インターフェロンアルファIFNαと免疫グロブリンFc領域とが結合した薬理学的有効量の持続型インターフェロンアルファ結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含んでなり、前記安定化剤が緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含む、液状製剤。前記インターフェロンアルファが天然型IFNα、天然型IFNα誘導体、または天然型IFNαと類似の活性を示すペプチドである、請求項1に記載の液状製剤。前記免疫グロブリンFc領域がIgG、IgA、IgD、IgEおよびIgMよりなる群から選ばれた免疫グロブリンに由来する、請求項1に記載の液状製剤。前記免疫グロブリンFc領域がIgG、IgA、IgD、IgEおよびIgMよりなる群から選ばれた相異なる起源を有する、2つ以上のドメインのハイブリッドである、請求項3に記載の液状製剤。前記免疫グロブリンFc領域が同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンの二量体または多量体である、請求項3に記載の液状製剤。前記免疫グロブリンFc領域がIgG4Fc領域である、請求項3に記載の液状製剤。前記免疫グロブリンFc領域が非グリコシル化ヒトIgG4Fc領域である、請求項6に記載の液状製剤。前記インターフェロンアルファが免疫グロブリンFc領域と非ペプチド性重合体を介して共有結合で連結された、請求項1に記載の液状製剤。前記非ペプチド性重合体がポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれる、請求項8に記載の液状製剤。前記糖アルコールがマンニトール、ソルビトールおよびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれる、請求項1に記載の液状製剤。前記糖アルコールの濃度範囲が液状製剤総量に対して1~10w/vである、請求項10に記載の液状製剤。前記緩衝剤がクエン酸緩衝溶液またはリン酸緩衝溶液である、請求項1に記載の液状製剤。前記緩衝剤のpH範囲が4~7である、請求項12に記載の液状製剤。前記緩衝剤のpH範囲が5.2~7である、請求項12に記載の液状製剤。前記等張化剤が塩化ナトリウムである、請求項1に記載の液状製剤。前記塩化ナトリウムが5~200mMで使用される、請求項15に記載の液状製剤。前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート80である、請求項1に記載の液状製剤。前記非イオン性界面活性剤の濃度範囲が液状製剤総量に対して0.001~0.05w/vである、請求項17に記載の液状製剤。前記安定化剤はメチオニンをさらに含む、請求項1に記載の液状製剤。前記メチオニンの濃度範囲が液状製剤総量に対して0.005~0.1w/vである、請求項19に記載の液状製剤。前記安定化剤が糖類、多価アルコールおよびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた成分をさらに含む、請求項1に記載の液状製剤。インターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とがポリエチレングリコールを介して連結された薬理学的有効量の持続型インターフェロンアルファ結合体と、安定化剤とを含んでなり、前記安定化剤はクエン酸緩衝溶液、マンニトール、ポリソルベート80、塩化ナトリウムおよびメチオニンを含む、液状製剤。a持続型インターフェロンアルファ結合体を製造する段階と、ba段階で製造された持続型インターフェロンアルファ結合体を、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み且つアルブミンは含まない安定化剤と混合する段階とを含んでなる、請求項1~請求項21のいずれか1項の液状製剤を製造する方法。前記等張化剤が塩化ナトリウムである、請求項23に記載の方法。緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み且つアルブミンは含まない、インターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とが共有結合した、持続型インターフェロンアルファ結合体安定化用安定化剤。緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み且つアルブミンは含まない安定化剤によって、免疫グロブリンFc領域に共有結合したインターフェロンアルファを有する持続型インターフェロンアルファ結合体を安定化させる方法。そこで、本発明者は、持続型インターフェロンアルファをウイルス汚染の恐れがなく、長期間効能を維持させることができるようにする安定した液状製剤を提供するために研究してきた結果、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み、アルブミンは含まない安定化剤が持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性を増大させることを確認し、本発明を完成するに至った。本発明の目的は、インターフェロンアルファIFNαと免疫グロブリンFc領域とが結合した薬理学的有効量の持続型インターフェロンアルファ結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含んでなり、前記安定化剤は緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含む、液状製剤を提供することにある。