"機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を調整する作用剤のスクリーニング方法であって、配列番号2、4、18、または20の少なくとも一つに対して少なくとも70のアミノ酸配列同一性を有する機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを作用剤と接触させること;および機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性を調整する作用剤を選択することを含む方法。ポリペプチドが細胞において発現し、接触が、細胞を作用剤と接触させることを含む、請求項1に記載の方法。ポリペプチドが細胞にとって異種である、請求項2に記載の方法。細胞が、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現カセットを含む、請求項3に記載の方法。ポリペプチドが細胞にとって内在性である、請求項2に記載の方法。機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性が、ポリペプチドによって媒介される電気生理学的変化を測定することによって決定される、請求項1に記載の方法。電気生理学的変化が、膜電位の変化、電流の変化、または陽イオンの内向き流束である、請求項6に記載の方法。膜電位色素アッセイで膜電位を測定することを含む、請求項6に記載の方法。パッチクランプアッセイで電気生理学的変化を測定することを含む、請求項6に記載の方法。測定が、機械刺激によって活性化される電気生理学的変化を測定することを含む、請求項6に記載の方法。機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性を調整すると同定された作用剤を、機械刺激によって活性化される電気生理学的変化を調整する能力について試験することを、さらに含む、請求項6に記載の方法。選択された作用剤が、ポリペプチドによって媒介される電気生理学的変化を低減または阻害する、請求項6に記載の方法。選択された作用剤が、ポリペプチドによって媒介される電気生理学的変化を増加させる、請求項6に記載の方法。細胞が真核細胞である、請求項2に記載の方法。細胞がニューロンである、請求項2に記載の方法。細胞が動物中にある、請求項2に記載の方法。動物がマウスである、請求項16に記載の方法。作用剤を動物に投与すること、および痛覚感受性に対する作用剤の効果を決定することを、さらに含む、請求項16に記載の方法。ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20を含む、請求項1に記載の方法。ポリヌクレオチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号17、または配列番号19を含む、請求項4に記載の方法。機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を拮抗する抗体。配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20に対して少なくとも70のアミノ酸配列同一性を有する機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドに、選択的に結合する、請求項21に記載の抗体。ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20を含む、請求項22に記載の抗体。モノクローナル抗体である、請求項22に記載の抗体。ヒト化抗体である、請求項22に記載の抗体。キメラ抗体である、請求項22に記載の抗体。対象における疼痛を改善する方法であって、請求項21~26のいずれか一項に記載の抗体を対象に投与することを含む方法。ポリペプチドが配列番号4または配列番号20を含む、請求項27に記載の方法。ポリペプチドが、膀胱、結腸、腎臓、肺、または皮膚において発現する、請求項27に記載の方法。ポリペプチドが後根神経節ニューロンにおいて発現する、請求項27に記載の方法。対象が哺乳動物である、請求項27に記載の方法。対象がヒトである、請求項27に記載の方法。疼痛が、急性の機械的疼痛、慢性の機械的疼痛、機械的痛覚過敏、機械的異痛、関節炎、炎症、歯痛、がん性痛、および陣痛からなる群より選択される、請求項27に記載の方法。配列番号1、3、17、または19に対して少なくとも70同一であり、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの少なくとも15連続ヌクレオチドに相補的であって、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの生産を阻害する、単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNAsiRNA。配列番号1、3、17、または19の少なくとも15連続ヌクレオチドに相補的である、請求項34に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNA。配列番号5~16のいずれか一つを含む、請求項34に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNA。請求項34に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット。請求項37に記載の発現カセットを含むベクター。請求項38に記載の発現カセットまたは発現ベクターを含む細胞であって、発現カセットまたは発現ベクターが細胞にとって異種である細胞。対象における疼痛を改善する方法であって、請求項34~36のいずれか一項に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを対象に投与することを含む方法。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAが、膀胱、結腸、腎臓、肺、または皮膚における機械刺激活性化陽イオンチャネルの生産を阻害する、請求項40に記載の方法。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAが、後根神経節ニューロンにおける機械刺激活性化陽イオンチャネルの生産を阻害する、請求項40に記載の方法。対象が哺乳動物である、請求項40に記載の方法。対象がヒトである、請求項40に記載の方法。疼痛が、急性の機械的疼痛、慢性の機械的疼痛、機械的痛覚過敏、機械的異痛、関節炎、炎症、歯痛、がん性痛、および陣痛からなる群より選択される、請求項40に記載の方法。以下の実施例は、本願に係る発明を例示するために記載するのであって、本願に係る発明を限定しようとするものではない。