"患者にニューレグリンアンタゴニストの有効量を投与することを含む、癌患者の腫瘍再発までの時間を増やす方法。患者へ治療薬を投与することを更に含む、請求項1に記載の方法。治療薬が化学療法剤又は抗体である、請求項2に記載の方法。化学療法剤がパクリタキセル又はシスプラチン、又はパクリタキセルとシスプラチンの組み合わせである、請求項3に記載の方法。抗体がEGFR,HER2、HER3、又はHER4抗体である、請求項3に記載の方法。癌が非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、前立腺癌、又は大腸癌からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。腫瘍再発までの期間の増加が、ニューレグリンアンタゴニストの非存在下における再発までの期間より少なくとも1.25倍大きい、請求項1に記載の方法。腫瘍再発までの期間の増加が、ニューレグリンアンタゴニストの非存在下における再発までの期間より少なくとも1.50倍大きい、請求項1に記載の方法。ニューレグリンアンタゴニストは、抗体、小分子、イムノアドヘシン、又はRNAである、請求項1に記載の方法。ニューレグリンアンタゴニストがNRG1アンタゴニストである、請求項1に記載の方法。ニューレグリンアンタゴニストが抗NRG1抗体である、請求項1に記載の方法。III.実施例以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。実施例1:方法細胞株NSCLC細胞株Calu3、H441、H1299、H1993、A549およびH596、およびKPL4乳癌細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC、マナッサスから得た。これらの細胞株は、10FBS、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびL-グルタミンを含有するPRMIで維持された。Calu3は、RPMIの代わりにATCC培地で培養された。Calu3、H441及びKPL4細胞株はTZV-b-アクチンeGFPのレンチウイルスで形質導入した。複数回の継代後、高GFP発現細胞が選別されて増幅され、約95のGFP陽性細胞を得て、これらの下位株はCalu3-GFPおよびH441-GFPおよびKPL4-GFPと記載された。マウスNSCLC細胞株のLKPH1とLKPH2は、KrasLSL-G12D/、p53FL/、Z/EG肺腫瘍担持マウスからの2つの独立した腫瘍由来であった。細胞株は、はじめに、5のFBS、ウシ下垂体抽出物、N2サプリメント、EGF、FGF、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびL-グルタミンを含むDMEM/F12培地で樹立された。LKPH1及びLKPH2は、10FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン及びL-グルタミンを含むDMEM高グルコース培地で培養した。誘導性shRNAレンチウイルス:本研究で使用したヘアピンオリゴヌクレオチドは、以下のとおりである。shNRG1:5’-GATCCCCCATGGTGAACATAGCGAATTTCAAGAGAATTCGCTATGTTCACCATGTTTTTTGGAAA-3’センス配列番号1及び5’-AGCTTTTCCAAAAAACATGGTGAACATAGCGAATTCTCTTGAAATTCGCTATGTTCACCATGGGG-3’アンチセンス配列番号2。shNRG1.2:5’GATCCCCGAGTATATGTGCAAAGTGATTCAAGAGATCACTTTGCACATATACTCTTTTTTGGAAA-3’センス配列番号3及び5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAGTATATGTGCAAAGTGATCTCTTGAATCACTTTGCACATATACTCGGG-3’アンチセンス配列番号4。shErbB4:5’-GATCCCCGATCACAACTGCTGCTTAATTCAAGAGATTAAGCAGCAGTTGTGATCTTTTTTGGAAA-3センス配列番号5及び5’AGCTTTTCCAAAAAAGATCACAACTGCTGCTTAATCTCTTGAATTAAGCAGCAGTTGTGATCGGG-3’アンチセンス配列番号6。shErbB3:5’-GATCCCCAAGAGGATGTCAACGGTTATTCAAGAGATAACCGTTGACATCCTCTTTTTTTTGGAAA-3’センス配列番号7及び5’-AGCTTTTCCAAAAAAAAGAGGATGTCAACGGTTATCTCTTGAATAACCGTTGACATCCTCTTGGG-3’アンチセンス配列番号8。マウスshNRG1:5-GATCCCCCATGGTGAACATAGCGAATTTCAAGAGAATTCGCTATGTTCACCATGTTTTTTGGAAA-3’センス配列番号9及び5’-AGCTTTTCCAAAAAACATGGTGAACATAGCGAATTCTCTTGAAATTCGCTATGTTCACCATGGGG-3アンチセンス配列番号10。相補的な二本鎖のshRNAオリゴヌクレオチドは、記載されているようにTet誘導ウイルス遺伝子導入ベクターに挿入した。ベクター系は、シャトルベクター及び、コドン最適Tetリプレッサー内部リボソーム進入部位-DsRedカセットを含む、DsRedを発現するウイルスベクター骨格を含み、Tet調節shRNA発現を可能とする。ルシフェラーゼshRNAコンストラクトは、以前に記載されているHoeflichら。ウイルスパッケージング及び細胞株の生成:誘導性shRNAを有するレンチウイルスコンストラクトが、水疱性口内炎ウイルスVSV-Gのエンベロープ糖タンパク質及びHIV-1パッケージングタンパク質GAG-POLを、リポフェクタミンインビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州を用いてHEK293T細胞内に発現するプラスミドを有する所望のshRNAを含む、pHUSH-レンティ-DsRedコンストラクトをコ-トランスフェクトすることにより、前述の方法に基づいて作成された。標的細胞は、これらのウイルスで形質導入した。>3継代後、収集され、プールされ、拡張された、上位約20のdsRed発現細胞を選択するためにFACSソーティングが用いられた。インビトロでの研究:shRNA発現を誘導するために、ドキシサイクリン誘導性shNRG1またはshルシフェラーゼを保有する安定な細胞株を、計6日間、1ug/mlのドキシサイクリンで増殖させた。誘導の初日に、細胞は10のFBSで増殖させ、続いて、更に4日間にわたりFBSの滴定が行われた。細胞は、増殖の最後の6時間の間は完全に血清飢餓であった。