"CD20抗原に対するモノクローナル抗体であって、ここで、その軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号5と少なくとも99同一性を共有する配列によってコードされ、その重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号7と少なくとも99同一性を共有する配列によってコードされ、そしてその軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来の定常領域である、抗体。その軽鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列配列番号5またはマウス核酸配列配列番号25によってコードされ、その重鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列配列番号7によってコードされ、そしてその軽鎖および重鎖の定常領域が、非マウス種由来の定常領域である、請求項1に記載の抗体。その軽鎖の各々および重鎖の各々の定常領域がヒト定常領域である、請求項1又は2に記載の抗体。その軽鎖の各々の定常領域がκタイプのものである、請求項1から3のいずれかに記載の抗体。その重鎖の各々の定常領域がγタイプのものである、請求項1から4のいずれかに記載の抗体。その重鎖の各々の定常領域がγ1タイプである、請求項5に記載の抗体。その重鎖の各々の定常領域がγ1タイプのものであり、そしてヒト核酸配列配列番号23によってコードされ、そしてその軽鎖の各々の定常領域がヒト核酸配列配列番号21によってコードされる、請求項6に記載の抗体。その軽鎖の各々が、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号13またはマウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号27によってコードされ、そしてその重鎖の各々が、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号19によってコードされる、請求項1から7のいずれかに記載の抗体。配列配列番号13からの推定ペプチド配列が、配列配列番号14であり、そして配列配列番号19からの推定ペプチド配列が、配列配列番号20である、請求項8に記載の抗体。配列配列番号27からの推定ペプチド配列が、配列配列番号28であり、そして配列配列番号19からの推定ペプチド配列が、配列配列番号20である、請求項8に記載の抗体。ラットハイブリドーマ細胞株によって産生された、請求項1から10のいずれかに記載の抗体。ラットハイブリドーマYB2/0細胞株ATCC番号CRL-1662でAmericanTypeCultureCollectionにおいて登録された、細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20において産生された、請求項11に記載の抗体。請求項1~12のいずれかに記載の抗体を発現する安定細胞株。SP2/0、YB2/0、IR983F、Namalwaヒト骨髄腫、PERC6、CHO株、特に、CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHOPro-5、CHOdhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag14、およびP3X63Ag8.653からなる群から選択される、請求項13に記載の安定細胞株。免疫エフェクター細胞中のFcγRIIIA受容体のインビトロ活性化のための、請求項1~12のいずれかに記載の抗体の使用。薬物としての使用のための、請求項1~12のいずれかに記載の抗体。白血病またはリンパ腫の治療用の薬物の製造のための、請求項1~12のいずれかに記載の抗体の使用。急性Bリンパ芽球性白血病acuteBlymphoblasticleukaemia、B細胞リンパ腫Bcelllymphoma、成熟B細胞リンパ腫matureBcelllymphoma、例えば、B型慢性リンパ性白血病BtypeChronicLymphocyticLeukaemiaB-CLL、小細胞性B細胞リンパ腫smallBcelllymphoma、B細胞前リンパ性白血病Bcellprolymphocyticleukaemia、リンパ球プラズマ細胞性リンパ腫lymphoplasmocyticlymphoma、マントル細胞リンパ腫mantlecelllymphoma、濾胞性リンパ腫follicularlymphoma、辺縁層MALT型リンパ腫marginalzoneMALTtypelymphoma、単球様B細胞を含むまたは含まないリンパ節辺縁層リンパ腫lymphnodemarginalzonelymphomawithorwithoutmonocytoidBcells、脾性辺縁層リンパ腫絨毛性リンパ球を含むまたは含まないsplenicmarginalzonelymphoma、トリコロイコサイティック白血病tricholeucocyticleukaemia、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫diffuselargeBcelllymphoma、バーキットリンパ腫Burkitt’slymphoma、ならびに自己免疫疾患を含む、Bリンパ系細胞が関与する任意の免疫不全疾患からなる群から選択される病状の治療用の薬物を製造するための、請求項1~12のいずれかに記載の抗体の使用。リンパ性白血病の治療用の薬物の製造のための、請求項1~12のいずれかに記載の抗体の使用。B型慢性リンパ性白血病BtypeChronicLymphoidLeukaemiaB-CLLの治療用の薬物の製造のための、請求項1~12のいずれかに記載の抗体の使用。慢性移植片対宿主病の治療用の薬物の製造のための、請求項1~12のいずれかに記載の抗体の使用。臓器特に、腎臓移植片拒絶の治療用の薬物の製造のための、請求項1~12のいずれかに記載の抗体の使用。白血病またはリンパ腫の治療用の薬物の製造のための、リンパ系細胞において発現される1以上のさらなる抗原に対する1以上のさらなる抗体と組み合わせての、請求項1~12のいずれかに記載の抗体の使用。リンパ系細胞において発現される前記抗原が、HLA-DR、CD19、CD23、CD80、CD22、CD32およびCD52から選択されることを特徴とする、請求項23に記載の抗体の使用。白血病またはリンパ腫の治療用の薬物の製造のための、FcγRsを発現する細胞、例えば、NKナチュラルキラー細胞、NKTナチュラルキラーT細胞、Tγδリンパ球、マクロファージ、単球または樹状細胞と組み合わせての、請求項1~12のいずれかに記載の抗体の使用。この目的を持って、本出願人は、リツキサンRituxan登録商標と比較して特に高いADCC活性を示す新規のCD20抗体を開発した。説明したがって、本発明の第1目的は、CD20抗原に対するモノクローナル抗体に関し、ここで、軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号5と少なくとも70同一性を共有する配列によってコードされ、重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号7と少なくとも70同一性を共有する配列によってコードされ、そして軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来の定常領域である。抗体は、ジスルフィド結合によって共に連結された重鎖および軽鎖から作製される。各鎖は、N末端位における、該抗体が指向されるdirectedagainst抗原に対して特異的な可変領域またはドメイン軽鎖については再構成されたV-J遺伝子および重鎖についてはV-D-J遺伝子によってコードされると、C末端位における、定常領域軽鎖については単一のCLドメインまたは重鎖についてはいくつかのドメインから作製されるとから作製される。本発明の目的のために、表現モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体組成物は、同一かつ独特の特異性を有する抗体分子の調製物を指す。軽鎖および重鎖における可変領域が軽鎖および重鎖の定常領域のそれとは異なる種由来である、本発明に従う抗体は、キメラ抗体と呼ばれる。マウス核酸配列配列番号5および配列番号7は、それぞれ、DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbHDSMZにおいて番号ACC474で入手可能な、マウスハイブリドーマCAT-13.6E12によって産生される抗体の軽鎖の各々の可変ドメインおよび重鎖の各々の可変ドメインをコードする。このハイブリドーマは、CD20に対するマウスIgG2a,κ-タイプモノクローナル抗体を産生する。これらのマウス配列は、本発明に従う抗体の可変領域の配列を得るために選択され、何故ならば、CD20抗原該抗原は、リツキサン登録商標によっても認識されるについてのCAT-13.6E12マウス抗体の特異性のためである。