"アンチトロンビンIIIAT-IIIの存在下で試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイであって、前記試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、前記試料にトロンビンに特異的な抗体を加える工程であって、前記トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、工程と、前記抗体の前記トロンビンとの結合を測定する工程と、存在するトロンビンの量を測定する工程と、を含む、イムノアッセイ。前記試料は、血液又は血液成分からなる群から選択される生物学的検体である、請求項1に記載のイムノアッセイ。前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、模倣物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1又は2に記載のイムノアッセイ。前記トロンビンに特異的な抗体は、ポリクローナル抗体又はその断片である、請求項1~3のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。前記抗体は、Phe-Pro-Arg-クロロメチルケトンPPACK、4-アミノフェニルピルビン酸APPA、4-2-アミノエチルベンゼンスルホニルフルオライドAEBSF、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドで、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、請求項1~4のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。前記イムノアッセイは、固相免疫測定法である、請求項1~5のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。前記固相免疫測定法は、サンドイッチイムノアッセイである、請求項6に記載のイムノアッセイ。前記トロンビンの量の測定は、トロンビンの標準曲線で行われる、請求項1~7のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。アンチトロンビンIIIAT-IIIを含む試料中のトロンビンを定量化するキットであって、トロンビンに特異的なポリクローナル抗体又はその断片と、トロンビンの基質結合部位を認識する小分子とを含み、前記トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、キット。前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、模倣物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項9に記載のキット。前記抗体は、Phe-Pro-Arg-クロロメチルケトンPPACK、4-アミノフェニルピルビン酸APPA、4-2-アミノエチルベンゼンスルホニルフルオライドAEBSF、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドで、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、請求項9又は10に記載のキット。前記キットは、イムノアッセイキットである、請求項9~11のいずれか一項に記載のキット。精製トロンビンを更に含む、請求項9~12のいずれか一項に記載のキット。アンチトロンビンIIIAT-IIIとトロンビンとを含む試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイであって、前記試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、前記トロンビンを活性部位がブロックされたトロンビンに対して産生されるトロンビンに特異的な抗体と接触させる工程と、結合した抗体のレベルを測定する工程と、を含む、イムノアッセイ。前記試料は、血液又は血液成分からなる群から選択される生物学的検体である、請求項14に記載のイムノアッセイ。前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、模倣物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項14又は15に記載のイムノアッセイ。前記トロンビンに特異的な抗体は、ポリクローナル抗体又はその断片である、請求項14~16のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。前記抗体は、Phe-Pro-Arg-クロロメチルケトンPPACK、4-アミノフェニルピルビン酸APPA、4-2-アミノエチルベンゼンスルホニルフルオライドAEBSF、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドで、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、請求項14~17のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。前記イムノアッセイは、固相免疫測定法である、請求項14~18のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。前記固相免疫測定法は、サンドイッチイムノアッセイである、請求項19に記載のイムノアッセイ。前記トロンビンの量の測定は、トロンビンの標準曲線で行われる、請求項14~20のいずれか一項に記載のイムノアッセイ。血液試料中のトロンビンのレベルを測定するためのインビトロで、簡単、迅速、かつ有効な検査の必要性がある。本発明は、アンチトロンビンIIIAT-IIIの存在下で試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイに関する。一態様では、イムノアッセイは、試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、トロンビンを活性部位がブロックされたトロンビンに対して産生されるトロンビンに特異的な抗体と接触させる工程と、結合した抗体のレベルを測定する工程とを含む。