"宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第1の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第2の工程と、前記補償経路を脱落させる第3の工程を含むことを特徴とする遺伝子欠損酵母の製造方法。前記代替代謝物が、リンゴ酸及び/またはコハク酸である請求項1に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記代替代謝物生産経路の構築工程が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼMDH遺伝子及び/またはリンゴ酸トランスポーターMAE遺伝子を導入及び/または増幅する工程である請求項1または2に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼMDHが、MDH1遺伝子、MDH2遺伝子及びMDH3遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子によりコードされるものである請求項3に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記リンゴ酸トランスポーターMAEが、mae1遺伝子によりコードされるものである請求項3に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記補償経路の構築工程が、前記第2の工程で欠損させる遺伝子と同一の遺伝子を導入する工程である請求項1~5のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記補償経路の構築工程において、第3の工程において脱落させて機能欠損が可能となるような選択マーカーを有しているプラスミドを使用する請求項1~6のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記遺伝子欠損の対象となる遺伝子が、エタノール生合成経路の遺伝子である請求項1に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記エタノール生合成経路の遺伝子が、ピルビン酸デカルボキシラーゼPDC及び/またはアルコールデヒドロゲナーゼADHをコードする遺伝子である請求項8に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記ピルビン酸デカルボキシラーゼPDCが、PDC1遺伝子、PDC5遺伝子及びPDC6遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子によりコードされるものである請求項9に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記アルコールデヒドロゲナーゼADHが、ADH1遺伝子、ADH2遺伝子、ADH3遺伝子、ADH4遺伝子及びADH5遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子によりコードされるものである請求項9に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記第2の工程を、PCR産物を用いたジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法を用いて行う請求項1~11のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記宿主酵母がサッカロマイセスSaccharomyces属に属する請求項1~12のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記宿主酵母がサッカロマイセスセレビシエである請求項13に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記第1~第3の工程の少なくとも1工程における菌株の取得を、選択マーカーを含むプレート上でのセレクションにより行う請求項1~14のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。前記選択マーカーが薬剤耐性マーカーまたは栄養要求性マーカーである請求項15に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。本発明の課題は、エタノール生産能を低減させるため遺伝子欠損させると生育阻害が生じ、特殊装置や多くの時間を要する方法でしか取得することができなかった遺伝子欠損酵母を簡便に取得することができる遺伝子欠損酵母の製造方法を提供することにある。本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第1の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第2の工程と、前記補償経路を脱落させる第3の工程を含む処理を行うことにより、生育阻害が生じる遺伝子を欠損させた酵母株を取得できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の[1]~[16]を含む。[1]宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第1の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第2の工程と、前記補償経路を脱落させる第3の工程を含むことを特徴とする遺伝子欠損酵母の製造方法。