本発明に従う抗体の可変領域は、配列配列番号5および配列番号7と少なくとも70同一性を共有し、この配列同一性は、本発明に従う抗体に、CAT-13.6E12マウス抗体のそれと同一である特異性を提供する。好ましくは、この配列同一性はまた、本発明に従う抗体に、CAT-13.6E12マウス抗体のそれと同一である標的に対する親和性を提供する。さらに、本出願人は、驚くべきことに、CAT-13.6E12マウス抗体は、FcγRIIIA受容体のエクトドメインを発現するジャーカット-CD16細胞JurkatCD16cellsの存在下でIL-2の分泌を誘発する能力を有することを示し図11に示される通り、これは、該マウス抗体とヒトCD16FcγRIIIAとの強力な結合を示し、このことも、本出願人がした選択を動機付けた。さらに、本発明に従う抗体において、軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来である。この点において、全ての非マウス哺乳動物種speciesおよび科families、特に、ヒト、サル、マウスmurineネズミmice以外、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌならびにトリが使用され得る。本発明に従う抗体は、当業者に周知の、標準的な組換えDNA技術を使用して、そしてより具体的には、例えばMorrisonetalProcNatlAcadSciUSA8168516855ここで、組換えDNA技術は、非ヒト哺乳動物由来の抗体における重鎖の定常領域および/または軽鎖の定常領域を、ヒト免疫グロブリンにおける対応の領域で置換するために使用されているに記載される、キメラ抗体作製技術を使用して、作製され得る。1つの特定の実施形態を以下に例示する。有利には、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号5と少なくとも80同一性を共有する配列によってコードされ、そして本発明に従う抗体の重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号7と少なくとも80同一性を共有する配列によってコードされる。有利には、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号5と少なくとも90同一性を共有する配列によってコードされ、そして本発明に従う抗体の重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号7と少なくとも90同一性を共有する配列によってコードされる。有利には、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号5と少なくとも95同一性を共有する配列によってコードされ、そして本発明に従う抗体の重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号7と少なくとも95同一性を共有する配列によってコードされる。有利には、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号5と少なくとも99同一性を共有する配列によってコードされ、そして本発明に従う抗体の重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号7と少なくとも99同一性を共有する配列によってコードされる。有利には、本発明はまた、前記重鎖および軽鎖の可変領域が、1以上のアミノ酸の1以上の置換、挿入または欠失を含む任意の抗体に関し、但し、これらの配列修飾は、標的に対する抗体の特異性または親和性に影響を与えること無しに、上記で規定した配列同一性パーセンテージレベルに適合する。本発明の抗体はまた、FRフレームワーク領域骨格backbone領域としても公知の、可変領域の高度に保存された領域と結合された、CAT-13.6E12抗体のCDR相補性決定領域を含む任意の抗体である。このような抗体は、CAT-13.6E12マウス抗体のそれと非常に類似している、そして好ましくは同一である、親和性および特異性を有する。好ましくは、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号5またはマウス核酸配列配列番号25によってコードされ、そして本発明に従う抗体の重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号7によってコードされる。したがって、本発明の1実施形態において、本発明に従う抗体は、CD20抗原に対するモノクローナル抗体であり、ここで、軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号5によってコードされ、重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号7によってコードされ、そして軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来の定常領域である。したがって、第2の実施形態において、本発明に従う抗体は、CD20抗原に対するモノクローナル抗体であり、ここで、軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号25によってコードされ、重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列配列番号7によってコードされ、そして軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来の定常領域である。両方の実施形態において、抗体は、それらのヌクレオチド配列において、単一ヌクレオチド異なる:それぞれシトシンおよびアデニンに対応する、配列番号5および配列番号25における318位に局在するヌクレオチド。これらの実施形態に従う本発明の抗体は、標的抗原CD20について特異性および親和性を有し、これらは、CAT-13.6E12マウス抗体のそれらに匹敵しており、そして好ましくは同一である。好ましくは、本発明に従う抗体の軽鎖の各々および重鎖の各々の定常領域は、ヒト定常領域である。本発明のこの好ましい実施形態において、抗体の免疫原性は、ヒトにおいて減少され、そしてしたがって、該抗体の有効性は、ヒトに対する治療投与の際に改善される。本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体の軽鎖の各々の定常領域は、κタイプのものである。任意のアロタイプ、例えば、Km1、Km1、2、Km1、2、3またはKm3が本発明の実施に好適であり、しかし好ましいアロタイプはKm3である。別のさらなる実施形態によれば、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の定常領域は、λタイプのものである。本発明の1つの特定の局面によれば、そして特に、本発明に従う抗体の軽鎖の各々および重鎖の各々の定常領域がヒト領域である場合、該抗体の重鎖の各々の定常領域は、γタイプのものである。この実施形態alternativeによれば、該抗体の重鎖の各々の定常領域は、γ1、γ2またはγ3タイプのものこれら3つの定常領域タイプは、ヒト補体に結合するという特徴を示す、あるいはγ4タイプのものでさえあり得る。重鎖の各々についてγタイプ定常領域を有する抗体は、IgGクラスに属する。免疫グロブリンGIgGは、ジスルフィド結合によって共に連結された、2つの重鎖および2つの軽鎖から構成されたヘテロ二量体である。各鎖は、N末端位においては、抗体が指向される抗原に特異的な可変領域またはドメイン軽鎖については再構成されたV-J遺伝子および重鎖についてはV-D-J遺伝子によってコードされるから、そしてC末端においては、定常領域軽鎖については単一のCLドメインから、あるいは重鎖については3つのドメインCH1、CH2およびCH3から構成されるから、構成されている。可変ドメインならびに重鎖のCH1ドメインおよび軽鎖のCLドメインを結合させることにより、Fabフラグメントが構成され、これらは、高度にフレキシブルなヒンジ領域を介してFc領域へ連結されており、各Fabフラグメントをその抗原標的へ結合させ、一方、抗体のエフェクター特性についてのメディエーターである、Fc領域は、FcγRおよびC1q受容体等のエフェクター分子へアクセス可能な状態のままである。CH2球状ドメインおよびCH3球状ドメインの両方から構成されるFc領域は、CH2ドメインでグリコシル化されており、Asn279へ連結されたラクトサミン型二分岐N-グリカンlactosaminetypebiantennaryNglycanが、前記2つの鎖の各々に存在している。好ましくは、前記抗体の重鎖の各々の定常領域はγ1タイプのものであり、何故ならば、このような抗体は、最も多数のヒト個体においてADCC活性を誘発する能力を示すためである。この点で、任意のアロタイプ、例えば、G1m3、G1m1、2、17、G1m1、17またはG1m1、3が、本発明の実施のために好適である。