"少なくとも2つの可溶性融合タンパク質を含んでなる、可溶性融合タンパク質複合体であって、第1の融合タンパク質が、インターロイキン-15IL-15ポリペプチドb又はその機能的断片と共有結合している第1生物活性ポリペプチドaを含み;そして第2の融合タンパク質が、可溶性インターロイキン-15受容体アルファIL-15Rαポリペプチドd又はその機能的断片と共有結合している第2生物活性ポリペプチドcを含み、第1及び第2融合タンパク質の一方又は両方が更に免疫グロブリンFcドメイン又はその機能的断片を含み、第1融合タンパク質のIL-15ドメインが第2融合タンパク質の可溶性IL-15Rαドメインと結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成している、可溶性融合タンパク質複合体。第1及び第2生物活性ポリペプチドの一方が第1可溶性T細胞受容体TCR又はその機能的断片を含んでいる、請求項1に記載の可溶性融合タンパク質複合体。他方の生物活性ポリペプチドが、請求項2に記載の第1可溶性TCR又はその機能的断片を含み、それによって増大した結合活性を有する多価TCR融合タンパク質複合体を作成する、請求項2に記載の可溶性融合タンパク質複合体。他方の生物活性ポリペプチドが第1可溶性TCRと異なる第2可溶性TCR又はその機能的断片を含んでいる、請求項2に記載の可溶性融合タンパク質複合体。TCRが特定抗原の認識に特異的である、請求項2~4に記載の可溶性融合タンパク質複合体。TCRが、α及びβ鎖TCRを含んでいるヘテロ二量体である、請求項2~4に記載の可溶性融合タンパク質複合体。TCRが1本鎖TCRポリペプチドを含んでいる、請求項2~4に記載の可溶性融合タンパク質複合体。1本鎖TCRが、ペプチドリンカー配列によってTCRV-β鎖と共有結合しているTCRV-α鎖を含んでいる、請求項7に記載の可溶性融合タンパク質複合体。1本鎖TCRが、TCRV-β鎖と共有結合している可溶性TCRCβ鎖断片を更に含んでいる、請求項8に記載の可溶性融合タンパク質複合体。1本鎖TCRが、TCRV-α鎖と共有結合している可溶性TCRCα鎖断片を更に含んでいる、請求項8又は9に記載の可溶性融合タンパク質複合体。第1生物活性ポリペプチドが、TCRαポリペプチド又はその機能的断片を含み、そして第2生物活性ポリペプチドが、TCRβポリペプチド又はその機能的断片を含んでいる、請求項1に記載の可溶性融合タンパク質複合体。第1及び第2生物活性ポリペプチドの一方又は両方が、抗体又はその機能的断片を含んでいる、請求項1に記載の可溶性融合タンパク質複合体。抗体が、特定抗原の認識に特異的である、請求項12に記載の可溶性融合タンパク質複合体。抗体が、1本鎖抗体又は1本鎖Fvである、請求項12又は13に記載の可溶性融合タンパク質複合体。1本鎖抗体が、ポリペプチドリンカー配列によって免疫グロブリン重鎖可変領域と共有結合している免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでいる、請求項14に記載の可溶性融合タンパク質複合体。第1生物活性ポリペプチドが抗体重鎖ポリペプチド又はその機能的断片を含み、そして第2生物活性ポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチド又はその機能的断片を含んでいる、請求項1に記載の可溶性融合タンパク質複合体。IL-15ポリペプチドが、天然のIL-15ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を含んでいるIL-15変異体である、請求項1に記載の可溶性融合タンパク質複合体。IL-15変異体が、IL-15アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する、請求項17に記載の可溶性融合タンパク質複合体。IL-15変異体が、天然のIL-15ポリペプチドと比較して、IL-15RβγC受容体に対する増大した又は減少した結合活性を有している、請求項17に記載の可溶性融合タンパク質複合体。IL-15変異体の配列が、天然のIL-15配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸変化を有している、請求項17~19の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。アミノ酸変化が、IL-15Rβ及び/又はIL-15RγCと相互作用するIL-15のドメイン中のアミノ酸置換又は欠失である、請求項20に記載の可溶性融合タンパク質複合体。アミノ酸変化が、成熟ヒトIL-15配列配列番号1の6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、109、111、又は112位における1つ又はそれ以上のアミノ酸置換又は欠失である、請求項20に記載の可溶性融合タンパク質複合体。アミノ酸変化が、成熟ヒトIL-15配列の6位のIをSに、8位のDをN若しくはAに、61位のDをAに、65位のNをAに、72位のNをRに、104位のVをPに、又は108位のQをAに置換すること、又はこれらの置換の何れかの組み合わせである、請求項22に記載の可溶性融合タンパク質複合体。アミノ酸変化が、IL-15アンタゴニスト活性又は天然のIL-15ポリペプチドと比較してIL-15RβγC受容体に対する減少した結合活性を有するIL-15変異体をもたらす、請求項23に記載の可溶性融合タンパク質複合体。アミノ酸変化が、成熟ヒトIL-15配列の72位でNをDに置換することである、請求項20に記載の可溶性融合タンパク質複合体。アミノ酸変化が、IL-15アゴニスト活性又は天然のIL-15ポリペプチドと比較してIL-15RβγC受容体に対する増大した結合活性を有するIL-15変異体をもたらす、請求項25に記載の可溶性融合タンパク質複合体。Fcドメイン又はその機能的断片が、IgGFcドメイン、ヒトIgG1Fcドメイン、ヒトIgG2Fcドメイン、ヒトIgG3Fcドメイン、ヒトIgG4Fcドメイン、IgAFcドメイン、IgDFcドメイン、IgEFcドメイン、及びIgMFcドメインからなる群より選ばれるFcドメインを含んでいる、請求項1に記載の可溶性融合タンパク質複合体。Fcドメインが、変化した相補体又はFc受容体結合特性を有するFcドメインをもたらすアミノ酸変化を含んでいる、請求項27に記載の可溶性融合タンパク質。アミノ酸変化が、IgG1CH2の234及び235位のロイシン残基の抗体コンセンサス配列に基づいてナンバリングすなわち、...PELLGG...アラニン残基による置換すなわち、...PEAAGG...、IgG1CH2の332位のリジン残基の抗体コンセンサス配列に基づいてナンバリングすなわち、...KCKSL...アラニン残基による置換すなわち、...KCASL...、又はこれらの何れかの組合わせからなる群より選ばれる、請求項28に記載の可溶性融合タンパク質。第1生物活性ポリペプチドが、ポリペプチドリンカー配列によってIL-15ポリペプチド又はその機能的断片と共有結合している、請求項1~29に記載の可溶性融合タンパク質複合体。第2生物活性ポリペプチドが、ポリペプチドリンカー配列によってIL-15Rαポリペプチド又はその機能的断片と共有結合している、請求項1~30に記載の可溶性融合タンパク質複合体。IL-15Rαポリペプチド又はその機能的断片が、ポリペプチドリンカー配列によってFcドメイン又はその機能的断片と共有結合している、請求項1~31に記載の可溶性融合タンパク質複合体。TCRドメインに対する抗原が、MHC又はHLA分子中で提示されるペプチド抗原を含んでいる、請求項5に記載の可溶性融合タンパク質複合体。ペプチド抗原が、主要関連ポリペプチド又はウィルスがコードするポリペプチドに由来している、請求項33に記載の可溶性融合タンパク質複合体。抗体ドメインに対する抗原が、細胞表面受容体又はリガンドを含んでいる、請求項13に記載の可溶性融合タンパク質複合体。抗体ドメインに対する抗原が、CD抗原、サイトカイン又はケモカインの受容体又はリガンド、成長因子受容体又はリガンド、細胞接着分子、MHC/MHC様分子、Fc受容体、Toll様受容体、NK受容体、TCR、BCR、陽性/陰性同時刺激受容体又はリガンド、死受容体又はリガンド、腫瘍関連抗原、或いはウィルスがコードする抗原を含んでいる、請求項13又は35に記載の可溶性融合タンパク質複合体。IL-15Rαポリペプチドが、IL-15ポリペプチドを結合することができるIL-15受容体アルファの細胞外ドメインを含んでいる、請求項1~34に記載の可溶性融合タンパク質複合体。IL-15Rαポリペプチドが、IL-15Rαsushiドメイン又はIL-15RαΔE3ドメインの何れかを含んでいる、請求項1~35の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。請求項1~36の何れか一項に記載の第2可溶性融合タンパク質複合体と共有結合している請求項1~36の何れか一項に記載の第1可溶性融合タンパク質複合体を含んでなる、可溶性融合タンパク質複合体。第1可溶性融合タンパク質複合体が、第2可溶性融合タンパク質複合体と同じである、請求項37に記載の可溶性融合タンパク質複合体。第1可溶性融合タンパク質複合体が、第2可溶性融合タンパク質複合体と異なる、請求項37に記載の可溶性融合タンパク質複合体。第1可溶性融合タンパク質複合体が、ジスルフィド結合で第2可溶性融合タンパク質複合体と共有結合している、請求項37に記載の可溶性融合タンパク質複合体。ジスルフィド結合が、第1可溶性融合タンパク質複合体の第2ポリペプチドのFcドメインを第2可溶性融合タンパク質複合体の第2ポリペプチドのFcドメインに共有結合させる、請求項40に記載の可溶性融合複合体。請求項1~36の何れか一項に記載の第1融合タンパク質をコードする核酸配列。請求項1~36の何れか一項に記載の第2融合タンパク質をコードする核酸配列。核酸配列が融合タンパク質をコードする配列に操作可能に結合しているプロモータ、翻訳開始シグナル、及びリーダー配列を更に含んでいる、請求項42又は43に記載の核酸配列。請求項42に記載の核酸配列を含んでなる、DNAベクター。請求項43に記載の核酸配列を含んでなる、DNAベクター。請求項42及び43に記載の核酸配列を含んでなる、DNAベクター。請求項42に記載の配列、請求項43に記載の配列、及び請求項42及び43に記載の配列の群から選ばれる核酸配列を含んでなる、細胞。方法が、a第1融合タンパク質をコードする請求項45に記載のDNAベクターを第1宿主細胞内に導入すること、b細胞又は培地中に第1融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で培地中で第1宿主細胞を培養すること;c宿主細胞又は培地から第1融合タンパク質を精製すること、d第2融合タンパク質をコードする請求項46に記載のDNAベクターを第2宿主細胞内に導入すること、e細胞又は培地中に第2融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で培地中で第2宿主細胞を培養すること;及びf宿主細胞又は培地から第2融合タンパク質を精製すること、及びg第1融合タンパク質のIL-15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性IL-15Rαドメインの間を結合させるのに十分な条件下で第1及び第2融合タンパク質を混合して可溶性融合タンパク質複合体を形成すること;を含んでなる、請求項1に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。請求項46に記載の核酸から発現されたポリペプチド間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で第1及び第2融合タンパク質を混合することを更に含み、ここで請求項37に記載の可溶性融合タンパク質複合体を形成する、請求項49に記載の方法。方法が、a第1融合タンパク質をコードする請求項45に記載のDNAベクター及び第2融合タンパク質をコードする請求項46に記載のDNAベクターを宿主細胞に導入すること、b細胞又は培地中に融合タンパク質を発現して、第1融合タンパク質のIL-15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性IL-15Rαドメインの間を会合させて可溶性融合タンパク質複合体の形成を可能にするのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること;c宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製すること;を含んでなる、請求項1に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。請求項46に記載の核酸から発現されたポリペプチド間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で第1及び第2融合タンパク質複合体を混合することを更に含み、ここでクレーム37に記載の可溶性融合タンパク質複合体を形成する、請求項51に記載の方法。方法が、a第1及び第2融合タンパク質をコードする請求項47に記載のDNAベクターを宿主細胞内に導入すること、b細胞又は培地中に融合タンパク質を発現して、第1融合タンパク質のIL-15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性IL-15Rαドメインの間を会合させて可溶性融合タンパク質複合体の形成を可能にする、及び請求項46に記載の核酸によってコードされるポリペプチドの間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること;c宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製すること;を含んでなる、請求項1に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。請求項46に記載の核酸から発現されたポリペプチド間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で第1及び第2融合タンパク質を混合することを更に含み、ここで請求項37に記載の可溶性融合タンパク質複合体を作成する、請求項53に記載の方法。方法が、a複数の細胞を請求項1~41に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させることここで複数の細胞は更に、請求項1に記載のIL-15ドメインによって認識されるIL-15R鎖を担持している免疫細胞又は請求項1に記載のFcドメインによって認識されるFc受容体鎖を担持している免疫細胞、及び請求項1に記載の生物活性ポリペプチドの少なくとも1つによって認識される抗原を担持している標的細胞を含んでいる、b標的細胞上の抗原と、免疫細胞上のIL-15R又はFc受容体鎖の間に、免疫細胞を結合及び活性化するのに十分に、特異的結合複合体架橋を形成すること;及びc結合した活性化免疫細胞によって標的細胞を殺傷すること:を含んでなる、標的細胞を殺傷する方法。標的細胞が、腫瘍細胞又はウィルス感染細胞である、請求項55に記載の方法。生物活性ポリペプチドがTCRを含んでいる、請求項55又は56に記載の方法。標的細胞上の抗原が、MHC又はHLA分子内に提示され、TCRによって認識される、腫瘍又はウィルスによってコードされるペプチド抗原を含んでいる、請求項57に記載の方法。免疫細胞が、T細胞、LAK細胞、NK細胞、マクロファージ、単球又は顆粒球である、請求項55に記載の方法。疾患細胞が疾患関連抗原を発現している、患者の疾患を予防又は治療する方法であって、方法が:a疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを含んでいる請求項1~41の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を患者に投与すること;b抗原発現疾患細胞と免疫細胞を発現しているIL-15R又はFc受容体の間に免疫細胞を局在化するのに十分に特異的結合複合体架橋を形成すること;及びc患者の疾患を予防又は治療するのに十分に疾患細胞を損傷又は殺傷すること:を含んでなる、方法。疾患細胞が疾患関連抗原を発現している、患者の疾患を予防又は治療する方法であって、方法が:aIL-15R鎖又はFc受容体鎖を担持している免疫細胞を疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを含んでいる請求項1~41の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と混合すること、b免疫細胞-融合タンパク質複合体混合物を患者に投与すること;c抗原発現疾患細胞と免疫細胞を発現しているIL-15R又はFc受容体の間に免疫細胞を局在化するのに十分に特異的結合複合体架橋を形成すること;及びd患者の疾患を予防又は治療するのに十分に疾患細胞を損傷又は殺傷すること:を含んでなる、方法。疾患が癌又はウィルス感染症である、請求項60又は61に記載の方法。疾患関連抗原がペプチド/MHC複合体である、請求項60又は61に記載の方法。請求項1~41の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体の有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における免疫応答を刺激する方法。請求項1~41の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体の有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における免疫応答を抑制する方法。少なくとも1つの可溶性融合タンパク質複合体が検出可能な標識を含んでいる、請求項1~41の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。検出可能な標識が、ビオチン、ストレプタビジン、酵素又はその触媒活性断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、又は蛍光性、リン光性若しくはケミルミネセント分子である、請求項66に記載の可溶性融合タンパク質複合体。方法が:a抗原と可溶性融合タンパク質複合体の生物活性ポリペプチドの間に特異的結合複合体を形成する条件下で、細胞又は組織を請求項66に記載の少なくとも1つの可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、b抗原に結合しなかった何れの可溶性融合タンパク質複合体も除去するのに適している条件下で細胞又は組織を洗浄すること;及びc抗原を含有している細胞又は組織の指標であるとして、特異的結合複合体を検出すること:を含んでなる、細胞又は組織上に提示される抗原を含有している細胞又は組織を検出する方法。生物活性ポリペプチドがTCRを含み、そして抗原がTCRによって認識されるMHC又はHLA分子内に提示されるペプチド抗原を含んでいる、請求項68に記載の方法。抗原提示のコピー数が細胞当り多くて1000コピーである、請求項68又は69に記載の方法。方法がインビボ、インビトロ、又はエクスビボで行われる、請求項68~70の何れか一項に記載の方法。第1可溶性融合タンパク質複合体と第2可溶性融合タンパク質複合体の二量体を形成することここで、それぞれの融合タンパク質複合体の第1生物活性ポリペプチドと第2生物活性ペプチドの結合部位は同一又は異なっているを含んでなる、請求項2又は12に記載の可溶性融合タンパク質複合体の分子当りの結合活性を増大する方法。分子当りの結合活性が、10又はそれ以上、20又はそれ以上、30又はそれ以上、40又はそれ以上、50又はそれ以上、60又はそれ以上、或いは70又はそれ以上増大する、請求項72に記載の方法。第1可溶性融合タンパク質複合体と第2可溶性融合タンパク質複合体の二量体を形成することを含んでなる、請求項2又は12に記載の可溶性融合タンパク質複合体の分子当りのIL-15活性を増大する方法。方法が:aIL-15をコードする第1DNAベクター及びIL-15Rα融合タンパク質をコードする第2DNAベクターを宿主細胞内に導入すること;bIL-15とIL-15Rα融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること;及びcIL-15:IL-15Rα融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製すること:を含んでなる、インターロイキン-15IL-15:インターロイキン-15受容体アルファIL-15Rα融合タンパク質複合体を製造する方法。IL-15Rα融合タンパク質複合体が、生物活性ポリペプチドと共有結合している可溶性IL-15Rαを含んでいる、請求項75に記載の方法。生物活性ポリペプチドが、IgGの重鎖定常ドメインである、請求項76に記載の方法。生物活性ポリペプチドが、IgGの重鎖定常ドメインのFcドメインである、請求項76に記載の方法。IL-15が、第2生物活性ポリペプチドと共有結合しているIL-15を含んでいる、請求項75に記載の方法。方法が:aIL-15をコードする第1DNA及びIL-15Rα/Fc融合タンパク質をコードする第2DNAを宿主細胞内に導入すること;bIL-15とIL-15Rα/Fc融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること;及びcIL-15:IL-15Rα/Fc複合体を宿主細胞又は培地から精製すること:を含んでなる、IL-15Rα/Fc融合タンパク質を含んでいるIL-15:IL-15Rα複合体を製造する方法。方法が:aIL-15とIL-15Rα/Fc融合タンパク質を宿主細胞内で同時発現すること;bIL-15とIL-15Rα/Fc融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で、宿主細胞を培地中で培養すること;及びcIL-15:IL-15Rα/FC融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製すること:を含んでなる、IL-15Rα/FC融合タンパク質を含んでいるIL-15:IL-15Rα融合タンパク質複合体を製造する方法。IL-15:IL-15Rα複合体を宿主細胞又は培地から精製することが、IL-15:IL-15Rα融合タンパク質複合体を特異的に結合する親和性試薬上にIL-15:IL-15Rα複合体を捕獲することを含んでいる、請求項75~81の何れか一項に記載の方法。IL-15Rα融合タンパク質が、IL-15Rα/Fc融合タンパク質及びFcドメインと特異的に結合する親和性試薬を含んでいる、請求項82に記載の方法。親和性試薬が、プロテインA又はプロテインGである、請求項83に記載の方法。親和性試薬が抗体である、請求項82又は83に記載の方法。IL-15:IL-15Rα複合体を宿主細胞又は培地から精製することが、イオン交換クロマトグラフィーを含んでいる、請求項75~85の何れか一項に記載の方法。IL-15:IL-15Rα複合体を宿主細胞又は培地から精製することが、サイズ排除クロマトグラフィーを含んでいる、請求項75~86の何れか一項に記載の方法。IL-15Rαが、IL-15RαSushiIL-15RαSuを含んでいる、請求項75~87の何れか一項に記載の方法。IL-15が突然変異IL-15である、請求項75~88の何れか一項に記載の方法。突然変異IL-15が、IL-15N72Dを含んでいる、請求項89に記載の方法。宿主細胞が哺乳動物の細胞である、請求項75~90の何れか一項に記載の方法。IL-15:IL-15Rα複合体のIL-15結合部位が完全に占有されている、請求項75~91の何れか一項に記載の方法。IL-15:IL-15RαSu/Fc複合体の両方のIL-15結合部位が完全に占有されている、請求項88に記載の方法。IL-15:IL-15Rα複合体が、複合体の電荷又はサイズ特性に基づいて精製される、請求項75~93の何れか一項に記載の方法。a宿主細胞内でIL-15N72DとIL-15RαSu/Fc融合タンパク質を同時発現すること;bIL-15N72DとIL-15RαSu/Fc融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること;及びcIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製することここで、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体の両方のIL-15結合部位は完全に占有されている:を含んでなる、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を製造する方法。完全に占有されているIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を、複合体の電荷特性に基づいてアニオン交換クロマトグラフィーで精製する、請求項95に記載の方法。完全に占有されているIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を、低イオン強度で中性pHの緩衝液を用いる結合条件及びイオン強度を上昇させる緩衝液を用いる溶出条件で、4級アミンに基づく樹脂を用いて精製する、請求項95に記載の方法。IL-15又はIL-15突然変異体をコードする第1ポリヌクレオチド及びIL-15受容体融合タンパク質をコードする第2ポリヌクレオチドを含んでなる、細胞。細胞が、IL-15N72Dをコードする第1発現ベクター及びIL-15RαSu/Fc融合タンパク質をコードする第2発現ベクターを含んでいる、請求項98に記載の細胞。二量体IL-15RαSu/Fc及び2つのIL-15N72D分子を含んでなる、単離された完全に占有されているIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体。複合体が、少なくとも90~95又はそれ以上精製された完全に占有されている複合体である、請求項100に記載の複合体。複合体が、5.6~6.5の間の等電点を有している、請求項100に記載の複合体。約114kDaの分子量を有している、請求項100に記載の複合体。IL-15N72D及び/又はIL-15RαSu/Fc融合タンパク質がグリコシル化されている、請求項100に記載の複合体。請求項75~97の何れか一項の方法に従って産生された、単離された完全に占有されているIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体。方法が、請求項100~105の何れか一項に記載の完全に占有されているIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体を対象に投与することを含んでなる、対象における免疫応答を調節する方法。免疫応答を増大又は減少する、請求項106に記載の方法。方法が、請求項100~105の何れか一項に記載の完全に占有されているIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体を対象に投与することを含んでなる、腫瘍を有している対象における免役応答を増強する方法。定義以下の定義は以下の明細書で用いられている特定の用語に対して提供されている。本明細書で用いられる用語を包含するcomprisingは、列挙されている要素を包含しているがその他の要素を排除していない組成物及び方法を意味するように意図されている。組成物及び方法を定義するために用いられる場合の実質的にからなるconsistingessentiallyofは、組合わせに対する本質的な意義とは別の要素を除外することを意味するものである。従って、実質的に本明細書で定義されているような要素からなる組成物は、単離及び精製方法由来の微量汚染物質、及びリン酸緩衝食塩水、保存剤等のような薬学的に許容される担体を除外しない。からなるconsistingofはその他の成分及び本発明の組成物を投与する実質的な方法の工程の微量要素以外を除外することを意味するものである。これらの変遷用語のそれぞれによって定義される実施態様は本発明の範囲内である。本明細書で用いられる用語IL-15:IL-15Rα融合タンパク質複合体は、生物活性ポリペプチドに共有結合している可溶性IL-15RαのIL-15Rαドメインと非共有結合で結合しているIL-15を有している複合体である。IL-15はIL-15又は第2生物活性ポリペプチドと共有結合している1L-15の何れかであってよい。本明細書で用いられる用語同時発現されたは、2つの異なったポリペプチドが、2つのポリペプチドが宿主細胞内又は宿主細胞の培養培地内で相互作用又は互いに結合して複合体を形成するように、宿主細胞内で同時に発現されることを意味するように意図されている。本明細書で用いられる用語親和性試薬は、他の分子と特異的に結合する組成物の何れかを意味するように意図されている。親和性試薬の例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、プロテインA、及びプロテインGを包含する。抗体は、特異的エピトープを結合する抗体及びその断片を包含する、免疫グロブリンの何れかである。この用語はポリクローナル、モノクローナル、キメラ、Fabs、Fvs、一本鎖抗体、及び一重又は多重免疫グロブリン変異鎖を、或いはCDRドメイン構造を、更に二重特異及び多重特異抗体も包含する。本明細書で用いられる用語抗原は、免疫系が、それに対する抗体又は特異的細胞介在免疫応答を引き起こすようにする何れかの物質を意味する。疾患関連抗原は、免疫系が、それに対する抗体又は特的細胞介在免疫応答を引き起こすようにする何れかの疾患と関連している何れかの物質である。本明細書で用いられる用語生物活性ポリペプチドは、抗原結合活性を有するTCR若しくは抗体、CD8を包含するCD分子、又はFcドメインを包含する抗体ドメインを包含する、本明細書で検討しているような望ましい効果を生ずることができるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのようなアミノ酸配列;糖若しくは多糖;脂質若しくは糖脂質;糖タンパク質;又はリポタンパク質への言及を意味している。本明細書で用いられる用語細胞は、原核、真核、初代細胞又は不死細胞株、組織又は臓器にあるそのような細胞の何れかの群を包含している。哺乳動物特にヒト起源の細胞で、1つ又はそれ以上の病原体に感染できることが好ましい。本発明の宿主細胞は、原核生物、真核生物、哺乳動物、鳥類、昆虫、植物又は細菌細胞を包含する、何れかの起源の、トランスフォーム、形質転換、形質導入又は感染した細胞でよく、或いはこれは本明細書に記載の核酸を伝搬するために用いることができる任意起源の細胞であってよい。本明細書で用いられる用語共役分子は、化学又はその他の適切な方法で共有結合しているすなわち融合しているTCR又は抗体分子、及び通常は化学の又は合成される分子であるエフェクター分子への言及を意味している。