[実施例1]材料と方法この実施例では、以下の実施例で使用した材料と方法の詳細を説明する。記載する方法においてさまざまな変更または置き換えを使用できることは、当業者には、すぐに理解されるであろう。細胞培養および一過性トランスフェクション.Neuro2A細胞は、45mgml1グルコース、10ウシ胎児血清、50単位ml1ペニシリンおよび50μgml1ストレプトマイシンを含有するイーグル最小必須培地中で成長させた。C2C12またはヒト胎児腎臓293THEK293T細胞は、45mgml1グルコース、10ウシ胎児血清、50単位ml1ペニシリンおよび50μgml1ストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地中で成長させた。細胞を、35mmディッシュ上、または24ウェルプレートに入れた12mm円形カバーガラス上にプレーティングし、リポフェクトアミン2000Invitrogenを製造者の指示に従って使用することにより、トランスフェクトした。Piezo1過剰発現実験の場合は、500~1000ngml1のPiezo1IRESGFPまたはベクターのみをトランスフェクトし、細胞を12~48時間後に記録した。Piezo2過剰発現実験の場合は、600~1000ngml1のmPiezo2またはベクターを、トランスフェクト細胞を同定するための300ngml1GFPと同時トランスフェクトし、細胞を12~48時間後に記録した。siRNA実験の場合は、20nM全siRNAと、トランスフェクト細胞を同定するための300または500ngml1GFPとを同時トランスフェクトし、トランスフェクションの3日後に細胞を使用した。mPiezo1に対するSmartpoolIのsiRNAをQiagenから購入しターゲット配列:CACCGGCATCTACGTCAAATAsiRNA1配列番号5、ACCAAGAAATACAACCATCTAsiRNA2配列番号6、TCGGCGCTTGCTAGAACTTCAsiRNA3配列番号7、およびCGGAATCCTGCTGCTGCTATAsiRNA4配列番号8、SmartpoolI中で一つにして各5nMで使用するか、個別に20nMで使用した。siRNA4は20nMでは、細胞剥離を引き起こし、続いて、トランスフェクションの3日後には細胞死を引き起こしたので、毒性だった。SmartpoolIIsiRNAは、Dharmaconから購入した4つの異なるsiRNAターゲット配列:GAAAGAGATGTCACCGCTA配列番号9、GCATCAACTTCCATCGCCA配列番号10、AAAGACAGATGAAGCGCAT配列番号11、GGCAGGATGCAGTGAGCGA配列番号12のプールであった。N2A細胞におけるPiezo2siRNA実験の場合、600ngml1のmPiezo2と300ngml1GFPとを、20nMPiezo1siRNA1のみと、または20nMPiezo2siRNAも一緒に、同時トランスフェクトした。トランスフェクションの3日後に細胞を記録した。mPiezo2に対するsiRNAは、Dharmaconから購入した4つの異なるsiRNAターゲット配列:GAATGTAATTGGACAGCGA配列番号13、TCATGAAGGTGCTGGGTAA配列番号14、GATTATCCATGGAGATTTA配列番号15、GAAGAAAGGCATGAGGTAA配列番号16のプールであった。DRG培養およびsiRNA.マウス後根神経節ニューロン雄C57Bl6マウス由来の調製および培養は、以前記述されたようにMChalfieNatRevMolCellBiol1044、ただし次に挙げる変更を加えて行った:成長培地に、100ngml神経成長因子NGF、50ngmlGDNF、50ngmlBDNF、50ngmlNT3、50ngmlNT4を補足した。低分子干渉RNAsiRNAによるノックダウンは、SCNヌクレオフェクターキットをヌクレオフェクターデバイスと共に製造者の指示SCNBasicNeuroprogram6;LonzaAGに従って使用して、新鮮単離DRGニューロンへのsiRNAのヌクレオフェクションによって達成した。被験siRNAごとに1匹のマウスから単離されたDRGニューロンを使用した。siRNAは、TRPA1の場合は150nM~250nMsmartpool、Qiagenで、またPiezo2の場合は250nMsmartpool、Qiagenで使用し、スクランブル対照Qiagenの濃度を相応に調節した。ヌクレオフェクション後に、ニューロンをRPMI培地中、37°Cで10分間回復させ、成長培地抗生物質を含まず、AraCを含まないものを加え、前もってラミニン2μgml1をコートしておいたポリDリジンコートカバーガラス上に、ニューロンをプレーティングした。トランスフェクションの2~4時間後に、成長培地の半分を新鮮培地と交換し、ニューロンを48~72時間成長させた。電気生理学.パッチクランプ実験は、Axopatch200B増幅器AxonInstrumentsを使って、標準的なホールセル記録またはセルアタッチト記録で行った。パッチピペットは、133CsCl、10HEPES、5EGTA、1CaCl2、1MgCl2、4MgATP、および04Na2GTP単位mMからなる内部溶液CsOHでpHを73に調節で満たした場合に、2~3MΩの抵抗を持っていた。細胞外溶液は、127~130NaCl、3KCl、1MgCl2、10HEPES、25CaCl2、10グルコース単位mMからなったNaOHでpHを73に調節。NMDG溶液は、150NMDG、10HEPES単位mMからなったpH75。イオン選択性実験の場合、内部溶液は150CsCl、10HepesからなりCsOHでpH73、一価外部溶液は150NaClまたはKCl、10HEPES単位mMからなりNaOHまたはKOHでpH73、二価外部溶液は、100CaCl2またはMgCl2、10HEPES単位mMからなったCsOHでpH73。セルアタッチト記録の場合、130NaCl、5KCl、10HEPES、1CaCl2、1MgCl2、10TEACl単位mMからなる溶液NaOHでpH73でピペットを満たし、膜電位をゼロにするために使用した外部溶液は、140KCl、10HEPES、1MgCl2、10グルコース単位mMからなったKOHでpH73。全ての実験は室温で行った。電流は20kHzでサンプリングし、2kHzでフィルタリングした。電圧は、Clampex101ソフトウェアAxonInstrumentsを使ってLJPを計算したイオン選択性実験を除いて、液間電位について補正しなかった。機械的刺激前のリーク電流は、オフラインで電流トレースから差し引いた。10mMルテニウムレッド保存溶液はDMSO中に、また100mMガドリニウム保存溶液は水中に、調製した。機械的刺激.