"c-Met二量体化を阻害することができるモノクローナル抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体であって、前記抗体が、それぞれ配列番号1、2および3のアミノ酸配列を有するCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含む重鎖と、それぞれ配列番号5、6および7のアミノ酸配列を有するCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含む軽鎖とを含んでなり、更に配列番号56のアミノ酸配列を含むヒンジ領域をも含んでなり、c-Metのリガンド非依存性活性化を特徴とする癌を有する予防または治療を必要とする患者の予防または治療に使用するための、モノクローナル抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。前記ヒンジ領域が配列番号57のアミノ酸配列を含んでなる、請求項1に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。前記ヒンジ領域が配列番号21のアミノ酸配列を含んでなる、請求項1に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。前記ヒンジ領域が配列番号22~28および配列番号58~72からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項1に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。c-Metの過剰発現を特徴とする癌を有する予防または治療を必要とする患者の予防または治療に使用するための、請求項1に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。c-Metの遺伝子増殖に起因するc-Metの過剰発現を特徴とする癌を有する予防または治療を必要とする患者の予防または治療に使用するための、請求項1に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。c-Metの遺伝子増殖に起因し、かつ、c-Metのリガンド非依存性活性化を生じるc-Metの過剰発現を特徴とする癌を有する予防または治療を必要とする患者の予防または治療に使用するための、請求項6に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。癌が、腎細胞癌および胃癌からなる群から選択される、c-Metの遺伝子増殖に起因するc-Metの過剰発現を特徴とする癌を有する予防または治療を必要とする患者の予防または治療に使用するための、請求項6に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。キメラ抗体からなる、請求項1に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。ヒト抗体からなる、請求項1に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。ヒト化抗体からなる、請求項1に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。配列番号4のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号8、9または10のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる、請求項11に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。配列番号4のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号8のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号22のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項12に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。配列番号4のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号9のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号22のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項12に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。配列番号4のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号10のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号22のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項12に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。配列番号4のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号8のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号28のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項12に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。配列番号4のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号9のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号28のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項12に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。配列番号4のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号10のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号28のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項12に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体。医薬としての、請求項1~18のいずれか一項に記載の抗体。c-Metのリガンド非依存性活性化を特徴とする癌を有する予防または治療を必要とする患者の予防または治療のための組成物であって、前記組成物は、請求項1~19のいずれか一項に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体からなる化合物を活性成分として含んでなる、組成物。医薬としての、請求項20に記載の組成物。c-Metのリガンド非依存性活性化を特徴とする癌を有する予防または治療を必要とする患者の予防または治療のための医薬の調製のための、請求項1~19のいずれか一項に記載の抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体、または請求項20または21に記載の組成物の使用。