"ブタジエンを生産するために十分な量にて発現するブタジエン経路酵素をコードしている、少なくとも1つの外因性の核酸を含むブタジエン経路を有する微生物を含む非天然微生物であって、上記ブタジエン経路は、ブタジエンシンターゼ;アセチル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;アセトアセチル‐CoAレダクターゼ;3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;クロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、またはクロトニル‐CoAトランスフェラーゼ;クロトン酸レダクターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成;グルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼ;グルタリル‐CoAデヒドロゲナーゼ;3‐アミノブチリル‐CoAデアミナーゼ;4‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;またはクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする非天然微生物。上記微生物は、2つの外因性の核酸を含み、上記2つの外因性の核酸は、それぞれブタジエン経路酵素をコードしていることを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記微生物は、3つの外因性の核酸を含み、上記3つの外因性の核酸は、それぞれブタジエン経路酵素をコードしていることを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記微生物は、4つの外因性の核酸を含み、上記4つの外因性の核酸は、それぞれブタジエン経路酵素をコードしていることを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、アセチル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;アセトアセチル‐CoAレダクターゼ;3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;およびブタジエンシンターゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、アセチル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;アセトアセチル‐CoAレダクターゼ;3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;ブタジエンシンターゼ;およびクロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、アセチル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;アセトアセチル‐CoAレダクターゼ;3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、アセチル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;アセトアセチル‐CoAレダクターゼ;3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、またはクロトニル‐CoAトランスフェラーゼ;およびクロトン酸レダクターゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、アセチル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;アセトアセチル‐CoAレダクターゼ;3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、またはクロトニル‐CoAトランスフェラーゼ;クロトン酸レダクターゼ;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、アセチル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;アセトアセチル‐CoAレダクターゼ;3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;ブタジエンシンターゼ;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、グルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;およびブタジエンシンターゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、グルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼ;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;ブタジエンシンターゼ;およびクロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、グルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼ;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、グルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼ;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、またはクロトニル‐CoAトランスフェラーゼ;およびクロトン酸レダクターゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、グルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼ;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、またはクロトニル‐CoAトランスフェラーゼ;クロトン酸レダクターゼ;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;ブタジエン;グルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼ;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、グルタリル‐CoAデヒドロゲナーゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;およびブタジエンシンターゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、グルタリル‐CoAデヒドロゲナーゼ;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;ブタジエンシンターゼ;およびクロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、グルタリル‐CoAデヒドロゲナーゼ;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、グルタリル‐CoAデヒドロゲナーゼ;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、またはクロトニル‐CoAトランスフェラーゼ;およびクロトン酸レダクターゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、グルタリル‐CoAデヒドロゲナーゼ;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、またはクロトニル‐CoAトランスフェラーゼ;クロトン酸レダクターゼ;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;ブタジエンシンターゼ;グルタリル‐CoAデヒドロゲナーゼ;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、3‐アミノブチリル‐CoAデアミナーゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;およびブタジエンシンターゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、3‐アミノブチリル‐CoAデアミナーゼ;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;ブタジエンシンターゼ;およびクロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、3‐アミノブチリル‐CoAデアミナーゼ;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、3‐アミノブチリル‐CoAデアミナーゼ;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、またはクロトニル‐CoAトランスフェラーゼ;およびクロトン酸レダクターゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、3‐アミノブチリル‐CoAデアミナーゼ;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、またはクロトニル‐CoAトランスフェラーゼ;クロトン酸レダクターゼ;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;ブタジエンシンターゼ;3‐アミノブチリル‐CoAデアミナーゼ;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、4‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;およびブタジエンシンターゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、4‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;ブタジエンシンターゼ;およびクロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、4‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、4‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;クロチルアルコールキナーゼ;2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、またはクロトニル‐CoAトランスフェラーゼ;およびクロトン酸レダクターゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、4‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;ブタジエンシンターゼ;クロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、またはクロトニル‐CoAトランスフェラーゼ;クロトン酸レダクターゼ;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成;ブタジエンシンターゼ;4‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ;およびクロチルアルコールジホスホキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記少なくとも1つの外因性の核酸は、異種性の核酸であることを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。上記非天然微生物は、実質的に嫌気性である培養媒体中に存在することを特徴とする請求項1に記載の非天然微生物。ブタジエンを生産するために十分な量にて発現するブタジエン経路酵素をコードしている、少なくとも1つの外因性の核酸を含むブタジエン経路を有する微生物を含む非天然微生物であって、上記ブタジエン経路は、ブタジエンシンターゼ;エリトロース‐4‐リン酸レダクターゼ;エリトリトール‐4‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼ;4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールキナーゼ;エリトリトール2,4‐シクロ二リン酸シンターゼ;1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸シンターゼ;1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸レダクターゼ;ブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ;エリトロース‐4‐リン酸キナーゼ;エリトロースレダクターゼ;またはエリトリトールキナーゼを含む、ことを特徴とする非天然微生物。上記微生物は、2つの外因性の核酸を含み、上記2つの外因性の核酸は、それぞれブタジエン経路酵素をコードしていることを特徴とする請求項37に記載の非天然微生物。上記微生物は、3つの外因性の核酸を含み、上記3つの外因性の核酸は、それぞれブタジエン経路酵素をコードしていることを特徴とする請求項37に記載の非天然微生物。上記微生物は、4つの外因性の核酸を含み、上記4つの外因性の核酸は、それぞれブタジエン経路酵素をコードしていることを特徴とする請求項37に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、エリトロース‐4‐リン酸レダクターゼ;エリトリトール‐4‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼ;4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールキナーゼ;エリトリトール2,4‐シクロ二リン酸シンターゼ;1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸シンターゼ;1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸レダクターゼ;およびブタジエンシンターゼを含む、ことを特徴とする請求項37に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、エリトロース‐4‐リン酸レダクターゼ;エリトリトール‐4‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼ;4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールキナーゼ;エリトリトール2,4‐シクロ二リン酸シンターゼ;1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸シンターゼ;1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸レダクターゼ;ブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ;およびブタジエンシンターゼを含む、ことを特徴とする請求項37に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、エリトリトール‐4‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼ;4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールキナーゼ;エリトリトール2,4‐シクロ二リン酸シンターゼ;1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸シンターゼ;1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸レダクターゼ;ブタジエンシンターゼ;エリトロース‐4‐リン酸キナーゼ;エリトロースレダクターゼ;およびエリトリトールキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項37に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、エリトリトール‐4‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼ;4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールキナーゼ;エリトリトール2,4‐シクロ二リン酸シンターゼ;1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸シンターゼ;1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸レダクターゼ;ブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ;ブタジエンシンターゼ;エリトロース‐4‐リン酸キナーゼ;エリトロースレダクターゼ;およびエリトリトールキナーゼを含む、ことを特徴とする請求項37に記載の非天然微生物。