"反芻動物の消化活動に由来するメタン生成を低減するためのおよび/または反芻動物の生産性を向上させるための動物飼養における活性化合物としての、式I式中、Yは、次の組成:CaHbOdNeSgの有機分子であり、ここで、aは、1~25に含まれ、bは、2~51に含まれ、dは、0~8に含まれ、eは、0~5に含まれ、gは、0~3に含まれるにより定義される少なくとも1個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも1種の有機分子またはその塩の使用であって、式II式中、uは、0~23に含まれ、ここで、u≠0のとき、炭素鎖は、モノ不飽和またはポリ不飽和であってもよいかつ任意の異性体形であってもよい、線状、環状、または分岐線状もしくは分岐環状の脂肪族炭素鎖であり、Zは、独立して、O、NH、またはN-R3であり、ここで、R1≠Hのとき、Z-R1は、エステル誘導体または第二級アミド誘導体を表し、R1は、独立して、水素、または1~10個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、R2は、独立して、水素、または1~23個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、かつR3は、独立して、水素、または1~10個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であるにより定義されるニトロオキシアルカン酸および/またはその誘導体が除外される、使用。aが、1~10に含まれ、bが、2~21に含まれ、dが、0~6に含まれ、eが、0~3に含まれ、gが、0~1に含まれる請求項1に記載の使用。式Iで示される少なくとも1種の有機分子が、式III式中、nは、0~12に含まれ、好ましくは0~6に含まれ、ここで、n≠0のとき、炭素鎖は、非置換であっても、3個までのヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、もしくはニトロオキシ基で置換されていてもよい、線状、環状、もしくは分岐状の脂肪族炭素鎖、またはモノ不飽和もしくはポリ不飽和のかつ任意の異性体形のアルケニル炭素鎖もしくはアルキニル炭素鎖であり、R4は、独立して、水素、または1~12個、好ましくは1~6個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、Xは、水素、R5、R5≡N、-OR5、-OCOR5、-NR5R6、-ONO2、-COOR5、-CONR5R6、-NHSO2R5、または-SO2NHR5であり、R5およびR6は、独立して、水素、または非置換の、もしくは3個までのヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、もしくはニトロオキシ基で置換された、C1~C12の直線状、分岐状、もしくは環状のアルキル鎖、モノ不飽和もしくはポリ不飽和であってもよいかつ任意の異性体形であってもよいアルケニル炭素鎖もしくはアルキニル炭素鎖であるで示される化合物である、請求項1に記載の使用。式Iで示される少なくとも1種の有機分子またはその塩が、3-ニトロオキシプロパノール、ラセミ体-4-フェニルブタン-1,2-ジイルジニトレート、2-ヒドロキシメチル-2-ニトロオキシメチル-1,3-プロパンジオール、N-エチル-3-ニトロオキシ-プロピオン酸スルホニルアミド、5-ニトロオキシ-ペンタンニトリル、5-ニトロオキシ-ペンタン、3-ニトロオキシ-プロピルプロピオネート、1,3-ビス-ニトロオキシプロパン、1,4-ビス-ニトロオキシブタン、1,5-ビス-ニトロオキシペンタン、3-ニトロオキシ-プロピルベンゾエート、3-ニトロオキシ-プロピルヘキサノエート、3-ニトロオキシ-プロピル5-ニトロオキシ-ヘキサノエート、ベンジルニトレート、イソソルビド-ジニトレート、ならびにN-[2-ニトロオキシエチル]-3-ピリジンカルボキサミド、2-ニトロ-5-ニトロオキシメチル-フラン、およびビス-2-ニトロオキシエチルエーテルから選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用。式Iで示される少なくとも1種の有機分子またはその塩が、3-ニトロオキシプロパノール、5-ニトロオキシ-ペンタンニトリル、5-ニトロオキシ-ペンタン、3-ニトロオキシ-プロピルプロピオネート、1,3-ビス-ニトロオキシプロパン、1,4-ビス-ニトロオキシブタン、1,5-ビス-ニトロオキシペンタン、3-ニトロオキシ-プロピルベンゾエート、3-ニトロオキシ-プロピルヘキサノエート、3-ニトロオキシ-プロピル5-ニトロオキシ-ヘキサノエート、イソソルビド-ジニトレート、ならびにN-[2-ニトロオキシエチル]-3-ピリジンカルボキサミド、およびビス-2-ニトロオキシエチルエーテルから選択される、請求項1~4のいずれか一項に記載の使用。