"ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、a前記ヒト対象のPKCイプシロンレベルを判定するステップと、b前記ヒト対象のPKCイプシロンレベルを、対照対象のPKCイプシロンレベルと比較するステップとを含み、前記ヒト対象のPKCイプシロンレベルが、前記対照対象のPKCイプシロンレベルより低い場合、前記方法は、前記ヒト対象におけるアルツハイマー病を示す方法。前記PKCイプシロンレベルが、1以上の細胞において測定される、請求項1に記載の方法。前記PKCイプシロンレベルが、PKCイプシロンタンパク質レベルまたはPKCイプシロン活性レベルである、請求項1に記載の方法。前記PKCイプシロンレベルが、RT-PCRにより測定される、請求項1に記載の方法。前記対照対象が、アルツハイマー病を有さない、請求項1に記載の方法。前記判定するステップaが、インビトロで行われる、請求項1に記載の方法。前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項2に記載の方法。前記判定するステップaが、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項1に記載の方法。前記ヒト対象の前記PKCイプシロンレベルが、前記対照対象のPKCイプシロンレベル以上である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される、請求項1に記載の方法。ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、aヒト対象から1以上の細胞を得るステップと、b前記1以上の細胞のPKCイプシロンレベルを判定するステップと、cステップaの前記1以上の細胞を、PKCイプシロンアクチベーターである薬剤と接触させるステップと、dステップcの前記1以上の細胞のPKCイプシロンレベルを、ステップcにおける前記接触の後に判定するステップとを含み、ステップdで判定されたPKCイプシロンレベルが、ステップbで判定されたPKCイプシロンレベルより大きい場合、アルツハイマー病が前記ヒト対象において示される方法。前記PKCイプシロンレベルが、PKCイプシロンタンパク質レベルまたはPKCイプシロン活性レベルである、請求項10に記載の方法。前記PKCイプシロンレベルがRT-PCRにより測定される、請求項10に記載の方法。前記PKCイプシロンレベルが、1以上の細胞において測定される、請求項10に記載の方法。前記ステップb、cおよびdが、インビトロで行われる、請求項10に記載の方法。前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項10に記載の方法。前記判定するステップb、d、またはbおよびdの両方が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項10に記載の方法。ステップdで判定された前記PKCイプシロンレベルが、ステップbで判定されたPKCイプシロンレベル以下である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される、請求項10に記載の方法。ヒト対象におけるアルツハイマー病の進行を判定またはモニターする方法であって、a前記ヒト対象のPKCイプシロンレベルを判定するステップと、b前記ヒト対象のPKCイプシロンレベルを、対照対象のPKCイプシロンレベルと比較するステップと、cステップbにおける前記比較に基づいて、前記アルツハイマー病の進行を判定またはモニターするステップとを含む方法。アルツハイマー病が進行するにつれて、前記ヒト対象のPKCイプシロンレベルが低下する、請求項18に記載の方法。前記PKCイプシロンレベルが、1以上の細胞において測定される、請求項18に記載の方法。前記PKCイプシロンレベルが、PKCイプシロンタンパク質レベルまたはPKCイプシロン活性レベルである、請求項18に記載の方法。前記PKCイプシロンレベルが、RT-PCRにより測定される、請求項18に記載の方法。前記対照対象が、アルツハイマー病を有さない、請求項18に記載の方法。前記判定するステップaが、インビトロで行われる、請求項1に記載の方法。前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項20に記載の方法。前記判定するステップaが、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項18に記載の方法。アルツハイマー病の進行が逆行するにつれて、PKCイプシロンレベルが前記ヒト対象において増加する、請求項18に記載の方法。