"所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する、顕微鏡装置。所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する、顕微鏡装置。所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する、顕微鏡装置。所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する、顕微鏡装置。前記画像形成装置は、前記観察領域に前記活性化光を照射する動作と、活性化光を照射された後の前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを交互に繰り返すことにより複数の前記蛍光画像を取得する、請求項1又は3に記載の顕微鏡装置。前記画像形成装置は、前記観察領域に対して前記活性化光を照射する動作と前記励起光を照射する動作とを少なくとも一部の期間において同時に実行する、請求項1又は3に記載の顕微鏡装置。前記画像形成装置において前記試料に照射される前記活性化光又は前記励起光の照射強度は、前記蛍光強度分布において前記蛍光強度が相対的に高い領域において相対的に低い強度に設定され、前記蛍光強度が相対的に低い領域において相対的に高い強度に設定される、請求項1から5のいずれか1項に記載の顕微鏡装置。前記照射強度設定装置は、前記蛍光強度分布を所定の蛍光強度の範囲毎に複数の水準に分類し、各々の前記水準毎に照射強度を設定する、請求項7に記載の顕微鏡装置。前記照射強度設定装置は、前記蛍光強度分布を階調反転させた分布に基づいて照射強度を設定する、請求項7に記載の顕微鏡装置。前記照射強度設定装置は、前記画像形成装置により取得された前記蛍光画像における蛍光輝点の密度に基づいて、前記活性化光の照射強度を再設定する、請求項1から9のいずれか1項に記載の顕微鏡装置。前記照射強度設定装置は、前記画像形成装置により取得された前記蛍光画像における蛍光輝点の平均間隔が、当該顕微鏡装置の光学分解能の2倍以上となるまで、前記活性化光の照射強度の設定を繰り返す、請求項10に記載の顕微鏡装置。前記照射強度設定装置は、前記蛍光強度分布における前記蛍光物質の密度が相対的に高い領域に合わせて前記活性化光又は前記励起光の照射強度を設定し、前記画像形成装置は、設定された前記照射強度の前記活性化光又は前記励起光を前記観察領域に対して照射する、請求項1から4のいずれか1項に記載の顕微鏡装置。前記画像形成装置は、生成した前記試料画像に対して前記活性化光又は前記励起光の照射強度分布の情報を付加した情報付加画像を生成する、請求項1から11のいずれか1項に記載の顕微鏡装置。前記画像形成装置は、複数の前記蛍光画像を重畳させて前記試料画像を生成する際に、複数の前記蛍光画像間で同一とみなせる座標に存在する複数の蛍光輝点を単一の蛍光輝点とする、請求項1から12のいずれか1項に記載の顕微鏡装置。前記画像形成装置は、複数の前記蛍光画像を時系列に沿って所定の時間間隔又は所定の枚数毎に区画し、各区画に属する複数の前記蛍光画像を重畳することにより複数の時系列画像を生成する、請求項1から12のいずれか1項に記載の顕微鏡装置。前記分布測定装置及び前記画像形成装置は、全反射蛍光観察によって前記蛍光画像を取得する、請求項1から15のいずれか1項に記載の顕微鏡装置。所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する、観察方法。所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する、観察方法。所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する、観察方法。所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する、観察方法。従来の観察方法では、同一視野内に蛍光物質の密度が大きく異なる複数の領域が存在する場合には、高密度に蛍光物質が配置された部位において個々の蛍光輝点を分離検出できないために、高解像度の画像を得ることができなかった。本発明の態様は、同一視野内で蛍光物質の分布に偏りがある場合でも高解像度の画像を得ることができる顕微鏡装置、および観察方法を提供することを目的とする。本発明のいくつかの態様は次のような試料の顕微鏡装置、観察方法を提供した。すなわち、本発明の一態様にかかる顕微鏡装置は、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する。また本発明の一態様にかかる顕微鏡装置は、所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する。また本発明の一態様にかかる顕微鏡装置は、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記活性化光照射後の前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する。また本発明の一態様にかかる顕微鏡装置は、所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する。また本発明の一態様にかかる観察方法は、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する。また本発明の一態様にかかる観察方法は、所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する。また、本発明の一態様にかかる観察方法は、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する。また本発明の一態様にかかる観察方法は、所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する。本発明の態様にかかる顕微鏡装置、および観察方法によれば、同一視野内で蛍光物質の分布に大きな偏りがある場合でも高解像度の画像を得ることができる。以下、図面を参照して試料の観察方法、および顕微鏡装置の一実施形態について説明する。なお、本実施形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。また、以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率などが実際と同じであるとは限らない。第1の実施形態図1は、第1の実施形態に係る顕微鏡装置を示す概要図である。顕微鏡装置10は、顕微鏡本体15と、顕微鏡本体15に装着された励起照明系11と、活性化照明系13と、制御部14と、記憶部16と、表示部17とを備えている。本実施形態の顕微鏡装置10は超解像顕微鏡技術StochasticOpticalReconstructionMicroscopy;STORMを用いた顕微鏡装置である。顕微鏡装置10では、所定波長の活性化光L2を照射されると活性化し、活性化状態で活性化光L2とは異なる波長の励起光L1を照射されると蛍光を発して不活性化する蛍光物質を標識として付与された試料を用いる。そして、励起照明系11と活性化照明系13とを用いて試料中の一部の蛍光物質のみを発光させることで離散的に分布した蛍光を観察する動作を繰り返し、これにより取得した多数の蛍光画像を用いて試料画像を形成する。顕微鏡本体15は、例えば、倒立顕微鏡である。顕微鏡本体15は、観察対象である試料を載置するステージ31を備えており、レーザ光源21から照射される励起光L1をステージ31に向けて反射させる全反射ミラー32と、後述するレーザ光源41から照射される活性化光L2をステージ31に向けて反射させる一方、励起光L1を透過させるダイクロイックミラー33と、ステージ31に載置された試料の蛍光画像を撮像するカメラ34と、が接続されている。