"サンプル中の核酸の検出方法であって、少なくとも第1及び第2核酸プローブを前記サンプル中の第1及び第2標的核酸にハイブリダイズさせ;酵素と第1発色性基質系を含み前記第1核酸プローブに特異的な第1発色性検出試薬に前記サンプルを接触させ、ここで、該接触は、前記酵素が前記第1発色性基質系に作用して検出可能な第1色素原を生じる条件下でなされ;前記酵素を変性させ;酵素と第2発色性基質系を含み前記第2核酸プローブに特異的な第2発色性検出試薬に前記サンプルを接触させ、ここで、該接触は、前記酵素が前記第2発色性基質系に作用して検出可能な第2色素原を生じる条件下でなされ;及び第1及び第2の検出可能な色素原を検出することを含む方法。前記変性が、変性剤を含む溶液で前記サンプルを処理することをさらに含む請求項1に記載の方法。前記変性剤が、ホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素、又は尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、及びその誘導体からなる群から選択される請求項2に記載の方法。前記変性剤がホルムアミドである請求項2に記載の方法。前記第1核酸プローブが第1ハプテンを含み、前記第2核酸プローブが第2ハプテンを含む請求項1に記載の方法。前記第1ハプテンがDIGとDNPの一方であり、第2ハプテンがDIGとDNPの他方である請求項5に記載の方法。前記第1及び第2発色性基質系が、ジアミノベンジジン、4ニトロフェニルホスフェート、ナフトールホスフェート/ファーストレッド25ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート、ブロモクロロインドリルホスフェート/ナフトールホスフェート、BCIP/NBT、BCIP/INT、テトラメチルベンジジン、22アジノジ3エチルベンゾチアゾリンスルホネート、oジアニシジン、4クロロナフトール、ニトロフェニルβDガラクトピラノシド、oフェニレンジアミン、5ブロモ4クロロ3インドリルβガラクトピラノシド、メチルウンベリフェリルβDガラクトピラノシド、pニトロフェニルαDガラクトピラノシド、5ブロモ4クロロ3インドリルβDグルクロニド、及び3アミノ9エチルカルバゾールを含む系からなる群から選択される請求項1に記載の方法。前記第1発色性基質系が、ファーストブルーBB又はナフトールホスフェート/ファーストレッドの一方であり、前記第2発色性基質系が、ファーストブルーBB/ナフトールホスフェート及びナフトールホスフェート/ファーストレッドの他方から選択される請求項1に記載の方法。前記サンプルが細胞を含む請求項1に記載の方法。前記細胞がスライドに固定される請求項9に記載の方法。前記細胞が組織である請求項9に記載の方法。前記第1及び第2の検出可能な色素原が明視野顕微鏡によって検出される請求項1に記載の方法。前記第1核酸プローブに特異的な前記第1発色性検出試薬が、前記第1ハプテンに特異的な第1抗体と該第1抗体に特異的な第2抗体をさらに含み、ここで前記第2抗体が酵素にコンジュゲートしている請求項5に記載の方法。前記酵素が、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ及びβラクタマーゼからなる群から選択される請求項13に記載の方法。前記第2の核酸プローブに対して特異的な前記第2発色性検出試薬が、前記第2ハプテンに特異的な第1抗体と、該第1抗体に特異的な第2抗体をさらに含み、ここで前記第2抗体が酵素にコンジュゲートしている請求項5に記載の方法。前記酵素が、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ及びβラクタマーゼからなる群から選択される請求項13に記載の方法。前記第1及び第2発色性検出試薬中の前記酵素が同じ酵素である請求項1に記載の方法。前記酵素がアルカリホスファターゼである請求項17に記載の方法。前記第1核酸プローブに特異的な前記第1発色性検出試薬が、前記第1ハプテンに特異的であり、酵素にコンジュゲートしている第1抗体と、前記第2ハプテンに特異的であり、酵素にコンジュゲートしている第2抗体をさらに含む請求項5に記載の方法。前記酵素が、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ及びβラクタマーゼからなる群から選択される請求項19に記載の方法。ハイブリダイズ工程及び接触工程が自動化されている請求項1に記載の方法。酵素と第1発色性基質系を含み第1核酸プローブに特異的な第1発色性検出試薬と;酵素と第2発色性基質系を含み第2核酸プローブに特異的な第2発色性検出試薬と;変性試薬を含んでなるキット。患者における癌を診断し、癌を患ってる患者の予後を提供し、患者における癌の再発の可能性を予測し、癌に対する患者の素因を予測し、又は患者が治療処置の候補であることを示し、癌がALK遺伝子再構成に関連している方法であって、患者サンプルに5及び3ALKブレイクアパートプローブをハイブリダイズさせ;前記5及び3ALKブレイクアパートプローブでのハイブリダイゼーションに関連したシグナルを検出し;融合型非再構成シグナル以外の任意のシグナルを異常なシグナルとしてスコア化し;前記スコアを使用して、前記患者における癌を診断し、前記患者に対する予後を提供し、前記患者における癌の再発の可能性を予測し、癌に対する前記患者の素因を予測し、又は患者が特定の治療法の候補であることを示す方法。前記癌が非小細胞肺癌である請求項23に記載の方法。前記5及び3ALKブレイクアパートプローブが、ALK再構成に関連したブレイクポイントに5又は3のいずれかでハイブリダイズするプローブセットである請求項23に記載の方法。前記5及び3ALKブレイクアパートプローブが、前記5及び3ALKブレイクアパートプローブに対して異なる色素原を用いる発色性検出により検出される請求項23に記載の方法。前記発色性検出が、前記5及び3ALKブレイクアパートプローブに特異的な第1及び第2発色性検出試薬それぞれを用いて5及び3ALKブレイクアパートプローブを検出することを含む請求項26に記載の方法。前記5ALKブレイクアパートプローブに特異的な前記第1発色性検出試薬が酵素と第1発色性基質系を含み、前記5ALKブレイクアパートプローブに特異的な前記第2発色性検出試薬が、酵素と第2発色性基質系を含む請求項27に記載の方法。前記発色性検出が、前記酵素が前記第1発色性基質系に作用して検出可能な第1色素原を生じる条件下で、前記サンプルを前記第1発色性検出試薬と接触させ;前記酵素を変性させ;及び前記酵素が前記第2発色性基質系に作用して検出可能な第2色素原を生じる条件下で前記サンプルを第2発色性検出試薬と接触させることを含む請求項28に記載の方法。前記変性が、変性剤を含む溶液で前記サンプルを処理することをさらに含む請求項29に記載の方法。前記変性剤が、ホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素又は尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、及びその誘導体からなる群から選択される請求項30に記載の方法。前記変性剤がホルムアミドである請求項30に記載の方法。前記酵素がアルカリホスファターゼである請求項28に記載の方法。前記基質がアルカリホスファーゼ基質である請求項33に記載の方法。前記アルカリホスファーゼ基質が、ナフトールホスフェート/ファーストレッド、ナフトールホスフェート/フクシン、ナフトールホスフェート/ファーストブルーBB25ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート、5ブロモ4クロロ3インドリルホスフェート/ナフトールホスフェート、BCIP/ニトロブルーテトラゾリウム、及びBCIP/pヨードニトロテトラゾリウムからなる群から選択される系である請求項26に記載の方法。