細胞外刺激により外因性Creリコンビナーゼ遺伝子の発現が誘導され、発現されたCreリコンビナーゼにより外因性AID遺伝子の向きを反転させることにより、AID発現を誘導することおよび停止させることが可能な非ヒト脊椎動物B細胞であって、以下の特徴:1内因性のAID遺伝子が機能的に破壊されており、内因性AID遺伝子発現によるAIDタンパク質は産生されないこと、2互いに逆方向の2つのloxP配列で挟まれた外因性のAID遺伝子、および該2つのloxP配列で挟まれた領域の上流側に存在する該動物細胞で機能し得るプロモーターを有し、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して順方向に配置されている場合には、該プロモーターによるAID遺伝子の発現が可能であり、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して逆方向に配置されている場合には、AID遺伝子の発現は停止すること、および3Creリコンビナーゼ遺伝子が、細胞外刺激によりCreリコンビナーゼ活性化が可能な形で導入されており、Creリコンビナーゼ活性化により、上記外因性AID遺伝子を含む2つのloxP配列に挟まれた領域の方向が反転すること、を有する上記B細胞の抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置換することを含む、ヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。非ヒト脊椎動物B細胞のCreリコンビナーゼ遺伝子は、Creリコンビナーゼがエストロゲンレセプターとの融合タンパク質を発現するような形で存在し、上記細胞外刺激がエストロゲンまたはその誘導体による刺激であり、細胞を細胞外からエストロゲンまたはその誘導体で刺激することにより、細胞内でCreリコンビナーゼの活性化が誘導される、請求項1記載のヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。非ヒト脊椎動物B細胞の抗体遺伝子の定常部のみをヒト抗体遺伝子の定常部に置換する、請求項1又は2に記載のヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。重鎖については定常部をコードするエキソンのうちCH1領域から分泌エキソンまでの領域をヒト由来IgG抗体重鎖定常領域と置換し、軽鎖については定常部エキソンのみをヒト由来κ軽鎖定常領域遺伝子と置換する、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。ヒト型抗体を産生するB細胞が定常部遺伝子の上流に存在するイントロンに含まれるスプライシング受容体配列及びスプライシングブランチポイント配列としてヒト抗体遺伝子由来のものを含み、定常部遺伝子の下流にあるポリA付加配列として非ヒト脊椎動物B細胞のものを含み、さらにスプライシング配列を含むヒト定常部遺伝子の上流にloxP配列で挟まれた薬剤耐性遺伝子を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載のヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。非ヒト脊椎動物B細胞の抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子への置換が前記B細胞の抗体遺伝子をターゲットとするターゲティングベクターを用いて行われる、請求項1~5のいずれか1項に記載のヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。非ヒト脊椎動物B細胞がニワトリB細胞株DT40細胞に由来する細胞である、請求項1~6のいずれか1項に記載のヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。非ヒト脊椎動物B細胞がニワトリB細胞株DT40SW細胞である、請求項7記載のヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。請求項1~8のいずれか1項に記載の作製方法により得られた、ヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来B細胞。請求項9記載のヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来B細胞において、Creリコンビナーゼ遺伝子を活性化させ培養を行い抗体可変部遺伝子に変異を導入することを含む、ヒト型抗体変異ライブラリーを作成する方法。ヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来B細胞において、Creリコンビナーゼがエストロゲンレセプターとの融合タンパク質を発現するような形で存在し、細胞を細胞外からエストロゲンまたはその誘導体で刺激することにより、細胞内でCreリコンビナーゼの活性化が誘導され、抗体可変部遺伝子に変異を導入する、請求項10記載のヒト型抗体変異ライブラリーを作成する方法。本発明は、ヒト型抗体を産生する、自発的変異導入能力を有するB細胞の作製方法の提供を目的とする。本発明者らは、上記のDT40SWから得られる抗体は、ニワトリIgM抗体であるため、DT40SWを用いた抗体作製システムによりヒトIgG1型抗体を得ることが可能になれば、医薬開発において非常に有用な技術となると考えた。上述のように医薬応用に向けた抗体探索にはヒト抗体あるいはヒト型化抗体の作製が必要である。上記の~のヒト抗体およびヒト型化抗体取得技術は広く用いられているが、潜在的に以下のような問題点がある。