"以下の工程:興味対象のゲノム遺伝子座で、1つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な少なくとも1つのDNA標的配列を同定する工程;興味対象のゲノム遺伝子座内の前記DNA標的配列の近辺に遺伝情報の喪失を創出するように前記少なくとも1つの稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程;及び前記DNA標的配列を前記少なくとも1つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させて、興味対象のゲノム遺伝子座内の前記DNA標的配列の近辺に前記遺伝情報の喪失を創出し、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程;を含んでなる、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断誘導変異誘発を増加させる方法。前記遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼが、表2及び表3から選択される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼが、Trex及びTdtの群から選択される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる、請求項2に記載の方法。前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼが配列番号194の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる、請求項3に記載の方法。以下の工程:前記興味対象のゲノム遺伝子座で、1つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列を同定する工程;前記少なくとも1つの稀切断性エンドヌクレアーゼを、興味対象のゲノム遺伝子座において少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができるように遺伝子操作する工程;前記DNA標的配列を前記少なくとも1つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させ、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程;を含んでなる請求項1に記載の方法。以下の工程:前記興味対象のゲノム遺伝子座で、それぞれ1つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な2つの近接するDNA標的配列を同定する工程;興味対象のゲノム遺伝子座で第1のDNA二本鎖破断を創出することができる第1の稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程;興味対象のゲノム遺伝子座で第2のDNA二本鎖破断を創出することができる第2の稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程;前記DNA標的配列を前記2つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させ、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程;を含んでなる請求項1に記載の方法。前記興味対象のゲノム遺伝子座中の前記少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断が12bp~200bp離間している、請求項5に記載の方法。興味対象のゲノム遺伝子座中に少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる前記稀切断性エンドヌクレアーゼが、少なくとも2つの触媒ドメインを含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである、請求項5に記載の方法。前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼと少なくとも1つのヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合タンパク質である、請求項8に記載の方法。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインがエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項9に記載の方法。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが表2及び表3から選択されるか、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項10に記載の方法。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが、ColE7、ITevI、NucA、NucM、SNaseからなる群より選択されるか、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項9に記載の方法。前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼが配列番号84のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる融合タンパク質である、請求項8に記載の方法。前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼが配列番号54のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる融合タンパク質である、請求項13に記載の方法。前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼが配列番号56又は配列番号57から選択されるタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる融合タンパク質である、請求項8に記載の方法。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインがエキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項9に記載の方法。前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼと2つのヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合タンパク質である、請求項8に記載の方法。前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼと1つのヌクレアーゼ触媒ドメインと1つの他の触媒ドメインとの融合タンパク質である、請求項8に記載の方法。前記メガヌクレアーゼ及び前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが少なくとも1つのペプチド性リンカーにより結合している、請求項8に記載の方法。i稀切断性エンドヌクレアーゼ;iiペプチド性リンカー;iiiヌクレアーゼ触媒ドメインを含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座中に少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記稀切断性エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである、請求項20に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記稀切断性エンドヌクレアーゼがICreIメガヌクレアーゼに由来する、請求項20に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記稀切断性エンドヌクレアーゼがICreIメガヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼである、請求項20に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインがエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項20に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが表2及び表3から選択されるか、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項24に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが、コリシンE7、ITevI、NucA、NucM、SNase、それらの機能的変異体、バリアント又は誘導体から選択される、請求項24に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが配列番号84のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項24に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが配列番号54のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項24に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが配列番号56又は配列番号57から選択されるタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項24に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインがエキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項20に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが配列番号145~149のTrexタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項30に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが配列番号194のTrexタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項30に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。i第2のペプチド性リンカー;及び又はii追加の触媒ドメインを更に含んでなる、請求項20に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。前記追加の触媒ドメインがヌクレアーゼ活性を有する、請求項33に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。細胞の興味対象のゲノム遺伝子座中で二本鎖破断誘導変異誘発を増加させるための、請求項20に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。請求項20に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼをコードする組換えポリヌクレオチド。請求項36に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクター。請求項20に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼとキャリアとを含んでなる組成物。請求項20に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼと、真核細胞における二本鎖破断誘導変異誘発の増加に使用するための指示書と、任意に、パッケージング材料、成分用容器及び二本鎖破断誘導変異誘発の増加に使用する他の構成要素とを含んでなるキット。以下の工程:興味対象のゲノム遺伝子座で、1つの頻繁切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列に近接する1つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列を同定する工程;前記稀切断性エンドヌクレアーゼを、興味対象のゲノム遺伝子座において1つのDNA二本鎖破断を創出することができるように遺伝子操作する工程;前記稀切断性エンドヌクレアーゼと前記頻繁切断性エンドヌクレアーゼとの融合タンパク質を作製する工程;前記DNA標的配列を前記融合タンパク質と接触させて少なくとも2つの近接する二本鎖破断を創出し、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程;を含んでなる、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断誘導変異誘発を増加させる方法。i稀切断性エンドヌクレアーゼ;iiペプチド性リンカー;及びiii頻繁切断性エンドヌクレアーゼを含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座中に少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出する融合タンパク質。前記稀切断性エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである、請求項41に記載の融合タンパク質。前記稀切断性エンドヌクレアーゼがICreIメガヌクレアーゼに由来する、請求項41に記載の融合タンパク質。前記稀切断性エンドヌクレアーゼがICreIメガヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼである、請求項41に記載の融合タンパク質。i第2のペプチド性リンカー;及び又はii追加の触媒ドメインを更に含んでなる、請求項41に記載の融合タンパク質。前記追加の触媒ドメインがヌクレアーゼ活性を有する、請求項45に記載の融合タンパク質。細胞の興味対象のゲノム遺伝子座中で二本鎖破断誘導変異誘発を増加させるための、請求項45に記載の融合タンパク質。請求項41に記載の融合タンパク質をコードする単離された、精製された又は組換えのポリヌクレオチド。請求項48に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。請求項41に記載の融合タンパク質とキャリアとを含んでなる組成物。請求項41に融合タンパク質と、細胞における二本鎖破断誘導変異誘発の増加に使用するための指示書と、任意に、パッケージング材料、成分用容器及び二本鎖破断誘導変異誘発の増加に使用する他の構成要素とを含んでなるキット。これら強力なツールが利用可能であるにもかかわらず、依然として、二本鎖破断誘導変異誘発を更に改善する必要がある。本発明者らは、標的付けられたDSB誘導変異誘発の効率を増大させる新たなアプローチを開発し、この新たなアプローチを実行するために幾つかの触媒ドメインを含んでなる新たなタイプのメガヌクレアーゼを生み出した。これら新規の酵素が遺伝情報の喪失を導くDNA切断を可能にし、NHEJ経路が標的付けられた変異誘発を生じる。発明の簡単な要旨1つの実施形態において、本発明は、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断誘導変異誘発を増加させる方法に関し、そのことにより、ゲノム工学及び細胞株工学の新たなツールを提供する。より具体的には、第1の観点では、本発明は、遺伝情報の喪失を導き、NHEJによる興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止する、興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断誘導変異誘発を増加させる方法に関する。第2の観点では、本発明は、遺伝子操作された酵素、より特定的には、興味対象のゲノム遺伝子座内のDNA配列を標的し、該DNA配列の近辺で少なくとも1つのDNA二本鎖破断及び遺伝情報の喪失を生じさせることができ、よってNHEJによる前記興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼに関する。第3の観点では、本発明は、興味対象のゲノム遺伝子座で少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断の創出し、NHEJによる興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止する方法に関する。第4の観点では、本発明は、遺伝子操作された酵素、より特定的には、興味対象のゲノム遺伝子座内のDNA配列を標的して、該興味対象の遺伝子座で少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができ、よってNHEJによる前記興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止する遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼに関する。第5の観点では、本発明は、興味対象のゲノム遺伝子座で、融合タンパク質により、少なくとも2回の切断が可能なDNA標的配列を同定する方法を説明する。第6の観点では、本発明は、1つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列を、1つの頻繁切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列に近接して含んでなる興味対象のゲノム遺伝子座において、少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる融合タンパク質に関する。本発明はまた、この方法の実施に使用される特異的ベクター、組成物及びキットに関する。上記目的は、本発明の或る観点を強調するものである。本発明の追加の目的、観点及び実施形態は、以下の発明の詳細な説明に見出される。図面の簡単な説明前述の特徴に加え、本発明は、以下の説明及び添付の図面から明らかになる他の特徴を更に含んでなる。本発明のより完全な認識及び付随する利点の多くは、下記の詳細な説明と併せて図面を参照することによって更に理解されるので、容易に認識される。発明の詳細な説明下記で特に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術的及び科学的用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝子学及び分子生物学の分野における当業者が通常理解する意味と同義である。下記のものと類似の又は等価な全ての方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料が本明細書中に記載されている。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書に従う。更に、材料、方法及び例は単なる例示であって、別段の特定がない限り、限定を意図していない。本発明の実施は、別段の指示がない限り、当業者の能力の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の従来技法を用いる。このような技法は文献に十分に説明されている。