本発明の他の目的は、a持続型インターフェロンアルファ結合体を製造する段階と、ba段階で製造された持続型インターフェロンアルファ結合体を、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み、アルブミンは含まない安定化剤と混合する段階とを含んでなる、持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤を製造する方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み、アルブミンは含まない、インターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とが共有結合した、持続型インターフェロンアルファ結合体安定化のための安定化剤を提供することにある。また、本発明の別の目的は、安定化剤として持続型インターフェロンアルファ結合体を安定化させる方法を提供することにあり、前記安定化剤は、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み、アルブミンは含まない安定化剤であり、前記持続型インターフェロンアルファ結合体はインターフェロンアルファ結合体、および免疫グロブリンFc領域が共有結合したものである。本発明に係る持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤は、安定化剤としてヒト血清アルブミンおよび人体に潜在的に有害な因子を含まないため、ウイルス感染のおそれがなく、インターフェロンアルファポリペプチドと免疫グロブリンFc領域との結合からなって天然型に比べて分子量が大きくかつ生理活性持続期間が増大した持続型インターフェロンアルファ結合体に対する優れた貯蔵安定性を提供するので、持続型インターフェロン結合体を安定的に保存するのに有用に使用できる。本発明の一つの様態として、インターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とが結合した薬理学的有効量の持続型インターフェロンアルファ結合体と、アルブミン非含有安定化剤とを含んでなり、前記安定化剤は緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含む、持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤を提供する。本発明は、他の様態として、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み且つアルブミンは含まない、インターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とが結合した、持続型インターフェロンアルファ結合体安定化のための安定化剤を提供する。本発明は、別の様態として、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含み且つアルブミンは含まない安定化剤を同時または順次添加し、インターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とが結合した持続型インターフェロンアルファ結合体を安定化させる方法を提供する。前記持続型インターフェロンアルファ結合体とは、生理活性ペプチドとしてのインターフェロンアルファIFNαと免疫グロブリンFc領域とが結合した形態のタンパク質であって、インターフェロンアルファ、両末端に反応基を有する一つ以上の非ペプチド性重合体および一つ以上の免疫グロブリンFc領域を含み、これらの構成要素が共有結合によって互いに連結されているものを含む。したがって、本明細書において、用語持続型とは、生理活性持続期間が天然型インターフェロンアルファに比べて増大したものを意味する。結合体とは、インターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域が非ペプチド性重合体を介して共有結合するなどの形で連結されたものを意味する。前記持続型インターフェロンアルファ結合体は、タンパク質薬物の生理活性減少を最小化し且つ生体内持続性を最大限増進させるためのタンパク質薬物の変形体である。本発明では免疫グロブリンFc領域を結合させることを特徴とする。本発明のインターフェロンアルファは、好ましくはヒトインターフェロンアルファである。また、天然型IFNα、天然型IFNα誘導体、または天然型IFNαと類似の活性を示すペプチドであってもよい。すなわち、本発明のインターフェロンアルファは、天然型インターフェロンアルファのアミノ酸配列だけでなく、その配列変異体を含むことができる。アミノ酸配列変異体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するものを意味する。インターフェロンアルファは、天然または組み換え起源のいずれの方法で製造されたものでも使用可能である。好ましくは、大腸菌を宿主細胞として用いて製造した組み換えヒトインターフェロンアルファHuIFNαであり、生物学的活性に大きく影響を及ぼさない範囲でアミノ酸の置換、除去、挿入による変異体も含む。本発明において、免疫グロブリンFc領域とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域1CH1および軽鎖不変領域1CL1を除いた、重鎖不変領域2CH2および重鎖不変領域3CH3部分を意味し、さらに重鎖不変領域にヒンジ部分を含むことができる。また、本発明の免疫グロブリンFc領域は、天然型と実質的に同等或いはそれより向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除いて、一部または全体重鎖不変領域1CH1および/または軽鎖不変領域1CL1を含む拡張されたFc領域であってもよい。