4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumに導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、バチラスサブチリスBacillussubtilis、バチラスアトロファエウスBacillusatrophaeus、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイBacillussubtilissubspspizizenii、シトロバクターコセリCitrobacterkoseri、エンテロバクターアエロゲネスEnterobacteraerogenes、エンテロバクタークロアカエEnterobactercloacae、エンテロバクターホルメシェイEnterobacterhormaechei、エンテロバクターサカザキEnterobactersakazakii、エシェリヒアコリEscherichiacoli、エシェリヒアフェルグソニーEscherichiafergusonii、パエニバチラスポリミキサPaenibacilluspolymyxa、又はパントエアアナナティスPantoeaananatis由来の遺伝子である請求項1に記載の形質転換体。4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の又はのDNAである請求項1に記載の形質転換体。配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列からなるDNAの何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、その染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項1~3の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、その染色体上に存在する4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項1~4の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869である請求項1~3の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項1~3の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項1~3の何れかに記載の形質転換体。コリネバクテリウムグルタミカムPHE21受託番号:NITEBP996、PHE212、PHE213、PHE214、PHE215、PHE216、PHE217、PHE218、PHE219、PHE2110、PHE2111、PHE2112、PHE221、PHE222、PHE223、PHE224、PHE225、PHE226、PHE227、PHE228、PHE229、PHE2210、PHE2211、PHE2212、PHE231、PHE232、PHE233、PHE234、PHE235、PHE236、PHE237、PHE238、PHE239、PHE2310、PHE2311、又はPHE2312の形質転換体。請求項1~9の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、4ヒドロキシベンゾエート又はその塩を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない請求項10に記載のフェノールの製造方法。還元条件下の反応液の酸化還元電位が-200~-500ミリボルトである請求項10又は11に記載のフェノールの製造方法。本発明は、4ヒドロキシベンゾエートを原料として効率よくフェノールを製造できる微生物、及び4ヒドロキシベンゾエートを原料として効率よくフェノールを製造できる方法を提供することを課題とする。上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。コリネバクテリウムグルタミカムに4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子を導入した形質転換体は、効率よく、4ヒドロキシベンゾエートからフェノールを生産できる。この形質転換体において、宿主のコリネバクテリウムグルタミカムの染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼ遺伝子が破壊又は欠損しているときは、一層効率よくフェノールを生産できる。この形質転換体は、還元条件下の反応液中で実質的に増殖しない状態で反応させる場合、特に、フェノール生産効率が高い。本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体及びフェノールの製造方法を提供する。項1.4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumに導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。項2.4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、バチラスサブチリスBacillussubtilis、バチラスアトロファエウスBacillusatrophaeus、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイBacillussubtilissubspspizizenii、シトロバクターコセリCitrobacterkoseri、エンテロバクターアエロゲネスEnterobacteraerogenes、エンテロバクタークロアカエEnterobactercloacae、エンテロバクターホルメシェイEnterobacterhormaechei、エンテロバクターサカザキEnterobactersakazakii、エシェリヒアコリEscherichiacoli、エシェリヒアフェルグソニーEscherichiafergusonii、パエニバチラスポリミキサPaenibacilluspolymyxa、又はパントエアアナナティスPantoeaananatis由来の遺伝子である項1に記載の形質転換体。項3.4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の又はのDNAである項1に記載の形質転換体。配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列からなるDNAの何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA項4.宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、その染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項1~3の何れかに記載の形質転換体。項5.宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、その染色体上に存在する4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項1~4の何れかに記載の形質転換体。項6.宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869である項1~3の何れかに記載の形質転換体。項7.宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項1~3の何れかに記載の形質転換体。項8.宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項1~3の何れかに記載の形質転換体。項9.コリネバクテリウムグルタミカムPHE21受託番号:NITEBP996、PHE212、PHE213、PHE214、PHE215、PHE216、PHE217、PHE218、PHE219、PHE2110、PHE2111、PHE2112、PHE221、PHE222、PHE223、PHE224、PHE225、PHE226、PHE227、PHE228、PHE229、PHE2210、PHE2211、PHE2212、PHE231、PHE232、PHE233、PHE234、PHE235、PHE236、PHE237、PHE238、PHE239、PHE2310、PHE2311、又はPHE2312の形質転換体。項10.項1~9の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、4ヒドロキシベンゾエート又はその塩を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。項11.反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項10に記載のフェノールの製造方法。項12.還元条件下の反応液の酸化還元電位が-200~-500ミリボルトである項10又は11に記載のフェノールの製造方法。本発明の形質転換体を用いることにより、4ヒドロキシベンゾエートからフェノールを高効率で製造することができる。一般に微生物はフェノールのような溶剤の細胞毒性により生育が阻害されるため、微生物を用いてフェノールを製造することは困難であったが、本発明方法によれば、微生物を用いて、実用上十分に効率良くフェノールを製造することができる。以下、本発明を詳細に説明する。Iフェノール生産能を有する形質転換体本発明のフェノール生産能を有する形質転換体は、4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウムグルタミカムに導入された形質転換体である。宿主宿主として用いられるコリネバクテリウムグルタミカムとは、バージーズマニュアルデターミネイティブバクテリオロジーBergey’sManualofDeterminativeBacteriology、Vol8、5991974に定義されている一群の微生物である。具体的には、コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumRFERMP18976、ATCC13032、ATCC13869、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020、ATCC31831、MJ233FERMBP1497又はMJ233AB41FERMBP1498等の菌株が挙げられる。中でも、RFERMP18976株、ATCC13032株、及びATCC13869株が好ましく、RFERMP18976株がより好ましい。なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウムフラバムBrevibacteriumflavum、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentum、ブレビバクテリウムディバリカタムBrevibacteriumdivaricatum、コリネバクテリウムリリウムCorynebacteriumlilium等のコリネ型細菌もコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumに菌名が統一されているLieblWetalTransferofBrevibacteriumdivaricatumDSM20297TBrevibacteriumflavumDSM20411BrevibacteriumlactofermentumDSM20412andDSM1412andCorynebacteriumglutamicumandtheirdistinctionbyrRNAgenerestrictionpatternsIntJSystBacteriol41255260、駒形和男らコリネフォルム細菌の分類発酵と工業45944963ため、本発明に含まれる。また、コリネバクテリウムグルタミカムは、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート乳酸デヒドロゲナーゼlactatedehydrogenase:LDH、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼphosphoenolpyrvatecarboxylase、マレートデヒドロゲナーゼmalatedehydrogenaseなどの遺伝子の破壊株が挙げられる。