"本明細書に記載される発明。発明の要旨本発明の1つの目的は、糖尿病の発症を予防するかまたは遅らせるための方法を提供することである。本明細書中で以後に提供される発明の詳細な記載から明らかである本発明のこの目的および他の目的は、1つの実施態様においては、糖尿病特に、I型糖尿病の発症を予防するかまたは遅延させるための方法によって、達成されている。この方法は、このような発症の予防または遅延を必要としている被験体に対して、薬学的有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与する工程を包含する。ここでは、上記のペプチドアンタゴニストは、ZOTレセプターに結合するが、哺乳動物の接着結合の孔を生理学的には調節しない。例えば、本発明は、以下を提供する:項目1糖尿病発症を予防または遅延させる方法であって、該方法は、糖尿病発症を予防または遅延させる必要のある被験体に、薬学的に有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与する工程を包含し、ここで該ペプチドアンタゴニストは、閉鎖帯毒素レセプターに結合するが、哺乳動物の接着結合の開きを薬学的に修飾しない、方法。項目2項目1に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが以下のアミノ酸配列:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24を含む、方法。項目3項目1に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが8~110個のアミノ酸の大きさである、方法。項目4項目3に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが8~40個のアミノ酸の大きさである、方法。項目5項目1に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが配列番号15に記載のアミノ酸配列を含む、方法。項目6項目1に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが配列番号15に記載のアミノ酸配列から成る、方法。項目7項目1に記載の方法であって、ここで前記糖尿病が、I型糖尿病である、方法。項目8項目1に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが、腸管送達のためのの経口投与組成物として投与される、方法。発明の詳細な説明上記で議論されているように、1つの実施態様においては、本発明の上記の目的は、糖尿病特に、I型糖尿病の発症を予防するかまたは遅延させるための方法によって達成されている。この方法は、そのような発症の予防または遅延を必要としている被験体に対して、薬学的に有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与する工程を包含する。ここでは、上記のペプチドアンタゴニストは、ZOTレセプターに結合するが、しかし、哺乳動物の接着結合の孔を生理学的には調節しない。本発明において使用されるゾヌリンの特定のペプチドアンタゴニストは、ここでは重要ではない。上記のペプチドアンタゴニストの例として、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有しているペプチドが挙げられる:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、および配列番号24。ペプチドアンタゴニストの大きさは、本発明にとっては重要ではない。一般的には、ペプチドアンタゴニストの大きさは、8~110アミノ酸まで、好ましくは、8~40アミノ酸の範囲であり、より好ましくは、8アミノ酸である。このペプチドアンタゴニストは、HighPerfiemanceLiquidChromatographyofPeptidesandProteins:SeparetionAnalysisandConformation、Mantら編、C.R.C.Press1991に記載されているような周知の技術、およびペプチド合成装置例えば、SymphonyProteinTechnologies,Incを使用して、または組換えDNA技術を使用することによってすなわち、ここでは、ペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切な発現ベクター例えば、E.coliまたは酵母の発現ベクター中に挿入され、それぞれの宿主細胞中で発現され、そして周知の技術を使用してそれらから精製される化学的に合成され、かつ精製され得る。ペプチドアンタゴニストは、小腸への送達のための経口投与組成物として投与され得る。