また、CH2および/またはCH3に該当する相当長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンFc領域は、1CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメインおよびCH4ドメイン、2CH1ドメインおよびCH2ドメイン、3CH1ドメインおよびCH3ドメイン、4CH2ドメインおよびCH3ドメイン、51つまたは2つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域またはヒンジ領域の一部との組み合わせ、6重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体でありうる。また、本発明の免疫グロブリンFc領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列変異体を含む。アミノ酸配列変異体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するものを意味する。例えば、IgGFcの場合、結合に重要であると知られた214~238、297~299、318~322または327~331番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として利用できる。また、ジスルフィド結合を形成することが可能な部位が除去されるか、或いは天然型FcからN末端の幾つかのアミノ酸が除去されるか、或いは天然型FcのN末端にメチオニン残基が付加されるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能を無くすために、補体結合部位、例えばC1q結合部位またはADCC部位が除去されることがある。このような免疫グロブリンFc領域の配列変異体を製造する技術は、特許文献7、特許文献8などに開示されている。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸置換は、当該分野に公知になっている。最も通常起こる置換は、アミノ酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly間の置換である。場合によっては、リン酸化、硫酸化、アクリル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などで修飾されることもできる。上述したFc誘導体は、本発明のFc領域と同一の生物学的活性を示すが、Fc領域の熱やpHなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体である。また、免疫グロブリンFc領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が除去された形態でありうる。このような免疫グロブリンFc糖鎖の増減または除去には化学的方法、酵素学的方法、および微生物を用いた遺伝工学的方法といった通常の方法が用いられる。ここで、Fcから糖鎖が除去された免疫グロブリンFc領域は、補体clqの結合力が顕著に低下し、抗体-依存性細胞毒性または補体-依存性細胞毒性が減少または除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このことからみて、薬物のキャリアとしての本来の目的にさらに符合する形態は、脱グリコシル化或いは非グリコシル化された免疫グロブリンFc領域であるといえる。本発明において、脱グリコシル化とは酵素で糖を除去したFc領域を意味し、非グリコシル化とは原核動物、好ましくは大腸菌から生産した、グリコシル化されていないFc領域を意味する。また、本発明の免疫グロブリンFcは、ヒト免疫グロブリンとその密接に関連した類似体の配列を有する。前記Fc領域はウシ、ヤギ、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源でありうる。また、免疫グロブリンFc領域は、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM由来またはこれらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドによるFc領域であってもよい。好ましくは、ヒト血液に最も富むIgGまたはIgM由来であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させるものとして公知になったIgG由来である。免疫グロブリンFcは、天然IgGを特定のタンパク質分解酵素で処理して製造することができ、組み換え技術を用いて形質転換された細胞からも製造することができる。好ましくは大腸菌から製造した組み換えヒト免疫グロブリンIgG由来のFcである。本発明において、組み換えは、二量体または多量体由来の単鎖ポリペプチドに連結されたFc領域を意味する。一方、IgGもIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のサブクラスに分けられる。本発明では、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドも可能である。好ましくは、IgG2およびIgG4サブクラスであり、より好ましくは補体依存性細胞傷害CDC、Complementdependentcytotoxicityのようなエフェクター機能が殆どないIgG4のFc領域である。また、最も好ましい本発明の薬物のキャリア用免疫グロブリンFc領域はヒトIgG4由来の非グリコシル化Fc領域である。ヒト由来のFc領域は、ヒトの生体で抗原として作用してこれに対する新しい抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を引き起こすおそれのある非ヒト由来のFc領域に比べて好ましい。