"A第1、第2および第3の発現ベクターの存在下で、潜在的宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、前記第1のベクターが、第1の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、前記第2のベクターが、第2の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、前記第3のベクターが、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼをコードするコード領域を含み、前記第1のベクターに対する前記第3のベクターの濃度比が少なくとも3:1であり、前記第2のベクターに対する前記第3のベクターの濃度比が少なくとも3:1である工程;B工程Aで得られた細胞に選択圧をかけ、前記第1のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程;C工程Bで得られた細胞に選択圧をかけ、前記第2のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程;D工程Cで得られた細胞を限界希釈し、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼmonoxygenaseを発現する細胞を選択する工程を含む、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼの発現のための細胞株の調製方法。工程Dで得られた細胞に増幅した選択圧をかけることにより、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼを増幅する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記第1の選択可能なマーカーが、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子である、請求項1に記載の方法。前記第2の選択可能なマーカーが、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子である、請求項1に記載の方法。前記選択可能なマーカーの少なくとも一方がジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子であり、前記増幅がメトトレキサートの存在下で行なわれる、請求項2に記載の方法。前記第1のベクターに対する前記第3のベクターの濃度比が少なくとも10:1であり、前記第2のベクターに対する前記第3のベクターの濃度比が少なくとも10:1である、請求項1に記載の方法。前記第3のベクターが、リボソーム結合部位、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のSV40エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を含む、請求項1に記載の方法。前記第3のベクターが、リボソーム結合部位、ヒトメタロチオニンを含む制御領域、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のエンハンサーに操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を含む、請求項1に記載の方法。前記エンハンサーがSV40エンハンサーである、請求項8に記載の方法。前記潜在的宿主細胞がCHOK1細胞を含む、請求項1に記載の方法。請求項1に記載の方法で得られる細胞株。Aペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼの不純試料を陰イオン交換クロマトグラフィーにかける工程であって、溶出が均一濃度である工程;B工程Aの溶離液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける工程であって、硫酸アンモニウムが使用されず、溶出が均一濃度である工程を含む、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼを発現および培養培地中への分泌後に精製する方法。工程Bにおいてカラム結合を助長するために、クエン酸ナトリウムが用いられる、請求項12に記載の方法。ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現させるための発現ベクターでトランスフェクトされたCHOK1細胞。前記発現ベクターが、リボソーム結合部位、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のSV40エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する、請求項14に記載の形質転換細胞。前記発現ベクターが、リボソーム結合部位およびヒトメタロチオニンIIAプロモーターを有する制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する、請求項14に記載の形質転換細胞。前記ベクターが、前記プロモーターの上流にエンハンサーをさらに含む、請求項16に記載の形質転換細胞。前記エンハンサーがSV40エンハンサーである、請求項17に記載の形質転換細胞。リボソーム結合部位、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のSV40エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクター。リボソーム結合部位およびヒトメタロチオニンIIAプロモーターを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクター。前記ベクターが前記プロモーターの上流にエンハンサーをさらに含む、請求項40に記載のベクター。前記エンハンサーがSV40エンハンサーである、請求項21に記載のベクター。A第1、第2および第3の発現ベクターの存在下で、潜在的宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、前記第1のベクターが、第1の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、前記第2のベクターが、第2の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、前記第3のベクターが、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードするコード領域を含み、前記第1のベクターに対する前記第3のベクターの濃度比が少なくとも3:1であり、前記第2のベクターに対する前記第3のベクターの濃度比が少なくとも3:1である工程;B工程Aで得られた細胞に選択圧をかけ、前記第1のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程;C工程Bで得られた細胞に選択圧をかけ、前記第2のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程;D工程Cで得られた細胞を限界希釈し、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現する細胞を選択する工程を含む、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの発現のための細胞株の調製方法。工程Dで得られた細胞に増幅した選択圧をかけることにより、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを増幅する工程をさらに含む、請求項23記載の方法。前記第1の選択可能なマーカーが、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子である、請求項23記載の方法。前記第2の選択可能なマーカーが、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子である、請求項23記載の方法。前記選択可能なマーカーの少なくとも一方がジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子であり、前記増幅がメトトレキサートの存在下で行なわれる、請求項24記載の方法。前記第1のベクターに対する前記第3のベクターの濃度比が少なくとも10:1であり、前記第2のベクターに対する前記第3のベクターの濃度比が少なくとも10:1である、請求項23記載の方法。前記第3のベクターが、リボソーム結合部位、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のSV40エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を含む、請求項23記載の方法。前記第3のベクターが、リボソーム結合部位、ヒトメタロチオニンを含む制御領域、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のエンハンサーに操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を含む、請求項23記載の方法。前記エンハンサーがSV40エンハンサーである、請求項30記載の方法。前記潜在的宿主細胞がCHOK1細胞を含む、請求項23記載の方法。請求項23~32のいずれか1項に記載の方法で得られる細胞株。請求項19~22のいずれか1項に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を含む細胞株。請求項14~18のいずれか1項に記載の細胞または細胞株によって発現されるペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ。グリシン残基を有し、遊離酸の形態であり、カルボニル基に結合された前駆体を、請求項35に記載のペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの存在下で反応させた後、ルイス塩基またはペプチジルα-ヒドロキシグリシンα-アミド化リアーゼの存在下で、さらに反応させることを含む、アミド化生成物のインビトロ産生方法。前記前駆体が、C末端グリシンを有するペプチドである、請求項36記載の方法。請求項36記載の方法で得られるアミド化生成物。Aペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの不純試料を陰イオン交換クロマトグラフィーにかける工程であって、溶出が均一濃度である工程;B工程Aの溶離液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける工程であって、硫酸アンモニウムが使用されず、溶出が均一濃度である工程を含む、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現および培養培地中への分泌後に精製する方法。工程Bにおいてカラム結合を助長するために、クエン酸ナトリウムが用いられる、請求項39記載の方法。Aグリシン残基を有し、遊離酸の形態であり、カルボニル基に結合された前駆体を、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの存在下で反応させることにより、ヒドロキシル化中間体を形成すること;およびB前記中間体を、ルイス塩基またはペプチジルα-ヒドロキシグリシンα-アミド化リアーゼのいずれかと同時またはその後反応させることを含む、アミド化生成物のインビトロ産生方法であって前記ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼが、請求項14~18のいずれか1項に記載の細胞または細胞株によって発現された、産生方法。工程Bでルイス塩基が用いられる、請求項41記載の方法。発明の概要したがって、本発明の目的は、酵素が後に製品の製造例えば、アミド化医薬品の製造に使用される場合に問題となり得る哺乳動物型のタンパク質および他の不純物が実質的にない培地中で良好な生存割合および良好な発現収率を有するのに充分強いPAM発現細胞またはPHM発現細胞を提供することである。