"C型肝炎ウイルスHCVエンベロープ2Ε2糖蛋白質を含有し、前記HCVΕ2が実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2である、組成物。含率が70超の二量体型および/または三量体型、および/または高次型HCVΕ2糖蛋白質を含む、請求項1に記載の組成物。含率80重量基準超の三量体型、または三量体および高次型HCVΕ2糖蛋白質、請求項1または請求項2の組成物。含率が80重量基準超の二量体HCVΕ2糖蛋白質を含む、請求項1または請求項2の組成物。含率が80重量基準超の高次型HCVΕ2糖蛋白質を含む、請求項1または請求項2の組成物。C型肝炎ウイルスHCVエンベロープ2Ε2糖蛋白質を含み、前記HCVΕ2は含率80重量基準超の三量体HCVΕ2糖蛋白質である、組成物。C型肝炎ウイルスHCVエンベロープ2Ε2糖蛋白質を含み、前記HCVΕ2は含率80重量基準超の高次型HCVΕ2糖蛋白質である、組成物。C型肝炎ウイルスHCVエンベロープ2Ε2糖蛋白質を含み、前記HCVΕ2は含率80重量基準超の三量体および高次型HCVΕ2糖蛋白質である、組成物。薬学的にもしくは生理的に許容可能な担体、および/または希釈液を更に含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。アジュバントを更に含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。前記アジュバントがISCOMATRIX商標である、請求項10に記載の組成物。前記HCV感染症の治療または予防における、またはそのための薬剤の製造における、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物の使用。HCV感染症の診断またはモニタリング、または抗HCV治療プロトコールのモニタリングにおける、あるいはそのための診断薬の製造における、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物の使用。前記診断薬が抗体であるか、またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項13に記載の使用。免疫応答を誘発するのに十分な条件下で、請求項1~11のいずれか一項に記載の有効量の組成物を被検対象または患者に一定時間投与するステップを含む、被検対象または患者における免疫応答を誘発するための方法。請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物を被験対象に投与するステップを含む、被検対象をHCV感染症に対して免疫化するための方法。HCVを治療または予防するのに十分な条件下で、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物を被検対象に一定時間投与するステップを含む、被験対象におけるHCV感染症を治療または予防するための方法。実質的に単量体を枯渇化させた有効量のHCVΕ2を被験対象に投与するステップと、生成された抗体を精製するステップと、を含む、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2に対する精製抗体を生成するための方法。請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット、固体基質または半固体基質。HCV感染症の治療または予防について現行の治療および実験的治療の欠点を考えた場合、HCV感染症の治療および予防において効果的な免疫応答を生じることが可能で、しかもHCV感染症を検出し且つ抗HCV治療のモニタリングにおける使用に対応した診断薬を生成することも可能な組成物を提供する必要に迫られているが、このニーズへの対応はまだ為されていない。本明細書全体にわたって、文脈上別途要求されない限り、含むcompriseという語、または有するcomprisesまたはからなるcomprisingなどのバリエーションは、明示された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を包含することを意味するが、他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を一切除外するものではない。本明細書において単数形1つのa、1つのanおよびそのtheは、文脈から特に明示されない限り、複数形の態様を包含する。ゆえに、例えば、1種の組成物acompositionと云った場合は1種の組成物だけでなく2種以上の組成物が包含され、1種の薬剤anagentと云った場合は1種の薬剤だけでなく2種以上の薬剤が包含され、本発明inventionと云った場合は発明の1つおよび複数の態様が包含されるといったようになる。本発明は、HCVΕ2糖蛋白質HCVΕ2中のHCVΕ2実質的に単量体を枯渇化させた、C型肝炎ウイルスHCVエンベロープ2Ε2糖蛋白質を含む組成物を提供する。本明細書において、語句Ε2実質的に単量体を枯渇化させたまたは実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2は、含率が30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1または1未満重量基準のΕ2単量体を含む、組成物を指す。一部の実施形態において、単量体型におけるHCVΕ2の比率は、重量基準で15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5または0.1未満である。実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2糖蛋白質は、組み換え手段または合成手段によって生成される糖蛋白質から誘導され得る。特定の実施形態において、組成物は、含率が1未満または0.1未満の単量体HCVΕ2を有する単量体HCVΕ2を実質的に含まない。関連する態様において、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2組成物は三量体HCVΕ2が富化されており、含率が70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99重量基準超の三量体HCVΕ2糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。別の態様において、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2組成物は二量体HCVΕ2が富化されており、含率が70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99重量基準超の二量体HCVΕ2糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。更なる態様において、単量体を枯渇化させた組成物は三量体または高次型HCVΕ2が富化されており、含率が70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99重量基準超の三量体および高次型HCVΕ2糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。一部の実施形態において、Ε2糖蛋白質は実質的にHCVΕ2三量体である。関連する実施形態において、Ε2糖蛋白質は実質的にHCVΕ2三量体および高次型である。更なる実施形態において、Ε2糖蛋白質は実質的に高次型HCVΕ2である。実質的に三量体HCVΕ2を含む組成物は、含率が80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99重量基準超のΕ2三量体を有する組成物の調製物を含む。実質的に三量体および高次型HCVΕ2を含む組成物は、含率が80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99重量基準超のΕ2三量体および高次型を有する組成物の調製物を含む。実質的に高次型HCVΕ2を含む組成物は、含率が80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99重量基準超の高次型Ε2を有する組成物の調製物を含む。一部の実施形態において、Ε2糖蛋白質は実質的にHCVΕ2二量体である。実質的に二量体HCVΕ2を含む組成物は、含率が約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99重量基準超のΕ2二量体を有する組成物の調製物を含む。一部の実施形態において、Ε2糖蛋白質は実質的にHCVΕ2二量体およびΕ2三量体である。一部の実施形態において、本明細書に記載されている実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を含む組成物は、HCV感染症の治療および/または予防における使用に対応している。本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を含む有効量の組成物を被検対象または患者に投与するステップを含む、被検対象または患者における免疫応答を誘発するための方法も更に提供する。本発明はまた、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を含む組成物を被検対象に投与するステップを含む、被験対象をC型肝炎ウイルス感染症に対して免疫化するための方法も提供する。実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を含む組成物、特に、被験対象をC型肝炎ウイルス感染症に対して免疫化するためのワクチン組成物もまた、本発明によって企図されている。関連する実施形態において本発明はまた、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を含む組成物を被検対象に投与するステップを含む、被検対象におけるC型肝炎感染症を治療するための方法も提供する。これらの実施形態によれば、組成物は一般的に、Ε2特異抗体の生成を含む免疫応答を誘発するのに十分な条件下で投与される。本発明の組成物は、単回投与または単回塗布として投与してもよい。代替方法として、組成物に反復投与または反復塗布を含めてもよく、例えば組成物を2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の回数投与できる。更なる実施形態において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を免疫学的に有効量だけ被験対象に注射するステップと、生成された抗体を単離し精製するステップと、を含む、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2に対する精製抗体を生成するための方法を提供する。別の実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2組成物は、薬学的にもしくは生理的に許容可能な担体、または希釈液を更に含有する。更なる実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させた組成物は、アジュバントを更に含む。1つの例示的な実施形態において、アジュバントはサポニンを主成分とするアジュバントである。関連する態様において、アジュバントはサポニンを主成分とし、コレステロールおよびステロールを更に含む。ISCOMATRIX商標アジュバントはその実例である。別の実施形態において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2に対して産生されるか反応する精製抗体を提供する。一部の実施形態において、生成される抗体は、例えば宿主細胞侵入またはウイルス出芽などのHCVライフサイクルの重要部分を少なくとも部分的に中和する抗体を包含する。本発明は、HCV感染症の治療もしくは予防における、またはそのための薬剤の製造における、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2の使用に更に関する。本発明はまた、HCV感染症の診断もしくはモニタリング、または抗HCV治療プロトコールのモニタリングにおける、あるいはそのための診断薬抗体などの製造における、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2の使用にも供する。他の態様においては、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を使用して抗体、抗原結合性フラグメント、リガンド、ペプチド、有機分子または無機分子などの結合分子を同定するための、スクリーニング法が提供されている。別の態様において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2糖蛋白質を含む、キットまたは固体基質または半固体基質を提供する。本発明のキットまたは基質は、診断、予後、治療的、または予防的用途、更にはHCVΕ2結合分子もしくはHCVレセプタ結合分子の設計および/またはスクリーニングの用途での使用に対応するように企図されている。キットおよび基質はまた、HCV感染症に対する治療プロトコールの効能をモニターするのにも有効である。上述の要約は本発明の全ての実施形態の網羅的な詳説ではなく、またいかなる形であれそう見なすべきでもない。表1は、ワクチン接種を受けたモルモット群1~7、ならびに実施例3に記載されているのと同じものを投与されている各群における抗原種、抗原量、アジュバントおよび被験対象数の一覧である。主題発明は、薬剤に対する特定のスクリーニング法、特定の薬剤処方、および各種医療方法論に限定されるものではなく、それゆえ多様であり得る。別途に定義されている場合を除き、本明細書に使用されている全ての技術用語および科学用語は、本発明が帰属する当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等な材料および方法はどのようなものも、本発明の実施または試験に使用し得る。開業医は、当該技術の定義および用語、ならびに当業者に公知の他の方法について、特にSambrooketal.,1989supra,Coliganetal.,CurrentProtocolsInProteinScience,JohnWileySons,Inc.,1995-1997具体的には1、5および6章、およびAusubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement47,JohnWileySons,NewYork,1999;ColowickandKaplan,eds.,MethodsInEnzymology,AcademicPress,Inc.;WeirandBlackwell,eds.,HandbookofExperimentalImmunology,Vols.I-IV,BlackwellScientificPublications,1986;Jokliked.,Virology,3rdEdition,1988;FieldsandKnipe,eds,FundamentalVirology,2ndEdition,1991;Fieldsetal.,eds,Virology,3rdEdition,Lippincott-Raven,Philadelphia,Pa,1996を参照されたい。本発明は、HCVΕ2糖蛋白質におけるHCVΕ2実質的に単量体を枯渇化させた、C型肝炎ウイルスHCVエンベロープ2Ε2糖蛋白質を含む組成物を提供する。本明細書において、語句Ε2実質的に単量体を枯渇化させたまたは実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2は、含率が30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1未満または1未満重量基準のΕ2単量体を含む、組成物を指す。用語HCVΕ2糖蛋白質、Ε2糖蛋白質、Ε2二量体、Ε2三量体またはΕ2、Ε2単量体、HCVΕ2、およびこれらに類するものは、任意の遺伝子型またはHCVの分離株に由来するΕ2糖蛋白質を包含する。この用語は、例えば、立体配座エピトープおよび/または他のエピトープを認識する1つ以上の抗体によってレセプタ結合を媒介するか中和抗体の結合を媒介する部分、またはΕ1Ε2二量体形成を媒介する部分を含む、全長Ε2糖蛋白質の一部を含めた非天然の改変体を更に包含する。一部の実施形態において、単量体型におけるHCVΕ2の比率は、重量基準で15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5または0.1未満である。実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2糖蛋白質は、組み換え手段または合成手段によって生成される糖蛋白質であり得る。特定の実施形態において、組成物は、含率が1未満または0.1未満の単量体HCVΕ2を有する単量体HCVΕ2を実質的に含まない。更なる態様において、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2組成物は三量体および高次型HCVΕ2が富化されており、含率が70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99重量基準超の三量体および高次型HCVΕ2糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。本明細書において、語句高次型のHCVΕ2糖蛋白質は、4つまたはそれ以上のΕ2蛋白質亜単位を有するΕ2蛋白質の型を指す。