[2]前記代替代謝物が、リンゴ酸及び/またはコハク酸である[1]に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[3]前記代替代謝物生産経路の構築工程が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼMDH遺伝子及び/またはリンゴ酸トランスポーターMAE遺伝子を導入及び/または増幅する工程である[1]または[2]に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[4]前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼMDHが、MDH1遺伝子、MDH2遺伝子及びMDH3遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子によりコードされるものである[3]に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[5]前記リンゴ酸トランスポーターMAEが、mae1遺伝子によりコードされるものである[3]に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[6]前記補償経路の構築工程が、前記第2の工程で欠損させる遺伝子と同一の遺伝子を導入する工程である[1]~[5]のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[7]前記補償経路の構築工程において、第3の工程において脱落させて機能欠損が可能となるような選択マーカーを有しているプラスミドを使用する[1]~[6]のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[8]前記遺伝子欠損の対象となる遺伝子が、エタノール生合成経路の遺伝子である[1]に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[9]前記エタノール生合成経路の遺伝子が、ピルビン酸デカルボキシラーゼPDC及び/またはアルコールデヒドロゲナーゼADHをコードする遺伝子である[8]に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[10]前記ピルビン酸デカルボキシラーゼPDCが、PDC1遺伝子、PDC5遺伝子及びPDC6遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子によりコードされるものである[9]に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[11]前記アルコールデヒドロゲナーゼADHが、ADH1遺伝子、ADH2遺伝子、ADH3遺伝子、ADH4遺伝子及びADH5遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子によりコードされるものである[9]に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[12]前記第2の工程を、PCR産物を用いたジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法を用いて行う[1]~[11]のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[13]前記宿主酵母がサッカロマイセスSaccharomyces属に属する[1]~[12]のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[14]前記宿主酵母がサッカロマイセスセレビシエである[13]に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[15]前記第1~第3の工程の少なくとも1工程における菌株の取得を、選択マーカーを含むプレート上でのセレクションにより行う[1]~[14]のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。[16]前記選択マーカーが薬剤耐性マーカーまたは栄養要求性マーカーである[15]に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。本発明の方法により、補償経路の働きで宿主酵母の遺伝子欠損による急激な生育阻害を防ぎ、目的遺伝子の欠損株を特殊装置や長時間を要さず簡便に取得することができる。本発明の方法によれば、相同組換え及びプレートを用いた簡便なセレクションで、宿主酵母の生育阻害が生じる一つあるいは複数の遺伝子の欠損株を取得可能であり、特殊な装置を用いて胞子形成分離を行う従来の方法に比べて、時間的金銭的なメリットが大きい。また、本発明により得られる組換え酵母は、有機酸等の有用化学物質等を生産するための生産菌として有用である。以下、本発明について詳細に説明する。本発明の遺伝子欠損酵母の製造方法は、宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第1の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第2の工程と、前記補償経路を脱落させる第3の工程を含むことを特徴とする。本明細書において遺伝子欠損とは、遺伝子が本来持つ機能が失われた状態を言い、遺伝子の塩基配列の一部もしくは全部が欠落すること、遺伝子の塩基配列が他の塩基配列に置換されること等により生じる。このような状態は自然に生じることもあるが、本発明では、任意の遺伝子を目的に応じて人為的に欠損させることを意味する。