別の態様では、イムノアッセイは、試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、試料にトロンビンに特異的な抗体を加える工程であって、トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、工程と、抗体とトロンビンとの結合を測定する工程と、存在するトロンビンの量を測定する工程とを含む。本発明の一実施形態では、試料は、血液又は血液成分からなる群から選択される生物学的検体である。本発明の別の実施形態では、小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、模倣物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。更なる実施形態では、トロンビンに特異的な抗体は、ポリクローナル抗体又はその断片である。本発明の更に別の実施形態では、抗体は、Phe-Pro-Arg-クロロメチルケトンPPACK、4-アミノフェニルピルビン酸APPA、4-2-アミノエチルベンゼンスルホニルフルオライドAEBSF、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドで、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される。本発明の更に別の実施形態では、イムノアッセイは、サンドイッチイムノアッセイ等の固相免疫測定法である。本発明の更に別の実施形態では、トロンビンの量の測定はトロンビンの標準曲線で行われる。本発明は、アンチトロンビンIIIAT-IIIを含む試料中のトロンビンを定量化するキットも提供し、キットは、トロンビンに特異的なポリクローナル抗体又はその断片と、トロンビンの基質結合部位を認識する小分子とを含み、トロンビンに特異的な抗体は、ブロックした活性部位を有するトロンビンに対して産生される。トロンビンに特異的なイムノアッセイによるトロンビンの検出は、血漿中に存在する物質の干渉によって損なわれることが本発明によって判明した。血漿中に検出した干渉は、少なくとも一部分は、AT-IIIが存在するためであり得ることも判明した。更に、本発明により、驚くべきことに、ヒルジンを含む試料にAT-IIIと共にトロンビンを加えることは、ヒルジンを欠く対照試料と比較して、試料中のトロンビンを検出するトロンビンに特異的なイムノアッセイの能力を増加させる結果となったことが判明した。これらの結果は、ヒルジンがアンチトロンビンIIIの存在下でトロンビンの検出を高めることを示している。トロンビン分子中のヒルジン及びAT-IIIの結合部位は異なること、及びAT-IIIとは対照的にヒルジンは小分子であることを考えると、これらの発見は驚くべきことである。トロンビン中のヒルジン結合部位は、トロンビンのフィブリノーゲン結合部位と重複するChangJY.Thehirudin-bindingsiteofhumanalpha-thrombin.Identificationoflysylresidueswhichparticipateinthecombiningsiteofhirudin-thrombincomplex.JBiolChem.1989May5;26413:7141~6;HuntingtonJA.Molecularrecognitionmechanismsofthrombin.JThrombHaemost.2005Aug;38:1861~72のに対して、AT-III結合部位は、トロンビンの触媒部位と重複するGriffithMJ.Kineticsoftheheparin-enhancedantithrombinIII/thrombinreaction.Evidenceforatemplatemodelforthemechanismofactionofheparin.JBiolChem.1982Jul10;25713:7360~5;andMarkwardtら、Theinfluenceofsyntheticthrombininhibitorsonthethrombin-antithrombinreaction.Thrombosisresearch.1973Vol.2,343~348。トロンビンをAT-IIIと混合した後にヒルジンを加えることは、ヒルジンの不在下の対照と比較して、トロンビンの検出に増加をもたらすことも判明した。AT-IIIを含む血漿試料又は他の試料を検査するとき、ヒルジンはトロンビンに特異的なイムノアッセイで遭遇する干渉を減少させる。メカニズムに拘束されないで、トロンビン中の抗原群は、トロンビンのAT-IIIとの結合によって隠される及び/又は変更されるように見え、またヒルジンを加えることは、AT-IIIがイムノアッセイに及ぼす干渉を減少させ、その結果イムノアッセイによるトロンビンの検出を増加させるように見える。これらの発見は、AT-IIIのレベルが高い条件下で、すなわち、血漿試料に見られる一般的な条件下で、トロンビンのレベルの測定を可能にするイムノアッセイ方法の開発への道を開く。本発明は、AT-IIIの存在下で試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイを提供し、その方法は、試料をフィブリノーゲン結合部位等のトロンビン基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、試料にトロンビンに特異的な抗体を加える工程と、抗体とトロンビンとの結合を測定する工程と、存在するトロンビンの量を測定する工程とを含む。用語接触は、小分子を試料と接触させる結合作用を指し、より具体的には、試料中に存在する小分子とトロンビンとの間で結合相互作用が発生するような方法で小分子をトロンビンと接触させる結合作用を指す。用語小分子は、例えば、400~50,000ダルトン、又は400~40,000ダルトン、又は400~8,000ダルトン、又は400~1000ダルトン、又は5,000~40,000ダルトン、又は1,000~8,000ダルトンの範囲等の400~100,000ダルトンの範囲の分子量を有する分子を指す。小分子は、類似の三次元構造を有するが非重複性配列を示すヒルジンの合成模倣物であり得る。ヒルジンの模倣物は、例えば、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリなどのスクリーニングによって識別することができる。スクリーニングは、トロンビン中の基質結合部位へのヒルジンの結合に対するペプチドの競合に依存することができる。