例1:c-Metに対する抗体の生成抗c-Met抗体を生成させるために、8週齢のBALB/cを、CHOの細胞膜上にc-Metを発現するトランスフェクションしたCHO細胞系20x106個/用量/マウスで3~5回皮下免疫し、または最初の免疫には完全Freundアジュバントと、また引き続く免疫には不完全Freundアジュバントと、混合したc-Met細胞外ドメイン融合タンパク質10~15μg/用量/マウスまたはこの組換えタンパク質の断片を2~3回皮下に免疫した。マウスにCHO-cMet細胞と組換えタンパク質との両方を投与した混合プロトコールも行った。細胞融合の3日前に、マウスに組換えタンパク質または断片をi.p.またはi.v.で追加免疫した。次いで、マウスの脾臓を回収してSP2/0-Ag14骨髄腫細胞ATCCに融合させ、HAT選択を行った。4回の融合を行った。一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能性断片、特にネズミ起源のものの調製には、マニュアル抗体ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNYpp7261988に詳細に記載されている手法、またはKohlerandMilsteinによって報告されているハイブリドーマの調製手法を参照することができる。得られたハイブリドーマを、最初にc-Met組換えタンパク質上でELISAによってスクリーニングした後、A549NSCLC、BxPC3膵臓、およびU87-MG神経膠芽腫細胞系上でFACS分析によってスクリーニングし、産生した抗体は腫瘍細胞上の本来の受容体を認識することもできることを確かめた。これら2種類の試験で陽性反応を示すものを増幅して、クローニングし、1セットのハイブリドーマを回収して、精製し、BxPC3モデルにおけるインビトロでの細胞増殖を阻害するその能力についてスクリーニングした。その目的のために、50,000個のBxPC3細胞を、96穴プレートで2mML-グルタミンを補足しSVFを含まないRPMI培地で培養した。24時間の培養後、試験を行う抗体を、0.0097~40μg/mlの最終濃度でhHGF100ng/mlの添加の60分前に添加した。3日後に、細胞を[3H]チミジン0.5μCiで16時間パルス標識した。トリクロロ酢酸不溶性DNAに組込まれた[3H]チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。結果を、それぞれのMabの本質的なアゴニスト効果を実際に評価するために生データーとして表した。次いで、少なくとも50細胞増殖を阻害する抗体を、c-Met二量体化に対するそれらの活性およびトランスフェクション細胞に対する活性化BRET分析について評価した。c-Met受容体活性を、活性化c-Metに対するGab1シグナル伝達分子増加を測定することによって定量した。その目的のために、c-Met二量体化のためにC-Met-RlucまたはC-Met-RlucとC-Met-K1100A-YFPとを発現するCHO安定細胞系、またはc-Met活性化のためにC-Met-RlucとYFPに融合したGab1の突然変異形態とを発現するCHO安定細胞系[MarounetalMolCellBiol19991917841799]を生成した。細胞を、白色の96穴マイクロプレート中のDMEM-F12/FBS5培養培地にBRET実験の1または2日前に分配した。細胞を最初に5CO2で37°Cにて培養して、細胞をプレートに接着させた。次に、細胞を200μlDMEM/ウェルで一晩飢餓状態に置いた。実験の直前に、DMEMを除去し、細胞をすばやくPBSで洗浄した。細胞を、試験を行う抗体または参照化合物の存在または非存在下において37°CにてPBS中で10分間インキュベーションした後、HGFを含むまたは含まないコエレンテラジンを50μlの最終容積で添加した。37°Cで更に10分間インキュベーションした後、485nmおよび530nmにおける発光取得を、Mithrasルミノメーターを用いて開始した1s/波長/ウェル15回反復。BRET比は、以前に[530nmにおける発光-485nmにおける発光×Cf]/485nmにおける発光上記式中、Cfは、同一実験条件でRluc融合タンパク質のみを発現する細胞についての530nmにおける発光/485nmにおける発光に相当するとして定義されている[AngersetalProcNatlAcadSciUSA20009736843689]。この方程式を簡略化すると、BRET比は、R.reniformisルシフェラーゼに融合したパートナーだけがアッセイに存在するときに同一実験条件下で得られた比530/485nmによって補正された、2つのパートナーが存在するときに得られた比530/485nmに相当することを示している。理解しやすくするため、結果をミリBRET単位mBUで表しており、mBUはBRET比に1000を乗じたものに相当する。この第二のインビトロ試験の後、i増殖の機能試験において全分子として固有活性を持たない、iiBxPC3増殖を有意に阻害する、およびiiic-Met二量体化を阻害する抗体224G11を選択した。実験では、Genentech製でありかつATCCで入手可能な5D5Mabを、固有アゴニスト活性に対するコントロールとして添加した。例2:CDR-移植によるマウス224G11Mabのヒト化工程1°軽鎖可変ドメインVLのヒト化予備段階として、224G11VLのヌクレオチド配列をIMGTデーターベースhttpimgtcinesfrに含まれるネズミの生殖細胞系遺伝子配列と比較した。それぞれ、V領域について99.31およびJ領域について94.28の配列同一性を示すネズミIGKV3-501およびIGKJ401生殖細胞系遺伝子を同定した。これらの高い相同性に関して、対応するマウス生殖細胞系の代わりに224G11VLヌクレオチド配列を用いて、直接ヒト相同性を調査した。第二段階では、224G11VLと最高の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を調査して、CDR移植のための最良のヒト候補を同定した。選択を最適にするため、アミノ酸配列間のアラインメントを行った。ヒトIGKV4-101生殖細胞系遺伝子では、配列同一性は67.30となったが、CDR1については異なる長さを示した224G11VLでは10アミノ酸、およびIGKV4-101では12アミノ酸。J領域については、ヒトIGKJ402生殖細胞系遺伝子配列同一性77.14を選択した。次の段階では、マウス224G11VLのCDR領域を、上記で選択したヒトフレームワーク配列に移植した。それぞれのアミノ酸位置を、VH/VL界面、抗原結合またはCDR構造における関与、可変ドメインの3D構造における残基の局在化、CDRアンカー、Vernierゾーンに属する残基のような幾つかの基準について分析した。配列番号8、配列番号9および配列番号10に対応し、FR領域およびマウス224G11VLに対応するCDRにそれぞれ4つ4、39、40、84、2つ39、40または1つ40のネズミ残基を含む3種類のヒト化バージョンを構築した。2°重鎖可変ドメインVHのヒト化予備段階として、224G11VHのヌクレオチド配列を、IMGTデーターベースhttpimgtcinesfrに含まれるネズミの生殖細胞系遺伝子配列と比較した。それぞれ、V領域について92.70、D領域について75.00およびJ領域について89.36の配列同一性を有するネズミIGHV1-1801、IGHD2-401およびIGHJ201生殖細胞系遺伝子を同定した。対応するマウス生殖細胞系の代わりに、これらの高い相同性に関して、224G11VHヌクレオチド配列を直接用いてヒト相同性を検索することに決定した。