"ポリTETA/CBA-ポリエチレングリコールグラフト共重合体を含む組成物。前記ポリTETA/CBA-ポリエチレングリコールグラフト共重合体がスキーム2またはスキーム3に示す構造を有する請求項1に記載の組成物。核酸とポリTETA/CBA-ポリエチレングリコールグラフト共重合体とを含む複合体。前記核酸がプラスミドDNAを含む請求項3に記載の複合体。前記核酸がsiRNAを含む請求項3に記載の複合体。前記グラフト共重合体と混合物を形成しているポリTETA/CBAをさらに含む、請求項3に記載の複合体。aポリTETA/CBAとbポリTETA/CBA-ポリエチレングリコールグラフト共重合体との混合物を含む組成物。細胞に核酸とポリTETA/CBA-ポリエチレングリコールグラフト共重合体とを含む複合体を接触させることを含む、細胞へのトランスフェクションを行う方法。前記核酸がプラスミドDNAを含む請求項8に記載の方法。前記核酸がsiRNAを含む請求項8に記載の方法。前記グラフト共重合体と混合物を形成しているポリTETA/CBAをさらに含むことを特徴とする、請求項8に記載の方法。ATETAとCBAとを混合して第1の混合物を形成し、該第1の混合物を第1の選択時間反応させてポリTETA/CBAを得る工程、B次いで、前記第1の混合物にポリエチレングリコールを付加して第2の混合物を形成し、該第2の混合物を第2の選択時間反応させる工程、およびC得られたポリTETA/CBA-ポリエチレングリコールグラフト共重合体を精製する工程を含む、ポリTETA/CBA-ポリエチレングリコールグラフト共重合体を製造する方法。前記精製が限外濾過によるものである、請求項12に記載の方法。前記限外濾過の分画分子量が5kDaである、請求項13に記載の方法。前記限外濾過の分画分子量が10kDaである、請求項13に記載の方法。本発明による例示的な組成物は、ポリTETA/CBA-ポリエチレングリコールグラフト共重合体を含む。本発明の別の例示的な実施形態は、核酸とポリTETA/CBA-ポリエチレングリコールグラフト共重合体とを含む複合体を包含する。核酸は、例えばプラスミドDNAまたはsiRNAを含みうる。この複合体は、上記グラフト共重合体と混合物を形成しているポリTETA/CBAをさらに含んでもよい。本発明のさらに別の例示的な実施形態は、ポリTETA/CBAとポリTETA/CBA-ポリエチレングリコールグラフト共重合体との混合物を含む。本発明のさらに別の例示的な実施形態は、細胞へのトランスフェクションを行う方法を含み、該方法は、細胞に核酸とポリTETA/CBA-ポリエチレングリコールグラフト共重合体とを含む複合体を接触させることを含む。核酸は、例えばプラスミドDNAまたはsiRNAを含みうる。この複合体は、上記グラフト共重合体と混合物を形成しているポリTETA/CBAをさらに含んでもよい。本発明による還元性ポリアミドエチレンイミンの改良およびその方法の開示および記載に先立ち、本明細書において開示する個々の構成、工程および材料はいくらか変更されうるものであるから、本発明はこれらの構成、工程および材料に限定されないものであることを理解されたい。また当然のことながら、本発明の範囲は添付の請求項およびその等価物によってのみ限定されるものであるから、本明細書で用いる用語は、個々の実施形態を説明する目的のためだけに使用されているものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の背景を説明し、その実施に関するさらなる詳細情報を提供するために本明細書で引用した刊行物およびその他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。文脈上明らかに別段の解釈がなされる場合を除き、本明細書および添付の請求項で使用されるa、anおよび[theで示される単数形は複数の対象を包含することに留意されたい。別段の定めがない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野において通常の技能を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本発明の説明および請求の範囲の記載に際して、下記の用語は以下に述べる定義に従って用いられる。本明細書において、~を含む、~を包含する、~を含有する、~を特徴とするおよびそれらと文法的に等価な用語は、記載されていないその他の要素または工程を除外しない包括的な用語、すなわちオープンエンドな用語である。~を含むは、より限定的な用語である~からなるおよび~から本質的になるを包含するものと解釈される。本明細書において、~からなるおよびそれと文法的に等価な用語は、請求項に明記されていない要素、工程または成分を除外する用語である。本明細書において、~から本質的になるおよびそれと文法的に等価な用語は、明記された材料または工程、および請求項に係る発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない材料または工程に、請求項の範囲を限定する用語である。ポリカチオン性遺伝子キャリアの臨床的な進展は、その設計調合要件が明確でないことにより妨げられている。本研究において、ポリエチレングリコールPEGと分岐SS-PAEIとのグラフト共重合体の合成が可能であること、調合の際にこれとポリカチオン性SS-PAEIとを組み合わせてPEGの相対重量を変更できること、さらにそれによって遺伝子キャリア集団の生理化学的特性を変化させて、遺伝子キャリアの生物活性を向上させるための設計および調合の要件を容易に検討できることを示す。PEGおよび/または標的リガンドによる修飾がポリプレックス形成およびキャリア機能を阻害し得ることは知られているため、本研究では、この問題が解決可能であること、および機能的に実用可能な2つの生成物pTETA/CBAとpTETA/CBA-g-PEG2kの混合物を用いてPEG重量を変更することにより、均一なポリプレックスを調製できることを示す。