"ポリ3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキシヘキサン酸生産能を付与した組換えクプリアヴィダスネカトールCupriavidusnecator株の染色体にR体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として植物油を含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、3-ヒドロキシヘキサン酸の分率が5~20モルであり、及び形質転換体内蓄積率が50~90重量であるポリ3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキシヘキサン酸を製造する方法。前記組換えクプリアヴィダスネカトール株が、NSDG株、NSDGΔA株、又はMF01株であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子が、アエロモナスキャビエAeromonascaviae株由来であり、a配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる、請求項1又は2に記載の方法。R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子が、クプリアヴィダスネカトール株由来であり、a配列番号2で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる、請求項1又は2に記載の方法。R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子が、クプリアヴィダスネカトール株由来であり、a配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる、請求項1又は2に記載の方法。R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子が、-アエロモナスキャビエ株由来であり、a配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び-クプリアヴィダスネカトール株由来であり、c配列番号2で表される塩基配列を含む核酸;又はd配列番号2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる、請求項1又は2に記載の方法。R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子が、-アエロモナスキャビエ株由来であり、a配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び-クプリアヴィダスネカトール株由来であり、c配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又はd配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる、請求項1又は2に記載の方法。本発明者らは、脂肪酸β-酸化系中間体をモノマーであるR-3-ヒドロキシアシル-CoA[R-3HA-CoA]に変換するR-ヒドラターゼをコードする遺伝子を、ポリ3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキシヘキサン酸生産能を付与した組換えクプリアヴィダスネカトール株に導入することによって、植物油を基本原料として、ポリ3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキシヘキサン酸を生産する微生物を製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、i既知のアエロモナスキャビエ由来のR-ヒドラターゼ遺伝子をP3HB-co-3HHx生産能を付与した組換えクプリアヴィダスネカトール株の染色体に導入することにより、植物油のみを原料として高3HHx分率のP3HB-co-3HHxを高い蓄積率で製造する方法、及びii水素細菌クプリアヴィダスネカトールより新規に同定したR-ヒドラターゼ遺伝子をP3HB-co-3HHx生産能を付与した組換えクプリアヴィダスネカトール株に導入することにより植物油のみを原料として高3HHx分率のP3HB-co-3HHxを高い蓄積率で製造する方法が提供される。より具体的には、本発明によれば、ポリ3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキシヘキサン酸生産能を付与した組換えクプリアヴィダスネカトールCupriavidusnecator株の染色体にR体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として植物油を含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、3-ヒドロキシヘキサン酸の分率が5~20モルであり、及び形質転換体内蓄積率が50~90重量であるポリ3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキシヘキサン酸を製造する方法が提供される。本発明の製造方法に使用することができる組換えクプリアヴィダスネカトール株は、限定されないが、NSDG株、NSDGΔA株、又はMF01株である。本発明の一態様では、本発明の製造方法に使用されるR体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、アエロモナスキャビエ株由来であり、a配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。本発明の一態様では、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、クプリアヴィダスネカトール株由来であり、a配列番号2で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。あるいは、a配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。本発明の一態様では、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、-アエロモナスキャビエ株由来であり、a配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び-クプリアヴィダスネカトール株由来であり、c配列番号2で表される塩基配列を含む核酸;又はd配列番号2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。本発明の一態様では、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、-アエロモナスキャビエ株由来であり、a配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び-クプリアヴィダスネカトール株由来であり、c配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又はd配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。R-ヒドラターゼをポリ3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキシヘキサン酸[P3HB-co-3HHx]生産微生物に導入することにより、高い増殖能と高いPHA生産能を維持しつつ、3HHx分離の高いP3HB-co-3HHxを生産する株を製造することができる。以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。前述の通り、本発明は、ポリ3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキシヘキサン酸[P3HB-co-3HHx]生産能を付与した組換えクプリアヴィダスネカトール株の染色体にR体特異的エノイルCoAヒドラターゼR-ヒドラターゼ遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として植物油を含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、3-ヒドロキシヘキサン酸3-HHxの分率が5~20molであり、及び形質転換体内蓄積率が50~90重量であるP3HB-co-3HHxを製造する方法を提供する。1組換えクプリアヴィダスネカトール株本発明の製造方法に使用される微生物としては、P3HB-co-3HHx生産能が付与された組換えクプリアヴィダスネカトール株が好ましい。