体液試料中の無細胞核酸を定量する方法であって、以下の工程を含む方法a関心対象の対象を特定する工程b該対象から体液を入手する工程c該体液試料中の無細胞核酸の濃度または量を決定する工程であって、該核酸の長さが100bp未満の核酸サイズ範囲内にある、工程。100bp未満のcf核酸サイズの濃度量を求める、請求項1記載の方法。PCR法を実行する方法によって工程cが実施され、X、好ましくは、50249bpのサイズ、好ましくはcfDNAのサイズが145bpである、工程bcfDNA総量から得られたcfDNA量のパーセントを計算する工程であって、が20より小さく、好ましくは5が腫瘍の存在を示す、工程。健康個体からの体液から、cfDNAが高度に放出されている個体、例えば癌患者からの体液を特定または分析する方法であって、以下の工程を含む方法a請求項1~7のいずれか一項記載の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNAを定量する工程であって、cfDNAのサイズ範囲が60~80bp、100~145bp、および180~400bpである、工程b健康個体と非健康個体との間で得られた3種類の定量レベルのうち少なくとも2種類、好ましくは3種類の定量レベルを直接比較する工程。生物学的試料中で変異断片と非変異cf核酸断片を識別するための方法であって、以下の工程を含む方法変異断片および非変異断片について計算された長い断片および短い断片の濃度の比を決定および比較する工程であって、前記長い断片は200bp~450bpに含まれ、かつ、前記短い断片は145bp未満であり、好ましくは50bp~99bpに含まれる、工程。健康個体からの体液から、cfDNAが高度に放出されている個体、例えば癌患者からの体液を特定または分析する方法であって、以下の工程を含む方法c請求項1~7のいずれか一項記載の方法によって2種類の体液試料中の無細胞DNAを定量する工程であり、cfDNAのサイズ範囲が60~80bp、100~145bp、および180~400bpである、工程dロジスティック関数におけるパラメータとして、これらの3種類の値のうちの2つを用いることによってサイズプロファイルを決定する工程であって、工程bにおいて得られたサイズプロファイル比較が特定の生理学的状況を示す、工程。個体の特定の生理学的状況、好ましくはcfDNAが高度に放出されている個体における特定の生理学的状況の診断、予後、セラグノスティック、または進展を行うための方法であって、以下の工程を含む方法a請求項1~7のいずれか一項記載の無細胞核酸を定量する方法によって、該個体から得られた体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRをある時間間隔の間にくりかえし計算する工程であって、該核酸の存在が該特定の生理学的状況に関連する、工程、およびb得られた完全性指数またはSFRを比較し、この時間間隔にわたって無細胞核酸の該完全性指数またはSFRが変化したかどうか確かめる工程。05未満、好ましくは01未満の値への完全性指数の減少が個体の癌の進行または特定の生理学的状況の進展を示す、請求項29記載の診断もしくは予後を行うための方法またはセラグノスティック方法。個体の特定の生理学的状況、好ましくはcfDNAが高度に放出されている個体における特定の生理学的状況の診断、予後、セラグノスティック、または進展のための方法であって、以下の工程を含む方法a請求項1~7のいずれか一項記載の体液試料中の無細胞核酸を定量する方法によって、該個体から得られた体液試料中の短い変異無細胞核酸または非変異無細胞核酸の濃度をある時間間隔の間にくりかえし計算する工程であって、該変異核酸または非変異核酸の存在が該特定の生理学的状況に関連する、工程、およびb得られた濃度を比較し、この時間間隔にわたって該無細胞核酸の該変異増幅断片または非変異増幅断片の濃度が変化したかどうか確かめる工程。患者において、核酸多型に関連する病理学的状況もしくは生理学的状況、例えば、腫瘍の存在もしくは腫瘍の進行の診断、予後を行うための方法、または患者において、核酸多型に関連する病理学的状況もしくは生理学的状況を確かめる工程を含むセラノスティック方法であって、以下の工程を含む方法a請求項3~7のいずれか一項記載の無細胞核酸を定量する方法による、該患者からの体液試料中の無細胞核酸の濃度の決定請求項10、13、および14のいずれか一項記載の方法による、該無細胞核酸中の該遺伝子多型の検出であって、発見された変異無細胞核酸対非変異無細胞核酸のパーセントが閾値より大きいかどうか確かめることによって、患者は該変異がある、または該変異がないと分類され、好ましくは、該閾値は所与の変異に特有のものであり、非変異患者および変異患者のコホートから決定される、検出ならびに請求項8、9、11、および12のいずれか一項記載の方法による、試料中の該無細胞核酸の完全性指数またはSFRの決定の群より選択される少なくとも2種類のバイオマーカーを研究する工程、b該少なくとも2種類のバイオマーカーを含むロジスティック関数によって、該少なくとも2つの値を組み合わせる工程、ならびにc該患者における病理学的状況または生理学的状況、例えば、癌の診断または予後を行うために、該ロジスティック関数の最終値を分析する工程。本発明者らは、本明細書において、無細胞核酸の分析に特異的であり、産業に利用可能な標準化された手順と適合する簡単かつ頑強かつ高感度かつ選択的な検出定量につながる一段階分析法で定量PCR法を使用することを提唱する。無細胞核酸は、PCRを最適に使用した時に通常選択されるプライマーよって増幅される配列の長さに一般的に対応する180bpのサイズまで強力に断片化されることが以前より知られていた。従って、定量されるDNAの濃度が増幅コピーの数に正比例するゲノムDNA分析とは異なり、QPCRによって決定される循環DNAの量はコピー数に比例しない。本発明者らの方法は、サイズの特異性および循環DNAの形態を考慮に入れている。これにより、2つの異なる配列の濃度を正確かつ直接的に比較することができ、別の配列に対する配列のパーセントを計算することもできる。体液試料中に存在する無細胞核酸のサイズプロファイルを決定することによって、本発明者らは、健康個体と高レベルのcfDNAを示す個体を識別することが可能なことを証明した。驚いたことに、本発明者らは、癌の経過観察および治療のために、一段階QPCR法を使用することによって3種類の重要なバイオマーカー無細胞核酸の特異的定量遺伝子多型の存在およびアポトーシス率を同時に決定できることを証明した。本発明の方法は特に以下の利点を示す。分析に必要な時間を、特に、腫瘍生検材料の分析と比較して大幅に短縮する。生物学的試料のサンプリングおよび取り扱いを容易にする。到達不可能な腫瘍の非侵襲的分析を可能にする。2つの無視できない臨床パラメータ、すなわち、無細胞核酸の量およびアポトーシス率を加える。これらの値は腫瘍成長と直接関係があるように思われる。本発明の応用分野は、親遺伝子の分析、臨床遺伝子分析、セラグノスティックス、診断マーカーの関数として療法の方向付けを可能にする治療戦略、民族起源の分析胎児cirDNA中の性別判定特定の生理学的状況の進展などがあるが、これに限定されない無細胞核酸の検出の全ての利用に関する。前記のように、以前に述べられたEllingeretalのような文献中にはctDNAサイズパターンについて非常に多くの差違がある。ctDNAを研究し、ctDNAが主に小さなサイズのctDNAであることを述べているわずかな最近の報告は、小さなサイズがモノヌクレオソームサイズの周囲にあることを常に示している。このことは、約180bpの強いバンドおよび約360bpの弱いバンドと、時として、それより大きなサイズのスメアをはっきりと示したのに対して、180bp未満ではバンドは絶対に現れない様々なおよび非常に多くのゲル電気泳動分析に基づいている。本発明の説明において示されたようなctDNAサイズパターンに関する本発明者らのデータは、この結論とはっきりと食い違う。本発明者らは本発明者らの結論に確信を持っているので、実施例VIIIにおいて180bp未満のサイズの有意な量のDNAがゲルに存在することを証明する。結果として、かつ下記の実施例により証明されるように、ctDNAは、主に、180bpより小さなサイズのctDNA、特に、100bpより小さなサイズのctDNAであり得る。本発明によれば、本発明者らは、ctDNA分析の必須のパラメータとして、100bpより小さなサイズのctDNAの量または濃度を決定し、100bpより小さなサイズのctDNAを含む画分からのctDNAの量を、150~400bpのサイズの画分または300bpまたは400bpより大きなサイズの画分と比較することを提唱する。