そのような形態は、四量体4、五量体5、六量体6、七量体7、八量体8、九量体9、十量体10、十一量体11、十二量体12、十三量体13、十四量体14、十五量体15、十六量体16、十七量体17、十八量体18、十九量体19、二十量体20、二十一量体、二十二量体、二十三量体などとして知られている。関連する態様において、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2組成物は三量体HCVΕ2が富化されており、含率が70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99重量基準超の三量体HCVΕ2糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。別の態様において、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2組成物は二量体HCVΕ2が富化されており、含率が70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99重量基準超の二量体HCVΕ2糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。別の態様において、組成物は実質的にHCVΕ2三量体を含む。更なる態様において、組成物は実質的にHCVΕ2三量体および高次型を含む。他の更なる態様において、組成物は実質的に高次型HCVΕ2を含む。実質的に三量体HCVΕ2を含む組成物は、含率が80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99重量基準超のΕ2三量体を有する組成物の調製物を含む。実質的に三量体および高次型HCVΕ2を含む組成物は、含率が80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99重量基準超のΕ2三量体および高次型を有する組成物の調製物を含む。実質的に高次型HCVΕ2を含む組成物は、含率が80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99重量基準超の高次型Ε2を有する組成物の調製物を含む。調製物中のΕ2単量体、二量体および三量体、ならびに高次型の各々の重量または比率を定量するための方法は記述されているか、または当業者に公知である。一実施形態において、Ε2糖蛋白質は実質的にHCVΕ2三量体または高次型である。三量体および高次型HCVΕ2を含む組成物は、含率が約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99重量基準超のΕ2三量体および高次型を有する組成物の調製物を含む。一部の実施形態において、Ε2糖蛋白質は実質的にHCVΕ2三量体である。実質的に三量体HCVΕ2を含む組成物は、含率が約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99重量基準超のΕ2三量体を有する組成物の調製物を含む。一部の実施形態において、Ε2糖蛋白質は実質的にHCVΕ2二量体である。実質的に二量体HCVΕ2を含む組成物は、含率が約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99重量基準超のΕ2二量体を有する組成物の調製物を含む。一部の実施形態において、Ε2糖蛋白質は実質的にHCVΕ2二量体およびΕ2三量体である。実質的に二量体および三量体型HCVΕ2を含む組成物は、含率が70、75、80、85、90、95、97、または99重量基準超のΕ2二量体および三量体を有する組成物の調製物を含み、および/または含率が30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1未満または1未満重量基準のΕ2単量体を有する組成物の調製物を含む。一部の実施形態において、本発明の組成物は、HCVΕ2糖蛋白質の混合物から単量体を除去するか、二量体および/または三量体のΕ2、および/または高次型を富化することによって得ることができる。一部の実施形態においては、単量体が枯渇化され、および/または二量体および/または三量体および/または高次型が富化されている。別の実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2組成物は、薬学的にもしくは生理的に許容可能な担体、または希釈液を更に含有する。更なる実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させた組成物は、アジュバントを更に含む。免疫原を1種以上のアジュバントとの混合物として投与すれば、その免疫原に対する被験対象の応答を増強し得る。免疫アジュバントは典型的に、次の1つ以上の方法で作用する:1免疫修飾、2拡張提示enhancedpresentation、3CTL産生、4標的化、および/または5デポ生成depotgeneration。例示的なアジュバントとしては、粒状または非粒状アジュバント、完全フロインドアジュバントCFA、アルミニウム塩、乳剤、ISCOMS、LPS誘導体例えばMPLおよびその誘導体例えば3D、ミコバクテリウム誘導蛋白質例えばムラミルジペプチドまたはムラミルトリペプチド、キラヤサボンソウQuillajasaponaria由来の特定のサポニン例えばQS21およびISCOPREP商標サポニン、ISCOMATRIX商標アジュバント、ならびにペプチド例えばサイモシンα1が挙げられる。アジュバントに関する詳細な説明は、CoxandCoulter,AdvancesinAdjuvantTechnologyandApplication,inAnimalParasiteControlUtilizingBiotechnology,Chapter4,Ed.Young,W.K.,CRCPress1992,andinCoxandCoulter,Vaccine153:248-256,1997に見出され得る。医薬組成物は、従来の医薬配合技術に従って好都合に調製される。例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences,18thEd.,MackPublishing,Company,Easton,PA,U.S.A.,1990を参照のこと。これらの組成物は、いずれか1種の活性物質のほか、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、バッファ、安定剤、または当該技術分野において周知の他の材料も含み得る。そのような材料は、無毒性でなければならず、且つ活性成分の効能を妨げるものであってはならない。担体は静脈内、経口または非経口など、投与に望ましい調製物の型に応じて、取り得る型が広範な種類に及ぶ。HCVΕ2糖蛋白質の例示的な型の1つは、遺伝子型のH771aΕ2661のアミノ酸384-661または別のHCV遺伝子型からの対応部分を含む、Ε2糖蛋白質のレセプタ結合部分である。一部の実施形態において、HCVΕ2糖蛋白質はHCVの天然改変体に実質的に類似するアミノ酸配列または構造を含む。例えば、Ε2蛋白質は、当該技術分野において公知の1種以上の分離株のアミノ酸配列例えばJFH-1、Con1、H77cもしくはΕD43分離株に実質的に類似する場合もあれば、遺伝子型1~6の1つによって発現した1種以上のΕ2糖蛋白質、またはこれらのフラグメントに実質的に類似する場合もある。他の実施形態において、HCVΕ2糖蛋白質は、宿主細胞レセプタを結合する天然HCVΕ2糖蛋白質の改変体であり、および/または中和エピトープもしくは立体配座エピトープによって認識される1つ以上のエピトープを含む。改変体の型の1つは、天然株もしくはその器内培養incultureの改変体の切断truncated型またはフラグメントである。例示的なフラグメントは、レセプタ結合ドメインを包含する。他の修飾HCVΕ2糖蛋白質は、変異体、類縁体、または誘導体を包含する。一部の実施形態においては、代替または補完として、HCVΕ2糖蛋白質は1つ以上の可変領域に欠失突然変異などの変異を含む。例示的な突然変異は、内容全体が参照により本願明細書に援用されている国際公開第2008/022401号パンフレットに開示されている。本明細書において断言しているように、3つの可変領域が含まれるか欠失しているΕ2糖蛋白質は、レセプタ結合二量体および/または三量体を形成して、許容される宿主細胞へのウイルス侵入を阻害し得る。一実施形態において、Ε2蛋白質はΕ2661Δ123である本明細書においてΔHVR123は、Δ123、D123、ΔHVR123、D123Ε2661-his、D123Ε2661、Δ123Ε2661およびΔ123Ε2661-hisとも呼ばれている。一部の実施形態において、Ε2661Δ123Ε2はHCVH77cのアミノ酸384~661を含み、このアミノ酸において可変領域1および2、ならびにigVR3は短リンカーモチーフΔHVR123で置換される。本発明の他の実施形態は、HVR1、HVR2またはigVRの任意の組み合わせが欠失しているか短リンカーで置換されたHCVΕ2蛋白質を含む。これらはΔ1;Δ1,2Δl2;Δ2;Δ2,3Δ23;Δ3;およびΔ1,3Δ13と略記することもできる。本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を含む有効量の組成物を被検対象または患者に投与するステップを含む、被検対象または患者における免疫応答を誘発するための方法も更に提供する。実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を含む組成物、特に、被験対象をC型肝炎ウイルス感染症に対して免疫化するためのワクチン組成物もまた、本発明によって企図されている。本明細書においてワクチンという用語は、被験対象における免疫応答を誘導する少なくとも1種の免疫学的に活性な成分のほか、必須ではないが、前記活性成分の免疫学的活性を増強する1種以上の追加成分例えばアジュバントも含み得る、医薬組成物を指す。加えて、ワクチンは医薬組成物に典型的な更なる成分を含んでいてもよい。ワクチンの免疫学的に活性な成分は、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2組成物を含む。用語ワクチンおよびワクチン組成物は、本発明において交換可能に使用されている。本発明において企図されている被験対象はヒトまたは動物であり、実験室または当該技術分野において受け入れられている試験動物または媒介動物を包含する。患者は、治療または予防を要するヒト被験対象を包含する。一部の実施形態においては、実質的に二量体もしくは実質的に三量体HCVΕ2、または二量体および三量体HCVΕ2糖蛋白質の混合物、または三量体および高次型HCVΕ2の混合物、または二量体、三量体および高次型HCVΕ2の混合物、または高次型HCVΕ2を含む、被験対象をHCV感染症に対して免疫化するための組成物、特にワクチン組成物が企図されている。別の態様において本発明は、HCVΕ2糖蛋白質を含む組成物を、ヒトまたはヒト以外の動物被験対象において抗体応答および/または細胞性免疫応答の生成における使用に対応できるよう、実質的に二量体型もしくは三量体型、および/または高次型にて提供する。真核細胞によって発現される組み換えHCVΕ2糖蛋白質は、単量体、二量体、三量体、および高次型の混合物として存在するのが一般的である。HCVΕ2は、真核細胞または原核細胞において発現し得る。真核生物細胞は、当該技術分野において公知の哺乳動物、植物、酵母、および昆虫の細胞を包含する。組み換え蛋白質は、宿主細胞内で蛋白質を発現させるのに十分な一時期にわたって、またはより好ましくは、宿主細胞が成長する培養培地内に蛋白質を分泌させるのに十分な一時期にわたって、宿主細胞を培養することによって生成される。組み換え宿主細胞宿主細胞、細胞、細胞系、細胞培養、および単細胞の実体として培養される原核微生物または真核細胞系を意味する他のそのような用語は交換可能に使用されており、組み換えベクターもしくは他の転写DNAのレシピエントとして使用することが可能であるかまたはそのように使用されてきた細胞を指し、トランスフェクションされた原細胞の後代を包含する。好適な哺乳類の細胞系は、限定はされないが、BHK、VERO、HT1080、293、293T、293F、RD、COS-7、CHO、Jurkat、HUT、SUPT、C8166、MOLT4/clone8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM、骨髄腫細胞例えば、SB20細胞およびCEMX174を包含し、例えば、ATCCから入手可能である。他の宿主細胞としては、限定されるものではないが、例えば、ピキアパストリスPichiapastorisなどの酵母、またはSf9細胞などの昆虫細胞が挙げられる。合成DNAは、好適なプロモータおよび他の適切な転写調節要素を含む発現ベクターへの分子クローニングによって再結合的に発現し、原核生物または真核生物の宿主細胞に転写され、組み換え蛋白質を生成し得る。そのような操作の技術は、Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual2nded..ColdSpringHarbourLaboratory,ColdSpringHarbour,NY,1989;Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPub.AssociatesandWiley-Interscience,NewYork,1988によって記載されている。例えば、酵母における発現の構造物は、好ましくは、関連する転写配列および翻訳調節配列が作動可能に連結された合成遺伝子例えば、GAL10、GAL7、ADH1、TDH3またはPGKなどのプロモータ、およびSセレビシエS.cerevisiaeADH1ターミネータなどの終結配列を含む。酵母は、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、ハンゼヌラポリモーファHansenulapolymorpha、ピキアパストリスPichiapastoris、クルイベロマイセスフラジリスKluyveromycesfragilis、クルイベロマイセスラクチスKluyveromyceslactis、およびシゾサッカロミセスポンベSchizosaccharomycespombeからなる群から選択され得る。また、YeastGenetics:Roseetal.,ALaboratoryCourseManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1990も参照されたい。当該技術分野において公知であるように、核酸分子は酵母における発現のために最適化されたコドンであってもよいSharpandCowe,Yeast,7:657-678,1991を参照のこと。任意の所定の細胞種に適切なベクターおよび制御要素は、当業者が本明細書の教示および当該技術分野において公知の発現ベクターの情報を鑑み選択できる。宿主細胞系におけるクローニングおよび発現に利用可能なベクターは、当該技術分野において周知であり、哺乳類の細胞系におけるクローニングおよび発現用のベクター、または酵母真菌細胞、細菌細胞系おけるクローニングおよび発現用のベクター、ファージおけるクローニングおよび発現用のベクター、ならびに昆虫の細胞系におけるクローニングおよび発現用のベクターを含むが、これらに限定されるものではない。発現蛋白質は、標準蛋白質の精製方法を使用して回収してもよい。翻訳調節要素は、M.Kozake.g.,Kozak,MammGenome,78:563-74,1996;Kozak,Biochimie.,769:815-21,1994;Kozak,JCellBiol,1082:229-241,1989;KozakandShatkin,MethodsEnzymol,60:360-375,1979によって論評されてきた。組み換え糖蛋白質は、例えば、Sambrook,etal.,1989supra、特に13節、16節および17節;Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySonsInc,1994、特に10章および16章;およびColiganetal.,1995-1997supra、特に1章、5章および6章に記載されている標準プロトコールを使用して、好都合に調製できる。ポリペチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、AthertonandShephard,PeptideSynthesis.InNicholsoned.,SyntheticVaccines,publishedbyBlackwellScientificPublications,andinRobergeetal.,Science,2695221:202-204,1995の9章に記載されているような化学合成によって例えば、溶液合成または固相合成を使用して合成できる。本発明はまた、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を含む組成物を被検対象に投与するステップを含む、被験対象をC型肝炎ウイルス感染症に対して免疫化するための方法も提供する。関連する実施形態において本発明はまた、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を含む組成物を被検対象に投与するステップを含む、被検対象におけるC型肝炎感染症を治療するための方法も提供する。本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を含む有効量の組成物を被検対象または患者に投与するステップを含む、被験対象または患者における体液媒介性または細胞媒介性の免疫応答を誘発するための方法も更に提供する。