ヒト患者におけるクロストリジウムディフィシルClostridiumdifficile感染を治療する方法であって、ヒトクロストリジウムディフィシル毒素中和ポリクローナル免疫グロブリンを該ヒト患者へ経皮投与することを含む、方法。クロストリジウムディフィシル毒素中和ポリクローナル免疫グロブリンが、ヒト患者へ筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与される、請求項1記載の方法。体重1kg当たり001~100mgのクロストリジウムディフィシル毒素中和免疫グロブリンがヒト患者へ投与される、請求項1記載の方法。クロストリジウムの毒素またはトキソイドをヒト患者へ経皮投与することをさらに含む、請求項1記載の方法。クロストリジウムの毒素またはトキソイドが、ヒト患者へ筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与される、請求項4記載の方法。ヒト患者におけるクロストリジウムディフィシル感染を予防する方法であって、クロストリジウムディフィシルの毒素またはトキソイドに対して誘起されたヒト毒素中和抗体を該ヒト患者へ経皮投与することを含む、方法。抗体がクロストリジウムディフィシル毒素中和ポリクローナル免疫グロブリンである、請求項6記載の方法。抗体が、ヒト患者へ筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与される、請求項6記載の方法。体重1kg当たり001~100mgの抗体がヒト患者へ投与される、請求項6記載の方法。クロストリジウムの毒素またはトキソイドをヒト患者へ投与することをさらに含む、請求項6記載の方法。クロストリジウムの毒素またはトキソイドが、ヒト患者へ筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与される、請求項10記載の方法。ヒト患者におけるクロストリジウムディフィシル感染を予防または治療する方法であって、クロストリジウムの毒素またはトキソイドを該ヒト患者へ経皮投与することを含む、方法。毒素またはトキソイドがクロストリジウムディフィシルの毒素またはトキソイドである、請求項12記載の方法。患者が、再発性クロストリジウムディフィシル関連下痢症を有しているか、またはそれを発症するリスクを有している、請求項12記載の方法。クロストリジウムの毒素またはトキソイドが、ヒト患者へ筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与される、請求項12記載の方法。患者が、症候性クロストリジウムディフィシル感染を有していないが、それを発症するリスクを有している、請求項12記載の方法。患者が、症候性クロストリジウムディフィシル感染を有している、請求項12記載の方法。詳細な説明本発明は、ヒトのような哺乳動物におけるCディフィシル疾患の予防および治療のための方法および組成物を提供する。その方法は、Cディフィシルトキソイドに対する抗体例えば、毒素中和ポリクローナル免疫グロブリン、Cディフィシルトキソイドそれ自体、またはそれらの組み合わせの、経皮例えば、筋肉内、静脈内、または腹腔内投与を含む、受動および能動の免疫感作アプローチを含む。例えば、本発明は、トキソイドAおよびまたはトキソイドBを含むワクチンの経皮投与例えば、筋肉内による再発性Cディフィシル関連下痢症CDADの予防およびまたは治療の方法を含む。本発明は、Cディフィシルトキソイド、Cディフィシルトキソイドを含有しているワクチン組成物、Cディフィシル毒素中和ポリクローナル免疫グロブリンを作製する方法、実質的に精製されたCディフィシル毒素中和ポリクローナル免疫グロブリン、およびCディフィシル毒素中和ポリクローナル免疫グロブリンのドナーを同定する方法を含む。これらの方法および組成物について、以下、さらに記載する。本発明の予防および治療の方法は、治療そのものの実施における、または後に受動免疫感作において使用するためのCディフィシル免疫グロブリンの作製における、Cディフィシルトキソイドによる予防接種を含む。Cディフィシルトキソイドは、Cディフィシル培養物からの毒素毒素A、毒素B、またはそれらの組み合わせの精製、および化学的な、例えば、ホルムアルデヒド下記参照、グルタルアルデヒド、過酸化物、または酸素による処理による毒素の不活化により作製され得る例えば、RelyveldetalMethodsinEnzymology93:241983;WoodrowandLevineedsNewGenerationVaccinesMarcelDekkerIncNewYork1990を参照のこと。または、毒性を欠くかまたは低下した毒性を有している野生型または変異型のCディフィシル毒素が、組み換え法を使用して作製され得る。遺伝学的方法によりトキソイドを作成する方法は、当技術分野において周知である例えば、米国特許第5085862号、第5221618号;第5244657号;第5332583号;第5358868号;および第5433945号を参照のこと。例えば、毒素のアミノ末端酵素領域を除去する欠失変異が作成され得る。欠失または点変異は、毒素活性部位に作成されてもよい。さらに、受容体または炭水化物の結合を防止する欠失または点変異が作成されてもよい。Cディフィシルトキソイドを含有しているワクチン組成物は、薬学的に許容される希釈剤例えば、生理食塩水にトキソイドを懸濁させることにより、または薬学的に許容される担体とトキソイドを会合させることにより、投与用に調製され得る。