"タンパク質をコード化している外因性DNA配列またはタンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性DNA配列およびグルタミンシンセターゼをコード化している外因性DNA配列で形質移入されたグルタミン栄養要求性ヒト細胞であって、これらの外因性DNA配列は1つの又は2以上のDNA構築物上に配置され、前記形質移入された細胞は前記タンパク質を産生する能力を有し且つ無グルタミン培地中で成長する能力を有する細胞。前記外因性DNA配列が2以上のDNA構築物上に配置される、請求項1記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞。前記グルタミン栄養要求性ヒト細胞が不死化されたグルタミン栄養要求性ヒト細胞である、請求項1または2記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞。前記不死化されたグルタミン栄養要求性ヒト細胞がヒト線維肉腫細胞である、請求項3記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞。前記ヒト線維肉腫細胞がHT1080株化細胞である、請求項4記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞。前記形質移入された細胞が足場非依存性であり、無血清、無グルタミン培地において浮遊成長能力を有する、請求項1~5の何れか1項に記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞。タンパク質の産生のための方法であって、a請求項1記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞を培養液中で前記タンパク質の発現に適切な条件下で培養することと、およびb前記タンパク質を回収することと、を含む方法。請求項7記載の方法であって、前記タンパク質がグリコシル化タンパク質である方法。グルタミン栄養要求性ヒト細胞における選択可能なマーカーとしてのグルタミンシンセターゼの使用。実施例1.ヒト線維肉腫株化細胞HT1080-R223の供給ヒトEPO遺伝子の複数のコピーを含んでいる足場依存性のヒトHT1080-R223株化細胞は、産業的なEPO生産に使用された株化細胞であり、トランスカリオティックセラピーズTranskaryoticTherapies,Inc.Cambridge,MA02139USによって最初に作出された。これは足場依存性のヒト線維肉腫HT1080株化細胞に由来する。親HT1080株化細胞ATTCNo.CCL121は、EPO産生能力をDNA構築物pREP022で形質移入されることにより獲得しており、この構築物はWO95/31560に記載されたDNA構築物pREO018と類似しているただし、DHFR遺伝子は逆の配向で配置されており、またpREP022はpREP018よりも約600塩基対低相同性の配列600basepairslesshomologoussequenceを含んでいる。この株化細胞は、さらに略してR223株化細胞と称される。実施例2.無血清培地中で浮遊状態での成長に対するR223株化細胞の適応静的なstaticフラスコで付着培養によって成長させた細胞は、トリプシン処理によって解離されて、10の透析された胎児のウシ血清dFBSおよび500nMMTXが添加されたHM9と称される、専売のグルタミン含有無血清培地中に再懸濁され、そして振盪フラスコ培養としてインキュベートされた。6日後に成長を開始し、そして細胞を同じ培地にサブカルチャーした図1。一旦、成長の確実なパターンreliablepatternが達成された場合、培地の血清含有量は1に減量された。再度、確実な成長が、血清サプリメントserumsupplementの完全な除去前に再達成された。血清が添加された及び無血清の培養物を、生産性を評価するため過成長overgrownさせた。結果は、付着培養のデータと共に表1に示される。適切な適応後の浮遊培養の比成長速度は、血清がない条件でさえ、血清が添加された付着培養でのそれと同等であった。血清添加培地で付着培養から浮遊培養へ適応する際に、EPO合成の比速度specificrateは24から12EU/106細胞/hまで50減少していた。しかしながら、次の無血清成長への適応adaptationで、この速度は実質的に18EU/106細胞/hに回復した。実施例3.無血清培地中で浮遊状態での成長に対するHT1080ATCCCCL121の適応HT1080株化細胞ATCCCCL121を、ATCCRockville,Maryland,USAから取得した。初めに、細胞を、10の胎児ウシ血清FBS含有のDMEMで付着培養により成長させた。浮遊および無血清への適応に対しての工程は、図2で表される模式図に従って実施できる。浮遊培養を開始するために、細胞をトリプシン処理によって付着培養から解離させ、そして、解離した細胞を2FBSを加えたHM9に再懸濁した。