これらの実施形態によれば、組成物は一般的に、Ε2特異抗体の生成を含む免疫応答を誘発するのに十分な条件下で投与される。本発明の組成物は、単回投与または単回塗布として投与してもよい。代替方法として、組成物に反復投与または反復塗布を含めてもよく、例えば組成物を2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の回数投与できる。本発明が思量するワクチン投与レジメンの例は、以下のとおりである:初期ワクチン投与後、被験対象は典型的に2~4週間の間隔例えば3週間の間隔を置いてブーストを投与され、任意選択的に、続いて反復的ブーストを投与される。本発明の特定の実施形態においては、単回投与ワクチンスケジュールが提供される。このスケジュールに従えば、組成物を単回投与するだけでC型肝炎を予防するのに十分であり、初期ワクチン投与後に一切ブーストを必要とせずに済む。一部の実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2に対して生成される抗体は、例えば宿主細胞侵入またはウイルス出芽などのHCVライフサイクルの重要部分を少なくとも部分的に中和する抗体を包含する。本発明は、HCV感染症の治療もしくは予防における、またはそのための薬剤の製造における、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2の使用に更に関する。ヒト化抗体および脱免疫抗体deimmunizedantibodiesもまた、本発明に包含される。用語製造は、産生またはスクリーニングを包含する。別の実施形態において本発明は、実質的に二量体型および/または三量体型、および/または高次型HCVΕ2糖蛋白質を含む組成物の有効量を被検対象または患者に投与するステップを含む、被験対象または患者における体液媒介性または細胞媒介性の免疫応答を誘発するための方法も提供する。関連する実施形態において本発明は、実質的に二量体型および/または三量体型、および/または高次型HCVΕ2糖蛋白質を含む組成物の有効量を被検対象または患者に投与するステップを含む、被検対象におけるC型肝炎感染症を治療するための方法、または被験対象をC型肝炎ウイルス感染症に対して免疫化するための方法を提供する。一部の実施形態において本発明は、i1種以上の二量体もしくは三量体または高次型HCVΕ2型に結合しおよび/またはii単量体HCVΕ2に結合しない抗体または薬剤を選択するステップを含む、治療用抗体または他の治療用結合剤を選択するための方法を提供する。本明細書に用いられている用語有効量は、治療上有効量および予防上有効量を包含し、本発明の組成物を単回投与にて、または連続放出seriesrelease系もしくは徐放系の一部として投与した場合に、一部の被験対象において所望の治療的、予防的、または生理的効力が得られる十分な量を意味する。時には所望の治療効果と共に好ましくない効果例えば、副作用が顕在化することがあり得る。よって、開業医は、適正な有効量を定量する際に潜在的な利益と潜在的リスクのバランスをとる。組成物の正確な所要量は、被験対象の化学種、年齢および全身状態、投与様式、ならびにこれらに類するものに応じて被験対象ごとに異なる。それゆえに、正確な有効量を特定することが不可能な場合もある。ただし、任意の個々の症例における適正な有効量は、当業者がありきたりの技法または実験を使用して定量し得る。当業者であれば、組成物もしくは他の薬剤の前回投与、被験対象のサイズ、被験対象の症状の重篤度、もしくは感染した母集団におけるの症状の重篤度、ウイルス量、および特定の組成物、または選択された投与経路などの因子に基づいて所要量を定量できるであろう。用語治療は、1種以上のHCV症状にあるかまたは進行したHCV症状を起こすリスクもしくはHCV伝播のリスクに曝されている少なくとも一部の被験対象において、測定可能なまたは統計学的に有意な任意の改善を指す。用語防止および予防ならびにこれらに類する用語は交換可能に使用され、今後の感染の防止もしくは減衰、またはHCVに感染するリスクの軽減、またはHCV感染症に伴う病態もしくは病態の徴候の重篤度の緩和もしくは発病の抑制を目的に、HCVに感染したことを知らない被験対象に本発明の組成物を投与することを包含する。ワクチン組成物の投与は、一般に予防を目的としたものである。組成物の予防的投与は、以後何らかの感染症の防止または減衰に役立つ。薬理学的に許容可能な組成物は、レシピエント患者が耐容性を示す組成物である。有効量のワクチンが投与されることが、企図されている。有効量とは、十分な体液性または細胞性免疫を誘導するなど所望の生物学的効力を得るのに十分な量のことを云う。これは、ワクチンの種類、レシピエントの年齢、性別、健康状態、および体重に依存し得る。所望の生物学的効力の例は、無症状化、症状の軽減、組織または経鼻的分泌におけるウイルス力価の低減、C型肝炎ウイルス感染の完全な予防、およびC型肝炎ウイルス感染に対する局部的予防を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明のワクチンまたは組成物が存在することによってレシピエント患者において感染性C型肝炎ウイルス株に対し少なくとも1つの一次もしくは二次の体液性または細胞性免疫応答を増強するかその増強を示す検出可能な生理的変化が起こる結果になった場合には、本発明のワクチンまたは組成物が生理的に有意なものになる。ワクチン組成物は、ウイルス感染症に対する保護を目的に投与される。対照群または一連の患者と比較して統計学的に有意な改善がある場合、予防は絶対的なものである必要はない即ち、防止または根絶が完全なものである必要はない。予防は、C型肝炎ウイルス感染の症状発現の重篤度または速度を低減することだけに限定されてもよい。一実施形態では、感染症の発症前予期される感染症を防止もしくは減衰させるため、または感染症の発症後のいずれかに、本発明のワクチン組成物を被験対象に提供し、それによりウイルス感染症から保護する。一部の実施形態では、被験対象間のウイルス伝播を低減する目的から、本発明のワクチン組成物を感染症の発症の前または後に被験対象に提供する。C型肝炎感染症もしくはHCV感染症に伴う症状の治療または防止を目的に、本発明の組成物を唯一の活性医薬剤として投与してもよくまたは1種以上の薬剤と併用してもよいことが、更に認識されるであろう。本発明の組成物もしくは組成物の組み合わせと併用投与される他の薬剤には、HCV感染によって引き起こされる疾患に対する治療薬、または直接もしくは間接的機序によってHCVウイルスの複製を抑制する治療薬が包含される。これらの薬剤は、限定はされないが、宿主免疫モジュレータ例えば、インターフェロン-α、ペグ化インターフェロン-α、コンセンサスインターフェロン、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、CpGオリゴヌクレオチド、およびこれらに類するもの;イノシン酸デヒドロゲナーゼ例えば、リバビリン、およびこれらに類するものなど、宿主細胞作用を阻害する抗ウイルス化合物;免疫機能を調節するサイトカイン例えば、インターロイキン2、インターロイキン6、およびインターロイキン12;1型ヘルパーT細胞応答の発生を増強する化合物;干渉RNAinterferingRNA;アンチセンスRNA;HCVに対するHCV抗原もしくは抗原アジュバントの組み合わせを含むワクチン;宿主の細胞成分と相互作用し、内部リボソーム導入部位IRESが開始したHCVウイルス複製の翻訳ステップを阻害することによりウイルス蛋白質合成をブロックするか、またはビロポリンviroporinファミリの膜蛋白質例えば、HCVP7、およびこれらに類するものを標的とする薬剤と共にウイルス粒子の成熟および放出をブロックするための薬剤;ならびにウイルス複製に関与するウイルスゲノムの他の蛋白質を標的化することによってHCVの複製を阻害し、および/または他のウイルス標的の作用を妨げる、任意の薬剤もしくは薬剤の組み合わせ例えばNS3/NS4Aプロテアーゼの阻害剤、NS3ヘリカーゼ、NS5Bポリメラーゼ、NS4A蛋白質、およびNS5A蛋白質が挙げられる。更に別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、HCVライフサイクルにおいて標的となる他の阻害剤限定はされないが、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、メタロプロテアーゼ、NS4A蛋白質、NS5A蛋白質、および内部リボソーム導入部位IRESを含むを更に含有していてもよい。投与は一般的に一定時間、Ε2特異抗体の生成を含む免疫応答または細胞性免疫応答を誘発するのに十分な条件下で行われる。免疫原性組成物は、肺経由、経口、静脈内水溶性の場合、腹膜内、筋内、皮下、皮内、髄腔内もしくは坐薬経路、またはインプラント例えば、徐放製剤を使用などの便宜的な方法で投与し得る。投与は全身投与または局所投与であり得るが、全身投与の方が便宜性が高い。他の投与の経路としては、パッチ剤貼付、細胞転写、インプラント、舌下、眼内、局所、経口、直腸、経膣、経鼻、または経皮が企図されている。本明細書において免疫応答は、本発明の組成物の存在に対する身体全体の反応を指し、抗体作製、および組成物に対する免疫の発現を包含する。ゆえに、抗原に対する免疫応答はまた、被験対象において関心のある抗原に対する体液性および/または細胞性免疫応答の発生も包含する。体液性免疫応答は、血漿細胞が生成した抗体によって媒介される。細胞性免疫応答は、Tリンパ球および/または他の白血球によって媒介されるものである。本明細書において抗体価は、被験対象ごとの免疫前試料の希釈率を超える値を生じさせた、免疫後血清の最高希釈率として定義し得る。本発明の実施形態はまた、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2から単離された成分に対する免疫応答を評価するためのアッセイも提供する。アッセイは、抗体応答および遅延型過敏症応答の測定を目的としたアッセイなどの、invivoアッセイを含んでもよい。一実施形態において、B細胞作用のほかB細胞/T細胞の相互作用を測定し得る。抗体応答アッセイでは、抗原チャレンジに続いて、血中の抗体価を比較し得る。これらのレベルは、抗体の種類例えば、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAまたはIgDに応じて数量化できる。また、血液中の抗体およびリンパ球の濃度を抗原性刺激なしで定量して、免疫系の発生を評価することもできる。アッセイはまたinvitroアッセイを含んでいてもよい。invitroアッセイは、細胞が分裂する能力、細胞が他の細胞の分裂を助ける能力、またはリンフォカインlymophokineおよび細胞が他の因子を放出し、活性化マーカーを発現させ、且つ標的細胞を溶解する能力を定量するステップを含み得る。マウスおよびヒトにおけるリンパ球はinvitroアッセイで比較できる。一実施形態において、末梢血液細胞、脾細胞、またはリンパ節細胞などのような類似する源からのリンパ球が比較される。ただし、ヒトおよびマウスの脾細胞における末梢血細胞の非限定例のような異なる源からのリンパ球を比較することも可能である。invitroアッセイでは、例えば、B細胞、T細胞、およびマクロファージの場合細胞を精製してもよいし、または例えば、脾細胞もしくはリンパ節細胞の場合その生来の状態のままにしておいてもよい。精製は、所望の結果を得るための任意の方法であり得る。細胞は、有糸分裂促進因子または特異性抗原を使用して増殖する能力を、invitroで試験し得る。特異性抗原の存在下で細胞が分裂する能力は、混合リンパ球反応MLRアッセイを使用して定量し得る。培養細胞からの上澄み液を試験して、細胞が特異的リンフォカインを分泌する能力を数量化してもよい。培養物から細胞を除去して、活性化抗原を発現する能力を試験することもできる。この試験の実施には、活性化抗原に結合する抗体またはリガンド、および活性化抗原をコードするRNAを結合するプローブの使用に関する非限定例に挙げられているような、何らかの好適な方法を用いることができる。また、一実施形態においては、表現型細胞アッセイを行うことによって、特定の細胞種の頻度を定量できる。末梢血球の計数を行うことによって、血中のリンパ球またはマクロファージの数を定量できる。CD4細胞数およびCD4/CD8比率の定量に関する非限定例に挙げられているように、抗体を使用して末梢血リンパ球をスクリーニングすることによって、或る抗原を発現する細胞のパーセントを定量できる。これらの実施形態によれば、組成物は一般的に、Ε2特異抗体応答または細胞性免疫応答の生成を含めた免疫応答を誘発するのに十分な条件下で、一定時間投与される。本発明の組成物は、単回投与または単回塗布として投与してもよい。代替方法として、組成物に反復投与または反復塗布を含めてもよく、例えば組成物を2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の回数投与できる。更なる実施形態において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を免疫学的に有効量だけ被験対象に注射するステップと、生成された抗体を単離し精製するステップと、を含む、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2組成物に対する抗体を生成するための方法を提供する。別の実施形態において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2に対して産生される精製抗体を提供する。別の実施形態において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させた型HCVΕ2に対して産生される抗体を提供する。一部の実施形態において、抗体は三量体、または二量体もしくは高次型、または三量体および二量体型HCVΕ2糖蛋白質、または三量体および高次型HCVΕ2糖蛋白質に存在するエピトープに特異的であり、単量体、二量体、三量体および高次型HCVΕ2間、または単量体および二量体/三量体型HCVΕ2間で識別され得る。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。更に、抗体は、典型的には当該技術分野の熟練者に公知の基準を用い、診断、予後、治療的、予防的、およびスクリーニングの用途に合わせて選択し得る。用語抗体antibodyおよび抗体antibodiesはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体から誘導される全ての多様な型を包含し、限定はされないが、全長抗体例えば、無傷のFc領域を有する抗原結合性フラグメント、例えば、Fv、Fab、Fab’、およびFab’2フラグメントを含む;ならびに単鎖抗体などの組み換え方法を使用して生成された抗体由来のポリペチドを包含する。本明細書に用いられている用語抗体antibodyおよび抗体antibodiesはまた、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化primatized抗体、または脱免疫抗体deimmunizedantibodyも指すほか、例えばトランスジェニック動物においてまたはバクテリオファージディスプレイを介して生成されるヒト抗体も指す。また、治療的に許容可能な他の型の抗体、およびその抗原結合性フラグメント、例えば、海生軟骨動物cartilagenousmarineanimalもしくはラクダ科Camelidaeまたはそのような抗体を基にしたライブラリから誘導される単一ドメイン抗体も包含し得る。抗体のフラグメント化型または修飾型を選択する際にはまた、フラグメントまたは修飾型が抗体またはフラグメントの半減期に対して受ける何らかの影響に対する配慮を必要とすることもあり得る。一部の実施形態において、抗体は薬学的にもしくは薬理学的に許容可能な担体、希釈液または賦形剤を具備する。他の実施形態において、抗体は診断または予後の目的に合わせて選択される。一部の実施形態においては、抗三量体、または抗二量体もしくは抗高次型HCVΕ2糖蛋白質抗体を具備するキットが提供される。薬学的に許容可能な担体および/または希釈液は、別段有害ではない即ち、それ自体でまたは活性組成物と共に実質的な有害な反応を引き起こす可能性の低い材料からなる賦形薬である。担体は、あらゆる溶媒、分散媒、被覆物、抗菌剤、および抗真菌剤、張度調節のための薬剤、吸収率もしくはクリアランス率増減のための薬剤、pH維持用のバッファ、キレート剤、メンブレン交差剤、または障壁交差剤を包含し得る。薬学的に許容可能な塩は、別段有害でない塩である。薬剤、または薬剤を含む組成物は、薬学的に許容可能な無毒性塩類酸添加塩類または金属複合体などの形で投与してもよい。経口投与の場合、組成物を固体製剤または液体製剤例えば、カプセル、丸薬、錠剤、トローチ剤、粉末、懸濁液、または乳剤に処方し得る。組成物を経口投与の形で調製する際には、経口液体製剤例えば、懸濁液、エリキシル剤、および溶液などの場合は、例えば、水、グリコール類、油類、アルコール類、香料類、保存料、着色剤、懸濁剤、およびこれらに類するもの;または経口固体製剤例えば、粉末、カプセル、および錠剤などの場合は、デンプン、糖、希釈液、造粒剤、潤滑油、結合剤、崩壊剤などの担体、およびこれらに類するものなどのような通常の医薬媒介物であれば、いかなるものも使用できる。固体薬用担体が使用されていることが明らかな場合、錠剤およびカプセルは、投与が容易であるという理由から最も有利な経口投与単位形式である。錠剤は、結合剤例えば、トラガカンタ、トウモロコシ、デンプン、またはゼラチン、崩壊剤例えば、アルギン酸、および潤滑油例えば、ステアリン酸マグネシウムを含有していてもよい。錠剤は、所望により、標準的な技術によって糖衣錠または腸溶錠とすることができる。活性組成物はカプセル化することにより、安定した状態で胃腸管を通過できるようになる。