"対象の分子を細胞壁を有する植物細胞中に導入する方法であって、細胞壁を有する植物細胞を提供するステップと、γ-ゼインペプチドを対象の分子と相互作用させて、γ-ゼイン連結構造体を形成するステップと、細胞壁を有する細胞とγ-ゼイン連結構造体とを互いに接触させるステップと、γ-ゼイン連結構造体の細胞壁を有する細胞中への取り込みを可能にするステップとを含む方法。γ-ゼインペプチドを対象の分子と相互作用させるステップが、対象の分子をγ-ゼインペプチドと融合させることを含む、請求項1に記載の方法。γ-ゼイン連結構造体の細胞壁を含む植物細胞の区画中への取り込みを可能にすることをさらに含む、請求項1に記載の方法。区画が、サイトゾル、核、トノプラスト、色素体、エチオプラスト、有色体、白色体、エライオプラスト、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔から成る群から選択される、請求項3に記載の方法。細胞壁を含む植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、キャノーラ、ナタネ、ワタ、ヤシ、ピーナッツ、ダイズ、オリザ属種Oryzasp、シロイヌナズナ属種Arabidopsissp、トウゴマ属種Ricinussp、およびサトウキビの細胞から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さやおよび茎から成る群から選択される組織由来である、請求項1に記載の方法。γ-ゼインペプチドが、配列番号1を含む、請求項1に記載の方法。対象の分子が、核酸、DNA、RNA、RNAi分子、遺伝子、プラスミド、コスミド、YAC、BAC、ポリペプチド、酵素、ホルモン、グリコペプチド、糖、脂肪、シグナルペプチド、抗体、ビタミン、メッセンジャー、二次メッセンジャー、アミノ酸、cAMP、薬物、除草剤、殺菌剤、抗生物質、およびそれらの組合せから成る群から選択される成分を含む、請求項1に記載の方法。対象の分子が、遺伝子を含む、請求項8に記載の方法。遺伝子が、外来性タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、請求項9に記載の方法。遺伝子を安定に組み込んだ細胞を選択することをさらに含む、請求項9に記載の方法。選択された細胞が、再生可能な細胞である、請求項11に記載の方法。再生可能な細胞から稔性植物を再生することをさらに含む、請求項12に記載の方法。遺伝子を発現させる方法であって、細胞壁を有する植物細胞を提供するステップと、γ-ゼインペプチドを遺伝子と相互作用させて、γ-ゼイン連結構造体を形成するステップと、細胞壁を有する植物細胞とγ-ゼイン連結構造体とを互いに接触させるステップと、γ-ゼインペプチドおよび遺伝子の細胞壁を含む植物細胞中への取り込みを可能にするステップと、植物細胞を有する植物の子孫において、遺伝子を発現させるステップとを含む方法。遺伝子を葉緑体において発現させる、請求項14に記載の方法。遺伝子を安定に発現する細胞を選択することをさらに含む、請求項14に記載の方法。γ-ゼインペプチドが、配列番号1を含む、請求項14に記載の方法。分子性物質を植物細胞中に移入するための方法であって、γ-ゼインペプチドをプラスミドDNAと相互作用させて、γ-ゼイン連結構造体を形成するステップと、γ-ゼイン連結構造体を、γ-ゼインペプチドおよびプラスミドDNA由来の遺伝子の植物細胞中への取り込みを許容する条件下で、無傷の壁を有する植物細胞と接触させるステップとを含む方法。植物細胞を有する植物の子孫において、遺伝子を安定に発現させることをさらに含む、請求項18に記載の方法。γ-ゼインペプチドが、配列番号1を含む、請求項18に記載の方法。以下の記述および表において、いくつかの用語を使用する。かかる用語が与えられる範囲を含めた、明細書および特許請求の範囲の明白かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する。戻し交配。戻し交配は、栽培者が、ハイブリッド子孫を親の1つに戻って、例えば、第1世代ハイブリッドF1をF1ハイブリッドの親の遺伝型の1つと繰り返して交配させるプロセスである。胚。胚は、成熟種子内に含有される小さい植物とすることができる。ゼイン。ゼインは、コーングルテンミールから作製されるトウモロコシタンパク質である。ゼインは、アミノ酸リジンおよびトリプトファンを欠いているために、食物タンパク質の唯一の供給源として適していない。ゼインは、水およびアルコールに不溶性であるが、水性アルコール、グリコール、およびグリコールエーテルに可溶性である。ゼインは、薄膜およびコーティングとして機能し、木の実および穀物産物のための水分障壁となる。ゼインは、糖菓のためのコーティングおよび鍋で料理した製品のための光沢としても機能する。ナノ粒子。通常100nm未満の、少なくとも1つのナノスケール寸法を有する微視的な粒子。本発明における使用に適したナノ粒子は、1nm~0.4umのサイズ範囲を有することができる。量子ドットは、1nm~10nm、好ましくは2~4nmにわたる中位径を有することができる。ナノ粒子は、金ナノ粒子、金で被覆されたナノ粒子、多孔質ナノ粒子、メソポーラスナノ粒子、シリカナノ粒子、ポリマーナノ粒子、タングステンナノ粒子、ゼラチンナノ粒子、ナノシェル、ナノコア、ナノ球体、ナノロッド、磁性ナノ粒子、およびそれらの組合せから選択することができる。量子ドット。量子ドットは、3つすべての空間方向において、伝導帯電子の挙動、価電子帯正孔、または励起子伝導帯電子および価電子帯正孔の結合したペアを制限する半導体ナノ構造である。制限は、静電ポテンシャル外部電極、ドーピング、ストレイン不純物strainimpurityによって生み出される、異なる半導体物質間インターフェース例えばコアシェルナノ結晶系におけるの存在、半導体表面例えば半導体ナノ結晶の存在、またはこれらの組合せによることができる。量子ドットは、分離した量子化エネルギースペクトルを有することができる。対応する波動関数は、量子ドット内で空間的に局在化されるが、結晶格子の多くの周期にわたる。量子ドットは、伝導帯電子、価電子帯正孔、または励起子の1~100のオーダーの小さい有限数すなわち、電気素量の有限数を含有する。安定化したまたは安定な形質転換体。安定化したまたは安定な形質転換体は、そのゲノムが1つの世代から次の世代へ再現性よく伝わる植物を表す。取り込み。取り込みは、γ-ゼインなどの粒子の細胞壁または細胞膜を通過する移行を表し、ここで、移行は、粒子が取り込まれる細胞以外の何かによって粒子に与えられる運動量の結果だけでは起こらない。比較のために述べると、粒子に与えられる運動量の結果だけで粒子の細胞壁または細胞膜を通過する移行を引き起こすデバイスまたは方法の例は、微粒子銃、遺伝子銃、微量注入、および/またはインペールフェクションimpalefectionテクノロジーである。特定の実施形態において、本発明は、植物系における小分子送達、生体分子送達、遺伝子送達、イメージング、および様々な生物工学的診断ならびにセンシング機能における適用のための、ペイロードを効率的に無傷の植物細胞中に送達するためのCPPとしてのγ-ゼインの使用に関する。本発明の他の実施形態において、加えたまたはゲスト分子は、γ-ゼイン分子に結合していてもよい。この特性は、例えば、バイオミメティクスなどの分野に関する、細胞内の分子部位の特異的なターゲティングおよびエディティング、種々の樹木、野菜および条植え作物における形質および病害抵抗性適用のための、非遺伝的に改変された生物選択肢、および一過性の形質転換選択肢のための、標的送達において用いることができる。本発明の実施形態は、植物における適したバイオセンサーを開発するためにも用いることができる。本発明の実施形態に従って、対象の分子を細胞壁を含む植物細胞中に導入する方法であって、対象の分子を含有するγ-ゼインを植物細胞と接触させ、γ-ゼインの植物細胞壁を通過する取り込みを可能にすることを含む方法を提供することができる。発明の特定の態様において、γ-ゼインは、対象の分子を可逆的または不可逆的に含有することができる、対象の分子と相互作用することができる、またはさもなければ対象の分子に結合かつ/もしくは対象の分子を有することができる。本発明の実施形態に従って、細胞壁を有する植物細胞は、無傷の細胞壁全体を含む任意の植物細胞とすることができる。細胞壁を有する細胞の例は、藻類、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、キャノーラ、ナタネ、ワタ、ヤシ、ピーナッツ、ダイズ、サトウキビ、オリザ属種Oryzasp、シロイヌナズナ属種Arabidopsissp、およびトウゴマ属種Ricinussp、好ましくはタバコ、ニンジン、トウモロコシ、ワタ、キャノーラ、ダイズおよびサトウキビ;より好ましくはタバコおよびニンジンを含むがこれらに限定されない。