このような遺伝子破壊株を宿主として用いることにより、フェノールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウムグルタミカムRFERMP18976のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が特に好ましい。このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、WO2005/010182A1に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子bsdBCD又はdca4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼは、4ヒドロキシベンゾエートの脱炭酸によるフェノールの生成反応を触媒する酵素である。4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来は特に限定されないが、バチラスサブチリスBacillussubtilis、バチラスメガテリウムBacillusmegaterium、バチラスリッケニフォーミスBacilluslicheniformis、バチラスアトロファエウスBacillusatrophaeus、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイBacillussubtilissubspspizizeniiのようなバチラス属細菌由来の遺伝子;シトロバクターコセリCitrobacterkoseriのようなシトロバクター属細菌由来の遺伝子;エンテロバクターアエロゲネスEnterobacteraerogenes、エンテロバクタークロアカエEnterobactercloacae、エンテロバクターホルメシェイEnterobacterhormaechei、エンテロバクターサカザキEnterobactersakazakiiのようなエンテロバクター属細菌由来の遺伝子;エシェリヒアコリEscherichiacoli、エシェリヒアフェルグソニーEscherichiafergusoniiのようなエシェリヒア属細菌由来の遺伝子;パエニバチラスポリミキサPaenibacilluspolymyxaのようなパエニバチラス属細菌由来の遺伝子;パントエアアナナティスPantoeaananatisのようなパントエア属細菌由来の遺伝子などが挙げられる。中でも、バチラス属細菌、特にバチラスサブチリス由来の遺伝子、エンテロバクター属細菌、特にエンテロバクタークロアカエ由来の遺伝子、エシェリヒア属細菌、特にエシェリヒアコリ由来の遺伝子が好ましい。なお、4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子は、由来により異なる種々の略称が用いられている。例えば、バチラスサブチリス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子はbsdBCDと略称されている。本明細書では、4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子を、由来を問わずdcaと略称することがある。バチラスサブチリス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号16の塩基配列からなるDNAが、バチラスアトロファエウス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号23の塩基配列からなるDNAが、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号26の塩基配列からなるDNAが、シトロバクターコセリ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号29の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクターアエロゲネス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号32の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクタークロアカエ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号35の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクターホルメシェイ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号38の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクターサカザキ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号41の塩基配列からなるDNAが、エシェリヒアコリ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号44の塩基配列からなるDNAが、エシェリヒアフェルグソニー由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号47の塩基配列からなるDNAが、パエニバチラスポリミキサ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号50の塩基配列からなるDNAが、パントエアアナナティス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号53の塩基配列からなるDNAが挙げられる。また、本発明では、配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。本発明においてストリンジェントな条件は、一般的な条件、例えば、MolecularCloningALaboratoryManualSecondEdition1989Vol2p1145に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度より5~10°C低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性は、Genomics863423512005MaterialsandMethodsに記載の方法で測定できる。簡単に説明すると、試験用液に被験酵素を添加し、100mMMESpH60、1mMDTT、5mM4ヒドロキシベンゾエートと酵素を含む反応液を調製し、270nmにおける吸光度の傾きを測定する。4ヒドロキシベンゾエートを添加しない系についても同様に反応を行い、バックグラウンド値とする。両測定値の差を4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性とする。また、本発明では、配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列と同一性が90以上、好ましくは95以上、より好ましくは98以上の塩基配列からなり、かつ4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYXver8GENETYX株式会社ゼネティックス製により算出した値である。配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列からなるDNAの類縁体は、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができ、これにより高確率で4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが得られる。形質転換のためのベクターの構築PCRで増幅した4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素をコードするDNAは、それぞれ、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。プラスミドベクターとしては、コリネバクテリウムグルタミカム内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentum2256由来のpAM330特開昭5867699、MiwaKetalCrypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteriaAgricBiolChem48290129031984及びYamaguchiRetalDeterminationofthecompletenucleotidesequenceoftheBrevibacteriumlactofermentumplasmidpAM330andtheanalysisofitsgeneticinformationNucleicAcidsSympSer162652671985、コリネバクテリウムグルタミカムATCC13058由来のpHM1519MiwaKetalCrypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteriaAgricBiolChem48290129031984及びpCRY30KurusuYetalIdentificationofplasmidpartitionfunctionincoryneformbacteriaApplEnvironMicrobiol577597641991、コリネバクテリウムグルタミカムT250由来のpCG4特開昭57183799、KatsumataRetalProtoplasttransformationofglutamateproducingbacteriawithplasmidDNAJBacteriol、1593063111984、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50特開昭62166890、pEK0、pEC5、pEKEx1EikmannsBJetalAfamilyofCorynebacteriumglutamicumEscherichiacolishuttlevectorsforcloningcontrolledgeneexpressionandpromoterprobingGene10293981991などが挙げられる。好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウムグルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3フォスフェートデヒドロゲナーゼA遺伝子のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子mdhのプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子ldhAのプロモーターPldhAなどが挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnBT1T2ターミネーター、大腸菌のtrpAターミネーター、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentumのtrpターミネーターなどが挙げられ、中でも、rrnBT1T2ターミネーターが好ましい。形質転換形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる。中でも、コリネバクテリウムグルタミカムには、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は、公知の方法KurusuYetalElectroporationtransformationsystemforCoryneformbacteriabyauxotrophiccomplementationAgricBiolChem544434471990及びVertesAAetalPresenceofmrrandmcrlikerestrictionsystemsinCoryneformbacteriaResMicrobiol1441811851993により行うことができる。形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地等を用いることができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質又は糖アルコール;酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸;エタノール、プロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種を単独で使用でき、又は2種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約01~10w/vとすればよい。