"哺乳動物由来の幹細胞の培養開始後5日目から7日目の間にPdx1蛋白質を1回以上導入し、9日目から11日目の間にNeuroD蛋白質を1回以上導入し、13日目から15日目の間にMafA蛋白質を1回以上導入することを含む、幹細胞から膵臓系細胞へと分化誘導する方法。哺乳動物由来の幹細胞がマウス、サル又はヒト由来の幹細胞である、請求項1に記載の方法。幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、請求項1又は2に記載の方法。膵臓系細胞がインスリン産生細胞である、請求項1から3の何れか1項に記載の方法。MafA蛋白質が、ポリアルギニンが付加されているMafA蛋白質である、請求項1から4の何れか1項に記載の方法。ラット膀胱癌由来804G細胞由来の細胞外マトリックス上で培養している哺乳動物由来の幹細胞に、Pdx1蛋白質、NeuroD蛋白質、及びMafA蛋白質を導入する、請求項1から5の何れか1項に記載の方法。請求項1から6の何れか1項に記載の方法により得られる、ES細胞から分化誘導された膵臓系細胞。請求項1から6の何れか1項に記載の方法により幹細胞から膵臓系細胞へと分化誘導する工程、及び分化誘導された膵臓系細胞を分離する工程を含む、ES細胞から分化誘導された膵臓系細胞を取得する方法。本発明は、ウイルスや遺伝子を用いることなくES細胞又はiPS細胞などの幹細胞から膵β細胞に分化させる方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、3種類の転写調節因子の組換え蛋白質Pdx1蛋白質、NeuroD蛋白質、及びポリアルギニンを付加したMafA蛋白質をES細胞に導入することによって膵β細胞に分化誘導させることに成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によれば、哺乳動物由来の幹細胞の培養開始後5日目から7日目の間にPdx1蛋白質を1回以上導入し、9日目から11日目の間にNeuroD蛋白質を1回以上導入し、13日目から15日目の間にMafA蛋白質を1回以上導入することを含む、幹細胞から膵臓系細胞へと分化誘導する方法が提供される。好ましくは、哺乳動物由来の幹細胞はマウス、サル又はヒト由来の幹細胞である。好ましくは、幹細胞はES細胞又はiPS細胞である。好ましくは、膵臓系細胞はインスリン産生細胞である。好ましくは、MafA蛋白質は、ポリアルギニンが付加されているMafA蛋白質である。好ましくは、ラット膀胱癌由来804G細胞由来の細胞外マトリックス上で培養している哺乳動物由来の幹細胞に、Pdx1蛋白質、NeuroD蛋白質、及びMafA蛋白質を導入する。本発明によれば、上記した本発明の方法により得られる、ES細胞から分化誘導された膵臓系細胞が提供される。本発明によればさらに、上記した本発明の方法により幹細胞から膵臓系細胞へと分化誘導する工程、及び分化誘導された膵臓系細胞を分離する工程を含む、ES細胞から分化誘導された膵臓系細胞を取得する方法が提供される。本発明によれば、ウイルスや遺伝子を用いることなくES細胞又はiPS細胞などの幹細胞を膵β細胞に分化させることができる。本発明の方法は、糖尿病患者に対する膵β細胞移植治療に利用する膵β細胞の作製方法として有用である。以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。本発明による幹細胞から膵臓系細胞へと分化誘導する方法は、哺乳動物由来の幹細胞にPdx1蛋白質、NeuroD蛋白質、及びMafA蛋白質を導入することを特徴とする方法である。膵β細胞の分化の過程では、上述の3因子を含む転写因子が一過性に発現することが重要である。本発明で用いる蛋白質導入法では、添加された蛋白質は細胞内に短時間で移行する。また、導入後1日ないし2日で完全に分解され消失し、一過性の発現が期待できる。さらに、発現プラスミドやウイルスベクターを用いて導入した場合のように発現した蛋白質が長時間細胞に影響することもなく、外来遺伝子が染色体に組み込まれることもない。本発明による方法は、臨床応用に不可欠な安全性の面をクリアしたものである。1型ならびに2型糖尿病に対して、インスリン産生細胞を移植する再生医療が期待されている。本治療法を臨床応用するためには、安全にES細胞またはiPS細胞から膵β細胞を分化させる技術が必須である。本発明で用いた技術は、ウイルスベクターを使用せず安全であり、移植に必要な膵β細胞の作製方法として利用できる。本発明で用いるES細胞は、哺乳動物由来のES細胞であればよく、その種類などは特に限定されず、例えば、マウス、サル又はヒト由来のES細胞などを使用することができる。ES細胞としては、例えば、その分化の程度の確認を容易とするために、Pdx1遺伝子付近にレポーター遺伝子を導入した細胞を用いることができる。例えば、Pdx1座位にlacZ遺伝子を組み込んだ129Sv由来ES細胞株R1、J1又は、Pdx1プロモーター制御下のGFPレポータートランスジーンをもつES細胞SK7株などを使用することができる。あるいは、Hnf3β内胚葉特異的エンハンサー断片制御下のmRFP1レポータートランスジーン及びPdx1プロモーター制御下のGFPレポータートランスジーンを有するES細胞PH3株を使用することもできる。