所望により、共役分子をペプチドリンカー配列又は担体分子を介して1つの又はいくつかの部位で融合することができる。あるいは、ペプチドリンカー又は担体を共役分子の構築を支援するために用いることができる。共役分子が共役毒素又は検出可能標識であることが特に好ましい。本明細書で用いられる用語エフェクター分子は、IL-15Rアルファ、IL-15RαSu、IL-15Rαエクソン3欠失、IL-2Rベータ又はガンマ-C、又はこれらの機能的断片のようなIL-15ドメイン、IL-15変異体又はIL-15受容体、及び更に免疫グロブリンFcドメイン又はその機能的断片を含んでいるポリペプチドのようなものを包含する、本明細書で検討しているような所望の効果を生ずることができるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのようなアミノ酸配列;糖又は多糖;脂質又は糖脂質;糖タンパク質;リポタンパク質;又は化学試薬を示している。用語融合分子及び融合タンパク質は互換可能に用いられて、遺伝子組み換え、化学の又はその他の適切な方法で共有結合しているすなわち、融合している生物活性ポリペプチド通常はTCR又は抗体とエフェクター分子通常はタンパク質又はペプチド配列への言及を意味している。所望により、融合分子を、ペプチドリンカー配列を介して1部位又はいくつかの部位で融合することができる。あるいは、ペプチドリンカーを融合分子の構築を支援するために用いることができる。融合分子が融合タンパク質であることが特に好ましい。一般に融合分子は共役分子から成っていてもよい。用語宿主細胞はクローニングベクター又は発現ベクターの何れかを含有している原核又は真核細胞の何れかへの言及を意味している。この用語は、宿主細胞の染色体又はゲノムにクローン遺伝子複数を含むが含まれるように遺伝子操作されている原核又は真核細胞も包含している。本明細書で用いられる用語免疫応答は、免疫細胞が、異なった接着及び/又は活性化工程に関与する多元的な工程を介して刺激を受けそして/又は血液からリンパ球、更には非リンパ組織へ集められる過程への言及を意味している。活性化条件が、サイトカイン、成長因子、ケモカイン及びその他の因子の放出を引き起こし、免疫細胞上の接着及びその他の活性化分子の発現を上方制御し、接着、形態変化、及び/又は組織からケモタキシスを伴う溢出を促進し、細胞増殖及び細胞毒性活性を増大し、抗原提示を刺激し、そして記憶細胞タイプの生成を含むその他の表現型変化をもたらす。免疫応答は、炎症又は別の免疫細胞の細胞毒性活性を抑制又は制御する免疫細胞の活性への言及も意味している。免疫応答はインビトロ又はインビボにおける免疫細胞の活性への言及を意味する。本明細書で用いられる用語ポリヌクレオチド及び核酸分子は、任意の長さのヌクレオチドの多量体型に言及するために互換可能に用いられる。ポリヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び/又はこれらの類縁体を含むことができる。ヌクレオチドは何れかの三次元構造を有することができ、そして公知又は未知の何れかの機能を果たすことができる。用語ポリヌクレオチドは、例えば、一重、二重螺旋及び三重螺旋分子、遺伝子又は遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、アンチセンス分子、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、アプタマー、プラスミド、ベクター、任意配列の単離されたDNA、任意配列の単離されたRNA、核酸プローブ、及びプライマーを包含する。核酸分子は改変核酸分子例えば、改変された塩基、糖、及び/又はヌクレオチド間の結合を含むも含むことができる。用語ポリペプチドは、好ましくはその大きさに関わらず本質的に20種の天然アミノ酸の何れかからなる、何れかのポリマーへの言及を意味している。用語タンパク質が比較的大きいタンパク質を参照するために用いられ、そして多くの場合ペプチドが小さいポリペプチドを参照するために用いられているが、この分野におけるこれらの用語の使用はオーバーラップしていることが多い。用語ポリペプチドは特段の断りがない限り、一般にタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを示す。一般に本発明に関して有用なペプチドは通常、遠心分離又はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような標準的分子サイズ測定技術で評価して、約0.1~100KD又は最高約1000KDの大きさ、好ましくは約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30及び50KDの間である。用語予防する、予防すること、予防、予防的治療等は、疾患又は病気を有していないが、疾患又は病気を発症するリスクが高いか罹りやすい対象の疾患又は病気が発症する確立を減少させることへの言及を意味している。予防等は対象が特定の病気又は疾患に決して罹らないように予防することを意味していない。予防は複数用量の投与を必要としてもよい。予防は全ての症状がなくなった対象の疾患の再発を防ぐこと、又は再発寛解疾患の再発を防ぐことを包含する。用語一本鎖抗体は、一本鎖形態に基づく抗体への言及を意味している。一本鎖抗体は抗体の最小結合サブユニットから成っていてよい。一本鎖抗体は、一本の安定に畳まれているポリペプチド鎖上で抗体の抗原-結合領域例えば、相補体決定領域の全て又は幾つか、重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域に存在するCDRとのみ結合できる。このように、一本鎖抗体は古典的な免疫グロブリンよりサイズが相当に小さいものであるが、抗体の抗原特異的結合特性を保持している。一本鎖抗体はリガンド、例えば、エフェクター分子又は薬物複合体の広い領域と結合できる。本明細書で用いられる用語可溶性は、水性緩衝液、例えば、細胞培地から低いG力遠心分離下例えば、通常の遠心機で約30,000回転/分以下で容易に沈殿しない融合分子、特に融合タンパク質を意味する。更に、融合分子は、低濃度の陰イオン又は非イオン洗浄剤の存在下又は非存在下において中性pH又はその付近で約5~37°Cより高い温度で水溶液に維持されるならば可溶性である。これらの条件下で、可溶性タンパク質は低い沈降価、例えば約10~50のスベドベルグ単位を有している。本明細書で参照する水溶液は一般に、pH、具体的には約5~9の範囲のpH、及び約2mM~500mMの範囲のイオン強度を確立するために緩衝化合物を有している。たまに、プロテアーゼ阻害剤又は弱い非イオン洗浄剤を添加する。また、所望により、ウシ血清アルブミンBSAのような担体タンパク質を数mg/ml添加してもよい。例示的な水性緩衝剤は、標準的なリン酸緩衝食塩水、トリス緩衝食塩水、又はその他の周知の緩衝剤及び細胞培地製剤を包含する。用語刺激する又は刺激することは、生理活性、例えば免疫応答を増大すること、増幅すること、補強すること、強化することへの言及を意味している。刺激は正の変化でよい。例示的な増大は、例えば、5、10、25、50、75或いは90~100までであってよい。その他の例示的な増大は2倍、5倍、10倍、20倍、40倍又は100倍までもを包含する。用語抑制する又は抑制することは、生理活性、例えば免疫応答を減少すること、弱めること、減らすこと、止めること又は安定化することを示している。抑制は負の変化でよい。例示的な減少は、例えば、5、10、25、50、75或いは90~100までであってよい。例示的な減少は2倍、5倍、10倍、20倍、40倍又は100倍までもを包含する。用語T細胞受容体TCRは、抗原の提示に応答してT細胞の活性化に関与する内在性膜タンパク質の複合体の又はこれに由来するポリペプチドへの言及を意味している。ある場合は、T細胞は、αβ又はγδヘテロ二量体T細胞受容体TCRを介してMHC産物と結合しているペプチドを認識する。TCRレパートリーは、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子で用いたものと同じ遺伝子再配列メカニズムにより創生された広汎の多様性を有している[TonegawaSBiosciRep8326。殆どの多様性は、α及びβ鎖の相補性決定領域3CDR3をコードする可変V及び結合J或いは多様性、Dの合流点で創生されるDavisandBjorkmanNature334395402。しかしながら、TCRは抗体のように、そして恐らく偶然ではなく、体細胞点突然変異を受けない。TCRは抗体と同じ程度の親和性成熟も受けない。天然に生じるようなTCRは、105~107M-の親和性を有していると思われるのに対して、抗体は通常105~109M-の親和性を有しているDavisetalAnnuRevImmunol16523544EisenetalAdvProteinChem49156。TCRに体細胞突然変異が存在しないことは低い親和性に関係しているかもしれないが、TCRが高い親和性を有することの選択的優位性がないとも反論されている。実際に、T細胞活性化の連続引き金ValituttietalNature375148151及び動的校正RabinowitzetalProcNatlAcadSciUSA9314011405モデルの両方とも、より長いオフ速度高い親和性に関係しているがシグナル伝達系に弊害をもたらすことを示唆している。より高い親和性TCRはT細胞応答に必要なペプチド特異性を保持できないという可能性もある。例えば、MHCの溝の内部で結合するペプチドは限られたアクセス可能表面を提示しBjorkmanPJCell89167170、これは順に相互作用中に生成されるエネルギーの量を制限する。一方、エネルギーをMHC螺旋に向けることによりTCRの親和性を増やすことは、恐らく負の選択中に胸腺の欠失をもたらすBevanMJImmunity7175178。用語TCRは、TCRVα及びVβドメインを含む分子を包含する、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヘテロ二量体及び一本鎖T細胞受容体又はその機能的断片を包含する。用語TCRは、例えば、2008年3月19日に出願されて米国特許公開第US20030144474号の、標題TCELLRECEPTORFUSIONSANDCONJUGATESANDMETHODSOFUSETHEREOFの米国仮特許出願に開示されているT細胞受容体も包含する。用語ベクターは、宿主細胞中で自己複製ができて、外来DNAを受け入れることができる核酸分子である。ベクターはそれ自体の複製起点、外来DNA挿入のために用いることができる制限エンドヌクレアーゼ用の1つ又はそれ以上の固有の認識部位、及び通常は抗生物質耐性をコードする遺伝子のような選択可能なマーカー、並びに挿入されたDNAの発現のための認識配列例えば、プロモーターをしばしば担持している。一般的なベクターはプラスミドベクター及びファージベクターを包含している。用語Fcドメイン又はFc領域は、免疫グロブリン重鎖断片結晶化可能領域への言及を意味している。一般に、Fcドメインは第2Fcドメインと相互作用して二量体複合体を形成できる、FcドメインはFc受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び/又は相補体系のタンパク質と結合でき、或いはこれらの結合活性を減少又は増大するために改変できる。FcドメインはIgG、IgA、IgD、IgM又はIgE抗体アイソタイプから得ることができ、そしてオプソニン化、細胞溶解、マスト細胞の劣化、好塩球増加及び好酸球増加、並びにの他のFc受容体依存性過程を包含する免疫活性;相補経路の活性化;及びインビボにおけるタンパク質安定性の影響を及ぼす。用いられている略語は:IgG、免疫グロブリン;h、ヒトの;IL、インターロイキン;R、受容体;Su、sushiドメイン;TCR、T細胞受容体;sc、一本鎖;sTNFR、可溶性腫瘍壊死因子-αTNF-α受容体;NK、ナチュラルキラー;KD、平衡解離定数;CTLs、細胞毒性Tリンパ球;aa、アミノ酸複数を含む;OVA、オボアルブミン;VSV、水疱性口内炎ウィルス;IMDM、イソコーブ改変ダルベッコ培地;CHO、チャイニーズハムスター卵巣;mAb、モノクローナル抗体;β2m、β2ミクログロブリン;SA、ストレプタビジン;HRP、ホースラディッシュペルオキシダーゼ;PE、フィコエリトリン;ABTS、2,2’-アジノビス3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸-ジアンモニウム塩;PLE、ペプチド負荷エンハンサー;c246scTCR、ヒトp53aa264-272ペプチド/HLA-A0201複合体に特異的な可溶性一本鎖TCR;c149scTCR,ヒトp53aa149-157ペプチド/HLA-A0201複合体に特異的な可溶性一本鎖TCR;OT1scTCR、OVAaa257-264ペプチド/H-2Kb複合体に特異的な可溶性一本鎖TCR;SEC、サイズ排除クロマトグラフィー;pMHCI、ペプチド/MHCクラスI;SPR、表面プラズモン共鳴;MW、分子量;m、ネズミ;A、吸光度;RU、応答単位である。本明細書で提供されている範囲は範囲内の全ての値を省略していると理解される。例えば、1~50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、又は50からなる群の何れかの数、数の組合わせ、又は部分範囲を包含すると理解される。1より大きいは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、100等又はその間の任意の値であると理解される。少なくとも特定値、はその値及びその値より大きい全ての値であると理解される。具体的に述べられているか又は文脈から明らかである場合を除いて、本明細書で用いられている用語又はは包括的であると理解される。具体的に述べられているか又は文脈から明らかである場合を除いて、本明細書で用いられている用語a、an、及びtheは単数又は複数であると理解される。具体的に述べられているか又は文脈から明らかである場合を除いて、本明細書で用いられている用語約は、当該技術分野において正常に許容される範囲内、例えば、平均値の2標準偏差内であると理解される。約は、述べられている値の10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.05、又は0.01以内であると理解できる。文脈から明らかな場合を除いて、本明細書で提供されている全ての数値は用語、約で修飾できる。本明細書の可変基の定義の何れかにおける化学基を列挙するリストは、何れかの単一基又は列挙されている基の組合わせとしての可変基の定義を包含する。本明細書の可変基又は態様についての実施態様の列挙は、何れかの単一の実施態様又は他の実施態様又はその部分との組み合わせとしての実施態様を包含する。本明細書に提供されている何れかの組成物又は方法は、本明細書に提供されているその他の何れかの組成物及び方法の1つ又はそれ以上と組合わせることができる。FcドメインIgGクラスの免疫グロブリンはヒト血液中に最も豊富にあるタンパク質である。これらの血中半減期は21日もの長期に達する。融合タンパク質は、IgGのFc領域と、各種サイトカイン及び可溶性受容体のような、別のタンパク質のドメインとの結合体であると報告されている例えば、CaponetalNature3375255311989ChamowetalTrendsBiotechnol1452601996米国特許第5,116,964号及び同第5,541,087号を参照されたい。原型の融合タンパク質はIgGFcのヒンジ領域でシステイン残基を介して結合しているホモ二量体タンパク質であって、重鎖可変及びCH1ドメイン並びに軽鎖のないIgG分子と類似の分子をもたらす。Fcドメインを含む融合タンパク質の二量体特性は、別の分子との高次相互作用すなわち、2価又は二重特異性結合をもたらす点で好都合である。構造的相同性に起因して、Fc融合タンパク質は類似のアイソタイプを有するヒトIgGのそれに相当するインビボの薬物動態プロファイルを示す。IL-15又はIL-15融合タンパク質の血中半減期を引き延ばすためにそして/又はその生物活性を増大するために、本発明に開示又は記載されているヒト重鎖IgGタンパク質のFc部分と共有結合しているIL-15Rαと非共有結合しているIL-15を含有している融合タンパク質複合体を作成することが望ましい。用語Fcは、単量体又は多量体の形態にあるかに関わらず、全抗体の非抗原結合断片の配列を含んでいる分子又は配列への言及を意味する。天然型Fcの原免疫グロブリン供給源はヒト起源であることが好ましく、何れかの免疫グロブリンであってもよいが、IgG1及びIgG2が好ましい。天然型Fcは二量体又は多量体形態内へ共有結合すなわち、ジスルフィド結合及び非共有関係で結合できる単量体ポリペプチドで構成されている。天然型Fc分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス例えば、IgG、IgA、IgE又はサブクラス例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2に依存して1~4の範囲にある。天然型Fcの一例は、IgGのパパイン消化由来のジスルフィド結合した二量体であるEllisonetalNucleicAcidsRes1040719を参照されたい。本明細書で用いられる用語天然型Fcは単量体、二量体、及び多量体形態に対する総称である。FcドメインはプロテインA、プロテインG、各種のFc受容体及び相補タンパク質に対する結合部位を含有している。ある実施態様では、用語Fc変異体は、天然型Fcから改変されているがサルベージ受容体であるFcRnへの結合部位を未だ含んでいる分子又は配列への言及を意味する。国際出願第WO97/34631号1997年9月25日公開及び同第WO96/32478号公報は例示的なFc変異体を、更にはサルベージ受容体との相互作用を記載していて、これは参照により本明細書に組み込まれている。従って、用語Fc変異体は非ヒト天然型Fcからヒト化された分子又は配列を含んでいる。更に、天然型Fcは、本発明の融合タンパク質に必要がない構造特性或いは生物活性をもたらすので除去されてもよい部位を含んでいる。従って、ある特定の実施態様では、用語Fc変異体は、1ジスルフィド結合形成、2選択された宿主細胞との不適合性、3選択された宿主細胞における発現に対するN-末端異種混交化、4グリコシル化、5相補体との相互作用、6サルベージ受容体以外のFc受容体への結合、又は7抗体依存性の細胞傷害ADCCに影響を及ぼすか或いはこれに関与する天然型Fcの部位又は残基の1つ又はそれ以上を欠失した分子又は配列を含んでいる。Fc変異体は以下に更に詳細に記載されている。用語Fcドメインは、天然型Fc及びFc突然変異分子、並びに上記の配列を包含する。Fc変異体及び天然型Fcと同様に、用語Fcドメインは、全抗体から消化されたか或いは組み替え遺伝子発現により又は別の方法で産生されたかに関わらず、単量体又は多量体形態にある分子を包含する。T細胞受容体TCRT細胞はその他の免疫細胞型多形核球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、B細胞、NK細胞と共に免疫系の細胞要素を構成する、細胞のサブグループである。生理的条件下で、T細胞は免疫監視において並びに外来抗原の排除において機能する。しかしながら、病的条件下では、T細胞が疾患の原因及び伝播において重要な役割を果すという強力な証拠がある。これらの疾患において、中枢又は末梢における、T細胞免疫寛容の破綻は自己免疫疾患の原因における基本的な過程である。TCR複合体は少なくとも7つの膜貫通タンパク質から成っている。ジスルフィド結合したαβ又はγδヘテロ二量体は単一型抗原認識ユニットを形成するが、ε、γ、δ、ξ、及びη鎖から成る、CD3の不変鎖は、T細胞活性化及び細胞免疫応答の同化をもたらすシグナル伝達経路へのリガンド結合のカップリングに関与する。TCR鎖の遺伝子多様性にも関わらず、2つの構造特性が全ての公知サブユニットに共通している。第1に、これらは恐らくα螺旋である、一本鎖膜貫通ドメインを有する膜貫通タンパク質である。第2に、全てのTCR鎖は予測される膜貫通ドメイン内に荷電アミノ酸を保有しているという独特な特性を有している。不変鎖はマウスとヒトの間に保存されている、単一の負の電荷を有し、そして可変鎖は1つのTCR-β又は2つのTCR-α正電荷を保有している。TCRの膜貫通配列は多数の種で高度に保存されているので、系統発生的に重要な役割を果しているのだろう。親水性アミノ酸、アルギニン及びリジンを含んでいるオクタペプチド配列が種の間で一致している。T細胞の応答はTCRに結合している抗原によって調節される。TCRの1つの型は、免疫グロブリン可変V及び定常C領域に類似しているα及びβ鎖からなる膜結合ヘテロ二量体である。TCRのα鎖が共有結合したV-αとC-α鎖を包含しているの対して、β鎖はC-β鎖と共有結合しているV-β鎖を包含している。V-α及びV-β鎖は、主要な組織的適合性複合体MHCヒトではHLA複合体として知られているとの関連でスーパー抗原又は抗原を結合できるポケット又は裂け目を形成する。概して、DavisAnnRevofImmunology3537FundamentalImmunology3rdEdWPaulEdRsenPressLTDNewYorkを参照されたい。TCR鎖αβ又はγδの細胞外ドメインも、細胞表面上で発現するための異種膜貫通ドメインとの融合体として遺伝子操作できる。このようなTCRは、CD3、CD28、CD8、4-1BB及び/又はキメラ活性化受容体CAR膜貫通又は活性化ドメインとの融合体を包含する。TCRは1つ又はそれ以上のαβ又はγδ鎖の抗原結合ドメインを含む可溶性タンパク質であってもよい。このようなTCRはTCR定常ドメインを有しているか又は有していないTCR可変ドメイン又はその機能的断片を包含してもよい。可溶性TCRはヘテロ二量体又は一本鎖分子であってもよい。融合タンパク質複合体本発明の可溶性融合タンパク質及び共役分子複合体は少なくとも2つの可溶性融合タンパク質を含んでいる。ある特定の実施態様では、第1融合タンパク質は、インターロイキン-15IL-15又はその機能的断片と共有結合している第1生物活性ポリペプチドを含み;第2融合タンパク質は可溶性インターロイキン-15受容体αIL-15Rαポリペプチド又はその機能的断片と共有結合している第2生物活性ポリペプチドを含み、そしてここで第1融合タンパク質のIL-15ドメインは第2融合タンパク質の可溶性IL-15Rαドメインと結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。本発明の融合タンパク質複合体は第1及び第2融合タンパク質の一方又は両方と結合している免疫グロブリンFcドメイン又はその機能的断片も含んでいる。Fcドメインが第1及び第2融合タンパク質と結合するFcドメインが相互作用して融合タンパク質複合体を形成することが好ましい。このような複合体は免疫グロブリンFcドメイン間にジスルフィド結合を形成することにより安定化させることができる。ある特定の実施態様では、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、IL-15ポリペプチド、IL-15変異体又はその機能的断片及び可溶性IL-15Rαポリペプチド又はその機能的断片を包含し、そこではIL-15及びIL-15Rαポリペプチドの一方又は両方が免疫グロブリンFcドメイン又はその機能的断片を更に包含している。ある特定の実施例では、生物活性ポリペプチドの1つが第1可溶性TCR又はその断片を含んでいる。別の又は第2生物活性ポリペプチドが第1可溶性TCR又はその機能的断片を含んでいるので、1価TCRと比べて同種リガンドに対する増大した結合活性を有する多価TCR融合タンパク質複合体を作り出す。更に、別の生物活性ポリペプチドは第1可溶性TCRとは異なる第2可溶性TCR又はその機能的断片を含んでいる。ある特定の実施例では、TCRは、例えば、天然型TCRと比較して同種リガンドに対するより高い親和性又は増大した結合親和性を有するものとして産生される。本明細書に記載されているような本発明の可溶性TCRがそのリガンドに対してより高い活性又は親和性を有している場合、細胞表面結合抗原に対する特異的なプローブとして有用である。本発明のある特定の好ましい実施例では、TCRは特定抗原の認識に対して特異的である。典型的な実施態様では、TCRはα鎖本明細書ではα、アルファ、又はa鎖という及びβ鎖本明細書ではβ、ベータ、又はb鎖というを含有しているヘテロ二量体である。別の典型的な実施態様では、TCRは一本鎖TCRポリペプチドを含んでいる。一本鎖TCRはペプチドリンカー配列によってTCRV-β鎖と共有結合しているTCRV-α鎖を含んでいてよい。一本鎖TCRは更にTCRV-β鎖と共有結合している可溶性TCRCβ鎖断片を含んでいてもよい。一本鎖TCRは更にTCRV-α鎖と共有結合している可溶性TCRCα鎖断片を含んでいてもよい。更なる実施態様では、第1及び第2生物活性ポリペプチドの一方又は両方が抗体又はその機能的断片を含んでいる。別の実施態様では、TCRドメインに対する抗原はMHC又はHLA分子中に存在するペプチド抗原を含んでいる。更なる実施態様では、ペプチド抗原は腫瘍関連ポリペプチド又はウィルスがコードするポリペプチドに由来している。別の実施態様では、抗体ドメインに対する抗原は細胞表面受容体又はリガンドを含んでいる。更なる実施態様では、抗原はCD抗原、サイトカイン又はケモカイン受容体又はリガンド、成長因子受容体又はリガンド、組織因子、細胞接着分子、MHC/MHC様分子、Fc受容体、Toll様受容体、NK受容体、TCR、BCR、陽性/陰性同時刺激受容体又はリガンド、死受容体又はリガンド、腫瘍関連抗原、或いはウィルスがコードする抗原を含んでいる。本明細書で用いられる用語生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は、本明細書で検討するような所望の効果を生み出すことのできる、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド;糖又は多糖;脂質又は糖脂質、糖タンパク質、又はリポタンパク質のようなアミノ酸配列を意味する。エフェクター分子は化学物質も包含する。生物活性又はエフェクタータンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするエフェクター分子核酸も意図されている。従って、適切な分子は調節因子、酵素、抗体又は薬剤、更にはDNA、RNA、及びオリゴヌクレオチドを包含する。生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は天然由来であってもよく或いは公知成分から、例えば、遺伝子組み換え又は化学合成、によって合成でき、そして異種成分を包含できる。生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は通常、遠心分離又はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような標準的分子サイズ測定技術で評価して、約0.1~100KD又は最大で約1000KDの大きさ、好ましくは約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30及び50KDの間である。本発明の望ましい効果は、これに限定されないが、例えば、増大した結合活性を有する本発明の融合タンパク質複合体を形成すること、標的細胞を殺傷して、例えば、疾患の予防又は治療において、細胞増殖又は細胞死を誘発して、免疫応答を開始すること、又は診断目的で検出分子として作用することを包含する。このような検出のために、アッセイを用いることができ、例えば、それを増殖するために細胞を培養すること、及び細胞を本発明のTCR融合複合体と接触させること、次いでTCR融合複合体が細胞の更なる発生を阻害するか否かを評価することを含んでいるアッセイを用いることができる。本発明に従って本発明の融合タンパク質複合体にエフェクター分子を共有結合することは多くの重要な利点をもたらす。公知構造のペプチドのようなものを包含している、単一のエフェクター分子を含んでいる本発明の融合タンパク質複合体を産生できる。更に、多種のエフェクター分子を同様のDNAベクターに産生できる。すなわち、感染細胞又は病的細胞を認識するために、異なったエフェクター分子のライブラリーを融合タンパク質複合体に結合することができる。更に、治療適用のために、本発明の融合タンパク質複合体の対象への投与よりむしろ、融合タンパク質複合体をコードするDNA発現ベクターを融合タンパク質複合体のインビボ発現のために投与できる。このような手法は典型的に組み換えタンパク質の製造に関連しているコストのかかる精製工程を避け、そして従来の手法に関連している抗原の取り込み及び処理の複雑さを避けることができる。述べたように、本明細書に開示されている融合タンパク質の成分、例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク毒素、免疫グロブリンドメイン又はその他の生物活性分子のようなエフェクター分子及び何れかのペプチドリンカーを、融合タンパク質が意図されている機能を有するという条件で、ほぼ任意の方法で構造化できる。具体的には、融合タンパク質のそれぞれの成分を所望により、少なくとも1つの適切なペプチドリンカー分別の成分と距離を空けることができる。更に、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の改変、同定及び/又は精製を促進するために、タグを包含できる。より具体的な融合タンパク質は以下に記載されている実施例中にある。リンカー本発明の融合複合体は、IL-15又はIL-15Rαドメインと生物活性ポリペプチドの間に挿入されたフレキシブルなリンカー配列も包含していることが好ましい。リンカー配列は、IL-15又はIL-15Rαドメインに対する生物活性ポリペプチドの効果的な位置決めが両方のドメインに機能活性を持たせるようにしなければならない。生物活性ポリペプチドがTCRである場合の実施態様では、リンカー配列は、T細胞受容体が提示MHCペプチド複合体を認識できるように、そしてエフェクター分子を望ましい位置へ送達できるように、TCR分子結合溝を位置付ける。エフェクター分子の良好な提示は、T細胞を培養してこれを増殖すること、T細胞を本発明のTCR融合複合体と接触させること、そしてTCR融合複合体が細胞の更なる発生を阻害するか否かを評価することの連続工程を含んでいるインビトロアッセイを包含している、以下に開示されているアッセイによって確認されるように、細胞がT細胞増殖を誘発又は阻害するか、或いは特定部位に対する免疫応答を開始するか阻害するかの何れかの細胞の活性を調節することができる。ある特定の実施態様では、可溶性融合タンパク質複合体は、第1生物活性ポリペプチドがポリペプチドリンカー配列によってIL-15又はその機能的断片に共有結合しているリンカーを有している。