好ましくは、アロタイプはG1m1、17である。本発明の1つの特定の局面によれば、前記抗体の重鎖の各々の定常領域は、γ1タイプのものであり、そしてヒト核酸配列配列番号23によってコードされ、軽鎖の各々の定常領域は、ヒト核酸配列配列番号21によってコードされる。したがって、このような抗体は、マウス可変領域と、γ1タイプ重鎖を含むヒト定常領域とを含む。したがって、この抗体は、IgG1サブクラスに属する。本発明に従う抗体の該実施形態によれば、該抗体は、2つの軽鎖[これらの可変ドメインは、マウス核酸配列配列番号5またはマウス核酸配列配列番号25によってコードされ、これらのヒト定常領域は、核酸配列配列番号21によってコードされる]、ならびに2つの重鎖[これらの可変ドメインは、マウス核酸配列配列番号7によってコードされ、そしてこれらの定常領域は、ヒト核酸配列配列番号23によってコードされる]を有する。優先的には、本発明に従う抗体の軽鎖の各々は、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号13またはマウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号27によってコードされ、そして重鎖の各々は、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号19によってコードされる。前記抗体の軽鎖の各々をコードするマウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号13は、前記抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列配列番号5を、前記抗体の軽鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列配列番号21に融合することによって得られる。前記抗体の軽鎖の各々をコードするマウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号27は、前記抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列配列番号25を、前記抗体の軽鎖の定常領域をコードするヒト核酸配列配列番号21に融合することによって得られる。前記抗体の重鎖の各々をコードするマウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号19は、前記抗体の重鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列配列番号7を、前記抗体の重鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列配列番号23に融合することによって得られる。本発明の特定の局面によれば、前記抗体の軽鎖の各々が、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号13によってコードされ、そして重鎖の各々が、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号19によってコードされる場合、核酸配列配列番号13から推定される軽鎖の各々のペプチド配列は、配列配列番号14であり、そして核酸配列配列番号19から推定される重鎖の各々のペプチド配列は、配列配列番号20である。本発明のさらに特定の局面によれば、前記抗体の軽鎖の各々が、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号27によってコードされ、そして重鎖の各々が、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号19によってコードされる場合、核酸配列配列番号27から推定される軽鎖の各々のペプチド配列は、配列配列番号28であり、そして核酸配列配列番号19から推定される重鎖の各々のペプチド配列は、配列配列番号20である。ペプチド配列配列番号14および配列番号28は、これら2つの配列上の106位に存在するアミノ酸だけが異なる。106位に局在するアミノ酸は、配列配列番号28においてはリシンKであり;それは、配列配列番号14においてはアスパラギンNである。本発明はまた、マウス-ヒトキメラ核酸配列によってコードされる軽鎖の各々が、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号13と少なくとも70相同性または同一性を共有し、そして、マウス-ヒトキメラ核酸配列によってコードされる重鎖の各々が、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号19と少なくとも70相同性または同一性を共有する、抗体に関し、これらの修飾は、該抗体特異性にも、あるいはADCC抗体依存性細胞媒介細胞傷害性AntibodyDependentCellmediatedCytotoxicity活性等のそのエフェクター活性effectoractivitiesにも悪影響を与えない。特に有利な様式において、本発明の抗体は、ラットハイブリドーマ細胞株によって産生される。本発明に従う抗体を産生する該株は、重要な特徴であり、何故ならば、それは、その特定の性質の確認certainを該抗体に提供するからである。実際に、抗体の発現方法は、翻訳後修飾、特にグリコシル化修飾これは、細胞系ごとに変化し得るを誘発し、そしてしたがって、同一の一次構造を有する抗体に異なる機能的特性を提供する。好ましい実施形態において、抗体は、ラットハイブリドーマYB2/0細胞株ATCC番号CRL-1662でAmericanTypeCultureCollectionにおいて登録された、細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20において産生される。この株は、例えばCHO細胞において産生される同一の一次構造を有する抗体と比較して改善されたADCC活性を有する抗体を産生するその能力のために、選択された。特定の実施形態によれば、本発明に従う好ましい抗体は、CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismesCNCMInstitutPasteur25rueduDocteurRoux75724ParisCedex15Franceにおいて、登録番号CNCMI-3314で、2004年11月8日に登録された、クローンR509によって産生された、抗体EMAB6である。EMAB6抗体の軽鎖の各々は、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号13によってコードされ、そして重鎖の各々は、マウス-ヒトキメラ核酸配列番号19によってコードされる。このキメラ抗体は、CD20に結合することにおいて、CAT-13.6E12マウス抗体と拮抗し、そしてリツキサン登録商標のそれよりも遥かに高い細胞傷害活性を有し、これは、これらの抗体の重鎖のN-グリカンの特異的なグリコシル化に一部寄与し得る実施例4を参照のこと。実際に、R509クローンの特徴は、0.6未満のフコース/ガラクトース比を有するEMAB6抗体組成をそれが産生することであり、これは、特許出願FR0312229において、強力なADCC活性を該抗体に提供するに最適であると示された。したがって、この抗体は、標的化される細胞がCD20を発現するコンディションの処置のための治療ツールとして特に興味深い。さらなる特定の実施形態によれば、本発明に従う別の好ましい抗体は、CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismesCNCMInstitutPasteur25rueduDocteurRoux75724ParisCedex15Franceにおいて、登録番号CNCMI-3529で、2005年11月29日に登録された、クローンR603によって産生された、抗体EMAB603である。EMAB603抗体の軽鎖の各々は、マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号27によってコードされ、そして重鎖の各々は、マウス-ヒトキメラアミノ酸配列配列番号19によってコードされる。このキメラ抗体は、CD20に結合することにおいて、CAT-13.6E12マウス抗体と拮抗し、そしてリツキサン登録商標のそれよりも遥かに高い細胞傷害活性を有し、これは、これらの抗体の重鎖のN-グリカンの特異的なグリコシル化に一部寄与し得る実施例3を参照のこと。実際に、R603クローンの特徴は、0.6未満のフコース/ガラクトース比を有するEMAB603抗体組成物をそれが産生することであり実施例4を参照のこと、これは、特許出願FR0312229において、強力なADCC活性を該抗体に提供するに最適であると示された。したがって、この抗体は、標的化される細胞がCD20を発現するコンディションの処置のための治療ツールとして特に興味深い。