例えば、は候補抗体の作製がマウスへの免疫に依存するハイブリドーマ法によるため免疫寛容の問題があること、ファージディスプレーを用いるは得られた抗体を完全抗体に改変する必要があること、は多くの遺伝子組換え操作が必要で多数の候補抗体を扱う場合煩雑なることなどである。また、いったん取得した抗体の親和性や特異性を改良することはDT40SWシステム以外の従来技術では容易ではない。DT40などの変異能力を有する細胞株は、本来保持する抗体遺伝子に変異を導入してライブラリーとして用いられてきたCumbersSJetalNatBiotechnol2011291134SeoHetalNatBiotechnol23731735TodoKetalJBiosciBioeng102478481。DT40を用いた抗体作製では免疫寛容は問題とならないが、得られた抗体はすべてニワトリIgM抗体であるため、現状では上記のの技術の応用が必要である。DT40SWシステムを他の従来技術を比較した時、多くの優位性がDT40システムに見いだされることから、ヒト抗体産生型に改変したDT40SWシステムの開発の重要性は明らかである。本発明者らは、上記の問題を解決するには、抗体作製システムが以下の~の特徴を備えていることが重要であると考えた。免疫寛容を回避できるinvitro技術である。抗体可変部遺伝子に変異が効率よく導入される。抗体遺伝子が細胞表面に提示発現される。抗体遺伝子が培地上清に分泌発現される。上記の及びは、有用な抗体を含む抗体ライブラリーの作製のために重要であり、及びは目的の抗体を産生する細胞をスクリーニングするために重要である。そのため、DT40細胞の特徴の一つである高頻度に起こる相同組換えを用いてニワトリ抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置換することにより、DT40SW細胞をヒト型抗体産生型に変換する方法に思い至った。特に本発明では、DT40細胞の変異能力を有効に活用して有用な抗体ライブラリーを作製するために、変異導入される可変部領域をニワトリのままにし、定常部をヒト型に置換することが有効であると考えた図4A。この場合、産生される抗体は、ニワトリヒトキメラ抗体であるが、定常部はヒト由来であることから医薬候補探索のための様々な試験に直接使用可能であり、候補探索の迅速化が可能となる図4B。産生されるヒト型抗体は、生体内で重鎖定常部を介した様々なエフェクター機能が期待できるIgG1であることが好ましいことから、今回、ヒトIgG1産生型DT40SWを樹立することとした。また、軽鎖定常部は、ヒト体内で最も存在量の多いκ鎖を用いることとした。抗体遺伝子は、プロモーター下流に小胞体へのターゲティングに必要なシグナルを含むリーダーペプチドをコードするエキソン、可変部をコードするエキソン、および定常部をコードするエキソンから構成される図4A。重鎖の場合は、定常部は複数のエキソンから構成され、抗体が分泌型あるいは膜結合型として発現されるかは使用するエキソンの違いによって決定される。したがって、上記~のような特徴を備えた細胞を構築するためには、重鎖については定常部をコードするエキソンのうちCH1から分泌エキソンまでの領域をヒト由来IgG1抗体重鎖定常部遺伝子と置換し、軽鎖については定常部エキソンのみをヒト由来κ軽鎖定常部遺伝子と置換することが、最も効率的な方法であるとの着想に至った。その際、可変部遺伝子と定常部遺伝子の間にあるイントロンには、変異導入に重要な領域があると考えられているため、この領域を改変除去することなく定常部の置換をすることが重要であると考えた。するDT40SWを作製するためには、ニワトリ抗体遺伝子の単離と構造解析、ニワトリ抗体遺伝子の定常部エキソンを置換するターゲティングベクターの構築が必要である。ゲノム解析の進展により、軽鎖抗体遺伝子領域は塩基配列が明らかになっていたが、重鎖については部分的な情報しか無く、未知領域を単離し、その配列の一部を明らかにした。明らかにした情報を基に重鎖および軽鎖抗体定常部遺伝子の置換のためのターゲティングベクターを作製しこれらのベクターを用いてキメラ抗体を産生する細胞の樹立に成功した。この細胞は、キメラ抗体を細胞表面および培養上清中に発現した。抗体可変部への変異導入を試みたところ、野生型DT40SWが内在性の抗体遺伝子に変異導入する場合と同等の効率で変異導入することに成功し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。1細胞外刺激により外因性Creリコンビナーゼ遺伝子の発現が誘導され、発現されたCreリコンビナーゼにより外因性AID遺伝子の向きを反転させることにより、AID発現を誘導することおよび停止させることが可能な非ヒト脊椎動物B細胞であって、以下の特徴:1内因性のAID遺伝子が機能的に破壊されており、内因性AID遺伝子発現によるAIDタンパク質は産生されないこと、2互いに逆方向の2つのloxP配列で挟まれた外因性のAID遺伝子、および該2つのloxP配列で挟まれた領域の上流側に存在する該動物細胞で機能し得るプロモーターを有し、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して順方向に配置されている場合には、該プロモーターによるAID遺伝子の発現が可能であり、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して逆方向に配置されている場合には、AID遺伝子の発現は停止すること、および3Creリコンビナーゼ遺伝子が、細胞外刺激によりCreリコンビナーゼ活性化が可能な形で導入されており、Creリコンビナーゼ活性化により、上記外因性AID遺伝子を含む2つのloxP配列に挟まれた領域の方向が反転すること、を有する上記B細胞の抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置換することを含む、ヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。