本発明の一実施形態では、ELISAサンドイッチアッセイが使用される。トロンビンの触媒部位に特異的なモノクローナル抗体を、ELISAマイクロタイタープレートをコーティングするのに使用することができる。プレートにブロッキング溶液中のトロンビンを充填し、過剰なトロンビンを数回洗浄して除去する。次に、ブロッキング溶液中のヒルジンを充填し、過剰なヒルジンを洗い流す。次に、プレートに結合したヒルジン100結合のヒルジンを、標識抗ヒルジンポリクローナル抗体を用いて検出する。ヒルジンのバウンディングは、標識ヒルジン、例えば、3H-ヒルジンを使用することで検出することができる。試験ウェル中に個々のペプチドがELISAに含まれ、特定のペプチドの存在によってプレートに結合するヒルジンの減少は、ペプチドが模倣ペプチドの可能性があることを示す。一実施形態では、トロンビン基質結合部位を認識する小分子は、トロンビンのフィブリノーゲンへの結合の少なくとも50を阻害する。本発明の方法で使用する小分子は、ペプチド、合成化合物、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、トロンビン基質結合部位への結合能力を保持するヒルジン誘導体及び/又は組換えヒルジン変異体であり得る。変異体は、天然起源のヒルジンに比べて、アミノ酸の置換、欠失、及び/又は付加を含むヒルジンポリペプチドを含む。典型的には、アミノ酸の置換、欠失、及び/又は付加は、トロンビン基質結合部位に結合するための変異体の能力を変えない。変異体は、非天然起源のアミノ酸残基も含み得る。誘導体は、グリコシル化変化、アシル化変化及び/又は他の化学変化を含み、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列に共有結合的に又は非共有結合的に結合するレポーター分子及び/又は他のリガンド等の非アミノ酸の置換基を含む。模倣物は、必ずしもヒルジンの構造を複製することなく、その三次元の立体構造を再現する能力を有する小分子を非常に多く含む。この模倣物がトロンビンを結合できるように、模倣物は、ヒルジンの完全な複製である必要はなく、またヒルジンの構造に十分に似ている近似であってもよい。本発明の一実施形態では、小分子は、試料中に存在するトロンビンを中和する量で被検試料に加える。本発明の別の実施形態では、試料中のヒルジンとトロンビンとの間のモル比は、0.64以上、例えば、0.67、1.27、2.55、5.10、10.20、12.76、20.41、25.52、40.82、51.05、81.63、102.56、205.13、410.26、816.36、及び1632.65、又はそれ以上のモル比である。一実施形態では、トロンビンは試料中に約1単位で存在すると思われ、ヒルジンは、約0.64アンチトロンビン単位又はそれ以上加える。しばしば、用語中和すると阻害するとは交換可能である。用語トロンビン基質結合部位を認識する分子は、トロンビン基質結合部位に対してアフィニティーを有する分子を指す。本発明の一実施形態では、トロンビン基質結合部位はエキソサイトIにある。本発明の別の実施形態では、結合の1つの重要な要素は、フィブリノーゲンの場合と同じくトロンビンの活性部位から離れた20Åの周りに位置するTyr76であるThierryRoseandEnricoDiCera.Three-dimensionalModelingofThrombin-FibrinogenInteraction.JBC2001Vol277N21,18875~1880。本発明のイムノアッセイは、任意の試料、例えば、血液等の生物学的検体、血漿等の血液成分及び他の血液由来の部分、トロンビン及びアンチトロンビンIIIを含む他の体液等で行うことができる。本発明によって使用されるトロンビンに特異的な抗体は、活性部位がブロックされたトロンビンに対して産生される。用語ブロックされた活性部位を有するトロンビンは、活性部位に結合したペプチドを有するトロンビンを指す。本発明の一実施形態では、トロンビンの活性部位は、P4~P2’のクレフトに存在するHuntingtonJA.Molecularrecognitionmechanismsofthrombin.JThrombHaemost.2005Aug;38:1861~72の図2に示される。ペプチド本明細書でブロッキングペプチドと呼ばれるは、例えば、約400~1000ダルトンの範囲で三アミノ酸ペプチド誘導体、Phe-Pro-Arg-クロロメチルケトンPPACK、4-アミノフェニルピルビン酸APPA又は4-2-アミノエチルベンゼンスルホニルフルオライドAEBSFであり得る。用語活性部位は、用語触媒部位と交換可能である。トロンビンに特異的な抗体は、トロンビンに結合特異性を示す及び/又はトロンビン結合が可能であるのであれば、モノクローナル抗体、単鎖、Fab免疫グロブリン発現ライブラリの生成物を含むFab断片、ポリクローナル抗体又はその断片であり得る。用語ポリクローナル抗体は、異種性抗体の集団を指す。これは、トロンビン内で異なるエピトープに特異的な抗原結合機能を有する抗体を含んでもよい。ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギ、ヤギ、ロバ、及びヒツジ等の哺乳類種の動物をヒトトロンビンで免疫することにより生成されてもよい。免疫に使用されるトロンビンは、精製ヒトプロトロンビンから調製することができる。免疫の経路は、皮内、腹腔内、皮下、筋肉内、頭蓋内、及び/又は静脈内が挙げられるが、これらに限定されない。用語モノクローナル抗体は、抗体産生細胞の単一クローン、例えば、ハイブリドーマ細胞の単一クローンから作製される抗体医薬を指す。典型的には、モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術によって作製される。用語ハイブリドーマは、所望する抗体を大量に作製する、例えば、モノクローナル抗体を作製するために操作された細胞を指す。モノクローナル抗体を作製するには、トロンビンで免疫した動物例えば、任意の哺乳類種の脾臓からB細胞を除去することができる。免疫に使用されるトロンビンは、精製ヒトプロトロンビンから調製することができる。免疫の経路は、皮内、腹腔内、皮下、筋肉内、頭蓋内、及び/又は静脈内が挙げられるが、これらに限定されない。次に、B細胞は、培養中に不確定に増殖することができる骨髄腫腫瘍細胞と融合されることができる。この融合は、細胞膜をより透過性にすることにより行なうことができる。