本明細書において生育阻害とは、野生株に比べて遺伝子改変した酵母の増殖速度が著しく低下する状態、あるいは全く増殖できなくなった状態のこと言う。生育阻害が生じる遺伝子とは、一つあるいは複数の遺伝子を欠損させると宿主の生育阻害が起こるような代謝の主要経路の遺伝子のことを言い、例えば、グリコーゲンシンターゼ、グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコース-6-ホスファターゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、グルコサミンリン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ヘキソースジホスファターゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ビスホスホグリセロムターゼ、ビスホスホグリセリン酸ホスファターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセロムターゼ、エノラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸シンターゼ、イソシトラーゼ、フマル酸ヒドラターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルCoAシンテターゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ等の酵素をコードする遺伝子が挙げられる。中でも、エタノールの生合成経路の遺伝子群は欠損による生育阻害が顕著であることから、本発明の欠損対象として好ましく、ピルビン酸デカルボキシラーゼPDCと略記する。、アルコールデヒドロゲナーゼADHと略記する。をコードする遺伝子が欠損対象として好ましい。特に好ましいのは、PDC1、PDC5、PDC6、ADH1、ADH2、ADH3、ADH4及びADH5遺伝子SacccharomycesGenomeDatabaseSystematicName:YLR044C,YLR134W,YGR087C,YOL086C,YMR303C,YMR083W,YGL256W,YBR145Wである。本発明において遺伝子欠損させる酵母は、遺伝子欠損可能な酵母であれば特に制限されるものではなく、例えば、サッカロマイセス属、クリベロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、チゴサッカロマイセス属、ヤロウイア属、ハンゼヌラ属、ピキア属、キャンディダ属等の酵母が挙げられ、中でもサッカロマイセス属のものが好ましく、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeが特に好ましい。また、形質転換により遺伝子を導入した際に形質転換体を選抜することが容易になることから、栄養要求性を持つ菌株が好ましい。本明細書において代替代謝物とは、欠損対象となるターゲット遺伝子を欠損させた時にターゲット遺伝子の代謝物の代わりに菌体内の酸化還元バランスを取ることができる代謝物のことを言う。例えば、エタノールの代替代謝物としては、乳酸、アクリル酸、酢酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、リンゴ酸、グリオキシル酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸、レブリン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸等の有機酸類や、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、イソブタノール、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール等のアルコール類が挙げられる。中でも、乳酸、リンゴ酸、コハク酸が代替代謝物として好ましく、リンゴ酸、コハク酸がより好ましい。本明細書において代替経路の構築とは、本発明の第1の工程において代替代謝物へとつながる代謝経路の遺伝子を宿主酵母にあらかじめ導入し、これら代謝物の生産機能を付与することである。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、リンゴ酸シンターゼ、イソシトラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、フマル酸リダクターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸トランスポーター等をコードする遺伝子を使用することができる。中でも、代替代謝物となるリンゴ酸やコハク酸の生産量が増大する代替経路が構築されるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸トランスポーター等の遺伝子を導入及び/または増幅することが好ましく、MDH1、MDH2、MDH3遺伝子SacccharomycesGenomeDatabaseSystematicName:YKL085W,YOL126C,YDL078C及びmae1遺伝子NCBIaccessionnumber:NM_001020205のうち1種あるいは複数種を導入及び/または増幅することが特に好ましい。上記導入する遺伝子の単離は、染色体DNAを鋳型としたPCR等の公知の方法によって行うことができる。あるいは、常法により調製された全mRNA、全RNAからRT-PCRにより得られたcDNA、あるいは市販のcDNAライブラリー等の核酸を鋳型とし、本発明に用いられる遺伝子の塩基配列に基づいて設計されるプライマーを用いたPCR法によって取得することができる。