細胞のPKCイプシロンタンパク質レベルを上げるための方法であって、1以上のヒト細胞を、無接触のヒト細胞と比較して前記細胞のPKCイプシロンタンパク質レベルを上げるために効果的な、ある量のPKCアクチベーターと接触させるステップを含む方法。前記ヒト細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項28に記載の方法。前記PKCアクチベーターが大環状ラクトンである、請求項28に記載の方法。前記大環状ラクトンがブリオスタチンである、請求項30に記載の方法。前記ブリオスタチンがブリオスタチン1である、請求項31に記載の方法。前記PKCイプシロンレベルが、PKCイプシロンタンパク質レベルまたはPKCイプシロン活性レベルである、請求項28に記載の方法。ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、aヒト対象から1以上の細胞を得るステップと、b前記1以上の細胞のPKCイプシロンレベルを判定するステップと、cステップaの前記1以上の細胞をAβペプチドと接触させるステップと、dステップcの前記1以上の細胞のPKCイプシロンレベルを、ステップcにおける前記接触の後に判定するステップとを含み、ステップdで判定されたPKCイプシロンレベルが、ステップbで判定されたPKCイプシロンレベルと有意に異ならない場合、アルツハイマー病が前記ヒト対象において示される方法。前記PKCイプシロンレベルが、PKCイプシロンタンパク質レベルまたはPKCイプシロン活性レベルである、請求項34に記載の方法。前記AβペプチドがAβ1-42である、請求項34に記載の方法。前記PKCイプシロンレベルがRT-PCRにより測定される、請求項34に記載の方法。前記PKCイプシロンレベルが1以上の細胞において測定される、請求項34に記載の方法。前記ステップb、cおよびdがインビトロで行われる、請求項に記載の方法。前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項34に記載の方法。前記判定するステップb、d、またはbおよびdの両方が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項34に記載の方法。ステップdで判定された前記PKCイプシロンレベルが、ステップbで判定されたPKCイプシロンレベル未満である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される、請求項34に記載の方法。PKCイプシロンに特異的な1以上の抗体を含むキット。PKCアクチベーターをさらに含む、請求項43に記載のキット。PKCイプシロンアクチベーターをさらに含む、請求項43に記載のキット。PKCイプシロンをコードしている遺伝子に特異的な1以上のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項43に記載のキット。PKCイプシロンをコードしている遺伝子に特異的な1以上のオリゴヌクレオチドを含むキット。PKCアクチベーターをさらに含む、請求項47に記載のキット。PKCイプシロンアクチベーターをさらに含む、請求項47に記載のキット。アルツハイマー病の治療に有用な化合物を同定する方法であって、aアルツハイマー病対象から1以上の細胞を得ることと、b前記1以上の細胞のPKCイプシロンレベルを判定することと、c前記細胞を候補化合物と接触させることと、d前記接触させるステップcの後に前記1以上の細胞のPKCイプシロンレベルを判定することとを含み、ステップdで判定されたPKCイプシロンレベルが、ステップbで判定されたPKCイプシロンレベルより大きい場合、前記候補化合物がアルツハイマー病の治療に有用な化合物であると同定される方法。前記PKCイプシロンレベルが、PKCイプシロンタンパク質レベルまたはPKCイプシロン活性レベルである、請求項50に記載の方法。前記PKCイプシロンレベルが、RT-PCRにより測定される、請求項50に記載の方法。前記ステップがインビトロで行われる、請求項50に記載の方法。前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項50に記載の方法。前記判定するステップbもしくはd、または両方が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項50に記載の方法。例1:患者集団および細胞培養アルツハイマー病患者AD、非AD認知症ハンチントン病、パーキンソン病および前頭側頭認知症患者、および年齢をマッチさせた対照AC症例のヒト皮膚線維芽細胞を、CoriellInstituteofMedicalResearchCamden、NJから入手した。線維芽細胞は、10FBSを補充した低グルコースInvitrogen、USAを含むDMEM中で維持し、培養して実験前に100コンフルエンスにした。