本研究において、血清存在下におけるキャリア性能を向上させるために、効率的で無毒な生体還元性ポリカチオンとポリエチレングリコールとを組み合わせた新規遺伝子キャリアを開発した。また、遺伝子キャリアの理想的な機能に最適な生理化学的特性を得るためにPEG重量を変更したポリカチオン-PEG共重合体調合物を調製する実現可能で簡便な方法を提供する。これにより、invitroでの使用に好適な生理化学的特性を備えると同時に簡便なinvivo評価にも使用できる遺伝子キャリアを設計する上で、遺伝子送達用の共重合体を複数合成する必要性を回避できる。ビスアクリルアミド基にTETAが付加される非制御下のマイケル付加反応を行った後、pTETA/CBAの多分散性指数PDIを低下させるために、参考文献11で使用されたものより分画分子量の高い5kDaメンブレンを用いて限外濾過を行った。予想した通り、この方法はPDIを低下させるのに効果的であり、PDIの低下は分子量の相対的な増加と相関した。ポリエチレンイミンの分子量および分岐の増加は、導入遺伝子の発現および細胞毒性と相関することが報告されていたため、本研究においても、この想定される作用をpTETA/CBAを用いて調べたところ、初代培養内皮細胞および不死化内皮細胞株において、生物活性に対する有意な影響は見られなかった6、7。これらの結果は、この遺伝子キャリアには細胞内の酸化還元電位を利用する能力および比較的高い分子量のポリカチオン類が引き起こす細胞内機能の破綻を回避する能力があるということにより説明される21。pTETA/CBAは血清含有培地においてbPEI25kDaより有意に高い導入遺伝子発現を示したものの、このpTETA/CBAの送達能力は、血清非存在下における活性より顕著に低かった。そこで、pTETA/CBA/pDNAポリプレックスと血清タンパク質との相互作用を低減させて血清存在下におけるキャリア機能を向上させるために、pTETA/CBA5kを等モルのポリエチレングリコールで修飾した。得られた生成物を精製した後、1HNMRで確認した。また、AKTAFPLCで分析した結果、対応する相対分子量も等モル修飾から予想されるものと一致した。pTETA/CBA5kのポリエチレングリコールによる修飾は、ポリプレックスの表面電荷を低下させたが、同時に核酸との縮合に悪影響を与えた16、22。細胞特異的な遺伝子送達を目的とするポリエチレングリコールおよび/またはリガンドによる修飾は一般に核酸との縮合を抑制することから、最大のキャリア性能を得るための最適比率を決定する上で、共重合体型遺伝子キャリアを複数合成する必要がある。この問題を解決するために、スクリーニング用に複数のキャリアを合成する必要性を回避する試みとして、本研究において、ポリカチオンとそのPEG化体との混合物の調合によってPEG/ポリカチオンの重量重量比を最適化するという手法の実現可能性を調べた。本研究では、pTETA/CBA5k単独、pTETA/CBA5k-PEG2k単独、ならびに10/90重量および50/50重量のpTETA/CBA5k-PEG2k/pTETA/CBA5kをそれぞれ含むポリプレックスの血清安定性を評価した。pTETA/CBAおよび10/90のpTETA/CBA5k-PEG2k/pTETA/CBA5kからそれぞれ形成されるポリプレックスは、6時間にわたり最大70のpDNAを血清ヌクレアーゼによる分解から十分に保護する。pTETA/CBA5k-PEG2kの重量を50および100に引き上げると、相対的に血清中におけるpDNAの保護力が低下した。この保護力は、DLSおよびTEMを用いて調べられる、各調合物のpDNAと縮合してナノサイズのポリプレックスを形成する能力と相関する。上記調合物を用いて、細胞培養系におけるルシフェラーゼ遺伝子の導入発現および細胞生存率を調べて、各調合物の生物活性を評価した。ポリエチレングリコールには、pTETA/CBA単独の場合と比較して血清含有培地における遺伝子送達を増大させる能力があったが、この増大が認められたのは、ポリエチレングリコールを特定の比率で用いた場合に限られた。これらの結果は、ポリエチレングリコール/ポリカチオン比率を変化させて、キャリア機能を向上させるポリエチレングリコール比率を容易に検討し最適化することが可能であること、および遺伝子キャリアの最適化のために現在行われている、生理化学的特性のそれぞれ異なる生体還元性共重合体を複数合成するという方法を回避できることを示す証拠となる。実験およびプロトコール材料および方法材料トリエチレンテトラミンTETA、トリス2-カルボキシエチルホスフィンTCEP、N-エチルマレイミドNEM、超分岐ポリエチレンイミンbPEI、Mw25,000およびHPLC用メタノールは、シグマアルドリッチ社セントルイス、ミズーリ州より購入した。シスタミンビスアクリルアミドCBAはポリサイエンス社ウォリントン、ペンシルバニア州より購入した。限外濾過装置および再生セルロースメンブレン1kDa、5kDaおよび10kDaは、ミリポア社ビルエリカ、マサチューセッツ州より調達した。レポーター遺伝子発現プラスミドpCMVLucは、pCMVプロモーターで駆動するpCIプラスミドプロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州にルシフェラーゼcDNAを挿入することにより構築し、Maxiprepインビトロジェン社、カールスバード、カリフォルニア州のプロトコールを用いて精製した。ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、ペニシリンストレプトマイシン、トリプシン様酵素TrypLEExpressおよびダルベッコリン酸緩衝生理食塩水は、GibcoBRL社カールスバード、カリフォルニア州より購入した。EGM-2SingleQuotsを添加したEBM-2はロンザ社バーゼル、スイスより購入した。