また図示は省略しているが、顕微鏡本体15には、ステージ31に励起光L1及び活性化光L2を照射する対物レンズや、試料から放射された蛍光観察光をカメラ34の受光面に結合させる結像レンズなどが設けられている。ステージ31は、試料に貼り付けられたカバーガラスと試料との界面で励起光L1及び活性化光L2を全反射させる全反射照明が可能に構成されている。全反射照明によれば、照明光励起光L1、活性化光L2が全反射する際にカバーガラスから試料側へにじみ出るエバネッセント光により試料を照明することができる。エバネッセント光が届く範囲は界面から100~150nm程度の範囲に限られるため、カバーガラス表面近傍に位置する蛍光物質のみを発光させることができ、バックグランウドの蛍光を著しく低減することで高いS/N比で実現することができる。なお、本実施形態の顕微鏡本体15は、上記の全反射照明と、通常の落射照明とを切り替えて使用可能に構成されている。励起照明系11は、レーザ光源21と、シャッタ22と、全反射ミラー32とを備えており、全反射ミラー32を介して顕微鏡本体15に接続されている。レーザ光源21は、試料に付与した蛍光物質を発光させるための励起光L1を顕微鏡本体15に供給する光源である。レーザ光源21は、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の励起光L1を射出するものであればよく、例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ波長532nm、赤色レーザ波長633nm、657nm、紫色レーザ波長405nm、青色レーザ波長457nmなどを用いることができる。シャッタ22は、顕微鏡本体15への励起光L1の供給、停止を切り替える装置であり、例えば、レーザ光源21から射出される励起光L1を遮蔽する遮光部材と、この遮光部材を励起光L1の光路に対して進退させる駆動装置とを備えた構成とすることができる。あるいはシャッタ22として、AOTFAcoustoOpticTunableFilter;音響光学フィルタを用いても良い。励起照明系11は、ステージ31上の観察視野観察領域の全域に対して励起光L1を照射するように構成されている。活性化照明系13は、レーザ光源41と、AOTF42と、スキャナ43と、ダイクロイックミラー33とを備えており、ダイクロイックミラー33が励起光L1の光路上に挿入されることで、活性化照明系13と顕微鏡本体15とが接続されている。レーザ光源41は、蛍光物質を活性化するための活性化光L2を顕微鏡本体15に向けて照射する。レーザ光源41は、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の活性化光L2を射出するものであればよく、例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ波長532nm、赤色レーザ波長633nm、657nm、紫色レーザ波長405nm、青色レーザ波長457nmなどを用いることができる。AOTF42は、音響光学フィルタAcoustoOpticTunableFilterであり、例えば二酸化テルルなどの複屈折結晶に超音波発振器からの超音波を加えることで、この複屈折結晶内に生じる疎密波を利用して、レーザ光源41から入射された活性化光L2を分光偏光させる機能を有する。AOTF42は、レーザ光源41から入射する活性化光L2の強度を設定値に制御し、スキャナ43に向けて射出する。スキャナ43は、活性化光L2を顕微鏡本体15のステージ31上で走査する。スキャナ43としては、例えば、二軸のガルバノスキャナを用いることができる。活性化照明系13は、ステージ31上の観察視野観察領域に対して、AOTF42により変調された照射強度の活性化光L2を、スキャナ43により走査しながら照射可能に構成されている。制御部14は、顕微鏡装置10を総合的に制御するコンピュータであり、記憶部16と、表示部17と、AOTFコントローラ18と、カメラコントローラ19とに接続されている。本実施形態において、制御部14は、少なくとも、これらの装置を制御するための制御信号を生成する制御信号生成機能と、カメラコントローラ19を介して蛍光画像を取得する蛍光画像取得機能と、取得した蛍光画像を解析する画像解析機能と、複数の蛍光画像から試料画像を生成する画像形成機能と、を有する。記憶部16は、例えば半導体メモリやハードディスクなどからなり、制御部14において使用されるプログラムや制御部14から供給されるデータ蛍光画像などを、制御部14から読出可能な状態で記憶する。表示部17は、例えばモニタ表示装置やプリンタ印刷装置であり、制御部14から出力される画像データに基づく映像を表示、印刷する機能を提供する。AOTFコントローラ18は、活性化照明系13に備えられたAOTF42を駆動制御する。AOTFコントローラ18は、制御部14から入力される制御信号に基づいてAOTF42を駆動し、レーザ光源41から出力された活性化光L2を変調する。カメラコントローラ19は、顕微鏡本体15に接続されたカメラ34を駆動制御する。カメラコントローラ19は、制御部14から入力される制御信号に基づいてカメラ34を動作させ、試料から放射された蛍光の画像を取得し、取得した蛍光画像を制御部14に出力する。なお、励起照明系11において、シャッタ22と全反射ミラー32との間に、AOTFが設けられていてもよい。また、活性化照明系13において、例えばAOTF42とスキャナ43との間に、シャッタが設けられていてもよい。さらに、レーザ光源21とレーザ光源41とを1つの筐体内に備え、複数種のレーザ光を射出可能に構成されたレーザ光源装置を採用してもよい。このようなレーザ光源装置を備える場合、レーザ光源装置とともにシャッタ22やAOTF42、スキャナ43を備えた照明系を構成することで、1つの照明系により励起光L1と活性化光L2の両方を顕微鏡本体15に供給可能となる。顕微鏡装置10は、制御部14に備えられた上記の機能を組み合わせて実行することにより、後述する観察方法の実施に必要な各種の動作を実現する。したがって、顕微鏡装置10は、蛍光物質の分布に対応する蛍光強度分布を測定する分布測定装置、観察領域の部分毎の活性化光の照射強度を設定する照射強度設定装置、及び、STORM撮影処理及び画像処理により試料画像を生成する画像形成装置の機能を兼ね備えたものである。次に、顕微鏡装置10を用いた観察方法について説明する。図2は、本実施形態の観察方法を示すフローチャートである。本実施形態の観察方法は、分布測定ステップS101と、照射強度設定ステップS102と、画像形成ステップS103と、からなる。分布測定ステップS101は、顕微鏡装置10において第1の蛍光画像を取得するステップS11と、第1の蛍光画像における二次元輝度分布蛍光強度分布を計算するステップS12とを含む。照射強度設定ステップS102は、上記の蛍光強度分布に基づいて活性化光L2の二次元強度マップ照射強度分布を設定するステップS13を含む。画像形成ステップS103は、二次元強度マップに基づき照射強度を制御された活性化光L2を試料に照射するステップS14と、試料に励起光L1を照射して第2の蛍光画像を取得するステップS15と、第2の蛍光画像を保存するステップS16と、撮影終了を判定するステップS17と、複数の第2の蛍光画像から試料画像を生成するステップS18と、を含む。顕微鏡装置10による観察手順の概略は以下の通りである。まず、分布測定ステップS101において、試料における蛍光物質の存在密度に対応する二次元輝度分布を把握する。その後、照射強度設定ステップS102において、二次元輝度分布に基づいて試料の領域毎に活性化光L2の照射強度を設定する二次元強度マップの作成。