生物学的試料中の微生物核酸を同時に検出および定量化するための方法であって、以下のことを含む方法:a前記の微生物核酸を単離および精製し;b少なくとも第1対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、および前記の対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含む反応混合物を提供し、ここで前記の微生物核酸および前記の対照核酸は異なるプローブにハイブリダイズする;c前記の生物学的試料を前記の反応混合物に添加し;d1回以上のサイクル工程を実施し、ここでサイクル工程は増幅工程を含み、この増幅工程は、もし前記の試料中に存在するならば前記の微生物核酸に由来する1個以上の増幅産物を生成することおよび前記の対照核酸に由来する増幅産物を生成することを含み、ここでサイクル工程はハイブリダイズ工程を含み、このハイブリダイズ工程は前記のプライマーペアにより増幅された配列を前記のプローブとハイブリダイズさせることを含み、ここでそれらのプローブはドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で標識されており、それらのプローブのそれぞれは異なる蛍光色素を有する;e前記の増幅産物により生成する、前記の対照核酸および前記の微生物核酸の濃度に比例する蛍光シグナルを検出および測定し、ここで前記の対照核酸の増幅産物の存在は、前記の微生物核酸に関する増幅産物の非存在下においてさえもその反応混合物において増幅が起こっていることを示す。その第1対照核酸が、定量標準核酸として、または定性的内部対照核酸としての役目を果たすために、異なる基準に従って分析される、請求項1に記載の方法。生物学的試料中の微生物核酸を同時に検出および定量化するための方法であって、以下のことを含む方法:a前記の微生物核酸を単離および精製し;b異なる濃度の第1および第2対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、および前記の対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含む反応混合物を提供し、ここで前記の微生物核酸ならびに前記の第1対照核酸および前記の第2対照核酸は異なるプローブにハイブリダイズする;c前記の生物学的試料を前記の反応混合物に添加し;d1回以上のサイクル工程を実施し、ここでサイクル工程は増幅工程を含み、この増幅工程は、もし前記の試料中に存在するならば前記の微生物核酸に由来する1個以上の増幅産物を生成することならびに前記の第1対照核酸および前記の第2対照核酸に由来する増幅産物を生成することを含み、ここでサイクル工程はハイブリダイズ工程を含み、このハイブリダイズ工程は前記のプライマーペアにより増幅された配列を前記のプローブとハイブリダイズさせることを含み、ここでそれらのプローブはドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で標識されており、それらのプローブのそれぞれは異なる蛍光色素を有する;e前記の第1対照核酸および前記の微生物核酸の増幅産物により生成する、それらの濃度に比例する蛍光シグナルを検出および測定し、および/または同時に前記の第2対照核酸の前記の増幅産物により生成された蛍光シグナルを検出し、ここで前記の第2対照核酸の増幅産物の存在は前記の微生物核酸に関する増幅産物の非存在下においてさえもその反応混合物において増幅が起こっていることを示す。その第1対照核酸が定量標準核酸であり、その第2対照核酸が定性的内部対照核酸である、請求項3に記載の方法。さらに工程eにおいて、前記の微生物核酸および前記の第1対照核酸により生成されたシグナルの比較により、前記の生物学的試料中の前記の微生物核酸の量を決定することを含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。増幅が5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる、前記の請求項のいずれかに記載の方法。前記の第1対照核酸が前記の微生物核酸の検出限界の20~5000倍の濃度で存在し、前記の第2対照核酸が前記の微生物核酸の検出限界の1~25倍の濃度で存在する、請求項3に記載の方法。前記の第1および前記の第2対照核酸が1つの対照試薬内で提供される、請求項3に記載の方法。微生物核酸をリアルタイムPCRにより同時に検出および定量化するための、異なる濃度の第1および第2対照核酸の使用。前記の第1および第2対照核酸が同じプライマーペアまたは異なるプライマーペアにより増幅されるが、異なるプローブにハイブリダイズする、請求項9に記載の使用。生物学的試料中の微生物核酸をリアルタイムPCRにより同時に検出および定量化するためのキットであって、異なる濃度の第1および第2対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、ならびに前記の第1および第2対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含み、前記の第1および第2対照核酸が1つの対照試薬内で提供される、前記キット。請求項1~8のいずれかに記載の方法に従って生物学的試料中の微生物核酸を同時に検出および定量化するためのキットであって、異なる濃度の第1および第2対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、ならびに前記の第1および第2対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含む、前記キット。前記の第1および第2対照核酸が同じプライマーペアにより増幅されるが異なるプローブにハイブリダイズする、請求項11または12のいずれかに記載のキット。生物学的試料中の微生物核酸をリアルタイムPCRにより同時に検出および定量化するための分析システムであって、以下を含む分析システム:-前記の微生物核酸を単離および精製するための溶解緩衝液および容器を含む、試料調製モジュール-その中で請求項1~8のいずれかに記載の方法を実施する反応容器を含む、増幅および検出モジュール-請求項11~13のいずれかに記載のキット。加えて、その生物学的試料をその試料調製モジュールからその反応容器に移すための移動モジュールを含む、請求項14に記載の分析システム。本発明は、先行技術を越える多数の利点を示す。特に、本発明はそのように同じ試薬を用いるあらゆる所与の微生物核酸に関する定性的および定量的アッセイの一般的な設計を可能にする。一部の態様において、上記で記述した第1対照核酸は内部定量標準核酸および定性的内部対照核酸の両方の役目を果たすことができる。従って、それは2つの別々の試験または試験キットそれぞれの必要性を排除する。2つの別々の試験の実施は追加の採血により患者に負担をかけ、その定量および定性試験が両方とも費用の払い戻しがある場合にはその健康管理システムに追加の費用を負わせる可能性がある。さらに、定量および定性試験両方に関して結果が出るまでの時間が、順次行なう定性的および定量的試験と比較した場合に低減する。好ましくは、前記の第1対照核酸は定性的および定量的結果を得るための異なる基準に従って評価される。好ましい態様において、リアルタイムPCRの間に得られた生データの同じセットを2つの異なる試験パラメーター設定に対して分析する。有効な定性的対照核酸に関して適用される定性的試験パラメーター設定は、定量的結果の出力に必要な内部定量標準に関して適用されるパラメーター設定と比較してより厳密である。定量反応における内部定量標準核酸に関する設定は、標的の存在がその内部定量標準核酸のそれぞれの増殖曲線に影響を及ぼし得るほど厳密であることはできない図1a参照。従って、本発明の好ましい態様は上記で記述した方法であり、ここでその第1対照核酸は、定量標準核酸として、または定性的内部対照核酸としての役目を果たすために、異なる基準に従って分析される。他の態様において、以下の理由により、第1および第2対照核酸を異なる濃度で用いることが好都合である可能性がある:通常、定量試験における内部定量標準核酸単数または複数は、それらが高濃度の標的核酸を有する試料においてもなお増幅および検出されるように、ある程度高い濃度を有する。従って、時には、特にその増幅反応が部分的に抑制されている場合、検出限界LODに近い低い陽性の試料の検出のための対照としてのそれの使用可能性は与えられない。その場合、高度に濃縮された対照核酸はそれぞれのアッセイの十分な感度の尺度としての役目を果たすことができない。従って、本発明の好ましい観点は以下のものである:生物学的試料中の微生物核酸を同時に検出および定量化するための方法であって、前記の方法は以下のことを含む:a前記の微生物核酸を単離および精製し;b異なる濃度の第1および第2対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、および前記の対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含む反応混合物を提供し、ここで前記の微生物核酸ならびに前記の第1対照核酸および前記の第2対照核酸は異なるプローブにハイブリダイズする;c前記の生物学的試料を前記の反応混合物に添加し;d1回以上のサイクル工程を実施し、ここでサイクル工程は増幅工程を含み、この増幅工程は、もし前記の試料中に存在するならば前記の微生物核酸に由来する1個以上の増幅産物を生成することならびに前記の第1対照核酸および前記の第2対照核酸に由来する増幅産物を生成することを含み、ここでサイクル工程はハイブリダイズ工程を含み、このハイブリダイズ工程は前記のプライマーペアにより増幅された配列を前記のプローブとハイブリダイズさせることを含み、ここでそれらのプローブはドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分で標識されており、それらのプローブのそれぞれは異なる蛍光色素を有する;e前記の第1対照核酸および前記の微生物核酸の増幅産物により生成する、それらの濃度に比例する蛍光シグナルを検出および測定し、および/または同時に前記の第2対照核酸の前記の増幅産物により生成された蛍光シグナルを検出し、ここで前記の第2対照核酸の増幅産物の存在は前記の微生物核酸に関する増幅産物の非存在下においてさえもその反応混合物において増幅が起こっていることを示す。