ここで、P3HB-co-3HHx生産能が付与された組換えクプリアヴィダスネカトール株とは、P3HB-co-3HHxを生合成させることを目的として、クプリアヴィダスネカトール株が本来有しているPHAシンターゼを変異あるいは遺伝子破壊などにより欠損した株に、炭素数6の3HHx-CoAを基質とすることができる広基質特異性PHAシンターゼ例えばアエロモナスキャビエ株由来PHAシンターゼやその変異酵素の遺伝子を導入された菌株、あるいは、クプリアヴィダスネカトール株が本来有しているPHAシンターゼ遺伝子が広基質特異性PHAシンターゼやその変異酵素の遺伝子に染色体上で置換された菌株を意味し、広基質特異性PHAシンターゼの作用によってクプリアヴィダスネカトール野生株が生合成できないP3HB-co-3HHxを合成する能力を有することを特徴とする。このような遺伝子の操作は、一般的な遺伝子工学的手法により容易に実行することができる。上記のP3HB-co-3HHx生産能が付与された組換えクプリアヴィダスネカトール株には、例えば、限定されないが、NSDG株、NSDGΔA株、MF01株が挙げられる。ここで、NSDG株とは、水素細菌クプリアヴィダスネカトールの一種であるH16株の染色体にPHAシンターゼ変異酵素の遺伝子であるphaCNSDGが導入された形質転換体をいう。phaCNSDGとは、クプリアヴィダスネカトールにおいてPHA合成酵素をコードするphaC遺伝子であって、phaCのアミノ酸配列配列番号4において、149位のアスパラギンNがセリンSに置換され、171位のアスパラギン酸DがグリシンGに置換された変異遺伝子をいう。また、NSDGΔA株とは、前記のNSDG株において、β-ケトチオラーゼ遺伝子であるphaACnを欠失させた形質転換体をいう。一方、MF01株とは、前記NSDG株のphaACnを広基質特異性β-ケトチオラーゼ遺伝子bktBCnに置換した形質転換体である。上記3種のH16変異株は、クプリアヴィダスネカトールのPHAシンターゼ酵素をコードする遺伝子の配列情報を基にして、一般的な遺伝子工学的手法を用いて作製することができる例えば、特許文献4を参照されたい。2R体特異的エノイルCoAヒドラターゼR-ヒドラターゼ遺伝子のクローニング本発明の製造方法に使用されるR-ヒドラターゼとは、脂肪酸β-酸化系中間体例えば、エノイル-CoAをポリヒドロキシアルカン酸PHAモノマーであるR-3-ヒドロキシアシル-CoA[R-3HA-CoA]例えば、R-3-ヒドロキシブタン酸[R-3HB]、R-3-ヒドロキシヘキサン酸[R-3HHx]に変換する酵素をいう。なお、本発明の製造方法に使用されるR-ヒドラターゼをコードする核酸は、一本鎖又は二本鎖型DNA、及びそのRNA相補体も含む。DNAには、例えば、天然由来のDNA、組換えDNA、化学合成したDNA、PCRによって増幅されたDNA、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはDNAが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、1つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、R-ヒドラターゼをコードする核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。本発明の製造方法において、R-ヒドラターゼ遺伝子として、アエロモナスキャビエ株由来のR-ヒドラターゼをコードする遺伝子phaJAcの塩基配列:GenBankAccessionNo.D88825中のヌクレオチド4475-4879ORF3を利用することができる。本明細書では、該遺伝子の塩基配列を配列番号1として配列表に記載する。また、本発明の製造方法において、R-ヒドラターゼ遺伝子として、クプリアヴィダスネカトール由来のR-ヒドラターゼをコードする遺伝子の塩基配列:iGenBankAccessionNo.AM260479中のヌクレオチド1167077-1167553H16A1070、本明細書中ではphaJ1に相当、及びiiGenBankAccessionNo.AM260480中のヌクレオチド454107-454562H16B0397、本明細書中ではphaJ2に相当、を利用することができる。本明細書では、上記iの遺伝子の塩基配列を配列番号2、iiの遺伝子の塩基配列を配列番号3として配列表に記載する。本発明の一態様として、アエロモナスキャビエ株由来のR-ヒドラターゼをコードする遺伝子は、a配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。本発明の好ましい態様として、アエロモナスキャビエ株由来のR-ヒドラターゼをコードする遺伝子は、a配列番号1で表される塩基配列からなる核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。本発明の一態様として、クプリアヴィダスネカトール株由来のR-ヒドラターゼをコードする遺伝子は、a配列番号2で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなるか、あるいはa配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。本発明の好ましい態様として、クプリアヴィダスネカトール株由来のR-ヒドラターゼをコードする遺伝子は、a配列番号2で表される塩基配列からなる核酸;又はb配列番号2で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなるか、あるいはa配列番号3で表される塩基配列からなる核酸;又はb配列番号3で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。本発明の一態様として、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、-アエロモナスキャビエ株由来であり、a配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び-クプリアヴィダスネカトール株由来であり、c配列番号2で表される塩基配列を含む核酸;又はd配列番号2で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。なお、上記R-ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸a又はbと核酸c又はdを隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される2つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。本発明の好ましい態様として、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、-アエロモナスキャビエ株由来であり、a配列番号1で表される塩基配列からなる核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び-クプリアヴィダスネカトール株由来であり、c配列番号2で表される塩基配列からなる核酸;又はd配列番号2で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。なお、上記R-ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸a又はbと核酸c又はdを隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される2つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。本発明の一態様として、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、-アエロモナスキャビエ株由来であり、a配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び-クプリアヴィダスネカトール株由来であり、c配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又はd配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。なお、上記R-ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸a又はbと核酸c又はdを隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される2つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。