従って、第1の局面において、本発明は、体液試料中の無細胞核酸を定量する方法であって、a関心対象の対象を特定する工程b前記対象から体液を入手する工程c前記体液試料中の前記無細胞核酸の濃度または量を決定する工程であって、前記核酸は短いサイズ範囲にある核酸であり、100bp未満の長さを有し、好ましくは、40~99bpに含まれる、工程を含む、方法に関する。ほぼとは、本明細書では規定された値の±10を意味することが意図される。好ましい態様において、本発明の方法は、100bp未満のサイズのcf核酸の濃度量を決定するために実施される。好ましい態様において、工程cは、PCR法を実行する方法によって実施され、100bpの断片の増幅から得られた値を差し引くことによって、好ましくは60~99bp範囲の断片の増幅から得られた値から、100~145bp範囲の断片の増幅から得られた値を差し引くことによって、前記体液試料中の無細胞核酸の量を決定する工程である。より好ましくは、無細胞核酸からの前記短い増幅断片は、55~65bpに含まれる長さを有し、ほぼ60bpが最も好ましい。本発明が、ポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法によって本発明による体液試料中の無細胞核酸を定量する方法である場合、以下の2つの工程ci短い増幅断片の濃度または量を決定する工程およびcii長い増幅断片の濃度または量を決定する工程を含む。前記長い増幅断片は短い断片を部分的または完全に含むことが好ましい。同じ局面において、ポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法によって無細胞核酸の完全性指数またはSFRが決定される時、本発明はまた、体液試料中の無細胞核酸の完全性指数を決定するための方法であって、a関心対象の対象を特定する工程b前記対象から体液を入手する工程c前記体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定する工程であって、前記完全性指数またはSFRは、前記無細胞核酸からの長い増幅断片および短い増幅断片の濃度の比として計算され、前記短い断片は100bp未満の長さを有し、前記長い増幅断片は180bp~450bpに含まれる、工程を含む、方法に関する。ポリメラーゼ連鎖反応PCRを実行する本発明の完全性指数またはSFRを決定するための方法の好ましい態様において、前記長い増幅断片は250bp~350bpに含まれ、前記短い増幅断片は50bp~99bpに含まれる。体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定するための本発明による方法の好ましい態様において、前記長い増幅断片は短い断片を部分的または完全に含む。本発明の完全性指数またはSFRを決定するための方法のより好ましい態様において、前記長い増幅断片は前記短い断片を部分的または完全に含む。別の局面において、本発明は、遺伝子多型、例えば、変異またはSNPを検出するための方法であって、a関心対象の対象を特定する工程b前記対象から体液を入手する工程、c前記体液試料中の無細胞核酸から短い増幅断片の濃度を決定する工程であって、増幅された前記無細胞核酸の短い断片は、検出される前記遺伝子多型を含有し、前記増幅された無細胞核酸の短い断片は、100bp未満、好ましくは40~99bpに含まれる長さを有する、工程を含む、方法を含む。より好ましくは、検出される前記遺伝子多型を含有する前記短い増幅断片は、55~65bpに含まれる長さを有し、ほぼ60bpが最も好ましい。好ましい態様において、本発明は、無細胞核酸にある遺伝子多型の存在を定性検出するための方法であって、a体液試料中の無細胞核酸の濃度または量を決定する工程b以下のパラメータおよび以下の工程一方でA1A2および他方でB1B2が2種類の短い配列を代表するものでありA1A2およびB1B2の配列の長さが50~100bpであり、長さが20異なるものとしA1A2またはB1B2のいずれかが遺伝子多型を含みCB1B2が短い断片B1B2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1A2が短い断片A1A2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値だとすると、iCB1B2CA1A2を計算する工程であって、B1B2は、遺伝子多型を含有する配列と定義される、工程またはiiCA1A2CB1B2を計算する工程であって、A1A2は、遺伝子多型を含有する配列と定義される、工程を統合することによって、遺伝子多型の存在の定性検出を決定する工程、任意で、CB1B2CA1A2またはCA1A2CB1B2が、遺伝子多型の存在の定性検出にとって有意な特定の閾値より大きいことを確かめる工程を含む、方法に関する。好ましくは、工程iiにおいて、同一のは変異cf核酸断片の定量検出である。好ましい態様において、本発明は、無細胞核酸にある遺伝子多型の存在を定性検出するための方法であって、以下a本発明による無細胞核酸を定量する方法によって、体液試料中の無細胞核酸の濃度または量を決定する工程であって、無細胞核酸の濃度または量はPCRを実行する方法によって決定される、工程b以下のパラメータおよび以下の工程一方でA1A2および他方でB1B2が2種類の短い増幅配列を代表するものでありA1A2およびB1B2の配列の長さが50~100bpであり、長さが20異なるものとしA1A2またはB1B2のいずれかが遺伝子多型を含みCB1B2が短い増幅断片B1B2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1A2が短い増幅断片A1A2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値だとすると、iCB1B2CA1A2を計算する工程であって、B1B2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義される、工程またはiiCA1A2CB1B2を計算する工程であって、A1A2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義される、工程を統合することによって、遺伝子多型の存在の定性検出を決定する工程、任意で、CB1B2CA1A2またはCA1A2CB1B2が、遺伝子多型の存在の定性検出にとって有意な特定の閾値より大きいことを確かめる工程を含む、方法に関する。好ましくは、工程iiにおいて、同一のは変異cf核酸断片の定量検出である。好ましい態様において、便利な数の既知試料を用いて、それぞれの変異について正の閾値が決定される。より好ましくは、正の閾値は、少なくとも2、5、7、8、9、10、125、15である。本発明による無細胞核酸にある遺伝子多型の存在を定性検出するための方法も本発明の一部をなす。ここで、コード鎖にある関心対象の遺伝子多型に対応する核酸は、位置B1またはA2で開始するプライマーの3末端に位置し、PCRを実行する方法はアレル特異的PCRである。好ましい態様において、検出される前記遺伝子多型は、遺伝性遺伝子多型または体細胞性遺伝子多型である。遺伝子多型とは、特に、個体または民族集団を識別することができる遺伝子多型、生物学的機能に影響を及ぼす非コード領域にある遺伝子多型、RNAエディティングなどの転写後修飾による遺伝子多型、またはタンパク質配列の修飾を意味する変異などのコード領域にある遺伝子多型を指定することが意図されるが、これに限定されない。これらの遺伝子多型の中で、病態もしくは生理学的状況に関連した遺伝子多型、または核酸、特に、核酸配列のエキソン領域、イントロン領域、もしくは非コード領域にある特定の遺伝子多型からなる群より選択される核酸の遺伝子多型が好ましい。本発明には、好ましくは、体液試料中の前記無細胞核酸にある遺伝子多型を検出するために、および無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定するために、PCR、特に、QPCRを実行する方法も含まれる。前記方法は、前記無細胞核酸にある本発明による遺伝子多型を検出するための方法を実行する工程および前記無細胞核酸の完全性指数を決定するために、本発明による方法を実行する工程を含む。好ましい態様において、前記方法は、体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定するために、本発明の方法を実行する工程を含む。