"明細書に記載の発明。発明の概要本発明の対象は、早い成長、高い細胞密度、および高い細胞生存率を促進するための特別な環境条件の開発を含む。本発明の目的は細胞系列の注意深い選択、培地条件の注意深い選択および操作、増強因子の取り込み、および方法を操作する様式の注意深い選択によって、高速でタキサンを生産することである。本発明の目的は培地の組成および環境条件を変化させることによってタキサンの生産を操作する能力を含む。特に、主要なタキサン産物としてタキソールまたはバッカチンIIIの生産を細胞に促進させること、および/または副産物セファロマニンの生産を抑制することも目的であり、それによって後工程での分離および精製の問題に、みごとな生物学的解決法を提供する。これらおよびその他の目的は本発明の一つまたはそれ以上の態様によって達成される。本発明者らは、タキソール、バッカチンIII、およびその他のタキソール様化合物、またはタキサンが、既知のあらゆるタキサン種、すなわち、brevifolia,canadensis,cuspidata,baccata,globosa,floridana,wallichiana,mediaおよびchinensisから非常に高い収量で産生されることを発見した。さらに、本発明の方法により、タキソール、バッカチンIII、およびその他のタキサンを既に報告されているよりも非常に短い時間で得ることが可能である。特に、本発明はTaxuschinensis種は急速な成長および極めて大量のタキソール、バッカチンIII、およびタキサンの短時間での生産が可能であることを発見した。Taxuschinensis種によって、本発明者らはタキソール、バッカチンIII、およびタキサンを他のTaxus種の組織培養から得られる量をはるかに上回る量で生産する細胞を操作することを可能にした。培養条件の特定の修飾は、任意のTaxus種の細胞培養から得られる様々なタキサンの収量を増強することが発見された。特に好ましい増強剤は、銀イオンまたは複合体、ジャスモニン酸、オーキシン関連成長調節剤、および34メチレンジオキシ6ニトロ桂皮酸などのフェニルプロパノイド経路の阻害剤を含む。増強剤は単独でまたは互いに組み合わせて、または収量を増強するその他の条件で使用することも可能である。Tchinensisの植物細胞培養からのタキサンの収量はこれらの一つまたはそれ以上の条件の使用によって特有に増強されると同時に、全Taxus種からのタキサンの収量がこれらの条件の使用により向上することがわかった。一つの態様においては、本発明は、一つまたはそれ以上の栄養培地における成長および産物形成条件下での懸濁培養でTaxus種の細胞を培養すること、および前述の細胞または前述の細胞培養の前述の培地、または、カルスまたは懸濁培養に由来する細胞およびフェニルプロパノイド代謝の阻害剤を含む栄養培地の両方から1種またはそれ以上のタキサンを回収することを含むTaxus種の細胞培養における高収量のタキサンを生産する方法を供給する。フェニルプロパノイド代謝の適切な阻害剤は34メチレンジオキシ6ニトロ桂皮酸、34メチレンジオキシ桂皮酸、34メチレンジオキシフェニルプロピオン酸、34メチレンジオキシフェニル酢酸、34メチレンジオキシ安息香酸、34トランスジメトキシ桂皮酸、4ヒドロキシ桂皮酸、フェニルプロピオン酸、フルオロフェニルアラニン、1アミノベンゾトリアゾール、2ヒドロキシ46ジメトキシ安息香酸、SKF525A、シュウ酸アンモニウム、ビニルイミダゾール、ジエチルジチオカルバミン酸、およびシナピン酸を含む。より好ましい態様においては、本発明の方法において使用されている一つまたはそれ以上の栄養培地の少なくとも一つはまた、エチレン作用の阻害剤でもあり得る別の増強剤;ジャスモン酸またはジャスモン酸のエステル;またはオーキシン関連成長調節因子をも含む。特定のより好ましい態様においては、その他の増強剤とは、銀含有化合物、または銀錯体、または銀イオンであるところのエチレン作用の阻害剤である。別の特定の好ましい態様においては、その他の増強剤はジャスモン酸またはそのアルキルエステルであり、およびさらに好ましくは、ジャスモン酸にエステル化されているアルキル基は1から6個の炭素原子を有する。さらにより好ましい態様においては、増強剤はジャスモン酸またはそのアルキルエステルであり、およびその培地はまた銀含有化合物、銀錯体または銀イオンをも含む。別の特定の好ましい態様においては、その他の増強剤はインドール酢酸、ピクロラム、αナフタレン酢酸、インドール酪酸、24ジクロロフェノキシ酢酸、37ジクロロ8キノリンカルボキシル酸、または36ジクロロoアニス酸などのオーキシン関連成長調節因子である。別の態様においては、本発明は、一つまたはそれ以上の栄養培地における成長および産物形成条件下での懸濁培養でTaxus種の細胞を培養し、および前述の細胞または前述の細胞と前述の培地の両方から1種またはそれ以上のタキサンを回収することを含むTaxus種の細胞培養における高収量のタキサンを生産する方法を提供するが、その際細胞はカルスまたは懸濁培養に由来し、および、栄養培地は、ジャスモン酸またはジャスモン酸のエステルまたはオーキシン関連成長調節因子でありうる少なくとも1種類の増強剤とともに銀含有化合物、または銀錯体、または銀イオンの形態で900μMまたはそれ以下の濃度の銀を含む。好ましい態様においては、増強剤はジャスモン酸またはジャスモン酸のエステルであり、銀の増強剤に対するモル比は95未満である。別の好ましい態様においては、増強剤はオーキシン関連成長調節因子であり、銀の増強剤に対するモル比は少なくとも0011である。上記の態様のいずれにおいても、一つまたはそれ以上の栄養培地は、αフェニルアラニン、βフェニルアラニン、またはその混合物でも有り得るタキサン前駆体をも含んでよい。上記の態様のいずれにおいても、一つまたはそれ以上の栄養培地は、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはこれらのアミノ酸の混合物をも含んでよく、または細胞の培養に使用する一つまたはそれ以上の栄養培地は、マルトース、スクロース、グルコースおよび/またはフルクトースを炭素源として、好ましくは一次炭素源として含んでよい。ある態様においては、栄養培地は細胞培養成長のためのものと、タキソールおよびタキサン産生のための物が同一である。別の態様においては、1種類またはそれ以上のタキサンの産生は栄養培地の組成物を変化させることによって培養中に誘導される。好ましい態様においては、培養における培地は周期的に交換され、一般的に培地の交換は、培養からのタキサンの周期的な除去を成し遂げる。好ましくは、前述のTaxus種の細胞は給餌バッチ工程により培養される。一般的に、タキソールまたはバッカチンIIIおよび/またはその他のタキサンは、前述の細胞または前述の細胞培養の前述の培地、またはその両方から回収される。一般的に、本発明に従ったTaxus種の培養は、タキサン産生の期間を通して平均15mgL日のタキサンの平均体積生産性を提供する。タキソールの平均体積生産性は一般的に、タキソール産生の期間の推定で少なくとも10mgL日である。バッカチンIIIの平均体積生産性は一般的に、タキサン産生の期間の推定で少なくとも15mgL日である。好ましくは、本発明の方法に従って培養する細胞はTaxus種の細胞であり、その種はT.brevifolia,T.canadensis,T,chinensis,T.cuspidata,T.baccata,T.globosa,T.floridana,T.wallichianaまたはT.mediaであり得る。好ましくは、本発明の方法に使用したTaxus種の細胞は、増強剤を含まない培地でのカルス培養または懸濁培養におけるELISAにより背景値を上回るタキソールを生産する細胞である。より好ましくは、本発明の方法に使用したTaxus種の細胞は、チオ硫酸銀、メチルジャスモン酸およびオーキシンを含む培地において10mgLの平均体積生産性をもって懸濁培養においてタキサンを生産する細胞である。発明の詳細な説明植物は長い間、薬剤および特別な化学物質の重要な原料を供給してきた。これらの産物は一般的に、回収した植物材料の抽出または化学的合成を通して得られていた。タキソールおよびタキサンは自然産物の検索から近年発見された最も重要な分類の抗癌剤の一つとなってきた。本明細書で使用されているタキソール様化合物またはタキサンという用語は、タキサン環を有するジテルペノイド化合物を記述するために互換的に使用する。タキサンはそれ自身が抗悪性物活性を有し、または生物活性を有する化合物を産生するように修飾されることも可能である。総タキサンという用語は以下の実施例5に記載されているような特徴的なUV吸光度を示す全てのタキサンについて言及する。本明細書で使用されているカルスという用語は、構造的に未分化であり、固体化された培地において培養される培養植物細胞の集団を記述するために使用される。本明細書で使用されている懸濁培養という用語は、液体栄養培地において分散する構造的に未分化な細胞を記載するために使用する。懸濁培養は様々な凝集の段階にある細胞を含むことが理解されよう。凝集の大きさの範囲は、本発明に記載されている懸濁液において、直径10ミクロンから、数千の細胞から成る直径数ミリメートルの凝集に至る範囲の大きさをもって計測される。本発明において有用な植物材料はあらゆる既知のTaxus種、たとえばbrevifolia,canadensis,cuspidata,bacatta,globosa,floridana,wallichiana,media,fastigiataおよびchinensissumatrama,celebica,およびspeciosaなどの同義の種,およびchinensisvar.mairei亜種を含むから得ることが可能である。特に、本発明者らは有意な量のタキソール、バッカチンIII、およびタキサンを高い体積生産性で産生する能力を有するものとしてTaxuschinensis種を同定した。本発明者らによって、特定のタキサン内容量は、植物種により、および組織源および特定の樹木に由来する植物種内において変化することが発見されている。タキサン産生のための高収量の源および培養を選択することが、医療使用のための十分な量のタキサンの供給に向けての重要な第一歩である。商業的適合性の基準商業的な魅力およびタキサン産生のための与えられた植物細胞培養を基にした工程の成功性を判断するために数々の基準を使用することが可能である。そのような基準は、発酵費用、後での回収の容易性、および生産量を含む、工程の鍵となる要因の効果を特徴化および実証すべきである。ここに記載される基準は、ブロス力価および体積生産性である。ブロス力価は全体のブロスにおける産物の濃度として定義され、通常1リットルのブロスあたりのミリグラム数として表現される。定義により、全ブロス力価は産物の細胞内および細胞外の部分は区別しない。ブロス力価は典型的にはバッチまたは給餌バッチ工程の効率評価に使用される。より高いブロス力価は、与えられた反応器の体積に対して産物の体積がより大きいこと、およびそれに付随して単位生産費用がより低いことを意味する。同様に、高力価産物は通常高収量で回収することが容易であり、単位生産費用の更なる改善へと導く。体積生産性は、単位反応体積あたり単位時間あたりに生産された産物の量として定義され、1リットルあたり1日あたりのミリグラム数の単位で表現される。タキサン産生の目的のために、時間の尺度は、収集および回収に先立つ、生産尺度において生産が起きる間の時間枠として定義する。