"明細書中に記載の発明。発明の要旨本発明の1つの局面では、植物セントロメアを同定するための方法が提供される。本発明の1つの実施形態では、この方法は、四分子分析を包含し得る。簡潔には、四分子分析は、個々の減数分裂の4つすべての産物を分析することによって、遺伝マーカーとセントロメアとの間の組換え頻度を測定する。特定の平均が、Arabidopsisにおけるquartetqrt1変異から生じ、これはArabidopsisにおいて花粉母細胞減数分裂の4つの産物を付着したままにさせる。quartet変異はまた、Arabidopsis以外の種において、本発明に従う用途を見出し得る。例えば、いくつかの天然に存在する植物種スイレン、ガマ、ヒースEricaceaeおよびEpacridceae、オオツマヨイグサOnagraceae、モウセンゴケDroseraceae、ランOrchidaceae、およびアカシアMimosaceaeを含むもまた、花粉クラスターを放出することが公知であるPreuss1944;Smyth1994。しかし、これらの種のいずれも実験系に開発されておらず、従って、遺伝分析のためのそれらの使用を著しく制限する。しかし、本発明者らにより、quartet変異を宿主植物に導入して、潜在的に任意の種において四分子分析の使用を可能にし得ることが意図される。花を受粉させるために使用される場合、1つの四分子は、4つの種子の形成を生じ得、そしてこれらの種子に由来する植物が、遺伝的に分析され得る。しかし、無秩序の四分子例えば、Arabidopsisにより産生される四分子を用いると、四分子分析を使用する遺伝マッピングは、2つのマーカーを同時にスコア付けすることを必要とする。別の局面では、本発明は、植物セントロメアを含む組換えDNA構築物を提供する。この組換えDNA構築物は、さらに、任意の他の所望される配列例えば、テロメア植物テロメア例えば、Arabidopsisthalianaのテロメア、あるいは酵母または任意の他の型のテロメアを含むを含み得る。自律複製配列ARS例えば、植物ARSArabidopsisthalianaのARSを含むを含むこともまた所望され得る。そしてさらに、構築物上に構造遺伝子を含むこと、または組換えDNA構築物上に物理的に配置され得る最大数の構造遺伝子およそ5000以下例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500、1000の同義遺伝子を含むことが所望され得る。使用されることが所望され得る構造遺伝子の例としては、選択可能マーカー遺伝子またはスクリーニングマーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、成長因子遺伝子、および種子貯蔵遺伝子が挙げられる。本発明の1つの実施形態では、構築物は、例えば、原核生物または真核生物下等真核生物または高等真核生物例えば、植物を含むにおいて、構造遺伝子を発現し得る。さらに別の局面では、本発明は、植物セントロメアを含む組換えDNA構築物であって、プラスミドである組換えDNA構築物を提供する。このプラスミドは、任意の所望される配列例えば、複製起点細菌例えば、E.coliおよびAgrobacteriumまたは植物もしくは酵母例えば、S.cerevisiaeなどにおける複製機能の起点を含むを含み得る。プラスミドはまた、細菌E.coliおよびAgrobacteriumを含むにおいて機能し得る選択マーカー、ならびに植物または酵母例えば、S.cerevisiaeにおいて機能する選択マーカーを含み得る。なおさらに別の局面では、本発明は、植物セントロメアを含む組換えDNA構築物であって、染色体として維持され得る組換えDNA構築物を提供し、ここで染色体は、分裂細胞に伝達される。植物セントロメアは、任意の植物由来であり得る。なおさらに別の局面では、本発明は、Arabidopsisthalianaセントロメアとしてさらに規定される植物セントロメアを提供する。本発明のさらに別の実施形態では、植物セントロメアは、Arabidopsisthalianaの第1染色体のセントロメアであり、そしてさらに、遺伝マーカーT22C23-T7およびT3P8-SP6によって隣接されるとして規定され得るか、または遺伝マーカーT22C23-T7およびT5D18、T22C23-T7およびT3L4、T5D18およびT3P8-SP6、T5D18およびT3L4、ならびにT3L4およびT3P8-SP6によって隣接されるとして規定され得る。本発明のさらに別の実施形態では、植物セントロメアは、Arabidopsisthalianaの第2染色体のセントロメアを含む。第2染色体のセントロメアは、例えば、配列番号209の核酸配列の約100~約611,000、約500~約611,000、約1,000~約611,000、約10,000~約611,000、約20,000~約611,000、約40,000~約611,000、約80,000~約611,000、約150,000~約611,000、または約300,000~約611,000個連続したヌクレオチド配列番号209の核酸配列を含むものを含むを含み得る。このセントロメアはまた、配列番号210の核酸配列の約100~約50,959、約500~約50,959、約1,000~約50,959、約5,000~約50,959、約10,000~約50,959、20,000~約50,959、約30,000~約50,959、または約40,000~約50,959個連続したヌクレオチドを含むとして規定され得、そして配列番号210の核酸配列を含み得る。このセントロメアは、配列番号209および210の両方に由来する配列前述のフラグメントを含むまたは配列番号209および210の全体を含み得る。特定の実施形態では、本発明者らは、配列番号209の3’フラグメントを配列番号210の5’フラグメントに融合し得ること必要に応じて、それらの間に配置される1以上の180bp反復配列を含むを意図する。なおさらに別の実施形態では、本発明は、Arabidopsisthalianaの第3染色体のセントロメアを提供する。本発明の1つの実施形態では、このセントロメアは、遺伝マーカーT9G9-SP6およびT5M14-SP6によって隣接されるとしてさらに規定され得、そしてさらに、T9G9-SP6およびT14H20、T9G9-SP6およびT7K14、T9G9-SP6およびT21P20、T14H20およびT7K14、T14H20およびT21P20、T14H20およびT5M14-SP6、T7K14およびT5M14-SP6、T7K14およびT21P20、ならびにT21P20およびT5M14-SP6からなる群から選択される遺伝マーカーの対によって隣接されるとして規定され得る。なおさらに別の実施形態では、本発明は、Arabidopsisthalianaの第4染色体のセントロメアを提供する。本発明の特定の実施形態では、このセントロメアは、配列番号211の核酸配列の約100~約1,082,000、約500~約1,082,000、約1,000~約1,082,000、約5,000~約1,082,000、約10,000~約1,082,000、約50,000~約1,082,000、約100,000~約1,082,000、約200,000~約1,082,000、約400,000~約1,082,000、または約800,000~約1,082,000個連続したヌクレオチド配列番号211の核酸配列を含むものを含むを含み得る。このセントロメアはまた、配列番号212の核酸配列の約100~約163,317、約500~約163,317、約1,000~約163,317、約5,000~約163,317、約10,000~約163,317、約30,000~約163,317、約50,000~約163,317、約80,000~約163,317、または約120,000~約163,317個連続したヌクレオチドを含むとして規定され得、そして配列番号212の核酸配列を含むとして規定され得る。このセントロメアは、配列番号211および212の両方に由来する配列前述のフラグメントを含むまたは配列番号211および212の全体を含み得る。特定の実施形態では、本発明者らは、配列番号211の3’フラグメントを配列番号212の5’フラグメントに融合し得ること必要に応じて、それらの間に配置される1以上の180bp反復配列を含むを意図する。さらに別の実施形態では、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、またはそれらのフラグメントによって与えられる核酸配列から選択される、Arabidopsisthalianaの第1染色体、第3染色体、または第5染色体のセントロメアを提供する。1つの実施形態では、この構築物は、前述の配列のうちの1つの少なくとも100塩基対全長以内を含む。さらに、この構築物は、1以上の180塩基対反復を含み得る。なおさらに別の実施形態では、本発明は、Arabidopsisthalianaの第5染色体のセントロメアを提供する。このセントロメアは、遺伝マーカーF13K20-T7およびCUE1によって隣接されるとしてさらに規定され得、そしてさらに、F13K20-T7およびT18M4、F13K20-T7およびT18F2、F13K20-T7およびT24I20、T18M4およびT18F2、T18M4およびT24I20、T18M4およびCUE1、T18F2およびT24I20、T18F2およびCUE1、ならびにT24I20およびCUE1からなる群から選択される遺伝マーカーの対によって隣接されるとして規定され得る。なおさらに別の実施形態では、本発明は、植物セントロメアを含み、そしてさらに反復ヌクレオチド配列のn個のコピーここで、nは少なくとも2であるを含むとして規定される、組換えDNA構築物を提供する。潜在的に、組換え構築物上に物理的に配置され得る任意の数の反復コピー約5、10、15、20、30、50、75、100、150、200、300、400、500、750、1,000、1,500、2,000、3,000、5,000、7,500、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、および約100,000を含むこのようなコピー数の中間にある全ての範囲を含むが、この構築物上に含まれ得る。1つの実施形態では、反復ヌクレオチド配列は、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211または配列番号212によって与えられる核酸配列から単離可能であり得る。使用され得るこのような配列の例を、図23A~23Dに提供する。使用される反復の長さは変動し得るが、好ましくは、約20bp~約250bp、約50bp~約225bp、約75bp~約210bp、約100bp~約205bp、約125bp~約200bp、約150bp~約195bp、約160bp~約190bp、および約170bp~約185bpの範囲約180bpを含むである。配列番号209、210、211、および212と組合せて、反復は、セントロメア構造の部分として含まれ得る。反復の数は変動し得、そして1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500またはそれより多数を含む。なおさらに別の局面では、本発明は、植物セントロメアおよびテロメア配列を含むミニ染色体ベクターを提供する。任意のさらなる所望される配列例えば、自律複製配列、第2テロメア配列および構造遺伝子がこのミニ染色体に付加され得る。1以上の前述の配列が、ミニ染色体上に物理的に配置され得る最大数まで、このような配列が付加され得る。ミニ染色体は、本明細書中に開示される任意のセントロメア組成物を含み得る。本発明の1つの実施形態では、ミニ染色体は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20および配列番号21からなる群から選択される核酸配列を含み得る。ミニ染色体はまた、抗生物質、除草剤、または他の薬剤に対する感受性を付与し、それによってミニ染色体を含む目的の植物、植物細胞、または任意の他の生物体の細胞の選択を可能にする、ネガティブ選択可能マーカーを含み得る。ミニ染色体はまた、細胞内のミニ染色体のコピー数を制御する遺伝子を含み得る。1以上の構造遺伝子もまた、ミニ染色体に含まれ得る。有用であるとして特に意図されるのは、機能的ベクターをなお維持しつつミニ染色体内に挿入され得る限り多くの構造遺伝子である。これは、1,2、3、4、5、6、7、8、9またはそれより多い構造遺伝子を含み得る。なおさらに別の実施形態では、本発明は、植物セントロメアを含む組換えDNA構築物を提供する。この細胞は、任意の型の細胞原核生物細胞または真核生物細胞を含むであり得る。細胞が真核生物細胞である場合、この細胞は、例えば、酵母細胞または高等真核生物細胞例えば、植物細胞であり得る。植物細胞は、双子葉植物例えば、タバコ、トマト、ジャガイモ、ダイズ、カノラ、ヒマワリ、アルファルファ、ワタ、およびArabidopsis由来であり得るか、または単子葉植物細胞例えば、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、シバturfgrass、エンバク、オオムギ、ソルガム、キビ、およびサトウキビであり得る。本発明の1つの実施形態では、植物セントロメアはArabidopsisthalianaのセントロメアであり、そして細胞は、Arabidopsisthaliana細胞であり得る。組換えDNA構築物は、テロメア、自律複製配列ARS、構造遺伝子、または選択可能マーカーもしくはスクリーニングマーカーのようなさらなる配列を含み得、この組換えDNA構築物上に物理的に配置され得る限り多くのこのような配列を含む。本発明の1つの実施形態では、細胞はさらに、この構造遺伝子を発現し得るとして規定される。本発明の別の実施形態では、前述の細胞を含む植物が提供される。なおさらに別の実施形態では、本発明は、トランスジェニック植物細胞を調製する方法を提供する。この方法は、出発植物細胞startingplantcellと植物セントロメアを含む組換えDNA構築物とを接触させ、それによってこの出発植物細胞がこの組換えDNA構築物で形質転換される、工程を包含する。組換えDNA構築物は、任意の所望される遺伝子例えば、この組換えDNA構築物上に物理的に配置され得る限り多くの構造遺伝子を含み得る。特定の実施形態では、セントロメアがArabidopsisthalianaのセントロメアであり、そして植物細胞がArabidopsisthaliana細胞であり得る。なおさらに別の局面では、本発明は、ミニ染色体ベクターを含むトランスジェニック植物を提供し、このベクターは植物セントロメアおよびテロメア配列を含む。ミニ染色体ベクターは、さらに自律複製配列、第2テロメア配列、または構造遺伝子例えば、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子、種子貯蔵遺伝子、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および成長因子遺伝子を含み得る。ミニ染色体上に物理的に配置され得る限り多くのこのような配列が含まれ得る。ミニ染色体ベクターはさらに、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20および配列番号21からなる群から選択される核酸配列を含み得る。トランスジェニック植物は、双子葉植物例えば、タバコ、トマト、ジャガイモ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリー、ダイズ、カノラ、ヒマワリ、アルファルファ、ワタ、およびArabidopsisのような任意の型の植物であり得るか、または単子葉植物例えば、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、シバ、エンバク、オオムギ、ソルガム、キビ、およびサトウキビであり得る。なおさらに別の局面では、本発明は、ミニ染色体ベクターを生成する方法を提供する。この方法は、a第1ベクターおよび第2ベクターを得る工程であって、この第1ベクターまたは第2ベクターが、選択可能マーカーもしくはスクリーニングマーカー、複製起点、テロメアおよび植物セントロメアを含み、そしてここでこの第1ベクターおよび第2ベクターが部位特異的組換えのための部位を含む、工程;ならびにbこの第1ベクターとこの第2ベクターとを接触させて、この第1ベクター上の部位特異的組換えのための部位と、この第2ベクター上の部位特異的組換えのための部位との間で部位特異的組換えを生じさせ、この選択可能マーカーもしくはスクリーニングマーカー、この複製起点、このテロメア、およびこの植物セントロメアを含むミニ染色体ベクターを作製する、工程を包含する。この接触させる工程は、インビトロまたはインビボここでは、AgrobacteriumもしくはE.coli細胞のような原核生物細胞、または酵母細胞のような下等真核生物細胞において接触させる工程を実施することが含まれるで実施され得る。この接触させる工程はさらに、高等真核生物細胞例えば、植物細胞Arabidopsisthaliana細胞を含むにおいて実施され得る。この接触させる工程は、潜在的に任意のリコンビナーゼCre、Flp、Gin、Pin、Sre、pinD、Int-B13、およびRを含むの存在下で実施され得る。第1ベクターまたは第2ベクターは、Agrobacterium媒介性形質転換のためにボーダーborder配列を含み得る。本発明の1つの実施形態では、植物セントロメアはArabidopsisthalianaセントロメアである。テロメアは植物テロメアであり得る。任意の植物の選択可能マーカーまたはスクリーニングマーカーGFP、GUS、BAR、PAT、HPT、またはNPTIIを含むが、使用され得る。なおさらに別の局面では、植物セントロメア活性について候補セントロメア配列をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、以下の工程:a候補セントロメア配列を含む単離された核酸配列を得る工程;bこの単離された核酸を用いて、植物細胞に組み込まれるように形質転換する工程;およびcこの候補セントロメア配列のセントロメア活性についてスクリーニングする工程、を包含する。この方法では、スクリーニングする工程は、組み込まれるように形質転換された植物細胞またはこの植物細胞を含む植物中に存在する表現型効果を得る工程、を包含し得、ここでこの表現型効果は、この単離された核酸配列を用いて組み込まれるように形質転換されていないコントロール植物細胞、またはこのコントロール植物細胞を含む植物には存在しない。スクリーニングされ得る表現型効果の型は、生存率の減少、この形質転換の効率の低下、組み込まれるように形質転換された核酸における遺伝子不安定性、異常な植物領域section、倍数性の増加、異数体、および遠位領域またはセントロメア性染色体領域における組み込み的な形質転換の増加が挙げられる。単離された核酸配列は、細菌人工染色体を含み得、これはさらにバイナリー細菌人工染色体として規定され得る。組み込まれるように形質転換する工程は、任意の型の形質転換例えば、Agrobacterium媒介性形質転換の使用を含み得る。本発明の1つの実施形態では、コントロール植物細胞は、候補セントロメア配列以外の核酸配列を用いて、組み込まれるように形質転換される。なおさらに別の局面では、本発明は、Arabidopsisポリユビキチン11プロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、ここでこのプロモーターは、配列番号180の核酸配列の約25~約2,000個連続したヌクレオチドを含む。本発明のさらなる実施形態では、このプロモーターは、配列番号180の核酸配列の約75~約2,000、約125~約2,000、約200~約2,000、約400~約2,000、約800~約2,000、約1,000~約2,000、または約1,500~約2,000個連続したヌクレオチドを含み得るか、または配列番号180の核酸配列を含み得る。この構築物を含むプロモーターは、任意のさらなる所望の配列例えば、エンハンサーの配列、テロメア配列、植物セントロメア配列、ARS、または構造遺伝子抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子、種子貯蔵遺伝子、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および成長因子遺伝子を含むを含み得る。本発明の1つの実施形態では、プロモーターは構造遺伝子の5’末端に作動可能に連結され得る。なおさらに別の局面では、本発明は、Arabidopsisの40Sリボソームタンパク質S16プロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、ここでこのプロモーターは、配列番号182の核酸配列の約25~約2,000個連続したヌクレオチドを含む。本発明の特定の実施形態では、このプロモーターは、配列番号182の核酸配列の約75~約2,000、約125~約2,000、約200~約2,000、約400~約2,000、約800~約2,000、約1,000~約2,000、または約1,500~約2,000個連続したヌクレオチドを含み得るか、または配列番号182の核酸配列を含み得る。この構築物を含むプロモーターは、任意のさらなる所望の配列例えば、エンハンサーの配列、テロメア配列、植物セントロメア配列、ARS、または構造遺伝子抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子、種子貯蔵遺伝子、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および成長因子遺伝子を含むを含み得る。本発明の1つの実施形態では、プロモーターは構造遺伝子の5’末端に作動可能に連結され得る。本発明のなおさらに別の局面では、ターミネーター配列を含むArabidopsisポリユビキチン11の3’調節配列を含む組換えDNA構築物を提供し、ここでこの3’調節配列は、配列番号181の核酸配列の約25~約2001個連続したヌクレオチドを含む。本発明の1つの実施形態では、この3’調節配列は、配列番号181の核酸配列の約75~約2001、約125~約2001、約200~約2001、約400~約2001、約800~約2001、または約1,000~約2001個連続したヌクレオチドを含むとしてさらに規定され得、そして配列番号181の核酸配列を含み得る。この組換え配列はさらに、任意の他の配列例えば、エンハンサー、テロメア配列、植物セントロメア配列、ARS、および構造遺伝子抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子、種子貯蔵遺伝子、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および成長因子遺伝子を含むを含み得る。本発明の1つの実施形態では、ターミネーターが構造遺伝子の3’末端に作動可能に連結され得る。なおさらに別の局面では、本発明は、ターミネーター配列を含むArabidopsisの40Sリボソームタンパク質S16の3’調節配列を含む組換えDNA構築物を提供し、ここでこの3’調節配列は、配列番号183の核酸配列の約25~約2,000個連続したヌクレオチドを含む。本発明の特定の実施形態では、この3’調節配列は、配列番号183の核酸配列の約75~約2,000、約125~約2,000、約200~約2,000、約400~約2,000、約800~約2,000、または約1,000~約2,000個連続したヌクレオチドを含み得、そして配列番号183の核酸配列を含み得る。この組換え配列はさらに、任意の他の配列例えば、エンハンサー、テロメア配列、植物セントロメア配列、ARS、および構造遺伝子抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子、種子貯蔵遺伝子、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および成長因子遺伝子を含むを含み得る。本発明の1つの実施形態では、ターミネーターが構造遺伝子の3’末端に作動可能に連結され得る。なおさらに別の局面では、本発明は、目的の植物、植物細胞または任意の他の生物体の細胞において外来遺伝子を発現させるための方法を提供する。外来遺伝子は、任意の生物体植物、動物、および細菌を含む由来であり得る。ミニ染色体を使用して、完全な生化学経路または調節経路を含む植物に、複数の外来遺伝子を同時に移入し得ることがさらに意図される。本発明のさらに別の実施形態では、ミニ染色体をDNAクローニングベクターとして使用し得ることが意図される。このようなベクターは、植物および動物の配列決定プロジェクトにおいて使用され得る。本発明は、酵母および細菌においてクローン化不可能unclonableであるが、植物に基づく系では容易にクローン化され得る配列のクローニングにおいて特に有用であり得る。本発明のなおさらに別の局面では、本明細書中に開示されるミニ染色体を使用して、DNAの機能的セグメント例えば、DNAの複製起点、テロメア、テロメア関連遺伝子telomereassociatedgene、核基質接着領域nuclearmatrixattachmentregionMAR、骨格結合領域SAR、境界エレメントboundaryelement、エンハンサー、サイレンサー、プロモーター、組換えホットスポットおよびセントロメアをクローン化し得る。この実施形態は、1以上の型の機能的エレメントについて欠損する欠損性ミニ染色体内にDNAをクローン化することによって、実施され得る。このような欠損したエレメントを補完する配列は、安定に遺伝されるミニ染色体を生じさせる。次いで、ミニ染色体上の選択可能マーカーまたはスクリーニングマーカーを使用して、欠損性ミニ染色体において非機能的であった型のクローン化された機能的エレメントを含む、生存可能なミニ染色体含有細胞について選択し得る。本発明のまたさらなる局面において、本明細書中に開示される配列はArabidopsisとは異なる植物に由来するセントロメア配列の単離のために使用され得る。そのような技術は、例えばハイブリダイゼーション分析または配列ベースの分析を使用し得る。本発明の一つの実施形態において、セントロメアは、農業的に重要な種、例えば、野菜作物チョウセンアザミ、コールラビ、キバナスズシロ、セイヨウニラネギ、アスパラガス、レタス例えば、結球、葉、ロマイン、チンゲンサイ、タロイモ、ブロッコリー、メロン例えば、マスクメロン、スイカ、クレンシャウcrenshaw、糖液、カンタロープ、芽キャベツ、キャベツ、カルバンcardoni、ニンジン、白菜、カリフラワー、オクラ、タマネギ、セロリ、パセリ、ヒヨコマメ、パースニップ、キクニガナ、体菜、コショウ、コラード、ジャガイモ、キュウリ植物マロウmarrow、キュウリ、カボチャ、ヒョウタン、ダイコン、乾燥球状タマネギ、カブカンラン、ナス、バラモンジン、エスカロール、シャロット、エンダイブ、ニンニク、ホウレンソウ、緑タマネギ、カボチャ、青菜、ビートテンサイおよび試料ビートサツマイモ、フダンソウ、セイヨウワサビ、トマト、ケール、カブ、ならびに薬味を含むから単離され得る。あるいは、セントロメアは、果物およびつる植物例えば、リンゴ、アンズ、サクランボ、ネクタリン、モモ、セイヨウナシ、プラム、プルーン、マルメロアーモンド、クリ、ヘイゼルナッツ、ぺカン、ピスタチオ、クルミ、カンキツ類、ブルーベリー、ボイゼンベリー、ツルコケモモ、干しブドウ、ローガンベリー、ラズベリー、イチゴ、クロイチゴ、ブドウ、アボガド、バナナ、キーウィ、カキ、ザクロ、パイナップル、熱帯果実、ナシ状果、メロン、マンゴー、パパイヤおよびライチから、単離され得る。本発明のまたさらに別の局面において、セントロメアは、本発明に従って畑作物植物例えば、マツヨイグサ、メドウフォームmeadowfoam、トウモロコシトウモロコシfieldcorn、スイートコーン、ポップコーン、ホップ、ホホバ、ピーナッツ、イネ、ベニバナ、小さな穀粒オオムギ、オートムギ、ライムギ、コムギなど、モロコシ、タバコ、カポック、マメ植物マメ、ヒラマメ、エンドウ、ダイズ、油脂植物セイヨウアブラナ、マスタード、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、トウゴマ、カカオの実、アメリカホドイモ繊維植物綿、アマ、マサ、ジュート、クスノキシナモン、カンフルまたはコーヒー、サトウキビ、茶および天然インドゴムノキ植物のような植物から単離され得る。セントロメアが単離され得るさらに他の植物の例としては、花壇向きの植物例えば、花、サボテン、多汁植物および観賞植物ならびに森林広葉樹および常緑樹、例えば針葉樹、果実樹木、観賞樹木、および木の実結実樹のような樹木、ならびに低木および他の苗木ストックが挙げられる。本発明のまたさらに別の局面において、本明細書中に記載されるミニ染色体ベクターを使用して、効率的な遺伝子置換研究を実施し得る。現在、遺伝子置換は、植物系においてはわずかな場合においてのみ検出されており、そして哺乳動物組織培養系においては低い頻度でのみ検出されているThomasら、1986;Smithiesら、1985を参照のこと。この理由は、相同遺伝子組換えの頻度に比較して、高頻度の非正統的非相同組換え事象である前者が遺伝子置換の原因である。人工染色体が、相同組換えに優先的に関与し得る。人工染色体は、送達の際、インタクトなままなので、非常に効率的な非正統的組換え機構のための基質として役立つような、組換え生成破壊末端が生成されない。従って、本明細書中に開示される人工染色体ベクターは、減数分裂の間、核において維持されて、そして、相同性依存性減数分裂組換えに関与するように利用可能である。さらに、原理上は、本発明の教示を使用して任意の長さの人工染色体が構築され得るので、そのベクターを使用して、同じ生物体または任意の他の生物体に由来する非常に長い長さのDNAを細胞内に導入し得る。特に意図される挿入片は、およそいくつかの塩基対~100メガベース対およそ、1kb、25kb、50kb、100kb、125kb、150kb、200kb、300kb、400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb、1MB、1.25Mb、1.5Mb、2Mb、3Mb、5Mb、10Mb、25Mb、50Mbおよび100Mbを含むの挿入片を含む。またさらに別の局面において、本発明は、植物細胞の遺伝子形質転換のためのミニ染色体ベクターの構築についての方法、そのベクターの使用、およびそれらによって形質転換された生物体を提供する。組換えDNA技術の一般原理を示す標準的な参考文献としては、Lewin1985が挙げられる。他の著作は、遺伝子操作の方法および産物を記載する。例えば、Maniatisら、1982;Watsonら、1983;Setlowら、1979;およびDillonら、1985を参照のこと。またさらに別の局面において、本発明は、トランスジェニック細胞を調製する方法を提供する。本発明の一つの実施形態において、この方法は、a以下の特徴を有するArabidopsisthalianaセントロメアDNAを含む核酸分子を得る工程:1mi342およびT27K12、mi310およびg4133、atpoxおよびATA、mi233およびmi167ならびにF13K20-t7およびCUE1および2からなる群から選択される一対の遺伝子マーカーによって定義されるArabidopsisthaliana染色体上の位置の地図作製、および2相同染色体の分離を示すパターンにおける減数分裂1の紡錘極へのDNAのソート、bその核酸分子を含む組換え構築物を調製する工程;およびcその組換え構築物でレシピエント細胞を形質転換する工程を包含する。例えば、その細胞は、より下等な真核生物細胞酵母細胞を含むであり得るか、またはより高等な真核生物細胞であり得る。その細胞がより高等な真核生物細胞である場合、その細胞は動物または植物細胞であり得る。本発明の一つの実施形態において、その細胞は、Arabidopsisthaliana細胞ではない。本発明の別の実施形態において、Arabidopsisthalianaセントロメアは、マーカー対mi342およびT27K12によって定義され、それはさらに、遺伝子マーカー対T22C23-t7およびT3P8-sp6によって定義される;そして/またはマーカー対mi310およびg4133によって定義され、それはさらに遺伝子マーカー対F5J15およびT15D9によって定義される;そして/またはマーカー対atpoxおよびATAによって定義され、それはさらに遺伝子マーカー対T9G9-sp6およびT5M14-sp6によって定義され得る;そして/またはマーカー対mi233およびmi167によって定義され、それはさらに遺伝子マーカー対T24H24.30k3およびF13H14-t7によって定義され得る;そして/または遺伝子マーカー対F13K20-t7およびCUE1によって定義され、それはさらにF13K20-T7およびT18M4、F13K20およびT18F2、F13K20-T7およびT18F2、F13K20-T7およびT24I20、T18M4およびT18F2、T18M4およびT24I20、T18M4およびCUE1、T18F2およびT24I20、T18F2およびCUE1、およびT24I20およびCUE1からなる群から選択される遺伝子マーカー対によって定義され得る。本発明の一つの実施形態において、形質転換は、Agrobacterium媒介性形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、または粒子衝撃bombardmentからなる群から選択される方法の使用を含む。その組換え構築物は、所望の要素テロメアArabidopsisthalianaテロメアもしくは、酵母テロメアを含むを含み得る。この組換え構築物はまた、自律性複製配列ARS例えば、ArabidopsisthalianaARSを含み得る。その組換え構築物はまた、原核生物もしくは真核生物選択可能もしくはスクリーニングマーカー遺伝子を含み得る。一つ以上の構造遺伝子が、組換え構築物とともに含むこともまた所望され得る。例示的な構造遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原菌防御遺伝子、植物ストレス誘導遺伝子、毒素遺伝子、種子貯蔵遺伝子、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および増殖因子遺伝子からなる群から選択される遺伝子が挙げられる。その方法は、この細胞からトランスジェニック植物を再生する工程をさらに包含し得る。またさらに別の局面において、本発明は以下の工程を包含する、セントロメア活性を与え得る核酸分子を同定する方法を提供する:aArabidopsisthalianaセントロメアDNAを含む、核酸分子を得る工程、ここでArabidopsisthalianaセントロメアは、mi342およびT27K12、mi310およびg4133、atpoxおよびATA、mi233およびmi167、ならびにF13K20-t7およびT17M11-sp6からなる群から選択される一対の遺伝子マーカーにより定義される;bその核酸分子を含む組換え構築物を調製する工程;ならびにc安定な遺伝形質パターンを実証する組換え構築物の能力を決定する工程。この方法において、安定な遺伝形質パターンを実証する能力が、組換え構築物を含む組換え細胞を調製することによって決定され得る。本発明の別の実施形態において、Arabidopsisthalianaセントロメアは、マーカー対mi342およびT27K12によって定義され、これはさらに遺伝子マーカー対T22C23-t7およびT3P8-sp6によって定義される;そして/またはマーカー対mi310およびg4133によって定義され、それはさらに遺伝子マーカー対F5J15-sp6およびT15D9によって定義される;そして/またはマーカー対atpoxおよびATAによって定義され、それはさらに遺伝子マーカー対T9G9-sp6およびT5M14-sp6によって定義され得る;そして/またはマーカー対mi233およびmi167によって定義され、それはさらに遺伝子マーカー対T24H24.30k3およびF13H14-t7によって定義され得る;そして/または遺伝子マーカー対F13K20-t7およびCUE1によって定義され、それはさらにF13K20-T7およびT18M4、F13K20-T20およびT18F2、F13K20-T7およびT24I20、T18M4およびT18F2、T18M4およびT24I20、T18M4およびCUE1、T18F2およびT24I20、T18F2およびCUE1、ならびにT24I20およびCUE1からなる群から選択される遺伝子マーカー対によって定義され得る。本発明の一つの実施形態において、その組換え構築物は、染色体に組み込まれる。この獲得工程は、ArabidopsisthalianaセントロメアDNAを含むBACクローンもしくはYACクローンを獲得する工程を包含する。このDNAは、パルスフィールドゲル電気泳動の使用を含む方法によって得られ得、そしてポジショナルクローニングを含む方法によって得られ得る。本発明の別の実施形態において、そのポジショナルクローニングは、このArabidopsisthalianaセントロメアDNAを含むクローンの連続セットを同定する工程を包含し得、ここでそのクローンのセットは、mi342およびT27K12、mi310およびg4133、atpoxおよびATA、mi233およびmi167ならびにF13K20-t7およびT17M11-sp6からなる群から選択される一対の遺伝子マーカーに隣接される。クローンの連続セットは、Arabidopsisthalianaセントロメアに及び得る。その組換え構築物は、選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカーを含み得、そしてその決定する工程は、選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカーにより与えられる表現型を決定する工程を包含する。その決定する工程は、例えば、組換え構築物が有糸分裂および/または減数分裂において安定な遺伝形質パターンを実証する能力を決定する工程を包含し得る。さらに別の実施形態において、本発明は、本発明により提供される方法によって調製されるトランスジェニック細胞を提供する。