"哺乳動物の組み換え型タンパク質の発現を増加させるための方法であって:a.シュードモナスフルオレッセンスの宿主細胞を、哺乳動物の組み換え型タンパク質をコードする核酸で形質転換する工程;およびb.哺乳動物の組み換え型タンパク質の発現が可能な条件下で、その細胞を培養する工程;を含み、エシェリキアコリの発現系内で実質的に同等の条件下でのタンパク質の発現レベルと比較したときにそのタンパク質の発現レベルが増加している方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質を単離する工程をさらに含む、請求項1の方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質を実質的に精製する工程をさらに含む、請求項2の方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質が可溶型で該宿主細胞内に存在する、請求項1の方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質が不溶型で該細胞内に存在する、請求項1の方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質が活性型で該細胞内に存在する、請求項1の方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質がヒトのペプチドである、請求項1の方法。組み換え型タンパク質が、全細胞タンパク質の約5を超えるように生産される、請求項1の方法。組み換え型タンパク質が、全細胞タンパク質の約10を超えるように生産される、請求項1の方法。組み換え型タンパク質が、少なくとも10g/Lの濃度で生産される、請求項1の方法。組み換え型タンパク質が、少なくとも20g/Lの濃度で生産される、請求項1の方法。組み換え型タンパク質が、少なくとも40g/Lの濃度で生産される、請求項1の方法。シュードモナスフルオレッセンスの宿主細胞内で哺乳動物の組み換え型タンパク質を生産するための方法であって:a.宿主細胞を哺乳動物の組み換え型タンパク質をコードする核酸で形質転換する工程;b.哺乳動物の組み換え型タンパク質の発現が可能な条件下で、その細胞を培養する工程;およびc.哺乳動物の組み換え型タンパク質を単離する工程、を含む方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質を実質的に精製する工程をさらに含む、請求項13の方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質が可溶型で宿主細胞内に存在する、請求項13の方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質が不溶型で宿主細胞内に存在する、請求項13の方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質が活性型で宿主細胞内に存在する、請求項13の方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質がヒトのペプチドである、請求項13の方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質が少なくとも約1kD~約500kDの間の質量を有する、請求項13の方法。哺乳動物の組み換え型タンパク質が約30kDを超える質量を有する、請求項19の方法。組み換え型タンパク質が、全細胞タンパク質の約5を超えるように生産される、請求項13の方法。組み換え型タンパク質が、全細胞タンパク質の約10を超えるように生産される、請求項13の方法。組み換え型タンパク質が、少なくとも10g/Lの濃度で生産される、請求項13の方法。組み換え型タンパク質が、少なくとも20g/Lの濃度で生産される、請求項13の方法。組み換え型タンパク質が、少なくとも40g/Lの濃度で生産される、請求項13の方法。宿主細胞内でヒトの組み換え型タンパク質を生産するための方法であって:a.宿主細胞をヒトの組み換え型ペプチドをコードする核酸で形質転換する工程;およびb.ヒトの組み換え型ペプチドの発現が可能な条件下で、その細胞を培養する工程;を含み、宿主細胞がシュードモナスフルオレッセンスである方法。ヒトの組み換え型タンパク質が可溶型で宿主細胞内に存在する、請求項26の方法。ヒトの組み換え型タンパク質が活性型で宿主細胞内に存在する、請求項26の方法。ヒトの組み換え型ペプチドをコードする核酸を含む、シュードモナスフルオレッセンス細胞。ヒトの組み換え型ペプチドを発現する、請求項29の細胞。従って、本発明の目的は、治療目的のために単離し精製することができる、哺乳動物の組み換え型タンパク質、特にヒトタンパク質を生産するための方法、およびこの方法を実現させることができる細胞を提供することである。本発明のさらなる目的は、哺乳動物の活性な組み換え型タンパク質、たとえば哺乳動物の複合タンパク質を生産するための改善された方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、哺乳動物の組み換え型タンパク質、特にヒトタンパク質を高レベルで生産するための改善された方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、可溶性または不溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質を高い発現レベルで供給する、形質転換された生命体を提供することである。シュードモナスフルオレッセンスが、組み換え型タンパク質、特に哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトの組み換え型タンパク質を生産するための優れた生命体であることが発見された。これらの発見に基づいて、本発明は、シュードモナスフルオレッセンスにおいて、哺乳動物の組み換え型タンパク質または哺乳動物に由来するタンパク質を生産する方法を提供する。さらに本発明は、哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するために形質転換されたシュードモナスフルオレッセンスを提供する。一つの実施形態においては、本発明は、細胞あたりまたは発酵反応物1リットルあたり、同等の条件下でのエシェリキアコリ生物よりも高いレベルまたは濃度でタンパク質が生産されるところのシュードモナスフルオレッセンス生物で、哺乳動物のタンパク質を生産する方法を提供する。さらに別の実施形態においては、本発明は、組み換えエシェリキアコリ生物の対応するバッチよりも、1リットルあたりのタンパク質をより多く生産するシュードモナスフルオレッセンス生物でバッチ培養で、哺乳動物のタンパク質を生産する方法を提供する。同等の条件または実質的に同等の条件とは具体的には、異なる生命体において、同様の機能するように結合した転写プロモーターおよびリボゾーム結合部位を用い、そして同じ初期誘導条件を用いることによる、組み換え型タンパク質の発現を意味する。同等の条件としては、同じベクターと関連する調節エレメント、たとえばこれらに限定されるわけではないが、エンハンサー配列、終止配列および開始又は複製配列、を用いることも含まれ得る。同等の条件としては、細胞発酵反応物が同じ総体積であることも含まれ得る。同等の条件としては、反応物1リットルあたりの総細胞濃度が同じであることも含まれ得る。一つの実施形態においては、この条件は、測定前の総誘導時間が同程度または同じであることも含む。しかしながら、別の実施形態においては、生命体に応じて誘導時間を変えてもよい。具体的には、エシェリキアコリ細胞のほとんどが変化しない時点においてシュードモナスフルオレッセンスにおけるタンパク質生産を測定できるように、シュードモナスフルオレッセンスは、タンパク質生産を減らすこと無く、エシェリキアコリを超えて長時間増殖する能力を有する。同等の条件を測定する一つの方法は、全細胞タンパク質あたりの組み換え型タンパク質のパーセントを比較することである。さらに同等の条件は、同一の培地を必要としない。培地を調整して、個々の生命体にとって最適な生産を確実にすることができる。別の実施形態においては、本発明は、シュードモナスフルオレッセンス生物でタンパク質を生産する工程、および生産されたタンパク質を単離する工程によって、哺乳動物の組み換え型タンパク質を生産するための方法を提供する。一つの下位実施形態においては、本方法は、タンパク質を実質的に精製する工程を含む。一つの実施形態においては、このタンパク質はヒトタンパク質に由来するか、またはヒト化されたものである。本発明は、少なくとも次の実施形態におけるシュードモナスフルオレッセンスの使用をも提供する:i1~75全細胞タンパク質パーセントtcpの間の範囲、または特に少なくとも約5tcp、10tcp、少なくとも15tcp、少なくとも20tcpまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞に存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産;ii1~75tcpの間の範囲、または特に少なくとも約5tcp、10tcp、少なくとも15tcp、少なくとも20tcpまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞の細胞質に存在する、可溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産;iii1~75tcpの間の範囲、または特に少なくとも約5tcp、10tcp、少なくとも15tcp、少なくとも20tcpまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞の細胞質に存在する、不溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産;iv1~75tcpの間の範囲、または特に少なくとも約5tcp、10tcp、少なくとも15tcp、少なくとも20tcpまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞のペリプラズム内にある、可溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産;v1~75tcpの間の範囲、または特に少なくとも約5tcp、10tcp、少なくとも15tcp、少なくとも20tcpまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞のペリプラズム内にある、不溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産;vi少なくとも40g/Lの細胞密度で培養した場合における、1~75tcpの間の範囲、または特に少なくとも約5tcp、10tcp、少なくとも15tcp、少なくとも20tcpまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞に存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産;vii細胞内に活性型で存在する、哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産;viii活性型の哺乳動物の複数サブユニット型の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産;ix次いで単離され精製される、哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産;およびx復元される、哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産。一つの実施形態においては、哺乳動物の組み換え型タンパク質は、複数サブユニット型のタンパク質、血液運搬タンパク質、酵素、全長抗体、抗体断片または転写因子からなる群より選択される。別の実施形態においては、本発明は、次のものを包含する:i実質的に一致する条件下で培養した場合、対応するエシェリキアコリ生物よりも高いレベルまたは濃度で哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス生物;ii1~75tcpの間の範囲、または特に少なくとも約5tcp、10tcp、少なくとも15tcp、少なくとも20tcpまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞に存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質およびペプチドを生産するように形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス生物;iii細胞に活性型で存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス生物;iv1~75tcpの間の範囲、または特に少なくとも約5tcp、10tcp、少なくとも15tcp、少なくとも20tcpまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞の細胞質に可溶性で存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス生物;v1~75tcpの間の範囲、または特に少なくとも約5tcp、10tcp、少なくとも15tcp、少なくとも20tcpまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞の細胞質に不溶性で存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス生物;vi1~75tcpの間の範囲、または特に少なくとも約5tcp、10tcp、少なくとも15tcp、少なくとも20tcpまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞のペリプラズムに可溶性で存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス生物;vii1~75tcpの間の範囲、または特に少なくとも約5tcp、10tcp、少なくとも15tcp、少なくとも20tcpまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞のペリプラズムに不溶性で存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス生物;viiiヒトを含む哺乳動物の複数サブユニット型の組み換え型タンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス生物;ix細胞内に活性型で存在する、ヒトを含む哺乳動物の複数サブユニット型の組み換え型タンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス生物。代替的な実施形態においては、以下に詳述するように、シュードモナス生物およびフルオレッセンス以外の近接する細菌を本発明における宿主細胞として用いる。一つの実施形態においては、シュードモナス属から、具体的には非病原性のシュードモナス種から、宿主細胞を一般的に選択することができる。同様に、あらゆるシュードモナスフルオレッセンス株、たとえばこれらに限定されるわけではないがMB101株か、または少なくとも一つのLacリプレッサータンパク質をコードするlacI導入遺伝子の、少なくとも一つの宿主細胞で発現可能な挿入されたコピーを含むように改変された株、たとえばMB214およびMB217を用いて、発明の所望の目的を達成することができる。このシュードモナス生物を、必要に応じて、一つ以上の遺伝子を付加または削除する遺伝子改変を行って、能力、プロセシングまたはその他の特性を改善してもよい。一つの実施形態においては、シュードモナス生物は、複数サブユニット型のタンパク質、血液運搬タンパク質、酵素、全長抗体、抗体断片または転写因子からなる群より選択される哺乳動物の組み換え型タンパク質をコードする核酸で形質転換される。一つの実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンス生物は、複数サブユニット型のタンパク質、血液運搬タンパク質、酵素、全長抗体、抗体断片または転写因子からなる群より選択される哺乳動物の組み換え型タンパク質を発現する。発現された、哺乳動物の組み換え型タンパク質またはヒトタンパク質は、典型的には少なくとも約1kDの質量、そして最大で約100、200、300、400または500kDの質量を有し、多くの場合は約10kD~約100kDの間の質量を有し、そして通常は約30kDを超える質量を有するだろう。哺乳動物の組み換え型タンパク質を生産するための方法本発明は、方法と、哺乳動物の組み換え型タンパク質を生産する、形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス生物とを提供する。一つの実施形態においては、本発明は、シュードモナスフルオレッセンス生物でタンパク質を生産する工程、および生産されたタンパク質を単離する工程によって、哺乳動物の組み換え型タンパク質を生産するための方法を提供する。発現後に、本技術分野において公知の技術、たとえばこれらに限定されるわけではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、抗体親和性、サイズ排除、またはタンパク質から細胞の残骸のほとんどの部分を取り除くその他の任意の方法によって、このタンパク質を単離することができる。一つの下位実施形態においては、この方法によって、実質的に精製されたタンパク質が提供される。単離されたタンパク質は、それが由来するところの天然のタンパク質のものと同様の活性を有することができる。このタンパク質を、天然のタンパク質のそれと近い、正確に折りたたまれた状態または立体配置で単離することができ、またはさらに復元または改変して、正確に折りたたまれた立体配置を取らせることができる。一つの下位実施形態においては、このタンパク質はヒトタンパク質に由来するか、またはヒト化されたものである。ヒト化タンパク質とは典型的には、ヒトに由来するタンパク質配列から部分的に成るキメラ性の哺乳動物型タンパク質である。ヒト化は抗体生産において特に有用であり、ヒト化抗体の開発は広範囲にわたって、たとえば米国特許第6,800,738号に記載されている。一つの実施形態においては、宿主細胞によるタンパク質の発現に続いて、タンパク質の単離を行う。別の実施形態においては、ペプチドのタンパク質を精製する。代替的な実施形態においては、タンパク質の単離の後で、そのタンパク質を精製する。活性なタンパク質を生産させるために、必要に応じて、単離されたまたは精製されたタンパク質の復元または再折りたたみを行ってもよい。別の実施形態においては、本発明は、エシェリキアコリ生物よりも高いレベルまたは濃度でタンパク質が生産されるところのシュードモナスフルオレッセンス生物で、哺乳動物のタンパク質を生産する方法を提供する。シュードモナスフルオレッセンス生物が、哺乳動物のタンパク質の高レベル生産に適しているかどうかは、従来技術においてこれらの生命体にてこのようなタンパク質の生産が成功しなかったことが理由で、予想されていなかった。本発明者らは、これらの生命体が哺乳動物のタンパク質を高レベルで生産する能力を本当に有すること、そして対応する評価法で試験した場合、エシェリキアコリよりも高い収率すなわち高いレベルでタンパク質を発現することが通常であることを見出した。