"カチオン化ゼラチンとヘパリンを含む徐放性ゼラチンハイドロゲル組成物。カチオン化ゼラチンとヘパリンとのポリイオンコンプレックスを含む徐放性ゼラチンハイドロゲル組成物。ヘパリンが低分子量ヘパリンである、請求項1または2に記載のハイドロゲル組成物。本発明の目的は、局所においてヘパリンあるいは低分子量ヘパリンを長時間にわたって徐放することにより、副作用となる出血傾向を軽減しつつ、病変部において効率よくHGFの産生を促進して、腎臓における線維化を抑制できる組成物を提供することである。本発明者らは、ゼラチンハイドロゲルを用いることにより低分子量ヘパリンを徐放化しうることを見いだした。さらに、低分子量ヘパリンとカチオン化ゼラチンとのポリイオンコンプレックスを形成させた後、これをゼラチンハイドロゲル内に包含させた徐放性ゼラチンハイドロゲル組成物を開発した。すなわち本発明は、カチオン化ゼラチンとヘパリンまたは低分子量ヘパリンを含む徐放性ゼラチンハイドロゲル組成物を提供する。別の態様においては、本発明は、カチオン化ゼラチンとヘパリンまたは低分子量ヘパリンとのポリイオンコンプレックスを含む徐放性ゼラチンハイドロゲル組成物を提供する。本発明はヘパリンをゼラチンハイドロゲルとの複合体とし、徐放化することに関する。以下、本発明のゼラチンとヘパリンまたは低分子量ヘパリンの複合体を含有する徐放性ゼラチンハイドロゲルについて説明する。ヘパリンは、動物のあらゆる組織に普遍的に存在するアミノ糖とウロン酸の二糖の繰り返し構造からなる多糖である。分子内に硫酸基をもつため、負の電荷をもっている。ヘパリンは抗血液凝固剤として臨床に使用されている。本発明の徐放性ハイドロゲル組成物において、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンとしては、市販の製品の任意のものを用いることができる。一例としては、ダルテパリンナトリウム、パルナパリンナトリウム等が挙げられる。低分子量ヘパリンとは、平均相対分子量が2,000~10,000、好ましくは3,000~8,000、より好ましくは4,000~6,000であるヘパリンをいう。ゼラチンは、動物牛や豚の皮膚や骨の主成分であるコラーゲンを酸、アルカリ、あるいは酵素によって処理、変性させて得られるタンパク質である。この処理によって、構成アミノ酸の側鎖が加水分解をうけ、等電点が変化するとともに、ランダムコイル構造をもつゼラチンが得られる。このゼラチンを熱脱水処理や化学処理によって分子間架橋し、水和させることにより、ハイドロゲルが形成できる。本発明においては、ゼラチンにアミノ基を導入してカチオン化したゼラチン誘導体カチオン化ゼラチンを用いる。ヘパリンは負の電荷をもつため、カチオン化ゼラチンと静電的に相互作用して、より強く結合することができる。カチオン化ゼラチンのカチオン化の工程は公知の技術を用いることができる。例えば特開2007182407に記載の方法を採用することができるが、カチオン化の方法は生理条件下でカチオン化する官能基を導入し得る方法であれば特に限定されない。ゼラチンハイドロゲルの有する水酸基あるいはカルボキシル基等に1、2または3級のアミノ基またはアンモニウム基を温和な条件下で導入する方法が好ましい。例えばエチレンジアミン、N,N-ジメチル-1,3-ジアミノプロパン等のアルキルジアミンや、トリメチルアンモニウムアセトヒドラジド、スペルミン、スペルミジンまたはジエチルアミド塩化物等を、種々の縮合剤、例えば1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩、塩化シアヌル、N,N’-カルボジイミダゾール、臭化シアン、ジエポキシ化合物、トシルクロライド、ジエチルトリアミン-N,N,N’,N’’,N’’-ペンタン酸ジ無水物等のジ無水物化合物、トリシルクロリド等を用いて反応させる方法を用いることができる。