体積生産性はバッチおよび給餌バッチ工程の基準としての力価を補足するもので、産物が産生の間に除去される工程、例えば周期的培地交換または別の除去方法、の評価に特に有用である。高い体積生産性は、与えられた時間を通して与えられた反応体積に対する産物体積が大きいこと、およびそれに付随して単位生産費用がより低いこと、および全工程の性能の向上を意味する。体積生産性が生物学的工程の本来の能力を計測するために使用される場合、例えば工程開発の初期の段階においては、生産周期の最も生産的な部分、すなわち、生合成の速度がその最大であるときの短い期間での生産性を測定することが有用である。これは一般的に、最大瞬間体積生産性と呼ばれる。しかし、工程の性能の計測において、より適切な基準は、全体の生産時期を通して測定される生産性である平均体積生産性である。明らかに、最大の平均体積生産性を達成するためには最大瞬間生産性が生産時期の大部分を通して維持されなければならない。別に規定しないかぎり、体積生産性という用語は全体の生産時期に対して決定された平均体積生産性を意味する。一般に、生産時期は、生育培地を産生培地に置き換えること、またはタキサン産生において有意な増強を誘発する増強剤を添加することによる栄養培地の組成物の変化によって開始する。Taxus細胞株の開始Taxus植物材料はその他の大陸と同様に北アメリカ全域から集められ得る。培養は生育に適したTaxusの組織を選択することから始められる。樹皮、形成層、針葉、幹、種子、球果、および根を含む植物のどの部分由来の組織でもカルスを誘導するために選択され得る。しかしながら、タキソールの収量を最良にするためには針葉および植物の分裂組織の部分が望ましい。最も望ましいのは針葉の新芽であり、これは一般にそれが黄緑色をしていることで同定され得る。新芽という語はその年の成育期のうちに生えた針葉を広く指している。培養物への汚染を防ぐために、組織は培地への導入に先だって表面を滅菌されるべきである。CLOROX処理等のどんな滅菌技術も有効である。それに加えて、セフォキシチン、ベンレート、クロクサシリン、アンピシリン、ゲンタマイシン硫酸塩、およびフォスフォマイシンのような抗生物質が植物材料の表面滅菌に用いられ得る。カルスの生育培養物は典型的には生育中の形態、増殖量、生成物の性質、およびその他の性質に多様性を示す。個々の細胞株は培地の成分に対する親和性に多様性があり、数多くの異なる増殖培地がカルスの誘導および増殖に用いられ得る。適切な培地の組成は培養されている生物種によって異なる。異なる種に対する望ましい培地は表3に挙げられる。例えば、Taxuschinensisに対する望ましい増殖栄養培地は、他のものも用いられ得るものの、ADIJKLMOPである。これらの培地は表2に挙げた成分を含むことが望ましい。技術を有する技術者はその量のいくらかの変化は細胞増殖に大きな影響を与えないことが認識し得るが、表2に示した量でその成分を含む培地を用いて培養が行われることが望ましい。例えば、培地Aが用いられるならば、成長ホルモンまたは調節物質は1ppbから10ppmの間の量で、望ましくは2ppbから1ppmの間の量で培地に含まれる。培地Dが用いられるならば、成長ホルモンまたは調節物質は1ppbから10ppmの間の量で、望ましくは2ppbから2ppmの間の量で培地に含まれる。その他の培地成分は表2に示された量の110から3倍までの濃度で含まれ得る。タキサンを大量に生成することはTaxus細胞を懸濁培養で増やすことによって可能になる。一般に、懸濁培養はカルス培養に成功した培地を用いて開始され得る。しかしながら、懸濁培養の必要性および特にタキサンの高い効率での生成のために、培地の修正が望ましい。Taxus細胞が修正され、本発明の方法によって特性を調節された培地中で培養された場合、培養物からの1種類あるいはそれ以上のタキサンの収量は有意に増加する。本明細書で用いられる栄養培地という語は、植物細胞のカルスの増殖および懸濁培養に適した培地を記載するために用いられる。栄養培地という語は一般的な語であり、生育培地および産生培地の両方を含む。生育培地と言う語は培養細胞の迅速な生育を可能にする栄養培地について記載するために用いられる。産生培地と言う語は培養細胞内でタキソール、バッカチンIIIおよびタキサンの生合成を可能にする栄養培地を指す。産生培地内で生育が起こり得、生育培地内で生成が起こり得、また最適な生育と生成が一つの栄養培地内で起こり得ることが理解されよう。懸濁増殖Taxusの懸濁培養では迅速な増殖速度と他の植物細胞培養のように迅速で高い細胞濃度が可能である。しかしながら最適な細胞濃度は細胞株によって異なるので任意のどんな細胞株にたいしても迅速に最適化できるような手法が考えられなければならない。様々なTaxus種の培養物は多量および微量栄養塩類、炭素源、窒素源、ビタミン類、有機酸、天然および合成植物成長調節因子を含む栄養培地に移すことで生育させられる。特にTaxus細胞の懸濁培養用の栄養培地は典型的にはカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、リン酸、硫酸、塩素、硝酸、およびアンモニウムと言った多量栄養分および銅、鉄、マンガン、モリブデン、亜鉛、ホウ素、コバルト、ヨウ素およびニッケルといった微量栄養分を補給する無機塩類を含む。この培地はまた、典型的にはミオイノシトール、チアミン、アスコルビン酸、ニコチン酸、葉酸、ピリドキシンおよび場合によってビオチン、パントテン酸、ナイアシン、およびその類似物等のビタミン類をも含む。これらの成分は表2に列挙された濃度の130から30倍の範囲の濃度で存在し得、望ましくは表2に列挙された濃度の120から20倍の濃度で、さらに望ましくは表2に列挙された濃度の13から3倍の濃度で、および最も望ましくは表2に列挙された濃度で含まれ得る。栄養培地はまた1種類またはそれ以上の炭素源、および典型的には栄養培地内の全炭素の50以上を供給するものである1次炭素源を含む。1次炭素源は望ましくはラクトース、ガラクトース、ラフィノース、マンノース、セロビオース、アラビソース、キシロース、ソルビトール、または望ましくはグルコース、フルクトース、スクロース、またはマルトースである。1次炭素源の濃度は005から10の範囲で有り得、望ましくは01から8の範囲で有り得る。栄養培地はまた、多量栄養塩類の形で加えられる任意の窒素源に加えて、望ましくは少なくとも部分的には有機栄養源によって供給される窒素源をも含む。これらの有機窒素源は01mMから60mMの、望ましくは1から30mMの範囲の濃度の窒素を供給し得る。この培地はまた酢酸、ピルビン酸、クエン酸、オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸およびそれらの類似物のような1種類またはそれ以上の有機酸をも含み得る。これらの成分は培地中に、01mMから30mMの濃度で、望ましくは05mMから20mMの濃度で含まれ得る。この培地はまた典型的にはピクロラム、インドール酢酸、1ナフタレン酢酸、インドール酪酸、24ジクロロフェノキシ酢酸、37ジクロロ8キノリンカルボキシル酸、36ジクロロoアニス酸およびその類似物のようなオーキシン関連成長調節因子、N6ベンジルアデニン、6γγジメチルアリルアミノプリン、キネチン、ゼアチン、NフェニルN123チヂアゾール5イル尿素および関連フェニル尿素誘導体およびその類似物のようなサイトキニン関連成長調節因子、GA3、GA4、GA7およびGA誘導体のようなジベレリン、アブシジン酸やその誘導体、ブラシノステロイド、およびエチレン関連成長調節因子を含む1種類またはそれ以上の天然または合成植物成長調節因子をも含む。さらに別の適切なオーキシン関連植物成長調節因子は以下に列挙される。栄養培地は、例えば1種類以上のオーキシン関連調節因子、1種類以上のサイトカイニン関連調節因子のような単一の種別に属する1つ以上の成長調節因子を含み得ることに注意されたい。成長調節因子は培地中に1010Mから103Mの間の濃度で、望ましくは108から3x105Mで、さらに望ましくは表2にあげられた濃度で含まれることが望ましい。他に記述がない限り、本明細書において定義される生育培地は、カルス培養培地および産生培地の通常の技術で最適化するために適切な開始点を提供する。当該技術分野における技能を有するものにとってはある種別の成分および任意の種別の成分を添加し、修飾し、操作することによって最適な結果を達成することは日常的技術範囲である。ある種の培地修飾は表および下記の実施例の中に供給される。液体培養物は空気のような好気的な環境に曝され、振とうされるか、あるいは撹拌されることで培養成分の適切な混合を可能にされることが望ましい。培養物は、適切な条件およびまたは環境下では0°Cから33°Cの範囲が可能であるものの、23°Cから27°Cの間の温度に保たれる。pHは約3から7の間で、望ましくは4から6の間で有り得る。培養物は様々な期間の間完全な暗黒から完全な照明下までの範囲の照明条件下で生育される。倍化速度は時間依存的にバイオマスの増加を調べることとともに、単に通常の部分培養の間の生育指数を調べることによって測定される。リットルあたり15から24グラムの最大乾燥重量濃度が達成される。様々なTaxus種懸濁物の生育特性は実施例4に詳述される。タキサン生成条件懸濁培養物における2次代謝産物の形成が生育と同時に起こる場合、その代謝は生育に関連していると呼ばれ、1種類の培地を形成することが良好な生育と多量の生成を達成するのに十分で有り得る。他の多くの系においては迅速な生育と高度の生成物形成は同時には起こらないことが分かっている。このような場合は生育および生成相は分離され、それぞれの相に対する培地が独立に開発される。Taxusにおけるタキサン生成の場合は、生育および生成物形成は分離され得、独立な培地がそれぞれに対して開発された。本発明の望ましい様式においては細胞増殖相の間の培地組成はタキサン生成相の間の培地組成とは異なる。例えば、炭素源、特に1次炭素源の種類と量が生育相と生成相では異なり得る。産生培地は生育培地におけるよりも多量の糖を含むことが望ましい。産生培地における糖の量は生育相における場合と比べて生成相において2から20倍多いことがより望ましい。1次炭素源はラクトース、ガラクトース、ラフィノース、マンノース、セロビオース、アラビノース、キシロース、ソルビトールであることが望ましく、またはグルコース、フルクトース、スクロース、またはマルトースであることが望ましい。1次炭素源の濃度は005から10の間で有り得、01から8で有ることが望ましい。タキソールまたはバッカチンの生成のために特に望ましい炭素源はマルトース、スクロース、グルコースおよびまたはフルクトースである。特に望ましい態様においてはこれらの糖は初期の栄養培地中に少なくとも35の濃度で含まれる。ビタミン、アミノ酸のような有機窒素源を含む有機添加物の種類およびレベルは、下記の増強剤の存在またはレベルと同様に、培地において変化し、または異なるであろう。天然または合成の植物成長調節物質の同一性およびレベルは、培地間で異なるであろう。同様に、多量元素および微量元素の塩のレベルおよび種類も、生育および産生培地間で異なるであろう。好ましくは、塩含量は生育培地に比べ産生培地において減少され、所望により硝酸塩および硫酸塩は不均等に減少され、かつ、より好ましくは減少度は220倍の係数による減少である。しかし、この培養系に対し単一の生育産生培地を設定することも可能であることは理解されよう。本発明の産生培地は、タキサン形成のみならず、タキソールまたはバッカチンIIIといった特定のタキサンの生成につながる直接的な細胞の生合成をも増加させる。