本発明の別の目的は、配列配列番号12を有する、本発明に従う抗体の軽鎖の発現のためのベクターpEF-EMAB6-Kに関する。このベクターは、本発明に従う抗体を発現させるベクターであり、この軽鎖は核酸配列配列番号13によってコードされ、この推定ペプチド配列は配列配列番号14である。このベクターは、前記抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列配列番号5および前記抗体の軽鎖の各々の定常領域をコードする核酸配列配列番号21が、宿主細胞中に導入されそして維持されるように挿入されている核酸分子である。それは、この発現に必須である配列プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子を有しているので、外来核酸フラグメントを宿主細胞中で発現させることを可能にする。このようなベクターは、当業者に周知であり、そして、暗黙の限定無しに、アデノウイルス、レトロウイルス、プラスミドまたはバクテリオファージであり得る。さらに、任意の哺乳動物細胞、例えば、YB2/0、CHO、CHOdhfr-例えば、CHODXB11、CHODG44、CHOLec13、SP2/0、NSO、293、BHKまたはCOSが、宿主細胞として、即ち、本発明に従う抗体を発現する細胞として使用され得る。本発明の別の目的は、配列配列番号18を有する、本発明に従う抗体の重鎖の発現のためのベクターpEF-EMAB6-Hに関する。このベクターは、本発明に従う抗体を発現させるベクターであり、この重鎖は核酸配列配列番号19によってコードされ、この推定ペプチド配列は配列配列番号20である。このベクターは、前記抗体の重鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列配列番号7および前記抗体の重鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列配列番号23が、宿主細胞中に導入されそして維持されるように挿入されている核酸分子である。それは、この発現に必須である配列プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子を有しているので、これらの外来核酸フラグメントを宿主細胞中で発現させることを可能にする。ちょうど前述したように、該ベクターは、例えば、プラスミド、アデノウイルス、レトロウイルスまたはバクテリオファージであり得、そして該宿主細胞は、任意の哺乳動物細胞、例えば、YB2/0、CHO、CHOdhfr-例えば、CHODXB11、CHODG44、CHOLec13、SP2/0、NS0、293、BHKまたはCOSであり得る。YB2/0細胞中においてpEF-EMAB6-KおよびpEF-EMAB6-Hベクターを共発現させることによって産生される抗体は、クローンR509CNCMにおいて登録番号CNCMI-3314で登録されたによって産生された、抗CD20EMAB6抗体によって例示される。この抗体は、B-CLLを有する患者由来の細胞この上にCD20抗原がより低レベルで発現される、およびモデルとして使用されるRaji細胞これは、B-CLLを有する患者由来の細胞と比較してより高い密度でCD20を発現するの両方において、リツキサン登録商標によって誘発されるそれよりも大きい細胞傷害性を誘発する。さらに、EMAB6抗体は、ジャーカット-CD16細胞JurkatCD16cellsにおいてIL-2インターロイキン2の分泌を誘発し、これは、リツキサン登録商標よりも遥かに高いレベルである。EMAB6抗体は、上述のベクターが発現されるのを可能にする培養培地中および条件下でR509クローンを増殖させることによって産生され得、したがって、それは、CD20抗原が関与するB細胞疾患より具体的には、B-CLLの診断および治療を促進するため、ならびにこの分野における研究のための非常に興味深いツールである。本発明の特定の目的は、本発明に従う抗体を発現する安定細胞株である。有利には、本発明に従う抗体を発現する安定細胞株は、以下からなる群から選択される:SP2/0、YB2/0、IR983F、ヒト骨髄腫、例えば、Namalwa、あるいはヒト起源の任意の他の細胞、例えば、PERC6、CHO株、特に、CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHOPro-5、CHOdhfr-CHODXB11、CHODG44、あるいは以下から選択される他の株:Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag14、およびP3X63Ag8.653。使用される株は、好ましくは、ラットハイブリドーマYB2/0細胞株である。この株は、例えばCHO細胞において産生される同一の一次構造を有する抗体に対して改善されたADCC活性を有する抗体を産生するその能力のために、選択された。本発明の1つの特定の局面によれば、本発明に従う抗体を発現しそしてより詳細には上述の群から選択される安定細胞株は、前述の2つのpEF-EMAB6-KおよびpEF-EMAB6-H発現ベクターを組み込んでいる。本発明の1つの特定の局面は、CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismesCNCMにおいて登録番号CNCMI-3314で登録された、クローンR509に関する。本発明の1つの特定の局面は、CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismesCNCMにおいて登録番号CNCI-3529で登録された、クローンR603に関する。本発明の別の目的は、本発明に従う抗体の重鎖をコードする配列配列番号19を有するDNAフラグメントに関する。マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号19は、前記抗体の重鎖の各々をコードする。それは、前記抗体の重鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列配列番号7を、前記抗体の重鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列配列番号23へ融合することによって得られる。本発明の別の特定の目的は、本発明に従う抗体の軽鎖をコードする配列配列番号13を有するDNAフラグメントに関する。マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号13は、前記抗体の軽鎖の各々をコードする。それは、前記抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列配列番号5を、前記抗体の軽鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列配列番号21へ融合することによって得られる。本発明の別の特定の目的は、本発明に従う抗体の軽鎖をコードする配列配列番号27を有するDNAフラグメントに関する。マウス-ヒトキメラ核酸配列配列番号27は、前記抗体の軽鎖の各々をコードする。それは、前記抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列配列番号25を、前記抗体の軽鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列配列番号21へ融合することによって得られる。本発明の1つの特定の目的は、エフェクター免疫細胞effectorimmunecellsのFcγRIIIA受容体をインビボまたはインビトロで活性化するための、本発明に従う抗体の使用に関する。実際に、本発明の抗体は、細胞傷害性であるという特徴および利点を有する。したがって、それらは、それらのFc領域でFcγRIIIA受容体を活性化する能力を示す。これはかなり興味深く、何故ならば、この受容体は、エフェクター細胞effectorcellsとして公知の細胞の表面において発現されるからである:該エフェクター細胞によって行われる該抗体のFc領域のその受容体への結合は、FcγRIIIA受容体の活性化、および標的細胞の破壊を生じさせる。エフェクター細胞は、例えば、NKナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、CD8リンパ球、Tγδリンパ球、NKT細胞、好酸球、好塩基球、または肥満細胞である。1つの特定の局面において、本発明の抗体は、薬物として使用される。有利には、このような薬物は、標的細胞がCD20を発現する細胞であるコンディション例えば、悪性B細胞リンパ腫の処置に意図される。1つの有利な局面によれば、本発明に従う抗体は、白血病またはリンパ腫の治療用の薬物を製造するために使用される。