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミンビタミンB1、ピリドキシンビタミンB6、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。培地のpHは約5~8が好ましい。好ましい微生物培養培地としては、A培地InuiMetalMetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditionsJMolMicrobiolBiotechnol7182196、BT培地OmumasabaCAetalCorynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithoppositeATPdependentregulationJMolMicrobiolBiotechnol891103等が挙げられる。培養温度は約15~45°Cとすればよく、培養時間は約1~7日間とすればよい。宿主染色体遺伝子の破壊又は欠失宿主のコリネバクテリウムグルタミカムは、その染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子poxFが、破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより一層効率良くフェノールを製造することができる。また、宿主のコリネバクテリウムグルタミカムは、その染色体上に存在する4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより、一層効率良くフェノールを製造することができる。poxF及びpobAの双方が破壊され、または欠失していることが特に好ましい。遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある米国特許第6303383号、特開平05007491号。具体的には、実施例1の項目に記載の方法により、poxFが破壊又は欠失したコリネバクテリウムグルタミカムを得ることができる。また、同様の方法でpobAが破壊又は欠失したコリネバクテリウムグルタミカムを得ることができる。IIフェノールの製造方法上記説明した本発明の形質転換体を、4ヒドロキシベンゾエートを含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含む方法によりフェノールを製造することができる。微生物の増殖反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25~38°Cで、約12~48時間培養して増殖させることが好ましい。培養用培地反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。炭素源として、糖類グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖;スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖;澱粉のような多糖;糖蜜等、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール;酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸;エタノール、プロパノールのようなアルコール;ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約01~10w/vとすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミンビタミンB1、ピリドキシンビタミンB6、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。培地のpHは約6~8が好ましい。具体的な好ましいコリネバクテリウムグルタミカム用培地としては、A培地InuiMetalMetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditionsJMolMicrobiolBiotechnol7182196、BT培地OmumasabaCAetalCorynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithoppositeATPdependentregulationJMolMicrobiolBiotechnol891103等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。反応液反応液は、フェノール前駆体を含有する水、緩衝液、無機塩培地などを用いることができる。前駆体としては4ヒドロキシベンゾエートを用いる。4ヒドロキシベンゾエートとしては、ナトリウム塩、カリウム塩のような塩;炭素数1~4のアルコールとのエステルなどが挙げられる。中でも、塩が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。前駆体は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。反応液中の4ヒドロキシベンゾエートの濃度は、約05~20w/vが好ましく、約1~10w/vがより好ましく、約2~5w/vがさらにより好ましい。4ヒドロキシベンゾエートは、芳香族化合物であるため細胞生存阻害作用を有するが、4ヒドロキシベンゾエート濃度が上記範囲であれば、効率良く、フェノールを製造できる。緩衝液としては、リン酸バッファー、トリスバファー、炭酸バッファーなどが挙げられる。緩衝液の濃度は、約10~150mMが好ましい。無機塩培地としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等の無機塩の1種又は2種以上を含む培地が挙げられる。中でも、硫酸マグネシウムを含む培地が好ましい。無機塩培地として、具体的には、BT培地OmumasabaCAetalCorynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithoppositeATPdependentregulationJMolMicrobiolBiotechnol891103等が挙げられる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。反応液のpHは約6~8が好ましい。反応中は、アンモニア水溶液、水酸化ナトリウム水溶液などを用いて、pHコントローラー微生物からの染色体DNAの抽出コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumRからの染色体DNA抽出は、A培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7gを蒸留水1Lに溶解に、炭素源として、最終濃度4になるように50グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット商品名:GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit、アマシャム社製を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。バチラスサブチリスBacillussubtilisNBRC14144からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。バチラスアトロファエウスBacillusatrophaeusJCM9070からの染色体DNA抽出は、JCMMediumNo22培地peptone10gbeefextract10gNaCl5gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。バチラスサブチリス亜種スピジゼニイBacillussubtilissubspspizizeniiNBRC101239からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。シトロバクターコセリCitrobacterkoseriATCCBAA895の染色体DNACatalogNoBAA895D5はATCCAmericanTypeCultureCollectionより入手した。エンテロバクターアエロゲネスEnterobacteraerogenesNBRC13534からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。エンテロバクタークロアカエEnterobactercloacaeNBRC13535からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。エンテロバクターホルメシェイEnterobacterhormaecheiATCC49162からの染色体DNA抽出は、TrypticSoyBroth培地TrypticSoyBroth30gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。エンテロバクターサカザキEnterobactersakazakiiATCCBAA894からの染色体DNACatalogNoBAA894D5はATCCAmericanTypeCultureCollectionより入手した。エシェリヒアコリEscherichiacoliWNBRC13500からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。エシェリヒアフェルグソニーEscherichiafergusoniiNBRC102419からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。パエニバチラスポリミキサPaenibacilluspolymyxaNBRC15309からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。パントエアアナナティスPantoeaananatisLMG20103からの染色体DNA抽出は、BCCMLMGBacteriCultureMediumNo1培地beefextract1gyeastextract2gpeptone5gNaCl5gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。クローニングベクターの構築クローニングベクターpCRB22の構築コリネバクテリウムカゼイJCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点以降、pCASE1oriと記す配列、及びクローニングベクターpHSG298タカラバイオ株式会社製をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、pCASE1ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号1pCASE1ori配列、配列番号2クローニングベクター-pHSG298を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。pCASE1ori配列増幅用プライマーa1;5’ATAGATCTAGAACGTCCGTAGGAGC3’配列番号3b1;5’ATAGATCTGACTTGGTTACGATGGAC3’配列番号4尚、プライマーa1及びb1には、BglII制限酵素部位が付加されている。クローニングベクターpHSG298増幅用プライマーa2;5’ATAGATCTAGGTTTCCCGACTGGAAAG3’配列番号5b2;5’ATAGATCTCGTGCCAGCTGCATTAATGA3’配列番号6尚、プライマーa2及びb2には、BglII制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、JapanCollectionofMicroorganismsより入手したコリネバクテリウムカゼイJCM12072から抽出したトータルDNA及びクローニングベクターpHSG298タカラバイオ株式会社製を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。