"a組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている;およびb組織の細胞表面に関する増殖因子受容体に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生または生存を調節するように活性化ドメインが増殖因子受容体に結合する:を含む二重特異的融合タンパク質。さらにペプチド半減期モジュレータを含む、請求項1に記載の融合タンパク質。a組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている;b組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが表面関連分子にさらされると、組織の再生または生存を調節するように活性化ドメインが表面関連分子に結合する;およびc二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ:を含む二重特異的融合タンパク質。a組織に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメイン;b組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが該分子にさらされると、組織の再生または生存を調節するように該活性化ドメインが該分子に結合する;およびc二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ:を含む二重特異的融合タンパク質。a組織に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメイン;b組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する結合ドメインであって、該結合ドメインが該分子にさらされると、組織の再生または生存を調節するように該結合ドメインが該分子に結合する;およびc二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ:を含む二重特異的融合タンパク質。a組織に関する少なくとも1個の標的分子に結合特異性を有する少なくとも1個の標的化ドメイン;b組織の細胞表面に関する少なくとも1個の分子に結合特異性を有する少なくとも1個の活性化ドメインであって、該活性化ドメインが該分子にさらされると、組織の再生または生存を調節するように該活性化ドメインが該分子に結合する;およびc二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ:を含む融合タンパク質。活性化ドメインまたは結合ドメインが増殖因子受容体、サイトカイン受容体または幹細胞関連抗原に特異的に結合する、請求項3~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。標的化ドメインが生物活性を有さない、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。標的化ドメインおよび活性化ドメインが、同じ細胞の異なる分子と結合する、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。標的化ドメインおよび活性化ドメインが、異なる細胞の異なる分子と結合する、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。活性化ドメインが、線維芽細胞増殖因子、上皮成長因子、ニューレグリン/ヘレグリン、インスリン様成長因子、肝細胞増殖因子、チモシン、顆粒球コロニー刺激因子、幹細胞因子、ペリオスチン、血管内皮増殖因子、間質細胞由来因子、血小板由来増殖因子、テラトカルシノーマ由来増殖因子、マスト細胞/幹細胞増殖因子、高親和性神経成長因子、BDNF/N-3増殖因子、NT-3増殖因子、トロンボポエチン、ペリオスチン、チモシン、骨形態形成タンパク質、インターロイキン、活性化受容体に特異性を有する抗体、それらの変異体、それらのアイソフォーム、それらの断片およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。標的化ドメインが、10-6Mから10-12Mの範囲の解離定数Kdで、標的分子と結合する、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。標的化ドメインが融合タンパク質のアミノ末端にあり、活性化ドメインが融合タンパク質のカルボキシ末端にある、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。標的化ドメインが活性化ドメインのアミノ末端にある、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。標的化ドメインが活性化ドメインのカルボキシ末端にある、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。標的化ドメインが融合タンパク質のカルボキシ末端にあり、活性化ドメインが融合タンパク質のアミノ末端にある、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。半減期モジュレータが非免疫原性のタンパク質である、請求項2~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。半減期モジュレータがヒト血清アルブミン、アルファ-フェトプロテイン、ビタミンD結合タンパク質、トランスサイレチン、単一鎖の抗体Fcドメイン、プロリン-、アラニン-、および/または、セリン-豊富な配列、アルブミン結合ドメイン抗体、それらの変異体、それらの断片、およびそれらの組合せのうちの一からの配列を含む、請求項17に記載の融合タンパク質。半減期モジュレータが血清アルブミンアミノ酸配列と少なくとも80同一である少なくとも100個の連続したアミノ酸を含む、請求項18に記載の融合タンパク質。半減期モジュレータが配列番号10、12、14~29、45~49、65~71または105のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を有する、請求項18に記載の融合タンパク質。標的化ドメインがミオシン、心臓ミオシン、DNA、ホスファチジルセリン、P-セレクチン、ICAM-1、それらの変異体、それらの断片、およびそれらの組合せからなる群から選択される標的分子と結合する、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。標的化ドメインがアネキシン、シナプトタグミンI、抗ホスファチジルセリン抗体、PS4A7、ラクトアドヘリン、抗ミオシン抗体、抗DNA抗体、それらの変異体、それらの断片、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。抗体が配列番号1、2、30、73、76~80のいずれか一つに記載される配列を有するscFv抗体である、請求項22に記載の融合タンパク質。アネキシンがアネキシンVであり、配列番号31、81、82または83のいずれか一つに記載される配列を有する、請求項22に記載の融合タンパク質。半減期モジュレータを融合タンパク質に結びつけるコネクタをさらに含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。invivoで2時間から24時間の間の半減期を示す、請求項2~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。invivoで24時間より長い時間の半減期を示す、請求項2~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。invivoで1週間より長い期間の半減期を示す、請求項2~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。融合タンパク質が、細胞動員、細胞増殖のアポトーシス、および/または、誘導の抑制を促進する、請求項2~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。融合タンパク質が、細胞の損傷を防ぎ、細胞の成長を促進し、幹細胞の運動性を促進し、幹細胞の分化を促進する、請求項2~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。組織が、心臓組織または腎組織、骨、軟骨、間接、皮膚、肝組織、膵臓組織、血球、肺組織、または神経系である、請求項2~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。さらにリーダーポリペプチドを含む、請求項2~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。リーダーポリペプチドが、配列番号41~42、87~91または244に記載される配列を含む、請求項32に記載の融合タンパク質。ポリヒスチジン含有ポリペプチドをさらに含む、請求項2~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。標的化ドメインが配列番号1、2、30、31、72~73、76~83、85または86のいずれか一つに記載される配列を含む、請求項2~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。活性化ドメインが配列番号3~9、32~40または50~64のいずれか一つに記載される配列を含む、請求項2~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。ポリヒスチジン含有ポリペプチドが、配列番号43~44、または92~94のいずれか一つに記載される配列を有する、請求項34に記載の融合タンパク質。活性化ドメインがNRG1beta、IGF1、SDF-1、IL-33、それらの変異体、それらのアイソフォーム、それらの断片およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項11に記載の融合タンパク質。医薬上好適な担体および治療上有効量の請求項1~37のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。組織再生を調節するようにそれを必要とする患者に請求項38に記載の医薬組成物を投与することを含む、対照の組織損傷を治療するための方法。ai組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている;およびii増殖因子受容体に結合特異性を有する活性化ドメイン、を含む二重特異的融合タンパク質を提供すること;およびbそれを必要とする患者に治療上有効な量の二重特異的融合タンパク質を投与し、それによって標的化ドメインが組織の損傷細胞に関する標的分子に特異的に結合し、その結果組織の第一の細胞に二重特異的融合タンパク質を標的化し、かつ、それによって活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生を促進するように活性化ドメインが第二の細胞の増殖因子受容体を活性化すること:を含む、対象の組織再生または生存を促進する方法。ai標的分子に結合特異性を有する標的化ドメイン;ii受容体に結合特異性を有する活性化ドメイン;iii二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータを含む二重特異的融合タンパク質を提供すること;およびbそれを必要とする患者に治療上有効な量の二重特異的融合タンパク質を投与し、それによって標的化ドメインが標的分子に特異的に結合し、その結果組織の第一の細胞に二重特異的融合タンパク質を標的化し、かつ、それによって活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生を促進するように活性化ドメインが第二の細胞の受容体を特異的に活性化すること:を含む、対象の組織再生または生存を促進する方法。標的化ドメインおよび活性化ドメインが同じ細胞に関する分子に結合する、請求項41または42に記載の方法。標的化ドメインおよび活性化ドメインが異なる細胞に関する分子に結合する、請求項41または42に記載の方法。幹細胞を患者に投与することをさらに含む、請求項41または42に記載の方法。第一の細胞は生存細胞であり、第二の細胞は損傷細胞または損傷のリスクのある細胞である、請求項42に記載の方法。請求項1~38のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。発明の概要本発明は、二重特異的融合タンパク質、二重特異的融合タンパク質をコードする核酸分子およびそのような二重特異的融合タンパク質を用いる治療方法を提供する。ある実施態様において、本発明は:a組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている;b組織の細胞表面に関する増殖因子受容体に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生または生存を調節するように活性化ドメインが増殖因子受容体に結合する、を含む二重特異的融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質はさらにペプチド半減期モジュレータを含む。本発明のある実施態様において、二重特異的融合タンパク質は、a組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている;b組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが表面関連分子surface-associatedmoleculeにさらされると、組織の再生または生存を調節するように活性化ドメインが表面関連分子に結合する;およびc二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。本発明の他の実施態様において、二重特異的融合タンパク質は、a組織に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメイン;b組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが該分子にさらされると、組織の再生または生存を調節するように該活性化ドメインが該分子に結合する;およびc二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。本発明の他の実施態様において、二重特異的融合タンパク質は、a組織に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメイン;b組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する結合ドメインであって、該結合ドメインが該分子にさらされると、組織の再生または生存を調節するように該結合ドメインが該分子に結合する;およびc二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。本発明のさらに他の実施態様において、二重特異的融合タンパク質は、a組織に関する少なくとも1個の標的分子に結合特異性を有する少なくとも1個の標的化ドメイン;b組織の細胞表面に関する少なくとも1個の分子に結合特異性を有する少なくとも1個の活性化ドメインであって、該活性化ドメインが該分子にさらされると、組織の再生または生存を調節するように該活性化ドメインが該分子に結合する;およびc二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。いくつかの実施形態において、活性化ドメインまたは結合ドメインは増殖因子受容体、サイトカイン受容体または幹細胞関連抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは生物活性を有さない。標的化ドメインおよび活性化ドメインは、同じ細胞の異なる分子と結合でき、また異なる細胞の異なる分子に結合できる。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、線維芽細胞増殖因子FGF、上皮成長因子EGF、ニューレグリン/ヘレグリンNRG/HRG、インスリン様成長因子IGF、肝細胞増殖因子HGF、チモシン、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、幹細胞因子SCF/マスト細胞増殖因子MGF、ペリオスチン、血管内皮増殖因子VEGF、間質細胞由来因子SDF、血小板由来増殖因子PDGF、テラトカルシノーマ由来増殖因子TDGF、ベータ-神経成長因子NGF、脳由来神経栄養因子BDNF、ニューロトロフィン-3NT-3、トロンボポエチンTPO、骨形態形成タンパク質BMP、アクチビンA、ベータセルリン、ベータ-カテニン、dickkopfホモログ1DKK1、エリスロポエチンEPO、成長ホルモンGH、ヘパリン結合性EGF様増殖因子HBEGF、インスリン、インターロイキンIL、白血病抑制因子LIF、単球走化性タンパク質1MCP1/CCL2、プレイオトロフィンPTN、形質転換増殖因子TGF、腫瘍壊死因子TNF、Wnt、活性化受容体に特異性を有する抗体、それらの変異体、それらのアイソフォーム、それらの断片およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは配列番号3-9、32-40または50-64のいずれか一つに記載される配列を含む。標的化ドメインおよび活性化ドメインは、融合タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端にあることができる。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは融合タンパク質のアミノ末端にあり、活性化ドメインは融合タンパク質のカルボキシ末端にある。いくつかの実施形態において、標的化ドメインはカルボキシ末端にあり、活性化ドメインは融合タンパク質のアミノ末端にある。いくつかの実施例において、半減期モジュレータは非免疫原性のタンパク質である。半減期モジュレータはヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのドメインIII、アルファ-フェトプロテイン、ビタミンD結合タンパク質、トランスサイレチン抗体Fcドメイン、抗体Fcドメインの単一鎖版、プロリン-、アラニン-、および/または、セリン-豊富な配列、それらの変異体、それらの断片、およびそれらの組合せのうちの一からの配列を含むことができる。例えば、半減期モジュレータは血清アルブミンアミノ酸配列と少なくとも80同一である少なくとも100個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは配列番号10、12、14-29、45-49、65-71または105のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、標的化ドメインはミオシン、心臓ミオシン、DNA、ホスファチジルセリン、P-セレクチン、ICAM-1、c-MetHGF受容体、それらの変異体、それらの断片、およびそれらの組合せからなる群から選択される標的分子と結合する。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、10-6Mから10-12Mの範囲の解離定数Kdで、標的分子と結合する。標的化ドメインはアネキシン、シナプトタグミン、抗ホスファチジルセリン抗体、PS4A7、ラクトアドヘリン、抗ミオシン抗体、抗DNA抗体、aDNASI1、aDNASI22、それらの変異体、それらの断片、およびそれらの組合せからなる群より選択できる。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは配列番号1-2、30-31、72-73、76-83または85-86のいずれか一つに記載される配列を有する。いくつかの実施形態において、抗体は配列番号1、2、30、73、76-80のいずれか一つに記載される配列を有するscFv抗体である。いくつかの実施形態において、アネキシンはアネキシンVであり、配列番号31、81、82または83のいずれか一つに記載される配列を有する。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは配列番号1、2、30、31または72-86のいずれか一つに記載される配列を含む。いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は半減期モジュレータを融合タンパク質に結びつけるコネクタをさらに含む。二重特異的融合タンパク質は、invivoで2時間から6時間の間、6時間から24時間の間、24時間より長い時間、または1週間より長い期間の半減期を示すことができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、細胞動員、細胞増殖のアポトーシス、および/または、誘導の抑制を促進する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、細胞の損傷を防ぎ、細胞の成長を促進し、幹細胞の運動性を促進し、かつ/または、幹細胞の分化を促進する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は組織再生を促進する。組織は、心臓組織、腎組織、骨、軟骨、間接、皮膚、肝組織、膵臓組織、血球、肺組織、または神経系であり得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はさらにリーダーポリペプチドleaderpolypeptideを含む。リーダーポリペプチドは、配列番号41、42、87-91または244のいずれか一つに記載される配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はポリペプチドアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、アフィニティータグは融合タンパク質のアミノ末端、融合タンパク質のカルボキシ末端、または融合タンパク質の中間にある。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はヘキサヒスチジン含有ポリペプチドを含む。ヘキサヒスチジン含有ポリペプチドは、配列番号43、44、または92-94のいずれか一つに記載される配列を有することができる。本明細書において提供される二重特異的結合剤は、必ずしも2個の結合特異性に制限されるというわけではない。ある実施形態において、標的化ドメインに加えて、二重特異的融合タンパク質は、ペプチド結合を経て直接または間接的に結び付けられる2個以上の活性化ドメインを含む。ある実施形態において、活性化ドメインに加えて、二重特異的融合タンパク質はペプチド結合を経て直接または間接的に結び付けられる2個以上の標的化ドメインを含む。他の実施態様において、本発明は、上記の二重特異的融合タンパクを生理学的に許容される担体との組合せで含む、医薬組成物を提供する。さらに他の実施態様の中で、病理的な組織障害に苦しむ患者に医薬組成物を投与して、その結果患者の病理的な組織障害を低下させることを含む、患者の病理的な組織障害を治療するための方法が提供される。本発明の態様は対象の組織再生または生存を促進する方法に関し、その方法は、ai組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている;およびii増殖因子受容体に結合特異性を有する活性化ドメイン、を含む二重特異的融合タンパク質を提供すること;およびbそれを必要とする患者に治療上有効な量の二重特異的融合タンパク質を投与し、それによって標的化ドメインが組織の損傷細胞に関する標的分子に特異的に結合し、その結果組織の第一の細胞に二重特異的融合タンパク質を標的化し、かつ、それによって活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生を促進するように活性化ドメインが第二の細胞の増殖因子受容体を活性化すること、を含む。いくつかの実施形態において、対象の組織再生または生存を促進する方法は、ai標的分子に結合特異性を有する標的化ドメイン;ii受容体に結合特異性を有する活性化ドメイン;iii二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータを含む二重特異的融合タンパク質を提供すること;およびbそれを必要とする患者に治療上有効な量の二重特異的融合タンパク質を投与し、それによって標的化ドメインが標的分子に特異的に結合し、その結果組織の第一の細胞に二重特異的融合タンパク質を標的化し、かつ、それによって活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生を促進するように活性化ドメインが第二の細胞の受容体を特異的に活性化すること、を含む。いくつかの実施形態において、第一および第二の細胞は同じである。また他の実施形態において、第一および第二の細胞は異なる。いくつかの実施形態において、第一の細胞は生存細胞であり、第二の細胞は損傷細胞である。また他の実施形態において、第一の細胞は損傷細胞であり、第二の細胞は生存細胞である。いくつかの実施形態において、方法は患者に幹細胞を投与することをさらに含む。ある実施形態において、病理的な組織損害は心筋梗塞に関する心臓組織の損傷である。他の実施形態において、病理的な組織損害は腎臓組織の損傷である。他の実施形態において、病理組織損害は骨、軟骨、間接、皮膚、肝組織、膵臓組織、血球、肺組織、または神経系におけるものである。ある実施形態において、そのような方法は患者に幹細胞を投与することをさらに含む。上記で説明されるように、二重特異的融合タンパク質をコードする核酸分子も本明細書において提供される。ある実施形態において、核酸分子はDNAであり、かつ、DNAはさらに二重特異的融合タンパク質コード配列に任意に結び付けられ、コーディング配列の転写および翻訳が少なくとも1個の真核細胞型で現れるような、転写および翻訳調節塩基配列を含む。