中でもエチレンジアミンまたはスペルミジンを反応させる方法が簡便且つ汎用性があり好適である。このとき、カチオン化ゼラチンのカチオン化の程度を示す指標として、アミノ基導入率を用いることができる。アミノ基導入率=カチオン化ゼラチンの一分子あたりのアミノ基の数/カチオン化前のゼラチン一分子あたりのアミノ基の数/カチオン化前のゼラチン一分子あたりのカルボキシル基の数100であらわされる。このアミノ基導入率は、好適には2以上60であり、特に好ましくは30以上50以下である。アミノ基導入率がこれらの下限以上であると、ゼラチンハイドロゲルとヘパリンまたは低分子量ヘパリンとの相互作用が強くなるので、徐放性の効果が向上する。一方、アミノ基導入率がこれらの上限を超えると、ゼラチンハイドロゲルのカチオン化が製造工程上困難になる場合がある。ゼラチンハイドロゲルは、架橋することにより水不溶性または水難溶性とする。ゼラチンは生体内で酵素によって分解されるため、ハイドロゲル作製時のゼラチン分子間の架橋度を変化させることによって、ハイドロゲルの分解を、数日から数カ月の範囲でコントロールすることが可能である。このゼラチンハイドロゲルは、すでに医用材料、医薬品添加物、食品などに用いられ、その生体適合性は実証済の材料である。このゼラチンハイドロゲルを用いることで、生物活性をもつタンパク質やプラスミドDNAの徐放化が可能であることが報告されている。この徐放システムでは、薬物はゼラチン分子と相互作用し、ハイドロゲル内に包含固定化されている。ハイドロゲルが分解され、ゼラチンが水可溶化されると、ハイドロゲル内に固定化されている薬物が放出されるという徐放メカニズムである。カチオン化ゼラチンハイドロゲルを製造するためには、公知の技術を用いることができる。例えば特開2007182407に記載の方法を採用することができる、すなわち、ゼラチンの分子鎖を化学的手法、紫外線照射、あるいは熱により脱水処理することによって水に溶解しにくいように架橋して作製することができる。このとき、架橋の程度の上昇とともに含水ハイドロゲルに対する水の重量比含水率は低下する。好ましい態様においては、ゼラチンハイドロゲルは、種々の化学的架橋剤を用いてゼラチンの分子間に化学架橋を形成させることにより不溶化または難溶化することができる。化学的架橋剤としては、例えばグルタルアルデヒド、例えばEDC等の水溶性カルボジイミド、例えばプロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基などの間に化学結合を作る縮合剤を用いることができる。好ましいものは、グルタルアルデヒドである。また、ゼラチンは、熱脱水処理、紫外線、ガンマ線、電子線照射によって架橋してもよい。さらに、これらの架橋処理を組み合わせて用いてもよい。他にも、塩架橋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用などを利用した物理架橋によりハイドロゲルを作製してもよい。ハイドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度の好ましい範囲は、溶液中のゼラチンの濃度1~20w/w、架橋剤濃度0.01~1w/wである。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、0~40°C、好ましくは25-30°Cで、1~48時間、好ましくは12-24時間で行うことができる。一般に、ゼラチンの濃度および架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。ゼラチンの架橋反応は、熱処理によっても行なうことができる。熱処理による架橋の例は以下のとおりである。ゼラチン水溶液10重量程度が好ましいをプラスチックシャーレに流延し、風乾することによってゼラチンフィルムを得る。