本発明に従う、同じ対照試薬内での異なる濃度の第1および第2対照核酸の利用は、上記で述べた問題を克服する。より低い、または最も低い濃度を有する核酸は定性的アッセイに関する定性的内部対照核酸に対応しており、陰性の結果が有効か否かを判定する能力を確実にし、すなわち陰性の結果はその内部対照核酸が検出されない場合は無効である。本発明によれば、当業者は、単一のアッセイで両方を実施することによる定量的および定性的構成を開発すること、従って開発費用を低減すること、必要とする物質および労働力がより少ないこと、製造費用を低減すること、ならびにアッセイを確立するのに必要な時間も削減することの間の相乗作用を利用することができる。さらに、追加の採血により患者に負担をかける患者の二重の検査が避けられ、定量および定性試験が両方とも費用の払い戻しがある場合にはその健康管理システムに関する費用も低減される。その定性的内部対照核酸および/または内部定量標準核酸は、競合的、非競合的または部分的に競合的であることができる。競合的は、プライマーを含む増幅反応において、それぞれの対照核酸および標的核酸単数または複数が少なくとも本質的に同じプライマー結合部位を有し、従って同じプライマーに関して競合することを意味する。競合的構成の利点の中には、例えばそのアッセイに導入しなければならない異なるプライマーのセットがより少なく、従ってそれの費用および全体的な複雑さが低減されることがある。さらに、そのプライマーの機能性は、標的プライマー特異的である阻害作用として監視される。非競合的は、そのそれぞれの対照核酸および標的核酸単数または複数が異なるプライマー結合部位を有し、従って異なるプライマーに結合することを意味する。そのような構成の利点には、とりわけ、その反応混合物中の異なる核酸の1回の増幅事象があらゆる競合作用なしに互いに独立して起こることができるという事実が含まれる。部分的に競合的は、そのそれぞれの対照核酸およびその標的核酸の少なくとも1つが同じプライマーに関して競合するが、少なくとも1つの他の標的核酸は異なるプライマーに結合することを意味する。本発明の方法単数または複数に従って、内部定量標準核酸を第1対照核酸として用いることにより、試料特異的な阻害作用だけでなく、おそらく定量標準核酸および微生物核酸に関する増幅および検出反応を同時に妨げる試料非特異的な阻害作用標的領域に無関係な阻害も均一化されleveled、結果としてより正確な力価がもたらされる。内部は、その第1対照核酸が、別々の実験においてではなく、その微生物核酸と同じ反応混合物内で増幅、検出および定量化されることを意味する。本発明の別の好ましい観点は上記で記述した方法であり、ここでその第1対照核酸は定量標準核酸であり、その第2対照核酸は定性的内部対照核酸である。当業者は、同じ実験から信頼できる定性的情報だけでなく場合により同等に信頼できる定量的情報も引き出すことができる。従って、別の観点において本発明は以下のものに関する:さらに以下のことを含む、上記で記述した方法:工程eにおいて、前記の微生物核酸および前記の第1対照核酸により生成されたシグナルの比較により、前記の生物学的試料中の前記の微生物核酸の量を決定する。好ましい態様において、その第1対照核酸および第2対照核酸は本質的に同じ配列を有する。好ましくは、それらは同じプライマー結合部位を有するが、異なるプローブ結合部位を有する。これは、その定性的および定量的測定のための対照核酸が、同じ選択された結合配列に基づき、アッセイの性能に関して、およびその分析物の配列単数または複数の点から見て、同じ好都合な特性を共有することができるという利点を与える。一般に用いられる分子生物学および核酸化学の技法は当技術分野の技術の範囲内であり、文献において説明されている。例えば、SambrookJetalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressニューヨーク州コールドスプリングハーバー1989GaitMJ編者1984NucleicAcidHybridizationHamesBDandHigginsSJ編者1984およびシリーズ、MethodsinEnzymologyAcademicPressIncを参照。同時には、本発明の意味において、例えば核酸の検出および定量化のような2つの作用が同じ反応または反応混合物内で実施されることを意味する。反応混合物は、本発明において用いられる場合、少なくとも生物学的反応または化学反応を促進するための全ての構成要素を含む。それはあらゆる分離した区画なしの単一の体積であり、すなわち、前記の反応混合物中に存在する全ての構成要素は、互いに直接接触している。生物学的試料は、天然起源のあらゆる試料であることができる。好ましくは、生物学的試料はヒトに由来し、それは体液である。本発明の好ましい態様において、その生物学的試料は血液である。当技術で既知であるように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常は複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の2つの最も一般的な種類は、プリン類およびピリミジン類である。ヌクレオチドは、さらにヌクレオシドの糖部分に共有結合したホスフェート基を含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖が含まれるヌクレオシドに関して、そのホスフェート基はその糖の2’、3’または5’ヒドロキシル部分のいずれかに結合していることができる。ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド、より一般的には本明細書においてオリゴマー化合物またはポリヌクレオチドと表され、より一般的にはポリマー化合物と表されるものの単量体単位である。上記のものに関する別の一般的な表現は、デオキシリボ核酸DNAおよびリボ核酸RNAである。本発明によれば、オリゴマー化合物は単量体単位からなる化合物であり、それはヌクレオチドのみ、または非天然化合物下記参照、より具体的には修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体もしくは非ヌクレオチド化合物のみ、またはそれらの組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、本発明の文脈においてオリゴマー化合物の亜集団である。この発明の文脈において、用語オリゴヌクレオチドは、単量体単位としての複数のヌクレオチドから形成されたポリヌクレオチドを指し、すなわち、オリゴヌクレオチドは、単量体単位を有するリボ核酸RNAおよびデオキシリボ核酸DNAのオリゴマー化合物またはポリマー化合物の特定の亜集団に属する。そのホスフェート基は一般にそのオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成するものとして言及される。RNAおよびDNAの通常の結合または主鎖は、3’から5’へのホスホジエステル結合である。本発明に従うオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチド下記参照は、主に当技術で記述されており当業者に既知であるように合成することができる。特定の配列のオリゴマー化合物を調製するための方法は当技術で既知であり、それには例えば適切な配列のクローニングおよび制限処理restriction、ならびに直接的な化学合成が含まれる。化学合成法には、例えばNarangSAetalMethodsinEnzymology689098により記述されたホスホトリエステル法、BrownELetalMethodsinEnzymology68109151により開示されたホスホジエステル法、BeaucageetalTetrahedronLetters221859において開示されたホスホルアミダイト法、GareggetalChemScr25280282において開示されたH-ホスホネート法、および米国特許第4458066号において開示された固体支持体法が含まれてよい。上記で記述した方法に関して、その核酸は二本鎖または一本鎖の形で存在することができ、それによりその二本鎖核酸はその方法が実施される前に加熱により変性しすなわち熱変性、すなわち一本鎖になる。別の態様において、プライマーおよび/またはそのプローブは化学的に修飾されてよく、すなわちそのプライマーおよび/またはそのプローブは修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む。そのプローブまたはそのプライマーは、従って修飾オリゴヌクレオチドである。修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体はいくつかの修飾により天然のヌクレオチドと異なるが、なお塩基、ペントフラノシル糖、ホスフェート部分、塩基様、ペントフラノシル糖様およびホスフェート様の部分、またはそれらの組み合わせからなる。例えば、標識をヌクレオチドの塩基部分に結合させることができ、それにより修飾ヌクレオチドが得られる。ヌクレオチド中の天然塩基を例えば7-デアザプリンにより置き換えることもでき、それによっても修飾ヌクレオチドが得られる。