。TBIを検出する前記方法が、抗TBIモノクローナル抗体とのTBIの特異的な結合を検出するステップを含む方法においてTBIを検出する場合のTBIIC50の10~30分の一のTBIIC50を有する、請求項1に記載の方法。前記方法が、前記第1のサンプルと比較して、前記第2のサンプルにおいて、前記レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。前記方法が、a前記試験サンプルとの前記接触の後の前記レポーター遺伝子の発現のレベルを、bそれぞれが既知濃度のTSHを含有する1つ以上の標準サンプルと前記トランスジェニック細胞を接触させた後の該レポーター遺伝子の発現のレベルと比較することによって、該試験サンプルにおけるTBIのレベルを決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。前記方法が、TBI特異的である、請求項1に記載の方法。前記TSHが、100mIU/ml未満の濃度を有する、請求項1に記載の方法。前記レポーター遺伝子の前記発現が、生物発光タンパク質の発現を含む、請求項1に記載の方法。前記生物発光タンパク質が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号03を含む、請求項8に記載の方法。前記トランスジェニック細胞が、CHO-MC4細胞およびRD-MC4細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項1に記載の方法。前記TSHが、甲状腺刺激モノクローナル抗体で置き換えられる、請求項1に記載の方法。前記TSHが、甲状腺刺激ポリクローナル抗体で置き換えられる、請求項1に記載の方法。試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIおよび甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリンTSIを検出するための方法であって、ai1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、1cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および2構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体TSHR遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ii甲状腺刺激ホルモンTSH、iiiコントロールサンプル、ならびにiv試験サンプル、を提供するステップ、b該トランスジェニック細胞および該TSHを、i該コントロールサンプルと接触させて、第1のサンプルを生成し、およびii該試験サンプルと接触させて、第2のサンプルを生成するステップであって、該接触が、該キメラTSHRに対する該TSHの結合のための条件下にある、ステップ、ならびにc該接触前および該接触後の、該トランスジェニック細胞における該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、i該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるTBIの存在を示し、ii該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが上昇していることが、該試験サンプルにおけるTSIの存在を示す、ステップを含む方法。前記方法が、前記第1のサンプルと比較して、前記第2のサンプルにおいて、前記レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。前記トランスジェニック細胞が、CHO-MC4細胞およびRD-MC4細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項13に記載の方法。キットであって、a1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、icAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子およびii構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体TSHR遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ならびにb甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIを検出するために該トランスジェニック細胞を使用するための説明書を備えるキット。前記キットが、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIを含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む、請求項16に記載のキット。前記キットが、甲状腺刺激ホルモンTSHをさらに含む、請求項16に記載のキット。前記キットが、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリンTSIを検出するための説明書をさらに含む、請求項16に記載のキット。前記キットが、甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリンTSIを含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む、請求項19に記載のキット。発明の概要本発明は、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIを検出するための方法であって、ai1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、1cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および2構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体TSHR遺伝子を含み、であって、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ii甲状腺刺激ホルモンTSH、iiiコントロールサンプル、ならびにiv試験サンプル、を提供するステップ、bトランスジェニック細胞およびTSHを、i該コントロールサンプルと接触させて第1のサンプルを生成し、およびii該第2のサンプルをもたらす試験サンプルと接触させて第2のサンプルを生成するステップであって、該接触が、該キメラTSHRに対する該TSHの結合のための条件下にある、ステップ、ならびにc該第1のサンプルおよび該第2のサンプルにおける該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるTBIの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。一実施形態において、TBIを検出する方法が、キメラTSHRを発現するトランスジェニック細胞を野生型TSHRを発現する細胞で置換するステップを含む方法においてTBIを検出する場合のTBIIC50の5~15分の一のTBIIC50を有する。他の実施形態において、TBIを検出する方法が、抗TBIモノクローナル抗体とTBIの特異的な結合を検出するステップを含む方法においてTBIを検出する場合のTBIIC50の10~30分の一のTBIIC50を有する。さらなる実施形態において、方法が、第1のサンプルと比較して、第2のサンプルにおいて、レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む。さらに他の実施形態において、方法が、a試験サンプルと接触させた後のレポーター遺伝子の発現のレベルを、bそれぞれが既知濃度のTSHを含有する1つ以上の標準サンプルとトランスジェニック細胞を接触させた後のレポーター遺伝子の発現のレベルと比較することによって、試験サンプルにおけるTBIのレベルを決定するステップをさらに含む。さらなる実施形態において、方法が、TBI特異的である。他の実施形態において、TSHが、100mIU/ml未満の濃度を有する。代替の実施形態において、レポーター遺伝子の発現が、生物発光タンパク質の発現を含む。さらなる実施形態において、生物発光タンパク質が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号03を含む。他の実施形態において、トランスジェニック細胞が、CHO-MC4細胞およびRD-MC4細胞から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態において、TSHが、甲状腺刺激モノクローナル抗体および/または甲状腺刺激ポリクローナル抗体で置き換えられる。