本発明のさらなる目的は、それ自体は有意な望ましくない不純物を共発現しないPAM発現細胞またはPHM発現細胞を提供することである。さらなる目的は、良好な発現収率をもたらすPAM発現細胞またはPHM発現細胞を提供することである。さらなる目的は、かかる細胞に有用な発現ベクターを提供することである。さらなる目的は、かかる細胞をトランスフェクトおよび選択するための良好な手法を提供することである。さらなる目的は、酵素反応用の高活性および高純度のPAMまたはPHMを提供し、それにより、良好な酵素反応および結果としてのアミド化生成物を提供することである。これらおよび他の目的は、本明細書に開示する本発明によって提供される。一実施形態において、本発明は、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼを発現させるための発現ベクターでトランスフェクトされたCHOK1細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、リボソーム結合部位、プロモーターおよび該プロモーターの上流のSV40エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、リボソーム結合部位およびヒトメタロチオニンIIAプロモーターを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、A第1、第2および第3の発現ベクターの存在下で、潜在的宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、該第1のベクターが、第1の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、該第2のベクターが、第2の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、該第3のベクターが、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼをコードするコード領域を含み、該第1のベクターに対する該第3のベクターの濃度比が少なくとも3:1であり、該第2のベクターに対する該第3のベクターの濃度比が少なくとも3:1である工程;B工程Aで得られた細胞に選択圧をかけ、該第1のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程;C工程Bで得られた細胞に選択圧をかけ、該第2のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程;D工程Cで得られた細胞を限界希釈し、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼを発現する細胞を選択する工程を含む、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼの発現のための細胞株の調製方法を提供する。別の実施形態において、本発明は細胞株UGL73-26/Mを提供する。別の実施形態において、本発明は、細胞株UGL73-26/Mによって発現されるペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼを提供する。別の実施形態において、本発明は、Aペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼの不純試料を陰イオン交換クロマトグラフィーにかける工程であって、溶出が均一濃度である工程;B工程Aの溶離液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける工程であって、硫酸アンモニウムが使用されず、溶出が均一濃度である工程を含む、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼを発現および培養培地中への分泌後に精製する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現させるための発現ベクターでトランスフェクトされたCHOK1細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、リボソーム結合部位、プロモーターおよび該プロモーターの上流のSV40エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、リボソーム結合部位およびヒトメタロチオニンIIAプロモーターを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、A第1、第2および第3の発現ベクターの存在下で、潜在的宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、該第1のベクターが、第1の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、該第2のベクターが、第2の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、該第3のベクターが、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードするコード領域を含み、該第1のベクターに対する該第3のベクターの濃度比が少なくとも3:1であり、該第2のベクターに対する該第3のベクターの濃度比が少なくとも3:1である工程;B工程Aで得られた細胞に選択圧をかけ、該第1のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程;C工程Bで得られた細胞に選択圧をかけ、該第2のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程;D工程Cで得られた細胞を限界希釈し、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現する細胞を選択する工程を含む、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの発現のための細胞株の調製方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、Aペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの不純試料を陰イオン交換クロマトグラフィーにかける工程であって、溶出が均一濃度である工程;B工程Aの溶離液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける工程であって、硫酸アンモニウムが使用されず、溶出が均一濃度である工程を含む、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現および培養培地中への分泌後に精製する方法を提供する。所望の酵素は、本発明の細胞および細胞株によって発現され、好ましい実施形態では、本発明の精製手法に従って精製される。次いで、該酵素の存在下で、グリシン残基を有し、遊離酸の形態であり、カルボニル基に結合された前駆体から始まる反応が行なわれる。反応条件および補因子は当該技術分野で知られている。本明細書に記載の実施例1および2に、アミド化生成物の典型的なアミド化反応および精製を示す。好ましいアミド化生成物が得られる。ペプチジルα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを用いた場合、中間体が得られ、これは、アミド化生成物を形成するために、ルイス塩基またはペプチジルα-ヒドロキシグリシンα-アミド化リアーゼのいずれかとのさらなる反応を必要とする。酵素産生細胞株、例えば本明細書に記載のものが、酵素を発現して培養培地中に分泌する場合、特定のある実施形態では、続いて、該酵素を精製するための一連の工程が行なわれ得る。収集工程では、ならし培地が細胞から分離される。第1のタンジェンシャルフロー濾過濃縮、ダイアフィルトレーションにより、低分子量成分が除去される。陰イオン交換クロマトグラフィー工程および疎水性相互作用クロマトグラフィー工程は、主に、タンパク質不純物および培地成分からの精製のために用いられる。ウイルス濾過前の最後のタンジェンシャルフロー濾過、濃縮およびバッファー交換は、望ましくは、保存前に実施される。改善された陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを、本明細書の特許請求の範囲に示す。驚くべきことに、望ましくは安定なCHOK1細胞が、内在ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の存在にもかかわらず、本発明の状況において使用され得ることがわかった。該内在遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有する選択可能なマーカーに基づくメトトレキサート選択を有意に妨げなかった。PAM遺伝子と、独立したベクター上の2つの選択可能なマーカーとの共トランスフェクションは、本明細書に記載のように、ゲノムのより望ましい部分で起こる共増幅の機会を有意に増大させると考えられる。SV40エンハンサーが使用される場合、エンハンサーは、任意の転写プロモーター、例えば限定されないが、SV40転写プロモーター、本明細書に記載の好ましいメタロチオニンIIAプロモーターなどとともに使用され得ると理解されている。本発明に従って発現および精製されるペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼは、望ましくないプロテアーゼ活性を実質的に含まず、本明細書に記載のような基質の効率的なα-アミド化に好適である。本明細書に記載の好ましい細胞株であるUGL73-26/Mは、良好な長寿命プロフィールを示したため、安定性が非常に重要である規模の拡大に特に有用であると考えられる。同様に、本明細書に記載の好ましい精製手法では、拡張可能な特性および有意な生成物純度が提供される。具体的には、画分収集が有意に単純化される均一濃度の溶出が使用される。先行技術のような疎水性相互作用クロマトグラフィーと共に硫酸アンモニウムを使用することは、硫酸アンモニウムが酵素の沈殿および不活化を引き起こし得るため、望ましくは回避する。類推により、本明細書に記載の発明は、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼに関して有益であったため、ペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼに関して有益であることが予測される。本明細書に記載の好ましい態様の1つ以上を組み合わせて使用され得る。例えば、限定を意図しないが、好ましいプロモーターが、好ましいエンハンサーおよび/または好ましい宿主細胞と一緒に使用され得る。APHMおよびBPALまたはルイス塩基のいずれかがPAMの代わりにアミド化に使用される場合、PHMおよびPAL使用される場合は、いくつかの様式で得られ得る。一部を以下に示す。PHM発現されたときPHM活性のみを含むPAM遺伝子の天然に存在する形態の発現カエルに由来する酵素の一例は、天然に存在するPHM酵素である。Mizunoら1986,PeptideC-Terminala-AmidatingEnzymePurifiedtoHomogeneityFromXenopuslaevisSkinBiochemBiophys.Res.Commun.,1373984-991を参照のこと。これは、後に、完全長PAMではなくPHMであることがわかった。Suzukiら1990,EMBO9134259-4265を参照のこと。完全長PAMの発現および切断PAM酵素をPHM活性とPAL活性の間の部位、例えば2塩基性切断部位で切断するため、特異的プロテアーゼが使用され得る。次いで、PHM触媒ドメインが精製によって得られ得る。例えば、Ouafikら,1992TheMultifunctionalPeptidylglycinea-AmidatingMonooxygenaseGene:Exon/IntronOrganizationofCatalytic,Processing,andRoutingDomainsMolecularEndocrinology6101571-1584には、ラット由来PAM内の2つの触媒ドメインの位置が記載されており、対の塩基部位での内部タンパク質分解性切断により、2つの触媒ドメインが分離され得ると記載されている。