ホールセル記録の場合、機械的刺激は、記録される細胞に対して80°の角度で配置したファイアポリッシュガラスピペット先端径3~4μmを使って達成した。細胞に向かうプローブの下向きの動きは、Clampexで制御された圧電結晶マイクロステージE625LVPZTコントローラーアンプリファイア;PhysikInstrumenteによって駆動された。プローブは、典型的には、細胞体から約2μmに配置した。MA電流活性化の閾を測定するために使用した圧電駆動刺激の強度は、細胞に触れる距離を超えて移動した距離と定義した。プローブは、前進運動のためのコマンドのランプセグメント中は、1μmmsの速度を有し、刺激は150msにわたって適用された。細胞の機械刺激感受性を評価するために、一連の機械的ステップを、1μm刻みで、機械刺激感受性電流の完全な回復を可能にする10秒ごとに適用した。内向きMA電流を80mVの保持電位で記録した。IV関係の記録には、電圧ステップを、60mVの保持電位から、機械的刺激の07秒前に適用した。DRGニューロンにおけるMA電流の記録のために、1細胞ごとに誘発された電流の最大振幅の少なくとも75に達する、電流のトレースの、80mVの保持電位における不活性化動態を、単一指数式とフィットさせいくつかの例では、先の報告OPHamillBMartinacPhysiolRev81685に従って、速順応性電流に関して双指数式とフィットさせ、解析には速い時定数を使用;図5A左パネル参照、解析に使用した各ニューロンごとにτinac値を得た。セルアタッチト記録の場合は、Clampexで制御された圧力クランプHSPC1デバイスALAscientificを使って、記録電極を介して、膜パッチを短い陰圧パルスで刺激した。別段の明記がある場合は、0から60mmHgまで10mmHg刻みの圧力ステップで、伸展活性化チャネルを80mVの保持電位で記録し、解析のために1細胞につき3~10の記録トレースを平均した。電流圧力関係は、I=1exps1の形のボルツマン式とフィットさせた式中、Iは所与の圧力における伸展活性化電流のピークであり、Pは適用されたパッチ圧単位mmHgであり、P50は、Imaxの50である電流値を惹起した圧力値であり、sは圧力に対する電流感受性を反映する。透過性比の決定.各溶液中の各細胞について逆転電位を、それぞれの電流電圧データの内挿によって決定した。これらの実験では、IV関係を、60mVの保持電位から、20mV刻みで60mVから60mVまで液間電位補正前の範囲にわたる電圧ステップで行った。透過性の比PXPCsを、各細胞ごとに各試験陽イオンXについて、その陽イオンが主要外部陽イオンである場合のMA活性化ホールセル電流の逆転電位から決定した。膜のそれぞれの側の透過陽イオンが単一であるとして簡略化されたGoldmanHodgkinKatzGHK式GBMonshausenSGilroyTrendsCellBiol19228を使用した:式中、RTzFは23°Cにおいて255の値を有する。二価陽イオンの場合は、適当に改変された式を使用した:比PXPCsは、各陽イオンについて、平均値±SEMとして表された。レシオメトリックカルシウムイメージング.細胞内Ca2イメージング実験は、細胞をCa2イメージングバッファー[10mMHEPESを補足した1×ハンクス平衡塩類溶液HBSS,13mMCa2]で3回洗浄することによって行い、次に、レシオメトリックCa2指示薬色素Fura2AMMolecularProbesを、製造者の推奨に従って、室温で30分間ローディングした。倒立顕微鏡でのイメージングに先だって細胞を3回洗浄した。交互する340380nmの光で細胞を照明することによって、Fura2蛍光を測定した。蛍光強度は510nmで測定した。細胞内Ca2濃度は340380比として表される。培養DRGニューロンのレシオメトリックカルシウムイメージングは、本質的に、文献記載のとおりに行った[1]。実験は、プレーティングの47~72時間後に、37°Cで行った。活性化に関する閾は、MO100μMを添加する直前の5時点からの平均ベースラインより40上に設定した。siRNA特異性、ニューロンの健康状態および応答性を確認controlするために、各実験の最後にカプサイシンCAPS,05μMを加えた。比較すべき全ての実験群を、同じDRG培養調製物を使って並列に処理した2つの独立した調製物を使用した。Piezo1抗血清の生成.合成ポリペプチドRQRRERARQERAEQ配列番号2のアミノ酸1454~1467に対するカスタムポリクローナル抗体は、標準的方法により、ウサギにおいて調製され、アフィニティ精製されたThermoFisherScientific,Openbiosystems。TRPA1生細胞ラベリングlivelabelingおよび免疫細胞化学.HEK293T細胞でのTRPA1生細胞ラベリングおよび免疫細胞化学は、本質的に、文献記載のとおりにSchmidtetal2009、ただし次に挙げる変更を加えて行った:Piezo1抗血清の特異性を評価するために、細胞にPiezo1IRESEGFPコンストラクトをトランスフェクトし、36時間後に、以下に概説する免疫細胞化学に使用した。Piezo1抗血清は1:100で使用し、AlexaFluor546Invitrogenにコンジュゲートした二次抗体によって検出した。Piezo1の膜発現を評価するために、細胞に、マウスTrpa1MYCHisコンストラクトとPiezo1とを同時トランスフェクトし、トランスフェクションの36時間後に、生細胞ラベリングに使用した。生HEK293T細胞をTRPA1抗体1:50と共にインキュベートした後、ヤギ抗ウサギのAlexaFluor488F2フラグメント1:200,Invitrogenと共にインキュベートすることによって、表面TRPA1を標識した。細胞を、PBS中の2パラホルムアルデヒドPFAで20分間固定し、洗浄し、過剰の非標識ヤギ抗ウサギIgGと共に1時間インキュベートすることにより、残存する未結合TRPA1抗体結合部位を全てブロックした。次に、04TritonX100を含有するPBS中で細胞を透過処理し、正常ヤギ血清PBS中の10血清でブロックし、Piezo1に対する一次抗体1:100およびcMYC1:100,9E11,マウス,SantaCruzBiotechnologyと共にインキュベートした後、二次抗体AlexaFluor568ヤギ抗ウサギIgGおよびAlexaFluor633ヤギ抗マウスIgG;1200;Invitrogenと共にインキュベートした。免疫細胞化学実験は、アルゴンレーザーの488nm線、HeNe緑色543nmレーザーおよびHeNe赤色633nmレーザーを使った逐次的照明により、オリンパス日本国東京Fluoview500共焦点顕微鏡を使って撮像した。40×および60×PlanAPO油浸対物レンズ後者は15のズームを使って、マージされた積層イメージを作成した。リアルタイムqPCR.