"コアcoreおよび前記コアを取り囲むシェルshellを含み、前記コアとシェルとの間にナノギャップが形成された、ナノ粒子。前記コアとシェルとがナノブリッジで連結されたことを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。前記コアの直径は1nm~900nmであることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。前記ナノギャップは0.01nm~100nmであることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。前記シェルの厚さは1nm~900nmであることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。前記コアは表面プラズモン共鳴を示す金属からなることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。前記シェルは表面プラズモン共鳴を示す金属からなることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。前記コアの表面に高分子が結合されたことを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。前記高分子はオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項8記載のナノ粒子。前記コアの表面にオリゴヌクレオチドが静電気的引力で付着したことを特徴とする、請求項9記載のナノ粒子。前記コアの表面に前記オリゴヌクレオチドの一方の末端が共有結合で付着し、前記オリゴヌクレオチドの一部は前記シェルに挿入されたことを特徴とする、請求項9記載のナノ粒子。前記オリゴヌクレオチドに光学活性分子が静電気的引力、共有結合で付着していることを特徴とする、請求項9記載のナノ粒子。前記光学活性分子はC、H、O、N、Sおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される原子で構成された分子であることを特徴とする、請求項12記載のナノ粒子。前記ナノ粒子の直径は1nm~990nmであることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。前記シェルの表面に有機分子、無機分子または生体分子からなる物質が共有結合または静電気的引力で結合されたことを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。コアにオリゴヌクレオチドを改質させるステップと、前記オリゴヌクレオチドが改質されたコアにシェルを形成するステップとを含む、コアとシェルとの間にナノギャップが形成されたナノ粒子の製造方法。コアに高分子をコーティングするステップと、前記コーティングされたコアにシェルを形成するステップとを含む、コアとシェルとの間にナノギャップが形成されたナノ粒子の製造方法。コアにC、H、O、N、Sおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される原子で構成された分子を改質させるステップと、前記分子が改質されたコアにシェルを形成するステップとを含む、コアとシェルとの間にナノギャップが形成されたナノ粒子の製造方法。請求項1ないし14のいずれか1項記載のナノ粒子を製造するステップと、前記ナノ粒子のシェルの表面に検出しようとする分析物を認識可能なバイオ分子を機能化するステップと、前記ナノ粒子を1つ以上の分析物を含むサンプルに露出させるステップと、レーザ励起excitationおよびラマン分光法を利用して1つ以上の分析物を検出および確認するステップとを含む、分析物を検出する方法。前記ラマン分光法が表面増強ラマン分光法SERS、表面増強共鳴ラマン分光法SERRSハイパーラマンおよび/または非干渉性反ストークスラマン分光法CARSであることを特徴とする、請求項19記載の方法。請求項1ないし15のいずれか1項記載のナノ粒子を含む、分析物検出用キット。請求項1ないし15のいずれか1項記載のナノ粒子を含む、分子診断チップまたは映像診断用組成物。請求項1ないし15のいずれか1項記載のナノ粒子と、前記ナノ粒子の内部または外部にCT造影剤、MRI造影剤、光学造影剤および超音波造影剤からなる群より選択されるいずれか1つとをさらに含む、ナノ粒子。請求項1ないし15のいずれか1項記載のナノ粒子と、遺伝子、抗体および薬物からなる群より選択されるいずれか1つとをさらに含む、ナノ粒子。単一ナノ粒子の内部にナノギャップが形成され、プラズモンカップリングplasomoniccouplingによる非常に高い電磁信号の増幅効果および高い再現性を有しており、これに基づいた光学信号の分析に有用に使用可能な、コアcoreおよび前記コアを取り囲むシェルshellを含み、前記コアとシェルとの間にナノギャップが形成され、前記コアとシェルとがナノブリッジで連結されるか、またはナノブリッジのないナノ粒子およびその製造方法を提供するためのものである。また、前記ナノ粒子を用いた分析物を検出する方法および前記ナノ粒子を含む分析物検出用キットを提供するためのものである。上記の課題を解決するために、本発明は、コアcoreおよび前記コアを取り囲むシェルshellを含み、前記コアとシェルとの間にナノギャップが形成されたナノ粒子を提供する。前記コアとシェルは、ナノブリッジで連結されるか、または連結されていないナノ粒子であり得る。本発明で使われる用語コアは、表面プラズモン共鳴を示す金属からなり、直径が1nm~900nmの球形または球形と類似する形態の粒子を意味する。表面プラズモン共鳴を示す金属として、金、銀または銅を用いることができる。本発明で使われる用語シェルは、前記コアを取り囲んでいる表面プラズモン共鳴を示す金属からなるコーティング層を意味する。前記シェルの厚さは0.1~900nmであり、好ましくは1nm~100nmである。前記シェルとコアとの間にはナノギャップが形成されているため、コアとシェルとの間には空間が形成されているという特徴がある。表面プラズモン共鳴を示す金属として、金、銀または銅を用いることができる。本発明で使われる用語ナノギャップは、前記コアとシェルとの間に形成されている空間を意味する。ナノギャップの厚さは0.01nm~100nmであることが好ましい。前記ナノギャップ空間によってコアとシェルとが区分され得、前記ナノギャップによってコアとシェルとが完全に接触しなくてもよく、一部領域ではコアとシェルとがナノブリッジによって接触していてもよい。したがって、本発明で使われるナノギャップが、必ずしもコアとシェルとの間を完全に分離する空間を意味するものではない。本発明で使われる用語ナノブリッジは、直径が0.5nm~20nmの、前記コアとシェルとを連結するナノギャップに存在するブリッジを意味する。本発明のナノ粒子は、コアとシェルとの間にナノブリッジされたナノギャップまたはナノブリッジのないナノギャップを含むことができる。したがって、好ましい態様として、本発明は、i金コアおよび銀シェルからなり、金コアと銀シェルとの間にナノギャップが形成されているナノ粒子、ii銀コアおよび金シェルからなり、銀コアと金シェルとの間にナノギャップが形成されているナノ粒子、iii金コアおよび金シェルからなり、金コアと金シェルとの間にナノギャップが形成されているナノ粒子、iv銀コアおよび銀シェルからなり、銀コアと銀シェルとの間にナノギャップが形成されているナノ粒子からなる群より選択されるナノ粒子に関するものである。最も好ましくは、本発明のナノ粒子は、金コアおよび金シェルからなり、金コアと金シェルとの間にナノギャップが形成されているナノ粒子である。また、コアをなす粒子の形状には制限がない。特に、前記コアとシェルとが一部領域で接触している場合には、ナノブリッジを通して接触する。すなわち、コア上にシェルが形成される場合、コアの表面全体からシェルの間にナノギャップが形成されるが、一部領域でシェルを形成する物質の一部が内部にナノブリッジを形成してコアと接触する構造を有することができる。その代表的な構造を図1および図2aの4に示した。図1および図2aの4に示されるように、シェルが形成される過程において一部がコア側に形成され得、これによってナノブリッジが形成され得る。ナノブリッジの個数は、1つ以上からナノギャップを形成可能な限度内で制限されない。直径が0.5nm~20nmであることが好ましい。ナノブリッジは、コアとシェルの構造をより安定的に維持できるようにし、SERSの信号をより増加させる1つの要素となり得る。