本発明は、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIおよび甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリンthyroidhormonestimulatingimmunoglobulinTSIを検出するための方法であって、ai1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターが、1cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および2構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体TSHR遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ii甲状腺刺激ホルモンTSH、iiiコントロールサンプル、ならびにiv試験サンプル、を提供するステップ、b該トランスジェニック細胞および該TSHを、i該コントロールサンプルと接触させて、第1のサンプルを生成し、およびii該試験サンプルと接触させて、第2のサンプルを生成するステップであって、該接触が、該キメラTSHRに対する該TSHの結合のための条件下にある、ステップ、ならびにc該接触前および該接触後の、該トランスジェニック細胞における該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、i該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるTBIの存在を示し、ii該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが上昇していることが、該試験サンプルにおけるTSIの存在を示す、ステップを含む方法をさらに提供する。一実施形態において、前記方法が、第1のサンプルと比較して、第2のサンプルにおいて、レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む。特定の実施形態において、トランスジェニック細胞が、CHO-MC4細胞およびRD-MC4細胞から選択される細胞を含む。キットであって、a1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、icAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子およびii構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体TSHR遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ならびにb甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIを検出するために該トランスジェニック細胞を使用するための説明書を備えるキットもまた、本明細書において提供される。一実施形態において、キットが、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIを含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む。他の実施形態において、キットが、甲状腺刺激ホルモンTSHをさらに含む。さらなる実施形態において、キットが、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリンTSIを検出するための説明書をさらに含む。他の実施形態において、キットが、甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリンTSIを含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む。定義本発明についての理解を容易にするために、多くの用語を下記に定義する。細胞に関して使用される場合の用語トランスジェニックは、トランスジーンを含有するまたはそのゲノムがトランスジーンの導入によって改変された細胞を指す。トランスジェニック細胞は、ヒト介入を介した、標的細胞の中への核酸通常DNAを含むトランスジーンの導入または標的細胞の染色体の中へのトランスジーンの統合を含む、いくつかの方法によって産生されてもよい。本明細書において使用される場合、用語トランスジーンは、実験的な操作によって細胞の中に導入される任意の核酸配列を指す。トランスジーンは、内因性DNA配列または異種DNA配列つまり外来性DNAであってもよい。用語内因性DNA配列は、それが、天然に存在する配列に比べていくつかの修飾たとえば点突然変異、選択可能なマーカー遺伝子の存在などを含有していない限り、それが導入される細胞において天然に見つけられるヌクレオチド配列を指す。用語異種DNA配列は、自然の中でライゲーションされていないまたは自然の中で異なる位置でライゲーションされている核酸配列にライゲーションされる、または操作されてライゲーションされるようになるヌクレオチド配列を指す。異種DNAは、それが導入される細胞に対して内因性ではないが、他の細胞から得られたものである。異種DNAはまた、いくつかの修飾を含有する内因性DNA配列を含む。一般に、必ずしもではないが、異種DNAは、それが発現される細胞によって通常産生されないRNAおよびタンパク質をコードする。異種DNAの例は、レポーター遺伝子、転写および翻訳調節配列、選択可能なマーカータンパク質たとえば薬剤抵抗性を付与するタンパク質などを含む。キメラ、融合、およびハイブリッド配列たとえばアミノ酸配列および/またはヌクレオチド配列に関する場合は、異なる起源由来の部分を含有する配列を指す。一実施形態において、その部分が、同じ生物、同じ組織、同じ細胞、同じウイルスなどに由来する、異なるタンパク質および/またはゲノム配列であってもよい。一実施形態において、キメラタンパク質が、アミノ酸配列をコードする、作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現によって産生される組換えタンパク質である。たとえば、キメラTSH受容体、キメラTSHR、およびキメラMC4受容体は、異なる生物由来のアミノ酸配列を含有するTSHRを区別なく指す。一実施形態において、キメラTSHRが、以前に記載される2008年8月7日に公開された米国特許出願公開第2008-0187942号明細書ように、hTSHRのアミノ酸残基262~335が、ラット黄体形成ホルモン絨毛性ゴナドトロピンLH/CG受容体由来の、対応する73アミノ酸残基と置換されたヒトTSHRhTSHRタンパク質配列によって例証される。好ましい実施形態において、キメラMC4受容体が、DNA配列配列番号02終止コドンを含む2193塩基対によってコードされる、730アミノ酸配列の配列番号01図2Aによって例証される。MC-4細胞は、キメラTSH受容体を発現する細胞を指す。たとえば、CHO-MC4細胞およびRD-MC4細胞は、以前に記載される2008年8月7日に公開された米国特許出願公開第2008-0187942号明細書ように、それぞれ、キメラTSH受容体を発現するトランスジェニックチャイニーズハムスター卵巣細胞およびトランスジェニックヒト横紋筋肉腫細胞を指す。レポーター配列およびマーカー配列は、酵素たとえばELISAおよび酵素ベースの組織化学的アッセイ、蛍光、ならびに発光系を含むが、これらに限定されない、任意の検出系において検出可能であるDNA、RNA、ならびに/またはポリペプチド配列を指すために区別なく使用される。例示的なレポーター遺伝子は、たとえばβ-グルクロニダーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質GFP遺伝子、大腸菌β-ガラクトシダーゼLacZ遺伝子、ハロバクテリウムβ-ガラクトシダーゼ遺伝子、ニューロスポラNeuropsoraチロシナーゼ遺伝子、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT遺伝子、エクオリンクラゲ生物発光遺伝子、アメリカホタル、ホチナスピラリスPhotinuspyralis由来のホタルルシフェラーゼEC1.13.12.7、ウミシイタケ、レニラレニフォルミス由来のレニラルシフェラーゼEC1.13.12.5、ならびにPhotobacteriumfischeri由来の細菌ルシフェラーゼEC1.14.14.3を含む。好ましい実施形態において、ルシフェラーゼ遺伝子が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号03をコードする。生物発光遺伝子は、エクオリンクラゲ生物発光遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子などのような、発光性の反応を触媒するタンパク質をコードするレポーター遺伝子を指す。ルシフェラーゼ遺伝子は、アメリカホタル、ホチナスピラリス由来のホタルルシフェラーゼEC1.13.12.7、ウミシイタケ、レニラレニフォルミス由来のレニラルシフェラーゼEC1.13.12.5、およびPhotobacteriumfischeri由来の細菌ルシフェラーゼEC1.14.14.3などのような、発光性の反応を触媒する、モノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を指す。好ましい実施形態において、ルシフェラーゼ遺伝子が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号03をコードする。本明細書において使用される場合、プロモーター、プロモーターエレメント、またはプロモーター配列は、関心のあるヌクレオチド配列にライゲーションされた場合に、関心のあるヌクレオチド配列のmRNAへの転写をコントロールすることができるDNA配列を指す。