さらに、セファロマニンのような夾雑副産物の生成は、樹皮組織に比べ最小化される。本発明の産生培地はまた、細胞の生存能力及び生合成の増加を促進し、さらに有意なレベルの産物を細胞外培地へ分泌させる。これらの特性は、タキサン生成の効率的な商業的スケール手法の運用において非常に重要である。細胞および培地よりタキソールおよびタキサンを抽出および回収する手法は、慣用された技術に基づく例えば実施例5を参照。イムノアッセイELISA技術は、商業的に入手可能なキットとしてHawaiiBiotechnologyにより提供されるプロトコールに主として基づいた本明細書に参照文献として記載されたGrothausら,1995,JournalofNaturalProducts,58,10031014をも参照。抗体は、タキソールまたはバッカチンIIIといったいずれのタキサンにも特異的であってよく、または、タキサン骨格に対し、より非特異的であってもよい。高速液体クロマトグラフィーの手法は、実施例5に詳述された既存のプロトコールより僅かに変更された。本発明において用いられた条件の下で、タキサンピークの明確な分離が達成され、その結果、正確な検出および定量がなされた。タキサンでない成分が共溶出する可能性があるため、タキサンピークのスペクトル純度は、ピーク領域を混合する前にダイオードアレイにより慣例法で検査された。タキサン標準品の保持時間は実施例5に示されており、かつクロマトグラムの例示は図4に含まれている。高等植物にとって、光は植物本体、培養細胞いずれにおいても二次代謝における有効な因子である。光の強度および波長の双方が重要であるSeibertおよびKadkade1980,PlantTissueCultureasaSourceofBiochemicalsEJ.Staba編,CRCPress,BocaRaton,Florida,pp123141。例えば、通常フラボノイドおよびアントシアニン生合成は、強度の強い連続光により促進され、一方、他の代謝産物については、暗所で培養された細胞が好ましい。培養細胞の緑化または光合成能力の増加は、産物生成または産物の範囲をも増加させるであろう。本発明者らの研究は、広範囲のみならず特異的な狭い範囲の光源の利用にも関する。実施例73に示されたように、光照射はタキソールの蓄積のみならず、培地への分泌の増加をも引き起こす可能性がある。タキソール生成に対する光の刺激効果は、タキサンの生合成に関する特異な制御機構の存在を示唆する。光受容体の特性および光により誘導される刺激の生化学的特性は未だ明らかでない。しかし、本発明によると、増強剤の導入が、最適の結果に対する光の役割をより重要でないものにする。不揮発性の溶存栄養分に加え、気体成分、主に酸素、二酸化炭素、およびエチレン植物ホルモンは、生育および産物生成において重要な役割を担っている。2つのパラメーターが重要である。生育およびタキソール生成を促進する溶存気体濃度は明らかに重要である。なぜなら、それらは反応装置を操作するする条件を規定するからである。さらに、最適な特定の濃度が維持されるよう、消費または生成の効率を反応装置の設計に考慮する必要がある。呼吸における重要性の他に、酸素は二次代謝産物の生合成の効率にも劇的な影響を与える。二次生合成経路において酸素を要求する過程に対する高い飽和定数は、反応装置内において細胞が高い酸素レベルに曝されていることを要求する。高い成長率を維持するためのCO2添加の重要性が報告されている。植物ホルモンであるエチレンは、二次代謝を含む植物の生育および発生の全ての側面において、多面発現的な役割を担う例えば、Payneら,1991を参照。本発明者らは、ある気体濃度の様式が、培養細胞における生育および二次代謝を促進することを見出している。例えば、酸素濃度の範囲は、1空気飽和から200空気飽和まで、および好ましくは10から100の範囲、および最も好ましくは25から95の範囲において、培養と両立する。二酸化炭素濃度の範囲は、003培地と平衡にある気相におけるvvから15まで、および好ましくは03から8の範囲において、培養と両立する。溶存気体の最適濃度は、細胞代謝により異なる可能性があり、例えば、速い成長を行っている細胞は、典型的に高めの酸素レベルを好み、かつ、高めの二酸化炭素レベルに対して感受性がより低いタキサン生合成中の細胞とは異なる最適値を有するであろう。最適値はまた、培養の速度論によっても異なる可能性があり、例えば、遅滞期にある細胞は、対数増殖期にある細胞とは異なる溶存気体濃度を好むであろう。溶存気体は、他の培養成分および増強剤と多様な様式により相互作用するであろう。例えば、酸素の要求は、生合成の誘導または刺激により変化するであろう。傷害反応としての呼吸効率の上昇は、植物培養細胞が誘導を受けた際に一般的に観察される。エリシターまたは刺激物は、それらの機能をエチレンを通じ仲介し、または二次代謝の促進とは独立にエチレン生成に影響を与えるであろう。その場合、微生物由来のエリシター調製物をエチレンに置換し、かつエリシター調製物中の他の微生物由来成分に関連する毒性を恐らく抑制することが望ましいであろう。あるいは、エチレンの作用を抑制し、従ってエリシターまたは刺激物が二次代謝をより独占的、従ってより効率的な方法で促進できるようにすることは有利であろう。下記のように、エチレン作用に影響を与えることが知られている成分である銀イオンは、実際タキサン生合成を有利に変化させる。増強剤二次代謝産物の生成は複雑な過程であり、究極的に二次代謝産物に変換されるべき前駆体を生成しかつ順々に修飾する、多数の異なる酵素の協調した作用を要求する。同時に、二次代謝産物生成は、他の酵素が目的の代謝産物の前駆体を代謝し、二次代謝産物を構築するのに必要な前駆体プールを流失させる場合には低下するであろう。低い生成または引き続く変換による利用可能な前駆体の量の制限、前駆体または中間産物の下流中間産物への変換の制限、または関連酵素の活性の制限は、二次代謝産物の生成を限定するであろう。いずれの特定の培養系においても、二次代謝産物が生成される効率は、前駆体が二次代謝産物に変換される経路において律速段階を形成する、これらの限定要因のうちの一つにより制御されるであろう。律速段階の原因となる限定要因の緩和は、当該培養系の二次代謝産物生成効率を、経路の他の過程が律速となる点にまで上昇させるであろう。生成効率全体を限定する特定の過程は、限定要因を緩和する作用と同様に、培養系間で異なるであろう。タキサンは一連の多数の酵素過程を通じて生成される二次代謝産物であり、本発明者らは、タキサン生合成における一つまたはそれ以上の効率限定過程を緩和する、複数のクラスの増強剤をつきとめた。これらの増強剤のうち一つのタキサン生成細胞への添加は、タキサンの生成効率を増加させる。さらに本発明者らは、本明細書中に記載されている増強剤の利用が、大部分のタキサン生成培養細胞において、少なくともいくつかの促進効果を示すであろうことを決定しており、生成効率全体が単一の効率限定過程ではなく、複数の限定要因の間の複雑な相互作用により決定されていることを示唆している。促進の程度は、一旦ある種の限定要因が緩和された際にタキサン生合成における他の過程の相対的限定効果を決定する、特定の細胞の状態に依存するであろうが、いずれか一つの限定要因の緩和はタキサン生成を増加させるであろう。多種の限定要因間の相互作用に影響する培養条件は、細胞の遺伝的構成、培地の組成および気体環境、温度、光照射および過程のプロトコールを含み、かつ特定の培養系に添加される増強剤は、本明細書中に示されたように個別の増強剤の効果を比較することにより経験的に決定されるであろう、当該培養系の限定要因の観点より通常選択されるであろう。さらに、培養系に一つより多い増強剤が存在する場合に、タキサン生成の更なる増加が達成されるであろうことが発見されている。本発明の意図する代表的な増強剤は表1に例示されている。本発明の増強剤は、複数の一般的なクラスに分類されるであろう。それらのクラスは、抗褐色化剤、抗老化剤、抗エチレン剤、オーキシン関連成長調節物質、前駆体、阻害剤、エリシター、刺激物およびジャスモン酸関連化合物といった植物成長調節物質である。本発明の意図する増強剤の一つのクラスは、抗褐色化剤である。本明細書中で使用されている抗褐色化剤の用語は、細胞培養過程における色素の形成を阻害するため栄養培地に添加される成分を示す。これらの色素は、細胞成長、生存能力、および産物生成に有害な影響を及ぼすことが一般的に観察される、フェノール類および関連化合物を含む。本発明の栄養培地において用いられる典型的な抗褐色化剤は、アスコルビン酸である。典型的には、抗褐色化剤は培地中に10ppbから1000ppmの範囲の濃度となるよう添加されるであろう。他の種別の増強剤は抗老化剤である。抗老化剤は細胞を老化より防護する、生物学的または非生物学的起源の物質である。この様な薬剤は例えば、老化を促進する化合物の生成を防ぐ、老化促進物質の活性を抑える、ラジカル除去剤または抗オキシダント活性を提供する、細胞性の膜及び小器官の無傷な状態を守護する、またはその他の機構により反応可能である。この様な薬剤にはエチレン反応の拮抗剤、スペルミン、スペルミジン、ジアミノプロパン、及びその類似物質等のポリアミン及びその代謝産物、抗褐色化剤、フェノール産物の阻害剤、及びラジカル除去剤、例えば還元型グルタチオン、没食子酸プロピル、及びβメルカプトエタノールアミン等のスルフヒドリル化合物を含む。抗エチレン剤はエチレン生成またはエチレン反応を阻害する物質として定義される。エチレン代謝を阻害する抗エチレン剤は、エチレン生合成拮抗剤及びエチレン反応拮抗剤へとさらに分類される可能性がある。エチレン生合成拮抗剤は、エチレンの生合成経路を阻害する化合物である、この生合成経路に沿った阻害される酵素の例はACC合成酵素、ACC酸化酵素、及びエチレン酸化酵素を含む。エチレン生合成拮抗剤の例はαアミノイソ酪酸、アセチルサリチル酸、メトキシビニルグリシン、アミノオキシ酢酸、及びその類似物を含む。エチレン活性拮抗剤の例は、銀を含有する化合物、銀錯体、または銀イオン、二酸化炭素、1メチルシクロプロペン、25ノルボルナジエン、トランスシクロオクテン、シスブテン、ジアゾシクロペンタジエン、及びその類似物を含む。適切な銀塩は硝酸銀、チオ硫酸銀、リン酸銀、安息香酸銀、硫酸銀、トルエン硫酸の銀塩、塩化銀、酸化銀、酢酸銀、ペンタフルオロプロピオン酸銀、シアン酸銀、乳酸の銀塩、ヘキサフルオロリン酸銀、亜硝酸銀、及びクエン酸の三銀塩を含む。多種の銀塩によるタキサン生合成の増強の例は例10に示す。抗エチレン剤は培地に10ppbから1000ppmの程度で含有させることが可能である。培地に銀が含まれる場合、銀は濃度が900μM以下、好ましくは500μM以下、更に好ましくは200μM以下になるよう添加する。培地に銀が含まれる場合、抗エチレン剤は濃度が10nM以上、好ましくは100nM、更に好ましくは1μM、及び一般的には10μM添加する。本発明において想定される増強剤は、植物成長調節剤、特にオーキシン、オーキシン様の活性を持つ化合物、及びオーキシン拮抗剤を含むオーキシン関連成長調節剤を含む。オーキシン関連成長調節剤は、一般的には濃度が1010Mと103Mの間で、好ましくは108と105Mの間で培地に含ませる。