別の特定の実施態様では、本明細書に記載されているような可溶性融合タンパク質複合体は、第2生物活性ポリペプチドがポリペプチドリンカー配列によってIL-15Rαポリペプチド又はその機能的断片に共有結合しているリンカーを有している。提示抗原を認識するためにTCR分子の結合溝を、或いは抗原を認識するために抗体分子の結合ドメインを効果的に位置づけることができるペプチドをもたらすヌクレオチド配列によって、リンカー配列がコードされることが好ましい。本明細書で用いられる語句IL-15又はIL-15Rαドメインに対する生物活性ポリペプチドの効果的な位置決め、又は同様の語句は、IL-15又はIL-15Rαドメインに結合している生物活性ポリペプチドが、IL-15又はIL-15Rαドメインが互いに相互作用してタンパク質複合体を形成できるように位置していることを意味するように意図されている。ある特定の実施態様では、IL-15又はIL-15Rαドメインが免疫細胞と相互作用して免疫反応を開始又は阻害するか、或いは細胞の成長を阻害又は刺激するこを許容するように効果的に位置している。本発明の融合複合体は、IL-15又はIL-15Rαドメインと免疫グロブリンFcドメインの間に挿入されたフレキシブルなリンカー配列も包含していることが好ましい。リンカー配列は、Fcドメイン、生物活性ポリペプチド及びIL-15又はIL-15Rαドメインを、それぞれのドメインが機能活性を持つように、効果的に位置つけるようにしなければならない。ある特定の実施態様では、Fcドメインは、適切な融合タンパク質複合体形成及び/又は免疫細胞又は相補体系のタンパク質上のFc受容体との相互作用を許容して、オプソニン化、細胞溶解、マスト細胞、好塩基球及び好酸球の脱顆粒、並びにその他のFc受容体依存性の過程;を包含するFcが介在する効果を刺激し;相補経路を活性化し;そして融合タンパク質複合体のインビボ半減期の増大することを可能にするように効果的に位置決めされている。リンカー配列は生物活性ポリペプチドの2つ又はそれ以上を結合して所望の機能活性を有する一本鎖分子を生成するためにも用いることができる。リンカー配列は好ましくは約7~20個のアミノ酸を、より好ましくは約8~16個のアミノ酸を含んでいる。リンカー配列は、望ましくない単一構造中に生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子を保持しないようにフレキシブルであることが好ましい。リンカー配列は、例えば、認識部位を融合分子から距離をあけて置くために用いることができる。具体的には、ペプチドリンカー配列を、例えば、これを化学的に架橋して分子柔軟性をもたらすために、生物活性ポリペプチドとエフェクター分子の間に位置付けることができる。リンカーは主にグリシン、アラニン及びセリンのような小さい側鎖を有するアミの酸を含んでいて柔軟性をもたらすことが好ましい。好ましくは、リンカー配列の約80又は90又はそれ以上がグリシン、アラニン、又はセリン残基を、特にグリシンとセリン残基を含有している。ヘテロ二量体TCRを含んでいる融合タンパク質複合体に関しては、リンカー配列はTCR分子のa鎖にも結合できるが、リンカー配列はTCR分子のβ鎖に適切に結合する。あるいは、リンカー配列はTCR分子のα及びβ鎖の両方に結合できる。このようにβペプチド鎖がα鎖と共に発現された場合は、結合したTCRポリペプチドは、図1に大まかに描かれているように畳み込まれて機能的なTCR分子をもたらす。1つの適切なリンカー配列は、ASGGGGSGGGすなわちAlaSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyであり、TCRのβドメインの第1アミノ酸と結合していることが好ましい。抗体可変領域を共に結合するために良好に用いられている多くのフレキシブルリンカーデザインの何れかを包含する異なったリンカー配列を用いることができる。WhitlowMetalMethodsACompaniontoMethodsinEnzymology297105を参照されたい。ある実施例では、エフェクター分子をTCRβ鎖分子と共有結合するために、リンカーのアミノ配列は、TCRβ鎖のC末端残基からエフェクター分子のN末端残基までの適切な距離を橋渡しすることができる。適切なリンカー配列を実験的に容易に確認することができる。また、リンカー配列の適切な大きさ及び配列もTCR分子の予測サイズ及び形状に基づいて従来のコンピュータモデリング技術によって確認できる。一般に、本発明の融合タンパク質複合体の製造は本明細書に開示されている方法により及び、例えば、ポリメラーゼ連鎖増幅反応PCR、プラスミドDNAの製造、制限酵素を用いるDNAの開裂、オリゴヌクレオチドの製造、DNAのライゲーション、mRNAの単離、DNAの適切な細胞への導入、宿主の形質転換又はトランスフェクション、宿主の培養に関する広く認められている組み換えDNA技術によって遂行できる。更に、融合分子はカオトロピック剤及び周知の電気泳動、遠心分離及びクロマトグラフィー方法を用いて単離及び精製できる。これらの方法に関する開示について、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualandAusubeletalCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNewYorkを概して参照されたい。本明細書で用いられている本発明の生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメイン又は酵素のようなその他の生物活性タンパク質のような因子を包含できる。また、生物活性ポリペプチドは、非タンパク質毒素、細胞毒性薬、化学療法剤、検出可能な標識,放射活性物質等のようなその他の化合物との複合体を包含できる。本発明のサイトカインは、他の細胞に影響を及ぼして細胞免疫性の様々な複数効果の何れかに関与する、細胞によって産生される何れかの因子によって定義される。サイトカインの例は、これに限定されないが、IL-2ファミリー、インターフェロンIFN、IL-10、IL-1、ILー17、TGF及びTNFサイトカインファミリー、及びIL-1からIL-35、INF-α、INF-β、INFγ、TGFβ、TNFα、並びにTNFβを包含する。本発明の一態様では、第1融合タンパク質はインターロイキン-15IL-15ドメイン又はその機能的断片と共有結合している第1生物活性ポリペプチドを含んでいる。IL-15はT細胞の活性化及び増殖に影響を及ぼすサイトカインである。免疫細胞の活性化及び増殖に作用するIL-15活性は、ある意味ではIL-2と類似しているが、根本的な違いはよく特徴付けられているWaldmannTA2006NatureRevImmunol6595601。本発明の別の態様では、第1融合タンパク質はIL-15変異体本明細書ではIL-15突然変異体ともよぶであるインターロイキン-15IL-15ドメインを含んでいる。IL-15変異体は、天然型又は野生型IL-15タンパク質とは異なったアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。IL-15変異体はIL-15Rαポリペプチドと結合してIL-15アゴニスト又はアンタゴニストとして機能することが好ましい。アゴニスト活性を伴うIL-15変異体はスーパーアゴニスト活性を有していることが好ましい。ある実施態様では、IL-15変異体はその1L-15Rαとの関連とは独立してIL-15アゴニスト又はアンタゴニストとして作用する。IL-15アゴニストは野生型IL-15と比較して相当の又は増加した生物活性によって例示される。IL-15アンタゴニストは野生型と比較して減少した生物活性で、又はIL-15が介在する応答を阻害する能力によって例示される。ある例では、IL-15変異体は増大した又は減少した活性でIL-15RβγC受容体と結合する。ある実施態様では、IL-15変異体の配列は、天然型IL-2配列と比べて、少なくとも1つのアミノ酸変化、例えば、置換又は欠失を有していて、このような変化はIL-15アゴニスト又はアンタゴニスト活性をもたらす。アミノ酸置換/欠失がIL-15Rβ及び/又はγCと相互作用するIL-15のドメイン内にあることが好ましい。アミノ酸置換/欠失がIL-15Rαとの結合或いはIL-15変異体を産生する能力に影響を及ぼさないことがより好ましい。IL-15変異体を生成する適切なアミノ酸置換/欠失は、想定される又は公知のIL-15構造、公知構造を有するIL-2のような同族分子とIL-15との比較に基づいて、本明細書で提供されているように、又はその他の実験方法で、合理的な或いは無作為的な突然変異生成及び機能アッセイによって確認できる。更なる適切なアミノ酸置換は同類又は非同類変化及び追加のアミノ酸の挿入である。本発明のIL-15変異体が、天然の成熟型ヒトIL-15配列の6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、109、111、又は112位に1つ又はそれ以上の1つのアミノ酸置換/欠失を含んでいることが好ましく;特にD8ND8は天然型成熟ヒトIL-15配列のアミノ酸及び残基位置を示し、そしてNはIL-15変異体のその位置で置換されたアミノ酸残基を示す、I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P又はQ108A置換はアンタゴニスト活性を有するIL-15変異体もたらして、N72D置換はアゴニスト活性を有するIL-15変異体をもたらす。サイトカインと同様に、ケモカインは、他の細胞に暴露されたときに細胞免疫の様々な複数効果の何れかに関与する、化学因子又は分子の何れかと定義される。適切なケモカインは、これに限定されないが。CXC、CC、C及びCX3Cケモカインファミリー、CCL-1からCCL-28、CXC-1からCXC-17、XCL-1、XCL-2、CX3CL1、MIP-1b、IL-8、MCP-1、及びランテスを包含する。成長因子は、特定の細胞に暴露されると病的細胞の増殖及び/又は分化を誘発する何れかの分子を包含する。成長因子はタンパク質及び化学分子を包含し、その幾つかは、GM-CSF、G-CSF、ヒト成長因子及び幹細胞成長因子を包含する。毒素又は細胞毒性薬は、細胞に暴露されたときに致死効果又は生育に対する阻害効果を有する物質の何れかを包含する。より具体的には、エフェクター分子は、例えば、ジフテリア毒素DT、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、シュードモナス外毒素PE、ヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質、又はゲロニンのような、植物又は細菌起源の細胞毒素であってよい。このような毒素の生物活性断片は当該技術分野において周知であって、例えば、DTA鎖及びリシンA鎖を包含する。更に、毒素は、例えば、ホスホリパーゼ酵素例えば、ホスホリパーゼCのような細胞表面で活性な薬剤であってよい。更に、エフェクター分子は、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、アドリアマイシン、ブレオマイシン、又はシスプラチンのような化学療法剤であってよい。更に、エフェクター分子は診断又は画像検討に適している検出可能な標識化分子であってよい。このような標識はビオチン、又はストレプタビジン/アビジン、検出可能なナノ粒子又は結晶、酵素又はその触媒活性断片;緑色蛍光タンパク質、FITC、フィコエリトリン、チクローム、テキサスレッド又は量子ドットのような蛍光標識;放射性核種、例えば、ヨウ素-131、イットリウム-90、レニウム-188、又はビスマス-212;リン発光或いはケミルミネセント分子、又はGd--又は常時性金属イオンをベースにした造影剤のような、PET、超音波又はMRIによって検出可能な標識を包含する。エフェクター又はタグを含んでいるタンパク質の製造及び使用に関連する開示について、例えば、MoskaugetalJBiolChem26415709PastanIetalCell476411986PastanetalRecombinantToxinsasNovelTherapeuticAgentsAnnRevBiochem61331ChimericToxinsOlsnesandPhilPharmacTher25355PCT出願公開第WO94/29350号;PCT出願公開第WO94/04689号PCT出願公開第WO2005046449号及び米国特許第5,620,939号を参照されたい。共役結合したIL-15及びIL-15Rαドメインを包含しているタンパク質融合又は共役複合体はいくつかの重要な用途を有している。例えば、TCRを含んでいるタンパク質融合又は共役複合体は、IL-15:IL-15Rα複合体を特異的にTCRを結合できるある特定の細胞へ送達するために用いることができる。従って、タンパク質融合又は共役複合体は、リガンドを含有している細胞を選択的に損傷又は殺傷する手段を提供する。TCRを含有しているタンパク質融合又は共役複合体のよって損傷又は殺傷可能な細胞又は組織の例は、TCRによって特異的に結合できる1つ又はそれ以上のリガンドを発現している腫瘍及びウィルス又は細菌に感染した細胞を包含する。損傷又は殺傷を受けやすい細胞又は組織は本明細書に開示されている方法で容易にアッセイできる。本発明のIL-15及びIL-15Rαポリペプチドは、天然由来のIL-15及びIL-15Rα分子、例えば、ヒト、マウス或いはその他の齧歯動物、又はその他の哺乳動物のIL-15及びIL-15Rα分子とアミノ酸配列において適切に対応する。これらのポリペプチド及びコードする核酸の配列は文献中で公知であって、ヒトインターロイキン15IL15mRNA-GenBank:U14407.1、ハツカネズミ筋肉インターロイキン15IL15mRNA-GenBank:U14332.1、ヒトインターロイキン-15受容体α鎖前駆体IL-15RAmRNA-GeneBank:U31628.1、ツカネズミ筋肉インターロイキン15受容体、α鎖-GenBank:BC095982.1を包含する。ある設定では、本発明の多価体のタンパク質融合又は共役複合体を、例えば、sc-TCR又はsc-抗体の結合価を増やすために作成することは有用である。特に、融合タンパク質複合体のIL-15とIL-15Rαドメインの間の相互作用は多価複合体を作成する手段を提供する。また、多価融合タンパク質は、例えば、標準的なビオチン-ストレプタビジン標識化技術を用いて1~4つの間のタンパク質同一又は異なっていると共に共有結合又は非共有結合で結合するか、又はラテックスビーズのような適切な固体支持体へ接合して作成できる。化学的に架橋したタンパク質例えば、デンドリマーへ架橋も適切な多価の種である。例えば、タンパク質を、ビオチニル化BirAタグ或いはCys又はHisのように化学反応性側鎖を有するアミノ酸残基のように改変できるタグ配列をコードする配列を包含させることにより、改変できる。このようなアミノ酸タグ又は化学反応性アミノ酸を融合タンパク質内の様々な位置に、好ましくは生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子の活性部位から離して、位置付けることができる。例えば、可溶性融合タンパク質のC-末端をタグ又はそのような反応性アミノ酸複数を含むを含有している別の融合タンパク質と共有結合させることができる。2つ又はそれ以上の融合タンパク質を適切なデンドリマ-又はその他のナノ粒子と化学的に結合して多価の分子を得るために適切な側鎖を包含させることができる。デンドリマーは、その表面の多数の異なった官能基のうちの何れか1つを有することができる合成化学ポリマーであるDTomaliaAldrichimicaActa2691101。本発明に従って用いるための例示的なデンドリマーは、例えば、システイン残基を結合できる、E9星形ポリアミンデンドリマー及びE9可燃性ポリアミンデンドリマーを包含する。例示的なナノ粒子はリポソーム、コアシェル粒子又はPLGAをベースとする粒子を包含する。本発明の別の実施態様では、融合タンパク質複合体の一方又は両方のポリペプチドは免疫グロブリンドメインを含んでいる。あるいは、タンパク質結合ドメイン-IL-15融合タンパク質は免疫グロブリンドメインと更に結合できる。好ましい免疫グロブリンドメインは、別の免疫グロブリンドメインと相互作用して上で提供されるような多重鎖タンパク質を形成できる領域を含んでいる。例えば、IgG1CH2-CH3のような、免疫グロブリン重鎖領域は安定に相互作用してFc領域を作り出す。Fcドメインを包含している好ましい免疫グロブリンドメインは、Fc受容体又は相補タンパク質結合活性を包含しているエフェクター機能を有する、及び/又はグリコシル化部位を有する領域も含有している。ある実施態様では、融合タンパク質複合体の免疫グロブリンドメインは、Fc受容体又は相補体の結合活性又はグリコシル化を減少又は増大して、それにより得られたタンパク質の生物活性に影響を及ぼす突然変異を含んでいる。例えば、Fc受容体への結合を減少させる突然変異を含有している免疫グロブリンドメインを、Fc受容体担持細胞への低結合活性を有する本発明の融合タンパク質複合体を生成するために用いることができ、これは特異抗原を認識又は検出するように設計された試薬にとって有利である。核酸及びベクター本発明は更に、核酸配列及び特に本発明の融合タンパク質をコードするDNA配列を提供する。好ましくは、DNA配列は、ファージ、ウィルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、YAC、又はエピソームのような細胞外複製に適しているベクターによって担持されている。特に、所望の融合タンパク質をコードするDNAベクターを本明細書に記載されている調製方法を促進して有意量の融合タンパク質を得るために用いることができる。DNA配列を適切な発現ベクター、すなわち、挿入されるタンパク質をコードする配列の転写及び翻訳に必須の要素を含有しているベクターに挿入できる。各種の宿主-ベクター系を、タンパク質をコードする配列を発現するために用いることができる。これらは、ウィルスに感染した哺乳動物細胞系例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルス等;ウィルスに感染した昆虫細胞系例えば、バキュロウィルス;酵母ベクターを含有している酵母、又はバクテリオファージDNA、プラスミドDNA或いはコスミドDNAで形質転換された細菌のような微生物を包含する。用いた宿主-ベクター系に応じて、多数の適切な転写及び翻訳要素のうちの何れか1つを用いることができる。概して前記Sambrooketal及び前記Ausubeletalを参照されたい。可溶性融合タンパク質複合体を作成する方法が本発明に含まれていて、方法は本明細書に記載されているように第1及び第2融合タンパク質をコードするDNAベクターを宿主細胞に導入すること、細胞又は培地中に融合タンパク質を発現して、第1融合タンパク質のIL-15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性IL-15Rαドメインの間を会合させて可溶性融合タンパク質複合体を形成させるのに十分な条件下で宿主細胞を培養すること、可溶性融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製することを含んでいる。一般に、本発明の好ましいDNAベクターは、5’から3’方向に、生物活性ポリペプチドをコードする第1ヌクレオチド配列を導入するための、エフェクター分子をコードする配列と操作可能に結合する第1クローニング部位を含有しているリン酸ジエステル結合によって結合しているヌクレオチド配列を含有している。DNAベクターでコードされる融合タンパク質成分はカセット形式で提供されてもよい。用語カセットとは、標準的な組み換え方法で各成分を別の成分に容易に置き換えることができることを意味する。特に、カセット形式に構成されたDNAベクターは、コードされた融合複合体を、血清型を有しているか又は発生させる能力を有している病原菌に対して用いられる場合に特に望ましい。融合タンパク質複合体をコードするベクターを作成するために、生物活性ポリペプチドをコードする配列を、適切なリガーゼを用いてエフェクターペプチドをコードする配列に結合する。提示されるペプチドをコードするDNAは適切な細胞株からのように天然の供給源からDNAを単離して、又は公知の合成方法、例えば、リン酸トリエステル方法によって得ることができる。例えば、OligonucleotideSynthesisIRLPressを参照されたい。合成オリゴヌクレオチドも市販の自動オリゴヌクレオチド合成器を用いて製造することができる。単離されたら、生物活性ペプチドをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応PCR又は当該技術分野で公知のその他の手段で増幅できる。生物活性ポリペプチド遺伝子を増幅するのに適切なPCRプライマーはPCR産物へ制限酵素認識部位を添加できる。PCR産物は好ましくはエフェクターペプチド用のスプライス部位及び生物活性ポリペプチド-エフェクター融合複合体の適切な発現及び分泌に必要なリーダー配列を含んでいる。PCR産物がリンカー配列をコードする配列、或いはこのような配列のライゲーションのための制限酵素部位を包含していることも好ましい。本明細書に記載されている融合タンパク質は、標準的な遺伝子組み換えDNA技術によって産生されることが好ましい。例えば、生物活性ポリペプチドをコードするDNA分子が単離されたら、配列をエフェクターポリペプチドをコードする別のDNA分子にライゲート結合することができる。生物活性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、エフェクターペプチドをコードするDNA配列と直接結合してもよい、又はより典型的には、本明細書で検討されたようなリンカー配列をコードするDNA配列を生物活性ポリペプチドをコードする配列とエフェクターペプチドをコードする配列の間に置いて適切なリガーゼを用いて結合させてよい。得られるハイブリッドDNA分子を適切な宿主細胞内で発現させて融合タンパク質複合体を産生できる。DNA分子を5’から3’方向に互いにライゲートして、ライゲーション後にコードされるポリペプチドの翻訳フレームが変化しないようにするすなわち、DNA分子をフレーム中で互いにライゲートする。得られるDNA分子はインフレーム融合タンパク質をコードする。その他のヌクレオチド配列も遺伝子構築物中に包含させることができる。例えば、エフェクターペプチドと融合した生物活性ポリペプチドをコードする配列の発現を制御する、プロモーター配列これは融合タンパク質を細胞表面又は培養培地に移動させるを、リーダー配列を構築物中に含有させるか、又は構築物が挿入されている発現ベクター中に存在させることができる。免疫グロブリン又はCMVプロモータが特に好ましい。変異生物活性ポリペプチド、IL-15、IL-15Rα又はFcドメインをコードする配列を得るときに、当業者は生物活性の損失又は減少なしで、ある特定のアミノ酸置換、付加、欠失及び翻訳後改変によってポリペプチドを改変できることを認識するだろう。特に、同類アミノ酸置換は周知である。すなわち、1つのアミノ酸を類似した大きさ、荷電、極性及び構造のアミノ酸による置換はタンパク質機能を有意に変化させる可能性は少ない。タンパク質の構成要素である20の標準アミノ酸は以下のように同類アミノ酸の4群に大まかに分類できる:非極性親水性グループはアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びバリンを包含する;極性非荷電、中性グループはアスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを包含する;正の荷電をもつ塩基性グループはアルギニン、ヒスチジン及びリジンを含む;及び負の荷電をもつ酸性グループはアスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。タンパク質において1つのアミノ酸の同じグループ内の別のアミノ酸による置換は、タンパク質の生物活性に対して不都合な影響を殆ど有さない。別の例では、アミノ酸位置の改変がタンパク質の生物活性を減少又は増強させることができる。このような変化は、不規則に、或いは標的残基の公知又は予測される構造、及び機能の特性に基づく部位特異的突然変異を介して導入できる。変異タンパク質の発現に続いて、改変に起因する生物活性の変化を結合又は機能アッセイを用いて容易に評価できる。ヌクレオチド配列間の相同性は、DNAハイブリダイゼーション分析によって確認でき、ここで2重鎖DNAハイブリッドの安定性は生じる塩基対の程度に依存している。高温度及び/又は低塩含量の条件はハイブリッドの安定性を減少させ、そして選択された程度より低い相同性を有する配列のアニールを阻害するように変化させることができる。例えば、約55のG-C含量を有する配列については、40~50C、6×SSC塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム緩衝液及び0.1SDSドデシル硫酸ナトリウムのハイブリッド及び洗浄条件が約60~70の相同性を示し、50~65C、1×SSC及び0.1SDSのハイブリッド及び洗浄条件が約82~97の相同性を示し、そして52C、0.1×SSC及び0.1SDSのハイブリッド及び洗浄条件は約99~100の相同性を示す。ヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較する及び相同性の程度を測定するための広範囲のコンピュータプログラムも利用可能で、市販及び無料ソフトウェアの両方の供給源を提供するリストはAusbeletalに見出せる。容易に入手できる配列比較及び複数配列アラインメントアルゴリズムは、それぞれ、theBasicLocalAlignmentSearchTool及びClustalWprogramsである。BLASTは世界的なウェブ、ncbinlmnihgovで入手可能であって、ClastalWのバージョンは2ebiacukで入手可能である。融合タンパク質の成分は、それぞれがその意図される機能を果たすことができれば、殆ど任意の順序で構成させることができる。例えば、ある実施多様では、生物活性ポリペプチドはエフェクター分子のC又はN末端に位置付けられる。本発明の好ましいエフェクター分子は、これらのドメインが意図している機能をもたらすサイズを有するだろう。本発明のエフェクター分子は、周知の化学架橋方法を含む多種の方法によって作成されて生物活性ポリペプチドと融合させることができる。例えば、MeansGEandFeeneyREinChemicalModificationofProteinsHoldenDayを参照されたい。SSWonginChemistryofProteinConjugationandCrossLinkingCRCPressも参照されたい。しかしながら、インフレーム融合タンパク質を作成する組み換え操作を用いることが一般に好ましい。述べたように、本発明による融合分子又は共役分子は幾つかの方法で構成できる。例示的な構造では、生物活性ポリペプチドのC-末端がエフェクター分子のN末端に操作可能に結合している。この結合は所望により組み替え方法で実現できる。しかしながら、別の構造では、生物活性ポリペプチドのN末端がエフェクター分子のC末端に結合している。その代わりに、或いは更に、必要に応じて、1つ又はそれ以上の追加エフェクター分子を生物活性ポリペプチド又は共役複合体内へ挿入することができる。ベクター及び発現本発明のタンパク質融合複合体を発現するために多数の戦略を用いることができる。例えば、上記の融合タンパク質構築物を、構築物を挿入し次いでライゲーションするために、ベクターに切れ目を入れる制限酵素を用いるような公知の方法によって適切なベクターに組み込むことができる。次いで融合タンパク質の発現のために、遺伝子構築物を含有しているベクターを適切な宿主に導入する。概要は、前記のSambrooketalを参照されたい。適切なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関する因子に基づいて経験的に行うことができる。例えば、ベクターは用いられている宿主に適合し、そしてこれに対して適切なレプリコンを有していなければならない。更に、ベクターは、発現されるべき融合タンパク質複合体をコードするDNA配列を収容できなければならない。適切な宿主細胞は真核及び原核細胞を包含し、容易に形質転換できて培養培地中で迅速な成長を示すものが好ましい。特に好ましい宿主細胞は、E.coli、Bacillussubtillus等のような原核細胞、及び動物細胞及び酵母株、例えば、S.cerevisiaeのような真核細胞を包含する。哺乳動物の細胞、特にJ588、NSO、SP2-O又はCHOが一般に好ましい。その他の適切な宿主は、例えば、Sf9のような昆虫細胞を包含する。従来の培養条件が用いられる。前記のSambrookを参照されたい。次いで、安定に形質転換された又はトランスフェクトされた細胞株を選択できる。本発明の融合タンパク質複合体を発現する細胞を公知の手順によって確認できる。例えば、免疫グロブリンと結合している融合タンパク質複合体の発現は、結合した免疫グロブリンに特異的なELISA及び/又はイムノブロッティングによって確認できる。IL-15又はIL-15Rαドメインに結合している生物活性ポリペプチドを含有している融合タンパク質の発現を検出するためのその他の方法は実施例に開示されている。上で大まかに述べたように、宿主細胞は、所望の融合タンパク質をコードする核酸を繁殖させるための予備的目的で用いることができる。従って、宿主細胞は融合タンパク質の産生を特異的に意図している原核又は真核細胞を包含できる。従って、宿主細胞は具体的に、酵母、ハエ、蠕虫、植物、カエル、哺乳動物細胞、及び融合体をコードする核酸を伝播できる器官を包含する。使用可能な哺乳動物細胞の限定しない例は、CHOdhfr細胞UrlaubandChasmProcNatlAcadSciUSA774216、293細胞GrahametalJGenVirol3659又はSP2又はNSOのような骨髄腫細胞GalfreandMilsteinMethEnzymol733を包含できる。所望の融合タンパク質複合体をコードする核酸を伝播できる宿主細胞は、昆虫例えば、Sp.frugiperda、酵母例えば、FleerRCurrentOpinioninBiotechnology3486496によって概説されているような、S.cerevisiae、S.pombe、P.pastoris.、K.lactis、H.polymorpha、真菌及び植物細胞を包含する非哺乳類真核細胞も包含する。E.coli及びBacillusのようなある特定の原核生物も意図されている。所望の融合タンパク質をコードする核酸を宿主細胞をトランスフェクトする標準的な技術によって、宿主細胞内へ導入することができる。用語トランスフェクトする又はトランスフェクションは、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウィルス形質導入及び/又は組み込みを包含する、核酸を宿主細胞内へ導入する全ての従来技術を包含するように意図されている。