また、染色体DNAライブラリーから、ハイブリダイゼーション等の公知の方法によって行うこともできる。代替経路の構築に使用されるベクターは、遺伝子が導入される酵母で複製され、安定に保持されるものであればいずれのものも用いることができ、染色体組み込み型プラスミド、シングルコピー型プラスミド、マルチコピー型プラスミドなどを用いることができる。例えば、pRSシリーズのYI、YC、YEタイプや、p4XXシリーズDominiketalGene156p119-122等が挙げられる。ベクター中に任意の遺伝子を組み込むには、例えば、その遺伝子を含むDNA断片を適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの制限酵素切断部位またはマルチクローニングサイトにインフレームで挿入し連結すればよい。本発明で使用する発現ベクターには、ベクターが細胞内に保持されていることを示す選択マーカーが含まれていることが好ましい。上記導入する遺伝子の機能発現に用いられるプロモーターは、その発現ベクターを導入する酵母中でその制御下の遺伝子の発現を誘導できるものであれば任意のものでよい。酵母中で発現させるためには、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター、MFα1プロモーター、ADHプロモーター、TEFプロモーター、CYC1プロモーター等の公知のプロモーターが使用できる。このうち、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターが最も好ましい。また、ターミネーターとしては、ENO1ターミネーター、GAL10ターミネーター、GAPDHターミネーター、ADHターミネーター、CYC1ターミネーター等の公知のターミネーターが使用できる。本明細書において補償経路の構築とは、本発明の第2の工程における欠損させたいターゲット遺伝子と同等の機能を発現する遺伝子を導入する工程に対応する。すなわち、遺伝子欠損の対象となるターゲット遺伝子と同一か、もしくは同等の機能発現を可能とする遺伝子を発現させてターゲット遺伝子の機能を補う状態にすることを言い、具体的には遺伝子欠損の対象となるターゲット遺伝子と同一か、もしくは同等の機能発現を可能とする遺伝子を酵母に導入し、発現させることを言う。例えば、酵母ゲノム上のADH1遺伝子を欠損させたい場合はPCR等により単離したADH1遺伝子を発現用プラスミドに連結し、形質転換により酵母に導入することで補償経路を構築することができる。導入する遺伝子は欠損させる遺伝子と同一のものが好ましいが、同じ機能を有するものであれば異なる遺伝子でもよいし、別の生物由来のものでもよい。また、導入する遺伝子は一種でもよいし、複数種でもよい。補償経路の構築に使用されるベクターはプラスミドであることが好ましい。酵母中でプラスミドの状態で自律複製されるものであればいずれのものも用いることができる。例えば、pRSシリーズのYC、YEタイプや、p4XXシリーズDominiketalGene156p119-122等のベクターが挙げられる。ベクター中に任意の遺伝子を組み込むには、例えば、その遺伝子を含むDNA断片を適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの制限酵素切断部位またはマルチクローニングサイトにインフレームで挿入し連結すればよい。補償経路構築用のプラスミドは、後に脱落させて機能欠損が可能となるような選択マーカーを有していることが好ましい。本発明で用いられる遺伝子またはそれを含む組換えベクターを用いて宿主酵母を形質転換するには、一般的に行われている遺伝子導入法、例えば、コンピテントセル法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコールPEG法、塩化リチウム法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。形質転換体の選択は、常法に従って行うことができるが、通常は使用した組換えベクターに組み込まれた選択マーカーを利用して行うことができる。本発明の第1の工程における代替代謝物生産経路の構築及び補償経路を構築する際の両者の実施順序は特に限定されない。すなわち、代替代謝物生産経路の構築後補償経路の構築を行なうこともできるし、補償経路の構築後代替代謝物生産経路の構築を行なうこともできる。また、補償経路の構築と代替代謝物生産経路の構築を同時に行なうこともできる。上記遺伝子が酵母に導入されたことの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロット法等を利用して行うことができる。例えば、形質転換された酵母からプラスミドを抽出し、遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCR増幅を行えばよい。その増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、サイバーセーフSYBRSafe等により染色し、増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、目的とする遺伝子が導入されたことを確認することができる。本発明の第1の工程における代替経路の構築及び補償経路の構築は、染色体上のターゲット遺伝子の機能を欠損することによって生じる酵母の生育阻害を回避することを目的としている。すなわち、続く第2の工程において染色体上のターゲット遺伝子を欠損させてその機能を失っても、補償経路として導入したプラスミド上の遺伝子がその機能を補うことにより、ターゲット遺伝子が欠損されても生育可能な状態を維持できる。