前記方法において、前記長い増幅断片は、短い非変異断片、および検出される前記遺伝子多型を含有する短い変異断片を含み、前記長い増幅断片は250bp~350bpに含まれ、前記短い増幅断片は100bp未満であり、好ましくは、50bp~99bpに含まれる。より好ましくは、前記増幅変異断片および非変異断片は、55~65bpに含まれる長さを有し、ほぼ60bpが最も好ましい。より好ましくは、体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定するための方法において、前記長い増幅断片は2種類の短い断片を部分的または完全に含み、短い増幅断片の一方は遺伝子多型を含有する。断片を部分的に含むとは、長い断片が、参照された短い断片の少なくとも10個の連続したbp、より好ましくは15、20、25、30、35、または40個の連続したbpを含有することを本明細書において指定することが意図される。また、本発明の方法の好ましい態様において、変異cf核酸断片およびまたは非変異cf核酸断片について、前記無細胞核酸の前記cf核酸断片の濃度が計算される。変異断片および非変異断片とはそれぞれ、本発明の方法において検出することが望ましい遺伝子多型を示す断片および遺伝子多型を示さない断片を本明細書において指定することが意図される。本発明の前記方法の好ましい態様において、短い変異断片およびまたは短い非変異断片について、長い断片および短い断片の濃度の比が計算される。特定の態様において、本発明の方法は、特定の遺伝子多型を示す無細胞核酸断片の濃度を決定する工程をさらに含む。前記断片は、規定された長さを有する遺伝子多型を示し、前記濃度は非変異断片の濃度と比較され、前記非変異断片は変異断片とほぼ同じ長さを有し、好ましくは、変異増幅断片または非変異増幅断片の長さは長さが20または20類似してもよい。また、本発明の特定の遺伝子多型を検出するための方法の好ましい態様において、前記方法は、無細胞核酸抽出物中にある非変異断片および変異断片の濃度を決定する工程ならびに得られた、または得られなかった短い非変異断片に対する短い変異断片の量のパーセントを計算する工程であって、前記パーセント計算値が前記遺伝子多型に関連した閾値より大きい場合に、対象が前記遺伝子多型を有するとみなされる、工程をさらに含む。また、本発明の方法の好ましい態様において、前記方法が、体液試料中の前記無細胞核酸にある遺伝子多型を検出するためにPCR、特に、QPCRを実行する場合、増幅変異断片およびまたは増幅非変異断片について、前記無細胞核酸の前記増幅断片の濃度が計算される。変異断片および非変異断片とはそれぞれ、本発明の方法において検出することが望ましい遺伝子多型を示す断片および遺伝子多型を示さない断片を本明細書において指定することが意図される。本発明の前記方法の好ましい態様において、短い増幅変異断片およびまたは短い増幅非変異断片について、長い増幅断片の濃度および短い増幅断片の濃度の比が計算される。特定の態様において、本発明の方法は、特定の遺伝子多型を示す無細胞核酸の増幅断片の濃度を決定する工程をさらに含む。前記増幅断片は、規定された長さを有する遺伝子多型を示し、前記濃度は、無細胞核酸の非変異増幅断片の濃度と比較され、前記非変異断片は変異断片とほぼ同じ長さを有し、好ましくは、変異増幅断片または非変異増幅断片の長さは長さが20または20類似してもよい。また、実行する本発明の特定の遺伝子多型を検出するための方法の好ましい態様において、前記方法は、無細胞核酸抽出物中にある増幅非変異断片および増幅変異断片の濃度を決定する工程ならびに得られた、または得られなかった短い増幅非変異断片に対する短い増幅変異断片の量のパーセントを計算する工程であって、前記パーセント計算値が前記遺伝子多型に関連した閾値より大きい場合に、対象が前記遺伝子多型を有するとみなされる、工程をさらに含む。特に好ましい別の局面において、本発明は、個体における無細胞核酸、特に、循環DNAを分析するための方法であって、a定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法によって、本発明による前記無細胞核酸を定量する工程およびbQPCRを実行する方法によって、本発明による前記無細胞核酸の完全性指数を決定する工程およびcQPCRを実行する方法によって、本発明による前記無細胞核酸にある遺伝子多型の存在を検出する工程を含む、方法に関する。好ましい態様において、前記核酸は、腫瘍関連遺伝子変化を有する核酸である。以下腫瘍関連遺伝子変化、好ましくは、CRC関連遺伝子変化を有するRASファミリー遺伝子、好ましくは、KRASまたはNRASおよびBRAF遺伝子からなる群より選択される核酸がより好ましい。体液試料とは、全血、血清、血漿、尿、痰、結腸流出液、骨髄、リンパ液、脳脊髄液、涙液、汗、乳、糞便、気管支洗浄液、および腹水からなる群より選択される体液を指定することが意図され、かつ好ましい。好ましい態様において、体液試料は、血漿および血清からなる群より選択される血液試料である。また、本発明の方法の好ましい態様において、前記無細胞核酸は、内因性無細胞核酸または外因性無細胞核酸、特に、ウイルス、細菌、真菌、胎児、および異種移植片に由来する無細胞核酸からなる群より選択される外因性無細胞核酸の群より選択される。関心対象の対象からの内因性無細胞核酸の中で、前記関心対象の対象は、疾患に罹患している対象、または疾患を発症するリスクのある対象、または生理学的状況もしくは生理学的状態を示す対象であることが好ましい。好ましい態様において、前記疾患は癌であり、より好ましくは、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、婦人科癌、頭頚部癌、甲状腺癌、膵臓癌、肝臓癌、または造血癌の群より選択される癌であるが、これに限定されない。また、好ましい態様において、前記癌は転移癌である。別の局面において、本発明は、健康個体からの体液から癌患者の体液を特定または分析する方法であって、a本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNAを定量する工程であって、cfDNAのサイズは50~100bpの範囲内にあり、かつcfDNAのサイズは101bp超である、工程b2種類の体液試料のそれぞれについて、これらの2種類の断片範囲のレベル間で得られた比を比較する工程であって、249bpであり、好ましくは、cfDNAのサイズが145bpである、工程bcfDNA総量から得られたcfDNA量のパーセントを計算する工程であって、が20より小さく、好ましくはが腫瘍の存在を示す、工程を含む、方法に関する。別の局面において、本発明は、健康個体からの体液から、cfDNAが高度に放出されている個体、例えば、癌患者からの体液を特定または分析する方法であって、a本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNAを定量する工程であって、cfDNAのサイズ範囲が60~80bp、100~145bp、および180~400bpである、工程b健康個体と非健康個体との間で得られた3種類の定量レベルを直接比較する工程を含む、方法に関する。本発明者らは、濃度量を決定することができるcfDNAサイズの範囲は3種類あり、この濃度量によって、健康対象からのcfDNAと、cfDNAが高度に放出されている個体、例えば、癌患者からのcfDNAを特定、分析、または識別できることを発見した。サイズ範囲は60~80bp、100~145bp、および180~400bpである。特定の生理学的状況の診断、予後、セラグノスティック、または進展は、cfDNAサイズプロファイルを比較することによって、好ましくは、ほぼ70bpの断片、ほぼ100bpの断片、およびほぼ300bpの断片を標的とした時に得られた少なくとも3種類の濃度値を組み合わせることによって、好ましくは、ロジスティック関数において、これらを組み合わせることによって評価することができる。従って、別の局面において、本発明は、健康個体からの体液から、cfDNAが高度に放出されている個体、例えば、癌患者からの体液を識別する方法であって、a本発明の方法によって2種類の体液試料中の無細胞DNAを定量する工程であり、cfDNAのサイズ範囲が60~80bp、100~145bp、および180~400bpである、工程bロジスティック関数におけるパラメータとして、これらの3種類の値を用いることによって、サイズプロファイルを決定する工程を含む、方法に関する。