本発明のこれらのおよび他の実施態様は、以下の詳細な記載を参照することにより明らかになるであろう。配列表の記載配列番号1は、抗DNAscFvSI-1のアミノ酸配列である。配列番号2は、抗DNAscFvSI-22のアミノ酸配列である。配列番号3は、野生型ヒトIGF-I成熟形態に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号4は、D12A置換を有するヒトIGF-1に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号5は、E9A置換を有するヒトIGF-1に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号6は、ヒトHGFアルファ鎖N-K1ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号7は、ヒトHGFアルファ鎖K1ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号8は、ヒトHGFアルファ鎖N-K2融合に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号9は、ヒトHGFアルファ鎖K2ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号10は、C34SおよびN503Q置換を有するヒト血清アルブミンHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号11は、C34SおよびN503Q置換を有するHSAリンカーの核酸配列である。配列番号12は、HSAのアミノ酸配列である。配列番号13は、HSAの核酸配列である。配列番号14は、C34SおよびN503Q置換およびポリペプチドコネクタを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号15は、C34SおよびN503Q置換およびポリペプチドコネクタを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号16は、C34SおよびN503Q置換およびポリペプチドコネクタを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号17は、C34SおよびN503Q置換およびポリペプチドコネクタを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号18は、C34SおよびN503Q置換およびポリペプチドコネクタを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号19は、ポリペプチドコネクタを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号20は、ポリペプチドコネクタを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号21は、ポリペプチドコネクタを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号22は、ポリペプチドコネクタを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号23は、ポリペプチドコネクタを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号24は、C34S置換を有するHSAリンカー、ドメインIのアミノ酸配列である。配列番号25は、HSAリンカー、ドメインIIのアミノ酸配列である。配列番号26は、N503Q置換を有するHSAリンカー、ドメインIIIのアミノ酸配列である。配列番号27は、HSAリンカー、ドメインIのアミノ酸配列である。配列番号28は、HSAリンカー、ドメインIIIのアミノ酸配列である。配列番号29は、ヒトアルファ-フェトプロテインのアミノ酸配列である。配列番号30は、抗ホスファチジルセリンscFvPS4A7のアミノ酸配列である。配列番号31は、ヒトアネキシンVAnxVのアミノ酸配列である。配列番号32は、ヒトHGFアルファ鎖N-K1ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号33は、ヒトHGFアルファ鎖K1ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号34は、ヒトHGFアルファ鎖N-K2ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号35は、ヒトHGFアルファ鎖K2ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号36は、ヒトVEGFアルファ単量体に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号37は、ヒトVEGFアルファ二量体に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号38は、ヒトFGF2に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号39は、ヒトNRG1アルファ、EGF様ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号40は、ヒトNRG1アルファ、全配列に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号41は、二重特異的融合タンパク質リーダーポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号42は、二重特異的融合タンパク質リーダーポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号43は、C-末端ヘキサヒスチジン含有ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号44は、C-末端ヘキサヒスチジン含有ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号45は、HSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号46は、N末端およびC末端の短いコネクタポリペプチドを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号47は、N末端およびC末端の短いコネクタポリペプチドを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号48は、N末端およびC末端の短いコネクタポリペプチドを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号49は、N末端およびC末端の短いコネクタポリペプチドを有するHSAリンカーのアミノ酸配列である。配列番号50は、ヒトFGF2に対応する増殖因子ポリペプチドの変異体のアミノ酸配列である。配列番号51は、ヒトHGFアルファ鎖に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号52は、ヒトHGFアルファ鎖K1ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号53は、ヒトHGFアルファ鎖N-K2ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号54は、ヒトHGFアルファ鎖K2ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号55は、ヒトNRG1ベータ細胞外ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号56は、ヒトNRG1ベータEGF様ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号57は、ヒト完全長ペリオスチンのアミノ酸配列である。配列番号58は、ヒトペリオスチンの領域のアミノ酸配列である。配列番号59は、ヒト骨形成タンパク質-2に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号60は、一本鎖ヒト骨形成タンパク質-2に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号61は、血管内皮増殖因子Bに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号62は、ヒト血管内皮増殖因子Bの一部のアミノ酸配列である。配列番号63は、ヒト血管内皮増殖因子Bの一部のアミノ酸配列である。配列番号64は、ヒト血管内皮増殖因子Bの一部のアミノ酸配列である。配列番号65は、ヒト血清アルブミンHSAのドメインIIIのアミノ酸配列である。配列番号66は、改質modifiedビタミンD結合タンパク質mVDBPのアミノ酸配列である。配列番号67は、改質ヒト血清アルブミンのドメインIIIのアミノ酸配列である。配列番号68は、ヒトAFPのアミノ酸配列である。配列番号69は、改質AFPのアミノ酸配列である。配列番号70は、アルブミン結合ドメインヒト抗体albudAbのアミノ酸配列である。配列番号71は、scFcと名づけられた、単量体の異型Fcのアミノ酸配列である。配列番号72は、シナプトタグミンIのアミノ酸配列である。配列番号73は、抗DNAscFv抗体のアミノ酸配列である。配列番号74は、非結合性シナプトタグミンI変異体のアミノ酸配列である。配列番号75は、非結合性scFv変異体DAscFvのアミノ酸配列である。配列番号76は、B7scFv抗ミオシンscFv抗体のアミノ酸配列である。配列番号77は、FD2抗ミオシンscFv抗体のアミノ酸配列である。配列番号78は、MCA1抗ミオシンscFv抗体のアミノ酸配列である。配列番号79は、MCB11抗ミオシンscFv抗体のアミノ酸配列である。配列番号80は、S3F5抗ミオシンscFv抗体のアミノ酸配列である。配列番号81は、ヒトアネキシンVの変異体AnxVmC317Sのアミノ酸配列である。配列番号82は、ヒトアネキシンVの変異体AnxVm3のアミノ酸配列である。配列番号83は、ヒトアネキシンVの変異体AnxVm23のアミノ酸配列である。配列番号84は、ヒトアネキシンVの非結合性変異体AnxVm1234のアミノ酸配列である。配列番号85は、ラクトアドヘリンの変異体のアミノ酸配列である。配列番号86は、ラクトアドヘリンの変異体のアミノ酸配列である。配列番号87は、アルファ接合因子のアミノ酸配列である。配列番号88は、app8リーダーポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号89は、aga2シグナルペプチドのアミノ酸配列である。配列番号90は、SUC2シグナルペプチドのアミノ酸配列である。配列番号91は、合成シグナルペプチドのアミノ酸配列である。配列番号92は、ヘキサヒスチジンタグのアミノ酸配列である。配列番号93は、ヘキサヒスチジンタグのアミノ酸配列である。配列番号94は、ヘキサヒスチジンタグのアミノ酸配列である。配列番号95から104、および配列番号182から184は、ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列に対応する。配列番号105は、プロリン-、アラニン-および/またはセリン-豊富な配列のアミノ酸配列である。配列番号106は、aDNASI1_mHSA_IGF1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号107は、aDNASI1_mHSA_IGF1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号108は、aPS4A7_mHSA_IGF1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号109は、aPS4A7_mHSA_IGF1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号110は、aDNASI1_mHSA_HGFNK1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号111は、aDNASI1_mHSA_HGFNK1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号112は、aPS4A7_mHSA_HGFNK1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号113は、aPS4A7_mHSA_HGFNK1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号114は、AnxVm1234_mHSA_IGF1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号115は、AnxVm1234_mHSA_IGF1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号116は、AnxVm1234_mHSA_NRG1bEGF融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号117は、AnxVm1234_mHSA_NRG1bEGF融合タンパク質の核酸配列である。配列番号118は、AnxV_mHSA_FGF2融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号119は、AnxV_mHSA_FGF2融合タンパク質の核酸配列である。配列番号120は、AnxV_mHSA_NRG1bEGF融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号121は、AnxV_mHSA_NRG1bEGF融合タンパク質の核酸配列である。配列番号122は、FGF2_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号123は、FGF2_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質の核酸配列である。配列番号124は、aDNASI1_mHSA_FGF2融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号125は、aDNASI1_mHSA_FGF2融合タンパク質の核酸配列である。配列番号126は、aDNASI1_mHSA_NRG1bEGF融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号127は、aDNASI1_mHSA_NRG1bEGF融合タンパク質の核酸配列である。配列番号128は、AnxV_mHSA_VEGFB111融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号129は、AnxV_mHSA_VEGFB111融合タンパク質の核酸配列である。配列番号130は、AnxV_mHSA_VEGFB167融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号131は、AnxV_mHSA_VEGFB167融合タンパク質の核酸配列である。配列番号132は、AnxV_mHSA_HGFNK1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号133は、AnxV_mHSA_HGFNK1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号134は、AnxV_mHSA_IGF1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号135は、AnxV_mHSA_IGF1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号136は、IGF1_mHSA_AnxV融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号137は、IGF1_mHSA_AnxV融合タンパク質の核酸配列である。配列番号138は、IGF1_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号139は、IGF1_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質の核酸配列である。配列番号140は、HGFNK1_mHSA_AnxV融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号141は、HGFNK1_mHSA_AnxV融合タンパク質の核酸配列である。配列番号142は、NRG1bEGF_mHSA_AnxV融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号143は、NRG1bEGF_mHSA_AnxV融合タンパク質の核酸配列である。配列番号144は、FGF2_mHSA_AnxV融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号145は、FGF2_mHSA_AnxV融合タンパク質の核酸配列である。配列番号146は、VEGFB167_mHSA_AnxV融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号147は、VEGFB167_mHSA_AnxV融合タンパク質の核酸配列である。配列番号148は、VEGFB111_mHSA_AnxV融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号149は、VEGFB111_mHSA_AnxV融合タンパク質の核酸配列である。配列番号150は、IGF1_mHSA_B7scFv融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号151は、IGF1_mHSA_B7scFv融合タンパク質の核酸配列である。配列番号152は、IGF1_mHSA_Syt1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号153は、IGF1_mHSA_Syt1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号154は、IGF1_mHSA_aDNASI1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号155は、IGF1_mHSA_aDNASI1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号156は、NRG1bEGF_mHSA_B7scFv融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号157は、NRG1bEGF_mHSA_B7scFv融合タンパク質の核酸配列である。配列番号158は、NRG1bEGF_mHSA_Syt1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号159は、NRG1bEGF_mHSA_Syt1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号160は、NRG1bEGF_mHSA_aDNASI1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号161は、NRG1bEGF_mHSA_aDNASI1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号162は、FGF2_mHSA_B7scFv融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号163は、FGF2_mHSA_B7scFv融合タンパク質の核酸配列である。配列番号164は、FGF2_mHSA_Syt1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号165は、FGF2_mHSA_Syt1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号166は、FGF2_mHSA_aDNASI1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号167は、FGF2_mHSA_aDNASI1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号168は、B7scFv_mHSA_IGF1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号169は、B7scFv_mHSA_IGF1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号170は、Syt1_mHSA_IGF1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号171は、Syt1_mHSA_IGF1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号172は、aDNASI1_mHSA_IGF1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号173は、aDNASI1_mHSA_IGF1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号174は、B7scFv_mHSA_NRG1bEGF融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号175は、B7scFv_mHSA_NRG1bEGF融合タンパク質の核酸配列である。配列番号176は、Syt1_mHSA_NRG1bEGF融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号177は、Syt1_mHSA_NRG1bEGF融合タンパク質の核酸配列である。配列番号178は、B7scFv_mHSA_FGF2融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号179は、B7scFv_mHSA_FGF2融合タンパク質の核酸配列である。配列番号180は、Syt1_mHSA_FGF2融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号181は、Syt1_mHSA_FGF2融合タンパク質の核酸配列である。配列番号185は、IGF1_mHSA_DAscFv融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号186は、IGF1_mHSA_DAscFv融合タンパク質の核酸配列である。配列番号187-190は、ヒトFGF2配列番号:38に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号191-194は、HGFアルファ鎖N-K1ドメイン配列番号:6、配列番号:32に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号195-197は、野生型ヒトIGF-I配列番号3に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号198は、ヒトNRG1アルファ、全配列配列番号40に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号199は、ヒトNRG1アルファ、EGF様ドメイン配列番号39に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号200-202は、ヒトNRG1ベータEGF様ドメイン配列番号56に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号203は、ヒトペリオスチンの領域配列番号58に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号204は、ヒト骨形成タンパク質-2配列番号59に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号205は、一本鎖ヒト骨形成タンパク質-2配列番号60に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号206は、ヒトVEGFアルファ単量体配列番号36に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号207は、ヒトVEGFアルファ二量体配列番号37に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号208-209は、血管内皮増殖因子B配列番号61に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号210-211は、ヒト血管内皮増殖因子Bに対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。配列番号212-214は、C34SおよびN503Q置換を有するヒト血清アルブミンHSAリンカー配列番号10に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。配列番号215は、改質ヒト血清アルブミンのドメインIII配列番号67に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。