最も好まれるオーキシン関連成長調節剤の例は、1ナフタレン酢酸、2ナフタレン酢酸、1ナフタレンアセトアミドナフチルアセトアミド、Nフタルアミド酸、1ナフトキシ酢酸、2ナフトキシ酢酸、βナフトキシ酢酸、1ナフトキシアセトアミド、3塩化フェノキシ酢酸、4塩化フェノキシ酢酸、4ヨウ化フェノキシ酢酸、インドールアセトアミド、インドール酢酸、インドイル酢酸、インドールアセチルロイシン、γ酪酸、4アミノ356トリクロロピコリン酸、4アミノ356トリクロロピクリン酸メチルエステル、36ジクロロoアニス酸、37ジクロロ8キノリンカルボン酸、フェニル酢酸、2ヨウ化フェニル酢酸、3ヨウ化フェニル酢酸、2メトキシフェニル酢酸、クロロプロファムイソプロピル3クロロカルバニレート、4塩化インドール3酢酸、5塩化インドール3酢酸、5臭化4塩化3インドイル酪酸、インドールアセチルフェニルアラニン、インドールアセチルグリシン、インドールアセチルアラニン、4塩化インドール、p塩化フェノキシイソ酪酸、1ピレノキシル安息香酸、リソホスファチジン酸、1ナフチルNメチルカルバミン酸、及びエチル5塩化1Hインダゾール3イル酢酸3インドールブタン酸を含む。その他の好まれるオーキシン関連成長調節剤の例は、ナフタレン26ジカルボキシル酸、ジ無水ナフタレン1458テトラカルボキシル酸、ナフタレン2スルホンアミド、無水4アミノ36ジスルホ18ナフタリン酸、35ジメチルフェノキシ酢酸、18ナフタルイミド、24ジクロロフェノキシ酢酸、23ジクロロフェノキシ酢酸、235トリクロロフェノキシ酢酸、2メチル4塩化フェノキシ酢酸、ニトロフェノキシ酢酸、DLαプロピオン酸、Dαプロピオン酸、4臭化フェノキシ酢酸、4フッ化フェノキシ酢酸、2ヒドロキシフェノキシ酢酸、5塩化インドール、6塩化3インドイル酢酸、5フッ化インドール、5塩化インドール2カルボン酸、3塩化インドール2カルボン酸、インドール3ピルビン酸、5臭化4塩化3インドイル酪酸、6塩化3インドイル酪酸、キノリン2チオグリコール酸、アミノフェニル酢酸、3ニトロフェニル酢酸、3塩化4ヒドロキシ安息香酸、クロルフルレノール、6塩化3インドイル酢酸、N5塩化1ナフタレンスルホンアミドヒドロクロライド、2塩化3プロピオンニトリル、o塩化フェノキシ酢酸、67ジメトキシ12ベンゾイソキサゾール3酢酸、3オキソ12ベンゾイソチアゾリン2イル酢酸、マストパラン、235トリヨード安息香酸、2プロパン酸、及びメコプロッププロパン酸を含む。他のオーキシン関連成長調節剤に適した例は、ナフトエ酸ヒドラジド、24ジブロモフェノキシ酢酸、3トリフルオロメチルフェノキシ酢酸、オキシインドール、インドール2カルボン酸、インドール3乳酸、βプロピオン酸、2臭化フェニル酢酸、3臭化フェニル酢酸、2塩化フェニル酢酸、3塩化フェニル酢酸、2メチルフェニル酢酸、3メチルフェニル酢酸、3トリフルオロメチルフェニル酢酸、3メチルチオフェニル酢酸、フェニルプロピオン酸、4塩化2メチルフェニルチオ酢酸、2塩化安息香酸、3塩化安息香酸、23ジクロロ安息香酸、34ジクロロ安息香酸、235トリクロロ安息香酸、246トリクロロ安息香酸、2ベンゾチアゾールオキシ酢酸、2塩化3プロプオンニトリル、24ジアミノsトリアジン、無水ナフタル酸、ジケグラックαLキシロ2ヘキスロフラノソン酸、クロルフルレノールメチルエステル、22メチルプロピオン酸、2塩化9ヒドロキシフルオレン9カルボン酸、246トリクロロフェノキシ酢酸、22メチルプロピオン酸、エチル4酪酸、N2オキシアセトアミド、4塩化2オキソベンゾチアゾリン3イル酢酸、2プロパン酸、2プロパン酸、4フッ化フェニル酢酸、3ヒドロキシフェニル酢酸、オルソニル6クロロトルエン、345トリメトキシ桂皮酸、2トリエチルアミン、インドール3プロピオン酸、イオキシニルナトリウム、2ベンゾチアゾール酢酸、及びチオ酢酸を含む。他の種別の植物成長調節剤も増強剤として栄養培地に含ませることが可能である。これらは、N6ベンジルアデニン、6γ,γジメチルアリルアミノプリン、キネチン、ゼアチン、NフェニルN123チジアゾール5イル尿素、及び関連フェニル尿素誘導体、及びその類似物等の、サイトカイニン関連成長調節剤、GA3、GA4、GA7、及びGA誘導体等のジベレリン類、アブシジン酸及びその誘導体、ブラシノステロイド、及びエチレン関連成長調節剤を含む。これらの成長調節剤は濃度が1010Mと103Mの間で、好ましくは108Mと105Mの間で培地に含ませることが可能である。他の種別の増強剤は前駆体または生合成前駆体である。本明細書中で使用する前駆体という用語は、栄養培地に加えられ細胞により代謝され及び取り込まれたタキソール及びタキサンになる化合物を示すために使用される。適した前駆体は、酢酸、ピルビン酸及びその類似物、αフェニルアラニン、βフェニルアラニン、フェニルイソセリン、Nベンゾイルフェニルイソセリン、安息香酸、シキミ酸、グルタミン、桂皮酸、及びその類似物などイソプレノイド化合物の前駆体を含む。これらの分子の誘導体も又前駆体として適している。他の種の増強剤は阻害剤である。阻害剤は酵素性または他の細胞性活性を阻害する化合物である。本明細書で使用する代謝阻害剤という用語は、栄養培地に加えられ、特定の生合成経路を阻害する化合物を示すために使用される。例えば、代謝阻害剤は、初期の生合成前駆体に関し競合する種々の経路を阻害することにより、タキソール、バッカチンIII、または他のタキサン生合成を増強するために使用することが可能である。この種の特に効果的な増強剤は、桂皮酸またはその誘導体の合成または代謝を阻害することが可能な化合物であるフェニルプロパノイドの代謝阻害剤を含む。これら化合物は、好ましくはpクマル酸、4フッ化DLチロシン、4メトキシ安息香酸、3ジメチルアミノ安息香酸、4メトキシ桂皮酸、4ニトロ桂皮酸エチルエステル、4ニトロシンナムアルデヒド、メルカプトエタノール、4ヒドロキシクマリン、シンナミルフルオレン、2シアノ4ヒドロキシ桂皮酸、シンナミルイデンマロン酸、4ジメチルアミノ桂皮酸、Nシンナミルピペラジン、Nトランスシンナモイルイミダゾール、2アミノインダン2ホスホン酸、ベンジルヒドロキシルアミン、プロカイン、モネシン、Nグリシン、3プロピオン酸、3プロピオン酸、さらに好ましくは、Dフェニルアラニン、Nグリシン、及びその酢酸塩複合体、DLメタフルオロフェニルアラニン、pフッ化DLフェニルアラニン、ジチオスレイトール、4フッ化桂皮酸、トランス34ジフルオロ桂皮酸、34ジフルオロDフェニルアラニン、ジエチルジチオカルバン酸、4フッ化ホスホン酸、34メチレンジオキシ安息香酸、及び最も好ましくは、34メチレンジオキシ6ニトロ桂皮酸、34メチレンジオキシ桂皮酸、334メチレンジオキシフェニルプロピオン酸、34メチレンジオキシフェニル酢酸、4フッ化Lフェニルアラニン、4ヒドロキシフェニルピルビン酸、4フッ化DLチロシン、トランス34ジメトキシ桂皮酸、フェニルプロピオル酸、L2ヒドロキシ3フェニルプロピオン酸、2ヒドロキシ46ジメトキシ安息香酸、SKF525Aエチルエステル、ビニルイミダゾール、オキサル酸アンモニウム、シナプ酸、及び1アミノベンゾトリアゾール、及び関連類似物質を含む。培地に含ませる場合、阻害剤は濃度が10ppbと1000ppmの間で、好ましくは濃度が100ppbと100ppmの間で、更に好ましくは濃度が1ppmと50ppmのあいだで加える。培養細胞中のタキソール、バッカチンIII、及び他の関連タキサンの収量を増進するために、本発明者らは多くのアプローチを試みた。生産性を増強させる方法の一つは、エリシターと呼ばれるものの使用である。本明細書で使用するエリシターという用語は、植物または培養植物細胞に添加したときに二次的代謝産物の増加を引き起こす、生物学的及び非生物学的起源の化合物を意味するために使用するAcademicPressNewYorkpp153196Ebel1984BioregulatorsChemistryandUses257271andDarvilletal1984AnnRevPlantPhysiol35243275。多くの異なる化合物がその起源の性質及びその細胞代謝における活性の方法に依存してエリシターとして機能することが可能である。当該研究分野において、本発明は二つの主要な種類のエリシターを使用した。1通常は選別された菌類、細菌類、及び酵母の集団の細胞壁抽出物または濾過物、及びその精製画分を含む生物的エリシター。2生物起源の化合物と同様な、化学的なストレス剤を含む非生物的エリシター表1に一覧されたエリシターを参照。加えて、重金属イオンを含む塩及び複合体も、効果的な非生物的エリシターとみなすことが可能である。これらは、コバルト、ニッケル、ランタン、セレニウム、バナジウム、鉛、カドミウム、クロム、アルミニウム、ヨウ素、バリウム、ビスマス、リチウム、ルビジウム、ストロンチウム、及び金などの例を含む。特筆すべきは、エリシター効果を伝達するある種の化合物、例えば下記に示すジャスモン酸関連化合物もエリシターとみなすことが可能であるということである。ChristenらはTaxusbrevifoliaの懸濁によるタキソールの生産のための菌類のエリシター及び選別された化合物の使用について報告している、しかし、エリシター処理に起因するタキソール蓄積程度の増加については特定していない。一般的には、2種類のエリシター効果タキサンの培地中への分泌並びにタキサンの培養細胞への蓄積発生の範囲はエリシター間で及び種間で異なるが、両種のエリシターは共に効果的である。最高の生産性増加はキトサングルタメート、リケナン、フェルラ酸、及び安息香酸により達成される。キトサン及びリケナンは微生物の細胞壁由来の多糖類複合体である。キトサンは単独で用いると培地に不溶であり、及び毒性があり、及び永久的に細胞に損傷を与える。一方キトサングルタメートは培地に容易に溶け、及び細胞の生育に影響を与えない。フェルラ酸及び安息香酸は生物起源の合成化学物質であり、及び一般的には生体系では抗オキシダントとして使用される。エリシター及び代謝ストレス剤は、本発明によれば、タキソール、バッカチンIII及び全タキサンを生産させ及び培養組織への分泌を最大にするために、エリシターの特異性、濃度、タイミングおよび添加継続時間を培養年齢及び培地組成の関数として評価して使用されるであろう。本発明において意図される他の種別の増強剤は刺激剤である。本明細書で使用する刺激剤という用語は、栄養培地に加えられ、特定の生合成経路をしげきまたは活性化する例えば生合成を導く化合物を示すために使用される。ジャスモン酸関連化合物は二次的代謝生合成を刺激することによりエリシター効果反応に寄与する種別の化合物である。ジャスモン酸関連化合物は、ジャスモン酸、及びメチルジャスモン酸、エチルジャスモン酸、プロピルジャスモン酸、ブチルジャスモン酸、ペンチルジャスモン酸、ヘキシルジャスモン酸などのそのアルキルエステル、ジヒドロジャスモン酸、及びメチルジヒドロジャスモン酸、エチルジヒドロジャスモン酸、nプロピルジヒドロジャスモン酸、ブチルジヒドロジャスモン酸、ペンチルジヒドロジャスモン酸、ヘキシルジヒドロジャスモン酸などのそのアルキルエステル、エピメチルジャスモン酸、フッ化メチルジャスモン酸、シスジャスモン、イソジャスモン、テトラヒドロジャスモン、12オキソフィトジエン酸、ジヒドロジャスモン、ジャスモニル酢酸、アプリトン、アミルシクロペンテノン、ヘキシルシクロペンテノン、ヘキシルシクロペンタノン、及びその関連誘導体及び類似物質を含む。ジャスモン酸関連化合物は濃度が109Mと103Mの間で、好ましくは濃度が106と5×104Mの間で、更に好ましくは濃度が105Mと2×104Mの間で培地に含ませる。特筆すべきは一種以上のジャスモン酸関連化合物を栄養培地に含ませることが可能であるということである。ジャスモン酸関連化合物、オーキシン関連成長調節剤、前駆体、及びその他の栄養物質は、これら化合物が培養中において代謝されることにより濃度が変化するということは当業者により認識されよう。特に示さない限り、本明細書において列挙された濃度は栄養培地における初期濃度を記載する。