"スキャフォールド膜型セリンプロテアーゼ-1MT-SP1ポリペプチド中に少なくとも1個の変異を有する変異型MT-SP1プロテアーゼであって、変異型MT-SP1ポリペプチドの基質特異性又は活性はスキャフォールドMT-SP1ポリペプチドと比較して改変されており、スキャフォールドMT-SP1ポリペプチドは野生型MT-SP1のアミノ酸配列と少なくとも95又は完全に同一であり、ここで、野生型MT-SP1のアミノ酸配列は配列番号1の配列又はその触媒活性部分又はその種変異配列であり、変異型MT-SP1は、アミノ酸位置41、58、59、60b、60c、61、62、63、97、98、100、146、151、169、170、172、173、175、176、177、178、179、181及び224から選択される位置に変異を有し、ここで、位置のナンバリングはキモトリプシンのナンバリングに従う、変異型MT-SP1プロテアーゼ。MT-SP1スキャフォールドポリペプチドは配列番号1の配列からなる、請求項1に記載の変異型MT-SP1プロテアーゼ。MT-SP1スキャフォールドポリペプチドは配列番号2の配列からなる、請求項1に記載の変異型MT-SP1プロテアーゼ。D60bI、D60bF、D60bR、D60bA、R60cI、R60cF、R60cD、R60cA、R60cW、F97N、F97D、F97E、F97A、F97W、F97R、Y146F、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、L172N、L172D、L172E、L172A、L172V、L172F、L172R、Q175D、Q175E、Q175A、Q175V、Q175F、Q175R、K224A、K224F、K224V及びK224Dから選択される変異を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の変異型MT-SP1プロテアーゼ。D60bI、D60bF、D60bR、D60bA、R60cI、R60cF、R60cD、R60cA、R60cW、F97N、F97D、F97E、F97A、F97W、F97R、F99Y、F99W、F99N、F99D、F99E、F99A、F99V、F99R、Y146F、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、L172N、L172D、L172E、L172A、L172V、L172F、L172R、Q175D、Q175E、Q175A、Q175V、Q175F、Q175R、M180E、M180Y、M180R、M180A、Q192A、Q192V、Q192D、Q192R、Q192F、W215F、W215Y、W215I、W215D、W215R、D217A、D217V、D217F、D217E、D217R、K224A、K224F、K224V及びK224Dから選択される変異を含む、請求項4に記載の変異型MT-SP1プロテアーゼ。L172D/Q175D、F99V/L172D、F99V/L172D/Q175D、F99V/K224F、F99V/Y146D、Y146D/K224F、Y146D/L172D/Q175D、F99V/Y146D/L172D/Q175D、F99I/L172D/Q175D、F99L/L172D/Q175D、F99T/L172D/Q175D、F99A/L172D/Q175D、F99I/K224F、F99L/K224F、F99T/K224F、F99V/Y146D/K224F、F99I/Y146D/K224F、F99L/Y146D/K224F及びF99T/Y146D/K224Fから選択される変異を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の変異型MT-SP1プロテアーゼ。野生型膜型セリンプロテアーゼ-1MT-SP1中に変異を有する変異型MT-SP1プロテアーゼであって、野生型MT-SP1のアミノ酸配列は配列番号1若しくは配列番号2の配列又はその触媒活性部分であり、変異は、F99Y、F99W、D217A、D217V、D217F、F99N、F99D、F99E、F99A、F99V、F99R、D217E、D217R、W215F、W215Y、W215I、W215D、W215R、Q192A、Q192V、Q192D、Q192R、Q192F、M180E、M180Y、M180R、M180A及びF99V/M180Eから選択され、ここで、位置のナンバリングはキモトリプシンのナンバリングに従う、変異型MT-SP1プロテアーゼ。血管内皮成長因子VEGF又はVEGF受容体VEGFRを切断する、請求項1~7のいずれか一項に記載の変異型MT-SP1プロテアーゼ。請求項1~8のいずれか一項に記載の変異型MT-SP1プロテアーゼを含む組成物。医薬組成物である、請求項9に記載の組成物。請求項8に記載の変異型MT-SP1プロテアーゼを含む医薬組成物の使用であって、血管内皮成長因子VEGF又はVEGF受容体VEGFRを切断するための使用。請求項8に記載の変異型MT-SP1プロテアーゼを含む医薬組成物であって、血管内皮成長因子VEGF又はVEGF受容体VEGFRを切断するための医薬組成物。VEGF又はVEGFRの切断は血管新生を阻害し又は細胞増殖を抑制する、請求項11又は12に記載の使用又は医薬組成物。VEGF又はVEGFRの切断は腫瘍特異的血管新生を阻害する、請求項11~13のいずれか一項に記載の使用又は医薬組成物。VEGF又はVEGFRの切断は患者の血管新生関連病態の治療をもたらす、請求項11~13のいずれか一項に記載の使用又は医薬組成物。病態が黄斑変性、癌、炎症及び糖尿病から選択される、請求項15に記載の使用又は医薬組成物。変異型MT-SP1は標的VEGFR上のP4-P3-P2-P1の基質認識部位を切断し、P4-P3-P2-P1部位はVEGFR上の4アミノ酸の配列を含む、請求項13~16のいずれか一項に記載の使用又は医薬組成物。変異型MT-SP1は、野生型MT-SP1基質認識部位と比較してVEGFRの基質認識部位に対してより選択的である、請求項17に記載の使用又は医薬組成物。P4-P3-P2-P1の基質認識部位は、RRVR、KVGR、RVRK、RKTK、KTKK及びKTTRから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の使用又は医薬組成物。P4-P3-P2-P1の基質認識部位はRRVRのアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の使用又は医薬組成物。