次いで、細胞はRNA抽出またはウェスタンブロッティングのために処理された。マウスの肺腫瘍細胞株におけるHER4ECD研究のために、LKPH細胞が2mg/mLの濃度でのHER4ECDの添加前に、24時間、血清飢餓状態で増殖させた。LKPH細胞は、その後、ウエスタンブロット法において処理する前に、さらに48時間インキュベートした。H441細胞に対する外因性NRG1の添加は以下のように行った:H441細胞は、1uM換えヒトNRG1β-1細胞外ドメインRDsystems、又は対照として1uM抗ブタクサIgG2Aの添加前に18時間血清飢餓であった。NRG1またはブタクサの添加から10分後に、細胞はウェスタンブロット法のために処理された。RNA単離、cDNA調製及びqPCR:RNAは、QiagenのRNeasyマイクロキットを用いて単離した。相補的DNAは、製造元の指示に従って、ABIの高忠実度キットを用いて全RNAから調製した。NRG1アルファ、NRG1ベータ、HER3、HER4の発現は、定量的リアルタイムPCRABI7500によって、ABIの遺伝子特異的プライマー/プローブを用いて決定した。遺伝子発現は、GAPDH又はRAB14ハウスキーピング遺伝子を用いて正規化した。インビボでの異種移植腫瘍の研究:腫瘍細胞1000万~2000万個が無胸腺ヌードマウスの右脇腹に移植された。腫瘍の大きさが約200立方ミリメートルに達したときに、マウスは異なる治療群に分けられた。マウスは、初期の研究のために、ビヒクル又は化学療法パクリタキセル、静脈内シスプラチン、腹腔内で処置された。化学療法の投与レジメンは、パクリタキセルを20mg/kg静脈内投与を一日おきに5用量、シスプラチンを、Calu3モデルにおいては第1日と第7日に、H441モデルにおいては第1日と第14日に、5mg/kg腹腔内投与であった。退行腫瘍及び時間を一致させたビヒクルコントロールが、化学療法の最終投与後少なくとも1週間で収集された。腫瘍はディスパーゼ/コラゲナーゼを用いて分離し、サンプルは、GFP陽性腫瘍細胞を収集するために、FACSソートした。NRG1ノックダウン研究について、治療群は次のとおりだった:スクロース、ドキシサイクリンdox、化学療法スクロース、及び化学療法ドキシサイクリン。スクロース又はドキシサイクリンによる処置は、化学療法の初回投与と同時に開始され、研究の期間継続した。5スクロース水がビヒクル群に対して自由に与えられ、5ショ糖中の1mg/mlのドキシサイクリンがドキシサイクリン群において与えられた。異種移植腫瘍増殖解析:時間をかけて同じ動物からの腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデリングアプローチを用いたPinheiroら、2009。このアプローチは、反復測定と研究終了前の動物の無処置関連終結による適度な脱落率の両方を扱うことができる。キュービック回帰スプラインが、各処置群についてlog2腫瘍体積の経時変化に非線形プロファイルを適合するために使用された。インビボでのLSL-K-rasG12D;p53Fl/及びLSL-K-rasG12D;p53Fl/FlHer4ECD研究:LSL-K-rasG12D;p53Fl/はアデノCreウイルスで感染させ、腫瘍誘導後16週間熟成させた。ベースラインCTスキャンが腫瘍誘導後16週目研究の0日目に実施され、マウスは開始時の腫瘍体積の平均値が等しいようにグループ化された。マウスは研究期間中、3週間に一回シスプラチン7mg/kg、またはリン酸緩衝生理食塩水を、隔週でHER4ECD-FC25mg/kgまたは抗ブタクサIgG2A25mg/kgを投与された。シリアルCTスキャンが第14日、第45日、第66日に行われた。X線マイクロコンピュータ断層撮影マイクロCT:2つのマイクロCTシステムvivaCT40とvivaCT75、ScancoMedical、スイスが、縦方向の肺イメージングのために利用された。動物は、マイクロCTシステム間で無作為に割り付けられ、ベースラインのイメージングに使用されるのと同じシステム上で再スキャンされた。データは38μmvivaCT40又は50μmvivaCT75の等方性ボクセルサイズで、1000画像、250ミリ秒vivaCT40または200ミリ秒vivaCT75の積分時間で、45keVの光子エネルギー、177ミリアンペアの電流で得られた。生体内イメージングの期間中、動物は、2イソフルランを含む医療空気で麻酔され、37°Cの定常温度で制御された暖かい空気流によって維持された。各セッションの撮像時間は動物あたり約15分vivaCT75または25分vivaCT40であり、推定された放射線量は、約0.2GyvivaCT75または0.1GyvivaCT40であった。画像データは、画像解析ソフトウェアパッケージのANALYZEAnalyzeDirect、Lenexa、カンザス州、米国を使って冠状面で評価された。一度各腫瘍の最大断面が同定されると、最大の腫瘍直径d1と最大垂直直径d2の推定値が決定された。総腫瘍量は、すべての腫瘍の指向性推定値の外積d1×d2の和として算出した。インビボマイクロCT腫瘍の分析は以前に検証され、エクスビボマイクロCT分析によって決定されるように、十分に総腫瘍体積と相関することが見出された。マイクロアレイ解析:2ラウンドのT7増幅プロトコルで使用される全RNAの量は、サンプルあたり10ngから50ngの範囲であった。第一ラウンドの増幅及び第二ラウンドのcDNA合成は、MessageAmpIIaRNA増幅キットアプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州を使用して行われた。Cye-5色素が次いでAgilentのクイックアンプラベリングキットAgilentTechnologies社、パロアルト、カリフォルニア州を用いてIVT反応により取り入れられた。各CY-5標識した試験サンプルは、CY-3標識ユニバーサルヒューマンリファレンスRNAAgilentTechnologies、パロアルト、カリフォルニア州でプールされ、製造業者のプロトコールに記載されているようアジレントのヒト全ゲノム4x44Kアレイ上へハイブリダイズさせた。アレイは、洗浄し、乾燥し、アジレントのDNAマイクロアレイスキャナでスキャンした。アジレントのFeatureExtractionソフトウェア9.5が、得られたアレイ画像を分析するために使用され、バックグランドを差し引かれたシグナル強度の個別のlog2比が得られた。改変Cybert-Tテストが、ビヒクル処置と化学療法群の間の発現プロファイルを比較するために行われた。偽の発見率q値を、複数の試験補正に適用した。siRNA:HER3M-003127-03、HER1M-003114-01、HER2、HER4、及び非標的コントロールの低分子干渉RNAオリゴsiRNAのプールは、DharmaconLafayette,COから購入した。