"感作性について化合物をスクリーニングするための方法であって、a試験される化合物を選択された範囲の希釈度まで希釈する工程;b選択された量の前記化合物の希釈物を、集密まで増殖させたケラチノサイト細胞の層に添加する工程;c前記ケラチノサイト細胞と化合物希釈物とを一緒にインキュベートする工程;d前記ケラチノサイト細胞を調べてケラチノサイト小疱形成応答を決定する工程;e前記ケラチノサイト小疱形成応答を定量化する工程;及びf前記ケラチノサイト小疱形成応答を用いて前記化合物の感作性を決定する工程を含む上記方法。前記ケラチノサイト小疱形成応答が、標準感作物質との比較を用いた小疱形成までの時間、ケラチノサイト細胞がインキュベーション後に小疱を産生した前記化合物の濃度、高濃度の前記化合物での小疱の大きさ、高濃度の前記化合物での小疱の数、並びに/又は小疱における放出されたタンパク質及び/若しくはそのネオエピトープの量というパラメータを用いて決定される、請求項1に記載の方法。前記標準感作物質が、オキサゾロン、1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン、mBBr、dBBr、グリオキサール、ホルムアルデヒド及びα-ヘキシル桂皮アルデヒドからなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。前記ケラチノサイト小疱形成応答が、SDS-PAGE及び/又はウェスタンブロットによる放出されたタンパク質及び/又はそのネオエピトープの量と種類の決定、膜プローブを使用する放出された小疱の量の測定、表面プラズモン共鳴の決定、水晶振動子マイクロバランス技術、小疱の放出に関して報告する工学的に操作された蛍光システム、蛍光エネルギー移動現象を示す蛍光標識化技法、絶対小疱数を計測するフローサイトメトリーシステム、細胞形態及び小疱放出を分析するハイスループットスクリーニング、小疱形成応答を分析するマイクロフルイディクス、小疱及び/又は細胞により放出される特定のタンパク質及び/又はそのネオエピトープの量を定量化する捕獲システム、光学顕微鏡を使用して及び/又は小疱形成応答を示す細胞を含有する必要な障壁特徴及び侵入特徴を示すインビトロ上皮組織を使用してケラチノサイト小疱形成応答を決定するケラチノサイト細胞の検査、からなる群から選択される方法により定量化される、請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法。前記ケラチノサイト小疱形成応答が、SDS-PAGE及び/又はウェスタンブロットによる放出されたタンパク質及び/又はそのネオエピトープの量と種類の決定、膜プローブを使用する放出された小疱の量の測定、小疱及び/又は細胞により放出される特定のタンパク質及び/又はそのネオエピトープの量を定量化する捕獲システム、光学顕微鏡を使用してケラチノサイト小疱形成応答を決定するケラチノサイト細胞の検査からなる群から選択される方法により定量化される、請求項1から4までのいずれか一項に記載の方法。前記小疱形成応答が、溶液蛍光を用いて溶液中の小疱膜の量を測定することにより、水性媒体中では非蛍光性であるが膜内に挿入されると強い蛍光性になる膜プローブを用いて定量化される、請求項1から5までのいずれか一項に記載の方法。前記膜プローブがFM1-43である、請求項6に記載の方法。前記小疱形成応答が、小疱及び/又はケラチノサイト細胞により放出されるタンパク質及び/又はそのネオエピトープの量をSDS-PAGE及び/又はウェスタンブロットを通じて決定することにより定量化される、請求項1から5までのいずれか一項に記載の方法。前記放出されるタンパク質及び/又はそのネオエピトープが、ケラチン5、ケラチン14、ケラチン1、ケラチン10、ケラチン8、ケラチン18、グルコース-6-ホスファターゼイソメラーゼ、移行型小胞体ATPアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、カルモジュリン、インポーチン5、ケラチン6A、B及びC、スタスミン、トランスゲリン-2、14-3-3タンパク質シグマ、カルレティキュリン、エンドプラスミン、ヒートショックプロテイン90、アクチンベータ、アクチンガンマ、アルファアクチニン、コフィリン1、エズリン、フィブロネクチン、ミオシン1c、プラスチン2、プラスチン3、チューブリンベータ2C、アネキシン2、ペルオキシレドキシン1、SSA/Roリボ核タンパク質、アルファエノラーゼ、並びにペプチジルプロリルシス-トランスイソメラーゼAからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。前記放出されるタンパク質及び/又はそのネオエピトープが、ケラチン5及びケラチン14を含む、請求項9に記載の方法。インキュベーション後、ケラチノサイト細胞の層から液体を吸引する工程、インキュベーション期間中に離昇した可能性のある小疱をケラチノサイト細胞から分離する工程、小疱を溶解する工程、及び全タンパク質濃度を測定することにより小疱形成応答を定量化する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。小疱が、遠心分離を用いてケラチノサイト細胞から分離される、請求項11に記載の方法。前記小疱形成応答が、アレルギー性接触皮膚炎、薬物誘導過敏症応答、化学的に誘導された喘息、食物アレルギーからなる群から選択される病気、及び/又は化合物との上皮接触を通じて引き起こされることのある他の病気についての予測的インビトロ試験として利用される、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。前記小疱形成応答を用い、関連するヒト上皮細胞を使用して薬物誘導過敏症反応を引き起こす純粋形態、又は混合物、製剤及び溶液での化合物のリスクを計測する、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。前記化合物の感作性を用いて、アレルギー性接触皮膚炎におけるリスクを評価する、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の自己免疫疾患を引き起こす能力を決定する、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の小疱形成を阻害する能力を決定する、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の薬物誘導過敏症を引き起こす能力を評価する、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。感作性について化合物をスクリーニングするためのケラチノサイト細胞の使用。前記化合物の感作性を用いて、前記化合物のアレルギー性接触皮膚炎を引き起こす能力を決定する、請求項19に記載の使用。前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の自己免疫疾患を引き起こす能力を決定する、請求項19に記載の使用。前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の薬物誘導過敏症を引き起こす能力を決定する、請求項19に記載の使用。前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の食物アレルギーを引き起こす能力を決定する、請求項19に記載の使用。化合物との上皮接触により引き起こされることがある状態に対する感作潜在力について化合物、混合物、製剤、及び溶液をインビトロスクリーニングするための製品であって、a標準化された濃度の試験物質;bケラチノサイト細胞培養物;及びc少なくとも1つの標準感作物質を含む、上記製品。前記製品が、アレルギー性接触皮膚炎、自己免疫疾患、薬物誘導過敏症反応、食物アレルギー、及び自己中毒のリスクからなる群から選択される状態についてスクリーニングする、請求項25に記載の製品。感作性について化合物、混合物、製剤又は溶液をスクリーニングするためのキットであって、a少なくとも1つのケラチノサイト細胞培養物;b前記少なくとも1つのケラチノサイト細胞培養物を集密的増殖まで増殖するための手段;c前記化合物、混合物、溶液の製剤を選択された範囲の希釈度まで希釈するための手段;d前記少なくとも1つのケラチノサイト細胞培養物を増殖するための手段及び希釈するための手段を使用するための使用説明書を含む、上記キット。少なくとも1つの標準感作物質をさらに含む、請求項26に記載のキット。定義本明細書で使用されるように、用語ケラチノサイト又はケラチノサイト細胞は、始原ヒトケラチノサイト、又は他の哺乳動物由来のケラチノサイトを意味するように意図されている。前記用語は、成人始原ヒト表皮ケラチノサイトHEKa若しくは新生児始原ヒト表皮ケラチノサイトHEKnなどの始原、不死化及び幹細胞培養系又はHaCaTなどのHEKn特徴を有する細胞系をさらに含んでいてもよい。本明細書で使用されるように、用語ケラチン単数又は複数は、皮膚、毛髪及び爪の重要な構造成分のうちの1つである線維状構造タンパク質のケラチンタンパク質ファミリーを意味するように意図されている。前記用語は、特定のケラチンサブタイプのケラチン1、5、8、10、14及び18を意味するように主として意図されているが、これらに限定されない。本明細書で使用されるように、用語ハプテンは、ヒト人体において内在性巨大分子、たとえば、タンパク質と免疫原性複合体を形成し、適応免疫系を活性化することができる生体異物化合物を意味するように意図されている。一般的に、前記用語は、皮膚障壁を破り、そこでタンパク質と反応したときに、たとえば、接触アレルギーを引き起こすことができる生体異物化合物のことであるが、たとえば、皮下に、静脈内に、経口的に、しかし、これらに限定されない他の入口経路を有する化合物のことでもありえる。本明細書で使用されるように、用語ハプテン化は、ハプテンと巨大分子、たとえば、タンパク質間の反応及び複合体形成を意味するように意図されており、ハプテン化されたタンパク質は、形成されたハプテン-タンパク質複合体、すなわち、ハプテンに結合しているタンパク質を意味するように意図されている。本明細書で使用されるように、用語ハプテン化部位又はハプテン化位置は、ハプテンが反応する特定のタンパク質の特定のアミノ酸、すなわち、タンパク質上のハプテンの正確な位置を意味するように意図されている。本明細書で使用されるように、用語小疱又は小疱形成は、膜小胞の形成及び細胞からの放出を意味するように意図されている。小疱形成は膜突起が形成されるプロセスである。小疱は、細胞の細胞膜で形成される突起であり、この突起は最終的に細胞から周囲の培地中に解離する又は出芽する。小疱は一般的には球状性質であり、径が約1μmから約100μmの細胞膜二重層からなる。用語ケラチノサイト小疱形成応答は、特に、ケラチノサイト又はすでに記載されているケラチノサイト型の細胞からの膜脂質小胞の細胞駆逐を意味するように意図されている。明細書で使用されるように、用語感作は、個人が、たとえば、接触アレルギー化合物、すなわち、巨大分子と免疫原性複合体を形成することにより、適応免疫系を活性化するハプテンに曝露される免疫過程を意味するように意図されている。明細書で使用されるように、用語誘発は、個人が感作される化合物の再曝露による、又は任意の交差反応性化合物の曝露による個人の皮膚炎症反応を意味するように意図されている。明細書で使用されるように、用語タンパク質誘導体化は、化合物たとえば、ハプテンがタンパク質に結合する事象を意味するように意図されている。明細書で使用されるように、用語アレルギー性接触皮膚炎ACDは、個人が感作される接触アレルゲンハプテン、又は任意の交差反応性化合物に再曝露されたときに個人が発症する皮膚免疫学的過敏性反応の臨床症状を意味するように意図されている。明細書で使用されるように、用語薬物過敏症反応DHR又はタンパク質薬物誘導過敏症反応は、薬物がハプテンとして作用し、内在性のタンパク質と共有結合して感作を、その後の再曝露では誘発を引き起こす、薬物への免疫媒介反応を意味するように意図されている。明細書で使用されるように、用語自己免疫疾患は、免疫応答が、通常、身体中に存在している内在性物質、成分及び組織に対して反応する疾患を意味するように意図されている。これには、関節炎リウマチ、SLE全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群SS、I型糖尿病及び乾癬などの疾患を含むことになるが、これらに限定されない。