次の工程を含む、試料中のサイクリン/CDK複合体の、RBタンパク質またはその部分ペプチドに対するリン酸化酵素活性の測定方法。aRBタンパク質基質と試料とを、リン酸化酵素によるリン酸化反応に必要な条件下で接触させる工程bRBタンパク質基質のリン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程以下の工程を含む、サイクリン/CDK複合体の、RBタンパク質に対するリン酸化酵素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法。aサイクリン/CDK複合体、およびRBタンパク質基質とを、被検化合物の存在下、リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程bRBタンパク質基質のリン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程c被検化合物の非存在下における基質のリン酸化のレベルと比較して、基質のリン酸化のレベルの変化を低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程以下の工程を含む、試料中のリン酸化されたRBタンパク質に対する脱リン酸化酵素活性の測定方法であって、前記リン酸化されたRBタンパク質が、サイクリン/CDK複合体によってリン酸化されたものである方法。aリン酸化されたRBタンパク質基質と試料とを、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程bRBタンパク質基質のリン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程以下の工程を含む、リン酸化されたRBタンパク質に対する脱リン酸化酵素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法。a前記リン酸化されたRBタンパク質に対する脱リン酸化酵素、およびリン酸化されたRBタンパク質基質を、被検化合物の存在下、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程bRBタンパク質基質の脱リン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程c被検化合物の被存在下における基質の脱リン酸化のレベルと比較して、基質の脱リン酸化レベルの変化を低下もしくは増加させる化合物を選択する工程サイクリンが、サイクリンA、サイクリンB、サイクリンD1、サイクリンD2、サイクリンD3、およびサイクリンEで構成される群から選択されるいずれかのサイクリンである、請求項1-4のいずれかに記載の測定方法。CDKが、CDK1、CDK2、CDK4、およびCDK6で構成される群から選択されるいずれかのCDKである、請求項1-4のいずれかに記載の測定方法。サイクリン/CDK複合体が、以下の群から選択されるいずれかの組み合わせからなる請求項1-4のいずれかに記載の測定方法。サイクリンA/CDK1、サイクリンA/CDK2、サイクリンB/CDK1、サイクリンD1/CDK4、サイクリンD1/CDK6、サイクリンD2/CDK4、サイクリンD2/CDK6、サイクリンD3/CDK4、サイクリンD3/CDK6、およびサイクリンE/CDK2リン酸化酵素がサイクリンD1/CDK4であり、抗体がRBタンパク質の780位セリンのリン酸化状態を識別しうるものである請求項7に記載の方法。リン酸化状態を識別することができる抗体が、そのリン酸化部位を識別しうるものであり、異なる部位をリン酸化する複数のサイクリン/CDK複合体が共存する試料に含まれるサイクリン/CDK複合体の活性を個別に測定する請求項1に記載の方法。抗体が、リン酸化されていないRBタンパク質基質よりも、リン酸化されたRBタンパク質基質との反応性が高いものである請求項1-4のいずれかに記載の方法。抗体が、リン酸化されたRBタンパク質基質よりも、リン酸化されていないRBタンパク質基質との反応性が高いものである請求項1-4のいずれかに記載の方法。RBタンパク質基質が標識されている、請求項1-4のいずれかに記載の方法。RBタンパク質基質が固相化されている、請求項1-4のいずれかに記載の方法。抗体が標識されている、請求項1-4のいずれかに記載の方法。RBタンパク質基質のリン酸化レベルの評価をELISA法により行う、請求項1-4のいずれかに記載の方法。請求項2に記載のスクリーニング方法により単離することができる化合物を主成分として含む、サイクリン/CDK複合体のタンパク質リン酸化酵素の活性調整剤。