配列番号216は、改質AFP配列番号69に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。配列番号217は、アルブミン結合ドメインヒト抗体配列番号70に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。配列番号218は、scFcと名づけられた、単量体の異型Fc配列番号71に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。配列番号219は、改質ビタミンD結合タンパク質、mVDBP配列番号66に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。配列番号220-221は、抗DNAscFv抗体配列番号73に対応する核酸配列である。配列番号222は、抗DNAscFvSI-1配列番号1に対応する核酸配列である。配列番号223は、B7scFv抗ミオシンscFv抗体配列番号76に対応する核酸配列である。配列番号224は、抗ホスファチジルセリンscFvPS4A7配列番号30に対応する核酸配列である。配列番号225-227は、ヒトアネキシンV配列番号31に対応する核酸配列である。配列番号228は、ヒトアネキシンVの変異体C317S、配列番号81に対応する核酸配列である。配列番号229-230は、ヒトアネキシンVの変異体AnxVm3、配列番号82に対応する核酸配列である。配列番号231-232は、ヒトアネキシンVの変異体AnxVm23、配列番号83に対応する核酸配列である。配列番号233-234は、ヒトアネキシンVの変異体AnxVm1234、配列番号84に対応する核酸配列である。配列番号235は、シナプトタグミンI配列番号72に対応する核酸配列である。配列番号236-237は、非結合性scFv変異体DAscFv;配列番号75に対応する核酸配列である。配列番号238は、リーダーポリペプチドに対応する核酸配列である。配列番号239は、アルファ接合因子に対応する核酸配列である。配列番号240は、app8リーダーポリペプチドに対応する核酸配列である。配列番号241は、aga2シグナルペプチドに対応する核酸配列である。配列番号242は、SUC2シグナルペプチドに対応する核酸配列である。配列番号243は、合成シグナルペプチドに対応する核酸配列である。配列番号244は、アルファ因子シグナル配列に対応するアミノ酸配列である。配列番号245は、アルファ因子シグナル配列に対応する核酸配列である。配列番号246は、DAscFv_mHSA_IGF1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号247は、DAscFv_mHSA_IGF1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号248は、DAscFv_mHSA_HGFNK1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号249は、DAscFv_mHSA_HGFNK1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号250は、AnxVm1234_mHSA融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号251は、AnxVm1234_mHSA融合タンパク質の核酸配列である。配列番号252は、AnxV_mHSA融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号253は、AnxV_mHSA融合タンパク質の核酸配列である。配列番号254は、NRG1bEGF_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号255は、NRG1bEGF_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質の核酸配列である。配列番号256は、AnxVm23_mHSA融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号257は、AnxVm23_mHSA融合タンパク質の核酸配列である。配列番号258は、AnxVm1234_mHSA_VEGFB111融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号259は、AnxVm1234_mHSA_VEGFB111融合タンパク質の核酸配列である。配列番号260は、AnxVm1234_mHSA_VEGFB167融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号261は、AnxVm1234_mHSA_VEGFB167融合タンパク質の核酸配列である。配列番号262は、AnxVm1234_mHSA_HGFNK1融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号263は、AnxVm1234_mHSA_HGFNK1融合タンパク質の核酸配列である。配列番号264は、AnxVm1234_mHSA_FGF2融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号265は、AnxVm1234_mHSA_FGF2融合タンパク質の核酸配列である。配列番号266は、mHSA_AnxV融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号267は、mHSA_AnxV融合タンパク質の核酸配列である。配列番号268は、mHSA_AnxVm23融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号269は、mHSA_AnxVm23融合タンパク質の核酸配列である。配列番号270は、mHSA_AnxVm1234融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号271は、mHSA_AnxVm1234融合タンパク質の核酸配列である。配列番号272は、HGFNK1_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号273は、HGFNK1_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質の核酸配列である。配列番号274は、VEGFB167_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号275は、VEGFB167_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質の核酸配列である。配列番号276は、VEGFB111_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号277は、VEGFB111_mHSA_AnxVm1234融合タンパク質の核酸配列である。発明の詳細な説明本発明の態様は、2個の結合ドメイン、特定の標的分子または標的細胞に結合特異性を有する標的化ドメインおよび組織再生を調節する受容体に結合特異性を有する活性化ドメインを含む二重特異的融合タンパク質を対象とする。いくつかの実施形態において、活性化ドメインが細胞を活性化する役割を果たす間、標的化ドメインは二重特異的融合タンパク質の標的を標的細胞または組織に絞る役割を果たし、その結果、標的組織の再生を促進する。本明細書で用いられる二重特異的タンパク質は2個以上の特定の分子に特異的に結合する能力を有する融合タンパク質をいう。いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は1組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている;および2組織の細胞の増殖因子受容体またはサイトカイン受容体に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが増殖因子受容体またはサイトカイン受容体にさらされると、組織の再生または生存を調節するように活性化ドメインが増殖因子受容体またはサイトカイン受容体に結合する、を含む。いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は1組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている;2組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが膜関連分子にさらされると、組織の再生または生存を調節するように活性化ドメインが膜関連分子に結合する、および3二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。いくつかの実施形態において、二重特異的タンパク質は:1虚血関連分子に結合する標的化ポリペプチドドメイン;および2組織再生または生存を調節するような増殖因子ポリペプチドまたはサイトカインポリペプチドなどの活性化ドメイン、を含む。いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は1組織に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメイン;2組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する結合ドメイン例えば、活性化ドメインであって、該結合ドメインが該分子にさらされると、組織の再生または生存を促進するように結合ドメインが該分子に結合する、および3二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。ある実施形態において、二重特異的融合タンパク質は半減期モジュレータHLMを含む。いくつかの実施形態において、HLMはポリペプチドである。HLMは2個の末端、N末端およびC末端を有することができ、一方の末端において、標的化ポリペプチドドメインとペプチド結合を経て連結され、他方の末端において活性化ドメインとペプチド結合を経て連結される。他の実施形態において、半減期モジュレータは一方の末端N末端またはC末端にて活性化ドメインまたは標的化ドメインと連結される。従って、半減期モジュレータは二重特異性融合タンパク質のN末端またはC末端にあることができる。半減期モジュレータは標的化ドメインまたは活性化ドメインとペプチド結合を経て連結され得る。本発明の他の態様は、1組織に関する少なくとも1個の標的分子に結合特異性を有する少なくとも1個の標的化ドメイン;2組織の細胞表面に関する少なくとも1個の分子に結合特異性を有する少なくとも1個の活性化ドメインなどの結合ドメインであって、該結合ドメインが該分子にさらされると、組織の再生を促進するように該結合ドメインが該分子に結合する;および3任意に、二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は2個以上の標的化ドメイン、各々の標的化ドメインは組織に関する標的分子に結合親和性を有する、を含み得る。各々の標的化ドメインは、同じ結合特異性例えば、同じ標的分子への結合特異性、または異なる結合特異性例えば、異なる標的分子への結合特異性を有し得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は2個以上の活性化ドメインを含む。各々の活性化ドメインは、同じ結合特異性例えば、細胞上の同じ受容体への結合特異性、または異なる結合特異性例えば、細胞上の異なる受容体への結合特異性を有し得る。当業者は、そのような二重特異的融合タンパク質が組織再生で使われることができるのを理解するであろう。いくつかの実施形態において、組織または臓器障害に続いて、または組織の細胞が損傷され得る事象に続いて、損傷細胞において二重特異的融合タンパク質を使用できる。いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は1個以上の増殖因子および/またはサイトカイン例えば、ケモカインおよび/またはインテグリンを発現する細胞を活性化できる。他の実施形態において、例えば損傷、または組織の細胞が損傷され得る事象かまたは機能不全になり得る事象例えば、糖尿病におけるベータ細胞機能障害に続いて、1個以上の増殖因子および/またはサイトカイン例えば、ケモカイン受容体および/またはインテグリンを組織に発現する細胞例えば、幹細胞、先祖細胞または免疫細胞を供給するために、二重特異的融合タンパク質が使われることができる。さらにまた、invivoで、そのような二重特異的融合タンパク質の投与は、損傷組織または損傷器官の修復または再生を容易にするために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された二重特異的タンパク質は、組織生存の調節において使われることができる。例えば、二重特異的タンパク質は、細胞の生存力を高めるか、または維持できる。いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は生存促進経路または細胞生存経路を活性化できる。いくつかの実施形態において、二重特異性タンパク質はアポトーシスを調節できる。いくつかの実施形態において、二重特異的タンパク質はa標的化ポリペプチドドメインであって、該標的化ドメインが標的分子に結合し、その結果組織の第一の細胞に二重特異的融合タンパク質を標的化する、およびb受容体に結合特異性を有する活性化ドメイン、を有することができる。活性化ドメインが受容体にさらされると、活性化ドメインは細胞動員、アポトーシスの抑制、細胞増殖の誘導、生存促進経路の活性化、再生、組織の生存を促進するように第二の細胞の受容体を活性化できる。当業者は、二重特異的融合タンパク質が最初の細胞集団に結合し、同じ細胞集団例えば、自己分泌方法上、または、異なった細胞集団例えば、傍分泌方法上で働くことができるのを理解するであろう。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは損傷している第一の細胞集団に関する標的分子に特異的に結合し、活性剤ドメインは生存細胞の第二の細胞集団の受容体に結合する。さらにまたいくつかの実施形態において、標的化ドメインは第一の細胞集団の表面にて組織特異的標的分子に特異的に結合し、活性剤ドメインは第二の細胞集団に特異的に働く。第一の細胞は、生存細胞、またはリスク細胞であり得る。本明細書で使用されるリスク細胞はまだアポトーシスを受けていないか、または損傷していないが、損傷するリスクにさらされている生存細胞のことをいう。いくつかの実施形態において、二重特異的タンパク質は、組織または器官の異なる細胞上で異なる分子に結合する、2個の異なる標的化ドメインおよび活性剤ドメインなどの結合ドメインを持有する。さらに、他の実施形態において、二重特異的タンパク質は、組織の同じ標的細胞上で異なる分子に結合する2個の異なる結合ドメインを有し、標的化ドメインは標的細胞に特異的に結合するように選択され、活性化ドメインは組織再生を促進するように選択される。本明細書で使用されるポリペプチドなる用語は、ペプチド結合によって結びつけられた複数のアミノ酸残基からなる分子をいう。本用語はそのように結びつけられたアミノ酸残基の数に関して全く意味を有さない。本明細書で使用される二重特異的なる用語は、融合タンパク質の、2個の異なるリガンド:標的化ポリペプチドドメインにより結合した標的分子および活性化ドメインの受容体、と相互作用する能力をいう。標的化ポリペプチドドメインおよび活性化ドメインの結合特性について、以下でさらに詳細に議論する。本明細書で使用される標的分子なる用語は、組織例えば、罹患しているまたは損傷している組織に関するあらゆる分子をいう。標的細胞は二重特異的タンパク質またはその標的化ドメインが特異的に結合できる細胞を意味する。好ましい標的分子は、標的細胞の外部で露出されるか、または増える。いくつかの実施形態において、標的分子は損傷細胞に関し、標的分子は生存細胞または損傷細胞の細胞内部に存在し、かつ損傷細胞の細胞外空間に露出される。そのような分子は、例えば壊死DNAなどまたはアポトーシス例えば、ホスファチジルセリンを受ける細胞で露出される分子、ミオシンその組織型特異的サブタイプを含む、ICAM-1またはP-セレクチンを含む。さらに他の実施形態において、標的分子は、正常または機能的な細胞または組織で検出されるレベルと比べて、罹患したまたは機能不全の細胞または組織の表面で存在するかまたは増やされた分子である。細胞は脂質二重層を含む原形質膜または細胞膜によって境界される。細胞膜はサイトゾル細胞の内側または細胞質側に面する表面および細胞外空間または細胞外部に面する表面を有すると考えられ得る。アポトーシスの間、陰イオンリン脂質の内側から原形質膜の外葉までの二層間の運動が起こる。アネキシンV、シナプトタグミンIまたはラクトアドヘリンなどのリン脂質結合タンパク質は、細胞膜外葉のホスファチジルセリンの存在を検出するために使用される。ホスファチジルセリンは、通常、生存細胞または非損傷細胞では細胞質側に制限され、アポトーシスにおいて細胞表面外側または細胞外空間に露出されるようになる、リン脂質である。ホスファチジルセリンは、invivoの画像解析においてマーカーとして使用された表2を参照。いくつかの実施形態において、標的分子は虚血関連分子である。虚血関連分子は、虚血または酸欠の後に、有意に高いレベル例えば、少なくとも2倍高いで検出されるあらゆる分子である。本明細書で提供されるものを含む、いかなる好適な結合アッセイも、虚血関連分子を特定するために使用され得る。検出される増加するレベルの分子は、上方調節または減少した代謝の結果によるものであり得、または増加する接近性accessibility例えば、細胞損傷からもたらされるのためであり得る。ある実施形態において、虚血関連分子が虚血後組織の細胞において、虚血事象を受けていない同じ組織の細胞に比べて有意に高いレベル例えば、少なくとも2倍高いで検出されるすなわち、分子は、虚血後組織で特有かまたは増やされる。更なる実施形態において、虚血関連分子は細胞損傷に関連するすなわち、分子は同じ型の非損傷細胞より損傷細胞において有意に高いレベルで検出される。ある虚血関連分子は、虚血事象の後または心臓の虚血を再現するために使用されるモデル系において、心臓で増やされる2倍またはより高い。そのような分子は、例えば、壊死DNAなどのまたはアポトーシスを受ける筋細胞または他の心臓細胞で露出される分子、コラーゲンコラーゲンI、III、ミオシンその組織型特異的サブタイプを含むまたは虚血後心臓で増やされる他の細胞外基質タンパク質などの傷ついた心臓組織で増やされる分子を含む。そのような分子は、invivoでの虚血再かん流またはinvitroでの模擬虚血再かん流に続く、または酸欠、ATP減少、増加する活性酸素種ROS、一酸化窒素シンターゼNOS生産、またはinvitroで培養された細胞の血清飢餓などの状態への暴露に続く、増加を基に特定できる。標的化ポリペプチドドメイン組織に関する標的分子例えば、虚血関連分子への結合は、標的化ポリペプチドドメインによって仲介される。このドメインは、この機能を果たすいかなるポリペプチド配列であってもよい。好ましくは、標的分子への標的化ドメインの結合は、生物活性を有さない。本明細書で用いられる、生物活性は、融合タンパク質のドメインへの分子の露出により実施される既知の活性として定義されたものをいう。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、標的分子、その断片またはその変異体に結合親和性を有する非抗体の自然発生のポリペプチドである。さらに、他の実施形態において、標的化ポリペプチドドメインは1個以上の抗体可変領域を含む。当業者は、直接または間接的に標的分子に結合できるいかなる標的化ドメインも検討されることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、アネキシンV配列番号:31、その断片、またはその変異体。他の実施形態において、標的化ドメインは、シナプトタグミンI、その断片、またはその変異体である。シナプトタグミンISytIは約5~40nMの結合親和性でCa2依存の方法でホスファチジルセリンと結合することが示された。いくつかの実施形態において、標的化ドメインとして、シナプトタグミン例えば、C2Bの2個のC2ドメインの1個を使用できる。いくつかの実施形態において、標的化ドメインはシグナル伝達または膜輸送例えば、プロテインキナーゼC、血液凝固因子V、およびVIIIに関与するCa2依存膜標的化タンパク質のC2ドメインである。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは配列番号:72において記載される配列を有する。乳脂肪球-EGF8としても知られるラクトアドヘリンは、マクロファージによって分泌される45kDaのホスファチジルセリン結合性糖蛋白質である。ラクトアドヘリンはアミノ末端にEGF様ドメイン、およびカルボキシ末端に2個のC-ドメインを含む。従って、いくつかの実施形態において、標的化ドメインはラクトアドヘリン、その断片またはその変異体のC-ドメインを含む。いくつかの実施形態において、C2ドメインの1個以上の残基が、標的分子への結合の、より好適なオンレート、または標的分子への結合の、より好適なオフレート、を達成するように結合性を改質するために改変され得る。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは配列番号:85または86において記載される配列を有する。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドドメインはT細胞免疫グロブリンムチン1および4TIMタンパク質を含む。他の実施形態において、標的化ポリペプチドドメインは血漿2糖蛋白質1を通して間接的にホスファチジルセリンと結合できる3G4抗体または抗体ドメインを含む。さらに、他の実施形態において、標的化ポリペプチドドメインはホスファチジルセリンと結合できる抗ホスファチジルセリン抗体例えば、PS4A7、配列番号30または抗体ドメインを含む。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドドメインは標的分子に結合するポリペプチドを含む。そのようなポリペプチドの代表的なものは、本明細書で配列番号31、72、81-83または85-86として提供される配列を含むかまたは有する。そのようなポリペプチド核酸配列の代表的なものは、本明細書で配列番号225-232または235として提供される配列を含むかまたは有する。標的化ドメインとして天然ポリペプチドを使用できる。しかしながら、そのような天然配列の部分および改変された配列を有するポリペプチドを、そのようなポリペプチドが以下により詳細に記載されるように、適切な結合親和性Kdで標的分子と結合する能力を有する限り、使用でき得ることは明らかであろう。本発明で用いられる、抗体は、免疫グロブリンの遺伝子によって実質的にコードされた1個以上のポリペプチドからなるタンパク質である。典型的な抗体は、2個の相同な対のポリペプチド鎖から構成される四量体であり、各々の対は1個の軽約25kD、および1個の重鎖約50-70kDを有する。VLおよびVHはそれぞれこれらの軽鎖および重鎖をいう。抗体可変領域は、主として抗原認識に関与するアミノ酸残基を含む抗体の可変鎖VLまたはVHのN-末端領域である。当業者は容易に、抗体可変領域を特定し、抗原認識をもたらすために必要な最小サイズを決定することができる。通常、抗体可変領域は少なくとも70個のアミノ酸残基、および、より一般的に少なくとも100個のアミノ酸残基を含む。抗体可変領域を含むポリペプチドは、さらに他の軽鎖、および/または重鎖系列を含み得、さらに抗体由来ではない配列を必要ではないが含み得る。抗体可変領域の配列は自然に発生し得るか、または、機能抗原認識が維持される限り、標準技術を用いて改質され得ることは、明らかであろう。抗体可変領域を含むあるポリペプチドは、一本鎖抗体単一のポリペプチド鎖として存在する抗体、より好ましくは、可変重鎖領域および可変軽鎖領域が連続したポリペプチドを形成するように直接またはペプチドリンカーを通して結合している一本鎖Fv抗体scFvである。scFv抗体は、化学的に合成され得るか、または直接あるいはペプチドコードリンカーにより連結されたVH-およびVL-コード配列を含む核酸から発現され得る。結合または特異的結合は本明細書において相互に用いられ、二重特異的タンパク質が特定の分子例えば、標的化ドメインが標的分子に実質的な親和性を示すか、または活性化ドメインが受容体などの細胞表面に関する分子に実質的な親和性を示すまたは、分子に接している細胞または組織に実質的な親和性を示すことを示し、融合タンパク質または、その標的化ポリペプチドドメインまたはその活性化ドメインが特定の分子に実質的な親和性を有する場合に起こるといわれており、他の分子と有意な交差反応性を示さないものは選択的である。好ましい実質的な結合は、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12Mまたはそれより良い解離定数Kdでの結合を含む。例えば、抗体抗原相互作用のKdは50の抗体と抗原分子が熱力学平衡で共に結合する抗体の濃度モル濃度として表現されるを示す。したがって、適当な固定抗原濃度のときに、50の高いすなわち、強い親和性抗体が、より低い親和性の抗体が同じパーセントでの結合を達成するために必要であろうものよりも低い抗体濃度にて、抗原分子と結合するであろう。Kdはまた、オンおよびオフレートKonおよびKoffの動的な比であり;すなわち、Kd=Koff/Konである。したがって、低いKd値は、より高いより強い親和性を示す。本明細書で用いられる、より良い親和性は、より強い親和性であり、その比較対象よりも低い数値の解離定数によって特定される、すなわち、10-10MのKdは10-9MのKdよりも低い数値であり、それゆえより良い親和性を示す。10-7Mより良いすなわち、より低いKd値であり、それゆえより強い親和性、好ましくは10-8Mより良い親和性が一般に好ましい。