"腎臓器移植に対する個体の免疫寛容を決定する方法であって、前記個体から得られる試料における、TLR5、PNOC、SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRL1、SLC8A1、及びFCRL2からなる群から選択される少なくとも2個の遺伝子の発現レベルを決定することを含む方法。SH2D1B、PNOC、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRL1、及びFCRL2の発現レベルが、免疫寛容を示すとみなされる個体の正常レベルより高く、TLR5及びSLC8A1の発現レベルが、免疫寛容を示すとみなされる個体の正常レベルより低い、請求項1に記載の方法。前記個体から得られる試料中の遺伝子TLR5、PNOC、及びSH2D1Bの発現レベルが決定される、請求項1に記載の方法。臓器移植に対する個体寛容の陽性予測が、SH2D1B及びPNOCの高レベル発現、及びTLR5の低レベル発現によりなされる、請求項3に記載の方法。以下の遺伝子:CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRL1、SLC8A1、及びFCRL2の1つ又は複数の発現レベルが更に決定される、請求項3に記載の方法。前記方法が、B細胞及びNK細胞のレベルを検出することを含み、そのような細胞のレベル上昇が、免疫寛容を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記方法が、CD4CD25intT細胞のレベルを決定することを含み、総CD4T細胞と比べたそのような細胞のレベル低減が、免疫寛容を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記方法が、ドナー特異的CD4T細胞のレベルを決定することを含み、そのような細胞のレベル低減が、免疫寛容を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記方法が、CD4T細胞のα-1,2-マンノシダーゼ遺伝子発現レベルに対するFoxP3遺伝子発現レベルの比率を決定することを含み、高い比率が免疫寛容を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記方法が、CD3細胞に対するCD19の比率を決定することを含み、高い比率が免疫寛容を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。ベータアクチン及び/又はHRPTの発現レベルが、対照として使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。TLR5、PNOC、SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRL1、SLC8A1、及びFCRL2からなる群から選択される少なくとも2個の遺伝子の発現レベルを検出するためのセンサー。前記TLR5、PNOC、及びSH2D1B遺伝子の発現レベルを検出するセンサー。以下の遺伝子:CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRL1、SLC8A1、及びFCRL2の1つ又は複数の発現を検出するための、請求項13に記載のセンサー。TLR5、PNOC、SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRL1、SLC8A1、及びFCRL2からなる群から選択される少なくとも2個の遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含むキット。前記TLR5、PNOC、及びSH2D1B遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含むキット。以下の遺伝子:CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRL1、SLC8A1、及びFCRL2の1つ又は複数の発現レベルを検出するための試薬を更に含む、請求項16に記載のキット。RT-PCRにより前記遺伝子の遺伝子発現レベルを検出するための試薬を含む、請求項15~17のいずれか一項に記載のキット。実施例材料及び方法研究対象患者:訓練セットの説明:寛容ネットワークインデックスIOT、IndicesofTolerancenetworkにより募集したこの集団患者は、71人の腎移植レシピエント、及び19人の年齢及び性別一致健常対照HCで構成されていた。5つの患者群には以下の患者が含まれていた:複数年にわたって免疫抑制を全て中止したにもかかわらず機能的に安定している血清クレアチニンCRT<160μmol/l、及び過去12月間に10未満の上昇11人の腎移植レシピエントTol-DF、唯一の免疫抑制剤として10mg/日未満のプレドニゾンで維持された、機能的に安定した腎機能同じ基準を有する11人の患者s-LP、移植以来カルシニューリン阻害剤を用いずに免疫抑制アザチオプリン及びプレドニゾンが維持された10人の患者s-nCNI、標準カルシニューリン阻害剤療法で維持された30人の患者s-CNI、生検で証明された本研究用に全て再評価した免疫主導性の慢性拒絶反応を有する9人の患者CR。患者の臨床的特徴は、表1に記述されている。試料は全て、盲目的様式で処理及び分析した。検査セットの説明:腎移植レシピエントの独立セットは、アメリカ合衆国で募集されたITN集団。IΤΝ集団は、以下の患者で構成されていた:1複数年にわたって免疫抑制を全て中止したにもかかわらず機能的に安定している血清クレアチニンCRTが基線の25以内Tol-DFn=24腎移植レシピエント、2ステロイドによる単独療法で維持された安定した腎機能を有するMonon=ll患者、3Tol-DFと同じ基準を使用して3剤免疫抑制投与計画カルシニューリン又はmTOR阻害剤、抗増殖剤、及びコルチコステロイドを含むで維持された臨床的に安定した腎機能を有するs-CNT被験者n=34、及び推定免疫媒介性同種移植片拒絶反応による慢性同種移植片腎症及び腎機能障害最初の移植後基線と比較して登録時の基線CRTが50増加を有すると定義されるCAN参加者n=20。腎疾患/機能不全の既往歴又は急性医学的疾患の根拠のない31人の健常対照志願者HCの群が更に登録された。群の特徴は表3に要約されている。全血mRNA及び凍結PBMCは、記載されている選択された検証アッセイを実施する実験室が受領した。血液試料:訓練セット試料は、全ての場合で静脈切開の24時間以内に処理した。PBMCを、リンパ球分離培地PAALaboratories社、サマセット、英国を使用して、密度勾配遠心分離により得た。細胞を洗浄し、10DMSOSigma社、ドーセット、英国及びヒト血清Biowest社、フランスに再懸濁し、直ちに-80°Cで凍結した。24時間後、細胞を液体窒素に移し、使用まで液体窒素で維持した。PBMCのフローサイトメトリー:解凍したPBMCを洗浄し、1×106/mLで再懸濁した。滴定量の蛍光色素結合モノクローナル抗体を使用して白血球を識別した。リンパ球の場合はCD45CD14-、T細胞の場合はCD3、B細胞の場合はCD19、NK細胞の場合はCD56CD3-、CD4T細胞の場合はCD4CD3、CD8T細胞の場合はCD8CD3。B細胞サブセットは、以前に記載されているように30、以下のように定義した:後期記憶B細胞の場合はCD19CD27IgD-CD24CD38-/int、未感作/成熟B細胞の場合はCDl9CD27-CD24intCD38int、T1/T2移行性B細胞の場合はCD19CD27-CD24CD38hi全て、Caltag社製、バーリンガム、アメリカ合衆国。