請求項4に記載のスクリーニング方法により単離することができる化合物を主成分として含む、サイクリン/CDK複合体のタンパク質リン酸化酵素によってリン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸化酵素の活性調整剤。天然由来である、請求項16または17のいずれかに記載の活性調整剤。RBタンパク質、またはヒト以外の種におけるそのホモログの被リン酸化部位を含むアミノ酸配列からなるペプチドを含む、請求項1-4のいずれかに記載の方法に用いるための抗体作成用免疫原。被リン酸化部位がリン酸化されている請求項19に記載の免疫原。被リン酸化部位が、ヒトRBタンパク質における356位のスレオニン、612位のセリン、780位のセリン、および807位のスレオニンからなる群から選択される少なくとも1つである請求項19または20のいずれかに記載の免疫原。被リン酸化部位が、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、および配列番号:8のいずれかからなるアミノ酸配列から選択される請求項21に記載の免疫原。RBタンパク質基質のリン酸化状態を識別する抗体を含む、請求項1-4に記載のいずれかの方法のためのキット。実施例1抗リン酸化ペプチド抗体の作製1免疫原の作製aペプチドの作製リン酸化サイトとして報告されたヒトRBタンパク質の356位のスレオニン、612位のセリン、780位のセリン、807位のセリンをそれぞれ含む以下の8本のペプチドを、ペプチド合成機を用いて作製した。phosphopRBT356:SFETQRTPRKSNLC配列番号:1pRBT356:SFETQRTPRKSNLC配列番号:2phosphopBRS612:YLSPVRSPKKKGSC配列番号:3pRBS612:YLSPVRSPKKKGSC配列番号:4phosphopRBS780:TRPPTLSPIPHIPC配列番号:5pRBS780:TRPPTLSPIPHIPCphosphopRBS807:GGNIYISPLKSPYKIC配列番号:7pRBS807:GGNIYISPLKSPYKIC配列番号:8上記アミノ酸配列は1文字表記で、アミノ末端からカルボキシル末端方向に記した。S、Tはそれぞれリン酸化セリン残基、リン酸化スレオニン残基を示す。90以上の純度であることをHPLCにより確認した。phosphopRBT356はヒトRBタンパク質の350番目から362番目までの、phosphopBRS612は606番目から618番目までの、phosphopRBS780は774番目から786番目までの、そしてphosphopRBS807は801番目から815番目までのアミノ酸配列に相当する。全てのペプチドのカルボキシル末端のシステイン残基は、ペプチドをキャリアータンパク質に共有結合させるために導入した。bペプチドのキャリアータンパク質への結合免疫原とするために、リン酸化ペプチドphosphopRBT356、S612、S780、およびS807をそれぞれキャリアータンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニンkeyholelimpethemocyaninと共有結合させた。これらのペプチドとKLHの結合にはmマレイミドベンゾイルNヒドロキシスクシニミドエステルmmaleimidobenzoylNhydroxysuccinimideesterを架橋物質として用いた。等量のKLHとペプチドを架橋した。このペプチドKLHを免疫原として使用した。c免疫原の調製と免疫方法キャリアータンパク質KLHとそれに結合したペプチドペプチド-KLH10μgをマウスの1回あたりの免疫原として用いた。15mlチューブで、100μlのフロイント完全アジュバントとペプチド-KLH各100μlを1mlシリンジと21ゲージ注射針を用いて、完全にエマルジョン化するまで混合した。マウスに対し、腹腔に各リン酸化ペプチドとアジュバントのエマルジョンを26ゲージ注射針を使用して注射した。免疫は1週間ごとに1回、合計4回行った。4回目の免疫の際、抗体力価をチェックするため、マウスの眼下静脈蒼より50~100μl採血し、ELISA法により抗体力価を確認した。2phosphopRBT356、phosphopRBS612、phosphopRBS780、およびphosphopRBS807に対するモノクローナル抗体の作成aハイブリドーマの作製十分な抗体力価の確認後、マウスより脾臓を摘出し、ポリエチレングリコールを用いてミエローマ細胞と細胞融合させた。ハイブリドーマの選別はHATセレクションで行った。ハイブリドーマの培養上清を用いたELISA法により、非リン酸化ペプチドよりもリン酸化ペプチドに対して反応性の高いクローンのスクリーニングを行った。