"リソソーム酵素のレベルまたは活性の減少を伴うリソソーム蓄積症に罹患しているか、またはこれに罹患しやすい対象に、リソソーム酵素の補充酵素を約5mg/mlを上回る濃度で含む組成物を髄腔内投与するステップを含む、方法。前記補充酵素が約10mg/mlを上回る濃度である、請求項1に記載の方法。前記組成物が、i緩衝剤、ii界面活性剤またはiii等張化剤のうちの1つ以上をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。前記組成物のpHが約3.0~8.0である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記組成物を5mL未満の単回用量体積で投与する、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記組成物を3mL未満の単回用量体積で投与する、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。前記組成物の髄腔内投与が、対象において実質的な有害作用を生じない、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。前記組成物の髄腔内投与が、T細胞性の適応免疫応答を生じない、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。リソソーム酵素のレベルまたは活性の減少を伴うリソソーム蓄積症に罹患しているか、またはこれに罹患しやすい対象に、リソソーム酵素の補充酵素を合成CSFではない製剤中に含む組成物を髄腔内投与するステップを含む、方法。前記補充酵素が約5mg/mlを上回る濃度である、請求項9に記載の方法。リソソーム酵素のレベルまたは活性の減少を伴うリソソーム蓄積症に罹患しているか、またはこれに罹患しやすい対象に、リソソーム酵素の補充酵素を含む組成物を髄腔内投与するステップを含み、投与が、免疫抑制剤の同時治療を行わない、前記組成物の髄腔内投与を含む、方法。治療する対象における免疫耐性誘導を含まない、請求項11に記載の方法。T細胞免疫抑制を用いた対象の前治療または前処置を含まない、請求項12に記載の方法。リソソーム酵素のレベルまたは活性の減少を伴うリソソーム蓄積症に罹患しているか、またはこれに罹患しやすい対象に、リソソーム酵素の補充酵素を含む組成物を、脳、脊髄および末梢器官の1つ以上の組織においてリソソーム酵素の正常なレベルまたは活性の少なくとも10が達成される治療有効量および投与間隔で髄腔内投与するステップを含む、方法。前記脳の1つ以上の組織が髄膜組織を含む、請求項14に記載の方法。前記髄膜組織が、軟膜組織、硬膜組織およびクモ膜組織からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。前記脳の1つ以上の組織が大脳の組織を含む、請求項16に記載の方法。前記大脳の組織が、大脳の表面組織または浅部組織である、請求項17に記載の方法。前記大脳の表面組織または浅部組織が、軟膜組織、大脳皮質リボン組織、大脳の表面から4mm以内の組織およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項18に記載の方法。前記大脳の組織が大脳の深部組織である、請求項17に記載の方法。前記大脳の深部組織が、大脳皮質リボンよりも下の組織、大脳の表面から4mmよりも下の組織、大脳の表面から6mmよりも下の組織、大脳の表面から10mmよりも下の組織およびこれらの組合せ組織からなる群より選択される、請求項20に記載の方法。前記脳の1つ以上の組織が小脳の組織を含む、請求項14に記載の方法。前記小脳の組織が、分子層の組織、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項22に記載の方法。前記小脳の組織が小脳の深部組織である、請求項22に記載の方法。前記小脳の深部組織が、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織および深部小脳核組織からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。前記1つ以上の脳の組織が脳幹の組織を含む、請求項14に記載の方法。前記脳幹の組織が、脳幹白質組織および/または脳幹核組織からなる群より選択される、請求項26に記載の方法。前記脊髄の1つ以上の組織が、脊髄の表面組織または浅部組織である、請求項14に記載の方法。前記脊髄の表面組織または浅部組織が、軟膜、白質束および脊髄表面の表面から4mm以内の組織からなる群より選択される、請求項28に記載の方法。前記脊髄の1つ以上の組織が脊髄の深部組織である、請求項14に記載の方法。前記脊髄の深部組織が、脊髄灰白質および上衣細胞、ならびに脊髄表面の表面から4mmよりも下の組織からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。前記脳の1つ以上の組織が表面組織または浅部組織を含む、請求項14に記載の方法。前記表面組織または浅部組織が、髄膜の軟膜組織、硬膜組織およびクモ膜組織、軟膜組織、大脳皮質リボン組織、大脳の表面から4mm以内の組織およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項32に記載の方法。前記組織が深部組織を含む、請求項14に記載の方法。前記深部脳組織が、大脳の深部白質、脊髄の深部灰白質、脳梁、脳室周囲組織、視床、海馬采、大脳皮質リボンよりも下の組織、大脳の表面から4mmよりも下の組織、大脳の表面から6mmよりも下の組織、大脳の表面から10mmよりも下の組織、プルキンエ細胞層、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織、および深部小脳核組織、ならびにこれらの組合せから選択される、請求項34に記載の方法。前記治療有効量が0.005mg/脳重量kg~100mg/脳重量kgの範囲にある、請求項14~35のいずれか1項に記載の方法。前記治療有効量が1mg/脳重量kgよりも大きい、請求項14~35のいずれか1項に記載の方法。前記治療有効量が10mg/脳重量kgよりも大きい、請求項14~35のいずれか1項に記載の方法。前記治療有効量が30mg/脳重量kgよりも大きい、請求項14~35のいずれか1項に記載の方法。前記投与間隔が2週間に1回である、請求項14~39のいずれか1項に記載の方法。前記投与間隔が1か月に1回である、請求項14~39のいずれか1項に記載の方法。前記投与間隔が2か月に1回である、請求項14~39のいずれか1項に記載の方法。リソソーム酵素のレベルまたは活性の減少を伴うリソソーム蓄積症に罹患しているか、またはこれに罹患しやすい対象に、リソソーム酵素の補充酵素を含む組成物を髄腔内投与するステップを含み、投与が、前記補充酵素が外表面から少なくとも少なくとも5mm下の脳深部組織へ送達されるような前記組成物の髄腔内投与を含む、方法。前記補充酵素が、外表面の少なくとも10mm下の深部脳組織へ送達される、請求項43に記載の方法。前記補充酵素が、深部脳組織のリソソームへ特異的に送達される、請求項43に記載の方法。前記深部脳組織が、大脳の深部白質、脊髄の深部灰白質、脳梁、脳室周囲組織、視床、海馬采、大脳皮質リボンよりも下の組織、大脳の表面から4mmよりも下の組織、大脳の表面から6mmよりも下の組織、大脳の表面から10mmよりも下の組織、プルキンエ細胞層、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織、および小脳核組織、ならびにこれらの組合せから選択される、請求項43、44および45のいずれか1項に記載の方法。リソソーム酵素のレベルまたは活性の減少を伴うリソソーム蓄積症に罹患しているか、またはこれに罹患しやすい対象に、ヒト細胞から産生されたリソソーム酵素の補充酵素を含む組成物を髄腔内投与するステップを含む、方法。前記リソソーム蓄積症が、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコース症、ガラクトシアリドーシスI型/II型、ゴーシェ病I型I/II型/III型、グロボイド細胞白質ジストロフィー、クラッベ病、グリコーゲン蓄積症II、ポンペ病、GM1-ガングリオシド症I型/II型/III型、GM2-ガングリオシド症I型、テイサックス病、GM2-ガングリオシド症II型、サンドホフ病、GM2-ガングリオシド症、α-マンノース症I型/II型、β-マンノース症、異染性白質ジストロフィー、ムコ脂質症I型、シアリドーシスI型/II型、ムコ脂質症II型/III型、I細胞病、ムコ脂質症IIIC型偽性ハーラーポリジストロフィー、ムコ多糖症I型、ムコ多糖症II型、ハンター症候群、ムコ多糖症IIIA型、サンフィリッポ症候群A、BまたはC型、ムコ多糖症IIIB型、ムコ多糖症IIIC型、ムコ多糖症IIID型、ムコ多糖症IVA型、モルキオ症候群、ムコ多糖症IVB型、ムコ多糖症VI型、ムコ多糖症VII型、スライ症候群、ムコ多糖症IX型、多種スルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症、CLN1バッテン病、CLN2バッテン病、ニーマンピック病A型/B型、ニーマンピック病C1型、ニーマンピック病C2型、濃化異骨症、シンドラー病I型/II型、ゴーシェ病およびシアル酸蓄積症からなる群より選択される、請求項1~47のいずれか1項に記載の方法。前記リソソーム蓄積症が、ハンター症候群、異染性白質ジストロフィーMLD症、サンフィリッポ症候群A型、サンフィリッポ症候群B型およびグロボイド細胞白質ジストロフィーGLD症からなる群より選択される、請求項1~48のいずれか1項に記載の方法。前記補充酵素が、組換えイズロン酸-2-スルファターゼI2S、アリールスルファターゼAASA、ヘパランN-スルファターゼHNS、α-N-アセチルグルコサミニダーゼNagluおよびβ-ガラクトシダーゼGLCからなる群より選択される、請求項49に記載の方法。前記補充酵素がマンノース-6-リン酸M6P残基を含む、請求項1~50のいずれか1項に記載の方法。前記補充酵素が、リソソーム標的化部分を含む融合タンパク質である、請求項1~51のいずれか1項に記載の方法。前記補充酵素が、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および/または髄膜細胞へ送達される、請求項1~52のいずれか1項に記載の方法。前記補充酵素が、さらに脊髄のニューロンへ送達される、請求項1~53のいずれか1項に記載の方法。前記髄腔内投与が、前記補充酵素の末梢標的組織内への全身送達を生じさせる、請求項1~54のいずれか1項に記載の方法。末梢標的組織が、肝臓、腎臓、脾臓および/または心臓から選択される、請求項55に記載の方法。前記髄腔内投与が、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび/または末梢標的組織内での補充酵素のリソソーム局在化を生じさせる、請求項1~56のいずれか1項に記載の方法。前記髄腔内投与が、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび/または末梢標的組織におけるGAG蓄積生じさせる、請求項1~57のいずれか1項に記載の方法。前記GAG蓄積が、対照と比較して少なくとも20、40、50、60、80、90、1倍、1.5倍または2倍だけ減少する、請求項58に記載の方法。前記髄腔内投与が、ニューロンにおける空胞化生じさせる、請求項1~59のいずれか1項に記載の方法。前記ニューロンがプルキンエ細胞を含む、請求項60に記載の方法。前記髄腔内投与が、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび/または末梢標的組織において補充酵素の酵素活性の増加を生じさせる、請求項1~61のいずれか1項に記載の方法。前記酵素活性が、対照と比較して少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍または10倍だけ増加する、請求項62に記載の方法。前記増加した酵素活性が、少なくとも約10nmol/時mg、20nmol/時mg、40nmol/時mg、50nmol/時mg、60nmol/時mg、70nmol/時mg、80nmol/時mg、90nmol/時mg、100nmol/時mg、150nmol/時mg、200nmol/時mg、250nmol/時mg、300nmol/時mg、350nmol/時mg、400nmol/時mg、450nmol/時mg、500nmol/時mg、550nmol/時mgまたは600nmol/時mgである、請求項62または63に記載の方法。前記酵素活性が腰部領域において増加する、請求項64に記載の方法。前記腰部領域において増加した酵素活性が、少なくとも約500nmol/時mg、600nmol/時mg、700nmol/時mg、800nmol/時mg、900nmol/時mg、1000nmol/時mg、1500nmol/時mg、2000nmol/時mg、3000nmol/時mg、4000nmol/時mg、5000nmol/時mg、6000nmol/時mg、7000nmol/時mg、8000nmol/時mg、9000nmol/時mgまたは10,000nmol/時mgである、請求項65に記載の方法。前記リソソーム蓄積症が末梢症状を伴い、かつ前記方法が対象への前記補充酵素の静脈内投与をさらに含む、請求項1~66のいずれか1項に記載の方法。前記静脈内投与が月1回投与以下の頻度である、請求項67に記載の方法。前記リソソーム蓄積症が末梢症状を伴い、かつ前記方法が対象への前記補充酵素の静脈内投与を含まない、請求項1~68のいずれか1項に記載の方法。ハンター症候群の治療方法であって、治療を必要とする対象に、組換えイズロン酸-2-スルファターゼI2S酵素を、ハンターハンター症候群の少なくとも1つの症状または特徴の強度、重症度もしくは頻度が減少するか、またはハンターハンター症候群の発症が遅延する治療有効量および投与間隔で髄腔内投与するステップを含む、方法。前記ハンター症候群の少なくとも1つの症状または特徴が、認知障害;白質病変;脳実質、神経節、脳梁および/または脳幹における血管周囲腔の拡大;萎縮;ならびに/あるいは脳室拡大である、請求項70に記載の方法。異染性白質ジストロフィーMLD症の治療方法であって、治療を必要とする対象に、アリールスルファターゼAASA酵素を、MLD症の少なくとも1つの症状または特徴の強度、重症度もしくは頻度が減少するか、またはMLD症の発症が遅延する治療有効量および投与間隔で髄腔内投与するステップを含む方法。前記MLD症の少なくとも1つの症状または特徴が、頭蓋内圧上昇、代償性水頭症、中枢神経系および末梢神経系のミエリン鞘ならびに内臓器官への硫酸化糖脂質の蓄積、CNSおよびPNS内での進行性脱髄および軸索消失、ならびに/あるいは運動および認知障害である、請求項73に記載の方法。サンフィリッポ症候群A型サンフィリッポA疾患の治療方法であって、治療を必要とする対象に、組換えヘパランN-スルファターゼHNS酵素を、サンフィリッポA疾患の少なくとも1つの症状または特徴の強度、重症度もしくは頻度が減少するか、またはサンフィリッポA疾患の発症が遅延する治療有効量および投与間隔で髄腔内投与するステップを含む方法。サンフィリッポ症候群B型サンフィリッポB疾患の治療方法であって、治療を必要とする対象に、組換えα-N-アセチルグルコサミニダーゼNaglu酵素を、サンフィリッポB疾患の少なくとも1つの症状または特徴の強度、重症度もしくは頻度が減少するか、またはサンフィリッポB疾患の発症が遅延する治療有効量および投与間隔で髄腔内投与するステップを含む方法。前記サンフィリッポAまたはサンフィリッポB疾患の少なくとも1つの症状または特徴が、聴力損失、言語障害遅延、運動能力欠如、活動亢進、知的障害、攻撃性および/または睡眠障害である、請求項75または76に記載の方法。前記組換えNaglu酵素が、Nagluとリソソーム標的化部分とを含む融合タンパク質である、請求項77に記載の方法。前記リソソーム標的化部分がIGF-IIである、請求項78に記載の方法。グロボイド細胞白質ジストロフィーGLD症の治療方法であって、治療を必要とする対象に、組換えβ-ガラクトシダーゼGLC酵素を、GLD症の少なくとも1つの症状または特徴の強度、重症度もしくは頻度が減少するか、またはGLD症の発症が遅延する治療有効量および投与間隔で髄腔内投与するステップを含む方法。前記GLD症の少なくとも1つの症状または特徴が、易刺激性、痙攣、知的退行、聴覚消失、視覚消失、ミオクローヌス発作、筋緊張亢進、発達遅延、発達能力の退行、過敏性、振戦、運動失調、痙攣、突発性の激しい嘔吐、白質ジストロフィー、大脳萎縮症、グロボイド細胞の発達および/または脱髄である、請求項80に記載の方法。髄腔内投与のための装置であって、体液接触ポートと、前記体液接触ポートと流体連結された第一流出口と、脊髄への挿入用に設定された第二流出口とを有する中空体と、前記脊髄へ前記中空体の挿入を固定するための固定機構とを含む、装置。前記固定機構が、前記中空体の表面に備え付けられた1つ以上のノブと、前記1つ以上のノブ上で調節可能な縫合リングとを含む、請求項82に記載の装置。前記体液接触ポートがリザーバを含む、請求項82または83に記載の装置。前記体液接触ポートが埋入可能である、請求項82~84のいずれか1項に記載の装置。前記体液接触ポートが注射可能なポートである、請求項82~85のいずれか1項に記載の装置。前記体液接触ポートが機械式ポンプである、請求項82~85のいずれか1項に記載の装置。多数のリソソーム蓄積障害は神経系に影響を及ぼし、したがって伝統的療法でこれらの疾患を処置するに際して独特の挑戦を実証する。罹患個体のニューロンおよび髄膜において、グリコサミノグリカンGACの大きな蓄積がしばしば認められ、種々の型のCNS症候を生じさせる。今までのところ、リソソーム障害に起因するCNS症候は、利用可能な任意の手段により首尾よく処置されてきた。したがって、脳に治療薬を有効に送達する必要性が依然として大いに存在する。さらに特定的には、リソソーム蓄積障害の処置のために中枢神経系に活性作用物質をより有効に送達することが大いに必要とされている。本発明は、中枢神経系CNSへの治療薬の直接送達のための有効且つ低侵襲性のアプローチを提供する。本発明は、一部は、酵素が種々の表面を横断して有効に且つ広範に拡散して、深部脳領域を含めて脳を横断する種々の領域に浸透するよう、リソソーム蓄積症のための補充酵素が高濃度例えば、約3mg/mg以上、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml以上での治療を必要とする対象の脳脊髄液CSF中に直接的に導入され得る、という予期せぬ発見に基づいている。さらに意外なことに、単なる生理食塩水または緩衝液ベースの処方物を用いて、そして対象において実質的な有害作用、例えば重篤な免疫応答を誘導することなく、このような高タンパク質濃度送達が達成され得る、ということを本発明人等は実証した。したがって、本発明は、CNS構成成分を有する種々の疾患および障害、特にリソソーム蓄積症の処置のための直接CNS送達のための非常に効率的で臨床的に望ましく、且つ患者に優しいアプローチを提供する。本発明は、CNSターゲッティングおよび酵素補充療法の分野における有意の進歩を示す。特に、本発明は、治療を必要とする対象への治療薬例えば、補充酵素の髄腔内IT投与の方法を提供する。いくつかの実施形態では、補充酵素は、組換え、遺伝子活性化または天然酵素であり得る。本明細書中で用いる場合、髄腔内投与、髄腔内注射、髄腔内送達という用語または文法的等価用語は、脊柱管脊髄周囲のクモ膜内空隙への注射を指す。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内投与または髄腔内送達は、腰椎区域または領域を介したIT投与または送達、すなわち腰椎IT投与または送達を指す。本明細書中で用いる場合、腰部領域または腰椎区域という用語は、第三および第四腰椎下方背部間の区域、さらに包括的には、脊椎のL2~S1領域を指す。腰椎IT投与または送達は、われわれの発明による腰椎IT投与または送達は、遠位脊椎管へのより良好な且つより有効な送達を提供するが、一方、大槽送達は、特に、典型的には遠位脊椎管に良好に送達しない、という点で、大槽送達すなわち、頭蓋骨と脊椎との間の開口部を経て小脳の周囲および下の空隙を介した注射より優れた差異を表す、ということが意図される。一態様において、本発明は、約5mg/ml超例えば6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、75mg/mlまたは100mg/ml超の濃度でリソソーム酵素に関する補充酵素を含む組成物を、リソソーム酵素のレベルまたは活性の減少を伴うリソソーム蓄積症に罹患しているかまたは、これに罹患しやすい対象に髄腔内投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、i緩衝剤、ii界面活性剤、またはiii等張化剤のうちの1つ以上を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約3.0~8.0例えば、4.0~7.5、5.0~7.5、5.5~7.7、5.5~7.0、6.0~7.0、6.5~7.5、6.5~7.0または5.5~6.5のpHを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、合成CSFでない処方物中に補充酵素を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約15mL未満例えば、10ml、9ml、8ml、7ml、6ml、5ml、4ml、3ml、2ml、1.5ml、1.0mlまたは0.5ml未満の単回用量体積で投与される。いくつかの実施形態では、組成物の髄腔内投与は、対象において実質的な有害作用を生じない。ある実施形態では、組成物の髄腔内投与は、適応T細胞媒介性免疫応答を生じない。さらに別の態様では、本発明は、リソソーム酵素に関する補充酵素を含む組成物を、リソソーム酵素のレベルまたは活性の減少を伴うリソソーム蓄積症に罹患しているかまたは、これに罹患しやすい対象に投与するステップを含む方法であって、投与が、同時的免疫抑制薬療法の非存在下での組成物の髄腔内投与を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法は、治療されている対象における免疫寛容を伴わない。ある実施形態では、当該方法は、T細胞免疫抑制薬を用いた対象の前治療または前処置を伴わない。さらなる一態様では、本発明は、脳、脊髄および末梢器官の1つ以上の組織中のリソソーム酵素の正常レベルまたは活性の少なくとも約10例えば、少なくとも約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90または95が達成される治療有効量および投与間隔でリソソーム酵素に関する補充酵素を含む組成物を、リソソーム酵素のレベルまたは活性の減少を伴うリソソーム蓄積症に罹患しているかまたは、これに罹患しやすい対象に髄腔内投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、酵素が送達される脳の1つ以上の組織は髄膜組織を含む。いくつかの実施形態では、髄膜組織は、軟膜組織、硬膜組織およびクモ膜組織からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、酵素が送達される脳の1つ以上の組織は、大脳の組織を含む。ある実施形態では、大脳の組織は、大脳の表面組織または浅部組織である。ある実施形態では、大脳の表面組織または浅部組織は、軟膜組織、大脳皮質リボン組織、海馬、大脳表面の表面から4mm以内の組織、フィルヒョーロバン腔隙、VR腔隙内の血管、海馬、脳の下面の視床下部の部分、視神経および視索、嗅球および嗅突起ならびにその組合せからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、酵素が送達される大脳の組織は、大脳の深在組織である。ある実施形態では、大脳の深在組織は、大脳皮質リボンに内在する組織、大脳表面の表面から4mmよりも下の組織、大脳表面の表面から6mmよりも下の組織、大脳表面の表面から10mmよりも下の組織、間脳、視床下部、視床、腹側視床および視床腹部、後脳、大脳脚、赤核、第三脳神経核、深部灰白質、レンズ核、基底核、尾状核、被核、扁桃、淡蒼球、ならびにその組合せからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、酵素が送達される脳の1つ以上の組織は、小脳の組織を含む。ある実施形態では、小脳の組織は、分子層の組織、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、小脳脚およびその組合せからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、小脳の組織は、小脳の深部組織である。ある実施形態では、小脳の深部組織は、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織および深部小脳核組織からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、酵素が送達される脳の1つ以上の組織は、脳幹の組織を含む。ある実施形態では、脳幹の組織は、脳幹白質組織および/または脳幹核組織からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、酵素が送達される脊髄の1つ以上の組織は、脊髄の表面組織または浅部組織である。ある実施形態では、脊髄の表面組織または浅部組織は、軟膜、白質路、ならびに脊髄表面の表面から4mm以内の組織からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、脊髄の1つ以上の組織は、脊髄の深部組織である。ある実施形態では、脊髄の深部組織は、脊髄灰白質および上衣細胞、ならびに脊髄表面の表面から4mmよりも下の組織からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、酵素が送達される脳の1つ以上の組織は、表面組織または浅部組織を含む。ある実施形態では、表面組織または浅部組織は、髄膜の軟膜組織、硬膜組織およびクモ膜組織、軟膜組織、大脳皮質リボン組織、大脳表面の表面から4mm以内の組織、ならびにその組合せからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、酵素が送達される組織は、深部組織を含む。ある実施形態では、深部脳組織は、大脳の深部白質、脊髄の深部灰白質、脳梁、室周囲組織、視床、基底核、間脳、海馬采、大脳皮質リボンよりも下の組織、大脳表面の表面から4mmよりも下の組織、大脳表面の表面から6mmよりも下の組織、大脳表面の表面から10mmよりも下の組織、プルキンエ細胞層、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織および深部小脳核組織、ならびにその組合せから選択される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、0.005mg/脳重量kg~100mg/脳重量kgの範囲である。ある実施形態では、治療有効量は、1mg/脳重量kgより大きい例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45または50mg/脳重量kgより大きい。ある実施形態では、治療有効量は、10mg/脳重量kgより大きい。ある実施形態では、治療有効量は、30mg/脳重量kgより大きい。いくつかの実施形態では、投与間隔は、2週間に1回である。いくつかの実施形態では、投与間隔は1か月に1回である。いくつかの実施形態では、投与間隔は2ヶ月に1回である。いくつかの実施形態では、投与間隔は1か月に2回である。いくつかの実施形態では、投与間隔は毎週1回である。いくつかの実施形態では、投与間隔は毎週2回または数回である。いくつかの実施形態では、投与は連続的であり、例えば連続注入ポンプによる。別の態様では、本発明は、リソソーム酵素に関する補充酵素を含む組成物を、リソソーム酵素のレベルまたは活性の減少を伴うリソソーム蓄積症に罹患しているかまたは、これに罹患しやすい対象に投与するステップを含む方法であって、補充酵素が外表面より少なくとも5mmより下例えば外表面より少なくとも6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mmまたはそれより深くの深部脳組織に送達されるように、投与が、組成物の髄腔内投与を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、補充酵素は、外表面より少なくとも10mmより下の深部脳組織に送達される。ある実施形態では、補充酵素は、具体的には、深部脳組織の細胞リソソームに送達される。いくつかの実施形態では、酵素が送達される深部脳組織は、大脳の深部白質、脊髄の深部灰白質、脳梁、室周囲組織、視床、海馬采、大脳皮質リボンよりも下の組織、大脳表面の表面から4mmよりも下の組織、大脳表面の表面から6mmよりも下の組織、大脳表面の表面から10mmよりも下の組織、プルキンエ細胞層、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織、および深部小脳核組織、ならびにその組合せから選択される。さらに別の態様では、本発明は、ヒト細胞から産生されるリソソーム酵素に関する補充酵素を含む組成物を、リソソーム酵素のレベルまたは活性の減少を伴うリソソーム蓄積症に罹患しているかまたは、これに罹患しやすい対象に髄腔内投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、リソソーム蓄積症は、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシスI/II型、ゴーシェ病I型/II型/III型、グロボイド細胞白質ジストロフィー症、クラッベ病、糖原病II型、ポンペ病、GM1-ガングリオシドーシスI型/II型/III型、GM2-ガングリオシドーシスI型、テイサックス病、GM2-ガングリオシドーシスII型、サンドホッフ病、GM2-ガングリオシドーシス、α-マンノーシドーシスI/II型、β-マンノーシドーシス、異染性白質ジストロフィー症、ムコリピドーシスI型、シアリドーシスI型/II型、ムコリピドーシスII型/III型、ムコリピドーシスIV型、I-細胞病、ムコリピドーシスIIIC型、偽性ハーラーポリジストロフィー、ムコ多糖症I型、ムコ多糖症II型、ハンター症候群、ムコ多糖症IIIA型、サンフィリッポ症候群A型、B型またはD型ムコ多糖症IIIB型、ムコ多糖症IIIC型、ムコ多糖症IIID型、ムコ多糖症IVA型、モルキオ症候群、ムコ多糖症IVB型、ムコ多糖症VI型、ムコ多糖症VII型、スライ症候群、ムコ多糖症IX型、多重スルファターゼ欠乏症、ニューロンセロイド脂褐素沈着症、CLN1バッテン病、CLN2バッテン病、ニーマンピック病A型/B型、ニーマンピック病C1型、ニーマンピック病C2型、濃化異骨症、シンドラー病I型/II型、ゴーシェ病およびシアル酸蓄積症からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、リソソーム蓄積症は、ハンター症候群、異染性ジストロフィーMLD症、サンフィリッポ症候群A型、サンフィリッポ症候群B型およびグロボイド細胞白質ジストロフィーGLD症からなる群より選択される。ある実施形態では、補充酵素は、組換えイズロン酸-2-スルファターゼI2S、アリールスルファターゼAASA、ヘパランN-スルファターゼHNS、アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼNagluおよびβ-ガラクトシダーゼGLCからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、補充酵素は、マンノース-6-ホスフェートM6P残基を含有する。いくつかの実施形態では、補充酵素は、リソソームターゲッティング部分を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、補充酵素は、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および/または髄膜細胞に送達される。ある実施形態では、補充酵素はさらに、脊髄中のニューロンに送達される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与はさらに、末梢標的組織における補充酵素の全身送達を生じる。ある実施形態では、末梢標的組織は、肝臓、腎臓および/または心臓、内皮、骨髄および骨髄由来細胞、脾臓、肺、リンパ節、骨および軟骨、卵巣および精巣から選択される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび/または末梢標的組織における補充酵素のリソソーム局在化を生じる。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび/または末梢標的組織におけるGAG貯蔵の低減を生じる。ある実施形態では、GAG貯蔵は、対照と比較して、少なくとも20、40、50、60、80、90、1倍、1.5倍または2倍低減される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、ニューロンにおける液胞化低減を生じる。いくつかの実施形態では、ニューロンはプルキンエ細胞を含む。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび/または末梢標的組織における補充酵素の酵素活性増大を生じる。ある実施形態では、酵素活性は、対照と比較して、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍または10倍増大される。ある実施形態では、酵素活性増大は、少なくとも約10nmol/時mg、20nmol/時mg、40nmol/時mg、50nmol/時mg、60nmol/時mg、70nmol/時mg、80nmol/時mg、90nmol/時mg、100nmol/時mg、150nmol/時mg、200nmol/時mg、250nmol/時mg、300nmol/時mg、350nmol/時mg、400nmol/時mg、450nmol/時mg、500nmol/時mg、550nmol/時mgまたは600nmol/時mgである。いくつかの実施形態では、酵素活性は、腰部領域で増大される。ある実施形態では、腰部領域における酵素活性増大は、少なくとも約500nmol/時mg、600nmol/時mg、700nmol/時mg、800nmol/時mg、900nmol/時mg、1000nmol/時mg、1500nmol/時mg、2000nmol/時mg、3000nmol/時mg、4000nmol/時mg、5000nmol/時mg、6000nmol/時mg、7000nmol/時mg、8000nmol/時mg、9000nmol/時mgまたは10,000nmol/時mgである。いくつかの実施形態では、リソソーム蓄積症は末梢症候を伴い、当該方法はさらに、対象に補充酵素を静脈内投与することを含む。ある実施形態では、静脈内投与は、週1回投与より高頻度でない例えば、週2回、月1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回、4ヶ月に1回、5ヶ月に1回または6ヶ月に1回より高頻度でない。ある実施形態では、静脈内投与は、毎月投与より高頻度でなく、例えば週2回、週1回、隔週毎、または月2回である。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内投与は、互いに一定時間内、例えば少なくとも2日以内、少なくとも3日以内、少なくとも4日以内、少なくとも5日以内、少なくとも6日以内、少なくとも7日以内または少なくとも1週間以内には実施されない。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内投与は、交互スケジュールで、例えば週1回、隔週、月2回または月1回、交互投与で実施される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、例えば週1回、隔週、月2回または月1回の静脈内投与のスケジュールで、そのスケジュールの第3または第4または第5投与毎に、静脈内投与の代わりに髄腔内投与に取り替えられ得る。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、例えば週1回、隔週、月2回または月1回の髄腔内投与のスケジュールで、そのスケジュールの第3または第4または第5投与毎に、髄腔内投与の代わりに静脈内投与に取り替えられ得る。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内投与は、逐次的に実施され、例えば先ず、静脈内投与を実施し例えば週1回、隔週、月2回または月1回用量投与を、2週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月または1年またはそれ以上の間、その後、髄腔内投与例えば週1回、隔週、月2回または月1回用量投与を、2週間より長い間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月または1年またはそれ以上の間を実施する。いくつかの実施形態では、髄腔内投与を先ず実施し例えば週1回、隔週、月2回、月1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回の用量投与を、2週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月または1年またはそれ以上の間、その後、静脈内投与例えば週1回、隔週、月2回または月1回用量投与を、2週間より長い間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月または1年またはそれ以上の間を実施する。いくつかの実施形態では、リソソーム蓄積症は末梢症候を伴い、当該方法は、補充酵素を髄腔内投与することを含むが、しかし対象への補充酵素の静脈内投与を伴わない。ある実施形態では、補充酵素の髄腔内投与は、対象の酵素補充欠損の末梢症候のうちの1つ以上を改善するかまたは低減する。別の態様では、本発明は、ハンター症候群の治療方法であって、ハンター症候群の少なくとも1つの症候または特徴が、強度、重症度または頻度において低減されるか、あるいは発症の遅延を示すような治療有効量および投与間隔で、組換えイズロン酸-2-スルファターゼI2S酵素を、治療を必要とする対象に髄腔内投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ハンター症候群の少なくとも1つの症候または特徴は、認知障害;白質損傷;脳の実質組織、神経節、脳梁および/または脳幹における血管周囲空隙拡大;萎縮;および/または脳室拡大である。さらに別の態様では、本発明は、異染性ジストロフィーMLD症の治療方法であって、MLDの少なくとも1つの症候または特徴が、強度、重症度または頻度において低減されるか、あるいは発症の遅延を示すような治療有効量および投与間隔で、組換えアリールスルファターゼAASA酵素を、治療を必要とする対象に髄腔内投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、MLDの少なくとも1つの症候または特徴は、頭蓋内圧増大、真空水頭症、中枢および末梢神経系におけるならびに内臓器官におけるミエリン鞘中の硫酸化糖脂質蓄積、進行性脱髄、CNSおよびPNS内の軸索損失、および/または運動および認知機能障害である。さらに別の態様では、本発明は、サンフィリッポ症候群A型サンフィリッポAの治療方法であって、サンフィリッポAの少なくとも1つの症候または特徴が、強度、重症度または頻度において低減されるか、あるいは発症の遅延を示すような治療有効量および投与間隔で、組換えヘパランN-スルファターゼHNS酵素を、治療を必要とする対象に髄腔内投与するステップを含む方法を提供する。別の態様では、本発明は、サンフィリッポ症候群B型サンフィリッポBの治療方法であって、サンフィリッポBの少なくとも1つの症候または特徴が、強度、重症度または頻度において低減されるか、あるいは発症の遅延を示すような治療有効量および投与間隔で、組換えアルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼNaglu酵素を、治療を必要とする対象に髄腔内投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、サンフィリッポAまたはサンフィリッポBの少なくとも1つの症候または特徴は、聴力損失、言語発達障害、運動能力欠如、多動性障害、進行性認知障害、攻撃性および/または睡眠障害である。いくつかの実施形態では、組換えNaglu酵素は、Nagluおよびリソソームターゲッティング部分を含む融合タンパク質である。ある実施形態では、リソソームターゲッティング部分はIGF-IIである。別の態様では、本発明は、グロボイド細胞白質ジストロフィーGLD症の治療方法であって、GLDの少なくとも1つの症候または特徴が、強度、重症度または頻度において低減されるか、あるいは発症の遅延を示すような治療有効量および投与間隔で、組換えβ-ガラクトシダーゼGLC酵素を、治療を必要とする対象に髄腔内投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、GLDの少なくとも1つの症候または特徴は、易刺激性、痙攣、知的退行、聴覚消失、失明、ミオクローヌス発作、筋緊張亢進、発達遅延、発達能力の退行、過敏症、振戦、運動失調、痙縮、偶発性重症嘔吐、白質ジストロフィー症、脳萎縮、グロボイド細胞の発達障害、および/または脱髄である。さらに別の態様では、本発明は、髄腔内投与のための装置、例えば、流体接触ポート;流体接触ポートと流体連絡する第一流出口、および脊髄中への挿入のために設計された第二流出口;ならびに脊髄における中空体の挿入を固定するための固定機構を提供する。いくつかの実施形態では、固定機構は、中空体の表面に載せられる1つ以上のノブ、および1つ以上のノブを覆って調整可能な縫合リングを含む。いくつかの実施形態では、流体接触ポートはリザーバを含む。ある実施形態では、流体接触ポートは、埋込可能である。ある実施形態では、流体接触ポートは注射可能なポートである。いくつかの実施形態では、流体接触ポートは機械式ポンプである。本願で用いる場合、約およびおよそという用語は、等価物として用いられる。本願で用いられる任意の数字は、約/およそを伴う場合も伴わない場合も、関連業界の当業者に理解される任意の通常変動を網羅するよう意図される。本発明のその他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明で明らかになる。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態を示して入るが、例証のために示されたものであって、本発明を限定するものではない、と理解されるべきである。本発明の範囲内の種々の変更および修正は、詳細な説明を読めば当業者に明らかになる。図面は例証に過ぎず、本発明を限定するものではない。定義本発明をより容易に理解するために、一定の用語を先ず以下で定義する。以下の用語および他の用語に関する付加的な定義は、本明細書全体を通して記述されている。およそまたは約は、本明細書中で用いる場合、およそまたは約という用語は、1つ以上の当該値に適用される場合、記述参照値と類似する値を指す。ある実施形態では、およそまたは約という用語は、別記しない限り、あるいはそうでない場合は本文から明らかな記述参照値のいずれかの方向でより大きいかまたはより小さい25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1またはそれ以下内にある一連の値を指すこのような数が考え得る値の100を超える場合を除く。改善:本明細書中で用いる場合、改善という用語は、ある状態の防止、低減または緩和、あるいは対象の状態の改善を意味する。改善は、疾患状態の完全回復または完全防止を包含するが、しかし必要とするわけではない。いくつかの実施形態では、改善は、関連疾患組織中に欠けている漸増レベルの関連タンパク質またはその活性を包含する。生物学的に活性な:本明細書中で用いる場合、生物学的に活性なという語句は、生物学的系において、特に生物体において活性を有する任意の作用物質の特徴を指す。例えば、生物体に投与された場合、その生物体に及ぼす生物学的作用を有する作用物質は、生物学的に活性であるとみなされる。タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態では、当該タンパク質またはポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部分は、典型的には、生物学的活性部分として言及される。バルク剤:本明細書中で用いる場合、バルク剤という用語は、凍結乾燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケークの物理的構造に寄与する例えば、開口構造を保持する本質的に均一な凍結乾燥ケークの生産を促す化合物を指す。バルク剤の例としては、マンニトール、グリシン、塩化ナトリウム、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトース、スクロース、トレハロース、ポリエチレングリコールおよびデキストランが挙げられる。陽イオン非依存性マンノース-6-ホスフェート受容体CI-MPR:本明細書中で用いる場合、陽イオン非依存性マンノース-6-ホスフェート受容体CI-MPRという用語は、リソソームへの輸送を定められているゴルジ装置における酸加水分解酵素上のマンノース-6-ホスフェートM6Pタグを結合する細胞受容体を指す。マンノース-6-ホスフェートのほかに、CI-MPRは、他のタンパク質、例えばIGF-IIも結合する。CI-MPRは、M6P/IGF-II受容体、CI-MPR/IGF-II受容体、IGF-II受容体またはIGF2受容体としても既知である。これらの用語およびその略語は、本明細書中で互換的に用いられる。同時免疫抑制薬療法:本明細書中で用いる場合、同時免疫抑制薬療法という用語は、前処置、前状態調節として、またはある処置方法と並行して用いられる任意の免疫抑制薬両方を包含する。希釈剤:本明細書中で用いる場合、希釈剤という用語は、再構成処方物の調整のために有用な製薬上許容可能な例えば、ヒトへの投与のために安全且つ非毒性の希釈物質を指す。希釈剤の例としては、滅菌水、注射用静菌性水BWFI、pH緩衝溶液後、リン酸塩緩衝生理食塩水、滅菌生理食塩溶液、リンガー溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。剤形:本明細書中で用いる場合、剤形および単位剤形という用語は、処置されるべき患者のための治療用タンパク質の物理的に別個の単位を指す。各単位は、所望の治療効果を生じるよう算定された予定量の活性物質を含有する。しかしながら、組成物の総投与量は、信頼できる医学的判断の範囲内で、担当医により決定される、と理解される。酵素補充療法ERT:本明細書中で用いる場合、酵素補充療法ERTという用語は、失われている酵素を提供することにより酵素欠乏症を矯正する任意の治療戦略を指す。いくつかの実施形態では、失われている酵素は、髄腔内投与により提供される。いくつかの実施形態では、失われている酵素は、血流中への注入により提供される。一旦投与されると、酵素は細胞に取り込まれ、リソソームに運ばれて、そこで酵素は、酵素欠乏のためにリソソーム中に蓄積された物質を除去するよう作用する。典型的には、有効であるべきリソソーム酵素補充療法に関して、治療用酵素は、貯蔵欠陥が顕在性である標的組織中の適切な細胞中のリソソームに送達される。改善する、増大するまたは低減する:本明細書中で用いる場合、改善する、増大するまたは低減するという用語、あるいは文法的等価物は、基線測定値、例えば本明細書中に記載される処置の開始前の同一個体における測定値、あるいは本明細書中に記載される処置の非存在下での一対照個体または多数の対照個体における測定値と比較した場合の値を示す。対照個体は、処置されている個体と同一型のリソソーム貯蔵疾患に罹患している個体であって、処置されている個体とほぼ同年齢である処置個体と対照個体単数または複数における疾患の段階が比較可能であることを保証するため。個体、対象、患者:本明細書中で用いる場合、対象、個体または患者という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象を指す。処置されている個体患者または対象としても言及されるは、疾患に罹患している個体胎児、幼児、小児、若者または成人である。髄腔内投与:本明細書中で用いる場合、髄腔内投与または髄腔内注射という用語は、脊柱管脊髄周囲の髄腔内空隙への注射を指す。種々の技法、例えば穿頭孔あるいは槽または腰椎穿刺等を通した外側脳室注射が用いられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内投与または髄腔内送達は、腰椎域または領域を介したIT投与または送達、すなわち、腰椎IT投与または送達を指す。本明細書中で用いる場合、腰部領域または腰椎域という用語は、第三および第四腰椎背中下部間の区域、さらに包括的には、脊椎のL2~S1領域を指す。リンカー:本明細書中で用いる場合、リンカーという用語は、融合タンパク質において、天然タンパク質中の特定位置に出現するもの以外のアミノ酸配列を指し、一般的に、柔軟性であるよう、または2つのタンパク質部分の間の構造物、例えばらせんを間に置くよう意図される。リンカーは、スペーサーとしても言及される。リオプロテクタント:本明細書中で用いる場合、リオプロテクタントという用語は、凍結乾燥およびその後の貯蔵時に、タンパク質または他の物質の化学的および/または物理的不安定性を防止するかまたは低減する分子を指す。リオプロテクタントの例としては、糖、例えばスクロースまたはトレハロース;アミノ酸、例えばグルタミン酸またはヒスチジン一ナトリウム;メチルアミン、例えばベタイン;リオトロピック塩、例えば硫酸マグネシウム;ポリオール、例えば三価またはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール;プロピレングリコール;ポリエチレングリコール;プルロニック;ならびにその組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、リオプロテクタントは、非還元糖、例えばトレハロースまたはスクロースである。