異なる10例のAD患者4つの家族性タイプおよび6つの散発性;これらの中で、10例のうち9例は、病理解剖で確認した、11例のACおよび8例のハンチントン病、1例のパーキンソン病および1例の前頭側頭型認知症が研究表:1に対して検討された。AD症例の平均年齢は69.6±13.01SD才であり、AC症例の平均年齢は63.364±7.65SD才であり、非AD認知症症例の平均年齢は56.44±9.7SD才であった。タンパク質の単離:細胞を含有するフラスコを1×PBSpH7.4で3×洗浄し、細胞スクレーパーを使用して細胞を収集した。収集した細胞を1.5mlの微小遠心管に移し、1000rpmで5分間遠心した。得た細胞ペレットをホモジナイズ緩衝液中に懸濁させ10mMTRISpH7.4、1mMPMSF、10mMEGTA、10mMEDTAおよび50mMNaF、30秒の間超音波処理した。ホモジネートを、4°Cでl0分間、10000rpmで再び遠心し、上清を収集し、タンパク質評価のために新しいチューブに移した。Bradfordタンパク質アッセイキットを使用して全タンパク質濃度を測定したThermoScientific、USA。免疫ブロット分析:タンパク質可溶化液それぞれタンパク質20μgを2×Laemmli緩衝液内で10分間煮沸し、4~20グラジエントTRIS-グリシンゲルを使用して分離した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、この膜をBSAで、室温でRT15分間遮断し、1:2000希釈の抗-PKC-εウサギポリクローナル抗体SantaCruzBiotechnology、SantaCruz、CA.;CatNo:sc-214、および1:5000希釈の抗βチューブリン、クラスIIIウサギモノクローナル抗体MilliporeCorporation、BillericaMA、CatNo:04-1049と共に1時間RTでインキュベートした。インキュベーション後、膜部分を標準的ウエスタンブロット洗浄緩衝液で3×洗浄し、さらにアルカリホスファターゼ結合した二次抗体JacksonImmunoresearchLaboratories、USA1:10000希釈と共に45分間インキュベートした。この膜部分を標準的なウエスタンブロット洗浄緩衝液で最後に3×洗浄し、1-ステップNBT-BCIP基質ThermoScientific、Rockford、ILを使用して発色させた。シグナル強度の画像をImageQuantRT-ECLGELifeSciences、Piscataway、NJで記録し、IMALソフトウエアBlanchetteRockefellerNeurosciencesInstitute、Morgantown、WVを使用して濃度定量化を実施した。PKC-εに対してこのように定量化した強度を、各レーンについてβ-チューブリンに対して正規化した。免疫蛍光:線維芽細胞を、低密度で充填したスライドNunc、Rochester、NY内で培養した。免疫蛍光染色のため、細胞を1×PBSpH7.43×で洗浄し、4パラホルムアルデヒドで4分間固定した。固定に続き、細胞を遮断し、1×PBS中の5血清および0.3TritonX100で30分間透過処理した。細胞を1×PBSで3×洗浄し、ウサギポリクローナルPKC-ε抗体SantaCruzBiotechnology、SantaCruz、CAと共に1時間、1:100希釈でインキュベートした。インキュベーション後、1×PBS中でスライドを3×洗浄し、FITC抗ウサギIgGJacksonImmunoresearchLaboratories、USAと共に1時間、1:400希釈でインキュベートした。細胞を洗浄し、DAPI4’,6-ジアミジノ-2’-フェニルインドール、ジヒドロクロリドThermoScientific、USAでも着色した。最後に、スライドを洗浄し、グリセロールPBS封入液中に固定し、LSM710Meta共焦点顕微鏡Zeiss、Germanyで、DAPIおよびFITCに対してそれぞれ350nmおよび490nm励起、ならびに470nmおよび525nm発光で観察した。5つの個々の視野を63×オイルレンズ拡大率で取り込み、各チャネルで平均蛍光強度MFIを分析した。RT-PCR:Trizol試薬Invitrogen、USAを使用して、製造者のプロトコルに従い、RNAを約1×106細胞から単離した。簡単に説明すると、オリゴdTおよびSuperscriptIIIInvitrogen、USAを使用して、50°Cで1時間2μgのRNAを逆転写した。PKC-εに対するプライマーを使用してフォワードプライマー-AGCCTCGTTCACGGTTCTATGC、リバースプライマー-GCAGTGACCTTCTGCATCCAGA、およびβ-チューブリンフォワードプライマー-TTGGGAGGTGATCAGCGATGAG、リバースプライマーCTCCAGATCCACGAGCACGGCOrigene、Rockville、MD、2μlのcDNA生成物を増幅した。