"好熱菌の酵素の遺伝子を含む大腸菌を、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる条件で、加熱して該大腸菌の細胞膜を破壊した状態で、該細胞内に前記酵素の基質であって、加熱後の細胞壁を透過する基質を透過させて、該酵素と該基質とを反応させ、該酵素が、70°C,10分間の処理で活性が消滅しないものであることを特徴とする大腸菌を用いた酵素反応方法。前記大腸菌を、60°C~80°Cで加熱することを特徴とする請求項1に記載の酵素反応方法。しかしながら、非特許文献2に記載の方法に於いても、いくつかの問題点が残されている。即ち、ポリリン酸を細胞内へ取り込ませるために、界面活性剤や有機溶媒等で細胞を処理する必要がある。この作業は本来細胞内に取り込まないポリリン酸を細胞の中に取り込ませるために必要な工程である。しかしながら、界面活性剤は不純物として生産物に混入すると、問題を引き起こす物質である。また、細胞の中にはポリリン酸を加水分解する酵素が存在したり、反応を行わせる上で副産物を生成する酵素が多数存在するという問題がある。本発明に係る酵素反応方法は、好熱菌の酵素の遺伝子を含む大腸菌を、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる条件で、加熱して該大腸菌の細胞膜を破壊した状態で、該細胞内に前記酵素の基質であって、加熱後の細胞壁を透過する基質を透過させて、該酵素と該基質とを反応させ、該酵素が、70°C,10分間の処理で活性が消滅しないものであることを特徴としている。本発明に係る酵素反応方法は、前記大腸菌を、60°C~80°Cで加熱することが好ましい。本発明を用いれば、不純物である界面活性剤を用いなくてもポリリン酸を細胞の中に透過させることができ、かつ細胞内で副産物を生成する酵素が多数存在するという問題を安全に回避できる。また、Xキナーゼのみを変えることによって、数多くの物質Xのリン酸化にも対応できる汎用宿主となる。この汎用宿主は、安価で安全なポリリン酸をリン酸化の基質として広く工業的に利用することを可能にするという効果をもたらす。ポリリン酸キナーゼポリリン酸キナーゼとはEC番号がEC2741の酵素であり、ポリリン酸とADPからATPを合成する。ポリリン酸キナーゼの種類によっては逆反応も起こる場合があるが、本発明に於いては限定されない。発明者は大腸菌の通常の酵素が活性を失う70°Cで10分程度の加熱処理でも、活性が維持されるポリリン酸キナーゼを見つけるために、すでに染色体DNAの配列が決定され、データベースDDBJに登録されているThermusthermophilusHB27の染色体DNAの配列をもとに、大腸菌のポリリン酸キナーゼと似ている遺伝子配列を探した。その結果、Thermusthermophilusには大腸菌ポリリン酸キナーゼと約30の相同性を有する遺伝子番号TTC0637を見いだした。ここでThermusthermophilusを選んだ理由は、この菌が好熱菌に分類されるからである。一般に好熱菌とは、至適生育温度が45°C以上の微生物であり、好熱菌の酵素は耐熱性の酵素が多いと言われている。特にThermusthermophilusは65~85°Cでも生育可能な微生物であり、目的の耐熱性ポリリン酸キナーゼを持つと期待できた。Thermusthermophilusのポリリン酸キナーゼ遺伝子を大腸菌に於いて発現させ、活性を測定した結果、70°Cで10分程度の加熱処理では活性を失わないことを確認した。Thermusthermophilusのポリリン酸キナーゼは至適温度を70°C付近に持ち、37°Cにおける大腸菌のポリリン酸キナーゼと同程度の比活性を持つことを確認した。これにより、高温でのATP再生系が構築できると考えられた。ただし、本発明に用いられるポリリン酸キナーゼは、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる加熱条件で、その活性が維持されるものであれば、その由来は特に限定されず、細菌、酵母、動物、植物など、いずれの生物であっても良い。耐熱性ポリリン酸キナーゼを発現する大腸菌Thermusthermophilusのポリリン酸キナーゼ遺伝子を大腸菌に於いて発現させた後、70°Cで10分程度の加熱処理を行い、遠心分離して上清と菌体を含む沈殿物に分けた。上清と沈殿物にそれぞれ、ポリリン酸とADPを加えた結果、沈殿物にポリリン酸とADPからATPを合成する活性が認められた。その結果、Thermusthermophilusのポリリン酸キナーゼ遺伝子を発現させた大腸菌を、70°Cで10分程度の加熱処理に晒すことにより、ポリリン酸とADPを細胞の中に透過させることができるようになることを確認した。加熱条件加熱条件は、70°Cで10分程度の加熱処理を例示するが、80°Cで5分程度の加熱処理でもよい。逆に60°Cの比較的低温で加熱処理する場合、時間を長くすればよい。