本明細書で説明されたものの中間的な値も考慮され、好ましい結合親和性は解離定数の範囲として示すことができ、例えば、本明細書で開示される抗体の好ましい結合親和性は、10-6から10-12Mすなわり、マイクロモルからピコモル、好ましくは10-7から10-12M、より好ましくは10-8から10-12M、さらにより良い範囲のKd値により示される。有意な交差反応性を示さない抗体は、目標からはずれた抗原off-targetantigenに結合しないであろうものである。例えば、一の実施形態において、心臓ミオシンに特異的および選択的に結合する抗体は、心臓ミオシン以外のミオシン分子または非ミオシンタンパク質またはペプチドよりも、心臓ミオシンに対して少なくとも2、好ましくは3、または4以上の桁の量のより良い親和性すなわち、2、3、または4以上の桁の量のより低いKd値を示す結合を示すであろう。結合親和性および選択性は、そのような特性を決定するために当分野で認識されるいずれの方法を用いることで決定でき、それは、例えば、Scatchard分析および/または競合結合アッセイの使用を含む。当技術分野で周知の技術のいずれかを用いて、結合を評価およびKd値を測定し得る。例えば、虚血関連DNA分子への結合は、標的DNA断片で適切な固相担体例えば、ビーズ、ELISAプレートまたはBIACOREチップをコーティングすることによって、一般的に評価される。DNAのいかなる配列にも結合する標的化ポリペプチドドメインでは、10塩基対以上の一本鎖または二本鎖のDNA断片は固体基質に固定化される。特定の配列またはDNA複合体例えば、DNAヒストン複合体に結合する標的化ポリペプチドでは、適切な対応する標的が固定化される。虚血関連分子を添加する前に、タンパク質の非特異的結合部位はBSA、乳、またはいかなる他の適切な遮断剤で遮断される。非コートウェルまたは非標的分子でコートされたウェルは特異性の対照controlの役割を果たす。二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインの増加する濃度は、標的でコートされた基質または対照基質で培養される。標的と結合しない融合タンパク質またはドメインはまた、特異性の対照として試験される。二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインの標的特異的、用量依存的結合は、使用される固相担体および結合技術に対応する標準プロトコルを用いる、増加用量の関数として、対照に対する標的への二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメイン結合の量を測定することにより評価される。そのようなプロトコルの代表的なものは、Wassafetal.,Anal.Biochem.3512:241-532006;Epub2006Feb10BIOCORE;およびMurrayandBrown,J.Immunol.Methods.1271:25-81990ELISAを含む。加えて、固定化された標的分子の量を変える研究または競合としての可溶性標的分子の量の増加を含む研究が、結合および特異性を監視するために実施され得る。標的分子への結合についての結合親和性および動的オンおよびオフレートは、標準的な技術を用いて測定され、他の陰性対照分子例えば、無関係の標的化ポリペプチドまたは標的化ポリペプチドを欠く融合タンパク質または非結合性標的ポリペプチドをもつ融合タンパク質および陽性対照分子例えば、標的分子と結合する親抗体、または標的分子と結合することが知られている他の抗体または抗体断片と比較される。例えば、非結合性標的化ポリペプチドは、非結合性アネキシンV変異体配列番号:84、核酸配列灰列番号233-234、非結合性シナプトタグミン変異体配列番号:74または非結合性scFv配列番号:75;核酸配列配列番号236-237であり得る。ある実施形態において、Kdは、バイオセンサー例えば表面プラスモン共鳴例えば、BIAcoreまたは共鳴ミラー分析resonantmirroranalysisIAsysを用いて測定される。そのような測定は、Heftaetal.,MeasuringAffinityUsingBiosensors,inAntibodyEngineering:APracticalApproach,McCaffertyetal.eds,pp.99-116OxfordUniversityPress,1996、およびそれらに引用された文献に記載されるように実施し得る。簡潔には、動的オンおよびオフレートKonおよびKoffが、虚血関連分子が組み合わせられたセンサーチップを使用して測定される。結合Konを評価するために、結合が質量感知検出を用いて監視される間に、異なる濃度の二重特異性タンパク質または標的化ポリペプチドドメイン溶液がチップを流れる。BIAcoreシステムGEHealthcare;Piscataway,NJを用いて、Konは、Rが観察されたシグナルであるところの、dR/dtに対するRのプロットの傾きである。結合に続いて、解離は、緩衝液をチップに流すことにより、測定され、Koffは類似した方法で測定される。そして、Kdは、以下の式を用いることで計算されるKd=Koff/Kon本発明の文脈では、二重特異的融合タンパク質が、10-8Mより低い、好ましくは10-7M、10-8M、10-9Mまたは10-10Mより低いKdで結合していれば、標的分子と結合している。また、このアッセイでの標的分子への二重特異的融合タンパク質の結合は陰性対照への二重特異的融合タンパク質の結合よりも、有意に高い例えば、少なくとも2、10、または100倍高い。好ましくは、固定化された標的への結合もまた、過剰の可溶性標的の使用に匹敵し得る。上で述べたように、ある標的分子は損傷細胞に特異的または、その中で増やされるである。代表的な標的分子はホスファチジルセリン、DNA、ミオシン、心臓ミオシン、c-MetHGF受容体、ホスファチジルセリン、P-セレクチン、およびICAM-1を含むが、これらに限られるものではない。損傷細胞への結合は、壊死またはアポトーシスを誘導された状態にさらされた培養細胞を用いることで、簡便にinvivoで示される。例えば壊死は、虚血/再かん流を刺激された培養心筋細胞で誘導され、本質的にはShanetal.,Am.J.Physiol.Cell.Physiol.294:833-8412008で説明されるように、アポトーシスを受けた細胞数の控除が後に続く、LDH放出アッセイ、またはトリパンブルーアッセイを使用することで監視できる。このアッセイは、下記でより詳細に議論するように、総死細胞の数および、総数および壊死に起因するアポトーシスを起こした細胞の数の違いを定量化する。アポトーシスを誘導する状態は、H2O2への露出を含み、アポトーシスは、例えば、アネキシンV結合、アポトーシスによって活性化される既知のカスパーゼによる標的ペプチド配列の開裂、またはDNAラダーリング本質的にKuramochi,J.Biol.Chem.27949:51141-472004に記載されるような、TUNELアッセイにより測定されるを含む、当分野で既知のさまざまな技術のいずれかを使用することで監視できる。壊死またはアポトーシスを受ける細胞への結合は、アポトーシスまたは壊死の誘導に続いて、細胞に蛍光標識された二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインまたは適切な対照タンパク質を加えることにより、評価し得る。数分から1日間の範囲の時間の細胞でのタンパク質の培養の後、細胞は洗浄され、次に、免疫蛍光、フローサイトメトリー、または同様の技術を使用して、細胞に結合した蛍光が測定される。あるいは、二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインまたは、ELISA実施で一般的な習慣である、二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインに結合する抗体と結合conjugateした酵素の使用または放射性同位元素標識法を含む、他の結合二重特異的タンパク質または標的化ポリペプチドドメインの検出方法が使用され得る。障害を被っていない細胞例えば、アポトーシスおよび壊死を受けていない細胞と比較して、虚血後の細胞例えば、壊死またはアポトーシスを受けている細胞へのより高い例えば2倍より高い結合が検出されれば、二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインは標的細胞に結合している。invivo標的化は、例えば、動物モデルへの虚血の誘導、および虚血の前後の標的組織において投与された二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインのレベルを比較することによって、示され得る。損傷細胞へのinvivo標的化は、動物モデルにおける組織損傷の誘導、二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインの投与、および損傷細胞と非損傷細胞における二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインのレベルの比較によって示され得る一の実施形態において、二重特異的融合タンパク質は、虚血再かん流傷害に続く、組織の損傷領域を標的化するよう設計される。このような場合には、invivo標的化の実証は、好ましくは虚血に続く血液供給の回復を引き起こす方法で、組織損傷を誘導することにより、実施し得る。多数の方法が、異なった組織でこれを行うために利用可能である。例えば、簡単な止血帯でマウスの後肢への血流を一時的に妨げることができる。あるいは、腎臓に導く動脈上で一時的な鉗子を使うことができる。マウス、ラット、犬、およびブタに示されるように、冠動脈の一時的な遮断で心臓の虚血再かん流傷害を誘導できる。動物モデルにおける組織損傷を引き起こすための代表的な方法を表1にまとめる。虚血再かん流傷害のための動物モデルは以下の参照でさらに詳細であるGreenbergetal.,Chapter7.Mousemodelsofischemicangiogenesisandischemia-reperfusioninjury.MethodsEnzymol.444:159-742008。Chimentietal.,Myocardialinfarction:animalmodels.MethodsMol.Med.98:217-262004。BlackSC,Invivomodelsofmyocardialischemiaandreperfusioninjury:applicationtodrugdiscoveryandevaluation.J.Pharmacol.Toxicol.Methods432:153-672000。標的化の特異性は、二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメイン沈着の比較を、Chenetal.,FASEBJ.412:3033-391990に示されるように、固定された腎臓と固定されていない腎臓において、またはZbindenetal.,Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.292:H1891-H18972007示されるように、放射性標識二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインを用いて、処理された後肢と未処理の後肢において、行うことにより照明できる。あるいは、二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインは、均質化された組織において、ELISAを用いて検出できるか、または画像化に適切な金属例えば、Tc99、YまたはGdで標識した二重特異的融合タンパク質または標的化ポリペプチドドメインを用いてリアルタイムで画像化できる。心臓の損傷領域での特異的な沈着は、Dumontetal.,Circulation10213:1564-82000に記載されるように測定できる。タンパク質の損傷組織への標的化を実行するための代表的な方法は表2に示される。上述のとおり、ある標的化ポリペプチドドメインは、標的分子例えば、DNA、ミオシン心臓ミオシンはc-Met、P-セレクチン、ICAM-1に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは抗ミオシン抗体例えば、ヒトの心臓ミオシンに対するR11D-10、心臓ミオシン重鎖に対する2G4-sD7、ヒトの心臓ミオシン重鎖に対する1B2および5C2、ヒトの心臓ミオシンに対する2F4、ミオシンに対するモノクロナール抗体、B7抗体、B7scFv、または当分野で既知の他の抗体である。いくつかの実施形態において、ある標的化ポリペプチドドメインは、標的分子に結合するscFv抗体を含む。例えば、標的化ドメインは抗DNASl-1scFvaDNASl1、配列番号1または73、抗DNASI-22scFvaDNASl22、配列番号:2であり得る。そのような抗体およびscFv抗体の代表的なものは、本明細書において提供される配列番号1、2、30、73および76-80の配列を含むかまたは有する。いくつかの実施形態において、そのような抗体およびscFv抗体核酸配列の代表的なものは、本明細書において提供される配列番号220-224の配列を含むかまたは有する。またあるいは、機能的に関連する抗体も標的化ポリペプチドドメインとして使用され得ることが明らかであろう。抗体は主に6個の重および軽鎖相補性決定領域CDRsに位置するアミノ酸残基を通して、標的抗原と相互作用する。この理由から、CDRs内のアミノ酸配列は、CDRsの外側の配列に比べて、個々の抗体の間で多様性がある。CDR配列はほとんどの抗体抗原相互作用の原因となるので、異なる抗体からの枠組み配列と1個の抗体からのCDR系列を組み合わせることにより、元の抗体の特性を模倣するよう改質された抗体を生成することが可能である。そのような枠組み配列は、生殖系抗体遺伝子配列を含む公共のDNAデータベースから得ることができる。したがって、本明細書において提供される標的化ポリペプチドドメイン配列の1個以上のCDRを、元の標的化ポリペプチドドメインの結合特性を保有する機能的に関連する抗体を作成するために使用できる。一の実施形態において、追加の、組み換え型に操作された標的化ポリペプチドドメインを作成するために、配列番号:1、2、30、73および76-80から選択される1個以上のCDR領域が、既知のヒトのフレームワーク領域およびCDRと組換え的に組合せられる。重および軽鎖可変枠組み領域はいくつかのまたは異なった抗体配列に由来することができる。CDR領域は、VbaseやIMGTなどのデータベースにおける既知の配列との位置あわせを用いることで容易に同定される。得られる標的化ポリペプチドドメインは、配列番号:1、2、30、73および76-80の標的化ポリペプチドドメインと1個以上のCDRを共有する。ある実施形態において、標的化ポリペプチドドメインは、配列番号:1、2、30、73および76-80に記載されるCDRの1個以上を含む。当分野において、抗体の重および軽鎖CDR3ドメインが抗原への抗体の結合特異性/親和性において特に重要な役割を果たすことは周知である。従って、ある実施形態において、本明細書に記載される特定の抗体の重および/または軽鎖CDR3を含む抗体が、生成される。抗体はさらに本明細書に記載される抗体の重および/または、軽鎖のCDR1および/またはCDR2を含むことができる。上述した改変抗体のCDR1、2および/または3領域は、本明細書において開示されるように、正確なアミノ酸配列を含むことができる。しかしながら、当業者は、特に、エピトープ特異性を改変せずにCDR3配列よりもより多くの変異を許容する、CDR1およびCDR2系列のために、正確なCDR配列からの何らかの逸脱そのような逸脱は、例えば、保存アミノ酸配列の置換であるが可能であり得ることを理解するであろう。従って、他の実施形態において、改変抗体は、本明細書で指定された抗体の対応するCDRと、例えば、80、90、95、98、99または99.5同一の、1個以上のCDR1およびCDR2から構成され得る。他の実施形態において、CDRの1個以上の残基が、結合のより好適なオンレート、または結合のより好適なオフレートを達成する結合を改質するために改変され得る。この戦略を用いて、はるかに高い結合親和力例えば、Kd=10-10以下を有する抗体を得ることができる。CDR領域を改変し、続いて得られた結合性分子を結合における所望の変化のために選別するために当分野で周知の親和性成熟の技術が使用できる従って、CDRが改変されるときに、結合性と低い免疫原生の最良の組合せに最適化された抗体を得るように、結合親和性の変化ならびに免疫原性を監視および記録できる。これらの改質後の抗原結合親和性が実質的に減少しない限り、1個以上の、抗体の可変領域の重および/または軽鎖の結合領域すなわち、非CDR残基または枠組み配列内で改質させることもできる。活性化ドメイン活性化ドメインは、細胞ネットワークの活性または1個の位置から他の位置までの細胞の動員を検出可能に調節するあらゆるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、細胞表面にて受容体と結合することにより、信号変換経路を活性化することができる。いくつかの実施形態において、ある活性化ドメインは、増殖因子ポリペプチド、サイトカインポリペプチド例えば、ケモカインポリペプチド、またはあらゆる受容体アゴニストまたはインテグリン結合リガンドである。そのような調節が、細胞増殖の誘導、細胞成長の誘導、細胞生存の促進および/または、アポトーシスの抑制などの細胞ネットワークの活動の増加か減少であり得ること、明らかであろう。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは他の因子または細胞例えば、幹細胞を動員できる。増殖因子ポリペプチドは検出可能に増殖因子受容体HGFまたはIGF受容体などの活性化を調節する。そのようなポリペプチドのいくつかは、適切な標的細胞において対応する増殖因子受容体の活性化の測定により決定されるとして、少なくとも10の野生型生物活性を保有する、野生型肝細胞増殖因子HGF、HGFアルファ鎖例えば、GENBANK受入番号P14210、またはその誘導体である。活性化は、例えば、本質的にはNishietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:7018-70231998に記載されるAKTのような、受容体キナーゼまたは下流タンパク質のりん酸化の測定により評価され得る。当分野で既知のMTTおよびCTGアッセイもまた、使用され得る。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは増殖因子である。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは前述のまたは変異体のタンパク質を含む。代表的な活性化ドメインは、線維芽細胞増殖因子FGF、線維芽細胞増殖因子1FGF1、線維芽細胞増殖因子2FGF2、基本的な線維芽細胞増殖因子bFGFとしても知られている、線維芽細胞増殖因子2、146aaFGF2-146aa、線維芽細胞増殖因子2、157aaFGF2-157aa、線維芽細胞増殖因子4FGF4、線線維芽細胞増殖因子7FGF7、上皮増殖因子EGF、インスリン様増殖因子IGF、インスリン様増殖因子1IGF1、インスリン様増殖因子2IGF2、肝細胞増殖因子HGF、肝細胞増殖因子-NK1ドメインHGF-NK1、肝細胞増殖因子-K1ドメインHGF-K1、肝細胞増殖因子-NK2ドメインHGF-NK2、肝細胞増殖因子K2ドメインHGF-K2、ニューレグリンNRG、ヘレグリンHRGとしても知られている、ニューレグリン-1ベータ細胞外ドメインNRG1beta-ECD、ニューレグリン-1ベータEGF様ドメインNRG1beta-EGF、チモシン、チモシンベータ4Tbeta4、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF幹細胞因子SCF、マスト細胞増殖因子MGFとしても知られている、ペリオスチン、血管内皮増殖因子VEGF、血管内皮増殖因子-Aとしても知られているVEGF-A、血管内皮増殖因子-A-121VEGF-A-121、血管内皮増殖因子-A-165VEGF-A-165、血管内皮増殖因子BVEGF-B、血管内皮増殖因子-B-167VEGF-B-167、血管内皮増殖因子CVEGF-C、間質細胞由来因子SDF、間質細胞由来因子-1SDF-1、間質細胞由来因子-1アルファSDF-1alpha、血小板由来増殖因子PDGF、血小板由来増殖因子-AAPDGF-AA、血小板由来増殖因子-ABPDGF-AB、血小板由来増殖因子-BBPDGF-BB、テラトカルシノーマ由来増殖因子TDGF、テラトカルシノーマ由来増殖因子1TDGF1、神経成長因子NGF、ベータ-神経成長因子beta-NGF、脳由来神経栄養因子BDNF、ニューロトロフィン-3NT-3、トロンボポエチンTPO、形質転換増殖因子-ベータ1TGF-beta1、形質転換増殖因子-ベータ2TGF-beta2、骨形態形成タンパク質BMP、骨形態形成タンパク質-2BMP2、一本鎖BMP-2scBMP2、骨形態形成タンパク質3BMP3骨形態形成タンパク質4BMP4、アクチビンA、ベータセルリン、ベータ-カテニン、dickkopfホモログ1DKK1、エリスロポエチンEPO、成長ホルモンGH、ヘパリン結合性EGF様増殖因子HBEGF、インスリン、インターロイキンIL、インターロイキン6IL-6、インターロイキン10IL-10、インターロイキン33IL-33、白血病抑制因子LIF、単球走化性タンパク質1MCP1、CCL2としても知られている、プレイオトロフィンPTN、腫瘍壊死因子アルファTNF-alpha、Wnt、Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt7a、Wnt8a、Wnt11、または活性化受容体のための特異性を有する抗体、それらの変異体、それらのアイソフォーム、それらの断片およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限られるものではない。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、増殖因子か増殖因子ドメインの一本鎖を含むように設計される。例えば、活性化ドメインは、リンカー例えば、GGGGSGGGGSGGGGS配列番号:103を経て共に結合する増殖因子ドメイン例えば、BMP-2の2個以上のコピーを含めるように設計され得る。代表的な増殖因子ポリペプチドは、本明細書において配列番号:3-9、32-40、または50-64で記載される配列を有する。代表的な増殖因子は、本明細書において配列番号:187-211で記載される核酸配列によってコードされ得る。標的化ドメインのいくつかのCDRのために上述したとおり、ポリペプチドドメイン、1個以上のドメインを共有する活性化ドメイン、モジュール、または活性化ドメインもしくは配列番号:3-9、32-40または50-64の変異体をもつアミノ酸配列が検討される。そのようなドメイン、モジュール、またはアミノ酸配列が特定され得、そのような活性化ドメインが、周知の技術を用いることで構成され得る。したがって、ある実施形態において、活性化ドメインは、少なくとも1個のドメイン、モジュール、アミノ酸配列または配列番号:3-9、32-40または50-64に記載される変異体を含む。同様に、サイトカインポリペプチドは、同じ方法を基に、対応するサイトカイン受容体の活性化を調節する。ある実施形態において、活性化ドメインは、細胞表面で増殖因子と結合する、増殖因子ポリペプチドである。代表的なそのような増殖因子受容体は、上皮成長因子EGF、ニューレグリン/ヘレグリンNRG/HRG、線維芽細胞増殖因子FGF、インスリン様成長因子例えば、IGF-I、血小板由来増殖因子PDGF、血管内皮成長因子VEGF、そのアイソフォーム例えば、VEGF-AまたはVEGF-C、テラトカルシノーマ由来増殖因子1TDGF1、形質転換増殖因子アルファTGF-α、形質転換増殖因子ベータTGF-β、およびそのアイソフォーム、例えば、TGF-β1、TGF-β2、トロンボポエチンTHPOまたはペリオスチンである。他のそのような受容体は、マスト/幹細胞増殖因子受容体SCFR、肝細胞増殖因子受容体HGF受容体、すなわち、c-Met、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、高親和性神経成長因子受容体、BDNF/NT-3増殖因子受容体、NT-3増殖因子受容体、または血管内皮増殖因子受容体1VEGFR-Iを含む。代表的なサイトカイン受容体は、例えばFLサイトカイン受容体、サイトカイン受容体共通ガンマ鎖のための受容体、インターロイキン-10受容体アルファ鎖、インターロイキン-10受容体ベータ鎖、インターロイキン-12受容体ベータ-1鎖、インターロイキン-12受容体ベータ-2鎖、インターロイキン-13受容体アルファ-1鎖、インターロイキン-13受容体アルファ-2鎖、インターロイキン-17受容体、インターロイキン-17B受容体、インターロイキン21受容体前駆体、インターロイキン-1受容体I型、インターロイキン-1受容体II型、インターロイキン-2受容体アルファ鎖、インターロイキン-2受容体ベータ鎖、インターロイキン-3受容体アルファ鎖、インターロイキン-4受容体アルファ鎖、インターロイキン-5受容体アルファ鎖、インターロイキン-6受容体アルファ鎖、インターロイキン-6受容体ベータ鎖、インターロイキン-7受容体アルファ鎖、高親和性インターロイキン-8受容体A、高親和性インターロイキン-8受容体B、インターロイキン-9受容体、インターロイキン-18受容体1、インターロイキン-1受容体様1前駆体、インターロイキン-1受容体様2、トール様受容体1、トール様受容体2、トール様受容体5、CX3Cケモカイン受容体1、C-X-Cケモカイン受容体3型、C-X-Cケモカイン受容体4型、C-X-Cケモカイン受容体5型、C-X-Cケモカイン受容体6型、C-Cケモカイン受容体1型、C-Cケモカイン受容体2型、C-Cケモカイン受容体3型、C-Cケモカイン受容体4型、C-Cケモカイン受容体6型、C-Cケモカイン受容体7型、C-Cケモカイン受容体8型、C-Cケモカイン受容体9型、C-Cケモカイン受容体10型、C-Cケモカイン受容体11型、ケモカイン受容体様2、およびケモカインXC受容体を含む。