さらに続く第3の工程において補償経路として導入したプラスミドを脱落させても、第1の工程において代替経路を構築しておいたことにより菌体内の酸化還元バランスを取ることができる代謝物が生産され、ターゲット遺伝子が欠損されても生育可能な酵母が得られるということである。第1の工程を行わない場合、あるいは第1の工程における代替経路の構築及び補償経路の構築のいずれか一方しか行わない場合、いずれの場合も第2あるいは第3の工程において生育阻害が生じ、目的とする酵母を得ることができない。本発明における前述の第1工程、第2工程及び後述の第3工程においては、一般的な薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子をマーカー遺伝子として利用することができる。例えば、G418耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などの公知の薬剤耐性マーカー遺伝子を使用することができる。あるいは、ウラシル要求性、リシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性、トリプトファン要求性、メチオニン要求性、ビオチン要求性、アデニン要求性などの栄養要求性を相補する公知の栄養要求性マーカー遺伝子を用いることができる。本発明の第2の工程における遺伝子欠損は、一般的な相同組換えによる遺伝子置換を用いて行うことができる。例えば、PCR産物を用いたジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法ワンステップ遺伝子破壊や、PCR産物もしくはプラスミドを導入後、マーカー遺伝子を回収する遺伝子破壊法ツーステップ遺伝子破壊などが挙げられる。いずれの場合も、相同組換えによってターゲット遺伝子をマーカー遺伝子に置換することにより遺伝子欠損が可能となる。マーカー遺伝子は、その5’末端側と3’末端側に宿主酵母の染色体DNAと相同配列を有するベクターの形態で宿主酵母内に導入され、相同配列と宿主染色体DNAとが相同組換えを起こすことにより、宿主酵母の染色体に挿入または置換によって導入され、これによってターゲット遺伝子が欠損される。塩基配列が明らかな宿主酵母の染色体DNAに基づいて相同配列を設計することにより、マーカー遺伝子を染色体の任意の位置に導入し、任意のターゲット遺伝子を欠損することができる。マーカー遺伝子を宿主酵母に導入するためのベクターは、線状のDNA断片であってもよく、またプラスミドのような環状であってもよい。ベクターの導入は、公知の遺伝子導入技術を用いて行うことができる。例えば、コンピテントセル法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコールPEG法、塩化リチウム法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。本発明において、ターゲット遺伝子が欠損されたことは、公知の方法によって確認することができる。例えば、ターゲット遺伝子の表現型による確認や、ターゲット遺伝子を挟んだ染色体上の領域に対してPCRを行い、増幅された断片の大きさに基づいて確認することもできる。また、ターゲット遺伝子に特異的なプローブを用いて検出してもよい。本発明における第3の工程である第1の工程にて構築した補償経路の脱落、すなわち前記プラスミドの脱落は、補償経路の構築に用いたプラスミド中の選択マーカーによる選択圧をかけずに菌株の培養を行い、酵母が分裂する際に自然にプラスミドが脱落することを利用する方法で行うことができる。プラスミドが脱落した菌株のスクリーニングには、脱落した菌株のみが生存できるポジティブスクリーニングを行うことができることから、前述の栄養要求性相補遺伝子としてUra3やLys2のマーカーを有するプラスミド及び5-フルオロオロト酸FOAやα-アミノアジピン酸αAA等が含有されたプレートを用いることが好ましい。酵母の培養に用いる培地は、炭素源としてグルコース、及び本発明で得られる組換え酵母が資化し得る窒素源、無機塩類、ビタミン類等を含有し、組換え酵母の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。静置培養、振とう培養、深部通気撹拌培養のいずれで行ってもよいが、振とう培養が好ましく用いられる。培養温度は通常、15~40°Cである。以下、実施例、参考例及び比較例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例1工程1代替経路及び補償経路の構築実施例1-1、参考例1~2:代替経路の構築1MDH3遺伝子の単離及びMDH3遺伝子を有するプラスミドの調製サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeBY4742株の染色体DNAを、QIAampDNAMinikitキアゲンQIAGEN社製を用い、添付説明書の記載に従って調製した。以下、ゲノムDNAの調製は全て説明書の記載に従った。得られた染色体を鋳型とし、配列番号1及び2で示される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてPCR反応を行い、約1.0kbpのMDH3遺伝子を含むDNA断片を取得した。PCR反応はPrimeSTARHSDNAPolymeraseタカラバイオ社製を用い、添付説明書の記載に従って行った。以下、PCR法は全て説明書の記載に従った。DNA断片の鎖長は、PCR反応生成物を0.9アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。得られたDNA断片とZeroBlunt登録商標TOPO登録商標CloningKitインビトロジェン社製を用い、添付された説明書の記載に従ってクローニングした。