式Iで示される少なくとも1種の有機分子が、3-ニトロオキシプロパノールと1,3-ビス-ニトロオキシプロパンとの混合物である、請求項1~5のいずれか一項に記載の使用。式Iで示される少なくとも1種の有機分子またはその塩が、ジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、少なくとも1種の追加の活性物質と組み合される、請求項1~6のいずれか一項に記載の使用。前記反芻哺乳動物が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、スイギュウ、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ウィルドビースト、アンテロープ、プロングホーン、およびニルガイからなる群から選択される、請求項1~7のいずれか一項に記載の使用。代謝チャンバー内で測定したときに乾物摂取量1キログラムあたりのリットル数で計算される反芻動物のメタン生成量が少なくとも10低減される、請求項1~8のいずれか一項に記載の使用。前記反芻動物に投与される式Iに定義される少なくとも1種の活性化合物の量が、飼料1kgあたり1mg~10gである、請求項1~9のいずれか一項に記載の使用。請求項1~6のいずれか一項に記載の式Iで示される少なくとも1種の有機分子を含む、飼料組成物または飼料添加物。ミネラルプレミックス、ビタミンプレミックス、もしくはビタミンとミネラルとを含むプレミックス、またはボーラスである、請求項11に記載の組成物。式I式中、Yは、次の組成:CaHbOdNeSgの有機分子であり、ここで、aは、1~25に含まれ、bは、2~51に含まれ、dは、0~8に含まれ、eは、0~5に含まれ、gは、0~3に含まれるにより定義される少なくとも1個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも1種の有機分子またはその塩を十分量で動物に経口投与することを含む、反芻動物の消化活動に由来するメタン生成を低減するためのおよび/または反芻動物の生産性を改善させるための方法であって、式II式中、uは、0~23に含まれ、ここで、u≠0のとき、炭素鎖は、モノ不飽和またはポリ不飽和であってもよいかつ任意の異性体形であってもよい、線状、環状、または分岐線状もしくは分岐環状の脂肪族炭素鎖であり、Zは、独立して、O、NH、またはN-R3であり、ここで、R1≠Hのとき、Z-R1は、エステル誘導体または第二級アミド誘導体を表し、R1は、独立して、水素、または1~10個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、R2は、独立して、水素、または1~23個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、かつR3は、独立して、水素、または1~10個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であるにより定義されるニトロオキシアルカン酸および/またはその誘導体が除外される、方法。前記少なくとも1種の有機分子が、ジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、少なくとも1種の追加の活性物質との組合せで、前記動物に投与される、請求項13に記載の方法。前記反芻哺乳動物が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、スイギュウ、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ウィルドビースト、アンテロープ、プロングホーン、およびニルガイからなる群から選択される、請求項13または14に記載の方法。前記反芻動物に投与される式Iに定義される少なくとも1種の活性化合物の量が、飼料1kgあたり1mg~10gである、請求項13~15のいずれか一項に記載の方法。代謝チャンバー内で測定したときに乾物摂取量1キログラムあたりのリットル数で計算される反芻動物のメタン生成量が少なくとも10低減される、請求項13~16のいずれか一項に記載の方法。[実施例][実施例1:メタン生成のinvitro試験]このin-vitro系により模倣したルーメン機能に及ぼす特定化合物の効果を試験するために、Hohenheim茎葉飼料値試験HFTの改変版を使用した。[原理:]ルーメン液組成物および適切な緩衝液混合物と共に、飼料をシリンジ中に入れる。溶液を39°Cでインキュベートする。8時間後、生成したメタンの量また組成を測定して、変換式に代入する。