pCASE1ori配列を増幅する場合はプライマーa1とb1の組み合わせ、クローニングベクターpHSG298を増幅する場合はプライマーa2とb2の組み合わせで行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1ori配列の場合約14kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約27kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムカゼイ株由来のプラスミドpCASE1ori配列含む約14kbDNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG298を含む約27kbDNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液とした。得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG298約27kbのDNA断片に加え、pCASEori配列の約14kbDNA断片が認められた。pCASE1ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。クローニングベクターpCRB207の構築コリネバクテリウムグルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseをコードするgapA遺伝子のプロモーター配列以降、PgapAと記すを含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK2233ファルマシア社製由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列以降、ターミネーター配列と記すを含むDNA断片を以下の方法により増幅した。PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列番号7PgapA配列、配列番号8ターミネーター配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PgapA配列増幅用プライマーa3;5’CTCTGTCGACCCGAAGATCTGAAGATTCCTG3’配列番号9b3;5’CTCTGTCGACGGATCCCCATGGTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG3’配列番号10尚、プライマーa3には、SalI制限酵素部位が、プライマーb3には、SalI、BamHI及びNcoI制限酵素部位が付加されている。ターミネーター配列増幅用プライマーa4;5’CTCTGCATGCCCATGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGA3’配列番号11b4;5’CTCTGCATGCTCATGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG3配列番号12尚、プライマーa4には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマーb4には、SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、コリネバクテリウムグルタミカムRから抽出した染色体DNA及びpKK2233プラスミドファルマシア社製を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。PgapA配列を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、ターミネーター配列を増幅する場合はプライマーとの組み合わせで行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、PgapA配列の場合約06kb、ターミネーター配列の場合、約04kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカムR由来PgapA配列を含む約06kbDNA断片10μlとクローニングベクターpCRB22約41kbを各々制限酵素SalIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションB液とした。得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SalIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB22約41kbのDNA断片に加え、PgapA配列の約06kbDNA断片が認められた。PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。上記PCRにより増幅したpKK2233プラスミド由来ターミネーター配列を含む約04kbDNA断片10μlを制限酵素NcoI及びBspHIで、上述のクローニングベクターpCRB2062μlを制限酵素NcoIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションC液とした。得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB206約47kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列の約04kbDNA断片が認められた。rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。クローニングベクターpCRB209の構築コリネバクテリウムグルタミカムR由来のgapAglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseA遺伝子のプロモーター以降、PgapAと記す配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号13pCRB207を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。pCRB207配列増幅用プライマーa5;5’CTCTCATATGCTGTTTTGGCGGATGAGAG3’b5;5’CTCTCATATGGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG3’尚、プライマーa5及びb5にはNdeI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニングベクターpCRB207を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaq宝酒造株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB207配列を含む約51kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したpCRB207由来遺伝子を含む約51kbDNA断片10μlを制限酵素NdeIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼ宝酒造株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションD液とした。得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NdeIで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクタ-をpCRB209と命名した。フェノール生産遺伝子のクローニングバチラスサブチリス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングバチラスサブチリス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするbsdBCD遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、bsdBCD遺伝子をクローン化するべく、配列番号16バチラスサブチリスbsdBCD遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。bsdBCD遺伝子増幅用プライマーa6;5’CTCTCATATGAAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG3’配列番号17b6;5’CTCTCATATGGATCAAGCCTTTCGTTCCG3’配列番号18尚、プライマーa6及びb6には、NdeI制限酵素部位が付加されている。バチラスアトロファエウス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングバチラスアトロファエウス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号23バチラスアトロファエウスdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa9;5’CTCTCATATGAAACTCGTTGTCGGGATG3’配列番号24b9;5’CTCTCATATGTCAGGCCTTTCTTTCC3’配列番号25尚、プライマーa9及びb9には、NdeI制限酵素部位が付加されている。バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングバチラスサブチリス亜種スピジゼニイ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号26バチラスサブチリス亜種スピジゼニイdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa10;5’CTCTCATATGAAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG3’b10;5’CTCTCATATGTCAAGCCTTTCGTTCCGG3’尚、プライマーa10及びb10には、NdeI制限酵素部位が付加されている。シトロバクターコセリ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングシトロバクターコセリ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号29シトロバクターコセリdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa11;5’CTCTCATATGAGACTGATTGTGGGGATG3’配列番号30b11;5’CTCTCATATGTTAACGCTTATCTTCCGCCAG3’配列番号31尚、プライマーa11及びb11には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エンテロバクターアエロゲネス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエンテロバクターアエロゲネス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号32エンテロバクターアエロゲネスdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa12;5’CTCTCATATGAAACTGATTATTGGGATGACCG3’b12;5’CTCTCATATGTTAACGCTTATCTGCCGCC3’尚、プライマーa12及びb12には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エンテロバクタークロアカエ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエンテロバクタークロアカエ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号35エンテロバクタークロアカエdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa13;5’CTCTCATATGAGATTGATCGTGGGAATGAC3’配列番号36b13;5’CTCTCATATGTTACAGCAATGGCGGAATGG3’配列番号37尚、プライマーa13及びb13には