前記ナノギャップによってコアとシェルとの間に空間が形成されており、このようなナノギャップによってラマン信号の増幅が可能であり、これにより、本発明にかかるナノ粒子を用いて増幅された光学信号の検出が可能である。特に、ナノギャップの再現性が非常に高いだけでなく、ラマン信号surface-enhancedRamanscattering、SERSを得る場合、信号の定量性、結果の再現性、合成の便宜性および簡便性、費用、プローブの安定性などが画期的に改善できる。これをより明確に説明するために、図1を参照して説明する。従来用いられていた多重ナノ構造multimericnanostructures;図1の左側構造は、プラズモンカップリングおよびSERSのための多重ポイントギャップmultiplepointgapを有しているが、非常に狭い表面積と不規則なポイントギャップを有している問題があった。特に、再現性が高く、定量的なSERS信号を放出させるためのギャップを有する特定のナノ構造を合成することが非常に難しいだけでなく、事実上不可能である。反面、本発明にかかるナノブリッジされたナノギャップのナノ粒子は、広い表面積を有する固定的で均一なギャップを提供する図1の右側構造。このような単一の内部ギャップ構造において、コアの表面全体がSERS強化のために使用可能であり、染料の位置も正確に構造の内部に位置させることができる。さらに、実際の使用においても、合成収率が高いだけでなく、簡単な方法で合成することができる。また、一部領域ではナノブリッジが形成され、コアとシェルとが連結されていることから、ナノ粒子全体の構造をより安定的に維持することができる。本発明にかかるナノギャップは、コア上に高分子が結合され、高分子が結合されたコア上にシェルが形成されることによって形成できる。すなわち、コアとシェルとの間に高分子が存在し、コアとシェルとの完全な接触を遮断することができ、これにより、遮断された空間がナノギャップとして形成できる。前記高分子は、オリゴヌクレオチドまたはlayer-by-layer多層組立方法に使用可能な高分子を用いることができ、以下に詳細に説明する。オリゴヌクレオチドを使用する場合、前記ナノ粒子のコアの表面には、オリゴヌクレオチドが静電気的引力または共有結合で付着しているという特徴がある。特に、本発明にかかるナノ粒子のコアの表面にはオリゴヌクレオチドの一方の末端が改質され、前記オリゴヌクレオチドの一部は前記シェルに挿入されたことを特徴とする。本発明で使われる用語オリゴヌクレオチドは、少数のヌクレオチドで構成された重合体で、一般に化学的合成が可能な短いヌクレオチド鎖を意味し、本発明にかかるナノ粒子を合成するのに重要な役割を果たす。具体的には、コアの表面に改質されたオリゴヌクレオチドのポリアデニンpolyAがコアの表面に位置することが好ましいが、この時、コアの周囲にシェルを形成する場合、オリゴヌクレオチドによってシェルが完全にコアと接触せずにナノギャップを形成することができる。反面、オリゴヌクレオチドを改質せず、例えば、シトレートやBSPPbisp-sulfonatophenylphenylphosphanedehydrateが改質される場合には、ナノギャップが形成できない。また、コアの表面に改質されたオリゴヌクレオチドは、ラマン活性分子などの光学信号物質が位置する光学信号物質-改質プラットフォームの役割を果たすことができる。すなわち、ラマン活性分子などの光学信号物質をオリゴヌクレオチドに結合させることにより、コアの表面、ナノギャップ、またはシェルの内部に位置させることができ、その位置および個数も正確に調整することが可能である。前記オリゴヌクレオチドは、3’末端または5’末端がリンカー化合物で改質され、リンカー化合物を通してコア粒子の表面に付着することができる。本発明で使われる用語リンカー化合物は、オリゴヌクレオチドをコア粒子の表面に付着させるために、各オリゴヌクレオチドの3’または5’末端に連結させた化合物を意味する。リンカー化合物を通してナノ粒子を架橋-結合させる方法は、当該分野で公知となっているFeldheim、TheElectrochemicalSocietyInterface、Fall、2001、pp.22-25。リンカー化合物の一末端はコアの表面に付着する反応基を保有するが、好ましくは、硫黄含有基、例えば、チオール基またはスルフヒドリル基sulfhydryl、HSである。前記反応基は、アルコールおよびフェノールの誘導体であって、酸素サイトに硫黄が含まれたRSHの式を有する化合物であり得る。あるいは、前記反応基はそれぞれ、RSSR’またはRSR’の式を有するチオールエステルthiolesterまたはジチオールエステルdithiolesterであり得る。あるいは、前記反応基は、アミノ基-NH2であり得る。本発明では、前記オリゴヌクレオチドの例として、3’-HS-CH23-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5’を用いたが、これに限定されるものではない。また、layer-by-layer多層組立方法に使用可能な高分子を用いる場合、前記ナノ粒子のコアの表面が高分子でコーティングされ、コーティングされたコア上にシェルが形成されてナノギャップを形成することができ、この場合、ナノブリッジは形成されない。高分子のコーティング方法は、共有結合または静電気的引力で可能であり、静電気的引力を応用する場合、layer-by-layer多層組立方法が可能である。前記Layer-by-layer多層組立方法は、正電荷および負電荷を帯びる高分子電解質をそれぞれ交互に積層して多層を製造する方法を意味する。したがって、1つの層だけでコーティングしてナノギャップの厚さを最小化するか、または多層の数を調整してナノギャップの厚さを調整することができる。前記高分子は、Layer-by-layer多層組立方法に用いられる物質であれば制限されず、一例として、正電荷性高分子のpoly-allylamineおよびpoly-L-lysineなどと、負電荷を有するpoly-styrene-sulfonateなどを使用することができる。さらに、本発明にかかるナノ粒子は、ナノギャップの内部に信号物質を含むことができるという特徴がある。特に、ラマン信号を測定するための信号物質の光学活性分子は、C、H、O、N、Sおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される原子で構成された分子であれば制限されず、また、金属イオン、金属イオンのキレート、または金属ナノ粒子を使用することもできる。具体的には、本発明で使われる信号物質は、蛍光有機分子、非蛍光有機分子、無機ナノ粒子、ラマン活性分子を包括する広義の概念で、発色が可能な標識物質を制限なく含むことができ、好ましくは、ラマン活性分子である。本発明で使われる用語ラマン活性分子は、本発明のナノ粒子が1つ以上の分析物に付着した時、ラマン検出装置による分析物の検出および測定を容易にする物質を意味する。ラマン分光法に利用可能なラマン活性分子は、有機原子、分子、または無機原子、分子などを含む。具体的には、ラマン活性分子の例として、FAM、Dabcyl、TRITCテトラメチルローダミン-5-イソチオシアネート、MGITCマラカイトグリーンイソチオシアネート、XRITCX-ローダミン-5-イソチオシアネート、DTDC3,3-ジエチルチアジカルボシアニンアイオダイド、TRITテトラメチルローダミンイソチオール、NBD7-ニトロベンズ-2-1,3-ジアゾール、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、パラ-アミノ安息香酸、エリトロシン、ビオチン、ジゴキシゲニンdigoxigenin、5-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシ、フルオレセイン、5-カルボキシ-2’,4’,5’,7’-テトラクロロフルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン、5-カルボキシローダミン、6-カルボキシローダミン、6-カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニンCy3、Cy3.5、Cy5、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、アミノアクリジン、量子ドット、炭素同素体、シアニド、チオール、クローリン、ブロム、メチル、リンまたは硫黄などがあるが、これに制限されず、使用されたラマン活性分子が顕著なラマンスペクトルを示さなければならず、特に、互いに異なる類型の分析物と結合したり関連付けられなければならない。好ましくは、ラマン分析時に用いる励起レーザ波長と共鳴してより高いラマン信号強度を示す分子である。