細胞を1パラホルムアルデヒド/PBSで固定し、48時間以内にFACScaliburでデータを得た。CD25発現を、31に記載のようにCD4T細胞で研究した。TGFβRDsystems社製、IL-10、及びIFNγ両方ともeBioscience社製、英国のB細胞産生を、2μΜモネンシン及び10μg/mLブレフェルジンAの存在下で、500ng/mLホルボール12-ミリステート13-アセタート及び1μΜイオノマイシンを用いて、37°Cにて5時間invitro刺激したPBMCの細胞内サイトカイン染色により評価した。各試料につき、最低10,000回のCD19事象を得た。抗ドナー抗体検出:末梢血を、血液凝固活性化因子バキュテーナーBectonDickinson社、サンホゼ、アメリカ合衆国で収集し、最低2時間及び最大24時間凝固させた。試料を遠心分離し、収集した血清を使用まで-80°Cで保管した。xMAP登録商標Luminex技術32によるあらゆる特異性のIgG抗HLA抗体のスクリーニング。洗浄した後、HLAコーティングLuminexスクリーニングビーズ及び12.5μlの患者血清又は対照血清をプレートに添加し、暗所で30分間ゆっくりと混合した。プレートを3回洗浄し、PE結合ヤギ抗ヒトIgG1:10を、各試験ウエルに添加した。プレートを1時間インキュベートし、洗浄緩衝液を添加し、その後、製造業者の推奨に従って、Luminex100機器を使用してデータを収集した。IgGサブクラス及び抗HLA広域特異性のスクリーニング:陽性血清を、IgGサブクラスの特定、並びにクラス1及びクラスII広域特異性の識別について試験した。スクリーニングは、クラスI及びIILuminex識別キットQuestBiomedical社を使用して実施した。結合患者抗体の検出に使用した二次抗体は以下の通りだった:ビオチンに結合された抗ヒトIgG1クローン8c/6-39、Sigma社、ビオチンに結合された抗ヒトIgG2クローンHP-6014、Sigma社、ビオチンに結合された抗ヒトIgG3クローンHP-6050、Sigma社、ビオチンに結合された抗ヒトIgG4クローンHP-6050、Sigma社、及びストレプトアビジン-フィコエリトリンCalbiochem社。機能アッセイ用の細胞画分:PBMCを、アッセイ当日に解凍した。T細胞サブセットCD4及びCD4CD25-CD25が枯渇したCD4細胞を、以前に記述されているように33、標準的陰性免疫分離を使用して分離した。純度は、フローサイトメトリーで検証した。特に、本発明者らは、蛍光色素が結合された2つの特定のセットのモノクローナル抗体を使用して、単離末梢血単核細胞を染色した。以下の分析には、リンパ球前側及びCD45CD14-発現で選択されたを使用した。第1のセットは、TCRガンマ/デルタ-FITC、CD25-PE、CD4-APCを含んでいた。CD4T細胞を選択し、このサブセット内でCD25の中間発現を研究して、CD4CD25intのレベルを得たCD25陰性から、CD4NEG細胞が示したのと同じくらい高いレベルのCD25までと定義した。CD25high細胞は、このゲートから除外する。第2のセットは、CD3-FITC、CD56-PE、及びCD19-APCを含んでいた。CD19細胞を選択し、その割合をCD3リンパ球の割合で除算して、変数B.Tを得た。ドナー、代用ドナー、及び第3の個体の細胞:31人の生体腎ドナーに由来する細胞を、訓練セットで71個のドナー特異的細胞アッセイに使用し、28人のドナーに由来する細胞を、検査セットで64個の細胞試料に使用した。ドナー血液が入手できなかった場合、元のドナーと同じHLAクラスII発現を示した代用ドナー細胞を取得した。これら細胞及び同様に不一致の第3の個体の細胞は、以下のものから使用した:AnthonyNolan骨髄登録からの健常志願者、HLA型が決定されている健常志願者、及びロンドンのHammersmithandGuy’s病院で献体時に収集された脾細胞。同様に不一致の第3の個体の細胞は、関連ドナー及びレシピエントと比較した際の、クラスIIHLA-DR及びHLA-DQのHLA不一致の数により選択した。ELISpot用のMLR培養:ヒトIFNγ-ELISpotPROMabtech社、スウェーデンキットを使用し、製造業者の説明書に従って発色させた。バックグラウンドを差し引いた陽性スポットを、ELISpotプレート用の自動的画像分析装置AID社、ドイツを使用して計数した。直接経路ドナー特異的応答T細胞頻度の定量的評価は、ドナーPBMC又はHLA型が決定された第3の個体の細胞のいずれかから分離されたT細胞及びNK細胞枯渇PBMCAPCでレシピエントCD4T細胞を刺激することにより行った。同種MLR培養を24時間にわたって実施した。複製物を、典型的には1ウエル当たり2×105個の応答細胞から開始した3つの倍加希釈物を用いて準備した。応答細胞に対する刺激因子の比率は、最高希釈物に使用された応答細胞の数、典型的には1ウエル当たり1×105個の応答細胞と比較して、APCの数が常に半分になるように使用することにより一定に維持した。ドナー反応性は、ドナーに対する頻度及び第3の個体に対する頻度の比率として表した。頻度の逆数をデータベースに記録しつまり、54,000個の細胞のうち1個は、54,000として記録した、したがって比率値>1.5は、ドナー刺激に対する低応答を示すと定義した。遺伝子発現解析用の血液試料採取:訓練セット集団の場合、末梢静脈血液を、PAXgeneBloodRNAチューブQIAgen社、クロウリー、英国に直接採取した。全血RNAを、DNAseI処理を含むPAXgeneBloodRNAキットQIAgen社を使用して抽出した。検査セット集団の場合、末梢静脈血を、Tempus商標BloodRNAチューブAppliedBiosystemsInc.社に直接採取した。全血RNAを、製造業者の説明書に従って抽出した。全RNA試料を、RT-PCR及びマイクロアレイによる遺伝子発現解析にかけた。mRNA研究用の試料;以下のもので構成される訓練セットからの95個の試料を使用した:10人のTol-DF患者に由来する13個の試料、11人のs-LP患者に由来する16個の試料、8人のs-nCNI患者に由来する8個の試料、28人のs-CNI患者に由来する40個の試料、9人のCR患者に由来する10個の試料、及び8人のHCに由来する8個の試料。検査セットとして、以下のもので構成される142個の試料を使用した:23人のTol-DF患者に由来する31個の試料、11人のMono患者に由来する14個の試料、34人のs-CNI患者に由来する52個の試料、18人のCAN患者に由来する25個の試料、及び20人のHCに由来する20個の試料。RNA品質管理:PAXgene登録商標訓練セット及びTempus商標検査セットで精製したRNAの品質及び完全性を、Agilent2100バイオアナライザーAgilentTechnologies社製でAgilentRNA6000Nanoキットを使用して決定した。ND-1000分光光度計NanoDropTechnologies社製でA260nmを測定することにより、RNAを定量化した。RNA増幅及び標識化:試料標識化は、One-ColourMicroarray-BasedGeneExpressionAnalysisプロトコールバージョン5.5、パーツ番号G4140-90040に詳述されるように実施した。