例えば、国際公開第96/11698号パンフレットを参照のこと。非経口投与の場合、組成物を担体に溶解し、溶液または懸濁液として投与し得る。経粘膜送達または経皮的パッチを含む送達の場合、組成物送達の用途には、当該技術上公知の適切な浸透剤が使用される。吸入の場合、送達には乾燥粉末エアロゾル、液体送達系、エアジェット噴霧器、推薬系などの何らかの便宜的な系が使用される。例えば、調製物をエアロゾルまたは噴霧の形で投与してもよい。また、組成物を持続送達または徐放の形で送達してもよい。例えば、持続送達可能な生分解性ミクロスフィアもしくはカプセル、または他のポリマー構成を製剤に混入してもよい。製剤は、薬物動態および生体分布が変わるように修飾し得る。薬物動態の概略説明については、例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences,1990supraを参照のこと。一部の実施形態においては、調製物を脂質単層または二重層例えば、リポソームもしくはミセルに移入してもよい。当該技術分野において公知の標的化治療薬を用い、或る種の細胞または組織に特異的な薬剤を送達することもできる。実際に投与される活性薬剤の量、ならびに投与の速度および時間経過は、疾患の性質および重篤度に依存する。治療の処方、例えば、投与、時間調整などの決定は、一般開業医または専門家の責任の範囲内にあり、典型的には、個々の患者の病態、送達部位、投与方法、および開業医に公知の他の因子が考慮される。技術およびプロトコールの例は、Remington’sPharmaceuticalSciences,1990supraに見出され得る。調製可能な持効性製剤は、免疫応答を誘導するうえで特に好都合である。持効性製剤の例としては、基質が造形物例えば、フィルムまたはミクロ莢膜の形態であるポリペチドを含有する、固体疎水性ポリマーの半透性基質が挙げられる。持効性基質の例としては、ポリエステル類、ヒドロゲル類例えば、ポリエステル繊維2-ヒドロキシエチル-メタクリレート、またはポリビニルアルコール、ポリ乳酸、L-グルタミン酸とエチル-L-グルタミン酸塩とのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸グリコール酸コポリマー、およびポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸グリコール酸などのポリマー類の場合は分子の放出可能期間が100日間にもわたるが、ヒドロゲルによっては蛋白質の放出期間がそれより短いものもある。脂質含量が約30超のコレステロールで、選択された比率が至適な治療用に調整されている、小型約200~800オングストロームのユニラメラ種のリポソームを用いることもできる。蛋白質の安定化は、スルフヒドリル残留物を修飾するステップと、酸性液から凍結乾燥させるステップと、含水量を制御するステップと、適切な添加剤を使用するステップと、特定のポリマーマトリックス組成物を作製するステップと、を介して遂行し得る。invivoでの蛋白質の半減期は、当該技術分野において公知の技術例えば、ポリエチレングリコールPEG基などの他の要素を結合するという手段を含むを使用して延長できる。当該技術分野において開示されているプライムブースト免疫付与化戦略が企図されている。例については、国際公開第2003/047617号パンフレットを参照のこと。ゆえに、組成物は、ワクチン、プライミングまたはブースト剤の形を取り得る。別の態様では、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を使用した、スクリーニング法が提供されている。実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2を含むスクリーニング法は、識別結合分子の同定を意図したものである。結合分子抗体または抗原結合フラグメントなど、配位子、ペプチド、有機分子または無機分子は一般に、当該技術分野において認知されているプロトコールを使用して、単離されスクリーニングされる。本発明はまた、HCV感染症の診断もしくはモニタリング、または抗HCV治療プロトコールのモニタリングにおける、あるいはそのための診断薬の製造における、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2の使用にも供する。本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2糖蛋白質またはそれをコードする核酸を被験対象に投与するステップと、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2に結合可能なとりわけレセプタ結合をブロックできるその被検対象由来の抗体を選択するステップと、を含む、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2組成物に対する精製抗体を生成するための方法を提供する。一部の実施形態においては、ウイルス活性を中和する能力ウイルス感染性、ウイルス出芽またはウイルス量viralloadを低減する能力などについて、抗体または抗原結合フラグメントを試験する。本発明は、推定の相互作用化合物を実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2糖蛋白質に接触させるステップと、推定の相互作用化合物とΕ2組成物との間の相互作用の結合特性、CD81などのHCVレセプタに結合する能力、またはHCVにより結合された他の宿主残基に結合する能力を定量するステップと、を含むスクリーニング方法を思量する。本発明は、被験対象に由来する試料を実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2糖蛋白質に接触させるステップと、試料成分とHCVΕ2糖蛋白質との間の相互作用を定量するステップと、を含む方法を思量する。一部の実施形態においては、様々なHCV遺伝子型からの様々な二量体および/または三量体、または単量体を枯渇化させたΕ2糖蛋白質のアレイを使用してもよい。一部の実施形態において、試料は血液試料などの抗体を含む試料である。一部の実施形態において、試料は感染した被験対象に由来するものである。対照試料には、感染していない個人に由来する試料が包含される。試料は、被験対象のいずれの部分に由来するものでもよい。便宜的な試料としては、血液、血清、血漿、尿、痰、およびこれらに類するものが挙げられる。当業者に公知の好適なアッセイとしては、ELISA、RIA、およびEIAなどのアッセイ、および競合アッセイが挙げられる。被験対象アッセイは、特にセロサーベイランスに有効である。別の態様において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2糖蛋白質を含む、キットまたは固体基質または半固体基質を提供する。本発明のキットまたは基質は、診断、予後、治療的もしくは予防的用途、更にはHCVΕ2結合分子もしくはHCVレセプタ結合分子の設計、および/またはスクリーニングの用途での使用に対応するように企図されている。キットおよび基質はまた、HCV感染症に対する治療プロトコールの効能をモニターするのにも有効である。一部の実施形態において、キットまたは基質は、実質的に単量体HCVΕ2を更に別の部分に含む。実質的に単量体HCVΕ2を含む組成物は、含率が80、85、90、95、97、または99重量基準超の単量体Ε2を有する組成物の調製物を含む。一部の実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2糖蛋白質を含むキットは、ウイルス感染症の診断もしくは予後、病原体モニタリング、またはセロサーベイランスキットに好都合にも使用され、またはそうしたキットにおける使用に対応したものであり、且つ任意選択的にパッケージ、指示書、ならびにバッファ、基質、抗体もしくはリガンド、対照抗体もしくは対照リガンド、および検出試薬などのような他の様々なコンポーネントを具備する。一部の実施形態においては、抗三量体および抗二量体、ならびに抗高次型HCVΕ2特異抗体が使用される。用語単離されたおよび精製されたは、通常その生来状態において単離および精製を伴う成分を、実質的または本質的に含有しない材料を意味する。例えば、単離された核酸分子は、天然状態でその側面に位置する配列から単離された核酸またはポリヌクレオチド例えば、通常はフラグメントに隣接している配列から除去されたDNAフラグメントを指す。特に、単離されたHCVΕ2は、蛋白質をその生来の細胞環境から、および細胞の他の成分との会合から、invitroで単離および/または精製することを含む。限定されるものではないが、単離された核酸、ポリヌクレオチド、ペプチドもしくはポリペチドは、精製により単離された生来の配列を指す場合もあれば、組み換え手段または合成手段によって生成される配列を指す場合もある。一部の実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させたHCVΕ2の精製物は、少なくとも95~99純度である。改変体と云った場合は、要素parts、誘導体、および化学的類似体が包含される。企図される化学的類似体には、側鎖の修飾、合成時の人為的アミノ酸および/またはそれらの誘導体の移入、ならびにリンカーもしくは架橋剤または他の手段の使用によって、とりわけ立体制約因子を課すことが含まれる。以下、非限定例を挙げながら本発明について更に詳しく説明する。実施例に使用されている材料および方法は、下掲のとおりである。蛋白質精製およびサイズ排除クロマトグラフィ:哺乳動物において発現されるΕ2蛋白質3つの別個の分離株から2つの型Ε2糖蛋白質を生成し、3つの可変領域HVR123-hisが欠失した野生型Ε2661-his構造物WT-his、WTΕ2661-hisおよび修正版modifiedversionΕ2661-hisを、293F細胞を使用して哺乳類の発現系にて発現させた。WT-hisは国際公開第2008/022401号パンフレットに記載されている。代替方法として、昆虫系または酵母発現系を使用して、Ε2糖蛋白質を生成することもできる。特に注記がない限り、3つの可変領域が欠失したWTおよび派生型modifiedversionのΕ2661-hisと云った場合は、HCVのH77c遺伝型1a株からのΕ2配列を指す。メーカーの指示書に従い、Ni-MACバッファAで平衡化させたNi-Sepharose6Fast-Flow樹脂GEHealthcareを使用して組織培養上澄み液を精製し、Ni-MACバッファBで結合蛋白質を溶出させた。蛋白質を含有する画分をBradfordアッセイBioRadで検出し、HiPrep26/10DesaltingカラムGEHealthcareおよびAKTAExplorer高速液体蛋白質クロマトグラフィシステムFPLC,GEHealthcareを使用して、リン酸緩衝食塩水1×PBS;10mMのNaPO4、150mMのNaClpH7.3にバッファ交換した。Ε2661/5-hisJFH1株:JFH1株においては余剰な4つのアミノ酸残基に資するインサーションが存在するという理由から、Ε2外部ドメインの端は事実上、残基665に位置するの異なる型を単離するため、AKTAExplorerFPLCシステムを使用し、TSKG3000swXLカラム21.5mm×60cm、TOSOHBiosciences、カラム容量CV200mLを1×PBS中で平衡化させ、分取サイズ排除クロマトグラフィを行った。最大注入容量は2mlであった。装填の前に、メーカーの指示書に従い、10,000のDaltonDa分子量カットオフMWCO濾過ユニットAmiconを使用して精製蛋白質を約10mg/mLに濃縮した。この濃度で蛋白質が溶液から析出したことから、これらの蛋白質の予測等電点PIProtParamを回避するため、バッファがpH7.3~6.8に滴定された。平均流速2ml/分で試料をランrunして、2mlずつの画分を60~160mL収集した。複数のランrunからの画分をプールして0.1~1mg/mL採取した。Waters社製の高性能液体クロマトグラフィシステムHPLC、Alliance、および最大装填容量0.2mLの小型TSKG3000swxlカラムTOSOH、7.8mm×30cm、15mLCVを使用して、分析用サイズ排除クロマトグラフィを行った。最高の解像度が得られるよう、1×PBS中で流速0.25mL/分にて60分間実験を実施した。この方法を使用して、ピーク単量体および二量体画分について室温で72時間にわたって安定性分析を実施し、その間、24時間ごとにランrunをプログラムした0分での標準試料を含む。精製ウシ血清アルブミンおよび卵白アルブミンを0.5mg/mLGEHealthcareにてサイズ標準対照size-standardcontrolとして使用した。NanoDropThermoScientificを使用して吸光度280nmにて蛋白質を定量した。ProtParamExpasyにてアミノ酸配列から定量された理論的な吸光係数εを使用して、濃度を調整した。WTおよびΔ123Ε2661-his蛋白質の4つの別個の画分を単離するため、NiSepharoseHighPerformanceクロマトグラフィを行った。蛋白質を5mlのHisTrapHPカラムGEHealthcareに装填し、20mMのリン酸ナトリウム、0.5MのNaCl、10mMのイミダゾール低UVpH7.4含有の結合バッファに入れた。予備溶出洗浄ステップを20mMのリン酸ナトリウム、0.5MのNaCl、25mMのイミダゾール低UVpH7.4を使用して行い、溶出を20mMリン酸ナトリウム、500mMのイミダゾール低UVpH7.4で行った。続いて、Superdex200pg26/60カラムGEHealthcare上でサイズ排除クロマトグラフィを行った。選択された画分をプールし、0.22μmを濾過した。蛋白質ごとに非分画混合調製物を調製した。その際、上記と同じNiセファロースクロマトグラフィ法を使用したが、サイズ排除は行わなかった。試料をNiセファロースから溶出させた後、HiPrep26/10脱塩カラムGEHealthcare上で直接に脱塩した。細菌において発現される蛋白質残基113~201MBP-LEL113-201間のCD81大細胞外ループLELに連結されたマルトース結合性蛋白質MBPからなるキメラの発現および精製は、前述したとおりであるDrummeretal.,BiochemBiophysResCommun328:251-257,2005;Drummeretal.,JVirol76:11143-7,2002。この二量体型のCD81-LELは、Ε2-CD81の相互作用を詳細に特性評価する目的に使用されてきたもので、生来のCD81と極似の擬態物で且つクローディン-1の第1細胞外ループEC1との相互作用が可能であることが立証されてきたHarrisetal.,JBiolChem285:21092-102,2010ばかりでなく、細胞関連の全長CD81間のホモタイプな相互作用、およびhCD81-LELの結晶構造に見られるホモ二量体を反映するものでもある。CD81MBP-LEL113-201WTおよびF186S形質転換BL21DE3細胞Invitrogenは、塩類およびアンピシリンを補給したテリフィックブロスTB中で生育された。0.1mMのイソプロピルβ-D-I-チオガラクトピラノシドIPTGを用い室温で4時間蛋白質発現を誘導し、細胞を回収し、洗浄して、-80°Cで保存した。可溶蛋白質をSバッファのソノポレーションで単離し、20,000xgで清澄化し、0.45umフィルターに通して濾過した。メーカーの指示書に従い、アミロース樹脂NewEnglandBiolabsを使用して蛋白質をアフィニティ精製した。10mMのマルトースに溶出させた蛋白質陽性画分を、ブラッドフォードアッセイBioRadで定量した。AKTAFPLCを使用し、Superdex200pg16/20カラムGEHealthcareをSバッファで平衡化させて、サイズ排除クロマトグラフィを行い、二量体および単量体蛋白質を単離した。HRSuperdex200カラムGEHealthcareおよびAKTAFPLCを使用した分析用サイズ排除クロマトグラフィで、単一の二量体ピークの単離を確認した。30,000DaMWCO濾過ユニットAmiconを使用して蛋白質を濃縮し、上述したように定量した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGE着色済みPrecision-Plusサイズ標準マーカーを使用して、プレキャスト4~12のNu-PAGENovexで、精製Ε2661-his蛋白質を分析した。必要に応じて蛋白質を非還元または還元条件に置き、クーマシーブリリアントブルー溶液0.1w/vクーマシーブリリアントブルーR-250Bio-Rad、5v/v氷酢酸、50v/vメタノールで染色して可視化した。ゲルを10v/vメタノール、および10v/v酢酸で脱色し、OdysseyLI-COR蛍光スキャナおよび定量ソフトウェアでクーマシー染色蛋白質の移行を分析した。10μlの4X還元/非還元試料バッファInvitrogenに添加された各HCV-His改変体3μgずつを使用して、WTおよびΔ123Ε2661-his蛋白質の4つの別個の画分および非分画の混合物を分析した。試料を70°Cで3分間加熱して、4~12のBis-Tris-NuPAGESDS-PAGEゲル上に載せた。還元ゲル用に、500ulのNuPAGE酸化防止剤Invitrogen,NP0005をゲルタンクの中心成分centrecomponentに添加してから、200vを印加した。ウエスタンブロット分析4X還元試料バッファInvitrogenに添加された各HCV-His改変体0.5μgずつを使用して、WTおよびΔ123Ε2661-his蛋白質の4つの別個の画分および非分画混合物を分析した。前述したように、還元SDS-PAGEを行った。その後、蛋白質を1時間の湿潤転写wettransferによってPVDFメンブレンに転写した。