上記少なくとも1つの外因性の核酸は、異種性の核酸であることを特徴とする請求項37に記載の非天然微生物。上記非天然微生物は、実質的に嫌気性である培養媒体中に存在することを特徴とする請求項37に記載の非天然微生物。ブタジエンを生産するために十分な量にて発現するブタジエン経路酵素をコードしている、少なくとも1つの外因性の核酸を含むブタジエン経路を有する微生物を含む非天然微生物であって、上記ブタジエン経路は、ブタジエンシンターゼ;マロニル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;3‐オキソグルタリル‐CoAレダクターゼケトン還元;3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;3‐ヒドロキシ‐5‐オキソペンタン酸レダクターゼ;3,5‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐ホスホナトオキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐[ヒドロキシホスホノオキシホスホリル]オキシペンタン酸デカルボキシラーゼ;ブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ;3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAレダクターゼアルコール生成;3‐オキソグルタリル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;3,5‐ジオキソペンタン酸レダクターゼケトン還元;3,5‐ジオキソペンタン酸レダクターゼアルデヒド還元;5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸レダクターゼ;または3‐オキソ‐グルタリル‐CoAレダクターゼCoA還元およびアルコール生成を含む、ことを特徴とする非天然微生物。上記微生物は、2つの外因性の核酸を含み、上記2つの外因性の核酸は、それぞれブタジエン経路酵素をコードしていることを特徴とする請求項47に記載の非天然微生物。上記微生物は、3つの外因性の核酸を含み、上記3つの外因性の核酸は、それぞれブタジエン経路酵素をコードしていることを特徴とする請求項47に記載の非天然微生物。上記微生物は、4つの外因性の核酸を含み、上記4つの外因性の核酸は、それぞれブタジエン経路酵素をコードしていることを特徴とする請求項47に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、マロニル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;3‐オキソグルタリル‐CoAレダクターゼケトン還元;3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;3‐ヒドロキシ‐5‐オキソペンタン酸レダクターゼ;3,5‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐ホスホナトオキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐[ヒドロキシホスホノオキシホスホリル]オキシペンタン酸デカルボキシラーゼ;ブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ;およびブタジエンシンターゼを含む、ことを特徴とする請求項47に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、マロニル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;3,5‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐ホスホナトオキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐[ヒドロキシホスホノオキシホスホリル]オキシペンタン酸デカルボキシラーゼ;ブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ;ブタジエンシンターゼ;3‐オキソグルタリル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;3,5‐ジオキソペンタン酸レダクターゼアルデヒド還元;および5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸レダクターゼを含む、ことを特徴とする請求項47に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、マロニル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐オキソペンタン酸レダクターゼ;3,5‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐ホスホナトオキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐[ヒドロキシホスホノオキシホスホリル]オキシペンタン酸デカルボキシラーゼ;ブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ;ブタジエンシンターゼ;3‐オキソグルタリル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成;および3,5‐ジオキソペンタン酸レダクターゼケトン還元を含む、ことを特徴とする請求項47に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、マロニル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;3,5‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐ホスホナトオキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐[ヒドロキシホスホノオキシホスホリル]オキシペンタン酸デカルボキシラーゼ;ブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ;ブタジエンシンターゼ;5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸レダクターゼ;および3‐オキソ‐グルタリル‐CoAレダクターゼCoA還元およびアルコール生成を含む、ことを特徴とする請求項47に記載の非天然微生物。上記ブタジエン経路は、マロニル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ;3‐オキソグルタリル‐CoAレダクターゼケトン還元;3,5‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐ホスホナトオキシペンタン酸キナーゼ;3‐ヒドロキシ‐5‐[ヒドロキシホスホノオキシホスホリル]オキシペンタン酸デカルボキシラーゼ;ブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ;ブタジエンシンターゼ;および3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAレダクターゼアルコール生成を含む、ことを特徴とする請求項47に記載の非天然微生物。上記少なくとも1つの外因性の核酸は、異種性の核酸であることを特徴とする請求項47に記載の非天然微生物。上記非天然微生物は、実質的に嫌気性である培養媒体中に存在することを特徴とする請求項47に記載の非天然微生物。請求項1から57のいずれか1項に記載の非天然微生物を、ブタジエンを生産するための条件下で、かつ十分な時間にわたって培養する工程を含むことを特徴とするブタジエンを生産する方法。上記非天然微生物は、実質的に嫌気性の培養媒体中に存在することを特徴とする請求項58に記載の方法。実施例1ブタジエンを生成するための経路一般的な代謝産物の4炭素ジエン1,3‐ブタジエンへの転化に必要な酵素を有する操作された非天然の微生物を使用した、直接的なブタジエン生成のための新規の過程が本明細書にて開示されている。ブタンジエンの直接的な生産への一つの新規の経路は、アルデヒドおよびアルコールデヒドロゲナーゼを用いた還元を介した公知のブタノール経路の代謝産物であるクロトニル‐CoAのクロチルアルコールへの還元を必要とする。クロチルピロリン酸を生成するためのキナーゼを用いたリン酸化およびそれに続くイソプレンシンターゼまたはそれらの改変体を使用したブタジエンの転化が、上記の還元に続く図2を参照。別の経路図3は、イソプレノイドの生合成のためのよく特徴付けられているDXP経路の変形経路である。この経路においては、基質は2‐メチル基を欠く、そして、ブタジエンシンターゼを介してイソプレンよりもむしろブタジエンを提供する。本明細書に記載しているように指向性進化のような方法を用いて、上記のブタジエンシンターゼをイソプレンシンターゼから得ることができる。最後に、図4は基質として3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAを含むブタジエンへの経路を示す。上記3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAは、天然のメバロン酸経路の基質である3‐ヒドロキシ‐3‐メチル‐グルタリルCoA図1を参照の代用物としてはたらく。図2のステップA‐P、図3のステップA‐Kおよび図4のステップA‐Oのための酵素の候補を以下に提供する。アセチル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラ‐ゼ図2、ステップAアセチル‐CoAチオラーゼは、2つのアセチル‐CoAの分子を1つのアセチル‐CoAおよび1つのCoAに転化させる。例示的なアセチル‐CoAチオラーゼ酵素は、Ecoli由来のatoBMartinetalNatBiotechnol21796‐802、C.acetobutylicum由来のthlAおよびthlBHanaietalApplEnvironMicrobiol737814‐7818ならびにS.cerevisiae由来のERG10HiseretalJBiolChem26931383‐31389の遺伝子産物を含む。アセトアセチル‐CoAレダクターゼ図2、ステップBアセトアセチル‐CoAの3‐ヒドロキシブチリル‐CoAへの還元を触媒するアセトアセチル‐CoAレダクターゼは、種々のClostridia種において、ブチレートへのアセチル‐CoAの発酵経路に関係しており、詳細に研究されているJonesetalMicrobiolRev50484‐524。Clostridiumacetobutylicum由来の上記酵素hbdにコードされているをクローニングし、Ecoliにおいて機能的に発現させているYounglesonetalJBacteriol1716800‐6807。さらに、Ecoliにおける脂肪酸酸化物複合体の2つのサブユニットfadBおよびfadJにコードされているは、3‐ヒドロキシアシル‐CoAとして機能するBinstocketalMethodsEnzymol71PtC403‐411。さらに、アセトアセチル‐CoAを3‐ヒドロキシブチリル‐CoAに還元することが実証された他の遺伝子の候補は、Zoogloearamigera由来のphbBPlouxetalEurJBiochem174177‐182およびRhodobactersphaeroides由来のphaBAlberetalMolMicrobiol61297‐309である。前者の候補の遺伝子は、NADPH依存性である。上記遺伝子のヌクレオチドの配列は決定されておりPeoplesetalMolMicrobiol3349‐357上記遺伝子をEcoliにおいて発現させている。上記遺伝子の基質特異性についての研究によって、アセトアセチル‐CoA以外の基質として3‐オキソプロピオニル‐CoAが受け入れられることを結論として導いた。さらなる遺伝子の候補には、ClostridiumkluyveriにおけるHbd1C末端領域およびHbd2N末端領域HillmerandGottschalkBiochimBiophysActa333412‐23、ならびにBostaurusにおけるHSD17B10WAKILetalJBiolChem207631‐638が含まれる。Clostridaの他の種およびMetallosphaerasedulaにおいて、いくつかの類似の酵素が見出されているBergetalScience3181782‐1786。3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラタ‐ゼ図3、ステップC3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラタ‐ゼEC4.2.1.55クロトナ‐ゼとも呼ばれるは、3‐ヒドロキシブチリル‐CoAを可逆的に脱水し、クロトニル‐CoAを生じさせるエノイル‐CoAヒドラターゼである。クロトナーゼ酵素は、ある生物特に、Clostridial種において、n‐ブタノール形成に必要である。また、Acidianus属およびMetallosphaera属の好熱酸性古細菌において、上記クロトナーゼ酵素は3‐ヒドロキシプロピオネート/4‐ヒドロキシブチレート回路の1ステップを構成する。後者の遺伝子配列は公知ではないが、C.acetobutylicumAtsumietalMetabEng10305‐311BoyntonetalJBacteriol1783015‐3024、C.kluyveriHillmeretalFEBSLett21351‐354およびMetallosphaerasedulaBergetalScience3181782‐1786において、クロトナーゼ遺伝子をコードする例示的な遺伝子を見出すことができる。Pseudomonasputidaのエノイル‐CoAヒドラターゼechにコードされているはクロトニル‐CoAの3‐ヒドロキシブチリル‐CoAへの転化を触媒するRobertsetalArchMicrobiol11799‐108。さらなるエノイル‐CoAヒドラターゼの候補には、P.putidaのphaAおよびphaB、ならびに、P.fluorescens由来のpaaAおよびpaaBがあるOliveraetalProcNatlAcadSciUSA956419‐6424。最後に、特定のEscherichiacoliの遺伝子は、エノイル‐CoAヒドラターゼの機能性が実証された。上記遺伝子は、maoCParketalJBacteriol1855391‐5397、paaFIsmailetalEurJBiochem2703047‐3054ParketalApplBiochemBiotechnol113‐116335‐346ParketalBiotechnolBioeng86681‐686およびpaaGIsmailetalsupraParkandLeesupraParkandYupsupraを含む。これらのたんぱく質を以下に特定する。クロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成図2、ステップD種々のアシル‐CoAデヒドロゲナーゼはアシル‐CoAを対応するアルデヒド還元し得る。したがって、それらアシル‐CoAデヒドロゲナーゼはクロトニル‐CoAをクロトンアルデヒドに天然に還元する。または、それらアシル‐CoAデヒドロゲナーゼは、クロトニル‐CoAをクロトンアルデヒドに還元するように操作され得る。上記酵素をコードする例示的な遺伝子は、脂肪アシル‐CoAレダクターゼをコードするAcinetobactercalcoaceticusacr1ReiseretalJBacteriol1792969‐2975、Acinetobactersp.M‐1脂肪アシル‐CoAレダクターゼIshigeetalApplEnvironMicrobiol681192‐1195、ならびに、ClostridiumkluyveriにおいてsucD遺伝子にコードされたCoA‐依存およびNADP‐依存コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼSohlingetalJBacteriol178871‐80を含む。