"表9に記載の少なくとも1個の変異を含むことを特徴とする、配列番号16053またはその断片を本質的に有するDNA。請求項1に記載のDNAを含む微生物。以下の工程:a請求項2に記載の微生物を培養し、b微生物により生産されたアカルボースを回収する、を含む、アカルボースの製造方法。本発明は野生型ゲノム、ならびに野生型、およびそれを基にさらに開発された株に導入されたすべての遺伝子組換え型のDNA配列を記載する。その結果、本発明の主要な部分を占める、最新の製造株を含む開発された株の最初の遺伝子型の解析が実行された。さらに、決定されたDNA配列に基づいて、本発明の他の部分として、潜在的遺伝子が同定され、それらの機能注解と結合されて説明される。特に、潜在的に製造収率の増加に寄与する、株開発工程を通しての変異修飾により影響される遺伝子-およびDNA-配列、ならびにそれらに由来するタンパク質配列が、本発明に寄与する。材料と方法上で簡潔に説明されるように、一連の変異誘発実験が、最初に土の試料から単離された、アクチノプラネスウタヘンシス野生型株SE50-100で行われた。これらの実験は、高成長速度、栄養成分要求および消費の最適化ならびに面倒な副産物の低い形成などの発酵による工業的生産に関連する他のパラメーターと同様に、アカルボースの改良された生産をもつ変異体の同定を目的とした。まず野生型株に基づいて、更なる変異誘発実験が以前の実験で選択された変異株について継続的に実施された。株開発の進行の間、優れた特質をもついくつかの変異体が新たな製造株として選択され、大規模生産に移された。これらから、最新の製造株および野生型株を含む7種の株が選択され、BielefeldUniversity’sCenterforBiotechnologyCeBiTecUniversitatsstrasse27,33615Bielefeld,Germanyにより配列決定された。表1はこのプロジェクトの間に使用されているすべての7種の株をそれらの開発の年代順に記載する。株培養それらのアカルボース生産性をチェックするための株の培養が以前に記載されたとおりに行われたSchmidtetal.,Naturwissenschaften,1977,64:535-536。DNAを単離するために、アクチノプラネス株は二段階振とうフラスコ系で培養された。無機塩類の他に、培地は炭素源としてのでんぷん加水分解物および窒素源としての酵母エキスを含んだ。予備培養percurtureおよび本培養maincultureはそれぞれ3日間および4日間、回転式振とう培養機上で28°Cにて実行された。その後、バイオマスは遠心分離によって集められた。株変異誘発アカルボース生産株の開発は、より高い産生株の段階的な選別方法により実施された。この方法は化学的または物理的な手段によるランダム変異の工程を使用する。変異を誘導するために使用される化学物質は、アルキル化剤またはフレームシフト型変異原物質として機能する染料のいずれかであった。細胞に変位を誘導するための物理学的処理は、365nmのUV光で行われた。菌糸体の断片は適切な緩衝系における変異誘発処理に使用された。処理の後に、生体物質は誘導された改変の形質発現を許容するために短期間液体培地で生育させられ、その後、寒天プレート上に播種された。変異誘発処理で生存したクローンのランダム選択は、小規模振とうフラスコ実験において、それらのアカルボース生産能についてチェックされた。この種の変異サイクルの間で得られた最良の変異体クローンは次の変異段階に選択された。変異および選択のそのようないくつかの段階は、生産性の漸増をもたらした。ゲノムDNAの調製A.utahensis株SE50-110のゲノムDNAの調製は、一般的に開示された手順ManiatisT.,FritschE.F.,SambrookJ.,MolecularCloning-ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,1982を改変して実施された。50mLの新たに成長した培養物の菌糸体は、Christ遠心分離機での遠心分離10分、4.000rpm、4°Cによって回収された。ペレットは同条件下で、15のスクロースMerckKGaA,Darmstadt,Germany,cat.7651、25mMTrisHClpH7.2MerckKGaA,Darmstadt,Germany,cat.1.08382.1000、および25mMEDTAMerckKGaA,Darmstadt,Germany,cat.8418を含むバッファーで4回洗浄された。