前記5及び3ALKブレイクアパートプローブが蛍光検出により検出される請求項23に記載の方法。前記5及び3ALKブレイクアパートプローブの少なくとも一つが、シルバーインサイツハイブリダイゼーションにより検出される請求項23に記載の方法。前記5及び3ALKブレイクアパートプローブの一方がシルバーインサイツハイブリダイゼーションにより検出され、前記5及び3ALKブレイクアパートプローブの他方が発色性インサイツハイブリダイゼーションにより検出される請求項23に記載の方法。前記スコア化が、前記サンプル中において約15~75、20~60、25~45、及び27~38の異常なシグナルを有する細胞からなる群から選択されるカットオフ範囲を適用することを含み、ここでカットオフ範囲内のサンプルが、前記患者における癌の診断、前記患者に対する良好な又は不良な予後、前記患者における癌の再発可能性の予測、前記患者の癌に対する素因の予測、又は特定の治療に対して前記患者が候補であることの指標に相関している請求項23に記載の方法。前記カットオフ範囲が適用される場合、前記方法が、90を超え、95を超え、99を超え、又は100からなる群から選択される感度及び/又は特異性を有する請求項39に記載の方法。前記カットオフ範囲に対する理想値からの距離DistanceFromIdealvalueが、≦0.2、≦0.1、及び0からなる群から選択される請求項39に記載の方法。サンプルが前記スコア化に基づきALK再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対する予後を提供することをさらに含む請求項39に記載の方法。サンプルが前記スコア化に基づきALK再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対する診断を提供することをさらに含む請求項39に記載の方法。サンプルが前記スコア化に基づきALK再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対する再発可能性の予測を提供することをさらに含む請求項39に記載の方法。サンプルが前記スコア化に基づきALK再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者の癌に対する素因の予測を提供することをさらに含む請求項39に記載の方法。サンプルが前記スコア化に基づきALK再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対して特定の治療法を提供することをさらに含む請求項39に記載の方法。前記サンプル中において約10~約40の異常なシグナルを有する細胞のカットオフを適用することをさらに含み、ここで、カットオフを超えるサンプルが、前記患者における癌の診断、前記患者に対する良好な又は不良な予後、前記患者における癌の再発可能性の予測、前記患者の癌に対する素因の予測、又は前記患者が特定の治療法に対する候補であることの指標に相関している請求項23に記載の方法。本発明は、発色性インサイツハイブリダイゼーションのためのシステム及び方法、特に単一アッセイにおける2以上の色調検出システム間の干渉を防止する方法に関し、さらにはブレイクアパートプローブを利用するアッセイをスコア化するための方法にも関する。インサイツハイブリダイゼーションは、中期又は間期の染色体調製物における、標的核酸配列を含有するサンプルと、標的核酸配列に対して特異的であるか、又は特異的にハイブリダイズ可能なプローブとを接触させることを含む。スライドは、場合によっては前処理されて、例えば均一なハイブリダイゼーションに干渉するおそれのある、パラフィン固定され、パラフィン包埋された組織に存在するパラフィン又は他の物質が除去される。染色体サンプル及びプローブを双方とも、例えば加熱により処理し、二本鎖核酸を変性させる。ハイブリダイゼーションを生じせしめるのに十分な時間及び条件下で、プローブとサンプルとを組合せる。染色体調製物を洗浄し、過度の標的核酸プローブを除去し、染色体標的の特異的標識を実施する。インサイツハイブリダイゼーション手順の一般的記述については、例えば米国特許第4888278号を参照のこと。蛍光インサイツハイブリダイゼーション、発色性インサイツハイブリダイゼーション及びシルバーインサイツハイブリダイゼーションについての多くの手順が、当該技術分野で知られている。例えばFISHを実施するための手順は、米国特許第5447841号、同5472842号、同5427932号、及び例えばPinkelらProcNatlAcadSci83293429381986PinkelらProcNatlAcadSci85913891421988及びLichterらProcNatlAcadSci85966496681988に記載されている。CISHは、例えばTannerらAmJPathol157146714722000、及び米国特許第6942970号に記載されている。さらなる検出方法は米国特許第6280929号に提供される。インサイツハイブリダイゼーションによるウイルスを検出するための例示的手順は、PoddigheらJClinPathol49M340M3441996に見いだすことができる。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、サンプル中で、少なくとも第1及び第2の核酸プローブを、第1及び第2の標的核酸にハイブリダイズさせることを含む。ついで、サンプルを、第1核酸プローブに特異的な第1の発色性検出試薬に接触させる。発色性検出試薬は、好ましくは酵素と第1の発色性基質を含む。この工程は、酵素が第1の発色性基質において、検出可能な第1の色素原を生成するように作用するのに適切な条件下でなされる。いくつかの実施態様では、第1及び第2の発色性検出試薬は、直接検出用の試薬を含む。いくつかの好ましい直接検出実施態様では、核酸プローブは、好ましくはハプテンで標識される。これらの実施態様では、試薬は、以下に詳細に記載するように、酵素に対する発色性基質及び酵素にコンジュゲートした抗ハプテン抗体を含む。いくつかの実施態様では、第1及び第2の発色性検出試薬は、間接検出用の試薬を含む。いくつかの好ましい直接検出実施態様では、核酸プローブは、好ましくはハプテンで標識される。これらの実施態様では、試薬は、以下に詳細に記載するように、酵素に対する発色性基質及び酵素にコンジュゲートした一次抗ハプテン抗体及び二次抗種抗体を含む。いくつかの好ましい実施態様では、酵素は、第1核酸プローブに特異的な第1発色性検出試薬の適用後に変性される。ついで、サンプルを、第2核酸プローブに特異的な第2発色性検出試薬と接触させる。発色性検出試薬は、好ましくは酵素と第2発色性基質を含む。この工程は、酵素が第2発色性基質において、検出可能な第2色素原を生成するように作用するのに適切な条件下でなされる。ついで第1及び第2色素原は、例えば明視野顕微鏡によって検出される。いくつかの実施態様では、第1及び第2発色性検出試薬は同じ酵素、例えばアルカリホスファターゼである。本発明の例示的方法の模式図を図1に提供する。このシステムは任意のCISHシステムに有用であり、ここでは1以上の標的が所望される。色調検出の順番は可逆的であり、例えば赤色検出が青色検出の前に実施されてよく、またその逆もしかりである。いくつかの実施態様では、システムではブレイクアパートプローブセットが使用される。標的遺伝子がバラバラになった場合、別個の色調シグナルが可視化されるが、プローブが共局在化しているならば、色の組合せが可視化される。変性工程により、第1発色性検出試薬のセットに使用される酵素が、第2発色性基質に作用することが防止される。同様に、これにより、2つの異なる有色色素原の可視化及び検出が改善される。いくつかの好ましい実施態様では、変性剤は、第1の発色性検出試薬セットにおいて酵素を変性させる物質である。