[試薬:]多量元素溶液:6.2gのリン酸二水素カリウムKH2PO40.6gの硫酸マグネシウム七水和物MgSO47H2O9mlの濃リン酸1mol/l蒸溜水に溶解して1lにするpH約1.6緩衝溶液:35.0gの炭酸水素ナトリウムNaHCO34.0gの炭酸水素アンモニウムNH4HCO3蒸溜水に溶解して1lにする微量元素溶液:13.2gの塩化カルシウム二水和物CaCl22H2O10.0gの塩化マンガンII四水和物MnCl24H2O1.0gの塩化コバルトII六水和物CoCl26H2O8.0gの塩化鉄IIIFeCl36H2O蒸溜水に溶解して100mlにするナトリウム塩溶液:100mgのナトリウム塩蒸溜水に溶解して100mlにする還元溶液:最初に3mlの水酸化ナトリウムc=1mol/l、次いで427.5mgの硫化ナトリウム水和物Na2SH2Oを71.25mlのH2Oに添加する媒体溶液に添加する直前に溶液を調製しなければならない[手順:][サンプル秤量:]飼料原料を1mmの篩にかけて-通常はTMR44の濃厚飼料、6の乾草、37のメイズサイレージ、および13のイネ科牧草サイレージ-64個のシリンジ中に正確に秤取する。これらのシリンジのうちの4個は、試験化合物の効果を含まないガス生成を呈する基質対照である。4個の他のシリンジは、ブロモエタンスルホネートが0.1mMになるように添加された陽性対照である。必要な場合、4個のシリンジは、担体対照を含有する試験化合物が担体を必要とする場合。残りのシリンジは、1グループあたり4個のシリンジで、試験物質を含有する。[媒体溶液の調製:]以下の順序でWoulff瓶中で成分を混合する。711mlの水0.18mlの微量元素溶液355.5mlの緩衝溶液355.5mlの多量元素溶液完成溶液を39°Cまで加温し、続いて、1.83mlのナトリウム塩溶液の添加および36°Cで還元溶液の添加を行う。指示薬が無色になった時、ルーメン液を添加する。[ルーメン液の採取:]連続撹拌下およびCO2ガス供給下で、750mlのルーメン液を約1,400mlの媒体溶液に添加する。シリンジへの充填、インキュベーション、ならびにガス体積およびVFA値の決定:希釈ルーメン流体24mlをガラスシリンジに添加する。次いで、緩速撹拌下39°Cでシリンジを8時間インキュベートする。8時間後、生成したガスの体積を測定し、気相中のメタンのパーセントをガスクロマトグラフィーにより決定する。[結果]発酵食物は、人工TMR44の濃厚飼料、6の乾草、37のメイズサイレージ、および13のイネ科牧草サイレージであった。実施例2~14で説明したように生成された化合物を2~0.005の乾物DM濃度になるように発酵シリンジに添加した。結果を以下の表に示す。[実施例2:比較例:メタン生成のinvitro試験]ニトロオキシ基を異なる有機基で置き換えた一連の分子を用いて、実施例1で説明したのと同一のinvitroアッセイを行った。さらに、無機塩NaNO3も試験した。表4に示される結果を参照されたい。一連の分子のうちニトロオキシ基が存在する場合にのみ、有意なメタン低減活性が観測されることが、このデータから実証される。[実施例3:3-ニトロオキシプロパノールの合成:]100mlのアセトニトリル中に溶解された50.1mmolの3-ブロモプロパノールおよび125.25mmolの硝酸銀を、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を70°Cで21時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、減圧下で濃縮した。残渣を水中に溶解して、TMBEで2回抽出した。有機相を水およびブラインで洗浄し、組み合わせ、Na2SO4で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、5.63gが残った。ヘプタン/エチルアセテート2:1を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量:4.82g38.8mmol、77.4。[実施例4:2-ヒドロキシメチル-2-ニトロオキシメチル-1,3-プロパンジオールの合成:]20mlのアセトニトリル中に溶解された5mmolの2-ブロモメチル-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオールおよび15mmolの硝酸銀を、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を70°Cで24時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、溶媒を減圧下で除去したところ、3.05gが残った。ジクロロメタン/メタノール50:1を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量:0.36g1.99mmol、40.2。