用語修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、本出願において互換的に用いられる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、上記で修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に関して概説したような様式でのいくつかの修飾により天然のヌクレオシドと異なる。非ヌクレオチド化合物は天然のヌクレオチドと異なるが、それはこの発明の意味においてなお-ヌクレオチドと同様に-オリゴマー化合物の単量体単位であることができる。従って、非ヌクレオチド化合物はヌクレオチドと共にオリゴマー化合物を形成することができなければならない。さらに非ヌクレオチド化合物は塩基様、ペントフラノシル糖様またはホスフェート様の部分を含有することができるが、それらの全てが非ヌクレオチド化合物中に同時に存在するわけではない。修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体はオリゴマー化合物の別の特定の亜集団に属し、1個以上のヌクレオチド、1個以上の非ヌクレオチド化合物または修飾ヌクレオチドを単量体単位として有する。従って、用語修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は実質的にオリゴヌクレオチドに類似した様式で機能する構造を指し、本出願全体にわたって互換的に用いられている。合成の視点から、修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、例えばホスフェート主鎖、リボース単位またはヌクレオチド塩基の適切な修飾によるオリゴヌクレオチドの化学修飾により作ることができる543VermaSandEcksteinFAnnuRevBiochem6799134。代表的な修飾には、ホスホジエステルヌクレオシド間結合の代わりのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステルもしくはホスホルアミデートヌクレオシド間結合;天然のプリンおよびピリミジン塩基の代わりにデアザ-もしくはアザ-プリンおよび-ピリミジン、5もしくは6位に置換基を有するピリミジン塩基;2、6もしくは8位もしくは7位7-デアザプリン類としてに変更された置換基を有するプリン塩基;アルキル-、アルケニル-、アルキニルもしくはアリール部分、例えば低級アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、もしくはフェニル、ベンジル、ナフチルのようなアリール基を有する塩基;例えばそれらの2’位に置換基を有する糖類;または炭素環式もしくは非環式の糖類似体が含まれる。この発明の精神と調和する他の修飾は、当業者には既知である。そのような修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、天然のオリゴヌクレオチドまたは天然の線に沿った合成オリゴヌクレオチドと機能的に互換性があるが構造的に異なるものとして最もよく記述される。より詳細には、典型的な修飾がVermaSandEcksteinFAnnuRevBiochem6799134またはWO0212263において開示されている。加えて、ヌクレオシド単位がヌクレオシド間ホスフェートまたは糖ホスフェート結合の代わりをする基を通して連結されている修飾を行うことができる。そのような結合には、VermaSandEcksteinFAnnuRevBiochem6799134において開示されている結合が含まれる。ヌクレオシド単位を連結するためにホスフェート結合以外が利用される場合、そのような構造もオリゴヌクレオシドと記述されてきた。核酸および標的核酸または微生物核酸は、当業者に既知であるようなヌクレオチドのポリマー化合物である。標的核酸または微生物核酸は、本明細書において、分析されるべき試料中の核酸、すなわち試料中のその存在、非存在および/または量を決定するべき核酸を意味するように用いられる。従って、この場合はその核酸が標的であり、従って標的核酸と表すこともできる。本発明によれば、その標的核酸は微生物由来であるため、その標的核酸は微生物核酸とも呼ばれる。例えば、血液がHCVを含有しているかどうかを決定しなければならない場合、その標的核酸または微生物核酸はHCVの核酸である。微生物はあらゆるウイルス、細菌、古細菌archaean、真菌またはあらゆる単細胞真核生物を意味する。微生物のは、微生物に由来する、または属することを意味する。検出するは、特定の対象、例えば標的またはシグナルの存在または非存在を決定することを意味する。定量化するは、特定の対象、例えば標的またはシグナルの量を決定することを意味する。測定するは、特定の対象、例えば標的またはシグナルの少なくとも相対的な値を決定することを意味する。第1および第2対照核酸を用いる本発明の特定の態様の意味において、その第1対照核酸は内部定量標準核酸としての役目を果たす。内部定量標準核酸は核酸であり、従って当業者に既知であるようなヌクレオチドのポリマー化合物である。内部定量標準核酸の場合では、その核酸は同時にその反応の有効性に関する対照として、および定量するための、すなわちその標的核酸または微生物核酸の量を決定するための基準として用いるのに適切であり、そのように用いられる。この目的に関して、その内部定量標準核酸はその標的核酸または微生物核酸と一緒に全ての可能性のある試料調製工程を経る。さらに、それはその方法全体を通してその同じ反応混合物内で処理される。その内部定量標準核酸は、直接または間接的に、その標的核酸の存在下または非存在下の両方において検出可能なシグナルを生成しなければならない。この目的に関して、その内部定量標準核酸の濃度は、それぞれの試験において、感度を損なわないように、しかし例えば非常に高い標的濃度においても検出可能なシグナルを生成するように、注意深く最適化されなければならない。好ましくは、その内部定量標準核酸、すなわちその第1対照核酸に関する濃度範囲は、反応あたり100コピー~反応あたり100000コピーの範囲を含むであろう。その内部定量標準核酸の可能性のある濃度は、例えばHIVに関して:1000コピー/反応、HCVに関して:7500コピー/反応であってよいが、これらの濃度は当業者に既知であるようにその特定のアッセイに適合されてよい。そのそれぞれのアッセイの検出限界LODの点では、その内部定量標準核酸に関する濃度範囲は好ましくは20~5000×LOD、より好ましくは20~1000×LOD、最も好ましくは20~500×LODである。反応混合物中のその内部定量標準核酸の終濃度は、成し遂げられる定量的測定範囲に依存する。その内部定量標準核酸は、例えばDNA、RNAまたはPNA、armoredDNAまたはarmoredRNA、およびそれらの修飾された形態であることができる。さらに、本発明の意味において、その第2対照核酸は定性的内部対照核酸としての役目を果たす。定性的内部対照核酸は、定性的検出アッセイの試験結果の有効性を確証するために特に重要である:少なくとも陰性の結果の場合では、その定性的内部対照核酸が検出されなければならず、そうでなければその試験自体が機能していないと考えられる。しかし、定性的構成において、陽性の結果の場合にはその定性的内部対照核酸は必ずしも検出されなければならないわけではない。定性試験に関して、その反応の感度が保証されており、従って厳密に制御されていることが重要である。結果として、その定性的内部対照核酸の濃度は、わずかな阻害の状況においてさえもその試験が無効であると考えられるように、比較的低くなければならない。それは、それぞれのアッセイおよびその感度に注意深く適合させなければならない。好ましくは、その定性的内部核酸、すなわちその第2対照核酸に関する濃度範囲は、反応あたり1コピー~反応あたり1000コピーの範囲を含む。そのそれぞれのアッセイの検出限界LODに関して、それの濃度は好ましくはアッセイのLOD~そのLODの25倍の値である。より好ましくは、それは2×~20×LOD、または2×~15×LOD、または2×~10×LODである。さらにもっと好ましくは、それは3×~7×LODである。検出限界またはLODは、予め定められたヒット率hitrateを有する試料中の核酸の最も低い検出可能な量または濃度を意味する。低いLODは高感度に相当し、高いLODは低感度に相当する。そのLODは通常は、特にその核酸がウイルス核酸である場合には単位cp/mlにより、またはIU/mlとしてのどちらかで表される。cp/mlはミリリットルあたりのコピー数を意味し、ここでコピーはそれぞれの核酸のコピーである。IU/mlは国際単位/mlを表し、WHO標準を指す。標的に応じて、臨床的分子診断アッセイにおけるLODの値は典型的には1000cp/ml未満である。好ましくは、本発明の状況において実施されるアッセイにおけるLODは1~500cp/mlである。LOCを計算するための広く用いられている方法は、プロビット分析である。それは、刺激用量および量子的quantal全か無か応答の間の関係を分析する方法である。典型的な量子的応答実験において、動物のグループに異なる用量の薬物を与える。それぞれの用量レベルでの死亡パーセントを記録する。次いで、これらのデータをプロビット分析を用いて分析することができる。プロビットモデルは、応答パーセントが累積正規分布として用量の対数と関連していると仮定する。すなわち、用量の対数は、その累積正規から死亡パーセントを読み取るための変数として用いることができる。他の確率分布ではなくその正規分布を用いることは、可能な用量の高い終端および低い終端において予測される応答率に影響を及ぼすが、中央付近ではほとんど影響を有しない。プロビット分析は、異なるヒット率で適用され得る。当技術で既知であるように、ヒット率は一般にパーセント[]で表され、分析物の特定の濃度における陽性結果の百分率を示す。従って、例えば、LODを95ヒット率で測定でき、これは、そのLODは有効な結果の95が陽性である設定に関して計算されることを意味する。