これらを次に振盪培養物としてインキュベートした。一旦2FBSを加えたHM9で細胞の浮遊成長が達成されたら、培養物を同じ培地で希釈して娘培養物daughterculturesを作出した。HT1080株化細胞の確実なReliable浮遊成長は、培養30日後に達成された図3。その後、培地の血清含有量を減らし、最終的に完全に排除した。細胞は、血清非存在下の連続的なサブカルチャーにおいて成長し続けた。実施例4.R223株化細胞の成長および生産性におけるアンモニアの効果アンモニアは、グルタミンがエネルギー基質として使用されたときに培養細胞によって産生されるカタボライトである。それは、細胞傷害性であり、また細胞成長を阻害し得る。更に、それはタンパク質のグリコシル化を、そのpHに対する効果細胞のゴルジ内でのにより阻害できる。フラスコ培養のR223細胞は、典型的には栄養素を与えられない培養では5mMの、栄養物供給を受ける発酵培養fermenterculturesでは10mMのアンモニアを産生する。アンモニアの効果の最初の検討では、R223細胞を振盪フラスコ中で、アンモニア添加なしか、又は、2、5若しくは10mMのアンモニア添加の何れかで成長させた。アンモニア複製培養ammoniareplicateculturesの各濃度は、オーバーレイガスのC02含量を変えることによって、3つの異なったpH値でセットアップされた。ここでの主要目的は、アンモニアにより及ぼされる成長阻害の程度を決定すること、および減少したpHがこの成長阻害を克服するか否かを試験することであった。アンモニアが細胞成長を阻害することが認められたが表2、減少したpHはアンモニアの阻害作用を緩和しなかった。但し、pHを減少させるために必要なpC02の上昇は、それ自身何らかの成長阻害を生じさせているであろう。培養は、ほんの3日後に終了した。非揮発性酸のカタボライトの蓄積が原因となって、全培養物のpHをpHユニットで数ポイントまで減少させたので、これ以上継続することは妥当validではなかった。引き続く実験表3では、オーバーレイガスのCO2含有量contentを非阻害的濃度に保っている間、pHを培地のNaHC03含有量を調整することによって変化させた。試験されたpHの範囲は、pH7.0から7.5であった。フラスコ培養のpHが、培養の最初の2日間でさえ、調節することができず、実質的に低下することは強調されなければならない。指定されたpH値は、各培養物の最初のinitialpHである。比成長速度は、pH7.53g/lのNaHCO3で最大であったが、しかし、このpHで、成長速度および最大細胞濃度の両方が10mMアンモニアの存在によって半減し、一方でEPO合成の比速度は4倍減少していた表3。pH7.251.5g/lのNaHCO3で比成長速度は減少し、そしてEPO合成の比速度はpH7.5での培養物と比較して増加した。しかしながら、成長速度はあまり影響されなかった、そして、EPO合成の比速度は、10mMアンモニアの存在によって影響されなかった。調査された中で最も低いpH7.00.75g/lのNaHCO3では、比成長速度はさらに減少したが、ここでも比成長速度のアンモニアによる影響はpH7.5よりも小さかった。EPO合成の比速度specificrateは、添加されたアンモニアの存在条件下で増加したこれは成長速度の減少に起因しているかもしれない。実施例5.5リットルスケールの発酵槽培養でのR223株化細胞の生産性R223株化細胞のために、5リットルの3つの発酵が実行され、これらは6.95および7.15の間の異なるpH値に制御された表4を参照されたい。各培養物には、主に消費された栄養分を十分な濃度に維持するように設定された、アミノ酸およびグルコースを含む、濃縮された栄養性飼料が与えられた。培養は、pH7.15およびpH7.05においてはよく成長したが、しかし、pH6.95における培養は、おそらくそのpHを制御するのに必要とされる高濃度のCO2が原因で成長できなかった。実施例6.GSでのR233の形質移入、およびGS形質移入体の付着培養における生産性。形質移入に使用された細胞は、実施例2のR233株化細胞の浮遊適応した無血清ストックからのものであった。これらの細胞が大きい多細胞性の凝集体として成長した際に、それらを、それらを実質的に単一の細胞懸濁液に変えるためにトリプシン処理した。形質移入のために、実施例2で得られた約107の単一の浮遊適応したR223株化細胞のアリクォットカルシウムもしくはマグネシウムなしのリン酸緩衝生理食塩水中を、GS遺伝子を含む20μgの直線化DNABebbingtonetal.,1992,Biotechnology10,169-175に記載されたDNAシークエンスpCMGSbamH1と混合し、そしてバイオラッド社ジーンパルサーを用いてエレクトロポレーション450ボルト,250μFした。コントロールとして、等アリクォットequivalentaliquotの細胞を、DNAの付加なしでエレクトロポレーションにかけた。