"対象において前立腺病態を処置するための方法であって、前記対象に、Engrailed-2EN2発現および/またはEN2活性を阻害する第1の薬剤と、PAX2発現および/またはPAX2活性を阻害する第2の薬剤とを含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。前記第1の薬剤が、siRNA、アプタマー-siRNAキメラ、EN2結合阻害剤、EN2結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド結合デコイ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記第1の薬剤が、アンチセンスEN2ポリヌクレオチドまたはEN2siRNAを含む、請求項1に記載の方法。前記第1の薬剤が、配列番号107、108、110、111、113および114からなる群から選択される配列を含むsiRNAを含む、請求項1に記載の方法。前記第1の薬剤が、配列番号107、108、110、111、113および114からなる群から選択される配列を含む短鎖ヘアピンRNAをコードする発現ベクターを含む、請求項1に記載の方法。前記第2の薬剤が、PAX2siRNA、アプタマー-siRNAキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、PAX2siRNAをコードするポリヌクレオチド、PAX2結合阻害剤、βデフェンシン-1DEFB1プロモーター内にPAX2結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド結合デコイ、アンギオテンシンIIの拮抗剤、アンギオテンシンII受容体の拮抗剤、アンギオテンシン変換酵素ACEの拮抗剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼMEKの拮抗剤、細胞外シグナル調節キナーゼ1、2ERK1、2の拮抗剤、AMPキナーゼ活性化剤、シグナル伝達兼転写活性化因子3STAT3の拮抗剤、およびRASシグナル伝達経路の遮断剤からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記第2の薬剤が、アンチセンスPAX2ポリヌクレオチドまたはPAX2siRNAを含む、請求項6に記載の方法。前記第2の薬剤が、配列番号3~15からなる群から選択される配列を含むPAX2siRNAを含む、請求項6に記載の方法。前記第2の薬剤が、配列番号3~15からなる群から選択される配列を含む短鎖ヘアピンRNAを含む発現ベクターを含む、請求項6に記載の方法。前記第2の薬剤が、アンギオテンシンIIの拮抗剤、アンギオテンシンII受容体の拮抗剤、またはアンギオテンシン変換酵素ACEの拮抗剤を含む、請求項6に記載の方法。前記第2の薬剤が、マイトジェン活性化タンパク質/細胞外シグナル調節キナーゼMEKまたは細胞外シグナル調節キナーゼERK1および/またはERK2の拮抗剤を含む、請求項6に記載の方法。前記第2の薬剤がAMPキナーゼ活性化剤を含む、請求項6に記載の方法。前記第2の薬剤がSTAT3の拮抗剤を含む、請求項6に記載の方法。前記第2の薬剤がPAX2DNA結合の阻害剤を含む、請求項6に記載の方法。前記PAX2DNA結合の阻害剤が、DEFB1プロモーター内にPAX2結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド結合デコイを含む、請求項14に記載の方法。前記デコイが、配列番号16、18、および19からなる群から選択される配列を含む、請求項15に記載の方法。前記医薬組成物が、DEFB1遺伝子発現またはDEFB1活性を増強する第3の薬剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記第3の薬剤が、DEFB1タンパク質またはDEFB1タンパク質を発現する発現ベクターを含む、請求項17に記載の方法。前記第1の薬剤および前記第2の薬剤の一方または両方が、前立腺細胞の表面に結合することができる標的化部分を含み、前記標的化部分が、アプタマー、ペプチド、抗体由来エピトープ結合ドメイン、細胞リガンド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記前立腺病態が前立腺癌または前立腺上皮内新生物PINである、請求項1に記載の方法。対象において前立腺癌またはPINを処置する方法であって、前記対象の前立腺組織に、EN2の発現および/または活性を低下させる第1の薬剤と、DEFB1の発現および/または活性を増強する第2の薬剤と、薬学上許容される担体とを含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。前記第1の薬剤が、DEFB1、DEFB1saRNA、DEFB1saRNAを発現する発現ベクター、DEFB1をコードする発現ベクター、インターフェロン-γ、またはそれらの組合せを含む、請求項21に記載の方法。対象において前立腺癌または前立腺上皮内新生物PINを処置するための方法であって、aEN2、PAX2およびDEFB1の発現レベルを決定すること;b前記対象由来の罹患前立腺組織においてPAX2とDEFB1の発現比を決定すること;caとbの結果に基づき、前記対象に、1EN2発現および/またはEN2活性を阻害する有効量の薬剤と、2PAX2発現および/もしくはPAX2活性を阻害する薬剤、ならびに/またはDEFB1の発現および/または活性を増強する薬剤を投与することを含む、方法。1EN2発現および/またはEN2活性を阻害する薬剤と、2PAX2発現および/もしくはPAX2活性を阻害する薬剤、ならびに/またはDEFB1の発現および/または活性を増強する薬剤とを含む、前立腺癌またはPINを処置するための医薬組成物。本出願の1つの態様は、対象において前立腺病態を処置するための方法に関する。該方法は、前記対象にEngrailed-2EN2発現および/またはEN2活性を阻害する有効量の第1の薬剤を投与すること;ならびに前記対象にペアードボックスホメオティック遺伝子2PAX2発現および/またはPAX2活性を阻害する有効量の第2の薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、前記対象にβ-デフェンシン-1DEFB1遺伝子発現および/またはDEFB1活性を増強する有効量の第3の薬剤を投与することをさらに含む。本出願の別の態様は、対象において前立腺癌または前立腺上皮内新生物PINを処置する方法に関する。該方法は、前記対象の前立腺組織にEN2の発現および/または活性を低下させる有効量の第1の薬剤を投与すること、ならびに前記対象にDEFB1の発現および/または活性を増強する第2の薬剤を投与することを含む。本出願の別の態様は、対象において前立腺癌または前立腺上皮内新生物PINを処置するための方法に関する。該方法は、aEN2、PAX2およびDEFB1の発現レベルを決定すること、b前記対象由来の罹患前立腺組織においてPAXとDEFB1の発現比を決定すること;およびcaとbの結果に基づき、前記対象に、1EN2発現を阻害する有効量の薬剤と、2PAX2発現および/もしくはPAX2活性を阻害する薬剤、ならびに/またはDEFB1の発現および/または活性を増強する薬剤を投与することを含む。本出願の別の態様は、前立腺癌またはPINを処置するための医薬組成物に関する。該医薬組成物は、1EN2発現および/またはEN2活性を阻害する薬剤と、2PAX2発現および/もしくはPAX2活性を阻害する薬剤、ならびに/またはDEFB1の発現および/もしくは活性を増強する薬剤とを含む。添付の図面は、本発明の1以上の実施形態を示し、記載の説明とともに、本発明の原理を説明するためのものである。可能な限り、同じ参照番号はこれらの図面を通じて実施形態の同じまたは類似の要素を表して使用される。そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、開示されている方法および組成物が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形である1つの、1つのおよびそのは、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の指示語を含むことを注記しておかなければならない。従って、例えば、ペプチドという場合には、複数のそのようなペプチドを含み、そのペプチドという場合には、1以上のペプチドおよび当業者に知られているその等価物を表すなどである。本明細書で使用する場合、用語核酸とは、骨格構造によって連結された少なくとも2つ、好ましくは10以上の塩基から構成されるポリデオキシリボヌクレオチドDNAもしくはその類似体またはポリリボヌクレオチドRNAまたはその類似体を意味する。DNAでは、共通塩基はアデニンA、グアニンG、チミンTおよびシトシンCであり、RNAでは、共通塩基はA、G、CおよびウラシルTの代わりにUであるが、核酸は塩基類似体例えば、イノシンおよび塩基脱落位置すなわち、1以上の位置にヌクレオチドを欠くホスホジエステル骨格、米国特許第5,585,481号を含み得る。例示的核酸としては、一本鎖ss、二本鎖ds、もしくは三本鎖ポリヌクレオチド、またはDNAおよびRNAのオリゴヌクレオチドが挙げられる。用語ポリヌクレオチドとは、10を超えるヌクレオチドを含有する核酸を意味する。用語オリゴヌクレオチドとは、約15~約100の間のヌクレオチドを含有する一本鎖核酸を意味する。用語プロモーターとは、その最も広い文脈で捉えるべきであり、正確な転写開始のためのTATAボックスまたはイニシエーターエレメントをはじめとする、ゲノム遺伝子由来の転写調節エレメントTREまたはそのキメラTREを含み、発生刺激および/または外部刺激、およびトランス活性化調節タンパク質または核酸に応答して、それと機能的に連結された遺伝子の活性化または抑制を調節する付加的TREすなわち、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー、およびサイレンサーを伴うまたは伴わない場合がある。プロモーターは、構成的に活性である場合、または発生段階により調節される様式で1以上の組織または細胞種で活性である場合がある。プロモーターは、ゲノム断片を含んでもよく、または組み合わされた1以上のTREのキメラを含んでもよい。用語EN2発現、PAX2発現またはDEFB1発現とは、EN2遺伝子、PAX2遺伝子またはDEFB1遺伝子の発現レベルを意味する。この発現には、転写レベル例えば、mRNA、翻訳レベル例えば、タンパク質および翻訳後レベル例えば、グリコシル化における発現が含まれる。用語EN2活性、PAX2活性またはDEFB1活性とは、EN2タンパク質、PAX2タンパク質またはDEFB1タンパク質の生理活性を意味する。タンパク質の活性には、例えば、転写、翻訳、細胞内移動、分泌、キナーゼによるリン酸化、プロテアーゼによる切断、同種親和性結合および他のタンパク質との異種親和性結合、ユビキチン化が含まれる。処置方法本出願の1つの態様は、対象において前立腺癌または前立腺上皮内新生物PINなどの前立腺病態を処置するための方法に関する。特定の実施形態では、該方法は、前記対象にEngrailed-2EN2発現および/またはEN2活性を阻害する有効量の第1の薬剤を投与すること、ならびに前記対象にPAX2発現および/またはPAX2活性を阻害する有効量の第2の薬剤を投与することを含む。本出願は、PAX/EN2発現および/または活性の様々な阻害剤を提供する。例示的阻害剤としては、siRNA、アプタマー-siRNAキメラ、PAX2またはEN2結合阻害剤、PAX2またはEN2結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド結合デコイ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、およびそれらの組合せが含まれる。siRNAは、EN2またはPAX2タンパク質産物の発現を低下または排除することができる、EN2およびPAX2の配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導するように操作可能な二本鎖RNAである。一実施形態では、第1の生理活性成分は、合成EN2指向性単鎖干渉RNAsiRNAを含む。合成により作製されたsiRNAは、酵素ダイサーによって細胞内で通常通り処理されるsiRNA種を構造的に模倣する。合成により作製されたsiRNAは、siRNAの安定性および機能性を高めることが知られている化学修飾をRNA構造に組み込むことができる。例えば、場合によっては、siRNAはロックド核酸LNA修飾siRNAとして合成され得る。LNAは、リボースの2’酸素と4’炭素を接続するメチレン架橋を含むヌクレオチド類似体である。この二環式構造は、LNA分子のフラノース環を3’-endo型コンフォメーションにロックし、それにより、標準的なRNAモノマーを構造的に模倣する。LNA修飾siRNAの治療上の開発はすでに記載されている:321-323,2009。特定の実施形態では、siRNAおよび対応するEN2cDNA配列は次の通りである。EN2cDNA5’TCAACGAGTCACAGATCAA3’センスsiRNA5’UCAACGAGUCACAGAUCAA3’アンチセンスsiRNA3’AGUUGCUCAGUGUCUAGUU5’EN2cDNA5’CCAACTTCTTCATCGACAA3’センスsiRNA5’CCAACUUCUUCAUCGACAA3’アンチセンスsiRNA3’GGUUGAAGAAGUAGCUGUU5’EN2cDNA5’CTCGAAAACCAAAGAAGAA3’センスsiRNA5’CUCGAAAACCAAAGAAGAA3’アンチセンスsiRNA3’GAGCUUUUGGUUUCUUCUU5’あるいは、または加えて、合成PAX2指向性siRNAを含むPAX2siRNAは、前立腺細胞においてPAX2発現をサイレンシングするまたは低下させるために使用することができる。特定の実施形態では、PAX2siRNAは、配列番号15および73~78:GGAUGCAGAUAGACUCGACUU、AUAGACUCGACUUGACUUC、CUUCAUCACGUUUCCUC、GUAUUCAGCAAUCUUGUCC、GAUUUGAUGUGCUCUGAUG、GUCGAGUCUAUCUGCAUCC、AUGUGUCAGGCACACAGACG、およびその少なくとも10、15または20の核酸の断片および保存的変異体、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第1および第2の生理活性成分の一方または両方は、細胞内でEN2標的siRNAへとプロセシングされる短鎖二本鎖ヘアピン様RNAshRNAを転写するように操作された発現ベクターを含み得る。これらのshRNAは、Ambion社のサイレンサー。従って、特定の実施形態では、前記第1の生理活性成分は、配列番号107、108、110、111、113および114からなる群から選択される配列を含むEN2siRNAを発現することができる発現ベクターを含む。あるいは、または加えて、前記第2の生理活性成分は、配列番号3~6および11~15からなる群から選択されるEN2配列を含むEN2siRNAを発現することができる発現ベクターを含み得る。合成siRNAおよびshRNAは、周知のアルゴリズムを用いて設計し、従来のDNA/RNA合成装置を用いて合成することができる。PAX2およびEN2siRNA、ならびにPAX2およびEN2shRNA発現構築物はOrigen社ロックヴィル、メリーランド州から商業的に入手可能である。このsiRNAの使用では、EN2および/またはPAX2の遺伝子発現をサイレンシグするためにRNA干渉RNAiの機構を利用する。このサイレンシングは、もともと、二本鎖RNAdsRNAを細胞にトランスフェクトする場合に見られていたものである。細胞内に入ると、dsRNAは、RNアーゼIII様酵素であるダイサーによって切断されて、それらの3’末端にヌクレオチド2個のオーバーハングを含む21~23ヌクレオチド長の二本鎖低分子干渉RNAsiRNAとなることが分かっている。ATPに依存する段階では、これらのsiRNAは、相補的mRNA配列のAGO2媒介切断のためのシグナルを提供する多重サブユニットRNAi誘導サイレンシング複合体RISCに組み込まれるようになり、これは次に、細胞エキソヌクレアーゼによるその次の分解をもたらす。アプタマー-siRNAキメラは、細胞内移行性アプタマーに化学的に連結されたsiRNAを含む標的化siRNAである。アプタマーは、多様な細胞表面分子、タンパク質、および/または高分子構造に高親和性結合を示す特定の三次元構造を形成することができるオリゴヌクレオチド種を含む、核酸型の抗体である。一般に、アプタマーは、ステム-ループまたはG-カルテットなどの定義された二次元および三次元構造に折りたたまれる15~50塩基長の範囲の低分子核酸である。アプタマーは、ATPおよびテオフィリンなどの低分子、ならびに逆転写酵素、トロンビン、および多様な細胞表面受容体などの高分子と結合することができる。アプタマーは上記の核酸阻害剤と化学的に連結またはコンジュゲートして、標的化核酸阻害剤を形成することができる。アプタマー-siRNAキメラは、標的化部分を、siRNAに連結されたアプタマーの形態で含有する。一実施形態では、阻害剤は、従前に記載されているように前立腺組織を標的とすることができるキメラアプタマー-siRNAオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、アプタマーは、細胞内移行性アプタマーである。特定の細胞表面分子に結合すると、アプタマーは細胞内移行を促進することができ、そこで核酸阻害剤が働く。一実施形態では、アプタマーおよびsiRNAは両方ともRNAを含む。アプタマーおよびsiRNAは、さらに本明細書に記載されるように、いずれのヌクレオチド修飾を含んでもよい。特定の実施形態では、アプタマーは、前立腺特異的膜抗原PSMAに特異的に結合する標的化部分を含む。アプタマーは、10-12M未満のKdで標的分子と極めて強固に結合することができる。アプタマーは、10-6、10-8、10-10、または10-12未満のKdで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは、極めて高い特異性で標的分子と結合することができる。例えば、標的分子とその分子上のただ1か所だけが異なる別の分子との間の結合親和性の違いが10,000倍より大きいアプタマーが単離されている。別の実施形態では、第1および第2の生理活性成分の一方または両方が、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、DNA骨格、RNA骨格、またはその化学誘導体を含み得る。一実施形態では、第1および第2の生理活性成分の一方または両方が、分解のためにEN2および/またはPAX2を標的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、生理活性成分は、EN2および/またはPAX2mRNA配列と相補的な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、合成により作製されてもよいし、または好適な発現ベクターから発現されてもよい。アンチセンス核酸は、RNアーゼH活性を促進するように、相補的結合を介してmRNAセンス鎖に結合するように設計され、これにより、そのmRNAの分解がもたらされる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ安定性および/または結合の増強を促すように化学的または構造的に修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、ペプチド核酸PNA、ロックド核酸LNA、モルホリノ骨格を有する核酸、メチルホスホネート、二重らせん安定化スチルベンまたはピレニルキャップ、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、およびホスホトリエステルなどを含む、非従来型の化学的または骨格付加または置換を有するオリゴヌクレオチドを作出するように修飾される。例として、修飾オリゴヌクレオチドは類似体を組み込んでもよく、または1以上の天然ヌクレオチドを類似体で置換してもよく;例えば、非電荷結合例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバメートなどまたは電荷結合例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどを組み込むヌクレオチド間修飾;インターカレーター例えば、アクリジン、ソラレンなど、キレーター例えば,金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など、もしくはアルキル化剤を組み込む修飾、および/または修飾結合例えば、αアノマー核酸などが挙げられる。いくつかの実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、その骨格内に少なくとも1個の中性電荷を含むように内部修飾される。例えば、前記オリゴヌクレオチドは、メチルホスホネート骨格または標的特異的配列に相補的なペプチド核酸PNAを含み得る。これらの修飾は、ヘリカーゼにより媒介される巻き戻しを阻止または低減することが分かっている。非電荷プローブの使用は、古典的ハイブリダイゼーションにおける負電荷核酸鎖の反発を軽減することによって、サンプル中のポリヌクレオチド標的に対するハイブリダイゼーション率をさらに高めることができる。PNAオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格がポリアミドに置換されている非電荷核酸類似体であり、これにより、PNAは、アミド結合によって互いに連結された2-アミノエチル-グリシン単位のポリマーとなる。PNAは、標準的なペプチド合成で使用されるものと同じBocまたはFmoc化学を用いて合成される。塩基アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンは、メチレンカルボキシル結合によってその骨格に連結される。よって、PNAは、非環式であり、アキラルであり、かつ、中性である。PNAの他の特性は、核酸に比べて高い特異性および融点、三重らせん形成能、酸性pHでの安定性、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼのような細胞酵素により認識されないことなどである。メチルホスホネート含有オリゴヌクレオチドは、非結合ホスホリル酸素の1つの代わりにメチル基を含有する中性DNA類似体である。メチルホスホネート結合を有するオリゴヌクレオチドは、中でも第一に、翻訳のアンチセンス遮断を介してタンパク質合性を阻害することが報告されている。しかしながら、この合成プロセスはキラル分子を生じ、オリゴヌクレオチドのカスタム生産のためのキラル的に純粋なモノマーを得るためには、これらを分割しなければならない。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドのリン酸骨格は、ホスホロチオエート結合またはホスホロアミダートを含み得る。このようなオリゴヌクレオチド結合の組合せもまた、本発明の範囲内にある。他の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合によって連結された修飾糖の骨格を含み得る。これらの修飾糖としては、限定されるものではないが、2-デオキシリボフラノシド、α-D-アラビノフラノシド、α-2’-デオキシリボフラノシド、および2’、3’-ジデオキシ-3’-アミノリボフラノシドを含むフラノース類似体を含み得る。別の実施形態では、2-デオキシ-β-D-リボフラノース基は、例えば、β-D-リボriboフラノースなどの他の糖類で置換されていてもよい。さらに、β-D-リボフラノースは、そのリボース部分の2-OHがC1-6アルキル基でアルキル化されているもの2-O--C1-6アルキルリボース、もしくはC2-6アルケニル基でアルキル化されているもの2-O--C2-6アルケニルリボース、またはフルオロ基で置換されているもの2-フルオロリボースが存在し得る。関連のオリゴマー形成糖としては、上記のようなロックド核酸LNAで使用されるものが含まれる。例示的LNAオリゴヌクレオチドとしては、米国特許第6,268,490号その開示は本明細書の一部として援用するに記載されているものなどの、2’-O-4’-Cメチレン架橋を有する修飾二環式モノマー単位が含まれる。化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドにはまた、2’位の糖修飾、5位のピリミジン修飾例えば、5-N-ベンジルカルボキシアミド-2’-デオキシウリジン、5-N-イソブチルカルボキシアミド-2’-デオキシウリジン、5-N-[2-1H-インドール-3イルエチル]カルボキシアミド-2’-デオキシウリジン、5-N-[1-3-トリメチルアンモニウムプロピル]カルボキシアミド-2’-デオキシウリジンクロリド、5-N-ナフチルカルボキシアミド-2’-デオキシウリジン、および5-N-[1-2,3-ジヒドロキシプロピル]カルボキシアミド-2’-デオキシウリジン、8位プリン修飾、環外アミンでの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモ-または5-ヨード-ウラシルの置換、メチル化、イソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどの異常塩基対の組合せなどの単独または任意の組合せを含み得る。リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで化学反応を触媒することができる核酸分子である。従って、リボザイムは触媒的核酸である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、およびテトラヒメナリボザイムなどの天然系に見られるリボザイムに基づく、ヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型の反応を触媒するいくつかの異なるタイプのリボザイムが存在する。