いくつかの実施態様では、変性剤は、例えばホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素、又は尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、又はその誘導体である。アルキル置換アミドの例には、限定されるものではないが、Nプロピルホルムアミド、Nブチルホルムアミド、Nイソブチルホルムアミド、及びNNジプロピルホルムアミドが含まれる。いくつかの実施態様では、変性剤はバッファーに提供される。例えば、ホルムアミドは、20mMの硫酸デキストラン、2XSSC、2.5mMのEDTA、5mMのトリス、pH7.4、0.05のブリジ35ラウリルエーテルを含有する10原液、pH7.4を含有するハイブリダイゼーション用バッファーで提供されうる。好ましい実施態様では、サンプルは、第1の標的プローブ検出酵素、例えばアルカリホスファターゼを変性させるのに十分な期間及び条件下で、変性剤で処理される。いくつかの実施態様では、サンプルは、約15~約30分、好ましくは約20~24分、約37°Cで、変性剤で処理される。いくつかの実施態様では、サンプルは、標的酵素を変性させ、第2の核酸プローブの標的へのハイブリダイゼーションを保存するのに十分な期間及び条件下で、変性剤で処理される。本発明の方法及びプロセスを実施するための付加的な試薬及び系を、以下にさらに詳細に記載する。1.核酸プローブ本発明は、一又は複数の標的核酸配列にハイブリダイズする核酸プローブを利用する。核酸プローブは、好ましくはハイブリダイゼーションに適した条件下、例えばインサイツハイブリダイゼーション、サウザンブロット、又はノーザンブロットに適した条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズする。好ましくは、検出プローブ部分は、任意の適切な核酸、例えばRNA、DNA、LNA、PNA、又はその組合せを含み、双方の標準的なヌクレオチド、例えばリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド、並びにヌクレオチド類似体を含むこともできる。LNA及びPNAは、DNAとDNA、又はDNAとRNAの間に形成されるものよりも安定したハイブリダイゼーション複合体を形成する、2つの核酸類似体の例である。LNAとPNA類似体は、化学合成中に、伝統的なDNA及びRNAヌクレオシドと組合せられ、プローブとして使用可能なハイブリッド核酸分子が提供される。LNA及びPNA類似体の使用により、ハイブリダイゼーションパラメーター、例えばハイブリダイゼーション複合体のTmを変更することができる。これにより、標的核酸配列への標的プローブ部分のハイブリダイゼーションに必要な条件と同様又は類似した条件下で、標的核酸プローブの検出標的配列にハイブリダイズする検出プローブの設計が可能になる。適切な核酸プローブは、所望のパラメーター、例えば温度、長さ、GC含有量等に基づき、プローブの選択を最適にする、コンピュータ実行アルゴリズムにより、又は手動で選択することができる。インターネット又はパーソナルコンピューターを介して使用するための、多くのコンピュータ実行アルゴリズム又はプログラムが入手可能である。例えば、標的核酸配列から複数の結合領域を生じさせるために、反復核酸配列を欠く配列領域が、手動で、又はコンピュータアルゴリズム、例えばRepeatMaskerを使用することで同定される。反復部を枯渇した、唯一の特異的プローブを作製する方法は、例えば米国特許出願公開第2001/0051342号及び同2008/0057513号、及び米国特許第61/291750号及び同61/314654号に見いだされる。数個から数百キロベースに及ぶ標的核酸配列、典型的には、実質的又は好ましくは完全に反復のない多くの結合領域において、核酸配列が同定される。いくつかの実施態様では、ハプテンは、例えば、ハプテニル化ヌクレオシドの使用により、核酸プローブに導入される。ハプテンと他のdNTPへの標識をコンジュゲートさせるための方法は、当該技術でよく知られている。手順の例は、例えば米国特許第5258507号、同4772691号、同5328824号、及び同4711955号を参照。実際、多くの標識dNTPが、例えばDetectionTechnologiesから商業的に入手可能である。標識は、ホスフェート又は糖等、dNTPの任意の位置に、直接又は間接的に結合可能である。プローブは、任意の適切な公知の核酸合成方法により合成可能である。いくつかの実施態様では、検出プローブは、ホスホラミダイトヌクレオシド及び/又はホスホラミダイトヌクレオシド類似体を使用し、化学的に合成することができる。例えばいくつかの実施態様では、プローブは、標準的なRNA又はDNAホスホラミダイトヌクレオシドを使用することにより合成される。いくつかの実施態様では、プローブは、LNAホスホラミダイト又はPNAホスホラミダイトのいずれかの、単独で又は標準的ホスホラミダイトヌクレオシドとの組合せを使用して合成される。いくつかの実施態様では、ハプテンは、所望の検出可能部分を有する脱塩基性ホスホラミダイトに導入される。また、検出プローブを合成するための他の方法を使用することもできる。例えば、LNA類似体、又はLNA類似体と標準的なヌクレオチドとの組合せから作製されるプライマーを、プローブの残りの部分の転写に使用することができる。他の例として、検出可能部分を有するプライマーは、プローブの残りの部分の転写に使用することができる。さらなる他の実施態様では、例えば転写又は化学的合成により生成されたプローブのセグメントは、酵素的又は化学的ライゲーションにより、結合させてもよい。多くのハプテンが、検出プローブの検出可能部分に使用されている。このようなハプテン類には、限定されるものではないが、ピラゾール、特にニトロピラゾール;ニトロフェニルK;ベンゾフラザン;トリテルペン類;尿素及びチオ尿素、特にフェニル尿素、及びフェニルチオ尿素;ロテノン、及びここではロテノイドと称されるロテノン誘導体;オキサゾール及びチアゾール、特にオキサゾール及びチアゾールスルホンアミド;クマリン及びクマリン誘導体;ポドフィロトキシン及びポドフィロトキシン誘導体により例証されるシクロリグナン;及びその組合せが含まれる。ハプテンの特定の例には、限定されるものではなが、24ジニトロフェニル、ビオチン、フルオレセイン誘導体、ジゴキシゲニン、5ニトロ3ピロゾールカルバミド、45ジメトキシ2ニトロシンナミド、2キノリン4カルバミド、213ベンゾキシアジアゾール5カルバミド、3ヒドロキシ2キノキサリンカルバミド、4アゾベンゼン4スルホンアミド、ロテノンイソオキサゾリン、2フェノキシアセトアミド、72オキソ2Hクロメン3カルボン酸、2アセトアミド4メチル5チアゾールスルホンアミド、及びpメトキシフェニルピラゾポドフィルアミドが含まれる。これらのハプテン類及びプローブにおけるそれらの使用は、それらの全体が出典明示によりここに援用される共有に係る米国特許出願公開第20080305497号、同20080268462号、及び同20080057513号に、さらに詳細に記載されている。2.発色性検出試薬本発明の方法は発色性検出試薬を利用する。発色性検出試薬は、酵素と、酵素の発色性基質を含有する。酵素は、発色性基質において作用し、有色の検出可能なシグナルを生成する。適切な酵素の例には、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ又はβラクタマーゼが含まれる。