リソソーム酵素:本明細書中で用いる場合、リソソーム酵素という用語は、哺乳動物リソソーム中の蓄積物質を還元し得るか、あるいは1つ以上のリソソーム貯蔵疾患症候を救出するかまたは改善し得る任意の酵素を指す。本発明に適しているリソソーム酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を包含し、組換えおよび合成方法を用いて生成され得るし、あるいは天然供給源から精製され得る。リソソーム酵素の例は、表1に列挙されている。リソソーム酵素欠乏症:本明細書中で用いる場合、リソソーム酵素欠乏症は、高分子物質例えば酵素基質をリソソーム中でペプチド、アミノ酸、単糖、拡散および脂肪酸に分解するために必要とされる酵素のうちの少なくとも1つにおける欠乏に起因する遺伝子障害の一群を指す。その結果、リソソーム酵素欠乏症に罹患している個体は、種々の組織例えば、CNS、肝臓、脾臓、腸、血管壁およびその他の器官中に物質を蓄積している。リソソーム蓄積症:本明細書中で用いる場合、リソソーム蓄積症という用語は、天然高分子物質を退社するために必要な1つ以上のリソソーム酵素の欠乏に起因する任意の疾患を指す。これらの疾患は、典型的には、リソソーム中に非分解分子の蓄積を生じて、貯蔵顆粒貯蔵小胞とも呼ばれるの数を増大する。これらの疾患および種々の例は、以下で詳細に記載される。ポリペプチド:本明細書中で用いる場合、ポリペプチドは、概して、ペプチド結合により互いに結合された少なくとも2つのアミノ酸の紐である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その各々が少なくとも1つのペプチド結合により他のものと結合される少なくとも3~5つのアミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、時として、非天然アミノ酸、あるいはそれでも任意にポリペプチド鎖に一体化し得る他の実体を包含する、と当業者は理解する。補充酵素:本明細書中で用いる場合、補充酵素という用語は、処置されるべき疾患において欠乏しているかまたは失われている酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、補充酵素という用語は、処置されるべきリソソーム蓄積症において欠乏しているかまたは失われているリソソーム酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、補充酵素は、哺乳動物リソソーム中の蓄積物質を低減し得るし、あるいは1つ以上のリソソーム蓄積症症候を救出するかまたは改善し得る。本発明に適している補充酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を包含し、組換えおよび合成方法を用いて生成し得るし、あるいは天然供給源から精製され得る。補充酵素は、組換え、合成、遺伝子活性化または天然酵素であり得る。可溶性の:本明細書中で用いる場合、可溶性のという用語は、均質溶液を生成する治療薬の能力を指す。いくつかの実施形態では、それが投与されそれが標的作用部位例えば、脳の細胞および組織に輸送される溶液中の治療薬の溶解度は、標的作用部位への治療的有効量の治療薬の送達を可能にするのに十分である。いくつかの因子が、治療薬の溶解度に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質溶解度に影響し得る関連因子としては、イオン強度、アミノ酸配列および他の同時可溶化剤または塩例えば、カルシウム塩の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、カルシウム塩がこのような組成物から除去されるよう処方される。いくつかの実施形態では、本発明による治療薬は、その対応する薬学的組成物中で可溶性である。非経口投与薬のためには等張溶液が一般的に好ましいが、等張溶液の使用は、いくつかの治療薬、特にいくつかのタンパク質および/または酵素に関する適切な溶解度を制限し得る、と理解される。わずかに高張性の溶液例えば、5mMリン酸ナトリウムpH7.0中に175mMまでの塩化ナトリウムおよび糖含有溶液例えば、5mMリン酸ナトリウムpH7.0中に2までのスクロースは、サルにおいて良好に耐容されることが実証されている。例えば、最も一般に認可されたCNSボーラス処方物組成物は、生理食塩水水中150mMのNaClである。安定性:本明細書中で用いる場合、安定なという用語は、長期間に亘ってその治療効力例えば、その意図された生物学的活性および/または物理化学的完全性のすべてまたは大部分を保持する治療薬例えば、組換え酵素の能力を指す。治療薬の安定性、ならびにこのような治療薬の安定性を保持する薬学的組成物の能力は、長期間に亘って評価され得る例えば、少なくとも1、3、6、12、18、24、30、36ヶ月またはそれ以上。概して、本明細書中に記載される薬学的組成物は、それらが、一緒に処方される1つ以上の治療薬例えば、組換えタンパク質を安定化し、あるいはそれらの分解を遅くするかまたは防止し得るよう、処方されている。一処方物の状況では、安定処方物は、貯蔵時、および加工処理例えば、凍結/解凍、機械的混合および凍結乾燥中に、その中の治療薬が本質的にその物理的および/または化学的完全性および生物学的活性を保持するものである。タンパク質安定性に関しては、それは、高分子量HMW集合体の形成、酵素活性の損失、ペプチド断片の生成および電荷プロフィールの移動により測定され得る。対象:本明細書中で用いる場合、対象という用語は、ヒトを含めた任意の哺乳動物を意味する。本発明のある実施形態では、対象は、成人、若者または幼児である。薬学的組成物の投与、および/または子宮内処置方法の実施も、本発明により意図される。実質的相同性:実質的相同という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較に言及するために本明細書中で用いられる。当業者に理解されるように、2つの配列は、それらが、対応する位置に相同な残基を含有する場合、一般的に実質的に相同であるとみなされる。相同残基は、同一残基であり得る。代替的には、相同残基は、ほぼ同様の構造的および/または機能的特徴を有する非同一残基であり得る。例えば、当業者に周知であるように、あるアミノ酸は、典型的には、疎水性または親水性アミノ酸として分類され、および/または極性または非極性側鎖を有するとして分類される。一アミノ酸の、別の同一型のアミノ酸への置換は、しばしば、相同置換とみなされ得る。当該技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、種々のアルゴリズム、例えば市販のコンピュータープログラム、例えばヌクレオチド配列に関するBLASTN、ならびにアミノ酸配列に関するBLASTP、ギャップ化BLASTおよびPSI-BLASTを用いて比較され得る。このようなプログラムの例は、Altschul,etal.,Basiclocalalignmentsearchtool,J.Mol.Biol.,2153:403-410,1990;Altschul,etal.,MethodsinEnzymology;Altschul,etal.,GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms,NucleicAcidsRes.25:3389-3402,1997;Baxevanis,etal.,Bioinformatics:APracticalGuidetotheAnalysisofGenesandProteins,Wiley,1998;およびMisener,etal.,eds.,BioinformaticsMethodsandProtocolsMethodsinMolecularBiology,Vol.132,HumanaPress,1999に記載されている。相同配列を同定することのほかに、上記のプログラムは、典型的には、相同性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、2つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99またはそれ以上が関連残基鎖上で相同である場合、実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連鎖は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連鎖は、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500残基またはそれ以上の残基である。実質的同一性:実質的同一性という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較に言及するために本明細書中で用いられる。当業者に理解されるように、2つの配列は、それらが、対応する位置に同一の残基を含有する場合、一般的に実質的に同一であるとみなされる。当該技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、種々のアルゴリズム、例えば市販のコンピュータープログラム、例えばヌクレオチド配列に関するBLASTN、ならびにアミノ酸配列に関するBLASTP、ギャップ化BLASTおよびPSI-BLASTを用いて比較され得る。このようなプログラムの例は、Altschul,etal.,Basiclocalalignmentsearchtool,J.Mol.Biol.,2153:403-410,1990;Altschul,etal.,MethodsinEnzymology;Altschul,etal.,NucleicAcidsRes.25:3389-3402,1997;Baxevanis,etal.,Bioinformatics:APracticalGuidetotheAnalysisofGenesandProteins,Wiley,1998;およびMisener,etal.,eds.,BioinformaticsMethodsandProtocolsMethodsinMolecularBiology,Vol.132,HumanaPress,1999に記載されている。同一配列を同定することのほかに、上記のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、2つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99またはそれ以上が関連残基鎖上で同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連鎖は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連鎖は、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500残基またはそれ以上の残基である。合成CSF:本明細書中で用いる場合、合成CSFという用語は、脳脊髄液と一致するpH、電解質組成、グルコース含量および浸透圧を有する溶液を指す。合成CSFは、人工CSFとも呼ばれる。いくつかの実施形態では、合成CSFはエリオットB溶液である。CNS送達に適している:本明細書中で用いる場合、CNS送達に適しているまたは髄腔内送達に適しているという語句は、それが本発明の薬学的組成物に関する場合、一般的に、このような組成物の安定性、耐容性および溶解度特性、ならびに標的送達部位例えば、CSFまたは脳にその中に含有される有効量の治療薬を送達するこのような組成物の能力を指す。標的組織:本明細書中で用いる場合、標的組織は、処置されるべきリソソーム蓄積症により影響を及ぼされる任意の組織、あるいは欠乏リソソーム酵素が正常に発現される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織は、リソソーム蓄積症に罹患しているかまたは罹患し易い患者において、検出可能な、または以上に高量の酵素基質が存在する、例えば当該組織の細胞リソソーム中に貯蔵される組織を包含する。いくつかの実施形態では、標的組織は、疾患関連病態、症候または特徴を示す組織を包含する。いくつかの実施形態では、標的組織は、欠乏リソソーム酵素が高レベルで正常に発現される組織を包含する。本明細書中で用いる場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織および/または末梢標的組織であり得る。標的組織の例は、以下で詳細に記載される。治療的部分:本明細書中で用いる場合、治療的部分という用語は、分子の治療作用を果たす分子の一部分を指す。いくつかの実施形態では、治療的部分は、治療活性を有するポリペプチドである。治療的有効量:本明細書中で用いる場合、治療的有効量という用語は、任意の医学的処置に適用可能な合理的利益/危険比で、処置対象に治療効果を付与する治療用タンパク質例えば、補充酵素の量を指す。治療作用は、客観的すなわち、何らかの試験またはマーカーにより測定可能または主観的すなわち、対象は、作用の指示を与えるかまたは作用を感じるであり得る。特に、治療的有効量は、例えば疾患に伴う症候を改善し、疾患の開始を防止するかまたは遅延し、および/または疾患の症候の重症度または頻度を下げることにより、所望の疾患または症状を処置し、改善し、または防止するために、あるいは検出可能な治療的または予防的作用を示すために有効な治療用タンパク質または組成物の量を指す。治療的有効量は、一般に、多重単位用量を含み得る用量投与レジメンで投与される。任意の特定治療用タンパク質に関して、治療的有効量および/または有効用量投与レジメン内の適切な単位用量は、例えば、投与経路、他の薬学的作用物質との組合せによって変わり得る。さらにまた、任意の特定患者に関する具体的治療的有効量および/または単位用量は、種々の因子、例えば処置されている障害、および障害の重症度;用いられる具体的な薬学的作用物質の活性;用いられる具体的組成物;患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食事;投与時間、投与経路および/または用いられる具体的融合タンパク質の排出または代謝の速度;処置の持続期間;ならびに医療業界で周知であるような同様の因子によって決まる。耐容可能な:本明細書中で用いる場合、耐容可能なおよび耐容性という用語は、このような組成物が投与される対象において悪反応を引き出さないか、代替的には、このような組成物が投与される対象において重篤な悪反応を引き出さない本発明の薬学的組成物の能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、このような組成物が投与される対象により良好に耐容される。処置:本明細書中で用いる場合、処置さらにまた処置するまたは処置することという用語は、特定の疾患、障害および/または症状例えば、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群B型の1つ以上の症候または特徴を、部分的にまたは完全に、緩和し、改善し、軽減し、抑制し、その開始を遅延し、その重症度を低減し、および/またはその発生率を低減する治療用タンパク質例えば、リソソーム酵素の任意の投与を指す。このような処置は、関連疾患、障害および/または症状の徴候を示さない対象の、および/または疾患、障害および/または症状の早期徴候のみを示す対象のものであり得る。代替的にまたは付加的に、このような処置は、関連疾患、障害および/または症状の1つ以上の確立された徴候を示す対象のものであり得る。詳細な説明本発明は、特に、中枢神経系CNSへの治療薬の有効な直接送達のための改良された方法を提供する。上記のように、本発明は、リソソーム蓄積症に関する補充酵素が、被験者における実質的な有害作用を誘導することなく、高濃度で処置を必要とする対象の脳脊髄液CSF中に直接導入され得る、という予期せぬ発見に基づいている。さらに意外なことに、合成CSFを用いることなく、補充酵素が単なる生理食塩水または緩衝液ベースの処方物中で送達され得る、ということを本発明人等は見出した。さらに予期せぬことに、本発明による髄腔内送達は、対象における実質的な有害作用、例えば重症免疫応答を生じない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、同時免疫抑制薬療法の非存在下で例えば、前処置または前状態調節による免疫寛容の誘導なしで、用いられ得る。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、種々の脳組織を通した効率的拡散を可能にして、表面、浅在および/または深部脳領域における種々の標的脳組織における補充酵素の効果的送達を生じる。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、末梢循環に進入するのに十分な量の補充酵素を生じた。その結果、いくつかの場合には、本発明による髄腔内送達は、肝臓、心臓および腎臓のような末梢組織における補充酵素の送達を生じた。この発見は予期せぬものであり、典型的には定期的髄腔内投与および静脈内投与を必要とするCNSおよび末梢構成成分の両方を有するリソソーム蓄積症の処置のために特に有用であり得る。本発明による髄腔内送達は、末梢症候を処置するに際して治療効果を危うくすることなく、静脈内注射の用量投与および/または頻度低減を可能にし得る、ということが意図される。本発明は、種々の脳標的組織への補充酵素の効率的且つ便利な送達を可能にして、CNS指標を有するリソソーム蓄積症の有効な処置を生じる種々の予期せぬ且つ有益な特徴を提供する。本発明の種々の態様は、以下の節で詳細に記載される。節の記載内容は、本発明を限定するものではない。各説は、本発明の任意の態様に適用し得る。この出願において、またはは、別記しない限りおよび/またはを意味する。リソソーム蓄積症および補充酵素本発明の方法は、任意のリソソーム蓄積症、特にCNS病因および/または症候を有するリソソーム蓄積症、例えば、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシスI/II型、ゴーシェ病I/II/III型、グロボイド細胞白質ジストロフィー症、クラッベ病、糖原病II型、ポンペ病、GM1-ガングリオシドーシスI/II/III型、GM2-ガングリオシドーシスI型、テイサックス病、GM2-ガングリオシドーシスII型、サンドホッフ病、GM2-ガングリオシドーシス、α-マンノーシドーシスI/II型、β-マンノーシドーシス、異染性白質ジストロフィー症、ムコリピドーシスI型、シアリドーシスI/II型、ムコリピドーシスII/III型、ムコリピドーシスIV型、I-細胞病、ムコリピドーシスIIIC型、偽性ハーラーポリジストロフィー、ムコ多糖症I型、ムコ多糖症II型、ハンター症候群、ムコ多糖症IIIA型、サンフィリッポ症候群A、BまたはD型、ムコ多糖症IIIB型、ムコ多糖症IIIC型、ムコ多糖症IIID型、ムコ多糖症IVA型、モルキオ症候群、ムコ多糖症IVB型、ムコ多糖症VI型、ムコ多糖症VII型、スライ症候群、ムコ多糖症IX型、多重スルファターゼ欠乏症、ニューロンセロイド脂褐素沈着症、CLN1バッテン病、CLN2バッテン病、ニーマンピック病A/B型、ニーマンピック病C1型、ニーマンピック病C2型、濃化異骨症、シンドラー病I/II型、ゴーシェ病およびシアル酸蓄積症これらに限定されないを処置するために用いられ得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて処置されるべきリソソーム蓄積症としては、ハンター症候群、異染性ジストロフィーMLD症、サンフィリッポ症候群A型、サンフィリッポ症候群B型およびグロボイド細胞白質ジストロフィーGLD症が挙げられる。リソソーム蓄積症の遺伝的病因、臨床症候発現および分子生物学知見は、Scriveretal.,eds.,TheMetabolicandMolecularBasisofInheritedDisease,7.sup.thEd.,Vol.II,McGrawHill,1995に詳述されている。したがって、上記疾患における酵素欠乏は当業者に既知であり、これらのいくつかは、以下の表に例示されている:補充酵素本発明の方法は、任意の補充酵素を送達するために用いられ得る。本明細書中で用いる場合、本発明に適した補充酵素は、処置されるべきリソソーム蓄積症において欠乏しているかまたは失われているリソソーム酵素の少なくとも一部の活性に取って替わるよう作用し得る任意の酵素を包含し得る。いくつかの実施形態では、補充酵素は、リソソーム中の蓄積物質を低減し得るし、あるいは1つ以上のリソソーム蓄積症症候を救出するかまたは改善し得る。いくつかの実施形態では、適切な補充酵素は、処置されるべきリソソーム蓄積症に関連づけられることが既知の任意のリソソーム酵素であり得る。いくつかの実施形態では、適切な補充酵素は、上記の表1に列挙された酵素から選択される酵素である。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、イズロン酸-2-スルファターゼI2S、アリールスルファターゼAASA、ヘパランN-スルファターゼHNS、アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼNagluまたはβ-ガラクトシダーゼGLCである。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、野生型または天然配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、野生型または天然配列と実質的相同性または同一性を有する例えば、野生型または天然配列との少なくとも70、75、80、85、90、95、98の配列同一性を有する修飾配列を有し得る。本発明に適している補充酵素は、任意の利用可能な手段により産生され得る。例えば、補充酵素は、補充酵素コード核酸を発現するよう工学処理された宿主細胞系を利用することにより、組換え的に産生され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、内因性遺伝子を活性化することにより産生され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、化学合成により、部分的にまたは完全に、調製され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、天然供給源からも精製され得る。酵素が組換え的に産生される場合、任意の発現系が用いられ得る。2~3ではあるが例を挙げると、既知の発現系としては、例えば卵細胞、バキュロウイルス、植物細胞、酵母または哺乳動物細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明に適している酵素は、哺乳動物中で産生される。本発明にしたがって用いられ得る哺乳動物細胞の非限定例としては、以下のものが挙げられる:BALB/cマウス骨髄腫株NSO/l、ECACC番号:85110503;ヒト網膜芽細胞PER.C6、CruCell,Leiden,TheNetherlands;SV40により形質転換されたサル腎臓CV1株COS-7、ATCCCRL1651;ヒト胚性腎臓株293または293細胞懸濁液培養中での増殖のためにサブクローン化、Grahametal.,J.GenVirol.,36:59,1977;ヒト繊維肉腫細胞株例えば、HT1080;ハムスター幼仔腎細胞BHK、ATCCCCL10;チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFRCHO、UrlaubandChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980;マウスセルトリ細胞TM4、Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980;サル腎細胞CV1ATCCCCL70;アフリカミドリザル腎細胞VERO-76、ATCCCRL-1587;ヒト子宮頚部癌細胞HeLa、ATCCCCL2;イヌ腎細胞MDCK、ATCCCCL34;バッファローラット肝細胞BRL3A、ATCCCRL1442;ヒト肺細胞W138、ATCCCCL75;ヒト肝細胞HepG2、HB8065;マウス乳癌MMT060562、ATCCCCL51;TRI細胞Matheretal.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982;MRC5細胞;FS4細胞;およびヒト肝細胞癌株HepG2。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ヒト細胞から産生される補充酵素を送達するために用いられる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、CHO細胞から産生される補充酵素を送達するために用いられる。いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて送達される補充酵素は、細胞取込みおよび/またはリソソームターゲッティングを助長するために脳細胞の表面の受容体と結合する部分を含有する。例えば、このような受容体は、マンノース-6-ホスフェートM6P残基を結合する陽イオン非依存性マンノース-6-ホスフェート受容体CI-MPRであり得る。さらに、CI-MPRは、他のタンパク質、例えばIGF-IIとも結合する。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、タンパク質の表面にM6P残基を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、CI-MPRに対するより高い結合親和性を有するビス-ホスホリル化オリゴ糖を含有し得る。いくつかの実施形態では、適切な酵素は、酵素当たりおよそ少なくとも20のビス-ホスホリル化オリゴ糖のほぼ平均まで含有する。他の実施形態では、適切な酵素は、酵素当たり約10、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60のビス-ホスホリル化オリゴ糖を含有し得る。このようなビス-ホスホリル化オリゴ糖は酵素上に天然に存在し得るが、酵素はこのようなオリゴ糖を保有するよう修飾され得る、ということに留意すべきである。例えば、適切な補充酵素は、UDP-GlcNAcからリソソーム酵素上のα-1,2-連結マンノースの6’位置へのN-アセチルグルコサミン-L-ホスフェートの移動を触媒し得るある種の酵素により修飾され得る。このような酵素を産生し、使用するための方法および組成物は、例えば、Canfield等により米国特許第6,537,785号および米国特許第6,534,300号これらの記載内容は各々、参照により本明細書中に援用されるに記載されている。いくつかの実施形態では、本発明に用いるための補充酵素は、脳細胞の表面の受容体と結合し得るリソソームターゲッティング部分と共役されるかまたは融合され得る。適切なリソソームターゲッティング部分は、IGF-I、IGF-II、RAP、p97、ならびにその変異体、相同体または断片例えば、野生型成熟ヒトIGF-I、IGF-II、RAP、p97ペプチド配列と少なくとも70、75、80、85、90または95同一な配列を有するペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、BBBを横断し、CNS中にこのような作用物質を送達するかまたは輸送するのを増強するよう修飾されていない。髄腔内送達本発明によれば、補充酵素はCNSに送達される。いくつかの実施形態では、処置を必要とする対象の脳脊髄液CSF中に投与することにより、補充酵素はCNSに送達される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、CSF中への所望の補充酵素を送達するために用いられる。本明細書中で用いる場合、髄腔内投与髄腔内注射とも呼ばれるは、脊柱管脊髄周囲の髄腔内空隙への注射を指す。種々の技法、例えば穿頭孔あるいは槽または腰椎穿刺等を通した外側脳室注射が用いられ得るが、これらに限定されない。例示的方法は、Lazorthesetal.AdvancesinDrugDeliverySystemsandApplicationsinNeurosurgery,143-192およびOmayaetal.,CancerDrugDelivery,1:169-179これらの記載内容は参照により本明細書中に援用されるに記載されている。本発明によれば、酵素は、脊柱管周囲の任意の領域で注射され得る。いくつかの実施形態では、酵素は、腰椎域または大槽中に注射されるか、あるいは脳室空隙中に脳室内注射される。本明細書中で用いる場合、腰部領域または腰椎区域という用語は、第三および第四腰椎下方背部間の区域、さらに包括的には、脊椎のL2~S1領域を指す。典型的には、腰部領域または腰椎区域を介した髄腔内注射は、腰椎IT送達または腰椎IT投与としても言及される。大槽という用語は、頭蓋骨と脊椎の上部との間の開口部を介した小脳の周囲および下の空隙を指す。典型的には、大槽を介した髄腔内注射は、大槽送達とも呼ばれる。脳室という用語は、脊髄の中央管と連続している脳中の空洞を指す。典型的には、脳室腔を介した注射は、脳室内大脳ICV送達と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内投与または髄腔内送達は、例えば、第三および第四腰椎下方背部間の区域、さらに包括的には、脊椎のL2~S1領域の間に送達される腰椎IT投与または送達を指す。腰椎IT投与または送達は、本発明による腰椎IT投与または送達が遠位脊柱管へのより良好な且つより有効な送達を提供するという点で大槽送達を上回って区別されるが、一方、大槽送達は、特に、典型的には遠位脊柱管に良好に送達しない、ということが意図される。IT送達のための安定処方物いくつかの実施形態では、所望の酵素は、髄腔内送達のために安定処方物中で送達される。本発明のある実施形態は、少なくとも一部は、本明細書中に開示される種々の処方物が、CNSの標的化組織、細胞および/または細胞小器官への1つ以上の治療薬例えば、酵素の有効な送達および分布を促す、という発見に基づいている。特に、本明細書中に記載される処方物は、高濃度の治療薬例えば、タンパク質または酵素を可溶化し得るし、CNS構成成分および/または病因を有する疾患の処置のために対象のCNSにこのような治療薬を送達するのに適している。本明細書中に記載される組成物は、それを必要とする対象のCNSに例えば髄腔内に投与される場合、安定性改善および耐容性改善によりさらに特性化される。本発明の前に、伝統的非緩衝化等張生理食塩水およびエリオットのB溶液人工CSFが、典型的には髄腔内送達のために用いられた。エリオットのB溶液に対するCSFの組成を表す比較は、以下の表2に含まれている。表2に示されているように、エリオットB溶液の濃度は、CSFの濃度と密接に類似している。しかしながら、エリオットのB溶液は、極度に低い緩衝剤濃度を含有し、したがって、特に長期間に亘って例えば、貯蔵状態の間、治療薬例えばタンパク質を安定化するために必要とされる適切な緩衝能力を提供し得ない。さらに、エリオットのB溶液は、いくつかの治療薬、特にタンパク質または酵素を送達するよう意図された処方物と非相溶性であり得るある種の塩を含有する。例えば、エリオットのB溶液中に存在するカルシウム塩は、タンパク質沈降を媒介し、それにより処方物の安定性を低減し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達に適した処方物は、合成または人工CSFではない。いくつかの実施形態では、髄腔内送達のための処方物は、それらが、それとともに処方される1つ以上の治療薬例えば、組換えタンパク質を安定化し、あるいはその分解を遅くするかまたは防止し得るよう、処方されている。本明細書中で用いる場合、安定なという用語は、長期間に亘ってその治療効力例えば、その意図された生物学的活性および/または物理化学的完全性のうちのすべてまたは大多数を保持する治療薬例えば、組換え酵素の能力を指す。治療薬の安定性、ならびにこのような治療薬の安定性を保持する薬学的組成物の能力は、長期間例えば、好ましくは少なくとも1、3、6、12、18、24、30、36ヶ月またはそれ以上に亘って評価され得る。処方物の状況では、安定処方物は、貯蔵時および加工処理例えば、凍結/解凍、機械的混合および凍結乾燥の間、その中の治療薬が本質的にはその物理的および/または化学的完全性ならびに生物学的活性を保持するものである。タンパク質安定性に関しては、それは、高分子量HMW集合体の形成、酵素活性の損失、ペプチド断片の生成、および電荷プロフィールの移動により測定され得る。治療薬の安定性は、特別な重要性を有する。治療薬の安定性は、長期間に亘る治療薬の生物学的活性または物理化学的完全性に関してさらに評価され得る。例えば、所定の時点での安定性は、早い時点例えば、処方0日目での安定性に対して、あるいは非処方治療薬に対して比較され得る。この比較の結果は、パーセンテージとして表される。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、長期間に亘って例えば、室温で、または加速貯蔵条件下で、少なくとも6~12ヶ月間に亘って測定、治療薬の生物学的活性または物理化学的完全性の少なくとも100、少なくとも99、少なくとも98、少なくとも97、少なくとも95、少なくとも90、少なくとも85、少なくとも80、少なくとも75、少なくとも70、少なくとも65、少なくとも60、少なくとも55または少なくとも50を保持する。いくつかの実施形態では、治療薬例えば、所望の酵素は、本発明の処方物中で可溶性である。可溶性のという用語は、均質溶液を生成するこのような治療薬の能力を指す。好ましくは、それが投与されそれが標的作用部位例えば、脳の細胞および組織に輸送される溶液中の治療薬の溶解度は、標的作用部位への治療的有効量の治療薬の送達を可能にするのに十分である。いくつかの因子が、治療薬の溶解度に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質溶解度に影響し得る関連因子としては、イオン強度、アミノ酸配列および他の同時可溶化剤または塩例えば、カルシウム塩の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、カルシウム塩がこのような組成物から除去されるよう処方される。したがって、髄腔内投与に適した処方物は、種々の濃度で当該治療薬例えば、酵素を含有し得る。いくつかの実施形態では、適切な処方物は、約300mg/mlまで例えば、約250mg/mlまで、200mg/mlまで、150mg/mlまで、100mg/mlまで、90mg/mlまで、80mg/mlまで、70mg/mlまで、60mg/mlまで、50mg/mlまで、40mg/mlまで、30mg/mlまで、25mg/mlまで、20mg/mlまで、10mg/mlまでの濃度で当該タンパク質または酵素を含有し得る。いくつかの実施形態では、適切な処方物は、約0~300mg/ml例えば、約1~250mg/ml、約1~200mg/ml、約1~150mg/ml、約1~100mg/ml、約10~100mg/ml、約10~80mg/ml、約10~70mg/ml、約1~60mg/ml、約1~50mg/ml、約10~150mg/ml、約1~30mg/mlの間の範囲の濃度で当該タンパク質または酵素を含有し得る。いくつかの実施形態では、髄腔内送達に適した処方物は、およそ1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、250mg/mlまたは300mg/mlの濃度で、当該タンパク質を含有し得る。いくつかの実施形態では、等張溶液が用いられる。いくつかの実施形態では、わずかに高張性の溶液例えば、5mMリン酸ナトリウムpH7.0中に、300mMまで例えば、250mMまで、200mM、175mM、150mM、125mMまでの塩化ナトリウムおよび糖含有溶液例えば、5mMリン酸ナトリウムpH7.0中に3まで例えば、2.4、2.0、1.5、1.0までのスクロースは、サルにおいて良好に耐容されることが実証されている。いくつかの実施形態では、適切なCNSボーラス処方物組成物は、生理食塩水水中150mMのNaClである。多数の治療薬、特に本発明のタンパク質および酵素は、本発明の薬学的組成物中でそれらの溶解性および安定性を保持するために、制御されたpHおよび特定の賦形剤を要する。以下の表3は、本発明のタンパク質治療薬の溶解性および安定性を保持するために重要であるとみなされるタンパク質処方物のある例示的態様を確認するのに役立つ。薬学的組成物のpHは、水性薬学的組成物中の治療薬例えば、酵素またはタンパク質の溶解度を変更し得る付加的因子である。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、1つ以上の緩衝剤を含有する。いくつかの実施形態では、本発明による組成物は、約4.0~8.0、約5.0~7.5、約5.5~7.0、約6.0~7.0および約6.0~7.5の間の上記組成物の最適pHを保持するのに十分な量の緩衝剤を含有する。他の実施形態では、緩衝液は、約50mMまで例えば、約45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mMまでのリン酸ナトリウムを含む。適切な緩衝剤としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸およびトリスヒドロキシメチルアミノメタントリスが挙げられる。適切な緩衝剤の濃度は、例えば、緩衝剤および処方物の所望の等張性によって、約1mMから約100mMまで、または約3mMから約20mMまでであり得る。いくつかの実施形態では、適切な緩衝剤は、約1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mMまたは100mMの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、処方物は、処方物を等張に保つために等張剤を含有する。IT送達と結びつけて用いられる場合、等張のとは、当該処方物が本質的にはヒトCSFと同じ等張性を有することを意味する。等張処方物は、一般的に、約240mOsm/kg~約350mOsm/kgの浸透圧を有する。等張度は、例えば、蒸気圧または凝固点型浸透圧計を用いて測定され得る。例示的等張剤としては、グリシン、ソルビトール、マンニトール、塩化ナトリウムおよびアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、適切な等張剤は、約0.01~5重量例えば、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0または5.0重量の濃度で、処方物中に存在し得る。いくつかの実施形態では、処方物は、タンパク質を保護するために安定化剤を含有し得る。典型的には、適切な安定化剤は、非還元糖、例えばスクロース、ラフィノース、トレハロース、またはアミノ酸、例えばグリシン、アルギニンおよびメチオニンである。処方物中の安定化財の量は、一般的に、処方物が等張であるような量である。しかしながら、高張処方物も適切であり得る。さらに、安定化剤の量は、治療薬の許容不可能な量の分解/凝集が起きるほど低すぎてはならない。処方物中の安定化剤の濃度の例は、約1mM~約400mM例えば、約30mM~約300mM、および約50mM~約100mM、あるいは0.1~15重量例えば、1~10重量、5~15重量、5~10重量の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、安定化剤と治療薬の質量比は、約1:1である。他の実施形態では、安定化剤と治療薬の質量比は、約0.1:1、0.2:1、0.25:1、0.4:1、0.5:1、1:1、2:1、2.6:1、3:1、4:1、5:1、10;1、or20:1であり得る。凍結乾燥に適切であるいくつかの実施形態では、安定化剤はリオプロテクタントでもある。本発明の薬学的組成物、処方物および関連方法は、対象のCNSに種々の治療薬を例えば、髄腔内、脳室内または槽内に送達するために、ならびに関連疾患の処置のために有用である。本発明の薬学的組成物は、リソソーム蓄積症に罹患している対象にタンパク質および酵素を送達するために特に有用である。いくつかの実施形態では、処方物に界面活性剤を付加することが望ましい。界面活性剤の例としては、ポリソルベート例えば、ポリソルベート20または80;ポロキサマー例えば、ポロキサマー188;トリトン;ドデシル硫酸ナトリウムSDS;ラウリル硫酸ナトリウム;ナトリウムオクチルグリコシド;ラウリル-、ミリスチル-、リノレイル-またはステアリル-スルホベタイン;ラウリル-、ミリスチル-、リノレイル-またはステアリル-サルコシン;リノレイル-、ミリスチル-またはセチル-ベタイン;ラウロアミドプロピル-、コカミドプロピル-、リノレアミドプロピル-、ミリスタミドプロピル-、パルミドプロピル-またはイソステアラミドプロピル-ベタイン例えば、ラウロアミドプロピル;ミリスタルニドプロピル-、パルミドプロピル-またはイソステアラミドプロピル-ジメチルアミン;ナトリウムメチルココイル-または二ナトリウムメチルオフェイル-タウレート;およびMONAQUAT商標シリーズMonaIndustries,Inc.,Paterson,N.J.、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー例えば、プルロニック、PF68等が挙げられる。典型的には、付加される界面活性剤の量は、それがタンパク質の凝集を低減し、粒子の形成または泡立ちを最小限にするような量である。例えば、界面活性剤は、約0.001~0.5例えば、約0.005~0.05または0.005~0.01の濃度で処方物中に存在し得る。特に、界面活性剤は、約0.005、0.01、0.02、0.1、0.2、0.3、0.4または0.5等の濃度で処方物中に存在し得る。いくつかの実施形態では、適切な処方物は、特に凍結乾燥処方物のために、1つ以上のバルク剤をさらに含み得る。バルク剤は、凍結乾燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケークの物理的構造に寄与する。例えばバルク剤は、凍結乾燥ケークの外観を改良し得る例えば、本質的に均一な凍結乾燥ケーク。適切なバルク剤の例としては、塩化ナトリウム、ラクトース、マンニトール、グリシン、スクロース、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。バルク剤の濃度の例は、約1~約10例えば、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5および10.0である。本発明による処方物は、品質分析、再構成時間凍結乾燥された場合、再構成の質凍結乾燥された場合、高分子量、水分およびガラス転移温度に基づいて評価され得る。典型的には、タンパク質の質および生成物分析は、例えば、サイズ排除HPLCSE-HPLC、陽イオン交換-HPLCCEX-HPLC、X線回析XRD、変調型示差走査熱量測定mDSC、逆相HPLCRP-HPLC、多角度光散乱MALS、蛍光、紫外線吸収、ネフェロメトリー、毛細管電気泳動CE、SDS-PAGEおよびその組合せこれらに限定されないを含めた方法を用いる生成物分解率分析を包含する。いくつかの実施形態では、本発明による生成物の評価は、外観液体またはケーク外観を評価するステップを含む。一般的に、処方物凍結乾燥化または水性は、室温で長期間保存され得る。貯蔵温度は、典型的には、0°C~45°C例えば、4°C、20°C、25°C、45°C等の範囲であり得る。処方物は、吸うかげる~数年の間貯蔵され得る。貯蔵時間は、一般的に、24ヶ月、12ヶ月、6ヶ月、4.5ヶ月、3ヶ月、2ヶ月または1ヶ月である。処方物は、投与のために用いられる容器中に直接貯蔵されて、移送ステップを排除し得る。処方物は、凍結乾燥容器凍結乾燥される場合中に直接貯蔵され得るが、これは、再構成容器としても機能して、移送ステップを排除し得る。代替的には、凍結乾燥物質処方物は、貯蔵のためにより小さい増分で測定され得る。貯蔵は、一般的に、タンパク質の分解を生じさせる環境、例えば日光、紫外線他の形態の電磁放射線、過剰な熱または寒冷、休息名熱ショック、ならびに機械的衝撃への曝露これらに限定されないを避けるべきである。いくつかの実施形態では、本発明による処方物は、液体または水性形態である。いくつかの実施形態では、本発明の処方物は凍結乾燥される。このような凍結乾燥処方物は、対象への投与の前に、それに1つ以上の希釈剤を付加することにより、再構成され得る。適切な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌性水および滅菌生理食塩溶液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、再構成時、そこに含有される治療薬は安定で、可溶性であり、そして対象への投与時に耐容性を実証する。本発明の薬学的組成物は、それらの耐容性により特性化される。本明細書中で用いる場合、耐容可能なおよび耐容性という用語は、このような組成物が投与される対象において悪反応を引き出さないか、代替的には、このような組成物が投与される対象において重篤な悪反応を引き出さない本発明の薬学的組成物の能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、このような組成物が投与される対象により良好に耐容される。髄腔内送達のための装置本発明による髄腔内送達のために、種々の装置が用いられ得る。いくつかの実施形態では、髄腔内投与のための装置は、流体接触ポート例えば注射用口;流体接触ポートと流体連絡する第一流出口、および脊髄中への挿入のために設計された第二流出口;ならびに脊髄における中空体の挿入を固定するための固定機構を含有する。図1に示した非限定例として、適切な固定機構は、中空体の表面に載せられる1つ以上のノブ、および1つ以上のノブを覆って、中空体が脊髄から滑り落ちないようにする調整可能な縫合リングを含有する。種々の実施形態では、流体接触ポートはリザーバを含む。いくつかの実施形態では、流体接触ポートは、機械式ポンプ例えば、注入ポンプを含む。いくつかの実施形態では、埋込みカテーテルは、リザーバ例えば、ボーラス送達のためまたは注入ポンプと連結される。流体接触ポートは、埋め込まれるかまたは外側に存在し得る。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、腰椎穿刺すなわち、緩徐ボーラス投与により、またはポートカテーテル送達系すなわち注入またはボーラス投与を介して実施され得る。いくつかの実施形態では、カテーテルは腰椎の薄板間に挿入され、尖端は、包膜空隙に所望のレベル一般的にL3~L4に装填される図2。静脈内投与に比して、髄腔内投与に適した単回用量投与容積は典型的に小さい。典型的には、本発明による髄腔内送達は、CSFの組成の平衡、ならびに対象の頭蓋内圧を保持する。いくつかの実施形態では、髄腔内送達は、対象からのCSFの対応する除去がない時に実施される。いくつかの実施形態では、適切な単回用量投与容積は、例えば約10ml、8ml、6ml、5ml、4ml、3ml、2ml、1.5ml、1mlまたは0.5ml未満であり得る。いくつかの実施形態では、適切な単回用量投与容積は、約0.5~5ml、0.5~4ml、0.5~3ml、0.5~2ml、0.5~1ml、1~3ml、1~5ml、1.5~3ml、1~4mlまたは0.5~1.5mlであり得る。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、所望量のCSFを除去するステップを最初に包含する。いくつかの実施形態では、約10ml未満例えば、約9ml、8ml、7ml、6ml、5ml、4ml、3ml、2ml、1ml未満のCSFが先ず除去された後、IT投与がなされる。それらの場合、適切な単回用量投与容積は、例えば約3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15mlまたは20mlより大きい。治療用組成物の髄腔内投与を実行するために、種々の他の装置が用いられ得る。例えば、所望の酵素を含有する処方物は、髄膜癌腫症のための薬剤を髄腔内投与するために一般に用いられるオンマヤOmmayaリザーバを用いて投与され得るLancet2:983-84,1963。さらに具体的には、この方法では、脳室チューブは前角中に形成される穴を通して挿入され、頭皮下に設置されるオンマヤリザーバに連結され、リザーバは皮下穿刺されて、リザーバ中に注入される補充されるべき特定酵素を髄腔内送達する。個体への治療用組成物または処方物の髄腔内投与のための他の装置は、米国特許第6,217,552号明細書この記載内容は参照により本明細書中に援用されるに記載されている。代替的には、薬剤は、例えば単回注射または連続注入により、髄腔内投与され得る。投薬処置は、単回用量投与または多数回用量投与の一形態であり得る、と理解されるべきである。注射のためには、本発明の処方物は、液体溶液中に処方され得る。さらに、酵素は固体形態で処方され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態も包含される。注射は、例えば、酵素のボーラス注射または連続注入例えば、注入ポンプを用いるの形態であり得る。本発明の一実施形態では、酵素は、対象の脳への外側脳室注射により投与される。注射は、例えば、対象の頭蓋骨に作られる穿頭孔を通してなされ得る。別の実施形態では、酵素および/または他の薬学的処方物は、対象の脳室中に外科的に挿入されるシャントを通して投与される。例えば、注射は、より大きい外側脳室中になされ得る。いくつかの実施形態では、より小さい第三および第四脳室への注射もなされ得る。さらに別の実施形態では、本発明に用いられる薬学的組成物は、対象の大槽または腰椎区域への注射により投与される。本発明の方法の別の実施形態では製薬上許容可能な処方物は、製薬上許容可能な処方物が対象に投与された後、少なくとも1、2、3、4週間またはそれ以上の間、対象に、本発明で用いられる酵素または他の薬学的組成物の持続性送達、例えば緩徐放出を提供する。本明細書中で用いる場合、持続性送達という用語は、投与後、長期間に亘って、好ましくは少なくとも数日間、1週間または数週間、invivoで本発明の薬学的処方物を連続送達することを指す。組成物の持続性送達は、例えば、長時間に亘る酵素の連続治療効果により実証され得る例えば、酵素の持続性送達は、対象における貯蔵顆粒の量の連続的低減により実証され得る。代替的には、酵素の持続性送達は、長時間に亘るinvivoでの酵素の存在を検出することにより実証され得る。標的組織への送達上記のように、本発明の意外な且つ重要な特徴の1つは、本発明の方法を用いて投与される治療薬、特に補充酵素、ならびに本発明の組成物は、脳表面全体に効果的に且つ広範囲に拡散し、脳の種々の層または領域、例えば深部脳領域に浸透し得る、という点である。