融合細胞は癌細胞であるので、急速かつ不確定に増殖させることができ、所望する抗体を大量に作製することができる。作製された抗体は、トロンビンに対する特異性及びアフィニティーを検査することができる。モノクローナル抗体を調製する方法、及び特異性を判定する方法は、当技術分野では公知である例えば、ShivanandPandey.HYBRIDOMATECHNOLOGYFORPRODUCTIONOFMONOCLONALANTIBODIESInternationalJournalofPharmaceuticalSciencesReviewandResearch.2010;Volume1,Issue2:88~94を参照されたい。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の作製及び精製は、当技術分野では周知であるImmunoassay,Eds.EleftheriosPDiamandisandTheodoreK.Christopoulos,AcademicPress1996,Chapter5。トロンビンに特異的な抗体は組換え可能であるImmunoassay,Eds.EleftheriosPDiamandisandTheodoreK.Christopoulos,AcademicPress1996,Chapter6。検出するために抗体を標識することは、当技術分野では周知であるImmunoassay,Eds.EleftheriosPDiamandisandTheodoreK.Christopoulos,AcademicPress1996,Chapter8。抗体を検出する及び標識抗体/抗体を標識するは、発見されることが可能な抗体を指す。抗体を検出することは、検出可能なシグナルに又はシグナルを発生する部分に、直接的に、又は間接的に例えば、別の抗体を通して結合させてもよい。シグナルは、放射性例えば、放射性ヨード、トリチウム、炭素、硫黄等で比色定量することによる蛍光シグナル等であり得る。シグナルを発生する基質に作用するシグナルを発生する部分としては、ホースラディシュペルオキシダーゼHRP[好適な基質としては、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンTMB;OPD;2,2’-アジノビス3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸二アンモニウム塩が挙げられる];アルカリホスファターゼ[好適な基質としては、リン酸p-ニトロフェニル二ナトリウム塩が挙げられる];及びβ-ガラクトシダーゼ[好適な基質としては、O-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシドが挙げられる]が挙げられるが、これらに限定されない。シグナルは、アビジン-ビオチン結合システムを利用して増幅されてもよい。抗原の抗原決定基と特異的抗体の抗原結合部分との間の結合相互作用に依存する異なるタイプのイムノアッセイは、当該技術分野において周知でありImmunoassay,Eds.EleftheriosPDiamandisandTheodoreK.Christopoulos,AcademicPress1996,Chapter8~19、例えば、固相免疫測定法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法ELISA、例えば、二部位抗原を固定化抗体と標識抗体との間にサンドイッチする、サンドイッチタイプイムノアッセイ、アビジン-ビオチンイムノアッセイシステム、ウエスタンブロット、免疫沈殿、ラジオイムノアッセイRIA、酵素イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ蛍光flurescentマーカーが抗体と抱合する、例えば、フルオレスセイン、ローダミン等、免疫沈殿、化学発光イムノアッセイ化学構造修飾上の光を取り除く有機分子が使用される、例えば、イソルミノール、ピロガロール、ルシフェリン、ルミノール等、生物発光イムノアッセイ、免疫ブロッティング技術等がある。抗原決定基は、抗体によって認識される抗原中の領域を指す。抗体をポリスチレン製マイクロタイターウェルに結合させるコーティングさせるために、以下の実施例に明記するように、抗原に特異的な抗体をpH9~9.6の炭酸緩衝液で希釈することができる。共有結合が報告されているImmunoassay,Eds.EleftheriosPDiamandisandTheodoreK.Christopoulos,AcademicPress1996,Chapter24。コーティング工程は、ブロッキング溶液、例えば、BSAの存在下で、抗原に特異的な抗体をウェル中でインキュベートすることによって通常行なわれる。第2の抗体は、コーティングする抗体に結合する抗原を検出するために使用することができる。第2の抗体を標識することができる。次に、充当した抗原例えば、トロンビンの標準物質は、検量線用に作成することができるImmunoassay,Eds.EleftheriosPDiamandisandTheodoreK.Christopoulos,AcademicPress1996,Chapter24。用語コーティング抗体、捕獲抗体、及び固定化抗体は、固形支持体の表面に存在する抗体を通常指す。コーティング抗体は、抗原を結合する部分が試料に存在する抗原と接触可能であるように方向付けることができる。検出が間接的である場合例えば、第の2抗体を通して行われる、第2の検出抗体は、捕獲抗体を生成するために使用される種とは異なる種で生成することができる。用語トロンビン量の測定は、定性測定又は定量測定を指す。ELISAは、定性的又は定量的であり得る。定性的結果は、被検試料内のトロンビンの存在に対して、単純な陽性又は陰性の結果を提供する。2~3回の標準偏差検査に固有の誤差は、陽性の試料を陰性の試料と区別するために典型的には使用される。定量的ELISAでは、試料の光学濃度ODを、典型的には既知量の精製トロンビンの段階希釈である標準曲線と比較する。本発明の一実施形態では、トロンビンの異なる既知濃度を以下のように調製する。43.9μg/mLの濃度のトロンビン標準溶液を、ブロッキング緩衝液1I-Blockを含有する0.05Tween-20を含むPBSで6.27μg/mL6270ng/mLの濃度に希釈する。次に、前回希釈した溶液から100μLをブロッキング緩衝液100μLが入ったチューブに移すことで、希釈したトロンビン基準溶液を段階的に2倍希釈7回する。