発色性検出アッセイに有用な酵素基質及び酵素基質系の特定の例には、限定されるものではないが、ジアミノベンジジン、4ニトロフェニルホスフェート、ナフトールホスフェート、ナフトールホスフェート/ファーストレッド25ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート/ナフトールホスフェート3ナフタレン2カルボキシアミド、ブロモクロロインドリルホスフェート、BCIP/NBT、BCIP/INT、テトラメチルベンジジン、22アジノジ3エチルベンゾチアゾリンスルホネート、oジアニシジン、4クロロナフトール、ニトロフェニルβDガラクトピラノシド、oフェニレンジアミン、5ブロモ4クロロ3インドリルβガラクトピラノシド、メチルウンベリフェリルβDガラクトピラノシド、pニトロフェニルαDガラクトピラノシド、5ブロモ4クロロ3インドリルβDグルクロニド、及び3アミノ9エチルカルバゾールが含まれる。いくつかの好ましい実施態様では、酵素がアルカリホスファターゼである場合、発色性基質系はナフトールホスフェート/ファーストレッド、ナフトールホスフェート/フクシン、ナフトールホスフェート/ファーストブルーBB25ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート、5ブロモ4クロロ3インドリルホスフェート/ナフトールスルファート、BCIP/ニトロブルーテトラゾリウム、及びBCIP/pヨードニトロテトラゾリウムからなる群から選択される。他の適切なアルカリホスファターゼ基質は当該技術分野で知られており、限定されるものではないが、WarpRedTM、バルカンファーストレッド、フェランギブルー、及びベクターブルー、ブラック及びレッドが含まれる。特に好ましい実施態様では、ナフトールホスフェートのジアゾニウム塩は、発色性赤色検出システムに利用される。最も好ましい実施態様では、ファーストブルーBB及びナフトールホスフェート/ファーストレッド発色性検出システムが、同様の組織で利用され、よって、組織サンプルにおいて、2つの標的分子を検出する2色発色性アッセイが提供される。いくつかの実施態様では、酵素は抗ハプテン抗体にコンジュゲートされる。これらの実施態様では、抗ハプテン抗体は、ハプテニル化核酸プローブに結合する。他の実施態様では、付加的な抗体が使用される。例えばいくつかの実施態様では、第1の抗体は、ウサギ、マウス又はヤギ抗ハプテン抗体であり、第2の抗体は、それぞれ酵素にコンジュゲートした抗ウサギ、抗マウス、又は抗ヤギ抗体である。適切なリンカー又は付着化学物質は、米国特許出願公開第2006/0246524号;同2006/0246523号、及び米国仮特許第60/739,794号に記載される。本発明は、抗体の使用を制限しない。任意の適切な抗原結合タンパク質を利用することができる。適切な抗原結合分子の例には、限定されるものではないが、抗体、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子、抗体断片、例えば当該技術分野で知られているF2断片、Fab断片、FabSH断片、及びFab断片、組換え抗体断片2断片、単鎖Fvタンパク質、ジスルフィド安定化Fvタンパク質、ダイアボディ、及びトリアボディ当該技術分野で知られているもの、及びラクダ抗体例えば、米国特許第6015695号;同6005079-5874541号;同5840526号;同5800988号;及び同5759808号を参照が含まれる。3.標的標的核酸分子は、任意の選択された核酸、例えばDNA又はRNAとすることができる。いくつかの実施態様では、標的核酸はスライドに固定された細胞において検出される。いくつかの実施態様では、標的核酸はスライドに固定された組織において検出される。特定の実施態様では、標的配列は、ゲノム標的配列又はゲノムサブ配列、例えば真核生物ゲノム、例えばヒトゲノムからのものである。いくつかの実施態様では、標的核酸は細胞質RNAである。いくつかの実施態様では、標的核酸分子は、病原体、例えばウイルス、最近、又は細胞内寄生体、、例えばウイルスゲノムから選択される。いくつかの実施態様では、標的核酸配列はゲノム配列、例えば真核生物又はウイルスのゲノム配列である。唯一の無反復DNAの少なくとも一部を含む、本質的に任意のゲノム標的配列に相当する標的核酸プローブを、生成させることができる。例えば、ゲノム標的配列は、真核生物ゲノム、例えば哺乳動物、真菌又は細胞内寄生体のゲノムの一部とすることができる。また、ゲノム標的配列はウイルス又は原核生物ゲノム、又はその一部とすることもできる。特定の実施例において、ゲノム標的配列は、感染生物に関連している。いくつかの実施態様では、標的核酸分子は、病気に関連した配列とすることができる。いくつかの実施態様では、病気又は病状に関連した標的配列は、ハイブリダイゼーションの検出は、病気又は病状に関連した情報を推測するのに使用することができるように選択される。ある実施態様では、選択される標的核酸分子は、腫瘍性の病気に関連した標的核酸分子である。いくつかの実施態様では、ゲノム標的配列には、癌に関連した少なくとも1の遺伝子、又は癌に関連した染色体領域が含まれる。いくつかの実施態様では、標的核酸配列は、癌に相関している、染色体構造異常、例えば転座、欠失、又は倍加に関連している可能性がある。いくつかの実施態様では、標的核酸配列は、少なくともいくつかの腫瘍性細胞において倍加又は欠失しているゲノム配列を含む。標的核酸配列は、実質的に、全体長において、少なくとも20塩基対長さ、少なくとも100塩基対長さ、少なくとも1000塩基対長さ、少なくとも50000、少なくとも100000、又は少なくとも250000塩基対の大きさで変化しうる。標的核酸配列は、任意の数の塩基対に及ぶことができる。いくつかの実施態様では、標的核酸配列は、少なくとも10000、少なくとも50000、少なくとも100000、少なくとも150000、少なくとも250000、又は少なくとも500000の塩基対長さである。具体例において、標的核酸配列が真核生物ゲノムからのものである場合、標的配列は、典型的には生物体のゲノムの小さな部分の20未満、10未満、5未満、2未満、又は1未満を表す。いくつかの例において、標的配列が感染生物からのものである場合、標的配列は、感染生物のゲノムの全て又はより大きな割合を表すことができる。特定の非限定例においては、腫瘍に関連した標的核酸配列が選択される。多くの染色体異常が、腫瘍細胞、特に癌細胞、例えばB細胞及びT細胞白血病、リンパ腫、乳癌、結腸癌、胃癌、食道癌、神経性の癌において同定されている。よって、いくつかの例において、標的核酸配列の少なくとも一部は、サンプル中の細胞の少なくともサブセットにおいて倍加又は欠失している。癌遺伝子に関連した転座は、いくつかのヒト悪性腫瘍について知られている。例えば、染色体18q112のブレイクポイント領域に位置するSYT遺伝子に関与する染色体再構成は、滑膜軟組織腫瘍においては一般的である。t転座は、例えば異なる標識を有するプローブを使用して同定することができ、第1のプローブは、SYT遺伝子から遠位的に伸長する標的核酸配列から生じる核酸分子を含み、第2のプローブは、SYT遺伝子に対して3又は近接して伸長する標的核酸配列から生じる核酸を含む。これらの標的核酸配列に対応するプローブが、インサイツハイブリダイゼーション手順に使用される場合、SYT遺伝子領域にtを欠く正常細胞は、2つの融合シグナルを示し、SYTの2つの無傷コピーを反映する。tを有する異常細胞は、単一の融合シグナルを示す。腫瘍形質転換に関与する遺伝子倍加の多くの例が観察されており、開示されたプローブを使用するインサイツハイブリダイゼーションにより、細胞遺伝学的に検出することができる。一例において、選択された標的核酸配列は、一又は複数の悪性腫瘍において倍加した遺伝子を含む。例えば、cerbB2又はHER2/neuとしても公知のHER2は、細胞成長の調節における役割を担っている遺伝子である。遺伝子はチロシンキナーゼファミリーのメンバーである、185kdの膜貫通細胞表面レセプターをコードしている。HER2はヒトの乳癌、卵巣癌、胃癌及び他の癌において増幅している。よってHER2遺伝子は、ゲノム標的核酸配列として使用可能であり、HER2に対して特異的な結合領域を有する核酸分子を含むプローブが生成される。