明細書で使用されるように、用語標準感作物質は、接触アレルギーを引き起こすことが知られている化合物を意味するように意図されている。これには、アレルギー試験のための標準パッチ試験シリーズに通常、存在する化合物、たとえば、ホルムアルデヒド、芳香混合物、及びパラベンを含むことになるが、これらに限定されない。明細書で使用されるように、用語集密は、細胞による細胞培養皿又はフラスコ又は別の材料の完全な又はほとんど完全な少なくともほぼ50~60の被覆度被覆を意味するように意図されている。明細書で使用されるように、用語潜在性エピトープ又はネオエピトープは、ハプテン化されたペプチド及びタンパク質、並びに/又は通常ならばプロセシングされていたと考えられるようにはプロセシングされていないタンパク質及びペプチド、並びに/又は架橋したタンパク質を意味するように意図されている。したがって、これらのエピトープは通常、免疫系から隠されている。明細書で使用されるように、用語エピトープ拡大は、支配的なエピトープとは異なり、それとは非交差反応性のエピトープへの免疫応答の発展を意味するように意図されている。通説とは反対に、本発明者らは、驚くべきことに、ヒトACDでは、ケラチノサイトが感作過程において決定的に重要な役割を果たしていることを発見した。ヒト皮膚の進化的防御システムは、大きな寄生生物、ウイルス及び微生物に向けられている。しかし、このために、反応性ハプテンの基底ケラチノサイトまでの下向及びその中への侵入を可能にする理想的重層化した生理化学的特性が生じることを明らかにすることが可能である。さらに、他のタンパク質に加えて、重要な標的はケラチンであり、具体的には、ヒト皮膚エクサープトにおけるケラチン5及び14K5及びK14であることが見出されている。特に、K5のアミノ酸システイン54C54は、ヒト組織及び始原ヒトケラチノサイトにおけるチオール反応性ハプテンの標的として同定されている。この残基は、デスモプラキンのC末端テールと決定的に重要な非共有的接触をし、それによって、デスモソーム細胞-細胞及びへミデスモソーム細胞-基底膜を通じて細胞をその周囲と固定化するアミノ酸のストレッチに位置している。近くの残基が変更されると、ケラチン-デスモプラキン相互作用を実質的に減らし、それによって、細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用を減らして、ホームレス細胞を生じることが明らかにされている。上皮細胞がその周囲との接触を失うならば、増殖調節過程の準備が整って誤った植民地化を防ぐ。したがって、ホームレス上皮細胞はアノイキス、すなわち、家がないことにより引き起こされるアポトーシスが運命付けられる。アポトーシス中、膜小胞、いわゆる小疱が細胞表面上に出現することがある。次に、細胞は、アポトーシス小体と呼ばれるさらに小さな断片に分解する。その後、食細胞が、炎症反応を引き起こすことなくアポトーシス小体を貪食する。小疱形成は一般的現象であり、アポトーシスに加えて、不運動性胚割球において、及びいくつかの細胞遊走事象において、たとえば、細胞分裂の細胞質分裂段階中に小疱形成が起きる。ヒトケラチノサイトに関する研究を通じて、ハプテンはケラチン及び他のタンパク質を共有結合的に修飾すること、並びにmBBrモノブロモビマンなどのチオール反応性ハプテンがK5のC54を修飾することを明らかにすることができる。さらに、ヒトケラチノサイトに関する研究を通じて、ハプテンは、タンパク質中の異なる求核基に対して向けられるが、小疱形成を引き起こし、したがって潜在性エピトープ及びネオエピトープたとえば、ハプテン化されたペプチド及びタンパク質、並びに/又は通常ならばプロセシングされていたと考えられるようには処理されていないタンパク質及びペプチドを放出することが明らかにされている。ウェスタンブロット実験を通じて、大部分アミン指向のハプテンオキサゾロン及び大部分アルギニン反応性ハプテングリオキサール由来の小疱もK5及びK14を含有することが明らかにされる。さらに、刺激物質たとえば、ドデシル硫酸ナトリウム、SDS及び非アレルギー性化合物たとえば、ノナン酸は小疱形成を開始しないことも明らかにされている。前記の説は実験動物マウス由来の血清でELISA実験を実施することによりインビボ背景では妥当であることが明らかにされる。感作化合物に皮膚接触を介して曝露されていた動物由来の血清では、K14に対する抗体が検出された。さらに、一部の感作化合物dBBrジブロモビマンを含むが、これに限定されないと接触すると、血清アミロイドP成分SAPなどの急性期タンパク質のレベルが増加することが見出された。通常、SAPの血漿濃度は炎症に呼応して増加する。慢性炎症は、自然免疫防御のせいで、自己攻撃自己毒性をもたらすことがあることは知られている。SAPのレベルが増加することは、アルツハイマー病などの自己毒性疾患においては一般的特長である。文献に基づけば、共有結合的修飾は、十中八九、ホームレス上皮細胞による誤った植民地化を防ぐ短絡防御機序である。要約すると、ハプテンは基底層まで侵入して降り、基底ケラチノサイトに入り、K5及びK14及び他のそれほど豊富ではないタンパク質と反応し、こうして小疱形成を引き起こし、ケラチン小体すなわち、他の細胞残遺物の中でもハプテン化された、すなわち、ケラチンの他に他のタンパク質を含む非自己タンパク質を含有する小疱を形成し、これは基底膜の下に落ちて、そこでそのネオ及び/又は潜在性エピトープは抗原提示細胞樹状細胞により貪食される。このように、この過程により、免疫系は大量の潜在性エピトープに曝露され、さらにそのタンパク質の一部はハプテン化される、すなわち、非自己になる。ハプテン化は、ネオエピトープが曝露されるようにタンパク質のプロセシングにも影響を与えうる。これらの面のすべてがおそらく個人を感作する一因である。エキソソームを含むが、これに限定されないもっと小さな小疱も感作の一因になることは排除されない。おそらく角質層と基底層の両方において、ハプテンが再びケラチン、ケラチン由来ペプチド及び/又は他のタンパク質を誘導体化すると、誘発が起こる。当然のことながら、他のタンパク質も誘導体化されることがあるが、しかし、ケラチノサイトは表皮において細胞の約95を構成しており、ケラチンは完全に分化したケラチノサイト中の全細胞タンパク質の≧80を構成している。注目すべきは、K5はK1などの他のII型ケラチンと相同であり、K14はK10などの他のI型ケラチンと相同である点である。したがって、化合物が基底上層においてK1及びK10と反応する誘発期には、相同エピトープが産生される。したがって、感作においても誘発においても、ケラチンが誘導体化されるので、身体は大量の高度に相同な/同一の再発エピトープにさらされることになる。さらに、本研究から生じるのが、化合物への上皮曝露による再発エピトープという説である。すべての重層化扁平上皮基底細胞は標的タンパク質を極めて大量に発現する細胞含有量の最大35。上皮細胞は身体全体の構造体の腔及び表面を裏打ちしており、多くの腺も表皮組織から形成される。たとえば、K5抗体は、気管支呼吸器上皮細胞、頸部、精巣上体、食道、上咽喉、口腔粘膜、前立腺、唾液腺、膀胱、扁桃腺中の扁平上皮細胞、膣及び外陰部/肛門皮膚などの組織中の細胞を染色する。肺中のマクロファージも染色される。ヒト角膜上皮もK5では染色する。K14及びK15はK5と一組で発現されるので、K14もこれらの組織及び細胞中に存在する。単純上皮細胞は相同なK8/K18対を発現するという事実と組み合わせると、したがってその結果は、身体中への化合物の進入経路とは無関係に、同一の又は高度に相同なエピトープに遭遇する一般的機序を示している。したがって、小疱形成応答の分析に他の上皮細胞及び上皮組織を使用するのは本発明の範囲内である。したがって、小疱形成応答は、たとえば、ACD、DHR、しかし化学的に誘導される喘息も含み、化合物との上皮接触を通じて引き起こされることがある他の病気も排除しない様々な病気の予測的インビトロ試験として利用することが可能である。身体中への化合物の進入経路とは無関係に、同一の又は高度に相同なエピトープに遭遇するという知見K5/K14及びK8/K18により例証されるは、他の意味を有する。したがって、化合物との上皮接触たとえば、皮膚を介してのせいで基底ケラチノサイトが死滅し、小疱を放出すると、ケラチン及び他のタンパク質に対する自己抗体及びおそらく記憶T細胞が産生され、個人はこの時点で感作されている。薬物などの別の無関係な化合物が摂取される/吸入される/又は他の方法で上皮組織と接触する場合、前記化合物は基底上皮細胞と反応することがあり、小疱形成も引き起こすことがある。個人がすでにそれに対する自己抗体を有するのと同じエピトープが再び小疱において放出される。次に、前記タンパク質エピトープに対する循環している記憶T細胞及び/又は自己抗体が動員されて、薬物過敏症反応DHRが観察される。このように、一部のDHR固定薬疹を含むが、これに限定されないでは、化合物が上皮細胞とどのようにして相互作用をするのかに関して、同じ機序が機能している可能性が高い。前記応答は大部分、放出された自己タンパク質に対して向けることが可能であるので、これらの知見は、個人が問題の薬物に以前一度も曝露されたことがない場合でも、DHRを観察することができる理由を説明している。この仮説も、薬物誘導過敏症反応においては基底ケラチノサイトが標的にされるという知見によって実証される薬物反応における皮膚の基底細胞と反応性の循環する抗体の発生率。TvanJoost.ActaDermatovenerStockhom54:183~188、1974。したがって、小疱形成応答は、関連のあるヒト上皮細胞を使用して薬物誘導過敏症反応DHRを引き起こす化合物純粋な形、混合物、製剤、溶液中、等のリスクも計測することが可能である。このように、本明細書に提示される発明は、上皮接触による薬物有害反応についての予測的スクリーニングの大きな前進を表している。さらに、本発明者らは、ハプテン化により、他の方法では免疫系に到達できない潜在性エピトープ、及び/又は別々にプロセシングされているネオエピトープが放出されることを明らかにしている。これは、接触アレルギーについてのみに重要なのではなく、自己免疫疾患における自己寛容の違反に関して緊急な意味を有する。この仮説は、マウス血清中でのK14に対する自己抗体についての我々の知見により裏付けられている。すなわち、ELISAは、ハプテン化されたタンパク質に対する抗体ではなく、タンパク質それ自体に向かう抗体を測定する。たとえ実験が、倫理的な理由で、マウスで実施されるにしても、ヒトも感作物質に皮膚接触すると自己抗体を発生させる可能性は高い。小疱形成が煽動され自己寛容が違反されるすなわち、K5及びK14に対する寛容の違反、上記の他のタンパク質に対する寛容の違反、相同性を通じたエピトープ拡大、リボ核タンパク質のような他のアポトーシス残渣の放出、等と、身体内で多くの過程が起こりうる。これらの自己免疫疾患の例には、SLE全身性エリテマトーデス;リウマチRA;シェーグレン症候群SS;及びI型糖尿病が含まれるが、他の自己免疫疾患を排除しない。とりわけ、これらの疾患及び他の自己免疫疾患中、ケラチンに対する自己抗体は文献において報告されてきた。その上、ケラチノサイトは、アトピー性皮膚炎に罹った患者由来の血清中に見出される自己抗体の標的である。したがって、小疱形成応答に関するこの知見を使用すれば、自己寛容の違反を引き起こす化合物、混合物、溶液及び他の製剤の能力を測定し、したがって自己免疫疾患を予防することも可能である。これは新しい知見であり、新しい説なので、この詳細な理解を提供する試験法は現在存在しない。グリシン豊富な細胞壁タンパク質GRPは、自己免疫障害における一般的標的である、ケラチン及び他の自己タンパク質たとえば、エプスタインバーウイルス由来核抗原-1EBNA-1、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質及び線維性コラーゲンと高い相同性を有する偏在性食物タンパク質である。GRP及びペプチド特異的T細胞クローン由来のペプチドエピトープに対する抗体は、自己免疫障害RA、SLE、乾癬性関節炎PsA、慢性特発性蕁麻疹CIU、CPI慢性パルボウイルスB19感染並びに食物アレルギー穀類、魚、果実及び野菜に罹った患者由来の血清中に見出すことができる。