第二段階では、224G11VHと最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索して、CDR移植のための最良のヒト候補を同定した。この目的のため、224G11VHのヌクレオチド配列を、IMGTデーターベースに属するヒト生殖細胞系遺伝子配列と共にアライメントした。ヒトIGHV1-202V配列は、ヌクレオチドレベルでは75.00およびアミノ酸レベルでは64.30の配列同一性を示した。J領域についての相同性の検索では、ヒトIGHJ404生殖細胞系遺伝子が78.72の配列同一性で同定された。次の段階では、マウス224G11VHCDR領域を、上記で選択されたヒトフレームワーク配列に移植した。それぞれのアミノ酸位置を、VH/VL界面、抗原結合またはCDR構造における関与、可変ドメインの3D構造における残基の局在化、CDRアンカー、Vernierゾーンに属する残基のような幾つかの基準について分析した。配列番号4に対応する1つの完全にヒト化形態を構築し、これは、FR領域およびマウス224G11VHに対応するCDRに全くヒト残基のみを含む。例3:改良されたヒンジ変異体の遺伝子工学処理ヒンジ領域は、免疫グロブリンの可変ドメインの柔軟性に強力に関与していることは、当業者に周知であるBrekkeetal1995Rouxetal1997を参照。224G11Mabのキメラ化工程中に、マウス定常ドメインIGHG1をヒト起源の同等なIGHG1部分で置換した。ヒンジ領域のアミノ酸配列は高度に分岐していたので、ヒンジ領域のネズミ化を行ってその長さと剛性を保持した。ヒトIGHG2ヒンジ領域は、マウスIGHG1ヒンジの最も近い相同物に対応しているので、この配列も同様に考慮した。マウスIGHG1およびヒトIGHG2ヒンジの部分をヒトIGHG1ヒンジ部分に組込むことによって、一連の7種類のヒンジ配列を構築した配列番号22~28。もう一つの一連のヒンジ変異体をデザインして構築し配列番号58~72、付加システインおよびヒンジドメインに沿ったその位置、ヒンジドメインに沿った1、2、3または4つのアミノ酸の欠失、およびこれら2つのパラメーターの組合せシステイン付加およびアミノ酸欠失の影響を評価した。例4:ヒト化224G11Mabおよび遺伝子工学処理したヒンジMabフォーマットの産生キメラ、ヒト化および/または遺伝子工学処理したヒンジ領域を含むすべての上記Mab形態を、一過性トランスフェクションおよびpCEP4発現ベクターを有するHEK293/EBNA系を用いることによって産生したInVitrogen米国。224G11Mab軽鎖配列番号18、配列番号19および配列番号20および重鎖配列番号14の可変ドメインのヒト化バージョンに対応する全ヌクレオチド配列を、包括的遺伝子合成によって合成したGenecustルクセンブルグ。それらを、ヒトIgG1またはIgG2免疫グロブリンの定常ドメイン[CH1-Hinge-CH2-CH3]の全コード配列を有するpCEP4ベクターInVitrogen米国にサブクローニングした。ヒンジ領域の修飾を、{Nhe1I-Bcl1}制限断片を所望な修飾を有する同等な部分に交換することによって行い、それぞれの{Nhe1-Bcl1}断片は包括的遺伝子合成によって合成したGenecustルクセンブルグ。すべてのクローニング段階は、実験室マニュアルに記載の通常の分子生物学の手法によってまたは供給業者の指示に従って行った。それぞれの遺伝子構築物は、BigDyeターミネーターサイクルシークエンシングキットAppliedBiosystems米国を用いるヌクレオチドシークエンシングによって完全に確認し、3100GeneticAnalyzerAppliedBiosystems米国を用いて分析した。懸濁液に馴化したHEK293EBNA細胞InVitrogen米国は、オービタルシェーカー110rpm回転速度上で250mlフラスコ中の6mMグルタミンを補足した50mlの無血清培地Excell293で日常的に増殖した。一過性トランスフェクションは、1mg/mlの最終濃度で混合した水中で調製した線状の25kDaポリエチレンイミンPEIおよびプラスミドDNA重鎖対軽鎖プラスミド比1:1に対して最終濃度1.25μg/mlを用いて2×106細胞/mlで行った。トランスフェクションの4時間後に、培養物を1容の新鮮な培養培地で希釈し、最終細胞密度106細胞/mlを達成した。培養工程は、細胞生育力およびMab産生に基づいて観察した。典型的には、培養物を4~5日間保持した。Mabは、プロテインA樹脂GEHealthcare米国上で通常のクロマトグラフィー法を用いて精製した。すべての様々な形態のMabは、機能評価に適したレベルで産生した。生産性レベルは、典型的には15~30mg/lの精製Mabである。例5:ホスホ-c-Met特異的ELISAアッセイによるc-Metリン酸化状態の評価この機能アッセイにより、MabのみによるまたはHGFの共存におけるc-Metリン酸化状態の変化を観察することができる。A549細胞を、12MWプレートの完全増殖培地[F12K10FCS]に播種した。細胞をHGF[100ng/ml]で刺激する前に16時間飢餓状態に置き、試験を行うそれぞれのMabを、リガンド刺激の15分前に30μg/mlの最終濃度で加えた。HGF添加の15分後に氷冷ライシスバッファーを加えて、リン酸化反応を停止した。細胞を機械的に掻き出し、細胞溶解物を13,000rpm、4°C、10分間の遠心分離によって集め、細胞溶解物は上清相に相当する。タンパク質含量をBCAキットを用いて定量し、使用まで-20°Cで保管した。c-Metのリン酸化状態を、ELISAによって定量した。ヤギ抗c-MetMabRD参照番号AF276をキャプチャー抗体として用い4°Cで一晩コーティング、TBS-BSA5緩衝液による飽和段階室温RTで1時間の後、タンパク質溶解物25μgを、コーティングを施した96MWプレートのそれぞれのウェルに加えた。RTで90分間インキュベーションの後、プレートを4回洗浄し、検出抗体を加えた抗ホスホ-c-MetMab;1230、1234および1235位のリン酸化Tyr残基に対する。更に1時間インキュベーションして4回洗浄した後、HRPにカップリングした抗ウサギ抗体を室温で1時間加え、発光検出を、ルミノールを加えることによって行った。発光は、MithrasLB920マルチモードプレートリーダー上で読み取った。ベースラインおよびHGF[100ng/ml]誘発c-Met受容体リン酸化レベルはいずれも、PBS処理によってもまたは付加ヒトc-Met受容体をターゲットとしないマウスまたはヒトMabの添加によっても影響を受けなかった図1。一方、マウスm224G11Mabは、HGF[100ng/ml]誘発c-Metリン酸化を強力に阻害したが図2B、それだけで受容体リン酸化を変更しなかった図2A。驚くべきことには、ヒト定常ドメインIgG1/κと組み合わさったm224G11由来の可変ドメインVHVLを意味するキメラ形態の224G11Mab224G11chim/IgG1は、減少したアンタゴニスト効力と関連した強力なアゴニスト活性最大HGF効果17、図2Aを生じたHGF最大効果を75阻害するm224G11と比較して、HGF最大効果を54阻害、図2B。またヒトIgG1/κ主鎖上で構築された224G11Mabの3種類のヒト化形態である[224G11]Hz1/IgG1、[224G11]Hz2/IgG1および[224G11]Hz3/IgG1も、マウス224G11と比較して減少したアンタゴニスト効果と有意なアゴニスト活性最大HGFレベルの11~24を生じた図2Aおよび2B。重鎖ヒンジドメインの一連の遺伝子工学処理したバージョンを構築し、c-Met受容体リン酸化アッセイを行った。