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エンテロバクターホルメシェイ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエンテロバクターホルメシェイ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号38エンテロバクターホルメシェイdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa14;5’CTCTCATATGAGATTGATTGTGGGAATGAC3’配列番号39b14;5’CTCTCATATGGAGTCTGGTTTAGTTCTCTGC3’配列番号40尚、プライマーa14及びb14には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エンテロバクターサカザキ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエンテロバクターサカザキ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号41エンテロバクターサカザキdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa15;5’CTCTCATATGAGGCTAATTGTCGGAATGAC3’配列番号42b15;5’CTCTCATATGTTAACGCTTACCATCCGCC3’配列番号43尚、プライマーa15及びb15には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エシェリヒアコリ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエシェリヒアコリ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号44エシェリヒアコリdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa16;5’CTCTCATATGAAACTGATCGTCGGGATG3’配列番号45b16;5’CTCTCATATGTTAGCGCTTACCTTCCGC3’配列番号46尚、プライマーa16及びb16には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エシェリヒアフェルグソニー由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエシェリヒアフェルグソニー由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号47エシェリヒアフェルグソニーdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa17;5’CTCTCATATGAGACTGATCGTCGGGAT3’配列番号48b17;5’CTCTCATATGTTAGCGCTTATCTGCCGC3’配列番号49尚、プライマーa17及びb17には、NdeI制限酵素部位が付加されている。パエニバチラスポリミキサ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングパエニバチラスポリミキサ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号50パエニバチラスポリミキサdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa18;5’CTCTCATATGAAGAAAATCATTGTAGGAATATCGG3’b18;5’CTCTCATATGCTATATCCGCTCTGGAATAGG3’尚、プライマーa18及びb18には、NdeI制限酵素部位が付加されている。パントエアアナナティス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングパントエアアナナティス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号53パントエアアナナティスdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa19;5’CTCTCATATGAGTAGATTACTGTTAATTTCATTCGTAC3b19;5’CTCTCATATGTTACTTAGCTAACAGAGGAGGG3’尚、プライマーa19及びb19には、NdeI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、バチラスサブチリスは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したバチラスサブチリスNBRC14144から抽出した染色体DNAを用いた。バチラスアトロファエウスは、JapanCollectionofMicroorganismsJCMより入手したバチラスアトロファエウスJCM9070から抽出した染色体DNAを用いた。バチラスサブチリス亜種スピジゼニイは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したバチラスサブチリス亜種スピジゼニイNBRC101239から抽出した染色体DNAを用いた。シトロバクターコセリは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したシトロバクターコセリ染色体DNAcatalogNoBAA895D5を用いた。エンテロバクターアエロゲネスは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したエンテロバクターアエロゲネスNBRC13534から抽出した染色体DNAを用いた。エンテロバクタークロアカエは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したエンテロバクタークロアカエNBRC13535から抽出した染色体DNAを用いた。エンテロバクターホルメシェイは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したエンテロバクターホルメシェイATCC49162から抽出した染色体DNAを用いた。エンテロバクターサカザキは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したエンテロバクターサカザキ染色体DNAcatalogNoBAA894D5を用いた。エシェリヒアコリWは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したエシェリヒアコリNBRC13500から抽出した染色体DNAを用いた。エシェリヒアフェルグソニーは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したエシェリヒアフェルグソニーNBRC102419から抽出した染色体DNAを用いた。パエニバチラスポリミキサは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したパエニバチラスポリミキサNBRC15309から抽出した染色体DNAを用いた。パントエアアナナティスは、BCCMLMGBelgianCoordinatedCollectionsofMicroorganismsLaboratoryforMicrobiologyUniversityofGentより入手したパントエアアナナティスLMG20103から抽出した染色体DNAを用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。バチラスサブチリスbsdBCD遺伝子を増幅する場合はプライマーa6とb6の組み合わせ、バチラスアトロファエウスdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa9とb9の組み合わせ、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa10とb10の組み合わせ、シトロバクターコセリdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa11とb11の組み合わせ、エンテロバクターアエロゲネスdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa12とb12の組み合わせ、エンテロバクタークロアカエdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa13とb13の組み合わせ、エンテロバクターホルメシェイdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa14とb14の組み合わせ、エンテロバクターサカザキdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa15とb15の組み合わせ、エシェリヒアコリWdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa16とb16の組み合わせ、エシェリヒアフェルグソニーdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa17とb17の組み合わせ、パエニバチラスポリミキサdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa18とb18の組み合わせ、パントエアアナナティスdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa19とb19の組み合わせで行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、バチラスサブチリスbsdBCD遺伝子の場合約23kb、バチラスアトロファエウスbsdBCD遺伝子の場合約23kb、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイdca遺伝子の場合約23kb、シトロバクターコセリdca遺伝子の場合約23kb、エンテロバクターアエロゲネスdca遺伝子の場合約23kb、エンテロバクタークロアカエdca遺伝子の場合約23kb、エンテロバクターホルメシェイdca遺伝子の場合約24kb、エンテロバクターサカザキdca遺伝子の場合約23kb、エシェリヒアコリWdca遺伝子の場合約23kb、エシェリヒアフェルグソニーdca遺伝子の場合約23kb、パエニバチラスポリミキサdca遺伝子の場合約23kb、パントエアアナナティスdca遺伝子の場合約23kbのDNA断片が検出できた。フェノール生産遺伝子発現プラスミドの構築フェノール生産遺伝子のpCRB209へのクローニング上記項に示したPCRにより増幅したバチラスサブチリス株由来bsdBCD遺伝子を含む約23kbDNA断片、バチラスアトロファエウス株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、シトロバクターコセリ株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、エンテロバクターアエロゲネス株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、エンテロバクタークロアカエ株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、エンテロバクターホルメシェイ株由来dca遺伝子を含む約24kbDNA断片、エンテロバクターサカザキ株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、エシェリヒアコリW株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、エシェリヒアフェルグソニー株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、パエニバチラスポリミキサ株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、及びパントエアアナナティス株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片のそれぞれ10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB2092μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これを、それぞれライゲーションE液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液及びQ液とした。