少なくとも1種のISCOM複合体、ならびに1種または複数種のインフルエンザウイルスに由来する、少なくとも1種のヘマグルチニンドメインからの少なくとも1種の外部ドメインおよび少なくとも1種のノイラミニダーゼドメインからの少なくとも1種の外部ドメインを含む組成物であって、該外部ドメインがインフルエンザウイルスから単離された外部ドメインに相当する、該組成物。少なくとも1種のヘマグルチニンドメインからの1種または複数種の外部ドメインおよび少なくとも1種のノイラミニダーゼドメインからの1種または複数種の外部ドメインがハイブリッドタンパク質として提示される、請求項1記載の組成物。ハイブリッドタンパク質が組換え体である、請求項2記載の組成物。少なくとも1種のヘマグルチニンドメインからの1種または複数種の外部ドメインおよび少なくとも1種のノイラミニダーゼドメインからの1種または複数種の外部ドメインが頭部ドメインである、請求項1~3のいずれか一項記載の組成物。インフルエンザウイルスがインフルエンザの亜血清型から、例えばxが1~16でありかつyが1~9であるHxNyから選択される、請求項1~4のいずれか一項記載の組成物。インフルエンザウイルスが、例えば1918H1N1型インフルエンザウイルスから選択されるN1H1型のウイルス、ならびにまたは2004H5N1型H1N1型Aカリフォルニア072009ウイルス、およびもしくはAカリフォルニア042009、およびもしくはAカリフォルニア092009、ならびにまたはAケンタッキーUR0602582007、ならびにまたはAシチメンチョウトルコ12005である、請求項5記載の組成物。少なくとも1種のヘマグルチニンドメインからの1~5種の外部ドメインおよび少なくとも1種のノイラミニダーゼドメインからの1~5種の頭部ドメインを含む、請求項1~6のいずれか一項記載の組成物。少なくとも1種のヘマグルチニン外部ドメインがAカリフォルニア092009の三量体HA外部ドメインから選択される、請求項7記載の組成物。少なくとも1種のノイラミニダーゼ頭部ドメインがAカリフォルニア092009ウイルスの四量体NA頭部ドメインから選択される、請求項7記載の組成物。ISCOM複合体が、少なくとも1種のサポニン、少なくとも1種の脂質および少なくとも1種の抗原を含むISCOMである、請求項1~9のいずれか一項記載の組成物。ISCOM複合体が、少なくとも1種のサポニン、および少なくとも1種の脂質を含むISCOMマトリックスである、請求項1~9のいずれか一項記載の組成物。添加剤、賦形剤、さらなるアジュバントもさらに含む、請求項1~11のいずれか一項記載の組成物。脊椎動物、例えば鳥類および哺乳類用の、例えばインフルエンザに対する免疫刺激薬、免疫調節薬またはワクチンとして用いるための、請求項1~12のいずれか一項記載の組成物。哺乳類がヒト;ネコ、イヌ、ウマ、鳥、例えばオウムなどのコンパニオンアニマル;畜牛、例えばウシ種、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはフェレット、ミンクなどの経済的に重要な種である、請求項13記載の組成物。1つの区画が少なくとも1種のISCOM複合体、ならびに1種または複数種のインフルエンザウイルスに由来する、少なくとも1種のヘマグルチニンドメインからの少なくとも1種の外部ドメインおよび少なくとも1種のノイラミニダーゼドメインからの少なくとも1種の外部外ドメインを含んだ組成物を含み、かつ別の区画が使用説明書を含む、少なくとも2つの区画を含むキット。詳細な説明本発明は、少なくとも1種のISCOM複合体、ならびにインフルエンザウイルスに由来する、少なくとも1種のHAドメインからの少なくとも1種の外部ドメインおよび少なくとも1種のNAドメインからの少なくとも1種の外部ドメインを含む組成物であって、該外部ドメインがインフルエンザウイルスから単離された外部ドメインに相当する、該組成物に関する。外部ドメインは、細胞外空間に及ぶ膜タンパク質のドメインである。外部ドメインは、通常、シグナル伝達につながる表面との接触を開始する、タンパク質の一部である。組成物において、外部ドメインは抗原として機能することができ、その結果、その組成物はワクチンとして用いることができる。単離とは、外部ドメインが他のタンパク質から、ならびにインフルエンザウイルスのNAおよびHAタンパク質のそれぞれの残部から実質的に単離されることを意味する。少ない残部アミノ酸が存在してもよい。外部ドメインは、完全な外部ドメインまたは同じ酵素活性およびもしくは抗原活性を有するその一部であってよい。1つの態様によれば、外部ドメインの一部はその頭部ドメインであってよい。完全な外部ドメインまたは同じ酵素活性およびもしくは抗原活性を有するその一部であるそのような外部ドメインは、インフルエンザウイルスから単離されてもよく、または合成により産生されてもよい。それらは、相互に分離されてまたは一緒に連結されて提示されてもよい。1つの態様によれば、外部ドメインは可溶性外部ドメインまたは可溶性頭部ドメインである。同じまたは異なるインフルエンザウイルスの種または株に由来する、少なくとも1種のヘマグルチニンドメインからの1種または複数種の外部ドメインおよび少なくとも1種のノイラミニダーゼドメインからの1種または複数種の外部ドメインがハイブリッドタンパク質として提示されてもよく、それは組換え体であってもよい。組換えにより産生されたHAおよびNA抗原は、両抗原の相対量を容易に制御できるワクチンの開発を可能にする。哺乳類および昆虫の両方である真核生物発現系は、それらの、タンパク質の天然の抗原構造のより良好な保存を考慮すれば、そのような糖タンパク質の産生に好ましいプラットフォームである。実施例1において説明したように、およびGenscripthttpwwwgenscriptcomgenesynthesishtmlにしたがって、ハイブリッドタンパク質は産生されうる。インフルエンザウイルスはインフルエンザの亜血清型から、例えばxが1~16でありかつyが1~9であるHxNyから、選択されうる。したがって、xは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15および16であってよく、かつyは1、2、3、4、5、6、7、8、9であってよい。