トキソイドは、当業者により決定され得る量で、アジュバントの存在下または非存在下で投与され得る。本発明において使用され得るアジュバントには、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびヒドロキシリン酸アルミニウムaluminumhydroxyphosphateのようなアルミニウム化合物が含まれる。抗原は、標準的な方法を使用して、アルミニウム化合物により沈殿させられるか、またはアルミニウム化合物に吸着させられ得る。具体例として、ミョウバン例えば、RehydragelLV登録商標ReheisIncBerkeleyHeightsNewJersey;最大2mgAlOH用量、例えば、約15mgAlOH用量が使用され得る。使用され得るさらなるアジュバントには、RIBIImmunoChemHamiltonMT、QS21Aquila、BayBayer、およびPolyphosphazeneVirusResearchInstituteCambridgeMA;WO952415が含まれる。本発明のワクチン組成物は、当業者により適切であると決定された量および計画で経皮例えば、筋肉内、静脈内、または腹腔内経路により投与され得る。例えば、100ng~500μg、1~250μg、10~100μg、25~75μg、または50μgのトキソイドが投与され得る。予防または治療の目的の場合、ワクチンは、例えば、1回、2回、3回、または4回、投与され得る。複数回投与される場合、投与間隔は、例えば、1週間~1ヶ月であり得る。Cディフィシル免疫グロブリンのドナーを刺激する目的の場合には、より多くの回数、投与され得る。例えば、1週間~1ヶ月の間隔で、例えば、最大6回、投与され得る。もう一つの例において、各50μgを、4回、8週間にわたり筋肉内投与することができる。そのようなスケジュールは、再発性Cディフィシル関連下痢症の治療に関連して、より詳細に後に記載される。予防接種がCディフィシルポリクローナル免疫グロブリン例えば、ヒトCディフィシルポリクローナル免疫グロブリンを作製するために実施される場合には、まず、免疫感作されたドナーからの血清試料が、酵素結合免疫吸着アッセイELISA分析により、Cディフィシル毒素Aおよび毒素Bの存在に関してモニタリングされる。簡単に説明すると、ELISAプレートを、炭酸重炭酸、pH85および1μgmlのタンパク質精製された毒素Aまたは毒素Bによりコーティングし、4°Cで一夜インキュベートする。ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水PBSで希釈された血清試料と接触させ、洗浄し、アルカリホスファターゼのような検出可能標識に連結された抗ヒト抗体と接触させる。バックグラウンドに対して2倍超のシグナルの検出を陽性とみなす。シグナルは、405nmにおける光学濃度測定により検出される。次いで、ELISAアッセイにおいて陽性であった試料を、毒素中和アッセイにおいて試験する。簡単に説明すると、血清試料100μlを、MEMで2倍段階希釈し、等しい容量の10MC50を含有している毒素Aと共に、37°Cで1時間、プレインキュベートする。毒素A濃度を細胞のチャレンジのため規準化する。例えば、細胞の50に影響を与える濃度の10倍が、チャレンジのために使用される。毒素Aのために使用される範囲は、10~100ngである。次いで、毒素A血清混合物100μlを、コンフルエントなIMR90細胞単層AmericanTypeCultureCollectionATCCRockvilleMaryland;Torresetalsupraに添加する。重層された細胞を、37°Cで16~18時間、インキュベートし、次いで、細胞毒性に関して判定する。細胞の少なくとも50が球状化から防御された場合、その血清は防御的と見なされる。毒素Bについての効力テストは、IMR90細胞アッセイ法における細胞毒性の決定の前に、血清試料が毒素Bと共にプレインキュベートされることを除き、毒素Aに関して上に記載されたのと同じ手法により、実施される。IMR90細胞の50に対して効果を有する毒素Bの量は、10~100pgである。上記のスクリーニング法は、Cディフィシルトキソイドにより予防接種されていないが、正常より高いCディフィシル毒素に対する抗体の血清レベルを有している対象を同定するためにも使用され得る。これらの対象は、Cディフィシル免疫グロブリンの作製のための、トキソイドによる予防接種のための良好な候補である。許容されるドナーが同定された後は、標準的な血漿分離法を使用して、ドナーから免疫グロブリンが入手される。免疫グロブリンは、Cohnの低温エタノール分画のような標準的な方法、またはサイジングsizingカラムクロマトグラフィもしくは例えば、プロテインAを使用した抗体アフィニティクロマトグラフィのような標準的なクロマトグラフィ法を使用して精製される。最大で1週間に2回、ドナーから全血500ml~1Lを入手し、遠心分離により血漿を単離し、細胞をドナーに戻す。好ましくは、精製された試料は、IgGのみを含有しているか、または主にIgGを含有しているが、例えば、IgG、IgA、およびIgMを含有している混合物も、本発明において使用され得る。上記のようにして調製されたCディフィシル免疫グロブリンは、Cディフィシル感染を有しているか、またはそれを発症するリスクを有している患者に、経皮例えば、筋肉内、静脈内、または腹腔内投与され得る。これらの患者集団には、例えば、入院高齢患者、養護ホーム居住者、慢性病患者、癌患者、エイズ患者、集中治療室の患者、および透析治療を受けている患者のような、広域性抗生物質を受容したことのある患者が含まれる。