このような、小腸への送達のための経口投与組成物は当該分野で周知であり、そして一般的には、胃腸管耐性の錠剤またはカプセル剤を含むRemington’sPharmaceuticalSciences,第16版、Osol編、MackPublishingCo.,第89章1980;Digenisら、J.Pharm.Sci.,83:915-9211994;Vantiniら、ClinicaTerapeutica,145:445-4511993;Yoshitomiら、Chem.Pharm.Bull.,40:1902-19051992;Thomaら、Pharmazie,46:331-3361991;Morishitaら、DrugDesignandDelivery,7:309-3191991;およびLinら、PharmaceuticalRes.,8:919-9241991;これらは各々、これら全体が本明細書中で参考として援用される。錠剤は、例えば、セルロース酢酸フタレートまたはセルロース酢酸テレフタレートのいずれかの添加によって、胃腸管耐性にされる。カプセルは、ペプチドアンタゴニスト単数または複数が、固いかまたは軟らかい、可溶性のゼラチンの容器または殻のいずれかの中に封入された、固体の投与量形態である。カプセルの製造で使用されるゼラチンは、加水分解によってコラーゲン様の材料から得られる。2つのタイプのゼラチンが存在する。タイプAは、酸処理によってブタの皮膚から誘導され、そしてタイプBは、アルカリ処理によって骨および動物の皮膚から得られる。固いゼラチンカプセルの使用によって、単一のペプチドアンタゴニストまたは、個々の被験体について最良と考えられる厳密な投与量レベルでそれらの組合せを処方することにおける選択を可能にする。固いゼラチンのカプセルは、2つの部分から構成される。一方が他方の中に滑り込み、それによってペプチドアンタゴニストを完全に取り囲む。これらのカプセルは、カプセルのより長いほうの端部にペプチドアンタゴニストまたはペプチドアンタゴニストを含有している胃腸管耐性のビーズを導入することによって充填され、そして次いで、キャップに滑り込ませる。固いゼラチンのカプセルは、ゼラチン、FDC着色料、およびしばしば、乳白剤例えば、ニ酸化チタンから大部分が作製される。USPは、製造の間の分解を防ぐという目的のために、ゼラチンが0.15w/vのニ酸化イオウを含有することを認可している。本発明の状況においては、小腸への送達のための経口投与組成物はまた、ペプチドアンタゴニストが、胃の中の胃液によって有意に不活化されるのを妨ぐ水性の緩衝剤を含む液体の組成物を含み、それによってペプチドアンタゴニストが活性な形態で小腸に到達することを可能にする。本発明において使用され得るこのような水性の緩衝剤の例として、重炭酸塩緩衝液pH5.5から8.7、好ましくは、約pH7.4が挙げられる。経口投与組成物が液体組成物である場合には、安定性の問題を最少にするために、組成物が投与の直前に調製されることが好ましい。この場合には、液体の組成物は、水性の緩衝剤中で凍結乾燥されたペプチドアンタゴニストを溶解させることによって調製され得る。使用されるペプチドアンタゴニストの薬学的有効量は、本発明にとっては重要ではなく、そして処置される被験体の年齢、体重および性別に依存して変化する。一般的には、糖尿病の発送を妨げるかまたは遅延させるために本発明において使用されるペプチドアンタゴニストの量は、約7.5×10-6Mから7.5×10-3Mの範囲、好ましくは、約7.5×10-6Mから7.5×10-4Mの範囲である。このような最終濃度を、例えば、腸管または血液中で達成するためには、本発明の単一の経口投与組成物中のペプチドアンタゴニストの量は、一般的には、約1.0μg~1000μg、好ましくは、約1.0μg~100μgである。以下の実施例は、例示的目的のためのみに提供され、そしていかなる場合においても本発明の範囲を限定するようには意図されない。実施例1ゾヌリンのペプチドアンタゴニストZOTヒトの腸管のゾヌリンゾヌリンiおよびヒトの心臓のゾヌリンゾヌリンhは全て腸管Fasanoら、Gastroenterology,112:8391997;Fasanoら、J.Clin.Invest.,96:7101995および内皮のtjに対して作用し、そして3個全てが、腸管内でのZOTレセプターの分布と一致するFasanoら1997前出;およびFasanoら1995前出同様の局所的な効果を有するFasanoら1997前出ので、1998年8月3日に出願された米国特許出願番号第09/127,815号においては、これらの3個分子は、同じレセプター結合部位と相互作用すると仮定された。従って、腸管のtjの調節に関係するレセプター-リガンド相互作用の絶対的な構造要件に関する知見を提供するために、ZOTおよびヒトのゾヌリンの一次アミノ酸構造の比較を、本明細書中で行った。これらの分子のN末端の分析によって、以下の共通のモチーフ図1中で四角で囲んだアミノ酸残基8~15を明らかにした:非極性腸管についてはGly、脳についてはVal、可変、非極性、可変、非極性、極性、可変、極性Gly。8位のGly、12位のVal、および13位のGlnは、全て、ZOT、ゾヌリンi、およびゾヌリンhにおいて高度に保存されている図1を参照のこと。これは、腸管内でのレセプター結合機能について重要であると考えられる。これらを確認するために、合成の8ペプチドである、GlyGlyValLeuValGlnProGly配列番号15FZI/0と命名し、そしてヒトの胎児のゾヌリンiのアミノ酸残基8~15に対応しているを化学的に合成した。