しかし、正常な対象はこれらの免疫応答を示さないグリシン豊富な細胞壁タンパク質は、自己免疫障害及び食物アレルギー障害において特異的抗原標的として作用する。C.Lunardi,et.al.、InternationalImmunology、Vol.12、No.5、pp647~657。さらに、血清から精製された抗GRPペプチド抗体はEBNA-1並びにケラチン、コラーゲン及びアクチンなどの自己抗原を特異的に認識した。したがって、植物、ウイルス及びヒト由来の明らかに多岐にわたるタンパク質間で共通相同性配列を通じた抗原拡大が、自己免疫疾患の他に食物アレルギーの原因である可能性がある。重要なことは、これが、GRPからではなく、上皮曝露による感作分子ハプテンの作用を通じて小疱に放出されるケラチン及び他のタンパク質からのエピトープ拡大の例になることは極めて考えうることである。したがって、本発明を使用すれば、たとえば、食物アレルギーに関連する問題に取り組むために小疱形成応答を研究することも可能である。化合物が上皮及び上皮細胞に遭遇すると起こることが、たとえば、上記の小疱形成応答を生じること、を分子理解したおかげで、アレルギー性接触皮膚炎におけるその感作潜在力上皮接触により引き起こされる他の病気自己寛容の違反を引き起こす、すなわち、自己免疫疾患の危険を冒すリスクDHRを引き起こすリスク食物アレルギーを引き起こすリスク自己毒性のリスクについて、たとえば、化合物、混合物、製剤、及び溶液をインビトロスクリーニングするための製品を開発することが可能になった。さらに、本発明により、他の物質これ以降、阻害剤と呼ばれるを、たとえば混合物、製剤、及び溶液に添加することにより小疱形成応答の阻害をスクリーニングするための手段として小疱形成応答を使用することが可能になる。次に、これらの阻害剤又は見出された阻害剤の重要な相互作用を再現する化合物は、感作及び本出願の別の場所で言及されている感作の負の下流効果を防ぐために、製剤、溶液、混合物、等における添加剤として潜在的には使用することが可能である。これは、本発明でのように、インビボ事象を再現する細胞ベースの試験においてのみ可能である。本発明のこれらの適用すべてが、新しい分子理解を通して可能になり、したがって、以前の技術では提供することができない適用を表す。皮膚などの上皮組織との接触により起こる反応を研究するために、本発明者らは、臭素原子の置換に先立って非蛍光性であるケージ化されたハプテンブロモビマンを配置した。免疫学的問題を引き起こすことがある有害な化合物は、アレルギー性接触皮膚炎などの疾患ではハプテンと呼ばれていることに注目すべきである。しかし、用語ハプテンの使用は、化合物との上皮接触を通じて生じうる他のあらゆる状態を排除すると解釈されるべきではない。それどころか、本発明は、新しい化合物、混合物、溶液及び他の製剤が自己免疫疾患、DHR、等を引き起こすリスクを計測するための手段としての小疱形成応答の使用も含む。ブロモビマンの解放は、好ましくは、生理的pHで強力な求核種であるチオールシステインと一緒に起こる。多くの、大部分ではないにしても、臨床ハプテンがチオール反応性であるために、チオールに対する優先反応性は有利である。ペプチド及びタンパク質中のその他の主要なハプテン反応性部分は、求核性アミノ基タンパク質のアミノ末端を構成するリシンのNH2基及びα-NH2基である。感作及び上皮免疫毒性の背後にある詳細な分子機序を解明に向けて大きく前進するために、反応基なしsynBim、1個の反応基mBBr又は2個の反応基dBBrを有する一連のビマンが配置された。第一ステップは、前記分子が皮膚角質層に接触することである。前記反応性分子の多くが角質層で反応するが、これは、実験ではヒト皮膚エクサープト及びケージ化されたmBBr及びdBBrハプテンを用いて見ることができるものである。しかし、前記分子のかなりの割合が、表皮の基底上層までさらに下に侵入するが、濾胞経路も生体異物を皮膚内に運び入れるのに重要である。前記侵入は、角質層の酸性pH前記分子はpHが低いときのほうがゆっくり反応するのせいであり、利用可能な基の多くは反応が終わっているからでもある可能性がある。基底上層では、細胞の角質化が基底細胞の周りに厚く比較的不浸透性の外膜を作るために、ハプテンはなかなか細胞に侵入できない。したがって、ハプテンは下の基底層まで侵入する。ここでは、細胞膜ははるかに薄くより流動性であり、したがって前記分子は基底細胞に入ることができる。ヒト皮膚エクサープトを用いた実験により、角質層に加えて、基底層の細胞はケージ化されたハプテンであるdBBr及びmBBrにより標識されていることが明らかにされている。第二のステップは、前記分子が基底細胞に入ることである。細胞外環境は酸化性であるために、細胞外システインは大部分ジスルフィドまで酸化される。しかし、還元された細胞内環境において、ハプテンは反応する相手の還元されたチオールを見出す。細胞内部に入ると、化合物は利用可能なすなわち、立体障害型ではない還元されたシステインチオール基と反応することになる。このステップでは、前記標識された細胞は基底ケラチノサイトであることが実証されている。さらに、ハプテンが反応するシステインのうちの1つは、K5のシステイン54C54であることが確かめられた。ナノスプレー源を備えたLTQ-FT-ICR質量分析計を使用して、チオール反応性ハプテンmBBrは、無傷の全層ヒト皮膚において、生きたヒトケラチノサイトがmBBrに曝露された場合には、K5のC54を修飾することが見出された。C54での激しい反応の理由の1つは、おそらく、細胞膜内部でのその高い有効濃度である。その上皮完全性に二重安全装置を備えておくのは生物の生命では非常に重要であり、KIFの束形成は、C54を含有するペプチドストレッチの高い有効局所濃度を保証し、細胞のその周囲への強い溶着を確実にする。一次配列において近いアミノ酸は、したがって、類似する高い有効濃度で入ってくる化合物の物理的範囲内にも位置している。アミン反応性化合物及びアルギニン反応性化合物により引き起こされる小疱形成をこの角度から見ると、残基K71及びR72が一次配列における最も近い候補である。第三ステップは、この残基C54が、デスモソームの完全性を維持するのに非常に重要であることがデスモプラキンとのその相互作用を通して明らかにされているK5のストレッチ内に位置していることである。易感染性細胞-細胞及び/又は細胞-マトリックス接触を有する上皮細胞がアポトーシスアノイキスを受けることは知られている。感作化合物との接触の結果である小疱形成は、天然に起こるアポトーシスと少なくともいくつかの機序を共有していると思われる。基底ケラチノサイトは、不溶性ケラチン中間径フィラメントKIFの最大35からなる。基底ケラチノサイトは時折アポトーシスを受けるので、不溶性ケラチン残渣の廃物除去の機序は進化してきた。身体では、アポトーシス基底細胞は、その残遺物を、かなりの程度K5及びK14からなることが明らかにされているいわゆるケラチン小体に詰め込む。細胞からケラチン小体が突出する。したがって、ケラチノサイトが感作化合物に曝露されると、天然に起こるアポトーシスの背後の機序のうちの少なくとも一部が起こり、KIF及び他の細胞残遺物が小疱に詰め込まれる。したがって、このステップは、ハプテン化が細胞を誘発して小疱を産生させる図1ことであるが、これはビマンへのケラチノサイト曝露後の蛍光性ビマン含有小疱のインビトロ作製により明らかにされている。非反応性非アレルゲン性物質であるsynBimを細胞に添加した場合には、これは起こらなかった。したがって、オキサゾロン、ホルムアルデヒド、CDNB1-クロロ2,4ジニトロベンゼン、グリオキサール、等などの非蛍光性臨床的関連ハプテンは小疱形成応答を誘発する。オキサゾロン主にアミン反応性及びグリオキサール主にアルギニン反応性の添加から生じる小疱もケラチンを含有する。SDS-PAGE実験では、チオール、アミン、及びアルギニン反応性感作物質は同じタンパク質を含有する小疱を生じることが明らかにされた。このステップでは、したがって、ハプテンをケラチノサイトに添加することにより、その細胞内位置並びに/又はハプテン化された/別にプロセシングされたペプチド及びタンパク質からなるネオエピトープを通じて、通常は免疫系から隠されている高量の潜在性エピトープの駆除を誘導することが明らかにされた。小疱は、言及されたケラチン以外にも他のタンパク質、たとえば、グルコース-6-ホスファターゼイソメラーゼ、移行型小胞体ATPアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、カルモジュリン、インポーチン5、ケラチン6A、B及びC、スタスミン、トランスゲリン-2、14-3-3タンパク質シグマ、カルレティキュリン、エンドプラスミン、ヒートショックプロテイン90、アクチンベータ、アクチンガンマ、アルファアクチニン、コフィリン1、エズリン、フィブロネクチン、ミオシン1c、プラスチン2、プラスチン3、チューブリンベータ2C、アネキシン2、ペルオキシレドキシン1、SSA/Roリボ核タンパク質、アルファエノラーゼ、及びペプチジルプロリルシス-トランスイソメラーゼAを含有することも、ナノスプレー源を備えたLTQ-FT-ICR質量分析計を使用して明らかにされた。さらに、ネオエピトープハプテン-タンパク質コンジュゲートは排出される小疱中のC54-ハプテンコンジュゲートを立証することにより例証されることが見出された。感作化合物は他のタンパク質も修飾すること、SDSゲル上の蛍光バンドにより視覚化されるように、これらのタンパク質は小疱に放出されることも明らかにされた。ネオエピトープ概念は、二座ハプテンたとえば、dBBrは、たとえば、ケラチン間の架橋結合を引き起こすという結果によりさらに実証される。ネオエピトープの形成に加えて、架橋結合から、変更されたタンパク質高次構造/プロセシング/クリアランスなどの他の問題が生じる。この説に一致して、一部の感作化合物グリオキサール、CDNB1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン及びdBBrジブロモビマンを含むが、これらに限定されないにより、血清アミロイドP成分SAPなどの急性期タンパク質のレベルが増加することが分かる。通常、SAPの血漿濃度は炎症に呼応して増加する。したがって、一部の感作分子は永久的炎症応答を煽動する可能性がある。SAPはタンパク質分解に高度に抵抗性であり、その結合はアミロイド線維を安定化し、インビトロでのその形成を増強し、全身性アミロイドーシス、自己免疫疾患及びアルツハイマー病におけるその病原性蓄積及び/又はインビボでの持続の一因となる。慢性炎症は、自然免疫防御のせいで自己攻撃自己毒性をもたらすことがあることは知られており、アルツハイマー病における炎症の際立った役割はますます関心を集めている。SAPは血液脳関門を通過することがあることも示唆されており、これは直接的に神経細胞傷害性である。SAPは、ヒト皮膚においてケラチン小体に、他にもインビトロでは単離されたKIF凝集体に結合することが分かっている。さらに、SLE中の抗SAP抗体の量は疾病活性と相関している。SAPも尿中に見出すことが可能である。一部の感作物質に曝露されているが、他の物オキサゾロンを含むが、これに限定されないには曝露されていないマウスの血清でSAPの量が増加するという知見は、追加の診断用インビトロ特長として利用することが可能である。ハプテンmBBr、dBBr、CDNB、オキサゾロン及びグリオキサールを含むが、他のものを排除しないに局所的に曝露されたマウスは、その血清中において抗核抗体ANAのレベルを増加させていたことも明らかにされた。上方調節されたレベルのANAは、一般に、様々な自己免疫疾患、すなわち、SLE、RA、SSのマーカーとして使用されている。第四ステップは、身体においては、ケラチン小体は基底膜の下に降りてくることが明らかにされたことである。ケラチン小体は抗原提示細胞により食べ尽くされることは明らかにされている。真皮では、これらは主に真皮樹状細胞である。ランゲルハンス細胞などの表皮抗原提示細胞も、当然のことながら、これらの細胞残遺物に曝露され、これらの細胞も十中八九、感作過程の一部である。したがって、このステップでは、ネオ及び潜在性エピトープは抗原提示細胞により食べ尽くされる。ケラチンが放出され抗原として機能することを実証するため、皮膚接触を通じてハプテンに曝露されたマウスにおいて、ケラチンに対して自己抗体のELISA捕獲が実施された。その結果により、ハプテンはケラチンを免疫系に曝露させること、及びそのタンパク質断片は、それに対してマウスが自己抗体を発現するので、抗原性であることが示されている。