細胞をHM9培地MTXなし0または10のdFBS含有で希釈し、96ウェル培養プレートまたは25cm2フラスコに分配し、35.5~37°Cでインキュベートした。HM9培地は最初2mMグルタミンを含んでいたが、これを、1日後に0.5mMに希釈し、それから10日後にグルタミンを含まないHM9培地に取り替えた。1日目または10日目に、MTX500nMを培養に再導入した。DNAの付加なしでエレクトロポレーションにかけられたコントロール細胞の培養に関しては、いかなる成長も得られなかった。DNAと共にエレクトロポレーションされた細胞に関しては、6枚の96ウェルプレート中で15のGS形質移入体が同定された。GS形質移入体は、MTXを含むもの及び含まないもの両方の初期培地initialmediumにおいて取得された。15のGS形質移入体のうち、7つは首尾よくフラスコ培養に拡大された表5。残りの8つのGS形質移入体は、異常な細胞形態を示したか、または成長が不十分であったため、捨てられた。分離された最初の7つのGS形質移入体のそれぞれのために、10血清補充された無グルタミンHM9培地を用いて、一群の複製静置フラスコ培養asetofreplicatestaticflaskculturesを用意した。1~4日間のインターバルで、培養物を、細胞を数えたり、EPO-ELISAによるEPO濃度を測定するために犠牲にした。これらのデータを重ねあわせることにより、EPO合成の比速度を、各GS形質移入体に関して見積ることができた。データを表5に要約する、比較のために非形質移入のR223株化細胞に関するデータを含める。全てのGS形質移入体は、非形質移入のR223株化細胞と比べて、EPO合成の比速度の上昇を示した。最も良いGS形質移入体3E10は、非形質移入のR223株化細胞よりも5~6倍高い合成速度synthesisrateを有していた。実施例7.浮遊培養および無血清培地へのGS形質移入体の適応。実施例6で得られた7つのGS形質移入体のうち、GS形質移入体3E10およびGS形質移入体8G3を浮遊培養に進行させた。細胞を無グルタミンHM9培地10dFBSおよび500nMMTXを添加で静置フラスコ中で付着培養として、35.5~37°Cで成長させた。細胞を、5日もしくは6日後に攪拌により解離して、同じ培地中に再懸濁し、同じ温度で振とうフラスコ培養としてインキュベートした。成長が、ほんの2日または3日後に開始された。細胞を、一度同じ培地でサブカルチャーし、次に過成長させて生産性を評価した。力価および産物合成速度は、10dFBSおよび500nMMTXの条件下で成長させた非形質移入のR223株化細胞よりも、少なくとも2倍高かった表6。GS形質移入体3E10および8G3の双方の浮遊培養に関して、無グルタミンHM9培地のdFBS含有量は、3E10に関しては10から2、1、0.2、0.1、0へと、また8G3に関しては10から2、1へと段階的に減少させられ、確実な細胞成長が更なる減少の前に各々のdFBS濃度で達成可能である。8G3は、1dFBS未満への適応はされなかった。実施例8.無血清浮遊培養におけるGS形質移入体3E10の生産性および代謝。実施例7での無血清成長に適応させたGS形質移入体3E10を、無血清無グルタミンのHM9培地の浮遊培養で35.5~37°Cで培養した。GS形質移入体3E10株化細胞では、グルタミンを含むHM9培地で同じ条件下で培養された、形質移入されていないR223株化細胞よりも、2~3倍高いEPO合成の比速度が得られた表7。GS形質移入細胞のより高いEPO-生産性は、代謝性アンモニア放出の減少を伴うものであった。6mMグルタミンを含むHM9培地で非形質移入のR223株化細胞をフラスコ培養した際には典型的に5mMアンモニアが産生されたのに対し、GS形質移入体3E10は、無グルタミンのHM9培地の中で僅か1.8mMアンモニアを産生した表8。実施例9.製品品質ProductQualityの分析。GS形質移入体3E10のフラスコ培養で産生されたEPOを、免疫精製し、その糖化形態glycoformの分布に関して分析した。図4は、実施例8で記載した、ピーク細胞濃度で得られたEPOおよび無グルタミンHM9培地で成長した3E10細胞の培養物の収穫物の等電点電気泳動IEFゲル分析を示している。HM9培地で生育した非形質移入のR223株化細胞からの対応するComparableサンプルを含める。GS形質移入体3E10から産生されたEPOは、非形質移入のR223株化細胞non-transfectedR223celllineと比べて、より酸性のアイソフォームの増大を示した。IEFゲルのスキャニングにより、アイソフォーム分布の定量化および理論上のアイソフォーム相対活性IRA;isoformrelativeactivityの計算が可能であった。データは、GS形質移入体3E10における製品品質の顕著な向上を示し、非形質移入のR223株化細胞のコントロール培養よりも、ほとんど2倍高いIRAを有するものであった表9および10。また、理論的のN-グリカン電荷Zが、GS形質移入体3E10のEPOに関して決定された。Zは、表10において非形質移入のR223株化細胞に関しては決定されなかった。