siRNAは、リバーストランスフェクションによってH522細胞に導入した。細胞/ウェルは、製造元の推奨に従って、50nmol/LでプールされたRNAiオリゴとOPTI-MEMInvitrogenに希釈されたDharmaFECTT-2001-02,Dharmaconトランスフェクション試薬を事前にインキュベートした混合物を含む、96穴マイクロタイタープレートに播種された。96時間のトランスフェクション後、細胞増殖への影響はAlamarBlue染色によって測定した。ウェスタンブロッティング:インビトロでの細胞培養液のウエスタンブロットのために、付着細胞を氷冷した1×リン酸緩衝食塩水PBSで3回洗浄し、RIPAバッファーPierceBiotechnology、ホルトプロテアーゼ阻害剤、及びホルトホスファターゼ阻害剤カクテルThermoScientificに溶解した。溶解液を回収し、ホモジナイズし、10分間遠心分離することによって明らかにした。マウスの主腫瘍溶解物は、上記のようにPBS洗浄せずに、調製した。上清タンパク質は、4から12のNuPAGENovexビス-トリスゲルInvitrogenで分画した。ブロッティングは、製造業者の仕様に従ってiBlotドライブロッティングシステムInvitrogenを用いて行った。ニトロセルロース膜のブロッキングと抗体染色は、製造者の指示に従って、オデッセイウエスタンブロット分析と赤外線撮像システムLI-CORBiosciencesを用いて行った。ブロットはオデッセイスキャナーLI-CORBiosciencesで可視化した。抗体:以下の一次抗体をウェスタンブロッティング実験に使用した:抗アクチン612656、BDBiosciences、抗GAPDHsc-25778,SantaCruzBiotechnology、抗EGF受容体2232,CellSignalingTechnology、抗ノイsc-284,SantaCruzBiotechnology、抗ErbB3sc-285,SantaCruzBiotechnology、抗ホスホHER34791,CellSignalingTechnology、抗ErbB4sc-283,SantaCruzBiotechnology、抗ホスホHER44757,CellSignalingTechnology、抗Akt4691,CellSignalingTechnology、抗ホスホAkt4058,CellSignalingTechnologyは、Stat/ホスホStat抗体サンプラーキット9939/9914,CellSignalingTechnology、抗MEK1/29126,CellSignalingTechnology、抗ホスホ-MEK1/22338,CellSignalingTechnology。LI-CorBiosciencesからの次の二次抗体を使用した:IRDye680結合ヤギ抗マウスIgG、IRDye800CW結合ヤギ抗ウサギIgG。実施例2:残存する病変と再発の研究のためのインビボモデルの最適化化学療法に応答して著しい回帰を示し、その後治療の中止後に腫瘍の再発が起きる幾つかの癌のモデルが作成され、腫瘍再発生に関与する細胞の研究に用いられた。これらの細胞は、腫瘍再発生細胞TRICである。モデルを作成するために、GFP標識ヒト腫瘍細胞が皮下移植され、それぞれのモデルに示すように、腫瘍の大きさが約200立方ミリメートルに達したときに、マウスをビヒクル又は化学療法のいずれかで処置した。GFP腫瘍細胞が、酵素消化と解離後に、FACSソーティングによって退行腫瘍又はビヒクル処置腫瘍から単離した。腫瘍は、化学療法の最終投与後、腫瘍増殖の再開前の最低1週間収集した。ヒト非小細胞肺癌NSCLCの細胞株Calu3とH441のGFPを発現する亜系統を、異種移植モデルを生成するために胸腺ヌードマウスに移植した。Calu3モデルについて、化学療法は、パクリタキセル20mg/kg、静脈内投与、5用量を隔日及びシスプラチン5mg/kg、腹腔内投与、2用量を7日ごとで構成された。図2A平均腫瘍体積±SEM、n=15/群として提示されたデータ。H441モデルについて、化学療法は、パクリタキセル20mg/kg、静脈内投与、5用量を隔日及びシスプラチン5mg/kg、腹腔内投与、2用量を14日ごとから成る。図2B平均腫瘍体積±SEMとして提示されたデータ;ビヒクル処置についてn=9/群、化学療法処置についてはn=14/群。GFPを発現するヒト乳癌細胞株KPL4の亜系統が、SCID/beizマウスの乳腺脂肪パッドに同所性に移植された。KPL4モデルについて、化学療法は、パクリタキセル20mg/kg、静脈内投与、5用量を隔日から成る。図2C平均腫瘍体積±SEM、n=12マウス/群として提示されたデータ。化学療法レジメンの完了後、化学療法で処置したマウスの腫瘍は、ビヒクルで処置したマウスよりも有意に小さかった。退行は、化学療法の最終投与後数週間持続したが、その後に腫瘍が再発した。図2AーC。また、非小細胞肺癌のLSL-K-rasG12D遺伝子改変マウスモデルが、Z/EGのCre-レポーター株と交配され、本研究で使用した。シスプラチン7mg/kgを腹腔内、3用量を7日ごとが、肺のAdenoCre感染すなわち腫瘍発生後12週間で開始された。肺が化学療法の最終投与後1週間で回収され、腫瘍細胞は酵素消化と解離後にFACSによって単離された。シスプラチンの最終投与後1週間で肺に存在するGFP陽性腫瘍細胞のFACS分析は、ビヒクルのコントロールと比較してシスプラチンを投与したマウスにおける腫瘍細胞数の有意な減少を明らかにした。図2Dデータは肺あたりのGFP陽性細胞数の平均値±SEM、n=6/群として提示される。従って、LSL-K-rasG12Dマウスのシスプラチン処置は、腫瘍量を大幅に減少させたが、生存期間の延長をもたらさず、腫瘍が治療後に再発することを示している。上記モデルの各々は、化学療法に応答したが、腫瘍は、ほぼ完全な切除にもかかわらず、治療後の様々な時期に再発した。腫瘍再増殖の発症前の化学療法を生き延びたGFP標識細胞は、TRICを含んでおり、更なる研究のために単離された。実施例3TRICにおけるNRG1の濃縮各モデルの所定の成長曲線に基づいて、退行またはビヒクルで処置した腫瘍は、最後の治療後1-3週間の間で、化学療法で処置した腫瘍の再増殖の発症前に採取された。腫瘍組織を酵素的に消化し、解離し、GFP陽性腫瘍細胞を、蛍光活性化細胞選別FACSにより単離した。ビヒクル処置腫瘍細胞と残存腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイルの違いを特徴付けるために、RNAを腫瘍細胞PI-GFPから単離し、発現プロファイリングを行った。Calu3とH441両方のモデルのマイクロアレイ解析は、NRG1発現がビヒクル処置腫瘍細胞に比べて、残存する化学療法処置された腫瘍細胞において有意に高かったことを明らかにした図3A-B。残存する化学療法処置細胞の濃縮は、2つの独立したマイクロアレイのプローブを用いて決定された。