後根神経節を、成体C57BL6J野生型マウスから新たに単離し、ドライアイス上で瞬間凍結した。DRGまたはsiRNAトランスフェクトN2A細胞GFP同時トランスフェクションの3日後、記録に使用したものと同じ条件から、Trizol処理を使って、全RNAを抽出した。他の組織に由来する全RNAは全て、Zyagenサンディエゴから購入した。Quantitect逆転写キットQiagenを使用して第1鎖cDNAを作製するために、500ngの全RNAを使用した。mPiezo1およびmPiezo2に関するリアルタイムTaqmanPCRアッセイアッセイid:Mm01241570g1およびMm01262433m1は、FAMリポーター色素および非蛍光クエンチャーと共にAppliedBiosystemsから購入した。AmpEraseUNGを含まないユニバーサルTaqManPCRマスターミックス20×AppliedBiosystemsを使用した。反応は、ABI7900HTfastリアルタイムシステムにおいて、製造者の指示に従い、20μlの反応液中に1μlのcDNAを使って、三つ一組にして行った。キャリブレーションと規格化は、2ΔΔCT法[4]法を使って行った。ここで、ΔΔCT=CTである。異なる組織におけるmRNA発現の解析図4Cには、ターゲット遺伝子をmPiezo1またはmPiezo2とし、一方、参照遺伝子はGAPDHとし、キャリブレーターは肺組織とした。mRNA発現のsiRNA誘導性ダウンレギュレーションの解析図3Aには、βアクチンを参照遺伝子として使用し、スクランブルsiRNAトランスフェクトN2A細胞をキャリブレーターとした。インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学.インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学は、以前記述されたとおりに行ったMChalfieNatRevMolCellBiol1044。簡単に述べると、成体雄C57BL6Jマウス、6~16週齢、または成体雄SpragueDawleyラットに、4PFAを灌流し、後根神経節を素速く切離した。後固定と30スクロースにおける凍結保護の後、単一DRGをOCTに包埋し、クリオスタットで10μmの厚さに薄切した。塩基3822~4886;4837~5849;5922~7019および7102~8171に対応する4つの異なる1000bpcRNAセンスおよびアンチセンスプローブを作製した。全てのプローブをインビトロ転写し、ジゴキシゲニンRocheDiagnosticsで標識した。蛍光インサイチューハイブリダイゼーションの場合は、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ジゴキシゲニンdigoxygeninPOD抗体1:500およびチラミドシグナル増幅TSA;NENを使って、ハイブリダイズしたプローブを検出し、可視化した。インサイチューハイブリダイゼーションとTSA検出の後に免疫組織化学を行った。ニワトリ抗NF2001:1000;Abcamおよびニトワリ抗ペリフェリン1:100;AbcamをマウスDRGに使用し、一方、ラットDRGにはモルモット抗TRPV11:1000;Abcam一次抗体を使用したこの抗体はマウスDRGでは機能しなかった。AlexaFluor568にコンジュゲートされた二次抗体によって一次抗体を検出した。比色インサイチューハイブリダイゼーションの場合は、アルカリホスファターゼ抗DIGAP抗体Roche;1:500を使用した後、NBTBCIP液体基質システムSigmaと共にインキュベートすることで、暗紫色を発色させた。切片をSlowfadeGold試薬Invitrogenに封入し、AX70顕微鏡オリンパスを使って撮像した。定量には蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを使用し、アルゴンレーザーの488nm線とHeNe緑色543nmレーザーを使った逐次的照明により、オリンパス日本国東京Fluoview500共焦点顕微鏡を使って撮像した。20×および40×PlanAPO油浸対物レンズを使って、マージされた積層イメージを作成した。どの実験群についてもイメージは同一の取得パラメータを使って撮影し、RAW画像をImageJNIHによる解析に使用した。平均蛍光強度任意単位で測定したものが、少なくとも10個のランダム未染色細胞から測定される平均バックグラウンド蛍光標準偏差の4倍よりも高ければ、そのニューロンはPiezo2陽性とみなした。二重カウントニューロンを避けるために、少なくとも50μm離れている切片だけを考慮した。平均蛍光強度任意単位で測定したものが、少なくとも10個のランダム未染色細胞から測定される平均バックグラウンド蛍光標準偏差の3倍よりも高ければ、そのニューロンはNF200陽性またはペリフェリン陽性とみなした。Piezo2の比色インサイチューハイブリダイゼーションも類似する結果を与えたが269Piezo2陽性ニューロン、データ未掲載、基質による発色の長さに依存する変動性ゆえに、定量には使わなかった。発表用にのみ、画像の明度、コントラストおよびレベルを調節した。Piezo1の分子クローニング.NCBIデータベースのmPiezo1のcDNA配列NM001037298からプライマーを設計した。Neuro2A全RNAから作製されたcDNAライブラリーから、プライマーmPiezo1fwd5atggagccgcacgtgctg3配列番号21およびmPiezo1rev5ctactccctctcacgtgtcca3配列番号22を使って、7644kbフラグメントを増幅し、NotI制限部位およびHindIII制限部位でpcDNA31Invitrogenにクローニングした。このコンストラクトを全配列決定したところ、NCBI配列と比較して、残基156におけるQの挿入、および3つのアミノ酸変化R147G、V228IおよびM1571Vが明らかになった。このベクターをさらに修飾して、3AscI制限部位およびFseI制限部位を含むようにしてから、これらの部位を使って、pIRES2EGFPClontech由来のIRESGFPPCRフラグメントを挿入した。N2A細胞からクローニングされたPiezo1のタンパク質配列配列番号2は次のとおりである。Piezo2の分子クローニング.NCBIデータベースのPiezo2のcDNA配列NM001039485からプライマーを設計した。成体C57BL6JDRG全RNAから作製されたcDNAライブラリーから、プライマーmPiezo2fwd5atggcttcggaagtggtgtgc3配列番号23およびmPiezo2rev5tcagtttgttttttctctagtccac3配列番号24を使って、8469kbフラグメントを増幅し、KpnI制限部位およびNotI制限部位でpCMVSport6Invitrogenにクローニングした。