ウシ胎児血清FBSはハイクローンラボラトリーズ社ローガン、ユタ州より購入した。ポリマーの合成pTETA/CBApTETA/CBAの合成は、参考文献1に記載の方法に変更を加えて50°Cにて行った。重合反応液のpHを7.0に調整した後、これを2つに分けて、分画分子量1kDaおよび5kDaの再生セルロースメンブレンを用いた限外濾過によって精製し、凍結乾燥させたスキーム1。pTETA/CBA5k-g-2kメトキシPEG2kmPEG2kを無水トルエンを用いて乾燥させた後、氷冷した無水エーテル中で沈殿させた。白色の沈殿物を回収し、減圧下で乾燥させた。次いで、溶媒としてのDCMジクロロメタン中、クロロギ酸p-ニトロフェニルを用いてmPEG2kを活性化し、撹拌しながら氷上で一晩反応させた。活性化したPEG生成物を氷冷した無水エーテル中で沈澱させて回収し、減圧下で乾燥させた。NMR分析によりPEGの活性化度を調べた後、等モルのpTETA/CBA5kおよび活性化PEG2kを溶媒としての無水ピリジン/DMSOに別々に溶解し、得られたポリエチレングリコール-炭酸塩溶液をpTETA/CBA5kの溶液に滴下した。室温で撹拌しながら、反応をUV-VIZにより400nmでモニターした。反応は約16時間で完了した。サンプルを限外濾過分画分子量:5kDaにより精製した後、凍結乾燥させた。PEG5kおよびPEG10kを用いた修飾も同様に行ったが、精製はそれぞれ分画分子量が10kDaおよび20kDaの再生セルロースメンブレンを用いて行い、その後精製物を凍結乾燥に供した。ポリTETA/CBA-g-PEG共役共重合体の組成を1HNMRでモニターし、適切なピークの曲線下面積AUC値を積分して相対的なPEG修飾量を評価した。1HNMRスペクトルの測定は、VarianInova400MHZ核磁気共鳴分光装置バリアン社、パロアルト、カリフォルニア州で標準的なプロトンパラメーターを用いて実施した。化学シフトは約4.7ppmに現れる残存するH2Oの共鳴を基準とした。ポリマーの特性pTETA/CBA1k、pTETA/CBA5kおよびpTETA/CBA5k-PEG2kの相対分子量の分析は、AKTA/FPLCアマシャムファルマシアバイオテック社を用いて行った。pTETA/CBA1k2mg/mLの分析にはSuperdexPeptideカラムHR10/30を用いた。30v/vアセチルニトリル溶離剤を含む溶離緩衝液0.3MNaAc、pH4.4を0.2mmのフィルターナイロン、オルテック社でろ過し、使用前に脱気した。流速は0.4mL/分に設定した。検量線は、標準物質として2~10kDaのポリヒドロキシプロピルメタクリル酸ポリHMPAを用いて作成した。pTETA/CBA5kおよびpTETA/CBA5k-PEG2kの分析は、Superose610/300GLカラムを使用し、標準物質として40~150kDaのポリHMPAを使用した以外は上記と同じ条件で行った。ポリカチオンの分岐相対分岐度は、参考文献5に記載の通り、ジスルフィド結合をトリス2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩TCEPを用いて還元し、N-エチルマレイミドNEMを用いて保護することによって求めた。NEMで修飾したポリマーの繰り返し単位をMALDI-TOFで分析した。MALDI-TOF分析は、Voyager-DESTR生体分光分析用ワークステーションパーセプティブバイオシステムズ社を用いて、陽イオンモードおよび遅延抽出モードで行った。スペクトルの外部補正は、公称質量が325~2,465の標準ペプチド混合物を用いて行った。酸塩基滴定各ポリカチオンの緩衝能は、既に確立されている方法14を用いて測定した。簡潔に述べると、6mgのポリマーを30mLのNaCl溶液0.1Mに溶解し、まず0.1MNaOHで滴定してpH10とした。次いで、0.1MHClを加えてpHを降下させた。これらのポリマーの絶対分子量は既知でないため、滴定値は、ポリカチオン溶液のpHを7.4から5.1に降下させるのに必要なHClのmmol数として示される。比較対照としてbPEIk25kDaを用いた。光散乱法およびゼータ電位測定表面電荷およびポリマー/pDNA粒子ポリプレックスの直径は、Malvern4700systemのZetasizer2000装置DTS5001セルおよび動的光散乱DLSユニットをそれぞれ用いて25°Cで測定した。各ポリプレックスは、所望の濃度に調製した15mgのpDNAを含有するHEPES緩衝液200mLに、HEPES緩衝液20mM、pH7.4、5ブドウ糖中に漸増濃度のポリマーを含有する溶液200mLを同量加えることにより調製した。ポリプレックスの平衡化を30分間行った後、濾過したmilliQで希釈して、最終容量2mLとした。透過型電子顕微鏡法TEM各ポリプレックスをHEPES緩衝液20mM、pH7.4、5ブドウ糖を用いて0.05mg/mLに調製し、そのうち5mLをTEM用の銅製グリッドプレートに載せて乾燥させた。各グリッドを、濾過した脱イオン水で3回注意深くすすいで、残った緩衝塩を除去した。次いで、各サンプルを、濾過したリンタングステン酸PTAで1分間染色した後、濾過した脱イオン水で再度洗浄した。TechnaiT12scopeEFMを用いて80kVで粒子像を視覚化した。20,000~200,000倍の拡大倍率を使用し、顕微鏡写真の撮影を110,000倍で行った。90新鮮なウサギ血清中におけるポリプレックスの安定性血清中のポリプレックスの安定性は最適化されたプロトコールを用いて評価した。以下簡潔に述べる。ポリマー溶液とpDNA溶液を同量混合することにより、ポリマーとpDNAの重量比w/wが24であるポリマー/pDNAポリプレックスをHEPES緩衝液中に形成させ、これを30分間平衡化させた。一方、500ngのフリーのpDNAをHEPES緩衝液中に含有するものも準備した。次いで、形成させたポリプレックスを新鮮なウサギ血清で希釈して血清濃度が90になるように調製し、37°Cで数時間にわたってインキュベーションを行った。