宿主細胞をトランスフェクトする適切な方法は、前記のSambrooketal及びその他の実験用教科書に見出せる。各種のプロモーター転写開始調節領域を本発明に従って用いることができる。適切なプロモーターの選択は提案された発現宿主に依存している。それらが選択された宿主内で機能する限り、異種起源由来のプロモーターを用いることができる。プロモーター選択はペプチド又はタンパク質産生の望ましい効率及びレベルにも依存している。tacのような誘導可能なプロモーターは、E.coliにおいてタンパク質発現のレベルを劇的に増大するためによく用いられている。タンパク質の過剰発現は宿主細胞に害を及ぼす。従って、宿主細胞生育を制限する可能性がある。誘導可能なプロモーター系の使用は遺伝子発現の誘導前に宿主細胞を受容可能な密度に培養されるようにするので、より高い産物収率を促す。本発明に従って各種シグナル配列を用いることができる。生物活性ポリペプチドをコードする配列と同族のシグナル配列を用いることができる。あるいは、発現宿主における効率的な分泌及びプロセスのために選択又は設計されたシグナル配列も用いることができる。例えば、適切なシグナル配列/宿主細胞の組み合わせは、B.subtilis中に分泌するためのB.subtilissacBシグナル配列と、Saccharomycescerevisiaeα-交配因子又はP.pastoris分泌のためのP.pastoris酸ホスファターゼphoIシグナル配列を包含する。シグナル配列はタンパク質をコードする配列とシグナルペプチダーゼ開裂部位をコードする配列を介して又は通常10未満のコドンからなる短いヌクレオチド架橋を介して直接結合してもよく、ここでこの架橋は下流のTCR配列の正確なリーディングフレームを保証する。転写及び翻訳を増強する要素は真核タンパク質発現系に対して確認されている。例えば、カリフラワーモザイクウィルスCaMVプロモーター1000bpを異種プロモーターのどちらかの側に位置づけることは、植物細胞における転写レベルを10~400倍まで上昇できる。発現構築物は適切な翻訳開始配列を包含するべきである。適切な翻訳開始のためにコザックコンセンサス配列を包含するように発現構築物を改変することは、翻訳のレベルを10倍まで増大できる。選択マーカーがよく用いられ、マーカーを目的の遺伝子とは異なる位置に結合できるように、これは発現構築物の1部であるか又はそれから分離している例えば、発現ベクターで遂行される。例は、抗生物質に対して耐性をもたらす例えば、blaはE.coli宿主細胞についてのアンピリシンに対する抵抗をもたらし、nptIIは各種の原核及び真核細胞についてのカナマイシン耐性をもたらすか又は宿主の最少培地での生育を可能にする例えば、HIS4はP.pasoris又はHis-S.cerevisiaeのヒスチジン不在での生育を可能にするマーカーを包含する。選択可能マーカーはマーカーの他に依存しない発現を許容するそれ自身の転写及び複写開始及び終止調節領域を有している。マーカーとして抗生物質耐性を用いる場合、選択用の抗生物質の濃度が、抗生物質に応じて、一般に、培地1mL当り抗生物質10~600μgの範囲で変化するだろう。発現構築物は公知の組み換えDNA技術を用いて構成されるSambrooketal1989Ausubeletal1999。制限酵素消化及びライゲーションはDNAの2つの断片を結合するために用いる基本的な工程である。DNA断片の末端はライゲーションの前に改変を必要とすることがあり、これは突出部に埋めること、ヌクレアーゼ例えば、ExoIIIで断片の末端部分を欠失すること、部位特異的突然変異、又はPCRで新規な塩基対を加えることによって達成できる。選択された断片の結合を促進するためにポリリンカー及びアダプターを用いることができる。発現構築物は、E.coliの一連の制限、ライゲーション、及び形質転換を用いて段階的に構成化される。発現構築物の構築のために適している多数のクローニングベクターは当該技術分野において公知であってλZAP及びpBLUESCRIPTSK-1、StratageneLaJollaCApETNovagenIncMadisonWI、Ausubeletal1999で引用されている、特定の選択は本発明に重要ではない。クローニングベクターの選択は、発現構築物の宿主細胞内への導入のために選択された遺伝子導入系に影響を受けるだろう。各段階の終わりに、得られた構築物を、制限、DNA配列、ハイブリダイゼーション及びPCR分析で分析できる。発現構築物を宿主内で線状又は環状の何れかのクローニングベクターとして形質転換するか、又はクローニングベクターから除去してそのまま用いるか、若しくは送達ベクター上に導入することができる。送達ベクターは選択された宿主細胞型中への発現構築物の導入及び保持を促進する。発現構築物は多数の公知遺伝子導入システム例えば、自然の形質転換受容性、化学的媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、遺伝子銃形質転換、トランスフェクション、又は接合Ausubeletal1999Sambrooketal1989の何れかによって宿主細胞内へ導入される。遺伝子導入システムは用いられた宿主細胞及びベクターシステムに応じて選択される。例えば、発現構築物を、プロトプラスト形質転換又はエレクトロポレーションによってS.cerevisias内に導入することができる。S.cerevisiasのエレクトロポレーションは容易に達成されて、スフェロプラスト形質転換に匹敵する形質転換効率を生じる。本発明は更に、目的の融合タンパク質を単離するための製造工程を提供する。この工程では、調節配列と操作可能に結合している目的のタンパク質をコードする核酸がその中に導入されている、宿主細胞例えば、酵母、真菌、昆虫、細菌又は動物細胞は培養倍地中で生産規模に生育させて目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激する。続いて、採取した宿主細胞から又は培養培地から目的の融合タンパク質を単離する。標準的なタンパク質精製技術を、培地又は採取した細胞から目的のタンパク質を単離するために用いることができる。特に、精製技術は、回転ボトル、撹拌フラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター、又は発酵槽を包含する各種の実行から、大規模で例えば、少なくともミリグラム量で所望の融合タンパク質を発現及び精製するために用いることができる。発現されたタンパク質融合複合体は公知の方法で単離及び精製できる。典型的には、培養培地を遠心分離又はろ過し、次いで上澄液を親和性又は免役親和性クロマトグラフィー、例えば、プロテインA若しくはプロテインG親和性クロマトグラフィー、又は結合したTCR若しくはその免疫グロブリン領域のような発現された融合複合体と結合するモノクローナル抗体の使用を含む免役親和性プロトコルにより精製する。本発明の融合タンパク質は公知技術の適切な組合わせによって分離及び精製できる。これらの方法は、例えば、塩析沈殿及び溶媒沈殿のような溶解性を利用する方法;透析、限外ろ過、ゲルろ過、及びSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法;イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法;アフィニティークロマトグラフィーのような特異的な親和性を利用する方法;逆相高速液体クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法及び等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、Ni-NTAのような金属親和性カラムを包含する。これらの方法に関する開示については、前記のSambrooketal及びAusubeletalを概して参照されたい。本発明の融合タンパク質が実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質が少なくとも80、又は90~95の均質性w/wであるように、融合タンパク質が細胞に自然に付随している細胞置換分から単離されていることが好ましい。少なくとも98~99の均質性を有している融合タンパク質は、多くの医薬、臨床及び研究適用に対して最も好ましい。実質的に精製されると融合タンパク質は治療適用のために、夾雑物を実質的に含まないはずである。部分的に又は実質的純粋にまで精製されると、可溶性融合タンパク質を治療的に、又は本明細書に記載されているようなインビトロ又はインビボでのアッセイの実施に用いることができる。実質的な純度はクロマトグラフィー及びゲル電気泳動のような各種標準技術によって確認できる。本発明の可溶性TCR融合複合体は、TCR融合複合体が発現後に培養培地に分泌され得るように十分に切断されているTCRドメインを含有している。従って、切断されたTCR融合複合体は疎水性残基に富んだ領域、典型的にTCR分子の膜貫通及び細胞質性ドメインを包含しない。従って、例えば、本発明の好ましい切断型TCR分子に関しては、TCR分子のβ鎖のおよそ最後のシステインからC末端及びα鎖のおよそ最後のシステインからC末端が切断型TCR融合複合体中に含まれていないことが好ましい。本発明の融合タンパク質複合体は癌性である又は感染している、或いは1つ又はそれ以上の病気に感染するかもしれない各種細胞を用いるインビトロ又はインビボでの使用に適している。ヒトのインターロイキン-15hIL-15は抗原提示細胞上に発現されたヒトIL-15受容体α鎖hIL-15Rαによって免疫エフェクター細胞にトランス提示されている。IL-15Rαは、主に細胞外sushiドメインhIL-15RαSuを介して、高い親和性38pMでIL-15に結合する。hIL-15及びhIL-15RαSuドメインを複数ドメイン融合複合体を構築するための骨格スカフォールドとして用いることができることをここで明らかにする。2価及び二重特異性T細胞受容体TCR融合複合体の両方をこのスカフォールドを用いてhIL-15及びhIL-15RαSu鎖のN末端と融合している各種一本鎖scTCRドメインの組み合わせを介して形成した。これらの融合体において、scTCRドメインは抗原結合活性を保持してhIL-15ドメインは受容体結合及び生物活性を示す。2価scTCR融合体は増大した分子結合力に起因する改善された抗原結合能力を示す一方、2つの異なったscTCRドメインを含有している融合体は2つの同種ペプチド/MHC複合体と結合する能力があった。scTCR及びscCD8αβドメインを含有している二重特異性ドメインも2価或いは1価のscTCR分子よりも同族ペプチド/MHC複合体との有意に優れている結合を示して、IL-15:IL-15Rαスカフォールドが複数ドメインの所定の標的との相互作用をサポートするのに必要な柔軟性を示すことを明らかにした。驚くべきことに、機能性TCRは、hIL-15及びhIL-15RαSuドメインとの融合体として別々にTCRα及びβ鎖を同時発現させることによっても形成できた。最後に、融合したhIL-15ドメインを部位特異的突然変異によって操作してスーパーアゴニスト又はアンタゴニストサイトカイン活性をもたらすことができた。同時に、これらの特性は、hIL-15及びhIL-15Rαドメインを新規な標的免疫分子を作成するための多用途で機能的なスカフォールドとして用いることができることを示している。IgGドメイン、特にFc断片は、承認された生物製剤を含む多数の治療用分子のための二量体のスカフォールドとして成功裏に用いられている。例えば、エタネルセプトはヒトIgG1のFcドメインに結合している可溶性ヒトp75腫瘍壊死因子-αTNF-α受容体sTNFRの二量体である。この二量体化は、エタネルセプトがTNFα活性の阻害を一量体のsTNFRより1,000倍まで強力にすることを可能にして、そして一量体形態より5倍長い血清半減期を有する融合体を提供する。結果的にエタネルセプトはインビボにおけるTNFαの炎症誘発活性を中和して多数の異なった自己免疫適応症について患者の予後を改善するのに効果的である。その二量体化活性に加えて、Fc断片は、天然のキラー細胞NK、好中球、食細胞及び樹状細胞上に提示されるFcγ受容体との相補活性及び相互作用を介して細胞毒性エフェクター機能ももたらす。抗癌治療用抗体及びその他の抗体ドメイン-Fc融合タンパク質との関連では、これらの活性は、動物の腫瘍モデル及び癌患者で観察された効果に重要な役割を果たしているようだ。しかし、これらの細胞傷害性エフェクターの応答は多くの治療適用において十分ではないかもしれない。従って、Fcドメインのエフェクター活性を改善して拡張すること、並びにT細胞活性を含む、細胞溶解性免疫応答を標的治療分子を介して疾患部位で採用するその他の方法を開発することにかなりの関心がもたれている。IgGドメインは、二重特異性抗体を形成するためのスカフォールドとして用いて、従来のハイブリドーマ融合技術によって作成された産物を質的及び量的に改善している。この方法はその他のスカフォールドの欠点を回避するが、臨床的開発及び使用をサポートするのに十分なレベルで二重特異性抗体を哺乳動物細胞内で産生するのは困難である。新規な、ヒト由来免疫刺激性多量体スカフォールドを開発する目的で、ヒトIL-15hIL-15及びIL-15受容体ドメインの使用に焦点を合わせた。hIL-15は、高い結合親和性平衡解離定数KD~10ー11MでhIL-15受容体α鎖hIL-15Rαと結合するサイトカインの短い4本α螺旋束ファミリーの一員である。次いで、得られる複合体をT細胞及びNK細胞表面上に表示されているヒトIL-2/15受容体β/共通γ鎖hIL-15RβγC複合体とトランスに提示する。このサイトカイン/受容体相互作用はエフェクターT細胞及びNK細胞の拡張及び活性化を引き起こし、これがウィルス感染及び悪性腫瘍細胞を撲滅するために重要な役割を果す。正常には、hIL-15及びhIL-15Rαは樹状細胞内で同時に産生されて細胞内で複合体を形成し、これは続いて分泌されて細胞表面上にヘテロ二量体として提示される。従って、hIL-15とhIL-15Rαの相互作用の特徴が、これらの鎖間結合ドメインが新規なヒト由来免疫刺激性スカフォールドとして働いて標的特異的結合が可能な可溶性二量体分子を作成することを示唆している。本明細書に、T細胞受容体TCR及びCD8結合ドメインを含んでいる多数の融合タンパク質の作成及び特性を記載して、標的抗原に対する増大した機能的結合親和性を有する可溶性ホモ二量体及び多部位特異的タンパク質複合体のためのヘテロ二量体の両方を作成するためにhIL-15:hIL-15Rαスカフォールドの使用の可能性を明らかにする。これらの融合タンパク質が免疫エフェクター細胞応答の刺激を可能にする強力なhIL-15活性を保持していることも示した。本明細書で、新規な、二量体分子を作成するためのhIL-15:hIL-15RαSuをベースとするスカフォールドの使用の可能性を明らかにする。二量体融合タンパク質複合体はそのhIL-15ドメイン及び結合ドメインの免疫刺激性及び標的特異的生物活性を保持して、hIL-15及びhIL-15Rαの付加が融合ドメインの空間的配置を著しく変更しないこと、及びサイトカイン活性に影響を及ぼさずに適度の構造的柔軟性をもたらすことを示唆した。従って、このスカフォールドは、c264scTCR二量体のような、多価融合複合体を形成して、分子、又はc264scTCR/c149scTCRヘテロ二量体のような、二重特異性分子の全体的結合親和性を増大するために用いることができる。全ての場合で、可溶性融合タンパク質は組み換えCHO細胞培養で比較的高いレベルで産生されて広範囲の細胞株スクリーニング及び最適化を行わずに細胞培養上澄液中にリットル当り数ミリグラム、そして細胞培養上澄液から容易に精製できた。hIL-15:hIL-15RαSuをベースとするスカフォールドの有用性が、ポリペプチド鎖2本の細胞外ドメインをhIL-15及びhIL-15RαSuのN末端と融合することにより、α/βTCRのような可溶性、生物活性、2本鎖分子を作成するために、拡張できたことも明らかにした。この形態が、恐らくhIL-15:hIL-15RαSu複合体の遠位N末端と融合している相互に折り込まれたTCRα/βと複合体の中間部に位置するhIL-15RβγC結合部位との間の立体障害に起因している、hIL-15活性の中等度の減少をもたらした。その他の形態も可能で従来の方法を用いて作成することができる。hIL-15:hIL-15RαSuをベースとするスカフォールドは、CD8α/β及びTCRドメインが同じpMHCI複合体と結合可能であるが空間的に異なった位置にある、OT1scTCR/scCD8ヘテロ二量体を作成するために用いることもできる。可溶性pMHCI試薬を用いる先の検討は、CD8がオフ速度及びオン速度の両方への影響を介して細胞表面でのTCR:pMHCI相互作用を安定化して増大することを確認している。pMHCI特異的T細胞の活性化に対するCD8の要件がTCR:pMHCI親和性と逆相関するように、T細胞のCD8コレセプター活性への依存性を確認する際にこの効果は重要である。しかしながら、可溶性の精製したCD8α/β、TCR及びpMHCIタンパク質を用いる幾つかの結合研究は、TCR:pMHCI相互作用がCD8の存在又は非存在による影響を受けないことを示して、共同結合効果を示唆しなかった。OT1scTCR/scCD8ヘテロ二量体を用いる細胞に基づくSPR結合研究の結果は、これら先の報告とは著しく異なって、同じ可溶性分子上に提示されたTCR及びCD8ドメインが、1価又は2価TCRドメインを担持している分子で観察されたよりもより優れたペプチド/MHC結合活性を示したことを明らかにしている。この効果は、T細胞上でのCD8及びTCR分子へのpMHCI結合に関する観察と一致して、pMHCI:OT1scTCR/scCD8ヘテロ二量体複合体のより遅いオフ速度及びより速いオン速度の両方に反映される。従って、OT1scTCR/scCD8ヘテロ二量体はT細胞上のOT1TCRの結合を模倣し、これがCD8コレセプター活性のpMHCへの強い依存性を示す。これらの結果は、scTCR/scCD8ヘテロ二量体及びこの分子の変異体が無細胞系における第三級のTCR:pMHCI:CD8複合体間の分子間相互作用を更に切断するための非常に有用なツールとして機能することを示唆している。また、増強されたpMHCI結合活性を有するscTCR/scCD8ヘテロ二量体ベースの試薬は、結合活性を増大するためにTCRドメインを突然変異させる必要なしで、病的細胞上の抗原提示を検出するのに有用である。OT1scTCR融合体に関するSPR実験の結果は、1価OT1TCRα/βヘテロ二量体の固定化OVAペプチド/H-2Kb複合体への結合親和性がほぼ6μMであることが示されているAlametalによって報告されたものと異なっている。この実験では、30μMの明確なKDを示したOT1scTCR/birA単量体及びOT1scTCR/briA二量体のOVAペプチド/H-2Kb結合を検出できなかった。1本鎖Vα-リンカー-Vβ-Cβ分子として形成されると、OTITCRは結合活性を欠失する可能性がある。しかし、OT1scTCR/briAと2本鎖構築物を比較して同等の活性を観察した。更に、先の研究は、CD8結合を無効にするKb突然変異を有するOVAペプチド/H-2Kb四量体が、高濃度の四量体を用いたときでさえ、OT1TCR担持細胞への特異的結合活性を殆ど或いは全く示さないことを明らかにして、OT1TCRとその同族pMHCIの間の非常に低い親和性相互作用を示唆している。対照的に、CD8結合突然変異がないOVAペプチド/H-2Kb四量体は、本研究で観察されたCD8のOT1TCR結合活性を増強する能力と一致して、OT1TCR担持細胞を色鮮やかに染色することが可能であった。hIL-15:hIL-15RαSuをベースとするスカフォールドは、IgGスカフォールドのFcドメインとほぼ同様に多価又は多重特異的の標的治療薬を作成するために利用できる。エフェクターNK及びCD8記憶T細胞の増殖及び活性化を刺激するその強力な活性を用いて、hIL-15ドメインは抗体依存性の細胞傷害性及びIgGに基づく手法に関連する相補体活性化を越えて、潜在的な免疫治療メカニズムの範囲を拡大する。IgG分子のFcドメインの活性を操作するために用いられているものと同様の手法を用いて、IL-15ドメインが、その機能的活性を増大又は減少するように突然変異できることを明らかにする。IL-15ドメインにN72D突然変異を含んでいるhIL-15:hIL-15RαSu融合分子が生物活性の3~4倍の増加を示す一方で、IL-15D8N突然変異は殆ど又は全く活性を表わさないことが示される。IL-15スーパーアゴニストに基づく融合タンパク質は癌又は感染性疾患のための標的免疫治療薬として役立つ一方、疾患部位でIL-15応答細胞を阻害できるIL-15アンタゴニストは、同種移植拒絶反応及び炎症性自己免疫疾患、特に記憶CD8T細胞が疾患病状の一因となっている場合の治療における治療可能性を有している。非標的IL-15突然変異/Fcγ2aアンタゴニストタンパク質は、実験動物モデルにおける膵島及び心臓同種移植の拒絶反応の抑制及び関節炎の発症及び進行を予防するのに有効であることが既に示されている。hIL-15:hIL-15RαSu融合タンパク質に関連しているIL-15アンタゴニストドメインを用いる同様のアプローチが可能である。さらに、ある特定の状況下では、多量体分子を作成するために機能的に不活性なスカフォールドを有することが望ましい。例えば、IL-15Rβγとの相互作用を除去する1L-15D8N突然変異を含んでいるscTCR/hIL-15:scTCR/hIL-15RαSu融合体がIL-15受容体複合体を提示する細胞の優れたTCR抗原特異的染色をもたらすことを見出した。本明細書における説明の目的のために標的ドメインとしてTCR及びCD8分子に焦点を合わせているが、hIL-15:hIL-15RαSuスカフォールドを、抗体、接着分子、又はその他の受容体に由来するタンパク質ドメインを用いてその他の新規な分子を構築するために使用できることを理解されたい。結晶構造に基づいて改変に利用可能なhIL-15及びhIL-15RαSuのC末端とのタンパク質ドメイン融合体を創出することも可能である。得られる分子は4つまでの異なった標的認識性能を有することができる。適切な融合パートナーを用いて、これらのタイプの分子は免疫エフェクター細胞と標的細胞の接合を促進して標的細胞の効果的な殺傷を達成できる。また、エフェクター細胞増殖及び細胞毒性をサポートする免疫刺激活性を提供することによって、複合体のIL-15ドメインはこれらの過程を更に補強できる。各種の多機能分子は、抗癌及び抗ウィルス免疫治療剤として用いるためにこの概念に基づいた。これまでは、標準的な哺乳類細胞における弱い発現レベルが治療薬としての組み換えhIL-15の開発を制限していた。本明細書で明らかにしたように、臨床開発及び潜在的に商品化をサポートできるレベルでのscTCR/hIL-15:scTCR/hIL-15RαSu複合体の発現を達成することができる。また、IL-15Rα鎖が、メカニズムに縛られることなく、恐らくサイトカインの薬物動態を改善することによって、hIL-15のインビボ活性を増強することが示されている。hIL-15:hIL-15RαSu複合体のこれら2つの特性は、その多価特質及び/又は多重特異性標的設計と組合わせて、癌及びウィルス感染症に対する免疫治療薬剤としてhIL-15の最大の能力を得る機会をもたらしている。実施例に提供されているように、免疫グロブリンFcドメインを含有しているhIL-15:hIL-15RαSu融合タンパク質複合体は更なる利点を有することが見出された。Fcドメインの結合が多価及び多重特異性相互作用が可能な多鎖分子の作成を許容する。実際に、同じscTCRの複数ドメインを含んでいる本発明の融合タンパク質複合体は二量体scTCR融合体の活性に基づいて予測されたものより増大した抗原結合活性を示した。ある場合では、本発明の融合複合体は、IL-15RβγC担持免疫細胞とFc受容体担持免疫細胞の両方を結合して活性化でき、強力な免疫刺激活性を許容する。2つのIL-15ドメインを含んでいる本発明のタンパク質融合複合体は、他のIL-15融合タンパク質と比較したときに想定されるよりも優れたIL-15活性を示すことが分かった。更に、本発明のタンパク質融合複合体は、ペプチド/MHC提示標的細胞に対する抗体Fc依存性細胞傷害性を介在することにおいてTCR-IgG1融合タンパク質よりもより有効であった。改善された活性は、タンパク質融合複合体のペプチド/MHC複合体との増強された結合及び/又はFc受容体又はIL-15受容体を提示するエフェクター細胞との増大した反応性の結果であるかもしれない。更に、突然変異生成分析によって、融合タンパク質複合体のTCR、IL-15及びIgGFcドメインのそれぞれがその結合及び機能活性を変化させるように容易に且つ独立して操作されて望ましい生物学的効果を有する多重特異的複合体をもたらすことが分かった。本発明の融合タンパク質複合体は、遊離のIL-15より有意に優れた薬物動態プロファイルを有していることが明らかにされた。また、異なった分析方法で観察された類似したPKプロファイルに基づくと、融合タンパク質複合体はポリペプチド鎖解離又は切断の証拠を有していない多鎖分子としてインビボで無傷のままである。更に、本発明の融合タンパク質複合体は動物において標的担持及び非標的担持腫瘍の両方に対する抗腫瘍活性を介在できることが示され、そして等モル用量を投与したrhIL-15よりもより強力な抗腫瘍効果を示した。また、融合タンパク質の有効用量による治療はこれらの動物モデルで良好な耐性を示した。実施例1-c264scTCR/huIL15RαSushi-huIgG1及びc149scTCR/huIL15N72D遺伝子融合体を含有している発現ベクターの構築。T2分子T2Mと呼ばれる融合タンパク質は多鎖ポリペプチドから成っている図1。本発明の一実施態様では、これらのポリペプチドの1つは、国際特許公開第WO2008143794号公報参照により本明細書に取り込まれているに開示されているようにタンパク質結合ドメインとIL-15又IL-15変異体の間の融合を含んでいる。T2の第2ポリペプチドはタンパク質結合ドメイン、IL-15Rαドメイン及び免疫グロブリンドメインの間の融合を含んでいる。或いは、タンパク質結合ドメイン-IL-15融合タンパク質は、更に免疫グロブリンドメインと結合してもよい。好ましい免疫グロブリンドメインは他の免疫グロブリンドメインと相互作用して多鎖タンパク質を形成できるようにする領域を含んでいる。例えば、IgG1、CH2-CH3のような、免疫グロブリンの重鎖領域は相互作用してFc領域を作成できる。好ましい免疫グロブリンドメインはFc受容体又は相補体タンパク質結合活性を包含する、エフェクター機能を有し、そして又はグリコキシル化部位を有する領域も含んでいる。ある実施態様では、T2分子の免疫グロブリンドメインは、Fc受容体又は相補体の結合活性若しくはグリコキシル化を減少又は補強して、それにより得られるタンパク質の生物活性に影響を及ぼす突然変異を含んでいる。例えば、Fc受容体との結合を減少する突然変異を含んでいる免疫グロブリンドメインはFc受容体担持細胞に対する低い結合活性を有するT2分子を作成するために用いることができ、これはTCR-特異抗原を認識又は検出するように設計された試薬に対して有利であろう。ヒトIL-15RαsushiドメインhuIL-15RαSushi及びヒトIgG1定常領域huIgG1CH1-CH2-CH3と融合しているp53aa264-2721本鎖TCRc264scTCRと呼ぶを含有している発現ベクターの構築を以下のように実施した。c264scTCR/huIgG1遺伝子断片を先に構築したpNEF38-c264scTCR/huIgG1ベクターからPacI及びM1uIで制限消化して除去した。遺伝子断片をゲルで精製し、同じ制限酵素で消化したpMSGVベクターにライゲートして、pMSGV-c264scTCR/huIgG1と呼ぶ構築物をもたらした。CMVプロモーターを含有しているDNA断片をpcDNA3.1から精製し、続いてNruI及びHindIIIで消化した。この断片を、PacIで消化してあるpMSGV-c264scTCR/huIgG1内にライゲートして、DNAポリメラーゼで充填して平滑末端を作成した後HindIIIで消化した。得られた構築物をpMC-c264scTCR/huIgG1と称した。先に構築された、pNEF38-c264scTCR/huIL15RαSushi国際公開第WO2008143794号公報を参照されたい由来のhuIL15RαSushi遺伝子断片をフロントプライマー:5’-TGTTGGGAATTCATCACGTGCCCTC-3’及びバックプライマ-:5’-TGGTGTGAATTCTCTAATGCATTTGAGACTGG-3’を用いて、次のPCR条件下でKODHOTStartDNAポリメラーゼEMDによって増幅した:95C、2分、1サイクル;95C、20秒、65C、20秒;70C、20秒、35サイクル;72C、10分、1サイクル。ヒトIL-15RαSushi遺伝子のPCR産物をゲルで精製してEcoRIで消化した。この遺伝子をEcoRIで消化してあるpMC-c264scTCR/huIgG1内にライゲートした。ヒトIL-15RαSushiドメインをコードするDNA断片のpMC-c264scTCR/huIgG1内へのクローニングは以下の配列を含んでいるc264scTCR/huIL15RαSushi-huIgG1融合遺伝子をもたらした:3’-免疫グロブリン重鎖リーダー-264TCRVα-ペプチドリンカー-264TCRVβ-ヒトTCRCβ-ヒトIL-15RαSushi-ヒトIgG1重鎖。図2に示されている、正確なヒトIL15RαSushi遺伝子挿入を含有している得られたベクターpMC.c264scTCR-Su/IgG1.PURを診断PCRに基づいて同定し、そしてDNAシークエンシングで再確認した。c264scTCR/huIL-15RαSushi/huIgG1遺伝子及びタンパク質はそれぞれ図3及び図4に示される。c264scTCR/huIL-15RαSushi-huIgG1遺伝子融合を含有している異なった発現ベクター内在EcoRI部位及び対応するコード配列を欠失しているを構築した。このベクターのために、c264scTCR遺伝子断片の部分をc264scTCR/huIgG1ベクターから、フロントプライマー:5’GTACGACTTAATTAACTCGAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGG3’及びバックプライマー:5’CTTCCCGTTAACCCACCAGCTCAGCTCCACGTG3’を用いて増幅した。c264scTCR遺伝子断片のTCRβ定常領域の残りの部分をc264scTCR/huIgG1ベクターから、フロントプライマー:5’CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3’及びバックプライマー:5’GAGGGCACGTGATGTCTGCTCTACCCCAGGCCTC3’を用いて増幅した。