そのフイルムを減圧下、好ましくは10mmHg程度で通常110~160°C、好ましくは120~150°C、通常1~48時間、好ましくは6~24時間放置することによって行なう。また、紫外線によりゼラチンフィルムを架橋する場合は、得られたゼラチンフィルムを殺菌ランプの下において通常室温、好ましくは0~40°Cで放置する。また、ゼラチン水溶液を凍結乾燥することによってスポンジ状成形体を得る。これを同様に、熱処理および紫外線、ガンマ線、電子線によって架橋することができる。あるいは、上述の架橋法を組み合わせて用いることもできる。ゼラチンハイドロゲルの形状立体構造は、特に制限はないが、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、ペースト状などがある。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、埋込片として用いるのに特に適している。本発明におけるカチオン化ゼラチンハイドロゲルは適宜、適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンハイドロゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で30分以上、又は-80°Cで1時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で1~3日間乾燥させることにより行うことができる。カチオン化ゼラチンハイドロゲルとヘパリンとの複合体は、凍結乾燥したカチオン化ゼラチンハイドロゲルを水、緩衝液、生理食塩水、リンゲル液などの中にヘパリンを含む溶液に含浸させることにより製造することができる。ゼラチンハイドロゲルとヘパリンとの複合体を生体に投与すると、複合体中に取り込まれているヘパリンは、ゼラチンハイドロゲルが生体内で分解されるに従って複合体外部へと徐々に放出される。この放出速度は、使用するゼラチンハイドロゲルの生体における分解および吸収の程度、ならびに複合体内でのヘパリンとゼラチンハイドロゲルとの結合の強さの程度および安定性により決定される。ゼラチンハイドロゲルの生体における分解および吸収の程度は、ハイドロゲル作製時における架橋の程度を調節することにより調節することができる。本発明にしたがえば、ヘパリンの優れた徐放性を有するとともに、十分な材料強度を有するヘパリン徐放材料を提供することができる。本発明の特に好ましい態様においては、ヘパリンとカチオン化ゼラチンのポリイオンコンプレックスを形成させ、これをゼラチンハイドロゲルに取り込ませて複合体を形成する。ポリイオンコンプレックスは、ヘパリンとカチオン化ゼラチンとがイオン結合により結合することにより形成されるコンプレックスである。ポリイオンコンプレックスは、ヘパリンとカチオン化ゼラチンとを、適当な緩衝溶液中で混合し、所定の時間放置することにより形成することができる。得られたポリイオンコンプレックスをゼラチン溶液と混合し、凍結乾燥した後に熱処理することにより、ポリイオンコンプレックス含有ゼラチンハイドロゲルを作製することができる。好ましくは、ハイドロゲルを構成するゼラチンとしては、アニオン性のゼラチン、例えば等電点4~6をもつゼラチンやカルボキシル基を導入したアニオン化ゼラチンを用いる。このことにより、カチオン性の高い物質が直接生体組織に接することによって起こり得る炎症反応を回避することができる。以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。カチオン化ゼラチンの作製用いたゼラチン新田ゼラチン株式会社より供与は、豚皮由来I型コラーゲンを酸処理して得た等電点pI9のゼラチンpI9ゼラチンと牛骨由来I型コラーゲンをアルカリ処理して得たpI5のゼラチンpI5ゼラチンである。コラゲナーゼLは新田ゼラチン株式会社より供与された。