また、Eipperら1993,Peptidylglycinea-AmidatingMonooxygenase:AMultifunctionalProteinWithCatalytic,Processing,andRoutingDomainsProteinScience2,489-497も参照のこと。PAM内への停止コドンまたはリーディングフレームを改変する点変異の導入代替法として、翻訳停止コドンTAA、TAG、TGAが、任意の種由来の任意のPAMcDNA内のPAMの2つの機能ドメインPHMおよびPAL間に導入され得るか、またはリーディングフレームを改変するために、かかる位置内に点変異が導入され得る。PHMcDNAのみを有する発現ベクターの再設計PCRを用い、PHMドメインのみをコードする切断型PAM遺伝子を合成し、プロモーターまたはエンハンサー/プロモーター配列の下流の発現ベクターに配置し得る。以下に、異なる型のPAM酵素およびその触媒ドメインに関するさらなる参考文献を示す。Mizuno,K.ら,1987CloningandsequenceofcDNAencodingapeptideC-terminalα-amidatingenzyme、XenopusLaevisBiochemBiophys.Res.Commun.,1482546-552Ohsuye,K.ら,1988CloningofacDNAencodinganewC-terminalα-amidatingenzymehavingaputativemembrane-spanningdomain、XenopusLaevisBiochem.Biophys.Res.Commun.,15031275-1281Koljekar,A.S.ら,1997Peptidylglycineα-amidatinghydroxylatingmonooxygenase:activesiteresidues,disulfidelinkagesandtow-domainmodelofthecatalyticcore,Biochemistry36:13901-13909Koljekar,A.S.ら,2002EssentialfeaturesofthecatalyticcoreofPeptidylglycineα-hydroxyglycineα-amidatinglyase,Biochemistry,41:12384-12394Bertelsen,A.H.ら,1990Cloningandcharacterizationoftwoalternativelysplicedratα-amidatingenzymecDNAsfromratmedullarythyroidcarcinoma,Arch.Biochem.Biophys.,279187-96JimenezN.ら,2003Androgen-independentexpressionofadrenomedullinandpeptidylglycineα-amidatingmonooxygenaseinhumanprostaticcarcinoma,MolecularCarcinogenesis35:14-24PAL天然に存在する形態のPALの発現PAMの2つの触媒ドメインは、ショウジョウバエと刺胞動物イソギンチャクの別々の遺伝子にコードされている。したがって、これらの種に由来するPALをコードする遺伝子は、プロモーターまたはエンハンサーenchancer/プロモーター配列の下流の発現ベクターに配置すると、発現され得る。Kolhekar,A.S.ら.1997NeuropeptideAmidationinDrosophila:SeparateGenesEncodetheTwoEnzymesCatalyzingAmidationJ.Neuroscience174:1363-1376を参照のこと。完全長PAMの発現および切断完全長の2つの機能を有するPAMを発現させ得、PHMを不活化させるために、PHMドメインとPALドメイン間および/またはPHMドメイン内の特異的プロテアーゼ部位で切断を行ない得る。任意の適当に特異的なプロテアーゼを用い、例えば、2塩基性切断部位でPHM活性をPAL活性から分離し得る。PAL活性/タンパク質は、さらに精製され得る。同様の手順および2塩基性切断部位の位置は、PHMの取得に関して上記に記載している。PALcDNAのみを有する発現ベクターの再設計PCRを用い、PALドメインのみをコードする切断型PAM遺伝子を合成し、プロモーターまたはエンハンサー/プロモーター配列の下流の発現ベクターに配置し得る。本発明の他の特徴および利点は、添付の図面、グラフ、表などに言及する本発明の以下の記載から明らかとなろう。発明の実施形態の詳細な説明本発明によるPAM発現細胞株内部的にはUGL73-26/MMWCB00と示すは、AmericanTypeCultureCollectionATCC,10801UniversityBoulevard,ManassasVirginia,20110-2209,U.S.A.に、2005年6月10日あたりに、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約に従って寄託された。ATCC受託番号はPTA6784である。この寄託細胞株は、この条約の下に公布された規定に従い、試料は、その時点で、および該条約によって求められる条件下で、ならびに特許法および該条約の調印国の規定に準じて入手可能となる。例えば、本出願またはこれを優先権主張するか、もしくはこれを参照する任意の他の米国特許出願の米国特許が発行された場合、該寄託物質の入手可能性に関するあらゆる制限は、ブダペスト条約または35U.S.C.§112に求められる程度まで変更不可的に解除される。本発明のPAM発現ベクターの構築を、以下に詳細に記載する。本明細書に示すプラスミドマップにおいて、αアミド化酵素例えば、図5、pAE73のプラスミドマップを参照と示す領域は、添付の配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有し、添付の配列番号2に示される715アミノ酸の一次翻訳産物をコードする。該翻訳産物は、シグナルペプチドをアミノ酸1~25に、プロ領域を26~41に、および成熟ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーを42~715に含む。本発明に従って発現および精製される酵素のほとんどは、該プロ領域を含み続け、非常に有効であることが示された。以下、好ましいPAM発現細胞株、その発酵、方法の開発、精製および使用の例を詳述する。以下により詳細に記載するように、PAM遺伝子を、pSV402MT発現ベクター内にクローニングし、PAM発現プラスミドpAE73を創製した。CHOK1細胞をpAE73DNAでトランスフェクトした。二重選択プロセスおよび限界希釈クローニング後、メトトレキサートの濃度を増加させ、CHO細胞株をさらに増幅した。接着細胞株73-26を、選択なし血清無含有の浮遊培養物UGL73-26/Mに変換した。UGL73-26/MMCBおよびMWCBは、BioRelianceCorp.において創製した。MCBおよびMWCBの両方を充分に特性化したところ、GMP施設においてのPAMの産生に対し、認可され得ると考えられる。UGL73-26/M細胞株を適合させ、攪拌槽バイオリアクター内での培養した。発酵の開発により、スピナーフラスコで14日間行なわれる種菌プロセスの定義付けがもたらされた。発酵/細胞培養相は17日間のプロセスである。発酵プロセスの重要なパラメータは以下の通り:第5、10および14日にグルコース添加2g/L、溶存酸素濃度≧70、発酵がその自然な設定点に達するpH、およびタンパク質無含有、非動物由来組織培養培地、SigmaC5467グルタミンを終濃度2mMまで補充である。簡便でロバストな下流精製プロセスを、C5467CHOならし培地からのPAMのために開発した。精製後、定常的に純度の4倍増加および活性酵素の40の総回収が得られる。該プロセスでは、製造レベルに規模を拡大し易い慣用的な濾過系およびバイオプロセスクロマトグラフィー樹脂が用いられる。細胞培養発酵と下流精製のプロセス全体を、10Lパイロットプラント/製造レベルの規模にした。記載のプロセスは、大量のPAMの産生について確認可能な製造プロセスに従いやすいものであるのがよい。大量のPAMを発現するCHO細胞株UGL73-26/Mを開発した。UGL73-26/M用に開発した細胞培養プロセスは、非動物タンパク質由来の培地中のものとした。単純なバッチ細胞培養プロセスが好ましかった。精製スキームの目的は、触媒的に活性な酵素の良好な収率を伴う、ロバストで拡張可能なプロセスを開発することであった。ベクターの構築該細胞株を作製するために使用される発現ベクターpAE73の創製は、Friedmanら.Bio/Technology7:359-3621989の研究結果を基にした。この論文に記載されたプロセスに従い、本発明者らは、試験用のpAE73発現ベクターの創製を進めた。各ベクターの主要成分は、ヒトメタロチオネインIIAhMTIIAプロモーターpHS1内に位置する、M.Karin氏より受領、SV40エンハンサーpSV40由来、ATCCおよび本明細書に記載のα-アミド化酵素遺伝子である。pAE73の誘導化pHS1pAE73の創製に使用する出発プラスミドは、1990年2月にUCSDのM.Karinから贈与プラスミドpHS1図1であった。pHS1は、Dr.Karinの研究室において、pUC8図2内にヒトメタロチオネインIIAプロモーターをスプライシングすることにより誘導されたものである。846bpのHindIII/BamH1断片を、pUC8マルチクローニング部位MCSのHindIII-BamH1部位内にクローニングした。得られたプラスミドpHS1は、該マルチクローニング部位内に挿入されたヒトメタロチオネインHAプロモーターを有する。pSV401MTおよびpSV402MTSV40エンハンサーをヒトメタロチオネインプロモーターの上流に挿入することにより、pHS1を発現ベクターpSV401MTまたはpSV402MT図3に変換した。SV40DNA断片は、pSV40プラスミドDNAをHindIIIで消化することにより調製した。1167bpのHindIII断片を、pHS1のHindIII部位内にクローニングした。SV40エンハンサーは、HindIIIDNA断片内に非対称に存在し、したがって、該エンハンサーは、hMTIIAプロモーターに近接して、または遠く離れてのいずれかで位置する。元のプラスミド内のlacZ遺伝子内のものに対するSV40エンハンサー内のBglI部位の配向により、該プラスミドの配置designationが決まる。pSV401MTは、hMTIIAプロモーターから遠く離れたSV40エンハンサーを有し、pSV402MTは、hMTIIAプロモーターに近接したSV40エンハンサーを有する。pSV402MTを、さらなるベクター構築に選択した。pAE73pAE73は、α-アミド化酵素遺伝子配列番号1を、pSV402MTのBamH1部位内にクローニングすることにより調製された。2870bpのα-AE遺伝子断片を、Bgl1およびBamH1DNA制限エンドヌクレアーゼでのpAE64の消化後に単離した。pAE64プラスミドは、SV40プロモーター/エンハンサーの下流に、可溶性75kDaのPAMタンパク質を発現するように修飾されたPAM遺伝子を含有する。このPAMDNA配列を別のCHO発現細胞株UGLB3/A1-7に使用し、75kDaのPAMタンパク質を発現させた。PAM遺伝子配列の誘導を図4に示す。2870bpのDNA断片を精製し、該断片のBgl1末端を、2つの相補DNAオリゴヌクレオチド断片AE96/AE97で修飾し、これにより、該断片のBgl1末端が新たなBamH1末端に変換された。AE96235’GATCCATCGATCGCACTAGTGCC3’AE97-165’ACTAGTGCGATCGATG3’該修飾PAMDNA断片を、発現ベクターpSV402MTのBamH1部位内にクローニングした。2つのBamH1末端を有するPAMDNA断片は、発現ベクター内にセンスまたはアンチセンスのいずれかの配向に連結され得るため、PAM遺伝子の配向を、該プラスミドのEcoR1による制限消化マッピングによって調べた。EcoR1部位と該発現ベクター両方におけるPAM遺伝子により、プラスミドDNAの単純な解析が可能になる。正しい配向のPAMを有するプラスミドをpAE73と表示し、そのプラスミドマップを図5に示す。