プロモーターは、典型的に、必ずしもではないが、それがmRNAへの転写をコントロールする関心のあるヌクレオチド配列の5’つまり、上流に位置し、また、RNAポリメラーゼおよび転写の開始のための他の転写因子による特異的な結合のための部位を提供する。誘導性プロモーターは、刺激の非存在下と比較して、刺激たとえば熱ショック、化学物質などの存在下において、作動可能に連結された核酸配列のより高いレベルの転写を指示することができるプロモーターを指す。たとえば、cAMP誘導性プロモーターは、cAMPの非存在下と比較して、cAMPの存在下において、作動可能に連結された核酸配列のより高いレベルの転写を指示することができるプロモーターを指す。例示的なcAMP誘導性プロモーターは、PEPCKプロモーターRoeslerら1998TheJournalofBiologicalChemistry,273、14950-14957;ヒトサイクリンD2プロモーターの翻訳開始部位に関して-294位に位置するcAMP応答性エレメントCREを含有するプロモーターMunizら2006BiologyofReproduction752:279-288;および乳酸デヒドロゲナーゼAサブユニットプロモーターのcAMP応答性エレメントCREを含有するプロモーターWelfeldら1989J.Biol.Chem.26412:6941-7を含む。好ましい実施形態において、例示的なcAMP誘導性プロモーターが、2008年8月7日に公開された米国特許出願公開第2008-0187942号明細書において記載されるように、サイクリックAMPcAMP調節エレメントCREAF401991を含有する236ヌクレオチド糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットプロモーターを含む。構成的プロモーターは、刺激たとえば熱ショック、化学物質などの非存在下において、作動可能に連結された核酸配列の継続的な転写を指示するプロモーターを指す。構成的プロモーターは、大腸菌σ70、σS、σ32、σ54、およびσAプロモーター、B.subtilisσBプロモーター、サルモネラPspv2およびPspvプロモーター、バクテリオファージT7T7RNAポリメラーゼによって認識される、バクテリオファージSP6SP6RNAポリメラーゼによって認識される、酵母pAdh、ADH1、cyc100、pPGK1、pCYCプロモーター、ならびにSV40プロモーター由来のものを含む。好ましい実施形態において、構成的プロモーターが、SV40プロモーターである。安定した形質転換および安定したトランスフェクションおよび文法上の等価物は、細胞のゲノムの中への、関心のある1つ以上のヌクレオチド配列の導入および統合を指す。したがって、安定した形質転換体は、安定した形質転換体由来のゲノムDNAが、関心のある1つ以上の異種ヌクレオチド配列を含有するが、一過性の形質転換体由来のゲノムDNAが、関心のある異種ヌクレオチド配列を含有しないという点で、一過性の形質転換体と区別される。細胞の安定した形質転換は、1つ以上の、関心のあるヌクレオチド配列に対して結合することができる核酸配列との、細胞のゲノムDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出されてもよい。その代わりに、細胞の安定した形質転換はまた、関心のあるヌクレオチド配列を増幅するための、細胞のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応によって検出されてもよい。TBI、甲状腺阻害免疫グロブリン、甲状腺阻害抗体TBAb、チロトロピン受容体阻害抗体、TSH結合抑制免疫グロブリン、チロトロピン結合抑制免疫グロブリンTBII、阻害性チロトロピン受容体抗体TSHRAbは、甲状腺刺激ホルモン受容体TSH受容体またはTSHRまたはチロトロピン受容体とも呼ばれる上のエピトープに対して特異的に結合し、かつその甲状腺刺激ホルモンTSHリガンドに対するこの受容体の結合を抑制するつまり低下させる抗体を指すために区別なく使用される。TBIは、K1-70モノクローナル抗体によって例証される。TSI、甲状腺刺激免疫グロブリン、甲状腺刺激抗体TSAb、刺激性チロトロピン受容体抗体TSHRAbは、甲状腺刺激ホルモン受容体TSH受容体またはTSHRまたはチロトロピン受容体とも呼ばれる上のエピトープに対して特異的に結合し、かつその甲状腺刺激ホルモンTSHリガンドに対するこの受容体の結合を刺激するつまり増加させる抗体を指すために区別なく使用される。甲状腺刺激抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。したがって、甲状腺刺激モノクローナル抗体およびモノクローナル甲状腺刺激抗体は、M22抗体によって例証されるように、TSH結合部位内のTSHRのエピトープに対して結合するモノクローナル甲状腺刺激抗体を区別なく指す。甲状腺刺激ホルモンTSHは、以前に記載されるように、例示的なアミノ酸配列を有するヒトTSHhTSHおよびウシTSHbTSHによって例証されるSzkudlinskiら1996Nat.Biotechnol.14:1257-1263。抗体および免疫グロブリンは、糖タンパク質たとえばIgG、IgM、IgA、IgE、IgDなどおよび/または抗原に対して結合するための可変ドメインFV領域とも呼ばれるを含有するその一部分を指す。一実施形態において、抗体が、ポリクローナル抗体、つまり形質細胞たとえばBリンパ球の1つを超えるクローンによって産生される免疫グロブリンである。他の実施形態において、抗体が、モノクローナル抗体MAb、つまり、ハイブリドーマ細胞の1つのクローンによって産生される免疫グロブリンである。他の実施形態において、抗体が、対象によって産生される自己抗体であり、同じ対象によって産生される抗原自己抗原と結合することができる。分子に関してなされる場合の抗原および免疫原は、特異的な液性免疫応答可溶性抗体応答を誘起することを含むおよび/または細胞性免疫応答CTL応答を誘起することを含むを誘導することができる任意の物質を指す。特異的に結合するおよび特異的な結合は、分子たとえばペプチドに対する抗体の結合またはペプチドに対する細胞たとえばT細胞の結合に関してなされる場合、相互作用が分子上の特定の構造の存在に依存性である、分子上の1つ以上のエピトープとの抗体または細胞の相互作用を指す。たとえば、抗体が、分子上のエピトープAに対して特異的である場合、標識されたAおよび抗体を含有する反応における、エピトープAまたは遊離非標識Aを含有するタンパク質の存在は、抗体に対して結合する、標識されたAの量を低下させるであろう。一実施形態において、分子に対して抗体が結合するレベルが、IC50、つまり、所与の生物学的プロセスまたはプロセスの構成成分たとえば酵素、抗体、細胞、細胞受容体、微生物などの50の抑制をもたらす、物質たとえば抑制剤、アンタゴニストなどの濃度を指す最大抑制濃度の半分を使用して決定される。それは、アンタゴニスト物質の効力の基準として共通して使用される。本明細書において使用される場合、サンプルおよび検体は、化学反応混合物などのような任意の組成物、生物学的および/または環境的供給源由来の組成物、ならびにこれらの組成物と接触するサンプリングデバイスたとえばスワブを含むように、それらの最も広い意味で使用される。生物学的サンプルは、体液尿、血液、プラスマ、糞便、脳脊髄液CSF、精液、痰、および唾液などならびに固体組織を含む、対象から得られるものを含む。生物学的サンプルはまた、細胞細胞株、単離された細胞が組織からの単離後に培養されるかどうかにかかわらず、組織から単離された細胞、組織学的および/または免疫組織化学的分析のために固定された細胞などのような固定細胞など、組織生検材料など、細胞抽出物、組織抽出物、ならびに細胞および/または組織から単離された核酸たとえばDNAおよびRNAなどをも含む。これらの例は、例証であり、本発明に適用可能なサンプルのタイプを限定するものとして解釈されないものとする。コントロールサンプルは、ある現象についてこの変動する1つ以上の変数について原因となる有意性を推測するために、1つ以上の特定の変数以外、コントロールおよび他のサンプルにおいて同じ条件を維持することによって、他のサンプルと比較するために使用されるサンプルを指す。たとえば、ポジティブコントロールサンプルは、現象が起こることが期待されるコントロールサンプルである。たとえば、ネガティブコントロールサンプルは、現象が起こることが期待されないコントロールサンプルである。標準サンプルは、他のサンプル試験サンプルなどを評価するためにレファレンスとして使用されるサンプルを指す。たとえば、それぞれが既知濃度および/または量のTSHを含有する1つ以上の標準サンプルは、試験サンプルにおけるTSHの濃度および/または量を評価するためのレファレンスとして使用されてもよい。用語低下させる、抑制する、小さくする、抑える、減少させる、および文法上の等価物より低い、より小さななどを含むは、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における任意の分子たとえばアミノ酸配列および核酸配列、抗体など、細胞、ならびに/または現象たとえば遺伝子の発現のレベル、疾患症状、甲状腺刺激ホルモンTSHリガンドの、その甲状腺刺激ホルモン受容体TSH受容体に対する結合などのような、2つの分子の結合のレベル、2つの分子の結合の特異度、2つの分子の結合の親和性、疾患症状、疾患に対する特異度、疾患に対する感度、結合の親和性、酵素活性などの、第2のサンプルと比べたまたは第2の対象に比べたレベルに関する場合、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における分子、細胞、および/または現象の量が、任意の当技術分野により許容されている、分析についての統計的方法を使用すると、統計的に有意な任意の量だけ、第2のサンプルにおけるまたは第2の対象におけるものよりも低いことを意味する。