[実施例5:rac-4-フェニルブタン-1,2-ジイルジニトレートの合成:]40mlのアセトニトリル中に溶解された7.5mmolの4-フェニル-1-ブテン、20.3mmolの硝酸銀、および7.5mmolのヨウ素lodeを、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を25°Cで30分間、次いで、79°Cで16時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、エチルアセテートで洗浄した。濾液を水で3回抽出してブラインで洗浄し、Na2SO4で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、1.92gが残った。ヘキサン/エチルアセテート10:1を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量:0.52g2.03mmol、27。[実施例6:N-エチル-3-ニトロオキシ-プロピオン酸スルホニルアミドの合成:]フラスコ内で、17mmolの3-クロロプロピオン酸スルホニルクロリドを5mlのテトラヒドロフラン中に溶解した。45分間にわたり33.3mmolのエチルアミンを添加した。その後、溶媒を減圧下で除去した。残渣を水中に溶解して、エチルアセテートで3回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Na2SO4で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去した。残渣を50mlのアセトニトリル中に溶解し、そして60mmolの硝酸銀を、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を70°Cで41時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタン中に溶解して、水で抽出した。再度、水相をジクロロメタンで2回洗浄した。合わせた有機相を水およびブラインで洗浄し、Na2SO4で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去した。収量:3.05g14.5mmol;84.5。[実施例7:3-ニトロオキシ-プロピルプロピオネートの合成:]9.1mmolのプロピオニルクロリドを10mlのTMBE中に溶解して、3°Cに冷却した。5mlのTMBE中の8.25mmolの3-ニトロオキシプロパノールおよび9.1mmolのトリエチルアミンを、3~6°Cで5分間かけて滴下した。冷却せずに2時間30分撹拌した後、反応混合物を1NHCl、水で2回抽出し、ブラインで洗浄し、Na2SO4で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、1.35gが残った。ヘキサン/エチルアセテート4:1を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量:1.14g6.4mmol、78.0。[実施例8:3-ニトロオキシ-プロピルベンゾエートの合成:]10mlのTMBE中に溶解された16.5mmolの3-ニトロオキシプロパノールおよび18.2mmolのトリエチルアミンを3°Cに冷却した。5mlのTMBE中の18.2mmolのベンゾイルクロリドを、3~6°Cで7分間にわたり滴下した。冷却せずに24時間30分撹拌した後、反応混合物を飽和NaHCO3、水、1NHCl、水で2回抽出し、ブラインで洗浄し、Na2SO4で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、3.3gが残った。ヘキサン/エチルアセテート1:0~2:1のグラジエントを用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量:0.66g2.9mmol、17.7。[実施例9:3-ニトロオキシ-プロピルヘキサノエートの合成:]10mlのジエチルエーテル中に溶解された20mmolの3-ニトロオキシプロパノールおよび20mmolのトリエチルアミンを0°Cに冷却した。18.2mmolのヘキソイルクロリドを、0~5°Cで5分間にわたり滴下した。冷却せずに19時間撹拌した後、反応混合物を1NHCl、水で2回抽出し、ブラインで洗浄し、Na2SO4で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、3.1gが残った。ヘプタン/エチルアセテート4:1を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量:2.4g10.9mmol、60.0。