55°Cアニーリング温度での25サイクルの増幅に続いて、E-ゲルInvitrogen、USA内でアンプリコンを分析した。FujiImageゲルスキャナーFLA-9000、FujiFilmを使用してゲル画像を記録し、IMALソフトウエアBlanchetteRockefellerNeurosciencesInstitute、Morgantown、WVを使用して濃度定量化を実施した。3つの独立した実験について、PKC-εOD光学密度と、β-チューブリンODとの正規化した比としてデータを表示した。可溶性のオリゴマーAβの調製:Noguchiら、2009年により記載された方法に従いオリゴマーAβを調製した。本方法で生成されたAβは、極めて神経毒性のある、アミロスフェロイドASPDと呼ばれる10~15nmの球状のAβ集合体であると報告された。ASPDの合成のため、Aβ1-42Anaspec、USAを100μΜの濃度で、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルロhexafluro-2-プロパノール中に、4°Cで一晩、次いで37°Cで3時間溶解した。最後に、溶解したAβを、アリコット40nmol/チューブの中で凍結乾燥させた。凍結乾燥したAβを、1μΜ濃度で、50PBS中に溶解し、4°Cで14時間ゆっくりと回転させた。インキュベーションを流して、100kDa分子量のカットオフフィルターUltrafree-MC、Millipore、USAを使用して有毒なASPDを精製した。100kdaを超える分子量の保持液を、線維芽細胞を処理するために使用した。オリゴマーAβ1-42での皮膚線維芽細胞の処理:ADとAC症例の両方の皮膚線維芽細胞を、100コンフルエンスまで7日間培養した。コンフルエント細胞は、これらが100コンフルエントになった後で、500nM最終濃度のASPDで、37°Cで24時間処理した。インキュベーションに続いて、細胞を1×PBSpH7.4で3×洗浄し、以前に記載されたウエスタンブロット法用に処理した。ImageQuantRT-ECLGELifeSciences、USAを使用して、結果として得たPKC-εに対するバンド強度を定量化し、IMALソフトウエアBlanchetteRockefellerNeurosciencesInstitute、Morgantown、WVを使用して、濃度分析を実施した。例2:脂肪酸メチルエステルシクロプロパン化脂肪酸メチルエステルの合成。シクロプロパン化脂肪酸の合成。クロロヨードメタンおよびジエチル亜鉛を使用した、改変されたSimmons-Smith反応を使用して、多価不飽和脂肪酸のメチルエステルをシクロプロパン化したTanakaら、Bioorg.Med.Chem.Let.2003年;13巻:1037~40頁;Furukawaら、Tetrahedron.1967年;53~58頁;Denmarkら、J.Org.Chem.1991年;56巻:6974~81頁。すべての装置は、60°Cで1時間ベーキングし、乾燥窒素を用いた炎光を使用して乾燥させた。撹拌子および温度プローブを有する100mlの3口丸底フラスコを、氷-ドライアイスの混合物で取り囲み、25mlのジクロロメタン中の1.25g4.24mmolのリノール酸メチルエステルまたはドコサヘキサエン酸メチルエステルを充填し、N2でバブリングした。24インチの長さの20ゲージニードルを使用して、ジエチル亜鉛51ml、54.94mmolのヘキサン中1M溶液を嫌気的に添加し、溶液を-5°Cに冷却した。絶え間なく撹拌しながら、ジヨードメタン8.2ml、101.88mmolまたはクロロヨードメタンClCH2Iを毎秒一滴ずつ滴下添加した。必要に応じて添加速度を低下させることで、この反応混合物を2°C以下に維持した。この反応中にて反応混合物は濁り、不溶性の白色の亜鉛生成物を遊離した。フラスコを密閉し、この混合物を1時間反応させておき、次いで2時間に渡りゆっくりと室温に戻した。フード内での爆発性残渣の形成を防止するため、ジエチル亜鉛は蒸発させなかった。混合物を撹拌しながら、100mlの水の中へゆっくりと注ぎ入れ、あらゆる過剰なジエチル亜鉛を分解した。エタンが生成した。この混合物をガラス遠心管内で、5000rpmで遠心させ、上部の水層を廃棄した。白色沈殿物をCH2Cl2で抽出し、有機相と合わせた。有機相を水で洗浄し、遠心した。ヘキサンプラス1酢酸エチルを使用して、シリカゲルGTLCで生成物を分析し、n-ヘキサン中の増加する濃度の1~10酢酸エチルを使用して、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製し、窒素下で蒸発させると、無色の油としてメチルエステルが残った。