α-アミド化酵素発現細胞株の創製トランスフェクションおよびクローニング3種類のプラスミド:pAE73、pSV2neoおよびpSY2dhfrをCHOK1細胞の形質転換に使用した。トランスフェクト細胞によるプラスミドの組込みにより形質転換細胞株の容易な選択が可能となるため、プラスミドpSV2neoおよびpSV2dhfrともにATCCから入手を使用した。また、プラスミドpSV2dhfrは、特に、CHOゲノム内へのSV40プロモーター/dhfrDNAの組込みにより該遺伝子および他の近位遺伝子の選択的増幅が可能となるため選択された。共増幅される遺伝子は、プラスミドpAE73内に担持されたα-アミド化酵素遺伝子であった。CHOK1細胞は、プラスミドDNAのリン酸カルシウム沈殿により形質転換した。プラスミドは、該細胞内にpAE73:pSV2neo:pSV2dhfrが10:1:1の比でトランスフェクトした。100mmdish1つあたり20μgのpAE73を添加した。トランスフェクションの2日後、形質転換細胞のみが生存可能となるように、細胞を、選択圧下、250mg/LのG418を含有する培地中で培養した。この培地中でのCHO細胞の培養では、pSV2neoプラスミドの安定な組込みが必要とされ得る。トランスフェクションの27日後、G418選択培地中でいったん安定な培養が確立されたら、メトトレキサートを該培養培地に添加した。形質転換細胞のG418プールを、100nM、500nM、1μMまたは5μMのメトトレキサートおよび250mg/LのG418を含有する培地中で培養した。2週間後トランスフェクションの6週間後、単離した細胞フォーカスは、クローニングシリンダーにより5μMメトトレキサートG418培地中で培養した細胞から確立され得る。この方法によって、25のフォーカスから細胞株を確立する試みを行なったが、移した後、2つのフォーカスからしか細胞が培養されず、この手法を却下した。限界希釈クローニングを0.5細胞/ウェルで、1μMメトトレキサートG418を含有する培地中で培養した細胞から同時に開始した。低濃度のメトトレキサートで培養した形質転換細胞は除外した。限界希釈クローニング開始から3週間後、単離物を24ウェルプレートに移し、次いで、2~3日間以内に増殖のため100mmdishに移した。CHOK1細胞のトランスフェクション開始から10週間後、73-26と表示する単離物のうちの1つを確立した。該細胞株を低温保存し、α-アミド化酵素発現を評価した。73-26は、この時点の6953U/106細胞/日を産生する最良の産生細胞株の1つであった。細胞株73-26の増幅73-26の初期クローンを継代し、1μMメトトレキサートG418を含有する培地中で維持される確立された細胞株を得た。pSV2dhfrプラスミドをトランスフェクションのために選択する目的は、形質転換細胞株を同定するための第2の選択方法が提供されるためだけでなく、細胞を高濃度のメトトレキサートで培養すると、dhfrミニ遺伝子が増幅されることが広く確立されているためであった。UnigeneLaboratoriesは、以前に、このプラスミドで形質転換された細胞株を用い、α-アミド化酵素の最大の産生をもたらすのに20~50μMの濃度のメトトレキサートが必要とされ得ることが示されたことを経験している。α-アミド化酵素細胞株73-26を直接、1μM、20μMまたは50μMのメトトレキサートを含有する培地に分割した。また、すべての培地に、第2の選択方法としてG418も含めた。この細胞株のα-アミド化酵素発現の進行を、種々の時間間隔で表1に示す。表1のデータは、以前に開発されたB3/A1-7細胞株のものと比べ、この細胞株におけるα-アミド化酵素の発現レベルの増大を示す。α-アミド化酵素遺伝子とdhfr遺伝子の共増幅は、メトトレキサートの濃度を増大させて継代培養を継続するより多くの酵素を発現する該細胞株能力により明白になる。20μMまたは50μMメトトレキサートの存在下で培養した細胞は、選択的増幅の3~4ヶ月後、最良の発現レベルを有した。継続的に数ヶ月間、継代培養すると、α-アミド化酵素の発現レベルは低下した。したがって、以前に凍結させたこの細胞株のストックを、浮遊適合細胞株の調製に使用した。浮遊適合α-アミド化酵素発現細胞株73-26の特性化この細胞株の開発の最終目的は、メトトレキサートおよびG418の選択圧なしで安定な方法を開発することである。該細胞株の所望される別の属性は、これが、浮遊培養において比較的高い細胞密度で培養されることであった。該目的を達成するために用いた方法を以下に記載する。浮遊適合無選択細胞株の調製無選択浮遊適合細胞の調製では、UGL73-26接着細胞を、血清、メトトレキサートおよびG418から離すことが必要とされた。この課題を達成するため、multiprongattack図5を開発した。除去のマトリックスmatrixofremovalは、可能な最終の細胞株に対して最後の数の細胞倍加を付加するという最終目的で確立された。将来的な研究開発のため、以前に凍結させた1991年12月16日73-26の20μMメトトレキサート細胞株を解凍し、浮遊適合血清無含有無選択細胞株を確立した。50μMメトトレキサートでのPAM活性はいくぶん高かったが、73-2650μM細胞株の活性培養物を再確立する試みは成功裏でなかった。該細胞株のα-アミド化酵素産生性を、浮遊適合プロトコルを開始する前に評価した表2。浮遊培養に適合させる前のこの細胞株のPAM活性は、細胞1つあたりの基準で、B3/A1-7対照よりも20倍大きい活性を有した。対照細胞株および73-26両方での酵素活性は、該細胞株を凍結する1991年12月16日直前の最初の試験で観察されたものの5~10倍であった表1。4種類の新たな浮遊適合血清無含有細胞株を、図6に示すように作製した。73-26/K-Nと表示する該細胞株を、37日間のプロセス後、低温保存した。浮遊適合73-26のα-アミド化酵素産生新たな73-26細胞株73-26/K、73-26/L、73-26/M、73-26/Nのバンク登録細胞を解凍し、スピナーフラスコ内で培養した。該細胞株を、週に3回Ex-Cell301培地中で継代することにより維持した。定期的に培地を完全に交換し、酵素産生性の24時間評価をα-AEアッセイによって評価した。細胞株は、80日間まで培養状態で維持した。以前の細胞株B3/A1-7の半連続的バッチプロセスは40日間プロセスであり、該細胞株の産生安定性を評価するため、この手順の長さの2倍を選択した。この研究のデータを表3に示す。この研究過程において、細胞株73-26/Lは第22日~第40日の間で終わったが、他のすべての細胞株は、80日の期間の最後まで活発に培養された。すべての細胞株が、初期の期間ではB3/A1-7よりも有意に多くのα-アミド化酵素を発現したが<40日間、73-26/Mおよび73-26/Nのみ、70日後もなお、大量の酵素を産生していた。80日の期間にわたって一貫してより多くのα-アミド化酵素を産生したことから、さらなる開発のためにUGL73-26/Mを選択した。その他の3種類の細胞株は、80日の試験期間の終了前に培養が終了したか、またはその産生性/細胞/日が最後の20日間で減衰したかのいずれかであった。CHOK1、UGL73-26、UGL73-26/MMCBおよびUGL73-26/MMWCB00のバンク登録前での細胞バンク登録の特性化研究特性化研究を、前駆細胞株73-26である宿主細胞株CHOK1およびUGL73-26/Mシードバンクにおいて行なった。40個のバイアルのUGL73-26/Mシードバンクを1998年2月4日に調製した。シードバンクの各バイアルには、90Ex-Cell301/10DMSO中4×106細胞/mLが含まれる。実施した研究はすべて、CHO細胞株がMCBおよびMWCBになる必要があるという結果と整合すると評価された表4参照。マスター細胞バンクUGL73-26/M細胞株は、BioRelianceCorp.において作製された。118MCBのバイアルのいくつかを用い、該細胞株を充分に特性化した。UGL73-26/MMCBのすべての研究の結果は、CHO起源の細胞株と整合し、感染性因子について陰性である。UGL73-26/MMCBのバイアルを用い、製造業者の研究用の238個のバイアルの細胞バンクUGL73-26/MMWCB00が、BioRelianceCorp.において創製された。UGL73-26/MMWCB00の研究のすべての結果は、CHO起源の細胞株と整合し、感染性因子について陰性である。スピナーフラスコおよび攪拌槽バイオリアクターにおけるUGL73-26/Mのプロセスの開発研究予備実験では、該細胞株の産生性が多数の生成では一貫して維持され得ないことが示されたため、バッチ発酵プロトコルを検討した。また、バッチプロトコルは、計画の容易さ、易拡張可能性および劇的なバッチ不成功の結果が少ないという利点を提供する。UGL73-26/Mの発酵プロセスの開発には、該細胞株の細胞内産生性に影響し得るいくつかのパラメータを検討する必要がある。以下に詳述する発酵開発は、溶存酸素DO、pHおよび培地補充を検討する主要な研究を示す。研究されなかった発酵パラメータは、インペラーのRPMおよび発酵温度であった。α-アミド化酵素発現に対する溶存酸素の効果スピナーフラスコ内のCHO培養培地の溶存酸素濃度の効果を調べるための実験を行なった。スピナーフラスコには0.1×106細胞/mLを播種した。2つのスピナーフラスコは、250mLTechneスピナーフラスコ内に150mLの培地を入れ、一方、第3のスピナーフラスコには250mLの培地を入れた。すべてのスピナーフラスコにおいて溶存酸素を毎日測定した。α-AEアッセイによるα-AE産生性の評価のため、清澄ならし培地のアリコートを毎日採取した。この研究では、低タンパク質CHO培地C1707、Sigma-Aldrichおよびタンパク質無含有CHO培地C5467、Sigma-Aldrichの2種類の培養培地を使用した。この2種類の培地中で培養したUGL73-26/Mの直接比較を図7に示す。2つの培養物中の溶存酸素レベルは著しく異なった。150mLのC1707中で培養した細胞は、等容量のC5467培養培地中で培養した細胞よりも、産生された全酵素/mLが少なかった。両培地の初期の溶存酸素濃度は約80DOで同じであったが、C5467培地の培養物の溶存酸素濃度は、絶対に50未満にならなかった。C1707培養物のDO含量は、第9日までに50未満となり、該培養物のピーク活性は2日後であった。これらのデータは、DO含量/細胞バイアビリティ/α-AE産生性間に相関性が存在し得ることを示す。また、スピナーフラスコの容積も潜在的臨界パラメータとして検討した。スピナーフラスコは一定溶存酸素濃度に維持されないため、培養物が溶存酸素を維持する能力は、培養物の表面:容量比に対し相対的である。スピナーフラスコの培養容積を増大させると、明らかに表面:容積比は変化する。一方のスピナーフラスコの培養容積を150mL5467sとし、他方を250mL5467saとした以外は、同一の培養物で開始した。DOおよびα-AE産生性に対する表面:容積比の変化の効果を図8に示す。図8に示すデータは、培養物の産生性が溶存O2によって大きく影響されることを示す。溶存O2濃度の減少が、培養物による利用のためであれ、表面:容積比の差による効果のためであれ、DO濃度が50未満の場合、培養物は48~72時間以内に、より多くのα-アミド化酵素を発現するのを停止する。細胞が最も良好に産生性である培養期に溶存酸素濃度を反映させるためには、バイオリアクター内の溶存O2を70に維持するのがよい。α-アミド化酵素発現に対する培地の効果UGL73-26/Mの培養培地の最も適切な選択肢の選択を容易にするために設計された研究、またはバイオリアクターの培養条件を規定する際の研究のいずれかの一部として、2種類のCHO培養培地C1707およびC5467Sigma-Aldrichを用いて数多くの攪拌培養を開始した。両培養培地は規定されたものであり、C1707は、トランスフェリンが添加された低タンパク質培地であり、C5467は非動物タンパク質培地である。培地はともに、購入時に、終濃度2mMまでL-グルタミンを添加する必要があった。以下の表5に、2つの培地のいずれかを用いたスピナーフラスコの多数のサンプリングのデータを示す。表5のデータでは、いずれかの培地におけるUGL73-26/M細胞株の酵素産生性の実質的な差は示されていない。SigmaCHO培養培地であるC5467は、動物由来の培地成分を含有しないため、米国および欧州連合の両方において、将来的な規制的ガイドラインに関して、より規制に準拠する培地の選択肢であり得る。