また、本発明によって、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分およびトランスジェニック細胞を含む組織培養物が提供される。本発明の別の実施形態において、Arabidopsisthalianaセントロメアは、マーカー対mi342およびT27K12によって定義され、それはさらに、遺伝子マーカー対T22C23-t7およびT3P8-sp6によって定義される;そして/またはマーカー対mi310およびg4133によって定義され、それはさらに遺伝子マーカー対F5J15-sp6およびT15D9によって定義される;そして/またはマーカー対atpoxおよびATAによって定義され、それはさらに遺伝子マーカー対T9G9-sp6およびT5M14-sp6によって定義され得る;そして/またはマーカー対mi233およびmi167によって定義され、それはさらに遺伝子マーカー対T24H24.30k3およびF13H14-t7によって定義され得る;そして/または遺伝子マーカー対F13K20-t7およびCUE1によって定義され、それはさらにF13K20-T7およびT18M4、F13K20-T7およびT18F2、F13K20-T7およびT24I20、T18M4およびT18F2、T18M4およびT24I20、T18M4およびCUE1、T18F2およびT24I20、T18F2およびCUE1、ならびにT24I20およびCUE1からなる群から選択される遺伝子マーカー対によって定義される。本発明のまたさらに別の局面において、本発明に従って使用されるセントロメアは、Arabidopsis例えば、Arabidopsisthalianaに由来しない。同様に、本発明に従うセントロメア組成物を含む植物または植物細胞はまた、Arabidopsisとは異なる植物に由来し得る。本発明は例えば、以下の項目を提供する。項目1植物セントロメアを含む、組換えDNA構築物。項目2テロメアをさらに含む、項目1に記載の組換えDNA構築物。項目3前記テロメアが植物テロメアである、項目2に記載の組換えDNA構築物。項目4前記植物テロメアがArabidopsisthalianaテロメアである、項目3に記載の組換えDNA構築物。項目5前記テロメアが酵母テロメアである、項目2に記載の組換えDNA構築物。項目6自律複製配列ARSをさらに含む、項目1に記載の組換えDNA構築物。項目7前記ARSが植物ARSである、項目6に記載の組換えDNA構築物。項目8前記植物ARSが、ArabidopsisthalianaARSである、項目6に記載の組換えDNA構築物。項目9構造遺伝子をさらに含む、項目1に記載の組換えDNA構築物。項目10前記構造遺伝子が選択マーカー遺伝子またはスクリーニングマーカー遺伝子を含む、項目9に記載の組換えDNA構築物。項目11第2の構造遺伝子をさらに含む、項目9に記載の組換えDNA構築物。項目12前記構造遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子および種子貯蔵遺伝子からなる群より選択される、項目9に記載の組換えDNA構築物。項目13前記構築物が前記構造遺伝子を発現し得る、項目12に記載の組換えDNA構築物。項目14前記構築物が、原核生物において前記構造遺伝子を発現し得る、項目13に記載の組換えDNA構築物。項目15前記構築物が、真核生物において前記構造遺伝子を発現し得る、項目13に記載の組換えDNA構築物。項目16前記真核生物が高等真核生物である、項目15に記載の組換えDNA構築物。項目17前記高等真核生物が植物である、項目16に記載の組換えDNA構築物。項目18前記構造遺伝子が、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および増殖因子遺伝子からなる群より選択される、項目9に記載の組換えDNA構築物。項目19前記構築物が前記構造遺伝子を発現し得る、項目18に記載の組換えDNA構築物。項目20前記構築物が、原核生物において前記構造遺伝子を発現し得る、項目19に記載の組換えDNA構築物。項目21前記構築物が、真核生物において前記構造遺伝子を発現し得る、項目19に記載の組換えDNA構築物。項目22前記真核生物が高等真核生物である、項目21に記載の組換えDNA構築物。項目23前記高等真核生物が植物である、項目22に記載の組換えDNA構築物。項目24プラスミドとしてさらに定義される、項目1に記載の組換えDNA構築物。項目25前記プラスミドが複製起点を含む、項目24に記載の組換えDNA構築物。項目26前記複製起点が細菌において機能する、項目25に記載の組換えDNA構築物。項目27前記複製起点がE.coliにおいて機能する、項目26に記載の組換えDNA構築物。項目28前記複製起点がAgrobacteriumにおいて機能する、項目26に記載の組換えDNA構築物。項目29前記複製起点が植物において機能する、項目25に記載の組換えDNA構築物。項目30前記複製起点が酵母において機能する、項目25に記載の組換えDNA構築物。項目31前記酵母がS.cerevisiaeである、項目30に記載の組換えDNA構築物。項目32前記プラスミドが選択マーカーを含む、項目24に記載の組換えDNA構築物。項目33前記選択マーカーが細菌において機能する、項目32に記載の組換えDNA構築物。項目34前記選択マーカーがE.coliにおいて機能する、項目32に記載の組換えDNA構築物。項目35前記選択マーカーが、Agrobacteriumにおいて機能する、項目32に記載の組換えDNA構築物。項目36前記選択マーカーが植物において機能する、項目32に記載の組換えDNA構築物。項目37前記選択マーカーが酵母において機能する、項目32に記載の組換えDNA構築物。項目38前記酵母がS.cerevisiaeである、項目37に記載の組換えDNA構築物。項目39染色体として維持され得、該染色体は分裂細胞において伝達される、項目1に記載の組換えDNA構築物。項目40前記植物セントロメアがArabidopsisthalianaセントロメアである、項目1に記載の組換えDNA構築物。項目41前記植物セントロメアがArabidopsisthalianaの第1染色体セントロメアである、項目40に記載の組換えDNA構築物。項目42前記セントロメアが遺伝マーカーT22C23-T7およびT3P8-SP6に隣接している、項目41に記載の組換えDNA構築物。項目43前記セントロメアが遺伝マーカーT22C23-T7およびT5D18、T22C23-T7およびT3L4、T5D18およびT3P8-SP6、T5D18およびT3L4、ならびにT3L4およびT3P8-SP6に隣接しているとさらに定義される、項目42に記載の組換えDNA構築物。項目44前記植物セントロメアがArabidopsisthaliana第2染色体セントロメアを含む、項目40に記載の組換えDNA構築物。項目45前記セントロメアが配列番号209の核酸配列の約100~約611,000の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目46前記セントロメアが配列番号209の核酸配列の約500~約611,000の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目47前記セントロメアが配列番号209の核酸配列の約1,000~約611,000の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目48前記セントロメアが配列番号209の核酸配列の約10,000~約611,000の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目49前記セントロメアが配列番号209の核酸配列の約20,000~約611,000の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目50前記セントロメアが配列番号209の核酸配列の約40,000~約611,000の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目51前記セントロメアが配列番号209の核酸配列の約80,000~約611,000の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目52前記セントロメアが配列番号209の核酸配列の約150,000~約611,000の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目53前記セントロメアが配列番号209の核酸配列の約300,000~約611,000の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目54前記セントロメアが配列番号209の核酸配列を含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目55前記セントロメアが配列番号210の核酸配列の約100~約50,959の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目56前記セントロメアが配列番号210の核酸配列の約500~約50,959の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目57前記セントロメアが配列番号210の核酸配列の約1,000~約50,959の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目58前記セントロメアが配列番号210の核酸配列の約5,000~約50,959の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目59前記セントロメアが配列番号210の核酸配列の約10,000~約50,959の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目60前記セントロメアが配列番号210の核酸配列の約20,000~約50,959の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目61前記セントロメアが配列番号210の核酸配列の約30,000~約50,959の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目62前記セントロメアが配列番号210の核酸配列の約40,000~約50,959の連続するヌクレオチドを含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目63前記セントロメアが配列番号210の核酸配列を含む、項目44に記載の組換えDNA構築物。項目64前記植物セントロメアがArabidopsisthaliana第3染色体セントロメアである、項目40に記載の組換えDNA構築物。項目65セントロメアが遺伝マーカーT9G9-SP6およびT5M14-SP6に隣接しているとさらに定義される、項目62に記載の組換えDNA構築物。項目66前記セントロメアがT9G9-SP6およびTI4H20、T9G9-SP6およびT7K14、T9G9-SP6およびT21P20、T14H20およびT7K14、T14H20およびT21P20、T14H20およびT5M14-SP6、T7K14およびT5M14-SP6、T7K14およびT21P20、ならびにT21P20およびT5M14-SP6からなる群より選択される一対の遺伝マーカーによって隣接しているとなおさらに定義される、項目65に記載の組換えDNA構築物。項目67前記植物セントロメアがArabidopsisthaliana第4染色体セントロメアである、項目40に記載の組換えDNA構築物。項目68前記セントロメアが配列番号211の核酸配列の約100~約1,082,000の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目69前記セントロメアが配列番号211の核酸配列の約500~約1,082,000の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目70前記セントロメアが配列番号211の核酸配列の約1,000~約1,082,000の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目71前記セントロメアが配列番号211の核酸配列の約5,000~約1,082,000の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目72前記セントロメアが配列番号211の核酸配列の約10,000~約1,082,000の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目73前記セントロメアが配列番号211の核酸配列の約50,000~約1,082,000の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目74前記セントロメアが配列番号211の核酸配列の約100,000~約1,082,000の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目75前記セントロメアが配列番号211の核酸配列の約200,000~約1,082,000の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目76前記セントロメアが配列番号211の核酸配列の約400,000~約1,082,000の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目77前記セントロメアが配列番号211の核酸配列の約800,000~約1,082,000の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目78前記セントロメアが配列番号211の核酸配列を含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目79前記セントロメアが配列番号212の核酸配列の約100~約163,317の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目80前記セントロメアが配列番号212の核酸配列の約500~約163,317の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目81前記セントロメアが配列番号212の核酸配列の約1,000~約163,317の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目82前記セントロメアが配列番号212の核酸配列の約5,000~約163,317の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目83前記セントロメアが配列番号212の核酸配列の約10,000~約163,317の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目84前記セントロメアが配列番号212の核酸配列の約30,000~約163,317の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目85前記セントロメアが配列番号212の核酸配列の約50,000~約163,317の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目86前記セントロメアが配列番号212の核酸配列の約80,000~約163,317の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目87前記セントロメアが配列番号212の核酸配列の約120,000~約163,317の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目88前記セントロメアが配列番号212の核酸配列を含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。項目89前記植物セントロメアがArabidopsisthaliana第5染色体セントロメアである、項目40に記載の組換えDNA構築物。項目90前記セントロメアが遺伝マーカーF13K20-T7およびCUE1に隣接している、項目89に記載の組換えDNA構築物。項目91項目90に記載の組換えDNA構築物であって、前記セントロメアがF13K20-T7およびT18M4、F13K20-T7およびT18F2、F13K20-T7およびT24I20、T18M4およびT18F2、T18M4およびT24I20、T18M4およびCUE1、T18F2およびT24I20、T18F2およびCUE1、ならびにT24I20およびCUE1からなる群より選択される一対の遺伝マーカーに隣接している、組換えDNA構築物。項目92nコピーの反復ヌクレオチド配列を含み、ここでnが少なくとも2である、項目1に記載の組換えDNA構築物。項目93nが約5~約100,000である、項目92に記載の組換えDNA構築物。項目94nが約10~約80,000である、項目92に記載の組換えDNA構築物。項目95nが約25~約60,000である、項目92に記載の組換えDNA構築物。項目96nが約100~約50,000である、項目92に記載の組換えDNA構築物。項目97nが約200~約40,000である、項目92に記載の組換えDNA構築物。項目98nが約400~約30,000である、項目92に記載の組換えDNA構築物。項目99nが約1,000~約30,000である、項目92に記載の組換えDNA構築物。項目100nが約5,000~約20,000である、項目92に記載の組換えDNA構築物。項目101nが約10,000~約15,000である、項目92に記載の組換えDNA構築物。項目102前記反復ヌクレオチド配列が、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211または配列番号212によって与えられる核酸配列より単離され得る、項目92に記載の組換えDNA構築物。項目103植物セントロメアおよびテロメア配列を含む、ミニ染色体ベクター。項目104自律複製配列を含む、項目103に記載のミニ染色体ベクター。項目105第2のテロメア配列を含む、項目103に記載のミニ染色体ベクター。項目106構造遺伝子を含む、項目103に記載のミニ染色体ベクター。項目107第2の構築遺伝子を含むとさらに定義される、項目103に記載のミニ染色体ベクター。項目108配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20および配列番号21からなる群より選択される核酸配列を含むとさらに定義される、項目103に記載のミニ染色体ベクター。項目109植物セントロメアを含む組換えDNA構築物で形質転換された細胞。項目110前記細胞が原核生物細胞である、項目109に記載の細胞。項目111前記細胞が真核生物細胞である、項目109に記載の細胞。項目112前記細胞が酵母細胞である、項目111に記載の細胞。項目113前記細胞が高等真核生物細胞である、項目109に記載の細胞。項目114前記高等真核生物が植物細胞である、項目113に記載の細胞。項目115前記植物細胞が双子葉植物由来である、項目114に記載の細胞。項目116前記双子葉植物がタバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリー、ダイズ、カノラ、ヒマワリ、アルファルファ、ワタおよびArabidopsisからなる群より選択される、項目115に記載の細胞。項目117前記双子葉植物がArabidopsisthalianaである、項目116に記載の細胞。項目118前記植物細胞が単子葉植物由来である、項目114に記載の細胞。項目119前記単子葉植物が、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、シバ、カラスムギ、オオムギ、ソルガム、キビおよびサトウキビからなる群より選択される、項目118に記載の細胞。項目120前記植物セントロメアがArabidopsisthalianaセントロメアである、項目109に記載の細胞。項目121Arabidopsisthaliana細胞としてさらに定義される、項目120に記載の細胞。項目122前記組換えDNA構築物がテロメアを含む、項目109に記載の細胞。項目123前記組換えDNA構築物が自律複製配列ARSを含む、項目109に記載の細胞。項目124前記組換えDNA構築物が構造遺伝子を含む、項目109に記載の細胞。項目125前記構造遺伝子が、選択マーカー遺伝子またはスクリーニングマーカー遺伝子を含む、項目124に記載の細胞。項目126前記組換えDNA構築物が第2の構造遺伝子を含む、項目124に記載の細胞。項目127前記構造遺伝子を発現し得るとさらに定義される、項目124に記載の細胞。項目128項目109に記載の細胞を含む、植物。項目129トランスジェニック植物細胞を調製する方法であって、出発植物細胞を、植物セントロメアを含む組換えDNA構築物と接触させ、それによって該出発植物細胞が、該組換えDNA構築物で形質転換される工程を包含する、方法。項目130前記組換えDNA構築物が構造遺伝子を含む、項目129に記載の方法。項目131前記組換えDNA構築物が第2の構造遺伝子を含む、項目130に記載の方法。項目132前記植物セントロメアがArabidopsisthalianaセントロメアである、項目129に記載の方法。項目133前記出発植物細胞がArabidopsisthaliana細胞である、項目132に記載の方法。項目134ミニ染色体ベクターを含むトランスジェニック植物であって、該ベクターが植物セントロメアおよびテロメア配列を含む、トランスジェニック植物。項目135前記ミニ染色体ベクターが自律複製配列を含む、項目134に記載のトランスジェニック植物。項目136前記ミニ染色体ベクターが第2のテロメア配列を含む、項目134に記載のトランスジェニック植物。項目137前記ミニ染色体ベクターが構造遺伝子を含む、項目134に記載のトランスジェニック植物。項目138前記構造遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子および種子貯蔵遺伝子からなる群より選択される、項目137に記載のトランスジェニック植物。項目139第1の外因性構造遺伝子が、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および増殖因子遺伝子からなる群より選択される、項目137に記載のトランスジェニック植物。項目140前記ミニ染色体ベクターが第2の構造遺伝子を含む、項目134に記載のトランスジェニック植物。項目141前記ミニ染色体ベクターが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号21からなる群より選択される核酸配列を含む、項目134に記載のトランスジェニック植物。項目142双子葉植物としてさらに定義される、項目134に記載のトランスジェニック植物。項目143前記双子葉植物が、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリー、ダイズ、カノラ、ヒマワリ、アルファルファ、ワタおよびArabidopsisからなる群より選択される、項目143に記載のトランスジェニック植物。項目144前記双子葉植物がArabidopsisthalianaである、項目143に記載のトランスジェニック植物。項目145単子葉植物としてさらに定義される、項目134に記載のトランスジェニック植物。項目146前記単子葉植物が、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、シバ、カラスムギ、オオムギ、ソルガム、キビおよびサトウキビからなる群より選択される、項目145に記載のトランスジェニック植物。項目147ミニ染色体ベクターを産生する方法であって、以下:a第1のベクターおよび第2のベクターを得る工程であって、該第1のベクターまたは該第2のベクターが選択マーカーまたはスクリーニングマーカー、複製起点、テロメア、および植物セントロメアを含み、そしてここで該第1のベクターおよび該第2のベクターは部位特異的組換えのための部位を含む、工程;およびb該第1のベクターと該第2のベクターを接触させて、該第1のベクター上の該部位特異的組換えのための部位と該第2のベクター上の該部位特異的組換えのための部位との間で部位特異的組換えを生じさせて、該選択マーカーまたはスクリーニングマーカー、該複製起点、該テロメアおよび該植物セントロメアを含む、ミニ染色体ベクターを作製する、工程を包含する方法。項目148前記接触させる工程がインビトロで行われる、項目147に記載の方法。項目149前記接触させる工程がインビボで行われる、項目148に記載の工程。項目150前記接触させる工程が原核生物細胞において行われる、項目149に記載の方法。項目151前記原核生物細胞がAgrobacterium細胞である、項目150に記載の方法。項目152前記原核生物細胞がE.coli細胞である、項目150に記載の方法。項目153前記接触させる工程が、下等真核生物細胞において行われる、項目149に記載の方法。項目154前記下等真核生物細胞が酵母細胞である、項目153に記載の方法。項目155前記接触させる工程が、高等真核生物細胞において行われる、項目149に記載の方法。項目156前記高等真核生物細胞が植物細胞である、項目155に記載の方法。項目157前記植物細胞がArabidopsisthaliana細胞である、項目156に記載の方法。項目158前記接触させる工程が、リコンビナーゼの存在下でなされる、項目147に記載の方法。項目159前記リコンビナーゼがCre、Flp、Gin、Pin、Sre、pinD、Int-B13、およびRからなる群より選択される、項目158に記載の方法。項目160前記第1のベクターまたは前記第2のベクターが、Agrobacterium媒介性形質転換のためのボーダー配列を含む、項目147に記載の方法。項目161前記植物細胞セントロメアがArabidopsisthalianaセントロメアである、項目147に記載の方法。項目162前記テロメアが植物テロメアである、項目147に記載の方法。項目163前記植物選択マーカーまたはスクリーニングマーカーがGFP、GUS、BAR、PAT、HPTまたはNPTIIからなる群より選択される、項目147に記載の方法。項目164植物セントロメア活性について候補セントロメア配列をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程:a候補セントロメア配列を含む単離された核酸配列を得る工程;b植物細胞を該単離された核酸で組み込まれるように形質転換する工程;およびc該候補セントロメア配列のセントロメア活性についてスクリーニングする工程、を包含する、方法。項目165前記スクリーニングする工程が、組み込まれるように形質転換された植物細胞または該植物細胞を含む植物に存在する表現型の効果を観察することを包含し、該表現型の効果は、該単離された核酸配列で組み込まれるように形質転換されていないコントロール植物細胞にも該コントロール植物細胞を含む植物においても存在しない、項目164に記載の方法。項目166前記表現型の効果が、減少した生存率、前記形質転換の減少した効率、組み込まれるように形質転換された核酸における遺伝的不安定性、異常な植物の領域、増加した倍数性、異数性および遠位の染色体領域またはセントロメアの染色体領域における増加した統合的な形質転換からなる群より選択される、項目165に記載の方法。項目167前記単離された核酸配列が細菌の人工的な染色体を含む、項目164に記載の方法。項目168前記細菌人工染色体がバイナリー細菌人工染色体としてさらに定義される、項目167に記載の方法。項目169前記組み込まれるように形質転換する工程が、Agrobacterium媒介性形質転換の使用を包含する、項目164の記載の方法。項目170前記コントロール植物細胞が、候補セントロメア配列以外の核酸配列で組み込まれるように形質転換されている、項目164に記載の方法。項目171Arabidopsisポリユビキチン11プロモーターを含む組換えDNA構築物であって、該プロモーターが配列番号180の核酸配列の約25~2,000の連続するヌクレオチドを含む、組換えDNA構築物。項目172前記プロモーターが配列番号180の核酸配列の約75~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目173前記プロモーターが配列番号180の核酸配列の約125~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目174前記プロモーターが配列番号180の核酸配列の約200~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目175前記プロモーターが配列番号180の核酸配列の約400~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目176前記プロモーターが配列番号180の核酸配列の約800~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目177前記プロモーターが配列番号180の核酸配列の約1,000~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目178前記プロモーターが配列番号180に核酸配列を含む、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目179エンハンサーをさらに含む、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目180テロメア配列をさらに含む、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目181植物セントロメア配列をさらに含む、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目182ARSをさらに含む、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目183前記プロモーターが構造遺伝子に作動可能に連結されている、項目171に記載の組換えDNA構築物。項目184前記構造遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子および種子貯蔵遺伝子からなる群より選択される、項目183に記載の組換えDNA構築物。項目185前記構造遺伝子が、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および増殖因子遺伝子からなる群より選択される、項目183に記載の組換えDNA構築物。項目186Arabidopsis40Sリボソームタンパク質S16プロモーターを含む組換えDNA構築物であって、該プロモーターは配列番号182の核酸配列の約25~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、組換えDNA構築物。項目187前記プロモーターが、配列番号182の核酸配列の約75~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目188前記プロモーターが、配列番号182の核酸配列の約125~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目189前記プロモーターが、配列番号182の核酸配列の約200~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目190前記プロモーターが、配列番号182の核酸配列の約400~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目191前記プロモーターが、配列番号182の核酸配列の約800~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目192前記プロモーターが、配列番号182の核酸配列の約1,000~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目193前記プロモーターが配列番号182の核酸配列を含む、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目194エンハンサーをさらに含む、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目195テロメア配列をさらに含む、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目196植物セントロメア配列をさらに含む、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目197ARSをさらに含む、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目198前記プロモーターが構造遺伝子に作動可能に連結されている、項目186に記載の組換えDNA構築物。項目199前記構造遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子および種子貯蔵遺伝子からなる群より選択される、項目198に記載の組換えDNA構築物。項目200前記構造遺伝子が、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および増殖因子遺伝子からなる群より選択される、項目198に記載の組換えDNA構築物。項目201Arabidopsisポリユビキチン113’調節配列を含む組換えDNA構築物であって、ここで該3’調節配列が配列番号181に記載の核酸配列の約25~約2001の連続するヌクレオチドを含む、組換えDNA構築物。項目202前記3’調節配列が配列番号181の核酸配列の約75~約2001の連続するヌクレオチドを含む、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目203前記3’調節配列が配列番号181の核酸配列の約125~約2001の連続するヌクレオチドを含む、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目204前記3’調節配列が配列番号181の核酸配列の約200~約2001の連続するヌクレオチドを含む、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目205前記3’調節配列が配列番号181の核酸配列の約400~約2001の連続するヌクレオチドを含む、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目206前記3’調節配列が配列番号181の核酸配列の約800~約2001の連続するヌクレオチドを含む、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目207前記3’調節配列が配列番号181の核酸配列の約1,000~約2001の連続するヌクレオチドを含む、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目208前記3’調節配列が配列番号181の核酸配列を含む、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目209エンハンサーをさらに含む、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目210テロメア配列をさらに含む、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目211植物セントロメア配列をさらに含む、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目212ARSをさらに含む、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目213前記3’調節配列が構造遺伝子に作動可能に連結されている、項目201に記載の組換えDNA構築物。項目214前記構造遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子および種子貯蔵遺伝子からなる群より選択される、項目213に記載の組換えDNA構築物。項目215前記構造遺伝子が、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および増殖因子遺伝子からなる群より選択される、項目213に記載の組換えDNA構築物。項目216Arabidopsis40Sリボソームタンパク質S163’調節配列を含む組換えDNA構築物であって、該3’調節配列が配列番号183の核酸配列の約25~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、組換えDNA構築物。項目217前記3’調節配列が配列番号183の核酸配列の約75~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目218前記3’調節配列が配列番号183の核酸配列の約125~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目219前記3’調節配列が配列番号183の核酸配列の約200~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目220前記3’調節配列が配列番号183の核酸配列の約400~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目221前記3’調節配列が配列番号183の核酸配列の約800~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目222前記3’調節配列が配列番号183の核酸配列の約1,000~約2,000の連続するヌクレオチドを含む、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目223前記3’調節配列が配列番号183の核酸配列を含む、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目224エンハンサーをさらに含む、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目225テロメア配列をさらに含む、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目226植物セントロメア配列をさらに含む、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目227ARSをさらに含む、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目228前記3’調節配列が構造遺伝子に作動可能に連結されている、項目216に記載の組換えDNA構築物。