同じ局面において、本発明はまた、健康個体からの体液から、cfDNAが高度に放出されている個体、例えば、癌患者からの体液を識別する方法であって、a本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNAを定量する工程であって、cfDNAは50~400bp範囲の様々なサイズである、工程b好ましくは、ほぼ70bpの断片、ほぼ100bpの断片、およびほぼ300bpの断片を標的とした時に得られた少なくとも3種類の濃度値を組み合わせることによって、好ましくは、ロジスティック関数、例えば、対数関数において、これらを組み合わせることによって、2種類の体液試料間のこれらの3種類のサイズ範囲について得られたサイズプロファイルを比較する工程を含む、方法に関する。同じ局面において、本発明はまた、生物学的試料生物学的液体中で変異cf核酸断片と非変異cf核酸断片を識別する方法であって、変異断片および非変異断片について計算された長い断片および短い断片の濃度の比を決定および比較する工程を含む、方法に関する。前記方法において、前記比は、50~450bp範囲の様々なサイズで比較され、好ましくは、前記長い断片は200bp~450bpに含まれ、好ましくは、少なくとも2種類の濃度値は、例えば、ほぼ200bpおよびほぼ300bpであり、前記短い断片は145bp未満であり、好ましくは、50bp~99bpに含まれる。好ましくは、生物学的液体中に存在する変異cf核酸断片と非変異cf核酸断片との間で80~145bp145~300bpまたは100~145bp145~350の比が比較される。健康個体からの体液から、cfDNAが高度に放出されている個体、例えば、癌患者からの体液を識別する方法であって、a本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNAを定量する工程であって、cfDNAのサイズ範囲が60~80bp、100~145bp、および180~400bpである、工程b好ましくは、ほぼ70bpの断片、ほぼ100bpの断片、およびほぼ300bpの断片を標的とした時に得られた少なくとも3種類の濃度値を組み合わせることによって、好ましくは、ロジスティック関数、例えば、対数関数において、これらを組み合わせることによって、2種類の体液試料間のこれらの3種類のサイズ範囲について得られたサイズプロファイルを比較する工程を含む、方法も好ましい。好ましい態様において、本発明による体液を識別する方法は、個体の特定の生理学的状況の進展を診断、予後、セラグノスティック、またはモニタリングするために実行され、工程bにおいて得られるサイズプロファイル比較は、その特定の生理学的状況を示す。別の局面において、本発明は、個体の特定の生理学的状況、好ましくは、cfDNAが高度に放出されている個体における特定の生理学的状況の進展を診断、予後、セラグノスティック、または評価するための方法であって、a本発明による体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定するための方法によって、前記個体から得られた体液試料中の無細胞核酸の完全性指数を時間間隔の間にくりかえし計算する工程であって、前記核酸の存在が前記特定の生理学的状況に関連する、工程、およびb得られた完全性指数またはSFRを比較し、この時間間隔にわたって無細胞核酸の前記完全性指数が変化したかどうか確かめる工程を含む、方法に関する。好ましい態様において、前記特定の生理学的状況は、cfDNAの放出または細胞アポトーシスをもたらす生理学的状況であり、好ましくは、癌、糖尿病、鎌状赤血球症、組織外傷、日焼け、血液透析、または激しい努力生産からなる群より選択される。特定の局面において、前記本発明の方法は、患者において腫瘍進行の診断、予後を行うための方法またはセラグノスティック方法であって、工程aにおいて、特定の生理学的状況に関連する前記核酸は前記腫瘍に関連し、工程bにおいて、この時間間隔にわたる完全性指数の減少は癌の進行を示す、方法に関する。好ましい態様において、05未満、好ましくは01未満の値への完全性指数またはSFRの減少は癌の進行を示す。別の局面において、本発明は、個体、好ましくは、cfDNAが高度に放出されている個体の特定の生理学的状況の進展の診断、予後、セラグノスティック、または評価を行うための方法であって、a本発明による体液試料中の無細胞核酸を定量する方法によって、前記個体から得られた体液試料中の短い変異無細胞核酸または短い非変異無細胞核酸の濃度を時間間隔の間にくりかえし計算する工程であって、前記変異核酸または非変異核酸の存在が前記特定の生理学的状況に関連する、工程、およびb得られた濃度を比較し、この時間間隔にわたって前記無細胞核酸の前記変異増幅断片または非変異増幅断片の濃度が変化したかどうか確かめる工程を含む、方法に関する。好ましい態様において、前記特定の生理学的状況は、cfDNAの放出をもたらす生理学的状況であり、好ましくは、自己免疫狼瘡、敗血症、心筋梗塞、多発性硬化症、または多くの努力生産からなる群より選択される。また、前記方法の好ましい態様において、特定の生理学的状況に関連する前記核酸は前記腫瘍に関連し、工程bにおいて、この時間間隔にわたる無細胞核酸の前記変異増幅断片または非変異増幅断片の濃度の増加は癌の進行を示す。別の局面において、本発明は、患者における癌治療の効力をモニタリングするための方法であって、a本発明による無細胞核酸を定量する方法によって、少なくとも1種類の癌マーカー核酸について、前記患者から得られた体液試料中の遊離核酸の完全性指数を時間間隔の間に計算する工程、およびb得られた完全性指数を比較し、この時間間隔にわたって前記無細胞核酸の前記完全性指数が増加または減少したかどうか確かめる工程であって、前記完全性指数の増加はこの癌治療の効力を示し、前記完全性指数の減少はこの癌治療の効力が無いこと示す、工程を含む、方法に関する。別の局面において、本発明は、個体、例えば、腫瘍を示す患者または腫瘍を示す可能性のある患者において無細胞核酸、特に循環DNAを分析するための方法であって、a本発明に従って、前記無細胞核酸にある遺伝子多型、例えば、SNPまたは変異の存在を定性検出する工程b本発明に従って、前記無細胞核酸を定量する工程およびc本発明に従って、前記無細胞核酸の完全性指数の決定を実行することによってアポトーシス率を決定する工程を含む、方法に関する。前記方法は、以下のパラメータおよび計算一方でA1A2および他方でB1B2が2種類の短い増幅配列を代表するものでありA1B2が長い増幅配列であり、A1A2またはB1B2のいずれかが遺伝子多型を含み、CB1B2が短い増幅断片B1B2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1A2が短い増幅断片A1A2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1B2が長い増幅断片だとすると、遺伝子多型の存在を定性検出する工程であって、CB1B2CA1A2は特定の閾値より大きく、B1B2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義されるかまたはCA1A2CB1B2は特定の閾値より大きく、A1A2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義される、工程比CB1B2CA1B2またはCA1A2CA1B2を決定することによって完全性指数を評価する工程、XおよびYがプライマーの5末端間の核酸上での距離であるか、増幅断片の長さであると考えると、XX、好ましくは、50045である。30060比はゲノムDNAでは038である。健康対象およびmCRC患者における14560および30060比の初期分析研究は感度100および特異性100を示す。従って、14560比は、特に平均の標準偏差が考慮された時には健康対象とmCRC患者を30060比より良好に識別するように思われるが、特異性が考慮された時にはあまり良好に区別しないように思われる。300145比は健康癌患者を識別するのに最適でなく、一般的に、30060比で得られた結果とは反対の結果を生じる。すなわち、mCRC患者からのcirDNAの場合、300145について得られた値の平均はより大きい。だが、完全性指数について以前に実施された少数の研究において従来より用いられてきたのは、このタイプの比である。cirDNA検出用の使用プライマー対の選択が、標的配列に応じて100~300bp断片の増幅収量にのみ基づくことを示すことは重要である。これらの完全性指数の計算を用いて、健康対象のcirDNAとmCRC患者のcirDNAを識別することができた。