次に、上記のようにUssingチャンバー中に固定したウサギの回腸を、100μgのFZI/0配列番号15、100μgのFZI/1配列番号29、1.0μgの6×His-ZOT1998年8月3日に出願された、米国特許出願番号第09/127,815号の実施例1に記載されているように得た、1.0μgのゾヌリンi1998年8月3日に出願された、米国特許出願番号第09/127,815号の実施例3に記載されているように得た、または1.0μgのゾヌリンh1998年8月3日に出願された、米国特許出願番号第09/127,815号の実施例3に記載されているように得たの単独で暴露したか;あるいは、100μgのFZI/0またはFZI/1に20分間予め暴露し、その時点で、1.0μgの6×His-ZOT、1.0μgのゾヌリンi、または1.0μgのゾヌリンhを添加した。次いで、ΔRtを、上記ように算出した。結果を、図2に示す。図2に示すように、FZI/0は、Rtにおいてはいかなる有意な変化をも誘導しなかったネガティブコントロールと比較して、0.5黒バーを参照のこと。対照的に、ZFI/0での20分間の予備処理は、Rtに対するZOT、ゾヌリンi、およびゾヌリンhの効果を、それぞれ、75、97、および100減少させた白バーを参照のこと。また図2に示されるように、この阻害効果は、8位のGly、12位のVal、および13位のGlyゾヌリンに対して言及されるようなをゾヌリンbの対応するアミノ酸残基それぞれ、Val、Gly、およびArg、配列番号30を参照のことで変更することによって化学的に合成された第二の合成ペプチドFZI/配列番号29が使用される場合には、完全に除去された影をつけたバーを参照のこと。上記の結果は、ZOTのN末端の残基8~15間にわたる領域および標的レセプターに結合のために重要なゾヌリンのファミリーでが存在すること、および8位、12位、および13位のアミノ酸残基がこの結合の組織特異性を決定することを実証する。実施例2糖尿病のラットのモデル腸管の透過性における変化は、糖尿病の発症に関係している事前の生理学的な変化の1つであることが示されているMeddings,Am.J.Physiol.,276:G951-9571999。傍細胞輸送の輸送および腸管の透過性は、完全には解明されていない機構を通じて細胞内tjによって調節される。ゾヌリンおよびその原核生物のアナログであるZOTは両方とも、tjを調節することによって腸管の透過性を変更する。この実施例においては、最初に、tjのゾヌリンに関係している障害が、糖尿病の病因に関係していること、およびゾヌリンのペプチドアンタゴニストの投与によって糖尿病が予防され得るかまたは発症が遅延され得ることが、実証されている。最初に、2つの遺伝的な交配品種すなわち、BB/Wor糖尿病の傾向があるDPラットおよび糖尿病耐性のDRラットHaberら、J.Clin.Invest.,95:832-8371993を、それらがゾヌリンの管内分泌および腸管の透過性に有意な変化を示すかどうかを決定するために評価した。より詳細には、年齢が適合するDPおよびDRラット20、50、75、および>100日齢を屠殺した。ラットを屠殺した後、25Gの針を回腸の内腔に配置し、そしてRingerの溶液を用いて腸管の洗浄を行って、管内のゾヌリンの存在を決定した。ゾヌリンの濃度を、以下のようなサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイELISAを使用して評価した:プラスチックのマイクロタイタープレートCostar、Cambridge、MAを、ポリクローナルウサギ抗ZOT抗体1998年8月3日に出願された、米国特許出願番号第09/127,815号の実施例2に記載されているように得た1:100希釈を用いて4°Cで一晩コーティングし、0.05v/vのTween20を含有しているPBSで3回洗浄し、次いで、0.1v/vのTween20を含有している300μlのPBSを用いて、室温で15分間のインキュベーションすることによってブロックした。次に、精製したヒトの腸管のゾヌリン1998年8月3日に出願された、米国特許出願番号第09/127,815号の実施例3に記載されているように得たを、プレート上にコーティングした。標準曲線を、0.05のTween20を含有しているPBS中で、以下の種々の濃度でゾヌリンを稀釈することによって得た:0.78ng/ml、1.56ng/ml、3.125ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、および50ng/ml。100μlのそれぞれの標準濃度または100μlの腸管の洗浄サンプルをウェル中にピペッティングし、そしてプレート振盪装置を使用して室温で1時間インキュベートした。結合していないゾヌリンをPBSを使用して洗浄し、そしてウェルを、振盪させながら室温で1時間の間アルカリホスフェートと結合させた100μlの抗ZOT抗体とともにインキュベートした。