項目229前記構造遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素固定遺伝子、植物病原体防御遺伝子、植物ストレス誘導性遺伝子、毒素遺伝子、レセプター遺伝子、リガンド遺伝子および種子貯蔵遺伝子からなる群より選択される、項目228に記載の組換えDNA構築物。項目230前記構造遺伝子が、ホルモン遺伝子、酵素遺伝子、インターロイキン遺伝子、凝固因子遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗体遺伝子、および増殖因子遺伝子からなる群より選択される、項目228に記載の組換えDNA構築物。項目231前記セントロメアが、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、および配列番号208からなる群より選択される核酸配列の少なくとも約100の連続するヌクレオチドを含む、項目67に記載の組換えDNA構築物。発明の詳細な説明本発明者らは、初めて、植物セントロメアの核酸配列を提供することにより、先行技術における欠陥を克服した。先行技術と比較して、この達成の重要性は、概して多細胞生物のセントロメアに関する当該分野の詳細な情報の全般的欠如により例証される。現在まで、セントロメアの配列に関する最も広範で確かな特徴付けは、S.cerevisiaeおよびS.pombeのような下等真核生物の研究から得られており、ここでは、セントロメア機能を分析する能力によって、所望されるDNAの明白な像を与えてきた。S.cerevisiaeのセントロメアは、合計わずか125bpすなわち、各酵母染色体の約0.006~0.06の、3つの必須領域CDEI、CDEII、およびCDEIIIからなるCarbonら、1990;Bloom、1993。S.pombeのセントロメアは、40kB長と100kB長との間であり、そして各染色体の1~3を含む反復エレメントから構成されるBaumら、1994。人工染色体の分離を追跡する四分子分析を使用するその後の研究により、天然に存在するS.pombeのセントロメアの1/5未満が、セントロメア機能に十分であることが実証されたBaumら、1994。対照的に、哺乳動物および他の高等真核生物のセントロメアは、あまり規定されていない。高等真核生物のセントロメア領域にハイブリダイズするDNAフラグメントは同定されているが、これらの機能性に関しては、ほとんど知られていないTyler-Smithら、1993を参照のこと。多くの場合、セントロメア領域への細胞学的および遺伝学的な両方の反復マッピングに対するプローブを用いると、セントロメアの反復はセントロメアの位置に相関する。これらの配列の多くは、無作為に反復したサテライトエレメントであり、そして300kB~5000kB長の範囲の配列に散在した反復配列であるWillard、1990。現在までに、これらの反復のうちのわずか1つである、アルフォイドサテライトとして公知の171bpエレメントが、インサイチュハイブリダイゼーションによって、各々のヒトセントロメアに存在することが示されているTyler-Smithら、1993。多くの他のゲノムDNAは、DNAの一定領域に基づいて遺伝を付与することが必要とされるので、反復それ自体が機能的セントロメアを表すか否かは未だ議論の余地があるWillard、1997。あるいは、いくつかの高等真核生物セントロメアの位置は、染色体フラグメントの分離を分析することによって推定されている。しかし、このアプローチは不正確である。なぜなら、限られたセットのフラグメントが入手され得、そして正常なセントロメア機能は、周囲の染色体配列によって影響を受けるからである例えば、Koornneef、1983を参照のこと;図2。インタクトな染色体において使用され得るセントロメアをマッピングするためのより正確な方法は、四分子分析であるMortimerら、1981。これは、そのネイティブな染色体の状況でセントロメアの機能的な規定を提供する。現在、この様式でマッピングされたわずかなセントロメアは、酵母Saccharomycescerevisiae、SchizosaccharomycespombeおよびKluyveromyceslactisを含む下等真核生物由来であるCarbonら、1990;Hegemannら、1993。これらの系において、セントロメアの正確なマッピングは、染色体ウォーキングストラテジーClarkeら、1980を使用して、セントロメアDNAをクローン化することを可能にした。引き続いて、人工染色体アッセイを使用して、より正確にセントロメア配列が規定づけられたHegemannら、1993;Baumら、1994。哺乳動物における信頼のおけるセントロメアアッセイを開発する試みは、あいまいな結果を生じた。例えば、Hadlaczkyら1991は、マウス細胞株において低頻度で、新規のでのセントロメア形成を生じさせ得る14kBのヒトフラグメントを同定した。しかし、インサイチュハイブリダイゼーション研究は、このフラグメントが、天然に存在するセントロメアには存在していないことを示し、セントロメア機能を試験するためのこのアプローチの信頼性に疑問を呼んでいるTyler-Smithら、1993。同様に、細胞株へのアルフォイドサテライトのトランスフェクションは、新たな染色体の形成を生じるが、これらの染色体はまた、セントロメア活性に寄与し得る宿主の配列を含むHaafら、1992;Willard、1997。さらに、新規の染色体は、その全長にわたりアルフォイドDNAの分散を有し得るが、なお単一のセントロメアくびれのみを有しており、アルフォイドDNA単独のブロックblockでは、セントロメア機能に不十分であり得ることを示しているTyler-Smithら、1993。植物のセントロメアは、凝縮した染色体において容易に可視化され得るが、植物のセントロメアは、酵母または哺乳動物由来のセントロメアほど広範に特徴付けられていない。遺伝的特徴付けは、染色体フラグメントの分離分析、そして特に、遺伝子を標識された末端セントロメアフラグメントを有する三染色体株の分析による例えば、Koornneef、1983を参照のこと;図2。さらに、遺伝的にRichardsら、1991または物理的にAlfenitoら、1993;Maluszynskaら、1991のいずれかでセントロメアに連鎖している反復エレメントが、同定されている。しかし、これらの配列の機能的重要性を試験した例はない。Arabidopsisthalianaの細胞学は、セントロメア構造を反復配列と相関付けるために役立ってきた。蛍光色素であるDAPIは、中期染色体におけるセントロメアクロマチンドメインの可視化を可能にする。180bpのpAL1反復配列に基づいた蛍光インサイチュハイブリダイゼーションFISHプローブは、5つすべてのArabidopsis染色体のセントロメア付近で、DAPIのしるしと共存したMaluszynskaら、1991;Martinez-Zapaterら、1986。pAL1についての機能的役割が提案されているが、より近年の研究では、Arabidopsisthalianaと密接に関連した種において、セントロメア付近でこの配列を検出することを失敗したMaluszynskaら、1991。これらの結果は特に、厄介である。なぜなら、試験された種のうちの1つであるA.pumilaは、A.thalianaと別の近縁種との間の交配に由来する複二倍体であると考えられるからであるMaluszynskaら、1991;Priceら、1995。別の反復配列pAtT12は、第1染色体上のセントロメアの5cM以内および第5染色体の中心領域に遺伝的にマッピングされたがRichardsら、1991、他の染色体上におけるその存在は確立されていない。pAL1と同様に、セントロメア機能におけるpAtT12の役割は、未だ実証されていない。セントロメアkinetochoreは、セントロメアcentromericDNAと紡錘体装置との間の必須の連結を構成するという事実が理由で、これらの構造に関係したタンパク質は、近年、熱烈な研究の中心になっているBloom、1993;Earnshaw、1991。セントロメアの近傍に特異的に結合するヒト自己抗体は、セントロメア関連タンパク質CENP、Rattner、1991および微小管に基づくモーターのキネシンスーパーファミリーに属するこれらのタンパク質の少なくとも1つYen、1991のクローニングを容易にした。酵母のセントロメア結合タンパク質もまた、遺伝学的研究および生化学的研究の両方を通して同定されているBloom、1993;Lechnerら、1991。Arabidopsisthalianaのセントロメアは、三染色体株を使用してマッピングされた。ここでは、染色体フラグメントKoornneef、1983または染色体全体Searsら、1970の分離を使用して、それぞれ、5、12、17、および38cM以内に4つのセントロメアを位置付けた図2。これらの位置は、より近年の研究によって、洗練されなかった。なぜなら、この方法は、生存可能な三染色体株を得る困難性により制限されるからであるKoornneef、1983。これらの因子は、算出されたセントロメアの位置において有意な誤差を入れ、そして1cMが約200kBに対応するArabidopsisではKoornneef、1987;Hwangら、1991、この方法は、実際的な染色体ウォーキングストラテジーをなすために十分な正確さで、いずれのセントロメアをもマッピングしなかった。Arabidopsisゲノムのマッピングはまた、Haugeら、1991によって考察された。I.四分子分析四分子分析を使用して、遺伝マーカーとセントロメアとの間の組換え頻度を直接的に測定し得る図1。この方法は、個々の減数分裂の4つ全ての産物の分析を必要とし、そして多細胞真核生物の減数分裂産物は代表的に解離するので、この方法は多細胞真核生物に以前には適用されていなかった。quartet変異マーカーの同定が、高等真核生物系において初めて、四分子分析を可能とするPreussら、1994。このquartetqrt1変異は、Arabidopsisにおいて花粉母細胞の減数分裂の4つの産物を付着させたままにさせる。花を受粉させるために使用される場合、1つの四分子は、4つの種子の形成を生じ得、そしてこれらの種子に由来する植物が、遺伝的に分析され得る。無秩序の四分子例えば、S.cerevisiaeまたはArabidopsisにより産生される四分子を用いると、四分子分析を使用する遺伝マッピングは、2つのマーカーを同時にスコア付けすることを必要とするWhitehouse、1950。四分子は、マーカーが平行配列非組換えであるかまたは非平行配列組換えであるかに依存して、異なるクラスに分類される図1。非組換えメンバーのみを有する四分子は、両親型PDと呼ばれ;組換えメンバーのみを有する四分子は、非両親型NPDと呼ばれ;そして、2つの組換えメンバーおよび2つの非組換えメンバーを有する四分子をテトラ型TTと呼ばれるPerkins、1953。2つの遺伝子座が異なる染色体上に位置付けられ、従って独立して類別される場合、テトラ型交差産物対両親型または非両親型の組合せの非交差産物の頻度は、2つの遺伝子座の各々とその個々のセントロメアとの間の交差の頻度に依存する。テトラ型四分子は、当該マーカーとそのセントロメアとの間で交差が生じた場合にのみ生じる。従って、セントロメアに密接に連鎖した遺伝子を同定するためには、TT頻度が0に近づくまで、対様式でマーカーを試験する。マーカーとその個々のセントロメアとの間の遺伝的距離センチモルガン、cMは、[1/2TT]/100の関数によって規定されるMortimerら、1981。四分子分析によって得られた位置情報は、2つの点の間の物理的距離を表すので、セントロメアに近づくにつれて、組換え事象の機会は減少する。四分子分析を使用して、酵母および他の真菌ここでは、単回の減数分裂の産物が、収集され得るにおけるセントロメアを遺伝的に追跡した。出芽酵母であるSaccharomycescerevisiaeは、有糸分裂凝縮を欠き、従って細胞遺伝学Hegemannら、1993は、なお四分子分析に起因して、セントロメア機能の発見のための媒体として使用した。減数分裂に次いで、子嚢内に保持される4つの胞子が生成され、これらが遺伝子分離について直接アッセイされ得る。劣性のqrt1変異は、減数分裂の4つの産物を付着させたままにさせることによって、Arabidopsisにおいて四分子分析を実施することを可能にさせるPreussら、1994;およびSmythe、1994;両方とも、本明細書中で参考として援用される。以前に示されたように、各4分子において、遺伝子座は、2:2の比で分離する図6。個々の四分子は、微細なブラシを用いて花において操作され得1時間あたり20個の四分子の速度、そしてこのような交配のうちの30で、4つの生存可能な種子が獲得され得るPreussら、1994。高精度でセントロメアをマッピングすることは、高密度の遺伝マップを必要とし、そして現在のArabidopsisマップは多くの生存可能なマーカーを含んでいるが、各々をqrt1バックグラウンドに交配させることは大変な作業である。あるいは、数百のDNA多型が、2つの異なる株両方とも、qrt1変異を含むを交配することによって、同時に導入され得る。高密度RFLPマップChangら、1988およびPCRに基づいたマップKoniecznyら、1993;Bellら、1994が、Landsberg株とColimbia株の交配からArabidopsisにおいて作成されているArabidopsisのマップおよび遺伝マーカーデータは、http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsisおよびhttp://cbil.humgen.upenn.edu/atgc/sslp_info/sslp.htmlでインターネットから利用可能である。これらの株は、DNA配列レベルで1程度異なり、そして共直線性の遺伝マップを有するChangら、1988;Koornneef、1987。四分子分析でのセントロメアマッピングは、2つのマーカーこのうち1つは、セントロメアに連鎖されていなければならないの同時分析を必要とする図1。これらのセントロメア連鎖マーカーを同定するために、5つ全ての染色体にわたり分布したマーカーをスコア付けし、そして対様式で比較した。最初に、PCR分析によってスコア付けされ得る遺伝マーカーが試験されたKoniecznyら、1993;Bellら、1994。このようなマーカーは、現在、任意の遺伝子座をマッピングするために十分に高密度である。なぜなら、さらなるPCRで検出可能な多型が同定され、それらが分析に組み込まれるからである。さらに、図5に記載のように、セントロメアをマッピングするために有用な新たなCAPSおよびSSLPマーカーが、容易に同定され得る。Arabidopsis四分子セットの収集物が、四分子分析において使用するために本発明者らによって調製された。現在までに、1,000を超える単離された四分子種子からの子孫植物が発芽されており、そして各四分子の子孫植物から、葉組織が収集され、そして保存されている。個々の植物由来の葉組織を使用して、PCRに基づいたマーカー分析のためのDNAを作製した。植物はまた、自殖され、そしてそれらが産生した種子を収集した。これらの個々の種子のセットの各々から、実生を発芽させ得、そしてそれらの組織をゲノムDNAの作製のために使用した。複数の実生からプールされた組織は、制限酵素DNA断片長の多型RFLPの分析のためのサザンゲノムDNAブロットを作製するために有用である。四分子分析のために使用される有益な個体の種子ストックの例示的リストを、図4に提供する。II.マッピングストラテジー2つの細菌人工染色体BACライブラリーに関する以前のDNAフィンガープリント分析およびハイブリダイゼーション分析は、Arabidopsisゲノムのほぼ全ての単一コピー部分をカバーする物理的地図の組立てへと導いたMarraら、1999。しかし、Arabidopsisセントロメア付近の反復DNA180bp反復、レトロエレメント、および中頻度反復配列を含むの存在は、特定の染色体にセントロメアBACコンティグを固着させるanchor試みを複雑にしたMurataら、1997;Heslop-Harrisonら、1999;Brandesら、1997;Franzら、1998;Wrightら、1996;Konieczynyetら、1991;Pelissierら、1995;VoytasおよびAusubel、1988;Chyeら、1997;Tsayら、1993;Richardsら、1991;Simoensら、1988;Thompsonら、1996;Pelissierら、1996。本発明者らは、遺伝マッピングを使用して、特定のセントロメアにこれらの非固着コンティグを明らかに割り当て、ゲノム全体について情報的informativeな交差を有する48植物体において多型マーカーをスコア付けたCopenhaverら、1998。この様式において、いくつかのセントロメアコンティグを染色体腕実施例6を参照のことの物理的地図に関連付け、そしてセントロメア境界を規定するDNAマーカーの多くのセットを生成した。DNA配列分析は、第II染色体および第IV染色体のコンティグの構造を確証したLinら、1999。CEN2およびCEN4を、分析のために特に選択した。両方とも、それらの遠位端に3.5MbのrDNAアレイを有し、rDNAとセントロメアとの間にそれぞれ測定上3および2Mbの領域、ならびにその長腕上に16および13Mbの領域を有する構造的に類似した染色体上に存在するCopenhaverおよびPikaard、1996。第II染色体および第IV染色体の実質的に完全な、そして注釈をつけたannotated配列を使用して、ヌクレオチドレベルでセントロメアの分析を実施したhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide.html。遺伝的に規定されたセントロメア境界において配列組成を分析し、そして隣接したセントロメア周囲領域と比較した図12A~T。2つのセントロメアの分析は、配列パターンの比較および保存された配列エレメントの同定を容易にした。セントロメア配列が、180bp反復配列を保有することを見出した。これらの配列は、ゲノム中の他の箇所でほとんど反復を有さず、かつ全く長い配列を有さない、各セントロメアコンティグ図3、図12B、12Lのギャップ中に存在することが見出された。これらのギャップ付近のBACクローンは、180bp反復、5SrDNAまたは160bp反復を含む、コンティグ間のDNAのバルクにおそらく寄与する反復エレメントに対応する末端配列を有する図3。蛍光インサイチュハイブリダイゼーションは、これらの反復配列が、Arabidopsisセントロメアの豊富な成分であることを示したMurataら、1997;Heslop-Harrisonら、1999;Brandesら、1997。遺伝マッピングおよびパルスフィールドゲル電気泳動により、セントロメア領域内の測定上0.4~1.4Mbの間の長い配列内に多くの180bp反復が存在することが示されたRoundら、1997;配列分析によって、ギャップ付近に分散されたさらなるコピーが明らかとなった。本発明者らは、特に、ミニ染色体の構築のためにこのような180bpの反復の使用を意図する。第II染色体および第IV染色体の注釈をつけたannotated配列により、機能的セントロメアおよびその隣接領域の両方において、中頻度反復DNAに対して相同性を有する領域を同定した図12B~12Eおよび図12L~12O。CEN2を含む4.3Mbの配列決定された領域およびCEN4を含む2.8Mbの配列決定された領域において、レトロトランスポゾン相同性が、DNA配列の10より多くそれぞれ最大62および70を説明することを見出した図12C、12M。トランスポゾンまたは中頻度反復エレメントに対して類似性を有する配列は、類似のゾーンを占めることが見出されたが、それはさほど共通ではなかった第II染色体および第IV染色体について、それぞれ29および11の最大密度図12D~12Eおよび図12N~12O。最後に、DrosohilaおよびNeurosporaのセントロメアの場合Sunら、1997;Cambareniら、1998とは異なり、低複雑性のDNAマイクロサテライト、ホモポリマー域tractおよびAT富化等容変化isochoreを含むは、Arabidopsisのセントロメアにおいて富化されていることが見出されなかった。CEN2付近では、単純な反復配列密度は、遠位染色体腕上の密度に匹敵し、セントロメア内の配列の1.5、隣接領域内の3.2を占め、そして20~319bp長の範囲平均71bpである。CEN2でのミトコンドリアDNAの挿入を除いて、セントロメア周辺のDNAは、平均約64のATのゲノムに顕著に由来するいかなる大きな領域も含まなかった図12F、12PBevanら、1999。180bp反復とは異なり、CEN2およびCEN4付近の他のすべての反復エレメントは、隣接領域においてよりも、遺伝的に規定されたセントロメア内においてあまり豊富ではなかった。機能的セントロメアドメインの外側の高密度の反復エレメントは、それらが、セントロメア活性には不充分であり得ることを示唆する。従って、これらの反復配列において富化されたArabidopsisゲノムのセグメントを同定することは、セントロメア機能を提供する領域を正確に位置付けず;同様の状況は、他の高等真核生物のゲノムにおいて生じ得る。セントロメアに隣接する反復DNAは重要な役割を果たし得、核を生じるように作用するか、またはセントロメア構造を安定化させるために作用する変化されたクロマチン高次構造を形成する。あるいは、他の機構が、セントロメア付近の反復エレメントの蓄積を生じさせ得る。進化的なモデルは、組換えの低い領域における反復DNAの蓄積を予期したがCharlesworthら、1986;Carlesworthら、1994、多くのArabidopsisの反復エレメントは、セントロメアそれ自体においてよりも組換え的に活性なセントロメア周囲領域において、より豊富である。代わりに、レトロエレメントおよび他のトランスポゾンは、優先的に、セントロメアに隣接する領域内に挿入され得るか、またはより高い率で、ゲノムの休止から排除され得る。III.セントロメア組成物本発明の特定の局面は、植物セントロメアを含む単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関する。本発明の1つの実施形態では、植物セントロメアは、Arabidopsisthalianaのセントロメアである。本発明のさらなる実施形態では、A.thalianaの第2染色体セントロメアを含む核酸配列が提供される。Arabidopsisthalianaの第2染色体セントロメアの配列は、配列番号209および配列番号210の核酸配列によって例示される。図17に示されるように、配列番号209および配列番号210の核酸配列は、A.thalianaの第2染色体において一連の180bp反復に隣接する。このように、第2染色体セントロメアはさらに、配列番号209もしくは配列番号210に含まれる核酸配列、またはこれらの配列の両方から単離された配列に連鎖されたn個数の反復を含むとして規定され得る。本発明の特定の実施形態では、反復数nは、約2、4、8、15、25、40、70、100、200、400、600、800、1,000、1,500、2,000、4,000、6,000、8,000、10,000、30,000、50,000、または約100,000である。使用される実際の反復配列は変動し得る。使用され得る反復配列の代表的なサンプルを、図23A~23Dに提供し、そしてこれは、配列番号184~208に提供される核酸配列に含まれる。使用される反復の長さもまた変動し得、そして例えば、約10bp、20bp、40bp、60bp、80bp、100bp、120bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、もしくは約200bpの反復、またはそれより長い反復配列例えば、図23A~図23Dに列挙されるようなを含み得、そしてこれは、配列番号184~208に提供される核酸配列に含まれる。配列番号209および配列番号210の核酸配列の単離されたセグメントはまた、本発明での使用を意図され、これは、一連の反復に連鎖されていてもされていなくともよい。特に、配列番号209または配列番号210の核酸配列の約100、200、400、800、1,500、3,000、5,000、7,500、10,000、15,000、25,000、40,000、75,000、100,000、125,000、150,000、250,000、350,000、450,000、600,000、700,00、および約800,000bpの連続した核酸セグメントが、特に本発明の一部を形成する。本発明の特定の実施形態では、このような核酸配列は、n個数の反復配列に連鎖され得、ここでnは、例えば、2、4、8、15、25、40、70、100、200、400、600、800、1,000、1,500、2,000、4,000、6,000、8,000、10,000、50、000または約100,000である。反復配列は、例えば、図23A~図23Dに列挙される反復、および配列番号184~208によって提供される核酸配列中に含まれる反復の連続したヌクレオチドの、約10bp、20bp、40bp、60bp、80bp、100bp、120bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、もしくは約200bp、またはそれより長いセグメントを含み得る。本発明の別の実施形態において、A.thaliana第4染色体セントロメアを含む核酸配列が、提供される。Arabidopsisthaliana第4染色体セントロメアの配列は、配列番号211および配列番号212の核酸配列によって例示される。図18に示されるように、Arabidopsisの配列番号211および配列番号212の核酸配列は、一連の反復配列に隣接する。このように、第4染色体セントロメアはさらに、配列番号211もしくは配列番号212に含まれる核酸配列、または配列番号211および配列番号212の両方に由来する配列に連結されている、n数の反復を含むとして規定され得る。本発明の特定の実施形態において、反復nの数は、およそ2、4、8、15、25、40、70、100、200、400、600、800、1,000、1,500、2,000、4,000、6,000、8,000、10,000、50,000もしくは約100,000である。使用される実際の反復配列は、変動し得る。使用され得る反復配列の代表的なサンプルは、図23A~23Dに示されており、ここでこれらの配列は、配列番号184~208に示される核酸配列に含まれている。使用される反復の長さもまた変動し得、そして例えば、約10bp、20bp、40bp、60bp、80bp、100bp、120bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、または約200bp以上の反復を含み得る。配列番号211および配列番号212の核酸配列の単離されたセグメントもまた、一連の反復配列に連結されているか、または連結されていないかのいずれかで、本発明で使用されることが意図される。詳細には、配列番号211または配列番号212の核酸配列の約100、200、400、800、1,500、3,000、5,000、7,500、10,000、15,000、25,000、40,000、75,000、100,000、125,000、150,000、250,000、350,000、450,000、600,000、700,000bpの連続する核酸セグメントは、本発明の一部を特異的に形成する。本発明の特定の実施形態において、このような核酸配列は、nの数の反復配列例えば、ここでnは、2、4、8、15、25、40、70、100、200、400、600、800、1,000、1,500、2,000、4,000、6,000、8,000、10,000、50,000もしくは約100,000であるに連結され得る。この反復配列は、例えば、配列番号184~208の配列の連続するヌクレオチドの約10bp、20bp、40bp、60bp、80bp、100bp、120bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、または約200bp以上のセグメントを含み得る。また、Arabidopsisポリユビキチン11遺伝子由来の調節領域そのプロモーターおよびターミネーター配列を含むが、本発明によって提供される。これらの調節領域の核酸配列は、配列番号180および配列番号181の核酸配列によって例示される。また、配列番号180および配列番号181の核酸配列の約10、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200、300、500、750、1,000、1,500および約2,000ヌクレオチドからの連続するストレッチstretchが、このような配列に含まれる。本発明の特定の実施形態において、Arabidopsisポリユビキチン11プロモーター配列を、コーディング配列の5’端に作動可能に連結することが所望され得る。Arabidopsisポリユビキチン11ターミネーター配列を、コーディング配列の3’端に作動可能に連結することもまた所望され得る。なおさらに、Arabidopsis40Sリボソームタンパク質S16遺伝子由来の調節領域そのプロモーターおよびターミネーターを含むが、本発明によって提供される。これらの調節領域の核酸配列は、配列番号182および配列番号183の核酸配列によって例示される。配列番号182および配列番号183の核酸配列の約10、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200、300、500、750、1,000、1,500および約2,000ヌクレオチドからの連続するストレッチもまた、このような配列に含まれる。本発明の特定の実施形態において、Arabidopsis40Sリボソームタンパク質S16遺伝子配列を、コーディング配列の5’端に作動可能に連結することが所望され得る。Arabidopsis40Sリボソームタンパク質S16遺伝子配列を、コーディング配列の3’端に作動可能に連結することもまた所望され得る。なおさらに、遺伝子配列および関連する調節配列、ならびにセントロメア領域由来の他の機能を有する配列が、本発明によって提供される。詳細には、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号21、ならびにこれらの配列の約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、250、300、350、400、500、550、590、1,000および約1,500の連続するヌクレオチドこの配列の全長まで、および全長を含むによて示されるセントロメア配列を含む。セントロメア含有核酸配列は、組換えミニ染色体の作製および使用のための他の配列とともに提供され得る。具体的に本発明の範囲内にあるこのような核酸配列は、本明細書とともに提供される配列表に列挙される核酸配列を含む。本発明は、総ゲノムDNAまたは他の核酸に対して富化され、かつ宿主細胞中に取り込まれる場合に組換え分子にセントロメア活性を付与し得る、A.thaliana細胞から単離可能な核酸セグメントに関する。本明細書中で使用される場合、核酸セグメントは、特定の種の総ゲノム核酸から精製された、核酸分子をいう。従って、セントロメア機能を付与する核酸セグメントは、セントロメア配列を含み、なおA.thalianaの総ゲノム核酸から単離されているか、またはそれを含まないように精製されている、核酸セグメントをいう。核酸セグメントおよびこのようなセグメントのより小さなフラグメント、ならびにまた組換えベクター例えば、BAC、YAC、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含むが、用語核酸セグメント内に含まれる。同様に、単離されたかまたは精製されたセトロメア配列を含む核酸セグメントは、セントロメア配列を含む核酸セグメント、および特定の局面では、他の天然に存在する配列から実質的に単離された調節配列、すなわち他の核酸配列をいう。この局面において、用語遺伝子は、機能的な核酸セグメント、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位をいうために簡素化のために使用される。当業者に理解されるように、この機能的な用語は、両方のゲノム配列、cDNA配列、およびタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドを発現し得るうか、または発現するように適合され得る、より小さな操作された遺伝子セグメントを含む。他の供給源から実質的に単離されたは、目的の配列この場合は、セントロメアの配列が、本明細書中に提供されるゲノム核酸クローンに含まれることを意味する。もちろん、これは、本来単離されたような核酸セグメントをいい、そして後にヒトの手によってセグメントに付加された遺伝子またはコーディング領域を除かない。特定の実施形態において、本発明は、本発明のセントロメア由来の連続する配列を含むセントロメア機能配列をコードする核酸配列を取り込んでいる、単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関する。特定の他の実施形態において、本発明は、A.thalianaセントロメア由来の連続する核酸配列を、それらの配列内に含む、単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関する。また、セントロメア機能活性を示す核酸セグメントが、最も好ましい。本発明の核酸セグメントは、配列自体の長さにかかわらず、他の核酸配列例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコーディングセグメントなどと組み合わされ得、その結果、それらの全体の長さは、かなり変動し得る。従って、ほぼ任意の長さの核酸フラグメントが用いられ得、ここで全長は、好ましくは、調製の容易さおよび意図された組換えDNAプロトコールでの使用によって制限されることが、意図される。iプライマーおよびプローブ組換え構築物ミニ染色体を含むの構築におけるそれらの使用に加えて、本明細書中に開示される核酸配列は、種々の他の使用を見出し得る。例えば、本明細書中に開示されるセントロメア配列は、核酸ハイブリダイゼーションの実施形態において、プローブまたはプライマーとしての使用を見出し得る。このように、本発明のセントロメア配列例えば、配列番号1~212、ならびに特に配列番号1~21および配列番号180~212によって示される配列と同じ配列を有する、少なくとも14ヌクレオチド長の連続する配列からなる配列領域、またはそれらのセントロメア配列の14ヌクレオチド長のDNAセグメントに相補的である配列領域を含む核酸セグメントが、特定の有用性を見出す。配列番号1~212に示される配列の全ての中間の長さを含み、ならびにそれらの配列の全長配列まで、および全長配列を含む、より長い連続する同一配列または相補配列例えば、約20、30、40、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000bpなどの配列もまた、特定の実施形態において有用である。本明細書中に詳細に記載されるように、このような核酸プローブがセントロメア配列に特異的にハイブリダイズする能力は、他の植物または動物由来の同様な部分的に相補的な配列の存在の検出において、このプローブの使用を可能にする。しかし、他の使用変異種プライマー、または他の遺伝構築物の調製における使用のためのプライマーの調製のためのセントロメアの使用を含むが、意図される。本発明のセントロメア配列配列番号1~212に示される配列を含むに同一であるか、またはそれらの配列に相補的である、8、9、10、11、12、13、14、15,16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100または101~200のヌクレオチド程度さえの連続するヌクレオチドのストレッチからなる配列領域を有する核酸フラグメントが、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。より小さなフラグメントは、一般的に、ハイブリダイゼーション実施形態における使用を見出し、ここで連続する相補領域の長さは、変動し得る例えば、約10~14の間、および約100または200ヌクレオチドが、より大きな連続する相補ストレッチもまた、検出を所望する相補配列の長さに従って、使用され得る。もちろん、フラグメントもまた、他の技術によって例えば、機械的剪断によって、または制限酵素での消化によってなど入手され得る。小さな核酸セグメントまたはフラグメントは、例えば、自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して一般に実施されるように、化学手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸再生成技術の適用例えば、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号のPCRTM技術本明細書中に参考として各々援用されるによって、組換え産生のために組換えベクター中に選択された配列を導入することによって、ならびに分子生物学の当業者に一般に公知の他の組換えDNA技術によって、得られ得る。