"明細書中に記載の発明。本発明の目的は、VEGFの発現を調節するのに有用な化合物、組成物および方法を提供することである。本発明は、VEGFの発現を調節するのに有用な化合物、組成物および方法を提供する。本発明は、低分子干渉RNAsiRNA、2本鎖RNAdsRNA、マイクロRNAmiRNAおよび低分子ヘアピンRNAshRNA分子などの小さな核酸分子まとめて一般用語iRNA物質に該当するを用いたRNA干渉RNAiによりVEGF活性の発現を調節するのに有用な、化合物、組成物および方法を提供する。iRNA物質は、修飾されていない核酸分子であってもよいし、化学的に修飾された核酸分子であってもよい。iRNA物質は化学的に合成されてもよいし、ベクターから発現されてもよいし、あるいは酵素によって合成されてもよい。本発明は、RNAiによって細胞中および哺乳動物中のVEGF遺伝子の発現または活性を調節することが可能な、化学的に修飾されたさまざまな合成iRNA物質を提供する。化学的に修飾されたiRNA物質を使用することにより、分解に対する耐性の増大、標的部分に対する特異性の向上、細胞への取り込みの増大などによってiRNA物質の1つまたは複数の性質を改善し得る。1態様では本発明は、VEGF遺伝子の発現を下方制御するiRNA物質を提供する。VEGF遺伝子とは、VEGFをコードする配列および/またはVEGFのオープンリーディングフレームORFの5’または3’に存在し得るものなどのVEGF制御配列を含み得る。1実施形態では、本発明は、センス配列およびアンチセンス配列を含む単離iRNA物質であって、そのセンス配列およびアンチセンス配列がRNA二重鎖を形成し得ることを特徴とする単離iRNA物質を提供する。センス配列は、VEGF配列の約19~23ヌクレオチドの標的配列と同一または実質的に同一なヌクレオチド配列を含み得る。1実施形態では、標的とされるVEGF配列は、配列番号2~401のいずれか1つの配列を含む表1参照。1実施形態では、iRNA物質のセンス配列は、VEGF標的配列のいずれかと同一または実質的に同一である配列、例えば表1に提示するセンス配列、配列番号2~401のいずれかと実質的に同一である配列を含む。他の実施形態では、iRNA物質のアンチセンス配列は、標的配列のいずれかと相補的あるいは実質的に相補的な配列、例えば配列番号2~401のいずれかと相補的な配列を含み得る。実質的に同一とは、ヌクレオチド配列間のミスマッチが50、40、30、20、10、5、または1未満であることを意味する。標的配列とセンス配列の間の違いがわずか1、2、3、4、または5ヌクレオチドであることが好ましい。さらに、互いに相補的な配列例えば、センス配列とアンチセンス配列は完全に相補的であってもよいし、あるいは完全な相補性を欠くヌクレオチドを1、2、3、4、または5個以下だけ有していてもよい。1実施形態では、iRNA物質のセンス配列とアンチセンス配列との対は、表2に提示するiRNA物質のいずれか1つを含むか、またはセンス鎖において表2に列挙した配列との違いが1、2、3、4、または5ヌクレオチド以下である配列か、アンチセンス鎖において違いが1、2、3、4、または5ヌクレオチド以下である配列か、あるいは両方の鎖において違いが1、2、3、4、または5ヌクレオチド以下である配列を含む。1つの好ましい実施形態では、iRNA物質のセンス配列は、配列番号456、配列番号550、配列番号608、および配列番号634からなる群から選択される配列、あるいは前記に列挙した配列との違いが1、2、3、4、または5ヌクレオチド以下である配列を含む。他の実施形態では、iRNA物質のアンチセンス配列は、VEGF標的配列のいずれかと完全に相補的あるいは実質的に相補的な配列、例えば配列番号2~401のいずれかと相補的あるいは実質的に相補的な配列を含む。他の実施形態では、iRNA物質のアンチセンス配列は、表2に提示された任意のアンチセンス配列からなる群から選択される配列、あるいは表2に列挙した配列との違いが1、2、3、4、または5ヌクレオチド以下である配列を含む。好ましい実施形態では、このアンチセンス配列はセンス配列と完全に相補的であるか、あるいはセンス配列とのヌクレオチドのミスマッチをわずか1、2、3、4、または5個だけ有している。好ましい実施形態では、iRNA物質のアンチセンス配列は、配列番号457、配列番号551、配列番号609、および配列番号635からなる群から選択される配列、あるいは前記に列挙した配列との違いが1、2、3、4、または5ヌクレオチド以下である配列を含む。他の実施形態では、iRNA物質は化学的に修飾されている。例えば、iRNA物質は非ヌクレオチド部分を含み得る。化学修飾または他の非ヌクレオチド部分は、センス配列およびアンチセンス配列を核酸分解に対して安定化することが可能である。さらに、結合体を使用して取り込みを増大させ、特定の種類の細胞へのiRNA物質の取り込みを狙うことも可能である。好ましい修飾には、実施例、表6~19に具体的に提示する修飾がある。他の実施形態では、iRNA物質は、1ヌクレオチド~約6ヌクレオチドの範囲の3’突出部分を含む。本明細書で使用する3’突出部分は、iRNA配列の3’端から伸びる少なくとも1つの対合しないヌクレオチドを指す。3’突出部分はリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいは修飾リボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドを含み得る。3’突出部分は好ましくは1ヌクレオチド長~約5ヌクレオチド長、より好ましくは1ヌクレオチド長~約4ヌクレオチド長、および最も好ましくは約2ヌクレオチド長~約4ヌクレオチド長である。3’突出部分はiRNA物質のセンス配列上またはアンチセンス配列上にあってもよいし、あるいは両方の配列上に存在していてもよい。1つの好ましい実施形態では、本発明のiRNA物質は、標的VEGF配列に相補的な23ヌクレオチドのアンチセンス配列、および少なくとも21ヌクレオチドのセンス配列を含む。それぞれの配列は互いに相補的な少なくとも21個のヌクレオチドを含むことが可能であり、少なくともアンチセンス配列は2ヌクレオチドの3’突出部分を有し得る。1実施形態では、iRNA物質のセンス配列とアンチセンス配列の両方が3’突出部分を含み、該3’突出部分の長さはそれぞれの配列に関して同じであっても異なっていてもよい。1実施形態では、それぞれの配列上の3’突出部分は1~約6例えば、1~約3ヌクレオチド長の範囲である。好ましい実施形態では、3’突出部分はiRNA物質の両方の配列上に存在し、2ヌクレオチド長である。他の好ましい実施形態では、3’突出部分はiRNA物質の両方の配列上に存在し、3’突出部分は2つのチミジル酸残基TTを含む。1実施形態では、iRNA物質は、VEGFタンパク質をコードするRNA配列との相補性を有する約19~25例えば約19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドを有するアンチセンス配列を含む。該iRNA物質は、約19~25例えば約19、20、21、22、23、24、または25個のヌクレオチドを有するセンス配列をさらに含むことが可能であり、アンチセンス配列とセンス配列は、少なくとも約19、20、または21個の相補的ヌクレオチドを含む、異なるヌクレオチド配列を有し得る。1実施形態では、本発明のiRNA物質は、VEGFをコードするRNA配列との相補性を有する約19~約25例えば、約19~約23ヌクレオチドを有するアンチセンス領域、および約19~25例えば、約19~約23ヌクレオチドを有するセンス領域を含む。センス領域およびアンチセンス領域は、少なくとも約19個の相補的ヌクレオチドを有する直線状の分子中に含まれ得る。センス鎖配列は、VEGFのヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含み得る。1実施形態では、iRNA物質は、VEGF標的配列に相補的な約21ヌクレオチドのアンチセンス配列、および該アンチセンス配列に相補的な約21ヌクレオチドのセンス配列を含む。iRNA物質は非ヌクレオチド部分を含み得る。1実施形態では、iRNA物質のセンス配列またはアンチセンス配列は、2’-O-メチル2’-OMeピリミジンヌクレオチド、2’-デオキシヌクレオチド例えばデオキシシトジン、2’-デオキシ-2’-フルオロ2’-Fピリミジンヌクレオチド、2’-O-メトキシエチル2’-O-MOE、2’-O-アミノプロピル2’-O-AP、2’-O-N-メチルアセタミド2’-O-NMA、2’-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル2’-O-DMAEOE、2’-O-ジメチルアミノエチル2’-O-DMAOE、2’-O-ジメチルアミノプロピル2’-O-AP、2’-ヒドロキシヌクレオチド、または2’-アラ-フルオロヌクレオチド、またはロック型核酸LNA;lockednucleicacid、拡張型核酸ENA;extendednucleicacid、ヘキソース核酸HNA、シクロヘキセン核酸CeNA、リボジフルオロトルイル、5-アリルアミノピリミジン、または5-Me-2’-修飾ピリミジンを含み得る。2’修飾は2’-OMe修飾であることが好ましく、2’-フルオロ修飾であることがより好ましい。好ましい実施形態では、1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドがiRNA物質のセンス鎖上に存在する。1実施形態では、iRNA物質は、核酸塩基の修飾、例えば3’脱塩基性のカチオン修飾などのカチオン修飾などを含む。カチオン修飾は、例えば、iRNA物質の1つまたは複数の末端ヌクレオチド上の、アルキルアミノ-dT例えばC6アミノ-dT、アリルアミノ結合体、ピロリジン結合体、フタルアミド、ヒドロキシプロリノール結合体またはアミノオキシ結合体であってよい。アルキルアミノ-dT結合体は、iRNA物質のセンス鎖またはアンチセンス鎖の3’端に結合していることが好ましい。ピロリジンリンカーは、センス鎖の3’または5’端、あるいはアンチセンス鎖の3’端に結合していることが好ましい。アリルアミンウリジンは、アンチセンス鎖の5’端にはなく、センス鎖の3’または5’端に存在することが好ましい。アミノオキシ結合体は、ヒドロキシルプロリノールと結合してセンス鎖またはアンチセンス鎖の3’または5’端に存在することができる。他の実施形態では、VEGFを標的とするiRNA物質は、例えば細胞内への進入を容易にするため、あるいはエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる切断を阻害するために、結合体を含む。結合体は、例えば親油性物質、テルペン、タンパク質結合物質、ビタミン、炭水化物、レチノイドまたはペプチドであってよい。例えば結合体は、ナプロキセン、ニトロインドールまたはスタッキング相互作用に貢献する他の結合体、葉酸、イブプロフェン、レチノールまたはC5ピリミジンリンカーであってよい。他の実施形態では、結合体はグリセリド脂質結合体例えばジアルキルグリセリド誘導体、ビタミンE結合体、またはチオコレステロールである。結合体はアンチセンス鎖の3’端、あるいはセンス鎖の5’または3’端に存在することが好ましく、結合体はアンチセンス鎖の3’端およびセンス鎖の3’端には存在しないことが好ましい。1実施形態では、結合体はナプロキセンであり、結合体はセンス鎖またはアンチセンス鎖の5’または3’端に存在することが好ましい。1実施形態では、結合体はコレステロールまたはチオコレステロールであり、結合体はセンス鎖の5’または3’端に存在することが好ましく、アンチセンス鎖には存在しないことが好ましい。幾つかの実施形態では、コレステロールは、ピロリジンリンカー、またはセリノールリンカー、またはヒドロキシプロリノールリンカーによってiRNA物質と結合している。他の実施形態では、結合体はコラン酸であり、コラン酸はセンス鎖の5’または3’端、あるいはアンチセンス鎖の3’端と結合している。1実施形態では、コラン酸はセンス鎖の3’端およびアンチセンス鎖の3’端と結合している。他の実施形態では、結合体はレチノール酸であり、レチノール酸はセンス鎖の5’または3’端、あるいはアンチセンス鎖の3’端と結合している。1実施形態では、レチノール酸はセンス鎖の3’端およびアンチセンス鎖の3’端と結合している。1態様では、本発明のiRNA物質は、VEGF遺伝子によってコードされるRNAの発現を調節するRNAi活性を有する。VEGF遺伝子は互いにある程度の配列同一性を共有する可能性があり、したがってiRNA物質は、異なるVEGF標的間で共有されている配列、または特定のVEGF標的に特有な配列を標的とすることによって、1群のVEGF遺伝子、あるいは別例として特定のVEGF遺伝子を標的とすることが可能である。したがって、1実施形態では、iRNA物質は、VEGFヌクレオチド配列例えばRNA配列の保存領域を標的とすることが可能である。保存領域は、幾つかの異なるVEGF関連配列例えば、異なるVEGFアイソフォーム、スプライシング変異体、突然変異遺伝子などと配列同一性を有し得る。したがって、1つのiRNA物質が幾つかの異なるVEGF関連配列を標的とすることが可能である。1実施形態では、iRNA物質は化学的に修飾される。他の実施形態では、iRNA物質は二重鎖分子を含み、その二重鎖分子の1つまたは複数の配列が化学的に修飾されている。このような化学修飾の非限定的な例には、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、2’-デオキシリボヌクレオチド、2’-O-メチルリボヌクレオチド、2’-デオキシ-2’-フルオロリボヌクレオチド、共通塩基ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、5’-C-メチルヌクレオチド、および末端へのグリセリルおよび/または逆方向デオキシ無塩基残基の取り込みがある。これらの化学修飾は、iRNA物質において使用すると、同物質の細胞内におけるRNAi活性の維持を助長することが可能であり、iRNA物質の血清中安定性を増大させることが可能である。1実施形態では、iRNA物質は1つまたは複数の化学修飾を含み、2本鎖RNAのセンス配列およびアンチセンス配列は約21ヌクレオチド長である。好ましい実施形態では、アンチセンス配列および/またはセンス配列の5’端の最初のヌクレオチド間結合、かつ好ましくは最初の2つのヌクレオチド間結合が、好ましくはホスホロチオエートによって修飾される。好ましい実施形態では、センス配列および/またはアンチセンス配列の3’端の最初の、および好ましくは最初の2つ、3つ、または4つのヌクレオチド間結合が、好ましくはホスホロチオエートによって修飾される。センス配列とアンチセンス配列の両方の5’端、およびセンス配列とアンチセンス配列の両方の3’端を、記載したように修飾されることがより好ましい。他の態様では、VEGF発現の下方制御を仲介するiRNA物質は、iRNA構築体のセンス配列とアンチセンス配列の間の結合親和性を調節する、1つまたは複数の化学修飾を含む。1実施形態では、本発明は、iRNA物質の細胞への取り込みを調節することが可能な1つまたは複数の化学修飾を含むiRNA物質を特徴とする。他の実施形態では、本発明は、iRNA物質の薬物動態を改善する1つまたは複数の化学修飾を含むiRNA物質を特徴とする。このような化学修飾には、結合体、例えば細胞受容体のリガンド、例えば天然に存在するタンパク質リガンド由来のペプチドなど;タンパク質局在化配列;抗体;核酸アプタマー;ビタミンおよび他の補助因子、例えば葉酸、レチノイドおよびN-アセチルガラクトサミンなど;ポリマー、例えばポリエチレングリコールPEG、例えばPEG5およびPEG20など;リン脂質;ポリアミン、例えばスペルミンまたはスペルミジンなど;およびその他があるが、これらだけには限られない。1実施形態では、iRNA物質は、AL-DP-4003、AL-DP-4116、AL-DP-4015、AL-DP-4120、AL-DP-4002、AL-DP-4115、AL-DP-4014、AL-DP-4119、AL-DP-4094、AL-DP-4118、AL-DP-4107、AL-DP-4122、AL-DP-4004、AL-DP-4117、AL-DP-4016、AL-DP-4121、AL-DP-4127、AL-DP-4128、AL-DP-4129、およびAL-DP-4055からなる群から選択される二重鎖分子を含む表2および3を参照。1つの好ましい実施形態では、iRNA物質は、アンチセンス配列5’AAGCUCAUCUCUCCUAUGUGCUG3’配列番号609およびセンス配列5’GCACAUAGGAGAGAUGAGCUU3’配列番号608を含む、AL-DP-4094として記載される二重鎖を含む。他の好ましい実施形態では、iRNA物質は、アンチセンス配列5’CUUUCUUUGGUCUGCAUUCACAU3’配列番号635およびセンス配列5’GUGAAUGCAGACCAAAGAAAG3’配列番号634を含む、AL-DP-4004として記載される二重鎖を含む。他の好ましい実施形態では、iRNA物質は、アンチセンス配列5’GUACUCCUGGAAGAUGUCCTT3’配列番号551およびセンス配列5’GGACAUCUUCCAGGAGUACTT3’配列番号550を含む、AL-DP-4015として記載される二重鎖を含む。他の好ましい実施形態では、iRNA物質は、アンチセンス配列5’UGCAGCCUGGGACCACUUGTT3’配列番号457およびセンス配列5’CAAGUGGUCCCAGGCUGCATT3’配列番号456を含む、AL-DP-4055として記載される二重鎖を含む。1実施形態では、本明細書に記載するiRNA物質のアンチセンス配列は、標的外の配列とはハイブリダイズしない。例えばアンチセンス配列には、標的外の配列と相補的なヌクレオチドは5、4、3、2、または1個未満しか含まれなくてよい。標的外off-targetとは、VEGFヌクレオチド配列以外の配列を意味する。他の実施形態では、標的外の発現抑制を阻害するためにセンス鎖を修飾する。センス鎖は、ピロリジンリンカーによってセンス鎖と結合したコレステロールなどの、コレステロール部分を含み得る。他の実施形態では、本明細書に記載のiRNA物質のアンチセンス配列は、ヒトのVEGF配列、およびヒト以外の哺乳動物、例えばマウス、ラット、またはサルのVEGF配列とハイブリダイズし得る。他の態様では、本発明は、iRNA物質、例えば本明細書に記載のiRNA物質を対象、例えばマウス、ラット、サルまたはヒトなどの哺乳動物の対象の眼に送達する方法を提供する。他の態様では、本発明は、対象、例えばマウス、ラット、サルまたはヒトなどの哺乳動物対象の眼にiRNA物質を送達する方法を提供する。1実施形態では、眼の脈絡膜領域内の1つまたは複数の細胞に、iRNA物質を送達することが可能である。1つの好ましい実施形態では、iRNA物質は、眼内の標的部位におけるVEGF遺伝子の発現を下方制御する。眼、例えば眼の脈絡膜細胞に送達されるiRNA物質は、非修飾iRNA物質であってよい。1実施形態では、ホスホロチオエート結合によってiRNA物質を安定化することが可能である。他の実施形態では、iRNA物質のセンス配列またはアンチセンス配列、あるいは両方の配列の3’端は、3’脱塩基性のカチオン修飾などカチオン基を用いて修飾することが可能である。カチオン修飾は、例えば、1つまたは複数のiRNA物質の末端ヌクレオチド上のアルキルアミノ-dT例えばC6アミノ-dT、アリルアミン、ピロリジン、フタルアミド、ヒドロキシプロリノール、ポリアミン、カチオンペプチド、またはカチオン性アミノ酸であってよい。修飾体は、外側または末端のカチオン残基であってよい。好ましい実施形態では、ピロリジンキャップがセンス鎖の3’または5’端、あるいはアンチセンス鎖の3’端に結合している。1実施形態では、iRNA物質のセンス配列またはアンチセンス配列、あるいは両方の配列が、糖、例えば糖結合体またはアルキルグリコシド成分、例えばグルコース、マンノース、2-デオキシグルコース、またはこれらの類似体を用いて修飾されうる。他の実施形態では、酵素基質、例えば身体の他の組織例えば眼以外の組織における酵素レベルと比較して関連酵素が多量に存在する基質に、iRNA物質を結合させることが可能である。1実施形態では、対象に投与されたiRNA物質のうち少なくとも約30、40、50、60、70、80、90またはそれ以上が眼に到達する。好ましい実施形態では、対象に投与されたiRNA物質の約30~90、40~80または50~70が眼に到達する。他の態様では、本発明は、組成物、例えば薬剤として許容可能な担体または希釈剤中に本発明のiRNA物質を含む医薬組成物を特徴とする。iRNA物質は、本明細書に記載の任意の物質であってよい。1実施形態では、iRNA物質を、本明細書に記載する任意の化学修飾などによって化学的に修飾する。好ましい修飾iRNA物質には、表2~19に提示するiRNA物質がある。他の態様では、本発明は、対象における疾患または状態を治療または予防するための方法を特徴とする。この方法は、対象における疾患または状態を治療または予防するのに適した条件下において、本発明の組成物を、単独で、あるいは1つまたは複数の他の治療用化合物と組み合わせて、対象に投与することを含み得る。1実施形態では、例えばカテーテルまたは他の配置式デバイス例えば、多孔質材料、非多孔質材料、またはゼラチン材料を含む網膜用ペレットまたはインプラントによって、望ましくないVEGF発現が存在する部位またはその部位近辺にiRNA物質が投与される。1実施形態では、例えば眼の前房または後房;または強膜、経脈絡膜空間、または硝子体外側の無血管野に挿入することが可能な眼内インプラントによって、iRNA物質が投与される。他の実施形態では、薬剤が強膜を越えて治療が望ましい部位、例えば眼の眼内空間および黄斑へと拡散するのが可能となるように、強膜上などの無血管野にインプラントが配置される。さらに、経強膜拡散の部位は黄斑の近辺であることが好ましい。他の実施形態では、注射によって、例えば眼内注射、網膜注射、または網膜下注射によって、眼にiRNA物質が投与される。他の実施形態では、例えばパッチまたは液体点眼剤によって、あるいはイオン導入法などによって、眼にiRNA物質が局所投与される。軟膏剤または滴下可能な液体は、アプリケータまたは点眼器など当分野で知られている眼内送達系によって送達することが可能である。1実施形態では、血管新生の部位またはその部位の近辺にiRNAが送達される。1実施形態では、iRNA物質は繰り返し投与される。iRNA物質の投与は、一定範囲の時間周期で行うことが可能である。iRNA物質は1時間毎、1日毎、数日毎に1回、1週間毎、あるいは1ヶ月毎に投与することが可能である。投与のタイミングは、患者の症状の重篤度などの要因に応じて、患者毎に変わる可能性がある。例えば、有効用量のiRNA物質を、1ヶ月に1回として無期限に、あるいは患者が治療をもはや必要としなくなるまで、患者に投与することが可能である。さらに、iRNA物質を含む徐放性組成物を使用して、標的VEGFヌクレオチド配列の領域において比較的一定な用量を保つことが可能である。他の実施形態では、片眼当たり約0.00001mg~約3mg程度、あるいは好ましくは片眼当たり約0.0001~0.001mg、片眼当たり約0.03~3.0mg、片眼当たり約0.1~3.0mgあるいは片眼当たり約0.3~3.0mgの用量で、眼にiRNA物質を送達する。他の実施形態では、例えば眼に影響を与える障害または状態の発症を予防するかまたは遅延させるために、iRNA物質を予防的に投与する。例えば、血管新生性の障害に罹患しやすいかあるいはそうでなければ該障害のリスクを有する患者に、iRNAを投与することが可能である。1実施形態では、本明細書に記載するiRNA物質を用いてヒトの片眼を治療し、他の実施形態ではヒトの両眼を治療する。他の態様では、VEGF発現を阻害する方法が提供される。1つのこのような方法は、有効量の本発明のiRNA物質を投与することを含む。他の態様では、成人発症型の黄斑変性症を治療する方法が提供される。この方法は、治療上有効な量の本発明のiRNA物質を投与することを含む。1実施形態では、乾燥型の成人黄斑変性症AMDのヒトが診断され、他の実施形態では、湿潤型のAMDのヒトが診断されている。1実施形態では、本明細書に記載するiRNA物質を用いた治療を受けるヒトは50才より上、例えば75才~80才であり、成人発症型の黄斑変性症のヒトが診断されている。他の実施形態では、本明細書に記載するiRNA物質を用いた治療を受けるヒトは30才~50才であり、後期発症型の黄斑変性症のヒトが診断されている。他の実施形態では、本明細書に記載するiRNA物質を用いた治療を受けるヒトは5才~20才であり、中期発症型の黄斑変性症のヒトが診断されている。他の実施形態では、本明細書に記載するiRNA物質を用いた治療を受けるヒトは7才以下であり、初期発症型の黄斑変性症のヒトが診断されている。1態様では、望ましくないVEGFの発現によって特徴付けられる、任意の疾患または障害を治療する方法が提供される。特に好ましい実施形態は、望ましくないVEGFの発現によって特徴付けられる、眼または網膜の障害の治療を含む。該疾患または障害は、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、腫瘍または転移性がん例えば、結腸がんまたは乳がん、肺疾患例えば、喘息または気管支炎、関節リウマチ、乾癬であってよい。他の血管新生性の障害も、本発明において特徴付ける方法によって治療することが可能である。他の態様では、本発明は、本発明のiRNA物質を含むキットを特徴とする。キットのiRNA物質は化学的に修飾することができ、また細胞、組織または生物中でVEGF標的遺伝子の発現を調節するのに有用であり得る。1実施形態では、キットは2つ以上の本発明のiRNA物質を含む。本発明は例えば、以下の項目を提供する:項目1センス配列およびアンチセンス配列からなる単離iRNA物質であって、センス配列およびアンチセンス配列がRNA二重鎖を形成し、アンチセンス配列がVEGFのヌクレオチド配列の約19~23ヌクレオチドの標的配列と十分相補的なヌクレオチド配列を含んでなり、前記標的配列は、配列番号1~401からなる群から選択される配列との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下であることを特徴とするiRNA物質。項目2前記センス配列が、配列番号2~401からなる群から選択される配列との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下である配列を含んでなる、項目1に記載のiRNA物質。項目3前記センス配列が、配列番号456、配列番号546、配列番号548、配列番号550、配列番号552、配列番号590、配列番号592、配列番号594、配列番号596、配列番号608、配列番号610、配列番号612、配列番号614、配列番号634、配列番号636、配列番号638、配列番号640、配列番号646、配列番号648、および配列番号650からなる群から選択される配列との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下である配列を含んでなる、項目1に記載のiRNA物質。項目4配列番号608との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下であることを特徴とする、項目3に記載のセンス鎖配列。