加熱条件は、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる条件であれば、特に限定されない。Xキナーゼ本発明では物質Xをリン酸化する工程を含むことを特徴とする。物質Xをリン酸化する酵素をXキナーゼとする。XキナーゼはATPを利用して物質Xをリン酸化し、ADPを生じさせる。生成したADPはポリリン酸と耐熱性ポリリン酸キナーゼによってATPへと再生される。全体の反応を考えた場合、Xキナーゼとポリリン酸キナーゼによって、物質Xをポリリン酸でリン酸化することになる。本発明では耐熱性ポリリン酸キナーゼを発現する大腸菌の中に導入するXキナーゼを変えることによって、あらゆる物質Xのリン酸化に対応できることを示すために、フルクトース6リン酸を物質Xとし、フルクトース6リン酸からフルクトース16二リン酸へ変換する工程を例示する。フルクトース16二リン酸は虚血性心疾患の薬として期待される物質である。この場合のXキナーゼはホスホフルクトースキナーゼであるが、物質Xとそれに対応したXキナーゼは特に限定されるものでない。ホスホフルクトースキナーゼホスホフルクトースキナーゼとはEC27156の酵素であり、ATPとフルクトース6リン酸からADPとフルクトース16二リン酸を合成する。発明者は大腸菌の通常の酵素が活性を失う70°Cで10分程度加熱処理でも、活性が維持されるホスホフルクトースキナーゼを見つけるために、ThermusthermophilusのDNAの配列を元に、PropionibacteriumfreudenreichiiのホスホフルクトースキナーゼP29495と相同性を有する遺伝子を探した。その結果、約28の相同性を有する遺伝子遺伝子番号TTC1597を見いだした。ここでThermusthermophilusを選んだ理由はこの菌が好熱菌に分類されるからである。特にThermusthermophilusは65~85°Cでも生育可能な微生物であり、耐熱性のホスホフルクトースキナーゼを持つと期待できた。Thermusthermophilusのホスホフルクトースキナーゼ遺伝子を大腸菌に於いて発現させ、活性を測定した結果、70°Cにおいて、ATPとフルクトース6リン酸からADPとフルクトース16二リン酸を合成することを確認した。ただし、本発明に用いられるホスホフルクトースキナーゼは、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる加熱条件でも、その活性が維持されるものであれば、その由来は特に限定されず、細菌、酵母、動物、植物など、いずれの生物であっても良い。耐熱性ポリリン酸キナーゼと耐熱性ホスホフルクトースキナーゼ遺伝子を発現する大腸菌Thermusthermophilusのポリリン酸キナーゼ遺伝子を保持する大腸菌にホスホフルクトースキナーゼ遺伝子を発現するプラスミドを導入した。両遺伝子を発現する大腸菌を、70°Cで10分程度の加熱処理を行い、ポリリン酸とフルクトース6リン酸を加えた結果、フルクトース16二リン酸を生産することを確認した。本発明者は、これらの問題点の全て解決する方法として、好熱菌のポリリン酸キナーゼを利用するものである。即ち、好熱菌のポリリン酸キナーゼ遺伝子を導入した大腸菌を加熱処理70°Cで10分程度加熱することにより細胞膜を破壊し、これにより界面活性剤を使用することなくポリリン酸を外部から細胞内に導入し、ATPを再生する用にしたものである。また、リン酸化したい物質Xをリン酸化する酵素以下Xキナーゼと記載する。をポリリン酸キナーゼと同時に発現させることにより、大腸菌の細胞の中でXをリン酸化させることができる。ここでXキナーゼ以外の大腸菌由来の酵素は、加熱処理によって活性が消失するので、目的のリン酸化反応だけがポリリン酸で行えるようになる。これにより、副産物を生成する酵素が多数存在するという問題が解決できることになる。好熱菌のポリリン酸キナーゼとXキナーゼの遺伝子を導入した大腸菌は、Xキナーゼのみを変えることによって数多くの物質Xのリン酸化に対応できる。好熱菌のポリリン酸キナーゼを導入した大腸菌は数多くの物質Xをリン酸化するための汎用宿主となる。本発明の概略を図1に示す。実施例1:耐熱性ポリリン酸キナーゼを発現するプラスミドの構築先ず、Thermusthermophilusのポリリン酸キナーゼを発現する大腸菌の構築を行った。データベースDDBJに登録されているThermusthermophilusHB27のDNAの配列の中からDDBJの遺伝子検索ソフトによって大腸菌のポリリン酸キナーゼと似ている配列を探した。その結果、ThermusthermophilusHB27には大腸菌ポリリン酸キナーゼと30の相同性を有する遺伝子TTC0637を見いだした。2種のオリゴヌクレオチドプライマーGGAATTCCATATGCACCTCCTTCCCGAAGCNdeIサイト付加、配列番号3およびGAAGTCGACTAGCTCCAGGCGCTGGGCGTSalIサイト付加、配列番号4を作製し、Thermusthermophilusの染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。