また、天然系には見られないが、denovoで特定の反応を触媒するように操作されたリボザイムがいくつか存在する。好ましいリボザイムはRNAまたはDNA基質を切断し、より好ましくは、RNA基質を切断する。リボザイムは一般に、標的基質の認識および結合とそれに続く切断によって核酸基質を切断する。この認識は多くの場合、ほとんどはカノニカルな、または非カノニカルな塩基対相互作用に基づくものである。標的基質の認識は標的基質の配列に基づくものであることから、この特性は、リボザイムを、核酸の特異的切断を標的化するための特に良い候補とする。三重らせん形成オリゴヌクレオチドTFOは、二本鎖および/または一本鎖いずれかの核酸と相互作用することができる分子である。TFOが標的領域と相互作用すると、三重らせんと呼ばれる構造が形成され、この場合、ワトソン-クリックおよびフーグスティーンの両方の塩基対合に依存して複合体を形成するDNAが3鎖存在する。TFOは、標的領域と高い親和性および特異性で結合することができる。好ましい実施形態では、三重らせん形成分子は、10-6、10-8、10-10、または10-12未満のKdで標的分子と結合する。本発明で使用するための例示的TFOとしては、PNA、LNA、およびLNA修飾PNA、例えば、Zorro-LNAが含まれる。好ましい実施形態では、三重らせん形成オリゴヌクレオチドは、本明細書で詳しく記載されるDEFB1プロモーター内のPAX2結合部位を標的とする。外部ガイド配列EGSは、ある複合体を形成する標的核酸分子と結合する分子であり、この複合体はRNアーゼPにより認識され、RNアーゼPがこの標的分子を切断する。EGSは、選択されたRNA分子を特異的に標的とするように設計することができる。RNアーゼPは、細胞内でトランスファーRNAtRNAのプロセシングを補助する。細菌のRNアーゼPは、標的RNA:EGS複合体に天然tRNA基質を模倣させるEGSを使用することによって、事実上いずれのRNA配列の切断に対しても動員が可能である。同様に、真核生物のEGS/RNアーゼP指向性RNA切断も、真核細胞内の目的の標的を切断するために使用可能である。一実施形態では、EN2発現および/またはEN2活性を阻害する薬剤は、EN2siRNA、アプタマー-siRNAキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、EN2siRNAをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される1以上のメンバーを含む。別の実施形態では、PAX2発現および/またはPAX2活性を阻害する薬剤は、PAX2siRNA、アプタマー-siRNAキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、PAX2siRNAをコードするポリヌクレオチド、PAX2結合阻害剤、βデフェンシン-1DEFB1プロモーター内にPAX2結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド結合デコイ、アンギオテンシンIIの拮抗剤、アンギオテンシンII受容体の拮抗剤、アンギオテンシン変換酵素ACEの拮抗剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼMEKの拮抗剤、細胞外シグナル調節キナーゼ1、2ERK1、2の拮抗剤、AMPキナーゼ活性化剤、シグナル伝達兼転写活性化因子3STAT3の拮抗剤、およびRASシグナル伝達経路の遮断剤、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される1以上のメンバーを含む。一実施形態では、PAX2発現または活性の阻害剤すなわち、第2の生理活性成分は、DEFB1プロモーターなどのPAX2標的部位へのPAX2の結合を遮断する。一実施形態では、第2の生理活性成分は、DEFB1プロモーター内にPAX2結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド結合デコイを含む。このデコイは、DEFB1などの天然PAX2標的遺伝子へのその結合を阻止または低減することを目的に、PAX2と結合してそれを中和するために過剰量で投与される。好ましい実施形態では、このデコイは、高親和性でPAX2と結合することが知られている配列を含む。例示的デコイ配列としては、配列番号16、18、および19で例示されるような、DEFB1プロモーター内のPAX2結合配列が含まれる。別の実施形態では、PAX2発現または活性の阻害剤は、アンギオテンシンIIの拮抗剤、アンギオテンシンIIタイプ1受容体AT1Rの拮抗剤、またはアンギオテンシン変換酵素ACEの拮抗剤を含む。一実施形態では、この阻害剤は、アンギオテンシンIIタイプ1受容体AT1Rの拮抗剤である。例示的AT1R拮抗剤としては、ロサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、およびテルミサルタンが含まれる。別の実施形態では、この阻害剤は、エナラプリルなどのアンギオテンシン変換酵素ACEの拮抗剤である。他の実施形態では、PAX2発現または活性の阻害剤は、MEK、ERK1、またはERK2の拮抗剤、例えば、U0126またはPD98059を含む。U0126は、化学的に合成された有機化合物であり、細胞AP-1拮抗剤と最初に認識されたものであり、そのすぐ上流にある活性化因子であるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ1および2MEK1およびMEK2としても知られる、IC50:それぞれ70および60nMを阻害することによる、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼMAPKカスケードの選択性の高い強力な阻害剤であることが分かっている。U0126は、不活性型MEKの活性化だけを阻害するPD98059とは異なり、活性型および不活性の両方のMEK1、2を阻害する。MEK活性化の遮断は、AP-1複合体の成分であるc-Fosおよびc-Junの上流誘導因子であるp62TCFElk-1を含むいくつかの因子の下流リン酸化を妨げると考えられる。U0126によるMEK/ERK経路の阻害はまた、H-RasおよびK-Rasの発癌作用を妨げ、上流増殖因子の作用を阻害し、炎症性サイトカインおよびマトリックスメタロプロテイナーゼの産生を遮断することもできる。PD98059は、invivoにおいてMEK1活性化およびMAPキナーゼカスケードの選択性の高い阻害剤として働くことが示されている。PD98059は、不活性型のMEK1と結合し、c-Rafなどの上流活性化因子による活性化を妨げる。PD98059はMEK1およびMEK2の活性化を、それぞれIC50値4μMおよび50μMで阻害する。他の実施形態では、PAX2発現または活性の阻害剤は、AMPキナーゼ活性化剤である。好ましい実施形態では、AMPキナーゼ阻害剤は、5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド-1-β-4-リボフラノシドAICARを含む。PAX2発現は、AT1R、MEK、ERK1、ERK2、およびAMPKの下流標的であるシグナル伝達兼転写活性化因子3STAT-3によって調節されることが知られている例えば、図27参照。よって、別の実施形態では、PAX2発現または活性の阻害剤は、ロサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、U0126、PD98059、AICAR、およびそれらの組合せなどのSTAT-3拮抗剤を含み得る。別の実施形態では、1種類以上の生理活性成分としては、前立腺組織への生理活性成分の送達を標的化するための標的化ドメインが含まれる。前記標的化部分は、前立腺細胞の表面に結合することができるアプタマー、ペプチド、抗体由来エピトープ結合ドメイン、ウイルス、または細胞リガンドを含み得る。前記標的化部分は一般に、ウイルスベクターもしくはリポソームなどの送達ビヒクル中に遺伝子操作により組み込んでもよいし、またはMeadeetal.,Adv.DrugDeliv.,604-5:530-536,2008に記載されているように、siRNAなどの生理活性成分に化学的にコンジュゲートしてもよい。好ましい実施形態では、前記標的化部分は、癌性または前癌前立腺組織においてその発現がアップレギュレートされている細胞表面エピトープに結合する。一実施形態では、前記標的化部分は、上記のようなアプタマーを含む。別の実施形態では、前記標的化部分は、前立腺細胞に結合することが知られているペプチドを含む。例示的前立腺標的化ペプチドが記載される。一実施形態では、前記細胞結合ペプチドは、例えば、ファージディスプレーライブラリーから単離される。結合細胞表面分子または受容体向けに操作されたファージディスプレーライブラリーは当業者に周知である。一実施形態では、前記ペプチドは、例えば、Joliotetal.,NatureCellBiol.,63:189-196,2004およびHeitzetal.,Br.J.Pharmacol.,157:195-206,2009に記載されているように、真核細胞膜を経た生理活性成分の侵入を促進するために、細胞内移行性ペプチド細胞透過性ペプチドCPPまたはタンパク質形質導入ドメインPTDとも呼ばれるを含む。本発明において使用するための例示的細胞内移行性ペプチドとしては、限定されるものではないが、HIVTAT49-57ペプチドRKKRRQRRR、配列番号79、HIVTAT48-60ペプチドGRKKRRQRRRPPQ、配列番号80、低分子量プロタミンLMWPペプチド例えば、TDSP5、VSRRRRRRGGRRRR、配列番号81、米国特許公開第2007/0071677号に記載;PEP-1としても知られるChariotTMKETWWETWWTEWSQPKKKRKV、配列番号82;Antp43-58RQIKIWFQNRRMKWKK、配列番号83ペプチド、MPGHIVGp41-SV40NLS、GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV、配列番号84、SAPVRLPPPVRLPPPVRLPPP、配列番号85、MPGR9RRRRRRRRR、配列番号86、MAPKLALKLALKALKAALKLA、配列番号87;およびKALAKALAKALA、配列番号88、K-FGFAAVALLPAVLLALLAP、配列番号89、ペネトラチンRQIKIWFQNRRMKWKK、配列番号90、ブフォリンIITRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK、配列番号91、トランスポータンGWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL、配列番号92、Ku70VPMLK、配列番号93、プリオンMANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP、配列番号94、およびpVECLLIIILRRRIRKQAHAHSK、配列番号95、Pep-7SDLWEMMMVSLACQY、配列番号96、HN-1TSPLNIHNGQKL、配列番号97、およびCP26KWKSFIKKLTSAAKKVVTTAKPLISS配列番号98が含まれる。別の実施形態では、前記標的化部分は、IgG抗体可変領域;単離されたCDR領域;2つのドメイン間の結合による抗原結合部位の形成を可能とするペプチドリンカーによって連結されたVHドメインとVLドメインを含む、一本鎖Fv分子scFv;二重特異性scFv二量体;VHドメインまたはVLドメインからなる、CH3ドメイン、一本鎖ダイアボディーフラグメント、dAbフラグメントに連結されたscFvを含むミニボディー;VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFabフラグメント;重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端に、抗体のヒンジ領域に由来する1以上のシステインを含む数個の残基が付加されていることでFabフラグメントとは異なる、Fab’フラグメント;定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するFab’フラグメントである、Fab’-SHフラグメント;2つの連結したFabフラグメントを含む二価フラグメントである、Fab’2;VHドメインおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;それらの誘導体、および抗原結合機能を保持する他のいずれかの抗体フラグメントからなる群から選択される抗体由来エピトープ結合ドメインを含む。Fv、scFv、またはダイアボディー分子は、VHドメインとVLドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化させることができる。さらに、前記標的化部分は、Fc領域に少なくとも部分的に結合されてもよい。Fc領域は、Fc受容体を有するナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、および肥満細胞の動員を促し、食作用細胞または細胞毒性性細胞を刺激して、抗体媒介性食作用または抗体依存性細胞媒介性細胞毒性作用により標的前立腺細胞を破壊することができる。さらに、抗体由来標的化薬剤を使用する場合、その中の標的化ドメインのいずれかもしくは全て、および/またはFc領域は、当業者に周知の方法論を用いてヒト化され得る。特定の実施形態では、該方法は、前記対象に、DEFB1発現またはDEFB1活性を増強する第3の薬剤を投与することをさらに含む。DEFB1発現またはDEFB1活性を増強する薬剤の例としては、限定されるものではないが、DEFB1タンパク質、DEFB1saRNA、DEFB1saRNAをコードする発現ベクター、DEFB1タンパク質をコードする発現ベクター、インターフェロン-γ、およびそれらの組合せが含まれる。第1の薬剤、第2の薬剤および/または第3の薬剤は、単一の医薬組成物で同時に投与してもよいし、または個々に投与してもよい。一実施形態では、第1の薬剤、第2の薬剤および/または第3の薬剤は、対象の前立腺癌組織またはPIN組織に直接投与される。別の態様では、本発明は、対象において前立腺癌またはPINを処置するための方法であって、前記対象にEN2発現および/またはEN2活性を阻害する有効量の第1の薬剤を投与すること、ならびに前記対象にDEFB1発現および/またはDEFB1活性を増強する有効量の第2の薬剤を投与することを含む方法を提供する。低分子活性化RNAsaRNAまたはdsRNA活性化因子は、それが低分子RNA誘導遺伝子活性化またはRNAaと呼ばれる機構によって遺伝子発現を活性化すること以外は、siRNAと同様である。dsRNAは、dsRNAの内因性供給源として働く一群の低分子非コードRNAであるマイクロRNAmiRNA種を含む。DEFB1saRNAは、その遺伝子の非コード核酸配列に相補的なリボヌクレオチド鎖を含む。好ましい実施形態では、前記DEFB1saRNAは、DEFB1プロモーターまたはエンハンサー配列を含むDEFB1転写調節配列を標的とするリボ核酸配列を含む。dsRNA活性化因子およびそれらをコードするポリヌクレオチドは、Lietal.,Proc.Natl.Acad.SciUSA,10346:17337-17342,2006Chenetal.,Mol.CancerTher,.73:698-7032008に記載されているように、合成またはsiRNAもしくはshRNAとして構築することができる。本出願の別の態様は、被験者において癌性、前癌性、または非癌性の前立腺病態をモニタリングまたは診断し、それらの結果に基づいて、前記対象の前立腺組織に、EN2発現および/またはEN2活性を阻害する有効量の薬剤、ならびにPAX2発現またはPAX2活性を阻害する第2の薬剤を投与するための方法に関する。特定の実施形態では、被験者において癌性、前癌性、または非癌性病態をモニタリングまたは診断するための方法は、被験者から得られた細胞または体液においてPAX2とDEFB1またはEN2とDEFB1の発現比を決定することを含み、この場合、PAX2とDEFB1の発現比またはEN2とDEFB1の発現比は、1以上の癌性、前癌性、または非癌性病態と相関している。一実施形態では、対象において前立腺病態を処置するための方法は、a前記対象由来の罹患前立腺組織においてPAX2とDEFB1の発現比を決定すること;およびbaの結果に基づき、前記対象の前立腺組織にEN2発現および/またはEN2活性を阻害する第1の生理活性成分、ならびにPAX2発現および/またはPAX2活性を阻害する第2の生理活性成分を投与することを含む。好ましい実施形態では、前記方法は、前記対象の前立腺組織にDEFB1の発現および/または活性を増強する第3の生理活性成分を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前立腺病態は、前立腺癌またはPINである。別の実施形態では、対象において前立腺病態を処置するための方法は、aEN2、PAX2およびDEFB1の発現レベルを決定すること、b前記対象由来の罹患前立腺組織においてPAX2とDEFB1および/またはEN2とDEFB1の発現比を決定すること;およびcaとbの結果に基づき、前記対象に、1EN2発現を阻害する有効量の薬剤、および2PAX2発現および/もしくはPAX2活性を阻害する薬剤、ならびに/またはDEFB1発現および/もしくはDEFB1活性を増強する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、前立腺病態は、前立腺癌またはPINである。特定の実施形態では、前記決定工程は、内部対照遺伝子の発現レベルに対するPAX2遺伝子の発現レベルを決定すること、同じ対照遺伝子の発現レベルに対するDEFB1遺伝子の発現レベルを決定すること、およびPAX2とDEFB1の発現レベルに基づいてPAX2とDEFB1の発現比を決定することを含む。その発現が全ての細胞種で実質的に一定であることが分かっている限り、いずれの好適な内部対照遺伝子も使用可能である。例示的内部対照遺伝子としては、限定されるものではないが、β-アクチン遺伝子、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼGAPDH遺伝子などが含まれる。一実施形態では、前立腺細胞からのPAX2とDEFB1の発現比は、被験者において癌性、前癌性、および非癌性前立腺病態を識別するために使用される。一実施形態では、PAX2とDEFB1の発現比が100:1以上であれば、対象に前立腺癌が存在することが示される。別の実施形態では、PAX2とDEFB1の発現比が40:1以上、100:1未満であれば、対象において前立腺上皮内新生物PINが存在することが示される。さらに別の実施形態では、PAX2とDEFB1の発現比が40:1未満であれば、対象において正常な前立腺が示される。他の実施形態では、前立腺細胞からのPAX2とDEFB1の発現比は、被験者において癌性、前癌性、および非癌性前立腺病態を識別するために使用される。一実施形態では、PAX2とDEFB1の発現比が100:1以上であれば、対象に前立腺癌が存在することが示される。別の実施形態では、PAX2とDEFB1の発現比が40:1以上、100:1未満であれば、対象において前立腺上皮内新生物PINが存在することが示される。本明細書で使用する場合、用語前立腺上皮内新生物には、小葉上皮内新生物および腺管上皮内新生物が含まれる。さらに別の実施形態では、PAX2とDEFB1の発現比が40:1未満であれば、正常な前立腺状態が示される。特定の実施形態では、被験者において癌性、前癌性、および非癌性病態をモニタリングまたは診断するための方法は、癌のリスクがあることが疑われる被験者の組織から得られた細胞または体液においてPAX2発現レベルを決定すること、癌のリスクがあることが疑われる被験者の組織から得られた細胞または体液においてEN2発現レベルを決定すること、および被験者の組織からのPAX2およびEN2発現レベルと、癌を含まない対照対象の同じ組織から得られた発現レベルを比較することを含み、この場合、対照対象に比べて、被験者のPAX2およびEN2の発現レベルがそれぞれ少なくとも2倍高いことが、癌または癌を発症する高いリスクを示す。少なくとも50、100、150、200、250、300、400またはそれを超える発現レベルの上昇が見られる場合がある。これらの細胞は、癌においてEN2およびPAX2がアップレギュレートされているいずれの組織から得てもよい。好ましい組織としては、前立腺および前立腺組織が含まれる。好ましい体液としては、血液、血漿、血清、および尿が含まれる。特定の実施形態では、前記方法は、代わりにまたは加えて、被験者の組織から得られた細胞または体液においてEN2およびPAX2に加えてDEFB1発現レベルを決定し、それらの発現レベルを対応する参照レベル例えば、正常な対照対象の細胞または体液から得られた発現レベルと比較する工程を含んでもよく、この場合、対照に比べての被験者におけるEN2およびPAX2の発現レベルの上昇、および対照に比べての被験者におけるDEFB1の発現レベルの低下が、癌または癌を発症するリスクを示す。さらに、本明細書で開示される方法は、血液、尿、血漿、血清、涙、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、房水または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門および膣分泌液、汗、精液、濾出液、浸出液、および滑液などの対象の体液中のPAX2、EN2、および/またはDEFB1の測定を含む、検出を含み得る。遺伝子発現レベルおよび遺伝子発現比は、mRNAレベルで例えば、RT-PCR、QT-PCR、オリゴヌクレオチドアレイなどによるまたはタンパク質レベルで例えば、ウエスタンブロット、抗体マイクロアレイ、ELISAなどによる決定することができる。mRNA発現レベルおよびそれからの比を決定するための好ましい方法論には、定量的逆転写酵素PCRQT-PCR、定量的リアルタイムRT-PCR、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、またはそれらの組合せが含まれる。タンパク質発現レベルおよびそれからの比を決定するための好ましい方法論には、ELISAおよび抗体マイクロアレイの使用が含まれる。いくつかの実施形態では、前記方法は、被験者から得られた前立腺細胞または体液においてアンドロゲン受容体ARの状態すなわち、ホルモン感受性またはホルモン不応性を決定することをさらに含む。この前立腺組織のARの状態は、対照における前立腺病態を決定するために、同じ組織におけるEN2とDEFB1の比および/またはPAX2とDEFB1の比と併用可能である。他の実施形態では、前記方法は、前立腺病態を有する前立腺組織から得られた細胞または体液においてエストロゲン受容体/プロゲステロン受容体ER/PRの状態を決定することをさらに含む。この前立腺組織のER/PRの状態は、対照における前立腺病態を決定するために、同じ組織におけるPAX2とDEFB1の比と併用可能である。本発明のモニタリングおよび診断方法は、臨床医に発癌起始組織または前癌組織の予後因子を提供する。この検査の候補には、癌の高リスク患者年齢、人種によるが含まれる。診断法として、陽性または陰性PAX2、EN2、および/またはDEFB1判定の後に、癌の状態を同定するためにバイオマーカーを用いたさらなるスクリーニングを行うことができる。さらに、これらの患者は、PAX2/EN2/DEFB1調節剤による処置の候補となり得る。あるいは、これらの検査は、患者に対してそれらの癌療法の有効性をモニタリングするため、処置経過を調べるため、または癌の再発をモニタリングするために使用することができる。別の例として、臨床医による直腸指診時の前立腺における結節の検出などの癌の潜在指標を呈する患者、またはPSAの急上昇を受けている患者は、多くの場合、待機療法状況にある。これらの患者が癌を有するかどうか、または癌を発症するかどうかを確認することは難しい場合が多い。例えば、組織、血液、血漿、血清、および/または尿からの患者サンプルにおけるPAX2、EN2、DEFB1発現レベル、またはPAX2とDEFB1および/もしくはEN2とDEFB1の発現比の分析は、前立腺癌の疑いのあるヒトにおいて生検をとる判断を補助するために使用することができ、このことにより、不必要な前立腺生検の数を減らし、疾患に対するより早期の介入を導くことができる。生検では、さらなる分析のために標的器官から小組織サンプルを取り出す。前立腺生検は一般に、PSA血液検査からのスコアが前立腺癌の存在の可能性に関連するレベルにまで上昇した際に行われる。血液タンパク質マーカーの同定はより正確またはより早期の癌診断を提供し、癌の治療および管理にプラスの影響を持ち得る。本明細書に開示されているように、異常なPAX2発現は、癌の進行の初期に見られ、腫瘍形成の起始事象である可能性がある。従って、PAX2タンパク質または抗原の存在に関してスクリーニングするために採取した患者由来のサンプルを、癌の早期検出のために使用することができる。さらに、PAX2/EN2/DEFB1スクリーニングの組み込みは、臨床医に発癌起始組織または前癌組織の予後因子を提供し得る。この検査の候補には、癌の高リスク患者年齢、人種によるが含まれる。診断法として、陽性PAX2判定の後に、他のバイオマーカーを用いたさらなるスクリーニングを行うことができる。さらに、これらの患者は、それらの癌の化学予防法としてのPAX2阻害剤の候補でもあり得る。あるいは、この検査は、患者に対して、それらの癌療法の有効性の尺度として、または癌の再発をモニタリングするためにも使用可能である。処置用組成物さらなる態様において、本発明は、本明細書記載の方法に従って前立腺癌または前立腺上皮内新生物PINを処置するための組成物を提供する。一実施形態では、前記組成物は、EN2発現および/またはEN2活性を阻害する第1の薬剤、PAX2発現および/またはPAX2活性を阻害する第2の薬剤、ならびに薬学上許容される担体を含む。前記組成物は、DEFB1の発現および/または活性を増強する第3の薬剤をさらに含み得る。