最終的に、ペレットは4.5mLの同バッファーに再懸濁され、リゾチームMerckKGaA,Darmstadt,Germany,cat.1.05281.0010およびRNAseQiagen,Hilden,Germany,cat.19101がそれぞれ5mg/mLおよび50μg/mLの最終濃度で加えられ、混合物は45分間37°Cで培養された。SDSServa,Heidelberg,Germany,cat.20767およびタンパク質加水分解酵素KQiagen,Hilden,Germany,cat.19133の、それぞれ0.5および2μg/mLの最終濃度での添加の後に、培養は50°Cにて5分間続けられた。NaClMerckKGaA,Darmstadt,Germany,cat.1.06404.1000が最終濃度300mMで添加され、容量がWFIで8mLに調整された。溶解物lysateは3つの連続したフェノール/SEVAG抽出SEVAGは24部のクロロホルム[MerckKGaA,Darmstadt,Germany,cat.1.02445.1000]および1部のイソアミルアルコール[MerckKGaA,Darmstadt,Germany,cat.1.979.1000]の混合物であるに供され、フェノールが、10mLSEVAGでのDNA溶液の洗浄により除去された。DNAは0.1容量の3M酢酸ナトリウムpH4.8MerckKGaA,Darmstadt,Germany,cat.6268および1容量の冷イソプロパノールMerckKGaA,Darmstadt,Germany,cat.1.09634.1011の添加で沈殿した。DNAは遠心によりペレット化され25分、4.000rpm、4°C;Christ遠心分離機、DNAペレットは、70のエタノールMerckKGaA,Darmstadt,Germany,cat.1.00983.1011で十分に5x洗浄され10分、4.000rpm、4°C;Christ遠心分離機、空気乾燥された。最終的に、200μLのTris、pH8.5に4°Cにて一晩再懸濁され、DNA濃度が260nmおよび280nmの光学密度を測定することにより決定された。調製されたDNAのサイズは、DNA溶液のアリコート10μLを品質チェックとしての1アガロースゲルを通した電気泳動に供することにより分析された。フォスミドライブラリー構築フォスミドは、より小さい挿入サイズが望まるとき、ゲノムライブラリーを調製するために一般的に使用される。挿入は、40kbの平均のサイズを有し、他のライブラリーの型よりもより均一な範囲をもたらす、無作為の切断により生産される。フォスミドはそれらの均一な範囲のため、においてギャップを閉じるための優れた候補である。アクチノプラネスウタヘンシス野生型のためのフォスミドライブラリー構築がIITBiotechGmbH,Universitatsstr.25,33615Bielefeld,Germanyにより、ゲノムDNA上で行われた。大腸菌EPI300細胞における構築のため、CopyControl登録商標クローニングシステムEPICENTREBiotechnologies,726PostRoad,Madison,WI53713,USAが用いられた。キットは、BiozymScientificGmbH,Steinbrinksweg27,31840HessischOldendorf,Germanyから入手した。フォスミドライブラリー配列決定アクチノプラネスウタヘンシス野生型のためのフォスミドライブラリー配列決定が、3730xlDNA分析器AppliedBiosystems,850LincolnCentreDrive,FosterCity,CA94404,USAの上にIITBiotechGmbHUniversitatsstr上で、IITBiotechGmbH,Universitatsstr.25,33615Bielefeld,Germanyによって行われた。装置は96本のキャピラリーで並行サンガー配列決定法Sangeretal.,J.Mol.Biol.,1975,943:441-448を実行する。得られるフローグラムファイルは、FASTA形式で呼ばれる塩基であり、FASTA形式で格納された。両方のファイルは後にギャップ閉鎖と品質評価に使用された。