メンブレンを2スキムミルク含有のPBSで一晩ブロックした。一次抗体を1スキムミルク含有の0.05TBSに1:1000Penta-HisおよびΕ2の希釈率で添加した。0.05TBSで10分ずつ3回洗浄を行った。ヒツジ抗マウスIgGHRPの二次抗体Milliporeを1スキムミルク含有の0.05TBSに1:2000の希釈率で添加した。0.05TBSで10分ずつ3回洗浄を行った。メーカーの指示書に従い、ECLPlusWesternBlottingDetectionReagentGE,ProductcodeRPN2132をメンブレンに塗布し、バンドを520nmにて可視化した。マススペクトロメトリ分析MALDI-TOF-MS:マトリックス支援レーザー脱離イオン化法MALDI飛行時間型TOFマススペクトロメトリMSを使用して、マススペクトロメトリ分析を行った。メーカーの指示書に従い、MALDI-TOF-MS分析前にZipTipMilliporeを使用して、単量体および二量体Ε2661-his蛋白質WTおよびΔHVR123を精製した。バイオセンサー分析および評価全ての実験を、Biacore2000ユニットGEHealthcareを使用して行った。蛋白質リガンドを10mMの酢酸ナトリウムpH4.2にバッファ交換した後、アミンカップリング法でCM5チップGEHealthcareに固定し、約800の応答単位RUを得た。固定化は1×HBS-Nバッファ0.01Hepes、0.15MのNaCl、3mMのEDTA中で行った。あらゆる実験において、前述のフローセル内で陰性対照リガンドを固定したか、または、代わりに、陰性対照検体注射剤を使用して非特異的結合を減算できるようにした。速度実験をHBS-EPバッファ0.01Hepes、0.15MのNaCl、3mMのEDTA、0.05のTween20中で流速10uL/分にて行った。蛋白質検体を4~5回の連続2倍希釈serialtwo-folddilutionでHBS-EPに溶かし、開始濃度を0.1mg/mLとしてシステムに注入した。注入を250秒間行い、会合速度を得て、600秒間解離させた。濃度精度が保証されるように、中点濃度にて独立したローディングコントロールを含めた。各サイクル間で流速100uL/分にて再生成を行い、100mMのリン酸に2つの15uLパルスを含めた。BIAevaluationソフトウェアGEHealthcareを使用して、平衡熱力学に基づく3つの理論的結合モデルに従い、未加工のバイオセンサーデータに対して大域的適合を行った。注目すべきことに、バックグラウンド減算後は、いずれの未加工データにもバルク屈折率効果RIが観測されなかった。このため、RIは、適合時に定数ゼロ値に設定された。それぞれの反応スキーム内で、成分AおよびBはそれぞれリガンドおよび検体を表す。1:1ラングミュア結合モデル。式中、kaは順方向でkdは逆方向である。KD=kd/ka検体とリガンド間の会合速度ka=1/Msは正反応を表し、モル検体濃度Mおよび秒単位の時間sの関数である。解離速度kd=1/sは、時間に相関するが濃度には依存しない逆反応を表す。平衡解離定数、即ちモル単位MのKDは、解離速度kdを会合速度kaで除算することによって計算できる。二状態結合立体配座変化モデル。式中、ka1は順方向でkd1は逆方向である。式中、ka2は順方向でkd2は逆方向である。KD=kd1/ka1×kd2/ka2このモデルは、上述した1:1の結合相互作用を一次会合速度ka1=1/Msおよび解離速度kd1=1/sで記述する、2つの反応速度式を生成する。二次会合速度ka2=1/sおよび解離速度kd2=1/sは、検体とリガンドとの間の相互作用時に発生する立体配座変化のキネティクスを表す。この相互作用は、時間に相関するが検体濃度には依存しないものとして記述される。全般的なKD値は、一次方程式および二次方程式によって生成されたKD値を乗算することによって得られる。二価検体モデル:式中、ka1×2は順方向でkd1は逆方向である。式中、ka2は順方向でkd2×2は逆方向である。KD=n/aこのモデルは、上述した1:1の結合相互作用を一次会合速度ka1=1/Ms×2および解離速度kd1=1/sで記述する一方、2つの利用可能なリガンド結合部位が反映されるように会合速度kaを2倍に乗算する、2つの反応速度式を生成する。二次会合速度ka2=1/RUsは、応答単位RUおよび秒単位の時間sの関数として計算される。2つの利用可能なリガンド結合部位が反映されるように、二次解離速度kd2=1/Ms×2を2倍に乗算する。特に、一価結合および二価結合の次数はそれぞれの濃度で異なることから二価結合モデルはアフィニティ定数KDを生成できず、その結果、解離速度kdが濃度非依存ではなくなる。センサーチップによって検出された屈折率の変化が、チップ上に吸収される質量の変化応答単位RUで測定されると比例する場合、各リガンドの検体結合能Rmaxの理論的最大数を以下の方程式を使用して計算した。Rmax=検体質量MW/リガンド質量MW×RL×S式中、RLは固定されたリガンドのレベルCD81-LEL二量体RU、Sは相互作用の化学量論比であり、それによって、分子量、RUおよび結合速度の関係を記述する。理論的Rmaxは多くの場合、アミンカップリングなどの非特異的な固定化法を使用するときは特に、固定されたリガンドの官能性/有効性が損なわれるのが一般的であるため、実験的Rmaxを超える。実験的Rmaxを直接使用して相互作用システムのKDを定量し得るが、チップを飽和させるには大量の検体が必要とされ、しばしば定量が困難であるため、代わりに、上記のような複数の検体濃度にて会合センサーグラムの大域的適合によって、実験的RmaxおよびKDが予測される。動力学解析にはKD濃度の0.1~10倍が至適である。直接結合directbindingエンザイムイムノアッセイ。96ウェルMaxisorb酵素結合免疫吸着プレートNalgeNuncを、4°Cにて一晩16時間、PBSで希釈した0.5g/mlのスノードロップGalanthusnivalisレクチンSigmaで被覆した。次いで、レクチンを除去して、未被覆部位をBSA10PBS10mg/mLのBSASigma含有PBSで室温にて1~2時間ブロックした。その後、0.05のTween20PBST含有のPBSで希釈した2μg/mlの組み換えΕ2蛋白質を添加して、室温にて1時間インキュベートした。続いて、プレートをPBST中で4回洗浄した。続いて、モルモット血清を含むBSA5PBST5mg/mLのBSA含有PBSTの連続希釈液を、スノードロップGalanthusnivalisレクチンで被覆したプレートに結合されたΕ2に適用し、室温にて2時間インキュベートした。メーカーの指示書に従い、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体ウサギ抗モルモット免疫グロブリンDAKOBSA5PBSTで1:1000に希釈を使用して結合抗体を検出し、テトラメチルベンジジン基質Sigmaで現像させた。結果として得られた吸光度値光学密度をFluostarBMGtechnologies上で450nm~620nmバックグラウンドにて読み取った。CD81阻害アッセイ概略説明すると、96ウェルMaxisorb酵素結合免疫吸着プレートNalgeNuncを、5μg/mLの二量体CD81MBP-LEL113-201を含有するPBSで被覆し、4°Cで16時間インキュベートした。MBP-LEL113-201を除去した後、BSA10PBS10mg/mLのBSASigma含有PBSで37°Cにて2時間ブロックし、非特異的な結合を減少させた。続いて、プレートをPBST0.05のTween-20Sigm含有PBS中で4回洗浄した。免疫血清を含むBSA5PBST5mg/mLのBSA含有PBSTの連続希釈液をH77cまたはJFH1WTΕ2661-his蛋白質のいずれか50ngと混合してから、MBP-LEL113-201で被覆されたイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε2661-hisを、ウサギ抗his抗体RocklandImmunochemicalsを使用して検出した。PBSTで更に洗浄した後、メーカーの指示書に従い、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体ウサギ抗モルモット免疫グロブリンDAKOBSA5PBS/Tweenで1:1000に希釈を使用して、MBP-LEL113-201に結合された残基Ε2複合体を検出し、テトラメチルベンジジン基質Sigmaで現像させた。結果として得られた吸光度値光学密度をFluostarBMGtechnologies上で450nm~620nmバックグラウンドにて読み取った。各血清試料について80阻害力価を計算した。HCVpp中和アッセイpNL43.LUC.R-E、および非機能的nonfunctionalΕ1Ε2空をコードするpcDNA4HisMaxベクターまたはH77cpΕ1Ε2ベクターDrummeretal.,FEBSLett546:385-90,2003のいずれか各1μgでHEK293T細胞をコトランスフェクションした。トランスフェクション後72時間目に、HCVppを含む培養液上清を収集して濾過した0.45μm。モルモット血清の連続希釈液をH77cHCVppウイルスと共に37°Cで1時間インキュベートしてから、4つに分注してquadruplicate、前日に48ウェル組織培養プレートNunc,Nalge内に単層で3×104細胞/ウェルで播種しておいたHuh7.5細胞に添加した。4時間のインキュベーション37°C、5のCO2後、細胞をPBSで洗浄し、培地を交換した。更に3日間インキュベーション37°C、5のCO2中した後、細胞を溶解して、ルミネセンスオプティクスluminescenceoptics搭載のFluostarBMGlabtechnologiesでルシフェラーゼ活性をアッセイした。HCV細胞培養由来ウイルスHCVcc侵入、侵入阻害、および中和アッセイ。前述したように、Gaussiaルシフェラーゼ遺伝子を含む感染性J6/JFH1キメラ遺伝子型2aゲノムをコードするプラスミドDNAからHCVRNAをinvitroで転写した。感染を消失させるGND変異を含む同じプラスミドを、陰性対照として含めた。T7Megascriptキットを使用して、XbaIでの消化により線状化したDNAプラスミドを転写した。続いて、DNA鋳型をDNaseIと共にインキュベートして除去し、フェノールクロロホルム法を使用して、増幅されたRNAを析出させた。RNAを定量し、1アガロース-ホルムアルデヒドゲルで撮像した。メーカーの指示書に従い、DMRIE-CInvitrogen試薬を使用してRNAをHuh7.5細胞単層中にトランスフェクションし、72時間後に、HCVccを含有する上澄み液を回収した。上澄み液を清澄化して、-80°Cで保存した。HCVcc感染力価を限界希釈アッセイTCID50Lindenbachetal.,Science3095734:623-626,2005で定量した。概略説明すると、ウイルス株を連続希釈し、96ウェルのディッシュに3×103/ウェルで蒔かれた細胞に適用した。感染後72時間目に細胞を1×PBSで洗浄し、抗FLAG抗体で感染した細胞が検出されるのに先立って、氷冷メタノール中で固定した。PBSTで1:3に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと共役したヤギ抗マウスポリクローナル抗体を使用して結合抗体を検出し、室温にて1時間インキュベートした。続いて、細胞をPBSで2回洗浄し、PBSTで1回洗浄した。3,3’-ジアミノベンジジンDAB基質を添加して感染した細胞を可視化し、室温にて5分間インキュベートした。その後、細胞をPBSで2回洗浄し、乾燥が回避されるようにPBSバッファ50μlを細胞に添加した。細胞を顕微鏡で可視化し、陽性ウェルを計算した。TCID50をリード-ミュンヒReedandMuench,Asimplemethodofestimatingfiftypercentendpoints,TheAmericanJournalofHygiene27:493-497,1938を使用して計算した。リード-ミュンヒReed-Muench法では、50の感染を生起する正確な希釈率を計算するために、次の方程式を用いる。LogTCID50=log50超の希釈率-PD×log希釈比HCVcc中和アッセイの場合、モルモット血清の連続希釈液100ulを10ウシ胎仔血清含有のDMEMで調製し、非必須アミノ酸DMFNEAAを100ulのHCVccウイルスに添加し、室温にて1時間インキュベートしてから、前日に96ウェル組織培養プレートに8×103細胞/ウェルで播種しておいたHuh7.5細胞に添加した。4時間後に、細胞から抗体/ウイルスの混合物を除去して、PBS中で3回洗浄して、500uLのDMFNEAAで置き換えた。感染後44時間目に、ウミシイタケRenillaルシフェラーゼキットPromegaと、ルミネセンスオプティクスluminescenceoptics搭載のFluostarBMGlaboratoriesとを使用して、組織培養上澄み液におけるルシフェラーゼ活性を定量した。実施例1Ε2661-hisWTおよびΕ2コアドメイン糖蛋白質の単離および特性評価Ε2661-his蛋白質H77c、Con1およびJFH-1分離株由来のWTならびにΔHVR123の両方の大量調製物を293F細胞にて発現させ、ニッケルアフィニティクロマトグラフィを使用して分泌された蛋白質をC末端ポリヒスチジンタグを介して精製した。cDNAの調製は、Con1Ε2HCVCon1ポリ蛋白質残基384-661;GenBankアクセッション番号AJ238799およびJFH1Ε2HCVJFH-1ポリ蛋白質残基384-665;GenBankアクセッション番号AB047639をコードして行われた。単量体化学種のWTおよびΕ2コアドメイン蛋白質を単離するため、分取グレードの高解像度サイズ排除クロマトグラフィを行った図1。発現プロファイルΕ2661/5-his全体で50画分を複数のランrunから収集し、対応する画分をプールした。更なる特性評価のために、Ε2661/5-his単量体、二量体および高次分子量ショルダーにまたがる約20中央画分0.1~1mg/mLの蛋白質を含むを単離した。図2~4に示すように、各3つの分離株のWT、ΔHVR123に対する分析用サイズ排除クロマトグラフィにおいて、ピーク画分の単離が単量体ピークおよび二量体ピークを表していることが確認されただけでなく、ショルダー内部の3つ目の別個のピークが三量体化学種を表しているらしいことも確認された。分析ゲル濾過カラム上で単一欠失ΔHVR1、ΔHVR2ΔigVR、二重欠失ΔHVR12、ΔHVR23、ΔHVR13または三重欠失ΔHVR123、Ε2の可変領域の欠失を含むH77cΕ2661-hisのニッケルアフィニティ精製型を分析し、無傷のH77cWTWTΕ2661-hisと比較した。Ε2661-hisの単量体、二量体、三量体、および高分子量型を裏付ける証がΕ2661-hisの全ての型に含まれていることは、結果から明らかである。分析用サイズ排除クロマトグラフィを使用した安定性分析から実証されたように、室温にて72時間にわたって単量体化学種または二量体化学種の分解は検知できなかったか、または高次型への自然発生的な会合は存在しなかったデータ不図示。Con1およびJFH1Ε2661/5-his蛋白質を同様に精製し、推定の単量体、二量体、および三量体に対応する個々のピークの分析的ゲル濾過を誘導した。図6~8においてH77c、Con1およびJFH-1WTA、ならびにΔHVR123BΕ2661-his蛋白質に関して示すように、非還元条件下および還元条件下で各画分についてSDS-PAGE分析を行った。高次三量体および二量体蛋白質の大部分がジスルフィド結合されていたが、還元剤で処理された後は単量体に移行した。また、還元SDS-PAGEによって、H77c誘導WT画分13~23全体で約100~150kDa、55kDa、および45kDa間を移行している更に他の化学種が検出されたことから、これらの型は極めて混成的であることが認められた図6Aの下側パネル。ΔHVR123画分においては、画分15~18全体で100kDa、45kDa、および40kDaにて移行する化学種がほかにも観測された。蛋白様化学種が小型化されたことは、高次分子量画分内のΕ2661-his分子の一部が、切断truncated型Ε2661-hisおよび/またはN-結合型グリコシル化によって差次的に修飾されたΕ2661-hisと共に、異常なジスルフィドを形成してしまうことを示唆している可能性がある。また、分泌された他の蛋白質が非変性条件nativecondition下でΕ2661-hisと共精製され、2661-hisと共に異常なジスルフィドを形成した可能性も想定し得る。より高分子量の化学種は、酸化されたままの二量体Ε2661-his型を表している可能性が高いが、生合成中にΕ2661-his分子と共に異常なジスルフィドに関与した他の高分子量蛋白質が分泌された可能性があることも表し得る。同様な移行プロファイルは、Con1およびJFH1H77cWTA、ならびにΔHVR123BΕ2661-his蛋白質の個々の画分に収集された蛋白質において観測された図7および8。非還元条件下および還元条件下で、H77cWTおよびΔHVR123Ε2661-his蛋白質の3つの別個のピークの平均分子量を定量した。実施例2組み換えCD81へのΕ2661-his蛋白質の結合に関する動力学解析H77c、Con1およびJFH1分離株由来のWT蛋白質およびΔHVR123Ε2661/5-his蛋白質の両方の高純度且つ安定な単量体試料を正常に単離した後、MBP-LEL113-201への結合の比較動力学解析を行った。二量体MBP-LEL113-201WTをアミンカップリングを介してセンサーチップに固定し、MBP-LEL113-201F186S変異体を先行するまたはリファレンスフローセルに固定して、非特異的結合を減算できるようにした。