EN2発現および/またはEN2活性を阻害する薬剤、PAX2発現および/またはPAX2活性を阻害する薬剤、ならびにDEFB1の発現および/または活性を増強する薬剤の例は、処置方法の節に記載されている。薬学上許容されるとは、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、前記材料は、望ましくない生体作用を引き起こさずに、またはそれが含まれている医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、核酸またはベクターとともに対象に投与され得る。当業者に周知のように、前記担体は当然のことながら有効成分の分解を最小限とするように、また、対象における有害な副作用を最小限とするように選択される。別の実施形態では、前立腺癌またはPINを処置するための組成物は、EN2発現および/またはEN2活性を阻害する第1の生理活性成分とDEFB1の発現および/または活性を増強する第2の生理活性成分、ならびに薬学上許容される担体を含む。生理活性成分は、本明細書に記載されるような生理活性成分およびそれらの組成物のいずれを含んでもよい。好適な担体およびそれらの製剤は、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacyedARGennaroMackPublishingCompanyEastonPA1995に記載されている。一般に、製剤と等張性とするために適当な量の薬学上許容される塩が製剤に使用される。薬学上許容される担体の例としては、限定されるものではないが、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のpHは好ましくは約5~約8、より好ましくは約7~約7.5である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性剤形が含まれ、これらのマトリックスは成形品、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子の形態である。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じてある特定の担体がより望ましい場合があることは、当業者には明らかであろう。医薬担体は当業者に公知である。これらは最も一般には、無菌水、生理食塩水、および生理学的pHの緩衝溶液などの溶液をはじめとする、ヒトへの薬物の投与に標準的な担体であろう。前記組成物は、筋肉内または皮下投与することができる。他の化合物は、当業者に使用されている標準的な手順に従って投与される。医薬組成物は、選択された分子の他、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含み得る。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などの1以上の有効成分を含んでもよい。非経口投与のための調剤には、無菌水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルションが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール/水溶液、エマルションまたは懸濁液生理食塩水および緩衝媒体を含むが含まれる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または硬化油が含まれる。静脈内ビヒクルとしては、補液および栄養補給剤、電解質補給剤ブドウ糖加リンゲル液に基づくものなどが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの、保存剤および他の添加剤も存在してよい。局所投与用の製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、水剤および散剤を含み得る。慣例の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要であるまたは望ましい場合がある。経口投与用の組成物としては、散剤または顆粒剤、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル剤、サシェ剤、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい場合がある。組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応により、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応により形成された薬学上許容される酸または塩基付加塩として投与される可能性がある。前記材料は溶液、懸濁液中に存在してもよい例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれる。これらは抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞種に標的化することができる。ステルスおよび他の抗体コンジュゲートリポソーム結腸癌への脂質媒介薬物ターゲティングなどのビヒクル、細胞特異的リガンドへのDNAの受容体媒介ターゲティング、リンパ球指向性腫瘍ターゲティング、およびinvivoにおけるネズミ神経膠腫細胞の高特異性治療用レトロウイルスターゲティング。一般に、受容体は構成的またはリガンド誘導型のいずれかでエンドサイトーシス経路に関与する。これらの受容体はクラスリン被覆ピット内にクラスターを形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に入り、酸性化エンドソームを通過し、そこで受容体が選別され、その後、細胞表面へと再循環するか、細胞内で貯蔵されるようになるか、またはリソソームで分解される。細胞内移行経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節などの多様な機能を果たす。多くの受容体は、細胞種、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンド価、およびリガンド濃度に応じて2つ以上の細胞内経路をたどる。本明細書に記載の組成物は、開示される方法の実施または実施の補助に有用なキットとして、任意の好適な組合せで一緒に包装することができる。いくつかの実施形態では、前立腺癌またはPINなどの前立腺病態を処置するためのキットは、EN2発現もしくは活性の阻害剤、PAX2発現もしくは活性の阻害剤、および/またはDEFB1発現または活性の活性化剤を含む。これらの阻害剤または活性化剤は、上記の生理活性成分のいずれを含んでもよい。本明細書に開示される組成物は、局所処置が望まれるか全身処置が望まれるかによって、および処置される領域によって、いくつかの方法で投与することができる。例えば、前記組成物は、経口、非経口例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射的に、吸入により、対外、局所経皮、眼内、膣、直腸、鼻腔内を含むなどによって投与され得る。本明細書で使用する場合、局所的鼻腔内投与とは、一方または両方の鼻孔から鼻および鼻道への組成物の送達を意味し、核酸またはベクターの噴霧機構もしくは滴下機構による、またはエアゾール化を介した送達を含み得る。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または滴下機構による送達を介した鼻または口を経たものであり得る。また、挿管によって呼吸器系のいずれの領域例えば、肺へも直接送達を行うことができる。組成物の非経口投与は、使用する場合、一般に注射を特徴とする。注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液のいずれかとしての、注射前に液体中の溶液もしくは懸濁液とするのに好適な固体形態、またはエマルションとしての慣例の形態で調製することができる。さらに最近改訂された非経口投与のアプローチは、一定の用量が維持されるように緩徐放出または徐放性系の使用を含む。組成物の正確な必要量は、対象の種、齢、体重および健康状態、使用する特定の核酸またはベクター、その投与様式などに応じて対象ごとに異なる。適当な量は、当業者ならば、本明細書に教示が与えられているので、通常の実験だけを用いて決定することができる。従って、組成物を投与するために効果的な用量および計画は経験的に決定することができ、このような決定を行うことは当業者の範囲内である。組成物の投与のための用量範囲は、症状傷害が影響を受ける所望の効果をもたらすために十分なものである。この用量は、望まない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほどの大きさであるべきではない。一般に、用量は、患者の齢、状態、性別および疾患の程度、投与経路、またはその投与計画に他の薬物が含まれるかどうかによって異なり、当業者ならば決定することができる。用量は、いずれの禁忌の事象においても個々の医師によって調整可能である。用量は可変であり、1日1用量以上の投与で1日または数日間投与することができる。所与の医薬製剤種の適当な用量については文献に指針を見出すことができる。例えば、開示されている組成物の、単独使用の場合の典型的な1日用量は、上述の因子に応じて約1μg/kg~大100mg/kg体重以上/日の範囲であり得る。特定の実施形態では、処置方法は、罹患組織のPAX2とDEFB1の発現比P/D比および/または前立腺特異抗原PSAの状態に基づいて調整することができる。従って、PAX2発現レベルのモニタリングは、薬物の奏功または耐性を予測するため、ならびに抗EN2、抗PAX2、および/またはDEFB1療法の候補となり得る患者を特定するために使用可能である。用語抗EN2療法および抗PAX2療法とは、EN2/PAX2発現またはEN2/PAX2活性を阻害するための方法を意味する。用語DEFB1療法とは、DEFB1発現を増強するための方法を意味する。用語DEFB1療法は、EN2/PAX2発現またはEN2/PAX2活性を阻害するための方法は含まないが、このような方法はDEFB1発現の増強ももたらす場合がある。他の阻害剤いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の薬剤は、1つ又は複数の従来の化学療法剤と併用される。本発明で使用される例示的な化学療法剤としては、以下のものが含まれる:フィナステリド、デュタステリド、ツロステリド、ベキスロステリドbexlosteride、イゾンステリドizonsteride、FCE28260、及びSKF105、111を含む5-アルファ-レダクターゼ阻害剤;QLT-0267等のインテグリン結合キナーゼILK阻害剤;分泌Frizzled関連タンパク質-1sFRP1、分泌Frizzled関連タンパク質-2sFRP2、分泌Frizzled関連タンパク質-3sFRP3/FRZB、分泌Frizzled関連タンパク質-4sFRP4、分泌Frizzled関連タンパク質-5SFRP5、Dickkopf-1DKK1、Dickkopf-2DKK2、Dickkopf-3DKK3、Wnt阻害因子-1WIF1、ケルベロス、スクレロスチン、IWR-1-endo、IWP-2、IWP-3、IWP4、ピルビニウム、XAV939、及び他のWNTシグナル伝達経路阻害剤;ベバシズマブアバスチン、カバジタキセル、ケトコナゾール、プレドニゾン、シプロイセル-TAPC8015、プロベンジ、アルファラディン塩化ラジウム-223、MDV3100、オルテロネルTAK-700、PROSTVAC、カボザンチニブXL-184、DMAPT;シクロパミン、IP-926、ビスモデギブ、及び他のヘッジホッグHhシグナル伝達経路阻害剤;フルタミド、ルプロリドluprolide、タモキシフェン等の抗エストロゲン薬;ダウノルビシン、フロウロウラシルflourouracil、フロクスウリジン、インターフェロンアルファ、メトトレキサート、プリカマイシン、メカプトプリンメカプトプリン、チオグアニン、アドラマイシンadramycin、カルムスチン、ロムスチン、シタラビン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エストラムスチン、アルトレタミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、プロカルバジン、ムタマイシン、ブスルファン、ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、ストレプトゾシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、イダマイシン等の代謝拮抗剤及び細胞毒性剤、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、エストラジオール、ロイプロリド、メゲストロール、オクトレオチド、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、エトポシド、ポドフィロトキシン、ゴセレリン等のホルモン、メルファラン、クロラムブシル、メトロレタミンmethlorethamine、チオテパ等のナイトロジェンマスタード誘導体、ベータメタゾン等のステロイド、及びウシ生菌マイコバクテリウム、ジカルバジンdicarbazine、アスパラギナーゼ、ロイコボリブンleucovoribn、ミトタン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テキソテルtexotere、シドホスファミドcydophosphamide、アドリアマイシン、5-フロウロウラシル5flourouracil、ヘキサメチルメラミン等の他の抗腫瘍剤、アシビシン;アクラルビシン;アコダゾール塩酸塩;アクルクニンacrqnine;アドゾレシンadozolesin;アルデスロウキンaldesloukin;アルトレタミン;アンボマイシン;酢酸アメタントロン;アミノグルトイミドaminogluthimide;アムサクリン;アナストロゾール;アントラマイシン;アスパラギナーゼ;アスペルリン;アザシチジン;アゼテパ;アゾトマイシン;バチマスタット;ベンゾデパ;ビカルタミド;ビサントレン塩酸塩;ビスナフィドジメシラート;ビセレシン;硫酸ブレオマイシン;ブレキナルナトリウム;ブロピリミン;ブスルファン;カクチノマイシン;カルステロン;カラセミド;カルベチマーcarbetimer;カルボプラチン;カルムスチン;カルビシン塩酸塩;カルゼレシン;セデフィンゴール;クロラムブシル;シロレマイシン;シスプラチン;クラドリビン;クリスナトールメシラート;シクロホスファミド;シタラビン;ダカルバジン;ダクチノマイシン;ダウノルビシン塩酸塩;デシタビン;デキソルマプラチンdexormaplatin;デザグアニン;デザグアニンメシラート;ジアジコン;ドセタキセル;ドキソルビシン;ドキソルビシン塩酸塩;ドロロキシフェン;ドロロキシフェンクエン酸塩;プロピオン酸ドロモスタノロン;ズアゾミリンduazomyrin;エダトレキサート;エフロミチン塩酸塩;エルサミトルシン;エンロプラチン;エンプロルファートenprorfate;エピプロピジン;エピルビシン塩酸塩;エルブロゾール;エソルビシン塩酸塩;エストラムスチン;リン酸エストラムスチンナトリウム;エタニダゾール;ヨード化ケシ油エチルエステルI131;エトポシド;リン酸エトポシド;エトプリン;ファドロゾール塩酸塩;ファザラビン;フェンレチニド;フロクスウリジン;リン酸フルダラビン;フルオロウラシル;フルロシタビン;ホスキドン;フォストリエシンナトリウム;ゲムシタビン;ゲムシタビン塩酸塩;金Au198;ヒドロキシ尿素;イダルビシン塩酸塩;イホスファミド;イルモホシン;インターフェロンアルファ-2a;インターフェロンアルファ-2b;インターフェロンアルファ-n1;インターフェロンアルファ-n3;インターフェロンベータ-Ia;インターフェロンガンマ-Ib;イプロプラチン;イリノテカン塩酸塩;ランレオチド酢酸塩;レトロゾール;ロイプロリド酢酸塩;リアロゾール塩酸塩;ロメトレキソールナトリウム;ロムスチン;ロソキサントロン塩酸塩;マソプロコール;メイタンシン;メクロレタミン塩酸塩;酢酸メゲストロール;酢酸メレンゲストロール;メルファラン;メノガリル;メルカプトプリン;メトトレキサート;メトトレキサートナトリウム;メトプリン;メツレデパ;ミチンドミド;ミトカルシン;ミトクロミン;ミトギリン;ミトマルシン;マイトマイシン;ミトスペルmitosper;ミトタン;ミトキサントロン塩酸塩;ミコフェノール酸;ノコダゾール;ノガラマイシン;オルマプラチン;オキシスラン;パクリタキセル;ペグアスパルガーゼ;ペリオマイシンpeliomycin;ペンタムスチン;ペプロマイシン硫酸塩;ペルホスファミド;ピポブロマン;ピポスルファン;ピロキサントロン塩酸塩;プリカマイシン;プロメスタン;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニムスチン;プロカルバジン塩酸塩;ピューロマイシン;ピューロマイシン塩酸塩;ピラゾフリン;リボプリン;ログレチミド;サフィンゴール;サフィンゴール塩酸塩;セムスチン;シムトラゼン;スパルホサートナトリウム;スパルソマイシン;スピロゲルマニウム塩酸塩;スピロムスチン;スピロプラチン;ストレプトニグリン;ストレプトゾシン;塩化ストロンチウムSr89;スロフェヌル;タリソマイシン;タキサン;タキソイド;テコガランナトリウム;テガフール;テロキサントロン塩酸塩;テモポルフィン;テニポシド;テルロキシロノteroxirono;テストラクトン;チアミプリン;チオグアニン;チオテパ;チアゾフリン;チラパザミン;トポテカン塩酸塩;トレミフェンクエン酸塩;酢酸トレストロン;リン酸トリシリビン;トリメトレキサート;グルクロン酸トリメトレキサート;トリプトレリン;ツブロゾール塩酸塩;ウラシルマスタード;ウレデパ;バプレオチド;ベルテポルフィン;ビンブラスチン硫酸塩;ビンクリスチン硫酸塩;ビンデシン;ビンデシン硫酸塩;ビネピジン硫酸塩;ビングリシナート硫酸塩;ビンロイロシン硫酸塩;酒石酸ビノレルビン;ビンロシジン硫酸塩;ビンゾリジン硫酸塩;ボロゾール;ゼニプラチン;ジノスタチン;ゾルビシン塩酸塩、20-epi-1,25ジヒドロキシビタミンD3;5-エチニルウラシル;アビラテロン、アクラルビシン;アシルフルベン;アデシペノール;アドゼレシン;アルデスロイキン;ALL-TKアンタゴニスト;アルトレタミン;アンバムスチン;アミドックス;アミホスチン;アミノレブリン酸;アムルビシン;アトルサクリンatrsacrine;アナグレリド;アナストロゾール;アンドログラフォリド;血管形成阻害剤;アンタゴニストD;アンタゴニストG;DHEA;ブロミンエピアンドロステロンbromineepiandrosterone;エピアンドロステロン;アンタレリクス;抗神経化形態形成タンパク質-1;抗アンドロゲン剤、前立腺癌;抗エストロゲン剤;抗腫瘍薬;アンチセンスオリゴヌクレオチド;アフィジコリングリシナート;アポトーシス遺伝子修飾因子;アポトーシス調節因子;アプリン酸;ara-CDP-DL-PTSA、アルギニンデアミナーゼ;アスラクリン;アタメスタン;アトリムスチン;アキシナスタチン1;アキシナスタチン2;アキシナスタチン3;アザセトロン;アザトキシン;アザチロシン;バッカチンIII誘導体;バラノール;バチマスタット、BCR/ABLアンタゴニスト;ベンゾクロリン;ベンゾイルスタウルスポリンbenzoylstaursporine;ベータラクタム誘導体;ベータ-アレチン;ベタクラマイシンB;ベツリン酸;bFGF阻害剤、ビカルタミド;ビサントレン;ビスアジンジニルスペルミンbisazindinylspermine;ビスナフィド;ビストラテンA;ビセレシン;ブレフラート;ブロピリミン;ブドチタン;ブチオニンスルホキシミン;カルシポトリオール;カルホスチンC;カンプトテシン誘導体;カナリアポックスIL-2;カペシタビン;カルボキサミド-アミノ-トリアゾール;カルボキシアミドトリアゾール;CaRestM3;CARN700;軟骨由来阻害剤;カルゼレシン;カゼインキナーゼ阻害剤ICOS;カスタノスペルミン;セクロピンB;セトロレリクス;クロリン;クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト;cis-ポルフィリン;クラドリビン;クロミフェン類似体;クロトリマゾール;コリスマイシンA;コリスマイシンB;コンブレタスタチンA4;コンブレタスタチン類似体;コナゲニン;クランベシジン816;クリスナトール;クリプトフィシン8;クリプトフィシンA誘導体;クラシンA;シクロペンタアントルキノンcyclopentanthrequinone;シクロプラタムcycloplatam;シペマイシン;シタラビンオクホスファート;細胞溶解因子;シトスタチン;ダクリキシマブdacliximab;デシタビン;デヒドロジデムニンB;デスロレリン;デキシホスファミドdexifostamide;デクスラゾキサン;デクスベラパミル;ジアジコン;ジデムニンB;ジドックス;ジエチルノルスペルミン;ジヒドロ-5-アザシチジン;ジヒドロタキソール、9-;ジオキサマイシン;ジフェニルスピロムスチン;ドコサノール;ドラセトロン;ドキシフルリジン;ドロロキシフェン;ドロナビノール;デュオカンニシンSAduocannycinSA;エブセレン;エコムスチン;エデルホシン;エドレコロマブ;エフロルニチン;エレメン;エミテフル;エピルビシン;エプリステリド;エストラムスチン類似体;エストロゲンアゴニスト;エストロゲンアンタゴニスト;エタニダゾール;リン酸エトポシド;エキセメスタン;ファドロゾール;ファザルビンfazarbine;フェンレチニドfenretinido;フィルグラスチム;フルナステリドfrnasteride;フラボピリドール;フレゼラスチン;フルアステロン;フルダラビン;フルオロダウノルシン塩酸塩;トルフェニメキスtorfenimex;ホルメスタン;フォストリエシン;ホテムスチン;ガドリニウムテキサフィリン;硝酸ガリウム;ガロシタビン;ガニレリクス;ゼラチナーゼ阻害剤;ゲムシタビン;グルタチオン阻害剤;ヘプスルファム;ヘレグリン;ヘキサメチレンビスアセトアミド;ヒペリシン;イバンドロン酸;イダルビシン;イドキシフェン;イドラマントン;イルモホシン;イロマスタット;イミダゾアクリドン;イミキモド;免疫賦活剤ペプチド;インスリン様増殖因子-1受容体阻害剤;インターフェロンアゴニスト、インターフェロン;インターロイキン;イオボングアンiobonguane;ヨードドキソルビシン;イポメアノール、4;トリノテカンtrinotecan;iroplact;イルソグラジン;イソベンガゾール;イソホモハリコンドリンB;イタセトロン;ジャスプラキノリド;カハラリドF;ラメラリン-Nトリアセタート;ランレオチド;レイナマイシン;レノグラスチム;硫酸レンチナン;レプトルスタチン;レトロゾール;白血病抑制因子;白血球アルファインターフェロン;ロイプロリドエストロゲンプロゲステロン;リュープロレリン;レバミソールリアロゾール;直鎖ポリアミン類似体;リポフィリカジサッカリドlipophilicadisaccharideペプチド;親油性白金化合物;リッソクリナミド-7;ロバプラチン、ロンブリシン;ロメトレキソール;ロニダミン;ロソキサントロン;ロバスタチン;ロキソリビン;ルルトテカン;ルテチウムテキサフィリン;リソフィリンlysofylline;細胞溶解性ペプチド;マイタンシン;マンノスタチンA;マリマスタット;マソプロコール;マスピン;マトリライシン阻害剤;マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤;メノガリル;メルバロン;メテレリン;メチオニナーゼ;メトクロプラミド;MIF阻害剤;ミフェプリストン;ミルテホシン;ミリモスチム;ミスマッチ二本鎖RNA;ミトグアゾン;ミトラクトール;ミトマイシン類似体;ミトナフィド;ミトトキシンmitotoxin線維芽細胞増殖因子-サポリン;ミトキサントロン;モファロテン;モルグラモスチム;モノクローナル抗体、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン;モノホスプリオリルmonophospliorylリピドAミオバクテリウム細胞壁sk;モピダモール;多剤耐性遺伝子genie阻害剤;多腫瘍抑制因子1に基づく治療;マスタード抗癌剤;ミカペルオキシドB;ミコバクテリウム細胞壁抽出物;ミリアポロン;N-アセチルジナリン;N-置換ベンズアミド;ナファレリン;ナグレスチプnagrestip;ナロキソンペンタゾシン;napavin;ナフテルピン;ナルトグラスチム;ネダプラチン;ネモルビシン;ネリドロン酸;中性エンドペプチダーゼ;ニルタミド;ニサマイシン;一酸化窒素合修飾因子;窒素酸化物酸化防止剤;ニトルリンnitrullyn;O6-ベンジルグアニン;オクトレオチド;オキセノン;オリゴヌクレオチド;オナプリストン;オルルダリセトロンorldarisetron;オンダンセトロン;オラシン;経口サイトカイン誘導因子;オルマプラチン;オサテロン;オキサリプラチン;オキサウノマイシン;パクリタキセル類似体;パクリタキセル誘導体;パラウアミン;パルミトイルリゾキシン;ネリドロン酸;パナキシトリオール;パノミフェン;パラバクチン;パゼリプチン;ペガエペルガーゼpegaepergase;ペルデシン;ペントサンポリ硫酸ナトリウム;ペントスタチン;ペントロゾールpentrozole;ペルフルブロン;ペルホスファミド;ペリリルアルコール;フェナジノマイシン;フェニルアセタート;ホスファターゼ阻害剤;ピシバニール;ピロカルピン塩酸塩;ピラルビシン;ピリトレキシム;placetinA;placetinB;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;白金錯体comprex;白金化合物;白金-トリアミンコイル型iplex;ポルフィマーナトリウム;ポルチロマイシンportiromycin;プロピルビス-アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテアソーム阻害剤;プロテインAに基づく免疫修飾因子;プロテインキナーゼC阻害剤;プロテインキナーゼC阻害剤、微細藻類タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤;プリノムクレオシドホスホリルアストpurinomucleosidephosphorylast阻害剤;プルプリン;ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン結合体;rafアンタゴニスト;ラルチトレキセド;ラモセトロン;rasファルネシルタンパク質転写阻害剤;ras阻害剤、;ras-GAP阻害剤、レタリプチン脱メチル化retalliptinedemethylated;エチドロン酸レニウムRe186;リゾキシン;リボザイム;RIIレチンアミド;ログレチミド;ロヒツキン;ロムルチド;ロキニメックス;ルビギノンB1;ルボキシル;サフィンゴール;サイントピン;SarCNU;サルコフィトールA;サルグラモスチム、Sdi1模倣剤;セムスチン;老化由来阻害剤1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シグナル伝達修飾因子;単鎖抗原結合タンパク質;シゾフィラン;ソブゾキサン;ボロカプテイトナトリウム;フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロールsolverol;ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミンsonermin;スパルホス酸;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン;スポンギスタチン1;スクアラミン;幹細胞阻害剤;幹細胞分裂阻害剤;スチピアミド;ストロメライシン阻害剤;スルフモニンsulfmonine;超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト;スラジスタsuradista;スラミン;スワインソニン;合成グリコサミノグリカン;タリムスチン;タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム;テガフール;テルラピリリウムtellurapyrylium;テロメラーゼ阻害剤;テモポルフィン;テモゾロミド;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン;タリブラスチン;サリドマイド;チオコラリン;トロンボポイエチン;トロンボポイエチン模倣体;チマルファシン;チモポイエチン受容体アゴニスト;チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;エチルエチオプルプリンスズ;チラパザミン;チタノセンジクロリド;トポテカン;トプセンチン;トレミフェン;全能性幹細胞因子;翻訳阻害剤;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキサート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド;チロシンキナーゼ阻害剤;チルホスチン;UBC阻害剤;ウベニメクス;尿生殖洞由来増殖阻害因子;ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト;バプレオチド;バリオリンB;ベクター系、エリトロシットerytrocyte遺伝子治療;ベラレソール;毒液、抗毒液、ベラミン;ベルジン;ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン;ビタキシン;ボロゾール;ザノテロン;ゼニプラチン;ジラスコルブ;ジノスタチンスチマラマー、免疫刺激薬又は治療剤、それらの代謝産物、塩、及び誘導体、及びそれらの組み合わせ。