huIL15RαSushi遺伝子断片をc264scTCR/huIL15RαSushiベクターから、フロントプライマー:5’GTAGAGCAGACATCACGTGCCCTCCCCCCATG3’及びバックプライマー:5’CCTTGGTGCTAGCTCTAATACATTTGAGACTGGGGGTTGTCC3’を用いて増幅した。huIgG1重鎖定常領域遺伝子断片をc264scTCR/huIgG1ベクターから、フロントプライマー:5’CCAGTCTCAAATGTATTAGAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTC3’及びバックプライマー:5’GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTACCAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC3’を用いて増幅した。TCRβ定常領域配列及びhuIL15RαSushi遺伝子を含有している得られた産物を鋳型として用いて、フロントプライマー:5’CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3’及びバックプライマー:5’CCTTGGTGCTAGCTCTAATACATTTGAGACTGGGGGTTGTCC3’を用いるPCRによって遺伝子断片を作成した。得られたPCR産物及びhuIgG1遺伝子断片は、フロントプライマー:5’CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3’及びバックプライマー:5’GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTACCAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC3’を用いるPCRによってTCRβc/huIL15RαSushi/huIgG1融合遺伝子を作成するための鋳型の役割を果した。c264scTCRPCR産物をPacI及びHpaIで消化して、TCRβc/huIL15RαSushi/huIgG1融合遺伝子をHpaI及びNsiIで消化した。消化した遺伝子断片をCMVプロモーターを含有しているpMSGVレトロウィルスベクター内にライゲートした。得られたベクターをc264scTCR/Sushi/hIgG1-pMSGV又はpMSGVc264SuIgと表した図5。c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1遺伝子及びタンパク質の配列は、それぞれ図6及び図7に示される。1本鎖TCR結合ドメインすなわち、c264scTCRとIL-15又はIL-15変異体の融合を産生する発現ベクターの作成は国際公開第WO2008143794号公報に開示されている。特に有用なIL-15変異体はIL-15の生物活性を減少若しくは消去するもの又はIL-15の生物活性を増大するものである。例えば、72位を置換したすなわち、N72D置換ヒトIL-15変異体はIL-15の生物活性を5~10倍増大できる。IL-15変異体は以下の表に提供される。すぐ上の図に記載されているIL-15変異体を含有している融合タンパク質複合体を、TCR特異的抗原である、p53aa264-272/HLA-A2.1と結合するそれらの能力について特徴付けた。p53aa264-272/HLA-A2.1を提示する細胞を生成するために、HLA-A2.1陽性T2細胞2×106/mLに20μMのp53aa264-272ペプチドを、1×PLEAltorBioscienceの存在下37°Cで2~3時間負荷した。ペプチドで培養されなかったT2細胞及びIL-2/15Rβγcを発現する32Dβ細胞をコントロールに供した。次いで、p53ペプチド負荷T2細胞、コントロールT2細胞、又は32Dβ細胞2×105/100μLを次の二量体融合タンパク質複合体320nMと4°Cで30分間培養した:1c264scTCR/huIL15c264scTCR/huIL15RαSushi、2c264scTCR/huIL15D8Ac264scTCR/huIL15RαSushi、及び3c264scTCR/huIL15D8Nc264scTCR/huIL15RαSushi。160nMの精製したc264scTCRhuIL15融合タンパク質及び160nMの精製したc264scTCRhuIL15RαSushi融合タンパク質を4°Cで3時間培養して、これらの複合体を生成した。次いで染色する、細胞を洗浄緩衝液0.5のBSAと0.05のアジ化ナトリウムを含有しているPBSで1度洗浄して、0.5μgのビオチニル化マウスモノクローナル抗ヒトTCRCβ抗体BF1で100μLの洗浄緩衝液中、4°Cで30分間染色した。細胞を1度洗浄して、0.5μgのR-フィコエリトリン共役ストレプタビジンで100μLの洗浄緩衝液中、4°Cで30分間染色した。細胞を洗浄してフローサイトメトリーで分析するために再懸濁した、c264scTCR/huIL15D8Ac264scTCR/huIL15RαSushi複合体及びc264scTCR/huIL15D8Nc264scTCR/huIL15RαSushi複合体は、p53ペプチド負荷T2細胞を特異的に染色することに関して、c264scTCR/huIL15D8Nc264scTCR/huIL15RαSushiと同等の活性を示した。これらの結果は、これらの融合複合体のそれぞれにおいて多価scTCRドメインが十分に機能的であることを示している。IL-15変異体D8A及びD8Nを含有している融合タンパク質複合体は32Dβ細胞上に存在している1L-15Rβγc受容体との結合活性を示さない。1L-15Rβγc受容体結合の同様な検討をIL-15変異体を含有しているその他の融合タンパク質を用いて実施して表1に要約した。結果は、IL-15変異体を含有している本発明の融合タンパク質及び融合タンパク質複合体がペプチド/MHC複合体を認識する活性を保持して、1L-15Rβγc受容体との結合活性の減少又は増大を示すことを示唆している。ある特定のT2分子に関しては、1L-15及びIL-15Rα成分と融合した複数の異なった結合ドメインを有することが有用である。このような分子の活性を説明する一例では、HLA-A2と関連して提示されるp53aa149-157ペプチドに特異的な、1本鎖TCRドメインc149scTCRと呼ばれるをIL-15N72Dドメインと結合して、得られた融合タンパク質を、c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1融合タンパク質と同時に発現させて、c264scTCR及びc149scTCR結合ドメインを有する多鎖T2タンパク質を産生した。c149scTCR/IL15N72D遺伝子融合を生成するために、c149scTCR遺伝子断片TCR-α、リンカー、TCR-β及びTCR-β定常断片をc149scTCR/huIgG1発現ベクターからフロントプライマー:5’GACTTCAAGCTTAATTAAGCCACCATGGACAGACTTACTTCTTC3’及びバックプライマー:5’-CTTCCCGTTAACCCACCAGCTCAGCTCCACGTG-3’を用いて増幅した。c149scTCR/huIgG1ベクターのTCRβ定常領域の残分をフロントプライマー:5’CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3’及びバックプライマー:5’CACCCAGTTGTCTGCTCTACCCCAGGCCTC3’を用いて増幅した。huIL15N72D遺伝子をc264scTCR/huIL15N72D発現ベクターからフロントプライマー:5’CTGGGGTAGAGCAGACAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTG3’及びバックプライマー:5’CCTCATGCATTCGAATCCGGATCATTAAGAAGTGTTGATGAACATTTGG3’を用いて増幅した。TCRβ定常領域配列及びhuIL15N72D遺伝子を含有している得られた産物を鋳型として用い、フロントプライマー:5CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3’及びバックプライマー:5’CCTCATGCATTCGAATCCGGATCATTAAGAAGTGTTGATGAACATTTGG3’を用いるPCRによって遺伝子断片を生成した。c149scTCRPCR産物をPacI及びHpaIで消化して、TCRβc/huIL15N72DPCR産物をHpaI及びBstBIで消化した。消化した遺伝子断片をCMVプロモーター含有pMSGVレトロウィルスベクター内にライゲートした。得られたベクターをc149scTCR/IL15N72D-pMSGVn又はpMSGV-c149IL15N72Dと称した図8。c149scTCR/huIL15N72D遺伝子及びタンパク質の配列をそれぞれ、図9及び図10に示す。実施例2-融合タンパク質を産生するトランスフェクトした宿主細胞株の生成。発現ベクターを、いくつかの異なる形質転換、トランスフェクション又は形質導入方法によって多様な宿主細胞株内に導入することができる。このような一方法では、CHO-K1細胞5×105を6ウェルのプレートに播種してCO2インキュベータ中で1晩培養した。細胞を、c264scTCR/huIL15N72D融合遺伝子を含有している発現ベクター5μgで、10μLのMirusTransIT-LT1試薬Mirusを用いて製造会社のプロトコールに従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後1日目に細胞を4mg/mLのG418Invitrogenを用いて選択した。G418耐性細胞を増殖し、TCR/IL15融合タンパク質発現細胞を限界希釈法で3回サブクローンして産生細胞株を、捕獲抗体、抗ヒトTCRCβ抗体BFI及び検出抗体であって既に記載されている出願公開第WO2008143794号公報を参照されたいビオチニル化抗ヒトIL-15抗体BAM247、RDSystemsを用いるTCR及びhuIL15特異的ELISAによって、培養培地中に分泌される可溶性融合タンパク質のレベルに基づいてスクリーニングした。次いで、c264scTCR/IL15N72D産生細胞株を、c264scTCR/huIL15RαSushi-huIgG1融合遺伝子を含有している偽型レトロウィルスベクターで以下のようにして形質導入した。偽型レトロウィルスベクターを産生するために、ポリリジンをコーティングした10cmのディッシュBDBioscience内で2×106個の293GPパッケージング細胞をCO2インキュベーター内で2日間37°Cで培養した。次いで、細胞に、リポフェクタミン2000Invitrigenを用いて、9μgのプラスミドpMC-c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1及び4μgのVSV-Gエンベロープタンパク質をコードするプラスミドpMD-Gを同時導入した。トランスフェクション後48時間目に、ウィルスを含有している上澄液を採取して、0.45μMのフッ化ポリビニリデンフィルターを通過させて細胞残屑を除去した。10μg/mlのポリブレンSigmaAldrichの存在下でウィルスをc264scTCR/IL15N72D産生細胞6ウェルプレート中、1×105細胞/ウェルに適用した。形質導入後2日目に、細胞を10μg/mlのピューロマイシン及び2mg/mlのG418を用いて選択した。ピューロマイシン及びG418耐性細胞を増殖し、T2融合タンパク質複合体発現細胞を限界希釈法で3回サブクローンして、産生細胞株を、捕獲抗体、抗ヒトIgG抗体JacksonImmunoResearch、及び検出抗体であるビオチニル化抗ヒトIL-15抗体BAM247、RDSystemsでhuIgG1/huIL15特異的ELISAを用いて、培養培地中に分泌される可溶性融合タンパク質のレベルに基づいてスクリーニングした。実施例3-T2融合タンパク質の生成及び精製。c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1を発現する細胞株を生育条件すなわち、小規模培養フラスコ、スピナー、若しくは撹拌フラスコ、又は大規模の中空繊維、ウェーブバッグ若しくは撹拌タンク生物反応器、又は同等の培養容器及び反応器中で、25~37°Cで5~28日間下で培養して、培養培地中に可溶性タンパク質としてT2分子を産生した。T2分子を精製するために、培養培地をpH調節してセファロースに共有結合させた抗TCR抗体BF1を含有している免疫親和性カラムに付した。カラムを洗浄して、T2分子を0.5Mのクエン酸ナトリウム、pH4.0で溶出した。溶出したタンパク質を濃縮して緩衝液をリン酸緩衝食塩液PBSに交換し、次いでrプロテインA-セファロースカラムに付した。洗浄工程に続いて、タンパク質を0.5Mのクエン酸ナトリウム、pH4.0で溶出し、次いでPBSに緩衝液を交換した。得られたタンパク質をクーマシー-染色SDS-PAGE及びサイズ排除クロマトグラフィーで特性化した。還元SDS-PAGE条件下で、精製したT2タンパク質は、ホモ二量体分子に予想される単一バンドに移動する精製したc264scTCR/huIgG1及びc264scTCR/huIgG1ΔCH1融合タンパク質と比較して、c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1成分に予想される分子量に対応する2つのポリペプチドバンドに移動した図11。非還元変性条件下では、c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1バンドは二量体ポリペプチドと一致する分子量に移動するのに対して、c264scTCR/huIL15N72Dバンドはその単量体形態と一致していた。サイズ排除ゲルろ過クロマトグラフィーにより、天然のT2タンパク質は4本鎖2×c264scTCR/IL15N72D、2×c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1分子の予想される分子量で溶出された図12。これらの結果は、図1に示すように、T2分子がhuIL15N72D及びhuIL15RαSushiドメインの間の相互作用並びにhuIgG1間の共有結合相互作用に一致している多鎖構造を示すことを確認している。同様な哺乳動物細胞発現及び親和性クロマトグラフィー精製方法を本明細書に記載されているその他のT2タンパク質複合体を生成するために用いた。実施例4-T2分子の結合活性のインビトロでの特性化T2分子のドメインの結合活性を特性化してこれらの活性をその他の融合タンパク質のそれと比較するためにインビトロアッセイを実施した。IgG1ドメインを特性化するために、マイクロタイターウェルを抗ヒトIgG1抗体でコーティングして、c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る、等モル量の精製したT2タンパク質、又は精製したc264scTCR/huIgG1融合タンパク質をウェルに適用した。結合及び洗浄工程に続いて、結合したタンパク質を標準的なELISA条件下で抗ヒトIgG1抗体を用いて検出した。図13に示されているアッセイの結果は、T2分子のIgG1ドメインが、TCR/IgG1融合体の相当するドメインと同等の抗体結合活性を示し、T2IgG1ドメインが生来の構造を保持することを示唆していることが明らかになった。T2分子のTCRドメインを同様のアッセイで評価した。等モル量のT2又はc264scTCR/huIgG1タンパク質がIgG1Abでコーティングしたウェル上に捕獲されて抗ヒトTCRCβ抗体W4Fで検出された。図14に示されているように、T2タンパク質は抗TCR抗体に対して、c264scTCR/huIgG1タンパク質より2倍高い反応性を示した。T2分子の4本鎖TCR融合タンパク質組成物をc264scTCR/huIgG1融合体のホモ二量体組成物と比較すると、このことは予想される。T2分子のTCRドメインのペプチド/MHC結合活性を評価した。等モル量のT2c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る又はc264scTCR/huIgG1タンパク質を抗ヒトIgG1abでコーティングしたウェルに捕獲してp53aa264-272ペプチド/HLA-A2ストレプタビジン-HRP四量体で検出した。図15に示すように、T2タンパク質は、ペプチド/MHC試薬に対して、c264scTCR/huIgG1タンパク質より3倍高い結合活性を示した。その構造及び抗TCRAb反応性図14を参照されたいに基づくとT2タンパク質はc264scTCR/huIgG1よりわずかに2倍高い結合活性を示すことが予測されるので、このことは予想外であった。従って、T2分子構造は、個々の成分に基づいて予測されるものよりもより優れた抗原特異的結合活性をもたらす。この増強した結合活性は、より小さい立体障害、優れた親和性効果、協調相互作用及び/又はTCRドメインとペプチド/MHC抗原の間の優れた構造適合の結果であろう。実施例5-T2IL-15ドメインの生物活性の特性化T2分子のIL-15ドメインの活性も評価した。マイクロタイターウェルを抗ヒトIL-15抗体でコーティングして、c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る、精製したT2タンパク質、又は精製したc264scTCR/huIL15N72D融合タンパク質の等モル量をウェルに適用した。結合及び洗浄工程に続いて、結合したタンパク質を標準的なELISA条件下で抗ヒトIL-15抗体で検出した。図16に示したように、T2タンパク質は、それぞれのT2分子が2つのIL-15ドメインを含有しているという仮説に基づいて予測したように、抗IL-15Abに対してc264scTCR/huIL15N72D融合体と比較して増大した反応性1.6倍高いを示した。T2分子のIL-15ドメインの生物活性を、サイトカイン依存性32Dβ細胞株を用いる増殖アッセイで更に特性化した。細胞増殖を測定するために、32Dβ細胞2×104細胞/ウェルを濃度を上昇させたT2タンパク質c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る又はc264scTCR/huIL15N72D融合タンパク質と37°Cで48時間培養した。細胞増殖試薬WST-1RocheAppliedScienceを製造会社の手順に従って、細胞生育の終わりの4時間の間に添加した。代謝的に活性な細胞によるWST-1の染色されたフォルマザン染料への変換を440nmの吸収測定で確認した。図17に示したように、T2タンパク質は、c264scTCR/huIL15N72D融合タンパク質より3倍優れた生物活性を示した。その構造及び抗IL-15Ab反応性図16を参照されたいに基づくと、T2タンパク質はc264scTCR/huIL15N72Dより2倍だけ高いIL-15活性を示すと予測されるので、このことは予想外であった。これらの結果は共に、これらの成分単独では又は他の融合タンパク質形態と関連しては観察されなかったものより増大したTCR結合活性及びIL-15生物活性をもたらすT2分子形態の多くの利点を説明している。IL-15応答免疫細胞の増殖を促進するT2タンパク質の能力を霊長動物モデルで試験した。カニクイザル2頭、雄1頭、雌1頭に精製したT2タンパク質c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る0.5mg/kgを静脈内に注射した。5日後に採血した血液をCD8記憶T細胞マーカーCD8及びCD95及びNK細胞マーカーCD56及びCD16で染色して処置前に採取した血液と比較した。図18に示すように、T2処置はCD8CD95記憶T細胞A及びCD56dimCD16エフェクターNK細胞Bの増殖をもたらした。これらの結果はインビボで強力なIL-15活性を示しているT2分子と一致している。実施例6-T2Fcドメインの結合及び生物活性の特性化T2分子のIgG1Fcドメインの結合活性を細胞結合アッセイで特性化した。Fcガンマ受容体担持U937細胞を33nMのT2タンパク質c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る、c264scTCR/huIgG1又はA2AL9scTCR/IgG1陰性コントロールと20分間培養した。細胞を1度洗浄して、PE-共役p53aa264-272ペプチド/HLA-A2四量体と培養した。U937細胞表面上のFcガンマ受容体への結合を、図19Aに示すように、フローサイトメトリーで分析した。タンパク質の濃度範囲を用いる同様なU937結合試験も実施して、染色細胞に対する平均蛍光強度を図19Bにプロットした。これらの検討の結果は、U937細胞が、対応するc264scTCR/huIgG1融合タンパク質よりT2分子によってより効果的に染色されることを示していて、T2分子のFc受容体結合活性を検証した。Fcドメインの生物活性を評価するために、抗体依存性細胞傷害性ADCC活性を介在するT2分子の能力を評価した。この検討では、0.137~100nMのT2タンパク質、c264scTCR/huIgG1又はA2AL9scTCR/IgG1陰性コントロールを96ウェルプレートに添加した。HLA-A2陽性T2標的細胞を10μMのp53aa264-272ペプチドでパルスして50ug/mlのカルセイン-AMで標識化した。融合タンパク質をウェル当り1×104標的細胞と混合して、1×106/ウェルの新鮮なヒトPBMCを添加した。プレートをCO2インキュベーター中、37°Cで2時間培養し、100μlの条件培地を採取して、溶解細胞からのカルセイン放出を分析した。カルセインをEx-485nm、Em-538nm、及びカットオフ-530nmで蛍光リーダーを用いて定量した。特異的な細胞溶解を次の式で算出した:特異的溶解=exp-バックグラウンド-自動放出/完全放出-バックグラウンド-自動放出×100。Exp=融合タンパク質T2細胞PBMC;バックグラウンド=培地のみ;自動放出=T2細胞のみ;完全放出=T2細胞0.5トリトンX-100。データ点当り3通りに決定した結果を図20に示してT2タンパク質の2つの異なったロットを特性化した。結果は、T2タンパク質が、ペプチド/MHC提示標的細胞に対してTCR-IgG1融合タンパク質よりもより効果的にADCC様活性を介在することを示している。改善された活性は、T2分子のペプチド/MHC複合体への増強された結合及び/又はFc受容体又はIL-15受容体を提示しているエフェクター細胞との増大した反応性の結果であろう。実施例7-細胞上に提示されたペプチド/MHC複合体と結合するT2分子の特性化T2タンパク質の細胞上のペプチド/MHC標的との結合活性を評価するために、HLA-A2陽性T2細胞を各種の量のp53aa264-272ペプチドでパルスした。次いで、細胞をそれぞれ83nMのT2タンパク質c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る、c264scTCR/huIgG1又はA2AL9scTCR/IgG1陰性コントロールと培養した。細胞をビオチニル化抗TCRAbBF1及びストレプタビジン-PEと培養した。次いで、細胞を、図21Aに示すようにフローサイトメトリーで分析した。染色細胞に対する平均蛍光強度を図21Bにプロットした。結果は、T2分子がc264scTCE/huIgG1融合タンパク質と比較して、細胞上のp53ペプチド/HLA-A2複合体を検出する増強された能力を表わすことを示す。これらの結果は、T2タンパク質が、c264scTCR/huIgG1融合よりもより効果的に標的細胞上の腫瘍関連ペプチド抗原と結合できることを示唆している。別のペプチド/MHC標的に特異的なTCRドメインを含有しているT2分子を用いて同様な結果が期待される。例えば、ヒト腫瘍関連タンパク質;p53、gp100、MART1、MAGE-A3、PSMA、PSA、Her2/neu、hTERT、チロシナーゼ、スルビビン、WT1、PR1、NY-ESO1、EGFR、BRAF及びその他に由来する様々なペプチドがHLA分子に結合すること及びTCR相互作用を介するヒトT細胞応答に対する標的であることが知られている。更に、HIV、HCV、HBC、CMV、HTLV、HPV、EBV及びその他に由来するウィルスペプチド抗原を提示するHLA複合体に特異的なTCRが同定されている。これらのTCRは、IL-15又はhuIL15RαSushiタンパク質と融合でき、そして上記のような適切なペプチド負荷抗原提示細胞上でペプチド/MHC反応性について特性化できる。実施例8-2つの異なったTCRドメインを担持しているT2分子の特性化上で示したように、T2分子のIL-15、IL-15Rα及びIgG成分と融合した複数の異なったTCRドメインを有することは有用である。これは、1つ以上の抗原標的活性を単一の多鎖タンパク質内に存在させることができる。この手法の実行可能性を明らかにするために、c264scTCR-Sushi-hIgG1-pMSGVc及びc149scTCR-hIL15N72D-pMSGVn発現ベクターをIMDM-10培地で培養したCHO細胞内に同時トランスフェクトした。室温で6日間トランスフェクト体を培養した後、培養上澄液を採取した。c149scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1のT2分子をELISAで特性化した。c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1及びc264scTCR/huIL15N72Dの精製したT2分子をコントロールとして用いた。TCRドメインを評価する1つのアッセイでは、ウェルを抗ヒトTCRAbBF1でコーティングし、融合タンパク質を添加して、結合したタンパク質をビオチニル化抗ヒトTCRAbW4F-BNで検出した。図22に示した結果は、c149scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1から成るT2分子のTCRドメインが抗TCR抗体で検出可能であったことを示している。T2タンパク質のIgG1及びIL-15ドメインを評価するために、上記のようなヤギ抗ヒトIgGAb捕獲及び抗ヒトIL-15Ab検出から成るELISAを用いた。図23に示したように、c149scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1から成るT2分子はこの形態で検出可能であり、IgG及びIL-15N72Dを含有しているタンパク質鎖の間の相互作用を示した。c149scTCRドメインの活性も、抗ヒトIgGAb捕獲及びp53aa149-157ペプチド/HLA-A2ストレプタビジン-HRP四量体による検出を用いるELISAで試験した。図24に示したように、c149scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1から成るT2分子はこの形態で検出可能であり、IgG1ドメインを有する分子もc149scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖の間の相互作用を介するp53aa149-157ペプチド/HLA-A2複合体との結合活性も有していることを示した。抗ヒトIgGAb捕獲及びp53aa149-157ペプチド/HLA-A2或いはp53aa264-272ペプチド/HLA-A2四量体による検出、又は抗TCRAbBF1捕獲及び抗TCRAb若しくは抗IL-15Ab検出から成る更なるアッセイは、それぞれのドメインがc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1及びc149scTCR/huIL15N72D鎖から成るT2タンパク質において機能的に結合されたことを立証した図24。別のタンパク質鎖、すなわち、c264scTCR/huIL15N72D及びc149scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖上でこれら2つのTCRドメインが発現されるT2分子も作成した。これらの分子のFc及びTCR活性を、続いてU937細胞と結合して、そしてp53aa264-272ペプチド/HLA-A2四量体による検出、次いでフローサイトメトリーによって評価した。図25に示したように、c264scTCR/huIL15N72D及びc149scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成るT2分子は、Fcドメインを介するU937細胞上のFcガンマ受容体を結合すること及びc264scTCRドメインを介してp53aa264-272ペプチド/HLA-A2複合体を認識することが可能であった。これらの検討は複数の機能的TCRドメイン並びにIL-15、IL-15Rα及びIgG1ドメインを有するT2分子が図1に示す構造を形成できることを立証している。実施例9-マウス及びカニクイザルにおけるT2タンパク質薬物動態の特性化IL-15による治療可能性の主な制約はインビボにおけるサイトカインの非常に短い生物学的半減期である。動物モデルにおけるT2分子の生物学的薬物動態特性を評価するために、HLA-A2/Kbトランスジェニックマウス5匹マウス/時点に精製したT2タンパク質c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る135μg/マウスを静脈内注射した。このc264scTCRが制限されている、HLA-A2.1の存在がタンパク質の薬物動態に影響を与え、そして他の非ヒトモデルより薬物動態より関連性のあるヒト化観点をもたらすはずであるので、HLA-A2/Kbトランスジェニックマウスモデルを選択した。この試験で、注射後0、1、4、8、24、48、72、及び96時間点で血液を採取して血清中のT2タンパク質の濃度をELISAで測定した。2つの異なったELISA形態を用いた:1ヤギ抗ヒトIgGAb捕獲及び抗ヒトTCRAbW4F-BN検出、又は2ヤギ抗ヒトIgGAb捕獲及び抗ヒトIL-15Ab検出。これらのアッセイは無傷タンパク質及び多鎖タンパク質複合体の安定性の評価を可能にする。図26Aに示したように、T2分子は静脈内注射に続いて約9~11時間の生物学的半減期を有していた。これは報告されているIP注射後のマウスで観察された~1時間のヒトIL-15の半減期StoklasekTAetal2006JImmunol1776072よりかなり長い。また、T2分子は供給された用量と一致した血清濃度に達したのに対して、先に報告された研究StoklasekTAetal2006JImmunol1776072ではIL-15の投与された用量は殆ど血清中で回収されなかった。従って、T2分子は遊離のヒトIL-15より有意に優れている薬物動態プロファイルを有している。更に、2つのELISAを用いて観察された同様なPKプロファイルに基づくと、T2タンパク質は開裂の証拠の無い、多鎖分子として無傷のままであった。霊長動物モデルにおけるT2分子の生物学的薬物動態特性を評価するために、カニクイザル2頭、雄1頭、雌2頭に精製したT2タンパク質c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る0.5mg/kgを静脈内注射した。