高性能ゲノム配列解読装置ゲノムシーケンサーFLXゲノムシーケンサーFLXGSFLXシステム454LifeSciences,15CommercialStreet,Branford,CT06405,USAは、アクチノプラネスウタヘンシス野生型株SE50-100ならびに最新の生産株SN19910-37-21のピロ配列決定pyrosequencingのために使用された。2個の異なるプロトコルおよび試薬系がGSFLXプラットホームで使用された1.長ペアエンドlongpairedendPEプロトコルでの標準系。PEライブラリー構築のためのゲノムDNA断片サイズは2.5~3.0kbであった。プロトコルは、2×100塩基の平均読み取り長および約100Mbの配列決定された塩基の総数をもたらす。2.全ゲノムショットガンWGSプロトコルでのチタン系。WGSライブラリー構築のためのゲノムDNA断片サイズは500~800bpであった。プロトコルは、400~500塩基の読み取り長および400~600Mbの範囲の配列決定された塩基の総数をもたらす。プロトコルに関する詳細は製造者の説明書、すなわちGSFLXSequencingMethodManualDecember2007,GSFLXPairedEndDNALibraryPreparationMethodManualDecember2007,GSFLXTitaniumSequencingMethodManualOctober2008およびGSFLXTitaniumGeneralLibraryPreparationMethodManualOctober2008で提供される。ゲノムアナライザーIIxクラスターステーションCluster-Stationおよびペアエンドモジュールを含むゲノムアナライザーIIxGAIIxシステムIllumina,Inc.,9885TowneCentreDrive,SanDiego,CA92121,USAは、5個の以前の生産株、SN223-29-47、C445-P47、SN12755-48、SC3687-18-43およびSC7177-40-17の合成時解読sequencing-by-synthesisのために使用された。5個の株全てのために、約330bpのゲノムDNA断片サイズおよび2×36塩基の読み取り長をもつペアエンドプロトコルが使用された。ライブラリー調製、クラスター生成および配列決定は、製造者の説明書、Paired-EndsequencingSamplePreparationGuidePart1005063Rev.BSeptember2009,UsingthePaired-EndClusterGenerationKitv2ontheClusterStationandPaired-EndModulePart1005629Rev.CFebruary2009およびUsingSBSSequencingKitv3ontheGenomeAnalyzerPart1005637Rev.ANovember2008に従って実施された。野生型ゲノムアセンブリ概要GSFLXプラットホームによって生成されたすべてのアクチノプラネスウタヘンシス野生型読み取りの自動化されたアセンブリは、NewblerアセンブラソフトウェアgsAssemblerversion2.0.00.22,454LifeScienceで実施された。アセンブリアルゴリズムの詳細な情報に関しては、GenomeSequencerFLXSystemSoftwareManualPartC,version2.3October2009を参照のこと。野生型ゲノム仕上げNewblerプログラムにより自動化されたdenovoアセンブリの後でも存在する連続する配列コンティグcontigの間に残るギャップを閉じるために、視覚アセンブリソフトウェアパッケージConsedGordonetal.,GenomeResearch,1998,8:195-202が利用された。グラフィカルユーザーインターフェース内で、連続するコンティグの末端のプライマー対が選択された。これらのプライマー対は、その後、連続するコンティグの間のギャップを埋めるために、以前に構築されたフォスミドライブラリーを発祥とするクローンからの所望の配列を増幅するために使用された。これらのフォスミド読み取りのDNA配列が決定された後に、すべての適切な読み取りの手動のアセンブリは異なるプログラム機能の補助により実施された。詳細には、フォスミド読み取りは、まずコンティグの5’末端に並べられ、その5’残余により伸長される。その後、コンティグに隣接する3’末端がその伸長に並べられ、以前に存在するギャップを埋め、2個のコンティグが接合される。