低分子量ヘパリンLMWHは扶桑薬品工業株式会社より供与されたパルナパリンナトリウム重量平均分子量5000を用いた。エチレンジアミン、1エチル3カルボジイミド塩酸塩EDC、246トリニトロベンゼンスルホン酸TNBS、19ジメチルメチレンブルーDMB、およびドデシル硫酸ナトリウムSDSは、ナカライテスク株式会社から購入した。ゼラチンのカチオン化誘導体は、pI9ゼラチンのカルボキシル基へのエチレンジアミンの導入により作製した。pI9ゼラチン1gを24mlの01Mリン酸緩衝水溶液PB、pH50に37°Cで溶解させた。次に、ゼラチンのカルボキシル基に対して、05、10、20、30、50、70、10、および50倍モル量のエチレンジアミンを加えた。11Nの塩酸水溶液を用いて、溶液のpHを50に調整した。その後、ゼラチンのカルボキシル基に対して、3倍モル量のEDCを添加し、PBを加えることで液量50ml、ゼラチンの最終濃度が2wtとした。37°Cで4時間攪拌、エチレンジアミン導入反応を行った。反応物を再蒸留水doubledistilledwater、DDWで3日間透析した。カチオン化ゼラチンのアミノ基導入率はTNBS法で求めた。pI9ゼラチンとカチオン化ゼラチンを02Mリン酸緩衝生理食塩水溶液PBS、pH74に溶解させた1mgml。その溶液100μlに4wtの炭酸水素ナトリウム水溶液200μlと01wtのTNBS水溶液200μlを加え、37°C、2時間、反応させた。反応後、10wtのSDS水溶液2000μlと1NのHCl100μlを加え、溶液の415nmにおける吸光度を測定した。この吸光度とβ-アラニンを用いた検量線から、pI9ゼラチンのカルボキシル基当りのアミノ基導入率を算出した。得られたカチオン化ゼラチンは、以下、エチレンジアミンの添加モル量によってE05~E50と表した。図1に、ゼラチンのアミノ基導入反応に与えるエチレンジアミン添加量の影響を示す。エチレンジアミンの添加濃度の増加とともにゼラチンへのアミノ基導入率ゼラチンのカチオン化度は増大した。なお、統計分析は、ANOVAを用いた。p値が005より低いとき有意差があるとした。カチオン化ゼラチンハイドロゲルからの低分子量ヘパリンまたはヘパリンの徐放実施例1で得られたカチオン化ゼラチンをグルタルアルデヒドにより架橋して、E50、E10、E3、E0.5のカチオン化ゼラチンハイドロゲルを作製し、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンを含浸させた。ゼラチンハイドロゲルを生体内に埋め込んでインビボにおけるヘパリンまたは低分子量ヘパリンの徐放特性を調べた。低分子量ヘパリンおよびヘパリンの125Iラベル低分子量ヘパリンまたはヘパリン1mgmLを30mL01molLリン酸緩衝液pH74で調製と、チラミン138mgとを混合し、EDCを加え、次にNヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩33mgを加え、攪拌しながら一晩反応させた。滅菌水に透析2~3日後、凍結乾燥2~3日した。チラミン導入低分子量ヘパリンまたはヘパリンにNaI125を反応させ、PD10カラムGEヘルスケアでゲル濾過し、溶出バッファー3~4mL付近で現れる高い放射活性を有する画分を放射ラベル化体として使用した。生体内における放射ラベル化体の徐放の確認E50もしくはpI9ゼラチンを用いて作製したゼラチンハイドロゲル2mgに放射ラベル化体20μLを4°Cにて一晩含浸させた。ネンブタール麻酔下において6週齢のddyマウス背部皮下にゲルを埋め込んだ。なおコントロールとして放射ラベル化体の溶液20μLを100μLにメスアップして背部皮下に投与した。埋込約72時間後においてマウスを安楽死処分し、背部の皮および残存するゲルの放射活性を測定した。埋込直後におけるハイドロゲルの放射活性に対して残存する放射活性の割合を算出した。結果を図2に示す。