このことは、小疱に見出された他のそれほど豊富ではないタンパク質たとえば、スタスミン及びカルモジュリンは感作物質と接触すると身体内に放出されることも実証している。これらのステップは、システインよりも他のアミノ酸と優先的に反応するハプテンにも当てはまる。これは、ハプテンのパネルをヒトケラチノサイトに添加することにより明らかにされ、細胞応答を視覚化した。ハプテンは、媒体DMSOとは反対に、小疱形成を煽動する。synBimなどの非アレルギー性化合物、又はノナン酸は、小疱形成を誘導しない。刺激化合物のSDSは小疱形成を引き起こさず、代わりに、細胞はSDSに曝露されると溶解するように思われる。小疱はケラチンと他のタンパク質を含有する。小疱形成は身体でも起こる一般的応答であることは、単座又は多座である同じ求核種と異なる反応機序を通じて反応する多様な求核種アミノ酸に向けられる感作化合物に曝露されたマウスにおいてK14に対する自己抗体を捕獲することにより実証されてきた。細胞への化合物の添加に先立って、活性化ステップたとえば、第1相解毒酵素による活性化を含むことにより、プロハプテンは反応型単数又は複数の転換されることが可能であることが想定されている。プレハプテンは、身体の外で活性化されるために、従来のハプテンに類似する形で機能する。これらのステップ1~4が感作を確立する。これらの発見に基づくインビトロ試験は本明細書の発明の中核である。したがって、いくつかの実験を通して、ヒト組織におけるハプテンの卓越した標的はケラチノサイトであることが見出された。表皮が約95のケラチノサイト又はその残遺物角質細胞からなるにしても、ケラチノサイトの役割は見過ごされてきたことは驚きである。皮膚の重層性のせいで、ハプテンは、大量細胞の全タンパク質含有量の最大35のケラチン5及び14K5及びK14を含有する基底ケラチノサイトに到達することが可能である。このように、本発明は、たとえば、ACDに対する感作物質である化合物に晒されたケラチノサイトは小疱を産生し、これらの小疱は、免疫を確立するのに重要な役割を果たしているケラチンなどのタンパク質を含有しているという発見に基づいている。小疱に見出される他のそれほど豊富ではないタンパク質たとえば、スタスミン及びカルモジュリンも、感作物質に接触すると身体内にも放出される。したがって、標準感作物質との比較を用いた、小疱形成までの時間などの小疱形成の異なる面の測定、インキュベーション後にケラチノサイト細胞が小疱を産生する化合物の濃度、高濃度の化合物での小疱の大きさ、高濃度の化合物での小疱の数、小疱中のK5及びK14などの放出されたタンパク質の量は、本発明の基礎である。小疱は、当技術分野で公知である遠心分離、超遠心分離及び蛍光標識細胞ソーティングを通じて分離することが可能である。本発明において使用される細胞は、たとえば、マルチウェルプレートにおいて、細胞培養皿上で、試験管で、フラスコで、顕微鏡用スライドガラス上で及びバイオリアクターで培養することが可能である。重層扁平上皮における基底細胞は極めて大量に、細胞含有量の最大25~35、K5及びK14を発現する。したがって、感作及び誘発が、摂取を通じて、目接触、吸入を通じて、等などの身体中への物質の進入経路とは無関係である病気においても、記載されている機序ステップ1から4まで、上記参照が関与している可能性がある。したがって、化合物がケラチノサイトの小疱形成を引き起こす場合、問題の化合物がACDに加えて他の状態も誘導することがあるという高リスクが存在する。したがって、本発明の小疱形成応答は、化合物との上皮接触により引き起こされることがある他の状態の予測的試験としても利用することが可能である。これらの状態には、化学的に誘導される喘息が含まれるが、他の病気を排除しない。さらに、身体内への化合物の進入経路に関係なく、同一の又は高度に相同なエピトープに遭遇するという知見K5/K14及びK8/K18により例証されるには他の意味もある。この例は、小疱形成応答も重要である可能性があるDHRである。したがって、本発明の別の目的は、小疱形成応答を用いて、薬物誘導過敏症反応DHRを引き起こす化合物純粋な形、混合物、製剤、溶液中、等のリスクを計測することである。このように、本発明は、上皮接触による薬物有害反応についての予測的スクリーニングの大きな前進を表している。前記試験を使用して、これらの効果と関連付けて小疱形成応答の阻害剤についてスクリーニングすることも可能である。先ず、仮の阻害剤が、インビトロ試験において、感作物質についてと同じ方法で細胞に添加される。極度の、強い、中程度の及び弱い感作物質と同じタイムスケール又は濃度では小疱は形成されないはずである。仮の阻害剤がこの第一ステップを通過する、つまり、小疱形成応答が記録されない場合、阻害剤は次のステップに移される。次のステップは、細胞を異なる強度の感作物質を用いるインビトロ試験において前記阻害剤と一緒にインキュベートすることである。小疱形成応答は評価され、感作物質それ自体から生じた小疱形成応答と比較される。阻害剤は、それが小疱形成応答を減少させる又は完全に妨げる場合には、成功であると見なされる。したがって、小疱形成が煽動され、免疫学的閾値を通過すると、自己寛容が違反されることが提案される。これらの寛容違反には、K5、K14及び、放出されたタンパク質と他の自己タンパク質間たとえば、K5とK8間及びK14とK18間の相同性を通じたエピトープ拡大を含むいくつかの標的が含まれる。したがって、本明細書に提示される本発明は小疱形成応答を用いて、自己寛容の違反を引き起こし、したがって、自己免疫疾患を煽動する化合物、混合物、溶液及び他の製剤の能力を測定することが可能である。前記試験を使用して、これらの効果と関連付けて小疱形成応答の阻害剤についてスクリーニングすることも可能である。したがって、感作化合物は、一般に、ケラチノサイトを促進して小疱を産生させると結論付けることができる。これは、最終的には感作ACD;及び/若しくは自己免疫疾患;及び/若しくは他のアレルギーをもたらし;並びに/又はDHRに対して個人を抗原刺激する記号論理学的連鎖の事象における重要な関門に相当する。それぞれの場合の特定の結果は、個人の免疫系及びその環境要因に依存する可能性がある。規制問題を反映する段階的予測的インビトロ試験の開発を可能にしたいくつかの実行可能なパラメータが同定されている。その上、混合物、溶液、製剤、等は、化合物の組合せ効果をその特定の調製物において試験するために希釈/溶解後に使用することが可能である。どの感作化合物が放出されるのかとは無関係に同じエピトープが放出されるので、法律制定前には考えられていなかった相加的及び潜在的には相乗的ですらある効果が存在する。消費者製品の大部分が同じ製剤中たとえば、香水、洗髪剤、化粧水、等中に多くの感作化合物を含有するので、これには化合物の試験方法及び安全限界の評価方法に関して大きな意味がある。マウスLLNA、すなわち、間もなく時代遅れになることになるACDに対するOECD承認試験の1つの重要な特長は、それが化合物を極度に、強力に、中程度に、弱い又は非アレルギー性に分類する段階的読取りを与えることである。類別は、化合物の法的取り扱い及び分類に免疫毒性学的基礎を与える。これは、本発明の細胞ベースのインビトロ試験において取り組む特長である。段階的読取りを可能にするのに十分なダイナミックレンジを与える応答の混合が使用される。この例には、異なる濃度のハプテンにおいて、ハプテン添加後のどの時点で小疱形成が起きるのか;どの濃度で小疱形成は起きるのか固定された時点;濃度x及び時間yにおいて何個の小疱が周囲の培地中に放出されるのか;が含まれるしかし、他の変数を排除しない。標準化は、たとえば、ノナン酸又は類似の化合物などの非アレルゲン及び非刺激物質を用いた処置を受けたマウスとの比較を通じて与えられることになる。対照試料はどんな試験化合物にも晒されたことがない。細胞は、ヒト始原ケラチノサイト、ケラチノサイト由来の細胞系又は必要な小疱形成応答を共有する他の上皮細胞であってよい。測定されるパラメータは、組み合わされたシグナルが段階的読取りを与えることになる行列を形成することになる。LLNAに存在するが、他の細胞ベースの試みでは見落とされてきた別の重要な特長は、キャリブレーション及び再現性という特長である。典型的には、HCAαヘリックス桂皮アルデヒドを使用して、応答を較正し、試験手順の状態の検査をする。HCAキャリブレーション実験は、典型的には、時には年間を通じて含まれる。本発明の試験では、特定の信頼できる応答を与えることが知られている制御された物質を添加することによりキャリブレーションは与えられることになり、例には、オキサゾロン、1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン、mBBr、及びHCAが含まれるが、他の物質を排除しない。このキャリブレーションは試験が行われるたびに実行することが可能である。これは、pH測定ごとに前にpH電極が較正されることに類似している。したがって、本発明の試験は、実際に、間もなく時代遅れになるLLNAよりすぐれたキャリブレーションを与えることになる。すでに言及されたように、本明細書に提示される本発明には、始原ヒトケラチノサイト、他の哺乳動物由来のケラチノサイト及び前記細胞の特徴すなわち、有害な化合物と接触すると小疱形成するを共有する他の関連する哺乳動物上皮細胞が含まれる。本発明には、前記細胞の特徴すなわち、有害な化合物と接触すると小疱形成するを共有する細胞系も含まれる。本発明には、ケラチン及び/又はその変異体を発現する他の細胞/細胞系も含まれる。本発明には、重層組織まで分化したケラチノサイトの使用も含まれる。前記ケラチン及びその他のタンパク質の化学修飾は極めて意味深い事象であり、これらのタンパク質又はその変異体又はこれらのタンパク質に基づく配列を有するペプチドが、化合物、混合物、溶液又は製剤の感作力を計測する手段を提供することができると考えられる。すなわち、試験は潜在的には細胞なしでも設定することができ、関連するタンパク質/ペプチドと問題の化合物単数又は複数間の反応を直接測定することができる。細胞ベースのアッセイの出力基準新しい化合物純粋な形、混合物、溶液及び他の製剤でが細胞に添加されるときの小疱形成応答は、i.SDS-PAGE及びウェスタンブロットを通じた放出されるタンパク質たとえば、K5及びK14又は他のタンパク質の量。ii.デジタルカメラに連結した光学顕微鏡を使用する放出された小疱の大きさ及び量。iii.膜プローブ、たとえば、FM1-43MolecularProbesを使用する放出された小疱の量。このプローブは水性媒体中では非蛍光性であり、細胞膜又は小疱膜に挿入されると、強い蛍光性になる。蛍光量はハプテンに強度と相関する、すなわち、ハプテンが強力であるほど、蛍光も高くなる。iv.蛍光標識細胞ソーティングを使用する放出された小疱の大きさ及び量。小疱は大きさにより分別され、それに続いて、その含有量はSDS-PAGE及び/又はウェスタンブロットを使用して分析することができる。v.絶対小疱数を計測し小疱の大きさを測定するフローサイトメトリー法、たとえば、GuavaPersonalCellAnalysis-96PCA-96SystemMillipore。vi.ラボオンチップ。ラボオンチップ又はマイクロ流体デバイスは、最も一般的には、光学顕微鏡に適しているが、ポリジメチルシロキサンPDMSに限定されない透明の材料からなるデバイスである。前記デバイスは、大きさがわずかミリメートルから数平方センチメートルである。前記用語は、実デバイスに連結されているポンプ及びバルブのような機械的流量調節器又は流量計及び粘度計のようなセンサーのことでもある。前記デバイス内部にはマイクロメーターサイズのチャンバー及びチャネルがあり、これらは、細胞培養、細胞ソーティング及び1個、又は数個の細胞を異なる化合物に曝露するなどのいくつかの実験室ステップを統合する機能を有する。1個、又は数個の細胞から出現する小疱の数及び時間スケールの他にも大きさはこの方法を用いて評価される。vii.ハイスループットスクリーニング。この方法は、撮像デバイス及びタンパク質分析と組み合わせてしかしこれらに限定されない、ロボットスクリーニングアッセイを使用する多数の化合物の急速インビトロスクリーニングのために使用される。HTSでは、多くの化合物は、好ましくは、細胞上で並行して試験され同時にスクリーニングされる。画像分析は、小疱数、小疱の大きさ及び標識された細胞成分の蛍光強度などの多くの異なるパラメータについて画像から数値データを生み出すことができる。