以下に述べる最低二種以上の種類の増強剤からの増強剤を組み合わせると、いかなる一種の薬剤を単独で用いたときに観察される最高の増強をも上回るTaxus細胞によるタキサン生産の増強を示す。これらの種別の増強剤は、エリシター、ジャスモン酸関連化合物、エチレン作用の阻害剤、フェニルプロパノイド代謝の阻害剤、抗老化剤、前駆体、及びオーキシン関連成長調節剤である。つまり、好まれる手法において、本発明は、少なくとも二種のこれらの薬剤群から選択された増強剤の存在下におけるTaxus種細胞の培養により一種またはそれ以上のタキサンの生産を増強させる方法を提供する。好まれるタキサンの生産方法はエチレン作用の原型阻害剤である銀を、少なくとも一種の他の増強剤と組み合わせて用いる、特に好まれる方法においては、その他の増強剤はジャスモン酸メチルであるか、または34メチレンジオキシニトロ桂皮酸等のフェニルプロパノイド代謝の阻害剤である。お互いに組み合わせて使用する場合、ジャスモン酸関連化合物及びエチレン作用阻害剤は培地にお互いに特定の割合で含ませることができる。例えば、ジャスモン酸メチル及びチオ硫酸銀を組み合わせて用いる場合、ジャスモン酸メチルのチオ硫酸銀に対するモル比は00001から95の範囲の間で、好ましくは0001と8の間の範囲で、更に好ましくは01と7の範囲の間で、最も好ましくは1と5の範囲の間でになるであろう。お互いに組み合わせて使用する場合、オーキシン関連成長調節剤及びエチレン作用阻害剤は培地にお互いに特定の割合で含ませることができる。例えば、オーキシン関連成長調節剤及びチオ硫酸銀を組み合わせて用いる場合、オーキシン関連成長調節剤のチオ硫酸銀に対するモル比は0011から1000の範囲の間で、好ましくは0015と100の間の範囲で、更に好ましくは002と50の範囲の間で、最も好ましくは005と30の範囲の間になるであろう。一般的には、Taxus細胞をタキサンの生産のために培養する場合、一種またはそれ以上のオーキシン関連成長調節剤を培養培地に加える。オーキシン関連成長制御因子の存在は細胞の成長を促進するが、より重要な事項は培養によるタキサンの生産を増強することである。少なくとも一種の他の増強剤をオーキシン関連成長制御因子と同時に添加することにより、さらなる増強を得ることが可能である。本発明において好まれる方法において、一種またはそれ以上の増強剤を十分量培地に添加することにより、一種またはそれ以上のタキサンの生産量をを増強剤が存在しないときの生産量の相対比で、少なくとも3倍、好ましくは少なくとも5倍、更に好ましくは少なくとも10倍、更に好ましくは少なくとも30倍に増強する。他の本発明において好まれる方法において、一種またはそれ以上の増強剤を十分量培地に添加することにより、タキソールの容積測定生産性を、少なくとも10mgLday、好ましくは少なくとも15mgLday、更に好ましくは少なくとも22mgLdayに増強する。他の本発明において好まれる方法において、一種またはそれ以上の増強剤を十分量培地に添加することにより、タキソールの全ブロス力価を、少なくとも150mgL、好ましくは少なくとも200mgL、更に好ましくは少なくとも350mgLに増強する。他の本発明において好まれる方法において、一種またはそれ以上の増強剤を十分量培地に添加することにより、バッカチンIIIの容積測定生産性を、少なくとも15mgLday、好ましくは少なくとも20mgLday更に好ましくは少なくとも25mgLdayに増強する。他の本発明において好まれる方法において、一種またはそれ以上の増強剤を十分量培地に添加することにより、バッカチンIIIの全ブロス力価を、少なくとも100mgL、好ましくは少なくとも150mgL、更に好ましくは少なくとも250mgLに増強する。他の本発明において好まれる方法において、一種またはそれ以上の増強剤を十分量培地に添加することにより、タキサンの容積測定生産性を、少なくとも15mgLday、好ましくは少なくとも25mgLday、更に好ましくは少なくとも40mgLdayに増強する。他の本発明において好まれる方法において、一種またはそれ以上の増強剤を十分量培地に添加することにより、タキサンの全ブロス力価を、少なくとも200mgL、好ましくは少なくとも300mgL、更に好ましくは少なくとも400mgLに増強する。以上に増強剤として示した多くの化合物は他の植物系においても使用された。これら非Taxus系における公式化、管理、及び適切な生理的濃度水準は当該技術者に、本発明と同値のこれら薬剤を適用する手引きを提供する。細胞材料本発明の方法において培養に適する細胞はTaxusのいかなる種由来でもあることができる。好ましくは、細胞は、生来タキサンを比較的高収量で生産する細胞系由来であると良い。特に、この様な細胞は一種またはそれ以上のタキサンを標準条件下で高水準で生産する、または標準条件下でタキサンの高い平均容積測定生産性を示す能力を有している。適切な細胞系は、細胞系の細胞を標準タキサン生産条件下で培養し、及び培養液における生産された一種またはそれ以上のタキサンの水準を観察し、または以下に述べる手段により培養液中の細胞による一種またはそれ以上のタキサンの平均容積生産性を決定することにより単離することが可能である。試験手段産生培地において使用される細胞は特定の細胞系に適応した適当な培地において生育する。対数増殖期の終了の後、細胞の一部をタキサンの生産試験のために培養する。カルス培養は固形培地が使用してもよいが、生産培養は、一般的に液体培地で行われる。生産培養においては、細胞は表2におけるN培地、スクロースを7マルトースで代用するのを除いては表2におけるのと同様のN培地、または特定の細胞系の生育及び維持を最大限にする栄養培地において培養される。生産培養においては、細胞密度は新鮮な重量を基本として1520パーセントの範囲であるべきである。細胞は1020日間、25度2度において暗条件で培養する。液体培養は適切に揺り動かし及び空気にさらすべきである、例えば、旋回式振盪機で120180rpm。細胞系の特徴を評価する生産培養は適した増強剤を含む。一般的には六種の選択的増強カクテル最高五種の増強剤の組み合わせを各々の細胞系に対し試験する。組み合わせは以下の表Aに示す。培養の終了時に培養における個々のタキサンの力価を、本明細書で示したELISA分析を行うことにより測定することができる、または、培養において生産されたタキサンのプロフィールを、実施例5において示したようにHPLC解析により決定することができる。好まれる細胞系は一種またはそれ以上のタキサンを、一種またはそれ以上の増強カクテルにおける最低目標タキサン水準を越えて生産する。好まれる細胞系は、少なくとも一種の増強カクテルにおいて、及び、更に好ましくは二種またはそれ以上の増強カクテルにおいて、力価及び生産性の双方の目標水準を越える。適した細胞系の生産培養終了時の最低目標タキサン力価は、少なくとも100mgLタキサンである。あるいは、生産培養行程終了時の最低平均容量測定生産性目標は10mgLdayタキサンである。さらに好まれる細胞系は、生産培養終了時の最低タキサン力価は少なくとも100mgLタキソールまたは200mgLバッカチンIII、または生産培養行程終了時の平均容量測定生産性は10mgLdayタキソールまたは15mgLdayバッカチンIIIに達する。様々な種に適した産生培地は表5に列挙するが、その他のものも使用できる可能性がある。例えば、表2の培地B、C及びNは、Taxuschinensisの産生培地として特に適している。培地は表2に列挙した成分を含むことが望ましい。これらの培地は、主要な及び重要ではない無機塩、有機物及び成長ホルモンまたは成長調節剤を、一般には表2に示した各培地成分の濃度の、好ましくは110から始まり3倍の範囲で、量において含むことが望ましい。培地BまたはNを使用した場合、成長調節剤を特に、量において01ppmから20ppmの間で、好ましくは1ppmから10ppmの間で培地に含ませる。培地CまたはNを使用した場合、成長調節剤を好ましくは01ppmから5ppmの範囲水準で含ませる。本発明における意図において、本明細書で示した培地において、他の慣例的組成物有機物、ビタミン、アミノ酸、前駆体、活性剤及び阻害剤などの代用、成長調節剤を含む様々な組成物の添加または削除、または割合の変更等の装飾を、成長とタキサン生産を表2において示した培地において観察されるものと同等またはそれ以上にするために行う可能性があることは、当該技術者により理解されている。操作工程の方法植物細胞培養工程の操作方法は、栄養、細胞、および産物が時間について加えられ、またはのぞかれる方法Payneetal1991を参照する。最初に全栄養分が供給され、培養期間の最後に細胞および産物よりなる培養内容が回収される操作方法は1段階バッチ工程と呼ばれる。バッチ工程が2つの連続した期、成長期、および産生期の間に、培地が換えられる方法では、操作法は2段階バッチ工程と呼ばれる。本発明の観点において、生育培地から産生培地への変換は、急な工程変更、または連続的一連の工程による段階的、または段階的変更により引き起こされる。ある極端な例において、段階的変更は次第に大きく変化する組成の培地への段階的置換により成し遂げられる。また別の場合、段階的変更は成長期培養への産生培地の一つまたはそれ以上の化合物の供給により成し遂げられる。これは、給餌バッチ工程の一例である。給餌バッチ工程においては、栄養物、および/または一つまたはそれ以上の増強剤などの特異的培地物質が培養の間、定期的または連続的に供給される。ある成分を最初にバッチ法によって栄養培地に加え、次いで給餌バッチ法によって加えてもよく、または専ら給餌バッチ法によってのみ加えてもよいことに注意すべきである。給餌バッチ工程の使用で、細胞を長期にわたる産生状態にすることが可能で、事実、細胞の産生能力は増強されることが発見された。実施例15、17、および表16、および18に示したように、給餌バッチ工程において加える栄養物および増強剤は全タキサン生産量および、タキソールおよびバッカチンIIIとしての特定のタキサンの合成効果において有意な改良が見られる。さらにこの操作法はさまざまな異なる培養条件下におけるさまざまな異なる細胞系についても適用可能であることがわかった。成分を給餌バッチ式で添加することは、特定の成分の濃度が培養中で低いレベルで保たれなければならないとき特に有利である。たとえば、基質の阻害効果を回避する場合などである。同様に、給餌バッチ式の添加は、栄養培地に最初に成分を加えた時に細胞が消極的反応を示すとき、または、化学量論的に有意量の化合物は溶解度や有毒限界量のために加えることができないときに有利である。さらに、ある成分を含む給餌溶液の連続的または連続定期的給餌バッチ添加は、パルス式の添加のような急激な方法で成分が加えられると、細胞が消極的反応を示す場合に特に好ましい。給餌バッチ法で加えられることにより好ましい反応を細胞が示す特定の化合物には、アルファーおよびベータフェニルアラニンなどのタキサン前駆体や炭素源としてのマルトース、フルクトース、およびグルコース、アミノ酸としてのグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、マクロ栄養物質としてリン酸、カルシウム、、およびマグネシウム、およびオーキシン関連成長調節因子およびジャスモン酸関連化合物などの増強剤などが含まれる。該当技術分野において通常の知識を有する技術者には、供給される成分の組成は、タキサン産物の増加のための産生期間の延長やより高いバイオマス濃度を得るための増殖期の延長などの、望みの結果を得るために変化させうることは明白であろう。