本発明の好ましい態様として、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ遺伝子は、-アエロモナスキャビエ株由来であり、a配列番号1で表される塩基配列からなる核酸;又はb配列番号1で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸;及び-クプリアヴィダスネカトール株由来であり、c配列番号3で表される塩基配列からなる核酸;又はd配列番号3で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β-酸化系中間体をR-3-ヒドロキシアシル-CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。なお、上記R-ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸a又はbと核酸c又はdを隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される2つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。前記R-ヒドラターゼ遺伝子は、例えば、後述する実施例10及び16に記載するように、配列番号1~3の塩基配列に基づいてプライマーとして合成ヌクレオチドそれぞれ、配列番号17と18、配列番号23と24、及び配列番号25と26を設計し、それぞれ、クプリアヴィダスネカトール株の染色体DNAや、染色体DNAを含むプラスミドなどを鋳型として増幅することができる。核酸を増幅するための手法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCRSaikiR.K.ら,Science,230,1350-13541985、ライゲース連鎖反応LCRWuD.Y.ら,Genomics,4,560-5691989、及び転写に基づく増幅KwohD.Y.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,1173-11771989等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応SDAWalkerG.T.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,392-3961992;WalkerG.T.ら,Nuc.AcidsRes.,20,1691-16961992、自己保持配列複製3SRGuatelliJ.C.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,1874-18781990、及びQβレプリカーゼシステムLizardi,P.M.ら、BioTechnology,6,1197-12021988等の恒温反応を利用することができるが、これらに限定されない。本発明の製造法においては、PCR法を使用することが好ましい。本明細書において、ストリンジェントな条件下とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、DNAの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrook,J.ら、MolecularCloning,ALaboratoryManual3rdedition,ColdSpringHarborLaboratory,7.42-7.452001に示されるが、ニトロセルロースフィルターに関し、5×SSC、0.5SDS、1.0mMEDTApH8.0の前洗浄溶液、約40~50°Cでの、約50ホルムアミド、2×SSC~6×SSC又は約42°Cでの約50ホルムアミド中の、スターク溶液Stark’ssolutionなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液のハイブリダイゼーション条件、及び約60°C、0.5×SSC、0.1SDSの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばDNAの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び/又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び/又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及び約68°C、0.2×SSC、0.1SDSの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度及び洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。上記のような核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載の塩基配列に対して、それぞれ、少なくとも30以上、好ましくは50以上、より好ましくは70以上、さらにより好ましくは90以上、最も好ましくは95以上の同一性を有する。なお、同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、2つの核酸配列の同一性パーセントは、Devereuxら,Nucl.AcidsRes.,12,3871984に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループUWGCGより入手可能なGAPコンピュータープログラムGCGWisconsinPackage、バージョン10.3を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。本発明の最も好ましい態様として、アエロモナスキャビエ由来のR-ヒドラターゼとしては、配列番号1で表される塩基配列からなる核酸、あるいはクプリアヴィダスネカトール由来のR-ヒドラターゼとしては、配列番号2又は3で表される塩基配列からなる核酸である。3遺伝子置換ベクターの構築及び組換え微生物の作製本発明によれば、R-ヒドラターゼをコードする遺伝子を相同性組換え用ベクターに組み込んだ遺伝子置換ベクター、又は該遺伝子を自律複製ベクターに組み込んだ発現ベクターが提供される。ここで、ベクターに遺伝子を組み込む方法としては、例えば、Sambrook,J.ら,MolecularCloning,ALaboratoryManual3rdedition,ColdSpringHarborLaboratory,1.12001に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット例えば、トーヨーボー社製等を用いることもできる。ベクターは、簡単には当該技術分野において入手可能な組換え用ベクター例えば、プラスミドDNA等に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本発明のポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造方法に用いられるベクターとしては、微生物内で、微生物の染色体に既に組み込まれている微生物由来のポリエステル重合酵素遺伝子を外来の広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子によって置換することを目的として、限定されないが、相同性組換え用ベクターpK18mobsacBSchaferら,Gene145,69-731994、pJQ200Quandt,J.及びHynes,M.P.,Versatilesuicidevectorswhichallowdirectselectionforgenereplacementingram-negativebacteria,Gene1993127:15-21を使用することが好ましい。あるいは、グラム陰性菌で自律複製することが知られている広宿主域ベクターpBBR1-MCS2GenBankAccessionNo.U23751、pJRD215M16198Davision,J.ら、1987Gene,51,275-80を参照、pJB861U82000、pHRP311Parales,R.E.及びHarwood,C.S.1993Gene,133,23-30を参照が例示されるが、これらに限定されない。また、大腸菌用のプラスミドとして、例えば、pBAD24GenBankAccessionNo.X81837、pDONR201、pBluescript、pUC118、pUC18、pUC19、pBR322等を使用することができる。また、当業者であれば、組換えベクターに適合するように制限末端を適宜選択することができ、さらに、所望のタンパク質を発現させるために、宿主細胞に適した組換えベクターを適宜選択することができる。このようなベクターは、本発明で使用する遺伝子が目的の宿主細胞の遺伝子と相同性組換えが起るように機能する領域必要に応じて、自立複製起点、接合伝達領域、選択マーカー例えば、カナマイシン耐性遺伝子等が適切に配列されており又は導入することにより、該核酸が適切に組換えられるように構築されている又は構築することが好ましい。ベクターの構築については、実施例10、11、13、及び16に記載した。