所定の各時点でインキュベーション液から25mL125ngpDNAずつ取り、それぞれに10mLの停止用緩衝液250mMNaCl、25mMEDTA、2SDSを加えた。これらのサンプルは分析に使用するまで-70°Cで凍結して保存した。一旦解凍したサンプルは、ポリカチオンとpDNAとを完全に分離するために60°Cで一晩インキュベーションを行った。次いで、50mMDTTを2mLずつ各サンプルに加え、複合体をすべて確実に解離させるために37°Cでさらに30分間インキュベーションを行った。最後に、エチジウムブロミドEtBrで染色した2アガロースゲルに各サンプルをロードし、TAE40mMトリス酢酸塩、1mMEDTA緩衝液を用いて、96Vで30分間電気泳動を行った。GelDocソフトウェアを用いてゲル画像を確認した。細胞培養マウス膵ランゲルハンス島内皮細胞SVRおよび大腸腺癌細胞CT-26ATCC、マナセ、ヴァージニア州は、37°C、5v/vCO2に設定した加湿インキュベーター内で、10FBSおよび1ペニシリンストレプトマイシンを含有するDMEMを用いて培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECインビトロジェン社は、37°C、5v/vCO2に設定した加湿インキュベーター内で、EGM-2SingleQuotsを添加したEBM-2培地を用いて培養した。invitro遺伝子導入発現細胞培養系におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現は、各ポリマーおよびpCMVLucプラスミドDNAを用いて行った。細胞は0.5mLの培地を含む24穴プレートに播種した。細胞数が70コンフルエントに達したところで、0.5mgのpDNAを用いてHEPES緩衝液中に重量比w/wが24のポリプレックスを調製した。ポリプレックスの平衡化を30分間行った後、細胞へのトランスフェクションを血清存在下で行った。具体的には、20mLのポリプレックス0.5mgpDNAを各ウェルに加えてインキュベーションを4時間行った後、培地を新しい血清含有培地と交換して、細胞をインキュベーター内に合計48時間静置した。次いで、細胞を1mLのPBSで洗浄し、細胞培養用溶解緩衝液プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州で処理した。ルシフェラーゼの定量は、ルシフェラーゼアッセイシステムプロメガ社とダイネックステクノロジーズ社シャンティリー、ヴァージニア州のルミノメーターとを用いて行った。細胞溶解液中のタンパク量は、ウシ血清アルブミンシグマ社、セントルイス、ミズーリ州の検量線およびBCAプロテインアッセイキットピアス社、ロックフォード、イリノイ州を用いて測定したn=4。細胞生存率アッセイ細胞を24穴プレートに播種し、細胞数が約70コンフルエントに達したところでトランスフェクションを行った。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの場合と同様に、ポリプレックスを調製した。平衡化ポリプレックス0.5mgpDNAを含むHEPES緩衝液20mLを各ウェルに加えて、各細胞培養物に血清存在下でトランスフェクションを行った。細胞を合計18時間インキュベートした後、MTTアッセイシグマ社を用いて細胞生存率を調べた。細胞生存率は、未処理の細胞を基準として求めたn=4。結果1.pTETA/CBA5kの2段階合成および性状分析合成および性状分析pTETA/CBApTETA/CBAは非常に効果的な遺伝子キャリアであることが確認されており、また、有意な細胞毒性を示さない超分岐構造を作製する上で、様々な分岐構造へと派生させることができる。スキーム1に示すようにサンプルを合成、精製した後、試験に用いた。重合は、マイケル付加反応によって、TETAモノマーのアミン基にCBAモノマーが付加されることにより起こる。TETAモノマーには4つの反応性アミン基が存在するので、高度に分岐した生成物をゲル化前に得ることができる。重合反応は100MeOH中、様々な温度で実施し、それぞれ1HNMRでモニターした。合成温度はサンプルの分岐度と相関することが示されたデータ示さず。分画分子量が1kDa、5kDaまたは10kDaの限外濾過膜を用いてサンプルからオリゴマーポリカチオンを排除した結果、予想した通り、サンプルの多分散性指数PDIが低下した。このPDIは、FPLCでモニターしたサンプルの相対分子量とも相関する。市販のbPEI25kも比較用の外部対照として分析した。GPC分析では、bPEI25KのMnおよびMwの値が過小評価されるので、ポリTET/CBAの分子量を推定するためには外挿法を用いる必要がある。さらに、pTETA/CBA5kは、従来の精製方法に従って得られたサンプルと同等の緩衝能を有する表1。a:FPLCで測定した数平均分子量Mn、重量平均分子量Mw、多分散性Mw/Mn。b:0.1MNaCl水溶液におけるpHを7.4から5.1にシフトさせるのに必要なHClのmol数により求められるポリマー画分の緩衝能滴定値。c:分岐度はMALDI-TOFにより測定した。pTETA/CBA5k-PEG2kPEG化は血清存在下のポリカチオン性キャリアの機能をinvitroでもinvivoでも向上させることが可能であるが、これは主としてポリプレックスの表面電荷に起因する。しかし、ほぼ中性の電荷を持つ粒子はイオン性の反発力が小さいため、溶液中で凝集しやすい。そこで、必要に応じてpTETA/CBA5kと混合することによりpTETA/CBAポリカチオンに対するPEGの重量百分率重量を容易に調整することができ、無毒な分岐ポリカチオンの粒子の特性および機能性に対する影響を検討することができるpTETA/CBA5k-PEG化体を、1つのモデルシステムとして合成したスキーム2。ポリカチオンへのPEG修飾は、UV-VIZ分光光度計により検量線を用いて400nmでモニターした。