従って、本発明のセントロメア配列は、DNAフラグメントの相補ストレッチと二重鎖分子を選択的に形成するそれらの能力のために使用され得る。意図される適用に依存して、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度を達成するために、種々の条件のハイブリダイゼーションを用いることが所望される。高い選択性を必要とする適用に関して、代表的には、ハイブリッドを形成する比較的にストリンジェントな条件を用いることが所望される。例えば、比較的に低い塩および/または高い温度の条件を選択する例えば、約50°C~約70度の温度での0.02M~約0.15MNaClが提供される。このような選択条件は、たとえあったとしても、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチをほとんど許容せず、そしてセントロメアDNAセグメントを単離するために特に適切である。これらの条件および以下の条件で本発明によって提供される核酸配列にハイブリダイズする核酸配列配列番号1~212により示される配列を含むは、本発明の一部を形成する。ハイブリダイゼーションによる核酸セグメントの検出は、当業者に周知であり、そして米国特許第4,965,188号および同第5,176,995号その全体において、本明細書中に参考として詳細に援用されるの教示は、ハイブリダイゼーション分析の方法の例示である。教示例えば、Maloyら、1991;Segal,1976;Prokop,1991;およびKuby,1994のテキストに見出される教示は、特に関連する。もちろん、いくつかの適用については、例えば、基礎となる鋳型にハイブリダイズする変異プライマー鎖を用いる変異体の調製を所望する場合、または関連する種由来のセントロメア機能付与配列、機能的等価体などを単離しようとする場合、より低いストリンジェントハイブリダイゼーション条件が、代表的には、ヘテロ二重鎖の形成を可能にするために必要とされる。これらの状況において、約20°C~約55°Cの範囲の温度で、条件例えば、約0.15M~約0.9Mの塩を用いることが所望され得る。従って、交差ハイブリダイズ種が、コントロールハイブリダイゼーションに関して陽性のハイブリダイズシグナルとして容易に同定される。任意の場合、温度の増大または塩の減少と同じ様式でハイブリッド二重鎖を脱安定化するように作用する、漸増量のホルムアミドの添加によって条件がよりストリンジェントになり得ることが、一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件が容易に操作され得、それによって一般に、所望の結果に依存して、方法が選択される。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションを決定するために、適切な手段例えば、標識と組み合わせて、本発明の核酸配列を用いることは、利点である。検出可能なシグナルを生じ得る、広範な種々の適切なインジケーターindicator手段蛍光、放射性、酵素または他のリガンド例えば、アビジン/ビオチンを含むは、当該分野において公知である。好ましい実施形態において、放射性試薬または他の環境的に所望されない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タグ例えば、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼを用いるが所望されるようである。酵素タグの場合には、相補核酸含有サンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを同定するために、ヒトの目にみえるかまたは分光光度的な手段を提供するために用いられ得る、比色定量インジケーター基質が、公知である。一般に、本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションプローブは、溶液でのハイブリダイゼーションにおける試薬、ならびに固相を用いる実施形態における試薬の両方として有用であることが意図される。固相に関する実施形態において、試験DNAまたはRNAが、選択されたマトリクスまたは表面に吸着されるか、あるいはそうでなければ添加される。次いで、この固定された一本鎖核酸は、所望の条件下で選択されたプローブとの特異的なハイブリダイゼーションに供される。この選択された条件は、必要とされる特定の基準例えば、GC含量、標的核酸の型、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズなどに依存するに基づく特定の環境に依存する。非特異的に結合したプローブ分子を除去するためのハイブリダイズした表面の洗浄後に、特異的なハイブリダイゼーションが、標識によって検出されるか、または定量さえもされる。ii大きな核酸セグメント各セントロメアに隣接するマーカーを使用して図3を参照のこと、隣接マーカー、およびこれらのマーカーの間にコードされるセントロメアの両方を含む連続するDNAフラグメントを精製することが可能であり得る。これを実行するために、染色体全体のサイズまでの非常に大きなDNAフラグメントが、例えば、Copenhaverら1995に記載される方法を使用して、アガロースにArabidopsis組織を包埋することによって調製される。DNAのこれらの大きな片は、任意の制限酵素を用いてアガロース中で消化され得る。インタクトなセントロメアを単離するために特に有用である制限酵素としては、非常に大きなDNAフラグメントを生じる酵素が挙げられる。このような制限酵素としては、6塩基対よりも大きな特異性を有する酵素例えば、AscI、BaeI、BbvCI、FseI、NotI、PacI、PmeI、PpuMI、RsrII、SanDI、SapI、SexAI、SfiI、SgfI、SgrAI、SbfI、SrfI、Sse8387I、Sse8647I、Swa、UbaDI、およびUbaEIなど、またはArabidopsisゲノムにおいて低い頻度で切断し、そしてセントロメア領域内に特異的である任意の他の酵素が挙げられる。あるいは、より多い頻度で切断する制限酵素による部分消化が、使用され得る。あるいは、セントロメアのいくらか、または全てにわたる大きなDNAフラグメントが、RecA補助制限エンドヌクレアーゼRARE切断Ferrin,1991を使用して産生され得る。これを実行するために、染色体全体のサイズまでの非常に大きなDNAフラグメントは、例えば、Copenhaverら1995により記載される方法を使用して、アガロースゲル中でArabidopsis組織を包埋することによって調製される。精製されるDNAの領域に隣接する部位に相同な配列を有する一本鎖DNAオリゴマーが、リコンビナーゼ酵素RecAを使用して、アガロースに包埋されたDNAと3本鎖複合体を形成するように作製される。次いで、DNAは、部位特異的メチラーゼ例えば、AluIメチラーゼ、BamHIメチラーゼ、damメチラーゼ、EcoRIメチラーゼ、HaeIIIメチラーゼ、HhaIメチラーゼ、HpaIIメチラーゼ、またはMspメチラーゼなどで処理される。メチラーゼは、RecA/DNAオリゴマー複合体によって保護される3重鎖領域内の部位を除く、その認識配列により特定される全ての部位を改変する。次いで、RecA/DNAオリゴマー複合体は、アガロースに包埋されたDNAから除去され、次いでこのDNAは、使用されるメチラーゼに対応する制限酵素例えば、EcoRIメチラーゼが使用される場合には、EcoRI制限エンドヌクレアーゼが切断を行うために使用されるで切断される。改変から保護された部位のみが、制限エンドヌクレアーゼによる切断に供される。従って、部位特異的メチラーゼ/制限エンドヌクレアーゼの対の認識配列を含むセントロメア領域に隣接する標的を選択することによって、RAREは、染色体の残りから領域全体を切断するために使用され得る。この方法は、それに隣接する配列情報を使用することによって未知の組成のDNAフラグメントを単離するために使用されるということに留意することは重要である。従って、この方法は、染色体の物理的マップにおける任意のギャップ内に含まれるDNAを単離するために使用される。次いで、この方法によって単離されたDNAは、配列決定され得る。次いで、制限酵素での消化によってか、またはRARE切断によって生じる大きなDNAフラグメントは、パルスフィールドpulsed-fieldゲル電気泳動PFGESchwartzら、1982を使用して、サイズにより分離される。詳細には、Contour-clampedHomogeneousElectricFieldCHEF電気泳動種々のPFGEが、10Mb程度の大きさのDNA分子を分離するために使用され得るChuら、1985。次いで、CHEFゲル上で分離される大きなDNAフラグメントは、両方のセントロメア隣接マーカーおよび従ってセントロメアを含むフラグメントのサイズを同定し、そして測定する、標準的なサザンハイブリダイゼーション技術を使用して分析され得る。既知のサイズの標準物との比較により、セントロメア含有フラグメントのサイズを決定した後に、セントロメアフラグメントを含むゲルからの領域は、二連のゲルから切断され得る。次いで、このセントロメアDNAは、分析され、配列決定され、そして以下に記載されるような種々の適用ミニ染色体の構築を含むにおいて使用される。以下に詳細に示されるように、ミニ染色体は、ゲルスライス内でのDNA連結を可能にする標準的な技術を使用してアガロースゲルから切り出されたセントロメアフラグメントに、テロメラーゼおよび選択マーカーを付着させることによって構築され得る。次いで、植物細胞が、本明細書中以下に記載される技術を使用して、ハイブリッドDNA分子を用いて形質転換され得る。IV.セントロメア配列を含む組換え構築物本発明の開示を鑑み、本明細書中に記載される組換えDNA構築物を構築することは、当業者に可能である。有用な構築方法は、当業者に周知である例えば、Maniatisら、1982を参照のこと。構築されるように、ミニ染色体は、好ましくは、植物において機能的な自立複製配列ARS、植物において機能的なセントロメア、および植物において機能的なテロメアを含む。ミニ染色体ベクターの構築に使用され得る植物セントロメアに加えての基本的なエレメントは、当業者に公知である。例えば、使用され得るテロメア配列の1つの型は、総計して数kb例えば、3~4kbの長さになる、モノマー反復CCCTAAAのヘッドからテイルheadtotailのアレイからなるArabidopsisテロメアである。他の生物のテロメアと同様に、Arabidopsisのテロメアは、長さが変動し、そして厳密な長さの要件を有さないようである。クローニングされたテロメアの例は、GenBank登録番号M20158RichardsおよびAusubel,1998に見出され得る。酵母テロメア配列もまた、記載されている例えば、Louis,1994;Genbank登録番号S70807に記載されている。さらに、Arabidopsisthaliana由来の高等真核生物テロメアを単離するための方法は、RichardsおよびAusubel1988により記載されている。高等真核生物は、複製起点として使用される特定の配列を保有しないが、代わりに染色体に沿って分布した無作為の部位からそれらのDNAを複製すると一般に考えられている。Arabidopsisにおいて、細胞は、70kb毎におよそ1回で複製起点を形成すると考えられているVan’tHof,1978。従って、高等真核生物は、各染色体上に潜在的に無作為の位置で複製起点を有しているので、特定の起点配列を記載することは不可能であるが、十分なサイズの植物DNAのセグメントは、細胞によって認識され、そして起点は構築物上に作製されることが一般に推定される。例えば、70kbよりも大きなArabidopsisゲノムDNAの任意の片は、ARSを含むと予測される。組換えベクター上にDNAのこのようなセグメントを含ませることによって、ARS機能が、ベクターに提供され得る。さらに、多くのS.cerevisiae自立複製配列が、配列決定されており、そしてARS機能を満たすために使用され得る。1つの例は、Saccharomycescerevisiae自立複製配列ARS131AGenBank番号L25319である。多くの複製起点もまた、配列決定されており、そしてE.coliからクローニングされており、そして本発明に使用され得る例えば、ColE1複製起点OhmoriおよびTomizawa,1979;GenBank番号V00270。使用され得る1つのAgrobacterium起点は、RiA4である。Agrobacteriumrhizogenes株A4のプラスミド中の複製起点の局在は、Jouaninら1985により記載された。i組換え構築物の調製における考慮基本的エレメントに加えて、陽性または陰性の選択植物マーカー例えば、抗生物質または除草剤耐性遺伝子、および外来DNAの挿入のためのクローニング部位が、含まれ得る。さらに、可視的マーカー例えば、緑色蛍光タンパク質もまた、所望され得る。E.coli中でベクターを増殖させるために、テロメア間にスタッファーstufferフラグメントを付加することによって、線状分子を環状に変換することが必要である。E.coliプラスミド複製起点および選択マーカーを含ませることもまた、好ましい。複製、および植物細胞への移入を改善するために、Agrobacterium配列を含ませることもまた、所望され得る。本発明者らは、図7A~7Hに多数の例示的なミニ染色体構築物を記載したが、多くの変化が、これらの構築物に存在するエレメントの順番および型においてなされ得、そして本発明の範囲において機能的なミニ染色体をなお得ることは、当業者に明らかである。酵母において複製する人工植物染色体もまた、この系により与えられる大きな挿入能および反復DNA挿入物の安定性を利用して構築され得るBurkeら、1987を参照のこと。この場合、酵母ARSおよびCEN配列は、ベクターに付加され得る。人工染色体は、テロメアを分離するスタッファーフラグメントを使用して、環状分子として酵母で維持される。いかなる任意の供給源由来のDNAフラグメントも、精製され得、そして任意の適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位でミニ染色体中に挿入され得る。このDNAセグメントは、通常、このフラグメントによりコードされるタンパク質の発現のために、種々の調節シグナルを含む。あるいは、ミニ染色体中に存在する調節シグナルが、利用され得る。挿入を達成するために必要とされる技術および手順は、当該分野において周知であるManiatisら、1982を参照のこと。代表的には、これは、環状プラスミドまたは線状DNAフラグメントを制限エンドヌクレアーゼの存在下でインキュベートして、その結果、制限エンドヌクレアーゼがDNA分子を切断することによって達成される。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖の内部ホスホジエステル結合を優先的に破壊する。それらは、周囲のヌクレオチド配列にかかわらず、比較的に非特異的に、ポリヌクレオチド結合を切断し得る。しかし、特定のヌクレオチド配列のみを切断するエンドヌクレアーゼが、制限酵素と呼ばれる。制限エンドヌクレアーゼは、一般的に、特定の認識部位でDNA分子を内部切断し、これにより、多くの場合しかし、全ての場合ではないにおいて、所定の点の周囲で2倍対称性を示す認識配列内で破壊を生じる。多くのこれらの酵素は、スタッガードstaggered切断を生成し、突出している一本鎖5’または3’末端を有するDNAフラグメントを生じる。このような端は、粘着性stickyまたは粘着性cohesiveといわれる。なぜなら、それらは、相補3’または5’端に水素結合するからである。結果として、酵素例えば、EcoRIにより生じる任意のDNAフラグメントの端は、その酵素により生じる任意の他のフラグメントとアニールし得る。これは、例えば、外来遺伝子のプラスミドへのスプライシングを適切に可能にする。本発明で特に有用であり得るいくつかの制限エンドヌクレアーゼとしては、HindIII、PstI、EcoRI、およびBamHIが挙げられる。いくつかのエンドヌクレアーゼは、平滑端を有する、すなわち任意の突出している一本鎖を欠損するフラグメントを作製する。平滑端を作製する別の様式は、突出を残すがポリメラーゼ例えば、クレノーでこの突出を埋めて、それによって平滑端を生じる、制限酵素を使用することである。DNAが同じ位置で両方の鎖にわたって切断する制限酵素を用いて切断された場合に、平滑端の連結が、このフラグメントを直接的に一緒に連結するために使用され得る。この技術の利点は、端の任意の対が、配列にかかわらず一緒に連結され得るということである。末端ヌクレオチドを優先的に破壊するヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼといわれる。例えば、小さな欠失が、DNAの各3’端から始まり、そして3’~5’の方向で一本鎖を除去して、各端で一本鎖フラグメントを有するDNA分子の集団いくつかは、末端ヌクレオチドを含むを生成するエキソヌクレアーゼを用いる処理によって、任意のDNA分子において生成され得る。同様に、5’端からDNAを消化するエキソヌクレアーゼ、または両方の鎖からヌクレオチドを除去する酵素が、しばしば、使用されてい得る。本発明に特に有用であり得る、いくつかのエキソヌクレアーゼとしては、Bal31、SI、およびExoIIIが挙げられる。これらの核酸分解反応は、インキュベーション時間、温度、および欠失を作製するために必要とされる酵素濃度を変動させることによって制御され得る。ホスファターゼおよびキナーゼはまた、どのフラグメントが連結され得る端を有するかを制御するために使用され得る。有用なホスファターゼの例としては、エビアルカリホスファターゼ、および仔ウシ腸アルカリホスファターゼが挙げられる。有用なキナーゼの例は、T4ポリヌクレオチドキナーゼである。一旦、供給源DNA配列およびベクター配列が適切な末端を生じるように切断され、改変されると、これらは、2つのDNA分子のライゲーションを媒介し得る酵素とともにインキュベートされる。この目的のために特に有用な酵素には、T4リガーゼ、E.coliリガーゼ、または他の類似の酵素が挙げられる。これらの酵素の作用は、直鎖状DNAのシーリングを生じ、所望のフラグメントを含むより大きなDNA分子を産生する例えば、米国特許第4,237,224号;同第4,264,731号;同第4,273,875号;同第4,322,499号および同第4,336,336号を参照のこと。これらは、本明細書中において参考として具体的に引用される。直鎖状のプラスミドの終端および挿入されるDNAフラグメントの終端が、ライゲーション反応が成功するために、相補的であるかまたは平滑末端でなければならないことが理解される。適切な相補性は、適切な制限エンドヌクレアーゼを選択することによって達成され得るすなわち、フラグメントが同じ制限エンドヌクレアーゼによって産生されるか、またはプラスミドを直線化するために使用されるのと同じ突出overhangを生成する制限エンドヌクレアーゼによって産生される場合、両方の分子の終端は相補的である。以前に議論したように、本発明の1つの実施形態において、本発明に使用される少なくとも2つのクラスのベクターが、外来オリゴヌクレオチドフラグメントを1つの方向のみで受容するように適合される。次いで、DNAセグメントをベクターに結合した後に、得られたハイブリッドDNAを、大きな集団のクローンまたはライブラリーから選択し得る。DNA配列の分子クローニングに有用な方法には、高分子量のゲノムDNAの供給源から、独立して複製可能なベクターDNA分子へフラグメント化された、DNAセグメントのインビトロ結合を含む。クローニングベクターには、プラスミドDNACohenら、1973を参照のこと、ファージDNAThomasら、1974を参照のこと、SV40DNANussbaumら、1976を参照のこと、酵母DNA、E.coliDNA、および最も重要に植物DNAが挙げられ得る。形質転換すなわち、異種DNA配列を宿主細胞に挿入し、これによって宿主が挿入された配列の効率的な発現が可能になるを行うのに有用であり得る種々のプロセスが公知である。ii調節エレメント本発明の1つの実施形態において、構築物は、植物プロモーター、例えば、CaMV35SプロモーターOdellら、1985、またはCaMV19Sのような他のものLawtonら、1987、nosEbertら、1987、AdhWalkerら、1987、ショ糖シンターゼYangおよびRussell、1990、a-チューブリン、アクチンWangら、1992、cabSullivanら、1989、PEPCaseHudspethおよびGrula、1989あるいはR遺伝子複合体と関連するものChandlerら、1989を含み得る。根細胞プロモーターのような組織特異的なプロモーターConklingら、1990および組織特異的なエンハンサーFrommら、1989はまた、有用であると意図され、ABA誘導性プロモーターおよびトルゴール誘導性プロモーターのような誘導性プロモーターも同様である。本発明の特定の実施形態において、Lat52プロモーターが使用され得るTwellら、1991。特に有用な組織特異的プロモーターは、SCARECROWScr根特異的プロモーターDiLaurenzioら、1996である。転写開始部位とコード配列の開始との間のDNA配列すなわち、非翻訳リーダー配列は、遺伝子発現に影響し得る。従って、特定のリーダー配列を使用することも望み得る。機能性遺伝子が、新規なプロモーターまたはエンハンサーなど、あるいはおそらく相同なまたは組織特異的な例えば、根特異的、襟/鞘特異的、輪生体特異的、茎特異的、earshank特異的、または仁莢、穀粒kernel特異的または葉特異的プロモーターエレメントまたは制御エレメントの制御下で導入され得る。本発明の特定の実施形態において、機能性遺伝子は、プロモーターに対してアンチセンス配向であり得る。iiターミネーター転写を終結させ、そしてコード配列により産生されるmRNAのポリアデニル化を可能にするシグナルとして作用する3’末端DNA配列に機能性遺伝子を連結することも望ましくあり得る。このようなターミネーターは、機能性遺伝子のネイティブなターミネーターであり得るか、あるいは、異種の3’末端であり得る。本発明とともに使用され得るターミネーターの例は、Agrobacteriumtumefaciensのノパリンシンターゼ遺伝子由来のターミネーターnos3’末端Bevanら、1983、Agrobacteriumtumefaciensのオクトピンシンターゼ遺伝子由来のT7転写に対するターミネーター、およびジャガイモまたはトマト由来のプロテアーゼインヒビターIまたはIIの3’末端である。iiiマーカー遺伝子本発明に従って1つ以上のマーカー遺伝子を使用することが望ましくあり得る。このようなマーカーは、原核生物系、下等真核生物系または高等真核生物系における使用に適合され得るか、または前出のクラスの生物の任意の組み合わせにおける使用に可能であり得る。選択可能マーカータンパク質またはスクリーニングマーカータンパク質を使用することによって、形質転換体を同定する能力が提供または向上され得る。マーカー遺伝子は、マーカータンパク質を発現する細胞に別の表現形を与え、従って、このような形質転換された細胞が、マーカーを有さない細胞から区別され得る遺伝子である。このような遺伝子は、マーカーが化学的手段すなわち、選択的な試薬例えば、除草剤、抗生物質などの使用によって選択され得る特性を与えるか否か、あるいは単純に、観察または試験すなわち、スクリーニング例えば、緑色蛍光タンパク質によって同定され得る特性であるか否かに依存して、選択可能マーカーまたはスクリーニングマーカーのいずれかをコードし得る。もちろん、適切なマーカータンパク質の多くの例が当該分野で公知であり、本発明の実施において使用され得る。形質転換された細胞を同定または選択する手段としてその分泌が検出され得る分泌可能マーカーをコードする遺伝子もまた、用語選択可能マーカーまたはスクリーニングマーカーに含まれる。例としては、抗体相互作用によって同定され得る分泌可能抗原であるマーカー、または触媒活性によって検出され得る分泌可能酵素であるマーカーが挙げられる。分泌可能タンパク質は、多くのクラスに分類され、これには、例えば、ELISAによって検出可能な小さな拡散性のタンパク質;細胞外溶液中で検出可能な小さな活性酵素例えば、α-アミラーゼ、β-ラクタマーゼ、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ;および細胞壁に挿入または捕捉されるタンパク質例えば、エクステンシンまたはタバコPR-Sの発現ユニットに見出されるようなリーダー配列を含むタンパク質が挙げられる。選択可能分泌可能マーカーに関して、細胞壁に隔離されるタンパク質をコードし、そのタンパク質が独特のエピトープを含む遺伝子の使用は、特に有利であると考えられる。このような分泌された抗原マーカーは、植物組織における低いバックグラウンドを提供するエピトープ配列、効率的な発現および原形質膜を横切る標的化を与えるプロモーター-リーダー配列を理想的に使用し、そして細胞壁に結合され、依然として抗体にアクセス可能であるタンパク質を産生する。独特のエピトープを含むように改変される通常分泌される壁タンパク質は、このような要件全てを満たす。1.選択可能マーカー多くの選択可能マーカー遺伝子は、本発明に従って使用され得、これには、neoPotrykusら、1985カナマイシン耐性を提供し、カナマイシン、G418、パロモマイシンなどを使用するために選択され得る;barbialaphosまたはホスフィノスリシン耐性を与える;変異EPSPシンターゼタンパク質Hincheeら、1988グリフォセート耐性を与える;ブロモキシニルに対する耐性を与えるKlebsiellaozaenae由来のbxnのようなニトリラーゼStalkerら、1988;変異アセトラクテートシンターゼALSイミダゾリノン、スルホニルウレアまたは他のALS阻害化学物質に対する耐性を与える欧州特許出願154,204、1985;メトトレキセート耐性DHFRThilletら、1988、dalaponデハロゲナーゼ除草剤dalaponに対する耐性を与える;または変異アントラニレートシンターゼ5-メチルトリプトファンに対する耐性を与えるが挙げられるが、これらには限定されない。変異EPSPシンターゼが使用される場合、適切な葉緑体通過transitペプチド、CTP米国特許第5,188,642号またはOTP米国特許第5,633,448号の組込みおよび改変トウモロコシEPSPSPCT出願WO97/04103の使用によるさらなる利点が理解され得る。形質転換体を選択するための系において使用され得る選択可能マーカーの例示的な実施形態は、Streptomyceshygroscopicus由来のbar遺伝子またはStreptomycesviridochromogenes由来のpat遺伝子のような酵素ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする選択可能マーカーである。酵素ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼPATは、除草剤bialaphos、ホスフィノスリシンPPT中の活性成分を不活性化する。PPTは、グルタミンシンターゼを阻害Murakamiら、1986;Twellら、1989し、素早いアンモニアの蓄積そして細胞死を引き起こす。選択可能マーカー遺伝子として、プロトプラスト由来の除草剤耐性稲の産生のためのbarの使用は、Rathoreら、1993によって記載された。多数のS.cerevisiaeマーカーもまた公知であり、本発明とともに使用され得、例えば、HIS4遺伝子Donahueら、1982;GenBank番号J01331が挙げられる。クローン化され、配列決定され、本発明に従って使用され得るE.coliマーカー遺伝子の例は、Ap遺伝子であり、これは、ampacillinのようなβラクタム抗生物質に対する耐性を与えるGenBank受託番号U66885のヌクレオチド4618~5478。2.スクリーニングマーカー使用され得るスクリーニングマーカーには、β-グルクロニダーゼGUSまたはuidA遺伝子種々の色素形成基質が公知の酵素をコードする;R座遺伝子植物組織においてアントシアニン色素赤色の産生を調節する産物をコードするDellaportaら、1988;β-ラクタマーゼ遺伝子Sutcliffe、1978種々の色素形成基質が公知である酵素例えば、PADAC、色素形成セファロスポリンをコードする;xylE遺伝子Zukowskyら、1983色素形成カテコールを変換し得るカテコールジオキシゲナーゼをコードする;α-アミラーゼ遺伝子Ikutaら、1990;チロシナーゼ遺伝子Katzら、1983チロシンをDOPAおよびドパキノンに酸化し得る酵素をコードし、次いで、これは濃縮して容易に検出可能な化合物メラニンを形成する;β-ガラクトシダーゼ遺伝子色素形成基質が存在する酵素をコードする;ルシフェラーゼlux遺伝子Owら、1986バイオルミネセンス検出を可能にする;エクオリン遺伝子Prasherら、1985カルシウム感受性バイオルミネセンス検出に使用され得る;または緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子Sheenら、1995;Haseloffら、1997;Reichelら、1996;Tianら、1997;WO97/41228が挙げられる。トウモロコシR遺伝子複合体由来の遺伝子もまた、スクリーニング可能なマーカーとして使用され得る。トウモロコシのR遺伝子複合体は、大部分の種子および植物の組織におけるアントシアニン色素の産生を調節するように作用するタンパク質をコードする。トウモロコシの株は、1つまたは4つもの多さのR対立遺伝子を有し得、これは、発生および組織特異的方法で色素沈着を調節するために合わさる。従って、このような細胞に導入されるR遺伝子は、赤色色素の発現を引き起こし、安定に組み込まれる場合、赤色セクターとして視覚的に得点付され得る。トウモロコシ株が、アントシアニン生合成経路における酵素中間体C2、A1、A2、BzlおよびBz2をコードする遺伝子に対する優性な対立遺伝子を保有するが、R座に劣性の対立遺伝子を保有する場合、Rでのその株由来の任意の細胞の形質転換は、赤色色素形成を生じる。例示的な株には、Wisconsin22rg-Stadler対立遺伝子およびTR112を含む、K55誘導体r-g、b、Plであるが挙げられる。あるいは、C1およびRの対立遺伝子が一緒に導入される場合、トウモロコシの任意の遺伝子型が利用され得る。本発明における使用を意図される別のスクリーニングマーカーは、lux遺伝子によってコードされる、ホタルルシフェラーゼである。形質転換された細胞におけるlux遺伝子の存在は、例えば、X線フィルム、シンチレーション計測、蛍光分光測光法、微光low-lightビデオカメラ、フォトン計測カメラまたはマルチウェル照度計を使用して検出され得る。この系が組織培養プレートのようなバイオルミネセンスのための集団的populationalスクリーニングのために、または全植物スクリーニングのために開発され得ることも想定される。緑色蛍光タンパク質GFPをコードする遺伝子は、特定の有用なレポーター遺伝子として意図されるSheenら、1995;Haseloffら、1997;Reichelら、1996;Tianら、1997;WO97/41228。緑色蛍光タンパク質の発現は、特定の波長の光による照射に従う蛍光として細胞または植物において視覚化され得る。3.ネガティブ選択可能マーカー選択され得る特性をコードする遺伝子の導入は、細胞由来のミニ染色体minichrosomeを除くため、または特定のミニ染色体を含む細胞を選択するために有用であり得る。調査されたネガティブな選択可能マーカーの例は、酵素シトシンデアミナーゼStouggard、1993である。この酵素の存在下では、化合物5-フルオロシトシンは、植物および動物の細胞に毒性である5-フルオロウラシルに変換される。従って、この遺伝子とともにミニ染色体を含む細胞は、直接選択され得る。植物に特定の化合物に対する感受性を与えるタンパク質をコードする他の遺伝子はまた、この文脈において有用である。例えば、Agrobacteriumtumefaciens由来のT-DNA遺伝子2は、α-ナフタレンアセトアミドNAMをα-ナフタレン酢酸NAAへの変換を触媒するタンパク質をコードし、植物を高濃度のNAMに感受性にするDepickerら、1988。V.植物からのセントロメアの単離本発明者らは、初めて、植物セントロメアの核酸配列を提供した。これによって、当業者は、潜在的に任意の種由来のセントロメア配列を得ることができる。本発明者らは、このようなセントロメアを単離するために使用され得る多くの方法を、本明細書中以下に提供する。i保存配列の利用本発明者らによって同定された多数のセントロメア配列はまた、本発明者らによって高度に保存されることが示された例えば、実施例5B、表3および表4を参照のこと。従って、多くの遺伝子がArabidopsisセントロメア内に存在するという本発明者らの新規な発見は、他の生物における合成遺伝子を発見するために使用され得るすなわち、種から種への遺伝子順において進化的に保存された関係。例えば、それぞれのArabidopsis遺伝子の配列は、他の植物由来の配列データベースによる探索に使用され得る。使用され得るこのような配列の例示的なリストは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号21によって与えられる配列である。表3および4に列挙される遺伝子もまた有用である。同一または類似の遺伝子を発見することによって、セントロメア領域内またはその近くに存在し得る候補を同定する。連結されたマーカーを使用するこれらの遺伝子のマッピングは、潜在的なセントロメア領域を同定する。セントロメア配列を得るためにハイブリダイゼーションが使用される場合、ヘテロ二本鎖の形成を可能にするためによりストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件を使用することが望ましくあり得る。これらの状況において、約0.15M~約0.9Mの塩、約20°C~約55°Cの範囲の温度のような条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイゼーション種は、制御ハイブリダイゼーションに関してポジティブハイブリダイゼーションシグナルとして容易に同定され得る。いかなる場合でも、増加した温度または減少した塩と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するのに役立つ、ホルムアミドの増加した量の添加によって、条件はよりストリンジェントにされ得ることが一般的に理解される。このように、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って、所望の結果に依存した選択方法が一般的にある。iiセントロメア関連特徴の同定第2の方法は、本発明者らがArabidopsisセントロメアおよび隣接するペリセントロメアの領域に発見した独特のDNAの性質についての利点を利用する。セントロメアは、10~70のレトロエレメント、15までの偽遺伝子および29までのトランスポゾンである領域によって隣接される180bpの反復の長いアレイから構成される図12A~Tを参照のこと。これはセントロメアについて独特である。なぜなら、レトロエレメント、トランスポゾンおよび偽遺伝が、セントロメア領域およびペリセントロメア領域の外側では非常に稀であるからである。さらに、遺伝子密度は、染色体腕上4.5kbごとに1遺伝子の平均から、セントロメアでは150kbにつき1遺伝子に減少する。この独特のセントロメア組成は、多数の方法で開拓され得、他の種におけるセントロメア領域を、例えば、以下のように見出し得る:1レトロエレメント、トランスポゾン、反復DNAエレメントおよび偽遺伝子に特異的なマーカーは、類似のエレメントとともに密な領域を遺伝的にマップするために工夫され得る。2第2の方法は、インサイチュハイブリダイゼーション、好ましくは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションFISHを含む。特定の種に対してネイティブな、レトロエレメント、トランスポゾンおよび/または反復DNAからなる、蛍光的に標識されるDNAプローブは、顕微鏡と組み合わせられ得、Arabidopsisセントロメアにおいて発見されたものと類似ののDNAエレメントを有する染色体の部分を同定し得る。3配列データベースを利用して、本発明者らによって同定されるArabidopsisの組成に類似した、増加した数の反復DNA、偽遺伝子、レトロエレメントおよびトランスポゾンを有するゲノムの領域は、セントロメア性の生物の染色体の領域を同定するために使用され得る。iiiセントロメア関連タンパク質の利用第3の方法は、公知のセントロメアタンパク質またはセントロメアタンパク質を免疫沈降する工程および結合したDNAを分析する工程を包含する。セントロメアタンパク質に特異的な抗体は、細胞から抽出されたタンパク質でインキュベートされ得る。抽出物は、ネイティブであっても、DNAをタンパク質に架橋するために先に処理されていてもよい。抗体および結合タンパク質は、タンパク質抽出物から精製され得、DNAが単離され得る。次いで、DNAは、FISH上で議論したようにのためのプローブとして使用され得るか、または隣接セントロメア配列を見つけ出すためにライブラリーをプローブするために使用され得る。1.セントロメア関連タンパク質特異的抗体初めてセントロメア関連遺伝子を同定することによって、本発明者らは、このようなセントロメア関連遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の産生を可能にした。抗体は、本発明のセントロメア関連タンパク質に結合するモノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得る。抗体のセントロメア関連タンパク質標的は、セントロメア領域に結合するタンパク質を含む。