他の例においては、悪性細胞において欠失している腫瘍抑制遺伝子である標的核酸配列が選択される。例えば、染色体9p21に位置するp16領域、p14、D9S1748、p15、及びD9S1752は、ある種の膀胱癌で欠失している。染色体1の短腕の遠位領域、及び染色体19の動原体周囲領域に含まれる染色体欠失は、中枢神経系のある種の固形腫瘍の特徴的分子特色である。従って、いくつかの実施態様では、本発明はブレイクアパートプローブセットを提供する。いくつかの実施態様では、ブレイクアパートプローブセットは、染色体転座に対する公知のブレイクポイントに一方の側でハイブリダイズする第1のプローブ、及び公知のブレイクポイントの他方の側でハイブリダイズする第2のプローブを含む。転座が検出可能なように、ブレイクアパートプローブセットの各プローブに対して、種々の発色性検出試薬が利用される。ブレイクアパートプローブセットの例には、限定されるものではないが、粘膜関連リンパ組織、未分化リンパ腫キナーゼ、ETS関連遺伝子、及びアンドロゲン関連再構成パートナー様TMPRSS2で、前立腺癌を示唆するものが含まれる。上述の例は、単に例証目的でのみ提供されるものであり、制限することを意図したものではない。腫瘍の形質転換及び/又は成長に相関する多くの他の細胞遺伝学的異常は、当業者には知られている。また、腫瘍の形質転換に相関しており、開示された方法において有用であり、開示されたプローブが調製可能な標的核酸配列には、EGFR遺伝子、CMYC遺伝子、D5S271、リポタンパク質リパーゼ遺伝子、RB1、p53、NMYC、CHOP、FUS、FKHR、並びに例えば:ALK、Ig重鎖、CCND1、BCL2、BCL6、MALF1、AP1、TOP2A、TMPRSS、ERG;ETV1、EWS;FLI1、PAX3、PAX7、AKT2、MYCL1、REL、及びCSF1Rが含まれる。開示された標的核酸プローブ又は方法は、外来遺伝子の少なくとも任意の1つを含有するそれぞれのヒト染色体の領域を含む。例えば、いくつかの開示されたプローブ又は方法用の標的核酸配列は、外来遺伝子の任意の一つ、及び十分に付加的な近接ゲノム配列を、全体で少なくとも100000塩基対、又は全体で100000~50000塩基対含む。ある種の実施態様では、標的核酸分子に特異的なプローブを、染色体数の指標を提供する第2のプローブ、例えば染色体特異性プローブとの組合せでアッセイする。例えば、少なくともHER2遺伝子を含有する染色体17の領域に特異的なプローブは、染色体17のセントロメアに位置するアルファサテライトDNAにハイブリダイズする染色体17プローブと組合せて使用することができる。CEP17プローブの包含により、相対コピー数のHER2遺伝子が測定できるようになる。例えば通常のサンプルは、2未満のHER2/CEP17比率であるが、HER2遺伝子が倍加されているサンプルは、2以上のHER2/CEP17比率を有するであろう。同様に、任意の他の選択されたゲノム標的配列の位置に対応するCEPセントロメアプローブも、同様染色体における唯一の標的に対するプローブと組合せて使用することができる。他の例において、標的核酸配列は、病気又は病状と関連したウイルス又は他の微生物から選択される。細胞又は組織サンプルにおける、ウイルス又は微生物誘導性標的核酸配列は、生物体の存在の指標となる。例えば、プローブは、癌遺伝子又は病原体ウイルス、細菌又は細胞内寄生体、クリプトスポリジウムパルバム、赤痢アメーバ、及びランブル鞭毛虫、並びにトキソプラズマ、エイメリア、タイレリア、及びバベシア種のゲノムから選択することができる。いくつかの例において、標的核酸配列はウイルスゲノムである。例示的なウイルス及び対応するゲノム配列には、ヒトアデノウイルスA、ヒトアデノウイルスB、ヒトアデノウイルスC、ヒトアデノウイルスD、ヒトアデノウイルスE、ヒトアデノウイルスF、ヒトアストロウイルス、ヒトBKポリオーマウイルスヒトボカウイルス、ヒトコロナウイルス229E、ヒトコロナウイルスHKU1、ヒトコロナウイルスNL63、ヒトコロナウイルスOC43、ヒトエンテロウイルスA、ヒトエンテロウイルスB、ヒトエンテロウイルスC、ヒトエンテロウイルスD、ヒトエリスロウイルスV9、ヒト泡沫状ウイルス、ヒトヘルペスウイルス1、ヒトヘルペスウイルス2、ヒトヘルペスウイルス3、ヒトヘルペスウイルス41型、ヒトヘルペスウイルス42型、ヒトヘルペスウイルス5菌株AD169、ヒトヘルペスウイルス5菌株メルリン菌株、ヒトヘルペスウイルス6A、ヒトヘルペスウイルス6B、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8M型、ヒトヘルペスウイルス8P型、ヒト免疫不全ウイルス1、ヒト免疫不全ウイルス2、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス-1、ヒトパピローマウイルス-18、ヒトパピローマウイルス-2、ヒトパピローマウイルス-54、ヒトパピローマウイルス-61、ヒトパピローマウイルス-cand90、ヒトパピローマウイルスRTRX7、ヒトパピローマウイルス10型、ヒトパピローマウイルス101型、ヒトパピローマウイルス103型、ヒトパピローマウイルス107型、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス24型、ヒトパピローマウイルス26型、ヒトパピローマウイルス32型、ヒトパピローマウイルス34型、ヒトパピローマウイルス4型、ヒトパピローマウイルス41型、ヒトパピローマウイルス48型、ヒトパピローマウイルス49型、ヒトパピローマウイルス5型、ヒトパピローマウイルス50型、ヒトパピローマウイルス53型、ヒトパピローマウイルス60型、ヒトパピローマウイルス63型、ヒトパピローマウイルス6b型、ヒトパピローマウイルス7型、ヒトパピローマウイルス71型、ヒトパピローマウイルス9型、ヒトパピローマウイルス92型、ヒトパピローマウイルス96型、ヒトパラフルエンザウイルス1、ヒトパラインフルエンザウイルス2、ヒトパラインフルエンザウイルス3、ヒトパレコウイルス、ヒトパルボウイルス4、ヒトパルボウイルスB19、ヒト呼吸器多核体ウイルス、ヒトライノウイルスA、ヒトライノウイルスB、ヒトスプマレトロウイルス、ヒトT-リンパ球向性ウイルス1、ヒトT-リンパ球向性ウイルス2が含まれる。ある種の例では、標的核酸配列は、癌遺伝子ウイルス、例えばエプスタインバーウイルス又はヒトパピローマウイルスからのものである。他の例では、標的核酸配列は病原体ウイルス、例えば呼吸器多核体ウイルス、肝炎ウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス、又は単純ヘルペスウイルスからのものである。4.サンプルを分析するための方法いくつかの実施態様では、本発明は、サンプルの分析、ハイブリダイゼーション及びシグナルプロセシング及び検出のための方法を提供する。これらの方法は、特にサンプルに適用され、ここでブレイクアパートプローブセットが、サンプル中の遺伝子の再構成、例えばALK遺伝子の再構成を検出するために使用される。ブレイクアパートプローブセットは、一般的に、再構成に関連インサイツ例えばブレイクポイントに対してそれぞれ5及び3である、標的配列領域を指向する、少なくとも5及び3プローブセットを含む。いくつかの好ましい実施態様では、プローブは、それらが異なる色調の色素原、例えば青色及び赤色色素原又は色素原と銀の組合せで検出されるように標識される。例として、非小細胞肺癌においてALK再構成を使用すると、再構成されていない配列ALK遺伝子は、紫色のシグナル、又は場合によってはわずかに分離した赤色と青色のシグナルとして可視化される、赤色と青色の色素原の融合シグナルを示す。ALK遺伝子が再構成されている場合、赤色及び青色のシグナルは分離している。