SigmaCHO培養培地であるC5467は、将来的な研究のための培地の選択肢である。α-アミド化酵素発現に対するグルコースの効果UGL73-26/Mのバッチ培養物の栄養状態を検討する研究により、培養開始の4~5日後、培地中のグルコース濃度は、未使用培地のほぼ502g/Lであることが明らかになった。酵素産生性に対するグルコース補充の効果の徹底的な研究を、さらなるグルコースを培養物に添加する一連のスピナーフラスコ実験として行なった。スピナーフラスコには、2g/Lのグルコースを1~3回、特定の時間間隔で補充した。α-AE産生性に対するグルコース添加の効果を表6に示す。UGL73-26/Mのバッチ培養物へのグルコースの添加により、培養物の最大産生性は、グルコース添加計画に応じて50~100増大した。第5、10および15日目にグルコースを補充したスピナーフラスコでは、非補充対照と比べ、最も多くの酵素が発現されるようである。これらの培養物の平均相対産生性は対照の195であった。他の補充培養物では、3回補充のものよりほんのわずか産生性が低かった143~164。さらなるグルコースを補充した培養物はすべて、培地中でのピーク酵素濃度の遅延を示した。ピーク酵素濃度は、グルコース補充培養物では第17/18日目に観察されたのに対し、対照の非補充培養物では第13日目であった表7。α-アミド化酵素発現に対するpHの効果ならし培地のpHは攪拌槽バイオリアクターでは制御され得るが、スピナーフラスコにおいては対処され得ないプロセス変量の1つである。スピナーフラスコでは、培地成分が消費されるにつれて、および細胞の副生成物が産生されるにつれて、培養物のpHは低下する。150mL5467sまたは250mL5467saのいずれかの容積のUGL73-26/Mの2つの250mLスピナーフラスコのpHプロフィールを、以下に図9に示す。培養物のpHは、バッチの前半では低下し、次いで培養の後半では上昇した。pHの低下は、おそらく、培養前半での培養物中の乳酸濃度の増大によるものである。培養の最後でのpHの上昇は、細胞が該乳酸を炭素供給源として異化することによるものである。培養物の産生性はpHの低下に影響されない図8。いくつかのn=56~10L攪拌槽バイオリアクターは、スピナーフラスコ内の条件を模倣し、pH制御なしで実行した。攪拌槽バイオリアクター内のCHO細胞をC5467培地中で、70DOおよび37°Cにて培養した。バイオリアクター内のならし培地の平均pHプロフィールは、2つのスピナーフラスコで観察されたものと同様である図10。バイオリアクター内で溶存酸素濃度は70に、温度は37°Cに維持した。バイオリアクターを上記のようにpH制御なしで実行させたことに加え、一連のバイオリアクターは、該バイオリアクターのpHが設定pH点7.0~7.4に自由になるように実行した。所望のpHに達した時点で、これをそのpHに発酵の持続期間、維持した。攪拌槽バイオリアクター内のCHO細胞をC5467培地中で、70DOおよび37°Cにて培養した。攪拌槽バイオリアクター内でのα-AE産生性に対するpH制御の維持の効果を図11に示す。図11は、pH設定点を開始しなかった場合、それらの実行に対する実行の間、各日のバイオリアクターにおける平均α-AE活性を示す。pHが設定点の0.5pH単位以内になった後でのみpH設定点を設定した場合の個々の実行のデータもまた図11に示す。培養pHと酵素活性と間に明白な相関性がある。pH設定点なしで実行させたバイオリアクターの活性プロフィールは、培養の最初の16日間のすべての実行について優れている。唯一の例外は、pH設定点が7.1である場合の実行に対するプロフィールであった。この差は、おそらく、培養を、その他の実行よりも長く持続させたためであった。平均pH設定点なしの研究でのピークα-AE活性は、第16日目で280,707単位/mLであった。生細胞密度に対するpHの効果はなかったデータ示さず。培養物は、1.0~1.5×106細胞/mLのピーク生細胞密度まで培養させた。最大細胞密度は、バイオリアクターにイノキュレートしてから8~10日後に達成された。pH7.1で実行させた1つの培養物以外は、細胞バイアビリティに対するpHの影響はなかったデータ示さず。細胞培養物のバイアビリティは、15日以上培養した場合で50生細胞より大きかった。7.1のpH設定点で実行させた1つのバイオリアクターでは、20日間の培養で>50生細胞が維持された。研究開発したUGL73-26/Mの発酵パラメータの概要α-AE発現細胞株UGL73-26/Mの確立後、α-アミド化酵素の至適発現のための臨界パラメータを規定するために一連の実験を行なった。動物タンパク質無含有培地Sigma,C5467では、該酵素の高レベルの発現が支持されることが測定された。CHO細胞は、L-グルタミンを終濃度2mMで補充したC5467培地中で、バッチ培養物として培養され得る。しかしながら、該培養物は、その産生性をさらに促進するためには、D-グルコース補充を必要とする。至適グルコース補充は、第5、10および15日目で2g/Lであった。バイオリアクターのDO濃度は70に維持するのがよく、バイオリアクターのpHは、培地の緩衝能とCHO細胞による培地成分の代謝の関数となるpHに調整されるようにするのがよい。下流精製の開発UGL73-26/M以下の節に、本発明者らが開発した、UGL73-26/Mクローンを用いて産生されたPAMの下流精製についてまとめる。代表的な実験のみ該プロセスの開発作業の論理的な進行を示すをこの概要に含める。各工程の簡単な説明を示すが、これは、精製プロセスにおけるその工程の機能の記載である。精製実行は、SDS-PAGE一定タンパク質および一定単位、PAM活性アッセイならびにBradfordタンパク質アッセイを用いて解析した。実験はすべて、Boonton,NJ試験施設に技術移転する前または直後に完了した。本明細書に記載の方法を用い、PAMバッチ1330-D-1003、1330-D-1004、1330-D-1005、1330-D-1006、1330-1009および1330-1010を製造した。第1のタンジェンシャルフロー濾過TFF1工程の説明:TFF1工程を用い、クロマトグラフィーの前にCHO細胞ならし培地の濃縮およびダイアフィルトレーションを行なう。ならし培地を濃縮し、ダイアフィルトレーションによって導電率を低下させ、陰イオン交換カラムへの結合を助長する。TFF1工程では、再生セルロースPLCTK30kDa膜Milliporeを取り付けたPellicon2Moduleを使用する。研究開発:この工程の最初の検討では、TFFがクロマトグラフィーの前に必要とされ得るか否かに着目した。水での希釈によるCHOならし培地の導電率の低下を、TFFの代替法として検討した。クロマトグラフィーの前にならし培地を希釈しないと、充填後、PAM活性の大部分が通過画分中に存在した。ならし培地の導電率をほぼ5mSまで低下させると、通過画分中に検出されるPAM活性の量は最小限になった。しかしながら、ならし培地を陰イオン交換カラムに直接充填すると、2つの問題が確認された。一部の培地成分が不可逆的にカラムに結合し、樹脂がひどく変色した。勾配溶出後、大きなUV吸光度特性を示す別の培地成分が、PAM活性とともに共溶出された。CHO細胞ならし培地C5467を水で希釈し、導電率をほぼ5mSまで低下させ、50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.0で平衡化させたQ-セファロースFFカラムPharmaciaに直接充填した。カラムを、100A50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.0から68B50mMTRIS、475mMNaCl、0.001TX-100pH8.0までの60分かけた直線勾配にかけた。充填直後、大きな暗色のバンドがカラム上部に出現し、クロマトグラフィー実行中、残存した。カラムを2MNaClで清浄にし、1.0MNaOHで殺菌した。清浄手順および殺菌手順を行なっても、暗色バンドはカラムから除去されなかった。続いて、カラムは、より厳しい清浄手順を行なった。カラムを、以下の一連の清浄試薬:0.5MNaOH1MNaCl、0.1M酢酸、0.1M酢酸1MNaClおよび70エタノールにさらした。試験したいずれの条件でも暗色バンドはカラムNEG:001:225-245から除去されなかった。着色バンドは、未使用C5467培地中に存在する一成分のアウリントリカルボン酸であると同定された。TRISでpH8.0まで緩衝化したアウリントリカルボン酸の6mg/Lの溶液培地濃度を、50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.0で平衡化させたQ-セファロースFFカラムに直接充填した。充填直後、着色バンドがカラム上部に出現した。このカラムは、上記と同じ勾配溶出および清浄手順を行なった。アウリントリカルボン酸は、実行中、陰イオン交換カラムに結合したまま残存したNEG:001:276-290。アウリントリカルボン酸は、pH8.0において、水溶液中で容易に重合し、高電荷密度で巨大分子をもたらす。負の電荷を有する巨大分子は、明らかに、DNAとそっくりに陰イオン交換カラムに不可逆的に結合する。この物質をカラムに反復的に適用すると、おそらく充填容量が減少し、したがって、カラム全体の寿命に負の影響を及ぼす。第2の培地成分は、PAMとともに共溶出することがわかった。非ならし培地または未使用培地を、50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.0で平衡化させたQ-セファロースFFカラムに直接充填した。このカラムを再度、上記と同じ勾配溶出条件に供した。該酵素が典型的に溶出される領域に大きなUVピークが観察されたNEG:001:248-257。ならし培地から精製したピークのSDS-PAGE解析により、該物質は、低分子量タンパク質または非タンパク質性培地成分のいずれかであることが明らかとなったNEG:001:225-245。C5467培地はタンパク質水解生成物を含有し、これは、該酵素のピークと一致する最大UVピークの説明となり得る。両方の培地成分であるアウリントリカルボン酸および非同定UVピークは、クロマトグラフィーの前にTFFによって有効に除去される。該酵素は30kDa膜によって保持され貯留物、低分子量培地成分はフィルターを通過する透過物。再生セルロースPLCTK30kDa膜Milliporeを取り付けたPelliconXL装置を用い、ならし培地を10倍に濃縮してダイアフィルトレーションを行なった。該物質は、4~5容量の25mMTRIS、0.0005TX-100pH7.0を用いて、最終導電率ほぼ3mSまでダイアフィルトレーションを行なった。該物質を、50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.0で平衡化させたQ-セファロースFFカラムに充填した。このカラムは上記のような勾配溶出が行なわれた。樹脂の変色は観察されず、該酵素と共溶出される最大UVピークは存在しなかった。得られた酵素ピークの回収および比活性を、それぞれ47および2.1×106U/mgとなるまで測定したNEG:004:263-283。TFF工程の種々の段階における酵素安定性を検討した。ならし培地は、最初に、50mMTRIS、0.001TX-100pH7.0でダイアフィルトレーションを行なった後、5倍濃縮した。ダイアフィルトレーションおよび濃縮で得られた試料を、活性の低下および分解について解析した。SDS-PAGEでは分解は観察されず、酵素活性のほぼ95が回収されたNEG:008:245-251。陰イオン交換クロマトグラフィーQ-セファロースFF工程の説明:陰イオン交換AEXクロマトグラフィー工程により、CHO細胞ならし培地からのPAMの全体精製が提供される。該工程では、主に、高分子量タンパク質が除去される。しかしながら、例えば、該酵素の切断型形態などの一部の低分子量タンパク質もまた除去される。該クロマトグラフィー工程では、定常的に、該酵素2~3倍の精製がもたらされる。活性酵素の回収は、典型的には50~75である。CHO細胞の発酵後、供給原料流中に存在し得るDNAは、該プロセスのこの段階で有効に除去される。研究開発:Q-セファロースFF工程の開発前に、本発明者らは、陽イオン交換CEXクロマトグラフィーを用いてPAMの精製を簡単に検討した。CEXクロマトグラフィーの使用は、最初にTFF工程を伴って、またはなしで検討した。精製は、SP550CTosoHaasカラムにおいて行ない、pH5.0~6.0の移動相を使用した。