インフルエンザウイルスはヒト、鳥、牛、例えばウシ種、ブタ、ヒツジ、ヤギのような任意の種由来であってよい。鳥インフルエンザウイルス、例えばH1~6N1~9もしくはヒトインフルエンザウイルスH1~3N1~2またはそのNAおよびHA由来の外部ドメインの任意の組み合わせが用いられてもよい。NA外部ドメインおよびまたはHA外部ドメインはインフルエンザウイルスの、例えばヒトおよび鳥インフルエンザウイルスの、異なる種由来であってよい。したがって、1種または複数種の、ヒトおよび鳥NA外部ドメインが、1種または複数種の、ヒトおよび鳥HA外部ドメインと組み合わされてもよく、そのためにNAおよびHAは、HxNyの異なるタイプのものであってよい。1つの態様によれば、インフルエンザウイルスは、例えば1918H1N1型インフルエンザウイルスから選択されるN1H1型ウイルス、ならびにまたは2004H5N1型H1N1型Aカリフォルニア072009ウイルス、およびもしくはAカリフォルニア042009、およびもしくはAカリフォルニア092009、ならびにまたはAケンタッキーUR0602582007、ならびにまたはAシチメンチョウトルコ12005などのA型インフルエンザである。NA由来およびHA由来の1種または複数種の外部ドメインが用いられてもよい。組成物は、少なくとも1種のヘマグルチニンドメインからの1~5種の外部ドメインおよび少なくとも1種のノイラミニダーゼドメインからの1~5種の頭部ドメインを含んでもよい。1つの態様によれば、少なくとも1種のヘマグルチニン外部ドメインはAカリフォルニア092009の三量体HA外部ドメインから選択される。1つの態様によれば、少なくとも1種のノイラミニダーゼ頭部ドメインはAカリフォルニア092009ウイルスの四量体NA頭部ドメインから選択される。Aカリフォルニア092009タンパク質の配列は、当技術分野において、例えば、httpwwwncbinlmnihgovprotein227809830およびhttpwwwncbinlmnihgovprotein227809834を通じて公知である。ISCOM複合体はアジュバントおよび免疫調節剤として用いられてもよい。それらはISCOMおよびまたはISCOMマトリックス複合体であってよい。ISCOMマトリックス複合体およびまたはISCOM複合体は、インフルエンザ感染に対する免疫反応を誘発するように意図された抗原の1種または複数種とともに用いられてもよい。抗原ならびにISCOMマトリックス複合体およびまたはISCOM複合体は、混合物の状態で、または別々に投与されてもよい。ISCOMマトリックス複合体は少なくとも1種のグリコシドおよび少なくとも1種の脂質を含む。グリコシドはアジュバント効果を有し、好ましくは、特にキラヤサポナリアモリナに由来するサポニンである。脂質は少なくともステロール、例えばコレステロールであり、さらに任意で、リン脂質でもよい。ISCOMマトリックス複合体は、必ずしもグリコシドではない、1種または複数種の他の免疫調節物質を含んでもよく、EP0436620B1に記述されているように産生されてもよい。ISCOM複合体は少なくとも1種のグリコシド、少なくとも1種の脂質、および少なくとも1種の抗原物質またはエピトープを含む。これらの抗原物質はタンパク質およびペプチド、糖タンパク質および糖ペプチド、糖質などのような異なる種類のものであってよい。グリコシドはアジュバント効果を有し、好ましくは、特にキラヤサポナリアモリナに由来するサポニンである。これらの複合体は、含まれる抗原の免疫原性を強化し、かつ1種または複数種の免疫調節物質を含んでもよい。ISCOMはEP0109942B1、EP0242380B1およびEP0180546B1に記述されているように調製されてもよい。さらに、EP96006473に記述されているように、輸送およびまたはパッセンジャー抗原が用いられてもよい。外部ドメイン抗原をISCOMマトリックス複合体およびもしくはISCOM複合体と混合してもよく、ISCOMマトリックス複合体上へ結合もしくは複合化させてもよく、またはISCOMと混合してもよく、またはISCOM複合体上へカップリングさせてもよい。調製されたISCOM複合体は外部ドメイン抗原以外の1種または複数種の抗原を含んでもよい。1つの態様によれば、1種または複数種の外部ドメイン抗原はISCOM複合体に組み込まれて用いられてもよい。そのようなISCOM複合体を次いで、1種または複数種の外部ドメイン抗原と混合してもよい。1種または複数種の抗原を用いてもよく、EP96006473に記述されているように輸送およびパッセンジャー抗原を用いてもよい。ISCOM粒子に組み込まれるためには、抗原はいくらかの疎水性部分を持つ必要があり、または、ISCOMマトリックスに静電付着される必要がある。疎水性部分を持たない抗原がそのような分子にカップリングされてもよい。疎水性分子およびカップリング方法はEP180564に記述されている。免疫原性複合体に含まれる脂質は、少なくともステロール、例えばコレステロールであり、さらに任意で、リン脂質でもよい。用いられる脂質は、特に、本出願人らの特許であるEP0109942B1、具体的には3頁に、および特許EP0436620B1の7頁7~24行目に記述されているものである。特に、コレステロールなどのステロール、ならびにホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンなどのリン脂質が用いられる。ガングリオシドGM1であるコレラ毒素受容体を含む、糖脂質などの細胞結合成分に結合する脂質含有受容体、およびフコース含有血液型抗原が用いられてもよい。細胞結合成分がひいては、粘液を標的とする分子として機能し、脂質含有物質を含む複合体と単に混合するだけで脂質含有物質に結合しうる。受容体を含むISCOM複合体は、例えばWO9730728に記述されている。本発明の1つの態様において、インフルエンザに対するワクチン接種で用いるための免疫原性複合体中のグリコシドは、キラヤサポナリアモリナ由来のサポニン画分である。キラヤサポナリアモリナに由来するサポニンの任意の部分断片も使用されうる。さらに、キラヤサポナリアモリナの部分断片の任意の組み合わせが用いられうる。したがって、2つまたはそれ以上の部分断片がそれぞれ、ISCOM複合体またはISCOMマトリックス複合体に組み込まれうる。