別の実施形態においては、本発明は、組み換えエシェリキアコリ生物の対応するバッチよりも、1リットルあたりのタンパク質をより多く生産するシュードモナスフルオレッセンス生物のバッチ培養で、哺乳動物のタンパク質を生産する方法を提供する。いくつかの実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンスにおいて、活性型の哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトの複数サブユニット型のタンパク質を生産すること;シュードモナスフルオレッセンスにおいて、哺乳動物の組み換え型血液輸送タンパク質、たとえばヒトの血液運搬タンパク質、具体的にはトランスフェリンおよびアルブミンを生産すること;シュードモナスフルオレッセンスにおいて、活性型の哺乳動物の組み換え型酵素、たとえば哺乳動物の組み換え型酵素を生産すること;シュードモナスフルオレッセンスにおいて、抗体および抗体断片、たとえば一本鎖抗体およびFab断片を生産すること;ならびにシュードモナスフルオレッセンスにおいて、哺乳動物の組み換え型、たとえばヒト転写因子を生産することを含む方法が提供される。一つの実施形態においては、哺乳動物の組み換え型タンパク質を多量体として、またはコンカタメリックな前駆体で、たとえば少なくとも二つの小ペプチド1-15アミノ酸単位で一列に並んだ形態で生産する。代替的な実施形態においては、哺乳動物の組み換え型タンパク質を多量体として、またはコンカタメリックな前駆体では生産しないが、その代わりに一本鎖のポリペプチドとして生産する。生体分子のスクリーニング本発明の別個の実施形態は、所望の活性または特性を示す少なくとも一つのものを特定するための哺乳動物の生体分子のスクリーニングライブラリーのプロセスに、シュードモナスフルオレッセンス生物を提供する。シュードモナスフルオレッセンス細胞を、試験することが望ましい哺乳動物に由来する多数の核酸で形質転換し、形質転換された宿主細胞のライブラリーを作製することができる。発現と同時に、細胞質またはその細胞からその後に回収されるもののいずれかを試験するための、少なくともいくつかの核酸でコードされたポリペプチドが生産される。その試験が行われるであろう活性および特性の例としては、次のものが挙げられる:ポリペプチドの発現レベル;ポリペプチドの安定性;および生体触媒活性および特性。生体触媒活性および特性の実例としては、次のものが挙げられる:酵素活性;タンパク質の相互作用/結合性;タンパク質安定性;基質の使用法;産物の形成;反応条件、たとえばpH、塩分濃度もしくは反応温度;所定の触媒反応についての生体触媒パラメータ、たとえばKmおよびVmax;ならびに安定性の挙動、たとえば熱安定性および生体触媒の寿命の半分。得られたこの試験結果を、さらなる開発のためにライブラリーのメンバーの選択に用いてもよい。タンパク質の発現本発明の重要な側面は、シュードモナスフルオレッセンス生物における発現によって、哺乳動物、たとえばヒトの組み換え型タンパク質を、1~75全細胞タンパク質パーセントtcpの間の範囲という高レベルで発現することである。この発現されたタンパク質は、シュードモナスフルオレッセンス細胞内にある時は可溶性または不溶性であり得る。このような高レベルの可溶性または不溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質は、哺乳動物のタンパク質の既存の公知の発現系を凌ぐ改善であり得る。特に、大規模な発酵反応物において回収される高レベルの哺乳動物のタンパク質は、公知の技術によっては通常不可能である。一つの実施形態においては、本発明は、エシェリキアコリの発現系で見出されるそれを上回る、哺乳動物のタンパク質の発現レベルを提供する。一つの実施形態においては、それぞれの細胞における組み換え型タンパク質の濃度は、比較評価においてエシェリキアコリで見られる濃度よりも高い。一つの実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンスの発現系において測定される全細胞タンパク質と比較した組み換え型タンパク質のレベルは、エシェリキアコリにおいて発現する同じ組み換え型タンパク質のそれよりも高い。別の実施形態においては、本明細書で記載されるシュードモナスフルオレッセンスの発現系における可溶性タンパク質のレベルまたは量は、類似のエシェリキアコリの発現系における可溶性の組み換え型タンパク質のレベルまたは量よりも高い。別の実施形態においては、活性なタンパク質の総量は、エシェリキアコリの発現系に由来する量よりも多い。別個の実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンスの発現系において測定される全細胞タンパク質と比較した活性な組み換え型タンパク質のレベルは、エシェリキアコリにおいて発現する同じ組み換え型タンパク質のそれよりも高い。一つの実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンスにおいて発現するタンパク質のレベル、濃度または量は、エシェリキアコリにおいて発現する組み換え型タンパク質の、類似の評価法でのレベル、濃度または量の少なくとも2x、少なくとも3x、少なくとも4x、少なくとも5x、少なくとも6x、少なくとも7x、少なくとも8x、少なくとも9x、少なくとも10xまたはそれ以上である。シュードモナスフルオレッセンスの発現系としての利点の一つは、それらのタンパク質生産能力に否定的な影響を与えること無く、大規模な培養で細胞を培養できることである。この能力は、その他の細菌系、たとえばエシェリキアコリにおいて見られる能力を凌いでいる。別の実施形態においては、本方法は、エシェリキアコリのバッチ培養よりも高い総レベルで、シュードモナスフルオレッセンスにて組み換え型タンパク質が生産されるところのバッチ培養で哺乳動物のタンパク質生産することを含む。さらに別の実施形態においては、本発明は、組み換えエシェリキアコリ生物の対応するバッチよりも、1リットルあたりのタンパク質をより多く生産するシュードモナスフルオレッセンス生物のバッチ培養で哺乳動物のタンパク質を生産する方法を提供する。本発明は一般的に、方法と、1-75全細胞タンパク質tcpの発現レベルを、可溶性または不溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質に与える能力を有する、形質転換されたシュードモナスフルオレッセンス生物とを提供する。細胞内で発現される哺乳動物の組み換え型タンパク質は、活性型で発現され得る。その他の実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンスは、少なくとも1、5、10、15、20、25、30、40、50、55、60、65、70または75tcpの哺乳動物の組み換え型タンパク質を提供する。これらのタンパク質は可溶性でもよく、可溶性の場合では、生産の間は、細胞の細胞質またはペリプラズム内に存在し得る。可溶性タンパク質は、たとえばこれらに限定されるわけではないが、圧力によって細胞膜を破裂させる方法すなわちフレンチプレス法、または細胞膜のリゾチーム分解法によって、細胞から容易に放出される。界面活性剤、たとえば非イオン性界面活性剤を用いると、通常は細胞を溶解させることもできる。可溶性のタンパク質を、緩衝液の構成要素、たとえば緩衝液のpH、塩濃度またはさらなるタンパク質成分たとえば複数サブユニット型の複合体を調節することによって、さらに安定化させることができる。たとえば遠心分離および/またはクロマトグラフィー、具体的にはサイズ排除クロマトグラフィー、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーによって、その他のタンパク質および細胞の残骸から、可溶性タンパク質を単離または精製することができる。タンパク質は不溶性でもよい。不溶性タンパク質は通常、細胞質の封入体内で見られるが、ペリプラズム内で見られることも多い。すべての不溶性タンパク質が封入体内にあるわけではなく、小タンパク質凝集物のような膜凝集物、または細胞質もしくはペリプラズム内のその他のあらゆる不溶型にも見られることがある。不溶性タンパク質は通常、たとえば還元剤、具体的には尿素または塩酸グアニジンを用いて復元することができる。たとえば遠心分離および/またはクロマトグラフィー、具体的にはサイズ排除クロマトグラフィーによって、不溶性タンパク質またはタンパク質凝集物を単離することができる。不溶性凝集物内のタンパク質は通常、たとえばVinogradovetalAnalBiochem153202348に記載のミセルまたは逆ミセルを用いての凝集物の可溶化によって分離することができる。特定の実施形態においては、無機塩培地すなわち約4°C~約55°Cを含む温度範囲内で培養すると、シュードモナスの宿主細胞は、少なくとも1tcpの発現レベルかつ少なくとも40g/Lの細胞密度の哺乳動物の組み換え型ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはその断片を有することができる。特定の実施形態においては、発現系はペプチドの組み換え型タンパク質、たとえば少なくとも10リットルの発酵規模の無機塩培地すなわち約4°C~約55°Cを含む温度範囲内で培養すると少なくとも5tcpの発現レベルかつ少なくとも40g/Lの細胞密度の哺乳動物の組み換え型タンパク質を有するだろう。本技術分野において公知の標準的な技術によって、発現レベルを測定することができる。一つの実施形態においては、タンパク質の量グラムは、所定のサンプルにおける全細胞タンパク質のグラムの量に匹敵する。別の実施形態においては、この測定は1リットルあたりの組み換え型タンパク質のレベルである。別の実施形態においては、公知の標準、たとえばBSAコントロールに照らして、このレベルまたは量を測定することができる。たとえば精製タンパク質の吸光度を分析することによって、タンパク質具体的には抗体親和性についてのマーカーの親和性を公知の標準と比較して測定することによって、または活性のレベルを公知の標準たとえば既知量の精製した活性なタンパク質と比較して測定することによって、組み換え型タンパク質のレベルまたは量を測定することができる。特定の状況においては、シュードモナスフルオレッセンス細菌を発現用宿主細胞として用いる場合、ジスルフィド結合を含む標的ポリペプチドを活性な可溶型で回収するために、さらなるジスルフィド結合を促進しない条件または薬剤を必要とすることが分かった。従って、一つの実施形態においては、遺伝子導入ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または断片は、その天然の状態の分子内ジスルフィド結合を少なくとも一つ含む。その他の実施形態においては、タンパク質は、最大で2、4、6、8、10、12、14、16、18または20を超える、その天然の状態のジスルフィド結合を有し得る。いくつかの実施形態においては、精製または単離前の生産過程において、細胞のペリプラズム内でタンパク質が発現するか見出される。適切な分泌シグナル配列に融合することによって、タンパク質をペリプラズム内に分泌させることができる。一つの実施形態においては、シグナル配列は、シュードモナスフルオレッセンスのゲノムを原産とするシグナル配列である。具体的な実施形態においては、シグナル配列は、リン酸結合タンパク質、Lys-Arg-Orn結合タンパク質LAObpまたはKRObp分泌シグナルペプチド、外膜ポーリンEOpreE分泌シグナルペプチド、アズリン分泌シグナルペプチド、鉄III結合タンパク質FeIIIbp分泌シグナルペプチドまたはリポタンパク質BLprB分泌シグナルペプチドである。一つの実施形態においては、組み換え型ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはそれらの断片は、その活性状態で折りたたまれた分子内立体配置を有する。シュードモナスフルオレッセンスは通常、正確に折りたたまれた立体配置の哺乳動物のタンパク質をより効率的に生産する。一つの実施形態においては、50を超えて発現された、遺伝子導入ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または生産されたそれらの断片を、可溶性、活性型または不溶性の状態の一本鎖ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはそれらの断片として生産できるが、細胞質内またはペリプラズム内では復元可能な形態である。別の実施形態においては、発現されたタンパク質の約60、70、75、80、85、90、95を活性型で得ることができ、または活性型に復元することができる。定義本明細書を通して、タンパク質という用語は、アミノ酸のあらゆるコンカテマーまたはポリマーを含むものとして用いられる。ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質という用語は、相互に交換して用いることができ、その中の一つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的アナログであるところのアミノ酸のポリマー、ならびに天然のアミノ酸のポリマーを含む。単離されたという用語は、細胞内の天然の状態で見られるような普通に随伴するその他の物質成分、たとえばその他の細胞内成分を実質的にまたは本質的に含まない核酸、タンパク質またはペプチドを意味する。精製されたまたは実質的に精製されたという用語は、タンパク質がその他の細胞成分から分離されること、およびタンパク質との天然の複合体には存在しない細胞で見られるその他のタンパク質およびペプチドから分離されることを意味するものとして用いられる。特定の実施形態においては、精製タンパク質は、標準的なcGMPガイドラインで規定されるような治療にまたは獣医に用いることが承認された純度、またはFDAによって承認された純度である。全細胞タンパク質のパーセントtcpという用語は、凝集した細胞内タンパク質のパーセントとしての宿主細胞におけるタンパク質の量を意味する。あるいは、この用語は、その細胞によって発現された所定のタンパク質の相対量を表す全細胞タンパク質の割合の基準を意味する。機能できるように結合という用語は、そこでの転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメント、それらの調節エレメントはコード配列の発現を導くことができる、が、そのコード配列に関連して宿主細胞内で作用するような配置で、コードする配列に共有結合しているあらゆる立体配置を意味する。本明細書で用いられるように、哺乳動物という用語は、哺乳綱のあらゆる動物を含むまたは示すことを意味し、たとえばヒトまたは非ヒトの哺乳動物、具体的にはこれらに限定されるわけではないが、ブタ、ヒツジ、ウシ、げっ歯類、有蹄類、ブタ、ブタ、ヒツジ、仔ヒツジ、ヤギ、ウシ、シカ、ラバ、ウマ、サル、サル、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスが挙げられる。本明細書で用いられるように、哺乳動物の組み換え型タンパク質またはペプチドという用語は、哺乳動物の天然のタンパク質配列に由来するタンパク質または哺乳動物の天然の核酸配列に由来するもしくはそれから生じるタンパク質を含むことを意味する。哺乳動物の天然のmRNAに実質的に一致する核酸配列から、またはcDNAまたはその断片に実質的に一致する核酸配列から、このような組み換え型タンパク質を生産することができる。本技術分野において用途が知られている特定の宿主細胞のコドンに従って、この配列を調節することができる。二つの核酸またはポリペプチドに照らして、実質的に一致するというフレーズは、タンパク質のドメイン全体にわたって最も一致するように揃えて、本技術分野において公知のアルゴリズムを用いて測定した場合に、二つの配列において、残基が少なくとも50、60、70、80、90またはそれを超える同一性を有することを意味する。比較のために配列を最大限揃えることを、本技術分野において公知のアルゴリズムたとえばSmithandWatermanAdvApplMath2482NeedlemanandWunschJMolBiol48443PearsonandLipmanProcNatlAcadSciUSA852444AltschuletalJMolBiol215403410によって、これらのアルゴリズムをコンピュータで実施することによって、または検査によって実施することができる。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、全国バイオテクノロジー情報センターを通して公に利用することができる。断片という用語は、ヌクレオチド、タンパク質またはペプチドの配列の一部の配列または部分配列を意味する。本明細書で用いられるように、可溶性という用語は、生理学的条件下の緩衝液で10-30分間回転させた場合において、約5,000×重力~20,000×重力の間での遠心分離によって、タンパク質が沈殿しないことを意味する。可溶性タンパク質は、封入体またはその他の沈殿物の一部分ではない。本明細書で用いられるように、不溶性という用語は、生理学的条件下の緩衝液で10-30分間回転させた場合において、5,000×重力~20,000×重力の間での遠心分離によって沈殿し得るタンパク質を意味する。不溶性タンパク質は、封入体またはその他の沈殿物の一部分であり得る。封入体という用語は、細胞内に含まれる任意の細胞内の物体であって、タンパク質の封鎖された凝集物を包含することを意味する。本明細書で用いられるように、相同という用語は、i所定のオリジナルのタンパク質の配列と少なくとも70、75、80、85、90、95または98類似したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、オリジナルのタンパク質の所望の機能を保持するものか、またはii所定の核酸の配列と少なくとも70、75、80、85、90、95または98類似した配列を有する核酸であって、オリジナルの核酸配列の所望の機能を保持するもの、のいずれかを意味する。本発明および開示のすべての実施形態においては、開示された任意のタンパク質、ペプチドまたは核酸を、所望の機能を保持する、相同または実質的に相同なタンパク質、ペプチドまたは核酸と置換することができる。本発明および開示のすべての実施形態において、任意の核酸が開示される場合、本発明は、その開示される核酸にハイブリッド形成するすべての核酸をも包含するものとみなされるべきである。一つの制限されない実施形態においては、相同なポリペプチドの同一ではないアミノ酸配列は、表1に示される15の保存的または半保存的な基のいずれか一つの一員であるアミノ酸であり得る。生産された哺乳動物のタンパク質のタイプ一般的に、哺乳動物の組み換え型タンパク質は、そのアミノ酸配列が、公知のあらゆる哺乳動物のタンパク質、またはアミノ酸配列が推定されるあらゆる推定される哺乳動物タンパク質又は哺乳動物に由来するタンパク質であり得る。このタンパク質を、複数サブユニット型のタンパク質、血液運搬タンパク質、酵素、全長抗体、抗体断片または転写因子からなる群より選択することができる。タンパク質のアミノ酸配列を改変して、所望の特質に調節すること、たとえば相互作用の特定のタイプを保証することができる。この配列を調節して、たとえばその免疫反応性を調節して小さくしたり、または吸光度を高めたり、排出を抑制したり、さもなければ生命体、具体的には哺乳動物におけるバイオアベイラビリティを促進することができる。従って、このタンパク質のアミノ酸配列を調節して、特定の翻訳後修飾またはタンパク質の立体配置を保証することができる。一つの実施形態においては、哺乳動物のタンパク質はケモカインまたはサイトカインである。