変異型MT-SP1は、L172D、Y146F、N175D、D217F、F99V及びK224Fから選択される変異を含む、請求項13~20のいずれか一項に記載の使用又は医薬組成物。変異型MT-SP1は変異K224F及びF99Vを含む、請求項21に記載の使用又は医薬組成物。VEGFRがVEGF-R2/flk-1/KDRである、請求項13~22のいずれか一項に記載の使用又は医薬組成物。組成物が更に抗癌剤を含む、請求項13~23のいずれか一項に記載の使用又は医薬組成物。[実施例1.十分理解されている開始スキャフォールドに基づいて、改変された基質特異性を有する設計型MT-SP1プロテアーゼをクローニング及び特徴付けする方法]セリンプロテアーゼMT-SP1を、VEGF及びVEGFRの特異的タンパク質分解に対する突然変異誘発用のスキャフォールドプロテアーゼとして選択した、これは部分的には、セリンプロテアーゼMT-SP1が生化学的及び構造技術[Harris,RecentResultsCancerRes.1998;152:341~52]を用いて十分に特徴付けされているためである。MT-SP1は、多数の細胞外タンパク質-タンパク質相互作用ドメインを有する膜結合セリンプロテアーゼである。プロテアーゼドメインは、完全に異なるP1-LysPSSCLを使用してのみプロファイリングされており図4A~4C、塩基性-非塩基性-Ser-Arg又は非塩基性-塩基性-Ser-Arg/Lysの増大した特異性が明らかとなっている。MT-SP1のX線結晶構造によって、P2特異性を示す可能性がある60のループ中の活性及び9個のアミノ酸挿入を制御すると考えられる構成要素が明らかになる。MT-SP1の変異体を作製し、特徴付けしている。以下に記載のように、種々のプロテアーゼ変異体を発現させ精製している。活性及び特異性を確認するための初期活動を実施しており、サンプルの結果は図1~11に示す。[実施例2.MT-SP1の発現及び精製]表11に示すように、変異型MT-SP1ポリペプチド変異体は、ポリペプチド当たり1個の変異を含む可能性があり、或いは任意の組合せで2個以上の変異残基を含む可能性がある。野生型及び変異型MT-SP1を、N末端6ヒスチジンタグ、プロドメイン、及びプロテアーゼドメインを含むpQE細菌発現ベクターQiagenにクローニングし、生成したコンストラクトはBL21大腸菌細胞に形質転換する。細胞は100mLの培養物中で0.6のODまで増殖させ、封入体中のプロテアーゼの発現は、1mMの最終濃度までIPTGを加えることによって誘導する。4~6時間後、細菌は遠心分離によってペレット状にし、ペレットは50mMのトリスpH8、500mMのKCl、及び10グリセロールバッファーAに再懸濁させる。細胞は超音波処理によって溶解させ、6000×gでの遠心分離によってペレット状にする。ペレットは50mMのトリスpH8、6Mの尿素、100mMのNaCl及び1の2-メルカプトエタノールバッファーBに再懸濁させる。膜及びオルガネラは10,000×gでの遠心分離によってペレット状にし、上清はニッケルNTAカラムQiagenを通過させる。カラムは50mMのトリスpH8、6Mの尿素、100mMのNaCl、20mMのイミダゾール、1の2-メルカプトエタノール及び0.01のTween20バッファーDで洗浄する。カラムは、Tween20を含まないバッファーDで再度洗浄する。次いで、プロテアーゼを、50mMのトリスpH8、6Mの尿素、100mMのNaCl、1の2-メルカプトエタノール及び250mMのイミダゾールバッファーEを含むカラムから溶出させる。次いで、プロテアーゼを~1mLの体積に濃縮し、1Lの50mMのトリスpH8、3Mの尿素、100mMのNaCl、1の2-メルカプトエタノール、及び10のグリセロール中、4°Cで一晩透析する。最後に、プロテアーゼを、50mMのトリスpH8、100mMのNaCl、及び10のグリセロール中、4°Cで一晩透析する。最後の透析工程において、プロテアーゼは自己切断によって自己活性化状態になり、6ヒスチジンタグ及びプロドメインが除去される。結果:この細菌発現系を使用して、種々のミリグラム量を得る。プロテアーゼは封入体中で生成され、1カラム精製法によって精製し、更に、連続的な透析工程によってリフォールディングさせる図1。一旦リフォールディングすると、プロドメイン及びプロテアーゼドメインの間の接合部、配列RQAR/VVGGでの切断によって、プロテアーゼは自己活性化する。[実施例3.野生型及び変異型MT-SP1を特徴付けするための、コンビナトリアルライブラリーの合成及びスクリーニング]固定P1アミノ酸法個々のP1置換Fmoc-アミノ酸ACC-樹脂約25mg、0.013mmolを、Multi-Chem96ウエル反応装置のウエルに加えた。樹脂含有ウエルはDMF0.5mLを用いて溶媒化した。20ピペリジンを溶かしたDMF溶液0.5mLを加え、次に30分間攪拌した。反応ブロックのウエルを濾過し、DMF3×0.5mLで洗浄した。無作為のP2位を導入するために、Fmoc-アミノ酸4.8mmol、10当量/ウエル;Fmoc-アミノ酸、mol:Fmoc-Ala-OH、3.4;Fmoc-ArgPbf-OH,6.5;Fmoc-AsnTrt-OH、5.3;Fmoc-AspO-t-Bu-OH、3.5;Fmoc-GluO-t-Bu-OH、3.6;Fmoc-GlnTrt-OH、5.3;Fmoc-Gly-OH、2.9;Fmoc-HisTrt-OH、3.5;Fmoc-Ile-OH、17.4;Fmoc-Leu-OH、4.9;Fmoc-LysBoc-OH、6.2;Fmoc-Nle-OH、3.8;Fmoc-Phe-OH、2.5;Fmoc-Pro-OH、4,3;Fmoc-SerO-t-Bu-OH、2.8;Fmoc-ThrO-t-Bu-OH、4.8;Fmoc-TrpBoc-OH、3.8;Fmoc-TyrO-t-Bu-OH、4.1;Fmoc-Val-OH、11.3の等張性混合物Ostresh,J.M.etal.,1994Biopolymers34:1681~9を、DICI390μL、2.5mmol、及びHOBt340mg、2.5mmolをDMF10mLに溶かしたものを用いて事前に活性化させた。溶液0.5mLを各ウエルに加えた。反応ブロックは3時間攪拌し、濾過し、DMF3×0.5mLで洗浄した。無作為のP3及びP4位を同じ方法で導入した。P4アミノ酸のFmocを除去し、DMF3×0.5mLで樹脂を洗浄し、AcOH150μL、2.5mmolの0.5mLキャッピング溶液、HOBt340mg、2.5mmol及びDICI390μL、2.5mmolをDMF10mLに溶かしたもので処理した。