項目5前記アンチセンス配列が、配列番号457、配列番号547、配列番号549、配列番号551、配列番号553、配列番号591、配列番号593、配列番号595、配列番号597、配列番号609、配列番号611、配列番号613、配列番号615、配列番号635、配列番号637、配列番号639、配列番号641、配列番号647、配列番号649、および配列番号651からなる群から選択される配列との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下である配列を含んでなる、項目1に記載のiRNA物質。項目6配列番号609との違いが1、2、または3ヌクレオチド以下であることを特徴とする、項目5に記載のアンチセンス鎖配列。項目7非ヌクレオチド部分をさらに含むことを特徴とする、項目1に記載のiRNA物質。項目8センス配列およびアンチセンス配列が核酸分解に対して安定化されている、項目7に記載のiRNA。項目91つの3’突出部分をさらに含み、前記3’突出部分が1~6ヌクレオチドからなる、項目1に記載のiRNA物質。項目10第2の3’突出部分をさらに含み、前記第2の3’突出部分が1~6ヌクレオチドからなる、項目9に記載のiRNA。項目11アンチセンス配列およびセンス配列の5’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートをさらに含む、項目1に記載のiRNA物質。項目12アンチセンス配列およびセンス配列の3’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートをさらに含む、項目1に記載のiRNA物質。項目13アンチセンス配列およびセンス配列の5’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートを、かつアンチセンス配列およびセンス配列の3’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートをさらに含む、項目1に記載のiRNA物質。項目142’修飾ヌクレオチドをさらに含む、項目1に記載のiRNA物質。項目15前記2’修飾ヌクレオチドが、2’-デオキシ、2’-デオキシ-2’-フルオロ、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル2’-O-MOE、2’-O-アミノプロピル2’-O-AP、2’-O-ジメチルアミノエチル2’-O-DMAOE、2’-O-ジメチルアミノプロピル2’-O-DMAP、2’-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル2’-O-DMAEOE、および2’-O-N-メチルアセタミド2’-O-NMAからなる群から選択される修飾を含んでなる、項目14に記載のiRNA物質。項目16項目1乃至15のいずれか1項に記載のiRNA物質と細胞を接触させることからなる、対象の細胞中のVEGFのRNA量を減少させる方法。項目17項目1乃至15のいずれか1項に記載のiRNA物質を作製する方法であって、前記iRNA物質の合成からなり、センス鎖およびアンチセンス鎖が、核酸分解に対して該iRNA物質を安定化する修飾を少なくとも1つ含んでなることを特徴とする方法。項目18項目1に記載のiRNA物質と、薬剤として許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物。項目19有効量の項目1に記載のiRNA物質を投与することからなる、VEGFの発現を阻害する方法。項目20成人黄斑変性症AMDを有する、あるいは成人黄斑変性症のリスクを有すると診断されたヒトを治療する方法であって、治療上有効な量の項目1に記載のiRNA物質をそのような治療の必要がある対象に投与することからなる方法。別途定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載した方法および材料と同等または均等な方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することが可能であるが、有用な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定することは目的としない。本発明の他の特徴および利点は、添付の図面および記載事項から、かつ特許請求の範囲から明らかとなろう。本願全体を通じて引用した全ての参照文献、係属中の特許出願および公開特許明細書の内容は、本願明細書に援用される。矛盾がある場合は、定義を含めて本明細書が優先される。表の簡単な説明表1は、本発明の物質によって標的とされるVEGF遺伝子中の配列を提示する。これらの配列は、本発明のiRNA物質の一部のセンス鎖でもありうる。表2は、VEGF遺伝子を標的とする123個のiRNA二重鎖、VEGF遺伝子中の標的配列、および実施例中に記載の活性データを提示する。表3は、ホスホロチオエートによる安定化を含むように修飾されたiRNA二重鎖、および実施例中に記載の活性データを提示する。表4は、AL-DP-4094二重鎖を基にして安定化のために修飾されたiRNA二重鎖、および実施例中に記載の活性データを提示する。表5は、本発明の幾つかのiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA二重鎖の活性データを提示する。表6は、1つまたは複数のホスホロチオエート、2’-O-メチルおよび2’-フルオロ修飾を含むiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA物質の活性データを提示する。表7は、交互に配列された2’-O-メチルおよび2’-フルオロ修飾を含むiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA物質の活性データを提示する。表8AおよびBは、コレステロールまたはコラン酸結合体を含むiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA物質の活性データを提示する。表9は、ナプロキセン結合体を含むiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA物質の活性データを提示する。表10は、ビオチン結合体を含むiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA物質の活性データを提示する。表11は、アルデヒド、レチナールおよび他のレチノイド結合体を含むiRNA物質を提示する。表12は、ポリエチレングリコール結合体を含むiRNA物質を提示する。表13は、リボジフルオロトルイル修飾を含むiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA物質の活性データを提示する。表14は、2’-アラフルオロ-2’-デオキシヌクレオシド修飾を含むiRNA物質に関する、HeLa細胞中でのiRNA物質の活性データを提示する。表15は、メチルホスホネート修飾を含むiRNA物質を提示する。表16は、C-5アリルアミノ修飾を含むiRNA物質を提示する。表17は、表中に示した様々な修飾および該修飾の組合せを含むiRNA物質を提示する。表18は、表中に示した様々な修飾および該修飾の組合せを含むiRNA物質の物理的特徴を提示する。詳細な説明二本鎖dsRNAは、RNA干渉RNAiとして知られるプロセスによって、mRNAの配列特異的な発現抑制サイレンシングを誘導する。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含めた多種多様な生物において起きる。dsRNAの21~23nt断片が、例えばRNA分解を引き起こすことによる、RNA発現抑制の配列特異的なメディエーターであることが実証されている。理論に縛られることは望むものではないが、これらの21~23nt断片の中に存在する、特定の長さの断片にすぎない分子シグナルが、RNAiを仲介する細胞因子を動員する可能性がある。本明細書に記載するのは、これらの21~23nt断片、および他のiRNA物質を調製し投与するための方法、ならびに遺伝子機能を特異的に不活性化させるためのそれらの使用である。iRNA物質あるいは同一または類似の性質の組換え生成または化学合成されたオリゴヌクレオチドを使用することによって、哺乳動物細胞において発現抑制するために特定のmRNAを標的とすることが可能になる。さらに、比較的長いdsRNA物質の断片を、例えば以下に記載したように使用することも可能である。哺乳動物細胞では、長いdsRNAは、有害であることが多いインターフェロン応答を誘導する可能性があるが、siRNAは、少なくとも細胞および宿主に有害である程度にまでインターフェロン応答を誘導することはない。特に、iRNA物質中のセンス配列およびアンチセンス配列の長さは、例えば有害なインターフェロン応答の誘導を回避する程度に充分短い、31、30、28、25、または23nt未満であってよい。したがって、哺乳動物細胞への例えば、本明細書に記載したように調合したiRNA物質の組成物の投与を使用して、インターフェロン応答を回避しながら、標的遺伝子の発現を抑制することが可能である。さらに、別種のiRNA物質を使用して、例えば対立遺伝子がヘテロ接合である対象において、標的遺伝子の一方の対立遺伝子を選択的に標的とすることが可能である。RNA二重鎖などのiRNA物質の標的相補配列アンチセンス配列は、5’リン酸を有することが可能であり、ATPを使用してsiRNA上の5’-リン酸部分を維持することが可能であるニッカネンらNykanenetal、Cell107:309、2001が、5’-リン酸を欠くiRNA物質を外部から導入しても活性があることが示されてきており、siRNA構築体の5’-リン酸化はinvivoで起こりうることが示唆されている。血管内皮増殖因子VEGF血管透過性因子としても知られているVEGFは、血管形成増殖因子である。VEGFは、少なくとも3つの異なるアイソフォームが存在するホモ2量体の45kDaの糖タンパク質である。VEGFのアイソフォームは内皮細胞中で発現される。VEGF遺伝子は、189アミノ酸のタンパク質アイソフォームを発現する8個のエクソンを含む。165アミノ酸のアイソフォームはエクソン6によってコードされる残基を欠き、一方121アミノ酸のアイソフォームは、エクソン6および7によってコードされる残基を欠く。VEGF145は、145個のアミノ酸を含みエクソン7を欠くと予測されるアイソフォームである。VEGFは、Flt-1VEGFR-1またはKDR/flk-1VEGFR-2などの内皮のチロシンキナーゼ受容体と結合することによって、内皮細胞に作用することが可能である。VEGFR-2は内皮細胞中で発現され、内皮細胞の分化および脈管形成に関与している。第3の受容体であるVEGFR-3は、リンパ球新生と関係があるとされている。これらの種々のアイソフォームは、様々な生物活性および臨床上の意義を有している。例えばVEGF145は血管形成を誘導し、VEGF189と同様にただしVEGF165とは異なりVEGF145は、細胞外マトリクス関連のヘパリン硫酸に依存しない機構によって細胞外マトリクスと効率良く結合する。ヒトVEGF121のコード配列に相当するmRNAGenbank受託番号AF214570、配列番号1を、図1に示す。VEGFはinvitroにおいて内皮細胞分裂促進因子および走化性誘因物質としての活性を示し、invivoにおいて血管透過性および血管形成を誘導する。VEGFは広くさまざまな種類のがん細胞によって分泌され、腫瘍に関連する脈管構造の発達を誘導することによって腫瘍の増殖を助長する。VEGFの機能を阻害することにより、免疫不全マウスにおける実験的な原発性腫瘍の増殖と転移の発生の両方が制限されることが示されている。VEGFはまた、関節リウマチおよび乾癬などの炎症性疾患においても異常に高いレベルで発現され、喘息症状の発現中に起こる炎症、気道リモデリングおよび血管リモデリングに関与している。VEGF発現の上昇は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、および黄斑変性症を含めた、重度の視力低下をもたらすことの多い幾つかの形の眼部の血管新生とも関係がある。iRNA物質本明細書で使用するRNA物質は、非修飾RNA、修飾RNA、またはヌクレオシド代用物である。好ましい例には、非修飾RNAよりもヌクレアーゼ分解に対して高い耐性を有するRNA物質がある。好ましい例には、2’糖修飾、1本鎖突出部分好ましくは1本鎖の3’突出部分の修飾、または特に1本鎖の場合、1つまたは複数のリン酸基あるいは1つまたは複数のリン酸基類似体を含む5’修飾を有するRNA物質がある。本明細書で使用するiRNA物質は、標的遺伝子好ましくは内在性または病原性の標的RNAの発現を下方制御することが可能なRNA物質であるか、切断されてそのようなRNA物質となることが可能なRNA物質である。理論によって縛られることは望むものではないが、iRNA物質は、当分野ではRNAiと呼ばれることもある標的mRNAの転写後切断や、転写前または翻訳前の機構など幾つかの機構のうち1つまたは複数によって作用するのかもしれない。iRNA物質は1本の鎖を含んでいてもよいし、あるいは2本以上の鎖を含んでいてもよく、例えばiRNA物質は2本鎖iRNA物質であってよい。iRNA物質が1本鎖である場合、1つまたは複数のリン酸基あるいは1つまたは複数のリン酸基類似体を含む5’修飾を含むことが特に好ましい。iRNA物質またはその断片が標的遺伝子の下方制御を仲介することが可能であるように、iRNA物質は標的遺伝子との相同性が十分な領域を含むべきであり、かつヌクレオチド数として十分な長さでなければならない。説明を容易にするために、本明細書では、用語ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、RNA物質の1つまたは複数のモノマーサブユニットに関して用いられる場合がある。本明細書では当然ながら、本明細書における用語リボヌクレオチドまたはヌクレオチドの使用は、修飾RNAまたはヌクレオチド代用物の場合には、修飾ヌクレオチド、または1つまたは複数の位置における代用物置換部分をも意味し得る。したがってiRNA物質は、標的RNAと少なくとも部分的に相補的であり、幾つかの実施形態では完全に相補的な領域であるか、あるいは該領域を含む。iRNA物質と標的の間に完璧な相補性が存在する必要はないが、その対応性は、iRNA物質またはその切断産物が、標的RNA例えばmRNAのRNAi切断などによって、配列特異的な発現抑制を誘導することが可能である程度に十分でなければならない。標的鎖との相補性、または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。特にアンチセンス鎖における完全な相補性が望ましいことが多い一方で、幾つかの実施形態では、特にアンチセンス鎖中に、1つまたは複数、ただし好ましくは6、5、4、3、2、あるいはこれより少ない標的RNAに対するミスマッチを含み得る。ミスマッチ、特にアンチセンス鎖中のミスマッチは、末端領域において最も許容され、存在する場合は、1つまたは複数の末端領域中、例えば5’および/または3’末端の6、5、4、または3ヌクレオチド以内に存在することが好ましい。センス鎖は、分子全体としての2本鎖の性質を維持するためにアンチセンス鎖と十分相補的でありさえすればよい。iRNA物質の1本鎖領域は、修飾されるか、あるいはヌクレオシド代用物、例えばヘアピン構造の非対合領域、例えば2つの相補領域をつなぐ領域であって修飾またはヌクレオシド代用物を有し得る領域を含むことが多いと思われる。例えばエキソヌクレアーゼに対してiRNA物質の3’または5’末端のうち1つまたは複数を安定化するための修飾、またはアンチセンスsRNA物質がRISCに進入するのを助けるための修飾も好ましい。修飾には、C3またはC6、C7、C12アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサーC3、C6、C9、C12、無塩基部位、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ホスホロアミダイトを提供しかつ他のDMT保護ヒドロキシル基を有するためRNA合成中に多数の結合を可能にする、特殊なビオチン試薬またはフルオレセイン試薬が挙げられる。iRNA物質には:インターフェロン応答を誘導するのに十分な長さの分子ダイサーDicerによって切断されてベルンシュタインらBernsteinetal、Nature409:363~366、2001、RISCRNAi誘導サイレンシング複合体に進入しうる分子;およびインターフェロン応答を誘導しない程度に十分短い分子これらの分子もDicerによって切断可能であり、かつ/またはRISCに進入することが可能である、例えばRISCへの進入を可能にする大きさの分子、例えばDicer切断産物に類似の分子がある。インターフェロン応答を誘導しない程度に十分短い分子を、本明細書ではsRNA物質または短いiRNA物質と呼ぶ。本明細書で使用するsRNA物質または短いiRNA物質は、iRNA物質、例えば2本鎖RNA物質または1本鎖物質であって、ヒト細胞中で有害なインターフェロン応答を誘導しない程度に十分短い、例えばヌクレオチド対が60未満、ただし好ましくは50、40、または30未満の二重鎖領域を有するものを指す。sRNA物質またはその切断産物は、例えば標的RNA好ましくは内在性標的RNAまたは病原体標的RNAに関してRNAiを誘導することによって、標的遺伝子を下方制御することが可能である。sRNA物質のそれぞれの鎖は、30、25、24、23、22、21、または20ヌクレオチド長以下であってよい。鎖は少なくとも19ヌクレオチド長であることが好ましい。例えばそれぞれの鎖が21~25ヌクレオチド長であってよい。好ましいsRNA物質は、17、18、19、29、21、22、23、24、または25ヌクレオチド対の二重鎖領域、および1つまたは複数の突出部分、好ましくは2~3ヌクレオチドの1つまたは2つの3’突出部分を有する。本明細書で使用する1本鎖iRNA物質は、1つの分子で構成されるiRNA物質である。1本鎖iRNA物質は、鎖間の対合によって形成された二重鎖領域を含むことが可能であり、例えば1本鎖iRNA物質はヘアピン構造またはパン-ハンドル構造であってもよいし、該構造を含んでもよい。1本鎖iRNA物質は、標的分子に関してアンチセンスであることが好ましい。好ましい実施形態では、1本鎖iRNA物質は5’リン酸化状態であるか、あるいは5’最先端にホスホリル類似体を含む。5’リン酸修飾には、RISC仲介型遺伝子発現抑制と適合性のある修飾があげられる。適切な修飾には:5’-1リン酸HO2OP-O-5’;5’-2リン酸HO2OP-O-PHOO-O-5’;5’-3リン酸HO2OP-O-HOOP-O-PHOO-O-5’;5’-グアノシンキャップ7-メチル化または非メチル化7m-G-O-5’-HOOP-O-HOOP-O-PHOO-O-5’;5’-アデノシンキャップAppp、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造N-O-5’-HOOP-O-HOOP-O-PHOO-O-5’;5’-モノチオリン酸ホスホロチオエート;HO2SP-O-5’;5’-モノジチオリン酸ホスホロジチオエート;HOHSSP-O-5’、5’-ホスホロチオレートHO2OP-S-5’;酸素/イオウ置換された1リン酸、2リン酸および3リン酸のその他の任意の組合せ例えば5’-α-チオ3リン酸、5’-γ-チオ3リン酸など、5’-ホスホロアミダイトHO2OP-NH-5’、HONH2OP-O-5’、5’-アルキルリン酸R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えばRPOHO-O-5’-、OH2OP-5’-CH2-、5’-アルキルエーテルリン酸R=アルキルエーテル=メトキシメチルMeOCH2-、エトキシメチルなど、例えばRPOHO-O-5’-がある。これらの修飾を、2本鎖iRNAのアンチセンス鎖に使用することも可能である。1本鎖iRNA物質は、RISCに進入して標的mRNAのRISC仲介型切断に関与することができる程度に十分長くなければならない。1本鎖iRNA物質は少なくとも14、およびより好ましくは少なくとも15、20、25、29、35、40、または50ヌクレオチド長である。1本鎖iRNA物質は、200、100、または60ヌクレオチド長未満であることが好ましい。ヘアピンiRNA物質は、少なくとも17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチド対以上の二重鎖領域を有することになろう。二重鎖領域は、長さが200、100、または50以下であることが好ましいと思われる。二重鎖領域の好ましい範囲は、長さが15~30、17~23、19~23、および19~21ヌクレオチド対である。ヘアピンは、1本鎖突出部分または末端の非対合領域好ましくは3’側、かつ好ましくはヘアピンのアンチセンス側を有することが好ましいと思われる。好ましい突出部分は2~3ヌクレオチド長である。本明細書で使用する2本鎖dsiRNA物質は、鎖間ハイブリダイゼーションが二重鎖構造の領域を形成し得る、2本以上、および好ましくは2本の鎖を含むiRNA物質である。iRNA物質の糖、塩基、または骨格に対する他の適切な修飾は、2004年1月16日に出願された共願のPCT出願第PCT/US2004/01193に記載されている。iRNA物質は、2004年4月16日に出願された共願のPCT出願第PCT/US2004/011822中に記載された塩基などの、非天然塩基を含み得る。iRNA物質は、非炭水化物の環状担体分子などの非天然の糖を含み得る。iRNA物質中に使用するための非天然の糖の代表的な特徴は、2003年4月16日に出願された共願のPCT出願第PCT/US2004/11829に記載されている。iRNA物質は、ヌクレアーゼ耐性を高めるのに有用なヌクレオチド間結合例えば、キラルホスホロチオエート結合を含み得る。さらに、あるいは別例として、iRNA物質はヌクレアーゼ耐性を高めるためのリボース模倣体を含み得る。ヌクレアーゼ耐性を高めるための代表的なヌクレオチド間結合およびリボース模倣体は、2004年3月8日に出願された共願のPCT出願第PCT/US2004/07070に記載されている。iRNA物質は、2004年3月8日に出願された共願のPCT出願第PCT/US2004/07070に記載された構造などのZXY構造を有し得る。iRNA物質は、両親媒性部分と複合体形成し得る。iRNA物質と共に使用するための代表的な両親媒性部分は、2004年3月8日に出願された共願のPCT出願第PCT/US2004/07070に記載されている。他の実施形態では、iRNA物質は、モジュラー複合体を特徴とする送達物質と複合体形成し得る。該複合体は、a縮合剤例えば、例えばイオン相互作用または静電相互作用によって、核酸を引き寄せる、例えば核酸と結合することが可能な物質;b融合誘導物質例えば、細胞膜と融合し得る、かつ/または細胞膜を介して輸送され得る物質;およびc標的化基、例えば細胞または組織を標的とする物質、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、特定の種類の細胞と結合する抗体;のうち1つまたは複数好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ全てと結合した担体物質を含み得る。送達物質と複合体形成したiRNA物質は、2004年3月8日に出願された共願のPCT出願第PCT/US2004/07070に記載されている。iRNA物質は、iRNA二重鎖のセンス配列とアンチセンス配列の間などに非標準的な対を有し得る。非標準的なiRNA物質の代表的な特徴は、2004年3月8日に出願された共願のPCT出願第PCT/US2004/07070に記載されている。これらの種類の修飾の多くは実施例に提示され、表3~18中に記載されている。iRNAの設計本発明は、細胞中のVEGFmRNAのレベルを低下させるために使用し得る活性iRNA物質を同定するための、VEGF遺伝子の遺伝子歩行に基づくものである。VEGF遺伝子中のiRNA物質の配列候補の全てに活性があるわけではなく、その多くは相当な標的外の影響も有している。本発明は、活性があり相当な標的外の影響は有していない配列を選択することによって、当分野の技術を進展させる。さらに、本発明のiRNA物質に関して選択した配列は多数の生物種間で保存されているため、動物試験および毒性試験に1つの物質を使用することが可能であると同時に、ヒトにおける治療目的でも同じものを使用することができる。これらの結果に基づいて、本発明は特に、VEGFが介在する障害、特にAMDなどの眼の障害を治療する際に、単離形態および以下に記載する医薬組成物として使用することが可能なiRNA物質を提供する。このような物質は、VEGF遺伝子と相補的な少なくとも15個以上の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖、およびセンス鎖の配列と相補的な少なくとも15個以上の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含むことになろう。特に有用なのは、表1に提示したヌクレオチド配列を含むか、本質的に該配列から構成されるか、あるいは該配列で構成されるiRNA物質、例えば表2に提示した物質、あるいは表3~18に提示したその修飾体のいずれかである。iRNAの標的になると思われるVEGF遺伝子の遺伝子歩行分析を、本明細書で行うように実施することによって、候補iRNA物質を設計することが可能である。被転写領域の全体または一部分に対応する、重複した、隣接した、または狭い間隔を置いた候補物質を作製し試験することが可能である。それぞれのiRNA物質を試験し、標的遺伝子の発現を下方制御する能力に関して評価することが可能である以下の候補iRNA物質の評価を参照されたい。本発明のiRNA物質は、表2に活性があることが示されているiRNA物質または表3~18に提示した修飾配列のうちの1つに由来する、少なくとも15以上の連続したヌクレオチドを基本とし、該ヌクレオチドを含んでなることが好ましい。このような物質では、物質は表中に提示した配列全体を含んでもよいし、該配列で構成されてもよいし、あるいは本質的に該配列で構成されてもよく、あるいは15以上の連続した残基と共に標的遺伝子の隣接領域由来の他のヌクレオチドを含んでもよい。配列情報および望ましい特徴、ならびに表1に提示した標的配列の情報に基づいて、iRNA物質を合理的に設計することが可能である。例えば、候補の二重鎖の相対的融解温度に従い、iRNA物質を設計することが可能である。一般に二重鎖は、アンチセンス鎖の3’端よりもアンチセンス鎖の5’端において低い融解温度を有するべきである。したがって本発明は、表1または2に提示した物質のうちの1つと本質的に同一である少なくとも15、16、17、18、19、20、21または23ヌクレオチドの配列をそれぞれ含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなるiRNA物質を提供する。iRNA物質のアンチセンス鎖は、15、16、17、18、19、25、29、40、または50ヌクレオチド長であるか、少なくとも15、16、17、18、19、25、29、40、または50ヌクレオチド長でなければならない。アンチセンス鎖は、50、40、または30ヌクレオチド長以下でなければならない。