Cディフィシル免疫グロブリンは、ドナー力価に依って、100μmkg~100mgkgまたは1~50mgkgの範囲内、例えば、約15mgkgの量で投与され:免疫グロブリンの中和力価が高いほど、投与される必要がある量は、低くなる。免疫グロブリンは、例えば、1回または2回、投与され得る。例えば、治療的な受動免疫感作の場合には、初回量を治療のために投与し、再発を予防するために2回目を投与することができる。本発明の方法および組成物を、本発明を支持する実験的な証拠と共に、以下のように、さらに詳細に記載する。ワクチン作製概要Cディフィシル毒素Aおよび毒素Bは、培養ビン10~20Lにおいて培養されたCディフィシルの嫌気培養物において産生される。CディフィシルのマスターMasterセルバンクおよびワーキングworkingセルバンクが、CディフィシルATCC43255株からATCCにおいて調製された凍結乾燥リサーチresearchセルバンクから製造された。ワクチン作製のため、増殖培地に懸濁した透析サックで培養されたCディフィシル培養物により、毒素を産生させる。多数のサック培養物をプールし、生存可能なCディフィシルおよび胞子を、遠心分離、それに続くサブミクロン濾過により除去する。得られた濾液を濃縮し、透析濾過diafilteredし、4°Cで60飽和硫酸アンモニウムにより毒素を沈殿させ、ペレットを凍結保管する。硫酸アンモニウムペレットを、リン酸緩衝液に再溶解させ、S300セファクリルサイズ排除カラムに適用する。毒素Aおよび毒素Bを含有しているピークを収集し濃縮する2:1の毒素A毒素B比で、50~60毒素。次いで、毒素調製物を、425mgmlリジンを含有している溶液中で、4°C~6°Cで、425mgmlホルムアルデヒドにより、18日間不活化する。不活化の後、安定剤として使用するため、ホルムアルデヒド濃度を透析濾過により0016にまで低下させる。最終産物を、25mgmlの濃度で、06mlの充填容量でガラスバイアルに充填する。現在の方法は、15~20mgLまたは150~200回分のトキソイドを与える。同一性、効力、および安全性のロットリリーステスティングlotreleasetestingアッセイは、全て、臨床前ロットにおいて確立された。GMPマスターセルバンクおよびプロダクションProductionセルバンクが作製され、認定され、安定的な条件で保管された。Cディフィシルトキソイドワクチン調製を、以下、さらに詳細に記載する。マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクリサーチシードresearchseedは、基準株ATCC43255のアンプルを使用して、標準的な方法により、ATCCによる契約の下で調製され凍結乾燥された。オキソイドリインフォースドクロストリジアル培地OxoidReinforcedClostridialMediumRCMが、シードストックを培養するために使用されたOxoidLtdHampshireEngland。培地中のウシ由来材料は、オーストラリア、ニュージーランド、オランダ、および米国で、ヒト消費用に使用される健康な動物から入手された。培養物は、保存剤として5デキストランおよびトレハロースを使用して、RCM中で安定化された。CディフィシルマスターセルバンクMCBおよびワーキングセルバンクWCBの調製CディフィシルのMCBは、リサーチシードストックの凍結乾燥バイアルを、RCMATCCにより使用されたのと同じロットに再懸濁させ、インキュベートし、それに続いて、トリプトン048酵母抽出物024マンニトール01TYM培地で2回増幅することにより、調製された。グリセロールを凍結保護剤として添加し、およそ1mlずつに分割したもの250個を急速凍結させ、液体窒素中で保管した。ワーキングセルバンクは、MCBのバイアルを接種原として使用して、同様の様式で調製された。セルバンク試験マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクは、生存率、純度、同一性、および毒素発現に関して試験された。生存率は、固形培地および液体培地の両方における増殖により証明された。純度は、嫌気培養下でのグラム染色およびコロニー形態学、ならびに好気増殖の欠如により試験された。Cディフィシルの同一性は、ガスクロマトグラフィ脂肪酸分析、および臨床的な嫌気的同一性試験により証明された。毒素の発現および同一性は、透析サックでセルバンクを培養し、交差免疫電気泳動により両毒素の発現に関して培養物を試験することにより確認された。毒素Aの発現および同一性は、ELISAによっても確認された。毒素Bの発現は、細胞毒性に関する試験および細胞毒性の特異的な中和により確認された。毒素発現は、ATCC43255標準と平行に測定され、比較可能であることが示された。培養および毒素発現毒素は、窒素源例えば、1~100gL、5~20gL、または12gLの濃度のトリプトン、酵母抽出物1~100gL、15~35gL、または24gL、リン酸緩衝液、炭素源例えば、マンニトール1~50gL、例えば、8gL、グルコース、グリセロール1~50gL、例えば、4gL、またはマンニトールグリセロール例えば、上に示された量を含有している培地に懸濁した、透析サック13~14000分子量カットオフで培養されたCディフィシルの嫌気培養物において産生される。産生は、ワーキングセルバンクのバイアルを小さい静置培養物において増幅し、その培養物の一定分量を、透析サックに接種するために使用することにより、開始させられる。