"試料中のカルシウムイオンの濃度を決定するための方法であって、以下:aその試料を式IここでR1は水素、ハロゲン、カルボキシ、アルキルおよびホルミルから選択され、R2は水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、モルホリノ、CN、カルボキシおよびホルミルから独立して選択され、R3は水素、ハロゲン、N-アルキルサルフェート、カルボキシ、アルコキシ、フェニル、CN、CF3、および第三級ブチルから独立して選択され、R4は水素、ハロゲンまたはアルキルから独立して選択され、R5およびR7は独立して水素またはアルキルであり、R6は水素、アルキル、アルコキシおよびハロゲンから選択され、またはここでR3およびR4は芳香族架橋を形成しており、そしてXは正に荷電した対イオンである;の化合物を含む溶液と混合し、それによりカルシウムイオンをその化合物に結合させ;bカルシウムイオンをその化合物から放出させ、ここで前記の放出がその化合物の吸光度の変化を引き起こし;cその吸光度の変化を測定し;dcにおいて測定された吸光度の変化をカルシウムイオンの濃度を決定するために用いる;の工程を含む、前記方法。式Iの化合物を含む溶液がpH8.5からpH11.5の範囲のpHを有する、請求項1に記載の方法。式Iの化合物を含む溶液がpH9.0からpH10.5の範囲のpHを有する、請求項1または2に記載の方法。式IのR1が水素またはハロゲンのどちらかである、請求項1~3のいずれかに記載の方法。式IのR2が水素、ハロゲンまたはアルキルである、請求項1~3のいずれかに記載の方法。式IのR3が水素、ハロゲン、カルボキシまたはアルコキシである、請求項1~3のいずれかに記載の方法。請求項1の工程bにおけるカルシウムイオンの放出が、20°Cにおいて7.0以上のlogkのカルシウムイオンに対する結合定数を有するカルシウムキレート剤により誘発される、請求項1~3のいずれかに記載の方法。請求項1の工程bにおけるカルシウムイオンの放出が、EDTA、DTPA、EGTA、DTPMPおよび/またはEDPMPにより誘発される、請求項7に記載の方法。pH8.5からpH11.5の範囲のpHを有し、請求項1に定義された式Iの化合物を含有する、カルシウムの測定のための試薬。0.10mMから50mMの範囲の濃度の式Iの化合物を含む、請求項9に記載の試薬。緩衝系を含み、その緩衝系がAMPD=2-アミノ-2-メチル-1.3-プロパンジオール、CHES=2-N-シクロヘキシルアミノ-エタンスルホン酸、AMPSO=3-[ジメチルヒドロキシルメチル-メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、CAPSO=3-シクロヘキシルアミノ-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸、CAPS=3-シクロヘキシルアミノ-2-プロパンスルホン酸、グリシン緩衝系、または炭酸緩衝系から選択される、請求項9に記載の試薬。式IのR1が水素またはハロゲンのどちらかである、請求項9~11のいずれかに記載の試薬。式IのR2が水素、ハロゲンまたはアルキルである、請求項9~11のいずれかに記載の試薬。式IのR3が水素、ハロゲン、カルボキシまたはアルコキシである、請求項9~11のいずれかに記載の試薬。カルシウムの測定のための検査キットであって、請求項9~14のいずれかに記載の試薬を含む検査キット。実施例1MN-BAPTAの合成MN-BAPTAの合成を図1において図式的に示す。a1-2-クロロ-エトキシ-2-ニトロ-ベンゼン2-ニトロ-フェノール168,7gおよびトルエン-4-スルホン酸2-クロロエチルエステル100gを500mlのDMF中で溶解させ、199gの炭酸カリウムを注意深く添加した後110~120°Cで1時間攪拌した。その反応混合物を砕いた氷および水の混合物8l中に注ぎ、それを強く攪拌した。残留物を濾過して分離し、水で数回洗浄し、乾燥させた。収量:100~120gb4-メチル-1-ニトロ-2-2-2-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-ベンゼン1-2-クロロ-エトキシ-2-ニトロ-ベンゼン116gおよび5-メチル-2-ニトロ-フェノール88gを500mlのDMF中で溶解させ、160gの炭酸カリウムを注意深く添加した後90~110°Cで4時間攪拌した。