本発明の実施形態は、胚、分裂組織の細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、茎、無傷の単一の植物細胞の組織培養物および懸濁液を含むがこれらに限定されない、任意の組織由来の、またはそれらがどこにおいて発見されても、細胞壁を含む細胞を含むことができる。本発明の実施形態において、対象の分子は、本発明に従って植物細胞に送達することができる任意の分子とすることができる。対象の分子、または対象の分子の成分は、任意の小分子、核酸、DNA、RNA、RNAi、miRNA分子、遺伝子、プラスミド、コスミド、YAC、BAC、ポリペプチド、酵素、ホルモン、グリコペプチド、糖、脂肪、シグナルペプチド、抗体、ビタミン、メッセンジャー、二次メッセンジャー、アミノ酸、cAMP、薬物、除草剤、殺菌剤、抗生物質、および/またはそれらの組合せを含むことができるがこれらに限定されない。本発明の実施形態は、病害の予防または治療のための方法を含む。非限定的な例である実施形態は、本発明の方法を使用しての、殺菌剤、抗生物質、および/または他の薬物のそれらを必要としている細胞への送達を含む。本発明の態様において、γ-ゼイン連結構造体を、種々の植物細胞オルガネラ中に取り込むことができる。γ-ゼイン連結構造体を取り込むことができる位置の例は、サイトゾル、核、トノプラスト、色素体、エチオプラスト、有色体、白色体、エライオプラスト、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔を含むがこれらに限定されない。本発明の他の実施形態において、γ-ゼイン連結構造体の細胞壁を含む細胞中への取り込みは、シンプラストまたはアポプラスト経路経由で起こることができる。本発明の追加の実施形態は、遺伝的に改変された植物細胞およびそれらを生み出すための方法を含み、ここで、植物細胞は、本発明の方法を通してそこに導入された1つまたは複数の核酸を有する。実施形態の1つの例において、対象の遺伝子および選択マーカーを含むプラスミドは、本発明によるγ-ゼインを通して細胞壁を有する植物細胞中に導入することができる。別の実施形態において、安定な形質転換体は、対象の遺伝子および/または選択マーカーを安定に組み込んだものから選択することができる。代替の実施形態において、現在対象の遺伝子を含む植物細胞を、増殖し、対象の分子を含む他の細胞を作製することができる。他の実施形態において、現在対象の分子を含む植物細胞は、対象の分子を含む植物全体を再生するために使用することができる再生可能な細胞とすることができる。別の態様において、本発明は、組織培養物において使用するための、対象の分子を含む再生可能な植物細胞を作り出す方法を提供する。組織培養物は、好ましくは、再生可能な細胞と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生する能力があろう。かかる組織培養物における再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織の細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さやまたは茎とすることができる。まださらに、本発明の実施形態は、本発明の組織培養物から再生した植物を提供する。代わりに、本発明は、所望の形質を細胞壁を有する植物細胞中に導入する方法であって、所望の形質を提供する能力がある対象のγ-ゼイン遺伝子を、細胞壁を有する植物細胞中に配置し、対象のγ-ゼインが結合した遺伝子の細胞壁を通過する取り込みを可能にすることを含む方法を提供する。所望の形質の例は、雄性不稔、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌性、真菌性、および/またはウイルス性病害に対する抵抗性から選択される形質、ならびに修飾油プロフィール、改変デンプンおよび繊維含量、増強されたビタミンおよびアミノ酸含量などの利点をエンドユーザーに付与する形質を含むがこれらに限定されない。本発明の別の態様は、所望の分子または対象の遺伝子を含む安定な植物系統を生み出す方法であって、所望の分子または対象の遺伝子を、植物細胞壁を通過するγ-ゼイン媒介移行によって最初に導入することができる方法を提供する。遺伝的に安定化する方法、またはさもなければ改変植物系統は、当業者によく知られており、自殖、戻し交配、ハイブリッド作製、安定な個体群への交配などの技法を含むがこれらに限定されない。細胞壁を通過するγ-ゼイン媒介移入によって植物細胞またはその祖先中に最初に導入された、所望の分子または対象の遺伝子を含むすべての植物および植物細胞は、本発明の範囲内である。有利にも、細胞壁を通過するγ-ゼイン媒介移入によって植物または細胞またはその祖先中に最初に導入された対象の分子または遺伝子を含む植物細胞を、他の、異なる、植物との育種交配において使用し、優位な特徴および表現型を有する第1世代F1ハイブリッド細胞、種子、および/または植物を作製することができる。対象の分子が1つまたは複数の遺伝子を含む実施形態において、遺伝子1つまたは複数は、優性または劣性対立遺伝子とすることができる。例として、遺伝子1つまたは複数は、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌抵抗性のための抵抗性、真菌抵抗性、ウイルス性病害抵抗性、雄性稔性、雄性不稔、強化された栄養価、および工業利用のような形質を付与するであろう。特異的なタンパク質またはRNA産物例えばRNAiをコードする遺伝子の単離および特徴づけを可能にした分子生物学的技法の出現で、植物生物学の分野の科学者は、特異的な様式で細胞の形質を改変するために、外来性遺伝子、または天然もしくは内在性遺伝子の追加もしくは改変バージョンおそらく異なるプロモーターによって駆動されるを含有し発現するように細胞のゲノムを操作することへの強い興味をもつようになった。かかる外来性、追加および/または改変遺伝子は、本明細書で、集団的に導入遺伝子と呼ぶ。この15から20年にわたり、トランスジェニック植物細胞を作製するためのいくつかの方法が開発され、特定の実施形態において、本発明は、細胞の形質転換のバージョン、ならびにγ-ゼイン連結構造体の植物細胞壁および細胞膜を通過する取り込みを通して導入遺伝子を細胞壁を有する植物細胞中に導入することを通して、それらを作製する方法に関する。本発明の実施形態において、導入遺伝子は、発現ベクター中に含有されていてもよい。細胞形質転換は、特定の細胞において機能するであろう構築物をコードする発現ベクターの構築を伴うことができる。かかるベクターは、制御エレメント例えば、プロモーターの調節下にある、または制御エレメントに作動可能に連結している遺伝子を含むDNAを含むことができる。発現ベクターは、1つまたは複数のかかる作動可能に連結している遺伝子/制御エレメント組合せを含有することができる。ベクター1つまたは複数は、プラスミドの形であってよく、導入遺伝子1つまたは複数を細胞壁を含む植物細胞の遺伝子材料中へ組み込むための本明細書で記載したような形質転換方法を使用して、単独または他のプラスミドと組み合わせて使用し、形質転換細胞を作製することができる。γ-ゼインを介した取り込みのための発現ベクター:マーカーまたはレポーター遺伝子発現ベクターは、マーカーを含有する形質転換細胞が、ネガティブ選択すなわち、選択マーカー遺伝子を含有しない細胞の増殖を阻害することによってまたはポジティブ選択すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産物をスクリーニングすることによって回収されることを可能にする、制御エレメント例えば、プロモーターに作動可能に連結している少なくとも1つの遺伝子マーカーを含むことができる。形質転換のための多くの選択マーカー遺伝子は、形質転換技術においてよく知られており、例えば、抗生物質もしくは除草剤、または阻害剤に対して非感受性であることができる改変標的をコードする遺伝子とすることができる、選択的な化学薬品を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子を含む。いくつかのポジティブ選択方法も、当技術分野で知られている。