その後、画像形成ステップS103において、二次元強度マップに基づいて活性化光L2の強度を変調しながら試料に照射する動作と、励起光L1を照射して第2の蛍光画像を得る動作とを、数百回から数万回繰り返すSTORM撮影処理。そして、撮影した多数の第2の蛍光画像を合成することで、高解像度の試料画像を得るSTORM画像処理。以下、各段階の手順について詳細に説明する。まず、顕微鏡装置10のステージ31上に、標識として蛍光物質を付与された試料がセットされる。観察対象となる試料は、例えば培養液に浸漬された細胞などである。蛍光物質としては、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発して不活性化する蛍光物質が用いられる。具体的には、米国特許公開第2008/0032414号明細書に記載されたものを用いることができ、例えば、2種類のシアニン染料を結合させた染料対Cy3-Cy5染料対、Cy2-Cy5染料対などを用いることができる。上記の染料対において、一方の染料第1の染料が励起光により発光する光放射部分を形成し、他方の染料第2の染料が、光照射に応答して第1の染料を活性化するか、あるいは第1の染料の状態を切り替えるスイッチとして機能する活性化部分を形成する。例えば、Cy3-Cy5染料対では、Cy5が光放射部分であり、Cy3はCy5を活性化可能な活性化部分である。したがって、Cy3-Cy5染料対を含む蛍光物質に、Cy3の吸収波長に対応する緑色レーザ532nmを照射すると、光放射部分であるCy5が活性化され、Cy5が蛍光状態に移行する。そして、Cy5が蛍光状態にある蛍光物質に対してCy5の吸収波長に対応する赤色レーザ633nmを照射すると、Cy5が発光するとともに、非活性状態暗状態に戻る。STORMでは、蛍光物質における蛍光状態と暗状態とのスイッチング動作を制御することで、試料に付与された蛍光物質のごく一部のみを選択的に発光させ、蛍光物質を1分子レベルで検出可能としている。ステージ31への試料のセットが完了したならば、制御部14は、分布測定ステップS101を開始する。分布測定ステップS101では、まず、第1の蛍光画像を取得するステップS11が実行される。ステップS11では、最初に、活性化照明系13から射出される活性化光L2が顕微鏡本体15に供給され、ステージ31上の試料に対して活性化光L2が照射される。このとき、励起照明系11のシャッタ22が閉状態とされることで励起光L1が遮断され、顕微鏡本体15には活性化光L2のみが入射する。また、AOTF42は、制御部14から入力される制御信号に基づいて動作するAOTFコントローラ18により、レーザ光源41から入射する活性化光L2を一定強度で出力する状態とされる。そして、スキャナ43により活性化光L2が観察視野全域に対して走査され、視野全域の試料に対して均一な強度の活性化光L2が照射される。これにより、視野全域にわたって試料に含まれる蛍光物質が活性化される。例えば、蛍光物質がCy3-Cy5染料対を有する場合には、光放射部分であるCy5が蛍光状態に移行し、発光可能な状態となる。なお、活性化光L2は全反射照明、落射照明のいずれの形態で試料に照射してもよい。図3は、全反射照明により活性化光L2あるいは励起光L1を試料Sに照射する場合を示す説明図である。図3に示すように、ステージ31のカバーガラス31a上に試料Sが配置されており、活性化光L2はカバーガラス31aの下方からカバーガラス31aの表面に対して斜めに入射する。そして、活性化光L2はカバーガラス31aと試料Sとの界面で全反射され、上記界面から試料S側へにじみ出すエバネッセント光EVが試料Sの界面側表層に照射される。これにより、試料Sのごく表層部分に位置する蛍光物質のみが選択的に活性化される。一方、落射照明の場合には、カバーガラス31aの法線方向に活性化光L2を入射させ、カバーガラス31aを透過させた活性化光L2を試料Sに照射する。この場合、試料Sの厚さ方向の全体に活性化光L2が照射される。続いて、活性化照明系13が活性化光L2を射出しない状態とされるとともに、励起照明系11のシャッタ22が開状態とされ、レーザ光源21から射出される励起光L1が全反射ミラー32を介して顕微鏡本体15に供給される。本実施形態の顕微鏡装置10では、励起照明系11から供給された励起光L1は観察視野全域に照射される。そうすると、活性化光L2で活性化されている蛍光物質は、励起光L1が照射されることにより蛍光を発するとともに、不活性状態に移行する。この蛍光物質が発する蛍光を、カメラコントローラ19を介してカメラ34を動作させることで撮影し、第1の蛍光画像を取得することができる。撮影された第1の蛍光画像はカメラコントローラ19から制御部14に送信され、制御部14は必要に応じて第1の蛍光画像を記憶部16に記憶させる。次に、ステップS12では、制御部14において、第1の蛍光画像における二次元輝度分布蛍光強度分布が算出される。ここで図4は、分布測定ステップS101で得られる第1の蛍光画像を概略的に示す図である。図4に示す第1の蛍光画像E1では、図中に印で示された蛍光の輝点が、観察視野E内に偏って存在している。すなわち、試料の部位により蛍光物質の存在密度が異なっているために、蛍光物質が多い部分では輝点が多く、そのために蛍光強度が強くなる。一方、蛍光物質が少ない部分では輝点が少なく、したがって蛍光強度が弱くなる。このような蛍光強度の偏りは、あらゆる試料において通常見られる現象であり、例えば細胞試料等では、細胞組織ごとの密度の差異によって蛍光強度分布二次元輝度分布の不均一を生じる。図4において、輝点が密集している領域蛍光強度が強い部分は、例えば細胞中の細胞核近傍の部分に対応し、輝点が散在している領域蛍光強度が低い部分は、例えば細胞内の小器官の部分に対応する。第1の蛍光画像E1から観察視野における蛍光強度の分布を導出することで、例えば、図5に示すような二次元輝度分布を得ることができる。図5に示す二次元輝度分布EMは、領域R1~R4の4つの領域に区画されており、各々の領域R1~R4に対して、蛍光強度の水準レベルが設定されている。領域R1は、輝点密度が最も大きく、放射強度が最も大きい範囲に対応する。以後、領域R2、R3、R4の順に、輝点密度が小さくなり、より低い放射強度の範囲に対応して分類されている。なお、図5では、蛍光強度を4水準に分類しているが、分類する水準の数は特に限定されない。AOTF42による制御が可能な範囲で細かく分類することが可能である。以上の手順により二次元輝度分布EMを取得したならば、照射強度設定ステップS102に移行し、二次元強度マップを作成、保存するステップS13が実行される。ステップS13において、制御部14は、分布測定ステップS101で算出した二次元輝度分布EMに基づいて、観察視野の位置毎に活性化光L2の照射強度を規定する二次元強度マップを作成する。二次元強度マップの作成にあたっては、図5に示した二次元輝度分布EMにおいて蛍光強度が最も高い領域R1に対する活性化光L2の照射強度を最も低く設定する一方、蛍光強度が最も低い領域R4に対する活性化光L2の照射強度を最も高く設定する。領域R2、R3については、それぞれの放射強度のレベルに応じて領域R1、R4の中間の照射強度に設定される。すなわち、観察視野において、蛍光物質が多く存在する領域R1、R2には比較的弱い活性化光L2が照射されるようにし、蛍光物質が少ない領域R3、R4には、比較的強い活性化光L2が照射されるようにする。二次元強度マップは、本実施形態の場合、AOTFコントローラ18に出力する制御信号のマップであるため、AOTF42において活性化光L2に対する所望の変調照射強度の変化が可能であれば、そのデータ形式は特に限定されない。