"a糞便試料を準備する工程とb該試料のクロストリジウムレプツム群の多様性を分析する工程とc結果を健常個体から得た対照試料と比較する工程とd該被検体試料と該対照試料との間の相違を決定する工程とを備え、クロストリジウムレプツム群の細菌の多様性の低下が1型糖尿病リスクの増加を示す、個体における1型糖尿病リスクを診断する方法。試料におけるクロストリジウムレプツム群の細菌の多様性を、a試料からDNAを抽出し、bプライマー5’-GCACAAGCAGTGGAGT-3’及びプライマー5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGTTTTRTCAACGGCAGTC-3’でPCRを行い、c直線変性勾配を有するアクリルアミド-ビスアクリルアミド37.5:1ゲルを用いてDGGE分析を行い、d該DGGEゲルを分析することで決定し、クロストリジウムレプツム群の細菌の多様性の低下が1型糖尿病リスクの増加を示す、請求項1に記載の方法。個体における1型糖尿病リスクの増加を診断する方法であって、i被検体と健常対照個体との間で血清代謝物の濃度差を決定する工程と、ii該個体の血清において一つ以上の糖尿病関連自己抗体インシュリン抗体、グルタミン酸脱炭酸酵素自己抗体、膵島細胞自己抗体の発生を決定する工程とを備え、A健常個体と比較したAB陰性個体における代謝物レベルの上昇若しくはAB陽性個体における代謝物レベルの低下が1型糖尿病リスクの増加を示すか、又はB健常個体と比較したAB陰性個体における代謝物レベルの低下若しくはAB陽性個体における代謝物レベルの上昇が1型糖尿病リスクの増加を示す、方法。Aの場合の代謝物がリゾホスファチジルコリンである、請求項3に記載の方法。個体の遺伝的背景を評価する、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。少なくとも一種のクロストリジウム属系統菌株群IVクロストリジウムレプツム群の細菌又はその代謝物を個体に投与することにより、該個体における1型糖尿病の発症を予防する方法。前記個体は、1型糖尿病リスクが高いか又は1型糖尿病の発症に対して感受性である、請求項1に記載の方法。前記クロストリジウムレプツム群の細菌の多様性の低下を診断することによって前記感受性又はリスクの増加を測定する、請求項2に記載の方法。前記投与される細菌が非病原性である、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。本発明の目的は、a糞便試料を準備する工程とb該試料のクロストリジウムレプツム群の多様性を分析する工程とc結果を健常個体から得た対照試料と比較する工程とd該被検体試料と該対照試料との間の相違を決定する工程とを備え、クロストリジウムレプツム群の細菌の多様性の低下が1型糖尿病リスクの増加を示す、個体における1型糖尿病リスクを診断する方法、及びi被検体と健常対照個体との間で血清代謝物の濃度差を決定する工程とii該個体の血清において一つ以上の糖尿病関連自己抗体インシュリン抗体、グルタミン酸脱炭酸酵素自己抗体、膵島細胞自己抗体の発生を決定する工程とを備え、A健常個体と比較したAB陰性個体における代謝物レベルの上昇若しくはAB陽性個体における代謝物レベルの低下が1型糖尿病リスクの増加を示すか、又はB健常個体と比較したAB陰性個体における代謝物レベルの低下若しくはAB陽性個体における代謝物レベルの上昇が1型糖尿病リスクの増加を示す図1fことを特徴とする更なる方法を提供することである。発明の一実施形態では、事例Aで分析する代謝物がリゾホスファチジルコリンである。本発明は、1型糖尿病リスクを有する個体を膵島自己免疫の発症の前又は付近である初期段階で診断できる相当な利点を提供する。特に、リスクが高い個体は可能な限り早期に診断すべきである。腸内微生物叢試料は下部消化管から得ることができ、好ましくは、例えば糞便試料である。初期段階でリスク群に属すると診断された時点で、腸内微生物叢の多様性を正常化することによって、個体における1型糖尿病の発症を予防することができる。具体的に、本発明の目的は、少なくとも一種のクロストリジウム属系統菌株群IVクロストリジウムレプツム群の細菌又はその代謝物を個体に投与することによって該個体における1型糖尿病の発症を予防する方法を提供することである。[定義]本発明に関して、クロストリジウムレプツム群-クロストリジウム属系統菌株群IV-の細菌としては、例えば、アセトアナエロバクテリウムエロンガツム、アナエロフィルムアギリ、アナエロフィルムペントソボランス、アナエロツルンカスコリホミニス、ブチリコッカスプリカエコルム、クロストリジウムセルロシ、クロストリジウムレプツム、クロストリジウムメチルペントーサム、クロストリジウムオルビスシンデンス、クロストリジウムスポロスフェロイデス、クロストリジウムビリデ、エタノリゲネスハービネンス、ユウバクテリウムデスモランス、ユウバクテリウムシラエウム、ユウバクテリウムプラウティイ、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ、ヒドロゲノアナエロバクテリウムサッカロボランス、オシリバクターバレリゲネス、パピリバクターシンナミボランス、シュードフラボニフラクターカピロサス、ルミノコッカスアルブス、ルミノコッカスブローミイ、ルミノコッカスカリダス、ルミノコッカスフラベファシエンス、スポロバクターターミティディス、サブドリグラヌルムバリアビレ及び他の近縁であるが無培養の細菌が挙げられる。本発明に関して、非病原性細菌とは、個体に有害でない細菌を意味する。特に、健常個体の腸内細菌叢に天然に存在する細菌が好ましい。本発明に関して、クロストリジウムレプツム群の細菌の多様性の低下という表現は、健常個体と罹患個体との間の統計的に有意な相違を意味する例えば、それぞれ17アンプリコン対12アンプリコン。