別の実施形態においては、哺乳動物のタンパク質は、次のタンパク質のいずれか一つである:IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12elasti、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-18BPa、IL-23、IL-24、VIP、エリスロポエチン、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、血小板由来増殖因子PDGF、MSF、FLT-3リガンド、EGF、線維芽細胞増殖因子FGF;たとえばaFGFFGF-1、bFGFFGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6またはFGF-7、インスリン様増殖因子たとえばIGF-1、IGF-2;腫瘍壊死因子たとえばTNF、リンホトキシン、神経成長因子たとえばNGF、血管内皮増殖因子VEGF;インターフェロンたとえばIFN-α、IFN-β、IFN-γ;白血病抑制因子LIF;毛様体神経栄養因子CNTF;オンコスタチンM;幹細胞因子SCF;トランスフォーミング増殖因子たとえばTGF-α、TGF-β1、TGF-β1、TGF-β1;TNFスーパーファミリーたとえばLIGHT/TNFSF14、STALL-l/TNFSF13BBLy5、BAFF、THANK、TNFアルファ/TNFSF2およびTWEAK/TNFSF12;またはケモカインBCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、エオタキシン-1、エオタキシン-2/MPIF-2、エクソダス-2/SLC、フラクタルカイン/ニューロタクチン、GROアルファ/MGSA、HCC-1、I-TAC、リンフォタクチン/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1/ABCD-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α/GROβ、MIP-3α/エクソダス/LARC、MIP-3α/エクソダス-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1α、TARCまたはTECK。あるいは、このタンパク質はケモカインまたはサイトカインではない。別の実施形態においては、哺乳動物のタンパク質は、次のタンパク質の一つではない:IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12elasti、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-18BPa、IL-23、IL-24、VIP、エリスロポエチン、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、血小板由来増殖因子PDGF、MSF、FLT-3リガンド、EGF、線維芽細胞増殖因子FGF;たとえばaFGFFGF-1、bFGFFGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6またはFGF-7、インスリン様増殖因子たとえばIGF-1、IGF-2;腫瘍壊死因子たとえばTNF、リンホトキシン、神経成長因子たとえばNGF、血管内皮増殖因子VEGF;インターフェロンたとえばIFN-α、IFN-β、IFN-γ;白血病抑制因子LIF;毛様体神経栄養因子CNTF;オンコスタチンM;幹細胞因子SCF;トランスフォーミング増殖因子たとえばTGF-α、TGF-β1、TGF-β1、TGF-β1;TNFスーパーファミリーたとえばLIGHT/TNFSF14、STALL-1/TNFSF13BBLy5、BAFF、THANK、TNFアルファ/TNFSF2およびTWEAK/TNFSF12;またはケモカインBCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、エオタキシン-1、エオタキシン-2/MPIF-2、エクソダス-2/SLC、フラクタルカイン/ニューロタクチン、GROアルファ/MGSA、HCC-1、I-TAC、リンフォタクチン/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-l/ABCD-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α/GROβ、MIP-3α/エクソダス/LARC、MIP-3α/エクソダス-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1α、TARCまたはTECK。一つの実施形態においては、このタンパク質はブタタンパク質ではなく、特にブタ増殖因子ではない。現時点での本開示のさらなる実施形態では、哺乳動物の組み換え型タンパク質、それらの断片またはその他の誘導体またはそれらのアナログは抗体であり得る。これらの抗体としては、たとえば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明のこの側面としては、キメラ性の抗体、一本鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにFab断片またはFab発現ライブラリーの産物も挙げられる。複数サブユニット型のタンパク質の生産本発明の一つの実施形態においては、シュードモナス種の宿主細胞による、哺乳動物の組み換え型の複数サブユニット型タンパク質の生産が提供される。別の実施形態においては、哺乳動物の組み換え型の複数サブユニット型タンパク質を発現するように形質転換されたシュードモナス種の宿主細胞が提供される。一つの実施形態においては、複数サブユニット型のタンパク質、たとえば哺乳動物またはヒトの組み換え型タンパク質、がシュードモナスの宿主細胞内で発現する。一つの実施形態においては、宿主細胞による複数サブユニット型のタンパク質の発現の後、複数サブユニット型のタンパク質が単離される。別の実施形態においては、ペプチドの複数サブユニット型のタンパク質が精製される。このタンパク質は、精製もしくは単離前の細胞によって会合することができ、または単離もしくは精製の間もしくは後で、さらに会合することができる。必要に応じて、このタンパク質またはその任意の一部の復元または再折りたたみを行って、活性なタンパク質を生産することができる。種々のベクターおよび発現系のあらゆるものを用いて、宿主細胞内で複数サブユニット型のタンパク質を発現させることができる。この複数サブユニットを単一のベクター上に位置させてもよく、必要に応じて種々のプロモーターに機能するように結合させてもよく、必要に応じてポリシストロン配列内に位置させてもよい。それぞれのサブユニットが異なるベクター上にあってもよい。複数のベクターを用いることができる。それぞれのサブユニットが、一つ以上の選択マーカーの制御下にあってもよい。調節エレメントをベクター上、たとえばペリプラズムの分泌シグナル配列、インターナルリボゾームエントリーサイト、アクチベーター配列、プロモーターおよび終止シグナル上に含めてもよい。一つの実施形態においては、2004年11月19日にDowGlobalTechnologies社から出願された米国特許出願第10/994,138号に記載されているように、栄養素要求性選択マーカーを伴う発現系を用いて、シュードモナス内で複数サブユニット型のタンパク質が発現される。この出願では、サブユニットをコードするそれぞれの核酸の制御が、栄養素要求性選択マーカーの制御下にある。発現することが可能な複数サブユニット型のタンパク質としては、ホモメリックタンパク質およびヘテロメリックタンパク質が挙げられる。複数サブユニット型のタンパク質は二以上のサブユニットを含んでもよく、サブユニットは同一でも異なっていてもよい。たとえば、このタンパク質は2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれを超えるサブユニットを含むホモメリックタンパク質であってもよい。このタンパク質は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれを超えるサブユニットを含むヘテロメリックタンパク質であってもよい。哺乳動物の複数サブユニット型のタンパク質の具体例としては:レセプター、たとえばイオンチャネルレセプター;シグナルタンパク質、たとえばキナーゼ、GTPアーゼ、ATPアーゼ;膜貫通型タンパク質;細胞外マトリックスタンパク質、たとえばコンドロイチン;コラーゲン;免疫調整剤、たとえばMHCタンパク質、全鎖抗体および抗体断片;酵素、たとえばRNAポリメラーゼおよびDNAポリメラーゼ;ならびに膜タンパク質が挙げられる。血液タンパク質の生産本発明の一つの実施形態においては、哺乳動物の組み換え型血液タンパク質を生産することが提供される。一つの実施形態においては、宿主細胞による血液タンパク質の発現に続けて、血液タンパク質が単離される。別の実施形態においては、血液タンパク質が精製される。別の実施形態においては、血液タンパク質を単離した後、血液タンパク質が精製される。必要に応じて、このタンパク質の復元または再折りたたみを行って、活性なタンパク質を生産することができる。一般的に、適切な宿主細胞、たとえばシュードモナスフルオレッセンス宿主細胞を、血液タンパク質をコードする核酸構築物で形質転換する工程、形質転換された宿主細胞を、発現に適した条件下で培養する工程、そして任意に、その細胞によって発現された組み換え型血液タンパク質を単離し、または単離して精製する工程によって、本発明の組み換え型血液タンパク質を生産する。別の実施形態においては、哺乳動物の組み換え型血液タンパク質を発現するように、提供される対象の血液タンパク質の発現に適切な遺伝子および調節エレメントを含むベクターで形質転換された、シュードモナスシュードモナス種の宿主細胞が提供される。発現することができる血液タンパク質としては、たとえばこれらに限定されるわけではないが、運搬タンパク質、たとえばアルブミン、具体的にはヒトアルブミン配列番号:1、表2およびウシアルブミン;トランスフェリン、たとえばヒトトランスフェリン配列番号:2、表2、ウシトランスフェリン、ラットトランスフェリン、組み換え型トランスフェリン、組み換え型トランスフェリンの半分子、特性が改変された組み換え型トランスフェリンの半分子;ハプトグロビン;フィブリノーゲンおよびその他の凝固因子;補体成分;免疫グロブリン;酵素インヒビター;基質前駆体、たとえばアンギオテンシンおよびブラジキニン;インスリン;エンドセリン;グロブリン、たとえばアルファ、ベータおよびガンマ-グロブリン;ならびに哺乳動物の血中に主に見られるその他のタイプのタンパク質、ペプチドおよびそれらの断片が挙げられる。多数の血液タンパク質について、アミノ酸配列が報告されておりSSBaldwinCompBiochemPhysiol106b203218を参照すること、たとえば、ヒト血清アルブミンNucleicAcidsResearch922pp61036114およびヒト血清トランスフェリンProcNatlAcadSciUSA81pp27522756についてのアミノ酸配列が挙げられる。具体的な実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンス内でのアルブミンの生産が提供され、アルブミンの発現のための単数または複数の核酸配列と調節エレメントとを含む発現ベクターで、シュードモナスフルオレッセンス宿主細胞を形質転換する工程、アルブミンの発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程、およびシュードモナスフルオレッセンスによって発現されたアルブミンを回収する工程を含む。この実施形態によると、発現されるアルブミンは、ヒトアルブミン、ウシアルブミン、ウサギアルブミン、ニワトリアルブミン、ラットアルブミンおよびマウスアルブミンからなる群より選択される。別の実施形態においては、アルブミンを治療的に活性なポリペプチドと融合することができ、このポリペプチドは、哺乳動物起源でも、または非哺乳動物起源でもよい。さらに具体的な実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンス内でのトランスフェリンの生産が提供され、トランスフェリンの発現のための核酸と調節エレメントとを含む発現ベクターで、シュードモナスフルオレッセンス宿主細胞を形質転換する工程、トランスフェリンの発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。別の実施形態においては、トランスフェリンの発現後、および一つの実施形態においてはタンパク質を単離する工程。さらなる実施形態においては、単離後にトランスフェリンを精製することができる。発現されるトランスフェリンは、ヒト血清トランスフェリン、グリコシル化ヒトトランスフェリン、非グリコシル化ヒトトランスフェリン、ヒトトランスフェリンのN末端の半分子、ウシトランスフェリン、ラットトランスフェリン、マウストランスフェリン、霊長類のトランスフェリン、組み換え型トランスフェリン、組み換え型トランスフェリンの半分子、特性が改変された組み換え型トランスフェリンの半分子、トランスフェリンポリヌクレオチド、トランスフェリンポリペプチドにコードされたトランスフェリンポリペプチド、トランスフェリンポリペプチド、トランスフェリン抗体、トランスフェリン断片および治療的に活性なポリペプチドに融合したトランスフェリンからなる群より選択される。さらに別の実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンス内でのグロブリンの生産が提供され、グロブリンの発現のための核酸と調節エレメントとを含む発現ベクターで、シュードモナスフルオレッセンス宿主細胞を形質転換する工程、グロブリンの発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程、および必要に応じてタンパク質を単離する工程を含む。さらなる実施形態においては、発現の後にグロブリンを単離し、宿主細胞から精製される。発現されるグロブリンは、ヒトグロブリン、ウシグロブリン、ウサギグロブリン、ラットグロブリン、マウスグロブリン、ヒツジグロブリン、サルグロブリン、ステロイド結合グロブリンおよび治療的に活性なポリペプチドと融合したグロブリンからなる群より選択される。さらなる実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンス内でのインスリンの生産が提供され、インスリンの発現のための核酸と調節エレメントとを含む発現ベクターで、シュードモナスフルオレッセンス宿主細胞を形質転換する工程、インスリンの発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程、および任意にタンパク質を単離する工程を含む。さらなる実施形態においては、宿主細胞によってインスリンを生産した後、インスリンを単離し精製することができる。発現されるインスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン、マウスインスリン、ラットインスリン、ブタインスリン、サルインスリンおよび治療的に活性なポリペプチドと融合したインスリンからなる群より選択される。ヒトインスリンの遺伝子についての受入番号はJ00265であり、合成されたヒトインスリンの遺伝子についての受入番号はJ02547である。組み換え型血液タンパク質を生産するための全長DNA、または血液タンパク質またはその部分のアミノ末端部もしくはカルボキシ末端部のいずれかをコードする切断型DNAを、利用可能な源から得ることができるか、または標準的な手法による公知の配列に従って合成することができる。酵素の生産本発明の一つの実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンス種の宿主細胞による哺乳動物の組み換え型酵素またはコファクターの生産が提供される。別の実施形態においては、哺乳動物の組み換え型酵素またはコファクターを発現するように形質転換されたシュードモナス種の宿主細胞が提供される。本実施形態において発現される酵素およびコファクターとしては、たとえばこれらに限定されるわけではないが、アルドラーゼ、アミンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アスパルターゼ、B12依存性酵素、カルボキシペプチダーゼ、カルボキシエステラーゼ、カルボキシリアーゼ、ケモトリプシン、CoA要求性酵素、シアノヒドリンシンテターゼ、シスタチオンシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、ジアフォラーゼ、ジオキシゲナーゼ、エノアートレダクターゼ、エポキシドヒドラーゼ、フメラーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ニトリルヒドラーゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、オキシドレダクターゼ、オキシニチラーゼ、ペプチダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼおよび治療的に活性なポリペプチドに融合した酵素が挙げられる。別の実施形態においては、酵素は中温性酵素のポリペプチド、たとえばヒトおよび/または獣医上の治療および/または診断用途に適したものでもよい。このような治療用の中温性酵素の例としては、たとえば、組織プラスミノゲンアクチベータ;ウロキナーゼ、レプチラーゼ、ストレプトキナーゼ;カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ;DNアーゼ、アミノ酸ヒドロラーゼたとえばアスパラギナーゼ、アミドヒドロラーゼ;カルボキシペプチダーゼ;プロテアーゼ、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、コラゲナーゼ;ノイラミニダーゼ;ラクターゼ、マルターゼ、スクラーゼおよびアラビノフラノシダーゼが挙げられる。さらに別の実施形態では、組み換え型酵素代替物の発現のための核酸と調節エレメントとを含む発現ベクターで、シュードモナスフルオレッセンス宿主細胞を形質転換する工程、および組み換え型酵素代替物の発現に適した条件下でその細胞を培養する工程による、シュードモナスフルオレッセンス細胞内での組み換え型酵素代替物の生産が提供される。宿主細胞内で発現される組み換え型酵素代替物は、アルガシダーゼベータ、ラロニダーゼおよび治療的に活性なポリペプチドに融合した組み換え型酵素代替物からなる群より選択される。哺乳動物の抗体および抗体断片の生産本発明の一つの実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンス種の宿主細胞による、哺乳動物の組み換え型の一本鎖、Fab断片および/または全鎖抗体またはそれらの断片もしくは部分の生産が提供される。一つの実施形態においては、タンパク質の発現の後、そのタンパク質を単離することができ、任意に精製することができる。必要に応じて、このタンパク質を復元して、活性なタンパク質を生産することができる。生産の間に、この抗体または抗体断片を、任意に、細胞内での標的としての分泌シグナル配列に結合する。別の実施形態においては、哺乳動物の組み換え型の一本鎖、Fab断片および/または全鎖抗体またはそれらの断片もしくは部分を発現するように形質転換された、シュードモナス種の宿主細胞が提供される。一つの実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンス細胞は、一本鎖抗体またはそれらの断片もしくは部分を生産することができる。一本鎖抗体には、安定的に折りたたまれた単一のポリペプチド鎖上の、抗体の抗原結合領域が含まれ得る。