前立腺癌前立腺癌は、多くの国々で重要な疾患となっており、西洋世界の人々において最も一般的に診断される悪性疾患であり、その発症は、年齢と共に著しく増加する。このように前立腺癌が増加し、近年多数の著名人が前立腺癌で死亡しているため、この癌に対処する必要性が強調されている。スクリーニングがより広範に利用可能なると、前立腺癌による死亡率を抑制できることが示唆されている。現行の前立腺癌スクリーニングは、直腸診及び前立腺特異抗原PSAレベルの測定で構成されている。直腸内触診には、検査する人によってかなりのばらつきがあり、PSAレベルは、良性前立腺肥大症BPH、前立腺炎症、及び他の状態でも上昇する場合があるため、これらの方法には、特異性が欠如している。PSAには診断試験として大きな欠陥があることが、22,000人を超えるプロスペクティブ研究であるPhysiciansHealthStudyに含まれていた、前立腺癌を発症した366人の被験者で示された。研究の開始時に保管された血清中のPSAレベルが測定され、その後4年以内に前立腺癌を発症した被験者の47のみが、高レベルであったことが見出されたGannetal,JAMA273,289-294,1995。前立腺癌は、当業者に周知のグリーソン方式を使用してスコア化することができるGleasonetal,CancerChemotherRep50,125-128,1966。グリーソン方式では、細胞学的特徴ではなく組織構造が使用される。1~5の等級良好~不良に区別されるが使用され、最も高頻度でより重症な病変区域の総合スコアを組み合わせる。グリーソンスコアは、腫瘍の病期の評価病期分類に加えて、有益であり得る予後情報を提供する。2~4及び8~10のグリーソンスコアは、良好な的中率を示すが、約4分の3の腫瘍は、中間の値を示す。2つの主要な系が、前立腺癌の病期分類に使用されている:TNM系及びJewett系BensonOlssonetal,InTheProstate,ed.Fitzpatrick,J.M.andKraneR.J.,pp261-272,Edinburgh,ChurchillLivingstone1989。病期分類は、腫瘍のあらゆる転移拡散を考慮に入れるものであり、局所リンパ節転移又は局所的浸潤のいずれであるかを評価するのは難しいため、困難である。また、腫瘍組織は、正常な前立腺組織と肉眼で区別することはできないため、及び前立腺は、別個の被膜を欠如しており、繊維性脂肪組織の層に包まれているため、腫瘍サイズを測定するのが難しい。T1~T4の範囲の前立腺腫瘍のT病期は、4つのカテゴリにより記述される。T1の場合、癌は、微視的であり、単系であり、触知不能である。医師は、腫瘍を触知することができないか、又は経直腸超音波法等の画像法を用いて視認することができない。BPHを治療することにより、疾患を明らかにしてもよく、又はPSAが高いために実施される針生検を使用することにより確認された。T2の場合、医師は、DREで癌を触知することができる。疾患は、前立腺の一方又は両方の側の前立腺に限定されていると考えられる。T3の場合、癌は、前立腺のすぐ外側に進行している。T4の場合、癌は、身体の他の部位に拡散している。したがって、現在のスクリーニング法は不十分である。ほとんどの患者の主要な死因である癌を診断するための又はその考え得る転移拡散を予測又は予防するための信頼できる方法は存在しない。PAX2PAX遺伝子は、核転写因子をコードする9つの発生調節遺伝子のファミリーである。PAX遺伝子は、胚形成に重要な役割を果たし、非常に秩序付けられた時間的及び空間的パターンで発現される。それらは全て、進化の過程にわたって高度に保存されているDNA結合ドメインをコードする384塩基対のペアードボックス領域を含有するStuartetal.,Ann.Rev.Gen.,28219-236,1994。発生過程に対するPAX遺伝子の影響は、多数の天然マウス、及びPAX遺伝子のヘテロ接合体欠損の直接的原因でさえあり得るヒト症候群により実証されている。PAX2配列は、開示されているDressleretal.,Development,109,787-795,1990。ヒトPAX2タンパク質及びその変異体のアミノ酸配列並びに上記タンパク質をコードするDNA配列は、配列番号39~50に列挙されている配列番号39、ヒトPAX2遺伝子のエキソン1によりコードされるアミノ酸配列;配列番号40、ヒトPAX2遺伝子プロモーター及びエキソン1;配列番号41、ヒトPAX2のアミノ酸配列;配列番号42、ヒトPAX2遺伝子;配列番号43、ヒトPAX2遺伝子変異体bのアミノ酸配列;配列番号44、ヒトPAX2遺伝子変異体b;配列番号45、ヒトPAX2遺伝子変異体cのアミノ酸配列;配列番号46、ヒトPAX2遺伝子変異体c;配列番号47、ヒトPAX2遺伝子変異体dのアミノ酸配列;配列番号48、ヒトPAX2遺伝子変異体d;配列番号49、ヒトPAX2遺伝子変異体eのアミノ酸配列;配列番号50、ヒトPAX2遺伝子変異体e。PAXタンパク質は、ペアードドメインと呼ばれるドメインを介して、及びある場合にはホメオドメインを介して特定のDNA配列と結合する。ペアードドメインPDは、PAX2を含むPAXタンパク質全てにより共有されているコンセンサス配列である。PDは、α3-ヘリックスに位置するアミノ酸のDNA結合を指図して、DNA-タンパク質複合体を形成する。PAX2は、DEFB1TATAボックスのすぐ上流の5’-CCTTG-3’配列番号1認識部位でDEFB-1プロモーターと結合することによりBoseSKetal.,MolImmunol.2009,46:1140-8、DEFB-1発現抑制することが報告されている。PAX2の場合、ペアードドメインのアミノ酸は、DEFB1プロモーターのCCTTG配列番号1DNAコア配列を特異的に認識及び相互作用する。この配列叉はその相補的配列を含む、長さが64塩基までの及びそれを超えるオリゴヌクレオチドは、阻害剤であることが予想される。PAX2発現が検出されている癌の例は、表1に列挙されている。EN2EN1及びEN2遺伝子、マウス及びEngrailedショウジョウバエ分節遺伝子の相同体は、ホメオドメインドメイン転写因子をコードするJoyner,TrendsGenet.12:15~20、1996。PAX及びEN遺伝子は、脳の発生を調節し、発生制御ヒエラルキーに重要な位置を占める遺伝子ネットワークの一部であるJoyner,1996。ツメガエルでの研究は、EN2及びPAX2が、ツメガエルwnt-1の発現に、及びwnt/β-カテニン経路によるシグナル伝達に不可欠であることを示唆しているKoenigetal.,Dev.Biol.,340:318-328,2010。EN2は、ヒト乳癌の癌遺伝子候補として特定されておりMartinetal.,Oncogene,24:6890-901,2005、その発現は、小児脳腫瘍及び急性骨髄白血病AMLでは調節解除されることが見出されているKozmiketal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:5709-13,1995;Nageletal,GenesChromosomesCancer,42:170-8,2005。他の研究では、ツメガエルEN2が、真核生物開始因子4EeIF4Eと結合し、eIF4E及びeIF4E結合タンパク質の迅速なリン酸化を開始させることが示されているBrunet,2005。eIF4Eは、典型的には、翻訳機構に見出され、癌治療の標的であるGraffetal.,CancerRes.,683:631-634,2008。最近の研究では、eIF4Eリン酸化が、腫瘍形成を促進し、前立腺癌進行に関連していることが示されているFuricetal.,PNAS,10732:14134-39,2010。ヒトEN2タンパク質のアミノ酸配列、及びヒトEN2mRNA遺伝子配列は、それぞれ配列番号99及び100に示されている。DEFB1β-デフェンシンは、上皮及び白血球の産物である、広域性抗菌活性を有する陽イオン性ペプチドであるGanzandWeiss,SeminHematol.,344:343-54,1997。これらの2エキソンの単一遺伝子産物は、上皮表面で発現され、皮膚を含む部位で分泌される。現在まで、上皮由来の5つのβ-デフェンシン遺伝子が、ヒトで特定及び特徴付けられている:DEFB1Benschetal.,FEBSLett.,3682:331-5,1995、DEFB2Harderetal.,Genomics,463:472-5,1997、DEFB3Harderetal.,J.BiolChem.,2768:5707-13,2001;JiaetalGene,2631-2:211-8,2001、DEFB4、及びHE2/EP2。ヒトDEFB1又はhBD-1のアミノ酸配列、及び転写開始部位の上流の644個ヌクレオチドを含む、ヒトDEFB1遺伝子配列の5’調節配列は、それぞれ配列番号63及び64に示されている。各β-デフェンシン遺伝子産物の一次構造は、小型、6個システインモチーフ、高陽イオン電荷、及びこれらの特徴を超えた精巧な多様性を特徴とする。デフェンシンタンパク質の最も特徴的な特性は、3つのジスルフィド結合のネットワークを形成するそれらの6個システインモチーフである。β-デフェンシンタンパク質中の3つのジスルフィド結合は、C1-C5、C2-C4、及びC3-C6間である。隣接したシステイン残基間の最も一般的な間隔は、6、4、9、6、0である。β-デフェンシンタンパク質中のシステイン間の間隔は、カルボキシ末端に最も近いC5及びC6を除いて、アミノ酸1つ又は2つ分異なっている場合がある。全ての既知の脊椎動物β-デフェンシン遺伝子では、これらの2つのシステイン残基は互いに隣接している。β-デフェンシンタンパク質の第2の特徴は、小型であることである。各β-デフェンシン遺伝子は、サイズが59~80個アミノ酸の範囲であり、平均サイズが65個アミノ酸であるプレプロタンパク質をコードする。その後、この遺伝子産物は、未知の機序により切断されて、サイズが36~47個アミノ酸の範囲であり、平均サイズが45個アミノ酸の成熟ペプチドを生成する。これらの範囲の例外は、β-デフェンシンモチーフを含み、精巣上体で発現されるEP2/HE2遺伝子産物である。β-デフェンシンタンパク質の第3の特徴は、高濃度の陽イオン性残基である。成熟ペプチド中の正荷電残基アルギニン、リジン、ヒスチジンの数は、6~14個の範囲であり、平均は9個である。β-デフェンシン遺伝子産物の更なる特徴は、それらの一次構造が多様であるにも関わらず、三次構造は明らかに保存されていることである。6個のシステイン以外は、どの位置のアミノ酸も、このタンパク質ファミリーの全ての既知メンバーで1つも保存されていない。しかしながら、二次及び三次構造並びに機能に重要であると考えられる、保存されている位置が存在する。β-デフェンシンタンパク質の一次アミノ酸配列に大きな多様性があるにも関わらず、限定的なデータではあるが、このタンパク質ファミリーの三次構造が保存されていることが示唆されている。構造コアは、BNBD-12及びDEFB2によりコードされるタンパク質に代表されるように、3つのストランドの逆平行βシートである。3つのβ-ストランドは、β-ターン及びα-ヘアピンループにより接続されており、また、2番目のβ-ストランドは、β-バルジを含んでいる。これらの構造は、正しい三次構造に折り畳まれると、陽イオン性及び疎水性残基の見かけ上の無作為配列が、球状タンパク質の2つの側に集中する。1つの側は、親水性であり、多くの正荷電側鎖を含み、他方は、疎水性である。溶液中で、DEFB2遺伝子によりコードされるHBD-2タンパク質は、N末端付近にα-ヘリックス区域を示した。これは、アルファ-デフェンシンの溶液構造又はβ-デフェンシンBNBD-12には以前に見出されていない。その側鎖がタンパク質表面に向いているアミノ酸は、β-デフェンシンタンパク質間であまり保存されないが、コアβ-シートの3つのβ-ストランドのアミノ酸残基は、より高度に保存されている。β-デフェンシンペプチドは、プレプロペプチドとして生成され、その後切断されてC末端活性ペプチド断片を放出する。しかしながら、気道上皮のヒトβ-デフェンシンペプチドの細胞内プロセシング、保存、及び放出の経路は、判明していない。DEFB1の遺伝子座8p23.3は、欠失のホットスポットであり、より不良な予後を示す患者と関連している。したがって、DEFB1及び恐らくはPAX2は、バイオマーカーとして、例えば、前立腺癌の早期検出用のスクリーニングに使用することができる。更に、提示されているデータは、その喪失が、早ければPINと共に又はそれ以前でも生じる場合があり、前立腺癌の発症の主な寄与要因である可能性を示す。PAXタンパク質は、進化中で保存されている転写因子のファミリーであり、ペアードドメイン及びホメオドメインと呼ばれるドメインを介して、特定のDNA配列に結合することができる。ペアードドメインPDは、あるPAXタンパク質例えば、PAX2及びPAX6により共有されているコンセンサス配列である。PDは、α3-ヘリックスに位置するアミノ酸のDNA結合を指図して、DNA-タンパク質複合体を形成する。PAX2の場合、HDのアミノ酸は、CCTTG配列番号1DNAコア配列を特異的に認識及び相互作用する。この配列又はその相補体を含むオリゴヌクレオチドは、阻害剤であることが予想される。PAX2タンパク結合用のDEFB1プロモーターの重要なDNA領域は、AAGTTCACCCTTGACTGTG配列番号16の配列を有する。1つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、V-CCTTG-W配列番号17の配列を有し、V及びWは、1~35個ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。ある実施形態では、V又はW又はその両方は、配列番号16に示されいるDEFB1プロモーターのCCTTG配列を通常は隣接する連続ヌクレオチド配列を含む。あるいは、V及び/又はWのヌクレオチド配列は、PAX2認識配列との干渉を回避するように、DEFB1プロモーターと無関係であってもよく、又は無作為に選択されていてもよい。DEFB1プロモーターに対するPAX2結合を阻害するオリゴヌクレオチドの他の例には、これらに限定されないが、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる5’から3’方向:CTCCCTTCAGTTCCGTCGAC配列番号18、CTCCCTTCACCTTGGTCGAC配列番号19、ACTGTGGCACCTCCCTTCAGTTCCGTCGACGAGGTTGTGC配列番号20、ACTGTGGCACCTCCCTTCACCTTGGTCGACGAGGTTGTGC配列番号21、ACCCTTGAC配列番号101、TCACCCTTGACTG配列番号102、GTTCACCCTTGACTGTG配列番号103、AGAAGTTCACCCTTGACTGT配列番号25、GCGATTAGAAGTTCACCCTTGACTGTGGC配列番号104、GCGATTAGAAGTTCACCCTTGACTGTGGCACCT配列番号105、TTAGCGATTAGAAGTTCACCCTTGACTGTGGCACCTCCC配列番号28。アンチセンス分子は、標準的又は非標準的塩基対合のいずれかにより標的核酸分子と相互作用するように設計することができる。アンチセンス分子及び標的分子の相互作用は、例えば、RNAseH媒介性RNA-DNAハイブリッド分解により、標的分子の破壊を促進するように設計することができる。あるいは、アンチセンス分子は、転写又は複製等の、標的分子で通常起こるはずのプロセシング機能を妨害するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最も接近可能な領域を見出すことによりアンチセンス効率を最適化するための方法は、多数存在する。例示的な方法は、invitro選択実験並びにDMS及びDEPCを使用したDNA修飾研究であろう。アンチセンス分子は、10-6、10-8、10-10、又は10-12以下の解離定数Kdで標的分子と結合することが好ましい。核酸送達EN2/PAX2発現又は活性の核酸に基づく阻害剤、並びにDEFB1発現又は活性の核酸に基づく活性化因子は、当業者に周知の好適な発現ベクターを使用して、前立腺標的細胞に送達することができる。本明細書で使用される場合、用語発現ベクターは、核酸の発現を指図可能なあらゆる核酸を含む。そのため、用語発現ベクターは、ウイルスベクター及びプラスミドベクター等を含む。発現ベクターは、2つの主要な送達スキーム:ウイルスベクターを使用したウイルスに基づく送達系、及び例えばプラスミドベクターを使用した非ウイルスに基づく送達系を使用して、細胞に送達することができる。そのような方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載の組成物及び方法を用いた使用に容易に適応可能である。ある場合には、これらの方法を使用して、媒体に固有であるか又は媒体に操作された標的特徴を使用することにより、ある疾患及び細胞集団を標的とすることができる。細胞に送達される核酸は、EN2及びPAX2等の外来性遺伝子の発現を指図するためのプロモーター及び/又はエンハンサーを含む1つ又は複数の転写調節エレメントを含む。プロモーターは、転写開始部位に対して比較的固定された位置から転写を開始するように機能するDNA配列を含む。プロモーターは、RNAポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含有しており、他の上流エレメント及び応答エレメントと共に作用することができる。好ましいプロモーターは、前立腺細胞での発現、特に前立腺癌細胞で上方制御されている発現を指図することが可能なプロモーターである。プロモーターは、構成的プロモーター例えば、HCMV又はSV40又は前立腺細胞又は前立腺癌細胞で優先的発現を示すものを含んでいてもよい。エンハンサーは、一般的に、転写開始部位から離れて機能するDNA配列を指し、転写単位に対して5’又は3’のいずれにあってもよい。更に、エンハンサーは、イントロン内並びにコード配列内にあってもよい。それらは、通常は、長さが10~300bpであり、cisで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加及び/又は制御するように機能する。好ましいエンハンサーは、前立腺細胞、前立腺癌細胞で、及び/又はアンドロゲンシグナル伝達又はアンドロゲン欠乏に応答して、高レベル発現を指図するものである。プロモーター及び/又はエンハンサーは、光又は特定の化学的誘導剤のいずれかにより特異的に活性化されてもよい。いくつかの実施形態では、例えば、テトラサイクリン又はデキサメタゾンの投与により制御される誘導可能な発現系を使用してもよい。他の実施形態では、遺伝子発現は、ガンマ線照射及び外照射療法EBRTを含む放射線への曝露、又はアルキル化化学療法薬により増強することができる。前立腺特異性転写調節エレメントTREを発現ベクターに組み込んで、前癌性及び/又は癌性前立腺細胞における発現の転写標的化を可能にすることができる。例示的な前立腺特異性TREには、米国特許出願公開第2003/0235874号に記載の前立腺特異抗原PSA又はhk3、前立腺特異膜抗原PSMA、プロバシンPB、腺性カリクレイン-2hk2遺伝子、オステオカルシン、キメラPSA-PSMA、又はPSEに由来する1つ又は複数の調節エレメントを含む天然TRE及びキメラchrimericTRE、並びに既に存在いている可能性があるものに加えて、1つ又は複数の外因的に付加されたアンドロゲン応答性調節エレメントが含まれる。PSA、プロバシン、及び腺性カリクレインTREは、アンドロゲン誘導可能であり、好ましくは、アンドロゲン感受性細胞でのセンスDEFB1及び/又はEN2/PAX2のアンチセンス発現に使用される。逆に、PMSATREは、アンドロゲン欠乏により特異的に誘導され、好ましくは、去勢耐性前立腺細胞での発現に使用される。1つの実施形態では、核酸の高レベル前立腺特異的発現は、Satoetal.,GeneTher.,158:583-593,2008及び米国特許出願公開第2006/0223141号に記載の前立腺prosate特異2段階転写増幅TSTA系2段階増幅を使用して達成することができる。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。発現ベクターは、一般的に、転写終結用の配列を含有しており、mRNA安定性に肯定的な影響を与える1つ又は複数のエレメントを更に含有していてもよい。発現ベクターは、感染細胞又は形質移入細胞中で共通のmRNAからの2つ以上のタンパク質の発現を容易にするために、隣接するタンパク質コード領域間に内部リボソーム侵入部位IRESを更に含んでいてもよい。加えて、発現ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を更に含んでいてもよい。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達されたか否かを判断するために使用され、送達されると発現される。好ましい標識遺伝子は、大腸菌lacZ遺伝子であり、これは、β-ガラクトシダーゼ及び緑色蛍光タンパク質をコードする。ウイルスに基づく送達系いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生物活性成分の阻害剤又は活性化因子は、ウイルス由来の発現ベクターを使用して、遺伝子操作ウイルスとして送達される。例示的なウイルスベクターには、以下のものが含まれていてもよく、又は以下のものに由来してもよい、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、HIVウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、シンドビス、及び他のRNAウイルス等。また、これらのウイルスがベクターとしての使用に好適である特性を共有する任意のウイルスファミリーが好ましい。レトロウイルスには、マウスモロニー白血病ウイルスMMLV、HIV、及び他のレンチウイルスベクターが含まれる。アデノウイルスベクターは、比較的安定しており、作業が容易であり、高い力価を有し、エアゾル製剤で送達することができ、非分裂細胞を形質移入することができる。ポックスウイルスベクターは大型であり、遺伝子を挿入するための幾つかの部位を有しており、熱安定性であり、室温で保管することができる。ウイルス送達系では、典型的には、1つ又は複数の遺伝子が取り除かれたか又は外来性遺伝子を有し、及び/又は取り除かれたウイルスDNAの代わりに、遺伝子/プロモーターカセットがウイルスゲノムに挿入されているウイルスベクターが使用される。取り除かれた遺伝子複数可の必要な機能は、初期遺伝子の遺伝子産物をtransで発現するように操作された細胞系により供給することができる。