[実施例10:3-ニトロオキシ-プロピル5-ニトロオキシ-ヘキサノエートの合成:]10mlのジエチルエーテル中に溶解された20mmolの3-ニトロオキシプロパノールおよび20mmolのトリエチルアミンを0°Cに冷却した。18.2mmolの5-ニトロオキシペントイルクロリドを、0~5°Cで5分間かけて滴下した。冷却せずに一晩撹拌した後、反応混合物を1NHCl、水で2回抽出し、ブラインで洗浄し、Na2SO4で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去した。ヘプタン/エチルアセテート4:1を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量:2.4g9.1mmol、50.0。[実施例11:ベンジルニトレートの合成:]80mlのアセトニトリル中に溶解された10mmolのベンジルブロミドおよび25mmolの硝酸銀を、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を70°Cで5時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタン中に溶解して、水で抽出した。再度、水相をジクロロメタンで2回洗浄した。合わせた有機相を水およびブラインで洗浄し、Na2SO4で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去した。収量:1.55g10.1mmol;100。[実施例12:1,3-ビス-ニトロオキシ-プロパンの合成:]20.0mLの無水アセトニトリル中の1,3-ジブロモプロパン2.00g、1.0eqの溶液に、硝酸銀3.70g、2.2eqを添加した。暗所において反応混合物を70°Cで2時間加熱した。得られた混合物をセライトに通して濾別し、そして濾液を濃縮した。残渣を水50.0mL中に溶解し、ジクロロメタン2×50.0mLで抽出し、硫酸マグネシウムで脱水し、そして溶媒を減圧下で蒸発させたところ、無色液体として1.44gの化合物が得られた収率=87。[実施例13:1,4-ビス-ニトロオキシ-ブタンの合成:]20.0mLの無水アセトニトリル中の1,4-ジブロモブタン2.00g、1.0eqの溶液に、硝酸銀3.50g、2.2eqを添加した。暗所において反応混合物を70°Cで2時間加熱した。得られた混合物をセライトに通して濾別し、そして濾液を濃縮した。残渣を水50.0mL中に溶解し、ジクロロメタン2×50.0mLで抽出し、そして硫酸マグネシウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、無色液体として1.49gの化合物が得られた収率=89。[実施例14:1,5-ビス-ニトロオキシ-ペンタンの合成]20.0mLの無水アセトニトリル中の1,5-ジブロモペンタン2.00g、1.0eqの溶液に、硝酸銀3.30g、2.2eqを添加した。暗所において反応混合物を70°Cで2時間加熱した。得られた混合物をセライトに通して濾別し、そして濾液を濃縮した。残渣を水50.0mL中に溶解し、ジクロロメタン2×50.0mLで抽出し、そして硫酸マグネシウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、無色液体として1.38gの化合物が得られた収率=82。[実施例15:5-ニトロオキシ-ペンタンニトリルの合成:]40.0mLの無水アセトニトリル中の5-ブロモバレロニトリル4.00g、1.0eqの溶液に、硝酸銀4.60g、1.1eqを添加した。暗所において反応混合物を70°Cで2時間加熱した。得られた混合物をセライトに通して濾別し、そして濾液を濃縮した。残渣を水50.0mL中に溶解し、ジクロロメタン2×50.0mLで抽出し、そして硫酸マグネシウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、無色液体として3.56gの化合物が得られた収率=99。[実施例16:ビス-2-ニトロオキシエチルエーテルの合成]30mlのアセトニトリル中に溶解された16.05mmolのビス2-ブロモエチルエーテルおよび40.13mmolの硝酸銀を、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を70°Cで16時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、減圧下で濃縮した。残渣を水中に溶解して、TMBEで2回抽出した。有機相を水およびブラインで洗浄し、組み合わせ、Na2SO4で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、3.06gが残った。ヘプタン/エチルアセテート1:1を用いてシリカゲルで粗生成物を濾過した。