本発明の1つの特定の目的は、以下からなる群から選択される病状の治療用の薬物の製造のための、本発明に従う抗体の使用である:急性Bリンパ芽球性白血病acuteBlymphoblasticleukaemia、B細胞リンパ腫Bcelllymphoma、成熟B細胞リンパ腫matureBcelllymphoma、例えば、B型慢性リンパ性白血病BtypeChronicLymphocyticLeukaemiaB-CLL、小細胞性B細胞リンパ腫smallBcelllymphoma、B細胞前リンパ性白血病Bcellprolymphocyticleukaemia、リンパ球プラズマ細胞性リンパ腫lymphoplasmocyticlymphoma、マントル細胞リンパ腫mantlecelllymphoma、濾胞性リンパ腫follicularlymphoma、辺縁層MALT型リンパ腫marginalzoneMALTtypelymphoma、単球様B細胞を含むまたは含まないリンパ節辺縁層リンパ腫lymphnodemarginalzonelymphomawithorwithoutmonocytoidBcells、脾性辺縁層リンパ腫絨毛性リンパ球を含むまたは含まないsplenicmarginalzonelymphoma、トリコロイコサイティック白血病tricholeucocyticleukaemia、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫diffuselargeBcelllymphoma、バーキットリンパ腫Burkitt’slymphoma、ならびに自己免疫疾患を含む、Bリンパ系細胞が関与する任意の免疫不全疾患。本発明の別の目的は、リンパ性白血病の治療用の薬物の製造のための、本発明に従う抗体の使用である。本発明の別の目的は、B型慢性リンパ性白血病B-CLLの治療用の薬物の製造のための、本発明に従う抗体の使用である。さらに、本発明に従う抗体は、CD20がB細胞においてあまり強く発現されていないコンディション、そして好ましくは、B-CLLB型慢性リンパ性白血病の治療に特によく適している。この点において、本発明に従う抗体は、白血病またはリンパ腫の治療用の薬物の製造のために、1以上のさらなる抗体、例えば、リンパ系細胞lymphoidcellsにおいて発現される1以上のさらなる抗原例えば、抗原HLA-DR、CD19、CD23、CD22、CD80、CD32およびCD52等に対するモノクローナル抗体、と組み合わせて使用され得る。したがって、リンパ系細胞上で多量に発現される分子、CD52抗原を標的にし、そしてホストエフェクター機構hosteffectormechanisms補体結合、抗体依存性細胞傷害性を動員することによって細胞溶解を誘発するヒト化抗体Campath-1H登録商標アレンツズマブalentuzumab、MabCampathR登録商標が、CLLの治療において使用されるMoretonPHillmenPSeminOncol30493501;RawstronACetalBlood10320272031;RobakTLeukLymphoma45205219;StanglmaierMetalAnnHematol83634645。臨床試験はまた、CLLを有する患者における抗原HLA-DR、CD22、CD23、CD80を標的にする抗体または免疫毒素immunotoxinsを評価しているところであるMavromatisBHChesonBDBloodRev18137148;MavromatisBChesonBDJClinOncol2118741881ColemanMetalClinCancerRes93991S3994S;SalvatoreGetalClinCancerRes89951002。さらなる実施形態において、本発明に従う抗体は、NK細胞、NKTナチュラルキラーT細胞、Tγδリンパ球、マクロファージ、単球または樹状細胞等の、FcγRsを発現する細胞と組み合わせて、即ち、細胞性治療cellulartherapyと組み合わせて、使用され得るPellerSKaufmanSBlood781569PlatsoucasCDetalJImmunol1292305;KimbyEetalLeukaemia3501504;SoorskaarDetalIntArchAlleryApplImmunol87159164ZieglerHWetalIntJCancer27321327;ChaperotLetalLeukaemia1416671677;VuillierFDighieroGBullCancer90744750。さらに、本発明に従う抗体は、有利なことに、患者へ投与される用量を減少させる:有利なことに、患者へ投与される抗体用量は、リツキサン登録商標の用量よりも、2倍、5倍、または10倍、25倍、50倍、または特に有利なことに100倍少ない。有利なことに、患者に投与される抗体用量は、リツキサン登録商標の用量よりも、2~5倍、5~10倍、5~25倍、5~50倍、または5~100倍少ない。したがって、本発明に従う抗体、例えばEMAB6抗体は、有利には、187.5mg/m2、75mg/m2、37.5mg/m2、15mg/m2、7.5mg/m2未満、または特に有利には、3.75mg/m2未満の用量で投与され得る。投与される用量は、有利には、187.5mg/m2~75mg/m2、または75mg/m2~37.5mg/m2、75mg/m2~15mg/m2、75mg/m2~7.5mg/m2、あるいは75mg/m2~3.75mg/m2である。したがって、本発明はまた、本発明に従う抗体を含む有効量の組成物を患者へ投与することを含む、標的細胞がCD20を発現する細胞である疾患例えば、悪性B細胞リンパ腫を治療するための方法に関する。より詳細には、該治療法は、特に、白血病またはリンパ腫の治療に適している。なおより詳細には、それは、有効量の本発明に従う抗体または抗体組成物を投与することを含む、以下から選択される病状を治療するための方法である:急性Bリンパ芽球性白血病acuteBlymphoblasticleukaemia、B細胞リンパ腫Bcelllymphoma、成熟B細胞リンパ腫matureBcelllymphoma、例えば、B型慢性リンパ性白血病BtypeChronicLymphocyticLeukaemiaB-CLL、小細胞性B細胞リンパ腫smallBcelllymphoma、B細胞前リンパ性白血病Bcellprolymphocyticleukaemia、リンパ球プラズマ細胞性リンパ腫lymphoplasmocyticlymphoma、マントル細胞リンパ腫mantlecelllymphoma、濾胞性リンパ腫follicularlymphoma、辺縁層MALT型リンパ腫marginalzoneMALTtypelymphoma、単球様B細胞を含むまたは含まないリンパ節辺縁層リンパ腫lymphnodemarginalzonelymphomawithorwithoutmonocytoidBcells、脾性辺縁層リンパ腫絨毛性リンパ球を含むまたは含まないsplenicmarginalzonelymphoma、トリコロイコサイティック白血病tricholeucocyticleukaemia、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫diffuselargeBcelllymphoma、バーキットリンパ腫Burkitt’slymphoma、ならびに自己免疫疾患を含む、Bリンパ系細胞が関与する任意の免疫不全疾患。本発明の特定の目的は、受容者のB細胞が関与する症状を治療するための、慢性移植片対宿主病chronicgraftversushostdiseaseの治療用の薬物の製造のための、本発明に従う抗体の使用である。最後に、本発明の最後の目的は、臓器特に、腎臓移植片拒絶の治療用の薬物の製造のための、本発明に従う抗体の使用である。最近の研究RatanatharathornetalBiolBloodMarrowTransplant9505511;BeckeretalAmJTransplant49961001は、実際に、このようなコンディションの治療における抗CD20抗体の利点を示した。本発明のさらなる局面および利点は、例示的な例として理解されるべきでありかつ本発明の範囲を限定しない下記の実施例において説明される。実施例実施例1:抗CD20キメラ抗体EMAB6およびEMAB603のための発現ベクターの構築A.CAT-13.6E12マウス抗体の可変領域の配列の決定マウスハイブリドーマCAT-13.6E12細胞供給業者:DSMZ、ref.ACC474これは、IgG2a,κ型免疫グロブリンを産生する由来のトータルRNAを、単離したRNAeasyキット、Qiagenref.74104。逆転写後、CAT-13.6E12抗体の軽鎖Vκおよび重鎖VHの可変ドメインを、5’RACE技術RapidAmplificationofcDNAEndsGeneRacerキット、Invitrogenref.L1500-01を使用して増幅した。前記2つの工程のために使用したプライマーは、以下であった:1.リバース転写プライマーa.マウスカッパKappa特異的アンチセンスプライマー配列番号1b.マウスG2a特異的アンチセンスプライマー配列番号22.5’RACEPCRプライマーa.マウスカッパ特異的アンチセンスプライマー配列番号3b.