1個のフォスミド読み取りの長さまたは質がギャップを埋めるために十分でない場合、プライマー選択、配列決定および手動のアセンブリの複数の繰り返しが行われた。野生型ゲノム注釈コード配列CDSの同定野生型ゲノム上の潜在的遺伝子と部分的な遺伝子配列付録appendixを参照はコンピュータ分析のシリーズによって同定された。すべての利用されたプログラムは、GenDBの注釈パイプラインMeyeretal.,NucleicAcidsResearch,2003,318:2187-95の一部である。CDSの同定のため、内因性のintrinsic、外因性のextrinsic、および組み合わせられた方法は、最良の結果を達成するために適用された。CDSの内因性予測に関与するプログラムはGlimmerDelcheretal.,NucleicAcidResearch,1999,27:4636-41である。それは、まず分析されるゲノムから取られる最適の特徴でのCDSからのトレーニングセットを構成する。このセットに基づいて、ゲノム配列のすべてのCDSを同定するために実行される実際の検索で使用される、補間マルコフモデルinterpolatedMarkovmodelが計算される。Glimmerは、実際にそこにあるよりも多くのCDSについて計算する傾向がある。外因性CDE予測がCRITICABadgeretal.,Mol.Biol.Evol.,1999,16:512-24により実施された。CRITICAはまず、公共のDNAデータベースからの配列と少なくともわずかな類似性を示すゲノム配列のリストを決定するためにBLASTNアルゴリズムAltschuletal.,J.Mol.Biol.,1990,2153:403-10を利用する。翻訳されたアミノ酸配列が、DNA類似性を基にして期待されるものよりも高い類似性を所有するならば、それは保存されたコード配列であることの証拠として解釈される。CRITICAは、従前は未知であった配列の予測を改良するために、ヘキサヌクレオチドの分布に基づく内因性分析とこれらの結果を結合する。これにもかかわらず、CRITICAは、公共データベースでホモログ配列が全くないとして既に蓄積されている場合でも、まだ少数のCDSを予測する傾向がある。ReganorソフトウェアMcHardyetal.,Bioinformatics,2004,2010:1622-31は、GlimmerおよびCRITICAによって計算された結果を最適化するために使用された。それは、両方のプログラムの結果を結合し、その結果、それぞれの短所を最小にする。さらに、CRITICAによって予測されたCDSは、Glimmerによって計算された内因性予測で補足された、結合した結果の基礎を形成する。注釈および機能予測同定されたオープンリーディングフレームは、それらの潜在的な機能に関するそれらのRNAおよび/またはアミノ酸配列から結論を得るために、さまざまな異なったソフトウェアパッケージを通して分析された。それらの機能の予測の他にも、さらなる特徴および構造上の特性についても計算されている。相同性を基にした検索は、公共の、および/または独自のヌクレオチドおよびタンパク質データベースとの比較の手段によって、保存配列を同定するために適用された。有意な配列類似性が遺伝子の主要なセクション中で見つけられたなら、遺伝子がA.utahensisにおいて同様の機能を有するはずであると結論づけられた。アクチノプラネスウタヘンシスの遺伝子リストを注釈するために使用された、相同性を基にした方法は、BLASTXと呼ばれるCoulson,TrendsinBiotechnology,1994,12:76-80。BLASTXは、特定のヌクレオチド配列を3個のフォワードおよび3個のリバースの相補的リーディングフレームへと、それらをタンパク質データベース例えば、全米バイオテクノロジー情報センターNCBIの公共の、非冗長タンパク質データベースnr-aaに対して比較する前に、翻訳する。酵素の分類は酵素委員会EC番号Webb,EdwinC.,SanDiego:PublishedfortheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiologybyAcademicPress,1992,ISBN0-12-227164-5に基づいて実行された。