植物形質転換に適した1つの一般的に使用される選択マーカー遺伝子は、植物制御シグナルの調節下にある、カナマイシンに対する抵抗性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼIInptll遺伝子を含むことができる。例えば、FraleyetalProcNatlAcadSciUSA804803を参照されたい。別の一般的に使用される選択マーカー遺伝子は、抗生物質のハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とすることができる。例えば、VandenElzenetalPlantMolBiol5299を参照されたい。抗生物質に対する抵抗性を付与する、細菌起源の追加の選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド-3’-アデニルトランスフェラーゼ、およびブレオマイシン抵抗性決定要因を含む。HayfordetalPlantPhysiol861216、JonesetalMolGenGenet21086、SvabetalPlantMolBiol14197、HilleetalPlantMolBiol7171を参照されたい。他の選択マーカー遺伝子は、グリフォセート、グルホシネートまたはブロモキシニルなどの除草剤に対する抵抗性を付与する。ComaietalNature317741744、GordonKammetalPlantCell2603618およびStalkeretalScience242419423を参照されたい。除草剤に対する耐性を付与する選択マーカーは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPATを含む。植物形質転換に適した他の選択マーカー遺伝子は、細菌起源のものではない。これらの遺伝子は、例えば、マウスジヒドロ葉酸還元酵素、植物5-エノイルピルビニルシキミ酸-3-リン酸シンターゼおよび植物アセト乳酸シンターゼを含む。EichholtzetalSomaticCellMolGenet1367、ShahetalScience233478、CharestetalPlantCellRep8643を参照されたい。植物形質転換に適したマーカー遺伝子の別の群は、抗生物質などの毒性物質に対する抵抗性に関する形質転換細胞の直接的な遺伝子選択よりはむしろ仮定的に形質転換された植物細胞のスクリーニングを必要とする。これらの遺伝子は、特異的な組織における遺伝子の発現の空間パターンを定量化または可視化するために特に有用であり、しばしばレポーター遺伝子と呼ばれる。なぜならそれらは、遺伝子発現の調査のための遺伝子または遺伝子制御配列に融合することができるからである。形質転換細胞をスクリーニングするための一般的に使用される遺伝子は、βグルクロニダーゼGUS、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含む。JeffersonRAPlantMolBiolRep5387、TeerietalEMBOJ8343、KonczetalProcNatlAcadSciUSA84131、DeBlocketalEMBOJ31681を参照されたい。最近、植物組織の破壊を必要としない、GUS活性を可視化するためのinvivoでの方法が利用可能になった。MolecularProbespublication2908ImageneGreenTMp14およびNalewayetalJCellBiol115151a。しかしながら、GUS活性を可視化するためのこれらのinvivoでの方法は、低感受性、高い蛍光バックグラウンド、および選択マーカーとしてのルシフェラーゼ遺伝子の使用に関連する制限のために、形質転換細胞の回収に有用であると判明していない。つい最近になって、FluorescentProteins例えばGFP、EGFP、EBFP、ECFP、およびYFPをコードする遺伝子が、原核細胞および真核細胞における遺伝子発現に関するマーカーとして利用された。ChalfieetalScience263802を参照されたい。蛍光タンパク質および蛍光タンパク質の変異体は、スクリーニング可能なマーカーとして使用することができる。γ-ゼインを介した取り込みのための発現ベクター:プロモーター発現ベクターに含まれる遺伝子は、制御エレメント、例えば、プロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動されなければならない。プロモーターのいくつかの型が、単独またはプロモーターと組み合わせて使用することができる他の制御エレメントのように、形質転換技術において現在よく知られている。本明細書では、プロモーターは、転写の開始から上流であってもよく、RNAポリメラーゼおよび転写を開始するための他のタンパク質の認識および結合に関与することができるDNAの領域への参照を含む。植物プロモーターは、植物細胞において転写を開始する能力があるプロモーターとすることができる。発生調節下にあるプロモーターの例は、葉、根、種子、繊維、木部導管、仮導管、または厚壁組織などのいくつかの組織において、優先的に転写を開始するプロモーターを含む。かかるプロモーターは、組織優先と呼ばれる。いくつかの組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、組織特異的と呼ばれる。細胞型特異的プロモーターは、1つまたは複数の器官におけるいくつかの細胞型、例えば、根または葉における維管束細胞における発現を主に駆動する。誘導性プロモーターは、環境的調節下にあることができるプロモーターとすることができる。誘導性プロモーターによって転写をもたらすことができる環境条件の例は、嫌気性条件または光の存在を含む。組織特異的、組織優先、細胞型特異的および誘導性プロモーターは、非構成的プロモーターの群を構成する。構成的プロモーターは、大部分の環境条件下で活性であることができるプロモーターとすることができる。A.誘導性プロモーター誘導性プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい。任意選択で、誘導性プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。誘導性プロモーターでは、誘導剤に応答して転写の速度が上昇する。任意の誘導性プロモーターを、本発明において使用することができる。WardetalPlantMolBiol22361366を参照されたい。典型的な誘導性プロモーターは、銅に応答する、ACEI系由来のものMettetalPNAS9045674571;ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤に応答する、トウモロコシ由来のIn2遺伝子HersheyetalMolGenGenetics227229237およびGatzetalMolGenGenetics2433238;ならびにTn10由来のTetリプレッサーGatzetalMolGenGenetics227229237を含むがこれらに限定されない。特に有用な誘導性プロモーターは、植物が通常は応答しない誘導剤に応答するプロモーターとすることができる。典型的な誘導性プロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーターとすることができ、その転写活性は、糖質コルチコイドホルモンによって誘導することができる。SchenaetalProcNatlAcadSciUSA880421。B.構成的プロモーター構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよいか、または構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。異なる構成的プロモーターを、本発明において利用することができる。典型的な構成的プロモーターは、CaMV由来の35SプロモーターOdelletalNature313810812およびキャッサバ葉脈モザイクウイルスCsVMVプロモーター例えば、米国特許第7,053,205号および第6,664,384号を参照されたいなどの、植物ウイルス由来のプロモーター;イネアクチン遺伝子由来のプロモーターMcElroyetalPlantCell2163171;ユビキチンChristensenetalPlantMolBiol12619632およびChristensenetalPlantMolBiol18675689;pEMULastetalTheorApplGenet81581588;MASVeltenetalEMBOJ327232730;およびトウモロコシH3ヒストンLepetitetalMolGenGenetics231276285およびAtanassovaetalPlantJournal2291300を含むがこれらに限定されない。