4時間の攪拌後、樹脂をDMF3×0.5mL、CH2Cl23×0.5mLで洗浄し、95:2.5:2.5のTFA/TIS/H2Oの溶液で処理した。1時間のインキュベートの後、反応ブロックを開き、96ディープウエルのタイタープレートに置き、ウエルは他の切断溶液2×0.5mLで洗浄した。回収プレートを濃縮させ、基質含有ウエルはEtOH0.5mLで希釈し、2回濃縮した。個々のウエルの含有物は、CH3CN:H2O混合物から凍結乾燥させた。各ウエル中の基質の合計量は、1種の基質の収率に基づいて0.0063mmol50であると見積もって推定した。P1別種アミノ酸法Fmoc-Clで7-アミノクマリン-4-酢酸を処理することによって、7-アミノクマリン-4-酢酸を調製した。7-アミノクマリン-4-酢酸10.0g、45.6mmolとH2O228mlを混合させた。NaHCO33.92g、45.6mmolを少量加え、次にアセトン228mlを加えた。溶液は氷浴で冷却し、Fmoc-Cl10.7g、41.5mmolを1時間の行程で攪拌しながら加えた。氷浴を除去し、溶液は一晩攪拌した。アセトンは回転蒸発によって除去し、生成したゴム状の固体は濾過によって回収し、ある程度の量のヘキサンで洗浄した。リンクアミドAM樹脂と7-Fmoc-アミノクマリン-4-酢酸の縮合によって、ACC-樹脂を調製した。リンクアミドAM樹脂21g、17mmolはDMF200mlを用いて溶媒化した。混合物は30分間攪拌させ、濾過用カニューレを用いて濾過し、20ピペリジンを溶かしたDMF200mlを加えた。25分間攪拌した後、樹脂を濾過しDMF3回、各々200mlで洗浄した。7-Fmoc-アミノクマリン-4-酢酸15g、34mmol、HOBt4.6g、34mnol、及びDMF150mlを加え、次にジイソプロピルカルボジイミドDICI5.3ml、34mmolを加えた。混合物は一晩攪拌し、濾過し、洗浄しDMF、3回、200ml;テトラヒドロフラン、3回、200ml;MeOH、3回、200ml、P2O5で乾燥させた。Fmoc分析により測定して、樹脂の置換レベルは0.58mmol/g>95であった。P1別種ライブラリー合成:個々のP1置換Fmoc-アミノ酸ACC-樹脂~25mg、0.013mmolを、MultiChem96ウエル反応装置のウエルに加えた。樹脂含有ウエルはDMF0.5mLを用いて溶媒化した。濾過後、20ピペリジンを溶かしたDMF溶液0.5mLを加え、次に30分間攪拌した。反応ブロックのウエルを濾過し、DMFで洗浄した0.5mLで3回。無作為のP2位を導入するために、Fmoc-アミノ酸[4.8mmol、10当量/ウエル;Fmoc-アミノ酸、mol:Fmoc-Ala-OH、3.4;Fmoc-ArgPbf-OH,6.5;Fmoc-AsnTrt-OH、5.3;Fmoc-AspO-t-Bu-OH、3.5;Fmoc-GluO-t-Bu-OH、3.6;Fmoc-GlnTrt-OH、5.3;Fmoc-Gly-OH、2.9;Fmoc-HisTrt-OH、3.5;Fmoc-Ile-OH、17.4;Fmoc-Leu-OH、4.9;Fmoc-LysBoc-OH、6.2;Fmoc-Nle-OH、3.8;Fmoc-Phe-OH、2.5;Fmoc-Pro-OH、4,3;Fmoc-SerO-t-Bu-OH、2.8;Fmoc-ThrO-t-Bu-OH、4.8;Fmoc-TrpBoc-OH、3.8;Fmoc-TyrO-t-Bu-OH、4.1;Fmoc-Val-OH、11.3]の等張性混合物を、DICI390μL、2.5mmol、及びHOBt340mg、2.5mmolをDMF10mlに溶かしたものを用いて事前に活性化させた。溶液0.5mlを各ウエルに加えた。反応ブロックは3時間攪拌し、濾過し、DMFで洗浄した0.5mlで3回。無作為のP3及びP4位を同じ方法で導入した。P4アミノ酸のFmocを除去し、DMFで樹脂を洗浄し3×0.5mL、AcOH150μL、2.5mmolの0.5mLキャッピング溶液、HOBt340mg、2.5mmol、及びDICI390μL、2.5mmolをDMF10mlに溶かしたもので処理した。4時間の攪拌後、樹脂をDMF0.5mlで3回、CH2Cl20.5mlで3回で洗浄し、95:2.5:2.5のTFA/TIS/H2Oの溶液で処理した。1時間のインキュベートの後、反応ブロックを開き、96ディープウエルのタイタープレートに置き、ウエルは他の切断溶液で洗浄した0.5mlで2回。回収プレートを濃縮させ、基質含有ウエル中の物質はEtOH0.5mlで希釈し、2回濃縮した。個々のウエルの含有物は、CH3CN/H2O混合物から凍結乾燥させた。各ウエル中の基質の合計量は、1種の基質の収率に基づいて0.0063mmol50であると見積もって推定した。両方のライブラリーを使用するスクリーニング法:ミリグラム量のP1置換ACC樹脂は、記載する方法によって合成することができる。Fmoc-アミノ酸置換ACC樹脂は96ウエルの反応ブロックの57ウエル中に置き:サブライブラリーは19アミノ酸の第2の固定位置P4、P3、P2によって示したシステインは削除し、ノルロイシンはメチオニンで置換した。基質の合成、キャッピング、及び切断は、P2、P3及びP4サブライブラリーに関するもの以外、前項に記載のものと同じであり、等張性混合物ではなく、個々のアミノ酸5当量のFmoc-アミノ酸モノマー、5当量のDICI、及び5当量のHOBtをDMFに溶かしたものを、空間的に示すP2、P3又はP4位に導入した。完全別種及びP1固定コンビナトリアルライブラリーの調製は、前述したのと同様に行った。ライブラリーは250μMの最終濃度まで96ウエルプレート中に等分した。変異型プロテアーゼは、50nM~1μMの濃度にMTSP活性バッファー50mMのNaHepes、pH8.0、100mMのNaCl、0.01のTween-20中に希釈した。Ac-QGR-AMCに対する初期活性を使用して、50nMの野生型ラットMT-SP1とほぼ等しい濃度に変異型プロテアーゼの濃度を調節した。P1-Argライブラリーにおける酵素活性を、Spectra-MaxDelta蛍光光度計MolecularDevicesにおいて30°Cで1時間アッセイした。励起及び発光を、それぞれ380nm及び460nmにおいて測定した。ライブラリーの合成及び蛍光性スクリーニングP1別種ライブラリー:Ai.合成:前に示したのと同様のP1別種ライブラリーを合成した。種々のMT-SP1変異体の特異性を、野生型MT-SP1と比較して特徴付けた。Aii.