P.gingivalisのsucDは、別のコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼであるTakahashietalJBacteriol1824704‐4710。これらのコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、1,4‐ブタンジオールの生成経路の一部として、4‐ヒドロキシブチル‐CoAを4‐ヒドロキシブタナルに転化することが参照文献に明確に示されている。Pseudomonasspにおいてアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをアシル化する上記酵素bphGによってコードされているは、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒドおよびホルムアルデヒドを酸化およびアシル化することが実証されているように、別の能力を有する酵素でもあるPowlowskietalJBacteriol175377‐385。アシル‐CoAを対応するアルデヒドに転化するさらなる酵素のタイプとして、マロニル‐CoAレダクターゼがある。上記マロニル‐CoAレダクターゼは、マロニル‐CoAをマロン酸セミアルデヒドに転化する。好熱酸性古細菌における3‐ヒドロキシプロピオネート回路を介した独立栄養性の炭素固定において、マロニル‐CoAレダクターゼは重要な酵素であるBergetalScience3181782‐1786Thauer3181732‐1733。上記酵素は、NADPHを補因子として利用し、MetallosphaeraおよびSulfolobussppにおいて特徴づけられているAlberetalJBacteriol1888551‐8559HugleretalJBacteriol1842404‐2410。上記酵素は、MetallosphaerasedulaにおいてMsed_0709にコードされているAlberetalsupraBergetalsupra。Sulfolobustokodaii由来のマロニル‐CoAレダクターゼをコードする遺伝子はクローニングされ、Ecoliにおいて異種的に発現させられたAlberetalsupra。これら酵素のアルデヒドデヒドロゲナーゼの機能は、Chloroflexusaurantiacus由来の2機能性のデヒドロゲナ‐ゼと同様であるが、配列の相同性は低い。マロニル‐CoAレダクターゼ酵素の両候補は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼと高い配列の相同性を有している。上記アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アスパラティル‐4‐リン酸のアスパラギン酸セミアルデヒドへの還元および同時発生の脱リン酸化を触媒する。SulfolobussolfataricusおよびSulfolobusacidocaldariusを含む他の生物におけるタンパク質に対する配列の相同性によって、さらなる遺伝子の候補を見出すことができる。さらに、CoAアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼに対する別の候補は、Clostridiumbeijerinckii由来のald遺伝子であるTothApplEnvironMicrobiol654973‐4980。これらのたんぱく質を以下に特定する。クロトンアルデヒドレダクターゼアルコール形成図2、ステップEクロトンアルデヒドレダクターゼアルコール形成活性を示す酵素は、クロトンアルデヒドからクロチルアルコールを形成し得る。次の酵素は、天然にこの活性を有する。または、この活性を示すように操作され得る。アルデヒドのアルコールへの転化を触媒する酵素例えば、アルコールデヒドロゲナーゼまたは同等のアルデヒドレダクターゼをコードする例示的な遺伝子は、C2‐C14に対する中鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードするalrATanietalApplEnvironMicrobiol665231‐5235、Saccharomycescerevisiae由来のADH2AtsumietalNature45186‐89、E.coli由来のC3よりも長い分子に対して好適なyqhDSulzenbacheretalJMolBiol342489‐502、ならびに、C.acetobutylicum由来のブチルアルデヒドをブタノールに転化するbdhIおよびbdhIIWalteretalJBacteriol1747149‐7158を含む。Zymomonasmobilis由来のADH1は、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドおよびアクロレインを含むいくつかのアルデヒドにおいて活性を有することが実証されているKinoshitaApplMicrobiolBiotechnol22249‐254。ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052由来のCbei_2181は、クロトンアルデヒドをクロチルアルコ‐ルに転化し得る別の有効なアルコールデヒドロゲナーゼもコードしている。4‐ヒドロキシブチレーデヒドロゲナーゼ活性EC1.1.1.61を示す酵素も、この種類に分類される。上記酵素は、RalstoniaeutrophaBravoetalJForensicSci49379‐387、ClostridiumkluyveriWolffetalProteinExprPurif6206‐212およびArabidopsisthalianaBreitkreuzetalJBiolChem27841552‐41556において特徴づけられている。クロチルアルコールキナーゼ図2、ステップFクロチルアルコールキナーゼ酵素は、クロチルアルコールのリン酸基からヒドロキシル基への転化を触媒する。以下に記載した上記酵素は、天然に、上記活性を有する。または、この活性を示すように操作され得る。リン酸基のアルコール基への転化を触媒するキナーゼは、EC2.7.1の酵素分類に属する。このステップにおいて好適な候補は、3,5‐ジヒドロキシペンタン酸のメチルアナログメバロン酸の末端ヒドロキシル基をリン酸化するメバロン酸キナーゼEC2.7.1.36である。このステップにおけるいくつかの遺伝子の候補は、Scerevisiae由来のerg12、Methanocaldococcusjannaschi由来のmvk、Homosapeins由来のMVKおよびArabidopsisthalianacol由来のmvkである。グリセロールキナーゼもグリセロールにおける末端ヒドロキシル基をリン酸化し、グリセロール‐3‐リン酸を形成する。この反応は、Escherichiacoli、SaccharomycescerevisiaeおよびThermotogamaritimaを含む種々の種において生じる。E.coliのグリセロールキナーゼは、ジヒドロキシアセトンおよびグリセルアルデヒドのような代替えの基質を受け入れることが示されているHayashietalJBiolChem2421030‐1035。T,maritimeは、2つのグリセロールキナーゼを有するNelsonetalNature399323‐329。グリセロールキナーゼは、広い範囲の基質特異性を有することが示されている。CransおよびWhitesideは、異なる4つの生物Escherichiacoli、S.cerevisiae、BacillusstearothermophilusおよびCandidamycoderma由来のグリセロールキナーゼについて研究を行ったCransetalJAmChemSoc1077008‐7018Nelsonetalsupra。CransおよびWhitesideは、66の異なるグリセロールのアナログを研究し、上記酵素は1つの末端ヒドロキシル基の位置においてある範囲内の基質を受け入れることができ、メチル基によってC2の水素原子を置換できると結論付けた。興味深いことに、4つの生物に由来する全ての酵素のカイネティックの定数は、非常に類似していた。上記遺伝子の候補は:ホモセリンキナーゼは、3,5‐ジヒドロキシペンタン酸のリン酸化を導き得る別の可能性のある候補である。この酵素も、E.coli、StreptomycesspおよびS.cerevisiaeを含む種々の生物において存在する。E.coli由来のホモセリンキナーゼは、多数の基質において活性を持つことが示されており、例えば、上記基質はL‐2‐アミノ,1,4‐ブタンジオール,アスパラギン酸セミアルデヒドおよび2‐アミノ‐5‐ヒドロキシバレラートを含むHuoetalBiochemistry3516180‐16185HuoetalArchBiochemBiophys330373‐379。アルファ位置aiphapositionにおけるカルボキシル基がエステルまたは、ヒドロキシメチル基によって置換された基質に対して、この酵素は作用し得る。上記遺伝子の候補は:2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ図2、ステップG2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ酵素は、リン酸基の2‐ブテニル‐4‐リン酸のリン酸基への転化を触媒する。下記の酵素は、上記活性を天然に有する。または、この活性を示すために操作し得る。リン酸基の別のリン酸基への転化を触媒するキナーザは、EC2.7.4酵素分類に属する。下記の表は、EC2.7.4酵素分類における種々の有益なキナーゼ酵素を記載している。ホスホメバロン酸キナーゼ酵素は、特に重要である。ホスホメバロン酸キナーゼ酵素EC2.7.4.2は、アナログの2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼへの転化を触媒する。この酵素は、Saccharomycescerevisiaeにおけるerg8によってTsayetalMolCellBiol11620‐631、ならびに、Streptococcuspneumoniae、StaphylococcusaureusおよびEnterococcusfaecalisにおけるmvaK2DounetalProteinSci141134‐1139WildingetalJBacteriol1824319‐4327によってコードされている。StreptococcuspneumoniaeおよびEnterococcusfaecalisの酵素はクローニングされ、E.coliにおいて特徴づけられた。PilloffetalJBiolChem2784510‐4515DounetalProteinSci141134‐1139。ブタジエンシンターゼ図2、ステップHブタジエンシンターゼは、2‐ブテニル‐4‐二リン酸の1,3‐ブタンジエンへの転化を触媒する。下記の酵素は上記活性を天然に有する。または、この活性を示すように、操作され得る。イソプレンシンターゼは、ジメチルアリル二リン酸のイソプレンへの転化を天然に触媒する。しかし、イソプレンシンターゼは、2‐ブテニル‐4二リン酸からの1,3‐ブタジエンの合成も触媒し得る。イソプレンシンターゼは、PopulusalbaSasakietalFEBSLetters20055792514‐2518、PuerariamontanaLindbergetalMetabolicEng20101270‐79SharkeyetalPlantPhysiol2005137700‐712およびPopulustremulaxPopulusalbaMilleretalPlanta2001213483‐487を含む種々の生物において見出すことができる。さらなるイソプレンシンターゼ酵素は、ChotanietalWO2010031079SystemsUsingCellCultureforProductionofIsopreneCervinetalUSPatentApplication20100003716IsopreneSynthaseVariantsforImprovedMicrobialProductionofIsopreneに記述されている。クロトニル‐CoAヒドラーゼ、シンターゼ、トランスフェラーゼ図2、ステップIクロトニル‐CoAヒドラーゼは、クロトニル‐CoAのクロトン酸への転化を触媒する。下記の酵素は、天然に上記の活性を有する。または、この活性を示すように操作され得る。3‐ヒドロキシイソブチルリル‐CoAヒドラーゼは、バリンの分解の間における3‐ヒドロキシイソブチルリル‐CoAの3‐ヒドロキシイソブチレートへの転化を効率よく触媒するShimomuraetalJBiolChem2691424814253。この酵素をコードする遺伝子は、RattusnorvegicusのhibchおよびHomosapiensのhibchを含む。H.sapiensの酵素は、基質として3‐ヒドロキシブチルリル‐CoAおよび3‐ヒドロキシプロピオニル‐CoAも受け入れるShimomuraetalsupra。配列相同性による候補の遺伝子は、SaccharomycescerevisiaeのhibchおよびBacilluscereusのBC_2292を含む。これらのたんぱく質を以下に特定する。種々の真核生物のアセチル‐CoAヒドロラーゼEC3.1.2.1は、広い基質特異性を有する。よって、適当な候補酵素の代わりになる。例えば、Rattusnorvegicusの脳由来の酵素RobinsonetalResCommun71959965は、ブチリル‐CoA、ヘクサノイル‐CoAおよびマロニル‐CoAと反応し得る。その配列は報告されていないが、エンドウの葉のミトコンドリア由来の酵素も広い基質特異性を有する。上記広い基質特異性は、アセチル‐CoA、プロピオニル‐CoA、ブチリル‐CoA、パルミトイル‐CoA、オレオイル‐CoA、サクシニル‐CoAおよびクロトニル‐CoAにおける活性が実証されているZeiheretalPlantPhysiol942027。Scerevisiae由来のアセチル‐CoAヒドラーゼACH1は、別の候補酵素の代わりになるBuuetalJBiolChem2781720317209。これらのたんぱく質を以下に特定する。別の候補ヒドラーゼは、ヒトのジカルボン酸チオエステラーゼacot8であり、にグルタリル‐CoA、アジピル‐CoA、スベリル‐CoA、セバシル‐CoAおよびドデカンジオイルおいて活性を示すWestinetalJBiolChem2803812538132。さらに、別の候補ヒドラーゼは、クロゼットclosetE.coliのホモログfesBであり、広い範囲のCoAチオエステルの加水分解もし得るNaggertetalJBiolChem2661104411050。類似の酵素がラットの肝臓において特徴づけられているDeanaetalBiochemInt26767773。他の可能性であるE.coliのチオエステルヒドロラーゼは、tesABonneretalChem24731233133、ybgCKuznetsovaetalFEMSMicrobiolRev29263279and、paaISongetalJBiolChem2811102811038およびybdBLeducetalJBacteriol18971127126の遺伝子産物を含む。これらのタンパク質を以下に同定する。さらに、別の候補ヒドロラーゼは、acidaminococcusfermentans由来のグルタコン酸CoA‐トランスフェラーゼである。グルタリル‐CoA、アセチル‐CoAおよび3‐ブテノイル‐CoAに対する活性を備えるアシル‐CoAへの部位特異的突然変異誘発法によって、この酵素を形質転換したMacketalFEBSLett405209212。これは、以下のことを示唆している。スクシニル‐CoA:3‐ケト酸‐CoAトランスフェラーゼおよびアセトアセチル‐CoA:アセチル‐CoAトランスフェラーゼをコードする酵素が、この反応のステップに対する候補としても機能し得るが、それらの機能を変化するために確実な変異を必要とする。これらのたんぱく質を下記に同定する。クロトニル‐CoAシンターゼは、クロトニル‐CoAのクロトン酸への転化を触媒する。下記の酵素は、天然に上記の活性を有する。または、この活性を示すように操作され得る。候補酵素の1つのADP‐形成アセチル‐CoAシンセターゼACD,EC6.2.1.13は、アシル‐CoAエステルの対応する酸への転化と同時に生じるATPの合成とを結合する。広い基質特異性を備える種々の酵素が文献に記載されている。Archaeoglobusfulgidus由来のACDIAF1211にコードされているは、種々の直鎖状および側鎖状の基質に作用することが示された。上記基質は、例えば、アセチル‐CoA、プロピオニルアセチル‐CoA、ブチリル‐CoAb、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、イソ吉草酸、コハク酸、フマル酸、酢酸フェニル、インドール酢酸MusfeldtetalJBacteriol184636644である。Haloarculamarismortui由来の上記酵素注釈:スクシニル‐CoAシンターゼは、基質としてプロピオン酸、酪酸butyryateおよび側鎖酸イソ吉草酸およびイソ酪酸を受け入れる。