6270ng/mLから49ng/mLまで希釈した8種類の希釈液を調製する。次に、上述のトロンビン希釈液をそれぞれ、ブロッキング緩衝液で更に希釈し1:10、トロンビンの最終濃度4.9ng/mL、9.8ng/mL、19.5ng/mL、39、78ng/mL、156.7ng/mL、313.5ng/mL、及び627ng/mLを得た。次の工程で、最終のトロンビン溶液をそれぞれ100μL、あらかじめコーティングしたマイクロELISAプレートに移し、小分子を加えることなく以下に詳細説明するように免疫測定を行なう。免疫測定は自動化することができるImmunoassay,Eds.EleftheriosPDiamandisandTheodoreK.Christopoulos,AcademicPress1996,Chapter21。本発明の一実施形態では、固相免疫測定法が行われる。チューブ、ビーズ、磁性微粒子材料、プラスチックビーズ、プラスチック支持体、カラム、小シート、及びアッセイプレート、例えば、マイクロタイターウェル等の様々な固相を使用することができる。本発明の一実施形態では、下記の開発した二部位サンドイッチタイプのイムノアッセイを使用して、被検試料中のトロンビンを検出する。第1の工程で、トロンビン基質結合部位を認識する小分子を被検試料に加える。小分子は、少なくとも1NIH単位のトロンビンを中和する最終濃度、例えば、20NIH単位のトロンビンを中和する量で加えるヒルジンであり得る。トロンビンを含む試料を、約15分間小分子と一緒にインキュベートすることができる。次に、小分子を含む試料をピペットでとり、過剰量のトロンビンに特異的なポリクローナル抗体捕獲抗体であらかじめコーティングした固相にインキュベートする。このインキュベート中に、試料中のトロンビンが捕獲抗体と結合しboundsto、次に他の試料成分すべてを洗い流す。次に、過剰量のトロンビンに特異的な標識ポリクローナル抗体を加える。インキュベーション後に、過剰量の標識抗体を洗い流し、結合した標識抗体のシグナルを測定する例えば、光学濃度[OD]を測定することによる。上述の既知量の精製トロンビンを用いて作成したトロンビン標準曲線と比較及び外挿することで、トロンビンのレベルの定量化/測定を行うことができる。このイムノアッセイの実施形態では、トロンビンに特異的な同じポリクローナル抗体が、捕獲抗体及び標識抗体として役立つ。別の実施形態では、モノクローナル抗体が、捕獲抗体として、及び標識抗体として使用される。そのような実施形態では、捕獲抗体及び標識抗体は異なり、互いの結合を妨害しないように、トロンビン上の個別のエピトープを認識しなければならない。一実施形態では、トロンビンに特異的なモノクローナル抗体は、基質結合部位に向けられない。例示的なELISAでは、トロンビンに特異的な捕獲抗体、例えば、ポリクローナル抗体は、マイクロタイターウェルに過剰にあらかじめコーティングされる。より具体的には、抗体溶液例えば、2mg/mLの濃度のタンパク質をコーティング緩衝液50mM炭酸緩衝液;pH=9.6で1:200~1:100の範囲、例えば、1:500に希釈し、希釈した抗体100μLを各ウェルに加える。マイクロタイタープレートを2~8°Cで一晩インキュベートする。次に、コーティング溶液を捨て、マイクロタイタープレートを洗浄緩衝液0.05Tween-20を含むPBS200μL/ウェルで3回洗浄する。続いて、200μLのブロッキング緩衝液1I-Blockを含む洗浄緩衝液を各ウェルに加え、マイクロタイタープレートを37°Cで1時間インキュベートする。インキュベート終了時に、ブロッキング緩衝液を取り除く。被検試料、例えば、生体液等をそれぞれ、トロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる。試料は、小分子と一緒に約15分間インキュベートすることができる。被検試料は、ブロッキング緩衝液で1:5に希釈することができ、次に、希釈した各試料100μLをあらかじめコーティングしたウェルに加える。次に、プレートを37°Cで1時間インキュベートする。インキュベート期間後に試料溶液を捨て、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄する。次に、ブロッキング緩衝液で1:200~1:100の範囲、例えば、1:500に希釈した、トロンビンを検出するHRP抱合ポリクローナル抗体を含む100μLの溶液例えば、2mg/mLの濃度のタンパク質を有するストック溶液からを、各ウェルに加える。プレートを37°Cで1時間インキュベートし、上述のように洗浄緩衝液で洗浄し、ELISAHRP基質用の3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンTMB液体基質システム100μLを各ウェルに加える。プレートを室温で約60分間強い青色が高濃度のトロンビンを含むウェルで観察されるまでインキュベートする。100μLの停止液1Mの塩酸を各ウェルに加えて反応を止める。プレートをOD450nmで読み取り、試料中のトロンビンの正確な濃度を、上述したようにトロンビンの既知濃度から作成したトロンビン標準曲線と比較することによって、外挿することができる。典型的には、トロンビンの標準曲線の線形範囲を使用して、被検試料中のトロンビンの正確な濃度を計算する。本発明の一実施形態では、捕獲抗体は、抗ヒトトロンビンヒツジポリクローナル抗体例えば、AffinityBiologicals製の抗体;カタログ番号SAHT-APである。本発明の別の実施形態では、ポリクローナル抗体を産生させるために使用する免疫原は、活性部位がPPACKでブロックされた精製ヒトプロトロンビンから調製したトロンビンである。本発明の別の更なる実施形態では、検出する抗体は、HRP抱合ヒツジ抗ヒトトロンビン抗体例えば、AffinityBiologicals製の抗体;カタログ番号SAHT-HRPである。本発明の別の実施形態では、間接ELISAアッセイを使用する。例示的な間接ELISAでは、被検試料を、トロンビンの基質結合部位、例えば、フィブリノーゲン結合部位を認識する小分子と接触させ、次に、固相、例えば、マイクロタイタープレートのウェルに加え、そこでプラスチックに、例えば、電荷相互作用を通して、付着する時間を与える。次に、非反応タンパク質の溶液、例えば、ウシ血清アルブミン又はカゼインを加え、被検試料内に存在する抗原によってコーティングされない状態を保持するウェル中の任意のプラスチック表面をブロックする。