前記信号物質は、ナノギャップに含まれ得るが、オリゴヌクレオチドに共有結合または静電気的引力で改質されて内部ナノギャップに位置するか、またはオリゴヌクレオチドとは別個でコア粒子の表面にラマン活性分子を共有結合、または静電気的引力で結合させることができる。オリゴヌクレオチドにラマン活性分子を改質させる場合、ラマン活性分子の位置を調整できるという特徴がある。すなわち、コアに改質されるオリゴヌクレオチドの末端に近い位置にラマン活性分子を改質する場合、ナノ粒子においてラマン活性分子はコアに近づいて位置することができ、これを調整してラマン活性分子をナノギャップに位置させることが可能である。例えば、ラマン活性分子の位置に応じてラマン信号が異なり得、内部ギャップに位置する場合、ラマン信号が最も強く検出され得、高い均一性と再現性のある信号を発生させることができる。オリゴヌクレオチドとは別個でラマン活性分子をコアの表面に結合させる場合、ラマン活性分子の付着量を極大化できるという特徴がある。本発明にかかるナノ粒子全体の直径は1nm~990nmであることが好ましく、20nm~500nmであることがより好ましい。また、本発明にかかるナノ粒子のシェル上に再度ナノ粒子およびシェルを形成することができ、これにより、ナノ粒子の内部にナノギャップが複数の層として存在するナノ粒子の形成が可能であり、その形成方法は、前記ナノギャップおよびシェルの形成方法を繰り返すことによって可能である。さらに、本発明にかかるナノ粒子のシェルの表面は、多様な物質を結合させ、ナノ粒子の特性を向上させることができる。例えば、生体内でナノ粒子を使用する場合、生体適合性高分子を表面に改質することができる。また、本発明にかかるナノ粒子のシェルの表面にバイオ分子を機能化することができる。本発明にかかるナノ粒子の表面がバイオ分子として機能化する場合、ナノ粒子が測定対象にのみ結合することができ、ナノ粒子を用いた分析能力をより向上させることができる。前記ナノ粒子に機能化するバイオ分子の例として、抗体、抗体断片、遺伝子組換え抗体、単一鎖抗体、受容体タンパク質、結合タンパク質、酵素、抑制剤タンパク質、レクチン、細胞癒着タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸またはアプタマーが挙げられる。また、本発明は、コアにオリゴヌクレオチドを改質させるステップと、前記オリゴヌクレオチドが改質されたコアにシェルを形成するステップとを含む、本発明にかかるコアとシェルとの間にナノギャップが形成されたナノ粒子の製造方法を提供する。前記第1ステップは、コアにオリゴヌクレオチドを改質させるステップであって、公知の文献に従って当業界で知られた方法で実施可能であり、本発明の実施例では、S.J.Hurst、A.K.R.Lytton-Jean、C.A.Mirkin、Anal.Chem.78、83132006の文献を参照した。前記第2ステップは、シェルを形成するステップであって、金属前駆体例えば、goldprecursor;HAuCl4、還元剤NH2OH-HClおよびポリ-N-ビニル-2-ピロリドンpoly-N-vinyl-2-pyrrolidone;PVPとホスフェートバッファー溶液phosphate-bufferedsolutionを用いて反応させることができる。前記ナノ粒子の製造方法によってコア-ナノギャップ-シェルのナノ粒子を高い収率で製造することができ約95以上、特に、ナノギャップの再現性に非常に優れるという特徴がある。また、前記第1ステップで信号物質が結合されたオリゴヌクレオチドを使用する場合、信号物質が含まれたナノ粒子を製造することができ、これにより、ナノ粒子内の信号物質の位置および信号物質の個数などを容易に調整することができる。さらに、本発明は、コアに高分子をコーティングするステップと、前記コーティングされたコアにシェルを形成するステップとを含む、本発明にかかるコアとシェルとの間にナノギャップが形成されたナノ粒子の製造方法を提供する。前記高分子のコーティングは、layer-by-layer多層組立方法で可能であり、前記高分子は、Layer-by-layer多層組立方法に用いられる物質であれば制限されず、一例として、正電荷性高分子のpoly-allylamineおよびpoly-L-lysineなどと、負電荷を有するpoly-styrene-sulfonateなどを使用することができる。また、本発明は、本発明にかかるナノ粒子を製造するステップと、前記ナノ粒子のシェルの表面に検出しようとする分析物を認識可能なバイオ分子を機能化するステップと、前記ナノ粒子を1つ以上の分析物を含むサンプルに露出させるステップと、レーザ励起excitationおよびラマン分光法を利用して1つ以上の分析物を検出および確認するステップとを含む、分析物を検出する方法を提供する。前記分析物の例として、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、グリコプロテイン、リポプロテイン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝産物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝産物、補助因子、抑制剤、薬物、薬学物、栄養物、プリオン、毒素、毒物、爆発物、殺虫剤、化学無機剤、生体有害性製剤、放射性同位元素、ビタミン、ヘテロ環芳香族化合物、発癌物質、突然変異誘発要因、麻酔剤、アンフェタミン、バルビツレート、幻覚剤、廃棄物または汚染物であり得る。また、分析物が核酸の場合、前記核酸は、遺伝子、ウイルスRNAおよびDNA、バクテリアDNA、カビDNA、哺乳動物DNA、cDNA、mRNA、RNAおよびDNA断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、改質されたオリゴヌクレオチド、単一鎖および二重鎖核酸、自然的および合成核酸が挙げられる。さらに、前記ナノ粒子に機能化するバイオ分子の例として、抗体、抗体断片、遺伝子組換え抗体、単一鎖抗体、受容体タンパク質、結合タンパク質、酵素、抑制剤タンパク質、レクチン、細胞癒着タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸またはアプタマーが挙げられる。機能化は、ナノ粒子の表面にバイオ分子を静電気的引力で付着させるか、直接結合させるか、またはリンカーを通して官能基化することができ、このような機能化方法は特に制限されない。好ましくは、本発明の分析物は、任意の公知のラマン分光法によって検出または確認可能であり、好ましくは、表面増強ラマン分光法SERS、SurfaceEnhancedRamanScattering、表面増強共鳴ラマン分光法SERRS、SurfaceenhancedresonanceRamanspectroscopy、ハイパーラマンおよび/または非干渉性反ストークスラマン分光法CARS、coherentanti-StokesRamanspectroscopyを用いることができる。本発明において、用語表面増強ラマン散乱法SERSとは、粗処理された特定金属表面に吸着していたり、数百ナノメートル以内の距離に位置している時に発生するラマン散乱の一種で、この時、ラマン散乱の強度は、一般的なラマンの強度に比べて106~108倍以上増加する現象を利用した分光法をいう。用語表面増強共鳴ラマン分光法SERRSとは、SERS活性表面での吸着物に対するレーザ励起波長の共鳴現象を利用した分光法をいう。用語非干渉性反ストークスラマン分光法CARSとは、ラマン活性媒質に固定可変の2つのレーザ光を入射させ、これらの結合によって得られる反ストークス放射のスペクトルを測定する分光法をいう。このような実施態様において、ラマン活性基板は、1つ以上のラマン検出単位装置と作動可能に結合できる。ラマン分光法による分析物の検出のための様々な方法は当該分野で公知となっている例えば、米国特許第6,002,471号、第6,040,191号、第6,149,868号、第6,174,677号、第6,313,914号。SERSおよびSERRSにおいて、ラマン検出の感度は、粗い金属表面、例えば、銀、金、白金、銅またはアルミニウム表面上に吸収された分子に対して106以上に増強される。ラマン検出装置の非制限的な例は、米国特許第6,002,471号に開示されている。励起ビームは、532nmの波長における周波数重畳したNd:YAGレーザ、または365nmの波長における周波数重畳したTi:サファイアレーザによって生成される。パルスレーザビームまたは連続レーザビームが使用可能である。励起ビームは、共焦点の光学器および顕微鏡レンズを通過して1つ以上の分析物を含有するラマン活性基板上に焦点が集められる。