"トランスジーンを構築するための方法であって、a連続したインサートの配列を受容可能な骨格を有するクローニングベクタープラスミドを用意する工程;bトランスジーンに包含される、少なくとも第一のインサート及び第二のインサートを用意する工程;及び、c単一の反応により、前記第一のインサート及び前記第二のインサートを前記骨格に移行させる工程を含む方法。トランスジーンを作成するための方法であって、a第一、及び第二のドッキングポイントを有するクローニングベクタープラスミドを用意する工程;bトランスジーンに包含される、第一のヌクレオチド配列を第一のシャトルベクターに導入する工程;cトランスジーンに包含される、第二のヌクレオチド配列を第二のシャトルベクターに導入する工程;及び、d前記第一のヌクレオチド配列と前記第二のヌクレオチド配列を、同時に、前記シャトルベクターから前記クローニングベクタープラスミドの、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程を含む方法。トランスジーンを作成するための方法であって、a第一、及び第二のドッキングポイントを有するクローニングベクタープラスミドを用意する工程;bトランスジーンに包含される、プロモーターヌクレオチド配列をプロモーターシャトルベクターに導入する工程;cトランスジーンに包含される、発現ヌクレオチド配列を発現シャトルベクターに導入する工程;dトランスジーンに包含される、調節ヌクレオチド配列を調節シャトルベクターに導入する工程;及び、e前記プロモーター、発現、及び調節ヌクレオチド配列を、同時に、前記プロモーター、発現、調節シャトルベクターから前記クローニングベクタープラスミドの、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程を含む方法。トランスジーンのアレイを同時に合成するための方法であって、a第一、及び第二のドッキングポイントを有する一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程;bトランスジーンに包含される、少なくとも一のプロモーターヌクレオチド配列を対応するプロモーターシャトルベクターに導入する工程;cトランスジーンに包含される、少なくとも一の発現ヌクレオチド配列を対応する発現シャトルベクターに導入する工程;dトランスジーンに包含される、少なくとも一の調節ヌクレオチド配列を対応する調節シャトルベクターに導入する工程;e前記プロモーター、発現、及び調節ヌクレオチド配列を、同時に、前記プロモーター、発現、及び調節シャトルベクターから、前記クローニングプラスミドの前記第一及び第二のドッキングポイントの間に移行させる工程;及び、f一のプロモーターモジュール、一の発現モジュール、及び一の調節モジュールのうち少なくとも二つが、それぞれの一次クローニングベクター分子に移行する方法。トランスジーン、又は他の複雑なDNAコンストラクトを合成するためのモジュラークローニングベクターを作成するための方法であって、a骨格を含むクローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は第一、及び第二のドッキングポイントを含み、それぞれのドッキングポイントは骨格内に固定されていて、エンドヌクレアーゼに対する少なくとも一の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位を含む工程;b前記第一のドッキングポイントを、前記第一のドッキングポイントの、少なくとも一の非可変性希少制限部位に対応する第一のエンドヌクレアーゼ酵素で切断し、3’端を有する切断された第一のドッキングポイントを生成する工程;c前記第二のドッキングポイントを、前記第二のドッキングポイントの、少なくとも一の非可変性希少制限部位に対応する第二のエンドヌクレアーゼ酵素で切断し、5’端を有する切断された第一のドッキングポイントを生成する工程;d第一、及び第二のインサートを用意する工程であって、それぞれのインサートは5’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び3’末端を有し、前記第一のインサートの5’末端は切断された第一のドッキングポイントの3’末端と適合可能であって、前記第二のインサートの3’末端は、切断された第二のドッキングポイントの5’末端と適合可能であって、前記第一のインサートの3’末端と前記第二のインサートの5’は適合可能であって、第三のエンドヌクレアーゼ酵素に対する第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位を形成する工程;及び、eインサートと切断したクローニングベクタープラスミドを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第一、及び第二のインサートの、骨格内の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での自己配向、前記第一、及び第二のドッキングポイントの再形成、及び、クローニングベクタープラスミド分子を形成する工程を含む方法。修飾したクローニングベクタープラスミド分子を提供する請求項5に記載の方法であって、更に、f次いで、前記モジュラークローニングベクタープラスミドを、前記第一、及び第三のエンドヌクレアーゼ酵素により、前記第一のドッキングポイントと前記第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位とで切断することにより、前記第一のインサートを除去し、切断された第一のドッキングポイントにおける3’末端と、切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位における5’末端を生成する工程;g5’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び3’末端を有する第三のインサートを用意する工程であって、前記第三のインサートの5’末端は切断された第一のドッキングポイントの3’末端と適合可能であって、前記第三のインサートの3’末端は切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位の5’末端と適合可能である工程;及び、h前記第三のインサート、及び切断されたクローニングベクタープラスミド分子を適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第一のドッキングポイントと前記第三のエンドヌクレアーゼ部位との間における前記第三のインサートの自己配向、及び、前記第一のドッキングポイントと前記第三のエンドヌクレアーゼサイトの再形成を行う工程を含む方法。修飾したモジュラークローニングベクタープラスミドを提供する請求項5に記載の方法であって、更に、i次いで、前記モジュラークローニングベクタープラスミドを、前記第二、及び第三のエンドヌクレアーゼ酵素により、前記第二のドッキングポイントと前記第三の非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位とで切断することにより、前記第二のインサートを除去し、切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位における3’末端と、切断された第二のドッキングポイントにおける5’末端を生成する工程;j5’末端、目的とするヌクレオチド配列、及び3’末端を有する第四のインサートを用意する工程であって、前記第四のインサートの5’末端は切断された第三のエンドヌクレアーゼ部位と適合可能であって、前記第四のインサートの3’末端は切断された第二のドッキングポイントの5’末端と適合可能である工程;及びk前記第四のインサート、及び切断されたクローニングベクタープラスミド分子を適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第三のエンドヌクレアーゼ部位と前記第二のドッキングポイントとの間における前記第四のインサートの自己配向、及び前記第三のエンドヌクレアーゼ部位、及び前記第二のドッキングポイントの再形成を行う工程を含む方法。インサートがdenovo合成、組換え、及びPCRターミネーター突出クローニングからなる群から選ばれる方法により作成される請求項5に記載の方法。トランスジーン、又はその他の複雑なDNAコンストラクトを合成するための方法であって、a骨格を含む一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は少なくとも第一のドッキングポイント及び第二のドッキングポイントを有し、それぞれのドッキングポイントは骨格内に固定され、非可変性希少制限酵素に対する少なくとも一の希少制限部位を有する工程;b前記第一のドッキングポイントを前記第一のドッキングポイントの一の希少制限部位に対応する第一の非可変性希少制限酵素で切断し、3’末端を有する切断された骨格を生成する工程;c前記第二のドッキングポイントを前記第二のドッキングポイントの一の希少制限部位に対応する第二の非可変性希少制限酵素で切断し、5’末端を有する切断された骨格を生成する工程;d目的とするプロモーター配列、前記第一のドッキングポイントの3’末端に適合可能な5’末端、及び3’末端を有するプロモーターインサートを用意する工程;e目的とする発現配列、プロモーターインサートの3’末端と適合可能で、第三の非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する5’末端、及び3’末端を有する発現インサートを用意する工程;f目的とする調節配列、発現インサートの3’末端と適合可能で、第四の非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する5’末端、及び、工程cで切断された、切断された第二のドッキングポイントの5’末端と適合可能な3’末端を有する調節インサートを用意する工程;g前記プロモーター、発現、及び調節インサートと切断されたクローニングプラスミドとを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーションと、前記第一、及び第二のドッキングポイントの間におけるプロモーター、発現、及び調節インサートの自己配向と、連鎖配置と、を引き起こし、第一、及び第二のドッキングポイントを再形成し、クローニングベクタープラスミド分子を形成する工程を含む方法。修飾したモジュラー一次クローニングベクタープラスミドを提供する請求項9に記載の方法であって、更に、hモジュラー一次クローニングベクタープラスミドを一対の希少制限酵素を用いて、プロモーター、発現、及び調節インサートの少なくとも一が有する一対の希少制限部位で切断し、3’末端と5’末端を有する切断されたベクタープラスミドを生成する工程;iプロモーターインサート、発現インサート、調節インサートから選択される一の第五のインサートを用意する工程であって、前記第五のインサートは切断されたベクタープラスミドの3’末端に適合可能な5’末端、及び切断されたベクタープラスミドの5’末端に適合可能な3’末端を有する工程;及びj前記第五のインサートと切断されたベクタープラスミドとを適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーションと、同じ配列で、前記モジュラー一次クローニングベクタープラスミドでの前記第五のインサートの自己配向と、及び一対の制限部位の再形成とを行う工程を含む方法。