更なる機能的遺伝子予測のために、タンパク質のオルソロググループのクラスターCOG分類システムが適用される、Tatusovetal.,Science,1997,2785338:631-7andTatusovetal.,NucleicAcidsRes.2001,291:22-8。潜在的な膜貫通タンパク質を同定するために、ソフトウェアTMHMMKroghetal.,J.Mol.Biol.,2001,3053:567-80andSonnhammeretal.,Proc.Int.Conf.Intell.Syst.Mol.Biol.,1998,6:175-82が利用される。膜貫通タンパク質の膜貫通ヘリックスおよび他の特徴を予測するために隠れマルコフモデルが利用される。それらから得られた情報により、膜に関連する機能的な予測が、有意により強い結論を得る。ソフトウェアSignalPBendtsenetal.,J.Mol.Biol.,2004,340:783-95andNielsenetal.,proteinEngineering,2997,10:1-6は、同定されたCDSの分泌能力を予測するために使用された。これは、アミノ酸配列内の潜在的なシグナルペプチド切断部位の出現および位置を探索する、隠れマルコフモデルおよびニューラルネットワークによって行われる。得られたスコアは、翻訳されたタンパク質の分泌のための確率測度として解釈できる。SignalPは古典的なシグナルペプチド結合メカニズムによって分泌されるそれらのタンパク質だけを取り出す。古典的経路を経て分泌されないアクチノプラネスウタヘンシスからのさらなるタンパク質を同定するために、ソフトウェアSecretomePが適用されたBendtsenetal.,BMCMicrobiology,2005,5:58。潜在的な神経回路網は、エキソプロテオームにおけるその発生にもかかわらず、シグナルペプチドを欠くことが知られている、分泌タンパク質で訓練された。翻訳された遺伝子の最終的な分泌能力は、SignalPおよびSecretomeP予測の結果の組み合わせにより得られる。多シストロン性転写単位を明らかにするために、共同転写遺伝子を、その方向および隣接遺伝子への接近により予測する独自のソフトウェアが開発されたSalgadoetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,9712:6652-7から持ち込まれた。これらの予測の観点から、オペロン構造が決定でき、さらにそれらに基づいて、含まれたプロモーターとオペレータ要素の高い確率で、さらなる配列領域を引き出すことができる。一本鎖DNA、RNA分子それぞれの二次構造はRNAshapesソフトウェアSteffenetal.,Bioinformatics,2006,224:500-503によって計算された。結果は、オペロンおよび遺伝子末端をそれぞれ示す、転写終結の内因性予測に使用された。生産株参照アセンブリすべての6個の生産株として得られる読み取りのアセンブリは、野生型参照ゲノムにそれらをマッピングすることにより達成された。この作業のため、ゲノムシーケンサーFLX読み取り長400~500塩基WGSおよびゲノムアナライザーIIx読み取り長2×36塩基PEシステムそれぞれを基とする2個の読み取り型を考慮して、2個の異なるソフトウェアプログラムが利用された。gsMapperソフトウェアversion2.3,454LifeScienceは、野生型参照ゲノムに対するゲノムシーケンサーFLXプラットホームからの読み取りを整列alignするために使用された。プログラムは、参照配列内で読まれた各々のために最良の整列alignment位置を発見するために発見的問題解決法を実装する。すべての読み取りが整列された後に、参照に隣接して整列する読み取りのための多重整列は、コンティグを形成するために実施される。コンティグの多重整列から、コンセンサスベースコール配列は、各々の塩基への品質および信頼値をもたらす、多重整列における読み取りに関する伝達信号を使用することで作成される。マッピングアルゴリズムの詳細な情報に関してはGenomeSequencerFLXSystemSoftwareManualPartC,version2.3October2009を参照のこと。CLCGenomicsWorkbenchCLCbio,Finlandsgade10-12,Katrinebjerg,8200AarhusN,Denmarkの一部として、PE情報をもつ短い読み取りアセンブリアルゴリズムが、参照ゲノムに対するゲノムアナライザーIIxプラットホームからの読み取りを整列するために使用された。