Calu3異種移植モデルについて、8.6倍濃縮p=0.003、q=0.003が、第一プローブを用いて測定され図3A、左のマイクロアレイパネル、5.3倍濃縮P=0.001、q=0.002n=8/群が第二プローブを用いて測定された図3A、右マイクロアレイパネル。H441異種移植モデルについて、4.9倍濃縮p<0.001、q=0.009が、第一プローブを用いて決定され図3B、左のマイクロアレイパネル、2.8倍濃縮P=0.001、q=0.013n=8/群が第二プローブを用いて決定された図3B、右マイクロアレイパネル。選択的スプライシングに起因する、NRG1alphaNRG1αとNRG1betaNRGβと呼ばれる、受容体結合に必要とされるNRG1のEGF様ドメインの2つの活性なアイソフォームがある。我々は、NRG1α及びNRG1βの濃縮を定量的リアルタイムPCRqPCRにより確認した図3AーB。Calu3異種移植モデルについて、独立した腫瘍サンプルを用いて、NRG1αの発現が4.7倍濃縮されp=0.02図3A、左のqPCRのパネル、NRG1βが3.4倍濃縮されたp=0.04図3A、右のqPCRパネルn=6/群。H441異種移植モデルについて、マイクロアレイ解析と同じ腫瘍サンプルを用いて、NRG1αが11.4倍濃縮され図3B、左のqPCRのパネル、NRG1βが12.1倍濃縮された図3B、右のqPCRパネル。NRG1のmRNAはKPL4乳癌異種移植モデルからのTRICに富んでいる。濃縮は、2つの独立したマイクロアレイプローブを用いて決定した図3C。LSL-K-rasG12Dモデルでは、NRG1の発現は、マイクロアレイに基づくバルクビヒクルで処置した腫瘍細胞に比して残存する化学療法処置された腫瘍細胞において有意に高かった。13.7倍濃縮p<0.001、q=1n=6/群がマイクロアレイ解析を用いて決定された図3D、マイクロアレイパネル。濃縮は独立したサンプルについて、qPCRで検証され、9倍濃縮を示したp=0.04図3D、qPCRのパネル。NRG1は、Calu3、H441およびLSL-K-rasG12Dの全3モデルにおいて、残存する処置細胞中に著しく富む少数の遺伝子の一つであった。興味深いことに、HER3又はHER4受容体の発現はどちらも、全モデルにおいて一貫して高められてはいなかった。NRG1受容体、HER3、の活性化は、ホスホHER3について腫瘍の免疫染色によってアクセスされた。残存腫瘍における腫瘍細胞の大多数は、p-HER3陽性であったが、ビヒクル処置した腫瘍は、p-HER3陽性細胞の散在クラスターのみを示した。他のHER3リガンド、NRG2の発現は、残存腫瘍細胞内は見いだされなかった。従って、残存腫瘍細胞はNRG1を発現し、受容体の活性化の増大を示し、NRG1自己分泌活性を増大することが実証された。実施例4-NRG1発現の調節残存腫瘍細胞で観察されるNRG1の発現の増加は、原発腫瘍に存在する細胞のNRG1発現亜集団の濃縮から生じる可能性がある。あるいは、化学療法は、細胞毒性効果にその後耐性がある細胞でNRG1発現を誘導する可能性があり、または発現レベルが、腫瘍の大きさや増殖速度に影響される可能性がある。これらの可能性を区別するために、NRG1発現レベルが、化学療法の後にqPCRによって、異なる体積の腫瘍で様々な時点で評価された。NRG1のmRNAレベルは、化学療法シスプラチンパクリタキセルの単回投与の後には増加しなかった。実際には、残存腫瘍を除いて、NRG1レベルは試験された全ての時間と体積において同等であった。これらの結果は、NRG1の発現が化学療法によって誘発されないか、または腫瘍の大きさに影響されないことを示しており、NRG1発現細胞の既存の亜集団の濃縮と一致している。実施例5-NSCLCにおける自己分泌NRG1-HERシグナル伝達リガンドとその受容体の両方を共発現するモデルを同定するために、親のCalu3細胞とH441細胞並びに更なるヒトNSCLC細胞株のパネルにおいて、NRG1とその受容体の発現を調べた。NRG1αとNRG1βの転写産物の発現レベルは細胞株間で異質であったが、それらは正常な肺と比較した場合、細胞株の大半ではるかに高かった。驚いたことに、H441細胞では、NRG1転写物は、細胞がインビボで腫瘍として増殖されたときだけ存在していた。培養されたH441細胞は、検出可能なNRG1α又はNRG1β転写産物を発現せず、インビトロ及びインビボで増殖した細胞の特性の違いを強調している。4つのHER受容体のウェスタン分析は、6つのヒトNSCLC株のなかで異種発現を明らかにした。Calu3は、他の細胞株に比して4つの受容体全てにおいて、インビトロ発現の最高レベルを持っていた。NRG1自己分泌シグナル伝達の可能性のある下流メディエーターを評価するために、NRG1shNRG1にドキシサイクリン誘導性shRNAを運ぶCalu3、H441及びH1299親細胞株の安定した亜系統、及び恒常的に発現されるdsREDレポーター遺伝子が生成された。NRG1遺伝子は複数のプロモーターを含有し、少なくとも15の異なるアイソフォームを生じる大規模な選択的スプライシングを受ける。全ての活性なアイソフォームは、RTKの活性化のために必要かつ十分であるEGF様ドメインを含んでいる。shNRG1は、すべての可能なアイソタイプのノックダウンを可能にするために、共通のEGF様ドメインを標的とした。ドキシサイクリン誘導性shRNAを持つルシフェラーゼshLucに適合した安定な細胞株が、コントロールとして生成された。NRG1αとNRG1βの転写物の効果的かつ特異的な減少~90は、ドキシサイクリンdoxの存在下で培養した場合に、Calu3-shNRG1細胞内でのみであった。doxの存在下で培養した血清飢餓Calu3-shNRG1細胞において、関連するp-HER3レベル、p-AKTレベルの減少、及びp-HER4のわずかな減少が測定された。これらの溶解物におけるp-Stat3またはp-Mek1/2のレベルにおいて検出可能な変化は認められなかった。H441細胞はインビトロで任意NRG1転写物を発現していなかったので、これらの細胞内のNRG1シグナル伝達のメディエーターは、外因性NRG1リガンドで刺激することによって評価した。血清飢餓細胞のNRG1刺激により、p-HER3及びp-AKTの増加があった。p-Stat3またはp-Mek1/2のレベルにおいて検出可能な変化は認められなかった。NRG1エフェクター経路もまたマウス肺癌細胞で評価した。二つの独立した細胞株、LKPH1及びLKPH2は、LSL-K-rasG12D肺腫瘍;p53Fl/肺腫瘍から由来し、総称してLKPH株と称された実施例1を参照。dox誘導性shNrg1またはshLucを運搬する安定した亜系統が生成された。NRG1転写物の減少は、doxの存在下でLKPHshNrg1細胞株においてのみ見られた。さらに、doxの存在下で培養した血清飢餓LKPH-shNRG1細胞におけるp-HER3およびp-AKTのレベルの低下があった。