ライブラリーの酵素アッセイ:タンパク質分解酵素の濃度を、280nmにおいて測定した吸光度によって決定したGill,S.C.etat.1989AnalBiochem182:319~26。触媒活性を有するトロンビン、プラスミン、トリプシン、uPA、tPA、及びキモトリプシンの割合を、MUGB又はMUTMACを用いた活性部位の滴定により定量化したJameson,G.W.etal.1973BiochemicalJournal131:107~117。PSSCL由来の基質をDMSOに溶かした。各約1.0×10-9molのP1-Lys、P1-Arg、又はP1-Leuサブライブラリー361化合物を、0.1μMの最終濃度で96ウエルのマイクロ蛍光プレートDynexTechnologies,Chantilly,Va.の57ウエルに加えた。各約1.0×10-10molのP1別種サブライブラリー6859化合物を、各化合物0.01μMの最終濃度で96ウエルプレートの20ウエルに加えた。酵素0.02nM~100nMを加えることによって加水分解反応を開始させ、PerkinElmerLS50B発光分光計、380nmでの励起及び450nm又は460nmでの発光を用いて蛍光性を調べた。セリンプロテアーゼのアッセイは、50mMのトリスpH8、100mMのNaCl、0.5mMのCaCl2、0.01のTween20、及び1のDMSO基質由来を含むバッファーにおいて25°Cで行った。システインプロテアーゼ、パパイン及びクルザインのアッセイは、100mMの酢酸ナトリウム、pH5.5、100mMのNaCl、5mMのDTT、1mMのEDTA、0.01のBrij-35、及び1のDMSO基質由来を含むバッファーにおいて25°Cで行った。B.137,180の基質配列のP1別種ライブラリーを用いたプロテアーゼのプロファイリング:全アミノ酸が基質配列中のP1部位に結合する可能性を試験するために、P1別種テトラペプチドライブラリーを作製した。P1別種ライブラリーは、システインが除かれ、ノルロイシンが含まれる全アミノ酸として、P1位のみが系統的に一定に保たれている20ウエルからなる。P2、P3及びP4位は、ウエル当たり合計6,859基質配列の全アミノ酸の等モル混合物からなる。いくつかのセリン及びシステインプロテアーゼをプロファイリングして、最適P1アミノ酸の同定における、このライブラリーの適用可能性を試験した。キモトリプシンは、大きな疎水性アミノ酸に対する予想された特異性を示した。トリプシン及びトロンビンは、P1塩基性アミノ酸Arg>Lysに対する選好性を示した。プラスミンも、塩基性アミノ酸Lys>Argに対する選好性を示した。P1-Asp特異性を有する唯一の知られている哺乳動物セリンプロテアーゼであるグランザイムBは、他の酸性アミノ酸、Gluを含む全ての他のアミノ酸中のアスパラギン酸に対して異なる選好性を示した。ヒト好中球エラスターゼに関するP1プロファイルは、アラニン及びバリンに対する標準的な選好性を有する。システインプロテアーゼ、パパイン及びクルザインは、これらの酵素に関して知られている広範囲のP1基質配列特異性を示したが、アルギニンに対する適度な選好性が存在する。MT-SP1野生型プロテアーゼは、Arg又はLysを好んだ。C.P1一定ライブラリーを用いたMT-SP1プロテアーゼのプロファイリング:P1一定テトラペプチドライブラリーを、前に開示したのと同様に作製する。P1一定ライブラリーは、システインが除かれ、ノルロイシンが含まれる全アミノ酸として、P1位のみが系統的に一定に保たれている20ウエルからなる。P2、P3及びP4位は、ウエル当たり合計6,859基質配列の全アミノ酸の等モル混合物からなる。いくつかのセリン及びシステインプロテアーゼをプロファイリングして、最適P1アミノ酸の同定における、このライブラリーの適用可能性を試験した。MT-SP1は、P1におけるアミノ酸Arg及びLysを好む。[実施例4.PSSCLによる、MT-SP1変異体の拡張した特異性の決定]P1-Arg固定PSSCLライブラリーをDMSO中に再懸濁させ、ウエル当たり5~10ナノモルの濃度で不透明黒色の96ウエルプレート中に配列させる。変異型プロテアーゼは、5nM~5μMの濃度で50mMのトリスpH8、50mMのNaCl、及び0.01のTween20MTSP活性化バッファー中に希釈する。100マイクロリットルのプロテアーゼ溶液を各ウエルに加え、Spectramax蛍光プレートリーダーMolecularDevicesを使用して、ACC脱離基の蛍光を380nmでの励起及び460nmでの発光によって測定する。P4~P2伸長サブサイトの各々における変異型プロテアーゼの特異性は、P4~P2PSSCライブラリー中の各配列アミノ酸の蛍光性によって測定する。結果:PSSCLによるスクリーニングにより、野生型MT-SP1が、P4及びP3位において、塩基性アミノ酸Arg、Lysに対する選好性を有することを確認されたが、これは、Takeuchietal.,Y.Biol.Chem.,Vol.275,Issue34,26333~26342,2000年8月25日による公開データと合致する。しかしながら、PSSCLプロファイルは更に、その特異性がやや広く、P4及びP3位において、Arg又はLys以外の種々のアミノ酸が受け入れられることを明らかにしている図2A。基質特異性を狭めた変異体をいくつか作製し上記を参照、それを、VEGF受容体において同定した、切断部位の候補部位に向けた下記を参照。1つの変異体、L172DCB18は非常に狭い特異性プロファイルを示し、Arg又はLysが、P4及びP3位中の他のアミノ酸より好まれる図2B。候補となる切断配列は、L172DRRXRに関する特異性プロファイルがよく合致するVEGFR2RRVR中で同定している。MT-SP1の変異体は、P1-ArgPSSCLを用いてプロファイリングしている特異的変異体に関して、表11参照。全ての変異体が、1つ又は複数の基質配列位置において選択性の増大を示している。代表的なプロファイルを図2A~Hに示す。[実施例5.プロテアーゼファージディスプレーを使用する、ペプチド配列特異的標的切断が可能であるMT-SP1変異体の選択]ファージミドを、iM13ファージの形態形成に必要な全ての遺伝子を有し、iiファージの複製起点と相互作用して、一本鎖DNAの生成を開始させるパッケージシグナルを有し、iii破壊されたファージの複製起点を有し、ivアンピシリン耐性遺伝子を有する、ように構築する。非効率的なファージの複製起点と完全なプラスミドの複製起点との組合せは、ファージとしてではなく、プラスミドとしてRF、複製形、DNAとして、宿主細菌中でベクターが増殖することを助長する。