図3Aに示されるように、hIgG1/κアイソタイプと関連したアゴニスト効果の著しい減少がIgG2ベースの構築物と遺伝子工学処理したIgG1/κ構築物[MH、MUP9HおよびTH7]のいずれについても観察された。アンタゴニスト効果も、付随して増加した。最高のヒト配列を有するhIgG1/κベースのTH7ヒンジ変異体を選択して、ヒト化工程を完成した。次の段階で、224G11Mab可変ドメインの3種類のヒト化バージョンを、ヒトIgG2/κまたはIgG1/κベースのTH7遺伝子工学処理したヒンジ定常ドメインに組み合わせることによって作成した。hIgG2/κヒト化構築物については、ヒト化バージョンHz3は強力なアゴニズムを示し図4A、3種類すべてのヒト化バージョンについては、アンタゴニスト効果はネズミ224G11Mabで観察されたものより低く、およびキメラhIgG1ベースのMabに匹敵したHGF効果の阻害56~57、図4B。一方、3種類のヒト化バージョンHz1、Hz2またはHz3と遺伝子工学処理したIgG1/TH7変異体の組合せは、c-Met受容体リン酸化の弱いアゴニスト活性5~6のHGF効果および強力なアンタゴニスト効果HGF効果の阻害68~72に関してマウス224G11Mabの特性をほぼ完全に回復した図5Aおよび5B。これらの変異体は、キメラIgG1ベースの224G11Mabと比較して高度に改良されていたが、IgG2ベースのヒト化形態と比較しても高度に改良されていた。第二の一連の重鎖ヒンジドメインの遺伝子工学処理したバージョンを構築し、c-Met受容体リン酸化アッセイを行った。図17Aに示されるように、すべての新たなバージョンc224G11[C2]、c224G11[C3]、c224G11[C5]、c224G11[C6]、c224G11[C7]、c224G11[Δ1-3]、c224G11[C7Δ6]、c224G11[C6Δ9]、c224G11[C2Δ5-7]、c224G11[C5Δ2-6]、c224G11[C9Δ2-7]およびc224G11[Δ5-6-7-8]は、それらのアゴニズム活性がc224G11についての23と比較してHGF効果の6~14の間にあるので、c224G11より弱いアゴニスト効果を示した。c224G11[TH7]として、すべての新たなバージョンではアンタゴニスト効果が付随して増加した[図17B]。これらの結果は、点突然変異および/または欠失による重鎖ドメインの遺伝子工学処理は抗体のアゴニスト/アンタゴニスト特性を変更する可能性があることを示していた。例6:BRET分析最初のセットの実験では、無関連のマウスIgG1、ヒトIgG1およびヒトIgG2は、いずれのBRETモデルでもHGF誘発BRETシグナルの効果を持たなかった12回の独立した実験からの典型的実験;図6。これらのMabを、直ちにコントロールとして引用する。マウス224G11MabのIgG1キメラ形態[224G11]chimのc-Met二量体化およびc-met活性化BRETモデルに対する効果を評価した。マウス224G11Mabは、c-Met二量体化モデルではHGF誘発BRETシグナルの59.4を阻害したが、[224G11]chimMabは28.9しか阻害しなかった図7A。[224G11]chimおよびm224G11抗体はHGF誘発BRETシグナルをそれぞれ34.5および56.4阻害した図7Bので、[224G11]chim抗体はHGF誘発c-Met活性化の阻害にも余り有効ではなかった。更に、[224G11]chimはc-Met活性化に対してHGF誘発シグナルの32.9に対応する部分アゴニスト効果を有したが、m224G11単独ではc-Met活性化に全く効果がなかった。m224G11については21.3であったのに対して[224G11]chim単独ではHGF誘発シグナルの46.6に対応するBRET増加を誘発したので、この[224G11]chimの部分アゴニスト効果はc-Met二量体化BRETモデルでも見られた図7A。図8Aおよび8Bにおいて、224G11抗体のヒンジが突然変異したキメラ形態は、それぞれ[224G11][MHchim]、[224G11][MUP9Hchim]、[224G11][MMCHchim]および[224G11][TH7chim]についてHGF誘発活性化BRETシグナルを59.7、64.4、53.2および73.8阻害し図8B、HGF誘発c-Met二量体化BRETシグナルを61.8、64.4、52.5および64.4阻害した図8Aので、HGF誘発BRETシグナルに対して[224G11]chimよりも大きな阻害効果を示した。c-Met活性化に対して部分アゴニスト効果を有する[224G11]chimとは逆に、224G11抗体のヒンジが突然変異したキメラ形態は、m224G11について見られるようにc-Met活性化単独に対しては有意な効果を示さなかったそれぞれ5.1、7.6、-2.0および-6.9。図9Bでは、[224G11][TH7chim]と同様に、TH7ヒンジを有する224G11IgG1抗体の3種類のヒト化バージョンは、単独で試験したときには活性化モデルにBRETシグナルの有意な増加を誘発せず、HGF誘発BRETシグナルを強力に阻害した:Hz1、Hz2およびHz3形態について、それぞれ59.9、41.8および57.9。更に、[224G11][TH7Hz1]、[224G11][TH7Hz2]および[224G11][TH7Hz3]は、二量体化モデルではHGF誘発BRETシグナルを、それぞれ52.2、35.8および49.4阻害した図9A。[224G11]chimとは逆に、224G11IgG2抗体のキメラ形態[224G11][IgG2chim]は、単独では部分アゴニスト効果示さず、c-Met活性化モデルではHGF効果の66.3を阻害した図10B。c-Met二量体化モデルでは、[224G11][IgG2chim]は、HGF誘発BRETシグナルの62.4を阻害した図10A。重鎖ヒンジドメインの遺伝子工学処理したバージョンの第二の一連のアゴニスト効果を、c-Met活性化BRETモデルで評価した図18。c-Met活性化についての部分アゴニスト効果を有するc224G11とは対照的に、224G11抗体のc224G11[C2]、c224G11[C3]、c224G11[C5]、c224G11[C6]、c224G11[C7]、c224G11[Δ1-3]、c224G11[C7Δ6]、c224G11[C6Δ9]、c224G11[C2Δ5-7]、c224G11[C5Δ2-6]、c224G11[C9Δ2-7]およびc224G11[Δ5-6-7-8]ヒンジが突然変異したキメラ形態は、c-Met活性化単独については有意な効果を示さなかった。例7:キメラおよびヒト化224G11形態によるc-Met認識直接ELISAを開始し、組換えc-Met上での様々なキメラおよびヒト化形態の結合能を決定した。簡単に説明すれば、RDSystems製の組換え二量体性c-Metを、96穴のImmunlonIIプレート上に1.25μg/mlでコーティングした。4°Cで一晩インキュベーションした後、ウェルを0.5ゼラチン/PBS溶液で飽和した。次いで、プレートを37°Cで1時間インキュベーションした後、試験を行う抗体の2倍希釈液を加えた。プレートを更に1時間インキュベーションした後、ネズミの抗体を検出するためのヤギ抗マウスIgGHRPと、キメラおよびヒト化抗体認識のためのヤギ抗ヒトκ軽鎖HRPを加えた。プレートを1時間インキュベーションし、ペルオキシダーゼ基質TMBUptimaを加え、5分後に1MH2SO4で中和した。図11に示した結果は、すべての試験形態はc-Met認識について類似していることを示していた。例8:インビトロでのNCI-H441細胞のHGF誘発増殖に対するネズミおよびキメラ224G11の効果ATCCのNCI-H441細胞を、RPMI1640培地InvitrogenCorporationScotland英国、10FCS、1L-グルタミン中で常法により培養した。