哺乳動物由来のES細胞の培養方法は常法により行うことができ、例えば、所望によりフィーダー細胞としてのマイトマイシンC処理マウス胚線維芽細胞MEFの存在下において、白血病阻害因子LIF,ESGRO1000単位ml、Chemicon製を添加した分化培地10ウシ胎児血清FBS、01mM2メルカプトエタノール、100μM非必須アミノ酸、2mMLグルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地DMEM、シグマ製で維持することができる。iPS細胞人工多能性幹細胞:inducedpluripotentstemcellとは、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。人工多能性幹細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフヤニッシュらのグループ、ウイスコンシン大学のジェームストムソンJamesThomsonらのグループ、ハーバード大学のコンラッドホッケドリンガーKonradHochedlingerらのグループなどを含む複数のグループが成功している。人工多能性幹細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として大きな期待を集めている。例えば、国際公開WO2007/069666号公報には、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子及びMycファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。本発明で用いるiPS細胞は、体細胞を初期化することにより製造することができる。ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、本発明で言う体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物例えば、マウスなどのげっ歯類、またはヒトなどの霊長類であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。本発明で言うiPS細胞は、所定の培養条件下例えば、ES細胞を培養する条件下において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉及び内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本発明における人工多能性幹細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。体細胞からiPS細胞を製造するためには、まず、少なくとも1種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してiPS細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。iOct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子iiOct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子iiiOct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子、hTERT遺伝子、SV40largeT遺伝子ivOct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子本発明では、哺乳動物由来の幹細胞にPdx1蛋白質、NeuroD蛋白質、及びMafA蛋白質を導入する。幹細胞に対して、上記3種類の蛋白質を導入する手順は特に限定されず、同時に導入してもよいし、順番に逐次に導入してもよい。好ましくはPdx1蛋白質、NeuroD蛋白質、及びMafA蛋白質の順番で、各蛋白質を導入することができる。特に好ましくは、幹細胞の培養開始後5日目から7日目の間にPdx1蛋白質を1回以上導入し、9日目から11日目の間にNeuroD蛋白質を1回以上導入し、13日目から15日目の間にMafA蛋白質を1回以上導入することができる。本発明で用いるPdx1蛋白質、NeuroD蛋白質、及びMafA蛋白質の由来は特に限定されず、導入する幹細胞ES細胞又はiPS細胞などが由来する哺乳動物の種類と同種又は近い種類の哺乳動物のPdx1蛋白質、NeuroD蛋白質、及びMafA蛋白質を用いることができる。例えば、マウス由来の幹細胞に導入する場合には、ラット又はマウスの組み換えPdx1蛋白質、NeuroD蛋白質及びMafA蛋白質を用いることができる。また、ヒト由来の幹細胞に導入する場合には、ヒトの組み換えPdx1蛋白質、NeuroD蛋白質及びMafA蛋白質を用いることができる。また、Pdx1蛋白質、NeuroD蛋白質、及びMafA蛋白質としては、組み換え蛋白質を用いることが好ましい。即ち、Pdx1遺伝子、NeuroD遺伝子、及びMafA遺伝子をそれぞれコードする発現ベクターを構築し、これを適当な宿主大腸菌などに導入し、得られた形質転換体を、導入された遺伝子を発現するような適当な条件下で培養することによって所望の組み換え蛋白質を製造することができる。