得られたプラスミドとp413GPDベクターをそれぞれSpeI及びSmaIで制限酵素処理し、SeaPlaque登録商標GTG登録商標agaroseCAMBREX社製を用いて作製した1.0アガロースゲルで電気泳動することによりSpeI-SmaI断片を単離、精製した。その後、Takaraligationmixタカラバイオ社製を用いて連結し、MDH3遺伝子がp413GPDに連結された目的のプラスミドを得た。挿入されたDNA断片の塩基配列をDNAシーケンサーにより調べたところ、配列番号3で示される塩基配列を有するDNAを有していた。2mae1遺伝子の単離及びmae1遺伝子を有するプラスミドの調製シゾサッカロマイセスポンベSchizosaccharomycespombeのcDNAライブラリーバイオアカデミア社を鋳型とし、配列番号4及び5で示される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてPCR反応を行い、mae1遺伝子を含む約1.3kbpのDNA断片を取得した。DNA断片の鎖長は、反応生成物を0.9アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。得られたDNA断片とZeroBlunt登録商標TOPO登録商標CloningKitインビトロジェン社製を用い、添付説明書の記載に従ってクローニングした。得られたプラスミドとp415GPDベクターをそれぞれSpeI及びPstIで制限酵素処理し、SeaPlaque登録商標GTG登録商標agaroseCAMBREX社製を用いて作製した1.0アガロースゲルで電気泳動することによりSpeI-PstI断片を単離、精製した。その後、Takaraligationmixタカラバイオ社製を用いて連結し、mae1遺伝子がp415GPDに連結された目的のプラスミドを得た。挿入されたDNA断片の塩基配列をDNAシーケンサーにより調べたところ、配列番号6で示される塩基配列を有するDNAを有していた。3PDC1遺伝子欠損酵母へのMDH3及びmae1遺伝子の導入形質転換の宿主として、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeBY4742のPDC1遺伝子が欠損された市販の遺伝子欠損株オープンバイオシステムズ社から購入、以下ΔPDC1株とする。を用いた。上記1及び2で調製したプラスミドを用いて、ChenDYangBKuoT1992CurrGenet2183-84に記載の形質転換法により、ΔPDC1株を形質転換し、実施例1-1の形質転換体1を得た。形質転換体選択培地には、以下に示す組成のSD寒天培地に必要に応じてアミノ酸を添加した寒天培地を用いた。すなわち、形質転換体1は、SDUra、Lys寒天培地SD寒天培地にウラシル20mg/L、リシン塩酸塩30mg/Lを添加したものを用いて30°Cで3日間培養することにより生育するコロニーを選抜することにより取得した。SD寒天培地組成:イーストナイトロジェンベースYeastNitrogenBase:Difco社製67gLグルコース20gL寒天20gL4形質転換体の培養結果得られた形質転換体1を、以下に示す組成のSC液体培地作製時に、選択マーカーに対応するアミノ酸を除いて作製した液体培地を用いて試験管培養試験を行った。すなわち、実施例1-1の形質転換体1にはヒスチジン及びロイシンを添加せずに作製したSC-His-Leu液体培地を用いた。参考として、形質転換していないΔPDC1株参考例1及びBY4742参考例2を並べて培養した。参考例1及び2には通常のSC液体培地を用いた。実施例1-1及び参考例1~2に使用したプラスミド、寒天培地及び液体培地を表1に示す。各培地5mLに、各プレートから1白金耳植菌し、30°Cで一晩培養し、これを前培養溶液とした。得られた前培養溶液を、新たな試験管中のSC液体培地5mLに初発の濁度OD660が0.05になるように植菌し、30°Cで培養した。OD660は濁度計miniphoto518R,TAITEC社製で測定した。また培養上清中のエタノール、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸の含有量を以下の条件で、液体クロマトグラフィー島津製作所社製を用いて定量した。結果を表2に示す。SC液体培地組成:イーストナイトロジェンベースYeastNitrogenBase:Difco社製67gLグルコース20gL硫酸アデニン20mgLウラシル20mgLトリプトファン20mgLヒスチジン塩酸塩20mgLアルギニン塩酸塩20mgLメチオニン20mgLチロシン30mgLロイシン60mgLイソロイシン30mgLリシン塩酸塩30mgLフェニルアラニン40mgLグルタミン酸100mgLアスパラギン酸100mgLバリン150mgLトレオニン200mgLセリン400mgL液体クロマトグラフィー分析条件:サンプル:培養上清、カラム:ShodexSH1011300×8.0mm、昭和電工株製、移動相:20mM硫酸、流速:0.6ml/分、カラム温度:60°C、検出:RI検出器。表2に示す通り、実施例1のサッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeは、参考例1、2よりも多くの有機酸を生産しており、代替経路の構築が確認された。実施例1-2:補償経路の構築5ADH1遺伝子の単離及びADH1遺伝子を有するプラスミドの調製サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeBY4742株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号7及び8で示される塩基配列を有するDNAをプライマーとして用いてPCR反応を行い、ADH1遺伝子を含む約1.0kbpのDNA断片を取得した。