さらに、セントロメア関連タンパク質特異的抗体がセントロメア関連タンパク質のさらなる単離および特徴付けを可能にすることが、詳細には意図される。例えば、セントロメアによってコードされるタンパク質が単離され得る。このようなタンパク質の組換え産生は、抗体の産生に対する抗原の供給源を提供する。あるいは、セントロメアは、アフィニティ方法を使用して、セントロメア結合タンパク質を単離するためのリガンドとして使用され得る。一旦単離されると、これらのタンパク質は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生のための抗原として使用され得る。この技術のバリエーションは、セントロメアの近傍に結合する抗体の使用によるセントロメア関連タンパク質のクローニングによって、Rattner1991によって示されている。抗体を調製しそして特徴付けるための手段は、当該分野で周知である例えば、Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHaborLaboratory、1988を参照のこと;これは本明細書中で参考として援用される。モノクローナル抗体mAbを産生するための方法は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同じ株から始まる。手短には、ポリクローナル抗体は、本発明に従って動物を免疫原性組成物を用いて免疫し、そしてその免疫された動物から抗血清を回収することによって調製される。幅広い範囲の動物種は、抗血清の産生のために使用され得る。典型的には、抗血清の産生のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギである。ウサギは、操作の容易さ、維持および比較的多量の血液量のために、ポリクローナル抗体の産生に好ましい選択である。当業者に周知なように、所与の組成物は、その免疫原性において種々であり得る。従って、宿主免疫系をブーストすることがしばしば必要であり、これは、ペプチドまたはポリペプチド免疫原をキャリアに結合することによって達成され得る。例示的および好ましいキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニンKLHおよびウシ血清アルブミンBSAである。オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンもまた、キャリアとして使用され得る。ポリペプチドをキャリアタンパク質に結合するための手段は、当該分野で周知であり、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンコイルmaleimidobencoyl-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビスビアゾ化ベンジジンを含む。特定の免疫原性組成物の免疫原性が、アジュバントとして公知の、免疫応答の非特異的な刺激物質の使用によって高められ得ることもまた、当該分野において周知である。例示的および好ましいアジュバントには、完全フロイントアジュバント殺されたMycobacteriumtuberculosisを含む、免疫応答の非特異的刺激物質、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原性組成物の量は、免疫原および免疫化に使用される動物の性質により変化する。種々の経路が、免疫原を投与する皮下、筋内、皮内、静脈内、腹腔内ために使用され得る。ポリクローナル抗体の産生は、免疫に続いて、種々の時点で免疫された動物の血液をサンプリングすることによってモニターされ得る。第2の、ブースト注入が与えられ得る。ブーストおよび滴定のプロセスは、適切な滴定が達成されるまで繰り返される。望ましいレベルの免疫原性が得られる場合、免疫された動物は、放血され得、血清が単離され、そして保管され、そして/または動物はmAbを産生するために使用され得る。モノクローナル抗体は、米国特許第4,196,265号本明細書中において参考として援用するに例示されるような周知の技術の使用によって容易に調製され得る。典型的には、この技術は、適切な動物を選択された免疫原性組成物例えば、精製されたかまたは部分的に精製された、ミニ染色体関連のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを免疫することを包含する。免疫組成物を、抗体産生細胞を刺激するのに効果的な様式で投与される。マウスおよびラットのようなゲッ歯動物が好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジまたはカエルの細胞の使用もまた可能である。ラットの使用は、特定の利点Goding1986を提供し得るが、マウスが好ましく、BALB/cマウスが最も好ましい。なぜなら、このBALB/cマウスは慣用的に使用され、高いパーセンテージの安定な融合を与えるからである。免疫に続いて、抗体を産生する潜在性を有する体細胞詳細には、Bリンパ球B細胞を、mAb産生プロトコルにおける使用のために選択する。これらの細胞は、生検脾臓、扁桃またはリンパ節から、または末梢血サンプルから得られ得る。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましく、前者は、これらが、分割形質芽細胞段階にある抗体産生細胞のリッチな供給源でありからであり、後者は、末梢血が容易にアクセス可能であるからである。しばしば、動物のパネルは、免疫され、そして最も高い抗体滴定を有する動物の脾臓が除かれ、脾臓リンパ球が、シリンジを用いて脾臓をホモジナイズすることによって得られる。典型的には、免疫されたマウス由来の脾臓は、約5×107~2×108のリンパ球を含む。次いで、免疫された動物由来の抗体産生Bリンパ球を、不死化ミエローマ細胞の細胞一般的に、免疫された動物と同じ種の1つと融合する。ハイブリドーマ産生融合手順における使用に適切なミエローマ細胞株は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、そして望ましい融合細胞ハイブリドーマのみの増殖を支持する特定の選択培地における増殖を不可能にする酵素欠損である。多数のミエローマ細胞の任意の1つが、当業者に公知なように使用され得るGoding1986;Campbell1984。例えば、免疫動物がマウスである場合、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7およびS194/5XX0Bulが使用され得;ラットについては、R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F、および4B210が使用され得;そしてU-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6が全てヒト細胞融合と関連して有用である。1つの好ましいマウスミエローマ細胞は、NS-1ミエローマ細胞株P3-NS-1-Ag4-1とも呼ばれるであり、これは、細胞株貯蔵番号GM3573を要求することによって、NIGMSHumanGeneticMutantCellRepositoryから容易に入手可能である。使用され得る別のマウスミエローマ細胞株は、8-アザグアニン耐性マウスmousemurinミエローマSP2/0非プロデューサー細胞株である。抗体産生脾臓またはリンパ節細胞およびミエローマ細胞のハイブリッドを産生するための方法は、通常、体細胞とミエローマ細胞とを2:1の比でこの比は、それぞれ約20:1~約1:1で変化し得るが、細胞膜の融合を促進する因子化学的または電気的の存在下で混合する工程を包含する。Sendaiウイルスを使用する融合方法は、Kohlerら、1975;1976に記載され、ポリエチレングリコールPEG例えば、37v/vPEGを使用する方法がGefterら、1977に記載される。電気的に誘導される融合方法の使用はまた、適切であるGoding1986。融合手順は、一般的に、低い頻度約1×106~1×108で生存可能なハイブリッドを産生する。しかし、これは、問題を生じない。なぜなら、この生存可能な、融合ハイブリッドは、選択的な培地において培養することによって、もとの融合されていない細胞特に、通常は、無限に分裂を続ける、融合されていない骨髄腫細胞から区別されるからである。選択的な培地は、一般的に、組織培養培地における、ヌクレオチドの新たな合成をブロックする薬剤を含む培地である。例示的かつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートは、プリンおよびピリミジンの両方の新たな合成をブロックし、一方、アザセリンは、プリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキセートが使用される場合、この培地は、ヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンを追加されるHAT培地。アザセリンが使用される場合、培地は、ヒポキサンチンが追加される。好ましい選択培地は、HATである。ヌクレオチド回収経路を作動し得る細胞のみが、HAT培地中で生存し得る。骨髄腫細胞は、回収経路の重要な酵素例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼHPRTを欠き、これらは生存し得ない。B細胞は、この経路を作動し得るが、これらは、培養物中で限定された寿命を有し、一般的に約2週間以内に死滅する。従って、骨髄腫細胞およびB細胞から形成されたこれらのハイブリッドのみが、選択的な培地中で生存し得る細胞である。この培養は、そこから特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。代表的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートにおける単一クローン希釈によって細胞を培養し、次いで個々のクローン上清を、約2~3週間後に所望の反応性について試験することによって行われる。このアッセイは、感度がよく、単純であり、そして迅速であるべきである例えば、放射性免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなど。次いで、選択されたハイブリドーマは、連続的に希釈され、そして個々の抗体産生細胞株にクローン化され、次いでこのクローンは、無限に増殖されてmAbを提供する。この細胞株は、2つの基本的な方法で、mAb産生のために利用され得る。ハイブリドーマのサンプルは、最初の融合のための体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用された型の、組織適合性の動物にしばしば、腹腔内に注射され得る。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生された特定のモノクロナール抗体を分泌する腫瘍を生じる。次いで、この動物の体液例えば、血清または腹水は、高濃度でmAbを提供するために引き出され得る。個々の細胞株はまた、インビトロで培養され得るが、mAbは、それらが容易に高濃度で得られ得る培養培地中で、自然に分泌される。いずれかの手段によって産生されるmAbは、所望の場合、濾過、遠心分離および種々のクロマトグラフ方法例えば、HPLCまたはアフィニティークロマトグラフィーを用いて、さらに精製され得る。2.ELISAおよび免疫沈降ELISAは、例えば、候補セントロメア配列におけるセントロメア関連タンパク質の発現の同定において、本発明と共に使用され得る。従って、このようなアッセイは、Arabidopsis以外の種からのセントロメアの単離を容易にし得る。保存された、セントロメア関連コード配列を同定することによって、本発明者らは、このようなスクリーニングのための重要な手段を提供してきた。ELISAアッセイにおいては、ミニ染色体コードタンパク質抗原配列を含むタンパク質またはペプチドは、選択された表面好ましくは、タンパク質親和性を示す表面例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルに固定される。不完全に吸着した物質を除去するための洗浄後、アッセイプレートウェルに、試験抗血清に関して抗原的に中性であることが知られている非特異的タンパク質例えば、ウシ血清アルブミンBSA、カゼインまたは粉乳の溶液を結合させるか、またはこれらでコートすることが望ましい。これは、固定化表面上の非特異的吸着部位をブロックすることを可能にし、従って、抗血清の表面への非特異的結合によって生じたバックグラウンドを減少させる。抗原性物質のウェルへの結合、バックグラウンドを減少させるための非反応性物質でのコーティング、および非結合物質を除去するための洗浄の後、固定化表面は、免疫複合体抗原/抗体形成を導く様式で試験されるべき抗血清または臨床的抽出物もしくは生物学的抽出物と接触される。このような条件は、好ましくは、抗血清を、希釈剤例えば、BSA、ウシγグロブリンBGGおよびリン酸緩衝化生理食塩水PBS/Tween登録商標で希釈する工程を包含する。これらの添加された薬剤はまた、非特異的バックグラウンドの減少に役立つ傾向がある。次いで、層状の抗血清は、約2~約4時間、好ましくは、約25°C~約27°Cのオーダーの温度でインキュベートされる。インキュベーションの後、抗血清接触表面は、非免疫複合体化物質を除去するために洗浄される。好ましい洗浄手順は、PBS/Tween登録商標またはホウ酸塩緩衝液のような溶液で洗浄する工程を包含する。試験サンプルと結合抗原との間の特定的免疫複合体の形成、および次の洗浄の後、発生および等量の免疫複合体形成は、第1の抗体に対する特異性を有する第2の抗体を、同じ手順に供することによって決定され得る。検出手段を提供するために、第2の抗体は、好ましくは、適切な色素生産性基質とのインキュベーションの際に、色または光を発生する関連した酵素を有する。従って、例えば、抗血清結合表面を、ウレアーゼまたはペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgGと、免疫複合体形成の発生を支持する時間および条件下で接触させ、そしてインキュベートする例えば、PBS含有溶液中、室温で2時間のインキュベーションことが望ましい。第2の酵素標識化抗体とのインキュベーション、および非結合物質を除去するための次の洗浄後、標識の量は、色素生産性基質例えば、酵素標識としてペルオキシダーゼの場合、尿素およびブロモクレゾールパープル、または2,2’-アジノ-ジ-3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸ABTSおよびH2O2とのインキュベーションによって定量化される。次いで、定量化は、発色の程度を例えば、可視スペクトル分光測定器を用いて測定することによって達成される。3.ウエスタンブロットセントロメア結合抗体は、イムノブロットまたはウエスタンブロット分析における使用例えば、固体支持体マトリックス例えば、ニトロセルロース、ナイロンまたはそれらの組み合わせ上に固定化されたタンパク質の同定のためを見出し得る。免疫沈降と共に、ゲル電気泳動の後、これらは、抗原の検出における使用のための単一工程の試薬として使用され得、抗原の検出において使用されるこの抗原に対する第2の試薬は、有害なバックグラウンドを引き起こす。これは、研究される抗原が免疫グロブリン免疫グロブリン結合細菌細胞壁成分の使用を除くである場合に特に有用であり、研究される抗原は、検出薬剤と交差反応するか、またはこれらは、交差反応シグナルとして、同じ相対分子量で移動する。ウエスタンブロットと共に使用するための免疫学に基づく検出方法タンパク質部分に対する、酵素学的標識化、放射標識化、または蛍光標識化二次抗体を含むは、この点における特定の使用であると考えられる。iv遺伝子マッピングに基づくアプローチArabidopsisにおけるセントロメアの同定のために本明細書中で概説される、遺伝子マッピング技術は、他の種における使用を見出し得る。1つの局面においては、これは、Arabidopsis染色体と他の種の染色体との間のシンテニーに基づいて、本明細書中に提供されるマッピングデータの実際の使用を包含する。さらに、本明細書中に記載される技術を用いて、新しいマッピングデータが得られ得る。例えば、四分子を作製する任意の植物においては、四分子分析について本明細書中に記載される詳細な手順は、セントロメアの単離のために使用され得る。手短には、四分子分析は、個々の減数分裂の4つの産物すべてを分析することによって、遺伝マーカーとセントロメアとの間の組換え頻度を測定する。特定の利点は、Arabidopsisにおけるquartetqrt1変異から生じ、これは、付着したままのArabidopsisにおける花粉母細胞の減数分裂の4つの産物を引き起こす。Arabidopsisに加えて、いくつかの天然に存在する植物種は、花粉クラスターを放出することが知られており、これらの植物としては、スイレン、ガマ、ヒースEricaceaeおよびEpacridceae、オオマツヨイグサOnagraceae、モウセンゴケDroseraceae、ランOrchidaceae、ならびにアカシアMimosaceaeが挙げられるPreuss1994、Smyth1994。しかし、これらの種は、実験系に開発されておらず、これらの使用は、遺伝的分析に限定される。しかし、quartet変異のクローニングおよび導入、または非変異Quartet遺伝子のアンチセンスコピーは、潜在的に任意の種における四分子分析の使用を可能にし得ることが、本発明者らによって予想される。RFLP分析と組み合わせたサザンゲノムDNAブロットは、高度の分解能でセントロメアをマッピングするために使用され得る。貯蔵接種組織は、制限フラグメントの分析のための必要量のDNAを提供する。サザンブロットは、放射活性方法または非放射活性方法によって標識されたプローブとハイブリダイズされる。多くの場合において、標的領域の近くに連結される新しい多型DNAマーカーを同定することが所望され得る。いくつかの場合において、これは容易になされ得る。例えば、多くの植物ゲノムにおいて、多型Sau3A部位は、約8~20kBごとの測定について見出され得る。サブトラクション方法は、このような多型性を同定するために利用可能でありRosenbergら、1994、そしてこれらのサブトラクションは、選択された、セントロメアYACクローンまたはBACクローン由来のDNAを用いて行われ得る。潜在的にセントロメアに連結されるRFLPマーカーについてのスクリーニングもまた、セントロメア連結YACクローン由来のDNAフラグメントを用いて行われ、制限酵素のパネルで消化された標的生物体由来のゲノムDNAのブロットをプローブし得る。全セントロメア領域がクローン化されていることを確認するために、各セントロメアのいずれかの端のマーカーにハイブリダイズするクローンまたは一連のクローンが同定される。これらの試みは、セントロメアにおける繰り返しDNAの存在およびセントロメアクローンの潜在的な不安定性によって複雑になり得る。従って、有用なプローブとして役立つ独特の配列を有する大きなクローンの同定は、染色体歩行ストラテジーを単純化する。ブロットハイブリダイゼーションは、クローンの構造とゲノムDNAの構造との比較を可能にし、従って、クローンが欠失または再配列を受けたか否かを決定する。同定されたセントロメアクローンは、これらが同じ配列を共有するか否か、これらが細胞学的に規定されたセントロメア領域にインサイチュで局在化するか否か、およびArabidopsisセントロメアの近くにマッピングされると考えられる、反復配列を含むか否かを決定するために使用される、ハイブリダイゼーション実験のために有用であるRichardsら、1991;Maluszynskaら、1991。PFGEおよびYACゲノム分析を行うための例示的な方法が記載されたEcker、1990。Arabidopsisthalianaにおけるゲノムマッピングのための大きな挿入YACライブラリーが、Creusotら1995に記載された。ArabidopsisthalianaDNAの2つのYACライブラリーにおいて繰り返しDNA配列を有するクローンの分析は、Schmidtら1994によって考察された。Arabidopsisの酵母人工染色体ライブラリーの構築および特徴付けは、GrillおよびSomerville1991によって記載された。特に有用な型のクローンは、細菌の人工染色体BACである。なぜなら、データは、YACクローンがしばしばセントロメアに広がり得ないことを示唆したからであるWillard,1997。例えば、Arabidopsisthaliana由来の細菌性人工染色体ライブラリーの構築および特徴付けが記載されているChoiら、1995。大きなゲノムDNAフラグメントを有する植物変異体の補完は、形質転換受容性のミニ染色体ベクターを用いて達成され得、それによって、位置クローニングの速度を上げるLiuら、1999。IGFArabidopsisBACライブラリーの構築および特徴付けは、Mozoら1998によって記載された。完全なBACに基づく、Arabidopsisthalianaゲノムの物理的マッピングが記載されているMozoら、1998。VI.核酸セグメントの部位特異的組み込みおよび切除ミニ染色体の構築のために、核酸セグメントの部位特異的組み込みまたは切除のための技術を利用し得ることが、本発明者らによって具体的に予想される例えば、以下の実施例8Bを参照のこと。このような技術はまた、植物に導入される導入遺伝子ミニ染色体ベクターを含むの、部位特異的組み込みまたは切除のために使用され得る。核酸分子の部位特異的組み込みまたは切除は、相同組換えの手段によって達成され得る例えば、米国特許第5,527,695号を参照のこと本明細書中に参考としてその全体が具体的に援用される。相同組換えは、類似のヌクレオチド配列を有する任意の対のDNA配列間の反応り、2つの配列は、相互作用組換えして、新しい組換えDNA種を形成する。相同組換えの頻度は、共有するヌクレオチドDNA配列の長さが増加するにつれて増加し、そして環状ブラスミド分子の場合よりも直鎖化プラスミド分子の場合の方が高い。相同組換えは、決して同一ではない2つのDNA配列間で生じ得るが、組換え頻度は、2つの配列間の相違が増加するにつれて減少する。導入DNA配列は、目的のDNA分子を、宿主細胞の内在的な配列と相同性を共有する配列に連結することによる、相同組換えを介して標的化され得る。一旦、DNAが細胞に侵入すると、2つの相同配列は相互作用し得、相同なゲノムDNA配列が位置した部位に、導入DNAを挿入する。従って、導入DNAに含まれる相同配列の選択は、導入DNAが相同組換えを介して組み込まれる部位を決定する。例えば、目的のDNA配列が、宿主植物細胞の単一のコピー遺伝子と相同性を共有するDNA配列に連結される場合、目的のDNA配列は、その単一の特異的部位のみでの相同組換えを介して挿入される。しかし、目的のDNA配列が、宿主真核生物細胞のマルチコピー遺伝子と相同性を共有するDNA配列に連結される場合、目的のDNA配列は、遺伝子のコピーが位置する各々の特異的部位での相同組換えを介して挿入され得る。DNAは、相同組換え反応によって宿主染色体またはベクターに挿入され得、その組換え反応としては、単一の相互組換え導入DNAの全長の挿入を生じるまたは2つの相互組換え2つの組換え事象の間に位置するDNAのみの挿入を生じるのいずれかが挙げられる。例えば、外来遺伝子を、選択された遺伝子が位置するゲノム部位に挿入することを所望する場合、導入DNAは、選択された遺伝子と相同な配列を含むべきである。次いで、単一の相同組換え事象は、選択された遺伝子に挿入されている全導入遺伝子配列を生じる。あるいは、2つの組換え事象は、目的のDNA配列この配列は、ゲノムに挿入されることが意図されるの各末端を、選択された遺伝子と相同なDNA配列に隣接させることによって達成され得る。相同な隣接領域の各々に関与する相同組換え事象は、外来DNAの挿入を生じる。従って、ゲノム相同性を共有する2つの領域間に位置するこれらのDNA配列のみが、そのゲノムに組み込まれるようになる。導入配列は、相同組換えを介する特定の部位への挿入について標的化され得るが、高等真核生物における相同組換えは、ランダムな挿入事象と比較して、比較的まれな事象である。植物細胞においては、外来DNA分子は、細胞のゲノムにおいて相同な配列を見出し、そして約0.5×104~4.2×104の頻度で組換える。従って、相同組換えを介して組み込まれた導入DNA配列を含む任意の形質転換細胞はまた、ランダムに組み込まれた導入DNA配列の多くのコピーを含むようである。従って、部位特異的組換えについてのより正確なメカニズムを使用することが所望され得る。部位特異的組換えを行うための好ましい様式は、部位特異的リコンビナーゼ系の使用を包含する。一般的に、部位特異的リコンビナーゼ系は、3つの要素からなる:2対のDNA配列第1および第2の部位特異的組換え配列および特定の酵素部位特異的リコンビナーゼ。部位特異的リコンビナーゼは、2つの部位特異的組換え配列間のみの組換え反応を触媒する。多くの異なる部位特異的リコンビナーゼ系が、本発明に従って使用され得、それらの部位特異的リコンビナーゼ系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:バクテリオファージP1のCre/lox系Hoessら、1982;米国特許第5,658,772号本明細書中にその全体が参考として具体的に援用される、酵母のFLP/FRT系GolicおよびLindquist、1989、ファージMuのGinリコンビナーゼMaeserおよびKahmann、1991、E.coliのPinリコンビナーゼEnomotoら、1983、sre遺伝子によってコードされるリコンビナーゼORF469これは、R4ファージゲノムの組み込みを媒介し得るMatuuraら、1996、ShigelladysenteriaeのpinDによってコードされる部位特異的リコンビナーゼTominaga、1997、Salmonellatyphiの主要な病原性の島pathogenicityislandにおいてコードされる部位特異的リコンビナーゼZhangら、1997、バクテリオファージP4インテグラーゼファミリーのInt-B13部位特異的リコンビナーゼRavatnら、1998およびpSR1プラスミドのR/RS系Arakiら、1992。バクテリオファージP1Cre/loxおよび酵母FLP/FRT系は、部位特異的組換えのために特に有用な2つの系を構築する。これらの系においては、リコンビナーゼCreまたはFLPは、そのそれぞれの部位特異的組換え配列それぞれ、loxまたはFRTと特異的に相互作用し、間にある配列を反転または切除する。これらの2つの系各々に対する配列は、比較的短くloxについては34bp、そしてFRTについては47bp、従って、形質転換ベクターとの使用に都合がよい。FLP/FRTリコンビナーゼ系は、植物細胞において効率的に作用することが示されているが、例えば、細菌細胞またはインビトロでもまた使用され得る。FLP/FRT系の効率は、そのFRT部位の構造を示し、そして存在するFLPタンパク質の量は、切除活性に影響を及ぼす。一般的に、短い不完全なFRT部位は、完全な全長FRT部位よりも高い切除産物の蓄積を導く。この系は、分子内反応および分子間反応の両方を触媒し、DNA切除および組み込み反応のためのそれらの用途を示し得る。組換え反応は可逆的であり、そしてこの可逆性は、各方向における反応の効率を弱め得る。部位特異的組換え配列の構造の変更は、この状況を改善するための1つのアプローチである。部位特異的組換え配列は、組換え反応の産物がもはや逆反応の基質として認識されないような様式で変異され得、それによって組み込みまたは切除の事象を安定化する。Cre-lox系バクテリオファージP1において発見されたにおいては、loxP間の組換えは、Creリコンビナーゼの存在下で生じる例えば、米国特許第5,658,772号本明細書中にその全体が参考として具体的に援用されるを参照のこと。この系は、酵母ゲノムに導入されている2つのlox部位間に位置する遺伝子を切除するために使用されているSauer、1987。Creは、誘導性の酵母GAL1プロモーターから発現され、そしてこのCre遺伝子は、自己複製酵母ベクターに位置した。lox部位は、非対称的なヌクレオチド配列であるので、同じDNA分子のlox部位は、お互いに関して同じ配向または反対の配向を有し得る。同じ配向にあるlox部位間の組換えは、2つのlox部位間に位置するDNAセグメントの欠失、および最初のDNA分子の得られた末端間の接続を生じる。欠失DNAセグメントは、DNAの環状分子を形成する。最初のDNA分子および得られた環状分子は、各々単一のlox部位を含む。同じDNA分子の反対の配向にあるlox部位間の組換えは、2つのlox部位間に位置するDNAセグメントヌクレオチド配列の反転を生じる。さらに、2つの異なるDNA分子に位置するlox部位に近接するDNAセグメントの、逆の交換が起こり得る。これらの組換え事象のすべては、Creコード領域の産物によって触媒される。VII.形質転換宿主細胞およびトランスジェニック植物細菌、酵母細胞、植物細胞または1以上のミニ染色体を有する植物全体を形質転換するための方法および組成物は、本開示のさらなる局面である。このような形質転換プロセスから誘導される、トランスジェニック細菌、酵母細胞、植物細胞もしくは植物、またはこのようなトランスジェニック植物由来の子孫および種子もまた、本発明のさらなる実施形態である。細菌および酵母細胞を形質転換するための手段は、当該分野において周知である。代表的に、形質転換の手段は、他の細菌または酵母例えば、E.coliまたはSaccharomycescerevisiaeを形質転換するために使用されるこれらの周知の手段に似ている。植物細胞のDNA形質転換のための方法としては、Agrobacterium媒介植物形質転換、プロトプラスト形質転換本明細書中で使用される場合、プロトプラスト形質転換としては、PEG媒介形質転換、エレクトロポレーションおよびプロトプラスト融合形質転換が挙げられる、花粉への遺伝子移入、生殖器官への注入、未熟な胚への注入および微粒子銃が挙げられる。これらの方法の各々は、異なる利点および不都合を有する。従って、特定の植物系統へ遺伝子を導入する1つの特定の方法は、必ずしも別の植物系統に対して最も効果的ではないかも知れないが、どの方法が特定の植物系統に対して有用であるかは、当該分野において周知である。細胞へ形質転換DNAセグメントを導入するための多くの方法が存在するが、すべてが植物細胞へDNAを送達するために適切であるわけではない。適切な方法は、DNAが細胞に導入され得る実質的に任意の方法例えば、Agrobacterium感染、DNAの直接的送達例えば、プロトプラストのPEG媒介形質転換Omirullehら、1993、乾燥/阻害媒介DNA取り込み、エレクトロポレーション、シリコンカーバイド繊維を用いる攪拌、DNAコート粒子のアクセリレーションaccelerationなどによるを含むと考えられる。特定の実施形態においては、加速方法が好ましく、例えば、微粒子銃などが挙げられる。DNAの細胞への導入のための技術は、当業者に周知である。遺伝子を細胞に送達するための4つの一般的な方法が記載されている:1化学的方法Grahamら、1973;Zatloukalら、1992;2物理的方法例えば、微量注入Capecchi、1980、エレクトロポレーションWongら、1982;Frommら、1985;米国特許第5,384,253号および遺伝子銃Johnstonら、1994;Fynanら、1993;3ウイルスベクターClapp1993;Luら、1993;Eglitisら、1988a;1988b;ならびに4レセプター媒介機構Curielら、1991;1992;Wagnerら、1992。iエレクトロポレーション短い、高圧の電気パルスの、種々の動物細胞および植物細胞への適用は、原形質膜におけるナノメートルサイズの孔の形成を導く。DNAは、これらの孔を通るか、または孔の閉鎖を伴う膜成分の再分配の結果としてかのいずれかで、細胞の原形質に直接取り込まれる。エレクトロポレーションは、非常に効率的であり得、そしてクローン遺伝子の一過性の発現、および組み込まれた目的の遺伝子のコピーを保有する細胞株の樹立の両方のために使用され得る。リン酸カルシウム媒介トランスフェクションおよびプロトプラスト融合と対照的に、エレクトロポレーションは、1つの、または多くても2、3の組み込まれた外来DNAのコピーを有する細胞株を、頻繁に生じる。エレクトロポレーション手段によるDNAの導入は、当業者に周知である。この方法において、特定の細胞壁分解酵素例えば、ペクチン分解酵素は、無処理の細胞よりも、エレクトロポレーションによってより形質転換されやすい標的レシピエント細胞を与えるために使用される。あるいは、レシピエント細胞は、機械的な傷によって、より形質転換しやすくされる。エレクトロポレーションによって形質転換を行うために、もろい組織例えば、細胞の懸濁培養物、もしくは胚形成カルスのいずれかを使用し得るか、または代替的に、未熟な胚もしくは他の組織化された組織を直接形質転換し得る。選択した細胞を、ペクチン分解酵素ペクトリアーゼに曝露するかまたは制御された様式で機械的に傷付けることによって、選択した細胞の細胞壁を部分的に分解する。次いで、このような細胞は、エレクトロポレーションによるDNA移入のレシピエントとなりこれは、この段階で行われ得る、次いで、形質転換された細胞は、新しく組み込まれたDNAの性質に依存する、適切な選択プロトコルまたはスクリーニングプロトコルによって同定される。ii微粒子銃植物細胞に形質転換DNAセグメントを送達するためのさらに有利な方法は、微粒子銃である。この方法において、粒子は、核酸でコートされ得、そして推進力によって細胞に送達され得る。例示的な粒子としては、タングステン、金、白金などから成る粒子が挙げられる。単子葉植物を再現可能に安定に形質転換する効果的な手段であることに加え、微粒子銃の利点は、プロトプラストの単離Cristouら、1998も、Agrobacterium感染への感受性も必要とされないことである。アクセリレーションによってトウモロコシ細胞にDNAを送達する方法の例示的な実施形態は、微粒子銃粒子送達システムBiolisticsPracticeDeliverySystemであり、これは、DNAでコートされた粒子または細胞を、スクリーン例えば、ステンレス鋼スクリーンまたはNytexスクリーンを通して、懸濁液中で培養された植物細胞でカバーされたフィルター表面に進ませるために使用され得る。スクリーンは粒子を分散し、それによって粒子は大きな凝集体ではレシピエント細胞に送達されない。発射装置と衝撃される細胞との間に介在するスクリーンは、衝撃凝集体のサイズを減少させ、そして大きすぎる衝撃物によりレシピエント細胞に与えられる損傷を減少させることによって、より高い頻度の形質転換に寄与し得ると考えられる。衝撃bonbardmentのためには、懸濁液中の細胞は、好ましくはフィルターまたは固体培養培地上で濃縮される。あるいは、未熟な胚または他の標的細胞が、固体培養培地上に配置され得る。衝撃bombardされる細胞は、微粒子遮断板の下に、適切な距離で位置づけられる。所望の場合、1以上のスクリーンもまた、加速デバイスと衝撃される細胞との間に位置づけられる。本明細書中に記載される技術の使用を通して、マーカー遺伝子を一過性に発現する細胞の1,000以上までの病巣を取得し得る。外来性の遺伝子産物を発現する、衝撃後48時間の病巣中の細胞の数は、しばしば1~10の範囲であり、平均1~3である。衝撃形質転換においては、最大数の安定な形質転換体を得るために、衝撃前の培養条件および衝撃パラメータを最適化し得る。衝撃のための物理的パラメータおよび生物学的パラメータの両方は、この技術において重要である。物理的因子は、DNA/微粒子沈殿物の操作に関与する因子、またはマクロ発射体macroprojectileまたはミクロ発射体microprojectileのいずれかの飛行および速度に影響を与える因子である。すべての工程を含む生物学的因子は、衝撃の前および直後の細胞の操作、衝撃に関連する外傷の軽減を助けるための、標的細胞の浸透圧調整、および形質転換DNA例えば、直鎖化DNAまたはインタクトな高次コイルプラスミドの性質にもまた関与する。衝撃前の操作は、未熟な胚の成功した形質転換のために、特に重要であると考えられる。従って、条件を完全に最適化するために、小スケールの研究における種々の衝撃パラメータを調節することを所望し得ることが予想される。特に、物理的パラメータ例えば、間隙の距離、飛行距離、組織の距離およびヘリウム圧を調節することを所望する。また、レシピエント細胞の生理学的状態に影響を与え、従って、形質転換効率および組み込み効率に影響を与え得る条件を変更することによって、外傷減少因子TRFを最小にし得る。例えば、浸透圧状態、組織水分補給およびレシピエント細胞の継代培養段階または細胞周期は、最適な形質転換のために調整され得る。他の慣用的な調整の実行は、本開示を考慮すると、当業者に公知である。iiiAgrobacterium媒介移入Agrbacterium媒介移入は、植物細胞に遺伝子を導入するための広く適用可能な系である。なぜなら、そのDNAは、植物組織全体に導入され得、それによって、プロトプラストからのインタクトな植物の再生についての必要性を回避するからである。植物細胞にDNAを導入するためのAgrobacterium媒介植物組み込みベクターの使用は、当該分野で周知である。例えば、Fraleyら、1985;Rogersら、1987に記載される方法を参照のこと。Agrbacterium媒介移入における進歩は、現在、DNAの大きいセグメントの導入を可能にするHamilton,1997;Hamiltonら、1996。従来の形質転換ベクターを使用する場合、染色体組み込みが、外来DNAの安定な遺伝に必要とされる。しかし、本明細書中に記載のベクターは、組み込みを伴って、または組み込みを伴わずに、形質転換に使用され得る。なぜなら、安定な遺伝に必要とされるセントロメア機能は、ミニ染色体に含まれるからである。特定の実施形態において、ミニ染色体が染色体に組み込まれない形質転換事象が、発現および挿入性変異誘発における部位特異的な変化を伴う問題が回避され得るという点で、好ましくあり得る。Ti-DNAの組み込みは、ほとんど再編成を生じることのない、比較的正確なプロセスである。