最適な産生活性および効果を達成するための最適条件の選択は、本明細書の開示に基づいて通常の知識を有する技術者には容易である。本明細書において、培地交換とは培養からの使用済み培地の除去、および引き続き行われる新鮮培地の添加を意味する。細胞はおおむね操作の間中、培養中に維持される。本発明の方法において、培地交換法は容量当たりのタキサンの高産生を可能にし、且つ持続させ、バッチ法に比べ、優れた工程効率および全産生レベルの向上に有用である。培地交換法を行う場合、細胞外産物はその後の回収および精製過程は、他の操作法の場合より容易である。実施例14および表15に示したように、培地交換はタキサン全般および、タキソール、バッカチンIIIおよび、10脱アセチルバッカチンIIIなどの特定のタキサンの高産生活性を維持することを成功させる。さらに、この操作法はバッチ操作法に比べ、タキサン全般および、タキソールおよびバッカチンIIIなどの特定のタキサンに対し、容積当たりの産生増加ももたらす。さらに、この操作法はさまざまな異なる培養条件下におけるさまざまな異なる細胞系に対し、適用可能である。実施例73に示したように、3日毎の使用済み培地の除去および、新鮮培地の再添加は、増殖条件でのタキサンおよびタキソールの産生の有意な増強や、同様に細胞外産物の量の増加をもたらす。培地交換の刺激的効果は、細胞内産物の除去によって、フィードバック阻害や産物の分解が回避されるためであろう。細胞内産物除去による、2次的代謝物の産生および培養液への分泌へのこのような好ましい効果は、多くの文献中でも、RobinsandRhodesおよびAsadaandShulerにより報告されている。定期的な使用済み培地の除去は、上記の利点を含み、さらに他の、非タキサン、阻害物質フェノール化合物などが培地から除去されることにより、2次的生合成への抑制を取り除く作用をする。活発に生合成を行っている細胞への新鮮培地の再添加は、減少した必須栄養物質の供給による産生増強をもたらすであろう。例えば、Miyasakaetalは、単なるスクロースの培地添加によりSa1viamiltiorhizaの静止期の細胞を刺激し、ジテルペン代謝産物、クリプトタンシノンおよびフェルギノールの産生をさせることを報告している。おそらく、静止期において炭素の限界により、生合成が止まっていたのだろう。本発明において用いた定期的培地交換法は上記の要素の結果として有益となるだろう。培地交換の量、交換頻度、および交換する培地の組成はさまざまでありうることは理解されよう。培地交換による生合成および分泌の活性化能は、連続的、半連続的、または給餌バッチ法において、効率的商業的工程の操作や構築にとって重要な意味を持つ。バッチ培養の内容の全部でないが大部分が回収されて、連続的細胞増殖および産生のために新鮮な培地の添加がされると、その工程は繰り返し汲み出し充填操作に似て、半連続工程と呼ばれる。新鮮培地が連続的に供給されて流れ出る培地が連続的に除去されると、この工程は連続的と呼ばれる。細胞が反応装置内に保持される場合、工程はパーフュージョン法と呼ばれる。細胞が連続的に流れ出る培地とともに除去されると、その連続的工程は恒成分培養槽と呼ばれる。このようなさまざまな操作工程の方法がここで記載したタキサン合成系に適用できることは理解されよう。以下の実施例は、本発明を実施するのに用いた材料と方法のさらなる記載のために提供される。実施例は説明を意図しており、いかなる方法においても発明を限定するものではない。実施例1カルスの開始Taxus植物材料は多くの野生型および培養系の植物から得られた。材料は研究室において到着後すぐに処理するか、または4°Cで使用時まで保存した。材料は最初に希釈セッケン溶液で洗浄し、水でリンスし、CLOROX溶液で10分間、表面を滅菌した。材料は滅菌条件下で3回滅菌水でリンスした。針は1ポリビニルピロリドン100mglアスコルビン酸溶液中で切断される。針は切断末端を培地E表2参照中にして静置した。30から40の植物組織片を培地プレート当たりに培養した。組織片を含むプレートは25±1°Cの暗黒下で培養した。プレートは毎日、微生物の汚染を調べ、汚染が見られたときは、非汚染針を取り出して新鮮な培地Eプレートの中に置いた。実質的カルス形成を観察し、カルスを20日目に組織片から分離し、表3に示したさまざまなカルス増殖培地へと移した。たとえばTaxuschinensisのカルスは培地Dに移した表2参照。この最初の手順は非常に効率がよく、低い汚染率および高い90以上の最初の組織片のカルス誘導率へとつながった。同様の手順をTaxusbrevifoliaTaxuscanadensisTaxuscuspidataTaxusbaccataTaxusglobosaTaxusfloridanaTaxuswallichianaTaxusmediaおよびTaxuschinensisの開始培養に対しても首尾よく用いることができた。実施例2カルスの増殖組織片から取り出したカルスは、25±1°Cの暗黒下で培養した。健康なカルス部分を新鮮な培地に7から10日毎に移植したが、この移植の頻度は褐色化を防ぎ、長くカルスを維持するために非常に重要であった。さまざまな種のカルスに対して好ましい成長および維持培地を表3にまとめた。実施例3懸濁培養の開始1gの生重量のカルス材料を、各種に対して適当な培地表3参照25mlを含む125mlの3角フラスコに無菌的に接種した。例えば培地DはTaxaschinensisに用いられた。フラスコにシリコンキャップBelloNJを被せ、旋回振盪機上に120rpmで24±1°C暗黒下で置いた。懸濁培養はおよそ3から10日で形成された。最初に、培地はミラクロスフィルターCalbiochemを含むブフナー漏斗を用いフラスコ内容物を吸引濾過することにより交換し、すべての生物を新鮮な培地に再懸濁した。細胞が増殖したとき、1から2gの細胞を一般に新たな25mlの新鮮な培地を含む125mlフラスコに移し、その後毎週副培養サブカルチャーした。実施例4懸濁細胞の成長典型的成長率および細胞濃度は表4にまとめた代表的種の懸濁培養において達成される。ある詳細な例として、時間ごとの生物重量生重量および乾燥重量の増加はTaxuschinensis系統K1について図1に示した。最大増殖率はもっとも急速に生物重量が増殖曲線上で増加した点における勾配を取ることで測定した。Taxuschinensisの細胞培養は最大倍加時間25日で増殖した。この増殖率はTaxus種の懸濁培養について以前報告されていたものより有意に高い。例えば、Christenetalは、3から4週間の培養で生物重量は5から10倍に増加すると報告した。これは、Taxusbrevifolia懸濁培養についての平均倍加時間7から12日に換算される。高濃度での培養能力は、細胞培養過程の量的産生能力を最大にするのに重要である。Taxusbrevifoliaの培養では、1lの培養当たり乾燥重量1g以下にしか届かないChristenetalにあるデータより計算されるが、Taxuschinensisの懸濁培養では18日の成長の後1l当たり8から20gの乾燥重量に到達することが可能である。細胞の生存率は005フルオレセインジアセテートの溶液Widholm1972StainTechnol47189194によりアセトン中で染色し、倒立蛍光顕微鏡下で青色光の励起により緑の蛍光を発した細胞を数えることにより決定した。細胞の生存率は増殖期を通じ90以上であった。急速増殖条件下での高生存率を維持しながらの細胞の高細胞濃度への培養能力は、タキソール、バッカチンIII、およびタキサンの産生のための植物培養過程の経済的操作に対しての前もって必須となる重要な要素である。実施例5タキソール、バッカチンIII、および他のタキサン類の解析51.ELISA法ELISA解析を用いて、細胞培養抽出液中のタキソールの検出を行った。この方法は高感受性を提供した。しかしポリクローナル抗体が用いられるため、他のタキサンとの交差反応が見られた。画分回収式の調製用解析スケールHPLCは、10デアセチルタキソール、7キシロシル10デアセチルタキソール、セファロマニン、10デアセチル7エピタキソール、7エピタキソール、並びに他の未同定タキサンとの交差反応を示した。そのような交差反応にも関わらずこの方法はタキサン産物の検出に特に有用であり、多くの細胞系統が素早くスクリーニングされることが見いだされた。優位なタキサンの産生を示す細胞抽出液は、概略を後に示すHPLC法を用い詳細に解析した。モノクローナルELISA解析HawaiiBiotechTA02も、細胞抽出液中のタキソールの検出に用いた。この方法は高い感受性01ngmLおよび有意な低い交差反応を提供する。52タキソール、バッカチンIII、および他のタキサンの抽出タキサンの上清からの抽出は存在濃度に依存していくつかの方法により成し遂げられた。十分量のタキサンが液体倍地中に存在するとき、試料はとても迅速かつ効率的に調製された。培地を完全に乾燥し真空中で、測定された量のメタノールを加えた。この混合物を超音波により完全に溶解するまで、または試料の分散が達成されるまで振盪した。HPLC解析に先立ち遠心により固体を除去した。量的回収は1mgLのレベルであったが、検出レベルは01mgL以下であった。タキサンの培養上清中の濃度が非常に低いとき1mgL以下は培地は3倍量のメチレンクロライドとイソプロピルアルコールとの混合液により抽出した。有機層を乾燥で減少させ、計量したメタノールの中に再構成した。多くの抽出では9095のタキソール、セファロメニン、およびバッカチンIIIが06mgLのレベルで回収された。上清のタキサン濃度が5mgLを越えるときはより迅速な試料調製を用いた。上清1に対し容量3の01酢酸を含むメタノールに混合する。この混合を30分間音波撹拌し、濾過し、HPLC解析を行った。全ブロス試料細胞を含む培養上清は手順の節で記述したのと同様の方法で調製した。培地1に対し容量3の01酢酸を含むメタノールに混合した。この混合物は30分間超音波撹拌し、さらに30分間静置し、濾過し、HPLC解析した。細胞物質は、新鮮に回収した細胞を凍結しおよび引き続き真空乾燥し、およびメタノールソックスレーを50サイクル繰り返し行うことにより抽出した。メタノールは回転式真空機により濃縮し100倍、試料はHPLCにより解析した。一般に、70から80のタキサンは10から15の測定可能な分解とともに回収された。ソックスレーに先立つ試料の乾燥を十分に行うと、タキソールの分解は5以下にとどまることが後に判明した。固体培地およびカルスの抽出はタキサンレベルが低いときの細胞の抽出と等しい。しかし、最終メタノール抽出でのメチレンクロライドIPAと水の分離はいつも引き起こされる。タキサンレベルが5mgLを越えるとき、全培地の抽出法は固体培地上のカルスの試料の調製に適用される。53高性能液体クロマトグラフィー法高性能液体クロマトグラフィー解析は、CM3500CM3200ポンプから構成されるLDC2勾配高圧混合解析系、CM4100可変容量自動試料調製機、およびコンピューターに接続したSM5000光ダイオード光線検出器を用い、高炭素注入ディフェニルカラムにおいて行われた。EldexCH150カラムオーブンにより、カラム温度は35°Cに制御された。タキサンのHPLC定量解析は、以下の2成分勾配溶出法を用い行った。クロマトグラフィー法は類似のいくつかの公表された方法を用い、トリフルオロ酢酸を含むリン酸緩衝液の使用および長勾配の適用などの改良とともに行われた。これらの改良は混合物からのタキソールおよび他のタキサン類の分解能を有意に向上させる。タキサン類の比保留時間は以下に示す。