次の工程で、トロンビンを特異的に結合する一次抗体を各ウェルに加える。その後、一次抗体を結合する二次抗体を各ウェルに加える。二次抗体は付着した酵素を有し、それは抗体の結合特性に無視できる効果を有する。次に、この酵素用の基質を加える。この基質は、酵素と反応すると色が変わる。色の変化は、二次抗体が一次抗体と結合したことを示す。典型的には、非結合の抗体が取り除かれるように、一次抗体及び二次抗体を加えた後プレートを洗浄する。別の実施形態では、酵素に連結した1つの抗体が、試料内のトロンビンの有無を検出するために使用される。分光計を使用して、色の強度に対して定量値を与える。検出可能なシグナルは、放射性例えば、放射性ヨード、トリチウム、炭素、硫黄等で比色定量することによる蛍光シグナル等であり得る。本発明は、アンチトロンビンIIIAT-IIIを含む試料中のトロンビンを定量化するキットを提供する。キットは、トロンビンに特異的なポリクローナル抗体と、トロンビンの基質結合部位を認識する小分子の構成要素と、を含み、トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される。キットは、取扱説明書、及び/又は標準曲線作成用の精製トロンビンを含み得る。キットの構成要素は、粉末、溶液及び/又はそれらの組み合わせとして提供され得る。溶液は冷凍形態で提供され得る。以上又は以下に引用する出願、特許、及び刊行物の開示は、参考として本明細書に組み込まれる。以下の実施例は例示であり、限定するものではない。材料及び方法イムノアッセイ手順:1.マイクロELISAプレートを捕獲抗体でコーティングする。マイクロELISAプレート96ウェル;Costar;カタログ番号9018を抗ヒトトロンビンヒツジポリクローナル抗体AffinityBiologicals;カタログ番号SAHT-AP;ポリクローナル抗体産生に使用した免疫原は活性部位がPPACKでブロックされた精製ヒトプロトロンビンから調製したトロンビンであったでコーティングした。以下の手順でコーティングを行った。抗体をコーティング緩衝液50mM炭酸緩衝液;pH=9.6;Sigma;カタログ番号C-3041で1:500に希釈し、希釈した抗体100μLを各ウェルに加えた。次に、マイクロELISAプレートを2~8°Cで一晩約16時間インキュベートした。次に、コーティング溶液を捨て、ウェルを洗浄緩衝液[0.05Tween-20Sigma;カタログ番号P-1379を含むPBSBiologicalIndustries;カタログ番号02-023-SA]200μL/ウェルで3回洗浄した。続いて、ブロッキング緩衝液[1I-BlockTropix;カタログ番号AI300を含む洗浄緩衝液]200μLを各ウェルに加え、ELISAプレートを37°Cで1時間インキュベートした。被検試料を加える前にブロッキング緩衝液を取り除いた。2.被検試料及び標識結合抗体をあらかじめコーティングしたウェルに加え、標識結合抗体のシグナルを測定する。被検試料をブロッキング緩衝液で1:5に希釈し、希釈した各試料100μLをあらかじめコーティングしたマイクロELISAプレートに加えた。次に、プレートを37°Cで1時間インキュベートした。インキュベート期間後に試料溶液を捨て、ウェルを上述の洗浄緩衝液200μL/ウェルで3回洗浄し、HRP抱合アンチトロンビン抗体AffinityBiologicals;カタログ番号SAHT-HRP;ブロッキング緩衝液で1:500に希釈;標識抗体100μLを各ウェルに加えた。未処置のブタ血漿を陰性対照として用いた。ブロッキング緩衝液中の既知濃度のトロンビン4.9~627ng/mLを陽性対照として用いた。陰性対照群及び陽性対照群のOD結果は下記の結果に示されない。プレートを37°Cで1時間インキュベートし、上述の洗浄緩衝液200μL/ウェルで3回洗浄し、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンTMB-HRP基質;Sigma、カタログ番号T-0440100μLを各ウェルに加えた。プレートを室温約22±3°Cで約60分間強い青色が最高濃度のトロンビンを含むウェルで観察されるまでインキュベートした。100μLの停止液1Mの塩酸;RiedeldeHaen;カタログ番号30721を各ウェルに加えて反応を止めた。プレートをOD450nmで読み取った。得られたOD値の上昇は、試料中のトロンビンのより高い濃度を示す。試料中のトロンビンの正確な濃度を、既知量の精製トロンビンを用いて作成したトロンビンの標準曲線と比較することによって外挿する。トロンビンの標準曲線の線形範囲を使用して、試料中の正確なトロンビンの濃度を計算する。以下の実施例で使用する異なる濃度のトロンビンの調製異なる濃度のトロンビンを調製するために、Omrix社内標準43.9μg/mLを使用した。異なる濃度を得るために、そのトロンビン標準をブロッキング緩衝液上記の成分を参照のことで6.27μg/mL6270ng/mLの濃度に希釈した。次に、前回希釈した溶液から100μLをブロッキング緩衝液100μLが入ったチューブに移すことで、希釈したトロンビン標準溶液を段階的に2倍希釈7回した。6270ng/mLから49ng/mLまで希釈した8種類の希釈液を調製した。次に、上述のトロンビン希釈液をそれぞれ、更に希釈し1:10、被検試料にした。実施例1-試料中のトロンビンを検出するサンドイッチELISA被検試料中のトロンビンを検出するために、二部位サンドイッチタイプのイムノアッセイを開発した。手短に、トロンビンを含む試料を、過剰量のアンチトロンビンポリクローナル抗体捕獲抗体であらかじめコーティングした固相にピペットで移し、材料及び方法の項で説明したようにインキュベートした。このインキュベート中に、試料中のトロンビンは捕獲抗体と結合しboundsto、次に他の試料成分すべてを洗い流した。次に、過剰量の標識アンチトロンビン抗体を加えた。インキュベート後に、過剰量の標識抗体を洗い流した。このイムノアッセイでは、同じポリクローナル抗体を捕獲抗体及び検出/標識抗体として用いた。ポリクローナル抗体は、アフィニティー精製したIgGヒツジ抗ヒトトロンビンであった。抗体は、活性部位/触媒部位がPPACKでブロックされた精製ヒトトロンビン精製したプロトロンビンから調製を免疫原として用いて産生した。PPACKは、トロンビンの触媒部位に結合するペプチドである。この実験では、上記の開発したイムノアッセイが試料中のトロンビンのレベルを検出する能力を調べた。