一般的に、形質転換体は、組換えベクターを宿主細胞に組み込むことによって作製することができる。この場合、宿主細胞として原核細胞例えば、大腸菌S17-1株等、枯草菌であっても真核細胞哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等であっても使用することができる。組換えベクターの宿主細胞への導入形質転換は公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌大腸菌、Bacillussubtilis等の場合は、例えばCohenらの方法Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,21101972、プロトプラスト法Mol.Gen.Genet.,168,1111979やコンピテント法J.Mol.Biol.,56,2091971、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ラルストニア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等に属する菌体への発現ベクターの導入では、接合伝達法を使用することができるJ.Bacteriol.,147,1981981。この接合伝達法は、簡単には、細胞同士の接触によって染色体ゲノム又はプラスミドを一方の細胞から他方の細胞に移行させる細胞の性質を利用したものであり、例えば、目的のDNAを担持する自己伝達性プラスミドが導入された供与菌と該プラスミドを有しない受容菌との接合に始まり、両菌体における橋の形成、該プラスミドの複製と移行、並びにDNA合成の完了と共に菌体の分離といった一連の工程によって遺伝子導入を可能にする手段である。本発明の製造方法に使用される宿主細胞としては、上述した通り、P3HB-co-3HHx生産能を付与した組換えクプリアヴィダスネカトール株が好ましい。より好ましくは、NSDG株、NSDGΔA株、又はMF01株である。なお、後述する実施例4では、作製した遺伝子置換ベクターpK18msNSDG-ABを上記の株に接合伝達法により導入し、ベクターが相同領域で単交差相同性組換えにより染色体に挿入された組換え株をカナマイシン耐性を指標に単離した。なお、R-ヒドラターゼ遺伝子が染色体上に導入される位置は、該遺伝子が染色体上にある既存の調節配列下で発現するような位置であれば特に限定されない。一態様では、好ましくはR-ヒドラターゼ遺伝子はphaCNSDG遺伝子と同じ転写単位の領域内に挿入されたものである。より好ましくはphaCNSDG遺伝子の下流に挿入されたものである。4共重合ポリエステルの合成ポリエステル合成は、上述したP3HB-co-3HHx生産能を付与した組換えクプリアヴィダスネカトール株例えば、H16CAc株、NSDG株、NSDGΔA株、又はMF01株を植物油を含む所定の培地で培養し、培養細胞例えば、菌体内又は培養物例えば、培地中に共重合ポリエステルを生成及び蓄積させ、培養細胞又は培養物から目的とする共重合ポリエステルを採取することにより行われる。なお、本発明の製造方法に使用される形質転換体の培養法は、通常、宿主細胞の培養に使用される方法に従って行われる。組換えクプリアヴィダスネカトール株を宿主とした場合の培地として、微生物が資化し得る植物油を添加し、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源のいずれかを制限した培地が挙げられる。典型的には、培地温度を25°C~37°Cの範囲にし、好気的に1~10日培養することにより、共重合ポリエステルを菌体内に生成し蓄積させ、その後、回収精製することによって所望の共重合ポリエステルを調製することができる。本発明の製造方法で使用される形質転換体の親株であるクプリアヴィダスネカトールは、植物油を炭素源として成長し得る細菌として知られている。ここで、使用可能な植物油としては、一般的には、市販されている植物油を使用することができ、その供給源は特に限定されない。好ましくは、大豆油、コーン油、大豆油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ヤシ油、パーム油、ナタネ油、魚油、鯨油、豚油又は牛油などの天然油脂である。また、本発明によれば、本発明の形質転換体は、親株のクプリアヴィダスネカトールと同様の培養条件で培養することができ、培地中の植物油の濃度は、0.1~5が好ましいが、当業者であれば適宜調整することができる。また、必要であれば、培地中に窒素源や無機物を添加してもよい。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。培養は、通常、振とう培養が用いられ、好気的条件下で、25°C~37°Cで遺伝子発現誘導後少なくとも1日以上行うことが好ましい。抗生物質として、カナマイシン、アンピシリン等を培地に添加してもよい。また、必要であれば、遺伝子発現誘導剤として、アラビノース、インドールアクリル酸IAA、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドIPTG等を使用することができる。当業者であれば、所望の遺伝子発現のために可能な培養条件、遺伝子発現の誘導条件等を適宜選択できる。5共重合ポリエステルの精製と構造解析本発明において、共重合ポリエステルは、下記の通り精製することができる:培地から遠心分離によって形質転換体を回収し、蒸留水で洗浄後、乾燥又は凍結乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した形質転換体を懸濁させ、室温で所定時間撹拌し、共重合ポリエステルを抽出する。抽出の段階で、必要であれば加熱してもよい。濾過によって残渣を除去し、上清にメタノールを加えて共重合ポリエステルを沈殿させ、沈殿物を濾過又は遠心分離によって、上清を除去し、乾燥させて精製した共重合ポリエステルを得ることができる。得られた共重合ポリエステルが所望のものであることを確認するための手段は、限定されないが、NMR核磁気共鳴、ガスクロマトグラフィーを用いる方法を含む。本発明によれば、共重合ポリエステルのモノマーユニットの比、即ち、3-ヒドロキシブタン酸3HBと3-ヒドロキシヘキサン酸3HHxの比を遺伝子発現条件、培養条件等を変えることにより適宜調節することができる。本発明の製造方法によって得られる共重合ポリエステルの3HHx分率は、好ましくは5~20モル、より好ましくは5~15モル、さらにより好ましくは5~10モルである。用語モルは、本明細書中で使用するとき、多成分系における各成分のモル数の和で、ある成分のモル数を割ったものをいう。例えば、本発明の製造方法により得られる共重合体の一般式を3HB及び3HHxのモノマーユニットの数として、それぞれa及びbを用いて表記した場合、3HHx分率は、式:a×100/abにより求めることができる。なお、後述する実施例18で示すように、本発明の製造方法により、3HHx分率が異なる共重合ポリエステルを得ることができた表1及び2、後述。本発明の製造方法によって製造された共重合ポリエステルは、乾燥菌体重量当り50重量以上、好ましくは55重量以上の割合で菌体に蓄積される。以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。実施例1使用したクプリアヴィダスネカトール株以下の実施例では、遺伝子組換え用の宿主としてクプリアヴィダスネカトールH16株野生株、DSM428、H16株の染色体上のPHAシンターゼ遺伝子phaCCnを削除したH16ΔC株Mifune,J.ら、Can.J.Chem.2008,86:621、及びH16株の染色体上のPHAシンターゼ遺伝子phaCCnを土壌細菌アエロモナスキャビエ由来のPHAシンターゼ遺伝子phaCAcに置換したH16CAc株Mifune,J.ら、上述を用いた。実施例2二重アミノ酸変異型PHAシンターゼ遺伝子のクローニングアエロモナスキャビエ由来のPHAシンターゼに二重アミノ酸変異を導入した変異型酵素が報告されているTsuge,T.ら,FEMSMicrobiol.Lett2007,277:217-222;Kichiseら,Appl.Environ.Microbiol.2002,68:2411-2419;特開2008-29218。本明細書では、本変異型PHAシンターゼ遺伝子をphaCNSDGと称する。phaCNSDGがクローニングされたpBBREE32-NSDGTsuge,T.ら,上述を鋳型とし、下記の配列1及び配列2のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaCNSDGを増幅した。PCRはKODプラストーヨーボー社製を用い、98°Cで20秒、61°Cで15秒、68°Cで2分の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。