さらに、本発明の方法および本発明の組成物は、現存するCNS送達方法、例えばICV注射では標的化するのが困難である脊髄の出の組織、ニューロンまたは細胞、例えば腰部領域に治療薬例えば、補充酵素を効果的に送達する。さらに、本発明の方法および組成物は、血流ならびに種々の末梢器官および組織への十分量の治療薬例えば、補充酵素を送達する。したがって、いくつかの実施形態では、治療用タンパク質例えば、補充酵素は、対象の中枢神経系に送達される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質例えば、補充酵素は、脳、脊髄および/または末梢期間の標的組織のうちの1つ以上に送達される。本明細書中で用いる場合、標的組織という用語は、処置されるべきリソソーム蓄積症により影響を及ぼされる任意の組織、あるいは欠損リソソーム酵素が正常では発現される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織としては、リソソーム蓄積症に罹患しているかまたは罹患しやすい患者において、例えば組織の細胞リソソーム中に貯蔵される酵素基質が検出可能量でまたは異常に高い量で存在する組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的組織としては、疾患関連病態、症候または特徴を示す組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的組織としては、欠損リソソーム酵素が抗レベルで正常では発現される組織が挙げられる。本明細書中で用いる場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織および/または末梢標的組織であり得る。標的組織の例は、以下で詳細に記載される。脳標的組織概して、脳は、異なる領域、層および組織に分けられ得る。例えば、髄膜組織は、脳を含めた中枢神経系を包む膜系である。髄膜は、3つの層、例えば硬膜、クモ膜および軟膜を含有する。概して、髄膜の、ならびに脳脊髄液の主な機能は、脳神経系を保護することである。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、髄膜の1つ以上の層に送達される。脳は、大脳、小脳および脳幹を含めた3つの主な細区画を有する。大脳半球は、ほとんどの他の脳構造の上に位置し、皮質層で覆われている。大脳の下層には脳幹が横たわり、これは茎に似ており、その上に大脳が取り付けられている。脳の後部、大脳の下および脳幹の背後には、小脳が存在する。脳の正中線近くおよび中脳の上に位置する間脳は、視床、視床後部、視床下部、視床上部、腹側視床および視蓋腹部を含有する。中脳mesencephalonは、midbrainとも呼ばれ、視蓋、外被、ventricularmesocoelia、ならびに大脳脚、赤核および第三脳神経核を含有する。中脳は、視覚、聴覚、運動制御、睡眠/覚醒、警戒および温度調節に関連する。脳を含めた中枢神経系の組織の領域は、組織の深さに基づいて特性化され得る。CNS例えば脳組織は、表面組織または浅部組織、中深部組織および/または深部組織として特性化され得る。本発明によれば、治療用タンパク質例えば、補充酵素は、対象において処置されるべき特定疾患に関連した任意の適切な脳標的組織単数または複数に送達され得る。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質例えば、補充酵素は、表面および浅在脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、中深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、表面または浅在脳標的組織、中深部脳標的組織および/または深部脳標的組織の組合せに送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、脳の外表面の少なくとも4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mmまたはそれより下または内側の深部脳組織に送達される。いくつかの実施形態では、治療薬例えば酵素は、大脳の1つ以上の表面組織または浅部組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面組織または浅部組織は、大脳の表面から4mm内に位置する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面組織または浅部組織は、軟膜組織、大脳皮質リボン組織、海馬、フィルヒョーロバン腔隙、VR腔隙内の血管、海馬、脳の下面の視床下部の部分、視神経および視索、嗅球および嗅突起ならびにその組合せから選択される。いくつかの実施形態では、治療薬例えば酵素は、大脳の1つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面組織または浅部組織は、大脳の表面から4mmより下例えば、5mm、6mm、7mm、8mm、9mmまたは10mmに位置する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化深部組織は、大脳皮質リボンを包含する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化深部組織は、間脳例えば、視床下部、視床、腹側視床および視床腹部等、後脳、レンズ核、基底核、尾状核、被核、扁桃、淡蒼球およびその組合せのうちの1つ以上を包含する。いくつかの実施形態では、治療薬例えば酵素は、小脳の1つ以上の組織に送達される。ある実施形態では、小脳の1つ以上の標的化組織は、分子層の組織、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、小脳脚およびその組合せからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、治療薬例えば酵素は、小脳の1つ以上の深部組織、例えばプルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織例えば、顆粒細胞層に比して深部および深部小脳核組織これらに限定されないに送達される。いくつかの実施形態では、治療薬例えば酵素は、脳幹の1つ以上の組織に送達される。いくつかの実施形態では、脳幹の1つ以上の標的化組織は、脳幹白質組織および/または脳幹核組織を包含する。いくつかの実施形態では、治療薬例えば酵素は、種々の脳組織、例えば灰白質、白質、脳室周囲域、軟膜-クモ膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状核/被殻領域、中脳、脳橋または延髄の深部領域、およびその組合せこれらに限定されないに送達される。いくつかの実施形態では、治療薬例えば酵素は、脳中の種々の細胞、例えばニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および/または髄膜細胞これらに限定されないに送達される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、深部白質の乏突起グリア細胞に送達される。脊髄概して、脊髄の領域または組織は、組織の深度に基づいて特性化され得る。例えば、脊髄組織は、表面組織または浅部組織、中深部組織、および/または深部組織として特性化され得る。いくつかの実施形態では、治療薬例えば酵素は、脊髄の1つ以上の表面組織または浅部組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面組織または浅部組織は、脊髄の表面から4mm内に位置する。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面組織または浅部組織は、軟膜および/または白質路を含有する。いくつかの実施形態では、治療薬例えば酵素は、脊髄の1つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化深部組織は、脊髄の表面から4mm内部に位置する。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化深部組織は、脊髄灰白質および/または上衣細胞を含有する。いくつかの実施形態では、治療薬例えば酵素は、脊髄のニューロンに送達される。末梢標的組織本明細書中で用いる場合、末梢器官または組織は、中枢神経系CNSの一部ではない任意の器官または組織を指す。末梢標的組織としては、血管系、肝臓、腎臓、心臓、内皮、骨髄および骨髄由来細胞、脾臓、肺、リンパ節、骨、軟骨、卵巣および精巣が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質例えば補充酵素は、末梢標的組織のうちの1つ以上に送達される。生体分布および生物学的利用能種々の態様において、標的組織に一旦送達されると、治療薬例えば補充酵素は、細胞内に局在化される。例えば、治療薬例えば酵素は、標的細胞例えば、プルキンエ細胞のようなニューロンのエキソン、軸索、リソソーム、ミトコンドリアまたは空胞に局在化され得る。例えば、いくつかの実施形態では、髄腔内投与酵素は、酵素が血管周囲腔隙内に移動するよう例えば、拍動補助対流機構により、移動力学を実証する。さらに、投与タンパク質または酵素と神経細繊維との会合に関する活性軸索輸送機構も、中枢神経系の深部組織中への、髄腔内投与タンパク質または酵素の分布に寄与し得るし、そうでなければそれを助長し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬例えば補充酵素は、本明細書中に記載される種々の標的組織において、治療的または臨床的有効レベルまたは活性を達成し得る。本明細書中で用いる場合、治療的または臨床的有効レベルまたは活性は、標的組織において治療作用を付与するのに十分なレベルまたは活性である。治療作用は、客観的すなわち、何らかの試験またはマーカーにより測定または主観的すなわち、対象が作用の指標または感覚を提示するであり得る。例えば、治療的または臨床的有効レベルまたは活性は、標的組織における疾患に伴う症候例えば、GAG貯蔵を改善するのに十分である酵素レベルまたは活性であり得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬例えば補充酵素は、標的組織における対応するリソソーム酵素の正常レベルまたは活性の少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95である酵素レベルまたは活性を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬例えば補充酵素は、対照例えば、処置を伴わない内因性レベルまたは活性と比較して、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍または10倍増大される酵素レベルまたは活性を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬例えば補充酵素は、標的組織中で、少なくとも約10nmol/時mg、20nmol/時mg、40nmol/時mg、50nmol/時mg、60nmol/時mg、70nmol/時mg、80nmol/時mg、90nmol/時mg、100nmol/時mg、150nmol/時mg、200nmol/時mg、250nmol/時mg、300nmol/時mg、350nmol/時mg、400nmol/時mg、450nmol/時mg、500nmol/時mg、550nmol/時mgまたは600nmol/時mgの酵素レベルまたは活性増大を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、腰部領域を標的化するために特に有用である。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬例えば補充酵素は、少なくとも約500nmol/時mg、600nmol/時mg、700nmol/時mg、800nmol/時mg、900nmol/時mg、1000nmol/時mg、1500nmol/時mg、2000nmol/時mg、3000nmol/時mg、4000nmol/時mg、5000nmol/時mg、6000nmol/時mg、7000nmol/時mg、8000nmol/時mg、9000nmol/時mgまたは10,000nmol/時mgの腰部領域における酵素レベルまたは活性増大を達成し得る。概して、本発明に従って送達される治療薬例えば補充酵素は、CSFならびに脳、脊髄および末梢器官の標的組織中で十分に長い半減期を有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬例えば補充酵素は、少なくとも約30分、45分、60分、90分、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、12時間、16時間、18時間、20時間、25時間、30時間、35時間、40時間、3日まで、7日まで、14日まで、21日まで、または1ヶ月までの半減期を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬例えば補充酵素は、投与の12時間、24時間、30時間、36時間、42時間、48時間、54時間、60時間、66時間、72時間、78時間、84時間、90時間、96時間、102時間または1週間後に、CSFまたは血流中に検出可能なレベルまたは活性を保持し得る。検出可能なレベルまたは活性は、当該技術分野で既知の種々の方法を用いて決定され得る。ある実施形態では、本発明に従って送達される治療薬例えば補充酵素は、投与後例えば、対象への薬学的組成物の髄腔内投与の、1週間、3日、48時間、36時間、24時間、18時間、12時間、8時間、6時間、4時間、3時間、2時間、1時間、30分後、またはそれ未満の後、対象のCNS組織および細胞中で、少なくとも30μg/mlの濃度を達成する。ある実施形態では、本発明に従って送達される治療薬例えば補充酵素は、対象の標的化組織または細胞例えば、脳組織またはニューロン中で、このような対象への投与後例えば、対象へのこのような薬学的組成物の髄腔内投与の、1週間、3日、48時間、36時間、24時間、18時間、12時間、8時間、6時間、4時間、3時間、2時間、1時間、30分後、またはそれ未満の後、少なくとも20μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも7.5μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも2.5μg/ml、少なくとも1.0μg/mlまたは少なくとも0.5μg/mlの濃度を達成する。髄腔内投与によるリソソーム蓄積症の処置リソソーム蓄積症は、リソソーム機能の欠陥に起因するかなり稀な遺伝性代謝障害の一群を表す。リソソーム症は、リソソーム内の酵素基質を含めた未消化高分子物質の蓄積表1参照により特性化され、これが、このようなリソソームのサイズおよび数の増大を、そして最終的には細胞機能不全および臨床的異常を生じる。本明細書中に記載される本発明の方法は、標的化細胞小器官への1つ以上の治療薬例えば、1つ以上の補充酵素の送達を有益に助長し得る。例えば、ハンター症候群のようなリソソーム蓄積症は罹患細胞のリソソーム中のグリコサミノグリカンGAGの蓄積により特性化されるため、リソソームは、リソソーム蓄積障害の処置のための所望の標的細胞小器官を表す。本発明の方法および組成物は、CNS病因または構成成分を有する疾患を処置するために特に有用である。CNS病因または構成成分を有するリソソーム蓄積症としては、例えばサンフィリッポ症候群A型、サンフィリッポ症候群B型、ハンター症候群、異染性白質ジストロフィー症およびグロボイド細胞白質ジストロフィー症が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の前に、伝統的療法は、対象に静脈内投与されることに限定されており、一般的には、根元的酵素欠乏症の体細胞性症候を処置するに際して有効であるに過ぎない。本発明の組成物および方法は、このようなCNS病因を有する疾患に罹患している対象のCNS中に直接、有益に投与され、それによりCNS例えば脳の罹患細胞および組織内の治療的濃度を達成し、したがって、このような治療薬の伝統的全身投与に伴う制限を克服し得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、リソソーム蓄積障害の神経学的および体細胞性後遺症または症候群の両方を処置するために有用である。例えば、本発明のいくつかの実施形態は、CNSまたは神経学的後遺症ならびにリソソーム蓄積症の書状発現の処置のために、対象のCNSに1つ以上の治療薬を送達する例えば、髄腔内、静脈内または槽内に組成物および方法に関するが、一方、そのリソソーム蓄積症の全身性または体細胞性症状発現も処置するためでもある。例えば、本発明のいくつかの組成物は、対象に髄腔内投与され、それにより、対象のCNSに1つ以上の治療薬を送達して、神経学的後遺症を処置し、それと対になって、全身循環の細胞および組織例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓またはリンパ節の細胞および組織の両方にこのような治療薬を送達するために1つ以上の治療薬を静脈内投与し、それにより体細胞性後遺症を処置する。例えば、リソソーム蓄積症例えばハンター症候群を有するか、そうでなければ影響を及ぼされる対象は、1つ以上の治療薬例えば、イズロン酸-2-スルファターゼを含む薬学的組成物を、神経学的後遺症を処置するために、少なくとも週1回、2週間に1回、月1回、2ヶ月に1回またはそれ以上、髄腔内投与され得るが、一方、異なる治療薬は、当該疾患の全身性または体細胞性症状発現を処置するために、より高頻度ベースで例えば、1日1回、隔日に1回、週3回または週1回、対象に静脈内投与され得る。例えば、ハンター症候群に罹患している患者は、脳における組織学的変化を示し、これらの例としては、萎縮、皮質ニューロン膨潤、大脳白質低減、血管周囲腔隙拡張、ならびにプルキンエ細胞樹状突起膨潤が挙げられ得る。白質に関連した重症び漫性性病変、脳萎縮および水頭症が、認知障害を有する患者においては、その障害を有さない患者と比較して、より一般的であった、ということを磁気共鳴画像処理/分光法試験は示しているVedolin,L.,etal.,AJNRAmJNeuroradiol200728,1029-1033。精神遅滞または発達遅延といったような極度の神経学的後遺症を有さない患者でさえ、萎縮、脳室拡大、ならびに血管周囲腔隙拡張を含む脳異常を有することが示されたMatheus,MG,etal.,Neuroradiology200446,666-672。非限定例として、ムコ多糖症IIIA型MPSIIIA;サンフィリッポ症候群A型は、最も重篤な型のサンフィリッポ症候群A型であって、世界中で約100,000人に一人が罹患している。サンフィリッポ症候群A型サンフィリッポAは、グルコサミノグリカンGAGヘパランスルフェートのリソソーム異化に関与するエキソスルファターゼである酵素ヘパランN-スルファターゼHNSの欠乏により特性化されるNeufeldEF,etal.TheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDisease2001pp.3421-3452。この酵素の非存在下では、GAGヘパランスルフェートはニューロンおよびグリア細胞のリソソーム中に蓄積するが、脳の外側には余り蓄積しない。非限定例として、ムコ多糖症IIIB型MPSIIIB;サンフィリッポ症候群B型病は、酵素アルファ-N-アセチル-グルコサミニダーゼNagluの欠乏により特性化される常染色体劣性障害である。この酵素の非存在下では、GAGヘパランスルフェートはニューロンおよびグリア細胞のリソソーム中に蓄積するが、脳の外側には余り蓄積しない。非限定例として、グロボイド細胞白質ジストロフィーGLD症は、ガラクトセレブロシダーゼGALCの機能不全により引き起こされる稀な常染色体劣性リソソーム貯蔵障害である。GALCは、ミエリンの正常構成成分であるガラクトシルセラミドをガラクトースとセラミドに、そしてガラクトシドセラミド合成の有害副産物であるサイコシンガラクトシルスフィンゴシンをガラクトースとスフィンゴシンに分解する可溶性リソソーム酸ヒドロラーゼ酵素である。GALC欠乏は、2つの関連するが別個の経路である中枢および末梢神経系それぞれ、CNSおよびPNSの神経学的損傷を生じさせる。第一の経路は、過剰サイコシン蓄積を生じて、その結果、有髄細胞のアポトーシスを引き起こす。第二の経路では、ガラクトシルセラミドが蓄積し、活性化ミクログリア中に貪食されて、その病気がそう呼ばれる特徴的グロボイド細胞を生成する。非分解基質を蓄積する他のリソソーム貯蔵疾患に対比して、一般的に、ニューロン組織における総ガラクトシルセラミドの増大は認められない。この障害の限定性臨床的特徴は中枢神経系CNS変性であって、これにより、主要な発達里程標石を失い、あるいはそれを達成できなくなる。進行性認知低下は、痴呆および若年死亡率を最高度に高める。当該疾患は、それ自体、幼児において早発性GLD、またはあらゆる年齢の個体において後発性GLD、症状発現し得る。早発性GLDに罹患した個体の寿命は、典型的には、2歳を超えることはない。後発性GLDは、あらゆる年齢の個体に現れ、疾患の進行は大きく異なり得る。異染性ジストロフィーMLD症は、酵素アリールスルファターゼAASAの欠乏に起因する常染色体劣性障害である。ヒトにおけるARSA遺伝子によりコードされるASAは、セレブロシド3-スルフェートまたはスフィンゴリピド3-O-スルホガラクトシルセラミドスルファチドをセレブロシドおよびスルフェートに分解する酵素である。当該酵素の非存在下では、スルファチドは神経系例えばミエリン鞘、ニューロンおよびグリア細胞に蓄積するが、内臓中に蓄積する程度は低い。これらの分子および細胞性事象は、CNSおよびPNS内の進行性脱髄および軸索損失であって、これは、臨床的に、重度の運動および認知機能障害を伴う。この障害の限定性臨床的特徴は中枢神経系CNS変性であって、これにより、認知障害例えば、精神遅滞、神経障害および失明等が生じる。非減定例として、MLDは、それ自体、幼児において症状発現し得る後期乳児型が、この場合、罹患小児は、典型的には、出生初年後例えば、約15~24ヶ月直ぐに症候を示し始め、一般的に、5歳を過ぎると生存しない。MLDは、それ自体、小児において症状発現し得る若年型が、この場合、罹患小児は、典型的には、約3~10歳までに認知障害を示し、寿命は種々であり得る例えば、症候開始後10~15年の範囲。MLDは、それ自体、成年において症状発現し成年開始型、あらゆる年齢例えば、典型的には16歳以降の個体に現れ、疾患の進行は大きく異なり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、1つ以上の治療薬例えば、1つ以上の補充酵素を、脳、脊髄および/または末梢器官の標的組織および細胞の1つ以上の細胞小器官例えばリソソームに送達して、種々のリソソーム蓄積症の処置を実行する。本明細書中で用いる場合、処置するまたは処置という用語は、当該疾患に伴う1つ以上の症候の改善、当該疾患の1つ以上の症候の開始の防止または遅延、および/または当該疾患の1つ以上の症候の重症度または頻度の低下を指す。いくつかの実施形態では、処置は、リソソーム症に罹患しているかまたは罹患しやすい患者における神経学的障害の重症度および/または発生率を部分的にまたは完全に緩和し、改善し、軽減し、抑制し、開始を遅延し、重症度および/または発生率を低減することを指す。本明細書中で用いる場合、神経学的障害という用語は、中枢神経系例えば、脳および脊髄の機能障害に伴う種々の症候を包含する。神経学的障害の症候としては、例えば、発達遅延、進行性認知障害、聴力損失、言語発達障害、運動能力欠如、多動性障害、攻撃性および/または睡眠障害等が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、処置は、種々の組織におけるリソソーム貯蔵例えば、GAGのような貯蔵された高分子物質低減を指す。いくつかの実施形態では、処置は、脳標的組織、脊髄ニューロン、および/または末梢標的組織におけるリソソーム貯蔵低減を指す。ある実施形態では、リソソーム貯蔵は、対照と比較して、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100またはそれ以上低減される。いくつかの実施形態では、リソソーム貯蔵は、対照と比較して、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍または10倍低減される。いくつかの実施形態では、リソソーム貯蔵は、リソソーム貯蔵顆粒の存在により測定される例えば、ゼブラストライプ形態。いくつかの実施形態では、処置は、ニューロン例えば、プルキンエ細胞を含有するニューロンにおける空胞形成低減を指す。ある実施形態では、ニューロンにおける空胞形成は、対照と比較して、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100またはそれ以上低減される。いくつかの実施形態では、空胞形成は、対照と比較して、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍または10倍低減される。ある実施形態では、本発明による処置は、リソソーム蓄積症に関連した1つ以上の病理学的または生物学的マーカーの存在、または代替的にはその蓄積の低減例えば、約5、10、15、20、25、30、40、50、55、60、65、70、75、80、90、95、97.5、99またはそれ以上の低減、または完全排除を生じる。このような低減または排除は、CNSの細胞および組織例えば、ニューロンおよび乏突起グリア細胞において特に明らかであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、対象への投与時に、本発明の薬学的組成物は、対象のCNS細胞および組織において例えば、大脳皮質、小脳、尾状核および被殻、白質および/または視床において、バイオマーカーリソソーム付随膜タンパク質1LAMP1の蓄積の低減を実証するかまたは達成する。LAMP1は、リソソーム膜において高度に発現される糖タンパク質であり、その存在は、リソソーム蓄積症を有する患者で増大されるMeikle,etal.ClinChem.199743:1325-1335。したがって、リソソーム蓄積症を有する患者におけるLAMP1の存在または非存在例えば、LAMP染色により確定されるは、リソソーム活性の有用な指標、ならびにリソソーム蓄積症の診断およびモニタリングの両方のためのマーカーを提供し得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、疾患例えば、リソソーム蓄積症に関連する1つ以上の病理学的または生物学的マーカーの存在または蓄積を低減するか、そうでなければ排除する方法に関する。同様に、本発明のいくつかの実施形態は、リソソーム蓄積症に関連した1つ以上の病理学的または生物学的マーカー例えばLAMPの分解または分解速度を増大する方法に関する。いくつかの実施形態では、処置は、認知能力の喪失の進行低減を指す。ある実施形態では、認知能力の喪失の進行は、対照と比較して、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100またはそれ以上低減される。いくつかの実施形態では、処置は、発達遅延低減を指す。ある実施形態では、発達遅延は、対照と比較して、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100またはそれ以上低減される。いくつかの実施形態では、処置は、生存例えば、生存時間増大を指す。例えば、処置は、患者の平均余命増大を生じ得る。いくつかの実施形態では、本発明による処置は、処置を伴わない同様の疾患を有する1人以上の対照個体の平均余命と比較して、約5より多く、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、約145、約150、約155、約160、約165、約170、約175、約180、約185、約190、約195、約200またはそれ以上、患者の平均余命を増大する。いくつかの実施形態では、本発明による処置は、処置を伴わない同様の疾患を有する1人以上の対照個体の平均余命と比較して、約6ヵ月より長く、約7ヵ月、約8ヵ月、約9ヵ月、約10ヵ月、約11ヵ月、約12ヵ月、約2年、約3年、約4年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年、約10年またはそれ以上、患者の平均余命を増大する。いくつかの実施形態では、本発明による処置は、患者の長期間生存を生じる。本明細書中で用いる場合、長期間生存という用語は、約40年、45年、50年、55年、60年またはそれ以上の生存時間または平均余命を指す。改善する、増大するまたは低減するという用語は、本明細書中で用いる場合、対照と対比する値を示す。いくつかの実施形態では、適切な対照は、基線測定値、例えば、本明細書中に記載される処置の開始前の同一個体における測定値、あるいは本明細書中に記載される処置の非存在下での一対照個体または多数の対照個体における測定値である。対照個体は、処置されている個体とほぼ同一年齢および/または性別である、同一疾患に苦しむ個体である処置個体および対照個体単数または複数における疾患の段階が比較可能であることを保証するため。処置されている個体患者または対象とも呼ばれるは、当該疾患を有するかまたは当該疾患を発症する可能性を有する個体胎児、幼児、小児、若者または成人である。個体は、残留内因性リソソーム酵素発現および/または活性を有し得るし、あるいは測定可能な活性を有さない。例えば、サンフィリッポ症候群A型を有する個体は、正常HNS発現レベルの約30~50未満、約25~30未満、約20~25未満、約15~20未満、約10~15未満、約5~10未満、約0.1~5未満であるHNS発現レベルを有し得る。免疫寛容一般的に、本発明による治療薬例えば補充酵素の髄腔内投与は、対象において重篤な副作用を生じない。本明細書中で用いる場合、重症副作用は、実質的免疫応答、毒性または死これらに限定されないを誘導する。本明細書中で用いる場合、実質的免疫応答という用語は、重症または重篤免疫応答、例えば適応T細胞免疫応答を指す。したがって、多くの実施形態において、本発明の方法は、同時免疫抑制剤療法すなわち、前処置/前状態調節として、あるいは当該方法と並行して用いられる任意の免疫抑制剤療法を包含しない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、処置されている対象における免疫寛容誘導を包含しない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、T細胞免疫抑制剤を用いる対象の前処置または前状態調節を包含しない。いくつかの実施形態では、治療薬の髄腔内投与は、これらの作用物質に対する免疫応答を高め得る。したがって、いくつかの実施形態では、酵素補助療法に対して寛容な補助酵素を患者に接種させることが有用であり得る。免疫寛容は、当該技術分野で既知の種々の方法を用いて誘導され得る。例えば、T細胞免疫抑制剤、例えばシクロスポリンACsAおよび抗増殖剤、例えばアザチオプリンAzaを、低用量の所望の補充酵素の毎週髄腔内注入と組合せた初期30~60日レジメンが、用いられ得る。当業者に既知の任意の免疫抑制剤は、本発明の組合せ療法と一緒に用いられ得る。このような免疫抑制剤としては、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、CTLA4-Igおよび抗TNF剤、例えばエタネルセプト例えば、Moder,2000,Ann.AllergyAsthmaImmunol.84,280-284;Nevins,2000,Curr.Opin.Pediatr.12,146-150;Kurlbergetal.,2000,Scand.J.Immunol.51,224-230;Ideguchietal.,2000,Neuroscience95,217-226;Potteretal.,1999,Ann.N.Y.Acad.Sci.875,159-174;Slaviketal.,1999,Immunol.Res.19,1-24;Gazievetal.,1999,BoneMarrowTransplant.25,689-696;Henry,1999,Clin.Transplant.13,209-220;Gummertetal.,1999,J.Am.Soc.Nephrol.10,1366-1380;Qietal.,2000,Transplantation69,1275-1283参照が挙げられるが、これらに限定されない。抗IL2受容体アルファ-サブユニット抗体ダクリズマブ例えば、ゼナパックスTMこれは、移植患者において有効であることが実証されているも、免疫抑制剤として用いられ得る例えば、Wisemanetal.,1999,Drugs58,1029-1042;Beniaminovitzetal.,2000,N.EnglJ.Med.342,613-619;Ponticellietal.,1999,DrugsR.D.1,55-60;Berardetal.,1999,Pharmacotherapy19,1127-1137;Eckhoffetal.,2000,Transplantation69,1867-1872;Ekbergetal.,2000,Transpl.Int.13,151-159参照。付加的免疫抑制剤としては、抗CD2Brancoetal.,1999,Transplantation68,1588-1596;Przepiorkaetal.,1998,Blood92,4066-4071、抗CD4Marinova-Mutafchievaetal.,2000,ArthritisRheum.43,638-644;Fishwildetal.,1999,Clin.Immunol.92,138-152および抗CD40リガンドHongetal.,2000,Semin.Nephrol.20,108-125;Chirmuleetal.,2000,J.Virol.74,3345-3352;Itoetal.,2000,J.Immunol.164,1230-1235が挙げられるが、これらに限定されない。投与本発明の方法は、治療的有効量の本明細書中に記載される治療薬例えば補充酵素の単回ならびに多数回投与を意図する。治療薬例えば補充酵素は、対象の症状例えば、リソソーム蓄積症の性質、重症度および程度によって、一定間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の治療的有効量の治療薬例えば補充酵素は、一定間隔で例えば、年1回、6ヶ月に1回、5ヶ月に1回、3ヶ月に1回、隔月2ヶ月に1回、毎月1ヶ月に1回、隔週2週間に1回、毎週、定期的に髄腔内投与され得る。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、他の投与経路例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腸管外、経皮的、または経筋肉的に例えば、経口的または鼻にと共同で用いられ得る。いくつかの実施形態では、他の投与経路例えば、静脈内投与は、隔週、毎月、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回、4ヶ月に1回、5ヶ月に1回、6ヶ月に1回、毎年投与以下の頻度で実施され得る。本明細書中で用いる場合、治療的有効量という用語は、主として、本発明の薬学的組成物中に含有される治療薬の総量に基づいて確定される。一般的に、治療的有効量は、対象に対して意義のある利益例えば、根元的疾患または症状を処置し、調整し、治癒し、防止し、および/または改善することを達成するのに十分である。例えば、治療的有効量は、所望の治療的および/または予防的作用を達成するのに十分な量、例えばリソソーム酵素受容体またはそれらの活性を調整し、それによりこのようなリソソーム蓄積症またはその症候を処置する例えば、対象への本発明の組成物の投与後の、ゼブラ体の存在または出現の、あるいは細胞空胞形成の低減または排除ために十分な量であり得る。一般的に、それを必要とする対象に投与される治療薬例えば、組換えリソソーム酵素の量は、対象の特質によって決まる。このような特質としては、対象の症状、疾患重症度、全身健康状態、年齢、性別および体重が挙げられる。これらのおよびその他の関連因子によって、適切な投与量を、当業者は容易に決定し得る。さらに、最適投与量範囲を同定するために、客観的および主観的検定がともに任意に用いられ得る。治療的有効量は、多重単位用量を含み得る用量投与レジメンで一般に投与される。任意の特定の治療用タンパク質に関しては、治療的有効量および/または有効用量投与レジメン内の適切な単位用量は、例えば投与経路、他の薬学的作用物質との組合せによって変わり得る。さらにまた、任意の特定患者のための具体的治療的有効量および/または単位用量は、種々の因子、例えば処置されている障害および障害の重症度;用いられる具体的薬学的作用物質の活性;用いられる具体的組成物;患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食餌;投与時間;投与経路、および/または用いられる具体的融合タンパク質の排出または代謝速度;処置の持続期間;ならびに医療業界で周知であるような因子によって決まり得る。いくつかの実施形態では、治療有効量は、約0.005mg/脳1kg~500mg/脳1kg、例えば、約0.005mg/脳1kg~400mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~300mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~200mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~100mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~90mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~80mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~70mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~60mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~50mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~40mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~30mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~25mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~20mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~15mg/脳1kg、約0.005mg/脳1kg~10mg/脳1kgの範囲である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、約0.1mg/脳1kgより多く、約0.5mg/脳1kgより多く、約1.0mg/脳1kgより多く、約3mg/脳1kgより多く、約5mg/脳1kgより多く、約10mg/脳1kgより多く、約15mg/脳1kgより多く、約20mg/脳1kgより多く、約30mg/脳1kgより多く、約40mg/脳1kgより多く、約50mg/脳1kgより多く、約60mg/脳1kgより多く、約70mg/脳1kgより多く、約80mg/脳1kgより多く、約90mg/脳1kgより多く、約100mg/脳1kgより多く、約150mg/脳1kgより多く、約200mg/脳1kgより多く、約250mg/脳1kgより多く、約300mg/脳1kgより多く、約350mg/脳1kgより多く、約400mg/脳1kgより多く、約450mg/脳1kgより多く、約500mg/脳1kgより多い。いくつかの実施形態では、治療有効量は、mg/体重1kgによっても定義され得る。当業者が理解するように、脳重量および体重は相関し得るDekabanAS.Changesinbrainweightsduringthespanofhumanlife:relationofbrainweightstobodyheightsandbodyweights,AnnNeurol1978;4:345-56。したがって、いくつかの実施形態では、投与量は、表4に示されるように換算され得る。いくつかの実施形態では、治療有効量は、mg/CSF15ccによっても定義され得る。当業者が理解するように、脳重量および体重に基づいた治療有効量は、mg/CSF15ccに換算され得る。例えば、成人におけるCSFの容積は約150mLであるJohansonCE,etal.Multiplicityofcerebrospinalfluidfunctions:Newchallengesinhealthanddisease,CerebrospinalFluidRes.2008May14;5:10。したがって、成人への0.1mg~50mgの単一用量注射は、成人では約0.01mg/CSF15cc0.1mg~5.0mg/CSF15cc50mg用量である。任意の特定の対象に関して、具体的投与量レジメンは、個体の必要性、ならびに酵素補充療法の投与を施すかまたは指図する専門家の判断によって経時的に調整されるべきであり、そして本明細書中に記述される投与量範囲は単なる例であって、本発明の範囲または実行を限定するものではない、とさらに理解されるべきである。キット本発明はさらに、本発明の処方物を含有するキットまたは他の製品を提供し、そしてその再構成凍結乾燥された場合および/または使用のための機器を提供する。キットまたはその他の製品としては、容器、IDDD、カテーテル、ならびに髄腔内投与および関連外科手術に有用な任意のその他の物質、装置または設備が挙げられ得る。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、注射器薬剤充填済み注射器、アンプル、カートリッジ、リザーバまたはlyo-jectsが挙げられる。容器は、種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから作られ得る。いくつかの実施形態では、容器は薬剤充填済み注射器である。適切な薬剤充填済み注射器としては、ベイクドシリコン被覆膜を有するホウケイ酸ガラス注射器、噴霧シリコンを有するホウケイ酸ガラス注射器またはシリコンを含有しないプラスチック樹脂注射器が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、容器は、処方物、ならびに再構成および/または使用に関する指示を示し得る容器上の、または容器に付随したラベルを保持し得る。例えば、ラベルは、処方物が上記のようなタンパク質濃度に再構成される、ということを示し得る。ラベルはさらに、処方物が、例えばIT投与のために有用であるかまたは意図される、ということを示し得る。いくつかの実施形態では、容器は、治療薬例えば補充酵素を含有する単一用量の安定処方物を含有し得る。種々の実施形態において、単一用量の安定処方物は、約15ml未満、10ml、5.0ml、4.0ml、3.5ml、3.0ml、2.5ml、2.0ml、1.5ml、1.0mlまたは0.5mlの容量で存在する。代替的には、処方物を保持するよう基は、多数回使用バイアルであって、これは、処方物の反復投与例えば、2~6回投与を可能にし得る。キットまたは他の製品はさらに、適切な希釈剤例えば、BWFI、生理食塩水、緩衝化生理食塩水を含む第二容器を包含し得る。希釈剤および処方物の混合時に、再構成化処方物中の最終タンパク質濃度は、一般的に、少なくとも1mg/ml例えば、少なくとも5mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも25mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも75mg/ml、少なくとも100mg/mlである。キットまたは他の製品はさらに、商業的および使用者の見地から望ましい他の物質、例えば他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針、IDDD、カテーテル、注射器および使用説明書を伴う添付文書を包含し得る。本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するよう意図されるべきでない。引用文献はすべて、参照により本明細書中に援用される。GalCタンパク質のIT送達の実施例実施例1:髄腔内送達のためのGALC処方物の物理化学的特性化本実施例は、タンパク質の髄腔内IT送達中の異なる溶液条件下でのその行動および安定性を理解するために、GalCの物理化学的特性化を記載する。特に、本実施例は、GalCの上首尾のIT送達のために重要であるGalC処方物を記載する。いくつかの実施形態では、この処方物は、5mMNaリン酸塩150mMNaCl、pH6.00.005ポリソルベート20を含む。いくつかの実施形態では、この処方物は、<5mM、<10mM、<15mMおよび<20mMのNaリン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、この処方物は、150mMNaClで、pH≧5.5および≦pH7.0を包含する。種々のリン酸塩モル濃度およびpHのPBS送達ビヒクルを、成体カニクイザルで試験した図3。5.5~7.0のpH範囲での5mMリン酸塩は副作用を示さなかったが、一方、pH7.0~7.5の20mMリン酸塩およびpH7.5~8.0の10~20mMリン酸塩は、サルにおいて副作用を示した図3。3mMクエン酸塩、リン酸塩およびホウ酸塩緩衝液50mMNaCl含有中のhGalC1mg/mlの熱安定性を、pH5.0~8.0の範囲内のpHの一関数として調べた図4。hGalC特異的活性を、基線20~25°Cで、ならびに40°Cで2週間測定したが、最高特異的活性は、pH6.0~6.5で保持された図4。hGalC特異的活性を、さらに、5°Cで3ヶ月で測定した。最高特異的活性は、pH6.0~6.5で保持された図5。hGalcの融解温度を、pHの一関数として測定し表5、異なる処方物においても独立して測定した表6。5°Cで~3週間、ならびに40°Cで2週間でのhGalC特異的活性の保持により確定した場合の、hGalCの熱安定性を、塩濃度の一関数としても評価した図6。結果は、pH6.5で、5mMリン酸塩50mMNaCl本明細書中では550と略記から50mMリン酸塩150mMNaCl本明細書中では50150と略記までの範囲の種々の塩濃度において、5°Cで3週間後、hGalCは最高特異的活性を保持する、ということを示した図6。沈降分析沈降速度は、遠心分離で発生される遠心力に応答して分子が動く速度を測定する分析的超遠心分離AUC法であり、溶液中のタンパク質会合状態を決定するための有用な技法である。一次沈降速度実験は、自己会合および/または非理想特性に関して試料を評価するための、5MNaリン酸塩、pH6.0150mMNaCl含有中のヒトGalCの希釈シリーズ図7であった。希釈シリーズを、各濃度での正規化gs曲線gs対sとしてプロットした。希釈時のより低いs値への曲線における全般的シフトは、解離を示し、これは、迅速可逆的自己会合系である。異なるイオン強度を比較した場合図7A、BC、曲線組は、イオン強度を上げるとより低いs値にシフトすることは明らかであり、イオン相互作用も会合過程に関与し、自己会合は高塩濃度では低減されることを示している。マウスGalCも、同一時間で150mMNaClで実験して、hGalCと比較した。対応するイオン強度150mMNaClを比較した場合、mGalCの自己会合の自由エネルギーがhGalCのものより低いことは明らかである。図7における曲線は、約20Sでのカットオフであって、解離をより明白に示した;しかしながら、広範囲分布解析WDAを用いてこれらの実験を分析し、結果を対数スケールでプロットした場合、より高い凝集物s>20Sが明らかに観察され得る。高オリゴマーへの凝集図8は、50mMNaClで特に目立っており、10mMNaClで多少低減され、そして500mMNaClでpH6.0では有意に減少したが、しかし存在する。イオン強度の各々からの最高濃度からのWDA曲線を、図8にプロットする。pH6.0での汎用緩衝液中での自己会合汎用緩衝液中でのこれらの条件下で、自己会合は、図9で分かるように、リン酸塩緩衝液中とほぼ同一規模であると思われる。汎用緩衝液中でのhGalC自己会合のエネルギー論に及ぼすpHの作用も調べた。希釈シリーズを、pH4.5、5.0、6.0、6.5、7.0および7.5で実施した。pH4.5および5.0での試料は不溶性で、本質的に100のhGalCが沈澱しており、上清中では何も測定されないままであった。pHの作用は図10で明らかであり、この場合、最小量の自己会合がpH7.5で観察され、かなりの量の自己会合がpH6.0で観察される。その傾向は、より高いpHでの種々のイオン強度で観察されたものと同様である。イオン強度およびpHをともに上げると、最高濃度すべて約1.0mg/mLでより小さいオリゴマーを選択するよう平衡をシフトする。1/3連続希釈まで濃度を下げると図7参照、平衡は、約5.2Sの沈降係数を有することが明らかである最小種の方へシフトする。約10~13Sで生じるピークは、5S種の四量体を表すと思われる。自己会合モデルにこれらのデータを合わせる努力は今までのところ不首尾に終わっており、不定度のグリコシル化から生じる固有の微小不均一性のためであると思われる。pH6.0での汎用緩衝液中の自己会合5mMNaリン酸塩、pH6.0150mMNaCl含有中のGalCのストレスおよび基線試料を、希釈シリーズ実験で比較した赤→青→緑→黒。最低濃度黒~0.03mg/mLに関する結果は平坦であったが、これが、曲線がほとんどノイズを有さないと思われる理由である。ストレス試料では、基線試料よりはるかに高い濃度で存在するlns=3.0~20S周囲に凝集物が存在する。それは、正規化プロットにおいて希釈時のその持続性により立証されるように、試料のほぼ一定の割合を表す図11、図12、図13。したがって、それは、少なくとも500kg/molのモル質量を有する不可逆的凝集物である。