およそ5日間の37°Cにおける増殖の後、サック内の材料を採集する。採集された産物を、増殖型の細胞および胞子を除去するため、遠心分離し、濾過する05μm、続いて02μm。濾液を洗浄し、濃縮し、硫酸アンモニウムにより沈殿させる。培養単位の調製培養単位は、2つのサイドアームポートを有する8Lまたは16Lのスピナーフラスコ、透析サック、およびリン酸緩衝液の1Lまたは2Lのフラスコからなる。最大25個の8Lまたは16Lの単位を、各産生ランのために接種する。培養単位は、スピナーフラスコで培地を溶解させ、サイドアームポート間に透析サックを吊るし、ポートの端にキャップをし、100mMリン酸緩衝液のフラスコを1つのポートへ取り付けることにより調製される。培地の滅菌および嫌気生活の作出のため、単位全体をオートクレーブ処理する。50°C未満にまで冷却した後、リン酸緩衝液をポンプで透析サックへと送り込み、単位を37°Cで一夜平衡化しその間に、増殖栄養素が透析サックへと拡散し、細菌増殖に適した条件が確立される、その後、接種を行う。接種および培養ワーキングセルバンクのバイアルを解凍し、嫌気TYスターター培地トリプトン048および酵母抽出物02450mlに接種するために使用する。フラスコを、14~16時間、37°Cの嫌気チャンバーに置く。接種原を含む適切な容量の希釈剤およそ2mlを、各透析サックに添加する。次いで、培養単位をインキュベーターに戻し、5日間放置する。不必要な撹拌を防止することにより、オートクレーブ処理の後、嫌気生活を維持する。採集、濾過、および沈殿インキュベーションの後、培養単位をインキュベーターから取り出し、透析サックの内容物をポンプで送り出し、プールし、培養物の純度および同一性に関して試験する。遠心分離、それに続く、05μmプレフィルター、次いで02μm滅菌フィルターによる濾過により、生存可能なCディフィシル生物および胞子を除去する。濾液を、毒素Aおよび毒素Bの濃度、ならびに無菌性に関して試験し、30000MWカットオフ中空糸カートリッジを用いた限外濾過により10倍に濃縮する。濾液を、25mMトリス、pH75により洗浄し、低分子量培地成分を減少させる。濾過された飽和硫酸アンモニウム溶液を、60飽和の最終溶液が得られるよう、濃縮物に添加する。その溶液を4°Cで48時間以上インキュベートし、遠心分離および上清の廃棄により、毒素を含有している沈殿物を採集する。硫酸アンモニウムペレットを、さらなる加工まで、-10°C以下で凍結保管する。精製および不活化ペレットを、室温で、100mMリン酸緩衝液、pH74と混合することにより解凍する。可溶化された毒素を、遠心分離により清浄化し、045μmフィルタを使用して濾過する。次いで、清浄化された材料を、セファクリルS300ハイリゾリューションHighResolutionPharmaciaBiotechnologyゲル濾過カラムにおいて分画する。典型的なクロマトグラフィプロファイルを図1に示す。毒素ピークを収集し、50±05mgmlに濃縮する。収集は、クロマトグラムの視覚的検査により決定されるような、毒素ピークの上昇期から開始し、下降期の変曲点まで継続する。精製の後、毒素溶液を、425mgmlのホルムアルデヒドを使用して、4~6°Cで、18日間不活化する。不活化は、425mgmlリジン塩酸塩を含有している100mMリン酸緩衝液においてpH70±02で実施される。不活化期間は、マウスにおける致死の完全な排除のために必要とされる期間の3倍を越えるよう設定される。従って、不活化の6日目までに、05mgのトキソイドによる腹腔内接種は、マウスにおいて致死または体重変化を与えないようになる。これは、IMR90細胞における細胞毒性力価のおよそ6log10の減少に相当する。18日間の不活化の後、生物学的活性は、典型的には、8~9log10という完全な不活化のため、IMR90細胞に対する効果により判断されるように、さらに2~3桁減少する。18日間の不活化の後、不活化された毒素を、50mMリン酸、100mMNaCl、pH74に緩衝液交換し、ホルムアルデヒド濃度を016±004mgmlに低下させる。25mgmlの可溶性不活化毒素を滅菌濾過し、グレーブチルゴム栓graybutylrubberstoppersを有する2mlI型ホウケイ酸ガラスバイアルに充填する。不活化および製剤化の条件を支持する研究ホルムアルデヒドによる毒素不活化のための最適条件を確立するため、拡張的な研究を実施した。生物学的活性の損失をモニタリングするため、これらの研究は、Cディフィシル毒素の生物学的活性の高感度の指標となるIMR90組織培養系を利用したTorresetalsupra。研究されたパラメータには、完全なトキソイド化toxoidingを容易にするために設計された、ホルムアルデヒドおよび毒素の濃度、緩衝液の組成、pH、時間、温度、ならびに添加されるLリジンの効果が含まれた表1。表1試験されたパラメータ一般に、Cディフィシル毒素は、全ての条件下で、37°Cでの不活化に対して極めて感受性であり、極めて迅速に不活化が起こった例えば、8時間で7log10の活性の損失。従って、不活化の制御および再現性を最大限にするため、本発明者らは、4°Cで不活化することに決定した。4°Cで不活化されたトキソイドは、37°Cでホルムアルデヒドにより不活化されたトキソイドより高い抗体力価を誘導した。選択された明示された条件の下では、インビトロのおよそ5~6log10の損失に相当する、検出可能なインビボの生物学的活性の完全な損失が、6日間の不活化で起こる。十分な安全性の余裕を提供するため、不活化はさらに12日間継続され、その間に、さらに2~3log10の細胞毒性が失われる。