クローニングされたDRG由来のmPiezo2遺伝子を配列決定したところ、3つのアミノ酸挿入領域がエクソンとして正しくアサインされていないNCBIアノテーションとの相違が明らかになった628E、833の14残基および1751の56残基。本発明者らがマウスDRGからクローニングしたPiezo2のタンパク質配列配列番号4は次のとおりである。系統学的解析.系統学的解析を行うために使用したPiezo配列のアクセッション番号を、TMHMM2プログラムを使って予想されたTMドメインの数と共に記載する。いくつかの種については、複数の予想遺伝子配列を融合して完全な配列を得た。HsPiezo1ヒト:NP0011363362,2521aa31TMMmPiezo1マウスMusmusculus:NP0010323751,2546aa30TMGgPiezo1ニワトリ:XP4142092,1718aa;XP4231062,217aa25TMDrPiezo1ゼブラフィッシュ:XP6963554,2538aa29TMHsPiezo2ヒト:NP0713512,2752aa35TMMmPiezo2マウス:NP0010345743,2753aa34TMGgPiezo2ニワトリ:XP4191382,3080aa33TMDrPiezo2ゼブラフィッシュ:XP002666625,2102aa24TMCiPiezoカタユウレイボヤ:XP0021229011,1669aa;XP0021288501,591aa33TMDmPiezoキイロショウジョウバエ:NP0010363463,2671aa36TMCePiezoカエノラブディティスエレガンス:NP5016482,800a;NP5016472,184333TMDdPiezoキイロタマホコリカビ:XP640187,3080aa35TMAtPiezoシロイヌナズナ:NP1823275,2440aa28TMOsPiezoジャポニカイネOryzasativa-japonicagroup:NP0010431051,2196aa24TMTtPiezoiテトラヒメナサーモフィラ:XP9769671,4690aa30TMTtPiezoiiテトラヒメナサーモフィラ:XP0010217041,4136aa29TMTtPiezoiiiテトラヒメナサーモフィラ:XP0010176821,2636aa26TMデータ解析.全ての図において、データは平均値±SEMとして示されている。別段の明記がない限り、統計的有意性は、2つの試料間の相違を比較するために、対応のない両側スチューデントt検定を使って評価した。分散が有意に異なる場合は、ウェルチの補正をした対応のない両側スチューデントt検定を使用した。p<005,p<001,p<0001。[実施例2]Neuro2A細胞はMA電流を発現するメカノトランスダクションに関与するタンパク質を同定するために、初代細胞から記録されるものに類似するロバストなMA電流を発現する細胞株を探したBCosteMCrestPDelmasJGenPhysiol12957。数種類のマウス細胞株およびラット細胞株Neuro2A、C2C12、NIH3T3、Min6、50B11、F11、PC12を、圧電駆動のガラスプローブからなる機械的刺激を使ったホールセル構成のパッチクランプによってスクリーニングしたGCMcCarterDBReichlingJDLevineNeurosciLett273179;BCosteMCrestPDelmasJGenPhysiol12957;LJDrewJNWoodPCesareJNeurosci22RC228。Neuro2AN2Aマウス神経芽細胞腫細胞株が、かなり迅速な順応動態を有する最も一貫したMA電流を発現した図1A。これに比して、他の細胞株において記録されたMA電流の代表例として、C2C12マウス筋芽細胞細胞株は、不活性化の動態が遅いMA電流を発現した図1B。80mVの保持電位において記録されたN2AMA電流はすべて、150msの機械的刺激パルスの最後には不活性化されているのに対し、C2C12MA電流は、部分的にしか不活性化されていない図1C。これらの電流は、速順応性MA電流と遅順応性MA電流とが記述されているDRGニューロンにおいて発現する一部の電流と共通する動態特性を有しているBCosteetalJGenPhysiol12957;LJDrewetalJPhysiol556691;LJDrewetalPLoSONE2e515;JHuGRLewinJPhysiol577815;CWetzeletalNature445206表1および下参照。不活性化動態の相違は、これらの細胞株において発現するメカノトランスダクション装置の構成要素が異なることを示唆するが、不活性化動態のこの相違は、細胞株の膜伸展性などといった間接的因子によるものである可能性もある。N2AMA電流とC2C12MA電流の電流電圧関係は80mVと80mVの間は直線的であり、逆転電位Erevはそれぞれ66および67mVであって、内向き電流がNMDGクロライド外部溶液で抑制されたことからデータ未掲載、陽イオン非選択的透過性図1D~Eが示唆される。最後に、N2A細胞において発現したMA電流の振幅は、C2C12MA電流よりおよそ2倍大きい図1F。[表1]無処理細胞株およびPiezo1処理細胞株における不活性化の動態パッチ膜伸展刺激をセルアタッチトモードで使用することにより、N2AMA電流をさらに特徴づけたBeschetalPflugersArch445161。短い陰圧パルスは、内在性チャネルの開口を惹起し図1G、単一チャネルコンダクタンスは229±14pS、Erevは62mVだった図1H。圧力パルスの強さを増加させると、これらのMAチャネルの漸進的かつ可逆的な開口が誘導された図1I。電流圧力関係は、60mmHgでの最大開口を特徴とし、半値活性化P50は280±18mmHgだった図1J。これらのコンダクタンスおよびP50値は、報告されている伸展活性化チャネルの性質に似ているChoetalEurJNeurosci232543;EarleyetalCircRes95922;SharifNaeinietalJMolCellCardiol4883。[実施例3]Piezo1Fam38AはN2A細胞のMA電流に必要であるN2Aにおける候補MAイオンチャネルのリストを作成するために、N2Aと、試験した他のマウス細胞株について、遺伝子発現プロファイリングを行い、基準の組合せを使って、N2A細胞中で豊富な転写産物に焦点を絞った。膜を少なくとも2回またぐ全てのイオンチャネルに共通する特徴と予想されるタンパク質を選択した。既知の陽イオンチャネル、または機能未知のタンパク質のいずれかを選ぶことによって、このリストに優先順位を付けた。N2A細胞中でsiRNAノックダウンを使用し、ホールセルモードでピエゾ駆動の圧力刺激によるMA電流を測定することによって、各候補を試験した。