その反応混合物を砕いた氷および水の混合物8l中に注ぎ、それを強く攪拌した。残留物を濾過して分離し、水で数回洗浄し、乾燥させた。その粗生成物をメタノール中で懸濁し、淡黄色の残留物を再度濾過して分離し、メタノールで洗浄し、乾燥させた。収量:150~165gc2-2-2-アミノ-フェノキシ-エトキシ-4-メチル-フェニルアミン100gの4-メチル-1-ニトロ-2-2-2-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-ベンゼンおよび10gの木炭上パラジウムを3,5lのジオキサン中で懸濁し、室温で5,5barの水素圧の下で水素化した。窒素で3回フラッシュした後、窒素雰囲気下で触媒を濾過して除き、残った溶液を蒸発させ、生成物を真空下で乾燥させた。収量:80gd2-2-2-ビス-メトキシカルボニルメチル-アミノ-フェノキシ-エトキシ-4-メチル-フェニル-メトキシカルボニルメチル-アミノ-酢酸メチルエステル2-2-2-アミノ-フェノキシ-エトキシ-4-メチル-フェニルアミン80gを2,5lのDMF中で溶解させ、285mlのブロモ酢酸メチルエステル、429gの炭酸カリウム、および36,8gのヨウ化ナトリウムを添加した。その反応混合物を80°Cまで2時間加熱した。蒸発後、残ったブロモ酢酸メチルエステルをヘキサンを用いて生成物から除去した。その粗生成物をメタノール中での結晶化によりさらに精製した。収量:93ge2-2-2-ビス-メトキシカルボニルメチル-アミノ-5-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-4-メチル-フェニル-メトキシカルボニルメチル-アミノ-酢酸メチルエステル50gの2-2-2-ビス-メトキシカルボニルメチル-アミノ-フェノキシ-エトキシ-4-メチル-フェニル-メトキシカルボニルメチル-アミノ-酢酸メチルエステルを600mlの氷酢酸中で溶解させた。強い攪拌の下で91,5mlの氷酢酸中1モル濃度の硝酸を添加し、第2工程において28mlの濃硫酸を添加した。温度を30°Cまで上昇させた。その反応混合物を10lの氷/水混合物の中に直接注いだ。その残留物を濾過して分離し、水で水回洗浄し、真空下で乾燥させた。その粗生成物をさらに、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、まずヘキサン/酢酸エチルエステル1:1を溶離液として用いて、2回目にトルエン/アセトニトリル1:1を溶離液として用いて精製した。その生成物を最後にプロパン-2-オールから結晶化した。収量:20gfNM-BAPTA;2-2-2-ビス-カルボキシメチル-アミノ-5-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-4-メチル-フェニル-カルボキシメチル-アミノ-酢酸のカリウム塩9,5gの2-2-2-ビス-メトキシカルボニルメチル-アミノ-5-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-4-メチル-フェニル-メトキシカルボニルメチル-アミノ-酢酸メチルエステルを、水/メタノールの混合物それぞれ230ml中で溶解させ、160mlの1モル濃度の水酸化カリウム溶液を添加した。その反応混合物を1時間還流させた。冷却して室温まで下げて250mlの水を添加した後、その溶液のpHをpH3に調節し、メタノールを蒸発させた。その生成物を、酸性酸エチルエステルを用いた溶媒抽出により単離した。蒸発後、その生成物を真空下で乾燥させた。その2-2-2-ビス-カルボキシメチル-アミノ-5-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-4-メチル-フェニル-カルボキシメチル-アミノ-酢酸をメタノール中で溶解させ、等モルのメタノール中水酸化カリウムを添加した。蒸発および乾燥の後、その適切なカリウム塩を単離することができた。