不活化期間の終了時、細胞培養系中の活性は、検出可能しきい値において、かろうじて検出可能である。典型的な不活化の動力学を、図2に示す。低濃度のホルマリンが、トキソイド復帰を防止するため、ワクチンの製剤に含まれる。他の毒素で復帰を低下させることが既知である、活性化部位へのLys取り込みにも関わらずRelyveldProgImmunobiolStand3:2581969、復帰は検出された。製剤化の選択は、様々な条件の下で、復帰の可能性を含むトキソイドの安定性を決定するために行われた、多数の研究に基づいていた。一般に、トキソイドは、低濃度の残余ホルマリンの存在下または存在下で、4°Cで安定していた。残余ホルマリンの非存在下では、部分的な復帰が比較的高い温度28~37°Cで起こり、トキソイドは、数日~数週かけて検出可能な生物学的活性を回復した表2。表2ホルマリンの非存在下におけるCディフィシルトキソイドの部分的な復帰認められるように、長期間2ヶ月以上、復帰のための最適条件37°Cへの曝露の後ですら、部分的な復帰のみが検出されている。この時間の後、最初に不活化された8~9log10のうちおよそ5log10が回復された。復帰は、全ての温度で、0010以上の濃度のホルマリンを含めることにより、完全に防止された表3。従って、製剤化されたトキソイドワクチンのための規格は、0012~0020のホルマリン濃度を保証するよう設定されている。表3低濃度のホルマリンによる復帰の防止不活化前のCディフィシル毒素の特徴決定サイズ排除クロマトグラフィの後、ホルムアルデヒド処理の前に、部分精製された毒素調製物を特徴決定するための研究を行った。毒素Aおよび毒素Bは、トリス-グリシン還元SDSPAGEにおいて十分に分離されない。しかしながら、全毒素毒素Aおよび毒素Bは、クーマシー染色されたトリス-グリシン還元SDSPAGEゲルの濃度測定スキャニングによって推定され得る。全毒素は、全タンパク質の50~60を占める。これらの還元ゲルのイムノブロットは、一つの大きな抗毒素A反応性バンド、ならびに抗毒素B反応性の一つの大きなバンドおよびいくつかの小さいバンドを示す。本発明者らは、ワクチン中の主要な不純物の同定を行った。精製されたバルク毒素をSDSPAGEゲルに過負荷し、還元SDSPAGE条件下でタンパク質を分離した。毒素バンドを切り取るため、244kDaの予備染色されたマーカーの直下で、ゲルを切断した。次いで、毒素バンドより下のタンパク質をPVDF膜に転写し、配列データベースとの相同性比較のためアミノ酸配列決定に供した。18~25サイクルのN末端配列決定から、本発明者らは、およそ35kDaの不純物がCディフィシル3ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼであり、45~47kDaの不純物がCディフィシルグルタミン酸デヒドロゲナーゼであり、60~70kDaのタンパク質がgroELのホモログまたは細菌hsp60ファミリーのタンパク質およそ70の相同性であることを同定した。抗毒素A抗体および抗毒素B抗体を用いたウェスタンブロッティングにより確認されたように、毒素Aタンパク質と毒素Bタンパク質との良好な分離は、非還元PAGEゲルを使用して達成される。還元ゲルの場合と同様に、多数の比較的低分子量の抗毒素B反応性バンドが観察される。毒素Aは、DEAE5PWカラムを使用したイオン交換HPLCによっても毒素Bから分離され得る。毒素A毒素B比は、ELISAにより測定した場合、およそ22、イオン交換クロマトグラフィにより測定した場合、およそ19である。ミョウバン吸着トキソイドワクチン本発明者らは、市販の20mgml酸化アルミニウムを含有している無菌RehydragelLV登録商標ReheisIncBerkeleyHeightsNewJerseyから、トキソイド吸着のためのミョウバンを調製する。この材料を、まず、pH74の50mMリン酸緩衝液、100mMNaCl、100mgmlホルムアルデヒドにより、3mgml酸化アルミニウムにまで希釈する。希釈されたミョウバンを、クラス100条件下で、グレーブチルゴム栓を有する無菌の発熱性物質なしの10ml容量ガラスバイアルに無菌的に充填する。Cディフィシル免疫グロブリンドナーを作製するための予防接種のための候補の同定上述のように、Cディフィシル免疫グロブリンドナーは、Cディフィシルトキソイドワクチンの経皮投与によって作製され得る。予防接種のための好ましい候補は、既にCディフィシルトキソイド中和抗体を有している対象である。これらのドナーは、毒素に曝されたことがあり、有用な力価に達するために、より少ない追加刺激を必要とするであろう。本発明者らは、静脈内免疫グロブリンの9つの商業的なロットを試験し、それらが極めて低いレベルのCディフィシル毒素Aおよび毒素Bに対する中和抗体を含有していることを見出した。これらの調製物中の抗毒素の力価は、いずれの毒素に対しても<1:50であり、毒素Aより毒素Bに対する力価の方が高い。本発明者らは、Nevadaのセンターからの100人の専門家血漿ドナーの調査も実施した。その結果は、これらの個体の2および13が、それぞれ抗毒素Aおよび抗毒素Bの中和抗体を有していたが、力価は極めて低かったことを示している。これらのデータは、Cディフィシル治療用の過免疫ヒト抗毒素を調製する目的のため、未刺激の血清陽性血漿ドナーからの血漿を選択することは効果的でないであろうこと、および、治療用のヒト免疫グロブリンを作製するためには、トキソイドワクチンによる免疫感作によりドナーを刺激する必要があることを示している。