セイヨウアブラナBrassicanapusALS3構造遺伝子の5’側にあるXbal/NcoI断片または該Xbal/NcoI断片に類似したヌクレオチド配列であるALSプロモーターは、特に有用な構成的プロモーターを代表する。PCT出願WO96/30530を参照されたい。C.組織特異的または組織優先プロモーター組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい。任意選択で、組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。組織特異的プロモーターに作動可能に連結している対象の遺伝子で形質転換した植物は、排他的、または優先的に、特異的な組織において、導入遺伝子のタンパク質産物を産生することができる。任意の組織特異的または組織優先プロモーターを、本発明において利用することができる。典型的な組織特異的または組織優先プロモーターは、ファゼオリン遺伝子由来のものなどの根に好ましいプロモーターMuraietalScience23476482およびSenguptaGopalanetalProcNatlAcadSciUSA8233203324;cabまたはリブロース1,5-二リン酸カルボキシラーゼ由来のものなどの葉特異的および光誘導プロモーターSimpsonetalEMBOJ427232729およびTimkoetalNature318579582;LAT52由来のものなどの葯特異的プロモーターTwelletalMolGenGenetics217240245;Zml3由来のものなどの花粉特異的プロモーターGuerreroetalMolGenGenetics244161168またはapg由来のものなどの小胞子に好ましいプロモーターTwelletalSexPlantReprod6217224を含むがこれらに限定されない。導入遺伝子によって産生されたタンパク質の、葉緑体、液胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁またはミトコンドリアなどの細胞内区画への輸送またはアポプラスト中への分泌のための輸送は、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を、対象のタンパク質をコードする遺伝子の5’および/または3’領域に作動可能に連結することによって達成することができる。構造遺伝子の5’および/または3’末端にある標的配列は、タンパク質合成およびプロセシングの間、コードされたタンパク質が最終的にどこに区画化されることができるかを決定することができる。代わりに、かかる細胞内区画標的タンパク質は、対象の分子を所望の細胞内区画に向けるために、γ-ゼインに直接的に連結していてもよい。シグナル配列の存在は、ポリペプチドを細胞内オルガネラもしくは細胞内区画に、またはアポプラストへの分泌に向ける。多くのシグナル配列は、当技術分野で知られている。例えば、BeckeretalPlantMolBiol2049、ClosePSMastersThesisIowaStateUniversity、KnoxCetalStructureandOrganizationofTwoDivergentAlphaAmylaseGenesfromBarleyPlantMolBiol9317、LerneretalPlantPhysiol91124129、FontesetalPlantCell3483496、MatsuokaetalProcNatlAcadSci88834、GouldetalJCellBiol1081657、CreissenetalPlantJ2129、KalderonetalAshortaminoacidsequenceabletospecifynuclearlocationCell39499509、SteifeletalExpressionofamaizecellwallhydroxyprolinerichglycoproteingeneinearlyleafandrootvasculardifferentiationPlantCell2785793を参照されたい。外来性タンパク質遺伝子および農学的遺伝子本発明によるトランスジェニック植物では、外来性タンパク質を、商業的量で産生することができる。したがって、当技術分野でよく理解されている、形質転換植物の選択および繁殖のための技法により、多数のトランスジェニック植物をもたらし、それらを従来の様式で回収し、次いで、外来性タンパク質を、対象の組織からまたは総バイオマスから抽出することができる。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、HeneyandOrrAnalBiochem114926によって考察されている、既知の方法によって達成することができる。本発明の態様において、外来性タンパク質の商業的産生のために提供されるトランスジェニック植物は、細胞または植物とすることができる。他の態様において、対象のバイオマスは、種子とすることができる。より高い発現レベルを示す、比較的少数のトランスジェニック植物に関して、主に従来のRFLP、PCRおよびSSR分析を通して、組み込まれたDNA分子の近似の染色体位置を同定する遺伝子地図を作製することができる。これに関する典型的な方法について、GlickandThompsonMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnologyCRCPressBocaRaton269284を参照されたい。染色体位置に関する地図情報は、対象のトランスジェニック植物の専売保護に有用であってよい。権限のない繁殖を企てることができ、他の生殖質との交配が行われた場合、組み込み領域の地図を、疑わしい植物に関する類似の地図と比較し、後者が対象の植物と共通の起源を有するかどうか決定することができる。地図の比較は、すべて従来の技法である、ハイブリダイゼーション、RFLP、PCR、SSRおよび配列決定を伴うであろう。同様に、農学的遺伝子は、形質転換細胞またはそれらの子孫において発現させることができる。より詳細には、植物を、本発明の方法を通して遺伝的に操作し、農学的に興味のある様々な表現型を発現させることができる。この点に関して使用することができる典型的な遺伝子は、以下に分類したものを含むがこれらに限定されない。1.有害生物または病害に対する抵抗性を付与し、以下のものをコードする遺伝子:A植物病害抵抗性遺伝子。植物防御は、植物における病害抵抗性遺伝子Rの産物と病原体における対応する非病原性Avr遺伝子の産物との間の特異的な相互作用によってしばしば活性化される。植物変種を、クローン化された抵抗性遺伝子で形質転換し、特異的な病原体株に対する抵抗性がある植物を遺伝子工学で作ることができる。例えば、JonesetalScience266789クラドスポリウムフルブムCladosporiumfulvumに対する抵抗性に関するトマトCf-9遺伝子のクローニング;MartinetalScience2621432プロテインキナーゼをコードするトマト斑葉細菌病菌Pseudomonassyringaepvtomatoに対する抵抗性のためのトマトPto遺伝子;MindrinosetalCell781089シュードモナスシリンゲPseudomonassyringaeに対する抵抗性のためのシロイヌナズナRSP2遺伝子を参照されたい。Bダイズシストセンチュウsoybeancystnematodeなどの有害生物に対する抵抗性を付与する遺伝子。例えば、PCT出願WO96/30517;PCT出願WO93/19181を参照されたい。CバチルスチューリンゲンシスBacillusthuringiensisタンパク質、その誘導体またはそれをモデルとして作られた合成ポリペプチド。例えば、Btδ内毒素遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列を開示している、GeiseretalGene48109を参照されたい。さらに、δ内毒素遺伝子をコードするDNA分子は、例えば、ATCC受託番号40098、67136、31995および31998の下で、AmericanTypeCulturCollection,Manassas,Va.から購入することができる。Dレクチン。例えば、いくつかのクリビアミニアタCliviaminiataマンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を開示している、VanDammeetalPlantMolecBiol2425による開示を参照されたい。