この試験で、注射後0、1、4、8、24、48、72、96及び120時間点で血液を採取して血清中のT2タンパク質の濃度をELISAで測定した。3つの異なったELISA形態を用いた:1抗ヒトTCRAbβF-1捕獲及びHRP共役ヤギ抗ヒトIgGAb検出、又は2抗ヒトIL-15Ab捕獲及びHRP共役ヤギ抗ヒトIgGAb検出、又は3抗ヒトIL-15Ab捕獲及び抗ヒトTCRAbW4F-BN検出。これらのアッセイは無傷タンパク質及び多鎖タンパク質複合体の安定性の評価を可能にする。図26Bに示したように、T2分子は静脈内注射に続いて約4~6時間の生物学的半減期を有していた。これは報告されている皮下注射後のサルで観察された~1時間のIL-15の半減期VillingerFetal2004Vaccine223510よりかなり長い。従って、T2分子は遊離のIL-15より有意に優れた薬物動態プロファイルを有しているように思われる。更に、3つのELISAで観察された同様のPKプロファイルに基づくと、これらのデータはT2タンパク質が開裂の証拠の無い、多鎖分子として無傷のままであることを示唆しているネズミのPKデータをサポートしている。実施例10-異種移植腫瘍マウスモデルにおける固形ヒト腫瘍に対するT2分子の抗腫瘍活性T2分子の治療効果を確認するために、ヌードマウスにおいてp53HLA-A2A375メラノーマ細胞株を有する原発腫瘍増殖モデルにおける抗腫瘍活性を試験した。腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射して、腫瘍を治療開始前に100mm3まで生育させた。腫瘍担持マウスに、32μg/用量1.6mg/kgのc264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成るT2タンパク質、32μg/用量1.6mg/kgのc264scTCR/huIL2、又は60μg/用量3mg/kgの264scTCR/huIgG1を静脈内注射した。マウスを1日おきに1週間処置し3回注射、9日の休息期間に続いてその後1日おきに更に一週間処置した3回注射。試験中に、腫瘍の生育を測定して腫瘍容量をプロットした図27。結果をPBSのみで処置したマウスにおけるA375腫瘍の生育と比較した。図27に示したように、A375腫瘍の生育はT2分子又はTCRIL2若しくはTCRIgG融合タンパク質の何れかで処置したヌードマスにおいて阻害された。以前の研究では、このモデルにおけるp53特異的TCR-IL2又はTCR-IgG融合タンパク質の抗腫瘍効果は、エフェクタードメイン活性を、TCRドメインを介して腫瘍部位を標的化した結果であったことが示されたBelmontetal2006ClinImmunol12129、Mosqueraetal2005JImmunol1744781。この可能性を評価するために、非標的化TCRドメインを有するタンパク質がA375腫瘍異種移植マウスモデルで試験されるだろう。p53に特異的なT2タンパク質と比較した非標的化T2分子のA375腫瘍に対する減少した有効性は、腫瘍抗原標的化がT2分子の抗腫瘍活性で役割を果している証拠を提供するだろう。実施例11-IL-15及びFcドメインに突然変異を有するT2分子の特性化国際出願公開第WO2008143794号公報に開示されているように、IL-15Rβγ鎖と相互作用するその能力を増大又は減少してその生物活性に影響を及ぼす突然変異を1L-15ドメインに導入することができる。例えば、上で示したように、N72D置換はIL-15の生物活性を5~10倍増大することができる。別の例では、アンタゴニスト機能をもたらすIL-15の活性を減少することが有用である。T2分子形態に関連するこのような突然変異の効果を試験するために、IL-15ドメインの8位すなわち、D8N及び65位すなわち、N65Dの置換を含んでいるc264scTCR/huIL15構築物を作成してc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1タンパク質と同時発現した。c264scTCR/huIL15変異体及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖の得られた複合体を、実施例5に記載されているように32Dβ細胞を用いるIL-15生物活性について試験した。図28に示したように、IL-15D8N及びN65D変異を含んでいるT2分子は、IL-15N72Dドメイン又はc264scTCR/huIL15融合を含んでいるT2分子と比較して32Dβ細胞増殖をサポートするそれらの能力の有意な減少を示した。実施例5の結果と一致して、IL-15N72Dドメインを含んでいるT2分子はc264scTCR/huIL15N72D又はc264scTCR/huIL15融合体の何れかよりもより高いIL-15活性を示した。Fcガンマ受容体又は相補体と相互作用するその能力を減少することが先に示されたIgG1FcドメインHessellAJetal2007Nature4491011040、参照により本明細書に取り込まれている内にも突然変異を導入した。例えば、IgG1CH2の234位及び235位のロイシン残基抗体コンセンサス配列に基づく番号付けすなわち、...PELLGG...のアラニン残基による置換すなわち、...PEAAGG...は、Fcガンマ受容体結合の損失をもたらすのに対して、IgG1CH2の322位のリジン残基抗体コンセンサス配列に基づく番号付けすなわち、...KCKSL...のアラニン残基による置換すなわち、...KCASL...は相補体活性化の損失をもたらすHessellAJetal2007Nature4491011040、参照により本明細書に取り込まれている。これらの置換をc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1構築物内に導入して、得られたタンパク質をc264scTCR/huIL15N72D又は上記の別のTCR-IL15変異体と同時発現した。これらの複合体がp53aa264-272ペプチド-負荷HLA-A2陽性T2標的細胞に対するヒトPBMCのADCC活性を介在する能力を実施例6に記載されているようにして評価した。Fc機能を変化させることが知られているその他の突然変異は、例えば、LazaretalPNAS103400540102006参照により本明細書に取り込まれているに提供されている。図29に示したように、c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1-LALA及びc264scTCR/huIL15N72D鎖を含んでいるT2複合体はFc-LALA変異体によって示されたFcガンマ受容体結合の損失と一致して高レベルのADCC活性を介在することができなかった。これと対照的に、c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1-KA及びc264scTCR/huIL15N72D鎖又は上記のIL-15変異体N65D又はD8Nを含んでいる複合体はc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1-c264scTCR/huIL15N72D複合体と同レベルのADCC活性を示した。メカニズムに捕らわれずに、これらのデータも、IL-15ドメイン及びFc相補体結合ドメインがADCC活性を介在することとは関連していないという可能性に基づいて予測される。IL-15及びFc突然変異の、ヒトNK及びT細胞応答を刺激するT2分子の能力への影響も試験した。1.8~5×105細胞/mLのヒトPBMCを、上記の突然変異を含んでいる1nMのT2分子、又はコントロールとして10ng/mLの組み換えヒトIL-2又はIL-15を含んでいる培地中、37°Cで4日間培養した。次いで、NK細胞傷害性を、NK感受性K-562細胞を標的細胞として用いて評価した後、50μg/mlのカルセイン-AMで標識化した。各種比のPBMC及びK-562細胞を混合してCO2インキュベーター内、37°Cで2時間培養し、100μlの条件培地を採取して、溶解した細胞から放出されたカルセインについて分析した。カルセインをEx-485nm、Em-538nm、及びカットオフ-530nmで蛍光リ-ダーを用いて定量した。特異的細胞溶解を次の式を用いて計算した:特異的溶解=exp-バックグラウンド-自動放出/[完全放出-バックグラウンド-自動放出×100、Exp=K-562細胞PBMC;バックグラウンド=培地のみ;自動放出=K-562細胞のみ;完全放出=K-562細胞0.5トリトンX-100。図30に示したように、c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1及びc264scTCR/huIL15N72D鎖を含んでいるT2分子との培養は、培地だけで培養した後に観察されたものと比較してヒトPBMCのNK細胞溶解活性を刺激することができた。更に、FCドメインLALA及びKA変異体を含んでいるT2分子もNK細胞を刺激できたのに対して、IL-15ドメインにN65D又はD8N置換を含有しているものはNK細胞傷害性を殆ど又は全く刺激しないはずだ。これらの結果と一致して、ヒトPBMCの、c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1及びc264scTCR/huIL15N72D鎖を含んでいるT2分子、又はFcドメインLALA及びKA変異体を有するものとの培養はCD56NK細胞の増殖の増大をもたらしたのに対して、IL-15N65D又はD8N置換を含んでいるT2分子はそれほどのNK細胞増殖活性をもたらさなかった図31。それぞれのIL-15の機能性に基づいてこのような結果が期待される。ある適用に対しては、T2分子とIL-15又はFc受容体との間の減少した相互作用は、これらの受容体を担持している細胞との非特異的結合を減少するために望ましいだろう。これを評価するために、IL-15及びFc突然変異を含有しているT2分子をペプチドを負荷させたT2細胞を用いてTCR特異的標的細胞認識について評価した。T2分子又はc264scTCR-ストレプタビジン四量体陽性コントロールによる細胞染色を、実施例7に記載された方法を用いてp53ペプチドを負荷させたT2細胞T2.265及び負荷させていないT2細胞T2上で実施した図32A。非負荷細胞の染色に基づくと、c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1及びc264scTCR/huIL15N72D鎖を含むT2分子は、c264scTCR-ストレプタビジン四量体又はBF1抗体コントロールと比較して、有意な細胞結合を示すことが明確である。FcLALA又はIL-15N65D若しくはD8N突然変異の導入はこの細胞結合を減少して、Fc及びIL-15受容体の両方との相互作用がT2複合体結合に役割を果していることを示唆している。FcLALAとIL-15N65D又はD8N突然変異との組合わせは、c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1-LALA及びc264scTCR/huIL15D8Nを含む分子が上記BF1抗体陰性コントロールを負荷していないT2細胞との結合を示さないように、T2複合体結合を更に減少する。p53ペプチド負荷細胞の染色もFc又はIL-15突然変異の導入によって達成される。しかしながら、ペプチド負荷対非負荷細胞のT2分子染色の平均蛍光強度を比較したとき特異的対非特異的の比、c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1-LALA及びc264scTCR/huIL15D8N鎖を含むT2分子がp53ペプチド抗原に対して最も高い染色特異性をもたらすことが明確である図32B。これらの結果は、T2分子のTCR、IL-15及びIgGFcドメインのそれぞれの結合活性が容易に独立して操作されて望ましい生物活性を有する多重特異的複合体をもたらすことを示している。別の場合では、IL-15ドメイン及びIgGFcドメイン活性を改変して、T2複合体の治療インデックスを最適化して毒性を最小化することが有用である。例えば、その治療効果の一部をADCC活性に依存している標的複合体はIL-15成分の耐容用量レベルを超える高いレベルの用量すなわち、1~20mg/kgを必要とするかもしれない。そのような場合は、その活性を減少する突然変異をIL-15ドメイン中に含有している複合体がより良い治療活性及びより低い毒性をもたらすと期待される。上記のIL-15ドメイン中のN65D又はD8N置換、又はIL-15活性を減少することが見出されている、I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P又はQ108Aを包含する、その他の置換を含有しているT2分子は特に注目される。実施例12-非標的化T2分子の特性化いくつかの適用では、T2複合体を用いて特異抗原を標的化する必要はない。このような分子では、TCR結合ドメインのような抗原特異的ドメインは突然変異によって又は完全に欠失させることによって不活性化できる。本明細書に記載されている方法を用いて、T2MΔTCRと称するhuIL15RαSushi/huIgG1及びhuIL15D8N鎖を含むような分子の活性を、c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1及びc264scTCR/huIL15N72D鎖を含むT2分子T2Mと称する及びhuIgG1鎖を欠失しているT2分子c264scTCR/huIL15RαSushi及びc264scTCR/huIL15N72D、T2MΔIg又はc264scTCR二量体と称すると比較した。実施例5に記載されているように32Dβ細胞生育をサポートする能力を試験したときに、T2MΔTCRは組み換えヒトIL-15を用いて観察されたものの>24倍である非常に強いIL-15活性を示した図33A。ヒト免疫細胞生育をサポートするT2MΔTCRの能力も評価した。1×106細胞/mlのヒトPBMCをT2M0.5nM、T2MΔTCR0.5nM、又はT2MΔIg1nMの存在下又は非存在下で培地と7日間培養した。細胞を抗CD45RO及び抗CD8、又は抗CD8、抗CD95、及び抗CCR7、又は抗CD56及び抗CD16で染色して、FACScanで分析した。図33Bに示される8つの異なったドナーから得た平均した結果は、T2MΔTCR及びその他のT2分子が、エフェクター記憶T細胞を包含する、各種CD8記憶T細胞及びNK細胞サブセットの増殖を効果的に刺激できたことを示唆している。これらの細胞のNK細胞活性を実施例11に記載されている方法を用いて試験した。図33Cに示される2つのドナーPBMC調製物からの代表的な結果は、T2MΔTCR及びその他のT2分子がNK細胞溶解活性を効果的に刺激できたことを示唆している。これらの結果の全てが、T2MΔTCRタンパク質は強力な免疫刺激性分子であることを示唆している。実施例13-T2分子のインビボ活性T2分子の免疫刺激活性を更に特性化するために、T2M、T2MΔTCR、IgG1CH1ドメインを欠失しているT2MΔTCRT2MΔTCRΔCH1、Fc-LALA突然変異を有するT2MT2MLALA及びIL-15D8N突然変異を有するT2T2MD8NをC57BL/6マウスにおいてNK及びCD8T細胞の増殖を誘発するそれらの能力について試験した。更に、c264scTCR/huIL15N72D、c264scTCR/huIL15RαSushi及びc264scTCR/huIL15N72Dc264scTCR/huIL15RαSushi複合体を評価した。マウスにIL-15の2.5μg用量に相当する量の融合タンパク質を1日目と4日目に静脈内に注射した。8日目に、血液細胞と脾臓細胞を採取し、CD8T細胞及びNK細胞について染色して、フローサイトメトリーで分析した。図34に示した結果はT2分子が血液及び脾臓のNK細胞及びCD8T細胞の両方をインビボで増殖させるのに効果的であることを示唆している。T2MLALAはT2Mと同様の活性を示して、FcR結合及びシグナル伝達はNK及びCD8T細胞の増殖に有意な役割を果さないであろうことを示唆した。T2MD8N処置はT2Mと比較すると減少した活性をもたらし、ヒトPBMCを用いるインビトロにおける分子の免疫刺激活性をD8N突然変異が消失するという知見を確認した。TCRの欠失T2MΔTCR及びTCRとCH1の欠失T2MΔTCRΔCH1は減少した活性を示した。これらの結果はこれらのより小さい分子のより短い半減期に起因しているかもしれない。c264scTCR/huIL15N72D、c264scTCR/huIL15RαSushi及びc264scTCR/huIL15N72Dc264scTCR/huIL15RαSushi複合体もT2Mと比較して減少したインビボ活性を示して、T2分子がより強力な免疫刺激性化合物であることを示唆しているインビトロ結果を立証した。実施例14-多重特異的T2分子多重結合ドメインのスカフォールドとして作用するIL-15とIL-15Rα/IgGFcの融合ドメインの能力を更に特性化するために、huIL15N72Dと結合したH-2Kb-制限OVAaa257-264ペプチドSIINFEKLに特異的な1本鎖TCRドメインOT1scTCRとhuIL15RαSushi/huIgG1融合と結合した1本鎖CD8α/βドメインを含む、融合タンパク質複合体OT1-CD8-T2Mを作成した。1本鎖CD8α/βドメインは、G4S4ペプチドリンカーを介してネズミCD8βの細胞外ドメインと結合しているネズミCD8αの細胞外ドメインを含んでいる。CD8が、TCR特異的ペプチド/MHC接合部と遠位のMHC分子内の部位と結合することが十分に特性化される。従って、OT1-CD8-T2M複合体のOTscTCRとscCD8α/βドメインの両方がOVAaa257-264/H-2Kb-分子上の異なった部位で相互作用すると期待される。これを試験するために、OT1-CD8-T2Mの結合活性をOT1scTCR/huIL15N72D融合体のそれとELISAで比較した。それぞれのタンパク質の等モル量を抗TCRCβmAbH57でコーティングしたウェウル上に捕獲して、OVAaa257-264/H-2Kb四量体又はIL15、CD8α、CDβ或いはTCRVα2に対するmAbでプローブした。アッセイを抗ヒトIgでコーティングしたウェルで実施して、抗TCRVα2でプローブした。図35Aに示したように、OT1-CD8-T2Mタンパク質は抗IL-15、CD8α、CD8β、TCRVα2及びヒトIg抗体に対して反応性を示した。T2M融合複合体の多価形態に基づいて期待されるように、OT1scTCR/huIL15N72Dより抗TCRVα2mAbに対して約3倍高い反応性があった。しかしながら、OT1scTCR/huIL15N72D融合体はOVAaa257-264/H-2Kb四量体との結合を殆ど或いは全く示さなかったのに対してOT1-CD8-T2Mタンパク質では結合が明らかに表れた図35B。これらの結果は、OT1-CD8-T2M複合体のOTscTCR及びscCD8α/βドメインの両方がOVAaa257-264/H-2Kb分子と結合して親和性の高い安定な相互作用をもたらすことを示唆している。実施例15-機能的スカフォールドとしてのIL15:IL-15Rαドメインペプチド/MHCクラスIpMHCI四量体の製造-上記のようなC57BL/6マウスリンパ球から抽出した全RNAから、ネズミH-2Kb遺伝子をクローンした。細胞外領域をHLA-A0201コード配列31を置き換えるHLA-A0201重鎖発現ベクター31内にライゲートした。β2m、HLA-A0201及びH-2Kb発現ベクターを個々にE.coli内に形質転換し、記載31のようにして組み替えタンパク質の発現を誘発して、不溶性封入体として発現した。ペプチドと共に複合体活性及び溶解性タンパク質を、httpwwwmicrobiologyemoryedualtmanjdaWebSitev3ptetPrepOverviewshtmlに記載されているリフォールディング方法で得た。p53aa264-272及びaa149-157ペプチド/HLA-A0201試薬をそれぞれA2/p53.264-272及びA2/p53.149-157と称し、OVAaa257-264ペプチド/2KbをKb/OVA。257-264と称する。ELISA-免役プレートMaxisorbNuncRochesterNYを、c264scTCR融合タンパク質を捕獲するためのBF18A3.31mAbで、或いはOT1scTCR融合タンパク質を捕獲するためのH57-597mAbでコーティングした。洗浄した後、結果の部に詳述したような各種プローブを用いてタンパク質を検出した。次いで、ABTS2,2’-アジノビス3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸-ジアンモニウム塩基質を加えて、96ウェルプレートリーダーVersamaxSunnyvaleCAを用いて405nmにおける吸光度を測定した。フローサイトメトリー-c264scTCR融合タンパク質複合体を特性化するために、T2細胞をペプチド負荷エンハンサーPLE、AltorBioScienceCorpMiramarFLの存在下、37°Cで2時間p53aa264-272ペプチドでパルスした。OT1scTCR融合タンパク質複合体について、ネズミリンパ腫EL4細胞を100μg/mlのOVAペプチド及びPLEで37°Cで6時間パルスした。各種のbirA融合タンパク質SA-PEと複合したを加えて4°Cで1時間培養した。サンプルを2回洗浄して、CellQuestソフトウェアBDBiosciencesSanJoseCAを用いてFACScanフローサイトメトリーで分析した。IL-15ドメインの結合活性を評価するために、32Dβ細胞を320nMのc264scTCR融合タンパク質複合体と4°Cで30分間培養した。タンパク質の結合を、ビオチニル化BF18A3.31mAbで15分間、及びSA-PEそれぞれ5μg/mlで15分間順に検出した。染色した細胞を上記のようにフローサイトメトリーで分析した。細胞増殖アッセイ-先に記載されている25ようにして細胞増殖を測定した。すなわち、32Dβ細胞1×105細胞/ウェルを、等モル濃度のTCR/hIL-15RαSuの存在下又は非存在下で、濃度を増大させたscTCR/hIL-15又はscTCR-hIL15突然変異タンパク質と37°Cで48時間培養した。細胞増殖試薬WST-1RocheAppliedScienceIndianapolisINを製造会社の手順に従って細胞増殖の最後の4時間の間に添加した。代謝的に活性な細胞によるWST-1の着色フォルマザン色素への変換を440nmにおける吸光度測定によって確認した。Prizm4ソフトウェアGraphPadSoftwareLaJollaCAで適合させる非線形回帰可変傾斜曲線によって実験データから作成した用量依存曲線でEC50を確認した。表面プラズモン共鳴-Ot1scTCR融合タンパク質のそれらの同種pMHCIとの親和定数を、BIAcore2000計器GEHealthcarePiscatawayNJで表面プラズモン共鳴SPR手法を用いて確定した。ビオチニル化pMHCI複合体を、HBS緩衝液10mMのHEPES、150mMのNaCL、3.4mMのEDTA、0.005のp20界面活性剤、pH7.4中2μg/mlのタンパク質を流速10μl/分で注入して、SA5センサーチップGEHealthcarePiscatawayNJのストレプタビジンでコーティングした表面上に固定化した。これは固定化したpMHCI複合体の1000~1200RUをもたらした。精製したOT1scTCR融合タンパク質をHBS中で1μM、0.5μM及び0.25μMに希釈する。それぞれの濃度を流速10μl/分で新たに固定化したpMHCI表面上、並びにビオチンでブロックしたコントロールのストレプタビジン表面ベースライン上に1度注入し50μlて、結合曲線を記録した。解離定数KD及び結合konと解離koffの比を、BIA評価4.1.1ソフトウェアGEHealthcareSciencesPiscatawayNJを用いて、修正した結合曲線ベースラインを差し引いたから計算した。hIL-15:hIL-15Rαスカフォールドを用いるscTCR二量体の作成-c264scTCR/hIL-15と称する生物活性な、二元機能を有する融合タンパク質は、hIL-15のN末端を3つのドメイン、p53aa264-257ペプチド抗原c264scTCRに特異的なHLA-A0201-制限キメラTCRと融合することによって生成できることを先に示した25図36A。c264scTCR及びヒトIL-15Rαのsushi結合ドメインaa1-66hIL-15RαSuを用いて同様な融合タンパク質を構築し、これはhIL-15結合に応答可能な構造要素を含有することが示されている。この融合タンパク質は遺伝子学的にbirAペプチドタグと結合してストレプタビジンの存在下でビオチニル化及びそれに続く多量体化を可能にする32。この融合タンパク質をc264scTCR/hIL-15RαSu/birAと称し、そのCHO細胞からの発現及び精製はc264scTCR/hIL-15のそれと同様であった25。これらの融合タンパク質は細胞培養上澄液のリットル当りミリグラムのレベルで容易に産生できるデータは示されていない。hIL-15とhIL-15RαSuドメインの間の高い特異的結合活性に基づいて、この融合タンパク質はヘテロ二量体複合体を形成できると推測した。更に、ヒトIL-15:IL15Rα複合体の結晶構造の実験は、2つのタンパク質のN-末端がほぼ50Å離れて複合体の反対端にあることを示唆した33。従って、scTCRドメインのこれらの領域との融合は複合体形成を阻害しないことが期待される。c264scTCR/hIL-15とc264scTCR/hIL-15RαSu/birA融合タンパク質の間の結合の最初の証拠が、hIL-15及びc246scTCR/hIL-15タンパク質を捕獲するためのプレートに結合したc264scTCR/hIL-15RαSu/birAを用いるELISAで観察された25。二量体c264scTCR融合タンパク質複合体c264scTCR二量体と称するを更に特性化するために、等モル量の精製c264scTCR/hIL-15とc264scTCR/hIL-15RαSu/BirA融合タンパク質を混合して10分以上室温で結合させた。複合体及び個々のタンパク質融合体をサイズ排除クロマトグラフィーで評価した。図36Bに示すように、精製c264scTCR/hIL-15とc264scTCR/hIL-15RαSu/BirA融合タンパク質調製物中の主要種は単量体タンパク質それぞれ、分子量MW=115及び113kDaと一致するSECプロファイルを示したのに対して、2つのタンパク質の混合物は二量体複合体に対応する分子量MW>192kDaを有する主要ピークをもたらした。従って、c264scTCR二量体調製物中により大きい分子量の種が出現したことはヘテロ二量体複合体が生成されたことの証拠である。c264scTCR二量体を単量体c264scTCR/BirAタンパク質と、TCR特異抗原、p53aa246~272/HLA-A0201を結合するそれらの能力について比較した。それぞれの場合に、タンパク質をビオチンリガーゼでビオチニル化した後、SA-PEと複合体化して32先に記載されるように32多量体フローサイトメトリー染色試薬を作成した。様々な濃度のp53aa264-272ペプチドでパルスされたHLA-A0201-陽性T細胞を染色するために用いる場合、両方の試薬は、ペプチドの濃度依存的に増大する抗原特異的結合を示した図37A。しかしながら、c264scTCR二量体を含む染色試薬は単量体由来C264scTCR/birA対応物より最大3倍より良く染色した図37B。メカニズムに囚われることなく、これらのデータはIL-15:IL-15Rα相互作用による二量体化がscTCRの機能活性を保存して、増大した親和性を通してその同種HLA/ペプチドとのscTCR複合体の効果的な親和性を増大することを示唆している。birAタグによるビオチニル化を複合体のscTCR/hIL-15のC-末端を対象としたときに同様な結果が観察されたデータは示していない。このことは複合体のC末端が、二量体化又は融合タンパク質複合体の抗原結合ドメインの何れにも影響を与えずに、有意な大きさの分子のプローブストレプタビジンのMWはほぼ60kDaであると、共役するために利用しやすいことを明らかにしている。これらの検討を、二重特異的分子を生成する可能性を試験するために拡張した。149~157のアミノ酸残基に広がるヒトp53タンパク質のHLA-A0201制限エピトープを認識する第2scTCRc149scTCRを作成した24。このscTCRをhIL-15と融合して、c149scTCR/hIL-15と称する、得られたタンパク質をCHO細胞内でc264scTCR/hIL-15αSu/birA融合体と同時発現した。組み換えCHO細胞培養液の上澄液中で観察されたこの融合複合体を抗IL-15抗体を用いて固定化してHRP-標識化p53aa264-272又はp53aa149-157ペプチド/HLA-A0201四量体の何れかでプローブした。図37Cに示すように、抗IL-15抗体が捕獲した融合タンパク質複合体は両方のペプチド負荷HLA四量体と結合できた。この結果は、hIL-15:hIL-15RαSuスカフォールドと融合したときに、個々のscTCR分子が機能活性を保持して、hIL-15:hIL-15RαSu複合体の空間配置が個々におよそ40kDaの分子量を有しているscTCRドメインの充填に有意には影響を及ぼさないことを明らかにしている。hIL-15:hIL-15RαSuスカフォールドのタンパク質二量体化に対する汎用性を明らかにするために、一方がhIL-15のN-末端に融合していて他方がhIL-15RαSu/birAタンパク質のN-末端に融合している2つの1本鎖OT1TCRを対合して第2二量体scTCR融合複合体を作成した。OT1は、ネズミH-2Kbとの関連で、アミノ酸残基257-264に広がるOVAタンパク質のエピトープを認識するとよく特徴付けられたTCRである34。組み換えCHO細胞発現のために、OT11本鎖TCROT1scTCR遺伝子を作成して、hIL-15とOT1scTCR/hIL-15RαSu/birA構築物と融合した。親和性精製したOT1scTCR融合タンパク質は捕獲試薬として抗マウスTCRCβH57抗体、及びHRP標識化、OVAaa257-264ペプチド負荷H-2Kb四量体を用いるELISAでpMHCI結合活性を有することが見出された図42。OT1scTCR二量体とOT1scTCR/birA単量体の間の結合活性の相違を区別するために、c264scTCR二量体についての上記方法と同様だが、OVAaa257-264ペプチドを負荷したH-2Kb陽性EL4細胞を用いてフローサイトメトリー分析を行った。図38に示すように、OT1scTCR二量体を含むSA-PE四量体は実際に、単量体OT1scTCR/birA融合体を含むものより有意によく染色した。ストレプタビジンセンサーチップ上に固定化されたビオチニル化OVAaa257-264ペプチド負荷H2-Kb/birA複合体に対するOT1scTCR単量体及び二量体の結合親和性を評価するために表面プラズモン共鳴アッセイも実施した。