一本鎖抗体は、伝統的な免疫グロブリンよりもそのサイズが小さいが、抗体の抗原特異的結合特性を保持することができる。一本鎖抗体を治療、たとえばむき出しの一本鎖抗体、二重特異性抗体バインダー、放射性複合体、またはエフェクタードメインとの融合体、診断薬、たとえば腫瘍の画像化もしくはインビボもしくはエクスビボのガンマーカーアッセイ、研究道具、たとえばタンパク質精製および検出、具体的には新規の治療用標的の同定およびキャラクタライゼーション、抗体マイクロアレイ、表示技術および/または遺伝子もしくは薬物送達のための媒体に用いることができる。別の実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンス細胞は、Fab断片またはその部分を生産する。Fab断片は特定の抗体の一部でもよい。Fab断片は抗原結合部位を含むことができる。Fab断片は2本の鎖:軽鎖断片および重鎖断片を含むことができる。これらの断片を、リンカーまたはジスルフィド結合を解して結合することができる。本発明のその他の実施形態においては、全鎖抗体を、シュードモナスフルオレッセンス内、およびその他のシュードモナス種内で発現させることができる。Fc領域を含むインタクトな抗体はインビボでの分解およびクリアランスに対してより強く抵抗することができ、それによって、血液循環においてより長い生物学的半減期を有する。このような抗体を、継続した治療が必要な疾患のための治療剤として用いることができる。一つの実施形態においては、別個のシストロン配列またはポリシストロン配列を含む発現ベクターを提供することによる、シュードモナス種内で機能を有する抗体またはその断片を生産する方法が提供される。別個のシストロン発現ベクターは、軽鎖および重鎖の発現が、別個のプロモーターによって独立して制御されるように、免疫グロブリンの軽鎖を発現させるための第一のプロモーター-シストロンペアと、免疫グロブリンの重鎖を発現させるための第二のプロモーター-シストロンペアとを含むことができる。発現カセットのポリヌクレオチド内のそれぞれのシストロンは、全長抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸配列に機能するように結合した翻訳開始領域TIRを含み得る。一つの実施形態においては、TIR配列を操作して、軽鎖および重鎖についての異なる翻訳強度の組み合わせを提供することができる。代替的な実施形態においては、重鎖コード配列は、軽鎖コード配列と同じプラスミド上に位置することができる。代替的な実施形態においては、重鎖配列および軽鎖配列は、単一のプラスミド内におけるポリシストロン配列に見られるか、または宿主のゲノム内にコードされる。別の実施形態においては、機能を有する抗体の軽鎖および重鎖をそれぞれコードする二つの別個の翻訳単位で形質転換された宿主細胞内で、その抗体またはその断片を生産するための方法が提供される。一つの実施形態においては、この方法は次の工程を含む:a軽鎖および重鎖が逐次的に発現するように、それに適する条件下で宿主細胞を培養し、それによって軽鎖および重鎖の生産を時間的に分ける工程;ならびにb軽鎖および重鎖を会合させて、機能を有する抗体またはその断片を形成させる工程。さらなる実施形態においては、シュードモナスの発現系は、治療用のヒト一本鎖、Fab断片もしくは全鎖抗体またはそれらの部分、たとえばこれらに限定されるわけではないが、Fab、Fab’、Fab’2、Fab’2-ロイシンジッパー、Fv、dsFv、抗CD18抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または以下の表3に記載されたもの、を発現することができる。転写因子の生産本発明の一つの実施形態においては、シュードモナスフルオレッセンス種の宿主細胞による哺乳動物の組み換え型転写因子の生産が提供される。一つの実施形態においては、タンパク質発現の後、そのタンパク質を単離することができる。別の実施形態においては、そのタンパク質を精製することができる。必要に応じて、このタンパク質を復元して、活性なタンパク質を生産させることができる。別の実施形態においては、哺乳動物の組み換え型転写因子を発現するように形質転換された、シュードモナス種の宿主細胞が提供される。本発明の発現系内への挿入に適する転写因子としては、ヘリックスターンヘリックスファミリーおよびPacファミリーのメンバー、ならびに本技術分野において公知のその他の転写因子ファミリーのものが挙げられる。本発明での使用に適するこれらのファミリーのメンバーとしては、哺乳動物および哺乳動物のホモログおよびアナログ:転写レギュレータ;ASNCファミリーの転写因子、たとえばASNC_trans_reg、推定される転写レギュレータ;luxRファミリーの細菌調節タンパク質;細菌調節ヘリックスターンヘリックス転写因子;arsRファミリーの細菌調節タンパク質;ヘリックスターンヘリックスドメインの転写因子、特にrpiRファミリー;細菌調節タンパク質転写因子、細菌調節ヘリックスターンヘリックス転写因子;DNA結合ドメイン転写因子;転写因子のMarRファミリー;転写因子のROKファミリー;調節タンパク質のMerRファミリー;アルギニンリプレッサー転写因子;フィルミキュート転写因子;鉄取り込み調節転写因子;シグマ転写因子;応答調節レシーバー転写因子;トリプトファンRNA結合アテニュエータータンパク質転写因子;推定される糖結合ドメイン転写因子;PRDドメイン転写因子;窒素調節タンパク質転写因子;遺伝能力のネガティブレギュレータ、たとえばMecA;ネガティブ転写レギュレータ転写因子;細菌転写レギュレータ転写因子;グリセロール-3-リン酸反応性転写因子;鉄依存性リプレッサー転写因子;および転写レギュレータ転写因子に特異的な多数の種が挙げられる。シュードモナス種によって発現される転写因子を、診断用、治療用および研究用に利用することができる。ベクターの調製ポリヌクレオチド哺乳動物の組み換え型タンパク質およびペプチドを、そこから宿主細胞がそのタンパク質を発現させることができるところの機能遺伝子を形成する転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントに、その中の標的ポリペプチドのコード配列が機能するように結合したポリヌクレオチドから発現させることができる。このコード配列は、入手できるのであれば、標的ポリペプチドについての天然のコード配列であり得るが、選択された発現用宿主細胞で用いるために:たとえば、シュードモナス種、たとえばシュードモナスフルオレッセンスのコドン使用頻度を反映した遺伝子を合成することによって、選択された、改良されたまたは最適化されたコード配列を用いることもできる。結果として生じるこれらの遺伝子は、一つ以上のベクター内に構築されるか、またはそのベクター内に挿入されることになり、次いで発現用の宿主細胞内に形質転換されるだろう。発現可能な型で提供されると言われる核酸またはポリヌクレオチドとは、選択された細菌の発現用宿主細胞によって発現され得る少なくとも一つの遺伝子を含む核酸またはポリヌクレオチドを意味する。調節エレメント本明細書で用いられる調節エレメントは、遺伝子をコードする標的の哺乳動物の組み換え型タンパク質に、機能するように結合することができる。本明細書で用いられるタンパク質をコードする遺伝子コード配列は、成熟したポリペプチドのコード配列および転写調節エレメントに加えて、さらにコード化エレメント、たとえば一つ以上のペプチドタグ、プレペプチド、プロペプチド、プレプロペプチドについてのコード配列、または選択された発現用宿主細胞内で機能する分泌シグナルペプチド以外の、本技術分野において公知のその他の一般的に利用されるコード化エレメントを含むことができる。本明細書で用いられるように、機能するように結合したという用語は、転写調節エレメントおよび任意の翻訳調節エレメントがその中で、コード配列に関連して、調節エレメントがコード配列を直接発現させることができるような配置でコード配列と共有結合しているところの任意の立体配置を意味する。一つの実施形態においては、調節エレメントは宿主細胞内に形質転換される前の全遺伝子の一部であろう;しかしながら、その他の実施形態においては、調節エレメントは別の遺伝子の一部であり、その遺伝子は、宿主のゲノムの一部、別の生命体のゲノムの一部、またはそれらに由来するものであり得る。プロモーターおよびアクセサリーエレメント本発明により使用されるプロモーターは構成的プロモーターでもよく、または調節プロモーターでもよい。有用な調節プロモーターの一般的な例としては、lacプロモーターすなわちlacZプロモーターに由来するファミリーのもの、特にDeBoerによる米国特許第4,551,433号に記載のtacプロモーターおよびtrcプロモーター、ならびにPtac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5およびT7lacプロモーターが挙げられる。本発明による発現系に有用な非lac型プロモーターの一般的な例としては、たとえば、表4に列挙されたものが挙げられる。たとえば、次のものを参照すること:JSanchezRomeroandVDeLorenzoManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnologypp46074HSchweizerCurrentOpinioninBiotechnology12439445andRSlaterandRWilliamsMolecularBiologyandBiotechnologypp12554。選択された細菌の宿主細胞を起源とするプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーターを用いて、ターゲットポリペプチド、たとえばシュードモナスのアントラニル酸塩または安息香酸塩オペロンプロモーターPant,Pbenをコードする導入遺伝子の発現をコントロールしてもよい。配列が同一か否かにもかかわらず、その中で二つ以上のプロモーターが別のものと共有結合しているタンデムプロモーター、たとえば、Pant-Pbenタンデムプロモータープロモーター間のハイブリッドまたはPlac-Placタンデムプロモーターを用いてもよい。調節プロモーターは、プロモーターがその一部である遺伝子の転写をコントロールするために、プロモーター調節タンパク質を利用する。本明細書で調節プロモーターを用いる場合、対応するプロモーター調節タンパク質も本発明による発現系の一部となるだろう。プロモーター制御タンパク質の例としては:アクチベータタンパク質たとえばエシェリキアコリのカタボライトアクチベータタンパク質、MalTタンパク質;AraCファミリー転写活性化因子;リプレッサータンパク質、たとえばエシェリキアコリのLacIタンパク質;および二重機能制御タンパク質、たとえばエシェリキアコリのNagCタンパク質が挙げられる。多数の調節プロモーター/プロモーター制御タンパク質のペアが本技術分野において知られている。プロモーター制御タンパク質は、プロモーターのコントロール下で、遺伝子の少なくとも一つのDNA転写制御領域から離れるかまたは結合することができるように、エフェクター化合物、すなわちその制御タンパク質と可逆的にまたは不可逆的に結合する化合物と相互作用する。それによって、遺伝子の転写を開始する際に、転写酵素の作用を可能にしたりまたは阻止する。エフェクター化合物はインデューサーまたはコリプレッサーのいずれかとして分類され、これらの化合物は天然のエフェクター化合物および無償性のインデューサー化合物を含む。多数の調節プロモーター/プロモーター制御タンパク質/エフェクター化合物のトリオが本技術分野において知られている。細胞培養または発酵の間を通してエフェクター化合物を用いることができるが、調節プロモーターを用いる一つの実施形態においては、宿主細胞の生物体量が所望の量または密度にまで培養した後、適切なエフェクター化合物を順番に直接的にまたは間接的に培養液に添加し、その結果、所望の単数または複数のターゲット遺伝子を発現させる。一例として、lacプロモーターのファミリーを利用する場合、lacI遺伝子が系内に存在してもよい。このlacI遺伝子、通常は構成的に発現された遺伝子である、は、これらのプロモーターのlacオペレーターと結合するLacリプレッサータンパク質LacIタンパク質をコードする。従って、lacプロモーターのファミリーを利用する場合、lacI遺伝子をその発現系内に含ませてその中で発現させることができる。lacプロモーターのファミリーの一員、たとえばtacプロモーターの場合においては、エフェクター化合物はインデューサーであり、好ましくは無償性のインデューサー、たとえばIPTGイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド、イソプロピルチオガラクトシドとも称されるである。その他のエレメントその他の調節エレメントは、発現構築物内に含まれてもよい。このようなエレメントとしては、たとえばこれらに限定されるわけではないが、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、その他のプロモーター、アクチベータ、翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナル、転写ターミネーター、シストロニックレギュレーター、ポリシストロニックレギュレーター、タグ配列、たとえばヌクレオチド配列のタグおよびタグペプチドコード配列、であって、発現されたポリペプチドの同定、分離、精製または単離を促進させるものが挙げられる。本発明によるタンパク質をコードする遺伝子は少なくとも、哺乳動物のタンパク質のコード配列に加えて、機能できるように結合した次の調節エレメント:プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルを含むことができる。発現系において宿主細胞として有用な種のいずれかから、たとえば選択された宿主細胞から、有用なRBSを得ることができる。多くの種および種々のコンセンサスRBSが知られており、たとえば、DFrishmanら、Gene23425765;およびBESuzekら、Bioinformatics17112330に記載され引用されるものである。さらに、天然のまたは合成のいずれかのRBSを用いてもよく、たとえばEP0207459号合成RBS;OIkehataetal1989、EurJBiochem18156370天然のRBS配列のAAGGAAGに記載のものである。本発明において有用な方法、ベクターおよび翻訳エレメントおよび転写エレメント、ならびにその他のエレメントのさらなる例は、たとえば、Gilroyらによる米国特許第5,055,294号および第5,128,130号;Rammlerらによる第5,281,532号;Barnesらによる第4,695,455号および第4,861,595号;Grayらによる第4,755,465号;ならびにWilcoxによる第5,169,760号に記載されている。ベクター本発明の酵素をコードするDNAのシュードモナスによる転写を、エンハンサー配列をベクターまたはプラスミド内に挿入することによって促進させる。典型的なエンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を促進させる、通常約10から300bpのサイズのシス作用性DNAエレメントである。例としては、本明細書の他の箇所に記載されたような種々のシュードモナスのエンハンサーが挙げられる。一般的に、組み換え発現ベクターは、シュードモナスの宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー、たとえばシュードモナスフルオレッセンスの抗生物質を含まない耐性遺伝子、ならびに下流の構造配列の転写を導くための高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターを含むだろう。このようなプロモーターは、酵素、たとえば3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、酸性ホスファターゼまたは特に熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来するものでもよい。適切な段階で、翻訳開始配列および翻訳終止配列、そして一つの実施形態においては翻訳後の酵素の分泌を導くことが可能なリーダー配列を伴う異種構造配列が集合する。任意に、この異種配列が、所望の特性、たとえば安定性または発現された組み換え型生産物を容易に精製できることを付与するN-末端同定ペプチドを含む融合酵素をコードしてもよい。酵素の発現の際にシュードモナスフルオレッセンスで用いるのに有用な発現ベクターを、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナルおよび終止シグナルと共に、機能的プロモータを有する読み取り可能なリーディング相に挿入することによって構築する。このベクターは、一つ以上の表現型選択マーカーおよびベクターの維持を確かにするための複製起点を含むことになり、必要であれば、宿主内での増幅能が付与される。本技術分野において、ベクターは、宿主細胞内で組み換え型タンパク質を発現させるために有用なものとして知られており、それらのいずれかを、本発明による遺伝子を発現させるために用いてもよい。このようなベクターとしては、たとえばプラスミド、コスミドおよびファージ発現ベクターが挙げられる。有用なプラスミドベクターの例としては、たとえばこれらに限定されるわけではないが、発現プラスミドpBBR1MCS、pDSK519、pKT240、pML122、pPS10、RK2、RK6、pRO1600およびRSF1010が挙げられる。このような有用なベクターのその他の例としては、たとえば:NHayaseApplEnvirMicrobiol60333642AALushnikovetalBasicLifeSci3065762SGraupnerandWWackernagelBiomolecEng171116HPSctiweizerCurrOpinBiotech1243945MBagdasarianandKNTimmisCurrTopicsMicrobiolImmunol964767TIshiietalFEMSMicrobiolLett11630713INOlekhnovichandYKFomichevGene1406365MTsudaandTNakazawaGene13625762CNietoetalGene8714549JDJonesandNGuttersonGene61299306MBagdasarianetalGene1623747HPSchweizeretalGenetEng236981PMukhopadhyayetalJBact17247780DOWoodetalJBact145144851およびRHoltwicketalMicrobiology14733744に記載されたものが挙げられる。シュードモナスの宿主細胞において有用となり得る発現ベクターのさらなる例としては、示されたレプリコンに由来するような、表5に列挙されたものが挙げられる。発現プラスミドのRSF1010は、たとえばFHeffronetalProcNatlAcadSciUSA72362327、およびKNagahariandKSakaguchiJBact133152729に記載されている。プラスミドRSF1010およびその派生物は、本発明において特に有用なベクターである。典型的には、本技術分野において知られているRSF1010の有用な派生物としては、たとえばpKT212、pKT214、pKT231および関連するプラスミド、ならびにpMYC1050および関連するプラスミドたとえばThompsonらによる米国特許第5,527,883号および第5,840,554号を参照することが挙げられ、例えばpMYC1803がある。