好ましい範囲は15~30、17~25、19~23、および19~21ヌクレオチド長である。代表的なiRNA物質には、表2の物質あるいは表1に提示した標的配列と相補的な物質のうちの1つに由来する15個以上のヌクレオチドを含むが、長さ25ヌクレオチド長以下のiRNA物質がある。iRNA物質のセンス鎖は、15、16、17、18、19、25、29、40、または50ヌクレオチド長であるか、少なくとも15、16、17、18、19、25、29、40、または50ヌクレオチド長でなければならない。センス鎖は、50、40、または30ヌクレオチド長以下でなければならない。好ましい範囲は15~30、17~25、19~23、および19~21ヌクレオチド長である。代表的なiRNA物質には、表2の物質あるいは表2の標的配列のうちの1つに由来する15個以上のヌクレオチドを含むが、25ヌクレオチド長以下のiRNA物質がある。iRNA物質の2本鎖部分は、長さが15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40、または50ヌクレオチド対であるか、少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40、または50ヌクレオチド対でなければならない。2本鎖部分は、長さが50、40、または30ヌクレオチド対以下でなければならない。好ましい範囲は長さ15~30、17~25、19~23、および19~21ヌクレオチド対である。表2に提示した物質は、それぞれの鎖に関して23ヌクレオチド長である。iRNA物質は、該物質の3’端のそれぞれに2ヌクレオチドの突出部分を備えた21ヌクレオチドの2本鎖領域を含む。これらの物質を本明細書に記載したのと同様に修飾して、これらの配列の少なくとも一部分15個以上の連続したヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド塩基およびオリゴヌクレオチド結合に対する修飾のうち少なくともいずれかを含む同等な物質を得ることが可能である。特に好ましいのは、表3~18に提示した修飾および物質である。一般に本発明のiRNA物質は、iRNA物質またはその断片がVEGF遺伝子の下方制御を仲介し得るように、VEGF遺伝子と十分相補的な領域を含み、ヌクレオチド数として充分な長さである。本発明のiRNA物質のアンチセンス鎖は、VEGF遺伝子のmRNA配列と完全に相補的であることが好ましい。しかし、iRNA物質と標的の間に完璧な相補性が存在する必要はなく、その対応性は、iRNA物質またはその切断産物が、例えばVEGFのmRNAのRNAi切断によって配列特異的な発現抑制を誘導することができる程度に十分でなければならない。したがって本発明のiRNA物質は、表2に提示した物質などの、VEGF遺伝子の配列の1つと以下に定義するようにほぼ同一である少なくとも16、17または18ヌクレオチドの配列をそれぞれ含んでなるセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる物質を含み、ただし鎖1つ当たり1、2または3ヌクレオチド以下がそれぞれ他のヌクレオチドによって置換されており例えば、ウラシルによって置換されたアデノシン、VEGF発現を阻害する能力はほぼ保っているものとする。したがってこれらの物質は、VEGF遺伝子と同一な少なくとも15個以上のヌクレオチドを有するが、VEGFのmRNA配列に関して、あるいはセンス鎖とアンチセンス鎖との間に関して1、2または3塩基のミスマッチが導入されていることになる。特にアンチセンス鎖では、標的VEGFのmRNA配列とのミスマッチは末端領域において最も許容され、存在する場合は好ましくは1つまたは複数の末端領域内、例えば5’および/または3’末端の6、5、4、または3ヌクレオチド以内、最も好ましくはセンス鎖の5’末端またはアンチセンス鎖の3’末端の6、5、4、または3ヌクレオチド以内に存在することが好ましい。センス鎖は、分子全体の2本鎖の特徴を維持するのに十分な程度にアンチセンス鎖と相補的でありさえすればよい。iRNA物質が、分子、例えば表2および表3~18に例示した分子などの一端または両端に1本鎖領域または非対合領域を含むように、センス鎖とアンチセンス鎖を選択することが好ましい。したがってiRNA物質は、好ましくは突出部分例えば1つまたは2つの5’または3’突出部分、ただし好ましくは2~3ヌクレオチドの3’突出部分を含むように対合したセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む。大部分の実施形態は、3’突出部分を有することになろう。好ましいsiRNA物質は、iRNA物質の一端または両端に長さ1~4ヌクレオチド、あるいは好ましくは2または3ヌクレオチドの1本鎖突出部分、好ましくは3’突出部分を有することになろう。突出部分は一方の鎖が他方の鎖より長い結果であってもよいし、あるいは同じ長さの2本の鎖がずれを生じた結果であってもよい。5’端はリン酸化されていることが好ましい。二重鎖領域の好ましい長さは15~30ヌクレオチドであり、最も好ましくは、例えば上述したsiRNA物質の範囲内の、18、19、20、21、22、および23ヌクレオチド長である。siRNA物質の2本の鎖が例えば共有結合により結合している実施形態も含まれる。必要な2本鎖領域および好ましくは3’突出部分を提供するヘアピン構造または他の1本鎖構造も、本発明内にある。iRNA物質の合成オリゴヌクレオチド例えば、ある種の修飾オリゴヌクレオチド、またはリボヌクレオチドを欠くオリゴヌクレオチドの部分は、例えばカルーテルらCaruthersetal、MethodsinEnzymology211:3、1992;トンプソンらThompsonetal、国際公開第99/54459号パンフレット;ビンコットらWincottetal、NucleicAcidsRes.23:2677、1995;ビンコットらWincottetal、MethodsMol.Bio.74:59、1997;ブレンナンらBrennanetal、Biotechnol.Bioeng.61:33、1998;およびブレンナンBrennan、米国特許第6,001,311号明細書に記載されたのと同様の、当分野で知られているプロトコルを使用して合成することが可能である。これらの参照文献はいずれも、本願明細書に援用する。オリゴヌクレオチドの合成には、一般的な核酸保護基および結合基、例えば5’端にジメトキシトリチル、および3’端にホスホロアミダイトなどを使用する。本発明のある種のiRNA物質などのRNAに関して使用する合成法は、ユースマンらUsmanetal、J.Chem.Soc.109:7845、1987;スカリンジらScaringeetal、NucleicAcidsRes.18:5433、1990;ビンコットらWincottetal、NucleicAcidsRes.23:2677、1995;およびビンコットらWincottetal、MethodsMol.Bio.74:59、1997に記載されたのと同様の手順に従い、一般的な核酸保護基および結合基、例えば5’端にジメトキシトリチル、および3’端にホスホロアミダイトなどを使用する。修飾iRNA物質を生産するためのさまざまな合成法の詳細な説明は、実施例において提示する。あるいは、本発明の核酸分子を、個別に合成して合成後に例えばライゲーションによってモーアらMooreetal、Science256:9923、1992;ドレーパーらDraperetal、国際公開第93/23569号パンフレット;シャバロバらShabarovaetal、NucleicAcidsRes.19:4247、1991;ベロンらBellonetal、NucleosidesandNucleotides、16:951、1997;ベロンらBellonetal、Bioconjugate8:204、1997、あるいは合成および/または脱保護の後のハイブリダイゼーションによって、連結させることが可能である。2つの異なる核酸配列から、または1つの断片がiRNA物質のセンス領域を含み第2の断片がiRNA物質のアンチセンス領域を含む断片から、iRNA物質を構築することも可能である。iRNA物質を広範囲にわたって修飾し、ヌクレアーゼ耐性基、例えば2’-アミノ、2’-C-アリル、2’-フルオロ、ジフルオロトルイル、5-アリルアミノ-ピリミジン、2’-O-メチル、2’-Hを用いた修飾によって安定性を増大させることが可能である総説に関しては、ユースマンおよびセデルグレンUsmanandCedergren、TrendsinBiochem.Sci.17:34、1992を参照。iRNA構築体は、一般的な方法を使用してゲル電気泳動によって精製してもよいし、あるいは高圧液体クロマトグラフィHPLC;その全容を本願明細書に援用する、ビンコットらWincottetalの上記文献を参照によって精製し、水中に再懸濁させてもよい。本発明の他の態様では、DNAベクターまたはRNAベクターに挿入した転写ユニットからiRNA物質を発現させることが可能である。組換えベクターはDNAプラスミドであってもよいし、ウイルスベクターであってもよい。iRNA物質を発現するウイルスベクターは、限定するものではないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスに基づいて構築することが可能である。iRNA物質を発現することが可能である組換えベクターを、本明細書に記載するように送達し、標的細胞中に維持することが可能である。あるいは、iRNA物質の一過性の発現をもたらすウイルスベクターを使用することも可能である。iRNA物質の評価本明細書に記載するiRNA物質はいずれも、以下のように評価および修飾することが可能である。例えばiRNA物質を対象の体内に導入するときなど、iRNA物質はエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断の影響を受ける可能性がある。切断、例えばiRNA物質上でのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる切断の部位を決定する方法、および切断の機構を決定する方法を使用することが可能である。iRNA物質を修飾してこのような切断を阻害することが可能である。dsRNA、例えばiRNA物質を評価して、修飾、特に切断、例えば対象の体内に見られる成分による切断の影響を受けやすい部位を同定することが可能である。該成分は身体の特定の領域、例えば特定の組織、器官、または体液例えば血液、血漿、または血清などに特異的であってよい。身体のある領域において、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断のいずれかによる切断を受けやすいiRNA物質中の部位は、身体の他の領域においては切断に対して耐性であってもよい。iRNA物質を評価するための方法は、1対象の体内に存在する物質、および好ましくは治療用dsRNAが導入される体内コンパートメントこれは、治療物質が直接導入されるコンパートメント、例えば循環系、および治療物質が最終的に標的とするコンパートメント、例えば肝臓または腎臓;場合によっては、例えば2つが同一である眼などを含むに存在する成分が、dsRNA、例えばiRNA物質を切断する、1つまたは複数の地点を決定する工程と、および2例えばエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、あるいは両方によるdsRNA中の1つまたは複数の切断地点を同定する工程とを含み得る。任意選択で、この方法は、このような部位における切断を阻害するように修飾したRNA例えばiRNA物質を提供することをさらに含む。上述の工程は、1つまたは複数の以下のアッセイを使用することによって実施することが可能である。すなわちia候補のdsRNA、例えばiRNA物質と試験物質例えば生物学的物質を接触させることと、b大きさに基づくアッセイ、例えばゲル電気泳動を使用して、iRNA物質が切断されるかどうかを判定すること。好ましい実施形態では、経時変化を測定し、様々な時間インキュベートした幾つかのサンプルを上記の大きさに基づくアッセイに供する。好ましい実施形態では、候補dsRNAを標識しない。この方法は全染色法であってよい。iia放射標識した候補dsRNA、例えばiRNA物質を供給することと;b候補dsRNAと試験物質を接触させることと、c大きさに基づくアッセイ、例えばゲル電気泳動を使用して、iRNA物質が切断されるかどうかを判定すること。好ましい実施形態では、経時変化を測定し、経時変化の測定においては幾つかのサンプルを様々な時間インキュベートし、大きさに基づくアッセイに供する。好ましい実施形態では、断片中に存在するヌクレオチドの数を測定することが可能である条件下において測定を行う。例えばインキュベートしたサンプルを、切断産物の長さの割り当てを可能にするマーカーを有するゲルで泳動する。ゲルがラダー型消化物である標準品を含んでいてもよい。センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを標識することが可能である。特定の実験では、1本の鎖のみを標識することが好ましい。5’端、3’端、あるいは内部の位置に標識を取り込ませることが可能である。断片の長さおよびしたがって切断地点は、ラダーに基づいた断片の大きさから、かつRNAseT1などの部位特異的エンドヌクレアーゼを使用するマッピングから決定することが可能である。iii任意の方法、例えば本明細書に記載する方法、例えば前述の方法の1つによって生成される断片を、質量分析法によって分析してもよい。iRNAと試験物質を接触させた後に、フェノール-クロロホルム抽出とその後の沈殿などによって、iRNAを精製例えば、部分的に精製することが可能である。次いで液体クロマトグラフィを使用して断片を分離することが可能であり、そして質量分析法を使用してそれぞれの断片の質量を測定することが可能である。これによって、例えば、直接的なリン酸の切断例えば5’または3’エキソヌクレアーゼ切断による場合、あるいは環状リン酸の形成を介して2’OHによって仲介される場合など、切断の機構を決定することが可能である。他の実施形態では、切断部位に関する情報を使用して、修飾、例えば切断を低減させる修飾のための骨格の原子、糖または塩基を選択する。代表的な修飾は、本明細書に記載する修飾など、エンドヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾を含む。特に好ましい修飾には、2’修飾、例えば2’-O-メチル化ヌクレオチドまたは2’-デオキシヌクレオチド例えば2’デオキシ-シトジン、または2’-フルオロ、ジフルオロトルイル、5-Me-2’-ピリミジン、5-アリルアミノ-ピリミジン、2’-O-メトキシエチル、2’-ヒドロキシ、または2’-アラ-フルオロヌクレオチド、またはロック型核酸LNA、拡張型核酸ENA、ヘキソース核酸HNA、またはシクロヘキセン核酸CeNAがある。1実施形態では、2’修飾は少なくとも1つの5’-ウリジン-アデニン-3’5’-UA-3’ジヌクレオチド、少なくとも1つの5’-ウリジン-グアニン-3’5’-UG-3’ジヌクレオチド、少なくとも1つの5’-ウリジン-ウリジン-3’5’-UU-3’ジヌクレオチド、または少なくとも1つの5’-ウリジン-シチジン-3’5’-UC-3’ジヌクレオチドのウリジン上、あるいは少なくとも1つの5’-シチジン-アデニン-3’5’-CA-3’ジヌクレオチド、少なくとも1つの5’-シチジン-シチジン-3’5’-CC-3’ジヌクレオチド、または少なくとも1つの5’-シチジン-ウリジン-3’5’-CU-3’ジヌクレオチドのシチジン上に存在する。2’修飾を、iRNA物質中の全てのピリミジンに施すことも可能である。1つの好ましい実施形態では、2’修飾はiRNA物質のセンス鎖上の2’OMe修飾である。より好ましい実施形態では、2’修飾は2’フルオロ修飾であり、2’フルオロはセンス鎖またはアンチセンス鎖、あるいは両方の鎖上に存在する。骨格の修飾、例えばリン酸骨格においてOをSで置換することによる修飾、例えばホスホロチオエート修飾の提供を使用して、エンドヌクレアーゼ活性を阻害することが可能である。幾つかの実施形態では、1つまたは複数のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換することによって、iRNA物質を修飾している。隣接するデオキシリボヌクレオチドがホスホロチオエート結合によって結合し、iRNA物質がセンス鎖またはアンチセンス鎖上に4個を超える連続したデオキシリボヌクレオチドを含まないことが好ましい。C5アミノリンカーでUを置換すること;GでAを置換すること配列の変更はアンチセンス鎖上ではなくセンス鎖上に存在することが好ましい、あるいは2’、6’、7’、または8’位置で糖を修飾することにより、iRNA物質のエンドヌクレアーゼによる切断を阻害することも可能である。好ましい実施形態は、1つまたは複数のこれらの修飾がアンチセンス鎖上ではなくセンス鎖上に存在する実施形態、またはアンチセンス鎖ではこのような修飾がより少ない実施形態である。代表的な修飾は、エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾も含む。エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は、本明細書において見ることが可能である。1実施形態では、iRNA物質は、iRNA物質の1つまたは複数の末端ヌクレオチド間の結合に、ホスホロチオエート結合またはP-アルキル修飾を含む。他の実施形態では、iRNA物質の1つまたは複数の末端ヌクレオチドは、糖の修飾、例えば2’または3’糖修飾を含む。代表的な糖修飾体には、例えば2’-O-メチル化ヌクレオチド、2’-デオキシヌクレオチド例えばデオキシ-シトジン、2’-デオキシ-2’-フルオロ2’-Fヌクレオチド、2’-O-メトキシエチル2’-O-MOE、2’-O-アミノプロピル2’-O-AP、2’-O-N-メチルアセタミド2’-O-NMA、2’-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル2’-DMAEOE、2’-O-ジメチルアミノエチル2’-O-DMAOE、2’-O-ジメチルアミノプロピル2’-O-AP、2’-ヒドロキシヌクレオチド、または2’-アラ-フルオロヌクレオチド、またはロック型核酸LNA、拡張型核酸ENA、ヘキソース核酸HNA、またはシクロヘキセン核酸CeNAがある。2’修飾は2’OMeであることが好ましく、2’フルオロであることがより好ましい。エキソヌクレアーゼによる切断を阻害すると報告されている修飾を、1つのiRNA物質上で組み合わせることも可能である。例えば1実施形態では、iRNA物質の少なくとも1つの末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合と2’糖修飾例えば2’Fまたは2’OMe修飾とを有する。他の実施形態では、iRNA物質の少なくとも1つの末端ヌクレオチドが、5’Me-ピリミジンと2’糖修飾例えば2’Fまたは2’OMe修飾とを有する。エキソヌクレアーゼによる切断を阻害するために、iRNA物質は、核酸塩基の修飾、例えば3’脱塩基性のカチオン修飾などのカチオン修飾などを含むことが可能である。カチオン修飾は、iRNA物質の1つまたは複数の末端ヌクレオチド上の、例えばアルキルアミノ-dT例えばC6アミノ-dT、アリルアミノ結合体、ピロリジン結合体、フタルアミドまたはヒドロキシプロリノール結合体であってよい。アルキルアミノ-dT結合体は、iRNA物質のセンス鎖またはアンチセンス鎖の3’端に結合していることが好ましい。ピロリジンリンカーは、センス鎖の3’または5’端、あるいはアンチセンス鎖の3’端に結合していることが好ましい。アリルアミンウリジンは、センス鎖の3’または5’端に存在し、アンチセンス鎖の5’端には存在しないことが好ましい。他の実施形態ではiRNA物質は、iRNA物質の1つまたは複数の末端ヌクレオチド上に結合体を含む。結合体は、例えば親油性物質、テルペン、タンパク質結合物質、ビタミン、炭水化物、レチノイドまたはペプチドであってよい。例えば結合体は、ナプロキセン、ニトロインドールまたはスタッキング相互作用に貢献する他の結合体、葉酸、イブプロフェン、コレステロール、レチノイド、PEG、またはC5ピリミジンリンカーであってよい。他の実施形態では、結合体はグリセリド脂質結合体例えばジアルキルグリセリド誘導体、ビタミンE結合体、またはチオコレステロールである。結合体はアンチセンス鎖の3’端、あるいはセンス鎖の5’または3’端に存在することが好ましく、結合体はアンチセンス鎖の3’端、およびセンス鎖の3’端には存在しないことが好ましい。1実施形態では、結合体はナプロキセンであり、結合体はセンス鎖またはアンチセンス鎖の5’または3’端に存在することが好ましい。1実施形態では、結合体はコレステロールであり、結合体はセンス鎖の5’または3’端に存在することが好ましく、アンチセンス鎖には存在しないことが好ましい。幾つかの実施形態では、コレステロールは、ピロリジンリンカー、またはセリノールリンカー、アミノオキシ、またはヒドロキシプロリノールリンカーによってiRNA物質と結合している。他の実施形態では、結合体はdU-コレステロールであり、あるいはコレステロールがジスルフィド結合によってiRNA物質と結合している。他の実施形態では、結合体はコラン酸であり、コラン酸はセンス鎖の5’または3’端、あるいはアンチセンス鎖の3’端と結合している。1実施形態では、コラン酸はセンス鎖の3’端、およびアンチセンス鎖の3’端と結合している。他の実施形態では、結合体はPEG5、PEG20、ナプロキセンまたはレチナールである。他の実施形態では、1つまたは複数の末端ヌクレオチドは2’-5’結合を有する。2’-5’結合はセンス鎖上、例えばセンス鎖の5’端上に存在することが好ましい。1実施形態では、iRNA物質はL-糖を、好ましくはセンス鎖の5’または3’端に含む。1実施形態では、iRNA物質は、エキソヌクレアーゼ耐性を増大させるために1つまたは複数の末端ヌクレオチドに、例えばiRNA物質のセンス鎖またはアンチセンス鎖の3’端にメチルホスホネートを含む。1実施形態では、iRNA物質は、1つまたは複数のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換することによって修飾されている。隣接するデオキシリボヌクレオチドをホスホロチオエート結合によって連結し、iRNA物質が4個を超える連続したデオキシリボヌクレオチドをセンス鎖またはアンチセンス鎖上に含まないことが好ましい。幾つかの実施形態では、細胞および生物サンプル中での高い安定性を有するiRNA物質は、ジフルオロトルイルDFT修飾、例えば2,4-ジフルオロトルイルウラシル、またはグアニジンのイノシンへの置換を含む。記載の方法を使用して、治療用dsRNA、例えばiRNA物質を選択および/または最適化することが可能である。本明細書に記載の方法によって作製されたdsRNA、例えばiRNA物質は、本発明の範囲内にある。これらの方法を使用して、候補のdsRNA例えば候補iRNA物質であって非修飾状態であるか、あるいは修飾例えば分解を阻害する修飾、dsRNA分子を標的化する修飾、あるいはハイブリダイゼーションを調節する修飾を含むものを評価することが可能である。このような修飾は本明細書に記載されている。切断アッセイを、修飾または非修飾の候補体が標的を発現抑制する能力を決定するアッセイと組み合わせることも可能である。例えば、候補物を任意選択で試験して、標的または標的外配列を発現抑制する該候補物の能力を評価すること、切断に対する該候補物の感受性を評価すること、該候補物に例えば分解を阻害するために、例えば本明細書に記載するようにして修飾を施して修飾候補物を生成すること、この修飾候補物を、発現抑制の能力および分解に抵抗する能力のうち一方または両方に関して試験することが可能であると思われる。この手順を繰り返すことも可能である。修飾は1度に1つ導入してもよいし、まとめて導入してもよい。細胞を用いる方法を使用して標的RNAを発現抑制する能力を調べると、好都合であることが多いと思われる。この後に様々な方法、例えば動物全体を用いる方法を行って、活性を確認することが可能である。本発明は、本明細書に記載の方法によって得られた切断部位に関する情報を使用して、dsRNA、例えばiRNA物質を修飾することを含む。本発明の核酸分子の活性の最適化修飾塩基、糖および/またはリン酸を備えた核酸分子を化学合成することにより、血清リボヌクレアーゼによる核酸分子の分解を妨げ、該分子の効能を高める可能性がある例えば、エクシュタインらEcksteinetal、国際公開第92/07065号パンフレット;ペルラウルトらPerraultetal、Nature344:565、1990;ピーケンらPhiekenetal、Science253:314、1991;ユースマンおよびセデルグレンUsmanandCedergren、TrendsinBiochem.Sci.17:334、1992;ユースマンらUsmanetal、国際公開第93/15187号パンフレット;およびロッシらRossietal、国際公開第91/03162号パンフレット;スプロートSproat、米国特許第5,334,711号明細書;ゴールドらGoldetal、米国特許第6,300,074号明細書;およびブルジンらBurginetal、上記を参照されたい;これらは全て本願明細書に援用する。全ての前述の参照文献に、本明細書に記載の核酸分子の塩基、リン酸および/または糖部分に施すことが可能な種々の化学修飾が記載されている。細胞内でのそれらの有効性を高める修飾、ならびにオリゴヌクレオチド合成時間を短縮し化学的要件を減らすための核酸分子からの塩基の除去が望まれる。iRNA物質の糖、塩基、または骨格に対する他の適切な修飾は、本明細書の他の箇所に記載する。核酸分子のヌクレアーゼ安定性および有効性の有意な増大を伴って核酸分子に導入することができる糖、塩基およびリン酸修飾について報告する幾つかの例が当分野に存在している。例えば、オリゴヌクレオチドを修飾して安定性を増大させ、かつ/またはヌクレアーゼ耐性の基、例えば2’-アミノ、2’-C-アリル、2’-フルオロ、2’-O-メチル、2’-O-アリル、2’-H、ヌクレオチド塩基修飾を用いた修飾によって生物学的活性を増大させる総説に関しては、ユースマンおよびセデルグレンUsmanandCedergren、TrendsinBiochem.Sci.17:34、1992;ユースマンらUsmanetal.、NucleicAcidsSymp.Ser.31:163、1994;ブルジンらBurginetal.、Biochemistry35:14090、1996を参照。核酸分子の糖修飾は、当分野において広く報告されているエクシュタインらEcksteinetal.、国際公開第92/07065号パンフレット;ペルラウルトらPerraultetal.、Nature344:565、1990;ピーケンらPiekenetal.、Science253:314、1991;ユースマンおよびセデルグレンUsmanandCedergren、TrendsinBiochem.Sci.17:334、1992;ユースマンらUsmanetal.、国際公開第93/15187号パンフレット;スプロートSproat、米国特許第5,334,711号明細書、およびビーグルマンらBeigelmanetal.、J.Biol.Chem.270:25702、1995;ビーグルマンらBeigelmanetal.