マッピングアルゴリズムの詳細な情報に関しては、CLCGenomicsWorkbenchUserManual3.7.1を参照のこと。生産株における変異の同定野生型株SE50-100と最新の生産株SN19910-37-2の間の遺伝的変異はgsAssemblerソフトウェアversion2.3,454LifeScienceの手段により、参照アセンブリ工程の間に、自動的に決定される。単一ヌクレオチド多型SNPならびに構造的な変化を決定するためのアルゴリズムの詳細は、GenomeSequencerFLXSystemSoftwareManualPartC,version2.3October2009に見つけられる。野生型株および5個の以前の製造株の間の変異は、CLCGenomicsWorkbenchCLCbio,Finlandsgade10-12Katrinebjerg,8200AarhusN,Denmarkを使用することで決定された。CLCGenomicsWorkbenchUserManual3.7.1に詳細に記載された、SNPおよび欠失/挿入多型DIPの高性能データ分析に特有化されたアルゴリズムが使用された。アクチノプラネスウタヘンシス野生型株の配列決定、アセンブリ、および注釈アクチノプラネスウタヘンシス野生型株SE50-100のゲノム配列概要は、3種の高性能処理の実行からの配列情報の組み合わせにより決定された。これらは、2個のペアエンドPEおよび1個の全ゲノムショットガンWGSアプローチを使用して、ゲノムシーケンサーFLXシステム上で実施された。配列決定は、合計で約4億700万の配列決定された塩基を占める約200万の読み取りの成功したヌクレオチド配列決定をもたらしたそれぞれの実行の結果の詳細な情報に関しては表2を参照のこと。配列決定された読み取りは、その後長さで500塩基を超える、476個の連続した配列コンティグへと成功裏に99.65組み立てられたassembled。得られた9,122,632塩基のゲノムサイズの概要を考慮すると、43.88倍のゲノム範囲coverageが達成された。480,03091.48の成功裏にマッピングされたペアエンド読み取りのため、これらのコンティグは既に順序付けされ、11のの足場に方向付けされたその順序および方向付けペアエンド情報から知られている複数のコンティグ。表3はアクチノプラネスウタヘンシス野生型株SE50-100の予備的なゲノム配列の概要に至るアセンブリ工程の成功およびエラー率のさらなる内面insideを与える。興味深いことに、以前に公表されたアカルボースクラスターのゲノム配列Wehmeier,Biocat.Biotrans.,2003,21:279-285andWehmeierandPiepersberg,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2004,63:613-625は、上述した配列決定の結果と同一ではなかった。合計で、37の単一ヌクレオチド多型SNPおよび24の欠失/挿入多型DIPが以前の配列決定の試みによる野生型配列に人工的に導入されたことがわかった図1を参照のこと。これらの不備のある配列決定の修正は、acbC遺伝子の小さな伸長42塩基ならびにacbE遺伝子内のいくつかの一時的なフレームシフトの修正をもたらした。これは、しかしながら、遺伝子の注釈全体および全アカルボースクラスターに関する結果を全く有していなかったフォスミドライブラリー配列決定によるゲノム配列概要の仕上げ野生型株SE50-100の全ゲノム足場を得るために、999の不作為に選択されたフォスミドクローンの末端挿入配列terminalinsertsequenceが決定された図2。配列決定実行の品質ならびにアセンブリ工程の正確さを裏付けるように、11のペアエンドを基にした足場と、フォスミドライブラリーを基にした全ゲノム足場の間に矛盾は全く見つけられなかった。合計で600のサンガー読み取りは、ゲノム概要の残余のギャップの大部分をカバーする選択されたクローンに由来した。これらの読み取りの手動のアセンブリにより、コンティグ間の411のギャップはそれぞれ埋められ、閉じることができた。残っている64のコンティグは、単一、円形の足場を形成して、フォスミドライブラリー内の長い反復性DNA配列および/またはカバーされていない領域のためにこの方法では埋めることができなかった。