本発明に関して、代謝物は、好ましくは、リゾリン脂質例えば、lysoPC、lysoPCのようなリゾホスファチジルコリン、スフィンゴシン-1-リン酸、アラキドン酸、アラキドン酸由来の脂質メディエーター例えば、プロスタグランジンE2又はロイコトリエンLTA4、LTB4、ドコサヘキサエン酸エイコサペンタエン酸由来の脂質メディエーター例えば、レゾルビンE1及びレゾルビンE2のようなレゾルビン、マレシン、プロテクチン、分枝鎖アミノ酸バリン、イソロイシン、ロイシン並びにそれらのケト酸例えば、ケトロイシン、グルタミン酸である。本発明に関して、健常個体と比較した代謝物レベルの上昇/低下とは、代謝物の濃度が、膵島自己抗体を持たず1型糖尿病リスクがあると考えられない健常個体における平均濃度に関して規定した設定閾値より上/下であることを意味する。本発明の一実施形態では、試料中のクロストリジウムレプツム群の細菌の多様性を次のように決定する:a糞便試料からDNAを抽出する;bプライマー5’-GCACAAGCAGTGGAGT-3’及びプライマー5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGTTTTRTCAACGGCAGTC-3’を用いて、20mMのトリス-HCLpH8.4、50mMのKCl及び2mMのMgCl2を含む反応緩衝液中に1μLの適当に希釈した鋳型DNA、0.4μMの両プライマー、0.2mMのdNTP、1.25ユニットのTaqポリメラーゼインビトロジェン社を含有する30μLの総容積でPCRを行う。PCRプログラムは、94°Cで5分間の初期変性の後に、94°Cで45秒間の変性、60°Cで30秒間のプライマーアニーリング及び72°Cで60秒間の伸長を30サイクル、そして72°Cで30分間の最終保持からなる;cDGGE分析は、DcodeUniversalMutationDetectionSystemバイオラッド社を用い0.5×TAE緩衝液20mMのトリス-酢酸、0.5mMのEDTA、pH8.0中で16時間、85V、60°Cにて維持して行う。30から60100は7M尿素及び40脱イオンホルムアミドの直線変性勾配を有する8アクリルアミド-ビスアクリルアミド37.5:1ゲル上に試料をロードする。このゲルをSYBRGreenI分子プローブで室温にて20分間染色し、その画像をGelDocXRGelDocumentationSystemバイオラッド社で保存する;d該DGGEゲルをBioNumericsソフトウエアAppliedMathsBVBA社で分析する;ここで、クロストリジウムレプツム群の細菌の多様性の低下が1型糖尿病リスクの増加を示す。血清代謝物の測定は、個体、好ましくは子供、の様々な年齢で追跡調査することができ、その結果を診断する子供と同一年齢の対照群と比較する。また診断する子供について様々な血清代謝物を測定することもでき、そのレベルを対照群についての該代謝物のレベルと比較する。一実施形態では、1種以上の血清代謝物の上述するモニタリングを、子供における自己免疫の発生のモニタリング及び/又は1型糖尿病を発症する遺伝的リスクの決定と組み合わせる。[前糖尿病NODマウスにおける長期的な血清リピドミクス]第一の目的は、NODマウスが、後にT1Dへ進行する子供の長期的研究1型糖尿病予測及び予防プロジェクト;DIPPにおいて観察されたリピドームに基づく代謝表現型を反復できる1型糖尿病の良いモデルであるかを検証することである。従って、NODマウスを用いたマウス実験を行い、人体実験に用いたプロトコールを検証した研究1。合計70匹のNOD/Bomマウスメス26匹を3週齢からa糖尿病の発症進行群まで又はb糖尿病表現型がいない場合には非進行群その後メスで36週齢、オスで40週齢まで、血清を収集しながら毎週モニターした図1a。DIPP研究と同様に、第一に、同一コロニーのマウスにおける糖尿病の進行個体と非進行個体との間の、初期の前糖尿病のリピドームプロファイルの相違に興味を持った。合計1172試料、すなわち平均してマウス1匹あたり30試料メスのマウスから733試料及びオスのマウスから439試料を含む26匹のメスのマウス12匹の進行群、14匹の進行群及び13匹のオスのマウス7匹の進行群、6匹の非進行群由来の完全な試料系列について、各試料で154種の脂質を測定して、超高速液体クロマトグラフィーUPLCと質量分析MSとを組み合わせて用いたリピドミーム解析を行った。糖尿病の進行個体と非進行個体とで脂質濃度を比較すると、生後数週間3~10週はメスの進行群における全脂質低下傾向によって特徴付けられた一方、糖尿病の発症に近い期間15週以降はトリアシルグリセロール及びリン脂質の上昇によって特徴付けられた図1b。オスのマウスではこのような変化は観察されなかった補足図1。10週齢でメスNODの進行群は非進行群よりも類似した血糖値を有した図1cが、驚いたことに、進行群と非進行群との間に体重の差は明らかでないという事実図1eにもかかわらず、進行群はグルコース刺激性血漿インスリンレベルと同様に高い空腹時血漿インスリンレベルを示した図1d。と共に、これらの結果は、後に糖尿病に進行するマウスが若齢でグルコース刺激性インスリン分泌GSISの上昇により特徴付けられること、又は後に糖尿病に進行するマウスが体重の程度に対して不適当にインスリン抵抗性であることを暗示する。実際、この1型糖尿病への初期発展段階に関連したGSISの増加は、後に糖尿病に進行する子供がインスリン自己抗体IAA陽性への抗体陽転に先立って低い血清ケトロイシンレベルと一層インスリン分泌性のアミノ酸であるロイシンレベルの上昇とにより特徴付けられるという我々の初期の知見参考文献2、14と一致する。