本発明の持続型インターフェロンアルファ結合体は、インターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とを結合させて製造される。その結合方法としては、インターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とを非ペプチド性重合体を用いて交差結合させ、或いは組み換え技術によってインターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とが連結した形での融合タンパク質に組み換えることができる。また、本発明で使用される持続型インターフェロンアルファ結合体は、特許文献6に開示された方法で製造することができる。交差結合の際に使用される非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、PLAポリ乳酸、polylacticacidおよびPLGAポリ乳酸グリコール酸、polylacticglycolicacidのような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれる。好ましくはポリエチレングリコールである。当該分野に既に知られているこれらの誘導体および当該分野の技術水準で容易に製造することが可能な誘導体も本発明の範囲に含まれる。本発明の持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤には、持続型インターフェロンアルファ結合体が薬理学的有効量で含まれる。用語薬理学的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的な利益/危険の比率で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効用量水準は、個体の種類および重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、およびその他の医薬/薬学分野によく知られている要素によって決定できる。一般に、インターフェロンアルファの薬理学的有効量は使い捨てバイアル内に約30~200μg程度が含有された量である。本発明で使用される持続型インターフェロンアルファ結合体の濃度は0.1mg/mL~50mg/mLであり、好ましくは0.1mg/mL~5.0mg/mLである。前記生体内持続性および安定性を高めた持続型インターフェロンアルファ結合体の場合、インターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とが結合した形態であるので、分子量および体積が一般のインターフェロンアルファとは確然に異なるから、タンパク質を安定化するための特別な組成が求められる。また、生理活性ペプチドであるインターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域はそれぞれ物理化学的特性の異なるペプチドまたはタンパク質であるから、生理活性ペプチドであるインターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域を同時に安定化しなければならない。よって、本発明はこのような目的のために安定化剤を提供するが、本発明において、安定化剤は持続型インターフェロンアルファ結合体が安定的に貯蔵できるようにする物質を意味し、安定化は一定の時間特定の貯蔵条件の下で活性成分の損失が特定量未満、一般的に10未満であることを意味する。通常、5±3°Cで2年、25±2°Cで6ヶ月、または40±2°Cで1~2週間持続型インターフェロンアルファ結合体が90以上、好ましくは約95程度の残存率を維持する場合、このような製剤は安定したものと理解できる。持続型インターフェロンアルファ結合体のようなタンパク質において、貯蔵安定性は、正確な投与量を保障するためだけでなく、持続型インターフェロンアルファ結合体に対する抗原性物質の潜在的な生成を抑制するために重要である。貯蔵中に持続型インターフェロンアルファ結合体が10程度の損失を示すことは、組成物内で凝集体や断片などを生じさせ、抗原性物質に転換されない限り、実質的な投与の際に許容すべきものと理解できる。本発明の前記安定化剤は、持続型インターフェロンアルファ結合体に安定性を与えるために、緩衝剤、糖アルコール、等張化剤および非イオン性界面活性剤を含むことができ、好ましくはメチオニンをさらに含むことができる。前記緩衝剤は、持続型インターフェロンアルファ結合体を安定化させるために液状製剤のpHが急激に変化しないように溶液のpHを維持させる役割をする。緩衝剤は、アルカリ塩リン酸カリウムまたはナトリウムまたはこれらの水素または二水素塩、クエン酸ナトリウム/クエン酸、酢酸ナトリウム/酢酸をはじめとして、当業界における公知の任意の、他の薬学的に許容されるpH緩衝剤を含むことができ、これらの緩衝剤の混合物も使用できる。本発明の実施例を参照すると、持続型インターフェロンアルファ結合体は、緩衝剤のpHによって安定化の度合いが異なり、pH5.5のクエン酸緩衝溶液の下で持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性が増大することが分かる実施例2。緩衝剤は、好ましくはリン酸緩衝溶液またはクエン酸緩衝溶液であり、より好ましくはクエン酸緩衝溶液である。クエン酸緩衝溶液を構成するクエン酸塩の濃度は、好ましくは5mM~100mMであり、より好ましくは10mM~50mMである。緩衝剤のpHは、好ましくは4.0~7.0、より好ましくは5.0~7.0、さらに好ましくは5.2~7.0、さらに一層好ましくは5.2~6.0である。前記糖アルコールは、単糖類の誘導体であって、糖を接触還元させ、糖が有しているカルボニル基=COが水酸基-OHになったことを意味するもので、持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性を増大させる役目をする。