表4血漿ドナーの抗毒素抗体レベルn=100能動及び受動の免疫感作法の臨床前評価マウスの能動免疫感作8匹の雌SwissWebsterマウスの群を、1週間間隔で2回、ミョウバン吸着トキソイドワクチンにより腹腔内IP免疫感作した。トキソイドは、ヒト製剤を模倣するためにミョウバンに吸着させられたアルミニウム1mg当たりタンパク質0144mgの比率。用量は、吸着ワクチンの一連の10倍希釈で投与された。動物は、免疫原性の比較のための4つの異なるトキソイドロットを投薬された:1つは研究用ロットロット2733、3つは、臨床的産物の作製の方法に従い製造されたワクチンロットロット133、135、および144であった。2回目の免疫感作の1週間後、血清を、ELISAにより、全抗体に関して試験し、細胞毒性中和により、毒素Aおよび毒素Bに対する抗体に関して試験した。細胞毒性中和アッセイにおいては、毒素10×MC50を、37°Cで1時間、2倍抗体希釈物と共にインキュベートし、次いで、IMR90細胞の単層培養物へと接種する。中和力価は、球状化から細胞の50を防御する抗体の最も高い希釈率として表される。ELISAデータは、抗毒素免疫が用量依存的に発達することを示す。トキソイドの特定の稀釈液における応答の大きさを比較したところ、毒素Aは毒素Bよりわずかに免疫原性が強いようである。トキソイドは、中和抗体応答も誘発した。球状化から細胞を防御する中和抗体を誘発するために必要とされるトキソイドの用量は、毒素Aより毒素Bの方が高く、このことからも、マウスにおいては毒素Aの方が免疫原性が強いことが証明される。トキソイドワクチンが毒素AおよびBの致死効果からマウスを防御するか否かを決定するため、マウスの群を、1週間おきに2回、ワクチンにより腹腔内免疫感作した。次いで、それらに、毒素A100ng、IPまたは毒素B200ng、IVのLD50の5倍をチャレンジした。14日間、疾病および死亡に関して、動物をモニタリングした。免疫感作されていない動物は、チャレンジ後24時間以内に死亡した。結果は、>50ngのタンパク質を含有している吸着トキソイドの用量で毒素Aからマウスが防御され、>5mgの用量で毒素Bからマウスが防御されることを示した。上記の免疫原性実験において、毒素Aは、毒素Bのチャレンジから動物を防御するのに必要とされる用量より10~100倍低い用量で防御的であった。トキソイドの免疫原性に対するミョウバンの効果を、マウスにおいて試験した。10匹の動物の群を、可溶性トキソイドまたはミョウバン吸着トキソイドにより1週間毎に3回、腹腔内免疫感作した。ミョウバン吸着は、アルミニウム1mg当たり0144mgのトキソイドタンパク質を混合することにより、投薬の直前に実施された。動物は、10μgのトキソイド単独、または10μgのミョウバン吸着トキソイドを受容した。抗毒素免疫応答は、血清試料におけるELISAおよび細胞毒性中和により測定された。ELISAにより決定された全抗体力価は、可溶性トキソイドおよびミョウバン吸着トキソイドについて比較可能であった。両方の毒素に対する中和抗体力価は、ミョウバン吸着トキソイドを受容した群の方が高かった。マウスは、非経口投与された精製された毒素Aおよび毒素Bに対して極めて感受性であり、従って、トキソイド不活化をモニタリングするために使用され得る。個々に試験された、精製された毒素Aおよび毒素BのLD50は、およそ50ngである。不活化前の部分精製された毒素調製物は、およそ4~8ngの各毒素に相当する、20ng未満の全タンパク質というLD50を有しており、そのことは、毒素が、共に投与された場合、協同作用することを示唆しているかもしれない。ホルマリンによる不活化の後、約500mgの毒素Aトキソイドおよび250μgの毒素Bトキソイドに相当する、125mgの全タンパク質を含有している、投与された中で最大の用量の不活化トキソイドを動物が受容した場合、マウスにおいて毒性は観察されない。これらのデータは、625×104倍超の致死の最小の減少を示す。より高感度の組織培養アッセイにより決定されるように、不活化の実際の程度は、少なくとも8桁の大きさである。マウス安全性アッセイも、不活化の期間を定義するために使用される。トキソイド05mgは、典型的には、5~6日目に完全に許容されるようになる。不活化は、05mgの腹腔内チャレンジの後、マウスにおいて致死を示さないようになるために必要とされる不活化の長さの3倍の後に中止される。予防接種は毒素Aおよび毒素Bの生物学的効果からマウスを防御するため、製造されたトキソイドワクチンの主要な効力アッセイとして役立つよう、マウスモデルを適合化した。このアッセイにおいては、マウスを免疫感作し、次いで、血清を回収するために採血し、その血清を、IMR90組織培養系におけるインビトロ毒素中和活性に関して試験する。このアッセイを利用するため、本発明者らは、まず、IMR90系で測定されるようなインビトロ中和活性と、マウスにおける防御が相関することを決定した。トキソイドワクチンの4つのロットを、1週間毎に2回、マウスに腹腔内予防接種するために使用した。トキソイドは、上記のようなミョウバンに吸着させ、一連の10倍用量において試験した。ワクチンの2回目の投薬から7日後、動物から採血をし、個々のマウスからの血清を、IMR90細胞に対する毒素AおよびBの効果を中和する能力に関して試験した。動物を、4日間、回復させ、次いで、致死量の毒素Aまたは毒素Bのいずれかをチャレンジした。中和抗体力価と、両毒素によるチャレンジからの生存との相関は、高度に有意であったウィルコクソン順位和検定によりp<00001。