[ヒト及びNODマウスの前糖尿病リピドームプロファイルのマッピング]マウスとヒトとの間で自己免疫性糖尿病の初期代謝表現型の類似性を体系的に研究するため、メスのNODマウス及びDIPP研究対象児参考文献2由来の長期的リピドームプロファイルの比較解析を進めた。しかしながら、遺伝的要因と環境的要因双方に対するメタボロームの感受性参考文献6及び可変的な疾患浸透度を考慮すると、リピドームプロファイルは異なるペースで独立に変化し得る。最近、正常発達又は初期疾患発症の期間におけるような経時的な代謝プロファイルの成熟を、隠れマルコフモデルHMM方法論を用いて得られた代謝状態の点から記述できるという概念を紹介した参考文献15。平均的なリピドームプロファイルの進行を観察する図1b代わりに、我々のアプローチは、各個体のリピドームプロファイルをそれぞれのペースで成熟させることを可能にする。かかる個体プロファイルを、基礎となる統計モデルを用いて一連の進行的HMM状態平均脂質プロファイルにより記述されるに捕捉する。ここで、HMM方法論を適用してメスのNODマウスの長期的リピドームプロファイルを研究し図2a、若齢3~10週での代謝状態の進行を記述する3状態HMMを同定した図2b。最初の2つの状態は、それぞれおよそ4週及び6週の平均週齢に相当し、進行群の中でリン脂質及びトリアシルグリセロールの減少により特徴付けられた図2c。マウスモデルに特徴が類似する3状態HMMモデルを、T1Dに進行した子供の長期的研究由来の完全なリピドミクスデータ参考文献2にも適用した。ネステッドケースコントーロール研究は56人のT1D進行群及び73人のマッチした非進行群を含み、計1196試料、すなわち誕生と糖尿病発症進行群においてとの間で平均して子ども一人当たり9.3試料で構成した。メスのNODマウスにおけるように、生後1年に相当する初期状態は、低いトリアシルグリセロール及び特異的なリン脂質により特徴付けられた補足図2。糖尿病を呈している子供補足図2及び糖尿病を呈しているメスのNODマウス図2cにおける状態進行の類似性は、リピドームに反映される初期疾患段階が、類似する代謝撹乱を共通に有することを示唆する。しかしながら、全身脂質代謝の相違及びリピドームプロファイルに対する食事関連効果を示す複数種を比較することは、常に難題である。結論として、マウスと人間との間の分子脂質のマッピングは些細なことであり得ない。マウス及びヒトのリピドームプロファイルの進行を比較するため、我々は、2つの種でそれらの依存性を捕捉する新たなマッピングアルゴリズムを適用した参考文献16。このストラテジーを用いることによって種間でリピドームプロファイルを比較することが可能であり、我々は、進行群/非進行群対ヒト/マウスに関する二元配置分析によって疾患影響を捜した。我々は、種間の機能的及び構造的に関係する脂質の関連性を見出し図2d、リン脂質の低下と若齢での疾患発症との強い関連性を確かめたHMM状態1。従って我々は、膵島自己抗体に対する最初の抗体陽転に先立ち子供で認められる脂質変化は、メスのNODマウスの進行群における初期変化の特徴でもあると結論付けることができる。[初期糖尿病の進行におけるリゾホスファチジルコリン及びIAA]膵島自己抗体陽性への抗体陽転は、後にT1Dに進行する子供におけるリゾホスファチジルコリンlysoPC血清レベルの一時的な上昇と関連する参考文献2。ここで、我々は、8週齢のNODマウスにおけるIAAレベルを測定し、IAA陰性IAA-進行群のメスのNODマウスはIAA-非進行群と比較してlysoPCが上昇したことを同様に確かめた図1f。興味深いことに、高lysoPCを有するIAA陽性IAAマウスは糖尿病から保護されたため図1f、IAA陽性は糖尿病進行と反対の関連性を有した。その疾患進行と反対の関連性のため、lysoPCと組み合わせたIAA測定は、NODマウスをその糖尿病発症のリスクに従って階層化するのに役立ち得ることが推測できる。我々は、NODマウスを用い低リスク群のマウスと比較して4.3倍高い自己免疫性糖尿病リスクがある95下側信頼限界=2.6、1000倍リサンプリングから計算指定した高リスク群において自己抗体陽性とlysoPC濃度とを組み合わせることにより、進行群と非進行群との間である程度充分に区別されたχ2=5.75、Pχ2=0.0044;補足図3代理マーカーを得た。[T1Dリスクに関連した特異的な膵島及び肝臓経路]独立した実験において、最初の実験と同一コロニー由来の正常血糖のメスのNODマウスを8週齢n=57又は19週齢n=14で屠殺して、血液、肝臓及び膵臓の試料を集めた研究2。上述したアルゴリズムを用いたその後のリスク層別化のために、UPLC/MSに基づく血清リピドミクス解析用に16匹の8週齢マウス7匹はIAA及び13匹の19週齢マウス6匹はIAAを選択した。糖尿病発症のリスクが高いマウスは、より重篤な膵島炎にかかる傾向を示した図3a。並行的な肝臓及び膵島のトランスクリプトミクスを19週齢のマウスに行った。高リスクマウスと低リスクマウスとを比較した場合、IAAレベルと無関係に、遺伝子セット濃縮解析GeneSetEnrichmentAnalysis:GSEAを用いた膵島遺伝子発現データのパスウェイ解析は、予想した様に高リスク群において様々なアポトーシス経路及び免疫調節経路のアップレギュレーションを示した表1。これら経路は、糖尿病リスクと無関係にIAAマウスとIAA-マウスとを比較した場合にもアップレギュレートしたことから、自己免疫状態と関連していた。CTLA4経路由来のCD3参考文献18、Toll様受容体シグナル伝達経路参考文献19、20及びIL-7経路参考文献21由来の炎症誘発性ケモカインCCL5すなわちRANTES等、これら経路のアップレギュレートした遺伝子産物の幾つかは自己免疫性糖尿病への進行に関係することが知られている。[表1.メスのNODマウスの膵島炎におけるパスウェイ解析]1高い糖尿病リスクHR対低い糖尿病リスクLR及び2IAA陽性LR対その他、の2つの異なる比較について偽発見率FDRq<0.25である、最大10個の有意に影響を受けた経路を示す。