各場合において、分離および回収の結果は不充分であり、充填後、酵素活性の大部分は通過画分中に確認されたNEG:004:006-029およびNEG:004:102-119。結合を助長するための移動相のpHの低下は、低pHでの該酵素の安定性の欠如の可能性のため、考慮しなかった。この点で、CEXクロマトグラフィーは却下した。勾配溶出を用いた一連のAEXクロマトグラフィー実行をQ-セファロースFFカラムにおいて検討した。Q-セファロースFF精製はすべて、1.1×13.7cmカラムにおいて行ない、180cm/時で実行した。精製開発の初期において、新鮮ならし培地の入手可能性は限定的であり、したがって、これらの実験の多くは、凍結/解凍材料で行なった。ならし培地をTFFによって濃縮/ダイアフィルトレーションし、50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.0で平衡化させたカラムに充填した。このカラムを、100A50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.0から68B50mMTRIS、475mMNaCl、0.001TX-100pH8.0までの60分かけた塩直線勾配にかけた。pH7.0またはpH8.5のいずれかのHEPESバッファーを用いた同様の勾配実行もまた検討した。概して、この勾配実行では、ほとんど精製はもたらされず、酵素比活性は不充分な結果となったNEG:004-139-156、NEG:005:119-132、NEG:009:009-022およびNEG:009:024-038。多くの場合で、酵素活性は、おそらく差示的なグリコシル化の結果として、この勾配全体において散在的であった。開発を継続している際、逐次塩工程を用いた段階的溶出方法を、Q-セファロースFFカラムにおいて検討した。濃縮/ダイアフィルトレーションを行なったならし培地を、50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.0で平衡化させたQ-セファロースカラムに充填した。このカラムは、175mMNaCl、225mMNaClおよび275mMNaClでの逐次段階的溶出が行なわれた。酵素活性は、175mMと225mMの間の塩工程で等しく分布し、全体回収oはほぼ41であった。SDS-PAGEによる解析により、175mMおよび225mM両方のNaCl画分において75kDaの酵素の存在が明らかとなったNEG:005:198-211。両方の塩工程での酵素活性は、グリコシル化の差またはおそらく活性を保持している該酵素の切断型形態によるものであり得る。スピナーフラスコ実行または10Lバイオリアクター実行のいずれかの新鮮なならし培地を、残りの陰イオン交換実験に使用した。スピナーフラスコからのCHOならし培地00020S3をTFFにさらし、次いで、50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.0で平衡化させたQ-セファロースFF上に充填した。酵素をカラムから、1回の塩工程、50mMTRIS、225mMNaCl、0.001TX-100pH8.0で溶出させた。回収されたピークの回収および比活性の値は、それぞれ34および1.9×106U/mgであったNEG:008:021-033。同様に、10LバイオリアクターからのCHOならし培地00021BR、第14日をTFFにさらし、1回の225mMNaCl工程を用いてQ-Sepharose上で精製した。この実行での回収および比活性の値は、それぞれ37および2.3×106U/mgであったNEG:008:065-075。また、HEPES移動相を用いた段階的溶出を、活性酵素の回収を改善する取り組みにおいて検討した。2連の精製実行を、50mMHEPES、225mMNaCl、0.001TX-100pH8.0を溶出バッファーとして用いて行なった。10Lバイオリアクター実行Boontonパイロット施設、実行番号1、第15日からのCHOならし培地を、これらの精製実行のための投入物質として使用した。両方の精製実行での回収および比活性は、それぞれ、ほぼ60および3.0×106U/mgであったNEG:008:263-288。HEPES移動相の使用により、酵素の回収および純度が明らかに改善された。Q-セファロースFF精製に対する細胞バイアビリティの効果を検討した。10Lバイオリアクター実行から、第14日および第21日に収集したCHOならし培地BOOlOlの精製を比較した。第14日および第21日における細胞バイアビリティを測定し、それぞれ95および48であると決定された。第14日および第21日のCHOならし培地は、TFF、および50mMHEPES、225mMNaCl、0.001TX-100pH8.0を段階的溶出バッファーとして用いたQ-セファロースFF精製が行なわれた。第14日の物質の精製では、49の回収および2.15×106U/mgの比活性がもたらされたが、第21日での実行では、40の回収および2.1×106U/mgがもたらされたNEG:009:114-125およびNEG:009:149-166。また、10Lバイオリアクター実行からの第12日および第15日のCHOならし培地00107BRを用いた精製も行なった。第12日および第15日での細胞バイアビリティを測定し、それぞれ86および80であると決定された。各場合において、酵素はQ-セファロースFFカラムから、50mMTRIS、225mMNaCl、0.001TX-100pH8.0を用いて溶出した。第12日の物質では、62の回収および1.9×106U/mgの比活性がもたらされたが、第15日の物質では、54の回収および4.3×106U/mgの比活性が得られたNEG:009:195-203およびNEG:009:227-236。細胞バイアビリティは、AEXクロマトグラフィー後の全体的な回収または酵素比活性に対して有意な影響を及ぼさないようであった。実用範囲を確立するため、Q-セファロースFFクロマトグラフィーの臨界パラメータを特定し、検討した。該精製手順に取り組むために設計した計画を規定し、酵素の回収および純度に対する影響を調べるために検討した。2通りのQ-セファロースFF精製実行を、異なる段階的溶出バッファー、50mMTRIS、250mMNaCl、0.001TX-100pH7.8または50mMTRIS、200mMNaCl、0.001TX-100pH8.2低pH/高塩濃度および高pH/低塩濃度のいずれかを用いて比較した。これらの実験の論理的説明は、実用範囲を規定するためにクロマトグラフィーを極端な溶出条件に供することであった。10Lバイオリアクター実行からのTFF処理したCHOならし培地2132-D-1004を、精製のための投入物質として使用した。低pH/高塩濃度の計画では、ならし培地を、50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH7.8で平衡化させたカラムに充填した。酵素をカラムから、50mMTRIS、250mMNaCl、0.001TX-100pH7.8で溶出した。酵素の回収および比活性の値は、それぞれ66および2.0×106U/mgであったNEG:010:151-161。高pH/低塩濃度の計画でのならし培地は、50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.2で平衡化させたカラムに充填し、50mMTRIS、200mMNaCl、0.001TX-100pH8.2で溶出した。この場合の回収および酵素比活性は、それぞれ66および2.4×106U/mgであったNEG:010:140-150。これらのデータに基づき、Q-セファロースFFカラムは[7.8~8.2]のpH範囲で実行され得、溶出バッファー中の塩化ナトリウム濃度は[200mM~250mMNaCl]の間で種々であり得る。30Lバイオリアクター実行に精製規模拡大するのを補助するため、Q-セファロースFFカラムの実用容量を確立した。カラムの実用容量は、2つの様式:[酵素単位/mL樹脂]および[mgタンパク質/mL樹脂]で規定した。この実験の大きな進歩は、通過画分および洗浄工程で確認される酵素活性が合計で≧10である規定された。TFFにさらされたCHOならし培地100mL2132-D-1002を、50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.0で平衡化させたQ-セファロースFFカラムに充填した。ならし培地の酵素活性およびタンパク質濃度は、それぞれ1.97×106U/mLおよび2.41mg/mLであると決定された。AEXカラムMilliporeVantage-L、1.1×13.7cmを、線速度180cm/時で実行した。50mMTRIS、225mMNaCl、0.001TX-100pH8.0で、段階的溶出を行なった。1未満の総酵素活性が、カラム通過画分および洗浄工程において確認された。ほぼ51の酵素単位がメインピークで回収された。13.0mLのカラム容積に対し、実用容量は、[1.51×107U/mL樹脂]または[18.5mgのタンパク質/mL樹脂]のいずれかであると算出されたNEG:010:081-092。Q-セファロースFF工程の真の充填容量を決定するため、さらなる実験を計画している。疎水性相互作用クロマトグラフィーフェニル-セファロースFF、低置換工程の説明:疎水性相互作用クロマトグラフィーHIC工程により、AEX工程後に残留するタンパク質不純物の大部分が除去され、さらに2倍の精製がもたらされる。HIC後のSDS-PAGE解析により、少量の低分子量不純物を伴うのメジャーバンドが明らかになった。典型的には、HIC後の活性酵素の回収は50~75である。研究開発:B3/A1-7クローンから産生されるPAMのために開発した精製プロセスでもHICを用いた。リガンド-タンパク質相互作用促進するため、硫酸アンモニウムを含有する移動相を使用した。硫酸アンモニウムを含有するバッファーへの酵素の長期間の曝露により、予測不可能な沈殿および酵素変性がもたらされた。これらの問題を最小限に抑える試みにおいて、Hofmeisterシリーズで他の塩、例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを検討した。塩化ナトリウムを含有する移動相を用いた逆直線勾配を、最初に検討した。これらのクロマトグラフィー研究の投入物質は、TFF1で得られたものまたはQ-セファロースFFで得られたもののいずれかとした。最初のTFF工程後の直接HICを、AEX工程を排除する試みにおいて検討した。典型的には、酵素を等容量の水で、その後、等容量の20mMTRIS、4MNaClpH7.0で希釈した。塩添加前の水での希釈により、タンパク質濃度が減少し、塩析によって引き起こされる沈殿の可能性が最小限になる。希釈した物質を、10mMTRIS、2.0MNaClpH7.0で平衡化させたフェニル-セファロースFFカラムに充填した。酵素をカラムから、100A10mMTRIS、2.0MNaClpH7.0から100B10mMTRISpH7.0までの逆直線勾配で、68分間にわたって溶出した。概して、活性酵素の回収はほぼ50であったNEG:005:170-185およびNEG:005:212-226。また、塩化ナトリウム移動相を用いた段階的溶出方法も検討した。TFF1またはQ-セファロースFFクロマトグラフィーのいずれかにかけられた酵素を、等容量の水で、その後、等容量の20mMTRIS54MNaClpH7.0で希釈した。希釈した物質を、10mMTRIS、2MNaClpH7.0で平衡化させたHICカラムに充填した。このカラムをさらなる平衡バッファーで洗浄した後、10mMTRIS、1.0MNaClpH7.0で洗浄した。酵素をカラムから、10mMTRIS、400mMNaClpH7.0で溶出した。活性酵素の収率は相当であったが、なされた精製はほんのわずかであったNEG:008:034-046およびNEG:008:135-148。塩化ナトリウムの使用は、硫酸アンモニウムの場合のように塩析を引き起こさないようであったが、高濃度の塩化ナトリウムにおいて、酵素が経時的に変性した。クエン酸ナトリウムは、比較的低濃度でHICカラムへの酵素の結合を促進することがわかった。TFFにさらされたCHOならし培地を等容量の水で、その後、等容量の20mMTRIS、1.0Mのクエン酸ナトリウムpH7.0で希釈し、10mMTRIS、0.5Mクエン酸ナトリウムpH7.0で平衡化させたフェニル-セファロースFFカラムに充填した。このカラムをさらなる平衡バッファーで洗浄し、10mMTRISpH7.0でストリッピングした。