収量:9g実施例2NM-BAPTAを用いるカルシウムイオンの測定に関する一般的な手順式Iに従うモノ-ニトロ-BAPTA型化合物を用いるカルシウムイオンの測定を、逆滴定法で実施した。目的の試料の分割量をモノ-ニトロ-BAPTA型化合物を含む溶液と混合し、インキュベートした。RocheDiagnosticsドイツの自動分析器上で、この試薬はR1と呼ばれる。安定したベースラインシグナルが得られるまでインキュベーションを実施した。通常は10未満で安定したベースラインシグナルが得られ、ほとんどは2~5分以内に得られる。次いで試料およびR1場合により、例えば蒸留水で希釈されるの混合物を分析し、すなわち最も適切な波長単数または複数における吸光度の値を、またはスペクトルを測定する。次いで式Iに従う化合物に結合したカルシウムイオンを、放出剤、例えばEDTAの添加により放出させる。この第2の試薬はRocheDiagnosticsドイツの自動分析器上でR2と呼ばれる。必要な場合、その混合物を蒸留水でさらに希釈することができる。次いで試料の最後の混合物、R1およびR2場合により、例えば蒸留水で希釈されるを分析し、すなわち最も適切な波長単数または複数における吸光度の値を、またはスペクトルを測定する。吸光度の変化は目的の試料中のカルシウムイオンの濃度に直接相関しており、そのカルシウムイオンの濃度は標準的な手順に従って計算される。表Iにおいて、RocheDiagnosticsドイツの5種類の異なる自動分析器上でのカルシウムイオンの測定に推奨される適用に関する概観を示す。ModularPおよびModularD分析器に関する推奨される適用は同じである。実施例3NM-BAPTAを用いるカルシウム測定の線形性本発明で開示するカルシウムイオンの測定のための方法は技術的に優れており、例えばそれは非常に高い精度を示す。これは例えば理論的に予想された値および実際に測定された値を比較した場合に明らかになる。カルシウムイオンの異なる濃度→理論値を、新規の方法で実際に測定された値と比較する。2種類の異なる分析器であるModularPおよびcobasc501共にRocheDiagnosticsにより供給されている上でそれぞれ測定した値による2つのみの代表的な実施例を、図2および3として示す。これらの2つの図は、その測定の顕著な技術的質/精度を実証している。図2および3から明らかであるように、実際に測定された全ての値は対応する予想された理論値の95~105の範囲内にあり、それは調べた全濃度範囲にわたるカルシウムイオンの相当に正確な測定へと変換される。実施例4NM-BAPTAの最小濃度の決定循環中のカルシウムイオンの濃度はごく稀に4mmol/Lを超える。5mmol/Lまでのカルシウムを信頼できる方法で測定することができる試薬は、循環中のカルシウムイオンを決定するのに最も適しているはずである。様々な濃度のカルシウムイオン図4および5において予想された値を、ModularP機器上で、表1の最後の段において記述した適用により測定した。しかし、正規の濃度のそれぞれ90または80のNM-BAPTAしか用いなかった。それぞれ図4および5から分かるように、たとえ検出混合物中に実施例2で示した標準的な手順と比較して80のNM-BAPTAしか存在していなくても、5mmol/Lまでのカルシウムイオンはなお95~105で回収されるrecovered。図5から明らかであるように、NM-BAPTAの濃度を80まで低減させた場合、5mMより上の値は低すぎる値で回収される傾向がある。これは、一部の病的試料中に存在するようなカルシウムの高い濃度の測定のためにはそのような試料が上記の実施例におけるように約1:70で希釈される場合、それらの試料中のカルシウムイオンの正確な測定を保証するために、NM-BAPTAの終濃度は約0.2mmol/Lであるべきであることを意味する。実施例5NM-BAPTAのpHに依存する安定性カルシウムの測定のための試薬は、輸送条件下および分析器のボードの上の両方で可能な限り安定であるべきである。その安定性を調べるため、NM-BAPTAを異なるpHの値で保管した。短期ストレスモデルを適用し、NM-BAPTAを含有する試薬を35°Cで保管した。