viii.小疱の放出に関して報告する工学的に操作された蛍光システム。K5-GFP緑色蛍光タンパク質又はたとえば、蛍光性である類似のタンパク質形質転換細胞たとえば、正常なヒト表皮ケラチノサイトHEKn又は必要なHEKn特徴を共有する細胞系が使用される。試験化合物が添加されると、それが感作物質である場合、その化合物は小疱形成をもたらし、K5は小疱内に放出されるために、小疱は蛍光性になり培地中の蛍光を定量化することができる。他のタンパク質構築物、たとえば、K14-GFP構築物も使用することが可能である。ix.たとえば、互いとの又は、たとえば、デスモプラキン若しくは近接空間接触している他のタンパク質との蛍光エネルギー移動現象を示す蛍光K5及びK14構築物などの蛍光標識法を使用して、小疱中へのタンパク質の放出に関して報告してもよい。デスモプラキンとK5が空間的に離れている場合は、蛍光エネルギー移動FRET現象はもはや示されない。x.たとえば、K14及びK5に対する抗体又は結合物質に基づく捕獲システムたとえば、ELISAを使用して、細胞により周囲の培地に放出される特定のタンパク質の量を定量化することもできる。xi.水晶振動子マイクロバランス法xii.たとえば、捕獲試薬として小疱中のタンパク質に対する抗体を使用する表面プラズモン共鳴。xiii.細胞は、アポトーシスのタイムスケールと両立するタイムスケールで小疱形成を放出するために、及び小疱放出細胞はアポトーシス細胞と少なくともいくつかの特長を共有していると思われるために、アポトーシスを測定するのに使用される標識及びキットたとえば、アネキシンV又はカスパーゼキットを使用して、たとえば、免疫蛍光及びフローサイトメトリーを用いて小疱形成応答を測定することもできる。xiv.細胞たとえば、HEKn細胞又はHEKn特徴を有する細胞系は半透過性支持体上で増殖させることが可能であり、その小疱及び/又は小疱内容物は、フロースルーを使用することにより収穫することができる。例には、Transwell登録商標PermeableSupportsCorningLifeSciencesを使用することが含まれるが、これに限定されない。試験される化合物純粋な形、混合物、溶液及び他の製剤でが表面に添加され、フロースルーが収集され、放出されたタンパク質の量すなわち、細胞からの小疱形成応答が測定される。類似する形で、支持体マトリックスは細胞を増殖させるためにも使用することが可能である。xv.必要な障壁特徴及び透過特徴を示すインビトロ上皮組織であって、小疱形成応答を示す細胞を含有する上記インビトロ上皮組織を分析において使用することが可能である。試験される化合物純粋な形、混合物、溶液及び他の製剤でが組織の表面に添加され、フロースルーが収集され、放出されたタンパク質の量すなわち、組織中の細胞からの小疱形成応答が測定される。本発明の追加の態様は、感作性について化合物又はその混合物、製剤、及び溶液をスクリーニングするためのキットであって、i1つ又は複数のケラチノサイト細胞培養物ii前記1つ又は複数のケラチノサイト細胞培養物を集密まで増殖させるための手段iii試験する前記化合物を選択された範囲の希釈度まで希釈する手段iv本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従ってii及びiiiにおける前記手段を使用するための使用説明書を含む上記キットを包含する。さらに、前記キットは上記の1つ又は複数の標準感作物質を含みうる。さらに、前記キットは、たとえば、試験される前記化合物を選択された範囲の希釈度まで希釈するための手段及びケラチノサイト培養物を集密まで増殖させるための手段、又は特定の試薬の使用手段の使用を開示する説明資料を含みうる。前記説明資料は、電子書式でたとえば、コンピュータディスケット若しくはコンパクトディスク書かれてもよいし、又は視覚的たとえば、ビデオフィルムでもよい。前記キットは、前記キットの設計目的である特定の適用を促進するための追加の成分を含んでいてもよい。したがって、たとえば、前記キットは、特定の開示された方法の実行のために常用されている緩衝剤、増殖培地、補助剤及び他の試薬を含むことが可能である。そのようなキット及び適切な内容物は当業者には周知である。前記キットは、本明細書に記載されるケラチノサイト小疱形成応答を評価するための手段を、1つ又は複数の別々に包装された試薬として、少なくとも1つのアッセイに十分な量で、他にもそれを使用するための別々の使用説明書をさらに含みうる。前記包装された試薬の使用のための使用説明書も典型的には含まれる。そのような使用説明書は、典型的には、試薬濃度並びに/又は混合される試薬と化合物の相対量、試薬/試料混合物の維持期間、温度、緩衝条件及び同等の物などの少なくとも1つの試験方法パラメータを説明する具体的表現を含む。前記キットは、箱、袋、サッチェル、プラスチック製容器たとえば、成型プラスチック又は他の透明包装、ラッパーたとえば、密封された若しくは密封可能なプラスチック、紙、又は金属製ラッパー、或いは他の容器などのキャリア手段をさらに含み得る。いくつかの例では、キット成分は、箱又は他の容器などの1つの包装単位であって、1つ又は複数のキット成分を入れることができる仕切りを有しうる上記包装単位に封入されることになる。他の例では、キットは、1つ又は複数の容器、たとえば、バイアル、管、及び、たとえば、試験される1つ又は複数の生体試料を保持することができる同等の物を含む。他のキット実施形態は、たとえば、生体試料を取り扱う、収集する及び/又は処理するのに有用でありうる注射器、綿棒、又はゴム手袋を含む。キットは、随意に、たとえば、点滴器、注射器、及び同等の物を含む、生体試料をある場所から別の場所に移動させるのに有用な道具も含有しうる。さらに、前記キットは、使用済みの又はもはや必要ではない物たとえば、対象試料、等を破棄するための処分手段を含んでいてもよい。そのような処分手段は、制限なく、プラスチック、金属又は他の不透過性袋、箱若しくは容器などの廃棄物質からの漏れを含有することができる容器を含むことが可能である。キット成分は、ケラチノサイト細胞培養物若しくは培地補助剤のためのドライアイス又は冷却しておくべき成分、たとえば、増殖培地のための氷嚢などの、異なる貯蔵及び輸送温度に必要な包装をさらに含みうる。例1ACDにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。光学顕微鏡を使用する分析細胞培養正常なヒト表皮ケラチノサイトHEKn、CascadeBiologics、Portland、OR、USAは、60μMのCaCl2、抗生物質ゲンタマイシン/アンホテリシン及び1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologicsを補充されたフェノールレッド無しのEpiLifeケラチノサイト培地CascadeBiologicsにおいて維持された。代わりに、200μMのCaCl2を含有し、HKGS1v/vを補充された、抗生物質のないMedium154が使用される。細胞は、加湿された5CO2インキュベーターにおいて37°Cで増殖させた。補充された培地中の成分の最終濃度は、ウシ下垂体抽出物、0.2v/v;ウシインスリン、5mg/mL;ヒドロコルチゾン、0.18mg/mL;ウシトランスフェリン、5mg/mL;ヒト表皮増殖因子、0.2ng/mL;随意に、ゲンタマイシン、10μg/mL、及びアンホテリシンB、0.25μg/mLであった。試薬はすべて、CascadeBiologics、Portland、OR、USAから入手した。ケラチノサイトは、第5又は第6継代で実験に使用された。スクリーニング継代6のHEKn細胞は分割され、1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologics、抗生物質添加なしを補充されたmedium154CascadeBiologics中18500細胞/mlまで再懸濁された。細胞懸濁液0.5mlは24ウェルプレートNuncMultidishesNunclon、SigmaAldrich、Stockholm、Swedenの各ウェルに添加され、5CO2、37°Cでインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、HKGSを補充された新鮮な154培地抗生物質添加なしで1日おきに交換された。試験される化合物たとえば、mBBr、SDS、CDNB、ノナン酸、HCA、オキサゾロンはSigmaAldrichから購入し、qBBr、dBBr、グリオキサール及びホルムアルデヒドはMerck-Schuchardt、Darmstadt、Germanyから入手したはDMSOSigmaAldrich、Stockholm、Sweden中、最終濃度の50mM、5mM及び0.5mMまで希釈された。これらの保存液は、実験が実施されるたびに新たに調製された。代わりに、混合物、溶液、製剤、等は、DMSO中における希釈/溶解後に使用することができるその特定の調製物における化合物の組合せ効果を試験するため。同じエピトープが放出されるために、法律制定前は考えられなかった相加効果が存在する。1実験を開始する直前の細胞調製:細胞培養プレート中の培地は、HKGS1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologicsを補充された250μlの新鮮なMedium154CascadeBiologicsに置き換えられ、細胞は5CO2、37°Cで保管される。2培地中での試験化合物の調製:245μlのMedium154は0.5mlのマイクロチューブに添加され、37°Cまで予熱された水浴。5μlの化合物の保存液は、予熱された培地を含有するマイクロチューブに添加された。次に、これらの溶液は直ちに24ウェルプレートの細胞に添加された。3マイクロチューブ中の溶液すなわち、250μl培地試験化合物は各プレートに添加された。したがって、試験における各化合物の最終濃度は、0.5mM、0.05mM、及び0.005mMであった。細胞と試験化合物を含有するプレートは5CO2、37°Cで24時間インキュベートされた。4A各ウェルは、デジタルカメラに連結された光学顕微鏡NikonTE300倒立顕微鏡を用いて調べられて、小疱形成応答を決定した。所定の時点1.5;2.5;24時間での産生された小疱の量は、盲検試験すなわち、小疱を計測する顕微鏡使用者は、各ウェルにどの化合物が添加されているのかに関する知識はまったくないでの目視検査を通じて評価された。測定されたパラメータは:小疱形成までの時間極度の感作物質オキサゾロンを含むオキサゾロン1.5時間強い感作物質dBBr、mBBr、CDNBを含むmBBr2.5時間CDNB24時間細胞が24時間後に小疱を産生した濃度極度の感作物質オキサゾロンを含む0.5mM、0.05mM強い感作物質dBBr、mBBr、CDNBを含む0.5mMdBBrは0.05mMでも中程度の感作物質グリオキサールを含む0.5mM弱い感作物質HCAを含む試験された濃度では小疱形成なし小疱の量時間24時及び濃度0.5mMで極度の感作物質オキサゾロンを含む高量の小疱強い感作物質dBBr、mBBr、CDNBを含む中程度量の小疱中程度の感作物質グリオキサールを含む低量の小疱弱い感作物質HCAを含む小疱は検出されないである。これらの3種のエンドポイントを使用して、化合物の感作潜在力の収集分析が行われた。オキサゾロンは極度の感作物質であり、mBBR及びCDNBは強い感作物質であり、グリオキサールは中程度の感作物質であることが見出され、HCAは試験された濃度では小疱形成を誘導しなかった。これらの結果はLLNA実験とよく相関しており、前記方法が化合物の感作性を決定するためによく機能することを実証していた。例2ACDにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。蛍光色素による分析この例は、ハプテン誘導小疱形成の差、すなわち、ハプテンの強度を定量化するための蛍光の測定のために、試験化合物の添加の24時間後オキサゾロンにより例証される、3×90μlは24ウェルプレートの各ウェル濃度0.5mM、0.05mM、及び0.005mMから96ウェルプレートNunc、F96multisorpに移されたこと以外は、例1に述べられる通りに実施された。10μl最終濃度5μg/mlの色素FM1-43T3163、MolecularProbes、InvitrogenAB、Stockholm、Swedenが各ウェルに添加された。