Eアビジンなどの、ビタミン結合タンパク質。PCT出願US93/06487を参照されたい。その出願は、害虫に対する幼虫駆除剤としてのアビジンおよびアビジン相同体の使用を教示している。F酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼもしくはプロテイナーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。例えば、AbeetalJBiolChem26216793イネシステインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列、HuubetalPlantMolecBiol21985タバコプロテイナーゼ阻害剤IをコードするcDNAのヌクレオチド配列、SumitanietalBiosciBiotechBiochem571243ストレプトマイセスニトロスポレウスStreptomycesnitrosporeusアルファ-アミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列および米国特許第5,494,813号HepherandAtkinson,1996年2月27日に発行されたを参照されたい。Gエクジステロイドもしくは幼若ホルモンなどの昆虫特異的ホルモンもしくはフェロモン、それらの変異体、それに基づく模倣体、またはそれらのアンタゴニストもしくはアゴニスト。例えば、HammocketalNature344458による、幼若ホルモンの失活剤、クローン化された幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現の開示を参照されたい。H発現するとすぐに、影響される有害生物の生理機能を乱す、昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド。例えば、ReganJBiolChem2699発現クローニングは、昆虫利尿ホルモン受容体をコードするDNAをもたらすおよびPrattetalBiochemBiophysResComm1631243アロスタチンallostatinは、ジプロプテラプンタータDiplopterapuntataにおいて同定することができるの開示を参照されたい。昆虫特異的、麻痺性神経毒をコードする遺伝子を開示している、Tomalskietal.への米国特許第5,266,317号も参照されたい。Iヘビ、スズメバチ、または任意の他の生物によって天然において産生される昆虫特異的毒液。例えば、サソリ昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種発現の開示に関して、PangetalGene116165を参照されたい。Jモノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積を司る酵素。K翻訳後修飾を含めた、生物学的に活性のある分子の修飾に関与する酵素:例えば、天然であろうと合成であろうと、糖分解酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。callase遺伝子のヌクレオチド配列を開示している、Scottetal.の名前でのPCT出願WO93/02197を参照されたい。キチナーゼコード配列を含有するDNA分子は、例えば、受託番号39637および67152の下で、ATCCから得ることができる。タバコスズメガのキチナーゼをコードするcDNAのヌクレオチド配列を教示している、KrameretalInsectBiochemMolecBiol23691、およびパセリubi4-2ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列を提供している、KawallecketalPlantMolecBiol21673も参照されたい。Lシグナル伝達を刺激する分子。例えば、BotellaetalPlantMolecBiol24757による、リョクトウのカルモジュリンcDNAクローンに関するヌクレオチド配列の開示、およびトウモロコシのカルモジュリンcDNAクローンのヌクレオチド配列を提供している、GriessetalPlantPhysiol1041467を参照されたい。M疎水性モーメントペプチドmomentpeptide。PCT出願WO95/16776真菌植物病原体を阻害するTachyplesinのペプチド誘導体の開示およびPCT出願WO95/18855病害抵抗性を付与する合成抗菌性ペプチドを教示しているを参照されたい。N膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断薬。例えば、JaynesetalPlantSci8943の、遺伝子導入タバコ植物をシュードモナスソラナセアラムPseudomonassolanacearumに対して抵抗性にするための、セクロピン-β溶解ペプチド類似体の異種発現の開示を参照されたい。Oウイルス侵入型タンパク質またはそこ由来の複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、コートタンパク質遺伝子が由来してもよいウイルスによって、および関連するウイルスによってもたらされる、ウイルス感染および/または病害の発症に対する抵抗性を与える。BeachyetalAnnrevPhytopathol28451を参照されたい。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイルスX、ジャガイモウイルスY、タバコエッチ病ウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対するコートタンパク質媒介抵抗性は、形質転換植物に付与されてきた。同文献。P昆虫特異的抗体またはそこ由来の免疫毒素。したがって、昆虫の腸における重大な代謝機能を標的とする抗体は、影響される酵素を失活させ、昆虫を殺すであろう。TayloretalAbstract497SeventhIntlSymposiumonMolecularPlantMicrobeInteractions単鎖抗体断片の作製を通しての遺伝子導入タバコにおける酵素失活を参照されたい。Qウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、ウイルス攻撃から保護されることを示す、TavladorakietalNature366469を参照されたい。R病原体または寄生虫によって天然に産生される、発育停止タンパク質。例えば、真菌エンドα-l,4-D-ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ-α-l,4-D-ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌のコロニー形成および植物栄養分放出を促進する。LambetalBioTechnology101436を参照されたい。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特徴づけは、ToubartetalPlantJ2367によって報告され得る。S植物によって天然に産生される、発育停止タンパク質。例えば、LogemannetalBioTechnology10305は、オオムギリボソーム失活遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、真菌病害に対する抵抗性の増加を有することを示した。2.以下の除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子:Aイミダゾリノンまたはスルホニル尿素などの、成長点または分裂組織を阻害する除草剤。このカテゴリーの典型的な遺伝子は、例えば、それぞれ、LeeetalEMBOJ71241、MikietalTheorApplGenet80449によって報告されているような、変異ALSおよびAHAS酵素をコードする。Bグリフォセート例えば、それぞれ、変異5-エノイルピルビニルシキミ酸-3-リン酸シンターゼEPSP遺伝子組換え核酸の導入および/または天然のEPSP遺伝子のinvivoでの突然変異誘発の様々な形を通して、aroA遺伝子およびグリフォセートアセチルトランスフェラーゼGAT遺伝子によって付与される抵抗性、グルホシネートストレプトマイセスハイグロスコピカスStreptomyceshygroscopicusおよびストレプトマイセスビリジクロモゲネスStreptomycesviridichromogenesを含めた、ストレプトマイセス属Streptomyces種由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPAT遺伝子などの他のホスホノ化合物、ならびにピリジノキシpyridinoxyまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサノンACCase阻害剤コード遺伝子。