収量:2.94g15.0mmol、93.4。[実施例17:エチル-3-ニトロオキシプロピオネートと比較した3-ニトロオキシプロパノールのinvivo効果:][材料および方法]10頭のヒツジのルーメンにカニューレを挿入した。外科手術の1ヶ月後に試験を開始した。3種の処理、すなわち、対照、添加物1、および添加物2いずれも単回用量を施した。添加物1は、エチル-3-ニトロオキシプロピオネートであり、添加物2は、本発明に係る3-ニトロオキシプロパノールである。実験計画は、各期間および3つの連続期間で1種の処理あたり3頭のヒツジを用いる3×3ラテン方格で構成した。各期間は、処理への適応の28日間と、チャンバー内でのメタン測定およびルーメンサンプル採取の連続2日間と、を含んでいた。適応期全体を通じて、14日目に中期のメタン測定を行った。それに加えて、22日目および23日目の時に、ナイロンバッグ中に入れられたアルファルファ乾草およびエンバクのサンプルをヒツジのルーメン内でインキュベートして、乾物ルーメン分解を決定した。チャンバー内でのメタン測定の2日間29日目および30日目では、朝の給餌の2時間後、ルーメン内容物サンプルを採取し、サブサンプル化し、ただちに凍結し、その後、DNAの抽出さらには揮発性脂肪酸およびアンモニア態窒素の濃度の決定を行った。実験動物をそれぞれ3頭の動物からなる3つのサブグループにランダムに割り付けて、3種の処理対照、添加物1、および添加物2の1つに無作為に帰属した。3つのサブグループは、チャンバー内でのメタン測定前の適応日数が同一になるように、2日間の間隔をあけて食餌への適応を開始した。新鮮な水が常に得られる檻の中に動物を個別に維持した。60:40の比の15~20cmに裁断されたアルファルファ乾草およびエンバクと、ミネラル-ビタミン栄養補助剤と、で構成される食餌を、9:00および14:00の2回の等しい給餌時刻でエネルギー維持レベルの約1.1倍で動物に提供した。新たな物質摂取量を試験全体にわたり動物ごとに毎日モニターした。飼料と同一の時刻にルーメンカニューレを介して添加物を1日2回提供した。ルーメンに入れる直前に、各添加物の対応量いずれの添加物についても、1頭の動物あたり1日につき100mgを10グラムの粉砕エンバク中にピペット添加し、セルロース紙で包んだ。活性分子が揮発性であるので、以上に挙げた手順は、4°Cの低温室で行った。[メタン測定およびサンプル採取]4つのメタンチャンバーのセットを使用した。14、29、および30日目、動物をメタン測定用チャンバー内に入れた。各測定チャンバーは、幅1.8m×深さ1.8m×高さ1.5mの大きさであった。チャンバーの気温を15~20°Cに維持した。各チャンバー内で、動物を適応時と同一の檻の中に個別に拘束した。毎日09:00に割込みを行って、チャンバーの床を清掃し、動物に給餌した。流量を1日3回計算してから平均して23時間排出値を導出したので、これらの割込みは、毎日のメタン排出にほとんど影響しなかった。空気流量およびメタン濃度を各チャンバーの流入ダクトおよび流出ダクトで測定した。各チャンバーの排気ダクトで空気速度を終日にわたり連続的にモニターした。4つのダクトチャンバー1、2、および3、ならびにバックグラウンドのそれぞれの空気流をサブサンプル化して、ガスアナライザーADMMGA3000Spurlingworks,Herts,UKを用いてメタン濃度を連続的に測定した。チャンバーのすべての流入ダクトおよび排気ダクトで逐次的に空気流をサンプリングするのに、11分間を要したチャンバー1、2、3で3分間、バックグラウンドで2分間。要約すると、各測定日に、新鮮な空気の流入とチャンバー排気とのメタン濃度差および平均空気速度から、各チャンバーのメタン流量を計算した。[ルーメンサンプル分析]ルーメン内容物のサンプルを凍結乾燥し、ビーズビーターMini-beadBeater;BioSpecProducts,Bartlesville,OK,USAを用いて物理的破壊により十分混合し、その後、溶解インキュベーションでより高い温度95°Cを用いるように変更を加えて、製造業者の説明書に従って、QIAamp登録商標DNAStoolMiniKitQiagenLtd,WestSussex,UKを用いて、約50mgのサンプルでDNA抽出を行った。DNAサンプルを定量リアルタイムPCRqPCR増幅用の鋳型として使用した。全細菌、全原生動物、および全メタン生成古細菌の存在量を、リアルタイムPCRqPCRにより定量した。16SrRNA遺伝子標的の全細菌Maedaetal.,2003および18SrRNA遺伝子標的の全原生動物Sylvesteretal2005を増幅するために、異なるプライマーセットを使用した。メタン生成古細菌の検出用に設計されたプライマーは、メチル補酵素MレダクターゼmcrA遺伝子Denmanetal.,2007を標的とした。