結合していない結合体を、PBSを用いて洗い流し、そして、最初に、1/20000に稀釈した100μlのExtra-AvidinSIGMA,St.Louis,MOを、0.1MのTris-HClpH7.3、1.0mMのMgCl2、1.0w/vのBSAに、15分間かけて添加し、そして次いで、1.0mg/mlのp-ニトロフェニルホスフェート基質SIGMA,StLouis、MOを含有している100μlの溶液とともに37°Cで30分間、それぞれのウェルをインキュベートすることによって、着色反応を起こさせた。吸光度を、405nmでの酵素免疫アッセイリーダー上で読み取った。ELISA-サンドイッチ方法のアッセイ内およびアッセイ間での精度を評価するために、係数偏差CVを、連続3日間、種々の濃度のゾヌリンを用いて2つのサンプルに由来する3個の複製物を使用して計算した。ELISA-サンドイッチ方法のアッセイ内試験によって、9.8のCV値を得た。アッセイ間試験のCVは、1日目は4.2、2日目は3.3、そして3日目は2.9であった。ゾヌリンの濃度を、腸管の洗浄液中で検出したng/mgのタンパク質として表現し、そして暴露された表面積mm2でによって較正した。結果を図3に示す。図3に示すように、管腔内のゾヌリンの4倍の増大を、最初に、糖尿病の傾向にあるラット50日齢において観察した第2番目の棒。この管腔内のゾヌリンの増大は、腸管の透過性における増大と相関していることを見出した。管腔内のゾヌリンの増大は、これらの糖尿病の傾向にあるラットにおいては高いままであり、そして完全に発症したblown糖尿病への進行と相関することを見出した。注:糖尿病の傾向のあるラット>100日齢は、管腔内のゾヌリンの増大はなかった。これは、驚くべきである。なぜなら、このラットは、糖尿病に進行しなかったからである。このラットについての血液グルコースは正常であった。従って、ゾヌリンは、I型糖尿病の病因に関係している透過性の変化の原因である。ゾヌリンの分泌の増大は年齢に関係し、そして糖尿病の発症を進行させる。次に、糖尿病がゾヌリンのペプチドアンタゴニストの投与によって予防され得るかどうかを決定するために、BB/Worラット21~26日齢を、BiomedicalResearchModels,Inc.Rutland,MAから入手し、そして2つのグループすなわち、処置したグループおよびコントロールのグループにランダマイズした1つのグループあたりn=5。両方のグループを、ラットの固形飼料HarlanTeklabDiet7012の標準的な食餌で維持した。全ての食物および水を、あらかじめオートクレーブした。毎日、一日の水の摂取量を測定し、そして100mlの新しい水を与えた。処置したグループには、飲料水中に補充した10μg/mlのゾヌリンのペプチドアンタゴニスト配列番号15を受容させた。ラットを、ヘパフィルターケージの中に収容した。ラットの糖尿病を、以下のように診断した:ラットを、1週間に2回秤量した。血液グルコールを、OneTouch登録商標グルコースモニタリングシステムJohnsonJohnsonを使用して1週間に1回決定した。毎週、尿検査のための試薬の小片を、グルコースDiastix登録商標およびケトンKetositx登録商標Bayerをモニターするために使用した。>250mg/dlの血液グルコースを有するラットを一晩断食させ、そして>200mg/dlの血液グルコースレベルを糖尿病と考えた。これらの指針は、BiomedicalResearchModels,Inc.によって供給されたデータに従う。結果を、図4に示す。図4に示すように、コントロールのラットの804/5、そしてゾヌリンのペプチドアンタゴニストで処置したラットの402/5が、80日齢までに糖尿病を発症した。ゾヌリンの分泌における変化は、糖尿病の発症と平行していた。糖尿病の臨床的な所見の後、ラットを以下のように屠殺した:ラットに、ケタミン麻酔を使用して麻酔し、そして中線切開を行って心臓に接触できるようにした。18Gの針を、心臓の内部に配置し、そして全採血によって死を生じさせた。次いで、ゾヌリンアッセイを、上記に記載するように行った。糖尿病が存在しなかったこれらのラットについては、研究の終わりを80日齢とした。BiomedicalResearchModel,Inc.,に従うと、糖尿病の傾向にあるラットのうちの80が、80日齢までに糖尿病を有して存在した。ゾヌリンアッセイの結果を、図5に示す。図5に示すように、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストで処置しなかった糖尿病のラットが、図3に示す結果と一致して、管腔内ゾヌリンの増大を有することを観察した。さらに、管腔内のゾヌリンは、糖尿病を発症しなかった糖尿病の傾向にあるラットDP-処置およびコントロールのラットDP-未処置の両方と比較して、糖尿病のラットDRにおいて2から4倍増大した。糖尿病を発症しなかった糖尿病ではないコントロールラットは、無視できるレベルのゾヌリンを有し、これは、図3に示すゾヌリンのレベルと一致した。さらに、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストでの処置にもかかわらず糖尿病を発症した2匹の糖尿病の傾向にあるラットは、良好に処置されたラット、および未処置のコントロールのラットよりも有意に高い、管腔内ゾヌリンのレベルを示した。