分析物からのラマン放出光は、顕微鏡レンズおよび共焦点光学器によって集められ、スペクトル分離のために単色光装置と結合される。共焦点光学器としては、背景信号を減少させるためのダイクロイックフィルタdichroicfilter、遮断フィルタ、共焦点ピンホール、対物レンズおよび鏡の組み合わせを含む。共焦点光学器だけでなく、標準フルフィールドfullfield光学器も使用可能である。ラマン放出信号は、信号をカウンティングしてデジタル化するコンピュータとインタフェースで接続されたアバランシェフォトダイオードを含むラマン検出器によって検出される。検出装置の他の例は、米国特許第5,306,403号に開示されており、これは、単光子カウンティング方式で作動するガリウム-砒素光電子増倍管RCAModelC31034またはBurleIndustriesModelC3103402が備えられたスペックスモデルSpexModel1403の二重格子分光計が挙げられる。励起化供給源は、SpectraPhysics、モデル166からの514.5nm線のアルゴン-イオンレーザ、およびクリプトンkrypton-イオンレーザInnova70、非干渉性の647.1nm線を含む。他の励起化供給源としては、337nmでの窒素レーザLaserScienceInc.および325nmでのヘリウム-カドミウムレーザLiconox米国特許第6,174,677号、発光ダイオード、Nd:YLFレーザ、および/または多様なイオンレーザおよび/または染料レーザを含む。励起ビームは、バンドパスフィルタCorionによってスペクトルで精製され、6X対物レンズNewport、ModelL6Xを用いるラマン活性基板上に焦点化できる。対物レンズは、ホログラフィックビームスプリッタKaiserOpticalSystems、Inc.、ModelHB647-26N18を用いて分析物を励起させ、ラマン信号を収集し、励起ビームおよび放出されたラマン信号に対する直角形態を作るのにすべて使用可能である。ホログラフィックノッチフィルタKaiserOpticalSystems、Inc.は、レイリーRayleigh散乱放射線を減少させるのに使用可能である。他のラマン検出器としては、赤色増強された高感度の電荷結合素子RE-ICCD検出システムPrincetonInstrumentsが装着されたISAHR-320分光器を含む。フーリエ変換分光器マイケルソン干渉計に基づく、荷電された注入装置、光ダイオードアレイ、InCaAs検出器、電子増倍CCD、高感度CCDおよび/または光トランジスタアレイなど、他の類型の検出器が使用可能である。当該分野で公知の任意の適切な形態または構成のラマン分光法または関連手法が分析物の検出に使用可能であり、これは、ノーマルラマンスキャッタリング、共鳴ラマンスキャッタリング、表面増強ラマンスキャッタリング、表面増強共鳴ラマンスキャッタリング、非干渉性反ストークスラマン分光法CARS、刺激ラマンスキャッタリング、逆ラマン分光法、刺激ゲインラマン分光法、ハイパーラマンスキャッタリング、分子光学レーザ試験器molecularopticallaserexaminer、MOLEまたはラマンマイクロプローブまたはラマン顕微鏡法または共焦点ラマンマイクロ分光器、3次元またはスキャニングラマン、ラマン飽和分光法、時間分解共鳴ラマン、ラマン解離分光法またはUV-ラマン顕微鏡法を含むが、これに限定されない。本発明の特定の実施態様において、ラマン検出装置は、コンピュータと作動可能に結合できる。検出装置からのデータはプロセッサによって処理され、データは主記憶装置に格納できる。標準分析物に対する放出プロファイル上のデータはさらに、主記憶装置またはROMに格納できる。プロセッサは、ラマン活性基板での分析物からの放出スペクトルを比較し、サンプルの分析物の類型を確認することができる。プロセッサは、検出装置からのデータを分析し、様々な分析物の正体および/または濃度を測定することができる。互いに異なって備えられたコンピュータは、特定の履行に使用可能である。したがって、システムの構造は、本発明の他の実施態様で異なり得る。データ収集作業以降、典型的に、データはデータ分析作業に送られる。分析作業を容易にするために、検出装置によって得られたデータは、前記のようにデジタルコンピュータを用いて典型的に分析する。典型的に、コンピュータは、検出装置からのデータの受け入れおよび格納だけでなく、収集されたデータの分析および報告のために適切にプログラミングされる。また、本発明は、本発明にかかるナノ粒子を含む分析物検出用キットを提供する。このような検出キットには、当該分野で一般に用いられる道具、試薬などが含まれる。このような道具/試薬としては、好適な担体、検出可能な信号を生成できる標識物質、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが含まれるが、これに制限されない。標識物質が酵素の場合には、酵素の活性を測定可能な基質および反応停止剤を含むことができる。好適な担体としては、これに限定されないが、可溶性担体、例えば、当該分野で公知の生理学的に許容される緩衝液、例えば、PBS、不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、ラテックスに金属をめっきした磁性微粒子のような高分子、その他、紙、ガラス、金属、アガロースおよびこれらの組み合わせであり得る。本発明にかかるナノ粒子は、従来検出のために用いられていた分子診断チップ分野、または従来映像診断に用いられていたナノ粒子を代替することができる。そこで、本発明にかかるナノ粒子は、DNAチップ、タンパク質チップなどの分子診断チップ分野において応用が可能であり、検出しようとする分析物は、遺伝子、ウイルスRNAおよびDNA、バクテリアDNA、カビDNA、哺乳動物DNA、cDNA、mRNA、RNA、DNA断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、改質されたオリゴヌクレオチド、単一および二重鎖核酸、自然的および合成核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、グリコプロテイン、リポプロテイン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝産物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝産物、補助因子、抑制剤、薬物、薬学物、栄養物、プリオン、毒素、毒物、爆発物、殺虫剤、化学無機剤、生体有害性製剤、放射性同位元素、ビタミン、ヘテロ環芳香族化合物、発癌物質、突然変異誘発要因、麻酔剤、アンフェタミン、バルビツレート、幻覚剤、廃棄物、汚染物などに適用可能である。また、DNA、特定疾病の発病および進行に関係のあるタンパク質バイオマーカーなどの分析物の検出に高度に適用可能であり、大規模ゲノム配列分析、単一塩基多形成SNPの検出、配列比較、遺伝子型別分析、疾病相関および薬剤開発などの分子診断方法および分子映像分野において応用が可能である。さらに、本発明にかかるナノ粒子の表面には、他の信号を示す物質をナノ粒子の内部または外部に含むことができ、例えば、CT造影剤、MRI造影剤、光学造影剤、超音波造影剤またはこれらの組み合わせを追加的に含むことができる。これにより、ナノ粒子によるラマン分析とともに、CT、MRI、光学または超音波分析を同時に行うことができるという特徴がある。なお、本発明にかかるナノ粒子は、遺伝子、抗体または薬物などを含むことができ、これにより、ナノ粒子を薬物の伝達体carrierとして疾病の治療に使用することができる。本発明にかかるナノギャップ粒子のナノ構造は、信号物質に対する広い表面積を有し、再現性が高く、厚さが均一なナノギャップを提供する。これにより、コアの表面全体がSERS強化のために使用可能であり、信号物質の位置も正確にナノギャップの内部に位置させることができる。さらに、実際の使用においても、合成収率が高いだけでなく、簡単な方法で合成することができる。したがって、非常に高い信号の増幅効果を示すだけでなく、高い再現性によって商用化の極めて重要な前提条件である信号の再現性と定量性の問題を克服することができる。以下、本発明の理解のために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであって、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。使用物質金ナノ粒子はTedPella社Redding、CA、USAから購入した。すべての他の化学物質HAuCl43H2O、PolyvinylpyrrolidoneKvalue:29-32、NH2OHHCl、Dithiothreitol、BSPPはSigma-Aldrich社St.Louis、MO、USAから購入し、追加の精製なしに使用した。