キラヤサポナリアモリナ由来のサポニン画分という用語は、本明細書の全体を通しておよび特許請求の範囲においてキラヤサポナリアの半精製されたもしくは規定されたサポニン画分または実質的に純粋な画分の一般的記述として用いられる。この画分は、本質的に1画分を含むISCOM複合体またはISCOMマトリックス複合体の混合物が用いられる場合に得られる良好な結果に負の影響を与えるいかなる他の画分も含まないということが重要である。1つの態様によれば、免疫原性複合体の一部として、またはそれとの混合物の状態で、キラヤサポナリアモリナ由来のサポニン画分以外の少なくとも1種のさらなるアジュバント、または、ISCOMマトリックスもしくはISCOM複合体に組み込まれているもの以外の少なくとも1種のグルコシドもしくはサポニンをさらに含む、本発明にしたがって用いるための免疫原性複合体が提供される。サポニンではない有用なアジュバントの例は、さまざまな油およびAl3である。ISCOM複合体およびISCOMマトリックス複合体にそれぞれ組み込まれうる、またはそれらと混合されうるさらなるアジュバントの例は、所望の免疫調節効果を有する天然のまたは合成の任意のアジュバント、例えば、キラヤサポナリアモリナのサポニン粗抽出物に由来する天然サポニン分子、またはその誘導体、合成もしくは半合成サポニン分子であり例えば、QuilA由来のサポニンおよびサポニン画分、細胞壁骨格、ブロック重合体、例えば、親水性ブロック共重合体、例えばCRL1005、TDM、リポペプチド、LPSおよびLPS誘導体、さまざまな細菌種由来の脂質Aおよびその誘導体、MDP誘導体、置換MDP、MDPのトレオニル類似体、CpG変種、CpGODN変種、外来性ヒトおよび動物免疫調節剤例えばGMCSF、IL2、天然または修飾毒素であるアジュバント活性細菌毒素、大腸菌の易熱性毒素、百日咳菌毒素およびBPの線維状ヘマグルチニン、DDA、硫酸デキストランのようなポリアニオンならびにサポニンのようなリポ多糖類であり、これらの全てが参照により組み入れられる、CRCCritRevImmunol8283101CharacterisationofanontoxicmonophosphoryllipidAJohnsonAGetalRevInfectDis9555125516DevelopmentalstatusofsyntheticimmunomodulatorsBerendtMJetalYearImmunol193201ImmunopotentiatingconjugatesStewartTullDEVaccine85314044を参照されたい。ISCOM粒子は任意のサポニンから作製されたISCOM複合体またはISCOMマトリックス複合体であってよい。アジュバント画分Aおよび他の少なくとも1種のアジュバントが異なるもしくは同じISCOM粒子もしくはISCOMマトリックス粒子上にカップリングされてもよく、またはアジュバントの1種もしくは複数種がISCOM粒子と混合されてもよい。ISCOM粒子に組み込まれるためには、アジュバントはいくらかの疎水性分子を持つ必要がある。疎水性部分を持たないアジュバントが、そのような分子にカップリングされてもよい。疎水性分子およびカップリング方法は、EP180564に記述されている。好ましくは、アジュバントは異なるISCOM粒子に組み込まれる。本発明の別の態様において、QuilAのアジュバント画分AはISCOM粒子に組み込まれるのに対し、他の少なくとも1種のアジュバントはISCOM粒子に組み込まれず、組成物において遊離形態で用いられる。本発明の別の好ましい態様において、QuilAのアジュバント画分はISCOM粒子またはISCOMマトリックス粒子に組み込まれるのに対し、他のアジュバントはISCOM粒子またはISCOMマトリックス粒子に組み込まれず、組成物において遊離形態で用いられる。別の特に好ましい態様において、組成物は、ISCOM粒子またはISCOMマトリックス粒子に組み込まれているQuilAの画分A、およびISCOM粒子またはISCOMマトリックス粒子に組み込まれていない、少なくとも1種の他のアジュバントを含む。別の好ましい態様において、少なくとも他のアジュバントはMPLまたはコレラ毒素CTである。MPLまたはコレラ毒素は同じISCOM粒子もしくはISCOMマトリックス粒子に組み込まれてもよく、またはそれぞれ、異なるISCOM粒子もしくはISCOMマトリックス粒子に組み込まれてもよい。好ましくは、MPLまたはコレラ毒素は遊離形態である。ISCOMマトリックス複合体、ISCOM複合体およびまたは少なくとも1種のさらなるアジュバントで用いるためのキラヤサポナリアモリナ由来のサポニン画分は、キラヤサポナリアモリナの画分A、画分B、画分C、キラヤサポナリアモリナの粗画分QA121から選択されうる。しかしながら、最新の強力な分離法により、60種超の異なる構造が報告および記述されている。本明細書において説明するように調製された場合、キラヤサポナリアモリナの画分A、BおよびCはそれぞれ、定義できる特性を有する化学的に密接に関連している分子の群または族を表す。それらが得られるクロマトグラフィー条件は、溶出プロファイルおよび生物学的活性に関するバッチ間の再現性が高度に一致しているような条件である。キラヤサポナリアモリナ由来の1つのサポニン画分という用語は、本明細書の全体を通しておよび特許請求の範囲においてキラヤサポナリアの半精製されたもしくは規定されたサポニン画分または実質的に純粋な画分の一般的記述として用いられる。この画分は、本質的に1画分を含むISCOMまたはISCOMマトリックスの混合物が用いられる場合に得られる良好な結果に負の影響を与えるいかなる他の画分も含まないということが重要である。サポニン調製物は、所望であれば、少量の、例えば40重量までの、例えば30重量までの、25重量までの、20重量までの、15重量までの、10重量までの、7重量までの、5重量までの、2重量までの、1重量までの、05重量までの、01重量までの、他のサポニンまたは他のアジュバント材料などの他の化合物を含みうる。本発明によるサポニン画分A、BおよびCは、WO9611711に記述される通りであり、B3、B4およびB4b画分は、EP0436620に記述される通りであり画分QA1~21はEP03632279B2に記述される通りである。