Simmons-Smith反応は、出発物質の立体配置を保存する。Furukawaら、Tetrahedron.1967年;53~58頁。ドコサヘキサエン酸メチルエステルを、90~95収率でDHA-CP6へと変換した。生成物は、無色の油であり、エタノール中での単一の吸収度は202nmで最大であり、I2との反応はなかった。IRスペクトルは、3070および1450cm-1でのシクロプロパン環の吸収を示した。同じ条件下で、エイコサペンタエン酸メチルエステルをEPA-CP5に変換し、アラキドン酸メチルエステルをAA-CP4に変換した。リノール酸メチルエステルをDCP-LAメチルエステルに変換したが、これは、既知の試料と等しかった。メチルエステルの加水分解。メチルエステル0.15gを1mlの1NLiOHおよび1mlのジオキサン中に溶解した。ジオキサンおよびメタノールを、それが均一になるまで添加し、この溶液を60°で一晩撹拌した。生成物をCH2Cl2中に抽出し、遠心した。水層および白色の界面を水で再抽出し、白色層が形成されなくなるまで洗浄した。生成物をN2下で蒸発させ、シリカゲル上でのクロマトグラフィーで精製した。n-ヘキサン中20EtOAcの中で生成物である無色の油を溶出した。10EtOAc/ヘキサン中のTLCおよびC18RP-HPLCで、205nmでのUV検出を使用して、その純度をチェックした。エポキサイド基は、従来の手段、例えば適切なアルケンをm-クロロ過安息香酸またはt-ブチルヒドロペルオキシドで酸化することによって、導入することができる。合成した他の化合物として、図1に表されているものが挙げられるBR-101~BR-118。例2:ドコサヘキサエン酸を使用した精製したPKCイプシロンの活性化プロテインキナーゼCアッセイ。組換えPKC1ngのアルファまたはイプシロンアイソフォームを、10マイクロモルのヒストン、5mMCaCl2、1.2μg/μlのホスファチジル-L-セリン、0.18μg/μlの1,2ジオクタノイル-sn-グリセロールDAG、10mMMgCl2、20mMHEPESpH7.4、0.8mMEDTA、4mMEGTA、4グリセロール、8μg/mlのアプロチニン、8μg/mlのロイペプチン、および2mMベンズアミジンの存在下、BR-101DCP-LAと混合した。0.5マイクロCi[γ32P]ATPを添加した。このインキュベーション混合物を、総量10マイクロリットルで、37度で15分間インキュベートした。1×2cmのセルロースホスフェート紙片WhatmanP81の上にこの反応混合物をスポットすることによって、この反応を中止し、即時に0.5H3PO4中で2回、1時間に渡り洗浄した。このセルロースホスフェートの紙片をシンチレーションカウンターでカウントした。一部の実験では、ホスファチジルセリン、ジアシルグリセロール、および/またはカルシウムを取り除いた。DHAメチルエステルは、CaymanChemicalAnnArbor、MEから購入した。PKCアイソザイムは、CalbiochemSanDiego、CAから購入した。精製されたPKCεは、Calbiochemから購入した。結果精製されたPKCεを使用したPKC測定は、試験した最低の濃度10nMにおいて、化合物BR-101は、2.75倍のPKCεの活性化を生じたことを示した。PKCαは、影響を受けなかったデータは示されていない。化合物BR-102はまた、活性化されていないPKCεのおよそ1.75倍までPKCεの活性化を選択的に誘発した。低濃度でPKCεを活性化するこれら化合物の有効性は、これらが優れた治療的候補となることを示唆している。例3:他のPKCアクチベーターを使用した、精製されたまたは細胞のPKCイプシロンの活性化材料。培地はK-DMedicalColumbia、MDまたはInvitrogenCarlsbad、CAから得た。Aβ1-42はAnaspecSanJose、CAから購入した。多価不飽和脂肪酸メチルエステルはCaymanChemicals、AnnArbor、MIから入手した。他の化学薬品はSigma-AldrichChemicalCo.St.Louis、MOから入手した。PKCアイソザイムは、CalbiochemSanDiego、CAから入手した。精製されたPKCεはCalbiochemから購入した。細胞培養。ラット海馬H19-7/IGF-IR細胞ATCC、Manassas、VAをポリ-L-リジンコーティングしたプレートにプレーティングし、DMEM/10FCS中で、35°Cで数日間培養し、およそ50カバー度が得られるまでこれを続けた。次いで細胞は、39°Cで、培地を、10ng/ml塩基性の線維芽細胞成長因子を含有する5mlのN2培地で置きかえることによって、神経細胞表現型へと分化するように誘導し、T-75フラスコ内で、37°Cで培養した。