ハムスターの能動免疫感作ハムスターは、毒素Aおよび毒素Bの作用に対して高度に感受性であるため、この種は、Cディフィシル感染の優れたモデルを提供する。Cディフィシルの存在下でのクリンダマイシンの単回投与の後、ハムスターは、劇症性の下痢および出血性の盲腸炎により2~3日以内に死亡する。トキソイドワクチンにより筋肉内免疫感作されたハムスターは、その後Cディフィシルをチャレンジされた場合、死亡および下痢から防御される。この免疫感作の経路は、血清抗体IgGを誘導するが、検出可能な粘膜の抗体を誘導せず、このことは、高力価のIgGが、Cディフィシルにより引き起こされる腸疾患から防御し得ることを示している。死亡および下痢からの防御のレベルを定量するため、ハムスターの群を、およそ100μgのトキソイドAおよびBを含む溶液n=15またはプラセボn=10により、0日目、14日目、および21日目に筋肉内予防接種した。最終投薬の2週間後、ハムスターに、10mgのクリンダマイシン、続いて1×105CディフィシルATCC43255株を胃内にIGチャレンジした。チャレンジ後の14日間、体重減少、下痢、および生存に関して、動物をモニタリングした図3。トキソイドワクチンにより免疫感作されたハムスターは、偽免疫感作対照と比較して、死亡p≧00001および下痢p=00057から防御された図4。個々の各動物からの血清を分析したところ、毒素中和抗体レベルが存在し、防御と相関していた。ハムスターおよびマウスにおける受動免疫感作2つの動物モデルにおける実験は、受動免疫感作の治療効力を確認する。毒素中和抗体調製物による処置は、致死的なチャレンジからマウスを防御する。上記のクリンダマイシンチャレンジモデルを利用して、毒素中和抗体を与えられたハムスターは、死亡および下痢から防御されることが示された。下痢を発症しているハムスターは、毒素中和抗体の非経口投与により治癒され得る。受動的に投与された抗体の防御治療活性は用量依存性であり、抗体含有調製物により処置された動物において達成される受動血清中和抗体レベルと相関する。致死的チャレンジからのマウスの受動的防御毒素中和抗体の防御力を試験するため、マウスに、腹腔内IP経路により、毒素Aおよび毒素Bの両方に対する抗体を含有している過免疫マウス腹水を与え、次いで、毒素Aまたは毒素Bをチャレンジした。100μl、10μl、または1μlの用量のプールされた腹水をマウスに単回投与し、血清中の受動的に入手された中和抗体のレベルを決定するため、毎日採血をした。次いで、動物に、毒素A5×LD50IPまたは毒素B5×LD50IVをチャレンジし、7日間モニタリングした。毒素Aおよび毒素Bの直接投与は、マウスを死亡させる。100μl用量の腹水は、毒素Aによる致死から動物の60を防御し、毒素Bによる致死から動物の80を防御した。マウスは、抗体投与後、最長23日間、毒素Aチャレンジから防御された。このレベルの致死からの防御を入手するためには、毒素注射の30分以内に抗体を投与しなければならなかった。実験室における測定は、生存していた動物が、全て、腹水の注入の結果として、≧200の相反血清中和力価を有していたことを示した。毒素中和抗体の半減期は、この研究の条件下では、2週間であると推定された。クリンダマイシンチャレンジ後のハムスターの受動的防御雌ハムスターの群に、過免疫マウスの腹水をIPで単回投与した。段階的な用量が投与された1匹当たり6、2、06、または02mlの腹水。非免疫マウスからの腹水を、陰性対照とした。動物は、腹水を受容した翌日に受動血清抗体レベルを測定するために採血され、2日後にクリンダマイシンをチャレンジされた。チャレンジ後の3週間、生存、下痢、および体重減少に関して、動物をモニタリングした図5。死亡からの防御は、3つの最も高い用量群において達成され、死亡および下痢の両方からの防御は、最高用量の抗体を受容した動物において見られた図6。中和抗体のレベルは、死亡および下痢からの防御と相関していた。完全に防御された動物は、およそ800の相反血清中和抗体を有し、最小有効力価は200であった。この研究におけるハムスター血清中の中和抗体の半減期は、14日であると推定された。中和抗体を使用したハムスターにおける下痢の治療抗生物質関連下痢症のハムスターモデルは、Cディフィシルに対する予防戦略の評価に有用なものである。しかしながら、ハムスターにおけるCディフィシル疾患は極めて重度であり、クリンダマイシンチャレンジの後、迅速に、急性盲腸炎および死亡が起こる。感染の重度は、死亡からは防御するが下痢からは防御しないよう設計された、予定された量の毒素Aおよび毒素Bに対する中和抗体の投与によって低下させることができる。死亡を予防し、下痢は予防しない用量を、用量範囲実験において確定した。動物が下痢を有している期間中、付加的な中和抗体は、下痢を消散することができた。非免疫動物からの腹水を与えられた動物は、下痢に罹患し続け、最終的に死亡した。治療された動物は、処置後24時間以内に下痢から回復し、再発しなかった。実験の設計および下痢の結果を、図7および8に示す。この実験は、Cディフィシル関連下痢症を治療するために毒素中和抗体が使用され得ることを示す。回復は迅速であった。非ヒト霊長類におけるトキソイドワクチンの免疫原性毒素Aおよび毒素Bの両方に対する中和抗体が、本発明のトキソイドワクチンによる免疫感作の後にアカゲザルにおいて誘導された。3匹の動物の群に、ミョウバン吸着ワクチンまたはプラセボのいずれかを含む液体ワクチンを与えた。研究は、非ヒト霊長類において高力価の中和抗体を誘起するワクチンの能力を証明するために設計された。プラセボ対照は、主として、安全性比較のため含まれた。