ISH結果の臨床的使用は、好ましくは広いカットオフ範囲にわたる感度及び特異性により決定されるような、方法のロバスト性に依存し、ここでカットオフは、再構成が存在する場合のスコアである、サンプル内の細胞のパーセンテージである。本発明は、臨床サンプルに容易に適用され、自動化に適したロバスト試験を提供する。本発明の方法において、サンプル中の細胞は、融合シグナル又は異常シグナルを有する場合にスコア化される。好ましい実施態様では、融合シグナル以外の任意のシグナルの存在は、異常としてスコア化される。このような異常シグナルの例には、シグナルの分割、5シグナルの損失、3シグナルの損失、融合及び分割の組合せ等が含まれる。このシステムは、異常シグナルが別々に分類されるシステムと比較して、かなり単純である16931703EunheeらJThorOnc6459465を参照。驚くべきことに、本発明の方法は、臨床サンプルからのRNA及びタンパク質発現データと比較して、広範囲のカットオフで100特異性及び感度を提供する。複数のALKインヒビターは、ALK再構成を用いた、NSCLCを処置するための癌用薬剤として開発されている。本発明の方法は、ALKインヒビターも用いた処置に適切な患者を同定するのに有用である。いくつかの実施態様では、5及び3ALKブレイクアパートプローブは、患者のサンプルにハイブリダイズし、例えば5プローブ用に1色、3プローブ用に1色生成する、発色性検出システムを用いて検出される。上述したように、サンプルは分析され、サンプル内の細胞が、正常な融合シグナル又は異常なシグナルを有する場合にスコア化され、ここで異常なシグナルは、正常な融合シグナル以外の任意のシグナルである。異常なシグナルを有し、細胞の約15~75、20~60、25~45、及び27~38からなる群から選択されるカットオフ範囲に入る異常なシグナルを有するサンプルは、ALK再構成に対してポジティブであるとスコア化される。いくつかの実施態様では、ポジティブサンプルが取られた患者は、ALKインヒビターを用いた処置の対象であると同定されている。いくつかの実施態様では、ALKインヒビターが患者に投与される。実施例1この実施例は、アルカリホスファターゼを変性させ、続く第1の発色性検出反応に必要な時間に関するデータを提供する。抗DIG抗体抗マウスAP抗体ブロック赤色検出ブロック抗DNP抗体抗ウサギAP抗体赤色検出実施例2この実施例は、いくつかの異なる2色CISHプロトコルからのデータを提供する。データには、ブロック工程後、青色発色性沈殿物が残存していることが示されており、37°Cでの付加的なブロック工程は、第1の検出システムからの有色沈積物に悪影響を及ぼさなかった。ブロック工程が使用される場合、青色及び赤色のISHシグナルの双方がはっきりと生成され、近接近しているプローブは、紫色の組合せた色調を生じせしめた。DIG標識5ALKプローブ及びDNP標識3ALKプローブの同時ハイブリダイゼーション実施例3ホルムアミドを用いた変性工程を、2色検出プロトコルにおいて、いくつかのプローブセットを使用した。図2は、ブロック工程が2つの異なる色調検出システムで使用されない場合の、明視野ブレイクアパートインサイツハイブリダイゼーションの色調概略図を示す写真を提供する。図3は、APベースの2色インサイツハイブリダイゼーションシグナルにおける、ブロック工程の影響を示す、例示的写真を提供する。図3は、ブロックが色調検出システム間で使用される場合に、バックグランド染色が大きく低下することをさらに例証する。物質及び方法ALK及びMALT1プローブの設計。ブレイクアパートアッセイを、ALK遺伝子座の配列を評価するように設計した。2つの無反復プローブを生成させ、ALK遺伝子の隣接セントロメア領域及びテロメア領域にハイブリダイズさせた。生物情報学的ツールを使用し、反復エレメントを除去した。プライマー3プログラムを使用し、領域を横切る唯一の配列に対してプライマーを設計した。設計されたPCR断片及びプライマーを、ヒトゲノムに対する類似性について分析し、ヒトBLAT及びBlastntプログラムにより転写した。他の領域に対する高度な類似性を示す断片を除外し、全てのPCR断片を、配列決定により検証した。5ALKプローブに対するPCR断片をライゲーションし、ランダム増幅させ、ジゴキシゲニンにコンジュゲートしたdUTPを使用するニックトランスレーションにより標識した。同様に、3ALKプローブを、24ジニトロフェニルにコンジュゲートしたdCTPを使用するニックトランスレーションにより標識した。同じ技術を適用することにより、MALT1ブレイクアパートプローブを、MALT1遺伝子の公知のブレイクポイント領域に隣接する、693kbのテロメア領域、及び~500kbのセントロメア領域をカバーするように設計した。反復枯渇した5MALT1プローブをDNPで、3MALT1プローブをDIGで、それぞれ標識した。ALK及びMALT1プローブ特異性試験。5及び3ALKのDNAプローブの種子を、Vysisニックトランスレーションキットを使用し、スペクトルグリーンdUTPを用いて個々に標識し、NucAwayスピンカラムを使用して精製し、5DIG標識ALKプローブ及び3DNP標識ALKプローブと同様の緊縮性で処方した。VysisCEP2スペクトルオレンジ標識プローブを使用し、5ALKスペクトルグリーン標識プローブ及び/又は3ALKスペクトルグリーン標識プローブを評価するために、同容量のCEP2オレンジ色プローブと5ALK緑色プローブを、アルコール脱水後に、比較ゲノムハイブリダイゼーション中期御トロールスライドに適用した。標的中期のプローブを84°Cで同時変性させ、密封された加湿チャンバー内にて、42°Cで一晩ハイブリダイズさせた。2XSSCを用い、72°Cで2分、緊縮洗浄を実施し、空気乾燥後にDAPIIIでカバースライドをかけた。ALKプローブと同様、5及び3MALT1DNAプローブの種子を、スペクトルグリーンdUTPで個々に標識し、ALKプローブと同様の方式で、VysisCEP18スペクトルオレンジプローブに対する、それらの共局在性を評価した。適切なフィルターを具備するZeissAxioskop蛍光顕微鏡を使用し、SPOTCCD顕微鏡デジタルカメラにて写真を撮った。コントロール及び試験臨床組織サンプル。常套的にプロセシングされ、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された扁桃腺のサンプルを、共局在化した5及び3ALK又はMALT1プローブセットを可視化するための、ネガティブコントロールとして使用した。記録されたALCL及びMALTのリンパ腫のケースを、それぞれALK又はMALT1baISHアッセイの性能試験により分析した。組織ブロックを4μmに切断し、荷電したガラススライド上に配した。自動化された明視野ブレイクアパートインサイツハイブリダイゼーションプロトコル。明視野インサイツハイブリダイゼーションALK及びMALT1遺伝子のブレイクアパートアッセイについての、全ての最適化及び性能評価を、BenchMarkXT自動化スライドプロセシングシステムを用いて実施した。対比染色に対するベーキングからの全ての工程を、中断なしに実施可能なように、baISH機器ソフトウェアを作製した。機器においてスライドを65°Cで20分ベーキングし、その後LiquidCoverslipTMプライムドEZPrepTM脱パラフィン工程を実施した。1xの反応用バッファーを用いた加熱処理と、ISHプロテアーゼ2又はISHプロテアーゼ3を用いた組織消化の組合せにより、DNA標的を回収した。5及び3ALK又はMALTプローブの混合物を、Ventanaハイブリダイゼーション用バッファーにおいて、ヒト胎盤DNAと共に処方した。プローブと標的DNAを85°Cで20分同時変性させ、44°Cで5時間ハイブリダイゼーションを実施した。緊縮洗浄工程を、2XSSCを用い、72°Cで実施した。ALK及びMALTbaISH適用の双方にとっての、ISHシグナル検出のシーケンスを、青色検出、続いて赤色検出を用いて実施した。