反応は16時間で完了した。先に記載した通り、mPEG5kおよびmPEG10kによる修飾も行ったが、これらのグラフト共重合体はナノサイズの粒子を形成することも、導入遺伝子を発現させることもできなかったデータ示さず。NMR分析およびピークのAUC値の比較から、PEG:TETA/CBA5kのモル比は約0.96/1であることが示された。これはAKTAFPLCによる分析表1とよく一致している。pTETA/CBAのPDIおよび分子量が生物活性に与える影響上述した通り、低分子量LMWのPEIはN/P比が低い場合にpDNAとの縮合が制限され、該縮合はPEG修飾によってもしばしば阻害されることから、不安定化要因であるオリゴマーを排除することによって、キャリア性能を妨げることなく平均分子量を増大させ、pTETA/CBAのPDIを低下させることが好ましい17。図1A~Dから分かるように、pTETA/CBAのPDIが低下して相関的に分子量が増大しても、キャリア性能に対する悪影響は生じず、pTETA/CBA1kに対して実施した従来の合成精製方法を用いた場合と同等であった。より具体的には、pTETA/CBA5kは、現行の標準であるbPEI25kDaより、HUVEC初代培養細胞において毒性が有意に低く、HUVECおよびSVRのいずれの内皮細胞においても導入したルシフェラーゼ遺伝子の発現が高かった。また、この結果は、心筋芽細胞H9C2を用いてpTETA/CBA10kと比較した場合の結果図2A~Bとも一致した。bPEI25kDaの毒性は、高分子量ポリカチオン類の細胞内蓄積によるものであると考えられている3。これらのポリカチオン類は、細胞膜と相互作用してその機能を破綻させる可能性があり、かつ/または細胞内のタンパク質および核酸と相互作用して細胞内輸送および遺伝子の転写翻訳などの細胞内プロセスおよび核内プロセスを阻害する可能性がある18、19。非分解性のbPEI25kDaと比較すると、生体還元性ポリカチオンであるpTETA/CBAはこれらの細胞内相互作用が弱く、その結果その相対分子量に関係なく初代培養内皮細胞において低毒性を示すと考えられる20。pTETA/CBA画分で観察された導入遺伝子の高発現も、この現象と核酸の細胞内放出とを結びつけることにより説明できるだろう6、9。pTETA/CBAに対する血清の影響血清含有培地、およびinvivoで投与された場合にポリプレックスが遭遇する血清は、粒子の不安定化および治療用遺伝子のヌクレアーゼ分解またはinvivoの細網内皮系による貪食により、ポリカチオンの性能をしばしば低下させる。ここに示すデータは、過去の所見と一致している。具体的には、血清含有培地中の大腸腺癌細胞CT-26におけるpTETA/CBAの性能は、bPEI25kDaより有意に優れているが、血清を含まない培地中でトランスフェクションを行った場合と比較すると低い図3。そのため、スキーム2に示すような核酸送達用のpTETA/CBA5k-g-PEG共重合体を開発する必要がある。ポリプレックスの性状分析pTETA/CBA5kおよびpTETA/CBA5k-g-PEG2kそれぞれの核酸と縮合してポリプレックスを形成する能力を、粒径分析およびゼータ電位測定により調べた。確かに、いずれの遺伝子キャリア候補でも200nm未満かそれに近い直径を持つナノサイズの粒子が形成されたが、好ましい低ポリマー濃度では、予想した通り、PEG修飾によりポリプレックスの形成が阻害された図4A。また、pCMVLucとの縮合に十分なポリマー濃度では、PEG修飾によりポリプレックスの表面電荷が低下し、ポリプレックスは安定した状態にはなかったと考えられる図4B。ポリプレックスの特性に対するPEG重量の影響PEG化ポリエチレンイミンキャリアを使用して得られた過去の所見と、pTETA/CBAポリカチオンのPEG化が核酸との縮合を阻害することを示した今回の所見図4A~Bは一致する。この問題を解決し、ポリマー溶液とPEG共重合体溶液との混合により検討用にPEG/ポリカチオンの重量を調整することが可能か否かを確認することを目的として、かつ表面電荷が低く均一で安定したポリプレックスを維持する最適な調合物を同定することを目的として、pTETA/CBA5k-g-PEG2k、pTETA/CBA5k、ならびにこれら2つの分子種からなる10/90重量および50/50/重量混合物をそれぞれ用いて、ポリカチオン/pDNAの総重量比が24となるポリプレックスを調製したスキーム2。血清安定性血清存在下のポリプレックスの安定性に対するPEG重量の影響を調べるために、形成後30分間平衡化したポリプレックスを新鮮なウサギ血清に加えて、最終血清濃度が90となるように37°Cで調製した。採取したサンプルをアガロースゲルを用いた電気泳動に供し、所定の各時点における未分解のpCMVLuc量を、未処理である対照の0時間を基準として視覚化した。図5A~Bより、pTETA/CBA5kおよび10PEGは、6時間の時点で80以上のpDNAをヌクレアーゼ分解から保護していることが分かる。PEG重量を50および100に引き上げると、粒子の安定性の低下およびpDNA保護力の減弱が起こり、pDNA保護力に関しては、インキュベーション開始から6時間の時点でそれぞれ60および40のpDNAしか保護されない。ポリプレックスの分析調合の簡便性およびキャリア機能の向上のためには、様々なPEG重量で構成される安定したポリプレックスがそれぞれ均一の形態を持ち、ポリプレックスのサイズおよび表面電荷はそれぞれ単峰型の分布を示すことが必須である。各調合物のポリプレックスのサイズをTEMにより視覚化した図6A~D。各ポリプレックスのサイズおよび分布を、動的光散乱法DLSにより得られた各ポリプレックスの測定値と比較して分析したところ、互いに一致しており、過去の所見とも一致した図6F。図6A~Dはポリプレックスの形態変化を示しており、PEG重量の増加につれてポリプレックスがコンパクトでなくなり、半透明の外殻を伴うことが分かる。