さらに、他の活性化ドメインは溶質キャリヤー有機アニオン輸送体ファミリーのための受容体、メンバー1A2SLCO1A2、スフィンゴシンキナーゼ1SPHK1、分泌リンタンパク質1SPP1オステオポンチンOPNとも呼ばれる、腫瘍タンパク質53TP53、トロポニンT1型TNNT1、TSPY様タンパク質2TSPYL2、ビスファチン、WAP4二硫化中核ドメイン1WFDC1、チモシンベータ4、無羽型wingless-typeMMTV結合部位ファミリー、メンバー11WNT11である。代表的な活性化ドメインは、例えばレジスチン、間質性細胞由来因子-1SDF-1、シグナル誘導性増殖関連遺伝子1SIPA1、および上述された他のリガンドのいずれか、ならびに実質的に同族の受容体に結合する能力を保有する上述の部分や誘導体、を含む。インテグリンは、他の細胞またはそれを囲む組織への細胞接着を仲介する受容体である。ンテグリンは細胞表面と、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンおよびラミニンなどの細胞外基質成分を結合する。代表的なインテグリンは、例えば、α1β1、α2β1、α4β1、α5β1、α6β1、αLβ2、αMβ2、αIIbβ3、αVβ3、αVβ5、αVβ6、α6β4、を含む。初期の試験として、適切な受容体への二重特異的融合タンパク質または、その活性剤ドメインの結合は、当分野で既知の技術を用いることで評価され得る。1個の代表的なアッセイでは、適切な受容体の組換え型の細胞外ドメインで適切な固相担体をコーティングすることにより、結合が示される。二重特異的融合タンパク質の活性化ドメインによって認識されない受容体からの細胞外ドメインは、特異的対照として用いられる。また、いかなる固定された受容体も有しない支持基質は、参照として用いられる。虚血関連分子への結合のための上記と同様の方法は、使用される固相担体および結合技術に対応する標準プロトコルを用いて、受容体への特異的、用量依存的結合について実行される。また、受容体の量を変化させるか、または競合としての可溶性標的のレベルを増やすことを含む研究が、結合性および特異性を監視するために実行される。あるいは、二重特異的融合タンパク質は支持体に固定化され、対応する受容体の可溶性の細胞外ドメインの結合は、用量依存性、特異的結合性を示すために用いられる。二重特異的融合タンパク質の受容体への結合のための結合親和力および動的オンおよびオフレートは標準技術を用いて測定され、他の陰性対照分子対照活性化ドメインと無関係の融合タンパク質、活性剤ドメインを欠いている融合タンパク質および陽性対照分子増殖因子またはサイトカインなどの、組換え型の野生型受容体リガンドと比較される。二重特異的融合タンパク質の平衡および動的結合パラメータはまた、リガンドの他の分子との融合が、リガンドのその対応する受容体との通常の結合に影響するかどうか測定するために、非融合の野生型リガンドで測定した同じパラメータと比較される。そのような情報は、二重特異的融合タンパク質の有効量を決定するために使用され得る。二重特異的融合タンパク質は陰性対照で観察されたそれよりも有意に高い親和性例えば、少なくとも100倍で固定化された増殖因子受容体、またはサイトカイン受容体に結合する。さらに、固定化された受容体への結合は、過剰の可溶性ポリペプチド、可溶性受容体、またはポリペプチドもしくは受容体に結合し、それらの相互作用を遮断する抗体を使用することで競合できる。好ましくは、二重特異的融合タンパク質は、天然のリガンドのその受容体への結合性の1000倍以内の親和性で、受容体またはサイトカインと結合する。二重特異的融合タンパク質または活性化ドメインは、同族の受容体活性化を調節する能力をさらに有する。そのような活性は、例えば、新生子ラット心室筋細胞NRVMまたは細胞株などの培養心筋細胞を使用する、虚血再かん流の細胞モデルを使用して評価され得る。一般に、模擬的な虚血SIは代謝阻害剤デオキシグルコースおよびジチオン酸塩および代謝物質高カリウム、乳酸、低pHまたは嫌気性チャンバーでの酸欠によって引き起こされる。再かん流は、酸素処理された緩衝液中の再懸濁によって模倣される。いかなる外因性の代謝阻害剤または代謝物質がない場合、虚血―酸欠および代謝物質蓄積の2個の第一の構成要素を提供する、虚血のinvitroでの成人心筋細胞ペレットモデルが、開発された。表3は、二重特異的融合タンパク質が心筋細胞の損害を防いで、心臓幹細胞の成長、運動性または分化を促進する、および/または損傷組織の修復を促進する能力を示すための代表的な方法を示す。天然の増殖因子およびサイトカインは活性化ドメインとして使用できる。しかしながら、そのような天然配列の部分および改変された配列を有するポリペプチドを、そのようなポリペプチドが同族の受容体例えば、以下で議論するアッセイの一つを使用するを活性化する能力を保有し、そのようなポリペプチドが検出可能に受容体を、好ましくは天然のリガンドで観察されるものの少なくとも1好ましくは、少なくとも10程度受容体を活性化する条件で、使用でき得ることは明らかであろう。増殖因子受容体と結合するいくつかの活性化ドメインは、本明細書において配列番号:3-9、32-40、および50-64にて提供される。そのような配列を含む融合タンパク質の活性は当分野において周知である例えば、Hashinoetal.,J.Biochem.1194:604-6091996;Nishietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:7018-231998。特定用途のための活性化ドメインは所望の治療結果に基づいて選択され得る。一般に、例えばFGF2、VEGFアルファまたはその部分または誘導体を含み、同族の受容体に結合する能力を実質的に保有する活性剤ドメインは、血管新生を増加させるために使用され得る。生存の増加、および幹細胞の分化再生の目的のために、IGF、HGFまたはNRG1または、その部分または派生物を含む活性化ドメインが、使用され得る。いくつかの場合、同時に活性化ドメインと標的化ポリペプチドの両方の活動を評価することは望ましい。ELISAはこの目的のために都合よく使用され得る。標的化ポリペプチド例えば、DNAの基質はELISAプレートに吸着され、その後適切なBSA含有バッファーで遮断される。その後、二重特異的融合タンパク質が添加され、続いて活性化の組換基質例えば、活性剤が増殖因子であれば、基質は組換え型同族の受容体か受容体断片細胞外ドメインであるが添加される。この基質は、検出のために蛍光標識されるか、またはリガンド結合にそれほど影響しない受容体の領域に標識した抗体を用いて検出される。一般に、二重特異的融合タンパク質のinvivo活性は、二重特異的融合タンパク質の活性化ドメインによって制御される分子のシグナル伝達の変化を検出することによって、評価される。これは典型的に、細胞表面受容体のリン酸化状態の変化または処理組織のフローサイトメトリー、免疫蛍光、ELISA、ホスホラベリング、またはウェスタン分析によって検出されるホスホ-AKTまたはホスホ-ERKなどの下流の伝達物質に関与する。他の機能評価は、染色による生存細胞の数およびのための試験、アネキシンV結合によるアポトーシスのレベル免疫蛍光を経て、またはフローサイトメトリー、カスパーゼ活性の検出、TUNELアッセイTUNEL陽性細胞の数の減少またはDNAラダーリングを含む。各々の場合において、アッセイで検出された制御された分子のレベル、機能活性、またはリン酸化における変化が有意例えば、少なくとも2倍に誘導されていれば、二重特異的融合タンパク質はinvivoで機能する。患者の損傷組織の修復は、あらゆる臨床的に関連している規格を使用して評価できる。例えば、筋細胞また線維芽細胞の数などの細胞数、または瘢痕化の量の定量によって、または出力のための機能的アッセイ、またはLVEDP、LVDP、dp/dT、LV重量、室体積、および拡張期壁応力を含む心臓の機能評価の構造的態様と共に、梗塞組織の修復を測定できる。そのような評価のための方法は周知であり、文献に十分に記載される。一般に、そのような臨床的評価のいずれかにおいて、有意な例えば、少なくとも2倍の変化をもたらすならば、二重特異的融合タンパク質は損傷組織を修復するといえる。半減期モジュレータ当業者は、治療への応用で用いられる二重特異的タンパク質が、それらの比較的低い分子量のため最適の血清半減期を示さない可能性を理解するであろう。したがって、いくつかの治療への応用では、二重特異的タンパク質の半減期を調節することが、望ましくなり得る。いくつかの実施形態において、器官の病的な障害をうけたまたは損傷した領域での二重特異的タンパク質の蓄積を達成するために、二重特異的タンパク質は半減期モジュレータと結合conjugateされる。そのような半減期モジュレータは融合タンパク質の生体内の半減期を増加させることができる。例えば、半減期変調器を含む二重特異的タンパク質の半減期は約1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間以上である。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータを含む二重特異的タンパク質の半減期は約24時間以上である。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータを含む二重特異的タンパク質の半減期は約1週間以上である。標的化ポリペプチドドメインと活性化ドメインはペプチド結合を通して直接連結され得る。いくつかの実施形態において、それらは半減期モジュレータを経て連結され得る。好ましい実施形態において、半減期モジュレータはポリペプチドである。従って、半減期モジュレータは2個の末端、N-末端、およびC-末端を有することができる。いくつかの実施形態において、連結する、半減期モジュレータが、ペプチド結合を経てある末端で標的化ポリペプチドドメインに連結され、ペプチド結合を経てもう片方の末端で活性化ドメインに連結される。ある実施形態において、リンカーはN-末端において標的化ポリペプチドドメインのC-末端と、C-末端において活性化ドメインのN-末端と連結される。他の実施形態において、リンカーはC-末端において標的化ポリペプチドドメインと、N-末端において活性化ドメインと連結される。またさらに、他の実施形態において、半減期モジュレータは二重特異的タンパク質の末端の一つで連結される。例えば、いくつかの実施形態において、半減期モジュレータはC-末端において活性化ドメインのN-末端と連結される。他の実施形態において、半減期モジュレータは標的化ドメインのC-末端において連結される。他の実施例において、半減期モジュレータはN-末端において活性化ドメインのC-末端と連結できる。さらにまた、他の実施形態において、半減期モジュレータはN-末端において標的化ドメインのC-末端と連結できる。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、腎クリアランスを最小にするように、二重特異的タンパク質の大きさを約70kDaを超えるか相当半径に推進するように設計される。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、FcRn受容体仲介の再生を通して、または、ヒト血清アルブミンHSAなどの血清成分への結合を通して二重特異的融合タンパク質の半減期を延長するように設計される。好ましくは、半減期モジュレータはヒトにおいて非免疫原性である。半減期モジュレータは、少なくとも100の連続したアミノ酸から成る領域の上で少なくとも50の配列同一性を保有する、ヒト血清タンパク質またはその誘導体であり得る。本明細書で用いられる、配列同一性は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の参照配列との比較に関連して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が最適に並べられるとき、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が同じであるか、または参照配列内の対応する位置で、特定の割合で同じヌクレオチドまたは残基を有する。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータに存在する1個以上のグリコシル化部位のグリコシル化で半減期モジュレータを改質できる。例えば、以下のアミノ酸:アスパラギン、セリン、トレオニンを半減期モジュレータのグリコシル化を改質するために加えるか、または除くことができる。いくつかの実施形態において、二重特異的タンパク質の半減期モジュレータのグリコシル化は二重特異的タンパク質の半減期を調節できる。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ配列は、グリコシル化を減少させるように改質される。そのような改質は、AsnNのGlnQまたはAlaAによる置換、および/または、SerSのThrTまたはAlaAによる置換を含む。ヒト血清アルブミンHSAは、一つにはFcRNとの結合および再生利用のため、天然に長い血清半減期を有する。HSAは血液で最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて安全性が示されている。いくつかの実施形態において、HSAの503位置のアスパラギン、脱アミド化され、半減期を減少させ得る、をN503Q置換により除去できる。いくつかの実施形態において、HSAのシステインC34をセリンまたはアラニンSまたはAに置換して遊離システインを除去し、交互に起きるジスルフィド結合構成を最小にし得る。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータはN503Q置換および追加のグリシン末端をもつ改質HSAのドメインIIImHSA_dIIIの改質型である。そのような改質型はFcRnに結合するHSA特性および増加された血清半減期を保有する。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ヒト血清アルブミンアミノ酸配列配列番号:12と少なくとも70、80、85、90、95同一の少なくとも100個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、配列番号10、12、24-28、65、または67に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ核酸配列は配列番号212-215に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ヒトアルファフェトプロテインAFPアミノ酸配列配列番号:29、68と少なくとも70、80、85、90、95同一の少なくとも100個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、AFPのN-結合型グリコシル化部位はN251Q置換で除去される。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは配列番号29、68、または69に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ核酸配列は配列番号216に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ビタミンD結合タンパク質VDBPアミノ酸配列と少なくとも70、80、85、90、95同一の少なくとも100個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、VDBPのN-結合型グリコシル化部位はN288QまたはN288T置換で除去される。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは配列番号66に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ核酸配列は配列番号219に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ヒトトランスサイレチンTTRアミノ酸配列と少なくとも70、80、85、90、95同一の少なくとも100個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、トランスサイレチンN118N-結合型グリコシル化部位を除去するように改質される。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータはトランスサイレチンの単量体型である。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ヒトFcアミノ酸配列と少なくとも70、80、85、90、95同一の少なくとも100個の連続したアミノ酸を含む。抗体のFcドメインは天然に、FcRnと結合し、延長された半減期をもたらす能力を有する。いくつかの実施形態において、抗体のFcドメインはFcガンマRと結合しないように操作される。例示的な実施形態において、FcドメインはN397をQで置換するよう操作されるN297Q変異体。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータはscFcと名づけられたFcの単量体型変異体である。例えば、天然に二量体化してFcを形成するIgG重鎖サブセットはヒンジ-CH2-CH3である。いくつかの実施形態において、Fcドメインは、ヒンジ-CH2-CH3-リンカー-ヒンジ-CH2-CH3を創出するために、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS配列番号:104のような可動性リンカーとヒンジ-CH2-CH3との結合により一本鎖を形成する操作される。例示的な実施形態において、一本鎖FcscFcはN397をQで置換およびC220をSで置換N297Q、C220Sするように操作される。いくつかの実施形態において、scFcドメインは配列番号71に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ核酸配列は配列番号218に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、PASylationアミノ酸配列と少なくとも70、80、85、90、95同一の少なくとも100個の連続したアミノ酸を含む。PASylationは、PEGylationを模倣するプロリン-、アラニン-、および/または、セリン豊富な配列WO/2008、155134を参照である。プロリン、アラニン、および/またはセリンのポリペプチド伸長は大きい流体力学半径で準構造化された立体的なドメインを形成し、その結果、融合タンパク質のクリアランスを抑える。いくつかの実施形態において、PASylationアミノ酸配列は約200、300、400、500または600のアミノ酸長である。例えば、PASylationはアミノ酸配列ASPAAPAPASPAAPAPSAPA配列番号:105の20回の反復である。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、アルブミン結合ドメインヒト抗体albudAbアミノ酸配列配列番号:70と少なくとも70、80、85、90、95同一の少なくとも100個の連続したアミノ酸を含む。アルブミン結合ドメイン抗体は、血清アルブミンに非共有的に結合することによって、融合タンパク質半減期を増加させることができるWO2008/096158を参照。いくつかの実施形態において、アルブミン結合ドメインヒト抗体は、Lys-ArgKex2プロテアーゼ部位を除去し、C-端末アルギニンを除去するために操作される。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ核酸配列は配列番号217に記載された配列を含む。そのような半減期モジュレータの代表的なものとして、配列番号10、12、14-29、45-49、65-71または105のいずれかに記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータはジスルフィド結合を形成する能力を減少するためにシステイン残基をセリンまたはアラニン残基で置換するように改質できる。半減期モジュレータは、二重特異的融合タンパク質と、単独または短い例えば、2から20のアミノ酸残基のコネクタポリペプチドを用いて、組み込まれ得るか、結合conjugateされ得る。いくつかの実施形態において、コネクタポリペプチドは、半減期モジュレータの一または両端の、N-末端において、C-末端において、またはN-末端およびC-末端の両方に存在しています。リンカーのN-末端での使用のための好適な短いコネクタポリペプチドは、例えば-Gly-Ala-GAおよび-Ala-Ser-ASなどのジペプチドを含む。リンカーのC-末端での使用のための好適な短いコネクタポリペプチドは例えば-Leu-Gln-LQおよび-Thr-Gly-TGなどのジペプチドを含む。いくつかの実施形態において、コネクタは2個のアミノ酸より長い。例えば、コネクタは5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100長のアミノ酸である。好ましくは、そのようなコネクタは、柔軟例えば、グリシン豊富であるかまたは構造化例えば、アルファヘリックス豊富されている。いくつかの実施形態において、コネクタまたはポリペプチドリンカーは配列番号:41-42、87-91に記載された配列を有する。いくつかの実施形態において、コネクタはトランスサイレチンなどのヒトタンパク質に基づく。配列番号:46-49は、N-およびC-末端の両方に代表的なコネクタジペプチドを持つ配列番号:45の半減期モジュレータを記載する。しかしながら、そのような短いコネクタポリペプチドおよび、存在するなら、配列番号:95-104または182-184に記載されるコネクタは、半減期モジュレータの1個または両方のいずれかに位置し得ることは明らかであろう。ある好適な半減期モジュレータは、半減期モジュレータなしの融合タンパク質と比べて、二重特異的融合タンパク質の長期の半減期を提供する。半減期モジュレータの半減期への効果は、生理条件下で安定性を決定するアッセイを用いることで評価できる。例えば、二重特異的融合タンパク質は、試料が培養直後および24時間毎に取り除かれる条件で、37°Cで120時間、血清例えば、ヒト血清中で培養できる。続いて、上述された結合アッセイは、各々の時点で機能的な二重特異的融合タンパク質のレベルを検出するために実施される。続いて、このレベルは半減期比較を提供するために半減期モジュレータなしでまたは異なった半減期モジュレータを使用して組み立てられた二重特異的融合タンパク質のレベルが比較される。任意の要素および代表的な二重特異的融合タンパク質上述されたものの追加の要素が、本明細書において提供された二重特異的融合タンパク質に任意に含まれていることは、明らかであろう。そのような要素は、二重特異的融合タンパク質の発現の促進、調製または精製、あるいは標的化の機能を果たすことを含む様々な目的のために存在し得る。例えば、N-端末リーダーポリペプチドが存在し得る。代表的なリーダーポリペプチドは、配列番号:41-42、87-91、または244のいずれか一つに記載される配列を含むかまたは有する。あるいはまた、二重特異的融合タンパク質は精製を容易にするためにポリヒスチジン例えば、ヘキサヒスチジンタグを含み得る。そのようなタグは、少なくとも6個のヒスチジンの連続したアミノ酸残基を含み、C-またはN-末端に位置し得る。ある実施形態において、ヘキサヒスチジンタグは二重特異的融合タンパク質のC-末端にて含まれる。追加アミノ酸残基もまた、残りの二重特異的融合タンパク質とポリヒスチジンの結合点に存在し得る。本明細書にて提供されるある二重特異的融合タンパク質は、配列番号:43、44または92-94に記載されるようなC-末端ポリヒスチジン含有ポリペプチドを含む。ある二重特異的融合タンパク質は、以下の一つを満たす一般構造体を有するまでの範囲である。一般に、1日あたり、体重キログラムあたり約0.1mgから約100mgの範囲の投与量レベルを提供する組成物が好ましい。ある実施形態において、単位用量形態は約10mgから100mgの間の二重特異的融合タンパク質を含む。医薬組成物は、組織損傷の治療または予防のため例えば、心筋梗塞または腎臓損傷の治療のためにパッケージ化され得る。パッケージ化された医薬製剤は、治療上有効量の本明細書に記載されたような少なくとも1個の医薬組成物を保持する容器および含まれる組成物が患者における組織損傷心筋梗塞または腎臓損傷などの治療のために使用されることを示す使用説明例えば、ラベルを含む。医薬組成物は、各々が密封された容器において固定量の二重特異的融合タンパク質を含む、複数の単回投与単位でパッケージされ得る。あるいは、容器は医薬組成物の複数回投与を保持し得る。治療方法医薬組成物は、患者の病理的組織障害を治療するために患者好ましくは牛、豚、馬、鶏肉、猫、犬、またはより好ましくはヒト、などの哺乳動物に投与できる。本発明の文脈において、治療なる用語は予防的および治療的投与の両方を含む。予防的応用では、本明細書に記載される医薬組成物は、組織損傷の予防、遅延または重症度の減少のために、病理的組織障害にり患しているかそうでなければリスクのある患者に投与される。治療的応用では、治療は、病理的組織障害の重症度を減少させるか、または障害の後に組織を再生させるために実施される。いくつかの実施形態において、他の治療用の組成物と組み合わせて医薬組成物を投与できる。代表的な病理的組織障害は、心臓組織の損傷例えば、心筋梗塞に関する障害、腎臓組織の損傷、および組織の損傷、および虚血性脳梗塞例えば、脳虚血brainischemiaとしても知られている脳の局所貧血cerebralischemia、重篤な肢虚血または他の虚血に続く組織損傷を含む。いくつか実施形態において、障害から組織を保護するためおよび/または組織または器官障害後の組織および/または血液供給の再生のため、医薬組成物を使用できる。いくつかの実施形態において、医薬組成物を自己免疫疾患、例えばLupusとしても知られる全身性エリテマトーデスSLEを予防する、遅延、減少、または治療するために投与できる。