一実施形態において、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における分子、細胞、および/または現象の量が、第2のサンプルにおけるまたは第2の対象における同じ分子、細胞、および/または現象の量よりも、少なくとも10低い、少なくとも25低い、少なくとも50低い、少なくとも75低い、および/または少なくとも90低い。他の実施形態において、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における分子、細胞、および/または現象の量が、第2のサンプルにおけるまたは第2の対象における同じ分子、細胞、および/または現象の量よりも、これらに限定されないが、10~100、20~100、30~100、40~100、50~100、60~100、70~100、80~100、および90~100低いなどのように、5~100の任意の数のパーセンテージだけ低い。一実施形態において、第1のサンプルまたは第1の対象が、限定されないが、本発明の組成物および/または方法を使用して操作されたサンプルまたは対象によって例証される。さらなる実施形態において、第2のサンプルまたは第2の対象が、限定されないが、本発明の組成物および/または方法を使用して操作されていないサンプルまたは対象によって例証される。代替の実施形態において、第2のサンプルまたは第2の対象が、限定されないが、第1の対象と比較して、異なる投薬量でおよび/または異なる期間および/または異なるルートの投与によって、本発明の組成物および/または方法を使用して操作されたサンプルまたは対象によって例証される。一実施形態において、第1および第2のサンプルまたは対象が、本発明の組成物および/または方法の異なるレジメンたとえば投薬量、期間、投与のルートなどのの効果が、一方のサンプルまたは対象について決定することが求められる場合などのように、同じであってもよい。他の実施形態において、第1および第2のサンプルまたは対象が、一方のサンプル対象、たとえば、臨床試験に参加している患者および入院中の他の個人に対する、本発明の組成物および/または方法の効果を比較する場合などのように、異なってもよい。用語増加させる、上昇させる、上げる、および文法上の等価物より高い、より大きななどを含むは、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における任意の分子たとえばアミノ酸配列および核酸配列、抗体など、細胞、ならびに/または現象たとえば遺伝子の発現のレベル、疾患症状、甲状腺刺激ホルモンTSHリガンドの、その甲状腺刺激ホルモン受容体TSH受容体に対する結合などのような、2つの分子の結合のレベル、2つの分子の結合の特異度、2つの分子の結合の親和性、疾患症状、疾患に対する特異度、疾患に対する感度、結合の親和性、酵素活性などの、第2のサンプルと比べたまたは第2の対象に比べたレベルに関する場合、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における分子、細胞、および/または現象の量が、任意の当技術分野により許容されている、分析についての統計的方法を使用すると、統計的に有意な任意の量だけ、第2のサンプルにおけるまたは第2の対象におけるものよりも高いことを意味する。一実施形態において、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における分子、細胞、および/または現象の量が、第2のサンプルにおけるまたは第2の対象における同じ分子、細胞、および/または現象の量よりも、少なくとも10大きい、少なくとも25大きい、少なくとも50大きい、少なくとも75大きい、および/または少なくとも90大きい。これは、限定を伴うことなく、第2のサンプルにおけるまたは第2の対象における同じ分子、細胞、および/または現象の量よりも少なくとも10大きい、少なくとも15大きい、少なくとも20大きい、少なくとも25大きい、少なくとも30大きい、少なくとも35大きい、少なくとも40大きい、少なくとも45大きい、少なくとも50大きい、少なくとも55大きい、少なくとも60大きい、少なくとも65大きい、少なくとも70大きい、少なくとも75大きい、少なくとも80大きい、少なくとも85大きい、少なくとも90大きい、および/または少なくとも95大きい、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における分子、細胞、および/または現象の量を含む。一実施形態において、第1のサンプルまたは第1の対象が、これに限定されないが、本発明の組成物および/または方法を使用して操作されたサンプルまたは対象によって例証される。さらなる実施形態において、第2のサンプルまたは第2の対象が、これに限定されないが、本発明の組成物および/または方法を使用して操作されていないサンプルまたは対象によって例証される。代替の実施形態において、第2のサンプルまたは第2の対象が、これに限定されないが、第1の対象と比較して、異なる投薬量でおよび/または異なる期間および/または異なるルートの投与によって、本発明の組成物および/または方法を使用して操作されたサンプルまたは対象によって例証される。一実施形態において、第1および第2のサンプルまたは対象が、本発明の組成物および/または方法の異なるレジメンたとえば投薬量、期間、投与のルートなどのの効果が、一方のサンプルまたは対象について決定することが求められる場合などのように、同じであってもよい。他の実施形態において、第1および第2のサンプルまたは対象が、一方のサンプル対象、たとえば、臨床試験に参加している患者および入院中の他の個人に対する、本発明の組成物および/または方法の効果を比較する場合などのように、異なってもよい。用語実質的に低下していないは、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における任意の分子たとえばアミノ酸配列および核酸配列、抗体など、細胞、ならびに/または現象たとえば遺伝子の発現のレベル、疾患症状、甲状腺刺激ホルモンTSHリガンドの、その甲状腺刺激ホルモン受容体TSH受容体に対する結合などのような、2つの分子の結合のレベル、2つの分子の結合の特異度、2つの分子の結合の親和性、疾患症状、疾患に対する特異度、疾患に対する感度、結合の親和性、酵素活性などの、第2のサンプルと比べたまたは第2の対象に比べたレベルに関する場合、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における分子、細胞、および/または現象の量が、第2のサンプルにおけるまたは第2の対象における量の91~100であることを意味する。用語改変するおよび修飾するは、任意の分子および/または現象のレベルに関する場合、上昇および/または減少を指す。実質的に同じは、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における任意の分子たとえばアミノ酸配列および核酸配列、抗体など、細胞、ウイルス、ならびに/または現象たとえば遺伝子の発現のレベル、疾患症状、甲状腺刺激ホルモンTSHリガンドの、その甲状腺刺激ホルモン受容体TSH受容体に対する結合などのような、2つの分子の結合のレベル、2つの分子の結合の特異度、2つの分子の結合の親和性、疾患症状、疾患に対する特異度、疾患に対する感度、結合の親和性、酵素活性などの、第2のサンプルと比べたまたは第2の対象に比べたレベルに関する場合、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における分子、細胞、および/または現象の量が、任意の当技術分野により許容されている、分析についての統計的方法を使用すると、第2のサンプルにおけるまたは第2の対象における量と異ならないことを意味する。一実施形態において、第1のサンプルにおけるまたは第1の対象における分子、細胞、および/または現象の量が、第2のサンプルにおけるまたは第2の対象における量の90~100たとえば90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、および100である。任意の数の範囲に対する本明細書における言及は、その範囲によって包含される、それぞれの数値分数および整数を含むを明確に含む。例証するために、また、限定を伴うことなく、少なくとも50の範囲に対する本明細書における言及は、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60などの整数および分数50.1、50.2、50.3、50.4、50.5、50.6、50.7、50.8、50.9などを含む。さらなる例証において、50未満の範囲に対する本明細書における言及は、整数49、48、47、46、45、44、43、42、41、40などおよび分数49.9、49.8、49.7、49.6、49.5、49.4、49.3、49.2、49.1、49.0などを含む。