本発明の糖アルコールの濃度は、好ましくは液状製剤総量に対して1~10w/v、さらに好ましくは5w/vである。前記糖アルコールは、エリスリトール、ガラクチトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、マルチトール、ソルビトール、ラクチトール、およびマンニトールよりなる群から選ばれ、好ましくはマンニトールおよびソルビトールよりなる群から選ばれた少なくとも1種である。本発明の実施例を参照すると、通常の緩衝剤の条件下で安定化物質としてマンニトールを添加したとき、持続型インターフェロンアルファ結合体が安定していることが分かる実施例1。前記等張化剤は、持続型インターフェロンアルファ結合体を液状製剤上で体内に投与するとき、浸透圧を適切に保つ役目をし、持続型インターフェロンアルファ結合体を液状製剤でさらに安定化させる付随的な効果も示す。このような等張化剤の代表的な例としては水溶性無機塩を挙げることができ、好ましくは塩化ナトリウムである。本発明の一実施例によれば、緩衝剤、糖アルコールおよび非イオン性界面活性剤の存在下で、等張化剤としての塩化ナトリウムを含ませる場合、持続型インターフェロンアルファ結合体の貯蔵安定性を増加させる結果が得られた。これは、緩衝剤、糖アルコールおよび非イオン性界面活性剤と等張化剤としての塩化ナトリウムとの同時使用が相乗効果を示して持続型インターフェロンアルファ結合体に特別な安定性を与えることを示す。前記塩化ナトリウムの濃度は、液状製剤総量に対して、好ましくは5~200mM、より好ましくは150mMであり、剤形に含まれた成分の種類および量などに応じて、それぞれの混合物が全て含まれた液状製剤が等張液となるように適切に調節できる。前記非イオン性界面活性剤は、タンパク質溶液の表面張力を低めて疎水性の表面にタンパク質が吸着または凝集することを防止する役目をする。本発明に使用できる非イオン性界面活性剤の好適な例としては、ポリソルベート系非イオン性界面活性剤およびポロキサマー系非イオン性界面活性剤などを挙げることができ、これらの一つまたは2つ以上の組み合わせの形で使用できる。その中でも、ポリソルベート系非イオン性界面活性剤がさらに好ましい。ポリソルベート系非イオン性界面活性剤の例としてはポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、およびポリソルベート80などがあり、その中でもポリソルベート80が好ましい。本発明の実施例を参照すると、ポリソルベート80を含む持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤が、ポロキサマー188を含む液状製剤と類似し或いはそれよりやや安定し、0.005ポリソルベート80を含む液状製剤より高い濃度である0.02ポリソルベート80を含む持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤が安定性にさらに優れることが分かる実施例3。前記非イオン性界面活性剤を液状製剤に高濃度で使用することは、高濃度の非イオン性界面活性剤がUV分光法や等焦点法などの分析法によるタンパク質の濃度測定または安定性の評価時に干渉効果を誘発し、タンパク質の安定性を正確に評価することが難しいので適さない。よって、本発明の液状製剤には、前記非イオン性界面活性剤が好ましくは0.1w/v以下の低濃度、より好ましくは0.001~0.05w/v、さらに好ましくは0.02w/vで含まれる。本発明の安定化剤はメチオニンをさらに含んでもよい。前記メチオニンは、溶液状態でタンパク質の酸化反応などによって起りうる不純物の生成を抑制させて対象タンパク質をさらに安定化させる効果がある。メチオニンの濃度は、好ましくは0.05~0.1w/v、より好ましくは液状製剤総量に対して0.01~0.1w/vである。本発明の実施例を参照すると、メチオニンの含まれていない液状製剤では酸化した持続型インターフェロンアルファ結合体が増加し、0.01メチオニンの含まれた液状製剤では酸化した持続型インターフェロンアルファ結合体が増加しなかった。このような結果は、メチオニンの含まれた液状製剤が持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性をさらに効果的に提供することを示す実施例5。本発明の前記安定化剤はアルブミンを含有しないことが好ましい。タンパク質の安定化剤として利用できるヒト血清アルブミンはヒトの血液から製造されるので、ヒト由来の病原性ウイルスによる汚染可能性が存在し、ゼラチンまたはウシ血清アルブミンは疾患を引き起こし、或いは一部患者の場合にはアレルギー反応を誘発する可能性がある。よって、本発明のアルブミン非含有安定化剤は、ヒトまたは動物由来の血清アルブミンまたは精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないため、ウイルス感染のおそれがない。また、本発明の安定化剤は糖類または多価アルコールをさらに含んでもよい。持続型インターフェロンアルファ結合体の貯蔵安定性を増大させるためにさらに含まれうる糖類および多価アルコールのうち、糖類の好ましい例としてはマンノース、グルコース、フコースおよびキシロースなどの単糖類、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノースおよびデキストランなどの多糖類を挙げることができ、多価アルコールの好ましい例としてはプロピレングリコール、低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量のポリプロピレングリコールなどを挙げることができ、これらの1種または2種以上の組み合わせの形で使用できる。