プレートは暗所で2分間インキュベートされ、蛍光は、励起510nm及び発光626nmのプレートリーダーSpectraMaxM2、MolecularDevices、GotenborgsTermometerfabrik、Goteborg、Swedenにおいて検出された。色素FM1-43は水性溶媒中では実質的に非蛍光性であるが、細胞膜又は小疱膜中に挿入されると強い蛍光性になるので、この色素を使用して溶液中の小疱膜の量を測定することが可能である。したがって、蛍光はハプテンの強度と相関しており、すなわち、ハプテンが強いほど、それだけ多くの小疱が周囲の培地に放出され、その培地中の蛍光はそれだけ高くなった。例3ACDにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。放出されたタンパク質の分析SDS-PAGE及びウェスタンブロットを通じて放出されたタンパク質たとえば、K5及びK14の量を観察することにより、小疱形成応答の定量化も行われた。小疱は例4に記載される通りに収集され溶解された。SDS-PAGE:試料は、XTSampleBuffer4XBioRad、Hercules、CA、USA及びmilli-Q水を用いて希釈された小疱:ブロッティングでは46μg、30μl及びSDS-PAGEでは29.2μg、40μl。K14及びK5:0.2μg、5μl。1μlのDTT2Mが各試料に添加され、続いてゲル上に適用する前に96°Cで2分間加熱する。電気泳動プログラム:200V、400mA、50W、50分。MOPSランニング緩衝液。ゲルは固定され、蛍光について走査され励起480nm、発光530nm及びクーマシー染色されたBio-Safe商標Coomassie、BioRad、Hercules、CA、USA。次に、ゲルはタンパク質の定量的測定のために使用された。ウェスタンブロット:固定されていないゲルはポリビニルジフルオリド膜PVDFReady-gelBlottingSandwiches、7×8.5cm、BioRad、Hercules、CA、USA上にブロットされた。ブロッティングプログラム:70V、400mA、50W、30分。トランスファー緩衝液。NovexXCellII商標BlotModuleE19051、Novex、SanDiego、CA、USA。ブロットは、ブロッキング緩衝液50mMのTris-HClpH8、0.2MNaCl、3の脱脂粉乳、抗体希釈緩衝液で1:5000に希釈された始原ケラチン5又はケラチン14モルモット抗ヒトポリクローナル抗体LifespanBiosciencesInc、Seattle、US、並びに抗体希釈緩衝液中1:2000に希釈されたペルオキシダーゼウサギ抗モルモットIgGHL二次抗体Invitrogen、Carlsbad、CA、USA中でインキュベートされた。ブロットは各ステップ間に洗浄緩衝液50mMのTris-HClpH8、0.2MNaCl、0.05のTween-20で3×10分間洗浄され、DAB及び過酸化尿素SIGMAFAST商標3,3’-ジアミノベンジジンタブレット、Sigma-AldrichChemieGmbh、Munich、Germanyで現像された。ペルオキシダーゼ-DAB反応は、ミリ-Q水で洗浄することにより消光された。ブロットの現像後、分析により、K5及び/又はK14がSDS-PAGEゲル上に存在するかどうかが示された。例4小疱の収集小疱の収集を改善し、死んだ非粘着性細胞による汚染を回避するために、この手順に従った。この手順により、小疱形成応答を測定するのに使用することができる試料が得られる。細胞細胞HEKnは、75cm2フラスコにおいて開始密度約1.8×105細胞/cm2で増殖され、細胞が70~80培養密度に到達するまで培養された上記の通り。試験化合物mBBr、dBBr、qBBrSigmaAldrich及びオキサゾロンSigmaAldrichの50mM保存液は、DMSO中で調製され、グリオキサールSigmaAldrichはダルベッコPBSCa、Mgなし;PAALaboratories、Linz、Austria中、79mMで調製された。インキュベーション前に、試薬は5mLのHEPES緩衝液140mMNaCl、20mMHEPES、5mMKCl、1mMMgCl2、0.06mMCaCl2、10mMD-Glucose中、そのそれぞれの濃度mBBr、dBBr0.05mM;qBBr、グリオキサール、オキサゾロン0.5mMまで希釈された。試験化合物を用いたインキュベーション細胞層はHEPES緩衝液を用いて洗浄され、5CO2加湿インキュベーターThermoForma、ThermoFisherScientific、Waltham、MA、USA中、37°Cで24時間、試薬液と一緒にインキュベートされた。小疱の調製インキュベーション培地は細胞層から吸引され、500×g、室温で5分間遠心分離されて、インキュベーション期間中に離昇した可能性のある細胞から小疱を分離した。このステップは、小疱から死んだ非粘着性細胞を分離する。小疱は上清中に存在し、細胞はペレット化された。小疱溶液の更なる使用上清中の小疱は、エタノール、ドライアイス及び37°Cの水浴を使用して4×凍結融解サイクルを用いて溶解された。前記ライセートは濃縮され、5kDaMWCO4mlのAgilentSpinConcentratorsforProteinsAgilenTechnologies、SantaClara、CA、USA中で脱塩された。全タンパク質濃度は、PierceBCAProteinAssayを用いて決定された。濃縮物は、前記タンパク質の分析が実施されるまで-20°Cで保存された例3に記載される方法に従って。例5ACDにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。蛍光標識細胞ソーティングによる分析この例では、試験手順は例1にある通りに実施され、小疱の収集は例4にある通りに実施された。次に、小疱の大きさと量は、ソーティング機能のあるフローサイトメーターFACSAria、BD、Biosciencesを使用して分析された。次に、小疱は大きさに従って分別され、各小疱が計測された。ビーズは大きさの標準として使用することが可能である。小疱溶液のさらなる使用収集され小疱は溶解され、例3に記載されるタンパク質含有量に関して分析された。例6ACDにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。フローサイトメトリーを使用する分析このスクリーニングは、例5にある通りに実施された。小疱の数はフローサイトメーターたとえば、GuavaPersonalCellAnalysis-96PCA-96System、Milliporeにおいて計測された。小疱の大きさは、サイズ標準ビーズを使用して評価することが可能である。例7ラボオンチップを使用する、ACDにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング細胞培養細胞HEKnは、75cm2フラスコにおいて開始密度約1.8×105細胞/cm2で増殖され、細胞が70~80培養密度に到達するまで培養された上記の通り。ラボオンチップ継代6のHEKn細胞は分割され、1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologics、抗生物質添加なしを補充されたmedium154CascadeBiologics中18500細胞/mlまで再懸濁された。細胞懸濁液0.5mlは、たとえば、ポリジメチルシロキサンPDMSからなるが、これに限定されないマイクロ流体デバイスに添加され、5CO2、37°Cでインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、HKGSを補充された新鮮な154培地抗生物質添加なしで、前記デバイスを洗い流すことにより1日おきに交換された。スクリーニングmBBr、dBBr、qBBrSigmaAldrich及びオキサゾロンSigmaAldrichの保存液たとえば、50mMは、DMSO中で調製され、グリオキサールSigmaAldrichはダルベッコPBSCa、Mgなし;PAALaboratories、Linz、Austria中、79mMで調製された。インキュベーション前に、試薬は5mLのHEPES緩衝液140mMNaCl、20mMHEPES、5mMKCl、1mMMgCl2、0.06mMCaCl2、10mMD-Glucose中、そのそれぞれの濃度mBBr、dBBr0.05mM;qBBr、グリオキサール、オキサゾロン0.5mMまで希釈された。試験化合物を用いたインキュベーションマイクロ流体デバイスは光学顕微鏡試料台上に載せられ、透過光及び蛍光撮像たとえば、NikonTE300倒立顕微鏡を可能にした。顕微鏡試料台は好ましくは自動化され、同一チップ上のいくつかの化合物の自動調査を可能にした。前記デバイスは、37°C、5CO2加湿インキュベーターにおいて封入される必要がある。前記細胞を含有する前記デバイスは、純粋なHEPES緩衝液で洗い流された。その後、前記流れは試験溶液に交換され、試薬液と一緒にインキュベートされた。小疱をモニターする細胞は連続してたとえば、20分毎にモニターされ、試験溶液への曝露中に撮像された。小疱形成開始までの時間は、上記の通りにモニターされた。しかし、小疱の大きさと形状も、顕微鏡に接続されたデジタルカメラにより記録された。同時に、放出された小疱はマイクロ流体透析により収集され、マイクロチューブに収集された。マイクロチューブは遠心分離されて例2に記載された通りに、インキュベーション期間中に離昇した可能性のある細胞から小疱を分離した。小疱溶液のさらなる使用収集され小疱は溶解され、例3に記載されるタンパク質含有量に関して分析された。例8ハイスループットスクリーニングを使用する、ACDにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング細胞培養細胞HEKnは、75cm2フラスコにおいて開始密度約1.8×105細胞/cm2で増殖され、細胞が70~80培養密度に到達するまで培養された上記の通り。スクリーニング継代6のHEKn細胞は分割され、1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologics、抗生物質添加なしを補充されたmedium154CascadeBiologics中18500細胞/mlまで再懸濁された。細胞懸濁液0.5mlはいくつかの24ウェルプレートNuncMultidishesNunclon、SigmaAldrich、Stockholm、Swedenの各ウェルに添加され、5CO2、37°Cでインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、HKGSを補充された新鮮な154培地抗生物質添加なしで1日おきに交換された。mBBr、dBBr、qBBrSigmaAldrich及びオキサゾロンSigmaAldrichの保存液たとえば、50mMは、DMSO中で調製され、グリオキサールSigmaAldrichはダルベッコPBSCa、Mgなし;PAALaboratories、Linz、Austria中、79mMで調製された。インキュベーション前に、試薬は5mLのHEPES緩衝液140mMNaCl、20mMHEPES、5mMKCl、1mMMgCl2、0.06mMCaCl2、10mMD-Glucose中、そのそれぞれの濃度mBBr、dBBr0.05mM;qBBr、グリオキサール、オキサゾロン0.5mMまで希釈され、例1に記載されるとおりに細胞に添加された。前記ウェルは、好ましくは、プレート搭載ロボット、たとえば、ハミルトンプレート搭載ロボット付きのオリンパスScan∧Rを備えたHCSデバイスに載せられた。細胞形態と小疱の両方が、異なる濃度の多数の試験化合物についてモニターされることになる。小疱溶液のさらなる使用収集され小疱は溶解され、例3に記載されるタンパク質含有量に関して分析された。例9工学的に操作された蛍光システムを使用する、ACDにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニングケラチノサイトは、標準手順に従ってケラチン5及びケラチン14にカップリングされた緑色蛍光タンパク質を発現するように形質転換された。次に、代わりにこれらの工学的に操作された細胞を使用して、例1及び4にある通りに試験は実施された。