プラスミドpMYC1803はRSF1010に基づくプラスミドpTJS260Wilcoxによる米国特許第5,169,760号を参照することに由来するものであり、これは制御されたテトラサイクリン耐性マーカーならびにRSF1010プラスミドに由来する複製座および移動座を保持している。その他の典型的な有用なベクターとしては、Puhlerらによる米国特許第4,680,264号に記載されたものが挙げられる。一つの実施形態においては、発現プラスミドを発現ベクターとして用いる。別の実施形態においては、RSF1010またはその派生物を発現ベクターとして用いる。さらに別の実施形態においては、pMYC1050もしくはその派生物、またはpMYC1803もしくはその派生物を、発現ベクターとして用いる。選択マーカー遺伝子を用いて、宿主細胞内にプラスミドを維持することができ、プラスミド内に存在させることもできる。これは単数または複数の抗生物質耐性遺伝子でもよく、この場合において対応する単数または複数の抗生物質は発酵培地に添加されることになり、あるいは、本技術分野において有用であると知られている選択マーカー遺伝子のその他の任意のタイプのもの、たとえばプロトトロフィー復元遺伝子でもよく、この場合においてプラスミドは対応する形質、具体的には生体触媒性の形質、たとえばアミノ酸生合成もしくはヌクレオチドを生合成する形質または炭素源を利用する形質、についての栄養素要求株である宿主細胞内で用いられることになる。分子遺伝学および遺伝子操作技術に必要な多数の配列情報は、広く公に利用可能である。哺乳動物ならびにヒトの完全なヌクレオチド配列、遺伝子、cDNA配列、アミノ酸配列およびゲノムにアクセスすることは、URLアドレスhttpwwwncbinlmnihgovEntrezにおけるGenBankから実行できる。WeizmannInstituteofScienceGenomeandBioinformaticsから、遺伝子およびそれらの生産物についての情報ならびに生物医学的な応用について統合された電子百科事典であるGeneCardsから、さらなる情報を得ることもできる。ヌクレオチド配列の情報も、EMBLNucleotideSequenceデータベースまたはDNADatabankまたは日本から入手することができる;アミノ酸配列についての情報のさらなるサイトには、GeorgetownsproteininformationresourcewebsiteおよびSwissProtが挙げられる。形質転換本技術分野において公知の形質転換の任意の方法を利用して、シュードモナス宿主細胞を単数または複数のベクターで形質転換してもよく、その細菌の宿主細胞をインタクトな細胞として、またはプロトプラストすなわち細胞質体を含むとして形質転換してもよい。典型的な形質転換の方法としては、ポレーションの方法、たとえばエレクトロポレーション、プロトプラスト融合、細菌の接合および二価カチオンによる処理、たとえば塩化カルシウム処理すなわちCaCl/Mg2処理、または本技術分野におけるその他の周知の方法が挙げられる。たとえば、MorrisonJBact132349351ClarkCurtissandCurtissMethodsinEnzymology101347362SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualKrieglerGeneTransferandExpressionALaboratoryManualandAusubeletaledsCurrentProtocolsinMolecularBiologyを参照すること。シュードモナス生物本明細書での主要な発明はシュードモナスフルオレッセンスを用いることであるが、その他のシュードモナス生物および近接する細菌も有用であり得る。シュードモナスおよび近接するbacteriaは一般的に、グラムプロテオバクテリアのサブグループ1すなわちGramNegativeAerobicRodsandCocciBergeysManualofDeterminativeBacteriologypp217289として定義されるグループの一部である。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ1は、この分類に用いられる基準に従って、この表題に分類されるであろうプロテオバクテリアをも含む。この表題は、この欄に既に分類された群をも含むが、もはや、たとえばアシドボラクス属、ブレブンジモナス属、ブルクホルデリア属、ヒドロジェノファーガ属、オシアニモナス属、ラルストニア属およびストエノトロフォモナス属、スフィンゴモナス属およびそれに由来するブラストモナス属、キサントモナス属の種であると既に呼ばれているものに属する生物を再編することで生じたもの、アシドモナス属、アセトバクター属に属する生物を再編することで生じたもの、のような、Bergeyに定義されたようなものではない。さらに、宿主は、シュードモナス属、シュードモナスエナリア、シュードモナスニグリファシエンスおよびシュードモナスプトレファシエンスに由来する細胞を含むことができ、これらはそれぞれアルテロモナスハロプランクティス、アルテロモナスニグリファシエンスおよびアルテロモナスプトレファシエンスとして再分類されている。同様に、たとえばシュードモナスアシドボランスおよびシュードモナステストステロニは、それぞれコマモナスアシドボランスおよびコマモナステストステロニとして再分類されており、ならびにシュードモナスニグリファシエンスおよびシュードモナスピシシダは、それぞれシュードアルテロモナスニグリファシエンスおよびシュードアルテロモナスピシシダとして再分類されている。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ1は、シュードモナダセアエ科、アゾトボアクテラセアエ科現在ではしばしはシュードモナダセアエ科のアゾトバクターグループの異名で呼ばれている、リゾビアセアエ科およびメチロモナダセアエ科現在ではしばしはメチロコッカセアエ科の異名で呼ばれている:の科のいずれかに属するものとして分類されているプロテオバクテリアをも含む。その結果、これらの属に加えて、グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ1に含まれる、ここに記載されたもの以外のさらなるプロテオバクテリア属としては:1アゾトバクターグループのアゾリゾフィルス属の細菌;2シュードモナダセアエ科のセルビブリオ属、オリジェラ属およびテレジニバクター属の細菌;3リゾビアセアエ科のケラトバクター属、エンシフェラ属、リベリバクター属カンジダタスリベリバクターとも呼ばれるおよびシノリゾビウム属の細菌;ならびに4メチロコッカセアエ科のメチロバクター属、メチロカルダム属、メチロミクロビウム属、メチロサルシナ属およびメチロスファエラ属の細菌が挙げられる。別の実施形態においては、グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ2から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ2は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される丸括弧内に、目録に列挙され、公に利用可能な状態で寄託されたその株の総数を示し、別記がない限り、すべてがATCCに寄託されている:アシドモナス2;アセトバクター93;グルコノバクター37;ブレブンジモナス23;ベイジェリンキア13;デルキシア2;ブルセラ4;アグロバクテリウム79;ケラトバクター2;エンシフェラ3;リゾビウム144;シノリゾビウム24;ブラストモナス1;スフィンゴモナス27;アルカリゲンス88;ボルデテラ43;ブルクホルデリア73;ラルストニア33;アシドボラクス20;ヒドロジェノファーガ9;ズーグロエア9;メチロバクター2;メチロカルダムNCIMBにおいて1;メチロコッカス2;メチロミクロビウム2;メチロモナス9;メチロサルシナ1;メチロスファエラ;アゾモナス9;アゾリゾフィルス5;アゾトバクター64;セルビブリオ3;オリジェラ5;シュードモナス1139;フランシセラ4;キサントモナス229;ストエノトロフォモナス50;およびオシアニモナス4。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ2の典型的な宿主細胞の種としては、次の細菌丸括弧内に単数または複数のその典型的な株のATCC番号またはその他の寄託番号を示すが挙げられるが、これらに限定されるわけではない:アシドモナスメタノリサ;アセトバクターアセチ;グルコノバクターオキシダンス;ブレブンジモナスジミニュータ;ベイジェリンキアインディカ;デルキシアグモーサ;ブルセラメリテンシス、ブルセラアボラタス;アグロバクテリウムチューメファシエンス、アグロバクテリウムラジオバクター、アグロバクテリウムリゾーゲネス;ケラトバクターヘインチ;エンシフェラアドヘエレンス;リゾビウムレグミノザラム;シノリゾビウムフレンジ;ブラストモナスナタトリア;スフィンゴモナスパウチモビリス;アルカリゲンスフェイシャリス;ボルデテラパーツシス;ブルクホルデリアセパシア;ラルストニアピケッチ;アシドボラクスファシリス;ヒドロジェノファーガフラバ;ズーグロエアラミジェラ;メチロバクタールーテウス;メチロカルダムグラシーレ;メチロコッカスカプスラタス;メチロミクロビウムアギール;メチロモナスメタニカ;メチロサルシナフィブラータ;メチロスファエラハンソニイ;アゾモナスアギリス;アゾリゾフィルスパスパリ;アゾトバクタークロオコクム;セルビブリオミクタス;オリジェラウレサラリス;シュードモナスアエルギノーサ、シュードモナスフルオレッセンス;フランシセラツラレンシス;ストエノトロフォモナスマルトフィア;キサントモナスカンペストリス;およびオシアニモナスドウドロッフィ。別の実施形態においては、グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ3から宿主細胞を選択する。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ3は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブレブンジモナス;アグロバクテリウム;リゾビウム;シノリゾビウム;ブラストモナス;スフィンゴモナス;アルカリゲンス;ブルクホルデリア;ラルストニア;アシドボラクス;ヒドロジェノファーガ;メチロバクター;メチロカルダム;メチロコッカス;メチロミクロビウム;メチロモナス;メチロサルシナ;メチロスファエラ;アゾモナス;アゾリゾフィルス;アゾトバクター;セルビブリオ;オリジェラ;シュードモナス;テレジニバクター;フランシセラ;ストエノトロフォモナス;キサントモナス;およびオシアニモナス。別の実施形態においては、グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ4から宿主細胞を選択する。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ4は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブレブンジモナス;ブラストモナス;スフィンゴモナス;ブルクホルデリア;ラルストニア;アシドボラクス;ヒドロジェノファーガ;メチロバクター;メチロカルダム;メチロコッカス;メチロミクロビウム;メチロモナス;メチロサルシナ;メチロスファエラ;アゾモナス;アゾリゾフィルス;アゾトバクター;セルビブリオ;オリジェラ;シュードモナス;テレジニバクター;フランシセラ;ストエノトロフォモナス;キサントモナス;およびオシアニモナス。一つの実施形態においては、グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ5から宿主細胞を選択する。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ5は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:メチロバクター;メチロカルダム;メチロコッカス;メチロミクロビウム;メチロモナス;メチロサルシナ;メチロスファエラ;アゾモナス;アゾリゾフィルス;アゾトバクター;セルビブリオ;オリジェラ;シュードモナス;テレジニバクター;フランシセラ;ストエノトロフォモナス;キサントモナス;およびオシアニモナス。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ6から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ6は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブレブンジモナス;ブラストモナス;スフィンゴモナス;ブルクホルデリア;ラルストニア;アシドボラクス;ヒドロジェノファーガ;アゾモナス;アゾリゾフィルス;アゾトバクター;セルビブリオ;オリジェラ;シュードモナス;テレジニバクター;ストエノトロフォモナス;キサントモナス;およびオシアニモナス。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ7から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ7は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:アゾモナス;アゾリゾフィルス;アゾトバクター;セルビブリオ;オリジェラ;シュードモナス;テレジニバクター;ストエノトロフォモナス;キサントモナス;およびオシアニモナス。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ8から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ8は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブレブンジモナス;ブラストモナス;スフィンゴモナス;ブルクホルデリア;ラルストニア;アシドボラクス;ヒドロジェノファーガ;シュードモナス;ストエノトロフォモナス;キサントモナス;およびオシアニモナス。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ9から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ9は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブレブンジモナス;ブルクホルデリア;ラルストニア;アシドボラクス;ヒドロジェノファーガ;シュードモナス;ストエノトロフォモナス;およびオシアニモナス。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ10から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ10は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブルクホルデリア;ラルストニア;シュードモナス;ストエノトロフォモナス;およびキサントモナス。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ11から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ11は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:シュードモナス;ストエノトロフォモナス;およびキサントモナス。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ12から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ12は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブルクホルデリア;ラルストニア;シュードモナス。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ13から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ13は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブルクホルデリア;ラルストニア;シュードモナス;およびキサントモナス。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ14から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ14は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される:シュードモナスおよびキサントモナス。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ15から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ15は、シュードモナス属のプロテオバクテリアの群と定義される。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ16から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ16は、次のシュードモナス種丸括弧内に単数または複数の典型的な株のATCC番号またはその他の寄託番号を示すのプロテオバクテリアの群と定義される:シュードモナスアビエタニフィラ;シュードモナスアエルギノーサ;シュードモナスアルカリゲンス;シュードモナスアングリセプチサ;シュードモナスシトロネロリス;シュードモナスフラベセンス;シュードモナスメンドシナ;シュードモナスニトロレデュセンス;シュードモナスオレオボランス;シュードモナスシュードアルカリゲネス;シュードモナスレジノボランス;シュードモナスストラミネア;シュードモナスアガリシ;シュードモナスアルカリフィラ;シュードモナスアルギノボラ;シュードモナスアンデルソニイ;シュードモナスアスプレニ;シュードモナスアゼラシア;シュードモナスベイジェリンキ;シュードモナスボレアリス;シュードモナスボレオポリス;シュードモナスブラシカセラム;シュードモナスブタノボラ;シュードモナスセルローサ;シュードモナスアウランチアカ;シュードモナスクロロラフィス;シュードモナスフラジ;シュードモナスルンデンシス;シュードモナスタエトロレンス;シュードモナスシッシコラ;シュードモナスコロナファシエンス;シュードモナスジテルペニフィラ;シュードモナスエロンガータ;シュードモナスフレクテンス;シュードモナスアゾトフォルマンス;シュードモナスブレンネリ;シュードモナスセドレラ;シュードモナスコルガータ;シュードモナスエクストレモリエンタリス;シュードモナスフルオレッセンス;シュードモナスゲッサルジ;シュードモナスリバネンシス;シュードモナスマンデリイ;シュードモナスマルジナリス;シュードモナスミグラエ;シュードモナスムシドレンス;シュードモナスオリエンタリス;シュードモナスローデシアエ;シュードモナスシンカンサ;シュードモナストラーシ;シュードモナスベローニ;シュードモナスフレデリクスベルゲンシス;シュードモナスゲニクラタ;シュードモナスジンゲリ;シュードモナスグラミニス;シュードモナスグリモンティ;シュードモナスハロデニトリフィカンス;シュードモナスハロフィリア;シュードモナスヒビスキコラ;シュードモナスフッチエンシス;シュードモナスハイドロゲノボラ;シュードモナスジェッセンイ;シュードモナスキロネンシス;シュードモナスランセオラタ;シュードモナスリニ;シュードモナスマルギナタ;シュードモナスメフィチサ;シュードモナスデニトリフィカンス;シュードモナスペルツシノゲナ;シュードモナスピクトラム;シュードモナスサイクロフィラ;シュードモナスフルバ;シュードモナスモンテイリ;シュードモナスモッセリイ;シュードモナスオリジハビタンス;シュードモナスプレコグロッシシダ;シュードモナスプチダ;シュードモナスレアクタンス;シュードモナススピノサ;シュードモナスバレアリカ;シュードモナスルテオラ;シュードモナススツッツェリ;シュードモナスアミグダリ;シュードモナスアバラナエ;シュードモナスカリカパパヤエ;シュードモナスシッコリ;シュードモナスフィクセレクタエ;シュードモナスフソコバギナエ;シュードモナスメリアエ;シュードモナスシリンジャエ;シュードモナスビルジフラバ;シュードモナスサーモカルオキシドボランス;シュードモナスサーモトレランス;シュードモナスチベルバレンシス;シュードモナスバンコウベレンシス;シュードモナスウィスコンシネンシス;およびシュードモナスキアメンシス。