2非ヒト脊椎動物B細胞のCreリコンビナーゼ遺伝子は、Creリコンビナーゼがエストロゲンレセプターとの融合タンパク質を発現するような形で存在し、上記細胞外刺激がエストロゲンまたはその誘導体による刺激であり、細胞を細胞外からエストロゲンまたはその誘導体で刺激することにより、細胞内でCreリコンビナーゼの活性化が誘導される、1のヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。3非ヒト脊椎動物B細胞の抗体遺伝子の定常部のみをヒト抗体遺伝子の定常部に置換する、1又は2のヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。4重鎖については定常部をコードするエキソンのうちCH1領域から分泌エキソンまでの領域をヒト由来IgG抗体重鎖定常領域と置換し、軽鎖については定常部エキソンのみをヒト由来κ軽鎖定常領域遺伝子と置換する、1~3のいずれかのヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。5ヒト型抗体を産生するB細胞が定常部遺伝子の上流に存在するイントロンに含まれるスプライシング受容体配列及びスプライシングブランチポイント配列としてヒト抗体遺伝子由来のものを含み、定常部遺伝子の下流にあるポリA付加配列として非ヒト脊椎動物B細胞のものを含み、さらにスプライシング配列を含むヒト定常部遺伝子の上流にloxP配列で挟まれた薬剤耐性遺伝子を含む、1~4のいずれかのヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。6非ヒト脊椎動物B細胞の抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子への置換が前記B細胞の抗体遺伝子をターゲットとするターゲティングベクターを用いて行われる、1~5のいずれかのヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。7非ヒト脊椎動物B細胞がニワトリB細胞株DT40細胞に由来する細胞である、1から6のいずれかのヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。8非ヒト脊椎動物B細胞がニワトリB細胞株DT40SW細胞である、7のヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法。91~8のいずれかの作製方法により得られた、ヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来B細胞。109のヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来B細胞において、Creリコンビナーゼ遺伝子を活性化させ培養を行い抗体可変部遺伝子に変異を導入することを含む、ヒト型抗体変異ライブラリーを作成する方法。11ヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来B細胞において、Creリコンビナーゼがエストロゲンレセプターとの融合タンパク質を発現するような形で存在し、細胞を細胞外からエストロゲンまたはその誘導体で刺激することにより、細胞内でCreリコンビナーゼの活性化が誘導され、抗体可変部遺伝子に変異を導入する、10のヒト型抗体変異ライブラリーを作成する方法。本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010258404号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。本発明では、DT40SW細胞を、ヒトIgG1型抗体を細胞表面に提示しかつ培養上清中にも分泌できるよう改良した。この細胞株DT40SWhgの抗体可変部遺伝子への変異能力は、すでに様々な抗原に対する抗体の作製に用いられているDT40SWよりも優れており、より優れた抗体ライブラリーの作製を可能にする。さらに、DT40SWhgは、DT40SWが備える有用な特徴:変異と発現を一細胞内で一体的に行えるので変異抗体の作製が簡便である、細胞表面に抗体を提示し、抗原への結合に基づいた目的抗体の選択が容易であり、変異と選択による目的抗体の高機能化が簡便である、変異機能は任意に停止、再開できることから有用な変異の固定や再変異による抗体の改変が可能である、をすべて保持しており、かつ、抗体として取り扱いやすいヒトIgG1型抗体を産生する。抗体Fc部分がヒトIgG1であることから、Fc部分を介した様々な免疫反応、例えば、抗体依存性細胞傷害や補体依存性細胞障害といった、医薬利用を目的として有用な抗体を探索する時、必ず評価しなければならない抗体の機能を、DT40SWhgの抗体ライブラリーから単離されたクローンから産生されるヒトIgG1型の完全型抗体を直接用いることで迅速に評価できる。本発明で作製した細胞株を使用した抗体作製システムは、従来のヒト型抗体作製法で問題となっていた様々な問題を回避できることから、癌などの難治性疾患の治療に役に立つ抗体の開発を迅速化する重要な基盤技術となる。本発明のヒト型抗体を産生するB細胞は非ヒト由来のB細胞を用いて以下のようにして作製する。本発明においてヒト型抗体を産生するB細胞を作製するための非ヒト由来のB細胞は、体細胞超変異に必須の役割を持つ酵素であるAIDactivationinducedcytidinedeaminaseを構成的、または誘導的に発現し、抗体の遺伝子に自発的な変異を導入する性質を有するものであれば、どのような細胞も用いることができる。由来動物種、細胞株種は限定されない。