また、本発明で用いるMafA蛋白質としては、ポリアルギニンが付加されているMafA蛋白質を用いることが好ましい。本発明で用いることができるPdx1蛋白質、NeuroD蛋白質、及びMafA蛋白質の各々の塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、以下の通り配列表にも記載する。哺乳動物由来の幹細胞ES細胞又はiPS細胞などを培養する方法は特に限定されず、当業者に公知の定法により行うことができる例えば、白木伸明粂昭苑ES細胞からの内胚葉系細胞の分化誘導実験医学別冊培養細胞実験ハンドブック2973012008;及びNatureprotocols230812007を参照。本発明によれば、幹細胞から膵臓系細胞へと分化誘導することができる。分化誘導された膵臓系細胞は、好ましくはインスリン産生細胞である。さらに本発明によれば、ES細胞又はiPS細胞などの幹細胞から膵臓系細胞へと分化誘導する際に、被験物質の存在下で幹細胞を培養し、被験物質の非存在下で幹細胞を培養した場合における膵臓系細胞への分化誘導の程度と被験物質の存在下で幹細胞を培養した場合における膵臓系細胞への分化誘導の程度とを比較することによって、幹細胞から膵臓系細胞へと分化誘導を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法が提供される。被験物質としては、成長因子又は低分子化合物などを使用することができる。この際、インスリンの発現量を指標として、膵臓系細胞へと分化誘導の程度を測定することが可能である。以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。実施例1:ラット組換えPdx1蛋白質、ラット組み換えNeuroD蛋白質、及びポリアルギニンを付加したマウス組換えMafA蛋白質の大腸菌での発現及び精製図1及び図2ラットPdx1遺伝子、ラットNeuroD遺伝子およびマウスMafA遺伝子は米国ベイラー研究所の野口洋文先生から提供されたものを用いたDiabetes5217322003Diabetes5428592005。制限酵素サイトを付加したプライマーを用い、PCR法により、Pdx1、NeuroDの両遺伝子をpET21aベクターにそれぞれ組み込んだ。MafAは、あらかじめポリアルギニンを付加してあるpGEX6p1ベクターに組み込んだ。大腸菌BL21株に、形質転換により上記plasmidを導入し、37°Cで培養する。対数増殖期にある菌体にIPTGを添加し、24°Cで12時間培養する。遠心により回収した菌体を、細胞溶解液により溶解し、Pdx1およびNeuroDはTALONresinにより精製した。MafAはGlutathioneSepharose4Bにより精製した後、PreScissionProteaseによりGSTタグを切断した。精製後の蛋白質はSDSPAGEの後、クマシー染色およびウエスタンブロット法により発現を確認した。結果を図2に示す。図2に示す通り、ラット組換えPdx1蛋白質、ラット組み換えNeuroD蛋白質、及びポリアルギニンを付加したマウス組換えMafA蛋白質の大腸菌での発現を確認できた。実施例2:HeLa細胞への組み換え蛋白質の導入図3実施例1で精製した組み換え蛋白質を細胞内に導入されることをHela細胞を用いて確認した。Hela細胞にそれぞれの蛋白質を終濃度1μMとなるよう培地に添加した。蛋白質添加の6時間後にSDSサンプルバッファーで細胞を回収した。導入の確認はそれぞれの蛋白質を認識する抗体を用いてウエスタンブロット法により行なった。結果を図3に示す。Pdx1およびNeuroDはそれ自身PTDProteintransductiondomainを持ち、細胞内に導入されることはすでに報告されているが、MafAがポリアルギニンを付加することにより、細胞内に導入されることは本実験では初めて実証された。実施例3:マウスES細胞から膵β細胞への分化誘導図4~7マウスES細胞から膵β細胞への分化誘導方法は粂らの方法に従った図4の上。粂らの方法では、ES細胞を3種類の培地条件で17日間培養するとインスリン産生細胞が増加することを提唱している。具体的には、マウスES細胞からインスリン産生細胞への分化は図4上に示すように17日間で行なった。Medium1はActivinAbasicFGFを含むDMEM培地、Medium2はB27添加物レチノイン酸KAADCyclopamineFGF10を含むRPMI培地、Medium3はNicotinamideGLP1を含むDMEM培地であり、図に示すように段階的に培地を交換し分化を誘導した。ES細胞への蛋白質の導入は、図4下表に示すようにDay579111315に蛋白質の終濃度1μMとなるようそれぞれ培地に直接添加した。Day17の時点で、細胞を固定し抗インスリン抗体で免疫染色を行なった図5上。インスリン陽性細胞の数はカウンターで計数し、図4下表に示すグループ間で比較した図5下。さらに、Day17の分化細胞からRNAを抽出し、RTPCR法によりcDNAを合成した。以下のプライマーを用いてインスリン1遺伝子の発現を定量RTPCR法により測定した図67。