ゾヌリンのこのレベルは、糖尿病の進行に必須の透過性の変化を開始するために十分であるが、ZOT/ゾヌリンレセプターは、ペプチドアンタゴニストによって効率良くブロックされた。また、糖尿病の臨床的な所見の後、屠殺したラットの腸管組織を、エキソビボでの透過性における変化を評価するために、Ussingチャンバー中に固定した。より詳細には、空腸および回腸の切片を屠殺したラットから単離し、そして腸管の内容物をリンスして除いた。それぞれの腸管のセグメントの6個の切片を調製し、そしてLuciteUssingチャンバー0.33cm2の開口部に固定し、電圧クランプ装置EVC4000;WorldPrecisionInstruments、Saratosa、FLに接続し、そして53mMのNaCl、5.0mMのKCl、30.5mMのNa2SO4、30.5mMのマンニトール、1.69mMのNa2PO4、0.3mMのNaHPO4、1.25mMのCaCl2、1.1mMのMgCl2および25mMのNaHCO3pH7.4を含有している新しく調製した緩衝液に浸した。浸す溶液を、一定温度の循環ポンプに接続し、そして95のO2および5のCO2でガス処理した水のカバーをかけたレザーバーを用いて37°Cで維持した。電位差を測定し、そして短い循環電流および組織抵抗を、Fasanoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5242-52461991に記載されているように計算した。結果を、図6~7に示す。エキソビボでのUssingチャンバーの透過性の研究において実証され、そして図6に示すように、糖尿病に進行した全てのラットが、それらの腸管の透過性を増大させた。糖尿病耐性のDRラットは、細胞付近の透過性のにおいて感知できる程度の変更は有さなかった第1の棒。未処置の糖尿病の傾向にあるラットDP-未処置;第2の棒は、空腸および回腸の細胞付近の透過性の有意な増大を有した。より重要なことは、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストで処置した糖尿病の傾向にあるラットDP-処置;第3の棒が、空腸に制限された小腸の細胞付近の透過性において有意な増大を有したことである。しかし、図6に示すように、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストでの予備処置は、遠位の回腸においてこれらの変化を妨害した。結果として、病因に関係する細胞付近の透過性における変更は、回腸に限定される。また、図6に示すように、結腸の透過性においては有意な変化は存在しなかった。これは、ゾヌリンレセプターの分布の局所的な分布と一致する。これらの結果を、さらに、糖尿病を発症したラットDP-Dまたは糖尿病を発症していないラットDP-Nのいずれかである、未処置の糖尿病の傾向にあるラットの小腸中での、エキソビボでの腸管の透過性の比較によって確認した図7。回腸のRtにおいては、DP-DラットとDP-Nラットとの間で有意な変化は観察されなかったが、DP-Nラットと比較して、DP-Dラットの回腸の粘膜の有意に低いRtが観察された図7。従って、以下の結論を作成し得る:1ペプチドアンタゴニストは、糖尿病の発症のために必要とされる透過性の変化を効率良くブロックすることが可能であった;そして2ペプチドアンタゴニストで処置したこれらのラットにおいては、管腔内のゾヌリンのレベルは、糖尿病を発症していない処置したラットよりも3倍高い。糖尿病を発症した処置したラットのこの集団においては、ペプチドアンタゴニストの量は、糖尿病を予防するために必要な十分な数のZOT/ゾヌリンレセプターをブロックするためには十分ではない場合がある。処置したラットの60は、糖尿病を発症しなかった。ラットのこの集団においては、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストは、糖尿病の発症に必要な腸管の透過性の増大を効率良く妨げた。図5に示すように、処置したラットは、未処置のコントロールに匹敵する管腔内ゾヌリンのレベルを有したが、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストの存在に起因して、小腸の全体的な透過性は、糖尿病の進行に必要な生理学的な変化を開始するために十分には変更されなかった。興味深いことに、図5に示すように、糖尿病を発症しなかった1匹のコントロールの動物は、無視できるゾヌリンのレベルを有し、このことはさらに、糖尿病の病因におけるゾヌリンの役割をサポートする。従って、BB/Worラットにおける糖尿病の病因の初期の事象は、ゾヌリンによって媒介される腸管の細胞付近の透過性の変化を含む。さらに、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストの使用を用いたゾヌリンのシグナル伝達システムの阻害は、糖尿病の発症を妨げるか、または少なくとも一部遅延させる。本発明は、詳細に、そしてその特異的な実施態様を参照して記載されているが、種々の変更および改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなくその中で行われ得ることが、当業者に明らかである。"