pI9ゼラチンに含浸させた場合は、徐放開始72時間後には9割弱が放出されてしまうのに対して、E50ゼラチンに含浸させた場合は、含浸72時間後においても、5割前後のヘパリンが残存していた。これは、ゼラチンにアミノ基を導入することにより、強い陰性荷電を持つヘパリンとの相互作用が高まったためと考えられる。蛍光ラベル化1mgmLヘパリン溶液を01molLNa2CO3溶液で溶解し市販のCy55に1mL添加し室温で30分間放置した。PD10カラムでゲル濾過を行い溶出バッファー35~45mL付近で現れる強い蛍光を発する画分を蛍光ラベルヘパリンとして使用した。生体内における蛍光ラベル化体の徐放の確認E50もしくはpI9ゼラチンを用いて作製したゼラチンハイドロゲル2mgに蛍光ラベルヘパリン20μLを4°Cにて一晩含浸させた。ネンブタール麻酔下において6週齢のddyマウス背部皮下にゲルを埋め込む。なおコントロールとして蛍光ラベル化ヘパリンの溶液20μLを100μLにメスアップして背部皮下に投与した。埋込後、経時的に背部皮下におけるゲルの蛍光強度を観察したLas4000富士フイルム。結果を図3に示す。pI9ゼラチンに含浸させた場合24時間でほぼ放出してしまうのに対し、E50ゼラチンに含浸させた場合72時間時点でもヘパリンが残存していた。低分子量ヘパリンの抗facterXa活性熱架橋より低分子量ヘパリンの抗facterXa活性が失活しないかどうかを調べた。低分子量ヘパリン水溶液5mgmLを実施例1で得られたカチオン化ゼラチンの水溶液30mgmLまたはpI9ゼラチンの水溶液100mgmLとを等量混合した。さらにこれらの混合液と等量のpI5ゼラチン水溶液E50とのポリイオンコンプレックスには100mgmL、pI9とのポリイオンコンプレックスには200mgmLの濃度で使用を混合し、ポリテトラフルオロエチレンモールド44×44mm2、深さ8mmに37°Cで流延した後、液体窒素にて凍結した。凍結乾燥の後、得られた乾燥ハイドロゲル24×24×2mm3を160°Cで96時間熱脱水処理を行った。この低分子量ヘパリン含有ゼラチンハイドロゲルを5~10mg程度秤量、秤量したゲルに500μLのPBSを添加し、37°Cで溶出開始、溶出開始から1248時間後においてPBSをサンプリングした。溶出開始24時間後においてPBSを回収した後、残っているゲルをコラゲナーゼで分解し、ゲル溶解液をPBSで500μLに合わせた。それぞれの時間ごとに回収された溶液の抗FactorXa活性から、ゲル中に残存する低分子量ヘパリンの抗FactorXa活性を求め、熱架橋していない等量の低分子量ヘパリンの活性値と比較した。具体的には、PBS中に溶出してきた低分子量ヘパリンの硫酸基を19ジメチルメチレンブルーで検出することで、溶出量を算出した。次にこの量に相当する抗FactorXa活性を低分子量ヘパリン標準液を用いて測定した検量線から算出しその値を100とし、溶出してきた低分子量ヘパリンの活性比を算出した。なお、抗FactorXa活性はテストチームヘパリンSを用いた酵素法により測定した。結果を下記の表に示す。最下段のheatLMWHは、低分子量ヘパリンを粉末の状態で、熱架橋条件下160°C96時間においた場合に得られた抗FactorXa活性を示す。いずれの時間においても加熱によりある程度の抗FactorXa活性の低下がみられたが、医薬品として用いるのに十分な活性が保持されていることが確認された。カチオン化ゼラチンと低分子量ヘパリンのポリイオンコンプレックスを含有するゼラチンハイドロゲルアミノ基導入率の異なるカチオン化ゼラチン水溶液を異なる濃度で調製した。この水溶液を低分子量ヘパリン水溶液5mgmlと、37°Cで同体積にて混合させ、両者のポリイオンコンプレックスを形成させた。カチオン化ゼラチンと低分子量ヘパリンとの混合比は、カチオン化ゼラチンのモル数低分子量ヘパリンのモル数をCGLHモル比で表した。