増殖アッセイのため、細胞を使用の3日前に継代し、プレートに播種する前に増殖のコンフルエント期になるようにした。NCI-H441細胞を、96穴組織培養プレートで200μlの無血清培地RPMI1640培地1L-グルタミン中で3.75x104細胞/ウェルの密度で播種した。24時間の培養後、試験を行う抗体をNCI-H441に加え、37°Cで30分間インキュベーションした後、HGFを400ng/ml5nMの最終濃度で更に142時間加えた。それぞれの抗体について試験した用量は、10~0.0097μg/mlそれぞれのウェルでの最終濃度の範囲である。この実験において、ネズミIgG1Mabをネズミアイソタイプコントロールとして加え、試験した抗体は下記のものであった:m224G11およびそのヒトIgG1キメラ形態であって、[224G11]chimとして同定されたもの。細胞単独-/HGFで培養したウェルも包含された。次いで、細胞を、[3H]チミジンAmershamBiosciencesABUppsalaスウェーデン0.25μCiで7時間および30分間パルス標識した。トリクロロ酢酸不溶性のDNAに取り込まれた[3H]チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。結果は、未変換cpmデーターとして表しており、腫瘍細胞に抗c-MetMabを単独で加えたときに起こり得る潜在的な固有アゴニスト活性を一層良好に評価できる。図12に示した結果は、予想されるように、ネズミ抗体m224G11は、癌細胞に単独で加えたときには、試験用量がいくらであってもアゴニスト効果を示さなかった。この実験でこの化合物について観察されたcpm変動に関するアイソタイプコントロールでは、HGF誘発増殖の有意な阻害は観察されなかった。m224G11抗体を単独で加えたときには、mIgG1アイソタイプコントロールMabまたは細胞単独と比較してアゴニスト効果を全く示さなかった。78に達する用量依存性抗増殖活性が、m224G11について見られた阻害の計算:100-[試験細胞Mabのcpm-バックグラウンドmIgG1の平均cpm×100/細胞HGFの平均cpm-細胞単独の平均cpm]。驚くべきことには、224G11Mabのキメラ形態を単独で加えたときには、有意な用量依存性アゴニスト効果を誘発した。このアゴニスト効果は、インビトロでのHGF誘発増殖阻害に影響し、ネズミ224G11についての78からそのキメラ形態についての50へと変化した。このような低めのインビトロでの固有アゴニスト活性が、未変化のインビボ効果と互換性があるかどうかを決定するため、m224G11および[224G11]chimの両方をインビボ試験のために産生した。上記検討では、30μg/マウスの用量は有意なインビボ活性を示したので、その用量をインビボ評価に選択した。例9:NCI-H441異種移植モデルでのネズミおよびキメラ224G11Mabのインビボ比較NCI-H441は、乳頭状肺腺癌に由来し、高レベルc-Metを発現し、c-MetRTKの構成性リン酸化を示す。NCI-H441異種移植モデルでの抗体のインビボ効果を評価するため、6~8週齢の無胸腺マウスを滅菌フィルターを頂部に取り付けたケージに収容し、無菌条件に保持し、仏国および欧州指針に準じて操作した。マウスに、9x106個の細胞を皮下投与した。次いで、細胞移植の6日後に、腫瘍は測定可能となり約100mm3、動物を類似した腫瘍サイズの6尾のマウスの群に分け、最初に抗体/マウスを60μgの初回量で投与し、次いで週2回それぞれの試験抗体を30μg/用量で投与した。マウスを、異種移植片増殖速度の観察のために追跡した。腫瘍体積は、式:πパイ/6×長さ×幅×高さによって計算した。図13に示した結果は、アゴニスト活性を欠いているネズミMabは、予想されるように、インビボでは低試験用量であっても強力なアンタゴニストとして機能することを示している。ネズミMabで見られたのとは対照的に、キメラ抗体は、大変一過性のインビボ活性を示し、腫瘍は細胞接種後20日で治療を完全に免れた。この実験は、アンタゴニスト活性の減少を生じるインビトロでのアゴニスト効果の増加も、インビボでのアンタゴニスト活性の有意な喪失に関与していることを明らかに示している。例10:NCI-H441細胞のインビトロでのHGF誘発増殖に対するネズミ224G11Mabならびにこの抗体の様々なキメラおよびヒト化バージョンの効果ATCCのNCI-H441細胞を、RPMI1640培地InvitrogenCorporationScotland英国、10FCS、1L-グルタミン中で常法により培養した。増殖アッセイのため、細胞を使用の3日前に継代し、プレートに播種する前に増殖のコンフルエント期になるようにした。NCI-H441細胞を、96穴組織培養プレートで200μlの無血清培地RPMI1640培地1L-グルタミン中で3.75x104細胞/ウェルの密度で播種した。24時間の培養後、試験を行う抗体をNCI-H441に加え、37°Cで30分間インキュベーションした後、HGFを400ng/ml5nMの最終濃度で更に142時間で加えた。それぞれの抗体について試験した用量は、10~0.0097μg/mlそれぞれのウェルでの最終濃度の範囲である。この実験において、ネズミIgG1Mabをネズミアイソタイプコントロールとしておよびアゴニストの負のコントロールとして加えた。試験した抗体は下記のものであった:im224G11、iiそれぞれ、[224G11]chim、[224G11][MHchim]、[224G11][MUP9Hchim]、[224G11][MMCHchim]、[224G11][TH7chim]として同定されるそのヒトIgG1キメラ形態、iiiそれぞれ、[224G11][Hz1]、[224G11][Hz2]、[224G11][Hz3]と表されるそのヒト化IgG1形態。細胞単独-/HGFで培養したウェルも包含された。ハイブリドーマ細胞系としてATCCで入手可能なGenetech製の5D5全長whole抗体を、完全アゴニストの正のコントロールとして導入し、その後m5D5と命名した。次いで、細胞を、[3H]チミジンAmershamBiosciencesABUppsalaスウェーデン0.25μCiで7時間および30分間パルス標識した。トリクロロ酢酸不溶性のDNAに取り込まれた[3H]チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。結果は、未変換cpmデーターとして表しており、腫瘍細胞に抗c-MetMabを単独で加えたときに起こり得る潜在的な固有アゴニスト活性を一層良好に評価できる。図14Aに記載の結果は、予想された通り、アイソタイプコントロールまたはm224G11のいずれもNCI-H441増殖に対してアゴニスト活性を全く示さないことを示していた。アイソタイプコントロールはHGF誘発細胞増殖に対して効果が見られなかったが、m224G11は、10μg/mlの最終濃度で加えたときには66阻害を示した。アゴニストコントロールとして用いたm5D5は、予想されたように、単独で細胞に加えたときには完全な用量依存性アゴニスト効果を示した。既に観察されているように、[224G11]chimMabは有意な用量依存性アゴニスト効果を示し、このキメラ形態の阻害活性は、ネズミ形態についての66の代わりに19と減少した。単独で加えると、3種類のIgG1ヒト化Mabは、m224G11形態と比較して用量依存性アゴニスト効果を示した。[224G11][Hz1]、[224G11][Hz2]および[224G11][Hz3]は、約46、30および35の類似するアンタゴニスト活性を示した。これらの活性は、m224G11について見られた活性より有意に低い。図14Bでは、様々なIgG1キメラ形態を試験した。