動物は、ミョウバン吸着ワクチン110μgまたはプラセボを含む溶液を5回受容した。ワクチンは、臀部に筋肉内経路により、05mlの容量で、0日目、8日目、29日目、65日目、および118日目に投与された。免疫応答および臨床病状をモニタリングした図9。5回分が与えられた後、有害な病状または感受性は認められなかった。免疫感作された動物は、全て、結合抗体および中和抗体の両方により応答した。数回のワクチン投薬が、有意な中和抗体を誘導するために必要とされ;65日目および118日目における追加投薬は中和抗体レベルをさらに高めた。ミョウバン吸着ワクチンは、いくつかの動物において、より迅速な、より高い応答を誘導した図10。研究は、免疫グロブリン調製物へと加工するのに適している、誘導レベルの中和ワクチンにより誘導された抗体の実現可能性を示し、初回刺激された動物における追加投薬の、高力価の防御抗体を誘発する能力を証明した。この実験は、多数回のトキソイドの追加投薬による過免疫感作が、非ヒト霊長類において安全であることも証明した。能動免疫感作法の臨床的評価下記の研究においては、トキソイドAおよびBを含有している非経口Cディフィシルワクチンが、再発性Cディフィシル関連下痢症CDADの多数回のエピソードの履歴を有する3人のヒト対象に投与された。対象は、8週間にわたり4回の50μgのワクチンの筋肉内接種を受容した。2人の対象は、血清IgG抗毒素Aおよび抗毒素B抗体のレベルの増加を示し、両毒素に対する血清細胞毒素中和活性を示した。予防接種の後、3人の対象は全員、経口バンコマイシンによる治療を中止したが、CDADのさらなる再発はなかった。これは、Cディフィシルワクチンの使用が、高いCDADのリスクを有する対象の治療において有効であることを示す。この研究の目的は、Cディフィシルワクチンが、安全であり、免疫原性であり、かつCDADの多数の再発を有する患者において再発を予防するか否かを調査することであった。非盲検予備研究は、3人の対象1人の男性、51歳、および2人の女性、71歳および33歳において実施された。各対象は、抗生物質使用後のCDADを発症しており、大便がCディフィシル毒素陽性となる再発性CDADの立証された履歴を有していた。彼らの下痢は、メトロニダゾールまたはバンコマイシンによる治療により改善されたが、全ての症例において、抗生物質治療中止から3~14日以内に少なくとも3度CDADが再発した。また、対象は、経口生菌療法、コレスチラミン、リファンピシン、および静脈内免疫グロブリンを含む再発性CDADのためのその他の多様な治療にも応答しなかった。その結果として、研究参加の時点で、彼らは、それぞれ10ヶ月、22ヶ月、および9ヶ月という期間、メトロニダゾールまたはバンコマイシンによるほぼ継続的な治療を必要としていた。Cディフィシルトキソイドワクチンは、以前に記載されたようにして作製されたKotloffetalInfectImmun69:9889952001。簡単に説明すると、毒素AおよびBを含有しているCディフィシルATCC43255株の培養物濾液を、S300セファクリルサイズ排除カラムを使用して部分精製し、ホルムアルデヒドにより不活化した。ワクチンの全タンパク質濃度は、052mgmlであり、その約44を毒素AおよびBが占め、毒素A毒素B比は15:1であった。そのワクチンを、04ml当たり50μgのタンパク質を含有するよう希釈し、これを、各接種において送達される用量とした。登録評価を完了した後、対象は、0日目、7日目、28日目、および56日目に、三角筋部に、Cディフィシルワクチンの4回の筋肉内接種を受容した。全ての対象がバンコマイシンを経口摂取し続け少なくとも125mg、1日2回、56日目に中止した。各訪問時および70日目に血液試料を入手した。血清抗毒素抗体濃度を、ELISAにより測定し、血清毒素中和活性を、以前に記載された組織培養細胞毒素アッセイ法を使用して決定したKyneetalNewEnglandJournalofMedicine342:3903972000;KyneetalLancet357:1891932001;KotloffetalInfectImmun69:9889952001;KellyetalAntimicrobialAgentsChemotherapy40:3733791996。予防接種はよく許容され、対象は注入部位における最小限の不快感を報告した。1人の対象71歳女性は、4回目の接種の後に一過性の多発性関節痛を発症した。2ヶ月後、リウマチ性多発筋痛症と診断され、予防接種と関係がある可能性があるとみなされた。彼女は、経口コルチコイド治療を受け、効果は良好であった。2人の対象が、予防接種後に血清IgG抗毒素Aおよび抗毒素B抗体レベルの増加を示した図11。これらの対象は、いずれも、血清中の毒素Aおよび毒素Bに対する細胞毒素中和活性も示した。1人の対象51歳男性は、増加した血清抗毒素抗体レベルまたは中和活性を示さなかった。予防接種を完了しバンコマイシン治療を中止した後、2ヶ月間、3人の全ての対象を追跡したところ、いずれも再発性CDADを発症しなかった。この研究は、Cディフィシルトキソイドワクチンが、再発性CDADを有する患者における毒素Aおよび毒素Bに対する防御免疫応答の誘導において有効であり得ることを示している。予防接種の後、以前はバンコマイシンによる長期治療を必要としていた3人の対象全員が、それ以上CDADを再発することなく、療法を中止することができた。本明細書において引用された全ての参照が、参照により完全に組み入れられる。本発明のその他の態様は、前述の特許請求の範囲の範囲内である。