腫瘍発達またはcirDNA総濃度の関数において他の比または完全性指数を計算できたと強調しなければならない。図5のヒストグラムは、60bpおよび145bpの断片を増幅することによって得られた値の相対比率が健康対象ではmCRC患者と比較して逆になることを示す。本発明者らは、cirDNA量が多くなればなるほど、完全性指数は小さくなることを発見した。例えば、cirDNA総量の関数において249bpの長い断片の増幅値は減少するのに対して、60bpの短い断片の増幅は増加する。要約すると、本実施例の結果は、QPCRによるcfDNA検出に関する革新的な特徴の決定を初めて可能にする。1増幅断片のサイズはcfDNA定量に大きな影響を及ぼす。2100bpより小さなアンプリコンの検出が最適である。3完全性指数の測定値を用いて、mCRC対象のcirDNAと健康個体のcirDNAを識別することができ、mCRC対象のcirDNAとゲノムDNAも識別することができる。4同一のサイズのアンプリコンを生じるプライマー対の増幅を比較することだけで、cirDNA抽出物をPCR増幅した結果を正確に比較することができる。実施例IICRC異種移植片マウスモデルから抽出されたcirDNAのQPCR分析によるサイズ分布材料および方法a細胞株および試薬SW620CRC細胞をRPMI10胎仔ウシ血清中で維持した。SW620細胞はホモ接合性KRASG12V変異を有する。b異種移植片モデル雌無胸腺ヌードマウスの皮下に1x106個の癌細胞を異種移植した。移植して3週間後にマウスをCO2で安楽死させた。腫瘍重量は300~650mgであった。末梢血を採決してEDTAチューブに入れ、血漿調製のためにすぐに使用した。c血漿および血清の調製マウス血液試料を5mlBDバキュテナーKE35チューブに収集した後に、CR4jローターを備えたHeraeusMultifugeLR遠心機に入れて2000rpm、4°Cで10分間、遠心分離した。上清を滅菌15mlエッペンドルフチューブの中に収集し、14000rpm、4°Cで10分間遠心分離した。次いで、DNA抽出するために上清をすぐに処理するか、または80°Cで保管した。QPCRアッセイにおいて、新鮮に単離された血漿または保管された血漿を比較した時に有意差は認められなかった。同じ2段階遠心分離プロセスを用いて血清を調製したが、EDTAを含まないチューブに血液を入れ、次いで、室温で1時間、放置した。マウスおよびヒトの血漿および血清をサンプリング後3時間以内に単離した。dDNA抽出同じ手順を用いて、異なる細胞株からのctDNAおよびゲノムDNAを抽出した。QIAmpDNAminiBloodkitを用いて溶出量60μlで血液および体液プロトコールに従って、200μlの血漿からDNAを精製した。血漿調製中には試料を4°Cに保った。使用するまでDNA試料を20°Cに凍結した。QPCRアッセイにおいて、新鮮に抽出されたDNAまたは保管されたDNAを比較した時に有意差は認められなかった。eQPCRによるctDNA定量DNAをQPCRアッセイによって定量した。リアルタイムPCR増幅を、MyiCyclerIQ5IQまたはChromo4機器においてIQ5Opticalシステムソフトウェア20およびMJOpticonMonitor3ソフトウェアを用いて反応体積25μlで実施した。それぞれのPCR反応混合物は、125μlのmixPCR25μlのそれぞれの増幅プライマー25μlのPCRによって分析された水、および5μlのDNA抽出物からなった。サーマルサイクリングは95°C3分の最初の変性工程から開始し、次に、95°C10秒および60°C30秒の40サイクルが行われた。融解曲線は、55°C~90°Cから02°Cごとに測定して得られた。定量のためのキャリブレーターとして、HCT116s細胞およびMC38細胞に由来するゲノムDNAの段階希釈液を使用した。IQ5Opticalシステムソフトウェア20またはMJOpticonMonitor3ソフトウェアによって検量線から試料濃度を外挿した。MIQEガイドラインにおいて推奨されるような妥当な確実性で検出することができる濃度である検出限界は3コピーアッセイであった。CRC臨床試料分析に以前に用いられたものと同じヒトKRASイントロン2の60~409bpDNA配列を増幅することによって、血漿抽出物をアッセイした。さらに、同じアプローチによって、マウスKRASイントロン1の60~385bpDNA配列を増幅することによって非腫瘍cirDNAをアッセイした。この方法を用いて、非異種移植対照ヌードマウスからの血漿抽出物もアッセイした。図7Aおよび7Bは、200~300bpの配列を増幅した時に腫瘍由来cirDNAと非腫瘍由来cirDNAを有意に識別することを初めて証明する。次に、腫瘍cirDNAの特定のオリゴヌクレオチドによりDNA配列増幅を分析することによってDNA配列の特定および定量をすることができる。PCRはSNP検出用に以前に改造された。既知のSNPを検出するための最も簡単なPCR法の1つは、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの名前でも知られるアレル特異的ハイブリダイゼーションである。この方法では、1ヌクレオチドだけ異なる2種類の短いオリゴヌクレオチドプローブが用いられる。研究されているDNAを、これらの2種類の標識プローブと別々にハイブリダイズさせる。ゲノムDNAは、完全に相補する配列を有するプローブとしかハイブリダイズしない。アレル特異的PCR法は、DNA増幅の定量が可能なシグナルをもつ二本鎖DNAマーカーを用いて実施することができる。SYBRGreenによる変異の分析は単純性および迅速性という大きな利点を有する。それにもかかわらず、SYBRGreenによる簡単な分析でも、特に、点変異を特定する場合、ごくわずかな非特異的検出が生じる。従って、このアプローチは、目標が臨床用キットまたは産業用キットである場合、信頼性があまり高くない。この非特異性作用を回避するために様々な方法が開発されたが、2つ以上の工程からなり、そのため、さらに時間がかかる。従って、本発明者らは、遺伝子多型が存在するか、または遺伝子多型が存在しないかを定性的に結論づける分析方法を設計および開発した。遺伝子の変異状況陽性の決定は、非変異cirDNAに対する変異cirDNAのパーセントを計算することによって確立される。それぞれの所与の変異について、と呼ばれる非特異性のパーセントを決定することが可能である。を超えると、遺伝子が多型を含むことが明確に証明される。しかしながら、いわゆる増幅の使用はcirDNA分析には危険な場合がある。なぜなら、本発明者らの結果から、この場合、増幅DNA定量は増幅断片の長さの関数において非常に大きく変化することが証明されているからである。従って、本発明者らの結果を念頭において、本発明者らは、IntPlex法において、検出される変異を含む100bpより小さなアンプリコンの増幅を同一サイズのアンプリコンの増幅と比較する。cirDNAに含まれる配列内の可能性のある不均衡をできるだけ限定するために、対照アンプリコンは増幅配列の近くに配置される。参照アンプリコンを定量することによって、ある決まったcirDNA総量も決定確認することができるだろう。モノヌクレオソームのサイズは180~220bpであるので、220bpより大きなアンプリコンの量と180bpより小さなアンプリコンの量との比は従来より完全性すなわちアポトーシスの程度に相当する。従って、本発明者らは、変異アンプリコンの末端と対照アンプリコンの末端が220bpの最小距離によって分けられるようにIntplexを設計した。長い断片のサイズを短い断片のサイズおよび180bpまで小さくすることによって、より一般的に健康対象と病態をもつ個体を識別すできるように完全性指数を最適化することができる。図9は、SNPを分析するためのIntPlex法の使用の一例を示す。本実施例では、プライマーB1は、その3末端に、状況と比べて塩基変化を含む。プライマーA1およびA2を用いて増幅すると60bpの断片が生じる。変異断片はプライマーB1およびB2によって増幅される。A1およびB2プライマーを用いて増幅すると300bpの断片が生じる。結果として、本発明は、一例として示した模式図に基づいて、遺伝子多型の存在の定性検出cirDNAの特異的定量アポトーシス率の評価図9の模式図における以下の計算による遺伝子多型の存在の定性検出特定の閾値より大きなB1B2A1A2B1B2は、遺伝子多型を含む配列と定義されるcirDNA総量A1A2量の特異的定量腫瘍cirDNA量B1B2量の特異的定量B1B2またはA1A2A1B2でのcirDNA断片化の決定によるアポトーシス率の評価を統合する、cfDNAを分析するための方法にある。