b腹水の取得と抗体の精製限界希釈法により得られたハイブリドーマクローンを75cm2フラスコで培養した後、マウスの腹腔に注射した。ハイブリドーマを注射する10日前に1mlの、3日前に05mlのプリスタンをマウスに注射しておいた。1~2週間後にマウスの状態を見ながら腹水を採取した。腹水に終濃度50になるように硫安を添加し、4°Cで1時間以上攪拌した。高速遠心によりその沈澱を回収した。最小限の純水で沈澱を完全に溶解後、透析膜を用いてPBSに対して透析した。完全にPBSに平衡化させた後、proteinAセファロースと複合体を形成させた。最後にproteinAセファロースから抗体を溶出させた。3抗体力価および特異性の検定ペプチドを10μgmlになるようにPBSに溶かし、ELISA用マイクロタイタープレートに1ウェルあたり50μlづつ分注して、4°Cで一晩感作した。感作後、ペプチド溶液を除き、1BSA-01Tween20PBSを1ウェルあたり200μlづつ分注して、室温で1時間以上ブロッキングした。精製した抗体を01Tween20PBSで必要に応じて希釈した。希釈したそれらのサンプルを感作プレート1ウェルあたり100μl添加し、室温に1時間静置した一次反応。一次反応後、洗浄瓶を用いて、各ウェルをPBSで4回以上、十分に洗浄した。01Tween20PBSで3000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG抗体MBL社製330を各ウェルに100μlづつ分注し、室温に1時間静置した。二次反応後同様に、PBSで洗浄した後、750μMTMB溶液を1ウェルあたり100μl添加し、30°Cで5~20分間発色させた発色反応。15NH3PO4を100μlづつ加え発色反応を停止させ、マイクロタイタープレートリーダーを用いて、450nmにおける吸光度を測定した。実施例2組み換えサイクリンD1/CDK4、サイクリンE/CDK2、サイクリンB/CDK1の作製1PCR法によるサイクリン、CDKのcDNA単離a各サイクリン、CDK増幅用プライマーの設定各サイクリン、CDKの全長cDNAを増幅するため、以下に示すプライマーを作製した。各サイクリンおよびCDKのcDNAの塩基配列は次のアクセッションナンバーでGenBankに登録されている。サイクリンD1:X59798サイクリンE:M73812M74093サイクリンB:M25753CDK1:X05360CDK2:X61622X62071CDK4:NM000075フォワードプライマー:5ATAGGATCCATGGAACACCAGCTCCTGTGC3配列番号:95’側3つの塩基ATAは制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5側4番目から9番目は制限酵素BamHIサイト。リバースプライマー:5ATACTCGAGGATGTCCACGCTCCGCACGTC3配列番号:105’側3つの塩基ATAは制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5側4番目から9番目は制限酵素XhoIサイト。フォワードプライマー:5ATAAGATCTATGAAGGAGGACGGCGGCGCG3配列番号:115’側3つの塩基ATAは制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5側4番目から9番目は制限酵素BglIIサイト。リバースプライマー:5ATACTCGAGCGCCATTTCCGGCCCGCTGCT3配列番号:125’側3つの塩基ATAは制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5側4番目から9番目は制限酵素XhoIサイト。フォワードプライマー:5ATAGGATCCATGGCGCTCCGAGTCACCAGG3配列番号:135’側3つの塩基ATAは制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5側4番目から9番目は制限酵素XhoIサイト。リバースプライマー:5ATACTCGAGCACCTTTGCCACAGCCTTGGC3配列番号:145’側3つの塩基ATAは制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5側4番目から9番目は制限酵素XhoIサイト。フォワードプライマー:5ATAGGATCCATGGAAGATTATACCAAAATA3配列番号:155’側3つの塩基ATAは制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5側4番目から9番目は制限酵素BamHIサイト。