用語プライマーは、本明細書において当業者に既知であるように用いられ、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるDNA合成を始動させるprimeことができる修飾オリゴヌクレオチド、すなわち、例えばそのオリゴヌクレオチドの3’末端が遊離3’-OH基を提供し、それにさらなるヌクレオチドが鋳型依存性DNAポリメラーゼにより結合されて、3’から5’へのホスホジエステル結合が確立され、それによりデオキシヌクレオシド三リン酸が用いられ、それによりピロホスフェートが放出されるものも指す。用語プローブも本発明の文脈においてオリゴヌクレオチドであるが、以下の特定の機能を有する:それは反応混合物中の他の核酸に、好ましくはそれらの検出を可能にするためにハイブリダイズする。従って、好ましくはそれらのプローブは特定の核酸に特異的に結合する。プローブは好ましくは少なくとも1個の標識を有する。プローブは例えば異なる色素で、そのそれぞれのプローブを互いに独立して検出および測定できるように標識することができる。しばしばレポーター基と呼ばれる標識は、一般に核酸、特にオリゴマー化合物または修飾オリゴヌクレオチドおよびそれに結合したあらゆる核酸をその試料の残りの部分から識別可能にする基である標識が結合している核酸は、標識した核酸結合化合物、標識プローブまたは単にプローブと呼ぶこともできる。本発明に従う好ましい標識は蛍光標識であり、それは例えばフルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、およびクマリン色素のような蛍光色素である。本発明に従う好ましい蛍光色素は、FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan、CY5.5、LC-Red640、LC-Red705である。上記で記述した方法に関して、その核酸は二本鎖または一本鎖の形で存在することができ、それによりその二本鎖核酸はその方法が実施される前に加熱により変性しすなわち熱変性、すなわち一本鎖になる。別の好ましい態様において、プライマーおよび/またはプローブは化学的に修飾されてよく、すなわちそのプライマーおよび/またはそのプローブは修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む。そのプローブまたはそのプライマーは、従って修飾オリゴヌクレオチドである。検出可能なシグナルは、微生物核酸、内部対照核酸または定性的標準核酸のような化合物により生成され、その化合物をその試料の残りの部分から識別可能にするシグナルである。本発明によれば、前記の検出可能なシグナルは定量化することができ、または定性的様式で分析することができる。検出可能なシグナルは、例えば放射性であり、または発光シグナルのように光学的であることができる。本発明に従う好ましい検出可能なシグナルは、蛍光色素により放出される蛍光シグナルである。PCR反応の阻害または抑制は、試料の大部分において観察される標準的な反応と比較してより効率の低いPCR反応を意味する。その阻害または抑制作用は、対照および/または標的に関する増殖曲線の低減した蛍光レベルにおいて、遅延したCT値において、その増殖曲線の傾きの変化において、その反応特性の転換点または他の特徴における変化においてのいずれかで見ることができる。その阻害または抑制作用は、変化した試料調製の有効性、試料に関連する作用、可能性がありそしてしばしば予測できないその増幅および/または検出反応を阻害する因子の存在、ならびに他の理由の結果もたらされ得る。従って、抽出手順の不成功または他の試料に基づく要因により試料が陰性と判定される一方で検出および定量化されるべき微生物核酸が実際にはその試料中に存在することがある可能性がある。生成することは、直接または間接的にもたらすことを意味する。従って、検出可能なシグナルの文脈において、生成することは、例えば蛍光シグナルを放出する蛍光色素の場合において直接もたらすこと、または誘発することもしくは誘導することの意味で間接的にもたらすことを意味することができる;例えば、蛍光色素などの標識により、または蛍光色素などの標識を有する核酸プローブにより、検出可能なシグナルを生成する微生物核酸。当業者に既知であるように、プライマーおよびプローブの文脈における用語特異的なまたは特異的にハイブリダイズするは、別個の核酸に特異的なプライマーまたはプローブがストリンジェントな条件下でその核酸に結合するという意味を含む。好ましくは、本発明に従う方法において用いられるプライマーおよびプローブは、その微生物核酸および/またはその第1および第2対照核酸の配列の一部と少なくとも80同一である。ポリメラーゼ連鎖反応PCRは、数ある参考文献の中でも米国特許第4683202号、第4683195号、第4800159号、および第4965188号において開示されており、本発明に従う方法に用いられる最も好ましい核酸増幅技法である。PCRは典型的には選択された核酸鋳型例えば、DNAまたはRNAに結合する2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。本発明において有用なプライマーには、微生物核酸または定量標準核酸の核酸配列内で核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドが含まれる。プライマーは一般に用いられる方法による制限消化物から精製することができ、またはそれは合成により生成することができる。そのプライマーは好ましくは増幅における最大効率のために一本鎖であるが、プライマーは二本鎖であることができる。二本鎖プライマーをまず変性させ、すなわち鎖を分離するための処理をする。二本鎖核酸の変性の1つの方法は加熱によるものである。熱安定性ポリメラーゼは熱安定性であるポリメラーゼ酵素であり、すなわちそれは、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性が達成されるのに必要な時間、高温にさらされた際に、不可逆的に変性することがない酵素である。一般に、その合成はそれぞれのプライマーの3’末端において開始され、その鋳型鎖に沿って5’から3’への方向に進行する。熱安定性ポリメラーゼは、サーマスフラバスThermusflavus、T.ルベールT.ruber、T.サーモフィラスT.thermophilus、T.アクアチカスT.aquaticus、T.ラクテウスT.lacteus、T.ルーベンスT.rubens、バチルスステアロサーモフィラスBacillusstearothermophilus、およびメタノサーマスフェルビダスMethanothermusfervidusから単離されてきた。それでもなお、熱安定性でないポリメラーゼも、その酵素が補充されるならば、PCRアッセイにおいて用いることができる。鋳型核酸が二本鎖である場合、それをPCRにおいて鋳型として用いることができる前に、2つの鎖を分離する必要がある。鎖の分離は、物理的、化学的または酵素的手段を含めたあらゆる適当な変性法により成し遂げることができる。それらの核酸鎖を分離する1つの方法は、その核酸をそれが大部分変性される例えば、50、60、70、80、90または95より多くが変性されるまで加熱することを伴う。鋳型核酸を変性させるために必要な加熱条件は、例えば緩衝塩濃度ならびに変性させる核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するであろうが、典型的には、温度および核酸の長さなどの反応の特徴に応じた時間、約90°Cから約105°Cまでの範囲である。変性は典型的には約3秒~4分例えば5秒~2分30秒、または10秒~1.5分実施される。二本鎖鋳型核酸を熱により変性させる場合、その反応混合物を、それぞれのプライマーが前記の微生物核酸および/または内部標準核酸上のそれの標的配列にアニーリングするのを促進する温度まで冷却させる。アニーリングの温度は、通常は約35°Cから約75°Cまで例えば約40°Cから約70°Cまで;約45°Cから約66°Cまでである。アニーリングの時間は、約5秒から約1分まで例えば、約10秒から約50秒まで;約15秒から約40秒までであることができる。次いでその反応混合物を、前記ポリメラーゼの活性が促進または最適化される温度、すなわちそのアニーリングしたプライマーから伸長が起きて前記の微生物核酸および/または内部標準核酸に相補的な産物が生成されるのに十分な温度に調節する。その温度は、核酸鋳型にアニーリングしているそれぞれのプライマーから伸長産物が合成されるのに十分であるべきだが、伸長産物をそれの相補的な鋳型から変性させるほど高くてはならない例えば、その伸長のための温度は一般に約35°から80°Cまで例えば、約40°Cから約75°Cまで;約45°Cから約72°Cまでの範囲である。伸長時間は、約5秒から約5分まで例えば約10秒から約3分まで;約15秒から約2分まで;約20秒から約1分までであることができる。新たに合成された鎖は二本鎖分子を形成し、それは次の反応工程で用いられ得る。鎖分離、アニーリング、および伸長の工程は、その微生物核酸および/または内部標準核酸に対応する望まれる量の増幅産物が生成されるのに必要なだけ多く繰り返すことができる。その反応における制限要因は、その反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシド三リン酸の量である。そのサイクル工程すなわち、変性、アニーリング、および伸長は、好ましくは少なくとも1回繰り返される。検出における使用に関して、サイクル工程の回数は、例えばその試料の性質に依存するであろう。その試料が核酸の複雑な混合物である場合、検出に十分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクル工程が必要とされるであろう。