このために、次第に増加する濃度のトロンビンを含むブロッキング緩衝液の試料を調製し上述したように、試料中のトロンビンの最終濃度は、約4.9ng/mL、約9.8ng/mL、約19.5ng/mL、約39ng/mL、約78ng/mL、約156.7ng/mL、約313.5ng/mL、及び約627ng/mLに調製した、上項の材料及び方法の項で詳細に説明したようにイムノアッセイを行った。標識結合抗体のシグナルが各試料で検出され、結果を図1に示す。結合抗体のシグナルは、正確な濃度のトロンビンを含む緩衝液の試料中のトロンビンの濃度に直接関係することが判明した。最も低い5種類の希釈液は線形範囲内であった。したがって、このイムノアッセイは、既知量の精製トロンビンを用いて作成したトロンビンの標準曲線と比較することでトロンビンを含む緩衝液の被検試料中のトロンビンのレベルを測定するために使用することができるツールであると結論付けられた。実施例2-トロンビンに特異的なイムノアッセイによるトロンビンの検出への血漿中に存在する物質の干渉先の実験は、前述のイムノアッセイがトロンビンを含む緩衝液の試料中のトロンビンを検出する能力を示している。この実験では、上記の開発したイムノアッセイが、次第に増加する濃度のトロンビン実施例1と同じを添加したブタ血漿試料InstituteofanimalresearchKibutzLahavIsraelから入手中のトロンビンを検出する能力を調べた。同等の濃度のトロンビンを含むブロッキング緩衝液を、基準として用いた。上記のようにイムノアッセイを行い、両群[すなわち、群1-トロンビンを添加した血漿試料▲、及び群2-トロンビンを含む緩衝液の試料◆]のOD値を図2に示す。血漿中のトロンビンに対して得られたOD結果は、同じ濃度のトロンビンでブロッキング緩衝液中のトロンビンに対して得られたOD結果よりはるかに低いことが分かる。したがって、イムノアッセイは、血漿中に存在する物質の干渉によって損なわれることが判明した。実施例3-トロンビンに特異的なイムノアッセイによるトロンビンの検出へのAT-IIIの干渉実施例2は、トロンビンに特異的なイムノアッセイに干渉する物質が血漿中にあることを示している。ヒト血漿中のAT-IIIの正常濃度は高く、およそ0.12mg/mLである。血漿中に存在するAT-IIIがイムノアッセイに干渉する因子であるかどうかを調べるために、次の実験を行った。このために、AT-IIIを含む試料Americandiagnostica;カタログ番号433;ブロッキング緩衝液で最終濃度1IU/mLに希釈、又はAT-IIIを含まない試料上述のブロッキング緩衝液溶液を調製した。次に、異なる濃度のトロンビンをこれらの試料に加えた上述したように、最終濃度4.9、9.8、及び19.5ng/mLに調製した。試料中のトロンビンを検出するために、上述したようにイムノアッセイを行った。AT-IIIの存在下で得られたOD結果は、AT-IIIの非存在下で得られたOD結果よりはるかに低いことが分かる図3。AT-IIIは、トロンビンイムノアッセイに干渉を引き起こすことが判明した。したがって血漿中に検出される干渉実施例2は、少なくとも一部は、AT-IIIの存在のためであり得ることを示している。実施例4-血漿中のトロンビンを検出するためのイムノアッセイにおいてヒルジンを加えることの有益な効果ヒルジンはヒル類に自然に生じる65アミノ酸の小さなペプチドであり、抗凝血性の特性を有する。ヒルジンはトロンビン中のフィブリノーゲン結合部位基質結合部位に結合し、一方でAT-IIIはトロンビン中の触媒部位/活性部位に結合する。次の実験の組で、トロンビンに特異的なイムノアッセイにおいてAT-III干渉にヒルジンを加えることの効果を調べた。このために、AT-IIIを含む異なる溶液[以下の溶液1、4、及び7を参照]を調製し、異なる濃度のヒルジンを、異なる溶液に混合した以下の群2、3、5、6、8及び9を参照。次に、異なる濃度のトロンビンを混合液に加え、イムノアッセイを行った。溶液1~9の調製:1.AT-IIIAmericandiagnostica;カタログ番号433をブロッキング緩衝液で希釈する、最終濃度1IU/mL。2.溶液1ヒルジンSigma;カタログ番号94581、最終濃度1U/mL1Uのヒルジンは1ATUアンチトロンビン単位[ATU];1ATUは1NIH単位のトロンビンを中和するインヒビターの量として定義するに相当。3.溶液1ヒルジンのみ加える、最終濃度5U/mL。4.溶液1ヘパリンPharmacare、最終濃度10IU/mL。ヘパリンは、AT-IIIによってトロンビンの不活性化を増加させる。5.溶液4ヒルジン、最終濃度1U/mL。6.溶液4ヒルジン、最終濃度5U/mL。7.ブタ血漿。8.7ヒルジン、最終濃度1U/mL。9.7ヒルジン、最終濃度5U/mL。次に、上述した材料及び方法の項を参照方法で、最終濃度4.9ng/mL、9.8ng/mL、19.5ng/mL、39ng/mL、78ng/mL、156.7ng/mL、313.5ng/mL、及び627ng/mLでトロンビンを各溶液1~9に加えた。この実験では、トロンビンを、AT-IIIと共にヒルジンを含む溶液2、3、5、6、8及び9に加えた。調製した試料異なる濃度のトロンビンで混合した溶液1~9を希釈し、あらかじめコーティングしたELISAプレートにピペットで移し、材料及び方法の項に明記したようにODレベルを測定した。トロンビンを含む異なる試料のOD値を図4、5及び6に示す。図4では、試料はブタ血漿である試料は溶液7~9で調製した。図5では、試料はAT-IIIを含む溶液である試料は溶液1~3で調製した。図6では、試料はAT-III及びヘパリンを含む溶液である試料は溶液4~6で調製した。ヒルジンを加えることは、用量依存的様式で、トロンビンに特異的なイムノアッセイにおけるAT-IIIの干渉を減少させることが観察された。これらの結果は、AT-IIIを含む試料において、トロンビンに特異的なイムノアッセイによるトロンビンの検出を向上させるためには、トロンビンの基質結合部位に結合可能な小分子のヒルジンを被検試料に加えることが有益であることを示している。実施例5-血漿中のトロンビンを検出するためのトロンビンに特異的なイムノアッセイにおいてヒルジンを加えることの有益な効果上記の実験の結果は、AT-IIIを含む試料にヒルジンを加えることは、特異的なイムノアッセイにおいてトロンビンの検出を向上させることを示している。上記の実験では、AT-IIIと共にヒルジンを含む試料にトロンビンを加えた。しかしながら、被検血漿試料は既にトロンビンを含み、ほとんどのトロンビンはアンチトロンビンIIIに付着している。