タキソールは、用いたカラムとハードウェアに依存して31分から33分の間で溶出する。タキソール、セファロマニン、およびバッカチンIIIの保留時間は国立ガン協会より得た真性試料を用いて決定した。上にまとめた他のタキサン類の保留時間は、HauserChemicalから提供された解析標準品と比較した。既知のタキサン類の同定は保留時間および紫外線スペクトルの比較に基づいて行った。タキソールおよびバッカチンIIIの紫外線スペクトルと類似のUVスペクトルを示すが、これらのタキサン類の比保留時間を示さない化合物はタキサン類と考えられる。タキソール、セファロマニン、およびバッカチンIIIの定量は真性物質から決定された係数に基づいて行った。10デアセチルバッカチンIIIの定量はバッカチンIIIに対し決定された係数を用い行われた。必要な場合、他のタキサン類の定量はタキソールおよびバッカチンIIIの計算に用いた係数により行われた。用語全タキサン類はタキソールおよびバッカチンIIIと類似の特異的UVスペクトルを示したタキサン類の合計を表す。Taxus培養において同定された全タキサン類は、10デアセチルバッカチンIII、9ディヒドロバッカチンIII、7エピ10デアセチルバッカチンIII、バッカチンIII、9ディヒドロ13アセチルバッカチンIII、7キシロシル10デアセチルセファロマニン、7キシロシル10デアセチルタキソール、7エピバッカチンIII、10デアセチルタキソール、7キシロシルタキソール、セファロマニン、7エピ10デアセチルタキソール、タキソール、2ベンゾイル2デアセチル1ヒドロキシバッカチンI、タキソールC、7エピタキソール、および2ベンゾイル2デアセチルバッカチンIを含む。タキサン類の特異的なUV吸光度を示さないが、重量スペクトルにおいて特異的なタキサン重量断片化特性を示す、タキサン類もTaxus細胞培養において観察された。Taxus細胞中で産生されたそのようなタキサン類の例には、タクスウンナニンCおよびその類似体およびその誘導体が挙げられる。各標準品は典型的に注入され最初標準品、次いで3または4試料、各3成分の面積を227nmクロマトグラムから計算した。各成分の係数はデータの線形最小2乗解析により得られた。10μLの各試料が注入され、注入当たりの量は標準データ回帰に基づき計算された。これらの結果は1リットル当たりの総量または乾燥重量パーセントに換算された。図4に上清試料の典型的クロマトグラムを示す。54迅速高性能液体クロマトグラフィー法上記の方法に加え、いくつかのHPLCの迅速な方法がより多くの試料を処理できるようにするために開発された。以下にこれらの方法のうち2つの詳細を示す。方法1迅速高性能液体クロマトグラフィーは、環境温度において前述のハードウェアを用い、PhenomenexCurosilGカラム行った。タキサン類の定量HPLC解析は以下に示す2成分勾配溶出法で行った。タキサン類に観察された比保留時間は以下に示す。タキソールは用いたカラムおよびハードウェアに依存して約8分で溶出した。タキソール、バッカチンIII、および10デアセチルバッカチンIIIの標準品は50mgL10mgL、および1mgLレベルで調製した。標準品を最初に注入し、その後9試料を注入し、各3成分の面積を227nmクロマトグラムから算出した。各成分の係数はデータの線形最小2乗解析により得られた。10μLの各試料を注入し、1リットル当たりの量を試料の希釈および標準試料のデータ回帰に基づくピーク面積から計算した。方法2迅速高性能液体クロマトグラフィーは前述のハードウェアを用い、環境温度において、PhenomenexIBSILカラムで行った。タキサン類の定量HPLC解析は以下の2成分勾配溶出法で行った。タキサン類に観察された比保留時間は以下に示す。タキソールは用いたカラムおよびハードウェアに依存して約95分で溶出した。定量は前述のように行った。上記の方法の流速および勾配間隔および時間についての修飾によって、植物細胞培養解析にの最適なクロマトグラフィーが行われるこ々も見いだされた。54.タキソールのMSMS確認細胞培養上清中のタキソールの同定のため、フローインジェクションとイオンスプレー常圧化学イオン化とを組み合わせたMSMS法図6に示されるを用い確かめた。図6にあるデータを得るのに用いた手順の詳細を以下に示す。重量スペクトル計測機:SciexAPI3の3重4極子常圧イオン化源。窒素を遮断ガスとしてして用い、アルゴンをCIDスペクトルの衝突ガスとして用いた。界面:イオンスプレー界面はイオン蒸発イオン化機電気スプレーにより産生された。ゼロガスを噴霧ガスとして用いた。LCポンプ5μL分で作動するABI140B二重シリンジポンプ装置を使用。溶剤:5050アセトニトリルH2O2mMNH4OAc01ギ酸。注入量:5μL、スペクトルは全てフローインジェクション注入で求めた。この方法により、細胞培養試料中におけるタキソールの明確な存在の確認およびHPLCの結果によく一致する定量結果が得られた。実施例6さまざまな種からのタキソールの生産さまざまなTaxus種培養からのタキソールの生産を表5にまとめた。カルスは20日暗黒下で各種毎に示される固体培地において培養された。細胞および培地を一緒に乾燥し、メタノール抽出し、示したようにELISAまたはHPLCにより検定した。実施例771増殖培地における生産タキソールおよびタキサン類の生産は、Taxuschinensis細胞系統K1の増殖培地Aへの移植の最初の2日間に開始した。15日において観察される最大タキソールは881μgフラスコであり、044mgLに相当する。このうち461は細胞外培地に存在した。15日目に、全タキサン濃度は7287μgフラスコ、または36mgLとなり、このうち586が細胞外培地に存在した。生存率は蛍光染色実施例4により計測され常に90以上であった。このことは細胞外タキソールおよびタキサン類は細胞の溶解によるものではなく、分泌によるものであることを示唆する。タキソール、バッカチンIIIおよび関連タキサン類の生産レベルを、タキサン生合成用の増強剤を添加しないさまざまな異なる増殖条件表2および他の実施例において詳しく述べたにおいて、さまざまに異なる細胞系統により決定した。これらの回収データは細胞は増殖に最適な条件で培養され、タキサン生合成条件でないとき、タキソール生合成レベルは典型的には05mgL以下であり、常に2mgL未満であり、容量当たりのタキソール生産活性は典型的には003mgL日から007mgL日の範囲にあり、常に03mgL日未満であった。同様にバッカチンIII生産レベルは典型的には05mgL以下であり、常に1mgL以下であった。容量当たりのバッカチンIIIの生産活性は典型的には003mgL日以下であり、常に015mgL日未満であった。同様に全タキサン価のレベルは典型的には5mgL未満であり、常に20mgL以下であった。容量当たりの全タキサン生産活性は、典型的には1mgL日未満であり、常に3mgL日未満であった。72生産増強のための培地交換タキソールおよび全タキサン生産活性の有意な改良は、9日目における無菌的培地Aの吸引除去および新鮮培地の添加、および同じ処置の12日目の繰り返しによって認められた。実験は15日間で打ち切られ、結果は図2に示される。培地交換による重要な生産活性の増加は表6にまとめた。タキソールおよびタキサン類の総生産量は、上記処置を施さない対照と比較して46倍に高まった。重要なことに、細胞外培地から回収されるタキソールは49倍、全タキサン類は59倍に、培地交換しなかった対照に比較して高まった。タキソールおよび全タキサン生産活性の増加、およびさらに細胞外への産物の蓄積を引き起こす注目すべき能力は、効率的操作、細胞の再使用を伴う連続的工程、およびその後の精製工程の簡易化のために重要である。73.増殖培地におけるタキサン生産に対する光の効果光は光合成だけでなく、植物細胞培養中の2次的代謝にもさまざまな面で重要な役割を果たす。実施例4、71および72に記載した実験は暗黒条件で行ったが、Taxuschinensis培養の光への反応をここで記述する。1グラムの生重量の7日目Taxuschinensis系統K1の細胞を125ml三角フラスコ中の25mlの生育培地A表2参照に移植し、24±1°Cにおいて回転振盪機で120rpmで培養した。同じフラスコを暗黒条件および標準GroLuxランプに3フィート離しておいた。ランプのスペクトル特異性は図3に示される。結果は表7に示される。培養を光に曝すことは全タキサンのレベルおよび細胞外の蓄積に影響しなかった。しかしタキサンの内容は有意に2つの処理で変化した。たとえば光下で培養したものはタキソールを暗黒条件下のものより28倍も多く生産した。細胞外タキソールの割合もまた暗黒処理のものより有意に高かった。光処理の使用、特に特異的スペクトルでの使用は、タキソールの生産のための細胞培養工程において有用でありうる。実施例8エリシターエリシターという単語は、植物細胞培養物に加えられたとき二次代謝の増加をひきおこす生物学上のまたは生物の、および非生物学上のまたは無生物の起源を有する化合物を意味する。多くのエリシターが有効であるとわかっているが、代表例、すなわち、キトサングルタメートの使用が、本明細書中に詳しく記載されている。キトサンは、いくつかの植物細胞培養物組織においてはエリシターとして以前に試されたが、褐色化および生存率の損失などの毒性を伴う反応は、キトサンの使用を非実用的にする。事実、そのような毒性反応は、論文において報告された多くのエリシターの共通の欠点である。特にキトサングルタメートなどの化学的に修飾されたキトサンの使用により、毒性効果を回避しつつ、タキソールおよびタキサン生合成を誘導することは新しいアプローチである。培地Dにおいて7日から8日成長させたTaxuschinensis系統K1の懸濁液はmirachlothフィルターを有する滅菌ブフナー漏斗の使用で無菌的に吸引濾過された。新鮮な2グラム重量の細胞は、125mlエルレンマイヤーフラスコにおいて25mlのC培地表2参照へ無菌的に移された。005のキトサングルタメート溶液は、新たに調製され、および022μmカートリッジフィルターを通して濾過滅菌された。1g乾燥重量当たり165ミリグラムのエリシターの濃度となるように、この溶液の825μlを実験の開始時にフラスコに加えた。フラスコは、暗やみにおいて110rpmで旋回撹拌器で24プラスマイナス1°Cで保温培養された。フラスコは15日で破壊的に試料とされ、および成長、細胞の色および培地の観察および細胞の生存率が記録された。試料は実施例5において記載されたようにタキサンの分析に付した。この実験の結果は表8において示されている。エリシター処理は、非処理の対照標準よりも細胞当たりの全タキサン生産量が多く、ささやかな改良の結果となった。エリシターの非毒性の性質は、両方の処理において観察される高生存率から明白である。実際に、対照標準に比べてエリシター処理において増加した乾燥重量は再現性をもって観察された。細胞の高濃度も加味すると、エリシター処理においては全タキサンの1.8倍の力価、すなわち758mgl対対照標準42.4mglの結果となった。細胞当たりの基準および力価においての比較の両方で、エリシター処理はタキソール生合成の増加の結果をもたらしたる。分泌の程度も、対照標準に比べエリシター処理のほうがより高かった。本明細書中に記載されているエリシター処理は、タキソール産物の増加、より有利な産物の側面、産物分泌の増加および細胞の高生存率の保持力の結果となる。これらの生産の特性は、タキソール生産の細胞の培養過程にかなりの改良を表す。