"精製ビリルビンオキシダーゼBODであって、配列番号2のバチルスプミルスのBODと比較して少なくとも80の同一性百分率を有すること、ビリルビンをビリベルジンへと酸化する反応を触媒すること、及び4つの銅原子と結合することを特徴とする、精製ビリルビンオキシダーゼBOD。請求項1に記載のBODをコードすることを特徴とする、核酸分子。配列番号1、配列番号5又は配列番号7から選ばれる配列を有する、請求項2に記載の核酸分子。請求項2又は3に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、発現ベクター。請求項4に記載の発現ベクターによって形質転換されることを特徴とする、請求項1に記載のBODを発現する宿主細胞。請求項1に記載のBODを調製する方法であって、a請求項5に記載の宿主細胞を調製する工程と、b工程aで調製される宿主細胞を培養する工程と、c前記宿主細胞を溶解する工程と、d工程cで得られる溶解物をアフィニティクロマトグラフィによって処理する工程と、e前記精製BODを回収する工程とを含み、工程aで調製される前記宿主細胞が、pFD1ベクターによって形質転換される大腸菌BL21Star株であること、及び工程bで実施される前記培養が、20°C~30°Cの温度で20h~30hの期間、嫌気条件下で振とうしながら行う液相培養であって、その間に前記BODの発現がイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGを添加することによって誘導されることを特徴とする、請求項1に記載のBODを調製する方法。液体試料中のビリルビン濃度を測定するための、請求項1に記載のBODの使用。請求項1に記載のBODを含むことを特徴とする、ビリルビンをアッセイするキット。液体試料中に溶解したビリルビンをアッセイする方法であって、a酵素反応前の前記液体試料のλmax=440nmでの吸光度を測定する工程と、b前記液体試料中に請求項1に記載のBODを導入する工程と、c酵素反応後の前記液体試料のλmax=440nmでの吸光度を測定する工程と、d工程a及び工程cで測定される吸光度の差異を算出するとともに、既知のビリルビン含有量を有する標準溶液に関して測定される吸光度の差異と比較する工程と、e前記液体試料のビリルビン濃度を決定する工程とを含むことを特徴とする、液体試料中に溶解したビリルビンをアッセイする方法。試料中に存在するビリルビンを分解するための、請求項1に記載のBODの使用。ケラチン繊維の酸化染色のための組成物における試薬としての、請求項1に記載のBODの使用。木材パルプを処理するための、請求項1に記載のBODの使用。工業用溶剤中で使用される染料を変色させるための、請求項1に記載のBODの使用。少なくとも1つの請求項1に記載のBODを含む被覆材でコーティングされる導電性材料を含む、BOD電極。請求項14に記載の電極から構成されることを特徴とする、ビリルビンバイオセンサー。請求項14に記載の電極から構成されることを特徴とする、酸素センサー。上に酸化反応を触媒する酵素が固定化されるアノードと、カソードとしての請求項14に記載の電極とを含む、酵素バイオ燃料電池。1.材料1.1大腸菌株DH5α:supE44、ΔlacU169、Φ80lacZDM15、hsdR17、recA1、endA1、gyrA96、thi-1、relA1Hanahan1983。この菌株を使用して、タンパク質発現ベクターを構築する工程の間にプラスミドを増幅する。BL21Star:F-ompThsdSBrB-、mB-galdcmrne131DE3Invitrogen。この菌株を使用して、エルレンマイヤーフラスコ内でバチルスプミルスのBODを産生させる。引き続き、この菌株を、pET21aベクター内のT7プロモーターの制御下でバチルスプミルスのBODをコードするDNA配列を含有するpFD1プラスミドによって形質転換する。1.2ベクターpFD1:C末端の位置において6×HisタグとインフレームでクローニングされたバチルスプミルスのBODをコードする核酸配列配列番号1を含有するpET21aプラスミド。pFD1ベクターのプラスミドマップを図2に示す。1.3培養培地LB強化培地:10g/lトリプトン5g/l酵母エキス5g/lNaCl蒸留H2O約1LpHは調整せず、1barで50分間オートクレーブ処理する。2.