従って、宿主を殺傷せずに維持することができる。更に、プラスミド起点を有することは、ファージミドの効率的なファージ様増殖とは無関係に複製可能であることを意味する。アンピシリン耐性遺伝子によりベクターを増幅させることができるが、これは、ファージ粒子中へのファージミドDNAのパッケージ化を増大させる。MT-SP1変異体遺伝子と遺伝子3又は遺伝子8M13コートタンパク質の融合体は、標準的なクローニング法を使用して構築することができるSidhu,MethodsinEnzymology,2000,V328,p333。次いで、MT-SP1をコードする遺伝子内の変異体のコンビナトリアルライブラリーを、p3又はp8M13コートタンパク質との融合体としてM13の表面上に提示し、当該標的切断に対応する固定、アルデヒド含有ペプチドに対して作用させる。アルデヒド成分はプロテアーゼの切断性結合を切断するプロテアーゼの能力を阻害するが、この成分がペプチドのプロテアーゼ認識に干渉することはない。固定標的ペプチドに対する特異性を有する変異型プロテアーゼ提示ファージは、標的ペプチドコーティングプレートと結合すると思われ、一方で非特異的ファージは洗浄除去する。連続的な周期の作用によって、標的配列に対する増大した特異性を有するプロテアーゼを単離することができる。従って、アルデヒドを含まない標的配列を合成することができ、単離したファージを、ペプチドの特異的加水分解について試験することができる。[実施例6.VEGFR2のストーク領域におけるMT-SP1変異体切断の確認]VEGF受容体2VEGF-R2/KDRのポリペプチド配列を、細胞外配列番号8及び細胞内配列番号9ドメインの各配列について表12に示す。MT-SP1の天然のP4~P1基質特異性とほぼ一致する配列は太字で示す。2つの配列、すなわち、箱で囲った配列RVRK、及び二重下線を引いた配列RRVRは、L172D及び野生型MT-SP1の認識プロファイルと合致する。マウスIgG2.5μgのFcドメインと融合したVEGF-R2Flk1の精製細胞外ドメインは、1μMのMT-SP1と共に再懸濁させ、変異型プロテアーゼは17.1uLのMTSP活性化バッファーに再懸濁させた。反応混合物は37°Cで2時間インキュベートし、PNGaseFを用いて脱グリコシル化させ、SDS-PAGE電気泳動によって分離した。完全長Flk1-Fc及び切断産物は、クーマシーブリリアントブルーを用いた染色、及びエドマンのプロトコールによって塩基配列決定したN末端によって同定した。精製VEGFR2-Fcは、受容体の細胞外ストーク領域中の配列RRVR/KEDEで野生型及び変異型MT-SP1によって切断する。従って、本発明は、ストーク領域中のVEGFRを切断することができるプロテアーゼを提供し、本発明の一実施形態では、血管新生が原因的又は貢献的役割を果たす癌、黄斑変性又は他の疾患の治療の必要がある患者に、このようなプロテアーゼを投与する。[実施例7.精製VEGF受容体の切断のアッセイ]マウスIgG3~10μgのFcドメインと融合したVEGF-R2の精製細胞外ドメインは、MTSP活性化バッファー20μLに再懸濁させる。変異型プロテアーゼは100nM~1μMの最終濃度に加える。反応混合物を37°Cで1~2時間インキュベートし、更に、SDS-PAGE電気泳動によって分離させる。クマシーブルー染色、銀染色、及び/又はウエスタンブロットによってバンドを目に見える状態にする。結果:精製VEGFR2-Fcは、野生型及び変異型MT-SP1により効率よく切断される図3。変異型プロテアーゼによる切断によって、~80kDa及び30kDaの見かけの分子量を有する切断産物が生成するが、VEGFR2中の切断部位候補の分析により、MT-SP1変異体がVEGFR2の膜隣接ストーク領域を標的化することが示唆される。変異体L172Dは完全長VEGFR2を切断するが、野生型と比較して低い割合で切断する。いくつかの変異体N175D及びD217Fは、野生型より高い有効性で受容体を切断する。プロテアーゼ変異体又は野生型は、いずれもFcドメインを切断しない。[実施例8.内皮細胞由来VEGF受容体の切断のアッセイ]ヒト臍帯血管内皮細胞HUVECをCambrexから購入し、2のウシ胎児血清FCS及び抗真菌薬-抗生物質を含む完全なサプリメントを有するEBM-2内皮細胞基本培地、Cambrex中で培養した。生存アッセイ用に、一晩96ウエルプレートで、EBM-2中に2×105細胞/mlの密度で細胞を平板培養した。翌日、24時間でDMEM10のFCSと培地を交換することによって、細胞を血清枯渇状態にした。次いで、プロテアーゼを10~1000nMの種々の濃度で加え、プロテアーゼの存在下で2時間、細胞をインキュベートした。VEGFを20ng/mLの最終濃度で加え、細胞は72時間インキュベートした。その72時間の最後に、製造者のプロトコールに従ってMTTアッセイSigmaによって細胞数を測定した。内皮細胞の表面からのVEGF受容体の切断を目に見える状態にするために、細胞は24ウエルプレート内で70の集合状態まで増殖させ、この時点で培地を除去し、200uLのDMEM及び10のFCSを各ウエルに加えた。試験するプロテアーゼは10~1000nMの最終濃度で加えた。細胞はプロテアーゼの存在下で1~3時間インキュベートし、培地を除去した。細胞は1mLの氷冷PBSで洗浄し3回、ピペット先端を使用してプレートからはがし取った。再懸濁させた細胞は5000rpmで遠心分離に施し、上清は除去した。ドライアイス上での3回の凍結解凍サイクルによって、50uLの溶解バッファーPBS0.1のNP40中に細胞を溶解させた。細胞溶液は15,000rpmで遠心分離に施して膜及びオルガネラを除去し、30uLの上清はSDSゲル電気泳動によって分離した。タンパク質はPVDF膜に移し、細胞内ドメインを認識する抗VEGFR2抗体Chemiconを用いてプローブ処理した。タンパク質分解切断による内皮細胞の表面からの可溶性VBGF受容体の放出は、サンドウィッチELISAを使用して検出した。HUVECは24ウエルプレート内で増殖させ、前述したのと同様にプロテアーゼを用いて処理した。3時間のインキュベーションの後、100uLの培地を除去し、プロテアーゼ阻害剤PefablocRocheを1mg/mLの最終濃度まで加えた。次いで、培地を、VEGFR2の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体MAB3573,RDSystems、PBS中に1:125希釈で処理したMaxisorpプレートNuncに加えた。