例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiology;MolecularCloning:ALaboratoryManualThirdEdition;OligonucleotideSynthesis;Mullisら,米国特許第4683195号;NucleicAcidHybridization;TranscriptionAndTranslation;CultureOfAnimalCells;ImmobilizedCellsAndEnzymes;BPerbalAPracticalGuideToMolecularCloning;theseriesMethodsInENZYMOLOGY、具体的には第154巻及び第155巻及び第185巻,GeneExpressionTechnology;GeneTransferVectorsForMammalianCells;ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology;HandbookOfExperimentalImmunology,第I巻~第IV巻;及びManipulatingtheMouseEmbryoを参照。第1の観点によれば、本発明は、以下の工程:興味対象のゲノム遺伝子座で、1つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な少なくとも1つのDNA標的配列を同定する工程;興味対象のゲノム遺伝子座内の前記DNA標的配列の近辺に遺伝情報の喪失を創出するように前記少なくとも1つの稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程;及び前記DNA標的配列を前記少なくとも1つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させて、興味対象のゲノム遺伝子座内の前記DNA標的配列の周囲に前記遺伝情報の喪失を創出し、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程;を含んでなる、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断誘導変異誘発を増加させる方法である。好適な実施形態において、前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、別の酵素活性により、興味対象のゲノム遺伝子座中に1つのDNA二本鎖破断を創出し、遺伝情報の喪失を生じる。より好適な実施形態において、前記別の酵素活性はヌクレアーゼ活性である。別のより好適な実施形態において、前記別の酵素活性はエキソヌクレアーゼ活性である。この好適な実施形態において、前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、DNA端部を導き、そのためエキソヌクレアーゼ活性によりプロセシングされて遺伝情報の喪失を可能にし、前記興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止する、1つのDNA二本鎖破断を創出するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、DNA端部を導き、そのためヌクレアーゼ活性以外の酵素活性、デホスファターゼ活性によりプロセシングされる1つのDNA二本鎖破断を創出するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。好適な実施形態において、前記本発明の稀切断性エンドヌクレアーゼは、表2及び表3に示される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、Trex及びTdtからなる群より選択される触媒ドメイン、それらの機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼと、配列番号194のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号171~174及び配列番号197からなる群より選択される。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号201の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号201のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体と融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼと、配列番号201のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の観点において、本発明はまた、遺伝子操作された酵素、より特定的には、興味対象のゲノム遺伝子座内でDNA配列を標的することができるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼであって、該DNA配列の近辺に別の酵素活性により少なくとも1つのDNA二本鎖破断及び遺伝情報の喪失を生じさせ、よってNHEJによる前記興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止するように遺伝子操作されたキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼに関する。例えば、非限定例として、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、興味対象のゲノム遺伝子座内の標的付けられた配列で1つのDNA二本鎖破断を創出してDNA端部を導く稀切断性エンドヌクレアーゼと、該DNA端部をプロセシングして興味対象のゲノム遺伝子座で情報の喪失を生じさせ得るヌクレアーゼドメインとの間の融合タンパク質である。前記ヌクレアーゼドメインは、エキソヌクレアーゼドメインであり得る。別の非限定例として、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、興味対象のゲノム遺伝子座内の標的付けられた配列で1つのDNA二本鎖破断を創出してDNA端部を導く稀切断性エンドヌクレアーゼと、少なくとも1つのDNAフラグメントを付加し、無瘢痕再ライゲーションを防止することによって、該DNA端部をプロセシングして興味対象のゲノム遺伝子座で遺伝情報の喪失を生じさせ得るポリメラーゼ活性との間の融合タンパク質である。好適な実施形態において、前記本発明の稀切断性エンドヌクレアーゼは、表2及び表3に示される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、Trex及びTdtからなる群より選択される触媒ドメイン、それらの機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼと、配列番号194のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号171~174及び配列番号197からなる群より選択される。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号201の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号201のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体と融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼと、配列番号201のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。第3の観点において、本発明は、NHEJによる興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止するように、興味対象のゲノム遺伝子座での少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出する方法に関する。換言すれば、前記方法は、後記少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断が介在配列の除去を可能にし、興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを予防するように、少なくとも2つの近接する二本鎖破断を創出することができる少なくとも1つの二本鎖破断創出剤の導入による、前記興味対象のゲノム遺伝子座中への2つの近接するDNA二本鎖破断の創出を含んでなる。この第3の観点によれば、本発明は、以下の工程:前記興味対象のゲノム遺伝子座で、1つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列を同定する工程;前記少なくとも1つの稀切断性エンドヌクレアーゼを、興味対象のゲノム遺伝子座において少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができるように遺伝子操作する工程;前記DNA標的配列を前記少なくとも1つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させ、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程;を含んでなる方法に関する。この第3の観点の好適な実施形態において、本方法の前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、興味対象のゲノム遺伝子座において2つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる1つのキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼを提供するように遺伝子操作されている。この第2の観点の別の好適な実施形態において、本方法の前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、興味対象のゲノム遺伝子座において2より多い近接するDNA二本鎖破断を創出することができる1つのキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼを提供するように遺伝子操作されている;この好適な実施形態において、前記1つのキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、興味対象のゲノム遺伝子座において3つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる。好適な実施形態において、前記本発明の稀切断性エンドヌクレアーゼは、表2及び表3に示される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、ColicinE7、ITevI、NucA、NucM、SNase、BspD6Iからなる群より選択される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号84の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号84のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体と融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号54のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体と融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと、配列番号54のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号85~87及び配列番号91~93からなる群より選択される。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56及び57からなる群より選択される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号57の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体と融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと、配列番号56のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号57のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと、配列番号57のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号61~66及び配列番号70~75からなる群より選択される。この第3の観点の別の実施形態において、本発明は、2つの遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼを示唆し、以下の工程:興味対象のゲノム遺伝子座で、それぞれ1つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な2つの近接するDNA標的配列を同定する工程;興味対象のゲノム遺伝子座で第1のDNA二本鎖破断を創出することができる第1の稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程;興味対象のゲノム遺伝子座で第2のDNA二本鎖破断を創出することができる第2の稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程;前記DNA標的配列を前記2つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させ、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程;を含んでなる。好適な実施形態において、興味対象のゲノム遺伝子座でDNA配列をそれぞれ標的する前記2つの遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼは、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼではない。別の好適な実施形態において、興味対象のゲノム遺伝子座でDNA配列をそれぞれ標的する前記2つの遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼは、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、興味対象のゲノム遺伝子座でDNA配列をそれぞれ標的する前記2つの遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼの一方のみが、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。好適な実施形態において、前記興味対象のゲノム遺伝子座に誘導される前記少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断は、少なくとも12bp離間している。別の好適な実施形態において、前記興味対象のゲノム遺伝子座に誘導される前記少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断は、少なくとも20bp、50bp、100、200、500又は1000bp離間している。別の好適な実施形態において、前記興味対象のゲノム遺伝子座に誘導される前記少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断間の距離は、12bp~1000bp、より好ましくは12bp~500bp、より好ましくは12bp~200bpである。第4の観点において、本発明は、興味対象のゲノム遺伝子座内のDNA配列を標的することができる稀切断性エンドヌクレアーゼであって、前記興味対象の遺伝子座で、少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出して少なくともDNAフラグメントの除去を導き、よってNHEJによる該興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止するように遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼ、より特定的にはキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼに関する。好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、少なくとも2つの触媒ドメインを含んでなる。より好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、2つのヌクレアーゼドメインを含んでなる。換言すれば、本発明は、以下:i稀切断性エンドヌクレアーゼ;iiペプチド性リンカー;iiiヌクレアーゼ触媒ドメインを含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座に少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼに関する。好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、メガヌクレアーゼである;別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、ICreI由来メガヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、ICreIメガヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼである。より好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと少なくとも1つのヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合タンパク質である。前記より好適な実施形態において、前記ヌクレアーゼ触媒ドメインはエンドヌクレアーゼ活性を有する;或いは、前記ヌクレアーゼ触媒ドメインはエキソヌクレアーゼ活性を有する。好適な実施形態において、前記本発明の稀切断性エンドヌクレアーゼは、表2及び表3に示される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、Trex、コリシンE7、ITevI、NucA、NucM、SNase、BspD6Iからなる群より選択される触媒ドメイン、それらの機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと、配列番号145~149、配列番号97、配列番号106又は配列番号60、配列番号107~108、配列番号41及び112、配列番号43及び113、配列番号45~47及び116~118、配列番号124~125のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼと配列番号194のタンパク質とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号171~174及び配列番号197からなる群より選択される。