n=10の19週齢のメスのNODマウス3匹のIAALR、2匹のIAA-LR、2匹のIAAHR、3匹のIAA-HRの膵島でトランスクリプトミクスを行った。N:経路における遺伝子の数、NES:正規化濃縮スコア、Source:遺伝子リスト情報源。高リスクマウスにおいてアップレギュレートした様々な経路は、IAA力価に関連しなかった。これら高い糖尿病発症リスクに関連する経路は、主に代謝経路であり、TCAサイクル及び解糖/糖新生のアップレギュレートした遺伝子を含んだ表1。これら経路の代謝産物を直接測定するため、我々は、飛行時間型質量分析計に連結した二次元ガスクロマトグラフィーGC×GC-TOFMSを用いて参考文献22膵島のメタボロミクス解析を行った。グルタミン酸及びアスパラギン酸などの幾つかの重要な代謝物だけでなく限界marginal有意水準で全3つの分岐鎖アミノ酸BCAAのアップレギュレートも見られたため、メタボロミクスは、高リスクマウスの膵島におけるエネルギー及びアミノ酸の代謝の異常調節を裏付けた図3b。これら上昇したアミノ酸はβ細胞における既知のインスリン分泌促進物質である参考文献23。この経路の最上位遺伝子であるグルコース-6-リン酸、触媒、2G6PC2;高リスク群対低リスク群の比11、P=0.0034は、肝臓から血流へのグルコース放出を制御する。しかしながら、この研究に含まれた動物は、先の長期的研究におけるように、正常血糖であり、2群間で体重に差はなかった。従って、β細胞及び肝臓における代謝変化は、自己免疫性糖尿病の発症リスクが高いマウスにおいてGSISの上昇が観察されたことを説明できる図1c~e。[T1Dへの進行におけるインスリン抵抗性のマーカー]臨床研究から、インスリン抵抗性がT1Dへの進行の危険因子であることの証拠が存在する引用文献24、25。また、NODの遺伝的背景はマウスをインスリン抵抗性にしやすくし得ることも知られている参考文献26。高リスクマウスの観察した代謝表現型について可能性のある説明としてのインスリン抵抗性を検査するため、別のNODコロニーにおいて2つの独立な研究を行い、n=36のメスのNOD/MrkTacマウスを8~11週齢の間GSIS、グルコース及びインスリン耐性並びに血漿レプチンについて検査し研究3、n=42のメスのNOD/MrkTacを10週齢で屠殺して膵島炎、血漿レプチン及びアディポネクチンについて検査した研究4。先と同様に、血清リピドミクス及びIAAアッセイを行って、マウスを糖尿病高リスク群と糖尿病低リスク群とに階層化した。高リスクマウスにおけるGSISの上昇を確認した図4aが、恒常性モデル評価HOMA-IR指標又は白色脂肪組織及び筋肉におけるGLUT4発現で補足図4a~c、群間の腹腔内グルコース又はインスリンに対するグルコース応答に有意な差は認められなかった図4b~c。より高齢なマウスの結果図3aと同じく、糖尿病発症のリスクが高い10週齢のメスのNODマウスは低リスク対照群よりも既により膵島炎にかかる兆候を有しているが、両群における平均の膵島炎の度合いは中程度である図4d。驚くべきことに、脂肪組織由来ホルモンであるレプチン図4e及びアディポネクチン図4fは両方とも、体重又は肥満度に有意な差が無いにも関わらず補足図4d~f高リスクマウスの血漿で上昇した。[腸内微生物叢の多様性の低下は糖尿病リスクと関連する]最近、無菌マウスの血清メタボロームが後にT1Dに進行する子供の前自己免疫メタボロームと類似し参考文献27、従って、T1D進行群の腸内微生物叢は重要な構成要素を欠き得るか又は子供をT1Dに罹りやすくする機能障害を有することを暗示していることを見出した。マウス及び人間で観察した糖尿病進行群のメタボロームの類似性図2を前提として、高リスクマウスと低リスクマウスとの間で観察した代謝の相違がそれらの腸内微生物組成の相違に影響され得ることを見出した。先述した変性勾配ゲル電気泳動DGGEを用いた研究2から高リスクマウス及び低リスクマウス由来の盲腸試料の微生物組成を特徴付けた参考文献28、29。全細菌組成は高リスクマウスよりも低リスクマウスにおいて一貫しており補足図5、高リスクマウスの細菌はフィルミクテス門のクロストリジウムレプツム群の多様性を有意に低下した図3cことを実際に見出した。[IAA陽性と自己免疫性糖尿病からの保護]抗体陽転後の子供で代謝プロファイルが正常化すること参考文献2を前提に、自己抗体の発生が初期の代謝障害に対する生理反応であり得ることを先で提示した。本研究において研究2のマウス、メスのIAA低リスクマウスにおいてパスウェイを調査し、それらを他の全ての群に対して比較した。IAA低リスクマウスは、IL-4経路及びIL-6経路などの膵島の幾つかのシグナル伝達経路の上昇により特徴付けられた表1。IL-4はNODマウスで糖尿病から保護してくれることが知られている参考文献30。対照的にIAA低リスクマウスでは、主としてミトコンドリア機能及びTCAサイクル、BCAA異化、ベータ酸化、並びに酸化的リン酸化に関連する経路の発現が減少した。これら経路のダウンレギュレーションがT1Dに対してどのように保護し得るかは不明である。しかしながら、これら経路のダウンレギュレーションは活性酸素種ROS産生が減少した状態をもたらし参考文献31、少なくとも部分的にはβ細胞の機能性の保存を説明できる。これは、減少したROS産生と糖尿病に進行しないIAAマウスにおけるβ細胞アポトーシスの予防とを関連付ける潜在的な保護メカニズムを提示する。我々の結果は、抗体陽転したが顕性疾患に進行しなかった個体における糖尿病からの保護の点について同様な研究の必要性を強く主張する。この研究は、大規模臨床研究参考文献2からの我々の先の知見の組織特異的状況への翻訳可能性を強調する。