さらに他の例証において、5~10の範囲に対する本明細書における言及は、5、6、7、8、9、および10のそれぞれの整数ならびに5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9などのようなそれぞれの分数を含む。発明の説明本発明は、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIを検出するための組成物および方法を提供する。本発明の方法は、TBIに対して高感度であり、かつ特異的であり、TBIおよび甲状腺刺激免疫グロブリンTSIの両方の二重検出に使用されてもよい。本発明の組成物および方法は、TBIおよび/またはTSIの存在と関連する疾患の診断に、疾患および/または処置レジメン、治療薬、ワクチンなどの進行をモニターするのに、ならびに臨床医が処置決定を下すのを支援するのに有用である。本発明は、A甲状腺阻害免疫グロブリンTBIの検出のためのアッセイ、B甲状腺阻害免疫グロブリンTBIおよび甲状腺刺激免疫グロブリンTSIの二重検出のためのアッセイ、ならびにCキットの下で、さらに記載される。A.甲状腺阻害免疫グロブリンTBIの検出のためのアッセイ本発明は、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIを検出するための方法であって、ai1cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子たとえばルシフェラーゼ遺伝子および2構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体TSHR遺伝子を含む、1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ii甲状腺刺激ホルモンTSHたとえばbTSH、およびiiiコントロールサンプル、ならびにiv試験サンプルたとえば、TBIを含有することが疑われるを提供するステップ、bトランスジェニック細胞およびTSHを、i第1のサンプルをもたらすコントロールサンプルおよびii第2のサンプルをもたらす試験サンプルと接触させるステップであって、接触が、キメラTSHRに対するTSHの結合のための条件下にある、ステップ、ならびにc第1のサンプルおよび第2のサンプルにおけるレポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、第1のサンプルと比較した、第2のサンプルにおけるレポーター遺伝子の発現のレベルの低下が、試験サンプルにおけるTBIの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。一実施形態において、本発明のTBIアッセイは、甲状腺阻害免疫グロブリンが、例示的なCHO-MC4細胞上に発現されるTSH受容体TSHRに対して結合する甲状腺刺激ホルモンTSHと競合する、細胞ベースの免疫グロブリン競合アッセイである。いくつかの実施形態において、TBIアッセイが、CHO-MC4細胞、細胞増殖培地、bTSH、Thyretain商標反応バッファーQuidelCorp.DiagnosticHybrids,Inc.、Ohio、USA、ルシフェラーゼ基質、および患者血清サンプルを使用することを含む。本発明のTBIアッセイの試薬および構成成分は、当業者に入手可能であるThyretain商標アッセイ;QuidelCorp.DiagnosticHybrids,Inc.。本発明のアッセイは、実施例1において例証される。本発明のTBIアッセイの例示的なCHO-MC4細胞は、キメラヒト/ラットTSHRおよび糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、遺伝子的に操作されたチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞である。CHO-MC4細胞は、Thyretain商標アッセイQuidelCorp.DiagnosticHybrids,Inc.において使用される。本発明の方法は、グレーブス病、橋本甲状腺炎Endoら1978J.Clin.EndocrinologyMetabolism465:734-739;Takasuら1987J.Clin.EndocrinologyMetabolism642:239-245;甲状腺機能低下症Takasuら1984J.Clin.EndocrinologyMetabolism5991:142-146;新生児甲状腺機能低下症Isekiら1983572:384-387;Matsuuraら1980TheNewEnglandJournalofMedicine30313:738-741;非甲状腺腫性甲状腺機能低下症Arikawaら1985J.Clin.EndocrinologyMetabolism605:953-959;甲状腺機能正常または甲状腺機能低下自己免疫性甲状腺炎Chiovatoら199071:40-45;原発性粘液水腫Drexhageら1980Nature289:594-596;Konishiら1983J.Clin.EndocrinologyMetabolism573:544-549;および特発性粘液水腫Kohnら2003Autoimmunity36:331-337などのような、TBIの存在と関連する疾患の診断に有用である。本発明の方法はまた、疾患および/または処置レジメン、治療薬、ワクチンなどの進行をモニターするのにならびに臨床医が処置決定を下すのを支援する際にも有用である。当技術分野は、本発明においても使用されるMC4キメラ受容体を使用する、甲状腺ホルモン自己抗体についてのアッセイを記載している2008年8月7日に公開された米国特許出願公開第2008-0187942号明細書。しかしながら、当技術分野のアッセイは、MC4キメラ受容体が、刺激抗体に対してのみ反応性であり、かつ、甲状腺ホルモン阻害抗体の結合が、排除されているおよび/または低下しているという見解に基づいて、甲状腺ホルモン刺激阻害ではなく免疫グロブリンTSIを測定するように設計されたものなので、本発明の方法は、驚くべきものである。さらに、当技術分野は、TSIを検出するその方法の特異度が、刺激自己抗体に対して優先的に結合するつまり阻害自己抗体とは対照的にことによって、野生型受容体よりも大きな特異度をもたらすキメラMC4受容体を発現する細胞を使用することの結果であると述べた。また、当技術分野は、TSIを検出するその方法の感度が、刺激自己抗体に対して優先的に結合するつまり阻害自己抗体とは対照的にことによって、野生型受容体よりも大きな感度をもたらすキメラMC4受容体を発現する細胞を使用することの結果であると述べた。TBIを検出する際の本発明の方法の驚くべき側面に加えて、本発明の方法は、TBIを検出するのに高感度であることの驚くべき利点を提供する。したがって、一実施形態において、TBIを検出するための本発明の方法が、野生型TSHRを発現する細胞で、キメラTSHRを発現するトランスジェニック細胞を置換するステップを含む方法においてTBIを検出する場合のTBIIC50の5~15分の一の最も好ましくは7.5分の一のTBIIC50を有する。本明細書におけるデータは、CHO-MC4細胞によって発現されるキメラTSHRが、TBIを検出する際に、野生型TSHRよりも有用であることを実証する実施例2および4。たとえば、本明細書におけるデータは、野生型TSHRを発現するH10細胞と比較して、キメラTSHRを発現するCHO-MC4細胞を使用する場合、TBIを検出する際に、感度がより高く、CHO-MC4細胞のIC50が、H10細胞の7.5分の一であったことを実証する。TBIを検出するための本発明の感度に関しての他の驚くべき利点は、本発明の方法が、抗TBIモノクローナル抗体とTBIの特異的な結合を検出するステップを含む方法においてELISAアッセイにおいてなどTBIを検出する場合のTBIIC50の10~30分の一の最も好ましくは22分の一のTBIIC50を有することである。本明細書におけるデータは、CHO-MC4細胞を使用する本発明のTBIアッセイのIC50が、1.344ng/mlであり、これは、TRAbアッセイの22分の一であることを示す実施例3および4。TSH受容体TSHRがラットルテオトロピン-絨毛性ゴナドトロピンLH-CG受容体に対して連結されている、先行技術のキメラ受容体TSHR-LH/CGRが、TSIに対して高感度であるが、TBIに対して非常に感度が悪いことが報告されたので、本発明の方法について上記に議論される感度は、少なくとも部分的に驚くべきものであるTaharaら1991BBRC179:70-77;Taharaら1997Thyroid76:867-877。さらに、先行技術は、本発明の例示的なトランスジェニック細胞たとえばCHO-MC4細胞およびRD-MC4細胞によって発現されるMC4キメラ受容体TSHR-LH/CGRが、TSIに対するエピトープを保持するが、TBIに対するエピトープを欠いたことを示唆したKohnら2003Autoimmunity36:331-337;Sandersら2011J.MolecularEndocrinol.46;81-99。必須ではないが、一実施形態において、本発明の方法が、d第1のサンプルと比較した、第2のサンプルにおけるレポーター遺伝子たとえばルシフェラーゼ遺伝子の発現のレベルの低下を検出するステップをさらに含む。また、必要とされるわけではないが、一実施形態において、本発明の方法が、試験サンプルにおけるTBIのレベルを決定するステップをさらに含む。