遺伝子操作技法2.1スーパーコンピテント細菌の形質転換スーパーコンピテントDH5α細菌を、InoueetalInoueetal1990Gene962328によって記載されるプロトコルに従ってSEM法簡便かつ効率的な方法を使用して調製する。2.2DNA調製プラスミドDNA精製キットQuiagenを、小量及び大量のDNA調製に使用する。2.3二本鎖DNAのシーケンシング二本鎖DNAをシーケンシングする。シーケンシング反応は、BigDyeTerminatorv1.1又はv3.1シーケンシングキットを用いて実施する。試薬は、様々な蛍光標識を有する4つのddNTPBigDyeTerminator、AmpliTaqDNAポリメラーゼ、及び反応に必要な他の全ての構成要素を含有する。取り込まれていない標識、塩及び他の汚染物質を除去するために、ABI3130xlシーケンサーを通過させる前に、伸長生成物を精製するものとする。2.4BOD発現ベクターの構築PCRを、バチルスプミルス細菌SAFR-032株のゲノムDNAに対してPhusionHFDNAポリメラーゼを用いて実施する。バチルスプミルスのBODをコードする遺伝子のDNA配列の3’末端及び5’末端に相補的な2つのオリゴデオキシリボヌクレオチド配列番号3及び配列番号4を、DNA合成のためのプライマーとして使用する。引き続き、増幅生成物及びまたpET21aプラスミドを、その認識配列がBamH1についてセンスオリゴヌクレオチド及びXho1についてアンチセンスオリゴヌクレオチド中に導入されているそれぞれ配列番号3及び配列番号4に示される2つの制限酵素BamH1及びXho1によって処理する。消化生成物をNucleospin登録商標キットNucleoSpin登録商標ExtractIIClontechLaboratoriesInc.によってゲル精製し、引き続き、BOD遺伝子を、37°Cで終夜のT4DNAリガーゼとの同時インキュベーションによってプラスミド中にライゲーションする。引き続き、新たに形成されるプラスミドを、アンピシリンを含有するプレート上でのDH5α細菌の形質転換によって、選択し、増殖させる。3.バチルスプミルスのビリルビンオキシダーゼ酵素の産生、精製及び特徴付け3.1野生型BOD酵素の産生BOD酵素を、野生型BODをコードする配列を有するpET21a組換えプラスミドによる大腸菌BL21star株中で産生させる。アンピシリン150mg/lLBA及び0.25mMCuSO4を添加したLB培地の前培養物50mlに、アンピシリン100mg/lを添加したLB寒天プレート上で単離したクローンを接種し、37°Cで終夜、220rpmで振とうする。引き続き、5L容のエルレンマイヤーフラスコ中の0.25mMCuSO4を含有する2リットルのLBA培地に、1/100量を接種する。これを、0.8~1OD600nm/mlのOD600nmが得られるまで、振とうしながら220rpm37°Cでインキュベートする。引き続き、培養を、200μMのIPTGによって誘導し、25°Cで4時間振とうする180rpm~220rpm。引き続き、細胞を、細菌中への銅の取込みを増大させるために、嫌気条件下で振とうしながら培養及びタンパク質誘導を20時間継続するように、マグネチックバーの入った無菌の2L容ショットボトル中に移す。遠心分離4000g、4°Cによって回収した細胞を水で洗浄し、-20°Cで保存する。大腸菌におけるこのBODの発現の誘導が僅か24時間で行われることを強調することが重要である。これは、現在利用可能な市販の酵素の誘導のためのプロトコルと比較して、相当な利点を示す。これは、ミロセシウムベルカリア由来のBODの産生には最大5日間の誘導期間が必要となる場合があるためである。3.2野生型BOD酵素の精製3.2.1細胞の破壊、及びDNaseIによる処理2リットルの培養物由来の細胞ペレットを、500mMNaCl及び20mMイミダゾールを含有する40mlの50mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.6中に取り、超音波1秒及び中断1秒のサイクルによる40W、3分間の超音波処理出力で10回超音波処理する。得られた試料粗抽出物と称するに、MgCl2を添加して最終濃度を2mMとし、DNaseI粗抽出物1ml当たり1Uによって30分間常温で処理する。引き続き、不溶性の細胞の残骸を、20000gで60分間の遠心分離によって粗抽出物から除去する。