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号84の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号84のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号54のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号85~87及び配列番号91~93からなる群より選択される。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56及び57からなる群より選択される触媒ドメイン、それらの機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号57の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号57のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号61~66及び配列番号70~75からなる群より選択される。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、第2のペプチド性リンカー及び追加の触媒ドメインを更に含んでなる。換言すれば、本発明は、以下:i稀切断性エンドヌクレアーゼ;iiペプチド性リンカー;iiiヌクレアーゼ触媒ドメインiv第2のペプチド性リンカーv追加の触媒ドメインを含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座に少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼに関する。好適な実施形態において、前記追加の触媒ドメインはヌクレアーゼドメインである;この場合、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、稀切断性エンドヌクレアーゼと2つのヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合タンパク質である。より好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと2つのヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合タンパク質である。別のより好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと1つのヌクレアーゼ触媒ドメインと1つの他の触媒ドメインとの融合タンパク質である。2つの近接する二本鎖破断を創出することができ、稀切断性エンドヌクレアーゼのDNA結合性ドメインと2つの他のヌクレアーゼ触媒ドメインとから構成されるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼもまた、本発明の範囲内に包含される。第5の観点において、本発明は、遺伝情報の喪失を少なくとも導き且つNHEJによる興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを予防する融合タンパク質により少なくとも2回切断可能なDNA標的配列を、当該興味対象のゲノム遺伝子座で同定する方法を記載する。より特定的には、この観点は、以下の工程:興味対象のゲノム遺伝子座で、1つの頻繁切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列に近接する1つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列を同定する工程;前記稀切断性エンドヌクレアーゼを、興味対象のゲノム遺伝子座において1つのDNA二本鎖破断を創出することができるように遺伝子操作する工程;前記稀切断性エンドヌクレアーゼと前記頻繁切断性エンドヌクレアーゼとの融合タンパク質を作製する工程;前記DNA標的配列を前記融合タンパク質と接触させて少なくとも2つの近接する二本鎖破断を創出し、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程;を含んでなる、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断誘導変異誘発を増加させる方法である。第6の観点において、本発明は、1つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列を、1つの頻繁切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列に近接して含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座中に少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる融合タンパク質に関する。換言すれば、本発明は、以下:i稀切断性エンドヌクレアーゼ;iiペプチド性リンカー;ii頻繁切断性エンドヌクレアーゼを含んでなる融合タンパク質に関する。好適な実施形態において、前記融合タンパク質の前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、メガヌクレアーゼである;別の好適な実施形態において、前記融合タンパク質の前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、ICreI由来メガヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記融合タンパク質の前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、ICreIメガヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記更なる融合タンパク質は、第2のペプチド性リンカー及び追加の触媒ドメインを含んでなる。換言すれば、本発明は、1つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列を、1つの頻繁切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な1つのDNA標的配列に近接して含んでなり、前記融合タンパク質が以下:i稀切断性エンドヌクレアーゼ;iiペプチド性リンカー;ii頻繁切断性エンドヌクレアーゼ;iv第2のペプチド性リンカー;v追加の触媒ドメインを含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座中に少なくとも2つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる融合タンパク質に関する。好適な実施形態において、前記追加の触媒ドメインはヌクレアーゼドメインである。別の好適な実施形態において、前記追加の触媒ドメインは非ヌクレアーゼ触媒ドメインである。本発明はまた、本発明のエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド、それらをコード及び又はベクター化する特異的ベクター、それらを含んでなる組成物及び又はキットに関する。これらの全ては、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断誘導変異誘発を増大させる本発明の方法の全体又は一部の実施に使用される。このようなキットは、細胞における二本鎖破断誘導変異誘発の増大に使用するための指示書、パッケージング材、成分のための1又はそれより多い容器及び二本鎖破断誘導変異誘発の増大に使用するその他の構成要素を含有し得る。定義-ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書中では一文字コードに従って指称する。一文字コードでは、例えば、QはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。-アミノ酸置換は、或るアミノ酸残基の別のアミノ酸残基での置き換えを意味し、例えば、ペプチド配列におけるアルギニン残基のグルタミン残基での置き換えはアミノ酸置換である。-変更増強増大改善した切断活性とは、標的DNA配列に対する第1のメガヌクレアーゼの活性との比較において、第2のメガヌクレアーゼによる当該標的DNA配列に対するメガヌクレアーゼ切断活性の検出レベルの増加をいう。通常、第2のメガヌクレアーゼは、第1のもののバリアントであり、第1のメガヌクレアーゼと比較して1又はそれより多い置換アミノ酸残基を含んでなる。-ヌクレオチドは下記のとおり指称する:ヌクレオシドの塩基を指称するために一文字コードを使用する:aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドに関しては、rはg又はaを表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はcを表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。-メガヌクレアーゼにより、12~45bpの二本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼが意図される。メガヌクレアーゼは、各ドメインが単量体上にある二量体酵素であるか、又は2つのドメインを単一ポリペプチド上に含んでなる単量体酵素である。-メガヌクレアーゼドメインにより、メガヌクレアーゼのDNA標的の一方の半分と相互作用する領域であって、該DNA標的の他方の半分と相互作用する他方のドメインと会合して該DNA標的を切断し得る機能的メガヌクレアーゼを形成することができる領域が意図される。-メガヌクレアーゼバリアント又はバリアントにより、親メガヌクレアーゼのアミノ酸配列中の少なくとも1つの残基を異なるアミノ酸で置き換えることで得られるメガヌクレアーゼが意図される。バリアントとしては、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又はそれより多いアミノ酸残基の置換を有するものが挙げられる。このようなバリアントは、ベースの又は親のメガヌクレアーゼ配列に対して75、80、85、90、95、975、98、99、995又はそれより多い相同性又は同一性を有し得る。-ペプチドリンカー、ペプチド性リンカー又はペプチドスペーサーは、融合タンパク質における異なる単量体の接続及び該融合タンパク質の活性のための正確なコンホメーションの採用を可能し、且つ標的に関していずれの単量体の特異性も変更しないペプチド配列を意味するものとする。ペプチドリンカーは種々のサイズであり得る。このようなペプチド性リンカーの非限定例を表1に示す。-に関連するにより、前記選択した細胞タイプ又は前記選択した生物と特徴を共有する細胞タイプ又は生物が意図される;選択した細胞タイプ又は生物に関連するこの細胞タイプ又は生物は、前記選択した細胞タイプ又は生物に由来することもあり、しないこともある。-サブドメインにより、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域であって、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的のハーフ部位の別個の部分と相互作用する領域が意図される。-ターゲティングDNA構築物最小修復マトリクス修復マトリクスは、インサイチュでDNA標的の5側領域及び3側領域に相同である第1及び第2の部分を含んでなるDNA構築物を意味するものとする。DNA構築物はまた、第1の部分と第2の部分との間に位置し、インサイチュで対応するDNA配列と幾らかの相同性を有するか、或いはインサイチュでDNA標的の5側領域及び3側領域と相同性を有さない第3の部分を含んでなる。DNA標的の切断後、興味対象の遺伝子座に含まれる標的付けられた遺伝子を含有するゲノムと修復マトリクスとの間で相同組換え事象が刺激される。ここで、DNA標的を含有するゲノム配列は、修復マトリクスの第3の部分並びに修復マトリクスの第1及び第2の部分の一部分で置き換わる。-機能的バリアントにより、DNA標的配列を切断し得るバリアントが意図される。好ましくは、前記標的は親メガヌクレアーゼにより切断されない新たな標的である。例えば、このようなバリアントは、DNA標的配列と接触するか又は該DNA標的と直接若しくは間接に相互作用する位置にアミノ酸変化を有する。-選択は、観察した特定の表現型に基づく1又はそれより多いメガヌクレアーゼバリアントの単離を意味するものとする。この選択は、観察がなされるペプチド形態のバリアントの選択であり得、或いは選択したメガヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチドの選択であり得る。-スクリーニングは、特定の表現型を示す1又はそれより多いメガヌクレアーゼバリアントの逐次又は同時の選択を意味するものとする。-に由来は、親メガヌクレアーゼから創られ、したがってそのペプチド配列が当該親メガヌクレアーゼのペプチド配列に関連するが、該配列から得られるメガヌクレアーゼバリアントを意味するものとする。-ICreIにより、配列表の配列番号1の配列に相当する、pdbアクセッションコード1g9yの配列を有する野生型ICreIが意図される。-新規な特異性を有するICreIバリアントにより、親メガヌクレアーゼのものとは異なる切断標的パターンを有するバリアントが意図される。互いに等価であり同様に使用される用語新規な特異性、改変された特異性、新規切断特異性、新規基質特異性とは、DNA標的配列のヌクレオチドに対するバリアントの特異性をいう。本特許出願において、記載される全てのICreIバリアントは、配列番号195に示されるように、野生型ICreI配列の第1メチオニンの後に、追加のアラニンを含んでなる。これらバリアントはまた、野生型ICreI配列の最後のプロリンの後に、2つの追加のアラニン残基及びアスパラギン酸残基を含んでなる。これら追加の残基は、当該酵素の性質に影響しない。混乱を回避するために、これら追加の残基は、本特許出願において言及するICreI又はバリアント中の残基の番号付けには影響しない。なぜならば、これらへの言及は、専ら、バリアント中に存在する野生型ICreI酵素の残基をいうからである。例えば、ICreIの残基2は、実際には、最初のメチオニンの後に追加のアラニンを含んでなるバリアントの残基3である。-ICreI部位により、ICreIによって切断される22~24bpの二本鎖DNA配列が意図される。ICreI部位には、野生型非パリンドロームICreIホーミング部位及びC1221とも呼ばれる配列5t12c11a10a9a8a7c6g5t4c3g2t1a1c2g3a4c5g6t7t8t9t10g11a12のような派生パリンドローム配列が含まれる。-ドメイン又はコアドメインにより、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼに特徴的なαββαββαフォールドであるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが意図される。当該ドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する、逆平行βシートに折り畳まれた4つのβ鎖を含んでなる。このドメインは、前記DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断し得る機能的エンドヌクレアーゼを形成することができる。例えば、二量体ホーミングエンドヌクレアーゼICreIの場合には、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基6~94に相当する。-サブドメインにより、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域であって、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的のハーフ部位の異なる部分と相互作用する領域が意図される。-キメラDNA標的又はハイブリッドDNA標的により、2つの親メガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合体が意図される。加えて、この標的の少なくとも一方の半分は、少なくとも2つの別個のサブドメインにより結合されたヌクレオチドの組合せを含んでなり得る。この定義には、本発明に従うキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼにより認識される、稀切断性エンドヌクレアーゼ標的配列及び頻繁切断性エンドヌクレアーゼ標的配列を含んでなるDNA標的配列も包含される。-βヘアピンにより、ループ又はターンにより接続された、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの連続する2つのβストランドの逆平行βシートが意図される。-単鎖メガヌクレアーゼ、単鎖キメラメガヌクレアーゼ、単鎖メガヌクレアーゼ誘導体、単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体又は単鎖誘導体により、WO2009095793に記載のようなペプチド性スペーサーにより連結された2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメイン又はコアドメインを含んでなるメガヌクレアーゼが意図される。単鎖メガヌクレアーゼは、親メガヌクレアーゼ標的配列の各々からの異なる1つの半分を含んでなるキメラDNA標的配列を切断することができる。-DNA標的、DNA標的配列、標的配列、標的部位、標的、部位、興味対象部位、認識部位、ポリヌクレオチド認識部位、認識配列、ホーミング認識部位、ホーミング部位、切断部位により、ICreIのようなLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ若しくはバリアント又はICreIに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼで認識切断される20~24bpのパリンドローム状、部分的パリンドローム状又は非パリンドローム状の二本鎖ポリヌクレオチド配列が意図される。このDNA標的配列は、ゲノム配列内で認識されたときにエンドヌクレアーゼで切断可能であることに適格であり、所与のエンドヌクレアーゼ又はそのバリアントのDNA標的配列に相当することが知られている。これら用語は、メガヌクレアーゼにより二本鎖破断が誘導される独特のDNA位置、好ましくはゲノム位置に言及するものである。DNA標的は、C1221について上記で示したように、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5→3配列で定義される。DNA標的の切断は、センス鎖及びアンチセンス鎖についてそれぞれ2位及び2位のヌクレオチドで生じる。そうでないと記載しない限り、ICreIメガヌクレアーゼバリアントによるDNA標的の切断が生じる位置は、DNA標的のセンス鎖上の切断部位に相当する。-DNA標的ハーフ部位、ハーフ切断部位又はハーフ部位により、各々のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが結合する、DNA標的の部分が意図される。-キメラDNA標的又はハイブリッドDNA標的により、2つの親メガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合体が意図される。加えて、この標的の少なくとも一方の半分は、少なくとも2つの別個のサブドメインが結合したヌクレオチドの組合せを含んでなり得る。-用語エンドヌクレアーゼとは、DNA又はRNA分子内、好ましくはDNA分子内の核酸同士間の結合の加水分解を触媒し得る任意の野生型の又はバリアントの酵素をいう。エンドヌクレアーゼは、DNA又はRNA分子をその配列とは無関係に切断せず、DNA又はRNA分子を、標的配列又は標的部位と呼ばれる特異的なポリヌクレオチド配列で認識切断する。