センス:CAGCCCTTAGTGACCAGCTAアンチセンス:ATGCTGGTGCAGCACTGATC本実施例では、図4の下に示すようにDay5からDay13の間で、導入する蛋白質の種類を検討した。その結果、Day5および7にPdx1をDay9および11にNeuroDをDay13および15にMafAを導入した細胞でInsulin陽性細胞の数が最も多かった図5。一方で、3因子それぞれ単独での処理では対照群との間に差はみられなかった。さらに、3因子の導入はInsulin遺伝子の発現も著明に増加した図6。また、図7に示すように、Day9からの蛋白質導入ではInsulin遺伝子の発現の増加が起こらないことから、3因子をそれぞれ特定の時期に導入することが分化誘導に重要であることが示唆された。実施例4:804G細胞由来の細胞外マトリックスを用いた、3因子の蛋白質導入によるマウスES細胞からインスリン産生細胞への分化ラット膀胱癌由来の細胞株804Gはラミニン5およびフィブロネクチンを含む細胞外マトリックスを産生する。このマトリックスは膵β細胞の生育およびグルコース応答性のインスリン分泌を改善するDiabetes492332000Diabetes5320342004。培養プレートを予め804G細胞の培養上清で一晩コーティングし、ES細胞を播種した。本実験では、InsGFPトランスジェニックマウス由来のES細胞マウスES細胞株ING112を用い、GFPの蛍光をインスリン産生細胞への分化の指標とした。分化誘導方法および蛋白質導入方法は上記と同様に行ない、培養17日目でInsGFP陽性細胞の数をカウンターで計数し、804Gマトリックス処理群および3因子導入群を比較した図8のa、b。図8のa及びbに示すように、マウスES細胞株ING112において、804G細胞由来の細胞外マトリックスはInsGFP陽性の細胞数を著明に増加し、さらに3因子を導入した群は、導入していない群に比べInsGFP陽性の細胞数を増加した。Insulin1遺伝子の発現を比較した結果を図8のcに示す。培養17日目で分化細胞からRNAを抽出し、RTPCR法によりcDNAを合成した。以下のプライマーを用いてInsulin1遺伝子の発現を定量RTPCR法により測定し、対照群、804Gマトリックス処理群および3因子導入群を比較した。センス:CAGCCCTTAGTGACCAGCTAアンチセンス:ATGCTGGTGCAGCACTGATC図8のcに示す通り、804G細胞外マトリックスおよび蛋白質導入によりInsulin1遺伝子の発現は増加した。膵臓特異的遺伝子の発現をRTPCR法により検討した結果を図8のdに示す。培養17日目で分化細胞からRNAを抽出し、RTPCR法によりcDNAを合成し、以下のプライマーを用いて膵臓特異的遺伝子の発現を解析した。Actセンス:CCTCATGAAGATCCTGACCGAアンチセンス:TTGCCAATAGTGATGACCTGGIns1センス:CAGCCCTTAGTGACCAGCTAアンチセンス:ATGCTGGTGCAGCACTGATCIns2センス:TCCGCAACAATCAAAAACCATアンチセンス:GCTGGGTAGTGGTGGGTCTAPdx1センス:CCAAAACCGTCGCATGAAGTGアンチセンス:CTCTCGTGCCCTCAAGAATTTTCNeuroDセンス:CTTGGCCAAGAACTACATCTGGアンチセンス:GGAGTAGGGATGCACCGGGAAMafAセンス:ACACTGCCCACCATCATCACTCアンチセンス:CTTCTCGCTCTCCAGAATGTGCGlut2センス:ACAGAGCTACAATGCAACGTGGアンチセンス:CAACCAGAATGCCAATGACGATKir62センス:GGCTCCTAGTGACCTGCACCAアンチセンス:CCACAGCCACACTGCGCTTGCGSUR1センス:CCAGACCAAGGGAAGATTCAアンチセンス:GTCCTGTAGGATGATGGACAIAPPセンス:TGATATTGCTGCCTCGGACCアンチセンス:GGAGGACTGGACCAAGGTTGCACNA1Aセンス:GGTCACACCTCACAAGTCCACアンチセンス:CCAGTCTTCTGGAACATCTCTTGCACNA1Cセンス:ATGCAAGACGCTATGGGCTATアンチセンス:CAGGTAGCCTTTGAGATCTTCTTCCACNA1Dセンス:ACATTCTGAACATGGTCTTCACAGアンチセンス:AGGACTTGATGAAGGTCCACAG図8のdに示す通り、804G細胞外マトリックスおよび蛋白質導入により、検討したすべての遺伝子の発現が認められた。ヒトiPS細胞から分化誘導した細胞のInsulin遺伝子の発現を調べた結果を図8のeに示す。ヒトiPS細胞への蛋白質の導入は、Day151719212325に蛋白質の終濃度1μMとなるようそれぞれ培地に直接添加した。培養28日目で分化細胞からRNAを抽出し、RTPCR法によりcDNAを合成し、以下のプライマーを用いてInsulin遺伝子の発現を解析した。センス:GAGGCCATCAAGCAGATCACアンチセンス:GGCTGCGTCTAGTTGCAGTA図8のeに示す通り、ヒトiPS細胞においても、804G細胞外マトリックスおよび蛋白質導入によりInsulin遺伝子の発現が認められた。"