そして、上記酵素は、順および逆方向において作用することが示されているBrasenetalArchMicrobiol182277287。超好熱性クレンアーキアのPyrobaculumaerophilum由来のPAE3250にコードされているACDは、アセチル‐CoA、イソブチリル‐CoA好適な基質およびフェニルアセチル‐CoAと反応するすべての特徴づけられたACDにおいて広い基質の範囲を有することを示したBrasenetalsupra。A.fulgidus、H.marismortuiおよびP.aerophilum由来の上記酵素は全てクローニングされ、機能的に発現させられ、そして、E.coliにおいて特徴づけられているMusfeldtetalsupraBrasenetalsupraこれらのたんぱく質を下記に同定する。別の候補CoAシンセターゼは、スクシニル‐CoAシンセターゼである。E.coliのsucCD遺伝子は、スクシニル‐CoAシンセターゼ複合体を形成する。上記複合体は、1つのATPの付随的concaminant消費を伴うコハク酸からのスクシニル‐CoAの形成を天然に触媒する。上記反応は、インビボにおいて可逆的であるBucketalBiochem2462456252。これらのたんぱく質を下記に、同定する。さらなる例示的なCoA‐リガーゼは以下を含む。ラットのジカルボン酸‐CoAリガーゼ上記リガーゼの配列は、まだ、同定されていないVamecqetalBiochemicalJournal230683693、P.chrysogenum由来の2つの特徴づけられた酢酸フェニル‐CoAリガーゼの両方LamasMaceirasetalBiochemJ395147155WangetalBiochemBiophyResCommun360453458、Pseudomonasputida由来の酢酸フェニル‐CoAリガーゼMartinezBlancoetalJBiolChem26570847090およびBacilissubtilis由来の6‐カルボキシヘキサン酸‐CoAリガーゼ41224130。さらなる候補酵素は、Musmusculus由来のアセトアセチル‐CoAシンセターゼHasegawaetalBiochimBiophysActa1779414419およびHomosapiens由来のアセトアセチル‐CoAシンセターゼOhgamietalBiochemPharmacol65989994である。上記酵素は、ATP依存性のアセト酢酸のアセトアセチル‐CoAへの転化を天然に触媒する。これらのたんぱく質を下記に同定する。クロトニル‐CoAトランスフェラーゼは、クロトニル‐CoAのクロトン酸への転化を触媒する。下記の酵素は、上記活性を天然に有する。または、この活性を示すように操作され得る。種々のトランスフェラーゼは広い特異性を有する。よって、上記トランスフェラーゼはCoA受容体を利用し得る。例えば、上記CoA受容体は、酢酸、コハク酸、プロピオン酸、酪酸、2‐メチルアセト酢酸、3‐ケトヘキサン酸、3‐ケトペンタン酸、吉草酸、クロトン酸、3‐メルカプトプロピオン酸、ビニル酢酸、酪酸、などである。例えば、Roseburiasp.A2-183由来の酵素は、ブチリル‐CoA:酢酸:CoAトランスフェラーゼ活性およびプロピオニル‐CoA:酢酸:CoAトランスフェラーゼ活性を有することが示されたCharrieretalMicrobiology152179185。例えば、RoseburiaintestinalisL1-82、RoseburiainulinivoransDSM16841、EubacteriumrectaleATCC33656において酷似したホモログを見出し得る。プロピオニル‐CoAトランスフェラーゼ活性を有する別の酵素を、Clostridiumpropionicumにおいて見出し得るSelmeretalEurJBiochem269372380。この酵素は、CoA受容体をとして、酢酸、R‐乳酸、S‐乳酸、アクリル酸および酪酸を使用し得るSelmeretalEurJBiochem269372380SchweigerandBuckelFEBSLetters1717984。例えば、ClostridiumnovyiNT、ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052およびClostridiumbotulinumCstr.Eklundにおいて、酷似したホモログを見出し得る。E.coliにおいてYgfhはプロピオニル‐CoA:コハク酸CoAトランスフェラーゼをコードするHalleretalBiochemistry3946224629。例えば、CitrobacteryoungaeATCC29220、Salmonellaentericasubsp.arizonaeserovar、およびYersiniaintermediaATCC29909において、酷似したホモログを見出しうる。これらのタンパク質を下記に同定する。さらなる候補酵素は、2つのユニット酵素であり、PseudomonasにおいてpcaIおよびpcaJによってコードされ、上記酵素は3‐オキソアジピル‐CoA/コハク酸トランスフェラーゼ活性を有することが示されているKaschabeketalsupra。ホモロジーに基づいた類似した酵素が、Acinetobactersp.ADP1KowalchuketalGene1462330およびStreptomycescoelicolorにおいて存在する。さらなる例示的なスクシニル‐CoA:3:オキソ酸‐CoAトランスフェラーゼが、HelicobacterpyloriCorthesyTheulazetalJBiolChem2722565925667およびBacillussubtilisStolsetalProteinExprPurif53396403において存在する。これらのタンパク質を下記に同定する。CoA受容体として酢酸を利用し得るCoAトランスフェラーゼは、アセトアセチル‐CoAトランスフェラーゼであり、E.coliのatoAアルファサブユニット遺伝子およびatoDベータサブユニット遺伝子によってコードされているVanderwinkeletalBiochemBiophysResCommun33902908KorolevetalActaCrystallogrDBiolCrystallogr5821162121。この酵素も、CoAの一部を種々の側鎖状および直鎖状アシル‐CoA基質から酢酸に移すことが示されており、上記基質は、イソ酪酸、吉草酸Vanderwinkeletalsupraおよび酪酸butanoateVanderwinkeletalsupraを含む。類似した酵素が、CorynebacteriumglutamicumATCC13032DuncanetalApplEnvironMicrobiol6851865190、ClostridiumacetobutylicumCaryetalApplEnvironMicrobiol5615761583およびClostridiumsaccharoperbutylacetonicumKosakaetalBiosciBiotechnolBiochem715868において存在する。これらのタンパク質を下記に同定する。上記の酵素は、クロトニル‐CoAにおいて所望の活性を示し得る。さらなる例示的なトランスフェラーゼの候補は、Clostridiumkluyveriのcat1、cat2およびcat3の遺伝子産物によって触媒され、上記遺伝子産物はスクシニル‐CoA、4‐ヒドロキシブチリル‐CoAおよびブチリル‐CoAトランスフェラーゼ活性の各々を示すことが示されているSeedorfetalsupraSohlingetalEurJBiochem212121127SohlingetalJBacteriol178871880。類似したCoAトランスフェラーゼ活性も、TrichomonasvaginalisvanGrinsvenetalJBiolChem28314111418およびTrypanosomabruceiRiviereetalJBiolChem2794533745346において存在する。これらのタンパク質を下記に同定する。嫌気性細菌Acidaminococcusfermentans由来のグルタコン酸CoA‐トランスフェラーゼEC2.8.3.12酵素は、二酸グルタコニル‐CoAdiacidglutaconylCoAおよび3‐ブテノイル‐CoAと反応するMacketalFEBSLett405209212。この酵素をコードする遺伝子は、gctAおよびgctBである。この酵素は、減衰するが、他のCoA誘導体による検出可能な活性を有し、上記誘導体はグルタリル‐CoA、2‐ヒドロキシグルタリル‐CoA、アジピル‐CoAおよびアクリリル‐CoAを含むBuckeletalEurJBiochem118315321。上記酵素は、クローニングされ、E.coliにおいて発現させられているMacketalEurJBiochem2264151。これらのタンパク質を下記に同定する。クロトン酸レダクターゼ図2、ステップJクロトン酸レダクターゼ酵素は、クロトン酸のクロトンアルデヒドへの転化を触媒し得る。下記の酵素は、上記活性を天然に有する。または、この活性を示すように操作され得る。カルボン酸レダクターゼは、カルボン酸の対応するアルデヒドへのマグネシウム、ATPおよびNADPH依存性の還元を触媒するVenkitasubramanianetalJBiolChem282478485。この酵素carによってコードされるをクローニングし、E.cpliにおいて機能的に発現させたVenkitasubramanianetalJBiolChem282478485。nptの遺伝子産物の発現は、転写後の修飾を介して、上記酵素の活性を改善する。npt遺伝子は、特定のホスホパンテテイントランスフェラーゼPPTaseをコードする。上記PPTasは、不活アポ酵素を活性ホロ酵素へ転化する。この酵素の天然の基質はバニリン酸であり、上記酵素は芳香族および脂肪族の基質の広い受け入れを示すVenkitasubramanianetalinBiocatalysisinthePharmaceuticalandBiotechnologyIndustiresedRNPatelChapter15pp425440CRCPressLLCBocaRatonFL。さらなるcarおよびnpt遺伝子を、配列の相同性に基づいて同定し得る。Streptomycesgriseusにおいて見出されたさらなる酵素の候補は、griC遺伝子およびgriD遺伝子によってコードされる。griCおよびgriDの両方の欠失は、3‐アミノ‐4‐ヒドロキシ安息香酸の代謝の分路の生成物である細胞外の3‐アセチルアミノ‐4‐ヒドロキシ安息香酸の細胞外の蓄積を誘導するので、この酵素は、3‐アミノ‐4‐ヒドロキシ安息香酸を3‐アミノ‐4‐ヒドロキシベンズアルデヒドに転化すると考えられているSuzukietalJAntibiot60380387。griCおよびgriDのSGR_665Nocardiaiowensisのnptに配列が類似している酵素との共発現は、有益に成り得る。類似した性質を有する酵素アルファ‐アミノアジピン酸リダクターゼAAR,EC1.2.1.31は、特定の真菌においてリジン生合成経路に関与する。この酵素は、アルファ‐アミノアジピン酸をアルファ‐アミノアジピン酸セミアルデヒドに天然に還元する。アデニル酸のATP依存性形成を介してカルボキシル基が、初めに、活性化される。その後、上記アデニル酸は、NADPHによって還元され、アルデヒドおよびAMPを生成する。この酵素は、CARの様にマグネシウムを利用し、PPTaseによる活性化を必要とする。AARに対する酵素候補およびそれに対応するPPTaseをSaccharomycescerevisiaeMorrisetalGene98141145、CandidaalbicansGuoetalMolGenetGenomics269271279およびSchizosaccharomycespombeFordetalCurrGenet28131137において見出す。S.pombe由来のAARをE.coliにおいて発現させると、有意な活性を示したGuoetalYeast2112791288。Penicilliumchrysogenum由来のAARは、代替えの基質としてS‐カルボキシメチル‐L‐システインを受け入れる。しかし、上記AARは、アジペート、グルタミン酸またはジアミノピメリン酸と反応しないHijarrubiaetalJBiolChem27882508256。これまでにP.chrysogenumのPPTaseをコードする遺伝子は、同定されていない。クロトニル‐CoAレダクターゼアルコール形成図2、ステップKクロトンアルデヒドレダクターゼアルコール形成酵素は、クロトニル‐CoAからクロチルアルコールを形成するために必要な2つの還元ステップを触媒する。アシル‐CoAをアルコールに転化する例示的な2つのステップのオキシドリラクターゼを下記に提供する。上記酵素は、クロトニル‐CoAをクロチルアルコールに天然に転化しうる。または、上述したようにするように操作され得る。これらの酵素は、アセチル‐CoAのような基質をエタノールに転化するもの例えば、E.coli由来のadhEKessleretalFEBSLett2815963およびブチリル‐CoAをブタノールに転化するもの例えば、C.acetobutylicum由来のadhE2FontaineetalJBacteriol184821830を含む。C.acetobutylicum由来のadhE2酵素が、4‐ヒドロキシブチリル‐CoAからBDOを生成することが参照文献Burketalsupraにて明確に示された。アセチル‐CoAのエタノールへの還元に加えて、LeuconostocmesenteroidesにおいてadhEにコードされている酵素は、側鎖化合物のイソブチルアルデヒドをイソブチリル‐CoAに酸化することが示されたKazahayaetalJGenApplMicrobiol184355KooetalBiotechnolLett27505510。別の例示的な酵素は、マロニル‐CoAを3‐HPに転化し得る。この活性を有するNADPH依存性酵素は、Chloroflexusaurantiacusにおいて特徴づけられてお、上記酵素は3‐ヒドロキシプロピオン酸回路に関与しているHugleretalsupraStraussetal215633643。この酵素は、高い基質特性であり、他の公知のオキシドリラクターゼにたいして低い配列相同性を示すHugleretalsupra。他の生物が同様な経路を有し得る生物情報学的な根拠があるがKlattetalEnvironMicrobiol920672078、他の生物においてはこの特定の反応を触媒する酵素は見られない。Roseiflexuscastenholzii、Erythrobactersp.NAP1およびマリンガンマプロテオバクテリウムmarinegammaproteobacteriumHTCC2080を含む他の生物における酵素の候補は、配列相同性によって推測され得る。グルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼ図2、ステップLグルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼ酵素グルタミン酸発酵嫌気細菌において特徴づけられているは、ナトリウムイオン転移デカルボキシラーゼである。上記ナトリウムイオン転移デカルボキシラーゼは、補因子としてビオチンを利用し、4つのサブユニットアルファ、ベータ、ガンマおよびデルタから構成されるBoiangiuetalJMolMicrobiolBiotechnol10105119BuckelBiochimBiophysActa15051527。上記酵素は、FusobacteriumnucleatumBeatrixetalArchMicrobiol154362369およびAcidaminococcusfermentansBrauneetalMolMicrobiol31473487において特徴づけられている。Fnucleatumのグルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼのアルファサブユニット、ベータサブユニット、ガンマサブユニットおよびデルタサブユニットに対するアナログを、S.aciditrophicusにおいて見出す。エノイル‐CoAデヒドロゲナーゼとして注釈される遺伝子syn_00480、別のGCDは、予想されるオペロンにおいて、ビオチン‐カルボキシルキャリアーsyn_00479とグルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼアルファサブユニットsyn_0048との間に配置される。例示的な遺伝子産物のためのタンパク質の配列は、続いて以下に示すGenebankアクセション番号を用いて見出し得る。グルタリル‐CoAデヒドロゲナーゼ図2、ステップMグルタリル‐CoAデヒドロゲナーゼGCD,EC1.3.99.7およびEC4.1.1.70は、グルタリル‐CoAのクロトニル‐CoAへの酸化的脱炭酸を触媒する二機能性酵素である図3、ステップ3。二機能性GCD酵素はホモ4量体であり、電子受容体として電子伝達フラボタンパク質を利用するHarteletalArchMicrobiol159174181。