DIGハプテンをマウス抗DIG抗体で標識し、DIG抗体をAPコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体と反応させ、AP酵素をファーストブルーで着色させた。ついで、AP酵素をハイブリダイゼーション用バッファーを用いて30分変性させた。2XSSCを用いてスライドを洗浄させた後、第2のISH検出を実施した。DNPハプテンをウサギ抗DNP抗体で標識し、DNP抗体をAPコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体と反応させ、AP酵素をファーストレッド検出で着色させた。全てのスライドを、ヘマトキシリンII及び青化試薬で対比染色した。対比染色されたスライドを、スライドを洗浄するために、DAWNを含有する蒸留水ですすいだ。最後に、空気乾燥されたスライドに、TissueTekフィルムカバースライドをかけた。baISHスライドを分析し、ニコンデジタルカメラDSFi1を具備するNikonECLPSE90i顕微鏡を用いて写真を撮った。結果及び分析ALK及びMALTプローブ特異性5及び3ALKのDNAプローブの染色体2への局在化。スペクトルグリーン、及びVysisCEP2スペクトルオレンジでニックトランスレーションされた5又は3ALKのDNAプローブの同時ハイブリダイゼーションを、正常なリンパ球中期展伸において実施した。5ALK緑色プローブとVysisCEP2オレンジ色プローブを同じ染色体に局在化させると、予期するように、5ALKプローブが染色体2の短腕に検出された。3ALK緑色プローブ、及びVysisCEP2オレンジ色プローブも、同じ染色体に局在化させると、3ALKプローブが染色体2の短腕にハイブリダイズした。5ALK緑色プローブ又は3ALK緑色プローブのいずれかと、他の染色体とのクロスハイブリダイゼーションは、観察されなかった。よって、5及び3ALKプローブの、正常なリンパ球中期展伸における、標的配列に対する独立した特異性が示された。5及び3MALT1のDNAプローブの染色体18への局在化。スペクトルグリーン、及びVysisCEP18スペクトルオレンジでニックトランスレーションされた5又は3MALT1のDNAプローブのハイブリダイゼーションを、正常なリンパ球中期展伸において実施した。5MALT1緑色プローブとVysisCEP18オレンジ色プローブを、染色体18の長腕に局在化させた。3MALT1緑色プローブ、及びVysisCEP18オレンジ色プローブも、染色体18の長腕に局在化していることが示された。5MALT1緑色プローブ又は3MALT1緑色プローブのいずれかと、他の染色体とのクロスハイブリダイゼーションは、観察されなかった。よって、5MALT1及び3MALT1プローブの、染色体18における、標的配列に対する特異性が示された。ALK及びMALT1明視野ブレイクアパートISH性能扁桃腺における正常なALK及びMALT1遺伝子。ホルマリン固定され、パラフィン包埋された扁桃腺切片における各プローブの性能を確認するために、5ALKプローブの青色検出及び3ALKプローブの赤色検出を別々に実施した。12の青色又は赤色ドットは、正常の扁桃腺細胞において観察されるため、我々は、5ALK及び3ALKプローブが正しくDNA標的にハイブリダイズしており、APベースのISH検出を使用し、各標的に対して適切な感度が達成されていることを確認した。ALKbaISHが正常な扁桃腺切片で実施されている場合、5ALKプローブ及び3ALKプローブは同時局在化しており、紫色ドットとして、青色及び赤色ドットの重複が生じた。よって、この観察により、5及び3ALKプローブの双方が、標的DNA配列に成功裏にハイブリダイズしていることが確認された。正常な扁桃腺細胞において、青色又は赤色のみのドットを示す、いくつかの細胞が存在することを記しておくべきである。全細胞におけるISHアッセイとは異なり、組織切片でのDNAISHにおいて、多くの細胞は、組織切片内に部分的に現れるのみである。また、3MALT1プローブに対する青色検出及び5MALT1プローブに対する赤色検出を、正常な扁桃腺切片における各プローブのアッセイ性能を試験するために、別々に実施した。ALKプローブを用いて見られるように、正常な扁桃腺細胞の核には、12の青色又は赤色MALT1ISHシグナルが存在した。よって、我々は、5及び3MALT1プローブが、自動化されたISHプロトコルを用いて正しい標的配列と認識し、各MALT1プローブハイブリダイゼーションに対する感度が十分であることを確認した。3MALT1及び5MALT1プローブは、baISHにおいて共に試験され、アッセイでは、扁桃腺切片において青色と赤色とが重複した結果として、紫色ドットのシグナルが生じた。ALKbaISHアッセイにおいては、青色又は赤色のISHシグナルのみを含む、正常な扁桃腺細胞が存在した。上述したように、この現象は、スライスされた組織切片における部分的細胞の故である。このことは、FISHベースの融合シグナル及びブレイクアパート/スプリットシグナルアッセイにおける問題点である。融合シグナルISH及びブレイクアパートISHアッセイには、擬陽性及び擬陰性のバックグランドが常に存在するであろう。APベースのシグナルの組合せは、種々のブロック法を使用することにより、免疫組織化学適用において多重化しており、2つのISHアッセイ間の熱処理が効果的である。しかしながら、2つのプローブの混合物を使用する、明視野2色ISH適用について、2つのAP検出間の熱ブロック工程により、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションが変性する。よって、我々は、別のブロック法を見つける必要がある。我々は、プローブとDNA標的との間の特異的ハイブリダイゼーションを保存しつつ、ハイブリダイゼーション用バッファーが、AP酵素用のブロック/変性試薬として有用であることを観察した。リンパ腫における転座したALK及びMALT1遺伝子。ALK及びMALT1遺伝子に対する明視野baISHを、それぞれALKALCL及びMALTリンパ腫のケースに適用した。紫色のドットに見える、重複した青色及び赤色のALKISHシグナルが、ホルマリン固定され、パラフィン包埋されたALKALCL組織切片の正常なリンパ球で観察された。単離された青色及び赤色のブレイクアパートISHシグナルがALKリンパ腫細胞で見られ、無傷のALK遺伝子は、同様の細胞において、重複した青色及び赤色シグナルと伴い可視化された。よって、ALK転座は、光学顕微鏡を使用する、自動化された明視野baISHを用いて示され、組織形態及びISHシグナルと相関している。正常な扁桃腺切片で観察されるように、5及び3MALT1ISHシグナルは、MALTリンパ腫のケースの正常なリンパ球の核において、紫色のドットとして見える。しかしながら、別の5及び3MALT1ISHシグナルは、それぞれ赤色及び青色ドットとしてはっきりと可視化され、MALTリンパ腫細胞において重複した5及び3MALT1ISHシグナルも同様である。ALKbaISHアッセイに使用される同様のbaISH適用を、任意のプロトコル変更をすることなく、MALT1遺伝子の再構成を示すために、成功裏に使用した。再構成した5及び3ALK又はMALT1領域の間の距離は一定ではなく、遺伝子のブレイクポイントの展伸性に依存する。各ケースの全てのリンパ腫細胞が同様の遺伝子の再配置パターンを示すことが明らかであるため、リンパ腫における遺伝子の再構成はランダム事象であるか、又はリンパ腫細胞の不均一性が存在すると推測される。ALKALCL間のリンパ腫細胞、及びMALTリンパ腫の大きさは、有意に異なっている。細胞が大きくなればなるほど、切片化からのブレイクアパートISHシグナルのトランケーションアーチファクト擬陽性の可能性が大きくなる。