HPLCで精製された染料がコーティングされたチオール化オリゴヌクレオチドはIDT社Coralville、IA、USAから購入し、ホスフェートバッファー0.17M、pH=8.0でdithiothreitolDTT、0.1Mを用いて還元した。還元したオリゴヌクレオチドは、desaltingNAP-5columnSephadexG-25medium、DNAgradeで精製した。超純水ウォーターnanopureH2O;>18.0MOは、Milli-Qwaterpurificationシステムで精製し、すべての実験に使用した。TEM分析では、EDSユニットLinkoxfordISIS310を備えたformvar/carbonがコーティングされたcoppergridTedPella社;Redding、CA、USAおよびHR-TEMJEOL、Japan、300kVを使用した。NNPおよびシリカで取り囲むナノ粒子に対する光学計算方法ElectromagneticwaveとブリッジされたAuコア-ギャップ-シェルの関連性を理解するために、所与の境界条件でtime-harmonicMaxwellequationを計算できる商業的に利用可能なFEMsoftwareCOMSOLを用いて3Dfiniteelementmodelを研究した。線形x偏光された偏波λ=632nmを、ブリッジされたAuコア-ギャップ-シェル粒子に入射させた。JohnsonおよびChristyの金の実験誘電定数empiricaldielectricconstantsを補間法interpolationとともに用いた1P.B.Johnson、R.W.Christy、Phys.Rev.B.6、4370-43791972;2P.G.Etchegoin、E.C.LeRu、M.Meyer、J.Chem.Phys.125、1647052006。金の相対的透磁率relativepermeabilityはμr=1とし、複素屈折率complexrefractiveindexはで計算した。水、空気、およびシリカの誘電定数は、それぞれewater=1.332、eair=1、eSiO2=1.462である。ギャップ部分内の空気とDNAとの混合物の有効誘電率effectivedielectricconstantは下記のMaxwell-Garnett式で決定した:式中、eeffは水または空気とDNAとの混合物の有効誘電率であり、e0は水または空気の誘電率であり、eDNAはDNAの誘電率でありG.Rong、A.Najmaie、J.E.Sipe、S.M.Weiss、BiosensorsandBioelectronics23、1572-15762008eDNA~1.5、fはギャップ部分内のDNAの体積分率volumefractionを示す。300ヌクレオチドがギャップ部分内に存在すると仮定し、これにより、ギャップ部分内のDNAの体積分率は約0.0048である。ナノ-ラマン実験装置のセットアップラマンスペクトルは、反転した光学顕微鏡invertedopticalmicroscopeを備えたナノ-ラマン分光器nano-Ramanspectroscope;Axiovert200、Zeissおよび独立に調整される圧電器x、yサンプルスキャナpiezoelectricx、ysamplescanner、PhysikInstrumenteで測定した。514.5nmラインのアルゴンイオンレーザargonionlaser;MellesGriot、USA、632.8nmラインのヘリウム-ネオンレーザHe-Nelaser;JDSU、USA、および785nmラインのダイオードレーザdiodelaser;BWTEKINC.を単一モードの光ファイバsingle-modeopticalfiberと結合された励起ソースexcitationsourceとして用いた。ダイクロイックミラーdichroicmirror;ChromaTechnologyCorp.で50nWから1mWの励起レーザビームを油浸顕微鏡対物レンズoil-immersionmicroscopeobjective×100、1.3numericalaperture;×50、0.5numericalaperture;Zeissに反射させ、カバーガラススリップの上部面の回折限界スポットdiffraction-limitedspot<300nm、632.8nmのレーザ使用時×100、×50対物レンズのそれぞれに対して<3μmに集中させた。NanoscopeIVcontrollerを備えたAFMBioscope、DigitalInstruments、VeecoMetrologyGroupをマイクロメカニカルステージ上に装着させた。背景ラマン信号は、液化窒素で冷凍された-125°CCCDcharge-coupleddeviceに収集した。閉鎖型Closed-looppiezoelectricflexuresamplestage上のタッピングモードtapping-modeの閉鎖型closed-loopAFMスキャナをラマンまたはレイリースキャッタリング信号と<50nmのオーバーラップ正確度overlapprecisionを有するAFM表面形状イメージtopographicalimageおよびサンプルイメージに関連付けるために使用した。レーザの焦点をAFMtipと一致させ、AFMtipに対して対称的に分散できるようにした。スキャッタリングスペクトルscatteringspectraは、500~2000cm-1の範囲で単一および10秒で測定した。すべてのデータは、Siからの背景信号を除去して訂正baseline-correctionした。ラマン分析に用いられたすべての溶液は、384wellopticalbottomplateNuncTM、NewYork、USAを用いた。AFM-correlatednanoRamananalysisでは、Ploy-L-lysineがコーティングされたカバーガラスpiranha-etchedを用いた。実施例1:Core-gap-shellナノ粒子の製造非常に正確な位置調整能力を有するラマン染料改質プラットフォームRaman-dyemodificationplatformとしてDNAストランドstrandを用いて、内部ナノギャップを有する単一のNNPナノ粒子を下記の方法で製造した。また、下記の方法を図式的に図2aに示した。典型的な製造方法として、DNAが改質された金ナノ粒子20nm粒子;DNA配列:3’-HS-CH23-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5’を、S.J.Hurst、A.K.R.Lytton-Jean、C.A.Mirkin、Anal.Chem.78、83132006の文献に従って製造した。前記DNAが改質された金ナノ粒子のコアを取り囲むシェルAuを形成するために、前記DNAが改質された金ナノ粒子を金前駆体goldprecursor;HAuCl4、還元剤NH2OH-HClおよび1のポリ-N-ビニル-2-ピロリドンpoly-N-vinyl-2-pyrrolidone;PVP;MW40,000とホスフェートバッファー溶液phosphate-bufferedsolution;0.3MNaCl;10mMPB;pH7.4で反応させ、常温で30分間gentlevortexingした。シェルの形成過程に応じたナノ粒子の形態変化を確認するために、シードseeds;DNAが改質された金ナノ粒子、1nMの量を基準として、金前駆体goldprecursor;HAuCl4、還元剤NH2OH-HClの量を調整した。具体的には、DNAが改質された金ナノ粒子溶液100μL;0.3MPBSで1nM濃度は、50μLの1PVP溶液と混合した。前記溶液をそれぞれ1.5μL、5.2μL、10.3μLまたは30.4μLのヒドロキシアミンヒドロクロリド溶液hydroxylaminehydrochloridesolution;10mMと混合させた後、それぞれ1.5μL、5.2μL、10.3μLまたは30.4μLのクロロ金酸溶液chloroauricacidsolution;5mMと混合させた。反応物の量に応じて、多様なナノ構造が形成された図2bおよび図2c;中間体1、2および3および生成物4、5。また、各溶液に対して製造されるナノ構造のパターンは図3のように観察された。前記製造過程において、粒子溶液の色が桃色DNAが改質された金ナノ粒子から淡桃色中間体1;突起構造buddingstructures、青色中間体2、紫色中間体3;中間シェル構造に変化し、最終的に、図2bに示されるように、レッド-ワイン色NNP構造に変化した。これは、それぞれ図2bおよび図2cに示されたUV-VisスペクトルおよびHR-TEMイメージと一致するものである。