二次元強度マップは、例えば、分布測定ステップS101で得られた二次元輝度分布EMにおいて、領域R1~R4に、それぞれの放射強度のレベルの逆数を割り当てたマップとして作成することができる。例えば、領域R1~R4の放射強度のレベルがそれぞれ4,3,2,1であれば、二次元強度マップにおける領域R1~R4には、それぞれ0.251/4、0.331/3、0.51/2、11/1が照射強度の制御値として設定される。あるいは、二次元輝度分布EMを階調反転させた反転画像として作成してもよい。例えば、領域R1~R4の放射強度のレベルに対応する階調値が200、150、100、50であり、階調値の範囲が1~255であるとしたとき、二次元強度マップにおける領域R1~R4には、それぞれ55、105、155、205が照射強度の制御値として設定される。このようにして照射強度設定ステップS102で生成された二次元強度マップ照射強度分布のデータは、制御部14から記憶部16に保存される。二次元強度マップの設定が終了したならば、制御部14は、画像形成ステップS103を開始する。画像形成ステップS103では、照射強度設定ステップS102で設定された二次元強度マップを用いて数百から数万枚の第2の蛍光画像を取得するSTORM撮影処理ステップS14~S17と、第2の蛍光画像から試料画像を生成するSTORM画像処理ステップS18とが実行される。まず、ステップS14では、制御された活性化光L2が試料に照射される。顕微鏡装置10では、励起照明系11のシャッタ22が閉状態とされ、顕微鏡本体15には活性化光L2のみが供給される。制御部14は、記憶部16に保存されている二次元強度マップを読み出し、二次元強度マップを構成する個々のデータ制御信号を、AOTFコントローラ18に送信する。AOTFコントローラ18は、入力された制御信号に基づいてAOTF42を駆動する。活性化照明系13では、レーザ光源41から射出された活性化光L2が、AOTFコントローラ18により駆動されるAOTF42により二次元強度マップに設定された照射強度に変調される。そして、照射強度を制御された活性化光L2がスキャナ43により位置制御されてダイクロイックミラー33に入射し、ダイクロイックミラー33で反射されてステージ31上の観察視野の所定位置に照射される。このとき、顕微鏡装置10が全反射照明モードにある場合には、図3に示したように、活性化光L2はエバネッセント光EVとして試料Sに照射され、試料Sのごく表層部分に位置する蛍光物質のみが選択的に活性化される。上記のステップS14では、二次元強度マップに基づいて、観察視野の部分毎に制御された照射強度の活性化光L2が照射されるので、観察視野内の蛍光物質が相対的に高密度に存在する領域高密度領域には相対的に低い強度の活性化光L2が照射され、蛍光物質が相対的に低密度に存在する領域低密度領域には相対的に高い強度の活性化光L2が照射される。そうすると、上記の高密度領域では蛍光物質が活性化される確率が相対的に低くなり、低密度領域では活性化される確率が相対的に高くなる。しかしその一方で、高密度領域では蛍光物質の量が多く、低密度領域では蛍光物質の量が少ないため、活性化光L2により活性化される蛍光物質の量は、高密度領域と低密度領域とでほぼ同等の量になる。次に、ステップS15に移行すると、活性化照明系13が活性化光L2を射出しない状態とされるとともに、励起照明系11のシャッタ22が開状態とされ、レーザ光源21から射出される励起光L1が全反射ミラー32を介して顕微鏡本体15に供給される。これにより、励起光L1が観察視野全域に照射され、活性化光L2で活性化されている蛍光物質のみが選択的に発光する。蛍光を発した蛍光物質は不活性状態に移行する。この蛍光物質が発する蛍光を、カメラコントローラ19を介してカメラ34を動作させることで撮影し、第2の蛍光画像を取得することができる。撮影された第2の蛍光画像はカメラコントローラ19から制御部14に送信される。ここで図6は、第2の蛍光画像を概略的に示す図である。図6に示す第2の蛍光画像E2では、撮影された蛍光の輝点を印で示し、二次元輝度分布EMにおける領域R1~R4の境界を重ねて図示することで、領域R1~R4のそれぞれにおける輝点の密度を識別可能にしている。図6に示すように、本実施形態で取得される第2の蛍光画像E2は、領域R1~R3の各領域における輝点印の密度がほぼ均一化されたものとなる。これは、領域R1に対する活性化光L2の照射強度を低くするとともに、領域R3に対する活性化光L2の照射強度を高めることで、領域R1~R3において活性化される蛍光物質の量がほぼ同等となるように補正しているからである。そして、ステップS16において、制御部14は受信した第2の蛍光画像を記憶部16に記憶させる。第2の蛍光画像が記憶部16に保存されたならば、ステップS17において、STORM撮影処理が終了したか否かが判定される。すなわち、予め設定された枚数の第2の蛍光画像の取得が終了したか否かが判定される。第2の蛍光画像の枚数が予定数に達していない場合には、ステップS14に戻り、上述したステップS14~S16が繰り返し実行される。本実施形態の場合、ステップS15において発光した蛍光物質は、発光するとともに不活性化されるため、ステップS17からステップS14に戻って活性化光L2の照射が再度行われる場合には、試料Sに含まれる蛍光物質は不活性状態である。そのため、ステップS14を再実行する毎に、活性化される蛍光物質は確率的に異なるものとなり、その後のステップS15で取得される第2の蛍光画像は、前のサイクルで取得された第2の蛍光画像と異なる輝点パターンを示すものとなる。このようにして、ステップS14~S16を繰り返し実行することで、輝点の位置が異なる第2の蛍光画像を数百枚~数万枚取得する。なお、このような数百から数万回の第2の蛍光画像の取得が可能となるのは、試料Sに付与された蛍光物質が、発光させたときに不活性状態に戻る性質を有していることから、1回の撮影毎の発光時間を短くすることができ、退色までの期間を長くすることができること、及び、活性化光L2によって活性化する蛍光物質が全体のごく一部であり、1回の撮影で発光させる蛍光物質が比較的少ないことによる。一方、予定数の第2の蛍光画像の撮影が完了している場合には、ステップS17において終了と判定され、ステップS18に移行する。ステップS18では、記憶部16に蓄積された数百~数万枚の第2の蛍光画像を重ね合わせることで、試料画像を生成する。第2の蛍光画像を重ね合わせる際には、制御部14において、複数の第2の蛍光画像の間でほぼ同一と見なせる座標に存在する複数の蛍光輝点は、単一の蛍光輝点となるように変換する。本実施形態では領域毎に活性化光L2の照射強度を異ならせているため、領域毎に蛍光物質が活性化される確率が異なることとなる。特に蛍光物質の存在密度が比較的低い領域R3において、活性化光L2の照射強度を高めていると、領域R3では同一の蛍光物質が活性化される確率が高くなる。そこで、上記のように同一と見なせる蛍光輝点を間引くことで、照射強度を変化させたことに起因する試料画像の不具合の発生を防止することができる。なお、同一と見なせる蛍光輝点は、それらの間隔によって判断することができ、例えばSTORMの分解能約20nm未満の間隔である場合に同一の蛍光輝点と判定するように設定する。あるいは、上述の蛍光輝点を間引く方法に代えて、生成した試料画像に対して二次元強度マップの情報を付加した情報付加画像を生成する方法を採用してもよい。すなわち、第2の蛍光画像をそのまま重ねることで試料画像を作成し、作成された試料画像に対して、領域R1~R4のそれぞれで異なる色の着色を施してもよい。このようにすると、蛍光物質の存在密度が比較的大きい領域R1において画像がつぶれてしまうのを防止できるとともに、存在密度が比較的低い領域R3における画像の鮮明度を向上させることができる。