更に、工程h、i、及びjをプロモーターインサート、発現インサート、及び調節インサートから選ばれる、一又はそれ以上の追加のインサートを用いて、繰り返す工程を含む、請求項10に記載の方法。トランスジーン、又はその他の複雑なDNAコンストラクトのアレイを同時に合成する方法であって、a5’末端、目的のヌクレオチド配列、及び3’末端を含むインサート挿入することができる骨格を含む少なくとも一の一次クローニングベクタープラスミドを用意する工程であって、前記骨格は、連続した配置のプロモーター、発現、及び調節インサートを受容可能であって、第一、及び第二のドッキングポイントを含み、各ドッキングポイントは骨格内に固定されており、非可変性希少制限酵素に対する少なくとも一の制限部位を有している工程;b前記第一のドッキングポイントの制限部位のうちの一つに対応する希少制限酵素で前記第一のドッキングポイントを切断する工程;c前記第二のドッキングポイントの制限部位のうちの一つに対応する希少制限酵素で前記第二のドッキングポイントを切断する工程;dプロモーターヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一のプロモーターインサートを用意する工程であって、少なくとも一のプロモーターインサートの5’末端は、工程bで切断された、前記第一のドッキングポイントの3’末端と適合可能である工程;e発現ヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一の発現インサートを用意する工程であって、少なくとも一の発現インサートの5’末端は、少なくとも一のプロモーターインサートの3’末端と適合可能であり、第三の非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成する工程;f調節ヌクレオチド配列が挿入されている、少なくとも一の調節インサートを用意する工程であって、少なくとも一の調節インサートの5’末端は、少なくとも一の発現インサートの3’末端と適合可能であり、第四の非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成し、少なくとも一の調節インサートの3’末端は、工程cで切断された、前記第二のドッキングポイントの5’末端と適合可能である工程;及びgその後、少なくとも一の前記プロモーター、発現、及び調節インサートとの少なくとも異なる二種と、少なくとも一のそれぞれ残るインサートと、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する工程を含む方法。工程gにおいて、少なくとも二つの前記プロモーター、発現、及び調節インサートの少なくとも異なる二種と、少なくとも一のそれぞれ残るインサートと、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの、自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する請求項12に記載の方法。工程gにおいて、前記プロモーター、発現、及び調節インサートのそれぞれの少なくとも異なる二種と、切断されたクローニングベクタープラスミドとを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記骨格の前記第一、及び第二のドッキングポイントの間での、前記プロモーター、発現、調節インサートそれぞれの、自己配向、及び連続配置を行い、これにより、その骨格中に、異なるプロモーター、発現、調節インサートの組み合わせを有するプラスミドのアレイを作成する請求項12に記載の方法。修飾されたモジュラー一次クローニングベクタープラスミドを提供する請求項12、13、又は14に記載の方法であって、更に、hハイスループットスクリーニングにより工程gの生成物を検査する工程;i一次クローニングベクタープラスミドである、工程gの特定の生成物を単離する工程;j工程iの一次クローニングベクタープラスミドの骨格を、前記プロモーター、発現、調節インサートの一つの5’端と3’端において、これに対応する一対の希少制限酵素により切断する工程;k第六のインサートを用意する工程であって、前記第六のインサートの5’末端は工程jで切断された骨格の3’末端と適合可能であって、前記第六のインサートの3’末端は工程jで切断された骨格の5’末端と適合可能である工程;及び、lその後、前記第六のインサートと工程jで切断された骨格とを、適切な反応混合液に投入し、同時に、ライゲーション、前記第六のインサートの前記骨格への自己配向を行う工程を含む方法。前記骨格において、連続的に一つのインサートをもう一つのインサートに置き換えるため、更に、任意の数のインサートについて、工程h、i、j、k、及びlを繰り返し行う工程を含む請求項13に記載の方法。インサートがdenovo合成、組換え、PCRターミネーター突出クローニング技術、及び制限エンドヌクレアーゼマッピングからなる群から選ばれる方法により作成される請求項12に記載の方法。請求項5、9、又は12のいずれかに記載の方法であって、前記骨格が更に、前記第一のドッキングポイントの5’末端の上流に位置する順方向のユニークなHE部位、及び前記第二のドッキングポイントの3’末端の下流に位置する逆方向のユニークなHE部位を有し、前記方法は、更に、m前記骨格をユニークなHE制限酵素を用いて、それぞれのユニークなHE部位で切断する工程;nインサートを含む切断片を精製する工程;及び、o前記切断片を目的のゲノム宿主に挿入する工程を含む方法。従って、本発明は、クローニングベクタープラスミドを使用することによって、DNAコンストラクト又はトランスジーンを迅速に組み立てる方法を提供する。本発明はまた、プロモーター、発現、及び3’調節ヌクレオチド配列の各々一つなど、インサート又はモジュール双方としても知られる複数のDNA断片を、各インサートを逐次的に導入しなければならないのではなく、単一工程でクローニングベクタープラスミドに組み込む方法も提供する。このような方法を、本明細書ではダイナミックなベクター構築と称する。一つの実施態様において、本発明は、インサートの連鎖配列を受容することができる骨格をクローニングベクタープラスミドに備えさせ、トランスジーンに含めるべき少なくとも第一インサート及び第二インサートを用意して、単一反応にて第一インサート及び第二インサートの双方を骨格へ移行させる工程を含む、トランスジーンを構築するための方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、第一及び第二のドッキングポイントを含むクローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべき第一ヌクレオチド配列を第一シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき第二ヌクレオチド配列を第二シャトルベクターへ導入して、第一ヌクレオチド配列及び第二ヌクレオチド配列をシャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含む、トランスジーンを作製するための方法を提供する。本発明はまた、第一及び第二のドッキングポイントを含むクローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべきプロモーターヌクレオチド配列をプロモーターシャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき発現ヌクレオチド配列を発現シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき調節ヌクレオチド配列を調節シャトルベクターへ導入して、プロモーター、発現及び調節ヌクレオチド配列を、プロモーター、発現及び調節シャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含む、トランスジーンを作製するための方法も提供する。他の実施態様において、本発明は、第一及び第二のドッキングポイントを含む一次クローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべき少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列を対応するプロモーターシャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき少なくとも1つの発現ヌクレオチド配列を対応する発現シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき少なくとも1つの調節ヌクレオチド配列を対応する調節シャトルベクターへ導入して、プロモーター、発現及び調節ヌクレオチド配列をプロモーター、発現及び調節シャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含み、1つのプロモーターモジュール、1つの発現モジュール、及び1つの調節モジュールのうち、少なくとも2つの組合せが、2つの別々の一次クローニングベクター分子へ移行されるものである、トランスジーンのアレイを同時に合成するための方法を提供する。