マウス、ヒツジ、ラット、ウサギ、ニワトリなどの脊椎動物のB細胞若しくはその細胞株又はそれらの変異株を用いることができる。好ましくはニワトリB細胞由来のDT40細胞株を用いる。DT40細胞株は、Bリンパ腫由来の細胞であり、第2染色体がトリソミーという特徴をもつ。DT40株としては、野生型DT40株又は本発明者らが独自に樹立したDT40SW株変異機能を司る遺伝子AIDの発現を可逆的にスイッチすることにより、その抗体変異機能をONOFF制御できる変異株詳細はKanayamaNTodoKRethMOhmoriHBiochemBiophysResCommn3277075及び特開2006109711号公報に記載されているを用いることができる。該B細胞は、細胞外刺激により外因性Creリコンビナーゼ遺伝子の発現が誘導され、発現されたCreリコンビナーゼにより外因性AID遺伝子の向きを反転させることにより、AID発現を誘導することおよび停止させることが可能な脊椎動物B細胞であって、以下の特徴:1内因性のAID遺伝子が機能的に破壊されており、内因性AID遺伝子発現によるAIDタンパク質は産生されないこと、2互いに逆方向の2つのloxP配列で挟まれた外因性のAID遺伝子、および該2つのloxP配列で挟まれた領域の上流側に存在する該動物細胞で機能し得るプロモーターを有し、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して順方向に配置されている場合には、該プロモーターによるAID遺伝子の発現が可能であり、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して逆方向に配置されている場合には、AID遺伝子の発現は停止すること、および3Creリコンビナーゼ遺伝子が、細胞外刺激によりCreリコンビナーゼ活性化が可能な形で導入されており、Creリコンビナーゼ活性化により、上記外因性AID遺伝子を含む2つのloxP配列に挟まれた領域の方向が反転すること、を有するB細胞である。該細胞を得るためには、まず、内因性のAID遺伝子を発現し得る任意の脊椎動物に由来する細胞の、内因性のAID遺伝子を機能的に破壊して内因性AID遺伝子の発現によるAIDタンパク質の産生が起こらないように細胞を改変するとよい。内因性AID遺伝子の両対立遺伝子の一方は、通常の手法にのっとりAID遺伝子ターゲティングベクターを作製して遺伝子破壊ノックアウトを行い、もう一方の対立遺伝子座には、Creリコンビナーゼによりその方向が反転し得るように構築された外因性のAIDをコードする遺伝子を含むDNA構築物を含有するAID遺伝子ターゲティングベクターを作製して、相同組換えを起こすことにより、内因性AID遺伝子は破壊され、外因性AID遺伝子の発現制御が可能な細胞を作製し得る。Creリコンビナーゼによりその方向が反転し得るように構築された外因性のAID遺伝子は、互いに逆方向の2つのloxP配列に挟まれている。さらに、この2つのloxP配列で挟まれた領域の上流側に、対象とする動物細胞において機能するプロモーターが存在し、相同組換えにより該プロモーターもゲノム上に挿入されるように、ターゲティングベクターを設計するとよい。このようにして、Creリコンビナーゼによりその方向が反転し得るように構築された外因性のAID遺伝子を細胞のゲノムに組込むことにより、該外因性AID遺伝子が上記プロモーターに対して順方向に配置されている場合は、該プロモーターによってAID遺伝子の発現が誘発される。言うまでもなく、該AID遺伝子が上記プロモーターに対して逆方向に配置された場合には、AID遺伝子の発現は起こらない。ここで用いる、適切なプロモーターは当業者であれば、様々なものを想到し得、適切なものを選択することができる。例えば、βアクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、CAGプロモーターが挙げられる。例えば、上記のCreリコンビナーゼ遺伝子は、Creリコンビナーゼがエストロゲンレセプターとの融合タンパク質を発現するような形で存在し、上記細胞外刺激がエストロゲンまたはその誘導体による刺激であり、細胞を細胞外からエストロゲンまたはその誘導体で刺激することにより、細胞内でCreリコンビナーゼの活性化が誘導される。エストロゲン誘導体刺激を細胞に与えると、Creリコンビナーゼの活性化が誘導される。したがって、細胞外からエストロゲン誘導体を作用させたときにのみ、Creリコンビナーゼが活性化しここで、上記融合タンパク質が核内に移行して、CreリコンビナーゼがloxP配列に作用し得ることを指す、AID遺伝子を含むloxP配列に挟まれた領域が反転される。また、上記2つのloxP配列に挟まれた領域内に、AID遺伝子と同じ向きのマーカー遺伝子をさらに含んでいてもよく、ここで、AID遺伝子が該プロモーターに対して順方向に配置されている場合には該マーカー遺伝子も順方向に配置されているため該マーカー遺伝子が発現して、AID遺伝子が該プロモーターに対して順方向に配置されてAID遺伝子が発現可能である細胞を該マーカーにより選択可能となる。さらに、上記2つのloxP配列に挟まれた領域内に、AID遺伝子とは逆向きのマーカー遺伝子をさらに含んでいてもよく、ここで、AID遺伝子が該プロモーターに対して逆方向に配置されている場合には該マーカー遺伝子は順方向に配置されているため該マーカー遺伝子が発現して、AID遺伝子が該プロモーターに対して逆方向に配置されてAID遺伝子を発現できない細胞を該マーカーにより選択可能となる。このようなB細胞は、特許第4487068号公報の記載に従って得ることができる。本発明のヒト型抗体を産生するB細胞を作製するには、上記の非ヒト由来B細胞の抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子で置換する。