芳香族化合物における増殖中のPseudomonasstrainsKB740およびK172の細胞抽出物において、上記酵素は初めて特徴づけられたHarteletalsupra。しかし、これらの生物における関連遺伝子は公知でない。グルタリル‐CoAデヒドロゲナーゼcgHをコードする遺伝子および同種の転写制御因子gcdHが、Azoarcussp.CIBにおいて同定されたBlazquezetalEnvironMicrobiol10474482。gcdH活性が不足しているAzoarcus系統は、Pseudomonasputida由来の異種性の遺伝子gcdHの同定のために使用されるBlazquezetalsupra。Pseudomonasputidaにおける同種の転写制御因子は同定されていない。しかし、locusPP0157は、Azoarcusの酵素に対して高い配列の相同性>69同一性を有する。さらなるGCD酵素を、PseudomonasfluorescensおよびParacoccusdenitrificansにおいて見出すHusainetalJBacteriol163709715。ヒトのGCDは、詳細にわたり研究され、E.coliにおいて過剰発現されDwyeretalBiochemistry391148811499、結晶化され、活性領域における保存されたグルタミン酸を含む触媒機能が説明されているFuetalBiochemistry4396749684。SyntrophusaciditrophicusにおけるGCDは、クロトン酸における増殖中のCO2同化の方向性において作用するMouttakietalApplEnvironMicrobiol73930938。S.aciditrophicusにおける2つのGCD遺伝子が、AzoarcusのGcdH:syn_0048031およびsyn_0114631に対するタンパク質配列の相同性によって同定された。AzoarcusのGcdRに対する明確な相同性は見出されなかった。例示な遺伝子産物に対するタンパク質の配列を、続いて以下に示すGeneBankアクセション番号を使用することによって見出し得る。3‐アミノブチリル‐CoAデアミナーゼ図2、ステップN3‐アミノブチリル‐CoAは、リジン発酵における中間生成物である。3‐アミノブチリル‐CoAは、トランスアミナーゼまたはアミノ化デヒドロゲナーゼを介したアセトアセチル‐CoAからも形成され得る。この可逆的酵素は、Fusobacteriumnucleatum、Porphyromonasgingivalis、Thermoanaerobactertengcongensisおよび種々の他の生物において存在し、リシンの発酵に関与する種々の遺伝子と共に配置されているKreimeyeretalJBiolChem200728271917197。4‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ図2、ステップO種々の酵素は、4‐ヒドロキシブチリル‐CoAのクロトノイル‐CoAへの脱水を天然に触媒する。この変化は、Clostridiumaminobutyricumによる4‐アミノ酪酸発酵ScherfetalEurJBiochem215421429およびにClostridiumkluyveriによるコハク酸‐エタノール発酵ScherfetalArchMicrobiol161239245にとって必要である。この変化も、古細菌例えば、Metallosphaerasedulaにおいては、3‐ヒドロキシプロピオン酸/4‐ヒドロキシ酪酸の無機栄養性二酸化炭素同化経路の一部として重要なステップであるBergetalsupra。4‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼの可逆性は、詳しく報告されておりMuhetalBiochemistry351171011718FriedrichetalAngewChemIntEdEngl4732543257MuhetalEurJBiochem248380384、平衡定数が、クロトニル‐CoA側において、約4である事が報告されている。クロチルアルコールジホスホキナーゼ図2、ステップPクロチルアルコールジホスホキナーゼ酵素は、クロチルアルコールにおける二リン酸基のヒドロキシル基への転化を触媒する。下記の酵素は、上記活性を天然に有する。または、この活性を示すように操作され得る。二リン酸基の転化を触媒するキナーゼは、EC2.7.6酵素分類に属する。下記の表は、EC2.7.6酵素分類における種々の有効なキナーゼ酵素を記載する。EscherichiacoliHoveJensonetalJBiolChem1986261676571およびMycoplasmapneumoniaeM129McElwainetalInternationalJournalofSystematicBacteriology198838417423において同定されているリボース‐リン酸ジホスホキナーゼ酵素およびチアミンジホスホキナーゼ酵素は、特に重要である。例示的なチアミンジホスホキナーゼ酵素を、Arabidopsisthalianaにおいて見出すAjjawiPlantMolBiol20076515162。エリトロース‐4‐リン酸レダクターゼ図3、ステップA経路のステップAにおいて、エリトロース‐4‐リン酸レダクターゼまたはエリトリトール‐4‐リン酸デヒドロゲナーゼによって、エリトロース‐4‐リン酸をエリトリトール‐4‐リン酸に転化する。エリトロース‐4‐リン酸の還元は、エリトリトールを生成中のLeuconostocoenosにおいて観察されるVeigadaCunhaetalJBacteriol17539413948。NADPHは補因子として同定されたVeigadaCunhaetalsupra。しかし、エリトロース‐4‐リン酸の遺伝子は同定されなかった。したがって、Leuconostocoenos由来のエリトロース‐4‐リン酸レダクターゼ遺伝子を同定し得、このステップに適用し得る。さらに、同様な反応を触媒する酵素をこのステップに利用し得る。これらの酵素の例は、1‐デオキシ‐D‐キシルロース‐5‐リン酸レダクトイソメラーゼEC1.1.1.267であり、1‐デオキシ‐D‐キシリロースxylylose‐5‐リン酸の2‐C‐メチル‐D‐エリトリトール‐4‐リン酸ステップAを比較すると、1つの付加的なメチル基を有するへの転化を触媒する。1‐デオキシ‐D‐キシルロース‐5‐リン酸レダクトイソメラーゼをコードするdxrまたはispC遺伝子は、よく研究されている:EscherichiacoliおよびMycobacteriumtuberculosis由来のDxrタンパク質は精製されて、結晶構造が同定されたYajimaetalActaCrystallogrSectFStructBiolCrystCommun63466470MacetalJMolBiol345115127HenrikssonetalActaCrystallogrDBiolCrystallogr62807813HenrikssonetalJBiolChem2821990519916。改良された活性および変化させたカイネティクスを伴う部位特異的突然変異誘発法によって、Synechocystissp由来のDxrタンパク質は研究されているFernandesetalBiochimBiophysActa1764223229FernandesetalArchBiochemBiophys444159164。さらに、Escherichiacoli由来のグリセルアルデヒド‐3‐リン酸レダクターゼYghZは、グリセルアルデヒド‐3‐リン酸およびグリセロール‐3‐リン酸間の転化を触媒するDesaietalBiochemistry4779837985。上記グリセルアルデヒド‐3‐リン酸レダクターゼYghZも、このステップに適用され得る。次の遺伝子はステップAの転化に使用され得る:エリトリトール‐4‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼ図3、ステップB経路のステップBにおいて、エリトリトール‐4‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼまたは4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールシンターゼによって、エリトリトール‐4‐リン酸を4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールに転化する。このステップに対する的確な酵素は、同定されていない。しかし、同様の反応を触媒する酵素をこのステップに適用し得る。例えば、2‐C‐メチル‐D‐エリトリトール4‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼまたは4‐シチジン5’‐ジホスホ‐2‐C‐メチル‐D‐エリトリトールシンターゼEC2.7.7.60である。2‐C‐メチル‐D‐エリトリトール4‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼは、イソプレノイド生合成のためのメチルエリトリトールリン酸経路に存在して、2‐C‐メチル‐D‐エリトリトール4‐リン酸および4‐シチジン5’‐ジホスホ‐2‐C‐メチル‐D‐エリトリトールステップBの転化を比較すると、余分のメチル基を有する間の転化を触媒する。2‐C‐メチル‐D‐エリトリトール4‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼは、ispDによってコードされ、EscherichiacoliIspDの結晶構造が同定されたKempetalActaCrystallogrDBiolCrystallogr5711891191KempetalActaCrystallogrDBiolCrystallogr59607610RichardetalNatStructBiol8641648。MycobacteriumtuberculosisH37Rv由来のispD遺伝子はクローニングされて、Escherichiacoliにおいて発現させられた。N末端側のHis‐tagを用いて組換えタンパク質を精製したShietalJBiochemMolBiol40911920。さらに、StreptomycescoelicolorのispD遺伝子は、クローニングされ、E.coliにおいて発現させられた。組換えタンパク質は、物理的および動力学的に特徴づけられたCaneetalBioorgMedChem914671477。次の遺伝子は、ステップBの転化に使用され得る。4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールキナーゼ図3、ステップC経路のステップCにおいて、4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールキナーゼによって、4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールを2‐ホスホ‐4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールに転化する。このステップに対する的確な酵素は、同定されていない。しかし、同様の反応を触媒する酵素をこのステップに適用し得る。例えば、4‐ジホスホシチジル‐2‐C‐メチルエリトリトールキナーゼEC2.7.1.148である。4‐ジホスホシチジル‐2‐C‐メチルエリトリトールキナーゼも、イソプレノイド生合成のためのメチルエリトリトールリン酸経路に存在して、4‐シチジン5’‐ジホスホ‐2‐C‐メチル‐D‐エリトリトールおよび2‐ホスホ‐4‐シチジン5’‐ジホスホ‐2‐C‐メチル‐D‐エリトリトールステップCの転化を比較すると、余分のメチル基を有する間の転化を触媒する。4‐ジホスホシチジル‐2‐C‐メチルエリトリトールキナーゼは、ispE遺伝子にコードされており、Escherichiacoli、ThermusthermophilusHB8およびAquifexaeolicusのIspEの結晶構造が同定されたSgrajaetalFEBSJ27527792794MiallauetalProcNatlAcadSciUSA10091739178WadaetalJBiolChem2783002230027。上記生物由来のispE遺伝子はクローニングされて、発現させられた。特徴づけを行うために組換えタンパク質が精製された。次の遺伝子は、ステップCの転化に使用し得る:エリトリトール2,4‐シクロ二リン酸シンターゼ図3、ステップD経路のステップDにおいて、エリトリトール2,4‐シクロ二リン酸シンターゼによって、2‐ホスホ‐4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールをエリトリトール2,4‐シクロ二リン酸に転化する。このステップに対する的確な酵素は、同定されていない。しかし、同様の反応を触媒する酵素をこのステップに適用し得る。例えば、2‐C‐メチル‐D‐エリトリトール2,4‐シクロ二リン酸シンターゼEC4.6.1.12である。2‐C‐メチル‐D‐エリトリトール2,4‐シクロ二リン酸シンターゼも、イソプレノイド生合成のためのメチルエリトリトールリン酸経路に存在して、2‐ホスホ‐4‐シチジン5’‐ジホスホ‐2‐C‐メチル‐D‐エリトリトールおよび2‐C‐メチル‐D‐エリトリトール‐2,4‐シクロ二リン酸ステップDの転化を比較すると、余分のメチル基を有する間の転化を触媒する。2‐C‐メチル‐D‐エリトリトール2,4‐シクロ二リン酸シンターゼは、ispF遺伝子にコードされ、Escherichiacoli、Thermusthermophilus、HaemophilusinfluenzaeおよびCampylobacterjejuniのIspFの結晶構造は、同定されたRichardetalJBiolChem27786678672SteinbacheretalJMolBiol3167988LehmannetalProteins49135138KishidaetalActaCrystallogrDBiolCrystallogr592331GabrielsenetalJBiolChem2795275352761上記の生物に由来するisp遺伝子はクローニングされて、発現させられた組換えタンパク質は、結晶化のために精製された。次の遺伝子は、ステップDの転化に使用され得る。1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸シンターゼ図3、ステップE図3のステップEは、1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸シンターゼによるエリトリトール2,4‐シクロ二リン酸の1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸への転化を含む。現在までに、この活性を有する酵素は同定されていない。この転化は、E‐4‐ヒドロキシ‐3‐メチルブタ‐2‐エニル‐二リン酸シンターゼEC1.17.7.1による、2‐C‐メチル‐D‐エリトリトール‐2,4‐シクロ二リン酸の1‐ヒドロキシ‐2‐メチル‐2‐E‐ブテニル4‐二リン酸への還元に類似している。この酵素は、細菌および植物に見出されるイソプレノイド生合成のための非メバロン酸経路に関係する鉄‐硫黄タンパク質である。E.coliの酵素ispGにコードされるを含むほとんどの細菌性の酵素は、電子のドナーとして還元型フェレドキシンまたはフラボドキシンを利用するZepecketalJOrgChem7091689174。好熱性シアノバクテリアThermosynechococcuselongatusBP-1由来の類似性の酵素gcpEにコードされるは、E.coliにおいて、異種的に発現されて、特徴づけられたOkadaetalJBiolChem2802067220679。ThermusthermophilusおよびArabidopsisthaliana由来のさらなる酵素の候補は、特徴づけられており、E.coliにおいて発現されているSeemannetalJBiolInorgChem10131137KollasetalFEBSLett532432436。1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸レダクターゼ図3、ステップF1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸の同時発生の脱水および還元は、1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸レダクターゼ活性を有する酵素によって触媒される図3、ステップF。上記酵素は、生成物の混合物ブテニル4‐二リン酸または2‐ブテニル4‐二リン酸を形成する。類似性の反応は、イソプレノイドの生合成のための非メバロン酸経路において4‐ヒドロキシ‐3‐メチルブタ‐2‐エニル‐二リン酸レダクターゼEC1.17.1.2によって触媒される。この酵素は、電子のドナーとして還元型フェレドキシンまたはフラボドキシンを利用する鉄‐硫黄タンパク質である。4‐ヒドロキシ‐3‐メチルブタ‐2‐エニル‐二リン酸レダクターゼE.coliispHにコードされているの最大限の活性には、フラボドキシンおよびフラボドキシンレダクターゼの両方が必要であるWolffetalFEBSLett541115120GrawertetalJAmChemSoc1261284712855。