前立腺特異的組織標的化及び/又は発現用のウイルスベクターは、記載されている。例えば、Zhangetal.,CancerGeneTher.,16:820-831,2009;Trujilloetal.,GeneTher.,1711:1325-1332,2010;Kraaijetal.,Prostate、678:829-839,2007;米国特許出願公開第2008/0247996号及び第2009/0130061号を参照されたい。これらの文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非ウイルス送達系は、例えば、陽イオン性リポソーム例えば、DOTMA、DOPE、DC-コレステロール及び陰イオン性リポソーム等のリポソームを含む脂質製剤を使用した、プラスミドベクター又は他の非核酸生理活性薬剤の送達に使用される。リポソームは、必要に応じて、特定の細胞に対する標的化を容易にするために、1つ又は複数のタンパク質又はペプチドに更に結合されていてもよい。化合物及び陽イオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に輸入性の血液に投与してもよく、又は気道の細胞を標的とするために気道に吸入してもよい。更に、生理活性薬剤は、本明細書に記載の標的化部分moitiesを使用して前立腺癌細胞に標的化することができるか、又は所定の放出速度又は用量に従って1つ又は複数の生理活性薬剤を徐放するように設計することができるマイクロカプセル又はナノ粒子の成分として投与することができる。他の実施形態では、核酸は、エレクトロポレーションによりinvivoで送達することができる。そのための技術は、Genetronics,Inc.社サンディエゴ、カリフォルニア州から、並びにSONOPORATION商標機器ImaRxPharmaceuticalCorp.社、ツーソン、アリゾナ州により利用可能である。生理活性成分は、溶液又は懸濁液中にあってもよい例えば、微粒子、リポソーム、又は細胞に組み込まれている。これらは、抗体、受容体、又は受容体リガンドにより、特定の細胞タイプを標的とすることができる。ステルス及び他の抗体結合リポソーム前立腺細胞を標的とする脂質媒介性薬物を含む等の媒体、細胞特異性リガンドによるDNAの受容体媒介性標的化、リンパ球依存性腫瘍標的化、及びマウス神経膠腫細胞のinvivo高特異性治療用レトロウイルス標的化。一般的に、受容体は、エンドサイトーシスの経路に関与し、構成的であるか又はリガンド誘導性であるかのいずれかである。これらの受容体は、クラスリン被覆ピットでクラスターを形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に進入し、酸性エンドソームを通過し、そこで分類されて、その後細胞表面に再利用されるか、細胞内に保管されるか、又はリソソームで分解されるかのいずれかである。内部移行経路は、養分吸収、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日和見性進入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベルの調節等の様々な機能に役割を果たす。多くの受容体は、細胞タイプ、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンド原子価、及びリガンド濃度に応じて、複数の細胞内経路に従う。本発明は、以下の例により更に説明されるが、それらは限定と解釈されるべきでない。本出願の全体にわたって引用された全ての参考文献、特許、及び公開特許出願、並びに図及び表の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ヒトベータデフェンシン-1は、後期前立腺癌に細胞毒性であり、前立腺癌腫瘍免疫に役割を果たす。この例では、DEFB1を、誘導可能な発現系にクローニングして、それが、正常な前立腺上皮細胞並びにアンドロゲン受容体陽性AR及びアンドロゲン受容体陰性AR-前立腺癌細胞系にどのような影響を及ぼすかを検査した。DEFB1発現の誘導は、AR-細胞DU145及びPC3での細胞増殖の減少をもたらしたが、AR前立腺癌細胞LNCaPの増殖には影響を示さなかった。また、DEFB1は、カスパーゼ媒介性アポトーシスの迅速誘導を引き起こした。示されたデータは、先天性腫瘍免疫におけるその役割の証拠を提供し、その喪失が、前立腺癌の腫瘍進行に寄与することを示す最初のデータである。1.1物質及び方法細胞系:細胞系DU145を、DMEM培地で培養し、PC3を、F12培地で増殖し、LNCaPを、RPMI培地LifeTechnologies,Inc.社、グランドアイランド、ニューヨーク州で増殖した。3系統全ての増殖培地は、10容積/容積のウシ胎仔血清LifeTechnologies,Inc.社で補完されていた。hPrEC細胞を、前立腺上皮細胞基本培地CambrexBioScience,Inc.社、ウォーカーズビル、メリーランド州で培養した。細胞系は全て、37°C及び5CO2で維持した。組織試料及びレーザーキャプチャーマイクロダイセクション:根治的前立腺摘除を受けた承諾患者から得られた前立腺組織を、施設内治験審査委員会認可プロトコールに従って、HollingsCancerCenter腫瘍バンクから取得した。このプロトコールには、試料のプロセシング、切片化、組織学的特徴付け、RNA精製、及びPCR増幅のためのガイドラインが含まれていた。凍結組織切片を病理学的に検査した後、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションLCMを実施して、アッセイする組織試料が、良性前立腺細胞の純粋な母集団で構成されていることを保証した。分析する各組織切片毎に、良性組織を含む3つの異なる領域でLCMを実施し、その後収集した細胞をプールした。根治的前立腺摘除を受ける前にインフォームドコンセントを提供した患者から前立腺組織を得た。施設内治験審査委員会認可プロトコールに従って、HollingsCancerCenter腫瘍バンクから、試料を得た。このプロトコールには、試料のプロセシング、切片化、組織学的特徴付け、RNA精製、及びPCR増幅のためのガイドラインが含まれていた。外科医及び病理学者から受け取った前立腺標本を、OCT化合物中で直ちに凍結した。各OCTブロックを切断して、連続切片を生成し、それらを染色及び検査した。良性細胞、前立腺上皮細胞内新生物PIN、及び癌を含有する区域を識別し、Arcturus社製PixCellIIシステムサニーベール、カリフォルニア州を使用して未染色スライドから領域を選択するための指針に使用した。捕捉物質を含有するCapを、Arcturus社製PicoPureRNA単離キットの20μlの溶解産物と接触させ、直ちにプロセシングした。RNAの量及び品質は、5’アンプリコンを生成するプライマーセットを使用して評価した。このセットには、リボソームタンパク質L323’アンプリコン及び5’アンプリコンは、298塩基離れている、グルコースリン酸イソメラーゼ391塩基離れている、及びグルコースリン酸イソメラーゼ842塩基離れている用のものが含まれる。様々な調製組織に由来する試料を使用して、これらのプライマーセットについて、0.95~0.80の比率を日常的に得た。更なる腫瘍試料及び正常試料を、病理学者が全体的に解剖し、液体窒素で瞬間冷凍し、hBD-1及びcMYC発現を評価した。DEFB1遺伝子のクローニング:DEFB1cDNAを、逆転写PCRでRNAから生成した。PCRプライマーを、ClaI及びKpnIの制限部位を含有するように設計した。DEFB1PCR産物を、ClaI及びKpnIで制限消化し、TAクローニングベクターにライゲーションした。その後、TA/DEFB1ベクターを、ヒートショックにより大腸菌に形質移入し、個々のクローンを選択し、増殖した。プラスミドを、DNAMidiprepsQiagen社、バレンシア、カリフォルニア州で大腸菌培養から単離し、自動塩基配列決定により配列完全性を確認した。その後、DEFB1遺伝子断片を、ClaI及びKpnIで消化したpTRE2にライゲーションした。これは、方向性を確保するための中間ベクターとしての役目を果たした。その後、pTRE2/DEFB1構築体を、ApaI及びKpnIで消化して、DEFB1インサートを切り出し、それを、これもApaI及びKpnIで同時消化したエクジソン誘導可能な発現系のpINDベクターInvitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州にライゲーションした。この構築体を、再び大腸菌に形質移入し、個々のクローンを選択し、増殖した。プラスミドを単離し、pIND/DEFB1の配列完全性を、自動配列決定により再び確認した。細胞形質移入:細胞1×106個を、100mmのペトリ皿に接種し、一晩増殖した。その後、細胞を、リポフェクタミン2000Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州を使用し、Opti-MEM培地LifeTechnologies,Inc.社、グランドアイランド、ニューヨーク州中で、ヘテロ二量体エクジソン受容体を発現する1μgのpVgRXRプラスミド、及び1μgのpIND/DEFB1ベクター構築体又は空のpIND対照ベクターと共に同時形質移入した。RNA単離及び量的RT-PCR:DEFB1構築体で形質移入した細胞でのDEFB1タンパク質発現を確認するために、ポナステロンAPonAでの24時間の誘導期間後に、RNAを収集した。簡潔に述べると、全RNAを、SV全RNA単離システムPromega社、マディソン、ウィスコンシン州を使用して、トリプシン処理により回収したおよそ1×106個の細胞から単離した。細胞を溶解し、全RNAを、スピンカラムによる遠心分離により単離した。LCMにより収集した細胞の場合、製造業者のプロトコールに従って、PicoPureRNA単離キットArcturusBiosciences社、マウントビュー、カリフォルニア州を使用して、全RNAを単離した。無作為プライマーPromega社を使用して、両供給源に由来する全RNA1反応当たり0.5μgを逆転写してcDNAにした。製造業者のプロトコールに従って、AMV逆転写酵素II酵素1反応当たり500単位;Promega社を、ファーストストランド合成に使用し、TflDNAポリメラーゼ1反応当たり500単位;Promega社を、セカンドストランド合成に使用した。各々の場合、その後の1PCR反応当たり50pgのcDNAを使用した。TaqMan逆転写系に由来するMultiScribe逆転写酵素ReverseTranscripatase及びSYBRR登録商標GreenPCRマスターミックスAppliedBiosystems社を使用して、生成したcDNAに対して2段階QRT-PCRを実施した。DEFB1用のプライマー対を、公開されているDEFB1配列GenBank受入番号U50930から生成した。プライマー配列は、以下の通りである:40サイクルのPCRを、標準条件下で56°Cのアニーリング温度を使用して実施した。加えて、β-アクチン表2をハウスキーピング遺伝子として増幅して、全cDNAの初期含有量を正規化した。DEFB1発現を、DEFB1とβ-アクチンとの相対的発現比率として計算し、DEFB1発現を誘導した及び誘導しなかった細胞系並びにLCM良性前立腺組織で比較した。陰性対照として、cDNAテンプレートを用いないQRT-PCR反応も実施した。反応は全て、三重反復で3回実行した。MTT細胞生存率アッセイ:細胞増殖に対するDEFB1の影響を検査するために、代謝性3-[4,5-ジメチルチアゾール-2イル]-2,5ジフェニルテトラゾリウムブロミドMTTアッセイを実施した。pVgRXRプラスミド及びpIND/DEFB1構築体又は空pINDベクターで同時形質移入したPC3、DU145、及びLNCaP細胞を、96ウエルプレートにウエル当たり1~5×103細胞で播種した。播種した24時間後に、10μMポナステロンAを含有する新しい増殖培地を毎日添加して、24時間、48時間、及び72時間DEFB1発現を誘導し,その後製造業者の説明書Promega社に従って、MTTアッセイを実施した。反応は全て、三重反復で3回実施した。フローサイトメトリ:DEFB1発現系を同時トランスフェクトしたPC3及びDU145細胞を60mmの皿で増殖し、10μMのポナステロンAにより12、24、及び48時間誘導した。各インキュベーション時間後、培地をプレートから収集してあらゆる非付着細胞を保持し、プレートを洗浄するのに使用したPBSと合わせた。残りの付着細胞をトリプシン処理により回収し、非付着細胞及びPBSと合わせた。次いで、細胞を4°Cで5分間ペレット化し500×g、PBSで2回洗浄し、5μlのアネキシンV-FITC及び5μlのPIを含有する100μlの1×アネキシン結合緩衝液pH7.4の0.1Mヘペス/NaOH、1.4MNaCl、25mMCaCl2に再懸濁させた。細胞を暗所で室温にて15分間インキュベートし、次いで400μlの1×アネキシン結合緩衝液で希釈し、FACscanBectonDickinson社、カリフォルニア州サンノゼで分析した。全ての反応を3回実施した。顕微鏡分析:細胞形態を位相差顕微鏡法により分析した。ベクターを含まないか、空のプラスミド又はDEFB1プラスミドを含有するDU145、PC3及びLNCaP細胞を、6ウェル培養プレートBDFalcon社、米国に播種した。翌日、10μMのポナステロンAを含有する培地でプラスミド含有細胞を48時間の間誘導し、一方で、対照細胞には新鮮な培地を与えた。次いで、細胞を倒立型ZeissIM35顕微鏡CarlZeiss社、ドイツ下で観察した。SPOTInsightMosaic4.2カメラDiagnosticInstruments社、米国を用いて、細胞の1視野の位相差写真を得た。倍率32倍の位相差顕微鏡で細胞を検査し、デジタル画像を非圧縮TIFFファイルとして保存し、かつ画像処理及びハードコピーの提示のためにPhotoshopCSソフトウェアAdobeSystems社、カリフォルニア州サンノゼにエクスポートした。カスパーゼ検出:前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出は、APOLOGIX登録商標CarboxyfluorescinCaspase検出キットCellTechnology社、カリフォルニア州マウンテンビューを用いて行った。活性カスパーゼに不可逆的に結合するFAM-VAD-FMK阻害剤の使用により、活性カスパーゼを検出した。簡潔に述べると、DEFB1発現系を含有するDU145及びPC3細胞1.5-3×105個を35mmのガラス底マイクロウェル皿Matek社、マサチューセッツ州アッシュランドに播種し、培地のみ、又は前述のPonA含有培地で24時間処理した。次に、カルボキシフルオレセイン標識ペプチドフルオロメチルケトンFAM-VAD-FMKの10μlの30倍作用希釈液を300μlの培地に添加し、各35mm皿に加えた。次いで、細胞を5のCO2下で37°Cにて1時間インキュベートした。次いで、培地を吸引し、2mlの1倍作用希釈液の洗浄緩衝液で細胞を2回洗浄した。細胞を、微分干渉コントラストDIC下で、又は488nmのレーザー励起下で観察した。蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡Zeiss社LSM5Pascal及び63倍のDIC油浸レンズをVario2RGBLaserScanningModuleと共に用いて分析した。統計分析:統計的な差異は、対応のない数値に対するスチューデントのt検定を用いて評価した。両側計算によりP値を決定し、0.05未満のP値を統計学的に有意であると見なした。1.2結果前立腺の組織及び細胞株におけるDEFB1発現:良性及び悪性の前立腺組織、hPrEC前立腺上皮細胞並びにDU145、PC3及びLNCaP前立腺癌細胞におけるDEFB1発現レベルを、QRT-PCRにより測定した。DEFB1発現は良性臨床試料の全てにおいて検出された。DEFB1相対発現の平均量は0.0073であった。さらに、hPrEC細胞におけるDEFB1相対発現は0.0089であった。良性の前立腺組織試料及びhPrECにおいて検出されたDEFB1発現において、統計的な差異はなかった図1A。前立腺癌細胞株における相対DEFB1発現レベルの分析により、DU145、PC3及びLNCaPにおけるレベルが有意に低いことが明らかとなった。さらなる基準点として、患者番号1215からの前立腺組織の隣接悪性切片での相対DEFB1発現を測定した。3つの前立腺癌株で観察されたDEFB1発現のレベルは、患者番号1215からの悪性前立腺組織と比較して有意差はなかった図1B。さらに、全ての4つの試料における発現レベルは、内因性DEFB1発現がほとんど又は全く確認されないテンプレートを含まない陰性対照に近かったデータ未記載。DEFB1発現系をトランスフェクトした前立腺癌細胞株に対してもQRT-PCRを実施した。24時間の誘導時間後、相対発現レベルはDU145において0.01360、PC3において0.01503、及びLNCaPにおいて0.138であった。増幅産物をゲル電気泳動により検証した。良性、PIN及び癌を含有する領域を含む前立腺組織において、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによるQRT-PCRを実施した。DEFB1の相対発現は良性領域で0.0146であるのに対し、悪性領域では0.0009であった図1C。これは94の減少に相当し、有意な発現のダウンレギュレーションを再度証明するものである。さらに、PINの分析から、DEFB1の発現レベルは70の減少である0.044であることが明らかとなった。患者番号1457における発現を、他の6人の患者の良性領域で認められた平均発現レベルと比較すると図1A、ほぼ2倍の発現に相当する1.997の比率が明らかとなった図1D。しかしながら、良性組織における平均発現レベルと比較した発現比率は、PINにおいて0.0595であり、かつ悪性組織において0.125であった。DEFB1は細胞膜透過性及びラフリングを引き起こす:前立腺癌細胞株におけるDEFB1の誘導は、DU145及びPC3の細胞数における有意な減少をもたらしたが、LNCaPにおける細胞増殖には影響を及ぼさなかった図2。陰性対照として、空のプラスミドを含有する3つの全ての株において細胞増殖をモニタリングした。PonA添加後のDU145、PC3又はLNCaP細胞における観察可能な細胞形態の変化はなかった。さらに、DEFB1誘導により、DU145及びPC3の両方において形態学的変化がもたらされた。細胞の外観はより円形であり、かつ細胞死の指標である膜ラフリングを呈した。両株にはアポトーシス小体も存在していた。DEFB1発現は細胞生存率の低下をもたらす:MTTアッセイにより、PC3及びDU145細胞においてDEFB1による細胞生存率の低下が示されたが、LNCaP細胞に対する有意な効果は示されなかった図3。24時間後の相対細胞生存率は、DU145において72及びPC3において56であった。誘導から48時間後の分析では、DU145における49の細胞生存率及びPC3における37の細胞生存率が明らかとなった。DEFB1発現から72時間後には、DU145及びPC3それぞれにおいて44及び29の相対細胞生存率がもたらされた。DEFB1は後期前立腺癌細胞において迅速なカスパーゼ媒介アポトーシスを引き起こす:PC3及びDU145に対するDEFB1の作用が細胞増殖抑制性又は細胞毒性であるのかどうかを決定するために、FACS分析を行った。通常の増殖条件下で、90を超えるPC3及びDU145の培養物が生存可能かつ非アポトーシス性左下象限であり、アネキシンV又はPIで染色されなかった。PC3細胞においてDEFB1発現を誘導した後のアポトーシス細胞数右下及び右上象限は、合計して12時間で10、24時間で20、及び48時間で44であった図4B。DU145細胞について、アポトーシス細胞数は合計で、誘導から12時間後に12、24時間後に34、及び48時間後に59であった図4A。PonAによる誘導後の空のプラスミドを含有する細胞において、アポトーシスの増加は認められなかったデータ未掲載。共焦点レーザー顕微鏡分析によりカスパーゼ活性を決定した図5。DU145及びPC3細胞においてDEFB1発現を誘導し、活発にアポトーシスを起こしている細胞において緑色蛍光を発するFAM-VAD-FMKとカスパーゼとの結合に基づいて、活性をモニタリングした。DIC下での細胞の分析から、0時間における生存対照のDU145パネルA、PC3パネルE及びLNCaPパネルI細胞の存在が示された。488nmの共焦点レーザーによる励起からは検出可能な緑色染色は生じず、それはDU145パネルB、PC3パネルF又はLNCaPパネルJにおいてカスパーゼ活性がないことを示している。24時間の誘導後、DU145パネルC、PC3パネルG及びLNCaPパネルK細胞はDIC下で再度見ることができた。蛍光下での共焦点分析から、DU145パネルD及びPC3パネルH細胞においてカスパーゼ活性を示す緑色染色が明らかとなった。しかしながら、LNCaPパネルLでは緑色染色はなく、それはDEFB1によりアポトーシスが誘導されないことを示した。結論として、本研究では前立腺癌におけるDEFB1の機能的役割を提供する。さらに、これらの知見から、DEFB1が腫瘍免疫に関与する自然免疫系の一部であることが示される。提示するデータは、生理学的レベルで発現したDEFB1は、AR-ホルモン抵抗性前立腺癌細胞に対して細胞毒性を示すが、ARホルモン感受性前立腺癌細胞又は正常前立腺上皮細胞に対してはそうでないことを実証する。DEFB1が正常前立腺細胞において細胞毒性を有さずに構成的に発現されることを考えると、後期AR-前立腺癌細胞は自らをDEFB1細胞毒性に対して感受性とする異なる表現型特性を有しているのかもしれない。したがって、DEFB1は後期前立腺癌の治療に対する有望な治療薬であり、また他の癌に対しても同様である可能性がある。PAX2発現のsiRNA媒介ノックダウンはp53状態非依存性の前立腺癌細胞死をもたらす本実施例では、p53遺伝子状態が異なる前立腺癌細胞におけるRNA干渉によるPAX2発現阻害の効果を検討する。結果から、PAX2阻害によりp53状態に関係なく細胞死がもたらされることが実証され、それは前立腺癌においてPAX2によって阻害されるさらなる腫瘍抑制遺伝子又は細胞死経路が存在することを示すものである。2.1材料及び方法PAX2のsiRNAサイレンシング:効率的な遺伝子サイレンシングを達成するために、ヒトPAX2mRNAアクセション番号NM_003989.1を標的とする4つの相補的な低分子干渉リボヌクレオチドsiRNAのプールを合成したDharmaconResearch社、米国コロラド州ラファイエット。4つのsiRNAの第2プールを内部標準として使用して、PAX2siRNAの特異性を試験した。合成した配列のうちの2つはGL2ルシフェラーゼmRNAアクセション番号X65324を標的とし、2つは非配列特異的であった表3。siRNAのアニーリングについて、35Mの1本鎖をアニーリング緩衝液100mM酢酸カリウム、30mMHEPES-KOHpH7.4、2mM酢酸マグネシウム中で90°Cにて1分間インキュベートし、続いて37°Cで1時間インキュベートした。ウェスタンブロット分析:簡潔に述べると、細胞をトリプシン処理により回収し、PBSで2回洗浄した。溶解緩衝液を製造元の使用説明書Sigma社に従って調製し、次いで細胞に添加した。オービタルシェーカー上で4°Cにて15分間インキュベーションした後、細胞溶解物を次いで採取し、12000×gで10分間遠心分離して細胞破片をペレット化した。次いで、タンパク質含有上清を採取して定量した。次に、25μgのタンパク質抽出物を8-16勾配SDS-PAGENovexに装填した。電気泳動後、タンパク質をPVDF膜に転写し、次いでTTBS0.05Tween20及び100mMTris-Cl中5脱脂粉乳液で1時間ブロッキングした。次いで、ブロットを1:2000希釈のウサギ抗PAX2一次抗体Zymed社、カリフォルニア州サンフランシスコでプローブした。洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼHRP結合抗ウサギ抗体1:5000希釈、Sigma社と共に膜をインキュベートし、AlphaInnotechFluorchem8900において化学発光試薬Pierceを用いてシグナル検出を可視化した。対照として、ブロットを剥離し、マウス抗βアクチン一次抗体1:5000;Sigma-Aldrich社及びHRP結合抗マウス二次抗体1:5000;Sigma-Aldrich社で再プローブし、シグナル検出を再度可視化した。位相差顕微鏡法:PAX2ノックダウンの細胞増殖に対する効果を位相差顕微鏡法により実施例1の記載に従って分析した。MTT細胞毒性アッセイ:製造元のプロトコルPromega社に従って、Codebreakerトランスフェクション試薬を使用して、DU145、PC3及びLNCaP細胞1×105に0.5μgのPAX2siRNAプール又は対照siRNAプールをトランスフェクトした。次に、細胞懸濁液を希釈し、96ウェルプレートにウェル当たり1~5×103細胞で播種し、2、4又は6日間増殖させた。培養後、3-4,5-ジメチルチアゾール-2イル-2,5ジフェニルテトラゾリウムブロミド、MTTPromega社の着色ホルマザン生成物への変換を測定することにより細胞生存率を決定した。走査型マルチウェル分光光度計で540nmにおける吸光度を読み取った。汎カスパーゼ検出:前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出を実施例1の記載に従って実施した。定量的リアルタイムRT-PCR:実施例1に記載したように定量的リアルタイムRT-PCRを実施し、PC3、DU145及びLNCaP細胞株におけるPAX2siRNA処理後の遺伝子発現を確認した。GAPDH対照遺伝子、BAX、BID及びBADのプライマ対は以下の通りである:反応は、MicroAmpOptical96-wellReactionPlatePEBiosystems社において行った。60°Cのアニーリング温度を使用して標準条件下で40サイクルのPCRを実施した。定量値は、指数的増幅が開始するサイクル数閾値により決定し、かつ3回繰り返して得られた値を平均した。メッセージレベルと閾値との間には逆関係があった。さらに、GAPDHをハウスキーピング遺伝子として用い、全cDNAの初期含有量を正規化した。