本発明の液状製剤には、前記緩衝剤、等張化剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤およびメチオニン以外に、本発明の効果を損傷させない範囲内で当業界における公知のその他の成分または物質が選択的にさらに含まれてもよい。本発明は、別の様態として、a持続型インターフェロンアルファ結合体を製造する段階と、ba段階で製造された持続型インターフェロンアルファ結合体を、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含む安定化剤と混合する段階とを含んでなる、持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤を製造する方法を提供する。前記a持続型インターフェロンアルファ結合体を製造する段階は、インターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とを非ペプチド性重合体を用いて交差結合させ、或いは組み換え技術を用いてインターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域とを融合させることにより行われる。非ペプチド性重合体を用いたインターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域との交差結合は、両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体、インターフェロンアルファおよび免疫グロブリンFc領域を反応させ、これらを相互共有結合によって連結させる段階と、非ペプチド性重合体の両末端にインターフェロンアルファおよび免疫グロブリンFc領域がそれぞれ共有結合によって連結された結合体を分離する段階とを含んでなる。前記3つの構成要素の共有結合は順次または同時に起りうる。例えば、非ペプチド性重合体の両末端にそれぞれインターフェロンアルファおよび免疫グロブリンFc領域を結合させる場合には、インターフェロンアルファおよび免疫グロブリンFc領域のうちいずれか一つを先ず非ペプチド性重合体の一方の末端に結合させた後、残りの成分を非ペプチド性重合体の他方の末端に結合させる方式で順次反応を行う方が、目的のタンパク質結合体以外の副産物の生成を最小化するのに有利である。前記a段階で製造された持続型インターフェロンアルファ結合体を、緩衝剤、糖アルコール、非イオン性界面活性剤および等張化剤を含む安定化剤と混合し、本発明の持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤を製造することができる。前記安定化剤は、好ましくは等張化剤として塩化ナトリウムを含むことができ、メチオニン、糖類および多価アルコールよりなる群から選ばれる少なくとも1種の成分をさらに含むことができる。以下、本発明を実施例および実験例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。[製造例1]持続型インターフェロンアルファ結合体の製造免疫グロブリンを用いた免疫グロブリンFc領域の製造免疫グロブリンFc領域を製造するために、10mMのリン酸塩緩衝液に溶解した分子量150kDaの免疫グロブリンGImmunoglobulinG、IgG、緑十字200mgにタンパク質加水分解酵素パパインPapain、Sigma社を2mg処理して37°Cで2時間ゆっくり攪拌しながら反応させた。酵素反応の後、生成された免疫グロブリンFc領域を精製するためにスーパーデキスカラム、タンパク質Aカラムおよび陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを順次行った。具体的に、反応液を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液PBS、pH7.3に平衡化させたスーパーデキス200カラムSuperdex200、Pharmacia社に点滴し、同様の緩衝液を用いて1mL/分の流速で溶出させた。免疫グロブリンFc領域より分子量が相対的に大きい未反応免疫グロブリンIgGとFab’2などは前方から溶出するので、これを先ず除去した。免疫グロブリンFc領域と類似した分子量を有するFabは次のようにタンパク質Aカラムクロマトグラフィーを行って除去した。20mMのリン酸塩緩衝液pH7.0に平衡化させたタンパク質AカラムPharmacia社に、スーパーデキス200カラムから溶出した免疫グロブリンFc領域含有分画を5mL/分の流速で負荷した後、カラムに結合していないタンパク質を除去するために同一の緩衝液で十分に洗浄した。ここに100mMのクエン酸ナトリウムpH3.0緩衝液を流して純度の高い免疫グロブリンFc領域を溶出させた。タンパク質Aカラムで精製されたFc分画を最後に陽イオン交換樹脂カラムpolyCAT、PolyLC社を用いて最終精製したが、10mMの酢酸塩緩衝液pH4.5を直線濃度勾配塩化ナトリウム濃度0.15M→0.4M方法で流して高純度のFc分画を得た。IFNα-PEG連結体の製造両末端にアルデヒド反応基を有する分子量3.4kDaのポリエチレングリコールであるALD-PEG-ALDShearwater社をヒトインターフェロンアルファ-2bhIFNα-2b、分子量20kDaが5mg/mLの濃度で溶解した100mMのリン酸塩緩衝液に、IFNα:PEGのモル比が1:1、1:2.5、1:5、1:10および1:20となるように添加した。ここに還元剤としての水素化シアノホウ素ナトリウムNaCNBH3、Sigma社を最終濃度20mMとなるように添加し、4°Cでゆっくり攪拌しながら3時間反応させた。インターフェロンアルファのアミノ末端部位に選択的にPEGが連結され且つPEGとインターフェロンアルファとが1:1で結合した連結体を得るために、前記反応混合物をもってスーパーデキスSuperdexR、Pharmacia社サイズ排除クロマトグラフィーを行った。