この半透明の外殻は、PEG重量の増加によるものと考えられる。図6Dに示すように、pTETA/CBA5k-g-PEG2kでは凝集が起こった。この凝集はDLSによる分析でも認められ、データに悪影響を及ぼした。したがって、この調合物は分析から除外し、図6Eには示していない。pTETA/CBA5k、10PEGおよび50PEGをそれぞれ用いた調合物は、溶液中で150nm未満のポリプレックスを生成する。また、PEG重量は予想通り、ポリプレックスの表面電荷と逆相関する図6E。キャリア機能および生物活性に対するPEG調合物の影響遺伝子送達用PEG共重合体調合物の血清存在下における潜在的な利点を調べるために、大腸腺癌細胞CT-26を用いてルシフェラーゼ遺伝子導入アッセイを行った。10PEGを用いて調合したポリプレックスおよび50PEGを用いて調合したポリプレックスでは、pTETA/CBAポリカチオン単独よりも、血清存在下において導入遺伝子の発現が高かった図7A。さらに、これらのポリプレックスはCT-26細胞に対して毒性を示さない図7B。2.pTETA/CBA-g-PEG2kの1段階合成従来のPEG化合成は、ポリマー生成物を得るのに2回の合成濾過工程が必要であるため、時間のかかる工程を要すると言えるスキーム1および2を参照のこと。そこで、最終生成物を得るまでの時間を半減させる1段階の合成濾過方法をpTETA/CBA-g-PEG2k用に開発したスキーム3。この方法で得られたポリマーは、先の記載よりも高分子量分画分子量:10kDaで精製した場合、低分子量の精製物より優れた縮合保護プロファイルを持つことから静脈内投与時の毒性プロファイルに優れており、よってより広い治療濃度域を有する。合成および性状分析pTETA/CBAは非常に効果的な遺伝子キャリアであることが既に確認されており、また、有意な細胞毒性を示さない超分岐構造を作製する上で、様々な分岐構造へと派生させることができる。スキーム3に示すようにpTETA/CBA-g-PEG2kサンプルを合成、精製した後、試験に用いた。重合は、マイケル付加反応によって、TETAモノマーのアミン基にCBAモノマーが付加されることにより起こる。上述したように、TETAモノマーには4つの反応性アミン基が存在するので、高度に分岐した生成物をゲル化前に得ることができる。このポリマーは、マイケル付加反応によって、第1級アミン基および第2級アミン基を含む機能性アミンがCBAのアクリルアミド官能基へ付加されるモル比1:1ことにより合成される。この重合反応は、遮光フラスコlightsensitiveflask内で、溶媒としてMeOHを用い、窒素雰囲気下、30°Cで10時間行う。簡潔に述べると、撹拌棒を備えた褐色の反応器にTETAおよびCBA1Mを入れ、反応器を密閉して30°Cに設定したオイルバス中に静置し、10時間継続して重合反応を行う。その後、pH7の水溶液中で8時間かけてNHSおよびEDCを用いて活性化したmPEG2kを10重量、反応液に滴下する。次いで、さらに2時間反応させ、100を超えるTETAを加えて反応を停止する。次いで、遊離のアクリルアミド基をすべて確実にクエンチするために、さらに24時間そのまま反応させる。得られたポリマー生成物は、まず脱イオン化した超純水で反応液を希釈した後pH7に調整し、これを限外濾過分画分子量:5,000または10,000することにより単離する。4Barrで一晩、精製を行った後、濃縮および凍結乾燥を行う。1HNMR分析の結果から、5kDaで濾過したポリマーのPEG2k/pTETA/CBA比は9であり、10kDaで濾過したポリマーのPEG2k/pTETA/CBA比は3~4、すなわちCBA146~171分子あたりPEGユニットが1つ存在することが分かった。MALDI-TOF分析から、ポリマーの91が分岐しており、10kDaで濾過したポリマーの84.3が分岐していることが分かった。PEGはすべて、ポリマーのOアームと結合しているものと考えられる。AKTAFPLC分析から、5kDaで濾過したpTETA/CBA-g-PEG2kの平均分子量は10.89kDaであるが、その分布は広く、3~30kDaであることが分かった。このpTETA/CBA-g-PEG2kのサイズ特性は、2段階合成法によって得られる類似体と同様であるが、10kDaで濾過した生成物は該類似体よりはるかに低い重量比でより小さい複合体を形成する図8および図4A。pTETA/CBA-g-PEG2kの調合物はすべて、siRNAキャリアとして優れたトランスフェクション特性を示した。このポリマーは、様々なパーセンテージのPEG調合物および様々な重量比で使用できる図9A~F。このポリマーをpTETA/CBA5kと混合して、ルシフェラーゼを標的とするsiRNA濃度:40nMと複合体を形成させた。図9Fは、PC-3細胞における上記ポリマーの作用を示す。100pTETA/CBA-g-PEG2k調合物が3分の1少ない量ではあるものの、ルシフェラーゼを阻害することができたことは注目すべき点である。PEG化ポリマー調合物の血清安定性を90新鮮なラット血清中で測定し、2時間毎に試験開始後6時間まで調査した。siRNA分解を最も阻害したのはpTETA/CBA-g-PEG2kとpTETA/CBAとの50混合物であったが、6時間後の阻害率では10の減少が見られた図10。他の比率では、6時間後の阻害率は40以上の減少が見られた。分画分子量5kDa以下で濾過したポリマーは、PEG化に関係なく、用量160μgで毒性を示すことが分かった。PEG化がPEIとの複合体における表面電荷を低下させて補体活性化を抑制することはこれまで報告されているが、今回に限って言えばそのような結果は確認されていない。この毒性は1段階合成でも2段階合成でも確認される。このポリマーで形成可能なナノ複合体重量比6:1はsiRNAまたはDNAの量に換算すると27μg以下であるで送達できる最大用量は1.5mg/kg未満である。この用量はinvivoでの使用としてはかなり低い。