、国際公開第97/26270号パンフレット;ビーグルマンらBeigelmanetal.、米国特許第5,716,824号明細書;ユースマンらUsmanetal.、米国特許第5,627,053号明細書;ウルフらWoolfetal.、国際公開第98/13526号パンフレット;カルペイスキーらKarpeiskyetal.、TetrahedronLett.39:1131、1998;エアルンショーおよびゲイトEarnshawandGait、BiopolymersNucleicAcidSciences48:39、1998;ベルマおよびエックシュタインVermaandEckstein、Annu.Rev.Biochem.67:99、1998;およびブルリーナらBurlinaetal.、Bioorg.Med.Chem.5:1999、1997を参照;これらの参照文献は全て、その全容を本願明細書に援用する。このような刊行物には、触媒反応を変化させずに核酸分子中への糖、塩基、および/またはリン酸修飾などの取り込み位置を決定するための一般的な方法および戦略が記載されており、これらの参照文献は本願明細書に援用する。このような教示を鑑みると、細胞内でRNAiを促進するiRNA物質の能力が著しく阻害されない限りは、本発明のiRNA核酸分子を修飾するために、類似の修飾を本明細書に記載したのと同様に使用することが可能である。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および/または5’-メチルホスホネート結合によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学修飾は、安定性を増大させるが、過剰な修飾は何らかの毒性または活性の低下を引き起こす可能性がある。したがって、核酸分子を設計するときは、これらのヌクレオチド間結合の量は最少限でなければならない。これらの結合の濃度を低下させれば、毒性が低下し、これらの分子の有効性の増大および高い特異性をもたらすはずである。iRNA物質の3’および5’端は修飾することが可能である。このような修飾は、分子の3’端、5’端あるいは両端にあってよい。このような修飾は、末端のリン酸全体、あるいはリン酸基の1つまたは複数の原子の修飾または置換を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドの3’および5’端を、他の官能性分子体、例えば標識成分、例えば蛍光物質例えばピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3またはCy5色素あるいは保護基例えばイオウ系、シリコン系、ホウ素系またはエステル系などと結合させることが可能である。官能性分子体は、リン酸基および/またはスペーサーを介して糖と結合させることが可能である。スペーサーの末端原子は、リン酸基または糖のC-3’もしくはC-5’のO、N、S、C基の結合原子と結合することが可能であり、あるいは該結合原子を置換することが可能である。あるいはスペーサーは、ヌクレオチド代用物例えばPNAの末端原子と結合することが可能であり、あるいは該末端原子を置換することが可能である。これらのスペーサーまたはリンカーは、例えば-CH2n-、-CH2nN-、-CH2nO-、-CH2nS-、OCH2CH2OnCH2CH2OH例えばn=3または6、脱塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノ、またはビオチンおよびフルオレセイン試薬を含み得る。スペーサー/リン酸-官能性分子体-スペーサー/リン酸の配列構成をiRNA物質の2つの配列間に挿入すると、該配列構成はヘアピン型RNA物質中のヘアピンRNAループの代用となり得る。3’端は-OH基であってよい。理論によって縛られることは望まないが、ある種の成分を結合すると、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性に関する特性を改善し得ると考えられる。同様に、理論によって縛られることは望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善するような末端の改変を導入することは、望ましい可能性がある。末端修飾の他の例には、色素、インターカレート剤例えばアクリジン、架橋剤例えばソラレン、マイトマイシンC、ポルフィリンTPPC4、テキサフィリン、サフィリン、多環式芳香族炭化水素例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン、人工エンドヌクレアーゼ例えばEDTA、親油性担体例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-Oヘキサデシルグリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メタノール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-オレオイルリトコール酸、O3-オレオイルコレイン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンおよびペプチド結合体例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、PEG例えばPEG-40K、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン例えばビオチン、輸送/吸収促進物質例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸、および合成リボヌクレアーゼ例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン-イミダゾール結合体、テトラアザ大環状化合物のEu3結合体がある。幾つかの実施形態では、レチノールまたはレチノイン酸などの結合体を、iRNA物質の5’または3’端、あるいは両端と結合させることが可能である。このような結合体の使用により、網膜色素上皮細胞などのレチノール受容体を発現する細胞への、iRNA物質の特異的な取り込みおよび送達を改善し得る。活性を調節するためあるいは分解に対する耐性を調節するためなどの幾つかの理由で、末端修飾を加えることが可能である。活性を調節するのに有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体を用いた5’端の修飾がある。例えば好ましい実施形態では、iRNA物質、特にアンチセンス配列が、5’リン酸化を受けるか、あるいは5’の最末端にホスホリル類似体を含む。5’リン酸修飾には、RISC仲介型遺伝子発現抑制と適合性のある修飾が挙げられる。適切な修飾には:5’-1リン酸HO2OP-O-5’;5’-2リン酸HO2OP-O-PHOO-O-5’;5’-3リン酸HO2OP-O-HOOP-O-PHOO-O-5’;5’-グアノシンキャップ7-メチル化または非メチル化7m-G-O-5’-HOOP-O-HOOP-O-PHOO-O-5’;5’-アデノシンキャップAppp、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造N-O-5’-HOOP-O-HOOP-O-PHOO-O-5’;5’-モノチオリン酸ホスホロチオエート;HO2SP-O-5’;5’-モノジチオリン酸ホスホロジチオエート;HOHSSP-O-5’、5’-ホスホロチオレートHO2OP-S-5’;酸素/イオウ置換された1リン酸、2リン酸および3リン酸例えば5’-α-チオ3リン酸、5’-γ-チオ3リン酸など、5’-ホスホロアミダイトHO2OP-NH-5’、HONH2OP-O-5’、5’-アルキルリン酸R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えばRPOHO-O-5’-、OH2OP-5’-CH2-、5’-アルキルエーテルホスホネートR=アルキルエーテル=メトキシメチルMeOCH2-、エトキシメチルなど、例えばRPOHO-O-5’-の任意の他の組合せがある。他の実施形態では本発明は、本発明のiRNA物質の結合体および/または複合体を特徴とする。このような結合体および/または複合体を使用して、細胞などの生物系へのiRNA物質の送達を容易にすることが可能である。本発明により提供される結合体および複合体は、細胞膜を横断して治療用化合物を移送すること、薬物動態を変えること、および/または本発明の核酸分子の局在化を調節することによって治療活性を与え得る。本発明は、小分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負に帯電したポリマーおよび他のポリマー、例えばタンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、またはポリアミンなどこれらに限定はされないの分子を、細胞膜を横断して送達するための、新規な結合体および複合体の設計および合成を含む。一般に、記載の輸送体は、分解性リンカーを用いて、または用いずに、単独あるいは多成分系の一部として使用するように設計される。これらの化合物は、血清の存在下または不在下において、異なる組織に由来する幾つかの種類の細胞への本発明の核酸分子の送達および/または局在化を改善すると予想されるシュレンジャーおよびチェックSullengerandCech、米国特許第5,854,038号明細書を参照。本明細書に記載する分子の結合体は、生分解性核酸リンカー分子などの生分解性のリンカーを介して、生物学的に活性がある分子と結合させることが可能である。iRNA物質の投与望ましくないVEGF発現を特徴とする障害を有すると診断された患者は、VEGFの悪影響を阻害することによって望ましくないVEGF遺伝子発現と関係がある症状を軽減するために、本明細書に記載するiRNA物質を投与することによって、治療することが可能である。例えばiRNA物質は、血管新生障害などの眼の疾患と関係がある症状を軽減することが可能である。他の例では、結腸がんまたは乳がんなどの腫瘍または転移性がん;喘息または気管支炎などの肺疾患;または関節リウマチまたは乾癬などの自己免疫疾患を有する患者を治療するために、iRNA物質を投与することが可能である。抗VEGFiRNA物質は、全身に、例えば経口で、または筋肉内注射によって、あるいは静脈内注射によって、投与経路に合った、薬剤として許容可能な担体と混合して投与することが可能である。iRNA物質は、対象に投与するためのリポソームなどの送達用ビヒクル、担体および希釈剤およびそれらの塩を含んでよく、かつ/あるいは薬剤として許容可能な調合物中に存在していてもよい。核酸分子を送達するための方法は、いずれも本願明細書に援用する、アクハターらAkhtaretal.、TrendsinCellBio.2:139、1992;DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics、アクハターAkhtar編、1995;マウラーらMaureretal.、Mol.Membr:Biol.、16:129、1999;ホフランドおよびフアングHoflandandHuang、Handb.Exp.Pharmacol.137:165、1999;およびリーらLeeetal.、ACSSymp.Ser.752:184、2000に記載されている。ベイゲルマンらBeigelmanetal、米国特許第6,395,713号明細書、およびスリバンらSullivanetal、国際公開第94/02595号パンフレットには、核酸分子を送達するための一般的な方法がさらに記載されている。核酸分子は、当業者に知られているさまざまな方法によって、例えば、リポソーム封入、イオン導入法、またはその他のビヒクル、例えばヒドロゲル、シクロデキストリン例えば、ゴンザレスらGonzalezetal.、BioconjugateChem.10:1068、1999を参照、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアへの組み込み、またはタンパク質様ベクターオーハーレおよびノルマンドO’HareandNormand、国際公開第00/53722号パンフレットなどこれらに限定はされないによって、細胞に投与することが可能である。本発明の方法では、iRNA物質を、裸のiRNA物質として送達用試薬と共に、あるいはiRNA物質を発現する組換えプラスミドまたはウイルスベクターとして、対象に投与することが可能である。iRNA物質は、裸のiRNAとして投与することが好ましい。本発明のiRNA物質を、望ましくないVEGF発現が存在する領域またはその近辺、例えば血管新生の領域またはその近辺などの組織の細胞へiRNA物質を送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することが可能である。例えば、遺伝子ガン、エレクトロポレーションによって、あるいは他の適切な非経口投与経路によって、iRNA物質を投与することが可能である。適切な経腸投与経路には経口送達が挙げられる。適切な非経口投与経路には、血管内投与例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管へのカテーテル注入;組織周囲および組織内への注射例えば、眼内注射、網膜内注射、または網膜下注射;皮下への注射またはデポー、例えば皮下注入浸透圧ポンプなどによる;血管新生部位またはその近辺の領域への直接施用、例えばカテーテルまたは他の配置式デバイス例えば、多孔質、非多孔質、またはゼラチン材料を含んでなる網膜用ペレットまたはインプラントによる施用、がある。血管新生部位またはその近辺にiRNA物質を注射または注入することが好ましい。本発明のiRNA物質は、眼内インプラントを使用して送達することが可能である。このようなインプラントは生分解性および/または生体適合性インプラントであってもよいし、あるいは非生分解性インプラントであってもよい。インプラントは活性物質に対して透過性でも非透過性であってよく、前房または後房などの眼房に挿入されてもよいし、あるいは強膜、経脈絡膜空間、または硝子体外側の無血管野に移植されてもよい。好ましい実施形態では、治療が望ましい部位、例えば眼の眼内空間および黄斑へ薬剤が強膜を経て拡散しうるように、強膜上などの無血管野にインプラントを配置することが可能である。さらに、経強膜拡散の部位は黄斑の近辺であることが好ましい。本発明のiRNA物質は、例えばパッチまたは眼への直接施用により、あるいはイオン導入法によって、局所投与することも可能である。軟膏剤、スプレー、または滴下可能な液体は、アプリケータまたは点眼器などの当分野で知られている眼部送達系によって送達することが可能である。該組成物を眼の表面に、あるいは瞼の内部に直接投与することも可能である。このような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリビニルアルコールなどのムコ多糖類似体、ソルビン酸、EDTAまたは塩化ベンジルクロムなどの保存剤、ならびに通常量の希釈剤および/または担体を含み得る。本発明のiRNA物質は、例えば米国特許第5,672,659号および米国特許第5,595,760号明細書に記載された組成物などの、徐放性組成物に含めて提供することが可能である。即放性または徐放性組成物の使用は、治療する状態の性質に依存する。状態が急性または超急性の障害で構成される場合、徐放性組成物よりも即放性の形態を用いる治療が好ましいと思われる。あるいは、ある種の予防的治療または長期治療に関しては、徐放性組成物が適切である場合がある。ニードルまたは他の送達用デバイスなどを用いて、眼の内部にiRNA物質を注射することが可能である。本発明のiRNA物質は、単回用量または複数回用量として投与することが可能である。本発明のiRNA物質の投与が注入による場合、その注入は単回の徐放性投与であってもよいし、あるいは複数回の注入によって送達されてもよい。血管新生部位またはその近辺の組織に本発明の物質を直接注射することが好ましい。血管新生部位またはその近辺の組織に本発明の物質を複数回注射することも好ましい。投与1回当たり体重に対して約1μg/kg~100mg/kg程度の用量レベルが、血管新生疾患の治療において有用である。眼に直接投与するとき、好ましい用量範囲は片眼当たり約0.00001mg~約3mg、あるいは好ましくは片眼当たり約0.0001~0.001mg、片眼当たり約0.03~3.0mg、片眼当たり約0.1~3.0mgあるいは片眼当たり約0.3~3.0mgである。当業者は、本発明のiRNA物質をある対象に投与するための適切な投与計画を、容易に決定することも可能である。例えばiRNA物質を、例えば血管新生部位またはその近辺への単回の注射またはデポーとして、対象に1回投与することが可能である。あるいはiRNA物質を、約3~約28日、より好ましくは約7~約10日の期間、1日1回または2回対象に投与することが可能である。好ましい投与計画では、iRNA物質を、望ましくないVEGF発現の部位またはその近辺血管新生部位の近辺などに、1日1回、7日間注射する。投与計画が複数回投与を含んでなる場合、対象に投与される有効量のiRNA物質とは、投与計画全体で投与されるiRNA物質の総量を含み得ることは理解されよう。当業者には当然のことであるが、投与される特定のiRNA物質、投与の時間、投与の経路、調合物の性質、排泄速度、治療される特定の障害、疾患の重篤度、iRNA物質の薬力学的作用、ならびに患者の年齢、性別、体重、および一般的健康状態を含めたさまざまな要因に応じて、正確な個々の用量をある程度調節することが可能である。さまざまな投与経路の異なる有効性を鑑みると、必要な用量レベルは広範囲に変化することが予想される。例えば、経口投与は一般に、静脈内または硝子体内への注射による投与より高い用量レベルを必要とすると予想されるであろう。これらの用量レベルの変化は、当分野でよく知られている標準的かつ日常的な最適化実験を使用して調節することが可能である。正確な治療上有効な用量レベルおよび投与パターンは、上記に定義した要因を考慮して主治医により決定されることが好ましい。既存の血管新生疾患を治療すること以外に、本発明のiRNA物質を予防的に投与して、これらの障害および関連障害の発症を予防するかあるいは遅延させることが可能である。予防用途では、特定の血管新生性障害に罹患しやすいか、そうでなければそのリスクのある患者に、本発明のiRNAを投与する。本発明により特徴付けられるiRNA物質は、対象に投与する前に、当分野で知られている技法に従って医薬組成物として調合されることが好ましい。本発明の医薬組成物は、少なくとも滅菌状態で発熱物質を含まないことを特徴とする。本明細書で使用する医薬調合物医薬製剤とは、ヒトおよび家畜に使用するための調合物を含む。本発明の医薬組成物を調製するための方法は、当分野の技術の範囲内にあり、例えばその全開示を本願明細書に援用する、Remington’sPharmaceuticalScience、第18版、米国ペンシルバニア州イーストン所在のマック出版社MackPublishingCompany、1990年、およびTheScienceandPracticeofPharmacy、2003、ゲンナロらGennaroetal.に記載されているものである。本発明の医薬調合物は、本発明のiRNA物質例えば0.1~90重量、または生理的に許容可能なその塩を、生理的に許容可能な担体媒体と混合させた状態で含む。好ましい生理的に許容可能な担体媒体は、水、緩衝水溶液、通常の生理食塩水、0.4生理食塩水、0.3グリシン、ヒアルロン酸などである。本発明の医薬組成物は、従来の医薬品賦形剤および/または医薬品添加剤も含み得る。適切な医薬品賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節物質、緩衝剤、およびpH調節剤がある。適切な添加剤には、生理的に生体適合性である緩衝剤例えば、トロメタミン塩酸塩、キレート剤例えば、DTPAまたはDTPA-ビスアミドなどの添加、またはカルシウムキレート複合体例えば、カルシウムDTPA、CaNaDTPA-ビスアミドなど、あるいは任意選択で、カルシウム塩またはナトリウム塩例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウムの添加がある。本発明の医薬組成物は、液体形態で使用するために包装することが可能であり、あるいは凍結乾燥させることも可能である。固形組成物用に、従来の非毒性の固形担体;例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを使用することが可能である。例えば、経口投与用の固形医薬組成物は、上記に列挙した担体および賦形剤のいずれかと、10~95、好ましくは25~75の1つまたは複数の本発明のiRNA物質とを含み得る。薬剤として許容可能な調合物とは、本発明の核酸分子が該分子の望ましい活性に最も適した物理的位置に有効に分布することを可能にする組成物または調合物を意味する。本発明の核酸分子と調合するのに適した物質の非制限的な例には、CNSへの薬物の進入を増大させることが可能なP-糖タンパク質阻害剤Pluronic登録商標P85などジョリエット-リアントおよびティレメントJolliet-RiantandTillement、Fundam.Clin.Pharmacol.13:16、1999、徐放送達用のポリDL-ラクチド-コグリコリドミクロスフェアなどの生分解性ポリマーがある。本発明の核酸分子の送達戦略に関する他の非制限的な例には、ボアドらBoadoetal.、J.Pharm.Sci.87:1308、1998;タイラーらTyleretal.、FEBSLett.421:280、1999;パルドリッジらPardridgeetal.、PNASUSA.92:5592、1995;ボアドBoado、Adv.DrugDeliveryRev.15:73、1995;アルドリアン-ヘルラダらAldrian-Herradaetal.、NucleicAcidsRes.26:4910、1998;およびタイラーらTyleretal.、PNASUSA96:7053、1999中に記載された物質がある。本発明はさらに、ポリエチレングリコール脂質を含む表面修飾リポソームPEG修飾リポソーム、あるいは長期循環リポソームまたはステルスリポソームを含む組成物の使用を特徴とする。これらの調合物は、標的組織中の薬物の蓄積を増大させるための方法をもたらす。この種の薬物担体は単核性食細胞系MPSまたはRESによるオプソニン作用および除去に耐性があり、したがって血中循環時間の延長および組織の封入薬物への暴露の増大を可能にするラジックらLasicetal.、Chem.Rev.95:2601、1995;イシワタらIshiwataetal.、Chem.Phare.Bull.43:1005、1995。このようなリポソームは、おそらく血管外漏出および血管が新生された標的組織における捕捉によって、腫瘍中に選択的に蓄積することが示されているラジックらLasicetal.、Science267:1275、1995;オクらOkuetal.、Biochim.Biophys.Acta1238:86、1995。長期循環リポソームは、特にMPSの組織中に蓄積することが知られている従来のカチオンリポソームと比較して、DNAおよびRNAの薬物動態および薬力学的作用を高めるリウらLiuetal.、J.Biol.Chem.42:24864、1995;コイらChoietal.、国際公開第96/10391号パンフレット;アンセルらAnselletal.、国際公開第96/10390号パンフレット;ホランドらHollandetal.、国際公開第96/10392号パンフレット。長期循環リポソームは、肝臓および脾臓などの代謝が活発なMPS組織への蓄積を回避する能力に基づいて、カチオンリポソームよりも強力にヌクレアーゼ分解から薬物を保護する可能性もある。本発明は、薬剤として許容可能な担体または希釈剤中に薬剤として有効な量の所望の化合物を含む、保存または投与用に調製された組成物も含む。治療用途に関して許容可能な担体または希釈剤は、薬学の分野でよく知られており、例えば本願明細書に援用するRemington’sPharmaceuticalSciences、マック出版社MackPublishingCo.エイ.アール.ゲンナロA.R.Gennaro編、1985に記載されている。例えば、保存剤、安定剤、色素および着香剤を与えることが可能である。これらは安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびp-ヒドロキシ安息香酸のエステルなどである。さらに、抗酸化剤および懸濁剤を使用することが可能である。本発明の核酸分子を、他の治療用化合物と組み合わせて対象に投与して、全体的な治療効果を高めることも可能である。多数の化合物を使用して徴候を治療することによって、副作用の存在を減らしながら有益な効果を高めることが可能である。あるいは、本発明のある種のiRNA物質を、細胞内で真核生物プロモーターから発現させることが可能である例えば、アイザントおよびバイントラウブIzantandWeintraub、Science229:345、1985;マクギャリーおよびリンドクイストMcGarryandLindquist、Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:399、1986;スカンロンらScanlonetal.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10591、1991;カシャニ-サベットらKashani-Sabetetal.、AntisenseRes.Dev.2:3、1992;ドロプリックらDropulicetal.、J.Virol.66:1432、1992;ベエラシンゲらWeerasingheetal.、J.Virol.65:5531、1991;オージェーバンジェットらOjwangetal.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10802、1992;チェンらChenetal.、NucleicAcidsRes.20:4581、1992;サルバーらSarveretal.、Science247:1222、1990;トンプソンらThompsonetal.、NucleicAcidsRes.23:2259、1995;グッドらGoodetal.、GeneTherapy4:45、1997。当業者であれば理解していることであるが、任意の核酸を、真核生物細胞中で適切なDNA/RNAベクターから発現させることが可能である。このような核酸の活性は、該核酸を酵素的核酸により一次転写産物から放出させることによって増大し得るドレーパーらDraperetal.、国際公開第93/23569号パンフレット、およびスリバンらSullivanetal.、国際公開第94/02595号パンフレット;オオカワらOhkawaetal.、NucleicAcidsSymp.Ser.27:156、1992;タイラらTairaetal.、NucleicAcidsRes.19:5125、1991;ベンチュラらVenturaetal.、NucleicAcidsRes.21:3249、1993;コブリアらChowriraetal.、J.Biol.Chem.269:25856、1994。本発明の他の態様では、本発明のRNA分子は、DNAまたはRNAベクター中に挿入した転写ユニット例えば、カウチュレらCoutureetal.、TrendsinGenetics12:510、1996を参照から発現させることが可能である。