NRG1のmRNAを欠いた培養液におけるp-Mek1/2及びp-Stat3のレベルの変化は、ウェスタンブロットで検出可能ではなく、これらのエフェクター経路はNrg1により係合されていなかったことを示唆している。共に、H441細胞のNRG1刺激とCalu3及びLKPH1/2細胞におけるNRG1ノックダウンからのデータは、PI3K経路がNSCLC細胞内のNRG1シグナル伝達の主要な下流エフェクターであることを示唆している。ヒトとマウスのNSCLCモデルの両方におけるNRG1転写産物とHER受容体の発現の増大、及びNRG1ノックダウン時に培養された腫瘍細胞におけるHER3シグナル伝達の活性の減少は、NSCLCにおける自己分泌性NRG1-HER3シグナル伝達のループがあることを示唆している。加えて、残存腫瘍細胞におけるその発現の増大は図3、NRG1自己分泌性シグナル伝達が、化学療法抵抗性及び/又は疾患の再発において役割を果たし得ることを示唆している。実施例6-NRG1ノックダウンは化学療法後の腫瘍の再発を遅延する化学療法後の原発腫瘍の増殖や再発におけるNRG1ノックダウンの影響を、NRG1ノックダウン単独または化学療法との併用での影響を評価することにより決定した。HERファミリー受容体の異なる発現パターンを示す3つのヒトNSCLCのモデルが、この研究で用いられた。Calu3モデルは、すべての受容体の高タンパク質レベルを有し、H441は、HER2及びHER3の強い発現、及びHER1の中程度の発現を示し、H1299は、HER1、Her2及びHer3の中程度の発現レベルを示している。Calu3モデルにおけるNRG1ターゲティングの有効性を決定するためにCalu3-shNRG1の瘍を有するマウスが4つのグループに割り当てられた;1ビヒクルスクロース、2ビヒクルdox、3化学療法スクロース、及び4化学療法dox。上記の実施例2に記載したのと同じ化学療法レジメンを用いて、5スクロースまたはdox2g/Lが適宜飲料水中に経口投与された。腫瘍体積を研究期間中週2回測定した。腫瘍増殖曲線が本研究で使用した個々のマウスについて作成されビヒクルスクロースについてn=12匹のマウス、ビヒクルdoxについてn=13匹のマウス、図5A及び5Bの自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍堆積の適合を生成した線形混合効果LMEとして提示される。ビヒクルdox群2倍になる時間TDT=44.5日対ビヒクルスクロースTDT=17日において、腫瘍体積倍加時間の大幅な遅延が発生し、NRG1ノックダウンは部分的に腫瘍の成長を阻害することを示唆している図5A。腫瘍の再発におけるNRG1の影響を、化学療法dox群と化学療法スクロース群における腫瘍の増殖とを比較することで評価した。化学療法スクロースTDT=124日に対して化学療法dox群TDT>181日、研究の終了までに到達しなかったにおいて腫瘍再発に著しい遅延があった図5B。更に、化学療法によるかよらないかに関わらず、doxで処置されたマウスからの再発腫瘍の多くは、生存可能な腫瘍組織はごくわずかな領域であって主に茶色/黒の粘液状の液体で構成されていた。したがって、測定された体積はdox処置群における実際の腫瘍体積よりもかなり大きかった。Calu3-shLucコントロール研究のグループのいずれの間にも違いは観察されなかった。更に、化学療法の最終投与3日後のCalu3腫瘍において、免疫組織化学的検査IHCが増殖マーカーKi67について行なわれた。化学療法スクロース腫瘍と比較して、化学療法dox処理腫瘍におけるKi67陽性細胞の割合が著しく低く、NRG1シグナル伝達が化学療法後の残存腫瘍細胞の増殖を刺激することを示唆している。初期および後期の時点で収集された腫瘍細胞におけるNRG1αとNRG1βアイソフォームのmRNAレベルが測定された。NRG1転写物は後期の時点で増加し、ノックダウンがインビボで維持されていないことを示している。H441異種移植モデルにおいて、NRG1ノックダウンの影響も調べられた。原発腫瘍増殖において最小限度の影響であったが自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積のLME適合解析として示された図6An=12/群の腫瘍増殖曲線、化学療法スクロースTDT=94日に対して、化学療法dox群TDT>150日、研究の終了までに到達せずにおける腫瘍の再発に著しい遅延があった図6B。インビボ研究でH441-shLucの腫瘍体積にはそのような差は認められなかった。Calu3異種移植モデルと同様に、H441モデルはまた、後半の時点でNRG1転写産物のレベルを増加を示した。NRG1レベルの回復の背後にあるメカニズムを調べるために、腫瘍細胞をレンチウイルスで形質導入した遺伝子の発現について分析した。shRNAで細胞を形質導入するために使用されるレンチウイルスはまた、dsRedマーカー遺伝子を含んでいるので、初期および後期の時点でのdsRed陽性腫瘍細胞の割合が、フローサイトメトリーによって比較された。レンチウイルス遺伝子発現のインビボでの損失が、早期5日及び後期の時点>100日での腫瘍について、レンチウイルスのdsRed導入遺伝子を発現する腫瘍細胞ヒト特異的ESA陽性の割合を調べるFACS解析により評価された。初期の時点でマウスはスクロース又はdoxを投与され、後期の時点でマウスは化学療法スクロースまたは化学療法doxを投与された。スクロースおよびdoxで処置した腫瘍の両方において、後期の時点でのdsRed陽性細胞の割合が有意な減少が観察され、その減少はdox処置腫瘍について著しく大きかった1.8倍対4.1倍、p=0.007。これは、ウイルス導入遺伝子発現の損失が、NRG1レベルの回復と相関していることを示唆している。Calu3及びH441両方の細胞がHER3タンパク質レベルの増大を示しており、腫瘍再発におけるNRG1の役割が受容体の過剰発現を伴う腫瘍に特異的であるかどうかの質問を提起している。この問題に対処するために、HER3のはるかに低いレベルを持っているH1299異種移植モデルが用いられた。NRG1単独のノックダウンは、H441モデルに類似して、原発腫瘍増殖へのわずかな影響があった。対照的に、H1299腫瘍の非常に高悪性な増殖にもかかわらず、NRG1ノックダウンは化学療法への応答の増強をもたらし、化学療法スクロースTDT=11.5日n=12/群に対して化学療法dox群TDT=30.45日において腫瘍再発の有意な遅延を生じた。更に、NRG1に対して異なるshRNAを発現するH1299の安定な亜系統が生成され、NRG1のmRNAレベルにおいてより穏やかな減少を生じた。H1299-shNRG1.2を用いたインビボ研究においても、NRG1ノックダウン時の化学療法への応答の増強が示された。しかし、増殖阻害の程度は、このモデルではより小さく、NRG1ノックダウンの小さな程度と一致している。