記載されるSpielmannら、1986;Jorgensenら、1987のように、移入されるべきDNAの領域は、その境界配列によって規定され、介入DNAが、通常、植物ゲノム内に挿入される。記載されるKleeら、1985のように、近年のAgrobacterium形質転換ベクターは、E.coliおよびAgrobacteriumにおいて複製可能であり、簡便な操作を可能にする。さらに、Agrbacterium媒介遺伝子移入のベクターにおける近年の技術進歩は、ベクター中の遺伝子および制限部位の配置を改変し、種々のポリペプチドをコードする遺伝子を発現し得るベクターの構築を容易にした。この記載されるRogersら、1987ベクターは、挿入されたポリペプチドコード遺伝子の直接的な発現のためのプロモーターおよびポリアデニル化部位に隣接される、簡便なマルチリンカー領域を有し、そして本発明の目的に適切である。さらに、攻撃性armedTi遺伝子および安全化disarmedTi遺伝子の両方を含むAgrobacteriumが、形質転換に使用され得る。Agrbacterium媒介移入が効率的である植物系統において、遺伝子移入の容易および明確化された性質から、これが、選り抜きの方法である。葉盤leafdiskおよび他の組織例えば、子葉および胚軸のAgrobacterium媒介形質転換は、Agrobacteriumが天然で感染する植物に制限されるようである。Agrobacterium媒介形質転換は、双子葉植物において最も効率的である。記載されるBytebierら、1987;米国特許第5,591,616号参照として本明細書中に詳細に援用されるように、Agrobacteriumベクターを使用して、アスパラガスにおいて、そしてトウモロコシにおいてより有意に、トランスジェニック植物が産生されているが、ほとんどの単子葉植物は、Agrobacteriumの天然の宿主ではないようである。従って、商業的に重要な穀物例えば、イネ、コーンおよびコムギは、通常、代替的な方法を使用して形質転換されなければならない。しかし、上記のように、Agrobacteriumを使用するアスパラガスの形質転換もまた、達成され得る例えば、Bytebierら、1987を参照のこと。Agrobacterium媒介移入は、AgrobacteriumT-DNAの組み込みにおいて欠損性であるが、そのDNAの細胞への送達には受容性である変異体を使用することによって、より効率的になり得るMysoreら、2000a。さらに、Agrobacterium根形質転換に反抗性であるArabidopsis生態型およびArabidopsis変異体においてさえ、生殖細胞系列形質転換が、行われ得るMysoreら、2000b。Agrobacterium形質転換方法を使用して形成されるトランスジェニック植物は、代表的に、1つの染色体上に単一の遺伝子を含む。このようなトランスジェニック植物は、その付加された遺伝子について半接合性であるといわれ得る。このような植物に対するより正確な名前は、独立分離個体independentsegragationである。なぜなら、各々の形質転換された植物は、ただ1つのT-DNA組み込み事象を示すからである。付加された外来DNAについてホモ接合性であるトランスジェニック植物すなわち、2コピーの導入遺伝子を含み、1つの遺伝子が染色体対の各染色体上の同じ遺伝子座にある、トランスジェニック植物が、より好ましい。ホモ接合性トランスジェニック植物は、単一の付加された導入遺伝子を含む独立分離個体トランスジェニック植物を有性交配自家受粉させて、産生された種子のいくつかを出芽させ、そして生じた植物を、コントロールネイティブ、非トランスジェニック植物または独立分離個体トランスジェニック植物と比較した、増強された活性について分析することによって、得られ得る。ミニ染色体が染色体に組み込まれていない植物が、さらにより好ましい。このような植物は、2nxと呼ばれ得、ここで、2nは、染色体の二倍体数であり、xは、ミニ染色体の数である。最初、形質転換体は、2n1すなわち、1個のさらなるミニ染色体を有するであり得る。この場合において、この植物を自家受粉させるか、またはこの植物を別の2n1の植物と交配させて、2n2である植物を産生することが望ましくあり得る。この2n2の植物は、この植物が、減数分裂を介してこのミニ染色体をその全ての子孫に継代することが期待されるという点で、好ましい。2つの異なるトランスジェニック植物をまた交配して、2つの独立して分離している付加された外来ミニ染色体を含む子孫を産生し得ることが、理解されるべきである。適切な子孫の自家受粉は、目的のポリペプチドをコードする、両方の付加された外来ミニ染色体についてホモ接合性である植物を産生し得る。親植物への戻し交配および非トランスジェニック植物との異種交配out-crossingもまた、意図される。iv他の形質転換方法植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、およびこれらの処理の組み合わせに基づく方法を使用して達成され得るPotrykusら、1985;Lorzら、1985;Frommら、1986;Uchimiyaら、1986;Callisら、1987;Marcotteら、1988を参照のこと。トランスジェニック植物を作製する目的のための、これらの系の異なる植物系統への適用は、プロトプラストからその特定の植物系統を再生する能力に依存する。プロトプラストからの穀物の再生についての例示的方法は、記載されているFujimuraら、1985;Toriyamaら、1986;Yamadaら、1986;Abdullahら、1986。プロトプラストから首尾よく再生されない植物系統を形質転換するために、昆虫の細胞または組織にDNAを導入する他の方法が、利用され得る。例えば、未成熟の胚または外植片からの穀物の再生が、記載されるVasil1988ようにもたらされ得る。さらに、粒子銃すなわち高速微粒子銃技術が、利用され得るVasil1992。後者の技術を使用して、記載されるKleinら、1987;Kleinら、1988;McCabeら、1988ように、DNAは、小さい金属粒子の表面上で、細胞壁を介して細胞質内に運ばれる。この金属粒子は、細胞のいくつかの層を貫通し、従って、組織外植片内の細胞の形質転換を可能にする。例えば、プロトプラスト融合は、構築されたミニ染色体を宿主細胞例えば、酵母細胞中に組み込み、次いで、これらの細胞を植物プロトプラストに融合するために、使用され得る。植物セントロメアを欠失する染色体例えば、本実施例における酵母細胞が、植物細胞によって排除され、一方、ミニ染色体が安定に維持される。本発明と共に使用され得るプロトプラスト融合についてのプロトコルの多くの例が、記載されている例えば、Negrutiuら、1992、およびPetersonを参照のこと。リポソーム融合は、例えば、脂質の小滴リポソーム内に組換え構築物をパッケージングし、次いで、これらのリポソームを植物プロトプラストに融合し、従って、ACをその植物細胞に送達することによって、セントロメア例えば、ミニ染色体を含む組換え構築物を導入するために使用され得るLurquiおよびRollo、1993を参照のこと。VIII.植物における発現のための外来遺伝子本発明の1つの特定の重要な進歩は、本発明が、植物細胞における外来遺伝子の発現のための方法および組成物を提供することである。本発明の構築物の1つの進歩は、これらが、潜在的に生化学経路全体を表す、複数の遺伝子の導入を可能にすることである。重要なことに、本発明は、多くの構造遺伝子を含むミニ染色体での植物細胞の形質転換を可能にする。別の利点は、1より多いミニ染色体が導入され得、組み合わせの遺伝子が移動およびシャッフリングされるのを可能にすることである。さらに、植物からミニ染色体を排除する能力が、さらなる柔軟性を提供し、これが、植物内に含まれる遺伝子のセットを改変することを可能にする。さらに、部位特異的リコンビナーゼを使用することによって、植物中に存在する既存のミニ染色体に遺伝子を付加することが可能である。付加された遺伝子は、しばしば、特定のタンパク質またはポリペプチド産物の発現を指向する遺伝子であるが、しかし、それらはまた、非発現DNAセグメントであり得る例えば、それら自身の転移を指向しないトランスポゾン例えば、Ds。本明細書中で使用される場合、発現遺伝子は、RNA例えば、mRNA、アンチセンスRNAなどへ転写され得る、またはタンパク質に翻訳され得る、目的の形質として発現され得る、などの任意の遺伝子であり、選択マーカー遺伝子、スクリーニングマーカー遺伝子または非スクリーニングマーカー遺伝子に限定されない。本発明者らはまた、2つの発現遺伝子必ずしもマーカー遺伝子ではないがマーカー遺伝子と組み合わせにおいて使用される場合、形質転換のための同じDNAセグメントまたは異なるDNAセグメントのいずれかの上で、別々の遺伝子を使用し得ることを意図する。後者の場合、異なるベクターは、レシピエント細胞に同時に送達され、同時形質転換を最大化する。レシピエント細胞に送達されるべき特定のDNAセグメントの選択は、形質転換の目的に依存する。作物の形質転換の主な目的の1つは、いくつかの商業的に所望される農業上重要な形質を、植物に付加することである。このような形質としては、除草剤抵抗性または耐性;昆虫抵抗性または耐性;疾病抵抗性または耐性ウイルス性、細菌性、真菌性、線虫性;ストレス耐性および/または抵抗性例えば、乾燥、熱、寒冷、凍結、過剰の湿度、塩ストレスに対する抵抗性または耐性によって例示されるような;酸化ストレス;収量増加;食物の含量および性質;物理的外見;雌性不稔;枯れdrydown;直立性standability;多産性;デンプンの含量および質;油の含量および質;タンパク質の質および含量;アミノ酸組成;などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、任意のこのような所望の形質単数または複数を付与する1以上の遺伝子例えば、除草剤耐性をコードする遺伝子単数または複数を組み込むことを所望し得る。特定の実施形態において、本発明は、1つより多い外因性遺伝子を含むミニ染色体minichrmosomeを有するレシピエント細胞の形質転換を意図する。本明細書中で使用される場合、外因性遺伝子は、同一の内容物において宿主のゲノム中で通常見出されない遺伝子である。これにより、この遺伝子は、宿主ゲノム遺伝子とは異なる種から単離され得るか、あるいは、宿主ゲノムであるが、変更されていないネイティブな遺伝子において見出される調節領域とは異なる、1つ以上の調節領域に作動可能に連結された宿主ゲノムから単離されることが意図される。2つ以上の外因性遺伝子はまた、異なる導入遺伝子コードベクターを用いるか、または2つ以上の遺伝子コード配列を組み入れた1つのベクターを用いるかのいずれかで、1つの形質転換事象において供給され得る。例えば、輻輳の位置、発散したdivergent位置、または同一線上のcolinear位置のいずれかにおいて、bar発現ユニットおよびaroA発現ユニットを保持するプラスミドが、特に有用であると考えられる。さらに好ましい組み合わせは、昆虫の耐性遺伝子例えば、Bt遺伝子の、プロテアーゼインヒビター遺伝子例えば、pinIIと一緒の組み合わせ、または上記の遺伝子のいずれかを組み合わせたbarの使用である。もちろん、任意の種類descriptionの、任意の2つ以上の導入遺伝子例えば、除草剤耐性、昆虫耐性、疾患ウイルス、細菌、真菌、線虫耐性または干ばつ耐性、雄性不稔、ドライダウンdrydown、スタンドアビリティーstandability、多産性、デンプン特性、油量oilquantityおよび油質oilqualityを与える導入遺伝子、または収量もしくは栄養の質を高める導入遺伝子が、所望のように使用され得る。i除草剤耐性フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子barおよびpat、グリホサート耐性EPSPシンターゼ遺伝子、グリホサートオキシドレダクターゼをコードするグリホサート分解酵素遺伝子gox、deh遺伝子ダラポンを不活性化するデハロゲナーゼデハロゲナーゼ酵素をコードする、除草剤耐性例えば、スルホニル尿素およびイミダゾリノンimidazolinoneアセトラクターゼシンターゼ、およびbxn遺伝子ブロモキシニルを分解するニトリラーゼ酵素をコードするは、形質転換における使用のための除草剤耐性遺伝子の良い例である。bar遺伝子およびpat遺伝子は、酵素であるフォスフィノスリシンアセチルトラスフェラーゼPATをコードし、このPATは、除草剤フォスフィノスリシンを不活性化し、そしてこの化合物がグルタミンシンターゼ酵素を阻害することを妨げる。酵素5-エノールピルビルシキメート3-ホスフェ-トシンターゼEPSPシンターゼは、通常、除草剤N-ホスホノメチルグリシングリホサートによって阻害される。しかし、グリホサート耐性EPSPシンターゼ酵素をコードする遺伝子は、公知である。これらの遺伝子は、植物形質転換における使用のために特に意図される。deh遺伝子は、酵素ダラポンデハロゲナーゼをコードして、そして除草剤ダラポンに対する耐性を与える。bxn遺伝子は、ブロモキシニルを、非除草剤分解産物に変換する特異的な酵素ニトリラーゼnitrilase酵素をコードする。ii昆虫耐性導入され得る潜在的昆虫耐性遺伝子としては、Bacillusthuringiensis結晶crystal毒素遺伝子またはBt遺伝子Watrudら、1985が挙げられる。Bt遺伝子は、鱗翅類ペストpestまたは甲虫類ペスト例えば、EuropeanCornBorerECBに対する耐性を提供し得る。このような実施形態における使用のための好ましいBt毒素遺伝子としては、CryIAb遺伝子およびCryIc遺伝子が挙げられる。昆虫の成長または発生に影響するB.thuringiensisの他の種由来のエンドトキシン遺伝子もまた、これに関して使用され得る。本明細書中で開示される形質転換プロトコルにおける使用のための好ましいBt遺伝子は、コード配列が、植物、およびより詳細には、単子葉植物において発現の増加をもたらすために、改変さえれているBt遺伝子であることが意図される。合成遺伝子を調製するための手段は、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第5,500,365号および同第5,689,052号で開示されるこれらの開示の各々は、それらの全体が参考として本明細書中で特に援用される。このような改変されたBt毒素遺伝子の例としては、合成BtCryIAb遺伝子Perlakら、1991、および1800bと呼ばれる合成CryIAc遺伝子PCT出願WO95/06128が挙げられる。当業者に公知の他のBt毒素遺伝子のいくつかの例は、以下の表1において与えられる。プロテアーゼインヒビターはまた、昆虫耐性を提供し得Johnsonら、1989、従って、植物における形質転換における利用を有する。トマトまたはジャガイモ由来のプロテアーゼインヒビタ-II遺伝子であるpinIIの使用は、特に有用であると考察される。Bt毒素遺伝子と組み合わせた、pinII遺伝子の使用は、さらにより都合が良く、その組み合わされた効果は、相乗作用の殺虫剤活性を生じることが発見されている。昆虫の消化系の阻害剤をコードする他の遺伝子、または阻害剤の産生を容易にする酵素または補因子をコードする遺伝子もまた有用であり得る、この群は、オリザシスタチンoryzacystatinインヒビタ-およびアミラーゼインヒビター例えば、小麦および大麦由来のそれらのインヒビタ-によって例示され得る。また、レクチンをコードする遺伝子は、さらなる殺虫剤特性、または代替の殺虫剤特性を与え得る。レクチン元々、フィトヘマグルチニンと呼ばれるは、種の範囲から、赤血球を凝集させる能力を有する、炭水化物結合タンパク質である。レクチンは、ゾウムシ、ECBおよび根切り虫rootwormに対する活性を有する殺虫剤として最近同定されたMurdockら、1990;CzaplaおよびLang、1990。有用であるよう意図されたレクチン遺伝子としては、例えば、大麦病原体凝集素germagglutininおよび小麦病原体凝集素WGAならびにライスレクチンGatehouseら、1984が挙げられ、WGAが好まれる。昆虫ペスト中に導入される場合、昆虫に対して活性な大きいポリペプチドまたは小さいポリペプチド例えば、溶解性lyticペプチド、ペプチドホルモンならびに毒物および毒液のようなの産生を制御する遺伝子は、本発明の別の局面を形成する。例えば、特定の昆虫ペストに対して指向される若年性juvenileホルモンエステラーゼの発現は、殺虫活性も生じ、またはおそらく変態の停止を生じることが意図されるHammockら、1990。昆虫の表皮の完全性integrityに影響する酵素をコードする遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、本発明のさらに別の局面を形成する。このような遺伝子としては、例えば、キチナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼをコードする遺伝子およびニコマイシンnikkomycinキチン合成を阻害する化合物の産生ための遺伝子もまた挙げられ、これらのいずれかの導入が、昆虫耐性植物を産生するために意図される。昆虫の脱皮に影響する活性をコードする遺伝子例えば、エクジステロイドUDPグルコシルトランスフェラーゼの産生に影響する遺伝子もまた、本発明の有用な導入遺伝子の範囲内にあたる。昆虫ペストに対する、宿主植物の栄養の質を低下する化合物の産生を容易にする酵素をコードする遺伝子もまた、本発明により包含される。例えば、そのステロール組成物を変更することにより、植物の殺虫活性を与えることを可能にし得る。ステロールは、昆虫の食物由来で、昆虫から得られ、そしてホルモン合成および膜安定性のために使用される。従って、新規の遺伝子例えば、所望されないステロールの産生を直接促進する遺伝子、または所望のステロールを所望しない形態に変換する遺伝子の発現による、植物ステロール組成物の変更が、昆虫の成長および/または発生においていて負の効果を有し、従って、植物に殺虫活性を賦与する。リポキシゲナーゼは、昆虫において抗栄養の効果を示し、そして昆虫の食物の栄養の質を低下するために示された天然に存在する植物酵素である。従って、さらに、本発明の実施形態は、昆虫の摂食に耐性であり得る増強されたリポキシゲナーゼ活性を有するトランスジェニック植物に関する。Tripsacumdactyloidesは、トウモロコシcorn根切り虫を含む、特定の昆虫に対して耐性であるイネ科の植物の一種である。昆虫に対して毒性であり、または昆虫に対して毒性のある化合物の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子は、Tripsacumから単離され、そしてこれらの新規の遺伝子は、昆虫に対して耐性を与えるのに有用であると予測される。Tripsacumにおいて昆虫耐性の根拠は、遺伝的なものであることが公知である。なぜなら、上記の耐性は、性的交配sexualcrossを介するZeamaysに伝達されたからであるBransonおよびGuss、1972。他の穀類の植物種、単子葉植物種または双子葉植物種が、昆虫耐性植物を産生するのに有用である、昆虫に対して毒性のあるタンパク質をコードする遺伝子を有し得ることが、さらに予測される。潜在的な殺虫活性を有するとして特徴付けられるタンパク質をコードするさらなる遺伝子もまた、これと一致して導入遺伝子として使用され得る。このような遺伝子としては、例えば、根切り虫の阻害物質として使用され得るカウピートリプシンインヒビターCpTI;Hilderら、1987;トウモロコシ根切り虫の阻害物質として特に有用と証明し得るアベルメクチンをコードする遺伝子AvermectinandAbamectin.、Campbell,W.C.、編、1989;Ikedaら、1987;リボソーム不活性化タンパク質遺伝子;および植物構造を調節する遺伝子さえ、挙げられる。抗昆虫抗体遺伝子、および植物の外側に適用される非毒性殺虫剤前毒性殺虫剤pro-insecticideを、植物の内側の殺虫剤に変換し得る酵素をコードする遺伝子を含むトランスジェニック植物もまた、意図される。iii環境またはストレス耐性種々の環境ストレス例えば、限定されないが、乾燥ストレス、過度の水分ストレス、寒冷ストレス、凍結ストレス、高温ストレス、塩ストレス、および酸化oxidativeストレスに耐性である植物の能力の改善もまた、新規の遺伝子の発現を通して、行われ得る。有益性は、WinterFlounderCutlerら、1989のような抗凍結タンパク質の導入またはその合成遺伝子誘導体の導入を介して、凍結温度に対する耐性の増加によって、実現され得る。改善された寒冷耐性はまた、クロロプラストにおけるグリセロール-3-ホスフェートアセチルトランスフェラーゼの発現の増加を介して与えられ得るWolterら、1992。酸化ストレス高い光強度と組み合わせて、寒冷温度のような条件によってしばしば悪化するに対する耐性は、スーパーオキシドジスムターゼの発現によって与えられ得Guptaら、1993、そしてグルタチオンレダクターゼによって改善され得るBowlerら、1992。このようなストラテジーは、新しく出現した領域における凍結に対する耐性、ならびに成熟がより遅く、より高い収量の種類を、相対的により早い成熟帯zoneに広げることを考慮し得る。植物の水含有量、全水ポテンシャル、浸透圧ポテンシャルおよび膨圧を有利にもたらす新規遺伝子の発現が、乾燥に耐えられる植物の能力を増強することが、予期される。本明細書中で使用される場合、用語旱魃抵抗性droughtresistanceおよび旱魃耐性droughttoleranceは、正常な環境と比較する場合、水のアベイラビリティにおける減少により誘導されるストレスに対する植物の増加した抵抗性または耐性、ならびにより水の少ない環境で機能および生存する植物の能力をいうために使用される。本発明のこの局面では、例えば、浸透圧的に活性な溶質例えば、ポリオール化合物の生合成をコードする遺伝子の発現が、旱魃に対する防御を与えることが提唱される。このクラスには、マンニトール-L-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子LeeおよびSaier、1982およびトレハロース-6-リン酸シンターゼをコードする遺伝子Kaasenら、1992が存在する。細胞における本来のホスファターゼの引き続く作用を介して、または特定のホスファターゼの導入および共発現により、これらの導入された遺伝子は、各々、マンニトールまたはトレハロースのいずれかの蓄積を生じ、これらは両方とも、ストレスの効果を緩和し得る保護化合物として十分に示されている。トランスジェニックタバコにおけるマンニトール蓄積が立証されており、そして予備的な結果は、高レベルのこの代謝物を発現する植物が、適用された浸透圧的ストレスに耐え得ることを示すTarczynskiら、1992、1993。同様に、酵素機能を保護することにおける他の代謝物例えば、アラノパインalanopineまたはプロピオン酸または膜統合性を保護することにおける他の代謝物例えば、アラノパインのいずれかの効力は、示されておりLoomisら、1989、そして従って、これらの化合物の生合成をコードする遺伝子の発現は、マンニトールに類似するか、または相補的な様式で旱魃抵抗性を与え得る。浸透圧的に活性であり、そして/または旱魃droughtおよび/または乾燥desiccationの間にいくらかの直接的保護効果を供給する、天然に存在する代謝生成物の他の例としては、フルクトース、エリスリトールCoxsonら、1992、ソルビトール、ズルシトールKarstenら、1992、グルコシルグリセロールReedら、1984;ErdMannら、1992、スクロース、スタキオースKosterおよびLeopold、1988;Blackmanら、1992、ラフィノースBernal-LugoおよびLeopold、1992、プロリンRensburgら、1993、グリシン、ベタイン、オノニトールononitolおよびピニトールVernonおよびBohnert、1992が挙げられる。連続したキャノピーの生育およびストレスの時間の間の増加した生殖適応度は、遺伝子例えば、上記の浸透圧的に活性な化合物および他のそのような化合物を制御する遺伝子の導入および発現により増強される。現在、浸透圧的に活性なポリオール化合物の合成を促進する好ましい遺伝子は、酵素マンニトール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ、トレハロース-6-リン酸シンターゼおよびミオイノシトール0-メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。特定のタンパク質の発現がまた旱魃耐性を増加することが、予期される。後期胚形成タンパク質の3つクラスは、構造類似性に基づいて設定されているDureら、1989を参照のこと。LEAの全ての3つのクラスは、成熟すなわち、乾燥種子に存在することが実証された。LEAタンパク質のこれらの3つのクラスにおいて、II型デヒドリン型は、一般に、栄養植物部分における旱魃耐性および/または乾燥耐性に関連しているすなわち、MundyおよびChua、1988;Piatkowskiら、1990;Yamaguchi-Shinozakiら、1992。最近、タバコにおけるIII型LEAHVA-1は、草高、成熟度および旱魃耐性に影響することが見出されたFitzpatrick、1993。イネにおいて、HVA-1遺伝子の発現は、水の欠乏および塩分に対する耐性に影響したXuら、1996。このように、すべての3つのLEA群由来の構造遺伝子の発現は、旱魃耐性を与えた。水ストレスの間に誘導される他のタイプのタンパク質としては、チオールプロテアーゼ、アルドラーゼ、および膜通過輸送体が挙げられGuerreroら、1990、これらは、旱魃ストレスの間の種々の保護および/または修復型の機能を与え得る。脂質生合成、そしてそれにより膜組成を達成する遺伝子もまた、植物に旱魃耐性を与える際に有用であることはまた、予期される。旱魃抵抗性を改良するためのこれらの遺伝子の多くは、相補的な作用形態を有する。従って、これらの遺伝子の組み合わせが、植物における旱魃抵抗性の改良において相加的および/または相乗的な効果を有し得ることが認識される。これらの遺伝子の多くはまた、凍結耐性または、抵抗性を改良する;凍結および旱魃の間に受ける物理的ストレスは、事実上類似し、そして同様の様式で緩和され得る。利点は、これらの遺伝子の構成的発現を介して与えられ得るが、これらの新規遺伝子を発現する好ましい手段は、膨圧誘導プロモーター例えば、Guerreroら、1990およびShaganら、1993これらは、参考として本明細書中に援用されるにおいて記載される膨圧誘導遺伝子についてのプロモーターの使用を介し得る。これらの遺伝子の空間的発現パターンおよび時間的発現パターンは、植物が、ストレスに対してより良好に耐えることを可能にする。乾燥土壌からの増加した水の吸い上げを可能にする特定の形態学的形質に関連する遺伝子の発現が有益であることが、提唱される。例えば、根の特徴を変化させる遺伝子の導入および発現は、水の取り込みを増強し得る。ストレスの時間の間に生殖適応度を増強する遺伝子の発現が有意な価値があることが、予期される。例えば、雌花部分すなわち、毛silkの花粉脱粒shedおよび受容性receptivenessの同調性を改良する遺伝子の発現は、有益であり得る。さらに、ストレスの時間の間に穀粒の発育不全を最小化する遺伝子の発現が、収穫される粒の量を増加し得、従って価値があることが提唱される。収穫高の決定における水の全体的な役割を考えると、新規遺伝子の導入および発現を介して植物がより効率的に水を利用することを可能にすることが、土壌水分のアベイラビリティが制限されない場合でも、全体的な効率を改良することが予期される。水のアベイラビリティに関するストレスの全ての範囲にわたって水の使用を最大にする植物の能力を改良する遺伝子を導入することにより、収穫安定性または収穫高の一貫性は、現実化し得る。vi疾患抵抗性疾患に対する増加した抵抗性が、植物例えば、単子葉植物例えば、トウモロコシへの遺伝子の導入を介して、現実化され得ることが、提唱される。ウイルス、細菌、菌類および線形動物により引き起こされる疾患に対する抵抗性を生じさせることが、可能である。マイコトキシンを産生する生物体の制御が、導入された遺伝子の発現を介して実現され得ることもまた、予期される。ウイルスに対する抵抗性は、新規遺伝子の発現を介して生じ得る。例えば、トランスジェニック植物におけるウイルス性コートタンパク質の発現が、ウイルスおよびおそらく他の近種のウイルスによる植物の感染に対する抵抗性を与え得ることが実証されているCuozzoら、1988、Hemenwayら、1988、Abelら、1986。必須のウイルス機能に標的化されたアンチセンス遺伝子の発現がまた、ウイルスに対する抵抗性を与え得ることが、予期される。例えば、ウイルス核酸の複製に応答可能な遺伝子に標的化されたアンチセンス遺伝子は、複製を阻害し、ウイルスに対する抵抗性を誘導し得る。アンチセンス遺伝子の使用を介する他のウイルス機能の妨害がまた、ウイルスに対する抵抗性を増加し得ると考えられる。さらに、サテライトウイルスの使用が挙げられるがこれに限定されない他の試みを介して、ウイルスに対する抵抗性を達成することが可能であり得ることが、提唱される。細菌および菌類により引き起こされる疾患に対する増加された抵抗性が、新規遺伝子の導入を介して実現され得ることが、提唱される。いわゆるペプチド抗生物質、病因関連PRタンパク質、毒素抵抗性、および宿主病原相互作用例えば、形態学的特徴に影響するタンパク質をコードする遺伝子が有用であることが、予期される。ペプチド抗生物質は、細菌および他の微生物の増殖に対して阻害的であるポリペプチド配列である。例えば、セクロパインcecropinおよびマゲイニンといわれるペプチドのクラスは、細菌および菌類の多くの種の増殖を阻害する。単子葉植物たとえば、トウモロコシにおけるPRタンパク質の発現が、細菌性疾患に対する抵抗性を与えることにおいて有用であり得ることが、提唱される。これらの遺伝子は、宿主植物に対する病原体の攻撃の後に誘導され、そして少なくとも5つのタンパク質のクラスに分類されるBol,LinthorstおよびCornelissen、1990。β-1’3-グルカナーゼ、キチナーゼ、ならびにオスモチンおよび疾患生物体に対する抵抗性として植物において機能すると考えられるタンパク質が、PRタンパク質に含まれる。抗菌特性を有する他の遺伝子は、同定されている例えば、UDA有針イラクサ科のレクチンおよびヘベインheveinBroakaertら、1989;Barkai-Golanら、1978。特定の植物疾患がフィトトキシンの産生により引き起こされることは、公知である。これらの疾患に対する抵抗性が、フィトトキシンを分解するか、そうでなければ不活性化し得る酵素をコードする新規遺伝子の発現を介して達成されることが、提唱される。宿主植物と病原体との間の相互作用を変化させる新規遺伝子の発現が、宿主植物の組織を侵襲する疾患生物体の能力例えば、葉クチクラのろう質waxinessの増加または他の形態学的な特徴を減少する際に有用であり得ることもまた、予期される。v植物の農学的特徴作物植物が生育され得る場所を決定する2つの要因は、生育期の間の平均の日中気温および霜の間の時間の長さである。特定の作物を生育することが可能である地域において、成熟まで生育しそして収穫が可能となる最大時間に関して、種々の制限が存在する。例えば、特定の地域で生育される変種は、最大の可能な収穫を伴って、必要とされる時間内で成熟し、そして収穫可能な水分含有量までドライダウンするその能力について選択される。従って、種々の成熟度の作物が、異なる生育場所に関して開発される。収穫を可能にするために十分にドライダウンされる必要性を除いて、収穫後のさらなる乾燥に必要とされる量のエネルギーを最小にするために、野外で最大に乾燥することが望ましい。また、より容易に産物例えば、子実がドライダウンし得るほど、生育および穀粒充填に入手可能である時間がより長くなる。成熟および/またはドライダウンに影響する遺伝子が同定され得、そして形質転換技術を使用して植物系統に導入され得、異なる生育場所または同じ生育場所に適用されるが、収穫の際の水分に対する収穫高の比が改良されている新たな変種を作出することが考えられる。植物開発の調節に関与する遺伝子の発現は、特に有用であり得る。立位性standabilityおよび他の植物生長特徴を改良し得る遺伝子が植物へ導入され得ることが、予期される。より強い柄、改良された根系を与えるか、または雌穂落下量を防ぐかもしくは減少させる新規遺伝子の植物における発現は、農家にとって大いに価値がある。例えば、光の分配および/または中断を増加することにより得られ得る光合成生成物の総量を増加する遺伝子の導入および発現が有利であることが、提唱される。さらに、光合成効率および/または林冠を増加する遺伝子の発現が、生産性をさらに増加する。作物植物中のフィトクロム遺伝子の発現が有利であり得ることは、予期される。このような遺伝子の発現は、頂芽優勢を減少し得、植物に半矮性を与え、そして耐陰性を増加する米国特許第5,268,526号。このような試みは、野外における増加した植物集団を可能にする。vi栄養の利用利用可能な栄養を利用する能力は、作物植物の生育における制限因子であり得る。新規遺伝子の導入によって、栄養の取り込み、耐性pH極値、植物にわたる流動、貯蔵プール、および代謝活性に対するアベイラビリティを変化させることが可能であることが、提唱される。これらの改変は、植物例えば、トウモロコシが、利用可能な栄養をより効率的に使用することを可能にする。例えば、植物中に正常に存在し、そして栄養の利用に関与する酵素の活性増加が栄養のアベイラビリティを増加することが、予期される。このような酵素の例は、フィターゼphytaseである。植物による増強された窒素の利用が望ましいことが、さらに予期される。植物におけるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子例えば、E.coligdhA遺伝子の発現は、有機化合物中の窒素の増加した固定化を誘導し得る。さらに、植物におけるgdhAの発現は、グルタミン酸の過剰なアンモニアの取り込みにより、除草剤グルフォシネートglufosinateに対する増強された抵抗性を誘導し得、従って、アンモニアを解毒する。新規遺伝子の発現が、以前にはアクセス可能ではなかった栄養供給源例えば、より複雑な分子恐らくは高分子から栄養価値のある成分を放出する酵素を利用可能にし得ることもまた、予期される。vii雄性不稔雄性不稔は、ハイブリッド種子の産生において有用である。雄性不稔が新規遺伝子の発現を介して産生され得ることが、提唱される。例えば、雄性花序および/または配偶体の発達に干渉するタンパク質をコードする遺伝子の発現が、雄性不稔を生じることが、示された。トランスジェニックタバコおよびナタネ油oilseedのセイヨウアブラナrapeの葯におけるキメラのリボヌクレアーゼ遺伝子は、雄性不稔を誘導することが実証されているMarianiら、1990。細胞質雄性不稔を与える多くの変異が、トウモロコシにおいて発見された。特にT細胞質といわれる1つの変異はまた、サザンSouthernコーン夏疫病に対する感受性と相関する。T細胞質と相関するTURF-13と称されるDNA配列Levings、1990が、同定された。形質転換を介してTURF-13の導入を通じて、疾患感受性から雄性不稔を区別することが可能であることが、提唱される。育種目的および子実産生のために雄性不稔を回復し得ることが必要である場合、雄性稔性の回復をコードする遺伝子もまた導入され得ることが提唱される。viii改良された栄養含有量遺伝子は、特定の作物の栄養の質または含有量を改良するために、植物に導入され得る。作物の栄養組成を変化する遺伝子の導入は、飼料価または食品価を非常に増強し得る。例えば、多くの子実のタンパク質は、特にブタ、家禽、およびヒトに与えられる場合、飼料および食品としての目的としては最適以下であり得る。このタンパク質は、これらの種の食餌において必須であるいくつかのアミノ酸を欠乏し、この子実への補充物の添加を必要とする。制限必須アミノ酸としては、リジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、バリン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられ得る。いくつかのアミノ酸は、コーンが飼料処方のために他の投入物で補充される後のみに制限される。種子および子実の中のこれらの必須アミノ酸のレベルは、アミノ酸の生合成を増加するための遺伝子の導入、アミノ酸の分解を減少するための遺伝子の導入、タンパク質中のアミノ酸の貯蔵を増加するための遺伝子の導入、または種子もしくは子実へのアミノ酸の輸送を増加するための遺伝子の導入が挙げられるが、これらに限定されない機構により上昇し得る。作物のタンパク質組成は、種々の方法でアミノ酸の収支を改良するために変化され得、この方法としては、ネイティブなタンパク質の発現を上昇すること、乏しい組成を有する作物の発現を減少すること、ネイティブなタンパク質の組成物を変化すること、優れた組成を所有する全体的に新規なタンパク質をコードする遺伝子を導入することが挙げられる。作物植物の油含有量を変化する遺伝子の導入はまた、価値を有し得る。油含有量の増加は、食餌および食品の使用のための種子の代謝エネルギー含有量および密度の増加を生じ得る。導入された遺伝子は、脂肪酸または脂質の生合成における律速または制御された工程を取り除くかまたは減少する酵素をコードし得る。このような遺伝子としては、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、ACP-アセチルトランスフェラーゼ、β-ケトアシル-ACPシンターゼ、および他の周知の脂肪酸生合成活性をコードする遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。他の可能性は、アシル保有タンパク質のような酵素活性を有しないタンパク質をコードする遺伝子である。油中に存在する脂肪酸の収支を変化する遺伝子は、導入され得、これはより健康的であるかまたは栄養的な飼料を供給する。導入されたDNAはまた、脂肪酸生合成に関与する酵素の発現をブロックする配列をコードし得、これは作物中に存在する脂肪酸の割合を変化する。