EP03632279B2の画分QA1234567891011121314151617181920および21、特にQA7、17~18が用いられてもよい。それらはEP0362279B2に、特に6頁、ならびに8頁および9頁の実施例1に記述されているように得られる。キラヤサポナリアモリナ由来のサポニンの、任意のタイプの粗画分または半精製画分が用いられてもよい。本特許の目的のために用いられるキラヤサポナリアモリナの粗画分は、他の親油性の非サポニン成分からいくぶん精製された任意のサポニン組成物である。これは、キラヤサポナリアモリナの精製された、しかし非分画化調製物である任意のサポニン画分であってよい。サポニンが相互に分離されていないそのような粗画分は、例えば、DesertKingChile、SigmaAldrich、Berghausen、BrenntagBiosectorから生産および納品されうる。WO9611711に記述される画分A、BおよびCは、親水性キラヤサポナリアモリナ粗抽出物のクロマトグラフィー分離、および親油性画分を分離するための70アセトニトリル水溶液を用いた溶出から得られた、親油性画分から調製される。この親油性画分を次いで、酸性水溶液中25~60のアセトニトリル勾配を使用する溶出を用いた半分取HPLCにより分離する。本明細書において画分AまたはQHAといわれる画分は、約39のアセトニトリルで溶出される画分であるか、またはその画分に対応する。本明細書において画分BまたはQHBといわれる画分は、約47のアセトニトリルで溶出される画分であるか、またはその画分に対応する。本明細書において画分CまたはQHCといわれる画分は、約49のアセトニトリルで溶出される画分であるか、またはその画分に対応する。1つの態様によれば、サポニンの粗画分が用いられる。別の態様によれば、サポニンの粗画分が任意の他の精製されたサポニン画分、例えば上記の異なるサポニン画分とともに用いられてもよい。本発明の1つの態様によれば、ISCOMマトリックス複合体もしくはISCOM複合体に組み込まれる、キラヤサポナリアモリナ由来のサポニン画分、または、同じくISCOMもしくはISCOMマトリックス複合体に組み込まれるかもしくはそれと混合される、少なくとも1種のさらなるアジュバントは、キラヤサポナリアモリナの画分A、画分B、画分Cか、キラヤサポナリアモリナの半精製調製物か、キラヤサポナリアモリナの精製調製物か、または精製された任意の亜画分、例えば、QA1~21から選択される。キラヤサポナリア由来の少なくとも2つのサポニン画分をそれぞれ含む、ISCOMマトリックスおよびまたはISCOM複合体が用いられてもよい。異なるサポニン画分の、任意の組み合わせの重量が用いられてもよい。任意の2つの画分の、任意の組み合わせの重量、例えば、それぞれキラヤサポナリアモリナの、画分Aの任意の重量と、別の画分、例えば任意の粗サポニン画分または画分Cの任意の重量とが用いられてもよい。ISCOMマトリックスおよびまたはISCOM複合体は、ISCOMマトリックスおよびまたはISCOM複合体中のキラヤサポナリアモリナの、サポニン画分の重量の合計に基づいて計算して、01~999重量、5~95重量、10~90重量、15~85重量、20~80重量、25~75重量、30~70重量、35~65重量、40~60重量、45~55重量、40~60重量、50~50重量、55~45重量、60~40重量、65~35重量、70~30重量、75~25重量、80~20重量、85~15重量、90~10重量、95~05重量、50~99重量、60~90重量、70~90重量、75~85重量の1つのサポニン画分、例えばキラヤサポナリアモリナの画分Aと、各区間における、最大100である残りにあたる別のサポニン、例えば任意の粗画分または任意の他の画分、例えばキラヤサポナリアモリナの画分Cとを含んでもよい。1つの態様によれば、画分Aおよび画分Cの重量に基づいて計算して、5~99重量の1つの画分、例えばキラヤサポナリアモリナの画分Aと、重量の最大100である残りにあたる別の画分、例えばキラヤサポナリアモリナの粗サポニン画分または画分Cとを含む、本発明にしたがって用いるためのISCOMマトリックスおよびまたはISCOM複合体が提供される。別の態様によれば、画分Aおよび画分Cの重量に基づいて計算して、40重量~99重量の1つの画分、例えばキラヤサポナリアモリナの画分Aと、1重量~60重量の別の画分、例えばキラヤサポナリアモリナの粗サポニン画分または画分Cとを含む、本発明にしたがって用いるためのISCOMマトリックスおよびまたはISCOM複合体が提供される。さらにある態様によれば、画分Aおよび画分Cの重量に基づいて計算して、70重量~95重量の1つの画分、例えばキラヤサポナリアモリナの画分Aと、30重量~5重量の別の画分、例えばキラヤサポナリアモリナの粗サポニン画分または画分Cとを含む、本発明にしたがって用いるためのISCOMマトリックスおよびまたはISCOM複合体が提供される。1つの態様において、キラヤサポナリアモリナ由来のサポニン画分がQA1~21の任意の1つから選択される、本発明にしたがって用いるためのISCOMマトリックスおよびまたはISCOM複合体が提供される。本発明の1つの局面によれば、インフルエンザに対するワクチン接種で用いるための、1種もしくは複数種の外部ドメイン抗原、ならびに1つもしくは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体およびもしくは希釈剤、ならびにまたはさらなるアジュバントとともに本発明による少なくとも1種のISCOMマトリックスおよびまたはISCOM複合体を含む組成物、例えばワクチンが提供される。そのような組成物は、1つもしくは複数の異なるタイプのISCOMマトリックス複合体粒子およびまたは1つもしくは複数の異なるタイプのISCOM複合体粒子を含んでもよく、個々のタイプの複合体粒子のそれぞれがキラヤサポナリアモリナ由来の1つのサポニン画分を含み、一つの複合体におけるサポニン画分は、他の複合体粒子におけるサポニン画分とは異なる。組成物はいくつかの粒子を含んでもよい。しかしながら、1つの態様によれば、ある粒子はある単一のタイプのキラヤサポナリアモリナ画分を含むのみでありうる。