増幅混合物は、23μlの最終体積中に、11.5μlの2×RT-PCRスーパーミックスBio-RadBio-RadLaboratoriesInc.,Hercules,CA,USA、0.4μlの各プライマー、および0.5μlのサンプルを含有していた。蛍光発光測定のために、次のプログラム、すなわち、95°Cで5分間のサイクル、95°Cで15秒間、60°Cで30秒間、72°Cで55秒間、および75°Cで6秒間の40回のサイクルを用いて、各ペアのプライマーに対して増幅効率を評価した。55°Cから95°Cに温度を上昇させることにより融解曲線を作成し、5°Cごとに読み値を取得した。次のプログラム、すなわち、95°Cで5分間のサイクル、95°Cで15秒間、60°Cで15秒間、および72°Cで45秒間の40回のサイクル蛍光発光測定を含む、ならびに45°Cの設定温度および95°Cの最終温度の融解曲線を用いて、各標的グループの増幅を行った。プラスミドpCR登録商標4-TOPOInvitrogen商標,Carlsbad,CA,USAを標準として用いて、DNAのコピー数として表される、細菌、原生動物、およびメタン生成古細菌の絶対量を決定した。それぞれのプライマーセットを用いて得られたPCR産物を精製し、次いで、pCR登録商標4-TOPO登録商標プラスミドInvitrogen商標,Carlsbad,CA,USA中にクローニングして、組換えプラスミドを生成した。PCRを用いて予想インサートが検証された単一コロニーを、抗生物質およびX-galと共に、固体培地で一晩増殖させた。その後、形質転換E.コリE.coliコロニーのスクリーニングを行って、陽性コロニーのいくつかをランダムに選択した。PCRによりコロニー中の挿入断片の存在を検査した後、液体培地で陽性コロニーの大量培養を一晩行った。PureLink商標MiniprepキットInvitrogen商標,Carlsbad,CA,USAを用いて、これらの培養物に属するプラスミドを抽出し、次いで、配列決定して挿入断片の存在を検証した。プラスミドDNA濃度およびインサートを有するベクターの分子質量を用いて、プラスミド抽出物中に存在する16SrRNA遺伝子のコピー数を計算した。108~102個のコピー数範囲を提供するように濃縮プラスミドを逐次希釈10倍して、標準曲線を作成した。16sRNAを参照遺伝子として用いて、DenmanandMcSweeny2006に記載のように、メタン生成古細菌および原生動物の相対存在量の定量化に利用した。ガスクロマトグラフィーにより揮発性脂肪酸を分析し、我々の研究室Martin-Garciaetal.,2004で確立したプロトコルに従って比色法によりアンモニア態N濃度を分析した。[ルーメン分解性]50μmの細孔サイズを有する5cm×10cmナイロンバッグR510Ankominsituバッグ、MacedonNY中に3グラムの2mm粉砕飼料を入れた。動物の食餌に使用される2種の成分、すなわち、エンバクおよびアルファルファ乾草を試験した。エンバクの入ったバッグは、ルーメン内で24時間インキュベートしたが、アルファルファ乾草の入ったバッグは、48時間インキュベートした。異なる飼料原料のルーメン内の平均滞留時間に基づいて、インキュベーション時間を選択した。22日目および23日目、1種の飼料および1頭の動物および1つの期間あたり2個のバッグであった。朝の給餌の直前にバッグをルーメン内に入れた。24または48時間でそれらをルーメンから取り出し、冷水で洗浄し、そして-20°Cで凍結させた。すべての期間の終了時、溶解性を考慮してルーメン内でインキュベートしなかった1種の飼料あたり2個のバッグを含めて、短時間冷水プログラムを用いて、凍結バッグを洗浄機で洗浄した。洗浄後、バッグを60°Cのオーブン中に48時間入れた。インキュベーション時間にわたる乾物の損失としてルーメン分解性を計算した。[実験動物のケア]ヒツジに対する管理および実験手順はすべて、実験動物保護のためにスペインガイドライン2005年10月10日のActNo.1201/2005に厳格に従って熟練者により行った。動物保護条件を考慮して、チャンバー内の温度、湿度、および排気を注意深くモニターした。また、良好な空気の質および更新速度を保証する限界内に維持すべく、CO2濃度を連続的にモニターした。チャンバー内に割り付けられた間、動物は、なんらストレス挙動を示さなかった。[統計解析]添加物を含む効果を調べるために、個別のメタン排出、VFAプロファイル、酢酸対プロピオン酸の比、アンモニア態N濃度、全細菌、全原生動物、および全メタン生成古細菌の濃度のlog10変換、ならびに相対存在量を解析した。各解析に対して平均値の標準誤差SEMを計算した。最小有意差LSD試験を用いて、平均値をさらに比較した。[結果]乾物摂取量は、処理により影響を受けずP>0.05、14日目および30日目に動物をメタンチャンバー内に導入した時、摂取量のごくわずかな減少が観測された。