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ17から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ17は、たとえば次のシュードモナス種に属するものを含む蛍光性シュードモナスとして本技術分野において知られているプロテオバクテリアの群と定義される:シュードモナスアゾトフォルマンス;シュードモナスブレンネリ;シュードモナスセドレラ;シュードモナスコルガータ;シュードモナスエクストレモリエンタリス;シュードモナスフルオレッセンス;シュードモナスゲッサルジ;シュードモナスリバネンシス;シュードモナスマンデリイ;シュードモナスマルジナリス;シュードモナスミグラエ;シュードモナスムシドレンス;シュードモナスオリエンタリス;シュードモナスローデシアエ;シュードモナスシンカンサ;シュードモナストラーシ;およびシュードモナスベローニ。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ18から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ18は、シュードモナスフルオレッセンス種の亜種、変種、株およびその他の特定の下位のユニットのすべての群と定義され、たとえば、丸括弧内に示された代表的な株のATCCまたはその他の受託番号を伴った次のもの属するものが挙げられる:シュードモナスフルオレッセンスバイオタイプA、次亜種1すなわち次亜種Iとも呼ばれる;シュードモナスフルオレッセンスバイオタイプB、次亜種2すなわち次亜種IIとも呼ばれる;シュードモナスフルオレッセンスバイオタイプC、次亜種3すなわち次亜種IIIとも呼ばれる;シュードモナスフルオレッセンスバイオタイプF、次亜種4すなわち次亜種IVとも呼ばれる;シュードモナスフルオレッセンスバイオタイプG、次亜種5すなわち次亜種Vとも呼ばれる;シュードモナスフルオレッセンス次亜種VI;シュードモナスフルオレッセンスPf0-1;シュードモナスフルオレッセンスPf-5;シュードモナスフルオレッセンスSBW25;ならびにシュードモナスフルオレッセンスサブスピーシーズセルロサ。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ19から宿主細胞を選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ19は、シュードモナスフルオレッセンスバイオタイプAのすべての株の群と定義される。このバイオタイプの特定の株は、シュードモナスフルオレッセンスMB101株Wilcoxによる米国特許第5,169,760号を参照すること、およびその誘導体である。その誘導体の例は、シュードモナスフルオレッセンスMB214株であり、MB101染色体のasdアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子座内、天然のエシェリキアコリのPlacI-lacI-lacZYA構築物すなわちその中ではPlacZが欠失していたに挿入することによって構築される。一つの実施形態においては、宿主細胞は、シュードモナダレス目のプロテオバクテリアの任意のものである。特定の実施形態においては、宿主細胞は、シュードモナダセアエ科のプロテオバクテリアの任意のものである。本発明において用いることができるさらなるシュードモナスフルオレッセンス株としては、シュードモナスフルオレッセンスミグラおよびシュードモナスフルオレッセンスロイトキトクが挙げられ、次のようなATCCが指定されている:NCIB8286;NRRLB-1244;NCIB8865株CO1;NCIB8866株CO2;1291ATCC17458;IFO15837;NCIB8917;LA;NRRLB-1864;ピロリジン;PW2ICMP3966;NCPPB967;NRRLB-899;13475;NCTC10038;NRRLB-16036;IFO15840;52-1C;CCEB488-ABU140;CCEB553IEM15/47;IAM1008AHH-27;IAM1055AHH-23;1IFO15842;12ATCC25323;NIH11;denDoorendeJong216;18IFO15833;WRRLP-7;93TR-10;10852-22;IFO15832;143IFO15836;PL;1492-40-40;IFO15838;182IFO3081;PJ73;184IFO15830;185W2L-1;186IFO15829;PJ79;187NCPPB263;188NCPPB316;189PJ227;1208;191IFO15834;PJ236;22/1;194KlingeR-60;PJ253;196PJ288;197PJ290;198PJ302;201PJ368;202PJ372;203PJ376;204IFO15835;PJ682;205PJ686;206PJ692;207PJ693;208PJ722;212PJ832;215PJ849;216PJ885;267B-9;271B-1612;401C71A;IFO15831;PJ187;NRRLB-31784;IFO15841;KY8521;3081;30-21;IFO3081;N;PYR;PW;D946-B83BU2183;FERM-P3328;P-2563FERM-P2894;IFO13658;IAM-112643F;M-1;A506A5-06;A505A5-05-1;A526A5-26;B69;72;NRRLB-4290;PMW6NCIB11615;SC12936;A1IFO15839;F1847CDC-EB;F1848CDC93;NCIB10586;P17;F-12;AmMS257;PRA25;6133D02;6519E01;N1;SC15208;BNL-WVC;NCTC2583NCIB8194;H13;1013ATCC11251;CCEB295;IFO3903;1062;またはPf-5。発酵発酵という用語は、文字通りの発酵が用いられる実施形態およびその他の非発酵性の培養モードが用いられる実施形態の両方を含む。発酵は任意の規模で実施してもよい。一つの実施形態においては、発酵培地をリッチな培地、最少培地および無機塩培地の中から選択してもよい;リッチな培地を用いても良いが、避けたほうが好ましい。別の実施形態においては、最少培地または無機塩培地のいずれかが選択される。さらに別の実施形態においては最少培地が選択される。無機塩培地は、無機塩、および炭素源、たとえばグルコース、ショ糖またはグリセロールからなる。無機塩培地の具体例としては、たとえば、M9培地、シュードモナス用培地ATCC179、DavisandMingioli培地BDDavisandESMingioliinJBact601728を参照することが挙げられる。無機塩培地を作製するために用いられる無機塩としては、たとえばリン酸カリウム、硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウム、硫酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムならびに微量元素、たとえば塩化カルシウム、鉄、銅、マンガンおよび亜鉛のホウ酸塩および硫酸塩から選択されるものが挙げられる。典型的には、無機塩培地には、有機窒素源、たとえばペプトン、トリプトン、アミノ酸または酵母エキスは含まれない。その代わりとして無機窒素源を用い、これは、たとえばアンモニウム塩、アンモニア水およびアンモニアガスの中から選択すればよい。典型的な無機塩培地は、グルコースを炭素源として含むものであろう。無機塩培地と比較すれば、最少培地は無機塩および炭素源を含むことができるが、たとえば低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトンまたはその他の成分を追加することができるが、それらの追加は極めて微量のレベルである。一つの実施形態においては、以下の表7に列挙された成分を用いて培地を調製することができる。これらの成分を次の順序で添加することができる:最初にNH4HPO4、KH2PO4およびクエン酸を約30リットルの蒸留水に溶解すればよい;次いで、微量元素の溶液を添加し、次いで消泡剤、たとえばUcolubN115を添加することができる。次いで、たとえば約121°Cで加熱滅菌した後、グルコース、MgSO4およびチアミン塩酸塩の滅菌溶液を添加すればよい。アンモニア水を用いてpHを約6.8にコントロールすることができる。次いで、滅菌蒸留水を添加して、最初の体積を371からグリセロールストック分123mL引いたものに調整することができる。薬品は種々の供給業者、たとえばMerck社から市販されている。この培地によって、シュードモナス種および類縁の細菌の高い細胞密度での培養が可能となる。バッチプロセスとしてHCDCを開始することができ、次いで、二相供給式バッチ培養とする。バッチ部における無制限の培養の後、生物体量の濃度が数倍に高まり得る時間であるところの3倍化する時間にわたって、培養をコントロールして培養の比速度を低下させることができる。このような培養手段についてのさらに詳細な点は、RiesenbergDetalHighcelldensitycultivationofEscherichiacoliatcontrolledspecificgrowthrateJBiotechnol201727に記載されている。本発明による発現系を任意の発酵形式で培養することができる。本明細書では、たとえばバッチ発酵モード、フェドバッチ発酵モード、半連続発酵モードおよび連続発酵モードを採用してもよい。本発明による発現系は、任意の規模すなわち体積の発酵における導入遺伝子の発現にとって有用である。従って、たとえばマイクロリットルスケール、センチリットルスケールおよびデシリットルスケールの発酵体積を採用すればよい;そして1リットルスケールおよびより大きな発酵体積を採用することができる。一つの実施形態においては、発酵体積は1リットルかまたはそれを超えたものとなるだろう。別の実施形態においては、発酵体積は、5リットル、10リットル、15リットル、20リットル、25リットル、50リットル、75リットル、100リットル、200リットル、500リットル、1,000リットル、2,000リットル、5,000リットル、10,000リットルもしくは50,000リットルかまたはそれを超えたものとなるだろう。本発明においては、形質転換された宿主細胞の増殖、培養および/または発酵を、宿主細胞が生存可能な温度範囲、たとえば約4°Cから約55°Cの範囲内の温度で行う。さらに、増殖は、活発な細胞分裂および/または拡張の生物学的状態、ならびに分裂していない細胞および/または非拡張性の細胞が代謝を維持している生物学的状態の両方を示すために用いられ、後者の使用は維持という用語と同義である。細胞密度哺乳動物の組み換え型タンパク質を発現させる際にシュードモナスフルオレッセンスを用いることのさらなる利点には、シュードモナスフルオレッセンスが、エシェリキアコリまたはその他の細菌の発現系に比較して高い細胞密度で培養できるという能力が含まれる。このために、本発明によるシュードモナスフルオレッセンスの発現系は、約20g/L以上の細胞密度を提供することができる。本発明によるシュードモナスフルオレッセンスの発現系も同様に、体積あたりの生物体量に関して述べられたように、少なくとも約70g/Lの細胞密度を提供することができる。ここでこの生物体量は乾燥細胞重量として測定される。一つの実施形態においては、細胞密度は少なくとも20g/Lとなるだろう。別の実施形態においては、細胞密度は少なくとも25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/Lまたは少なくとも150g/Lとなるだろう。別の実施形態においては、誘導時の細胞密度は、20g/Lと150g/Lとの間;20g/Lと120g/Lとの間;20g/Lと80g/Lとの間;25g/Lと80g/Lとの間;30g/Lと80g/Lとの間;35g/Lと80g/Lとの間;40g/Lと80g/Lとの間;45g/Lと80g/Lとの間;50g/Lと80g/Lとの間;50g/Lと75g/Lとの間;50g/Lと70g/Lとの間;40g/Lと80g/Lとの間となるだろう。単離および精製本発明のタンパク質を単離し、本技術分野において周知の標準的な技術によって、実質的に純粋となるまで精製してもよい。かかる技術としては、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、調製用電気泳動、界面活性剤による可溶化、カラムクロマトグラフィーのような基質を伴う選択的な沈降、免疫精製法およびその他の方法が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。たとえば、分子付着性が立証されているタンパク質を、逆にリガンドと融合させてもよい。適切なリガンドと共に、タンパク質を精製用カラムに選択的に吸着させて、次いで比較的純粋な形態でカラムから放つことができる。次いで、酵素活性によって融合タンパク質を除去する。さらに、免疫アフィニティーカラムまたはNi-NTAカラムを用いてタンパク質を精製することができる。一般的な技術は、たとえば、RScopesProteinPurificationPrinciplesandPracticeSpringerVerlagNYDeutscherGuidetoProteinPurificationAcademicPress米国特許第4,511,503号SRoeProteinPurificationTechniquesAPracticalApproachOxfordPressDBollagetalProteinMethodsWileyLisaIncAKPatraetalProteinExprPurif1818292およびRMukhijaetalGene165p3036にさらに記載されている。さらに、たとえばDeutscherGuidetoProteinPurificationMethodsinEnzymologyvol182およびこのシリーズのその他の巻;ColiganetalCurrentProtocolsinProteinScienceWileyGreeneNY;ならびにタンパク質精製生産に使用する際の製造業者の文献、たとえばPharmaciaPiscatawayNJorBioRadRichmondCalif組み換え技術を組み合わせることによって、適切なセグメント、たとえばFLAG配列との融合またはプロテアーゼにより切断可能な配列を介して融合可能なそれに匹敵する配列との融合が可能になる、も参照すること。さらに、たとえば、HochuliChemischeIndustrie126970HochuliPurificationofRecombinantProteinswithMetalChelateAbsorbentinSetlowGeneticEngineeringPrincipleandMethods128798PlenumPressNYandCroweetalQIAexpressTheHighLevelExpressionandProteinPurificationSystemQUIAGENIncChatsworthCalifも参照すること。本技術分野において公知の方法によって発現されたタンパク質の検出を行い、たとえばラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング技術または免疫沈降が挙げられる。遺伝子組み換えによって生産され発現した酵素を、数え切れないほど多くの方法によって組み換え細胞培養液から回収し精製することができる。たとえば高速液体クロマトグラフィーを、必要に応じて最終的な精製工程で採用することができる。本発明において発現された特定のタンパク質は不溶性凝集物封入体を形成してもよい。いくつかのプロトコールが、封入体からのタンパク質の精製に適している。たとえば、封入体の精製は通常、たとえば、50mMTRIS/HClpH7.5、50mMNaCl、5mMMgCl2、1mMDTT、0.1mMATPおよび1mMPMSFの緩衝液でインキュベーションを行うことによる宿主細胞の破壊によって、封入体の抽出、分離および/または精製が必要である。通常、加圧型細胞破壊装置を介して2-3回通過させることを利用して、細胞懸濁液を溶解させる。PolytronBrinkrnanInstruments社を用いて、または氷上で音波処理を行って、細胞懸濁液をホモジナイズしてもよい。細菌を溶解する別の方法は、当業者にとって自明であるたとえばSambrookJEFFritschandTManiatisedsMolecularCloningALaboratoryManual2dedColdSpringHarborLaboratoryPressAusubeletaledsCurrentProtocolsinMolecularBiologyを参照すること。必要に応じて、封入体を可溶化してもよく、典型的にはその溶解した細胞懸濁液を遠心分離に付して不要な不溶性物を除去してもよい。封入体を形成したタンパク質を、適合性を有する緩衝液で希釈または透析を行うことによって再生してもよい。適切な溶媒としては、約4Mから約8Mの尿素、体積/体積ベースで少なくとも約80のホルムアミドおよび約4Mから約8Mのグアニジン塩酸塩が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。グアニジン塩酸塩および類似の薬剤は変性剤ではあるが、この変性は不可逆的ではなく、たとえば透析による変性剤の除去または希釈によって再生するだろう。このことによって、免疫学的におよび/または生物学的に活性なタンパク質の再構成が可能となる。その他の適切な緩衝液は、当業者にとって公知である。あるいは、宿主のペリプラズムから組み換え型タンパク質を精製することも可能である。組み換え型タンパク質が宿主細胞のペリプラズム内に移動した場合、宿主細胞を溶解した後では、低温浸透圧ショックを本技術分野において公知のその他の方法に付加することによって、細菌のペリプラスム画分を単離することができる。ペリプラズムから組み換え型タンパク質を単離するためには、たとえば、細菌細胞を遠心分離に付してペレットを形成させればよい。このペレットを、20ショ糖を含む緩衝液に再懸濁させてもよい。この細胞を溶解するために、細菌を遠心分離に付して、ペレットを氷冷の5mMMgSO4に再懸濁させ、氷浴内で約10分間維持してもよい。細胞懸濁液を遠心分離に付して、その上清についてデカンテーションを行って保存してもよい。上清内に存在する組み換え型タンパク質を、当業者が周知の標準的な分離技術によって、宿主のタンパク質から分離することができる。初期の塩の分画化によって、関心対象の組み換え型タンパク質から、多数の不要な宿主細胞のタンパク質または細胞の培地に由来するタンパク質を分離することができる。