次に、小疱の量は、GFPを検出するプレートリーダーSpectramax、MolecularDevicesInc、Sunnyvale、CA、USAにおいて分析された。例10ACDにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。捕獲システムを使用する分析ELISAスクリーニングは、例1に記載される通りに実施された。小疱は、例4に従って分離され、溶解された。次に、小疱含有量、たとえば、K14の量は、サンドイッチELISAシステムを使用して分析された。コーティングヒト抗K14捕獲抗体LifespanBiosciences、Seattle、WA、USはPBSに希釈された1対500。50μlの溶液が96ウェルプレートのウェルに添加された。プレートはパラフィンで覆われ、湿室において、4°Cで一晩インキュベートされた。ランニング各ウェルは吸引され、300μlの洗浄緩衝液TRIS、0.05TWEENで合計3回洗浄された。最後の洗浄後、残っている洗浄緩衝液は、プレートを清潔な紙タオルに倒立させることにより取り除かれた。150μlのブロッキング溶液0.5BSA、0.05MTRIS、pH7.4が各ウェルに添加され、前記プレートは室温RTで1時間インキュベートされた。洗浄ステップは、以前に記載された通りに4回実施された。小疱内容物は試料緩衝液0.05MTRIS、0.015MNaCl、pH7.4に1対100、1対5、1対5、1対5で希釈され、50μl/ウェルはプレートに3通りに添加された。ヒトK14GenwayBiotech、SanDiego、CAは正の対照として使用され、プレートにおいて1対400から1対6400までの試料緩衝液での連続希釈により、2通りに調製された。プレートは室温で1時間インキュベートされた。洗浄ステップは、上に記載される通りに4回実施された。ヒト抗K14抗体LifespanBiosciences、Seattle、WA、USは適切に希釈され1対3000、50μlが各ウェルに添加され、プレートは室温で30分から1時間インキュベートされた。洗浄ステップは、上に記載される通りに4回実施された。ビオチン化された検出抗体マウスIgG、IgM、IgAFab2断片に対するヤギポリクローナル、Abcam、Cambridge、MA、USAは、試料緩衝液に1/1500で希釈され、50μlが各ウェルに添加された。プレートは37°Cで2時間インキュベートされた。洗浄ステップは、以前に記載された通りに4回実施された。ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼは試料緩衝液に1対2000で希釈され、50μlが各ウェルに添加され、プレートはRTで1時間インキュベートされた。洗浄ステップは、上に記載される通りに4回実施された。1mMのABTS溶液は、70mMのクエン酸緩衝液pH4.2中で調製され、光から保護された使用まで。10μlのH2O230が10mlのABTS溶液に添加された。H2O2の添加後直ちに、100μlの前記溶液がプレートの各ウェルに添加された。プレートは光から保護され、30分から最長1時間までインキュベートされた。その後、吸光度がプレートリーダーSpectramax、MolecularDevicesInc、Sunnyvale、CA、USAにおいて405nmで測定された。放出された小疱が多いほど、この方法により検出されるK14もそれだけ多くなる。例11ACDにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。アポトーシスを測定することによる分析スクリーニングは、例1に記載される通りに実施された。アポトーシス細胞を検出するために、ApoDETECTAnnexinV-FITCキットInvitrogen、Carlsbad、CA、USAが、マニュアルの使用説明書に従って使用された。細胞は、フローサイトメトリー又は蛍光顕微鏡により分析された。アポトーシス細胞の量が多いほど、それだけアレルゲン/感作化合物は強かった。例12半透性支持体上で増殖させた細胞を使用する、ACDにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニングケラチノサイトは、細胞が代わりに半透性支持体0.4~8μmポアサイズのTranswell登録商標PermeableSupports、CorningLifeScience上で増殖されること以外は、例1に記載される通りに増殖させた。スクリーニングは、例1に従って実施された。フロースルーは標準ピペットを用いて収集され、例3に記載される通りに放出されるタンパク質たとえば、K5及びK14に関して分析された。例13DHRを引き起こす化合物の能力を試験する細胞培養正常なヒト表皮ケラチノサイトHEKn、CascadeBiologics、Portland、OR、USAは、60μMのCaCl2、抗生物質ゲンタマイシン/アンホテリシン及び1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologicsを補充されたフェノールレッド無しのEpiLifeケラチノサイト培地CascadeBiologicsにおいて維持された。代わりに、200μMのCaCl2を含有し、HKGS1v/vを補充された、抗生物質のないMedium154が使用された。細胞は、加湿された5CO2インキュベーターにおいて37°Cで増殖させた。補充された培地中の成分の最終濃度は、ウシ下垂体抽出物、0.2v/v;ウシインスリン、5mg/mL;ヒドロコルチゾン、0.18mg/mL;ウシトランスフェリン、5mg/mL;ヒト表皮増殖因子、0.2ng/mL;随意に、ゲンタマイシン、10μg/mL、及びアンホテリシンB、0.25μg/mLである。試薬はすべて、CascadeBiologics、Portland、OR、USAから入手した。ケラチノサイトは、第6継代で実験に使用された。スクリーニング継代6のHEKn細胞は分割され、1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologics、抗生物質添加なしを補充されたmedium154CascadeBiologics中18500細胞/mlまで再懸濁された。細胞懸濁液0.5mlは24ウェルプレートNuncMultidishesNunclonの各ウェルに添加され、5CO2、37°Cでインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、HKGSを補充された新鮮な154培地抗生物質添加なしで1日おきに交換された。試験される薬物候補は、DMSOSigmaAldrich中、最終濃度の50mM、5mM及び0.5mMまで希釈された。これらの保存液は、実験が実施されるたびに新たに調製された。1実験を開始する直前の細胞調製:細胞培養プレート中の培地は、HKGS1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologicsを補充された250μlの新鮮なMedium154CascadeBiologicsで置き換えられ、細胞は5CO2、37°Cで保管された。2培地中での試験化合物の調製:245μlのMedium154は0.5mlのマイクロチューブEppendorf、SigmaAldrich、Stockholm、Swedenに添加され、37°Cまで予熱された水浴。5μlの薬物候補の保存液は、予熱された培地を含有するマイクロチューブに添加された。次に、これらの溶液は直ちに24ウェルプレートの細胞に添加された。3マイクロチューブ中の溶液すなわち、250μl培地試験化合物は各プレートに添加された。したがって、試験における各化合物の最終濃度は、0.5mM、0.05mM、及び0.005mMであった。細胞と試験化合物を含有するプレートは5CO2、37°Cで24時間インキュベートされた。4A各ウェルは光学顕微鏡NikonTE300倒立顕微鏡を用いて調べられて、小疱形成応答を決定した。所定の時点1.5;2.5;24時間での産生された小疱の量は、盲検試験すなわち、小疱を計測する顕微鏡使用者は、各ウェルにどの化合物が添加されているのかに関する知識はまったくないでの目視検査を通じて評価された。測定されたパラメータは:小疱形成までの時間極度の感作物質1.5時間から強い感作物質2.5時間~24時間細胞が24時間後に小疱を産生した濃度極度の感作物質0.005mM強い感作物質0.05mM中程度の感作物質0.5mM弱い感作物質は試験された濃度では小疱形成なし小疱の量時間24時及び濃度0.5mMで極度の感作物質:高量の小疱強い感作物質:中程度量の小疱中程度の感作物質:低量の小疱弱い感作物質:小疱は検出されないである。これら3種のエンドポイントを使用して、化合物の感作潜在力すなわち、感作する及び/又はDHRを誘発する能力の収集分析が行われた。4B薬物候補の添加の24時間後、薬物誘導小疱形成の差、すなわち、化合物の強度を定量化するための蛍光の測定のために、3×90μlは24ウェルプレートの各ウェル濃度0.5mM、0.05mM、及び0.005mMから96ウェルプレートNunc、F96multisorpに移された。10μl最終濃度5μg/mlの色素FM1-43T3163、MolecularProbesが各ウェルに添加された。プレートは暗所で2分間インキュベートされ、蛍光は、励起510nm及び発光626nmのプレートリーダーSpectraMaxM2、MolecularDevicesにおいて検出された。色素FM1-43は水性溶媒中では実質的に非蛍光性であるが、細胞膜又は小疱膜中に挿入されると強い蛍光性になるので、この色素を使用して溶液中の小疱膜の量を測定することが可能である。したがって、蛍光は化合物の強度と相関しており、その場合、すなわち、化合物が強いほど、それだけ多くの小疱が周囲の培地に放出されすなわち、薬物候補の作用を通じてそれだけ多くのエピトープが放出された、その培地中の蛍光はそれだけ高くなった。例14他の上皮細胞を使用してDHRを引き起こす化合物の能力を試験する細胞培養ヒト食道上皮細胞HEEC、ScienCellResearchLaboratories、Carlsbad、CA、USA、つまり、DHRに関連する上皮細胞は、上皮細胞培地-2EpiCM-2、ScienCellResearchLaboratories、Carlsbad、CA、USAにおいて維持された。細胞は、加湿された5CO2インキュベーターにおいて37°Cで増殖させた。試薬はすべて、CascadeBiologics、Portland、OR、USAから入手した。スクリーニングHEEC細胞は分割され、EpiCM-2中18500細胞/mlまで再懸濁された。細胞懸濁液0.5mlは24ウェルプレートNuncMultidishesNunclonの各ウェルに添加され、5CO2、37°Cでインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、1日おきに交換された。試験される薬物候補は、DMSOSigmaAldrich中、最終濃度の50mM、5mM及び0.5mMまで希釈された。これらの保存液は、実験が実施されるたびに新たに調製された。1実験を開始する直前の細胞調製:細胞培養プレート中の培地は、250μlの新鮮なEpiCM-2で置き換えられ、細胞は5CO2、37°Cで保管された。2培地中での試験化合物の調製:245μlのEpiCM-2は0.5mlのマイクロチューブEppendorf、SigmaAldrich、Stockholm、Swedenに添加され、37°Cまで予熱された水浴。5μlの薬物候補の保存液は、予熱された培地を含有するマイクロチューブに添加された。次に、これらの溶液は直ちに24ウェルプレートの細胞に添加された。3マイクロチューブ中の溶液すなわち、250μl培地試験化合物は各プレートに添加された。したがって、試験における各化合物の最終濃度は、0.5mM、0.05mM、及び0.005mMであった。細胞と試験化合物を含有するプレートは5CO2、37°Cで24時間インキュベートされた。4A各ウェルは光学顕微鏡NikonTE300倒立顕微鏡を用いて調べられて、小疱形成応答を決定した。所定の時点1.5;2.5;24時間での産生された小疱の量は、盲検試験すなわち、小疱を計測する顕微鏡使用者は、各ウェルにどの化合物が添加されているのかに関する知識はまったくないでの目視検査を通じて評価された。測定されたパラメータは:小疱形成までの時間細胞が24時間後に小疱を産生した濃度小疱の量である。