したがって、1つのタイプの実質的に純粋なサポニン画分または粗サポニン画分が1つのISCOMマトリックス複合体または粒子に組み込まれてもよく、別のタイプの実質的に純粋なサポニン画分または粗サポニン画分が別のISCOMマトリックス複合体または粒子に組み込まれてもよい。組成物またはワクチンは、タイプごとに、物理的に異なる粒子に組み込まれた1つのタイプのサポニンを有する、少なくとも2つのタイプの複合体または粒子を含みうる。組成物において、キラヤサポナリアモリナ由来の1つのサポニン画分およびキラヤサポナリアモリナ由来の別のサポニン画分が異なるISCOMマトリックス複合体粒子およびまたはISCOM複合体粒子に別々に組み込まれている、ISCOMマトリックス複合体粒子およびまたはISCOM複合体粒子の混合物が用いられてもよい。1つのサポニン画分および任意の他のサポニン画分の含量に基づく、異なるISCOM複合体の、任意の組み合わせの重量が用いられてもよく、例えば、画分Aと、別の画分、例えばそれぞれキラヤサポナリアモリナの任意の粗サポニン画分または画分Cとが用いられてもよい。これらの値は、同じ1つのISCOMマトリックス複合体粒子およびまたはISCOM複合体粒子におけるサポニン画分の可能な混合物に関する上記のものと同じであってよいが、ここでは、別々のISCOMマトリックス複合体粒子およびまたはISCOM複合体粒子におけるサポニン画分のものである。さらに別の態様において、QuilAの画分AはISCOM粒子もしくはISCOMマトリックス粒子に組み込まれ、少なくとも1種の他のアジュバントは、異なるISCOM粒子もしくはISCOMマトリックス粒子それぞれに組み込まれ、または1つもしくは複数の他のQuilA画分もしくは1つもしくは複数の他のアジュバントは、同じISCOMもしくはISCOMマトリックス粒子であるがQuilAの画分Aが組み込まれた粒子とは異なる粒子に組み込まれ、または他の少なくとも1種のアジュバントは遊離形態である。組成物において、画分Aは、同じまたは異なるISCOM複合体およびまたはISCOMマトリックス複合体中で、キラヤサポナリアモリナ由来の画分Cおよび粗サポニン画分のうちの少なくとも1つ、例えば画分Qと組み合わされてもよい。キラヤサポナリアモリナの異なる画分を含むISCOMマトリックス複合体を組み合わせることにより、動物にとって毒性の低い組成物を産生することが可能である。ゆえに、1つの態様において、本発明にしたがって用いるための組成物は、同じまたは異なるISCOM複合体およびまたはISCOMマトリックス複合体中で、画分CおよびQの少なくとも1つと組み合わせて、画分Aを含む。組成物はさらに、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体およびまたは希釈剤、ならびにさらなるアジュバントを含んでもよい。組成物は、ISCOM複合体粒子またはISCOMマトリックス粒子に組み込まれるサポニン以外の少なくとも1種のアジュバントを含んでもよい。このさらなるアジュバントはキラヤサポナリアモリナ由来のサポニン画分であってよく、これは免疫原性ISCOMマトリックス複合体粒子もしくはISCOM複合体粒子へ結合されてもよく、またはそれらと混合されてもよい。それはまた、別のタイプのサポニンまたは任意の他のタイプのアジュバントであってもよく、これらは免疫原性ISCOMマトリックス複合体粒子もしくはISCOM複合体粒子に組み込まれてもよく、それらへ結合されてもよく、またはそれらと混合されてもよい。組成物はワクチンであってもよい。本明細書においてワクチンという用語は、免疫反応を生み出すことができる材料をいう。本発明のワクチンはインフルエンザに対する免疫を生み出しうる。組成物は、感染が起きるのを防ぐために予防的に用いられてもよく、または既存の感染を処置するために治療的であってもよく、または免疫学的試薬の産生用であってもよい。インフルエンザウイルスに由来する外部ドメインからの抗原以外の抗原はISCOM複合体に組み込まれてもよく、ISCOM複合体もしくはISCOMマトリックス複合体へカップリングされてもよく、またはISCOM複合体もしくはISCOMマトリックス複合体と混合されてもよい。本発明はまた、処置のための混合ワクチンまたは混合獣医薬にも関する。本発明による組成物の処方は当業者には周知である。適当な薬学的に許容される担体およびまたは希釈剤は、ありとあらゆる従来の溶媒、分散媒体、増量剤、固形担体、水溶液、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知であり、例として、RemingtonsPharmaceuticalSciences18thEditionMackPublishingCompanyPennsylvaniaUSAに記述されている。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合でない限り、本発明の薬学的組成物において、それらの使用が企図される。追加の活性成分を組成物に組み入れることもできる。1つの他の局面によれば、組成物は脊椎動物、例えば鳥類および哺乳類用の、例えばインフルエンザに対する免疫刺激薬、免疫調節薬またはワクチンとして使用されうる。哺乳類はヒト;ネコ、イヌ、ウマ、鳥、例えばオウムなどのコンパニオンアニマル;畜牛、例えばウシ種、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはフェレット、ミンクなどの経済的に重要な種でありうる。本発明はまた、1つの区画が少なくとも1種のISCOM複合体、ならびに1種または複数種のインフルエンザウイルスに由来する、少なくとも1種のヘマグルチニンドメインからの少なくとも1種の外部ドメインおよび少なくとも1種のノイラミニダーゼドメインからの少なくとも1種の外部ドメインを含む組成物を含み、かつ別の区画が使用説明書を含む、少なくとも2つの区画を含むキットにも関する。別の局面によれば、本発明は、1つの区画がISCOM複合体およびまたはISCOMマトリックス複合体を含み、かつ別の区画が少なくとも1種のヘマグルチニンドメインからの少なくとも1種の外部ドメインおよび少なくとも1種のノイラミニダーゼドメインからの少なくとも1種の外部ドメインを含む、少なくとも2つの区画を含むキットに関する。