手短かに言えば、0.5μgの全RNAを、AgilentLowRNAinputLinearAmpキットAgilentTechnologies社製をシアニン3-CTPの存在下で使用した増幅及び標識化ステップに使用した。cRNAの収量及び色素取り込み率を、ND-1000分光光度計で測定した。RISET2.0Agilent社製特注マイクロアレイのハイブリダイゼーション:全血試料は全て、RISET2.0マイクロアレイプラットフォームでハイブリダイズした。これは、三重反復で提供された5,069個のプローブを含む特注Agilent社製8×15K60merのオリゴヌクレオチドマイクロアレイである。有効なEntrez遺伝子識別記号を有する4607個の遺伝子に対応する選択されたプローブ及び有効なEntrez遺伝子識別記号に割り当てることができなかった更なる407個のプローブは、最適化されたプローブのハイブリダイゼーション特性で、交差ハイブリダイゼーションを回避し、複数の遺伝子転写物変異体の検出に最適化されていた。ハイブリダイゼーション手順は、RNA品質及び完全性を制御した後で、Agilent社製遺伝子発現ハイブリダイゼーションキットAgilentTechnologies社を使用して、One-ColourMicroarray-BasedGeneExpressionAnalysisプロトコールに従って実施した。手短かに言えば、ハイブリダイゼーション緩衝液中の0.6μgのCy3標識断片化cRNAを、RISET2.0マイクロアレイに一晩17時間、65°Cハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを、Agilent社製遺伝子発現洗浄緩衝液1で1分間室温にて1回洗浄し、その後0.005のN-ラウロイルザルコシンを含有する予め加温された37°CAgilent社製遺伝子発現洗浄緩衝液2で第2の洗浄を1分間行った。最後の洗浄ステップは、アセトニトリルを用いて30秒間実施した。走査及びデータ分析:Agilent社製マイクロアレイスキャナーシステムAgilentTechnologies,Inc.製社を使用して、Agilent社製マイクロアレイの蛍光シグナルを検出した。Agilent社製特徴抽出ソフトウェアFESv.9.5.1.1を使用して、マイクロアレイ画像ファイルを読み取り、処理した。遺伝子発現の差異を決定するために、RosettaResolver遺伝子発現データ分析システムv.7.1.0.2.、RosettaInpharmaticsLLC社を使用して、FES由来の出力データファイルを更に分析した。最初に、人為的な共通基準を、IOTデータセットに含まれていた全ての試料から計算した。この基線を使用して、各遺伝子及び試料のlog2比率を計算した。加えて、試料と共通基準との間の観察された差異の信頼性を示すp値を、RosettaResolverソフトウェアに実装されている汎用誤差モデルを適用して、各遺伝子について計算した34。アノテーション濃縮解析:異なる試料群の間で差別的であり、両研究セットに共通していることが見出された遺伝子のリストを、完全RISET2.0マイクロアレイ配置と比較して、生物学的経路アノテーション用語の統計的に有意な濃縮について分析した。予測バックグラウンド分布と比較した用語濃縮は、フィッシャー直接検定を使用してスコア化した。アノテーションは、異なる供給源、例えば、GeneOntologyGO、www.geneontology.org、シグナル経路メンバシップ、配列モチーフ、染色体近接性、文献キーワード、及び細胞特異的マーカー遺伝子から導き出した。定量的RT-PCR解析;200ngの全血全RNAを、qPCR1本鎖合成キットStratagene社を使用して逆転写し、合成cDNAをRT-PCR解析にかけた。マイクロアレイデータ検証:マイクロアレイ遺伝子発現解析により特定された選択されたセットの遺伝子を、定量的RT-PCRで検証した。定量的RT-PCRは、以下の遺伝子についてAppliedBiosystems社製の既製TaqManパネルを使用して実施した:Hs01017452_mlBリンパ球チロシンキナーゼBLK、Hs00236881_mlCD79b分子CD79b、Hs01099196_mlヘパラン硫酸グルコサミン3-O29スルホトランスフェラーゼ1HS3ST1、Hs01592483_mlSH2ドメイン含有1BSH2D1B、Hs00172040_mlT細胞白血病TCL1A。訓練セットでスクリーニングされた他のアッセイ:本発明者らは、間接経路IFNγELISpot、並びに直接及び間接経路trans-vivoDTHアッセイも実施した。サイトカイン遺伝子のRT-PCR増幅を、ドナー細胞及びレシピエント細胞の直接及び間接経路培養で実施し、TCRレパートリー解析は、TCR-ランドスケープ解析で達成したデータ非表示。統計:多くの群比較においてn<20であり、データは正規分布していなかったため、ノンパラメトリック検定を使用して統計的有意差を推定した。ウィルコクソンの符号付順位検定を使用して、同じ患者群内の応答を比較した。マン-ホイットニーU検定を使用して、患者群間の中央値を比較した。通常はカテゴリーデータ及び抗HLA抗体の存在又は非存在として記録される臨床変数間の関連性を比較するために、本発明者らは、フィッシャー直接検定を使用した。0.05未満だった場合、両側p値を使用して有意差を示した。マイクロアレイ及びバイオマーカーの統計分析;マイクロアレイにより検出された有意に変更された発現を、4階級分析、及び1偽陽性率FDR、FalseDiscoveryRateのBenjamini-Hochberg補正を用いたクラスカル-ワリス検定を使用して統計的に決定した。本発明者らは、データが幾つかの場合に正規性から逸脱すると考えられたため、この解析にはノンパラメトリック検定を選択した。同様の手順を使用して、バイオマーカーを順位付けした欠測値は、試料全体の平均と同値とし、対数スケールで試験した。寛容患者を検出する幾つかの変数の予測能力を評価するために、本発明者らは、受信者動作特性ROC曲線を使用した。これらを構築するために、まず、4階級分析により、訓練セット内の識別的発現されたTol-DFのプローブを特定し、クラスカル-ワリス検定を使用して順位付けした。その後、最上位の発現が有意に異なるプローブを、2項回帰モデルに追加し、試料内の階級化を実施するために使用した。2項回帰手順を使用して、Tol-DF患者の確率p[1]、.....、p[n]を各被験者について計算した。ROC曲線は、確率閾値を0から1の間で変動させることにより生成し、閾値tの各々の値について、p[i]>tの場合、被験者iの実際の階級対予測階級の2×2階級化表をTol-DFと同値に設定した。被験者のブートストラップリサンプリングは、試料内階級化結果がロバストであることを示した。検査セットの場合、訓練セット分析と同じプローブを使用した。寛容腎移植患者のデモグラフィックス:訓練セットは、71人のヨーロッパ系腎移植レシピエント及び19人の年齢及び性別一致健常対照で構成されていた表1。Tol-DF群の大部分は献体ドナーであり11人中7人、高度のHLA不一致不一致中央値4.0は、主に男性であり11人中9人、末期腎不全の原因は様々であり、輸血及び以前の移植等の幾つかの感作事象の根拠があった表2。これら患者は、比較的無事象の移植後経過を示しており、1人の患者のみが急性細胞性拒絶反応ACRの発症が記録されていた。免疫抑制を受けていない期間は、1年~21年間と様々であった。検査セットのTol-DF群表3は、24人の患者で構成されており、そのほとんどは、HLAが高度に一致した生体ドナー不一致中央値0.0から移植を受けており、免疫抑制を1~32年間中止していた。Tol-DFレシピエントは、Bリンパ球及びNKリンパ球の数の増加を示した。