マウスG2a特異的アンチセンスプライマー配列番号4得られるVHおよびVκPCR産物を、ベクターpCR4Blunt-TOPO中へクローン化しZerobluntTOPOPCRクローニングキット、Invitrogen、ref.K2875-20、そして配列決定した。マウスCAT-13.6E12抗体のVκ領域のヌクレオチド配列は、配列配列番号5のように示され、そして推定されるペプチド配列は、配列配列番号6である。該Vκ遺伝子は、Vκ4クラスに属する[KabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterestNIHPublication913242]。CAT-13.6E12のVH領域のヌクレオチド配列は、配列配列番号7であり、そして推定されるペプチド配列は、配列配列番号8である。該VH遺伝子は、VH1クラスに属する[KabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterestNIHPublication913242]。B.キメラ抗体EMAB6およびEMAB603のための重鎖および軽鎖発現ベクターの構築1.軽鎖カッパベクター1.1.抗体EMAB6についての軽鎖ベクターpCR4Blunt-TOPOシークエンシングベクターにクローン化したVκ配列を、以下のクローニングプライマーを使用して増幅した:aVκセンスプライマー配列番号9下線が引かれた配列はSpeI制限部位に対応し、太字で記載の配列はKozakコンセンサス配列に対応し、ATGイニシエータinitiatorはイタリック体である。bVκアンチセンスプライマー配列番号10このプライマーは、マウスVκ配列イタリック体を、ヒト定常領域Cκ太字へ連結している。下線が引かれた配列は、DraIII制限部位に対応する。得られるVκPCR産物は、CAT-13.6E12マウス抗体の天然シグナルペプチドをコードする配列を含む。次いで、このVκPCR産物を、ヒト定常領域Cκ[その核酸配列は、配列配列番号21であり、そしてその推定ペプチド配列は、配列配列番号22である]の5’で、配列配列番号11に対応する軽鎖キメラ化ベクターlightchainchimerisationvector図1のSpeI部位およびDraIII部位の間にクローン化した。DraIII制限部位を作製しマウスVκ配列のクローニングが起こることを可能にするために、このキメラ化ベクターのヒトCκ配列は、サイレント突然変異silentmutagenesisによって予め修飾されている。このキメラ化ベクターは、RSVプロモータおよびbGHウシ成長ホルモンポリアデニル化配列ならびにdhfrジヒドロ葉酸還元酵素選択遺伝子を含む。このベクターによってコードされるキメラEMAB6抗体の軽鎖配列は、ヌクレオチド配列については配列番号13として示され、そして推定ペプチド配列配列番号14に対応する。1.2.抗体EMAB603についての軽鎖ベクタープロトコルは、下記のVκアンチセンスプライマー以外、EMAB6抗体のための軽鎖ベクターについてと同一である実施例1、B-1.1を参照のこと:b’Vκアンチセンスプライマー配列番号29このプライマーは、マウスVκ配列イタリック体を、ヒト定常領域Cκ太字へ連結している。下線が引かれた配列は、DraIII制限部位に対応する。このプライマーはまた、突然変異AAC→AAAアンチセンスプライマー配列配列番号29において囲まれているヌクレオチドを導入し、これは、CAT-13.6E12の天然Vκ配列配列番号5および配列番号6を参照のことに対しての突然変異N106Kに対応するヌクレオチド配列および推定ペプチド配列配列番号25および配列番号26を参照のこと。このベクターによってコードされるキメラEMAB603抗体の軽鎖配列は、ヌクレオチド配列については配列番号27として示され、そして推定ペプチド配列配列番号28に対応する。2.重鎖ベクター同様のアプローチを、EMAB6およびEMAB603抗体の重鎖のキメラ化に適用した。先ず、pCR4Blunt-TOPOベクターにクローン化されたVH配列を、下記のクローニングプライマーを使用して増幅した:aVHセンスプライマー配列番号15下線が引かれた配列は制限部位SpeIに対応し、太字で記載の配列はKozakコンセンサス配列に対応し、ATGイニシエータはイタリック体である。bVHアンチセンスプライマー配列番号16このプライマーは、マウスVH配列イタリック体を、ヒトG1定常領域太字へ連結している。下線が引かれた配列は、ApaI制限部位に対応する。増幅したVHフラグメントは、CAT-13.6E12マウス抗体の天然シグナルペプチドをコードする配列を含む。次いで、このVHPCR産物を、γ1ヒト定常領域[その核酸配列は、配列配列番号23であり、そしてその推定ペプチド配列は、配列配列番号24である]の5’で、配列配列番号17に対応する重鎖キメラ化ベクター図3のSpeI部位およびApaI部位の間へクローン化した。このキメラ化ベクターは、RSVプロモータおよびbGHウシ成長ホルモンポリアデニル化配列ならびにneo選択遺伝子を含む。このベクターによってコードされるキメラEMAB6およびEMAB603抗体の重鎖配列は、ヌクレオチド配列については配列番号19として、そして推定ペプチド配列については配列番号20として示される。3.最終発現ベクター3.1.EMAB6抗体発現ベクターEMAB6抗体の発現のために、カッパ軽鎖キメラ化ベクター実施例1、B-1.1を参照のことのRSVプロモータを、ヒトEF-1アルファプロモータで置換した。最終軽鎖pEF-EMAB6-K発現ベクターは、図2に示され、そして配列配列番号12に対応する。このベクターによってコードされるキメラEMAB6抗体の軽鎖配列は、ヌクレオチド配列については配列番号13として示され、そして推定ペプチド配列配列番号14に対応する。EMAB6抗体の発現のために、重鎖キメラ化ベクター実施例1、B-2を参照のことのRSVプロモータを、ヒトEF-1アルファプロモータで置換した。このようにして得られた最終重鎖pEF-EMAB6-H発現ベクターは、図4に示され、そして配列配列番号18に対応する。3.2.EMAB603抗体発現ベクター軽鎖転写単位およびdhfr遺伝子を含む前記軽鎖ベクターのBgIII-PvuIIフラグメントを前記重鎖ベクターのXhoI部位へサブクローン化することによって、抗CD20EMAB603抗体の重鎖転写単位および軽鎖転写単位の両方を含む独特な発現ベクターを2つの軽鎖および重鎖キメラ化ベクターそれぞれ、実施例1、B-1.2およびB2を参照のことから構築した。このpRSV-HL-EMAB603発現ベクターは、2つの選択遺伝子、即ち、neoネオ-ホスホトランスフェラーゼIIおよびdhfrジヒドロ葉酸還元酵素、ならびにRSVプロモータの制御下にある2つの重鎖および軽鎖転写単位を含む図12。実施例2:抗CD20キメラEMAB6およびEMAB603抗体を産生するYB2/0株由来の細胞株の製造ラットYB2/0細胞株ATCCCRL-1662を、5ウシ胎仔血清JRHBiosciences,ref.12107を含有するEMS培地Invitrogen,ref.041-95181Mにおいて培養した。トランスフェクションのために、5百万個の細胞を、Optimix培地Equibio,ref.EKITE1において、EMAB6抗体の発現については25μgの軽鎖ベクターpEF-EMAB6-K図2AatIIで線形化および27μgの重鎖ベクターpEF-EMAB6-H図4ScaIで線形化で、あるいはEMAB603抗体の発現についてはベクターpRSV-HL-EMAB603で、エレクトロポレーションしたBioradエレクトロポレーター、モデル1652077。適用したエレクトロポレーション条件は、0.5-mLキュベット中、230ボルトおよび960マイクロファラッドであった。次いで、各エレクトロポレーションキュベットを、5,000細胞/ウェルの密度で、5P96プレート上に分配した。5透析血清Invitrogen,ref.10603-017、500μg/mLG418Invitrogen,ref.10131-027および25nMメトトレキサートSigma,ref.M8407を含有する選択的RPMI培地Invitrogen,ref21875-034中に、トランスフェクションの3日後に、配置した。前記耐性トランスフェクションウェルresistanttransfectionwellsからの上澄みを、ヒトIg配列に特異的なELISAアッセイを適用することによって、キメラ免疫グロブリンIgの存在についてスクリーニングした。最大量の抗体を産生する10個のトランスフェクタントを、P24プレート上で増幅し、そしてそれらの上澄みを、ELISAを使用して再アッセイし、それらの生産力を評価し、そして限られた希釈limiteddilution40細胞/プレートによって、クローニングに最適な3つのプロデューサを選択した。クローニング後、R509.6A4クローンR509-33903/046-6H116A4、生産力:17μg/106細胞以後、R509と呼ぶ、ならびにR603クローンを、それぞれキメラEMAB6およびEMAB603抗体の産生のために選択し、そしてこれらはCDハイブリドーマ産生培地Invitrogen、ref.11279-023に次第に順化した。