溶液中にタウロコール酸ナトリウムを有するhGalCタウロコール酸ナトリウムNaTC1中では、自己会合は有意に低減される。主境界線は低s値にシフトされ、高オリゴマー化が抑制される図14。5デキストロースを有するhGalC5mMNaリン酸塩、pH6.0中のGalCへの5デキストロースの付加は、大型凝集物を形成した図15。18Sでのピークは、約440kDaの最小モル質量に対応し、そして56Sでのピークは、10.0MDaより大きいモル質量に対応する150Sを越えて伸びる尾を有する12.4MDaの最小モル質量に対応する。1.0から0.3mg/mLへの希釈時に、このパターンに非常に小さい変化が認められるが、これは、5~6時間の沈降実験の時間スケールで、これらのオリゴマーがほとんど不可逆的であることを示している。hGalC固有蛍光hGalCの固有蛍光試験23Trpを使用を実施して、分子相互作用に及ぼすpHおよび塩濃度の役割を評価した図16および図17。分子相互作用は、500mMNaClまたは1NaTC中で最小であった330nm~350nm間で最高相対蛍光図16。二次構造の小変化が、pHの一関数として観察された。沈澱は、pH4.5および5.0で観察された図17。要約hGalCおよびmGalCの相対的溶解度を評価するために、ポリエチレングリコールPEG誘導性固相アプローチを用いたMiddaughetal.,J.Biol.Chem.1979,254,367-370。このアプローチは、タンパク質の相対溶解度を定量的に測定可能にした。各GalCの緩衝化溶液5mMリン酸ナトリウム150mMNaCl含有、pH6.0を、異なる濃度のPEG10kDaに導入することにより、溶解度測定を実施した。対数タンパク質溶解度対PEG濃度のプロットは、線状傾向を生じた。見掛けの溶解度をゼロPEG濃度に外挿することにより、各タンパク質の相対溶解度を得た。mGalC対hGalCの相対溶解度は、如何なる差異も示さなかった。hGalCの溶解度実験では、2~8°Cで5mMリン酸ナトリウム異なる塩濃度を有する、pH6.0~6.5中で、3週間後に、沈澱または活性損失は観察されなかった。~30mg/mLでの溶解度は、処方物5mMNaリン酸塩150mMNaCl、pH6.0で達成され、2~8°Cで50日後、沈澱は観察されなかった。AUCデータは、ネイティブ状態のGalCが、より高次のオリゴマーとの濃度依存的可逆的会合である、ということを示唆している。生物物理学的データは、より高次のオリゴマーに対する機能的および構造的重要性が認められ得る、ということを示唆している。高pH値では、AUCにより測定した場合、低活性保持、低Tm値およびより均質な系が認められる。5mMリン酸ナトリウム150mMNaCl含有、pH6.0中では、単量体、四量体および他の高次種間に平衡が存在すると思われる。さらに、pHは、6.5~7.5のpH範囲でAUCプロフィールに劇的に作用するわけではない。全体的に、GalC系は、試験緩衝液中で迅速可逆的高自己会合系である。実施例2:125I-hGalCの単回髄腔内用量投与または単回静脈内ボーラス注射後のSprague-Dawleyラットにおける放射能の薬物動態および組織分布本実施例は、単回髄腔内用量投与または単回静脈内ボーラス注射後の雄Sprague-DawleyラットにおけるI-hGALCの薬物動態および組織分布を例証する例示的結果を示す。全血、血清、赤血球、脳脊髄液CSFおよび組織中の放射能の濃度および含量を測定し、その結果生じたデータに関して、非コンパートメント解析を実施した。ヒトにおける意図された投与経路であるので、髄腔内および静脈内経路を選択した。潜在的ヒト曝露、現存毒性および薬物動態データならびに被験物質により課せられる任意の制限に基づいて、用量レベルを選択した。薬物動態および組織分布試験に用いるために容認された種であるため、ラットを試験のために選択した。この試験に用いられる動物数は、各時点での予測可変性を適切に評価し、実験目的を達成するのに必要とされる最小数であった。材料および方法試験系82匹のSprague-DawleyラットRattusnorvegicusを、2009年4月15日にCharlesRiverCanadaInc.St.Constant,Quebec,Canadaから受け取った。処置開始時に、動物はほぼ10~11週齢であった。さらに9匹の雄ラットを、2009年4月28日にCharlesRiverCanadaから受け取った;これらの動物は、到着時はほぼ9週齢で、試験の完全用量投与のために十分なカニューレ挿入動物が利用可能であることを保証する必要があった。雄ラットの体重は、処置開始時に342~453gの範囲であった。用量投与時は1匹の雄ラットを除いてすべての体重がプロトコールに記述された範囲250~350gより高かったが、しかしながら、動物は健常で、用量投与のためには実際の体重を用いたため、この小偏差が試験または得られたデータに影響を及ぼすとは考えられなかった。動物管理PCS-MTLに到着後、獣医学スタッフの有資格員が全動物を全身身体検査した。受け取った動物には、有意の異常は検出されなかった。金網床で自動給水弁を備えたステンレス製ケージに、動物を個別に収容した。環境強化プログラムは、適切なSOPに従った。各ケージには、試験、群、動物番号および性別を示す色コード化ケージカードではっきりと標識を付けた。AIMS登録商標刺青系を用いて、各動物を独自に同定した。試験実行中の環境条件は、それぞれ19~25°Cおよび30~70の標的温度および相対湿度で、制御した。光周期は明12時間及び暗12時間であった但し、予定された活動のために遮断される場合を除く。食餌指定手順中を除いて、全動物には、市販の標準認証実験室用ペレット餌PMI認証齧歯類餌5002:PMINutritionInternationalInc.を自由に摂らせた。餌中の夾雑物例えば、重金属、アフラトキシン、有機リン、塩素化炭化水素、PCBの最大許容可能濃度は、メーカーにより制御され、慣例的に分析される。ヒト消費に適した自治体水道水0.5μm静菌性ポリカーボネートフィルターを通して濾過を、動物は、指定手順中以外は自由に利用できた。試験の目的を妨げ得る食餌材料中の既知の夾雑物は存在しないと考えられた。馴化および無作為化少なくとも6日2009年4月15日に受け取った動物に関してまたは3日2009年4月28日に受け取った付加的動物に関してで、動物の受け入れと髄腔内カニューレを設置するための手術との間に、物理的および環境的条件に動物を馴れさせた。馴化期間中、コンピューターベースの無作為化手順を用いて、全動物を計量し、無作為化した。パラメーターとして体重を用いて、層化後に無作為化を実施した。体重範囲の両極端は、群に割り当てなかった。動物を、以下のように試験群に割り当てた:群1および群2の各ラットは、約3μCi/動物の公称放射化学用量を摂取した。群3の各ラットは、約6μCi/動物の公称放射化学用量を摂取した。髄腔内用量投与処方物初回髄腔内用量投与日に、髄腔内用量投与処方物を調製した。十分量の125I-hGALG溶液を測定し、十分量の測定非標識化hGALC溶液に付加した。測定容積のビヒクルを付加し、全体を静かに混合した。約150μCi/mLの標的放射能レベルで濃度3mg/mLの溶液を調製した。その結果生じた処方物を、低タンパク質結合フィルター0.22μmGVPVDFフィルターユニットを通して滅菌容器中に濾過し、冷蔵保存2~8°Cして、用量投与のための使用を待つ間、光から保護した。静脈内用量投与処方物初回静脈内用量投与日に、静脈内用量投与処方物を調製した。十分量の125I-hGALG溶液を測定し、十分量の測定非標識化hGALC溶液に付加した。測定容積のビヒクルを付加し、全体を静かに混合した。約3μCi/mLの標的放射能レベルで濃度0.3mg/mLの溶液を調製した。その結果生じた処方物を、低タンパク質結合フィルター0.22μmGVPVDFフィルターユニットを通して滅菌容器中に濾過し、冷蔵保存2~8°Cして、用量投与のための使用を待つ間、光から保護した。用量投与処方物の分析処置の前後に、液体シンチレーション分光法により用量投与の各々の日にPCS-MTLで各放射能標識用量投与処方物を分析して、放射能濃度を確定した。ビヒクル中に用量投与処方物の適切な希釈液を調製することにより放射能濃度を確定し、各希釈液の二重反復実験用アリコートを分析した。分析反復分析を含む完了後に、残りの用量投与処方物を捨てた。被験物質の比放射能の算定用量投与処方物中の被験物質の比放射能を、用量投与処方物中の放射能の平均用量投与の前および後測定レベルおよび被験物質の総質量提供された濃度に基づいてから算定した。臨床的観察到着当日と試験終了日これらの日には、動物を1回だけ検査したを除いて、馴化および試験期間を通して、死亡率および健康障害の徴候および処置に対する反応に関して、全動物を1日2回検査した。詳細な検査は、毎週実施した。体重馴化中、外科手術前および用量投与前日に1回、個体体重を測定した。用量投与前日に記録された体重のみを報告した。外科手術動物受け入れと外科手術との間に最低6日または9匹の付加的動物に関しては3日置いて、動物が実験室環境条件に慣れるようにさせた。手術当日に、そして術後2日目に再び、スペアを含めて全動物が、ベンザチンペニシリンGプロカインペニシリンG抗生物質の単回筋肉内注射を受けた。概して、手術の前および初回投与の約8時間後に、そしてその後、必要と思われた時に、ブプレノルフィン0.05mg/kgを皮下投与した。数匹の動物に関しては、8~12時間の代わりに、初回投与の約6時間後に、ブプレノルフィンを投与した。ラットにおけるブプレノルフィンの半減期を考えると、プロトコールからのこの逸脱は、これらの動物の健康に影響せず、したがって、試験で得られた妥当性またはデータに影響を及ぼさなかった。頭蓋から頸部の背側-胸部領域まで剃毛することにより、動物を準備した。術前にイソフルラン/酸素ガスで動物を麻酔して、手術手順を通してイソフルランガス麻酔下に保持した。術前、ならびに手術手順の終了時に、麻酔下にある間、低刺激性潤滑性眼用薬を各眼に投与した。術前に、そして初回投与後約24時間間隔で2回の他の場合に、各動物に抗炎症薬カルプロフェン、5mg/kgでを皮下注射した。動物を、定位台に載せた。頭蓋の尾側縁から頸部にかけて、約2cmの皮膚切開を施した。環椎-後頭膜を曝露するために、背側頸部筋肉を分離した。開創器を用いて、膜への接触を助長した。環椎-後頭膜を切開し、カテーテルが腰部領域に配置されるまで、髄腔内カテーテルを徐々に尾側に挿入した。コットンスワブを用いて過剰量の流体を除去し、環椎-後頭膜を乾かした。その直後に、接着剤を用いて、カテーテル球部を膜に固着した。一旦接着剤が乾いたら、カテーテルをしっかりと固定して、開創器を除去した。頭蓋上にカテーテルで小ループを作り、非吸収性物質の縫合糸を用いて球部を取り付けた。カテーテルが一旦固定されたら、それを、接触ポートを配置するために切開を施された背側胸部領域に通した。これを、非吸収性物質を用いてその場に縫合した。頸部筋肉を閉じる前に、温い生理食塩水すなわち、約37.5°Cの2mLフラッシュを創傷に施した。吸収性物質の簡単な断続縫合を用いて、筋肉を閉じた。接触ポート部位を2mLの温生理食塩水でフラッシュして、吸収性縫合物質の連続皮内縫合を用いて皮膚を閉じた。術後、ならびに必要なしと考えられるまでその後毎日1回、局所抗生物質軟膏を手術部位に投与した。カテーテルおよび接触ポートの死容積を、手術時点で確定した。手術日と処置日との間の前処置機関中に1回、開存性検査を実施した。処置カテーテル/接触ポートの外科的埋込みと処置開始との間に少なくとも7日の期間を置いて、適切な回復を可能にした。髄腔内用量投与前に、必要な場合は、接触ポートを剃毛した。グルコン酸クロルヘキシジンおよび水を用いて、穿刺部位を清浄にし、その部位を滅菌水の浸漬ガーゼで拭いて、その後、ポビドンヨード10を3回通した。接触ポートを、用量投与注射器に連結された針で穿刺し、被験物質を徐々に投与した。用量投与後、汚染を制限するために、その部位をヨードで拭いた。試験1日目に、群1動物に処方125I-hGALGを皮下腰椎接触ポート中への緩徐ボーラス髄腔内注射により投与し、その後、0.04mLの生理食塩水フラッシュを施して、60μg/動物の標的用量レベルおよび約3μCi/動物の放射能線量を送達した。試験2日目に、群3動物に処方125I-hGALGを皮下腰椎接触ポート中への緩徐ボーラス髄腔内注射により投与し、その後、0.04mLの生理食塩水フラッシュを施して、60μg/動物の標的用量レベルおよび約3μCi/動物の放射能線量を送達した。緩徐ボーラス髄腔内注射の5分以内に、群3動物に、尾静脈中への静脈内カテーテルを介して静脈内注射3.33mL/kgも施し、その後、0.6mLの生理食塩水フラッシュを施して、1mg/kgの標的用量レベルを、3μCi/動物のおよその放射能レベルとともに送達した。試験3日目に、群2動物に処方125I-hGALGを尾静脈中への静脈内カテーテルを介して静脈内注射3.33mL/kgも施し、その後、0.6mLの生理食塩水フラッシュを施して、1mg/kgの標的用量レベル、ならびに3μCi/動物のおよその放射能レベルを送達した。投与容積は、各動物の最新実際体重を基礎にした。動物への送達後の処方125I-hGALGを充填したまたは空の注射器の重量を記録した。各動物に送達された用量を、注射器から放出された投与処方物の正味重量ならびに処方用量中の測定放射能濃度に基づいて算定した。用量投与中、用量投与処方物の任意の少量の逆流を吸収するためにガーゼが利用可能であり、被験物質喪失を、プロジェクト特異的手順に従って液体シンチレーション計数により説明した。処方被験物質の投与のために用いられた注射器および静脈内カテーテルを、保持した。静脈内カテーテルおよび選定髄腔内接触ポート/カテーテルを、プロジェクト特異的手順により放射能のレベルに関して分析した。試料収集血液/血清および組織群1~3に関して、一時点当たり3匹の動物から、用量投与の10分、30分、ならびに1、3、6、24、48および96時間後に、末端血液試料最大可能容積を収集した。髄腔内投与は群3では静脈内投与に先行し、末端血液試料に関する時機は、静脈内投与の時間を基礎にした。腹大動脈からの放血により、イソフルラン麻酔下で安楽死させたラット群1、2および3、ならびに3匹のスペア動物の腹大動脈から、末端血液試料を収集した。約3mLの血液群1、2および3を、K3-EDTAを含有する適切な試験管に移して、全血試料を供給し、加工処理を待つ間、湿潤氷上に保持した。群2および3、ならびにスペア動物に関しては、さらなる1.5mLの血液を、プロトロンビン時間PTT、活性化部分トロンビン時間APTTおよびフィブリノーゲンの分析のためにクエン酸ナトリウムを含有する試験管中に移した。4°Cで15分間、2700RPMで、遠心分離を待つ間、血液試料を湿潤氷上に保存した。血漿試料を約-80°Cで凍結保存した後、発送し、出願人により意図された実験室で分析した。スペア動物からの血漿は、PTT、APTTおよびフィブリノーゲンの分析のための空試料として役立てるためのものであった。すべての分析を実施するには不十分な血液容積が得られた場合群1、2及び3には、放射能分析のための血液が優先権を有した。残りの血液群1、2および3、ならびに3匹のスペア動物を、血清生成のために凝固活性剤を含有する試験管中に移し、約30分の期間に亘って、室温で凝固させた後、遠心分離した。スペア動物から収集した試料を用いて、非処置動物からの血液試料の凝固を評価した。放血後、以下の試料を、指示通りに群1~3から、一時点当たり3匹の動物から収集した:脂肪組織腎臓脂肪、副腎、骨大腿骨、脳、眼、心臓、腎臓、大腸、大腸内容物、肝臓、肺、筋肉骨格筋、坐骨神経、小腸、小腸内容物、脊髄腰椎、胸椎、頚椎、脾臓、胃、胃内容物、甲状腺/上皮小体、膀胱内容物。収集時、組織を計量し、次いで加工処理して、総放射能に関して分析した。上記の全組織、ならびに末端血液および血清をスペア動物からも収集して、放射能のバックグラウンドレベルを決定するために用いた。残りの死骸を指示冷凍庫中で凍結保持-10°C~-20°Cして、放射能崩壊させた後、生物学的廃棄物として処分した。群1および3からの各時点での最初の動物の死骸を冷凍庫から回収して、解凍し、接触ポートおよびカテーテルを取外し、水で洗い流して、残留放射能に関して実証した。脳脊髄液脳脊髄液CSF試料を、安楽死の直前の剖検で全動物から収集した。群1~3からの3匹の動物/時点を、用量投与の10分、30分、ならびに1、3、6、24、48および96時間後に、安楽死させた。一直線に頭を保持するために必要な定位台を用いて、大槽を介してCSFの試料最大可能容積を取り出した。CSFを平滑管に移して、湿潤氷上に置いた。一部分約20μLを加工処理して、総放射能含量に関して分析した。CSFをスペア動物からも採取して、放射能のバックグラウンドレベルを決定するために用いた。バックグラウンド放射能レベルの決定スペア動物から採取した血液、血清および組織を、群1、2および3における動物の血液、血清および組織に関するバックグラウンド放射能レベルの決定のために用いた。スペア動物から採取したCSFを、CSFに関するバックグラウンド放射能レベルの決定のために用いた。放射能測定のための試料加工処理血液、血漿、血清およびCSFに関するものを除いて、全試料を採取後に計量した。全群に関して、K3-EDTA上に採取した全血の二重反復実験用100μL計量アリコートを、放射能の分析のために得た。全血のトリクロロ酢酸TCAを用いたタンパク質沈降を、以下のように実施した:TCAの15水溶液の等価容積を、全血の二重反復実験用100μL計量アリコートに付加した。試料100μL全血100μLTCAを掻き混ぜることにより混合し、次いで、10000rpmで約15分間、4°Cで遠心分離して、上清を別の試験管にデカントした。上清およびペレットの両方を、放射能含量に関して分析した。血清収集のための血液を、室温で約30分間保持して、凝固させた後、2700rpm1250rcfで約10分間、4°Cで遠心分離して、血清を分離した。次に血清試料を、放射能分析のためにアリコート処理2×100μL計量アリコートするのを待つ間、湿潤氷上に保持した。血清分離後に得た濃縮赤血球を、放射能分析のための加工処理を待つ間、湿潤氷上に保持した。残りの血清を凍結保存した-10°C~-20°C。全血および赤血球血清分離後に得て、等容積の脱イオン水と混合しw/v、ポリトロン乳化剤で均質化したの二重反復実験用100μL計量アリコートを、Soluene-350中で可溶化し、過酸化水素30w/vで脱色して、放射能の分析のために液体シンチレーション流体と混合した。TCA血液沈澱ペレットを、35水酸化テトラエチルアンモニウムTEAH中で可溶化し、過酸化水素30w/vで脱色して、放射能の分析のために液体シンチレーション流体と混合した。膀胱内容物、TCA血液上清、用量投与処方物の二重反復実験用計量アリコート希釈および血清を、放射能測定のために液体シンチレーション流体と直接混合した。CSFの二重反復実験用計量アリコート約10μL/アリコートを、35TEAH中で可溶化した後、放射能測定のために液体シンチレーション流体と混合した。組織試料を、全部、35TEAH中で可溶化した。次に、二重反復実験用アリコートを、放射能測定の前に液体シンチレーション流体と混合した。大腸内容物を、既知容積の水中で均質化した。大腸内容物LINCホモジネート、胃内容物STCおよび小腸内容物SINCの二重反復実験用計量アリコートを、35TEAH中で可溶化し、放射能測定のために液体シンチレーション流体と混合した。放射能測定標準操作手順SOPに従って、液体シンチレーション分光法により、放射能測定を実行した。各試料を、5分間または0.1の誤差2シグマに計数したどちらを最初にしてもよい。外部標準に関する範囲のシフトに基づいた自動クエンチ補正により、全計数を絶対放射能DPMに換算した。適切なバックグラウンドDPM値を、全試料DPM値から差し引いた。バックグラウンドを差し引いた後、バックグラウンド値以下の放射能を示した試料を、その後の全操作に関してゼロとみなした。データ解析放射能濃度全放射能測定値を、試料中の放射能濃度dmp/gおよび質量eq/gおよびパーセンテージ投与放射能の算定のために、標準コンピューターデータベースプログラムDebraバージョン5.2に入れた。dmp/gおよび質量eq/gでの放射能の血液、血清、組織およびCSF濃度を、用量溶液中の放射能標識被験物質の測定比放射能dpm/mgまたは適切な質量単位に基づいて算定した。血液試料中の放射能濃度を、ラット血液の密度に基づいて質量eq/mLに変換した。総器官重量に関して、総組織含量を算定した。薬物動態血液、血清、CSFおよび組織中の総放射能の薬物動態PKプロフィールを、認証コンピュータープログラムを用いて濃度対時間データの非コンパートメント解析により特性化したWinNonlin,version3.2,PharsightCorp.,MountainView,California,USA。静脈内および血管外投与経路に基づいて、モデルを選択した。検出可能または定量可能でないと報告された濃度値は、概算しなかった;それらを、不参加試料として処理した。濃度データを、各時点で異なる動物から得て、平均値を用いて複合薬物動態プロフィールを生成した。群1AnimalNos.1001,1002,1003および群2AnimalNos.2001,2002,2003に関する10分試料採取、ならびに群1に関する48時間試料採取AnimalNos.1019,1020は、正常時点の10または6分以上逸れた。薬物動態分析では、平均時間を算定し、用いたため、プロトコールからのこの偏差は、試験の妥当性または得られたデータに影響しなかった。放射能濃度対時間曲線下の面積AUCを、線形台形法線形補間法を用いて算定した。実際の場合、PKプロフィールの末端消失相を、少なくとも最後の3つの観察濃度値を用いて最適合の線R2に基づいて同定した。非計量濃度データを用いて、対数線形回帰を用いて、末端消失相の勾配を算定した。決定計数R2が0.8未満である場合、または無限大へのAUCの外挿が総面積の20より大きい場合、kelの決定に頼るパラメーターは報告されなかった。結果用量投与処方物の分析表8各用量投与日に、全群への用量投与の前後に、液体シンチレーション分光法により各処方物のアリコートを分析し、これらの分析から被験物質の比放射能を算定した。髄腔内投与のための処方物中の全体的平均放射能濃度±S.D.は、群1に関しては、345.4×106±4.92×106dpm/g155.60μCi/g、および群3に関しては、334.4×106±5.87×106dpm/g150.62μCi/gであった。静脈内投与のための処方物中の全体的平均放射能濃度は、群2に関しては、4.4×106±4.22×105dpm/g1.97μCi/g、そして群3に関しては、4.7×106±2.31×105dpm/g2.11μCi/gであった。髄腔内処方物における被験物質の比放射能は、群1用量に関しては、51.16μCi/mgおよび群3用量に関しては、49.53μCi/mgと算定された。静脈内処方物中の被験物質の比放射能は、群2用量に関しては、6.53μCi/mg、群3用量に関しては、6.99μCi/mgと算定された。動物の体重および投与用量表9用量投与前日の群1、2および3における動物の平均体重は、それぞれ405g373g~452gの範囲、410g367g~453gの範囲および395g342g~444gの範囲であった。群1動物に髄腔内投与された125I-hGALCの算定平均用量は、41±0.014μg/動物であって、これは、2.12±0.72μCi/動物の放射化学的用量と等価であった。Themeandoseof群2動物に静脈内経路により投与された125I-hGALCは、1.00±0.02mg/kg2.69±0.14μCi/動物であった。群3に関しては、髄腔内および静脈内投与された125I-hGALCの算定平均用量は、1.08±0.04mg/kg5.72±0.31μCi/動物であった。群1における動物に投与された平均化学用量および放射化学用量は、標的用量レベルより低くそれぞれ、約32および29、これはプロトコールからの逸脱を生じた。しかしながら、動物に投与された実用量が算定全体を通して用いられたため、これらの低い値は試験の妥当性または得られたデータに影響しないとみなされた。臨床的観察処置関連臨床徴候は、intrathecallyat60μg/動物で髄腔内に、1mg/kgで静脈内に125I-hGALCを投与後のラットの何れにおいても観察されなかった。凝固評価早い時点で用量投与後10分~6時間、処置動物から採取された血液は30分以内に完全に凝固しない、ということが注目された。しかしながら、3匹の非処置スペアラットから採取された血液は容易に凝固したが、これは、被験物質が凝固過程を何らかの形で妨げていることを示唆する。30分未満またはそれより長い凝固時間は、プロトコールからの逸脱を引き起こした。しかしながら、分析用の多少の血清を提供するためには、いくつかの試料に関してはより長い凝固時間を要した。得られた結果の再検討は、血清において得られた濃度値と血液が凝固に要した時間の長さとの間に相関を明示しなかった。したがって、この延長または短縮凝固時間は、試験の妥当性または得られたデータに影響しなかった。血液、血清、赤血球、CSFおよび組織中の総放射能の薬物動態血液、血清および赤血球中の総放射能濃度表10、表11、表12、表18~21125I-hGALCの髄腔内および/または静脈内用量投与後の雄ラットの血清中の放射能標識物質の平均濃度を、表10に示す。全血および赤血球中の放射能標識物質の平均濃度を、表11に示す。平均データを、図18にグラフで示す。TCA沈降後の血液の上清およびペレット中で回収される放射能の平均パーセンテージを、表12に示す。群141μg/動物の髄腔内平均用量投与髄腔内用量投与後、血清および血液中の放射能標識物質の最高平均濃度Cmaxは、用量投与後3時間で観察されたそれぞれ、0.108±0.026μgeq/gおよび0.093±0.023μgeq/g。血液中の放射能レベルは、用量投与後3~6時間では相対的に一定のままであったが、一方、血清中の放射能レベルは、わずかに減少した。その後、血清および血液中の放射能濃度は減少し、用量投与後48時間までには定量限界LOQより低くなった。赤血球に関しては、Cmaxは用量投与後6時間で観察され、0.08±0.024μgeq/gであった。その後、赤血球放射能濃度は減少し、用量投与後48時間までにはLOQより低くなった。髄腔内用量投与後の平均血液対血清比は、試験期間全体を通して1未満であった0.7~0.9の範囲が、これは、放射能標識物質が血球と特定的に会合しなかったことを示す。赤血球対血清比のその値0.8~0.9の範囲は、放射能が血球と実質的に会合されなかった、ということも支持した。血液で見出された用量のパーセンテージを、標準血液容積/体重すなわち、64.0mL/kgを用いて概算した。tmax最高放射能濃度が生じる時間では、投与用量の約6が血液と会合された。群21.00μg/kgの静脈内平均用量投与静脈内用量投与後、血清14.864±0.853μgeq/gおよび血液10.228±0.447μgeq/g中の放射能標識物質の最高平均濃度Cmaxは、用量投与後10分で観察されたすなわち、分析初回時点。その後、血清および血液中の放射能濃度は徐々に減少したが、用量投与後96時間で依然として検出可能で血清:0.088±0.006μgeq/g、Cmaxの0.59;血液:0.051±0.002μgeq/g、Cmaxの0.50、血液中の用量の概算は68.4から0.3に低減した。赤血球に関しては、5.136±1.529μgeq/gというCmaxが用量投与後10分で観察された。その後、赤血球放射能濃度は減少し、用量投与後96時間までにはLOQより低くなった。静脈内用量投与後の平均血液対血清比は、試験期間全体を通して1未満であった0.6~0.8の範囲が、これは、放射能標識物質が血球と特定的に会合しなかったことを示す。赤血球対血清比のその値0.4~0.6の範囲は、放射能が血球と実質的に会合されなかった、ということも支持した。群3髄腔内用量投与とその後の静脈内用量投与:1.08mg/kg併合用量髄腔内用量投与目標60μg/動物および静脈内用量投与1mg/kg後、血清14.675±0.810μgeq/gおよび血液9.974±0.558μgeq/g中の放射能標識物質の最高平均濃度Cmaxは、用量投与後10分で観察されたすなわち、分析初回時点。その後、血清および血液中の放射能濃度は徐々に減少したが、用量投与後96時間で依然として検出可能で血清:0.077±0.0010μgeq/g、Cmaxの0.52;血液:0.037±0.033μgeq/g、Cmaxの0.37、血液中の用量の外挿は32.6から0.1に低減した。赤血球に関しては、6.113±1.748μgeq/gというCmaxが用量投与後10分で観察された。その後、赤血球放射能濃度は減少し、用量投与後96時間までには定量限界より低くなった。平均血液対血清比および赤血球対血清比が1未満であったそれぞれ、0.7~0.8および0.4~0.7の範囲ことにより示されるように、放射能標識物質は血球と特定的に会合しなかった。全血中の125I-沈澱性物質表12群1、2および3に関するトリクロロ酢酸TCAによる全血における沈澱後のペレットおよび上清中の放射能の回収に関する平均値を、表12に要約する。全血中のタンパク質を沈澱させるためにTCAの15水溶液を用いる場合、放射能は主に血液のペレット中で回収された群1:100~67;群2:100~91;群3:100~88が、これは、循環放射能の大部分がタンパク質と会合され、したがって遊離125ヨウ素を反映していない、ということを示唆している。組織および脳脊髄液CSF中の放射能濃度表13、表14、表15、図19~30125I-hGALCの単回髄腔内および静脈内用量投与後の組織およびCSF中の放射能の平均濃度を、表13に示す。平均データは、図19~30にグラフで示す。平均組織対血清比は表14に示し、そして組織、CSF、ならびに消化器および膀胱内容物中の投与用量の回収は表15に示す。群141μg/動物の髄腔内平均用量投与髄腔内用量投与後、検査した組織のすべてにおける125I-hGALC物質の全身分布が認められたが、しかしながら、CSF中の放射能レベルはLOQを下回った。雄ラットの組織中の125I-hGALC物質の最高平均濃度は、甲状腺/上皮小体4.127±1.635μgeq/gで用量投与後48時間で、そして胃0.203±0.101μgeq/g、腎臓0.096±0.014μgeq/gおよび肺0.058±0.014μgeq/gでは用量投与後3時間で観察された。他の組織ではレベルは低く、tmax値は一般的に用量投与後3~6時間で観察された。最低Cmax値は、脳0.005±0.001μgeq/gおよび腎臓脂肪0.006±0.000μgeq/gで観察された。用量投与後48および96時間までに、大部分の組織中の放射能レベルは検出限界を下回ったが、但し、甲状腺/上皮小体、腎臓および胃は異なった。用量投与後96時間で、最高平均濃度は、甲状腺/上皮小体1.927±1.585μgeq/g、Cmaxの46.7、それに続いて、腎臓0.005±0.001μgeq/g、Cmaxの5.2および胃0.002±0.001μgeq/g、Cmaxの1であった。組織対血清比は、一般的に、髄腔内用量投与後24時間までの組織に関しては1未満であった。例外は、甲状腺/上皮小体、腎臓および胃であった。最高比は、断然、甲状腺/上皮小体に関して観察された。血清濃度がLOQより低かったため、用量投与後48および96時間までに、組織対血清比は算定され得なかった。全組織において回収された放射能のレベルは投与用量の1未満で、最高比率は用量投与後3時間で肝臓0.91において観察された。用量投与後1時間で、投与用量の1より大きい比率は、胃含有物1.8でのみ見出された。用量投与後3時間までに、投与用量の1より大きい比率は、小腸内容物2.6、胃内容物5.0および膀胱内容物1.2で検出された。用量投与後6時間で、投与用量の1より大きい比率は、小腸内容物1.7および胃内容物4.0で見出された。用量投与後96時間までに、少量の125I-hGALC-由来放射能0.1未満が腎臓、甲状腺/上皮小体、胃および膀胱内容物中で依然として回収され、最高回収率は甲状腺/上皮小体0.09で得られた。群21.00μg/kgの静脈内平均用量投与静脈内投与後、群2ラットの組織中の放射能標識物質の最高平均濃度Cmaxは、甲状腺/上皮小体294.521±52.953μgeq/g;用量投与後48時間で、続いて、肺20.629±2.125μgeq/g;用量投与後30分、肝臓11.335±1.436μgeq/g;用量投与後10分、副腎8.827±2.435μgeq/g;用量投与後10分、脾臓6.595±0.625μgeq/g;用量投与後10分および腎臓3.027±0.330μgeq/g;10分で観察された。組織に関するtmax値は用量投与後10分~3時間の間に生じたが、但し、甲状腺/上皮小体は用量投与後48時間であった。最低平均放射能Cmax値は、腎臓脂肪0.158±0.019μgeq/g、CSF0.210±0.363μgeq/g、脳0.252±0.041μgeq/g、骨格筋0.275±0.025μgeq/gおよび脊髄0.293±0.028μgeq/gにおいて観察された。用量投与後96時間までに、放射能は、分析した18の組織のうち7つで依然として検出され、最高平均濃度は、甲状腺/上皮小体218.917±45.098μgeq/g、Cmaxの74.3、次いで、肝臓0.126±0.014μgeq/g、Cmaxの1.1、脾臓0.111±0.009μgeq/g、Cmaxの1.7および腎臓0.099±0.010μgeq/g、Cmaxの3.3で検出された。用量投与後10分で、平均組織対血清比は分析した全組織に関して1未満であった。用量投与後30分および1時間までに、平均組織対血清比は、肺および甲状腺/上皮小体に関して1より大きかった。用量投与後3および6時間では、平均組織対血清比は、肝臓、肺および甲状腺/上皮小体に関して1より大きかった。用量投与後24および48時間で、用量投与肝臓、肺、脾臓および甲状腺/上皮小体は、1を上回る平均組織対血清比を有した。用量投与後96時間で、平均組織対血清比は、腎臓、肝臓、脾臓および甲状腺/上皮小体に関して1より大きかった。最高組織対血清比は、甲状腺/上皮小体96時間で2485、肺24時間で6.5および肝臓24時間で2.2で観察された。投与された放射能の比率に関して、組織中の最高平均値は、肝臓用量投与後10分で41.7、肺30分で7.0、腎臓10分で2.2、小腸1時間で1.5および甲状腺/上皮小体48時間で1.4で観察された。消化管内容物では、最高平均値は、胃内容物の10.3用量投与後3時間で、小腸内容物における5.4用量投与後3時間でおよび大腸内容物における1.16時間であった。用量投与後96時間までに、投与用量の最高比率は、甲状腺/上皮小体1.0、肝臓0.5および腎臓0.1で観察された。用量投与後のこの時点で、投与用量の0.01未満が、胃および膀胱内容物中に残存した。群3髄腔内用量投与とその後の静脈内用量投与:1.08mg/kg併合用量髄腔内および静脈内用量投与後、群3ラットの組織中の放射能標識物質の最高平均濃度Cmaxは、甲状腺/上皮小体296.957±57.793μgeq/g;用量投与後24時間で、続いて、肝臓10.181±0.600μgeq/g;用量投与後10分、副腎9.567±1.678μgeq/g;用量投与後10分、肺5.305±0.194μgeq/g;用量投与後1時間、脾臓5.042±0.902μgeq/g;用量投与後10分、胃4.454±1.455μgeq/g;用量投与後3時間、腎臓3.390±0.183μgeq/g;1時間およびCSF2.087±2.912μgeq/g;10分で観察された。組織に関するtmax値は用量投与後10分~3時間の間に生じたが、但し、大腸は用量投与後6時間、および甲状腺/上皮小体は用量投与後24時間であった。最低平均放射能Cmax値は、腎臓脂肪0.188±0.020μgeq/g、脳0.283±0.062μgeq/g、脊髄0.327±0.062μgeq/gおよび骨格筋0.411±0.009μgeq/gにおいて観察された。用量投与後96時間までに、放射能は、分析した18の組織のうち8つで依然として検出され、最高平均濃度は、甲状腺/上皮小体43.962±23.164μgeq/g、Cmaxの14.8、次いで、肝臓0.137±0.018μgeq/g、Cmaxの1.3、腎臓0.124±0.005μgeq/g、Cmaxの3.7、脾臓0.083±0.009μgeq/g、Cmaxの1.6および副腎0.069±0.016μgeq/g、Cmaxの0.7で検出された。用量投与後10分で、平均組織対血清比は分析した全組織に関して1未満であった。用量投与後30分および1時間までに、平均組織対血清比は、甲状腺/上皮小体に関して1より大きかった。用量投与後3および6時間では、平均組織対血清比は、胃および甲状腺/上皮小体に関して1より大きかった。用量投与後24で、肝臓および甲状腺/上皮小体は1を上回る平均組織対血清比を有した。用量投与後48および96時間で、平均組織対血清比は、腎臓、肝臓、および甲状腺/上皮小体に関して、ならびに脾臓96時間に関して、1より大きかった。最高組織対血清比は、甲状腺/上皮小体48時間で854、肝臓48時間で1.8および腎臓96時間で1.6で観察された。投与された放射能の比率に関して、組織中の最高平均値は、肝臓用量投与後10分で19.0、腎臓1時間で1.2および小腸3時間で1.2で観察された。消化管内容物では、最高平均値は、胃内容物の8.8用量投与後3時間で、小腸内容物における4.3用量投与後3時間でおよび大腸内容物における1.06時間であった。用量投与後96時間までに、投与用量の最高比率は、肝臓0.3で、甲状腺/上皮小体0.1および腎臓0.05で観察された。用量投与後のこの時点で、投与用量の0.01未満が、副腎、心臓、肺、脾臓、胃および膀胱内容物中に残存した。血液、血清、赤血球、CSFおよび組織中の放射能の薬物動態表16および表17125I-hGALCの単回髄腔内および/または静脈内用量投与後のラットの血液、血清、赤血球、CSFおよび組織中の放射能の平均薬物動態パラメーターを、表16および表17に示す。血液、血清および赤血球髄腔内用量投与群1:41μg/動物後、血清、全血および赤血球に関する時間ゼロから最終測定可能時点までの放射能濃度対時間曲線下平均算定面積AUC0-tlastは、それぞれ1.48μgeqh/g、1.33μgeqh/gおよび1.24μgeqh/gであった。血清、全血および赤血球中の放射能に関して報告された見掛けの終末t1/2値は、それぞれ5.34、5.02および4.08時間であった。消失速度定数、kを、血清、全血および赤血球において、それぞれ0.130h-1、0.138h-1および0.170h-1と算定した。AUC0-infを、血清、全血および赤血球において、それぞれ1.54μgeqh/g、1.37μgeqh/gおよび1.25μgeqh/gと算定した。血清、全血および赤血球からの放射能に関する排出相は、AUC0-infの算定のために必要とされる極度に低い外挿値パーセンテージそれぞれ4.0、3.2および1.4により立証されるように、良好に限定された。静脈内用量投与群2:1.00mg/kg後、血清、全血および赤血球に関する平均AUC0-tlast値は、それぞれ71.1μgeqh/g、51.2μgeqh/gおよび33.9μgeqh/gであり、見掛けの終末t1/2値は、それぞれ30.7、27.1および10.9時間であった。k値は、血清、全血および赤血球において、それぞれ0.0226h-1、0.0256h-1および0.0635h-1として算定された。血清、全血および赤血球からの放射能に関する排出相は良好に限定され、AUC0-infは、血清、全血および赤血球において、それぞれ75.0μgeqh/g外挿5.21、53.2μgeqh/g外挿3.75および35.7μgeqh/g外挿4.94として算定された。見掛けの分布容積Vzは、全血735mL/kg、次いで、血清591mL/kgおよび赤血球441mL/kgにおいて最大であった。被験物質のクリアランスは、血清から13.3mL/h/kgで、全血に関して18.8mL/h/kgで排出された。群3動物への髄腔内用量投与および静脈内用量投与併合1.08mg/kg後、血清、全血および赤血球に関する平均AUC0-tlast値は、それぞれ89.8μgeqh/g、66.9μgeqh/gおよび49.2μgeqh/gであった。血清、全血および赤血球中の放射能に関して報告された見掛けの終末t1/2値は、それぞれ25.5、20.9および9.61時間であり、kは、0.0272h-1、0.0332h-1おおび0.0721h-1であった。さらにまた、3つのマトリックスすべてに関する排出相は良好に限定され、AUC0-infは、血清、全血および赤血球において、それぞれ92.6μgeqh/g、68.0μgeqh/gおよび51.0μgeqh/g外挿:3.06、1.64および3.69として算定された。Vzは、全血478mL/kg、次いで、血清429mL/kgおよび赤血球293mL/kgにおいてより大きかった。クリアランス値は、全血に関して15.9mL/h/kgおよび血清に関して11.7mL/h/kgであった。組織125I-hGALCの髄腔内用量投与群1:41μg/動物後のラットからの組織中の最高AUC0-tlast値は、甲状腺/上皮小体313μgeqh/gで、次いで、胃2.60μgeqh/gおよび腎臓1.84μgeqh/gで観察された。いくつかの組織に関しては、無限大までのAUCの外挿が20より大きいため、あるいは終末相におけるデータを欠くため、kまたはKから得られる任意のパラメーターすなわち、t1/2およびAUC0-infは概算できなかった。概算できなかった組織眼、心臓、腎臓、大腸、肺、小腸および胃に関しては、kは0.01ないし0.17h-1の範囲であり、そしてt1/2は一般的に4~6時間の範囲であったが、但し、腎臓に関しては58.6時間、そして胃に関しては39.1時間であった。静脈内用量投与群2;1.00mg/kg後、AUC0-tlastに関する最高値は、甲状腺/上皮小体24989μgeqh/gで、次いで、肺165μgeqh/g、肝臓100μgeqh/g、脾臓56.1μgeqh/g、副腎43.1μgeqh/gおよび腎臓40.7μgeqh/gにおいて観察された。最低AUC0-tlast値は、腎臓脂肪0.617μgeqh/gおよび脳0.735μgeqh/gに関して観察された。kから得られるパラメーターは、排出相が不十分に限定された組織甲状腺/上皮小体およびCSF、あるいはAUC0-infへの外挿が20より大きい組織腎臓脂肪および脳に関しては報告されなかった。肝臓および肺に関するAUC0-inf値のみが、血清の値75μgeqh/gより大きかった。最高報告AUC0-inf値は、肺167μgeqh/g;外挿0.832、次いで肝臓105μgeqh/g;外挿4.15、脾臓61.2μgeqh/g;外挿8.33、副腎46.8μgeqh/g;外挿7.89および腎臓46.7μgeqh/g;外挿12.7に関するものであった。AUC0-inf値に関する最低報告値を、脊髄2.51μgeqh/g;外挿4.87、次いで、筋肉2.69μgeqh/g;外挿1.93および眼5.64μgeqh/g;外挿5.19に関して算定した。組織における最長算定可能t1/2は、腎臓に関する41.6時間、次いで、副腎に関する34.6時間、および脾臓に関する31.8時間であった。最短報告t1/2は、坐骨神経に関する4.18時間であった。群3に関しては、髄腔内および静脈内用量投与1.08mg/kg、併合用量後、AUC0-tlastに関する最高値は、甲状腺/上皮小体16776μgeqh/gで、次いで、肝臓96.5μgeqh/g、胃72.1μgeqh/g、腎臓57.9μgeqh/g、脾臓46.9μgeqh/g、肺44.1μgeqh/gおよび副腎43.9μgeqh/gにおいて観察された。最低AUC0-tlast値は、腎臓脂肪0.954μgeqh/gおよび脳1.03μgeqh/gに関して観察された。kから得られるパラメーターは、AUC0-infに対する外挿が20より大きい腎臓脂肪および脳か、またはR2が0.8より低いCSF組織に関しては、報告しなかった。甲状腺/上皮小体および肝臓に関するAUC0-inf値だけが、血清92.6μgeqh/gの値より大きかった。最高報告AUC0-inf値は、甲状腺/上皮小体18390μgeqh/g;外挿8.78、次いで、肝臓102μgeqh/g;外挿5.0、胃72.6μgeqh/g;外挿0.766、腎臓64.4μgeqh/g;外挿10.1、脾臓49.3μgeqh/g;外挿4.85、副腎45.8μgeqh/g;外挿4.25および肺45.4μgeqh/g;外挿2.88に関してであった。AUC0-inf値に関する最低報告値は、脊髄3.77μgeqh/g;外挿6.55、次いで、筋肉4.66μgeqh/g;外挿6.25に関して算定された。組織における最長算定可能t1/2は、腎臓に関する36.4時間、次いで、肺に関する27.5時間、肝臓に関する25.7時間および甲状腺/上皮小体に関する25.4時間であった。最短報告t1/2は、坐骨神経に関する4.71時間であった。考察髄腔内投与後、血清および全血中の放射能の最高平均濃度は用量投与後3時間で観察されたが、これは、全身循環への用量投与関連物質の相対的に迅速な分布を示唆している。静脈内投与後、血清および全血中の放射能の最高平均濃度は、測定された初回時点で観察された。1未満という血液対血清比により反映されるように、血清中の濃度は、常に、全血中の濃度より高かった。これは、用量投与関連物質が用量投与後任意の時間に任意の群の血球と特定的に会合されない、ということを示した。血液タンパク質のTCA沈降後、放射能は主にペレット中で回収されたが、これは、循環放射能の大部分が会合されたタンパク質であったということを示唆しており、観察された放射能分布が遊離125Iヨウ素の傾向を主に反映しているわけではなかったことを示している。群2静脈内用量投与1.00mg/kgを群3髄腔内および静脈内併合用量投与1.08mg/kgと比較した場合、群3血清および全血における濃度は、一般的に、群2のものと類似していると思われた。両群に関する両マトリックス中の放射能の減少も、血液対血清比により評価されるように、非常によく似ていた。群2および群3血清および血液に関するAUC0-tlastおよびAUC0-infの比較は、用量投与関連物質への曝露が群3動物においてわずかに高いことを示した。群1において、CSF中の放射能のレベルは非常に低く、髄腔内腔隙への直接的な被験物質の投与によると思われない知見であったが、非常に低いレベルは脳において観察された。しかしながら、放射能は、全身循環中に、ならびに全身組織中に、用量投与の直ぐ後に観察され、これは、用量投与関連物質が投与後髄腔内腔隙からかなり迅速に分布された、ということを示唆している。胃および腸内容物における高レベルは、用量投与関連物質が糞便を介して排出されるということを示唆したが、しかし排出物における直接測定はこの試験では実施しなかった。さらに、膀胱内容物における高レベルも尿を介した排出を示唆している。被験物質それ自体の分布/持続というよりむしろこの組織におけるヨウ素標識の損失ならびに標識の持続と考えられる甲状腺/上皮小体における高レベル以外に、抗レベルの放射能は、肝臓、肺、副腎、脾臓および腎臓で観察されたが、これらは被験物質の代謝および/または排出に関与すると思われる組織であった。放射能の分布は、群2および3において、用量投与後の初回時点までに全身性および広範であった。最高濃度は、一般的に、肝臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、そして特に甲状腺/上皮小体に関連した。したがって、3つの群すべての組織中の放射能の分布パターンは、非常によく似ていた。さらにまた、すべての動物の甲状腺/上皮小体で観察された高レベルの放射能特に、用量投与後の漸増回数に伴う顕著な濃度増大と考えられるは、おそらくは、被験物質それ自体の分布/持続というよりむしろ、この組織におけるヨウ素標識の損失および標識の持続を示した。CSFレベルは、用量投与後早い時点で、群1と比較してこれらの群においてより高かったが、これは、放射能標識物質が血液脳関門を横断し得た、ということを示唆している。群2と比較して、これもまた用量投与後早い時点で、わずかに高いレベルが群3のこのマトリックス中で観察されたが、これは、この濃度が、静脈内用量投与から分布する被験物質関連物質、ならびに髄腔内腔隙中に直接注射された物質により説明された、ということを示唆している。したがって、群1に関して観察されたLOQより低い値は、この分析法により考えられる量より低い、極度に少量の試料容積中の極度に低い濃度の結果であり得る。組織対血清比は、一般的に、用量投与後96時間までに全群の組織の大多数において1未満であったが、これは、用量投与関連物質が組織中に分布され、一般的に、血清からより組織からより迅速に掃去された、ということを示している。全群に関して、用量投与関連物質への組織の大多数の曝露AUC0-tlastにより評価は、血清の場合より低かった。結論雄ラットへの125I-hGALCの単回髄腔内公称60ug/動物および/または静脈内ボーラス用量投与公称濃度1mg/kg後、血液、血清、赤血球、CSFおよび組織中の放射能の濃度を測定した。血清および全血中の放射能の最高観察濃度は、髄腔内投与後の用量投与後3時間で全身循環への相対的に迅速な分布を示す、あるいは静脈内用量投与後初回時点10分で生じた。血清中の濃度は血液中より高かったが、これは、被験物質関連物質が血球と特定的に会合されなかったことを示している。組織中への放射能の分布は、用量投与後の早い時点までに全身性および広範であり、概して、組織への分布パターンは3つの群すべての間で類似していた。全群に関して、用量投与関連物質への組織の対部分の曝露AUC0-tlastにより評価は、血清の場合より低かった。3群すべてに関する甲状腺/上皮小体における高濃度は、この組織における用量投与関連物質の分布および存続というよりむしろ、ヨウ素標識の損失を示すと考えられた。静脈内用量投与後96時間までに、放射能は検査した組織の少数において依然として検出された。実施例3:twitcherマウスにおけるICVおよびICV/IPRMGALC注射および生存延長の前臨床試験本実施例は、rmGALCの毎週IP注射を施されたtwitcherマウスにおける生存延長を示す前臨床試験の一実施形態を実証する。本実施形態では、サイコシンレベル低減および全体的運動機能走り方改善とともに、髄鞘形成改善が坐骨神経において観察された。いくつかの実施形態では、単回ICVまたはICV/IPrmGALC注射で処置したtwitcherマウスは、生存増大、ならびに脳サイコシンレベルの63までの低減を示した。rmGALCの単回ICV投与後の重要な終点すなわち、生存、脳サイコシンレベルにおける、全身投与の付加ICV/IP後のこれらの終点における非常に小さな改善を伴う陽性結果は、CNS単独レジメンがGLDの処置のための実行可能な臨床的選択肢である、ということを示唆している。序論グロボイド細胞白質ジストロフィーGLD症は、約1:100,000の出現率スカンジナビア諸国では1.9:100,000で出生児に生じる常染色体劣性リソソーム貯蔵障害である。進行性末梢PNSおよび中枢CNS神経系障害であるGLDは、ガラクトセレブロシダーゼGALCの酵素活性の欠陥を引き起こして、基質脂質を分解するすなわち、ガラクトシルセラミドをガラクトースとセラミドに;ガラクトシルスフィンゴシンサイコシンをガラクトースとスフィンゴシンに分解する遺伝子突然変異の結果である。