得られた12種類のライゲーションE液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液及びQ液それぞれを、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約51kbのDNA断片に加え、バチラスサブチリス株由来bsdBCD遺伝子ライゲーションE液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、バチラスアトロファエウス株由来dca遺伝子ライゲーションG液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ株由来dca遺伝子ライゲーションH液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、シトロバクターコセリ株由来dca遺伝子ライゲーションI液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、エンテロバクターアエロゲネス株由来dca遺伝子ライゲーションJ液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、エンテロバクタークロアカエ株由来dca遺伝子ライゲーションK液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、エンテロバクターホルメシェイ株由来dca遺伝子ライゲーションL液の場合、長さ約24kbの挿入断片が、エンテロバクターサカザキ株由来dca遺伝子ライゲーションM液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、エシェリヒアコリW株由来dca遺伝子ライゲーションN液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、エシェリヒアフェルグソニー株由来dca遺伝子ライゲーションO液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、パエニバチラスポリミキサ株由来dca遺伝子ライゲーションP液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、パントエアアナナティス株由来dca遺伝子ライゲーションQ液の場合、長さ約23kbの挿入断片が認められた。バチラスサブチリス株由来bsdBCD遺伝子を含むプラスミドをpCRB209bsdBCDBS図1、バチラスアトロファエウス株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaBAE、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaBSS、シトロバクターコセリ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaCKO、エンテロバクターアエロゲネス株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaEAE、エンテロバクタークロアカエ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaECL、エンテロバクターホルメシェイ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaEHO、エンテロバクターサカザキ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaESA、エシェリヒアコリW株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaECK、エシェリヒアフェルグソニー株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaEFE、パエニバチラスポリミキサ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaPPY、パントエアアナナティス株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaPAMと命名した。コリネバクテリウムグルタミカムの染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウムグルタミカム株poxF遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウムグルタミカム株の染色体上poxF遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際してコリネバクテリウムグルタミカムRの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。poxF1領域増幅用プライマーa7;5’CTCTTCTAGATACGTCCTAAACACCCGAC3’配列番号19b7;5’GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC3’配列番号20尚、プライマーa7には、XbaI制限酵素部位が付加されている。poxF2領域増幅用プライマーa8;5’CAAGTCAGCAATGGTTGGTC3’b8;5’CTCTTCTAGATGATCAGTACCAAGGGTGAG3’尚、プライマーb8には、XbaI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、コリネバクテリウムグルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウムグルタミカムpoxF1領域の場合約08kb、poxF2領域の場合約08kbのDNA断片が検出できた。次に、上記のPCRにより増幅したpoxF1領域断片とpoxF2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。さらに、得られたpoxF1及びpoxF2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpoxF欠失断片の増幅を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、poxF欠失断片約16kbが検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカムR由来poxF欠失配列約17kbDNA断片10μlと約44kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725JMolMicrobiolBiotechnolVol8243254、特開20061244402μlを各々制限酵素XbaIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションF液とした。得られたライゲーションF液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約44kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来pheA欠失遺伝子ライゲーションF液の場合、長さ約17kbの挿入断片が認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来poxF欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725poxFCGと命名した。コリネバクテリウムグルタミカム株pobA遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウムグルタミカム株の染色体上pobA遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際してコリネバクテリウムグルタミカムRの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。pobA1領域増幅用プライマーa20;5’CTCTTCTAGAGAAACGATCAAGTGCACCAG3’配列番号56b20;5’GACACGAGCGTTTATACCTCTAATTGCCACTGGTACGTGG3’配列番号57尚、プライマーa20には、XbaI制限酵素部位が付加されている。pobA2領域増幅用プライマーa21;5’GAGGTATAAACGCTCGTGTC3’配列番号58b21;5’CTCTGAGCTCGAGAACACGAACCATACGAG3配列番号59尚、プライマーb21には、SacI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、コリネバクテリウムグルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウムグルタミカムコリpobA1領域の場合約10kb、pobA2領域の場合約10kbのDNA断片が検出できた。次に、上記のPCRにより増幅したpobA1領域断片とpobA2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。さらに、得られたpobA1及びpobA2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpobA欠失断片の増幅を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、pobA欠失断片約20が検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカムR由来pobA欠失配列約20DNA断片10μlと約44kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725JMolMicrobiolBiotechnolVol8243254、特開20061244402μlを各々制限酵素XbaI及びSacIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションR液とした。得られたライゲーションR液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaI及びSacIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約44kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来pobA欠失遺伝子ライゲーションN液の場合、長さ約20kbの挿入断片が認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来pobA欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725pobACGと命名した。副生経路遺伝子破壊株の構築コリネバクテリウムグルタミカム株poxF遺伝子破壊株の構築マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウムグルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725poxFCGを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムRを形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地A液体培地、および15寒天に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10スクロース含有BT寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2mlを蒸留水1Lに溶解、および15寒天に塗付した。