また、我々の研究は、特異的代謝障害が、進化段階の初期に識別でき、自己免疫性糖尿病への進行に関係する発症メカニズムと潜在的につながりがあり得ることを目立たせる補足図6。我々の研究は、C.レプツムのような特定の細菌群の多様性の低下が初期の代謝障害と関連することを暗示する。糖尿病に関連した微生物組成の相違が同一コロニーのマウスの中で観察されたという事実は、観察された微生物多様性の低下が恐らくは免疫性又は代謝性応答の結果であることを示唆する。微生物群落は障害に対し感受性で後にその本来の状態に戻ることができない場合があり参考文献44、腸内微生物叢の多様性の低下は例えば肥満で認められている参考文献45。興味深いことに、C.レプツム亜群由来の抗炎症性共生細菌であるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの多様性の低下がクローン病をも特徴付ける参考文献46。本発明を下記の非限定的実施例により説明する。しかしながら、上記詳細な説明及び実施例で示す実施形態は説明的な目的のみのためのものであり、本発明の範囲内で様々な変更及び改変が可能であることを理解すべきである。[実験動物及び試料収集]全実験手法はトゥルク大学の実験動物福祉委員会により認可された。マウスは、固定した12:12時間の明暗周期で21±1°Cに保った動物室で飼育した。標準的なげっ歯類用固形飼料SpecialDietServices社、英国、ウィザム及び水を自由摂取可能にした。用いたNOD/Bomマウスのコロニーは、トゥルク大学の動物施設で繁殖及び維持し、TaconicEurope社デンマーク、ライから購入したマウスを起源とした。26匹のメスと44匹のオスのNODマウス研究1に、3週齢から開始してマウスが糖尿病を発症するまで2週連続で血糖≧14.0mmol又はメスのマウスが36週齢、オスのマウスが40週齢に達するまで毎週、尾静脈から静脈穿刺により血液試料採取を行った。メタボロミクス解析のために血清を分離して-70°Cで素早く凍結させた。8週齢でインスリン自己抗体IAAの検出用血液試料を尾静脈から収集した。10週齢で4時間絶食後及び2日間後の腹腔内グルコース1g/kg投与5分後、正午から午後2時の間にインスリン用血漿試料を収集した。正常血糖のメスのNOD/Bomマウスの別の群研究2を、8週齢n=57又は19週齢n=14でCO2麻酔下の断頭により屠殺して、血液、肝臓及び膵臓の試料を収集した。メスのNOD/MrcTacの別個の2群n=36及び42、研究3及び4は5週齢でTaconicUSA社米国ニューヨーク州ハドソンから供給された。研究3では、8週齢で4時間の絶食後グルコース10wt/vol、体重1kgあたり1gを投与して尾静脈血のグルコース及び血清インスリンを測定することによって腹腔内グルコース耐性試験を行った。10週齢で尾静脈からリピドミクス用及びIAA用血清試料を収集した。11週齢で1時間の絶食後ヒトインスリン体重1kgあたり1.0IU、プロタファン、ノボノルディスク社、デンマーク、バグスバードを投与することによって腹腔内インスリン耐性試験を行った。研究4では、マウスを10週齢で4時間の絶食後、麻酔下の心臓穿刺により屠殺した。生殖腺白色脂肪組織WAT貯留物を注意深く切り離して加重し、肥満症のマーカーとして用いた。IAA用、リピドミクス用及びアディポカインパネル解析用の血清試料、生殖腺WAT、腓腹筋及びに膵臓の試料を収集し、分析まで-70°Cで保存した。HOMA-IR、すなわちインスリン耐性の推定値を、空腹時インスリンμIU/mL×空腹時グルコースmmol/L/22.5として計算した。GraphPadPrism4を用いてスチューデントt検定又は二元配置ANOVAで統計的有意性を分析した。[血漿中のグルコース、インスリン、レプチン及びアディポネクチン]PrecisioXtraグルコースモニタリング装置アボットダイアベティスケア社、イリノイ州で血糖を測定した。マウスウルトラセンシティブELISAキットメルコディア社、スウェーデン、ウプサラで、又はMilliplexマウスアディポカインパネルミリポア社、米国マサチューセッツ州ビレリカでレプチンとともに、血漿インスリンを分析した。ミリポア製マウスアディポネクチンELISAキットで血漿アディポネクチンを測定した。[膵島の単離]Ficoll400シグマアルドリッチ社、米国ミシガン州セントルイス勾配法参考文献1aを用いて膵島を単離した。簡単に言うと、10mMのHEPES、1mMのMgCl2、5mMのグルコースを含有するpH7.4のHBSS中で、膵臓をコラゲナーゼP0.5mg/mL、ロシュダイアグノスティックス社、ドイツ、マンハイムと共に17分間インキュベートした。2ラウンドの洗滌後、ペレットを25Ficoll中に再懸濁し、密度23、密度20及び密度11のものを上に重層した。遠心分離後、密度23と密度20との間の膵島の層を収集し、2回洗滌してから、ペレットをメタボロミクス又はRNA抽出用溶解緩衝液中での均質化のために急速冷凍した。試料を解析まで-70°Cで保存した。[糖尿病の組織病理]正常血糖のNODマウス由来の膵臓を凍結切片にした。>20μmの間隔を空けた5μm切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色して、膵島炎について次の通りに格付けした。0:目に見える浸潤なし、I:膵島周囲炎、II:<50の膵島浸潤を有する膵島炎、III:>50の膵島浸潤を有する膵島炎。8匹のメスの10週齢低リスクマウス由来の計678個の膵島60~123個の膵島/匹及び8匹の高リスクマウス由来の633個の膵島59~102個の膵島/匹、並びに4匹のメスの19週齢低リスクマウス由来の52個の膵島11~17個の膵島/匹及び3匹の高リスクマウス由来の28個の膵島7~10個の膵島/匹を格付けした。