3.2.2ニッケルカラムによるアフィニティクロマトグラフィ0.22μmフィルターを通してろ過し、OD280nmが10となるまで希釈した超音波処理上清を、AKTApurifierシステムGCHealthcare登録商標に連結し、500mMNaCl及び20mMイミダゾールを含有する50mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.6中で平衡化したHisPrepFF16/10アフィニティカラムGCHealthcare登録商標上に注入する。溶出を、1ml/分の流速で、500mMNaCl及び1Mイミダゾールを含有する50mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.6を5から30へと変化させるグラジエントを用いて実施する。BODタンパク質を含有する画分を、ABTS活性試験によって特定し、結合し、濃縮し、AmiconYM10膜に対する遠心分離によって、50mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.6を用いて脱塩する。この段階で、BODタンパク質は純粋であり、可溶性形態で-20°Cで保存することができる。ここで再度、市販のBOD精製法と比較することによって、このタンパク質の使用によってもたらされる明確な利点を強調することができる。これは、市販のBODに必要不可欠な連続型のクロマトグラフィサイズ排除、陰イオン交換又は陽イオン交換、疎水性等とは対照的に、純粋な酵素を得るために単一の精製工程しか必要とされないためである。3.2.3野生型BOD酵素の特徴付け3.2.3.1分子量決定全タンパク質の重量の分析を、備え付けたナノ液体クロマトグラフィ装置の上流にC4脱塩予備濃縮カラムμ-Precolumn登録商標カートリッジ、AcclaimPepMap300、内径300μm×5m、LCPackingsDionex及びC4分析カラムC4PepMap300、内径75μm×5cm、LCPackingsDionexを連結したLCQDecaXP質量分析器を用いて実施した。BODについて61005.91Daの重量が得られたすなわち、タンパク質の理論重量と比較して130.4Daの差異。理論重量はN末端メチオニンで切断されたタンパク質について算出されたが、僅か0.80Daの差異が見出され、これによって、タンパク質成熟プロセス時の細菌におけるこのアミノ酸の切断が示される。3.2.3.2濃度測定溶液の酵素濃度を、標準としてBSAを使用するブラッドフォード法に従って算出するBradfordanalBiochimie722481976。3.2.3.3酵素アッセイ酵素アッセイを、3mlの体積、37°C、0.1Mシトレート/ホスフェートバッファーにおいて、Varianの分光光度計を使用して実施し、ABTSの酸化を、時間の関数として420nmで追跡するε420nm=36mM-1cm-1。酵素の比活性は、1分当たり及びタンパク質1mg当たりに酸化されるABTSのμmol単位で表す。使用される標準ABTS濃度は1mMである。酵素を、0.05OD420nm/分~0.3OD420nm/分の傾きを測定するように希釈する。4.野生型のバチルスプミルスのBOD酵素の酵素特性を研究する技法4.1定常状態における速度定数kcat及びミカエリス定数KMの決定4.1.1基質は2,2’-アジノビス3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸ABTSである実験を、0.1Mシトレート/ホスフェートバッファーpH3において、Varianの分光光度計によって37°Cで実施する。本試験において、ABTS濃度は、0mMから5mMまで変化させる。試験は、酵素を添加することによって開始する。実験点は、以下の式に従って、Sigma-plot6.0ソフトウェアを使用して、ミカエリスメンテンモデルに従う非線形回帰によって解析する:ミカエリスメンテンモデル:kss=kcat×[S]/KM[S]結果:kcat=391.3s-1、及びKM=31.7μM。図3は、ABTS濃度の関数としてのバチルスプミルスのBODの比活性単位:U/mgをグラフとして例示する。比較として、バチルスサブチリスの相同CotAタンパク質は、同じ最適な活性条件下でABTSに対して、322s-1のkcat、124μMのKMを示すMartinsetal2008JBiolInorgChem13183193。