プラスミドpCRA725poxFCGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725poxFCG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラスサブチリスBacillussubtilisのsacRsacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725poxFCG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacRsacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウムグルタミカムR株poxF遺伝子マーカーレス破壊株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumΔpoxFと命名した。コリネバクテリウムグルタミカム株poxFpobA遺伝子破壊株の構築マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウムグルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725pobACGを用いて、電気パルス法AgricBiolChemVol54443447及びResMicrobiolVol144181185により、コリネバクテリウムグルタミカムΔpoxFを形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地A液体培地、および15寒天に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10スクロース含有BT寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2mlを蒸留水1Lに溶解、および15寒天に塗付した。プラスミドpCRA725pobACGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725pobACG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラスサブチリスBacillussubtilisのsacRsacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725pobACG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacRsacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウムグルタミカムΔpoxF株にpobA遺伝子のマーカーレス破壊を重ねた株を、コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumΔpoxFΔpobAと命名した。フェノール生産遺伝子導入株の構築コリネバクテリウムグルタミカムΔpoxF株へのフェノール生産遺伝子導入上述のプラスミド12種類pCRB209bsdBCDBS、pCRB209dcaBAE、pCRB209dcaBSS、pCRB209dcaCKO、pCRB209dcaEAE、pCRB209dcaECL、pCRB209dcaEHO、pCRB209dcaESA、pCRB209dcaECK、pCRB209dcaEFE、pCRB209dcaPPY及びpCRB209dcaPAMをそれぞれ用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムΔpoxF株を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209bsdBCDBS、pCRB209dcaBAE、pCRB209dcaBSS、pCRB209dcaCKO、pCRB209dcaEAE、pCRB209dcaECL、pCRB209dcaEHO、pCRB209dcaESA、pCRB209dcaECK、pCRB209dcaEFE、pCRB209dcaPPY及びpCRB209dcaPAMの導入が認められた。pCRB209bsdBCDBSの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE21、pCRB209dcaBAEの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE212、pCRB209dcaBSSの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE213、pCRB209dcaCKOの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE214、pCRB209dcaEAEの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE215、pCRB209dcaECLの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE216、pCRB209dcaEHOの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE217、pCRB209dcaESAの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE218、pCRB209dcaECKの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE219、pCRB209dcaEFEの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2110、pCRB209dcaPPYの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2111、pCRB209dcaPAMの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2112と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要を、表1にまとめて示した。コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE21は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足258郵便番号2920818の独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託した受託日:2010年10月21日、受託番号:NITEBP996。コリネバクテリウムグルタミカムΔpoxFΔpobA株へのフェノール生産遺伝子導入上述のプラスミド12種類pCRB209bsdBCDBS、pCRB209dcaBAE、pCRB209dcaBSS、pCRB209dcaCKO、pCRB209dcaEAE、pCRB209dcaECL、pCRB209dcaEHO、pCRB209dcaESA、pCRB209dcaECK、pCRB209dcaEFE、pCRB209dcaPPY及びpCRB209dcaPAMをそれぞれ用いて、電気パルス法AgricBiolChemVol54443447及びResMicrobiolVol144181185により、コリネバクテリウムグルタミカムΔpoxFΔpobA株を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209bsdBCDBS、pCRB209dcaBAE、pCRB209dcaBSS、pCRB209dcaCKO、pCRB209dcaEAE、pCRB209dcaECL、pCRB209dcaEHO、pCRB209dcaESA、pCRB209dcaECK、pCRB209dcaEFE、pCRB209dcaPPY及びpCRB209dcaPAMの導入が認められた。pCRB209bsdBCDBSの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE221、pCRB209dcaBAEの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE222、pCRB209dcaBSSの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE223、pCRB209dcaCKOの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE224、pCRB209dcaEAEの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE225、pCRB209dcaECLの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE226、pCRB209dcaEHOの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE227、pCRB209dcaESAの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE228、pCRB209dcaECKの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE229、pCRB209dcaEFEの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2210、pCRB209dcaPPYの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2211、pCRB209dcaPAMの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2212と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要を、表2にまとめて示した。コリネバクテリウムグルタミカムR株へのフェノール生産遺伝子導入上述のプラスミド12種類pCRB209bsdBCDBS、pCRB209dcaBAE、pCRB209dcaBSS、pCRB209dcaCKO、pCRB209dcaEAE、pCRB209dcaECL、pCRB209dcaEHO、pCRB209dcaESA、pCRB209dcaECK、pCRB209dcaEFE、pCRB209dcaPPY及びpCRB209dcaPAMをそれぞれ用いて、電気パルス法AgricBiolChemVol54、443447及びResMicrobiolVol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209bsdBCDBS、pCRB209dcaBAE、pCRB209dcaBSS、pCRB209dcaCKO、pCRB209dcaEAE、pCRB209dcaECL、pCRB209dcaEHO、pCRB209dcaESA、pCRB209dcaECK、pCRB209dcaEFE、pCRB209dcaPPY及びpCRB209dcaPAMの導入が認められた。pCRB209bsdBCDBSの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE231、pCRB209dcaBAEの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE232、pCRB209dcaBSSの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE233、pCRB209dcaCKOの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE234、pCRB209dcaEAEの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE235、pCRB209dcaECLの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE236、pCRB209dcaEHOの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE237、pCRB209dcaESAの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE238、pCRB209dcaECKの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE239、pCRB209dcaEFEの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2310、pCRB209dcaPPYの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2311、pCRB209dcaPAMの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2312と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要を、表3にまとめて示した。