その一方で、あたかも蛍光物質が一様に分布しているような試料画像となるため、照射強度を変化させた領域R1~R4を色分けして表示する等により二次元強度マップの情報を付加することで、蛍光物質の存在密度に基づく情報をユーザーに提供することができる。なお、活性化光L2の照射強度に応じた情報としては、上記の色分けの他に、領域R1~R4の境界線を試料画像に重ねて示す方法や、領域R1~R4に対応させて試料画像の背景色を異ならせる方法などを用いてもよい。以上に説明した本実施形態の観察方法によれば、観察視野において蛍光物質の存在密度に偏りがあったとしても、鮮明な試料画像を得ることができる。以下、かかる作用効果について詳細に説明する。従来のSTORM撮影処理では、図4に示した第1の蛍光画像E1のように蛍光物質の偏りがある場合、領域R1のような蛍光物質が密集した領域では、画像がつぶれてしまっていた。これは、図7Bに示すように、蛍光輝点同士が近接して配置されていると、検出パルスが分離不可能に重なってしまい、2つの蛍光輝点として検出することができなくなるためである。蛍光物質の1分子ごとの蛍光輝点を検出するには、図7A、図7Cに示すように、蛍光物質の分子1つが孤立しているか、あるいは蛍光物質の分子同士が適度に離れて配置されている必要がある。そこで、本実施形態の観察方法では、観察視野における蛍光物質の存在密度に応じて活性化光L2の照射強度を異ならせることとした。すなわち、蛍光物質が相対的に多く存在する領域には相対的に弱い活性化光L2を照射し、蛍光物質が相対的に少ない領域には相対的に強い活性化光L2を照射することとした。これにより、図6に示したように、領域R1~R3の各領域における蛍光輝点印の密度をほぼ均一化することができるとともに、図7Cに示したような、蛍光輝点同士がほどよく離れている状態とすることができる。したがって、図6に基づく蛍光輝点の検出によれば、蛍光物質の1分子に対応する蛍光輝点を識別することが可能である。なお、図6において、蛍光輝点同士の平均的な間隔は、活性化光L2の照射強度により調整することができる。活性化光L2の照射強度を高めれば、より多くの蛍光物質が活性化されることから、蛍光輝点同士の平均的な間隔が狭くなり、逆に照射強度を低くすると間隔が広くなる。蛍光輝点同士の間隔は、狭すぎると図7Cに示したように個々の蛍光輝点を検出することが困難になる。一方、蛍光輝点同士の間隔が広すぎると第2の蛍光画像の1枚当たりの蛍光輝点の数が少なくなるために、第2の蛍光画像の必要枚数が多くなり、測定時間が長くなったり、蛍光物質の退色の問題が生じやすくなったりする。したがって、蛍光輝点同士の平均的な間隔蛍光輝点の存在密度が適切な範囲となるように、活性化光L2の照射強度を調整することが好ましい。具体的に、第2の蛍光画像における蛍光輝点同士の間隔は、顕微鏡装置10の光学分解能の2倍以上とすることが好ましく、3倍程度とすることがより好ましい。少なくとも光学分解能の2倍以上の間隔があれば、個々の蛍光輝点を識別することができる。また、光学分解能の3倍程度とすれば、蛍光輝点を比較的高密度に配置することができるので、効率良く観察を行うことができる。例えば、顕微鏡装置10の光学分解能が200nmであるならば、第2の蛍光画像における蛍光輝点同士の平均的な間隔が、600nm程度となるように、活性化光L2の照射強度を調整すればよい。詳しくは、二次元強度マップにおいて、領域ごとの制御値の差又は比率を維持したまま、二次元強度マップ全体の制御値を増加又は減少させればよい。また、上記の蛍光輝点同士の間隔を調整するために、ステップS15で取得した第2の蛍光画像に基づいて、活性化光L2の照射強度の再調整を行ってもよい。この場合、制御部14において、カメラコントローラ19から取得した第2の蛍光画像を解析し、蛍光輝点同士の平均的な間隔を算出する。そして、算出された間隔が光学分解能の2倍未満である場合には、次に実行されるステップS14において照射する活性化光L2の照射強度を低く補正する。あるいは、算出された間隔が光学分解能の例えば4倍以上と広すぎる場合には、活性化光L2の照射強度を高く補正する。さらに、上記の補正後に第2の蛍光画像から蛍光輝点同士の平均的な間隔を算出し、算出された間隔が適切な範囲を超えている場合には、上記の活性化光L2の照射強度の補正を再度実施してもよい。またさらに、蛍光輝点同士の平均的な間隔が適切な範囲少なくとも光学分解能の2倍以上となるまで、活性化光L2の照射強度の補正を繰り返してもよい。また本実施形態において、ステップS14における活性化光L2の照射を行った後、ステップS15、S16による第2の蛍光画像の取得動作を、複数回繰り返して実行してもよい。これにより、活性化させた蛍光物質を有効に利用して第2の蛍光画像を効率良く取得することができる。なお、発光した蛍光物質は不活性化するため、このように励起光L1の照射を繰り返すと、観測される蛍光の輝点数が徐々に減少していく。輝点数が少なすぎると第2の蛍光画像を取得する時間が無駄になるため、ステップS15の繰り返し回数は、2~5回程度である。上記のように1回の活性化光照射に対して複数回の励起光照射を行う場合には、最初の励起光照射により取得される第2の蛍光画像に基づいて、輝点の平均間隔の調整活性化光L2の照射強度の調整を行う。2回目以降の第2の蛍光画像では輝点の数が減って平均間隔が大きくなるため、個々の輝点を検出しやすくなるからである。上記のように第2の蛍光画像の情報に基づいて活性化光L2の照射強度を調整し、次回以降のサイクルで得られる第2の蛍光画像における蛍光輝点同士の間隔を適切な範囲に調整することで、高解像度の画像を効率良く取得することが可能となる。また本実施の形態において、第1の蛍光画像を、第2の蛍光画像の一部として用いてもよい。第1の蛍光画像も試料の蛍光物質の蛍光輝点を撮影したものであるため、第2の蛍光画像とともに重畳して試料画像の作成に用いることができる。第1の蛍光画像において蛍光輝点が過度に密集した領域が生じないように活性化光L2の強度を調整しておくと、試料画像の重畳に好適に用いることができる第1の蛍光画像とすることができる。また本実施形態において、二次元強度マップ作成のための第1の蛍光画像を複数枚取得してもよい。この場合に、第1の蛍光画像を取得する度に活性化光L2を試料に照射してもよく、活性化光L2を1回照射した後、第1の蛍光画像の取得動作を複数回実行してもよい。そして、二次元強度マップを作成する際には、取得した複数の第1の蛍光画像を重畳した画像において二次元輝度分布を算出し、かかる二次元輝度分布に基づいて二次元強度マップを作成する。二次元強度マップの作成に複数の第1の蛍光画像を用いるようにすることで、個々の第1の蛍光画像における蛍光輝点の数を減らすことができるため、試料画像の一部として用いることができる第1の蛍光画像を得やすくなる。第2の実施形態図8は、第2実施形態に係る顕微鏡装置を示す概要図である。なお、図8中の第1実施形態と共通の構成要素には同一の符号を付し、それらについての詳細な説明は省略する。第2実施形態の顕微鏡装置60は、第1実施形態の活性化照明系13に代えて、活性化照明系63を備えた構成である。活性化照明系63は、水銀ランプ61と、空間光変調装置62と、ダイクロイックミラー33とを備えており、ダイクロイックミラー33を介して顕微鏡本体15に接続されている。空間光変調装置62には、光変調コントローラ68が接続され、光変調コントローラ68は制御部14と接続されている。空間光変調装置62は、例えば、DMDデジタルミラーデバイス;登録商標や液晶パネルである。DMDは、多数の微小鏡面マイクロミラーを平面に配列した構成を備えている。空間光変調装置62としてDMDを用いた場合には、光変調コントローラ68から入力される駆動信号に基づいてマイクロミラーの角度を高速にスイッチングし、入射光を反射させる方向を制御することで、個々のマイクロミラーに対応する領域の射出光量を制御することができる。