4.1.2基質は非抱合型ビリルビンである実験を、50mMリン酸ナトリウムバッファーpH7において、Varianの分光光度計において37°Cで実施する。本試験において、ビリルビン濃度は、0μMから60μMまで変化させる。酵素の添加によって開始する本試験は、比色変化によって450nmでビリルビンの酸化を追跡するものであるε450nm=32mM-1cm-1。実験点は、以下の式に従って、Sigma-plot6.0ソフトウェアを使用して、ミカエリスメンテンモデルに従う非線形回帰によって解析する:ミカエリスメンテンモデル:kss=kcat×[S]/KM[S]結果:kcat=70s-1、及びKM=22μM。図4は、バチルスプミルスのBODに関するミカエリスメンテン式非抱合型ビリルビン濃度の関数としてのkss単位:s-1のグラフ表示である。4.1.3基質は抱合型ビリルビンである実験を、50mMリン酸ナトリウムバッファーpH4.8において、Varianの分光光度計において37°Cで実施する。本試験において、ビリルビン濃度は、0μMから150μMまで変化させる。酵素の添加によって開始する本試験は、比色変化によって440nmで抱合型ビリルビンの酸化を追跡するものであるε440nm=25mM-1cm-1。実験点は、以下の式に従って、Sigma-plot6.0ソフトウェアを使用して、ミカエリスメンテンモデルに従う非線形回帰によって解析する:ミカエリスメンテンモデル:kss=kcat×[S]/KM[S]結果:kcat=66.8s-1、及びKM=35.1μM。図5は、50mMシトレート/ホスフェートバッファーpH4.8における、37°CでのバチルスプミルスのBODによる抱合型ビリルビンの酸化に関する触媒活性を表す。4.1.4基質はシリンガルダジンSGZである実験を、50mMシトレート/ホスフェートバッファーpH6.2において、Varianの分光光度計において37°Cで実施する。本試験において、メタノールで希釈したSGZ濃度は、0μMから300μMまで変化させる。酵素の添加によって開始する本試験は、比色変化によって530nmでSGZの酸化を追跡するものであるε530nm=64mM-1cm-1。実験点は、以下の式に従って、Sigma-plot6.0ソフトウェアを使用して、競合阻害のあるミカエリスメンテンモデルに従う非線形回帰によって解析する:競合阻害のあるミカエリスメンテンモデル:kss=kcat×[S]/KM[S][S]2Ki結果:kcat=116.1、KM=45.6μM、及びKi=82.9μM。図6は、50mMシトレート/ホスフェートバッファーpH6.2における、37°CでのバチルスプミルスのBODによるシリンガルダジンの酸化に関する触媒活性を表す。4.1.5基質は2,6-ジメトキシフェノールDMPである実験を、50mMリン酸ナトリウムバッファーpH6.8において、Varianの分光光度計において37°Cで実施する。本試験において、2,6-ジメトキシフェノール濃度は、0μMから4000μMまで変化させる。酵素の添加によって開始する本試験は、比色変化によって468nmでDMPの酸化を追跡するものであるε468nm=14.8mM-1cm-1。実験点は、以下の式に従って、Sigma-plot6.0ソフトウェアを使用して、ミカエリスメンテンモデルに従う非線形回帰によって解析する:ミカエリスメンテンモデル:kss=kcat×[S]/KM[S]結果:kSS=57.3s-1、及びKM=822μM。図7は、50mMシトレート/ホスフェートバッファーpH6.8における、37°CでのバチルスプミルスのBODによるDMPの酸化に関する触媒活性を表す。4.2pHの関数としての研究4.2.1pHの関数としての活性4.2.1.1ABTSpHの関数としての反応速度定数の変動の研究を、基質として1mMABTSを使用して、0.1Mシトレート/ホスフェートバッファーにおいて、3~7のpH範囲に対して実施する。実験は、Varianの分光光度計を使用して37°Cで実施する。活性は、420nmで測定される比色変化をもたらすABTSの酸化によって追跡する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。バチルスプミルスのBODによるpHの関数としてのABTSの酸化の結果を、図8のグラフに相対活性として示す。4.2.1.2非抱合型ビリルビンpHの関数としての反応速度定数の変動の研究を、基質として30μM非抱合型ビリルビンを使用して、0.2Mtris-HClバッファーにおいて、7~8.5のpH範囲に対して実施する。