面白いことに、より多くの反応物が添加されるほど、より小さい突起buddingsphereが現れ始め、DNAが改質された金表面の横に形成された。漸進的にシェルのような構造が形成され、この過程でナノギャップが観察された図2b、図2c、図3。UV-Visスペクトルは、溶液の色変化およびHR-TEMイメージと密接な関連性があることを示した図2b。中間体1のUV-Visスペクトル図2bの1は、約680nmのプラズモン共鳴ピークplasmonicresonancepeakが合成された突出構造buddingstructures;図2cの1の長い軸に沿ったtransversemodeに起因することを示し、このようなピークは、シェルが形成されるにつれて漸進的に消えた図2bの4。最終生成物Au-NNPs金コア-ナノブリッジされたナノギャップ-金シェル形態のナノ粒子;約20nmのコア、約1.2nmのギャップ、および約11nmのシェルにおいて、プラズモン共鳴ピークは、完璧なナノシェル構造に起因するより広いピーク形態図2bの4とともに、標本粒子templateparticles;DNAが改質された金ナノ粒子DNA-Au-NNPsに対して約520nmに近接したが、UV吸光度は、DNA-Au-NNPs図2bの4のUV-スペクトルは2倍に希釈された溶液から得られたより4倍以上強化された。計算された生成物の吸光係数extinctioncoefficientは約7.2×109M-1cm-1であった。重要なことに、中間体2、3、および最終生成物4、5のHRTEMイメージは、シェルが部分的にコアの表面に接触してナノブリッジを形成しており、ナノブリッジされたナノギャップがコアの表面に沿って形成されていることを示す平均ギャップの大きさは約1.2nm;図2cの4、5、6。最終生成物Au-NNPsは高い収率約95で合成され、すべての粒子は、図2cの4および5に示されたTEMイメージのように均一な内部ナノブリッジされたナノギャップを有していた。TEMイメージで測定された平均直径は42±5nm図4であった。図2cの6に示されたAu-NNPの元素マッピングelementlinemappingは、減少する金原子の領域約1.2nmを示すが、これは、図2cの5で観察されたナノギャップと一致するものである。製造されたNNPは、溶液内で待機条件常温および0.3MPBSで6ヶ月以上実質的に安定した。比較例1:オリゴヌクレオチド以外の物質で表面改質したナノ粒子の製造表面改質されたオリゴヌクレオチドの役割を理解するために、下記のように比較例を製造した。シトレート安定化された20nmの金ナノ粒子をシードseedsとして用い、10mMのホスフェートバッファーまたは脱イオン化された水を使用することを除き、実施例1と同様の方法でナノ粒子を製造した。この場合、枝分かれした形態branchedまたはナノシェルが金コア上に形成されたが、内部ナノギャップは形成されなかった図5。また、BSPPbisp-sulfonatophenylphenylphosphanedehydrateが金ナノ粒子の表面に改質され、このようなBSPPが改質された金ナノ粒子をシードとして用いることを除き、実施例1と同様の方法でナノ粒子を製造した。この場合にも、シェルの成長はやや不規則であり、高い多分散型のナノ構造polydispersenanostructuresとなり、内部ナノギャップが形成されなかった図6。前記両者の場合とも、表面電荷シトレート-金ナノ粒子およびBSPP-金ナノ粒子のゼータポテンシャルはそれぞれ-35±3mVおよび-45±3mVであるは、DNA-AuNPs-25±1mVとさほど変わらなかったが、シェルの成長パターンは完全に相違している。また、mPEG分子量5,000チオール改質された金ナノ粒子をシードとして用いることを除き、実施例1と同様の方法でナノ粒子を製造した。この場合にも、内部ナノギャップが形成されていない、やや潰れた五角形構造または球形態のナノ粒子が製造された図7。前記結果により、DNAが本発明にかかるコア-ナノギャップ-シェル構造のナノ粒子を合成する上で極めて重要であることを確認することができた。比較例2:A10spacerの代わりにT10spacerを用いたナノ粒子の製造A10spacerの代わりにT10spacerを用いることを除き、実施例1と同様の方法でナノ粒子を製造した。この場合、単一核化single-nucleatedナノ構造中間体1は、少量の前駆体の存在下でほとんど観察されなかった図8。より多量の前駆体を用いる場合、多重核化multiplenucleationsitesが金コアの表面に形成され、最終ナノ構造において内部ナノギャップは形成されなかった。金の表面に対するチミンよりアデニンの高い親和力に起因して、チミンがspacerとして用いられる場合、アデニンがspacerとして用いられる場合よりも約40高いDNAloading能力を示すと判断される1S.J.Hurst、A.K.R.Lytton-Jean、C.A.Mirkin、Anal.Chem.78、83132006;2Z.Wang、J.Zhang、J.M.Ekman、P.J.A.Kenis、Y.Lu、NanoLett.DOI:10.1021/nl100675p2010。前記結果は、NNPナノ構造の合成において適切なDNA配列の必要性を示し、内部ナノブリッジおよびナノギャップの形成は、チオール化DNAが改質された金コアの表面、ヌクレオチド塩基のAuCl4-イオンキャプチャー効果グアニンのアミン基1A.Schimanski、E.Freisinger、A.Erxleben、B.Lippert、InorganicaChimicaActa283、2231998;2K.R.Brown、M.J.Natan、Langmuir14、7261998;3Z.Ma、S.Sui、Angew.Chem.Int.Ed.41、21762002、PVPなどに起因すると判断される。実施例2:金ナノ粒子、ブリッジのないナノギャップ粒子およびシリカで取り囲むコア-シェル粒子のFEM計算Au-NNPとEM波長electromagneticwaveの関連性を理解するために、FEM3Dfinite-element-methodを計算に適用しWustholz、K.L.etal.Structure-activityrelationshipsingoldnanoparticledimersandtrimersforsurface-enhancedRamanspectroscopy.J.AM.Chem.Soc.132、10903-109102010、前記結果を、silicaが取り囲むAu-Auコア-シェルナノ粒子と比較した図9。すべての計算では、4つの内部ナノブリッジがAuコアとAuシェルとの間に形成されたものとして設定した。コアの半径は20nmであり、ナノブリッジはシリンダ形態の2.5nm×1.2nm、ギャップの大きさまたはシリカの厚さは1.2nm、およびシェルの厚さは11nmである。X軸に入射した線形偏光された偏波linearlypolarizedplanewaveincidentalongthex-axisがプラズモン励起plasmonexcitationのために用いられた。EM強化に対する強度の結果は図9aに示した。前記結果は、EM強化がNNPの内部ギャップに集中的に位置することを示し、入射した光りより最大33倍程度効果が強化されていることを示す。反面、シリカで取り囲むAu-Auコア-シェルの構造では、同じ領域で単に3.2倍だけ強化されたことを確認することができた。NNPとシリカで取り囲む粒子のEF値はそれぞれ1.2×106、1.0×102であった。前記計算されたEF値1.2×106は、3つの100nmの金コアおよびシリカコーティングで構成されたL形態のトリマーナノアンテナ構造1.1×106と比較できるWustholz、K.L.etal.Structure-activityrelationshipsingoldnanoparticledimersandtrimersforsurface-enhancedRamanspectroscopy.J.AM.Chem.Soc.132、10903-109102010。前記計算では、表面の粗さと化学的強化chemicalenhancementは考慮されておらず、前記2つの要素はSERS全体の強化を増加させることが予想される。前記結果は、NNPでの高いEM強化は、コアとシェルのナノギャップ~1.2nmに起因するものであることを示す。重要なことに、内部ナノブリッジも強化要素に影響を及ぼす。ブリッジのないAu-ナノギャップ粒子に対する計算結果がNNPと比較された図9cの黒色ライン。計算結果は、このようなナノブリッジの追加が102倍以上の強化を誘導することを示す。