本発明者らが、XおよびYがプライマーの5末端間のDNA上にある距離であると考えることによって統合システムをモデル化するのであれば、統合システムIntplexは、XYXX理想的には、50である。この方法は、摘出後に実施され、解剖病理学検査室および分析検査室の存在を必要とし、費用と時間がかかる。特異的な分析方法によって変異、特に、抗EGFR治療のセラグノスティック状況ではKRASSNPを簡単かつ厳密に定量および検出できるのであれば、cirDNAは非侵襲的かつ強力な診断ツールになり得るだろう。従って、本発明者らは、標的化CRC治療のセラグノスティック状況においてIntPlex法を、より特異的なKRASSNP検出に合うようにした。これは、強力で特異的なEGFR阻害剤の使用およびKRASの変異状況に関する差し迫った臨床上の必要性に対する反応をもたらし得るだろう。このシステムでは変異は3末端に位置し、従って、2つの可能性のある設計従来IntplexおよびリバースIntplexにつながった。前記のように、Intplexシステムは、100bpより小さなサイズのDNA断片を増幅する2種類のプライマー対を含む。この増幅によって、一方の末端から他方の末端まで300bp離れた断片が得られる。この設計は、参照増幅すなわち標準を構成する配列を増幅するためのプライマー対、および変異配列を増幅する別のプライマー対を含む。正確に同じサイズの、かつ他方の近くにある配列を有する参照アンプリコンを使用することによって、例えば、リバースKRASの場合では、従来KRASシステムの場合ではの比を計算することによって変異DNAパーセントを決定することが可能である。本発明者らの以前の結果は、cirDNA試料を用いてQPCRによって作製されたアンプリコンのサイズが極めて重要なことを示している。さらに、プライマーA1B2を用いて得られた断片のQPCR分析によって、完全性指数を決定することができる。DIIはcirDNAの断片化状況を示す。完全性指数はアポトーシス率の逆数に相当する。aQPCRIntPlexシステムの設計従来Intplexでは、KRASG12V変異を検出するために文献中に典型的に用いられるプライマーG12Vが用いられる。このプライマーは、変異が3末端に位置するセンスオリゴヌクレオチドである。リバースIntplexでは、変異が3末端にあるアンチセンスプライマーが用いられる。これらの2つのシステムのプライマーは全てソフトウェアによって選択された。システムIntplexKconvおよびKrevは、KRAS変異G12Vを検出するために適用された。この変異を特異的に検出するプライマーは、KRAS遺伝子の変異領域をカバーするように設計されている。センスプライマーは、コードDNA鎖に含まれる配列を含むと従来より定義される。従来IntplexシステムおよびリバースIntplexシステムは、変異を標的とするプライマーのセンス方向またはアンチセンス方向の点で異なる。bcirDNAを定量するためのサイズパラメータの重要性の説明本実験において、本発明者らは、異種移植マウスの血漿試料から単離されたcirDNAを用いて、2つのIntplexシステムKrevおよびKconvを試験した。効力および感度を証明するために、またはKRASG12VまたはBRAFV600E変異の存在を検出するために、Intplexシステム用に特別設計されたオリゴヌクレオチドプライマーの配列および化学修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドの配列を表2に示した。本実施例では、ブロッカー法を用いたASまたはQPCRを使用した。従来IntPlexシステムおよびインバースIntPlexシステムを用いてBRAFおよびKRASの変異が検出された。表2本発明者らの結果から、KrevおよびKconvを用いて同一プロファイルが得られた。図12および13は、標的配列とは無関係にアンプリコンが同じサイズの時にcirDNA濃度の測定値が同等であることをはっきりと示している。さらに、この結果から、67bpアンプリコンについて得られた値は、KconvおよびKrevそれぞれの189bpアンプリコンについて得られた値の22倍および14倍、312bpアンプリコンおよび320bpアンプリコンについて得られた値と比較した時に79倍および90倍であることが分かる。従って、これらの結果のクロス分析は、同一サイズのアンプリコンを生じるプライマーシステムを用いたQPCRによるcirDNA定量の正確度を裏付け、結果として2つの分析システムKrevおよびKconvを実証している。表3KrevおよびKconvを用いた異なるタイプのDNAのアポトーシス率完全性比は、短いDNA断片の濃度と長いDNA断片の濃度との比、すなわち、Krevの場合はA1B2B1B2およびKconvの場合はA1B2A1A2に相当する。アポトーシス率は、アポトーシス由来のDNAおよび壊死由来のDNAの割合の評価、従って、cirDNAの由来の決定を可能にする。システムKrevを用いて、本発明者らは、胎盤ゲノムDNAの場合、078のアポトーシス率、SW620CRC培養細胞の変異DNAの場合、200のアポトーシス率を得た。システムKconvを用いて、本発明者らは、胎盤DNAの場合、128の率、SW620細胞からのDNAの場合、192の率を得た。本発明者らはまた、2つのシステムKrevおよびKconvを用いて、異種移植マウスの血漿試料から単離されたcirDNAのアポトーシス率も計算した。得られたアポトーシス率はKrevの場合、833であり、Kconvの場合、834であった。cirDNAのアポトーシス率は、ゲノムDNAのアポトーシス率より大きい。胎盤DNAおよび細胞DNAの率を比較した時、これらが組織および細胞に由来したために、従って、サンプリング方法が異なったためにアポトーシス率が異なったのかもしれない。注目すべきことに、2つのシステムKrevおよびKconvにおいて同一試料のアポトーシス率は非常に似ており、このことは、この尺度のロバストネスを強調する。このロバストネスは、同一サイズの2つの配列の増幅を直接比較したことに加えて、このような配列が極めて類似していたことに由来する。同じサイズであるが、変異配列からかなり離れた配列を用いても類似レベルの正確度は得られないであろう。2血液試料中のBRAF変異の検出遺伝子BRAFはCRC腫瘍の14超において体細胞変異を受ける。変異V600EはBRAF変異の90超に相当する。KRAS変異と同様に、BRAF変異があると抗EGFR治療が効かなくなる。従って、転移性CRC患者の治療時に、この変異の存在の評価が必要とされる。従って、本発明者らは、cirDNAの中のBRAF変異を検出するために従来IntPlexシステムを設計および開発した。このIntplexシステムを用いて、ゲノムの中にBRAF変異V600Eを含むヒトCRCHT29細胞が異種移植されたマウスの血漿試料が分析されている。短い参照アンプリコンの平均濃度は315ngmlであり、従って、試料S4HT29のcirDNA中にある長いアンプリコンの平均濃度の約8倍であった。同様に、プライマー対ヒトWTBRAFを用いて得られた断片の濃度は15ngmlであり、短いBRAFアンプリコンの濃度の約12であった。これらの結果は、短いDNA配列の標的化が、長い配列の標的化より重要なcirDNA抽出物増幅が生じることをはっきりと裏付けている。WT参照配列に対する変異ヒトDNAのパーセントは775であった。これは、このHT29細胞株におけるBRAF変異のヘテロ接合性を考慮に入れた時、理論的に50になったはずである。Intplexシステムの感度を評価するために、異種移植マウスの血漿からのDNA試料S4を胎盤ゲノムDNA試料で110に希釈した。図15にまとめた結果から、変異DNAは非変異DNAの695に相当し、これは、無希釈S4試料を用いて得られたものの約110であることが分かる。長い配列の増幅は参照配列の増幅よりわずかであるが、有意に少なかった。これらの2つの実験の結果は、アンプリコンのサイズを正確に考慮に入れる重要性と、IntPlexシステムの妥当性を示している。実際には、変異cirDNAパーセントの計算値は、参照として用いられる増幅システムの関数において劇的に異なることがある同じサイズの参照を使用した時には775、288bpの参照を使用した時には567。cirDNAがゲノムDNAで希釈された時にcirDNAパーセントが同じサイズの参照の場合では695、288bpの参照の場合では845であるという知見は、cirDNAがゲノムDNAで希釈された時にサイズパラメータが重要でないことを示している。