図1に示されているように、訓練セットのTol-DF患者は、末梢血B細胞及びNK細胞の割合の増加、及びそれに対応したT細胞の割合の減少を示した。B細胞及びT細胞の割合を比率として表わすと、Tol-DF患者は、HCを含む他の全ての研究群と比較して、最も高い比率を示した。6人のTol-DF患者及び10人のs-CNI患者の場合、1リンパ球サブセット当たりの細胞の絶対数を計算することも可能だった。これにより、比率の変更は、B細胞及びNK細胞の数の増加によるものであり、Tol-DF群はいずれもリンパ球減少症でなかったため、T細胞数の低減によるものではないことが示された表2。訓練セットでの知見と一致して、検査セットのTol-DF患者も、HCを除く他の全ての群と比較して、末梢血B細胞の割合の上昇及びより高い比率のB:T細胞割合を示した図1E及びH。Tol-DF患者で検出された末梢血B細胞の特徴的な増殖を考慮して、B細胞サブセット分析図8及びサイトカイン産生図9を、両研究セットからの選択された患者で更に評価した。Tol-DF群は、後期記憶貯留が減少し、移行性及び未感作B細胞サブセットが同時に増加するというB細胞サブセット再分布の傾向を示した。B細胞サブセットの割合を比率として検討すると、Tol-DF患者は、CR患者と比較して、有意により低い割合の記憶B細胞及びより高い割合の移行性B細胞を有することが見出された。Tol-DF患者に由来するB細胞のかなりの割合は、invitro刺激の際に、IL-10又はΙFΝγではなく、TGFβを産生することが見出された。しかしながら、IL-10産生の有意差は、いずれの研究群でも検出されなかった。各患者群に由来するB細胞が、刺激の際にいずれかのサイトカインを産生する能力を、各サイトカインを産生するB細胞の数の比率を計算することにより分析した。これにより、Tol-DF患者のB細胞が、偏ったサイトカイン応答を示し、他の研究群に由来するB細胞よりも、TGFβを産生する傾向がより高いことが示唆された。寛容レシピエントは、末梢血中により少数の活性化CD4T細胞を有していた。CD4T細胞によるCD25の発現を、上述のように分析した。訓練セットのTol-DF患者は、HC、s-LP、s-nCNI、及びCR群と比較して、活性化T細胞であると広く考えられている9、10有意により低い割合の循環中CD4CD25intT細胞を有することが見出された図2A。興味深いことには、CD4CD25hi制御性T細胞の割合の有意差は、s-CNIによる完全な免疫抑制を受けた患者と他群との間でのみ検出された図2B。検査セットでも同様の結果が見出され、Tol-DF患者は、s-CNI群及びCAN群と比較して、有意により低い割合のCD4CD25intT細胞を有するが、ここでも、Tol-DFと他の研究群との間には、CD4CD25hiTregの割合の差異は検出されなかった図2C及び2D。他の群間の統計的比較は、表5に示されている。本発明者らが、ポリクローナル刺激により誘導された自己T細胞増殖を抑制する濃縮CD4CD25hiT細胞の能力を試験すると、いずれの患者群間又は健常対照間でも有意差は見出されなかったデータ非表示。更に、Tol-DF患者は、CD3CD8CD28-又はCD3CD4-CD8-T細胞等の、より高い割合の他の制御性T細胞サブセットを示さなかったデータ非表示。大多数の寛容レシピエントは、検出可能な抗ドナーHLA特異的抗体を有していなかった。血清非ドナー特異的抗体NDSAは、LuminexxMAP分析により、訓練セットの全ての研究群に由来する幾人かの患者で検出可能であった図3A。この集団内では、Tol-DF患者は、検出可能なドナー特異的抗体DSAを有していなかったが、他の全ての群には、検出可能なDSAを有する患者が幾人か存在し、CR患者のほとんど半分は、検出可能なドナー特異的及び非ドナー特異的抗HLAクラスI及びクラスII抗体を両方とも有していた。訓練セットと同様に、検査セット内の22人のTol-DF患者中1人のみが、検出可能なDSAを有していたデータ非表示。興味深いことには、一般的に、DSA陽性患者は、DSA陰性患者よりも不良な移植機能を有し、推定糸球体濾過率は、DSA陰性患者の6013~94の範囲と比較して、DSA陽性の患者は3117~87の範囲だった。検出された抗ドナー抗体が病原性である可能性を、訓練セットで試験した図3B。抗クラスI抗体を有する20人の患者中7人、及び抗クラスII抗体を有する13人の患者中4人に、本発明者らは、補体結合アイソタイプIgGl及びIgG3を見出し、残りの陽性ケースは、もっぱら非補体結合アイソタイプだった。NDSA抗クラスI及び抗クラスII抗体の検出は、以前に移植を受けていること、移植の前に検出可能なパネル反応性抗体を有することと有意に関連していたフィッシャー直接検定、p<0.05。しかし、過去の妊娠、輸血、移植片機能不全、又はACRの発症とは関連しなかった。対照的に、DSA抗クラスII抗体は、過去のACR発症、及びドナーとレシピエントとの間のHLA不一致の数と関連していたフィッシャー直接検定、p<0.05。寛容患者は、より低頻度の直接経路抗ドナーIFNγCD4T細胞応答を示す。直接経路CD4T細胞抗ドナー応答及び抗第3の個体ドナーと等しく不一致応答の比較を、IFNγELISpotにより評価した。Tol-DF患者は、訓練セット内の他の全ての安定患者群と比較して、ドナー特異的低応答性を示す、有意により高い比率の応答抗ドナー頻度:抗第3の個体頻度を示した図4A;ドナー及び第3の個体に対する個々の応答頻度は、図10に示されている。ドナー特異的低応答性は、応答T細胞に由来するCD25細胞の枯渇が、応答頻度の増加をもたらさなかったため、Tregにより媒介されなかったデータ非表示。検査セットのTol-DF群は、ドナーとHLAが完全に一致していた頻度が高かったため、抗ドナー及び抗第3の個体IFNγ応答は、一般的に非常に低かった応答頻度>1/200,000。それにも関わらず、このTol-DF群の抗ドナー応答における傾向は、一般的に再現されたが、他群と比較して有意差は検出されなかった図4B。寛容レシピエントは、末梢血中で、より高い比率のFoxP3及びα-l,2-マンノシダーゼ遺伝子の発現を示した。FoxP3及びα-l,2-マンノシダーゼの全血遺伝子発現レベルは、両方とも移植後の抗ドナー免疫反応性と関連することが示されており11、それをqRT-PCRで分析した図11。FoxP3及びα-1,2-マンノシダーゼ発現の比率を計算すると、訓練セットのTol-DF群とCR群とHC群との間に、有意差が検出された図5A。最も高い比率を示す患者群は、HC、s-LP、及びTol-DFだったが、この比率は、CRでは劇的により低かったTol-DF以外の群間比較のマンホイットニーU検定のp値は、表6に示されている。この比率は、eGFRと有意に相関しており、血清クレアチニンと逆相関したピアソン係数:それぞれ、0.372p=0.002及び-0.299p=0.014、データ非表示。同じ分析を検査セットで実施すると、Tol-DF患者での比率は、HCを除く他の全ての患者群での比率より有意に高かった図5B。訓練セット及び検査セットの結果を組み合わせると、寛容は、高い比率の末梢血FoxP3及びα-1,2-マンノシダーゼ発現と関連していることが示される。寛容患者は、特徴的な遺伝子発現プロファイルを示した。移植研究に焦点をおいて設計されたRISET2.0特注マイクロアレイを、5,069個のプローブを含むように構築し、末梢血試料中の4607個の遺伝子有効なEntrez遺伝子識別記号の発現を分析するために使用した。マイクロアレイデータの4階級分析を、訓練セットで実施した図6。