例えば、植物にグリフォセート抵抗性を付与することができる、EPSPの形のヌクレオチド配列を開示している、Shahetal.への米国特許第4,940,835号、およびBarryetalへの米国特許第6,248,876号を参照されたい。変異aroA遺伝子をコードするDNA分子は、ATCC受託番号39256の下で得ることができ、変異遺伝子のヌクレオチド配列は、Comaiへの米国特許第4,769,061号において開示され得る。Kumadaetal.への欧州特許出願第0333033号、およびGoodmanetal.への米国特許第4,975,374号は、L-ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与する、グルタミン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。PAT遺伝子のヌクレオチド配列は、Leemansetal.への欧州出願第0242246号において提供されることができ、DeGreefetalBioTechnology761は、PAT活性をコードするキメラbar遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作製を報告している。セトキシジムおよびハロキシホップなどの、フェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサノンに対する抵抗性を付与する典型的な遺伝子は、MarshalletalTheorApplGenet83435によって報告されているAcc1-S1、Acc1-S2およびAcc1-S3遺伝子を含む。グリフォセート抵抗性を付与する能力があるGAT遺伝子は、Castleetal.へのWO2005012515において報告されている。2,4-D,フェノキシプロピオン酸およびピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子は、DowAgroSciencesLLCに付与されたWO2005107437において報告されている。CトリアジンpsbAおよびgs遺伝子またはベンゾニトリルニトリラーゼ遺伝子などの、光合成を阻害する除草剤。PrzibilaetalPlantCell3169は、変異psbA遺伝子をコードするプラスミドを用いたクラミドモナスの形質転換を報告している。ニトリラーゼ遺伝子に関するヌクレオチド配列は、Stalkerへの米国特許第4,810,648号において開示されており、これらの遺伝子を含有するDNA分子は、ATCC受託番号53435、67441、および67442の下で入手可能である。グルタチオンS-トランスフェラーゼをコードするDNAのクローニングおよび発現は、HayesetalBiochemJ285173によって報告され得る。3.以下のものなどの、価値が追加された形質を付与するまたはこれに寄与する遺伝子:A例えば、植物をステアリル-ACPデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子で形質転換し、その植物のステアリン酸含量を増加させることによる、修飾脂肪酸代謝。KnultzonetalProcNatlAcadSciUSA892624を参照されたい。B減少したフィチン酸含量1フィターゼコード遺伝子の導入は、フィチン酸の分解を強化し、形質転換植物に遊離のリン酸をさらに追加するであろう。クロコウジカビAspergillusnigerフィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示に関して、例えば、VanHartingsveldtetalGene12787を参照されたい。2遺伝子は、減少したフィチン酸含量を達成するために導入することができよう。例えばトウモロコシにおいて、これを、フィチン酸の低いレベルによって特徴付けられるトウモロコシ変異体を司ることができる、単一の対立遺伝子と関連するDNAをクローニングし、次いでこれを再導入することによって、達成することができよう。RaboyetalMaydica35383を参照されたい。C例えば、植物を、デンプンの分枝パターンを修飾する酵素をコードする遺伝子で形質転換することによってもたらされる、修飾炭水化物組成物。ShirozaetalJBacteol170810連鎖球菌変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列、SteinmetzetalMolGenGenet20220レバンスクラーゼ遺伝子とすることができる、枯草菌Bacillussubtilisのヌクレオチド配列、PenetalBioTechnology10292αアミラーゼとすることができる、バチルスリケニフォンBacilluslichenifonnを発現するトランスジェニック植物の作製、ElliotetalPlantMolecBiol21515トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列、SogaardetalJBiolChem26822480オオムギαアミラーゼ遺伝子のものとすることができる、部位特異的突然変異誘発、およびFisheretalPlantPhysiol1021045トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素IIを参照されたい。本発明の特定の実施形態において、γ-ゼインは、ナノ粒子に融合していてもよい。ナノ粒子の表面は、官能化していてもよく、これは、例えば、標的とされる取り込みを可能にすることができるかまたはナノ粒子の表面へ他の物質が可逆的または不可逆的に結合することを可能にすることができる。非限定的な例として、ナノ粒子例えば、金ナノ粒子または量子ドットの表面は、例えば、さらに官能化または誘導体化することができる、アルカンチオラートの自己組織化単層で官能化していてもよい。別の非限定的な例において、ナノ粒子の表面は、それら自体がさらに官能化または誘導体化していてもよい、リンカーで誘導体化していてもよい。一実施形態において、ナノ粒子は、ペグ化していてもよい。他の実施形態において、ナノ粒子は、コア活性または不活性、立体コート活性または不活性、切断可能な結合、および/または標的分子もしくはリガンドの1つまたは複数を含むことができるか、またはこれらの1つまたは複数で多官能化していてもよい。ナノ粒子は、金ナノ粒子、金で被覆されたナノ粒子、多孔質ナノ粒子、メソポーラスナノ粒子、シリカナノ粒子、ポリマーナノ粒子、タングステンナノ粒子、ゼラチンナノ粒子、ナノシェル、ナノコア、ナノ球体、ナノロッド、磁性ナノ粒子、およびそれらの組合せから選択することができる。同様に、本発明の特定の実施形態において、γ-ゼインは、量子ドットに融合していてもよい。本発明の態様において、γ-ゼインおよびナノ粒子を、細胞の様々な部分中に取り込むことができる。ナノ粒子を取り込むことができる位置の例は、サイトゾル、核、トノプラスト、色素体、エチオプラスト、有色体、白色体、エライオプラスト、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔を含むがこれらに限定されない。本発明の他の実施形態において、細胞壁を含む細胞中へのナノ粒子の取り込みは、シンプラストまたはアポプラスト経路経由で起こることができる。本発明の他の態様において、γ-ゼインおよび量子ドットを、前述の細胞の様々な部分中に取り込むことができる。本発明を、例示のために提供し、いかなる様式においても本発明を限定することを意図しない、以下の実施例においてさらに記載する。γ-ゼイン/YFP融合タンパク質の構築γ-ゼインタンパク質の改変トウモロコシZeamaysN末端領域をコードするDNA配列GenBankAccessionAAL16977.1,GI:16305109を、PhiladiumYellowFluorescenceProteinYFPEvrogen,Moscow,RussiaのN末端に融合した。6つのアミノ酸のγ-ゼインモチーフを改変した。ここで、第2の残基を、ヒスチジンからアルギニンに変えた。この改変を、融合配列を核に向けるために行った。