組換えベクターはDNAプラスミドまたはウイルスベクターであってよい。iRNA物質を発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスこれらに限定はされないに基づいて構築することが可能である。他の実施形態では、polIII系構築体を使用して本発明の核酸分子を発現させる例えば、トンプソンThompson、米国特許第5,902,880号明細書および同第6,146,886号明細書を参照。iRNA物質を発現することが可能な組換えベクターを上述のように送達し、標的細胞中に維持することが可能である。あるいは、核酸分子の一過性の発現をもたらすウイルスベクターを使用することも可能である。このようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することが可能である。ひとたび発現すると、iRNA物質は標的mRNAと相互作用し、RNAi応答を生じる。iRNA物質発現ベクターの送達は、全身的、例えば静脈内または筋肉内投与、対象から外部移植した標的細胞に投与した後の対象への再導入、あるいは所望の標的細胞への導入を可能にすると思われる任意の他の手段総説に関しては、カウチュレらCoutureetal.、TrendsinGenetics12:510、1996を参照などによるものよい。本発明のiRNA物質の他の眼部適応症には、増殖性糖尿病性網膜症糖尿病性網膜症の最も重度の段階、ブドウ膜炎黄斑浮腫をもたらすことが多い眼の炎症状態、白内障手術後ののう胞状黄斑浮腫、近視性変性高度の近視を有する患者が脈絡膜の血管新生を発症する状態、炎症性黄斑変性症感染または他の原因のため黄斑領域に炎症を有する患者が、脈絡膜の血管新生を発症する状態、および虹彩の血管新生虹彩の表面上の新しい血管の成長を伴う、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉鎖症の重大な合併症がある。本発明のiRNA物質の他の眼部以外の適応症には、腎臓がんおよび結腸がんなどこれらに限定はされないのがん、ならびに乾癬がある。固形腫瘍およびその転移は、該腫瘍が生存するための新しい血管の成長に依存する。乾癬は、皮膚細胞を過度に速く増殖させ、その結果濃い白色または赤色の皮膚の斑点を生じる、慢性的な炎症性皮膚疾患である。前臨床および臨床データから、VEGF誘導型の血管の成長および血管の漏出が、この病態の進行において役割を果たすことが示唆されている。本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、これらの実施例はさらに限定するものとして解釈すべきではない。siRNAの設計VEGF-A121mRNA配列のエクソン1~5内の400個の標的配列を同定し表1参照、配列番号2~401、これらを標的とする、対応するsiRNAをバイオインフォマティクススクリーニングに供した。配列がVEGF配列に特異的であり、他のいかなる遺伝子由来の配列にも特異的ではないことを裏付けるために、上記標的配列を、NCBI提供のBLAST検索エンジンを使用してGenbankの配列に対して調べた。BLASTアルゴリズムの使用については、アルトシュールらAltschuletal.、J.Mol.Biol.215:403、1990;ならびにアルトシュールおよびギッシュAltschulandGish、Meth.Enzymol.266:460、1996に記載されている。siRNAがサル、ラットおよびヒトのVEGF配列と交差反応する能力に関して、siRNAの優先順位の付与も実施した。少数のリード候補物を同定するために、これら400個の標的配列候補のうち、実験的スクリーニングによる分析用に80個を選択した。これら80個の標的配列114について、合計114個のsiRNA分子を設計した表2。siRNAオリゴヌクレオチドの合成Expedite商標8909、ABI392およびABI394合成装置ドイツ国64293、ダルムスタット、フランクフルターシュトラーセFrankfurterStr.129b所在のアプライドバイオシステムAppliedBiosystems、アプレラドイツランドゲーエムベーハーAppleraDeutschlandGmbHで、CPG固形支持体およびExpedite商標RNAホスホロアミダイトいずれもプロリゴバイオケミーゲーエムベーハーProligoBiochemieGmbH、ドイツ国ハンブルグ、ゲオルグハイケンシュトラーセ14Georg-Hyken-Str.14から入手を使用して、1μmoleスケールでRNAを合成した。補助試薬は、マリンクロートバーケルMallinckrodtBakerドイツ国64347、グリーズハイムGriesheim、イムロイシュネルパルク4ImLeuschnerpark4から得た。ホスホロチオエート結合は、酸化ヨウ素溶液を、アセトニトリルに溶かしたBeaucage試薬5、重量/体積の溶液で置換することによって導入した。固形支持体からのオリゴリボヌクレオチドの切断および塩基の脱保護は、水中メチルアミン41とエタノール中メチルアミン33の3:1v/v混合物を用いて実施した。2’-脱シリル化は、確立された手順ビンコットらWincottetal.、NucleicAcidsRes.23:2677~2684、1995に従って行った。粗製オリゴリボヌクレオチドは、22×250mmのDNAPac登録商標PA100カラムを使用して、10mMのNaClO4、20mMのTrispH6.8、6Mの尿素を含むバッファーA、および400mMのNaClO4、20mMのTrispH6.8、6Mの尿素を含むバッファーBを用いて、アニオン交換HPLCによって精製した。流速は4.5mL/分で、15のバッファーBで始めて45分間で55まで増大させた。精製した化合物を、LC/ESI-MSLC:EttanMicro商標、ドイツ国79111、フライブルクムンツィンガーシュトラーセ9MunzingerStrasse9所在のアマシャムバイオサイエンスヨーロッパゲーエムベーハーAmershamBiosciencesEuropeGmbH、ESI-MS:LCQ、DecaXP商標、ドイツ国63303、ドライアイヒDreieichイムスタイングルント4~6ImSteingrund4~6所在のサーモフィニガンThermoFinnigan、およびキャピラリー電気泳動P/ACEMDQキャピラリー電気泳動システム、ドイツ国85702、ウンターシュライスハイムUnterschleissheim所在のベックマンコールターゲーエムベーハーBeckmanCoulterGmbHによって特性解析を実施した。単離したオリゴリボヌクレオチドの純度は少なくとも85であった。収率および濃度は、分光光度計を使用して、260nmの波長におけるそれぞれのRNA溶液のUV吸収率によって測定した。アニーリングバッファー20mMのリン酸ナトリウム、pH6.8;100mMの塩化ナトリウムに溶かした相補鎖の等モル溶液を混合し、水浴中において85~90°Cで3分間加熱し、3~4時間かけて室温に冷却することによって2本鎖RNAを作製した。RNAは使用するまで-20°Cに保った。siRNAの有効性スクリーニング2つの有効性スクリーニングを使用して、VEGFのsiRNAを、リード候補物となるそれらの能力に関してスクリーニングした。表2は、幾つかのsiRNAについての、内在性VEGF遺伝子の発現を阻害する能力の相対的有効性を示している。この工程で、候補siRNAの数を選別した。ヒトHeLaまたはARPE-19分化型の性質を有するヒト網膜色素上皮細胞株ダンらDunnetal.、Exp.EyeRes.62:155、1996を、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM10ウシ胎児血清100μlに含めて、96ウェルプレート17,000細胞/ウェルで培養した。細胞が約90コンフルエントに達したとき約24時間後、20nMで始めて3倍希釈系列としたsiRNAを用いて細胞をトランスフェクションした。1ウェルあたり0.4μlのトランスフェクション試薬Lipofectamine商標2000米国カリフォルニア州カールスバッドCarlsbad所在のインビトロジェンコーポレーションInvitrogenCorporationを使用し、トランスフェクションは製造業者のプロトコルに従って行った。すなわち、siRNA:Lipofectamine商標2000複合体を、以下のように調製した。適量のsiRNAを無血清のOpti-MEM登録商標I低血清培地で希釈し、軽く混合した。Lipofectamine商標2000を使用前に軽く混合し、次いで96ウェルプレートの各ウェルについて0.4μlを、無血清のOpti-MEM登録商標I低血清培地25μlで希釈し、軽く混合し、室温で5分間インキュベートした。5分間のインキュベーション後、1μlの希釈siRNAを、希釈したLipofectamine商標2000と合わせた合計体積は26.4μlである。この複合体を軽く混合し、室温で20分間インキュベートしてsiRNA:Lipofectamine商標2000複合体を形成させた。次いで、10ウシ胎児血清をDMEMに加えたもの100μlを、siRNA:Lipofectamine商標2000複合体のそれぞれに加え、プレートを前後に揺らすことによって軽く混合した。100μlの前述の混合物を、細胞の入った各ウェルに加え、このプレートを24時間CO2インキュベータ中で37°Cにてインキュベートし、次いで培養培地を除去し、10ウシ胎児血清を加えたDMEM100μlを加えた。培地交換後、馴化培地を24時間HeLa細胞または72時間ARPE-19細胞で回収し、DuoSet登録商標ヒトVEGF用ELISA開発キット米国55413、ミネソタ州ミネアポリス所在のアールディーシステムズインコーポレイテッドRDSystems、Inc.を使用してヒトVEGFのELISAを行った。このキットは、細胞培養上清および血清中の天然および組換えヒトVEGFを測定するための、サンドウィッチELISAの開発に必要な基本的要素を含む。使用した材料を以下に挙げる:捕捉抗体:0.25mlのPBS137mMのNaCl、2.7mMのKCl、8.1mMのNa2HPO4、1.5mMのKH2PO4、pH7.2~7.4、0.2μm濾過を用いて再構成した場合、576μg/mlの抗ヒトVEGFヤギ抗体。再構成後、60日間まで2~8°Cで保存するか、あるいは等分して6ヶ月まで霜取り手動式のフリーザーで-20°C~-70°Cにて保存した。担体タンパク質を含まないPBSで0.8μg/mlの作業濃度に希釈した。検出抗体:1.0mlの試薬希釈液ReagentDiluent;1ウシ血清アルブミンのPBSpH7.2~7.4溶液、0.2μm濾過を用いて再構成したとき、4.5μg/mlのビオチン化抗ヒトVEGFヤギ抗体。再構成後、60日間まで2~8°Cで保存するか、あるいは等分して6ヶ月まで霜取り手動式のフリーザーで-20°C~-70°Cにて保存した。試薬希釈液で25ng/mlの作業濃度に希釈した。標準品:0.5mlの試薬希釈液を用いて再構成したとき、110ng/mlの組換え体。この標準品を軽く攪拌しながら少なくとも15分間を放置してから、希釈液を作製する。再構成した標準品は60日間まで2~8°Cで保存するか、あるいは等分して6ヶ月まで霜取り手動式のフリーザーで-20°C~-70°Cにて保存することが可能である。試薬希釈液による2倍希釈系列を使用した7点標準曲線、および4000pg/mlの高濃度標準品が推奨される。ストレプトアビジン-HRP:1.0mlの、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合したストレプトアビジン。6ヶ月まで2~8°Cで保存した。バイアルのラベルに指定された作業濃度に希釈した。一般的なELISAプロトコルに従ったミネソタ州ミネアポリス所在のアールディーシステムズインコーポレイテッド。対照は、siRNA無し、ヒトVEGFのsiRNACand5、a.k.a.、hVEGF5ライヒらReichetal.、MolVis.9:210、2003、およびヒト、ラットおよびマウスのVEGF間で保存されている21nt配列に整合マッチングするsiRNAhrmVEGF、フィレウアーらFilleuretal.、CancerRes.63:3919~3922、2003とした。siRNAの活性を、ライヒらReichetal.上記の対照ヒトVEGFsiRNAの活性と比較し、は対照のヒトVEGFsiRNAより低い活性を表し、は対照と類似の活性を表し、は対照より高い活性を表すものとした表2。図2は、突出部分が1つおよび2つのsiRNAのHeLa細胞における活性を示す。中実の記号を有する実線は突出部分が1つのsiRNAを表し、中空の記号を有する実線は突出部分が2つのsiRNAを表し;破線は対照siRNAを表す。全てのsiRNAが対照siRNAより活性が高く、VEGFの発現を約80阻害する可能性がある。これに対し、ライヒらReichetal.上記のsiRNAは、同じ実験条件下において内在性hVEGFのレベルを約20低下させた。同様に、同じ実験条件下において、コンセンサス配列に基づくsiRNAであるhrmVEGFフィレウアーらFilleuretal.、上記は、発現レベルを約45低下させた。図3は、突出部分が1つおよび2つのsiRNAのARPE-19細胞における活性を示す。中実の記号を有する実線は突出部分が1つのsiRNAを表し、中空の記号を有する実線は突出部分が2つのsiRNAを表し;破線は対照siRNAを表す。全てのsiRNAが対照siRNAより活性が高く、VEGFの発現を約90阻害する可能性がある。これに対し、ライヒらReichetal.Mol.Vis.9:210、2003のsiRNAは、同じ実験条件下においてhVEGFのレベルを約35低下させた。同様に、同じ実験条件下において、コンセンサス配列に基づくsiRNAであるhrmVEGFフィレウアーらFilleuretal.、上記は、発現レベルを約70低下させた。図4および5は、突出部分が1つおよび2つのsiRNAを、その類似体である平滑末端siRNAとそれぞれHeLa細胞において比較した結果を示す。その結果は、siRNA中の突出部分の存在が遺伝子の発現抑制の阻害において高い有効性をもたらす点で、エルバシルらElbashiretal.GenesDevelopment15:188、2001のデータと一致する。しかし重要なことは、平滑末端siRNAの活性が、対照siRNAを使用して得た結果に匹敵していることに留意することである。低酸素条件下におけるVEGF合成のサイレンシングに関するinvitroアッセイヒトHeLa細胞を、100μlの増殖培地DMEM10FBSに含めて細胞10,000個/ウェルとして96ウェルプレートで平板培養した。細胞接種の24時間後に細胞が約50コンフルエントに達した時点で、30nMで始まるsiRNAの3倍希釈系列液を用いて細胞をトランスフェクションした。ウェル当たり0.2μlのLipofectamine商標2000トランスフェクション試薬米国カリフォルニア州カールスバッド所在のインビトロジェンコーポレーションInvitrogenCorporationを使用し、トランスフェクションはインビトロジェン製品の挿入紙に記載されているように行った。対照は、siRNA無し、ヒトVEGFのsiRNAライヒらReichetal.、MolVis.9:210、2003、およびヒト、ラットおよびマウスのVEGF間で保存されている21nt配列に整合するsiRNAhrmVEGF、フィレウアーらFilleuretal.、CancerRes.63:3919~3922、2003とした。トランスフェクションはそれぞれのプレートにおいて2連で行った。さらに、プレートを2連としてトランスフェクションを行うことによって、トランスフェクション後24時間で増殖培地を交換し、1つのプレートを正常な酸素下増殖条件37°C、5CO2、20酸素に保ち、2つめのプレートは低酸素条件37°C、1酸素、窒素で平衡に保つことが可能であるようにした。低酸素条件は、Pro-ox酸素濃度コントローラ米国ニューヨーク州レッドフィールド所在のバイオスフェリクス社BioSpherix、Ltd.をPro-oxinvitro培養用チャンバと結合させて使用することによって維持した。培地交換後24時間、細胞を正常酸素条件または低酸素条件に保った。次いで馴化培養培地を両方のプレートから回収し、DuoSetVEGFELISA米国ミネソタ州ミネアポリス所在のRDSystemsにおいて分泌されたVEGFのレベルを試験した。アッセイは製造者のプロトコルに従い、かつ実施例2に記載したのと同様に行った。デフェロキサミンによって化学的に低酸素条件を誘導するために、130μMのデフェロキサミンシグマSigmaD9533を使用した。トランスフェクション後24時間で、デフェロキサミンを新たな増殖培地に加えた。デフェロキサミンで処理した細胞を、次いで正常な増殖条件37°C、5CO2、20酸素下で増殖させた。図6は、最初のヌクレオチドがそれぞれ319および343に相当するORF領域に対するsiRNA突出部分が1つのsiRNAと突出部分が2つのsiRNAの両方、および対照siRNAを用いて得た結果を示す。低酸素条件である、1酸素図6Bまたは130μMデフェロキサミン図6Cでは、3つの実験siRNA、すなわちORF343を対象とするAL-DP-4094突出部分1つ、およびORF319を対象とする2つのsiRNA突出部分1つおよび2つは、VEGFの発現の約95の阻害を達成した。ライヒらReichetal.上記およびフィレウアーらFilleuretal.上記の対照siRNAは、VEGF発現をそれぞれ45および85阻害する能力を示す。図8のAおよびBは、siRNAとしてAL-DP-4014、ホスホロチオエート修飾型AL-DP-4014AL-DP-4127、表3参照、および突然変異型AL-DP-4014AL-DP-4140、表5参照を用いて得た結果を示す。正常および低酸素のいずれの条件下においても、非修飾型siRNAAL-DP-4014およびホスホロチオエート修飾型siRNAAL-DP-4127は、内在性VEGFの発現を元の発現レベルの20未満に低下させた。低酸素条件下では、ホスホロチオエート修飾型siRNAはVEGFの発現をほぼ無効にした。VEGFの修飾型siRNA分子は、完全な活性を保ちつつ増大した安定性を示すVEGFのORF319を標的とするAL-DP-4014についてホスホロチオエート誘導体を作製した。該誘導体を表3に示す。これらのsiRNAを、実施例3に記載したHeLa細胞アッセイにおいて試験し、図7は、これらの誘導体がHeLaアッセイにおいて非修飾型siRNAと同程度の活性を有することを示す。AL-DP-4094siRNAの配列表1を保持しているが、ホスホロチオエート結合、O-メチル修飾ヌクレオチド、および2’-フルオロ修飾ヌクレオチドなどの様々な修飾を含む1群のsiRNAを合成した表4。このsiRNA群をHeLa細胞において試験したが、図9のA~Eは、AL-DP-4094siRNAの全ての修飾型が、VEGF発現を効率良く90超低下させたことを実証しており、以前に同定された2つのVEGFsiRNAライヒらReichetal.上記のAcuity、およびフィレウアーらFilleuretal.上記のFilleurのいずれよりも有効性が高いことを示している。図10も、HeLa細胞におけるinvitroアッセイのデータを示す。図10中のグラフは、非修飾型のAL-DP-4094siRNAおよびホスホロチオエート修飾型AL-DP-4004のsiRNAAL-DP-4219が、VEGF発現を70超低下させたことを示す図10。化合物AL-DP-4094のスクランブル型例えば、AL-DP-4216およびAL-DP-4218配列を以下に示す;下線を引いたヌクレオチドは、AL-DP-4094と比較したミスマッチなヌクレオチドを表すは、VEGF発現を阻害しなかった。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的とするsiRNAAL-DP-3015;以下参照も、VEGF発現を阻害しなかった。AL-DP-4216AL4094MIs5’-GCACAUUGGACAGUUGUGGUU-3’AL4094MIas’3-GUCGUGUAACCUGUCAACACCAA-’5AL-DP-4218AL4094M5s5’-GCACAUAGAAGUGACGCGCUU-3’AL4094M5as’3-GUCGUGUAUCUUCACUGCGCGAA-’5AL-DP-30155’-GAACUGUGUGUGAGAGGUCCU-3’’3-CGCUUGACACACACUCUCCAGGA-’5Stains-All染色法米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマSigmaを行って、修飾siRNAの安定性を調べた。アッセイを行うために、siRNA二重鎖を90ヒト血清中で37°Cにてインキュベートした。反応混合物のサンプルをさまざまな時間地点0、0.25、1、2、4、および24時間で急冷し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。経時的なRNAの切断から、血清ヌクレアーゼによる分解に対するsiRNA二重鎖の感受性に関する情報が得られた。ホスホロチオエート修飾と組み合わせてO-メチルおよび2’フルオロ修飾を使用すると、ホスホロチオエート修飾を単独で使用した場合より、安定性がより高まることが分かった。例えば、AL-DP-4094siRNAの修飾型には、ホスホロチオエート修飾siRNAAL-DP-4198、ホスホロチオエートおよびO-メチル修飾siRNA例えば、AL-DP-4180、AL-DP-4175、およびAL-DP-4220、ならびにホスホロチオエートおよびO-メチルおよび2’-フルオロ修飾siRNA例えば、AL-DP-4197およびAL-DP-4221があった表4。AL-DP-4180、AL-DP-4175、およびAL-DP-4197のsiRNAは、ヒト血清中でAL-DP-4198siRNAよりも安定性が高いことが分かった。ホスホロチオエート修飾はエキソヌクレアーゼ分解に対してsiRNAを安定化させ、O-メチルおよび2’-フルオロ修飾は、エンドヌクレアーゼ分解に対してsiRNAを安定化させることが見出された。異なるラット血清および眼部組織におけるVEGFsiRNAのinvitro安定性アッセイ1.組織ホモジェネートの調製少なくとも3匹のラットから集めた眼全体、網膜、硝子液からの組織を切除し、液体窒素中で直ぐに凍結させた。この凍結組織を、ドライアイスで予め冷却した装置を使用して、ドライアイス上で粉砕した。1mlのRIPAバッファー50mMのTris-HCl、pH8.0、150mMのNaCL、1mMのNa2EDTA、0.5のデオキシコール酸Naデオキシコール酸、1のIGEPALCA-630、0.05のSDSを凍結組織粉末に加え、この混合物を完全に激しく混合した。このホモジェネートを4°Cにおいて5分間10,000×gで遠心分離し、ペレットを捨てた。上清の分割試料100μlを予め冷却した微量遠心分離チューブに移し、-70°Cで保存するか、あるいは直ぐに安定性アッセイに使用した。2.T4ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ32P-ATPを使用する、1本鎖のセンスまたはアンチセンスsiRNAの5’端標識以下の試薬を使用した。T4ポリヌクレオチドキナーゼPNK10ユニット/μl米国マサチューセッツ州ビバリーBeverly所在のニューイングランドバイオラボNewEnglandBiolabs10×T4PNKバッファー700mMのTris-HCl、100mMのMgCl2、50mMのジチオスレイトールDTT、pH7.6γ-32P-ATP米国コネチカット州シェルトンShelton所在のパーキンエルマーPerkinElmer250μCi、3000Ci/mmol3.3μMH2Oで希釈した合成RNAオリゴの10μMストックMicrospinSephadex商標G-25カラムアマシャムバイオサイエンスAmershamBiosciencesRNAseを含まない水および0.65ml微量遠心分離1.5mlチューブ。25μlのキナーゼ反応混合物には以下のものを含めた:2.5μl:10μMストックのセンスまたはアンチセンス最終濃度1μM由来2.5μl:10×PNKバッファー1×1.5μl:γ32-ATP約0.2nM1.0μl:10ユニット/μlのT4PNK10ユニット17.5μl:dH2O反応混合物を37°Cで1時間インキュベート水浴した後、Sephadex商標G-25スピンカラムアマシャムAmershamによって標識siRNAを分画した。0.5μLを使用して、放射標識サンプル1mlの1分あたりのカウント数cpm/mlを決定した。3.放射標識された1本鎖siRNAの部分的なアルカリ加水分解ラダーサイズマーカーのサンプルを作製するために、5’端がγ32P標識されたsiRNAの一部を、以下のようにアルカリ加水分解した:5’端標識siRNAセンスまたはアンチセンスを2.5μl、0.5MのNa2CO3/NaHCO3pH9.5を6.0μl、10mg/mlのtRNAを1.5μl、およびdH2Oを20.0μl含んだ30μlの加水分解反応物を、90°Cで7.5分間インキュベートし、次いで氷上または4°Cで冷却した。30μlの90ホルムアミド、50mMのNa2EDTA、10mMのDTT、ならびにXCBBキシレンシアノールおよびブロモフェノールブルー、このうち1μl4μlのホルムアミド色素をゲル電気泳動分析に使用した。4.放射標識された1μMストックsiRNA二重鎖のアニーリングセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが放射標識された種々のsiRNA二重鎖の1μMストック30μlを調製した。サンプルを90°Cで2分間加熱し、次いで37°Cで1時間インキュベートし、次いで使用するまで-20°Cで保存した。5.siRNA二重鎖の品質管理:siRNA二重鎖のサンプルを、トリス-ホウ酸、EDTATBE中の15ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によって分析した。150Vで1時間電気泳動してからサンプルを泳動した。0.5~1μlのsiRNA二重鎖または1本鎖siRNA、3~3.5μlの0.5×TBE、1μlの5×非変性の色素液合計体積=5μlを混合することによって、サンプルを調製した。6.安定性反応2μlのsiRNA二重鎖を、PCRチューブ0.2ml中で18μlの血清または組織溶解物または対照用バッファーに加えた。siRNA二重鎖を加えた直後に、2μlを取り出して18μlの90ホルムアミド、50mMEDTA、10mMDTTおよびキシレンシアノールおよびブロモフェノールブルーXCBBに加えることによって、ゼロ時間地点のサンプルを除去した。他のサンプルは、15分、30分、1時間、2時間、および4時間後に取り出し、同様に処理した。これらのサンプルは、96ウェルプレート中に保存した。幾つかの実験では、時間地点を8、24および48時間に延長した。バッファーリン酸緩衝生理食塩水、PBS、1×作業用PBSであり、0.14Mの塩化ナトリウム、0.003Mの塩化カリウム、0.002Mのリン酸カリウム、0.01Mのリン酸ナトリウムを含むについての経時サンプルは、実験のゼロ時間地点および最終時間地点で採取した。20ポリアクリルアミドゲル75Wで1時間のプレラン済みによる1×TBE10×=890mMトリス、890mMホウ酸、20mMEDTA、pH8.0中の電気泳動によって、サンプルを分析した。