さらに別の実施態様において、本発明は、トランスジーン又は他の複雑なDNAコンストラクトの合成用のモジュラークローニングベクタープラスミドを作製するための方法であって、骨格を含むクローニングベクタープラスミドを用意し、当該骨格は第一及び第二のドッキングポイントを含んでおり、各ドッキングポイントは骨格内に固定され且つエンドヌクレアーゼ酵素に対する少なくとも1つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位を含んでおり;第一のドッキングポイントを、第一のドッキングポイントの少なくとも1つの非可変性希少制限部位に対応する第一エンドヌクレアーゼ酵素で切断して、3’端を備える切断された第一のドッキングポイントを生成し;第二のドッキングポイントを、第二のドッキングポイントの少なくとも1つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位に対応する第二ヌクレアーゼ酵素で切断して、5’端を備える切断された第二のドッキングポイントを生成し;少なくとも第一及び第二インサートを用意し、各インサートは5’端、目的とするヌクレオチド配列及び3’端を含んでおり、第一インサートの5’端は切断された第一のドッキングポイントの3’端と適合可能であり、第二インサートの3’端は切断された第二のドッキングポイントの5’端と適合可能であって、第一インサートの3’端は第二インサートの5’端と適合可能で第三エンドヌクレアーゼ酵素に対する第三非可変希少エンドヌクレアーゼ部位を形成して;インサート及び切断されたクローニングベクタープラスミドを適切な反応混合物へ入れて骨格内の第一と第二のドッキングポイントの間で第一及び第二インサートの同時ライゲーション及び自己配向を引き起こし、第一及び第二のドッキングポイントを再形成して、モジュラークローニングベクタープラスミドを形成する工程を含む方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、骨格を含む一次クローニングベクタープラスミドを用意し、当該骨格は少なくとも第一のドッキングポイント及び第二のドッキングポイントを含んでおり、各ドッキングポイントは骨格内に固定され且つ非可変性希少制限酵素に対する少なくとも1つの希少制限部位を含んでおり;第一のドッキングポイントを第一のドッキングポイントの希少制限部位の一つに対応する第一非可変性希少制限酵素で切断して、3’端を備える切断された骨格を生成し;第二のドッキングポイントを第二のドッキングポイントの制限部位の一つに対応する第二非可変性希少制限酵素で切断して、5’端を備える切断された骨格を生成し、目的とするプロモーター配列、第一のドッキングポイントの3’端に適合可能な5’端、及び3’端が挿入されているプロモーターインサートを用意し;目的とする発現配列、プロモーターインサートの3’端に適合して第三非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する5’末端、及び3’末端を含む発現インサートを用意し;目的とする調節配列、発現インサートの3’に適合して第四非可変性希少制限酵素に対する希少制限部位を形成する5’端、及び工程cで切断された、切断された第二のドッキングポイントの5’端に適合可能な3’端を含む調節インサートを用意して;プロモーター、発現及び調節インサート、並びに切断されたクローニングベクタープラスミドを適切な反応混合物へ入れて第一と第二のドッキングポイントの間でプロモーター、発現及び調節インサートの同時ライゲーション、自己配向及び連鎖配置を引き起こし、第一及び第二のドッキングポイントを再形成し、モジュラー一次クローニングベクタープラスミドを形成する工程を含む、トランスジーン又は他の複雑なDNAコンストラクトを合成するための方法を提供する。さらに別の実施態様において、本発明は、5’端、目的とするヌクレオチド配列及び3’端を有するインサートを挿入することができる骨格を含む少なくとも1つの一次クローニングベクタープラスミドを用意し、当該骨格はプロモーター、発現、及び調節インサートの連鎖配列を受容して作動可能となり、且つ、少なくとも第一及び第二のドッキングポイントを含んでおり、各ドッキングポイントは骨格内に固定され且つ非可変性希少制限酵素に対する少なくとも1つの制限部位を含んでおり;第一のドッキングポイントを第一のドッキングポイントの制限部位の一つに対応する第一非可変性希少制限酵素で切断し;第二のドッキングポイントを第二のドッキングポイントの制限部位の一つに対応する第二非可変性希少制限酵素で切断し;プロモーターヌクレオチド配列が挿入されている少なくとも1つのプロモーターインサートを用意し、その少なくとも1つのプロモーターインサートの5’端は工程bで切断された第一のドッキングポイントの3’端に適合可能であり;発現ヌクレオチド配列が挿入されている少なくとも1つの発現インサートを用意し、その少なくとも1つの発現インサートの5’端は少なくとも1つのプロモーターインサートの3’端に適合して、第三非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成し;調節ヌクレオチド配列が挿入されている少なくとも1つの調節インサートを用意し、その少なくとも1つの調節インサートの5’端は前記少なくとも1つの発現インサートの3’端に適合して第四非可変性希少制限酵素に対する制限部位を形成するものであり、前記少なくとも1つの調節インサートの3’端は工程cで切断された第二のドッキングポイントの5’端に適合可能であり;その後、プロモーター、発現及び調節インサートうちの1つの少なくとも2つの異なる種と、残るインサートの各々の少なくとも1つと、切断されたクローニングベクタープラスミドとを適切な反応混合物へ入れて、骨格内の第一と第二のドッキングポイントの間でプロモーター、発現及び調節インサートの各々一つの同時ライゲーション、自己配向及び連鎖配置を引き起こして、それらの骨格内でプロモーター、発現及び調節インサートの異なる組合せを有するプラスミドのアレイを創出する工程を含む、トランスジーン又は他の複雑なDNAコンストラクトのアレイを同時に合成するための方法を提供する。本発明の特徴及び利点のさらなる理解は、以下の図面及び説明に鑑みてさらに完全に認められるであろう。本明細書で使用する場合、クロマチン修飾ドメインCMDの用語は、クロマチン構造の維持及び/又は改変と関係している種々のタンパク質と相互作用するヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用する場合、クローニングの用語は、DNA分子をプラスミドへライゲーションして、それを宿主の増殖の際の増幅のために適切な宿主細胞に移行させるプロセスを指す。本明細書で使用する場合、クローニングベクター及びクローニングベクタープラスミドの用語は、複製の起点、抗生物質抵抗性遺伝子などのプラスミドを内包する宿主細胞のポジティブセレクションをするための手段;及びマルチクローニングサイトを最低限含んでいる環状DNA分子を指し、互換的に使用される。本明細書で使用する場合、エンドヌクレアーゼ部位に関して共通のの用語は、ゲノム内に比較的高頻度に現れる何れのエンドヌクレアーゼ部位も指すものである。本明細書で使用する場合、適合可能なの表現は、同じ制限酵素で切断されたか又は他の何らかの方法によって創出された、他の何れかの相補性末端と水素結合を形成することができるDNAの鎖の、5’又は3’の何れかの末端又は端部をいう。制限酵素に対する特異的認識部位を含むDNAは何れも、同じ配列を含む他の何れのDNAと同様に切断されるので、それら切断された端部は相補的になり、よって適合可能となるであろう。従って、同じ制限酵素で切断された何れのDNA分子の端部も、ジグソーパズルの隣接するピースが嵌合するように、互いに嵌合し、酵素的につなぎ合わせることができる。適合可能な端部は、組み合わされた場合に特定の制限酵素に対する認識部位を形成することになる。本明細書で使用する場合、denovo合成の用語は、所望のDNA分子全体の部分配列を表す相補性一本鎖DNA分子の適合可能な突出を連結させることによって、如何なる長さのものでも二本鎖DNA分子を合成するプロセスを指す。本明細書で使用する場合、DNAコンストラクトの用語は、クローニングベクタープラスミド内での継続的なクローニング工程によって合成され、invitroの培養細胞、又はinvivoのトランスジェニックマウスなどの何らかの適切な宿主における遺伝子発現に向けて一般に使用されるDNA分子を指す。このようなマウスを作製するのに使用されるトランスジーンは、特にトランスジーンが設計及び合成される期間にあっては、DNAコンストラクトと称することもできる。本明細書で使用する場合、DNA断片の用語は、タンパク質をコードする配列、レポーター遺伝子、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、ポリA尾部、マルチクローニングサイト、核局在化シグナル、若しくはmRNA安定化シグナル、又は他の何らかの天然若しくは合成のDNA分子、又はその何れか一部分を含むDNAの単離された分子をも指すものであるが、これらに限定されることはない。あるいは、DNA断片は、invitroで生産された完全に合成起源のものであってもよい。さらに、DNA断片は、単離された天然及び/又は合成断片の何れの組合せをも含みうる。本明細書で使用する場合、ドッキングプラスミドの用語は、DNA断片をDNAコンストラクトへ組み立てるために本発明において使用される、特化されたクローニングベクタープラスミドを指す。本明細書で使用する場合、エンドヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ酵素の用語は、DNA分子においてコードされた認識部位に結合してそのDNA分子をその配列内またはその配列近傍の正確な位置で切断する触媒分子の分類の1種または複数種のメンバーを指す。本明細書で使用する場合、エンドヌクレアーゼ認識部位、認識部位、同族配列又は同族配列複数の用語は、DNA分子又は遺伝子に結合して切断する制限酵素に必要なヌクレオチドの最低限の配列を指す。本明細書で使用する場合、エンハンサー領域の用語は、標的遺伝子の発現には必要ないが、適切な条件下に遺伝子発現のレベルを増加させるようなヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用する場合、遺伝子発現宿主選択遺伝子GEH-Sの用語は、光学センサ、PCR増幅、生化学的分析により、若しくは細胞/生物生存分析適切な抗生物質又は化学物質で処理した場合の、細胞又は生物に対する抵抗性又は毒性により選択、追跡、又は検出されうる形質を、宿主生物に与えることのできる遺伝子エレメントを指す。本明細書で使用する場合、遺伝子プロモーター又はプロモーターの用語は、遺伝子の発現に必要なヌクレオチド配列、又は全長プロモーターの何れか一部分を指す。本明細書で使用する場合、インサート及びモジュールの用語は、原則的にほぼ同義であり、これらの区別をするとすれば、インサートはベクターへ挿入され、それがひとたび挿入されれば、それからはより一般的にモジュールと称されることのみである。モジュールはその後、ベクターから除去することができる。また、インサートの用語は、モジュラーアクセプタベクターへのインサートとして使用される、単離されたモジュールに対して一般的に使用される。本明細書で使用する場合、イントロンの用語は、2つのタンパク質コーディング領域すなわちエクソンの間に認められる、哺乳類細胞遺伝子内の非タンパク質コーディング領域のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用する場合、局在化シグナルLOCの用語は、目的とするタンパク質の細胞内局在に対するシグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用する場合、マルチクローニングサイトMCSの用語は、クローニングベクタープラスミドへのDNA断片のクローニングを目的とした、少なくとも1つのユニークなエンドヌクレアーゼ部位、及び、さらに典型的には、ユニークなエンドヌクレアーゼ部位の集団を含むヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用する場合、mRNA安定化エレメントの用語は、いくつかのmRNAを分解から保護すると考えられる結合タンパク質によって認識されるDNAの配列のことである。本明細書で使用する場合、複製の起点ORIの用語は、宿主細胞内でのプラスミドの複製又は複写を指向するヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用する場合、PCRターミネーター突出クローニング技術の表現は、相補性DNA突出とのジャンクション部位として働くことのできる、保護された5’突出ヌクレオチドを備えた一本鎖DNAプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用して、遺伝子モジュールを増幅するプロセスを指す。