73番目の候補であるFam38AFamilywithsequencesimilarity38のノックダウンが、MA電流の顕著な減少を引き起こした図2A~B、表2。追跡実験では、この遺伝子に対する異なるsiRNAで、MA電流のロバストな減弱が観察された図2C。試験したsiRNAは全て、qPCRによってアッセイされるターゲット転写産物を有意に減少させた図3A。[表2]siRNAノックダウンのための候補タンパク質Fam38Aが圧力によって活性化されるイオンチャネルの発現に必要なタンパク質をコードしていることから、この遺伝子を、圧力を意味するギリシャ語πιεσηpιesiから、Piezo1と名付けた。Piezo1のノックダウンが、一般的細胞シグナリングまたは細胞生存を損なうかどうかを調べるために、N2A細胞にTRPV1cDNAとスクランブルsiRNAまたはPiezo1siRNAのどちらか一方とをトランスフェクトした。カプサイシン応答に相違は観察されなかった図3B~C。次に、Piezo1が、パッチ膜伸展によって誘発されるN2AMA電流にも必要であるかどうかを決定するための実験を行った図2D~E。ここでも、Piezo1に対するsiRNAで、強力なノックダウンが観察された。このことは、上記2つの機械的刺激プロトコールのどちらかを使って記録されるMA電流の発現にPiezo1が必要であることを示唆している。哺乳動物Piezo1KIAA0233,Fam38A,Mibについては、ほとんど何もわかっていない。その発現は、老人斑関連アストロサイトにおいて誘導されKSatohetalBrainRes110819、このタンパク質はインテグリン活性化に関与することが示唆されているBJMcHughetalJCellSci12351。二価イオン非含有および5mMEGTA溶液の細胞外灌流を30~60分行うとインテグリン機能が破壊されるがROHynesCell110673、これは、MA電流を抑制しなかった図3D~E。したがってPiezo1siRNAがインテグリン調整によってMA電流をブロックするとは思われない。ただし、Piezo1の機械的活性化が、インテグリン活性化と、細胞の接着、分裂および移動を含むさまざまな下流帰結とにつながる可能性は考えられる。[実施例4]Piezoはさまざまな種の間で保存されている大きな膜貫通タンパク質であるPiezoタンパク質は非哺乳動物種に存在するが、特徴づけたと報告されたものはない。多くの動物、植物および他の真核生物種は、単一のPiezoを含有する図4A。脊椎動物哺乳動物、鳥、魚は、2つのメンバー、Piezo1Fam38AおよびPiezo2Fam38Bを有する。ただし、初期の脊索動物であるユウレイボヤは単一のメンバーを有する。繊毛虫Ciliophora界でも複数のPiezoが存在する。すなわち、テトラヒメナサーモフィラは3つのメンバーを有し;ヨツヒメゾウリムシParameciumtetraureliaは6つのメンバーを有する図示していない。酵母または細菌には明確なホモログが同定されなかった。Piezoタンパク質の二次構造および全体の長さは中等度に保存されており、一方、他のタンパク質に対する相同性はごくわずかである。TMHMM2プログラムでアッセイしたところ、全てが24~36個の予想膜貫通ドメインを有する変動はおそらく不正確なcDNAまたは膜貫通予想に起因する。予想タンパク質は2100~4700アミノ酸であり、膜貫通ドメインは、マウスPiezo1の疎水性プロット図4Bによって例証されるとおり、推定タンパク質の全体にわたって配置されている。qPCRによって決定されたPiezo1の発現プロファイル図4Cには、膀胱、結腸、腎臓、肺および皮膚におけるロバストな発現と、試験した他の組織DRG感覚ニューロンを含むにおける低い発現とが含まれる。このパターンはラットにおけるノーザンブロット発現解析と合致するKSatohetalBrainRes110819。膀胱、結腸、および肺は、内臓痛に関連するメカノトランスダクションを起こしGBurnstockMolPain569、腎臓の一次線毛は尿の流れを感知するLRodatDespoixPDelmasPflugersArch458179。DRGにおける低いmRNAレベルは、Piezo1が、そこで観察されるMA電流の説明にはならないだろうということを示唆しているがBCosteMCrestPDelmasJGenPhysiol12957;LJDrewJNWoodPCesareJNeurosci22RC228;JHuGRLewinJPhysiol577815、Piezo1は体性感覚のもう一つの推定部位である皮膚において発現している。膀胱、結腸および肺ではPiezo2発現も観察されるが、腎臓または皮膚では少ない。興味深いことに、Piezo2の極めて強い発現がDRG感覚ニューロンに観察され、体性感覚メカノトランスダクションにおける潜在的役割が示唆される下記参照。[実施例5]Piezo1はさまざまな細胞タイプにおいてMA電流を誘導するN2A細胞から完全長Piezo1をpIRES2EGFPベクター中にクローニングした。トランスフェクションの12~48時間後に、ホールセルモードでMA電流の電気生理学的記録を行った。N2A、HEK293T図5A~FおよびC2C12細胞株図6A~Cにおいて、Piezo1トランスフェクト細胞は大きなMA電流を示したが、モックトランスフェクト細胞はそうではなかった。Piezo1を過剰発現するどの細胞でも、MA電流電圧関係は、内在性N2AMA電流に似ていて図5B、5E、6B、および1D、Erevは約6mVだった。Piezo1過剰発現細胞において誘発されるMA電流の活性化の閾および不活性化の時定数は、試験した3つの細胞株全てにおいて類似している表1参照。次に、Piezo1誘導MA電流のイオン選択性を特徴づけた。細胞外バス溶液に非透過陽イオンNMDGを代用すると、内向きMA電流が抑制されたことから、このチャネル活性は陽イオン性であることが実証された図6D。CsClのみの内部溶液とバス中のさまざまな陽イオンとを使って記録することにより、イオン選択性をさらに調べた。Na、K、Ca2およびMg2イオンは全て透過することができ、Ca2にわずかな選択性があった図5Gおよび図6E~F。さらにまた、30μMのルテニウムレッドおよびガドリニウム多くの陽イオン性MA電流のブロッカーであることが知られているLJDrewJNWoodPCesareJNeurosci22RC228;JHaoetalMechanosensitivityoftheNerveousSystemIKeAKamkin編,Springer,オランダ,2008vol2の51~67ページは、Piezo1誘導性MA電流をそれぞれ746±25n=6および843±38n=5ブロックした図5Hおよび6G~H。次に、パッチ膜伸展刺激をセルアタッチトモードで使用して、Piezo1トランスフェクト細胞をアッセイした図5I~N。