1時間のインキュベーションの後、プレートはPBS0.01のTween20PESTで洗浄し、これも細胞外ドメインを認識するビオチン化ポリクローナル抗体BAF357,RDSystems、1:500希釈で処理した。1時間のインキュベーションの後、プレートはPBSTで洗浄し、更に、ストレプトアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼUpstateで処理した。プレートは1時間インキュベートし、更に、PBSTで洗浄し、製造者のプロトコールに従ってTMB基質Amershamを使用して染色した。結果:野生型MTSP、及びCB18、CB83及びCB152を含むより特異的な変異体は、用量依存式の内皮細胞のVEGF依存性の増殖を効果的に阻害した図7A。図7Bは、MTSP変異体が内皮細胞の表面上のVEGF受容体を切断することを示すが、これは、MTSP変異体が、VEGF受容体を不活性化させることによって、VEGF依存性の細胞増殖を阻害するという予想と合致する。HUVECをバッファー対照又はMTSP変異体と共にインキュベートし、更に、細胞抽出物を、VEGFR2の細胞内ドメインを認識する抗体でプローブ処理するウエスタンブロットを示す。野生型MTSP及び変異体は完全長受容体上側バンドを切断して、切断形下側バンドを生成させる。更に、切断受容体の細胞外ドメイン外部ドメインは、図7C中のELISAによって示されるように培地中で検出することができ;放出外部ドメインはMTSP及び変異体で処理したサンプル中では検出可能であるが、対照中では検出可能ではない。[実施例9.角膜マイクロポケットモデル]急性最大許容量を測定するために、漸増量の精製した野生型及び変異型MTSPを、C57BL/6マウスに静脈内注射した。マウスは毒性及び死の外見的徴候を観察した。角膜マイクロポケットアッセイ用に、C57BL/6マウスはアベルチンを用いて腹腔内麻酔し、眼はプロパラカインHClAllergan,Irvine,CAで局所処理した。VEGF-A165を含むヒドロン/スクラルフェートペレット100ug、RDSystemsを、走査顕微鏡Zeiss下で両目の縁から1mmの所に角膜マイクロポケットに注入し、次にマイクロナイフMedtroniXomed,Jacksonville,FLを使用して腔内直線的角膜切開術を施した。角膜マイクロポケットはvonGraefeナイフ32×30mmを用いて縁を切開し、次にペレットを注入し、エリスロマイシンを局所施用した。8日後、細隙灯生体顕微鏡及び式2π×容器長/10×時計時間を使用することによって血管新生を定量化する。不均一な分散をとる両側t検定を使用することによってP値を測定したマイクロソフトエクセル。第0日から始めて第7日まで12時間間隔で1日2回、種々の用量のプロテアーゼを腹腔内注射した。結果:野生型MT-SP1はマウスに十分な耐性があり、急性最大許容量MTDは50mg/kgであると決定した図8。有意なことに、プロファイリングライブラリー中で狭い特異性を有することが示された図2参照いくつかのMT-SP1変異体は、十分な耐性がありすなわち、低い毒性を有していた、高い最大許容量をもたらした。例えば、CB18及びCB152は、野生型MT-SP1に関して死を引き起こした用量で耐性があった。これは、選択性を狭くすることはプロテアーゼ薬剤の毒性を低下させるための機構となり得ることを示す。野生型MT-SP1及び変異体は、マウス角膜マイクロポケットモデルにおいてVEGF誘導型血管新生を阻害するそれらの能力に関して試験した。前に大まかに述べたように、VEGFのペレットは通常血管であるマウスの角膜に注入し、血管新生の量は8日後に定量化した。マウスを野生型又は変異型MT-SP1のいずれかで治療すると、血管新生は用量依存式に阻害された図9。MTD50mg/kgでの野生型MT-SP1によるマウスの治療は、42の血管新生の阻害をもたらした。CB18の場合、低い毒性のために高濃度で投与することが可能であり、高用量80mg/kgでは75の阻害を得た。従って、野生型MT-SP1がVEGF誘導型血管新生を阻害する際に有効であっても、それを高レベルで投与することができた事実のために、CB18を用いて優れた有効性を得た。[実施例10.血管透過性に関するマイルスアッセイ]血管新生以外に、VEGFは血管の浸透も誘導し、周辺組織への流体の漏出を引き起こす。VEGF誘導型の血管透過はマイルスアッセイを使用して測定した。簡潔には、ヌード無胸腺マウスに、尾部静脈注射によって0.5のエバンスブルー色素100uL、PBS中、Sigmaを注射した。色素注射後1時間で、100ngのVEGFを20uLのPBSに溶かしたものを、マウスの背面の2点に皮内注射した。色素の漏出によるVEGF注射部位における青い斑点の出現によって、血管透過を目に見える状態にする。青い斑点の領域を測定することによって半定量的に、血管透過の程度を測定することができる。それらが血管透過を阻害したかどうかを決定するために、野生型MT-SP1及び変異体を、色素注射の直後に種々の用量で腹腔内注射し、血管透過の量は色素漏出の領域を測定することによって決定した。結果:野生型及び変異型MT-SP1の注射は、血管透過の用量依存式の阻害をもたらした図10。試験した最高用量で、野生型MT-SP1は80まで血管透過を阻害した。同様に、CB18とCB152の両方が血管透過を阻害し、CB152は低い10mg/kg用量で野生型より高い有効性を示した野生型の25阻害と比較してCB152の60阻害。それらの最高用量で、3つ全てのプロテアーゼはAVASTIN商標、大腸癌用に認められた抗VEGF抗体に匹敵する有効性を有していた。[実施例11.腫瘍異種移植片モデル]ネズミルイス肺癌LLC細胞を、C57BL/6マウスの背面正中線上、或いはDMEM/10FCS/ペニシリン/ストレプトマイシンPNS/L-グルタミン中に継代する。T241ネズミ線維肉腫はDMEM/10FCS/PNS/L-グルタミン中で増殖させ、ヒト膵臓BxPc3腺癌はRPMI培地1640/10FCS/PNS中で増殖させる。腫瘍細胞106は、ネズミ腫瘍に関してはC57BL/6マウス8~10週齢の背面正中線、ヒト腫瘍に関しては重症複合免疫不全SCIDマウスに皮下注射し、100~200mm3に増殖させて典型的には10~14日間腫瘍摂取を実証し、109pfuのプロテアーゼコードアデノウイルス又は対照アデノウイルスAdFcを静脈内注射によって尾部静脈に投与する。式0.52×長さmm×幅mm長さの短い方を幅とする。を使用することによって、10~14日間のカリパス測定によってmm3の腫瘍サイズを計算する。