特徴づけられた触媒システムにおいて、還元型フラボドキシンは、NADP依存性フラボドキシンレダクターゼによって再生させられる。Aquifexaeolicus由来の酵素lytBにコードされているは、E.coliにおいてHis-tag付加酵素として発現させられ、特徴づけられたAltinciceketalFEBSLett532437440。植物における類似性の酵素は、ArabidopsisthalianaのhdrにコードされるBotellaPaviaetalPlantJ40188199。鉄‐硫黄クラスター形成に関与する遺伝子の発現レベルを変化させることは、提案した経路例えば、図3のステップEおよびステップFにおける必要とされる酵素における鉄‐硫黄タンパク質の活性において有利な効果を有し得る。E.coliにおいて、鉄‐硫黄を含むタンパク質IspH図3のステップFに類似しているの過剰発現が、鉄‐硫黄クラスターのアセンブリに含まれるisc領域由来の遺伝子の共発現によって促進させられることが実証されたGrawertetalJAmChemSoc1261284712855。上記遺伝子クラスターは、icsS、icsU、icsA、hscB、hscAおよびfdxより成る。これらの遺伝子の過剰発現は、鉄‐硫黄タンパク質のアセンブリのパイプライン鉄‐硫黄タンパク質の機能的発現に必要とされるの合成の能力を改善することが示された。同様なアプローチを本明細書にも適用し得る。ブテニル‐4‐二リン酸イソメラーゼ図3、ステップGブテニル‐4‐二リン酸イソメラーゼは、2‐ブテニル‐4‐二リン酸およびブテニル‐4‐二リン酸の可逆的な相互転換を触媒する。下記の酵素は上記活性を天然に有する。または、この活性を示すように操作され得る。有用な遺伝子は、イソペンエニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸を相互転換する酵素をコードするものを含む。これらは、EscherichiacoliRodriguezConcepcionetalFEBSLett473328332、SaccharomycescerevisiaeAndersonetalJBiolChem19892641916975およびSulfolobusshibataeYamashitaetalEurJBiochem2004271108793由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ酵素を含む。E.coliのIdiタンパク質に触媒される異性化の反応機構は、その機構の詳細について特徴づけられているdeRuycketalJBiolChem2811786417869。Saccharomycescerevisiae、BacillussubtilisおよびHaematococcuspluvialis由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ酵素が、E.coliにおいて異種的に発現させられているLaupitzetalEurJBiochem27126582669KajiwaraetalBiochemJ324421426。ブタジエンシンターゼ図3、ステップHブタジエンシンターゼは、2‐ブテニル4‐二リン酸の1,3‐ブタジエンへの転化を触媒する。下記の酵素は上記活性を天然に有する。または、この活性を示すように操作され得る。イソプレンシンターゼは、ジメチルアリル二リン酸のイソプレンへの転化を天然に触媒するが、2‐ブテニル4‐二リン酸からの1,3‐ブタジエンの合成も触媒し得る。PopulusalbaSasakietalFEBSLetters57925142518、PuerariamontanaindbergetalMetabolicEng127079SharkeyetalPlantPhysiol137700712およびPopulustremulaxPopulusalbaMilleretalPlanta213483487を含む種々の生物において、イソプレンシンターゼを見出し得る。さらなるイソプレンシンターゼ酵素が、ChotanietalWO2010031079SystemsUsingCellCultureforProductionofIsopreneCervinetalUSPatentApplication20100003716IsopreneSynthaseVariantsforImprovedMicrobialProductionofIsopreneに記載されている。エリトロース‐4‐リン酸キナーゼ図3、ステップI経路のステップIにおいて、エリトロース‐4‐リン酸は、エリトロース‐4‐リン酸キナーゼによってエリトロースに転化される。酵母によるエリトリトールの産業上の発酵性生成において、ペントースリン酸経路を介してグルコースは、エリトロース‐4‐リン酸に転化される。エリトロース‐4‐リン酸は、脱リン酸化および還元されてエリトリトールを生成するMoonetalApplMicrobiolBiotechnol8610171025。よって、多くのこれらのエリトリトールを生成する酵母例えば、において、エリトロース‐4‐リン酸キナーゼは存在する。上記酵母は、TrichosporonoidesmegachiliensisSN-G42SawadaetalJBiosciBioeng108385390、CandidamagnoliaKohletalBiotechnolLett2521032105およびTorulasp.HAJNYetalApplMicrobiol12240246OhetalJIndMicrobiolBiotechnol26248252を含む。これまでにエリトロース‐4‐リン酸キナーゼは同定されていない。しかし、このステップに使用され得る広い基質範囲を有する種々のポリオールホスホトランスフェラーゼが存在する。例えば、グリセルアルデヒドおよびグリセルアルデヒド‐3‐リン酸ステップAを比較すると、1炭素短い間の可逆的な転化を触媒するトリオースキナーゼEC2.7.1.28である。他の例は、5Cポリオールアルデヒドのリン酸化を触媒するキシルロキナーゼEC2.7.1.17またはアラビノキナーゼEC2.7.1.54を含む。以下の遺伝子は、ステップIに使用され得る。エリトロースレダクターゼ図3、ステップJ経路のステップJにおいて、エリトロースは、エリトロースリダクターゼによってエリトリトールに転化される。酵母によるエリトリトールの産業上の発酵性生成において、ペントースリン酸経路を介してグルコースは、エリトロース‐4‐リン酸に転化される。エリトロース‐4‐リン酸は、脱リン酸化および還元されてエリトリトールを生成するMoonetalsupra。よって、多くのこれらのエリトリトールを生成する酵母例えば、において、エリトロースレダクターゼは存在する。上記酵母は、TrichosporonoidesmegachiliensisSN-G42Sawadaetalsupra、CandidamagnoliaおよびTorulasp.HAJNYetalsupraOhetalsupraを含む。TorulacorallinaLeeetalBiotechnolProg19495500LeeetalApplEnvironMicrobiol6845344538、CandidamagnoliaLeeetalApplEnvironMicrobiol6937103718およびTrichosporonoidesmegachiliensisSN-G42Sawadaetalsupra由来のエリトロースレダクターゼが特徴づけられ、精製された。種々のエリトロースレダクターゼ遺伝子がクローン化された。そして、上記遺伝子は、ステップJに適用され得る。以下の遺伝子はステップJの転化に使用され得る:エリトリトールキナーゼ図3、ステップK経路のステップKにおいて、エリトリトールはエリトリトールキナーゼによってエリトリトール‐4‐リン酸に転化される。エリトリトールキナーゼEC2.7.1.27は、エリトリトールのリン酸化を触媒する。エリトリトールキナーゼは、エリトリトールを利用する細菌例えば、BrucellaabortusSperryetalJBacteriol121619630において特徴づけられた。BrucellaabortusのeryA遺伝子は、Escherichiacoliにおいて機能的に発現させられており、生じたeryAは、エリトリトールのエリトリトール‐4‐リン酸へのATP依存性転化を触媒することが示されたLilloetalBioorgMedChemLett13737739。以下の遺伝子はステップKの転化に使用され得る。マロニル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ図4、ステップA図4に記載の経路のステップAにおいて、マロニル‐CoAおよびアセチル‐CoAは、マロニル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼベータケオチオラーゼbeta‐keothiolaseによって縮合されて3‐オキソグルタリル‐CoAを形成する。これまで、マロニル‐CoAにおいて活性を有する酵素は報告されていないが、この転化に対する好適な候補はベータ‐ケトアジピル‐CoAチオラーゼEC2.3.1.174である。上記酵素は、3‐オキソアジピル‐CoAチオラーゼとも呼ばれ、ベータ‐ケトアジピル‐CoAをスクニシル‐CoAおよびアセチル‐CoAに転化し、芳香族化合物の分解のためのベータ‐ケトアジピル経路の重要な酵素である。PseudomonasputidaHarwoodetalJBacteriol17664796488およびAcinetobactercalcoaceticusDotenetalJBacteriol16931683174を含む単一の細菌および真菌において、上記酵素は広くに存在している。PseudomonasstrainB13においてpcaFにコードされている遺伝子産物KaschabeketalJBacteriol184207215、PseudomonasputidaUにおいてphaDにコードされている遺伝子産物Oliveraetalsupra、PseudomonasfluorescensSTにおいてpaaEにコードされている遺伝子産物DiGennaroetalArchMicrobiol88117125およびEcoli由来のpaaJにコードされている遺伝子産物NogalesetalMicrobiology153357365もこの転化を触媒する。種々のベータ‐ケトチオラーゼは、オキソアジピル‐CoA形成の方向づけにおいて重要かつ選択的な活性を示す。上記ベータ‐ケトチオラーゼは、Pseudomonasputida由来のbkt、PseudomonasaeruginosaPAO1由来のpcaFおよびbkt、BurkholderiaambifariaAMMD由来のbkt、Ecoli由来のpaaJならびにPputida由来のphaDを含む。これらの酵素も、3‐オキソグルリル‐CoA3‐オキソアジピル‐CoAに構造的に類似している化合物の合成に使用され得る。別の適切なベータ‐ケトチオラーゼは、オキソピメロイル‐CoA:グルタリル‐CoAアシルトランスフェラーゼEC2.3.1.16であり、グルタリル‐CoAとアセチル‐CoAとを結合させて、3‐オキソピメロイル‐CoAを形成する。この転化を触媒する酵素は、Ralstoniaeutropha以前は、Alcaligeneseutrophusとして知られていたにおいて見出され、遺伝子bktBおよびbktCにコードされているSlateretalJBacteriol18019791987HaywoodetalFEMSMicrobiologyLetters529196。BktBタンパク質の配列は公知である;しかし、BktCタンパク質の配列は報告されていない。Rhodopseudomonaspalustrisのpimオペロンもベータ‐ケトチオラーゼをコードしpimBによってコードされる、ベンゾイル‐CoAの分解下において、この転化を触媒することが予測されるHarrisonetalMicrobiology151727736。Saciditrophicusにおけるベータ‐ケトチオラーゼ酵素の候補が、bktBに対する配列の相同性によって同定された43同一性、e値=1e-93。アセチル‐CoAおよびプロピオニル‐CoAからベータ‐ケトバレリル‐CoAの形成を触媒するベータ‐ケトチオラーゼ酵素は、3‐オキソグルタリル‐Coの形成を触媒し得る。Zoogloearamigeraは2つのケトチオラーゼを有し、上記のケトチオラーゼはプロピオニル‐CoAおよびアセチル‐CoAからベータ‐ケトバレリル‐CoAを形成し得、R.eutrophaは、この転化も触媒し得るβ酸化ケトチオラーゼを有するSlateretalJBacteriol18019791987。これらの遺伝子の配列またはそれらの翻訳されたタンパク質の配列は報告されていない。しかし、R.eutropha、Z.ramigeraまたは他の生物における種々の候補を、R.eutropha由来のbktBに対する配列の相同性に基づいて同定し得る。それらは、以下を含む:2つのアセチル‐CoA分子をアセトアセチル‐CoAに変換することが公知であるベータ‐ケトチオラーゼEC2.1.3.9をさらなる候補は含む。例示的なアセトアセチル‐CoAチオラーゼ酵素は、E.coli由来のatoBMartinetalsupra、Cacetobutylicum由来のthlAおよびthlBHanaietalsupraならびにS.cerevisiae由来のERG10Hiseretalsupraの遺伝子産物を含む。3‐オキソグルタリル‐CoAレダクターゼケトン還元図4、ステップB図4に示される経路のステップBにおける3‐オキソグルタリル‐CoAから3‐ヒドロキシ基へにおいて、この酵素は3‐オキソ基の還元を触媒する。3‐オキソアシル‐CoAデヒドロゲナーゼ酵素は、3‐オキソアシル‐CoA分子を3‐ヒドロキシアシル‐CoA分子に転化し、上記酵素は、しばしば、脂肪酸ベータ酸化またはフェニル酢酸の異化に関与する。例えば、E.coliにおける2つの脂肪酸酸化複合体のサブユニットfadBおよびfadJにコードされるは、3‐ヒドロキシアシル‐CoAデヒドロゲナーゼとして機能するBinstocketalMethodsEnzymol71PtC403411。さらに、PseudomonasputidaUにおいてphaCOliveraetalsupraによってコードされる遺伝子産物およびPseudomonasfluorescensSTにおいてpaaCDietalsupraによってコードされる遺伝子産物は、フェニル酢酸またはスチレンの異化中において、3‐オキソアジピル‐CoAを形成するための3‐ヒドロキシアジピル‐CoAの可逆的な酸化を触媒する。さらに、フェニル酢酸分解オペロンにおいて他の遺伝子に対するE.coliのpaaHにおける隣接域NogalesetalsupraおよびpaaHの変異体がフェニル酢酸を生成できないという事実から、E.coliのpaaH遺伝子が3‐ヒドロキシアシル‐CoAデヒドロゲナーゼをコードすることが予想される。3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドロゲナーゼアセトアセチル‐CoAレダクターゼとも呼ばれるは、アセトアセチル‐CoAの3‐ヒドロキシブチリル‐CoAへの可逆的なNADPH依存性の転化を触媒する。この酵素は、種々のClostridiaの種における酪酸に対するアセチル‐CoA発酵経路に関与し、詳細が研究されているJonesandWoodssupra。酵素の候補は、C.acetobutylicum由来のhbdBoyntonetalJBacteriol17830153024、C.beijerinckii由来のhbdColbyetalApplEnvironMicrobiol5832973302およびMetallosphaerasedula由来の幾らかの類似した酵素Bergetalsupraを含む。Clostridiumacetobutylicum由来の酵素hbdによってコードされるはクローニングされており、E.coliにおいて機能的に発現させられているYounglesonetalsupra。アセトアセチル‐CoAを3‐ヒドロキシブチリル‐CoAへと還元することが実証されたさらに他の遺伝子は、Zoogloearamigera由来のphbBPlouxetal上掲およびRhodobactersphaeroides由来のphaBAlberetal上掲である。前者の遺伝子は、NADPH依存性である。上記遺伝子のヌクレオチドの配列は決定されておりPeoplesetal上掲上記遺伝子はEcoliにおいて発現されている。さらなる遺伝子としては、Clostridiumkluyveriにおけるhbd1C末端領域およびhbd2N末端領域HillmerandGottschalkBiochimBiophysActa33341223、ならびにBostaurusにおけるHSD17B10WAKILetal上掲が含まれる。3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成図4、ステップC3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAレダクターゼは、3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAを3‐ヒドロキシ‐5‐オキソペンタン酸へと還元する。