Symmetrybreakingcouldbeapossibleoriginofthisadditionalfieldenhancement41.Sonnefraud、Y.etal.Experimentalrealizationofsubradiant、superradiant、andfanoresonanceinring/diskplasmonicnanocavities.ACSNano4、1664-16702010。NNP構造の入射波長に対する依存性を3つの種類の波長514nm、632nm、および785nm;図9dで調べた。ここで、632nmの入射波長は最も高い信号強度を示した。このような強い波長依存性は実験結果図10aとよく一致した。実施例3:ラマン染料の位置が調整されたナノ粒子の製造DNAストランドを、内部ナノギャップの形成だけでなく、ラマン染料改質のためのプラットフォームの形成のために用いた。3つの種類の異なる染料の位置で改質された、還元されたチオール化オリゴヌクレオチドROXgap760μL、4.3μM:3’-HS-CH23-ROX-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5’、ROXshell131μL、24.9μM:3’-HS-CH23-A10-PEG18-ROX-AAACTCTTTGCGCAC-5’、およびROXouter456μL、7.1μM:3’-HS-CH23-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-ROX-5’を、シトレート-金ナノ粒子1ml、1.0nMとそれぞれ混合した後、20分間常温で反応させた。10mMpH7.4の最終ホスフェート濃度として得るために、前記溶液を100mMのホスフェートバッファーROXgap、ROXshell、ROXouterに対して、それぞれ176μL、113μL、146μL添加でそれぞれ調整し、10SDS溶液ROXgap、ROXshell、ROXouterに対して、それぞれ1.9μL、1.2μL、1.6μL添加で0.1wt/volSDSの最終濃度に調整した。前記溶液を20分間オービタルシェーカorbitalshakerで追加的に反応させた後、20分ごとに2MのNaCl10mMPB、0.1SDS溶液を4回に分けて添加0.05M2回、0.1M2回して0.3MのNaClに合わせたROXgapに対して、それぞれ48.5μL、48.5μL、97μL、97μL添加;ROXshellに対してそれぞれ31.1μL、31.1μL、62.3μL、62.3μL添加;ROXouterに対してそれぞれ40μL、40μL、80μL、80μL添加。ただし、ROXouter配列が添加された溶液の場合にのみ、ROX分子と金表面の非特異的な相互反応を最小化するために、ウォーターバスwaterbath;60°Cで約5分間加熱した。前記溶液コロイドを1日間常温でvortexした。次に、前記溶液を遠心分離し12,000rpm、15分、上澄液を除去した後、沈殿物を再度10mMのPB溶液pH7.4に分散させ、この過程を2回繰り返した。最終的に、溶液を0.3MのPBS1mlに再分散させた後、粒子濃度を紫外線-可視光線分光計ultravioletvisiblespectrophotometer;Agilent8453spectrophotometer、USAで測定した。1日間、0.1DTTによって放出された上澄液の蛍光光度を用いてDNAloading数を定量化した後S.J.Hurst、A.K.R.Lytton-Jean、C.A.Mirkin、Anal.Chem.78、83132006、約100個のDNA-改質された金ナノ粒子を下記で用いた。すべてのラマン実験は、反転した光学顕微鏡invertedopticalmicroscopeを備えたナノ-ラマン分光器nano-Ramanspectroscope;Axiovert200、Zeissで行ったD.K.Lim、K.S.Jeon、H.M.Kim、J.M.Nam、Y.D.Suh、NatureMater.9、602010。典型的に、50倍の対物レンズNA0.5および300μWのlaserpowerを分析全般に用いた。サンプル溶液それぞれ20μLを384wellopticalbottomplateNuncTM、NewYork、USAに置いた。まず、入射波長依存度incidentwavelengthdependenceを、図4Aに示されたAu-gROXgap-AuNPプローブ0.5nmで分析した。SERS信号は514.5および785nmの励起波長excitationwavelengthsでは観察されなかったが、ROXの1504および1645cm-1でラマンシフトを有する強いSERS信号が観察され、これは、先に報告された文献と一致するものである1P.Zhang、Y.Guo、J.AM.Chem.Soc.131、38082009;2C.L.Zavaleta、etal.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA116、135112009;3K.Faulds、W.E.Smith、D.Graham、Anal.Chem.76、4122004。金シェルのないROX-改質された金ナノ粒子の場合、SERSスペクトルは632.8nmの励起波長では観察されなかった。次に、3つの種類の異なる染料-改質されたNNPナノ粒子に対する時間依存的ラマン結果は、信号がNNP構造内の染料の位置と密接な関連性があることを意味する図10b、図10cおよび図10d。最も強く、再現性に優れた信号がAu-NNPROXgapで観察された。染料が内部ギャップから遠く位置するほど、ラマン信号は弱くなり、再現性が低下したAu-NNPROXgap>Au-NNPROXshell>Au-NNPROXouter。このような実験結果から、強いSERS信号は、ラマン染料が内部ナノギャップに位置するAu-NNPROXgapから再現性あるように得られることを確認することができた。また、高い均一性と再現性のある信号の発生は、金コアの表面に均一に分布して定量的に調整された染料分子によると判断される。金コアとチオール化オリゴヌクレオチドとの間のAu-S結合および前記オリゴヌクレオチドを内部に含む金シェルが、非常に安定したプローブの形成を可能とし、ラマン染料を均一に非常に狭い内部ナノギャップに限らせることが分かる。また、前記ナノ粒子は、同じ光学特性を常温で6ヶ月以上維持した。実施例4:染料の量が調整されたナノ粒子の製造内部ナノギャップ内のラマン染料の数を下記のような方法で調整し、これによる特性を確認し、全体的な過程を図式的に図11aに示した。ポリAspacerが0.3MのPBS条件で用いられる場合、ナノ粒子の大きさおよびDNAspacerのDNAloading特性に応じて、20nmの金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのloading数が約100個となり得ることが知られているS.J.Hurst、A.K.R.Lytton-Jean、C.A.Mirkin、Anal.Chem.78、83132006。そこで、表面保護surfaceprotecting配列およびROXgap-改質された配列混合物表面保護配列:3’-HS-CH23-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5’、ROXgap-改質された配列:3’-HS-CH23-ROX-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5’に対して、4つの種類の異なる割合99:1259μL、12.6μM:2.4μL、13.8μM、90:10235μL、12.6μM:24μL、13.8μM、50:50131μL、12.6μM:120μL、13.8μMおよび0:1000:760μL、4.3μMでシトレート-金ナノ粒子citrate-AuNPs;1ml、1.0nMにそれぞれ接合させ、20分間、常温で反応させた。前記溶液を10mMpH7.4の最終ホスフェート濃度として得るために、100mMのホスフェートバッファー99:1、90:10、50:50、0:100に対して、それぞれ126.1μL、125.9μL、125.1μL、176μL添加でそれぞれ調整し、10SDS溶液99:1、90:10、50:50、0:100に対して、それぞれ1.3μL、1.3μL、1.3μL、1.9μL添加で0.1wt/volSDSの最終濃度に調整した。