ゲルをphosphorimager登録商標用カセットに移し、増感スクリーンで覆い、一晩露光させた後にスキャンした。ポリアクリルアミドゲル分析から、眼部環境はヒト血清よりヌクレアーゼが少ないことが示された。非修飾型のVEGFsiRNAであるAL-DP-4014を、ラット眼の抽出物中の安定性に関して試験することによって、エキソヌクレアーゼ活性のみが存在することが明らかになった。ヒト血清においては、AL-DP-4127および-4140表4および5を用いた実験から、末端を修飾するホスホロチオエート修飾はエキソヌクレアーゼ分解に対しては保護するが、エンドヌクレアーゼ活性に対しては保護しないことが示された。これらの結果は、ラットの眼全体の抽出物において行った実験と一致した。末端が修飾されたホスホロチオエート誘導体AL-DP-4127および-4140は、非修飾のAL-DP-4014siRNAおよび非修飾のCand5siRNAライヒらReichetal.上記と比較して、エキソヌクレアーゼ活性に対して安定化されていた。しかし-4127および-4140siRNAは依然としてエンドヌクレアーゼ分解を受けていた。リード化合物AL-DP-4094に対する修飾は、siRNAをエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ分解に対して安定化した。ホスホロチオエート修飾されたsiRNAAL-DP-4198は、非修飾型の4094化合物と同程度に分解されたが、AL-DP-4180およびAL-DP-4220中と同様にO-メチル修飾を加えることによって、ラットの眼全体の抽出物においてsiRNAを安定化した。特に、siRNAは、上記のラットの眼全体の抽出物よりもラット網膜溶解物中において一般により安定であった。非修飾型のAL-DP-4094も、修飾型のAL-DP-4198、-4180、または-4220siRNAも、網膜溶解物中では分解されなかった。エンドヌクレアーゼ感受性部位をAL-DP-4094siRNA上でマッピングした。ヒト血清中でのインキュベーション後のStains-All染色法および放射標識技法によって上記参照、AL-DP-4094siRNAの安定性を調べた。これらのアッセイから、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対する感受性が明らかとなった。RP-HPLCを使用して、血清中インキュベーション後にsiRNAの断片プロファイルを調べた図11。ヒト血清中での-4094siRNAのインキュベーション後に、断片をフェノール-クロロホルム抽出し、沈殿させ、次いでLC/MS分析に供した。図12は、同定された断片および関連特性を示す。VEGFを標的とするsiRNAに対する修飾の詳細な検討表6VEGFのmRNAを標的とするsiRNA二重鎖について8つの異なる主な化学修飾パターンを合成して評価した表6。使用したリボース糖修飾体は、2’-O-メチル2’OMeまたは2’-フルオロ2’Fのいずれかとした。表6に示したように、ピリミジンPyとプリンPuの両方を修飾することが可能であった。最初の4つのパターンA~Dでは、両方の鎖上の1つおきの位置に2’OMeを組み込んだ。4種の構成は、1センス鎖上の各偶数位およびアンチセンス鎖の各奇数位、2センス鎖上の各奇数位およびアンチセンス鎖の各偶数位、3両方の鎖上の各偶数位、ならびに4両方の鎖上の各奇数位に合成した。第5のパターンEでは、二重鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の、全てのピリミジンヌクレオチドに2’OMe修飾を組み込んだ。パターンFでは、5’-PyPu-3’ジヌクレオチド、特にUA、CA、UG部位両方の鎖のみの、ピリミジンにだけ2’OMe修飾を有する二重鎖が含まれた。パターンGの二重鎖は、アンチセンス鎖のピリミジンに2’F修飾、およびセンス鎖のピリミジンに2’OMe修飾を有するものとした。パターンHは、5’-PyPu-3’ジヌクレオチド、UA、CA、UG部位両方の鎖のみに2’F修飾ピリミジンを有するアンチセンス鎖と、5’-PyPu-3’ジヌクレオチド、UA、CA、UG部位両方の鎖のみのピリミジンだけに2’OMe修飾を有するセンス鎖とを有するものとした。A~D:2’-OMeが完全に交互1つおきになっている両方の鎖4種の構成:偶数/奇数;奇数/偶数;偶数/偶数;奇数/奇数E:2’-OMeピリミジン両方の鎖F:UA、CA、UG部位のみに2’-OMeピリミジン両方の鎖G:全てのピリミジンが2’-OMeピリミジンセンス全てのピリミジンが2’-FピリミジンアンチセンスH:UA、CA、UG部位のみに2’-OMeピリミジンセンスUA、CA、UG部位のみに2’-Fピリミジンアンチセンス表2由来の17個の異なる親のVEGF二重鎖について試験した。1.siRNA二重鎖の血清中安定性の評価2μMのsiRNA二重鎖最終濃度を、90のプールしたヒト血清中で37°Cにてインキュベートした。30分、4時間、および24時間後にドライアイス上でサンプルを急冷した。それぞれのsiRNA配列について、同じ濃度のサンプルを血清の不在下PBS中で37°Cにおいて24時間インキュベートした。全てのサンプルを急冷した後、フェノール:クロロホルムを使用してRNAを抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。サンプルを風乾し、変性ローディングバッファー中に再懸濁させた。それぞれの時間地点の3分の1について、施用した20アクリルアミド19:1、7M尿素、1×TBEのゲルで60°Cにて泳動して分析した。Stains-All溶液で染色することによってRNAを視覚化した。それぞれの修飾siRNAの安定性の定性的評価は、それぞれの二重鎖のセットについて元の親の非修飾siRNAとの比較によって行った。PBS対照を、投入したsiRNAの品質のマーカーとして用いた。2.VEGFのモジュール式化学修飾体の安定性4種のモジュール式化学修飾体、1センス鎖とアンチセンス鎖の両方において全てのピリミジンを2’-O-メチル2’OMeで置換、2センス鎖とアンチセンス鎖の両方においてUA、UG、CA対のピリミジンを2’OMeで置換、3全てのピリミジンをセンス鎖においては2’OMeで、アンチセンス鎖においては2’-フルオロ2’Fで置換、4UA、UG、CA対のピリミジンをセンス鎖においては2’OMeで、アンチセンス鎖においては2’Fで置換、についてスクリーニングした。非修飾型である親の二重鎖および4種のモジュール式化学修飾体を含めて、合計85種のsiRNAをスクリーニングした。親の非修飾型二重鎖と肉眼により比較することによって評価すると、スクリーニングした85個のsiRNAのうち35個は少なくとも24時間安定であった。これら35個の二重鎖は、両方の鎖に2’OMeピリミジンを有するか、またはセンス鎖に2’OMeピリミジン、およびアンチセンス鎖に2’Fを有していた前述の化学修飾体1および3。修飾された残基が比較的少ない二重鎖のうち、4時間の時間地点で非修飾の親二重鎖と比較して少なくとも50の完全長の物質が残存していたのは5個のみであった。全てのピリミジンを2’OMeまたは2’Fのいずれかで置換することによって、90ヒト血清中37°Cにおいて約24時間、血清中のヌクレアーゼによる分解からsiRNAが保護される。保護された二重鎖は、血清の不在下でインキュベートした二重鎖と比較して、24時間の時点で約85~100の完全長の物質が残存していた。UA、UG、およびCAジヌクレオチド対のピリミジンを最小限修飾すると、非修飾の親二重鎖と比較して数個のsiRNAを安定化しただけで、長期のヌクレアーゼ耐性に関しては十分には安定化しなかった。幾つかのRNaseA標的候補部位はメチル化によって保護されずYpN、例えばUC、UU、おそらくこのことが血清エンドヌクレアーゼに対する耐性が低い理由である。3.二重鎖活性の分析二重鎖を、前に記載したHeLa細胞アッセイで活性に関して試験した。表6および図13~29は、上述のそれぞれの修飾に関するHeLa細胞における二重鎖活性の概要およびグラフを提示している。iRNA物質の合成即効型脱保護モノマーを使用するRNA合成1.RNA合成AKTA10合成装置アマシャムバイオサイエンスAmershamBiosciencesを使用して、固相上でのホスホロアミダイト技術を使用することによって、35~60μmolの範囲のスケールでオリゴリボヌクレオチドを合成した。多孔質ガラスCPG、負荷量70μmol/gまたはポリスチレン負荷量71μmol/gでできた固形支持体上で合成を行った。全てのアミダイトは無水アセトニトリル70mMに溶解し、モレキュラーシーブを加えた。5-エチルチオテトラゾールETT、アセトニトリル中600mMを活性化溶液として使用した。結合時間は8分であった。ヨウ素/水/ピリジンの混合物50mM/l0/90v/vを用いて、あるいは無水アセトニトリルに溶かした3-エトキシ-1,2,4-ジチアゾリン-5-オンEDITHの100mM溶液を使用して、ホスホロチオエート結合を導入するために酸化を行った。標準的なキャッピング試薬を使用した。ヒドロキシプロリノールリンカーを使用してコレステロールで修飾したCPG以下に記載から始めることにより、センス鎖の5’または3’端を介してRNAにコレステロールを結合させた。DMT保護基はコレステロール結合RNAからは除去したが、結合していないRNAにはDMTを残して精製を容易にした。2.支持体結合オリゴヌクレオチドの切断および脱保護固相合成の後、該合成カラムに、40のメチルアミン水溶液とメチルアミンエタノール溶液の3:1v/v混合物14mLを30分間かけて通過させることによって、支持体からRNAを切断した。コレステロール結合RNAについては、メチルアミン水溶液とメチルアミンエタノール溶液との比を1:13とした。溶出液を4つの15mLスクリューキャップ付きバイアルに分け、さらに30分間65°Cに加熱した。この溶液を続いてスピードバック登録商標で減圧下において乾燥させた。それぞれのバイアル中の残渣を250μLのN-メチルピロリジン-2-オンNMPに溶解し、120μLのトリエチルアミンTEAおよび160μLのTEA3HFを加えた。この混合物を2時間65°Cにした。周囲温度に冷却した後、1.5mLのNMPおよび1mLのエトキシトリメチルシランを加えた。10分後、3mLのエーテルを加えることによってオリゴリボヌクレオチドを沈殿させた。ペレットを遠心分離によって回収し、上清は捨て、固形物を1mLのバッファー10mMリン酸ナトリウム中で再構成した。3.オリゴリボヌクレオチドの精製Source商標RPC15で10cmの床高に詰め込んだ16/10HRカラムアマシャムバイオサイエンスAmershamBiosciencesを使用して、AKTAExplorerシステムアマシャムバイオサイエンスAmershamBiosciencesで、逆相HPLCによって粗製オリゴヌクレオチドを精製した。バッファーAは10mMのリン酸ナトリウムであり、バッファーBは65アセトニトリルを含むバッファーAとした。6.5mL/分の流速を使用した。260、280、および290nmにおけるUV透過について記録した。DMTを有するオリゴリボヌクレオチドについては、カラム体積CVの10倍以内で7B→45Bの勾配を使用し、コレステロール結合RNAについては、14CV以内で5B→100Bの勾配を使用した。適切な画分を集め、減圧下で約10mLに濃縮した。DMTを有するオリゴヌクレオチドは、周囲温度において数時間、体積の3分の1の1MNaOAc、pH4.25で処理した。最後に、精製オリゴヌクレオチドを、Sephadex商標G-25を含むカラムでのサイズ排除クロマトグラフィによって脱塩した。このオリゴヌクレオチド溶液を体積15mL未満まで濃縮した。溶液の濃度は、UV分光光度計で260nmにおける吸光度を測定することによって決定した。アニーリングまで、個々の鎖は-20°Cで凍結溶液として保存した。4.オリゴリボヌクレオチドの分析コレステロール結合RNAを、CGEおよびLC/MSによって分析した。非結合RNAもIEX-HPLCによって分析した。CGE分析は、254nmの固定波長検出器を備えたベックマンコールターBeckmanCoulterのPACEMDQCE装置で行った。有効長20cmのeCap商標DNAキャピラリーベックマンコールターBeckmanCoulterを使用した。全ての1本鎖RNAサンプルは、6Mの尿素を含む変性条件eCap商標ssDNA100ゲルバッファーキット、ベックマンコールターBeckmanCoulterで40°Cにて分析した。サンプルは5~8秒間10kVで動電学的に注入した。泳動時の電圧は15kVとした。IEXHPLC分析は、固定波長検出器260および280nm、カラムオーブン、オートサンプラーおよび内部脱気装置を備えたダイオネクスDionexBioLC登録商標システムで行った。ダイオネクスDNAPac登録商標P100カラム4250mmを、流速1.0mL/分および30°Cで使用した。非結合RNA20μL、1OD/mLの濃度を注入した。溶出液Aは20mMのNa2HPO4、10mMのNaBr、10のアセトニトリル、pH11を含み、溶出液Bは溶出液Aに1MのNaBrを含むものとした。溶出は、20B、1分間で開始し、次いで到達濃度を80Bとする20分間の直線勾配を使用した。LC-MS分析は、Jetstreamカラムヒーターおよび固定波長検出器254nmを備えたEttan商標μLCシステムアマシャムバイオサイエンスAmershamBiosciencesで行った。マイクロスプレー供給源およびイオントラップ検出器を備えたサーモフィニガン社ThermoFinniganのLCQ商標DecaXPESI-MSシステムを、HPLCとオンラインで結合させた。オリゴヌクレオチドサンプル非結合RNAに関しては水中濃度1OD/mLで25μLサンプル、コレステロール結合RNAに関しては40μLを、60°Cにおいて200μL/分の流速で、ウォーターズWatersのXterra登録商標C8MSカラム2.1×50mm;粒径2.5μmに注入した。溶出液Aの組成はH2O中に400mMのヘキサフルオロイソプロパノールHFIP、16.3mMのTEA、pH7.9であり、溶出液Bはメタノールとした。非結合RNAに関しては、溶出は7B、3分間で開始し、次いで13分間で7B→25Bの勾配を使用した。コレステロールが結合したものに関しては、開始条件を35B、3分間とし、次いで溶出液Bの濃度を30分間で75Bに増大させた。分析値は表6に提示する。5.オリゴリボヌクレオチドのアニーリング等モル濃度のRNA溶液を組み合わせることによって、相補鎖をアニーリングした。混合物を凍結乾燥し、適切な体積のアニーリングバッファー100mMのNaCl、20mMのリン酸ナトリウム、pH6.8で再構成して、所望の濃度とした。この溶液を95°Cの湯浴中に置き、次いで3時間以内に周囲温度に冷却した。二重鎖形成の程度を、非変性条件の10ポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGEによって調べ、バンドをstains-all試薬シグマSigmaで染色することによって視覚化した。リボおよび2’-O-メチルのホスホロアミダイトを含む標準的脱保護モノマーを使用するRNA合成A.RNA/2’OMeチオエート端2’-OMeヌクレオチドを有するキメラRNA分子を、ABIの394型機で、製造者により文書化された標準サイクルを使用し数箇所の待機工程に変更を加えて合成した。固形支持体はCPG500Aとした。モノマーは、標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイトまたは2’OMeRNAホスホロアミダイトのいずれかであり、別途記載のない限りはアセトニトリルCH3CN中に0.15Mの濃度で使用した。具体的には、RNAホスホロアミダイトは5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-2’-O-tブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-O-tブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-O-tブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトであり;2’OMeRNAホスホロアミダイトは、5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-2’-O-メチル-アデノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-O-メチル-グアノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-O-メチル-シチジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-ウリジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトとした。カップリング時間は全てのモノマーに関して10分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである。活性化物質:5-エチルチオ-1H-テトラゾール0.25M;キャップA:5無水酢酸/THF/ピリジン;キャップB:10のN-メチルイミダゾール/THF。リン酸の酸化にはTHBP10、ACN中10分間を、一方ホスホロチオエートの酸化には0.05MのEDITH試薬/アセトニトリルを使用した。脱トリチル化は3TCA/ジクロロメタンを用いて行った。DMT保護基はサイクルの最終工程後に除去した。合成の終了後、多孔質ガラスCPGをスクリューキャップ付きの滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノールメチルアミン:アンモニア8Mメチルアミンのエタノール溶液/30アンモニア水の混合物1:11.0mLを用いて55°Cで5時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基についての脱保護を実施した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を5mLの遠心分離チューブに移し;続いて0.25mLの50アセトニトリルで3回洗浄した。チューブを-80°Cで15分間冷却し、その後凍結乾燥装置中で乾燥させた。得られた白色の残渣を200uLのNMP/Et3N/Et3N-HFに再懸濁させ、65°Cで1.5時間加熱して、2’位のTBDMS基を除去した。次いでオリゴヌクレオチドを、Et3N1を含む乾燥ジエチルエーテル400uL中に沈殿させた。液体を注意深く除去して、チューブの底にペレットを得た。残留エーテルをスピードバックで除去して、白い綿毛状の物質として粗製RNAを得た。サンプルを1mLのRNaseを含まない水に溶かし、260nmにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物を-20°Cで保存した。粗製オリゴヌクレオチドは、HPLCによって分析および精製した。粗製オリゴヌクレオチドは、逆相イオン対RPIPHPLCによって分析および精製した。RPHPLC分析は、固定波長検出器260および280nm、カラムオーブン、オートサンプラーおよび内部脱気装置を備えたギルソンGilsonLCシステムで行った。XTerra登録商標Cl8カラム4.6250mmは、65°Cにおいて1.0mL/分の流速で使用した。RNA1OD/mL濃度で、分析実施用に20μL、分取実施用に1mLを注入した。溶出液Aは0.1MのTEAAc、HPLC水、pH7.0を含み、溶出液BはHPLC水、70アセトニトリル、pH7.0中の0.1MのTEAAcとした。溶出は10B、2分間で開始し、次に25B、4分間とし、次いで到達濃度50Bとしてさらに30分間の直線勾配を使用した。次いで、精製された乾燥オリゴヌクレオチドを、SephadexG25Mを使用して脱塩した。B.2’-フルオロ修飾を有するオリゴヌクレオチドの合成ABIの394型機で、製造者により文書化された標準サイクルを使用し数箇所の待機工程に変更を加えて、RNA分子を合成した。固形支持体はCPGとした500A、TsTAG001はエーエムケミカルズエルエルシーAMChemicalsLLCから、ならびにrCおよびrUはプライムシンセシスPrimeSynthesisからのものであった。モノマーは、標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイトまたは2’Fホスホロアミダイトのいずれかであり、別途記載のない限りはアセトニトリルCH3CN中に0.15Mの濃度で使用した。具体的には、RNAホスホロアミダイトは5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-2’-O-tブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-O-tブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-O-tブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトであり;2’FRNAホスホロアミダイトは5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-フルオロ-2’-デオキシ-シチジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルオロ-2’-デオキシ-ウリジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトであった。カップリング時間は全てのモノマーに関して10分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである。活性化物質:5-エチルチオテトラゾール0.25M;キャップA:5無水酢酸/THF/ピリジン;キャップB:10N-メチルイミダゾール/THF;リン酸の酸化にはTHBP10、ACN中で10分間、一方ホスホロチオエートの酸化には0.05MのEDITH試薬/アセトニトリルを使用した。脱トリチル化は3のTCA/ジクロロメタンを用いて行った。DMT保護基はサイクルの最終工程後に除去した。合成の終了後、CPGをスクリューキャップ付き滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノールアンモニア混合物1:31.0mLを用いて55°Cで7時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を5mLの遠心分離チューブに移し;続いて0.25mLの50アセトニトリルで3回洗浄した。チューブを-80°Cで15分間冷却してから、凍結乾燥装置中で乾燥させた。得られた白色の残渣を200uLのNMP/Et3N/Et3N-HFに再懸濁し、50°Cで16時間加熱して、2’位のTBDMS基を除去した。次いでオリゴヌクレオチドを、Et3N1を含む乾燥ジエチルエーテル400uL中に沈殿させた。液体を注意深く除去して、チューブの底にペレットを得た。残留エーテルをスピードバックで除去し、白い綿毛状の物質として粗製RNAを得た。サンプルを1mLのRNaseを含まない水に溶かし、260nmにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物を-20°Cで保存した。粗製オリゴヌクレオチドは、HPLCによって分析および精製した。次いで、精製された乾燥オリゴヌクレオチドを、SephadexG25Mを使用して脱塩した。C.ホスホロチオエートRNAオリゴリボヌクレオチドの合成ABIの394型機ALN0208で、製造者により文書化された標準サイクルを使用し以下に記載したように数箇所の待機工程に変更を加えて、オリゴヌクレオチドを合成した。固形支持体は多孔質ガラスCPG、2μmolerACPG、520A、またはrUCPG、500Aとした。モノマーは、標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイトであり、別途記載のない限りはアセトニトリルCH3CN中に0.15Mの濃度で使用した。具体的には、RNAホスホロアミダイトは5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-2’-O-tブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-O-tブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-O-tブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトであった。カップリング時間は10分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである。活性化物質:5-エチルチオテトラゾール0.25M;キャップA:5無水酢酸/THF/ピリジン;キャップB:10N-メチルイミダゾール/THF;PS酸化、0.05MのEDITH試薬/アセトニトリル。脱トリチル化は3TCA/ジクロロメタンを用いて行った。合成の終了後、CPGをスクリューキャップ付き滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノールメチルアミン:アンモニアの混合物1:11.0mLを用いて55°Cで5時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を5mLの遠心分離チューブに移し;続いて0.25mLの50アセトニトリルで3回洗浄した。チューブを-80°Cで15分間冷却した後、凍結乾燥装置中で乾燥させた。得られた白色の残渣を200μLのTEA3HFに再懸濁させ、65°Cで1.5時間加熱して、2’位のTBDMS基を除去した。次いでオリゴヌクレオチドを、乾燥MeOH400μLを加えることによって沈殿させた。可能な限り高速で5分間、微量遠心分離チューブ中で遠心した後、液体を除去した。残留メタノールはスピードバックで除去した。サンプルを1mLのRNaseを含まない水に溶かし、260nmにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物を-20°Cで保存した。オリゴヌクレオチドはHPLCによって分析および精製し、次いでSephadexG25Mを使用して脱塩した。2’-FRNAおよび2’O-MeRNAを交互に有するオリゴヌクレオチド表7の合成A.2’F用のCPGの合成塩基が適切に保護された5’-O-DMTr-2’-デオキシ-2’-フルオロリボヌクレオシドのCPGを、スキームAに示すように合成した。5’-O-DMTr-2’-デオキシ-2’-フルオロ-NNBz-Aおよび5’-O-DMTr-2’-デオキシ-2’-フルオロ-NiBu-Gは、報告されたのと同様に合成したカワサキらKawasakietal.、J.Med.Chem、1993年、36、831。化合物1001を、二塩化エチレン中DMAPの存在下で無水コハク酸と反応させることによって、化合物1005が生成した。化合物1005を、アセトニトリル-二塩化エチレン中DMAPの存在下において、2,2’-ジチオビス5-ニトロピリジンDTNPおよびトリフェニルホスフィンで処理し、その後lcaaCPGでクーマーらKumaretal.NucleosidesNucleotides、1996年、15、879により報告されたのと同様に処理して、所望のCPG1009が生成した。