GraphPadPrism4を用いてスチューデントt検定又は二元配置ANOVAで統計的有意性を分析した。[IAAアッセイ]ヒトIAAについて既に文献記載された方法参考文献2aを少し改変した放射性結合マイクロアッセイRIAにより、マウスIAAを測定した。マウス血清2.5μL及び高IAA力価を有するヒトから得た血清プールの標準試料の段階希釈物5μLを、過剰量の未標識ヒト組換えインスリンロシュダイアグノスティックス社、ドイツ、マンハイムの存在下又は不存在下で15,000cpmのモノ125I--インスリンアマシャムGEヘルスケア社、英国、バッキンガムシャーと共に72時間インキュベートした。8μLのプロテインA及び4μLのプロテインGセファロースアマシャムGEヘルスケア社を含有する50μLのTBT緩衝液50mMのTris、pH8.0、0.1ツイーン20を加えることにより、抗体複合体を沈降させた。反復洗滌の後、結合放射能を液体シンチレーション検出器1450MicrobetaTrilux、パーキンエルマーライフサイエンスワラック社、フィンランド、トゥルクで測定した。全結合から非特異的結合過剰な未標識インスリンを差し引くことにより特異的結合を計算して、各プレートについて実行した標準曲線に基づき相対ユニット数RUで表現した。マウスIAA陽性のカットオフ値は、16匹のBALBマウスで平均値3SDS、すなわち、1.79相対ユニットRUに設定した。[リピドーム解析]エッペンドルフチューブ中の血清試料10μLに10個の脂質化合物を含有する標準混合物を1試料あたり0.2μgの濃度レベルで混ぜ、10μLの0.9塩化ナトリウム及び100μLのクロロホルム:メタノール2:1と混合した。2分間ボルテックスをして1時間静置した後、試料を1000rpmで3分間遠心分離し、下側の有機層60μLをバイアルインサートに取り、20μLの3つの標識脂質標準試料を1試料あたり0.2μgの濃度レベルで混ぜた。AcquityUltraPerformanceLCUPLC、マサチューセッツ州ミルフォードに連結したウォーターズQ-TofPremier質量分析器でリピドミクスランを行った。溶媒系は、11の1MNH4Acと0.1のHCOOHとを含む水、21の1MNH4Ac、0.1のHCOOHを含むLC/MSグレードのアセトニトリル/イソプロパノール5:2で構成した。65A/35Bから100Bまでのグラジエントランに6分間かけ、5分間の再平衡化工程を含む全実行時間は18分であった。カラム50°Cで実施はAcquityUPLCBEHC181×50mm、1.7μm粒子であり、流速は0.200mL/分であった。ESIモードを用いて脂質をプロファイルし、m/zが300~1200の質量範囲でデータを収集した。MZmineソフトウエアバージョン0.60参考文献3a、4aを用いてデータを処理し、脂質同定は内部スペクトルライブラリーに基づいた参考文献5。[メタボローム解析]PBSで緩衝化した細胞溶液のタンパク質濃度に応じて、20~40μLの試料を膵島メタボローム解析用に取り分けた。10μLの内部標準標識パルミチン酸-161616-d3250mg/Lと400μLのメタノール溶媒を試料に加えた。2分間のボルテックスを行い室温で30分間インキュベートした後、10000rpmで5分間の遠心分離により上清を分離した。試料を一定流量の窒素ガスの下で乾燥させ、25μLのMOX1時間、45°C及びMSTFA1時間、45°Cで誘導体化した。代謝物混合物に5種類のアルカンを含む保持指標標準混合物5μL125ppmを加えた。時間飛行型質量分析器に連結した二次元ガスクロマトグラフィーGC×GC-TOF/MSによって、膵島試料を分析した。用いた機器は、アジレントテクノロジー社カリフォルニア州サンタクララ製アジレントGC6890N及びCTCアナリティクスAG社スイス、ツヴィンゲン製CombiPALオートサンプラーを備えたLecoPegasus4DLeco社、ミシガン州セントジョーゼフであった。変調器、二次オーブン及び時間飛行型質量分析器はLeco社製であった。GCは、1:20の比のスプリットモードで操作した。39.6psigの一定圧力のヘリウムをキャリアガスとして用いた。一次元目のGCカラムは非極性RTX-5カラム10m×0.18mm×0.20μm、Restek社、ペンシルバニア州ベレフォンテであり、極性BPX-50カラム1.50m×0.10mm×0.1μm、SGEアナリティカルサイエンス社、オーストラリア、リングウッドに連結していた。温度プログラムは次の通りであった:開始温度50°C、1分間→295°C、7°C/分、3分間。二次オーブンを前記オーブン温度より20°C高く設定した。注入口及び移送ラインの温度を260°Cに設定した。二次元分離時間を5秒に設定した。用いた質量範囲は45~700amuであり、データ収集速度は100スペクトル/秒であった。LecoChromaTOFソフトウエアを用いて生データを処理してから、社内で開発したソフトウエアMyllyを用いてアラインメントした。社内の参照化合物ライブラリーをPalisadeCompleteマススペクトルライブラリー、600K版PalisadeMassSpectrometry、ニューヨーク州イサカと共に用いて、代謝物を同定した。[遺伝子発現及びパスウェイ解析]RneasyミニキットキアゲンGmbH社、ドイツ、ヒルデンを用いて膵島からのRNA抽出を行い、肝臓、骨格筋腓腹筋及び生殖腺白色脂肪組織からトリゾール試薬インビトロジェン社、カリフォルニア州カールスバッドに続いてRNaseを含まないDNaseI処理キアゲンGnbH社を用いてRNA抽出を行い、Rneasyミニキットで精製を行った。マイクロアッセイ分析用の膵島及び肝臓を19週齢の正常血糖のメスのNOD/Bomマウスから集めた。GLUT4mRNA発現用の骨格筋及び脂肪組織を10週齢のメスのNOD/MrkTacマウスから集めた。