この際、非ヒト由来B細胞が有する抗体の定常部の遺伝子をヒト抗体定常部の遺伝子で置換すればよい。抗体遺伝子の置換は、相同組換えにより行うことができる。このためには、本発明のヒト型抗体産生細胞の作製に用いる非ヒトB細胞の動物種の抗体遺伝子を単離し、構造を解析し、該抗体遺伝子の定常部エキソンを置換するターゲティングベクターを構築する。次いで、このようにして構築したターゲティングベクターを用いて上記非ヒトB細胞の抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置換する。ヒト抗体定常部遺伝子の具体的な導入方法の概略は以下の通りである。以下の方法では、ニワトリDT40SWを用いる場合の方法を示す。ターゲティングベクター定常部遺伝子の上流約2kbpと下流2~5kbpを相同組換えに必要な領域として使用する。定常部遺伝子の上流のイントロンに含まれるスプライシング受容体配列およびスプライシングブランチポイント配列は、ヒト抗体遺伝子のものを使用する。定常部遺伝子の下流にあるポリA付加配列はニワトリ由来を使用する。loxP配列で挟まれた薬剤耐性遺伝子を、スプライシング配列を含むヒト定常部遺伝子の上流に配置する。キメラ抗体産生細胞の作製このターゲティングベクターが抗体定常部遺伝子に正しく導入されると、野生型の抗体遺伝子の構造は図6Bのように変化する。薬剤耐性遺伝子により抗体遺伝子を分断しているので抗体遺伝子は不活性化して抗体を産生することはできない。したがって、薬剤耐性に加えて細胞表面上の抗体産生の消失をフローサイトメトリーによって解析することによって、ターゲティングが目的どおりに起こった細胞の候補を絞り込むことが可能である。想定通りの組み込みが起こっているかどうかについては、PCRあるいはサザンブロットによるゲノム遺伝子の解析により確認することができる。この方法で用いるDT40SW細胞には、変異型エストロジェンレセプターとの融合タンパク質としてCreリコンビナーゼを発現させている。MerCreMerは、通常不活性型であるが、エストロジェンの誘導体の一つである4ヒドロキシタモキシフェンを培地中に添加することにより活性化させることができるZhangYetalNucleicAcidsRes24543548。したがって、ターゲティングベクターを導入していったん抗体産生を失った細胞に4OHTを作用させると、Creリコンビナーゼが活性化してloxP配列で挟まれた薬剤耐性遺伝子が除去され、図6Cのような抗体遺伝子構造に変化する。この構造では、再度、抗体遺伝子の発現が可能になるので導入されたニワトリ抗体可変部とヒト抗体定常部とのキメラ抗体の発現が期待できる。キメラ抗体を細胞表面に発現するようになった細胞は、フローサイトメトリーなどによって単離することが可能である。抗体は、重鎖と軽鎖から構成されるので、図6Dのように軽鎖→重鎖あるいは重鎖→軽鎖の順に段階的に遺伝子組換えを進めて、キメラ抗体産生細胞を作製する。外来抗体可変部遺伝子への変異導入ヒトIgG1κ定常部産生型DT40SWは、これまでに確立しているDT40SWを用いたinvitro抗体作製方法と同様の操作により抗体可変部遺伝子への変異導入が可能である。この細胞は初期状態では変異導入機構はOFFであるが、4OHTによる処理により変異をONにスイッチした細胞を作製できる。変異がONの細胞は緑色蛍光タンパク質を発現するのでフローサイトメトリーによるソーティングにより分離することができる。その後、培養を継続するだけで外来抗体可変部に変異が導入された細胞集団が生成する。この変異体ライブラリーから目的の特異性、親和性を有した抗体を産生する細胞を単離する。変異と選択を繰り返すことにより、取得抗体の親和性成熟も可能である。この方法では、細胞自身の保持する変異能力を使うことから、変異と選択の操作の連続化が容易である。取得された抗体の特性は、細胞の変異機能を4OHTによる処理によりOFFにすることにより可能である。以上のようにこの方法により、DT40の抗体変異機能を損なわずにヒトIgG1κ定常部とのキメラ抗体を発現するDT40SWを作製することができる。該細胞をDT40SEhgと呼ぶ。この細胞は従来のDT40SWと全く同様に抗体作製に使用することが可能であり、得られるヒトIgG1型抗体は、ヒト抗体定常部を介したエフェクター機能について様々な評価に直接使用できることから、医薬開発に向けた迅速な候補抗体の取得のための技術として極めて有用である。本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。Aニワトリ抗体軽鎖定常部遺伝子のヒト抗体κ鎖定常部遺伝子への置換1ヒトκ鎖定常部遺伝子ターゲティングベクターの構築図6に示した概略に沿って、ニワトリ軽鎖定常部をヒトκ鎖定常部に置換する方法を図7に示す。ターゲティングベクターの構築にあたって、上述の項目に加えて次の点に特に工夫した。遺伝子発現や変異導入に関わる因子であるmatrixattachmentregionや3’エンハンサーを改変削除しない様にターゲティングアームを設計した、ベクターに組み込むヒトκ鎖定常部遺伝子を含む断片にはヒトCκ上流部分のイントロンにスプライシングアクセプター配列およびブランチポイント配列もふくまれるようにした、ベクターに組み込むヒトCκ遺伝子断片にはポリA付加配列は含ませず、ニワトリ抗体軽鎖遺伝子上のポリA配列が使用されるようにした。以下に、ターゲティングベクターの構築手順を示す。ニワトリ軽鎖遺伝子は、すでにクローニングされており、ゲノム解析により周辺の塩基配列も明らかになっているInternationalChickenGenomeSequencingConsortiumNature432695716。ニワトリ抗体軽鎖可変部周辺の遺伝子断片を得るために、明らかになっている配列を基にしてプライマーをデザインし、PCRによって遺伝子断片を得た。