遺伝子発現は、プロアポトーシス遺伝子とGAPDHとの間の相対発現比率として計算した。全ての反応は3連で行った。2.2結果PAX2タンパク質発現のsiRNA阻害:siRNAが効果的にPAX2mRNAを標的としていることを確認するために、ウェスタンブロット分析を実施して、6日間の処理期間にわたってPAX2タンパク質発現レベルをモニタリングした。細胞においてPAX2siRNAプールによるトランスフェクションを1ラウンド実施した。結果から、DU145における4日目図6、パネルA及びPC3における6日目図6、パネルBまでにPAX2タンパク質のノックダウンが示されたことにより、PAX2mRNAの特異的標的化が確認された。PX2のノックダウンにより前立腺癌細胞の増殖が阻害される:培地のみ、陰性対照非特異的siRNA又はPAX2siRNAによる6日間の処理期間後に細胞を分析した図7。DU145パネルA、PC3パネルD及びLNCaPパネルG細胞は全て、培地のみを含有する培養皿中で少なくとも90のコンフルエントに達した。DU145パネルB、PC3パネルE及びLNCaPパネルHを陰性対照非特異的siRNAで処理しても、細胞増殖に影響を及ぼさず、かつ細胞は再度6日後にコンフルエントに達した。しかしながら、PAX2siRNAでの処理により、細胞数における有意な減少がもたらされた。DU145細胞は約15コンフルエントパネルCであり、かつPC3細胞はわずか10コンフルエントパネルFであった。siRNA処理後、LNCaP細胞は5コンフルエントであった。細胞毒性アッセイ:2、4、及び6日間の曝露期間後に細胞生存率を測定し、かつ処理細胞の570-630nmの吸光度を未処理対照細胞の吸光度で割った比率として表す図8。2日間処理した後の相対細胞生存率は、LNCaPにおいて77、DU145において82、及びPC3において78であった。4日後、相対細胞生存率は、LNCaPにおいて46、DU145において53、及びPC3において63であった。6日間の処理後、相対細胞生存率は、LNCaPにおいて31、PC3において37、及びDU145において53まで低下した。陰性対照として、陰性対照非特異的siRNA又はトランスフェクション試薬単独での6日間の処理期間後に細胞生存率を測定した。両方の条件において、通常の増殖培地と比較して細胞生存率における統計的に有意な変化はなかった。汎カスパーゼ検出:カスパーゼ活性を共焦点レーザー顕微鏡分析により検出した。DU145、PC3及びLNCaP細胞をPAX2siRNAで処理し、緑色蛍光を発する活発にアポトーシスを起こしている細胞のカスパーゼとFAM標識ペプチドとの結合に基づいて活性をモニタリングした。培地のみで処理した細胞のDIC下での分析は、0時間での生存可能なDU145A、PC3E及びLNCaPI細胞の存在を示している図9。488nmの共焦点レーザーによる励起からは検出可能な緑色染色は生じず、それは未処理DU145B、PC3F又はLNCaPJにおいてカスパーゼ活性がないことを示している。PAX2siRNAでの4日間の処理後、DU145C、PC3G及びLNCaPK細胞はDIC下で再度見ることができた。蛍光下では、処理されたDU145D、PC3H及びLNCaPL細胞は、カスパーゼ活性を示す緑色染色を呈した。PAX2阻害がプロアポトーシス因子に及ぼす影響:DU145、PC3及びLNCaP細胞をPAX2に対するsiRNAで6日間処理し、p53転写調節依存性及び非依存性のプロアポトーシス遺伝子発現を測定し、細胞死経路をモニタリングした。BAXについては、LNCaPにおいて1.81倍の増加、DU145において2.73倍の増加、及びPC3において1.87倍の増加があった図10、パネルA。BIDの発現レベルは、LNCaPにおいて1.38倍及びDU145において1.77倍増加した図10、パネルB。しかしながら、BID発現レベルは、PC3において処理後に1.44分の1に低下した図10、パネルC。BADの解析により、LNCaPにおける2.0倍の発現増加、DU145における1.38倍の増加、かつPC3における1.58倍の増加が明らかとなった。これらの結果は、前立腺癌細胞の生存がPAX2発現に依存的であることを実証している。p53発現細胞株LNCaP、p53変異株DU145、及びp53欠損株PC3におけるPAX2ノックダウンの結果としてp53が活性化され、その後3つの全ての株においてカスパーゼ活性を検出し、それはプログラムされた細胞死の開始を示すものであった。BAX発現は、p53状態に非依存的に全ての3つの細胞株においてアップレギュレートされた。プロアポトーシス因子BADの発現もまた、PAX2阻害に続いて全ての3つの株で増加した。PAX2siRNAで処理後、BID発現はLNCaP及びDU145において増加したが、実はPC3において低下した。これらの結果から、前立腺癌において認められた細胞死はp53発現に影響されるが、これに依存しないことが示される。p53状態に関係なく異なる細胞死経路を介した前立腺癌細胞におけるアポトーシスの開始により、PAX2が他の腫瘍抑制因子を阻害することが示される。PAX2癌遺伝子の阻害は、前立腺癌細胞のDEFB1媒介死をもたらす新規癌治療薬の開発の標的としての役目を果たす腫瘍特異的分子の同定は、癌研究における主要な目標であると考えられている。実施例1では、前立腺癌において高頻度のDEFB1発現の低下があること、及びDEFB1発現の誘導はアンドロゲン受容体陰性ステージ前立腺癌における急速なアポトーシスをもたらすことが実証された。これらのデータは、DEFB1が前立腺腫瘍の抑制において役割を果たしていることを示している。さらに、DEFB1が正常な前立腺上皮の免疫系における自然発生的な成分であることを考えると、DEFB1は副作用がわずか、又は副作用がない有望な治療薬になると期待される。実施例2は、PAX2発現を阻害することにより、p53非依存性の前立腺癌細胞死がもたらされることを実証した。これらのデータは、PAX2により阻害されるさらなるプロアポトーシス因子又は腫瘍抑制因子があることを示している。さらに、データは、前立腺癌において過剰発現される発癌因子PAX2が、DEFB1の転写リプレッサであることを示している。本研究の目的は、DEFB1発現の低下がPAX2癌遺伝子の異常発現によるものであるのか、及びPAX2の阻害によりDEFB1発現及びDEFB1媒介細胞死がもたらされるかどうかを決定することである図11。3.1材料及び方法RNAの単離及び定量的RT-PCR:RNAの単離及びDEFB1の定量的RT-PCRを実施例1に記載の通りに実施した。DEFB1レポータ構築物の作製:pGL3ルシフェラーゼレポータプラスミドを使用してDEFB1レポータ活性をモニタリングした。DEFB1転写開始部位の160塩基上流の領域は、DEFB1TATAボックスを含んだ。領域はまた、PAX2結合に必要なCCTTG配列番号:1配列も含んだ。PCRプライマはKpnI及びNheIの制限部位を含むように設計した。DEFB1プロモータのPCR産物をKpnI及びNheIで制限消化し、同様に制限消化したpGL3プラスミドにライゲーションした図12。構築物を大腸菌にトランスフェクトし、個々のクローンを選択して増殖させた。プラスミドを単離し、自動配列決定によりDEFB1/pGL3構築物の配列完全性を検証した。ルシフェラーゼレポータアッセイ:1μgのDEFB1レポータ構築物又は対照pGL3プラスミドを、1×106個のDU145細胞にトランスフェクトした。次に、0.5×103個の細胞を96ウェルプレートの各ウェルに播種し、一晩増殖させた。その後、PAX2siRNAを含有する新鮮培地又は培地のみを添加し、細胞を48時間インキュベートした。製造元のプロトコルPromega社に従ってBrightGloキットによりルシフェラーゼを検出し、プレートをVeritas社の自動96ウェルルミノメータで読み取った。プロモータ活性を相対発光として表した。膜透過性分析:アクリジンオレンジAO/臭化エチジウムEtBr二重染色を実施して、凝縮クロマチン染色によって細胞膜完全性の変化及びアポトーシス細胞を同定した。AOは生存細胞だけでなく初期のアポトーシス細胞も染色し、一方でEtBrは膜透過性を失った後期アポトーシス細胞を染色する。簡潔に述べると、細胞を2穴チャンバ培養スライドBDFalcon社、米国に播種した。空のpINDプラスミド/pvgRXR又はpINDDEFB1/pvgRXRでトランスフェクトした細胞を、10μMのポナステロンAを含有する培地で24又は48時間誘導した。対照細胞には、24時間及び48時間で新鮮培地を供給した。PAX2阻害が膜完全性に与える効果を決定するために、DU145、PC3及びLNCaPを含有する別個の培養スライドをPAX2siRNAで処理し、4日間インキュベートした。この後、細胞をPBSで1回洗浄し、AOSigma社、米国とEtBrPromega社、米国との2mlの混合溶液1:15μgmlで5分間染色した。染色後、細胞を再びPBSで洗浄した。蛍光はZeissLSM5PascalVario2LaserScanningConfocalMicroscopeCarlZeiss社、ドイツイェーナによって観察した。励起カラーホイールはBS505-530緑及びLP560赤のフィルタブロックを含み、それはAOから発光された緑色光を緑色チャネルに、かつEtBrからの赤色光を赤色チャネルに分離可能とした。それぞれ個々の実験内でのレーザー出力及び利得制御設定は、対照とDEFB1誘導細胞との間で同一であった。AOに対して543nm、及びEtBrに対して488nmの波長でKr/Ar混合ガスレーザーにより励起を提供した。スライドを倍率40倍で分析し、デジタル画像を非圧縮TIFFファイルとして保存し、かつ画像処理及びハードコピーの提示のためにPhotoshopCSソフトウェアAdobeSystems社、カリフォルニア州サンノゼにエクスポートした。PAX2のChIP分析:クロマチン免疫沈降ChIPにより、転写因子によるプロモータのインビボ占有及び免疫沈降による転写因子結合クロマチンの濃縮に基づいて、DNA結合タンパク質の結合部位の同定が可能となる。DU145及びPC3細胞株はPAX2タンパク質を過剰発現するが、DEFB1を発現しない。細胞を1.0のホルムアルデヒドを含有するPBSで10分間インキュベートして、タンパク質をDNAに架橋させた。次いで、試料を超音波処理し、600bpの平均長のDNAを得た。ProteinADynabeadsで事前に清澄化した超音波処理クロマチンを、PAX2特異抗体又は無抗体対照アイソタイプ一致対照抗体と共にインキュベートした。次いで、洗浄した免疫沈降物を収集した。架橋を元に戻した後、DNAをプロモータ特異的プライマを用いてPCRにより分析し、DEFB1がPAX2免疫沈降試料に示されるかどうかを決定した。プライマは、DEFB1TATAボックス及び機能CCTTG配列番号:1PAX2認識部位を含むDEFB1mRNA開始部位のすぐ上流の160bp領域を増幅するように設計した。これらの研究について、陽性対照に免疫沈降前であるが、架橋は戻された入力クロマチンの一定分量のPCRを含めた。全てのステップは、プロテアーゼ阻害剤の存在下で実施した。3.2結果PAX2のsiRNA阻害はDEFB1発現を増加させる:siRNA処理前のDEFB1発現のQRT-PCR分析から、DU145において0.00097、PC3において0.00001、及びLNCaPにおいて0.0004の相対発現レベルが明らかとなった図13。PAX2のsiRNAノックダウンの後、相対発現は、DU145において0.03294338倍の増加、PC3において0.0002022.2倍の増加、及びLNCaPにおいて0.000194.92倍の増加であった。陰性対照として、PAX2欠損株であるヒト前立腺上皮細胞株hPrECは、処理前に0.00687、及びsiRNA処理後に0.00661の発現レベルを明らかとし、これによりDEFB1発現において統計的変化がないことが確認された。PAX2のsiRNA阻害はDEFB1プロモータ活性を増加させる:図14は、PAX2阻害によりDEFB1プロモータ活性の増加がもたらされることを示している。PC3プロモータ/pGL3及びDU145プロモータ/pGL3構築物を作製し、PC3及びDU145細胞それぞれにトランスフェクトした。siRNA処理によるPAX2阻害前後にプロモータ活性を比較した。DEFB1プロモータ活性は、処理後にDU145において2.65倍、及びPC3において3.78倍増加した。DEFB1は細胞膜透過性をもたらす:膜完全性を共焦点分析によりモニタリングした。図15に示すように、膜透過性の無傷細胞はAOにより緑色に染色される。さらに、膜非透過性の形質膜障害を有する細胞はEtBrにより赤色に染色され得る。非誘導DU145A及びPC3D細胞はAOで陽性染色されて緑色発光したが、EtBrでは染色されなかった。しかしながら、DU145B及びPC3E両方でのDEFB1誘導により、24時間での赤色染色によって示される細胞質におけるEtBrの蓄積がもたらされた。48時間後までに、DU145C及びPC3Fは凝縮核を有し、かつ見かけ上黄色となるが、これはAO及びEtBrそれぞれの蓄積に起因する緑色と赤色の両方の染色の存在によるものであった。PAX2阻害は膜透過性をもたらす:細胞をPAX2siRNAで4日間処理し、膜完全性を共焦点分析により再度モニタリングした。図16に示すように、DU145及びPC3の両方は凝縮核を有し、かつ見かけ上黄色であった。しかしながら、LNCaP細胞の細胞質及び核は、siRNA処理後も緑色のままであった。また、細胞周囲の赤色染色は、細胞膜完全性の維持を示している。これらの知見は、PAX2阻害は、DU145及びPC3における特異的なDEFB1媒介細胞死をもたらすが、LNCaP細胞においてはもたらさないことを示している。LNCaPにおいて認められた死は、PAX2阻害後のLNCaPにおける既存の野生型p53のトランス活性化によるものである。PAX2はDEFB1プロモータに結合する:ChIP分析をDU145及びPC3細胞において実施し、PAX2転写リプレッサがDEFB1プロモータに結合するかどうかを決定した図17。図17Aでは、レーン1は分子量100bpのマーカーを含んでいる。レーン2は、架橋及び免疫沈降前にDU145から増幅したDEFB1プロモータの160bp領域を表す陽性対照である。レーン3は、DNAを用いずに実施したPCRを表す陰性対照である。レーン4及び5は、架橋したDU145及びPC3それぞれに由来するIgGを用いて実施した免疫沈降物からのPCRを表す陰性対照である。架橋後に抗PAX2抗体で免疫沈降した25pgのDNAレーン6及び8及び50pgのDNAレーン7及び9のPCR増幅は、DU145及びPC3それぞれにおいて160bpのプロモータ断片を示している。図17Bでは、レーン1は分子量100bpのマーカーを含んでいる。レーン2は、架橋及び免疫沈降前にDU145から増幅したDEFB1プロモータの160bp領域を表す陽性対照である。レーン3は、DNAを用いずに実施したPCRを表す陰性対照である。レーン4及び5は、架橋したDU145及びPC3それぞれに由来するIgGを用いて実施した免疫沈降物からのPCRを表す陰性対照である。架橋後に抗PAX2抗体で免疫沈降した25pgのDNAレーン6及び8及び50pgのDNAレーン7及び9のPCR増幅は、DU145及びPC3それぞれにおいて160bpのプロモータ断片を示している。この実施例の結果は、発癌因子PAX2がDEFB1発現を抑制することを実証している。抑制は転写レベルで起こる。さらに、DEFB1プロモータのコンピュータ解析から、DEFB1TATAボックスに隣接するPAX2転写リプレッサに対するCCTTG配列番号1DNA結合部位の存在が明らかとなった図1。デフェンシン細胞毒性の顕著な特徴の1つは、膜完全性の破壊である。これらの結果は、前立腺癌細胞におけるDEFB1の異所性発現は細胞膜障害による膜電位の消失をもたらすことを示している。同様の現象がPAX2タンパク質発現を阻害した後に認められる。従って、PAX2の発現又は機能の抑制は、DEFB1発現の回復及びその後のDEFB1媒介細胞死をもたらす。また、本結果から、自然免疫による前立腺癌治療、及び潜在的な他の癌治療のための直接療法としてDEFB1の有用性が確立される。移植腫瘍細胞におけるDEFB1発現の効果DEFB1を過剰発現する腫瘍細胞をヌードマウスに注射することによって、DEFB1の抗腫瘍能を評価する。両方向テトラサイクリン応答性プロモータを有するpBI-EGFPベクターにDEFB1をクローニングする。Tet-Off細胞株は、pTet-OffをDU145、PC3及びLNCaP細胞にトランスフェクトし、かつG418で選択することにより作製される。pBI-EGFP-DEFB1プラスミドを、pTK-Hygと共にTet-Off細胞株に同時トランスフェクトし、かつハイグロマイシンで選択する。生存率>90の単一細胞懸濁液のみを使用する。各動物において、約500,000個の細胞を雌ヌードマウスの右脇腹に皮下投与する。ベクターのみのクローンを注射した対照群及びDEFB1過剰発現クローンを注射した群の2群が存在する。統計学者による判定に従い、35匹のマウスが各群に含まれる。動物を週2回計量し、腫瘍増殖をキャリパーでモニタリングし、かつ次の式を用いて腫瘍体積を決定する:体積=0.5×幅2×長さ。腫瘍の大きさが2mm3に達したとき、又は移植から6ヶ月後に、全ての動物をCO2過剰投与により屠殺する;腫瘍を切除し、計量し、中性緩衝ホルマリンに保存して病理学的検査を行う。群間の腫瘍増殖の差異を、要約統計量及びグラフ表示によって記述的に特徴付ける。統計的有意性はt検定又はノンパラメトリックな同等法のいずれかで評価する。移植腫瘍細胞に対するPAX2siRNAの影響インビトロ試験で用いたヘアピンPAX2siRNA鋳型オリゴヌクレオチドを用いて、インビボでDEFB1発現のアップレギュレーションの影響を検討する。センス及びアンチセンス鎖表3参照をアニーリングし、ヒトU6RNApolIIIプロモータの制御下で、pSilencer2.1U6hygrosiRNA発現ベクターAmbionにクローニングする。クローン化プラスミドを配列決定し、検証して、PC3、DU145及びLNCap細胞株にトランスフェクトする。スクランブルshRNAをクローニングし、本試験における陰性対照として用いる。ハイグロマイシン耐性コロニーを選択し、マウスに細胞を皮下導入し、かつ腫瘍増殖を上述の通りにモニタリングする。DEFB1プロモータに結合するPAX2の小分子阻害剤の影響PAX2DNA結合ドメインに相補的な短鎖オリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの例としては、以下で提供されるCCTTG配列番号1認識配列を含む20量体及び40量体のオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらの鎖長は無作為に選択したが、他の鎖長は結合の遮断に有効であると予測される。陰性対照としてスクランブル配列CTCTG配列番号22を有するオリゴヌクレオチドを設計して特異性を検証した。オリゴヌクレオチドは、リポフェクタミン試薬又はCodebreakerトランスフェクション試薬Promega社によって前立腺癌細胞及びHPrEc細胞にトランスフェクトする。DNA-タンパク質相互作用を確認するために、2本鎖オリゴヌクレオチドを[32P]dCTPで標識し、電気泳動移動度シフトアッセイを実施する。オリゴヌクレオチドで処理した後に、QRT-PCR及びウェスタン分析によりDEFB1発現をモニタリング可能である。最後に、前述のようにMTTアッセイ及びフローサイトメトリにより細胞死を検出し得る。認識配列番号1:CTCCCTTCAGTTCCGTCGAC配列番号18認識配列番号2:CTCCCTTCACCTTGGTCGAC配列番号19スクランブル配列番号1:CTCCCTTCACTCTGGTCGAC配列番号23認識配列番号3:ACTGTGGCACCTCCCTTCAGTTCCGTCGACGAGGTTGTGC配列番号20認識配列番号4:ACTGTGGCACCTCCCTTCACCTTGGTCGACGAGGTTGTGC配列番号21スクランブル配列番号2:ACTGTGGCACCTCCCTTCACTCTGGTCGACGAGGTTGTGC配列番号24本発明のオリゴヌクレオチドのさらなる例は以下のものを含む:認識配列番号1:5’-AGAAGTTCACCCTTGACTGT-3’配列番号25認識配列番号2:5’-AGAAGTTCACGTTCCACTGT-3’配列番号26スクランブル配列番号1:5’-AGAAGTTCACGCTCTACTGT-3’配列番号27認識配列番号3:5’-TTAGCGATTAGAAGTTCACCCTTGACTGTGGCACCTCCC-3’配列番号28認識配列番号4:5’-GTTAGCGATTAGAAGTTCACGTTCCACTGTGGCACCTCCC-3’配列番号29スクランブル配列番号2:5’-GTTAGCGATTAGAAGTTCACGCTCTACTGTGGCACCTCCC-3’配列番号30この代替的な阻害性オリゴヌクレオチド集合は、DEFB1プロモータ配列番号:25及び28に由来するPAX2結合に対する認識配列を含む。PAX2遺伝子は、前立腺を含む多様な癌細胞の増殖及び生存のために必要とされる。さらに、PAX2発現の阻害によって自然免疫成分DEFB1により媒介される細胞死がもたらされる。DEFB1の発現及び活性の抑制は、PAX2タンパク質がDEFB1プロモータ内CCTTG配列番号1認識部位を含む2本鎖オリゴヌクレオチドデコイの過剰量と結合することによって達成され得る。このようなオリゴヌクレオチドデコイの使用は、前立腺癌の治療に有望な治療標的を提供する。この方法では、オリゴヌクレオチドデコイとPAX2との結合により、PAX2とDEFB1プロモータとの結合が阻止又は低減され、それ故DEFB1発現が継続可能となる。上述のオリゴヌクレオチド配列及び実験は、さらなるPAX2阻害薬を設計するためのモデルを示した例である。DEFB1発現の減少によって腫瘍形成が増加する機能低下マウスの作製:Cre/loxPシステムは、前立腺発癌の基盤をなす分子的機構の解明において有用となっている。前立腺内における誘導崩壊にDEFB1Cre条件付きKOが用いられる。DEFB1Cre条件付きKOは、DEFB1コードエクソンを挟むloxP部位を含有するターゲッティングベクターの作製、このベクターを有する標的ES細胞、及びこれらの標的ES細胞からの生殖細胞系列キメラマウスの作製を包含する。ヘテロ接合体を前立腺特異的Creトランスジェニック体と交配させ、ヘテロ接合体交雑雑種を用いて前立腺特異的DEFB1KOマウスを作製する。4つの遺伝毒性化学化合物がげっ歯類に前立腺癌を誘発することが確認されている:N-メチル-N-ニトロソ尿素MNU、N-ニトロソビス2-オキソプロピルアミンBOP、3,2X-ジメチル-4-アミノ-ビフェニルMAB及び2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾールphenylimidazow4,5-ビピリジンPhIP。前立腺の腺腫及び腺癌における誘発試験のために、これらの発癌化合物を胃内投与又は静脈内注射してDEFB1-トランスジェニックマウスを処理する。組織学、免疫組織学、mRNA及びタンパク質の分析により、腫瘍増殖の差異及び遺伝子発現の変化について前立腺試料を試験する。GOFマウスの作製:PAX2誘導可能GOFマウスについて、PAX2GOFバイトランスジェニック及び野生型モノトランスジェニックの同腹仔に対し、5週齢よりドキシサイクリンDoxを投与し、前立腺特異性PAX2発現を誘発する。簡潔に述べると、PROBASIN-rtTAモノトランスジェニックマウスtet依存性rtTA誘導物質の前立腺細胞特異的発現を本発明者らのPAX2トランスジェニック応答動物系と交配する。バイトランスジェニックマウスには、誘導のために飲料水よりDoxを給餌する週2回、500mg/Lを新たに調製。バイトランスジェニックマウスにおけるトランスジェニックファウンダー系統を用い、初回の実験より低いバックグラウンドレベル、良好な誘導性並びにPAX2及びEGFPレポータの細胞型特異的発現を確認する。実験群のサイズについては、各群野生型及びGOFにおいて年齢及び性別でマッチングした5~7個体によって統計的有意性を考慮する。本試験における全動物について、分析及び比較のために、始めに前立腺組織を1週間間隔で採取して発癌時間パラメーターを決定する。PCR遺伝子型決定、RT-PCR及びqPCR:以下のPCRプライマ及び条件を用いて、PROBASIN-rtTAトランスジェニックマウスの遺伝子型を決定する:PROBASIN5フォワード5’-ACTGCCCATTGCCCAAACAC-3’配列番号:31;RTTA3リバース5’-AAAATCTTGCCAGCTTTCCCC-3’配列番号:32;95°Cで5分間変性、その後95°Cで30秒、57°Cで30秒、72°Cで30秒の30サイクル、その後72°Cで5分間伸長し、600bpの産物を得る。以下のPCRプライマ及び条件を用いて、PAX2誘導可能トランスジェニックマウスの遺伝子型を決定する:PAX2フォワード5’-GTCGGTTACGGAGCGGACCGGAG-3’配列番号:33;リバース5’IRES5’-TAACATATAGACAAACGCACACCG-3’配列番号:34;95°Cで5分間変性、その後95°Cで30秒、63°Cで30秒、72°Cで30秒の34サイクル、その後72°Cで5分間伸長し、460bpの産物を得る。以下のPCRプライマ及び条件を用いて、Immortomouseヘミ接合体の遺伝子型を決定する:Immol1、5’-GCGCTTGTGTCGCCATTGTATTC-3’配列番号:35;Immol2,5’-GTCACACCACAGAAGTAAGGTTCC-3’配列番号:36;94°Cで30秒、58°Cで1分、72°Cで1分30秒、30サイクルで約1kbの導入遺伝子バンドを得る。PAX2ノックアウトマウスの遺伝子型を決定するために、以下のPCRプライマ及び条件を用いる:PAX2フォワード5’-GTCGGTTACGGAGCGGACCGGAG-3’配列番号:37;PAX2リバース5’-CACAGAGCATTGGCGATCTCGATGC-3’配列番号:38;94°Cで1分、65°Cで1分、72°Cで30秒、36サイクルで280bpのバンドを得る。DEFB1ペプチド動物試験:CharlesRiverLaboratories社より購入した6週齢の雄胸腺欠損ヌードマウスの肩甲骨皮下に、106個の生存PC3細胞を注射する。