骨格筋及び生殖腺白色脂肪組織におけるGLUT4mRNAを定量リアルタイムPCRにより測定した。HighCapacityRNA-to-cDNAキットを製造元のプロトコールに従って用いてcDNA合成を行った。リアルタイムPCRは、7300Real-TimePCRシステム、GLUT4用の予め設計したTaqManGeneExpressionAssay、及びβ-アクチン用のTaqManEndogenousControlAssayで行った。20μLのPCR反応物は、8μLのcDNA、8μLのTaqManGeneExpressionMasterMix、1μLのGLUT4TaqManGeneExpressionAssay、1μLのβ-アクチンTaqManEndogenousControlAssay及び2μLのDEPC水を含んだ。リアルタイムPCR用サイクルパラメータは次の通りであった:50°Cを2分間、95°Cを10分間の後、95°C15秒間及び60°C1分間を40サイクル。GLUT4mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子として用いたβ-アクチンに比例して発現した。比較CT法及びRQ=2-ΔΔCT式を用いて相対遺伝子発現量を算出した。全試薬はアプライドバイオシステムズ社米国カリフォルニア州フォスターシティ製であった。アンビオン社テキサス州オースティンのIlluminaRNATotalPrepAmplificationキットカタログ番号AMIL1791を用いて300ngの全RNAからRNA増幅を行った。一晩14時間のIVT反応の間にcDNAをビオチン化した。増幅の前後でRNA/cRNA濃度をNanodropND-1000デラウエア州ウィルミントンでチェックし、RNA/cRNA品質をバイオラッド社カリフォルニア州ハーキュリーズのExperion電気泳動ステーションにより制御した。[ハイブリダイゼーション]1.5μgの各試料をIlluminaWhole-GenomeGeneExpressionDirectHybridizationプロトコール改訂版Aに従ってIllumina社のマウスWG-6ExpressionBeadChipsバージョン2BD-201-0602と一晩18時間58°Cでハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションを1μg/mLのシアニン3-ストレプトアビジンGEヘルスケア社、英国、チャルフォントカタログ番号PA43001で検出した。チップをIlluminaBeadArrayReader、BeadScanソフトウエアバージョン3.5でスキャンした。数値結果をIllumina社のGenomeStudioソフトウエアv1.0でいかなる正規化も行わずに抽出した。[処理]Illumina社のGenomeStudioソフトウエアからエクスポートしたBeadSummaryデータを、RBioconductor参考文献7aのビーズアレイパッケージ参考文献6aを用いて次の通りに前処理した。データを、対数底2に変換し、分位法参考文献8aを用いて正規化して、1組のマイクロアレイについてプローブ輝度の分布を均等化した。[パスウェイ解析]マイクロアレイ遺伝子発現データ解析に通常使用されるパスウェイ解析技術である遺伝子セット濃縮解析GSEA参考文献9aは、コルモゴルフ-スミルノフ様統計量を用いて、最もアップレギュレート又はダウンレギュレートした遺伝子群の中に選択遺伝子セットが濃縮されているかを検査する。マイクロアレイデータのための線形モデル手法参考文献10aは、線形モデルを各遺伝子の発現データにあてはめて、事後残差の標準偏差を用いて修正t統計量を計算し、発現値の遺伝子特異的可変性を説明することにより、示差的に発現した遺伝子を同定する。ここで、遺伝子の示唆的発現を検査するためにRBioconductorパッケージ参考文献7a及びLIMMA参考文献10aを用いた。次に、遺伝子リストをランク付けるために修正t統計量を用いて予めランク付けしたGSEA解析を行い、GeneOntologyGO参考文献11a、GenMAPP参考文献12a、BioCarta、SignalTransductionKnowledgeEnvironment及びMolecularSignaturesDatabase内で企画されているKEGG参考文献9aのような様々なパスウェイデータベースから遺伝子セットの濃縮を検査した。[クラスタリング]濃縮経路のリーディングエッジleadingedge遺伝子は、濃縮シグナルを説明する遺伝子である参考文献9a。GSEAにより統計的有意性を見出される選択経路について、全リーディングエッジ遺伝子の平均発現量としてパスウェイプロファイルを計算した。次に、この選択経路のパスウェィプロファイルの行列を選択代謝物プロファイルで補強した。次に、この行列中の数値を自己抗体陰性非進行群IAA-NPで正規化した、すなわち、可変性の各数値をIAA-及びNP試料由来の平均値で除算して対数底2尺度に変換した。次に、可変性を単位分散にスケール変更した。最後に、クラスター間の距離を計算するためにユークリッド計量完全連結法参考文献14aを用いて階層クラスタリングを適用した。数値をクラスタリングしヒートマップとして示すために、gplotsと呼ばれるRパッケージhttp:wwwr-projectorgを用いた。[微生物解析]FastDNASpinKitforSoilQBIOgene社、カリフォルニア州カールスバッドを製造元の使用説明書を改変して用い参考文献15a、盲腸由来の300mgの糞便試料からDNAを抽出した。最優勢菌PCR-DGGE及び群特異的PCR-DGGEビフィズス菌、ラクトバチルス群、ユーロバクテリウムレクタル-ブラウティアココイダスクロストリジウム群Erec群、クロストリジウムレプツムクロストリジウム群Clept群及びバクテロイダス標準属のPCR-DGGEを上述するように行った参考文献16。