ヒトSH-SY5Yニューロブラストーマ細胞ATCCは、45F12K/45MEM/10FCS中で培養した。マウスN2Aニューロブラストーマ細胞は、DMEM/10FCS中でグルタミンなしで培養した。18日齢の胎仔のラット海馬の神経細胞。SpragueDawleyラットの脳を、ポリ-D-リジンSigma-Aldrich、St.Louis、MOでコーティングされた12-または96-ウェルプレート上で、0.5mMグルタミンおよび25μΜグルタメートInvitrogen、Carlsbad、CAを含有するB-27neurobasal培地内でプレーティングし、培地内で3日間グルタメートなしで培養した。5CO2下、37°Cで維持したインキュベーター内で神経細胞を14日間培養した。培養細胞に対するすべての実験は、他に述べられていない限り、3回重複して行った。すべてのデータ点は、平均値±SEとして表示されている。BR-101DCP-LAは、すべての実験においてその遊離酸で使用し、その一方で、BR-111DHA-CP6、BR-114EPA-CP5、およびBR-116AA-CP4は、これらのメチルエステルで使用した。プロテインキナーゼCアッセイ。ラットの海馬細胞を培養し、0.2mlの均質化緩衝液20mMTRIS-HCl、pH7.4、50mMNaF、1μg/mlロイペプチン、および0.1mMPMSF中ですくい取り、超音波処理により、Marsonixマイクロ-プローブソニケーター5秒、10W内でホモジナイズした。PKCを測定するため、10μlの細胞ホモジネートまたは精製されたPKCアイソザイムCalbiochemから購入を、10μΜヒストン、4.89mMCaCl2、1.2μg/μlのホスファチジル-L-セリン、0.18μg/μlの1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロール、10mMMgCl2、20mMHEPESpH7.4、0.8mMEDTA、4mMEGTA、4グリセロール、8μg/mlのアプロチニン、8μg/mlのロイペプチン、および2mMベンズアミジンの存在下、37°Cで15分間インキュベートした。0.5μCi[γ-32P]ATPを添加し、前に記載した通り、ホスホセルロース上への吸着により32P-ホスホタンパク質の形成を測定した。NelsonおよびAlkon、J.Neurochemistry.1995年;65巻:2350~57頁。BR-101DCP-LAおよび同様の化合物による活性化の測定のため、ジアシルグリセロールおよびホスファチジルセリンの非存在下、Kannoらにより記載された通り、PKC活性を測定し、添加したEGTAおよびCaCl2の非存在下、Kannoら、J.LipidRes.2006年;47巻:1146~50頁で記載の通り、PKCδ、ε、η、およびμを測定した。高濃度のCa2は、PKCホスファチジルセリン結合部位と相互作用し、活性化を防止するので、低濃度のCa2を使用する。ブリオスタチン活性化の測定に対して、1,2-ジアシルグリセロールは、他に述べられていない限り、省略した。結果および考察これらのPKCアイソザイム特異性を判定するため、新しい化合物を精製されたPKCと共に5分間プレインキュベートし、PKC活性を放射分析により測定した。上の例2に対して示されているように、BR-101DCP-LAは、10μΜでPKCの効果的なアクチベーターであるが、他のPKCアイソフォームに対する作用は比較的低かったデータは示されていない。より高い濃度では、BR-101DCP-LAは、PKCδおよそ1~100μΜを部分的に阻害し、PKCγ50~100μΜを活性化したデータは示されていない。BR-111DHA-CP6、BR-114EPA-CP5、およびBR-115AA-CP4は、それぞれドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、およびアラキドン酸のシクロプロパン化誘導体であるが、精製されたPKCεを同じ程度まで活性化した。PKCを活性化するために必要な濃度は、BR-101DCP-LAに対する濃度よりも約100分の1低く、これはより高い親和性を示唆した。シクロプロパン化リノレニルおよびリノレイルアルコールBR-104およびBR-105、エポキシステアリン酸BR-116、およびベルノリン酸メチルエステルBR-117は、PKCに対する作用がわずかにあるか、またはなかった。シクロプロパン化ベルノリン酸メチルエステルBR-109は、1μΜより上の濃度でPKCεを阻害した。ジアシルグリセロール結合部位に結合したPKCアクチベーターは、ブリオスタチン、グニジマクリン、およびホルボールエステルなどを含めて、PKC活性の一時的な活性化を生じ、続いてより長い下方制御が生じた。