注射から1週間後、動物を3群のうちの1群に無作為に割り付けする-I群:対照;II群:DEFB1を100μg/日、週5日、2~14週間腹腔内注射;III群:DEFB1を100μg/日、週5日、8~14週間腹腔内注射。動物は、1ケージにつき4匹として無菌飼育で維持し、毎日観察する。腫瘍を10日間隔でキャリパーを用いて測定し、腫瘍の体積はV=L×W2/2を用いて算出する。上皮内の腫瘍及び癌の化学予防を目的としたPAX2発現の標的化癌化学予防は、癌の予防、又は前癌状態若しくはさらにより早期における治療と定義される。侵襲性癌への進行期間が長いことは重要な科学的機会であるが、化学予防薬候補の臨床的利点を示すことに対しては経済的な障害でもある。したがって、近年の化学予防薬開発研究の重要な構成要素は、薬剤の臨床的利益又は癌発生率減少効果を正確に予測する癌より早期のエンドポイント又はバイオマーカーを特定することとなっている。多くの癌において、IENは前立腺癌などの早期エンドポイントである。PAX2/DEFB1経路がIEN中に、及びおそらくより早期の病理組織学的状態においても調節解除されることを考慮すれば、これは癌化学予防のための強力な予測的バイオマーカーかつ優れた標的となる。表1に示すように、PAX2遺伝子は数多くの癌において発現される。さらに、数種類の癌が異常PAX2発現を有することが示されている図18。表4には、前立腺癌の化学予防剤としての有用性を有し得る、PAX2を抑制し、かつDEFB1発現を増加させる多数の化合物が示されている。アンジオテンシンIIAngIIは、血圧及び心血管系恒常性の主な調節因子であり、かつ強力なマイトジェンとして認識されている。AngIIは、G-タンパク質共役受容体スーパーファミリーに属するが、組織分布及び分子内シグナリング経路が異なる2つの受容体サブタイプ、アンジオテンシンI型受容体AT1R及びアンジオテンシンII型受容体AT2Rと結合することより、その生物学的効果を媒介する。AngIIは、その血圧に対する効果に加えて、創傷治癒などの組織再構築、心臓の肥大及び発生を包含する多様な病理的状況においてある役割を果たすことが示されている。実際に、前立腺を含む多様な癌の細胞及び組織におけるレニンーアンジオテンシン系RASのいくつかの成分の局所的発現が最近の研究で明らかになっている。AT1Rのアップレギュレーションは、アポトーシス及び増殖調節因子を回避することを学習した癌細胞に対して相当な利点をもたらす。今日、数多くの癌はPAX2を異常発現することが示されている。PAX2発現標的による化学予防は、癌関連死に対して大きな影響を有し得る。8.1材料及び方法細胞培養:hPrEC細胞、並びにDU145、LnCap及びPC3細胞株を、実施例1の記載に従って培養した。試薬及び処理:5若しくは10μMのAngII、5μMのAT1R拮抗薬Los、5μMのAT2R拮抗薬PD123319、25μMのMEK阻害剤U0126、20μMのMEK/ERK阻害剤PD98059又は250μMのAMPキナーゼ誘発物質AICARで細胞を処理した。ウェスタンブロット分析:ウェスタンブロット分析は実施例2の記載に従って実施した。そしてブロットを、1:1000-2000希釈の一次抗体抗PAX2、抗ホスホPAX2、抗JNK、抗ホスホJNK、抗ERK1/2又は抗ホスホERK1/2Zymed、カリフォルニア州サンフランシスコでプローブした。洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼHRPと結合した抗ウサギ抗体1:5000希釈;Sigma社と共に膜をインキュベートし、AlphaInnotechFluorchem8900で化学発光試薬Pierceを用いてシグナル検出を可視化した。対照として、ブロットを剥離し、マウス抗βアクチン一次抗体1:5000,Sigma-Aldrich社及びHRP結合抗マウス二次抗体1:5000,Sigma-Aldrich社で再プローブし、シグナル検出を再度可視化した。QRT-PCR分析:PC3及びDU145前立腺癌細胞株並びにhPrEC正常前立腺上皮細胞におけるPAX2ノックダウン後の遺伝子発現における変化を確認するために、実施例1の記載に従って定量的リアルタイムRT-PCRを実施した。60°Cのアニーリング温度を用いて、標準的な条件下でPCRを40サイクル実施した。定量値は、指数的増幅が開始するサイクル数閾値により決定し、かつ3回繰り返して得られた値を平均した。メッセージレベルと閾値の間には逆関係があった。さらに、GAPDHをハウスキーピング遺伝子として用い、全cDNAの初期含有量を正規化した。相対発現は、各遺伝子とGAPDHとの間の比率として計算した。全ての反応は3連で行った。チミジン取り込み:細胞の増殖は、[3H]チミジンリボチド[3H]TdRのDNAへの取り込みによって決定した。0.5×106細胞/ウェルのDU145細胞懸濁液をその適切な培地に播種した。細胞は、指示された濃度のAngIIの存在下又は非存在下で72時間インキュベートした。細胞を同一培地中で37kBq/ml[メチル-3H]チミジンに6時間曝露させた。付着細胞を5トリクロロ酢酸で固定し、SDS/NaOH溶解緩衝液で1晩溶解させた。BeckmanLS3801液体シンチレーションカウンタカナダで放射能を測定した。懸濁細胞培養物を、セルハーベスタPackardinstrument社、コネティカット州メリデンで回収し、かつ1450microbeta液体シンチレーションカウンタPerkinElmerLifeSciences社で放射能を測定した。8.2結果DU145前立腺癌細胞におけるPAX2発現に対するAngIIの影響を調査するために、AngIIで30分から48時間にわたって処理した後にPAX2発現を検討した。図19に示すように、PAX2発現はAngII処理後に時間と共に徐々に増加した。LosでDU145を処理することでRASシグナリングを遮断すると、PAX2発現は有意に低下した。図20Aに示すように、LosでのDU145細胞処理後、未処理対照DU145細胞と比較すると、PAX2発現は48時間後に37低下し、72時間後では50低下した。AT2R受容体がAT1Rの作用を妨害することは公知である。したがって、AT2R受容体の遮断がPAX2発現に与える影響を検討した。DU145をAT2R遮断剤PD123319で処理することにより、PAX2発現は処理から48時間後に7倍増加、かつ96時間後に8倍増加した図20B。まとめると、これらの知見より、PAX2発現はAT1R受容体経路によって調節されていることが証明される。AngIIはAT1R媒介MAPK活性化及びSTAT3リン酸化を経て前立腺癌細胞の増殖に直接影響することが公知である。DU145をAngIIで処理すると、増殖率は2~3倍増加した図21。しかしながら、Losで処理することによって増殖率は50低下した。さらに、Losで30分間前処理することでAT1R受容体を遮断したところ、AngIIの増殖に対する影響が抑制された。PAX2の発現及び活性化の調節におけるAT1Rシグナリングの役割をさらに検討するために、多様なMAPキナーゼシグナリング経路成分の遮断がPAX2発現に与える影響を検討した。MEK阻害剤U0126でDU145細胞を処理したところ、PAX2発現が有意に低下した図22。さらに、MEK/ERK阻害剤PD98059で処理しても、PAX2は低下した。DU145細胞のLosでの処理は、ERKタンパク質レベルには影響を及ぼさないが、ホスホERKの量は低下した図23A。しかしながら、DU145をLosで処理するとPAX2発現は有意に減少した。U0126及びPD98059での処理後に同様の結果が認められた図23B。PAX2発現は、ERKの下流の標的であるSTAT3によって調節されることも公知である。DU145のLos、U0126、及びPD98059での処理により、ホスホSTAT3タンパク質レベルの低下がもたらされた図23C。これらの結果は、前立腺癌細胞においてPAX2はAT1Rを介して調節されることを実証する。さらに、AT1RシグナリングがJNKによるPAX2活性化に及ぼす影響を検討した。DU145をLos、U0126、及びPD98059で処理したところ、いずれもホスホPAX2タンパク質レベルが有意に低下するか又は抑制された図24A。しかしながら、Los及びU0126はホスホJNKタンパク質レベルを低下させなかった図24B。したがって、ホスホPAX2の低下はPAX2レベルの低下よるものであって、リン酸化の低下によるものではないとみられる。5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド-1-β-4-リボフラノシドAICARは、エネルギー恒常性及び代謝ストレスに対する応答を調節するAMPキナーゼ活性化物質として幅広く用いられている。最近の報告では、薬剤又はAMPK過剰発現を用いた活性化AMPKの抗増殖及びプロアポトーシスの作用が示されている。AMPK活性化は、脂肪酸シンターゼ経路の阻害並びにストレスキナーゼ及びカスパーゼ3の誘導を含む多様な機構によって、ヒトの胃癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌、膵臓細胞及び肝臓癌細胞においてアポトーシスを誘導し、かつマウス神経芽細胞において酸化ストレス誘導アポトーシスを亢進させることが示されている。さらに、PC3前立腺癌細胞の処理により、p21、p27及びp53タンパク質発現及びPI3K-Akt経路の阻害が増加した。これらの経路はいずれもPAX2によって直接的又は間接的に調節される。前立腺癌細胞をAICARで処理したところ、PAX2発現図23B、並びにその活性化体のホスホPAX2図24Aが抑制された。さらに、PAX2発現を調節するホスホ-STAT3も抑制された図23C。最後に、PAX2のアップレギュレーション及び過剰発現につながる異常RASシグナリングは、DEFB1腫瘍抑制因子遺伝子の発現を抑制するという仮説を立てた。この可能性を調査するために、正常前立腺上皮一次培養物hPrECをAngIIで処理し、かつPAX2及びDEFB1の発現レベルを検討した。正常前立腺細胞対前立腺癌細胞において、DEFB1発現とPAX2発現との間の逆関係が発見された。図25に示すように、未処理hPrECは、PC3前立腺癌細胞におけるPAX2発現と比較して、10の相対PAX2発現を示した。逆に、未処理PC3細胞は、未処理hPrEC細胞におけるDEFB1発現と比較して、わずか2のDEFB1発現を示した。hPrEC細胞中で10μMのAngIIによる72時間の処理後、未処理hPrEC細胞と比較して、DEFB1発現は35低下し、かつPAX2発現は66増加した;96時間後までに、未処理hPrEC細胞と比較して、DEFB1発現は50低下し、かつDEFB1は79増加した。さらに、hPrECにおける72時間後のPAX2発現の増加は、PC3前立腺癌細胞で認められたPAX2レベルの77となった。AngII処理から96時間後、PAX2発現はPC3細胞におけるPAX2発現の89となった。これらの結果から、調節解除されたRASシグナリングは、前立腺細胞においてDEFB1発現を抑制し、かつPAX2発現を活性化することが実証される。アポトーシス阻害は、癌の発生に寄与する重要な病態生理学的因子である。癌治療の顕著な進歩にもかかわらず、進行性疾患の治療においてはほとんど進歩していない。発癌が多年にわたる多段階、多経路の進行疾患であることを考慮すると、この過程を阻害、遅延、又は逆行させるための医薬品又は他の薬剤の使用による化学予防は、癌研究において非常に有望な領域であると認識されている。前立腺癌の化学予防を目的とした薬物療法の成功には、癌発生を抑制するという全般的な目標を有し、宿主に対する臨床的影響を最小限に維持しながら、標的細胞に対する特異的効果を有する治療薬を用いることが必要とされる。したがって、早期段階の発癌の機構を理解することは、特定の治療法の有効性を判定する上で重要である。異常PAX2発現及びそのアポトーシス抑止の重要性は、その後の腫瘍形成に対する寄与と共に、これが前立腺癌治療のための適切な標的となり得ることを示唆する。前立腺癌においてPAX2はAT1Rにより調節される図26。この場合、RASシグナリングが調節解除されると、PAX2癌遺伝子発現が増加し、かつDEFB1腫瘍抑制因子の発現が減少する。したがって、AT1R拮抗薬の使用によりPAX2発現が低下し、かつDEFB1の再発現を介した前立腺癌細胞死の増加がもたらされる図27。これらの結果によって、レニン-アンジオテンシンシグナリング経路、AMPキナーゼ経路又はPAX2タンパク質の不活性化すなわち抗PAX2抗体接種を包含する他の方法を介したPAX2発現のターゲティングは、癌予防にとって有望な標的を表すという新たな知見が提供される表4。この研究から、前立腺癌におけるPAX2癌遺伝子のアップレギュレーションはRASシグナリングの調節解除によるものであることが証明される。PAX2発現は、アンジオテンシンI型受容体によって媒介されるERK1/2シグナリング経路によって調節される。さらに、ロサルタンLosによってAT1Rを遮断することによりPAX2発現が抑制される。さらに、AMPK活性化物質であるAICARも、潜在的なPAX2阻害剤として有望性を示している。まとめると、これらの試験から、これらの薬剤クラスが潜在的なPAX2発現抑制因子として関係付けられ、かつ最終的に新規化学予防剤として役立ち得ることが強く指摘される。前立腺組織の等級付け手段及び前立腺癌発生の予測因子としてのPAX2-DEFB1発現レベル9.1材料及び方法QRT-PCR分析:根治的前立腺切除術を受けた患者から前立腺切片を採取した。病理検査後、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを実施して、正常、増殖性上皮内腫瘍PIN及び癌の組織の領域を単離した。前述の方法によりQRT-PCRを実施して発現を評価した。各領域のDEFB1及びPAX2発現及びGAPDHを内部標準として用いた。採血及びRNA単離:製造元のプロトコルに従い、QRT-PCR用に各個人よりPAXgene登録商標BloodRNA試験管QIAGEN社に血液2.5mlを採取した。全血をPAXgene登録商標安定化剤と完全に混合し、RNA抽出前に6時間室温で保存した。次いで、製造元の使用説明書QIAGEN社に従い、PAXgene登録商標BloodRNAキットを用いて全RNAを抽出した。汚染ゲノムDNAを除去するために、PAXgene登録商標BloodRNASystemスピンカラムに吸着させた全RNA試料を、DNaseIQIAGEN社と共に25°Cで20分間インキュベートしてゲノムDNAを除去した。全RNAを溶離かつ定量し、PAX2発現とDEFB1発現との比率を比較するために前述の方法に従ってQRT-PCRを実施する。9.2結果図28では、患者番号1255、1343、1477、及び1516からの前立腺組織切片のQRT-PCR分析により、0.005を超える相対DEFB1発現レベルが示され、それはグリーソンスコア6と相関し、一方で、0.005未満のDEFB1発現レベルを有する患者番号1188及び1215は、グリーソンスコア7を有した。したがって、DEFB1発現とグリーソンスコアとの間には逆関係があり、それは図29Aにおいてさらに確認される。逆に、図29Bに示すように、悪性前立腺組織及びPINにおけるPAX2発現とグリーソンスコアとの間には正の相関があった。図29A及び29Bでは、別個の患者からの正常、PIN及び癌の組織を、相対的なDEFB1図29A及びPAX2図29Bの発現レベルについて試験及び比較した。全般的に、GAPDH内部標準に対するPAX2発現レベルの範囲は、正常良性組織では0~0.2の間、PINにおいては0.2~0.3の間、及び癌悪性組織においては0.3~0.5の間であった図29B。DEFB1については、PAX2と比較して逆関係があった。GAPDH内部標準に対するDEFB1発現レベルの範囲は、正常良性組織では0.06~0.005の間、PINにおいて0.005~0.003の間、及び癌悪性組織において0.003~0.001の間であった。したがって、良性、前癌PIN及び悪性の前立腺組織の予測因子としてPAX2-DEFB1発現比率を用いる、ドナルド予測因子DPFと称される予測スケールを開示する。DPFに基づくPAX2-DEFB1比率が0~39の間である組織は、正常病理学的に良性前立腺組織に相当する。PAX2-DEFB1比率が40~99の間の組織は、DPFスケールに基づきPIN前癌組織に相当する。最後に、PAX2-DEFB1比率が100~500の間の組織は、悪性組織低~高悪性度の癌に相当する。現在、前立腺癌発生の予測バイオマーカーに対する決定的なニーズがある。前立腺癌の発症が、PSA検査又は直腸指診などの現行のスクリーニング法によって疾患が検出可能となるはるか以前に起こることは公知である。前立腺癌の進行及び早期発生のモニタリングが可能な信頼度の高い検査法であれば、より有効な疾患管理によって死亡率が大きく低下し得ると考えられる。本明細書には、医師が前立腺の病理学的状態を事前に十分に知ることを可能とする予測指標が開示される。DPFは、前立腺疾患の進行と関連するPAX2-DEFB1発現比率の低下を測定する。この強力な尺度は、患者が前立腺癌を発症する可能性を予測できるだけでなく、前悪性癌の初期発症も特定し得る。最終的に、この手段は、医師がより悪性度の高い疾患を有する患者をそうでない患者から識別することを可能とする。癌特異的マーカーの同定は、循環腫瘍細胞CTCの同定を助けるために用いられている。末梢血中に広まった腫瘍細胞を検出することにより、腫瘍のステージング、予後判定、及び補助療法の有効性を初期評価する代替的マーカーの同定のための臨床的に重要なデータを提供可能であることを証明する新たな証拠もある。さらに、全循環細胞の遺伝子発現プロファイリングを比較することにより、前立腺癌を早期検出するための予測因子として、それぞれ免疫監視及び癌生存において一役割を果たすDEFB1及びPAX2遺伝子の発現を検討することができる。宿主防御ペプチドヒトβデフェンシン-1の機能分析:癌におけるその潜在的役割についての新たな洞察10.1材料及び方法細胞培養:hPrEC細胞並びにDU145、LnCap、及びPC3細胞株を、実施例1の記載に従って培養した。組織サンプル及びレーザーキャプチャーマイクロダイセクション:根治的前立腺切除術を受ける前にインフォームドコンセントを提出した患者より前立腺組織を採取した。治験審査委員会が承認したプロトコルに従い、Hollings癌センター腫瘍バンクよりサンプルを入手した。これにはサンプルの処理、切片化、組織学的特性評価、RNA精製及びPCR増幅に対するガイドラインが含まれていた。外科医及び病理医より受け取った前立腺検体は、OCTコンパウンド中で速やかに凍結させた。各OCTブロックを切り出して連続切片を作製し、それを染色して検査した。良性細胞、前立腺上皮内腫瘍PIN及び癌を含む領域を同定し、本発明者らがArcturusPixCellIISystemカリフォルニア州、サニーベールを用いて未染色スライドから領域を選択する際の指標とするために用いた。キャプチャーした材料を収容するカップを、ArcturusPicoPureRNAIsolationKitからの20μlの溶解物に曝露させ、速やかに処理した。RNAの量及び品質は、5’アンプリコンを生成するプライマーセットを用いて評価した。セットはリボソームタンパク質L32用3’アンプリコンと5’アンプリコンとの間隔は298塩基、グルコースリン酸イソメラーゼ用391塩基間隔、及びグルコースリン酸イソメラーゼ用842塩基間隔のものを含む。通常、多様な調製組織からのサンプルを用いて、これらのプライマーセットについては0.95~0.80の比率が得られた。病理医が肉眼で見て追加的な腫瘍及び正常なサンプルを切り出し、液体窒素で瞬間凍結させてhBD-1及びcMYC発現について評価した。hBD-1遺伝子のクローニング:hBD-1cDNAは、公開hBD-1配列アクセション番号U50930から作製したプライマを用いて逆転写PCRによりRNAから作製したGanz社、2004。PCRプライマはClaI及びKpnIの制限部位を含むように設計した。hBD-1PCR産物をClaI及びKpnIで制限消化し、TAクローニングベクターにライゲーションした。次いで、TA/hBD1ベクターを熱ショックにより大腸菌のXL-1Blue株にトランスフェクトし、個々のクローンを選択して増殖させた。CellCultureDNAMidiprepQIAGEN社、カリフォルニア州バレンシアでプラスミドを単離し、かつ配列完全性を自動配列決定により検証した。次いで、hBD-1遺伝子フラグメントを、方向付けを目的とした中間ベクターとして役立つ、ClaI及びKpnIで消化したpTRE2にライゲーションした。pTRE2/hBD-1構築物をApaI及びKpnIで消化させてhBD-1インサートを切り取った。インサートを、これもApaI及びKpnIで二重消化したEcdysoneInducibleExpressionSystemInvitrogen社、カリフォルニア州カールスバッドのpINDベクターにライゲーションした。構築物を大腸菌にトランスフェクトし、個々のクローンを選択して増殖させた。プラスミドを単離し、自動配列決定によりpIND/hBD-1の配列完全性を再度検証した。細胞トランスフェクション:細胞1×106を、100mmペトリ皿に播種し、一晩培養した。次に、Lipofectamine2000Invitrogenを用いて、ヘテロ二量体エクジソン受容体を発現するpvgRXRプラスミド1μg、およびpIND/hBD1ベクター構築物またはpIND/βガラクトシダーゼβgal対照ベクター1μgを、OptiMEM培地LifeTechnologies,Inc.で細胞にコトランスフェクトした。ポナステロンAPonAでβgal発現を誘導し、βガラクトシダーゼ検出キットInvitrogenで細胞を染色することにより、トランスフェクション効率を測定した。陽性染色青色コロニーを計数することによりトランスフェクション効率を評価したところ、細胞株で細胞の60~85がβガラクトシダーゼを発現したことが実証された。免疫細胞化学:hBD1タンパク質発現を検証するために、2チャンバー培養スライドBDFalcon、米国に、DU145およびhPrEC細胞を1.5~2×104細胞/チャンバーで播種した。pvgRXR単独対照またはhBD1プラスミドをトランスフェクトしたDU145細胞は10μMPonAを加えた培地で18時間誘導し、一方、トランスフェクトしない細胞には新鮮な増殖培地を加えた。誘導後、細胞を1×PBSで洗浄し、4パラホルムアルデヒドで1時間室温にて固定した。それから、細胞を1×PBSで6回洗浄し、2BSA、0.8正常ヤギ血清VectorLaboratories,Inc.、カリフォルニア州バーリンゲームおよび0.4トリトンX100を加えた1×PBSで1時間室温にてブロックした。次に、ブロッキング溶液で1:1000に希釈したウサギ抗ヒトBD1ポリクローナル一次抗体PeproTechInc.、ニュージャージー州ロッキーヒル中で細胞を一晩インキュベートした。これに続いて、細胞をブロッキング溶液で6回洗浄し、ブロッキング溶液で1:1000に希釈したAlexaFluor488ヤギ抗ウサギIgGHL二次抗体中で1時間室温にてインキュベートした。細胞をブロッキング溶液で6回洗浄した後、GelMountBiomeda、カリフォルニア州フォスターシティを用いてカバースリップをマウントした。最後に、細胞を微分干渉コントラスト法DICおよび488nmのレーザー励起により観察した。共焦点顕微鏡法ZeissLSM5Pascalで63倍DIC油浸レンズを使用し、Vario2RGBレーザー走査モジュールを用いて蛍光シグナルを解析した。デジタル画像は、画像処理とハードコピー表示のためにPhotoshopCSソフトウェアAdobeSystemsにエクスポートした。RNA単離と定量的RTPCR:QRTPCRはすでに記載されているように実施したGibsonetal.,2007。簡潔に述べると、組織切片の全RNA反応当たり0.5μgを、ランダムプライマーPromegaを用いてcDNAに逆転写した。TaqManReverseTranscriptionSystemのMultiScribeReverseTranscriptaseおよびSYBRGreenPCRMasterMixAppliedBiosystems、カリフォルニア州フォスターシティを使用して作成したcDNAで2段階QRTPCRを実施した。公開配列からhBD1およびcMYCのプライマー対を作成した表5。hBD1およびcMYCは56.4°C、PAX2は55°Cのアニーリング温度を用いて標準条件下でPCRを40サイクル実施した。さらに、ハウスキーピング遺伝子としてβアクチン表5を増幅し、全cDNAの初期含量を正規化した。良性前立腺組織サンプルにおける遺伝子発現は、βアクチンに対する発現比として計算した。誘導前後の悪性前立腺組織、hPrEC前立腺初代培養物、および前立腺癌細胞株におけるhBD1発現レベルは、hPrEC細胞におけるhBD1発現の平均レベルに対して計算した。陰性対照として、cDNAテンプレートを用いないQRTPCR反応も実施した。すべての反応を最低3回行った。MTT細胞生存率アッセイ:細胞増殖に対するhBD1の影響を調べるために、代謝3[4,5ジメチルチアゾール2イル]2,5ジフェニルテトラゾリウム臭化物MTTアッセイを実施した。pvgRXRプラスミドおよびpIND/hBD1構築物または対照pvgRXRプラスミドでコトランスフェクトしたDU145、LNCaP、PC3およびPC3/AR細胞を96ウェルプレートにウェル当たり1~5×103細胞で播種した。播種24時間後から、10μMPonAを加えた新鮮な増殖培地を毎日加え、hBD1発現を24時間、48時間、および72時間誘導した後に、製造者の指示Promegaに従ってMTTアッセイを実施した。反応は3連で3回実施した。膜完全性の解析:アクリジンオレンジAO/臭化エチジウムEtBr二重染色を実施し、細胞膜完全性の変化、および凝縮クロマチン染色によるアポトーシス細胞を確認した。AOは生存細胞と初期アポトーシス細胞を染色するのに対し、EtBrは、膜が損傷した後期アポトーシス細胞を染色する。簡潔に述べると、PC3、DU145およびLNCaP細胞を2チャンバー培養スライドBDFalconに播種した。空のプラスミドまたはhBD1プラスミドをトランスフェクトした細胞を、10μMPonAを加えた培地で24時間または48時間誘導し、一方、対照細胞には各時点で新鮮な増殖培地を加えた。誘導後に、細胞をPBSで1回洗浄し、AOSigma、St.Louis、ミズーリ州とEtBrPromega5μg/mLの混液1:12mLで5分間染色し、再びPBSで洗浄した。