エンドヌクレアーゼは、代表的には約12~45塩基対長の、より好ましくは14~45bp長のポリヌクレオチド認識部位を有するとき、稀切断性エンドヌクレアーゼとして分類され得る。稀切断性エンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座でのDNA二本鎖破断を誘導することによってHRを有意に増加させる。稀切断性エンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、遺伝子操作されたジンクフィンガードメインとFokIのような制限酵素の触媒ドメインとの融合から生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は化学的エンドヌクレアーゼであり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいて、化学的又はペプチド性切断物質は、特異的標的配列を認識する核酸ポリマー又は別のDNAに結合されて、切断活性を特異的配列に対して標的付けられている。化学的エンドヌクレアーゼはまた、オルトフェナントロリンとDNA切断性分子と三重鎖形成性オリゴヌクレオチドとの結合体のような合成ヌクレアーゼを包含する。このような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による用語エンドヌクレアーゼに含まれる。稀切断性エンドヌクレアーゼはまた、例えば、FokI触媒ドメイン及びXanthomonas属の植物病原因子による感染プロセスで使用されるタンパク質ファミリーである転写アクチベーター様エフェクターに由来するDNA結合性ドメインを用いる新たなクラスのキメラヌクレアーゼである、TALENであり得る。FokIベースのTALEヌクレアーゼの機能的レイアウトは、本質的には、ジンクフィンガーDNA結合性ドメインがTALEドメインで置き換えられているZFNの機能的レイアウトである。このように、TALENによるDNA切断には、非特異的中心領域に接する2つのDNA認識領域が必要である。本発明に包含される稀切断性エンドヌクレアーゼはまた、TALENに由来し得る。稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは当該分野で周知である。ホーミングエンドヌクレアーゼはDNA標的配列を認識し、一本鎖又は二本鎖破断を生じさせる。12~45塩基対長、通常は14~40bp長のDNA標的部位を認識するホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的である。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ又はGIYYIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。二本鎖破断創出因子のような表現が、本発明による稀切断性エンドヌクレアーゼを適格にするために用いられ得る。野生では、メガヌクレアーゼは、本質的には、ホーミングエンドヌクレアーゼに代表される。ホーミングエンドヌクレアーゼは、数百のタンパク質ファミリーを含む天然メガヌクレアーゼの広範なファミリーである。これらタンパク質は、ホーミングと呼ばれるプロセスによって伝播する可動遺伝子エレメントによりコードされる:エンドヌクレアーゼは、可動エレメントが存在しない同族対立遺伝子を切断することにより、レシピエント遺伝子座に可動DNAを複製する相同組換え事象を刺激する。エンドヌクレアーゼは、効力及び特異性に関する例外的な切断特性を考えれば、新規で高度に特異的なエンドヌクレアーゼを誘導するための理想的な足場を努め得る。HEは4つの主要なファミリーに属する。LAGLIDADGファミリーは、最も広範で、最も特徴付けられた群である。現在、7つの構造が利用可能である。このファミリーのほとんどのタンパク質は単量体であり、2つのLAGLIDADGモチーフを提示する一方で、少数のものは唯1つのモチーフを有し、よって二量体化してパリンドローム又は偽パリンドロームの標的配列を切断する。LAGLIDADGペプチドがそのファミリーメンバー内で保存された唯一の領域ではあるが、これらタンパク質は非常に類似する構造を有する。触媒コアは、ホモ二量体、例えばICreI、IMsoI及びICeuIに関しては完全な二回転対称であり、単量体、例えばISceI、IDmoI又はIAniIに関しては偽対称である2つのDNA結合性ドメインに挟まれている。両単量体とも又は両ドメインとも、二価カチオンの周辺に組織化される触媒コアに寄与する。触媒コアの直ぐ上部で、2つのLAGLIDADGペプチドはまた、二量体化界面において本質的な役割を果たしている。DNA結合は、DNA主要溝上に位置する2つの典型的なサドル形状のαββαββαフォールドに依存する。その他のドメインは、例えば、PIPfuI及びPISceIのようなインテイン中に見出すことができ、このタンパク質スプライシングドメインもまたDNA結合に関与する。N末端IDmoIドメインとICreI単量体との融合による機能的なキメラメガヌクレアーゼの作製は、LAGLIDADGタンパク質の可塑性を証明している;国際PCT出願WO03078619及びWO2004031346。異なるグループもまた、ICreI;国際PCT出願WO2006097784、WO2006097853、WO2007060495及びWO2007049156;、ISceI、PISceI及びIMsoIの特異性を局所的に変更する半合理的アプローチを使用している。加えて、局所的に変更した特異性を有する数百のICreI誘導体が、半合理的アプローチ及び高スループットスクリーニングを組み合わせることにより人工的に創り出された:-ICreIの残基Q44、R68及びR70、又はQ44、R68、D75及びI77が変異誘発され、DNA標的の±3~5位で変更した特異性を有するバリアントの一団がスクリーニングにより同定された;。-ICreIの残基K28、N30及びQ38、又はN30、Y33及びQ38、又はK28、Y33、Q38及びS40が変異誘発され、DNA標的の±8~10位で変更した特異性を有するバリアントの一団がスクリーニングにより同定された;国際PCT出願WO2007060495及びWO2007049156。2つの異なるバリアントを組み合わせて、各バリアントDNA標的配列の異なる2つの半分の融合から生じたキメラ標的を切断し得る機能的なへテロ二量体エンドヌクレアーゼに組み立てた;国際PCT出願WO2006097854及びWO2007034262。更に、ICreIの残基28~40及び44~77は、ホーミングエンドヌクレアーゼの標的ハーフ部位の異なる部分に結合し得る2つの部分的に分離可能な機能的サブドメインを形成していることが示された;国際PCT出願WO2007049095及びWO2007057781。ICreIの同じ単量体内の2つのサブドメインからの変異を組み合わせることにより、各サブドメインが結合する±3~5位及び±8~10位のヌクレオチドを含んでなるパリンドロームの組合せDNA標的配列を切断し得る新規キメラ分子の設計が可能になった;国際PCT出願WO2007049095及びWO2007057781。メガヌクレアーゼバリアントを製造する方法及び哺乳動物細胞又は酵母細胞における切断誘導組換えに基づくアッセイは、国際PCT出願WO2004067736;に記載されている。これらアッセイは、標準的な方法によりモニターすることができる機能的なLacZレポーター遺伝子を生じる。前の2つの工程の組合せにより、4つの異なるサブドメインを含むより大きなコンビナトリアルアプローチが可能になる。この異なるサブドメインは別々に改変されて、選択された特異性を有する完全に再設計されたメガヌクレアーゼバリアントが得られるように組み合わされる。第1の工程において、新規なメガヌクレアーゼの二者一組が、切断したい標的に由来するパリンドローム状標的を切断する新たな分子に組み合わされる。その後、このハーフメガヌクレアーゼを組み合せることで、興味対象の標的を切断するへテロ二量体種が生じ得る。4セットの変異の、モデル標的配列又は異なる遺伝子からの配列を切断するへテロ二量体エンドヌクレアーゼへの組立てが、以下のCellectisの国際特許出願:XPC遺伝子、RAG遺伝子、HPRT遺伝子、β2ミクログロブリン遺伝子、Rosa26遺伝子、ヒトヘモグロビンβ遺伝子及びヒトインターロイキン2レセプターγ鎖遺伝子に記載されている。これらバリアントは、真性の染色体配列を切断するために用いることができ、遺伝子治療を含むいくつかの分野において、新しい展望のための道を切り開く。このようなエンドヌクレアーゼの例としては、ISceI、IChuI、ICreI、ICsmI、PISceI、PITliI、PIMtuI、ICeuI、ISceII、ISceIII、HO、PICivI、PICtrI、PIAaeI、PIBsuI、PIDhaI、PIDraI、PIMavI、PIMchI、PIMfuI、PIMflI、PIMgaI、PIMgoI、PIMinI、PIMkaI、PIMleI、PIMmaI、PIMshI、PIMsmI、PIMthI、PIMtuI、PIMxeI、PINpuI、PIPfuI、PIRmaI、PISpbI、PISspI、PIFacI、PIMjaI、PIPhoI、PITagI、PIThyI、PITkoI、PITspI、IMsoIが挙げられる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、例えばISceI、ICreI、ICeuI、IMsoI及びIDmoIであり得る。前記LAGLIDADGエンドヌクレアーゼは、2つのLAGLIDADGモチーフを含有し単量体として機能し、且つその分子量が唯一のLAGLIDADGモチーフを含有しホモ二量体として機能するICreIのような他のファミリーメンバーの分子量の約2倍であるファミリーのメンバーであるISceIであり得る。本出願で言及するエンドヌクレアーゼは、野生型及びバリアントのエンドヌクレアーゼの両方を包含する。本発明によるエンドヌクレアーゼは、バリアントエンドヌクレアーゼ、すなわち天然には存在せず、遺伝子工学的操作又はランダム変異誘発により得られるエンドヌクレアーゼ、すなわち遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼであり得る。このバリアントエンドヌクレアーゼは、例えば、野生型の、天然に生じるエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列における少なくとも1つの残基の異なるアミノ酸での置換により得ることができる。前記置換は、例えば、部位特異的変異誘発及び又はランダム変異誘発により導入することができる。本発明の枠内で、このようなバリアントエンドヌクレアーゼは依然として機能的である。すなわち、それらは、標的配列を認識し、特異的に切断して遺伝子ターゲッティングプロセスを開始する能力を保持する。本発明によるバリアントエンドヌクレアーゼは、対応する野生型エンドヌクレアーゼの標的配列とは異なる標的配列を切断する。新規特異性を有するこのようなバリアントエンドヌクレアーゼを取得する方法は、当該分野において周知である。エンドヌクレアーゼバリアントは、ホモ二量体であってもよいし、へテロ二量体であってもよい。新規特異性を有するエンドヌクレアーゼは、遺伝子を標的することにより興味対象の導入遺伝子をゲノム中に所定の位置で組み込む、本発明による方法において使用することができる。-親のメガヌクレアーゼは、野生型メガヌクレアーゼ又は該野生型メガヌクレアーゼの同一の性質を有するバリアント、或いは同じメガヌクレアーゼの野生型バージョンと比較して幾らか変更した特徴を有するメガヌクレアーゼを意味するものとする。本発明において、親のメガヌクレアーゼとは、工程において第1シリーズのバリアントが由来する当初のメガヌクレアーゼ、又は工程において第2シリーズのバリアントが由来するメガヌクレアーゼ、又は工程において第3シリーズのバリアントが由来するメガヌクレアーゼをいうことができる。-送達ベクターにより、本発明で必要とされる因子化学物質及び分子を細胞に接触させるか又は細胞内若しくは細胞区画内へ送達するために、本発明において使用することができる任意の送達ベクターが意図される。これには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬剤送達ベクター、化学キャリア、ポリマーキャリア、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、超微粒気泡、ナノ粒子、エマルジョン又は他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これら送達ベクターは、分子、化学物質、高分子、又は他のベクター、例えばプラスミド、Diatosにより開発されたペプチドの送達を可能にする。これらの場合において、送達ベクターは分子キャリアである。送達ベクターにより、トランスフェクションを実行するための送達方法もまた意図される。-用語ベクターとは、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。本発明におけるベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半合成若しくは合成の核酸からなり得る線状若しくは環状のDNA若しくはRNA分子が挙げられるが、これらに限定されない。好適なベクターは、自律複製及び又は連結された核酸の発現が可能なものである。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルソミクソウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、及び二本鎖DNAウイルス、及びポックスウイルスを含むが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては:トリ白血病肉腫群、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLVBLV群、レンチウイルス、スプマウイルスが挙げられる。-レンチウイルスベクターは、比較的大きなパッケージング能力、低い免疫原性及び広範囲の異なる細胞タイプを高効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達に非常に有望であるHIVベースのレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、通常、産生細胞中への3つ又はそれより多いプラスミドの一過性トランスフェクション後に生じる。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面上のレセプターとの相互作用により標的細胞に進入する。進入に際して、ウイルスRNAは、ウイルス逆転写酵素複合体により媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は二本鎖線状ウイルスDNAであり、これが感染細胞のDNAへのウイルス組込みのための基質である。-組込みレンチウイルスベクターは、非限定例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るベクターを意味する。-対して、非組込みレンチウイルスベクターは、ウイルスインテグラーゼの作用により標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。好適なベクターの1つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。好適なベクターは、自律複製及び又は連結された核酸の発現が可能なものである。作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができるベクターは、本明細書中で発現ベクターと呼ぶ。本発明によるベクターは、YAC、BAC、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半合成若しくは合成のDNAからなり得る線状若しくは環状のDNA若しくはRNA分子を含むが、これらに限定されない。一般には、組換えDNA技法に有用な発現ベクターは、しばしば、一般には環状二本鎖DNAループをいうプラスミドの形態である。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。ベクターは選択マーカーを含み得る。例えば:真核細胞培養については、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、及びヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ;ScerevisiaeについてはTRP1;Ecoliにおいてはテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性。好ましくは、前記ベクターは、興味対象のポリペプチドをコードする配列が該ポリペプチドの産生又は合成を可能にするに適切な転写及び翻訳制御エレメントの制御下に配置されている発現ベクターである。したがって、前記ポリヌクレオチドは発現カセットに含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、前記コーディングポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位及び転写終止部位を含んでなる。これはまた、エンハンサー又はサイレンサーエレメントを含んでなり得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドを発現させる細胞に依存する。適切なプロモーターとしては、組織特異的及び又は誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例は:重金属レベルの増大により誘導される真核生物性メタロチオニンプロモーター、イソプロピルβDチオガラクトピラノシドに応答して誘導される原核生物性lacZプロモーター及び温度上昇により誘導される真核生物性熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺特異的抗原、αアンチトリプシンプロテアーゼ、ヒトサーファクタントA及びBタンパク質、βカゼイン及び酸性ホエータンパク質遺伝子である。-誘導性プロモーターは、病原体又はストレスにより、より好ましくは低温、高温、UV光、又は高イオン濃度のようなストレスにより誘導され得る。誘導性プロモーターは化学物質により誘導され得る;;;で概説される。送達ベクター及びベクターは、ソノポレーション若しくはエレクトロポレーションのような任意の細胞透過技法又はこれら技法の派生法と組み合わされ得る。-細胞により、任意の原核生物又は真核生物の生存細胞、インビトロ培養用にこれら生物から導いた細胞株、動物又は植物起源の初代細胞が意図される。-初代細胞により、非常に少数のものしか分裂を経験していないので、連続分裂性の又は人工的に不死化した細胞株と比較して、由来する組織の主要な機能的構成要素及び特徴をより代表する、生存組織から直接取り出し、インビトロ増殖用に樹立した細胞が意図される。よって、これら細胞は、言及するインビボ状態についてより価値のあるモデルである。-本発明の枠内で、真核細胞とは、真菌、植物若しくは動物細胞又は下記に列挙する生物に由来するインビトロ培養用に樹立した細胞株をいう。より好ましくは、真菌は、アスペルギルス属、ペニシリウム属、アクレモニウム属、トリコデルマ属、クリソスポリウム属、モルティエレラ属、クルイベロマイセス属又はピキア属のものである;より好ましくは、真菌は、アスぺルギルスニガー、アスペルギルスニデュランス、アスペルギルスオリゼ、アスペルギルステレウス、ペニシリウムクリソゲナム、ペニシリウムシトリヌム、アクレモニウムクリソゲナム、トリコデルマリーゼイ、モルティエレラアルペン、クリソスポリウムルクノウェンス、クルイベロマイセスラクティス、ピキアパストリス又はピキアシフェリイである。