例えば、Kuoetal.,PNAS,2001,98:4605~4610を参照のこと。一定でない分散をとる両側t検定マイクロソフトエクセルを使用することによって、P値を測定した。結果:VEGFR2の切断が受容体を不活性化させると仮定すると、精製タンパク質又はアデノウイルスによってコードされるタンパク質としての、治療有効量のプロテアーゼの全身送達は、LLC腫瘍増殖の阻害をもたらす。腫瘍増殖の阻害の失敗は、内因性プロテアーゼ阻害剤セルピンによるプロテアーゼの不活性化によるものである可能性がある。このような事象では、セルピンとプロテアーゼの共有結合は、SDS-PAGEによりプロテアーゼのサイズの増大として検出可能である。それをセルピン不活性耐性にする変異を、プロテアーゼに施すことができる。[実施例12.VEGFR切断]図1に示すように、スキャフォールドプロテアーゼ及び変異体を、酵母菌又は細菌発現系において多数のミリグラム量、活性プロテアーゼとして首尾良く発現させた。例えば、Harris,1998及びTakeuchi,2000に記載のプロトコールを参照のこと。MT-SP1を設計して、Flk-1/KDRを選択的に切断する変異体を得た。表11に示す他のMT-SP1変異体は、前述したのと同様にクローニングし発現させた。図1に示すように、MT-SP1変異体は細菌中で発現させ、封入体から精製した。各プロテアーゼが高い触媒活性を保持し、それは>99の純度であり、それらは結晶学試験に適したものとなる。表13は、野生型及び変異型MT-SP1の予測される標的切断配列を示す。この表では、Hydは任意の疎水性アミノ酸すなわち、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンを表し、Xxxは任意のアミノ酸を表す。[実施例13.VEGFRストーク領域配列RRVRに対する増大した選択性を有する1、2及び3個の変異からなる変異体]RRVR標的切断配列に対する増大した選択性を示すPSSCLプロファイルによって、多数の変異体を特徴付けした図2A~H。それらは、どのサブサイト:P2又はP3及びP4プロファイルが変異によって最も影響を受けたかに基づいて、2つのサブクラスに分けた。Ala、Ile及びValへのPhe99の変異は、Valに対するプロテアーゼのP2選択性を増大させ、基質を含むAlaの特異性を低下させた。この影響は、変異体F99VMT-SP1CB38及びF99I/L172D/Q175DMT-SP1CB159において見られる図2C及びD。例えばPhe99からTrp、Asn、Asp、Ala又はArgへの変異は、基質を含むAla、Ser、Trp、Lys及びIleに対するP2選択性を増大させた。P2選択性に影響を与えた他の変異は、Met80からGlu及びAlaへの変異、Trp215からTyr及びPheへの変異であった。Arg及びGluへのGln192の変異はP3選択性のみを改変した。Tyr146Asp、Leu172Asp、Gln175Asp、Lys224Phe及びMet180Gluにおける変異は、変異体L172DCB18と同様に、P3及びP4の基質を含むArg及びLysに対する変異体の選択性を増大させた図2B。これらの個々の変異を一緒に分類することによって、非常に選択的なP3及びP4プロファイルを有する変異型プロテアーゼ、変異体L172D/Q175DCB83及びY146D/K224FCB155等を与えた図2E及びF。結果:個別に確認した変異を分類してP2及びP3/P4におけるプロテアーゼ選択性を狭めることによって、P3及びP4位においてArg及びLys残基に対する4倍を超える選択性、及び改変されたP2特異性を有する多数の変異体を作製した。2つの変異体F99V/L172D/Q175DCB151及びF99V/K224FCB152は、P3及びP4サブサイトにおいて他のアミノ酸よりArg及びLysに少なくとも3倍を超えて選択的であり、P2サブサイトにおいてAlaよりValに2倍選択的である図2G及びH。PSSCLにおけるこれらの特性は、所望のRRVR配列に対するMT-SP1プロテアーゼの選択性を改変する際の、表10からの変異の有効性を示す。[実施例14.RRVR及びRQAR基質の優先的切断に関するスクリーニング]基質ライブラリーによって決定した、所望の特異性プロファイルが一致する変異型プロテアーゼを、所望の切断配列に対応する個々のペプチド基質を使用してアッセイして、選択性の変化の程度を決定した。2つの基質:Ac-RRVR-AMC及びAc-RQAR-AMCを表した。基質のプロファイリングによって決定した第2の配列、RQARがMT-SP1の好ましい配列である。それは更に完全長プロテアーゼ中の配列と一致し、プロテアーゼ活性化のために切断されるはずである。ミカエリス-メンテンの運動定数を、標準的な運動法によって測定した。簡潔には、Costar96ウエル黒色半領域アッセイプレートのウエル中の50μLの合計体積のMT-SP1活性バッファー中に、1mM~2μMの一連の12の濃度に基質を希釈する。溶液は5分間で30°Cに温め、0.1nM~20nMのプロテアーゼ溶液50μLを、アッセイのウエルに加えた。435nmにおいてカットオフフィルターを使用して、380nmの励起波長、450nmの放射波長において、蛍光分光光度計MolecularDevicesGeminiXPSで蛍光を測定した。30秒間隔で得た読み取り値を用いて、30分間蛍光の増大率を測定した。基質濃度の逆数と基質切断の速度の逆数をグラフ化し、ラインウィーバー-バークの式1/速度=Km/Vmax1/[S]1/Vmax;Vmax=[E]kcatに適合することによって、運動定数kcat、Km及びkcat/Kmを計算した。特異性定数kcat/Kmは、特定のプロテアーゼによって基質がどの程度十分に切断されるかの指標である。結果:野生型MT-SP1及び7個の変異体の特異性定数kcat/Km図6は、PSSCLから誘導したRQAR及びRRVRの相対選択性の半定量的結果が、個々の基質に関して測定すると一致することを示す。野生型プロテアーゼ、MT-SP1は、RRVR基質の2倍を超えてRQAR基質を好む。6個の変異型プロテアーゼのうちの5個が、RQARより標的配列RRVRを好む。2個の変異体、CB152及びCB159は、8倍を超えてRQARよりRRVRを好む。唯一の例外はCB38であり、そのプロファイルは選択性がP4サブサイトのみであったことを示唆した。RQAR及びRRVRの相対的選好性以外に、個々の基質の運動定数測定は、各変異体に関する基質切断の有効性を定義する。