N2A細胞およびHEK293T細胞におけるPiezo1の過剰発現は、陰圧パルスによって誘発される大きな電流を生じさせた図5I、5L。Piezo1を過剰発現する細胞および内在性N2A細胞における電流圧力関係は類似していて、N2AおよびHEK293T過剰発現細胞におけるP50はそれぞれ281±28および312±35mmHgだった図5J、5M、および1J。ベクターのみをトランスフェクトしたHEK293T細胞では、N2A内在性MAチャネルに類似するチャネル活性は検出されなかったデータ未掲載。それゆえに、Piezo1過剰発現は、試験した細胞株の全てにおいて、圧電駆動のガラスプローブ刺激とパッチ膜伸展のどちらによっても誘発されるMA電流を誘導する。これは、これら2つの異なる機械刺激プロトコールが同じMAチャネルを活性化することの、初めての証明である。[実施例6]Piezo2はPiezo1誘導電流とは異なるMA電流を誘導する完全長Piezo2をDRGニューロンからクローニングし、異種発現時のその機械的感受性を調べた。Piezo2GFP同時トランスフェクト細胞は、N2A細胞内在性MA電流を抑制するためにPiezo1siRNAと同時トランスフェクトしたものおよびHEK293T細胞において、大きなMA電流を示したが、モックトランスフェクト細胞ではそうならなかった図7A~F。Piezo2誘導MA電流電圧関係は80mVと80mVの間は直線的で図7B、7E、N2A細胞およびHEK293T細胞における逆転電位Erevはそれぞれ63±04mVn=3および87±15mVn=7だったことから、比較的非選択的な陽イオンコンダクタンスが示唆される。Piezo1と同様に、Piezo2誘導電流は、非透過陽イオンNMDGによって抑制され、ガドリニウムおよびルテニウムレッドによって阻害された[それぞれ、850±37n=5および792±42n=5]図8。これらの特徴は、DRGニューロンから記録されたMA電流のプロファイルと合致するGCMcCarteretalNeurosciLett273179;LJDrewetalJNeurosci22RC228;また、JHuGRLewinJPhysiol577815も参照されたい。異種発現したPiezo2が誘導するMA電流の不活性化動態を単一指数式とベストフィットさせると、算出される不活性化の時定数ιinacは、80mVで測定した場合、N2A細胞68±07ms,n=27でもHEK293T細胞73±07,n=11でも、比較的早い。さらにまた、Piezo2誘導MA電流の不活性化の動態は、内向き電流図7Gでも外向き電流図7Hでも、また試験した全ての保持電位で図7I、Piezo1誘導MA電流より速い。これらの相違は、Ca2透過性が高いせいではない。というのも、Piezo1誘導MA電流とPiezo2誘導MA電流のCa2選択性は類似しているからであるデータ未掲載。したがってPiezo1およびPiezo2はユニークなチャネル特性を付与する。セルアタッチトモードで膜パッチの陰圧刺激を使用することでPiezo2誘導MA電流の性質をさらに特徴づけようとする最初の試みでは、Piezo2依存的チャネル活性を検出することができなかった図示していない,21パッチ。[実施例7]Piezo1は形質膜に検出される上記の結果は、Piezo1および2がメカノトランスダクション複合体の構成要素であり、したがって形質膜に存在するはずであることを示唆している。以前の報告により、小胞体におけるFam38APiezo1の発現が示されているKSatohetalBrainRes110819;BJMcHughetalJCellSci12351。マウスPiezo1に対するペプチド抗体を作製した。この抗体は、Piezo1トランスフェクトHEK293T細胞を特異的に認識したが、ナイーブHEK293T細胞は認識しなかった図9A。Piezo1およびTRPA1形質膜に発現する異が知られているイオンチャネルをトランスフェクトした細胞では、Piezo1発現の大半がTRPA1と同様細胞内部に存在したものの、生細胞標識された表面TRPA1と共に、Piezo1の同時染色が観察されたMSchmidtAEDubinMJPetrusTJEarleyAPatapoutianNeuron64498。これは、Piezo1タンパク質が形質膜またはその近傍に局在化しうることを実証している図9B。抗体には、Piezo1の内在性N2A発現を検出できるほど十分な感度がなかったデータ未掲載。[実施例8]Piezo2はDRG速順応性MA電流に必要であるqPCRで評価したところ、DRGでは、Piezo2が比較的高レベルに発現するが、Piezo1はそうではない図4C。DRGのニューロンおよび膠細胞の不均一集団内でのPiezo2発現を特徴づけるために、成体マウスDRG切片で、インサイチューハイブリダイゼーションを行った図10A。Piezo2mRNA発現は、DRGニューロンの20合計2391個のニューロン中、下記方法の項参照に観察された。Piezo2は、機械感覚ニューロン中に存在するマーカーであるペリフェリン60およびニューロフィラメント20028も発現するDRGニューロンのサブセットにおいて発現する図11MEGoldsteinetalJNeurosciRes3092;SNLawsonExpPhysiol87239;SNLawsonetalJCompNeurol228263;HSannetalCellTissueRes282155。侵害受容マーカーTRPV1との多少のオーバーラップ24は、有害機械感覚におけるPiezo2の潜在的役割を、さらに示唆している。次に、siRNAトランスフェクションを使って、DRGニューロンのMA電流におけるPiezo2の役割を直接調べた。まず最初に、RNAiアプローチを、TRPA1DRGニューロンにおいて発現し、カラシ油MOによって活性化されるイオンチャネルで検証したMBandelletalNeuron41849;SEJordtetalNature427260図12A~B。Piezo2の機能的発現をブロックするsiRNAの能力は、Piezo2cDNAとPiezo2siRNAの両方を同時トランスフェクトしたN2A細胞で実証された図12C、15倍減少。次に、ホールセルMA電流を、GFPとスクランブルsiRNAまたはPiezo2siRNAのどちらか一方スクランブルsiRNAについてはn=101、Piezo2siRNAについてはn=109とを同時トランスフェクトしたDRGニューロンから記録した。記録されたMA電流は、先に述べられているとおり、その不活性化動態に従ってグループ分けされた図10BBCosteetalJGenPhysiol12957;LJDrewetalJNeurosci22RC228;LJDrewetalJPhysiol556691;JHuGRLewinJPhysiol577815;CWetzeletalNature445206。