実験は、Varianの分光光度計を使用して37°Cで実施する。活性は、450nmで測定される比色変化をもたらすビリルビンの酸化によって追跡するε450nm=32mM-1cm-1。本試験は、酵素を添加することによって開始する。バチルスプミルスのBODによるpHの関数としての非抱合型ビリルビンの酸化の結果を、図8のグラフに相対活性として示す。4.2.1.3抱合型ビリルビンpHの関数としての反応速度定数の変動の研究を、基質として100μM抱合型ビリルビンを使用して、0.1Mシトレート/ホスフェートバッファーにおいて、3~7のpH範囲に対して実施する。実験は、Varianの分光光度計を使用して37°Cで実施する。活性は、440nmで測定される比色変化をもたらす抱合型ビリルビンの酸化によって追跡する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。バチルスプミルスのBODによるpHの関数としての抱合型ビリルビンの酸化の結果を、図8のグラフに相対活性として示す。4.2.1.4シリンガルダジンSGZpHの関数としての反応速度定数の変動の研究を、基質として22μMシリンガルダジンを使用して、0.1Mシトレート/ホスフェートバッファーにおいて、3~7.5のpH範囲に対して実施する。実験は、Varianの分光光度計を使用して37°Cで実施する。活性は、530nmで測定される比色変化をもたらすシリンガルダジンの酸化によって追跡する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。バチルスプミルスのBODによるpHの関数としてのシリンガルダジンの酸化の結果を、図8のグラフに相対活性として示す。4.2.1.52,6-ジメトキシフェノールDMPpHの関数としての反応速度定数の変動の研究を、基質として1mMDMPを使用して、0.1Mシトレート/ホスフェートバッファーにおいて、3~7.5のpH範囲に対して実施する。実験は、Varianの分光光度計を使用して37°Cで実施する。活性は、468nmで測定される比色変化をもたらすDMPの酸化によって追跡する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。バチルスプミルスのBODによるpHの関数としてのDMPの酸化の結果を、図8のグラフに相対活性として示す。4.2.2pHの関数としての安定性野生型BODのpHの関数としての安定性を、常温でのpH3~9の範囲の混合バッファーにおける均一となるまで精製した酵素の希釈によって決定する。この混合バッファーは120mMTris、30mMイミダゾール及び30mM酢酸によって構成され、そのイオン強度はNaClによって190mMに調整される。様々な試料を、時間に応じて採取する。残存活性を、1mMABTSを含有する0.1Mシトレート/ホスフェートバッファーpH3において、Varianの分光光度計を使用して、4°Cで測定する。4°CでのpHの関数としてのABTSの酸化の比活性及び相対活性の結果を、図9A及び図9Bのグラフに示す。4.3温度の関数としての研究4.3.1温度の関数としての活性温度の関数としての反応速度定数の変動の研究を、1mMのABTSの存在下において、0.1Mシトレート/ホスフェートバッファーpH3において実施する。温度は10°C~85°Cの範囲とする。活性は、温度調整されたVarianのCaryUVBiomelt分光光度計によって追跡する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。図10は、ABTS酸化に関する温度の関数としてのバチルスプミルスのBODの相対活性を表すヒストグラムである。4.3.2温度の関数としての酵素の安定性酵素を、80°Cの乾燥浴drybathにおいて10mg/mlの濃度でプレインキュベートする。2μlの試料を採取し、酵素を、活性試験のために酵素濃度を調整するように、50mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.6中に希釈する。80°Cでインキュベートした酵素の残存活性を、1mMのABTSの存在下において、37°Cで0.1Mシトレート/ホスフェートバッファーpH3において、Varianの分光光度計を使用して、決定する。本試験は、酵素を添加することによって開始する。