SLEは多くの組織または系、例えば、関節、皮膚、肝臓、腎臓、血球、心臓、肺、神経系、血管、が攻撃されて、炎症を起こすようになるところの自己免疫疾患である。免疫系は自己に対して、特に核タンパク質およびDNAに対して抗体を生産する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、それを必要とする対象に、障害から組織を保護するため、および障害の後に組織を再生するために投与できる。いくつかの実施形態において、既存の免疫抑制または他の治療と組み合わせて医薬組成物を投与できる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、それを必要とする対象に、I型糖尿病を予防、遅延、減少または治療するために投与できる。I型糖尿病において、生体の自己免疫系はすい臓のインシュリン生産ベータ細胞を破壊する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、それを必要とする対象に、ベータ細胞を再生するために投与できる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、当分野で既知のI型糖尿病治療と組み合わせて投与できる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、それを必要とする対象に、組織または器官の変性を予防、遅延、減少または治療するために投与できる。例えば、医薬組成物をアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、またはルーゲーリッグ病としても知られる筋萎縮性側索硬化症ALSなどの脳、脊椎または神経の変性を治療するために使用できる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、当分野で既知の既存の治療と組み合わせて投与できる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、それを必要とする対象に、骨および/または軟骨に関する疾患を予防、遅延、減少またはを治療するために投与できる。いくつかの実施形態において、骨および/または軟骨組織を再生するために医薬組成物を使用できる。医薬組成物は、当分野で既知の既存の治療と組み合わせて投与できる。例えば、リポソームでカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、二重特異的融合タンパク質を発現できる組換え細胞、受容体介在、またはレトロウイルス、または他の核酸ベクターを含むあらゆる様々な既知の送達系を、二重特異的融合タンパク質を投与するために使用できる。二重特異的融合タンパク質は、いかなる便利な経路、例えば、注入、静脈内ボーラス、上皮または皮膚粘膜内例えば、口腔粘膜、直腸または腸の粘膜などを通した吸収で投与され得、他の生理活性物質と共に投与され得る。投与は、全身または局所とできる。加えて、二重特異的融合タンパク質を心室内およびくも膜下注入を含む、あらゆる適当な経路で中枢神経系に導入することが望ましく;脳室内注射は例えば、オマヤ槽などの貯蔵槽に取り付けられた心室内カテーテルによって容易にされ得る。さらに、経肺投与も、例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤aerosolizingagentを含む製剤によって用いることができる。特定の実施形態において、本発明の二重特異的融合タンパク質を、局所的に、治療が必要である領域に投与することが望ましいことであり得;これは、例えば、外科手術の際の局所注入、局所的適用の方法により例えば、外科後の創傷包帯と併せて、注射、カテーテル、座薬、またはインプラント、該インプラントは、多孔質、無孔またはゲル状材料を有する、により達成され得る。他の実施形態において、リポソームなどの小胞を二重特異的融合タンパク質を送達するために利用できる。さらに別の実施形態において、制御放出系;例えば、そのような制御放出系は治療標的またはその近く例えば、組織損傷をうけているか、またはリスクのある生体の器官に位置し得る、で二重特異的融合タンパク質を送達する。そのような送達系の使用は当業者に周知である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される二重特異的融合タンパク質は、その損傷組織に幹細胞を動員する能力により、少なくとも部分的に、病理的組織障害を治療するために効果的である。ある場合において、十分な幹細胞が患者例えば、心臓幹細胞の中に存在し得る。しかしながら、ある実施形態において、幹細胞例えば、自己骨髄由来幹細胞を共投与することは、有益であり得る。そのような幹細胞は、二重特異的融合タンパク質の前または後に投与されるか、または同時に同じ医薬組成物においてまたは分離された組成物において、投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される二重特異的タンパク質は、組織生存の増進に有効である。いくつかの実施形態において、二重特異的タンパク質は、投与され、特定の組織または器官例えば、心臓を標的化することができる。二重特異的タンパク質はその後、標的化ドメインの組織関連標的分子との結合を通して、特定の組織または器官例えば、他の器官ではない、心臓で蓄積できる。いったん標的分子と結合すると、二重特異的融合タンパク質は標的分子から解離、離れて再度標的分子、傍分泌様方法における組織の異なる細胞例えば、損傷細胞またはリスク細胞の増殖因子受容体、またはサイトカイン受容体と再結合re-associateできる。上述のように、至適用量は、当分野で既知の要素に依存するが、一般に、投与量あたり約0.5mgから約400mgの二重特異的融合タンパク質例えば、投与量あたり10mg、50mg、100mg、200mg、300mg、または400mgの範囲である。治療法上、二重特異的融合タンパク質の上記の医薬組成物中の一投与量は、時間、日、週、月、または年あたり1回以上例えば、時、日、週、月、または年あたり2、4、5、6、7、8、9、10、11、12回治療的に患者に投与できる。より一般的に、体重のキログラムあたり約0.1mgから約100mgの範囲の二重特異的融合タンパク質の量を含む日ごとまたは週ごとの単回投与で、投与される。他の実施形態において、二重特異的融合タンパク質を含む医薬組成物は、週あたり約0.1mgから週あたり約2500mg、週あたり約0.1mgから週あたり約10mg、週あたり約1mgから週あたり約100mg、週あたり約10mgから週あたり約500mg、週あたり約100mgから週あたり約2500mg、週あたり約10mgから週あたり約100mg、週あたり約100mgから週あたり約1000mgの範囲の投与量で患者に投与され得る。あるいは、二重特異的融合タンパク質を含む医薬組成物は、一日おきに約0.1mgから一日おきに約500mg、一日おきに約1mgから一日おきに約75mg、一日おきに約10mgから一日おきに約50mg、一日おきに約20mgから一日おきに約40mgの範囲の投与量で投与され得る。あるいは、二重特異的融合タンパク質を含む医薬組成物は、週あたり約0.1mgを3回から週あたり約100mgを3回、週あたり約1mgを3回から週あたり約75mgを3回、週あたり約10mgを3回から週あたり約50mgを3回、週あたり約20mgを3回から週あたり約40mgを3回、の範囲の投与量で投与され得る。さらなる実施形態において、二重特異的融合タンパク質を含む医薬組成物は、哺乳動物例えば、ヒトに1、2、3または4時間;日あたり1、2、3または4回;1日おきまたは3、4、5、または6日おき;週あたり1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回;二週おきに;月あたり1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30回;2ヶ月おきに;6ヶ月あたり1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回;年あたり1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回;または半年おきに投与される。治療計画の間、二重特異的融合タンパク質を含む医薬組成物が、必ずというわけではないが、異なる頻度で投与され得ることは、明らかであろう。以下の実施例が限定の目的でなく、例示の目的で提供される。特に明記しない限り、すべての試薬および溶剤は、標準の商用グレードであり、更なる精製なしで使用される。慣用的な変更を使用して、以下の実施例で提供された手順は、本発明の範囲内で、異なる二重特異的融合タンパク質および医薬組成物を調製および使用するために、当業者により変更され得る。実施例1代表的な二重特異的融合タンパク質の調製標的化ポリペプチドドメインがDNAと結合し、活性化ドメインがNRG1である二重特異的融合タンパク質が調製された。2個のドメインが改質ヒト血清アルブミンHSAリンカーによって連結された。NRG1は短いコネクタポリペプチドを組み込むHSAリンカーのアミノ末端に組換え的に融合され、抗DNAscFvは追加の短いコネクタポリペプチドを組み込む改質されたHSAリンカーのカルボキシ末端に組換え的に融合された。改質されたHSAリンカーは2個のアミノ酸置換を含む。天然のHSAの位置34のシステイン残基は、この部位での酸化による潜在的なタンパク質の多様性を減少させるためにセリンに変異した。天然のHSAのアミノ酸503の、脱アミドに高感受性で、減少した薬理半減期をもたらし得るアスパラギン残基は、グルタミンに変異した。改質されたHSAリンカーは二重特異的融合タンパク質に延長された循環半減期を与える。実施例2二重特異的融合タンパク質のinvitro活性実施例1で調製された代表的な二重特異的融合タンパク質そこでは、標的化ポリペプチドドメインがDNAと結合し、活性化ドメインがNRG1であるの両方の部分の活性は、二重特異的融合タンパク質の両方のアームがそれらの基質に同時に結合したときにだけ活性を与えるように設計されたELISAを用いて試験された。ELISAは、本質的にStokesetal.,J.Clin.Pathol.355:566-5731982およびGripenbergetal.,Scand.J.Immunol.1:151-1571978に記載されるとおりに実施された。より具体的に、二重特異的融合タンパク質の、1から50ng/mlのPBS溶液が、DNA抗DS-DNA抗体ELISAキットAlphaDiagnosticInternational,DistbyAutogenBioclear,UKで予備吸着されたプレートのウェルに添加され、検出抗体が添加される工程まで、製造者の指示通りに培養し、洗浄された。この段階で、100μlの1から50ng/mlビオチン化ヤギ抗ヒトNRG1-β1RDSystemsBAF377活性化アームへの抗体のPBS/1BSA/0.05Tween溶液が全てのウェルに加えられ、室温で1時間培養され、0.05Tween-20と共にPBSで洗浄された。PBSで希釈された100μlのストレプトアビジン-HRP2ug/mlのストックRDSystem890803の1:200の希釈が各々のウェルに加えられ、室温で30分間培養された。0.05Tween-20と共にPBSでの最終洗浄の後、100μlのSuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate製造者の説明書通りに、Piere,cat34077が添加され、蛍光代表的な陽性シグナルが、FusionMicroplatereaderPackardまたは同様の機器で測定された。検出されたシグナル量は、二重特異的融合タンパク質があるウェルで、DNAがないウェルまたは効力のないアームすなわち、活性化ドメインまたは標的化ポリペプチドドメインを含まないを含む陰性対照に比べて、優位に高い、細胞あたりのシグナル強度の増加、またはそれらの両方のいずれかである。実施例4二重特異的融合タンパク質を用いるマウスでの組織損傷修復実施例1の代表的な二重特異的融合タンパク質を含む組成物を、上述通りの心筋梗塞の誘導に続いて、マウスに投与した。投与は静脈注射である例えば、尾静脈。投与に続いて、心臓機能は以下の通り評価される。マウスを抱水クロラール400mg/kg体重、腹腔内で麻酔し、閉胸標本における左室LV圧およびLVおよび-dP/dtの測定のため、右頚動脈にマイクロチップ圧力トランスデューサモデルSPR-671、Millarをカニューレ挿入する。測定は二重特異的融合タンパク質による処理が心臓機能に影響することを確認するために未処理の対照マウスから得られたものと比較される。これらの測定の少なくとも一つを用いて評価した心臓機能において、有意な改善が観察された。実施例5融合タンパク質の発現および精製標的化ドメイン、半減期モジュレータ、および活性化ドメインを含む融合タンパク質が設計され、発現され、精製された。標的化ドメインおよび活性化ドメインの様々な組み合わせは、異なる方向におけるmHSA配列番号10半減期モジュレータ、異なる短いコネクタポリペプチド配列、および異なるポリペプチドリーダー配列で組み立てられた。合成DNA配列は、意図する発現生物例えば、CHOまたはPichiapastorisのコドン使用頻度、特定の制限酵素認識部位を含めるまたは避けるという要望、および当分野で既知のコドン最適化のための他の要素を考慮して各々のアミノ酸配列について設計された。DNA配列は、発現プラスミド、該プラスミドは発現生物に形質転換され、融合タンパク質が過剰発現される、に構築され、および/または組み立てられた。各々の融合タンパク質は、CibacronBlueSepharoseクロマトグラフィー、Ni親和性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む異なる方法の組合せを用いて精製された。完全な融合タンパク質または融合タンパク質に組み込まれるべき部分例えば、個々の標的化ドメイン、半減期モジュレータドメイン、または活性化ドメインをコードするDNAは、商業ソースBioBasic、DNA2.0より購入した。アミノ酸配列は明らかに定義された。コドン使用頻度や制限部位要求されるか、または禁止されるなどの制約は業者に伝えられた。興味のあるタンパク質をコードする最終的なDNA配列が、iso-コード配列の理論上のプールから、それらの規制、および低い発現mRNAレベルにおける高い二次構造の回避など、および業者の選好を避けるための一般的な戦略に従い、業者により選択された。いくつかの場合、コドン使用頻度はCHOまたはかPichia単独に合わせた。他の場合において、各々の生物の分配でまれなコドンを避けるために、組合せコドン使用頻度表が用いられた。いくつかの場合、完全長の融合タンパク質は、発現ベクターにおいて業者により供給された。他の場合において、興味のある発現ベクターのサブクローニングが必要であった。サブクローニング操作は、II型制限酵素とDNAリガーゼNewEnglandBiolabsを用いる伝統的な方法を使用することで実行された。代わりの組み合わせおよび標的化、活性化、および半減期モジュレータドメインの方向をもつ融合タンパク質を精算するための追加の分子クローニングは、これらの技術ならびにポリメラーゼ連鎖反応PCRを使用することで実施された。融合タンパク質は、機能的ドメインのいずれかの容易な置換または再構築のため、DNAレベルで機能的なドメインの間の連結点に位置する1個以上のII型制限部位と設計された。必要ならば、制限部位またはリンカー領域が、PCRに使用されるプライマーにそれらを組み込むことにより配列に加えられた。いくつかの場合、タンパク質は、PichiaPinkExpressionSystemInvitrogenA11151キットを用いて、Pichiapastorisで発現された。興味のあるタンパク質をコードする遺伝子が、組換えタンパク質の分泌を許容する発現pPinkα-HCプラスミドを使用して、Saccharomycescerevisiaeα接合因子分泌シグナルで、インフレームでクローニングされた。他の場合において、タンパク質は、Selexis/CHOのクローン系を用いて精製された。興味があるタンパク質をコードする遺伝子は、組換えタンパク質の発現を許容するために、Selexisベクターにクローニングされ、ポリクローナルCHO-K1細胞にトランスフェクトされた。pPinkα-HCプラスミドは、大腸菌において環状プラスミドの増殖および選択のための細菌性の複製起点pUCおよび耐性マーカーアンピシリンを含む。それはまた、Pichiaへの形質転換の間に線形ベクターの統合を標的化するために用いられる、TRP2遺伝子、およびPichiaのアデニン栄養要求性の補足のために含まれる、ADE2遺伝子も含む。AOX1プロモーターはメタノール誘導で高レベルの転写を確実にし、CYC1配列は効率的な転写終結を確実にする。プラスミドへのADE2欠損Pichiaの統合はアデニン欠損培地における生存駆動の選択viability-drivenselectionならびにコロニー色調に基づくスクリーニングを可能にした。高いコピー要素は白く見えたが、低いコピー要素はPichia空胞における、プリン前駆体の蓄積のためピンクまたは赤に見えた。白いコロニーがタンパク質産生のために選択され、いくつかの場合において、いくつかのコロニーが大規模生産リットルの前に小規模のタンパク質生産ミリリットルの効率のためにスクリーニングされた。pPinkα-HCプラスミドマップおよび詳細はInvitrogenより利用可能である。他の場合では、タンパク質は、Selexis/CHOクローン系を使用することで精製された。例示的な発現ベクターはpMP20KSELEXISであり、例示的細胞株はCHO-kl-SSELEXISである。pMP20Kは一般的に使用された遺伝要素を使用する。発現はヒトのGAPDプロモーターによって駆動される。MatrixAttachmentRegionまたはMAR要素といわれる遺伝要素は、染色質の動的組織化を制御し、周囲の染色質の効果から隣接する遺伝子を隔離し、その結果、コピー数依存、位置依存の遺伝子発現を増加させる。MAR要素は、組換えタンパクの所望のレベルの発現を示すクローンの分離の確率を改善し、生産の安定性を増加させることを示した。発現プラスミドに加えて、抗生物質耐性プラスミドpSV2-neo、SELEXISなどもまた、安定した形質転換体の選択のために、使用された。発現プラスミドは直線化され例えば、Pvulで、その後QIAQUICK精製QIAGENが続いた。LipofectamineLTXInvitrogenは、OptiMemIGibcoにおけるCHO細胞へのトランスフェクションのために使用された。トランスフェクトされた細胞は、10FBS含有F12Hams培地で2日間選択圧なし、その後4日間の選択圧で回復され、次いで、選択圧ありの無血清培地に変更された。HyClone登録商標ThermoScientificは、HT補完剤GIBCOと共に、HSA-融合BBAに使用される。発現に続いて、製造者の指示GEHealthcareに従って、タンパク質はCibacronBlueSepharoseクロマトグラフィー、Ni親和性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせで精製された。タンパク質生産は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEにより監視された。Pichiapastorisのタンパク質の発現とクロマトグラフィーによるその後の精製。興味のあるタンパク質をコードする遺伝子が、組み換えタンパク質の分泌発現を許容するために、pPinkα-HCプラスミドInvitrogenA11151キットを含むを使用して、Saccharomycescerevisiaeα接合因子分泌シグナル配列番号244、245でインフレームでクローニングされた。加えて、His6-タグをコードするDNAは、Ni親和性クロマトグラフィーにおいて組み換えタンパク質の精製の選択肢を許容するために遺伝子の3’末端に加えられた。簡潔に、プラスミドは化学的に有用なPichiaPinkStrain2Invirogen、カタログ番号A11154に形質転換され、培養物はBMGYバッファー複合グリセロール培地=1酵母エキス、2ペプトン、100mM燐酸カリウム、pH6.0、硫酸アンモニウム含有、アミノ酸なしの1.34YeastNitrogenBase、0.0004ビオチン、1グリセロール中で、振盪培養器で30°CでOD600=2~6まで生育された。このとき細胞はペレット状となり、タンパク質の発現が元の培地の1/5容量のBMMYバッファー複合メタノール培地=1酵母エキス、2ペプトン、100mMリン酸カリウム、pH6.0、硫酸アンモニウム含有、アミノ酸なしの1.34YeastNitrogenBase、0.0004ビオチン、0.5~1メタノールでの培地の交換により誘導された。培養物は、その後、振盪培養器で20~30°Cにて追加の24~48時間で生育された。12~24時間ごとに、追加のメタノール最終濃度0.5~1v/vまでが培地に追加された。採取時点で、細胞は遠心分離によりペレット状となり、上澄みが回収され、滅菌ろ過され、精製まで典型的には採取から3日以内4°Cにて保管された。以下の融合タンパク質は、下記の方法に基づいて精製されたIGF1_mHSA_AnxV配列番号136、137;IGF1_mHSA_AnxVm1234配列番号138、139;NRG1bEGF_mHSA_AnxV配列番号142、143;NRG1bEGF_mHSA_AnxVm1234配列番号254、255;FGF2_mHSA_AnxV配列番号144、145。組み換えタンパク質は、製造者の指示に従い、重力流で、NiSepharose6FastFlow樹脂GEHealthcare17-5318-04;樹脂1mL/50mLの上澄みを使用するNi親和性クロマトグラフィーによって精製された。これらの精製からの素通り画分はその後、50mMNaCl、20mMTris、pH7.0にバッファー交換し、遠心分離を用いて、同じバッファーで平衡したHiTrapBlueHP1mLカートリッジは、最終的な大きい培養物に、播種した3~5日後にCellBoostの量=培養物の7-12加えられた。興味のある分泌タンパク質を含む細胞上清が、培養物生存率が90より下に下降すると培養物をその最終容量に希釈した後~1週間、すぐに採取された。細胞上清が遠心分離によって採取され、滅菌ろ過された。精製が1週間以内に実施される場合は、上清は4°Cで保存され、そうでなければ、上清は-80°Cで保存された。融合タンパク質aDNASI1L23_mHSA_HGFNK1配列番号110、111、DAscFv_mHSA_IGF1配列番号246、247、DAscFv_mHSA_HGFNK1配列番号248、249は下記の方法で精製された。Selexis/CHO発現からの上澄みは、ddH2Oで1:0.5に希釈され、5mLBlueSepharoseカラムに2回通された。タンパク質は45mMオクタン酸ナトリウを含むバッファーで希釈され、PBSに対して透析した。タンパク質は、次に、ddH2Oで1:1に希釈し、1mLのQ陰イオン交換カラムにロードされて、緩やかな勾配勾配=10B、A=1:1PBS:水、B=PBS中の1MNaCl、PBS=標準DulbeccoPBS、Mg/Caなしで溶出した。興味のあるタンパク質を含む画分はプールされ、アリコート中で凍結された。最終的な純度はSDS-PAGEにより評価された。すべての精製タンパク質が、90より高い純度を示し、SDS-PAGEにおいて単一のバンドに泳動した。図14は予想された114kDaのMWにおける単一のバンドを有するaDNASI1L23_mHSA_HGFNK1配列番号110融合タンパク質のSDS-PAGEを示した。図15は予想された102kDaのMWにおける単一のバンドを有するDAscFv_mHSA_IGF1配列番号246融合タンパク質のSDS-PAGEを示した。図15は予想された115kDaのMWにおける単一のバンドを有するDAscFv_mHSA_HGFNK1配列番号248融合タンパク質のSDS-PAGEを示した。実施例6二重特異的融合タンパク質の損傷細胞への特異的結合標的化ドメイン、半減期モジュレータ、および活性化ドメインを含む融合タンパク質が作成され、標的化ドメインを通してinvitroでの損傷細胞に特異的に結合するその能力が検証された。使用される標的化ドメインは、アポトーシスの間、外側の細胞表面で露出されるようになるホスファチジルセリンに結合する、ヒトアネキシンVAnxV、配列番号31であった。特異的結合は、異なる活性化ドメインをもつ融合タンパク質、および異なる融合方向性例えば、N-末端活性化ドメインとC-末端標的化ドメイン、およびN-末端標的化ドメインとC-末端活性化ドメインによる融合タンパク質を含む、さまざまな融合タンパク質に示された。特異的結合はまた、心筋細胞およびと胚幹細胞由来ESC由来心臓細胞を含む、異なる細胞型の損傷細胞への結合も示した。いくつかの場合、心筋梗塞後のinvivoでの細胞損傷状態を模擬するための酸化的ストレスを誘導するため、細胞は過酸化水素H2O2で損傷された。アネキシンVの非結合性変異体AnxVm1234、配列番号84含む融合タンパク質は、損傷細胞に結合せず、融合タンパク質の結合がアネキシンV標的化ドメインによって調節されたことを示した。全体的に見て、これらのデータは融合された標的化ドメインの特異的結合を通して、活性化ドメインを特異的に損傷細胞に送達する融合タンパク質の能力を示す。細胞への融合タンパク質の結合はフローサイトメトリーを使用して観察された。アポトーシス細胞死は過酸化水素H2O2処理からの酸化的ストレスによって誘導された。アポトーシスを起こした細胞または死細胞が、ヨウ化プロピジウムPIでの標識化、または蛍光アネキシンVを基にした市販のアポトーシス検出キットによる標識化により同定された。いくつかの場合、融合タンパク質はまず、後の検出のために蛍光染料で、共有結合で標識化された。これらの場合において、融合タンパク質の非結合性変異体で培養された同等な細胞が、PI陽性であるが融合タンパク質蛍光陰性である一方、アポトーシスを起こした細胞への融合タンパク質の特異的結合は、PIおよび融合タンパク質蛍光の両方に陽性である細胞を観察することにより示された。他の場合において、融合タンパク質は最初に共有結合で標識化されず、代わりに、タンパク質融合で半減期モジュレータに結合する蛍光標識された二次抗体が、融合タンパク質の検出のために使用された。