これにより、活性化照明系63は、水銀ランプ61から射出される活性化光L3を、空間光変調装置62により変調し、所望の照射強度分布を有する面照明として顕微鏡本体15に供給することができる。第2実施形態の顕微鏡装置60では、活性化光L2を変調する装置として空間光変調装置62を用いているので、第1実施形態と同様に観察視野に対して、その領域毎に制御された照射強度の活性化光L2を照射することができる。したがって、第1実施形態と同様の観察方法を実施することができる。なお、第2実施形態に係る活性化照明系63では、第1実施形態の活性化照明系13のようにレーザ光を走査するスキャナを設ける必要はない。第3の実施形態以上の実施形態では、活性化用と励起用に波長の異なる2つのレーザを用いる顕微鏡装置について説明してきた。一方、1つの短波長レーザのみを用いる超解像顕微鏡技術として、dSTORMdirectStochasticOpticalReconstructionMicroscopyが知られている例えば、論文:AppliedPhysicsB93725731Photoswitchingmicroscopywithstandardfluorophores、SvandeLindeRKasperMHeilemannMSauer。dSTORMにおいては、従来のSTORMのように活性化用のレーザを照射することなく、蛍光物質の自発的な明滅を元に、少数の蛍光色素のみの画像を取得する。第3の実施形態の蛍光顕微鏡装置は、このdSTORMを適用した構成である。第3の実施形態の顕微鏡装置としては、図1に示した顕微鏡装置10から活性化照明系13を省略した構成を採用することができる。かかる構成の顕微鏡装置では、励起照明系11によって所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料を顕微鏡本体15のステージ31上の観察領域に配置し、この観察領域に対して、励起照明系11から励起光を照射することで蛍光物質を明滅させ、蛍光物質から放射される光をカメラ34により撮像することで蛍光画像を取得する。第3実施形態に係る顕微鏡装置において、制御部14は、カメラコントローラ19からの信号に基き観察領域の蛍光強度分布を測定し、蛍光強度分布に基づいて観察領域の部分毎の励起光の照射強度を設定する。そして、制御部14は、観察領域に対して部分毎に設定された照射強度の励起光を照射する動作と、観察領域の励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の蛍光画像を取得し、複数の蛍光画像から試料画像を生成する。したがって、第3実施形態に係る観察方法の手順は、図2に示した第1実施形態に係る観察方法と同様に、分布測定ステップS101と、照射強度設定ステップS102と、画像形成ステップS103と、を有する。ただし本実施形態の場合、分布測定ステップS101において、活性化照明系13ではなく、励起照明系11が用いられる。本実施形態では、分布測定ステップS101において、励起照明系11から観察領域に対して一様な強度分布の励起光L1を照射する。そして、励起光L1を照射された蛍光物質から射出される蛍光を、カメラコントローラ19を介してカメラ34を動作させることで撮影する。撮影された第1の蛍光画像はカメラコントローラ19から制御部14に送信される。制御部14は、第1の蛍光画像における二次元輝度分布蛍光強度分布を算出する。その後、照射強度設定ステップS102では、第1実施形態と同様に、二次元強度分布から二次元強度マップが作成される。一方、画像形成ステップS103では、照射強度設定ステップS102において作成された二次元強度マップに基づいて、照射強度を変調しながら励起光L1を試料に照射することで、数百から数万枚の第2の蛍光画像を取得し、第2の蛍光画像から試料画像を生成する。第1実施形態では活性化光L2の強度を変調していたが、本実施形態の場合には励起光L1を照射するのみで蛍光物質が発光するので、励起光L1の強度を変調しながら照射することになる。以上に説明した第3実施形態によれば、先の実施形態と同様に、蛍光物質の分布に大きな偏りがある場合でも高解像度の画像を得ることができる。また励起光の照射により自発的に明滅する蛍光物質を用いるので、照明系を簡素化することができる。第4の実施形態先の第1の実施形態では、活性化後に励起光を照射すると蛍光を発して不活性化する蛍光物質を用いた顕微鏡技術STORMに関して説明したが、蛍光物質の種類が異なる同様の技術として、PALMPhotoactivatedLocalizationMicroscopyも知られている例えば、特表2008-542826号公報、論文:ProposedmethodformolecularopticalimagingOpticsLettersvol20No3pp237239。先の第1実施形態の観察方法の手順は、試料画像の取得にPALMを用いる場合にもそのまま適用され、顕微鏡装置10、60の構成変更も不要である。顕微鏡装置10又は顕微鏡装置60において、制御部14は、カメラコントローラ19からの信号に基づき観察領域の蛍光強度分布を測定し、蛍光強度分布に基づいて観察領域の部分毎の励起光の照射強度を設定する。そして、制御部14は、観察領域に対して部分毎に設定された照射強度の活性化光を照射する動作と、励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の蛍光画像を取得し、複数の蛍光画像から試料画像を生成する。PALMを用いる場合には、試料に付与される蛍光物質が変更される。具体的には、蛍光物質として、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質が用いられる。このような蛍光物質としては、クラゲやサンゴ由来の蛍光タンパク質の変異種が挙げられる。例えば、クラゲ由来の蛍光タンパク質の変異種であるPAGFPは、活性化光の照射により蛍光強度が大幅に上昇し、PSCFPは、活性化光の照射により他の色の蛍光を発光可能に変化する。また、サンゴ由来の蛍光タンパク質の変異種であるDronpaは、活性化光の照射により励起波長の光の照射による発光が可能になり、Kaedeは、活性化光の照射により蛍光色が変化する。本実施形態の観察方法においても、図2に示した分布測定ステップS101と、照射強度設定ステップS102と、画像形成ステップS103を順次実行することにより、高解像の試料画像を得ることができる。分布測定ステップS101のステップS11では、活性化照明系13から均一強度の活性化光L2が試料に照射された後、励起光L1が試料に照射され、発光光の観測により第1の蛍光画像が取得される。本実施形態の場合も、例えば図4に示した第1の蛍光画像E1が取得される。なお、活性化光を照射しない状態でも励起光の照射により発光する蛍光タンパク質PSCFP、Kaedeを用いている場合には、変化前の蛍光PSCFPの青色光、Kaedeの緑色光を観測すればよいため、分布測定ステップS101における活性化光の照射は不要である。また、不活性化が可能な蛍光物質を用いている場合には、分布測定ステップS101の実行後に、蛍光物質を不活性化させ、蛍光物質の退色の進行を抑えるようにしてもよい。例えば、キンドリング蛍光タンパク質を用いる場合には、分布測定ステップS101において照射する活性化光の照射強度を、蛍光物質に自発的な不活性化が生じる照射強度とすればよい。またDronpaのように励起光の連続照射により不活性状態に戻る蛍光タンパク質を用いてもよい。次に、ステップS12において、第1の蛍光画像における二次元強度分布が算出される。当該ステップにおける具体的な処理は、第1の実施形態と同様であり、これにより図5に示した二次元輝度分布EMが取得される。