そのような場合、ヒルジンはトロンビン-AT-IIIの複合体に作用する必要がある。次の実験は、既にトロンビン及びAT-IIIを含む血漿試料中のトロンビンを検出するためのイムノアッセイにおいて、ヒルジンの有益な効果を検討する。次の実験の組では、様々な濃度のトロンビンをブタ血漿の試料に添加した最終濃度4.9ng/mL~627ng/mL;材料及び方法の項の試料の調製を参照。3つの群の試料を調製した。次の工程で、ヒルジンを群のうちの2つに、最終濃度1U/mL■又は20U/mL●で加えた。第3の群にはヒルジンを加えず、この群を対照▲として用いた。トロンビンが上述のELISAアッセイによって異なる群で検出された。この実験では、5U/mLのヒルジンを補充した非添加のブタ血漿を陰性対照として用いた陰性対照の結果は示さず。結果を図7に示す。試料に加えたヒルジンと試料中に存在するトロンビンとの間のモル比を下表1に示す。1トロンビンUは約400ng/mLトロンビンに相当する。トロンビンを添加した血漿の試料にヒルジンを加えることは、イムノアッセイでトロンビンを検出する能力にヒルジンの濃度に依存した増加が生じることが判明した。結果は更に、ヒルジンとトロンビンとの間のモル比が0.637755以上のとき、イムノアッセイの、トロンビンを検出する能力の増加が観察されたことを示している。実施の態様1アンチトロンビンIIIAT-IIIの存在下で試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイであって、前記試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、前記試料にトロンビンに特異的な抗体を加える工程であって、前記トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、工程と、前記抗体の前記トロンビンとの結合を測定する工程と、存在するトロンビンの量を測定する工程と、を含む、イムノアッセイ。2前記試料は、血液又は血液成分からなる群から選択される生物学的検体である、実施態様1に記載のイムノアッセイ。3前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、模倣物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様1又は2に記載のイムノアッセイ。4前記トロンビンに特異的な抗体は、ポリクローナル抗体又はその断片である、実施態様1~3のいずれかに記載のイムノアッセイ。5前記抗体は、Phe-Pro-Arg-クロロメチルケトンPPACK、4-アミノフェニルピルビン酸APPA、4-2-アミノエチルベンゼンスルホニルフルオライドAEBSF、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドで、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、実施態様1~4のいずれかに記載のイムノアッセイ。6前記イムノアッセイは、固相免疫測定法である、実施態様1~5のいずれかに記載のイムノアッセイ。7前記固相免疫測定法は、サンドイッチイムノアッセイである、実施態様6に記載のイムノアッセイ。8前記トロンビンの量の測定は、トロンビンの標準曲線で行われる、実施態様1~7のいずれかに記載のイムノアッセイ。9アンチトロンビンIIIAT-IIIを含む試料中のトロンビンを定量化するキットであって、トロンビンに特異的なポリクローナル抗体又はその断片と、トロンビンの基質結合部位を認識する小分子とを含み、前記トロンビンに特異的な抗体は、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、キット。10前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、模倣物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様9に記載のキット。11前記抗体は、Phe-Pro-Arg-クロロメチルケトンPPACK、4-アミノフェニルピルビン酸APPA、4-2-アミノエチルベンゼンスルホニルフルオライドAEBSF、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドで、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、実施態様9又は10に記載のキット。12前記キットは、イムノアッセイキットである、実施態様9~11のいずれかに記載のキット。13精製トロンビンを更に含む、実施態様9~12のいずれかに記載のキット。14アンチトロンビンIIIAT-IIIとトロンビンとを含む試料中のトロンビンを定量化するためのインビトロイムノアッセイであって、前記試料をトロンビンの基質結合部位を認識する小分子と接触させる工程と、前記トロンビンを活性部位がブロックされたトロンビンに対して産生されるトロンビンに特異的な抗体と接触させる工程と、結合した抗体のレベルを測定する工程と、を含む、イムノアッセイ。15前記試料は、血液又は血液成分からなる群から選択される生物学的検体である、実施態様14に記載のイムノアッセイ。16前記小分子は、天然起源のヒルジン、合成ヒルジン変異体、ヒルジン誘導体、組換えヒルジン変異体、模倣物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様14又は15に記載のイムノアッセイ。17前記トロンビンに特異的な抗体は、ポリクローナル抗体又はその断片である、実施態様14~16のいずれかに記載のイムノアッセイ。18前記抗体は、Phe-Pro-Arg-クロロメチルケトンPPACK、4-アミノフェニルピルビン酸APPA、4-2-アミノエチルベンゼンスルホニルフルオライドAEBSF、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドで、ブロックされた活性部位を有するトロンビンに対して産生される、実施態様14~17のいずれかに記載のイムノアッセイ。19前記イムノアッセイは、固相免疫測定法である、実施態様14~18のいずれかに記載のイムノアッセイ。20前記固相免疫測定法は、サンドイッチイムノアッセイである、実施態様19に記載のイムノアッセイ。21前記トロンビンの量の測定は、トロンビンの標準曲線で行われる、実施態様14~20のいずれかに記載のイムノアッセイ。"