一般にそのサイクル工程を少なくとも約20回繰り返すが、40回、60回、さらに100回ほどの多数回、繰り返してもよい。PCRとは別の核酸増幅反応には、リガーゼ連鎖反応LCR;WuDYandWallaceRBGenomics456069;およびBaranyFProcNatlAcadSciUSA88189193;ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応BaranyFPCRMethodsandApplic1516;Gap-LCRWO9001069;修復連鎖反応EP0439182A2、3SRKwohDYetalProcNatlAcadSciUSA8611731177GuatelliJCetalProcNatlAcadSciUSA8718741878WO9208808、およびNASBA米国特許第5130238号が含まれる。さらに、鎖置換増幅SDA、転写媒介性増幅TMA、およびQ-ベータ-増幅総説に関して、例えばWhelenACandPersingDHAnnuRevMicrobiol50349373AbramsonRDandMyersTWCurrOpinBiotechnol44147を参照がある。適切な核酸検出方法は当業者に既知であり、SambrookJetalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressニューヨーク州コールドスプリングハーバー1989、およびAusubelFetalCurrentProtocolsinMolecularBiology1987JWileyandSonsニューヨークのような標準的な教科書に記述されている。核酸検出工程を行う前に、例えば沈殿工程のようなさらなる精製工程があってもよい。その検出方法には、二本鎖DNAの中にインターカレートし、その後それの蛍光を変化させるエチジウムブロミドのような、特異的な色素の結合またはインターカレーションが含まれてよいが、それに限定されない。その精製された核酸を、場合により制限消化した後に電気泳動法により分離し、その後、可視化することもできる。特定の配列に対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびそれに続くそのハイブリッドの検出を利用する、プローブに基づくアッセイもある。当業者に既知のさらなる工程の後にその核酸を配列決定することも可能である。好ましい鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、Z05DNAポリメラーゼおよびその変異体である。本発明において有用な他の鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、TaqポリメラーゼおよびTthポリメラーゼである。本発明に従う方法に有用なさらに他の核酸ポリメラーゼは、当業者には既知である。本発明の状況において、その微生物核酸およびその対照核酸のそれぞれは、それらを検出の間に互いから識別可能にするために、異なる標識を有する異なるプローブに結合する。従って、前記の異なるプローブは、好ましくは異なる蛍光色素を有し、異なる波長の蛍光を放射する。これらの異なる蛍光シグナルは、好都合には、リアルタイムPCRを実施するためのほとんどの装置において用いられているような蛍光検出器の異なるチャンネルで互いに独立して検出することができる。やはり好ましくは、その微生物核酸、第1対照核酸および第2対照核酸に関する結果は、1つのディスプレイ上で異なるマスクで、または異なるディスプレイにおいて可視化される。本発明の意味において、核酸の精製、単離または抽出は以下のことに関する:核酸を上記で言及したアッセイの内の1種類において分析できる前に、それらは異なる構成要素の複雑な混合物を含有する生物学的試料から精製、単離または抽出されなければならない。しばしば、その第1工程に関して、その核酸の濃縮を可能にするプロセスが用いられる。細胞またはウイルス粒子の内容物を放出させるために、それらを酵素で、または化学物質で処理して、その細胞壁またはウイルス粒子を溶かす、分解する、または変性させることができる。このプロセスは、一般に溶解と呼ばれる。そのような溶解された物質を含有する、結果として得られた溶液は、溶解物と呼ばれる。溶解の間にしばしば直面する問題は、目的の構成要素を分解する他の酵素、例えば核酸を分解するデオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼが溶解手順の間に目的の構成要素と接触することである。これらの分解酵素は細胞外にも存在する可能性があり、または溶解前に異なる細胞区画中に空間的に分離されていた可能性がある。溶解が起こるにつれて、目的の構成要素が前記の分解酵素に曝露されるようになる。このプロセスの間に放出される他の構成要素は、例えば、リポ多糖類のファミリーに属し、細胞に対して毒性であり、ヒトまたは動物の療法において用いることが意図される生成物に問題を引き起こし得るエンドトキシンである可能性がある。上記で言及した問題に取り組むための様々な手段が存在する。核酸を遊離させることを意図する場合、カオトロピック剤、例えばチオシアン酸グアニジン、または陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性もしくは非イオン性界面活性剤を用いるのが一般的である。前に記述した酵素または望まれないタンパク質を急速に分解するプロテアーゼを用いるのも好都合である。しかし、これは前記の物質または酵素が後の工程で試薬または構成要素を妨げ得るという別の問題を生じさせる可能性がある。そのような溶解または上記で言及した試料調製プロセスにおいて好都合に用いることができる酵素は、タンパク質基質中のアミド結合を切断し、プロテアーゼ類または互換的にペプチダーゼ類として分類される酵素であるWalsh1979EnzymaticReactionMechanismsWHFreemanandCompanyサンフランシスコ第3章参照。先行技術で用いられているプロテアーゼ類は、アルカリ性プロテアーゼ類WO9804730または酸性プロテアーゼ類米国特許第5386024号を含む。先行技術において核酸の単離における試料調製に広く用いられてきたプロテアーゼは、中性pH付近で活性であり、当業者にサブチリシンとして知られているプロテアーゼのファミリーに属する、トリチラキウムアルバムTritirachiumalbumからのプロテイナーゼKである例えば、SambrookJetalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressニューヨーク州コールドスプリングハーバー1989参照。高アルカリ性および高温の両方においてその活性を保持する強いプロテアーゼである酵素エスペラーゼは、上記で言及した溶解または試料調製プロセスにおける使用に特に好都合であるEP1201753。溶解工程の後の試料調製工程において、目的の構成要素がさらに濃縮される。目的の非タンパク質性構成要素が例えば核酸である場合、それらは通常はそれらがプローブに基づくアッセイにおいて用いられる前にその複雑な溶解混合物から抽出される。核酸の精製のためのいくつかの方法が存在する:-例えば以下のような、配列依存性の、または生体分子特異的なbiospecific方法:親和性クロマトグラフィー固定された捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダーゼーション-例えば以下のような、配列非依存性の、または物理化学的な方法例えばフェノール-クロロホルムによる液体-液体抽出例えば純粋なエタノールによる沈殿濾紙による抽出セチル-トリメチル-アンモニウム-ブロミドのようなミセル形成剤による抽出固定されたインターカレートする色素、例えばアクリジン誘導体への結合シリカゲルまたは珪藻土diatomicearthsへの吸着カオトロピック条件下での磁性ガラス粒子MGPまたはオルガノシラン粒子への吸着。他の表面が可能であるが、ガラス表面への核酸の吸着は精製目的で特に興味深い。核酸がガラス表面に結合する挙動を利用して核酸を天然の環境から単離するための多くの手順が近年提案されてきた。修飾されていない核酸が標的である場合、数ある理由の中でも、その核酸を修飾しなくてもよく、天然の核酸でさえも結合し得るため、シリカ表面を有する物質への核酸の直接結合が好ましい。これらのプロセスは様々な文献により詳細に記述されている。例えば、VogelsteinBetalProcNatlAcadUSA766159において、核酸をヨウ化ナトリウムの存在下でアガロースゲルから粉砕フリントガラスに結合させるための手順が提案されている。プラスミドDNAを細菌からガラス粉上で過塩素酸ナトリウムの存在下で精製することが、MarkoMAetalAnalBiochem121382387において記述されている。DEA3734442において、酢酸を用いたファージ粒子の沈殿およびペルクロレートによるファージ粒子の溶解による、ガラス繊維フィルター上での一本鎖M13ファージDNAの単離が記述されている。ガラス繊維フィルターに結合した核酸を洗浄し、次いでメタノール含有トリス/EDTA緩衝液で溶離する。ラムダファージからDNAを精製するための類似の手順が、JakobiRetalAnalBiochem175196201において記述されている。その手順は、カオトロピック塩溶液中でのガラス表面への核酸の選択的結合、およびアガロース、タンパク質または細胞残留物のような夾雑物からの核酸の分離を伴う。ガラス粒子を夾雑物から分離するために、その粒子を遠心分離するか、または流体をガラス繊維フィルターを通して吸引するかのどちらかで処理することができる。しかし、これはその手順が大量の試料を処理するために用いられることを妨げる制限的な工程である。塩およびエタノールを添加することにより沈殿させた後の核酸を固定するための磁性粒子の使用はより好都合であり、例えばAldertonRPetalSAnalBiochem201166169およびPCTGB9100212において記述されている。