アルギニンは、細胞のサイトゾルおよび核中へのタンパク質移行の効率を改善することが示されたMitchelletalTheJournalofPeptideResearch56318325。γ-ゼインのN末端領域の改変された6つのアミノ酸VRLPPPの三量体を、YFPに融合した。さらに、6x-Hisタグを、γ-ゼイン三量体とYFPコード配列との間に配置した。6x-Hisモチーフを追加し、タンパク質精製を促進した。この融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号1として提示する。融合遺伝子配列配列番号2は、自動DNAシンセサイザーを通してホスホラミダイトの化学的性質を使用して化学的に合成した。この配列の化学的合成は、DNA2.0MenloPark,CAに委託した。配列は、大腸菌Escherichiacoli最適化ヌクレオチド配列を作製するためのDNA2.0専売アルゴリズムを使用して、大腸菌Escherichiacoli中での発現のために最適化されたコドンであった。アルゴリズムは、所望の宿主生物内で使用頻度が低いコドンを同定し、これらのコドンを使用頻度がより高いコドンで置換する。加えて、アルゴリズムは、cis-制御配列例えばリボヌクレアーゼ部位、RNA二次構造、転写終結部位および過剰な制限酵素を除去する。追加の配列を、γ-ゼイン/YFP融合遺伝子の末端に追加し、クローニングおよび発現を促進した。Shine-Dalgarno配列ShineJDalgarnoLNature254348およびユニークなSpeI制限酵素部位を遺伝子配列の5’末端に加えた。ユニークなXhoI制限酵素部位を、遺伝子配列の3’末端に加えた。得られたベクターを、pJ201:18056図1と名付けた。1.1pET発現ベクターの構築γ-ゼイン/YFP融合配列を、標準的なクローニング技法を通して、大腸菌Escherichiacoli発現ベクターpET280中にクローニングした。pET280は、pET28プラスミドNovagen,Gibbstown,NJの改変バージョンである。複数のクローニング部位およびリボソーム結合部位を、pET28から除去し、それによってpET280を作った。γ-ゼイン/YFPコード配列を含有するSpeI-XhoI断片を、pJ201:18056ベクターから切り出し、pET280発現ベクターの対応する制限部位中に連結した。得られたプラスミドは、制限酵素消化および配列決定を通して確認した。プラスミドは、BL21DE3大腸菌Escherichiacoliコンピテント細胞Invitrogen,Carlsbad,CAに形質転換した。単一のコロニーを単離し、さらなる使用までグリセロールストックとして保管した。1.2γ-ゼイン/YFP融合タンパク質の発現および単離γ-ゼイン/YFP融合タンパク質を、以下の条件を使用して誘発した:25°Cで、2リットルLのLuria-Bertaniブロスおよび50μg/mlのカナマイシン中で、0.6のO.D.600まで増殖したpET280/γ-ゼイン/YFP発現構築物を含有する培養物。所望のO.D.600に到達した後、培養物を、0.1mMのIPTGイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを用いて、25°Cで16時間、誘発した。発現したγ-ゼイン/YFP融合タンパク質を、単離し、精製した。2Lの細胞培養物を、24,000×gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。5gのγ-ゼイン/YFP含有細胞ペーストを、100mlの冷抽出溶液PBS中の0.5MのNaCl、5グリセロール、および0.5mlのSigmaProteaseInhibitorカクテルcatP8849に再懸濁した。細胞を、超音波処理BransonSonifierModel450を使用して、氷上で15分間破壊した。試料を、24,000×gで、4°Cで20分間遠心分離し、上清を、0.45μmMillipore登録商標濾過デバイスを通して濾過した。イミダゾールを、10mMの最終濃度まで試料に加えた。γ-ゼイン/YFP含有ライセートを、Akt商標Explorer100システムGE’Pharmaciaを使用して、5ml/minで、タンデム型の2×5mlのHisTrap商標カラムGE/Pharmacia,cat17-5248-02上に導入した。カラムを、緩衝液APBS中の0.5MのNaCl、10mMのイミダゾールで、A280の吸光度がベースラインに到達するまで洗浄した。次いで、カラムを、約4×カラム体積CVの体積で、10および20の緩衝液B緩衝液A中の0.2Mのイミダゾールで順次洗浄した。試料を、10~15CVにわたって、20~100の緩衝液Bで溶出し、4mlの画分を回収した図2。1.3SDS-PAGE分析タンパク質ゲルを移動させ、分画したタンパク質を可視化した。10~20μlの各試料を、XCellSureLock商標Mini-CellInvitrogen,catEI0001を使用しての電気泳動のために、プレキャスト10Bis-TrisSDS-PAGEゲルInvitrogen、catNP0302BOX上に導入した。試料を、MES-SDSランニング緩衝液Invitrogen、catNP0002において、200Vで35分間、移動させた。ゲルを、図3において例示するように、クマシーブルーR-250Bio-Rad、cat161-0436で染色した。γ-ゼイン/YFP試料を含有する画分を、プールし、10kDaMWCOを有するMilliporeSpinカラム中に移動し、ベンチトップエッペンドルフ遠心機モデル5810Rを使用して、4,000rpm、4°Cで20分間、遠心分離した。遠心分離後、緩衝液交換のために、無菌のPBS溶液を最大15mlまで追加した。このスピンおよびダイアフィルトレーションプロセスは、3回繰り返した。プールしたγ-ゼイン/YFP試料を、10kDaMWCOを有するSnakeSkin商標ひだ状の透析管ThermoScientific、cat68100中に移動し、2LのPBSに対して4°Cで終夜透析し、イミダゾール残基を除去した。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンBSA標準を用いたBradfordアッセイBio-Rad、cat500-0006を使用して、決定した図3。1.4Maldi-TPFペプチドマスフィンガープリンティングSDS-PAGEゲル約1μgからの1μgのタンパク質バンドを切り出し、Speed-Vacにおける12.5mMの炭酸水素アンモニウムを有する25アセトニトリルにおいて乾燥させた。タンパク質を、終夜のインキュベーション中、トリプシン12.5ng/μlによって、37°Cで消化した。ペプチドを、製造業者の指示に従って、C18ZipTipMillipore、cat2TC18S096を使用して精製した。質量スペクトル解析を、VoyagerBiospectrometryPerSeptiveBiosystems,モデルDESTRを使用して行い、陽イオン反射モードpositiveionreflectormodeにおいて質量スペクトルを収集した図4。データを、解析プログラムPAWSProteometricsInc.に入力し、ペプチド同一性を探索した。単細胞植物材料の調製2.1JTNT1細胞JTNT1細胞は、タバコから単離される光独立栄養細胞である。形質転換の3から4日前に、2mlのJTN1細胞を、250mlフラスコ中の50nMのDAS-PMTI-1微小管阻害剤および0.5~0.1v/vDMSOを含有する40mlのNT1BまたはLSBY2培地中に移動することによって、懸濁培養物を新鮮培地に継代した。単細胞を、微小管阻害剤の処理の4日後または7日後に回収した例えば、WO2008/083233において報告されているように。細胞を、最少培地および5二酸化炭素中で維持した。細胞を、14日に1回、O.D.6003.0にある1mlの懸濁液を移動することによって継代した。これらの細胞型を、γ-ゼイン/YFP融合ペプチドの送達および局在性のための標的細胞として使用した。2.2ニンジン細胞再生可能なニンジン凍結保存株D2-40-018を、解凍し、Linsmeier-SkoogLS培地NagataTNemotoYandHasezawaSIntRevCyto132130において報告されている中で培養した。培地用の塩を、PhytoTechnologyLaboratories,CatalogL689から購入した。活発に増殖している懸濁株を、一週間以内に樹立し、維持株を、2mlのPCVパック細胞容積を、散光下、125rpm、7日培養サイクルで、オービタルシェーカーInnova-3300上の28°Cで58mlのLSBY2懸濁20培地に移動することによって継代した。