NCI-H441細胞に単独で加えたときに用量依存性アゴニスト効果を示した[224G11]chim形態と比較して、[224G11][MHchim]、[224G11][MUP9Hchim]、[224G11][MMCHchim]、[224G11][TH7chim]形態は有意な固有アゴニスト効果を持たなかった。それらのアンタゴニスト活性は、m224G11Mab57について見られたものより高く、[224G11][MHchim]、[224G11][MUP9Hchim]、[224G11][MMCHchim]および[224G11][TH7chim]について阻害はそれぞれ79、78、84および93に達した。例11:224G11Mabの様々なIgG1ヒト化形態のインビトロ効果ATCCのNCI-H441細胞を、RPMI1640培地InvitrogenCorporationScotland英国、10FCS、1L-グルタミン中で常法により培養した。増殖アッセイのため、細胞を使用の3日前に継代し、プレートに播種するに増殖のコンフルエント期になるようにした。NCI-H441細胞を、96穴組織培養プレートで200μlの無血清培地RPMI1640培地1L-グルタミン中で3.75x104細胞/ウェルの密度で播種した。24時間の培養後、試験を行う抗体をNCI-H441に加え、37°Cで30分間インキュベーションした後、HGFを400ng/ml5nMの最終濃度で更に142時間で加えた。それぞれの抗体について試験した用量は、10~0.0097μg/mlそれぞれのウェルでの最終濃度の範囲である。この実験において、アゴニスト活性についてのネズミIgG1Mabをバックグラウンドの負のコントロールとして加え、試験した抗体は下記のものであった:im224G11、iiそれぞれ、[224G11]chim、[224G11][TH7chim]として同定されたそのヒトIgG1キメラ形態、iiiそれぞれ、[224G11][TH7Hz1]、[224G11][TH7Hz3]と表されるそのヒト化IgG1形態。細胞単独-/HGFで培養したウェルも包含された。ハイブリドーマ細胞系としてATCCから入手可能なGenetech製の5D5全長抗体を、完全アゴニストの正のコントロールとして導入し、その後m5D5と命名した。次いで、細胞を、[3H]チミジンAmershamBiosciencesABUppsalaスウェーデン0.25μCiで7時間および30分間パルス標識した。トリクロロ酢酸不溶性のDNAに取り込まれた[3H]チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。結果は、未変換cpmデーターとして表しており、腫瘍細胞に抗c-MetMabを単独で加えたときに起こり得る潜在的な固有アゴニスト活性を一層良好に評価できる。図15は、m224G11Mabが通常の阻害効果74阻害を示したことを示していた。キメラIgG1形態[224G11]chimは、予想されたように、用量依存性の固有アゴニスト効果、およびネズミ形態と比較して低めのアンタゴニスト効果を示した:74阻害に対して33。[224G11][TH7chim]は、この実験では極めて弱いアゴニスト活性を有した。しかしながら、それは、ネズミMabについて見られたものに近い高い阻害効果81を示した。2種類のヒト化形態は、固有アゴニスト効果を持たず、またネズミMabまたは[224G11][TH7chim]について見られたものに近いアンタゴニスト活性を有しており、[224G11][TH7Hz1]および[224G11][TH7Hz3]についてはそれぞれ67および76阻害であった。例12:野生型またはTH7-遺伝子工学処理したヒンジNCI-H441異種移植モデルを有するネズミ、キメラおよびヒト化224G11Mabのインビボ比較NCI-H441は、乳頭状肺腺癌由来であり、高レベルのc-Metを発現し、c-MetRTKの構成的リン酸化を明らかにしている。224G11ネズミの抗体のインビボ活性をセーブするためのヒンジの遺伝子工学処理の必要性を評価するため、6~8週齢の無胸腺マウスを、滅菌フィルターを頂部に取り付けたケージに収容し、無菌条件に保持し、仏国および欧州指針に準じて操作した。マウスに、9x106個の細胞を皮下接種した。次いで、細胞移植の6日後に、腫瘍は測定可能となり約100mm3、動物を類似した腫瘍サイズの6尾のマウスの群に分け、最初に抗体/マウスを2mgの初回量で投与し、次いで週2回それぞれの試験抗体を1mg/用量で投与した。m224G11、野生型ヒンジc224G11を示すキメラ形態、TH7遺伝子工学処理キメラ形態224G11[TH7chim]、野生型ヒンジを有する3種類のヒト化形態224G11[IgG1Hz1]、224G11[IgG1Hz2]および224G11[IgG1Hz3]、および3種類の対応するTH7-遺伝子工学処理形態224G11[TH7Hz1]、224G11[TH7Hz2]および224G11[TH7Hz3]を含む10種類の抗体を、この実験で評価した。マウスを、異種移植片増殖速度の観察のために追跡した。腫瘍体積は、式:πパイ/6×長さ×幅×高さによって計算した。図16に示した結果は、アゴニスト活性を欠いているネズミMabは、予想されるように、インビボでは強力なアンタゴニストとして機能することを示している。ネズミMabで見られたのとは対照的に、野生型ヒンジを有するキメラおよびヒト化抗体はいずれも、大変一過性のインビボ活性のみを示した。いずれにせよ、野生型ヒンジをTH7遺伝子工学処理したものに代えることによって、ネズミ抗体で見られたインビボ活性が完全に回復した。この実験は、アンタゴニスト活性の減少を生じるインビトロでのアゴニスト効果の増加も、インビボでのアンタゴニスト活性の有意な喪失に関与していることを明らかに示している。ネズミMabのインビボ特性を保持するには、野生型の代わりにTH7遺伝子工学処理領域が必要であることも示している。例13:インビトロでのc-Metダウンレギュレーションに対するm224G11およびそのヒト化形態h224G11の効果下記の例では、紛らわしさを回避するため、h224G11という表現は、本発明の抗体のヒト化形態224G11[TH7Hz3]を指す。c-Met受容体分解に対する抗c-Met抗体の活性を検討するために、2種類の細胞系を選択した。A549HTB-174およびNCI-H441CCL-185は、ATCCコレクションからの2種類のNSCLC細胞系である。NCI-H441細胞を、6穴プレートで、RPMI16401L-グルタミン10の熱不活性化したFBS中に、3x104細胞/cm2で、37°Cにて5CO2雰囲気中で24時間播種した。A549細胞を、6穴プレートで、F12K10の熱不活性化したFBS中に、2x104細胞/cm2で、37°Cにて5CO2雰囲気中で24時間播種した。次いで、細胞をリン酸緩衝食塩水PBSを用いて2回洗浄した後、更に24時間血清飢餓状態とした。抗c-Met抗体10μg/ml、無関連のmIgG110μg/ml、またはHGF400ng/mLを、無血清DMEM培地に37°Cで加えた。4時間または24時間インキュベーションした後、培地を徐々に除き、細胞を冷PBSで2回洗浄した。細胞を、500μlの氷冷ライシスバッファー[50mMTris-HClpH7.5;150mMNaCl;1NonidetP40;0.5デオキシコール酸;および1錠の完全プロテアーゼ阻害剤カクテル1アンチホスファターゼ]で溶解した。細胞溶解物を4°Cで90分間振盪し、15,000rpmで10分間遠心分離した。この段階において、細胞溶解物をウェスタンブロット分析で必要とされるまで-20°Cで保管することができた。タンパク質濃度は、BCAを用いて定量した。