この手順では、核酸を磁性粒子と共に凝集させる。その凝集物を、磁場をかけて洗浄工程を行なうことにより元の溶媒から分離する。1回の洗浄工程の後、その核酸をトリス緩衝液に溶解させる。しかし、この手順はその沈殿が核酸に選択的でないという点で不都合を有する。それどころか、様々な固体および溶解した物質も同様に凝集される。その結果、この手順は、存在する可能性があるかなりの量の、特異的な酵素反応のあらゆる阻害物質を除去するためには用いることができない。多孔質の特定のガラス母材中に磁性粒子を含有し、ストレプトアビジンを含有する層で覆われた磁性多孔質ガラスも、市場で入手可能である。この製品は、生物学的物質が複雑な調製工程においてそれらがビオチンに共有結合するように修飾される場合、生物学的物質、例えば、タンパク質または核酸を単離するために用いることができる。磁化可能な特定の吸着体は、非常に効率的であり、自動化された試料調製に適していることが証明された。フェリ磁性および強磁性ならびに超常磁性顔料がこの目的のために用いられる。最も好ましいMGP、および磁性ガラス粒子を用いる方法は、WO0137291において記述されている方法である。本発明の状況で核酸の単離に特に有用なのは、RBoometal495503に従う方法である。標的核酸が含まれる核酸をそれらの天然環境から精製および単離した後、その標的核酸を検出することができる。1態様において、本発明の方法には夾雑を避けるための工程が含まれる。例えば、1回のサーマルサイクラーの運転と次の運転の間で夾雑を低減または排除するための、ウラシル-DNAグリコシラーゼを利用する酵素的方法が、米国特許第5035996号、第5683896号および第5945313号において記述されている。加えて、本発明の方法を実施する際には、標準的な実験室封じ込めの実施および手順が望ましい。封じ込めの実施および手順には、方法の異なる工程に関する別々の作業領域、封じ込めフード、バリアーフイルターピペットティップ、および専用の空気置換airdisplacementピペットが含まれるが、それらに限定されない。人員による一貫した封じ込めの実施および手順が、臨床試料を取り扱う診断実験室における正確さのために必要である。上記で述べた方法は、好ましくはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分の間の蛍光共鳴エネルギー転移FRETに基づく。代表的なドナー蛍光部分はフルオレセインであり、代表的な対応するアクセプター蛍光部分にはLC-Red640、LC-Red705、Cy5、およびCy5.5が含まれる。典型的には、その検出工程にはそのドナー蛍光部分により吸収される波長で試料を励起すること、およびその対応するアクセプター蛍光部分により放射される波長を可視化および/または測定することが含まれる。本発明によれば、その検出の後にFRETの定量化が行なわれる。好ましくは、その検出工程はそれぞれのサイクル工程の後に実施される。最も好ましくは、その検出工程はリアルタイムで実施される。商業的に入手可能なリアルタイムPCR機器例えば、LightCycler商標またはTaqMan登録商標を用いることにより、PCR増幅およびその増幅産物の検出を単一の密閉された反応区画、例えばキュベット中で組み合わせることができ、サイクル時間が劇的に低減する。検出が増幅と同時に起こるため、リアルタイムPCR法では増幅産物の操作に関する必要性が省かれ、増幅産物間の交差汚染の危険性が減少する。リアルタイムPCRは処理時間を大きく低減し、臨床実験室における従来のPCR技術の魅力的な代替法である。以下の特許出願は、LightCycler商標技術において用いられるようなリアルタイムPCRを記述している:WO9746707、WO9746714およびWO9746712。LightCycler商標機器は高品質光学系を利用する微量蛍光光度計と組み合わせられた迅速なサーマルサイクラーである。この迅速な熱サイクル技法は、反応容器として薄いガラスキュベットを用いる。反応チャンバーの加熱および冷却は、加熱された空気および周囲の空気を交互に用いることにより制御される。低質量の空気およびキュベットの容量に対して高い割合の表面積のために、その熱チャンバー内で非常に迅速な温度交換速度を達成することができる。TaqMan登録商標技術は、2種類の蛍光部分で標識された一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第1の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、その吸収されたエネルギーはFRETの原理に従って第2の蛍光部分に移される。その第2の蛍光部分は一般にクエンチャー分子である。この形式において用いられる典型的な蛍光色素は、例えば、とりわけFAM、HEX、CY5、JA270、CyanおよびCY5.5である。PCR反応のアニーリング工程の間に、その標識されたハイブリダイゼーションプローブは標的核酸すなわち増幅産物に結合し、それに続く伸長段階の間に、Taqまたは当業者に既知の別の適切なポリメラーゼ、例えば好ましいZ05ポリメラーゼの5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性により分解される。結果として、その励起された蛍光部分およびクエンチャー部分は空間的に互いから分離された状態になる。結果として、クエンチャーの非存在下で第1の蛍光部分が励起された際に、その第1の蛍光部分からの蛍光放射を検出することができる。上記の両方の検出形式において、その放出されたシグナルの強度を元の標的核酸分子の数と相関させることができる。FRETの代替法として、増幅産物を蛍光DNA結合色素例えばSYBRGREENI登録商標またはSYBRGOLD登録商標MolecularProbesのような二本鎖DNA結合色素を用いて検出することができる。二本鎖核酸との相互作用の際に、そのような蛍光DNA結合色素は適当な波長の光により励起された後に蛍光シグナルを放射する。核酸にインターカレートする色素のような二本鎖DNA結合色素を用いることもできる。二本鎖DNA結合色素を用いる場合、通常、増幅産物の存在の確認のために融解曲線分析が実施される。FRETと関連する分子ビーコンも、本発明のリアルタイムPCR法を用いる増幅産物の存在の検出のために用いることができる。分子ビーコン技術は、第1の蛍光部分および第2の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを用いる。その第2の蛍光部分は一般にクエンチャーであり、その蛍光標識は典型的にはそのプローブのそれぞれの末端に位置する。分子ビーコン技術は、二次構造形成例えばヘアピンを可能にする配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを用いる。プローブ内での二次構造形成の結果として、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部分は空間的に近くにある。増幅産物へのハイブリダイゼーションの後、そのプローブの二次構造は壊され、その蛍光部分は互いから分離された状態になり、従って適切な波長の光での励起後にその第1の蛍光部分の放射を検出することができる。従って、本発明に従う好ましい方法は上記で記述したFRETを用いる方法であり、ここで前記のプローブは、前記の第1および第2の蛍光部分の間の空間的近接を可能にする核酸配列を含む。効率的なFRETは、その蛍光部分が直接局所的に近くにある場合で、かつそのドナー蛍光部分の放射スペクトルがそのアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重複する場合にのみ起こり得る。従って、本発明の好ましい態様において、前記のドナーおよびアクセプター蛍光部分は、前記プローブ上で互いに5ヌクレオチドより大きくない範囲内にある。さらに好ましい態様において、前記のアクセプター蛍光部分はクエンチャーである。上記のように、TaqMan形式では、PCR反応のアニーリング工程の間にその標識されたハイブリダイゼーションプローブがその標的核酸すなわち増幅産物に結合し、それに続く伸長段階の間にTaqまたは当業者に既知の別の適切なポリメラーゼ、例えば好ましいZ05ポリメラーゼの5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性により分解される。従って、好ましい態様において、本発明に従う方法では、5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を増幅に用いる。本発明に従う方法は、ウイルス核酸に好都合に適用することができる。従って、本発明の好ましい態様において、その微生物核酸はウイルス核酸である。ウイルス核酸の中でも、本発明に従う方法はHCVに好都合に適用することができる。従って、本発明の好ましい態様において、その微生物核酸はHCVの核酸である。しかし、本発明はあらゆる他の微生物核酸にも適用することができることは理解されなければならない。どのようにして内部標準に基づくTaqMan形式での定量結果の計算を行うかの例を以下で記述する。全PCR運転からの機器補正蛍光値の入力データから力価を計算する。標的核酸、例えば微生物核酸、および内部定量標準核酸の役目を果たす第1対照核酸を含有する試料のセットに対して、指定されたような温度プロフィールを用いるサーマルサイクラー上でPCRを行う。そのPCRプロフィールの間の選択された温度および時間において、試料に濾波された光を照射し、それぞれの試料に関してその標的核酸およびその内部定量標準核酸に関する濾波された蛍光データを収集する。PCR運転が完了した後、その蛍光読み取り値を処理して、その内部定量標準核酸に関する1セットの色素濃度データおよびその標的核酸に関する1セットの色素濃度データを得る。