Nelsonら、TrendsinBiochem.Sci.2009年;34巻:136~45頁。これを培養したラット海馬細胞において確認した。ブリオスタチンと共にラットH19-7/IGF-IR細胞0.04nMおよび0.2nMをインキュベートすることで、2倍の活性化を生じ、これが30分間持続し、続いて20の下方制御があり、24時間でベースラインに戻ったデータは示されていない。対照的に、DCP-LAに曝露されたPKCは、少なくとも4時間の間高いままであった。この持続性の活性化は、初代神経細胞内でしか観察されなかった。ブリオスタチンは、ホルボール12-ミリスチン酸エステル13-アセテートPMAEC50=1.35nM対10nMよりもPKCに対して高い親和性を有するにもかかわらず、ブリオスタチンは、PKCの下方制御においてPMAより効果が極めて低かった。PKC活性は、8時間でホルボールエステルにより強力に下方制御されているが、その一方で、ブリオスタチンで処理した細胞のPKCは、ベースライン上またはその付近にあるデータは示されていない。この差は、daCruzeSilvaら、J.Neurochem.2009年:108巻:319~30頁で報告された、PdBuにより生じるAβの増加を説明し得る。これらの研究者は、1μΜPdBuを培養されたCOS細胞に8時間適用し、Aβの増加を観察した。この増加は、ホルボールエステルによるPKCの下方制御に起因するものであったが、これらの結果と一致する。下方制御は、DCP-LAに対して、および関連化合物に対して測定することができなかった。例4:Aβ産生および分解に対するPKCアクチベーターの作用細胞培養。例3に対して上で記載されているように細胞培養を実施した。Aβの測定および細胞生存度アッセイ。Aβ1-42ヒト蛍光分析ELISAキットInvitrogenを使用して、製造者の指示書に従いAβを測定した。BiotekSynergyHTマイクロプレートリーダーで結果を測定した。製造者の指示書に従い、AlamarBlueおよびCyQuantNFInvitrogenで測定を行った。結果および考察Aβ産生に対するPKCε活性化の効果を測定するため、本発明者らは、多量のAβを産生する、ヒトAPPSwe/PSIDを形質移入したマウスneuro2aN2a神経芽細胞腫細胞を使用した。Petanceskaら、JNeurochem.1996年;74巻:1878~84頁。様々な濃度のPKCアクチベーター、ブリオスタチン、BR-101DCP-LAおよびBR-111DHA-CP6との、これらの細胞の24時間のインキュベーションは、細胞内と分泌されたAβの両方のレベルを著しく減少させた。ジアシルグリセロール結合部位への結合によりPKCを活性化するブリオスタチンを用いた場合、阻害は二相性であり、20nM以上の濃度では正味の影響はない。これは、このクラスのPKCアクチベーターが高濃度で使用された場合の、PKCを下方制御するその能力から説明することができる。対照的に、PKCのホスファチジルセリン部位に結合するBR-101DCP-LAおよびBR-111DHA-CP6は、10~100μΜまでの濃度で阻害を単調に増加させ、より高い濃度では下方制御の証拠がないことを示した。PKCアクチベーターにより引き起こされるAβレベルの減少は、Aβ合成の阻害またはAβ分解の活性化が原因であったかどうか判定するため、本発明者らは、BR-111DHA-CP60.01~10μΜおよび低濃度100nMの外因性の単量体Aβ-42を、培養したSH-SY5Y細胞に適用した。このAβ濃度は低すぎて、測定可能な毒性または細胞死を生じない。SH-SY5Y細胞は微量のAβしか産生しないので、この実験は、PKCアクチベーターのAβ分解を強化する能力の効果的な試験であった。24時間で、大部分のAβが細胞により取り込まれ培地内のAβ濃度は検出不能であった。0.01~10μΜのDHA-CP6の細胞への添加は、Aβの細胞レベルを45~63減少させたが、これは、PKCεアクチベーターが外因性のAβの分解速度を増加させたことを示した。DHA-CP6、ブリオスタチン、およびDCP-LAは、アラマーブルーおよびCyQuant染色で測定した場合、細胞生存または増殖に対して効果がなく、これは、Aβ産生の減少が、細胞増殖または細胞生存の変化から生じなかったことを示している。例5:TACE活性に対するPKCアクチベーターの効果TACEアッセイ。5μlの細胞ホモジネート、3μlの緩衝液50mMTRIS-HCl7.4プラス25mMNaClプラス4グリセロール、および1μlの100μΜTACE基質IVAβz-LAQAVRSSSR-DPaCalbiochemを1.5mlポリプロピレン遠心管内で、37°で20分間インキュベートすることによりTACEを測定したJinら、Anal.Biochem.2002年;302巻:269~75頁。4°Cまで冷却することにより、この反応を停止した。