次に、照射強度設定ステップS102において、二次元輝度分布EMに基づく活性化光L2の照射強度の二次元マップが作成される。当該ステップにおける具体的な処理は第1の実施形態と同様であり、作成された二次元強度マップは記憶部16に保存される。次に、画像形成ステップS103のステップS14では、上記で作成した二次元強度マップを用いて変調された活性化光L2が試料に照射される。すなわち、二次元強度マップに基づいて、蛍光物質が高密度に存在する領域には相対的に低い強度の活性化光L2が照射される一方、蛍光物質が低密度に存在する領域には相対的に高い強度の活性化光L2が照射される。これにより、活性化される蛍光物質の密度が視野全体で平均化される。次に、ステップS15において、試料に励起光L1が照射される。これにより、活性化状態の蛍光物質が発光し、その発光光がカメラ34によって撮影され、第2の蛍光画像が取得される。本実施形態の場合も、第1実施形態と同様に、図6に示す第2の蛍光画像E2のように、蛍光の輝点がほぼ均一な密度で存在する第2の蛍光画像が得られる。取得された第2の蛍光画像は、ステップS16において記憶部16に保存される。なお、本実施形態の場合、ステップS15、S16における第2の蛍光画像の取得動作は、ステップS14で活性化させた蛍光物質が退色してしまうか、不活性状態に戻るまで繰り返し実行される。次に、ステップS17において、撮影の終了が判断され、撮影が完了していない場合には、ステップS14に戻り、再び試料に対する活性化光L2の照射動作が実行される。この活性化光L2の照射により、退色していない蛍光物質が活性化される。その後、ステップS15、S16の第2の蛍光画像の取得、保存動作が実行される。ステップS14からステップS16が予め設定された回数繰り返し実行されると、ステップS17において撮影が終了していると判定され、ステップS18に移行する。そして、ステップS18の画像処理動作が実行されることにより、多数の第2の蛍光画像から高解像の試料画像が作成される。以上に説明した第4実施形態によれば、先の実施形態と同様に、蛍光物質の分布に大きな偏りがある場合でも高解像度の画像を得ることができる。第5の実施形態図9~図11は、第5の実施形態に係る観察方法の説明図である。図9は先の実施形態に用いられた観察方法第1態様を示した図である。図10は、観察方法の第2態様を示す図である。図11は、観察方法の第3態様を示す図である。第2態様の観察方法は、上述した第1、第2、第4実施形態に適用することができ、第3態様の観察方法は、先の第1~第4実施形態のいずれにも適用することができる。なお、図9~図11では、図2に示した各ステップのうち、説明に必要なステップのみを表示して説明する。具体的には、二次元輝度分布を計算するステップS12や二次元強度マップを作成するステップS13、第2の蛍光画像を保存するステップS16等についての図示を省略している。上記した第1、第2、第4実施形態の顕微鏡装置における第1態様の観察方法では、図9に示すように、蛍光物質の分布を測定するために第1の蛍光画像を取得するステップS11において、まず、試料に活性化光L2を照射し、試料に含まれる蛍光物質を活性化させるステップS1が実行される。その後、試料に励起光L1を照射し、試料から発せられる蛍光を検出して第1の蛍光画像を取得するステップS2が実行される。また、STORMPALM撮影処理においては、二次元強度マップに基づき照射強度を制御された活性化光L2を試料に照射し、蛍光物質を活性化するステップS14と、励起光L1を照射して蛍光物質を発光させ、第2の蛍光画像を取得するステップS15とが、この順に、所定枚数の第2の蛍光画像を取得するまで繰り返し実行される。上記に対して、図10に示す第2態様では、蛍光物質の分布を測定するために第1の蛍光画像を取得するステップS11において、試料に活性化光L2を照射するステップS1と、試料に励起光L1を照射して第1の蛍光画像を取得するステップS2とを同時に実行される。このとき、ステップS1とステップS2の開始タイミング及び終了タイミングは一致している必要はなく、少なくとも同時に実行される期間を有していればよい。上記のようにステップS1、S2が同時に実行されることで、蛍光物質の活性化と励起をほぼ同時に進行させ蛍光物質を発光させることができる。したがって、第2態様の観察方法でも第1態様と同様の第1の蛍光画像を取得することができ、蛍光強度分布を得ることができる。また図10に示す第2態様では、STORMPALM撮影処理においても、試料に活性化光L2を照射するステップS14と、試料に励起光L1を照射して第2の蛍光画像を取得するステップS15とが同時に実行される。このときも、ステップS14とステップS15の開始タイミング及び終了タイミングは一致している必要はなく、少なくとも同時に実行される期間を有していればよい。ステップS14、S15が同時に実行されることで、蛍光物質の活性化、励起をほぼ同時に進行させ蛍光物質を発光させることができるので、第1態様と同様の第2の蛍光画像を取得することができる。なお、1回の活性化光照射に対して、複数回の励起光照射及び画像取得が行われる場合には、試料に対して活性化光L2を照射している期間に、少なくとも1回の励起光L1の照射を行えばよい。例えば励起光L1の照射を3回行う場合に、最初の励起光L1の照射期間を活性化光L2との同時照射期間とすればよく、活性化光L2の照射期間中に2回の励起光L1の照射を行ってもよい。上記の第2態様の観察方法によれば、蛍光物質の活性化と励起とが同時に実行される。これにより、先の第1態様と比較して画像取得に要する時間を短縮することができ、効率良く超解像画像の測定及び作成を行うことができる。次に、先の第1~第4実施形態では、図2に示したように、蛍光物質の分布を得るための分布測定ステップS101と、活性化光L2の照射強度を制御するための二次元強度マップの作成を各々1回のみ実行することとしていた。これに対して、図11に示す第3態様の観察方法では、最初に第1の蛍光画像を取得するステップS11ステップS1、S2が実行され、その後に、第1の蛍光画像に基づいて作成した二次元強度マップに基づき変調した活性化光L2を照射するステップS14と、励起光L1を照射して第2の蛍光画像を取得するステップS15とが複数回図示では4回実行される。そして、所定枚数の第2の蛍光画像を取得した後に、再び第1の蛍光画像を取得するステップS11ステップS1、S2が実行され、かかる第1の蛍光画像に基づく計算によって二次元強度マップが更新される。その後は、更新された二次元強度マップに基づき変調した活性化光L2を照射するステップS14と、励起光L1を照射して第2の蛍光画像を取得するステップS15とが、所定回数実行される。また必要に応じて、二次元強度マップを更新する動作が実行される。第3態様において、二次元強度マップの更新動作の間隔は任意に設定することができる。二次元強度マップの更新動作は、所定枚数の第2の蛍光画像を取得する期間に少なくとも1回設定されていればよく、所定枚数例えば100枚、500枚、1000枚等の第2の蛍光画像を取得する毎に実行されるように設定されていてもよい。図11に示す第3態様では、数百枚から数万枚の第2の蛍光画像の取得動作中に二次元強度マップが更新されるので、STORMPALM撮影処理の進行に伴う蛍光物質の退色状況に対応した二次元強度マップを用いて活性化光L2が変調される。これにより、適切な数の蛍光輝点を含む第2の蛍光画像を効率良く取得することが可能な観察方法となる。第6の実施形態上記各実施形態の顕微鏡装置によれば、固定標本観察だけでなく、例えば図12に示すようなライブセル観察を行うこともできる。以下、第1実施形態の顕微鏡装置を用いてライブセル観察を行う場合について説明する。なお、第2~第4実施形態の顕微鏡装置を用いてライブセル観察を行う場合も全く同様である。