図11A及び図11Bは、80°Cでの酵素インキュベーション時間の関数としてのバチルスプミルスのBODの安定性ABTS酸化に関する比活性及び相対活性として表すをグラフとして表す。4.4尿素の存在の関数としての活性の研究第4.1.1項において上で記載されるプロトコルを、0M~6Mの範囲の尿素濃度の存在下において再現した。図12A及び図12Bは、25°C及び37°Cでの尿素濃度の関数としてのバチルスプミルスのBODの活性ABTS酸化に関する比活性及び相対活性として表すをグラフとして表す。25°Cでは、BODに対する尿素の活性化効果が明らかに観察される。この効果は、より良好な酵素効率に関与すると考えられる酵素の活性部位の僅かな立体配座変化によるものであると考えられる。既知のこの現象は、他のタンパク質については既に記載があるHongJieZhangetalBiochemicalandBiophysicalResearchCommunications238382386及びFanetalBiochemJ31597102を参照されたい。37°Cでは、この効果は見出されない。温度及び尿素の効果の組合せが過度に大きな活性部位の変化を引き起こし、結果として酵素の性能レベルの減少をもたらすという仮説を提示することが可能である。4.5NaClの存在の関数としての活性の研究実験を、漸増濃度のNaCl0mMから1000mMまでを含む50mMシトレート/ホスフェートバッファーpH6.2において、Varianの分光光度計によって37°Cで実施する。メタノール中に希釈したSGZの濃度は、本試験においては50μMに固定する。酵素を添加することによって開始する本試験は、比色変化によって530nmでSGZの酸化を追跡するものであるε530nm=64mM-1cm-1。図13は、NaCl濃度の関数としてのバチルスプミルスのBODによるSGZ酸化の相対活性を表す。4.6DTT又はEDTAの存在の関数としての活性の研究実験を、漸増濃度のDTT0mMから50μMまで又は他にはEDTA0mMから125mMまでを含む50mMシトレート/ホスフェートバッファーpH6.2において、Varianの分光光度計によって37°Cで実施する。メタノール中に希釈したSGZの濃度は、本試験においては50μMに固定する。酵素を添加することによって開始する本試験は、比色変化によって530nmでSGZの酸化を追跡するものであるε530nm=64mM-1cm-1。以下の表IIIは、相対活性の形式で示される得られた結果を並べるものである。4.7レマゾールブリリアントブルーRRBBR変色活性の研究多くの他のラッカーゼ及びビリルビンオキシダーゼと同様に、バチルスプミルスのBODは、織物産業に使用される染料に対する変色活性を有する。一例としてレマゾールブリリアントブルーRRBBRを選択し、その変色を、ABTS等の媒介因子の存在下又は非存在下において経時的に測定する。実験を、3mlでABTSの非存在下又は存在下において、50mMリン酸カリウムバッファーpH6において、Varianの分光光度計によって37°Cで実施する。RBBR濃度は、各タンクにおいて80mg/lに固定する。10μgの酵素を添加することによって開始する本試験は、593nmでRBBR染料の変色を経時的に追跡するものである。図13は、10μMのABTSの非存在下又は存在下における50mMリン酸カリウムバッファーpH6における、37°Cでの3.33μg/mlのバチルスプミルスのBODによるRBBRの変色を表す。5.バチルスプミルスのビリルビンオキシダーゼの4つの銅イオンの存在の検証4つの銅イオンの存在を、銅のモル濃度を測定するために銅濃度に関する較正範囲を使用するビキノリンアッセイによって決定するFelsenfeldG1960ArchBiochemBiophys87247251、Griffithsetal1961JBiolChem23618501856。結果を表IIIに示す。546nmでの比色アッセイに基づく各測定を二連で実施する。この技法によって、3.75μMのBODタンパク質試料に対する15.3μMすなわち4.08の比率の銅の存在を示すことが可能となり、酵素と結び付く4つの銅イオンの存在が明確に確認される。最後に、BODタンパク質における4つの銅イオンの存在を確認するために、タンパク質の銅に関する元素分析を、原子吸光によって実施した。結果によって、タンパク質1つ当たり4つの銅イオンの存在が明確に確認された。"