反応はKODPlusDNAポリラーゼを用いた。反応条件は、96°Cで2分間保持した後、94°Cで30秒間、59°Cで30秒間、68°Cで2分間の反応を10サイクル繰り返し、さらに94°Cで30秒間、68°Cで2分間の反応を25サイクル繰り返した。PCR産物および発現ベクターpET21aを制限酵素NdeIおよびSalIにより37°Cで2時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したそれぞれのDNA断片をLigationHighにより16°Cで2時間ライゲーションし、大腸菌MV1184株に形質転換した。得られたコロニーから目的のDNA断片が挿入されたプラスミドを抽出し、pETPPKを構築した。図2にpETPPKの構成を示した。実施例2:耐熱性ポリリン酸キナーゼの発現および精製pETPPKによって形質転換したBL21を、LB培地でOD600が0.5になるまで37°Cで培養後、0.2mMIPTGを添加してさらに22°Cで8時間培養を行った。集菌後、超音波で破砕を行い、70°Cで10分間熱処理を行った。その後、遠心し、上清をHisTrapHP1mlアマシャムバイオサイエンスカラムにより精製を行った。50mMのイミダゾールを含む緩衝液A20mMリン酸ナトリウムpH7.4,0.5MNaCl,15グリセロール10mlで洗浄後、0.5Mイミダゾールを含む緩衝液Aで溶出した。最終的に融合タンパク質を含む1mlのフラクションを得た。実施例3:耐熱性ポリリン酸キナーゼの活性5mMポリリン酸シグマ社ホスフェートグラスP65、80μMADP、50mMHEPESKOH、40mM2SO44mMMgCl2pH7.2を含む溶液を75°Cに保温し、精製したポリリン酸キナーゼ0.56mgを添加した。経時的に溶液を分取し、合成されたATPをバイオルミネッセンスキットロッシュによって測定した。図3にThermusthermophilusのポリリン酸キナーゼによるATP合成反応を示す。75°Cにおいて、ポリリン酸とADPからATPが生成している。次にThermusthermophilusのポリリン酸キナーゼと大腸菌のポリリン酸キナーゼの最適温度を比較した。上述した条件で温度だけを変更して、各温度でのATP合成速度を測定した。大腸菌のポリリン酸キナーゼでは30°C~40°Cで最も活性が高く温度を上げるにつれて活性が低下した。それに対してThermusのポリリン酸キナーゼでは60~80°C、特に70°Cで最も高い活性を示すことが分かる。最適温度を図4に示す。次にThermusthermophilusのポリリン酸キナーゼと大腸菌のポリリン酸キナーゼの耐熱性を比較した。ADPを含まない上述条件において、30~80°Cの各温度で10分間保温した後に、ADPを添加してATP合成速度を測定した。加温前のATP合成速度を100として表した。30~40°Cではあまり差が見られず、50°Cから大腸菌のポリリン酸キナーゼは大きく活性が低下し60°C以降では完全に活性が消失した。それに対しThermusthermophilusのポリリン酸キナーゼは50°C以上の温度でも活性が残っていた。各温度での熱処理後の残存活性のグラフを図5に示す。実施例4:耐熱性ホスホフルクトキナーゼThermusthermophilusのホスホフルクトキナーゼを発現する大腸菌の構築を行った。データベースDDBJに登録されているThermusthermophilusHB27のDNAの配列の中からDDBJの遺伝子検索ソフトによってPropionibacteriumfreudenreichiiのホスホフルクトースキナーゼP29495と似ている配列を探した。その結果、Thermusthermophilusには大腸菌キナーゼと約28の相同性を有する遺伝子TTC1597を見いだした。2種のオリゴヌクレオチドプライマーGGCCATATGAAACGCATCGGGGTGTTNdeIサイト付加、配列番号5およびTATAAGCTTGAGGGCCAGCACCTGCGATAHindIIIサイト付加、配列番号6を作製し、Thermusthermophilusの染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。反応はKODPlusDNAポリラーゼを用いた。反応条件は、94°Cで2分間保持した後、94°Cで15秒間、56°Cで30秒間、68°Cで90秒間の反応を35サイクル繰り返し、72°Cで10分間保持した。PCR産物および発現ベクターpET21bを制限酵素NdeIおよびHindIIIにより37°C2時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したそれぞれのDNA断片をLigationHighにより16°C2時間ライゲーションし、大腸菌MV1184株に形質転換した。