そのストレスをかけた試薬を、同じ試料の分割量を用いたその他の点では同じ条件の下でのカルシウムイオンの測定において用いた。その試薬にストレスをかけた後に測定した値を、0日目すなわちその試薬への温度ストレスが開始された日におけるストレスをかけていない試薬を用いて測定した値と比較した。用いた緩衝系は、それぞれpH7.4における100mmol/LHEPES、pH8.0における50mmol/LTris、pH10.0における50mmol/LNaHCO3、pH9.8における50mmol/Lグリシン、およびpH10における40mmol/LCAPSOであった。対応するデータを表3~7において要約する。表3から明らかであるように、NM-BAPTAを含有する試薬はpH7.4では安定ではない。カルシウムイオンの回収率は80以下の範囲内にのみある。表4:35°Cにおける50mmol/LTRISpH8.0中でのNM-BAPTAの安定性表4から明らかであるように、NM-BAPTAを含有する試薬は、pH8.0においてきわどいがまだ許容可能な安定性を有する。カルシウムイオンの回収率は大部分が80~90の範囲内である。表5~7から明らかであるように、本出願で開示した試薬はpH約10で優れた安定性を有する。そのような試薬に35°Cで1週間ストレスをかけた後のカルシウムイオンの回収率は優れており、全体としてbylarge90~110の望ましい範囲内であり、ほとんどが95~105でさえあった。この高い安定性は、用いられる緩衝系に関わらず達成することができる。実施例6NM-BAPTAを用いるカルシウムの測定にはマグネシウムによる干渉がないカルシウムイオンを2.53mmol/Lの生理的濃度で含む試料に、0~15mmol/Lのマグネシウムイオンを加えたspiked。その加えた試料を、Roche/Hitachi917分析器上で、実施例2においてModularPに関して示したような適用で測定した。3回の決定の結果の中央値を下記の表8において示す。表8で示した回収率の値から明らかであるように、上記の実験において、マグネシウムイオンはカルシウムイオンの測定に干渉しない。実施例7NM-BAPTAを用いるカルシウムの測定にはガドリニウムによる干渉がないカルシウムイオンを約2,35mmol/Lの生理的濃度で含む1つの試料および約3.40mmol/Lの高いレベルのカルシウムイオンを含む1つの試料に、異なるレベルのOmniscan登録商標を加えたC1:14μLを986μLに添加、C2:2,8を997μLに添加。Omniscan登録商標は頻繁に用いられるガドリニウムを含む造影剤である。その加えた試料を、Hitachi917分析器上で、実施例2においてModularPに関して示したような適用で測定した。3回の決定の結果の中央値を下記の表9において示す。表9で示した回収率の値から明らかであるように、測定された全ての値は十分に95~105の回収率の範囲であったため、上記の実験においてガドリニウムイオンはカルシウムイオンの測定に干渉しない。実施例8NF-BAPTAの合成NF-BAPTAの合成を図6において図式的に示す。a1-2-クロロ-エトキシ-2-ニトロ-ベンゼン実施例1参照b4-フルオロ-1-ニトロ-2-2-2-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-ベンゼン1-2-クロロ-エトキシ-2-ニトロ-ベンゼン10gおよび5-フルオロ-2-ニトロ-フェノール7,86gを50mlのDMF中で溶解させ、13,82gの炭酸カリウムを注意深く添加した後90~110°Cで19時間攪拌した。その反応混合物を砕いた氷および水の混合物500ml中に注ぎ、それを強く攪拌した。残留物を濾過して分離し、水で数回洗浄し、乾燥させた。その粗生成物をメタノール中で懸濁し、淡黄色の残留物を再度濾過して分離し、メタノールで洗浄し、乾燥させた。収量:9,5g。c2-2-2-アミノ-フェノキシ-エトキシ-4-フルオロ-フェニルアミン9,48gの4-フルオロ-1-ニトロ-2-2-2-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-ベンゼンおよび1,5gの木炭上パラジウムを500mlのジオキサンおよび60mlの氷酢酸中で懸濁し、室温で水素化した。