溶出液として10mMのリン酸カリウム緩衝液pH6.0を用いてIFNα-PEG連結体を精製し、PEGと結合していないインターフェロンアルファ、未反応PEG、および2つのインターフェロンアルファがPEGと連結された二量体副産物を除去した。精製されたIFNα-PEG連結体を5mg/mLの濃度で濃縮した。このことから、反応性が最もよく且つ二量体などの副産物が少ないIFNα:PEGの最適反応モル比は1:2.5~1:5であることを確認した。IFNα-PEG-Fc結合体の形成前記段階2で精製されたIFNα-PEG連結体を免疫グロブリンFc領域のN末端に結合させるために、前記段階1で準備された免疫グロブリンFc領域約53kDaを10mMのリン酸塩緩衝液に溶解させた後、IFNα-PEG連結体:Fcのモル比がそれぞれ1:1、1:2、1:4および1:8となるようにIFNα-PEG連結体と混合して反応させた。反応液を100mMのリン酸塩緩衝液状態にし、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで20時間ゆっくり攪拌しながら反応させた。このことから、反応性が最もよく且つ二量体などの副産物が少ないIFNα-PEG連結体:Fcの最適反応モル比は1:2であることを確認した。IFNα-PEG-Fc結合体の分離および精製前記段階3の結合反応の後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたIFNα-PEG-Fcタンパク質結合体を精製するために、スーパーデキスサイズ排除クロマトグラフィーを行った。反応混合物を濃縮した後、10mMのリン酸塩緩衝液pH7.3を用いて2.5mL/分の流速でカラムに通過させ、結合していないFcおよび未反応物質を除去し、IFNα-PEG-Fcタンパク質結合体分画を得た。得られたIFNα-PEG-Fcタンパク質結合体分画には、不純物として少量の未反応Fcおよびインターフェロンアルファ二量体が混在しているから、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行った。IFNα-PEG-Fcタンパク質結合体分画を10mMの酢酸ナトリウムpH4.5で平衡化させたPolyCATLPカラムPolyLC社に入れ、1Mの塩化ナトリウムNaClを含む10mMの酢酸ナトリウムpH4.5緩衝液を直線濃度勾配塩化ナトリウム濃度0M→0.5M方法で流してさらに精製した。最後に、陰イオン交換カラムを用いてIFNα-PEG-Fcタンパク質結合体を純粋に収得した。PolyWAXLPカラムPolyLC社を10mMのTris-HClpH7.5緩衝液で平衡化させた後、精製されたIFNα-PEG-Fcタンパク質結合体分画を負荷し、1Mの塩化ナトリウムを含む10mMのTris-HClpH7.5緩衝液を直線濃度勾配塩化ナトリウム濃度0M→0.3M方法で流して純粋なIFNα-PEG-Fcタンパク質結合体を精製した。多様な安定化剤による持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性の評価本発明に係る安定化剤として、クエン酸緩衝溶液の存在下に多様な種類の物質、すなわち、糖類、糖アルコールおよびアミノ酸が持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性に及ぼす影響を実験した。緩衝溶液は、クエン酸クエン酸ナトリウム緩衝剤を用いpH5.5、糖アルコールとしてマンニトール、アミノ酸としてアルギニンまたはグリシン、糖類としてスクロースを用いた。下記表1のような組成をそれぞれ持続型インターフェロンアルファ結合体の安定化剤として用いて40°Cで1週間保管した後、RP-HPLCおよびSE-HPLCを用いて分析した。表1のRP-HPLCおよびSE-HPLCは、Area/StartAreaとして、初期結果値に対比した持続型インターフェロンアルファ結合体の残存率を示す。表2を参照すると、通常の緩衝溶液の条件下で安定化物質としてマンニトールを添加したとき、持続型インターフェロンアルファ結合体が最も安定した。緩衝液のpHによる持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性の評価多様なpHの緩衝溶液で持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性を比較した。下記表3のような組成をそれぞれ持続型インターフェロンアルファ結合体の緩衝溶液として用いて40°Cで2週間保管した後、逆相クロマトグラフィー法を用いて分析した。安定化剤としてマンニトール、界面活性剤としてポリソルベート80を用いて、40°Cで2週間保管した後、RP-HPLCおよびSE-HPLCを用いて分析した。表4のRP-HPLCおよびSE-HPLCは初期結果値に対比した持続型インターフェロンアルファ結合体の残存率を示す。表3および表4より、pH5.2で1週分析の際に試料の沈殿発生を確認したとともに、pH6.0に比べてpH5.5のクエン酸緩衝溶液の下で持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性が増大することを確認した。これにより、持続型インターフェロンアルファ結合体は、緩衝液のpHによって安定化の度合いが異なり、特定のpH範囲でさらに高い安定性を示すことが分かる。非イオン性界面活性剤による持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性の評価本発明に係る安定化剤としてクエン酸緩衝溶液の存在下で非イオン性界面活性剤の種類および濃度が持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性に及ぼす影響を実験した。