得られたコロニーから目的のDNA断片が挿入されたプラスミドを抽出し、pETPFKを構築した。図6にpETPFKの構成を示した。実施例5:耐熱性ホスホフルクトキナーゼの精製と活性pETPFKで形質転換したBL21を、2YT培地でOD600が0.5になるまで28°Cで培養後、0.5mMIPTGを添加して更に7時間培養を行った。集菌後、リゾチームと超音波で破砕を行い、遠心上清をHisTrapHP1mlアマシャムバイオサイエンスカラムにより精製を行った。10mMのイミダゾールを含む緩衝液A20mMリン酸ナトリウムpH7.4,0.5MNaCl,15グリセロール10mlで洗浄後、0.5Mイミダゾールを含む緩衝液Aで溶出した。最終的に融合タンパク質を含む1mlのフラクションを得た。10mMポリリン酸シグマ社ホスフェートグラスP65、20mMフルクトース6リン酸、5mMADP、50mMMOPSNaOH、25mMKCl、5mMMgCl2を含む溶液を70°Cに保温し、精製したポリリン酸キナーゼ5mg、ホスホフルクトキナーゼ5mgを添加した。経時的に溶液を分取し、合成されフルクトース1,6二リン酸をExtremophiles3121129に記載の方法によって測定した。同反応に於いて、ポリリン酸キナーゼを含まない反応を対象とした。その結果、ポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼを含む反応ではフルクトース1,6二リン酸が合成され、ポリリン酸キナーゼを含まずホスホフルクトキナーゼのみを含む反応ではフルクトース1,6二リン酸が合成されないことが分かった。また、ポリリン酸を含まない反応系でもフルクトース1,6二リン酸は合成されない。このことから、ポリリン酸によってATPが再生され、それによってフルクトース1,6二リン酸が合成されていることがわかった。精製したポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼによるフルクトース1,6二リン酸の合成反応を図7に示す。実施例6:耐熱性ポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼを発現する大腸菌の構築pETPPKとpETPFKは、それぞれポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼを発現するプラスミドであるが、同じ大腸菌内では共存できない。そこで、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子をpETベクターと共存できるpACYCプラスミドへ移した。方法は2種のオリゴヌクレオチドプライマーGAAGAATTCAATGAAACGCATCGGGGTGTTEcoRIサイト付加、配列番号7およびTATAAGCTTGAGGGCCAGCACCTGCGATAHindIIIサイト付加、配列番号8を作製し、pETPFKを鋳型としてPCRを行った。反応はKODPlusDNAポリラーゼを用いた。反応条件は、96°Cで2分間保持した後、94°Cで30秒間、55°Cで30秒間、68°Cで1分間の反応を10サイクル繰り返し、更に94°Cで30秒間、61°Cで30秒間、68°Cで1分の反応を15サイクル繰り返した。PCR産物および発現ベクターpACYCを制限酵素EcoRIおよびHindIIIにより37°C2時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したそれぞれのDNA断片をLigationHighにより16°C2時間ライゲーションし、大腸菌MV1184株に形質転換した。得られたコロニーから目的のDNA断片が挿入されたプラスミドを抽出し、pACYCPFKを構築した。図8にpACYCPFKの構成を示した。pETPPKを保持する大腸菌BL21にpACYCPFKを導入した。pETPPKとpACYCPFKを同一菌体内に持つBL21を、LB培地でOD600が0.5になるまで37°Cで培養後、0.2mMIPTGを添加して22°Cで8時間培養を行った。実施例7:耐熱性ポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼを発現する大腸菌を用いたフルクトース6リン酸からフルクトース1,6二リン酸の合成10mMポリリン酸シグマ社ホスフェートグラスP65、10mMフルクトース6リン酸、5mMADP、50mMMOPSNaOH、25mMKCl5mMMgCl2を含む溶液を70°Cに保温し、pETPPKとpACYCPFKを同一菌体内に持つBL21の細胞2x107を混合した。経時的に溶液を分取し、合成されフルクトース1,6二リン酸を前記Extremophiles3121129に記載の方法によって測定した。耐熱性ポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼを発現する大腸菌を用いて、フルクトース1,6二リン酸の合成が起こることを図9に示す。"