インビトロ研究におけるH1299-shLucの化学療法を伴うか又は伴わないスクロース及びdoc処置群間の腫瘍体積において、差は認められなかった。shRNA媒介ノックダウンによるNRG1自己分泌シグナル伝達の阻害は、原発腫瘍増殖に控えめから中程度の影響のみを与えたが、化学療法後の腫瘍再発の大幅な遅延を与えた。異種移植モデルにおいてNRG1の長期的なノックダウンを維持することができないにもかかわらず、我々は、NRG1ノックダウンによって腫瘍再発の有意な遅延を観察した。これらの知見は、原発腫瘍の増殖を調節する鍵となる経路の違い、及び化学療法抵抗性、及び再発があることを示唆している。実施例7-リガンドトラップを使用するNRG1シグナル伝達の阻害は腫瘍の再発を遅延するLSL-K-rasG12D;p53Fl/マウスモデルにおける化学療法後に再発を促進する上でNRG1シグナル伝達の役割をテストするために、NRG1を隔離し、インビボでの受容体へのその結合を防止するために、リガンド-トラップアプローチを採用した。マウスIgG2AのFcに融合したヒトHER4細胞外ドメインの融合HER4-ECDが生成された。HER4はNRG1の高親和性結合を示している。HER4-ECDが、インビトロで血清飢餓LKPH1とLKPH2細胞に添加した場合、NRG1/HER3シグナル伝達の阻害は、減少したP-HER3レベルにより示されるように観察された。したがって、インビトロで、分子は、自己分泌媒介NRG1シグナル伝達を妨害するにおいて期待されるように振る舞った。肺腫瘍を有するLSL-K-rasG12D;p53Fl/マウスは、研究の開始時0日目にX線マイクロコンピュータ断層撮影マイクロCTにより撮像され、等しい開始腫瘍量の三つのグループに分けて、次のように扱われた:1PBSコントロールのIgG2A、2シスプラチンコントロールのIgG2A、及び3シスプラチンHER4-ECD。マウスは、腫瘍量の変化を測定するために、縦のマイクロCTスキャンを受けた。平均腫瘍量の分析図8Aグラフは、平均腫瘍体積/-SEM、ブタクサ、コントロールマウスIgG2a抗体を表わす、および腫瘍増殖率図8Bグラフは95信頼区間を用いた治療レジメンによる腫瘍量におけるで毎日の倍率変化を示すは、シスプラチン単独でなくシスプラチンHER4-ECDの併用のみで、腫瘍増殖の有意な阻害をもたらしたことが明らかになった。シスプラチンを投与したマウスでは、化学療法後の最初のマイクロCTスキャンで腫瘍増殖の静止状態を示したが、研究の終了時の平均収容量と全体的な腫瘍増殖速度は、ビヒクルおよびシスプラチン処置群との間に有意差は認められなかった図8AーB。第二の研究が、上記のように、LSL-K-rasG12D;p53Fl/Flマウスで実施された。しかし、この研究では、上記のグループに加えてHER4-ECD単剤群が含まれた。28日目のマイクロCTによる腫瘍量の分析は、シスプラチンビヒクル処置したマウスおよび他のすべてのグループに比べて、シスプラチンHER4-ECDで処置したマウスにおける腫瘍量の有意な減少を明らかにした。これとは対照的に、腫瘍増殖においてHER4-ECD処置単独では効果が無く、化学療法及び/又は腫瘍の再増殖におけるNRG1自己分泌シグナル伝達の固有の役割を更に支持している。この研究では、LSL-KrasG12D;p53Fl/Flマウスが、ビヒクルコントロールIgGn=10で、シスプラチンコントロールIgGn=11と、シスプラチンHER4-ECDn=8又はビヒクルHER4-ECDn=7で処置された。図8C中のグラフは、ベースライン±SEMからの腫瘍量の平均変更率を表している。Dunnettの多重比較検定が、ビヒクルコントロールのp=0.0016に対して処置群のすべてを比較するために利用された。組合せ活性は、その単独療法p<0.05、P<0.01に対して対応のないt-検定を用いて評価した。実施例8-NSCLCにおけるNRG1受容体どのHER受容体が、NSCLCのNRG1自己分泌性シグナル伝達で使用されているかを理解するために、我々はHER3及びHER4のノックダウンの影響を評価した。Calu3NSCLCモデルは、他の細胞株と比較して、すべてのHERファミリー受容体を高レベルで発現した。安定したdox誘導性shHER3Calu3-shHER3とshHER4Calu3-shHER4Calu3細胞亜系統、並びにルシフェラーゼにdox誘導性shRNAを運ぶコントロール細胞株が生成された。qPCRのによって測定されるようにHER3およびHER4転写レベルは、dox2μg/mlのの存在下でCalu3-shHER3とCalu3-shHER4のそれぞれにおいて減少し、ウェスタンブロット法による測定でタンパク質量の減少をもたらした。興味深いことには、doxの存在下でCalu3-shHER3で観察されたp-AKTのダウンレギュレーションの程度はCalu3-shHER4に見られるはるかに大きく、HER3がCalu3モデルでNRG1自己分泌シグナル伝達を仲介する優勢な受容体であることを示唆している。インビボでこの役割を確かめるために、スクロース又はdoxの何れかで処置されたCalu3-shHER4異種移植モデルを用いた研究が実施された。Calu3-shHER3またはCalu3-shHer4異種移植腫瘍が樹立されたマウスは、それらの飲料水中に、適宜、ビヒクルスクロース又はdox2mg/Lが投与されたn=14/群。doxの処置を受けたマウスTDT=19日で、スクロース処置を受けたものTDT=11日に比べて、Calu3-shHER3腫瘍成長の実質的な阻害があった。しかし、インビボ研究において、Calu3-shHER4における腫瘍増殖の顕著な阻害は無かった。インビトロでの受容体解析及びインビボ研究は、高いHER4レベルにもかかわらず、NRG1自己分泌性シグナリングは、このモデルで主にHER3を通して起こることを示している。NRG1自己分泌性シグナル伝達は、HER4高レベルを発現するかHER3を検出できないH522ヒトNSCLC細胞株において評価された。H522-shNRG1亜系統が生成された。血清飢餓H522-shNRG1細胞へのdoxの投与は、ホスホ-HER4およびホスホ-S6のレベルの低下をもたらす。差はH522-shLucコントロール細胞では観察されず、siRNAを介したニノックダウンが各HERファミリーの必要性を試験するために用いられた。HER4のノックダウンのみで、細胞増殖の減少を生じ、他のHERファミリー受容体では無かった。これらのデータはNRG1自己分泌性シグナル伝達は、H522細胞におけるHER4を通して起こることを示唆している。従って、NSCLCにおけるNRG1自己分泌性シグナル伝達はHER3およびHER4両方によって媒介され得る。前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。