より好ましくは、植物は、アラビドプシス属、タバコ属、ナス属、アキノノゲシ属、アブラナ属、イネ属、アスパラガス属、エンドウ属、ウマゴヤシ属、トウモロコシ属、オオムギ属、ライムギ属、コムギ属、トウガラシ属、キュウリ属、カボチャ属、スイカ属、ミカン属、モロコシ属のものである;より好ましくは、植物は、次の種:シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ジャガイモ、ナス、トマト、レタス、セイヨウアブラナ、ヤセイカンラン、ブラッシカラパ、アフリカイネ、イネ、アスパラガス、エンドウ、ムラサキウマゴヤシ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、パンコムギ、デュラムコムギ、カプシカムサティバス、ペポカボチャ、スイカ、メロン、ライム、ザボン、シトロン、マンダリンのものである。より好ましくは、動物細胞は、ヒト属、クマネズミ属、ハツカネズミ属、イノシシ属、ウシ属、ダニオ属、イヌ属、ネコ属、ウマ属、タイセイヨウサケ属、タイヘイヨウサケ属、ヤケイ属、シチメンチョウ属、ショウジョウバエ属、カエノラブディティス属のものである;より好ましくは、動物細胞は、次の種:ヒト、ドブネズミラット、ハツカネズミ、イノシシ、ウシ、ゼブラフィッシュ、タイリクオオカミ、イエネコ、ウマ、タイセイヨウサケ、ニジマス、セキショクヤケイ、シチメンチョウ、キイロショウジョウバエ、カエノラブディティスエレガンスのものである。-相同により、別の配列と、配列間での相同組換えを導くに充分な同一性を有する配列、より具体的には少なくとも95同一性、好ましくは97同一性、より好ましくは99の同一性を有する配列が意図される。-同一性とは、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、比較のために整列させ得る各配列中の位置を比較して決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、それら分子は、当該位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一の又は適合するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び又はプログラムの一部として利用可能であるFASTA又はBLASTを含むを使用して、2つの配列間の同一性を算出してもよく、例えばデフォルト設定で使用することができる。-変異により、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又はそれより多いヌクレオチドアミノ酸の置換、欠失、挿入が意図される。変異は、遺伝子のコーディング配列又はその調節配列に影響することがある。これはまた、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造安定性に影響し得る。-本発明の枠内で、表現二本鎖破断誘導変異誘発とは、エンドヌクレアーゼの切断部位で挿入欠失を導く、エンドヌクレアーゼ誘導DSB後のNHEJ事象に続く変異誘発事象をいう。-遺伝子は、特定のタンパク質又はタンパク質セグメントをコードする、染色体に沿って直鎖状様式で整列したDNAセグメントからなる、遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、代表的には、プロモーター、5非翻訳領域、1又はそれより多いコーディング配列、任意にイントロン、3非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー及び又はサイレンサーを更に含んでなり得る。-本明細書中で使用する場合、用語導入遺伝子とは、ポリペプチドをコードする配列をいう。好ましくは、導入遺伝子によりコードされるポリペプチドは、該導入遺伝子を挿入する細胞、組織又は個体中で発現していないか、又は発現しているが生物学的に活性でない。最も好ましくは、導入遺伝子は、個体の治療に有用である治療用ポリペプチドをコードする。-用語興味対象の遺伝子又はGOIとは、既知又は推定の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列をいう。-本明細書中で使用する場合、用語遺伝子座は、染色体上でのDNA配列の特定の物理的位置である。用語遺伝子座とは、通常、染色体上でのエンドヌクレアーゼの標的配列の特定の物理的位置をいう。本発明に従うエンドヌクレアーゼにより認識切断される標的配列を含んでなる遺伝子座は、本発明による遺伝子座と呼ぶ。また、表現興味対象のゲノム遺伝子座は、本発明による二本鎖破断の推定の標的であり得るゲノム中の核酸配列を言うために使用する。興味対象の内因性ゲノム遺伝子座により、ゲノム中の天然型核酸配列、すなわち、このゲノム遺伝子座に天然に存在する配列又はこの配列の対立遺伝子バリエーションが意図される。考えられる本発明の興味対象のゲノム遺伝子座は2つのオーバーラップする遺伝子間であり得、考えられるエンドヌクレアーゼの標的配列は2つの異なる遺伝子中に位置すると理解される。考えられる本発明の興味対象のゲノム遺伝子座は、細胞の遺伝物質本体中に存在する核酸配列だけでなく、前記遺伝物質本体とは独立して存在し得る遺伝物質の一部、例えばプラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン中又は非限定例としてミトコンドリア若しくは葉緑体のような細胞小器官中に存在する核酸配列をもいうと理解される。-表現遺伝情報の喪失により、興味対象のゲノム遺伝子座内で、本発明のエンドヌクレアーゼの認識部位に隣接し、該エンドヌクレアーゼ切断性部位の近辺で元の配列の変化を導く、少なくとも1つの所与のDNAフラグメント又は配列の消去又は付加が理解される。この遺伝情報の喪失は、非限定例として、2つのエンドヌクレアーゼ切断性部位の間の介在配列の消去であり得る;これはまた、別の非限定例として、独特なエンドヌクレアーゼDNA二本鎖破断後のエキソヌクレアーゼDNA端部プロセッシング活性の結果であり得る。この最後の場合では、興味対象のゲノム遺伝子座内の遺伝情報の喪失は、前記DNA標的配列の近辺、すなわち参照とされるエンドヌクレアーゼ切断性部位の近辺で生じる。これはまた、他の非限定例において、独特なエンドヌクレアーゼDNA二本鎖破断後の他の酵素、脱リン酸酵素活性によるDNA末端プロセッシング活性の結果であり得る。-表現興味対象のゲノム遺伝子座内での2つの近接するDNA二本鎖破断は、12bp~1000bp離れた2つのエンドヌクレアーゼ切断性部位を意味する。-無瘢痕再ライゲーションにより、二本鎖破断事象の創出後のNHEJプロセスによる、DNA破断端部の遺伝情報の喪失なしの、完璧な再ライゲーション事象が意図される。本発明は、このような無瘢痕再ライゲーションプロセスを回避することにより二本鎖破断媒介変異誘発を増加させる方法に関する。-融合タンパク質により、元来は別個のタンパク質をコードする2又はそれより多い遺伝子の連結から本質になる当該分野における周知プロセスの結果が意図される。前記融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一ポリペプチドを生じる。-キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、稀切断性エンドヌクレアーゼを含んでなる任意の融合タンパク質を意味する。該稀切断性エンドヌクレアーゼは、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼのN末端部分であり得る;反対に、稀切断性エンドヌクレアーゼは、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼのC末端部分であってもよい。2つの触媒ドメインを含んでなる本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、二機能性又は二機能性メガヌクレアーゼと説明することができる。2より多い触媒ドメインを含んでなる本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、多機能性又は多機能性メガヌクレアーゼと説明することができる。非限定例として、本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、稀切断性エンドヌクレアーゼと1つの触媒ドメインとの融合タンパク質であり得る;本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼはまた、稀切断性エンドヌクレアーゼと2つの触媒ドメインとの融合タンパク質であり得る。前記のように、本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、2つの同一の単量体のいずれか、2つの非同一の単量体のいずれか、又は単鎖メガヌクレアーゼを含んでなるメガヌクレアーゼであり得る。本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの稀切断性エンドヌクレアーゼ部分はまた、稀切断性エンドヌクレアーゼのDNA結合性ドメインであり得る。他の非限定例において、本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼ、すなわち、転写アクチベータ様エフェクターに由来するDNA結合性ドメインと1つ又は2つの触媒ドメインとの間の融合体に由来し得る。-頻繁切断性エンドヌクレアーゼにより、代表的には約4~8塩基対長、より好ましくは4~6bp長のポリヌクレオチド認識部位を有するエンドヌクレアーゼが意図される。-TALEヌクレアーゼにより、転写アクチベータ様エフェクターに由来するDNA結合性ドメインと、二量体化してDNA標的配列を切断する活性実体を形成するに必要である1つのFokI触媒ドメインとからなる融合タンパク質が意図される。-触媒ドメインにより、酵素の活性部位を含有するタンパク質ドメイン又はモジュールが意図される;活性部位により、基質の触媒反応が起きる酵素の部分が意図される。酵素は、触媒する反応により分類され名付けられる。EnzymeCommission番号は、触媒する化学反応に基く酵素用の番号分類スキームである。本発明の範囲では、任意の触媒ドメインを稀切断性エンドヌクレアーゼと融合させて、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼを作製することができる。このような触媒ドメインの非限定例を表2及び表3に、参照としてのGenBank又はNCBI又はUniProtKBSwissProt番号と共に示す。-ヌクレアーゼ触媒ドメインにより、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ酵素の活性部位を含んでなるタンパク質ドメインが意図される。このような触媒ドメインの非限定例を表2及び表3に、参照としてのGenBank又はNCBI又はUniProtKBSwissProt番号と共に示す。本発明の上記説明は、当業者が本発明の対象を製造し使用することができるように、その様式及び方法を提供する。この実施可能性は、特に、添付の特許請求の範囲の主題について提供される。上記で使用するように、句からなる群より選択される、から選択されるなどは、特定されたものの組合せを含む。本明細書中で数値限定又は範囲に言及する場合には終点は含まれる。また、数値限定内の全ての値又は部分的範囲は、あたかも明示的に記載されているように明確に含まれる。上記の説明は、当業者が本発明の対象を作製し、使用することができるように提示されており、特定の適用及びその要件に関して提供されている。好適な実施形態の種々の改変が、当業者に容易に明らかとなる。本明細書中で規定される包括的原理は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、他の実施形態及び応用に適用され得る。よって、本発明は、示された実施形態に限定されることを意図しておらず、本明細書中に開示された原理及び特徴と一致する最も広い範囲を意図される。本発明を概説してきたので、或る種の具体例を参照することにより更なる理解を得ることができる。実施例実施例1R1又はR1m及びD21又はD21mと呼ぶ2つの遺伝子操作された単鎖メガヌクレアーゼを、国際PCT出願WO2003078619、WO2004067736、WO2006097784、WO2006097853、WO2007060495、WO2007049156、WO2006097854、WO2007034262、WO2007049095、WO2007057781及びWO2009095793並びにChamesEpinatら,2005;ArnouldChamesら,2006;SmithGrizotら,2006に開示された方法を用いて作製する。ICreIに由来するこれらメガヌクレアーゼは、2つの異なるDNA配列を認識するように設計される。。これら2つのメガヌクレアーゼの発現は、CMVプロモーター及びポリAシグナル配列により駆動される。2つの対応する認識部位を近接してクローニングし、標的プラスミドを作製する。例えば、認識部位は10bp離間している。メガヌクレアーゼによるDNA切断は、特徴的な4nt3OHオーバーハングを生じる。両部位の同時切断は、介在配列を除去し、したがってNHEJによる無瘢痕再ライゲーションを排除すると期待される。ヒトHEK293細胞を、R1及びD21用の発現カセットを有する2つのプラスミド並びに標的プラスミドで一過性に同時トランスフェクトする。比較のために、HEK293細胞を、標的プラスミド及び唯1つのメガヌクレアーゼ発現プラスミドで一過性に同時トランスフェクトする。トランスフェクションの2日後にDNAを抽出し、標的化変異誘発を、図2に示すように変異検出アッセイにより評価する。2つの認識部位を含むDNAの高忠実度PCR増幅は、適切な特異的プライマーを用いて実行する。同じPCR増幅を、標的プラスミド単独でトランスフェクトした細胞から抽出したゲノムDNAについて行う。定量及び精製後、等モル量のPCR産物をアニーリング緩衝液中で混合し、この混合物の一部分を融解アニーリング工程に供すると、変異体及び野生型のDNAのランダムな再アニーリングによる歪んだ二重鎖DNAの形成が生じる。CEL1酵素を添加して、DNA二重鎖をミスマッチ部位で特異的に切断する。CEL1切断サンプルを分析ゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色し、DNAバンドを、デンシトメトリーを用いて定量する。変異誘発の頻度は、その後、Millerらに本質的に記載されるように計算し得る。標的プラスミドと、空のプラスミド;1つのメガヌクレアーゼ発現プラスミド;又はそれぞれR1及びD21を発現する2つのプラスミドとでトランスフェクトした細胞からのPCR産物もまた、高スループット配列決定により分析する。この場合、PCR増幅は、適切なプライマーを用いて行い、454sequencingsystemでの配列決定サービスを提供する会社により提供された特異的アダプター配列で挟まれたフラグメントを得る。PCRプールあたり約10000の利用可能な配列を得た後、部位特異的挿入又は欠失事象の存在について分析する。本発明者らは、2つのDNADSBの創出後の介在配列又はマイクロ配列の欠失が、部位特異的NHEJ駆動変異率を大きく増大させることを示すことができる。この欠失は、両方のメガヌクレアーゼが細胞中に導入される場合にのみ観察される。実施例2本実施例では、ICreIに由来する遺伝子操作された単鎖メガヌクレアーゼ並びにChamesEpinatら,2005;ArnouldChamesら,2006;SmithGrizotら,2006に記載されたものを、種々のヌクレアーゼドメインと融合して二機能性メガヌクレアーゼを作製する。最大活性を得るため、サイズが3~26アミノ酸の範囲である31の異なるリンカーを試験する。融合体は、本質的に非特異的なヌクレアーゼ活性を有することに基いて選択される18の異なる触媒ドメインを用いて作製する。合わせて、遺伝子操作された単鎖ICreI由来メガヌクレアーゼのN又はC末端への融合により1116の異なる構築物のライブラリを作製し、潜在的な二機能性メガヌクレアーゼの集団を創出する。これらキメラメガヌクレアーゼの発現は、CMVプロモーター及びポリAシグナル配列により駆動される。各キメラタンパク質の活性は、国際PCT出願WO2004067736及びEpinatArnouldら,2003;ChamesEpinatら,2005;ArnouldChamesら,2006;SmithGrizotら,2006において以前に記載した本発明者らの酵母アッセイを用いて評価する。新たな触媒ドメインの付加により生じるDNA切断活性をモニターするために、野生型メガヌクレアーゼにより結合され得るが切断されないICreIDNA標的配列を選択する。この標的は、-2位~2位での4ヌクレオチド置換を含む。その後、切断活性を示す酵素を、標的プラスミドがICreIメガヌクレアーゼの唯1つの切断部位を有することを除き、実施例1に記載のプロトコルに従って試験する。二機能性キメラエンドヌクレアーゼにより誘導される高率の部位特異的変異誘発を更に検証するため、同じストラテジーを、国際PCT出願WO2003078619、WO2008010093及びWO2009095793に記載のようにヒトRAG1遺伝子を切断するように設計された遺伝子操作された単鎖メガヌクレアーゼに適用する。二機能性メガヌクレアーゼを、内因性の同族認識部位でNHEJ駆動変異を誘導する能力について試験する。実施例1に記載したPCR産物の高スループット配列決定により、変異誘発活性を定量する。PCR増幅は、適切なプライマーを用いてメガヌクレアーゼトランスフェクト細胞から抽出したゲノムDNAについて行う。二機能性メガヌクレアーゼは、介在配列が欠失していることにより、NHEJによるDNA端部の無瘢痕再ライゲーションが防止されるので、増大した変異率を示した。実施例3ITevIの触媒ドメインと融合する親足場としてICreIメガヌクレアーゼを選択した。野生型ITevIは、GIYYIGファミリーの単量体切断酵素として機能して、標的DNAにおいてねじれ型二本鎖破断を創出する。生化学的及び構造的データを指針に、触媒ドメイン全体及びリンカーの欠失不耐性領域を含むITevIのN末端領域から種々の長さの構築物を設計した。1つを除き全ての場合で、フラグメントは、介在性の5残基ポリペプチドリンカーを用いてICreIのN末端に融合した。リンカー無しの融合構築物は、天然に、人工リンカー中のものと類似する残基を含んでいた。ICreIはホモ二量体であるので、全ての融合構築物は、3つの触媒中心を含む:二量体界面の天然のICreI活性部位及び単量体あたり1つのITevI活性部位。各三機能性メガヌクレアーゼの活性は、国際PCT出願WO2004067736及びEpinatArnouldら,2003;ChamesEpinatら,2005;ArnouldChamesら,2006;SmithGrizotら,2006において以前に記載された酵母アッセイを用いて評価した。全ての構築物は、C1221標的DNAを、野生型ICreIに匹敵する活性で切断することができた。ICreI触媒コアに依存しないITevI触媒ドメインの活性を検証するため、D20N点変異体を作製してICreI足場を不活化した。酵母アッセイにおける試験により、不活化されたICreI変異体タンパク質単独からは明らかな活性は示されなかった。しかし、切断活性は、ITevI触媒ドメインを有する融合体について観察することができた。表4:酵母アッセイにおける、ITevIICreI融合体についての活性。2つの親タンパク質標的に対する野生型及び融合タンパク質の相対活性を示す。最大活性は、所与の各タンパク質で天然型DNA標的に対して観察される。ICreIN20は、野生型ICreI足場の不活性バリアントである。他の全ての場合で、活性はC1221標的に対してのみ検出される。なぜならば、DNA認識はICreI足場により駆動されるからである。N20融合バリアントは、ITevI触媒ドメインに起因する切断活性を示す。相対活性は、次のように等級分けをする:-、検出可能な活性なし;、<25活性;、25~<50活性;、50~<75活性;、75~100活性。