スクランブルsiRNAトランスフェクト細胞におけるτinac分布に基づいて、4種類のニューロンが同定された図6D:τinac<10ms、10<τinac<30、τinac>30、非応答性ニューロン。約7msのτinacを持つPiezo2発現ニューロンは、τinac<10msDRG集団の中にあると予想される。注目すべきことに、τinac<10msのMA電流を発現するニューロンの比率は、スクランブルsiRNAトランスフェクトニューロンと比較して、Piezo2siRNAでは、特異的かつ有意に低減した図10C。スクランブルsiRNAトランスフェクトニューロンの287がτinac<10msであるのに対し、Piezo2siRNAトランスフェクトニューロンでは73だった図10D。Piezo2siRNA試料に存在するMA電流の動態が遅いニューロン10msと30msの間のτinacおよびτinac>30msは正常だった。Piezo2の喪失が速順応性ニューロンをノンレスポンダーへと添加するのだとすれば予想されるとおり、機械的に非感受性であるニューロンの数は増加する傾向が観察された。また、これらのRNAiデータを、150ms試験パルス中の電流不活性化の度合に従って解析したところ、同様の結論に達した図12E。τinac<10msの残存MA電流が、不完全なPiezo2ノックダウンによるのか、別のチャネル複合体の存在によるのかはわかっていない。ともかく、培養DRGにおける速順応性MAイオンチャネル活性の大半にとって、Piezo2は特異的に必要である。[実施例9]Piezo1およびPiezo2のターゲティングの治療的利益多くの研究により、脊椎動物メカノトランスダクションには、カルシウム透過性機械刺激活性化。ここでは、2つの異なる確立された方法、すなわちホールセル構成においてガラスプローブから適用される圧電駆動の圧力、およびセルアタッチトモードにおけるパッチピペットによる形質膜の伸展を使って、細胞ベースの機械刺激感受性をアッセイしたJHaoetalMechanosensitivityoftheNervousSystemIKeAKamkin編Springerオランダ,2008,vol2pp5167。これらのアッセイを使って、Piezo1は、Neuro2A細胞におけるMA電流にとって必要であり、Piezo2は、DRGニューロンにおけるMA電流のサブセットにとって必要であることがわかった。さらにまた、3つの異なる細胞タイプにおいてPiezo1またはPiezo2を過剰発現させることにより、MA電流の顕著な17~300倍の増加が起こる。それゆえに、Piezoは、さまざまな細胞タイプにおけるMA電流の発現にとって、必要かつ十分である。注目すべきことに、Piezo1またはPiezo2の過剰発現は、ユニークなMA電流順応特性を付与し、これは、それらが異なるMAイオンチャネルの構成要素であることを示している。Piezo1配列とPiezo2配列はユニークであると思われ、既知のイオンチャネルまたは他のタンパク質クラスには類似していない。予想膜貫通ドメインが非常に多いことマウスPiezo1およびPiezo2の場合、それぞれ30個および34個の膜貫通ドメインは、6つの膜貫通単位の4回の繰り返しから構成される24個の膜貫通ドメインを有する電圧活性化ナトリウムチャネルを連想させるMRHanlonBAWallaceBiochemistry412886。しかしPiezoタンパク質に当初からポア含有ドメインまたは反復ドメインが認められているわけではない。もしかすると、電位作動性チャネルのベータサブユニットMRHanlonBAWallaceBiochemistry412886またはATP感受性KチャネルのSURサブユニットSJTuckerFMAshcroftCurrOpinNeurobiol8316と同様に、Piezoタンパク質は、チャネルの適正な発現またはチャネルの性質を調整するのに必要なイオンチャネルの非導電性サブユニットであるのかもしれない。しかし、おそらくそうではないだろう。というのも、それは、Piezoが機能するのに必要な、MAチャネルのサイレントな導電性サブユニットを、ここで使用した全ての細胞タイプが発現することを含意することになるからである。あるいは、Piezoタンパク質は、既知のチャネルに対して有意な相同性を有さない最近同定されたイオン導電性チャネルであるOrai1と同様の、新しい種類のイオンチャネルを規定するのかもしれないMPrakriyaetalNature443230。Piezo1Fam38Aは、小胞体にも見いだされているのでKSatohetalBrainRes110819;BJMcHughetalJCellSci12351、Piezoは、形質膜でも細胞内コンパートメントでも作用する可能性がある。実際、ここに示すデータは、過剰発現したPiezo1を形質膜またはその近傍に見いだしうることを示している。Piezo1は、腎臓を含めて、メカノトランスダクションに関与するさまざまな組織において発現する。興味深いことに、類似する性質を有する伸展活性化チャネルが腎臓由来細胞で記述されているRSharifNaeinietalJMolCellCardiol4883;PGottliebetalPflugersArch。Piezo1発現配列タグESTは内耳にも見いだされる。有毛細胞のMAチャネルのコンダクタンスは、蝸牛における場所に依存して変動し、80~163pSの範囲にわたるAJRiccietalNeuron40983。この範囲はPiezo1によって伝導されるものとは類似していないが、コンダクタンスの変動は、それが未知の因子によって調整されうること、そしてそれゆえに、これを根拠に候補を除外してはならないことを示唆している。Piezo2は感覚ニューロンにおいて発現し、機械刺激活性化電流にとって必要である。機械的痛覚過敏は、炎症痛および神経障害性痛を含む多くの疼痛状態において優勢な状態である。したがってPiezo2は、さまざまな疼痛、痒み、および炎症適応症のターゲットになりうる。Piezo1およびPiezo2のターゲティングは、聴覚、血管緊張および血流の調節、腎臓における尿流量感知、肺の成長および傷害を含むさまざまな適応症、ならびに骨および筋ホメオスタシスこれらはいずれもメカノトランスダクションによって調節されるにおいても、治療的利益を有しうる。配列表は、87396817888ST25txtというタイトルのASCIIテキストファイルとして、本願と一緒に提出される。このファイルは2011年8月23日に作成されたもので、139キロバイトである。本明細書に記載する実施例および実施形態は例示を目的とするにすぎないこと、および当業者にはこれらを踏まえたさまざまな変更および改変が示唆され、それらが本願請求項の要旨および範囲に包含されることは、言うまでもない。本明細書において言及する刊行物、特許、および特許出願は、全て、参照により、あらゆる目的で、そのまま本明細書に組み込まれる。"