配列1:GGTTCGAATAGTGACGGCAGAGAGACAATCAAATCATGAGCCAACCATCTTATGGC配列番号5下線部はCsp45I制限酵素サイト配列2:AACCTGCAGGCCTGCCGGCGCCGTGCATATGCAAGCGTCATGCGGCGTCCTCCTCTG配列番号6下線部はSbfI制限酵素サイト増幅したphaCNSDG断片はTAクローニングキットトーヨーボー社製を用いて3’-末端にアデニン塩基を付加し、LigationHighトーヨーボー社製を用いてベクタープラスミドpTA2トーヨーボー社製のマルチクローニングサイトに連結したpTA2NSDGを作製した。実施例3二重アミノ酸変異型PHAシンターゼ導入用ベクターの作製pTA2NSDGをCsp45IとSbfIで切断し、phaCNSDGを含む遺伝子断片を単離した。次いで、組換えphaオペロンプロモーター領域-phaCAc-phaACn-phaB1Cnを含むpTA2C’ABMifune,J.ら、上述をCsp45I及びSbfIで切断し、アルカリホスファターゼトーヨーボー社製で5’-末端を脱リン酸化し、次いで先に得られたphaCNSDG断片を挿入することによりpTA2NSDG-ABを得た。ここで、phaB1Cnはクプリアヴィダスネカトール株の染色体上のアセトアセチル-CoA還元酵素遺伝子である。pTA2NSDG-ABをBamHIで切断し、プロモーター領域-phaCNSDG-phaACn-phaB1Cnを含む5.0kbpの遺伝子領域を単離した。また、pK18mobsacBSchaferら,Gene1994,147:198をBamHIで切断し、アルカリホスファターゼ処理により5’-を脱リン酸化した。Ligationhighにより2つの断片を連結し、pK18msNSDG-ABを作製した。実施例4NSDG株の作製得られた組換えプラスミドpK18msNSDG-ABを用いて、クプリアヴィダスネカトールH16ΔC株を接合伝達により形質転換した。まず、塩化カルシウム法によって、pK18msNSDG-ABを大腸菌S17-1株に導入した。次に、この組換え大腸菌をLB培地1トリプトン、1塩化ナトリウム、0.5イーストエキス、pH7.23.0ml中で37°C終夜培養した。これと並行して、クプリアヴィダスネカトールH16ΔC株をNR培地1魚肉エキス、1ポリペプトン、0.2イーストエキス3.0ml中で30°C終夜培養した。その後、大腸菌の培養液0.2mlに対して、クプリアヴィダスネカトールH16ΔC株の培養液0.1mlを混合し、30°Cで6時間培養した。この菌体混合液を0.2mg/mlカナマイシンを添加したSimmonsCitrate寒天培地ディフコ社製に塗布し、30°Cで3日間培養した。組換え大腸菌のプラスミドが、クプリアヴィダスネカトールに伝達され相同性組換えにより染色体上に取り込まれた該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はSimmonsCitrate寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーは組換え大腸菌からpK18msNSDG-ABが染色体に取り込まれたクプリアヴィダスネカトール形質転換体ポップイン株である。さらに、ポップイン株をNR培地で30°C終夜培養した後、10スクロースを添加したNR培地に塗布し、30°Cで3日間培養した。pK18mobsacB上のsacBにコードされるレヴァンスクラーゼはスクロースを基質にして細胞内に毒性多糖を蓄積する。このため、10スクロース添加培地においてはプラスミド領域が脱離した株ポップアウト株のみが生育することができる。これらのコロニーの中から染色体上にphaCNSDGが挿入されたクローンをPCR法によって選抜し、これをクプリアヴィダスネカトールNSDG株とした。NSDG株は、以下の遺伝子組換えにおいて適宜、宿主として使用した。実施例5phaACn-phaB1Cn破壊用ベクターH16CAc株用の作製クプリアヴィダスネカトールH16株のゲノムDNAを鋳型に、下記の配列3及び配列4のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaB1Cn下流の転写制御因子遺伝子phaRを含む1041bpの遺伝子領域を増幅した。配列3:TCGACCGGCGCCGACTTCTC配列番号7配列4:GCATGCCAGTGTCTTACTTCT配列番号8下線部はSphI制限酵素サイトPCRはKODプラストーヨーボー社製を用い、98°Cで20秒、65°Cで15秒、68°Cで1分15秒の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。増幅した断片はDNA精製キットプロメガ社製にて精製した。その後、T4キナーゼトーヨーボー社製により5’-末端をリン酸化し、HincII及びアルカリホスファターゼ処理を施したpUC118タカラバイオ社製とLigationHighにより連結した。さらに作製したプラスミドをNdeIとSphIで切断し、phaB1Cn下流を含む遺伝子領域を含む遺伝子領域を単離した。また、組換えphaオペロンプロモーター領域-phaCAc-phaACn-phaB1CnをpK18mobsacBに挿入したpK18C’ABMifune,J.ら、上述をNdeIとSphIで切断し、phaACn-phaB1Cn領域を除去した。上述のphaB1Cn下流を含む遺伝子領域を連結することで、プロモーター領域-phaCAc-phaRを持つpK18msC’Rを得た。さらに、pK18msC’RをEcoRI及びCsp45Iで切断して、BluntingHighトーヨーボー社製により末端を平滑化した後、LigationHighによるセルフライゲーションを行うことで、プロモーター領域とphaCAcの一部を除去することでphaACn-phaB1Cnを挟む2つの相同領域の長さを調節したpK18msC’RΔPを得た。実施例6phaACn-phaB1Cn破壊用ベクターNSDG株用の作製pK18NSDG-ABをNdeIとSphIで切断し、上述のphaB1Cn下流を含む遺伝子領域を連結することでプロモーター領域-phaCNSDG-phaRを含むpK18msNSDG-Rを得た。さらに、pK18msNSDG-RをEcoRI及びCsp45Iで切断し、次いで、BluntingHighにより末端を平滑化した後、LigationHighによるセルフライゲーションを行うことで、プロモーター領域とphaCAcの一部を除去することでphaACn-phaB1Cnを挟む2つの相同領域の長さを調節したpK18msNSDGRΔPを得た。実施例7phaB1破壊用ベクターの作製pTA2NSDG-ABを鋳型とし、下記の配列5及び配列6のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaACnを含む遺伝子領域を増幅した。PCRはKODプラスを用い、98°Cで20秒、65°Cで15秒、68°Cで1分20分の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。配列5:CGCCGCATGACGCTTGCATA配列番号9配列6:CCATATGCGGCCCCGGAAAACCCC配列番号10下線はNdeI制限酵素サイトその後、T4キナーゼにより5’-末端をリン酸化し、HincII及びアルカリホスファターゼ処理を施したpUC118とLigationHighにより連結した。得られたプラスミドをNdeIで切断し、phaACnを含む遺伝子領域を単離した。また、pK18msC’RをNdeIで切断し、アルカリホスファターゼ処理により5’-末端を脱リン酸化した。得られた断片をLigationHighで連結することでプロモーター領域-phaCNSDG-phaACn-phaRを有するpK18msC’ARを得た。さらに、pK18msC’ARをEcoRI及びXhoIで切断し、プロモーター領域及びphaCNSDG領域を除去した。次いで、BluntingHighにより末端を平滑化した後、LigationHighによるセルフライゲーションを行い、pK18msARを得た。実施例8phaACn破壊用ベクターH16CAc株用の作製pTA2NSDG-ABを鋳型とし、下記の配列7及び配列8のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaB1Cnを含む遺伝子領域を増幅した。PCRはKODプラスを用い、98°Cで20秒、65°Cで15秒、68°Cで1分の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。配列7:CGCATATGGTTGGCGCGGA配列番号11下線はNdeI制限酵素サイト配列8:GCCCGGATCCTATGCCCAACAAGGCACTAAG配列番号12下線はBamHI制限酵素サイトその後、T4キナーゼにより5’-末端をリン酸化し、HincII及びアルカリホスファターゼ処理を施したpUC118トーヨーボー社製とをLigationHighにより連結した。さらに作製したプラスミドをNdeIで切断し、phaB1Cnを含む遺伝子領域を含む遺伝子領域を単離した。