ポリイオンコンプレックスのみかけの分子サイズは、動的光散乱dynamiclightscattering、DLSDLS7000、大塚電子製、検出角度90°、37°Cを用いて測定した。測定試料として、カチオン化ゼラチン水溶液1mgmlおよび、表2の条件で、カチオン化ゼラチンと低分子量ヘパリン水溶液を同体積で混合して調製したポリイオンコンプレックス水溶液を用いた。ポリイオンコンプレックスのゼータ電位は電気泳動光散乱法ElectrophoreticLightScattering、ELSELS8000、大塚電子製を用いて測定した。測定試料として、溶媒に10mMPBを用いたカチオン化ゼラチン溶液1mgmlおよび、表2の条件で、カチオン化ゼラチンと低分子量ヘパリン溶液を同体積で混合して調製したポリイオンコンプレックス溶液を用いて、電場強度100Vcmで測定した。図4はカチオン化ゼラチンと低分子量ヘパリンとのポリイオンコンプレックスの見かけの分子サイズである。アミノ基導入率に関係なく、カチオン化ゼラチンの分子サイズは、ほぼ一定であった。一方、ポリイオンコンプレックスの分子サイズは、カチオン化ゼラチンのアミノ基導入率が270より大きい場合には、アミノ基導入率の増加とともに減少した。これは、アミノ基導入率の増加とともに、負電荷をもつ低分子量ヘパリンとの静電的相互作用が強まり、カチオン化ゼラチンと低分子量ヘパリンとのポリイオンコンプレックスがよりコンパクトになったことが理由であると考えられる。図5はカチオン化ゼラチンと低分子量ヘパリンとのポリイオンコンプレックスのゼータ電位である。カチオン化ゼラチンのゼータ電位は、そのアミノ基導入率とともに増大する傾向を示した。一方、ポリイオンコンプレックスのゼータ電位は、アミノ基導入率が46360の範囲で、その増加とともに高くなる傾向を示した。しかし、アミノ基導入率が360より大きい場合には、そのゼータ電位は導入率の増加とともに低下した。アミノ基導入率が565のカチオン化ゼラチンの場合には、ポリイオンコンプレックスは負の電荷をもっていた。ポリイオンコンプレックス含有ゼラチンハイドロゲル作製20wt濃度のpI5ゼラチン水溶液1mlと、カチオン化ゼラチンと低分子量ヘパリンとのポリイオンコンプレックス水溶液1mlを37°Cで混合した。混合溶液を、ポリテトラフルオロエチレンモールド44×44mm2、深さ8mmに37°Cで流延した後、液体窒素にて凍結した。凍結乾燥の後、得られた乾燥ハイドロゲル24×24×2mm3を160°C、24時間の条件で熱脱水処理を行った。ポリイオンコンプレックス含有ゼラチンハイドロゲルからの低分子量ヘパリンの徐放試験02MのPBS溶液500μlに57mgの乾燥重量のハイドロゲルを加えた。1、2、4、8、24、48、および96時間経過後に、ハイドロゲルを取り出し、新しいPBSに移した。96時間後のハイドロゲルをコラゲナーゼのPBS溶液1mgml、300μlに移し、ハイドロゲルを溶解させ、低分子量ヘパリンの全量を回収した。溶液中の低分子量ヘパリンはDMB比色法で定量し17、回収された全量ヘパリンを100として徐放率を算出した。すなわち、DMB16mgのメタノール溶液5mlと蟻酸ナトリウム2gの蟻酸溶液2mlの混合液をDDWで1000mlに希釈し、DMB溶液を調製した。DMB溶液200μlを回収されたコラゲナーゼPBS溶液25μlに加え、溶液の525nmにおける吸光度を測定した。図6はカチオン化ゼラチンと低分子量ヘパリンとのポリイオンコンプレックスを含むゼラチンハイドロゲルからの低分子量ヘパリン徐放曲線を示す。カチオン化ゼラチンとポリイオンコンプレックスを形成させた場合には、24時間後においても7割強がゲル中に保持されていた。なお、対照として、pI9と複合体を形成させた場合は4割程度が保持されていた。カチオン化ゼラチンのアミノ基導入率に関係なく、低分子量ヘパリンの徐放パターンは大きく変化しなかった。"