酵素活性は、カラム通過画分または洗浄画分のいずれにおいても確認されなかった。ほぼ50の酵素活性が10mMTRISpH7.0画分において確認されたNEG:005:064-076。この実験を、より低い終濃度のクエン酸ナトリウムを用いて繰り返した。この低塩濃度では、酵素を等容量の水で、その後、等容量の20mMTRIS、0.6Mのクエン酸ナトリウムpH7.0で希釈した後、10mMTRIS、300mMのクエン酸ナトリウムpH7.0で平衡化させたHICカラムに充填した。このカラムをさらなる平衡バッファーで洗浄し、10mMTRISpH7.0でストリッピングした。結果は、本質的に先の実行と同一であり、活性は、通過画分または洗浄画分のいずれにおいても確認されなかったNEG:008:203-213。段階的溶出方法の開発を補助するため、クエン酸ナトリウムバッファー系を用いた勾配溶出を検討した。TFFで得られたものを等容量の水で、その後、等容量の20mMTRIS、0.6Mのクエン酸ナトリウムpH7.0で希釈した後、10mMTRIS、300mMのクエン酸ナトリウムpH7.0中で平衡化させたカラムに充填した。このカラムを100A10mMTRIS、300mMのクエン酸ナトリウムpH7.0から100B10mMTRISpH7.0までの70分間かけて逆直線勾配にかけた。酵素活性のピークは該勾配の最後付近で確認された。他のタンパク質不純物がこの勾配領域で溶出されたとともに、10mMTRISpH7.0カラムストリップ中にまで拡張されたNEG:008:252-262。10mMTRISpH7.0ストリップ中に溶出される酵素とタンパク質のより良好な分離を達成するため、段階的溶出を検討した。Q-セファロースFF精製10Lバイオリアクター実行、00107BR、第12日からのピーク画分225mMNaClを、等容量の水で、その後、等容量の50mMTRIS、600mMのクエン酸ナトリウムpH7.0で希釈した。希釈した物質を、25mMTRIS、300mMのクエン酸ナトリウムpH7.0で平衡化させたフェニル-セファロースカラムに充填した。このカラムをさらなる平衡バッファーで洗浄した後、25mMTRIS、75mMのクエン酸ナトリウムpH7.0での第2の洗浄を行ない、25mMTRISpH7.0でストリッピングした。酵素活性はすべて、75mMのクエン酸ナトリウム画分において確認された。回収および比活性は、それぞれ42および2.0×106U/mgであると算出されたNEG:009:204-218。酵素と他のタンパク質不純物との良好な分離は、この方法を用いて達成された。TFF直後のHICAEX工程なしは、この工程では粗製供給物質流からDNAを排除する効果がないため、却下した。4回のHIC精製を、上記に詳述した塩化ナトリウム段階的溶出方法を用いて行なった。これらの実行の投入物質は、クロマトグラフィーの前にTFFにさらされたB3/A1-7CHOならし培地とした。このときの本発明者らのDNA内部基準は<10ng/mgタンパク質であった。各場合において、HIC後のメイン酵素ピーク中に存在する残留DNAレベルは該基準より6~10倍高く、それにより1回の工程でのHIC精製が許容され得ないことがわかったNEG:006:137-159、NEG:006:176-187およびNEG:006:192-200。30L容規模拡大の取り組みを補助するため、HIC精製工程の実用容量を検討した。大きな進歩は、カラム通過画分または洗浄画分のいずれかにおいて≧10の酵素活性の存在と規定された。産生実行のQ-セファロースで得られたもの125mL、0.368mg/mL、710,563U/mL1330-D-1003を等容量の水で、その後、等容量の50mMTRIS、0.6Mのクエン酸ナトリウムpH7.0で希釈した。希釈した物質を、25mMTRIS、300mMのクエン酸ナトリウムpH7.0で平衡化させたフェニル-セファロースFFカラムMilliporeVantage-L、1.1×15.8cm上に充填した。このカラムを180cm/時で実行した。このカラムをさらなる平衡バッファーで洗浄し、酵素を25mMTRIS、75mMのクエン酸ナトリウムpH7.0で溶出した。酵素活性は、通過画分または洗浄画分のいずれにおいても確認されなかった。メインピークはほぼ75の酵素活性単位を含んでおり、比活性は2.6×106U/mgであると算出された。15.0mLのカラム容積に対し、実用容量は5.92×106U/mL樹脂であると算出されたNEG:010:111-124。実用容量は、AEX後にカラムに充填されたタンパク質が極めて少なかったため、[mgタンパク質/mL樹脂]では報告されなかった。HIC工程の真の充填容量を決定するため、さらなる実験を計画している。HIC単位実行のための全体の時間は水希釈を排除し、実行流速を180cm/時から240cm/時に上げることにより劇的に短縮された。クエン酸ナトリウムへの曝露時間および樹脂上で費やされる時間量を最小限に抑えることにより、最終的に、活性酵素の減少の低減が補助され得る。133O-D-1003からQ-セファロースFFで得られたものを等容量の50mMTRIS、0.6Mのクエン酸ナトリウムpH7.0で希釈し、先のバラグラフで記載したHIC段階的溶出方法を用いて精製した。メインピーク25mMTRIS、75mMのクエン酸ナトリウムpH7.0の回収および比活性は、それぞれ77および2.4×106U/mgであると算出されたNEG:010:125-139。クエン酸塩を用いた希釈中またはその後でタンパク質沈殿は観察されなかったが、塩析現象を回避するため、該物質はゆっくりと希釈しなければならない。HIC方法は、実用範囲を確立するために移動相の塩濃度を変更することにより取り組んだ。回収および酵素比活性に対する効果を、2通りの異なる精製手順を行なうことにより検討した。第1の実行では、充填および溶出中のクエン酸塩濃度を減少させ、一方、第2の実行では、充填中のクエン酸塩濃度は減少させたが、溶出バッファーのクエン酸塩濃度は増大させた。10Lバイオリアクター実行からQ-セファロースFFで得られたもの133O-D-1005を、等容量の50mMTRIS、0.5Mクエン酸ナトリウムpH7.0で希釈し、25mMTRIS、250mMのクエン酸ナトリウムpH7.0で平衡化させたHICカラムに充填した。このカラムを25mMTRIS、50mMのクエン酸ナトリウムpH7.0で洗浄した。ほぼ51の酵素活性が50mMのクエン酸ナトリウム画分において確認され、1未満が通過画分および洗浄画分中に確認された。メインピークにおける酵素比活性は1.35×106U/mgであると算出されたNEG:010:175-186。第2のHIC実行では、Q-セファロースFFで得られたものを、上記のようにして希釈および充填したが、25mMTRIS、100mMのクエン酸ナトリウムpH7.0を溶出バッファーとして使用した。この場合、50の酵素活性が100mMクエン酸塩画分において確認され、2未満が通過画分および洗浄画分中に確認された。100mMクエン酸塩画分における酵素比活性は2.5×106U/mgであったNEG:010:163-174。第1のHIC実行で観察された比活性のほうが低く、これは、溶出バッファー中のクエン酸塩濃度の減少により、通常該酵素と共溶出するストリップ中に見られるさらなるタンパク質がもたらされ、したがって最終純度が低下することを示した。対照的に、溶出バッファー中のクエン酸塩濃度の増大は純度を低下させないようであった。これらのデータに基づき、溶出バッファー中のクエン酸ナトリウムの濃度は、最終純度を損なうことなく75~100mMの間で変更され得る。第2のタンジェンシャルフロー濾過TFF2工程の説明:TFF2を用いて、ウイルス濾過の前に、フェニル-セファロースFFで得られたものの濃縮およびダイアフィルトレーションを行なう。HICで得られたものを直接TFFにさらし、溶出バッファー25mMTRIS、75mMのクエン酸ナトリウムpH7.0中での長期保存による酵素の不活化を最小限に抑える。フェニル-セファロースFFで得られたものをほぼ3倍に濃縮し、ダイアフィルトレーションを行ない、ウイルス濾過に適したバッファー中に酵素を入れ、その後保存する。TFF2工程では、再生セルロースPLCTK30kDa膜Milliporeを取り付けたPellicon2Moduleを使用する。研究開発:TFF2手順は、最初は、B3/A1-7クローンを用いて産生されるPAMのために開発された。該酵素は、種々の条件下の50mMTRIS、25mMNaCl、0.0005TX-100pH8.0中で安定であることが示され、この理由のため、さらなる研究開発は試みなかった。C5467CHOならし培地由来のPAMの代表的な小規模精製10Lバイオリアクター実行からのCHO細胞ならし培地500mLの試料00107BR、第15日を8倍に濃縮し、50mMTRIS、0.001TX-100pH8.0に対してダイアフィルトレーションを行なった。TFF1で得られたもののほぼ3分の1を、上記の精製プロセスの規模縮小形態を用いて精製したNEG:009:219-249。精製データを表8にまとめる。この精製実行のこの工程収率は、比較的不充分であり、実際、HIC工程後の酵素比活性は低下した。しかしながら、SDS-PAGE解析により、おおむねα-アミド化酵素は、ほぼ75kDaの単一のメジャーバンドに精製されることが示された図12、レーン10。ゲルおよびデンシトメトリースキャン図13により、酵素の純度は高くほぼ純度67、低分子量不純物はごく微量しか存在しないことが明白に示された。該酵素は多くの精製バッファー中で経時的に不活化され、したがって、該プロセスの実施は各工程間で遅滞なく進行させなければならない。精製プロセスにおけるばらつきは、全体収率および比活性を低下させる不活性酵素の存在に起因した。より重要なことには、精製および発酵の開発はともに同時進行させ、これにより、観察されたばらつきがある程度説明され得る。該産生規模における工程収率および比活性は、その後、おそらく該プロセスにおいて該物質をより高速で移動させ、画分を速やかにアッセイした結果、ずっと良好になることがわかった。PAM下流精製プロセスの概要技術移転のパイロット施設に渡す情報を反映する各プロセス工程の精製手順を以下に詳述する。SDS-PAGEおよびデンシトメトリースキャンを含む代表的な小規模精製実行のデータを、表8および図11および12に含める。TFF1手順:清澄CHO細胞ならし培地を5倍に濃縮し、50mMTRIS、0.001TX-100pH8.0で、最終導電率4~6mSが達成されるまでダイアフィルトレーションを行なう。濾過中、膜貫通圧力を≦10psiに維持する。AEX手順:TFFによって濃縮/ダイアフィルトレーションした清澄CHO細胞ならし培地を、50mMTRIS、120mMNaCl、0.001TX-100pH8.0で平衡化させたQ-セファロースFFAmershamBiosciencesカラムに充填する。このカラムを180cm/時で実行し、UV吸光度を280nmにおいてモニターする。カラムをさらなる平衡バッファーで洗浄し、PAMをカラムから、50mMTRIS、225mMNaClpH8.0で溶出する。カラムを2.0MNaClで清浄にし、1.0MNaOHで殺菌する。カラムは、各実行間では10mMNaOH中に保存する。HIC手順:Q-セファロースで得られたものを、等容量の50mMTRIS、600mMクエン酸塩pH7.0で希釈し、25mMTRIS、300mMクエン酸塩pH7.0で平衡化させたフェニル-セファロースFFAmershamBiosciences上に充填する。カラムを240cm/時で実行し、UV吸光度を280nmにおいてモニターする。カラムを25mMTRIS、300mMクエン酸塩pH7.0で洗浄し、PAMをカラムから、25mMTRIS、75mMクエン酸塩pH7.0で溶出する。カラムを、それぞれ25mMTRISpH7.0および1.0MNaOHで清浄し、殺菌する。カラムは、各実行間では10mMNaOH中に保存する。TFF2手順:フェニル-セファロースFFで得られたものを最初にほぼ3倍に濃縮し、50mMTRIS、25mMNaCl、0.0005TX-100pH8.0を用いてダイアフィルトレーションを行ない、ウイルス濾過に適した容量までさらに濃縮し、保存する。10L攪拌槽バイオリアクタープロセス実行α-アミド化酵素の10L発酵および精製プロセスの概要いくつかの10L攪拌槽バイオリアクター実行に従って精製α-AEを調製した。α-アミド化酵素を誘導するためのプロセス工程は、上記および図14に示すように、14日間の種菌相、17日間の発酵相および2日間の精製スキームであった。これらの実験で使用した培養培地は、タンパク質無含有CHO培地C5467Sigma-Aldrichであった。