ZeissLSM5PascalVario2共焦点走査型レーザー顕微鏡CarlZeissで蛍光を観察した。励起カラーホイールにはBS505530緑色とLP560赤色フィルターブロックがあり、AOからの緑色発光を緑色チャネルに、EtBrからの赤色発光を赤色チャネルに分離することができた。個々の実験におけるレーザー出力と利得制御設定は、対照とhBD1誘導細胞とで同一とした。AOは543nm、EtBrは488nmの波長でKr/Ar混合ガスレーザーにより励起した。スライドを40倍の倍率で解析し、デジタル画像を無圧縮デシタルTIFFファイルとして保存し、画像処理とハードコピー表示のためにPhotoshopCSソフトウェアAdobeSystemsにエクスポートした。フローサイトメトリー:hBD1発現システムを用いてトランスフェクトしたPC3およびDU145細胞を60mm皿で増殖させ、10μMPonAで12時間、24時間、および48時間誘導した。細胞を採取し、実施例1に記載のようにフローサイトメトリーで解析した。カスパーゼ検出:前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出を、実施例1に記載のように実施した。PAX2のsiRNAサイレンシング:siRNAノックダウンと検証を、実施例2に記載のように実施した。10.2結果前立腺組織におけるhBD1発現:解析した前立腺癌凍結組織切片の82は、hBD1の発現をほとんど、またはまったく示さなかったDonaldetal.,2003。hBD1発現レベルを比較するために、ランダムに選択した悪性領域に隣接する正常前立腺組織の肉眼的切除またはLCMにより得られた正常前立腺組織でQRTPCR解析を実施した。肉眼的に切除した正常臨床サンプルのすべてにおいて、発現レベルの約6.6倍の差に相当する発現範囲でhBD1が検出された図31A。LCMにより捕捉した正常組織サンプルは32倍の発現差に相当する範囲のレベルでhBD1を発現した図31B。対応する患者プロファイルにサンプル数を一致させると、ほとんどの場合、hBD1発現レベルはグリーソンスコア6の患者サンプルの方がグリーソンスコア7の患者サンプルよりも高いことが判明した。さらに、同一患者番号1343から肉眼的切除とLCMにより得られた組織中のhBD1発現レベルを比較すると、2種類の単離法の間で854倍の発現差があることが実証された。したがって、これらの結果から、LCMは前立腺組織におけるhBD1発現を評価するための感度がより高い技術であることが示される。前立腺細胞株におけるhBD1発現:前立腺癌細胞株におけるhBD1のアップレギュレーションを検証するために、ポナステロンAPonAによる誘導が可能なDEFB1hBD1発現システムを用いてトランスフェクトした細胞でQRTPCRを実施した。さらに、テンプレートなしの陰性対照も実施し、増幅産物をゲル電気泳動により検証した。図32Aは、hBD1誘導前後の前立腺癌細胞株におけるhPrEC細胞と比較したhBD1の相対発現レベルを示す。hBD発現はhPrEC細胞と比較して前立腺癌細胞株で有意に低かった。24時間の誘導時間後、hBD1誘導前の細胞株と比較してDU145、PC3およびLNCaPでhBD1の相対発現レベルは有意に増加した。図32Aの星印1つは、hPrECと比較して発現レベルが有意に高いことを示す。星印2つは、hBD1誘導前の細胞株と比較して発現レベルが統計的に有意であることを示しているスチューデントのt検定、p<0.05。図32Bは、hBD1をトランスフェクトし、PonAにより誘導した陽性対照であるhPrEC細胞パネルA:DIC、パネルB:蛍光およびDU145細胞パネルC:DIC、パネルD:蛍光におけるhBD1発現の免疫細胞化学による検証を示す。hBD1に対する一次抗体で細胞を染色し、二次抗体の緑色蛍光に基づいてタンパク質発現をモニターした。488nmで共焦点レーザーにより励起すると、緑色蛍光が発生し、hPrEC陽性対照にhBD1タンパク質が存在することが示された。対照DU145細胞または空のプラスミドにより誘導したDU145細胞では検出可能な緑色蛍光は認められなかったデータは示さず。しかしながら、hBD1発現を誘導したDU145細胞の共焦点解析により緑色蛍光が判明し、PonAによる誘導後にhBD1タンパク質が存在することが示されたパネルD。Sizebar=20μM。hBD1の発現により細胞生存率が減少する:DU145、PC3、PC3/ARおよびLNCaP前立腺癌細胞株における相対細胞生存率に対するhBD1発現の影響を評価するためにMTTアッセイを実施した。空のベクターのMTT解析では、細胞生存率に統計的に有意な変化は認められなかった。hBD1誘導の24時間後では、相対細胞生存率はDU145細胞で72、PC3細胞で56であり、48時間後に細胞生存率はDU145細胞で49、PC3細胞で37に減少した図33。hBD1誘導の72時間後には、相対細胞生存率はさらにDU145で44、PC3細胞で29に減少した。逆に、LNCaP細胞の生存率には顕著な影響はなかった。LNCaPに認められるhBD1細胞毒性に対する耐性が、アンドロゲン受容体ARの存在に起因するのか否かを評価するために、PC3細胞におけるhBD1細胞毒性を異所性AR発現PC3/ARで調べた。PC3/AR細胞とPC3細胞との間に差は認められなかった。したがって、データからは、hBD1は後期前立腺癌細胞に対し特異的に細胞毒性であることが示される。PC3およびDU145に対するhBD1の影響が細胞増殖抑制性または細胞毒性のいずれであるのかを確認するために、FACS解析を実施し、細胞死を測定した。通常の増殖条件下で、PC3およびDU145培養物の90超が生存可能で非アポトーシス性であり左下象限、アネキシンVまたはPIで染色されなかった。PC3細胞におけるhBD1発現の誘導後、初期アポトーシスと後期アポトーシス/壊死それぞれ右下および右上象限を生じた細胞数を合計すると、12時間で10、24時間で20、48時間で44であった図4B。DU145細胞では、初期アポトーシスと後期アポトーシス/壊死を生じた細胞数を合計すると、誘導の12時間後で12、24時間で34、48時間後で59であった図4A。PonAによる誘導後に、空のプラスミドを加えた細胞にアポトーシスの増加は認められなかった。アネキシンVとヨウ化プロピジウムの取り込み試験から、hBD1はDU145およびPC3前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を有することが実証され、その結果からアポトーシスが細胞死のメカニズムであることが示される。hBD1は膜完全性とカスパーゼ活性化に変化をもたらす:hBD1誘導後に前立腺癌細胞で認められる細胞死がカスパーゼ介在性アポトーシスであるのか否かを調べた。hBD1発現に関与する細胞メカニズムをより深く理解するために、hBD1発現を誘導したDU145およびLNCaP細胞で共焦点レーザー顕微鏡解析を実施した図5。アポトーシスが活発に生じている細胞において、緑色蛍光性のFAMVADFMKのカスパーゼとの結合および開裂に基づいてパンカスパーゼ活性化をモニターした。DICによる細胞の解析より、0時間では生存可能な対照DU145パネルAおよびLNCaPパネルE細胞の存在が示された。488nmで共焦点レーザーにより励起すると、検出可能な緑色染色は生じず、DU145パネルBまたはLNCaPパネルF対照細胞にカスパーゼ活性が存在しないことが示された。24時間の誘導後、DICによりDU145パネルCおよびLNCaPパネルG細胞が再び確認された。蛍光下の共焦点解析から、DU145パネルD細胞ではhBD1発現の誘導後にパンカスパーゼ活性を示す緑色染色が判明した。しかしながら、hBD1発現を誘導したLNCaPパネルH細胞に緑色染色は生じなかった。したがって、hBD1の誘導後に認められる細胞死はカスパーゼ介在性アポトーシスである。ディフェンシンペプチドの抗菌活性のメカニズムは、孔形成による微生物膜の破壊であることが提示されているPapoandShai,2005。hBD1発現が膜完全性を変化させたか否かを確認するために、EtBr取り込みを共焦点解析により調べた。無傷の細胞は膜透過性であるAOにより緑色に染色され、原形質膜が損傷した細胞のみが、膜不透過性EtBrの取り込みにより赤色に染色された。対照DU145およびPC3細胞はAOで陽性染色され、緑色を発生したが、EtBrでは染色されなかった。しかしながら、DU145とPC3ではいずれもhBD1誘導の結果、24時間で細胞質にEtBrが蓄積し、赤色染色が認められた。48時間までに、DU145とPC3では核が濃縮し、また、それぞれAOとEtBrによる緑色と赤色の染色の共局在により黄色に見えた。逆に、48時間誘導後のLNCaP細胞では膜完全性に変化は認められず、AOによる陽性緑色蛍光が示されたが、赤色EtBr蛍光は発生しなかった。この知見から、hBD1発現に応答する膜完全性と透過性の変化は前立腺癌細胞の初期と後期とで異なることが示される。hBD1およびcMYCの発現レベルの比較:3人の患者からのLCM前立腺組織切片でQRTPCR解析を実施した図32。患者番号1457では、hBD1発現は正常からPINまでの間に2.7倍の減少、PINから腫瘍までの間に3.5倍の減少、正常から腫瘍までの間に9.3倍の減少を示した図34A。同様に、患者番号1457ではcMYC発現も同様の発現パターンに従い、発現は正常からPINまでの間に1.7倍、PINから腫瘍までの間に1.7倍、正常から腫瘍までの間に2.8倍減少した図34B。さらに、他の2人の患者では、cMYC発現において統計的に有意な減少が認められた。患者番号1569では正常からPINまでの間に2.3倍減少したのに対し、患者番号1586では正常からPINまでの間に1.8倍減少し、PINから腫瘍までの間に4.3倍減少し、正常から腫瘍までの間に7.9倍減少した。PAX2阻害後のhBD1発現の誘導:hBD1発現の調節におけるPAX2の役割をさらに調べるために、siRNAを利用してPAX2発現をノックダウンし、QRTPCRを実施してhBD1発現をモニターした。hPrEC細胞をPAX2siRNAで処理してもhBD1発現に影響はなかった図35。しかしながら、PAX2ノックダウンの結果、hBD1の発現は未処理細胞と比較してLNCaPでは42倍増加し、PC3では37倍増加し、DU145では1026倍増加した。陰性対照として、hBD1発現に顕著な影響のなかった非特異的siRNAで細胞を処理した。図35には、βアクチンと比較した発現比としてhBD1発現レベルを示す。星印は、PAX2siRNA処理前の細胞株と比較した発現レベルが統計的に高いことを示しているスチューデントのt検定、p<0.05。PAX2発現の阻害によりp53状態の異なる前立腺癌細胞で代替細胞死経路が生じる。11.1材料と方法細胞株:p53突然変異状態がすべて異なっている表6癌細胞株PC3、DU145およびLNCaPを、実施例1に記載のように培養した。前立腺上皮細胞株hPrECはCambrexBioScience,Inc.Walkersville、メリーランド州から入手し、前立腺上皮基礎培地で培養した。細胞は37°Cで5CO2下に維持した。PAX2のsiRNAサイレンシング:PAX2のsiRNAサイレンシングを実施例2に記載のように実施した。ウェスタンブロット解析:ウェスタンブロット解析を実施例2に記載のように実施した。位相差顕微鏡解析:細胞数に対するPAX2ノックダウンの影響を実施例1に記載のように位相差顕微鏡により解析した。MTT細胞毒性アッセイ:MTT細胞毒性アッセイを実施例1に記載のように実施した。パンカスパーゼ検出:前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出を実施例1に記載のように実施した。定量的リアルタイムRTPCR:PC3、DU145およびLNCaP細胞株におけるPAX2ノックダウン後の遺伝子発現の変化を検証するために、定量的リアルタイムRTPCRを実施例1に記載のように実施した。公開配列からBAX、BID、BCL2、AKTおよびBADのプライマー対を作成した表7。MicroAmpOptical96ウェル反応プレートPEBiosystemsで反応を実施した。60°Cのアニーリング温度を用いて標準条件下でPCRを40サイクルを実施した。指数関数的増幅が開始したサイクル数閾値により定量化を行い、3回反復から得られた値から平均した。メッセージレベルと閾値との間に逆関係が認められた。さらに、GAPDHをハウスキーピング遺伝子として使用し、全cDNAの初期含量を正規化した。相対発現は各遺伝子とGAPDHの比として計算した。すべての反応は3連で実施した。膜透過性アッセイ:膜透過性アッセイを実施例3に記載のように実施した。前立腺細胞におけるPAX2タンパク質発現の解析:PAX2タンパク質発現を、hPrEC前立腺初代培養物ならびにLNCaP、DU145およびPC3前立腺癌細胞株でウェスタンブロット解析により調べた。すべての前立腺癌細胞株でPAX2タンパク質が検出された図36A。しかしながら、hPrECではPAX2タンパク質は検出されなかった。ブロットを剥離し、内部対照としてβアクチンについてリプロービングして均等なロードを確保した。DU145、PC3およびLNCaP前立腺癌細胞株におけるPAX2特異的siRNAによる選択的標的化および阻害後のPAX2タンパク質発現もモニターした。6日間の処理期間にわたって、細胞にPAX2siRNAのプールのトランスフェクションを1ラウンド実施した。PAX2タンパク質は培地単独で処理した対照細胞で発現した。全3種類の細胞株でPAX2タンパク質のノックダウンが認められたことから、PAX2mRNAの特異的標的化が確認された図36B。前立腺癌細胞増殖に対するPAX2ノックダウンの影響:細胞数と細胞生存率に対するPAX2siRNAの影響を光学顕微鏡とMTT解析により解析した。細胞数に対するPAX2siRNAの影響を調べるため、PC3、DU145およびLNCaP細胞株に培地単独、非特異的siRNAまたはPAX2siRNAを6日間トランスフェクトした。培地単独を加えた60mm培養皿では各細胞株が80~90コンフルエントに達した。hPrEC、DU145、PC3およびLNCaP細胞を非特異的siRNAで処理すると、培地単独で処理した細胞と比較して細胞増殖にほとんど、またはまったく影響がないようであったそれぞれ図37A、37C、および37E。PAX2ヌル細胞株hPrECをPAX2siRNAで処理すると、細胞増殖に有意な影響がないようであった図37B。しかしながら、前立腺癌細胞株DU145、PC3およびLNCaPをPAX2siRNAで処理すると、細胞数は有意に減少したそれぞれ図37D、37Fおよび37H。前立腺癌細胞生存率に対するPAX2ノックダウンの影響:2日間、4日間または6日間曝露の後に細胞生存率を測定した。PAX2siRNAで処理した細胞の570~630nm吸光度を未処理対照細胞の吸光度で割った比として生存率百分率を計算した。陰性対照として、陰性対照非特異的siRNAによる各処理時間後または試薬単独のトランスフェクション後に細胞生存率を測定した。PAX2siRNA処理後の生存率百分率を非特異的siRNAで処理後の生存率百分率で割ることにより相対細胞生存率を計算した図38。2日間処理後に、相対生存率はDU145で116、PC3で81、LNCaPで98であった。4日間処理後に、相対細胞生存率はDU145で69、PC3で79、LNCaPで80に減少した。最後に、6日までに相対生存率はDU145で63、PC3で43、LNCaPで44となった。さらに、トランスフェクション試薬単独での処理後にも細胞生存率を測定した。各細胞株は細胞生存率の有意な減少を示さなかった。パンカスパーゼ活性の検出:共焦点レーザー顕微鏡解析によりカスパーゼ活性を検出した。LNCaP、DU145およびPC3細胞をPAX2siRNAで処理し、アポトーシスが活発に生じている細胞でFAM標識ペプチドのカスパーゼとの結合に基づいて活性をモニターした。こうした細胞では緑色に蛍光発光する。培地単独を用いた細胞の解析から、それぞれ生存可能なLNCaP、DU145およびPC3細胞の存在が示される。488nmで共焦点レーザーにより励起すると、検出可能な緑色染色は生じず、未処理細胞にカスパーゼ活性が存在しないことが示されたそれぞれ図39A、39Cおよび39E。PAX2siRNAで4日間処理後に、LNCaP、DU145およびPC3細胞は蛍光下で緑色染色を生じ、カスパーゼ活性を示したそれぞれ図39B、39Dおよび39F。アポトーシス因子に対するPAX2阻害の影響:LNCaP、DU145およびPC3細胞をPAX2に対するsiRNAで4日間処理し、プロおよび抗アポトーシス因子の両方の発現をQRTPCRにより測定した。PAX2ノックダウン後にBADを解析すると、LNCaPでは2倍、DU145では1.58倍、PC3では1.375倍であることが判明した図40A。BIDの発現レベルはLNCaPで1.38倍、DU145で1.78倍に増加したが、PAX2発現の抑制後にPC3でBIDに統計的有意差は認められなかった図40B。抗アポトーシス因子AKTの解析から、処理後に発現はLNCaPで1.25倍減少し、DU145では1.28倍減少したことが判明したが、PC3では何の変化も認められなかった図40C。膜完全性および壊死の解析:LNCaP、DU145およびPC3細胞で共焦点解析により膜完全性をモニターした。無傷の細胞は膜透過性であるAOにより緑色に染色され、原形質膜が損傷した細胞は膜不透過性EtBrの細胞質への取り込みにより赤色に、また、核内におけるAOとEtBrの共局在により黄色に染色された。未処理LNCaP、DU145およびPC3細胞はAOで陽性染色され、緑色を発生したが、EtBrでは染色されなかった。PAX2ノックダウン後、LNCaP細胞の膜完全性に変化は認められず、AOによる陽性緑色蛍光が発生し、赤色EtBr蛍光は発生しなかった。これらの知見から、LNCaP細胞はPAX2ノックダウン後にアポトーシスを生じているが、壊死性細胞死は生じていない可能性があることがさらに示される。逆に、DU145とPC3ではPAX2ノックダウンの結果、細胞質にEtBrが蓄積し、赤色染色が認められた。さらに、DU145とPC3はいずれも核が濃縮し、それぞれAOとEtBrによる緑色と赤色の染色の共局在により黄色に見えた。これらの結果は、DU145とPC3はLNCaPと比較して壊死性細胞死を伴う代替細胞死経路を経ていることを示している。前立腺癌の細胞増殖と生存におけるEngrailed2EN2の腫瘍形成の役割細胞培養:hPrEC細胞ならびにDU145、LNCaPおよびPC3細胞株は、実施例1に記載のように培養した。PAX2およびEN2のsiRNAサイレンシング:低分子干渉RNAノックダウンを、すでに記載されているように実施したGibsonetal.,CancerLett.,2482:251261,2007。簡潔に述べると、ヒトPAX2mRNAアクセッション番号NM003989.1を標的とする4個の相補的siRNAのプールを合成してDharmaconResearch,Lafayette,CO、米国、PAX2発現をノックダウンした。EN2遺伝子サイレンシングを達成するために、ヒトEN2mRNAアクセッション番号NM001427.2を標的とするsiRNA配列配列番号:107、108、110、111、113、114をAmbionAppliedBiosystems,Inc.から購入した。さらに、4個の非特異的siRNAの第2のプールを陰性対照として使用したDharmacon,Inc.。siRNA分子は、製造業者の指示に従ってCodeBreakerトランスフェクション試薬Promega,Inc.を用いてトランスフェクトした。RNA単離および定量的リアルタイムPCR:実施例1に記載のように、RNAを単離し、2段階QRTPCRを実施した。ヒトPAX2Cat.番号PPH06881A、配列番号33および34とEN2Cat.番号PPH00975A、フォワードプライマー5’GTTCGTGGATTCAAAGGTGGCT3’配列番号115、リバースプライマー5’TAAATCCCACACTGGTTCTCCG3’配列番号116のためのプライマー対をSuperArrayBioscience米国メリーランド州から購入した。すでに記載されているように、GAPDHをハウスキーピング遺伝子として増幅し、全cDNAの初期含量を正規化したGibsonetal.,CancerLett.,2482:251261,2007。細胞増殖アッセイ:細胞増殖率は、[3H]チミジンリボチド[3H]TdRのDNAへの取り込みにより測定した。適切な培地を加えた24ウェルプレートに約2.5~5×104個の細胞を播種した。指定濃度のsiRNAの不在下または存在下で細胞を72時間インキュベートした。細胞を同一培地中で37kBq/mL[メチル3H]チミジンに6時間曝露した。接着細胞を5トリクロロ酢酸で固定し、SDS/NaOH溶解用緩衝液で一晩溶解させた。BeckmanLS3801液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定した。すべてのアッセイを3連で3回実施した。ウェスタンブロット解析:ウェスタンブロット解析を実施例2に記載のように実施した。統計解析:対応のないスチューデントのt検定を用いて統計解析を実施した。両側検定によりP値を求め、0.05未満のP値を統計的に有意とみなした。統計学的差異がある場合は星印で示している。前立腺細胞におけるEN2発現の解析:EN2発現を調べるために、前立腺癌細胞株およびhPrEC前立腺初代培養物でQRTPCRを実施した。図41Aに示すように、EN2mRNA発現は、hPrEC細胞レーン1と比較して、DU145レーン2で2.15倍高く、PC3レーン3で30倍高く、LNCaPレーン4で7.8倍高かった。EN2タンパク質レベルのウェスタンブロット解析より、hPrEC細胞図41B、レーン3のEN2タンパク質レベルが低いことが示された。しかしながら、すべての前立腺癌細胞株でEN2が過剰発現した。EN2発現はDU145で最低だったのに対し、PC3細胞で発現レベルが最高であった。EN2発現は、hPrEC細胞と比較して、PC3レーン1で8倍高く、LNCaPレーン2で6倍高く、DU145レーン4前立腺癌細胞で4倍高かった。EN2の低分子干渉RNA介在性抑制:配列番号:107、108、110、111、113または114を有するEN2siRNAでの処理後に、PC3細胞におけるEN2発現のQRTPCR解析をモニターした。この試験により、PC3のEN2siRNA処理の48時間後に63、72時間後に43、96時間後に60に減少していることが判明した図42A。ウェスタンブロット解析を実施し、PC3前立腺癌細胞におけるEN2特異的siRNAによる選択的標的化および阻害後のEN2タンパク質レベルをモニターした。PC3細胞の処理後、タンパク質発現は48時間で70、72時間で20、96時間で26減少した図42B。EN2ノックダウンの効率をPC3図42BおよびLNCaP細胞株図42Cで比較した。72時間のsiRNA処理後に、未処理PC3図42B、レーン1およびLNCaP図42C、レーン3細胞と比較すると、EN2タンパク質レベルはPC3図42B、レーン2で25、LNCaP図42C、レーン4で60減少した。前立腺癌細胞増殖に対するEN2ノックダウンの影響:前立腺癌細胞増殖率に対するEN2発現の治療標的化と阻害の影響を調べるために、PC3およびLNCaP細胞におけるEN2に対するsiRNA処理の72時間後にチミジン取り込みアッセイにより細胞増殖をモニターした。150nMEN2siRNAを用いてPC3細胞を処理した結果、培地単独で処理した細胞と比較して細胞増殖率は20阻害された図43。しかしながら、EN2siRNAを用いてLNCaP細胞を処理した結果、非特異的siRNAで処理した細胞と比較して増殖率は81減少した。陰性対照として、細胞を非特異的siRNAで処理したところ、細胞生存率に有意な変化は認められなかった。前立腺癌におけるEN2発現に対するPAX2ノックダウンの影響:前立腺癌におけるEN2発現に対するPAX2の役割を調べるために、PAX2を特異的に標的とするsiRNAのプールを用いて、PC3およびLNCaP細胞を3日間処理した。前立腺癌細胞株では早ければ2日でPAX2発現のsiRNAノックダウンが生じることがすでに示されているGibsonetal.,CancerLett.,2482:251261,2007。QRTPCR解析から、EN2mRNAレベルは、培地単独で処理した対照細胞と比較して、PC3細胞株において91のダウンレギュレーションを生じたことが判明した図44A。さらに、LNCaP細胞のEN2mRNAは、対照と比較して23抑制された。PAX2siRNAの3日間処理後の前立腺癌細胞株におけるEN2タンパク質発現のウェスタンブロット解析から、EN2発現は、PC3レーン1およびLNCaPレーン3対照と比較して、PC3レーン2で70、LNCaPレーン4前立腺癌細胞株で26減少したことが示された。前立腺癌におけるEN2ノックダウン後のPAX2発現の解析:EN2siRNAでの処理後のLNCaP細胞においてPAX2のQRTPCR解析を実施し、EN2が前立腺癌においてPAX2発現を調整できるか否かを調べた。データから、LNCaP細胞において、PAX2mRNAレベルは48時間で90、72時間で67、96時間で90の有意な減少を示した図45A。さらに、タンパク質レベルでのPAX2とEN2の相関を試験するために、ウェスタンブロット解析を実施した。PAX2タンパク質レベルは、未処理細胞レーン1および非特異的siRNA処理細胞レーン2と比較して、EN2siRNA処理後48時間で50レーン3、72時間で66レーン4、96時間で72レーン5減少した図45B。この実施例は、正常前立腺上皮細胞と比較してヒト前立腺癌細胞においてEN2が過剰発現されることを実証している。調節解除されたPAX2およびEN2の発現が、特に癌細胞の増殖と生存によって最終的に腫瘍進行を促進する可能性があるというのが妥当である。以上の説明は、本発明の実施方法を当業者に教示するためのものであり、本説明を読むことで熟練技能者には明らかとなるようなその明白な修正および変更のすべてを詳述することを意図するものではない。しかしながら、そうした明白な修正および変更のすべては、下記の請求項に規定する本発明の範囲内に含まれることが意図される。本請求項は、文脈に具体的に反対の表示がない限り、そこで意図される目的を達成するのに効果的である任意の配列における請求項に係る成分および手段を含むことが意図される。"