リバースプライマー:5ATACTCGAGACTCTTCTTAATCTGATTGTC3配列番号:165’側3つの塩基ATAは制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5側4番目から9番目は制限酵素XhoIサイト。フォワードプライマー:5ATAGGATCCATGGAGAACTTCCAAAAGGTG3配列番号:175’側3つの塩基は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5側4番目から9番目は制限酵素BamHIサイト。リバースプライマー:5ATACTCGAGTCAGAGTCGAAGATGGGGTAC3配列番号:185’側3つの塩基ATAは制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5側4番目から9番目は制限酵素XhoIサイト。フォワードプライマー:5CATGGATCCATGGCTACCTCTCGATATGAG3配列番号:195’側3つの塩基は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5’側4番目から9番目は制限酵素BamHIサイト。リバースプライマー:5CATGTCGACCTCCGGATTACCTTCATCCTT35’側3つの塩基は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。5’側4番目から9番目は制限酵素SalIサイト。b鋳型DNAの調製サイクリン、CDKの全長cDNAをPCR法で増幅するための鋳型として、ヒト乳癌由来のZR751細胞のcDNAを用いた。まず、cDNAを作製するため、ZR751細胞よりフェノール-チオシアン酸グアニジン法ニッポンジーン、ISOGENを用いて全RNAを抽出、精製した。抽出した全RNAを基にオリゴdTまたはオリゴランダムプライマーを用いてcDNAを合成した逆転写反応。cPCR反応の条件PCR反応は以下の3段階の条件で行った。1;95°C5分間変性、52°C1分間アニール、72°C2分間伸長を1サイクル2;94°C30秒間変性、62°C30秒間アニール、72°C2分間伸長を35サイクル3;72°C10分間を1サイクルdベクターへのクローニングと組み換えバキュロウイルス液の調製増幅された各PCR産物をそれぞれ対応する制限酵素で消化した。制限酵素消化DNAをアガロースゲルで電気泳動した後、Genecleanで精製した。精製DNAを予めPCR産物の両末端と同じ制限酵素により消化したpFASTBACHTベクターへライゲーションした後、MolecularCloningColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYの方法に従って大腸菌DH5α株を形質転換し、複数のシングルコロニーを取得した。シングルコロニーから採取した、精製したpFASTBACHTベクターを大腸菌へトランスフォーメーションし、Luria寒天プレート上で生育させた。DH10BAC内では、部位特異的トランスポジションによって、pFASTBACHT内の発現カセットがバクミドDNAへ転移する。転移の起きたシングルの白いコロニーから組み換えバクミドDNAを精製した。組み換えバクミドDNAをCELLFECTINを用いてSf9細胞のトランスフェクションを行った。組み換えバキュロウイルスは培養液中に産出されるので、約1週間後に培養液を遠心分離し、その上清をウイルス液とした。以上の操作は基本的にBACTOBACBaculovirusExpressionSystemにより行った。e塩基配列の確認MolecularCloning前記の方法に従い、pFASTBACn6hishcyD、pFASTBACn6hishcyE、pFASTBACn6hishcyB、pFASTBACn6hishCDK1、pFASTBACn6hishCDK2、pFASTBACn6hishCDK4を精製した。それらのインサートDNAの塩基配列の決定をサンガー法に基づき、オートシークエンサーで行った。インサートDNAの配列とデータベース上に公開されている配列を比較し、クローニングされたcDNAがそれぞれ、サイクリンD1、サイクリンB、サイクリンE、CDK1、CDK2、CDK4であることを確認した。f組み換えタンパク質の精製Sf9細胞を75cm2のフラスコにほぼコンフルエントな状態にまで培養し、その培養液に組み換えバキュロウイルス液を加えた。感染後3~4日目に細胞を氷冷PBSに懸濁し、遠心洗浄を行った。