そこで、2つのポリマーpTETA/CBAおよびpTETA/CBA-g-PEG2kを、Centricon遠心濃縮機を用いて、分画分子量10,000で濾過した。高分子量画分および低分子量画分濃縮機の上部に回収された上清高分子量画分および下部に回収された上清低分子量画分をそれぞれ回収し、性状分析に用いた。低分子量画分は、重量比10:1未満で混合した場合では十分に複合体を形成せず、重量比を24:1とかなり高くしても粒径は大きかった1,200nm。様々な重量比で構成されるpTETA/CBA-g-PEG2k/pTETA/CBA調合物を、全量40ngのプラスミドDNAと複合体を形成させて、体内分布研究に用いた。25、50、75および100重量のpTETA/CBA-g-PEG2kを含む調合物で構成されるナノ複合体をそれぞれ20ブドウ糖を含む10mMHEPES200μL中に形成させ、これをCT-26担癌Balb/cマウスの尾静脈に静脈内注射した。48時間後にマウスを屠殺して臓器および腫瘍を摘出し、プラスミドDNAを、該プラスミドのF1ori領域をターゲットにしたTaqmanプライマーを用いてqPCRにより分析した。体内分布パターンの結果から、100pTETA/CBA-g-PEG2kを用いてポリマー:pDNA比3:1で構成した場合に、腫瘍に対する遺伝子送達が最大となることが示された図11A。しかし、それより高レベルのプラスミドDNAが複数の他の組織で認められた。この体内分布傾向は、他のパーセンテージのpTETA/CBA-g-PEG2kを含むポリマー調合物を用いたポリマー/pDNAの重量比が同じ複合体でも見られたが、プラスミドDNA量は低値であった。重量比が0.5/1のポリマー/pDNA複合体は異なる体内分布パターンを示した図11B。この重量比では、腫瘍において他の組織よりも高レベルのプラスミドDNAが認められ、75pTETA/CBA-g-PEG2k調合物では最も差が見られた。いずれの比率のポリマー/pDNA複合体でも、調合物中のpTETA/CBA-g-PEG2kのパーセンテージに関係なく体内分布パターンは同じであったため、それぞれ1つの調合物を選択してグループの代表とした図11C。ナノ複合体の最大用量は、沈澱生成、物理的力流体力学作用および用量制限毒性によって制限される。したがって現時点では、20ブドウ糖を含む10mMHEPES275μL容量において、ポリマー/siRNA重量比が3:1の場合、投与可能な最大用量はsiRNAとして55μgであると考えられる。75重量pTETA/CBA-g-PEG2k調合物を用いて、ポリマーとマウスHIF-1aを標的とするsiRNAとの比が0.5/1および3/1となるように調製されたナノ複合体を、尾静脈または局所的に腫瘍部位にCT-26担癌Balb/cマウスに静脈内注射した。その後、マウスを屠殺して、各個体から臓器および腫瘍を回収した。SV96TotalRNA精製キットを用いて全RNAを単離し、RT-qPCRにより、20ブドウ糖を含む10mMHEPESを静脈内注射または局所注射した対照マウスとmRNA値を比較した。RT-qPCRでCt値を予備比較したところ、マウスの腫瘍部位におけるmHIF-1a値は静脈内注射で63、局所注射で70減少することが示された図12。本発明によるpTETA/CBA-g-PEG2kの合成は、生体還元性分子とポリアミドアミンPAAまたはポリアミドエチレンイミンPAEIとを用いる従来の方法を改良したものである。いずれの方法も特徴は類似しているが、本発明の方法は、合成速度が従来法より50速く、2段階合成法とは異なる生成物が得られる。限外濾過により10kDaで精製したpTETA/CBA-g-PEG2kは、5kDaで濾過したものより優れた生理化学的特性を有する。この10kDaポリマーは、EPR効果enhancedpermeationandretentioneffect:透過性および滞留性の亢進効果がもたらすと考えられる受動的deselectiveターゲッティングにより、より優れたinvivo毒性プロファイルを有し、腫瘍部位において良好なトランスフェクション効率を維持する。これより低分子量のポリマーでは、複合体形成および用量制限毒性の問題から、50より高い阻害率を示すのに必要な量を送達することができない。様々なパーセンテージのPEG調合物および様々な重量比の中でも、75pTETA/CBA-g-PEG2kを重量比0.5:1で使用したもの、および100pTETA/CBA-g-PEG2kを重量比3:1で使用したものは、腫瘍内のタンパク質を阻害するsiRNAを静脈経由でinvivo送達する上で、最も優れた候補であると考えられる。これより高い重量比についても検討を行ったが、用量制限毒性により毒性が現れた。様々なパーセンテージの調合物を用いて高い重量比で構成した場合のinvitroでの使用の可能性は残されており除外すべきでない。pTETA/CBA-g-PEGとpTETA/CBAとの混合物により相乗効果が得られる。参考文献SaitoGSwansonJAandLeeKDDrugdeliverystrategyutilizingconjugationviareversibledisulfidelinkagesroleandsiteofcellularreducingactivitiesAdvDrugDeliveryRev55199215ChristianoRJandRothJAMolecularconjugatesatargetedgenedeliveryvectorformolecularmedicineJMolMed73479MerdanTKopecekJandKisselTProspectsforcationicpolymersingeneandoligonucleotidetherapyagainstcancerAdvDrugDeliveryRev54715758LeeMandKimSWPolyethyleneglycolconjugatedcopolymersforplasmidDNAdeliveryPharmNews9597BoussifOLezoualchFZantaMAMergnyMDSchermanDDemeneixBandBehrJAversatilevectorforgeneandoligonucleotidetransferintocellsincultureandinvivopolyethylenimineProcNatlAcadSci9272977301BanerjeePReichardtWWeisslederRBogdanovANovelHyperbranchedDendronforGeneTransferinVitroandinVivoBioconjugateChem15960968FischerDBieberTLiYElsasserHPandKisselTAnovelnonviralvectorforDNAdeliverybasedonlowmolecularweightbranchedpolyethylenimineeffectofmolecularweightontransfectionefficiencyandcytotoxicityPharmRes161273‐1279LutenJetalBiodegradablepolymersasnonviralcarriersforplasmidDNAdeliveryJournalofControlledRelease12697‐110LinCZhongZLokMCJiangXHenninkWEFeijenJandEngbersenJFJNovelbioreduciblepolysforhighlyefficientgenedeliveryBioconjugateChem18138145AndersonDGLynnDMandLangerRSemiautomatedsynthesisandscreeningofalargelibraryofdegradablecationicpolymersforgenedeliveryAngewChemIntEdEngl423153‐8ChristensenLVChangCWKimWJKimSWZhongZLinCEngbersenJFFeijenJReduciblepolydesignedfortriggeredintracellulargenedeliveryBioconjugateChem17123340MartelloaFEngbersenJFJFerrutiaPAbstractsJournalofControlledRelease132e1‐e18PlankCMechtlerKSzokaJrFCWagnerEActivationofthecomplementsystembysyntheticDNAcomplexespotentialbarrierforintravenousgenedeliveryHumGeneTher7143746WagnerEPlankCZatloukalKCottenMandBirnstielMLInfluenzavirushemagglutininHA2NterminalfusogenicpeptidesaugmentgenetransferbytransferrinpolylysineDNAcomplexestowardasyntheticviruslikegenetransfervehicleProcNatlAcadSciUSA897934‐7938VerbaanFJOussorenCVanDamIMTakakuraYHashidaMDCrommelinJAHenninkWEStormGThefateofpolymethacrylatebasedpolyplexesafterintravenousadministrationIntJPharm21499‐101SuhWHanSYuLandKimSWAnAngiogenicEndothelialCellTargetedPolymericGeneCarrierMolecularTherapy6664672MerkelOMetalIntegrinavb3TargetedGeneDeliveryUsingRGDPeptidomimeticConjugateswithCopolymersofPEGylatedPolyBioconjugateChemistry2012701280BurckhardtBCThelenPEffectofprimarysecondaryandtertiaryaminesonmembranepotentialandintracellularpHinXenopuslaevisoocytesPflugersArch42930612WangHetalBindingofSodiumDodecylSulfatewithLinearandBranchedPolyethyleneiminesinAqueousSolutionatDifferentpHValuesLangmuir2215261533GodbeyWTWuKKMikosAGPolymediatedgenedeliveryaffectsendothelialcellfunctionandviabilityBiomaterials200122471480LinCZhongZLokMCJiangXHenninkWEFeijenJEngbersenJLinearpolyswithsecondaryandtertiaryaminogroupsandvariableamountsofdisulfidelinkagesSynthesisandinvitrogenetransferpropertiesJournalofControlledRelease116130‐137KunathKMerdanTHegenerOHaberleinHKisselTIntegrintargetingusingRGDPEIconjugatesforinvitrogenetransferTheJournalofGeneMedicineVolume5Issue7Pages588599"