参考文献1LungCancerPrinciplesandPracticeThirdedn2AgusDBetalTargetingligandactivatedErbB2signalinginhibitsbreastandprostatetumorgrowthCancercell21271373alMoustafaAEetalExpressionofP185erbB2P160erbB3P180erbB4andheregulinalphainhumannormalbronchialepithelialandlungcancercelllinesAnticancerRes194814864BaldiPandLongADABayesianframeworkfortheanalysisofmicroarrayexpressiondataregularizedttestandstatisticalinferencesofgenechangesBioinformatics175095195BaoSetalStemcelllikegliomacellspromotetumorangiogenesisthroughvascularendothelialgrowthfactorCancerresearch66784378486BrennanSKandMatsuiWCancerstemcellscontroversiesinmultiplemyelomaJournalofmolecularmedicine87107910857CareyKDetalKineticanalysisofepidermalgrowthfactorreceptorsomaticmutantproteinsshowsincreasedsensitivitytotheepidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitorerlotinibCancerresearch66816381718CostelloRTetalHumanacutemyeloidleukemiaCD34CD38progenitorcellshavedecreasedsensitivitytochemotherapyandFasinducedapoptosisreducedimmunogenicityandimpaireddendriticcelltransformationcapacitiesCancerresearch60440344119DahabrehIJetalSomaticEGFRmutationandgenecopygainaspredictivebiomarkersforresponsetotyrosinekinaseinhibitorsinnonsmallcelllungcancerClinCancerRes1629130310DeanMFojoTandBatesSTumourstemcellsanddrugresistanceNaturereviews527528411DingLetalSomaticmutationsaffectkeypathwaysinlungadenocarcinomaNature4551069107512DoebeleRCetalNewstrategiestoovercomelimitationsofreversibleEGFRtyrosinekinaseinhibitortherapyinnonsmallcelllungcancerLungCancer6911213DyllaSJetalColorectalcancerstemcellsareenrichedinxenogeneictumorsfollowingchemotherapyPloSone3e242814GoffinJetalFirstlinesystemicchemotherapyinthetreatmentofadvancednonsmallcelllungcancerasystematicreviewJThoracOncol526027415GollamudiMetalAutocrineactivationofErbB2ErbB3receptorcomplexbyNRG1innonsmallcelllungcancercelllinesLungCancer4313514316GrayDCetalpHUSHasinglevectorsystemforconditionalgeneexpressionBMCBiotechnol76117HirschFRetalCombinationofEGFRgenecopynumberandproteinexpressionpredictsoutcomeforadvancednonsmallcelllungcancerpatientstreatedwithgefitinibAnnOncol1875276018HolmesWEetalIdentificationofheregulinaspecificactivatorofp185erbB2ScienceHornerMJetalSEERCancerStatisticsReview19752006In20JacksonELetalAnalysisoflungtumorinitiationandprogressionusingconditionalexpressionofoncogenicKrasGenesDev153243324821JohnsonBEandJannePARationaleforaphaseIItrialofpertuzumabaHER2dimerizationinhibitorinpatientswithnonsmallcelllungcancerClinCancerRes124436s4440s22JunttilaTTetalLigandindependentHER2HER3PI3KcomplexisdisruptedbytrastuzumabandiseffectivelyinhibitedbythePI3KinhibitorGDC0941Cancercell1542944023KosakaTetalMutationsoftheepidermalgrowthfactorreceptorgeneinlungcancerbiologicalandclinicalimplicationsCancerresearch648919892324KuyamaSetalImpactofHER2geneandproteinstatusonthetreatmentoutcomeofcisplatinbasedchemoradiotherapyforlocallyadvancednonsmallcelllungcancerJThoracOncol347748225LiQetalDevelopmentofanautocrineneuregulinsignalingloopwithmalignanttransformationofhumanbreastepithelialcellsCancerresearch647