しかし、GS形質移入体3E10ピーク細胞濃度での273および収穫での265のZ値は、非形質移入のR223株化細胞のフラスコ培養182~228から得られた値を超えた。ZをHermentinetal.,Glycobiology,1996,6,217-230にしたがい決定した;Zは、特定のシアル化アイソフォームの各自のシェアに前記アイソフォームの対応する負電荷negativechargeを乗じることによって得られ、これはアシアロasialo/中性、モノシアロmonosialo、トリ-、テトラ-、またはペンタアシアロpentasialoであるかどうかに依存する。前記積項saidproducttermsの数学的な和が、Zである。Z数は、特定の治療における糖タンパク質のインビボでのクリアランス速度と相関するHermentin,上記。実施例10.6リットル発酵槽の無血清浮遊培養における、GS形質移入体3E10の生産性、代謝、および製品品質GS形質移入体3E10を、エアリフト発酵槽でバッチ培養で成長させた。培養培地は、無グルタミンHM9であった血清なし。各培養には、主に消費された栄養分を十分な濃度に維持するように設定された、アミノ酸およびグルコースを含む、濃縮された栄養性飼料が与えられた。結果を表11に示す、非形質移入の親R223の発酵に関するデータを比較のために含める。GS形質移入体は、生存度の増大extendedviabilityを示し、結果として培養期間の増加を示した。産物合成の比速度は、変化のない非形質移入の親株化細胞のそれと同等であったが、しかし、より拡大した培養寿命culturelongevityは最大産物濃度の増加をもたらした。アンモニア蓄積は、GS形質移入体に関して少なくとも4倍低かった。IRAによって測定された製品品質は、GS形質移入体に関して改善された。実施例11.イスコブベース培地Iscoves-basedmediumの無血清浮遊培養におけるGS形質移入体の生産性および代謝実施例7で無血清成長に適応したGS形質移入体3E10を、振盪フラスコで無血清無グルタミンのイスコブ培地のバージョンで培養した。親株化細胞R223を、グルタミンを添加した同等のequivalent培地で並行して成長させた。使用した培地は、イスコブの修飾ダルベッコ培地IscovesModifiedDulbeccosMediumに、イスコブのサプリメント0.4g/Lのウシ血清アルブミン、30mg/Lのヒトのホロ-トランスフェリン、10mg/Lの組換え型のヒトインシュリン、1g/LのルトロールLutrolF68、および60μL/Lのエタノールアミンを加えたものであった。培地は、株化細胞R223の培養に関しては4mMグルタミンを含んでいたが、GS形質移入された株化細胞に関してはグルタミンは排除され、4mMグルタミン酸ナトリウム4mMアスパラギンに置き換えられた。GS形質移入された株化細胞3E10の産物合成の比速度は、非形質移入の親株R223より約50高かった表12。形質移入された株化細胞3E10は、アンモニア産生の比速度が7倍低かった表13。産物をこれらの培養の各々から精製し、等電点電気泳動IEFゲルで分析した。この分析の結果は図5に示され、この図は染色後のIEFゲルを示している。pH2.5から6.5のIEFゲルを変性条件下で泳動し、クーマシーブルーで染色した。R223の産物に関して、ゲルの長さに渡って広がる少なくとも13の可視バンドが存在する。GS形質移入の株化細胞3E10が産生する産物に関して、より塩基性のバンドゲルの上部に分離したは、株化細胞R223からの産物に関して低い強度であり、一方、より酸性のバンドゲルの下部のは、株化細胞3E10に関して強度が増加している。またGS-形質移入体3E10を用いて作製された産物に、少なくとも1つの検出可能な余分の酸性バンドが存在するが、それは親株R223からの産物では検出可能ではない。これは、GS形質移入された株3E10によって産生された産物に対するシアル酸付加度の増加を示している。図5のゲルデータは、IEF-ゲル写真をデンシトメータでスキャンすることによって、さらに定量化された。各バンドによって表された産物の相対的な比率が定量化された。データを表14に要約する、ここで各々のバンドの相対的な比率は、ゲルの各レーン上のトータル産物のパーセンテージとして表される。より酸性のバンド8~14は、最大の生物活性を有しており、一方より酸性度の低いバンドは、活性が相対的に僅かであるか又は活性がない。ゲル図5およびデンシトメータによるスキャンクロマトグラムゲルレーン4に関して図6およびゲルレーン5に関して図7から、GS-形質移入された細胞株であるGSR223の産物が、より酸性のアイソフォームに集中していることが明瞭である。非形質移入の株化細胞R223に関しては、バンド8~14が全産物の44を示し、一方、GS-形質移入された株化細胞GSR223に関しては、この比が73まで増加する。図6および7では、図5のゲルバンドの番号付けにしたがいピークに識別番号identifyernumbersが割り当てられる。"