色素濃度データのそれぞれのセットを同じ様式で処理する。いくつかの妥当性plausibilityチェックの後、その内部定量標準核酸およびその標的核酸に関してエルボーelbow値CTを計算する。エルボー値は、その標的核酸またはその内部定量標準核酸の蛍光が予め定められた閾値蛍光濃度と交差する点として定義される。力価の決定は、その標的核酸およびその内部定量標準核酸が同じ効率で増幅されるという仮定、ならびに計算されたエルボー値において等量の標的核酸および定量標準核酸のアンプリコンのコピーが増幅され、検出されるという仮定に基づく。従って、CTQS-CT標的は、log標的濃度/QS濃度に対して線形であり、ここでQSはその内部定量標準核酸を表す。次いで、例えば以下の方程式:T’=10aCTQS-CT標的2bCTQS-CT標的cにおけるような多項較正式を用いることにより、その力価Tを計算することができる。この多項式の定数およびその内部定量標準核酸の濃度は既知であり、従ってその式の中の唯一の変数は差CTQS-CT標的である。どのようにしてTaqManにおける定性的結果の計算を行うかの例を以下で記述する:全PCR運転からの機器補正蛍光値の入力データを分析する。おそらく標的核酸、例えば微生物核酸、および定性的内部対照核酸の役目を果たす対照核酸を含有する試料のセットに対して、指定されたような温度プロフィールを用いるサーマルサイクラー上でPCRを行う。そのPCRプロフィールの間の選択された温度および時間において、試料に濾波された光を照射し、それぞれの試料に関してその標的核酸およびその定性的内部対照核酸に関する濾波された蛍光データを収集する。PCR運転が完了した後、その蛍光読み取り値を処理して、その定性的内部対照核酸に関する1セットの色素濃度データおよびその標的核酸に関する1セットの色素濃度データを得る。色素濃度データのそれぞれのセットを同じ様式で処理する。その定性的内部対照核酸および存在するならばその標的核酸に関してエルボー値CTを計算する。エルボー値は、その標的核酸またはその内部定量標準核酸の蛍光が予め定められた閾値蛍光濃度と交差する点として定義される。その定性的内部対照は、指定された範囲内のCTが得られ、かつその蛍光が予め定められた最小蛍光強度を上回る場合、有効である。標的CTが得られない場合、その定性的内部対照は有効でなければならない。標的CTが得られた場合、それはその試料中の標的核酸の存在を示し、その定性的内部対照は有効または無効どちらであってもよい。上記の方法のいずれも本発明の意味において好ましく、ここで前記の第1および前記の第2対照核酸は1つの対照試薬内で提供される。信頼できる定性的検出のために、および同時に信頼できる定量のために、異なる濃度の第1および第2対照核酸を含む対照試薬の概念は、微生物核酸を標的とするあらゆるそれぞれのアッセイに好都合に用いることができる。従って、本発明の別の観点は、微生物核酸をリアルタイムPCRにより同時に検出および定量化するための異なる濃度の第1および第2対照核酸の使用である。上記で記述した使用はさらに好ましく、ここで前記の第1および第2対照核酸は同じプライマーペアまたは異なるプライマーペアにより増幅されるが、異なるプローブにハイブリダイズする。本発明に従う方法におけるこの概念の使用は特に好ましい。従って、別の観点において、本発明は、上記で記述した方法単数または複数に従って微生物核酸を同時に検出および定量化するための異なる濃度の第1および第2対照核酸の使用に関する。本発明は、生物学的試料中の微生物核酸をリアルタイムPCRにより同時に検出および定量化するためのキットも提供し、このキットは異なる濃度の第1および第2対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、ならびに前記の第1および第2対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含み、ここで前記の第1および第2対照核酸は1つの対照試薬内で提供される。好ましい態様において、本発明は、上記で記述した方法のいずれかに従って生物学的試料中の微生物核酸を同時に検出および定量化するためのキットを提供し、このキットは異なる濃度の第1および第2対照核酸、前記の微生物核酸の別個の配列部分に、ならびに前記の第1および第2対照核酸の別個の配列部分に、特異的にハイブリダイズする1種類以上のプライマーペア、ならびにこれらの1種類以上のプライマーペアにより増幅された配列のそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブを含む。本発明のさらに好ましい観点は上記で記述したようなキットであり、ここで前記の第1および第2対照核酸は同じプライマーペアにより増幅されるが異なるプローブにハイブリダイズし、従って競合的構成を提供する。しかし、非競合的または部分的に競合的なアッセイおよびそのそれぞれの方法を実施するためのキットも本発明に含まれることは理解されなければならない。そのようなキットはさらに、当技術で既知であるように、その試料調製手順の間に用いることができるプラスチック製品、例えば96もしくは384ウェル形式のマイクロタイタープレートまたは普通の反応チューブ例えばEppendorfドイツ、ハンブルクにより製造されたもの、および本発明に従う方法を実施するための全ての他の試薬を含んでいてよい。従って、そのキットは追加で核酸への親和性を有する材料を含有することができ、好ましくは核酸への親和性を有する材料はシリカ表面を有する材料を含む。好ましくは、シリカ表面を有する材料はガラスである。最も好ましくは、核酸への親和性を有する材料は磁性ガラス粒子を含む組成物である。そのキットはさらに、または追加で、プロテアーゼ試薬、および細胞の溶解を可能にする、例えばカオトロピック剤、界面活性剤もしくはアルコール類またはそれらの混合物を含有する溶解緩衝液を含むことができる。本発明に従うキットのこれらの構成要素は、チューブまたは保管容器中で別々に提供されてよい。その構成要素の性質に応じて、これらは単一のチューブまたは保管容器中で提供されることすら可能である。そのキットはさらに、または追加で、核酸が磁性ガラス粒子に結合した際のその磁性ガラス粒子の洗浄工程に適した洗浄溶液を含む。この洗浄溶液は、上記で記述したように、エタノールおよび/またはカオトロピック剤を緩衝液中に含有していてもよく、あるいはエタノールおよび/またはカオトロピック剤なしの酸性pHを有する溶液であってもよい。しばしば、その洗浄溶液または他の溶液は、使用前に希釈しなければならない原液として提供される。そのキットはさらに、または追加で、溶離液または溶離緩衝液、すなわちその磁性ガラス粒子に結合した核酸を溶離するための溶液または緩衝液例えば10mMトリス、1mMEDTA、pH8.0または純水を含んでいてよい。さらに、核酸の精製プロセスのために用いることができる追加の試薬または緩衝液も存在していてよい。好ましくは、そのキットは5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を含む。そのキットが逆転写活性を有する酵素を含むことも好ましい。別の好ましい態様において、そのキットは5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性および逆転写活性を有するポリメラーゼ酵素を含む。本発明の好ましい態様において、本発明に従う方法は分析システム内で実施される一連の方法中に組み込まれており、それによって好ましくは自動化可能なプロセスを形成している。従って、本発明の好ましい観点は以下のものである:生物学的試料中の微生物核酸をリアルタイムPCRにより同時に検出および定量化するための分析システムであって、システムは以下のものを含むシステム:-前記の微生物核酸を単離および精製するための溶解緩衝液および容器を含む、試料調製モジュール-その中で上記で記述した方法を実施する反応容器を含む、増幅および検出モジュール-上記のようなキット。その試料調製モジュールは、好都合には、上記で記述した試料調製手順のための構成要素、すなわち、例えば磁性ガラス粒子およびそれらを溶液から分離するための磁石、プロテアーゼ試薬、カオトロピック塩溶液、ならびに粗製の試料および試料調製に必要な試薬を収容する1個以上の容器を含むことができる。その増幅および検出モジュール中の反応容器は、例えばマイクロタイタープレート、遠心分離用バイアル、溶解チューブ、または本発明に従う反応混合物を収容するのに適したあらゆる他のタイプの容器であることができる。本発明の好ましい態様において、その分析システムは、本発明の方法を実施するための試薬を収容する保管モジュールを含む。前記の保管モジュールはさらに、本発明の方法に有用な他の構成要素、例えば使い捨て用品、例えばピペットティップまたは増幅および検出モジュール内で反応容器として用いるための容器さえも含むことができる。本発明の好ましい態様において、その分析システムには生物学的試料を最初のチューブからその分析システム上で使用可能な容器に移すための前分析preanalyticalシステムモジュールが含まれる。本発明のさらに別の好ましい態様において、その分析システムは生物学的試料を試料調製モジュールから増幅および検出モジュールに移すための移動モジュールを含む。たとえ前記の移動を手作業で行うことが可能であるとしても、その移動が例えばロボット装置、例えば電動の移動ラックまたはロボットピボットアームにより行われる自動化されたシステムを用いるのが好ましい。自動化可能なプロセスは、そのプロセスの工程が人による外部からの制御または影響がほとんどまたは全くなくても作動できる装置または機械を用いて実施するのに適していることを意味する。自動化された方法は、その自動化可能な方法の工程が人による外部からの制御または影響がほとんどまたは全くなくても作動できる装置または機械を用いて実施されることを意味する。