また、pK18msC’RをNdeIで切断し、アルカリホスファターゼ処理により5’-末端を脱リン酸化した。得られた断片を連結することでプロモーター領域-phaCNSDG-phaB1Cn-phaRを有するpK18msC‘BRを得た。実施例9phaACn破壊用ベクターNSDG株用の作製pK18msNSDG-R実施例6をNdeIにより切断し、上述実施例8で得たphaB1断片を連結することでプロモーター領域-phaCNSDG-phaB1Cn-phaRを有するpK18msNSDG-BRを得た。実施例10アエロモナスキャビエ由来R-ヒドラターゼ遺伝子phaJAc導入用ベクターの作製クプリアヴィダスネカトールH16株のゲノムDNAを鋳型にし、下記の配列9及び配列10のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaACnの上流phaCNSDGの一部を含む1kbpの遺伝子領域を増幅した。PCRはKODプラスを用い、98°Cで20秒、65°Cで15秒、68°Cで1分10秒の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。また、配列11及び配列12のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、phaB1Cnを含むphaACnの下流約1kbpの遺伝子領域を上記と同様のPCR条件で増幅した。得られた2つ遺伝子断片をDNA精製キットで精製し、それぞれ100ngずつ混合した溶液を鋳型としたフュージョンPCRを行った。2つの断片は末端が配列10及び配列11に設計した26bpの相補的配列によって相補的になっている。プライマーを添加しないPCR反応98°Cで20秒、65°Cで15秒、68°Cで2分10秒の反応を1サイクルとしてこれを10サイクルを行った後、配列9及び配列12に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして加え、さらにKODプラスを0.5μlを追加した後、98°Cで20秒、65°Cで15秒、68°Cで2分10秒の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。配列9:TGCGAATTCAGAACTCCCTGGTCGCCT配列番号13下線部はEcoRI制限酵素サイト配列10:CGTCGGATCCTCTAGATTCGAAGCGTCATGCGGCGTCCTCCTCTG配列番号14下線部はBamHI-XbaI-Csp45I、ヌクレオチド1-26は配列11との相補的配列配列11:ACGCTTCGAATCTAGAGGATCCGACGATAACGAAGCCAATCAAGG配列番号15下線部はCsp45I-XbaI-BamHI、ヌクレオチド1-26は配列10との相補的配列配列12:TGCGCAAGCTTTATGCCCAACAAGGCACTAAGAAAAG配列番号16下線部はHindIII制限酵素サイトphaACnの上下流1kbpが連結した2kbpの遺伝子断片をアガロースゲルから切り出してDNA精製キットにより精製し、さらにEcoRIとHindIIIで切断した。また、pK18mobsacBをEcoRIとHindIIIで切断し、アルカリホスファターゼ処理により5’-脱リン酸化を行った。これらの断片をLigationHighにより連結することでphaCNSDGの一部とphaB1Cnが連結した遺伝子領域を持つpK18msNSDG-Bを得た。その後、pEE32Fukui,T.ら,J.Bacteriol.1997,,179:4821を鋳型として、下記の配列13及び配列14のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってアエロモナスキャビエ由来のR体特異的エノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子phaJAcを増幅した。配列13:CATCTCCTGCAGGTTCGAAGAGGAGGACGCCGCATGAGCGCACAATCCCTGGAAGTAGGCCAGA配列番号17下線部はSbfI、ヌクレオチド14-19はCsp45I制限酵素サイト配列14:CGCCACCTGCAGGCTCTAGATTAAGGCAGCTTGACCACGGCTT配列番号18下線部はSbfI、ヌクレオチド15-20はXbaI制限酵素サイト得られた遺伝子断片をSbfIで切断し、イソプロパノール沈殿により精製した。またpTA2NSDG-AB実施例3に記述をSbfIで切断し、アルカリホスファターゼ処理により5’-脱リン酸化を行った後に、LigationHighによりphaJ断片と連結し、pTA2-NSDG-JABを得た。pTA2-NSDG-JABをBamHIで切断し、phaCNSDGの一部-phaJAc-phaACn-phaB1Cnを含む5.4kbpの断片をpK18mobsacBのBamHIサイトに連結することによりpK18msNSDG-JABとした。実施例11phaACn欠失及びphaJAc導入用ベクターの作製実施例10で得られたphaJAc断片をCsp45IとXbaIで切断し、イソプロパノール沈殿により精製した。この断片をCsp45IとXbaIで切断したpK18msNSDG-BとLigationHighにより連結することで、phaCNSDGの一部とphaJAc及びphaB1Cnが連結した遺伝子断片を持つpK18msNSDG-JBを得た。実施例12phaACn欠失及びbktBCn導入用ベクターの作製クプリアヴィダスネカトールH16株のゲノムDNAを鋳型に、下記の配列15及び配列16のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってbktBCn遺伝子領域を増幅した。配列15:TACATTCTAGAAAGGAGGCAAAGTCATGACGCGTGAAGTGGTAGTGGTA配列番号19下線部はXbaI制限酵素サイト配列16:GCTCAGGATCCACCCCTTCCTCAGATACGCTCGAAGATGGCGG配列番号20下線部はBamHI制限酵素サイトPCRはKODプラストーヨーボー社製を用い、98°Cで20秒、65°Cで15秒、68°Cで1分15秒の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。増幅した断片はDNA精製キットにて精製した。その後、XbaIとBamHIで切断し、イソプロパノール沈殿により精製した。またpK18NSDG-B実施例10をXbaIとBamHIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を施した。2つの断片をLigationHighにより連結し、phaCNSDGの一部-bktBCn-phaB1Cnを持つpK18msNSDG-bBを得た。実施例13phaACn欠失及びphaJAcbktBCn導入用ベクターの作製pK18msNSDG-JB実施例11をXbaIとHindIIIで切断し、phaJAc-phaB1Cnを含む遺伝子断片を単離した。また、pK18msNSDG-bB実施例12をXbaIとHindIIIで切断し、ベクター領域を含む遺伝子断片をアガロースゲルから切り出し、精製した。2つの断片をLigationHighにより連結し、phaCNSDGの一部-phaJAc-bktBCn-phaB1Cnを持つpK18msNSDG-JbBを得た。実施例14相同性組換え株の作製実施例13で作製した相同性組換え用プラスミドを用いて、実施例4と同様の手法によりクプリアヴィダスネカトール株を接合伝達により形質転換し、その後、目的とする組換えが生じたクローンをPCR法によって選抜した。すなわち、H16CAc株を宿主とし、pK18msC’BR実施例8、pK18AR実施例7、pK18msC’RΔP実施例5を用いてphaACn、phaB1Cn、phaACn-phaB1Cnを破壊したH16CAcΔA株、H16CAcΔB株、H16CAcΔAB株を作製した。また、NSDG株を宿主とし、pK18msNSDG-BR実施例9、pK18msAR実施例7、pK18msNSDG-RΔP実施例6を用いてphaACn、phaB1Cn、phaACn-phaB1Cnを破壊したNSDGΔA株、NSDGΔB株、NSDGΔAB株を作製した。またpK18msNSDG-bB実施例12を用いてphaACnをbktBCnに置換したMF01株、pK18msNSDG-JABを用いてphaCNSDGとphaACnの間にphaJAcを挿入したMF02株実施例10、pK18msNSDG-JBを用いてphaACnをphaJAcに置換したMF03株実施例11、pK18msNSDG-JbB実施例13を用いてphaACnをphaJAc-bktBCnに置換したMF04株を作製した図2参照。実施例15遺伝子発現用プラスミドの作製クプリアヴィダスネカトールH16株のゲノムDNAを鋳型にし、下記の配列17及び配列18のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってPHA顆粒結合タンパク質遺伝子phaPCnの上流領域0.5kbpの遺伝子領域PhaPプロモーター領域を増幅した。