窒素で3回フラッシュした後、窒素雰囲気下で触媒を濾過して除き、残った溶液を蒸発させ、生成物を真空下で乾燥させた。収量:7,52gd2-2-2-ビス-メトキシカルボニルメチル-アミノ-フェノキシ-エトキシ-4-フルオロ-フェニル-メトキシカルボニルメチル-アミノ-酢酸メチルエステル2-2-2-アミノ-フェノキシ-エトキシ-4-フルオロ-フェニルアミン7,52gを250mlのDMF中で溶解させ、38,4mlのブロモ酢酸メチルエステル、56gの炭酸カリウム、および2,13gのヨウ化ナトリウムを添加した。その反応混合物を80°Cまで21時間加熱した。蒸発後、残ったブロモ酢酸メチルエステルをヘキサンを用いて生成物から除去した。その粗生成物をメタノール中での結晶化によりさらに精製した。収量:4,14ge2-2-2-ビス-メトキシカルボニルメチル-アミノ-5-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-4-フルオロ-フェニル-メトキシカルボニルメチル-アミノ-酢酸メチルエステル2,5gの2-2-2-ビス-メトキシカルボニルメチル-アミノ-フェノキシ-エトキシ-4-フルオロ-フェニル-メトキシカルボニルメチル-アミノ-酢酸メチルエステルを、30mlの氷酢酸中で溶解させた。強い攪拌の下で4,54mlの氷酢酸中1モル濃度の硝酸を添加し、第2工程において11,35mlの濃硫酸を添加した。温度を30°Cまで上昇させた。その反応混合物を250mlの氷/水混合物の中に直接注いだ。その残留物を濾過して分離し、水で水回洗浄し、真空下で乾燥させた。その粗生成物をさらに、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、まずヘキサン/酢酸エチルエステル1:1を溶離液として用いて、2回目にトルエン/アセトニトリル1:1を溶離液として用いて精製した。収量:0,82gfNM-BAPTA;2-2-2-ビス-カルボキシメチル-アミノ-5-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-4-フルオロ-フェニル-カルボキシメチル-アミノ-酢酸のカリウム塩0,82gの2-2-2-ビス-メトキシカルボニルメチル-アミノ-5-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-4-mフルオロ-フェニル-メトキシカルボニルメチル-アミノ-酢酸メチルエステル5nitrophenoxyethoxy4mfluorophenylmethoxycabonylmethylaminoaceticacidmethylesterを、水/メタノールの混合物それぞれ20ml中で溶解させ、13,77mlの1モル濃度の水酸化カリウム溶液を添加した。その反応混合物を1時間還流させた。冷却して室温まで下げて250mlの水を添加した後、その溶液のpHをpH3に調節し、メタノールを蒸発させた。その生成物を、酸性酸エチルエステルを用いた溶媒抽出により単離した。蒸発後、その生成物を真空下で乾燥させた。その2-2-2-ビス-カルボキシメチル-アミノ-5-ニトロ-フェノキシ-エトキシ-4-フルオロ-フェニル-カルボキシメチル-アミノ-酢酸をメタノール中で溶解させ、等モルのメタノール中水酸化カリウムを添加した。蒸発および乾燥の後、その適切なカリウム塩を単離することができた。収量:0,75g実施例9カルシウムイオンのNF-BAPTAへの結合カルシウムイオンの存在下および非存在下でのNF-BAPTAの吸光度特性を、Uvikon930光度計を用いて分析した。吸収スペクトルを、0.15mmol/LのMN-BAPTAまたはNF-BAPTAそれぞれに関して、50mmol/LCAPSOpH7における、0.9NaClおよび0.01Brij-35中で、それぞれ0.09mmol/LCa2の非存在下または存在下のどちらかで得た。図7に示すように、MN-BAPTAまたはNF-BAPTAそれぞれに関する吸収スペクトルは非常によく似ており、これはこれらの化合物の両方、すなわち一般に式Iに従う化合物を、カルシウムイオンの測定において用いることができることを示している。"