摂取量に関して説明したように、体重チャンバー測定の前後に記録した体重の平均値としては、処理間で差異がなかったP>0.05表5。両者の添加物が食餌中に組み込まれた時、新たな物質摂取量1kgあたりのリットル数として表されるメタン排出は、14日目に有意に低減したP=0.020。対照に対して観測された低減は、添加物1および2では、それぞれ、14および23であった。2週間後、29日目、および30日目にメタン排出を記録した時、依然として数値の低減が見られたが、統計的有意差に達しなかった29日目および30日目で、それぞれ、P=0.061および0.183。最後の連続2日間に記録した測定値を一緒にプールした場合、添加の効果は、値を独立して考慮したときと類似の傾向を示すP=0.092。29日目および30日目に採取したルーメンサンプルのルーメン発酵パラメーターの研究は、対照と比較して両者の添加物を摂取した動物のルーメン内でより多くのプロピオン酸プロファイルの方向に発酵経路のシフトを示した表5。したがって、両者の処理で、酢酸対プロピオン酸の比は、有意に低減したP=0.002。アンモニア態N濃度は、処理間で類似しており、動物に供給された食餌に対して予想される範囲内にあった。第22日目および第23日目のinsacco分解研究は、アルファルファ乾草およびエンバクの両者のルーメン分解性に及ぼす添加処理の効果を示さなかった。ルーメン内の分析された微生物群の全濃度および相対濃度は、処理間で差異を示さなかったP>0.05。原生動物およびメタン生成古細菌の両者の存在量を全細菌に対して表した時、同一の影響の欠如が観測された。[結論]両者の添加物の使用は、メタン生成の有意な低減をもたらし、そのうえさらに、VFAプロファイルによれば、H2移動が関与する代謝経路のシフトは、添加物により促進された。この試験の目的は、1ヶ月間の動物の処理が、2週間の処理にわたり観測された結果の持続性を示すかを確認することであった。このことは、飼料添加物の実用の好適性を評価する場合、不可欠である。この研究では、両者の添加物は、発酵パターンのシフトによりさらに確認されるメタン排出における効果を1ヶ月間の処理にわたり示した。一方、発酵パターンの変化は、メタン生成の低減に起因するだけでなく、より低い繊維分解性にも起因する可能性があり、その結果、より少ない酢酸が生成されることにより、酢酸対プロピオン酸の比が低減されるであろう。このことが起こるのを排除するために、エンバクおよびアルファルファ乾草の入ったナイロンバッグを動物のルーメン内でインキュベートすることにより、ルーメン分解性評価は行った。その結果は、乾物分解に及ぼすそのような効果を示さなかった。このことは、無処理の動物と比較して、添加物を摂取した動物で記録された同一の細菌または原生動物のバイオマスによっても支持される。[実施例18:乳牛における3-ニトロオキシプロパノールのinvivo効果][材料および方法]動物:2産以上の産次かつ550~800kgの体重の6頭のルーメン瘻孔形成泌乳HolsteinXFriesian乳牛を研究に使用した。ウシは、研究の開始時、泌乳中期であった。実験食餌:研究全体を通じて、単一の完全混合飼料TMR食餌をすべてウシに提供した。試験期間中、ウシに不断給餌を行った5拒否。実験計画:泌乳中期30リットル以上の乳量を有するから開始して、3×3ラテン方格法で6頭のウシを3種の追加処理の1つに無作為に帰属した表8。処理期間は、5週間の継続期間であった。3-ニトロオキシプロパノールまたはプラセボの投与:朝夕の給餌時間にルーメンカニューレを介して所定用量の3-ニトロオキシプロパノールまたはプラセボを動物に投与した。期間計画:任意の時点で一度に2頭のウシしか、間接熱量計に収容することできないので、1週間ごとにウシを移動させてペアで入れ替えた。4週目の終了時、4頭の動物を間接熱量計に移動させて、個別のタイストール内に維持し、そこで、呼吸交換メタンおよび二酸化炭素の生成および酸素の消費の完全24時間測定値を得たCammelletal.,2000。[結果]飼料摂取量:毎日の乾物摂取量DMIに及ぼす生成物3-ニトロオキシプロパノールの有意な影響はなかった表9参照。メタン生成:メタン生成リットル/日およびメタン収率リットル/kgDMIは、3-ニトロオキシプロパノールにより有意に低減された。メタン生成は、500および2500mg/日の用量で投与した場合、それぞれ、対照値の93および90であった表9参照。メタン収率に関しては、対応する値は、低用量および高用量で、それぞれ、対照メタン収率の96および93であった。動物間で大きい変化が観測され、いくつかの動物は、他のいくつかの動物よりも大きい応答を示した。この結果は、乳牛のメタン生成低減における本発明に係る化合物の能力を示しており、給餌レジメンのさらなる改善に光明を投じる。"