キメラEMAB6およびEMAB603抗体の産生は、75-cm2および175-cm2バイアル中3×105細胞/mLへの希釈そして次いでローラーフラスコrollerflasks中4.5×105細胞/mLへの希釈によって得られた順化培養を、CDハイブリドーマ培地において、拡大することによって、達成された。いったん最大容量1Lが達成されると、細胞生存能cellviabilityが20だけになるまで、培養を継続した。産生後、キメラEMAB6およびEMAB603抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製しHPLCは、純度<95と評価した、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動によってチェックした。実施例3:キメラ抗体EMAB6およびEMAB603の機能活性のキャラクタライゼーションA.特異性Raji細胞によって発現されたCD20抗原に結合することについての、マウス抗体CAT-13.6E12CAT13との拮抗を研究することによって、キメラEMAB6抗体の抗原認識の特異性を評価した。その目的のために、EMAB6抗体0.5~50μg/mLで10μLを、Raji細胞4×106細胞/mlで50μLの存在下で、20分間、固定量のCAT-13.6E12マウス抗体5μg/mLで10μLと共に、4°Cでインキュベートした。洗浄後、フィコエリトリンPEへ結合されたマウス抗IgG抗体を、前記Raji細胞へ添加し、CAT-13.6E12マウス抗体の結合を特異的に検出した。種々の濃度のEMAB6の存在下で得られたメジアン蛍光強度MedianFluorescenceIntensitiesMFIをパーセンテージに変換し、ここで、100は、EMAB6抗体の非存在下でのCAT-13.6E12細胞への結合に対応する。増加する濃度のEMAB6の存在下におけるRaji細胞へのCAT-13.6E12CAT13抗体の結合についての阻害曲線をこのようにして得る図5。この研究により、前記キメラ化プロセスは、Raji細胞の表面に発現されるCD20への結合について親parentalCAT-13.6E12マウス抗体と拮抗する、EMAB6抗体の特異性に悪影響を与えていないことが実証される。EMAB603抗体の抗原認識特異性は、EMAB6抗体のそれと匹敵する。B.補体依存性細胞傷害活性EMAB6およびEMAB603抗体の補体依存性細胞傷害活性を、補体の供給源としての若いウサギ血清の存在下で、Raji細胞を用いて試験した;比較のために、抗CD20キメラ抗体リツキサン登録商標を、1つの試験に含めた。この試験のために、Raji細胞を、IMDMイスコフ改変ダルベッコ培地Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium5FCSウシ胎仔血清中、6×105細胞/mLに調整した。抗体をIMDM0.5FCSで希釈した。反応混合物を、50μL抗体、50μLの若いウサギ血清CedarlaneCL3441試薬の1/10IMDM0.5FCS希釈、50μL標的細胞、および50μLIMDM0.5FCS培地から作製した。最終抗体濃度は、5,000、1,250、250、および50ng/mLであった。抗体を含まないコントロールを、試験に含ませた。5CO2雰囲気中37°Cで1時間インキュベーション後、前記プレートを遠心分離し、そして上澄みへ放出された細胞内LDHのレベルを、特定の試薬細胞傷害性検出キットCytotoxicityDetectionKit1644793を使用して評価した。それぞれ100、50、25および0溶解に対応するtritonX1002を使用して溶解された種々の希釈の標的細胞を使用して得られた較正範囲を使用して、パーセンテージ溶解percentagelysisを評価した。図6Aにおいて示された結果は、EMAB6およびリツキサン登録商標は両方とも、Raji細胞の補体依存性溶解を誘発することを実証する。にもかかわらず、EMAB6補体活性は、リツキサン登録商標のそれよりも僅かに低いようであった。この差異は、この試験において使用した低濃度の抗体でより大きい。したがって、50および250ng/mLの濃度について、EMAB6の活性は、リツキサン登録商標のそれの45のオーダーのものである。この差異は、抗体濃度が増加されるにつれて小さくなり、EMAB6抗体の補体依存性細胞傷害活性は、試験した最高濃度即ち、5,000ng/mLでリツキサン登録商標のそれの92を示す。リツキサン登録商標のそれと比較してEMAB6抗体のこのより低い補体依存性傷害活性は、利点とみなされ得、何故ならば、それは、リツキサン登録商標と比較して、EMAB6の潜在的インビボ毒性これは、従来の補体経路の活性化に付随し、これは、望まれない炎症、アレルギーおよび血管活性を有する種々の分子の産生へと導くを制限するためである。EMAB603抗体の補体活性を図6Bに示す。C.ADCC活性キメラEMAB6抗体の細胞傷害性を、Raji細胞またはCLLを有する患者由来のBリンパ球の存在下で評価した。抗CD20キメラ抗体リツキサン登録商標を、比較のために試験に含めた。使用したカルセイン標識ADCC測定技術は、以下の通りであった:Myltenyiからの磁気ビーズMACSにおける分離技術を使用して、NK細胞をPBMCから単離した。該細胞を、IMDM5FCS45×105細胞/mLにおいて、洗浄しそして再懸濁させた。該エフェクター細胞および標的細胞を、15/1の比率で使用した。Ficoll処理後に得られたB-CLLを有する患者由来のPBMC末梢血単核細胞>95B細胞またはRaji細胞を、カルセインで予め標識しIMDM5FCS20μLカルセイン20μM中3×106細胞/mLで1mL細胞、37°Cで20分インキュベーション、次いでHBSSハンクス緩衝生理食塩水溶液HanksBufferedSalineSolutionで洗浄、そしてIMDM5FCS中において3×105細胞/mLに調整した。抗体を、IMDM0.5FCS最終濃度:500;50;5;0.5;0.005および0.005ng/mLで希釈した。反応混合物を、P96マイクロタイトレーションプレート中、50μL抗体、50μLエフェクター細胞、50μL標的細胞、および50μLIMDM培地から作製した。2つの陰性コントロールを使用した:-NK無しでの溶解:NKエフェクター細胞をIMDM5FCSで置換した。-抗体Ab無しでの溶解:抗体をIMDM5FCSで置換した。5CO2雰囲気において37°Cで4時間インキュベーション後、前記プレートを遠心分離し、そして上澄みと関連する蛍光を、蛍光光度計励起:485nm、放出:535nmを使用して測定した。それぞれ100、50、25および0溶解に対応するTritonX1002を使用して溶解された種々の希釈の標的細胞を使用して得られた較正範囲を使用して、パーセンテージ溶解を評価した。結果を、先ず、下記の式:溶解=抗体およびNKでの溶解-抗体無しでの溶解-NK無しでの溶解を使用して算出し、次いで相対的パーセンテージとして表し、ここで、100は、最高濃度のリツキサン登録商標で得られた値である。図7Aにおいて示されたRaji系細胞に対してのEMAB6抗体について得られた結果は、試験される濃度に関係なく、EMAB6抗体によって誘発された細胞傷害性はリツキサン登録商標によって誘発されたそれよりも大きいことを実証する。この差異は、特に、低抗体濃度で大きい。したがって、0.5ng/mLで、溶解パーセンテージは、EMAB6およびリツキサン登録商標について、それぞれ、96および4であった。用量を500倍250ng/mL増加させることによって、差異は依然として明らかであり、何故ならば、ADCCの相対的パーセンテージは、EMAB6およびリツキサン登録商標について、それぞれ、164および100であるからである。図式評価graphicalestimationng/mLならびにリツキサン登録商標およびEMAB6が同一のEMaxに達すると想定することによって、EC50[E最大値最高抗体濃度およびプラトーで得られる最大有効性の50に対応する抗体濃度]を算出すると、この試験におけるリツキサン登録商標EC50/EMAB6EC50比は、300に等しくなった。キメラEMAB603抗体の細胞傷害性を、EMAB6抗体についてのものと同一の手順を使用して、Raji細胞の存在下で評価した。その活性は、EMAB6抗体のそれと匹敵した図7Bを参照のこと。B-CLLを有する患者由来のリンパ球で、得られた結果図8に示すは、試験される濃度に関係なく、EMAB6抗体によって誘発された細胞傷害性はリツキサン登録商標によって誘発されたそれよりも大きいことを実証している。Raji細胞について既に観察されたように、この差異は、特に、低抗体濃度で大きい。0.5ng/mLEMAB6の濃度は、500ng/mLリツキサン登録商標即ち、1,000の濃度比と同一のパーセンテージ溶解を誘発する。5ng/mLで、溶解パーセンテージは、EMAB6およびリツキサン登録商標について、それぞれ、269および9である。試験した最大用量500ng/mLで、差異は依然として非常に大きく、何故ならば、ADCCの相対的パーセンテージが、EMAB6およびリツキサン登録商標について、それぞれ、350および100あるためである。