本明細書で使用する場合、ポリA尾部の用語は、メッセンジャーRNAmRNA分子の端部で一般的に見出されるアデニンAヌクレオチドの配列を指す。ポリA尾部シグナルは、目的とする遺伝子の発現を促進するために、DNAコンストラクト又はトランスジーンの3’端に組み込まれる。本明細書で使用する場合、プライマーサイトの用語は、DNA配列決定、PCR増幅、及び/又はRNA転写を開始することを目的として、その上に一本鎖DNAオリゴヌクレオチドがアニーリングすることのできるDNA鋳型として働くヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用する場合、pUC19の用語は、当業者に良く知られており、受入番号L09137としてNCBIGenbankデータベースに見られるプラスミドクローニングベクターを指す。本明細書で使用する場合、ランダムヌクレオチド配列の用語は、同じ分子の成分として特定される他のエレメントをコードする配列を複写しないヌクレオチド配列の組合せを示している。ランダム配列で必要とされるヌクレオチドの数は、ランダム配列に隣接するエンドヌクレアーゼ酵素の要求性に依存する。殆どのエンドヌクレアーゼは、DNA結合を安定化するため、最低でも2~4のさらなるランダム配列を必要とする。ランダム配列の数は、コドンを作り上げているヌクレオチドの数に対応して、3の倍数となることが好ましい。ランダム配列の好ましい最小数は従って6であるが、もっと少ないか又はもっと多くのヌクレオチドを使用してもよい。本明細書で使用する場合、エンドヌクレアーゼ部位に関して希少の用語は、ゲノム内で比較的低頻度でしか現れないエンドヌクレアーゼ部位を指す。本明細書で使用する場合、組換えアームの用語は、トランスジェニックDNAとゲノムDNAとの間の相同組換えを促進するヌクレオチド配列を指す。組換えの成功には、相同組換によって宿主ゲノムに組み込まれる予定のトランスジェニックDNAの領域に隣接する、左組換えアームLRAと右組換えアームRRAの存在が必要である。本明細書で使用する場合、組換えの用語は、リコンビナーゼ酵素による作用を受けることができるDNA配列と併せてランダム又は部位選択的リコンビナーゼ酵素を使用し、ある1つのDNA分子から別異のDNA分子に遺伝物質の一部を転位させるプロセスを指す。本明細書で使用する場合、レポーター遺伝子の用語は、目的とする特定のプロモーターの活性をモニターするのに有用なタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用する場合、シャトルベクターの用語は、DNA断片の端部を修飾することになる中間分子を作製するために本発明で使用される、特化したクローニングベクタープラスミドを指す。本明細書で使用する場合、タグ配列TAGの用語は、それが検出されること、又は場合によっては、何らかの内在性の対応物から識別されることを可能とするユニークなタンパク質領域をコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用する場合、非翻訳領域UTRの用語は、mRNA分子の非タンパク質コーディング領域を包囲するヌクレオチド配列を指す。これらの非翻訳領域は、mRNA分子の5’端5’UTR又は3’端3’UTRに存在しうる。本発明は、モジュールを含む新しく製造されたトランスジーンを取り上げ、選択的にモジュールの1以上を除去してそれを異なるインサートと置換する方法を提供する。このプロセスを本明細書では第二パス及び重複スレッディングと称する。本発明はさらに、単一工程で複数の異なるプロモーター、発現及び調節インサートをクローニングベクタープラスミドへ組み込むことによって、各々が異なるプロモーター、発現及び調節インサートを有している、異なるトランスジーンのアレイを創出するための方法を提供する。本発明はまた、組み合わせられたプロモーター、発現及び調節インサートが新しく導入されたクローニングベクタープラスミドを用意し、骨格ベクターとして組合せ全体を取り出して、単一のクローニングベクタープラスミドへ複数の骨格ベクターを挿入する工程を含む方法も提供する。本発明はまた、その中にドッキングポイントを有する骨格を備えさせることによって、トランスジーン又は他の複雑なDNAコンストラクトの合成用のモジュラークローニングベクタープラスミドを創出する方法も提供する。各ドッキングポイントは、好ましくは少なくとも1つの固定された非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位、より好ましくは2つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団、及び最も好ましくは3つの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団がある領域を表す。各ドッキングポイントの特定の制限部位は、その同族エンドヌクレアーゼ酵素によって切断される。これによって、プロモーター、発現又は調節ヌクレオチド配列などの、選択されたヌクレオチド配列を含む、予め構築されたインサートの1つの相補性5’端又は3’端と適合可能な、所望の5’又は3’端のいずれかが創出されることになる。それぞれ、切断された目的とするドッキングポイントと適合可能な5’端及び3’端を有する少なくとも2つのインサートを、切断されたクローニングベクタープラスミドと共に適切な反応混合物に添加することができ、適切な熱力学的環境とすれば、インサートを同時に、すなわち単一工程にてクローニングベクタープラスミドへ組み込ませることができる。この一回の添加及びライゲーション反応の間にドッキングポイントが再形成されそのドッキングポイントにおいてクローニングベクタープラスミドはモジュラーとなり、2つのモジュール間の結合は適切な制限酵素で再度切断することができる。次いでそのモジュールは、後から除去することができ、新しいモジュールをその場所に入れることができる。本発明の一つの実施態様は、クローニングベクタープラスミドにインサートの連鎖配列を受容することができる骨格を備えさせ、トランスジーンに含めるべき少なくとも第一インサート及び第二インサートを用意し、単一反応にて第一インサート及び第二インサートの双方を骨格に移行させる工程を含む、トランスジーンを構築するための方法に関する。より好ましくは、インサートは3つのインサート、具体的には少なくとも1つのプロモーター、発現、及び調節モジュールからなる。本発明の別の実施態様は、第一及び第二のドッキングポイントを含むクローニングベクタープラスミドを用意し、トランスジーンに含めるべきプロモーターヌクレオチド配列をプロモーターシャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき発現ヌクレオチド配列を発現シャトルベクターへ導入し、トランスジーンに含めるべき調節ヌクレオチド配列を調節シャトルベクターへ導入して、プロモーター、発現及び調節ヌクレオチド配列をプロモーター、発現及び調節シャトルベクターからクローニングベクタープラスミドへ、第一と第二のドッキングポイントの間に同時に移行させる工程を含む、トランスジーンを作製するための方法である。ドッキングポイントの各々の5’及び3’端の双方、並びにインサートの各々はすべて、別のドッキングポイント又はインサートの対応する端部に適合可能であることが好ましい。例えば、もしも第一のドッキングポイントがSgrAIなどの非可変性希少制限酵素に対する制限部位を含んでおり、且つそのドッキングポイントがその後切断されるのであれば、切断された第一のドッキングポイントの3’端で挿入されることが意図された第一インサートは適合可能な5’端を含むことになり、インサートが第一のドッキングポイントと組み合わせられるとSgrAIに対する制限部位が創出されることになろう。プラスミド内の第二のドッキングポイントは、例えば、SwaIなどの非可変性制限酵素に対する制限部位を有しうる。何れの第二インサートもその3’端にて適合可能なヌクレオチド配列を有し、切断された第二のドッキングポイントの切断された5’端と組み合わせられてSwalに対する制限部位を創出するであろう。さらに、第一インサートの3’端及び第二インサートの5’端は、モジュラークローニングベクタープラスミドへ同時に挿入して、さらにその後同じドッキングポイントで除去もするために、PacI又はSalIなどの第三非可変希少制限酵素に対する第三制限部位を創出する適合可能な端部を含まなければならない。本発明のモジュラー構造をコードする連鎖エレメントには、具体的には、3つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位、5’オリゴヌクレオチドプライマーサイト、順方向のユニークなHE部位、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、プロモーターモジュールの5’部分を規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、プロモーター/イントロンモジュールに対して3’側となる部位と発現モジュールに対して5’側となる部位との間の共有ジャンクションを規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、発現モジュールに対して3’側となる部位と3’調節モジュールに対して5’側となる部位とのジャンクションを規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、3’調節モジュールに対して3’側となる部位を規定する非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、5’オリゴヌクレオチドプライマーサイトの3’位に配置されたものと同じHE部位である逆方向のユニークなHE部位、逆方向の3’オリゴヌクレオチドプライマーサイト、及び3’挿入部位を規定する4つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位が含まれる。