例えば、枝分れの程度を増加することにより、作物のデンプン成分の栄養価を増強する遺伝子が導入され得、これはその代謝を遅延することによる家畜におけるデンプンの利用の改良を生じる。さらに、作物の他の主な構成要素が変化され得、これには、種々の他の栄養、プロセシング、または他の品質の局面に影響する遺伝子が挙げられる。例えば、色素沈着は、増加または減少され得る。飼料または食用作物はまた、不十分な量のビタミンしか有し得ず、十分な栄養価を提供するために補充を必要とする。ビタミン生合成を増強する遺伝子の導入は、例えば、ビタミンA、E,B12、コリンなどを含むと考えられる。ミネラル含有量もまた、至適以下であり得る。従って、とりわけ、リン、イオウ、カルシウム、マンガン、亜鉛および鉄を含む化合物の蓄積またはアベイラビリティに影響する遺伝子は、価値がある。作物の改良の多くの他の例は、本発明とともに使用され得る。この改良は、子実に関する必要はないが、例えば、サイレージについて作物価を改良し得る。このことを達成するためのDNAの導入は、リグニン産生を変化する配列例えば、ウシにとって優位な飼料価と関連する褐色中央脈表現型を生じる配列を含み得る。飼料価および食品価における直接的な改良に加えて、作物の加工を改良し、そして加工から生じる生成物の価値を改良する遺伝子もまた、導入され得る。湿式ミルを介する場合、作物を使用する。従って、例えば、浸漬時間を減少することにより効率を増加し、そしてこのような加工の費用を減少する新規遺伝子はまた、用途を見出され得る。湿式製粉生成物の価値を改良することは、デンプン、油、コーングルテン粉またはグルテン食餌の成分の量または質を変化することを含み得る。デンプンの上昇は、デンプン生合成における律速工程の同定および除去を介するか、またはデンプンにおける割合の増加を生じる作物のほかの成分のレベルを減少することにより、達成され得る。油は、湿式ミルの別の生成物であり、その価値は、遺伝子の導入および発現により改良され得る。油の特性は、調理油、ショートニング、潤滑剤または他の油に由来する生成物の生成および使用、ならびに食品に関連する適用において使用される場合のその健康に関する性状の改良におけるその有効性を改良するために、変化され得る。抽出の際に、化学合成のための出発物質として機能し得る新規脂肪酸もまた、合成され得る。油の特性における変化は、その油に存在する脂肪酸のタイプ、レベル、または脂質の調整を変化することにより達成され得る。次に、このことは、新規脂肪酸およびそれらを有する脂質の合成を触媒する酵素をコードする遺伝子の添加によるか、またはネイティブな脂肪酸のレベルを増加し、一方でおそらく前駆体のレベルを減少することにより、達成され得る。あるいは、脂肪酸生合成における工程を遅延させるかまたはブロックするDNA配列が、導入され得、これは、前駆体脂肪酸中間体における増加を生じるる。添加され得る遺伝子としては、デサチュラーゼ、エポキシダーゼ、ヒドラターゼ、デヒドラターゼおよび脂肪酸中間体を巻き込む反応を触媒する他の酵素が挙げられる。ブロックされ得る触媒工程の代表的な例としては、ステアリン酸からオレイン酸への、およびオレイン酸からリノレン酸への不飽和化が挙げられ、これは、ステアリン酸およびオレイン酸の各々の蓄積を生じる。他の例は、伸長工程の妨害であり、これは、C8~C12飽和脂肪酸の蓄積を生じる。ix化学薬品および生物製剤の生成または同化作用本発明に従って調製されるトランスジェニック植物が、全く生成されないか、または事前のコーン植物とは同じレベルでは生成されないかのいずれかである有用な生物学的化合物の生成または製造に使用され得ることが、さらに考えられる。あるいは、本発明に従って生成される植物は、特定の化合物例えば、有害廃棄物を代謝し得、これによりこれらの化合物のバイオレメディエーションを可能にするために作製され得る。これらの化合物を生成する新規植物は、本発明により提供される構築物を用いる、1つまたは潜在的に多くの遺伝子の導入および発現により可能にされる。可能な多くのアレイとしては、任意の生物体により現在生成される任意の生物学的化合物例えば、タンパク質、核酸、初期代謝物および中間代謝物、炭水化物ポリマー、バイオレメディエーションにおける使用のための酵素、二次植物代謝物例えば、フラボノイドまたはビタミンを生成する経路を改変するための酵素、薬剤を生成し得る酵素、および導入について、製造業にとって目的の化合物例えば、専門的な化学薬品およびプラスチックを生成し得る酵素が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は、植物により生成され得、収穫および/または加工に際して抽出され得、そして現在認識される任意の有用な目的例えば、薬剤、芳香およびいくつかの名前がつけられる産業的酵素のために使用され得る。x非タンパク質発現配列DNAは、植物の表現型に影響するための機能が未だタンパク質へ翻訳されてないRNA転写物を発現する目的のために植物に導入され得る。2つの例は、アンチセンスRNAおよびリボザイム活性を有するRNAである。両方とも、ネイティブな植物遺伝子または導入された植物遺伝子の発現の減少または除去において潜在的な機能を提供し得る。しかし、以下に詳細に述べるように、DNAは、植物の表現型をもたらすために必ずしも発現されない。1.アンチセンスRNA遺伝子は、構築されるかまたは単離され得、これは、転写される場合、標的メッセンジャーRNAの全てまたは部分に相補的であるアンチセンスRNAを生成する。このアンチセンスRNAは、メッセンジャーRNAのポリペプチド生成物の生成を減少する。このポリペプチド生成物は、植物ゲノムによりコードされる任意のタンパク質であり得る。上述の遺伝子は、アンチセンス遺伝子といわれる。従って、アンチセンス遺伝子は、目的の選択されたタンパク質の発現を減少した新規トランスジェニック植物を生成するために、形質転換方法により植物へ導入され得る。例えば、このタンパク質は、植物において反応を触媒する酵素であり得る。酵素活性の減少は、植物中の任意の酵素的に合成される化合物を含む反応の生成物例えば、脂肪酸、アミノ酸、炭水化物、核酸などを減少するかまたは除去し得る。あるいは、このタンパク質は、貯蔵タンパク質例えば、ゼインまたは構造タンパク質であり得、これらのタンパク質の減少した発現は、各々、種子のアミノ酸組成における変化または植物の形態学的変化を誘導し得る。上記の可能性は、例示によりのみ提供され、適用の完全な範囲を表さない。2.リボソーム遺伝子はまた、構築または単離され得、転写される場合、エンドリボヌクレアーゼとして作用し得るRNA酵素リボザイムを産生し、そして選択された配列でRNA分子の切断を触媒し得る。選択されたメッセンジャーRNAの切断は、それらのコードされたポリペプチド産物の産生を減少し得る。これらの遺伝子は、それらを保有する新規のトランスジェニック植物を調製するために使用され得る。このトランスジェニック植物は、上記で列挙されたポリペプチドを含むがこれらに限定されないポリペプチドの減少されたレベルを保有し得る。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するRNAタンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有するKimおよびCech,1987;Gerlachら、1987;ForsterおよびSymons,1987。例えば、多数のリボザイムは、高度の特異性でリン酸エステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質における幾らかのリン酸エステルの1つのみを切断するCechら、1981;MichelおよびWesthof,1990;Reinhold-HurekおよびShub,1992。この特異性は、この基質が特定の塩基対相互作用を介して化学反応の前にリボザイムの内部ガイドguide配列IGSに結合するという必要性に起因していた。リボザイム触媒は、最初、核酸を含む配列特異的切断/連結反応の一部として観測されてきたJoyce,1989;Cechら、1981。例えば、米国特許第5,354,855号は、特定のリボザイムが、公知のリボヌクレアーゼの配列特異性よりも優れた配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用し得、DNA制限酵素の配列特異性に接近し得ると報告している。幾らかの異なるリボザイムモチーフは、RNA切断活性を有すると記載されてきたSymons,1992。例は、TobaccoRingspotVirusProdyら、1986、AvocadoSunblotchViroidPalukatisら、1979;Symons、1981およびLucerneTransientStreakVirusForsterおよびSymons,1987を含むグループIの自己スプライシングイントロン由来の配列を含む。これらウイルスおよび関連ウイルス由来の配列は、予期された折り畳み二次構造に基づくハンマーヘッドhammerheadリボザイムとしていわれる。他の適切なリボザイムは、RNA切断活性を有するRNaseP由来の配列Yuanら、1992、YuanおよびAltman,1994,米国特許第5,168,053号および同第5,624,824号、ヘアピンリボザイム構造Berzal-Herranzら、1992;Chowriraら、1993およびHepatitisDeitaウイルスベースのリボザイム米国特許第5,625,047号を含む。一般的な設計およびRNA切断活性に指向されたリボザイムの最適化は、詳細に議論されてきたHaseloffおよびGerlach,1988,Symons,1992,Chowriraら、1994;Thompsonら、1995。リボザイム設計に関する他の可変は、所与の標的RNA上の切断部位の選択である。リボザイムは、贈呈complimentary塩基対相互作用によって部位へのアニーリングという長所によって所与の配列に標的化される。相同性の2つの伸長は、この標的化にために必要である。相同性配列のこれらの伸長は、上記で規定された触媒的リボザイム構造に隣接する。相同性配列の各伸長は、7~15ヌクレオチド長に変更し得る。相同性配列を規定するための唯一の必要性は、標的TNAにおいて、それらが、切断部位である特異的配列によって分離されるということである。ハンマーヘッドリボザイムについて、切断部位は、標的RNAに関するジヌクレオチド配列であり、ウラシルU続いて、アデニンまたはシトシン、もしくはウラシルA,C,もしくはUのいずれかであるPerrimannら、1992;Thompsonら、1995。任意の所与のRNAにおけるこのジヌクレオチドが生じる頻度は、統計学的に3/16である。従って、1,000塩基の所与の標的メッセンジャーRNAについて、187ジヌクレオチド切断部位が、統計学的に可能である。標的RNAの有効な切断のためのリボザイムの設計および試験は、当業者に周知のプロセスである。リボザイムを設計および試験するための科学的方法の例は、Chowriraら、1994およびLieberおよびStrauss1995によって記載されるこれらの各々は、参考として援用される。所与の遺伝子を下方調製する際に使用するための操作的かつ好ましい配列の同定は、所与の配列を調製および試験するという単純な問題であり、当業者に公知の慣用的に実行されるスクリーニング方法である。3.遺伝子サイレンシングの誘導遺伝子は、同時抑制の機構によってネガティブな遺伝子産物の減少された発現を有する新規なトランスジェニック植物を産生するために導入され得るということもまた、可能である。タバコ、トマト、およびペチュニアにおいて、ネガティブな遺伝子のセンス転写の発現は、アンチセンス遺伝子で観測された様式と類似の様式でネガティブな遺伝子の発現を減少または排除することが、実証されてきたGoringら、1991;Smithら、1990;Napoliら、1990;vanderKrolら、1990。導入された遺伝子は、標的化ネガティブタンパク質のすべてまたは一部をコードし得るが、その翻訳は、そのネガティブタンパク質のレベルの減少について必要とされないかもしれない。4.非RNA発現性配列Ds、Ac、またはMuのような転移性エレメントであるエレメントを含むDNAエレメントは、遺伝子に挿入され、変異を生じ得る。これらのDNAエレメントは、遺伝子を不活性化または活性化するために挿入され得、そしてそれによって特定の形質をタグ化し得る。この例において、転移性エレメントは、タグ化変異の不安定性を生じない。なぜなら、このエレメントの利用は、ゲノムにおいて移動するその可能性に依存しないからである。一旦、所望の形質が、タグ化されると、導入されたDNA配列は、例えば、PCR遺伝子クローニング技術と一緒にPCRプライマーとして導入されたDNA配列を用いて、対応する遺伝子をクローニングするために使用され得るShapiro,1983;Dellaportaら、1988。一旦同定されると、所望されるコントロールまたは調節領域を含む、特定の形質に対する全遺伝子は、所望の通りに、単離、クローニング、および操作され得る。遺伝子タグ化の目的のために、生物体に導入されたDNAエレメントの利用性は、DNA配列から独立し、そしてDNA配列の任意の生物学的活性、すなわちRNAへの転写またはタンパク質への翻訳に依存しない。このDNAエレメントの唯一の機能は、遺伝子のDNA配列を分裂させることである。発現されてないDNA配列新規の合成的配列を含むが、それらの細胞および植物およびその播種の独占的標識として細胞に導入され得ることは、予期される。標識DNAエレメントが、宿主生物体に対して遺伝子内因性の機能を崩壊することは必要ではない。なぜなら、このDNAの唯一の機能が、生物体の起源を同定しなければならないからである。例えば、独自のDNA配列は、植物に導入され得、そしてこのDNAエレメントは、その標識化供給源から惹起したような、すべての細胞、植物およびこれらの細胞の子孫を同定するからである。標識DNAの包含は、独占的生殖質またはこのような標識されてない生殖質由来の生殖質を区別することを可能にすることが、提案される。導入され得る別の可能なエレメントは、マトリックス付着領域エレメントMAR例えば、チキンリゾチームAエレメントStief,1989であり、これは、目的の発現可能な遺伝子のまわりで位置決めされ得、遺伝子の全体的な発現を増大させ、そして植物ゲノムへの組み込みの際に位置依存的効果を減少し得るStiefら、1989;Phi-Vanら、1990。5.その他本発明に関する使用を特異的に想定された非タンパク質発現配列の他の例としては、例えば、コドンの使用を変更するためのtRNA配列、および例えば、種々の薬剤例えば、抗体に抵抗性を所与し得るrRNA改変体が挙げられる。IX.生物学的機能的同等物改善および変更は、本発明のセントロメア性DNAセグメントにおいて作製され得、そして所望の特徴づけを有する機能的分子をなお得ることができる。以下は、同等物、すなわち改善された、二次生成分子でさえ作成するための、セントロメアの核酸の変更に基づく議論である。本発明の特定の実施形態において、変異されたセントロメア配列は、セントロメアの利用性を増大させるために有用であると予期される。本発明のセントロメアの機能は、セントロメアおよび/またはこのセントロメアと相互作用するタンパク質のDNA配列の二次構造に基づき得ることが、特異的に予期される。セントロメアのDNA配列を変更することによって、セントロメアおよび/またはセントロメア配列の二次構造のための1以上のセントロメア関連タンパク質のアフィニティーを変更し得、それによって、セントロメアの活性を変更し得る。あるいは、変更は、このセントロメアの活性を実行しない、本発明のセントロメアにおいて作製され得る。セントロメア活性を所与するために必要なDNAセグメントのサイズを減少するセントロメア配列における変更は、本発明において特に有用であると予期される。なぜなら、変更は、セントロメアが有糸分裂および減数分裂の間転移されたフィデェリティーを、増大するからである。X.植物用語植物とは、本明細書中で使用される場合、植物の任意の型をいう。本発明者らは、本発明で使用され得る幾らかの植物の例示的説明を以下に提供した。しかし、この列挙は、任意の限定する様式ではない。なぜなら、植物の他の型は、当業者に公知であり、そして本発明において使用され得るからである。農学で活用される植物の共通の分類は、野菜園芸朝鮮アザミ、コールラビ、キバナスズシロ、西洋にらねぎ、アスパラガス、レタス例えば、ヘッド、リーフ、ロメイン、白菜、タロイモ、ブロッコリ、メロン例えば、マスクメロン、スイカ、クレンショウ、ハネデュー、カンタロープ、ブラッセル芽、キャベツ、カードニcardoni、ニンジン、白菜、カリフラワー、オクラ、タマネギ、セロリ、パセリ、ヒヨコマメ、アメリカボウフウ、チコリー、中国産キャベツ、コショウ、コラード、ジャガイモ、キュウリ植物インゲンマメ、キュウリ、カボチャ、ウリ、ダイコン、乾燥球タマネギ、カブハボタン、ナス、サルシフィ、エスカロール、エシャロット、エンダイブ、ニンニク、ホウレンソウ、ネギ、カボチャ、緑色物green、テンサイ、砂糖ダイコンおよび飼料ビート、サツマイモ、フダンソウ、西洋ワサビ、トマト、ケール、蕪、および香辛料を含むである。市販の使用をしばしば見出す他の型の植物は、果実および蔓作物例えば、リンゴ、アプリコット、チェリー、ネクタリン、モモ、西洋なし、西洋スモモ、プルーン、マルメロアーモンド、クリ、ハシバミ、ベカン、ピスタチオ、クルミ、シトリス、ブルーベリー、ボイセンベリー、クランベリー、干しブドウ、ローガンベリー、キイチゴ、イチゴ、黒イチゴ、ブドウ、アボカド、バナナ、キーウィ、カキ、ザクロ、パイナップル、熱帯果実、ナシ、メロン、マンゴ、パパイヤおよびレイチを含む。最も広範に増幅した多くの植物は、農作物植物例えば、月見草、牧草フォームmeadowfoam、穀草フィールド、スイート、ポップコーン、ホップ、ホホバ、ピーナッツ、米、ベニバナ、小穀物オオムギ、カラスムギ、ライ麦、コムギなど、サトウモロコシ、タバコ、カボック、マメ植物マメbean、レンティル、エンドウマメ、ダイズ、油料植物セイヨウアブラナ、マスタード、アヘン、オリーブ、ヒマワリ、ココナツ、ヒマシ油植物、カカオの実、ラッカセイ、繊維植物ワタ、アマ、アサ、ジュート、クスノキ科シナモン、カンファー、または植物例えば、コーヒー、サトウキビ、茶、および天然ゴム植物である。植物のなお別の例としては、花壇用植物例えば、花、サボテン、多肉多重の植物、および装飾植物、ならびに木例えば、森広葉樹および針葉樹のような常緑樹、果実、装飾樹、および木の実保有木、ならびに低木および他の苗木が挙げられる。XI.定義本明細書中で使用される場合、用語自立性折り曲がり配列またはARSまたは複製起源とは、DNA複製を開始するタンパク質によって認識されるDNA複製の起源をいう。本明細書中で使用される場合、用語バイナリBACまたはバイナリ細菌性人工染色体とは、Agrobacterium媒介形質転換例えば、Hamiltonら、1996;Hamilton,1997;およびLiuら、1999に必要なT-DNAボーダー配列を含む細菌性ベクターをいう。本明細書中で使用される場合、用語候補セントロメア配列とは、潜在的なセントロメア機能に対してアッセイすると意図する核酸配列をいう。本明細書中で使用される場合、セントロメアとは、細胞分裂を介して娘細胞に分離する能力を所与する任意のDNA配列をいう。1つの事情において、この配列は、約1~約100娘細胞の約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または約95を含むの範囲の娘細胞への分離効率を産生し得る。このような分離効率における改変は、本発明の範囲内に重要な適用を見出す。例えば、100安定性を所与するミニ染色体輸送セントロメアは、選択内のすべての娘細胞に維持され得る一方で、1安定性を所与するミニ染色体輸送セントロメアは、トランスジェニック生物体に一時的に導入され得るが、所望の場合、排除され得る。本発明の特定の実施形態において、セントロメアは、核酸配列の安定な分離を所与し、有糸分裂または減数分裂有糸分裂および減数分裂の両方を含むを介して、セントロメアを含む組み換え構築物を含む。植物セントロメアは、必ずしも植物由来ではないが、植物細胞におけるDNA分離を促進する能力を有する。本明細書中で使用される場合、用語セントロメア関連タンパク質とは、セントロメアの配列によってコードされるタンパク質または宿主DNAによってコードされかつこのセントロメアに対して比較的高いアフィニティーで結合するタンパク質をいう。本明細書中で使用される場合、真核生物とは、生存生物体の細胞が核を含む生存生物体をいう。真核生物は、核を欠損する生物体である原核生物と区別され得る。真核生物および原核生物は、それらの遺伝情報が組織される方法ならびにRNAおよびタンパク質合成のそれらのパターンにおいて本質的に異なる。本明細書中で使用される場合、用語発現とは、構造的遺伝子が代表的にメッセンジャーRNAmRNAと称されるRNA分子を産生するプロセスをいう。このmRNAは、代表的ではあるがいつもではなく、ポリペプチドに転移される。本明細書中で使用される場合、ゲノムは、遺伝子のすべておよび生物体の所与の細胞内に遺伝的情報を含むDNA配列をいう。通常、これは、核内に含まれる情報を意味するが、細胞小器官をも含むように取られる。本明細書中で使用される場合、用語高等真核生物とは、多細胞真核生物をいい、代表的にそのより複雑な生理学的機構および比較的大きいサイズによって特徴付けられる。一般的に、植物および動物のような複雑な生物体は、このカテゴリーに含まれる。本発明によって形質転換される好ましい高等真核生物としては、例えば、単子葉被子植物種および双子葉被子植物種、裸子植物種、シダ植物種、これらの種の植物組織培養細胞、動物細胞および藻類細胞が挙げられる。真核生物および原核生物は、同様に本発明の方法によって形質転換され得ることが当然理解される。本明細書中で使用される場合、用語宿主とは、複製可能なプラスミドの複製である任意の生物体または植物染色体を含む発現ベクターをいう。理想的に、クローニング実験のために使用される宿主菌株は、使用される外来のDNAを分解し得る任意の制限酵素活性がないべきである。本発明において有用な、クローニングのための宿主細胞に好ましい例としては、細菌例えば、Escherichiacoli、Bacillussubtilis、Pseudomonas、Streptomyces、Salmonellaおよび酵母細胞例えば、S.cerevisiaeが挙げられる。ミニ染色体の発現のために標的化され得る宿主細胞は、任意の供給源の植物細胞であり得、そして特異的にArabidopsis、トウモロコシ、米、サトウキビ、サトウモロコシ、オオムギ、ダイズ、タバコ、コムギ、トマト、ジャガイモ、シトリス、または任意の他の農学的または科学的重要な種を含む。本明細書中で使用される場合、ハイブリダイゼーションとは、RNA-DNAハイブリッドを産生する相補的なRNAおよびDNA鎖の対、あるいは二本鎖DNA分子を産生するための一般的に異なるかまたは同一の供給源由来の2つのDNA一本鎖の対をいう。本明細書中で使用される場合、用語リンカーとは、一般的に50または60ヌクレオチド長までであり、そして化学的に合成されるかまたは他のベクターからクローニングされるDNA分子をいう。好ましい実施形態において、このフラグメントは、平滑切断酵素およびねじれ型切断酵素例えば、BamHIのための1つ、好ましくは1つより多くの制限酵素部位を含む。このリンカーフラグメントの1つの末端は、直鎖状分子の1つの末端に結合可能であるように適応され、そして他の末端は、この直鎖状分子の他の末端に結合可能であるように適応される。本明細書中で使用される場合、ライブラリーとは、クローニングされるランダムDNAフラグメントのプールである。原理的に、任意の遺伝子は、特異的ハイブリダイゼーションプローブでライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る例えば、Youngら、1977を参照のこと。各ライブラリーは、分散した制限酵素で産生されたフラグメントとしてまたは何千のプラスミドベクターにランダムに向きを変えられたフラグメントとして挿入された所与の生物体のDNAを含み得る。本発明の目的のために、E.coli、酵母およびSalmonellaプラスミドは、このゲノム挿入物が他の生物体からである場合に特に有用である。本明細書中で使用される場合、用語下等真核生物とは、比較的単純な生理機能および組成物と特徴付けられる真核生物、ならびに最も頻繁には単細胞をいう。本明細書中で使用される場合、ミニ染色体とは、セントロメアを含みかつ娘細胞に転移可能な組み換えDNA構築物である。細胞分裂を介するこの構築物の安定性は、約1~約1005、10、20、30、40、50、60、70、80、90、および95を含むの間の範囲であり得る。このミニ染色体構築物は、環式または直鎖状の分子であり得る。1以上のテロメア、ARS配列および遺伝子のようなエレメントを含み得る。含まれるこのような配列の数は、この構築物本体の物理的なサイズの限定によってのみ限定される。天然の染色体由来のDNAを含み得るが、1~100の範囲における分離効率を得ることを必要とされる最小量に対してDNAの量を限定することが好ましくあり得る。このミニ染色体は、有糸分裂または減数分裂を通してか、または有糸分裂および減数分裂の両方を通して遺伝され得る。本明細書中で使用される場合、用語ミニ染色体は、用語植物人工染色体またはPLACおよびこの用語ミニ染色体の意味の中にある構築物に特異的に適用するPLACまたは植物人工染色体に関連するすべての技術を包含しかつ含む。本明細書中で使用される場合、ミニ染色体でコードされたタンパク質によって、本発明のミニ染色体の配列によってコードされるポリペプチドが意味される。これは、配列例えば、選択マーカー、テロメアなど、ならびにこのミニ染色体上の任意の他の選択された機能的遺伝子によってコードされるそれらのタンパク質を含む。180塩基対の繰り返しは、配列番号184~212に開示される特定の繰り返しのいずれか1つまたは、それ由来の連続した配列として規定される。従って、所与の180塩基対の繰り返しは、180より多いかまたはこれ未満の塩基対を含み得、そしてそこに提供される特定の配列のいずれかによって示されない配列を反映し得る。本明細書中で示される場合、用語植物は、植物細胞、植物プロトプラスト、植物カルスなど、ならびにそれから再び産生された全植物を含む。本明細書中で使用される場合、用語プラスミドまたはクローニングベクターとは、共有結合で閉ざされた環式の染色体外DNAまたは直鎖状のDNA宿主細胞において自立的に繰り返し得、そして細胞の生存に通常非必須であるをいう。広範な種々のプラスミドおよび他のベクターは、公知であり、そして当該分野で一般的に使用される例えば、Cohenら、米国特許第4,468,464号これは、DNAプラスミドの例を開示し、特異的に本明細書中で参考として援用されるを参照のこと。本明細書中で使用される場合、プローブは、任意の生物学的試薬通常、同定の容易さのために同じ方法でタグ化されるであり、遺伝子、遺伝子産物、DNAセグメントまたはタンパク質を同定または単離するために使用される。本明細書中で使用される場合、用語組み換えとは、DNA鎖の崩壊および再結合を含む任意の遺伝子の交換をいう。本明細書中で使用される場合、調節配列とは、任意の遺伝子の転写または翻訳の効率に影響を及ぼす任意のDNA配列をいう。この用語は、プロモーター、エンハンサーおよびターミネータを含むが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、選択マーカーは、遺伝子の存在が、明確な表現型、およびこのマーカーを含む細胞に対する成長の利点を最もよく生じる遺伝子である。この成長の利点は、標準条件下、温度上昇のような変更された条件、または除草剤もしくは抗体のような特定の化学物質の存在下で存在し得る。選択マーカーの使用は、例えば、Broachら、1979に開示される。選択マーカーの例は、数ある中で、チミジンキナーゼ遺伝子、細胞性アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子およびジヒドリルホレートレダクターゼ遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、バーbar遺伝子およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。本発明における好ましい選択マーカーは、遺伝子の発現が宿主細胞に対して抗菌性の抵抗または除草剤抵抗を所与する遺伝子を含む。この遺伝子は、宿主細胞内のベクターの維持を可能にするために十分であり、そして新たな宿主細胞にプラスミドの操作を容易にする。本発明の特定の目的としては、例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、G-418、ビアラフォスbialaphos、およびグリフォセートに対して細胞性抵抗を所与するタンパク質である。本明細書中で使用される場合、スクリーニングマーカーは、遺伝子の存在が、同定可能な表現型を生じる遺伝子である。この表現型は、標準条件下、温度上昇のような変更された条件下、またはこの表現型を検出するために使用される特定の化学物質の存在下で観測可能であり得る。本明細書中で使用される場合、用語部位特異的組み換えとは、特定のDNA配列にてDNA鎖の崩壊および再結合を含む任意の遺伝子交換をいう。本明細書中で使用される場合、構造的遺伝子は、ポリペプチドまたはRNAをコードする配列であり、5’末端および3’末端を含む。構造的遺伝子は、宿主に構造的遺伝子が形質転換される宿主または別の種由来である。構造的遺伝子は、好ましいが、必要ではなく、構造的遺伝子の発現を調節する1以上の調節配列例えば、プロモーター、ターミネーターまたはエンハンサーを含む。構造的遺伝子は、好ましいが、必要ではなく、構造的遺伝子を含む生物体に関する幾らかの有用な表現型例えば、除草剤抵抗を所与する。本発明の1つの実施形態において、構造的遺伝子は、タンパク質例えば、tRNAまたはrRNA遺伝子に翻訳されないRNA配列をコードし得る。本明細書中で使用される場合、用語テロメアとは、染色体の末端をキャッピングし、それによって染色体末端の分解を予防し得、複製を確実にし、そして他の染色体配列に対する融合を予防し得る配列をいう。本明細書中で使用される場合、用語形質転換またはトランスフェクションとは、DNAの染色体性付加または染色体外性付加を介して新たなDNAの細胞における獲得acquisitionをいう。これは、プロセスによって、裸のDNA、タンパク質でコートされたDNA、または全ミニ染色体が細胞に導入される、このプロセスであり、潜在的な遺伝的変化を生じる。XII.実施例以下の実施例は、本発明の好ましい実施例を実証することを含む。本技術は、本発明の実行の際に十分な機能を本発明者によって開示される例示的技術に従う実施例において開示され、従ってその実行のために好ましい様式を構築することを考慮され得ることが、当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、多くの変更が、開示される特定の実施形態において作製され得、そして本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく同様なまたは類似の結果をなお得ることができることを理解するべきである。より詳細には、化学的にかつ生理学的に関連する特定の薬剤は、本明細書中で記載される薬剤と置換され得る一方で、同一または類似の結果が達成されることは、明らかである。当業者に明らかなすべてのこのような類似の置換および改善は、添付の特許請求の範囲によって規定される通りの、本発明の精神、範囲および概念の中にあるとみなされる。実施例1Arabidopsisthalianaマッピングmapping集団の産生花粉ドナー植物を生成するために、2つの親株輸送qrtlを、互いに交差させる。qrtl-1対立遺伝子は、Landsberg生態型バックグラウンドにあり、そしてqrtl-2対立遺伝子は、Columbia生態型バックグラウンドにあった。Landsberg生態型は、Columbia生態型から用意に識別可能である。なぜなら、それは、劣性の変異である、erectaを輸送し、ニワトリに対する幹、より緻密である開花、およびより丸くそして野生型より小さい葉を生じる。ドナー植物のマーカーとしてこれを利用するために、qrtl-2対立遺伝子を、artl-1メススチグマに交差した。F1子孫は、すべての分子のマーカーでへテロ接合性であるが、この子孫は、融合された対立遺伝子グレインの四分子のquartet表現型を維持する。さらに、Columbia植物のERECTA表現型を表示する。この可視的マーカーは、交差が生態型特異的マーカーを分離する植物を生成することにおいて功を奏することの同定として役立つ。さらなる試験を、子孫が分子遺伝子座でへテロ接合性であるこを保証するためにPCR分析を行うことにより、ドナー植物に対して行った。花粉粒がマーカー分離について直接的にアッセイされ得ないという事実に起因して、そして複数のマーカーアッセイに利用可能な長期供給源を作製したいという願望のために、ドナー植物によって生成される個々の四分子を交雑することが必要であった。これは、大量の組織および種子の両方を生じる後代植物のセットを作製した。これらの交雑は、雄性不稔性ms1について同型接合のレシピエント植物を生成することによって効果的に達成された。劣性変異体ms1を、レシピエント植物が自家受精したり、後代が四分子植物と間違えられたりすることを防ぐために選択した。同型接合性植物は自己受精しないという事実に起因して、異型接合の雄性不稔性1malesterility1植物によって生成された原種これから不稔性レシピエント植物が選択され得るは、維持される必要がある。実施例2四分子受粉四分子受粉を以下のように実施した。成熟した花をドナー植物から取り除き、そして成熟した四分子花粉粒を放出するようにガラスの顕微鏡用スライド上でトントンとたたいた。次いでこのスライドを20~40倍のZeiss解剖顕微鏡下に配置した。個々の四分子花粉粒を単離するために、小さな木製のだぼを使用し、このだぼにはゴム糊で眉毛を取り付けた。光学顕微鏡を使用して、四分子花粉ユニットを選択し、そして眉毛に接触させた。四分子は、優先的に眉毛に付着し、従って顕微鏡用スライドから釣り上げられ、そしてレシピエント植物の柱頭表面に運ばれる。この移動は、顕微鏡の使用を伴わずに実施し、次いで四分子が付着した眉毛をレシピエントの柱頭表面に対して配置し、そしてこの毛を、柱頭表面を横切るように手で引きずった。次いで、四分子は優先的にレシピエントの柱頭に付着し、そして交差受粉を完了した。最初に、各々3~4個の種子からなる57の四分子種子のセットを採集した。植物をこれらの四分子種子のセットから生育させ、そして組織を採集した。DNAを、PCRベースの分離分析のために、貯蔵した組織の少量から抽出した。さらに、可視的なerecta表現型の分離を記録した。この植物が種子を生じる場合、この種子を、サザンブロッティングによってRFLP分離を分析するために必要とされる、大量のDNAの供給源として採集した。実施例3セントロメアに及ぶコンティグcentromere-spaning-contigの調製および分析以前に、2つの細菌人工染色体BACライブラリーのDNAフィンガープリントおよびハイブリダイゼーション分析により、Arabidopsisゲノムの単一コピー部分のほぼ全てをカバーする物理的地図の構築がなされたMarraら、1999。しかし、Arabidopsisセントロメア近傍の反復DNA180bpの反復、レトロ要素retroelement、および中間反復配列を含むの存在は、特定の染色体にセントロメアBACコンティグを固定するための取り組みを複雑にしたMurataら、1997;Heslop-Harrisonら、1999;Brandesら、1997;Franzら、1998;Wrightら、1996;Koniecznytら、1991;Pelissierら、1995;VoytasおよびAusubel、1988;Chyeら、1997;Tsayら、1993;Richardsら、1991;Simoensら、1988;Thompsonら、1996;Pelissierら、1996。本発明者らは、これらの固定されていないコンティグを特定のセントロメアにはっきりと割り当てるために遺伝子マッピングを使用し、ゲノム全体についての情報を与える交差Copenhaverら、1998を用いて、48の植物において多形性マーカーを記録した。このようにして、いくつかのセントロメアコンティグを染色体腕の物理的地図に関連付け実施例6および表4を参照のこと、そしてセントロメア境界を規定するDNAマーカーの大きなセットを生成した。DNA配列分析は、第II染色体および第IV染色体についてのコンティグの構造Linら、1999を確証した。CEN2およびCEN4を、特に分析のために選択した。両方とも、構造的に類似した染色体上に存在し、3.5MbrDNAアレイをそれらの遠位端上に有し、それぞれ3Mbおよび2Mbを測定する領域をrDNAとセントロメアとの間に有し、そして16Mb領域および13Mb領域をそれらの長腕上に有するCopenhaverおよびPikaard、1996。第II染色体および第IV染色体の実質的に完全な、かつ注釈付きの配列を用いて、ヌクレオチドレベルでセントロメアの分析を実施したhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide.html。遺伝的に規定されたセントロメア境界内で配列組成を分析し、そして近接したセントロメア周囲領域と比較した図12A~T。2つのセントロメアの分析は、配列パターンの比較および保存された配列エレメントの同定を容易にした。セントロメア配列は、180bp反復配列を有することが見出された。これらの配列は、各セントロメアコンティグのギャップ中に存在することが見出され図3、図12B、12L、ゲノムの他の部分には、繰り返しはほとんどなく、そして長アレイも存在しなかった。これらのギャップ近傍のBACクローンは、コンティグ間のDNAの大部分180bp反復、5SrDNA、または160bp反復を含むを構成すると思われる反復エレメントに対応する末端配列を有する図3。蛍光インサイチュハイブリダイゼーションは、これらの反復配列がArabidopsisセントロメアの豊富な成分であることを示したMurataら、1997;Heslop-Harrisonら、1999;Brandesら、1997。