本出願人らは、特にNA抗原の寄与に重点を置きながら、フェレットモデルにおいて同型インフルエンザウイルスに対するワクチンとして2009Aインフルエンザウイルスの、組換えにより産生されたHAおよびNAサブユニットの効力にとりわけ取り組んだ。パンデミックH1N1型ウイルスの、可溶性の多量体型のHAおよびNA抗原が、哺乳類発現系において発現されている。糖タンパク質を単一段階アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その後、フェレットを一方の抗原または両方の抗原を用い、かつアジュバントとしてのISCOMマトリックスMを用いてまたは用いずに、免疫した。動物は両方の抗原に対して血清学的に反応したが、アジュバントとともに投与された場合に限られた。興味深いことに、ワクチンにNAを含めることで、HA抗体のレベルおよびウイルス中和活性のレベルが向上した。劇的に低減したウイルス肺力価から特に判断した際の、顕著な保護が、ISCOMマトリックスMと組み合わせたHA含有ワクチンで免疫した動物での同種攻撃により観察された。興味深いことに、NAを含有するISCOMマトリックスMアジュバント配合物は、感染の臨床的影響を明らかに低減した。本明細書において言及される全ての刊行物は、法律が許す最大の範囲内で、参照として本明細書に組み入れられる。本発明をこれから、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。実施例1HAおよびNA抗原の調製材料および方法A型インフルエンザ攻撃ウイルスA型インフルエンザウイルスオランダ6022009は、11日齢の孵化鶏卵の接種により、オランダにおける検査室で確認された2009A感染の最初の事例から分離された15。A型インフルエンザウイルスオランダ6022009のウイルス原液を、コンフルエントなメイディンダービーイヌ腎臓細胞に感染させることによって調製した。細胞病理学的変化が完了した後に、培養上清を低速遠心分離によって清澄化し、70°Cで貯蔵した。感染性ウイルス力価を、以前に記載のように、MCCK細胞において判定した16。これらのウイルスを用いた実験の全ては、生物学的安全性レベル3の条件下で行った。HAおよびNA抗原の調製A型インフルエンザウイルスカリフォルニア042009の可溶性ヘマグルチニン外部ドメインおよびノイラミニダーゼ頭部ドメインをコードするヒトコドン最適化配列を合成し、HEK293T細胞における発現のために発現プラスミドpS1lgの誘導体17にクローニングした。最近になって記述されているように、HA遺伝子の前にN末端CD5シグナルペプチドをコードする配列を置き、HA遺伝子の後にC末端の人工的なGCN4三量化ドメイン18およびアフィニティー精製用のStrepタグをコードする配列を置いた1920。NA遺伝子の前に、N末端CD5シグナルペプチド、二重のStrepタグおよび人工的なGCN4四量化ドメインを連続的にコードする配列を置いた18。sHA3およびsNA4抗原の産生図1Aに図示したように、2009Aインフルエンザウイルスの三量体HA外部ドメインおよび四量体NA頭部ドメインを発現するように、構築体をデザインした。sHA3およびsNA4タンパク質をHEK293T細胞における発現によって産生し、アフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製し、予想されるサイズの糖タンパク質を得た。ゲルろ過分析により、HAおよびNAサブユニットの三量体および四量体オリゴマー性がそれぞれ示された。これらの多量体複合体はまた、そのシアル酸結合およびノイラミニダーゼ活性によって判断した場合に、生物学的に活性であり、その天然状態をさらに裏づけた。実施例2タンパク質発現および精製ポリエチレンイミンを使用して、HEK293T細胞にsHAおよびsNA発現プラスミドを、比率15でトランスフェクトした。6時間のインキュベーション時間の後、トランスフェクション培地を、重炭酸ナトリウム、グルコース、プリマトンRLUF、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタMAXおよび15DMSOを補充した293SFMII発現培地に交換した。組織培養上清をトランスフェクションから5~6日後に収集し、StrepTactinアフィニティークロマトグラフィーを用いて培地からsHAおよびsNAタンパク質を精製した。sHAおよびsNAタンパク質の発現および精製を、ウエスタンブロッティングによりStrepTractinHRP結合体を用いておよびSDSPAGE分析によって確認した。タンパク質のオリゴマー形成をゲルろ過クロマトグラフィーによっておよびブルーネイティブPAGE分析によって判定した。参照基準としてBSAを用い、タンパク質量の定量化を行った。実施例3免疫および感染フェレット健常若年成体の非近交系雌性フェレット6~12ヶ月齢を商業的飼育者から購入した。循環血中の季節性AH1N1型およびAH3N2型インフルエンザウイルスに対する抗体ならびにブタ由来A型インフルエンザNL60209ウイルスに対する抗体がないか、血球凝集阻害アッセイ法によって動物を調べた。実験の開始前に、独立した動物倫理委員会によって実験プロトコルは承認された。ISCOMマトリックスMアジュバントをWO2004004762に記述されているように調製した。PBS中85のマトリックスAおよび15のマトリックスCを含む組成物75マイクログラムを、抗原に加えた。免疫および感染血清反応陰性のフェレット36匹をフェレット各6匹の6群に分け、それらに、以下の配合物を2回ワクチン接種したリン酸緩衝生理食塩水中375μgのsHA3375μgのsNA4ISCOMマトリックスM中375μgのsHA3IMM中375μgのsNA4IMM中375μgのsHA3375μgのsNA4PBSIMM。ワクチン接種はケタミンによる麻酔下、20日の間隔で、全量1mlにて後肢の大腿四頭筋に行った。フェレットは群単位で収容し、適宜、食料および水を摂取させた。最後のワクチン接種から32日後に、動物をケタミンメデトミジンで麻酔し、体重を量り、その後、3ml量のPBS中1×106TCID50のA型インフルエンザNL60209で気管内から攻撃した2122。フェレットをその後、臨床兆候の発生について毎日3回モニタリングした。