この障害は、乏突起グリア細胞およびミエリンの完全損失、ならびにガラクトシルセラミド貪食制マクロファージグロボイド細胞の存在により特性化される。この疾患の臨床的特徴は、2つの型で現われる:すなわち乳児期および後期開始型である。乳児型のGLDクラッベ病としても知られているは、GALC欠乏症と診断された全患者の90で起こり、症候は、通常は出生後3~6ヶ月以内に観察される;2~3週齢という早期に症状発現する症候の報告があるWenger,D.A.etal.,2001,GalactosylceramideLipidosis:GloboidCellLeukodystrophyKrabbeDisease,inTheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDisease,C.R.Scriver,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.,andValle,D,Editor.2001,McGraw-Hill.p.3669-3687この記載内容は、参照により本明細書中に援用される。この疾患の後期発症型変種は、10歳までに臨床的に現われるが、しかしながら、40歳で診断された患者が報告されているWenger,D.A.etal.,2001,GalactosylceramideLipidosis:GloboidCellLeukodystrophyKrabbeDisease,inTheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDisease,C.R.Scriver,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.,andValle,D,Editor.2001,McGraw-Hill.p.3669-3687この記載内容は、参照により本明細書中に援用される。後期発症型患者における機能の低減は、数年の期間に亘って次第に進行する。全身性酵素補充療法ERTは、リソソーム貯蔵障害LSD、例えばゴーシェ病、ファブリー病およびハンター症候群に罹患している患者に関する利益を提供してきたWenger,D.A.etal.,2001,GalactosylceramideLipidosis:GloboidCellLeukodystrophyKrabbeDisease,inTheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDisease,C.R.Scriver,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.,andValle,D,Editor.2001,McGraw-Hill.p.3669-3687;Neufeld,E.F.,2004,EnzymeReplacementtherapy.LysosomaldisordersoftheBrain,ed.F.M.a.W.Platt,S.V.2004:OxfordUniversityPress.327-338;Desnick,R.J.,2004.J.Inherit.Metab.Dis.,273:p.385-410これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に援用される。GLDに関するERTは、おそらくはこの疾患がPNSおよびCNSの両方に影響を及ぼすため、厳正に遂行されてこなかった。GLD患者に関する最新処置としては、造血細胞移植HCTが挙げられるが、しかしながら、この手法は有意の副作用すなわち30の処置関連死、生涯に亘る免疫抑制療法のため、ならびに前駆症状製患者においてのみ有効であるため、限界がある。twitcherマウスは、GLDを研究するために用いられる最も一般的な実験動物であり、この疾患に関する膨大な実験作業を実行させているWenger,D.A.,2000,Mol.Med.Today,611:p.449-451;この記載内容は、参照により本明細書中に援用されるが、しかし種々の程度の特性化を有するGLDの他の天然動物モデルが存在する。自然突然変異が、WestHighlandWhite/CairnテリアKobayashiT.,etal.,1980,BrainRes.,202:479-83;これらの記載内容は、参照により本明細書中に援用される、無角ドーセットヒツジPritchardD.,etal.,1980,Vet.Pathol.,17:399-405、飼いネコJohnsonK.,1970,J.Am.Vet.Med.Assoc.,157:2057-64;この記載内容は、参照により本明細書中に援用されるおよび非ヒト霊長類であるアカゲザルBaskinG.,etal.,1998,LabAnim.Sci.,48:476-82;この記載内容は、参照により本明細書中に援用されるにおいて存在する。初期の神経同種異系移植試験は、twitcherマウスのシュワン細胞の末梢神経機能を改善する能力が、insituでの同種異系移植片twitcher細胞への酵素補充により媒介されるということ、ならびに損傷twitcher末梢有髄細胞の長期回復が可能であることを実証した。しかしながら、この技法は、twitcherマウスの全体的療法として一般化され得なかったBaskinG.,etal.,1998,LabAnim.Sci.,48:476-82;この記載内容は、参照により本明細書中に援用される。罹患マウスにおいて、HCTは、罹患動物の寿命の有意の改善および体重増を実証したが、しかしながら骨髄低減状態調節を受けているマウスにおいて44日から100日以上の間に実証された生存可能性とともに、種々の効力が観察されているLin,D.,etal.,2007,Mol.Ther.,151:p.44-52;Hoogerbrugge,P.M.,etal.,1998,J.Clin.Invest.,816:p.1790-4;ともにこれらの記載内容は、参照により本明細書中に援用される。これらの研究における非処置マウスの典型的寿命は、約40日であった。これらのおよび他の試験において、再髄鞘形成速度も現存する脳病害も非処置対照に対比して処置マウスにおいて改善されることはなかったYeagerA.,etal.,1984,Science,225:1052-4;Toyoshima,E.,etal.,1986,J.Neurol.Sci.,742-3,p.307-18;ともにこれらの記載内容は、参照により本明細書中に援用される。L-シクロセリンを、単独でまたはHCTと組合せて用いたスフィンゴシン合成を標的にする基質抑制は、twitcherマウスの寿命を増大するLeVineS.,etal.,2000,J.Neurosci.Res.,60:231-6;BiswasS.,etal.,2003,Neurosci.Lett.,p347:33-6;ともにこれらの記載内容は、参照により本明細書中に援用される。L-シクロセリンは、不安の処置のために指示されるそのエナンチオマーであるD-シクロセリンとは異なって、ヒトが用いるには有毒過ぎる。遺伝子療法実験は、単独療法またはHCTとの組合せにおいて、トランスフェクト化細胞において酵素を生じる能力、ならびにtwitcherマウスにおける寿命を改善する能力を示しているLin,D.,etal.,2007,Mol.Ther.,151:p.44-52;この記載内容は、参照により本明細書中に援用される。基質低減、HCTおよび遺伝子療法はすべて、前駆症状製動物に用いた場合、最も有意の効力を提供し、症候性動物における疾患に全く影響を及ぼさないが、及ぼしても限定的である。したがって、ERTは、特に前駆症候性患者に施す場合、GLDの処置における実行可能な選択肢を提供し得る。結果HEK293由来ネズミGALCrmGALC;5mg/kgを用いた全身投与酵素補充療法は、多数回腹腔内IP注射として末梢投与した場合、twitcherマウスの寿命を改善し、ビヒクル処置動物と比較して、サイコシン蓄積を15低減した表18、図31。rmGALCでIP処置したマウスは、非処置またはビヒクル処置動物と比較して、走り方試験においてより良好に遂行し、坐骨神経組織病理学知見が改善された。末梢IP投与rmGALCは、脳に最小度に送達されて、脳サイコシンのわずかな低減を生じた。しかしながら、脳組織病理学知見においては如何なる変化も認められなかった。したがって、rmGALC5mg/kgの反復毎週全身投与IPで処置したtwitcherマウスにおいて観察された結果は、生存に有益で、脳サイコシンレベルをわずかに低減し、そして全体的運動機能を改善した。twitcherマウスにおける単回ICVおよび併用ICV/IPrmGALC結果は、高用量ICV/IP処置群が平均50日生存し120μg/5mpk、ビヒクル処置動物は36日生存したに過ぎない、ということを示している図32。ICVrmGALCで処置したマウスは、42日40μgおよび48日120μgの用量応答性平均生存時間を示しただけであった。単回120μgICV注射は、サイコシンの脳レベルを低減した63が、一方、40μgrmGALCの単回ICV注射は、サイコシンの39減少を生じた図33。ICV/IP投与は、ICV単独と比較して、サイコシン低減の如何なる付加的利益も提供しなかったが、しかし併用レジメンで観察されたサイコシンレベルの48低減は、毎週IP処置単独で観察されたもの15より有意に低かった。さらに、注射部位の遠位の部位での脳組織学知見の改善が、40μgレベルでのICV処置で観察された図34。これらの結果は、直接ICV注射後のrmGALCの脳における活性および生体分布を確証した。しかしながら、ICVrmGALCのみで処置したマウスは、坐骨神経繊維形態の回復または髄鞘形成を実証できず、全体的運動機能のわずかな改善のみであった例えば、走り方分析。rmGALCの単回ICV投与後の重要な終点すなわち、生存、脳サイコシンレベルにおける有意の改善は、全身循環における十分な酵素濃度が欠けていることを示唆する。臨床的用量投与パラメーター:twitcherマウスにおけるサイコシン再蓄積率適切な臨床的用量範囲を限定しようと努力して、twitcherマウスモデルにおいて以下の試験を実施した:-PND10での単回ICV注射後のtwitcherマウスにおける脳サイコシン再蓄積率-twitcherマウスにおけるrmGALC併用腹腔内IP脳室内ICV注射を用いた用量確認試験。中枢神経系におけるサイコシン再蓄積率を評価するために、PND19での12μgまたは40μgのrmGALCの単回ICV注射で、twitcherマウスを処置した。マウスの群n=3を、注射PND20の24時間後に、その後、3日毎に屠殺した。脳組織を取り出し、サイコシン分析、組織病理学および酵素活性分析に付した。動物組を生存に関してモニタリングしn=8、運動機能走り方分析をPND40で分析した。単回ICV注射後の脳ホモジネート中のサイコシンレベルを、質量分光分析LCMSLtd.,NorthCarolinaにより分析した。結果は、rmGALC投与の24時間以内にサイコシンが急速に減少することを示唆している図35。サイコシンの低減傾向は、酵素投与後24日間保持された。さらに、サイコシン濃度の減少は、ビヒクル処置動物と比較して、この期間の間は用量依存性であると思われた:ビヒクル処置平均:4.5ng/mlのサイコシン対12μgrmGALC平均:2.5mg/mlサイコシン対40μg/mlrmGALC平均:1.6ng/mlサイコシン。興味深いことに、試験終了時処置後28~32日目に両用量投与群で観察された漸増サイコシンレベルは、月1回ベースで投与された場合、ERTが首尾よくいかないことがある、ということを示唆している。より高頻度の用量投与計画が必要であり得る。各試料採取時点で動物が少数であるため、結果の変動性が明白であった。しかしながら、これらの結果に基づいて、サイコシン再蓄積がほぼ4週間28日スケジュールで起こることは明白である。生存時間を分析した場合、結果は、12μg/mLおよび40μg/mLrmGALC処置群がともに、48日12μg/mLおよび50.5日40μg/mLという生存中央値を有し、ビヒクル処置動物は40日生存した図36。予期せぬことに、40μgヒトGALCrhGALCで処置したマウスは、40日生存するビヒクル処置動物と比較して、単に42日までの生存利益を示した。rhGALCによるこの効力t芸源の理由単数または複数は不明であるが、しかし後述の節で考察する。しかしながら、この試験の結果から、低用量のrmGALCでも、twitcherマウスモデルにおける生存利益を示すのに有効である、ということは明らかである。臨床的用量投与パラメーター:twitcherマウスにおけるrmGALCおよびrhGALC用量分類試験従来の結果は、ICV/IPrmGALC120μgおよび5mpkで処置したtwitcherマウスが、ビヒクル処置動物より14日長く生存した、ということを示した。しかしながら、直接CNS注射のみで処置したtwitcherマウスは、12日120μgICVおよび6日40μgICVの平均生存の用量応答性改善を示した。ネズミ脳における120μgの用量は、患者における300mg/脳1kgの用量と解釈できる;したがって、低用量のrmGALCの効力を調べることが重要であった。さらに、twitcherマウスにおける効力に関して、rhGALCの早期ロットを検査した。マウスの群を、PND10で開始するrmGALCの毎週IP注射5mg/kgPND19での12μg30mg/脳1kgまたは26μg60mg/脳1kgのrmGALCまたはrhGALCの単回ICV注射で処置した。PND39で、マウス組n=3/群を、組織採取脳、坐骨神経、肝臓、血清のために屠殺した。脳組織を、サイコシン分析、組織病理学および酵素活性定量に付した。残りの動物生存n=8を、生存および走り方分析に関してモニタリングした。考察この用量確認試験の結果は、rmGALC投与に関する生存利益を示し、用量依存性傾向を伴った図37。12μg/5mpkおよび26μg/5mpk組合せ用量のrmGALCは、ビヒクル処置動物に関する40.5日と比較して、twitcherマウスの平均寿命をそれぞれ44.5および45.5日に延長した。12μg/5mpk38日および26μg/5mpk39.5日用量のrhGALCに関する生存利益は認められなかった。26μg/5mpkrhGALCは、罹患twitcherマウスの寿命を1.5日延長したが、しかしながら、何れの用量のrhGALCも、ビヒクル処置動物に関する生存日数に達しなかった図37。rmGALCで全身処置IPされた動物で以前観察されたように、rmGALCの併用ICV/IP投与を受けている全動物に関して走り方分析における改善が観察されたが、一方、単回ICV注射で処置された動物は、運動機能における利益をほとんど示さなかった図38。寿命における利益に関して観察されたように、rhがるで処置したマウスにおいては、走り方分析における利益は観察されなかった。しかしながら、rhGALCの特異的活性は、invitro活性におけるrmGALCの約33であることが判明した表19。したがって、これらの最新結果は、低用量のrmGALCでも、生存および運動機能の両方に有益であり、GLDの処置のためのERTの適時を増大する、ということを示唆する。サイコシン再蓄積が4週間28日スケジュールでほぼ起きることは、明白である。rmGALCおよびrhGALCの抗原性は、twitcherマウスがヌルモデルすなわち、それらは交差反応性免疫学的物質CRIM陰性であるであると予測されるべきものである。全体的に、rhGALC処置マウスICV/IPレジメンにおける最大血清抗体力価は、匹敵するICV/IPrmGALCレジメンで処置されたマウスより有意に高かった図39。抗体は、直接CNS注射で処置されたマウスにおいても存在したが、しかし最大力価は、ICV/IP処置を受けている動物より数倍低かった。中和抗体が生成され得たという可能性が存在する。GALC欠乏イヌを用いた試験を開始して、rhGALCの抗原性を特性化した。この試験では、罹患動物生後6週を、ヒトGALCの2mg/kgを毎週1回IV投与および/または2.25mg30mg/脳1kgIT投与またはビヒクル単独の投与で処置した。残りの試験に関しては、付加的処置を、8週目および毎月生後~16週まで施した。CSFを取り出した後、安楽死させて、抗体形成およびサイコシンレベルに関して分析した図40。MPSIIIAのHuntawayイヌモデルにおける組換えヒトヘパリンN-スルファターゼを用いた以前の試験は、試験における動物の寛容化を必要とする外因性酵素に対する顕著な抗体応答を実証した。しかしながら、ナイーブおよびrhGALC処置イヌからのCSFを検査する予備的結果は、非処置対照と比較して、サイコシンレベルの明らかな低減を示した図40。実施例4:マウスにおけるIT注射GALCの脳および肝臓の組織学的知見/標識化本実施例は、マウスにおけるIT注射hGalCおよびmGalCの一実施形態、ならびに種々の組織におけるGalC抗体の対応する検出および局在化を記載する。実験計画組織採取および組織学的染色それぞれ群BおよびCから組織学的分析のために利用可能な動物は3匹だけであった。脳および肝臓からの試料を、その後にパラフィン包埋するために、10中性緩衝化ホルマリン中に固定した。5μmパラフィン切片を、免疫組織化学IHC検査のために調製して、注射タンパク質を検出した。GalCAのIHC染色のために、3つの抗GalC抗体を用いた。1.マウスモノクローナル抗体エックマン博士の研究室で生成2.ウサギポリクローナル抗体群1により産生3.ウサギポリクローナル抗体群2により産生高感受性ABCチラミド蛍光増幅法を用いて、標的化タンパク質を標識した。染色結果は、GalC陽性細胞を緑色に示し、核をDAPIブルーとして対比染色し、バックグラウンド域を黒色として示した。結果群1ポリクローナル抗体は、マウス脳において、内因性タンパク質との強力な交差反応を有した。ビヒクル対照脳でも、すべてのCNS細胞が強陽性に染色された。注射タンパク質は、このような強バックグラウンドで確認されなかった図41。群2ポリクローナル抗体は、マウス脳において内因性タンパク質との弱い交差反応を有したが、しかしビヒクル対照脳におけるCNS細胞は依然として陽性であった。注射タンパク質は、バックグラウンドを上回って検出されなかった図42。マウスモノクローナル抗体は、許容可能な特異性を有し、ビヒクル対照脳においては、シグナルは非常に低かったデータは示されていない。IT注射後、タンパク質はすべて、脳表面の髄膜中で検出された。群1および群2のhGalCはともに、髄膜下の領域のCNS細胞ニューロンおよびグリア細胞中で検出され、群1処置動物のhGalCにおいて相対的に強いシグナルが認められた。陽性ニューロンおよびグリア細胞は、mGalC処置脳においては検出されなかった図43。小脳では、hGalCは髄膜中および顆粒帯表面における染色を生じたが、一方、mGalCは生じなかった図44。マウスモノクローナル抗体はマウス脳中で働いたが、しかし肝臓中の洞様細胞との強い交差反応性を示し、肝臓におけるIT注射タンパク質の細胞取込みを評価するために用いることはできなかった図45。群2ポリクローナル抗体は、肝臓組織において特異性を示し、ビヒクル対照脳においてはシグナルは非常に低かった。IT注射タンパク質はすべて、処置後、肝臓の洞様細胞および肝細胞の両方で検出され、群1処置動物のhGalCにおいては、陽性細胞は少なく、シグナルは弱かった図46。如何なる処置群においても高GalC活性は見出されなかったが、しかし陽性染色は、髄膜において、ならびに周囲領域のCNS細胞で見出され、これは、IHCが、細胞レベルで取り込まれた注射タンパク質の検出において感受性であることを示している図47。肝臓では、mGalCはより高い活性を示したが、しかしながら、群2AbによるIHCは、mGalCおよびhGalC間の非常に小さな差を検出した図48。hGalCにおける群1Abによる低検出可能活性は、低観察IHCレベルと一致した。要約IT注射後、注射タンパク質はすべて、IHCにより大脳の髄膜中で検出された。群1および群2の両方の注射hGalCの細胞更新は、CNS細胞ニューロンおよびグリア細胞中で検出され、群1処置脳のhGalCにおけるシグナルは相対的に強かった。要請ニューロンおよびグリア細胞は、mGalC処置脳では検出されなかった。小脳では、髄膜における陽性シグナルのほかに、群1および群2の両方の注射hGalCは、顆粒帯の表面の細胞の層中に見出された。全処置群の肝臓において、注射タンパク質は洞様細胞および肝細胞中に検出され、これは、循環系における髄腔内I2Sの終局的取込みを示唆する。群2のmGalCおよびhGalCは、群1のhGalCに対比して、同様の強い染色シグナルを有した。実施例5:イヌにおけるIT注射GALCの脳組織学的知見/標識化本実施例は、イヌにおけるIT注射GalCの一実施形態、ならびに脳におけるGalC抗体の対応する検出および局在化を記載する。この実施形態では、IT注射タンパク質は、髄膜で、ならびに髄膜下の表面皮質の領域で検出された。ICV注射タンパク質は、脳室周囲領域に見出された図49。GalCIHCは、IT注射後に皮質における拡散性細胞外染色パターンを示し、ニューロン円形では陰性シグナルを有した図50。陽性Iba染色を有する活性化ミクログリア細胞の限定性低減が、ICV注射脳室周囲領域およびIT注射皮質において観察された図51。形態学的変化グロボイド細胞はビヒクル群においてはLFB/PASで皮質中には見出されず、群を通して差異は観察されなかった。Iba染色で印を付けられたグロボイド細胞矢印は、脳室周囲領域の4つの限定区域において、ICV処置後に低減された図52。I2Sタンパク質のIT送達の例実施例6:IT送達I2Sの生体分布この試験の主な目的は、組換えヒトI2Sが、髄腔内-腰椎経路により生体MPSIIマウスの脳に送達され得るか否かを確定することであった。材料および方法動物:マウスを、12時間明暗周期下で、コロニー室中にケージ当たり4匹までの群で収容した。齧歯類餌LabDiet-5001、StLouis,MOおよび水Lexington,MA自治体水道水;逆浸透により精製を、実験期間中、自由に摂取させた。動物の管理は、実験室動物の管理および使用に関するガイドGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimalsNationalAcademyPress,WashingtonD.C.,1996に記載された指針に従って実行した。ThecurrentIKObreedingcolonywasestablishedfromfourcarrierfemalemiceheterozygousfortheIKOmutationthatwereobtainedfromDr.JosephMuenzerUniversityofNorthCarolinaから入手したIKO突然変異のための4匹のキャリアー雌を、C57BL/6バックグラウンド株の雄マウスC57BL/6NTac、Taconic,Hudson,NYと交配させて、異種接合性雌および半接合性雄ノックアウトマウス、ならびに野生型雄および雌同腹仔を産生した。子孫はすべて、組織でなのPCR解析による遺伝子型であった。この実験に用いたマウスはすべて、8~12週齢の半接合性IKO-/0または野生型WT同腹仔/0マウスとして同定された雄であった。イズルスルファーゼ:24mLのI2S組換えヒトイズルスルファーゼを、2Lのリン酸塩緩衝化生理食塩水PBSを4回取り替えながら透析した。I2Sを次に、Vivaspinカラムにより濃縮して、最終容積1mLのPBS中に再懸濁した後、0.2μmフィルターを用いてフィルター滅菌した。採集濃度は51mg/mLであった。髄腔内-腰椎注射:腹腔内注射により、200~300μL/体重10g250~350mg/kgで1.252,2,2-トリブロモエタノールアベルチンを用いて、成体マウスを麻酔した。尾の基部と肩甲骨との間で背側毛を除去し、剃毛区域をポビドン/ベタジンスクラブで、その後、イソプロピルアルコールで拭き取った。小さい正中線皮膚切開1~2cmを腰椎仙椎上に作って、背側正中線と腸骨の翼片方の腸骨の頭蓋側の交差を確認した。腸骨窩中の筋肉中臀筋肉はハート型筋肉で、ハートの上部の2つの側面は、腸骨の翼の位置に近い。気密性10~20μLガラス製はミルトン注射器に取り付けた32ゲージ針を、下にある骨からの抵抗が感じられるまで挿入した。2μL/20秒10μL/2分のおよその速度で被験物質10μLの注射を実施した。適宜、創傷クリップを用いて皮膚切開を閉じて、回復室で動物を回復させた後、適切なケージに戻した。組織学手順:最終注射の1時間後に、動物を屠殺した。脳および肝臓組織を採取し、10中性緩衝化ホルマリン中で固定し、次に、加工処理して、パラフィン中に包埋した。ヘマトキシリン/エオシンHE染色および免疫組織化学IHC染色のために、5μm切片を調製した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色:脳および肝臓切片を、HEで染色した。染色結果は、核を紫色に、そして細胞室を桃色~赤色として示した。HE染色スライドを、組織病理学的形態評価のために用いた。免疫組織化学:I2S生体分布評価のために、脱パラフィン化および再水和化脳および肝臓切片を、組換えヒトI2Sに対するマウスモノクローナル抗体2C4-2B2MaineBiotechnologyServices,Portland,MEとともに一晩インキュベートして、注射I2Sまたは、陰性対照抗体としての無関係マウスIgG;VectorLaboratories,Burlingame,CAを検出した。2~8°Cで一晩インキュベーション後、ホースラディッシュペルオキシダーゼと共役された二次ヤギ抗マウスIgGを付加した。さらに、37°Cで30分間インキュベーション後、Tyramide-AlexaFluor488標識溶液InvitrogenCorp.,Carlsbad,CAを、さらに10分間付加した。1.5μg/mlの4’-6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPIを核対比染色として含有する褪色防止封入液VectaShield;VectorLaboratoriesを用いて、切片を封入して、多チャンネルニコン蛍光顕微鏡で観察した。染色結果は、I2S細胞を緑色で、核を青色で、そしてバックグラウンド区域を黒色として示した。効力分析のために、脳および肝臓切片を、一次抗体としてのラット抗LAMP1リソソームマーカーとしてのリソソーム付随膜タンパク質IgGSantaCruzBiotechnology,SantaCruz,Californiaで染色した。無関係抗体としてのラットIgGを、陰性対照として用いた。ABCVectorLabs,Burlingame,Californiaからのアビジンビオチン複合体キット法を用いて、標的化マーカーを増幅した。要するに、脱パラフィン化切片を再水和し、一次抗体とともにインキュベートした。2~8°Cで一晩インキュベーション後、二次ビオチニル化ウサギ抗ラットIgGVectorLabs,Burlingame,Californiaを付加し、37°Cで30分間インキュベートして、次に、試料を洗浄し、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体VectorLaboratoriesで30分間処理した。発色のために、3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩DABを色原体として用いた。次いで、切片をヘマトキシリンで対比染色して、カバーガラスで覆った。染色結果は、LAMP-1陽性細胞を褐色で、核を青色として示した。代表的写真を撮影して、LAMP-1陽性細胞の区域をImage-ProPlusソフトウェアMediaCybernetics,Inc.,Bethesda,MDで解析し、スチューデントt検定を用いて比較統計学分析を実施した。電子顕微鏡法:3用量のI2S処置動物からの脳組織を、4°Cで一晩、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH7.4中の2.5PFA/2.5グルタルアルデヒドで固定した。次に、試料をカコジル酸塩緩衝液0.1M、pH7.4中で洗浄し、四酸化オスミウム中で後固定して、アルコールおよびプロピレンオキシド中で脱水し、エポン樹脂中に包埋した。超薄切片を100nmで切断し、クエン酸鉛で染色して、Tecnai商標G2SpiritBioTWIN透過型電子顕微鏡で検査した。結果免疫組織化学IHCにより測定した場合の脳では、I2Sはビヒクル対照動物において見出されなかった。これに対比して、髄膜細胞、大脳および小脳のニューロンは、I2S注射動物においてI2Sに対して陽性に染色された。染色シグナルは、3用量を投与された動物においてより強かった図53。ビヒクル処置IKOマウスの脳組織では、細胞空胞形成リソソーム蓄積症の組織病理学的特徴が、野生型動物と比較して、脳全体に見出された。I2S処置IKOマウスでは、非処置マウスと比較して、表面大脳皮質、尾状核、視床、小脳から白質までの細胞空胞形成の広範な低減が認められた図54。異常に高いリソソーム活性は、野生型動物と比較した場合、ビヒクル処置IKOマウスのミクログリア、髄膜および血管周囲細胞において、リソソーム付随膜タンパク質-1LAMP-1染色リソソーム活性および疾患状態の指標により見出された図55。I2S髄腔内処置マウスは、LAMP-1免疫染色における顕著な低減を有した。この低減は、LAMP-1陽性細胞の数の減少および薄い染色により特性化された。低減は、2および3用量のI2S処置動物の両方において、表面大脳皮質、尾状核、視床、小脳から白質までの全脳全体に見出された図56。種々の脳領域のLAMP-1免疫染色の外形計測分析は、評価した脳の全区域においてLAMP-1陽性染色の有意の低減が認められる、ということを確証した図56。ビヒクル処置IKOマウスにおける脳細胞の電子顕微鏡検査は、非晶質顆粒貯蔵物質を含有する拡張空胞ならびに層板およびゼブラ体様構造を有する封入体を明示した。微細構造レベルでのリソソーム貯蔵のこれらの典型的病理学的特徴は、I2S髄腔内-腰椎注射マウスにおいて低減された図57。肝臓では、ビヒクル処置マウスにおけるI2Sの陽性染色は認められなかった。I2S髄腔内注射マウスでは、多量の注射I2Sが洞様細胞中に明白に見出され図58、これは、髄腔内腔隙内の注射I2SがCSFと一緒に循環し、次に、循環系中にクモ膜顆粒を通して吸収されたことを示した。ビヒクル処置IKOマウスの肝臓組織では、HE染色および強LAMP-1免疫染色により実証される重症細胞空胞形成および異常に高いリソソーム活性が、WTマウスと比較して、見出された。肝臓における細胞空胞形成およびLAMP-1免疫染色の顕著な低減は、I2Sによる髄腔内処置後に見出された。HE染色は、ほぼ完全に消失した細胞質内空胞形成を明示し、ほぼ正常な肝臓細胞構造が認められた図59。IKOマウスにおいて、組換えヒトI2Sは、髄腔内-腰椎経路により脳に送達され、注射I2Sは、脳の種々の領域において広範な組織病理学的改善を生じる。注射I2Sは、脳において髄膜細胞およびニューロンで検出された。光学および電子顕微鏡レベルの両方での脳全体の細胞空胞形成低減。脳全体のLAMP-1リソソームマーカー低減。髄腔内注射I2Sは末梢循環に進入し、肝臓形態および組織学的マーカーを改善した。実施例7:I2SのIT送達の毒物学この実施例は、カニクイザルにおける毎月ボーラス髄腔内腰椎用量投与によるイズルスルファーゼに関連した臨床徴候を例証する。これを達成するために、以下の表21に示すように、14匹の雄カニクイザルを5つの処置群に無作為に割り当てた。全群の動物に、腰椎のレベルでのITで、毎月3回の間隔で用量投与した。1mlの用量投与容積を、0.3mlのPBSでカテーテル系からフラッシュした。各用量投与の1~2日前に、約2mlのCSFを、大槽のレベルでIT脊髄タップから採取した。血液試料2mlも、この時点で採取した。血液2mlおよびCSF0.1mlを、群5動物から、用量投与前、初回用量投与後0.5、1、2、4、8、24および48時間後に採取した。毎日少なくとも2回、臨床徴候を記録した。3回目の用量投与の約24時間後に剖検を実施して、選択組織を収穫し、保存した。1日目に、3匹の群4150mg動物すべてが、用量投与後3~12分以内に最小度に後半身を気にするしぐさを示し、5~15分間持続した;この徴候は、被験物質に関連すると思われる。体重、摂食量、ならびに神経学的/身体的検査パラメーターに、被検物に関連するとみなされる変化は認められなかった。血清およびCSF試料の分析、ならびに用量投与溶液分析物を提示する。内因性イズルスルファーゼ活性における変動は、カニクイザルからの種々の組織において観察された;脳および脊髄は、検査した他の末梢器官、例えば肝臓、心臓および腎臓より大きい内因性活性を有した。イズルスルファーゼ投与は、種々の脳領域において、ならびに脳幹および脊髄において、イズルスルファーゼ活性の用量依存的増大に関連した。IT送達は、左右の大脳半球の間の分布の観察可能な差を生じなかった。以下の器官において、イズルスルファーゼ活性の明白な用量依存的増大が認められた:脳、肝臓、心臓および腎臓。脳におけるイズルスルファーゼに関する免疫染色は、染色強度の用量依存的増大を実証した。3mg群では、髄膜下の髄膜細胞および限定グリア細胞染色が観察された:ニューロン染色は、3mg処置群からの動物においては明らかでなかった。イズルスルファーゼ染色は、脊髄において陽性で且つ用量依存的であって、最高染色強度は腰部領域で認められたが、ここは、イズルスルファーゼのIT投与が行なわれた場所である。肝臓、腎臓および心臓におけるイズルスルファーゼ染色強度は、用量依存的で、これらの器官におけるイズルスルファーゼ活性増大と一致した。要するに、月1回の間隔で送達される150mgまでの用量でのイズルスルファーゼのIT投与は、副作用を生じなかった。したがって、非観察副作用レベルNOAELは、この試験で用いた最高用量である150mgであると解釈された。イズルスルファーゼ投与は、CNSにおけるイズルスルファーゼ活性の用量依存的増大と関連し、肝臓、腎臓および心臓における全身レベルを生じた。被験物質であるイズルスルファーゼは、154mMNaCl、0.005ポリソルベート20、pH5.3~6.1中の用量投与溶液として供給された。供給用両党よ溶液の公称濃度は、0、3、30または150mg/mlであった。被験物質は、-82°~-79°Cで冷凍庫に保存した。リン酸塩緩衝化生理食塩水PBS、pH7.2を、用量投与後の、そして連続CSF採取後のフラッシュ剤として用いた。PBSは、Gibco、InvitrogenCorporationから入手した。被験物質用量投与調製物各時間間隔の用量投与の初日に、各濃度について1つのバイアルを-80°C箱型冷凍庫から取り出して、台上で室温に解凍させた。一旦解凍したら、群1、2および3に関するバイアルにラベルを貼って、計量し、用量投与を予定された各動物に関して0.22μmフィルターを通して引き出した。用量のすべてを投与した後、バイアルを再計量し、冷蔵庫に入れた。翌日動物003、群4および群5に関する用量投与当日、群1および4のための用量投与溶液を冷蔵庫から取り出して、台上に載せて、室温にした。一旦室温になったら、群1および4に関するバイアルを計量し、群4バイアルにラベルを貼って、群1および4において用量投与が予定されている各動物に関してフィルターを通して1mlを引き出した。次に、適量の群4用量投与溶液および群1ビヒクルを滅菌ポリプロピレンバイアル中に注入することにより、群5に関する用量投与溶液を調製した。群1および4から付加された量を、記録した。バイアルを静かに逆さにすることにより溶液を混合し、群5の動物のために2~1ml用量をフィルターを通して引き出した。用量投与完了時に群1および4に関するバイアルを再計量し、バイアルすべて群1~5を冷凍庫に入れた。14匹の動物を、表21に記載したように、処置群に無作為に割り当てた。ヒト投与のために意図された経路であるため、IT投与経路を選択した。この試験のために選定されたイズルスルファーゼの用量3、30、100および150mg/mlを選択して、3連続毎月ボーラスIT腰椎注射後に非ヒト霊長類中枢神経系CNS内の酵素の種々の用量レベルの生体分布を評価した。臨床観察臨床徴候の全体的出現率は、最小度であった。群1対照、群23mg、群330mgまたは群5100mgは、試験中の任意の時間で被験物質に関連があるとみなされる臨床徴候を有した。1日目に、3匹の群4150mg動物012~014すべてが、用量投与後3~12分以内に最小度に後半身を気にするしぐさを示し、5~15分間持続した。この徴候は被験物質に関連すると思われたが、低用量群のいずれにおいても観察されなかった。初回用量投与直後、または被験物質投与直後の当日に、他の臨床徴候は認められなかった。群4動物に関して観察された唯一の他の徴候は、35日目の動物013に関する嘔吐の単一エピソードであった。1か月に1回の髄腔内ボーラス投与としての被験物質の投与は、移植薬剤送達装置に固有の変化を考慮に入れた場合、任意の肉眼的または顕微鏡的悪変化と関連しなかった。対照群を含めた全群が、薬剤送達系に対する炎症反応を示す髄膜中の顕微鏡的変化を有した。30mg以上の被験物質用量を摂取した動物では、より顕著な好酸性構成成分を有する髄膜における炎症反応傾向を示したが、しかしこの差は、生物学的に有意であるとみなされなかった。対照と被験物質処置動物との間の差は非常にわずかであったため、非観察副作用レベルNOAELは、この試験で用いた最高用量である150mgであると解釈された。全群対照を含むにおける髄膜の全体的炎症反応は、サルにおいてこの期間中の髄腔内投与試験で一般的に遭遇するものよりわずかに顕著であった。しかしながら、これは、おそらくは、ビヒクルの何らかの特性と、または剖検の24時間前の用量投与の実行と関連があるとみなされた。脳イズルスルファーゼ染色は、3mg群の1匹を除いて、全処置群で陽性であり、最高染色強度は150mg群で見出された図60、61、62および63。3mg群では、髄膜下の髄膜細胞と少数のグリア細胞のみが陽性であった;注射イズルスルファーゼはニューロン中には検出されなかった。高用量群30、100および150mgでは、大脳ニューロンの大集団が、髄膜細胞、グリア細胞および血管周囲細胞とともに、イズルスルファーゼ染色に関して強陽性であった。イズルスルファーゼ免疫染色は、髄膜近くの表面の層I内のニューロンから、白質に隣接するより深部の層VI内のニューロンまで、大脳ニューロン中の注射イズルスルファーゼの広範な分布を明示した図64、65および66。ニューロンの顕著な染色は、150mg用量群に関しても観察された図67。全動物30~150mgの用量群において、脳の前部、中央および後部区分間に、ニューロンイズルスルファーゼ染色の顕著な差は見出されなかった。イズルスルファーゼ染色は全動物の脊髄において陽性で、最高染色強度は腰部領域であった図68および69。イズルスルファーゼ免疫染色も、用量依存的であった。ニューロン、髄膜細胞、グリア細胞、血管周囲細胞、ならびに神経繊維を取り囲む神経上膜/神経周囲膜/神経内膜結合細胞は、150mg群においてイズルスルファーゼ染色に関して強陽性であった図70および71。肝臓では、イズルスルファーゼに関する陽性染色は、動物の洞様細胞クッパー細胞および内皮細胞において見出された。しかしながら、イズルスルファーゼは、3mg処置群に関する肝細胞中では検出されなかった図72が、一方、肝細胞における陽性イズルスルファーゼ染色は、高用量群で見出され、150mg処置群ではより高い染色強度を示した図73、74および75。3mg処置群からの動物において、イズルスルファーゼに関する陽性染色は認められなかった図76。これに対比して、30、100および150mg群においては、間質細胞はイズルスルファーゼに関して陽性に染色され、顕著な染色は150mg群で観察された陽性細胞数および染色強度図77、78および79。腎臓3mg用量群からの動物においては、注射イズルスルファーゼはほとんどまたは全く検出されなかった図80。しかしながら、陽性イズルスルファーゼ染色は、30および100mg群の糸球体細胞および間質細胞で見出された図81および82。150mg群では、イズルスルファーゼ免疫染色はさらに、近位尿細管細胞のイズルスルファーゼ染色を、糸球体および間質細胞の顕著な染色とともに明示した図83。考察体重、摂食量、身体検査知見および神経学的検査知見に及ぼす被験物質関連の臨床徴候または作用は認められなかった。1日目に、群4150mg動物は、用量投与後3~12分以内に最小度に後半身を気にするしぐさを示し、5~15分間持続した;この徴候は、被験物質に関連すると判断された。イズルスルファーゼ投与は、種々の脳領域、ならびに脳幹および脊髄におけるイズルスルファーゼ活性の用量依存的増大と関連した。脊髄における最高レベルの染色強度は、腰部領域であったが、ここは、イズルスルファーゼのIT投与が行なわれた場所である。イズルスルファーゼのIT投与は全身曝露も生じ、肝臓、腎臓および心臓において用量依存的染色強度が認められた。30mg以上の用量で被験物質を摂取した動物は、髄膜における炎症傾向を示し、より顕著な好酸性構成成分を有した。月1回の間隔で送達される150mgまでの用量でのイズルスルファーゼのIT投与は、副作用を生じなかった。したがって、非観察副作用レベルNOAELは、この実施例で用いた最高用量である150mgであると解釈された。イズルスルファーゼ投与は、CNSにおけるイズルスルファーゼ活性の用量依存的増大と関連し、肝臓、腎臓および心臓における全身レベルを生じた。実施例8:IT送達したI2SのPK血清およびCSF本実施例は、カニクイザルにおける月1回のボーラス髄腔内腰椎注射および週1回のボーラス静脈内注射により投与したイデュルスルファーゼの6か月間の毒性試験に関連した、被検試料TA濃度に関する血清および脳脊髄液CSF解析を提供する。実験計画tの目的は、6か月の期間にわたり、イデュルスルファーゼI2sの髄腔内IT反復投与を毒性学および安全性薬理学の観点から評価することであった。試験計画を表22に示す。被検試料アイデンティティ:イデュルスルファーゼIV投与-ロット番号FDC06-0012.0mg/mLIT投与-イデュルスルファーゼ0mg/mLイデュルスルファーゼ3mg/mLイデュルスルファーゼ30mg/mlイデュルスルファーゼ100mg/mlアッセイ方法:イデュルスルファーゼ濃度を決定するために、ELISA酵素結合免疫吸着測定を用いて解析を行った。希釈係数を乗じる前の検出限界LODは1.25ng/mLであった。試料を1:50の希釈でスクリーニングしたため、アッセイ感度は62.5ng/mLである。検量曲線の上限を超えた試料をさらに希釈し、曲線の範囲内の値が得られるような適当な希釈で再試験した。選択された試料を、酵素活性アッセイを用いてさらに解析した。このアッセイのLODは、最小の試料希釈1:150で0.18mU/mLである。それぞれ生理食塩水または溶媒を投与した群1および2のすべての個体において、IV投与およびIT投与の期間を通して、血清イデュルスルファーゼレベルは138ng/mLから62.5ng/mL未満すなわちLOD未満の範囲であった。群1および2の個体の200個の被検CSF試料のうち、62個がアッセイLODを上回るI2Sレベルを示した。そのうち7個の値が高かった>1,000ng/mL。IT投与3の前に採取した1つの他のCSF試料は、I2Sが1,000ng/mLを上回るという試験結果であった。次いで、試料のイデュルスルファーゼ活性を試験した。各場合において、活性の結果はI2Sの存在を示し、活性レベルに基づきI2Sのおよその濃度を計算したところ、その結果は、抗原ELISAにより得られた結果から20以内にあった表23を参照。非特異的活性を除外するために、抗原ELISAの結果がLOD未満の無作為に選択した追加のCSF試料も酵素活性アッセイを用いて試験した。この試験では、血清およびCSF試料のイデュルスルファーゼ濃度を解析した。血清試料を以下のような計画に従って採取した:IV投与:投与1~10の投与前および投与の2時間後、投与11~23の投与前および投与の4時間後、ならびに剖検時。IT投与:投与1および2の投与前および投与の2時間後、投与3~6の投与前および投与の4時間後、ならびに剖検時。CSF試料を以下のような計画に従って採取した:IV投与:投与1の投与前および投与の2時間後、ならびに投与3および6の4時間後。IT投与:投与1および2の投与前および投与の2時間後、投与3~6の投与前および投与の4時間後、ならびに剖検時。一般的に、血清イデュルスルファーゼの方がCSFイデュルスルファーゼよりも早く除去されるようであった。それぞれ生理食塩水または溶媒を投与した群1および2の個体の血清イデュルスルファーゼレベルは、試験した全時点で138ng/mL以下であった。アッセイの検出限界LODを下回るレベルの個体もいた。高レベル>1,000ng/mLの結果が得られた7つの明らかな例外を除けば、アッセイのLODを上回る群1および2のCSF試料は比較的少なかった。IT投与3の前に1個体から採取した1つのCSF試料でも、イデュルスルファーゼが1,000ng/mLを上回る試験結果が得られた。上記の傾向から外れた結果が得られた試料を再試験し、確認した。さらに、これらの試料のイデュルスルファーゼ酵素活性を試験した。これらの活性の結果でも、イデュルスルファーゼの質量アッセイにより得られた結果から20以内にある高いイデュルスルファーゼレベルが確認された表23。イデュルスルファーゼの質量単位がLODに満たないCSF試料を無作為に試験することにより、この試料コホートにおける活性アッセイの特異性の妥当性を調べ、これらの試料中のイデュルスルファーゼレベルが確かにLOD未満であることが確認されたデータ不掲載。実施例9.IT送達したI2Sの生体内分布髄腔内投与がI2SをCNSの組織に送達する有効な方法であることが良好に示されたため、脳の深部組織内に分布することが可能であるか否か、またIT投与したI2Sの細胞局在が見られるか否かを判定するために、さらなる試験を行った。組換えヒトイズロン酸-2-スルファターゼI2S製剤を、pH6.0の154mMNaCl、0.005ポリソルベート20の溶媒で調製し製剤化した。3mg、30mgまたは100mgのI2Sを月1回、埋入した髄腔内ポートから6か月間連続で非ヒト霊長類に投与した。この試験の計画を下の表24にまとめる。I2Sの月1回、6か月間の非ヒト霊長類への反復投与は、試験した最高用量において高い忍容性が認められ、また重大な毒性学上の有害事象を全く伴わなかった。最後の6回目のI2S投与の24時間後に、非ヒト霊長類対象を屠殺し、この非ヒト霊長類のCNS組織を調べた。免疫組織化学IHCにより、CNSの細胞および組織全体にわたって、I2Sの広範囲な細胞内沈着があると判定された。脳の全組織でI2Sタンパク質がIHCにより検出され、大脳皮質から脳室白質にかけて沈着の勾配が見られた。灰白質においては、全群の大脳、小脳、脳幹および脊髄のニューロンでI2Sが用量依存的に検出された。高用量群の表面灰白質では、表面皮質において多数の大脳ニューロンがI2S染色で陽性であった図84A。またI2Sは、視床図84B、海馬図84C、尾状核図84Dおよび脊髄図84Eのニューロンでも検出された。髄膜細胞および血管周囲細胞もI2S染色で陽性であった図84F。図85および図86で図示されるように、非ヒト霊長類対象において、IT投与したI2SのCNS組織内への分布、特に灰白質、視床および大脳皮質における沈着が明らかである。さらに、図86および図87は、IT投与したI2Sが、非ヒト霊長類対象の図示したCNS組織内に用量依存的に蓄積することを示している。また共局在染色により、I2SのIT投与がニューロンおよびオリゴデンドロサイトの両方に関連することも明らかとなった。また図88により示されるように、IT投与したI2Sは、非ヒト霊長類対象の大脳全体にわたり分布し局在する。特に図89A~89Dは、線維染色により示されるように、非ヒト霊長類へのIT投与後のI2Sのニューロンによる取込みおよび軸索との関連を示している。また特に興味深いことに、本試験は、I2Sが神経細胞に対して選択的であり、このような神経細胞が髄腔内投与したI2Sの脳深部組織内への分布を促進し、またI2Sが軸索の構造に関連するらしいことを示しており、このことはI2Sの順行性の軸索輸送を示唆している。独立した動物試験での各種投与経路および用量の薬物動態データを下の表25に示す。下の表26に示すように、124I標識したI2Sを試験動物に投与した。またPETスキャンの結果を図106に示す。また本試験により、IT投与後の非ヒト霊長類対象の脳室付近の白質脳組織におけるIT投与I2Sの細胞内同定も示された。白質のI2S染色密度は全般的に灰白質よりも低く、I2Sはオリゴデンドロサイト内で検出された図90。具体的には、図90は、白質脳組織におけるI2Sの細胞内同定を示し、さらに、I2Sがミエリンと関連しないらしいことを示している。IT投与したI2Sが脳組織の深部に分布していることが示されたことに加え、本試験では、I2Sの標的細胞小器官内への局在、および重要なことに、ハンター症候群のようなリソソーム蓄積症において冒される細胞小器官であるリソソーム内へのI2Sの局在も確認された。具体的には、I2Sはリソソーム内に見られ、また軸索内でも検出された。図90は、IT投与したI2Sが、非ヒト霊長類対象のオリゴデンドロサイトのリソソーム内に局在することを示しており、これにより、IT投与したI2Sが脳の深部組織内に分布することが可能であり、かつ細胞内に局在化することが可能であることが確認される。送達されたI2Sが生物活性を保持しているか否かを判別するために、比活性アッセイを用いて脳内のI2Sレベルを測定した。最終投与の24時間後の3mgIT群の脳内での活性は、装置対照および溶媒対照の個体の基底レベルと外観的には異ならなかった。30mgIT投与および100mgIT投与個体の脳内での酵素活性は、剖検時投与の24時間後にベースラインを上回っていた。脳へのI2S送達の位置を判別するためのさらなる動物試験を図104および下の表27に示す。実施例10.ビーグル犬におけるIT送達の生体内分布上記の例で観察されたI2Sの分布パターンが、単回のITまたはICV投与を行った健常なビーグル犬でも再現された。コンピュータで出した数字を用いて、雄ビーグル犬を2群に無作為化した群1ICV、N=3;群2IT;N=4。全個体の腰椎クモ膜下腔または左側脳室投与用、および大槽試料採取用にカテーテルを埋入した。カテーテルはすべて、皮下チタン製接触ポートを終端とした。未投与の手術対照として追加のイヌを用いた。単回ボーラスで1mlのI2S注射20mMリン酸ナトリウム、pH6.0;137mM塩化ナトリウム;0.02ポリソルベート-20中、30mg/mlをITまたはICVで行い、次いで、リン酸緩衝生理食塩水PBS;pH7.2による0.3mlの洗い流しを行った。臨床兆候をモニターし、投与の24時間後に屠殺した。脳および脊髄の組織試料を採取し、ELISA、I2S酵素活性およびIHCにより測定されるI2S定量分析を行い、試験群間で比較した。IHCによる測定では、I2SがITおよびICVの両群の灰白質全体にわたり広範囲に分布していた。大脳皮質では、図91画像aおよびcに示されるように、ITおよびICVの両群において、表面の分子層から深部の内層までの6つの全ニューロン層でニューロンがI2S陽性であった。