これは、たとえば、1試験サンプルと接触させた後の、レポーター遺伝子の発現のレベルを、2それぞれが既知濃度のTSHを含有する1つ以上の標準サンプルとトランスジェニック細胞を接触させた後の、レポーター遺伝子の発現のレベルと比較することによって行われてもよい。本発明の方法のさらに驚くべき側面は、それらが、TBI特異的であるということである。サンプルにおけるTBIの存在を検出するための方法は、TBIに対して特異的であるまたはTBI特異的であるとも表され、ここで、方法は、その受容体キメラTSHRなどのようなTSHRに対するTSHの特異的な結合の、TBIによる抑制を検出するステップを含み、TBIによる抑制のレベルは、1つ以上の黄体形成ホルモンLH、ヒト絨毛性ゴナドトロピンhCG、および卵胞刺激ホルモンFSHの存在によって、実質的に改変されないつまり、1~10増加しないまたは1~10減少しない。たとえば、本明細書におけるデータは、3つの糖タンパク質ホルモンLH、hCG、およびFSHが、それらの最も高い、生物学的に正常な範囲の濃度でおよびそれらの最も高い、生物学的に正常範囲の濃度の2倍で本発明のTBIアッセイにおいて試験された場合に、実質的な交差反応性も、TSHRとのTSHの結合のTBI抑制への干渉もなかったという点で、本発明のTBIアッセイが、bTSHに対して特異的であったことを実証する実施例5。より詳細には、本発明のアッセイが、TBIによる86の抑制を検出したが、LH、hCG、およびFSHのいずれか1つと共にTBIを含有する混合物は、81~84の範囲の抑制を検出した。本発明のアッセイにおけるTSHの濃度の範囲を限定することを意図するものではないが、一実施形態において、TSHが、100mIU/ml未満の、より好ましくは、0.2mIU/ml~100mIU/mlの濃度を有する。図1Bは、TSH濃度が、100mIU/mlに等しいまたはそれよりも低い場合、生物発光遺伝子たとえばルシフェラーゼ遺伝子の発現およびTSH濃度の関係が、直線的であることを示す。本発明の方法において使用されるトランスジェニック細胞が、任意の特定のレポーター遺伝子を含有するようには意図されない。しかしながら、一実施形態において、レポーター遺伝子が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号03を含むタンパク質などのような生物発光タンパク質を発現する。本発明の方法において使用されるトランスジェニック細胞が、任意の特定のタイプに限定されるようには意図されない。しかしながら、一実施形態において、トランスジェニック細胞が、CHO-MC4細胞およびRD-MC4細胞によって例証される細胞を含む。一実施形態において、本発明の方法が、TSHを、甲状腺刺激モノクローナル抗体M22などおよび/または甲状腺刺激ポリクローナル抗体で置き換えることによって実行されてもよい図9。本明細書におけるデータは、本発明のTBIアッセイが、bTSHおよび/または甲状腺刺激免疫グロブリンTSIによる刺激を阻害する、例示的なサンプル18HMの能力を検出することができることを実証する図10。B.甲状腺阻害免疫グロブリンTBIおよび甲状腺刺激免疫グロブリンTSIの二重検出のためのアッセイ本発明は、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIおよび甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリンTSIを検出するための方法であって、ai1cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子たとえばルシフェラーゼ遺伝子および2構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体TSHR遺伝子を含む、1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ii甲状腺刺激ホルモンTSH、ならびにiiiコントロールサンプル、iv試験サンプルたとえば、TBIおよび/またはTSIを含有することが疑われるを提供するステップ、bトランスジェニック細胞およびTSHを、i第1のサンプルをもたらすコントロールサンプルおよびii第2のサンプルをもたらす試験サンプルと接触させるステップであって、接触が、キメラTSHRに対するTSHの結合のための条件下にある、ステップ、ならびにc接触前および接触後の、トランスジェニック細胞におけるレポーター遺伝子の発現のレベルを測定するたとえばルシフェラーゼ酵素活性から結果として生じる生物発光を検出することによってステップであって、i第1のサンプルと比較した、第2のサンプルにおけるレポーター遺伝子の発現のレベルの低下が、試験サンプルにおけるTBIの存在を示し、ii第1のサンプルと比較した、第2のサンプルにおけるレポーター遺伝子の発現のレベルの上昇が、試験サンプルにおけるTSIの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。実施例6~8における、本明細書におけるデータは、血清サンプルにおける検出を含む、TBIおよびTSIの両方を検出するための、本発明のアッセイの使用を実証する表8。本発明のTBIおよびTSIの両方の二重検出のための方法は、疾患および/または処置の進行をモニターするための、ならびに臨床医が処置決定を下すのを支援するための、グレーブス病および甲状腺機能亢進症などのような、TSIの存在と関連する疾患の診断に有用である。トランスジェニック細胞を任意の特定のタイプに限定することを意図するものではないが、一実施形態において、トランスジェニック細胞が、CHO-MC4細胞およびRD-MC4細胞によって例証される細胞を含む。C.キット本発明は、本発明の方法を実施するのを支援するためのキットを提供する。一実施形態において、キットが、i1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターが、1cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および2構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体TSHR遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ならびにii甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIを検出するためにトランスジェニック細胞を使用するための説明書を含む。用語キットは、試薬および他の材料の組み合わせに関して使用される。キットは、緩衝剤、タンパク質安定化試薬、シグナル産生系たとえば生物発光および/または蛍光生成系、抗体、コントロールサンプルなどのような試薬ならびに試験容器たとえばマイクロタイタープレートなどを含んでいてもよいことが、企図される。一実施形態において、キットが、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリンTBIを含有するポジティブコントロールサンプルを含む。他の実施形態において、キットが、甲状腺刺激ホルモンTSHを含む。TBIおよびTSIの両方の二重検出が所望される場合、キットは、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリンTSIを検出するための説明書をさらに含んでいてもよい。他の実施形態において、キットが、甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリンTSIを検出するために含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含んでいてもよい。実験以下の実施例は、本発明のある好ましい実施形態および態様を実証し、かつさらに例証するために提供され、その範囲を限定するものとして解釈されないものとする。続く実験の開示において、以下の略語が適用される:eq等価物;Mモル濃度;μMマイクロモル濃度;N正常;molモル;mmolミリモル;μmolマイクロモル;nmolナノモル;gグラム;mgミリグラム;μgマイクログラム;ngナノグラム;またはLリットル;mlミリリットル;μlマイクロリットル;μマイクロ;mミリ;IU国際単位;cmセンチメートル;mmミリメートル;μmマイクロメートル;nmナノメートル;°C摂氏度;sec.またはs秒複数可;min.およびm分複数可;MW分子量;甲状腺刺激ホルモンまたはチロトロピンTSH;bTSHウシTSH;TSI甲状腺刺激免疫グロブリン;TSAb甲状腺刺激抗体;EDTAエチレンジアミン四酢酸;RLU/sec1秒当たりの相対光単位relativelightunit;GMまたはPM増殖培地またはプランティング培地PlantingMedium;SM飢餓培地;HBSSハンクス平衡塩類溶液;EMEMイーグル最小必須培地;FBSまたはFCSウシ胎児血清またはウシ胎仔血清;DMSOジメチルスルホキシド;CHOチャイニーズハムスター卵巣細胞;CHO-RヒトTSH受容体によりトランスフェクトされたCHO細胞;CHO-Rluccre-ルシフェラーゼレポーター遺伝子複合体によりトランスフェクトされたCHO-R細胞;OxoidOxoid、Basingstoke、England;BBLBectonDickinsonMicrobiologySystems、Cockeysville、ME;DIFCODifcoLaboratories、Detroit、Nil;U.S.BiochemicalU.S.BiochemicalCorp.