センサーチップによって検出された屈折率の変化は、チップに吸収された質量の変化と比例し、それゆえに、応答単位RUの増加/減少は、固定されたリガンドと相互作用する検体の会合/解離を表す。これを更に調査するために、H77c、ConおよびJFH1分離株由来の、WTならびにΔHVR123の単量体、二量体および三量体試料を表す様々な画分間でバイオセンサーを使用した動力学解析技術を実施した。図9においてH77cに関して示したように、MBP-LEL113-201F186S対照を含むをチップに固定し、Ε2661-his蛋白質を数とおりの濃度で注射して、BIAevaluationソフトウェアで大域的適合を有効にした。適合ごとに最良適合モデルを最低Chi2値で定量して最小残差を観測した。WT二量体のRmaxが予測値を下回っていることは、この調製物の約半分が作用しない可能性のあることを示唆する。二量体WTおよびHVR123H77cΕ2661-his蛋白質は両方とも、二価検体モデルが好ましいものであることを示した。1:1ラングミュア結合モデルもまた、各蛋白質によって生成されたバイオセンサー曲線に対して良好な適合を示したことから、KD値を推定する目的に使用できると云える。図10に示す単量体、二量体および三量体Ε2661-his蛋白質の全てのKD値は、高次分子量型がMBP-LEL113-201と結合していたことを確証するものである。単量体蛋白質に二状態結合立体配座変化を用い且つ二量体/三量体蛋白質に1:1結合を用いた最良適合データから明らかとなったように、H77cにおいて二量体/三量体蛋白質のCD81に対するアフィニティ低い方のKD値が約10倍高い原因として二価相互作用が最も考えられる図10。Con1およびJFH-1は、似た傾向を示している図10。二量体のH77cΔHVR123Ε2661-his蛋白質は、CD81に対するアフィニティがWTに比べて約2倍大きい。実施例3モルモットにΔ123Ε2661-hisの単量体、二量体および混合蛋白質をワクチン接種する。HCV糖蛋白質Ε2レセプタ結合ドメインΕ2661の組み換え型から3つの全ての可変領域を欠失させた結果、誘発された交差中和抗体の平均力価は、マウスの無傷Ε2661-his蛋白質によって誘発されたものよりも高いことが実証された。大型の非近交系動物モデルにおいてΔ123Ε2661-his-his蛋白質に対する反応を定量するために、H77cΔ123Ε2661-his組み換え抗原で免疫されたモルモットで用量反応実験を行った。ゲル濾過クロマトグラフィで観測されたΕ2661-hisのいくつかの型の機能的有意性を、ワクチン接種用の単量体および二量体型Ε2661-hisを分離して調査した。抗原がワクチン調製物の免疫原性に影響するかどうかを判断するために、3週間間隔で30μgまたは100μgの抗原を含有するISCOMATRIX商標アジュバントを用い、モルモット4匹ずつの各群に3回ワクチン接種した表1。その後、モルモットを出血させて、血清を-80°Cで保存した。ニッケルアガロースアフィニティクロマトグラフィで抗原を精製し、単量体、二量体および高分子量型Ε2の混和物混合物を得た。TSK3000swカラム上で様々な型をゲル濾過によって分離した。マススペクトロメトリおよび沈降平衡によって単量体および二量体型の分子量を確認した。実施例4単量体のΔ123Ε2661-hisを示す相同平均抗体価は、混合型および二量体型と比べて弱免疫原性であるエンザイムイムノアッセイで、相同免疫化homologousimmunizingH77cΔ123Ε2661-his抗原を結合する能力についてモルモット血清を試験した。Δ123Ε2661-hisでワクチン接種されたモルモットにおいて抗体が相同免疫化homologousimmunizing抗原を認識する能力を有するようになったことが、結果から判明した。ワクチン群の間で、強力な用量特異的効果および抗原特異的作用が観測された。全ての場合において、100μgの蛋白質は、30μgのものよりも免疫原性が高かった。なお、混合型のΔ123Ε2661-hisでワクチン接種されたモルモットが誘発した抗体の平均力価は、二量体または単量体抗原でワクチン接種されたモルモットと比較して有意に高く、単量体群において観測された抗体平均力価が最も低かった図11。100μg混合群において平均抗体価は30μg混合群よりも約0.5log高く、二量体群よりも1log高く、単量体群よりも2log高かった図12。実施例5WTおよびΔ123型Ε2661-his混合物への免疫血清の結合直接結合directbindingエンザイムイムノアッセイで、WTおよびΔ123Ε2661-his混合物に対する免疫血清の反応性を調べた。データが示しているように、全ての動物によって誘発された、WTおよびΔ123抗原に対して反応する能力を有する抗体の平均力価は、有意なものであった。ただし、Δ123に対する抗体反応性の平均力価は、WTΕ2661-his蛋白質と比べて5~10倍高かった図13。誘発された抗体価は用量に関連し、用量の効果は100μg増大した。加えて、混合物および二量体型Ε2661-hisを投与されている動物によって誘発された抗体の平均力価は単量体蛋白質でワクチン接種された動物と比べて高かったことから、免疫原の型が抗体の力価に影響したと云える。実施例6免疫血清によって細胞表面レセプタCD81へのΕ2の結合を阻止する免疫血清がHCV糖蛋白質Ε2からCD81への結合を阻止する能力は、免疫血清がHCVを標的細胞に侵入できないように阻害する能力の主要な指標であると考えられている。固相エンザイムイムノアッセイでは、免疫血清がCD81MBP-LEL113-201の大細胞外ループの組み換え型とWTΕ2661-his蛋白質との間の相互作用をブロックする能力を調べた。免疫血清の連続希釈液をH77cまたはJFH1WTΕ2661-his蛋白質のいずれか100ngと混合してから、MBP-LEL113-201で被覆されたイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε2661-hisを、抗his抗体を使用して検出した。各血清試料について80阻害力価を計算した。これらは、図14においてドット-プロットとしてプロットされている。データが示しているように、Δ123蛋白質の混合物でワクチン接種された動物によって誘発された平均力価が最も高く、Ε2-CD81阻害抗体は、相同H77cおよび非相同JFH1Ε2661-hisの両方がCD81に結合するのを阻害できた。二量体型Ε2661-his蛋白質でワクチン接種された動物において誘発されたΕ2-CD81阻害抗体の平均力価は低く、各群内の少なくとも1つの動物は、80阻害率に達し得る抗体を誘発することに失敗した。Ε2-CD81阻害抗体の平均力価は、単量体Ε2661-hisでワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も低かった。これは、二量体型WTおよびΔ123Ε2661-hisの両方がΕ2-CD81阻害抗体の誘導において単量体Ε2661-hisよりも優れることを実証している。ただし、Ε2661-his蛋白質の混合物の内部に存在するΕ2661-hisの型は、二量体Ε2661-his単独よりも優れる。実施例7H77cHCVppの相同中和homologousneutralizationH77cΕ1Ε2糖蛋白質を含有するレトロウイルスの疑似型粒子を使用して、免疫血清が相同中和homologousneutralizationを媒介する能力を定量した。加熱により不活性化された免疫血清の連続希釈液を、HCVppと予混合してからHuh7.5細胞に4時間添加した。洗浄後に、更に3日間にわたって細胞をインキュベートし、細胞溶菌液におけるルシフェラーゼ活性を数量化した。結果から、HCVppの中和を媒介する能力は用量および抗原依存的でもあったことが判明した図15。100μgの抗原混合物を投与されたモルモットが誘発したNAb平均力価は、100μgの単量体、30μgの二量体または100μgの二量体について観測された同値の約10倍であった図16。30μg単量体を投与されたモルモットは、HCVppを中和する能力が限定されていることが判明した。その曲線は、抗原なしの対照群に類似している図15。実施例8細胞培養由来J6-JFH1の交差中和を免疫血清によって媒介する免疫血清の連続希釈液を、J6-JFH1細胞培養由来HCVと混合してHuh7.5細胞に添加した。上澄み液のルシフェラーゼ活性を、感染症の44時間後に数量化した。結果を図17に示す。100μgの抗原混合物を投与されているモルモットは、血清希釈率1/40にて侵入阻害率が90に達したことから、交差中和を媒介する能力が強力であることが判明した図17。100μgについて観測された50中和平均力価は、30μgおよび100μg単量体群よりもおよそ2log高く、二量体群および30μg混合群よりも1log高かった図18を参照のこと。実施例9蛋白質を4つの別個の画分に分画する293F細胞においてWTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-his蛋白質のH77c配列が発現した。HisTrapカラム上で、分泌された発現蛋白質を含有する組織培養上澄み液にニッケル-アフィニティ精製を行い、続いて、Superdex200pg26/60カラム上でゲル濾過を行った。WTΕ2661-his図19およびΔ123Ε2661-his図20の4つの個別のオリゴマーピークピーク1、2、3、4を観測し、ピークごとに画分を収集してプールした。加えて、WTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-his蛋白質の非分画調製物をHisTrapカラム上で部分的に精製したが、ゲル濾過は行わなかった。分析ゲル濾過カラム上で、WTΕ2661-his図21およびΔ123Ε2661-his図22について、各ピーク1~4に対応するプールされた画分を調べた。単一の図中にピーク1~4の個々のランrunを重ね合わせて配置し、それらの相対的な溶出時間を図示した。クロマトグラムの上側に、分子量標準の溶離時間を示す。還元図23および非還元条件下で図24、ゲル濾過精製型のWTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-his蛋白質をSDS-PAGEで分析した。還元条件下では、ピーク4のWTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-hisがそれぞれ、約55~65kDaおよび50~60kDaの広帯域として移行する図23。非還元条件下では、ピーク4の大部分のWTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-hisはそれぞれ約55~65kDaおよび50~60kDaの広帯域として移行し、1単位のWTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-hisを含む単量体型の蛋白質と一貫性を持つ図24。二量体蛋白質2単位に対して予期される分子量と一貫して、少量の約100kDa蛋白質が存在した。観測された広帯域は、WTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-hisでは、11部位および9部位のそれぞれにおいて混成N-結合型グリコシル化との一貫性がある。単量体型Ε2661-hisのほとんどは、他のΕ2661-his以外の混在蛋白質に乏しく、95超の純度であると推定された。還元条件下では、ピーク3のWTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-hisがそれぞれ、約55~65kDaおよび50~60kDaで移行した。還元SDS-PAGEにおいてピーク3蛋白質の平均的移行は幾分速かった。このことは、これらの蛋白質の質量が、ピーク4において観測された対応する単量体型を下回ることを示唆している。これは、蛋白質グリコシル化proteinglycosylationのレベルが低下したことを示している可能性がある図23。より高分子量の型のWTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-his蛋白質もまた、約100kDaで移行し、分子量が二量体Ε2661-hisと対応していることが、明瞭に見られた。非還元条件下では、ピーク3の蛋白質の大部分が約100kDaという予期された分子量で移行し、少量の単量体Ε2661-his蛋白質が存在する二量体型Ε2661-his2単位と一貫性を持つ図24。還元条件下では、WTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-hisピーク2がそれぞれ、約55~65kDaおよび50~60kDaで移行した。還元SDS-PAGEにおいてピーク2蛋白質の平均的移行は幾分速かった。このことは、これらの蛋白質の質量が、ピーク4において観測された対応する単量体型を下回ることを示唆している。これは、ピーク2蛋白質において蛋白質グリコシル化proteinglycosylationのレベルが低下したことを示している可能性がある図23。非還元条件下では、WTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-hisピーク2蛋白質の大部分がそれぞれ約170kDaおよび160kDaにて移行し、少なくとも3単位のΕ2661-hisの存在と一貫性を持つ。WTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-hisの両方に、少量の混在100kDa二量体Ε2661-hisが存在した図24。還元SDS-PAGEにおけるWTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-hisピーク1の移行によって明らかにされたように、蛋白質化学種の混成範囲は20kDa~250kDaに及ぶ図23。非還元条件下では、蛋白質の大部分は濃縮ゲルstackinggelと分離ゲルresolvinggelとの間の界面に残留した。このことは、この化学種の非還元型の分子量が300kDaを超え、且つΕ2661-hisの単位を4つ以上含むことを示唆している図24。一方、かなりの量の混在蛋白質が、20~250kDaの範囲に及ぶスミアとして観測された。各ピーク1~4においてΕ2661-his蛋白質に対応する蛋白質の化学種を分析するため、0.5μgの各蛋白質を4~12のNu-PAGEゲル上に載せて、還元条件下でランrunさせた後、PVDFメンブレンに転写した。C末端6xHisエピトープタグに特異的なPenta-His抗体図25またはΕ2残基411~428内に存在するエピトープに特異的なPenta-His抗体のいずれかを使用して、ブロットをプローブした図26。各画分1~4において、約50~60kDaで移行するΕ2661-his蛋白質化学種がPenta-His抗体によって検出されたことが、結果から判明した。ピーク1の蛋白質に対しては更に低い反応性が呈された。ピーク2および3の二量体型もまた存在する図25。各ピーク1~4では、Ε2661-his蛋白質が抗Ε2抗体によって検出された図26。ピーク4内の蛋白質の大部分は50~60kDaの化学種であり、約100kDaの化学種は少量検出された。ピーク3には、50~60kDaの化学種および100kDa型Ε2661-his蛋白質が含まれていた。ピーク2には、50~60kDaの化学種、および100~200kDaの範囲に及ぶ広範な蛋白質スミアが含まれていた。ピーク1には、Ε2661-hisの50~60kDaの化学種のほか、100~200kDa超の範囲に及ぶより高分子量の型が含まれていた。実施例10モルモットにWTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-his蛋白質でワクチン接種する3週間ごとに計3回、非分画、またはピーク1、2、3もしくは4蛋白質のいずれかのΔ123Ε2661-his100μgと75ISCO商標単位IUISCOMATRIX商標アジュバントとの混合物でモルモットにワクチン接種した。最終のワクチン接種後2週間目に、最後の出血を行った。代替方法として、2週間ごとに計3回、モルモットに100μgの非分画、またはピーク1、2、3もしくは4のWTΕ2661-his蛋白質と75IUISCOMATRIX商標アジュバントとの混合物を投与し、最終の免疫化後1週目に最後の出血を行った。実施例11モルモットにおけるWTΕ2661-hisおよびΔ123Ε2661-his蛋白質の相同画分に対する抗体反応固相エンザイムイムノアッセイでは、WTΕ2661-hisピーク1~4および非分画材料のいずれか1つでワクチン接種された動物から誘導された免疫血清について、相同抗原に結合する能力を調べた。マイクロプレートをGNAレクチンおよび相同免疫抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をBSAでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、TMB基質で可視化した。結果図27から明らかなように、相同抗原に反応する抗体の平均力価は、ピーク1およびピーク2の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も高かった。抗体の平均力価は、ピーク3および4蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も低く、これらの抗体の平均力価は非分画免疫群において誘発されたものより低かった。固相エンザイムイムノアッセイでは、Δ123Ε2661-his蛋白質ピーク1~4または非分画混合物でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清を、相同免疫化homologousimmunizing抗原に対する反応性に関して比較した。