細胞をHGNバッファーに懸濁し、氷冷しながら超音波処理を行った。続いて遠心分離を行い、得られた上清を可溶性画分とし精製に用いた。pFASTBACHTベクターの発現カセットではN末端側に6つのHis残基が付加される。抽出液の一部を用いてウエスタンブロットを行った後、抗5xHis抗体によりタンパク質の発現を確認した。可溶性分画をNiキレーティングセファロースカラムに通し、6xHisTagを介して組換えタンパク質をカラムに吸着させた。6xHisTagはNi2と錯体を形成するため、カラムのNi2に組み換えタンパク質が吸着する。カラムをHGNバッファーで洗浄した後、組み換えタンパク質をエリューションバッファーで溶出した。その際のイミダゾールの濃度は、10mM、25mM、50mM、100mM、250mM、500mM、1Mと段階的に変化させて溶出を行った。各イミダゾール画分について、ウエスタンブロットで抗5xHis抗体により検出される組み換えタンパク質が存在する画分を透析液、1mMDTT、1mMEDTA、50グリセロールに対して一晩透析した。透析後のサンプルをMonoQカラムに通した。FPLCを用いて吸着されたタンパク質を、0~1MNaClを含む10mMTrisHCl、1mMDTT、10グリセロールで濃度勾配をかけながら溶出させた。ウエスタンブロットで抗5xHis抗体により検出された組み換えタンパク質が存在する画分について透析液に対して透析を行った。実施例3ELISAによるサイクリンD1/CDK4、サイクリンE/CDK2、サイクリンB/CDK1活性測定系1活性測定用基質の作製サイクリン/CDK複合体の基質として様々な分子が知られているが発癌との関係で最も興味深いRBタンパク質を基質として選択した。ヒトRBタンパク質のアミノ酸配列307aa405aa、540aa645aa、および723aa833aaをコードするcDNA配列を、発現ベクターpGEXに組み込み、大腸菌内でグルタチオン‐s‐トランスフェラーゼGSTとの融合タンパク質として発現させた。発現させたそれぞれの産物を、アミノ酸配列順にGSTpRB1、GSTpRB2、GSTpRB3と名付けた。pGEXベクターでは、組み換えタンパク質は、GSTとの融合タンパク質として作られる。このGST酵素がグルタチオンGSHに対してアフィニティーを持っていることを利用して、組み換えタンパク質の精製を行った。組み換えタンパク質の発現を確認した後、その菌体を1Tween20PBSに懸濁後、超音波処理により菌体を破砕した。高速遠心後、上清を組み換えタンパク質を含む可溶性分画とした。この可溶性分画をGSHセファロース4Bカラムに通し、GSTp53タンパク質をカラムに吸着させた。カラムをWEバッファーで洗浄後、組み換えタンパク質をGバッファーを用いて溶出した。溶出された各発現蛋白は50mMTrisHCl、50グリセリンに対して透析した。2基質感作プレートの作製GSTpRB1、GSTpRB2、GSTpRB3を20μgmlになるようにPBSで希釈し、ELISA用マイクロタイタープレートに1ウェルあたり50μlづつ分注して、4°Cで一晩感作した。感作後、1BSA01Tween20PBSを1ウェルあたり200μlずつ分注し、室温で1時間以上ブロッキングを行った。3リン酸化反応サイクリン/CDK用反応バッファー中に各酵素を1アッセイあたり約100ngとなるように加え固相プレートに分注。30°Cで1時間、インキュベーションした。4抗原抗体反応一次反応:PBSで5回洗浄後、各50倍希釈した抗リン酸化モノクローナル抗体T356、S612、S780、S812をウェルあたり100μlずづ分注し、室温で1時間インキュベーションした。二次反応:PBSで10回洗浄後、40000倍希釈したHRP標識抗マウスIgGをウェルあたり100μlずつ分注し、室温で1時間インキュベーションした。発色:PBSで5回洗浄後、TMBをウェルあたり100μlずつ分注し、室温で30分間発色させた後、15NH3PO4をウェルあたり100μlずつ分注し反応を停止させた。5測定結果表2で示すように、発現させた各サイクリン/CDK複合体の活性を感度よく検出することが可能であった。実施例4CyclinD1CDK阻害剤スクリーニングシステムの構築1抗体感作条件抗リン酸化RBモノクロナル抗体には、クローン1C12、クローン4E4、クローン2C4を用いた。各抗リン酸化RB抗体をPBSで10μgmlに希釈し、マイクロプレート各ウェルに100μlづつ添加し、4°Cで15時間インキュベーションした。抗体溶液を振り払った後、25BSAを含むPBS中で、4°C、24時間ブロッキングした。風乾の後測定に供した。