アポトーシス率は、無希釈cirDNAの場合では741に相当し、希釈cirDNAの場合では121に相当するので、cirDNA量の関数においてかなり変化する。この差違は多くの点で重要であり、cirDNAの特徴である。3ヒト血漿試料中のcirDNAを分析するためのIntPlex法の使用の説明KRASのSNP変異ならびにBRAF変異V600Eは、孤発性変異CRCの約82の原因である。これらの変異は、KRAS変異およびBRAF変異がCRCに関連し、抗EGFR療法に応答しない患者の94に存在する。本発明者らは、IntPlex法を、cirDNA抽出物中のこれらの変異の検出に合うようにした。前記変異の存在を検出するために、Intplexシステム用に特別設計されたオリゴヌクレオチドプライマーの配列および化学修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドの配列を表4に示した。本実施例では、ブロッカー法を用いたASQPCRを使用した。BRAF変異および6つのKRAS変異が、従来IntPlexASBQPCRシステムおよびインバースIntPlexASBQPCRシステムそれぞれを用いて検出された。表4一例として、図17は、KRAS変異G12Vを明らかに有するCRC患者、その変異を有すようには見えなかったCRC患者、および健康個体からの血漿試料を用いて得られた結果を示す。CRC1では、cirDNAの断片の68が変異KRASG12Vを有するのに対して、他のKRAS変異のパーセントは、この患者では12を超えない。CRC2では、cirDNA断片の0~66がBRAF変異またはKRAS変異を有するように見える。HHP1では、cirDNA断片の0~32がBRAF変異またはKRAS変異を有するように見える。CRC2データは、明らかに変異したcirDNAの有意なを示すが、レベルは4種類の変異について同じであるように見える。非常に稀な症例を除き、これらの変異は互いに相反するという事実を考えると、CRC2の場合、変異状況を特異的に規定するための変異cirDNAの閾値に達していない。従って、CRC2血漿中の変異cirDNAを定量するために得られた値は非特異的な効果に相当する。ここでは正の閾値を少なくとも7に固定することができたが、それぞれの変異についての閾値を決定するためには、重要な試料数を用いた研究が必要とされる。さらに、変異パーセントと他のパーセントとの識別を評価するために、アルゴリズムを用いて試料内の閾値を統合することができる。それにもかかわらず、この数字はCRC1だけが変異を有していることを示す。驚いたことに、様々な臨床試料におけるこれらの結果および他の結果から、文献に記載の結果と比較して、変異cirDNA断片の割合は極めて高いように見えることが分かる。このことは、腫瘍cirDNAの高感度かつ特異的な分析を生じる本発明者らの方法の能力ならびにその革新的な特徴を示している。結果として、残念なことに、CRC2患者とは対照的に、CRC1患者はEGFR阻害剤で治療することができない。従って、本発明の一部である、この適合されたIntplex法は、cirDNAのサイズ集団の正確な知識に基づく簡単なcirDNA分析法であるように思われる。これは、一段階QPCRでcirDNAの直接分析を可能にするオリゴヌクレオチドプライマーの正確な選択に頼っている。循環核酸分析からの3組の独立したデータを同じ試験において統合することができる。実施例VIHHP対象およびCRC対象のcirDNA濃度プロファイル3人のCRC患者および3人の健康個体からの血漿試料から、前記のように60bp、73bp、101bp、145bp、185bp、249bp、300bp、357bp、409bpの断片を増幅するプライマーセットを用いたqPCRによってcirDNA濃度を決定した。得られた濃度プロファイルは、これらの全てについてCRC対象または健康対象のいずれかに特異的である。HHP対象の最大値平均は619ngml血漿であり、CRC対象の最大値平均は94359ngml血漿であった。30060比および30073比を使用した時に、HHPCRC完全性指数の比の計算による最良の識別が得られ、以前のデータが裏付けられた。明らかに、40960の比が最も高かったが、自由裁量によって考慮に入れなかった。なぜなら、CRC血漿中の409断片の増幅により得られた濃度が分析感度に近かったからである。ある断片サイズ増幅によって得られた濃度を、次のそれぞれの増加するサイズから差し引くことによって、60~409bpの範囲内にあり、連続した2つのアンプリコンサイズ間のcirDNA量のを評価することができる。ctDNAで表された値対ctDNA長さの画分を図18のヒストグラムに示した。データは、CRC血漿およびHHP血漿が6073bp、73101bp、および101145bp範囲にあるcirDNA量の同じプロファイルを示し、73101範囲ではCRC血漿のレベルの方が著しく高いことを示唆している。145185~357409bp範囲にはHHPcirDNAが存在しないこととは対照的に、cirDNAレベルが9から2に減少して有意に検出された。HHPからのcirDNAについて高い割合の409bpより大きなサイズが見出されたのに対して、CRCcirDNAについては非常に低いレベルが確かめられた。これらのデータは、当業者からは予想されない、HHP血漿とCRC血漿との良好な識別をはっきりと示している。実施例VII患者における病理学的状況または生理学的状況、例えば、腫瘍の存在または腫瘍進行の診断または予後を行うための方法において提唱されるロジスティック関数のパラメータ。前記病理学的状況または生理学的状況はSNP遺伝子マーカーに関連する診断または予後の内容に関連する最終値を得るために、少なくとも2種類のバイオマーカーを含む、ロジスティック関数によって組み合わせることができる値XYXX理想的には50300bp範囲に見出された。CRC019血漿中に、総ctDNAの61は73~145bpに見出されたのに対して、35および5はそれぞれ145~300bpおよび300bp範囲に見出された。30~130bpのゲル部分において、総ctDNAの57が観察された。これらのデータは、180bpより小さな、特に100bpより小さなサイズのctDNAが多量に存在することを証明する。従って、電気泳動は、ctDNAサイズを評価するための適切な分析方法ではない。これは、ctDNAが180bpより大きなサイズであると明らかに示した電気泳動分析に基づく以前に確立された仮説が間違っていると初めて証明したものである。本発明者らは、180bpより小さなサイズのctDNA断片が、以下の理由でシグナル閾値より小さくなるために、電気泳動および蛍光色素標識後に見えなくなると推論する。1180bpより小さなctDNA断片はヌクレオチドごとに異なる場合があり、そのため正確なサイズでは局所濃度が小さくなる。2Sybregreenなどの蛍光色素には最大インターカレーションレベルがあり、そのため小さなサイズのctDNAのシグナル強度は厳しく限定される。例えば、69bpDNA断片のシグナルは207bp断片のシグナルの13である。実施例IX100bpより小さな、例えば、60bpのサイズのctDNAのctDNA濃度から決定されるDIIは健康個体とCRC個体を有意に識別するゲノムDNAならびにマウス血漿ならびにヒト血漿からのctDNAのDII値の比較。DIIは、KRAS領域中にある300bp配列および60bp配列を標的化することによって得られた濃度の比によって評価された。HHPのDII平均値はCRCのDII平均値とは有意に異なる。類似の差違が動物モデルにおいて観察された。この場合、平均DIIは健康血漿ctDNAについては0447であり、非腫瘍由来ctDNAについては0645であり、腫瘍由来ctDNAについては0027であった。これは、DIIを決定するために、100bpより小さな、特に、ここで用いられた60bpのサイズのアンプリコンを検出する発見を支持する。表5ゲノムDNAならびにマウス血漿からのctDNAからのDII値の比較実施例X本発明のプライマーデザインを使用し、様々な遺伝子領域において計算されたDIIは高い正確度および少ないばらつきを示す本発明によるマルチプレックス法において用いられるプライマーのデザインについては2種類の構成convおよびinvがある。ここで、本発明者らは、KRASおよびBRAF領域におけるconv構成およびinv構成、KRAS遺伝子の2番目のイントロンにおけるconv構成を用いてCRC患者血漿からDIIを決定した。本発明者らは、これらのDIIを、同じ遺伝子内の離れた領域において計算されたDII、および2つの異なる遺伝子の離れた領域において計算されたDIIと比較した。