前記溶液を20分間オービタルシェーカorbitalshakerでさらに反応させた後、20分ごとに2MのNaCl10mMPB、0.1SDS溶液を4回に分けて添加0.05M2回、0.1M2回して0.3MのNaClに合わせた99:1に対してそれぞれ34.7μL、34.7μL、69.4μL、69.4μL添加;90:10に対してそれぞれ34.6μL、34.6μL、69.3μL、69.3μL添加;50:50に対してそれぞれ34.4μL、34.4μL、68.8μL、68.8μL添加;0:100に対してそれぞれ48.5μL、48.5μL、97μL、97μL添加。前記溶液コロイドを1日間常温でvortexした。次に、前記溶液を遠心分離し12,000rpm、15分、上澄液を除去した後、沈殿物を再度10mMのPB溶液pH7.4に分散させ、この過程を2回繰り返した。最終的に、溶液を0.3MのPBS1mlに再分散させた後、粒子濃度を紫外線-可視光線分光計ultravioletvisiblespectrophotometer;Agilent8453spectrophotometer、USAで測定した。1日間、0.1DTTによって放出された上澄液の蛍光光度を用いてDNAloading数を定量化した後S.J.Hurst、A.K.R.Lytton-Jean、C.A.Mirkin、Anal.Chem.78、83132006、その結果を図11bに示した。図11bに示されるように、意図したとおりに染料の量を調整できることを確認することができた。前記製造されたDNA-改質された金ナノ粒子を下記で用いた。4つの種類全体の割合に対して、オリゴヌクレオチド組成物とは無関係に、高い収率>95でAu-NNPROXgapnを製造し、すべてのNNPプローブの濃度は、超純水ウォーターnanopurewater;>18MOで0.5nMに調整した。次に、溶液に基づいたラマン研究が前記NNPプローブに対して行われた図12。染料がプローブに改質されていない場合、ラマン信号は検出されなかった。1つの染料だけがプローブに改質された場合には、小さいものの検出可能なラマン信号が観察された図12a、n=1。プローブあたりの染料の数が増加するにつれn=1からn=100、全体のスペクトル強度は定量的に増加した。特徴的なスペクトルピーク1504および1645cm-1は、プローブあたりのROX-改質されたヌクレオチドの数に比例し、これは、プローブあたりのROX染料の数がラマン信号の強度に比例することを示す図12b。前記結果により、コアとシェルとの間のプラズモンカップリングplasmoniccouplingによる強い電磁気的強化electromagneticenhancementおよびSERS強度は、本発明によってプローブあたりの改質された染料の数を調整することによって定量的に調整可能であることを確認することができる。実施例5:シェルの厚さが調整されたナノ粒子の製造ナノシェルの構造を変化させると、金属ナノ粒子のプラズモンplasmonic特性を変化させ得ることが知られている。これにより、コア-ナノギャップ-シェル構造において、シェルの厚さに応じたSERS信号の変化を確認するために、12、15、20、25、30および35nmのシェルの厚さを有する粒子を次のように製造した。DNA-改質された金ナノ粒子コアROXgap-改質された配列:3’-HS-CH23-ROX-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5’、DNAloading数=100の周囲に金シェルを形成するために、前記DNA-改質された金ナノ粒子100μL、0.3MPBSで1nMを50μLof1PVP溶液と混合した。前記溶液を33.6μL、53μL、124.8μL、302μLまたは432μLのヒドロキシアミンヒドロクロリドhydroxylaminehydrochloride溶液10mMと混合させ、それぞれ33.6μL、53μL、124.8μL、302μLまたは432μLのクロロ金酸chloroauricacid溶液5mMと混合させた。前記反応混合物を30分間常温でvortexした。遠心分離後、濃度を超純水ウォーター18MOで0.5nmに調整した。前記製造されたナノ粒子を用いてそれぞれ1504および1645cm-1で分析した。12nmから25nmへとシェルの厚さが増加するにつれ、SERS信号の強度は急激に増減することが分かった。しかし、シェルの厚さが>25nmの場合、SERS信号は急激に減少し始め、シェルの厚さが35nmの場合、ほぼ0に近く減少した図12c。前記結果は、より大きいナノ粒子はある程度SERSで強い電磁気的強化electromagneticenhancementを示すとの事実と一致するものであり、>25nmのシェルの厚さにおける電磁気的強化electromagneticenhancementの減少は、ギャップでの検出可能なラマン染料のラマン放出信号の減少に起因するもので、このような信号は検出されるために金属シェルを通過することが必要であるからである。重要なことに、シェルの厚さに応じた全体的なラマン信号変化の傾向図12cの黒色ラインおよび赤色ラインは、計算された領域強化結果の傾向図12cの青色ラインに沿った。実施例6:ナノ粒子の多重検知能力の測定本発明にかかるNNPナノ構造の多重検知能力multiplexingcapabilityを確認するために、2つの種類のラマン染料R6G-greenおよびCy3dyesを用い、オリゴヌクレオチドに前記染料を改質させて染料をナノギャップに位置させた。前記すべての粒子に対して、同じシェルの厚さ~11nmを用い、ROX染料プローブに対する条件と同じ条件濃度、実験器具などで分析した。指紋ピークfingerprintpeaksをR6G-greenおよびCy3染料のプローブに対して明確に確認し、両者の場合とも均一な時間依存スペクトルパターンを確認した。ROX染料を含む前記3つの種類の染料の中で、ギャップAu-NNPCy3nプローブn=100内にCy3染料を有するNNPが最も強いSERS信号を示した図13。前記結果は、他の染料と比較して、ナノギャップ内のCy3染料の相対的に広いラマンクロス-セクションRamancross-sectionおよび分子流動性molecularflexibility、およびR6G-greenのoff-resonance効果Abmax=504nmに起因する。内部ナノギャップ内の広い表面を利用できるため、より多くの染料が化学的または物理的に前記ギャップに改質され得図14b、これは、感度とともに多重検知能力を増加させることができる。実施例7:ナノ粒子の濃度に応じたラマン信号の測定および蛍光に基づいた検出方法との比較粒子の濃度とSERS強度との関係を確認するために、Au-NNPCy3100probesを用いて下記の実験を行った。まず、ナノ粒子を超純水ウォーター18MOで複数回洗浄し、粒子濃度分布1.9pM-250pMを650μWのlaserpowerで分析して図14aに示した。1190、1460および1580cm-1で現れたラマンシフトの結果は、粒子濃度とSERS強度との非常に優れた関連性R2=0.9862を示した図14a。溶液での前記検出限界1.9pMは、より強いlaserpowerを用いるか、またはナノギャップに位置するレポーター分子の数を増加させることによって改善できる。従来制限されていた数のラマン染料が不規則的に位置し得るナノ粒子間の外部連結部分に形成されたホットスポットとは異なり、本発明にかかるAu-NNPは、化学的または物理的にラマン染料分子を飽和させることができる。溶液状態でAu-NNPを用いてより高い感度を達成するために、非共鳴ラマンレポーター分子4,4’-ジピリジルで飽和されたAu-NNPを用いた。4,4’-ジピリジルで飽和されたAu-NNPを製造するために、まず、オリゴヌクレオチド3’-HS-CH23-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5’をAuNPコアの表面に改質させた。DNA-AuNPs500μLof1.0nMを100μLの4,4□-ジピリジル溶液0.1M、超純水ウォーターと混合し、混合溶液を常温で徐々に振とうしながらgentleshaking、3日間インキュベーションした。4,4’-ジピリジルの超過分は繰り返し遠心分離15分、12,000rpmおよび0.3MのPBSに再分散によって除去し、Auシェルの形成に成功した。4,4’-ジピリジル分子がAuシェルの形成前に、AuNPのコアの表面に物理吸着して飽和された。Cy3より分子の大きさが小さく高い付着量に起因して、より高い感度を提供することができる図10。プローブの濃度とラマン強度との間の線形関係が観察された。極めて重要な結果として、10fMの溶液でもラマン信号が測定された4,4’-ジピリジルの指紋ピークは1292cm-1、1230cm-1、および1022cm-1で明確に確認された。このような結果から、前記粒子が安定的なSERS信号を示し、非常に高い感度および定量的なSERSスペクトルを示すことを確認することができる。"