CPGの負荷量は文献中に報告されたのと同様に測定したプラカッシュらPrakashetal.、J.Org.Chem、2002年、67、357。適切に保護された2’-デオキシ-2’-フルオロA、CおよびGのCPGは、上述と同様に得たスキームA。aスキームAにおいて、i無水コハク酸、DMAP/ECD;iiDTNP、Ph3P、DMAPおよびlcaaCPGである。2’-FRNAおよび2’O-MeRNAを交互に有するキメラRNA分子を、ABIの394型機で、製造者により文書化された標準サイクルを使用し数箇所の待機工程に変更を加えて合成した。固形支持体はCPG500Aとした。モノマーは、標準的な保護基を有する2’-FRNAホスホロアミダイトまたは2’OMeRNAホスホロアミダイトのいずれかであり、別途記載のない限りはアセトニトリルCH3CN中に0.15Mの濃度で使用した。具体的には、2’OMeRNAホスホロアミダイトは、5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-2’-O-メチル-アデノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-O-メチル-グアノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-O-メチル-シチジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-ウリジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトとした。2’-FRNAホスホロアミダイトは、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-フルオロ-2’-デオキシ-シチジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルオロ-2’-デオキシ-ウリジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルオロ-N2-イソブチリル-2’-デオキシ-グアノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルオロ-N2-イソブチリル-2’-デオキシ-グアノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトとした。カップリング時間は全てのモノマーに関して10分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである。活性化物質:5-エチルチオテトラゾール0.25M;キャップA:5無水酢酸/THF/ピリジン;キャップB:10N-メチルイミダゾール/THF;リン酸の酸化は0.02MのI2/THF/H2Oを、一方PS酸化は上述と同様にEDITH試薬を使用して行った。脱トリチル化は3TCA/ジクロロメタンを用いて行った。最終的なDMT保護基は、合成装置中で除去した。合成の終了後、CPGをスクリューキャップ付き滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノール:アンモニアの混合物1:31.0mLを用いて55°Cで7時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を5mLの遠心分離チューブに移し;続いて0.25mLの50アセトニトリルで3回洗浄した。-80°Cで15分間チューブを冷却した後、凍結乾燥装置で乾燥させて、白い綿毛状の物質として粗製RNAを得た。サンプルを1mLのRNaseを含まない水に溶かし、260nmにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物は-20°Cで保存した。粗製オリゴヌクレオチドは、変性条件の20ポリアクリルアミドゲルによって分析および精製した。次いで、精製された乾燥オリゴヌクレオチドを、SephadexG25MアマシャムバイオサイエンスAmershamBiosciencesを使用して脱塩した。B.二重鎖活性の分析前述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表7および図30は、上述のそれぞれの修飾体についてのHeLa細胞における活性のグラフを提供する。結合型のVEGF分子表8、9、10および181.合成:ABIの394型機アプライドバイオシステムAppliedBiosystemsにて、製造者により文書化された標準的な93工程のサイクルを使用し、以下に記載したように数箇所の待機工程に変更を加えてRNA分子を合成した。固形支持体は多孔質ガラスCPG、1umole、500Aであり、モノマーは標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイト5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-2’-O-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-O-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-O-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイトとした。全てのアミダイトはアセトニトリルCH3CN中に0.15Mの濃度で使用し、カップリング時間は非修飾および2’-O-Me修飾モノマーに関しては6分、修飾および結合型モノマーに関しては12分とした。5-エチルチオテトラゾール0.25Mを活性化物質として使用した。PO酸化用にはヨウ素/水/ピリジン、およびPS酸化用にはビューケージBeaucage試薬2の無水アセトニトリル溶液を使用した。硫化時間は約6分であった。全ての合成は1umoleスケールで行った。以下の種類の修飾を使用して、これらのプロトコルを使用する合成を行った:1.非修飾のホスホジエステル骨格POのみ2.ホスホロチオエートPSのみ3.2’-O-Me、PS4.3’-ナプロキセン、2’F-5Me-U、PS5.5’-コレステロール、PS6.3’-コレステロール、PS7.2’F-5Me-U、PS8.3’-ビオチン、2’F-5Me-U、PS9.3’-コラン酸、2’F-5Me-U、PS10.メチルホスホネート11.C-5アリルアミノrU。2.脱保護-I核酸塩基の脱保護合成の終了後、多孔質ガラスCPGをスクリューキャップ付きバイアル、またはスクリューキャップ付きのRNaseを含まない微量遠心分離チューブに移した。55°Cで15時間エタノールアンモニア混合物アンモニア28~30:エタノール3:11.0mLを使用することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、同時に塩基およびリン酸の保護基を除去した。バイアルを氷上で短時間冷却し、次いでエタノールアンモニア混合物を新たな微量遠心分離チューブに移した。CPGは少量の脱イオン水2×0.1mLで洗浄した。上清を1つにし、10分間ドライアイスで冷却し、次いでスピードバックで乾燥させた。3.脱保護-II2’-O-TBDMS基の除去得られた白い残渣を、トリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリドTEA.3HF、約24HFおよび1-メチル-2-ピロリジノンNMPの混合物4:3:7400ulに再懸濁し、65°Cで90分間加熱して、2’位のtert-ブチルジメチルシリルTBDMS基を除去した。次いで反応をイソプロポキシトリメチルシランiPrOMe3Si、400ulを用いて停止させ、キャップを開けた状態でヒートブロックにて10分間さらにインキュベートしたこれによって、揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオリド付加生成物を蒸発させる。残留している反応停止試薬を、スピードバックで乾燥させることによって除去した。3トリエチルアミンのジエチルエーテル溶液1.5mlを加えた。この混合物を遠心分離した。RNAのペレットが形成された。ペレットを乱さずに、上清をピペットで取り出した。ペレットはスピードバックで乾燥させた。微量遠心分離チューブ中に白い綿毛状の物質として粗製RNAを得た。4.粗製オリゴマーの定量または粗分析サンプルを脱イオン水1.0mLに溶かし、以下のように定量した。ブランク測定は、水のみ1mLを用いて最初に行った。RNA溶液のサンプル20u1を水980uLで希釈し、微量遠心分離チューブ中で充分に混合させ、次いでキュベットに移し、260nmにおける吸光度の読み取り値を得た。粗製物を乾燥させ、-20°Cで保存した。5.MS分析:LC-MSを使用して粗製サンプル0.1ODを分析した。6.オリゴマーの精製aポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGEによる精製オールOwlの分離システム米国ニューハンプシャー州ポーツマスPortsmouth所在を使用して、垂直型スラブポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGEによってオリゴヌクレオチドを精製した。電気泳動用のアクリルアミド40、N,N’-メチレン-ビスアクリルアミドBIS、過硫酸アンモニウムAPS、N,N,N’N’-テトラメチレンジアミンTEMED、ブロモフェノールブルーBPB、キシレンシアノールXC、10×TBE0.89Mのトリス-ヒドロキシメチルアミノメタン、ホウ酸塩pH8.3、20mMのエチレンジアミンテトラ酢酸2ナトリウムは、ナショナルダイアグノスティックNationalDiagnostics米国ジョージア州アトランタ所在から得た。12の変性ゲルを、非修飾および修飾オリゴリボヌクレオチドの精製用に調製した。調製ゲルの厚さは1.5mmとした。ローディングバッファーは10×TBEに溶解した80ホルムアミドとした。ガラスプレートを除去した後、ゲルをサランラップ登録商標で覆い、蛍光TLCプレート上に置いて手持ち式UVランプで照射して視覚化した。所望のバンドを切り出し、2mLの水または0.03M酢酸ナトリウム中で一晩振とうさせた。スピードバックで乾燥させることによって溶出液を除去した。b高速液体クロマトグラフィHPLCによる精製:条件A:非修飾オリゴリボヌクレオチド、2’-O-Me/PSオリゴリボヌクレオチドの精製:注入サンプルの量は約100ODである。カラム:ダイオネクスDionexPA-100SemiprepバッファーA:水バッファーB:0.25MのTris.ClpH8.0バッファーC:0.375Mの過塩素酸ナトリウム加熱:65°C条件B:2’-O-Me/PSオリゴリボヌクレオチドを精製するためのプロトコル:カラム:ダイオネクスPA-100SemiprepバッファーA:水バッファーB:0.25MのTris.ClpH8.0バッファーC:0.8Mの過塩素酸ナトリウム加熱:65°C7.精製オリゴマーの脱塩精製した乾燥オリゴマーを、次いでSephadex登録商標G-25Mを使用して脱塩した。カートリッジを10mLの脱イオン水を用いて3回調整した。最後に、2.5mLのRNAseを含まない水に完全に溶かした精製したオリゴマーを、非常にゆっくりと1滴ずつ溶出させながらカートリッジに装荷した。3.5mlの脱イオン水を用いて、塩を含まないオリゴマーをスクリューキャップ付きバイアル中に直接溶出させた。精製したRNA物質をスピードバックで乾燥させ、-20°Cで保存した。ビオチン結合型siRNA表101.合成:ABIの394型機アプライドバイオシステムAppliedBiosystemsにて、製造者により文書化された標準的な93工程のサイクルを使用し、以下に記載するように数箇所の待機工程に変更を加えてRNA分子を合成した。固形支持体は多孔質ガラスCPG、1umole、500Aとし、モノマーは標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイト5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-2’O-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-O-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-O-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイトとした。修飾CPGおよびアミダイトは、周知の方法を使用して本明細書に記載したように合成した。全てのアミダイトはアセトニトリルCH3CN中0.15Mの濃度で使用し、カップリング時間は非修飾モノマーおよび2’-O-Meモノマーに関しては6分、修飾モノマーおよび結合型モノマーに関しては12分であった。5-エチルチオ-1H-テトラゾール0.25Mを活性化物質として使用した。PO酸化用にはヨウ素/水/ピリジン、およびPS酸化用にはBeaucage試薬2無水アセトニトリル溶液を使用した。硫化時間は約6分である。3’-ビオチン結合siRNAを合成するために、t-ブチル-過酸化水素を酸化剤として使用した酸化時間10分。2.脱保護-I核酸塩基の脱保護合成の終了後、多孔質ガラスCPGをスクリューキャップ付きバイアル、またはスクリューキャップ付きのRNaseを含まない微量遠心分離チューブに移した。55°Cで15時間エタノールアンモニア混合物[アンモニア28~30:エタノール3:11.0mL]を用いて、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸の保護基を除去した。バイアルを氷上で短時間冷却し、次いでエタノールアンモニア混合物を新たな微量遠心分離チューブに移した。CPGを少量の脱イオン水2×0.1mLで洗浄した。1つにした濾過物を次いで10分間ドライアイス上に置き、スピードバックで乾燥させた。3.脱保護-II2’-O-TBDMS基の除去得られた白色の残渣を、トリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリドTEA.3HF、約24HFおよび1-メチル-2-ピロリジノンNMPの混合物4:3:7400ulに再懸濁させ、65°Cで90分間加熱して、2’位のtert-ブチルジメチルシリルTBDMS基を除去した。次いで反応をイソプロポキシトリメチルシランiPrOMe3Si、400ulを用いて停止させ、キャップを開けた状態でヒートブロックにて10分間さらにインキュベートしたこれによって、揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオリド付加生成物を蒸発させる。残留している反応停止試薬を、スピードバックで乾燥させることによって除去した。3トリエチルアミンのジエチルエーテル溶液1.5mlを加え、混合物を遠心分離にかけて、RNAのペレットを得た。ペレットを乱さずに、上清をピペットで取り出した。ペレットをスピードバックで乾燥させた。微量遠心分離チューブ中に白い綿毛状の物質として粗製RNAを得た。4.粗製オリゴマーの定量または粗分析サンプルを脱イオン水1.0mLに溶かし、以下のように定量した。ブランク測定は、水のみ1mLを用いて最初に行った。RNA溶液のサンプル20u1を水980uLで希釈し、微量遠心分離チューブ中で充分に混合し、次いでキュベットに移し、260nmにおける吸光度の読み取り値を得た。粗製物を乾燥させ、-20°Cで保存した。5.MS分析:MSを使用してRNAサンプル0.1ODを分析した。6.オリゴマーの精製ポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGEによる精製オールOwlの分離システム米国ニューハンプシャー州ポーツマスPortsmouth所在を使用して、垂直型スラブポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGEによって、オリゴヌクレオチドを精製した。電気泳動用のアクリルアミド40、N,N’-メチレン-ビスアクリルアミドBIS、過硫酸アンモニウムAPS、N,N,N’N’-テトラメチレンジアミンTEMED、ブロモフェノールブルーBPB、キシレンシアノールXC、10×TBE0.89Mトリスヒドロキシ-メチルアミノメタン、ホウ酸塩pH8.3、20mMのエチレンジアミンテトラ酢酸2ナトリウムは、ナショナルダイアグノスティックNationalDiagnostics米国ジョージア州アトランタ所在から得た。12の変性ゲルを、オリゴリボヌクレオチドの精製用に調製した。調製ゲルの厚さは1.5mmであった。ローディングバッファーは10×TBEに溶解した80ホルムアミドとした。PAGEのガラスプレートを除去した後、ゲルをサランラップ登録商標で覆い、蛍光TLCプレート上に置いて手持ち式UVランプ米国カリフォルニア州アップランドUplandで照射して視覚化した。所望のバンドを切り出し、水2mLまたは0.03Mの酢酸ナトリウム中で一晩振とうさせた。溶出液を取り出しスピードバックで乾燥させた。全てのビオチン結合配列をPAGEによって精製した。7.精製オリゴマーの脱塩精製した乾燥オリゴマーを、次いでSephadex登録商標G-25MアマシャムバイオサイエンスAmershamBiosciencesを使用して脱塩した。カートリッジは脱イオン水を用いて3回調整したそれぞれ10mL。最後に、2.5mLのRNAseを含まない水中に完全に溶かした精製オリゴマーを、非常にゆっくりと1滴ずつ溶出させながらカートリッジに装荷した。塩を含まないオリゴマーを、脱イオン水3.5mlを用いてスクリューキャップ付きバイアルに直接溶出させた。精製したRNA物質をスピードバックで乾燥させ、-20°Cで保存した。8.品質管理aキャピラリーゲル電気泳動CGEbエレクトロスプレーLC/MSオリゴマーのサンプル約0.10ODを水に溶かし50ulと100ml、別々のチューブ中、次いでCGE分析およびLC/MS分析用の専用バイアル中にピペットで注入した。9.二重鎖の活性分析上述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表8、9、10および18、ならびに図31~35は、上記の各修飾体のHeLa細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。レチノイドとRNAの結合表14全トランスレチナールとオリゴヌクレオチドRNAの結合:レチナールをオリゴヌクレオチドに結合させるためのホスホロアミダイト104を、スキームB中に示すようにして合成した。スキームBにおいて、aiPh3P、DIAD、N-ヒドロキシフタルイミド/MeCN;iiH2、Pd-C10、1気圧atm/ETOAc;iiiホスフィチル化、である。工程1:化合物102モノベンジルペンタン-1,5-ジオール15.70g、80.82mmol、Ph3P25.43g、96.84mmolおよびN-ヒドロキシフタルイミド116.0g、98.08mmolを、アルゴン雰囲気下において無水CH3CN100ml中に入れた。非希釈DIAD20.0mL、103.25mmolを、攪拌溶液に1滴ずつ20分間かけて加え、攪拌を24時間続けた。反応はTLCによって調べた。溶媒を真空中で除去し;ジエチルエーテルを用いて残渣を練和し、濾過した。残渣をエーテルで洗浄し、濾過し、濾液を合わせた。ヘキサンを濾液に1滴ずつ、濾液が濁度を生じるまで加え、その後この溶液にエーテルを加えることによって、同溶液を均質にした。均質溶液を24時間5°Cで保存した。沈殿したPh3POを濾過除去し、エーテル-ヘキサン混合物1:1で洗浄した。合わせた濾液を蒸発乾固させ、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィヘキサン中10~15EtOAcにより精製して、粘性の淡黄色の油として24.5g89.3の化合物102を得た。1HNMR400MHz,CDCl3,25°C:7.84~7.82m,2H;7.75~7.73m,2H;7.34~7.33m,4H;7.29~7.26m,1H;4.51s,2H;4.22~4.18t,JH,H=6.71Hz,2H;3.52~3.48t,JH,H=6.4Hz,2H;2.04~1.78m,2H;1.73~1.56m,4H。13CNMR100MHz,CDCl3,25°C:163.9、138.8、134.6、129.2、128.6、127.8、127.7、123.7、78.6、73.1、70.3、29.6、28.2、22.5。工程2:化合物103化合物10223.5g、69.29mmolを、100mlのEtOAc/メタノール1:1中に入れた。この混合物を脱気し、アルゴンでパージし、これに2.4gのPd-C10-デグサ社Degusaの湿潤型を加えた。この混合物を次いで一晩水素添加し、焼結漏斗でセライト床を介して濾過した。その後残渣をシリカゲルのカラムに通し、40EtOAcヘキサン溶液を使用して溶出させ、白色固体として化合物10315.70g、90.9を得た。1HNMR400MHz,CDCl3,25°C7.83~7.81bm.2H;7.75~7.73bm,2H;4.23~4.19t,JH,H=6.4Hz,2H;3.70~3.66t,JH,H=5.80Hz,2H;1.83~1.79m,2H;1.67~1.60m,4H。13CNMR100MHz,CDCl3,25°C163.9、134.7、129.1、123.7、78.6、62.7、32.4、28.0、22.0。工程3:化合物104化合物1035.4g、21.67mmolおよびトリエチルアミン4ml、28.69mmolを、アルゴン下において無水EtOAc30ml中に入れた。2-シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト5.00ml、21.97mmolを、反応混合物に一滴ずつ加えた。Et3N.HClの白色の沈殿が試薬を加えた直後に形成され、この反応は10分以内に終了したTLCによって調べた。この沈殿を、焼結漏斗を介して濾過し、減圧下で溶媒を除去した。残渣を精製用のシリカゲルカラムに直接装荷した。ヘキサン/EtOAc9:1で溶出して、黄色い油、8.68g89.13として化合物104を得た。1HNMR400MHz,CDCl3,25°C7.85~7.81m,2H;δ7.77~7.72m,2H;4.22~4.19t.JH,H=6.80Hz,2H;3.91~3.76m,2H;3.72~3.53m,4H2.67~2.63t,JH,H=6.71Hz,2H;1.86~1.78m,2H;1.73~1.66m,2H;1.62~1.56m,2H;1.19~1.16m,12H。31PNMR162MHz,CDCl3,25°Cδ145.09。13CNMR100MHz,CDCl3,25°Cδ163.9、134.7、129.2、123.7、117.9、78.6、64.0、63.4、58.7、58.5、43.2、43.1、31.1、31.0、28.1、24.9、24.8、24.7、22.3、20.6、20.5。工程4:全トランスレチナールとオリゴヌクレオチドの結合全トランスレチナールを、スキームC中に示したようにオリゴヌクレオチドと結合させた。標準的な固相オリゴヌクレオチド合成条件下において、化合物104を固体に結合したオリゴヌクレオチド105と結合させて、化合物106を得た。化合物106のフタルイミド保護基を、サロらSaloetal.BioconjugateChem.1999年、第10巻、p.815によって報告されたのと同様にヒドラジニウム水和物で処理することにより選択的に除去して、化合物107を得た。暗条件下において、全トランスレチナールで化合物107を処理することによって、文献BioconjugateChem.1999、10、815中で報告されたのと同様に化合物108を得た。暗条件下での標準的なRNAオリゴヌクレオチドの脱保護および精製によって、所望のオリゴヌクレオチド-レチナール結合体109を得た。化合物109は、スキームC中に示したように化合物110からも得た。化合物106の完全な脱保護および精製によって非結合状態の遊離オリゴヌクレオチド110を得て、続いてこれを全トランスレチナールと反応させて所望の化合物109を得た。スキームCにおいて、aiホスホロアミダイト104、標準的なオリゴヌクレオチド合成サイクル;iiヒドラジニウム水和物/Py/AcOH0.124/4/7;iiiDMFまたはMeCNに溶解した全トランスレチナール;ivオリゴヌクレオチドRNAの脱保護MeNH2、TEA.3HFおよび精製;vオリゴヌクレオチドRNAの脱保護MeNH2、TEA.3HFおよび精製;viDMSO-H2Oに溶解した全トランスレチナール、である。工程4.1.:オリゴヌクレオチド合成AL-3166以外の全てのオリゴヌクレオチドは、ABI490型DNA合成装置で合成した。市販の多孔質ガラス固形支持体dT-CPGおよびU-CPG、および標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-2’-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイトを、オリゴヌクレオチド合成用に使用した。全てのホスホロアミダイトは、アセトニトリルCH3CN中に0.15Mの濃度で使用した。10分のカップリング時間を使用した。活性化物質は5-エチルチオテトラゾール0.25Mであり、PO酸化用にはヨウ素/水/ピリジンを使用した。配列AL-3166はAKTAoligopilot商標合成装置で合成した。全てのホスホロアミダイトをアセトニトリルCH3CN中に0.2Mの濃度で使用したが、グアノシンについては10THE/アセトニトリルv/v中に0.2Mの濃度として使用した。16分のカップリング/リサイクル時間を使用した。活性化物質は5-エチルチオテトラゾール0.75Mであり、PO酸化用にはヨウ素/水/ピリジンを使用し、PS酸化用には2,6-ルチジン/ACN1:1v/vに溶解したPADS2中を使用した。アミノオキシ-リンカーホスホロアミダイトを前述と同様に合成し、アセトニトリル中に0.15Mの濃度で使用した。アミノオキシ-リンカーホスホロアミダイトに関するカップリング時間は15分であった。全ての配列について、アミノオキシ-リンカーホスホロアミダイトのカップリングはABI390型DNA合成装置で行った。工程4.2.アミノオキシ-リンカーオリゴヌクレオチドからのフタルイミド保護基の切断アミノオキシ-リンカーのカップリング後、ピリジンに溶解した0.5M酢酸ヒドラジニウム0.16/4/2の無水ヒドラジン、ピリジン、酢酸2.5mlで、デュアルシリンジ法を使用してCPGを処理した。5分毎にシリンジを前後に押して、CPG上に新たな溶液を送った。酢酸ヒドラジニウム処理の後、CPGを2×5mlのピリジン、次に3×5mlのアセトニトリルで洗浄した。乾燥アルゴンで30秒間洗浄し、次いでCPGを乾燥させた。工程4.3.支持体上でのアルデヒドとの結合1-ピレン-カルボキシアルデヒドおよび全トランスレチナールはアルドリッヒAldrichから得たものであり、DMF中に0.5Mの濃度で使用した。4-ケト-レチノールはDMF中0.13Mの濃度で使用した。上述のCPGをアルデヒド溶液に加えた。結合は一晩約16時間室温で行った。反応が終了した後、CPGをDMF、次にアセトニトリルですすぎ、10~15分間風乾した。AL-3213配列については、全トランスレチナールおよび1-ピレン-カルボキシアルデヒドのいずれとの結合もアセトニトリル中で行った。