DT40SWのゲノムDNAから定常部上流の5’側ターゲティングアームIgCL5’に用いる遺伝子断片を、プライマーIgLD511とcCL5Bam2およびKODPlusDNAポリメラーゼを用いてPCRによって増幅し、SpeIとBamHIで処理した後、pBluescriptIISKに組込んだ。同様にして、定常部下流の3’側ターゲティングアームに用いる遺伝子断片をプライマーcCL3HindIIIとcCL3Kpn2を用いて増幅し、HindIIIとKpnIで処理した後、pBluescriptIISK中のIgCL5’の下流に組込んだ。さらに、humanBurkittslymphoma細胞株DaudiのゲノムDNAから、hCkを含む遺伝子断片をプライマーhCk5BamとhCkHindIIIを用いて増幅し、BamHIとHindIIIで処理した後、IgCL5’とIgCL3’の間に挿入した。さらに、両端にloxP配列を持つBlasticidinS耐性遺伝子をhCkの直上部のBamHIサイトに組込んだ。2ヒトκ鎖定常部遺伝子ターゲティングベクターを組み込んだDT40SWの作製A-1で作製したヒトCκ遺伝子ターゲティングベクター15μgをNotIで切断して直鎖化し、1×107細胞のDT40SWと混合して500μlの懸濁液とし、4mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに添加して、550V、25μFの条件で電気穿孔を行った。エレクトロポレーション法にはGenePulserXcellを用いた。電気穿孔後、細胞を10mlの増殖培地PRMI1640、Invitrogen社;10ウシ胎児血清、Invitrogen社;1ニワトリ血清、Sigma社に懸濁して24時間培養後、10mlの2×選択培地を添加し、終濃度20μgmlの濃度のブラストサイジンSとして96穴プレート2枚に分注して10~14日間培養した。4回の試行でブラストサイジンSにより選択されたコロニーが139クローン得られた。コロニーを形成した細胞を、RphycoerythrinlabeledmouseantichickenIgMmAbで染色し、FACSCaliburで解析した。目的どおり、ターゲティングされた細胞は、抗体重鎖を発現できることが期待できることから、抗ニワトリIgM抗体で染色されない3クローンを選択した。遺伝子レベルでの確認をするために、これらの細胞からゲノムDNAを抽出し、ターゲティングベクターの組み込みを、ターゲティングベクターの外側領域に対するプライマーとベクターに特異的なプライマー、すなわち、上流領域ではプライマーLLF1とBSR2、下流領域ではHckF2とcCL3dn6を用いてPCRにより確認した。クローン2と3で目的どおりターゲティングされたことを示すPCR産物の特異的な増幅が見られた。このうちクローン2を以降の操作に用いた。3ヒトκ鎖定常部の発現クローン2について、以前に報告したように50nMの4OHTで処理することによって薬剤耐性遺伝子を除去した。薬剤耐性遺伝子が除去された細胞では、抗体の発現が回復していることが期待される。細胞表面の抗体の発現をmouseantichickenIgMmAbクローンM1あるいはクローンM4RikenCellBankおよびmouseantihumanIgklightchainBDBioscience社によって染色し、フローサイトメトリーで解析したところ、細胞表面のIgMとヒトκ鎖の両方を発現する細胞が出現していることが確認された図10A。FACSAriaを用いてヒトCκを高発現する細胞をsinglecellsortingしたところ、これらはニワトリIgMとヒトCκを細胞表面に高発現していた。また、培養液中にもニワトリμ鎖とヒトκ鎖が会合した抗体が分泌されていることがELISAによって確認され、確認したくクローンはすべて薬剤耐性を失っていた。これらのうち、代表的なクローンをDT40SWhkと命名し以降の検討をおこなった。DT40SWhkに組み込んだヒトCκ遺伝子の転写レベルの発現をRTPCRによって解析した。DT40SWhkの全RNAをTRIzolによって抽出し、SuperscriptII逆転写酵素とオリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、軽鎖の増幅のためにセンスプライマーとアンチセンスプライマーあるいはを用い、また、内部標準としてβアクチンの転写産物をプライマーactin3とactin4を用いて増幅した。その結果、DT40SWhkはニワトリ抗体軽鎖を発現せず、ニワトリ軽鎖可変部とヒトκ鎖定常部のキメラ転写産物を発現していることが確認された。また、増幅産物の配列解析を行ったところ、エキソンの結合は正常であり、抗体軽鎖タンパク質を目的どおりコードする転写産物であることが確認された。Bニワトリ抗体μ鎖遺伝子のヒト抗体γ1鎖遺伝子への置換1ヒトγ1鎖遺伝子ターゲティングベクターの構築図4に示した概略に沿って、ニワトリμ鎖遺伝子をヒトγ1鎖遺伝子に置換する方法を図12に示す。ターゲティングベクターの構築にあたって、次の点を工夫した。遺伝子発現や変異導入に関わる因子であるμエンハンサーを改変削除しないようにターゲティングアームを設計した、5’側のターゲティングアームは、定常部のすぐ上流には繰り返し配列の多いスイッチ領域があるためSμの上流領域に設定する、ニワトリCμ遺伝子のCH1、CH2、CH3、CH4、分泌型C末端エキソンを、ヒトCγ1遺伝子のうちCH1、ヒンジ、CH2、CH3、分泌型C末端エキソンと置換し、膜貫通ドメインエキソンはニワトリμ鎖遺伝子のものを残す、ヒトCγ1遺伝子断片にはCγ1上流部分のイントロンにスプライシングアクセプター配列およびブランチポイント配列もふくまれるようにする、ヒトCγ1遺伝子断片には分泌型C末端下流のポリA付加配列は含ませず、ニワトリCμの分泌型C末端下流のポリA配列が使用されるようにする。