興味深い結果は、50溶解を生じる濃度に対応する。この試験において、リツキサン登録商標EC50/EMAB6EC50比は、10,000と評価されたリツキサン登録商標およびEMAB6は同一のEMaxに達すると想定しての、EC50についてのng/mLでの図式評価。したがって、これらの試験において、EMAB6およびEMAB603の細胞傷害活性は、リツキサン登録商標のそれよりも遥かに高い。D.CD16の活性化IL-2分泌キメラEMAB6抗体によって誘発されるCD16FcγRIIIAの活性化を、Raji細胞またはCLLを有する患者由来のBリンパ球の存在下で測定した。この試験は、ジャーカット-CD16細胞上において発現されるCD16FcγRIIIA受容体へ結合しそしてIL-2の分泌を誘発する前記抗体の能力を評価した。抗CD20キメラ抗体リツキサン登録商標を、比較のために試験に含める。CD16活性化の測定を、Raji細胞またはCLLを有する患者由来のBリンパ球の存在下、ジャーカット-CD16細胞株に対して、下記の様式で行った。96ウェルプレート中の混合物:50μL抗体溶液B-CLLを有する患者由来のBリンパ球については、IMDM5FCSで10,000、1,000、100および10ng/mLへ希釈、そしてRaji細胞については、10,000、2,000、1,000、200、100、50および25ng/mLに希釈、50μLPMAIMDM5FCSで40ng/mLへ希釈した、ホルボールミリステートアセテートPhorbolMyristateAcetate、50μLRajiまたはFicol処理後に得られるB-CLLを有する患者由来のPBMC>95B細胞IMDM5FCSで6×105/mLまで希釈、ならびに50μLジャーカット-CD16細胞IMDM5FCS中20×106/mL。抗体を含まないコントロールを、すべての試験において含めた。37°Cで一晩インキュベーション後、前記プレートを遠心分離し、そして上澄み中に含まれるIL-2を、市販のキットQuantikinefromR/Dを使用して評価した。OD読み取りは、450nmで行った。結果を、初めに、抗体濃度0~250ng/mL最終濃度の関数としてのIL-2レベルとして表し、次いで、相対的パーセンテージとして表し、ここで、100は、最高試験濃度でリツキサン登録商標を用いて得られた値である。図9Aにおいて示されるRaji系細胞で得られた結果は、EMAB6およびリツキサン登録商標の存在下で、ジャーカット-CD16細胞がIL-2を分泌することを実証し、これは、CD16への前記抗体のFc部分の結合を介しての細胞活性化を示す。しかし、EMAB6抗体は、リツキサン登録商標抗体よりも遥かに強力な誘発活性inductiveactivityを有する。したがって、6.25ng/mLで、IL-2パーセンテージは、EMAB6およびリツキサン登録商標について、それぞれ、112および21であった。50ng/mLで、差異は依然として大きく、IL-2のパーセンテージは、それぞれ、112および65であった。この差異は、濃度が増加するにつれて小さくなり、EMAB6およびリツキサン登録商標についてのIL-2のそれぞれのパーセンテージは、2,500ng/mLで124および100である。この試験において、リツキサン登録商標EC50/EMAB6EC50比は、15と評価されるリツキサン登録商標およびEMAB6が同一のEMaxに達すると想定しての、EC50についてのng/mLでの図式評価。これらの結果は、ADCC結果を確認し、両方ともCD16依存性である。それらは、EMAB6抗体のFc部分によってCD16FcγRIIIAへ結合することは、強力な細胞活性化が伴い、これは、エフェクター機能の誘導へ導く。Raji細胞の存在下でキメラEMAB603抗体によって誘発されるCD16FcγRIIIAの活性化は、EMAB6抗体によって誘発されるそれに匹敵する。B-CLLを有する患者由来のリンパ球で、得られた結果図10に示すは、抗CD20リツキサン登録商標およびEMAB6の存在下において、ジャーカット-CD16細胞は、IL-2を分泌することを実証し、これは、CD16への前記抗体のFc部分の結合を介しての細胞活性化を示す。しかし、EMAB6抗体は、リツキサン登録商標抗体よりも遥かに高い誘発力inductiveabilityを有する。実際に、リツキサン登録商標のIL-2分泌誘発活性は、2.5および25ng/mLの濃度でベースラインに付近であり、一方、EMAB6抗体のそれは顕著である。したがって、25ng/mLで、IL-2パーセンテージは、EMAB6およびリツキサン登録商標についてそれぞれ132および34であった。最高濃度2,500ng/mLで、IL-2パーセンテージは、それぞれ、148および100であった。この試験におけるリツキサン登録商標EC50/EMAB6EC50比は、100よりも大きく;それは、300と評価されるリツキサン登録商標およびEMAB6が同一のEMaxを達成すると想定しての、EC50についてのng/mLでの図式評価。結論として、Raji細胞において行った全ての試験は、EMAB6およびEMAB603抗体は、リツキサン登録商標とは異なって、非常に細胞傷害性であり、そしてCD16FcγRIIIAを発現する細胞の活性化を、特に抵抗体濃度で、誘発することを実証する。他方、同一条件下で、EMAB6の補体依存性細胞傷害活性は、リツキサン登録商標のそれと比較して約50減少する。これらの結果は、B-CLLを有する患者から単離された細胞を使用して行った研究によって確認され、EMAB6抗体が、B-CLLを有する患者由来のBリンパ球へ対して、リツキサン登録商標よりも遥かに細胞傷害性であることを示唆している。2つの抗体間の差異は、Raji細胞でよりも、B-CLLを有する患者由来のリンパ球で、より顕著であり、これは、このコンディションについて、リツキサン登録商標と比較してEMAB6の顕著な治療利益を実証する。この増加した差異の理由は、中でも、Raji細胞と比較して、B-CLLを有する患者由来のBリンパ球においてはCD20がより低く抗原発現されるためであるかもしれない。Raji細胞から類推して、B-CLLを有する患者由来のリンパ球に対するEMAB6抗体の補体依存性細胞傷害活性は、リツキサン登録商標によって誘発されるものよりも低くなければならないことが示唆され得、したがって、従来の補体経路の強力な活性化に付随する望ましくない効果の結果として、インビボにおいて毒性がより低いという利点を示す。実施例4:HPCE-LIFによるEMAB6およびEMAB603グリカンの分析EMAB6およびEMAB603抗体の重鎖のN-グリカン構造を、HPCE-LIFを使用して分析した。リツキサン登録商標の重鎖のN-グリカン構造もまた、比較のために分析した。その目的のために、抗CD20モノクローナル抗体を、SephadexG-25カラムHiTrapDesalting,AmershamBiosciencesにおいて脱塩し、エバポレートし、そして50mMβ-メルカプトエタノールの存在下で、PNGaseFGlykoの加水分解緩衝液中に再懸濁した。37°Cで16時間インキュベーション後、蛋白質分画を、無水エタノールを添加することによって沈殿させ、そして上澄みこれは、N-グリカンを含有したをエバポレートした。得られたオリゴ糖を、蛍光色素:APTS1-アミノ-ピレン-3,6,8-トリスルホネートを使用して直接標識したか、あるいは特定のエキソグリコシダーゼexoglycosidasesの作用に供し、その後APTSで標識した。得られた標識化オリゴ糖を、N-CHOキャピラリーへ注入し、レーザー誘起蛍光検出laserinducedfluorescencedetectionHPCE-LIFを備えるキャピラリー電気泳動によって分離および定量した。フコースレベルの評価を、単離フコシル化形態を加えることによってか、あるいはより詳細には、ノイラミニダーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびN-アセチルヘキソサミニダーゼの同時作用後に行い、これらは、電気泳動図において得られた、フコシル化または非フコシル化五糖[GlcNac2-Man3]に対応する2つのピークを生じた:フコースレベルとして表されるを、下記式を使用して算出した:ガラクトースレベルとして表されるを、ノイラミニダーゼおよびフコシダーゼの作用後に得られたガラクトースを含有するオリゴ糖形態のパーセンテージを加えることによって、算出した。使用した式は、下記の通りである:ガラクトースレベル=G1G1B2×G2G2Bフコース/ガラクトース比を、上述のように算出される、ガラクトースレベルでフコースレベルを割ることによって得る。この分析から表1を参照のこと、EMAB6およびEMAB603抗体は、リツキサン登録商標フコース=93と比較してほとんどフコシル化されていないフコース<25ようである。さらに、EMAB6およびEMAB603についてのFuc/Gal比フコース/ガラクトース比は、リツキサン登録商標Fuc/Gal比=1.63等のCHO細胞において発現される抗体とは異なり、低いFuc/Gal比<0.6。"