実施例4短縮型のICreI及び当該タンパク質のN又はC末端に融合した3つの異なるリンカーポリペプチドに基いて、タンパク質融合足場を設計した。全ての場合において、DNA結合にも切断活性にもほとんど~全く影響を有さずにICreI親足場表面を横切るベースライン融合リンカーを設計するという目標を有する構造モデルを作製した。2つのN末端融合足場のために、ICreIの残基2~153にわたるポリペプチドを使用した。C末端融合足場は、野生型ICreIの残基2~155を含有する。両融合足場タイプのために、リンカーの遊離末端は、出発点としてICreIDNA複合体構造を用いて構築したモデルから決定したように、DNAに対して近位に設計する。2つのICreIN末端融合足場及び単一のC末端融合足場を本発明者らの酵母アッセイで試験し、これは野生型ICreIのものと類似する活性を有することが判明した。コリシンE7は、単鎖及び二本鎖のDNAをプロセシングすることができるHNHファミリーの非特異的ヌクレアーゼである。生化学的及び構造的データを指針に、触媒ドメイン全体を包含するColE7の領域を選択した。このColE7ドメインをICreINFS1又はICreINFS2のN末端に融合して、それぞれhColE7CreD0101又はhColE7CreD0102を作製した。加えて、ICreICFS1を用いて、C末端融合構築物hCreColE7D0101を作製した。ICreIはホモ二量体であるので、全ての融合構築物は3つの触媒中心を含有する:二量体界面の天然ICreI活性部位及び単量体あたり1つのColE7活性部位。各三機能性メガヌクレアーゼの活性は、上記の酵母アッセイを用いて評価した。全ての構築物は、C1221標的DNAを、野生型ICreIに匹敵する活性で切断することができた。ICreI触媒コアに依存しないColE7触媒ドメインの活性を検証するために、D20N点変異体を作製してICreI足場を不活化した。本発明者らの酵母アッセイにおける試験により、不活化されたICreI変異体タンパク質単独からは明らかな活性は示されなかった。しかし、切断活性は、ColE7触媒ドメインを有する融合体について観察することができた。表5:酵母アッセイにおける、ColE7ICreI融合体についての活性。C1221標的に対する野生型及び融合タンパク質の相対活性を示す。ICreIXは、結晶構造に基づく短縮型のICreIを表し、融合足場の土台として使用した。N20構築物は、それぞれのICreIベース足場の不活性バリアントである。活性は、ICreI足場が活性である全ての場合で、又はDNA触媒作用がColE7ドメインにより提供されるときに検出される。相対活性は、次のように等級分けをする:-、検出可能な活性なし;、<25活性;、25~<50活性;、50~<75活性;、75~100活性。実施例5:メガヌクレアーゼ誘導変異誘発に対するTrex2又はTREX2の効果ヒトTrex2タンパク質は、3→5エキソヌクレアーゼ活性を示すことが知られている。236アミノ酸の機能型Trex2を、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼのメガヌクレアーゼ誘導標的化変異誘発に対する改善効果を測定するために、単鎖メガヌクレアーゼに融合した。SCMNTrex2により誘導される変異誘発のレベルを、専用細胞モデル及び293H細胞中の内因性遺伝子座において、SCMN及びTrex2タンパク質を独立して発現するベクターを同時トランスフェクトすることにより誘導される変異誘発のレベルと比較する。実施例5A:Trex2とメガヌクレアーゼとの同時トランスフェクションTrex2をコードするベクターの存在下又は不在下での変異誘発事象をモニターするため、メガヌクレアーゼSCGSをコードするベクターを細胞株に同時トランスフェクトした。SCGSメガヌクレアーゼは、2つのICreIバリアントの融合体に由来する単鎖タンパク質である。これは、Cricetulusgriseusグルタミンシンセターゼ遺伝子の第1エキソンに位置する22bpDNA配列を認識する。異なるメガヌクレアーゼ、例えばSCRAG1、SCXPC4及びSCCAPNS1を、Trex2発現ベクターを伴って又は伴わずに同時トランスフェクトして、内因性遺伝子座でのメガヌクレアーゼ誘導変異誘発に対する効果を分析した。材料及び方法aメガヌクレアーゼ誘導変異誘発をモニターする細胞モデルSCGSメガヌクレアーゼにより誘導されるNHEJ修復頻度を定量するためにプラスミドpCLS6810を設計した。SCGS誘導変異誘発の測定に使用した配列は、ATG開始コドンに続くアラニンをコードする2コドン;HAタグ配列;SCGS認識部位;ジ残基グリシンセリンのストレッチ;と同様なアラニンをコードする追加の2コドン;及び最後に自身のATG開始コドンを欠くGFPレポーター遺伝子から作られている。GFPレポーター遺伝子は、GS認識部位により導入されたフレームシフトに起因して不活性である。SCGSメガヌクレアーゼによるDNA二本鎖破断の創出に続くエラーを起こし易いNHEJ事象は、ATG開始コドンとインフレームでのGFP遺伝子発現の回復を導き得る。最終構築物を、cGPSCustomHumanFullKitDDのhsRAG1IntegrationMatrixCMVNeoを提供業者の指示に従って用いて、293H細胞株にRAG1遺伝子座にて導入した。このキットを用いて、RAG1遺伝子座に導入遺伝子の単一コピーを含有する安定な細胞株を得た。このように、この細胞株の、Trex2をコードするプラスミドを伴うか又は伴わないSCGSメガヌクレアーゼ発現プラスミドによるトランスフェクション後、GFP陽性細胞のパーセンテージを、トランスフェクトした分子実体が誘導する変異誘発性NHEJ修復の頻度と直接相関させる。bメガヌクレアーゼ誘導変異誘発をモニターする細胞モデルにおけるトランスフェクショントランスフェクションの1日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミンを製造業者の指示に従って用いて、10μgのトータルDNAを補充中1μgのSCGSコーディングベクターと0、2、4、6又は9μgのTrex2コーディングプラスミドとで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの4日後、Guava装置を使用するフローサイトメトリ分析用に細胞を採集した。1μgのSCGS発現プラスミド及び0、4及び9μgのTrex2コーディングプラスミドでトランスフェクトした細胞集団からゲノムDNAを抽出した。遺伝子座特異的PCRを、次のプライマー:5CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG10NGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCC3及び5CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGTCGATCAGCACGGGCACGATGCCを用いて行い、PCR産物を454sequencingsystemにより配列決定した。PCR産物あたり約10000配列を得た後、部位特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。c内因性遺伝子座でのメガヌクレアーゼ誘導変異誘発をモニターするための293H細胞でのトランスフェクショントランスフェクションの1日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミンを製造業者の指示に従って用いて、5μgのトータルDNAを補充中3μgのSCRAG1又はSCXPC4又はSCCAPNS1発現プラスミドと0又は2μgのTrex2コーディングプラスミドとで同時トランスフェクトした。遺伝子座特異的PCRを、次のプライマー:5CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG10N遺伝子座特異的フォワード配列RAG1用:GGCAAAGATGAATCAAAGATTCTGTCC3、XPC4用:AAGAGGCAAGAAAATGTGCAGC3及びCAPNS1用:CGAGTCAGGGCGGGATTAAG3及びリバースプライマー5CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG、XPC4用:GCTGGGCATATATAAGGTGCTCAA3及びCAPNS1用:CGAGACTTCACGGTTTCGCC3を用いて行った。PCR産物は454sequencingsystemにより配列決定した。PCR産物あたり約10000配列を得た後、部位特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。結果1-メガヌクレアーゼ誘導変異誘発を測定する細胞モデルにおいてGFP細胞のパーセンテージは、SCGS発現プラスミドを単独で又は漸増用量のTrex2コーディングベクターと共にトランスフェクトした96時間後に分析した。GFP細胞のパーセンテージは、トランスフェクトしたTrex2発現プラスミドの量と共に増加した。Trex2の不在下、SCGS発現は03のGFP細胞を導いた一方、2、4、6及び9μgのTrex2コーディングプラスミドは、それぞれ13、28、34及び48のGFPを導いた。このGFP細胞の表現型刺激は分子レベルで確証された。SCGSは24の標的化変異誘発を導いた一方、SCGS発現プラスミドと4及び9μgのTrex2コーディングベクターとの同時トランスフェクションは、この変異誘発性DSB修復をそれぞれ94及び131に刺激する。更に、変異誘発事象の性質を分析した。Trex2の存在下では、変異誘発事象の65までが、SCGSメガヌクレアーゼにより創出される3オーバーハングの完全な又は部分的な喪失に対応する。対照的に、Trex2活性の不在下では、このような変異誘発事象は、総変異誘発事象の20で見出される。2-内因性遺伝子座において遺伝子操作されたメガヌクレアーゼにより誘導される変異誘発に対するTrex2効果は、SCRAG1又はSCXPC4又はSCCAPNS1を発現するプラスミドをTrex2コーディングプラスミドを伴って又は伴わずに同時トランスフェクトすることによってRAG1、XPC4及びCAPNS1内因性遺伝子座で測定した。3μgのメガヌクレアーゼ発現ベクターと2μgのTrex2コーディングプラスミドとのトランスフェクションを行った。異なるメガヌクレアーゼにより誘導される変異誘発は、トランスフェクションの3日後に定量及び分析した。これら条件下で、Trex2は、調べた全ての遺伝子座にて、遺伝子座に依存して14から5まで変化する刺激係数で変異誘発を刺激する。変異誘発事象の性質も分析した。それによれば、メガヌクレアーゼにより誘導される欠失のパターンの改変が示された。図6に示されるように、特にRAG1及びCAPNS1遺伝子座にて、3オーバーハングの崩壊に相当する小さな欠失の頻度は、Trex2の存在下で有意に増加する。実施例5B:遺伝子操作されたメガヌクレアーゼのN又はC末端へのヒトTrex2タンパク質の融合細胞内でのTrex2の発現は、メガヌクレアーゼが標的としていない遺伝子座でのエキソヌクレアーゼ活性を導くことがある。更に、自明な理由から、2つの発現ベクターの同時トランスフェクションにより、両タンパク質の最適発現を制御することが困難になる。この困難を迂回し、Trex2活性をメガヌクレアーゼにより誘導されるDSBに標的付けるために、ヒトTrex2タンパク質を、遺伝子操作されたSCGSメガヌクレアーゼのN又はC末端に融合させた。4つのSCGSTrex2融合タンパク質を作製し、標的を切断する能力について試験した。各構築物により誘導される変異誘発のレベルを、実施例5Aに記載した細胞モデルを用いて測定した。材料及び方法aSCGSTrex2融合タンパク質の作製Trex2タンパク質を、SCGSメガヌクレアーゼとC末端又はN末端で、5アミノ酸のグリシンストレッチ又は10アミノ酸のグリシンストレッチ2をリンカーとして用いて融合した。これにより、それぞれSCGS5Trex、SCGS10Trex、Trex5SCGS、Trex10SCGSと名付けた4つのタンパク質構築物が生じた。最初に、SCGS及びTrex2を共に、CMVプロモーターの制御下での興味対象遺伝子の発現を駆動するの誘導体であるpCLS1853のAscIXhoI制限部位にクローニングした。プラスミド骨格上に位置する、特異的プライマー及びプライマーCMVfor又はV5reverseを用いて2つのORFを別々に増幅することによって、4つの融合タンパク質構築物を得た。次いで、2つのPCRフラグメントのゲル精製後、CMVforV5reverseオリゴヌクレオチドを用いてPCRアセンブリを実現した。次いで、最終PCR産物をAscI及びXhoIにより消化し、これら同じ酵素で消化したpCLS1853にライゲートした。下記の表に、異なる構築物を作製するために使用したオリゴヌクレオチドを示す。b染色体外SSA活性CHOK1細胞を、興味対象のタンパク質用の発現ベクター及びレポータープラスミドで、Polyfectトランスフェクション試薬の存在下、製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクトした。培養培地をトランスフェクションの72時間後に除去し、βガラクトシダーゼ液体アッセイのために溶菌検出緩衝液を添加した。1リットルの溶菌検出緩衝液は以下を含有する:100mlの溶菌緩衝液、10mlの100XMg緩衝液、110mlの8mgmlONPG溶液及び780mlの01Mリン酸ナトリウムpH75。OD420は、37°Cにて2時間のインキュベーション後に測定する。全体プロセスは、96ウェルプレートフォーマットを使用して、自動化Velocity11BioCelプラットフォームで行った。cメガヌクレアーゼ誘導変異誘発トランスフェクションの1日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミンを製造業者の指示に従って用いて、10μgのトータルDNAを補充中、漸増量の、SCGS又はSCGS5Trex、SCGS10Trex、Trex5SCGS及びTrex10SCGSをコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの3~4日後、Guava装置を使用するフローサイトメトリ分析用に細胞を採集した。1μg及び6μgのSCGS又はSCGS10Trex2発現プラスミドでトランスフェクトした細胞をゲノムDNA抽出用に採集した。遺伝子座特異的PCRを、次のプライマー:5CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG10NGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCC3及び5CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGTCGATCAGCACGGGCACGATGCCを用いて行った。PCR産物を454sequencingsystemにより配列決定した。PCR産物あたり約10000配列を得た後、部位特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。結果4つの融合タンパク質の活性を、先ず、CHOK1細胞中で染色体外アッセイを用いてモニターした。Trex2とSCGSとの融合は、実際、フォールディング及び又は活性を害し得る。図8は、4つの融合タンパク質はこのアッセイにおいて活性であることを示している。1-メガヌクレアーゼ誘導変異誘発を測定する細胞モデルにおいて実施例5Aに記載される細胞株を、SCGS又は4つの異なる融合タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。GFP細胞のパーセンテージの定量は、トランスフェクションの4日後にフローサイトメトリにより決定した。SCGSは05~1のGFP細胞を誘導した一方、4つの融合構築物は全て、GFP細胞のパーセンテージを用量依存的に2から9までに増強する。このストラテジーは同時トランスフェクションストラテジーより効率的であるようである。なぜならば、45のGFP細胞という最高頻度は9μgのTrex2発現ベクターを用いて得られた一方、この頻度は僅か3μgの任意の融合体発現ベクターを用いて得ることができるからである。1μg及び6μgのSCGS又はTrex210SCGS発現プラスミドの細胞トランスフェクション後、標的付けられた遺伝子座をPCR増幅により分析し、続いて配列決定した。欠失事象は、天然型メガヌクレアーゼと比較して、融合構築物で大きく増強した。1μg又は6μgのTrex210SCGS発現プラスミドは、24及び31の変異誘発事象を導いた。これらNHEJ頻度は、同時トランスフェクション実験において4又は9μgのTrex2発現ベクターを用いて得られたものより高かった。最後に、分子解析によって、SCGS又は融合体Trex210SCGSにより創出される3オーバーハングの完全な又は部分的な喪失がそれぞれ35及び80であることが示された。まとめると、これら結果は、融合タンパク質Trex2SCGSは、標的付けられた変異誘発性試薬として高度に活性であるの頻度ことを証明している。実施例5C:遺伝子操作されたメガヌクレアーゼと融合したTrex2の、不死化又は初代細胞株における内因性遺伝子座での変異誘発に対する効果SCGSと融合したTrex2は、不死化細胞株において遺伝子導入遺伝子座で標的付けられた変異誘発TMを刺激することが示された。融合を他の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼに適用し、初代細胞株中でのTMを刺激するために、Trex2をSCCAPNS1に融合し、TMを不死化細胞株及び初代細胞株中の内因性遺伝子座でモニターした。材料及び方法dTrex2SCCAPNS1融合タンパク質の作製Trex2タンパク質を、2の10アミノ酸リンカーを用いて、SCCAPNS1メガヌクレアーゼにN末端で融合した。クローニングストラテジーは、融合体TrexSCGSについて使用したものと同じであった。最初に、BSCCAPNS1及びTrex2を共に、CMVプロモーターの制御下での興味対象遺伝子の発現を駆動するの誘導体であるpCLS1853のAscIXhoI制限部位にクローニングした。下記の特異的プライマーを用いて2つのORFを別々に増幅することによって、融合タンパク質構築物を得た:CAPNS1Link10GSFor用には、5GGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCCAATACCAAATATAACGAAGAGTTC3を、V5リバースプライマー5CGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGG3と共に使用した;TrexORFは、CMVforプライマー5CGCAAATGGGCGGTAGGCGT3及びLink10TrexRevプライマー5CCTCCACCTCCAGATCCGCCACCTCCAGGAGAGGACTTTTTCTTCTCAGA3を用いて増幅した。次いで、2つのPCRフラグメントのゲル精製後、CMVforV5reverseオリゴヌクレオチドを用いてPCRアセンブリを実現した。次いで、最終PCR産物をAscI及びXhoIにより消化し、これら同じ酵素で消化したpCLS1853プラスミド中にライゲートして、TrexSCCAPNS1コーディングベクターを得た。e内因性遺伝子座での変異誘発についてTrex2メガヌクレアーゼ融合体をモニターするための293H細胞でのトランスフェクショントランスフェクションの1日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミンを製造業者の指示に従って用いて、5μgのトータルDNAを補充中100ngのSCCAPNS1又はTrexSCCAPNS1コーディングベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、ゲノムDNA抽出用に細胞を採集した。