Tol-DF患者と他の比較群、安定レシピエントs-CNI、s-nCNI、及びs-LP、CR、及びHCとの間で検出された有意に変更された遺伝子発現を、1偽陽性率FDRで補正したクラスカル-ワリスノンパラメトリック検定12を使用して統計的に決定した。他の研究群と比較して、Tol-DF患者での免疫抑制の欠如を検討するために、HC群を、この解析に含めた。255個の遺伝子に対応する260個のプローブが、研究群間で発現が有意に異なると特定された。同様の解析を検査セットで実施すると、発現が有意に変更された、1352個の遺伝子に対応する1,378個のプローブが特定され、174個のプローブ170個の遺伝子が、訓練セット及び検査セットの両方に共通していたことが見出された表7。マイクロアレイ発現を、下方制御されるか又は上方制御されるかのいずれかであることが検出されたプローブを含む、リスト内で高位に順位付けられた幾つかのプローブのqRT-PCR分析により検証した。全遺伝子の発現は、両アッセイを使用したところ、高度に相関しており図12A~E、選択された遺伝子のqRT-PCRで定量化された発現は、研究した遺伝子に依存して、少なくとも1つの他の患者群と有意に異なっていた図12F~J。興味深いことには、全ての選択された遺伝子のTol-DF患者試料中の発現レベル中央値は、訓練セットと検査セットとの間で非常に類似していたが、検査セットのサンプル数がより多かったため、それらの相関係数は一般的により高かった図13A~E。更に、Tol-DF患者の遺伝子発現は、試験した5個の遺伝子のうちの4個については、他群のほとんどと有意に異なっていた図12及び13F~J。上位に順位付けされたプローブのプローブ発現中央値は、表8に示されている。本発明者らは、寛容個体と非寛容個体を区別する有用性を有する、遺伝子発現解析に対するより正確な定量的手法の遺伝子発現診断能力を、マイクロアレイ解析により特定された上位順位の遺伝子を、任意の単一遺伝子の任意の重複プローブを除いて例えば、2位及び4位に順位付けられたTCL1A、4位に順位付けられたプローブは除く、ROC曲線を構築するための追加の2項回帰モデルに使用して調査した。これらのプローブを使用して、まず予測階級を生成する試料内ことにより、したがって各個体の階級化により、Tol-DF患者を特異的に特定する遺伝子発現特徴を構築した。この解析の場合、2階級ROC曲線寛容対非寛容は、非寛容比較群のHC群を含むもの及び含まないものの両方を構築した。これをしたのは、健常対照と寛容個体を比較することは、寛容特異的遺伝子発現を特定するためには興味深いが、腎移植患者の寛容に関する臨床診断検査を開発するという状況では、この比較は有用ではないからである。HCを除いて構築され、上位10位に順位付けられた遺伝子の発現に基づく表4対応するROC曲線図6Aは、訓練セット内で、0.01の閾値でピーク特異性及び感度が1、対応する陽性的中率PPV及び陰性的中率NPVが100であることをもたらしたHCを含むROC;閾値0.2、特異性0.853、感度0.923。訓練セット内では、良好な寛容患者の識別をもたらすのに3個の遺伝子及び6個の遺伝子で十分だったが、その後の検査セットのROC解析の特異性及び感度を向上させたため、上位10位に順位付けられた遺伝子を、使用のために選択した図6B。検査セットの試料解析内では、0.35の閾値で0.890の特異性及び0.806の感度、それぞれ71及び93のPPV及びNPVがもたらされたHCを含むROC;閾値0.23、特異性0.801、感度0.806。本発明者らは、訓練セットと検査セットとの間で特定された、174個の重複するプローブのセットでアノテーション濃縮解析を実施した。アノテーションされた経路と任意の有意な関連性を有することが見出された遺伝子の大部分は、B細胞関連経路内に濃縮されていた表9。これらデータと一致して、10個の遺伝子に対応する上位11位に順位付けられたプローブのうち、6個の遺伝子が、B細胞により発現されると記述されているか、又はB細胞機能に関連すると記述されている表4。このプローブリスト内で濃縮されたB細胞関連経路に加えて、タンパク質チロシンキナーゼ、二次シグナル伝達メッセンジャー分子の産生、及び他のT細胞活性化関連経路を含む他の経路も有意だった表9。クロスプラットフォームバイオマーカー診断能力。材料及び方法の項に記載されている全アッセイを、Tol-DF患者と他の全ての研究群とを区別するそれらの診断能力に関して、並行して試験した。検査セットで実施したアッセイは、訓練セット内で寛容を高度に予測した。それらは上記で考察されている。寛容の存在を示す種々のバイオマーカーを組み合わせることにより、本発明者らは、任意のそのような個別検査の診断能力を著しく向上させることが可能であると予期した。これは、検査セットで実際に観察された。実際、1B/Tリンパ球サブセットの比率、2CD4CD25intT細胞の割合、3抗第3の個体ELISpot頻度に対する抗ドナーの比率、4FoxP3/α-1,2-マンノシダーゼ発現の比率、及び5上位10位に順位付けられた遺伝子の特徴を使用して、バイオマーカー及びマイクロアレイデータを組み合わせて分析すると、訓練セットの特異性及び感度は、0.01の閾値で1だった。これは、PPV及びNPVが100だったことを意味した図7A。検査セットを分析すると、0.27の閾値で、0.923のピーク特異性及び0.903の感度が得られ、PPVは80、NPVは96だった図7B。これにより、遺伝子発現のみで得られたものと比較して、診断能力が向上した。したがって、クロスプラットフォームバイオマーカー特徴の適用は、遺伝子発現及び表現型解析に加えて、寛容の機械論的基盤の記述とより密接に関連する場合がある個体の免疫学的機能状態を考慮に入れることができるため、真の寛容を特定する能力を向上させた。この点で、患者T細胞及びB細胞応答の研究は有用な手法であり、本発明の中でバイオマーカーとしても使用することもできる。このクロスプラットフォームバイオマーカー特徴の有用性は、知らないうちに実効的寛容である場合がある腎移植患者を特定するその能力にある。図7C及びDに示されているように、検査セットの5人の安定レシピエントが、寛容特徴を有すると特定することができ、したがって、管理された免疫抑制離脱から利益を得ることができる。興味深いことには、検査セットの2人のCAN患者も、寛容である確率が高いと特定された。訓練セットのCR群とは異なり、CAN患者は、免疫媒介性拒絶反応を有することが生検により明らかにならならなかったが、不良な移植片機能に基づいて定義されたため、この知見は、慢性拒絶反応の臨床評価の差異により説明することができる。これら患者の検査に使用したクロスプラットフォームバイオマーカーは、これら2つの患者群間の微妙な差異、これら等の患者を経時的に連続して免疫モニタリングすることにより明らかにされる場合がある特性を検出するのに十分な感度を有することが可能である。統計データ統計専門家が、訓練セットを使用して、以下の感度及び特異性を計算した;その後、検査セットを使用して同じ計算を行った;統計専門家が、訓練セットを使用して、表にある遺伝子の感度及び特異性を計算した;その後、検査セットを使用して同じ計算を行った;最良の予測値並びに良好な一般化可能性を提供する可能性のある遺伝子及び追加バイオマーカーの中で最良のサブセットを選択するために、更なる解析を実施した。最初に、各サイズ1~14個のバイオマーカーの最良のサブセットを、赤池の情報量基準に基づいて選択した。各サブセットの選択されたバイオマーカーは、下記の表に示されている。2項回帰モデルを、これらサブセットの各々について推定し、検査セット中のオーバーフィッティングを回避するために、交差検定を使用して解の安定性を確立した。