結果として改良されたA.utahensis野生型株SE50-100のゲノム配列が、この文書の付録に蓄積される。改良されたゲノム系列に基づいて、アクチノプラネス属と密接に関連する放線菌類に典型的な、71.29のグアニン-シトシンGC含量が計算されたVenturaetal.,Microbiol.Mol.Biol.Rev.,2007,713:495-548。アクチノプラネスウタヘンシス野生型株ゲノムの注釈改良されたゲノム配列を基礎として、完全なゲノム注釈は実行され、985ヌクレオチドの平均遺伝子長をもつ8,027の推定のコード配列CDSの同定をもたらした。これに基づいて、アクチノプラネスウタヘンシスは、DNAコード領域71.68および非コード領域68.70間で約3の目立ったGC含量の差異をもつ、86.35のコーディング密度を示した。構造遺伝子の構成を調べることにより、オペロンあたり3.34遺伝子の平均数で5,980の遺伝子74.50を保有するhosting、1,793の推定の多シストロン性転写単位が予測された。全てのヌクレオチド配列ならびにそれらのアミノ酸翻訳が、この文書の付録に蓄積される。表4は真核生物の遺伝子予測工程の結果を要約する。さまざまな異なるプログラムが、同定されたオープンリーディングフレームの機能注釈を実行するために使用された。外因性タンパク質データベース比較に起因して、酵素委員会EC番号で、2,839のCDS35.67を酵素的に特徴付けることができた。さらに、典型的な膜貫通領域を保有する、701CDS8.73が膜関連タンパク質として同定および分類された。600のタンパク質の総数について、これにより細胞外培地中に分泌される可能性が高い、シグナルペプチド、が予測された。追加の657のタンパク質に関して、他の分泌機構が提案された。しかしながら、これらの予測は異常に高い数の分泌タンパク質をもたらすであろう。その上、タンパク質のオルソロググループのクラスターCOG分類システムが適用され、単一またCOGカテゴリーへの3,98349.62CDSの割当assignmentを明らかにした。付録の表9はCOG-カテゴリーおよびその細分の、より包括的な概説を提供し、一方で、一般的な注釈の結果は表5に要約される。完全な注釈の後でも、2,684の遺伝子33.44には、関連する機能をいまだ全く有さなかった。しかしながら、他の配列への遠いdistant類似性は公開データベースで見つけられた。4345.41の孤児遺伝子orphangeneに関しては、遠い関連配列でさえデータベースで見つけられなかった。注釈された野生型ゲノムは図3の円形プロットとして示される。順鎖forwardstrand最外円および逆鎖reversestrand2番目の円で描かれる遺伝子に加えて、GC含量3番目の円ならびにGC非対称skewがそこに描かれる。さらに、複製起点、以前に記載されたトレハロースLeeetal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,80:767-778およびアカルボースクラスター、約25の連続したリボソームタンパク質からなる興味深いタンパク質クラスターならびに組込および接合要素integrativeandconjugativeelementICEを含む、いくつかの重要性の高い部位が示される。表6はアクチノプラネスウタヘンシス野生型ゲノムの一般的特性を記載する。更なる外因性データベース検索により、最も相同的な遺伝子およびそれを基にする有機体は、各々のオープンリーディングフレームに割り当てられた。上記の詳細の注釈と共に、この情報は付録表10に各CDSのために記載される。多くの遺伝子について、さらに詳細な手作業での注釈が、上記の半自動化された情報に加えられる。これらの遺伝子は、これらの全ての要素に限定されるわけではないが、アカルボースクラスターWehmeierandPipersberg,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2004,63:613-625、トレハロースクラスターLeeetal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,80:767-778ならびに、でんぷん分解および合成酵素などのあるクラスのタンパク質、糖エピメラーゼ、マルトースの取り込み、輸送および代謝に関与する遺伝子、分泌タンパク質、セルラーゼおよび窒素代謝に関与する遺伝子および胞子形成関連遺伝子およびそれらのタンパク質翻訳を含む。