配列17:AAAGATCTAATATTGTTCTGTTCACGTCTTTGTTAGTTCC配列番号21下線部はBglII-SspI制限酵素サイト配列18:GAGGATCCCCGGGTACCTATGAATTCATATGTATATACCTCCCAGGCGTGTGGGTGGGTCAAG配列番号22下線部はBamHI制限酵素サイトPCRはKODプラスを用い、98°Cで20秒、65°Cで15秒、68°Cで30秒の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。増幅した断片はDNA精製キットにて精製し、その後T4キナーゼにより5’-末端をリン酸化し、HincII及びアルカリホスファターゼ処理を施したpUC118とLigationHighにより連結した。さらに作製したプラスミドをBglIIとBamHIで切断し、PhaPプロモーター領域のDNA断片を単離した。また、プラスミドpBAD24GenBankAccessionNo.X81837を制限酵素BamHIで切断してBADプロモーター領域を除去し、アルカリホスファターゼ処理を施した断片と上述のPhaPプロモーター領域をLigationHighにより連結した。得られたプラスミド制限酵素SspIで切断することphaPプロモーター領域、マルチクローニングサイト、rrnBターミネーター領域を含むDNA断片を単離した。また、多くのグラム陰性菌で自律複製することが知られている広宿主域ベクターpBBR1-MCS2GenBankAccessionNo.U23751を制限酵素SspIで切断し、複製起点等を含むDNA断片を単離して脱リン酸化処理を行った後に、上述のphaPプロモーター領域を含むDNA断片をLigationHighにより連結することで、発現用プラスミドpBBRPPを作製した。実施例16クプリアヴィダスネカトール由来R体特異的-エノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子phaJ1、phaJ2、phaJ3のクローニング既知のR体特異的-エノイル-CoAヒドラターゼとの相同性検索から、クプリアヴィダスネカトールにおける推定R体特異的-エノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子としてphaJ1配列番号2、phaJ2配列番号3、phaJ3を同定した。次にクプリアヴィダスネカトールのゲノムDNAを鋳型とし、下記の配列19及び配列20のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaJ1を増幅した。また同様に配列21、配列22のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaJ2を増幅した。さらに同様に配列23、配列24のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaJ3を増幅した。PCRはKODプラストーヨーボー社製を用い、98°Cで20秒、61°Cで15秒、68°Cで2分の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。配列19:TCCATATGCGTACCATCGCATCGCTG配列番号23下線部はNdeI制限酵素サイト配列20:CGCTCGAGTCACCCGTAGCGGCGCGTGA配列番号24下線部はXhoI制限酵素サイト配列21:CACATATGAAGACCTACGAGAACATC配列番号25下線部はNdeI制限酵素サイト配列22:CTCGAGTCAGGGAAAGCGCCGCAGGA配列番号26下線部はXhoI制限酵素サイト配列23:CACATATGCCAAGAATCTTCCGTTCT配列番号27下線部はNdeI制限酵素サイト配列24:ATCTCGAGTCAGAAGTAATAGCGGCTG配列番号28下線部はXhoI制限酵素サイト増幅した断片はNdeI及びXhoIで切断し、NdeI及びSalIで切断した発現ベクターpBBRPP実施例15とLigationHighにより連結することで、クプリアヴィダスネカトール由来phaJ1、phaJ2、phaJ3の発現ベクター、pBBR-phaJ1、pBBR-phaJ2、pBBR-phaJ3を得た。実施例17クプリアヴィダスネカトール由来phaJ発現株の作製上述のR-エノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子を含む発現ベクターをクプリアヴィダス用いて、クプリアヴィダスネカトールH16CAc株又はNSDGΔ株実施例14を接合伝達により形質転換した。まず、塩化カルシウム法によって、pBBR-phaJ1、pBBR-phaJ2、あるいはpBBR-phaJ3を大腸菌S17-1株に導入した。次に、この組換え大腸菌をLB培地1トリプトン、1塩化ナトリウム、0.5イーストエキス、pH7.23.0ml中で37°C終夜培養した。これと並行して、クプリアヴィダスネカトール株をNR培地1魚肉エキス、1ポリペプトン、0.2イーストエキス3.0ml中で30°C終夜培養した。その後、大腸菌の培養液0.2mlに対して、クプリアヴィダスネカトール株の培養液0.1mlを混合し、30°Cで6時間培養した。この菌体混合液を0.2mg/mlカナマイシンを添加したSimmonsCitrate寒天培地ディフコ社製に塗布し、30°Cで3日間培養した。組換え大腸菌のプラスミドがクプリアヴィダスネカトールに伝達され、保持される該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はSimmonsCitrate寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーはクプリアヴィダスネカトール形質転換体である。PCRによるベクターの保持を確認することでH16CAc/pBBR-phaJ1株、H16CAc/pBBR-phaJ2株、H16CAc/pBBR-phaJ3株、NSDGΔA/pBBR-phaJ1株、NSDGΔA/pBBR-phaJ2株、NSDGΔA/pBBR-phaJ3株をそれぞれ単離した。実施例18クプリアヴィダスネカトール組換え株による共重合ポリエステル合成NR培地前述で前培養したクプリアヴィダスネカトール組換え株を100mlのMB培地0.9リン酸水素二ナトリウム12水和物、0.15リン酸二水素カリウム、0.05塩化アンモニウム、1微量金属溶液に植菌し、坂口フラスコ中、30°Cで72時間振とう培養した。炭素源として1大豆油を用いた。発現ベクターpBBR-phaJ1、pBBR-phaJ2、あるいはpBBR-phaJ3を保持する組換え株においては、培地中に0.1mg/mlカナマイシンを添加した。培養終了後に遠心分離によって菌体を回収し、付着した油分を除くために70エタノールで洗浄したのち、蒸留水で洗浄した。得られた菌体は凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。乾燥菌体10~30mgに2mlの硫酸-メタノール混液15:85と2mlのクロロホルムを添加して密栓し、100°Cで140分間加熱することにより、菌体内ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。これに1mlの蒸留水を添加して激しく攪拌した。静置して二層に分離させた後、下層の有機層を取り出した。有機層0.5mlをキャピラリーガラスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所製GC-17A、キャピラリーカラムはGLサイエンス社製InertCap-1カラム長25m、カラム内径0.25mm、液膜厚0.4μmを用いた。温度条件は、初発温度100°Cから8°C/分の速度で昇温した。得られた結果を下記の表1及び2に示す。phaJAc遺伝子を染色体に導入した株はいずれも高い乾燥菌体重量、高いPHA蓄積率を維持しつつ、P3HB-co-3HHx中の3HHx分率が有意に向上していた。特にMF03株で合成されたP3HB-co-3HHx中の3HHx分率は9.2molに達しており、実用化に十分な柔軟性を備えていることが期待できる。また、クプリアヴィダスネカトール由来phaJを自律複製ベクターを用いて導入した場合では乾燥菌体重量やPHA蓄積率がやや減少する傾向が見られたものの、すべての宿主株においてphaJ1遺伝子又はphaJ2遺伝子の導入によってP3HB-co-3HHx中の3HHx分率が増加した。特に、NSDGΔA株を宿主としてphaJ1遺伝子又はphaJ2遺伝子を導入した株では3HHx分率は7.7~8.9molに達しており、実用化に十分な柔軟性を備えていることが期待できる。phaJ3遺伝子導入株では明らかな効果は見られなかった。実施例19phaJ1、phaJ2導入用ベクターの作製pBBR-phaJ1実施例16を鋳型に、配列25及び配列26のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaJ1断片を増幅した。