2リン酸化反応基質には、RBアミノ酸配列301aa928aaを大腸菌内でGSTfusion蛋白として発現させ、グルタチオンセファロース、フォスフォセルロースP11を用いて精製したものを用いたRB301。CyclinCDKには、CyclinD1CDK4、CyclinACDK2、CyclinECDK2、CyclinBCDK1各々バキュロバイラスを用いて、sf9内で発現させ、コバルトカラム、フォスフォセルロースP11を用いて精製したものを用いた。リン酸化バッファー50mMHEPES005tritonX15mMMgCl22mMEGTA200μgmlBSAにRB301、100μMATP、CyclinCDKを添加し最終容量180μl、30°Cで30分反応させた後、PBSを各アッセイあたり180μl加えて反応を停止させた。3反応リン酸化反応終了後、反応液を100μlづつ抗体感作プレートに添加し、室温で1時間インキュベーションした一次反応。洗浄ビンで5回洗浄洗浄液/PBSの後、05μgml抗GSTポリクロナル抗体をマイクロプレートの各ウェルに100μlづつ添加し、室温で1時間インキュベーションした二次反応。洗浄ビンで5回洗浄洗浄液/PBSの後、20000倍希釈HRP標識抗ラビットIgG抗体をマイクロプレートの各ウェルに100μlづつ添加し、室温で30分インキュベーションした三次反応。その後、TMBを用いて、室温で30分発色させた発色反応。上記ELISA法と同様に03μciγ32PATPによるリン酸化反応を行った後、10TCA、02ピロリン酸ナトリウムで反応を停止させた。不溶化した基質をグラスフィルターに吸着させ、2TCA002ピロリン酸ナトリウムで洗浄の後、放射線量をカウントした。図1にELISA法によるリン酸化反応測定結果について示す。いずれの酵素、リン酸化サイトの組み合わせにおいても、酵素の量に依存したOD値を上昇を認め、その反応曲線はなめらかなシグモイドカーブを描いた。このことから、本発明で構築したELISA系は、CyclinCDKのリン酸化活性を良好に測定できるものと考えられた。精製した4種類の酵素の間で、各サイトに対するリン酸化活性を比較すると、酵素によってリン酸化サイトに対する選択性のあることが示された。CyclinACDK2CyclinECDK2はThr356Ser612に、CyclinD1CDK4はSer780に選択性がみられた。また、CyclinBCDK1はSer612に選択性がみられた。RI法との間で、感度の比較を行ったところ、RI法と同等以上であることが示された図10。特に、CyclinACDK2CyclinECDK2においてはELISA法はRI法に比較して、10倍程度感度が高いものと考えられた。次に本ELISA系を用いて、阻害剤の阻害効果の判定が可能であるかどうか市販の薬剤を使って検討した。薬剤としては、cdc2cdk2選択的阻害剤であるOlomoucine、Roscovitine、リン酸化酵素全般的な阻害剤であるK252a、MEKに対する阻害剤U0126、Olomoucineisomerの5種類を使用した。図2~図5にK252a、Olomoucine、Roscovitineの阻害効果についてELISA法で検討した結果を示した。いずれの阻害剤を用いた場合においても阻害剤添加濃度依存的にOD値の低下をみた。Olomoucine、RoscovitineのIC50は公示の値ではそれぞれ7μM、700nMであるが、本発明における検討では、この値より10倍近く高くなった。これは、これら阻害剤がATP拮抗剤であるため、アッセイ系に用いるATP濃度によって値が異なるためと考えられる。論文上の報告では、ATPの濃度が15μM、使用している基質がhistoneH1であるのに対し、本発明において検討したELISA系ではATP濃度が100μM、基質がRBであることも原因ではないかと考えられる。またOlomoucine、Roscovitineはcdc2、cdk2選択的阻害剤で、cdk4に対しては阻害効果が著しく弱いことが報告されている。本発明における検討結果はこの報告を反映したものとなったCyclinD1CDK4に対する阻害効果は他の3種類に比べて低い。また、阻害効果の期待できないOlomoucineisomer、U0126においては、検討した濃度の範囲内では、ほとんど、OD値の低下はみられなかった図6~図9。さらに、RI法と同様な阻害効果の判定が可能かどうか、Olomoucine、Roscovitine、Olomoucineisomerを用いて、ELISA法と、RI法の間で阻害効果の判定について比較したところ、図11~13に示すように、ほぼ同様の阻害曲線を得ることができた。以上のことから、本発明で構築したELISAのシステムは、阻害剤のスクリーニング方法として有用であることが裏付けられた。