BioNumericsソフトウエアバージョン5.1AppliedMathsBVBA社、ベルギー、シントマルテンスラーテムを用いてプロファイルの比較及びアンプリコンの定量を行った。スチューデントt検定を不等分散で用いて、アンプリコン数の統計分析を行った。少なくとも1の総表面積を有するアンプリコンを類似性解析に含める複合データセットを用いるのに加えて、各細菌群からピアソン相関でクラスタリングを行った。BioNumericsソフトウエアで主成分分析を行った。[基礎統計分析]R統計ソフトウエアhttp:wwwr-projectorgをデータの分析及び可視化に用いた。ウィルコクソン順位和検定を用いて濃度を比較し、P値<0.05を統計的有意と考えた。多重比較を説明するため、q値を用いて参考文献17a、18a、有意に相違する脂質間の偽発見率を推定した。Rパッケージq値を用いて偽発見率を計算した。進行群の中央値濃度を非進行群の中央値濃度で除算して、得られた値の2を底としたlogをとることによって、倍率差を計算した。これは、ゼロより大きい/小さい値が進行群においてアップレギュレート/ダウンレギュレートした脂質に相当するため、解釈を簡単にする。クラスタリングでは、相関に基づくカスタマイズした距離メトリック:dij=1/log|式中、xi及びxjは試料セット中の脂質i及びjの濃度を示すを適用した。次いで、この距離測定参考文献19aを用いてウォードの方法を階層クラスタリングに適用した。[代謝状態進行の隠れマルコフモデル]進行群及び非進行群における代謝状態の発展を別々の隠れマルコフモデル参考文献20aによりモデル化し、個体を年齢の代わりに代謝状態に基づき整列させることと、進行群及び非進行群における代謝状態を比較することとを可能にした。モデルをデータに合わせるモデル化仮定は、個々のマウスが類似する発症進行を共通に有するが該状態のタイミングは変動してもよいことと、各状態における代謝物プロファイルは進行群と非進行群とで異なり得ること、である。ケヴィンマーフィーによるMATLABツールボックスを用いて標準バウム-ウェルチアルゴリズムによりモデルフィッティングを行った。モデル構造を我々の先の研究参考文献20aと同じやり方でブートストラップにより検証し、ノンパラメトリックブートストラップで信頼区間を推定した5000試料。[ヒト及びマウスの代謝物のマッピング]及びを、それぞれN個の試料及びM個の試料M≧Nによる次元DX及びDYである2つのデータ行列とする。タスクは、X中の各試料xiがY中のypとマッチするようなY中の試料の順列pを見出すことである、つまり、2つのデータ行列間で試料の1対1のマッチングを推測する。これらデータ行列は同一データ空間にないため、マッチング基準として距離を用いることは不可能である。我々は、この問題を解決するためにデータセット間の統計的依存性に基づく新たな方法論を紹介している参考文献21。そのアイディアは、データ特徴、すなわち統計的依存性を最大にする統計記述子から計算し、前記記述子に基づきマッチングを行うことである。実際、データセット間の統計的依存性が最大となるようにデータをより低次元の部分空間に投影し、この比較可能な部分空間において試料のマッチングを見出すであろう。及びを記述子とすると、ここで一次変換が選択される。相関性を依存性測定値として用いると、最適化問題を得る;相関性を最大化することは、正規分布したデータについての相互情報量を最大化することであり、一般的には合理的な計算上の近似値である。反復アルゴリズムを用いて、この最適化問題を解く。第1段階では、所定の順列pを前提として予測projectionを計算し、第2段階では、所定の予測を前提として順列を最適化する。これら2つの段階を収束まで交互に行う。実際、正準相関分析を用いて順列を前提として予測を計算することができ、所定の予測を前提として順列を解くことは、ハンガリー法アルゴリズムを用いて解くことができる割当問題をもたらす。上記の方法を用いて、ヒト-マウスデータセットのいずれかのペアを前提としてマッチングを見出すことができる。そのマッチングは、様々なヒト-マウスデータセットペアにより得られた解を組み合わせてコンセンサスマッチングを与えることによって、さらに向上させることができる。簡単にするために、ヒト-マウスデータセットのペアが独立な試料であると仮定し、多数のデータセットを近似的に仮定することを保持する。異なるマッチング解を組み合わせるため、観察された全てのマッチング解に基づき分割表を作成する。2つの種の脂質は分割表の行及び列の表示であり、各セルは、観察されたマッチング解において2つの種における対応する脂質が何回ペアになっているかの計数を与える。分割表を前提とするコンセンサスペアリングの発見は、分割表の行と列との間での最大二部マッチングの発見に帰着する。これを、ハンガリー法アルゴリズムを用いることにより再度解くことができる。[ブートストラップに基づく二元配置分析]NODマウスとDIPP研究における人間とが共通に有する疾患影響を見出すため、最初に2つの種の生物の代謝物をペアにし、次いでHMMにより人間とマウスの進行群及び非進行群の代謝状態を推定し、最後に進行群/非進行群対人間/マウスに対してブートストラップに基づく二元配置分析を行い、疾患影響及び生物効果並びにそれらの相互作用を同定した。データ駆動型ペアリング又は代謝物及び4つのHMMを上述のように計算した。疾患影響の二元配置分析は、最小二乗法により推定されるただ1つの平均パラメーターで表される生物効果を最初に除き、次いで、プールした人間及びマウスの疾患影響についてブートストラップ信頼区間を計算することにより行った。生物効果及び交差効果は類似の方法で推定した。[参考文献][実施例中の参考文献][補足図の参考文献]"