本発明のモジュラー構造をコードする他の連鎖エレメントには、具体的には、5’挿入部位を規定する2つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位、オリゴヌクレオチドプライマーサイト、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなHE部位、一対のユニークなHE部位の下流においてシャトルベクターモジュールのクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通の制限部位、非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、非可変性希少制限部位の固定された集団、順方向のユニークなHE部位、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、オリゴヌクレオチドプライマーサイト、一対の互いに反対方向のユニークなBstXI部位BstXI認識部位内の可変ヌクレオチド領域は、逆相補性方向に配置された2つの同じHE認識部位の順序付けによって生成する非相補性尾部と同じヌクレオチドにより規定される、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなHE部位;逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーサイト、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通の制限部位、逆方向のユニークなHE部位当該HE部位は、順方向のHE部位と同じである、非可変性希少制限部位の固定された集団、ランダムヌクレオチド配列、非可変性希少制限部位の固定された集団、非可変性で且つユニークな共通の制限部位、ランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなHE部位、逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーサイト、及び3つの非可変性で且つユニークな共通の制限部位が含まれうる。本発明は、必要とされることの多い操作の量を低減するために至適化されたクローニングベクターを使用することによって、denovoDNAコンストラクト又はトランスジーンへ種々のDNA断片を組み立てるための方法の一群である。一次ベクター本明細書中、ドッキングプラスミドと称するは、好ましくは3組の線状パターンに配列された希少エンドヌクレアーゼ部位を備えたマルチクローニングサイトMCSを含む。この配列は、使用者が、先行するクローニング工程でドッキングプラスミドへ既に組み込まれたDNAエレメントの完全性を破壊することなしに、複数のインサートを単一のトランスジーンコンストラクトへ組み立てることを可能とする、モジュラー構造を規定する。少なくとも3つのHEに対する2つの認識部位が、自己アニーリングすることのできない遺伝子カセットアクセプタ部位を創出する目的で、3つのモジュラー領域に隣接するように反対方向に配置される。HE部位は非対称且つ非パリンドロームであるため、2つのHE認識部位を反対方向に配置することによって非相補性突出3’付着末端を生成させることが可能である。こうして、HEI-Scelが/によって示されるその同族認識部位を切断する:5’...TAGGGATAA/CAGGGTAAT...3’3’...ATCCC/TATTGTCCCATTA...5’。MCS内に第二部位を逆に配置することで、2つの非相補性付着突出末端が生じるはずである:5’...TAGGGATAACCCTA...3’3’...ATCCCAATAGGGAT...5’これは、より大きなトランスジーンをベクターへサブクローニングすることが必要な場合に特に有用である。インサートのサイズに起因して、大きなインサートを受容するよりむしろ自己アニーリングすることが、ベクターにとって熱力学的により好都合である。この制限部位の配置により生じる非相補性尾部の存在で、自己ライゲーションに対する熱力学的傾向に対向する化学力がもたらされる。殆どのHE突出尾部の非対称性もまた、BstXIエンドヌクレアーゼ酵素部位5’CCANNNNN/NTGG3’、配列中Nは何れのヌクレオチドでもありうると組み合わせて使用した場合に強力なクローニングツールを創出する。BstXIの配列-中立ドメインは、自己アニーリングを防止しつつ2つの逆方向性HE突出尾部に対する適合可能な付着末端を生成させるために使用することができる。BstXII-SceI順方向I-SceI順方向I-SceI逆方向BstXII-SceI逆方向5’-CCAGATAA3’-GGTCCAGGGTAAT//ATTACCCTGTTATTATTGTCCCATTA//TAATGGGACGTGG-3’AATACACC-5’本発明で使用されるエンドヌクレアーゼ部位は、出現の序列に従って選択した。エンドヌクレアーゼ部位出現の頻度を調べるために、19の異なる遺伝子に対応するDNA配列情報を、ベクターNTIソフトウェアを使用して分析した。この研究は、DNA配列の計110,530ヌクレオチドを網羅するものであった。これらの分析の結果を、分析した110,530ヌクレオチド内に出現しているエンドヌクレアーゼ部位の事例数に従って計算した。エンドヌクレアーゼ部位は次いで、4種の分類に従って序列の上での表示を割り振り、共通の部位は110,530ヌクレオチド当たり25回より多く出現し、低頻度6bp部位は110,530ヌクレオチド当たり6~24回の間で出現し、希少部位は110,530ヌクレオチド当たり0~5回の間で出現する。好適な酵素の部分的なリストを、それらの出現の分類に従ってここに列挙する。共通のエンドヌクレアーゼ酵素:AseI、BamHI、BglII、BlpI、BstXI、EcoRI、HincII、HindIII、NcoI、PstI、SacI、SacII、SphI、StuI、XbaI6bpの認識部位を有するが、出現頻度が低いエンドヌクレアーゼ酵素:AarI、AatII、AflII、AgeI、ApaLI、AvrII、BseAI、BspDI、BspEI、BstBI、ClaI、EagI、EcoO109I、EcoRV、HpaI、KpnI、MfeI、NarI、NdeI、NgoMIV、NheI、NsiI、PmlI、SexAI、SmaI、SpeI、XhoI希少エンドヌクレアーゼ酵素:AclI、AscI、AsiSI、BsiWI、FseI、MluI、NotI、NruI、PacI、PmeI、PvuI、RsrII、SalI、SbfI、SfiI、SgrAI、SnaBI、SwaI、PI-SceI、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、I-PpoI、I-TliIこれらのリストに含まれない、同じ機能性を有する並びに本発明の精神及び意図を維持している他のエンドヌクレアーゼを使用することもできる。本発明の二次ベクターは、本明細書においてシャトルベクターとして知られており、希少エンドヌクレアーゼ部位が隣接する共通のエンドヌクレアーゼ部位と共にマルチクローニングサイトを含んでいる。シャトルベクターは、希少部位間の共通エンドヌクレアーゼ部位へDNAのクローニング断片をクローニングするために設計されている。クローニングされた断片は引き続き、1又は複数の希少エンドヌクレアーゼ部位での切断によって遊離され、シャトルベクターに見出される1又は複数の同じ希少エンドヌクレアーゼ部位を用いてドッキングプラスミドへ組み込むことができる。このように、従来のクローニングベクターと異なり、MCSの設計によってカセットすなわち、DNA断片のモジュールをドッキングプラスミドのモジュラー領域へ挿入することが可能になる。同様に、各々を同じ希少エンドヌクレアーゼ酵素を用いて容易に除去して、目的とする他の何れかのDNA断片と置換することができる。この特徴によって、使用者がDNAコンストラクト全体を再び作り上げる必要なしに実験計画の方向を迅速且つ容易に変更することが可能になる。このように、本発明のクローニングベクタープラスミドは、使用者が共通のエンドヌクレアーゼ部位を用い、カセット-受容モジュールを創出してDNA断片を中間ベクターへクローニングして、その後希少エンドヌクレアーゼ部位によって最終コンストラクトの所望のモジュラー部位にその断片を移行させることを可能にする。さらに、それによってドッキングプラスミド内の個々のモジュールを他のカセットモジュールと置換するように分子を後から改変することが可能になる。以下の説明で、従来の技術と比較した本発明の特徴を明らかにする。トランスジーンの個々の成分プロモーターエンハンサーP、発現タンパク質E、及び/又は3’調節領域3を、シャトルベクターからPE3ドッキングステーションプラスミドへ移行されるモジュールとして組み立てることができる。より高次の複雑性が必要とされるのであれば、組み立てられたトランスジーン、又は他のヌクレオチド配列を、その後一次ドッキングプラスミドへ移行することができる。5つの種のクローニングベクタープラスミドの各々を各々へ組み込まれる成分の理解を図るためにさらに詳細に説明する。まず、より複雑なPE3ドッキングステーションプラスミド及び一次ドッキングプラスミドから始める。PE3ドッキングプラスミドは、以下のように修飾されたpUC19骨格を含み、配列はpUC19Genbank配列ファイル、受入番号L09137に従って番号付けをしている。1.806から2617までAfl3-Aat2の配列のみをドッキングプラスミドに使用し、2.pUC19の1729bpのBspH1部位はTCATGAからGCATGAに変異させ、3.pUC19の1493bpのAcl1部位はAACGTTからAACGCTに変異させ、4.pUC19の1120bpのAcl1部位をAACGTTからCACGCTに変異させ、5.pUC19のAhd1部位をGACNNNNNGTCからCACNNNNNGTCに変異させ、6.BspH1/I-Ppo1/BspH1をコードする配列を、上記リストの突然変異工程2の後に、pUC19の残りのBspH1部位のみに挿入する。PE3ドッキングプラスミドのマルチクローニングサイトMCSは、列記された順に以下の連鎖エレメントを含む。1.前記の変異型pUC19ベクターに対する5’挿入部位を規定する3つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位AatII、BIpI、及びEcoO109Iと示すが、これらに限定されることはない;2.T7プライマーサイト;3.ユニークなHE部位例えば、I-Scel順方向;4.クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュールRNAS-CMD-1として働くことができるランダムヌクレオチド配列に隣接する、一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、KpnI及びAvrII;5.プロモーターモジュールの5’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、AsiSI、PacI、及びSbfI;6.プロモーター/イントロンアクセプタモジュールRNAS-Pとして働くことができるランダムヌクレオチド配列;7.プロモーター/イントロンモジュールの3’部分と発現モジュールの5’部分との間の共有ジャンクションを規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、SgrAI、Ascl、及びMIuI;8.発現アクセプタモジュールRNAS-Eとして働くことができるランダムヌクレオチド配列;9.発現モジュールの3’部分と3’調節モジュールの5’部分のジャンクションを規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、SnaBI、NotI、及びSalI;10.3’調節ドメインアクセプタモジュールRNAS-3として働くことができるランダムヌクレオチド配列;11.3’調節モジュールの3’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、SwaI、RsrII、及びBsiWI;12.クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュールRNAS-CMD-2として働くことができるDNAのランダムヌクレオチド配列に隣接する、一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、XhoI及びNheI;13.前記項目3のものと同じ、逆方向のユニークなHE部位;14.逆方向のT3プライマーサイト;及び、15.前記の変異型pUC19ベクターに対する3’挿入部位を規定する4つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、BspEI、PmeI、SapI、及びBspHI。一次ドッキングプラスミドは、PE3ドッキングステーションプラスミドで最初に構築される2つの完成トランスジーン、若しくは遺伝子ターゲティングトランスジーンを構築するのに必要な2つの相同性アームを組み立てるのに、又は2つの種のポジティブ若しくはネガティブセレクションエレメントを導入するのに使用することができる。一次ドッキングプラスミド内のマルチクローニングサイトMCSは、列記の順に以下の連鎖エレメントを含む。1.前記の変異型pUC19ベクターに対する5’挿入部位を規定する2つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、AatIl及びBIpI;2.M13リバースプライマーサイト;3.ゲノム発現宿主選択遺伝子アクセプタモジュールRNAS-GEH-S1として働くことができるDNAのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対のユニークなエンドヌクレアーゼ;4.HEの対の下流でシャトルベクターモジュールのクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、EcoO109I;5.左組換えアームモジュールの5’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、AsiSI、PacI、及びSbfI;6.左組換えアームアクセプタモジュールRNAS-LRAとして働くことができるランダムヌクレオチド配列;7.左組換えアームアクセプタモジュールの3’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、SgrAI、MIuI、及びAscl;8.ユニークなHE部位例えば、I-CeuI順方向;9.クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュールRNAS-CMD-1として働くことができるDNAのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、KpnI及びAvrII;10.T7プライマーサイト;11.複合トランスジーンアクセプタモジュールRNAS-PE3-1として働くことができるDNAのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の互いに反対方向のユニークなBstXI部位BstXI認識部位内の可変ヌクレオチド領域は、逆相補性方向に配列された2つの同じHE認識部位の配列によって生成する非相補性尾部と同じヌクレオチドによって規定される;例えば、PI-SceI順方向及びPI-SceI逆方向;12.複合トランスジーンアクセプタモジュールRNAS-PE3-2として働くことができるDNAのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対のユニークなエンドヌクレアーゼ部位;13.逆方向のT3プライマーサイト;14.クロマチン修飾ドメインアクセプタモジュールRNAS-CMD-2として働くことができるDNAのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対の非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、XhoI及びNheI;15.上述した項目8のものと同一の、逆方向のユニークなHE部位;16.右組換えアームモジュールの5’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、SnaBI、SalI、及びNotI;17.右組換えアームアクセプタモジュールRNAS-RRAとして働くことができるランダムヌクレオチド配列;18.右組換えアームアクセプタモジュールの3’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、RsrII、SwaI、及びBsiWI;19.シャトルベクターモジュールのクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、BspEI;20.ゲノム発現宿主選択遺伝子アクセプタモジュールRNAS-GEH-S2として働くことができるDNAのランダムヌクレオチド配列に隣接する一対のユニークなエンドヌクレアーゼ部位;21.逆方向に配置された、M13フォワードプライマーサイト;及び、22.前記の変異型pUC19ベクターに対する3’挿入部位を規定する3つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、PmeI、SapI、及びBspHI。本発明の3つのクローニングベクタープラスミドは、シャトルベクターとして知られている。シャトルベクターは、PE3及び一次ドッキングプラスミド同様、やはりpUC19骨格から構築されている。まさしくPE3及び一次ドッキングプラスミドと同じように、各シャトルベクターには前記1~6のように列記したように、pUC19骨格に同じ修飾がなされている。個々のシャトルベクターSVは、シャトルベクタープロモーター/イントロンP、シャトルベクター発現E、及びシャトルベクター3’調節3以下、それぞれSVP、SVE、及びSV3として同定される。各々を、以下にさらに詳説する.シャトルベクターPSVP:SVPは、トランスジーンコンストラクトへの組み立て用のプロモーター及びイントロン配列を調製するのに使用することのできるクローニングベクタープラスミドである。SVPプラスミドの例では、列記の順にMCS内に以下の連鎖エレメントを含むことができる。1.前記の変異型pUC19ベクターに対する5’挿入部位を規定する2つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、AatlI及びBlpI;2.T7プライマーサイト;3.T7プライマーサイトの下流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする、非可変性且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、EcoO109I;4.プロモーターモジュールの5’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、AsiSI、PacI、及びSbfI。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図2のプロモーターベクターの5’端で星印により示されるドッキングポイントを提供する;5.シャトルベクターにユニークな共通又は希少エンドヌクレアーゼ部位の何れかの集団を含む可変MCS;6.プロモーターモジュールの3’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、SgrAI、Ascl、及びMIuI。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図2のプロモーターベクターの3’端で円形により示されるドッキングポイントを提供する;7.T3プライマーサイトの上流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、BspEI;8.逆方向のT3プライマーサイト;及び9.前記の変異型pUC19ベクターに対する3’挿入部位を規定する2つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、PmeI及びSapI。シャトルベクターESVE:これは、トランスジーンコンストラクトへの組み立て用のトランスジーンによって発現されるべき配列を調製するのに使用することができるクローニングベクタープラスミドである。SVEプラスミドの例では、列記の順にMCS内に以下の連鎖エレメントを含むことができる。1.前記の変異型pUC19ベクターに対する5’挿入部位を規定する2つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、AatlI及びBlp\I;2.TJプライマーサイト;3.T7プライマーサイトの下流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、Eco0109\I;4.発現モジュールの5’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、SgrAI、Ascl、及びMluI。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図2の発現ベクターの5’端で円形により示されるドッキングポイントを提供する;5.シャトルベクターにユニークな共通又は希少エンドヌクレアーゼ部位の何れかの集団からなる可変MCS;6.発現モジュールの3’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、SnaBI、NotI、及びSaiI。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図2の発現ベクターの3’端で三角形により示されるドッキングポイントを提供する;7.T3プライマーサイトの上流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、BspEI;8.逆方向のT3プライマーサイト;及び、9.前記の変異型pUC19ベクターに対する3’挿入部位を規定する2つの非可変性且つユニークな共通の制限部位例えば、Pmel及びSapl。シャトルベクター3SV3:これは、トランスジーンコンストラクトへの組み立て用の3’調節配列を調製するのに使用することができるクローニングベクタープラスミドである。SV3プラスミドの例では、列記の順にMCS内に以下のエレメントを含むことができる。1.前記の変異型pUC19ベクターに対する5’挿入部位を規定する2つの非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、AatII及びBlpI;2.T7プライマーサイト;3.T7プライマーの下流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな共通のエンドヌクレアーゼ部位例えば、EcoO109I;4.3’調節モジュールの5’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、SnaBI、NotI、及びSaiI。