図14には、交差検定の結果が示されている。交差検定の結果は、このモデルが追加マーカーを包含した検査セットの特定の特徴にオーバーフィッティングし始めると考えられるため、最適解が少数のマーカー例えば、2~5個、又は好ましくは2~3個を含むべきであることを示唆した。これを確認するために、各サイズの最良のサブセットを含む2項回帰モデルを使用して、ROC曲線、並びに訓練セットの対応する最適感度及び特異性を推定した。訓練セット続いて、各サブセットサイズの訓練セットで得られた係数を使用することにより、検査セットの患者の寛容の確率を推定した。これら確率を最適カットオフ訓練セットでも推定したと組み合わせて使用して、検査セットの感度及び特異性を計算した。これら結果により、交差検定の結果が確認され、個々の患者で最良の寛容確率を予測するために、好ましくは、2、3、4、又は5個のバイオマーカー、より好ましくは2又は3個のバイオマーカーを用いたモデルの使用が支持される。考察本発明者らは、様々な程度の免疫抑制下で安定した腎機能を示す患者、慢性拒絶反応を起こす患者、及び健常対照から寛容な腎移植レシピエントを識別する1セットのバイオマーカーを開発した。寛容患者の訓練セットで特定されたバイオマーカーを、独立検査セットで検証した。本発明者ら、非投薬寛容レシピエントの末梢血中のB細胞及びNK細胞の増殖を見出した。これは、類似患者のより小さな集団での従来の研究結果に類似している13。また、マイクロアレイ解析は、Tol-DFと他群との間で発現が変更された遺伝子が、明白に及び強力にB細胞に偏っていることを明らかにした。特に、SH2D1B、TLR5、及びPNOC遺伝子の組み合わせが、個体の寛容を決定するための非常に有効な検査を提供することが判明した。同種移植片拒絶反応14及び15及び寛容16の開始及び維持におけるT細胞の役割は、明白に確立されているが、B細胞の役割及びB細胞が寛容状態に寄与することができる機序は、まだ解明されていない。興味深いことには、抗CD45RB療法により誘導された、移植寛容に関するネズミ研究は、B細胞の機構的役割を示している17。また、最近のデータは、未感作B細胞には、心臓移植のネズミモデルにおいて、抗原特異的同種相互作用後に、移植片拒絶反応を阻害する制御性T細胞を誘導する能力があることを示している18。Br-1IL-10産生B細胞の著しい増加は、この研究内のいずれの患者群でも検出されなかったが、本明細書で示されたデータは、B細胞移行性集団及び後期記憶集団の比率が変更されたこと、TGFβ産生細胞が相対的に増加したこと、血清ドナー特異的抗体及びドナー特異的直接T細胞低応答性が寛容レシピエントに存在しないことを示す。これらの観察は、腎移植寛容が、T細胞及びB細胞媒介性機能の両方の変更と関連している可能性があるという推測を可能にする。しかしながら、腎移植及び骨髄移植混合レシピエントのB細胞免疫及びT細胞免疫の両方を研究したPorcherayらによる最近の研究は、研究した寛容患者の幾人かでは、T細胞及びB細胞抗ドナー免疫が関連していないことを実証した19。この点において、この研究で寛容腎患者に観察されたB細胞特徴は、寛容の促進にB細胞が重要な役割を果たすこと示している可能性がある。機能アッセイを使用して抗ドナー応答をモニターすることにより、直接経路T細胞の低応答性は、固形臓器移植後に経時的に発生することが実証されている20、21。臨床の状況では、抗ドナーT細胞の頻度を計数することは、ステロイド退薬プロトコールに有用であることが判明している22。本研究では、ELISpotによる抗ドナー直接経路応答を測定することも、有用であることが判明し、ドナーT細胞及び第3の個体のT細胞に対する応答の比率を決定することにより、寛容患者のドナー特異的低応答性が明らかになる。しかしながら、この検査は、ドナー及びレシピエントが、幾つかのHLA不一致を有する場合により有用である。これと同様の研究は、寛容肝臓レシピエント23、24の遺伝子解析に注目しており、寛容腎臓レシピエント25、26の遺伝子解析にも注目している。これら研究で発現が異なっていた遺伝子のセットは、本明細書で特定されたものとは異なっており、個体が免疫学的に寛容か否かを決定するにはそれほど効果的ではない。これは、使用した臓器、患者群、RNA供給源及び調製プロトコール、又は使用した解析プラットフォームの違いを反映している可能性が高い。実際、この研究で使用したマイクロアレイは、公開及び未公開データの両方に基づき移植用に重点をおいて選択的に設計されており、したがって、かなりの数の免疫応答関連プローブを含んでいた。訓練セット内で見出された、最も高位に順位付けされた寛容関連遺伝子のうちの2つ、TCLIA順位2位MS4A1CD20順位5位は、両方ともB細胞関連遺伝子である。MS4A1は、寛容腎移植患者に関連することが、以前にBraudら25により特定されている。この研究により記述された寛容特徴の考え得る解釈は、検出された免疫学的バイオマーカーは、Tol-DF群の薬物媒介性免疫抑制の欠如によるものに過ぎないということであり得る。この可能性を検討するために、訓練セットの研究群を、別個の免疫抑制投与計画を受けている安定した腎移植患者、及び免疫抑制を受けていない被験者として健常対照を含むように特に選択した。訓練セットにおいて健常対照とTol-DF群との間に明白な相違が観察されたが、これらの相違は、検査セットでは再現されなかった。この知見は、寛容の機序が、訓練セットとは対照的に、寛容レシピエントがドナーとHLAが高度に一致している検査セット内でよりわずかである可能性があるという事実に起因する可能性がある。これら研究群を全て考慮に入れたため、本明細書に記載したバイオマーカーの組み合わせは、単に免疫抑制がなかったためではなく、移植寛容に特異的な記述であると考えられる。寛容患者及び健常対照の詳細な比較は、寛容の機構論的基盤についてより多くのことを明らかにすることができるが、臨床の状況では、この比較は関連性がないとするのが妥当である。興味深い比較は、訓練セットのTol-DF及びs-LP患者群の比較であり、それらは、10mg/日のプレドニゾンの使用において異なり、多くの臨床医により疑似生理学的なものとみなされている。s-LP群は、より高い割合の女性レシピエント、より高い割合の献体ドナー、及びTol-DF群より不良な腎機能を有していた。むしろ直観には反するが、記載されているアッセイのほとんどで、これら2つの群間に、免疫表現型、抗ドナー応答、FoxP3/α-1,2-マンノシダーゼ比率、及び遺伝子発現の明白な相違があった。これは、ステロイド単独療法が、バイオマーカーにより明らかにすることができる、患者免疫状態の有意差を誘発することができるという概念を支持する。訓練セット内のTol-DF患者のうちの1人は、骨髄供与を受けており、その4年前に同じドナーからの腎移植を受けていた。キメラ現象の証拠が検出されたため、この患者の免疫抑制は、初期に中止された。寛容誘発の機序がこの患者では異なる可能性があったため、バイオマーカー及びROC曲線解析は、この患者を含む場合と含まない場合で実施したが、この患者は、研究されたアッセイのいずれでも寛容群内の外れ値として出現することはなかった。この寛容特徴の有用性は、安全に免疫抑制を離脱することができる移植レシピエントを特定するその能力に依存する。本発明者らは、今や、バイオマーカーの特異的及び高感度のセットを開発した。それらを組み合わせると、寛容腎臓同種移植片レシピエントを特定することができ、免疫抑制剤を受けている幾人かの腎移植レシピエントも特定することができる。これらバイオマーカーの検証は、完全に独立したセットの患者を使用して達成された。