よって、baISHスライドが読まれる場合、一方の単色ISHシグナルが:1トランケーションアーチファクト、2遺伝子欠失、又は3遺伝子転座の故である場合、一方は注意深く考慮しなければならない。病理学者の間でスコア化される、高い一致率のブレイクアパートISHスライドが達成可能なように、単純なスコア化方法を開発しなければならない。また、2つの単色ISHシグナル間の距離をさらに分析することが、特定の病気に対する正確な遺伝子ブレイクアパート状態に必要である。実施例4まず、赤色検出を実施し、続いて青色検出を実施することを除き、実施例2の手順を繰り返した。結果を図9に与える。実施例5青色及び赤色検出工程の間に、変性のためのSDSを使用することを除き、実施例2の手順を繰り返した。結果は示さないが、不満足なものであった。実施例6この実施例は、ALK座位の5及び3領域にハイブリダイズする1対のプローブを使用して、NSCLCを煩っている患者からの、固定され包埋された肺腫瘍組織における、2色CISH及びSISH/CISHインサイツハイブリダイゼーションの評価を記載する。ALKの発現の増加に至るALK遺伝子再構成を検出するために、プローブを使用し、ALKインヒビター治療に対する反応性が高い可能性が示されている。2色CISH及びSISH/CISHを、複製物に20の肺腫瘍組織が入った組織マイクロアレイにおいて実施し、そのうちの10は、ALK発現に対してポジティブであると予定しており、10は、IHC及び逆転写酵素PCRにより、ALK発現に対してネガティブであると予定している。得られた染色された試料を明視野条件で評価し、5及び3ALKシグナルの数及び相対的位置について、試料毎に50の細胞を列挙した。2色CISHで染色されたアレイは、単一リーダーにより列挙され、複製物毎に1つの組織試料を評価し、次のISHパラメーターを測定した:P1.融合した5及び3ALKシグナルのみを有する細胞パーセントP2.融合及び分割した5及び3ALKシグナルの双方を有する細胞パーセントP3.分割した5及び3ALKシグナルのみを有する細胞パーセントP4.融合した5及び3ALKシグナル及び孤立した5シグナルの双方を有する細胞パーセントP5.融合した5及び3ALKシグナル及び孤立した3シグナルの双方を有する細胞パーセントP6.孤立した5ALKシグナルのみを有する細胞パーセントP7.孤立した3ALKシグナルのみを有する細胞パーセントP8.任意の非融合の5及び3ALKシグナルを有する細胞パーセントP9.任意の分割した5及び3ALKシグナル又は孤立した3シグナルを有する細胞パーセントP10.任意の分割した5及び3ALKシグナル又は孤立した5シグナルを有する細胞パーセントP11.任意の分割した5及び3ALKシグナルを有する細胞パーセント0~100細胞のカットオフ値を各パラメーターに適用し、ALK再構成について、ISHによりポジティブ、又はISHによりネガティブとして、各試料を分類した。カットオフ値にて、感度及び特異性をALKの再構成能力について算出し、IHC/RTPCRにより測定されるようにして、ALK発現を同定した。4つの最も良好な実行パラメータについての受信機運用特性曲線を図10にプロットした。各パラメーターに対するカットオフ値の最適範囲を同定するために、DFI=221/2であるDFIを、ROCプロットにおける全ての点について、図11に対カットオフ値でプロットしたAmJPathol16314051416を参照。これらの図から、100感度及び特異性を提供する孤立した3シグナル又は任意の分割した5及び3ALKシグナルを有する細胞パーセント、及び任意の非融合の5及び3ALKシグナルを有する細胞パーセントのみがわかる。図11から、これら2つのパラメーターの前者が、最も高いレベルの感度及び特異性を提供する最も広い範囲のカットオフ値により測定される場合、最もロバスト性のあるアッセイを提供することがわかる。前者のパラメーターについて、27~38の細胞のカットオフが、完全な性能を提供し、非常に良好な性能は、27~50の細胞のカットオフ、及び27~74のカットオフに見いだされた。ついで、2色CISH及びSISH/CISHハイブリダイゼーションが、4人の病理学者により列挙され、各試料の複製物、及び評価されたパラメーターの数の双方の評価を拡大し、以下のように命名した:P2:任意の非融合シグナルを有する細胞P3:対になった分割シグナルのみを有する細胞P4:融合し対になった分割シグナルを有する細胞P5:対になった分割シグナルを有し、融合シグナルを有する又は有さない細胞P6:他の融合又は非対シグナルにかかわらず、対になった分割シグナルを有する細胞P7:任意の非対5ALKシグナルを有する細胞P8:融合シグナル及び任意の非対5ALKシグナルを有する細胞P9:任意の非対3ALKシグナルを有する細胞P10:融合シグナル及び任意の非対3ALKシグナルを有する細胞P11:>2の全5ALKシグナルを有する細胞P12:>2の全3ALKシグナルを有する細胞P13:>2の融合シグナルを有する細胞P14:>2の対になった分割シグナルを有する細胞P15:>1の非対5ALKシグナルを有する細胞P16:>1の非対3ALKシグナルを有する細胞P17:対になった分割シグナル又は非対の5ALKシグナルのみを有する細胞P18:融合シグナル及び対になった分割シグナル又は非対の5シグナルを有するを有さない細胞P19:任意の対になった分割又は非対の5シグナルを有するを有さない細胞P20:対になった分割シグナル又は非対の3ALKシグナルのみを有する細胞P21:融合シグナル及び対になった分割シグナル又は非対の3シグナルを有するを有さない細胞P22:任意の対になった分割シグナル又は非対の3シグナルを有するを有さない細胞P23:平均の全5ALKシグナル/細胞P24:平均の全3ALKシグナル/細胞P25:平均の融合シグナル/細胞P26:平均の対になった分割シグナル/細胞P27:平均の非対5ALKシグナル/細胞P28:平均の非対3ALKシグナル/細胞P29:平均の非融合5ALK/細胞P30:平均の非融合3ALK/細胞P31:平均の対になった分割過度の5又は3ALK/細胞第1の分析により、各試料の双方の複製において、4人の病理学者の組合せた結果を使用し、ROC曲線を作製した。病理学者の組合せでは、2色CISH又はSISH/CISHの染色した試料のいずれかで、100感度及び特異性が達成されなかった。最も良好なパラメーター性能で測定されたように、また最初の単一リーダー研究で見出されたように、ROC曲線下の領域を、各曲線について算出したところ、任意の非融合5及び3ALKシグナルを有する細胞パーセントが、SISH/CISHの染色した試料において、AUC=0.833を有する最も良好な性能を提供した。このパラメーターにより、45~66のカットオフ値に見出される最も良好な性能を有する他のパラメーターと比較して、DFI対カットオフ曲線における広範囲の最低値が提供された。分割3及び5ALKシグナル、及び非対5又は3ALKシグナル/細胞の平均数の関連パラメーターにより、SISH/CISHの染色した試料での、4リーダー研究におけるP2に近い、良好な性能が提供された。一般的に、4リーダーは、単一リーダーよりも2色CISH染色を列挙するのがより困難である。2色CISHシグナルの列挙に伴いよく知られていることは、4リーダーについての問題である可能性があり、さらに訓練することで、それらの結果が改善されることが予期される。上の明細書で述べた全ての刊行物及び特許は、ここでは出典明示により援用される。本発明の記載された方法及びシステムの様々な修正及び変形は、本発明の範疇及び趣意を逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施態様に関連して記載したが、請求された本発明は、このような特定の実施態様に過度に限定されるべきではないと理解される。実際、この発明の分野の当業者にとって明らかな、本発明を実施するための記載の方法の種々の変形は、以下の請求の範囲の範疇に入ることを意図している。"