以下に、ターゲティングベクターの構築手順を示す。Sμの上流領域の5’側ターゲティングアームcIgH5’armに用いる遺伝子断片をえるために、Sμ付近の塩基配列accessionnoAB029075からプライマーJCFSac4とJCRBam2をデザインし、DT40SWのゲノムDNAからPCRによって増幅した。得られた遺伝子断片は、pCRBluntに組込み、塩基配列を確認した。3’側ターゲティングアームに用いるニワトリCμ遺伝子の分泌型C末端エキソンより下流の遺伝子情報は公開されていないため、ニワトリ分泌型IgMのmRNAの配列;accessionnoX01613からCH4ドメインに対するセンスプライマーcCmu4F1をデザインし、膜型IgMの膜貫通領域遺伝子の下流の3’UTRに対するプライマーmCmyu3’とともに用いてPCRによって遺伝子断片を増幅し、pCRBluntにクローニングしてTM1エキソンおよびTM2エキソンにコードされる膜貫通領域遺伝子および3’UTRの一部の配列を明らかにした。ニワトリ分泌型IgMの塩基配列と図14に示したTM1の配列を基にプライマーCH4F4とTM1R2をデザインし、これらを用いたPCRによってニワトリCμ遺伝子のCH4とTM1の間のゲノムDNAを用いて増幅した。この断片の増幅にはKODFXを用いた。得られた遺伝子断片をpCRBluntにクローニングし、5’側および3’側より部分配列を決定した。ヒトCγ1遺伝子断片は、humanBurkittslymphoma細胞株DaudiのゲノムDNAを鋳型としてプライマーhIgG1F1とhIgG1R1を用いて増幅し、pCRBluntにクローニングし、配列を確認した。cIgH3’armの上流のNotIサイトにhCγ1遺伝子を含むNotI断片を挿入し、cIgH3’armとhCγ1遺伝子を連結したBamHIEcoRI断片をpBluescriptIISKに挿入した。さらに、hCγ1の上流のSacIBamHI領域にcIgH5’armを挿入し、最後にcIgH5’armとhCγ1の間のBamHIにloxPで挟まれたブラストサイジン耐性遺伝子を挿入した。2ヒトγ1鎖遺伝子ターゲティングベクターを組み込んだDT40SWの作製B-1で作製したヒトCγ1遺伝子ターゲティングベクター15~40μgをNotIで切断して直鎖化し、1×107細胞のDT40SWと混合して500μlの懸濁液とし、4mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに添加して、550Vまたは700V、25μFの条件で電気穿孔を行った。エレクトロポレーション法にはGenePulserXcellを用いた。電気穿孔後、細胞を10mlの増殖培地に懸濁して24時間培養後、終濃度20μgmlの濃度のブラストサイジンSを含む増殖培地20mlに懸濁し、96穴プレート2枚に分注して10~14日間培養した。17回の試行でブラストサイジンSにより選択されたコロニーが207クローン得られた。目的どおりターゲティングされた細胞は、抗体重鎖を発現できなることが期待できることから、コロニーを形成した細胞をRPElabeledmouseantichickenIgMmAbクローンM1で染色し、FACSCaliburで解析した。その結果、抗ニワトリIgM抗体で染色されない1クローンを得た。遺伝子レベルでの確認をするために、これらの細胞からゲノムDNAを抽出し、ターゲティングベクターの組み込みを、ターゲティングベクターの外側領域に対するプライマーとベクターに特異的なプライマー、すなわち、上流領域ではプライマーJCF5とBSR3、下流領域ではhIgGF5とTM1R4を用いてPCRにより確認した。sIgであるクローンD2では目的どおりターゲティングされたことを示すPCR産物の特異的な増幅が見られた。今回の試行では、目的の細胞の取得効率が極めて悪いが、その後のトランスフェクション法の条件の最適化によって効率的な細胞株樹立法を確立している。3ヒトIgG1型抗体の発現クローンD2を50nMの4OHTで処理することによって薬剤耐性遺伝子を除去した。剤耐性遺伝子が除去された細胞では、抗体の発現が回復していることが期待される。細胞表面の抗体の発現をbiotin化mouseantihumanIgG1mAbおよびPECyTM5Streptavidinによって染色し、フローサイトメトリーで解析したところ、細胞表面のヒトIgG1を発現する細胞が出現していることが確認された図17A。FACSAriaを用いてヒトIgG1を高発現する細胞をsinglecellsortingし、得られたコロニーのフローサイトメトリー解析でヒトIgG1とヒトκ鎖を高発現する3クローンを選択した。これらのクローンが薬剤耐性遺伝子を失っていることをPCRで確認し、これらのクローンの培養上清中の抗体分泌をELISAによって検討した。500倍希釈したgoatantihumanIgGFcを96ウェルプレートGreiner社上に結合させ、系列希釈してプレート上に結合させたサンプル上清中のヒトIgG1型抗体を500倍希釈したperoxidaseconjugatedgoatantihumanIgGFcを用いて検出したところ、3クローンとも同等の分泌量が認められ、この方法により作成されたヒトIgG1型抗体産生型DT40が、膜型および分泌型抗体の両方の発現が可能であることが示された。これらのうち、代表的なクローン25をDT40SWhgと命名し詳細な検討をおこなった。DT40SWhgの増殖能力をDT40SWと比較したところ、同等の増殖を示した。すなわち、ヒト型抗体の発現は、変異をONにして長期に培養した場合も変異導入に重要な増殖過程には影響がないことが確認された。DT40SWhgに組み込んだヒトCγ1遺伝子およびヒトCκ遺伝子の転写レベルの発現をRTPCRによって解析した。