全細胞溶解物20μl中5μgをSDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を0.1TBS-Tween20TBST;5乾燥脱脂粉乳で室温にて1時間飽和し、TBST-5乾燥脱脂粉乳中で4°Cにて抗c-Met抗体希釈度1/1000で反応させた。抗体は、1乾燥脱脂粉乳を含むトリス緩衝食塩水-0.1Tween20v/vTBSTで希釈した。次いで、膜をTBSTで洗浄し、ペルオキシダーゼ接合二次抗体希釈度1:1000と共に室温で1時間インキュベーションした。免疫反応性タンパク質を、ECLで可視化した。c-Met可視化の後、膜を再度TBSTで洗浄し、TBST-5乾燥脱脂粉乳中でマウス抗GAPDH抗体希釈度1/200000と共にRTで1時間インキュベーションした。次いで、膜をTBSTで洗浄し、ペルオキシダーゼ接合二次抗体と共に室温で1時間インキュベーションした。膜を洗浄し、GAPDHを、ECLを用いて明らかにした。バンド強度は、デンシトメトリーによって定量した。図19Aおよび20Aに示した結果は、m224G11およびh224G11はA549およびNCI-H441細胞系のいずれにおいても用量依存的にc-Metを有意に下降調節することができることを示していた。この下降調節は4時間のインキュベーション時間後には既に有意であり、24時間後更に増加した。図19Aおよび20Aに示したヒトスグラムは、それぞれ4および3回の独立した実験の平均値に相当する。1つの有意な実験に対応するウェスタンブロット分析画像を、図19Bおよび20Bに包含させた。例14:インビトロでのc-Metシェディングに対するm224G11およびそのヒト化形態h224G11の効果c-Met受容体の可溶性シェディング形態は、天然ではヒト腫瘍を異種移植したマウスの血清またはc-Metを発現している腫瘍を有するヒト患者の血清に見られる。更に、DN30Mabのようなc-Metに対する抗体は、インビトロ実験におけるc-Metシェディング誘発因子として記載されている。m224G11がそのような特性を有するかどうかを決定するため、細胞を6穴プレートで、10FCS培地中に播種した。細胞が80コンフルエンスに達したときに、培地を除去し、新鮮な完全培地/-試験を行う化合物を加えた。細胞を、m224G11、アイソタイプコントロールmIgG1またはPBSと共に更に72時間インキュベーションした。PMAホルボールミリステートアセテートを、シェディング誘発因子として導入した。HGFも細胞で試験し、天然に存在するシェディングに対するc-Metリガンドの影響を決定した。次いで、上清を集めて0.2μmフィルターで濾過した後、ELISA試験を用いて、c-Metの可溶性形態をm224G11またはc11E1と同じエピトープを認識しない抗c-Met抗体で捕捉した図21。更に、それぞれのウェル由来の細胞をPBSで洗浄し、溶解して、タンパク質濃度を決定した。ELISAのため、224D10をキャプチャー抗体として用い、プレート飽和の後、6穴プレートからの濾過した上清をELISA試験に加えた。モノマー性c-Met形態を、正のコントロールとして用いた。上清をインキュベーションした後、プレートを洗浄して未結合c-Metを除去し、c11E1を用いて224G11Mabによって捕捉されたc-Metを検出した。試験の顕色は、HRP接合抗hFcポリクローナル抗体を添加することによって最後に行った。図22に示される結果は、c-Metの天然シェディングは、細胞をインビトロで72時間培養したときに起きたことを示している。mIgG1の効果は見られなかった。しかしながら、m224G11の添加はc-Metシェディングを阻害すると思われた。これらの結果は、図23の他の3種類の細胞系Hs746T、EBC1およびMKN45について確かめられた。その第二の実験では、正のシェディング誘発因子として加えたPMAは、予想した通り、c-Metシェディングを少なくとも2細胞系Hs746TおよびMKN45で有意に増加した。最後に、第三の実験では図24、HGFをコントロールとして導入した。細胞単独または細胞mIgG1と比較して、HGFによっては更なるシェディングは誘発されなかった。また、c-Metシェディングの有意な阻害は、m224G11で再度観察された。例15:様々な細胞系に対するh224G11Abの本質的効果本発明の上記実験では、5D5などの他の抗体で見られたのとは対照的に、m224G11およびそのヒト化形態h224G11は有意な固有活性腫瘍細胞系を示さないことが明らかになった。この特性を他の細胞系にひろげるため、Hs746T、NCI-H441、Hs578T、NCI-H125、T98G、MDA-MB-231、PC3など様々なレベルのc-Met発現を有する癌細胞系のセットで、ウェスタンブロット分析およびホスホELISA実験を様々な時間に加えた抗体単独で行った。同じ試験は、正常細胞HUVECでも行った。ホスホcMetELISAアッセイの方法は、本特許明細書の例5に既に記載した。ウェスタンブロット分析については、タンパク質溶解物をペレット化した細胞からプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤[10nMTrispH7.4、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA、0.5NonidetP40、100mMフッ化ナトリウム、10mMピロリン酸ナトリウム、2mMオルトバナジウム酸ナトリウム、2mMPMSF、10mg/mlロイペプチン、10mg/mlアプロチニン]を用いて4°Cでライシスバッファー中でインキュベーションすることによって作製した。タンパク質溶解物を遠心分離によって細胞破片を除き、8SDS-PAGEゲル上で電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜にエレクトロトランスファーした。c-Met実験については、溶解物を目的とする特異的タンパク質について免疫沈降させた後、電気泳動およびトランスファーした。図25~32に示された結果も、h224G11抗体の固有活性は、試験細胞で見られなかったことを再度明らかにしている。例16:ネズミ野生型224G11と、224G11[C2D5-7]NCI-H441異種移植モデルとして記載されたキメラヒンジ遺伝子工学処理224G11形態とのインビボ比較NCI-H441は、乳頭状肺腺癌由来であり、高レベルのc-Metを発現し、c-MetRTKの構成的リン酸化を示す。224G11ネズミの抗体のインビボ活性をセーブするためのヒンジの遺伝子工学処理の必要性を評価するため、6~8週齢の無胸腺マウスを、滅菌フィルターを頂部に取り付けたケージに収容し、無菌条件に保持し、仏国および欧州指針に準じて操作した。マウスに、9x106個のNCI-H441細胞を皮下接種した。次いで、細胞移植の6日後に、腫瘍は測定可能となり約100mm3、動物を類似した腫瘍サイズの6尾のマウスの群に分け、最初に抗体/マウスを2mgの初回量で投与し、次いで週2回それぞれの試験抗体を1mg/用量で投与した。マウスを、異種移植片増殖速度の観察のために追跡した。腫瘍体積は、式:πパイ/6×長さ×幅×高さによって計算した。図33に示した結果は、インビトロではアゴニスト活性を欠いているネズミMabは、予想されるように、強力なインビボアンタゴニストとして機能することを示している。インビトロで得られた結果から示唆されるように、リン酸化アッセイでは、有意なアゴニスト効果を示さなかったc224G11[C2D5-7]ヒンジ遺伝子工学処理した抗体は、NCI-H441異種移植モデルに対するm224G11の活性に匹敵する強力なインビボ活性を示す。例17:ADCC試験におけるh224G11の評価h224G11はIgG1アイソタイプであるので、ADCCはヒトにおけるそのインビボ効果の部分である可能性がある。