実施例2フェノール生産遺伝子を導入したコリネバクテリウムグルタミカム副生経路破壊株及びR株野生株のフェノール生成実験実施例1において作製したコリネバクテリウムグルタミカムΔpoxFフェノール生産遺伝子導入株表1参照を、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムΔpoxFフェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μgmlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムΔpoxFフェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μgmlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、終菌体濃度10となるようにBT液体培地07硫酸アンモニウム、005リン酸二水素カリウム、005リン酸水素二カリウム、005硫酸マグネシウム7水和物、00006硫酸鉄7水和物、000042硫酸マンガン水和物、000002ビオチン、000002チアミン塩酸塩に50ml懸濁した。この菌体懸濁液を容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下酸化還元電位;450mV、基質としてソディウム4ヒドロキシベンゾエートを250mMとなるように添加し、33°Cに保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが70を下回らないように25Nのアンモニア水を用いてpHコントローラーし、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。この結果、コリネバクテリウムグルタミカムPHE21株は、還元条件下における反応において、1時間後に65mM6gL、4時間後に180mMのフェノールを生成していた表4。同条件下におけるコリネバクテリウムグルタミカムPHE212~PHE2112株の結果も表4に併せて示した。表内の表示の略語は以下の通り<遺伝子起源略語>BS;バチラスサブチリスBAE;バチラスアトロファエウスBSS;バチラスサブチリス亜種スピジゼニイCKO;シトロバクターコセリEAE;エンテロバクターアエロゲネスECL;エンテロバクタークロアカエEHO;エンテロバクターホルメシェイESA;エンテロバクターサカザキECK;エシェリヒアコリWEFE;エシェリヒアフェルグソニーPPY;パエニバチラスポリミキサPAM;パントエアアナナティス次に、実施例1において作製したコリネバクテリウムグルタミカムΔpoxFΔpobAフェノール生産遺伝子導入株表2参照を、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムΔpoxFΔpobAフェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μgmlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムΔpoxFΔpobAフェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μgmlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、終菌体濃度10となるようにBT液体培地07硫酸アンモニウム、005リン酸二水素カリウム、005リン酸水素二カリウム、005硫酸マグネシウム7水和物、00006硫酸鉄7水和物、000042硫酸マンガン水和物、000002ビオチン、000002チアミン塩酸塩に50ml懸濁した。この菌体懸濁液を容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下酸化還元電位;450mV、基質としてソディウム4ヒドロキシベンゾエートを250mMとなるように添加し、33°Cに保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが70を下回らないように25Nのアンモニア水を用いてpHコントローラーし、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。この結果、コリネバクテリウムグルタミカムPHE221~PHE2212株は、還元条件下における反応において、1時間後に表5に示すようにフェノールを生成していた。この結果より、poxA遺伝子を破壊することによりフェノール生産性の向上が観察された。表内の表示の略語は以下の通り<遺伝子起源略語>BS;バチラスサブチリスBAE;バチラスアトロファエウスBSS;バチラスサブチリス亜種スピジゼニイCKO;シトロバクターコセリEAE;エンテロバクターアエロゲネスECL;エンテロバクタークロアカエEHO;エンテロバクターホルメシェイESA;エンテロバクターサカザキECK;エシェリヒアコリWEFE;エシェリヒアフェルグソニーPPY;パエニバチラスポリミキサPAM;パントエアアナナティスさらに、比較例として、実施例1において作製したコリネバクテリウムグルタミカムR株フェノール生産遺伝子導入株表3参照を、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムR株フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μgmlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムR株フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μgmlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、終菌体濃度10となるようにBT液体培地07硫酸アンモニウム、005リン酸二水素カリウム、005リン酸水素二カリウム、005硫酸マグネシウム7水和物、00006硫酸鉄7水和物、000042硫酸マンガン水和物、000002ビオチン、000002チアミン塩酸塩に50ml懸濁した。この菌体懸濁液を容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下酸化還元電位;450mV、基質としてソディウム4ヒドロキシベンゾエートを250mMとなるように添加し、33°Cに保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが70を下回らないように25Nのアンモニア水を用いてpHコントローラーし、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。この結果、コリネバクテリウムグルタミカムPHE231~PHE2312株は、還元条件下における反応において、1時間後に表6に示すようにフェノールを生成していた。この結果より、コリネバクテリウムグルタミカムR株野生株よりも、ΔpoxF株表4、さらにはΔpoxFΔpobA株表5にフェノール生産遺伝子を導入株した方が、フェノール生産性が高いことより、poxF遺伝子の破壊及びpobA遺伝子の破壊によりフェノール生産性に正の効果があることが明らかとなった。表内の表示の略語は以下の通り<遺伝子起源略語>BS;バチラスサブチリスBAE;バチラスアトロファエウスBSS;バチラスサブチリス亜種スピジゼニイCKO;シトロバクターコセリEAE;エンテロバクターアエロゲネスECL;エンテロバクタークロアカエEHO;エンテロバクターホルメシェイESA;エンテロバクターサカザキECK;エシェリヒアコリWEFE;エシェリヒアフェルグソニーPPY;パエニバチラスポリミキサPAM;パントエアアナナティス実施例3フェノール生産用宿主としての適性試験フェノールによる好気増殖への影響コリネバクテリウムグルタミカム、エシェリヒアコリおよびシュードモナスプチダについて、好気培養におけるフェノールの生育阻害試験を行った。尚、本試験に用いたシュードモナスプチダS12は、溶媒耐性菌として報告されており、これまでに唯一フェノール生産の宿主として用いられた技術が開示されている。コリネバクテリウムグルタミカムRをA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、33°C、15時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムRを、A液体培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40gを蒸留水1Lに溶解10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムRを、A液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノールが終濃度0、016、02、024、032mMとなるように添加し、33°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。エシェリヒアコリJM109をLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布し、37°C、15時間暗所に静置した。上記プレートで生育したエシェリヒアコリJM109を、LB液体培地1ポリペプトン、05酵母エキスおよび05塩化ナトリウム10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、37°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したエシェリヒアコリJM109をLB液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、016、020mMとなるように添加し、37°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。シュードモナスプチダF1およびS12をLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布し、30°C、15時間暗所に静置した。上記プレートで生育したシュードモナスプチダF1およびS12を、LBグルコース液体培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウムおよび04グルコース10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、30°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したシュードモナスプチダF1およびS12株をLBグルコース液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、010、020mMとなるように添加し、30°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。培地中へのフェノール添加による好気増殖への影響の解析結果を図2に示す。エシェリヒアコリは、016フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け、020フェノールでは完全に増殖が阻害された。シュードモナスプチダF1及び溶剤耐性菌として報告されていたシュードモナスプチダS12は、ほぼ同じ傾向を示し、010フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け020フェノールでは完全に増殖が阻害された。これに対して、コリネバクテリウムグルタミカムは、エシェリヒアコリが顕著な増殖阻害を受けた016のフェノール存在下においても増殖への影響はほとんどなく、エシェリヒアコリやシュードモナスプチダでは完全に増殖を阻害された020のフェノール存在下においても良好な生育を示した。さらに024のフェノール存在下において増殖が可能であった。このように、コリネバクテリウムグルタミカムはエシェリヒアコリおよびシュードモナスプチダと比較して、フェノールに対し高い耐性を有し、フェノール生産の宿主として高い適性を有することが示された。