A.utahensis野生型株の代謝能注釈されたEC番号の使用を通して、アクチノプラネスウタヘンシスの代謝能力を分析することが可能であった。京都遺伝子ゲノム百科事典KEGGの標準経路へのEC番号のマッピングは、解凍、TCAサイクル、ペントースリン酸経路などの中央代謝に関するすべての主要経路への有用性を明らかにした。しかしながら、Entner-Doudoroff経路の利用について、6-ホスホ-D-グルコン酸の2-デヒドロ-3-デオキシ-D-グルコネート-6リン酸への触媒作用のための鍵酵素ホスホグルコン酸デヒドラターゼが消失している。A.utahensis生産株のゲノム配列決定野生型株SE50-100に加えて、最新の生産株SN19910-37-21ならびに5種の以前の株が、これらの株において、遺伝的な差が増加したアカルボース生産の原因となることを明らかにするために、配列決定された。最新の株はゲノムシーケンサーFLXGSFLXシステム上で配列決定され、一方で以前の株は、ペアエンドデータに基づくゲノムアナライザーIIxGAIIxプラットホームのみを使用することで配列決定された。結果は表7に要約される。合計で、56億個の塩基が配列決定された。変異株と野生型の間の遺伝的変異の同定以前に終了した野生型ゲノムに対する結果の参照マッピングは、6種の生産株全てのアセンブリに通じる。加えて、生産株と野生型株の間のすべての遺伝的変異が決定できた。興味深いことに、野生型ゲノムが、生産株に由来する読み取りにより完全にカバーされているように、主要な欠失変異は全く起こっていなかった。しかしながら、1,826の単一ヌクレオチド多型SNPおよび128の欠失/挿入多型DIPは野生型ゲノムと最新の生産株の間で発見された。表8に記載されているように、各々のゲノムに導入されたSNPの数は、株開発の年代順で上昇する。全ての変異およびそれらの正確な変遷は、生産株と共に、初生産を示す、付録の表11に記載される。SNPを基にしたヌクレオチド転移transitionは、ガウス分布ではなかったが、2種の転移G→AおよびC→Tについて100倍よりも高い優先傾向を示した。図4はこれらの調査結果について表す。SNPおよびDIPが導入された位置に対する注釈された遺伝子座の比較により、1,896の遺伝子23.62が、図5で見ることができるように、ヌクレオチドレベルでのこれらの変異に影響を受けたことがわかった。これらのうち、376の遺伝子が、サイレント変異のみを保持して、同じタンパク質配列をまだコードしていた。他方で、816の遺伝子のタンパク質配列は、大部分のアミノ酸配列は不変のまま残しながら、その個々の位置が異なっていた。しかしながら、残りの704の遺伝子はそれらの長さおよび/またはリーディングフレームを変える変異を受けた。詳細には、429の遺伝子は野生型と比較して増加した長さを有することが、一方で275の遺伝子が短くなったと予測された。中央代謝の修飾変異誘発事象により影響を受けた酵素をコードする遺伝子は、アカルボース形成をコードするもののように、全体的な代謝ならびに特有の経路に影響を与える可能性がある。この理由で、これらの遺伝子は、変異誘発実験で導入された機能の損失を特定するために、それらのEC番号に従って、KEGGデータベースの標準経路にマッピングされた。中央代謝のいくつかの酵素がSNPで影響を受けた一方で、機能の損失の可能性をもたらす変異によりヒットしたのはほんのわずかな遺伝子だけであった。加えて、これらの大幅に変更された遺伝子の各々のため、同じEC番号で注釈された少なくとも1の他の遺伝子が、おそらくノックアウト型のための補助を受けて、まだ利用可能であった。アカルボースクラスターの修飾と以前の生産株の使用以前の生産株の配列決定により、それらが最初に導入された株まで時間を遡って変異を追跡することは可能であった。この分析は、図6に表されるように、アカルボースクラスターの配列上で特に教示されていた。クラスターに起こる13のSNPが、変異実験を実行した際に、連続して導入された。2のSNPが遺伝子acbWおよびacbVの間の遺伝子内領域に導入された。さらに、2のSNPがacbD遺伝子に導入された。acbDコードタンパク質、アカルビオシルトランスフェラーゼは、アカルボースインポーター複合体を通した再輸入の前に、細胞外空間にマルトデキストリンと共にアカルボースを導入すると信じられている。他の変異は、アカルボースインポーター複合体の対象結合タンパク質であるacbH遺伝子に位置する。"