遺伝子マッピングおよびパルスフィールドゲル電気泳動は、多くの180bp反復が、セントロメア領域中の0.4Mbと1.4Mbとの間を測定する長アレイに存在するRoundら、1997ことを示し;配列分析は、ギャップ近傍のさらに散在したコピーを明らかにした。本発明者らは特に、ミニ染色体の構築のためのこのような180bp反復の使用を意図する。第II染色体および第IV染色体の注釈付き配列は、中間反復DNAに対する相同性を有する領域を同定し、共に、機能的セントロメア内、および隣接領域中に存在する図12B~12Eおよび12L~12O。CEN2および2.8Mb配列決定領域CEN4を含むを含む4.3kb配列決定領域において、レトロトランスポゾン相同性が、DNA配列の10より多くを占めることが見出された。それぞれ最大で62および70である図12C、12M。トランスポゾンまたは中間反復エレメントに対する類似性を有する配列が、同様の帯域を占めることが見出されたが、しかし、あまり共通ではなかったそれぞれ、第II染色体、第IV染色体について最大で29および11の密度図12D~12Eおよび図12B~12O。最終的に、DrosophilaおよびNeurosporaセントロメアの場合Sunら、1997;Cambareriら、1998とは異なり、Arabidopsisのセントロメア中では、低コンプレキシティーDNAマイクロサテライト、ホモポリマー域、およびATリッチイソコアisochoresを含むが富化されていることは見出されなかった。CEN2近傍では、単純反復配列密度は、遠位の染色体腕上の密度に匹敵し、セントロメア内の配列の1.5を占め、フランキング領域では3.2であり、そして長さが20~319bpの範囲であった平均71bp。CEN2でのミトコンドリアDNAの挿入を除いて、セントロメア中および周囲のDNAは、約64ATのゲノム平均から有意に逸脱する大きな領域を含まなかった図12F、12PBevanら、1999。180bp反復とは異なり、CEN2およびCEN4の近傍では、他の反復エレメントは全て、遺伝的に規定されたセントロメア内で、フランキング領域よりも豊富ではなかった。機能的セントロメアドメインの外側の高濃度の反復エレメントは、セントロメア活性について不充分であり得ることを示唆する。従って、これらの反復配列中で富化されたArabidopsisゲノムのセグメントを同定することは、セントロメア機能を提供する領域を正確に突き止めなかった;同様の状況は、他の高等真核生物のゲノムにおいても起こり得る。セントロメアに隣接する反復DNAは、重要な役割を演じ得、これは、セントロメア構造を凝集させるか、または安定化するように働く、変化したクロマチン構造を形成する。あるいは、他の機構が、セントロメア近傍での反復エレメントの蓄積を生じ得る。進化モデルは、反復DNAが低い組換えの領域中に蓄積することを推定するがCharlesworthら、1986;Charlesworthら、1994、多くのArabidopsis反復エレメントは、セントロメア自体よりも、組換えが活性なセントロメア周囲領域において豊富である。代わりに、レトロエレメントおよび他のトランスポゾンは、セントロメアに隣接する領域に優先的に挿入し得るか、またはより高い速度でゲノムの残りの部分から除去され得る。実施例4セントロメアの遺伝子マッピングセントロメアをマッピングするために、数百の多形DNAマーカーについて異型接合性であるF1植物を、Landsberg生態型およびColumbia生態型由来のquartet変異体を交雑することにより生成したChangら、1988;Ecker、1994;KonieczyおよびAusubel、1993。これらの植物由来の四分子において、遺伝的マーカーは、2:2比で分離する図6;Preussら、1994。次いで、マーカーの分離を、Landsberg同型接合体においてF1植物由来の花粉四分子を交雑させることにより生成した植物において決定した。四分子内の花粉粒の遺伝子型を後代の遺伝子型から推測した。まず、種子を100より多くの成功した四分子受粉から生成し、そして組織および種子をこれらのうち57から採集した。これは、PCRのための十分な材料、ならびにサザンハイブリダイゼーションおよびRFLPマッピングに必要な大量の組織を生成するために必要な種子を提供した。セントロメアのより正確な位置付けを得るために、元の四分子受粉を、57の四分子から1000より多くの四分子まで増大させた。マーカー分離を決定するために、PCR分析を行った。雌親からのLandsbergバックグラウンドの寄与を説明するために、4つの四分子植物の各々か1つのLandsberg相補物を差し引いた。図5に示すように、ゲノム全体にわたる部位からのマーカーを、全ての他のマーカーのペアでの比較のために使用した。テトラ型は、一方または両方のマーカーとそれらのセントロメアとの間の交差を示し、一方、二型は、交差がなかったことまたは二重交差の存在を示す。従って、あらゆる遺伝子座において、得られた二倍体後代は、L/CまたはC/Cのいずれかであった。これらの植物内で生成されたマップは、既存のマップ雄と雌との両方における組換えの平均を表すとは異なり、雄性減数分裂にのみ基づく。従って、いくつかの十分に確立された遺伝的距離を再計算した。これによって、組換え頻度が有意に変化したか否かを決定する。分析により得られた大量の遺伝的データは、四分子分析を行うために、対で比較されなければならない。これらのデータ全部をMicrosoftExcel表計算フォーマットで管理し、Landsberg対立遺伝子を1の値に、そしてColumbia対立遺伝子を0の値に割り当てた。四分子において、1つの染色体上のマーカーの分離を、異なる染色体上のセントロメア連鎖参照遺伝子座と比較した以下の表2を参照のこと。各遺伝子座の値を適当な参照で掛け合わせ、そして各四分子についての結果を足すことによって、PD、NPD、およびTT四分子を、それぞれ2、0、および1の値で容易に区別した。この集団中の交差の位置をモニタリングすることは、セントロメアから組換えにより分離し得る染色体領域テトラ型、およびセントロメアと常に共分離する領域二型を同定したCopenhaverら、1988;Copenhaverら、1999。セントロメアでは、テトラ型頻度は0にまで減少した;結果として、セントロメア境界は、小さいが検出可能な数のテトラ型パターンを示す位置として規定された。約400の四分子におけるセントロメア連鎖マーカーの分離を記録することにより、セントロメア1~5を、それぞれ550kb、1445kb、1600kb、1790kb、および1770kbのコンティグに対応する物理的地図上の領域に位置決めした図3。さらに、各セントロメア間隔について、多数の有用な組換え体を同定した。分析の結果は、セントロメアが、組換え機構活性を制限する大きなドメイン内に存在すること、およびこれらのドメインと周囲の組換えに熟練したDNArecombination-proficientDNAとの間の転移が著しく急激であることを示した。180bp反復に対応する多形の分析RCENマーカー、Roundら、1997は、これらの反復が、遺伝的に規定されたセントロメア内にマッピングされることを確証した。180bp反復と関連した多形を、以前に記載Roundら、1997のようにパルスフィールドゲル電気泳動によって分析した。情報を与える交差を伴う四分子におけるこれらの多形の分離は、各セントロメアでの180bp反復アレイの完全な連鎖を確証した。遺伝単位において、セントロメア間隔は、平均して0.44cMであった組換え=1/2テトラ型頻度。このことは、組換え率が、221kb/cMのゲノム平均SomervilleおよびSomerville、1999;http://nasc.nott.ac.uk/new_ri_map.htmlを少なくとも10~30倍下回ったことを反映する。高等真核生物セントロメア近傍で代表的に観察される低い組換え頻度は、DNA改変またはクロマチン状態の異常に起因し得るChoo,1998;Puechberry、1999;MahtaniおよびWillard、1998;Charlesworthら、1986;Charlesworthら、1994。これらの状態を改変するために、そして従って組換え頻度を上昇させることによりセントロメアマッピング解像能を改善するために、F1Landsberg/Columbia植物を、DNA損傷を引き起こすこと、クロマチン構造を改変すること、またはDNA改変を変化させることが知られる一連の化合物の1つで処理した。F1Landsbergqrt1/Columbiaqrt1植物を、1’’平方ポットで24時間光下で生育し、そしてメタンスルホン酸エチルエステル0.05、5-アザ-2’-デオキシシチジン25または100mg/l、ゼオシンZeocin1μg/ml、メタンスルホン酸メチルエステル75ppm、cis-ジアミンジクロロ白金20μg/ml、マイトマイシンC10mg/l、n-ニトロソ-n-エチル尿素100μM、n-酪酸20μM、トリコスタチンA10μM、または3-メトキシベンズアミド2mMで処理した。植物に潅水し、そして花を有する茎をこれらの溶液中に浸漬した。あるいは、植物を350nmのUV7秒または10秒、または熱ショック38°Cまたは42°Cで2時間に曝露した。これらの植物由来の花粉四分子を使用して、各処理の3~5日後にLandsberg柱頭に受粉させた;続いて、F1植物をさらなる処理に供した1植物当たり5回まで、3~5日毎。処理植物由来の四分子を、Landsberg柱頭に交雑し、そして各処理に供した8~107四分子からの後代を回収し、そして分析し、600を超えるさらなる四分子を得た。サンプルサイズは、個々の処理が顕著な影響を有したかどうかを決定するには不充分であったが、これらの四分子は、セントロメアに直に隣接する領域においてより高い組換えを示したそれぞれ、未処理植物および処理植物において1.6対3.4組換え。セントロメアのマップ位置を、第2染色体から第5染色体上で精製した図1。これは、それぞれ880kb、1150kb、1260kb、および1070kbのコンティグが及ぶ間隔を生じ、全ての四分子が一貫して、同じ領域に対してセントロメア機能を位置付けしたCopenhaverら,1999。組換えを増大させる試みは、セントロメア近傍で交差を伴う多数の四分子を生じた;これらの交差は、セントロメア境界の狭い領域内に群がっていた。5つの交差がCEN2近傍の70kb領域にわたって起こり、そして7つが、CEN1近傍の200kb領域にわたって起こり、しかもそれぞれ880kbおよび550kbの近接したセントロメア間隔においては交差は検出されなかった図3。従って、セントロメアは、組換え機構活性を制限する大きなドメイン内で見出された;これらのドメインと周囲の組換えに熟練したDNAとの間の転移は、著しく急激である図12AおよびK。より多くの四分子の分析がさらなる組換え事象を生じたが、観察された交差分布は、セントロメア位置が、有意に精製されなかったことを示す。実施例5Arabidopsisセントロメアの配列分析A.セントロメア領域における遺伝子の量S.cerevisiaeにおいては、発現遺伝子は、1kbの必須セントロメア配列内に位置し、そしてS.pombeにおいては、多コピーのtRNA遺伝子は、セントロメア機能に必要である80kbフラグメント内に存在するKuhnら、1991。対照的に、高等真核生物のセントロメアにおいては、遺伝子は、著しい例外はあるが、比較的まれであると考えられる。Drosophilalight、concertina、responder、およびrolled遺伝子座の全てが、第2染色体のセントロメア領域にマッピングされ、そしてその本来のヘテロクロマチン背景からlightを取り出す転座が、遺伝子発現を阻害する。対照的に、ユークロマチンに通常存在する多くのDrosophila遺伝子およびヒト遺伝子は、それらがセントロメア近傍に挿入されたとき不活性となる。従って、セントロメア近傍に存在する遺伝子は、発現を可能にする特別な制御エレメントを有すると考えられるKarpen、1994;LoheおよびHilliker、1995。本明細書で提供されるArabidopsisCEN2およびCEN4の配列は、遺伝子密度および発現が、セントロメア位置および関連したクロマチンとどのように相関するかを理解するための強力な供給源を提供する。第II染色体および第IV染色体の注釈http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide.htmlは、CEN2およびCEN4内の、およびそれに近接した多くの遺伝子を同定した図8、図12A~12T。Arabidopsis染色体腕上における推定遺伝子の密度は、100kb当たり平均して25であり、そしてCEN2およびCEN4に隣接する反復リッチ領域では、それぞれ、これは、100kb当たり9遺伝子および7遺伝子にまで減少するBevanら、1999。多くの推定遺伝子はまた、組換えの不充分なrecombination-deficient遺伝的に規定されたセントロメア内に存在する。CEN2内では、100kb当たり5つの推定遺伝子が存在し;一方、CEN4は顕著に異なっており、100kb当たり12の遺伝子であった。推定セントロメア遺伝子のいくつかが転写されることの強力な証拠が存在した。ホスホエノールピルビン酸遺伝子CUE1は、1つのCEN5ボーダーを規定し;そしてこの遺伝子における変異は、光調節遺伝子発現において欠陥を引き起こすLiら、1995。CEN2およびCEN4の配列決定された部分内では、推定遺伝子の1727/160が、クローン化されたcDNAESTと95より大きい同一性を有し、CEN4において、CEN2においてよりも3倍大きくマッチングしたhttp://www.tigr.org/tdb/at/agad/。これらの遺伝子のうち24個が、複数のエキソンを有しており、そして4つが、既知の機能を有する単コピー遺伝子に対応する。同定された推定遺伝子のリストを以下の表3に示す。CEN4の境界内でコードされたさらなる遺伝子のリストを、表4に列挙する。これらの遺伝子の同定は、その遺伝子が、それ自体、独特の調節エレメントを含み得るか、またはセントロメア機能または遺伝子発現に関与する独特の制御または調節エレメントに隣接するゲノム位置に存在し得るという点で、有意である。特に、本発明者らは、ミニ染色体における選択した遺伝子への挿入のための、これらの遺伝子、またはこれらの配列の0~5kb上流または下流のDNA配列の使用を意図する。このようなエレメントは、セントロメアの独特の環境中にある場合でさえ、これらの遺伝子の発現の有益な調節制御をおそらく生じ得ることが期待される。残りの23の遺伝子がセントロメアで独特にコードされたか否かを調べるために、注釈付きのゲノムArabidopsis配列のデータベースにおいて検索を行った。2つの遺伝子を除いて、95より大きい同一性を有するホモログは、配列決定されたゲノムの80中のどの場所においても見出されなかった。単コピー遺伝子に対応する独立したcDNAクローンの数は、遺伝子発現のレベルの概算値を提供する。第II染色体上で、cDNAデータベースに対して高い質のマッチング95より大きい同一性を有する推定遺伝子が、平均して4つの独立したcDNAクローンとマッチングしたレンジ1~78。CEN2およびCEN4内では、27のうち11の遺伝子がこの平均を超える表3。最終的に、CEN2およびCEN4でコードされた遺伝子は、単一遺伝子ファミリーのメンバーではなく、しかもそれらは、セントロメア機能においてある役割を演じると推定される遺伝子にも対応せず、代わりに、多様な役割を有する。Arabidopsisセントロメア領域における多くの遺伝子は、早期の停止コドンまたは破壊されたオープンリーディングフレームに起因して機能的でないが、染色体腕上に偽遺伝子はほとんど見られなかった。これらの偽遺伝子の大部分は、可動エレメントに対して相同性を有するが、多くは、典型的には可動性ではない遺伝子に対応する図12I~Jおよび図12S~T。遺伝的に規定されたセントロメア内では、100kb当たり、1.0CEN2および0.7CEN4のこれらの非可動性偽遺伝子が存在した;セントロメアに隣接する反復リッチ領域はそれぞれ、100kb当たり1.5および0.9を有する。偽遺伝子および転移性エレメントの分布は重複しており、これらの領域におけるDNA挿入が遺伝子破壊に寄与したことを示す。B.セントロメアDNAの保存CEN2およびCEN4配列の保存を研究するために、PCRプライマー対を設計した。これらのプライマー対は、Columbia配列内の独特の領域に対応し、そして約20kbの間隔でLandsbergおよびColimbiaのセントロメア領域の調査に使用される図14A、B。分析に使用されたプライマーは、図15A、Bに列挙される。適切な長さの増幅産物を、大部分のプライマー対85に関して両方の生態型において得た。このことは、以下のことを示す。増幅された領域が高度に類似であることを示す。残りの場合、プライマー対は、ColumbiaDNAを増幅したが、LandsbergDNAを増幅しなかった非常に低いストリンジェンシーでさえも。これらの領域において、さらなるプライマーを設計し、非相同性の程度を決定した。CEN2におけるミトコンドリアDNAの大きな挿入の加えて、2つの他の非保存領域を同定した図14A、B。このDNAは、Landsbergセントロメアを含まないので、セントロメア機能のために必要であるようである;従って、セントロメア配列の関連する部分が、577kbCEN2および1250kbCEN4に減少した。LandsbergとColumbiaセントロメアとの間の高い程度の配列の保存は、以下のことを示した。組換え頻度の抑制は、非相同性の大きな領域に起因しないが、代わりにセントロメア自体の特性に起因することを示した。C.CEN2とCEN4との間の配列類似性セントロメア機能を識別するために、CEN2とCEN4との間の新規の配列モチーフついて検索を行った。レトロエレメント、トランスポゾン、特徴付けられたセントロメア反復、および可動性遺伝子に似ているコード配列の比較を除いて検索を行った。単純な反復配列ホモポリマートラクトtractおよびミクロサテライトを含むを覆った後、CEN2およびCEN4について417kbおよび851kbをそれぞれ測定する独特の配列のコンティグをBLASTを用いて比較したhttp://blast.wustl.edu。この比較は、以下のことを示した。セントロメア領域内の複合DNAは、全体配列の長さに渡って相同ではなかったことを示した。しかし、CEN2における16のDNAセグメントは、60以上の同一性でCEN4の11の領域に一致したことを示した図16。この配列は、関連した配列のファミリーにグループ化され、そしてAtCCS1~7Arabidipsisthalianaセントロメア保存配列1~7が設計された。これらの配列は、Arabidopsisゲノムにおいて反復されると以前に公知ではなかった。この配列は、合計17kb4のCEN2DNAを含み、1017bpの平均の長さを有した。そして65のATの含量であった。類似性に基づいて、一致する配列を、各々が8の配列AtCCS1およびAtCCS2;配列番号1~14、3の配列推定オープンリーディングフレームをコードする小さなファミリー由来AtCCS3;配列番号21~22、ならびに4の配列セントロメア内に一度見出されたAtCCS-AtCCS7;配列番号15~20、予測されたCEN2およびCEN4タンパク質に対応する配列の1つエキソンおよびイントロン全体に渡った類似性を有するAtCCS6;配列番号17を含む2つのファミリーを含む群に分類された図16。Arabidopsisゲノム配列データベースの検索は、以下のことを実証した。セントロメアおよびセントロメア周囲の領域において出現するAtCCS1~AtCCS5が、中程度に反復した配列であったことを実証した。この残りの配列は、遺伝的に定義されるセントロメアのみに存在する。全ての16のS.cerevisiaeセントロメアの同様の比較は、以下を定義した。保存された8bpのCDEIモチーフ、ATリッチな85bpのCDEIIエレメント、および7の高度に保存されたヌクレオチドを有する26bpのCDEII領域からなるコンセンサスを定義したFleigら、1995。対照的に、3つのS.pombeセントロメアの調査は、全体のセントロメア構造の保存を明らかにしたが、広く保存されたモチーフを明らかにしなかったClark、1998。実施例6マッピングの結果:Arabidopsis第1~5染色体第1染色体上のセントロメアをmi34356.7cMとT27K1259.1cMとの間にマッピングした。より洗練された位置は、マーカーT22C23-t7約58.3cMとT3P8-sp6約59.1cMとの間に、セントロメアを配置する。この間隔に含まれるのは、以前に記載されたマーカーEKRIVおよびRCEN1であった。第2染色体上のセントロメアをmi31018.6cMとg413323.8cMとの間にマッピングした。より洗練された位置は、マーカーF5J15-sp6約19.1cMとT15D9約19.3cMとの間に、セントロメアを配置する。以下の配列決定されたhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide.htmlBAC細菌人工染色体クローンは、以下のために公知である。マーカーF5J15-sp6とT15D9との間の領域T13E11、F27C21、F9A16、T5M2、T17H1、T18C6、T5E7、T12J2、F27B22、T6C20、T14C8、F7B19およびT15D19を測定するために公知である。T12JとF27B22との間に、BAC適用範囲におけるギャップが存在する。RARE切断、パルスフィールドゲルpulsefiedlgelまたはDNA配列タイリングtilingが、使用され、配列決定のためのギャップにおけるDNAを単離する。第3染色体上のセントロメアを、atpox48.6cMとATA53.8cMとの間にマッピングした。より洗練された位置は、マーカーT9G9-sp6約53.1cMとT5M14-sp6約53.3cMとの間にセントロメアを配置された。この間隔内に含まれるのは、以前に記載されたマーカーRCEN3である。第4染色体上のセントロメアをmi23318.8cMとmi16721.5cMとの間にマッピングした。より洗練された位置は、マーカーT24H24.30k3約20.3cMとF13H14-t7約21.0cMとの間にセントロメアを配置する。以下の配列決定されたhppt://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide.htmlBAC細菌人工染色体クローンは、マーカーF5J15-sp6とT6A13-sp6T27D20、T19B17、T26N6、F4H6、T19J18、T4B21、T1J1、T32N4、C17L7、C6L9、F6H8、F2I12、F14G16、およびF28D6との間の領域を測ることが公知である。F2I12とF14G16との間のBAC切断内のギャップが存在する。RARE切断、パルスフィールドゲルまたはDNA配列タイリングが使用され、配列決定のためのギャップ内のDNAが単離される。第5染色体上のセントロメアをnga7671.6cMとPhyC74.3cMとの間にマッピングした。より洗練された位置はマーカーF13K20-t7約69.4cMとCUE1約69.5cMとの間にセントロメアを配置する。この間隔に含まれるのは、公に利用可能なマーカー、um579D、mi291b、CMs1である。所定の第1~5染色体上のセントロメア内に位置することが公知のBACクローンを示す表、ならびにこれらのクローンの配列についてのGenbank目録番号を以下の表5および表6に示す。ListerandDeanRecombinantInbredGeneticmapに対応する遺伝的な位置すなわち、cM値は、http://nasc.nott.ac.uk/new_ri_map.htmlでオンラインで利用可能である。マーカーは、http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/abuoutcaps.htmlで利用可能である。実施例7セントロメアの機能を試験するためのBACベクターの構築BACクローンは、1つ以上の植物テロメアおよび選択マーカーを用いて、Agrobacterium形質転換に必要なDNAエレメントと一緒になって逆根管充填retrofittingされ得る図9。この方法は、任意のBACクローンを植物細胞に送達する手段を提供し、セントロメアの機能について試験する。この方法は、以下の方法で働く。転換ベクターは、逆根管充填カセットを含む。この逆根管充填カセットは、Tn10、Tn5、Tn7、Muまたは他の転移性エレメントに隣接しており、そして複製起点およびAgrobacteriumのための選択マーカー含み、植物テロメアアレイ、続いて、T-DNA右および左ボーダー、続いて第2の植物テロメアアレイ、および植物選択マーカー図9を含む。この転換ベクターは、標的BACを保有するE.coli株に形質転換され得る。次いで、逆根管充填カセットに隣接する転移性エレメントは、カセットのBACクローンへの転移をランダムに媒介する。この逆根管充填されたBACクローンは、今や適切なAgrobacteriumの株に形質転換され、次いで植物再に形質転換され得る。ここで高度のフィデリティーfidelityの減数分裂および有糸分裂の伝達ついて試験され得、この伝達は、このクローンが完全な機能性植物セントロメアを含んだことを示す。実施例8植物ミニ染色体の構築ミニ染色体を以下のように構築する。以前に単離された必須の染色体エレメントを組み合わせることによって構築する。例示的なミニ染色体ベクターとしては、シャトルベクターであるように設計されたベクターが挙げられる。シャトルベクターは、すなわち簡便な宿主例えば、E.coli、Agrobacterium、または酵母ならびに植物細胞において維持され得る。A.ミニ染色体の構築のための一般的な技術ミニ染色体は、E.coliまたは他の細菌細胞において、環状分子として維持され得る。テロメア配列ブロックの間の移動性stufferフラグメントと配置することによって維持され得る。このstufferフラグメントは、不必要なDNA配列であり、独特の制限部位に隣接する。このフラグメントは、環状DNAの制限消化によって除去され、テロメア末端を有する直鎖状分子を作製する。次いで、この直鎖状ミニ染色体は、例えばゲル電気泳動によって単離され得る。stufferフラグメントおよび植物テロメアに加えて、ミニ染色体は、複製起点および選択マーカーを含む。選択マーカーは植物において機能し得、環状分子が細菌細胞において維持されることを可能にする。ミニ染色体はまた、植物選択マーカー、植物セントロメア、および植物ARSを含み、植物細胞においてDNA分子の複製および維持が可能である。最後に、ミニ染色体はいくつかの独特の制限部位を含み、ここでさらなるDNA配列挿入物がクローン化され得る。例えば、ミニ染色体の物理的な構築の最も迅速な方法、すなわち種々の必須のエレメントの連結は、総合すると例えば、当業者に明瞭である。多数のミニ染色体ベクターが、現在の発明者によって設計され、そして本明細書中に例示の目的で開示されている図7A~図7H。しかし、これらのベクターは限定ではなく、当業者に明らかなように、多くの変化および変更がなされ得、そしてさらに機能的ベクターが得られ得る。B.ミニ染色体の構築のための変更された技術2段階の工程の方法が、ミニ染色体の構築のために開発された。この方法は、セントロメアDNAを含むBACクローンに必須のエレメントを加えることを可能にする。これらの手順は、インビボで起こり得、染色体の切断の問題を排除する。この染色体の切断の問題は、しばしば試験管内で生じる。この技術の詳細および利点は、以下のようである:11つのプラスミドは、作製され得る。このプラスミドはマーカー、Agrobacteriumの転移のための起点および植物におけるボーダー配列、選択およびスクリーニングのためのマーカー、植物テロメア、およびloxP部位またはインビボまたはインビトロでの部位特異的組換えに有用な他の部位を含む。第2のプラスミドは、BACクローンであり得、入手可能なゲノムライブラリーより単離される図11A。2単一のE.coli内でか、または試験管内でのいずれかで2つのプラスミドが混合され、そして部位特異的組換えcreが導入される。これは2つのプラスミドがloxP部位で融合することを引き起こす図11B。3必要であるとみなされる場合、有用な制限部位AseI/PacIまたはNotIは、過剰の物質例えば、他の選択マーカーまたは複製起点を除去するために含まれる。4変異は、KanR遺伝子有するか、または有さない図11B、11C、LAT52GUS遺伝子有するか、または有さない、LAT52GFP遺伝子を含み、そしてGUS遺伝子を含む図11C、11Dおよび11E。他の植物プロモーターの制御下で。C.安定な組み込まれないミニ染色体の調製方法ミニ染色体が宿主ゲノム内に組み込まれないことを確認するための技術が開発された図11F。特に、ミニ染色体は、宿主の染色体とは別の異なるエレメントとして維持されなければならない。導入されたミニ染色体が組み込まれないことを確認するために、本発明者らは、以下の多様性を想像する。この多様性は、致死植物遺伝子をコードする例えば、ジフテリアdiptheria毒素または任意の他の遺伝子産物発現された際に、植物に致死を引き起こす。この遺伝子は、右Agrobacteriumボーダーとテロメアとの間に位置し得る。植物核に入り、そして宿主染色体に組み込まれるミニ染色体は、致死を生じる。しかし、ミニ染色体が別のままである場合、そしてさらにこの構築物の端がテロメアまで分解される場合、致死遺伝子が除去され、そして細胞は生存する。実施例9二セントロメア染色体の分析によるセントロメア活性のインビボスクリーニング方法を、セントロメア活性のスクリーニングのために設計した図10。この方法において、植物は、2成分のBACクローン遺伝的に定義されたセントロメア領域のDNAを含むで初め形質転換される。DNAが宿主染色体中に組み込まれることを可能にすることによって、この組み込みが2つのセントロメアを有する染色体を生じると期待される。これは不安定な状況である。この状況は、しばしば染色体の破損につながる。有糸分裂および減数分裂減少の間に、逆の極に引かれる場合、2以上の機能的セントロメアを保有する単一の染色体が、2つのセントロメアの間での接合部で頻繁に破損するように、染色体の破損につながる。これは、重い増殖欠失および生存不能な子孫に引き起こし得る。細胞プロセスおよび発達プロセスに重要な、または必須な遺伝子が、破損現象によって破壊される場合に。従って、セントロメア機能を有する領域は、クローンの探索によって同定され得る。ここでこのクローンは、宿主植物に導入される際に、任意の以下の予測された特性を示す:形質転換の減少された効率;形質転換された植物が、異常なセクターおよび増加した致死を示すように天然の染色体に組み込まれた際の遺伝的不安定性の因果関係;特に形質転換された植物が、導入遺伝子の維持について選択しない条件下で増殖する際の維持の困難;染色体の遠位の先端でか、またはセントロメア領域でゲノムに組み込まれる傾向。対照的に、非セントロメアDNAを含むクローンは、よりランダムなパターンを組み込むと予測される。生じる組み込みの分布およびパターンの確認は、挿入されたDNAの末端の配列決定によって決定され得る。スクリーニングを、BiBACライブラリー2成分の細菌人工染色体においてセントロメアDNAをコードする100kbより大きいクローンの同定によって行ったHamilton、1997。これは、セントロメア由来のDNAをコードするクローンについてのBiBACゲノムライブラリーを含むスクリーニングフィルターによってなされる図10、工程1。BiBACベクターが使用されるのは、Arabidopsisゲノム物質の大きな挿入物を含み得るからであり、またAgrobacterium媒介形質転換に必要な2成分の配列をコードするからである。次いで、BiBACベクターを含むセントロメア配列を、Agrobacterium媒介形質転換によって直接染色体に組み込んだ図10、工程2。コントロールとして、非セントロメアDNAを含むBiBAC構築物をまた、形質転換に使用した。セントロメア機能を有する配列を保有するBiBACは、二セントロメア染色体の形成を生じる。形質転換された植物由来の子孫は、以下について分析される。二セントロメア染色体の形成に起因する染色体の破壊に寄与する生育不能および全体の形態学的な差について分析される図10、工程3。非セントロメア配列は、野生型植物との表現型の差をほとんど示さないと予測される。実施例10増加した組換えのための処理での洗練されたセントロメアマッピングArabidopssthalianaにおけるセントロメアについてのより洗練されたマップ位置を達成するために、種々の化学および環境処理を使用し、組換えを刺激した。これらの処理を、四分子セットの植物を作製するために達成された交雑種crossの花粉ドナーに使用した実施例2を参照のこと。花粉ドナー植物を、1インチ四方のポットに個別に植え、そして開花まで24時間の光で生育室で生長させた。次いで開花植物を以下の溶液の1つに漬け、そして50mlの同じ溶液で灌漑した。処理の後、次いで植物を生育室に戻し、そして標準条件下で2~5日育てた。次いで花粉を、新しく開いた花より収集し、そして使用し、実施例2に記載されるように柱頭を受粉させた。次いで花粉ドナー植物を再び上記のように処理し、そして別の回の受粉に使用した。花粉ドナー植物は、代表的に5~10回の処理および花粉の収集に供された。処理をまた、非化学試薬を使用して行った。上記のように、処理を使用し、Arabidopsisにおけるセントロメアについてのより洗練されたマップの位置を、さらなる花粉ドナー植物において組換えを刺激することによって達成した。処理は以下のようであった。水で満たされた浅い皿に花粉ドナー植物を含むポットを配置することによって乾燥を防ぐために、ヒートショック処理を行った。そして適切な温度の生育機に植物を含む皿を配置した。花粉ドナー植物を、BioRadUVチャンバーに配置することによって、UV照射を行い、そして異なる量の時間、適切な波長で植物を照射した。UV植物およびヒートショック植物の両方を、何回かの処理および花粉の収集に供した。ガンマ放射源コバルト-60に曝露した植物を1度のみ処理し、次いで有害な染色体の再編成の蓄積を防ぐために処分した。処理の後、次いで植物を生育室に戻し、そして標準条件下で2~5日生育した。次いで花粉を新しく開いた花より収集し、そして実施例2に記載のように感受性の柱頭を受粉するために使用した。次いで花粉ドナー植物を再び、上記のように処理し、そして別の回の受精に使用した。花粉ドナー植物は、代表的に5~10回の処理および花粉の収集に供された。結果を以下の表9に示す。実施例11遺伝性遺伝子移入の促進本発明者よって、以下のこともまた企図される。遺伝子移入を促進するために組換えを刺激する技術または処理を使用し得ることも、企図される。遺伝子移入は、育種技術を記述し、これによって1つ以上の所望の形質が別の系統Bから1つの系統Aに、移される。次いでこの形質は、同じ系統Aへの一連の戻し交配によって所望の系統Aの遺伝的バックグラウンドに単離される。所望の遺伝的バックグラウンドにおける所望の形質を単離するために必要とされる多数の戻し交配は、各戻し交配における組換えの頻度に依存する。戻し交配は、特定の所望の形質を、1つの供給源から近交系またはその形質がない他の植物に転移する。これは、例えば、以下のように初めに交配することによって、達成され得る。優位な近交系A反復性の親を、ドナー近交系非反復性の親と交配することによって。それらは、問題の形質のための適切な遺伝子例えば、本発明に従って調製された構築物を保有する。この交配の子孫は、反復性の子孫において、所望の性質非反復性の親から移されるについて最初に選択され、次いで選択された子孫は、優位な反復性の親Aに戻し交配される。所望の性質についての選択された5以上の戻し交配世代の後、その子孫は、移された特徴を調整する座についてヘミ接合であるが、大部分か、またはほとんど全ての他の遺伝子について優位な親と似ている。最後の戻し交配世代を自家受粉し、子孫を得る。その子孫は、移された遺伝子について純粋育種であるすなわち、1つ以上の形質転換現象。従って、一連の育種操作を通じて選択された導入遺伝子は、1つの系統から、全く異なる系統に、さらなる組換え操作の必要もなく移動され得る。導入遺伝子は、以下において役立つ。代表的に、任意の他の遺伝子として遺伝的に振舞う際に役立つ。そして任意の他のコーンcorn遺伝子に同一な様式における育種技術によって操作され得る。従って、1以上の導入遺伝子を本当に育種する近交系植物を産生し得る。異なる近交系植物との交配によって、異なる導入遺伝子の組み合わせを有する多数の異なるハイブリッドを産生し得る。この様式において、ハイブリッドと頻繁に関連する所望の農学特性ハイブリッド効力ならびに1以上の導入遺伝子によって与えられる所望の特徴を有する植物が、産生され得る。育種はまた、全体のミニ染色体を1つの植物から別の植物に移すために使用され得る。例えば、ミニ染色体を有する第1の植物を、ミニ染色体を有さない第2の植物交配させることによって、この交配の任意の世代の子孫が得られ得る。この子孫は、ミニ染色体を有するか、または任意のさらなる数の所望のミニ染色体を有する。一連の戻し交配を通じて、植物が得られ得る。この植物は、第2の植物の遺伝的バックグラウンドを有するが、しかし第1の植物由来のミニ染色体を有する。本明細書中で開示および請求された全ての組成物および方法が、本開示の観点における過度の実験法を有さないでなされ得、そして作成され得る。本発明の組成物および方法が、好ましい実施形態の用語において記載されるが、当業者には以下のことが明瞭である。変更が、本発明の、概念、精神および範囲から逸脱しないで以下に適用され得ることが明瞭ある。本明細書中に記載される組成物ならびに方法に適用され得、そして本明細書中に記載される工程または方法の工程の順序に適応され得ることが明瞭である。より具体的には、以下のことが明らかである。化学的および生理的の両方に関連した特定の薬剤が、本明細書中に記載される薬剤と置換され得るが、しかし、同じか、または類似の結果が達成され得ることが明らかである。当業者に明瞭なすべてのこのような類似の置換および変更は、添付の請求項によって定義されるように本発明の精神、範囲および概念内である。参考文献以下の参考文献は、それらが本明細書中に示される例示的な手順または他の詳細な補遺を提供する程度まで、本明細書中に参考として援用される。"