試料を1mlに希釈し、SpexFluorolog2蛍光分光計内で蛍光を素早く測定したex=320nm、em=420nm。結果および考察以前の研究者らは、ホルボール12-ミリスチン酸エステル13-アセテートなどのPKCアクチベーターは、sAPPαの増加およびAβの低下と相関するTACE活性において大きな増加を生じ、これはAPP基質の利用可能性に対してTACEおよびBACE1が競合していることを示唆し、PKCアクチベーターは、この競合をTACE優位へとシフトさせることを報告した。Buxbaumら、J.Biol.Chem.1998年;273巻:27765~67頁;Etcheberrigarayら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年:103巻:8215-20頁。しかし、これら以前の研究の多くは、線維芽細胞および他の非神経細胞型において行われ、これら細胞は、PKCアクチベーターに対して神経細胞とは異なる反応をするようである。例えば、Etcheberrigarayらは、10pM~100pMブリオスタチンによるヒト線維芽細胞におけるPKCの活性化が、α-セクレターゼ活性の初期速度をそれぞれ16倍および132倍増加させたことを発見したEtcheberrigarayら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年。しかし、ヒトSH-SY5Yニューロブラストーマ細胞、N2aマウス神経芽細胞腫細胞、およびラット海馬の初代神経細胞において、PKCアクチベーターであるブリオスタチン、BR-101DCP-LAおよび/またはBR-111DHA-CP6は、TACE活性においてわずかな増加しか起こさなかった。これは、PKCアクチベーターによる神経細胞のAβレベルの減少が、TACEの活性化以外のいくつかの他の機構により引き起こされているに違いないことを示唆している。例6:エンドセリン変換酵素活性に対するPKCアクチベーターの効果ECEアッセイ。SH-S757ニューロブラストーマ細胞を、ブリオスタチン0.27nM、BR-101DCP-LA1μΜ、およびBR-111DHA-CP61μΜと共にインキュベートした。エンドセリン-変換酵素ECEを、JohnsonおよびAhn、Anal.Biochem.2000年;286巻:112~118頁の方法を使用して蛍光分析により測定した。細胞ホモジネート試料20μlを、50mMMES-KOH、pH6.0、0.01C12E10ポリオキシエチレン-10-ラウリルエーテル、および15μΜMcaBK27-メトキシクマリン-4-アセチル[Ala7-2,4-ジニトロフェニルLys9]-ブラジキニントリフルオロアセテート塩Sigma-Aldrich内でインキュベートした。37°Cで60分後、トリフルオロ酢酸を0.5まで添加することによって、この反応をクエンチした。試料を水で1.4mlに希釈し、蛍光を、ex=334nm、em=398nmで測定した。結果および考察Aβは、インスリン分解酵素インスリジン、ネプリライシン、およびECEを含めたいくつかの酵素で、インビボで分解することができる。PKCεの過剰発現は、ECEを活性化することが報告されているのでChoiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年;103巻:8215~20頁、本発明者らは、ECEに対するPKCアクチベーターの効果を試験した。ブリオスタチン、BR-101DCP-LA、およびBR-111DHA-CP6はすべて、ECE活性の持続的増加を生じた。ECEは、ジアシルグリセロール結合CIドメインを有さないので、これは、ブリオスタチンによる活性化は、ECEの直接的活性化によるものではなく、PKCによる、ECEまたはいくつかのECE活性化中間体のリン酸化から生じるものに違いないことを示唆している。この結果はまた、PKCアクチベーターによる間接的活性化ECEは、患者におけるAβのレベルを減少させる有用な手段となり得ることを示唆している。PKCεを特異的に活性化する、本発明のPUFA誘導体などの化合物の利点は、これらが、ホルボールエステルおよび同様の1,2-ジアシルグリセロールDAG類似体と比べてあまり下方制御を生じないことにある。DAGに基づくアクチベーターへのPKCの二相性の反応とは、PKCアクチベーターは、ある時点においてAβレベルを減少させ、別の時点ではこれらを増加させることを意味する。daCruzeSilvaら、J.Neurochem.2009年;108巻:319~330頁。意図するものと反する効果を回避するためには、慎重な投薬および患者のモニターが必要とされる。この新しいクラスのPKCアクチベーターは、PKCを下方制御する能力に比較的劣るため、この問題は回避することができる。参考文献"