このようなものの一例は、硫酸アンモニウムであろう。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物内の水分量を効果的に減少させることによって、タンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質がそれらの溶解性に基づいて沈殿する。タンパク質の疎水性がより強ければ、より低濃度の硫酸アンモニウムで沈殿すると思われる。典型的なプロトコールとしては、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が20-30の間となるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することが挙げられる。この濃度では、ほとんどの疎水性タンパク質が沈殿するだろう。次いで関心対象のタンパク質が疎水性でない限り沈殿を廃棄し、関心対象のタンパク質が沈殿することが分かっている濃度にまで硫酸アンモニウムをその上清に添加する。次いで、沈殿を緩衝液で可溶化し、必要に応じて、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかによって過剰の塩を除去する。タンパク質の溶解性を利用するその他の方法、たとえば冷エタノール沈殿、は当業者にとって周知であり、タンパク質複合体混合物を分画するために用いることができる。組み換え型タンパク質の分子量を利用して、より大きなサイズまたはより小さなサイズのタンパク質からそれを単離することができ、異なる孔径の膜たとえばAmicon社またはMillipore社の膜を介する限外ろ過を用いて行う。第一工程としては、関心対象のタンパク質の分子量よりも低分子量のものを遮断する孔径の膜を介して、タンパク質混合物の限外ろ過を行えばよい。次いで、限外ろ過の残留液の限外ろ過を、関心対象のタンパク質の分子量よりも大きい分子量のものを遮断する膜に対して行えばよい。組み換え型タンパク質はその膜を通過して、ろ液内に移るだろう。次いで、このろ液を下記のようなクロマトグラフィーに付せばよい。そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性およびリガンドに対するアフィニティーに基づいて、組み換え型タンパク質をその他のタンパク質から分離することもできる。さらに、タンパク質に対して惹起された抗体をカラムの基質に結合させて、タンパク質を免疫精製することもできる。これらの方法のすべては本技術分野において周知である。当業者にとって、クロマトグラフィーの技術を、任意の規模でかつ多数の異なる製造業者たとえばPharmaciaBiotech社からの装置を用いて実施できることは自明であろう。再生および再度の折りたたみ不溶性タンパク質を再生または再度折りたたんで、タンパク質の二次構造および三次構造の配置を生み出すことができる。組み換え型生産物の配置を完成させる際に、必要に応じてタンパク質の再折りたたみ工程を利用することができる。本技術分野において公知の、タンパク質の解離/会合を促進させるための薬剤を利用して、再折りたたみおよび再生を完成することができる。たとえば、タンパク質をジチオスレイトールと共にインキュベートし、次いで酸化型グルタチオンのニナトリウム塩と共にインキュベートし、次いで再度折りたたむための薬剤、たとえば尿素を含む緩衝液と共にインキュベートすることができる。たとえば、リン酸緩衝食塩水PBSかまたは50mMNa-酢酸、pH6緩衝液200mMNaClに対して透析することによって、組み換え型タンパク質も再生することができる。あるいは、カラム、たとえばNiNTAカラム上で固定化している間に、プロテアーゼインヒビターを含む500mMNaCl、20グリセロール、20mMTris/HClpH7.4の液で、6M-1Mの尿素の直線勾配を利用することによって、タンパク質を再度折りたたむことができる。1.5時間以上をかけて、再生を実施することができる。再生後、250mMイミダゾールを添加することによってタンパク質を溶出することができる。PBSかまたは50mM酢酸ナトリウムpH6の緩衝液200mMNaClの液に対する最後の透析工程で、イミダゾールを除くことができる。精製されたタンパク質を4°Cで貯蔵するか、または-80°Cで凍結させることができる。その他の方法としては、たとえば、MHLeeetalProteinExprPurif25p16673WKChoetalJBiotechnology77p16978DeutscherGuidetoProteinPurificationMethodsinEnzymologyvol182およびこのシリーズの他の巻、ColiganetalCurrentProtocolsinProteinScienceWileyGreeneNYSRoeProteinPurificationTechniquesAPracticalApproachOxfordPressDBollagetalProteinMethodsWileyLisaIncに記載されたものが挙げられる。活性なタンパク質またはペプチドの分析典型的には、活性なタンパク質には、対応する天然のタンパク質に匹敵する生物学的機能または生物学的作用を有するタンパク質が含まれる。タンパク質との関連において、典型的にはこのことは、標準的なパラメータとして用いる対応する天然のタンパク質と比較して、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの生物学的機能または生物学的作用が少なくとも約20、約50、約60、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約98または100の活性であることを意味する。特定のタンパク質についてのアッセイであって、対応する標準の、目標とされる生物学的な比較アッセイを利用して、タンパク質の活性測定を行うことができる。組み換え型タンパク質の生物学的機能または生物学的作用が、組み換え型ポリペプチドが天然のポリペプチドと免疫学的に交差反応するという一つの指摘。活性なタンパク質は、哺乳動物の天然のタンパク質の比活性の少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90または95の比活性を持つことが典型的である。さらに、基質特異性kcat/Kmは、必要に応じて哺乳動物の天然のタンパク質と実質的に同じでよい。典型的には、kcat/Kmは、天然のタンパク質のそれの少なくとも30、40、50、60、70、80または90であろう。タンパク質およびペプチドの活性ならびに基質特異性kcat/Kmをアッセイする方法および定量する方法は、当業者にとって周知である。哺乳動物の組み換え型タンパク質の活性を、任意のタンパク質に特異的な、本技術分野において公知の従来のすなわち標準的なインビトロアッセイまたはインビボアッセイによって測定することができる。シュードモナスが生産した哺乳動物の組み換え型タンパク質の活性を、対応する哺乳動物の天然のタンパク質の活性と比較することができ、同じか類似の生理学的条件下で一般的に見られる天然のタンパク質の活性に対して、哺乳動物の組み換え型タンパク質が、実質的に同等または等価の活性を示すかどうかを決定することができる。組み換え型タンパク質の活性を、既に明らかにされた天然のタンパク質の標準的な活性と比較することができる。あるいは、組み換え型タンパク質の活性を、天然のタンパク質との同時の、または実質的に同時の比較アッセイにて測定することができる。たとえば、インビトロアッセイを用いて、組み換え型タンパク質と、ターゲットとの間、たとえば発現された酵素と基質との間、発現されたホルモンおよびホルモンレセプターとの間、発現された抗体と抗原との間などにある、検出可能なあらゆる相互作用を測定することができる。このような検出としては、比色の変化の測定、増殖の変化の測定、細胞死の測定、細胞の反発性の測定、放射能の変化の測定、溶解性の変化の測定、ゲル電気泳動および/またはゲル排除方法によって測定される分子量の変化の測定、リン酸化能力の測定、抗体特異性のアッセイ、たとえばELISAアッセイなどを挙げることができる。さらに、インビボアッセイとしては、天然のタンパク質の生理学的影響、たとえば重量の増加、電解質のバランスの変化、血液凝固時間の変化、血栓分解の変化および抗原による応答の誘導と比較しての、シュードモナスが生産したタンパク質の生理学的影響を検出するためのアッセイが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。一般的に、あらゆるインビトロアッセイまたはインビボアッセイを用いて、シュードモナスが生産する哺乳動物の組み換え型タンパク質の活動的な性質を測定することができ、そのような活性がアッセイ可能である限り、天然のタンパク質に対する比較分析が可能となる。あるいは、タンパク質と、通常はタンパク質と相互作用する分子、たとえば天然のタンパク質が通常総合作用するようなシグナル経路の基質または成分、との間の相互作用を促進するかまたは阻害する能力について、本発明において生産されるタンパク質をアッセイすることができる。典型的には、このようなアッセイは、タンパク質がターゲット分子と相互作用し、そしてタンパク質とターゲット分子とによる相互作用の生化学的な影響を検出できる条件下で、タンパク質を基質分子と結合させる工程を含んでもよい。タンパク質の活性を測定するために利用することができるアッセイは、たとえば、RalphPJetalJImmunol1321858SaikietalJImmunol1271044StewardWEIITheInterferonSystemsSpringerVerlagViennaandNewYorkBroxmeyerHEetalBlood60595SambrookJEFFritschandTManiatisedsMolecularCloningALaboratoryManual2dedColdSpringHarborLaboratoryPressBergerSLandARKimmeledsMethodsinEnzymologyGuidetoMolecularCloningTechniquesAcademicPressAKPatraetalProteinExprPurif1818292KodamaetalJBiochem9914651472StewartetalProcNatlAcadSciUSA9052095213LombilloetalJCellBiol128107115ValeetalCell423950に記載されている。<実施例>細菌株および培養条件別に明記しない限り、シュードモナス発現のすべての試験で用いた株のすべては、シュードモナスフルオレッセンスMB101株を基礎とした。エシェリキアコリJM109株Promega社、XL2BlueStratagene社またはTop10Invitrogen社を、一般的なクローニングに用いた。エシェリキアコリ発現の研究のために、BL21DE3Goldを用いた。シュードモナスフルオレッセンス株を、必要に応じて15μg/mLのテトラサイクリンおよび30μg/mLのカナマイシンを追加した、LB培地または最小塩類培地のいずれかで、30°Cで培養した。必要に応じて30μg/mLのカナマイシンおよび/または15μg/mLのクロラムフェニコールもしくは15μg/mLのテトラサイクリンを追加したLBで、エシェリキアコリ株を37°Cで培養した。増殖期に達した後、細胞を0.3mMのIPTGで誘導した。タンパク質活性の検出ELISAアッセイPBSpH7.6中で10μg/mLのβ-ガラクトシダーゼ溶液の200μLをマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに添加して、プレートをコーティングした。プレートを室温で16時間インキュベートし、次いで200μLのPBS0.1のTween-20PBS-Tで3回洗浄した。一次抗体を2w/vの脱脂粉乳を含むPBSで希釈した。200μLの希釈抗体をそれぞれのウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。このプレートを次いで200μLのPBS-Tで4回洗浄した。二次抗体も2w/vの脱脂粉乳を含むPBSで希釈し、それぞれのウェルに200μLを添加し、室温で1.5-2時間インキュベートした。このプレートを次いでPBS-Tで4回洗浄した。三次抗体を用いてscFv抗体:アルカリホスファターゼ結合ヒツジ抗マウス抗体Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA、カタログ番号A5324を検出した。それぞれの所望のウェルに200μLの希釈抗体溶液またはPBS-Tを添加し、室温で1.5時間インキュベートした。このプレートを次いでPBS-Tで4回洗浄した。それぞれのウェルに200μLの新しく調製したSigmaFastpNPP基質Sigma社カタログ番号R-2770を添加した。30分後に、50μLの3MNaOHをそれぞれのウェルに添加してこの反応を停止させ、405nmでの吸光度を読み取った。発酵シュードモナスフルオレッセンスについての発酵槽での培養のための接種材料を、600mLの化学的に規定された、酵母抽出物およびデキストロースを追加した培地を含む振盪フラスコに接種することによって作製する。典型的には、テトラサイクリンを添加して、一晩のインキュベートの間でのスターターカルチャーにおいて、ならびに発酵槽において、組み換えプラスミドが確実に維持できるようにする。次いで、振盪フラスコ培養物を、酵母抽出物を添加せずに高バイオマスを支持するように設計された、化学的に規定された培地を含む20Lの発酵槽に無菌で移す。気流を発酵槽内への気流と撹拌器の撹拌速度とを調節すること;アンモニア水を添加してpHが6.0を超えるように維持することによって、液体培養内での酸素は陽性レベルを維持する。フェドバッチ高密度発酵プロセスは、約24時間の初期の増殖期と、インデューサを添加して組み換え遺伝子の発現を開始させる遺伝子発現誘導期とに分けられる。制限された濃度で、発酵プロセスの全体を通して、グルコースをコーンシロップの形態で供給する。誘導期を開始させる標的細胞密度は通常、575nmにて150OD単位である。発酵の誘導期は通常、約45~55時間まで達することが可能である。この期の間、種々の分析のために発酵槽からサンプルを回収し、標的遺伝子発現、細胞密度のレベルなどを測定する。エシェリキアコリについてのそれぞれの発酵実験のために、凍結したグリセロールストックを-80°Cの貯蔵庫から取り出し、カナマイシンを添加した600mLのLB培地を含む振盪フラスコに接種する前に解凍し、希釈する。振盪フラスコ培養物を300rpmで振盪させながら一晩、37°Cでインキュベートし、次いで、複合培地を含む20Lの発酵槽に無菌で移す。発酵槽内の温度を37°Cに維持し、アンモニア水およびリン酸を添加してpHを7とし、そして20を超えるように酸素を溶解させる。短時間の初期バッチ期の後、速度を段階的に高めてグリセロールを供給して過剰の炭素を維持する。600nmでの細胞密度が24-28OD単位に達した時点で、インデューサ、たとえばイソプロピルチオガラクトシドを添加することによって、組み換え発現を実施する。発酵の誘導期は通常、発酵槽の容積に達する時まで、または増殖速度が顕著に低下し始める時まで、約3~5時間継続する。この期の間、種々の分析のために発酵槽からサンプルを回収し、標的遺伝子発現、細胞密度のレベルなどを測定する。細胞分画およびSDS-PAGE分析サンプルをA575=30に標準化し、1mLの標準化培養物をペレット化する。細胞を1mLの溶解緩衝液50mMのTris塩基;200mMのNaCl;5v/vのグリセロール;20mMのEDTA二ナトリウム塩;0.5v/vのTritonX-100;1mMのDTTで再懸濁させる。細菌溶解物に特異的なプロテアーゼインヒビターカクテルSigma社P8465を1X濃度で添加する。再懸濁させた細胞を、0.1mmのガラスビーズと一緒に、2mlのネジ込み式マイクロフュージチューブの全体の約3/4まで添加し、最も強い設定でBioSpecビーズミルにて4,1分間のインキュベートを用いて細胞を機械的に溶解させる。インキュベートの間、細胞を氷上に置く。約100μLの溶解細胞溶液をビーズから取り除き、新しいチューブに移してペレット化する。その上清可溶性画分を新しいチューブに移す。そのペレット不溶性画分を等量の溶解緩衝液プロテアーゼインヒビター100μLで再懸濁する。それぞれのサンプルの5μLを5μLの2XLDS負荷緩衝液Invitrogen社に添加し、4-12または10のBis-TrisNuPAGEゲルInvitrogen社上に負荷し、示されるように1XMES緩衝液または1XMOPS緩衝液のいずれかで稼動させる。実施例1:細胞質におけるscFVの発現一本鎖抗体断片scFVが診断薬および治療剤としての使用が増加していることが分かっている。これらの比較的小さいタンパク質は、免疫グロブリンの可変性の軽鎖および重鎖をコードする互いの遺伝子を融合することによって作られる。Gall3scFvのクローニングファージディスプレイベクターpCANTAB6内にクローニングされたGall3scFv遺伝子Genbank受入番号AF238290JMolBiol28011727を参照することを、774塩基対の産物を増幅するための鋳型として用いた。続いてこれをpCR2.1TOPOベクターInvitrogen,Carlsbad,CA,USA内にクローニングした。SpeI制限酵素およびSalI制限酵素NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USAで、TOPOベクターからscFv遺伝子を切り出し、シュードモナスフルオレッセンスベクターpMYC1803のSpeI部位XhoI部位内、Ptacプロモーターの下流、にクローニングして、pDOW1117を生産した。得られたプラスミドをシュードモナスフルオレッセンス内にエレクトロポレートした。SalI部位およびNcoI部位がコード配列に隣接するように、増幅した後、Gal13遺伝子をpET24d発現ベクターNovagen,Madison,WI,USA内にクローニングした。このPCR産物をSalIおよびNcoIで消化して、pET24dベクターのT7プロモーターの下流の同じ部位内にクローニングした。次いで、新たに形成された構築物を用いて、XL2Blueコンピテント細胞を形質転換した。配列を確認すると、すぐにそのDNA構築物を用いてBL21DE3GoldStratagene,SanDiego,CA,USAを発現用に形質転換した。エシェリキアコリおよびシュードモナスフルオレッセンスにおける一本鎖抗体断片scFvの発現エシェリキアコリおよびシュードモナスフルオレッセンスの両方で、scFv分子を発現させた。これらの中で、scFvはエシェリキアコリタンパク質のβ-ガラクトシダーゼ一本鎖抗体gal1311727への結合活性を有する。シュードモナスフルオレッセンスは、20Lの発酵の間に、エシェリキアコリの約6倍を超えてタンパク質を発現し、SDS-PAGEおよびデンシトメトリーで測定されるように、シュードモナスフルオレッセンスにおいては3.1g/Lの収量、およびエシェリキアコリにおいては0.5g/Lの収量であった表8を参照すること。シュードモナスフルオレッセンスは、約96の可溶性タンパク質を発現したのに対して、エシェリキアコリはわずかに48の可溶性タンパク質を発現した。図2に示されるように、両者の発現系から精製された成分が、酵素結合免疫吸着法ELISAによって活性であることが分かった。両方の株の溶解物から、等量のわずかの溶解物の可溶性画分からも、アフィニティークロマトグラフィーを用いて成分を精製した。最後に、シュードモナスフルオレッセンスについての全体量の回収プロセスは、エシェリキアコリについてのそれよりも約20倍を超えて効率的であり、1.34g/L対0.07g/Lであった。