f内因性遺伝子座での変異誘発についてTrex2メガヌクレアーゼ融合体をモニターするためのDetroit細胞でのトランスフェクショントランスフェクションの1日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、Amaxaを製造業者の指示に従って用いて、10μgのトータルDNAを補充中6μgのSCCAPNS1又はTrexSCCAPNS1コーディングベクターで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、ゲノムDNA抽出用に細胞を採集した。gCAPNS1遺伝子座でのディープシーケンシングディープシーケンシングのためのPCRを、次のプライマー:5CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC10NCGAGTCAGGGCGGGATTAAG3及びリバースプライマー5CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCGAGACTTCACGGTTTCGCC3を用いて行った。PCR産物は454sequencingsystemにより配列決定した。PCR産物あたり約10000配列を得た後、部位特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。結果3-不死化293H細胞株において構築物SCCAPNS1及びTrexSCCAPNS1が内因性遺伝子座での遺伝子操作メガヌクレアーゼ誘導標的化変異誘発を刺激し得るかどうかを決定するために、野生型293H細胞をSCCAPNS1又はTrexSCCAPNS1によりトランスフェクトした。SCCAPNS1でのトランスフェクションは16の標的付けられた変異誘発を導いた一方、融合体TrexSCCAPNS1でのトランスフェクションはTMを124までに刺激した。更に、変異誘発性配列の分析により、2、3及び4塩基対の小さな欠失事象の割合がSCCAPNS1でのTM事象の2から融合体TrexSCCAPNS1での67に増加することが示された。4-初代Detroit細胞株において構築物SCCAPNS1及びTrexSCCAPNS1が初代細胞においても内因性遺伝子座での遺伝子操作メガヌクレアーゼ誘導標的化変異誘発を刺激し得るかどうかを決定するために、野生型Detroit551細胞をSCCAPNS1又はTrexSCCAPNS1によりトランスフェクトした。SCCAPNS1でのトランスフェクションは11のTMを導いた一方、融合体TrexCAPNS1でのトランスフェクションはTMを125までに刺激した。更に、変異誘発性配列の分析により、2、3及び4塩基対の小さな欠失事象の割合がSCCAPNS1でのTM事象の35から融合体TrexSCCAPNS1での90に増加することが示された。実施例6:メガヌクレアーゼ誘導変異誘発に対する末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ発現の効果LAGLIDADGファミリー由来のホーミングエンドヌクレアーゼ又はメガヌクレアーゼは、長いDNA配列を認識し、DNA二本鎖を切断して、4ヌクレオチドの3オーバーハングを生じる。細胞は、主に2つの機序:インタクトの相同テンプレートを用いる相同組換え又は非相同末端連結により、この二本鎖破断を修復することができる。NHEJは、DSB修復後に変異を誘導することがあるエラーを起こし易い機序であると考えられている。よって、細胞中へのメガヌクレアーゼのトランスフェクション後、メガヌクレアーゼ遺伝子座での変異誘発頻度の測定は、メガヌクレアーゼ活性を評価する1つの方法である。ICreIタンパク質に由来するメガヌクレアーゼは、ゲノム部位での変異誘発を誘導することが示されている。ヒトTdtタンパク質は、DNA端部の3ヒドロキシ末端へのデオキシヌクレオチドの付加を触媒する508アミノ酸タンパク質である。コードされるタンパク質は、正常及び悪性のプレB及びプレTリンパ球の限定された集団において、分化初期の間に発現する。これは、RAG1及びRAG2エンドヌクレアーゼ切断後、DSB部位で非生殖系列エレメントを合成することによって抗原レセプターの多様性を生み出す。メガヌクレアーゼDSB誘導事象後、この活性は、標的付けられた部位でDNA配列を付加し得、よってメガヌクレアーゼにより誘導される標的化変異誘発を刺激する。実施例6A:Tdtとメガヌクレアーゼとの同時トランスフェクションこの仮説を検証するため、メガヌクレアーゼSCGSをコードするベクターを、Tdtをコードするベクターの存在下又は不在下で、変異誘発性NHEJ事象をモニターする細胞株に同時トランスフェクトした。SCGSメガヌクレアーゼは、2つのICreIバリアントが融合した単鎖タンパク質である。これは、Cricetulusgriseusグルタミンシンセターゼ遺伝子の第1エキソンに位置する22bpのDNA配列を認識する。更に、2つの異なるメガヌクレアーゼSCRAG1及びSCCAPNS1を、Tdt発現プラスミドを伴って又は伴わずに同時トランスフェクトし、内因性遺伝子座でのメガヌクレアーゼ誘導変異誘発に対する効果を、ディープシーケンシングにより分析した。材料及び方法dメガヌクレアーゼ誘導変異誘発をモニターするための細胞モデルSCGSメガヌクレアーゼにより誘導されるNHEJ修復頻度を定量するため、プラスミドpCLS6810設計した。SCGS誘導変異誘発の測定に使用した配列は、ATG開始コドンに続くアラニンをコードする2コドン;HAタグ配列、SCGS認識部位、グリシンセリンストレッチ、と同じアラニンをコードする2コドン及び最後に自身のATG開始コドンを欠くGFPレポーター遺伝子から作られている。GFPレポーター遺伝子自体は、GS認識部位により導入されたフレームシフトに起因して不活性であるので、SCGSメガヌクレアーゼによるDNA二本鎖破断の創出に続くNHEJによる変異誘発性DSB修復事象は、ATG開始コドンとインフレームでのGFP遺伝子発現の回復を導き得る。これら配列は、cGPSCustomHumanFullKitDDのhsRAG1IntegrationMatrixCMVNeoを用いて、最終構築物を293H細胞株のRAG1遺伝子座に標的するために使用するプラスミド中に配置した。このキットを用いて、導入遺伝子の単一コピーをRAG1遺伝子座に含む安定な細胞株を得た。このように、Tdtをコードするプラスミドを伴うか又は伴わないSCGSメガヌクレアーゼによるこの細胞株のトランスフェクション後、GFP陽性細胞のパーセンテージは、トランスフェクト種により誘導される変異誘発頻度と直接相関する。eメガヌクレアーゼ誘導変異誘発をモニターする細胞モデルでのトランスフェクショントランスフェクションの1日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミンを製造業者の指示に従って用いて、5又は10μgのトータルDNAを補充中それぞれ1μgのSCGSコーディングベクターと0、4、6若しくは9μgのTdtコーディングプラスミド、又は3μgのSCGSコーディングプラスミドと0又は2μgのTdtコーディングベクターとで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、Guava装置を使用するフローサイトメトリ分析用に細胞を採集した。3μgのSCGSコーディングベクターと0又は2μgのTdtコーディングプラスミドとに相当する条件を、ゲノムDNA抽出用に採集した。ディープシーケンシングのためのPCRを、次のプライマー:5CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG10NGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCC3及び5CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGTCGATCAGCACGGGCACGATGCC3を用いて行った。PCR産物を454sequencingsystemにより配列決定した。PCR産物あたり約10000配列を得た後、部位特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。f内因性遺伝子座でのメガヌクレアーゼ誘導変異誘発をモニターするための293H細胞でのトランスフェクショントランスフェクションの1日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミンを製造業者の指示に従って用いて、5又は10μgのトータルDNAを補充中3μgのSCRAG1コーディングベクターとそれぞれ05、1及び2μg又は1、3及び7μgのTdtコーディングプラスミドとで同時トランスフェクトした。3μgのSCCAPNS1コーディングベクターを、25μlのリポフェクタミンを製造業者の指示に従って用いて、2μgの空ベクタープラスミド又はTdtコーディングプラスミドと同時トランスフェクトした。トランスフェクションの7日後、ゲノムDNA抽出用に細胞を採集した。ディープシーケンシングのためのPCRを、次のプライマー:5CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG10N遺伝子座特異的フォワード配列:RAG1用にはGGCAAAGATGAATCAAAGATTCTGTCC3、CAPNS1用にはCGAGTCAGGGCGGGATTAAG3及びリバースプライマー5CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG内因性遺伝子座特異的リバース配列:RAG1用にはGATCTCACCCGGAACAGCTTAAATTTC3、CAPNS1用にはCGAGACTTCACGGTTTCGCC3を用いて行った。PCR産物を454sequencingsystemにより配列決定した。PCR産物あたり約10000配列を得た後、部位特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。結果1-メガヌクレアーゼ誘導変異誘発性NHEJ修復を測定する細胞モデルにおいてSCGSにより誘導される変異誘発性NHEJ修復を測定する細胞株を作製した。GFP細胞のパーセンテージを、SCGS単独又は漸増用量のTdtコーディングベクターでのトランスフェクションの96時間後に分析した。SCGSトランスフェクションはTdtの不在下で02±01のGFP細胞を導いた一方、全ての用量のTdtコーディングプラスミドは10±04のGFP細胞を導いた。3μgのSCGSコーディングプラスミドとpUCベクターとでのトランスフェクションは、06±01のGFP細胞を導いた一方、2μgのTdtコーディングプラスミドの存在下、GFP細胞のパーセンテージは19±03のGFP細胞に刺激された。3μgのSCGSと2μgの空ベクター又はTdtコーディングベクターとに相当する条件をディープシーケンシングにより分析した。SCGSと空ベクターとでのトランスフェクションは32の標的化変異誘発を導いた一方、Tdt発現プラスミドの存在下、TMは260までに刺激された。Tdtの不在下、挿入事象は総TM事象の29であった一方、Tdtの存在下、これら挿入事象は953までに増大した。最後に、Tdtコーディングプラスミドの存在下での挿入サイズの分析により、2~8bpの範囲の小さな挿入を有する特徴的な挿入が導かれた。2-内因性RAG1遺伝子座にてTdtが遺伝子操作メガヌクレアーゼ誘導標的化変異誘発を内因性遺伝子座で刺激し得るかどうかを決定するために、野生型293H細胞をSCRAG1コーディングベクターと種々の用量のTdtコーディングプラスミドとによりトランスフェクトした。2つの異なるトランスフェクションを、5又は10μgのトータルDNAを補充中3μgのSCRAG1コーディングベクターとそれぞれ05、1及び2μg又は1、3及び7μgのTdt発現プラスミドとで行った。Tdt発現ベクターの不在下、標的付けられた変異誘発は05~08の間で変化する。Tdtの存在下、TMは16までに刺激された。変異誘発性DSB修復の性質を分析し、これによりメガヌクレアーゼにより誘導されるTM事象のパターンの改変が示された。図13、パネルBに示されるように、挿入のパーセンテージはTdtの不在下でほとんど0であった一方、Tdt発現ベクターの存在下でこのパーセンテージは、TM事象の50から70までである。挿入のサイズもまた分析した。Tdtの存在下で、2~8bpの範囲の小さな挿入に対応する特異パターンの挿入が見られた。最後に、これら挿入物の配列は挿入が見かけ上ランダムであることを示しているようである。3-内因性CAPNS1遺伝子座にて別の内因性遺伝子座でのTdt発現効果を決定するために、野生型293H細胞を3μgのSCCAPNS1メガヌクレアーゼコーディングプラスミドと0又は2μgのTdtコーディングプラスミドとでトランスフェクトした。Tdt発現ベクターの不在下、標的付けられた変異誘発は74であった。Tdtの存在下、TMは139までに刺激された。変異誘発性DSB修復の性質を分析し、これによりメガヌクレアーゼにより誘導されるTM事象のパターンの改変が示された。図14、パネルBに示されるように、挿入事象はTdtの不在下、総TM事象の10であった一方、Tdt発現ベクターの存在下、挿入事象は、TM事象の65であった。挿入のサイズもまた分析した。Tdtの存在下、2~6bpの範囲の小さな挿入に対応する特異パターンの挿入が見られた。最後に、これら挿入物の配列は挿入が見かけ上ランダムであることを示しているようである。実施例6B:ヒトTdtとメガヌクレアーゼとの融合:標的付けられた変異誘発に対する効果Tdtとメガヌクレアーゼコーディングプラスミドとの同時トランスフェクションは、メガヌクレアーゼにより誘導される変異誘発の率を増大させることが示された。しかし、このストラテジーは、細胞内での同時に2つのプラスミドの存在を示唆する。更に、メガヌクレアーゼの切断に際して、新たに創出したDSBにてTdt活性を標的することは、有益である。よって、TdT及びメガヌクレアーゼタンパク質を含んでなるキメラタンパク質を工学的に操作する。ヒトTdtタンパク質を、異なる単鎖の遺伝子操作メガヌクレアーゼSCMN、SCRAG及びSCCAPNS1のN又はC末端に融合する。Tdtタンパク質に融合した2つのSCMNを作製する:検討するメガヌクレアーゼのN末端ドメイン又はC末端ドメインで融合。これら構築物を、興味対象の遺伝子座での変異誘発活性を増大する能力について試験する。材料及び方法hSCMNTdt融合タンパク質の作製Tdtタンパク質をSCMNメガヌクレアーゼにC末端又はN末端で10アミノ酸リンカー2を用いて融合する。これにより、それぞれSCMNTdt又はTdtSCMNと名付けた2つのタンパク質構築物を生じる。最初に、全てのSCMNを、CMVプロモーターの制御下での興味対象遺伝子の発現を駆動するの誘導体であるpCLS1853のAscIXhoI制限部位にクローニングした。特異的プライマーを用いて2つのORFを別々に増幅することによって、各SCMNTdt構築物について2つの融合タンパク質を得る。下記の表10に、種々のSCGSTdt構築物を作製するために使用するオリゴヌクレオチド性配列を示す。次いで、2つのPCRフラグメントのゲル精製後、TdtとSCMNとのCter融合体についてはCMVfor及びTDTRevオリゴヌクレオチドを用いて、又はTdtとSCMNとのNter融合体についてはTDTFor及びV5Revを用いてPCRアセンブリを実現する。最終PCR産物をpTOPOベクターにクローニングし、次いでAscI及びXhoIにより消化し、これら同じ酵素で予め消化したpCLS1853ベクターにライゲートする。実施例7:173塩基対離間する2つの配列を標的する2つのヌクレアーゼでの同時トランスフェクションの、変異誘発頻度に対する影響2つの近接する部位を標的する2つのヌクレアーゼにより誘導される変異誘発頻度に対する影響を調べるために、RAG1遺伝子内のDNA配列を標的する2つの遺伝子操作されたヌクレアーゼでの同時トランスフェクションを行った。ヌクレアーゼは、pCLS2222によりコードされる、DNA配列5TTGTTCTCAGGTACCTCAGCCAGC3を切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼと、DNA配列5TATATTTAAGCACTTATATGTGTGTAACAGGTATAAGTAACCATAAACA3を標的するTALENとからなるpCLS8964及びpCLS8965によりコードされるそれぞれ配列番号209~210。これら2つの認識部位は173bp離れている。材料及び方法細胞トランスフェクションヒト293H細胞を、12×106細胞10cmディッシュの密度で、完全培地DMEMに2mMLグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンB及び10FBSを補充中にプレートした。翌日、細胞を、両ヌクレアーゼ発現プラスミドを含有する10μgのトータルDNAで、リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬を製造業者のプロトコールに従って用いてトランスフェクトした。コントロールとして、各ヌクレアーゼを単独で発現させた。全ての条件について、サンプルは、空ベクターpCLS0003で10μgのトータルDNAに仕上げた。2日後、細胞を採集し、ゲノム抽出を行った。変異誘発頻度をディープシーケンシングにより決定した。T1及びT2標的を、454sequencingsystemでのハイスループット配列決定に必要とされる特異的アダプターに隣接する特異的プライマーを用いて増幅した。T1及びT2遺伝子座にて、プライマーFT2:5CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGCTTTACATTTACTGAACAAATAAC3及びRT1:5CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGGATCTCACCCGGAACAGCTTAAATTTC3を使用した。サンプルあたり5000~10000配列を分析した。結果ヌクレアーゼN1及びN2により標的T1及びT2で誘導される変異の率を、ディープシーケンシングにより測定した。結果を表11に示す。N1ヌクレアーゼでトランスフェクトした細胞に相当するサンプル中で、PCRフラグメントの063が変異を有していた。同様に、N2ヌクレアーゼでトランスフェクトした細胞に相当するサンプル中で、PCRフラグメントの146が変異を有していた。誘導された変異誘発の率は、細胞をN1及びN2の両方を発現するプラスミドでトランスフェクトしたとき、T1標的に対しては133まで、T2標的に対しては248まで増大した。このことは、2つの近接する配列を標的する2つのヌクレアーゼの存在が、変異誘発の頻度を約2倍まで刺激することを示している。興味深いことに、唯1つのヌクレアーゼプラスミドでトランスフェクトしたサンプルでは、観察された欠失の多数は小さな欠失である。対照的に、両ヌクレアーゼ発現プラスミドで同時トランスフェクトしたサンプルでは、欠失の大部分は大きな欠失であり、これは2つの切断部位間の介在配列に相当する。よって、173bp離間した2つの近接する配列を標的する2つのヌクレアーゼの同時トランスフェクションは、変異誘発頻度を刺激することが認められた。