いくつかのアシル‐CoAデヒドロゲナーゼは、アシル‐CoAをその対応するアルデヒドへと還元するEC1.2.1。上記酵素をコードする遺伝子の例としては、脂肪アシル‐CoAレダクターゼをコードするAcinetobactercalcoaceticusacr1Reiseretal上掲、Acinetobactersp.M‐1脂肪アシル‐CoAレダクターゼIshigeetal上掲、ならびに、ClostridiumkluyveriにおいてsucD遺伝子にコードされたCoA‐依存およびNADP‐依存コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼSohlingandGottschalk上掲SohlingandGottschalk上掲が含まれる。P.gingivalisのsucDは、別のコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼであるTakahashietal上掲。Pseudomonasspにおいてアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをアシル化する上記酵素bphGによってコードされているは、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒドおよびホルムアルデヒドを酸化およびアシル化することが実証されているように、さらに別の酵素であるPowlowskietal上掲。アセチル‐CoAをエタノールに還元することに加えて、LeuconostocmesenteroにおいてadhEによってコードされている酵素は、分枝化合物のイソブチルアルデヒドをイソブチリル‐CoAに酸化することが示されたKooetalBiotechnolLett27505510。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum等の溶媒生成生物solventogenicorganismsにおいて同様の反応ブチリル‐CoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するKosakaetalBiosciBiotechnolBiochem715868。アシル‐CoAをその対応するアルデヒドに変換するさらなる酵素のタイプとして、マロニル‐CoAレダクターゼがある。上記マロニル‐CoAレダクターゼは、マロニル‐CoAをマロン酸セミアルデヒドに変換する。好熱酸性古細菌における3‐ヒドロキシプロピオン酸回路を介した独立栄養性の炭素固定において、マロニル‐CoAレダクターゼは重要な酵素であるBergetal上掲Thauer上掲。上記酵素は、NADPHを補因子として利用し、MetallosphaeraおよびSulfolobussppにおいて特徴づけられているAlberetal上掲Hugleretal上掲。上記酵素は、MetallosphaerasedulaにおいてMsed_0709にコードされているAlberetal上掲Bergetal上掲。Sulfolobustokodaii由来のマロニル‐CoAレダクターゼをコードする遺伝子はクローニングされ、Ecoliにおいて異種的に発現させられたAlberetal上掲。当該酵素はまた、メチルマロニル‐CoAからその対応するアルデヒドへの変換を触媒することが示されているWO2007141208。上記酵素のアルデヒドデヒドロゲナーゼの機能性はChloroflexusaurantiacusに由来する二機能性デヒドロゲナーゼと同様であるが、配列の相同性はほとんどない。マロニル‐CoAレダクターゼ酵素の両候補は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼと高い配列相同性を有している。上記アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アスパルチル‐4‐リン酸のアスパラギン酸セミアルデヒドへの還元および同時発生の脱リン酸化を触媒する酵素である。SulfolobussolfataricusおよびSulfolobusacidocaldariusを含む他の生物におけるタンパク質に対する配列の相同性によって、さらなる遺伝子の候補を見出すことができる。アシル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成のさらに別の候補は、Clostridiumbeijerinckii由来のald遺伝子であるTothetalApplEnvironMicrobiol654973‐4980。当該酵素は、アセチル‐CoAおよびブチリル‐CoAをそれらの対応するアルデヒドに還元することが報告されている。この遺伝子は、SalmonellatyphimuriumおよびEcoliのアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするeutEに非常に類似しているTothetal上掲。3‐ヒドロキシ‐5‐オキソペンタン酸レダクターゼ図4、ステップD当該酵素は、3‐ヒドロキシ‐5‐オキソペンタン酸の末端のアルデヒド基をアルコール基へと還元する。アルデヒドからアルコールへの変換を触媒する酵素例えば、アルコールデヒドロゲナーゼまたは同等のアルデヒドレダクターゼ、1.1.1.aをコードする遺伝子の例としては、C2‐C14に対する中鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードするalrATanietal上掲、Saccharomycescerevisiae由来のADH2Atsumietal上掲、C3よりも長い分子に対して好適なE.coli由来のyqhDSulzenbacheretal上掲、ならびに、ブチルアルデヒドをブタノールに変換するC.acetobutylicum由来のbdhIおよびbdhIIWalteretal上掲が含まれる。yqhDの遺伝子産物は、NADPHを補因子として用いてアセトアルデヒド、マロンジアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドおよびアクロレインの還元を触媒するPerezetal28373467353PerezetalJBiolChem28373467353。Zymomonasmobilis由来のadhAの遺伝子産物は、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドおよびアクロレインを含む多数のアルデヒドにおいて活性を有することが実証されているKinoshitaetalApplMicrobiolBiotechnol22249‐254。4‐ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ活性を示す酵素EC1.1.1.61はまた、当該カテゴリーに分類される。上記酵素は、RalstoniaeutrophaBravoetal上掲、ClostridiumkluyveriWolffandKenealy上掲およびArabidopsisthalianaBreitkreuzetal上掲において特徴づけられている。A.thalianaの酵素はクローニングされ、酵母において特徴づけられた12882961。さらに別の遺伝子としては、Geobacillusthermoglucosidasiusに由来するアルコールデヒドロゲナーゼadhIがあるJeonetalJBiotechnol135127133。別の酵素の例としては、3‐ヒドロキシイソブチレートからメチルマロン酸セミアルデヒドへの可逆的な酸化を触媒する3‐ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼEC1.1.1.31がある。当該酵素は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの分解に関与し、細菌、真核生物および哺乳類において同定されている。ThermusthermophilusHB8に由来するP84067によってコードされている酵素は、構造的に特徴づけられているLokanathetalJMolBiol35290517。ヒト3‐ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼの可逆性は、同位体によって標識された基質を用いて実証されたManningetalBiochemJ2314814。当該酵素をコードするさらなる遺伝子としては、HomosapiensHawesetalMethodsEnzymol324218228およびOryctolaguscuniculusHawesetal上掲ChowdhuryetalBiosciBiotechnolBiochem6020432047における3hidh、Pseudomonasaeruginosaにおけるmmsb、ならびにPseudomonasputidaにおけるdhatAberhartetalJChemSocPerkin1614041406Chowdhuryetal上掲ChowdhuryetalBiosciBiotechnolBiochem67438441が含まれる。マロン酸セミアルデヒドから3‐HPへの変換は、他の2つの酵素によっても達成され得る:NADH依存性の3‐ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼおよびNADPH依存性のマロン酸セミアルデヒドレダクターゼ。NADH依存性の3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼは、細菌および植物におけるプロピオン酸に由来するベータ‐アラニン生合成経路に関与していると考えられているRathinasabapathiBJournalofPlantPathology159671674StadtmanJAmChemSoc7757655766。当該酵素は、これまでいずれの生物においても遺伝子に関連していない。NADPH依存性のマロン酸セミアルデヒドレダクターゼは、独立栄養性のCO2固定細菌において可逆的反応を触媒する。酵素活性はMetallosphaerasedulaにおいて検出されているが、遺伝子の同定は知られていないAlberetal上掲。3,5‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ図4、ステップE当該酵素は、図4ステップEの3,5‐ジヒドロキシペンタン酸をリン酸化し、3‐ヒドロキシ‐5‐ホスホナートオキシペンタン酸3H5PPを形成する。当該変換は、リン酸基からアルコールへのATP依存性の転移を可能にするECクラス2.7.1の酵素によって触媒され得る。当該ステップにおいて好ましい候補は3,5‐ジヒドロキシペンタン酸のメチルアナログメバロン酸の末端のヒドロキシル基をリン酸化するメバロン酸キナーゼEC2.7.1.36である。当該ステップにおけるいくつかの遺伝子の候補は、Scerevisiae由来のerg12、Methanocaldococcusjannaschi由来のmvk、Homosapeins由来のMVKおよびArabidopsisthalianacol由来のmvkである。グリセロールキナーゼもまた、グリセロールにおける末端のヒドロキシル基をリン酸化し、グリセロール‐3‐リン酸を形成する。当該反応は、Escherichiacoli、SaccharomycescerevisiaeおよびThermotogamaritimaを含むいくつかの種において生じる。E.coliのグリセロールキナーゼは、ジヒドロキシアセトンおよびグリセルアルデヒドのような代わりの基質を受け入れることが示されているHayashiandLin上掲。T,maritimeは2つのグリセロールキナーゼを有しているNelsonetal上掲。グリセロールキナーゼは、広い範囲の基質特異性を有することが示されている。CransおよびWhitesideは、異なる4つの生物Escherichiacoli、S.cerevisiae、BacillusstearothermophilusおよびCandidamycoderma由来のグリセロールキナーゼについて研究を行ったCransandWhitesides上掲Nelsonetal上掲。CransおよびWhitesideは、66の異なるグリセロールのアナログを研究し、上記酵素は1つの末端ヒドロキシル基の位置において、一連の基質を受け入れることができ、メチル基によってC2の水素原子を置換できると結論付けた。興味深いことに、4つの生物の全てに由来する酵素の反応速度定数は、非常に類似していた。上記遺伝子の候補は:ホモセリンキナーゼは、3,5‐ジヒドロキシペンタン酸のリン酸化を導き得る別の可能性のある候補である。当該酵素も、E.coli、StreptomycesspおよびS.cerevisiaeを含む多数の生物において存在する。E.coli由来のホモセリンキナーゼは、L‐2‐アミノ、1,4‐ブタンジオール、アスパラギン酸セミアルデヒドおよび2‐アミノ‐5‐ヒドロキシバレラートを含む多数の基質において活性を持つことが示されているHuoandViola上掲HuoandViola上掲。アルファ位置におけるカルボキシル基がエステルまたは、ヒドロキシメチル基によって置換された基質に対して、この酵素は作用し得る。上記遺伝子の候補は以下の遺伝子である:3H5PPキナーゼ図4、ステップF3H5PPから3H5PDPへのリン酸化は、3H5PPキナーゼによって触媒され得る図4、ステップF。ホスホメバロン酸キナーゼ酵素EC2.7.4.2は、メバロン酸経路において類似の変換を触媒する。当該酵素は、Saccharomycescerevisiaeにおけるerg8によってTsayetalMolCellBiol11620‐631、ならびに、Streptococcuspneumoniae、StaphylococcusaureusおよびEnterococcusfaecalisにおけるmvaK2DounetalProteinSci141134‐1139WildingetalJBacteriol1824319‐4327によってコードされている。StreptococcuspneumoniaeおよびEnterococcusfaecalisの酵素はクローニングされ、E.coliにおいて特徴づけられた。PilloffetalJBiolChem2784510‐4515DounetalProteinSci141134‐1139。3H5PDPデカルボキシラーゼ図4、ステップGブテニル4‐二リン酸は、3H5PDPデカルボキシラーゼによるATP依存性の3H5PDPの脱炭酸反応によって形成される図4、ステップG。当該活性を有する酵素はこれまで特徴づけされていないが、同様の反応は、イソプレノイドの生合成のためのメバロン酸経路に関与する酵素であるメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼによって触媒されるEC4.1.1.33。当該反応は、SaccharomycescerevisiaeにおけるMVD1、HomosapiensにおけるMVD、ならびにStaphylococcusaureusおよびTrypsonomabruceiにおけるMDDによって触媒されるTothetalJBiolChem27178957898ByresetalJMolBiol371540553。ブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ図4、ステップHブテニル4‐二リン酸イソメラーゼは、2‐ブテニル‐4‐二リン酸およびブテニル‐4‐二リン酸の可逆的な相互変換を触媒する。以下の酵素は、当該活性を天然に有していてもよいし、または当該活性を示すように設計されていてもよい。有用な遺伝子としては、イソペンエニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸を相互変換する酵素をコードしている遺伝子が含まれる。上記酵素としては、EscherichiacoliRodriguezConcepcionetalFEBSLett473328332、SaccharomycescerevisiaeAndersonetalJBiolChem19892641916975およびSulfolobusshibataeYamashitaetalEurJBiochem2004271108793に由来するイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ酵素が含まれる。E.coliのIdiタンパク質によって触媒される異性化の反応機構は、その機構の詳細について特徴づけられているdeRuycketalJBiolChem2811786417869。Saccharomycescerevisiae、BacillussubtilisおよびHaematococcuspluvialis由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ酵素が、E.coliにおいて異種的に発現させられているLaupitzetalEurJBiochem27126582669KajiwaraetalBiochemJ324421426。