、Cleveland、OH;FisherFisherScientific、Pittsburgh、PA;SigmaSigmaChemicalCo.、St.Louis、MO.;ATCCAmericanTypeCultureCollection、Rockville、Maryland;LTILifeTechnologies、Rockville、MD;ならびにPromegaPromegaCorp.、Madison、WI。以下の方法において、これらの方法において使用される溶液はすべて、無菌でありTSH、コントロール、患者検体を除いて、無菌的に処理した。操作はすべて、無菌条件下で、バイオセイフティーキャビネット中で行った。細胞培養培地たとえばHamのF-12、EMEMなどは、LTIから購入したが、非必須アミノ酸などのような添加試薬は、Sigmaから購入した。細胞のフリーザーバイアルは、温度のサイクリングが生存能力の損失をもたらし得るので、本発明の方法における解凍および使用の直前まで、それらの-80°Cまたはそれ未満の保存温度から暖めてはならない。それが、室温で不安定であるジチオトレイトールを含有するので、5×細胞溶解溶液は、1×溶液の調製のために必要とされる容量を取り出すのに十分な長さだけ、その-20°C保存温度から取り出されるべきである。それもまた、ジチオトレイトールを含有するので、還元されたルシフェラーゼ基質溶液は、使用の直前まで-20°Cで凍結させたまま保つべきであり、使用の時に、それは、取り出され、解凍され、かつ室温に達するように、25~37°Cの水浴中に置かれてもよい。一般に、ウェルたとえばマイクロタイタープレートなどから液体を除去する場合、液体は、ウェルから、バイオセイフティーフード中の入れ物の中に廃棄されてもよい。残留液は、無菌の吸収性のふきん上で、プレートを逆さまに置くことによって、流出させ、除去することができる。または、液体は、吸引器上で、細いチップを使用して、吸引によって除去されてもよい。吸引が使用される場合、プレートは、液体がウェルからあふれ出ないように、急な角度で保持され、吸引器チップは、液体を除去するために、ウェルの側面の下の方、ほぼ底に向けられ、最小限の残留物のみが残る。しかしながら、吸引器によって細胞が容易に除去され得るので、細胞単層の乱れを防ぐように注意を払わなければならない。下記の方法において示されるように、必要とされるわけではないが、検体、標準物質、およびコントロールを三通り実行することが推奨される。溶液3Solution3の粘着性の性質およびウェルにおいて適切な混合を実現する際の困難さのために、合計三通りの容量が、これらの試薬の1033μlであり、必要とされる三通りの容量10330μlの溶液3に移し、徹底的に混合し、110μlを三通りのウェルに移した場合に、最良の再現性が、実現された。細胞単層たとえばマイクロタイタープレートのウェル内での調製において、細胞が、ウェル内で均一に分布させることが好ましい。したがって、不均一な細胞分布を回避するために、ウェルの中への細胞懸濁液の移動は、防振性のバイオセイフティーフードにおいて実行されるべきである。プレート中のウェルがすべて、細胞を収容した後、プレートをカバーし、30分間、堅い防振性の表面上に注意深く置き、細胞を、ウェルの底にそのまま付着させた。これは、細胞の均一な分布がウェルのそれぞれにおいて存在することを確実にするのを助ける。実施例1サンプルにおけるTBIを検出するための方法甲状腺刺激免疫グロブリンを検出するための、キメラTSH受容体TSHRおよびCRE依存性ルシフェラーゼを発現する、安定してトランスフェクトされた細胞株CHO-MC4TSIバイオアッセイ、Thyretain商標は、以前に記載されている2008年8月7日に公開された米国特許出願公開第2008-0187942号明細書。補完的な甲状腺阻害抗体TBIバイオアッセイを開発するために、発明者らは、キメラTSHRの性能を野生型wtTSHRと比較した。wtまたはキメラTSHRおよびCRE依存性ルシフェラーゼを発現するCHO細胞を単離した。細胞を、15~18時間、37°Cで増殖させ、次いで、bTSH、TSI、TBI、および/または患者血清と共にインキュベートした。ルシフェラーゼ発現は、3時間のインキュベーション後に測定した。阻害活性は、bTSHのみによる誘導と比べた、ルシフェラーゼ発現の抑制パーセントとして定義した。キメラおよびwt細胞株の両方は、用量依存的な方式で、bTSHに応じたルシフェラーゼの誘導を示したが、異なるレベルの感度および最大の誘導を示した。wtTSHR発現細胞株は、0.8~50mIU/LのbTSHの濃度に対して応答したのに対して、キメラTSHR発現細胞株は、より広い動的な範囲1.6~200mIU/Lを有し、8倍高いレベルまで誘導された。両方の細胞株は、グレーブス病を有する患者由来の血清中のTSIを検出した。細胞株をTSIまたはbTSHにより刺激した場合、ルシフェラーゼ発現は、増加性の濃度の阻害MAb、K1-70RSR、Cardiff、U.K.またはTBIを含有する血清の追加によって、用量依存的な方式で低下した。キメラ細胞株は、K1-70の50抑制濃度IC50がキメラ細胞株で3~5分の一であったという点で、より高感度であった。また、wt細胞とは対照的に、キメラ細胞株は、TBIポジティブ血清により試験した場合に、3~4倍高い抑制活性を示し、段階希釈阻害血清によりS字形用量-応答曲線を一様に示した。結果は、wtと比較して、キメラTSHR細胞株が、より良好に働き、刺激および阻害バイオアッセイの両方を開発するための特有の媒介物となることを示す。A.血清サンプルにおけるTBIを検出するための例示的なプロトコール:1.1枚の黒色平/透明底96ウェルプレートを、100μl/ウェルの細胞付着溶液によりコーティングするたとえば米国特許出願公開第2008-0187942号明細書において記載されており、QuidelCorp.DiagnosticHybrids,Inc.、Ohio、USAからThyretain商標細胞付着溶液として市販で入手可能である。溶液を30秒間、ウェル上でそのままにし、次いで、溶液をデカントする。2.5mlのThyretain商標増殖培地に、CHOMC4細胞の1本のフリーザーバイアルを追加するたとえば米国特許出願公開第2008-0187942号明細書において記載されており、QuidelCorp.DiagnosticHybrids,Inc.、Ohio、USAからThyretain商標増殖培地として市販で入手可能である。3.48ウェルフォーマット中に100μl/ウェルで細胞を置くプレートの一番上および一番下の行ならびにプレートの左手および右手の最初の2列を抜かす。4.37°Cで16~18時間、細胞のプレートをインキュベートする。5.一晩の増殖期間の終わりに、コンフルエンスについて細胞を顕微鏡で調査し、細胞に混入物がないことを確認する。プレートをインキュベーターに戻す。6.400μIU/mlbTSHこれは、それぞれのウェルにおいてbTSHの100μIU/ml最終濃度を可能にするであろうを調製する。これが作業用ストックとなる。7.bTSHによりそれぞれのサンプルの1:11希釈液を調製する--40μLのそれぞれのサンプル、220μLの400μIU/mlbTSH、および180μLThyretain商標反応バッファーたとえば米国特許出願公開第2008-0187942号明細書において記載されており、QuidelCorp.DiagnosticHybrids,Inc.、Ohio、USAからThyretain商標反応バッファーとして市販で入手可能である。8.反応バッファーにおいて、正常血清を1:11に希釈することによって、ブランクコントロールを調製する40μL血清および400μL反応バッファー。9.40μlの正常血清、220μlの400μIU/mlbTSH、および180μLThyretain商標反応バッファーを希釈することによって、bTSHコントロールを調製する。注:プレートはまた、好ましくは、Thyretain商標反応バッファーのみを含有する反復ウェルを含有する。10.インキュベーターからプレートを取り出し、100μl/ウェルのThyretain商標反応バッファーにより細胞をすすぎ、次いで、それを細胞に再度供給する。11.100μl/ウェルで三通り、細胞に、調製したサンプルを追加する。12.3時間、37°Cで、細胞をインキュベートする。13.3時間のインキュベーション後に、すべてのウェルの内容物をデカントする。14.それぞれのウェルに75μl/ウェルBright-Glo商標を追加する。15.10分間、室温で細胞をインキュベートし、次いで、Veritas商標プレート読み取り装置上でプレートを読み取る。B.TBIアッセイにおける例示的なTSH濃度:図1は、CHO-MC4細胞を使用する、bTSH用量応答曲線を示す。図1Aは、0.2mIU/ml~400mIU/ml濃度範囲のbTSHの段階2倍希釈によるルシフェラーゼ誘導を示し、図1Bは、0.2mIU/ml~100mIU/mlのより狭い濃度のbTSHによるルシフェラーゼ誘導を示す。S/Bの比は、ルシフェラーゼのシグナル対バックグラウンド比を指し、これは、様々な実験から生成されるルシフェラーゼ活性RLUで測定されるものを標準化する。図1Aは、ルシフェラーゼ誘導が、bTSHの濃度と共に増加することを示す。bTSH濃度が100mIU/mlに等しいまたはそれよりも低い場合、ルシフェラーゼ誘導およびbTSH濃度の関係は、直線的である。