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図2の調節ベクターの5’端で三角形により示されるドッキングポイントを提供する;5.シャトルベクターにユニークな共通又は希少エンドヌクレアーゼ部位の何れかの集団からなる可変MCS;6.3’調節モジュールの3’部分を規定する非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位の固定された集団例えば、SwaI、RsrII、及びBsiWI。これらの非可変性希少エンドヌクレアーゼ部位は、図2の調節ベクターの3’端で四角形により示されるドッキングポイントを提供する;7.T3プライマーサイトの上流でのシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能とする非可変性で且つユニークな非希少エンドヌクレアーゼ部位例えば、BspEI;8.逆方向のT3プライマーサイト;及び、9.前記の変異型pUC19ベクターに対する3’挿入部位を規定する2つの非可変性で且つユニークな非希少エンドヌクレアーゼ部位例えば、PmeI及びSapI。本発明は、プラスミドクローニングベクターにおいてトランスジーンを作り上げるための方法を開示するが、コスミドなどの大きな染色体外DNA分子、又は細菌性人工染色体BACを含む人工染色体においてトランスジーンを作り上げるのに、類似の方法を使用することができる。植物で使用するには、T1ベクターも使用してよい。プラスミドクローニングベクターへ組み込むことのできる多種多様な遺伝子エレメントによっても、ほとんど又は全くさらに操作することなく、多種多様な宿主生物への最終トランスジーン産物の移行が可能となる。図2及び3は、本発明のモジュール方式の一般的な図である。図2に示すとおり、プロモーター、発現、及び3’調節シャトルベクターの各々一つが存在する。シャトルベクター内で隣接する各インサートは、ドッキングポイントを創出するのに特異的なエンドヌクレアーゼ制限部位である。さらに詳細には、図2で、プロモーターインサートPは5’端で星印により示される1以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第一群と、3’端で円形により示される1以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第二群に隣接しており;発現モジュールは5’端で円形により示されるエンドヌクレアーゼ制限部位の第二群と、3’端で三角形により示される1以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第三群に隣接しており;3’調節モジュール3は5’端で三角形により示されるエンドヌクレアーゼ制限部位の第三群と、3’端で四角形により示される1以上のエンドヌクレアーゼ制限部位の第四群に隣接している。その部位に特異的なエンドヌクレアーゼによって各エンドヌクレアーゼ認識部位を切断すると、一点鎖線矢印の末端のインサートにより図2の底部に示されるように、各モジュールの5’及び3’端で粘着末端が創出される。そうすればモジュールは、エンドヌクレアーゼ制限部位星印で示すの第一群及びエンドヌクレアーゼ制限部位四角形で示すの第四群に対して特異的なエンドヌクレアーゼによって、やはりその2つの固定されたドッキングポイントで切断されているクローニングベクタープラスミドと貼合せることができる。モジュラーベクターをクローニングベクタープラスミドと共に適切な反応混合物中に入れると、各モジュラーベクターの切断された粘着末端白抜きの星印、円形、三角形、及び四角形で示すはプラスミド内で自己配向して、切断された星印末端の貼合せ、切断された円形末端の貼合せ、切断された三角形末端の貼合せ、及び切断された四角形末端の貼合せと、順次連結することになる。この結果、図3に示す、組み立てられた骨格ベクターが得られる。さらに、星印、円形、三角形、及び四角形で示されるエンドヌクレアーゼ部位の組み合わされた群の各々は、特定のインサートを後から除去して目的とするインサートと置換できるように、その対応する特異的エンドヌクレアーゼにより再度切断することができる。複数の骨格ベクター例えば、PE3-1及びPE3-2は、単一のドッキングプラスミドへ挿入することができる。I-SceIなどのエンドヌクレアーゼの突出尾部の非対称性は、他のHEでの場合と同様に、BstXIエンドヌクレアーゼ酵素部位5’CCANNNNN/NTGG3’、配列中Nは何れのヌクレオチドでもありうると組み合わせて使用した場合に強力なクローニングツールを創出する。BstXIの配列中立ドメインを使用して、自己アニーリングを防止しつつも、2つの逆方向性I-SceI突出尾部に対して適合可能な付着末端を生成させることができる。この方法で、第一インサート、PE3-1その末端でl-Sce-1部位を有しているは、Bstxi/Sce1エンドヌクレアーゼ部位でそのプラスミドを切断することによってクローニングベクタープラスミドに配置することができる。次いで、I-Scelで再度切断して、その端部にl-Sce-1部位を有するPE3-2を挿入することができる。この骨格全体は、次いでPI-SceIによってそのドッキングプラスミドから切り出して、BstXl/PI-SceIエンドヌクレアーゼ部位を含む別のドッキングプラスミドへ挿入することができる。この第二のドッキングプラスミドもまた、PI-SceIに対するエンドヌクレアーゼ部位を有しており、その中に別のドッキングプラスミド用のさらに他のモジュールで、PE3-3及びPE3-4を含む可能性のあるものを挿入することができる図示せず。このようにして、研究者はより多くの情報を一細胞に入れ込むことができ、すなわち、複数の遺伝子を単一ベクターのコンテクスト内に挿入することができるが、これは当業者によって従前に成し遂げられているものではない。このような新規のプロセスによって、当該分野での研究者の仕事のための金銭と時間の双方を節約することができる。実施例1:PE3ドッキングプラスミド本発明を実施する方法の例として、これらのエレメントを含むトランスジーンを構築することができる。1.界面活性タンパク質CSP-Cに対するヒトプロモーターのヌクレオチド配列;2.マウス遺伝子顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子-レセプターβcGMRβcのタンパク質産物をコードする配列;3.ウサギβグロビンのイントロン配列;及び4.SV40ポリ-Aシグナル。SP-C配列は、内部BamH1部位を含んでおり、またNot1とEcoR1とだけでその親プラスミドから遊離させることができる。GMRβcは、内部Not1部位を有しており、その親プラスミドからBamH1及びXho1で切り出することができる。ウサギベータグロビンイントロン配列は、その親プラスミドからEcoR1で切り出すことができる。SV-40ポリA尾部は、Xho1及びSac1でその親プラスミドから切り出すことができる。エンドヌクレアーゼ部位のいくつかが多く存在するゆえに、親プラスミドのいずれも、必要な断片すべてを組み立てるのに使用することができない。PE3ドッキングプラスミド発明において所望のトランスジーンを作り上げるのに使用する工程は以下のとおりである。1.Not1及びPspOMIは適合可能な付着末端を生成させるので、ヒトSP-Cプロモーター配列はNot1及びEcoR1で切り出して、シャトルベクターPのPspOMI及びEcoR1部位へクローニングする。この反応の産物は、pSVP-SPCと称される。2.当業者に良く知られた増殖及び回収工程の後に、ウサギβグロビンイントロン配列をpSVP-SPCのEcoR1部位へクローニングする。得られる中間コンストラクトでのイントロンの方向は産物を配列決定することによって確かめられ、pSVP-SPC-rβGと称される。3.AsiS1及びAsc1を用い、pSVP-SPC-rβGからプロモーター及びイントロンを切り出して、1つの連続断片として単離する。同時に、プロモーター/イントロンセグメントのライゲーション用の調整のため、AsiS1及びAsdでPE3ドッキングプラスミドを切り出す。プロモーター/イントロン断片をドッキングプラスミドへつなぎ、増やして回収する。4.当業者に良く知られた技術を用いてGMRβc断片のXho1部位を埋め、平滑3’端を創出する。それを次いでpSVP-SPC-rβGのBamH1部位と平滑断端Pvu2部位へクローニングする。得られたプラスミドpDP-SPC-GMRβc-rβGを増やして回収した。5.最終クローニング工程は、SV-40ポリAA尾部の付加である。レシピエントベクターpDS1-SPC-GMRβc-rbβGと同様に、SV40-ポリA断片を、Xho1及びSac1で切り出す。DNAの片の双方をゲルで精製して回収する。ライゲーション混合液を、SV-40ポリAのpDS1-SPC-GMRβc-rβGに対するモル比10:1にて調製する。ライゲーション産物を増やして回収する。新しいプラスミド、pDS1-SPC-GMRββc-rβG-pAは、3’端のユニークなエンドヌクレアーゼ部位を含め、トランスジーンに必要とされる全てのエレメントを含み、これを用いてpDS1-SPC-GMRβc-rβG-pAプラスミド全体を真核細胞へのトランスフェクション又は受精卵の前核へのマイクロインジェクション用に線状化することができる。実施例2:ダイナミックなベクター構築ダイナミックなベクター構築を、以下の実施例に示す。1.ヒトサイトメガロウイルスCMV由来のプロモーター配列を、5’及び3’部分にそれぞれAsiSI及びAseIエンドヌクレアーゼを有するPシャトルベクターSVP内に挿入する。プラスミドを増幅させ、プロモーターモジュールをAsiSI及びAscIエンドヌクレアーゼ消化によってベクターから切り出して単離する。2.ルシフェラーゼタンパク質をコードする配列を、5’及び3’部分にそれぞれAscI及びNotIエンドヌクレアーゼを有する発現シャトルベクターSVE内に挿入する。プラスミドを増幅させ、発現モジュールをAscI及びNotIエンドヌクレアーゼ消化によってベクターから切り出して単離する。3.哺乳類イントロン及びSV40ポリアデニル化サイトをコードする配列を、5’及び3’部分にそれぞれNotI及びBsiWIエンドヌクレアーゼを有する3’調節シャトルベクターSV3内に挿入する。プラスミドを増幅させ、調節モジュールをNotI及びBsiWIエンドヌクレアーゼ消化によってベクターから切り出して単離する。4.プロモーターモジュールの5’部分及びレギュレーターモジュールの3’部分で、それぞれAsiSI及びBsiWIエンドヌクレアーゼを有するドッキングベクタープラスミドのエンドヌクレアーゼ認識部位を、AsiSI及びBsiWIエンドヌクレアーゼで切り出し、単離する。5.プロモーター、発現、及び調節モジュールをライゲーション混合物においてドッキングベクタープラスミドと組み合わせる。2時間のインキュベーション後に、ライゲーション混合物を用いて大腸菌を形質転換し、これをその後、アンピシリンを含むLB寒天プレートに播種する。プレートを37°Cで終夜インキュベートする。コロニーを単離して、個々の液体LBブロス培養液で増殖させる。プラスミドDNAを各LBブロス培養から単離する。DNAをエンドヌクレアーゼマッピングによって分析して、各コロニーからのプラスミドが3つのモジュラーインサートプロモーター、発現及び調節を含む否かを判定する。