また、pBBR-phaJ2実施例16を鋳型に、配列27及び配列28のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR法によってphaJ2断片を増幅した。配列25:TTGACACTAGTTCTAGAAGGAGGAGTATATACATATGCGTACCATCGCATCGC配列番号29下線部はXbaI制限酵素サイト配列26:GCCAAGCGGCCGCTTCGAAACTAGTTGCAGCTCGACTCACCCGTAG配列番号30下線部はSpeI制限酵素サイト配列27:GACCCACTAGTTCTAGAAGGAGGAATATACATATGAAGACCTACGAGAACAT配列番号31下線部はXbaI制限酵素サイト配列28:CAAGCGCGGCCGCTTCGAAACTAGTTCAGGGAAAGCGCCGCAGGAT配列番号32下線部はSpeI制限酵素サイトPCRはKODプラス東洋紡を用い、98°Cで20秒、60°Cで20秒、68°Cで50秒の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル行った。増幅した断片はDNA精製キットにて精製した。その後、T4キナーゼにより5’-末端をリン酸化し、HincII及びアルカリホスファターゼ処理を施したpUC118とLigationHighにより連結した。さらに作製したプラスミドをXbaIとSpeIで切断し、phaJ1及びphaJ2断片を含む遺伝子領域を単離した。また、pK18msNSDG-B実施例10をXbaIで切断後、脱リン酸処理を施し、上述のphaJ1断片、phaJ2断片をLigationHighによるライゲーションを行った。phaCNSDGとphaJ1、phaJ2の方向が同じものを選抜し、pK18msNSDG-J1B及びpK18msNSDG-J2Bとした。また同様に、pK18msNSDG-JB実施例11をXbaIで切断後、脱リン酸処理を施し、上述のphaJ1断片、phaJ2断片をLigationHighによるライゲーションを行った。phaCNSDGとphaJ1、phaJ2の方向が同じものを選抜し、pK18msNSDG-JAcJ1B及びpK18msNSDG-JAcJ2Bとした。実施例20相同性組換え株の作製上述の実施例で作製した相同性組換え用プラスミドを用いて、実施例4と同様の手法によりクプリアヴィダスネカトール株を接合伝達により形質転換し、その後、目的とする組換えが生じたクローンをPCR法によって選抜した。すなわち、NSDG株を宿主とし、pK18msNSDG-J1B実施例19を用いてphaAをphaJ1に置換したNSDGΔA-J1株、pK18msNSDG-JAcJ1B実施例19を用いてphaAをphaJAc-phaJ1に置換したMF03-J1株、pK18msNSDG-J2B実施例19を用いてphaAをphaJ2に置換したNSDGΔA-J2株を、pK18msNSDG-JAcJ2B実施例19を用いてphaAをphaJAc-phaJ2に置換したMF03-J2株を作製した。各株の遺伝子配置構造を図3に示す。実施例21クプリアヴィダスネカトール組換え株による共重合ポリエステル合成実施例20で作製したクプリアヴィダスネカトール組換え株による共重合ポリエステル合成を実施例18と同様の方法により行った。結果を表3に示す。NSDGΔA-J1株、NSDGΔA-J2株では、コントロールであるNSDGΔA株と比較してPHA生産量を低下することなく3HHx分率が3.2molから7.3~8.0molに向上した。この3HHx分率は、アエロモナスキャビエ由来のR-エノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子phaJAcを相同性組換えにより導入したMF03株実施例14での分率と比較すると、やや低かった。一方、phaJをphaJ1又はphaJ2とをタンデムに配置したMF03-J1株、MF03-J2株図3参照では、高いPHA生産量を維持しつつ3HHx分率が10.2~10.5molに改善された。実施例22クプリアヴィダスネカトール由来R体特異的エノイル-CoAヒドラターゼの機能解析実施例16において増幅し、NdeI及びXhoIで切断したphaJ1、phaJ2、phaJ3の各断片を、それぞれNdeI及びXhoIで切断した発現プラスミドpCOLDIIタカラバイオ社製に挿入した。得られたプラスミドをpCOLD-J1、pCOLD-J2、pCOLD-J3とした。これらの発現プラスミドは、アミノ末端側にヒスチジン6残基からなるタグ配列以下、Hisタグとするが付加された組換え型タンパク質が生産されるように構築されている。pCOLD-J1、pCOLD-J2、pCOLD-J3を用いて大腸菌BL21DE3株ノバジェン社製を形質転換した。得られたそれぞれの形質転換体を100mgのアンピシリンを含む100mLのLB培地で37°C、4時間培養し、イソプロピルチオガラクトピラノシドIPTGを最終濃度0.5mMとなるように添加して発現を誘導し、さらに15°Cで24時間、培養した。菌体を遠心分離によって回収した後、30mMイミダゾールと500mMNaClを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4で再懸濁し、超音波破砕、遠心分離によって可溶性タンパク画分を得た。この可溶性タンパク質画分を孔径0.22μmのフィルターでろ過した。次いで30mMイミダゾールと500mMNaClを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4であらかじめ平衡化したHisTrapFFcrudeカラム1mlGEヘスケア社製に供してHisタグを有するタンパク質を吸着させた。その後、イミダゾール濃度を30mMから500mMに直線的に増加させることにより吸着タンパク質を溶出させ、回収して精製酵素とした。クプリアヴィダスネカトール由来の3つの遺伝子phaJ1、phaJ2、phaJ3から発現したタンパク質を、以下では、それぞれPhaJ1、PhaJ2、PhaJ3とする。大腸菌で生産させたそれぞれの組換え型タンパク質の精製標品について、クロトニル-CoA炭素数4、2-ヘキセノイル-CoA炭素数6、2-オクテノイル-CoA炭素数8を基質としたエノイル-CoAヒドラターゼ活性測定を非特許文献4に記載の方法に従って行った。すなわち、基質を含む100mMトリス-塩酸緩衝液pH7.8に精製酵素を添加し総体積400μl、263nmにおける吸光度減少を分光光度計により測定した。その際、基質濃度を変化させて得た測定値をラインウェーバーバークプロットによって解析することで、ミカエリス定数Kmと最大速度Vmaxを算出した。結果を表4に示す。この結果から、PhaJ1、PhaJ2、PhaJ3ともに、基質鎖長が長いほど高い触媒効率を示すエノイル-CoAヒドラターゼであることを明らかにした。上記のエノイル-CoAヒドラターゼ活性測定では、二重結合への水付加における立体選択性については知見が得られない。そこで、PhaJ1、PhaJ2、PhaJ3による水和反応の立体特異性について以下のように検討した。PHAを蓄積したクプリアヴィダスネカトールの菌体からは、水不溶性のPHA顆粒画分を調製できるが、このPHA顆粒の表面にはPHA合成シンターゼが結合している。このPHAシンターゼはR-3-ヒドロキシアシル-CoAを特異的に重合し、CoA-SHを遊離させる。すなわち、エノイル-CoAヒドラターゼ活性測定の反応溶液にPHA顆粒画分と5,5’-ジチオビス2-ニトロ安息香酸DTNBを共存させると、エノイル-CoAヒドラターゼの特異性がR体特異的であれば、PHAシンターゼによる重合に伴って遊離したCoA-SHがDTNBと反応して412nmに特異的な吸収を有する黄色色素が生成する。逆にエノイル-CoAヒドラターゼがS体特異的であれば、黄色色素は生成しない。測定は非特許文献4に記載の方法に従って行った。すなわち、PHA顆粒画分はクプリアヴィダスネカトール野生株H16株を実施例18に記載の方法でフルクトースを炭素源とした100mlの培地により36時間培養した菌体から調製した。培養液から遠心分離によって集菌し、50mMトリス-塩酸緩衝液pH7.53mLに懸濁して超音波破砕した。破砕液を1,500xg、5分間の低速遠心分離で得られた上清について、さらに15,000xg、15分間の高速遠心分離を行い、その沈殿画分を50mMトリス-塩酸緩衝液pH7.53mLに懸濁してPHA顆粒画分とした。次に、0.2mMクロトニル-CoA、1mMDTNB、5μlPHA顆粒画分を含む100mMトリス-塩酸緩衝液pH7.8に精製酵素を添加し総体積400μl、412nmにおける吸光度増加を測定した。その結果、図4に示すように、PhaJ1、PhaJ2、PhaJ3を加えた場合では412nmの吸光度増加が観察された。この結果から、PhaJ1、PhaJ2、PhaJ3は全てR体特異的エノイル-CoAヒドラターゼであることが明らかとなった。"