1-ピレン-カルボキシアルデヒドの場合、アルデヒドは0.5Mでは完全には溶解せず、溶解しなかったアルデヒドを除去するための濾過を行わずに溶液をそのまま使用した。工程4.4.支持体に結合したオリゴヌクレオチドの脱保護-I核酸塩基の脱保護支持体上のレチナール結合オリゴヌクレオチドについては、支持体を5mlのチューブVWRに移した。1mLの40メチルアミン水溶液を用いて65°Cで15分間処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸基の脱保護を実施した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いでメチルアミンを濾過して新たな15mlチューブに入れた。CPGを3×1mLのDMSOで洗浄した。工程4.5.支持体に結合したオリゴヌクレオチドの脱保護-II2’TBDMS基の除去前述の混合物に、1.5mlのトリエチルアミントリヒドロフルオリドTREAT-HFを加え、60°Cで15分間加熱して、2’位のtert-ブチルジメチルシリルTBDMS基を除去した。次いで反応を5.5mlの50mM酢酸ナトリウムpH5.5を用いて停止させ、精製するまでフリーザー中に保存した。工程4.6.脱保護後のアルデヒドとの結合アミノオキシ-リンカーオリゴヌクレオチドを脱保護した後での、アルデヒド1-ピレン-カルボキシアルデヒドおよび全トランスレチナールとの結合も、代替結合方法として行った。工程4.7.脱保護後の結合のための脱保護-I核酸塩基の脱保護支持体を2mlのスクリューキャップ付きチューブに移した。65°Cで15分間の0.5mLの40メチルアミン水溶液処理により、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いでメチルアミンを濾過して新たな15mlチューブに入れた。CPGを2×0.5mLの50アセトニトリル/水で洗浄した。次いで混合物をドライアイス上で凍結させ、スピードバックで真空下において乾燥させた。工程4.8.脱保護後の結合のための脱保護-II2’TBDMS基の除去乾燥させた残渣を0.5mlのトリエチルアミントリヒドロフルオリドTEA.3HFに再懸濁させ、60°Cで15分間加熱して、2’位のtert-ブチルジメチルシリルTBDMS基を除去した。次いで反応混合物を室温に冷却し、2mlの乾燥メタノールを用いてRNAを沈殿させ、スピードバックで真空下において乾燥させた。次いでサンプルを2mlの水に溶かし、さらに分析するまでフリーザー中に凍結保存した。工程4.9.粗製オリゴマーの定量または粗分析全てのサンプルに関して、1μl、10μlまたは30μlの分割試料を999μl、990μlまたは970μlのヌクレアーゼを含まない脱イオン水で希釈し1.0mL、260nmにおいて吸光度の読み取り値を得た。工程4.10.結合型オリゴマーの精製aLC/MSによる粗分析粗製オリゴマーを最初にLC/MSにより分析して、予想される最終産物の存在および量を調べた。b逆相精製結合物のサンプルを、RPC-Source商標15カラム21.5×1cmで逆相HPLCによって精製した。バッファー系は:A=10ACN中の20mM酢酸ナトリウム、pH8.5およびB=70ACN中の20mM酢酸ナトリウム、pH8.5であり、流速5.0mL/分、ならびに波長を260および375とした。次いで、完全長オリゴヌクレオチドを含む画分を個々に脱塩した。工程4.11.精製オリゴヌクレオチドの脱塩精製したオリゴヌクレオチド画分を、PD-10Sephadex登録商標G-25カラムを使用して脱塩した。最初に、25~30mlの水を用いてカラムを平衡化した。次いでサンプルを体積2.5mlとして装荷した。次いで、3.5mlの塩を含まない画分としてサンプルを溶出させた。脱塩した画分を1つに合せ、必要となるまで凍結保存した。工程4.12.キャピラリーゲル電気泳動CGE、イオン交換HPLCIEXおよびエレクトロスプレーLC/MS約0.3ODの脱塩オリゴヌクレオチドを水で希釈して300μlとし、次いでCGE、IEXおよびLC/MS分析用の専用バイアルにピペットで移した。工程5.全トランスレチナールのオリゴヌクレオチドRNA3’端への結合:レチノイドの5’結合用のホスホロアミダイト116、およびレチノイドの3’結合用のCPG支持体115を、スキームDに示すように合成した。CPG支持体115は、レチノイドをオリゴヌクレオチドの3’に結合させるために使用した。aスキームDにおいて、iTBDMS-Cl、イミダゾール/Py、室温;iiaH2、Pd-C10/EtOAC-MeOH、4時間およびb-カプロラクトン、TEA、55°C、24時間;iiiTEA.3HF/THF;iva無水コハク酸、DMAP/EDC、24時間およびbDTNP、Ph3P、DMAP、その後lcaaCPGを添加;vホスフィチル化、である。工程5.1:化合物112化合物111120.0g、30.01mmolを、無水ピリジン100mLに溶かしたイミダゾール7.5g、110.16mmolの存在下でTBDMS-Cl5.43g、36.02mmolと共に一晩攪拌した。ピリジンを除去した後、生成物を酢酸エチル300mL中に抽出し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、次いで標準的な後処理を施した。得られた残渣を、1メタノールをジクロロメタンに溶かしたものを溶出液として用いてフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィに供し、薄い白色の固体として化合物112を得た24.4g、定量値。1HNMR500MHz、[D6]DMSO、25°C:7.33~7.13bm、15H、D2O交換後の14Hに相当;6.87~6.82bm、4H;5.01s、0.2H、回転異性体少数;4.99s、1.8H、回転異性体多数、4.68~4.64m、0.72H、回転異性体多数;4.14~4.07bm、1H、3.72s、7H、3.38~3.36m、0.6H、回転異性体少数;3.26~3.21m、1.4H、回転異性体多数;3.08~3.07m、0.3H、回転異性体、少数;2.99~2.89m、2.7H、回転異性体、多数;2.22~2.12m、2H、2.04~1.78m、2H;1.48~1.23m、6H、0.84、0.82s、9H、回転異性体多数および少数;0.05d、JH,H=1.5Hz、4.3H、回転異性体多数;0.03~0.02d、JH,H=5.5Hz、1.7H。工程5.2:化合物113化合物1129.4g、14.54mmolを15mLのβ-カプロラクトンに懸濁させ、懸濁液に10mLのTEAを加えた。この反応混合物を、55°Cの浴温で24時間、アルゴン下において攪拌した。反応の終了はTLC分析によって調べた。真空中で反応混合物からTEAを除去し、150mLのジクロロメタン-ヘキサン2:1混合物を残渣に加えた。このようにして得た均質溶液を、シリカゲルのカラムに直接装荷し、ジクロロメタン-ヘキサン2:1、次に非希釈ジクロロメタンを用いて溶出した。ジクロロメタン中4のメタノールを用いたシリカカラムの溶出によって、白色の固体として所望の化合物113を得た8.73g、78.9。1HNMR400MHz、[D6]DMSO、25°Cδ7.72~7.68bm、1H、D2Oと交換可能;7.33~7.16m、9H;6.88~6.84m、4H;4.68~4.62m、0.8H;4.57~4.52m、0.2H;4.34~4.31t、JH,H=5.18Hz、1H、D2Oと交換可能;4.14~4.08bm、1H;3.74~3.67m、7H;3.39~3.32m、3.3H;3.25~3.21m、1.7H;3.09~2.88m、4H。6.二重鎖の活性分析上述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表14および図38は、上記の各修飾物のHeLa細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。ポリエチレングリコールとsiRNAの結合表12PEG結合用のアミノリンカーオリゴヌクレオチド概要TSKゲル-SuperQ商標-5PW東ソーで、イオン交換分取クロマトグラフィを行った。イオン交換分析クロマトグラフィは、DNAPac登録商標Pa100ダイオネクスDionexで行った。電子スプレーイオン化質量スペクトルはアジレントAgilent1100MSD-SLを用いて記録した。HPLC法RNAをイオン交換クロマトグラフィカラム、DNAPac登録商標Pa100、4×250mm、分析用により分析したが、条件を、30°Cに加熱、流速1.5mL分-1、バッファーA=10CH3CN中の0.020MのNa2HPO4pH11;バッファーB=バッファーA10CH3CN中の1MのNaBrpH11、53分間で0→75の直線勾配とした。LC/ESI-MSの条件は以下の通り、すなわち:カラムはXTerra登録商標C82.1×30mm、2.5μm、2分間で5→35、30.5分間で35→70の直線勾配、流速0.200mL分-1、バッファーA=400mMHFIP/16.3mMTEA水溶液、バッファーB=100メタノールとした。RNAをイオン交換クロマトグラフィ5cmのインハウス充填カラム、TSKゲル-SuperQ-5PW、20μmによって精製したが、条件を、75°Cに加熱、流速50mL分-1、バッファーA=10CH3CN中の0.020MのNa2HPO4pH8.5;バッファーB=バッファーA10CH3CN中の1MのNaBrpH8.5、120分間で20→55の直線勾配とした。RNA合成特注のインハウス支持体およびホスホロアミダイト化合物を使用して、100~150μmolスケールで、AKTAOligoPilot商標100で保護RNAを構築した。ホスホロアミダイトは乾燥CH3CNに溶かした0.2molL-1溶液として使用し、カップリング時間を900秒とし、製造者の奨励する合成プロトコルを使用した。合成後、支持体に結合したRNAを45°Cにおいて90分間CH3NH2水溶液40で処理し、冷却し、濾過し、DMSO3×40mLで洗浄した。次いで濾液を40°Cにおいて60分間、TEA.3HF60mLで処理し、NaOAc水溶液0.05M、pH5.5、200mLを用いて急冷した。合成後に続いて分析イオン交換HPLC、分取HPLCを実施し、次いでSephadexG-25で脱塩した。工程1.オリゴヌクレオチド合成:一般的な結合手法をスキームEに示す。全てのオリゴヌクレオチドを、AKTAoligopilot商標合成装置で合成した。市販の多孔質ガラス固形支持体dT-CPG、またはフタルイミド-ヒドロキシ-プロリノール固形支持体、ならびに標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-2’-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイトを、オリゴヌクレオチド合成用に使用した。全てのホスホロアミダイトをアセトニトリルCH3CN中に0.2Mの濃度で使用したが、グアノシンについては10THE/アセトニトリルv/v中に0.2Mの濃度で使用した。16分のカップリング/リサイクル時間を使用した。活性化物質は5-エチルチオテトラゾール0.75Mであり、PO酸化用にはヨウ素/水/ピリジンを使用し、PS酸化用には2,6-ルチジン/ACN1:1v/vに溶解したPADS2を使用した。アミノリンカーホスホロアミダイトを合成し、アセトニトリル中に0.2Mの濃度で使用した。アミノリンカーホスホロアミダイトのカップリング/リサイクル時間は16分であった。aスキームEにおいて、i固相オリゴヌクレオチド合成;ii脱保護および精製;iiiPEG-NHSエステル、NaHCO3、pH8.1、1時間、である。工程2.脱保護-I核酸塩基の脱保護合成の終了後、支持体を100mlのガラス製容器に移した。40mLの40メチルアミン水溶液を用いて45°Cで90分間処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。容器を氷上で短時間冷却し、次いでメチルアミンを濾過して新たな500ml容器中に入れた。CPGを3×40mLのDMSOで洗浄した。次いで混合物をドライアイスで冷却した。工程3.脱保護-II2’TBDMS基の除去前述の混合物に60mlのトリエチルアミントリヒドロフルオリドTREAT-HFを加え、40°Cで60分間加熱して、2’位のtert-ブチルジメチルシリルTBDMS基を除去した。次いで反応を50mMの酢酸ナトリウムpH5.5220mlを用いて停止させ、精製するまでフリーザー中に保存した。工程4.粗製オリゴマーの定量または粗分析全てのサンプルについて、10μlの分割試料を990μlのヌクレアーゼを含まない脱イオン水で希釈し1.0mL、260nmにおける吸光度の読み取り値を得た。工程5.オリゴマーの精製aHPLC精製粗製オリゴマーは最初にHPLCダイオネクスPA100により分析した。バッファー系は:A=20mMのリン酸、pH11、B=20mMのリン酸、1.8MのNaBr、pH11、流速1.0mL/分、および波長260~280nmであった。それぞれのサンプルに関して5~15μlを注入した。サンプルは、TSK-GelSuperQ-5PW20カラム17.3×5cmでHPLCによって精製した。バッファー系は:A=10ACN中の20mMのリン酸、pH8.5、およびB=10ACN中の20mMのリン酸、1.0MのNaBr、pH8.5、流速50.0mL/分、ならびに波長260および294であった。完全長オリゴヌクレオチドを含む画分を次いで1つに集め、蒸発させ、脱イオン水で約100mlに再構成した。工程6.精製オリゴマーの脱塩精製したオリゴヌクレオチドは、SephadexG-25カラムを使用してAKTAExplorerアマシャムバイオサイエンスAmershamBiosciencesで脱塩した。最初に、水を用いて25ml/分の流速で20~30分間カラムを洗浄した。次いでサンプルをのせて25ml画分とした。溶出させた塩を含まない画分を1つに組合せ、乾燥させ、50mlのRNaseを含まない水で再構成した。工程7.キャピラリーゲル電気泳動CGEおよびエレクトロスプレーLC/MS約0.15ODの脱塩オリゴヌクレオチドを水で希釈して150μlとし、次いでCGE分析およびLC/MS分析用の専用バイアルにピペットで移した。工程8.PEGの結合A最初の反応条件精製および脱塩したRNAを凍結乾燥させた。RNA1mgをNaHCO3水溶液0.1M、200μl、pH8.1およびDMFそれぞれ200μLに溶かした。5K13当量、10mgまたは20K3.4当量、10mgのPEGを反応バイアルに直接加え、完全に攪拌混合した。反応は4°Cで一晩継続し、その後イオン交換HPLC分析を実施した。反応の85超が完了したとき、pHがおよそ7になるまでNaOAc水溶液0.05M、pH5.5を用いて反応を停止させた。Bホウ酸バッファーでの結合精製および脱塩したRNAを凍結乾燥させた。RNAのサンプル1mgをホウ酸ナトリウムバッファー200μL、0.05M、pH10に溶かした。5KPEG3mg、4.5当量のSunbright登録商標ME-50HS、日本油脂をCH3CN200μLに溶かした。RNA溶液をPEG溶液に加え、完全に攪拌混合した。反応は室温で1時間継続し、その後イオン交換HPLC分析を実施した。反応の85超が完了したとき、pHがおよそ7になるまでNaOAc水溶液0.05M、pH5.5を用いて反応を停止させた。CPEGリンカーASとHSの比較RNAのサンプル1mgをNaHCO3水溶液0.1M、200μl、pH8.1およびDMF200μLに溶かした。5KPEG13.5当量、10mg、SunbrightME-50HSまたはSunbrightME-50AS、日本油脂を反応バイアルに直接加え、完全に攪拌混合した。反応は4°Cで一晩継続し、その後イオン交換HPLC分析を実施した。反応の85超が完了したとき、pHがおよそ7になるまでNaOAc水溶液0.05M、pH5.5を用いて反応を停止させた。D最終的な最適化PEG結合精製および脱塩したRNAを凍結乾燥させた。RNAのサンプル50mgをNaHCO3水溶液0.1M、2mL、pH8.1およびDMF1mLに溶かした。20KPEG約2.7当量、400~520mgのSunbrightME-200HS、異なる配列に関してこの範囲内で異なる量をCH3CN2mLに溶かした。RNA溶液をPEG溶液に加え、完全に攪拌混合した。H2O250mLを反応混合物に加えて、濁度を低下させた。反応は室温で1時間継続し、その後イオン交換HPLC分析を実施した。反応の85超が完了したとき、pHがおよそ7になるまでNaOAc水溶液0.05M、pH5.5を用いて反応を停止させた。工程9.二重鎖の活性分析前述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表12および図45は、上記の各修飾体のHeLa細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。リボ-ジフルオロトルイルDFTヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド表13の合成ABIの394型機にて、製造者により文書化された標準的なサイクルを使用し、数箇所の待機工程に変更を加えてRNA分子を合成した。固形支持体は500ÅのdTCPG2umoleとした。モノマーはRNAホスホロアミダイトまたはリボ-ジフルオロトルイルアミダイトのいずれかとした。別途記載のない限り、全てのモノマーは標準的な保護基を有しており、アセトニトリルCH3CN中に0.15Mの濃度で使用した。具体的には、ホスホロアミダイトは、5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-2’-O-tブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-O-tブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-O-tブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-ジフルオロトルイルO-tブチルジメチルシリル-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト0.12Mであった。カップリング時間は全てのRNAモノマーに関して7分、DFTモノマーに関して10分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである:活性化物質:5-エチルチオ-1H-テトラゾール0.25M;キャップA:5無水酢酸/THF/ピリジン、キャップB:10N-メチルイミダゾール/THF;リン酸の酸化には0.02MのI2/THF/H2Oを要した。脱トリチル化は3TCA/ジクロロメタンを用いて行った。DMT保護基は、サイクルの最後の工程の後で除去した。合成の終了後、CPGをスクリューキャップ付き滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノールアンモニア混合物1:31.0mLを用いて55°Cで16時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を5mLの遠心分離チューブに移し;その後0.25mLの50アセトニトリルで3回洗浄した。-80°Cで15分間チューブを冷却してから凍結乾燥装置中で乾燥させた。得られた白色の残渣を200uLのトリエチルアミントリヒドロフルオリドに再懸濁させ、65°Cで1.5時間加熱して、2’位のTBDMS基を除去した。次いでオリゴヌクレオチドを、乾燥メタノール400uL中に沈殿させた。液体を注意深く除去して、チューブの底にペレットを得た。残留メタノールをスピードバックで除去し、白い綿毛状の物質を得た。1mLのRNaseを含まない水中にサンプルを溶かし、260nmにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物を-20°Cで保存した。粗製オリゴヌクレオチドは、20ポリアクリルアミド変性ゲルによって分析および精製した。精製した乾燥オリゴヌクレオチドを、次いでSephadexG25Mを使用して脱塩した。前述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表13および図46は、上述の各修飾体のHeLa細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。2’-アラフルオロ-2’-デオキシヌクレオシドで修飾されたRNA表14の合成ABIの394型機にて、製造者により文書化された標準的なサイクルを使用し、数箇所の待機工程に変更を加えてキメラRNA分子を合成した。固形支持体は500ÅのdTCPG2μmoleとした。モノマーはRNAホスホロアミダイトまたは2’-アラフルオロ-2’-デオキシ2’アラFホスホロアミダイトのいずれかとした。別途記載のない限り、全てのモノマーは標準的な保護基を有しており、アセトニトリルCH3CN中に0.15Mの濃度で使用した。具体的には、RNAホスホロアミダイトは、5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイル-2’-O-tブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-α-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-O-tブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-O-tブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-tブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトであり;2’アラFホスホロアミダイトは、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-ベンゾイル-2’-アラフルオロ-2’-デオキシシチジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-アラフルオロ-2’-デオキシウリジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-アラフルオロ-チミジン-3’-O-β-シアノエチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイトであった。カップリング時間は全てのモノマーに関して10分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである:活性化物質:5-エチルチオ-1H-テトラゾール0.25M;キャップA:5無水酢酸/THF/ピリジン、キャップB:10N-メチルイミダゾール/THF;リン酸の酸化には0.02MのI2/THF/H2Oを要した。脱トリチル化は3TCA/ジクロロメタンを用いて行った。最終的なDMT保護基は、最終サイクルの後で除去した。合成の終了後、CPGをスクリューキャップ付き滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノールと濃アンモニアの混合物1:31.0mLを用いて55°Cで5時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を5mLの遠心分離チューブに移し;その後0.25mLの50アセトニトリルで3回洗浄した。-80°Cで15分間チューブを冷却した後、凍結乾燥装置で乾燥させた。得られた白色の残渣を200uLのトリエチルアミントリヒドロフルオリドに再懸濁させ、65°Cで1.5時間加熱して、2’-OH位のTBDMS基を除去した。次いでオリゴヌクレオチドを、乾燥メタノール400uL中に沈殿させた。液体を注意深く除去して、チューブの底にペレットを得た。残留メタノールをスピードバックで除去し、白い綿毛状の物質を得た。1mLのRNaseを含まない水中にサンプルを溶かし、260nmにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物を-20°Cで保存した。粗製オリゴヌクレオチドは、20ポリアクリルアミド変性ゲルによって分析および精製した。精製した乾燥オリゴヌクレオチドを、次いでSephadexG25MアマシャムバイオサイエンスAmershamBiosciencesを使用して脱塩した。前述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表14および図47は、上記の各修飾体のHeLa細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。メチルホスホネート修飾siRNA表15の脱保護脱保護工程1:合成の終了後、多孔質ガラスCPGをスクリューキャップ付きバイアルに移した。アセトニトリル/エタノール/NH4OH45:45:10からなる溶液0.5mlを支持体に加えた。バイアルを密閉し、室温で30分間放置した。エチレンジアミン0.5mLをバイアルに加え、室温でさらに6時間放置した。上清を傾瀉し、支持体を1:1のアセトニトリル/水0.5mLで2回洗浄した。上清を合わせて水15mLで希釈した。AcCN/H2O1:9中の6MのHClを用いて、pHを7.0に調整した。サンプルを、Seppak登録商標C18カートリッジを使用して脱塩し、次いでスピードバックで乾燥させた。脱保護工程2:2’-O-TBDMS基の除去得られた白色の残渣をトリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリドTEA.3HF約24HFおよび1-メチル-2-ピロリジノンNMPの混合物4:3:7400ulに再懸濁させ、65°Cで90分間加熱して、2’位のtert-ブチルジメチルシリルTBDMS基を除去した。次いでイソプロポキシトリメチルシランiPrOMe3Si、400ulを用いて反応を停止させ、キャップを開けた状態でヒートブロックにて10分間さらにインキュベートしたこれによって、揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオリド付加生成物を蒸発させる。残留している反応停止試薬は、スピードバックで乾燥させることによって除去した。3トリエチルアミンのジエチルエーテル溶液1.5mlを加え、混合物を遠心分離にかけて、RNAのペレットを得た。ペレットを乱さずに、上清をピペットで取り出した。ペレットをスピードバックで乾燥させた。粗製RNAは、微量遠心分離チューブ中に白い綿毛状の物質として得られた。精製:全てのメチルホスホネート修飾配列はPAGEによって精製した。二重鎖の活性分析前述のHeLa細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表15および図48は、上記の各修飾体のHeLa細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。他の実施形態本発明の幾つかの実施形態について記載してきた。しかし、当然ながら、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更形態を作製することが可能である。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲の範疇内にある。"