この検証は、検査セットが、遺伝的に異なる集団に由来していた事実、並びに検査セット試料及び訓練セット試料の収集及び処理にも相違があったという事実により補強される。バイオマーカーは、臨床設定における決定ツールとして実用化することができる。それは、腎臓同種移植片レシピエントの個別化された安全な臨床的移植後管理を可能にすることができる。RT-PCRを使用した更なる検証寛容を決定する本方法を更に検証にするために、本発明者らは、異なる患者群で更なる研究GAMBIT研究を実施した。新しい研究群;寛容患者:1年を超えて完全に免疫抑制を受けておらず、CRTの上昇が中止前の基線から10未満である新しい患者。IOT研究の指標群に相当する安定患者;移植してから5年を超えており、任意の免疫抑制療法で維持されており、過去5年間に全体的な安定した腎臓機能平均eGFR変化が15未満を示している、安定的機能を示す成人腎移植レシピエント。IOT研究の対照群1、2、及び3に相当する慢性拒絶患者:過去3か月に移植片生検を受けており、免疫主導性の慢性同種移植片腎症を有すると分類された、移植後の1年間を超えて機能不全が増加している成人及び小児腎移植レシピエントIOT研究の対照群4に相当する。この研究では、本発明者らは、以下の患者群から新しい試料を収集した:安定患者から33個の試料慢性拒絶患者から12個の試料、及び寛容患者から5個の試料、健常対照から1個の試料寛容を喪失した患者から1個の試料。RT-PCRを、以下のプロトコールを使用して、選択された10個の遺伝子について実施した。RT-PCRプロトコール全血を、末梢静脈から、細胞を溶解しmRNAを安定化させる溶液を含有するTempusTube商標ABI社カタログ番号:4342792に直接収集した。チューブは、使用まで-20°Cで保管した。全血RNAを、TempusスピンRNA単離キットABI社カタログ番号:4380204を使用して抽出した。mRNAの量及び品質を、ND-1000分光光度計NanoDropTechnologies社を使用して測定した。その後、RNAを-80°Cで保管した。1μgの全血全RNAを、ABITaqman逆転写合成キットABI社カタログ番号:4304134を使用して、cDNAに逆転写し、直ちに使用した。cDNAを、384ウエルプレートABI社カタログ番号:4306737の1ウエル当たり20μl反応容積中で、下記に示したプライマー及びプローブを使用してRT-PCR解析にかけた。健常対照に由来する試料中の遺伝子発現のレベルをチェックし、同じ遺伝子の発現が患者由来の全血試料でも検出されることを実証する最初のRT-PCRステップの後、RT-PCRを、この研究の患者cDNAで実施した。データ前処理ステップ:データを読み込み、異なるプレートのデータと統合する。プレートタイプの変化96ウエルプレート及び384ウエルプレート間によるバッチ効果をチェックする。バッチ効果は見られなかった。ウエルを非テンプレート対照でチェックし、プレート汚染の可能性を検出する。35を超えるCT値を未決定とコード化する。技術的複製の変動係数をチェックし、3を超える場合はいかなる場合も警告を喚起する。本発明者は、複製品質が良好であり、懸念の理由はないことを見出した。平均値を使用して複製を総計する。dCTを、目的遺伝子とHPRT制御遺伝子との間のCT値の差として算出する。2-dCTを使用してdCTを再スケーリングして、陽性値のみを得る。過剰レベルの未決定発現による遺伝子SLC8A1からのデータを排除する。この遺伝子の発現は非常に低く、RT-PCRによる検出は不良である。この遺伝子は、外れ値により元々選択された偽陽性だった可能性が高い。欠測値を有する患者のデータを排除する安定患者のみが排除された。データをヒートマップ形式で生成し非表示、樹状図は、10又は3個の遺伝子のいずれかを使用した、患者の教師なし階層的クラスタ分析の結果を示す。10個の遺伝子の使用は、寛容患者を一緒にグループ化することを支援しないが、交差検定により選択された3個の遺伝子を使用すると、5人の寛容患者が、樹状図の最後の分岐下の右側に一緒にクラスタ化される傾向があることは明らかである。データ非表示。3個の遺伝子PNOC、SH2DB1、及びTLR5の発現レベルを示すボックスプロットが示されている。図15を参照されたい。当業者であれば明白であろうが、この3個の遺伝子を組み合わせて寛容患者と非寛容患者を区別する分類指標を生成するには、幾つかの方法が可能である。本発明者らは、本明細書において、2つの分類指標:1主要及び相互作用効果を用いたロジスティク回帰モデル、及び2分類ツリーの結果を示す。これらモデルのパラメーターを計算するために、本発明者らは、安定患者、慢性拒絶患者、及び寛容患者のデータを使用したが、結果を寛容対非寛容に二分する。ロジスティク回帰フィッティングの結果:2項ファミリーの分散パラメーターは1に設定したNull逸脱度:49の自由度で32.508残差逸脱度:43の自由度で14.892AIC:28.892推定列の係数は、寛容確率を計算するために使用した係数である。ロジスティク回帰分類指標を使用して得られたROC曲線については、図16を参照されたい。図17は、ロジスティク回帰分類指標を使用して推定された寛容確率のボックスプロットを示す。この方法を使用すると、単一の慢性拒絶患者が誤って寛容と分類され、5人の安定患者が寛容と分類され、これは、安定集団の15を構成し、免疫抑制離脱に適している可能性のあると予測された20以内に入る。回帰アルゴリズム:Z=-14.45794.156PNOC6.289SH2DBl5.054TLR5-l.523PNOCSH2DBl-51.584PNOCTLR5-2.339SH2DBlTLR5PTol=ez/ez1注意:各遺伝子の発現は2-dCTとして表されており、dCTは、各遺伝子と対照遺伝子HPRTとの間のCTの差として計算される。患者は、PTolが>0.0602である場合、寛容と分類される。図18は、3個の遺伝子PNOC、SH2DB1、及びTLR5を用いて推定された分類ツリーを示す。分類指標の性能が最適である場合、0より大きな寛容確率を有するあらゆる患者が寛容と分類される。終端ノードのうちの2つが、0より大きな寛容確率と関連した:1TLR5<3.37及びSH2DB1>1.02及びTLR5<1.58を示す患者寛容確率=0.600;及び2TLR5<3.37及びSH2DB1>1.02及びTLR5>1.58及びPNOC<0.042を有する患者寛容確率=0.333。図19は、分類ツリーのカットオフのボックスプロットを示す。図20は、推定分類ツリーの使用からもたらされたROC曲線を示す。感度、特異性、及びAUCは、0より大きな寛容確率を有するあらゆる患者を寛容と分類することに起因する。図21は、様々な確率に割り当てられた各群の患者の数を示す。1人のCR患者が誤って寛容と分類された回帰を使用した場合と同じ誤分類。同様に、5人の安定患者が寛容と分類された。これらの結果は、これら3個の遺伝子を使用して、寛容患者と非寛容患者の区別の成功が得られたことを示す。実施の成功は、異なる分類法を使用して達成することができ、それらのうちの2つは、本明細書で例示されている。表1:訓練セットIOT集団の臨床及びデモグラフィック特徴a、c、d、e、f:群ごとの中央値及び四分位範囲が示されている。