IT群およびICV群の小脳皮質では、図91画像cおよびdに示されるように、プルキンエ細胞を含むニューロンでI2Sが検出された。ITおよびICVの両群において、図91画像eおよびfに示されるように、海馬の多数のニューロンがI2S陽性であった。また図91画像gおよびhに示されるように、両群の視床および尾状核でもI2S陽性ニューロンが見られた。したがって、本試験は、IT投与した酵素が脳深部の細胞および組織内に分布する能力を確認するものであり、また、IT投与したI2Sのような酵素が、ハンター症候群のようなリソソーム蓄積症に関連したCNS発症の治療に有用であることを支持するものである。実施例11.IT送達したI2Sのinvivoでの有効性イズロン酸-2-スルファターゼ欠損マウスモデルIT投与したI2Sが脳の深部組織内に分布しI2Sの細胞内に局在する能力が示されたため、IT投与したI2Sの治療効果を判定するためにさらなる試験を行った。IT投与したI2Sが疾患進行を変化させる能力を試験するために、遺伝子操作されたイズロン酸-2-スルファターゼノックアウトIKOマウスのハンター症候群モデルを開発した。I2S遺伝子座の標的破壊を用いて組織および器官でのグリコサミノグリカンGAG蓄積を生じさせることにより、I2Sノックアウトマウスモデルを開発した。IKOマウスモデルは、特徴的な顔面粗造化および骨格異常を含めた、ヒトで見られるハンター症候群の身体的特性を多数示す。さらにIKOマウスモデルは、尿中および体全体の組織におけるグリコサミノグリカンGAGレベルの上昇、ならびに組織病理学的に観察された広範な細胞空胞化を示す。本試験では、市販のI2SElaprase登録商標を濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水PBSで再懸濁させた。6群の8~12週齢の雄IKOマウスをI2S10μL;26mg/mlで処置した。群Aおよび群BN=3にはそれぞれ、I2Sを260μgの用量で3回1日目、8日目および15日目および260μgの用量で2回1日目および8日目髄腔内に投与した。群Dにも、1日目、8日目および15日目の3回、260μgの用量で髄腔内投与による処置を行った。群CおよびEN=3は未処置の対照群、群FN=3は未処置の野生型対照であった。対照マウスにはI2Sを含まない溶媒を投与した。最後の注射の1時間後にマウスを屠殺し、次いで、免疫組織化学IHCおよび組織病理学的解析用に組織標本を作成した。3回目の注射後、I2S処置マウスの表面大脳皮質、尾状核、視床および小脳において、溶媒処置マウスに比べて広範な細胞空胞化の減少が見られた。また細胞空胞化の減少は、IT処置後の白質でも見られた。IT投与後のIKOマウスの脳組織へのI2Sの分布は明らかであった。IKOマウスにおけるI2Sの3回の週1回IT投与でも、CNS細胞空胞化の顕著な減少が光学顕微鏡レベルおよび電子顕微鏡レベルの両方で示された。I2SのIT投与後、細胞空胞化の減少は未処置IKOマウスに比べて明らかであったが、このことは、IT投与したI2Sが疾患進行を変化させることが可能であることを示している。図92に示されるように、細胞空胞化の減少は、I2SのIT投与後のIKOマウスの脳梁および脳弓において明らかであった。さらに、電子顕微鏡法により、灰白質ニューロン中の蓄積封入体および白質オリゴデンドロサイトの空胞化の存在の減少が示された。具体的には、IKOマウスにおけるI2SのIT投与では、特定のリソソーム蓄積症に特徴的な柵状のラメラ体ゼブラ小体の減少も示された。具体的には、図57は、電子顕微鏡検査を表し、I2Sを投与したIKOマウスのニューロンにおいて、特徴的なゼブラ小体が未処置IKOマウスに比べて減少したことを示している。同様に図57は、脳梁オリゴデンドロサイトの電子顕微鏡検査を示している。さらにIKOマウスへのI2SのIT投与では、表面大脳皮質、尾状核、視床、小脳および白質において、リソソームの活性および病的状態の指標である、リソソーム病の病理学的バイオマーカーのリソソーム膜タンパク質1LAMP1による免疫染色の顕著な減少も示された。図93Aに示されるように、処置IKOマウスの表面大脳皮質組織におけるLAMP1免疫染色の顕著な減少は、図93Bに示される未処置IKO対照マウスに比べて明らかであり、このことは疾患病態の改善を示している。図56は、脳組織の面積μm2で測定されたLAMP1の濃度を定量的に図示し、比較したものである。様々な脳領域におけるLAMP-1免疫染色の形態計測学的解析では、評価した脳の全領域でLAMP-1陽性染色の有意な減少が見られることが確認された。図56に示されるように、評価した脳組織の各領域皮質、尾状核および被殻CP、視床TH、小脳CBL、ならびに白質WMにおいて、処置IKOマウスのLAMP陽性領域が未処置IKO対照マウスに比べて減少しており、野性型マウスのLAMP陽性領域に近かった。特に、解析した脳組織の各領域のLAMP陽性領域が、治療期間の継続によりさらに減少したのは注目すべきことである。異常に高いリソソーム活性の減少は、脳の全領域の劇的な形態学的改善と相関していた。これらの結果により、IT投与したI2Sが、遺伝子操作されたIKOマウスモデルにおいてリソソーム蓄積症の進行を変化させることが可能であるということが確認され、さらに、IT投与したI2Sのような酵素がハンター症候群のようなリソソーム蓄積症に関連したCNS発症を治療する能力が確認される。実施例12.ハンター病患者の治療例えばIT送達による、CNSへの直接投与を用いて、ハンター病患者を効果的に治療することができる。本実施例は、遅発乳児型ハンター病の患者に対して、隔週EOW、全40週で、髄腔内薬物送達装置IDDDにより投与する、3用量レベルまでのI2Sの安全性を評価するために計画された多施設用量漸増試験を示すものである。ヒト治療に適した髄腔内薬物送達装置の様々な例を図89~図92に図示する。最大20患者まで登録:コホート1:5患者最低用量コホート2:5患者中間用量コホート3:5患者最高用量無作為に5患者を無治療とする。以下の基準を含むか否かに基づき、試験する患者を選択する:1生後30か月までに最初の症状が現れた;2スクリーニング時に歩行可能である自力で立ち上がり、片手を持たれた状態で10歩前へ歩く能力と定義される;3スクリーニング時に神経学的兆候が見られる。通常、造血幹細胞移植の経歴がある患者は除外される。遅発乳児型ハンター病の小児において、40週間、用量を漸増してIT注射により投与するI2Sの安全性を判定する。さらに、粗大運動機能に対するI2Sの臨床活性、ならびに単回および反復投与の血清中薬物動態および脳脊髄液CSF中濃度を評価する。rhASAタンパク質のIT送達実施例13:IT送達した組換えASAの毒性試験他の髄腔内投与した組換え酵素がCNSの細胞および組織内に分布する能力を評価するために、幼若の12か月齢未満カニクイザルにおいて1か月の期間にわたりGLP試験を行って、組換えにより調製したヒトアリールスルファターゼArhASAの反復髄腔内IT投与を毒性学および安全性薬理学の観点から評価した。pH6.0の154mMNaCl、0.005ポリソルベート20の溶媒で、rhASAの製剤を調製し製剤化した。これを行うために、9匹の雄および9匹の雌の幼若体カニクイザルを、下の表28に示すように、体重により3つの処置群の1つに無作為に割り当てた。個体投与1の1雄個体を除くに0、3または31mg/mlのrhASAを隔週、0.6mL0、1.8または18.6mgの総用量の短時間のIT注入で、1個体当たり計3用量になるように投与した。体重、臨床観察、神経学的および生理学的検査、臨床病理、眼科検査、ならびに毒物動態試料採取をモニターした。29、30または31日目最後のIT投与の約24時間後に全個体の剖検を行った。選択した組織を採取し、顕微鏡により検査した。カニクイザルのCNS組織で検出されたrhASAの濃度をELISAにより解析し、約2.5ng/組織mgに相当する正常ヒトrhASA濃度の10の治療標的と比較した。カニクイザルの脳の異なる領域から組織試料またはパンチ試料を摘出し、rhASAの存在に関してさらに解析した。図133~図138は、パンチ試料を摘出した組織を示している。パンチした組織試料は、図139A~139Gに示されるように、大脳皮質から深部白質および深部灰白質にかけての沈着の勾配を伴うrhASA濃度の増加を示した。18.6mg用量のrhASAを投与した6匹のサルのITおよびICVの両投与経路の同じパンチ試料を用いて検出されたrhASAの濃度を、図140A~140Bに示す。rhASAを髄腔内ITまたは脳室内ICVに投与した成体および幼若体カニクイザルの深部白質図140Aおよび深部灰白質図140B脳組織で検出されたrhASAの濃度は同等であった。次いで、成体および幼若体カニクイザルの脳から摘出したパンチ組織試料を解析して、摘出組織試料中に蓄積したrhASAの濃度を決定し、この濃度を、タンパク質1mg当たり2.5ngのrhASAの治療標的濃度健常対象における正常rhASA濃度の10に相当すると比較した。図141Aに示されるように、解析した各組織試料パンチにおいて、18.6mg用量のrhASAをIT投与することにより、2.5ng/タンパク質mgの標的治療濃度を上回るrhASA濃度を生じた。同様に、1.8mg用量のrhASAを幼若カニクイザルにIT投与した場合、解析した各組織試料パンチは、2.5ng/タンパク質mgの治療濃度内または治療濃度を上回るrhASAの濃度を示し、rhASA濃度の中央値は、試験した全組織パンチ試料で治療標的を上回っていた図141B。IT投与したrhASAが適切な細胞に分布するか否かを判定するために、1.8mgのrhASAをIT投与したカニクイザルの図142Aに示される領域の深部白質の組織を解析した。図142Bに示されるように、深部白質組織の免疫染色により、カニクイザルのオリゴデンドロサイト細胞内のrhASA分布が明らかとなった。同様に、図142Cは、IT投与したrhASAがカニクイザルの深部白質組織での共局在を示したことを表している。具体的には、染色下で、リソソームのような標的細胞小器官における共局在が明らかであり図142C、このことは、IT投与したrhASAが、オリゴデンドロサイトのリソソームを含めた、CNSの適切な細胞、組織および細胞小器官に分布することが可能であるという結論を支持する。実施例14.ICV投与とIT投与陽電子放射体124Iで標識されたrhASAを、pH6.0の154mMNaCl、0.005ポリソルベート20の溶媒で調製および製剤化した。3mgのrhASAに相当する量の製剤約38mg/脳kgに相当するを、脳室内ICVおよび髄腔内ITの投与経路で成体カニクイザルに投与した。カニクイザルの高解像度PETスキャン画像解析microPETP4を行って、投与した124I標識rhASAの分布を判定した。PET画像データ図143は、ICV投与した124I標識rhASAおよびIT投与した124I標識rhASAはともにCNSの組織に効率的に分布し、特にIT腰椎カテーテルにより投与した124I標識rhASAは、脊髄の全長にわたる脳脊髄液CSF中に迅速かつ均一に広がったことを示している。具体的には、図143に示されるように、ICV投与およびIT投与後に、治療濃度の124I標識rhASAが対象カニクイザルの脳、脊髄およびCSFを含めたCNS組織内で検出された。CNS組織内、特に脳組織内で検出されたrhASAの濃度は、2.5ng/タンパク質mgの治療標的濃度を上回った。rhASAタンパク質の分布はITおよびICVの投与経路において同程度であったが、図143から明らかなように、ICVの方が脊柱内での沈着が著しく少なかった。製剤投与の24時間後、ICV投与した124I標識rhASAおよびIT投与した124I標識rhASAはともにCNSの組織に効率的に分布した。具体的には、IT投与の24時間後に、ICV投与の16.7に対し投与量の12.4が頭部領域内にあった。したがって、rhASAをITで投与した場合、このようなCNS組織内、特に脳組織内で検出されたrhASAの濃度は、同じ用量のICV投与後に検出された濃度に近かった。図144に示されるように、124I標識rhASAのICV注射では、注射した量が大槽、橋槽、脚間槽および近位脊柱へ迅速に移動する。また図144で示されるように、IT投与でも、ICV投与で示されたのと同じ最初の区画槽および近位脊柱へ124I標識rhASAが2~5時間以内に送達された。図145に示されるように、ICVおよびITの両投与の24時間後に、124I標識rhASAの分布は、槽および近位脊柱領域において同程度であった。これらの結果により、rhASAを侵襲性の少ないIT投与経路で対象に送達して、標的細胞および組織内での治療濃度を達成し得るということが確認される。リソソーム蓄積症は、酵素の欠損または不全を原因とする異常な基質蓄積を生じる遺伝性疾患ファミリーの代表的なものである。これらの疾患のいくつかと関連する末梢症状は、組換え酵素の静脈内投与により効果的に軽減されるが、このような組換え酵素の静脈内投与は、大部分のリソソーム蓄積症に関連したCNS発症に大きな影響を与えることは期待されない。例えば、ハンター症候群の身体症状の治療用に組換えヒトイズロン酸-2-スルファターゼイデュルスルファーゼ、Elaprase登録商標;ShireHumanGeneticTherapies,Inc.Lexington、MAが認可されているが、発達遅延および進行性の精神障害を含み得るハンター症候群の神経発症の治療のための薬物療法はない。その原因の一つは、I2Sが分子量約76kDの大型で高度にグリコシル化された酵素であり、静脈内投与後に血液脳関門を横断しないという性質にある。したがって、本発明者らは、組換えヒト酵素、例えばイズロン酸-2-スルファターゼI2S、アリールスルファターゼArhASAおよびα-N-アセチルグルコサミニダーゼNagluなどの髄腔内製剤の髄腔内IT送達を調べる計画に取り組んだ。本明細書に提供される結果は、組換えリソソームタンパク質のIT腰椎投与により、投与したタンパク質のかなりの割合が脳に送達される、具体的には、このようなタンパク質がカニクイザルおよびイヌ両者の脳および脊髄のニューロン内に広範に蓄積されることを初めて示すものである。CNS組織の免疫組織化学的解析では、リソソーム蓄積症における病的なグリコサミノグリカン蓄積の部位であるリソソームに対してタンパク質が標的化されることが示された。さらに、ハンター症候群のIKOマウスモデル、サンフィリッポ症候群B型のNaglu-欠損マウスモデルおよび異染性白質ジストロフィーMLDのASAノックアウトマウスモデルで示された形態学的改善は、IT投与した酵素が適切な組織に分布し、適切な細胞区画および細胞小器官へ輸送されるという観察を補強するものである。I2SのIT腰椎投与後およびICV投与後に検出された脳内分布パターンの類似性は、CSFの総体流および活発な再混合を示唆するものである。したがって、臨床状況においてIT投与およびICV投与の両経路が潜在的に実行可能であるが、IT投与後に脊髄内でI2S蓄積が観察されたことは、ハンター症候群のようなリソソーム蓄積症の脊椎での続発症および構成要素に対処する上での明らかな利点を提供する。さらに、脊髄注射ポートは侵襲性が少なく、特に小児対象で長期にわたって使用するのにより適することが予想される。血管周囲細胞染色、および上記のPET画像解析で観察されたタンパク質移行動態による証拠は、酵素が、おそらく拍動による対流機序により血管周囲腔内に移動することを示している。活発な軸索輸送を示すI2Sと神経フィラメントとの関連が観察されたことにより、さらなる輸送機序が示唆される。後者はおそらく、脊髄および脳の細胞で広く発現され、脳実質への直接投与時にI2S酵素が標的細胞に取り込まれやすくするニューロンマンノース-6-リン酸M6P受容体と、タンパク質との相互作用から始まるのであろうBegleyら,CurrPharmDes200814:1566-1580。リソソーム酵素の軸索輸送が、invivoでの間接的な方法およびinvivoでのイメージングにより既に示唆されているが、本試験は、CSFを介して輸送される、ウイルスによらないまたは発現された酵素の軸索輸送の最初の直接的な証拠を提供するものである。したがって、CSFから脳表面および深部脳組織へのタンパク質送達は、活発な移動プロセスに依存すると思わるが、このようなプロセスはいずれもまだ記載されていない、すなわち、脳の細胞、組織および細胞小器官へのタンパク質または酵素の送達を明らかにするものである。実質間質およびCSFの流動力学がIT腰椎投与したタンパク質の脳白質への分布を妨げるという一般的な見解に反して、本試験は、リソソーム酵素のIT送達が、全脳組織内でのタンパク質の分布および蓄積、ならびに病的なグリコサミノグリカン蓄積の部位である標的細胞のリソソーム区画内での沈着を生じさせることを明らかに示している。例えば、Fenstermacherら,AnnNYAcadSci1988531:29-39およびDiChiroら,Neurology197626:1-8を参照されたい。IT腰椎送達が侵襲性の少ない性質であることに加え、この経路は、特に小児において、生物学的治療剤を脳に送達するための臨床上適切な手段を提供する。実施例15.毒性学本実施例は、6か月の期間にわたるrhASAの髄腔内IT投与の反復投与を、毒性学的および安全性薬理学的観点から示すものである。本試験のIT被検試料はrhASAであった。36匹の雄および36匹の雌カニクイザルを無作為に5つの処置群に割り当てた。群1の個体は未処置の埋植物装置対照ポートおよびカテーテルであり、これらの個体には溶媒も被検試料も投与しなかったが、被検試料の投与計画に合わせた計画で0.6mLのPBSを投与した。群2~5の個体には、0、3、10または31mg/mlのrhASAを隔週、0.6mL0、1.8、6.0または18.6mgの総用量のIT注入で投与したすなわち、合計12回の投与。6か月後最後のIT投与の24時間後に個体の剖検を行い、4週間の回復期間の終わりに残りの4個体/性別/群の剖検を行った。選択した組織を採取して保存し、顕微鏡で調べた。全般的に、被検試料に関連する変化は、2つの大きな種類に分類することが可能であり、全用量レベル1.8、6.0および18.6mg/投与で見られた。髄膜、脳実質、脊髄実質、三叉神経節、および場合により脊髄神経根/節またはこれらの構造を取り囲む神経上膜における浸潤通常は好酸性成分が顕著な白血球の増加。この増加は、被検試料タンパク質が髄腔内腔および神経系組織内に存在することによると解釈した。一部の個体の脊髄および脳でミクログリア細胞のわずかな局所的増加小膠細胞症は高用量のいずれの個体でも観察されなかった。形態学的変化は2種類とも、被検試料の存在に対する反応であると解釈した。いずれの個体においても、ニューロン壊死の証拠は見られなかった。被検試料に関連する変化はいずれも、脳、脊髄、脊髄神経根または脊髄神経節におけるいかなる生物学的に有害な反応とも関連しなかった。具体的には、ニューロン壊死または生物学的に重要なグリア反応の証拠が見られなかった。被検試料に関連する非神経系組織の病変は見られなかった。1か月の回復期間無投与期間の後、被検試料に関連する変化は、完全に消散するか、または被検試料の存在に伴って以前に増加した炎症性応答の残存物に限定されていた。回復個体において有害な形態学的影響は見られなかった。半定量的染色スコアを付ける盲目下での顕微鏡検査に基づけば、最終屠殺時に、アリールスルファターゼArhASA;被検試料に対する免疫組織化学染色が、全被検試料処置群でニューロンを除く脳および脊髄の各種細胞型において増加していた。またこの増加は、肝臓のKupffer細胞においても明らかであった。1か月の回復期間の後、被検試料処置個体全用量群におけるrhASA染色が対照装置および/または溶媒対照レベルに戻っていた。低用量群の回復雄の1個体では、大脳皮質において、複数の領域での以前の虚血を示すアストロサイト増加およびニューロン損失の複数の病巣が見られた。この個体でのこれらの病変の正確な病因は明らかでなかったが、10倍の用量を投与した高用量個体を含めた他の被検試料処置個体で同様の病変が見られなかったことは、これらの病変が被検試料に関係するものではなかったことを示している。本試験のIT被検試料はrhASAであった。36匹の雄および36匹の雌カニクイザルを無作為に5つの処置群に割り当てた。群1の個体は未処置の埋植物装置対照ポートおよびカテーテルであり、これらの個体には溶媒も被検試料も投与しなかったが、被検試料の投与計画に合わせた計画で0.6mLのPBSを投与した。群2~5の個体には、0、3、10または31mg/mlのrhASAを隔週、0.6mL0、1.8、6.0または18.6mgの総用量のIT注入で投与したすなわち、合計12回の投与。6か月後最後のIT投与の24時間後に個体の剖検を行い、4週間の回復期間の終わりに残りの4つ個体/性別/群の剖検を行った。選択した組織を採取して保存し、顕微鏡で調べた。下の表は、本試験の病理学的側面に関連する試験計画を示すものである。屠殺時に、脳を脳マトリックスで約3mmの冠状スライス厚に切った。最初のスライスと、そこから1枚おきのスライスを、組織病理学的評価および免疫組織化学的解析用にホルマリン中で固定した。脳を完全な冠状切片として処理した。これらの切片には、少なくとも以下の脳領域が含まれていた。新皮質前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質および後頭皮質を含む:脳切片1~8および存在すればスライス9古皮質嗅球および/または梨状葉:脳切片1~3大脳基底核尾状核および被殻を含む:脳切片3および4辺縁系海馬および帯状回を含む:脳切片4および5視床/視床下部、および黒質を含めた中脳領域:脳切片4および5小脳、脳橋および延髄:脳切片6~8および存在すればスライス9。脳切片を切片1~8/9一部の個体に関して切片9は試験施設により提供されたとしてデータ表に挙げられている。切片作成は個体間で若干異なっていた。上に挙げた脳切片1~8/9は、様々な解剖学的領域のおよその位置であった。脳切片は、後に可能性のあるさらなるスライド再検査それがある場合を容易にするために、その切片と関係のある診断とともに個々の切片としてデータ表に挙げられている。データ解釈の際には、被検試料による固有の影響すなわち、特定の脳領域に固有を同定するために、脳の個々の解剖学的部位上記を比較した。TPSでは、全個体の脳切片をすべてパラフィンに包埋して、5ミクロンに薄切し、ヘマトキシリンおよびエオシンHEで染色して、顕微鏡により調べた。さらに、対照および高用量の個体の脳をフルオロ-JadeB神経変性に関する脳の評価の感度を増強する染色およびBielschowskyの銀染色軸索、樹状突起および神経フィラメントを直接可視化することができる処理で染色して調べた。脊髄頸部、胸部および腰部を1センチメートルの切片に切った。次いで、最初のスライスと、そこから1枚おきのスライスを、組織病理学的評価および免疫組織化学的解析用にホルマリン中で固定した。全個体の脊髄切片頸部、胸部カテーテル先端を含むおよび腰部を約5ミクロンに薄切して、HEで染色し、各レベルで得られた横断切片および斜位切片を調べた。対照群および高用量群の脊髄の連続切片をBielschowsky銀染色および抗GFAPアストロサイトとその突起を直接可視化することができる免疫組織化学的染色でさらに染色した。脊髄神経後根および神経節中頸部、中胸部および中腰部で得られたをパラフィンに包埋し、連続切片をHEで染色した。さらに、対照群および高用量群の連続切片をBielschowsky銀染色で染色した。全個体の坐骨神経、脛骨神経および腓腹神経の切片に関しては、各神経の縦断切片をパラフィンに包埋して、約5ミクロンに薄切し、HEで染色した。各神経の横断切片をオスミウムで後固定し、Spurr樹脂に包埋して、約1~2ミクロンに薄切し、トルイジンブルーで染色した。オスミウム後固定および樹脂包埋は末梢神経のミエリン保存性に優れているため、神経をより詳細に調べることができる。剖検時に全個体から採取した全組織および肉眼的病変もパラフィンに包埋して、HEで染色し、顕微鏡で調べた。組織病理学的な処理および評価、ならびに免疫組織化学的解析をTPSにより行った。方法:アリールスルファターゼArhASA染色陽性対照スライドは試験依頼者から提供された。スライドはrhASAを注射したマウスの肝臓切片であった。陽性対照スライドはすべて、肝臓Kupffer細胞類洞マクロファージ内にrhASAの十分な証拠を示していた。陽性対照スライドを本試験の他のスライドとともに保管する。最初に、rhASA染色した切片のすべての評価を個体の処置群に対して盲目下で行った。これは、最初に病理学者が、ラベルの個体番号を隠した評価される実際の個体を知っている助手による状態でrhASA染色スライドを読み取り、評価する際にスコア重症度を口述し、同じ助手が直ちに染色スコア重症度をデータ表に記入することにより行われた。次いで、正確なデータ記入を保証するために、試験神経病理学者と助手の両者が個体IDを照合した。このような手順を踏んだのは、細胞内rhASA検出のための免疫組織化学的染色による染色の全体の強度の判断に偏りが生じないようにするためである。ニューロン、髄膜マクロファージ、血管周囲マクロファージおよびグリア細胞アストロサイトとミクログリア細胞であるが、おそらくは大部分がミクログリア細胞であるの相対的な染色の程度を、脳および脊髄のすべての切片で等級付けした。各群の各脳および脊髄レベルでの平均重症度スコアを合計し群ごと、脳一般rhASA染色、および脊髄一般rhASA染色という組織項目下での合計として記録した。一般に、脳のニューロンのrhASA染色は、脳の大脳皮質および他の核野におけるニューロンの尺度であった。髄膜マクロファージのrhASA染色は、髄膜マクロファージによる被検試料の取込みおよび/または髄膜マクロファージに内在するrhASAの証拠であった。血管周囲マクロファージのrhASA染色は、脳/脊髄のマクロファージによるrhASAの取込みまたは内在するrhASAの尺度であったが、脳および脊髄の血管周囲腔Virchow-Robin腔は髄膜と繋がっていることに留意するべきである。一般に、グリア細胞におけるrhASA染色の等級付けは主として、特に大脳皮質の灰白質および/または白質放線冠は大脳皮質下の白質である内への被検試料の取込み/被検試料の透過の尺度であった。白質でのrhASA染色は、アストロサイトおよびミクログリア細胞に見られるようであった。以下に挙げる等級付けスキームを用いて、各種細胞型ニューロン、グリア細胞、マクロファージのrhASA染色の程度を採点した。等級の説明染色された可能性のある細胞の110未満210~25325~50450~75575以上このスキームは厳密に定量的なものではないことに留意されたい。このスキームは、rhASAによる脳および脊髄の染色の程度を評価するための効率的で半定量的な方法として用いたものである。試験神経病理学者は、すべてのニューロン領域がrhASA染色で等しく染色されるわけではないことに留意した。また、一部の対照個体では内因性のニューロン染色が見られること、および脈絡叢の細胞および後根神経節のニューロンは対照個体においてもrhASAで強く染色されやすいことにも留意した。脈絡叢および後根神経節の染色の等級付けは行わなかったが、試験神経病理学者は対照動物においても染色が顕著であることに留意した。注:全用量群:低用量=1.8mg/投与;中用量=6.0mg/投与;高用量=18.6mg/投与。全用量群雌雄;下を参照の肝臓におけるrhASA染色の増加を除いては、被検試料に関連した非神経系組織の病変は見られなかった。終了時に屠殺した個体6か月間の隔週投与:rhASA染色切片以下に挙げる組織/細胞型においてrhASA染色の増加が見られた。特定の用量群の特定の細胞におけるrhASA染色の程度に対する被検試料の影響を考察する際には、比較のために同時溶媒対照および装置対照回復後に屠殺した個体とともに屠殺の染色レベルを考慮した。脳、髄膜、マクロファージ全用量群、雌雄脳、血管周囲、マクロファージ全用量群、雌雄脳、グリア細胞全用量群、雌雄脊髄、髄膜、マクロファージ全用量群、雌雄脊髄、血管周囲、マクロファージ全用量群、雌雄脊髄、グリア細胞中用量および高用量の雌雄肝臓、Kupffer細胞全用量群、雌雄内因性の染色があるため、脳および脊髄のニューロンにおけるARSA染色レベルを明確に定めることが最も困難であった。rhASA染色では、髄膜および脳/脊髄の血管周囲マクロファージにおいて、およびグリア細胞内においても一貫してrhASAレベルの増加が示された。対照個体と被検試料処置個体との間で、ニューロンにおけるrhASA染色の検出可能な差は見られなかった。回復後に屠殺した個体6か月間の隔週投与後に、1か月間の無投与期間全般的に、剖検前に1か月の無投与期間を設けた個体では、被検試料関連の変化が完全に消散するか、または著しく減少した。以下のような顕微鏡的変化が、被検試料との関連性を示す発生率および/または重症度で見られた。被検試料に関連する顕微鏡的変化回復個体脳、髄膜、浸潤中用量および高用量群、雌雄図111および図112脳、髄膜、浸潤、好酸球の中用量の雄;高用量の雌脳、血管周囲、浸潤中用量の雄;高用量の雌図113脳、血管周囲、浸潤、好酸球の中用量の雄;高用量の雌脳、灰白質、浸潤全用量群、雌雄脳、灰白質、浸潤、好酸球の低用量の雄脳、灰白質、好酸球、壊死低用量の雄脊髄、髄膜、浸潤中用量および高用量の雄;低用量および高用量の雌脊髄、髄膜、浸潤、好酸球の中用量の雄;低用量の雌脊髄、灰白質、浸潤低用量の雌脊髄、灰白質、浸潤、好酸球の低用量の雌後根神経節および神経根、神経上膜、浸潤中用量の雌脊髄神経根および神経節、浸潤、好酸球中用量および高用量の雄;全用量の雌三叉神経節、浸潤、好酸球中用量の雌雄これらの変化はすべて、終了時に屠殺した個体で認められた炎症性変化の増加の残存物であると解釈した。終了時に屠殺した個体の場合と同様に、一部の回復個体に依然として存在する炎症性の細胞浸潤の増加が、有害な作用を引き起こす形態学的変化を示すという証拠は見られなかった。被検試料に関連する非神経系組織の病変は見られなかった。回復後に屠殺した個体6か月間の隔週投与後に、1か月間の無投与期間:ARSA染色回復雄または雌において、装置および/または溶媒対照と比べてrhASA染色の増加は示されなかった。実際には、低用量、中用量および高用量の回復雄の脳では、一部の細胞型治療群間で異なるにおいて、装置および/または溶媒対照と比較してrhASA染色の減少が示された。これが実際の影響であるか否かを含め、その理由はわからなかった。可能性のある1つの説明は、外来性のrhASAの投与が内因性のrhASA産生をいくらか減少させた可能性があるということであろう。同様の所見は雄の脊髄では見られなかった。回復雄および雌では、肝臓における染色が、対照で認められたものと類似していた。全般的に、被検試料に関連する変化は、2つの大きな種類に分類可能であり、全用量レベル1.8、6.0および18.6mg/投与で見られた。髄膜、脳実質、脊髄実質、三叉神経節、および場合により脊髄神経根/節またはこれらの構造を取り囲む神経上膜における浸潤通常は好酸性成分が顕著な白血球の増加。この増加は、被検試料タンパク質が髄腔内腔および神経系組織内に存在することによると解釈した。一部の個体の脊髄および脳でミクログリア細胞のわずかな局所的増加小膠細胞症は高用量のいずれの個体でも観察されなかった。形態学的変化は2種類とも、被検試料の存在に対する反応であると解釈した。いずれの個体においても、ニューロン壊死の証拠は見られなかった。rhASA染色切片の評価は、この中間報告の執筆の時点では未決定である。被検試料に関連する変化はいずれも、脳、脊髄、脊髄神経根または神経節におけるいかなる生物学的に有害な反応とも関連しなかった。具体的には、ニューロン壊死または生物学的に重要なグリア反応の証拠が見られなかった。被検試料に関連する非神経系組織の病変は見られなかった。1か月の回復期間無投与期間の後、被検試料に関連する変化は、完全に消散するか、または被検試料の存在に伴って以前に増加した炎症性応答の残存物に限定されていた。回復個体において有害な影響は見られなかった。半定量的染色スコアを与える盲目下での顕微鏡検査に基づけば、アリールスルファターゼArhASA;被検試料に対する免疫組織化学染色が、全被検試料処置群でニューロンを除く脳および脊髄の各種細胞型において増加していた。またこの増加は、肝臓のKupffer細胞においても明らかであった。1か月の回復期間の後、被検試料処置個体全用量群におけるrhASA染色が対照装置および/または溶媒対照レベルに戻っていた。低用量群の回復雄の1個体では、大脳皮質において、複数の領域での以前の虚血を示すアストロサイト増加およびニューロン損失の複数の病巣が見られた。この個体でのこれらの病変の正確な病因は明らかではなかったが、10倍の用量を投与した高用量個体を含めた他の被検試料処置個体で同様の病変が見られなかったことは、これらの病変が被検試料に関係するものではなかったことを示している。この予備報告の発行の時点で、本試験における肉眼所見および顕微鏡所見パラフィン包埋、ヘマトキシリン/エオシン染色切片によるに厳密に基づけば、無毒性量NOAELは18.6mgであった。実施例16.薬物動態データ6か月の個体のデータ本実施例では、rhASAおよびNorthernBiomedicalResearch社の抗rhASA血清抗体の血清中およびCSF中濃度の解釈的分析を提供する。本実施例の目的は、幼若12か月齢未満カニクイザルにおいて、反復投与によるrhASAの髄腔内IT投与を、毒性学および安全性薬理学の観点から評価することであった。6か月間で全12回の投与を行った。最後の投与の24時間後または1か月後に個体の剖検を行った。試験計画を表29に示す。アッセイ方法-抗体解析有効な方法を用いて、カニクイザル血清中およびCSF中の抗rhASA抗体の定量化を行った。簡潔に述べれば、MSDストレプトアビジンでコートしたプレートのブロッキングからアッセイを始め、次いでビオチン標識rhASAとのインキュベーションを行う。洗浄段階の後、希釈試料、較正物質およびQCをプレートに加え、インキュベートする。さらなる洗浄段階の後、SULFOTAG標識剤を加え、インキュベートする。最後の洗浄段階を行い、MSDリード緩衝液を加える。直ちにプレートを読み取る。SOFTMaxProテンプレートを用いて、相対発光量RLUのシグナルデータを解析する。血清中およびCSF中濃度有効な方法を用いて、カニクイザル血清中およびCSF中のrhASAの定量化を行った。この方法は酵素結合免疫吸着測定ELISA技術に基づくものである。簡潔に述べればマイクロタイタープレートを組換えヒトアリールスルファターゼArhASAに対するウサギポリクローナル抗体SH040でコートする。rhASA標準品および試験試料とのインキュベーション後、結合したrhASAタンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼHRPコンジュゲート抗ASAモノクローナル抗体クローン19-16-3により検出する。次いで、プレートをHRPの基質であるTMBペルオキシダーゼとともにインキュベートする。この酵素-基質反応を2N硫酸H2SO4の添加により停止させ、吸光波長450nmでの各ウェルの吸光度を参照波長を655nmとして測定する。同じプレートでのrhASA検量曲線を用いて、試料中のrhASAの濃度を計算する。rhASAの血清中濃度のまとめを表30に示す。rhASAのCSF中濃度のまとめを表31に示す。抗rhASAの血清中抗体濃度のまとめを表32に示す。抗rhASAのCSF中抗体濃度のまとめを表33に示す。群および性別による抗体の出現率を表36に示す。カニクイザル血清中のrhASAの定量下限は39.1ng/mLであり、群1および2の血清試料はすべて定量下限未満BQLであった表30を参照。投与2、4、6、8、10および12の前およびの24時間後6か月後の剖検、回復期間の途中、ならびに回復後剖検前にrhASAの血清中レベルを試験した。群31.8mg/投与、群46.0mg/投与および群518.6mg/投与では、投与2、4、6、8、10および12の前、投与12の後、回復期間の途中、ならびに回復後剖検前のrhASAレベルは検出不可能であった。投与2の後では、血清中rhASAのレベルは用量依存的であった。投与4群3、投与6群3および4および投与8および10群3および4、ならびに群5の雄の後では、rhASAレベルは検出不可能であった。rhASAの血清中レベルは、群46.0mg/投与では投与4の後に、群518.6mg/投与では、雄で投与4および6の後、雌で投与4、6、8および10の後に減少した。この血清中rhASAレベルの明らかな減少は、抗rhASA抗体濃度の増加に関連している可能性がある。本試験における試料のばらつきおよび少ない群数を考えれば、rhASAの血清中レベルでの雌雄間の明らかな差はなかった。カニクイザルCSF中のrhASAの定量下限は19.5ng/mLであり、群1および2のCSF試料はすべてBQLであった表31参照。全投与群において、投与2、4、6、8、10および126か月後の剖検の前および後に、CSF中のrhASAが検出可能であった。そのレベルは投与後投与の約24時間後の方が高く、用量依存的であった。CSF中のレベルは血清中のレベルよりも大幅に高かった。本試験における試料のばらつきおよび少ない群数を考えれば、rhASAのCSF中レベルでの雌雄間の明らかな差はなかった。全投与群において、回復期間の途中および回復後剖検前にrhASAは検出されなかった。rhASA処置群の投与12剖検で採取されたCSF中のレベルは、投与8および11の後のレベルよりも低かった。剖検時の方がrhASAレベルが低い理由としては、剖検時に採取した量細胞計数、化学、rhASAおよび抗RHASA抗体用に合計約2.25mLの方が、生存中の投与間に採取した量rhASA濃度用に投与前または投与後に0.5mL以下よりも多かったということが考えられる。さらに、一部の個体は剖検時にカテーテルが塞がっていたため、カテーテルではなくCM穿刺により採取した。この経路は、カテーテルを介した試料採取に比べて、rhASA濃度が常に低い。これはCSFの体軸方向の総体流が制限されていることによるものと思われ、このような現象は、サルおよびヒトのような体が垂直方向に伸びている動物で生じることが認められている例えば、CSFの成分が個体の生涯を通して顕著な体軸方向の勾配を示すことがよく知られている。いくつかの時点では、RHASAで処置した全個体において血清中に抗rhASA抗体が検出された表32を参照。抗rhASA抗体のレベルが定量下限78.1ng/mLを上回っていれば、その個体を抗rhASA抗体に関して陽性であると定めた。一度血清転換した個体は、抗rhASA抗体に関して陽性のままであった。投与2の前の時点では、抗rhASA抗体に関して陽性の個体は見られなかった。投与4の前の時点では、番号026の雄群4;6.0mg/投与を除く全rhASA個体が血清中抗rhASA抗体に関して陽性であった。番号026の雄は、投与6の前の時点で血清中抗体に関して陽性であった。群518.6mg/kgでは、剖検抗体試料の抗体レベルが低くなっていた。この明らかな減少は、アッセイに干渉するrhASAの存在によるものであろう。力価は全般的に、低用量個体1.8mg/投与よりも中用量および高用量群6.0および18.6mg/投与の方が高かった。抗rhASA抗体の存在は、組換えヒトタンパク質でカニクイザルを処置することから得られる予測された結果である。結果のばらつきを考えれば、雌雄間の明らかな差はなかった。CSF中の抗rhASA抗体が検出可能な個体では、番号049群3;1.8mg/投与および番号057群4;6.0mg/投与の雌を除き、すべてが血清中のrhASA抗体も検出可能であった。抗体の濃度および出現率にばらつきがあるため、用量反応を決定することができない。抗rhASA抗体のレベルが定量下限78.1ng/mLを上回った個体を、抗RHASA抗体に関して陽性であると定める。血清中およびCSF中RHASAレベルならびに抗RHASA抗体に関する雌雄の合計数値を表34および表35に示す。上述のように、雌雄を合わせた結果は雌雄別々の結果と同様であった。実施例17.有効性本実施例では、11匹の野生型対照mASA/hASA-/-マウスを群Aに割り付け、これらには処置を行わなかった。34匹のhASAC69S/ASA-/-マウスを5つの各用量群に割り付け、これらには1、9、15/16および22日目に溶媒群Bまたは20mg/kg静脈内[IV];群Cもしくは0.04、0.12および0.21mgそれぞれ群D、EおよびFの用量のrhASAを投与した。IV投与はすべて尾静脈から行った。髄腔内IT投与はすべて、約2μL/20秒の範囲で12μLの量の注入として行った表37。ASAノックアウトマウスhASAC69S/ASA-/-はMLDのモデルとして認められており、この疾患に対して可能性のある治療法を試験するために用いられてきた。髄腔内経路はヒトでの投与経路を意図したものである。静脈内投与経路は、この化合物および同様の化合物に関して、MLDマウスで試験されている。末梢器官で予想される組織学的変化の陽性対照として、静脈内対照群を加えた。100、300または520mg/脳重量kgそれぞれ0.04、0.12、0.21mgのrhASAをマウスに投与した。本試験のために選択した、脳重量に対して正規化した用量レベルは、ヒトでの使用が計画されている用量、または毒性学試験もしくは以前のリソソーム蓄積症の有効性モデルで使用された用量に相当する。これらの用量は全く毒性を有さないと予想された。受取り種マウスMusmusculus系統hASAC69S/ASA-/-マウスおよび野生型対照齢数到着時で約14~17か月齢群数6個体数ASAノックアウトマウス34匹野生型対照11匹到着後、健康状態を評価するために各個体を検査した。飼育マウスを、CareFresh紙床敷と給水ボトルとを備えた高温ポリカーボネート製のフィルタートップケージで集団飼育した。各ゲージを、計画、群番号および個体番号、ならびに雌雄を明記したケージカードでわかりやすく標識した。耳パンチ方式を用いて、各個体を1個体ずつ区別した。個体の室内環境および光周期の目標条件は以下の通りであった:温度22°C±3°C湿度50±20光周期12時間の明期と12時間の暗期使用可能な野生型個体11匹をすべて群Aに割り付け、35~45の番号を付した。順化期間中に、ケージから取り出して、体重を量り、耳パンチを行う際に、ASA-/-hASA/-個体に連続する番号1~34を割り付けた。次いで、2011年1月3日にResearchRandomizerwww.randomizer.orgを用いて、マウスを治療群に割り付けた。最初の9つの番号を群Bに、次の5つの番号を群Cに、その次の5つの番号を群Dに、その次の5つの番号を群Eに、最後の10個の番号を群Fに割り付けた。個体は以下のように割り付けられた:被検試料および溶媒被検試料アイデンティティrhASA種類ヒト組換えアリールスルファターゼAARSA保管条件約4°C溶媒アイデンティティrhASA溶媒154mMNaCl、0.005ポリソルベート20、pH約6.0保管条件約4°C溶媒の調製溶媒を記載の通りに使用した。溶媒を卓上で温めた周囲温度。溶媒が温まってから、緩やかに回転および反転させて物質を混合した。ボトルをボルテックスしたり振盪させたりしなかった。物質を利用する前にボトルを乾燥させた。残った溶媒は冷蔵庫に戻した1°C~8°C。投与製剤の調製rhASAを溶媒で希釈して必要な濃度にした。被検試料を卓上で温めた周囲温度。被検試料が温まってから、緩やかに回転および反転させて物質を混合した。ボトルをボルテックスしたり振盪させたりしなかった。注射剤を追跡するための色素:赤外色素例えばIRDye登録商標、LI-CORBiosciences、Lincoln、NEなどを注射剤の追跡に用いた。このような色素は、髄腔内投与後の残存分析法として髄腔内注射剤で用いられてきた。投与前に色素を被検試料混合した。すなわち、1μLの1nmol色素を被検試料に加えた。赤外色素のほかに、1μLのFDCblueNo.10.25を注射剤の追跡に用いた。この青色の色素は一般的な食品添加物であり、一般に安全で無毒であると考えられている。rhASAまたは溶媒の腰仙部IT注射1、9、15または16日目と22日目に、群B、D、EおよびFの個体に髄腔内注射を行った。1.25の2,2,2-トリブロモエタノールAvertinを体重10g当たり200~300μL250~350mg/kgで腹腔内注射により使用して、成体マウスを麻酔した。クリッパーを用いて尾の基部から肩甲骨までの背中の体毛を除去した。剃毛した部分を、povidine/betadine洗浄、次いでイソプロピルアルコールにより消毒した。腰仙部脊椎の上で小さな正中皮膚切開1~2cmを行い、背側正中線と回腸の頭側の翼との交点を確認した。腸骨窩の筋肉中殿筋はハート型の筋肉である。このハートの上部両側がほぼ回腸の翼の位置にある。気密性の10~20μLガラス製Hamiltonシリンジに装着した32ゲージの針を、下にある骨の抵抗を感じるまで挿入した。被検試料10μL、赤外色素1μLおよび1μLのFDCblueNo.1合計注射量12μLを、約2μL/20秒12μL/2分の速度で注射した。創傷クリップを用いて皮膚切開を閉じた。注射が成功したか否かの判断を、赤外色素および可視性の青色色素がCNS全体に分布したか否かを画像で判定することにより行った。画像化の後、回復用チャンバーでマウスを回復させた。rhASAの静脈内注射1、9、15および22日目に、群Cの個体に静脈内注射を行った。IV注射のために、マウスを必要に応じてイソフルランを用いて麻酔し、保定器に入れた。尾を指で軽くはじいて温めることにより、尾静脈を拡大させた。次いで、注射部位を70エタノールでぬぐった。あるいは、マウスを暖かいチャンバー40°Cに1~1.5分間置いた。28~30ゲージの針を用いて被検物質を注射した。注射量は5~10mL/kgであった。4回目の投与の約24時間後に群B~Fの個体を安楽死させた。これらの個体を以下に詳述するような様々な組織採取法に供した。群Aには処置を施さなかったが、2011年1月の27日または28日に安楽死させ、以下に詳述するような組織採取法に供した。血清全個体イソフルラン麻酔下、全個体A~から後眼窩穿孔により終了時の血液試料約0.5mLを採取した。ガラス製チューブを眼窩に当て、眼球の下部に静かに差し込んで、眼球後部にある静脈排出路を破壊した。血液を毛管作用および/または自然流下により採取した。血液採取後に、眼窩を圧迫して止血した。全血試料を血清になるまで処理し、-80°C未満で凍結させた。血清を-80°Cで保管し、抗体に関して解析した。光学顕微鏡検査用の組織群A~F;1群当たりマウス5匹血液採取後に、CO2窒息によりマウスを安楽死させた。灌流前に尾部小片を採取し、可能性のある遺伝子型同定のために保管した。心膜腔を露出させた。1群当たり3匹のマウスを、ヘパリン処理した氷冷生理食塩水溶液0.9NaCl中1U/mLのナトリウムヘパリン、滅菌ろ過済み、次いで約4°Cの4パラホルムアルデヒドで経心的に灌流した。脳を取り出し、腹部を切開して内臓をさらに露出させた。凍結させた尾部小片を除く、脳および死体をパラホルムアルデヒドに漬けた。脂質分析用の組織群A、BおよびF;それぞれ6、4および5個体血液採取後に、CO2窒息により個体を安楽死させた。灌流前に尾部小片を採取し、可能性のある遺伝子型同定のために保管した。心膜腔を露出させた。脂質分析用に、1群当たり4~6匹のマウスを、ヘパリン処理した氷冷生理食塩水溶液0.9NaCl中1U/mLのナトリウムヘパリン、滅菌ろ過済みで経心的に灌流した。採取時に、重量を量ってから組織をドライアイス上で、または-80°Cの冷凍庫に入れて凍結させた。脳を左半球と右半球に分割した。右半球をMSによる脂質分析に用いる。左半球を可能性のあるN-アセチル-L-アスパラギン酸分析用に分析する。分析まで組織を-80°Cで保管した。rhASAにより、MLDマウスの脊髄、特に白質におけるスルファチドの蓄積が減少した図114。rhASA投与後にアルシアンブルー染色剤の光学濃度が統計的に有意に減少することが、脊髄の形態計測解析により示された図115。rhASA処置したMLDマウスも脳におけるリソソーム活性の減少を示した図116。この減少は、溶媒処置個体と比べて、高用量群0.21mg~520mg/脳重量kgにおいて統計的に有意であった図1171歳を超えた免疫耐性のMLDマウスhASAC69S/ASA-/-に毎週1回で4週間、rhASAの髄腔内腰椎投与を行った合計4回の投与。用量は、溶媒154mMNaCl、0.005ポリソルベート20、pH約6.0、0.04、0.12、0.21mg/投与正規化された用量はそれぞれ100、300および520mg/脳重量kgであった。終了時点で、脳および脊髄内でのスルファチドクリアランスおよびリソソーム活性の免疫組織化学的評価により有効性を評価した。組織中のスルファチドを標的としたアルシアンブルー染色を用いて、脊髄および脳切片を染色した。また脳切片を、リソソームプロセスの指標であるリソソーム膜タンパク質LAMPの有無に関しても染色した。さらに、アルシアンブルーおよびLAMPで染色した脊髄頸部、胸部および腰部および脳切片の形態計測解析を行った。これらの予備結果は、rhASAの髄腔内腰椎投与の有効性を示している。溶媒対照マウスに比べて、rhASA処置MLDマウスは、脳内のスルファチド蓄積アルシアンブルー染色により認められるおよびリソソーム活性の減少ような、疾患の組織学的マーカーにおける向上の証拠を示している。これらの組織病理学的変化は、末梢脊髄の投与部位付近脊髄の腰部領域だけでなく、脳の末梢部でも観察された。実施例18.生体内分布2概略本試験では、36匹の雄および36匹の雌の幼若体カニクイザル開始時に12か月齢未満を5つの各用量群に割り付け、0装置対照;0.6mLのPBSを投与、0溶媒対照、1.8、6.0または18.6mgそれぞれ群1、2、3、4および5の用量のrhASAを、隔週で6か月間、合計12回投与した。全投与を0.6mLの量の注入で行い、次いで、約10分間の0.5mLPBSによる洗い流しを行った表41。材料および方法組織採取脳を脳マトリックスで約3mmの冠状スライス厚に切った。各脳を以下のものを含む完全な冠状スライスに薄切した:新皮質前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質および後頭皮質を含む、古皮質嗅球および/または梨状葉、大脳基底核尾状核および被殻を含む、辺縁系海馬および帯状回を含む、視床/視床下部、中脳領域黒質を含む、小脳、脳橋および延髄。各組織試料が4mmの生検パンチにより得られた位置を図133~138に示す。図133~138の画像は、ウィスコンシン大学およびミシガン州ComparativeMammalianBrainCollectionsおよび国立健康医学博物館のものである。パンチ番号22は、この構造が剖検時に存在しなかったため採取されなかった。すべての脳試料を、酵素結合免疫吸着測定を用いたrhASAの解析まで-60°C以下で凍結させ保管した。最初のスライスと、そこから1枚おきのスライスを、組織病理学的評価および免疫組織化学的解析用にホルマリン中で固定した。2枚目の脳スライスと、そこから1枚おきのスライスを、被検試料濃度の分析用に凍結させた。凍結前に、生体内分布解析用に、偶数番号を付した被検試料解析用の脳スライスの右側部分から脳試料を採取した。脳試料の位置を剖検時に写真撮影し、脳スライス番号を記録した。