bTSHの濃度が、100mIU/mlよりも高い場合、ルシフェラーゼ活性の上昇は、下がり、誘導は、次第に、プラトーに近づくが、完全にはプラトーに達しない。図1Bは、bTSH濃度が、100mIU/mlに等しいまたはそれよりも低い場合の、図1Aの直線部分を拡大したものである。R2係数値は、1に近い。TBIアッセイにおいて、甲状腺阻害抗体は、細胞膜上に位置するTSH受容体の結合について、bTSHと競合する。そのため、bTSHの濃度は、アッセイ感度の決定のための重要な構成成分となる。図1Bにおいて示される、ルシフェラーゼ誘導のための直線的な範囲のbTSH濃度は、bTSHのより高い非直線的な濃度よりも、高い検出感度を有する。bTSHの濃度の直線的な範囲内で、最も高い濃度が、アッセイのための1つの最適な濃度として使用されてもよい。直線的な濃度はすべて、同じbTSH検出感度を有するが、より高いbTSH濃度は、より大きなシグナル対バックグラウンド比を意味する。実施例2キメラTSHRは、TBIを検出する際に、野生型TSHRよりも有用であるA.MC4およびTSHRwt細胞H10における、K1-70甲状腺阻害モノクローナル抗体MAbによる、甲状腺阻害免疫グロブリンTBIアッセイの検出感度の比較0.1~100ng/mlの段階希釈甲状腺阻害MAbK1-70を、CHO-MC4細胞またはH10細胞においてTBIアッセイにより試験した。結果を図3に示す。すべてのサンプルデータは、1:11希釈正常血清を有する反応バッファーのバックグラウンドRLUにより標準化した。抑制パーセンテージは、bTSHコントロールRLU-サンプルRLU/bTSHコントロールRLUとして計算した。結果は、CHO-MC4細胞が、H10細胞よりも、K1-70に対して、はるかに高い検出感度を有することを示す。CHO-MC4細胞のIC50は、H10細胞よりも7.5分の一であった。B.MC4およびH10細胞における、阻害抗体含有血清によるTBIアッセイの検出感度の比較あるTBIポジティブな患者の血清を、1:22~1:90,000に段階希釈し、MC4またはH10細胞においてTBIアッセイによって試験した。結果を図4に示す。結果は、CHO-MC4細胞における血清希釈液の抑制パーセンテージのS字形曲線を示し、これは、前の実験におけるK1-70のものに類似している。しかしながら、それは、H10細胞において同じ曲線を示さなかった。この結果は、CHO-MC4細胞が、H10細胞よりも、TBIの検出においてより高感度であることを確認するものである。実施例3本発明のTBIアッセイの感度は、Kronus商標ELISAアッセイなどのような競合的結合方法よりも高い発明者らは、本発明のTBIアッセイを、Kronus商標ELISAアッセイTRAbアッセイなどのような先行技術の競合的結合方法と比較するために、甲状腺阻害モノクローナル抗体K1-70用量応答曲線の比較を行った。本実験において、K1-70甲状腺刺激モノクローナル抗体を、CHO-MC4細胞におけるTBIアッセイおよびTRAbアッセイKronus商標の両方について試験する。結果を図5に示す。結果は、CHO-MC4細胞によるTBIアッセイのIC50が、1.344ng/mlであることを示し、これは、TRAbアッセイよりも22分の一であり、CHO-MC4細胞が、TRAbアッセイよりも高いTBI検出感度を有することを示す。実施例4本発明のTBIアッセイの感度以下のデータは、他のアッセイと、TBIを検出する際の本発明アッセイの感度を比較する。実施例5本発明のTBIアッセイの特異度表5および6は、糖タンパク質ホルモンサブファミリー--黄体形成ホルモンLH、ヒト絨毛性ゴナドトロピンhCG、および卵胞刺激ホルモンFSHを伴う、本発明のTBIアッセイについての特異度試験の結果を示す。実験において、それぞれのホルモンの2つの濃度について試験した。一方の濃度は、正常範囲内の最も高いレベルとし、他方は、その濃度の2倍とする。K1-70甲状腺阻害モノクローナル抗体は、ポジティブコントロールとして使用し、ホルモンは、反応バッファー中のK1-70と共に試験した。ヒトにおけるそれぞれのホルモンの正常範囲は、以下のとおりである:LH5~20mIU/ml;hCG0.1~8000mIU/ml;FSH1.4~116.3mIU/ml。データは、3つの糖タンパク質ホルモンをTBIアッセイにおいて試験した場合、実質的な交差反応性または干渉がなかったことを実証する。これらの結果は、TBIアッセイが、bTSHに対して非常に特異的であることを示す。実施例6本発明の二重バイオアッセイ方法は、TBIおよびTSIの両方をうまく検出することができるここで、発明者らは、キメラTSH受容体TSHRを発現し、かつ2008年8月7日に公開された米国特許出願公開第2008-0187942号明細書において記載される、同じトランスジェニック細胞CHO細胞株CHO-MC4を使用して、甲状腺刺激免疫グロブリンTSIおよび甲状腺阻害免疫グロブリンTBIの両方を検出するためのアッセイについて記載する。方法:阻害活性を検出するために、CHO-MC4細胞を、抗TSHR阻害MAbまたはヒト血清サンプルと混合したウシTSHbTSHにより誘導した。阻害活性は、bTSHのみによる誘導と比べた、ルシフェラーゼ発現の抑制パーセントとして定義した。MAbK1-70およびM-22は、RSRCardiff、U.K.から購入した。すべてのサンプルはまた、TSHR自己抗体TRAbELISA、Kronus商標およびTSIThyretain商標についても測定した。結果:bTSHにより刺激されたCHO-MC4細胞のルシフェラーゼ発現は、用量依存的な方式で、阻害MAbK1-70に応じて減少した。50の甲状腺機能正常コントロール血清は、7~52の抑制を示し、発明者らが、50抑制について事前の95パーセンタイルカットオフを確立するのを可能にした。自己免疫性甲状腺機能低下症を有する患者由来のTRAbポジティブおよびTSIネガティブ血清は、ルシフェラーゼ発現をバックグラウンドレベル100の抑制まで低下させた。階段希釈実験は、1:200までのこれらのサンプルにおける阻害活性の力価を実証した。TBIバイオアッセイは、K1-70MAbによるTRAbアッセイよりも、20倍を超えて高感度であり、1.34/-0.09ng/mlのIC50対29.73/-3.27ng/mlのIC50を示した。TBIバイオアッセイはまた、TSIを検出することもできた。刺激MAbM-22またはTSIポジティブ血清を使用すると、発明者らは、bTSHのみで見られるものを上回るルシフェラーゼ発現、つまりネガティブな抑制を観察した。両方のアッセイにおけるM-22刺激活性についての用量-応答は、それぞれ、TSIおよびTBIアッセイにおける0.14ng/mlおよび0.16ng/mlの50有効濃度EC50と本質的に同一であった。両方のアッセイにおいて試験したTSIポジティブ血清の階段希釈もまた、等価な用量-応答曲線を示した。A.段階希釈M22またはTSIポジティブ患者血清によるTBIアッセイ甲状腺刺激モノクローナル抗体M22またはTSIポジティブ血清を段階希釈し、CHO-MC4細胞を使用し、本発明のTBIアッセイを使用して試験した。結果は図6である。図6は、本発明のTBIアッセイが、甲状腺刺激免疫グロブリンTSIを検出することができることを両方の希釈曲線が実証することを示す。B.171TSIポジティブ血清サンプルを使用するTSIおよびTBIアッセイの間の相関本実験において、171TSIポジティブ血清を調製し、TSIまたはTBIアッセイで同時に試験した。結果を図7に示す。結果は、TSIおよびTBIアッセイの間の高い相関を示しR2=0.9、TBIアッセイが、TSIポジティブ血清を検出するために使用することができることを示す。実施例7本発明の二重バイオアッセイ方法は、甲状腺を刺激するものおよび甲状腺の刺激を阻害するものに、抗TSHR自己抗体を区別することができる本実験において、甲状腺刺激モノクローナル抗体M22および甲状腺阻害モノクローナル抗体K1-70を、100:0、90:10、80:20~0:100などのような様々な比でともに混合し、CHO-MC4細胞を使用して、本発明のTBIアッセイで試験した。結果を図8に示す。図8は、混合物中のK1-70の部分が、0から100に増加するとまたはM22が100から0パーセントに、TBI抑制は、マイナス100からプラス100まで次第に増加する。このことにより、TBIアッセイにおいて、それが、ネガティブな抑制が結果として生じるように、甲状腺刺激抗体を検出することができるだけではなく、阻害抗体をも示すことを示す。実施例8TBIおよび/またはTSIを検出するための本発明の二重バイオアッセイの感度以下の結果は、血清サンプルにおけるTBIおよび/もしくはTSIを検出するための表6またはモノクローナル抗体M22およびK1-70を使用した場合の表5および7、本発明の二重バイオアッセイの感度を示す。上記の本明細書において言及される刊行物および特許はすべて、参照によって本明細書において組み込まれる。本発明の記載される方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者らに明らかになるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載したが、主張される本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されないことが理解されたい。実際、当業者らに明らかな、本発明を実行するための記載されるモードの様々な修飾は、以下の請求項の範囲内にあることが意図される。"