インビトロでの[51Cr]放出細胞傷害性アッセイは、ターゲット細胞としてHs746TまたはNCI-H441細胞と、ヒト末梢血単核リンパ球から精製したNK細胞を用いて行った。簡単に説明すれば、百万個のHs746TまたはNCI-H441ターゲット細胞を、100μCiの51クロムの存在下にて20μgのh224G11Abと共にまたはなしで、1時間インキュベーションした。次いで、4x103個の細胞を、末梢血単核細胞PBMCから単離したヒト天然キラーNK細胞と共にNegativeselectionを用いて培養した。細胞を、一緒にして更に4時間、37°Cでインキュベーションした。細胞溶解率は、下式から計算した:[実験での51Cr放出-自発的51Cr放出/完全な51Cr放出-自発的51Cr放出]×100。自発的放出は、ターゲット細胞を天然キラー細胞の非存在下で培養したときに得られるカウント数を表す。完全放出は、ターゲット細胞を1TritonX-100で溶解したときに得られるカウント数を表す。h224G11は、NK/ターゲット細胞比100では、Hs746T図34AおよびNCI-H441図34B細胞の溶解を、それぞれ62.9および63.2有意に増加した。例18:免疫組織化学的検討IHCパラフィン包埋腫瘍IHC染色の手順:冷凍腫瘍の8~12μM切片を、予め冷却した-20°Cのアセトンで直ぐに3分間固定した。次に、スライドを室温で30分間~1時間冷却した。PBSで2回洗浄した後、内在性ペルオキシダーゼ活性をペルオキシダーゼ遮断試薬を用いて5分間遮断した。切片をPBSで洗浄して、アビジン/ビオチン遮断試薬中でインキュベーションした直後、非特異的部位をPBS-BSA4で室温にて30分間飽和した。次いで、スライドを、ビオチン化h224G1150~10μg/mlまたはヒトビオチン化IgG1/κ50~10μg/ml、結合部位をネガティブコントロールとして室温にて2時間インキュベーションした。切片をPBSで洗浄し、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体ユニバーサルと共に30~45分間インキュベーションした。3-アミノ-9-エチルカルバゾールを用いて、赤色反応生成物を発色させた。スライドをヘマトキシリンに4分間浸漬して対比染色した。結果を、図35A~Cに示す。h224G11は、様々な腫瘍タイプの細胞膜を差別的に染色する。この免疫組織化学の手順では、赤色反応生成物は細胞膜の正の染色に相関し、赤色反応生成物の欠如は負の染色および細胞膜が可視化されないことと相関している。IgGコントロールであるヒトIgG1/κは、コントロールと同等のアイソタイプである。例19:c-METを増幅し、マウスに異種移植された3つの細胞系に対する抗c-METMabのインビボ活性2種類の胃癌細胞であるHs746TATCCおよびMKN45JCRB、ならびに肺扁平上皮癌であるEBC-1JCRBは、図36A、37Aおよび38AでFACS解析によって示されるように、c-Metを過剰発現する3つの細胞系である。またこれらの細胞系は、c-Metの増幅細胞系として文献に記載されている。後者の点を確認するために、c-Met遺伝子増幅を、ΔΔCt法を用いた定量リアルタイムPCRにより測定した。それぞれ示した細胞系からQIAampDNAmidikitQiagenLesUlisFRを用いて50ngのゲノムDNAを抽出して用いた。参照遺伝子は、染色体17に位置するDNAトポイソメラーゼIIIアルファであった。c-MET遺伝子に対するプライマーはエクソン14に位置した。両方の遺伝子に対応するプライマーはSmolenetal.PNAS200610323162321に記載されており、同様なPCR効率が得られるものである。QPCRプロトコールは、95°Cで10分サイクル後、95°Cで15秒/95°Cで45秒を連続40サイクルからなる。データーは、最初に参照遺伝子で標準化し、その後各細胞系をハプロイドゲノムごとにc-Met遺伝子のシングルコピーを含有するMCG-7細胞で標準化した。図36B、37Bおよび38Bに示される結果は、3つの細胞系が5~10倍の遺伝子増幅と評価される有意なc-Met増幅を示したことを表している。この様な細胞はc-Metについて構成的に活性化されることが示されているので、ウエスタンブロットアッセイを行い、HGF50ng/mlの非存在下または存在下のいずれかで各細胞系のc-Metリン酸化のレベルを測定した。この目的のため、細胞は、無血清培地で一晩培養した後、50ng/mlのHGFで2分間処理するか、あるいは処理しなかった。細胞は、プロテアーゼ阻害剤を補足したライシスバッファーで溶解した。細胞溶解液は、4°Cで90分間インキュベートした後、遠心分離し、上清を回収した。タンパク質濃度をBCAタンパクアッセイPierceを用いて測定し、サンプルをイムノブロットした。抗c-Met抗体、CellSignalingのクローン25H2およびBiosourceの抗P-c-MetY1230、1234、1235を含有する抗生物質を用いた。Y1230/1234/1235に対するホスホ-特異的c-Met抗体を用いたイムノブロッティングは、各増幅細胞系において強いベースラインの受容体リン酸化を示した図36C、37Cおよび38C。これらの細胞にHGFを添加した場合は、追加のリン酸化は見られなかった。この最後の観察は、Hs746T、MKN45およびEBC-1細胞系では、c-MetはHGF非依存性経路により活性化されることを確認する。リガンド非依存性細胞系に対するインビボでの発明者らの抗c-Met抗体を試験するために、Hs746T、MKB45およびEBC-1細胞を、常法にしたがって完全DMEM、RPMI1640またはEMEM培地でそれぞれ培養した。細胞を移植前の2日間継代し、指数増殖期になるようにした。700万の細胞をSCIDHs746TおよびEBC-1についてまたはCD1スイスヌードマウスMKN45についてのいずれかに移植した。移植後5~7日目に、腫瘍は測定可能になり、腫瘍サイズを比較して動物を6尾のマウスのグループに分けた。マウスを、2mgh224G11Mab/マウスの初回量で腹腔内処理した後、週に2回1mg抗体/マウスで処理した。腫瘍体積は、週に2回測定し、式:πパイ/6×長さ×幅×高さにより算出した。Mann-Whitney試験を用いて各測定時間における統計解析を行った。この実験は、h224G11が、Hs746T、MKN45およびEBC1の腫瘍増殖を有意に減少することを表しており図36D、37Dおよび38D、ヒト化抗体が胃および肺リガンド非依存性細胞系の腫瘍増殖を阻害できることをすることを示す。これらの結果が得られる前は、ヒト化抗体の修飾されたヒンジの存在がどのようにそのc-Metリガンド非依存性化に影響を及ぼすのかは、変更されたヒンジがそのアゴニスト/アンタゴニスト特性にも影響するため、明らかではなかった。例20:SCIDマウスにおけるHs746T異種移植モデルに対するh224G11活性のエクスビボ解析hs746T腫瘍異種移植阻害を生じる反応のより正確な機構を決定するために、3つのh224G11の腹腔内接種の影響を、腫瘍有糸分裂インデックスKi67、アポトーシス活性化カスパーゼ3およびc-Met発現について免疫組織化学IHC法を用いて評価した。3尾のマウスをそれぞれの状態について分析した。コントロールのものと比較して処理した腫瘍において有意なc-Metのダウンレギュレーションが観察されたそれぞれ、図39CおよびD。図39AおよびBパネルは、アイソタイプコントロールに相当する。さらに、有意なKi67レベルの減少図39EおよびFおよび活性化カスパーゼ3染色の増加図39EおよびFが全ての所為した腫瘍においてみられ、これはH224G11が有意に細胞増殖を阻害し、腫瘍内の細胞アポトーシスを誘発できることを示す。"