ブタジエンシンターゼ図4、ステップIブタジエンシンターゼは、2‐ブテニル‐4‐二リン酸から1,3‐ブタジエンへの変換を触媒する。下記の酵素は、当該活性を天然に有していてもよいし、または当該活性を示すように設計されていてもよい。イソプレンシンターゼは、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンへの変換を天然に触媒するが、2‐ブテニル‐4‐二リン酸からの1,3‐ブタジエンの合成も触媒し得る。PopulusalbaSasakietalFEBSLetters200557925142518、PuerariamontanaLindbergetalMetabolicEng127079SharkeyetalPlantPhysiol137700712およびPopulustremulaxPopulusalbaMilleretalPlanta213483487を含む種々の生物において、イソプレンシンターゼを見出し得る。さらなるイソプレンシンターゼ酵素が、ChotanietalWO2010031079SystemsUsingCellCultureforProductionofIsopreneCervinetalUSPatentApplication20100003716IsopreneSynthaseVariantsforImprovedMicrobialProductionofIsopreneに記載されている。3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAレダクターゼアルコール生成図4、ステップJ当該ステップは、3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAにおけるアシル‐CoA基からアルコール基への還元を触媒する。アシル‐CoAからアルコールへ変換する二機能性オキシドレダクターゼの例としては、例えば以下のような基質を変換する二機能性オキシドレダクターゼが含まれる:アセチル‐CoAからエタノールへ例えばE.coliに由来するadhE、および、ブチリル‐CoAからブタノールへC.acetobutylicumに由来するadhE2。アセチル‐CoAからエタノールへの還元に加えて、LeuconostocmesenteroidesにおいてadhEにコードされている酵素は、分枝化合物のイソブチルアルデヒドをイソブチリル‐CoAに酸化することが示されているKazahayaetal上掲Kooetal上掲。別の例示的な酵素は、マロニル‐CoAを3‐HPに変換し得る。この活性を有するNADPH依存性酵素は、Chloroflexusaurantiacusにおいて特徴づけられており、当該酵素は3‐ヒドロキシプロピオン酸回路に関与しているHugleretal上掲StraussandFuchs。この酵素は、高度に基質特異的であり、他の公知のオキシドレダクターゼとの配列相同性はほとんどないHugleretal上掲。他の生物が同様な経路を有し得る生物情報学的な根拠があるがKlattetal上掲、他の生物においてはこの特定の反応を触媒する酵素は見られない。Roseiflexuscastenholzii、Erythrobactersp.NAP1およびマリンガンマプロテオバクテリウムHTCC2080を含む他の生物における酵素の候補は、配列相同性によって推測され得る。より長鎖のアシル‐CoA分子は、アルコール生成脂肪アシル‐CoAレダクターゼをコードするホホバSimmondsiachinensisFAR等の酵素によって当該アシル‐CoA分子に対応するアルコールへと還元され得る。E.coliにおけるFARの過剰発現は、結果としてFARの活性化および脂肪アルコールの蓄積をもたらすMetzetalPlantPhysiology122635644。当該ステップを触媒するための別の候補には、3‐ヒドロキシ‐3‐メチルグルタリル‐CoAレダクターゼまたはHMG‐CoAレダクターゼがある。当該酵素は、3‐ヒドロキシ‐3‐メチルグルタリル‐CoAにおけるCoA基をアルコール生成メバロン酸へと還元する。当該ステップにおける遺伝子の候補は以下の遺伝子である:3‐ヒドロキシ‐3‐メチルグルタリル‐CoAレダクターゼをコードする、SulfolobussolfataricusのhmgA遺伝子は、クローニングされ、シークエンスされ、E.coliにおいて発現されているBocharetalJBacteriol17936323638。S.cerevisiaeはまた、2つのHMG‐CoAレダクターゼを有しているBassonetalProcNatlAcadSciUSA8355635567。上記遺伝子はまた、Arabidopsisthalianaから単離されており、S.cerevisiaeにおいてHMG‐COAレダクターゼ活性を補完することが示されているLearnedetalProcNatlAcadSciUSA8627792783。3‐オキソグルタリル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成図4、ステップKいくつかのアシル‐CoAデヒドロゲナーゼは、アシル‐CoAをその対応するアルデヒドへと還元する能力を有している。従って、上記アシル‐CoAデヒドロゲナーゼは、天然に3‐オキソグルタリル‐CoAを3,5‐ジオキソペンタン酸へと還元してもよいし、または3‐オキソグルタリル‐CoAを3,5‐ジオキソペンタン酸へと還元するように設計されていてもよい。上記酵素をコードする遺伝子の例については、図4、ステップCにおいて議論した。3,5‐ジオキソペンタン酸レダクターゼケトン還元図4、ステップLケトンをヒドロキシル官能基へと変換するいくつかのアルコールデヒドロゲナーゼの例が存在する。上記酵素のうちのE.coliに由来する2つの酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼmdhおよび乳酸デヒドロゲナーゼldhAによってコードされている。さらに、Ralstoniaeutrophaに由来する乳酸デヒドロゲナーゼは、乳酸、2‐オキソブチレート、2‐オキソペンタン酸、および2‐オキソグルタル酸を含む、様々な長さの鎖を有する2‐ケト酸に対して高い活性を示すことが実証されているSteinbucheletalEurJBiochem130329334。アルファ‐ケトアジピン酸からアルファ‐ヒドロキシアジピン酸への変換は、ラットおよびヒトの胎盤にて発見されたことが報告されている酵素である2‐ケトアジピン酸レダクターゼによって触媒され得るSudaetalArchBiochemBiophys176610620SudaetalBiochemBiophysResCommun77586591。上記ステップのためのさらなる候補としては、ヒトの心臓に由来するミトコンドリアの3‐ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼbdhがあり、クローニングおよび特徴付けされているMarksetalJBiolChem2671545915463。上記酵素は、3‐ヒドロキシ酸において作用するデヒドロゲナーゼである。別の例示的なアルコールデヒドロゲナーゼは、C.beijerinckiiIsmaieletalJBacteriol17550975105およびT.brockiiLamedetalBiochemJ195183190PeretzetalBiochemistry2865496555において示されたように、アセトンをイソプロパノールへと変換する。メチルエチルケトンレダクターゼ、または2‐ブタノールデヒドロゲナーゼは、MEKの還元を触媒し、2‐ブタノールを形成する。例示的な酵素は、RhodococcusruberKosjeketalBiotechnolBioeng865562およびPyrococcusfuriosusvanderetalEurJBiochem26830623068において見出され得る。多数の生物が、4‐ヒドロキシ‐2‐ブタノンから1,3‐ブタンジオールへの還元を触媒し得る。上記生物は、なかでもBacillus属、Brevibacterium属、Candida属およびKlebsiella属に属する生物を包含しており、Matsuyamaetal米国特許第5413922号に記載されている。変異型のRhodococcusのフェニルアセトアルデヒドレダクターゼSar268およびLeifoniaのアルコールデヒドロゲナーゼもまた、上記変換を高収量にて触媒することが示されているItohetalApplMicrobiolBiotechnol7512491256。ホモセリンデヒドロゲナーゼEC1.1.1.13は、アスパラギン酸セミアルデヒドからホモセリンへのNADPH依存性の還元を触媒する。E.coliを含む多くの生物において、ホモセリンデヒドロゲナーゼは、アスパラギン酸からアスパルチル‐4‐リン酸へのATP依存性の変換も触媒する二機能性酵素であるStarnesetalBiochemistry11677687。上記の機能ドメインは、触媒的に独立しており、リンカー領域によって連結されているSibillietalJBiolChem2561022810230。また、ドメインは両方とも、トレオニンによるアロステリック阻害を受ける。thrAによってコードされている、E.coliの酵素のホモセリンデヒドロゲナーゼドメインは、アスパラギン酸キナーゼドメインから分離され、特徴付けされ、高い触媒活性およびトレオニンによる阻害の低減を示すことが見出されたJamesetalBiochemistry4137203725。上記のことは、例えばLactobacillusplantarumCahyantoetalMicrobiology152105112およびArabidopsisthalianaのhom1を包含する、他の二機能性トレオニンキナーゼに適用され得る。S.cerevisiaeにおけるhom6JacquesetalBiochimBiophysActa15442841およびLactobacillusplantarumCahyantoetal上掲におけるhom2によってコードされている単機能性のホモセリンデヒドロゲナーゼは、E.coliにおいて機能的に発現され、特徴付けされている。3,5‐ジオキソペンタン酸レダクターゼアルデヒド還元図4、ステップMいくつかのアルデヒド還元型レダクターゼは、アルデヒドをその対応するアルコールへと還元することができる。従って、上記レダクターゼは、天然に3,5‐ジオキソペンタン酸を5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸へと還元してもよいし、または3,5‐ジオキソペンタン酸を5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸へと還元するように設計されていてもよい。上記酵素をコードする遺伝子の例は、図4のステップ5において議論されている。5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸レダクターゼ図4、ステップNいくつかのケトン還元型レダクターゼは、ケトンをその対応するヒドロキシル基へと還元することができる。従って、上記レダクターゼは、天然に5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸を3,5‐ジオキソペンタン酸へと還元してもよいし、または5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸を3,5‐ジオキソペンタン酸へと還元するように設計されていてもよい。上記酵素をコードする遺伝子の例は、図4のステップLにおいて議論されている。3‐オキソ‐グルタリル‐CoAレダクターゼCoA還元およびアルコール生成図4、ステップO3‐オキソ‐グルタリル‐CoAレダクターゼCoA還元およびアルコール生成酵素は、3‐オキソ‐グルタリル‐CoAから5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸を形成するために必要とされる2つの還元ステップを触媒する。アシル‐CoAをアルコールへと変換する2ステップのオキシドレダクターゼの例は図4のステップJにおいて提示されている。上記酵素は、天然に3‐オキソ‐グルタリル‐CoAを5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸へと変換してもよいし、3‐オキソ‐グルタリル‐CoAを5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸へと変換するように設計されていてもよい。本願の全体において、様々な刊行物が参照されている。当該刊行物の全体的な開示GenBankおよびGI番号の公開を含むは、本発明に関連する技術の状況をより完全に記載するために、本願の明細書において参照によって引用されている。本発明は、上記の例を参照して記載されているが、本発明の精神から離れることなく、種々の変更が行われてもよいことは理解されるべきである。イソプレノイドおよびテルペンの天然経路を示している。ここに示された基質を産物に変換する酵素は、Aアセチル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ、Bヒドロキシメチルグルタリル‐CoAシンターゼ、C3‐ヒドロキシ‐3‐メチルグルタリル‐CoAレダクターゼアルコール生成、Dメバロン酸キナーゼ、Eホスホメバロン酸キナーゼ、Fジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、Gイソペンテニル‐二リン酸イソメラーゼ、Hイソプレンシンターゼを含んでいる。アセチル‐CoA、グルタコニル‐CoA、グルタリル‐CoA、3‐アミノブチリル‐CoA、あるいは4‐ヒドロキシブチリル‐CoAから、クロチルアルコールを経由して、ブタジエンの生産を行う例示的な経路を示している。ここに示された基質を産物に変換する酵素は、Aアセチル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ、Bアセトアセチル‐CoAレダクターゼ、C3‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ、Dクロトニル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成、Eクロトンアルデヒドレダクターゼアルコール生成、Fクロチルアルコールキナーゼ、G2‐ブテニル‐4‐リン酸キナーゼ、Hブタジエンシンターゼ、Iクロトニル‐CoAヒドロラーゼ、クロトニル‐CoAシンテターゼ、クロトニル‐CoAトランスフェラーゼ、Jクロトン酸レダクターゼ、Kクロトニル‐CoAレダクターゼアルコール生成、Lグルタコニル‐CoAデカルボキシラーゼ、Mグルタリル‐CoAデヒドロゲナーゼ、N3‐アミノブチリル‐CoAデアミナーゼ、O4‐ヒドロキシブチリル‐CoAデヒドラターゼ、Pクロチルアルコールジホスホキナーゼを含んでいる。エリトロース‐4‐リン酸からブタジエンの生産を行う例示的な経路を示している。ここに示された基質を産物に変換する酵素は、Aエリトロース‐4‐リン酸レダクターゼ、Bエリトリトール‐4‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼ、C4‐シチジン5’‐ジホスホ‐エリトリトールキナーゼ、Dエリトリトール2,4‐シクロ二リン酸シンターゼ、E1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸シンターゼ、F1‐ヒドロキシ‐2‐ブテニル4‐二リン酸レダクターゼ、Gブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ、Hブタジエンシンターゼ、Iエリトロース‐4‐リン酸キナーゼ、Jエリトロースレダクターゼ、Kエリトリトールキナーゼを含んでいる。マロニル‐CoAとアセチル‐CoAとからブタジエンの生産を行う例示的な経路を示している。ここに示された基質を産物に変換する酵素は、Aマロニル‐CoA:アセチル‐CoAアシルトランスフェラーゼ、B3‐オキソグルタリル‐CoAレダクターゼケトン還元、C3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成、D3‐ヒドロキシ‐5‐オキソペンタン酸レダクターゼ、E3,5‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ、F3H5PPキナーゼ、G3H5PDPデカルボキシラーゼ、Hブテニル4‐二リン酸イソメラーゼ、Iブタジエンシンターゼ、J3‐ヒドロキシグルタリル‐CoAレダクターゼアルコール生成、K3‐オキソグルタリル‐CoAレダクターゼアルデヒド生成、L3,5‐ジオキソペンタン酸レダクターゼケトン還元、M3,5‐ジオキソペンタン酸レダクターゼアルデヒド還元、N5‐ヒドロキシ‐3‐オキソペンタン酸レダクターゼ、O3‐オキソ‐グルタリル‐CoAレダクターゼCoA還元およびアルコール生成を含んでいる。化合物の略号は、3H5PP3‐ヒドロキシ‐5‐ホスホナトオキシペンタン酸、および3H5PDP3‐ヒドロキシ‐5‐[ヒドロキシホスホノオキシホスホリル]オキシペンタン酸を含んでいる。"