DT40SWhgの全RNAをTRIzolによって抽出し、SuperscriptII逆転写酵素とオリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、軽鎖はセンスプライマーCLL5BamとアンチセンスプライマーcCMUCLARあるいはhckRT2を用いて増幅し、重鎖はセンスプライマーChickenLH5EcoとアンチセンスプライマーcCmu2RまたはhCg11Rを用いて増幅した。その結果、DT40SWhgはニワトリ抗体を発現せず、ニワトリ抗体可変部とヒト抗体定常部のキメラ転写産物を発現していることが確認された。DT40SWhgに組み込んだヒトCγ1遺伝子およびヒトCκ遺伝子の発現を、細胞表面および細胞内のタンパク質レベルで確認するためにWesternblotを行った。回収した細胞をPBSで洗浄し01TritonX100および1100体積のProteaseinhibitornacalaitesque社を加えたPBSで5×106cells200μlの割合で細胞を懸濁し、15秒vortexした後、30min、oniceで静置した。この間、10min毎に撹拌した。12000rpm、10min遠心分離後、上清を回収し、無細胞抽出液とした。無細胞抽出液のタンパク質濃度をBCAProteinAssayKitで決定し、50μgまたは150μgの無細胞抽出液を125SDSPAGEにて分離した。分離したタンパク質は、polyvinylidenefluoride膜に転写して各抗体と反応させた後、ECLAdvanceWesternBlottingDetectionKitを用いて検出した。化学発光は、ChemiDocXRSsystemでデータを取り込んだ。抗体は、ヒトIgGFcの検出には5000倍希釈したperoxidaselabeledgoatantihumanIgGFc、ヒトκ鎖の検出には200倍希釈したbiotin化mouseantihumanIgklightchainと100000倍希釈したstreptavidinHRPConjugate、ニワトリIgMの検出には10000倍希釈したperoxidaseconjugatedgoatantichickenIgMを用いた。その結果、DT40SWhgは、約55kDaのヒトIgG1Fcを含む重鎖と約25kDaのヒトCκを含む軽鎖を発現しており、ニワトリIgMは発現していないことが示された。アミノ酸配列から推定されるニワトリヒトキメラ抗体の重鎖の分子量は56kDa、軽鎖鎖は28kDaで、ほぼ予測通りの分子量のタンパク質の発現が確認された。さらに、DT40SWhgからのヒトIgG1型抗体の分泌をFc部分に対する抗体を用いたELISAで確認しただけでなく、ヒトγ1鎖とヒトκ鎖の会合もそれぞれの特異的抗体を用いてELISAで調査した。ヒトγ1鎖とヒトκ鎖の会合は、goatantihumanIgGFc500倍希釈、Biotin化mouseantihumanIgkLightChain、StreptavidinHRPConjugateを用いて検出し、ニワトリIgMはgoatantichickenIgMとperoxidaseconjugatedgoatantichickenIgMを用いて検出した。系列希釈した培養上清を用いて分泌抗体の解析を行ったところ、DT40SWhgはニワトリIgMを分泌せず図21C、ヒトIgG1型抗体のみを分泌し、分泌された抗体はヒトγ1鎖とヒトκ鎖が会合した状態であることが確認された。すなわち、DT40SWhgは、ニワトリ抗体可変部とヒト抗体定常部のキメラ重鎖とキメラ軽鎖が安定に会合したキメラ抗体を、細胞表面と培養上清に発現可能な有用な細胞株であることが示された。CヒトIgG1型抗体産生DT40SWDT40SWhgにおける抗体可変部への変異導入DT40SWhgの変異機構を以前に報告済みの方法によりONにして抗体可変部への変異導入を解析した。4OHTによって細胞を処理後、GFPの細胞、すなわち、変異導入に必須のAIDの発現がONになった細胞を、FACSAriaを用いたフローサイトメトリーによって単一細胞として単離し、独立した2クローンを5mlスケールで5×105cells以上かつovergrowthしない状態で維持して41日間培養した。培養した細胞からゲノムDNAを単離し、重鎖可変部はプライマーCVH1F2およびCJH1R2を用いて、軽鎖可変部はプライマーCVLF61およびCVLR31を用いてPCRによって増幅し、pCRBluntベクターにクローニングした。プラスミドDNAは、HighPurePlasmidIsolationKitを用いて抽出し、ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKitを用いてSequence反応をおこない、ABIPRISM310GeneticAnalyzerを用いて塩基配列を解析した。41日間培養後のサンプルの塩基配列を、変異をONにする前の元の塩基配列と比較したところ、DT40SWhgの抗体可変部遺伝子には重鎖および軽鎖の両方においてオリジナル株であるDT40SWと比べて多数の変異が導入されていた。DT40SWhgは、塩基あたりの変異導入効率においても解析クローンに占める変異を有するクローンの割合においてもDT40SWと比べて高い頻度での変異導入が認められ、抗体ライブラリーを作製するのに十分な変異能力を備えていることが示唆された。また、可変部遺伝子に導入された変異の分布をみると、様々な部位に変異が導入されていた。すなわち、これらの結果は、DT40SWhgの変異能力をONにして一定期間培養することにより、任意の抗原に対する抗体が含まれた抗体ライブラリーを形成可能であることが示唆しており、DT40SWhgが抗体作製において有用な細胞株であること保証するものである。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。