感染の前にならびに感染から2日および4日後、フェレットをケタミンで麻酔している間に各フェレットの鼻および咽頭スワブを回収した。接種から4日後に、動物を秤量し、その後、ケタミンおよびメデトミジンによる麻酔中に放血によって安楽死させた。標準的な手順によって剖検を行った。実験とは関係ない理由によって1回目および2回目のワクチン接種の間に群1のフェレット1匹が死亡した。血清学血清サンプルを、ワクチン接種の前、2回目のワクチン接種の日、および攻撃の日に回収した。血清を使用まで20°Cで貯蔵した。以前に記載のように、抗HA抗体の存在については1シチメンチョウ赤血球を用いた血球凝集阻害アッセイ法を用い、ウイルス中和抗体の存在についてはマイクロウイルス中和アッセイ法を用いて、血清を調べた2324。血清をA型インフルエンザNL60209と反応性の抗体の存在について調べた。この目的のため、逆遺伝学ウイルスを作製した。これらのウイルスで得られた力価は、野生型株に対する力価に匹敵していた。A型インフルエンザNL60209に特異的な陽性対照血清を、このウイルスに感染したフェレットから得た15。HIアッセイ法において用いた他のH1N1型インフルエンザウイルスは、Aオランダ38686、Aオランダ2580、Aニュージャージー876、Aブタショープ156、Aイタリア144376、Aアイオワ1530、Aプエルトリコ834およびAブリズベン5907であった。これらのウイルスに感染したフェレットの血清サンプルをこのアッセイ法において陽性対照として用いた25。血清はまた、ノイラミニダーゼ阻害抗体の存在について、以前に記載されたフェツインに基づくアッセイ法を用いて調べた26。手短に言えば、96ウェルNuncMaxiSorpプレートを5μgmlのフェツイン100μlにより4°Cで終夜コーティングした。連続的に希釈した血清サンプル60μl量を、sNA4含有培養上清の等量とともに37°Cで30分間インキュベートし、その後、この混合物100μlを、フェツインでコーティングされたウェルに加えた。37°Cで1時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ノイラミニダーゼ活性をその後、ペルオキシダーゼ標識ピーナッツ凝集素を添加し、室温で1時間インキュベートし、プレートを洗浄し、各ウェルにペルオキシダーゼ基質100μlを添加することによって、測定した。5分後、03Mリン酸100μlの添加によって反応を停止し、ELISA読取機を用いて450nmでOD値を測定した。交差反応NI抗体について血清を調べるため、Aカリフォルニア042009に関する上記のものと類似のsNA4発現構築体を、AケンタッキーUR0602582007インフルエンザウイルスの頭部ドメインおよびAシチメンチョウトルコ12005インフルエンザウイルスの頭部ドメインについても作製した。これらのウイルスに感染したフェレットから得たA型インフルエンザNL60209およびAシチメンチョウトルコ12005に特異的な血清を陽性対照として用いた。上気道および下気道におけるウイルス複製右肺葉および副肺葉の全てのサンプルを感染フェレットから回収し、エタノールとともにドライアイス上で瞬間凍結し、さらなる処理まで70°Cで貯蔵した。肺サンプルを秤量し、その後、05ラクトアルブミン、10グリセロール、200Umlのペニシリン、200μgmlのストレプトマイシン、100Umlの硫酸ポリミキシンB、250μgmlのゲンタマイシンおよび50Umlのナイスタチンを含有するハンクス平衡塩類溶液中のFastPrep24でホモジナイズし、手短に遠心分離した。鼻および咽頭スワブを、肺サンプルをホモジナイズするために用いたのと同じ培地中にて70°Cで直接貯蔵した。咽頭、鼻および肺サンプルの四つ組の10倍連続希釈液を用いて、以前に記載のように、MDCK細胞に感染させた16。接種から5日後に回収した培養上清のHA活性を、感染の指標として用いた。力価をSpearmanKarber法にしたがって計算し、肺組織の場合には1グラムあたり、またはスワブの場合には1mlあたりのlogTCID50として表した27。病理組織診断A型インフルエンザNL60209ウイルスの接種後日数4日目に、フェレットを安楽死させ、肺を肉眼的に観察し、かつ秤量し、その後右肺からのサンプルを回収してウイルス力価を判定した。その後、左肺葉を10中性緩衝ホルマリンで膨張させた。固定およびパラフィン包埋の後、肺を4μmの薄片にし、組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン染色によって調べた。統計解析動物群間の有意性は一元配置ANOVAおよびANOVAの後のTukey検定によって解析した。差異は、P005で有意とみなした。結果sHA3およびsNA4の免疫によって誘導された抗体反応糖タンパク質を、同種ウイルス攻撃に対し防御免疫を誘導するその能力について試験した。フェレットを、アジュバントなしのsHA3sNA4、ISCOMマトリックスMで増強したsHA3sNA4、または同様に増強したsHA3もしくはsNA4を用いて、0日目および20日目に免疫した。血清を2回目の免疫の日および攻撃前の日に回収し、抗体反応を、同種ウイルスに対するHIおよびVNアッセイ法によって、ならびにNIアッセイ法によって測定した。これらのアッセイ法のいずれかでの反応は、PBSまたはアジュバントだけをワクチン接種した対照動物では観察されず、また、sHA3およびsNA4の非増強混合物を用いて免疫した動物においても観察されなかった。対照的に、増強したsHA3による免疫は、高いHI力価を誘導し、攻撃の日に91の幾何平均力価を有した。興味深いことに、sNA4をさらに含めることで、平均HI力価が468まで著しく増加した。また、NI力価測定から、アジュバント依存的なNA抗体誘導が明らかとなり、これは1回の免疫後には低かったが、しかし2回の免疫後には強力にブーストされた。しかしながら、この場合、sHA3の同時投与のために、これらの力価の明らかな増大は観察されなかった。観察されたHI力価と一致して、高いVN力価がsHAIMMワクチン接種動物およびsHAsNAIMMワクチン接種動物の両方において認められた。またここで、sNA4抗原とsHAsNAIMMワクチンとの同時投与は、平均VN力価の増加、つまりsHAIMM群およびsHAsNAIMM群それぞれにおいて、1202から1468に及ぶ平均値をもたらした。