078708526LiuLZetalAKT1amplificationregulatescisplatinresistanceinhumanlungcancercellsthroughthemammaliantargetofrapamycinp70S6K1pathwayCancerresearch676325633227LynchTJetalActivatingmutationsintheepidermalgrowthfactorreceptorunderlyingresponsivenessofnonsmallcelllungcancertogefitinibNEnglJMed3502129213928MarchettiAetalEGFRmutationsinnonsmallcelllungcanceranalysisofalargeseriesofcasesanddevelopmentofarapidandsensitivemethodfordiagnosticscreeningwithpotentialimplicationsonpharmacologictreatmentJClinOncol2385786529MatsuiWetalCharacterizationofclonogenicmultiplemyelomacellsBlood1032332233630NovakAetalZEGadoublereportermouselinethatexpressesenhancedgreenfluorescentproteinuponCremediatedexcisionGenesis2814715531OliverTGetalChroniccisplatintreatmentpromotesenhanceddamagerepairandtumorprogressioninamousemodeloflungcancerGenesDev2483785232PaezJGetalEGFRmutationsinlungcancercorrelationwithclinicalresponsetogefitinibtherapySciencePaoWetalAcquiredresistanceoflungadenocarcinomastogefitiniborerlotinibisassociatedwithasecondmutationintheEGFRkinasedomainPLoSMed2e7334PatelNVetalNeuregulin1andhumanepidermalgrowthfactorreceptors2and3playaroleinhumanlungdevelopmentinvitroAmericanjournalofrespiratorycellandmolecularbiology2243244035PhillipsTMetalTheresponseofCD24CD44breastcancerinitiatingcellstoradiationJournaloftheNationalCancerInstitute981777178536ReissmannPTetalAmplificationandoverexpressionofthecyclinD1andepidermalgrowthfactorreceptorgenesinnonsmallcelllungcancerLungCancerStudyGroupJCancerResClinOncol125617037SchaeferGetalGammaheregulinanovelheregulinisoformthatisanautocrinegrowthfactorforthehumanbreastcancercelllineMDAMB175Oncogene151385139438ShengQetalAnActivatedErbB3NRG1AutocrineLoopSupportsInVivoProliferationinOvarianCancerCellsCancercell1729831039ShiDetalOverexpressionofthecerbB2neuencodedp185proteininprimarylungcancerMolCarcinog521321840ShigematsuHLinLetalClinicalandbiologicalfeaturesassociatedwithepidermalgrowthfactorreceptorgenemutationsinlungcancersJournaloftheNationalCancerInstitute9733934641SinghMLimaetalAssessingtherapeuticresponsesinKrasmutantcancersusinggeneticallyengineeredmousemodelsNatBiotechnol2858559342SinnbergTetalInhibitionofPI3KAKTmTORsignalingsensitizesmelanomacellstocisplatinandtemozolomideJInvestDermatol1291500151543StoreyJDandTibshiraniRStatisticalsignificanceforgenomewidestudiesProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica1009440944544TzaharEetalErbB3andErbB4functionastherespectivelowandhighaffinityreceptorsofallNeudifferentiationfactorheregulinisoformsJBiolChem269252262523345WeinerDBetalExpressionoftheneugeneencodedproteininhumannonsmallcellcarcinomasofthelungCancerresearch5042142546YardenYandPelesEBiochemicalanalysisoftheligandfortheneuoncogenicreceptorBiochemistry303543355047YusteLetalActivationofErbB2byoverexpressionorbytransmembraneneuregulinresultsindifferentialsignalingandsensitivitytoherceptinCancerresearch656801681048ZhouBBetalTargetingADAMmediatedligandcleavagetoinhibitHER3andEGFRpathwaysinnonsmallcelllungcancerCancercell103950"