これらの場合では、アポトーシスを起こした細胞への融合タンパク質の特異的結合は、市販のアネキシンVを基にした検出キットからの蛍光シグナルの量と、融合タンパク質二次抗体からの蛍光シグナルの量の間の強い相関関係を示すことにより、示された。A.IGF1_mHSA_AnxVのアポトーシスを起こした心臓細胞への特異的結合。融合タンパク質IGF1_mHSA_AnxV配列番号136およびIGF1_mHSA_AnxVm1234配列番号138は、実施例5に記載の通り、発現され、精製された。両方のタンパク質は、製造者の指示に従い、AlexaFluor488AlexaFluor488マイクロスケールタンパク質標識化キット、Invitrogen、A30006で共有結合で標識化された。HL-1細胞WilliamC.Claycomb、LouisianaStateUniversityHealthSciencesCenter、成熟心筋細胞の特性をもつ心筋細胞株、はゼラチン/フィブロネクチンでプレコートされた96ウェルのプレートBD/Falcon、353072に、10FBSSigma、12103C、2mML-グルタミンInvitrogen/Gibco、25030、100U/mLペニシリン100ug/mLストレプトマイシンInvitrogen/Gibco、15070および0.1mMノルエピネフリンSigma、A0937を含む完全培地Claycomb培地Sigma、51800C中に1:3で播種され、37°Cおよび5のCO2で培養された。2日後に、細胞に、400uMH2O2Sigma、H1009が補足された培地0.1mL/ウェルが供給され、37°Cおよび5のCO2で15分間培養された。次に、H2O2が補足された培地を各ウェルから吸引し、完全培地に置き換え、細胞は37°Cおよび5のCO2で20~24時間培養された。翌日、離れた細胞を集めるため、各ウェルからの培地が96-deepwellv-bottomプレートを用いて得られた。どちらの場合も、3μLのヨウ化プロピジウムPIが培養の最終15分で添加された。細胞はBDFACSCantoIIフローサイトメータで、適切な非染色および単一染色singlestainされた対照を較正のために使用して、分析された。アポトーシスを起こした細胞は、BDBiosciencesアポトーシス検出キットからのアネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウムPIで共標識co-labelされた図2および3。56の細胞は、アポトーシスまたは細胞死の遅延を示す、二重陽性の象限にあった。陽性および陰性の集団は適正に分離された。IGF1_mHSA_AnxV配列番号136およびIGF1_mHSA_AnxVm1234配列番号138は、それぞれ、7.1および8.1mol染料/molタンパク質の標識化度DOLを達成して、AlexaFluor488でそれぞれ標識された。アポトーシスを起こした細胞はまた、80ng7.1nMのIGF1_mHSA_AnxVおよびPI図4および5、または80ng7.1nMのIGF1_mHSA_AnxVm1234およびPI図6および7で共標識された。IGF1_mHSA_AnxVによって標識された細胞は、融合タンパク質がアポトーシスを起した細胞または死細胞に特異的に結合したことを示す、アポトーシス検出キットの陽性対照と非常に類似した、非常によく分離された二重陽性のピーク細胞の53を示した。他方では、IGF1_mHSA_AnxVm1234によって標識された細胞は二重陽性のピークを示さず細胞の0、これは非結合性標的化アームが、計画されたようにアポトーシスを起した細胞または死細胞に結合しなかったことを示した。まとめると、これらのデータは、標的化ドメインとしてのアネキシンVAnxVを含む融合タンパク質がアポトーシスを起したまたは死滅した心臓細胞に特異的に結合でき、従って、障害をうけたまたは損傷した心臓組織を治療するために、活性化ドメインなどの生物学的例えば、治療法の効果を有する融合剤または分子を送達するために使用され得ることを示した。B.IGF1_mHSA_AnxVのアポトーシスを起こした心臓細胞への特異的結合。実施例6Aで観察された、アポトーシスを起した心臓細胞への結合がIGF1_mHSA_AnxV融合タンパク質のAnxV標的化ドメインに特異的であり、細胞表面IGF受容体へのIGF1ドメインの結合の結果でないことを検証するため、いかなる/全てのIGF1細胞表面受容体を飽和および遮断するためのIGF1予備培養工程を含めた実験を繰り返した。H2O2濃度を200μMとした以外は、実施例6Aと同じ方法を用いた。加えて、結合バッファーへの細胞の再懸濁の後に、しかしAlexaFluor488で標識された融合タンパク質の添加の前に、いかなる/全てのIGF1細胞表面受容体を予備遮断するために、800nMのIGF1Calbiochem、407240が添加され、10分間培養された。図8および9におけるアネキシンV-FITCおよびPI陽性対照は、約40が、遅延されたアポトーシスまたは細胞死の集団を示す、二重陽性であることを示した。図10および11は、実施例6Aに示されたように、非結合性対照融合、IGF1_mHSA_AnxVm1234が結合を示さなかった図12および13一方で、アポトーシスを起した細胞へのIGF1_mHSA_AnxVの結合を示した。次に、IGF1_mHSA_AnxVが感知され得る程度にIGF1ドメインを通して細胞に結合しなかったことを示すために、アッセイはIGF1遮断工程を加えて繰り返された。図14および15は、過剰なIGF1の存在下、およびそこでの培養後でさえ、アポトーシスを起した細胞とIGF1_mHSA_AnxVの結合を示した。これらのデータは、AnxV標的化ドメインが、タンパク質融合体のアポトーシスを起した細胞への特異的結合に関与することを示した。C.AnxV_mHSAの、アポトーシスを起したESC由来心臓細胞への特異的結合。AnxV_mHSA配列番号252およびAnxVm1234_mHSA配列番号250は、製造者の指示に従って、AlexFluor647AlexaFluor647カルボン酸、スクシンイミジルエステル、Invitrogen、A-20006に直接結合conjugateされた。胚幹細胞由来ESC由来心臓細胞PeterZandstra,UniversityofTorontoは、本質的にはYangetalNature2008,453:524-8に記載の通りに得られた。BauwensCL,etal..TissueEngPartA.2011Apr25.,GeometricControlofCardiomyogenicInductioninHumanPluripotentStemCells.からプロトコルを得た。凝集を基にしたhESCsの分化が、以前に記載した心筋系列への分化に向けられる、無血清のプロトコルを使用して実施された。HESC凝集体サイズは、マイクロウェルの加工された表面texturedsurfaceを含む、AggreWellTMインサートSTEMCELLTechnologies中で、定められた細胞濃度での強制的な凝集によって制御された。簡潔に、フィーダー枯渇hESCの単一細胞懸濁液は1000細胞/ウェルの密度でAggrewellに沈降された。細胞は低酸素状態で、ROCK阻害剤および0.5ng/mlのBMP4の添加と共に、基本培地としてのGlutamax、アスコルビン酸、トランスフェリン、ペニシリン/ストレプトマイシンが補足されたStemPro34中で一晩凝集させた。1日目に、培地は、10ng/mlのBMP4、3ng/mlのアクチビンA、および5ng/mlのbFGFをもつ基本培地で置き換えられた。4日目に、細胞はマイクロウェルから取り出され、DMEMF12で洗浄され、5KOSRを補足して、10ng/mlのVEGFおよび150ng/mlのDkk1をもつ基本培地中の低クラスタプレートに移された。8日目に、培地を10ng/mlのVEGF、150ng/mlのDkk1、および5ng/mlのbFGFをもつ基本培地で置き換えられた。12日目に、再び培地を置き換え同じサイトカイン、16日目までに細胞を正常酸素圧条件に移した。PI標識およびアネキシンV-FITC検出キットに基づき、H2O2またはドキソルビシン処理なしでも、心臓細胞は測定可能なアポトーシスを起した集団を示す図16。ドキソルビシンの更なる添加はアポトーシスを起した画分を増加させなかった。それにもかかわらず、アポトーシスを起した細胞集団はアポトーシス標的化融合タンパク質の結合を試験するのに十分であった。心臓細胞集団はまた、アネキシンV-FITC検出キットで共培養される間、AnxV_mHSAまたはAnxVm1234_mHSAのどちらかと共に培養された。AnxVm1234_mHSA融合からではなく、AnxV_mHSA融合でのAlexaFluor647からの蛍光シグナルは、アポトーシス検出キットからのFITCシグナルと強く相関し図17、これはAnxV_mHSAがアポトーシスを起したESC由来心臓細胞に特異的に結合することを示した。D.AnxV_mHSA_NRG1bEGFの、アポトーシスを起したESC由来心臓細胞への特異的結合。アポトーシスを起したESC由来心臓細胞との融合タンパク質AnxV_mHSA_NRG1b配列番号120の結合は、共有結合している蛍光色素分子での融合タンパク質の第一の改変の代わりに、二次検出計画を使用することで示された。融合タンパク質は製造者の指示に従ってAlexaFluor647AlexaFluor647カルボン酸、スクシンイミジルエステル、Invitrogen、A-20006によってそれ自身が共有結合で標識された抗HSA抗体アフィニティー精製したヤギ抗ヒトアルブミン抗体、BethylLabs、A80-129Aを使用して検出された。心臓細胞は実施例6Cに記載の通り、アネキシンV-FITC検出キットで共培養される間、AnxV_mHSA_NRG1bEGFと培養された。融合タンパク質は抗HSAAlexaFluor647二次抗体により検出された。AlexaFluor647からの蛍光シグナルは、アポトーシス検出キットからのFITCシグナルと強く相関した図18。これはAnxV_mHSA_NRG1bEGFがアポトーシスを起したESC由来心臓細胞に特異的に結合することを示した。さらに、融合タンパク質を除いた図18のリガンドなしが、二次検出試薬でまだ培養された対照実験は、AlexaFluor647シグナルとアポトーシスを基にするFITC信号に少しの相関関係も示さず、これは、元のAlexaFluor647蛍光シグナルが二次抗体単独での結合によるものではなく、融合タンパク質自身の結合によるものであることを示した。実施例7.融合タンパク質のそれらの標的への特異的結合患者の疾患関連領域に治療額を局所化するプロセスは、興味のある領域に制限されるかまたは特に豊富である分子エピトープを標的とすることによって達成できる。例えば、心筋梗塞は、この目的に利用できる、組織損傷の数個の標的分子例えば、DNA、心臓ミオシン、およびホスファチジルセリンを露出できる。いくつかの融合タンパク質が、これらの標的分子に特異的な標的化ドメインを含むように作成された。特に、アネキシンVおよびシナプトタグミンはホスファチジルセリンを標的とするために使用でき、SI-1一本鎖可変断片aDNASIscFvはDNAを標的とするために使用できる。しかしながら、当業者は、融合タンパク質に結合ドメインを含めることが各々の個々のドメインの特性の欠失または変化例えば、結合親和性の変化、生物活性の変化をもたらし得ることを理解するであろう。本明細書に開示された融合タンパク質の機能性が維持されるかどうかを決定するため、ELISAを基にしたinvitroでの結合テストが開発され、適用された。本質的には、アッセイは、標的化に適した融合タンパク質が、ウェル表面に覆われた同族の標的分子とのそれらの相互作用によって、激しい洗浄にも関わらず、マイクロプレートウェルに保持されたことを示した。融合タンパク質の存在は免疫化学的に定量された。同族の標的分子が存在しない、または同族でない標的分子が存在するとき、予期しない標的化ドメインの交差反応の不存在下で、保持は予想されなかった。同族の標的分子のあるときの保持、およびないときのクリアランスの組み合わせは、結合特異性および標的化機能の証拠であった。マイクロプレートPierce15041は、興味のあるエピトープでコーティングされた。ホスファチジルセリンPS、AvantiPolarLipids840032は、50μL/ウェルの12.5μg/mLのメタノール中の溶液を蒸発して乾燥することにより被覆された。DNASigmaD3664は、10μg/mLのDNAおよびDNACoatingReagentPierce17250の予備混合された1:1の溶液の50μLをウェルに添加することにより、被覆された。ミオシンは、DubleccoのPBS中の10g/mL溶液を培養することにより、被覆された。全ての被覆反応が室温にて2時間、200rpmで振動しながら実施された。洗浄の後、250μL/ウェルでタンパク質なしの遮断バッファーPierce37572が加えられ、プレートは室温で3~4時間培養された。さらなる洗浄の後、100μLのクロマトグラフィー精製融合タンパク質が、160ngmL~20μg/mLの範囲の濃度でウェルに加えられた。結合は、10mMHepes、140mMNaCl、2.5mMCaCl2、pH7.4中で、室温で2時間進行した。さらなる洗浄の後、100uLの検出抗体HRP結合ヤギ抗ヒトアルブミン抗、BethylLabsA80-129Pが、各々PBSTで1:5,000または1:50,000の希釈度でウェルに添加され、30~60分間培養された。さらなる洗浄の後、75μLのペルオキシダーゼ基質PierceTMBUltra34028がアプライされ、有意な着色を観察して、反応は75μLのStop溶液KPL50-85-05でクエンチされた。ウェルの吸光度はプレートリーダーTecanM200Proで450nmにて読みとられた。すべての融合タンパク質および抗体の組み合わせは三重で実施された。すべての洗浄工程は、自動化96ウェルプレート洗浄器Biotek、Elx405を用いて、サイクルの間に、5秒の浸漬のある250μLのPBST投入および吸引、および振盪工程がある工程の4サイクルで構成された。模擬コートされた空のウェル溶媒、コート試薬、またはバッファーのみおよび融合タンパク質のないウェルは陰性対照として含まれた。融合タンパク質は、実施例5で詳述されるように、作成された。IGF1_mHSA_Syt1配列番号152およびIGF1_mHSA_AnxV配列番号136はホスファチジルセリンに特異的に結合することを示した図19。aDNASI1_mHSA_FGF2配列番号124、aDNASI1_mHSA_NRG1bEGF配列番号126、および、IGF1_mHSA_aDNASI1配列番号154は、DNAに特異的に結合することを示した図20。融合タンパク質は、標的分子と特異的に結合することを示し、これは標的化ドメインを半減期モジュレータおよび活性化ドメインに融合したあとで、機能的な結合の保持を示し、さらにまた融合タンパク質に融合される能力を有する標的化ドメインならびに標的の幅を実証する。ホスファチジルセリンなどの特定の標的はアネキシンVおよびシナプトタグミンなどのさまざまな結合ドメインに対処し得る。逆に、aDNASI1がそのメンバーである、抗体由来scFvのような、特定のタンパク質のクラスは、対応する多種の標的分子またはエピトープに結合するメンバーの大きな多様性を有する。融合タンパク質へのscFvの成功した組み込みは、他の融合タンパク質における抗体由来標的化の応用の可能性を示すものである。aDNASI1ドメインはさらに、N-またはC-端末融合方向性のいずれにおいて、ならびに様々な活性化ドメインを含む融合において機能的であることが示された。総合すると、これらの結果は、融合タンパク質の標的化が、特定の標的エピトープ、特定の標的化ドメインのクラス、特定の翻訳方向性、または特定の活性化ドメイン含有分子制限されないであろうことを確証する。実施例8.細胞活性の改質精製融合タンパク質の活性化ドメインの生物活性は、刺激細胞において下流のシグナル伝達を測定することにより、invitroで示された。融合タンパク質の有効性は野生型、非融合活性化ドメインのものと比較された。異なる活性化ドメイン、異なる標的化ドメイン、および異なる融合方向性があるさまざまな融合タンパク質が作成され、生物活性を示した。これらのデータは、融合タンパク質が生物活性であり、生存促進または増殖の経路などの細胞経路にシグナル伝達できるように作成できることを示す。各融合タンパク質は陽性対照、市販で得られた非融合型のその活性化ドメイン、と並んで試験された。活性標的化ドメイン例えば、AnxVならびに非結合対照標的化ドメイン例えば、AnxVm1234またはDAscFvのある融合タンパク質の両方が使用され、活性化ドメインの活性が標的化ドメインの固有性および機能から独立していることが示された。刺激されるべき細胞が生育され、血清飢餓し、その後融合タンパク質で刺激された。次に、タンパク質は洗い流され、細胞活性はホスホ-AktpAktまたはホスホ-ErkpErkのいずれかのためにELISAによって測定された。A.NRG1bEGF融合タンパク質を用いる癌細胞でのAKT活性の刺激。実施例5に記載のように、融合タンパク質NRG1bEGF_mHSA_AnxV配列番号142およびAnxV_mHSA_NRG1bEGF配列番号120が作成された。野生型NRG1bEGFはRDSystems396HBCFから入手された。DU145細胞、ヒト前立腺癌、上皮性細胞は、10のFBSHyclone、SH30071、2mMのL-グルタミンInvitrogen/Gibco、25030および50UmLペニシリン50ugmLストレプトマイシンInvitrogen/Gibco、15070を含む完全培地RPMI-1640Invitrogen/Gibco、11875中で、96ウェルプレートBDFalcon、353072に25,000の細胞/ウェルで播種されて、一晩、37°Cおよび5のCO2で培養された。翌日、培地が吸引され、細胞は0.1mL/ウェルのPBSカルシウムおよびマグネシウムのない、Sigma、D8537で洗浄され、細胞は0.1mL/ウェルのRPMI-16400.5のFBSで再供給され、細胞は20~24時間、37°Cおよび5のCO2で培養された。翌日、細胞は、既存の0.1mL/ウェルに25μL/ウェルで添加する希釈された融合タンパク質または対照タンパク質で37°Cおよび5CO2で10分間刺激された。刺激はウェルから培地を吸引して停止され、0.2mL/ウェルの冷PBSで洗浄された。細胞はあらかじめ調製された、25μL/ウェルの完全M-PER溶解バッファー哺乳動物タンパク質抽出試薬Pierce/ThermoScientific、78501150mMNaCl、プロテアーゼ阻害剤カクテルRochecompletemini、04693124001、およびホスファターゼ阻害剤RochePhosSTOP、04906837001で溶解された。プレートは密封され、細胞はオービタルシェーカーで4°Cにて30分間溶解され、溶解物はドライアイス上で寒気凍結され、-78°Cで保管された。384ウェル平滑白色プレートMaxiSorp、Nunc、460372が、抗Akt捕捉抗体cloneSKB1、Millipore、05-591でコートされ、密封され、室温で一晩保管された。翌日、細胞溶解物が解凍され、ELISAプレート洗浄および遮断された。解凍された溶解物はプールされ、ELISAプレートは再度洗浄され、Akt標準またなプールされた溶解物がELISAプレートに加えられ、プレートは室温で2時間培養された。ELISAプレートは洗浄され、抗ホスホ-Akt検出抗体ビオチニル化したマウスmAb、CellSignaling、5102が加えられ、プレートは1.5時間室温で培養された。プレートは洗浄され、そして、ストレプトアビジン-ホースラディシュペルオキシダーゼSA-HRP、RDSystems、890803が添加され、プレートは30分間、室温で培養された。プレートは再度洗浄され、基質SuperSignalELISAPicoChemiluminescent、Pierce/ThermoScientific、37069が添加され、蛍光がプレートリーダーで読み取られた。pAkt標準曲線は直線両対数スケールに合わせられた。NRG1bEGFおよびNRG1bEGF_mHSA_AnxVの活性は図21に示される。市販野生型NRG1bEGFと融合タンパク質の両方が、pAkt経路を刺激する、生物活性を示した。同様に、図22は野生型および逆方向融合タンパク質、AnxV_mHSA_NRG1bEGFの活性を示す。これらの結果は、NRG1bEGF活性化ドメインからmHSAおよびAnxVに翻訳されるように融合しても、実施例5で発現および精製されたNRG1bEGF融合タンパク質が生物活性であるのと同様に、その生物活性が無効にならなかったことを示す。B.IGF1融合タンパク質を用いる癌細胞でのAKT活性の刺激。融合タンパク質、IGF1_mHSA_AnxV配列番号136、IGF1_mHSA_AnxVm1234配列番号138、およびIGF1_mHSA_B7scFv配列番号150は、実施例5に記載の通り作成された。野生型IGF1はCalbiochem407240から入手された。DU145細胞は、実施例8Aに記載の通り、生育され、刺激された。3個すべてのIGF1を基にしたタンパク質融合が、DU145癌細胞で、野生型IGF1と同様のpAkt刺激で、生物活性を示した図23~24参照。C.IGF1融合タンパク質を用いる心臓細胞でのAKT活性の刺激。融合タンパク質IGF1_mHSA_AnxV配列番号136は、実施例5に記載の通り作成された。野生型IGF1はCalbiochem407240から入手された。HL-1細胞WilliamC.Claycomb、LouisianaStateUniversityHealthSciencesCenter、成熟心筋細胞の特性をもつ心筋細胞株、はゼラチン/フィブロネクチンでプレコートされた96ウェルのプレートBD/Falcon、353072に、10FBSSigma、12103C、2mML-グルタミンInvitrogen/Gibco、25030、100U/mLペニシリン100ug/mLストレプトマイシンInvitrogen/Gibco、15070および0.1mMノルエピネフリンSigma、A0937を含む完全培地Claycomb培地Sigma、51800C中に60,000細胞/ウェルで播種され、37°Cおよび5のCO2で一晩培養された。細胞は実施例8Aに記載の通り、洗浄され、ELISAプロトコルに供された。IGF1_mHSA_AnxV融合タンパク質は、心臓細胞に生物活性を示し、その効力は野生型IGF1に匹敵する程度であった用量反応活性、図25を参照。これらのデータは、半減期モジュレータと標的化ドメインに融合された活性化ドメインが、作成でき、細胞を強力に刺激する能力を保持できることを示す。FGF2融合タンパク質は心臓細胞のEPK活性を刺激する。胚幹細胞ESC、PeterZandstra’slabatTheUniversityofTorontoにより提供されたから得られた心筋細胞は、ゼラチンでプレコートされた96ウェルプレートに、38.5XStemPro-34栄養補助剤StemPro-34培地にて提供、2mML-グルタミンInvitrogen/Gibco、25030、50U/mLペニシリン50ug/mLストレプトマイシンInvitrogen/Gibco、15070、0.4mMモノチオグリセロールSigma、M6145、50ug/mLアスコルビン酸Sigma、A4544、150ug/mLトランスフェリンSigma、T8158、10ng/mLVEGFRDSystems、293-VE、150ng/mLDKK-1RDSystems、5439-DK、および5ng/mL塩基性FGFFGF2、PeproTech、100-18bが補足されたStemPro-34培地Invitrogen/Gibco、10639中に、40,000細胞/ウェルで播種され、37°Cおよび5のCO2で一晩培養された。刺激の24時間前に、増殖培地は栄養補助剤および増殖因子なしのStemPro-34に変更した。細胞は実施例8Aに記載の通り、刺激され、溶解された。ELISAにおいて、96ウェルの高結合性黒色ELISAプレートがホスホ-Erk1/Erk2捕捉抗体RDSystems、DYC1018でコートされ、密封され、室温にて一晩保管された。翌日、溶解物は、ホスホ-Erk1/Erk2標準RDSystems、DYC1018およびホスホ-Erk1/Erk2検出抗体RDSystems、DYC1018が、Akt標準と抗ホスホ-Akt検出抗体の代わりに活性Erk1/Erk2レベルを測定するために使用されたことを除いて、実施例8Aに記載の通り、ELISAプロトコルに供された。融合タンパク質AnxV_mHSA_FGF2配列番号118は、pERKESC由来心臓細胞の刺激について野生型FGF2と比較され、生物活性を示した図26。実施例9.アポトーシスを起こした細胞で蓄積する融合タンパク質の蓄積および細胞活性の刺激融合タンパク質が、その標的化ドメインを通して細胞に特異的に結合し、次にそれらの活性化ドメインを通して細胞のシグナル伝達経路を刺激する能力はinvitroで示された。使用される標的化ドメインは、ヒトアネキシンVAnxV、配列番号31であった。AnxVはアポトーシスの間、外側の細胞表面に露出されるようになるホスファチジルセリンに結合できる。使用される活性化ドメインは、細胞表面で発現されたIGF1受容体に結合するIGF1配列番号3であった。いったん結合すると、IGF1受容体は細胞内シグナル伝達を開始する。融合タンパク質は、最初に、心筋梗塞後のinvivoでの細胞の損傷状態を模擬する、アポトーシスを起した心臓細胞に結合された。融合タンパク質結合細胞は、次いで、正常な心臓細胞におけるIGF1シグナル伝達を刺激するために使用され、これは梗塞域でまたは近くで、損傷または正常な細胞の近傍のシグナル伝達を活性化する融合タンパク質の傍分泌作用を模擬した。ホスホ-Akt、IGF1シグナルの下流標的、はELISAによって測定された。細胞結合融合タンパク質は心臓細胞においてAktシグナル伝達を刺激できた。野生型IGF1はAktシグナル伝達を誘導せず、これは、融合タンパク質のアネキシンV標的化ドメインが、シグナル伝達を起すために重要であることを示した。同様に、AnxV_mHSA融合タンパク質はAktシグナル伝達を誘導せず、これは、標的化ドメイン自身がシグナル伝達に十分でなかったことを示した。