単細胞作製のために、定常期にあるニンジン懸濁液の1mlのPCVを、1mMのコルヒチンを有する30mlのLS懸濁培地Sigma,CatalogC3915中に追加し、7日間培養した。単細胞を、3~7日間の培養物から作製し、形質転換実験の準備が整った。ニンジンの単細胞は、14日で60mlの新鮮なLSBY2液体培地を加えることによって培養物を希釈することによって、定常期で最大28日維持できるであろう。細胞のγ-ゼイン/YFP融合タンパク質処理細胞を、15μgのHoechstで、37°Cで10分間、前もって染色した。インキュベーション期間後、過度の染料を除去した。細胞を、4000rpmで5分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を、3スクロースを含有するPBSの1mlの溶液で、3回洗浄した。γ-ゼイン/YFP融合タンパク質を、50μMの濃度で、エッペンドルフ管内の1mlのニンジン単細胞またはJTNT1細胞に追加した。管を、100rpm、25°Cで、60分間、振盪機上に配置した。植物細胞内でのγ-ゼイン/YFP融合タンパク質蓄積100μlの融合タンパク質/細胞混合物のアリコートを、イメージングのために、10分、30分、および60分で取り出した。細胞を、5,000rpmで5分間遠心分離し、PBSで3回洗浄した。最後に、細胞を100μlのPBSに再懸濁した。融合ペプチドが、植物細胞の細胞内区画および組織中に内部移行および局在化する効率をモニターした。細胞は、LSM-Leica商標TCSSP2/UVまたはZeiss商標LSM上でイメージングした。高開口数1.2~1.3水浸型対物レンズ63×およびYFPを励起させるためのアルゴンイオン由来の488nmまたは514nmのレーザーラインを使用した。それぞれ、430~480nmおよびLP560nmフィルターを有する、405nmおよび488nmのレーザーを使用して、共焦点およびDifferentialInterferenceContrastDICイメージを捕らえた。γ-ゼイン黄色蛍光シグナルは、10分後、ニンジンおよびJTNT1単細胞の両方の核小体および細胞質に局在化していることが示された図5に例示。植物における、ペプチドおよびプラスミドDNAを用いた花の浸漬による、シロイヌナズナの形質転換精製したγ-ゼインペプチドを、図6において例示するプラスミドDNApDAB3831と混合した。0.25mgのγ-ゼインペプチドを、.5mgのプラスミドDNAに加え、水中で30分間インキュベートし、ペプチド/DNA複合体を形成した。pDAB3831は、シロイヌナズナUbiquitin10PromoterAtUbil0によって駆動される、PAT選択マーカー遺伝子およびCassavaVeinMosaicVirusPromoterCsVMVによって駆動される、PhiladiumYellowFluorescenceProtein遺伝子PhiYFPを含有する。γ-ゼインペプチド/pDAB3831複合体およびpDAB3831プラスミドDNAのみの別々の対照実験を、シロイヌナズナArabidopsisthatianacvColumbiaの4週齢の花芽に行った。20mLのペプチド/DNA複合体および20mlのDNA対照を、ガラストロフ中の湿潤培地5スクロースおよび0.04Silwet-77で、30秒間混合した。ペプチド/DNA溶液を含有する湿潤培地を使用し、改変CloughandBentプロトコールCloughSJandBentAF1998PlantJ1673543を使用して、シロイヌナズナ植物を形質転換した。浸漬後、湿潤複合体を4°Cで保管し、その後、2日後に同じプロトコールを使用して、同じ植物を浸漬するために使用した。形質転換ステップを繰り返して行い、形質転換の出現率を増加させた。植物をプラスチックドームによって覆い、湿度を24時間維持した。24時間後、ドームを取り外し、植物を、一定温度22°C下120~150μmol/m2/sの光強度および湿度40~50で、長日条件下16時間明期/8時間暗期で、Conviron登録商標モデルCMP4030およびCMP3244,ControlledEnvironmentsLimited,Winnipeg,Manitoba,Canadaにおいて標準的に成長させ、成熟および種子の産生を可能にした。T0種子を、回収し、滅菌した。さらに、種子を、4°Cで2日間春化処理した。陽性形質転換体を選択するために、種子を、10μg/mlのBASTAを含有するMS培地0.43MurashigeおよびSkoog塩混合物、2.5mMの2-[N-モルフォリノ]エタンスルホン酸、1×Gamborgビタミン溶液、0.9bacto-agar、pH5.7~5.9に播種し、インキュベーター22°C、100μmolquantam-2s-1中で7~10日間成長させた。推定上の形質転換体を同定し、土壌に移動し、成熟まで成長させた。導入遺伝子PATおよびYFPに関する分子解析シロイヌナズナトランスジェニック植物由来のgDNAおよびシロイヌナズナ生態型Columbia野生型対照由来のgDNAを、PlantDNAZOLキットInvitrogenIncを使用して、6週齢植物の葉物質から抽出した。PATおよびYFP遺伝子断片を、トランスジェニック植物のみからPCRで増幅した。50μLのPCR反応混合物は、100ngの鋳型DNA、1×ExTaq反応緩衝液TaKaRaBio、0.2mMのdNTP、各プライマー10pmol、および0.025ユニット/μLExTaqを含有した。YFPプライマーを、配列番号3および配列番号4として示す。PATプライマーを、配列番号5および配列番号6として示す。以下のPCRサイクリング条件を使用した。96°Cで5分間を1サイクル、以下のPCRプログラム:94°Cで15秒;65°Cで30秒;72°Cで1分を31サイクル、最終伸長を72°Cで7分間実施して産物合成を完了した。QIAquick商標ゲル抽出キットQiagenIncを使用して、増幅断片をゲル精製した。PCR断片を、高度なSanger配列決定テクノロジーMWGBiotechnologies,Incを使用し、PAT順方向プライマー配列番号5およびYFP順方向プライマー配列番号3を使用して、配列決定し、配列をSequencher商標ソフトウェアを使用して分析した。タンパク質移行効率の改善のための相同モチーフの同定およびγ-ゼイン配列の突然変異誘発γ-ゼインドメインと相同である追加のモチーフを同定し、細胞内タンパク質移行に関して試験した。これらの配列は、NCBINationalCenterforBiotechnologyInformationなどの現在の公開データベースから同定した。γ-ゼイン配列を、BLASTBasicLocalAlignmentSearchToolAltschuletal,1997アルゴリズムに関するインプットとして使用した。初期設定を使用して、配列を、寄託されたNCBIタンパク質配列に対して比較した。探索は、いくつかの相同なタンパク質配列を返した。同定されたγ-ゼインモチーフを改変して、細胞内タンパク質移行の効率を強化した。VRLPPP配列の様々な残基を、部位特異的突然変異誘発プロトコールを通して変える。改変γ-ゼイン配列を、上述のプロトコールを使用して、タンパク質およびDNAの植物細胞中への送達に使用した。キメラγ-ゼイン配列を使用した、細胞オルガネラのターゲティング追加の実験を行い、キメラγ-ゼイン/細胞オルガネラターゲティングモチーフを通しての細胞オルガネラのペプチドターゲティングを試験する。特定の実施例において、γ-ゼインおよび葉緑体ターゲティング配列を、YFPなどの蛍光タンパク質のN末端に融合した。YFPタンパク質の葉緑体へのターゲティングを、蛍光顕微鏡を通してイメージングする。当技術分野で知られている、様々な他の細胞オルガネラ例えばミトコンドリア、小胞体、核等への追加のターゲティング配列を、γ-ゼイン配列と組み合わせて融合し、特異的な細胞オルガネラを標的とするために使用する。タンパク質またはDNAのどちらかが、同定された細胞オルガネラを標的として送り込まれる。本発明を、いくつかの実施形態において記載してきたが、本発明を、本開示の精神および範囲内で、さらに改変することができる。したがって、本出願は、その一般原則を使用した、本発明の任意の変更形態、使用、または適応を包含することが意図されている。さらに、本出願は、本発明が関係し、添付の特許請求の範囲の制限およびそれらの均等物の範囲に入る、当技術分野で既知または習慣的な実行の範囲内にある、本開示からの逸脱を包含することが意図されている。[配列表]"