これら3種のエンドポイントを使用して、化合物の感作潜在力すなわち、感作する及び/又はDHRを誘発する能力の収集分析が行われた。4B薬物候補の添加の24時間後、薬物誘導小疱形成の差、すなわち、化合物の強度を定量化するための蛍光の測定のために、3×90μlは24ウェルプレートの各ウェル濃度0.5mM、0.05mM、及び0.005mMから96ウェルプレートNunc、F96multisorpに移された。10μl最終濃度5μg/mlの色素FM1-43T3163、MolecularProbesが各ウェルに添加された。プレートは暗所で2分間インキュベートされ、蛍光は、励起510nm及び発光626nmのプレートリーダーSpectraMaxM2、MolecularDevicesにおいて検出された。色素FM1-43は水性溶媒中では実質的に非蛍光性であったが、細胞膜又は小疱膜中に挿入されると強い蛍光性になるので、この色素を使用して溶液中の小疱膜の量を測定することが可能である。したがって、蛍光は化合物の強度と相関しており、その場合、すなわち、化合物が強いほど、それだけ多くの小疱が周囲の培地に放出されすなわち、薬物候補の作用を通じてそれだけ多くのエピトープが放出された、その培地中の蛍光はそれだけ高くなった。収集分析は、化合物の感作潜在力すなわち、感作する及び/又はDHRを誘発する能力についての情報を与える。例15自己免疫疾患を引き起こす化合物の能力を試験する細胞培養正常なヒト表皮ケラチノサイトHEKn、CascadeBiologics、Portland、OR、USAは、60μMのCaCl2、抗生物質ゲンタマイシン/アンホテリシン及び1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologicsを補充されたフェノールレッド無しのEpiLifeケラチノサイト培地CascadeBiologicsにおいて維持された。代わりに、200μMのCaCl2を含有し、HKGS1v/vを補充された、抗生物質のないMedium154が使用された。細胞は、加湿された5CO2インキュベーターにおいて37°Cで増殖させた。補充された培地中の成分の最終濃度は、ウシ下垂体抽出物、0.2v/v;ウシインスリン、5mg/mL;ヒドロコルチゾン、0.18mg/mL;ウシトランスフェリン、5mg/mL;ヒト表皮増殖因子、0.2ng/mL;随意に、ゲンタマイシン、10μg/mL、及びアンホテリシンB、0.25μg/mLである。試薬はすべて、CascadeBiologics、Portland、OR、USAから入手した。ケラチノサイトは、第6継代で実験に使用された。スクリーニング継代6のHEKn細胞は分割され、1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologics、抗生物質添加なしを補充されたmedium154CascadeBiologics中18500細胞/mlまで再懸濁された。細胞懸濁液0.5mlは24ウェルプレートNuncMultidishesNunclonの各ウェルに添加され、5CO2、37°Cでインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、HKGSを補充された新鮮な154培地抗生物質添加なしで1日おきに交換された。試験される化合物は、DMSOSigmaAldrich中、最終濃度の50mM、5mM及び0.5mMまで希釈された。これらの保存液は、実験が実施されるたびに新たに調製された。1実験を開始する直前の細胞調製:細胞培養プレート中の培地は、HKGS1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologicsを補充された250μlの新鮮なMedium154CascadeBiologicsで置き換えられ、細胞は5CO2、37°Cで保管された。2培地中での試験化合物の調製:245μlのMedium154は0.5mlのマイクロチューブEppendorfに添加され、37°Cまで予熱された水浴。5μlの試験化合物の保存液は、予熱された培地を含有するマイクロチューブに添加された。次に、これらの溶液は直ちに24ウェルプレートの細胞に添加された。3マイクロチューブ中の溶液すなわち、250μl培地試験化合物は各プレートに添加された。したがって、試験における各化合物の最終濃度は、0.5mM、0.05mM、及び0.005mMであった。細胞と試験化合物を含有するプレートは5CO2、37°Cで24時間インキュベートされた。4A各ウェルは光学顕微鏡NikonTE300倒立顕微鏡を用いて調べられて、小疱形成応答を決定した。所定の時点1.5;2.5;24時間での産生された小疱の量は、盲検試験すなわち、小疱を計測する顕微鏡使用者は、各ウェルにどの化合物が添加されているのかに関する知識はまったくないでの目視検査を通じて評価された。測定されたパラメータは:小疱形成までの時間:小疱形成を引き起こし、したがって上皮接触すると潜在的に自己免疫疾患を引き起こすことができる化合物:1.5時間から非常に可能性が高い強い可能性がある:2.5時間~24時間細胞が24時間後に小疱を産生した濃度:上皮接触すると潜在的に自己免疫疾患を引き起こす可能性が非常に高い化合物:強い可能性がある:0.05mM中程度の可能性がある:0.5mM弱い感作物質は試験された濃度では小疱形成する可能性は弱い小疱の量時間24時及び濃度0.5mMで極度に可能性が高い:高量の小疱強い可能性がある:中程度量の小疱中程度の可能性がある:低量の小疱可能性は弱い:小疱は検出されないである。これら3種のエンドポイントを使用して、自己免疫疾患を引き起こすことに関する化合物の効力の収集分析が行われた。4B試験化合物の添加の24時間後、小疱形成の差、すなわち、化合物の強度を定量化するための蛍光の測定のために、3×90μlは24ウェルプレートの各ウェル濃度0.5mM、0.05mM、及び0.005mMから96ウェルプレートNunc、F96multisorpに移された。10μl最終濃度5μg/mlの色素FM1-43T3163、MolecularProbesが各ウェルに添加された。プレートは暗所で2分間インキュベートされ、蛍光は、励起510nm及び発光626nmのプレートリーダーSpectraMaxM2、MolecularDevicesで検出された。色素FM1-43は水性溶媒中では実質的に非蛍光性であるが、細胞膜又は小疱膜中に挿入されると強い蛍光性になるので、この色素を使用して溶液中の小疱膜の量を測定することが可能である。したがって、蛍光は化合物の強度と相関しており、その場合、すなわち、化合物が強いほど、それだけ多くの小疱が周囲の培地に放出されすなわち、試験化合物の作用を通じてそれだけ多くの自己エピトープが放出された、その培地中の蛍光はそれだけ高くなった。例16化合物の阻害小疱形成に関して能力を試験する阻害効果についてスクリーニングされる化合物これ以降、阻害剤と呼ばれるは、その最終用途すなわち、通常、ケラチノサイト又は同等の物に小疱を産生させると考えられる化合物と一緒に混合物、溶液、製剤において使用するために関して適切な連続希釈においてDMSO中に溶解された。細胞培養正常なヒト表皮ケラチノサイトHEKn、CascadeBiologics、Portland、OR、USAは、60μMのCaCl2、抗生物質ゲンタマイシン/アンホテリシン及び1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologicsを補充されたフェノールレッド無しのEpiLifeケラチノサイト培地CascadeBiologicsにおいて維持された。代わりに、200μMのCaCl2を含有し、HKGS1v/vを補充された、抗生物質のないMedium154が使用された。細胞は、加湿された5CO2インキュベーターにおいて37°Cで増殖させた。補充された培地中の成分の最終濃度は、ウシ下垂体抽出物、0.2v/v;ウシインスリン、5mg/mL;ヒドロコルチゾン、0.18mg/mL;ウシトランスフェリン、5mg/mL;ヒト表皮増殖因子、0.2ng/mL;随意に、ゲンタマイシン、10μg/mL、及びアンホテリシンB、0.25μg/mLである。試薬はすべて、CascadeBiologics、Portland、OR、USAから入手した。ケラチノサイトは、第5又は第6継代で実験に使用された。スクリーニング継代6のHEKn細胞は分割され、1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologics、抗生物質添加なしを補充されたmedium154CascadeBiologics中18500細胞/mlまで再懸濁された。細胞懸濁液0.5mlは24ウェルプレートNuncMultidishesNunclonの各ウェルに添加され、5CO2、37°Cでインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、HKGSを補充された新鮮な154培地抗生物質添加なしで1日おきに交換された。オキサゾロンすなわち、小疱を引き起こしていたが、薬物/シャンプー/香水/皿洗い機液体/等中に含めたい化合物。ここではオキサゾロンにより例証されているが、使用を通じて上皮接触する任意の種類の製剤又は混合物中の任意の化合物でもよいは、DMSODMSO及びオキサゾロンはSigmaAldrich社製中、最終濃度の100mM、10mM及び1mMまで希釈された。その阻害効果についてスクリーニングされる化合物これ以降阻害剤と呼ばれるは、その最終用途すなわち、通常、ケラチノサイト又は同等の物に小疱を産生させると考えられる化合物と一緒に混合物、溶液、製剤で使用するために関して適切な連続希釈0.1μMから10Mにおいてハプテンとして同じ溶液中に溶解された。これらの保存液は、実験が実施されるたびに新たに調製される。1実験を開始する直前の細胞調製:細胞培養プレート中の培地は、HKGS1v/vヒトケラチノサイト増殖補助剤HKGS;CascadeBiologicsを補充された250μlの新鮮なMedium154CascadeBiologicsで置き換えられ、細胞は5CO2、37°Cで保管された。2培地中での試験混合物ハプテンと阻害剤の調製:245μlのMedium154は0.5mlのマイクロチューブEppendorfに添加され、37°Cまで予熱された水浴。5μlの保存液は、予熱された培地を含有するマイクロチューブに添加された。次に、これらの溶液は直ちに24ウェルプレートの細胞に添加された。3マイクロチューブ中の溶液すなわち、250μl培地試験化合物は各プレートに添加された。したがって、試験における各化合物の最終濃度は、0.5mM、0.05mM、及び0.005mMであった。細胞と試験化合物を含有するプレートは5CO2、37°Cで24時間インキュベートされた。4A各ウェルは、デジタルカメラに連結された光学顕微鏡NikonTE300倒立顕微鏡を用いて調べられて、小疱形成応答を決定した。所定の時点1.5;2.5;24時間での産生された小疱の量は、盲検試験すなわち、小疱を計測する顕微鏡使用者は、各ウェルにどの化合物が添加されているのかに関する知識はまったくないでの目視検査を通じて評価された。測定されたパラメータは:阻害剤なしでの小疱形成までの時間:オキサゾロン1.5時間阻害剤は、オキサゾロン又は新しい試験化合物が細胞に添加されると、ケラチノサイトが小疱を産生するのを停止するはずである。細胞が24時間後に小疱を産生した濃度オキサゾロン0.5mM、0.05mM弱い感作物質及び非感作物質は、0.5mM、0.05mM、及び0.005mMでは小疱形成しないので、阻害剤を添加することによって、同様に小疱形成しないはずである。小疱の量時間24時及び濃度0.5mM:極度の感作物質オキサゾロンのようなは高量の小疱を与える弱い感作物質及び非感作物質は、0.5mM、0.05mM、及び0.005mMでは小疱形成しないので、阻害剤は同様に、時間24時及び濃度0.5mMでは小疱形成をしないはずである。これらの3種のエンドポイントを使用して、化合物の阻害潜在力の収集分析が行われる。試験化合物が添加されると小疱形成応答を阻害するのに効率的である化合物は、阻害剤と呼ばれる。次に、その阻害剤又は類似物は、溶液、混合物、製剤、等中の試験化合物と一緒に使用して、アレルギー性接触皮膚炎/自己免疫疾患/DHR/化学的に誘導される喘息、等を引き起こすリスクを最小限に抑えることが可能である。"