2009A型インフルエンザウイルス感染後の臨床兆候に対する防御ワクチン接種したフェレットを2回目のワクチン接種から5週後に106TCID50の2009Aで攻撃した。接種後2日目以降に、臨床兆候が接種フェレットにおいて観察され、これには呼吸困難、昏睡状態、食欲減退および体重減少が含まれた。全体として、群2、3および4のフェレットでは軽度の臨床兆候しか観察されなかったが、群1、5および6のフェレットでは、より重度の症状が観察された。PBSおよびIMMをワクチン接種した対照群、およびアジュバント非添加sHAsNAワクチン群では、体重の減少が明らかになった。興味深いことに、sHAIMMで免疫した動物はほぼ同様の体重減少を示したが、sNA4含有配合物の両方のワクチン接種後では、体重は大きな影響を受けなかった。程度の差はあるが一貫して、死後に確定したフェレットの肺重量は、増強したsNA4ワクチン接種動物の、一致した傾向を示し、肺硬変に起因する疾患関連の増加は最も小さかった。フェレットの肺における肉眼的病理所見および組織病理学的所見インフルエンザウイルスの2009A型ウイルス接種から4日後、フェレットの肺を肉眼的に調べ、かつ秤量し、その後ウイルス複製および組織病理学的変化を評価するためサンプルを採取した。接種されたフェレットの肺において、赤黒く堅固に硬化した領域が肉眼的に観察された。罹患した肺組織の割合を評価したところ、群間で異なっていた。約50である肺中罹患域平均割合が群1、5および6のフェレットでは観察されたが、群2、3および4のフェレットでは硬化の程度があまりはっきりせず、それは25未満の罹患肺域を示した。また、相対的な肺重量は、これらの群において、群1、5および6のフェレットにおける肺重量と比べて少なかった。PBSもしくはアジュバントのみを用いてモックワクチン接種したフェレットまたは非増強sHA3sNA4を用いてワクチン接種したフェレットの肺において接種後4日目に観察された組織病理学的変化は、中等度から重度の壊死性の気管支間質性肺炎に特徴があった。多病巣性に、多くの好中球およびマクロファージ、ならびに不定数の赤血球、浮腫液および線維素が、これらのフェレットの肺の肺胞に存在していた。さらに、炎症性浸潤が肺胞中隔、細気管支、気管支、ならびに気管支および細気管支の壁に存在していた。組織病理学的変化の劇的な低減が増強したsNA4ワクチン接種動物において観察されたのに対し、sHAIMMを免疫したフェレットの病状発現の防止は部分的であった。上気道および下気道におけるウイルス複製に対する防御気道におけるウイルス複製に及ぼすワクチン接種の効果を測定するために、接種から4日後に肺、咽頭および鼻においてウイルス力価を判定した。図5に示されるように、攻撃ウイルスは、対照フェレットの肺において、ならびにsHA3およびsNA4の非増強混合物を免疫した動物において、効率的に複製し、およそ107~108TCID50グラム組織の平均ウイルス力価を有していた。これらのウイルス負荷は、アジュバント中のsHA3タンパク質で免疫した動物において、ならびにアジュバント中のsHA3およびsNA4で同時免疫した動物において、約5log10単位だけ低減された。平均ウイルス負荷は、増強したsNA4抗原で免疫した動物において2~3log10単位だけ低減された。鼻における高いウイルス負荷が攻撃後4日目に対照動物において観察された。群内の力価のバラツキが大きいために統計的に有意ではないが、これらのウイルス負荷は、増強したsHA3もしくは増強したsNA4、または非増強sHA3sNA4の組み合わせを用いて免疫した動物においてやや低いように思われた。鼻ウイルス力価の最大の低減は、sHA3およびsNA4抗原の増強した組み合わせを用いて免疫した動物においてみられた。咽頭におけるウイルス力価は全体として高く、sHA3およびsNA4の増強した組み合わせをワクチン接種した動物を除き、ワクチン接種による有意な影響を受けなかった。これらのフェレットは咽頭において検出可能な力価を有していなかった。sHA3およびsNA4の免疫によって誘導される交差反応抗体の反応sHA3およびsNA4抗原によって誘導される抗体が他のH1N1型インフルエンザウイルスと交差反応しうるかどうか調べるために、本発明者らはワクチン接種後の血清を用いてさらなるHIおよびNIアッセイ法を行った。予想通り、最大のHI力価は同種ウイルスに対して測定されたが、さまざまな程度の交差反応性が一連の他のH1株で観察された。したがって、交差反応性はAブタショープ156、Aイタリア144376、Aアイオワ1530、APR834およびIVR148について検出されなかったが、顕著な交差反応性がANL2580およびAニュージャージー876に対して、特に、ANL38686に対して測定され、多かれ少なかれ、その抗原ドメインの配列類似性と一致していた。表1異なるH1N1型株のHA中の抗原性領域の配列相同性配列利用不可na該当なしこれはsHA3IMMおよびsHA3sNA4IMMワクチン接種動物の両方に由来する血清にも当てはまった。同種ウイルスに対するHI活性の、初期に観察された相違と一致して、交差反応性のレベルは、sHA3IMMを用いて免疫した動物由来の血清よりもsHA3sNA4IMMを用いて免疫したフェレット由来の血清で著しく高く、かさねて、sNA4抗原の強化効果を裏づけた。各株に対するHI力価が同種インフルエンザAH1N1型ウイルスに感染したフェレットの対照血清において検出された。NA抗体の交差反応性を調べるために、本発明者らは2つの他のN1インフルエンザウイルスである、ヒトH1N1型株AケンタッキーUR0602582007および鳥H5N1型株Aシチメンチョウトルコ12005の、sNA4糖タンパク質複合体を作製した。本発明者らのNIアッセイ法において試験した場合、鳥H5N1型ウイルスsNA4タンパク質に対しsNA4IMMおよびsHA3sNA4IMM免疫動物のプール血清で強力なノイラミニダーゼ阻害活性が認められ、その一方で季節性H1N1型ウイルスsNA4タンパク質のいくらかの阻害が観察された。注目すべきは、H5N1型ウイルスに感染したニワトリに由来する対照血清の試験結果は、両方のヒトH1N1型ウイルスsNA4タンパク質に対して陰性であった。参考文献