その方法のための準備工程だけは手動で行わなければならない可能性があり、例えば貯蔵容器を充填および設置しなければならず、試料の選択および当業者に既知のさらなる工程、例えば制御コンピューターの操作は、人が行わなければならない。その装置または機械は、例えば自動的に液体を添加し、試料を混合し、または特定の温度での保温工程を実施することができる。典型的には、そのような機械または装置は、単一の工程およびコマンドが指定されているプログラムを実行するコンピューターにより制御されるロボットである。従って、好ましくは、本発明に従う分析システムはさらにシステムの構成要素を制御するための制御ユニットを含む。そのような制御ユニットは、前記の分析システムの種々の構成要素が正確に、そして正確なタイミングで、働き、相互作用すること、例えば試料などの構成要素を協調した様式で反応モジュールに移動させることを確実にするためのソフトウェアを含むことができる。その制御ユニットは、リアルタイムオペレーティングシステムRTOSを動かす処理装置も含むことができ、それはリアルタイムアプリケーションを意図するマルチタスクオペレーティングシステムである。言い換えれば、そのシステム処理装置は、リアルタイムな制約、すなわちシステム負荷に関係のない、事象からシステム応答までの操作上の期限を管理することができる。それは、そのシステム内の種々のユニットが与えられた命令に従って正確に作動および応答することをリアルタイムに制御する。本発明に従う使用、キットおよび分析システムの全ての他の好ましい態様および態様の具体的記述は、本発明に従う方法に関して言及したものである。実施例1:第1対照核酸を、定性的および定量的結果の出力を得るための異なる基準に従って評価するCOBASAmpliPrep/COBASTaqManHBV、HCVおよびHIV-1検査は商業的に入手可能なリアルタイムPCR検査であり、それらはウイルス標的HBV、HCVおよびHIV-1の正確な定量化に最適化されてきた。それらのアッセイは、PCR反応混合物の試料調製ユニットから増幅/検出ユニットへの自動化された移動のためのドッキングステーションを含む完全に自動化されたCOBASAmpliPrep/COBASTaqManシステム上、または手作業での移動を含むCOBASAmpliPrep/COBASTaqManシステム上、またはCOBASAmpliPrep/COBASTaqMan48システム上のいずれかで用いられる。COBASAmpliPrep/COBASTaqManHCV検査を、1セットの同一の試薬を用いる同時定量および定性検査の結果を提供するためのアプローチを研究するための例として用いた。その検査は15IU/mLの検出限界を有し、市場に出ている定量的HCV検査だけでなく定性的HCV検査にも匹敵する、またはそれよりも良い最高水準の感度を示す。この高い感度のため、その検査を定性的HCV検査としても用いることが試みられてきた。定量検査の主な焦点は正確なHCV力価を提供することであり、一方で定性検査の主な焦点はそのアッセイの高い感度を確実にすることである。COBASAmpliPrep/COBASTaqManHCV検査は本来は処置の成功を定量的に監視するために開発されたため、そのアッセイを一切の変更なしで用いても信頼できる定性的結果を提供することができるかどうかの分析を行った。データの再吟味によって、稀に起こるPCRの効率がより低い事象において、15IU/mLの感度がその現在のデータ分析設定ではその定量検査により保証されないことが明らかになった。阻害されたが有効なQS結果を示しているPCR反応および失敗した標的2183IU/mL検出の例を下記に示す:有効なQSであるため有効な結果をもたらした阻害されたPCR反応、および標的が検出されなかった結果を、図4aにおいて示す。そのQSは、0.8相対蛍光単位に相当する蛍光閾値設定を超えたため、有効であった。同じ試料の繰り返し検査は、標準的なPCR反応および2183IU/mLのHCV力価の結果を示した図4b。従って、一切の変更のない定量的COBASAmpliPrep/COBASTaqManHCV検査は、定性検査として用いることはできない。上記で言及した検査を用いて、そのIC/QS対照核酸のデータ分析パラメーター設定を、信頼できる定性的結果の出力が達成されるように最適化した。一般的適用可能性を実証するために、その最適化をCOBASAmpliPrep/COBASTaqManシステム上での市販のHBV、HCVおよびHIV-1アッセイの3種類全てに関して追加で行った。そのパラメーター設定における最小相対蛍光強度RFImin閾値をかなり上げることにより、その3種類全ての定量検査の感度は、確実にそれらを信頼できる定性的結果の出力をもたらすために用いることができるものになる。その相対的パラメーター設定を下記の表1において示す:。9.0の定性的RFIminの設定は、上記でHCVに関して示した例における阻害されたPCR反応を無効とするであろう。定性的結果の出力のための上記のRFIminの設定は、図1aにおいて示したように、標的の存在がそのIC/QS増殖曲線の蛍光強度に影響を及ぼす可能性があるため、定量的結果の出力のために同時に用いることはできない。結果として、その定性的RFIminの設定は、高い標的濃度の存在下では高い割合のIC/QS無効反応をもたらす。それに対し、ICは標的の存在下で有効であってはならないため、これはその定性的結果の出力の有効性には影響を及ぼさない。しかし、その定量的反応の有効性は著しく影響を受ける。従って、1つのIC/QSを有する同じ試験試薬が、保証されたその試験の感度を伴う信頼できる定性的結果の出力および許容できるほどに低いレベルのQSの無効な結果を伴う信頼できる定量検査の結果の両方を提供するために用いられる場合、これはその生データを本明細書で提案したような2つの異なるパラメーター設定のセットを用いて分析することによってのみ達成することができる。実施例2:異なる濃度の第1および第2対照核酸を、同じ試験試薬で定量的および定性的結果の出力を得るために用いるその目標は、同じ試験試薬のセットを用いて信頼できる定性的結果の出力および信頼できる定量検査結果の両方を提供することである。この目標に取り組むためのこのアプローチにおいて、内部対照核酸を含有する試薬は、2種類の異なるarmoredRNA粒子を有する配合物を含む。以下の試薬をこの実験のために用いることができる:aCOBASAmpliPrep/COBASTaqManHCV検査の試料調製試薬類磁性粒子懸濁液;プロテアーゼ溶液、溶解緩衝液;溶離緩衝液;b約1000コピー/反応の濃度レベルのQSarmored粒子、および約100コピー/反応の濃度レベルのICarmored粒子。armoredRNA粒子の生成を下記の図2において示す。そのarmored粒子により封入される転写産物は、異なるプライマー結合部位および異なるプローブ結合部位を有する。それらのプローブは、blackholequencherBHQと一緒に蛍光標識HEXおよびCY5で標識されている;cマグネシウム試薬;d以下を含むマスターミックス試薬:-Z05DNAポリメラーゼおよびUNG-3種類の異なるプライマーペア:標的HCVに対するもの、第1対照核酸に対するもの、および第2対照核酸に対するもの-3種類の異なるプローブ:FAMおよびBHQで標識された標的に対するもの、HEXおよびBHQで標識された第1対照核酸に対するもの、ならびにCY5およびBHQで標識された第2対照核酸に対するもの、-アプタマー-dNTPdUTP、dATP、dCTP、dGTP、dTTP-マスターミックス緩衝剤成分酢酸カリウム、グリセロール、トリシン、DMSO、ベタイン、IGEPAL、水。その試料調製および増幅/検出工程は、COBASAmpliPrep/COBASTaqManHCV検査のために確立された標本抽出パラメーターおよびPCRファイルを用いて実施される。それらの3種類の異なる蛍光色素に関する増殖曲線を求め、それを図3において示す。HCV試料に関して、定量的結果の出力を得るために、その力価を以下のように決定する:PCR運転が完了した後、その蛍光読み取り値を処理して、QS核酸HEX蛍光標識に関する1セットの色素濃度データ、定性的標準核酸Cy5蛍光標識に関する1セットの色素濃度データ、および標的核酸FAM蛍光標識に関する1セットの色素濃度データを得る。色素濃度データの3種類全てのセットを同じ様式で処理する。その定量的および定性的標準核酸ならびにその標的核酸に関してエルボー値CTを計算する。エルボー値は、その標的核酸またはそれらの2種類の内部対照核酸が予め定められた閾値蛍光濃度と交差する点として定義される。定量的結果の出力に関しては、力価の決定を、HEXおよびFAMに関する色素濃度データのみを分析することにより行う。力価の決定は、その標的核酸およびそのQS核酸が同じ効率で増幅されるという仮定、ならびに計算されたエルボー値において等量の標的核酸およびQS核酸のアンプリコンのコピーが増幅され、検出されるという仮定に基づく。従って、CTQS-CT標的は、log標的濃度/QS濃度に対して線形である。次いで、例えば以下の方程式:T’=10aCTQS-CT標的2bCTQS-CT標的cにおけるような多項較正式を用いることにより、その力価Tを計算することができ、ここでその式の中の唯一の変数は差CTQS-CT標的である。定性的結果の出力に関しては、CY5およびFAMに関する色素濃度データのみを分析する。CY5およびFAMに関する色素濃度データを比較することにより、そのソフトウェアはそのPCR反応が標的陰性または標的陽性のどちらであるかを決定する。そのPCR反応が標的陽性である場合、そのICの結果は無視され、従ってそれは有効でも無効でもよい。そのPCR反応が標的陰性である場合、その結果はそのICが有効な結果を示している場合にのみ有効である。上記で示した実施例において、全ての反応は低レベルのHCV標的を含有しており-そのそれぞれの試験結果の有効性とは関係ないが-全ての反応は有効なICを示す。