参考文献ArimondoPBCJThomasetalExploringthecellularactivityofcamptothecintriplehelixformingoligonucleotideconjugatesMolCellBiol2632433ArnouldSPChamesetalEngineeringoflargenumbersofhighlyspecifichomingendonucleasesthatinducerecombinationonnovelDNAtargetsJMolBiol35544358ArnouldSCPerezetalEngineeredICreIderivativescleavingsequencesfromthehumanXPCgenecaninducehighlyefficientgenecorrectioninmammaliancellsJMolBiol3714965AshworthJJJHavraneketalComputationalredesignofendonucleaseDNAbindingandcleavagespecificityNature4416569BeumerKJJKTrautmanetalEfficientgenetargetinginDrosophilabydirectembryoinjectionwithzincfingernucleasesProcNatlAcadSciUSA105198216BochJHScholzeetalBreakingthecodeofDNAbindingspecificityofTALtypeIIIeffectorsScience326150912BolducJMPCSpiegeletalStructuralandbiochemicalanalysesofDNAandRNAbindingbyabifunctionalhomingendonucleaseandgroupIintronsplicingfactorGenesDev17287588BrittABMoleculargeneticsofDNArepairinhigherplantsTrendsPlantSci42025BurdenandONMechanismofactionofeukaryotictopoisomeraseIIanddrugstargetedtotheenzymeBiochimBiophysActa1400139154CapecchiMRThenewmousegeneticsalteringthegenomebygenetargetingTrendsGenet5706CathomenTandJKJoungZincfingernucleasesthenextgenerationemergesMolTher1612007ChamesPJCEpinatetalInvivoselectionofengineeredhomingendonucleasesusingdoublestrandbreakinducedhomologousrecombinationNucleicAcidsRes33e178ChevalierBMTurmeletalFlexibleDNAtargetsiterecognitionbydivergenthomingendonucleaseisoschizomersICreIandIMsoIJMolBiol32925369ChevalierBSTKortemmeetalDesignactivityandstructureofahighlyspecificartificialendonucleaseMolCell10895905ChevalierBSRJMonnatJretalThehomingendonucleaseICreIusesthreemetalsoneofwhichissharedbetweenthetwoactivesitesNatStructBiol83126ChevalierBSandBLStoddardHomingendonucleasesstructuralandfunctionalinsightintothecatalystsofintroninteinmobilityNucleicAcidsRes29375774ChoulikaAAPerrinetalInductionofhomologousrecombinationinmammalianchromosomesbyusingtheISceIsystemofSaccharomycescerevisiaeMolCellBiol15196873ChristianMTCermaketalTargetingDNAdoublestrandbreakswithTALeffectornucleasesGenetics18675761CohenTannoudjiMSRobineetalISceIinducedgenereplacementatanaturallocusinembryonicstemcellsMolCellBiol1814448CritchlowSEandSPJacksonDNAendjoiningfromyeasttomanTrendsBiochemSci233948DonohoGMJasinetalAnalysisofgenetargetingandintrachromosomalhomologousrecombinationstimulatedbygenomicdoublestrandbreaksinmouseembryonicstemcellsMolCellBiol1840708DoyonJBVPattanayaketalDirectedevolutionandsubstratespecificityprofileofhomingendonucleaseISceIJAmChemSoc128247784DoyonYJMMcCammonetalHeritabletargetedgenedisruptioninzebrafishusingdesignedzincfingernucleasesNatBiotechnol267028DujonBLColleauxetalMitochondrialintronsasmobilegeneticelementstheroleofintronencodedproteinsBasicLifeSci40527EisenschmidtKTLanioetalDevelopingaprogrammedrestrictionendonucleaseforhighlyspecificDNAcleavageNucleicAcidsRes33703947EndoMKOsakabeetalMolecularcharacterizationoftrueandectopicgenetargetingeventsattheacetolactatesynthasegeneinArabidopsisPlantCellPhysiol473729EndoMKOsakabeetalMolecularbreedingofanovelherbicidetolerantricebygenetargetingPlantJ5215766EpinatJCSArnouldetalAnovelengineeredmeganucleaseinduceshomologousrecombinationinyeastandmammaliancellsNucleicAcidsRes31295262FeldmannEVSchmiemannetalDNAdoublestrandbreakrepairincellfreeextractsfromKu80deficientcellsimplicationsforKuservingasanalignmentfactorinnonhomologousDNAendjoiningNucleicAcidsRes28258596GimbleFSCMMoureetalAssessingtheplasticityofDNAtargetsiterecognitionofthePISceIhomingendonucleaseusingabacterialtwohybridselectionsystemJMolBiol3349931008GoubleAJSmithetalEfficientintototargetedrecombinationinmouseliverbymeganucleaseinduceddoublestrandbreakJGeneMed861622GrizotSJSmithetalEfficienttargetingofaSCIDgenebyanengineeredsinglechainhomingendonucleaseNucleicAcidsRes37540519HaberJPartnersandpathwaysrepairingadoublestrandbreakTrendsGenet16259264HaberJEInvivobiochemistryphysicalmonitoringofrecombinationinducedbysitespecificendonucleasesBioessays1760920HaninMSVolrathetalGenetargetinginArabidopsisPlantJ286717IchiyanagiKYIshinoetalCrystalstructureofanarchaealinteinencodedhomingendonucleasePIPfuIJMolBiol300889901KalishJMandPMGlazerTargetedgenomemodificationviatriplehelixformationAnnNYAcadSci105815161KimYGJChaetalHybridrestrictionenzymeszincfingerfusionstoFokIcleavagedomainProcNatlAcadSciUSA93115660KirikASSalomonetalSpeciesspecificdoublestrandbreakrepairandgenomeevolutioninplantsEmboJ1955626LiHHVogeletalDeletionofKu70Ku80orbothcausesearlyagingwithoutsubstantiallyincreasedcancerMolCellBiol27820514LiTSHuangetalTALnucleaseshybridproteinscomposedofTALeffectorsandFokIDNAcleavagedomainNucleicAcidsRes3935972LieberMRandZEKaranjawalaAgeingrepetitivegenomesandDNAdamageNatRevMolCellBiol56975LloydACLPlaisieretalTargetedmutagenesisusingzincfingernucleasesinArabidopsisProcNatlAcadSciUSA10222327MaJEKimetalYeastMre11andRad1proteinsdefineaKuindependentmechanismtorepairdoublestrandbreakslackingoverlappingendsequencesMolCellBiol2388208828MengXMBNoyesetalTargetedgeneinactivationinzebrafishusingengineeredzincfingernucleasesNatBiotechnol26695701MooreIMSamalovaetalTransactivatedandchemicallyinduciblegeneexpressioninplantsPlantJ4565183MooreJKandJEHaberCellcycleandgeneticrequirementsoftwopathwaysofnonhomologousendjoiningrepairofdoublestrandbreaksinSaccharomycescerevisiaeMolCellBiol16216473MoscouMJandAJBogdanoveAsimpleciphergovernsDNArecognitionbyTALeffectorsScience3261501MoureCMFSGimbleetalCrystalstructureoftheinteinhomingendonucleasePISceIboundtoitsrecognitionsequenceNatStructBiol976470MoureCMFSGimbleetalThecrystalstructureofthegenetargetinghomingendonucleaseISceIrevealstheoriginsofitstargetsitespecificityJMolBiol33468595NagyZandESoutoglouDNArepaireasytovisualizedifficulttoelucidateTrendsCellBiol1961729NouspikelTDNArepairinmammaliancellsNucleotideexcisionrepairvariationsonversatilityCellMolLifeSci669941009PadidamMChemicallyregulatedgeneexpressioninplantsCurrOpinPlantBiol616977PaquesFandPDuchateauMeganucleasesandDNAdoublestrandbreakinducedrecombinationperspectivesforgenetherapyCurrGeneTher74966PaquesFandJEHaberMultiplepathwaysofrecombinationinducedbydoublestrandbreaksinSaccharomycescerevisiaeMicrobiolMolBiolRev63349404PingoudAandGHSilvaPrecisiongenomesurgeryNatBiotechnol257434PorteusMHandDCarrollGenetargetingusingzincfingernucleasesNatBiotechnol2396773PosfaiGVKolisnychenkoetalMarkerlessgenereplacementinEscherichiacolistimulatedbyadoublestrandbreakinthechromosomeNucleicAcidsRes27440915PovirkLFDNAdamageandmutagenesisbyradiomimeticDNAcleavingagentsbleomycinneocarzinostatinandotherenediynesMutatRes3557189PuchtaHBDujonetalTwodifferentbutrelatedmechanismsareusedinplantsfortherepairofgenomicdoublestrandbreaksbyhomologousrecombinationProcNatlAcadSciUSA93505560RosenLEHAMorrisonetalHomingendonucleaseICreIderivativeswithnovelDNAtargetspecificitiesNucleicAcidsResRothsteinRTargetingdisruptionreplacementandallelerescueintegrativeDNAtransformationinyeastMethodsEnzymol194281301RouetPFSmihetalExpressionofasitespecificendonucleasestimulateshomologousrecombinationinmammaliancellsProcNatlAcadSciUSA9160648RouetPFSmihetalIntroductionofdoublestrandbreaksintothegenomeofmousecellsbyexpressionofararecuttingendonucleaseMolCellBiol148096106SargentRGMABrennemanetalRepairofsitespecificdoublestrandbreaksinamammalianchromosomebyhomologousandillegitimaterecombinationMolCellBiol1726777SeligmanLMKMStephensetalGeneticanalysisoftheChlamydomonasreinhardtiiICreImobileintronhomingsysteminEscherichiacoliGenetics147165364SiebertRandHPuchtaEfficientRepairofGenomicDoubleStrandBreaksbyHomologousRecombinationbetweenDirectlyRepeatedSequencesinthePlantGenomePlantCell14112131SilvaGHJZDalgaardetalCrystalstructureofthethermostablearchaealintronencodedendonucleaseIDmoIJMolBiol286112336SimonPFCannataetalSequencespecificDNAcleavagemediatedbybipyridinepolyamideconjugatesNucleicAcidsRes3635318SmithJSGrizotetalAcombinatorialapproachtocreateartificialhomingendonucleasescleavingchosensequencesNucleicAcidsRes34e149SonodaEHHocheggeretalDifferentialusageofnonhomologousendjoiningandhomologousrecombinationindoublestrandbreakrepairDNARepair510219SpiegelPCBChevalieretalThestructureofICeuIhomingendonucleaseEvolvingasymmetricDNArecognitionfromasymmetricproteinscaffoldStructure1486980StoddardBLHomingendonucleasestructureandfunctionQRevBiophys384995SussmanDMChadseyetalIsolationandcharacterizationofnewhomingendonucleasespecificitiesatindividualtargetsitepositionsJMolBiol3423141TeicherBANextgenerationtopoisomeraseIinhibitorsRationaleandbiomarkerstrategiesBiochemPharmacol75126271TeradaRYJohzukaHisatomietalGenetargetingbyhomologousrecombinationasabiotechnologicaltoolforricefunctionalgenomicsPlantPhysiol14484656TeradaRHUrawaetalEfficientgenetargetingbyhomologousrecombinationinriceNatBiotechnol2010304WangRXZhouetalChemicallyregulatedexpressionsystemsandtheirapplicationsintransgenicplantsTransgenicRes1252940ZuoJandNHChuaChemicalinduciblesystemsforregulatedexpressionofplantgenesCurrOpinBiotechnol1114651GrizotSJCEpinatetalGenerationofredesignedhomingendonucleasescomprisingDNAbindingdomainsderivedfromtwodifferentscaffoldsNucleicAcidsRes38200618MazurDJandFWPerrinoStructureandexpressionoftheTREX1andTREX235exonucleasegenesJBiolChem2761471827PerrinoFWdeSilvaUHarveySPryorEEJrColeDWandHollisTCooperativeDNAbindingandcommunicationacrossthedimerinterfaceintheTREX235exonucleaseJBiolChem2832144152"