実施例2:細胞質内でのヒトγ-IFNの発現ヒトガンマ-インターフェロンのクローニングPWGrayetalNature29885963に記載のMet-Cys-Tyr-Cys-Gln-Asp-Proから始まる組み換え型γ-IFNのN末端を伴う天然の分泌シグナルが欠如するように、ヒトガンマ-インターフェロンhu-γIFN、Genbank受入番号X13274を、ヒト脾臓のcDNAライブラリーInvitrogen,Carlsbad,CA,USA;カタログ番号10425-015から増幅した。得られた産物をpCR2.1TOPOベクター内にクローニングし、その配列を確認した。SpeI制限酵素およびXhoI制限酵素でhu-γIFN遺伝子をTOPOベクターから切り出し、pMYC1803の同じ部位内にクローニングした。別個の反応において、AflIII部位およびXhoI部位がコード配列に隣接するように、hu-γIFNを増幅した。得られた断片をTOPO-TAベクターInvitrogen社内にクローニングし、化学的にコンピテント化されたエシェリキアコリJM109細胞Promega,Madison,WI,USA内に形質転換した。AflIIIおよびXhoINewEnglandBiolabs社で消化することによってこの遺伝子を単離し、pET24dNovagen,Madison,WI,USAのT7プロモーターの下流のNcoI部位およびXhoI部位内にクローニングし、JM109内に形質転換した。陽性クローンをエシェリキアコリBL21DE3細胞Novagen社内に形質転換し、発現について試験した。ヒトガンマ-インターフェロンの精製シュードモナスフルオレッセンス培養物からの凍結した細胞ペーストを解凍し、溶解緩衝液50mMのNaCl、10mMのEDTAエチレンジアミン四酢酸、カタログ番号BPII8-500、FisherScientific,Springfield,NJ,USA、1mMのPMSFフェニルメチルスルホニルフロリド、カタログ番号P-7626、Sigma,St.Louis,MO、1mMのジチオスレイトールカタログ番号D-0632、Sigma社、および1mMのベンズアミジンカタログ番号B-6506、Sigma社を含む50mMのリン酸カリウム、pH7.2で、2mLの溶解緩衝液あたり約1グラムの細胞ペーストの割合で再懸濁した。マイクロフリューダイザモデル110Y,MicrofluidicsCorporation,Newton,MA,USAに3回通すことによって、細胞を破壊した。細胞の残骸および破壊されなかった細胞を、遠心分離BeckmanCoulter遠心分離装置;モデルJA25.50,BeckmanCoulter,Inc.,Fullerton,CA,USAを用いて4°C、23,708xgで60分間によって除去した。得られた上清細胞を含まない抽出物を、10w/vの珪藻土セライト産物、WorldMinerals,Inc.,Goleta,CA,USAを添加して清澄にし、得られたものを減圧ろ過にて、ろ紙Whatman1、カタログ番号1001-150、WhatmanPaperLtd.,Maidstone,Kent,UKに通した。清澄化した細胞抽出物を、緩衝液Aにて0.5mL/分の流速で平衡化したSP-SepharoseFASTFLOW6の架橋アガロースビーズ成分;カタログ番号17-0709-10、AmershamBiosciences,Piscataway,NJ,USAの3.2cmx13.5cmのクロマトグラフィーカラムに添加した。緩衝液Aの組成は次の通りであった:50mMのHEPES、pH7.8すなわちN-2-ヒドロキシエチルピペラジンN’-2-エタンスルホン酸、FisherScientific社、カタログ番号BP-310-100から、50mMのNaCl、1mMのEDTA、および0.02のアジ化ナトリウムカタログ番号71289、SigmaChemical社。負荷後、このカラムをカラム体積の3倍量カラム体積=108mLの緩衝液Aと、カラム体積の5倍量の0.4MのNaClを含む緩衝液Aとで洗浄した。さらに、2mL/minの流速で合計カラム体積の7倍分の、同じ緩衝液の0.4M~1Mの勾配を付けたNaClを添加して、カラムを展開した。次いで、純粋なIFN-γを含む画分を集めて、1XPBSリン酸緩衝化塩類溶液、pH7.2に対して4°Cで透析した。限外ろ過YM30限外ろ過膜を使用;カタログ番号13722、Millipore,Bedford,MAUSAよりによって、タンパク質を濃縮した。次いで、液体窒素で凍結させて80°Cで貯蔵した。エシェリキアコリおよびシュードモナスフルオレッセンスにおけるヒトγ-インターフェロンの発現γ-IFN遺伝子を発現するエシェリキアコリの発酵によって、ヒトγ-インターフェロンを商業的に生産する。このタンパク質を不溶型および不活性型の状態で、細胞質内で発現させる。組み換え体ポリペプチドを活性な医薬成分として生産するために、インターフェロンを回収し、溶解させ、再折りたたみさせ、次いで精製しなければならない。これらの単位操作のすべては、タンパク質の原価をかなり上昇させる。ヒト脾臓のcDNAライブラリーを、天然のシグナル配列を含まないγIFNcDNAを増幅するための鋳型として用い、エシェリキアコリの発現ベクターおよびシュードモナスフルオレッセンスの発現ベクター内にクローニングする。典型的な20Lの発酵反応の間に、シュードモナスフルオレッセンス構築物は約4g/LのγIFNタンパク質を生産した。可溶性画分および不溶性画分のSDS-PAGEおよびウエスタン分析から、タンパク質の大部分95が可溶性画分内に存在することが示される。図1は、シュードモナスフルオレッセンスサンプルの可溶性画分から精製されたhu-γ-IFNが、市販の標準に匹敵する活性を示すことを示す。図5および表9は、エシェリキアコリの発現系とシュードモナスフルオレッセンスの発現系との間でのγ-IFNの発現の比較を示す。ヒトガンマ-インターフェロン活性の評価セルラインおよび培地:Hela細胞カタログ番号CCL-2および脳心筋炎ウイルスECMV、カタログ番号VR-129Bを、AmericanTypeCultureCollectionManassas,VAから入手した。10ウシ胎血清Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA,USAを有するイーグル改変必須培地CellgroEMEM,Mediatech,Herdon,VA,USAで、37°C/5のCO2にて、HeLa細胞を維持した。既述のウイルス阻害アッセイinLymphokinesandInterferonsAPracticalApproachMJClemensetalIRLPressLtd,Oxford,Englandを用いて、精製hu-γIFNの活性を評価した。概略を言えば、HeLa細胞を96ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり3X104で播種した。24時間後、シュードモナスフルオレッセンスから単離された精製hu-γIFN、またはエシェリキアコリ組み換え体hu-γIFNRandDSystemsより、Minneapolis,MN,USAを、ウェルあたり0、0.01または0.05ngにて三通り、ウェルに添加した。hu-γIFNと共に細胞を24時間のプレインキュベートした後、ECMVを種々の希釈率で添加して、三通りのウェルを設定した。細胞を5日間インキュベートし、5-ブロモ-2’-デオキシウリジンカタログ番号1647229、RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,IN,USAの取り込みを監視する細胞増殖ELISAを利用して、その後細胞の生存性を測定した。活発に分裂する生きている細胞数の存在がより多いことによって、吸光度がより大きくなるという吸光単位として結果を表す。実施例3:細胞質内でのhGHの発現ヒトcDNAライブラリーからヒト成長ホルモンhGHを増幅するようなプライマーを設計した。この研究のために、製造業者のプロトコールに従ってAmpliTaqポリメラーゼPerkinElmer社を用い、鋳型としての上記のプラスミドと、プライマーELVIrevおよびhgh-sigを用い、そして95°Cで2分間95°Cで60秒間42°Cで120秒間72°Cで3分間を25回行うPCRサイクリングプロフィールによってhGHを増幅した。WizardPCRDNA精製キットPromega社を用い、SpeI制限酵素およびXhoI制限酵素NewEnglandBiolabs社で消化して、得られた産物を精製し、pMYC1803の同じ部位内にクローニングした図3。増幅されたhGHで見つかった変異体を、ELVIrevを伴うhgh-sigcorrプライマーと、PCRおよびクローニング手法を繰り返し利用して集めた。hGHの精製20Lの発酵の後、0.25MのNaCl工程の代わりにDEAEFF溶出と0~0.5MのNaCl勾配を用いた間を除いて、エシェリキアコリ細胞およびシュードモナスフルオレッセンス細胞の不溶性画分から、hGHを精製した。エシェリキアコリ内対シュードモナスフルオレッセンス内のヒト成長ホルモンの発現ヒト下垂体cDNAライブラリーから、ヒト成長ホルモンをコードするcDNAを増幅した。細菌による発現のために、天然の分泌シグナル配列を除去し、N末端のメチオニンを改変して構築物内とした。エシェリキアコリの発現のために、hGH遺伝子を含むpET25ベクターをBL21DE3内に形質転換した。これは、hGHの転写に必須の組み込まれたT7ポリメラーゼ遺伝子を含む。シュードモナスフルオレッセンスの発現の研究はMB214株にて行った。これは、Ptacプロモーターからの発現を制御するための、組み込まれたlacI遺伝子を含む。20Lの発酵規模で、両方の発現系を評価した。表10に示されるように、1グラムの乾燥生物体量あたりの生産されたタンパク質の量において、シュードモナスフルオレッセンスPfはエシェリキアコリECより高効率であった1.6倍に等しい。細胞分画化およびSDS-PAGE分析から、両方の発現系図4において、hGHが不溶性画分に見出されることが示される。驚くべきことに、乾燥生物体量1グラムあたりのタンパク質生産はわずかに1.6倍の違いしかないにも関わらず、エシェリキアコリと比較して、約7Xを超えるhGHモノマーを、シュードモナスフルオレッセンスから精製した。実施例4:ペリプラズム内でのタンパク質の発現分泌シグナルペプチドのキャラクタライゼーションアルカリホスファターゼコード配列-ゲノムDNA融合体の形成および発現によって、シュードモナスフルオレッセンスの分泌シグナルペプチドを発見した。そしてこのペプチドは、2004年11月22日に出願された米国出願第10/996,007号により詳細に記載されている。発現された融合体のうちの六つを、さらに次のように特徴づけた。phoA融合体として特定された、分泌された遺伝子についてのシグナル配列の切断部位を、その他のシュードモナス菌からの相同なタンパク質と、SPScanプログラムによって比較することで推定した。推定されるリポタンパク質の切断部位を、シグナルペプチダーゼIIモチーフと比較することで推定した;シグナルペプチダーゼIIは特異的にリポタンパク質のシグナル配列を切断する。六つのシグナルペプチドのすべてを、SignalP推定されるシグナルペプチドの分析のためのソフトウェアプログラム;CenterforBiologicalSequenceAnalysisoftheTechnicalUniversityofDenmarkより、httpwwwcbsdtudklservicesSignalPにて利用可能を用いて分析した。さらに、NielsonetalProteinEngineering1016を参照すること。いくつかの場合において、追加された供給源を用いてシグナルペプチドの同一性をさらに特徴づけた。この情報を表12に提示する。融合タンパク質を検出するためのphoA融合タンパク質のウエスタン分析融合タンパク質が生産されたかどうかを分析するために、遠心分離によって全細胞画分細胞質およびペリプラズムと細胞を含まない培地画分とに分けられた培養物に関して、アルカリホスファターゼに対する抗体を用いたウエスタン分析を実施した。挿入部位が決定された5株のうち、4つ推定されるアズリン、推定されるリン酸結合タンパク質、推定されるペリプラズムのリポタンパク質B、推定されるFeIII結合タンパク質が、予想されたサイズの融合タンパク質を生産し、そして一つ推定されるoprEタンパク質が予想よりも約40kD小さいタンパク質を生産した。そして一つ推定されるLys-Arg-Orn結合タンパク質が予想よりも約20kD小さいタンパク質を生産した。タンパク質をSDS-PAGEで分離し、XcellSureLockTMMini-CellおよびXCellIITMBlotModuleInvitrogen社を用いて、40Vで一時間かけて、ニトロセルロース膜に移した。SuperSignalWestHisProbeTMKitPierce社から提供の説明書を用いて、ウエスタン実験を実施した。pbp-hGH融合体の構築、発現および特徴付けシュードモナスフルオレッセンスのリン酸結合タンパク質分泌リーダーを、ヒト成長ホルモンhGH遺伝子の成熟したドメインのN末端と融合させ、発現および分泌について試験した。シュードモナスフルオレッセンスのクローンから、pbpシグナル配列を鋳型として、そしてsigpbpforプライマーおよびpbphghプライマーを用いて、pbpシグナル配列コード領域をPCR増幅し、次いでゲルで精製した。これによって、結果的にpbpシグナルペプチドCDSおよびhGHの成熟したドメインの5’末端についてのコード配列を含むオリゴヌクレオチド断片が生産された。プライマーELVIforおよびELVIrevを用いて、ヒト下垂体cDNAライブラリーClontech,PaloAltoCAから、ヒト成長ホルモンをコードするcDNAをPCR増幅した。これらのプライマーは、hGHの成熟したドメインのみを増幅し、pMYCl803/SpeIXhoI内にクローニングしてpDOW2400を形成するように設計されていた。プライマーpbphghrevcompおよびhghrevを用いて、pDOW2400からこの成熟したhGH遺伝子を増幅した。次いで、StrataprepカラムStratagene社で精製してプライマーおよびその他の反応成分を除去した。pbp-hGH融合体をコードするポリヌクレオチドを作製するために、二つのPCR反応物を混ぜ合わせて、二つの断片を結合させるために、sig_pbpforおよびhgh_revを用いて再び増幅した。予想された681bp断片を、上記のようなStrataprepを用いて精製し、XbaIおよびXhoIで制限消化し、脱リン酸化pDOW1269/XhoISpeIと連結してpDOW1323-10を形成させ、pMYC1803に類似のベクター内にてtacプロモーターの制御下にpbp-hGHを置いたが、tetRテトラサイクリン耐性マーカー遺伝子に代えてpyrF選択マーカーを用いた。連結混合物をMB101pyrFproClacIQ1内に形質転換した。DowChemicalCompanyのものによって、上記の方法を利用して挿入物の配列を決定した。この融合体のDNA配列およびアミノ酸配列を、図10および図11にそれぞれ提示する。得られた株をまず振盪フラスコ規模で試験した。プロセシングされたまたはプロセシングされなかったものの予想されたサイズの誘導されたバンドそれぞれ22.2kDaおよび24.5kDaをSDS-PAGEで検出した。タンパク質のほぼ半分がプロセシングされペリプラズムに局在化していることを示す、そしてプロセシングされたものの約半分が可溶性画分に、半分が不溶性画分にあった。発現の研究を20Lのバイオリアクターにスケールアップした。クーマシーで染色されたSDS-PAGEゲルのデンシトメトリーから、生産された総hGHの18がプロセシングされて可溶性となったことが示された。この株はすべての型のhGHを3.2g/L生産した;プロセシングされて可溶性となったものは0.6g/Lであった。pbp-scFv融合体の構築、発現および特徴付けリン酸結合タンパク質すなわちMet1などの推定される24アミノ酸のシグナル配列を、2アミノ酸Alaの位置で、gal2のscFv遺伝子gal2のオープンリーディングフレームと融合した。図8および図9を参照すること。このシグナル配列はプロセシングを受けているように思われ、ペリプラズムに分泌されたことが示唆される。さらに、細胞を含まない培養上清内でタンパク質が検出されたことから、培地への分泌も存在する。驚くべきことに、リン酸結合タンパク質のシグナル配列に融合することは、シュードモナスフルオレッセンス内でのgal2scFvの発現を改善するようである。アミノ末端で融合された分泌シグナルなしでは、gal2scFvの発現が検出できなかった。Gal2のクローニングプライマーsigpbpfor上記およびpbpgal2SOErev、これはpbpgal2SOEforの逆相補鎖を含む、を用い、そしてシュードモナスフルオレッセンスのpbp分泌シグナルペプチドをコードするプラスミドを鋳型としてを用いてPCRを実施した。これによって、結果的に、pbpシグナルペプチドコード配列CDSおよびgal2一本鎖抗体scAbまたはscFvの5’末端についてのCDSを含むオリゴヌクレオチド断片が生産された。プライマーpbpgal2SOEforおよびscFv2revを用い、そしてgal2をコードするポリヌクレオチドを鋳型として用いてPCRを実施した。これによって、結果的に、pbpシグナルペプチドの3’末端をコードするCDSと、オープンリーディングフレームOREをコードするgal2とを含むポリヌクレオチド断片が生産された。反応産物を精製した。それぞれ約15ngを、プライマーsig_pbp_forおよびscFv2revを用いてのさらなるPCR反応における鋳型DNAとして用いた。これによって、結果的に、gal2コード配列に融合したpbpシグナルペプチドCDSを伴う核酸断片が生産された。予想された、シグナル配列の-1アミノ酸これは切断部位がプロポーズされる前の最後のアミノ酸を、gal2scFvAlaの2アミノ酸と融合した。得られた融合体を、Ptacプロモーターの制御下のシュードモナスフルオレッセンスベクターpMYC1803内にクローニングし、プラスミドおよびpDOW1123pbp:gal2を生産させた。このプラスミドを、プラスミドpCN51-lacI2004年11月19日に出願された米国出願第10/994,138号に記載されているを保持するシュードモナスフルオレッセンスMB101株内に形質転換した。推定されるリン酸結合タンパク質のシグナル配列のgal2scFvとの融合リン酸結合タンパク質のシグナル配列を一本鎖抗体遺伝子と融合し、ペリプラズムおよび/または培養上清への分泌について試験した。得られた株をまず振盪フラスコ規模で試験した。不溶性タンパク質画分内で、プロセシングされたまたはプロセシングされなかったgal2の予想されたサイズの誘導されたバンド29kDaおよび27kDaをSDS-PAGEで検出したデータは示さず。発現の研究を20Lの発酵にスケールアップした。再度のSDS-PAGE分析から、誘導されたタンパク質の大部分が不溶性タンパク質画分に見られることが示された。ウエスタン分析から、いくらかのプロセシングされたgal2が、pbp:gal2pDOW1123についての可溶性タンパク質画分に存在することも示された。Epicentre細胞膜キットを用いてのpDOW1123を保持する株から調製されたペリプラズム画分のウエスタン分析から、可溶性gal2タンパク質が存在することが示された。QiagenNi-NTAプロトコールを利用して、組み換え体gal2scFvを、振盪フラスコ実験の細胞抽出物から単離し、次いでPMartineauetalJMolBiol280117127に記載のように再折りたたみを行わせた。この抗体は、ELISAアッセイにおいて、β-ガラクトシダーゼに対して活性を持つことが分かった。"