a年齢年;b各群の女性のパーセント;c移植後の期間年;dMDRD機能を使用した推定糸球体濾過率、http://nephron.org/mdrd_gfr_si;e血清クレアチニン値正常範囲60~105μmol/L;f末梢血リンパ球計数1L当たり×109細胞;g最初の移植を受けた患者のパーセント;h献体ドナーでの患者のパーセント;iドナー及びレシピエント間のHLAA、B、C、DR、及びDQ不一致の数の中央値最大10;j試料収集時にCNIを受けていた患者数;kミコフェノール酸モフェチルを受容していた患者の数;lアザチオプリンを受容していた患者の数;mステロイドを受容していた患者の数;n抗体誘発療法により治療された患者の数。HC、健常対照;Tol-DF、寛容薬物非投与表2:訓練セットIOT集団のTol-DF患者の臨床及び病歴の要約。a年齢年;b移植後の期間年;cMDRD機能を使用した推定腎糸球体濾過率、http://nephron.org/mdrd_gfr_si;d末梢血リンパ球計数1L当たり×109細胞;eドナー及びレシピエント間のHLAA、B、C、DR、及びDQ不一致の数最大10;f患者が全ての免疫抑制剤を受容していない年数;g移植回数;Tr:複数の移植前輸血を受けていた患者;PRA、パネル反応性抗体preTx:PRA>移植前に記録された1;PeakPRA:任意の既往PRA>記録された1;ACRIIA:生検で確認されたBanffスコアIIAの急性細胞性拒絶反応の1発症。N/D:データなし。表3:検査セットITN集団の臨床及びデモグラフィック特徴a、c、d、e:中央値及び四分位範囲は示されている。a年齢年;b女性のパーセント;c移植後の期間年;d血清クレアチニン値正常範囲60~105μmol/L;e白血球数1L当たり×109細胞;f移植を初めて受けた患者のパーセント;gドナー及びレシピエント間のHLAA、B、及びDR不一致の数の中央値最大6。HC、健常対照;Tol-DF、寛容非薬物投与;Mono、単独療法;s-CNI、安定カルシニューリン阻害剤;CAN、慢性同種移植片腎症。表4:訓練セット及びそれらのアノテーション濃縮内の上位に順位付けられた有意な遺伝子のリスト。灰色で網掛けした遺伝子は、B細胞関連遺伝子であることを示す。Tol-DFによる相対的発現;Tol-DF群による相対的な遺伝子発現上方制御↑又は下方制御↓表8に示されている各群の遺伝子発現の倍数差の中央値表5:フローサイトメトリーにより末梢血リンパ球サブセットの構成比を分析した際に、訓練セット及び検査セットの非寛容患者群間で実施されたマン-ホイットニーU検定の両側p値。表6:両研究集団の非寛容な患者群間のFoxP3及びα-1,2-マンノシダーゼ発現の計算された比率に対して実施したマン-ホイットニーU検定の両側p値。表7:4階級分析後に研究群による発現が有意に異なることが特定された訓練セット及び検査セットの両方に共通する174個のプローブのリスト。1の偽陽性率FDRで補正したクラスカル-ワリス検定によるp値で順位付けした。表8:訓練セットの患者群で検出された発現が異なるプローブの発現における対数倍数変化log-foldchangeの中央値全試料の中央値と比較して、1FDRで順位付けした。有意な識別的発現が検出された全ての遺伝子についての、訓練セット及び検査セットの各患者群の発現倍数を示すプロットは、オンライン資料で入手可能である。安定;混合群s-CNI、s-nCNI、s-LP。表9:有意に異なる発現を示し、訓練セット及び検査セットと共通した遺伝子のアノテーション濃縮。列挙されている遺伝子は、列挙されているアノテーション付経路と有意に関連していると特定された遺伝子である。網掛けした列は、B細胞関連経路であることを示す。文献1ChristensenLLetalTissueAntigens5163764419982OwensMLetalArchSurg1101450145119753RousseyKeslerGetalAMJTransplant673674620064UehlingDTetalSurgery7927828219765StroberSetalTransplantation691549155420006TakatsukiMetalTransplantation7244945420017LerutJetalAMJTransplant61774178020068PadiyarAetalPrimCare35433450v20089MiyaraMetalImmunity20093089991110ShevachEMetalJExpMed193F4146200111SawitzkiBetalAMJTransplant710911102200712StrimmerKetalBMCBioinformatics9303200813LouisSetalTransplantation81398407200614AfzaliBetalClinExpImmunol1483246200715ElyLKetalCurrOpinImmunol20575580200816LechlerRIetalNatRevImmunol3147158200317DengSetalJImmunol17860286032200718ReichardtPetalBlood11015191529200719PorcherayFetalAMJTransplant921262135200920deHaanAetalTransplantation6914341439200021HornickPIetalCirculation9712571263199822BeikAIetalNephrolDialTransplant1219491955199723MartinezLlordellaMetalJClinInvest11828452857200824MartinezLlordellaMetalAMJTransplant7309319200725BraudCetalJCellBiochem200726BrouardSetalProcNatlAcadSciUSA1041544815453200727AsareALetalBMCGenomics9474200828GuntherOPetalTransplantation88942951200929SawitzkiBetalCurrOpinOrganTransplant14650655200930CarsettiRetalImmunolRev197179191200431GarinMIetalBlood10920582065200732OzawaMetalTissueAntigens69Suppl1174179200733GameDSetalJAmSocNephrol1416521661200334WengLetalBioinformatics2211111121200635EdgarRetalNucleicAcidsRes30207210200236MazariegosGVetalTransplantation277313425200237MazariegosGVetalAmJTransplant368996June200338MartinezLlordellaMetalAmJTransplant730919February200739MartinezLlordellaMetalJClinInvest118284557August200840BrouardSetalAmJTransplant533040February200541BrouardSetalProcNatlAcadSciUSA251041544853September200742LouisSetalTransplantation1581398407February200643VelasquezSYetalTransplInt235463January201044LouvetCetalAmJTransplant5214353September200545BaetenetalJAmSocNephrol172943042006"