3つのモジュラーインサートを含むプラスミドは、トランスジーンpCMV-luc-SV40pAとして同定される。これは、I-SceIエンドヌクレアーゼを用いて線状化して、CMV-ルシフェラーゼマウスを作製すべくマウス前核へ注射することができる。本実施例におけるCMVプロモーターは、CMV-ルシフェラーゼマウスなどの宿主生物のすべての組織でルシフェラーゼ遺伝子の発現を指向する。実施例3:ダイナミックなベクター構築の再設計もし研究者が今度は特定の組織又は細胞型のみでルシフェラーゼが発現されるように発現パターンを改良することを望めば、CMVプロモーターを、限定された発現パターンをもたらすものに迅速且つ容易に置き換えることができる。以下の実施例で、pCMV-luc-pAの迅速な再設計を円滑にするための本発明の使用を示す。1.ニューロン特異的プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼNSEを、PシャトルベクターSVPに挿入して、前記実施例のプロモーターモジュールとして調製する。2.pCMV-luc-pAを、AsiSI及びAscIで切断して、CMVプロモーターモジュールを除く。完全な発現及び調節モジュールを含むドッキングベクタープラスミドの残りを単離する。3.NSEプロモーターモジュールを、完全な発現及び調節モジュールを含むドッキングベクタープラスミドの残りと共にライゲーション混合物に入れる。2時間インキュベートした後、その新しいライゲーション混合物を使用して大腸菌を形質転換する。大腸菌混合物を、前記実施例と同様にアンピシリンを含むLB寒天プレートに播種する。コロニーを翌日に単離し、増やして、各々からプラスミドDNAを単離する。エンドヌクレアーゼマッピングを使用して、所望のNSEプロモーターモジュールを含むプラスミドを同定する。実施例4:トランスジーンのアレイ以下の実施例は、プロモーター、発現、及び調節モジュールの異なる組合せを各々含んでいるトランスジーンのアレイを迅速に組み立てるための、本発明の使用を例示するものである。一連の6つのシャトルベクターとPE3ドッキングステーションベクターを使用し、コンビナトリアルアセンブリを用いて8つの異なるベクター産物を作製する。一連の6つのシャトルベクターは、2つのP-シャトルSVP、2つのE-シャトルSVE、及び2つの3-シャトルSV3からなる。2つの別異のP-シャトルSVPは、ヒトサイトメガロウイルスCMVプロモーター又はマウスSPC肺-特異的プロモーターの何れかを含み、各々は5’及び3’部分にそれぞれAsiSI及びAscIエンドヌクレアーゼを有している。2つの別異のE-シャトルは、ルシフェラーゼcDNA又はEGFPcDNAの何れかを含み、各々は5’及び3’部分にそれぞれAscI及びNotIエンドヌクレアーゼを有している。2つの別異の3-シャトルベクターは、SV40ポリAシグナル又はヒト成長ホルモンhGHの3’調節領域の何れかを含み、各々は、5’及び3’部分にそれぞれNotI及びBsiWIエンドヌクレアーゼを有している。プロモーターモジュールは、適切なシャトルベクターをAsiSI及びAscIエンドヌクレアーゼで消化することによって、それらのそれぞれのSVPシャトルベクターから個々に遊離される。得られる制限産物は、個々にゲル電気泳動に付し、適切なプロモーターモジュールに対応するDNAバンドをゲル精製に付す。この操作手順で、CMVプロモーターモジュール、又はAsiSI突出が5’側及び3’端にAscI突出が結合したSPCプロモーターモジュールのいずれかが得られることになる。発現モジュールは、適切なシャトルベクターをAscI及びNotI制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、それらのそれぞれのSVEシャトルベクターから個々に遊離される。得られる制限産物は、個々にゲル電気泳動に付し、適切な発現モジュールに対応するDNAバンドをゲル精製に付す。この操作手順で、ルシフェラーゼ発現モジュール、又はAscI突出が5’側及び3’端にNotI突出が結合したEGFP発現モジュールのいずれかが得られることになる。3’調節モジュールは、適切なシャトルベクターをNotI及びBsiWI制限エンドヌクレアーゼで個々に消化することによって、それらのそれぞれのSV3シャトルベクターから遊離される。得られる制限産物は、個々にゲル電気泳動に付し、適切な3’調節モジュールに対応するDNAバンドをゲル精製に付す。この操作手順で、SV403’調節モジュール、又はNotI突出が5’側及び3’端にBsiWI突出が結合したhGH3’調節モジュールのいずれかが得られることになる。PE3ドッキングステーションベクターは、AsiSI及びBsiWI制限エンドヌクレアーゼで消化することによって調製する。後からのベクターの再度のライゲーション防止に資するために、ベクター制限消化物を、37°Cで1時間、ウシ腸ホスファターゼCIPに曝す。得られたCIP処理済みのベクター制限産物は、次いでゲル電気泳動に付し、線状化PE3ベクター骨格に対応するDNAバンドをゲル精製に付す。得られた、ゲルで精製した7つのDNA断片からの試料を、診断電気泳動ゲルに流すことにより、同一性、完全性、純度、及び量について分析する。精製したPE3ドッキングステーションベクター及び個々のDNAモジュールの相対存在度に関する定量データを使用して、コンビナトリアルライゲーション反応に必要な各成分の量を規定する。ライゲーション反応を構成する場合、好結果がもたらされることの多い戦略が2つある。第一の戦略は、インサート対ベクターの比が約3:1であるライゲーション反応混合物を構成することである。1以上のインサートが単一のベクターに同時に導入されている場合に用いる第二の戦略は、ベクターへ挿入される予定の各遺伝子モジュールを、モル当量導入することである。これは、ライゲーション反応混合物に照らしてモル当量とするために可変体積のモジュールを反応容器に加えるか、又は中性緩衝液溶液を精製されたモジュールの各々にそれらの濃度がモル比基準で等量となるように添加することのいずれかによって成し遂げることができる。本実施例では、ゲルで精製したベクター及びインサート断片はすべて、10mMトリス、pH8.0の緩衝液を用いてモル当量に調整している。ライゲーション反応の総体積は150マイクロリットルに設定する。ライゲーション反応混合物は、以下の構成成分からなる:39マイクロリットルの超純水、15マイクロリットルの10×リガーゼ緩衝液、5マイクロリットルの精製したPE3ベクター骨格、15マイクロリットルの精製したCMVプロモーターモジュール、15マイクロリットルの精製したSPCプロモーターモジュール、15マイクロリットルの精製したルシフェラーゼ発現モジュール、15マイクロリットルの精製したEGFP発現モジュール、15マイクロリットルの精製したSV403’調節モジュール、15マイクロリットルの精製したhGH3’調節モジュール、及び1マイクロリットルのリガーゼ酵素。得られた反応成分を十分に混合して、その後16°Cにて終夜インキュベートする。予想されるベクターライゲーション産物は次のものを含む:pCMV-EGFP-SV40pCMV-EGFP-hGHpCMV-ルシフェラーゼ-SV40pCMV-ルシフェラーゼ-hGHpSPC-EGFP-SV40pSPC-EGFP-hGHpSPC-ルシフェラーゼ-SV40pSPC-ルシフェラーゼ-hGH次いで、ライゲーション混合物を用いて大腸菌を形質転換し、これをその後、アンピシリンを含むLB寒天プレートに播種する。プレートを37°Cで終夜インキュベートする。コロニーを単離して、個々の液体LBブロス培養液で増殖させる。プラスミドDNAを各LBブロス培養から単離する。DNAをエンドヌクレアーゼマッピングによって分析して、各コロニーへ取り込まれた、得られたベクターの同一性を判定する。前記実施例では、予測されたベクター産物の1つpCMV-EGFP-SV40は第一コンビナトリアルプロセスの間に生産されることがなかった。しかしながら、成功裡に生産された1つのベクターpCMV-ルシフェラーゼ-SV40は、所望のpCMV-EGFP-SV40ベクターを生産するためのベクター骨格として働くことができる。この技術を、第二パス組立てと称することができる。実施例5:第二パス組立て所望のpCMV-EGFP-SV40ベクターを作り上げるために、実施例4のpCMV-ルシフェラーゼ-SV40ベクター産物をAscI及びNotIで消化して、CIP処理し、引き続きゲルで精製した。ルシフェラーゼモジュールが除去されている、この線状化したベクター断片をコンビナトリアルベクター構築の前記実施例で生産されたEGFPモジュールを含むライゲーション混合物中でインキュベートした。ライゲーション混合物を用いて大腸菌を形質転換し、これをその後、アンピシリンを含むLB寒天プレートに播種する。プレートを37°Cで終夜インキュベートする。コロニーを単離して、個々の液体LBブロス培養液で増殖させる。プラスミドDNAを各LBブロス培養から単離する。DNAをエンドヌクレアーゼマッピングによって分析して、各コロニーからのプラスミドがEGFPインサートを含むか否かを判定する。本発明の多くの利点のうち、各々、プロモーター、発現、及び調節モジュールの異なる組合せを含むトランスジーンのアレイを迅速に非常に短時間で組み立てることができるのみならず、迅速且つ容易に新しい組立トランスジーンを変更又は再設計できることは、容易に理解されうるものである。従来は、各々、異なるプロモーター、発現、及び調節モジュールを有する、異なるトランスジーンのアレイを創出するための既知の方法を使用して、組み立てられたトランスジーンを変更することは、通常1年以上の実験時間がかかったはずである。本発明の方法を使用して、同数の所望のトランスジーンを数日又は数週間以内に作り、次いで各々の所望の試験を行い、これにより研究者は以前要した長時間を節約することができる。さらに、プロモーター、発現及び調節インサートの各々一つを同時に単一骨格へ挿入することができるダイナミックなベクター構築と、2つのP-シャトル、2つのE-シャトル、及び2つの調節シャトルをすべて組み合わせて8つの異なる型のトランスジーンを創出する前記の組合せ法の双方を、研究者が貴重な時間と金銭を節約するために使用することができる。元々denovo合成、組換え、及びPCRターミネーター突出クローニング法によって創出されたシャトルを取り上げて、これらの予製エレメントを多数のトランスジーンで迅速に組み立てる、本発明のドッキングポイント技術で用いることができる。本発明は、その実施態様の記載によって説明されており、実施態様が詳細に記載されているが、添付の請求の範囲をこのような詳細に制限又はいかようにも限定することは意図されていない。さらなる利点及び変更が、当業者に容易に明らかになることであろう。従って、本発明はその大局的な特徴において、特定の詳細、代表的な方法及び構造、並びに示され記載されたような説明された例に限定されることはない。従って、出願人の一般的発明概念の範囲又は精神から逸脱することなく、かかる詳細から逸脱してもかまわない。本明細書に組み入れられ、その一部を構成する添付の図面は、本発明の実施態様を示して、さらに上記本発明の一般的な説明、及び以下の詳細な説明と共に、本発明の原理を説明するのに役立つものである。"