マイクロプレートをGNAレクチンおよび相同免疫抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をBSAでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、TMB基質で可視化した。結果図28からわかるように、ピーク1およびピーク2のΔ123Ε2661-his蛋白質を投与されたモルモットにおいて誘発された抗体価が最も高かった。ピーク1およびピーク2の免疫原群の間で平均抗体価は類似していた。抗体の平均力価のうち最も低かったのは、ピーク4の蛋白質によって誘発されたもので、平均抗体価はピーク1またはピーク2を使用して得られた平均力価の少なくとも1/20、ピーク3の1/10、非分画混合物の1/8であった。非分画混合物を使用して得られた平均抗体価は、ピーク3を使用して抗原として得られたものと類似していた。この結果が示しているように、非分画混合物中に存在する免疫原性の大部分はピーク1およびピーク2中に存在するΕ2661-his蛋白質の型に起因する可能性があり、この型はΔ123Ε2661-hisの三量体型または高次型からなる。実施例12非分画WTおよびΔ123Ε2661-his蛋白質に対する抗体反応性固相イムノアッセイでは、Δ123Ε2661-hisピーク1~4または非分画混合物のいずれか1つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清について、相同H77c由来のWTおよびΔ123Ε2661-hisの非分画調製物に結合する能力を調べた。イムノアッセイでは、WT非分画蛋白質を抗原として使用することで、誘導された抗体の総レベルを標準化抗原と比較できる。エンザイムイムノアッセイでは、Ε2661-hisのΔ123型を被覆抗原として使用することで、Ε2の保存領域の大部分に対する総免疫応答を調べることができる。マイクロプレートをGNAレクチンで被覆し、続いてWTまたはΔ123Ε2661-his蛋白質で被覆した。未被覆部位をBSAでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、TMB基質で可視化した。結果図29から明らかなように、相同WTAおよびΔ123Ε2661-hisB蛋白質に反応する抗体の平均力価は、ピーク1およびピーク2の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も高かった。非分画WTAまたはΔ123Ε2661-hisBに反応する抗体平均力価は、ピーク3の蛋白質または非分画免疫血清でワクチン接種された動物によって誘発されたものの間で類似していた。抗体の平均力価は、ピーク4の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も低かった。Δ123Ε2661-hisでワクチン接種された動物から採取された免疫血清が、非分画WTおよびΔ123Ε2661-his蛋白質に対して示した反応性はそれぞれ類似していた。各免疫群由来の免疫血清が相同免疫化homologousimmunizing抗原図28およびΕ2661-his蛋白質の非分画混合物図29に結合する能力が同等であったことから、抗体がΕ2661-his蛋白質に対して特異的であることが確証される。実施例13ワクチン接種されたモルモット由来の血清が、Ε2および組み換え型の一次HCV細胞レセプタCD81間の相互作用を阻害する能力WTΕ2661-hisピーク1~4または非分画混合物のいずれか1つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清について、HCVCD81に対する一次細胞レセプタの組み換え型と相同H77cΕ2661-hisとの間の結合をブロックする能力を調べた。このアッセイでは、免疫血清内に存在する抗体のうち、Ε2661抗原上に存在するエピトープに結合できそれにより組み換えCD81との相互作用を阻止するものの総量を測定した。相同Ε2661-his蛋白質を使用して、誘発された抗体をブロックしている総Ε2-CD81を定量する一方、Ε2661-his抗原の非相同配列を使用して、異なるΕ2抗原に対する抗体応答の交差反応性の度合い、およびこの交差反応抗体がΕ2とCD81との相互作用を妨げる能力を測定した。免疫血清の連続希釈液を非分画H77cΕ2661-hisに添加してからMBP-LEL113-201で被覆されたエンザイムイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε2661-hisを抗his抗体、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した免疫グロブリンおよびTMB基質で検出した。結果図30Aから明らかなように、相同Ε2-CD81阻害抗体の平均力価は、WTΕ2661-hisピーク2の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も高かった平均力価344。Ε2-CD81阻害抗体の平均力価は、ピーク1および非分画蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものそれぞれ平均力価18および18が最も低かった。Ε2-CD81阻害抗体の平均力価は、分画されたピーク2~4の蛋白質で免疫化して誘発されたものの方が、非分画WTΕ2661-his抗原で免疫化して誘発されたものよりも高かった。その後、WTΕ2661-his抗体について、CD81に結合する非相同型の非分画WTΕ2661-hisの結合を阻害する能力を調べた図30B。JFH1Ε2蛋白質は、Ε2領域全体にまたがるアミノ酸の31にあるH77cとは異なる。非相同Ε2蛋白質とCD81との相互作用を妨げる能力は、種々のΕ2配列に対する抗体応答の広がりの尺度と見なすことができる。ピーク2のWTΕ2661-his免疫血清は、非相同Ε2-CD81阻害抗体の平均力価平均77が最も高かった。ピーク3の蛋白質でワクチン接種された動物3匹もまた、非相同Ε2-CD81阻害抗体を誘発した。ピーク1の蛋白質および非分画材料を投与された動物は、非相同Ε2がCD81に結合するのをブロックする能力のある抗体を誘発しなかった。Δ123Ε2661-hisピーク1~4または非分画Δ123Ε2661-his蛋白質のいずれか1つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清について、HCVCD81に対する一次細胞レセプタの組み換え型と相同H77cΕ2661-hisとの間の結合をブロックする能力を調べた。免疫血清の連続希釈液を非分画H77cΕ2661-hisに添加してからMBP-LEL113-201で被覆されたエンザイムイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε2661-hisを抗his抗体、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した免疫グロブリンおよびTMB基質で検出した。結果図31Aから明らかなように、相同Ε2-CD81阻害抗体の平均力価は、Δ123Ε2661-hisのピーク2の蛋白質でワクチン接種された動物において誘発されたもの平均940が最も高かった。ピーク1、3または4でワクチン接種された動物において誘発されたΕ2-CD81の50阻害力価は、非分画免疫群の2~3倍であった。その後、Δ123Ε2661-his抗体について、CD81に結合する非相同型の非分画Ε2661-hisの結合を阻害する能力を調べた図31B。CD81への非相同Ε2661-hisの結合を阻害する能力を有する抗体の平均力価は、Δ123Ε2661-hisピーク2の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたもの平均力価256が最も高かった。ピーク4単量体Ε2蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発された非相同Ε2-CD81阻害抗体の平均力価平均力価26は最も低かった。CD81への非相同Ε2661-hisの結合を阻害する能力を有する抗体の平均力価のうち、ピーク1、3または非分画混合物を投与された動物によって誘発されたものそれぞれ55、77および45は、中程度であった。実施例14Δ123Ε2661-his蛋白質でワクチン接種されたモルモットにおける相同中和抗体応答Δ123Ε2661-hisピーク1~4または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清について、相同H77cΕ1Ε2糖蛋白質H77cHCVpp含有の疑似型レトロウイルス粒子を中和する能力を調べた。この実験では、免疫抗原の配列において表されるのと同じ相同HCV糖蛋白質を使用して、ウイルス感染症をinvitroで阻止できる免各疫群からの動物によって誘発される抗体の、ビリオン調製物中の総量を定量する。そのような抗体は、ウイルスが肝細胞に侵入するのをinvitroで阻止できるという点で機能的と見なされる。中和抗体の特異性は、CD8LへのΕ2の結合を阻害できる抗体のみに限定されない。加熱により不活性化された免疫血清をDMF10で連続希釈し、等量のH77cHCVppを用い37°Cで1時間インキュベートした後、前日に3×104細胞/ウェルで播種しておいたHuh7.5細胞に添加した。3日後に、ルミノメータで、細胞溶菌液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。結果図32から明らかなように、相同ウイルス侵入の50をブロック中和化する能力のある抗体の平均力価IC50は、ピーク1またはピーク2の蛋白質でワクチン接種されたモルモットによって誘発されたものが最も高かった図32の最上部。平均IC50平均力価は、ピーク1平均2363およびピーク2の免疫血清群平均2288と類似していた。50相同中和抗体応答は、ピーク3または4蛋白質でワクチン接種されたモルモットによって誘発されたものそれぞれ平均727および705が最も低く、非分画免疫群平均力価918と類似していた。抗体が相同ウイルス侵入の80をブロックする能力を測定した結果、ピーク1またはピーク2の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発された平均力価平均IC80平均力価=280および170は、他の全ての群よりも高いことがわかった図32B。非分画混合物によって誘導されたIC80平均力価平均109は、ピーク3平均65およびピーク4の抗原によって誘導されたもの平均54よりも高かった。実施例15Δ123Ε2661-his蛋白質でワクチン接種されたモルモットにおける非相同交差中和抗体応答Δ123Ε2661-his蛋白質でワクチン接種されたモルモットに由来する免疫血清について、非相同J6/JFH1キメラ遺伝型2a細胞培養HCVcc由来ウイルスを交差中和する能力を調べた。この実験では、免疫抗原の配列と比べてかなり異種株の非相同HCV糖蛋白質をコードするHCV株を使用して、ウイルス感染症をinvitroで阻止できる各免疫群からの動物によって誘発される抗体の総量を定量する。そのような抗体は、遺伝的に異なるウイルスが肝細胞に侵入するのをinvitroで阻止できるという点で機能的で、且つ交差中和を行えるものと見なされる。加熱により不活性化された免疫血清を連続希釈し、当量のHCVccと混合した。血清/ウイルスの混合物をHuh7.5細胞に適用し、37°Cでインキュベートした後、除去して組織培養培地内で44時間インキュベートした。ウミシイタケRenillaルシフェラーゼ基質およびルミノメータを使用して、組織培養液に存在するルシフェラーゼ活性を測定した。結果が示しているように、非分画Δ123Ε2661-his蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発された抗体は、ウイルス感染量の50を中和する能力IC50の平均が360で範囲が100~900に及んだ図33A。ISCOMATRIX商標アジュバントのみでワクチン接種された動物2匹は平均50中和平均力価が40および60で、他の動物3匹は感染性ウイルスの50またはそれ以上を中和できなかった。交差中和抗体の平均力価は、ピーク1のΔ123Ε2661-his蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたもの平均IC50=1700が最も高かった図33A。ピーク2のΔ123Ε2661-hisおよび非分画免疫群でワクチン接種された動物によって誘発された交差中和抗体の平均力価は、それぞれ340および362で類似していた。ピーク3または4蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発された交差中和抗体の平均力価は、有意なものでなかった。ピーク1の蛋白質でワクチン接種された動物はいずれも、ウイルスの感染量の80を中和する能力を有し、平均力価が320で範囲が100~700に及んだ。ピーク2の蛋白質でワクチン接種された動物の平均IC80平均力価平均38は、非分画混合物平均46と類似していた図33B。ピーク3または4免疫群内の動物はいずれも、非相同ウイルス感染量の80を中和できなかった。実施例16WTΕ2661-his免疫血清の、H77cWTおよびΔ123抗原に対する反応性エンザイムイムノアッセイで、H77cWTΕ2661-his蛋白質のピーク1~4または非分画混合物のいずれか1つでワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清が、非分画H77cWTΕ2661-his抗原およびΔ123Ε2661-his抗原に結合する能力を比較した。イムノアッセイでは、WT非分画蛋白質を抗原として使用することで、誘導された抗体の総レベルを標準化抗原と比較できる。エンザイムイムノアッセイでは、Ε2661のΔ123型を被覆抗原として使用することで、Ε2の保存領域の大部分に対する総免疫応答を調べることができる。マイクロプレートをGNAレクチンおよび非分画H77c抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をBSAでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、TMB基質で可視化した。結果が示しているように、非分画H77cΕ2661-his抗原に反応する抗体の平均力価は、ピーク1およびピーク2のWTH77cΕ2661-his蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も高く、非分画WTΕ2661-hisで免疫化された動物よりも有意に高かった図34A。非分画WTH77cΕ2661-hisに反応する抗体の平均力価は、ピーク4の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も低かった。抗体の平均力価は、ピーク3の蛋白質および非分画免疫群でワクチン接種された動物によって誘発されたものの間では類似していた一方、ピーク1およびピーク2の免疫血清における平均抗体価よりも低く、ピーク4免疫群よりは高かった。各免疫群由来の免疫血清が相同免疫化homologousimmunizing抗原図27およびΕ2661-his蛋白質の非分画混合物図34に結合する能力が同等であったことから、抗体がΕ2661-his蛋白質に対して特異的であることが確証される。WTΕ2661-hisでワクチン接種された動物由来の免疫血清が非分画H77cΔ123抗原に結合する能力を比較した結果、3つの可変領域が全て欠失したΕ2のコアドメインに対する抗体の反応性は全般的に低いことが判明した。Ε2のコアドメインに反応する抗体の平均力価は、ピーク2の免疫血清によって生成されたものが最も高かった。Ε2のコアドメインに反応する抗体の平均力価は、他の全ての群によって誘発されたものの間で類似していた図34B。実施例17WTΕ2661-his免疫血清の、JFH1WTおよびΔ123抗原に対する交差反応性エンザイムイムノアッセイで、H77cWTΕ2661-his蛋白質のピーク1~4または非分画混合物のいずれか1つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清が、JFH1WTΕ2661-his抗原およびΔ123Ε2661-his抗原の非分画混合物と交差反応する能力を比較した。異種株のHCV由来のWT非分画蛋白質を抗原として使用することで、誘導された交差反応性抗体の総レベルを標準化抗原と比較できる。エンザイムイムノアッセイでは、非相同Ε2661-hisのΔ123型を被覆抗原として使用することで、その異種株のΕ2の保存領域の大部分に対する総交差反応性免疫応答を調べることができる。遺伝型2aJFH1Ε2配列は、遺伝型1aH77cΕ2配列のものとは最も異なる配列の1つであり、H77cΕ2とJFH1Ε2は、無傷型Ε2661においては31異なり、3つの可変領域が欠失したΕ2のコアドメインにおいては20異なる。マイクロプレートをGNAレクチンおよび非分画抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をBSAでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、TMB基質で可視化した。結果が示しているように、非分画WTJFH1Ε2661-his抗原に対する平均抗体価は、ピーク2のWTH77cΕ2661-his蛋白質でワクチン接種された動物における平均抗体価の方が他の免疫群の平均力価に比べて4倍高かった図35A。交差反応性抗体の平均力価は、ピーク4単量体蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も低く、非分画免疫群の1/5であった。