OVAペプチド/H-2Kb複合体に対するOT1scTCR二量体の見掛け上の結合親和性KDは約30μMであると推定されたのに対して、単量体OT1scTCR/birA融合タンパク質については結合が観察されなかった表1。これらのデータは、hIL-15:hIL-15Rα相互作用による二量体化がscTCRの生物活性を保存して、増大した親和性によってscTCR分子のその同種pMHCI複合体との効果的な親和性を増大することを裏付けている。Ot1scTCR/scCD8ヘテロ二量体の作成-CD8分子がOT1TCRとその同種OVAペプチド/H2-Kb複合体の間の相互作用に極めて重要な役割を果していることが先に明らかにされているので35~37、hIL-15:hIL-15RαSuスカフォールドは、細胞表面で発現されるOVAペプチド/H-2Kbに対するOT1TCR結合親和性を、そして細胞及び接着分子非存在条件下でCD8分子が増大するか否かを評価する機会をもたらす。これを実施するために、最初に、フレキシブルなリンカーを用いてネズミCD8のα及びβ鎖の細胞外ドメインを融合して1本鎖形態のネズミCD8分子scCD8を作成した。この融合遺伝子をレトロウィルス発現ベクター中でhIL-15RαSu/birAと融合した。次いで、組み換えレトロウィルスをOT1scTCR/hIL-15融合タンパク質を発現しているCHO細胞株を感染するために用いた。ヘテロ二量体融合タンパク質複合体を培養した組み替えCHO細胞の上澄液から抗TCR抗体ベースのアフィニティークロマトグラフィーを上記のように用いて精製した。この精製したタンパク質を捕獲試薬として抗TCR抗体及びプローブとしてビオチニル化抗mCD8α又は抗mCD8βmAbの何れかを用いるELISAに付した。図39Aに示すように、抗TCRAb固定化融合複合体はCD8α及びCD8βの両方を含んでいるので、OT1scTCR/scCD8ヘテロ二量体の形成を示唆している。フローサイトメトリー分析を用いて、細胞表面上に提示される様々な量のOVAペプチド/H-2Kb複合体に対するOT1scTCR/scCD8ヘテロ二量体の結合活性をOT1scTCR二量体と比較した。図39Bに示すように、OT1scTCR/scCD8ヘテロ二量体を含む染色試薬は、わずか10ng/mlのOVAペプチドを負荷したEL4細胞上で、OVAペプチド/H-2Kb複合体を容易に検出できたのに対して、OT1scTCR二量体を含む相当する試薬を用いたときはこのペプチド濃度で殆ど或いは全く染色が観察されなかった。ペプチドでパルスされていないEL4細胞上で、OT1scTCR/scCD8ヘテロ二量体のより高いバックグラウンド染色が観察されて、細胞表面上でCD8ドメインとMHC分子の間でペプチド非依存的な相互作用が生じたことを示唆している。T細胞上で発現されたCD8分子と結合するpMHCI四量体について同様な効果が報告されている38。OT1scTCR/scCD8ヘテロ二量体のペプチド特異的相互作用の結果を表面プラズモン共鳴分析で更に確認した。OT1scTCR/scCD8ヘテロ二量体のOVAペプチド/H-2Kb複合体に対する結合親和性KDを、OT1scTCR二量体について観察された~30μMより有意に高い、2.6μMであると推定した表1、図43。どの融合タンパク質もコントロールVSVペプチド/H-2Kb複合体との結合を示さなかった。OT1scTCR二量体の2価特性がこのアッセイ形式で増大した機能的親和性をもたらすと期待されることを考えると、特異的pMHCI結合活性の相違は驚くべきことである。更に、可溶性TCR、CD8α/β及びpMHCIタンパク質を独立した成分として用いて行った同様なSPR結合研究はCD8タンパク質とペプチド/H-2Kb複合体の間に単に弱い相互作用KD30~100μMのみを示し、TCR:ペプチド/H-2Kb相互作用に対するCD8の協調的効果を示さなかった39~41。まとめると、これらのデータは、OT1scTCR融合体へのCD8α/βドメインの付加は、2価OT1scTCR分子の作成よりもpMHCI結合により大きい影響を及ぼすことを示している。本発明者らの結果は更に、hIL-15:hIL-15RαSuスカフォールドは、複雑なタンパク質-タンパク質相互作用に適合する柔軟性を有する機能的な二重特異性分子を作成するために用いることができることを明らかにしている。また、本発明らは機能的なCD8分子を可溶性1本鎖分子として構築できることを初めて示して、scCD8ドメインがヘテロ二量体分子内でOT1scTCRと複合体を形成すると、その他の接着分子が存在していない無細胞条件下で、TCR:pMHCI相互作用を増強することを明らかにした。機能的TCRα/βヘテロ二量体の作成-上で示したように、hIL-15及びhIL-15RαドメインのN-末端は複合体の遠位末端にあり、このスカフォールドが多鎖タンパク質のポリペプチドと融合するために適しているか否かという問題を提起している。hIL-15及びhIL-15RαSuスカフォールドを用いて可溶性で、生物活性なヘテロ二量体TCRα/βを構築できるか否かを確認するために、細胞外OT1TCRVα-Cα及びVβ-CβドメインのC-末端をそれぞれ、hIL-15及びhIL-15RαSu/birAのN-末端に結合した。公表されているα/βTCRの結晶構造に基づくと、適切に折り畳まれたOT1TCRα/β分子のTCRCα及びCβC-末端アミノ酸は~18Å離れていると推測される42。OT1TCRα/hIL-15及びOT1TCRβ/hIL-15αSu/birA融合遺伝子を2つの別々の発現ベクター内にクローンしてCHO細胞内に同時にトランスフェクトした。分泌された融合タンパク質複合体を上記のように抗TCRCβmAbアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。還元条件下のクーマシー染色SDS-PAGEで分析すると、精製されたタンパク質のバンドが、2つの融合分子それぞれの計算された単量体MW40kDaと一致して、50kDaに移動したデータは示されていない。精製したタンパク質を更に機能的ELISA抗TCRCβmAbで捕獲:OVAペプチド/H2-Kb四量体でプローブで特性化した。図40Aに示すように、精製したタンパク質は1本鎖形態にあるOT1TCRと同等のpMHCI結合活性を有していることが分かった。同様な結果が、p53特異的264TCRのVα-Cα及びVβ-Cβ鎖とのhIL-15:hIL-15RαSu/birA融合体で観察された図40B。哺乳動物細胞内で可溶性α/βTCRヘテロ二量体を産生する以前の試みは殆どうまくいかなかった43、44。従って、本発明者らの結果は、トランスフェクト細胞内でhIL-15及びhIL-15RαSu/birAドメインの結合によってTCRα及びβ鎖が適切に折り畳まれていたことを示唆している。興味深いことに、hIL-15:hIL-15RαSuスカフォールドのN-末端との融合は、c264scTCR/c149scTCRヘテロ二量体複合体を用いて観察されたように機能的に独立した結合ドメインにとって十分な空間配置を提供できるる一方、OT1TCR及び264TCRのα及びβ鎖のような近接して対合している鎖の折り畳みを可能にする柔軟性を保持している。hIL-15:hIL-15RαSu融合複合体についてのhIL-15ドメインの生物活性-c264scTCR二量体のhIL-15:hIL-15RαドメインのIL-15受容体IL-15RβγC結合能力をhIL-15Rβ及びネズミγCmγC鎖を担持している32Dβ細胞を用いるフローサイトメトリー分析で評価した。これらの検討は野生型hIL-15ドメインを含有しているc264scTCR二量体を、更にhIL-15Rβ鎖との結合を増強するN72D又は減少するD8Nことが先に示されている25IL-15突然変異タンパク質ドメインを有する二量体も用いて実施した。また、本発明者らは、これらの突然変異がhIL-15:hIL-15RαSu複合体の形成に影響を及ぼさないことを明らかにしている25。c264scTCR二量体と培養した後、32Dβ細胞を抗TCRmAbで染色して細胞に結合している融合タンパク質二量体を検出した。図41Aに示したように、32Dβ細胞はhIL-15野生型又はhIL-15N72Dドメインを含有しているc264scTCR二量体によって確実に染色されたが、hIL-15D8Nドメインを含有しているものでは染色されず、複合体のIL15:IL-15RαSu部分が予測されたIL-15RβγC結合活性を保持していることを示唆した。融合タンパク質二量体のhIL-15生物活性も32Dβ細胞を用いる細胞増殖アッセイで試験した。図42Bに示すように、単量体scTCR/hIL-15融合体又は二量体scTCR/hIL-15:scTCR/hIL-15RαSu融合形態中のhIL-15野生型ドメインは濃度依存的に32Dβ細胞の生育をサポートできた、~300pMの半数最大刺激halfmaximalstimulation:EC50を示した。hIL-15N72D又はD8Nドメインは、これらが単量体又は二量体融合体中の何れに存在しているかに関わらず、それぞれ融合タンパク質の生物活性を増大又は消去した。これらの結果は、N72D又はD8N突然変異体を担持している非融合IL-15サイトカインで観察された機能活性と一致している25。従って、2つの独立したTCRドメインを含有している融合タンパク質複合体の形成はIL-15ドメインの生物活性を有意には変化させない。対照的に、OT1TCRα/βヘテロ二量体複合体に関してはIL-15活性の少なくとも3倍の損失がありデータは示されていない、ヘテロ二量体TCR構造の形成が、ある程度、hIL-15ドメインのhIL-15RβmγCと相互作用する能力を阻害することを示唆した。更に、これらの結果は、hIL-15ドメインが受容体結合及び機能活性を増強又は減少できるように容易に操作できて、よって異なる適用においてhIL-15:hIL-15RαSuスカフォールドの使用に更に柔軟性をもたらすことを示している。実施例16-免疫正常マウスにおけるT2分子の毒性プロファイル及び抗腫瘍活性T2分子、IgG1CH1ドメインを欠失しているT2MT2MΔCH1及び非標的化T2MΔTCRΔCH1タンパク質複合体の更なるインビボ効果を確認するために、腫瘍担持免疫正常C57BLマウスにおいて毒性及び抗腫瘍活性を試験した。B165×105/マウス又はEG71×106/マウスネズミ腫瘍細胞をC57BL/6NHsdマウスに試験0日目に皮下に注射した。試験1、4、8及び11日目に腫瘍担持マウスに、51又は25.5μg/用量のT2タンパク質c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る、47.7μg/用量のT2MΔCH1c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1CH2-CH3鎖から成るT2タンパク質の51μg/用量と等モル、16.6又は8.3μg/用量のT2MΔTCRΔCH1huIL15N72D及びhuIL15RαSushi/huIgG1CH2-CH3鎖から成るそれぞれT2タンパク質の51及び25.5μg/用量と等モル、又は1.2μg/用量のrhIL-15T2タンパク質の25.5μg/用量と等モルを静脈内に注射した。試験期間中、動物の体重及び腫瘍の容量を測定して結果をプロットした図44A-B及び45A-B。T2M、T2MΔCH1及びT2MΔTCRΔCH1タンパク質による処置はPBS処置後に観察されたものより有意にB16図44A及びEG7図45A腫瘍の生育を阻害して、それぞれの融合タンパク質複合体は等モル濃度で投与されたrhIL-15よりもより有効であった。また、腫瘍担持マウスの体重変化の測定の通り、T2M、T2MΔCH1及びT2MΔTCRΔCH1処置の細胞毒性効果は殆ど或いは全くなかった図44B及び45B。メカニズムにとらわれることなく、これらのデータは、免疫正常マウスにおいてこれらの分子のインビボ免疫刺激活性と一致している実施例13。実施例17-T2M及びその誘導体の免疫刺激及び抗腫瘍活性の更なる特性化同様な標的化IL-15:IL-15Rα-Fc複合体を更に特性化するために、c264scTCR/huIL-15及びc264scTCR/huIL-15Rα/IgG1Fc融合タンパク質を同時発現する組み換えCHO細胞株を作成した。ある場合は、ヒトIgG1ドメインは全重鎖定常CH1-CH2-CH3を包含し、第2の場合は、CH2-CH3ドメインすなわち、ΔCH1又はFCドメインを上記のようにして用いた。ヒトIgG1CH2-CH3ドメイン又はFcドメインのタンパク質配列を図46に示す。簡単にするために、この実施例では、得られたc264scTCR/huIL15N72Dスーパーアゴニスト:c264scTCR/huIL15Rα/IgG1CH1-CH2-CH3複合体をT2分子T2Mと、そしてc264scTCR/huIL15N72Dスーパーアゴニスト:c264scTCR/huIL15Rα/IgG1CH2-CH3複合体をT2M2上記のようにT2MΔCH1ともと称する。これらの複合体の利点はFcドメインを介する二量体化及びIL-15とIL-15Rαドメインの間の相互作用が、IL-15Rβγ陽性細胞及びFc受容体FcR陽性細胞と結合可能な四量体標的化分子を生ずることである。また、これらのドメインそれぞれの活性を同種受容体との相互作用を減少する突然変異体によって分析できる。組み替えCHO細胞による可溶性発現の後、これらの複合体を抗TCRCβmAb-セファロース及びプロテインAセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーで精製して均質にした。サイズ排除クロマトグラフィーが、無傷の複合体について期待されているサイズに分子が移動したことを示した。上記分析と同様に、ELISAに基づく方法が、T2M及びT2M2のscTCR及びIL-15ドメインがそれらそれぞれの結合活性を保持することを確認している。更に、T2M及びT2M2のIgG1ドメインは、scTCR-IgG1融合体のそれに匹敵する活性を有するペプチド/HLA四量体での特異的検出を可能にするFc受容体FcR担持細胞を結合する能力を保持している。T2M及びT2M2はp53aa264-272/HLA-A2複合体を提示している標的細胞に対するヒトリンパ球のADCC活性を介在することができた図47。これらの結果は、T2M及びT2M2がscTCR-IgG融合体について先に記載される抗体様エフェクター機能を保持していることを立証する。FcR結合活性を減少するFc突然変異LALAを含有している複合体を用いる検討は機能的FcドメインがADCC活性に必要であったことを明らかにした。T2M及びT2M2はIL-15依存性32Dβ細胞株の生育もサポートしたが、T2M2はT2Mより約~3倍低いインビトロIL-15活性を示した。マウスにおける免疫応答を刺激するこれらの分子の能力も評価した。IL-151mg/kgによるC57BL/6マウスの処置は、白血球WBC数、脾臓重量又は血中のNK及びCD8T細胞集団に殆ど或いは全く影響を与えなかったのに対して、IL-15N72D:IL-15Rα-IgGCH2-CH3複合体IL-15の用量と等モルでによる処置は、同様なIL-15:IL-15Rα-Fc複合体で先に観察された結果と一致して、脾腫及び上昇した血液CD8T細胞レベルをもたらした図48A及びB。T2M2複合体は等モル用量でより強力な免疫刺激効果を示して32Dβ細胞に対してより低いIL-15活性を示したにもかかわらず、T2M及びT2M2複合体の両方はWBCレベル、脾臓重量及び血液NK及びCD8T細胞集団の増加を刺激した。同様な処置によるNK及びCD8T細胞数に対する効果が脾臓において観察された。T2M2及びIL-15N72D/IL-15Rα-IgG複合体で処置したマウスから単離した脾細胞が、NK感受性YAC細胞に対して細胞溶解活性を示した図48C。用量応答検討は、0.4mg/kgという低い単回用量レベルでもこれらの効果が観察されることを示している図49A。T2M2及びIL-15N72D/IL-15Rα-IgGによるヌードマウスの処置は、血液及び脾臓中のNK細胞のパーセントが処置後4日目に増加して、これが処置後7日目にベースライン値付近まで減少したことを示した図49B。まとめると、これらの結果は、T2M2複合体がマウスにおけるCD8T細胞及びNK細胞応答を、IL-15のそれよりそしてNK細胞についてはIL-15N72D/IL-15Rα-IgG複合体のそれより有意に高い活性で刺激可能であったことを示している。これらの複合体の抗腫瘍活性をヌードマウスにおける皮下A375異種移植モデルで更に試験した。初期の研究では、組み換えヒトIL-15、c264scTCR-IL15及びc264scTCR-IL15N72D融合タンパク質又はc264scTCR-IL15N72D/c264scTCR-IL15Rα複合体は、s.c.A375腫瘍異種移植に対してPBS又はc264scTCR-IL15Rα融合タンパク質処置と比較して効果を示さなかった図50A。このモデルにおけるTCR-IL15融合の効果の欠如は、c264scTCR-IL2融合体を用いて報告されている結果と対照的に、これらのタンパク質がNK細胞応答を刺激できないことに起因していると思われる。上で示したように、T2M複合体をこのモデルで試験すると、NK細胞増殖を刺激するこれらの能力と一致して、これらは中等度だが統計的に有意な抗腫瘍活性を示した図50B。しかし、c264scTCR-IL15融合の等モル量による処置とは対照的に、T2Mの用量スケジュール3週間1日おきに4mg/kgは有意な体重減少及び最終投与後6匹マウスのうち2匹の死亡をもたらした。臨床所見はマウスの不活発化、猫背姿勢、及び赤みかかった肌を含んでいた。別のモデルにおけるIL-15タンパク質複合体の同時研究は、繰返し1日おき投与は良好な耐容性がないこと及び週に1回の投与が過剰な毒性なしで免疫刺激をもたらすことを立証した。1日おきから週に1回への用量計画の変更によって、NK細胞増殖の誘発に有効であることを示した用量レベルで、T2M2複合体がIL-15又はPBS処置と比較して有意により強い抗腫瘍活性を示した図50C。更に重要なことは、この週に1回の投与計画が腫瘍担持ヌードマウス及び免疫正常マウスにも良好な耐容性をもたらした。scTCR-IL15融合体及びT2M複合体の毒性プロファィルを上記のインビボ活性試験と同時に評価した。上に示したように、scTCR-IL15融合体による3週間の1日おき処置は腫瘍担持ヌードマウスに良好な耐容性をもたらしたが、T2M4mg/kg処置は動物の>30死亡率をもたらした。これを更に、1週間1日おきに9、18、又は36mg/kgのT2M又は等モル量のT2M2複合体を投与したHLA-A0201/Kb-トランスジェニックマウスで評価した。処置の開始1週間後に、体重及び臨床所見において用量及び時間に依存する効果が見られた。36mg/kgのT2Mを投与されたマウスは当量のT2M2で処置されたマウスで観察された12減少と比較して体重の20損失を示した。~9mg/kgのT2M又はT2M2で処置されたマウスは1週間の期間を越えても体重の変化が観察されなかった。興味深いことに、T2Mで観察されたより高い毒性は、T2M2で処置したマウスがT2Mで処置されたマウスより高いレベルのWBC数及びNK細胞レベルを示したように、増大した免疫細胞の活性化と相関しなかった。マウスの体重、脾臓重量及び免疫細胞に対する最小効果を0.4mg/kgのT2M2の単回用量i.v.投与後に観察した。更に、カニクイザルでの予備検討がT2Mの0.5mg/kg単回i.v.用量が観察された毒性効果を何も引き起こさず、しかしCD8記憶T細胞及びエフェクターNK細胞増殖を誘発できたことを示した。これらの検討の結果は、強力な免役刺激及び抗腫瘍活性並びに好ましい毒性及び薬物動態プロファイルを有する標的化IL-15融合複合体を作成できることを示している。これらの検討を介して、最適化されたTCR-標的化T2M2c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1CH2-CH3鎖から成るT2MΔCH1とも称するを定義して特性化した。c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1CH2-CH3構築物の核酸及びタンパク質配列をそれぞれ、図51及び52に示す。実施例18-抗体標的ドメイン含んでいるT2分子の特性化更なる疾患標的分子を作成するためのhuIL-15:huIL-15RαSuスカフォールドの有用性を明らかにするために、抗ヒトCD20単鎖抗体のC-末端をhuIL-15N72D及びhuIL-15RαSu/huIgG1CH2-CH3Fc鎖のN末端と結合して構築物を作成した。抗ヒトCD20単鎖抗体抗CD20scAb配列は柔軟なリンカー配列を介して結合しているリツキシマブ抗体の重鎖及び軽鎖Vドメインのコード領域を包含している。抗CD20scAb/hIL-15N72D構築物の核酸及びタンパク質配列をそれぞれ、図53及び54に示す。抗CD20scAb/huIL-15RαSu/huIgG1Fc構築物の核酸及びタンパク質配列をそれぞれ、図55及び56に示す。これらの配列を上記のような発現ベクター内にクローンして発現ベクターをCHO細胞内にトランスフェクトした。2つの構築物の同時発現が、可溶性抗CD20scAb/huIL-15N72D:抗CD20scAb/huIL-15RαSu/huIgG1Fc複合体抗CD20scAbT2Mと称するの形成及び分泌を可能にして、これをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いてCHO細胞培養上澄液から精製した。上記の分析とと同様に、ELISAに基づく方法は、抗CD20scAb/huIL-15N72D:抗CD20scAb/huIL-15RαSu/huIgG1Fc複合体の形成を立証した。更に、上記のような32Dβ細胞を用いる1L-15受容体結合及び細胞増殖アッセイは、この複合体がIL-15結合及び生物活性を示すことを示唆した。次いで、抗CD20scAbT2M複合体をヒトCD20バーキットリンパ腫ダウディ細胞株に対する抗原特異的結合活性について試験した。ダウディ細胞を抗CD20scAbT2M、c264scTCRT2M又はPBSと培養した。洗浄工程に続いて、細胞に結合した融合タンパク質複合体を、PEと共役しているヤギ抗ヒトIg抗体GAH-Ig-PEを用いてフローサイトメトリーで検出した図57。抗CD20scAbT2M複合体は、c264scTCRT2M又はGAH-Ig-PEでは観察されなかったダウディ細胞との有意な結合を示し、これらの細胞との特異的な反応性を示唆した。抗CD20scAbT2M複合体がADCCに基づくメカニズムを介してCD20腫瘍細胞を殺傷できたか否かを確認する試験も実施した。カルセイン-AMで標識したダウディ標的細胞をヒトPMBCE:T‐100:1及び各種濃度の抗CD20scT2M、c264scTCRT2M陰性コントロール又はキメラ抗CD20mAb陽性コントロールと混合した。培養期間後に、標的細胞溶解を上記のように評価した。図58に示すように、抗CD20scAbT2M複合体はCD20ヒトリンパ腫細胞に対するADCC活性を介在することにおいて非常に効果的であった。異なったエフェクターと標的細胞の比を試験する同様な検討でこのことが立証されて、ここで抗CD20scAbT2M複合体2nMではキメラ抗CD20mABに匹敵する活性を示した図59。これらの結果に基づくと、抗CD20scAbT2M分子は標準的な異種移植腫瘍モデル例えば、RossietalBlood20091143864GillisetalBlood20051053972及びXuanetalBlood201011528642871を参照されたいにおいてヒトリンパ腫細胞に対して抗腫瘍活性を示すことが期待される。更に、それぞれが個々にhuIL-15N72D及びhuIL-15RαSu/huIgG1Ch2-CH3Fc鎖と融合している又はその逆抗CD20軽鎖及び重鎖ドメインを含むT2M構築物を本明細書に記載のように作成して発現できる。2つのこのような融合構築物の核酸及びタンパク質配列を図60~63に示す。これらの融合タンパク質を含む精製した複合体は、上記のように、Fcドメイン及びIL-15生物活性、並びにCD20に特異的な結合活性を示すことが期待される。これらの複合体はCD20腫瘍細胞に対するADCC活性を介在すること及びインビボでCD20腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性が期待される。その他のCD抗原、サイトカイン又はケモカインの受容体又はリガンド、成長因子の受容体又はリガンド、細胞接着分子、MHC/MHC様分子、Fc受容体、Toll様受容体、NK受容体、TCR、BCR、陽性/陰性同時刺激受容体又はリガンド、死受容体又はリガンド、腫瘍関連抗原、ウィルスコード及び細菌コード抗原、並びに細菌特異的抗原に特異的な抗体配列を用いてscAb又は抗体認識ドメインを含む同様なT2M構築物を容易に作成できる。特に興味深いのは、CD3、CD4、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD51、CD52、CD70、CD74、CD80、CD152、CD147、CD221、EGFR、HER-2/neu、HER-1、HER-3、HER-4、CEA、OX40リガンド、cMet、組織因子、ネクチン-4、PSA、PSMA、EGFL7、FGFR、IL-6受容体、IGF-1受容体、GD2、CA-125、EpCam、細胞死受容体5、MUC1、VEGFR1、VEGFR2、PDGFR、TrailR2、葉酸受容体、アンジオポエチン-2、αvβインテグリン受容体及びHLA-DR抗原のエピトープに特異的な抗体ドメインを有するT2Mである。HIV、HCV、HBC、CMV、HTLV、HPV、EBV、RSV及びその他のウィルスに由来するウィルス抗原に対する抗体ドメインも興味深く、特にHIVエンベロープスパイク並びに/又はgp120及びgp41エピトープを認識するものが興味深い。このような抗体ドメインは当該技術分野で公知の配列から作成できるか或いは当該技術分野で公知の各種供給源すなわち、脊椎動物宿主又は細胞、コンビナトリアルライブラリー、ランダム合成ライブラリー、コンピュータモデリング等から新たに単離できる。更に、前述の通り、IL-15ドメイン及びIgGFcドメインの活性を増大又は減少して、抗体標的T2複合体の治療インデックスを最適化しそして毒性を最小化することは有益である。Fcドメインの活性を改変する方法は上に記載されていて当該技術分野で十分に特性化されている。このような場合、その活性を減少する突然変異をIL‐15ドメインに含んでいる複合体はよりすぐれた治療活性及びより低い毒性をもたらすことが期待される。IL-15ドメインに上記のN65D又はD8N置換、又はIL-15活性を減少することが知られている、I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P又はQ108Aを包含するその他の置換を含んでいる抗体標的T2分子が特に興味深い。実施例19:CHO細胞におけるIL-15N72D及びIL-15RαSu/Fc融合遺伝子の同時発現以前の研究は組み替えIL-15は哺乳動物の細胞によって発現されにくいことを示しているAWardetalProteinExprPurif684248。しかしながら、IL-15Rαを用いる細胞内複合体形成はERにおいてIL-15分解を抑制することが報告されているCBergamaschietalJBiolChem28341894199。従って、IL-15は、これをIL-15Rαと同時発現するとより高いレベルで産生できると仮定された。N末端にいわゆるsushiドメインSuを含んでいる、可溶性IL-15Rα断片はサイトカイン結合に関与する殆どの構造要素を担持することが知られている。可溶性IL-15RαSuその膜貫通ドメインを含まないとIL-15は溶液中で非常に安定なヘテロ二量体複合体を形成でき複合体のKd=100pMGBouchaudetalJMolBiol382112、そしてこれらの複合体はIL-15Rβγc複合体を介して免疫応答を調節すなわち、刺激又は阻害できるEMortieretalJBiolChem28116121619MPRubinsteinetalProcNatlAcadSciUSA10391669171TAStoklaseketalJImmunol17760726080GBouchaudetalJMolBiol382112。従って、IL-15N72D及びIL-15RαSu/Fcから成る複合体の産生のために選択した図64を参照されたい。IL-15RαSuドメインをヒトIgG-Fc領域と遺伝的に融合して精製及び鎖間ジスルフィド結合による二量体化を促進した。IL-15N72DとIL-15RαSu/Fcを同時発現するために、2つの個別レトロウィルスに基づく発現ベクター、pMSGV-IL-15RαSu/Fc及びpMSGV-IL-15N72Dを構築して、CHO細胞に同時にトランスフェクトした。組み替えCHO細胞を、2つの発現ベクターによってもたらされたネオマイシン及びピューロマイシン耐性要素に基づいて選択し、次いで、限定希釈クローニングを用いて個々の生産細胞株を作成した。無血清規定培地中で、ELISAに基づき、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体を約100mg/L産生できるクローンを同定した。この結果は、IL-15が哺乳動物細胞中でIL-15RαSuドメインと同時発現されると高レベルで発現され得るということを明らかにした。実施例20:IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体の精製及び特性化IL-15RαSu/FcとIL-15N72Dを組み替えCHO細胞内で同時発現して細胞内で構築すると、細胞培養上澄液内に4つの異なったタンパク質の形態が予測された:12つのIL-15N72Dサブユニットで完全に占有されている二量体IL-15RαSu/Fc分子、21つのIL-15N72Dサブユニットで部分的に占有されている二量体IL-15RαSu/Fc分子、3IL-15結合がない少量の遊離ホモ二量体IL-15RαSu/Fc分子、及び4遊離IL-15N72D。IL-15N72DはFc領域を欠失しているので、培養上澄液中の全てのFcを担持する融合タンパク質から遊離IL-15N72Dを分離するためにrプロテインAに基づくアフィニティー精製工程を用いた。次いで、IL-15RαSu/Fc複合体の多種の形態を分離するためにイオン交換クロマトグラフィーを展開した。IL-15RαSu/Fc二量体分子の計算した等電点pIは8.5である。予測通りに、20mMTris-HCl、pH8.0溶液中のこのタンパク質はその後QSFF樹脂に結合しないことが分かった。また、計算したIL-15N72DのpIは4.5である。従って、部分的に占有されているIL-15N72D:IL-15RαSu/Fcすなわち、二量体IL-15RαSu/Fc1つのIL-15N72D分子と完全に占有されているIL-15N72D:IL-15RαSu/Fcすなわち、二量体IL-15RαSu/Fc2つのIL-15N72D分子の全体の電荷は異なることが予測された。