採取される白質の量が最適になるように、4mmの円形パンチを用いて、または解剖用メスで切り取って試料を採取した。すべてのパンチを被検試料解析用に-60°C以下で凍結させ保管した。残りの脳スライスを、可能性のある被検試料解析用に-60°C以下で凍結させ保管した。脊髄頸部、胸部および腰部を1センチメートルの切片に切った。次いで、最初のスライスと、そこから1枚おきのスライスを、組織病理学的評価および免疫組織化学的解析用にホルマリン中で固定した。次いで、2枚目の脊髄スライスと、そこから1枚おきのスライスを、被検試料濃度の分析用に-60°C以下で凍結させ保管した。髄腔内カテーテルの先端部を含むスライススライス0がホルマリンで固定され、組織病理に関して解析されるように、スライスの配分を調節した。脳、肝臓および脊髄抽出物の調製ならびにrhASA濃度の決定米国食品医薬品局FDA医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施基準GLPの規則21CFR、Part58および適用されるMidwestBioResearch社の標準操作手順書を遵守した有効な方法を用いて、脳パンチ、脊髄および肝臓の試料を解析した。組織試料を溶解緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離により組織残骸を除去し、アッセイまで-80°Cで保管した。捕捉抗体としてポリクローナルウサギ抗体SH040および検出抗体としてHRP西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ASAモノクローナル抗体19-16-3を用いたELISAにより、ホモジネートの可溶性画分中のrhASA濃度を決定した。未結合物質を除去する洗浄段階の後、テトラメチルベンジジンTMB基質溶液をHRPコンジュゲート抗体の存在下で過酸化物と反応させて、最初の段階で抗ASA抗体と結合したrhASAの量に比例する比色シグナルを発生させた。各組織ホモジネート中の得られたrhASAの量を、標準曲線から内挿した。また、試料をビシンコニン酸BCAタンパク質決定アッセイでも解析し、試料中のタンパク質の濃度を得た。各試料のタンパク質濃度をアルブミン標準曲線の内挿により決定した。次いで、rhASA濃度の結果を、ビシンコニン酸アッセイにより決定された組織抽出物中の総タンパク質に対して正規化した。溶媒、1.8mg/投与、6.0mg/投与および18.6mg/投与群の全パンチのrhASAレベルを、それぞれ図118、図119、図120および図121に示す。装置対照、溶媒、1.8mg/投与、6.0mg/投与および18.6mg/投与群の回復個体の全パンチのrhASAレベルを、それぞれ図122、図123、図124、図125および図126に示す。脳の表面付近髄膜で採取した、選択したパンチのrhASAレベルを図127に示す。主に深部の脳白質を含むと考えられる、選択したパンチのrhASAレベルを図128に示す。白質は、有髄神経細胞突起または軸索の束で構成されている。主に深部の脳灰白質を含む、選択したパンチを図129に示す。白質とは対照的に、灰白質は神経細胞体を含む。表面、深部白質、深部灰白質の選択したパンチのrhASAの値を、各用量群について図130に示す。脊髄中濃度のデータを図131に示す。肝臓中濃度のデータを図132に示す。装置対照および溶媒投与対照群の肝臓、脊髄および脳中のrhASA濃度のレベルは、場合によって測定可能であった。肝臓および脊髄中のレベルは、いずれのrhASA処置群よりも低かった。装置対照および溶媒投与個体で測定されたrhASAレベルは、ELISAで使用した抗rhASA抗体と天然のカニクイザルタンパク質との交差反応性を示している。抗体とカニクイザルASAとの間の交差反応性の程度が不明であるということ、およびアッセイ標準品でrhASAを使用しているということから、装置対照および溶媒の組織で報告された値は組織中のカニクイザルrhASAの定量値を表すものではない。しかし、装置対照と溶媒投与の組織の間で検出されたrhASAレベルの相違は、異なる組織および解剖学的領域におけるカニクイザルrhASAの相対量のばらつきを示すものであると解釈され得る。脊髄スライス中のrhASAレベルは、1.8、6.0および18.6mg/投与群においてそれぞれ、雄では160~2352、1081~6607および1893~9252ng/タンパク質mgの範囲、雌では0~3151、669~6637および1404~16424ng/タンパク質mgの範囲であった図127。rhASAレベルは、脊椎の頸部領域よりも腰部領域の方が高かった。肝臓で検出されたrhASAタンパク質レベルは、rhASA処置群では用量依存的であり、溶媒群では非常に低かった。平均rhASAレベルは、1.8、6.0および18.6mg/投与群においてそれぞれ、雄では88、674および2424ng/タンパク質mg、雌では140、462および1996ng/タンパク質mgであった図128。全体的に、rhASAレベルは、rhASA投与群の脊髄スライスおよび肝臓から調製した試料では、用量依存的であるようであった。試験した多くの脳領域において、rhASAレベルとrhASA投与の間の明らかな用量相関が示されたが、他のものはこれほど明らかではなかった。一般に、脳のrhASAレベルはrhASA用量とともに増加した。実施例19:IT投与したrhASAとIV投与したrhASAの薬物動態PKおよび生体内分布本試験の目的は、カニクイザルへの髄腔内ITおよび静脈内IV投与後の各種の治療用補充酵素の薬物動態PKおよび生体内分布を評価することである。本試験では、第1a相I2S投与および第1b相rhASA投与のために、髄腔内腰椎IT-Lカテーテルを有する合計12匹の雄および12匹の雌カニクイザルを、体重により4つの処置群に無作為に割り付けた。両相では、投与後の特定の間隔で血液およびCSFをIT-CMカテーテルから採取した。第1a相の最後の試料を採取した後、第1b相の開始前に7日間のウォッシュアウト期間を設けた。第1b相の最後の試料を採取した後、第2相の開始までに7日間のウォッシュアウト期間を設ける。第1b相の合計12匹の雄および雌カニクイザルを、体重によりI2S群1a~6aおよびrhASA群1b~6bの12の処置群に無作為に割り付けた。IT-L投与後の血清中でのrhASAの絶対バイオアベイラビリティは、約30~40である。これに対し、IV投与の0.5のみがCSF中で生物学的に利用可能であった。IT-L投与後、血清中でのrhASAへの曝露量は、比例するよりも多く増加する。IT-L投与後、CSF中でのrhASAへの曝露量は、用量の増加に比例するよりも少ない増加であった。IT-L投与後の血清中のrhASAのバイオアベイラビリティは、約30~40である。これに対し、IV経路により投与した用量の0.5のみがCSF中で生物学的に利用可能であった。実施例20.MLD患者の治療例えばIT送達による、CNSへの直接投与を用いて、MLD患者を効果的に治療することができる。本実施例は、遅発乳児型MLDの患者に対して、隔週EOW、全40週で、髄腔内薬物送達装置IDDDにより投与する、3用量レベルまでのI2Sの安全性を評価するために計画された、多施設用量漸増試験を示すものである。ヒト治療に適した髄腔内薬物送達装置の様々な例を、図94、図95、図96および図97に図示する。最大20患者まで登録:コホート1:5患者最低用量コホート2:5患者中間用量コホート3:5患者最高用量無作為に5患者を無治療とする。以下の基準を含むか否かに基づき、試験する患者を選択する:1生後30か月までに最初の症状が現れた;2スクリーニング時に歩行可能である自力で立ち上がり、片手を持たれた状態で10歩前へ歩く能力と定義される;3スクリーニング時に神経学的兆候が見られる。通常、造血幹細胞移植の経歴がある患者は除外される。遅発乳児型MLDの小児において、40週間、用量を漸増してIT注射により投与するrhASAの安全性を判定する。さらに、粗大運動機能に対するrhASAの臨床活性、ならびに単回および反復投与の血清中薬物動態および脳脊髄液CSF中濃度を評価する。HNSのIT送達の例実施例21:ヘパランN-スルファターゼの慢性髄腔内投与本実施例は、ムコ多糖症IIIAMPSIIIA;サンフィリッポ症候群A型に特徴的な臨床像である神経症状を治療するために、髄腔内投与を用いて、組換えヒトヘパランN-スルファターゼrhHNSのようなリソソーム酵素を脳組織内に効率的に送達することができることを示すものである。本実施例に記載されている実験は、rhHNSの慢性IT投与において高い忍容性が認められ、脳、脊髄および肝臓で用量依存的な酵素活性が検出されたことを示している。簡潔に述べれば、ムコ多糖症IIIAMPSIIIA;サンフィリッポ症候群A型に特徴的な臨床像である神経症状を治療するための、組換えヒトヘパランN-スルファターゼHNSの髄腔内IT製剤を開発した。MPSIIIA患者の平均年齢が4.5歳であることから、発達中の脳に対する影響を評価するためのHNSに関するピボタルな毒性学試験を幼若カニクイザルにおいて行った。サルに髄腔内IT腰椎薬物送達装置を埋入し、隔週で短時間注入により投与し1.5、4.5または8.3mg/投与のHNSを6か月間;12用量、装置対照および溶媒対照には、ぞれぞれリン酸緩衝生理食塩水または溶媒を投与した。最後のIT投与の3か月および6か月後に1群当たり8個体雌雄それぞれ4個体の剖検を行い装置対照群は3か月後に剖検、溶媒群および3つのHNS用量群の8個体を最後のIT投与の1か月後に剖検した。HNSに関連する臨床兆候または肉眼的な中枢神経系の病変は観察されなかった。対照群に比べ、脳/脊髄を取り囲む髄膜/神経周膜において、脳脊髄液CSF白血球、主として好酸球の一過性の増加と相関する極めて軽度のものから最小限の平均重症度の細胞浸潤が見られたが、最終投与の1か月後に大部分が消散した。これらの変化は、脳または脊髄の有害な形態学的変化を伴わなかった。脳、脊髄および肝臓において、平均CSF中HNSレベルおよび組織中HNS活性レベルが高くなるという用量依存的な傾向があるようであった。無毒性量は最高用量である隔週投与の8.3mg/投与であったが、このことは、HNSが8.3mg/投与よりも高い濃度を含めた各種濃度で髄腔内に安全に投与され得ることを示している。サンフィリッポ症候群A型ムコ多糖症IIIA型MPSIIIA;サンフィリッポ症候群A型は、世界の約100,000に1人が罹患する稀なリソソーム蓄積症であり、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンGAGのリソソーム異化作用に関与する外部スルファターゼであるヘパランN-スルファターゼHNSの機能の欠如または不全が原因で生じるNeufeldEFら,TheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDisease2001pp.3421-3452。この酵素がなければ、ニューロンおよびグリア細胞のリソソーム内にヘパラン硫酸GAGが蓄積するが、脳以外での蓄積は少ない。この疾患に特徴的な臨床像は中枢神経系CNSの変性であり、この変性により、主要な発達段階がなくなるか、またはこれに達することができなくなる。進行性の認知低下から認知症および早期死亡に至る。rhHNSのIT送達MPSIIIA患者の平均年齢が4.5歳であることから、発達中の脳に対する影響を評価するためのHNSに関するピボタルな毒性学試験を幼若カニクイザル種の選択はヒトとの遺伝的および解剖的類似性に基づいたにおいて行った。文献によると、ヒトに対応するサルの年齢は、30~40か月の小児に対して7.6か月~12.1か月の範囲であるHoodRD,DevelopmentalandReproductiveToxicology:Apracticalapproach2006p.276。この取組みの一部として、HNSのIT腰椎投与を評価するために、幼若カニクイザルにおいて6か月間の毒性学試験を行った。以前の1か月齢幼若カニクイザルでの毒性試験から得られたデータを、6か月間反復投与による幼若サルでの試験の用量レベルの選択および計画の指針とした。本発明者らの知る限り、これが幼若非ヒト霊長類でのERTの慢性IT投与に関する最初の試験である。本試験では、約6~9か月齢、体重0.82~1.81kgの56匹の雄および56匹の雌幼若カニクイザルMacacafascicularisを用いた。サルにPMI-CertifiedPrimateDiet5048Richmond、INのビスケットを毎日15個与えた。水は、ろ過された自動給水システムによる自由摂取とし、採尿期間は水を与えなかった。到着時からサルをステンレス製ケージ内で2~4週間、グループ1ケージ当たり2匹で飼育したが、3か月齢の個体はステンレス製ケージ内で1匹ずつ飼育した。試験期間中は、全個体を、温度と湿度が管理された、明期12時間と暗期12時間のサイクルの部屋で、ステンレス製ケージ内で1匹ずつ飼育した。試験開始前に、全個体にSCポートおよびITカテーテルを外科的に埋入した。手術前にコハク酸プレドニゾロンナトリウムIV、30mg/kgおよびフルニキシンメグルミン筋肉内[IM]、2mg/kgを投与した。個体をSC硫酸アトロピン0.04mg/kgで前処置し、IMケタミンHCl;8mg/kgで鎮静させて挿管し、約1L/分の酸素および2.0イソフルランで維持した。腰椎L4、L5またはL6の背側突起の上で切開を行い、先細ポリウレタンカテーテル長さ25cm、外径0.9mm×内径0.5mm、6個の側孔の直径が0.33mmを挿入するために、L3、L4またはL5で半側椎弓切除術を行った。硬膜を小さく切開してカテーテルを挿入し、胸腰椎接合部の領域に向かって順方向に約10cm進めた。チタン製SCポートをITカテーテルに装着し、SC組織に埋入した。Isovue-3000.8ml;BraccoDiagnostics、Inc.、Princeton、NJを用いた脊髄造影像により、適切なカテーテル留置を確認した。手術から回復させた後、個体に酒石酸ブトルファノールIM、0.05mg/kgおよびセフチオフルナトリウムIM、5.0mg/kg、1日2回を2日間を投与した。本試験では、HNSを5mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウムおよび0.005ポリソルベート20を含むIT製剤溶媒pH7.0に溶かして調製した。HNSのEOW投与を、約11分間にわたる短時間注入、すなわち、6mL4分、次いで0.5mLリン酸緩衝生理食塩水PBSによる洗い流し7分で行った。溶媒対照群の個体には、IT製剤のみを投与し、DC個体にはPBSpH7.2をITで投与した。病的状態および死亡HNSに関連する死亡または早期の屠殺はなかった。投与時または毎日の観察時に、HNSに関連する臨床兆候は見られなかった。投与時または投与後に観察された誤留置、掻痒、振戦および運動失調は、投与の数分後~約4時間後までに消散し、これらはHNSまたは溶媒に対する反応ではなく、容積に関連する反応であると考えらた。投与時および投与直後に観察された臨床兆候は、対照群DCおよび/または溶媒投与群において同等の発生率で見られたが、用量反応の証拠は見られなかった。一般に、投与時の臨床兆候の発生率は、後の投与ごとに減少していった。HNSに関連する、体重、摂餌量、身体所見および神経所見の変化、またはECGもしくは眼科検査における変化は見られなかった。臨床病理学いずれのインターバル期間においても、HNSに関連すると考えられる血液学、血清化学、凝固または尿検査のパラメーターの変化は見られなかった。CSFの細胞計数および化学投与の24時間後に、DCおよび0mg/投与群を含めた全群の平均CSF白血球数に用量依存的な増加が見られた。投与した各用量で白血球数の全般的な増加が見られた。投与前に約半数の個体からCSFを採取したところ、これらの影響は、前回の投与から2週間で軽減されることが示された。投与5の後に、4.5mg/投与および8.3mg/投与群のHNS投与雄において、白血球の増加に加え、投与前の平均に比べて群の平均CSF中総タンパク質およびアルブミンの上昇4~5倍以下が観察されたDCおよび0mg/投与群に対してP≦0.05が、雌のHNS投与群ではそれほど明らかな傾向が見られなかった。HNS濃度および抗体解析一般的に、血清中の平均HNSレベルは、全群の全時点において検出限界LOD未満であった。DC対照および溶媒投与対照群の個体のCSF中HNS濃度は、一般的に定量下限LOQを下回っていた。統計解析は行わなかったが、CSF中の平均HNSレベルが1.5、4.5および8.3mg/投与群において高くなるという用量依存的傾向があるようであった。投与前のCSFの平均HNSレベルは、投与後のCSF中レベルよりも有意に低かった。試験終了時主要剖検および回復後剖検の6か月コホート雌雄における平均HNS濃度を表46にまとめる。所与の用量レベルにおいて、血清およびCSF中の抗HNS抗体レベルが試験を通して上昇し続けたにもかかわらず、CSF中のHNSの平均濃度は同じ範囲に維持されるようであった図146A。6か月/回復コホートでは、試験したいずれの時点でも、装置対照群PBSのみまたは溶媒群で血清またはCSF中に抗HNS抗体が生じた個体はいなかった。1.5、4.5および8.3mg/投与群の全個体が、試験前CSFおよび投与2の前に採取した血清およびCSF試料中の抗HNS抗体に関して陰性LOD未満の試験結果であった。試験の終わりまでに、全個体が血清中の抗HNS抗体に関して陽性の試験結果となった。1.5mg/投与および8.3mg/投与群の全個体、ならびに4.5mg/投与群の8個体中6個体が、1つ以上の時点でCSF中の抗HNS抗体に関して陽性の試験結果であった。4.5mg群の2個体で、剖検を含めたいずれの時点でも試料が採取されなかったため、これらの結果は、HNSを投与した全個体が抗体反応を生じたことを示すと思われる。3つのすべての用量レベルにおいて、投与2の後に血清中の抗HNS抗体濃度が検出され、投与4の後にレベルが顕著に増加した。統計解析は行わなかったが、血清中の抗体濃度が高くなるという用量依存的傾向があると思われ、試験終了までに、3つのHNS投与群間でレベルが同等になった図146B。本試験期間を通して、血清中の抗HNS抗体レベルは常にCSF中のレベルよりも高く9~236倍の血清中/CSF中抗体濃度、CSF中濃度に対する血清中濃度で最も高い比98および236倍は、投与の比較的初期6および10週目に8.3mgの用量レベルで見られた。血清中の抗HNS抗体濃度は、投与の初期6週目~14週目に、1.5mg、4.5mgおよび8.3mg/投与レベルにおいて、それぞれ9倍、16倍および16倍に増加した。同じ期間でのCSF中抗体濃度は、1.5mg、4.5mgおよび8.3mg/投与レベルにおいて、それぞれ30倍、41倍および52倍に増加し図146B、1か月間の無投与回復相の後でもかなりのレベルが維持されていた表47。抗HNS抗体が現れたのは、血清中よりもCSF中の方が遅かった図146C。血清中またはCSF中の抗体濃度の明らかな用量依存的な差は観察されず試料数が少ないため統計解析は行わなかった、雌雄間での抗体反応の差は見られなかった。CSF中に抗HNS抗体が存在しても、CSF中のHNSの平均濃度は維持されるようであったが、このことは、血清およびCSF中に抗HNS抗体が存在しても、IT投与されたHNSの濃度レベルが変化しなかったことを示している。6か月間のHNS反復投与の6か月/回復コホートの解析は、3か月中間および6か月コホートの屠殺個体の抗HNS抗体濃度が同等であることを示していた図146C。肉眼的および病理組織学的所見全用量レベルにおいて全屠殺間隔で、性別特異的に、または用量依存的であるというわけでないが、脳主として灰白質、脊髄灰白質および白質、脊髄神経後根/神経節および三叉神経節中用量雄のみの実質に好酸球浸潤図147Aが見られた図147B~147D。浸潤は、髄膜/神経周膜の浸潤および/または組織実質内でのHNSの存在透過に続発するものであると解釈された。炎症型の変化が多数見られたが、カニクイザルはHNSの投与に対して忍容性があると思われ、いずれの浸潤も神経系実質の有害な形態学的変化に関連する、またはこれを引き起こすとは考えられなかった。具体的には、HNS投与に関連するニューロン壊死/変性の証拠およびグリア反応が見られなかった。脳および脊髄の灰白質における、主として好酸球による細胞浸潤に関連した小膠細胞症は、以前に行った1か月間の幼若サル毒性試験において比較的よく見られた。このような変化は、6か月間の試験の3か月目中間の屠殺ではあまり見られなかったが、このような反応の残存した証拠が6か月のコホートで見られた図147F。ミクログリア細胞の反応は、一部の通常、タンパク質ベースの中枢に投与されたまたは中枢で反応する被検試料に対する反応の比較的初期の事象であることが多い。好酸球浸潤は、HNS投与個体のCSFにおける好酸球数の増加と確かに相関していたが、有害反応を誘発するのに十分な数の細胞は存在しなかった。全用量レベルにおいて、雌雄に関係なく、ほとんどのHNS投与群の脊髄神経後根/神経節で好酸球浸潤が観察された。各種神経系組織における浸潤は、髄膜/神経周膜の浸潤および/または組織実質内でのHNSの存在透過により生じたものであると解釈された。回復後に屠殺した個体では、HNSに関連する影響は、一般に見られなかったか、または対照レベルまで減少していた。脊髄の小膠細胞症のような一部の変化は、回復期間の後に完全に消散していた。HNSに関連する変化は、脳または脊髄における有害な構造上の顕微鏡的変化を全く伴わないようであった。脳、脊髄または神経節のニューロン壊死は認められなかった。HNS酵素活性6か月/回復コホートでは、溶媒投与群の脊髄および脳におけるHNS酵素活性0.0~0.154nmol/時タンパク質mgは、3か月中間コホートの組織で見られたレベル0.0~0.0154nmol/時タンパク質mgと同程度であった。脊椎での酵素活性レベルは、脳または肝臓で測定されたレベルよりも高く腰椎では1桁分高かった、4.5mgおよび8.3mg/投与群が同等のレベルであった。脊髄スライスのHNS酵素活性は、1.5、4.5および8.3mg/投与群において、雄図148Aでそれぞれ3.9~18.6、13.1~67.1および3.6~69.2nmol/時タンパク質mg、雌図148Bでそれぞれ1.8~16.2、4.5~61.2および21.1~66.0nmol/時タンパク質mgの範囲であった。1か月の回復期間後の脊髄組織では、酵素活性レベルが溶媒対照の数値と同じレベルまで戻っていた。脳スライスでのHNS酵素活性は、1.5、4.5および8.3mg/投与群において、雄図148Cでそれぞれ0.03~16.0、0.30~55.7および0.15~21.2nmol/時タンパク質mg、雌図148Dでそれぞれ0.04~5.1、0.0~14.4および0.9~33.2nmol/時タンパク質mgの範囲であった。回復後の脳組織では、酵素活性レベルが溶媒対照の数値と同じレベルまで戻っていた。内因性のレベルDC群と比較した、脳の異なる領域における活性の変化倍数を図149Aに示す。表面の試料において分布が増加する傾向が認められたが、腰椎IT投与したHNSが脳室周囲領域まで透過することが示された。6か月/回復コホートでは、1.5、4.5および8.3mg/投与群において、肝臓における平均活性レベルが、雄でそれぞれ0.50、2.41および6.65nmol/時タンパク質mg、雌でそれぞれ1.04、4.15および7.62nmol/時タンパク質mgであった図149B。溶媒対照個体のレベルは、雄で0.089nmol/時タンパク質mg、雌で0.083nmol/時タンパク質mgであった。回復期間後、肝臓におけるHNS活性レベルは、全用量群でベースラインの対照レベルと同等であった。免疫組織化学3か月中間コホートおよび6か月/回復コホートにおけるボーラスIT注射によるCNSへのHNS送達の結果、免疫反応性の被検試料が脊髄および脳の軟膜クモ膜組織まで送達された。HNSでITを投与した個体では、免疫反応性物質が、髄膜マクロファージおよび血管周囲マクロファージ内脳/脊髄に一貫してに存在し、隣接するグリア細胞および神経細胞集団内にばらつきながら存在していた。溶媒投与対照の個体図150Aでは染色が見られなかったことにより、ヒトHNSに対する抗体の特異性が示された。一般的に、免疫反応性は用量依存的であったすなわち、半定量的な段階付けスケールを用いて、免疫組織化学染色の一般的な用量依存的増加が認められた。ボーラスITによるCNSへのHNS送達により、大脳皮質および小脳において陽性の免疫染色が生じた図150B~150Dが、免疫反応性は、尾状核/被殻領域、中脳、または脳橋もしくは髄質の深部領域で一貫して明らかというわけではなかった。HNSを投与した全個体の肝臓において肝細胞ではなく、Kupffer細胞を含めた類洞壁細胞において、免疫反応性が明らかであった。修理不可能なカテーテル漏れのため早期に屠殺した1匹の雌4.5mg/投与群では、免疫反応性が明らかではなかった。1.5mg/投与群では、一部の残存した免疫反応性が明らかな肝臓および脳と脊髄の髄膜を除き、基本的に完全な回復が明らかであった。高用量4.5および8.3mg/投与では、免疫反応性強度および発生率が投与終了時よりも低かった。全用量レベルにおいて、1か月間の回復後に、脊髄、脳および肝臓のHNSレベルが、溶媒投与対照で見られたレベルに近かった。本試験では、ITで行った6か月間のHNSのEOW送達では、一般に高い忍容性が認められた。体重、臨床状態、眼科検査/神経学検査/身体検査、ECG、器官重量または器官の肉眼的外観の顕著な変化は観察されなかった。所見は、ごくわずかなものから軽度までの髄膜浸潤および硬膜外炎症を伴った、CSFの臨床病理における一過性の変化に限られていたが、これらは、回復期間後には、最高用量群を除く全群でほぼ完全に回復した。脳および脊髄全体にわたるHNSの広範な分布が観察された。HNSのEOWでのIT投与により、残存性の白血球浸潤およびアルブミン浸出を特徴とする炎症性応答が誘発され、これが投与の24時間後および剖検時に認められた。特定の理論に拘束されることを望むわけではないが、これはおそらく、カテーテル先端付近のタイトジャンクションの変化に関連した、局所的な一過性のBBBの不完全な開口により、白血球および血漿タンパク質がCSF内に侵入したことによるものであろうSimardJMら,LancetNeurol.20076,258-268;StamatovicSMら,Curr.Neuropharmacol.20086,179-192。これは2つの要素、すなわち、1つは投与の方法または量に関連する要素、もう1つはタンパク質のIT投与に関連する要素の結果であり得る。BBB透過性の一過性の変化投与の24時間後の剖検時の各用量群および対照の間に有意な差はなかったは、いかなる臨床兆候も伴わなかった。平均CSF中HNSレベルが高くなるという用量依存的傾向があると思われたが、所与の用量レベルにおいて、血清中およびCSF中の抗HNS抗体レベルの増加にもかかわらず、CSF中のHNSの平均濃度は同じ範囲で維持されるようであった。HNSを投与した幼若ザルの脳および脊髄において、ごくわずかなものから最小限までの平均重症度の髄膜の細胞浸潤が観察された。この顕微鏡的変化は溶媒投与対照でも認められ、一部の反応がITカテーテル留置および外来タンパク質に対する非特異的炎症性応答に関連していたことを示している。特にCNSに浸透する生物製剤/タンパク質をIT内に導入すると、ほとんどの場合、ある程度の炎症性応答を誘発しHovlandDNら,Toxicol.Pathol.200735,1013-1029;ButtMT,Toxicol.Pathol.201139,213-219、隣接する組織に損傷を与えるだけの数が存在すれば、有害作用を示し得る。しかし、本試験では、これらの細胞主として好酸球は、組織の反応/組織への浸透のマーカーになると思われ、有害反応と見なすのに十分な量では見られなかった。HNSに関連する変化は、脳または脊髄における有害な構造上の顕微鏡的変化を伴わないようであった。脳、脊髄または神経節のニューロン壊死は認められなかった。抗被検試料抗体の評価は、被検試料のクリアランスまたは生体内分布に対する中和抗体または結合抗体による潜在的な影響を理由に、毒性試験の重要な側面であるPonceRPら,Regul.Toxicol.Pharmacol.200954,164-182。本試験では、3か月中間コホートおよび6か月コホートの脳および脊髄において、用量依存的なおよび定量的に同様のレベルのHNS酵素活性が認められ、また血清およびCSF中の抗HNS抗体レベルの増加にもかかわらずCSF中のHNS平均濃度が同じ範囲に維持されるようであったが、このことは、中和活性がなかったことを示している。脊髄、脳および肝臓において、HNS酵素活性のレベルが高くなるという用量依存的傾向が見られるようであったが、そのレベルは、脊髄の腰部領域では注射部位付近が最も高く、脳では均一であり、また吻側から尾側にかけて、および右半球と左半球の間で有意差はなかった。6か月コホートの脳および脊髄組織では、3か月中間コホートに比べて、HNS蓄積の証拠が認められなかった。表面試料では分布が増加する傾向が認められたが、腰椎IT投与したHNSは深部の脳室周囲領域まで浸透した。肝臓でのHNS酵素活性は、HNSがIT送達後に全身に再分布することを示していたが、肝臓では、ピボタルな毒性試験における臨床病理パラメーターおよび解剖病理パラメーターの評価により、HNSに関連する有害作用は観察されなかった。全般的に、免疫組織化学の結果は、脊髄および脳の軟膜クモ膜髄膜、ならびに髄膜に隣接する神経組織ニューロン、グリア細胞において用量依存的な免疫反応性が観察されたという点で、組織酵素活性を裏付けるものであった。ボーラスIT注射または短時間IT注入後に、大脳および小脳の灰白質への良好な浸透が見られた。視床/視床下部の大脳基底核もしくは中心領域、中脳または脳橋/髄質のような深部構造では、免疫反応性は明らかではなかったが、酵素活性の結果は、腰椎IT投与したHNSが深部の脳室周囲領域に浸透したことを示している。したがって、免疫組織化学は、被検試料の生体内分布の検出に関しては感度の低い手法であるのかもしれない。免疫反応性は、肝臓のKupffer細胞および内皮細胞食作用が可能な細胞では明らかであったが、実質細胞肝細胞では明らかではなかった。幼若ザルにおける6か月間のIT反復投与の毒性試験に関する6か月/回復コホートの解析は、脊髄、脳および肝臓における生存中パラメーター、臨床病理および解剖病理、CSFおよび血清中のHNSおよび抗HNS抗体の濃度ならびにHNSの分布/細胞内局在を含めたHNSに関連する変化が、3か月中間屠殺および6か月屠殺の個体において同等であることを示していた。回復後屠殺の個体では、HNSの影響が見られなかったか、または有意に減少していた。したがって、6か月幼若ザルにおける試験の無毒性量は、最高投与量の8.3mg/投与であった。CSFの細胞充実度およびタンパク質濃度の変化をモニターすることは、病理組織学的評価で認められる形態学的変化の信頼できる関連要素であると考えられ、HNSによりITで治療した患者において有用であり得る。これらの変化は、IT投与したタンパク質に対する予想された反応であると考えられ、回復期間後に大部分が消散した。動物モデルによるこれらのデータは、リソソーム蓄積症の神経症状の治療ストラテジーとしてIT療法を追求するための確信を与えるものである。この幼若非ヒト霊長類での毒性学試験は、IT腰椎薬物送達装置によりHNSを小児患者に投与することの実現可能性および忍容性を示している。有害なCNS病理および有害な臨床兆候が見られなかったことは、最近の試験医薬品の書類承認を支持し、また、IT投与したHNSがサンフィリッポA症候群のCNS症状を安全かつ効果的に治療し得ることを示すものであった。材料および方法本実施例に記載されている各種実験で使用された材料および方法の例を以下に記載する。試験計画およびHNS投与サルを無作為に5つの処置群に分けた。群1には処置を施さず埋植物装置対照[DC]、ポートおよびカテーテル、溶媒も被検試料も投与しなかった。群2~5には、0、2.5、7.5または13.8mg/mlのHNSを0.6mLすなわち、0、1.5、4.5または8.3mgの総用量を、EOWでITにより投与した。3か月目に4個体/性別/群の剖検行い中間剖検;6回目の投与の24時間後、投与6か月目に4個体/性別/群3か月目に剖検するDC群を除くの剖検を行い主要剖検:12回目の投与の24時間後、1か月間の回復期間終了時に残りの4個体/性別/群の剖検を行った。剖検時に、選択した組織を採取し、処理して、顕微鏡で観察した。HNSを5mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウムおよび0.005ポリソルベート20pH7.0からなるIT製剤溶媒に溶かして準備した。HNSの隔週投与を、約11分間にわたる短時間注入、すなわち、6mL4分、次いで0.5mLリン酸緩衝生理食塩水PBSによる洗い流し7分で行った。溶媒対照群の個体には、IT製剤のみを投与し、DC個体にはPBSpH7.2をITで投与した。臨床評価臨床兆候および病的状態および死亡の観察を、最初の投与から始めて少なくとも1日2回記録した。手術前、手術当日、試験期間中の週1回および剖検時に体重を測定した。摂餌量を、手術前から始めて毎日モニターした。試験開始前、試験期間中の毎月および剖検前に身体検査心拍数、呼吸、体温、聴診、歩行運動、気性、腹部触診、リンパ節および全般的な外観および神経学的検査意識のレベル、追跡検査を行った。運動機能、大脳反射瞳孔反射、瞬目反射および角膜反射および脊髄反射足感覚反射、膝蓋腱反射、皮膚反射、固有感覚反射および尾部反射も評価した。最初のHNS投与前および中間剖検3か月または主要剖検6か月の前の週に、心電図検査ECG;リードI、IIおよびIIIおよび眼科検査を行った。サルをケタミンHClIM、8mg/kgで鎮静させ、眼を1トロピカミドで散大させて、倒像検眼鏡による眼科検査を行った。臨床病理学血液試料を、試験開始前、IT投与1、3、5、7、9および11の後、回復期中間および剖検時に、血液学および血清化学用に絶食個体から採取した。尿試料を、投与前、投与期間および回復期間の月1回、ならびに剖検前に受け皿から採取した。全細胞計数および化学分析用のCSF試料を、手術時、およびIT投与1、3、5、7、9、11の24時間後、回復期中間、および剖検時に腰椎カテーテルから採取したが、カテーテルの部分的な閉塞により試料が採取されない場合もあった。予想を上回るCSF白血球数が認められたため、3か月投与の5つのCSF試料は、投与前に各群の半数の個体から、また投与の24時間後に残りの個体から採取した。投与直前にCSFの量をあまり変化させないように、投与前の試料採取を投与の少なくとも1日前に行った。6か月個体および回復個体では、全細胞計数および化学分析用に、CSFを投与前に各群の半数の個体から、また投与の24時間後に残りの個体から採取した。閉塞によりカテーテルから試料が採取されない個体では、剖検時に脊椎穿刺大槽を行った。HNS解析HNS解析用の血液試料を、IT投与2、4、6、8、10、12の前および24時間後、回復期中間、および剖検時に末梢静脈から採取した。CSF試料を、IT投与2、4、6、8、10、12の前および24時間後、回復期中間、および剖検時に腰椎カテーテルから採取した。HNS濃度を酵素結合免疫吸着測定により決定した。捕捉抗体はポリクローナルウサギ抗HNSIgG、検出抗体は同じウサギ抗HNSIgGの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートであった。LODは0.22ng/mLであったため、LOQは0.66ng/mLと算出された。血清およびCSF試料を1:100および1:5希釈で二重反復によりスクリーニングし、検量曲線の上限を超えた試料はさらに希釈して再試験した。抗HNS抗体解析抗体解析用の血液を、IT投与2、4、6、8、10、12の約1週間前、回復期中間、および剖検時に末梢静脈から採取した。抗体解析用のCSF試料を、手術時に、およびIT投与2、4、6、8、10、12の約1週間前、回復期中間、および剖検時に腰椎カテーテルから採取した。MesoScaleDiscoveryMSD登録商標技術の電気化学発光ブリッジ試験を抗HNS抗体の検出に用いた。このアッセイは、任意の種の抗HNS抗体およびすべての免疫グロブリンアイソタイプのための一般的な高感度のスクリーニング方法である。LODは5ng/mLであり、試料を1:20希釈で二重反復によりスクリーニングし、有効な100ng/mLのアッセイ感度が得られた。検量曲線の上限を上回った試料はさらに希釈して再試験した。剖検および組織標本作成最後のIT投与の24時間後主要剖検または1か月間の回復期間の終了時回復後剖検に完全剖検を行った。全個体をケタミンHClIM、8mg/kgで鎮静させ、イソフルラン/酸素混合物下で維持し、ヘパリンナトリウム200IU/kgのIVボーラス投与を行った。生理食塩水に溶かした室温の0.001亜硝酸ナトリウムにより、200ml/分の速度で12分間約2400ml、左心室から還流を行った。採取後、組織試料を、病理組織学検査/免疫組織化学解析用には10中性緩衝ホルマリンで固定し、HNS活性の解析用には、ドライアイス上で凍結させて-60°C以下で保管した。脳マトリックスMBM-2000C、ASIInstruments、Inc.、Warren、MIで脳を3mmの冠状スライス厚に切った。最も吻側のスライスをスライス1として、スライスに番号を付した。スライス1、4、7、10、13および16を組織病理用に処理し、スライス2、5、8、11、14および17入手できればを免疫組織化学用に処理した。スライス3、6、9、12および15をHNS活性の解析用に凍結させた。脊髄頸部、胸部および腰部を1cmの切片に切った。最初のスライスと、そこから2枚おきのスライスを病理組織学的評価用に処理し、2番目のスライスと、そこから2枚おきのスライスを免疫組織化学解析用に処理した。3番目のスライスと、そこから2枚おきのスライスをHNS解析用に凍結させた。髄腔内カテーテルの先端部を含むスライススライス0がホルマリンで固定され、組織病理に関して解析されるように、スライスの配分を調節した。約5gの肝臓の重複試料を2つの別々の葉から採取してHNS解析用に凍結させ、約5gの追加の試料を免疫組織化学解析用に固定した。組織病理学脳、脊髄、脊髄神経後根/神経節、坐骨神経、脛骨神経および腓腹神経、全組織リストこの種でのこの期間の前臨床薬物安全性試験に典型的なものおよびあらゆる肉眼的病変を、剖検時に全個体から採取した。全体的な顕微鏡評価用に、組織切片をパラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン以下に記す特殊なすべての染色/包埋法に加えてで染色した。パラフィンブロックで作成した装置対照群、溶媒対照群および高用量群個体の脳切片を、フルオロ-JadeB神経変性の評価の感度を増強する染色およびBielschowsky銀軸索、樹状突起および神経フィラメントを直接可視化することができる処理で染色した。フルオロ-JadeBで染色したスライドを、フルオレセインイソチオシアネートフィルターキューブを用いて、蛍光下で調べた。脊髄を連続的に薄切し、カテーテル先端の位置の切片を含めた頸部、胸部および腰部で横断切片および斜位切片を切り各レベルで1枚のスライスを調べた、馬尾領域からさらに横断切片を切った。脊髄神経後根および神経節中頸部、中胸部および中腰部を処理して調べた。末梢神経坐骨神経、脛骨神経および腓腹神経を縦方向に薄切してパラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシンHEで染色した。横断切片をオスミウムで前固定してSpurr樹脂に包埋し、薄切して2μm、トルイジンブルーで染色した。装置対照群、溶媒対照群および高用量群の脊髄の連続切片、ならびに脊髄神経後根および神経節をBielschowsky銀で染色した。また、これらの群の脊髄切片を、アストロサイトとその突起を直接可視化することができる免疫組織化学染色である抗グリア線維性酸性タンパク質でも染色した。定量分析用の組織抽出物の調製凍結させた脳スライス3、6、9、12および15を、左半球と右半球に分割して分けた。各半球の表面から4mmを測って表面組織を採取し、残りの組織を深部組織とした。存在すれば例えば、スライス6および9が、さらに脳室周囲の試料を冠状スライスから切り取った。脳の半分右側だけを処理した左側は凍結させたままであったため、薄切により得られたのは、スライス1枚当たり2つ~3つの試料、すなわち、右側表面、右側深部および存在すれば右側脳室周囲すなわち、脳室深部;Vdeepであった。小脳および脳幹組織が存在すれば、半球を分割する前に分離して別に処理した。これと同様に脊髄切片を処理し、重量を量り、ホモジナイズした。10mMTris、5mMエチレンジアミン四酢酸、0.1IgepalにAlphaCompleteプロテアーゼ阻害剤微小錠剤RocheDiagnostics、Indianapolis、INを加えて調製した溶解緩衝液1ml/0.25組織g中、TeenALysingMatrixAチューブまたはポリプロピレン製コニカルチューブを用いて組織試料をホモジナイズした。Fastprep-24自動ホモジナイザーMPBiomedicals、Solon、OHまたはPowerGenModel125動力付きホモジナイザーOmniInternational、Kennesaw、GAで試料を40秒間処理した。ホモジナイズした後、試料をエタノール/乾燥氷浴および37°Cの水浴を用いた5回の凍結融解サイクルに供し、次いで、4°Cでの遠心分離により組織破片を沈殿させ、上清をアッセイまで-80°Cで保管した。特異的基質4-メチルウンベリフェリル-α-D-N-スルホグルコサミニドを用いて、2段階の蛍光定量アッセイによりHNS活性を決定した。免疫組織化学のための組織の処理および染色ホルマリン固定した厚さ3mmの各個体の冠状脳スライススライス番号2、5、8、11、14および176枚に、吻側から尾側に向かって1~6までの番号を付した。一般に、スライス1~4には基底核/視床/中脳および大脳が、尾側の2枚のスライスには小脳および脳幹延髄組織が含まれていた。脳、脊髄および肝臓の切片HE染色および各種特殊な染色で用いたものと同じパラフィンブロックのものを、HNSに対して免疫組織化学的に染色した。特異的マウスモノクローナル抗体クローン2C7;MaineBiotech、Portland、MEを用いて、IT投与したHNSの細胞内への取込みを検出し、この試薬により、内因性のカニクイザルHNSとの交差反応性がないことが示された。陰性対照は無関係なマウスIgGを用いて行った。脱パラフィンしたスライドを、一次マウス抗HNS抗体とともに2~8°Cで一晩インキュベートした。二次ヤギ抗マウスビオチン化免疫グロブリンGを加え、37°Cで30分間インキュベートした。アビジン/ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体を加えて、30分間インキュベートした。スライドをペルオキシダーゼ基質のジアミノベンジジン溶液中、所望の染色強度になるまでインキュベートした。核をヘマトキシリンで対比染色した。統計解析体重、体重変化、摂餌量、呼吸数、体温、心拍数、CSF細胞計数、CSF化学、臨床病理学データ、尿データ、ならびに絶対および相対器官重量を、一元配置分散分析、ならびにDunnett検定による装置対照および溶媒対照群と各HNS投与群との比較により解析した。さらに、2つの対照群を統計解析により相互に比較した。解析は、両側5および1の有意性レベルであった。全データを平均±標準偏差で表す。実施例22:ヘパランN-スルファターゼの生体内分布および薬物動態試験本実施例の実験は、ラットにおけるHNSの静脈内または髄腔内単回投与1mg/kgまたは10mg/kg後のHNSの組織分布を決定するために計画された。中でも例えば、これらの実験の目的は、陽電子放射断層撮影PETを用いてラットにおけるHNSの生体内分布BD特性を特徴付けること;異なる経路IVまたはITおよび異なる用量1mg/kgまたは10mg/kgで投与したときのHNSの分布パターンを比較すること;ならびに上記投与レジメンでの各対象器官におけるHNSの薬物動態特性を決定することであった。ラットにおける1mg/kgまたは10mg/kgの124I-HNS静脈内IVまたは髄腔内IT単回投与後の124I-スルファミダーゼHNSの薬物動態PKおよび生体内分布BDプロファイルを組織PET画像法により調べた。最初の20分間の動態像ならびにIVまたはIT投与の0.05IT投与のみ、1、2、4、8、24、48、96および192時間後の静態像から、対象領域における放射活性-時間のデータ得た。4つの各群1mg/kgIV、1mg/kgIT、10mg/kgIVおよび10mg/kgITの4匹のラットを本試験に用いた。IT投与後に頭部、脳脳脊髄液、CSFを含む、脊椎および肝臓領域における放射活性-時間のデータを、またIV投与後に血液、脳CSFを含む、肝臓、腎臓、心臓肺を含むおよび皮膚における放射活性-時間のデータを測定した。データをヨウ素124の崩壊半減期100.2時間により補正し、対象領域における注射量IDまたは画像化した組織1グラム当たりのIDID/gの百分率として表した後、体重200グラムに対して正規化した。対象領域における投与されたタンパク質総量ugまたは濃度μg/gを、対応するIDまたはID/gのデータから計算した。IT投与後の最初の20分間は、1mg/kgおよび10mg/kgにおいて、頭部領域のHNSの総量が0.002/分~0.011/分λzの一定速度で減少した。本報告では、2つの用量間および2つの投与経路間での薬物動態の比較にクリアランス速度および分布容積を用いなかった詳細な情報に関しては結果の節を参照されたい。脳の一定の消失速度は、2つの試験用量で基本的に同じλz:1mg/kgと10mg/kgでそれぞれ0.016/時と0.014/時あり、IT投与の192時間後までの静態像による決定された半減期は、同じ約2日であった。CmaxおよびAUC0-lastまたは0-infinitの値は、投与量に比例していた。これらのIT単回投与レジメンで投与した1~10mg/kgの用量範囲において、直線的なPK挙動が示された。脊椎の近位部分から遠位部分にかけて、濃度勾配が両用量レベルで観察された。IT投与後、肝臓のHNSタンパク質は、1mg/kgのHNSでは96時間後まで、10mg/kgのHNSでは192時間後まで測定可能であった。肝臓中の濃度は、1mg/kgでは2時間後に、10mg/kgでは7時間後にピークに達した。1mg/kgにおける消失は0.030±0.011/時平均λzであり、10mg/kgにおける消失λz:0.017±0/時との間に有意差はなくp=0.10、対応するt1/21mg/kgおよび10mg/kgの用量でそれぞれ28時間と42時間を有していた。IV投与後の肝臓、腎臓、心臓および皮膚における消失半減期は、1mg/kgおよび10mg/kgでそれぞれ、肝臓が47±10時間および38±13時間、腎臓が54±25時間および29±16時間、心臓が36±15時間および42±19時間、皮膚が40±21時間および31±13時間であったのに対し、脳における半減期は71±23時間および60±53時間であった。肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のCmaxの平均値は、1mg/kgでは9.6μg/g、0.30μg/g、0.25μg/g、0.22μg/gおよび0.08μg/g、10mg/kgでは132μg/g、7.9μg/g、3.9μg/g、3.7μg/gおよび1.8μg/であった。各個体のCmax値を用量に対して正規化すると、10mg/kgのCmax/投与の値は、上記すべての器官で1mg/kgの値よりも有意に高かったp値のほとんどが0.05未満、肝臓ではp=0.06。肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のAUClastの値は、1mg/kgでは525時間μg/g、16時間μg/g、14時間μg/g、9時間μg/gおよび7時間μg/gであり、10mg/kgでは6747時間μg/g、276時間μg/g、183時間μg/g、201時間μg/gおよび86時間μg/gであった。正規化後の10mg/kgにおけるAUClast/投与の値は、皮膚では1mg/kgの値よりも有意に高くp<0.01、心臓ではわずかな差が見られp=0.06、肝臓、脳および腎臓では有意な差がなかったp値はすべて0.34を上回った。同じ用量のHNSを注射した場合、髄腔内投与では静脈内投与よりも3logだけ大きい脳曝露量が得られた。脳における消失半減期は、ITでは2日、IV投与では3日であった。しかし、IT投与後の肝臓の曝露量は、同じ用量のHNSでIV投与後の曝露量と同程度であった。1mg/kgおよび10mg/kgのIT/IVによる肝臓での曝露量CmaxおよびAUClastは、0.4~1.2の範囲であった。実験計画中枢神経系CNSは大部分のリソソーム蓄積症に対して弱く、サンフィリッポ症候群A型またはB型ムコ多糖症III、異染性白質ジストロフィーMLDおよびハンター症候群のようないくつかのタイプの上記疾患では重度の損傷を受ける。本明細書に記載されているように、末梢投与した場合は血液脳関門を透過しにくいため、酵素タンパク質をCNS内への直接投与することにより、中枢神経組織での酵素タンパク質の濃度が増加し、さらにその治療効果が増強され得るということが考慮される。本試験では、異なる用量レベルで髄腔内ITまたは大槽投与を調べてIV投与と比較した。PETは非侵襲性の反復可能な定量技術であり、対象器官における薬物濃度の経時的な動的変化がわかる。標的器官血液循環中以外の活性部位における動的な濃度-時間のデータは有用であり、投与薬物の生物活性に直接関連するものである。さらに、動物でのPET試験から得られた組織曝露量に関する情報を、ヒトでの初回投与量の選択の指針として利用することができる。材料および方法被検試料HNS濃度が20mg/mlのヘパリンN-スルファターゼHNSを、145mM塩化ナトリウムを含むpH7.0の5mMリン酸ナトリウム緩衝液中で調製した。この材料をRP-HPLCにより精製して、99.9が二量体であるヘパリンN-スルファターゼを98.7含有させた。HNSをヨウ素124で標識した。試料入手源放射活性画像を、124I-H-N-スルファターゼを1mg/kgおよび10mg/kgでIVおよびIT投与した後のラットから得た。動物16匹の雄Sprague-DawleyラットをCharlesRiverLaboratories社から購入し190±60g、n=16、4群n=4に分けた。上記の各ラット群全4群に対し、異なる用量1mg/kgおよび10mg/kgで単回のIVまたはIT注射を行った。用量および注射量を、各個体の体重に基づき個々に調節した。2つのIV処置群では、35mg/kgの用量のペントバルビタールナトリウムのIV注射により鎮静化を行った。静脈内投与を、尾静脈からボーラス注射で行った。2つのIT処置群では、50mg/kgの用量でペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与してマウスを麻酔した。髄腔内投与を、大槽レベルで環椎後頭膜から1分間にわたって行った。実際に投与された放射活性をPETにより測定し、注射量として用いた。実験方法および/またはアッセイ方法IV注射後に心臓肺を含む、肝臓および腎臓の領域において、IT投与後に頭部領域において、最初の20分間の動態像2分ごとを2つ用量で得た。