変異体CB155及びCB159は、それぞれ2.2及び2.3×105M-1s-1でAc-RRVR-AMC基質を切断する図6。これらの割合は野生型、MT-SP1の3倍以内である。[実施例15.個々の基質の切断に関するスクリーニング]例えば、基質ライブラリーによって決定した、所望の特異性プロファイルが一致する変異型プロテアーゼを、所望の切断配列に対応する個々のペプチド基質を使用してアッセイする。個々の運動定数測定は、Spectra-MaxDelta蛍光計MolecularDevicesを使用して行う。各プロテアーゼは、アッセイバッファー中に50nM~1μMで希釈する。全てのACC基質はMeSOで5μM~500μMに希釈し、一方、AMC[DEFINED]基質は20μM~2000μMに希釈する。各アッセイは、5未満のMeSOを含む。合計10分間、それぞれ380nm及び460nmの励起波長及び発光波長で、15秒毎に酵素活性を調べる。全てのアッセイは1のDMSO中で行う。[実施例16.完全長タンパク質の切断に関するスクリーニング]変異型プロテアーゼをアッセイして、それらは完全長タンパク質の状態で存在すると所望の配列を切断することを確かめ、標的タンパク質の活性をアッセイして、その機能が切断事象によって損なわれたことを確認する。精製完全長タンパク質と変異型プロテアーゼのインキュベーション後に、SDS-PAGEによって切断事象を調べる。タンパク質は標準的なクマシーブルー染色を使用して、放射標識タンパク質を使用するオートラジオグラフィーによって、又は適切な抗体を使用するウエスタンブロットによって目に見える状態にする。或いは、標的タンパク質が細胞表面受容体である場合、その標的タンパク質を発現する細胞を変異型プロテアーゼに曝す。細胞を溶かし、SDS-PAGEによってタンパク質を分離し、更に、ウエスタンブロットによる視覚化によって切断事象を調べる。或いは、タンパク質分解によって放出される可溶性受容体をELISAにより定量化する。VEGFの切断:血管内皮成長因子VEGFは、胚形成及び成人期中に通常生成される内皮細胞特異的マイトジェンである。VEGFは、腫瘍成長を含む種々の正常及び病的プロセスにおける血管新生の、重要なメディエーターである。3個の高親和性同族VEGF受容体:VEGFR-1/Flt-1、VEGFR-2/KDR及びVEGFR-3/Flt-4が同定されている。MT-SP1が受容体以外にシグナル分子も切断するかどうかを判定するために、165アミノ酸組換え型のVEGF、VEGF165をSDS-PAGEによってアッセイした。VEGF165はPBS中で0.2μg/μLの濃度に再構築し、5μMの最終濃度に希釈した。プロテアーゼを含まない溶液、及び100nMのMT-SP1又はCB152を含む溶液を、5時間37°CにおいてVEGFと共にインキュベートした。生成したタンパク質切断産物は脱グリコシル化させ、SDS-PAGEによって分離し、銀染色した図11。MT-SP1はアッセイ条件下でVEGF165を効率よく切断するが、一方より選択的な変異体CB152はそうではない。この結果は、野生型MT-SP1を使用して、2つの異なる機構:マイトジェンの切断及び受容体の切断によるVEGFシグナルを遮断することができることを示す。CB152、VEGFR2のストーク領域中のRRVR配列に対する狭い選択性を有する変異体は、VEGFを切断しないが、VEGFRは切断し、低い毒性のために高濃度で投与することができる。VEGFRの切断:125I-VEGFR40,000cpmは種々の濃度のプロテアーゼと共にインキュベートし、サンプルはSDS-PAGEサンプルバッファー中で煮沸し、12ポリアクリルアミドゲル上で調べる。ゲルは乾燥させ、-70°Cにおいてx線フィルムKodakに曝す。VEGFR結合アッセイ:125I-VEGFR又はPMNを、前と同様に種々の濃度のプロテアーゼと共にインキュベートする。プロテアーゼに曝した125I-VEGFRと通常のPMNの結合、又は通常の125I-VEGFRとプロテアーゼに曝したPMNの結合は、シンチレーションを使用して定量化する。簡潔には105個の細胞を、プロテアーゼ阻害剤の存在下において96ウエルフィルタープレートMillipore中で、種々の濃度の125I-VEGFRと共にインキュベートする。細胞を真空吸引によって3回洗浄し、30μLのシンチレーション流体Wallacを各ウエルに加える。vanKesseletal.,J.Immunol.1991147:3862~3868及びPorteauetal.,JBC1991266:18846~18853から適合させたWallacMicrobetaシンチレーションカウンターで、シンチレーション数を計数する。[実施例17.血清中のMT-SP1の活性の測定]MT-SP1及びトリプシンの活性を、高濃度のウシ胎児血清の存在下においてアッセイした。血清中に存在する高濃度のマクロ分子プロテアーゼ阻害剤は、それをプロテアーゼがinvivoで活性化されるかどうかを試験するための優れたinvitro系にする。MTSP及びトリプシンは、100μLの最終体積中に高血清濃度0~10で、それぞれ100nM及び80nMでダルベッコの改変イーグル培地DMEM中に再懸濁させた。蛍光ペプチド基質Leu-Val-Arg-アミノメチルクマリンを15μMの最終濃度まで加え、380nmの励起波長及び460nmの発光波長で、蛍光プレートリーダーMolecularDevicesにおいて蛍光を検出した。図5に示すように、400秒後まで全基質を使用する酵素で、トリプシンは0血清中で非常に強い活性を示す。しかしながら、最低濃度の血清2.5中でさえも、恐らくマクロ分子プロテアーゼ阻害剤の結合のために、トリプシン活性は劇的に低下する。他方でMT-SP1は、全ての濃度の血清中でほぼ同じ活性を示し、MT-SP1を不活性化させる内因性プロテアーゼ阻害剤は血清中に存在しないことを示唆する。均等物特定の実施形態を本明細書で詳細に開示してきたが、これは単なる例示目的で行ったものであり、添付の特許請求の範囲の限定を目的とするものではない。特に、特許請求の範囲により定義される本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、種々の代用、変更及び修飾を本発明に施すことが可能であることは、本発明者が想定するところである。スクリーニング法、プロテアーゼスキャフォールド、又はライブラリー形式の選択は、本明細書に記載の実施形態に関する知識を有する当業者には日常的なことであると考えられる。他の態様、利点及び変更形態は特許請求の範囲内にあると考えられる。"