第1に、データは、遺伝子領域が何であっても、本発明者らの発明の際に計算されるDII値の高い正確度および少ないばらつきを初めてはっきりと証明する。DII値は0077から0094まで異なる。第2に、同じ遺伝子または異なる遺伝子の中にある離れたDNA配列を標的とするプライマー対を用いて得られた値は異なり、より正確には、本発明のプライマーデザインに従って見出された値より有意に小さい。QPCR分析からの値と、以前に述べられた実験条件下でのDNA抽出からの値の最大相関係数は23である。実施例XI100bpより小さなctDNAサイズ画分の量が関与する様々な指数の決定図18に示したデータから様々な指数が決定された。これらの指数は異なるサイズ画分から計算された。表6300bpのctDNA断片の割合は、300bp標的を増幅するプライマーセットを使用することによって決定された。ctDNA完全性指数は、300bp標的を増幅するプライマーセットを用いて決定された濃度と、82bp標的を増幅するプライマーセットを用いて決定された濃度との比を計算することによって決定された。サイズ画分比は、300bpの断片からなるように見られ、138~300bpの断片は目に見えない。データは、ctDNAサイズ画分分析、特に、本発明者らが本研究において計算したサイズ画分比、例えば、SFRの決定によるctDNAサイズ画分分析がKRASの変異ctDNAと非変異ctDNAとの区別に役立ち得ることをはっきりと示している。さらに、サイズ画分分析はctDNA放出機構の内容についての指示を開示することがある。それにもかかわらず、健康個体からのctDNAとは対照的にCRC患者における非腫瘍由来ctDNAは主にアポトーシスに由来し、より少ない程度で腫瘍由来ctDNAに由来し得ることがデータから示唆される。ここで実施されたような連続ネステッドQPCRを用いた増幅実験は時間がかかるので、このような指標の計算によってサイズパターン分析が容易になるはずである。実施例XIIIアンプリコン長を使用した時の総ctDNAからの変異断片の測定値の比較ctDNAの定量は、CRC40においてKRASG12D、CRC50においてKRASG12D、およびCRC60においてKRASG13D変異を有する腫瘍細胞のある患者の血漿から、82bp、138bp、300bpの漸増するサイズの標的を増幅することによって決定された。変異ctDNAの定量は、3に変異を含む同じリバースプライマー、ならびに5末端から82bp、138bp、および300bp離れた領域を標的とするプライマーから構成されるプライマー対を用いて行われた。非変異ctDNAは、同じフォワードプライマーおよび野生型配列を有する同じリバースプライマーを用いて定量された。総ctDNAは変異断片と非変異断片の合計に相当する。データは、変異体ctDNA断片の測定値が、検出されるアンプリコンのサイズに応じて異なることをはっきりと示し、アンプリコンサイズが100bpより小さい時に変異体ctDNA断片の量が非常に多いことを証明している。これにより、変異体断片のパーセントを決定することによって、ctDNAから変異の存在がより正確に検出される。この値が閾値パーセントを上回った時に、陽性検出は決定される。それぞれのCRC血漿について、82bpアンプリコンを検出した時の変異は138bpアンプリコンの検出と比較してCRC4において約25倍、CRC5において34倍、およびCRC6において63倍に増加するのに対して、値が計算されたctDNAに対する割合はCRC4において33倍、CRC5において39倍、およびCRC6において93倍であった。表9実施例XIV生検材料の配列決定によって決定されたKRAS変異状況と本発明によるctDNAに基づく方法によって決定されたKRAS変異状況とが完全に一致することを示す追加データ表10実施例XV様々なサイズのアンプリコンの検出からのctDNA量を用いて計算されたDII表11表12本発明者らは、動物実験からの様々な短い配列および長い配列のPCR増幅ならびに臨床試料のctDNAのサイズプロファイリングを用いてDIIを決定した。本発明者らが、60bpなどの短いアンプリコンを検出することによって決定される濃度がctDNA総濃度に相当すると考えるのであれば、DIIは、長いアンプリコンより大きなサイズのctDNA画分のに相当する。データから、60bpまたは73bpなどの249bpのサイズのアンプリコンを検出することによってDIIを計算した時に健康血漿とCRC血漿との間で最大の差が観察されたことが分かる。マウス実験から計算されたDIIは、この観察を裏付けている。より正確には、101bpまたは145bpなどの100bpより大きなサイズのアンプリコンのQPCR検出を用いて計算されたDIIと比較した時に、60bpまたは73bpを用いて計算されたDIIは臨床試料において約115であり、異種移植マウスにおいて約117である。従って、100bpより小さな、特に、73bpより小さなアンプリコンサイズの検出の使用によって、健康個体とCRC患者を良好に識別することが可能になる。300bpの画分の使用より、409bpの画分の使用によってCRC個体と健康個体が良好に識別されることに留意のこと。実施例XVI変異を検出するために本発明による方法を使用した時の変異の下流または上流に位置するDNA領域の説明非常に多くの報告が、変異を検出するように提唱した時に変異の下流または上流に位置する領域の標的化について説明した。例えば、この領域に対応するDNA配列とハイブリダイズするように様々なプライマーが設計された。ここで、本発明者らは、conv構成またはrev構成構成、それぞれ、これらのconv構成およびinv構成に関連する分子実体のconv設計およびrev設計とも呼ばれるのいずれかで、この方法に用いられるプライマーデザインの説明に従って、他の領域を標的化する分子実体の使用を保護することを主張する。本発明者らは、以下のパラメータが与えられれば、検出される変異からこれらの領域について説明することができる。プライマー最小サイズ15ヌクレオチドプライマー最大サイズ30ヌクレオチド2種類のプライマー間の間隔5bpA1A2またはB1B2のアンプリコンサイズ範囲35~100bpA1B2は250~450bpのサイズ範囲内にある。図11Aに示したようなconv設計の場合、保護される分子実体は、以下B2プライマーがハイブリダイズし、非センスDNA鎖にある変異の位置から5~85ヌクレオチド下流に位置する領域検出される変異の位置から430~100ヌクレオチド上流にプライマー対A1A2を設計することができる領域を標的とする分子実体である。図11Bに示したようなinv設計の場合、保護される分子実体は、以下A1プライマーがハイブリダイズし、非センスDNA鎖にある変異の位置から5~85ヌクレオチド上流に位置する領域検出される変異の位置から100~430ヌクレオチド下流にプライマー対B1B2を設計することができる領域を標的とする分子実体である。ABRAFV600E点変異が関心対象の時に本発明者らの方法の際に標的化されるDNA領域の例aプライマーなどの分子実体が、この変異に適用される本発明者らのマルチプレックス法の際に標的とすることができる領域を示した図23を参照されたい。この変異に適用される前記方法に有用な、選択されたオリゴヌクレオチド。bBRAF従来システム用のB2プライマー用の選択されたオリゴヌクレオチド表13cBRAFリバースシステム用のA1用の選択されたオリゴヌクレオチドプライマー表14BKRAS遺伝子の2番目のエキソンの2番目および3番目のコドンのホットスポット点変異が関心対象の時に本発明者らの方法の際に標的化されるDNA領域の例aプライマーなどの分子実体が、この変異に適用される本発明者らのマルチプレックス法の際に標的とすることができる領域およびプライマーを示した図24A~24Eを参照されたい。KRAS領域の2番目のエキソンUponEnsemblデータバンクからのKRASvKiras2Kirstenラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログSourceHGNCSymbolAcc6407点変異6151KRAS従来設計およびインバース設計図24A~24Eを参照されたい。bconv構成の際のKRASエキソン2ホットスポット変異を検出するためのA1A2プライマー対用の選択されたDNAオリゴヌクレオチド表15Cインバース構成の際のKRASエキソン2ホットスポット変異を検出するためのA1A2プライマー対用の選択されたDNAオリゴヌクレオチド表16A1SEQIDNO163196参考文献