投与の0.05IT群のみで入手、1、2、4、8、24、48、96および192時間後に、IV処置群では脳脳脊髄液CSFを含む、肝臓、腎臓、心臓肺を含む、筋肉、皮膚および骨を含む領域において、IT処置個体では頭部、脳CSFを含むおよび肝臓の領域において静態像を得た。画像を再構築して、3つの身体断面を1つの画像に融合した。データ解析PETデータを1mL当たり液体または1g当たり組織のナノキュリーnCi数で表した。静態像での脳、肝臓、腎臓、骨格筋、胃、心臓肺を含むおよび皮膚領域の相対活性を得た。IT注射した個体の頭部または脳領域全体の絶対活性を得た。IT注射した個体の脊柱1ミリメートル当たりの放射活性を、3つの選択した断面;近位頸部、中位肝臓上端の背部および遠位タンパク質を含む区画の遠位端から1cmのところの脊椎において決定した。全データを124Iの崩壊半減期100.2時間により補正し、外部で測定された活性による124I源の較正に基づく有効な位置合せ対して正規化した。次いで、データを全領域頭部および脳の注射量IDまたは組織1グラム当たりのIDID/gの百分率として表した後、体重200グラムに対して正規化した[データの正規化:IDまたはID/g/個体体重×200]。各群4個体しか使用しなかったため、正規化を導入してデータのばらつきを低減した。本試験では、各個体に注射したタンパク質投与量を用いて、HNSタンパク質の濃度または量を以下のように計算した:タンパク質濃度μg/g=ID/g×注射量のmg/kg×1000×0.2;対象領域における投与タンパク質の総投与量μg=ID×注射量のmg/kg×1000×0.2、ここで、注射量は1mg/kgまたは10mg/kgであり、0.2は体重に対する正規化係数である。4つの各群の個々の非コンパートメントデータに基づき、群の各PKパラメーターの平均および標準偏差を計算した。Studentのt検定を行って、λz、t1/2、CmaxおよびAUCの値を2つの試験用量間および2つの投与経路間で比較した。統計的有意性は、p値が0.05未満p<0.05であることと定めた。結果下の表、図およびPK解析中のHNSの量μgまたは濃度μg/gを、注射したタンパク質投与量1mg/kgまたは10mg/kgと、対応するIDまたはID/gの値とを乗じることにより計算した。1mg/kgおよび10mg/kgの用量での124I-HNSによる髄腔内処置動態像から得られた頭部領域での投与タンパク質の量μgを、時間の関数として図151にプロットした。静態像から得られた脳領域での濃度μg/gを、時間の関数として図152にプロットした。静態像から得られた、脳および脳領域内の注射したタンパク質の総量μgを、時間とともにそれぞれ図153および図154にプロットした。近位、中位および遠位脊椎の濃度-時間曲線μg/mmを図155~図157に示す。図158は、肝臓中のHNS濃度μg/gの変化を、1mg/kgおよび10mg/kgでの124I-HNSのIT投与後の時間とともに示したものである。総量-時間μgまたは濃度-時間μg/gのデータを非コンパートメントモデルWinNonlin5.2、Pharsight、MountainView、CAにより解析した。一定の消失速度λz、ピーク濃度Cmax、終末相半減期t1/2、血中濃度曲線下面積AUClastおよびAUC0-infなどのPKパラメーターを、各個体のデータから推定した。クリアランス速度および分布容積を推定したが、本報告では、以下のような2つの理由で、2つの用量間および2つの投与経路間でのPK比較には使用しなかった:1本試験は、血中PKではなく固体組織中のHNSの生体内分布に焦点を当てたものであった;2脳領域の放射活性は脳組織固体とCSF液体の放射活性の合計であり、本試験では両者を互いに分離することができなかった。λzは単位時間当たりに消失した注射量の百分率を示すものであったため、これを評価して比較に用いた。群の平均および標準偏差SDを計算し、2つの用量間で比較した。これらのPKパラメーターを下の表48にまとめる。投与後の最初の20分間に、頭部領域のHNSの総量ugが、1mg/kgでは1分当たり0.002~0.011λz、0.005±0.004/分、10mg/kgでは1分当たり0.003~0.0100.007±0.003/分の一定速度で減少した。これら2つの用量レベルの一定の消失速度の間に有意な差は見られなかったp=0.57、図151。脳の濃度-時間曲線μg/g、0.05~192時間は、二相性のプロファイルを示した図152。初期相は約2時間続く。一次速度過程の後に終末相が続く。脳の一定の消失速度は、2つの試験した用量において非常に類似し1時間当たり0.0016±0.003および0.014±0.001、約2日という半減期も類似していた1mg/kgおよび10mg/kgにおいてそれぞれ45±7および49±4時間。ピーク濃度の値257±90および2628±265μg/gおよびAUClast1mg/kgおよび10mg/kgにおいてそれぞれ8393±2457および83962±10083時は、用量を1mg/kgから10mg/kgに増加させると約10倍増加する。上記の観察は、これらのIT単回投与レジメンでの1~10mg/kgの範囲の用量における直線的なPK挙動を示していた。脳ではピーク濃度がIT投与の3分後Tmaxに現れた。脳および頭部領域の総量-時間曲線μg、0.05~192時間は、脳の濃度-時間曲線μg/gで見られたものと同じ二相性のパターンに従っていた図153および図154。脳領域のCmaxの値は、頭部領域の値よりも有意に低かったそれぞれ、1mg/kgでは69±8と200±0、p<0.01;10mg/kgでは836±117と1844±314ug、p<0.01。一定の消失速度は、1mg/kgおよび10mg/kgにおいてそれぞれ、脳では0.017±0.002/時と0.014±0.001/時、頭部領域では0.016±0.002/時と0.010±0.001/時であった。平均残留時間の値は、1mg/kgおよび10mg/kgにおいてそれぞれ、脳では42±5時間と51±5時間p=0.048、頭部では45±7時間と70±9時間p<0.01であった。これらの観察は、投与タンパク質が、低用量において高用量よりも速く両領域から消失することを示していた。HNSの1mg/kgおよび10mg/kgでのIT投与後のこれらの領域における平均半減期は、42~70時間の範囲であった。脊椎の近位部分から中位部分および遠位部分にかけての濃度勾配が両用量レベルで観察されたデータ不掲載。IT投与後に、ピーク濃度μg/脊柱mmが、近位部分では30分前後0~1時間、中位部分では1~4時間24時間である1匹のラットを除く、遠位部分では1~8時間で見られた。これらの部位における半減期には、ばらつきが見られた平均t1/2:1mg/kgおよび10mg/kgにおいてそれぞれ、脊椎の近位部分では32±13時間と45±18時間、中位部分では39±16時間と約50時間、遠位部分では30±12時間と約123時間。1mg/kgおよび10mg/kgの124I-HNSでのピーク濃度の平均値は、これら3つの各部位においてほぼ用量に比例していた脊椎の近位部分、中位部分および遠位部分において、それぞれ0.5μg/mmと6.0μg/mm、0.2μg/mmと0.9μg/mm、0.1μg/mmと0.5μμg/mm。AUClastの平均値は、ピーク濃度で見られたものと同じ比例パターンに従っていた近位部位、中位部位および遠位部位において、それぞれ9.5時間μg/mmと83時間μg/mm、6.8時間μg/mmと35時間μg/mm、2時間μg/mmと38時間μg/mm。ほとんどの末梢器官ではHNSが検出不可能であったが、肝臓においては、IT投与後の早くて1時間後投与後の最初の画像化時点から、1mg/kgでは96時間後4個体のうち3個体まで、10mg/kgでは192時間後全4個体まで測定可能であった図158。肝臓での濃度は、1mg/kgのIT投与の2時間後、10mg/kgのIT投与の7時間後にピークに達し、この後に一次速度過程を伴う消失相が続いた。一定の消失速度は1mg/kgλz:0.030±0.011/時の方が10mg/kgλz:0.017±0/時よりも速くp=0.10、これは1mg/kgの方がt1/2が短い1mg/kgおよび10mg/kgの用量で、それぞれ28±16時間と42±1時間、p=0.76ことに対応していた。1mg/kgのAUClast値は、10mg/kgの値と比べて約40倍減少していたそれぞれ204±50μg/gと7987±3276μg/g。1mg/kgおよび10mg/kgの用量での124I-HNSによる静脈内処置脳、肝臓、腎臓、心臓肺組織を含むおよび皮膚における濃度を、ぞれぞれ図159~図163に示されるように、1mg/kgおよび10mg/kgでのHNSのIV投与後の時間の関数としてプロットした。本試験では、これらの器官の最初の静態像の時点が投与の1時間後であったため、これらの濃度-時間曲線の初期相を観察することはできない。肝臓、腎臓、心臓および皮膚の濃度-時間曲線は、IV投与後の1~8時間では平坦相を示した。脳では、この平坦相が投与後24時間続いたが、このことは、脳が末梢器官よりも時間をかけてIV投与タンパク質を吸収したことを示している。残りのデータは、ほぼ一次速度過程を伴う終末消失相を示していた。肝臓、腎臓、心臓および皮膚における消失半減期は、1mg/kgおよび10mg/kgにおいてそれぞれ、肝臓では47±10時間と38±13時間、腎臓では54±25時間と29±16時間、心臓では36±15時間と42±19時間、皮膚では40±21時間と31±13時間であったのに対し、脳での半減期は、1mg/kgおよび10mg/kgにおいて、それぞれ71±23時間と60±53時間であった10mg/kg群のラット3は、t1/2を決定するためのデータが不十分なため除外した。p値<0.03の腎臓を除くこれらの器官では、1mg/kgの半減期と10mg/kgの半減期との間に統計的な差は見られなかった。肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のCmaxの平均値は、1mg/kgでは9.6μg/g、0.3μg/g、0.25μg/g、0.22μg/gおよび0.08μg/g、10mg/kgでは132μg/g、7.9μg/g、3.9μg/g、3.7μg/gおよび1.8μg/gであった。上記器官における10mg/kgでのCmax値の1mg/kgでの対応する値に対する比は、14、26、16、17および23であった。各個体のCmax値を用量に対して正規化すると、上記の全器官において、10mg/kgにおけるCmax/投与の値は、1mg/kgにおける値よりも有意に高かったp値のほとんどが0.05未満、肝臓ではp=0.06。肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のAUClastの値は、1mg/kgでは525時間μg/g、16時間μg/g、14時間μg/g、9.3時間μg/gおよび7時間μg/g;10mg/kgでは6747時間μg/g、276時間μg/g、183時間μg/g、201時間μg/gおよび86時間μg/gであった。上記器官における10mg/kgでのAUClastの1mg/kgでの対応するAUClast値に対する比はそれぞれ、13、17、13、22および12であった。正規化すると、皮膚では10mg/kgにおけるAUClast/投与が1mg/kgにおける値よりも有意に高くp<0.01、心臓ではわずかな差が見られp=0.06、肝臓、脳および腎臓では有意な差が見られなかったp値はすべて0.34を上回った。これらの観察により、以下のことが示された:1ほとんどの器官における半減期は、脳約3日を除き約2日であった;2肝臓における1グラム当たりの曝露量は皮膚、心臓および腎臓よりも高く、これら3つの曝露量は脳よりも高いかった;3用量が10倍増加すると10/1mg/kg、全試験器官の10mg/kgでのCmax値が1mg/kgでの値よりも10倍増加した。脳では、IV投与の1~24時間後Tmaxにピーク濃度に達した。IV処置とIT処置の比較1mg/kgおよび10mg/kgでのIVおよびIT投与後の脳および肝臓における濃度-時間曲線を、ぞれぞれ図164および図165で比較する。脳におけるIT/IVのCmaxの比は、1mg/kgおよび10mg/kgにおいて、それぞれ3212および1501であった。AUC0-192時間のこの比は1136および978であった。これらの観察は、同じ用量のHNSを注射した場合、髄腔内投与により、脳での曝露量が静脈内投与よりも約3log高い曝露量となることを示していた。脳における消失半減期は、両用量レベルにおいて、IT投与では2日1mg/kgおよび10mg/kgで45時間および49時間、IV投与では3日1mg/kgおよび10mg/kgで71時間および60時間であった。しかし、IT投与後の肝臓における曝露量は、同じ用量のHNSでIV投与後の曝露量と同等であった。肝臓における1mg/kgおよび10mg/kgでのIT/IVのCmaxの比は、それぞれ0.5と0.8、AUClastの比は、それぞれ0.4と1.2であった。結論124I-スルファミダーゼHNSの薬物動態および生体内分布プロファイルを、1mg/kgまたは10mg/kgの124I-スルファミダーゼの静脈内または髄腔内単回投与後のラットにおける組織PET画像により調べた。対象領域における、投与の0.05、1、2、4、8、24、48、96および192時間後の動的最初の20分および静的な濃度-時間データが得られた。IT投与後の動態像では、頭部領域のHNSの総量が、最初の20分間に0.005/分~0.007/分平均λzの類似した一定速度で減少していた。静態像では、脳からの消失速度は、試験した2つの用量で基本的に同じでありλz:1mg/kgおよび10mg/kgでそれぞれ0.016/時と0.014/時、半減期も約2日で同様であった。上記IT単回投与レジメンで投与された1~10mg/kgの用量範囲において、CmaxおよびAUClastの値は投与量に比例し、直線的PK挙動が示された。両用量レベルにおいて、近位脊椎から遠位脊椎にかけて濃度勾配が観察された。IT投与後、近位部分では20分前後で、中位部分では1~4時間で、遠位部分では1~8時間でピーク濃度が見られた。脊椎の異なる部分において、直線的PK挙動も示された。IT投与後、肝臓においては、HNSタンパク質が1mg/kgでは非常に早期から96時間後にかけて、10mg/kgでは非常に早期から192時間後にかけて測定可能であった。消失速度は1mg/kgλz:0.030/時の方が10mg/kgλz:0.017/時よりも速く、これは低用量の方がt1/2が短いことに対応していた1mg/kgおよび10mg/kgの用量でそれぞれ28±16時間および42±1時間。肝臓、腎臓、心臓および皮膚におけるIV投与後の消失半減期は、1mg/kgおよび10mg/kgにおいてそれぞれ、肝臓では47±10時間と38±13時間、腎臓では54±25時間と29±16時間、心臓では36±15時間と42±19時間、皮膚では40±21時間と31±13時間であったのに対し、脳での半減期は、1mg/kgおよび10mg/kgにおいて、それぞれ71±23時間と60±53時間であった。肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のCmaxの平均値は、1mg/kgでは9.6μg/g、0.3μg/g、0.25μg/g、0.22μg/gおよび0.08μg/g、10mg/kgでは132μg/g、7.9μg/g、3.9μg/g、3.7μg/gおよび1.8μg/gであった。各個体のCmax値を用量に対して正規化すると、上記の全器官において、10mg/kgにおけるCmax/投与の値は、1mg/kgにおける値よりも有意に高かったp値のほとんどが0.05未満、肝臓ではp=0.06。肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のAUClastの値は、1mg/kgでは525時間μg/g、16時間μg/g、14時間μg/g、9.3時間μg/gおよび7時間μg/g;10mg/kgでは6747時間μg/g、276時間μg/g、183時間μg/g、201時間μg/gおよび86時間μg/gであった。正規化すると、皮膚では10mg/kgにおけるAUClast/投与が1mg/kgでの値よりも有意に高くp<0.01、心臓ではわずかな差が見られp=0.06、肝臓、脳および腎臓では有意な差が見られなかったp値はすべて0.34を上回った。実施例23:HNSによるサンフィリッポ症候群A型サンフィリッポA患者の治療例えばIT送達による、CNSへの直接投与を用いて、サンフィリッポA患者を効果的に治療することができる。本実施例は、サンフィリッポAの患者に対して、隔週EOW、全40週で、髄腔内薬物送達装置IDDDにより投与する、3用量レベルまでのrhHNSの安全性を評価するために計画された、多施設用量漸増試験を示すものである。ヒト治療に適した髄腔内薬物送達装置の様々な例を、図94~97に図示する。最大20患者まで登録:コホート1:5患者最低用量コホート2:5患者中間用量コホート3:5患者最高用量無作為に5患者を無治療とする。以下の基準を含むか否かに基づき、試験する患者を選択する:サンフィリッポAの小児において、40週間、用量を漸増してIT注射により投与するHNSの安全性を判定する。さらに、認知機能に対するHNSの臨床活性、ならびに単回および反復投与の血清中薬物動態および脳脊髄液CSF中濃度を評価する。NAGLU-IGFIIのIT送達の例実施例24:rhNagluおよびNaglu-IGFIIのinvitro試験サンフィリッポB患者線維芽細胞の2種類の株であるGM02391P359LおよびGM01426E153K、ならびに正常ヒト線維芽細胞系を用いて、Nagluの各変異体による細胞内取込みの機序が研究されてきた。線維芽細胞は、その細胞系でM6P受容体が発現されることを理由に、リソソーム酵素の細胞内取込み試験のために、研究者により伝統的に使用されている。線維芽細胞をrhNagluまたはNaglu-IGFIIとともに37°Cで4時間、インキュベートすることにより、細胞内取込み試験を行った。インキュベーション後に細胞を洗浄して溶解させ、細胞溶解物中のNaglu酵素活性を測定した。rhNagluと線維芽細胞とのインキュベーションでは、細胞内に検出可能な酵素はほとんど見られなかった。これに対し、Naglu-IGFIIと線維芽細胞とのインキュベーションでは、細胞内に顕著なレベルの酵素が見られた図166。内部に取り込まれたNaglu-IGFIIの量は、インキュベーションに用いる酵素の量を増加させるにつれて飽和に達した。用量依存的な取込みの飽和は、受容体介在型の細胞内取込みの典型的な結果である。さらに、Naglu-IGFIIの内部取り込みは、外因性のM6Pによっては阻害されなかったが、外因性のIGFIIによって完全に阻害された図166。この結果は、Naglu-IGFIIの線維芽細胞への内部取り込みが、グリコシル化とは無関係にM6P/IGFII受容体に依存することを示しいていた。また、rhNagluおよびNaglu-IGFIIのリソソームへの輸送を試験する実験も行った。サンフィリッポB患者線維芽細胞GM01426を本試験に使用した。最初にタンパク質と細胞とインキュベートした後に、細胞を抗ヒトNagluポリクローナル抗体で染色することにより、rhNagluおよびNaglu-IGFIIの検出を調べた。LAMP-1リソソーム膜タンパク質1の免疫蛍光染色をリソソームの検出に用いた。rhNagluおよびNaglu-IGFIIのリソソームとの共局在を共焦点顕微鏡により可視化した図167。タンパク質と細胞のインキュベーションの4時間後に、広範なNaglu-IGFIIの内部取り込みが観察され、Naglu-IGFIIとリソソームの共局在が示された。これに対し、同じ時間内でrhNagluの内部取込みは示されず、リソソームとの共局在は観察されなかった。さらにこの結果は、Naglu-IGFIIが細胞内に取り込まれ、適切な細胞区画であるリソソームへ輸送されるという証拠を与えるものであった。内部の取り込まれたNaglu-IGFIIのサンフィリッポB患者線維芽細胞内での半減期は1.5日であると決定されたデータ不掲載。実施例25:マウスモデルでのinvitro試験野生型wtカニューレ処置ラットinvivoでの分子スクリーニングには、サンフィリッポBマウスモデルに加え、欠損動物モデルではないwtカニューレ処置ラットも用いた。カニューレ処置ラットでは、脊髄の上腰部および下位胸部にカニューレを外科手術によりに埋入し、カニューレからCSFへ35μlの単回注射を行った。この動物モデルを用いた分子スクリーニングで評価した基準は、脳および脊髄のNaglu活性アッセイおよび免疫組織化学であった。サンフィリッポ症候群B型マウスモデルサンフィリッポ症候群B型のマウスモデルNaglu-/-マウス、サンフィリッポBマウスはE.Neufeldらにより作製されたLiHHら,PNAS9625:14505-14510;1999。マウスNaglu遺伝子のエクソン6を、選択マーカーのネオマイシン耐性遺伝子の挿入により破壊する。得られたホモ接合体Naglu-/-マウスは完全にNaglu欠損であり図168、全GAGが肝臓および腎臓に蓄積される。Nagluが完全に欠損しているにもかかわらず、このマウスは全般的に健康であり、寿命が8~12か月ある。約5か月齢で他のリソソーム酵素発現の変化が起こり、このような変化としては、肝臓および脳におけるs-ガラクトシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼおよびβ-ヘキソサミニダーゼの代償性増加、肝臓におけるα-L-イズロニダーゼの上昇脳では見られない、ならびに肝臓および脳におけるノイラミニダーゼの減少が挙げられる。通常、尿閉および尿路感染症の結果、死亡する。サンフィリッポBの病理変化を叙述するために、サンフィリッポBマウスモデルが文献中で広く研究されてきた。Naglu-/-マウスのCNS病理に関連する表現型に関しては、4.5か月齢での活動性低下が報告されているが、他の年齢での活動亢進も観察されている。Naglu-/-マウス神経病理変化に関しては、EM電子顕微鏡によるニューロン、マクロファージおよび上皮細胞の空胞および封入体が記載されている。これらの病理変化は通常、33日齢から始まり、マウスの年齢が上がるとともに徐々に悪化する。アストロサイトおよびミクログリア細胞の活性化も組織病理学的解析により示されている。2種類のガングリオシドGM2およびGM3の生化学的分析では、脳における5倍および9倍の増加が示されているGM2およびGM3はNagluの直接の基質ではなく、短時間のERT後に有意な減少を示すことが困難であり得るため、POCのエンドバイオマーカーとして使用されなかった。Naglu酵素活性およびGAGレベルの測定による生化学的分析を行い、また抗ヒトNaglu抗体、抗LAMP-1抗体、抗Iba-1抗体および抗GFAP抗体の免疫組織化学による組織学的解析を行った。本試験で使用した抗ヒトNaglu抗体は、wtマウスの内因性マウスNagluまたはサンフィリッポBマウスの変異Nagluとは結合しないマウスモノクローナル抗体であった。LAMP-1免疫染色では、リソソーム膜タンパク質であるリソソーム膜タンパク質-1と結合する抗体を使用した。Iba-1染色では、ミクログリア細胞およびマクロファージ細胞に特異的なイオン化カルシウム結合アダプタータンパク質と結合する抗体を使用した。GFAP染色では、アストロサイトに特異的なグリア線維性酸性タンパク質と結合する抗体を使用した。サンフィリッポBマウスへの頭蓋内IC注射によるinvivoでの生物活性スクリーニング本試験の目的は、Naglu酵素の生物活性をinvivoで評価することであった。本試験では、サンフィリッポBマウスの脳へのIC注射によりタンパク質を投与した。本試験のためのサンフィリッポBマウスの年齢を8週齢に厳密に一致させた。IC注射経路が、分子の有効性を評価するための最良の計画であった。神経細胞内に取り込まれてリソソーム蓄積を減少させる能力により、Nagluタンパク質を評価した。免疫組織化学を用いて生体内分布を評価した。そして、リソソーム蓄積を、LAMP-1免疫染色法の陽性染色の数および大きさにより特徴付けた。サンフィリッポBマウスの頭蓋から右側大脳皮質への直接注射によりIC注射を行った。各個体に2マイクロリットルまたは35μgのNagluタンパク質を注射した。注射の7日後にマウスを屠殺した。注射の3、7および14日後にマウスを屠殺する予備試験で、屠殺時間を予め定めた。予備試験から、免疫組織化学試験には注射の7日後が最適な時間であることが決定された。脳切片を横断面で切り図169、NagluおよびLamp-1による免疫染色を行った。rhNaglu処置およびNaglu-IGFII処置サンフィリッポBマウスにおけるニューロンおよびグリア細胞の両方への細胞内取込みが、抗ヒトNaglu抗体を用いた免疫組織化学により示された図170および図171。細胞内取込みに関して、rhNaglu処置したサンフィリッポBマウスとNaglu-IGFII処置したサンフィリッポBマウスとの間に有意な差は見られなかった。さらに、rhNaglu処置およびNaglu-IGFII処置マウスの両方の脳組織のLAMP-1免疫染色は、リソソーム蓄積の有意なレベルの減少を示している。rhNaglu処置およびNaglu-IGFII処置群両方におけるリソソーム蓄積減少のレベルは、正常wtマウスとほぼ同じレベルであった。またリソソーム蓄積の減少は、IC注射後にNaglu-TAT、Naglu-KifおよびPerT-Nagluで試験したサンフィリッポBマウスでも観察されたデータ不掲載。本試験により、Nagluのすべての変異体のinvivo生物活性が示された。別の試験では、Naglu欠損マウスに溶媒を、または代わりに、PBSに溶かした組換えNaglu-IgF-II融合タンパク質構築物Nagluを週1回の投与で1回、2回もしくは3回、IT投与した。未処置の野生型マウス群を未処置野性型対照として使用し、Nagluを含まない溶媒を投与した。最後の注射の24時間後にマウスを屠殺した後、免疫組織化学IHCおよび組織病理学解析用に組織標本を作成した。組換えNagluのIT投与後に、Naglu欠損マウス脳組織へのNagluの分布が明らかであった。図172Aに示されるように、Naglu欠損マウスへの組換えNagluのIT投与では、溶媒をIT投与したNaglu欠損マウスに比べて、白質組織における細胞空胞化の広範な減少がもたらされた。同様に、図172Bに示されるように、形態計測学的解析により、処置マウスの白質組織におけるLAMP1免疫染色が、未処置Naglu欠損マウスに比べて顕著に減少していることが明らかとなり、これは疾患病態の改善を示すものである。図173A~173Bに示されるように、評価した脳組織の各領域皮質、尾状核および被殻CP、視床TH、小脳CBLならびに白質WMでは、Naglu処置マウスにおいて、LAMP陽性領域が未処置のNaglu欠損対照マウスに比べて減少し、野性型マウスのLAMP陽性領域にほぼ近かった。Nagluの2回または3回のIT投与後に、解析した脳組織の各領域のLAMP陽性領域が、単回投与に比べてさらに減少していたのは特に注目すべきことである図173A。これらの結果により、IT投与したNagluが、Naglu欠損マウスモデルにおいてサンフィリッポ症候群B型のようなリソソーム蓄積症の進行を変化させることができることが確認され、さらに、IT投与したNagluのような酵素が、サンフィリッポ症候群B型のようなリソソーム蓄積症に伴うCNS発症を治療することができることも確認される。wtカニューレ処置ラットへの髄腔内IT注射による分子スクリーニング本試験は、ポートによる薬物投与アプローチを直接模倣するものである。脳実質内への生体内分布を判定するために、Nagluタンパク質をIT注射によりwtカニューレ処置ラットに投与した。これらのラット内にあるカニューレは、脊髄の上腰部および下位胸部に留置されていた図174。ラットに35μlまたは385μgのrhNaglu、Naglu-TAT、Naglu-IGFIIおよびPerT-Nagluをカニューレから注射した溶解度の限度により、NagluKifは38.5μgしか注射されなかったが、これは他のNagluの10倍少ない。注射の4時間および24時間後に屠殺を行った。脳および脊髄の組織を採取し、Naglu活性アッセイによる測定を行った。処置個体の脳では、Naglu-TATおよびNaglu-IGFII処置個体が、rhNagluおよび他のすべてのNaglu変異体で処置した個体よりも高い活性を示した図175。全般的な傾向として、全処置個体において、脊髄でのNaglu活性の方が脳での活性よりも有意に高かったデータ不掲載。この現象は、IT注射に近い部位ほどタンパク質が多く吸収されたことを示しているのかもしれない。免疫組織化学解析により、IT注射の24時間後のNaglu-IGFII処置群の脳における生体内分布が、他のすべてのNaglu変異体で処置した群よりも広範であることが示された図176および図177。rhNaglu処置個体では、タンパク質が脳の髄膜でのみ観察された。脊髄切片では、IHCにより、灰白質ニューロンでのrhNagluの細胞内取込みがいくらか示されたが、その程度は脊髄ニューロンでのNaglu-IGFII取込みに比べれば、はるかに少なかったデータ不掲載。Naglu-TATをIT注射した群では、脳組織において最も高いNaglu活性が生化学的分析により観察されたが、IHCでは、髄膜に留まっているだけで、脳実質内へのNaglu-TATの浸透は示されなかった。IT注射後の脳でのNagluの細胞内取込みがM6P/IGFII受容体に依存することの有力な証拠である、髄膜を越えた生体内分布が、Naglu-IGFIIを除く他のすべてのNaglu変異体において示されなかった。本試験により、Naglu-IGFIIがサンフィリッポBのための薬物開発のリード分子であることが示された。実施例26:NAGLU-IGFIIを用いた概念実証試験実験計画サンフィリッポBマウスにおけるNaglu-IGFIIのIT注射後の生体内分布およびリソソーム蓄積の逆転の両方を示すための概念実証試験を計画した。本試験では、3群の8週齢のサンフィリッポBマウスをNaglu-IGFIIのIT注射により処置した。各IT注射は、10μl体積または260μgのNaglu-IGFIIであった。処置群は、1回注射群、2回注射群および3回注射の3つであった。1回注射群では、0日目にタンパク質の単回投与を行った。注射の24時間後にマウスを屠殺した。2回注射群では、0日目と7日目に2回のIT注射を行い、最後の注射の24時間後にマウスを屠殺した。3回注射群では、0日目、7日目および14日目にIT注射を行い、最後の注射の24時間後にマウスを屠殺した。3群の溶媒処置マウスも含まれていた。溶媒対照群では、サンフィリッポBマウスに処置群と同じ時間間隔で溶媒を注射し、処置群と同じ方法で屠殺した。試験結果の評価には、生化学的分析および組織学的解析の両方を適用した。生化学的分析には、組織中の酵素量を測定するNaglu活性アッセイおよびリソソーム蓄積の減少を評価する総GAGアッセイが含まれていた。肝臓および脳が生化学的分析の2つの対象組織であった図178および図179。組織学的解析には、形態学的評価のための組織のHE染色データ不掲載、ならびに抗ヒトNaglu抗体、LAMP、IbaおよびGFAPによる免疫組織化学染色IbaおよびGFAP染色は不掲載が含まれていた。本試験で使用した抗ヒトNaglu抗体は、wtマウスの内因性マウスNagluまたはサンフィリッポBマウスの変異Nagluと結合しないマウスモノクローナル抗体であった。AMP-1免疫染色では、リソソーム膜タンパク質と結合する抗体を使用した。Iba-1染色では、ミクログリア細胞およびマクロファージ細胞に特異的なイオン化カルシウム結合アダプタータンパク質と結合する抗体を使用した。GFAP染色では、アストロサイトに特異的なグリア線維性酸性タンパク質と結合する抗体を使用した。Naglu免疫蛍光法の代表的な顕微鏡像を図180に示す。図181には、代表的な脳の断面図が示されている。Naglu-IGFIIは、髄膜に近い大脳皮質内では検出されたが、尾状核、視床および白質のような皮質下領域では見られなかったデータ不掲載。同じ皮質下領域におけるLAMP-1、Iba-1およびGFAPの免疫染色ではリソソーム蓄積の逆転が確かに示されたことから、深部脳領域においてNaglu免疫染色が陰性であったのは、おそらくNaglu免疫蛍光法の感度が原因である考えられた。Lamp-1免疫染色の代表的な顕微鏡像を図182~図186に示す。タンパク質の分布および有効性の程度を示すために、大脳皮質、尾状核、視床および白質のような皮質下領域、ならびに小脳皮質を免疫組織化学解析のために選択した。Iba-1およびGFAP免疫染色の結果からデータ不掲載、LAMP-1免疫染色で見られたものは、ニューロンに加え、サンフィリッポBマウスモデルにおいて冒されることが報告されている2つの細胞型であるミクログリア細胞およびアストロサイトLi,2002,Ohmi2002における変化の複合効果であることが示された。技術的限界により、ニューロンにおけるリソソーム蓄積をLAMP-1免疫染色で明らかにすることはできなかった。ニューロンで空胞および封入体のようなリソソーム蓄積を最も良好に観察するためには、電子顕微鏡法を通常用いる本試験にはEMは含まれていなかった。細胞型の同定がニューロンおよびグリア細胞に限定されていたことが理解されるであろう。ニューロンは一般に、1つ以上の濃染した核小体を含む比較的大型で淡色の核、および頻繁に検出される細胞質により同定された。グリア細胞は一般に、小型で濃い核および目立たない細胞質により同定された。異なる型のグリア細胞、例えばアストロサイト、ミクログリア細胞、上衣細胞およびオリゴデンドロサイトなどの区別は通常、細胞型に特異的なマーカーでの染色により行うのが最も良い。Naglu-IGFIIのIT注射後の大脳皮質、尾状核、視床、白質および小脳において、LAMP-1免疫染色により示されたリソソーム蓄積の減少に加え、ミクログリア細胞の大きさおよび突起の数の減少がIba-1免疫染色により示され、またアストロサイトの細胞の大きさおよび突起の長さ/数の減少がGFAP免疫染色により示されたデータ不掲載。さらに、免疫組織化学で調べたものと同じ領域の脳組織のHE染色ヘマトキシリンおよびエオシンによる組織病理学的解析では、Naglu-IGFIIの3回のIT注射後のグリア細胞内において空胞の減少が示された。また上記の結果はすべて、Naglu-IGFIIのIT注射用量依存的効果も示していた。Naglu-IGFIIのIT注射後のサンフィリッポBマウスの生化学的分析では、Naglu活性が脳および肝臓で検出された。脳および肝臓における総GAGの減少により、Naglu-IGFIIの有効性が示された。免疫組織化学により、脳の実質におけるNaglu-IGFIIの生体内分布が示された。脳の大脳皮質領域だけでなく、脳の皮質下領域である白質および小脳皮質においても、リソソーム蓄積の減少、ミクログリア細胞およびアストロサイトの大きさおよび突起の減少がLAMP-1、Iba-1、GFAPの免疫染色、およびHE染色による組織病理学的解析により示された。結論特に、融合タンパク質のNaglu-IGFIIが、Nagluの天然の基質と同様の構造を有する基質に対してinvitro酵素活性を示すということが示された。invitroの細胞内取込み試験により、この分子が、M6P/IGFII受容体によりM6Pグリコシル化とは無関係に細胞に取り込まれることが示された。内部に取り込まれたNaglu-IGFIIはリソソームと共局在することが示された。Naglu-IGFIIは、サンフィリッポBマウスへのIC注射後にinvitroでリソソーム蓄積を減少させることが示された。Naglu-IGFIIは、rhNagluならびに他のNaglu融合物および改変物に比べて、IT注射後のwtカニューレ処置ラットの脳実質内への浸透において、これらすべてのものよりも優れていた。最後に、サンフィリッポBマウスへのNaglu-IGFIIのIT注射により、髄膜を十分に越えた広範な分布が示され、また大脳皮質および皮質下領域におけるリソソーム蓄積の逆転が観察された。まとめると、これらのデータは、Naglu-IGFIIがサンフィリッポB疾患治療のための候補薬物であることを示している。実施例27:IT送達したNAGLU-IGFIIの毒性、薬物動態PKおよび組織生体内分布試験マウスでの概念実証試験3群n=3のNaglu-/-マウスに、260μgのNaglu-IGFIIを含む10μLを単回ボーラスIT腰椎注射により投与した。260μgの用量は、520mg/脳重量kgの用量マウスの脳=0.0005kgに置き換えられる。1つ目の群では、0日目に注射を行い、注射の24時間後に屠殺を行った。2つ目の群では、0日目と7日目に注射を行い、最後の注射の24時間後に屠殺を行った。3つめの群では、0日目、7日目および14日目に注射を行い、最後の注射の24時間後に屠殺を行った。各Naglu-IGFII投与群を、年齢/疾患重症度に関する対照となる溶媒対照グループと対にした。脳および肝臓におけるNaglu酵素活性は、3つのNaglu-IGFII投与群とも同等であった。rhNaglu酵素活性を肝臓と脳で比較すると、肝臓において10倍以上のrhNaglu酵素活性が見られた。ラットおよび幼若ザルでのピボタルな毒性試験における投与の1か月、3か月および6か月後のrhHNS酵素活性のレベルが、脳および肝臓において同等であったことから、Naglu-/-マウスに投与したrhNaglu用量の一部は、ITではなく全身に送達されたということが考えられた。それでも、3回のIT注射後には、脳における総GAGレベルが統計的に有意な減少を示したp<0.05。肝臓においては、総GAGレベルが減少するという用量依存的傾向が見られ、これは2回または3回投与した群において統計的に有意であったp<0.05。IT注射後のNaglu-IGFIIの生体内分布が、髄膜を十分に越えた脳実質内で観察されたが、深部皮質下領域は抗Naglu抗体による免疫染色で陰性であった。リソソーム膜タンパク質LAMP免疫染色によるリソソーム活性の減少が、2回または3回投与した群でのみ観察された。リソソーム活性が減少した領域には、大脳皮質ならびに尾状核、視床および白質の深部皮質下領域が含まれていた。したがって、Naglu-IGFII投与個体での各種免疫染色パラメーターの減少は、抗NAGLU免疫染色が見られないにもかかわらず、治療レベルのNAGLUが存在し得ることを示していた。2回または3回投与した群においてのみ、アストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質GFAP免疫染色の減少およびミクログリア細胞/マクロファージのイオン化カルシウム結合アダプター分子Iba染色の減少により、炎症性応答の減弱が明らかとなった。解析した領域には、大脳皮質ならびに尾状核、視床および白質の深部皮質下領域が含まれていた。ラットでの試験IT投与したNaglu-IGFIIの毒性学的評価のためのげっ歯類として、S-Dラットを選択した。その結果、16匹のラット雌雄それぞれ8匹に、組換えNaglu-IGFIIを3日おきに、最大投与可能用量MFDならびにMFDの約1/4および1/2それぞれ低用量レベルおよび中用量レベルで、合計8回投与した。単回投与でのPK/生体内分布試験をS-Dラットで行い、雌雄の個体にIT-L投与した後、CSFおよび血清中濃度または組織分布をそれぞれ決定した。Naglu-IGFIIのIT-L投与を、毒性学および安全性薬理学神経、呼吸器および心血管の安全性の観点から雌雄両方の個体で評価するための毒性学試験を計画した。本試験の毒性学的評価には、臨床観察、体重、摂餌量、臨床病理学、適切な安全性薬理学的評価身体検査および心電図検査による、肉眼的組織評価および顕微鏡評価が含まれる。限られた数のCSFおよび血清試料を採取し、Naglu-IGFIIに関して、および被検試料に対する抗体に関して解析する。Naglu-IGFIIの組織分布および細胞内局在を、それぞれ酵素活性アッセイおよび免疫組織化学により定量化する。さらに、選択した試験には、あらゆる重要で顕著な毒性学的所見の可逆性、または遅発性出現の可能性を評価する回復期間が含まれる。サルにおける試験カニクイザルが遺伝的および解剖学的にヒトに類似しており、より適切な種であると考えられたため、IT投与したNaglu-IGFIIの毒性学的評価のためのげっ歯類以外の種としてこれを選択した。サンフィリッポ症候群B型の臨床試験で計画されている患者集団が小児であるため、Naglu-IGFIIの髄腔内薬物送達装置IDDDによる投与に関する慢性の6か月間の毒性学試験を幼若カニクイザルで行う。幼若カニクイザルは一般に、試験開始時の年齢が1歳未満約7~9か月齢であり、試験開始時の体重が900g~1,500gの間である。1か月間の反復投与による幼若カニクイザル毒性試験から得られたデータを、用量レベルの選択および6か月間の幼若ザル試験の計画の指針とする。反復投与毒性学試験は、予想される1~6か月の期間にわたる臨床適用経路IT-Lボーラスおよび投与頻度隔週;EOWを模倣するように計画されている。上記のように、毒性学試験は、Naglu-IGFIIのIT-L投与を、毒性学および安全性薬理学神経、呼吸器および心血管の安全性の観点から雌雄両方の個体で評価するために計画されている。本試験の毒性学的評価には、臨床観察、体重、摂餌量、臨床病理学、適切な安全性薬理学的評価身体検査および心電図検査による、肉眼的組織評価および顕微鏡評価が含まれる。限られた数のCSFおよび血清試料を採取し、Naglu-IGFIIに関して、および被検試料に対する抗体に関して解析する。Naglu-IGFIIの組織分布および細胞内局在を、それぞれ酵素活性アッセイおよび免疫組織化学により定量化する。さらに、選択した試験には、あらゆる重要で顕著な毒性学的所見の可逆性、または遅発性出現の可能性を評価する回復期間が含まれる。実施例28:NAGLU-IGFIIのEOW髄腔内投与本実施例は、Naglu-/-マウスモデルにおいて、EOWで6回の注射でのIT腰椎投与3か月間の試験の実現可能性を判定するために計画されたものである。本投与レジメンは、週1回の投与よりも臨床的に適切であり得る。8週齢のNaglu-/-雌雄マウスを以下の実験計画に従って調べた:肝臓、脳および血清でのNaglu活性アッセイ、血清での抗Naglu抗体アッセイ、ならびに肝臓および脳でのBCAアッセイを含む生理学的試験を行った。脳、脊髄および肝臓でのNagluIHC、ならびに脳および脊髄でのLamp染色を含む組織学的試験を行った。脳、脊髄および肝臓を採取し、10NBFで固定した。5μmのパラフィン切片を組織学的染色用に作成した。Nagluの免疫組織化学的IHC染色を用いて、注射したタンパク質の細胞内取込みを検出した。HE染色を用いて形態学的変化を観察した。リソソームの活性および病的状態の指標であるLAMP、活性化したアストロサイトおよびミクログリア細胞に対する2つのCNS病理マーカーであるGFAPおよびIba-1を、組織病理学的改善の評価に用いた。溶媒処置およびNaglu-IGFII処置マウスの脳、脊髄および肝臓におけるNaglu免疫染色では、脳および脊髄において、注射したNagluが髄膜MでのみIHCで検出され、Naglu陽性染色は他のいずれの領域でも検出されないことが示された図187。肝臓においては、類洞細胞SがNaglu陽性であり、肝細胞HではNaglu取込みが見られなかった。溶媒処置およびNaglu-IGFII処置マウスの肝臓および脊髄におけるLAMP免疫染色およびHE染色では、溶媒処置個体に比べ、Nagluで処置した肝臓および脊髄の両方の全体にわたりLAMP染色が減少していることが示された。HE染色により、処置群では溶媒処置個体に比べ、肝細胞における細胞空胞化が明らかに減少していることが示された図188および図189。溶媒処置およびNaglu-IGFII処置マウスの脳におけるHE染色では、3か月間のNaglu-IGFIIの6回の隔週IT注射後に、脳における形態学的改善が示された。処置群の脳では、全検査領域の細胞空胞化矢印が溶媒群に比べて減少していた図190。3か月間の6回のITNaglu注射後の各種脳領域におけるLAMPIHCでは、SFBマウスへのNagluIT投与により、溶媒処置群に比べ、全検査領域においてリソソーム活性が減少していることがLAMP免疫染色で明らかに示された図190。この減少は、LAMP陽性細胞の数が減少していること、細胞の大きさが小さいこと、および染色が明るいことを特徴とした。他の脳領域に比べて、脊髄に近い脳の尾状核の位置にある小脳および脳幹において顕著な減少が見られた。また、白質、海馬および視床を含めた深部脳領域でも明らかな減少が見られた。3か月間の6回のITNaglu注射後の各種脳領域におけるIbaIHCでは、ミクログリア細胞の活性化が明らかとなった図191。Naglu処置群において、溶媒処置群と比べて、陽性細胞数および染色強度の減少は見られなかった。しかし、検査したすべての脳領域において、陽性ミクログリア細胞の細胞形態が、溶媒群の大型で空胞のある細胞に比べて細胞の大きさが小さくなって変化していた挿入図。3か月間の6回のITNaglu注射後の各種脳領域におけるGFAPIHCでは、アストロサイトの活性化が明らかとなった図192。溶媒処置群に比べて、GFAP陽性染色が小脳および脳幹では減少し、他の検査領域ではわずかに減少していた。細胞内取込みに関しては、これらのデータは、脳および脊髄において、3か月間の6回の隔週NagluIGFIIIT注射の後のみでNagluが髄膜細胞で検出されたことを示している。脳および脊髄の他のいずれの領域でも、NagluはIHCにより検出されなかった。肝臓では、Naglu陽性染色が類洞細胞で見られた。脳および脊髄において、3か月間のNaglu-IGFIIの6回の隔週IT注射後に、IHCでは注射したNagluが検出されなかったが、脳および脊髄全体にわたり組織病理学的改善が見られた。HE染色では、検査したすべての脳領域で細胞空胞化の減少が示された。処置群の脊髄の全体にわたり、および深部脳領域である白質、海馬および視床を含む評価したすべての脳領域で、LAMP染色が減少し、Naglu-IGFII処置群の小脳および脳幹では顕著な減少が見られた。アストロサイトに対するGFAP染色の染色減少パターンは、LAMPほど劇的な減少ではなかったが、LAMP染色と一致していた。Iba-1染色により、検査したすべての脳領域において、ミクログリア細胞の大きさの減少が示された。肝臓では、HE染色により細胞空胞化の減少が示され、Naglu処置群においてはLAMP染色の顕著な減少が見られた。実施例29:サンフィリッポB患者の治療例えばIT送達による、CNSへの直接投与を用いて、サンフィリッポ症候群B型サンフィリッポB患者を効果的に治療することができる。本実施例は、サンフィリッポBの患者に対して、隔週EOW、全40週で、髄腔内薬物送達装置IDDDにより投与する、3用量レベルまでのNaglu-IGFIIおよび/またはrhNagluの安全性を評価するために計画された、多施設用量漸増試験を示すものである。ヒト治療に適した髄腔内薬物送達装置の様々な例を、図94~97に図示する。最大20患者まで登録:コホート1:5患者最低用量コホート2:5患者中間用量コホート3:5患者最高用量無作為に5患者を無治療とする。以下の基準を含むか否かに基づき、試験する患者を選択する:サンフィリッポBの患者において、40週間、用量を漸増してIT注射により投与するNaglu-IGFIIの安全性を判定する。さらに、認知機能に対するNaglu-IGFIIおよび/またはrhNagluの臨床活性、ならびに単回および反復投与の血清中薬物動態および脳脊髄液CSF中濃度を評価する。通常、治療有効量のNaglu-IGFIIおよび/またはrhNagluを、疾患の影響の性質および程度に応じて、髄腔内に定期的および継続的に投与する。ある間隔での投与は、本明細書で使用される場合、治療有効量を定期的に投与することを表す1回投与とは区別される。この間隔は、標準的な臨床技術により決定され得る。いくつかの実施形態では、Naglu-IGFIIおよび/またはrhNagluを、隔月で、月1回、月2回、3週間ごとに、2週間ごとに、週1回、週2回、週3回または毎日、髄腔内に投与する。一個人の投与間隔を固定する必要はなく、個人の必要に応じて徐々に変化させてもよい。例えば、身体的な疾患またはストレス時に、抗Naglu抗体が見られるもしくは増加した場合、または疾患症状が悪化した場合、投与の間隔を減らしてもよい。本明細書に記載の化合物、組成物および方法は、特定の実施形態に従って具体的に記載されているが、後の実施例は単に本発明の化合物を例示するためのものであり、これらを限定することを意図するものではない。本明細書および特許請求の範囲で使用される冠詞aおよびanは、そうでないことが明記されない限り、複数形の指示対象を含むということを理解するべきである。あるグループの1つ以上の要素の間にまたはもしくは、あるいはが含まれる請求項または記載事項は、そうでないことが明記されるかまたは文脈から明らかでない限り、1つ、2つ以上またはすべてのグループの要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する場合に満たされるものとする。本発明は、グループの中の正確に1つの要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する実施形態を含む。また本発明は、グループの2つ以上の要素または全要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する実施形態も含む。さらに本発明は、別途明記されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、列挙されている1つ以上の請求項の1つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、基本請求項に従属する別の請求項にまたは関連する他の任意の請求項として組み込まれるすべての変更、組合せおよび置換を包含するということを理解するべきである。要素が列挙されている場合例えば、マーカッシュ群またはこれと同様の形式において、要素の各下位グループも開示され、任意の要素1つまたは複数がそのグループから除外され得ることを理解するべきである。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むという場合、本発明の特定の実施形態または本発明の特定の態様は、このような要素、特徴などからなる、またはこのような要素、特性などから本質的になるということを理解するべきである。簡潔にするために、これらの実施形態があらゆる場合に正確に本明細書に具体的に記載されているわけではない。本発明の任意の実施形態または態様が、本明細書において具体的に除外されることが記載されているか否かにかかわらず、請求項から明確に除外され得ることも理解するべきである。本発明の背景を説明するために、および本発明の実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書において参照される刊行物、ウェブサイトおよびその他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。"