図12には、細胞核100と、細胞核100の表面から延びる多数の微小管101からなる微小管ネットワークの概略が示されている。図中の点線は、細胞核100の表面を示しており、かかる表面から外側に向かって多数の微小管101が延びている。細胞核100の表面近傍では、微小管101が非常に密集しているため、この密集領域では微小管101に付着した蛍光物質の密度が相対的に高くなる。また、細胞核100表面には微小管101を生成する組織が多数存在するため、かかる組織に蛍光物質が付着すると、蛍光物質の密度がさらに高くなる。一方、細胞核100から離れた位置では、微小管101が疎らになるため、細胞核100の表面近傍と比較すると蛍光物質の密度は著しく低くなる。第1実施形態に係る顕微鏡装置10によりライブセル観察を行う場合にも、図2に示した分布測定ステップS101と、照射強度設定ステップS102と、画像形成ステップS103が順次実行される。これにより、高解像のライブセル画像が得られる。分布測定ステップS101及び照射強度設定ステップS102の動作は、第1実施形態と同様である。すなわち、分布測定ステップS101では、均一強度の活性化光L2を試料に照射する動作の後、励起光L1を試料に照射して第1の蛍光画像を取得する動作が実行され、かかる第1の蛍光画像における二次元強度分布が算出される。照射強度設定ステップS102では、二次元輝度分布に基づく活性化光L2の照射強度の二次元強度マップが作成される。作成された二次元強度マップは記憶部16に保存される。図12に示すライブセルを観察する場合の二次元強度マップでは、細胞核100の表面近傍の微小管101が密集した領域に対して活性化光L2の照射強度が相対的に低く設定され、細胞核100から離れた微小管101が疎らに存在する領域に対して活性化光L2の照射強度が相対的に高く設定される。次に、画像形成ステップS103のステップS14では、上記で作成した二次元強度マップを用いて試料に活性化光L2が照射される。すなわち、上記の二次元強度マップに基づいて、蛍光物質が高密度に存在する領域に相対的に低い強度の活性化光L2が照射される一方、蛍光物質が低密度に存在する領域には相対的に高い強度の活性化光L2が照射される。これにより、活性化される蛍光物質の密度が視野全体で平均化される。次に、ステップS15において、試料に励起光L1が照射され、活性化状態の蛍光物質から発せられた蛍光をカメラ34で撮影することにより第2の蛍光画像が取得される。本実施形態の場合も、第1実施形態と同様に、図6に示す第2の蛍光画像E2のように、蛍光の輝点がほぼ均一な密度で存在する第2の蛍光画像が得られる。取得された第2の蛍光画像は、ステップS16において記憶部16に保存される。次に、ステップS17において、撮影の終了が判断され、撮影が完了していない場合には、ステップS14に戻り、再び試料に対する活性化光L2の照射動作が成される。この活性化光L2の照射により、退色していない蛍光物質が活性化される。その後、ステップS15、S16の第2の蛍光画像の取得、保存動作が実行される。ライブセル観察を行う場合、ステップS14~S17による第2の蛍光画像の撮影速度が比較的速く設定され、例えば、1秒当たり500枚程度の第2の蛍光画像が取得される。数分間の測定時間全体では、数万枚~二十万枚程度の第2の蛍光画像が取得される。ステップS14からステップS16が予め設定された回数繰り返し実行されると、ステップS17において撮影が終了していると判定され、ステップS18に移行する。ステップS18では、取得した第2の蛍光画像から試料画像が作成されるが、ライブセル観察の場合、微小管101等の動きを経時的に表示するための時系列画像が作成される。具体的には、測定時刻順に配列された第2の蛍光画像が時系列に沿って所定の時間間隔又は所定の枚数毎に区画され、区画ごとに第2の蛍光画像を重畳した時系列画像が生成される。例えば、第2の蛍光画像を、時系列に沿って250枚ずつ区画し、これら250枚の第2の蛍光画像を重畳して1枚の時系列画像を作成する動作が実行される。これにより、例えば1秒当たり500枚、3分間の測定を行った場合には、9万枚の第2の蛍光画像から360枚の時系列画像が作成される。作成された時系列画像は、顕微鏡装置に接続されたモニタ表示装置に連続的に表示される。これにより、超解像画像の動画により微小管101等の動きが表現される。時系列画像の表示方法は任意の方法を採用することができる。例えば、時間の経過に伴って画像を構成するドットの色を青系から赤系等に変化させながら表示する方法などを採用することができる。本実施形態のようにライブセル観察を行う場合に、二次元強度マップに基づいて活性化光L2を変調しながら第2の蛍光画像を取得することで、鮮明な時系列画像を得ることができる。具体的には、図12に示す細胞核100の表面近傍と、細胞核100から離れた位置とでは微小管101の密集度に大きな差があるため、例えば微小管101が密集した領域に合わせた照射強度で均一に活性化光L2を照射すると、微小管101の先端側の領域では、蛍光輝点がほとんど観測されなくなり、微小管101の動きが全く見えなくなる。一方、微小管101の先端側の蛍光物質の密度に合わせた照射強度で均一に活性化光L2を照射すると、細胞核100の表面近傍の蛍光輝点が多すぎるために画像が潰れて見えなくなる。よってこの観察方法では、視野内の特定部分でしか最適な解析ができない。これに対して本実施形態では、蛍光物質の密度が異なる領域に対してそれぞれ最適な照射強度の活性化光L2を照射するので、細胞核100の表面近傍から微小管101の先端部分にわたって鮮明な画像を得ることができ、広範囲の微小管101の経時的な動きを観察することができる。なお、ライブセル観察を行う場合には、観察中に細胞が移動するため、先の第5実施形態において説明した第3態様の観察方法を採用し、二次元強度マップを随時更新しながら第2の蛍光画像を取得するとよい。例えば、1枚の時系列画像を作成するために必要な第2の蛍光画像を取得する毎に、二次元強度マップの更新を行うとよい。これにより、細胞が移動による蛍光物質の分布の変化に対応した二次元強度マップに基づいて活性化光L2を変調することができ、蛍光輝点の分布が平均化された第2の蛍光画像を取得することができる。第7の実施形態上記第1から第6の実施形態では、ステップS14において、二次元強度マップに基づき変調した活性化光L2STORM/PALM又は励起光L1dSTOMを試料に照射することとしたが、活性化光L2又は励起光L1の照射強度を視野内で一定とすることもできる。具体的には、分布測定ステップS101のステップS11において、第1の蛍光画像が取得され、続くステップS12において第1の蛍光画像における二次元強度分布が算出される。そして、照射強度設定ステップS102において、二次元強度分布における放射強度の最大値に基づいて、活性化光L2の照射強度が設定される。すなわち、放射強度が最大である領域において適切な蛍光輝点間隔光学分解能の3倍以上が得られるように、活性化光L2の照射強度が設定される。次に、画像形成ステップS103では、照射強度設定ステップS102において設定された照射強度で活性化光L2を試料に照射するステップS14と、試料に励起光L1を照射することにより第2の蛍光画像を取得するステップS15とが所定回数繰り返し実行され、数百から数万枚の第2の蛍光画像が取得される。その後、ステップS18において、第2の蛍光画像から試料画像が生成される。本実施形態では、画像形成ステップS103において試料に照射する活性化光L2の照射強度を、分布測定ステップS101で観測した放射強度の最大値に基づいて設定するので、第2の蛍光画像において蛍光輝点の間隔が狭くなりすぎて画像が潰れてしまうのを防ぐことができる。また活性化光L2の照射強度を視野内で異ならせるための空間光変調装置62等が不要であるため、顕微鏡を安価に構成することができる。"