このことは、プロテインAの精製した調製物のIEFゲル分析と一致していて、これは5.6~6.5と6.8~7.5のpIを有する2つの主要な複合体のグループが完全に占有されている複合体と部分的に占有されている複合体の予測されるpIとそれぞれに一致することを明らかにした図65A。各タンパク質群のpIバンド間の不均質性は恐らくIgG1鎖におけるグリコシル化及びC-末端リジン変異体の程度に起因している。従って、異なったイオン強度を有する緩衝液をQSFFから完全に占有されている複合体と部分的に占有されている複合体を別々に溶出するために用いた。130mMのNaCl、20mMのTris-HCl、pH8.0を用いて単一タンパク質画分Q工程1をQSSFから溶出して、IL-15RαSu/Fc分子の部分占有を確認するELISAに基づいて、主に部分的に占有されている複合体を含有していることが分かった。300mMのNaCl、20mMのTris-HCl、pH8.0を用いる次の工程で、Q1c及びQ2cと称する2つのタンパク質画分がQSFFから溶出された。これらの調製物に行ったELISA分析が、Q1c画分が部分的に占有されている複合体全体の10と完全に占有されている複合体90の混合物を含んでいたのに対してQ2c画分が完全に占有されている複合体のみを含んでいたことを示したデータは示していない。これらの知見は精製したタンパク質製剤のIEFゲル分析と一致している図65B。Q工程1から溶出したタンパク質は5.6~7.5の範囲の広いpIを有している:pIが6.8~7.5のタンパク質は部分的に占有されている複合体を示している。Q工程2溶出の画分Q1cは5.6~6.5の範囲のpIを有するタンパク質すなわち、完全に占有されている複合体を主に含んでいたが、5.6~7.5のpIを有する少量の夾雑タンパク質を含んでいた。Q2c画分は5.6~7.5の範囲のpIを有するタンパク質のみを含んでいた。SEC分析で、精製したIL-15N72D:IL-15RαSu/FcのQ2c調製物が高純度で単一分子として溶出することが分かった図66。ホモ二量体の推定分子量は約114kDaであり、これはIL-15N72DとIL-15RαSu/Fcの融合タンパク質の推定アミノ酸配列に基づいて算出した分子量92kDaより大きかった。これは哺乳動物細胞で生産したタンパク質のグリコシル化に起因していると思われる。還元SDS-PAGE図65Cで、精製したIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc調製物は40kDa、16kDa及び13kDaの分子量を有する3つのタンパク質を含んでいることが分かった。しかしながら、N-グリコシダーゼFで消化した後は、~37kDa及び13kDaの分子量を有する2つのタンパク質のみが検出された図65D。これらの分子量はIL-15RαSu/Fc及びIL‐15又はIL-15N72Dの計算した分子量にごく近い。このことはこれら2つのタンパク質が哺乳動物細胞で生産中にグリコシル化されて、IL-15N72Dは13kDaと16kDaの分子量を有する2つの主要なグリコシル化形態で産生されたことを示唆している。図65Cに示されている異なった精製画分中にあるこれらのIL-15N72D種の相対存在量は、ELISA及びIEFゲル分析で確認された複合体の占有のレベルと一致している。IL-15N72DとIL-15RαSu/Fcは還元SDS-PAGEで分離されてこれらのN-末端アミノ酸配列はエドマン分解法で確認された。IL-15RαSu/FcとIL-15N72Dについて、それぞれ約15のN-末端アミノ酸配列が得られた。これらのタンパク質の確認されたN-末端アミノ酸配列は2つの遺伝子コード領域から推定されるこれらのアミノ酸配列と一致した。還元SDS-PAGE上の13及び16kDaに現れた2つの主要バンドに対するアミノ酸配列はIL-15N72Dであることが確認された。この配列確認は哺乳動物細胞におけるIL-15N72Dのグリコシル化の証拠を再びもたらした。実施例21:IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体の薬物動態特性IL-15及びインビトロで構築されたIL15:IL-15Rα/Fc複合体は、マウスにこれらのタンパク質を腹腔内注射したときに、それぞれ1時間及び20時間の血清半減期を有していたことが先に報告されているTAStoklaseketalJImmunol17760726080。IL-15及び同時に発現させた、精製したIL-15:IL-15αSu/Fc複合体を静脈内に投与したときに同様に挙動するか否かを評価するために、それらの薬物動態パラメータをCD-1マウスで確認した。静脈内投与は、ヒトにおいてIL-15:IL-15αSu-Fc複合体に関して用いられる薬剤送達のルートであると思われるので静脈内投与を選択した。雌のマウスに1.0mg/kgのIL-15:IL-15αSu/Fc又は0.28mg/kgのIL-15等モル用量を静脈内に注射して、IL-15については注射後15分から8時間、そしてIL-15N72D:IL-15αSu/Fcについては30分から72時間の様々な時点に血液を採取した。IL-15N72D:IL-15αSu/Fcの血清濃度を2つのELISA形態、無傷の複合体を検出する第1法抗IL-15AB検出及びIL-15αSu/Fc融合タンパク質のみを検出する別法抗ヒトIgGFcAb検出を用いて評価した。IL-15の濃度は標準的なIL-15特異的ELISAで評価した。単回静脈内急速注射後のIL-15:IL-15αSu/Fc及びIL-15についての予測フィット及び実際のデータを図67に示す。抗IL-15Abに基づく、又は抗ヒトIgGFcAbに基づくELISAを用いるIL-15:IL-15αSu/Fcの推定半減期はそれぞれ、約25時間又は18時間であった。これらの結果は、インビボでこの融合タンパク質は開裂せず、そしてIL-15はIL-15RαSu/Fc分子から有意には解離しなかったことを示している。IL-15:IL-15αSu/FcのクリアランスClは0.059~0.051mL/時間に及んで、定常状態における分布の容積Vssはアッセイの形式に依存して2.1~1.3mLに及んだ。これと比べると、IL-15は0.24時間の吸収半減期及び0.64時間の消失半減期を有していた。IL-15のClは49mL/時間であり、そしてVssは18.4mLであった。これらの結果は、IL-15:IL-15αSu/Fcが、IL-15より>24倍長い消失半減期を示し、そして>800倍遅く排泄されることを示している。実施例22:IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体のインビトロ及びインビボ生物活性同時発現及び精製されたIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体の生物活性をIL-15依存性32Dβ細胞増殖アッセイを用いて評価した。このアッセイのために、インビトロで構築したIVAIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体IL-15N72D:IL-15RαSu/FcIVAもIL-15N72DとIL-15RαSu/Fcを1:1の比で40°Cで30分混合して作成した。図68に示すように、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体は32Dβ細胞の生育をサポートするIL-15N72D:IL-15RαSu/FcIVAと同等の活性を有していた。IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体は15.61pMのEC50を示し、そしてIL-15N72D:IL-15RαSu/FcIVAは15.83pMのEC50を示した。このことは、同時発現されたIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体は細胞内で適切に処理されて精製後も完全なIL-15活性を保持していることを明らかにしている。従って、本明細書に提示されている方法は、個々に産生したインビトロ構築及びある場合はリフォールディングタンパク質を用いる現在の戦略よりもcGMPグレードの臨床材料を作成するための優れた手段を示している。IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体とIL-15wtも、C57BL/6マウスにおいてNK細胞及びCD8T細胞の増殖を誘発するそれらの能力について比較した。図69に示すように、IL-15wtは0.28mg/kgの単回静脈内投与後4日目にNK及びCD8細胞の増殖に対して有意な効果を有していない。これに対して、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体は血中及び脾臓内のNK及びCD8細胞の増殖を有意に促進し、これは血中のリンパ球増加症及び脾腫を導いた図69及び70。これらの知見はIL-15:IL-15Rα複合体がインビボでIL-15の生物活性を有意に増大したという先の報告と一致しているMPRubinsteinetalProcNatlAcadSciUSA10391669171TAStoklaseketalJImmunol17760726080SDuboisetalJImmunol18020992106MEpardaudetalCancerRes6829722983ABessardetalMolCancerTher827362745。IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体のこの増大した活性は、N72D突然変異タンパク質のIL-15Rβγc複合体との増大した結合活性XZhuetalJImmunol18335983607、インビボにおけるIL-15Rα鎖による最適化されたサイトカインのトランス提示樹状細胞及びマクロファージ上のFcR受容体を介して、サイトカインドメインの二量体特性IL-15Rβγcとの結合について増大した親和性及びIL-15と比較して増大したインビボ半減期25時間対<40分との組み合わせの結果と思われる。要約すると、本明細書に記載されている結果は、IL-15N72D及びIL-15RαSu/Fc遺伝子は組み換えCHO細胞において同時発現させることができて、完全に占有されているIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体は単純に拡張可能な精製方法を用いて細胞培養上澄液から高度に精製できることを明らかにする。上記実施例は以下の材料及び方法を用いて実施した。タンパク質複合体発現のためのベクターの構築IL-15RαSu/Fc融合遺伝子をヒトIL-15RαヒトIL-15Rαのaa1-66のsushiドメイン及びヒトIgG1Fc断片をコードするDNA鋳型のオーバーラップPCR増幅によって構築した。シグナルペプチド-IL-15RαSuコード領域RLWongetalProteinEngDesSel24373383及びヒトIgG1-Fc遺伝子断片LAMosqueraetalJImmunol17443814388をプライマー対:BA494:5’-GACTTCAAGCTTAATTAAGCCACCATGGACAGACTTACTTCTTC-3’;BA550R:5’-GTGAGTTTTGTCACAAGATTTCGGCTCTCTAATGCATTTGAGACTGGGGGTTG-3’、及びBA550F:5’GAGCCGAAATCTTGTGACAAAACTCAC-3’;BA393R:5’-GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTACCAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC-3’をそれぞれ用いて増幅した。得られたIL-15RαSu/Fc融合遺伝子をピューロマイシン耐性発現ベクターpMSGV-1MSHughesetalHumGeneTher16457472内にライゲートして発現ベクターpMSGV-IL-15RαSu/Fcを構築した。IL-15N72Dのコード配列XZhuetalJImmunol18335983607を、IRES領域の後にネオマイシン耐性遺伝子を搭載している改変レトロウィルス発現ベクターpMSGV-1MSHughesetalHumGeneTher16457472内にクローンして発現ベクターpMSGV-IL-15N72Dを構築した。CHO細胞におけるIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合複合体の同時発現IL-15N72DとIL-15RαSu/Fcの融合タンパク質図64を参照されたいを同時発現するために、pMSGV-IL-15RαSu/FcとpMSGV-IL-15N72DをCHO細胞内に同時にトランスフェクトした後、2mg/mLのG418HycloneLoganUTと10μg/mLのピューロマイシンHycloneLoganUTを含有している培地中で選択した。IL-15RαSu/Fc融合タンパク質も、コントロールとして組み換えヒト野生型IL-15IL-15wtを負荷するのに用いるために、別にCHO細胞で発現させた。融合タンパク質の産生のために、組み替えCHO細胞を無血清規定培地SFM4CHO、HycloneLoganUT中で37°Cで生育した。培養物の生育細胞密度が最大に達したとき、可溶性複合体を蓄積するために培養温度を30°Cに下げた。次いで、培養物の生育細胞密度が約10生育細胞に達したときに培養上澄液を採取した。精製手順組み替えCHO細胞培養培地を遠心分離し、濾過して細胞と残骸を除去してから、1MのTris-HClpH8.0で上澄液をpH8.0に調整した。可溶性IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合タンパク質複合体をアフィニティー及びイオン交換クロマトグラフィーに基づくプロセスの2工程を用いて精製した。IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体はIgG1-Fcドメインを含んでいるので、rProteinASepharoseFastFlowカラムを精製処理の第1工程として用いた。サンプルを負荷する前に、カラムを5カラム容量CVの20mMTris-HClpH8.0で洗浄し、5CVの0.1NNaOHで1時間消毒し、次いで7CVの20mMTris-HClpH8.0で平衡化した。上澄液を11mLのカラム上に2mL/分で負荷させて、次いでカラムを8CVの20mMTris-HClpH8.0で洗浄した後、7CVの洗浄緩衝液0.1MNa-クエン酸、pH5.0で洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した。次いで、タンパク質を0.2MNa-クエン酸pH4.0で溶出して、採取したピーク画分のpHを0.2Mのクエン酸を用いて直ちにpH3.5に調整した:標準ウィルス排除工程として、溶出したタンパク質を30分間この低pHで維持した。低pH維持工程の後に、溶出した調製物のpHを2MTris-HClpH8.0を用いてpH7.7に調整した。調製物をAmiconUltra-15遠心濃縮器30kDaカットオフ、MilliporeBillericaMAを用いて濃縮して緩衝液を20mMTris-HClpH8.0に変えた後、0.22μmフィルターCorningLifeSciencesLowellMAを用いて滅菌濾過した。次いで、タンパク質調製物をQSepharoseFastFlowイオン交換カラムに付した。5mLのカラムを緩衝液A20mMTris-HCl、pH8.0で洗浄し、5CVの0.1NNaOHで1時間消毒し、次いで緩衝液Aで平衡化した。調製物中のタンパク質濃度を最初に20mMTris-HClpH8.0で<1mg/mLに調整した後、1mL/分の速度でQSFFカラム上で負荷させた。次いで、以下の3工程勾配プロセすを用いてタンパク質をカラムから溶出した:第1工程として、4CVに対して、20mMTris-HClpH8.0、130mMNaCl、第2工程として、4CVに対して、20mMTris-HClpH8.0、300mMNaCl、そして最終工程として、2CVに対して、20mMTris-HClpH8.0、1MNaCl。タンパク質ピーク画分を採取し、緩衝液をPBSHycloneLoganUTに交換して、0.22μmフィルターを用いて濾過した。タンパク質濃度を、A280nm=0.79mg/mLの吸光係数を用いるUV分光光度計によって280nMで確認した。この吸光係数はIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体の推定アミノ酸配列に基づいて計算した。E.coli中で産生してリフォールディングしたIL-15N72D又はIL-15wtZhu、10093315で溶液中に複合体を構築するために、別に発現したIL-15RαSu/Fcを上記のようにrプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。これらのインビトロで構築した複合体を生物活性の評価、及び同時発現複合体におけるIL-15結合部位の占有程度の推定のための標準として用いた。ゲル電気泳動及びサイズ排除クロマトグラフィーSEC分析精製したタンパク質を異なったタイプのゲル電気泳動方法で分析した。これはNuPAGE12Bis-Trisゲル還元及び非還元条件下、4~20Tris-グリシンゲル自然条件、及びIEFpH3~10ゲルpI確認用を包含する。これら全てはInvitrogenクロマトグラフィーを純度を試験するため及びタンパク質の分子量を推定するために用いた。N-末端アミノ酸配列及びグリコシル化の分析興味深いタンパク質バンドを、PVDF膜上にブロットしてポンソーS溶液で染色する、SDS-PAGEで分離した。N-末端アミノ酸配列決定をエドマン分解法MolecularStructureFacilityUCDavisDavisCAを用いて実施した。融合複合体がグリコシル化されているか否かを試験するために、イオン交換クロマトグラフィー後の高度に精製されたタンパク質50μgを、2μLのN-グリコシダーゼCalbiochemLaJollaCAで、総容量50μLのPBS中、室温で48時間消化した後、還元条件下でNuPAGE12Bis-Trisゲル中電気泳動に付した。IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体のIL-15N72D占有の確認精製したIL-15RαSu/FcにIL-15wtE.coli中で産生してリフォールディングした、JYovandichNCIFredrickMDより提供されたを様々な比で15時間4°Cで負荷した。培養後、IL-15wt:IL-15RαSu/Fc複合体を上記のようにrプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。精製した複合体を、2つのELISA形態、無傷の複合体を検出する1つの方法抗ヒトIgGFcで捕獲して抗IL-15で検出する及びIL-15αSu/Fc融合タンパク質のみを検出するもう1つの方法抗ヒトIgGFcで捕獲して抗ヒトIgGFcで検出するを用いて評価した。無傷IL-15wt:IL-15αSu/Fc複合体とIL-15RαSu/Fcタンパク質濃度の間の比は、複合体のIL-15結合部位の占有率を反映している。占有率=無傷複合体ng/mL/IL-15RαSu/Fcng/mLI×100。次いで、完全に占有されている複合体IL-15RαSu/FcとIL-15wtを1:3の比で前もって結合したを精製後に精製したIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合タンパク質複合体の占有率を定量化するための標準として用いた。IL-15生物活性の確認先に記載されているXZhuetalJImmunol18335983607ように、IL-15依存性32Dβ細胞株を用いるインビトロ細胞増殖アッセイを、精製した複合体とIL-15wtタンパク質のIL-15生物活性を評価するために用いた。薬物動態の評価IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体及びIL-15wtの薬物動態プロファイルを雌のCD-1マウス1時点当りマウス4匹、HarlanIndianapolisINにおいて、IL-2について先に記載されているHJBelmontetalClinImmunol1212939ようにして評価した。IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体の血清濃度を上記のような2つのELISA形態で評価した。IL-15wt濃度を抗IL-15捕獲剤MAB647;RDSystemsMinneapolisMN及び抗IL-15検出剤BAM247;RDSystemsMinneapolisMNを用いるELISAで評価した。それぞれのELISA形態からのIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc濃度はPKSolution2.0を用いる1分画モデルと一致した。IL-15wtで処置したマウスから得られたデータは2分画モデルとして最もよくモデル化された。リンパ球刺激C57BL/6マウス雄、6週齢、HarlanIndianapolisINにIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合複合体1mg/kg又はヒトIL-15wt0.28mgkg等モル用量それぞれの、或いは陰性コントロールとしてPBSの単回用量を静脈内に注射した。処置後4日目に、プール血液1群当り5匹のマウス及び脾細胞を採取した。ヒストパックSigmaStLouisMOを用いて血液からPBMCを単離した。次いで、PBMC及び脾細胞をPEで標識した抗CD19、PEで標識した抗CD335NKp46、FITCで標識した抗CD4及びFITCで標識した抗CD8抗体BioLegendSanDiegoCAで染色した。染色した細胞をFACScanフローサイトメトリーBDBioscienceSanJoseCAで分析した。全ての動物実験はAltor’sIACUC承認プロトコールに従って実施された。以下のペプチドを前期実施例に示される検討で用いた。以下の融合タンパク質のタンパク質ドメインリンカー配列を示される実施例に用いた。以下に列挙した参考文献並びに本願で引用された全ての参考文献、特許、及びGenBankナンバー本願の優先日以前に入手可能なバージョンにおけるはそれらが独立して組み込まれているようにそれぞれが参照により組み込まれている。1KouzaridesTandZiffENature3366466512KouzaridesTandZiffENature3405685713KouzaridesTandZiffECancerCells171764RiekerJDandHuJCMethodsEnzymol3282822965BuschRPashineAGarciaKCandMellinsEDJImmunolMethods2631111216SternLJandWileyDCCell684654777SloanVSCameronPPorterGGammonMAmayaMMellinsEandZallerDMNature3758028068deKruifJandLogtenbergTJournalofBiologicalChemistry271763076349KostelnySColeMandTsoJJImmunol1481547155310HolligerPandHudsonPJNatBiotechnol231126113611HaydenLedbetterMSCervenyCGEsplingEBradyWAGrosmaireLSTanPBaderRSlaterSNilssonCABaroneDSSimonABradleyCThompsonPAWahlAFandLedbetterJAClinicalCancerResearch152739274612KubetzkoSBalicEWaibelRZangemeisterWittkeUandPluckthunAJBiolChem281351863520113CuestaAMSanchezMartinDSanzLBonetJCompteMKremerLBlancoFJOlivaBandAlvarezVallinaLPLoSOne4e538114MohlerKTorranceDSmithCGoodwinRStremlerKFungVMadaniHandWidmerMJImmunol1511548156115FeldmannMNatRevImmunol236437116WeinerLMNatRevCancer770170617BaeuerlePAKuferPandBargouRCurrOpinMolTher11223018ShenJVilMDJimenezXIacolinaMZhangHandZhuZJBiolChem281107061071419LuDandZhuZMethodsMolBiol525377404xiv20JackmanJChenYHuangAMoffatBScheerJMLeongSRLeeWPZhangJSharmaNLuYIyerSShieldsRLChiangNBauerMCWadleyDRooseGirmaMVandlenRYansuraDGWuYandWuLCJBiolChem21MortierEQuemenerAVusioPLorenzenIBoublikYGrotzingerJPletAandJacquesYJBiolChem2811612161922WaldmannTANatRevImmunol659560123BergamaschiCRosatiMJalahRValentinAKulkarniVAliceaCZhangGMPatelVFelberBKandPavlakisGNJBiolChem2834189419924TheobaldMBiggsJDittmerDLevineAJandShermanLAProcNatlAcadSciUSA92119931199725ZhuXMarcusWDXuWLeeHIHanKEganJOYovandichJLRhodePRandWongHCJImmunol1833598360726DeerJRandAllisonDSBiotechnolProg2088088927ZhaoYBennettADZhengZWangQJRobbinsPFYuLYLLiYMolloyPEDunnSMJakobsenBKRosenbergSAandMorganRAJImmunol1795845585428BelmontHJPriceSchiaviSLiuBCardKFLeeHIHanKPWenJTangSZhuXMerrillJChavillazPAWongJLRhodePRandWongHCClinImmunol121293929YangSRosenbergSAandMorganRAJImmunother3183083930CardKFPriceSchiaviSALiuBThomsonENievesEBelmontHBuilesJJiaoJAHernandezJWeidanzJShermanLFrancisJLAmirkhosraviAandWongHCCancerImmunolImmunother5334535731GarbocziDNHungDTandWileyDCPNAS893429343332ZhuXBelmontHJPriceSchiaviSLiuBLeeHIFernandezMWongRLBuilesJRhodePRandWongHCJImmunol1763223323233ChirifuMHayashiCNakamuraTTomaSShutoTKaiHYamagataYDavisSJandIkemizuSNatImmunol81001100734HogquistKAJamesonSCHeathWRHowardJLBevanMJandCarboneFRCell76172735DanielsMAandJamesonSCJExpMed19133534636NugentCTRenteriaROKuusReichelKandKumarAImmunolLett9820821537SchottEandPloeghHLEurJImmunol323425343438NeveuBEchasserieauKHillTKuusReichelKHoussaintEBonnevilleMandSaulquinXIntImmunol181139114539KernPHusseyRESpoerlRReinherzELandChangHCJournalofBiologicalChemistry274272372724340ArcaroAGregoireCBakkerTRBaldiLJordanMGoffinLBoucheronNWurmFvanderMerwePAMalissenBandLuescherIFJExpMed1941485149541WangRNatarajanKandMarguliesDHJImmunol1832554256442GarbocziDNGhoshPUtzUFanQRBiddisonWEandWileyDCNature38413414143LinADevauxBGreenASagerstromCElliottJandDavisMScience24967767944TrauneckerADolderBOliveriFandKarjalainenKImmunolToday10293245LaugelBvandenBergHAGostickEColeDKWooldridgeLBoulterJMilicicAPriceDAandSewellAKJBiolChem282237992381046WooldridgeLvandenBergHAGlickMGostickELaugelBHutchinsonSLMilicicABrenchleyJMDouekDCPriceDAandSewellAKJBiolChem280274912750147GakamskyDMLuescherIFPramanikAKopitoRBLemonnierFVogelHRiglerRandPechtIBiophysJ892121213348ColeDKDunnSMSamiMBoulterJMJakobsenBKandSewellAKMolImmunol452700270949AlamSMDaviesGMLinCMZalTNasholdsWJamesonSCHogquistKAGascoigneNRandTraversPJImmunity1022723750CheeverMAImmunolRev22235736851FerrariLacrazSZanelliENeubergMDonskoyEKimYSZhengXXHancockWWMaslinskiWLiXCStromTBandMollTJImmunol1735818582652ZhengXXGaoWDonskoyENeubergMRuedigerMStromTBandMollTinTransplantationVol81pp10911653FerrariLacrazSZhengXXFueyoASMaslinskiWMollTandStromTBTransplantation8215101517"