DNA断片の鎖長は、反応生成物を0.9アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。得られたDNA断片とZeroBlunt登録商標TOPO登録商標CloningKitインビトロジェン社製を用い、添付された説明書の記載に従ってクローニングした。得られたプラスミドとp426GPDベクターをClaI及びSalIで制限酵素処理し、SeaPlaque登録商標GTG登録商標agaroseCAMBREX社製を用いて作製した1.0アガロースゲルで電気泳動することによりClaI-SalI断片を単離、精製した。その後、Takaraligationmixタカラバイオ社製を用いて連結し、ADH1遺伝子がp426GPDに連結された目的のプラスミドを得た。挿入されたDNA断片の塩基配列をDNAシーケンサーにより調べたところ、配列番号9で示される塩基配列を有するDNAを有していた。6形質転換体1へのADH1遺伝子の導入上記5で調製したプラスミドを、ChenDYangBKuoT1992CurrGenet2183-84に記載の形質転換法により実施例1-1の形質転換体1へと導入した。培地には、SD寒天培地にリシン塩酸塩30mg/Lを添加したSDLys寒天培地を用い、30°Cで3日間培養し、表3に示す実施例1-2の形質転換体2を取得した。実施例1-2の形質転換体2からプラスミドを抽出し、PCR法によってADH1の遺伝子が導入されていることを確認した。すなわち、実施例1-2における補償経路の構築が確認できた。工程2生育阻害が生じる遺伝子の欠損7ADH1遺伝子欠損用DNA断片の作製サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeBY4742株の染色体DNAを鋳型としてPCR反応を行い、5’末端側の相同組換え配列としてADH1UP-229~-1、3’末端側の相同組換え配列としてADH1DN1048~1336の各DNA断片を増幅した。PCR用プライマーにはそれぞれ、配列番号10と11、配列番号12と13のプライマーを使用した。また、同様にpRS317ベクターを鋳型にして、配列番号14と15のプライマーを用いてLYS2マーカーの遺伝子断片を増幅した。これらの断片を精製後、各断片を混合して、配列番号10及び13のプライマーを用いて2回目のPCRを行うことにより約5.4kbpの断片を得た。最終的に得られたDNA断片をADH1遺伝子欠損用DNA断片と称する。実施例1-3、比較例1~3:8ADH1遺伝子欠損酵母の作製上記7で調製したADH1遺伝子欠損用DNA断片を使用し、ジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法を用いて、上記3、6で得られた実施例1-1の形質転換体1、実施例1-2の形質転換体2、ΔPDC1、及びBY4742を形質転換した。形質転換体選択培地には、表4に記載した寒天培地を用いて、30°Cで3日間培養し、4種類の形質転換体、すなわち形質転換体2から実施例1-3の形質転換体3、形質転換体1から形質転換体4比較例1、ΔPDC1から形質転換体5、BY4742から形質転換体6を取得した。9遺伝子欠損の確認上記8で得た4種類の形質転換体よりゲノムDNAを調製した。続いて、PCR法によって、ADH1遺伝子欠損用DNA断片がゲノムに組み込まれているかどうかを確認した。このPCRでは、3組のプライマーを用いて、目的の配列が予想通りの長さに伸長されるかの確認を行った。すなわち、ADH1遺伝子の相同組換え部分の全長を伸張するプライマーとして配列番号10と13のプライマーを使用し、LYS2マーカーの中程からADH1遺伝子3’末端側の相同組換え配列までを伸張するプライマーとして配列番号13と16のプライマーを使用し、ADH1遺伝子の中程からADH1遺伝子3’末端側の相同組換え配列までを伸張するプライマーとして配列番号13と17のプライマーを使用した図1参照。確認PCR及びADH1遺伝子欠損の結果を表5に示す。表5に示す通り、ADH1遺伝子の単独欠損では生育阻害が起こらないため、比較例3におけるBY4742のADH1遺伝子欠損は可能であるが、比較例2においてΔPDC1を宿主とした場合のADH1遺伝子欠損、すなわちPDC1遺伝子とADH1遺伝子の二重欠損は生育阻害が起こるため、代替経路及び補償経路が構築されていない比較例2では二重欠損株を得ることができず、技術的に難しいことがわかる。比較例1では代替経路は構築されているが、補償経路が構築されていないため、比較例2と同様に二重欠損株を得ることができない。一方、実施例1-3のようにあらかじめ代替経路MDH3遺伝子及びmae1遺伝子の導入と補償経路ADH1遺伝子をp426GPDベクターに連結したプラスミドの導入を構築しておいた形質転換体を使用することにより、ADH1遺伝子欠損が可能となることが示された。工程3補償経路の遺伝子の脱落10プラスミドの脱落上記8で得られた実施例1-3の形質転換体3を、ヒスチジン、ロイシン及びリシンを添加せずに作製したSC-His-Leu-Lys液体培地を用いで3日間培養した。その後、5-FOA1mg/Lを含むSC-His-Leu-Lys寒天培地に塗布すると、約1.3×105の頻度でコロニーが出現した。得られたコロニーを、ウラシルを含むSCUra-His-Leu-Lys寒天培地及びウラシルを含まないSC-Ura-His-Leu-Lys寒天培地の両方に移し、30°Cで一晩プレート培養した。移したコロニーのうち、SCUra-His-Leu-Lys寒天培地でのみ生育し、SC-Ura-His-Leu-Lys寒天培地では生育しなかった菌株を、プラスミドADH1遺伝子を連結したp426GPDベクターの脱落した実施例1の株として選抜した。実施例1の株は、ウラシル要求性が復活しており、PDC1遺伝子及びADH1遺伝子が両方とも欠損されている。"