交差反応性抗体の平均力価は、ピーク1および3蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものの間で相互に、および非分画免疫群と類似していた。免疫血清がJFH1Ε2コアドメインΔ123と交差反応する能力を調べた結果、抗体の平均力価は、ピーク2の免疫血清によって誘発されたものが、ピーク1、3および4免疫群と比べて4倍高いことが判明した図35B。JFH1のΔ123コアドメインに対する抗体交差反応の平均力価は、単量体ピーク4の蛋白質が誘発したものが最も低く、他の全ての免疫群と比べて少なくとも1/3低かった図35B。実施例18WT免疫血清群による相同ウイルスの中和WTΕ2661-his蛋白質ピーク1~4または非分画混合物のどちらか一方のワクチン接種を受けたモルモットによる免疫血清の誘発について、相同H77cΕ1Ε2糖蛋白質H77cHCVpp含有の疑似型レトロウイルス粒子を中和する能力を調べた。この実験では、免疫抗原の配列において表されるのと同じ相同HCV糖蛋白質を発現するビリオン調製物中の、ウイルス感染症をinvitroで阻止できる各免疫群からの動物が誘発する抗体の総量を定量する。そのような抗体は、ウイルスが肝細胞に侵入するのをinvitroで阻止できるという点で機能的と見なされる。加熱により不活性化された免疫血清をDMF10で連続希釈し、等量のH77cHCVppを用い37°Cで1時間インキュベートした後、前日に3×104細胞/ウェルで播種しておいたHuh7.5細胞に添加した。3日後に、ルミノメータで、細胞溶菌液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。結果が示しているように、ウイルス感染量の50を中和する能力を有する抗体の平均力価は、ピーク1、2、3および非分画混合物を投与された動物由来の免疫血清のものが、抗原なし免疫群の抗体の当該平均力価をかなり上回っていた図36A。抗原なし免疫群に対する平均中和抗体価は、単量体ピーク4の蛋白質を投与された動物の間で類似していた。相同ウイルスの50中和を媒介する能力を有する抗体の平均力価は、ピーク1および2免疫群によって誘発されたものそれぞれ平均2150および1600の間で類似しており、これらはピーク3平均1175および非分画免疫群平均1013よりも高かった。各ピーク2および非分画免疫群内で、動物3匹が誘発した中和抗体の平均力価は有意に低いと考えられ、且つそれらの平均力価は域外値である。これらの血清が示す特性は異常であり、アッセイを繰り返し行うことによって中和抗体の平均力価の高いものが存在することが判明し得る。域外値を分析の対象から除外した結果、非分画免疫群の平均IC50力価が1500であったのに対し、ピーク2は平均50中和力価2460を誘導したことが判明した。相同ウイルス感染量の80を阻止する能力を有する抗体を誘発した動物は、ピーク1、2、3および非分画免疫群内のものだけに限られていた図36B。ピーク1の免疫血清によって誘発された平均80中和力価平均力価225は、他の全ての免疫群と比べて高かった。域外値を含むピーク2免疫群の平均IC80力価は116であったが、3つの域外値を除外した結果、平均力価が174に上昇した。IC80平均力価は、非分画およびピーク3免疫群によって誘発されもの86の間で類似していた。非分画免疫群から3つの域外値を排除すると、平均IC80力価が126に上昇した。データが示しているように、ピーク1、2および3は、WTΕ2を免疫原として使用して中和抗体を誘発するための、好ましい免疫原である。実施例19遺伝型2a細胞培養由来HCVの交差中和WTΕ2661-his蛋白質のピーク1~4または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットが誘発した免疫血清について、非相同J6/JFH1キメラ遺伝型2a細胞培養cc由来HCVを中和する能力を調べた。この実験では、免疫抗原の配列と比べてかなり異なる非相同HCV糖蛋白質をコードするHCV株を使用して、ウイルス感染症をinvitroで阻止できる免各疫群からの動物によって誘発される抗体の総量を定量する。そのような抗体は、遺伝的に異なるウイルスが肝細胞に侵入するのをinvitroで阻止できるという点で機能的で、且つ交差中和を行えるものと見なされる。加熱により不活性化された免疫血清をDMF10NEAAで連続希釈し、当量の3.16TCID50/mlのHCVccと37°Cで20分間混合した。前日に8×103細胞/ウェルで播種して37°Cで5時間インキュベートしておいたHuh7.5細胞に、血清/ウイルスの混合物を塗布した。血清/ウイルスの混合物を除去し、PBSで4回洗浄して、DMF10NEAAに添加して44時間インキュベートした。ウミシイタケRenillaルシフェラーゼ基質およびルミノメータを使用して、組織培養液に存在するルシフェラーゼ活性を測定した。IC50の交差中和抗体の平均力価は、ピーク1およびピーク2のWT蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものそれぞれ平均力価155および368が、他の免疫群に比べて高かった図37A。HCVの非相同株の50中和を媒介する能力を有する抗体の平均力価は、ピーク3および4それぞれ平均34および39が最も低く、非分画蛋白質によって誘発された平均IC50力価は48であった図37A。ピーク1、2および非分画蛋白質でワクチン接種された動物のうち、ウイルス感染量の80を中和する能力を有する抗体を誘発したものは、ごく少数に限られていた図37B。免疫群ピーク1内の動物5匹、ピーク2内の2匹、および非分画群内の3匹は、IC80平均力価を有し図37B、それらの平均力価それぞれ38、27および30は類似していた。ピーク1、ピーク2および非分画免疫群において反応する動物の平均力価はそれぞれ48、50および47であった。これらの結果が示しているように、ピーク1およびピーク2は、WTΕ2661を免疫原として使用して交差中和抗体を誘発するための、好ましい免疫原である。実施例20野生型免疫血清の、Con1WTおよびΔ123Ε2661抗原に対する交差反応性エンザイムイムノアッセイで、H77cWTΕ2661-his蛋白質のピーク1~4または非分画混合物のいずれか1つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清が、遺伝型1bCon1WTΕ2661-his抗原およびΔ123Ε2661-his抗原の非分画混合物と交差反応する能力を比較した。異種株のHCV由来のWT非分画蛋白質を抗原として使用することで、誘導された交差反応性抗体の総レベルを標準化抗原と比較できる。エンザイムイムノアッセイでは、非相同Ε2661のΔ123型を被覆抗原として使用することで、その異種株のΕ2の保存領域の大部分に対する総交差反応性免疫応答を調べることができる。遺伝型1bCon1Ε2配列は、JFH1と比べて遺伝型1aH77cΕ2配列のものとの差異が少なく、H77cΕ2およびCon1Ε2は無傷型Ε2661においては20異なり、3つの可変領域が欠失したΕ2のコアドメインにおいては15異なる。マイクロプレートをGNAレクチンおよび非分画抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をBSAでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、TMB基質で可視化した。結果が示しているように、交差反応性抗体の平均力価は、ピーク2の蛋白質を投与された動物において誘発されたものが最も高く、他の免疫群の少なくとも2倍であった図38A。交差反応性抗体の平均力価は、ピーク4の蛋白質によって誘発されたものが最も低く、ピーク2の1/8で、非分画免疫群の1/3であった。免疫血清がCon1Ε2コアドメインΔ123と交差反応する能力を調べた結果、抗体の平均力価は、ピーク2の免疫血清によって誘発されたものが、ピーク1、3および4免疫群と比べて高いことが判明した図38B。ピーク2によって誘発された平均力価233750は、ピーク4免疫群の平均力価9000の26倍であった。Con1のΔ123コアドメインと交差反応する抗体の平均力価は、単量体ピーク4の蛋白質によって誘発されたものが、他の全ての免疫群と比べて最も低かった図38B。実施例21Δ123Ε2661-his免疫血清の、Con1野生型およびΔ123Ε2661-his抗原に対する交差反応性エンザイムイムノアッセイで、H77cΔ123Ε2661-his蛋白質のピーク1~4または非分画混合物のいずれか1つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清が、遺伝型1bCon1WTΕ2661-his抗原およびΔ123Ε2661-his抗原の非分画混合物と交差反応する能力を比較した。マイクロプレートをGNAレクチンおよび非分画抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をBSAでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、TMB基質で可視化した。結果が示しているように、WTCon1Ε2661抗原と交差反応する抗体の平均力価は、ピーク1平均220000および2平均300000蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も高く、他の免疫群の平均力価の少なくとも2倍であった図39A。交差反応性抗体の平均力価は、ピーク4の蛋白質によって誘発されたもの平均20000が他の群と比べて最も低かった。免疫血清がCon1Ε2コアドメインΔ123と交差反応する能力を調べた結果、Con1Ε2661-hisのコアドメインと交差反応する抗体の平均力価は、ピーク1およびピーク2の免疫血清のものそれぞれ平均力価は217500および2887500が他の免疫群と比べて高いことが判明した図39B。コアドメインに対して交差反応する抗体の平均力価は、ピーク4の蛋白質によって誘発されたもの平均39600が他の群と比べて最も低かった。実施例22Δ123Ε2661-his免疫血清の、JFH1WT抗原およびΔ123Ε2661-his抗原に対する交差反応性エンザイムイムノアッセイで、H77cΔ123Ε2661-his蛋白質のピーク1~4または分画された混合物のいずれか1つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清が、JFH1WTΕ2661抗原およびΔ123Ε2661抗原の非分画混合物と交差反応する能力を比較した。H77cΕ2およびJFH1Ε2は、Ε2661の無傷型においては31異なり、3つの可変領域が欠失したΕ2のコアドメインにおいては20異なる。マイクロプレートをGNAレクチンおよび非分画抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をBSAでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、TMB基質で可視化した。結果が示しているように、WTJFH1Ε2配列に反応する抗体の平均力価は、Δ123Ε2661-hisピーク1およびピーク2の抗原によって誘発されたものが有意に高く、非分画Δ123Ε2661-hisが誘導した平均力価の約2倍であった図40A。ピーク1およびピーク2のΔ123Ε2661-hisによって誘発された平均抗体価はそれぞれ50625および53500であった。ピーク3平均23188によって誘発された交差反応性抗体の平均力価は、非分画Δ123Ε2661-hisと比較して同程度であった。ピーク4によって誘発された交差反応性抗体の平均力価4225は、非分画免疫群の1/5で、且つピーク1およびピーク2の1/10であった。Ε2の非相同コアドメインに存在する保存エピトープをΔ123Ε2661-his抗体が認識する能力の調査では、ピーク1およびピーク2免疫群の抗体の平均力価それぞれ平均36625および41250が最も高いことが認められた図40B。ピーク3平均13363および4平均8088免疫群の交差反応性抗体の平均力価は、非分画免疫群平均22500よりも低く、ピーク1およびピーク2免疫群の約1/3~1/4であった。多くの変更態様が、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に明らかとなろう。出典AngusandPatel,FutureMicrobiol6:279-94,2011AthertonandShephard,PeptideSynthesis.InNicholsoned.,SyntheticVaccines,publishedbyBlackwellScientificPublications,Chapter9Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPub.AssociatesandWiley-Interscience,NewYork,1988Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySonsInc,Chapters10and16,1994Ausubeletal,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement47,JohnWileySons,NewYork,1999Bartoschetal,JBiolChem278:41624-30,2003Blishetal,PLoSMed5,9e,2008Coliganetal,CurrentProtocolsInProteinScience,JohnWileySons,Inc.,Chapters1,5and6,1995-1997ColowickandKaplan,eds.,MethodsInEnzymology,AcademicPress,Inc.CoxandCoulter,AdvancesinAdjuvantTechnologyandApplication,inAnimalParasiteControlUtilizingBiotechnology,Chapter4,Ed.Young,W.K.,CRCPress1992CoxandCoulter,Vaccine153:248-256,1997Dorner,etal,Nature474:208-11,2011Drummeretal,BiochemBiophysResCommun328:251-257,2005Drummeretal,FEBSLett546:385-90,2003Drummeretal,JVirol76:11143-7,2002Fieldsetal,eds,Virology,3rdEdition,Lippincott-Raven,PhiladelphiaHarrisetal,JBiolChem285:21092-102,2010Jokliked.,Virology,3rdEdition,1988;FieldsandKnipe,eds.FundamentalVirology,2ndEdition,1991Kaufmannetal,ProcNatlAcadSciUSA107:18950-5,2010Koutsoudakisetal,JVirol81:588-98,2007KozakandShatkin,MethodsEnzymol,60:360-375,1979Kozak,Biochimie.,769:815-21,1994Kozak,JCellBiol,1082:229-241,1989Kozak,MammGenome,78:563-74,1996Lawetal,NatMed14:25-7,2008Lindenbachetal,Science3095734:623-626,2005Lussoetal,JVirol79:6957-68,2005Mancinietal,PLoSOne4,e8254,2009McCaffreyetal,JVirol81:9584-90,2007McKeatingetal,JVirol78:8496-505,2004Pestkaetal,ProcNatlAcadSciUSA104:6025-30,2007Pilerietal,Science282:938-41,1998ReedandMuench,Asimplemethodofestimatingfiftypercentendpoints.TheAmericanJournalofHygiene27:493-497,1938Remington’sPharmaceuticalSciences,18thEd.,MackPublishing,Company,Easton,PA,U.S.A.,1990Robergeetal,Science,2695221:202-204,1995Roseetal,ALaboratoryCourseManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1990Sambrooketal,MolecularCloning:ALaboratoryManual2nded..ColdSpringHarbourLaboratory,ColdSpringHarbour,NY,Sections13,16and17,1989SharpandCowe,Yeast,7:657-678,1991Stamatakietal,ClinLiverDis12:693-712,2008Stiasnyetal,JVirol80:9557-68,2006Sultanaetal,JImmunol183:650-60,2009Vanwolleghemetal.,Hepatology47:1846-55,2008WeirandBlackwell,eds.,HandbookofExperimentalImmunology,Vols.I-IV.BlackwellScientificPublications,1986Younetal,Hepatology42:1429-36,2005Zhang,etal,JVirol78:1448-55,2004"