まとめると、これらのデータは、標的損傷組織に特異的である能力があること、および傍分泌様形式で活性化ドメインを通じて細胞経路でシグナル伝達を行う能力があるという融合タンパク質の二重機能性を示す。この結果は、正常組織でなく損傷組織に特異的に蓄積され、活性化ドメインを通して生存または再生を調節するという融合タンパク質の治療的な役割を示す。第一の工程では、融合タンパク質は、アポトーシスを受けているHL1心筋細胞におけるアネキシンV-ホスファチジルセリン結合を通して損傷細胞で蓄積できた。アポトーシス細胞死は過酸化水素H2O2での処理からの酸化的ストレスによって誘導された。損傷細胞への融合タンパク質の結合は、H2O2処理細胞の、増殖培地に含まれる分離されたアポトーシスを起している細胞と融合タンパク質を培養することにより実施された。第二の工程では、細胞結合融合タンパク質の活性化ドメインの生物活性は、刺激をうけた、細胞結合融合タンパク質がある血清飢餓心筋細胞、によってinvitroで評価された。刺激を停止させるために洗浄した後、刺激細胞における下流のシグナル伝達は、ホスホ-AktpAktのELISAにより測定された。融合タンパク質によって誘導されたpAktのレベルは、市販で得られた非結合型のものの活性化ドメインならびにアネキシンV標的化ドメインを含む融合タンパク質のものと比較された。融合タンパク質IGF1_mHSA_AnxV配列番号136は、実施例5に記載の通り、発現され、洗浄された。HL-1細胞WilliamC.Claycomb、LouisianaStateUniversityHealthSciencesCenter、成熟心筋細胞の特性をもつ心筋細胞株、はゼラチン/フィブロネクチンでプレコートされた96ウェルのプレートBD/Falcon、353072に、10FBSSigma、12103C、2mML-グルタミンInvitrogen/Gibco、25030、100U/mLペニシリン100μg/mLストレプトマイシンInvitrogen/Gibco、15070および0.1mMノルエピネフリンSigma、A0937を含む完全培地Claycomb培地Sigma、51800C中に1:2で播種され、37°Cおよび5のCO2で培養された。翌日、細胞に、400uMH2O2Sigma、H1009が補足された培地0.1mL/ウェルが再供給され、37°Cおよび5のCO2で15分間培養された。次に、H2O2が補足された培地を各ウェルから吸引し、完全培地に置き換え、細胞は37°Cおよび5のCO2で20~24時間培養された。翌日、離れた細胞を集めるため、各ウェルからの培地が96-deepwellv-bottomプレートUSAScientific、1896-1110に移された。各試料に、3個のウェルからの培地が96-deepwellv-bottomプレートの1個のウェルにプールされた。集められた細胞は次に、カルシウム結合バッファー、アネキシンV-FITCアポトーシス検出キットの成分、BDBiosciences、556547の存在下で、融合タンパク質と、37°Cおよび5のCO2で15分間培養された。融合タンパク質結合細胞は遠心分離によりペレット状にされ、PBSSigma、D8537で1回洗浄され、その後、細胞はカルシウム結合バッファーを含む100μL/ウェルのDMEMに再懸濁された。ゼラチン/フィブロネクチンでプレコートされた96ウェルのプレートに播種され、あらかじめ血清飢餓とされたHL-1細胞は、次いで100μL/ウェルの再懸濁された融合タンパク質結合細胞で20分間刺激された。刺激された細胞は、次いで、実施例5に記載の通り洗浄され、ELISAプロトコルに供された。H2O2にさらされなかった正常なHL-1細胞も、また、40μL/ウェルの0.025トリプシン-EDTAを使用するトリプシン処理により採取され、37°Cの培養器に置かれた。細胞分離は顕微鏡で監視され、トリプシンを非活性化するために10FBSを加えた100uL/ウェルのDMEMが加えられた。各々の試料について、3個のウェルからのトリプシン処理細胞が96-deepwellv-bottomプレートの1個のウェルにプールされた。細胞は冷PBSで洗浄され、300μLのDMEMで再懸濁された。細胞は、次に、カルシウムの存在下で、播種され、あらかじめ血清飢餓とされたHL-1細胞を用いて、上記の通りの処理で、融合タンパク質と培養された。細胞は実施例8Aに記載の通り、洗浄され、ELISAプロトコルに供された。ホスホ-Aktレベルの増加は図27に示されているように、標的AnxVおよび活性化IGF1ドメインの両方を含むアポトーシスにapoptotically捕捉された融合タンパク質によって刺激された細胞においてのみ観察された。野生型の、非融合IGF1は、おそらく、IGF1がアポトーシスを起こした細胞と結合せず、それゆえ捕捉されたかったため、細胞を刺激できなかった。融合タンパク質および野生型IGF1の両方には、実施例4Cに示されるように同等な活性を有し、それゆえ、捕捉された融合タンパク質によるホスホ-Aktレベルの増加は、それらの効力の違いによるものではなかった。非融合IGF1は理論上はアポトーシスを起こした細胞表面に発現したIGF1受容体と結合できたが、シグナル伝達を保持するための増殖因子が不十分のようであったか、増殖因子が、シグナル伝達に利用できない形で保有されていた。同様に、AnxV_mHSA融合タンパク質は細胞を刺激できなかった。実施例6に示されているように、AnxV_mHSA融合タンパク質はアポトーシスを起こした細胞に結合できた一方で、活性化ドメインを欠いていたので、傍分泌様の形でシグナル化はできなかった。おそらく、正常細胞は、融合タンパク質の捕捉のための、細胞表面に露出されたホスファチジルセリンを有しないため、ホスホ-Aktレベルの増加は未処理の細胞と予備混合されたいかなるタンパク質によって刺激された細胞の中に検出されなかった。同様に、正常細胞の細胞表面のIGF1受容体に結合することができるが、増殖因子の捕捉は、細胞を刺激するために十分ではなかった。まとめると、データは融合タンパク質の同時の標的化および活性化関数を示す。実施例10.損傷心臓組織への融合タンパク質のinvivoでの標的化。われわれは、アポトーシスを起こしたおよび壊死した細胞でAnxV標的化ドメインを通してホスファチジルセリンに特異的に結合する、融合タンパク質IGF1_mHSA_AnxV配列番号:136が、IGF1_mHSA_AnxVm1234配列番号:138ホスファチジルセリンと結合しない変異体よりも、心筋梗塞の次の損傷した心臓組織において長期間蓄積するであろうという仮説を試験した。実験的な心筋梗塞MIはマウスで誘導され、そして、被験物質は静脈に注入されIGF1_mHSA_AnxV、IGF1_mHSA_AnxVm1234、またはビヒクルのみの対照のいずれか、動物は12時間24時間または72時間後に殺処分され、心臓の梗塞した、境界域、および遠隔無損傷の領域でのタンパク質の蓄積がELISAおよび免疫組織化学により観察された。免疫組織化学は、投与後24時間で、IGF1_mHSA_AnxVが梗塞の縁の境界域に局在し、一方で結合性がない変異体のいずれも梗塞、境界域、または遠隔正常な領域で見られないことを示した。ELISAのデータは、標的タンパク質、IGF1_mHSA_AnxV、が、結合性がない変異タンパク質IGF1_mHSA_AnxVm1234よりも、より大きい範囲および長期間心臓の梗塞域および境界域に蓄積することを示した。これらのデータはIGF1_mHSA_AnxV、原型的な標的融合タンパク質、の、心筋梗塞に続く、損傷心臓組織に特異的に蓄積して、持続し、融合された活性化ドメインの特異的送達を可能にする、能力を示す。実験的な心筋梗塞MIは、以下で詳細に説明されるように、左冠状動脈の血管結紮でマウスに誘導された。60分後に、血管結紮を除去し、心臓の再かん流を起こした。MIの22時間後、尾静脈における注射で被験物質またはビヒクル対照の投与を行った。1群あたり15匹のマウスに以下を投与した:群1:ビヒクルのみの対照群2:15μgのIGF1_mHSA_AnxV群3:15μgのIGF1_mHSA_AnxVm1234各々の群で、5匹のネズミがそれぞれの以下の時に殺処分された:投与後12、24および72時間。それぞれの群/時点において、心臓の梗塞領域またはその境界領域におけるIGF1_mHSA_AnxVまたはIGF1_mHSA_AnxVm1234に特異的な抗HSAシグナルを特定するという目標のために、3匹の動物が免疫組織化学のために、2匹がELISAのために準備された。詳細なプロトコルは以下の通り。動物の作業はViviSourceInc.,WalthamMAで賃貸された実験室で、BiotrofixIncによって実施された。プロトコルがViviSourceIACUCにより審査承認されて、すべての動物福祉に関する事項が記述され、記録された。90匹のオスのC57B6、12週齢のマウスが研究の7~10日前に注文された予備研究での15匹を含む、CharlesRiverLaboratories。食物と水の自由な摂取が許容された。識別番号は、尾に油性マーカーを用いることによって動物に割り当てられた。動物は研究の前日に観察され、不健康に見えるものは除かれた。動物は除菌空気が21±2°Cおよび50±20の相対湿度で提供された部屋に収容された。部屋はオン、そして、薄明なしの12時間オンおよび12時間オフの照明/闇サイクルの自動タイマー上にあった。高品質なトウモロコシの穂軸、Shepherd’s登録商標1/4、は寝床として使用され、Bio-Huts登録商標forMiceBioServK3352またはRunnel登録商標BioServK3322、K3323が各々のケージに置かれた。動物はLabDiet登録商標5001食事で給餌された。水は自由に供給された。動物はケージあたり4~6匹収容された。処置日に、マウスは計量され、麻酔がプレキシグラスチャンバー内で100O2のイソフルレンがある状態で誘導された。マウスは自己調節加温パッドの処置面に置かれた。マウスは、背面で腹面が上にある状態でで適所に固定され、適切な大きさのintracath22Gを使用して気管内に挿管され、100O2中の1.0~2.5のイソフルラン麻酔が維持された。麻酔の処置レベルは足指、踵、尾をつまんだ際の無反応に伴う眼瞼の反射の損失で確認された。胸郭背の最も低い面から真向かいの胸骨の右側までを剃り、真空で毛を除去し、そして、septisolで皮膚を前処理した。皮膚切開は、肋骨に沿って、胸骨から中間の胸郭領域までの左胸部で行われた。肋骨5および6の間の肋間筋は心臓の左側で開かれ、肋骨は戻された。心臓左室および左心房が特定され、心嚢が開かれた。左肺は、穏やかに下方に押され、体から除去された。7-0絹縫合糸は、左冠状動脈の周りに取り付けられ、無菌ポリエチレンPE-10管の~2mmの断片上で結紮され、心臓は血管結紮の後の蒼白青白化、虚血に関する証拠としてで観察された。縫合糸の残りの端を切り、虚血時間の60分後にPE管および絹縫合糸を切り開くことにより、血管結紮を除去した。傷部は、滅菌加温塩水湿潤ガーゼスポンジで切開面を覆うことにより、湿潤が保たれた。いったん縫合糸が取り除かれると、心臓は虚血領域の適切な再かん流を観察された。左肺は、PEEP終末呼気圧を用いて再膨張させられ、反対側の肋骨は6-0非吸収性の単繊維ナイロン縫合糸で閉じられた。筋層は6-0吸収性の縫合糸で閉じられ、次いで皮膚が連続的に6-0絹縫合糸での閉鎖が続いた。ブプレノルフィンBedfordLabs登録商標Lot:18655303が鎮痛0.05mgkg、皮下にのために注入され、イソフルレンが遮断され、マウスは、自発呼吸がいったん起こると抜管され、回復のために補足の加熱のある清潔なケージに置かれた。処置の後、動物は麻酔から回復するまで加熱パッド上に残された。その後、清潔なケージに戻された。その後、処置日0日目およびそこから少なくとも1日1回、頻繁に観察された。動物は処置前、-1日目および0日目処置日およびその後殺処分まで日ごとに計量された。適切な濃度の被験物質上記で定義されたIGF1群1~3;エンドトキシンなしのPBS中の、ビヒクル、IGF1_mHSA_AnxV、またはIGF1_mHSA_AnxVm1234の10μLのアリコートは、使用日まで―80°Cで保管された。エンドトキシンなしのPBSは4°Cで保管された。各々の被験物質アリコートは、注入の直前に解凍された。200μLのエンドトキシンなしのPBS室温は、被験物質に追加されて、上下に何回かのピペット操作により混合され、次いで、ヘッドスペースがない注射器を使用して、200μLが尾静脈を通してMIの22/-1時間後にマウスに注入された。指定された時点投与後、12、24、または72時間では、マウスは以下の通り安楽死させられた:動物は深いケタミン/キシラジン麻酔に置かれた。処理群あたり3匹の動物について、開胸され、心臓が頂点で穴を開けられた。15の約0.1mlのKClが左室に注入され、動物は標準塩、次いで亜鉛ホルマリンでかん流固定された。心臓は、採集され、24~48時間の間、亜鉛ホルマリン中に保存され、次いで、70のエチルアルコールに移されて、4°Cで保管された。そして、免疫組織学測定のためにMassHistologyServicesに試料を送付した。処理群あたり2匹の動物について、動物は生理食塩水でかん流された。心臓は分離され、左室は塩水で洗浄された。心臓は、ちょうど左右の心室まで切り取られ、図6.1に示すように、4個の断片として解剖された。断片は集められ、計量され、凍結液体窒素中でされ、次に、ラベルされたマイクロ遠心チューブ1チューブあたり1個の試料、それゆえ、1心臓あたり4個の試料の中に-80°Cで保存され、ドライアイス上で、SilverCreekPharmaceuticalsに輸送された。免疫組織化学およびELISAの対照実験のための心臓組織を得るため、いくつかの追加のマウスが、上記の処置なしで安楽死させられ、心臓が上記のように切除および洗い流され、そのいくつかにおいては、15μL中の2μgの融合タンパク質IGF1_mHSA_AnxVが直接左室壁に注入された。注入されたタンパク質のあるなしにかかわらず、心臓は免疫組織化学の調製において、上記のとおり固定された。融合タンパク質の免疫組織学検出免疫組織化学はMassHistologyServiceInc、WorcesterMA、GLP準拠の組織病理学実験室で実施された。処理のためのそれらの標準プロトコルおよび特異的タンパク質の検出のための固定組織の染色が使用された。簡潔に、亜鉛ホルマリンで固定された心臓は、心室まで解剖されて、標準系のアルコールおよびキシレンを通して、慣習的に処理された。各心臓がパラフィンに包埋され、、Leicaミクロトーム上で各々厚さ6ミクロンの断片が作成され、顕微鏡スライドに置かれた。各心臓において、8個の連続して横断する断片が作られ、スライドに置かれ、100μm開けてskip、他の8個の断片が作られ、100μm開けて、これが心臓の長さを通して繰り返された。各々の8セットからの2個のスライドが、1個は形態学を明らかにするためにHEで、他方はHSA-局在のために抗-HSAで、細胞の核を示すためにDAPI対比染色で、染色された。伝統的な過程がHE染色に使用された。具体的に、組織は、キシレンで脱パラフィン処理されて、アルコールできれいにされ、水で水和されて、Harrisヘマトキシリンで染色された。スライドは、洗浄され、1の水性エオシンで染色され、一連のアルコールで脱水され、一連のキシレンできれいにされて、カバースリップされた。心臓の様々なレベルの断片を代表するスライドがその後、光学顕微鏡で観察され、梗塞領域を含む断片を探した。心臓組織におけるHSA-局在において、HEで染色されたものに隣接した断片は、キシレンで洗浄され、アルコールできれいにされ、水で水和されて、1:200で希釈したヤギ抗ヒトアルブミン一次抗体と4Cで一晩培養され、PBSで洗浄された。そして、AlexaFluor594ロバ抗ヤギIgG、ヤギ抗-HSA抗体に対する蛍光標識された抗体、はその後、抗-HSA局在の検出のための二時抗体として1:400希釈で1時間37Cで使用された。スライドは、PBSで洗浄され、核視覚化のためのDAPI染色も含むProLongGoldantifade試薬を使用することでカバースリップされた。陽性対照において、IGF1_mHSA_AnxVが直接注入された心臓からのスライドは、同様に抗-HSAプロトコルを使用することで処理された。加えて、MassHistologyServicesは天然のHSAを含む人間の肝組織の試料を、第一の検出抗体のための陽性対照として染色した。陰性対照は、第一の抗HSA抗体を除外しながらHSA-局在のために処理された直接注入されたマウス心臓およびをHSA-局在のために通常に処理されたナイーブな心臓融合タンパク質露出がないを含んだ。融合タンパク質のELISA検出心臓あたり4個の試料図28が以下のELISAのために調製された。試料は、Eppendorfsafe-lockマイクロ遠心チューブに移され、氷上で解凍された。各チューブに、PierceHaltProteaseInhibitorCocktailバッファーに100倍希釈を、1:5比のmg組織試料:uLバッファーで含むRIPAバッファーが加えられた。少なくとも100μLのバッファーは各サンプルに使用された。ZROB05およびZROB10ビーズの1:2比のビーズ:バッファーの50/50混合物が加えられた。チューブは速度9に設定されたBulletBlender組織ホモジナイザーに置かれ、3分間均質化され、均質化が完全でなかった場合、繰り返された。試料は遠心分離され、そして、各試料で総タンパク量を決定するためのBCAビシンコニン酸タンパク質アッセイ実施するためにアリコートを取った。酵素免疫測定法ELISA測定は標準方法を使用して行われた。具体的に、1日目に、Reacti-Bindプレートは4°Cにて、50μL/ウェルの、1:50でダルベッコのPBSに希釈された抗-HSA被覆抗体で、一晩コーティングされた。2日目に、ウェルは4回、プレート洗浄機プログラム6を用いてPBS-TPBS、0.05Tween20で洗浄された。非特異的結合は2時間室温にて200μL/ウェルの無タンパク質遮断バッファーで遮断され、ウェルはプレート洗浄機を用いてPBS-TPBS、0.05Tween20で4回洗浄された。50L/ウェル96ウェルプレートの各々の標準曲線試料または試験試料のいずれかはウェルに加えられた。試験試料はRIPAバッファープロテアーゼ阻害剤で8.745mgmLの最終総タンパク質濃度に希釈された。プレートは密封され、4°Cで一晩培養された。3日目に、ウェルはプレート洗浄機を用いてPBS-Tで4回洗浄され、100uL/ウェルの、PBS-Tで1:25,000で希釈されたヤギ抗-HSA-HRP検出抗体がウェルごとに加えられ、室温で30分間220rpmの振盪台上で培養され、光から保護された。ウェルはプレート洗浄機を用いてPBS-Tで4回洗浄された。ウェルあたり100μLの1-ステップのUltraTMBELISA試薬が室温にて加えられ、プレートは室温にて光から保護されて25分間培養された。100uLKLPTMB停止試薬の添加により、反応は停止された。色は青から黄色に変化する。5分後に、吸光度の読み取りがプレートリーダー上でA450の波長で行われた。融合タンパク質露出のない組織からの吸光度のためのバックグラウンド値が、上記と同じ手順を用いて作成されたナイーブな心臓の試料から得られた。バックグラウンド値は、違いを得るためにすべての試験試料の吸収値から引かれた。濃度-吸収関係の標準曲線はさまざまな既知量の融合タンパク質でスパイクされた試料から生成された。そして、各試験試料におけるタンパク質濃度は標準の濃度-吸収曲線との比較で決定された。各々の心臓試験試料からの2アリコートは、測定の変動を評価するために測定、これらはELISAデータ図29に含まれる標準偏差を基礎とする。使用される融合タンパク質は、実施例5に記載される通りに作成された、IGF1_mHSA_AnxV標的化タンパク質、とIGF1_mHSA_AnxVm1234結合性のない変異体を含む。ビヒクル対照はエンドトキシンなしのPBSSigmaであった。動物は注文時点で12週目の、手術の7~10日前に順応させられた雄C57/B6マウスであった。免疫組織化学に使用される染料と抗体:一次抗体はアフィニティー精製されたヤギ抗ヒトアルブミンHSA交差吸収抗体BethylLabs080-229Aロット3であった;蛍光標識された二次抗体は、AlexaFluor594ロバ抗ヤギIgGHLInvitrogen、A11058であった;DAPIがあるProLongGoldantifade試薬Invitrogen、P36931。ELISAに用いられる試薬は、RIPALysisおよび抽出バッファーPierce、89901;PierceHaltProteaseInhibitorCocktail、EDTA-なしPierce、78425;PierceBCAアッセイキット、23227;Reacti-BindプレートPierce、15041;Dulbecco’sPBSThermo、28374;タンパク質なしの遮断バッファーPierce、37572;抗-HSA被覆抗体BethyllabsantibodyA80-229A;ヤギ抗-HSA-HRP検出抗体BethylLabs、A80-229P;1ステップUltraTMBELISA試薬ThermoPierce、34028;KLPTMB停止試薬KLP、50-85-05;タンパク質なしの遮断バッファーPierce、37572;組織均質化ビーズtissuehomogenizationbeadsNextAdvance、ZROB05およびZROB10を含んだ。動物手術に用いられる材料は、ブプレノルフィンBedfordLabs登録商標ロット:18655303、イソフルレン、ケタミン、キシラジン、亜鉛ホルマリン、および15KClを含んだ。標的化されたおよび非結合変異体の融合タンパク質のELISAによる検出は、図29に要約される。梗塞境界領域で測定されたタンパク質は、投与後3種類の時間12、24、および72時間にて、標的化群2および非結合変異体群3融合タンパク質の各々2匹のマウスにおいて心臓の非梗塞領域のタンパク質と比較された。各々の心臓で、試料AおよびB1遠隔部図6-1で定義されるようにで測定されたタンパク質が加えられ、心臓の非梗塞領域におけるタンパク質を示す。同様に、試料B1-梗塞部およびB2で測定されたタンパク質が加えられ、周囲の境界領域を加えた心臓の梗塞領域におけるタンパク質を示す。図29に示すように、IGF1_mHSA_AnxV、標的化融合タンパク質群2、黒い棒は、注入後の12および24時間後に同じ動物の心臓の遠隔領域群2、灰色の棒におけるレベルと比較して、梗塞領域において高く上昇した。72時間では梗塞および非梗塞領域の両方で検出されなかった。それに比べて、非結合性変異タンパク質IGF1_mHSA_AnxVm1234群3、黒い棒12時間でわずかに上昇し、24時間で減少し、72時間で検出されなかった。非結合性タンパク質と標的化を比較すると、12および24時間の両方で、標的化IGF1_mHSA_AnxV2群、黒い棒は非結合性のIGF1_mHSA_AnxVm1234群3、黒い棒よりも梗塞境界領域で上昇した。これらの結果は、損傷心筋細胞へアポトーシスを起こしたまたは壊死した心筋細胞に関するホスファチジルセリンに能動的に結合することにより標的化する、融合タンパク質IGF1_mHSA_AnxVが、高濃度および非結合性変異体よりも長い時間、実験的MIにより損傷した心臓の領域に入り、維持することができることを示す。さらに、データは標的化融合タンパク質の心臓の損傷領域への特異的局在を示し、AnxV標的化ドメインを通した標的化の有効性を示した。投与24時間後の非結合性変異体IGF1_mHSA_AnxVm1234と比べて、免疫組織化学によるHSA含有融合タンパク質の局在も、梗塞および境界領域でのIGF1_mHSA_AnxVの、より大きい蓄積を示した。図30は梗塞および周囲の組織の形態学、ならびに梗塞の周囲の、梗塞の端部および境界領域でのIGF1_mHSA_AnxVに特異的な陽性染色を示す。左上:形態を示すHE染色。梗塞領域は、黒い曲線によって区画された縁の中央であり、生存は左上および右下である。200×倍率右上:この領域の連続切片はHSA含有タンパク質のために同じ倍率で染色された。赤はHSA局在を示し;青は細胞核のDAPI染色を示す。同じ領域の、より高い倍率の画像は、左下400×および右下600×に示される。損傷組織の縁中間の厚さの矢印での心筋細胞細い矢印における陽性のシグナルがある。左上および右上の白い箱は2個の隣接した6umスライドのほぼ同じ箇所であり、左下および右下これらの箱の近くの領域の拡大図である。比較として、図31は、非結合性変異体IGF1_mHSA_AnxVm1234についての同じ情報を示し、それに特異的な最小の染色を示す。左上:形態を示すHE染色。梗塞領域は、黒い曲線によって区画された縁の上部中央である200×倍率。右上:この領域の隣接領域はHSA含有タンパク質のために同じ倍率で染色された。赤は抗HSA局在を示し;青は細胞核のDAPI染色を示す。同じ領域の、より高い倍率の画像は、左下400×および右下600×に示される。損傷組織の縁中間の厚さの矢印での心筋細胞細い矢印および赤血球厚い矢印においてバックグラウンドシグナルしかない。左上および右上の白い箱は2個の隣接した6umスライドのほぼ同じ箇所であり、左下および右下これらの箱の近くの領域の拡大図である。図32は抗HSA抗体のHSA含有融合タンパク質への特異性を確認するために使用される対照を例示する。左上:記載された通りにIGF1_mHSA_AnxVが直接注入されるマウス心臓の陽性対照。濃い赤は、注入されたHSA含有融合タンパク質の強い局在を示す。右上:マウス心臓の陰性対照。左上は、IGF1_mHSA_AnxVの注入を含むが、染色が一次抗HSA抗体なしで続けられた同様の調製。特異的染色は全く見られなかった。左下:マウス心臓の第二の陰性対照。タンパク質は全く心臓に注入されず左上と同様に処理された。わずかな赤いバックグラウンド染色を見ることができるのみである。右下:ヒト肝臓の陽性対照。ヒト肝臓はかなりの量のHSAを生産する。抗-HSA抗体での染色は試料のいたるところで特異的染色を示す。すべての画像において:青い染色は、細胞核を示すDAPI染色を示す。本明細書に記載された実施例および実施形態が例示の目的のみであり、これらを踏まえた変更の様々改変が本出願の精神および範囲内、および付属された請求項の範囲内であることが理解されるであろう。引用された、すべての公表、特許、および特許出願全体は、すべての目的のために出典明示により本明細書に組込まれる。"