界面活性剤としては、ポリソルベート80とポロキサマー188を用いた。界面活性剤以外の安定化剤の組成は、実施例1で高い安定性を示すマンニトールを使用した。インターフェロンアルファの濃度は360μg/mL、緩衝溶液は20mMのクエン酸ナトリウム、pH5.5を用いた同様の条件に下記表5のような組成をそれぞれ付加し、これを持続型インターフェロンアルファ結合体の安定化剤として用いて、25±2°Cで4週間保管した後、RP-HPLCおよびSE-HPLCを用いて分析した。表5のRP-HPLCおよびSE-HPLCは初期結果値に対比した持続型インターフェロンアルファ結合体の残存率を示す。表5および表6を参照すると、SE-HPLCの結果では界面活性剤の種類および濃度による持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性に差異が殆どなかったが、RP-HPLC結果ではポリソルベート80がポロキサマー188と類似し或いはそれよりやや安定した。また、0.005ポリソルベート80を含む液状製剤より高い濃度である0.02ポリソルベート80を含む持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤が安定性にさらに優れることが確認された。持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤と市販中のインターフェロンアルファ薬物の液状製剤に持続型インターフェロンアルファ結合体を適用した液状製剤との安定性の比較評価実施例1~3の安定性実験で選択したpH5.5のクエン酸緩衝溶液、塩化ナトリウム、マンニトール、およびポリソルベート80からなる持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性を確認するために、市販中のインターフェロンアルファ薬物INFα2a、PegasysR液状製剤の安定化剤の組成に持続型インターフェロンアルファ結合体を適用した液状製剤の安定性の比較実験を行った。下記表7のような組成で持続型インターフェロンアルファ結合体液状製剤1を調製し、インターフェロンアルファ薬物IFNα2a、PegasysR液状製剤の安定化剤の組成に持続型インターフェロンアルファ結合体を適用した液状製剤液状製剤2を調製した。その後、25±2°Cで2週間保管した後、RP-HPLCを用いて分析した。表8のRP-HPLCは初期結果値に対比した持続型インターフェロンアルファ結合体の残存率を示す。安定性試験の結果、市販中のインターフェロンアルファ薬物IFNα2a、PegasysRの液状製剤の安定化剤の組成を適用した持続型インターフェロンアルファ結合体より本発明の持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤がさらに安定した組成であることを確認することができる。メチオニンがさらに含まれた持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤の安定性の評価既存の実施例で選択したpH5.5のクエン酸緩衝溶液、塩化ナトリウム、マンニトールおよびポリソルベート80の他に酸化反応防止のためのメチオニンをさらに含んでなる液状製剤の加速安定性を確認するために、25±2°Cで4週間保管した試料の安定性を分析した。下記表9のような組成で持続型インターフェロンアルファ結合体の液状製剤を調製して分析し、表10および表11のRP-HPLCおよびSE-HPLCは各時点の持続型インターフェロンアルファ結合体および不純物の含量を示す。表10は加速安定性試験25±2°CのRP-HPLC結果を示し、表11は加速安定性試験25±2°CのSE-HPLC結果を示し、不純物6は酸化した持続型インターフェロンアルファ結合体である。但し、SE-HPLCは試料の分子量を用いて分離する方法であり、酸化した形態と酸化していない形態は分子量の差が非常に小さいため、SE-HPLCによっては酸化した形態の持続型インターフェロンアルファ結合体を分離することができなかった。加速安定性試験の結果、メチオニンが含まれていない液状製剤では酸化した持続型インターフェロンアルファ結合体RP-HPLCにおける不純物6が増加することを確認し、0.01のメチオニンが含まれた液状製剤では酸化した持続型インターフェロンアルファ結合体が増加しないことを確認した。このような結果は、メチオニンの含まれた液状製剤が持続型インターフェロンアルファ結合体の安定性をさらに効果的に提供することを示す。持続型インターフェロンアルファ結合体液状製剤の長期保存安定性の試験実施例によって最終選択したpH5.5のクエン酸緩衝溶液、塩化ナトリウム、マンニトール、ポリソルベート80およびメチオニンからなる液状製剤の長期保存安定性を確認するために、5±3°Cで6ヶ月間保管した試料の安定性を分析した。その結果を図1および表12に示した。RP-HPLC、SE-HPLC、タンパク質の含量は初期結果値に対比した残存率を示す。長期保存安定性試験の結果、持続型インナーフェロンアルファ結合体は本発明の液状製剤で6ヶ月以上安定であることを確認した。以上の説明より、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想または必須的特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施できることを理解することができる。これに関連し、上述した実施例は全ての面で例示的なものに過ぎず、制限的なものではないと理解すべきである。本発明の範囲は、前述した詳細な説明よりは後述の請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価範囲から導出される全ての変更または変形形態が本発明の範囲に含まれると解釈されるべきである。