これらの実行のプロセスの詳細はすべて、適切なバッチの記録を見るとよい。プロセスフローダイアグラムである図14は、UGL73-26/Mクローンを用いて産生されるα-AE/PAMのために開発した最終プロセス工程を示す。第1相-種菌10L攪拌槽バイオリアクター用の種菌を調製するため、UGL73-26/MMWCB00のバイアルの1つを解凍した。このクリオバイアルの細胞を取り出し、新鮮培地中に入れた。細胞ペレットを新たな培地中に再懸濁し、C5467CHO培地を入れたスピナーフラスコに添加した。次の14日間、培養物を、400mLの培地細胞を入れた4つのフラスコ内に増殖した種菌スキーム図15を参照。培養物を、種菌相l2の最後でのα-AE発現について試験した。第12日目、平均酵素活性濃度は>13,000U/mLであった表9パネルC参照、培養物および細胞バイアビリティの生細胞計数を各時点で行ない、種菌培養物を修正した。培養物のバイアビリティは、概ね、この相の間で95よりも大きかった表9パネルA参照。種菌培養物の平均総生細胞計数は、第14日目で2.03×109であった表9パネルB参照。第2相-発酵10Lのバイオリアクターは、各種菌相の終了時に開始した。バイオリアクターに、未使用タンパク質無含有培地中1×105細胞/mLでL-グルタミンSigma,C5467を播種した。バイオリアクターパラメータを、下記の設定点;温度=37°C、RPM=60、pH=維持するpH設定点なしに設定し、pHは流動的にし開始時、pHはpH7.5より大きくならなりようにする、DO設定点は70DOにする。未使用培地の溶存酸素濃度は、70より大きくし、バイオリアクターの溶存酸素濃度は70まで流動的にさせ、次いで、該設定点に維持した。バイオリアクターには、第5、10および14日目に2g/Lのグルコースを補充した。第17日目にならし培地を収集した。収集物質をMilliporeOpticapFilterに通して清澄にした。後述する最初の2つの発酵では、第17日目ではなく第18日目に2131-D-1003および2131-D-1004を収集した。培養物の最大細胞密度は第10~17/18日目の間で達成され、維持された。これらの発酵の平均最大細胞密度は1.5-1.6×106細胞/mLであった表10パネルB。培養物のバイアビリティは、培養の最初の14日間で>80であり、収集した日の平均バイアビリティは76.0であった表10パネルA。培養物の産生性を、収集時、第17/18日目に評価した。平均清澄収集物は378,567単位のα-AE/mLを含んでいた表10パネルC。第3相-精製該精製プロセスは、上記のような5つの異なる工程を有する。清澄収集物を濃縮し、50mMTRIS、0.001TX-100pH8.0に対してダイアフィルトレーションした。酵素物質を平均してほぼ4倍に濃縮したデータ示さず。バッチの記録参照。このプロセス物質をQ-セファロースカラムに適用し、225mMNaClを含有する50mMTRIS、0.001Tritonバッファー中でのNaCl段階的勾配に従って溶出した。酵素溶液を50mMTRIS、600mMクエン酸pH7.0で希釈し、フェニルセファロースカラムに適用した。α-アミド化酵素をカラムから、クエン酸塩の工程勾配に従って溶出した。酵素物質を最終容量ほぼ1Lまで濃縮した。6つの酵素バッチのうち4つをウイルス除去フィルターに通して処理した。2つのバッチはMilliporeNFPフィルターに通して処理し1330-D-1005および1330-D-1006、2つのバッチは、PallTrincorDV50フィルターに通した1330-1009および1330-1010。各々のプロセス工程のデータを以下の表11に示す。最初の工程TFF1は、α-アミド化酵素活性単位の保持に関してほぼ定量的な工程であった。10Lバイオリアクター実行からのTFF濃縮物は、1.60×106単位/mgタンパク質の平均比活性を有する表11。Q-セファロースクロマトグラフィーカラムに適用したTFF1濃縮物は、カラムからほぼ3Lで溶出された。酵素比活性は、このプロセス工程で、3.33×106単位/mgまでほぼ2倍に増大した。Q-セファロース溶出液のタンパク質濃度および酵素活性濃度は非常に一貫していた表11参照。フェニル-セファロースクロマトグラフィー後、平均酵素比活性は、3.33×106から4.96×106単位/mgタンパク質まで増大した。フェニル-セファロース溶出液を、第2のTFF工程を用いて1Lまで濃縮した。この濃度工程後、比活性に変化はなかった表11。一部の酵素バッチからのTFF2濃縮物を、ウイルス除去フィルターに適用した。4つのうち3つの酵素バッチの比活性が低下した表11。最終精製酵素の平均比活性は、350,000単位/mgから4.61×106単位/mgタンパク質低下した。この比活性の低下は、おそらく一部の該酵素の不活化によるものであった。精製プロセスの各工程の一貫性を示すこのデータは重要である。しかしながら、本当に重要なのは、該プロセスの各工程での所望の生成物の回収パーセントである。表12は、α-アミド化酵素精製プロセスの各工程での回収パーセント、および4回または5回のプロセス工程後のプロセス全体収率を示す。表12は、酵素が両方のTFF工程から定量的に回収されたことを示す。クロマトグラフィー工程、Q-セファロースおよびフェニルセファロースでの平均回収パーセントは、それぞれ65.3および72.0である。試験した両方のウイルス除去フィルターで約80のα-AE活性が回収された。TFF2またはウイルス濾過を通した清澄回収物質の酵素精製プロセスの全体収率は、それぞれ40.8または38.8であった。結論高レベルのα-AE活性を発現する安定な充分特性化されたCHO細胞株UGL73-26/Mが開発された。高レベルの酵素発現は、非動物供給源の低タンパク質含有組織培養培地C5467Sigmaを用いる17日間のバッチ発酵プロセスにおいて達成される。臨界発酵パラメータ例えば、pH、DOおよびグルコース濃度などを検討し、最適化した。また、酵素がほぼ均一に精製され得るロバストな2工程の下流精製プロセスも開発した。この発酵および精製プロセスの一貫性は、製造レベルへの規模拡大に充分適している。以下に、本発明の細胞によって発現されるPAMを用いたアミド化生成物の産生を示す実施例を示す。実施例1:ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼを用いたグリシン増殖副甲状腺ホルモン断片のアミド化対応物への変換ピルビン酸塩を用いたrhPTHl-34Gly35-OHのアミド化rhPTHl-34Gly35-OHのアミド化に用いた成分および終濃度を表12に示す。アミド化の簡単な説明は以下の通りである。ほぼ12.4gのrhPTHl-34Gly35-OHを含む1,900mLの25mMMES、200mMNaClpH6.0を、攪拌器およびガススパージャーを取り付けたガラス槽内に供給した。この溶液に、以下の成分:3025mLの水、741mLの250mMMESpH6.3、1.03mLの3mM硫酸銅、124mLのヨウ化カリウム、62mLの190プルーフエタノール、124mLの400mMピルビン酸ナトリウムおよび124mLの100mMのアスコルビン酸ナトリウムを記載順に添加した。反応槽を水浴中に入れ、反応混合物を25~27°Cまで攪拌しながら昇温させた。反応混合物のpHを21mLの2MHClによって5.8に調整した。酸素のスパージングを開始したが、スパージング速度は、反応混合物の過剰な起泡が回避されるように調整した。47mLのPAMを添加し、反応混合物を25~27°Cで4時間35分間インキュベートしたインキュベーション期間中、酸素スパージングを行なった。反応混合物を74mLの2MのHClでpH2.4に酸性化した。この実施例で用いたPAM酵素は、上記のようにして構築し、本明細書においてUGL73-26/Mと表示する本発明の好ましいCHOK1細胞から発現された。また、この細胞株を用いて上記のATCC寄託物を提供した。グリシン増殖前駆体は、既知の供給源から得られるものであってもよく、既知の様式で生成されたものであってもよい。例えば、これは、米国特許第6,103,495号その実施例1~2に記載のものと同様の様式で発酵によって生成され、アミド化の前に米国特許第6,103,495号その実施例3に記載のようにして精製され得る。上記の本発明のアミド化に用いた具体的な前駆体は、係属中の米国特許出願第11/076,260号2005年3月9日出願および2005年10月6日に公開番号US2005/0221442で公開の細胞株によって発現させた。アミド化に使用する酵素がペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼPHMである場合、PHMをPAMに変えて、上記のものと同じ反応混合物が使用され得る。また、4~6時間のインキュベーション期間の最後に、反応混合物のpHを塩基の添加によって8~9に上昇させる。反応混合物は、反応終了前にさらに4~8時間攪拌する。PHMは、PAMを本明細書に教示したとおりに発現させた後、PHM触媒ドメインをPAM分子の残部から分離することにより得られ得る。あるいはまた、本明細書において使用されるベクターは、PHMの後でPALの前の触媒ドメインで翻訳が停止されるように修飾されていてもよい。あるいはまた、該ベクターは、第1の例では、上記のPAMコード領域の代わりにPHMコード領域を用いて構築され得る。PHMは、PAMのN末端部分のみ最初の約40kDaを発現させることにより得られ得る。PAMおよびその触媒ドメインの位置は文献に報告されている。かかる任意のPAMまたはPHMは、本発明に従って有用であると考えられる。例えば、Mizunoら,BBRCVol.148,No.2,pp.546-521987その開示は引用により本明細書に組み込まれるを参照のこと。特にMizunoのAE1を参照のこと。カエルの皮膚は、天然状態でPHMを発現することが知られている。実施例2:アミド化後精製陽イオン交換CEXクロマトグラフィー残留rhPTHl-34Gly35-OHからのrhPTHl-34-NH2の精製を、CEXクロマトグラフィーを用いて行なった。CEXクロマトグラフィー方法の簡単な説明は以下の通りである。アミド化で得られたものを酸性化して25mMMESpH6.5で平衡化させたToyopearlSP650MTosohBioscienceLLCカラム9cm×19cm上に充填した。カラムを180cm/時で実行し、カラム流出液のUV吸光度を280nmでモニターした。このカラムを25mMMESpH6.5で、カラム流出液pHのpHが6.5に戻るまで洗浄した。このカラムを25mMMES,80mMNaClpH6.5で、洗浄ピークが完全に溶出され、安定なUVベースラインが得られるまで洗浄した。生成物rhPTHl-34-NH2をカラムから、25mMMES,200mMNaClpH6.5で溶出した。UVピークをすべて回収したが、プール基準を決定するため、画分をRP-HPLCによってスクリーニングした。逆相RPクロマトグラフィーRPクロマトグラフィーを用い、塩形態のペプチドを塩化物から酢酸塩に交換した;RPクロマトグラフィーでは、ほんのわずかのペプチド精製しかもたらされない。CEXクロマトグラフィーで得られたものを3容量の333mM酢酸ナトリウムで希釈し、充分混合した。混合物は、充填前に室温で75分間放置した。酢酸塩希釈試料を、250mM酢酸ナトリウムpH7.5で平衡化させたAmberchromCG300MTosohBioscienceLLCカラム6cm×17cm上に充填した。カラムを180cm/時で実行し、カラム流出液のUV吸光度を280nmでモニターした。カラムを250mM酢酸ナトリウムpH7.5で60分間洗浄した。カラムを0.1酢酸中で平衡化させた。生成物rhPTHl-34-NH2をカラムから、0.1酢酸、40エタノールで溶出した。UVピークをすべて回収した。rhPTHl-34-NH2の特性化RPクロマトグラフィーで得られたものを濃縮し、凍結乾燥によって白色の綿毛様粉末にし、11.8gアミド化から95の全体収率のrhPTHl-34-NH2を得た。rhPTHl-34-NH2の分子質量は、エレクトロスプレーイオン化質量分析ESI-MSによって4,116.9Daであると決定され、これは、平均分子質量の計算値4,116.8Daと整合した。本発明は、特別の実施形態に関して説明されており、多くの他の変形および修飾、ならびに他の使用は、当業者に明らかである。したがって、本発明は、本明細書における特異的開示、または付け加えられた特許請求の範囲に限定されない。"