実施例9産生培地開発実施例6において記載された濃度を越えるタキソール生産力の増加のための努力においては、特別な産生培地を計画するために栄養濃度は処理された。培地Dにおいて成長させたTaxuschinensis系統K1の7日から8日たった懸濁液は、MIRACLOTHアクリル酸のバインダーを含むレーヨンポリエステル布地フィルターを有する滅菌ブフナー漏斗の使用で無菌的に吸引濾過された。新鮮な500mg重量の細胞は、5mlの産生培地BおよびC表2参照へ無菌的に移された。その容器は暗やみにおいて110rpmで旋回撹拌器で24プラスマイナス1°Cで18、25および42日のいろいろな時間の期間で保温培養された。処理は破壊的に試料とされ、および成長、細胞の色および培地の観察、および細胞の生存率が記録された。試料は実施例5において記載されたようにタキサンの分析をされた。この実験の結果は表9において示されている。9118日培養の結果タキサンおよびタキソールのかなりの濃度の生産によりTaxuschinensis細胞培養は培地の組成物の変化に応答する。これらのデータは表9において要約され、および試料のクロマトグラムは図4において示されている。培地Bにおいては、998mglの全タキサンが生産され、241mglのタキソールを含んだ。培地Cにおいては、110mglの全タキサンが生産され、213mglのタキソールを含んだ。乾燥重量の基準では、細胞は、培地Bにおいては018乾燥重量タキソール、培地Cにおいては0065乾燥重量タキソールを生産した。92長期培養TaxuschinensisK1系統の25および42日の長期培養後のタキソールおよびタキサンの生産は、培地Cにおいて研究され、その結果は図5において要約されている。以下に重大な観察が要約されている:iTuxus培養懸濁液は、タキソールおよびほかのタキサンのかなりの濃度を生産することができる。もっとも高い集積は42日で起こり、032の乾燥重量タキソール、および062の乾燥重量タキサンを含んだ;最終の培地体積に基づくタキソールの力価153mglおよび全タキサンの力価295mglに相当した。タンデム質量分光測定法によるこの試料の分析は、図6において示されたようなタキソールの存在を確認した。MSMSによる定量は、HPLCと非常に良い一致を示した。ii25日から42日の間のタキソール生合成の速度は、17日間においては直線的な生産であると仮定すると、1日につき、1リットル当たり76mgタキソールであった。この速度は、最初の25日においての生産速度よりも有意に高い。25日および42日の間の全タキサンの生合成の速度は、1日につき、1リットル当たり123mgであった。タキソール、バッカチンIII、および全タキサンの生産力の体積の平均は、それぞれ、36、05、および70mgldayであった。iii実施例7において記載された急速増殖条件などのタキサン生合成は増加されない急速増殖条件と比較して、産生培地の定式化は特定のタキソール含有量において45倍の増加の誘導も可能である。iv望ましくないタキサン産物を最小限度にし、産物スペクトルを希望する最終産物タキソールへの生合成を漏斗を通り抜けるようにする処理も可能であった。たとえば、25日では、タキソールは全タキサンの28を構成しおよび42日では、全タキサンの52を構成したが、それに対して生育培地実施例71参照においては、タキソールは全タキサンの12.2しか構成しなかった。処理した産物の側面のこの能力は、下流部門の精製および調節結果の純度に関わる産物に重要な影響を有するだろう。たとえば、タキサン副産物、セファロマニンの生産を押さえる能力は樹皮からのタキソールの精製に比べて、後の工程での精製を非常に単純化させる可能性がある。vTaxus細胞培養物はタキソール42日で87およびほかのタキサンのかなりの量の分泌を誘導した。細胞外タキソールおよびタキサンの存在は細胞溶解液に帰するというよりはむしろ分泌に帰するということは、いくつかの独立した観察により確証される:連続した生合成が25日と42日の間に起こり、このことは細胞は生きていておよび活動したことを示唆した。独立した観察は産生培地においては18日後に70以上の生存率が観察されたということを示した。異なるタキサンの異なる割合が分泌された。もし細胞が溶解するとしたなら、培地においての割合は異なるタキサンでも同じであるはずである。viこのTaxus細胞系統が産物濃度が非常に高い細胞外環境において生長し、および高い割合でタキソールを生産する能力をもつことは特に注目すべき価値がある。viiこれらの結果が得られるTaxus細胞系統は細胞の高濃度の増殖を急速にすることも可能であり、および急速増殖条件下で20世代後にも報告された生産性を明白にし、このことはその安定性および商業上の潜在能力を証明する。以前に報告された結果よりも、本明細書中に記載されている条件下でのTaxuschinensisの細胞系統により生産されるタキソールおよびタキサンの濃度は35から150倍高い。たとえば、Christenetalは培養の2から4週間後Taxusbrevifoliaの培養懸濁液より1から3mglのタキソールの生産を報告した。WickeramesinheおよびArtecaはTaxusmediaの細胞培養においては、乾燥重量の0009のタキソールの生産を報告した。要約すると、我々のデータはTaxuschinensis培養の念入りな開始および選択をもって、および特別に処理された生育培地条件をもって、細胞は高濃度の増殖の誘導も可能だろう。これらの細胞が産生培地条件に移されたとき、細胞は長期間に高い生存率を維持してタキソールおよびほかのタキサンのかなりの濃度を生合成および分泌することも可能である。提起的な培地の交換、光、および産生培地をもつエリシターの混合は、多くの協同性の生産性の増加の結果となる。これらの特性は、組織培養技術の使用のタキソールおよびタキサンの生産の十分な商業上の過程の重大な必要条件である。実施例10101銀の使用のタキサン生産の増加銀、化合物を含む銀の形態において、銀混合体、あるいは銀イオンは、Taxus種の細胞培養においてのタキソール、バッカチンIII、およびタキサン生合成の有用な増加因子であることが発見された。銀およびほかの増加因子の組み合わせもまたタキサン生産の高い割合の獲得および維持においては有用であることが発見された。培地L表2において培養されたKS1ATaxuschinensis懸濁液の7日たった細胞はMIRACLOTHフィルターにあわせた滅菌したブフナー漏斗の使用で無菌的に吸引濾過された。15から20の範囲において新鮮な細胞の濃度を与えるため、約075から1グラム重量の新鮮な細胞は表10において示された所定の組成物の培養培地の4から5mlへ植えつけられた。その容器は暗やみにおいて110rpmで旋回撹拌器で25プラスマイナス1°Cで保温培養された。蒸発分は滅菌された蒸留水の付加により補正された。全液の試料すなわち細胞外および細胞内のタキサンの両方は周期的な間隔で得られ、および実施例5において概説された方法にしたがってHPLCにより処理および分析がされた。表10において要約されたデータはタキソール、バッカチンIII、およびほかのタキサンの生産は化合物を含むいろいろな銀によりうまく増加させられるということを指し示す。化合物および異なる逆イオンを含む異なる銀の多様性の増加を示している表10において説明したように、この増加は第一に培地にある銀の存在に帰する。これらの生産の濃度は増加されない培養において観察された生産の濃度その生産濃度は実施例7において詳しく述べられているよりも重大に高い。102チオ硫酸銀の使用のタキサン生産の増加毒性の考慮および調製物および保管の容易に基づくと、チオ硫酸銀は二次的な実験において使用される。チオ硫酸銀の調製のために使われる方法は以下であった:198gのチオ硫酸ナトリウム5水和物は80mlの水に溶解された。いきおいよく全体をかき回して20mlの01M硝酸銀溶液が加えられ、その結果100mlの20mMのチオ硫酸銀の貯蔵溶液となった。チオ硫酸カリウムは同等の効果のある結果をもつチオ硫酸ナトリウムの適所に使用されることも可能であった。その貯蔵溶液は所定の実験の開始時に細胞培養培地のなかへ022μMカートリッジフィルターを用いて滅菌濾過された。チオ硫酸銀溶液と同様なもう一つの調製方法もまた適合される。細胞培養実験計画案は表10において記載された実験のために記載されたものと同様であった。表11はTaxuschinensisの異なる多くの細胞培養の一つの増加因子として銀の使用により獲得されたデータを要約した。これらのデータは銀は一般的にタキサン生合成の基本的な増加をもたらすということを示す。いかなる所定の場合において観察された特別な産物の側面は細胞の系統および培養培地の特性を反映する。銀イオン混合体は成長調節、炭素源、塩、微量元素、およびそのようなものなどの生合成の好む培地においてはほかの因子と組み合わせにおいて使用されるときタキサン生産の増加においてとくに効果的だろう。実施例11ジャスモン酸メチルおよびジャスモン酸関連化合物の使用のタキサン生産の増加ジャスモン酸および関連化合物と同様に、ジャスモン酸のメチルエステルジャスモン酸メチルは、Tuxus種の細胞培養においてタキサン生合成の増加因子として有用であることが発見された。ジャスモン酸メチルおよびほかの増加因子の結合もまたタキサン生産の高い割合の獲得および維持においては有用であることが発見された。培地M表2において培養されたTaxuschinensis懸濁液の7日たった細胞はMIRACLOTHフィルターにあわせた滅菌したブフナー漏斗の使用で無菌的に吸引濾過された。15から20の範囲において新鮮な細胞の濃度で、細胞は表12において示された所定の組成物の培養培地の4から5mlへ植えつけられた。その培養物は暗やみにおいて120または180rpm容器の大きさに依存するで旋回撹拌器で24プラスマイナス1°Cで保温培養された。蒸発分は滅菌された蒸留水の付加により補正された。全液の試料すなわち細胞外および細胞内のタキサンの両方は周期的な間隔で得られ、および実施例5において概説された方法にしたがってHPLCにより処理および分析がされた。表12はいくつかの代表的なTaxuschinensis細胞系統の増加因子としてジャスモン酸およびジャスモン酸メチルエステルの使用により獲得されたデータを要約した。これらのデータはジャスモン酸およびジャスモン酸メチルエステルは一般的にタキサン生合成の基本的な増加をもたらすということを示す。いかなる所定の場合において観察された特別な産物の側面は細胞の系統および培養培地の特性を反映する。これらの増加因子の存在において獲得されたこれらの生産の濃度は増加されない培養において観察された生産の濃度その生産濃度は実施例7において詳しく述べられているよりも重大に高い。ジャスモン酸、ジャスモン酸メチルエステル、および関連化合物は、ほかの増加因子、成長調節、炭素源、塩、微量元素、およびそのようなものなどの生合成の好む培地においてはほかの因子と結合において使角されるときタキサン生合成の効果的増加因子である。実施例1234メチレンジオキシ6ニトロ桂皮酸の使用のタキサン生産の増加桂皮酸類似化合物、34メチレンジオキシ6ニトロ桂皮酸および関連化合物はTuxus種の細胞培養においてタキサン生合成の有用な増加因子であることが発見された。MDNAおよびほかの増加因子の結合もまたタキサン生産の高い割合の獲得および維持においては有用であることが発見された。培地M表2において培養されたTaxuschinensis懸濁液培養SS12242の7日たった細胞はMIRACLOTHフィルターにあわせた滅菌したブフナー漏斗の使用で無菌的に吸引濾過された。細胞は15から20の新鮮な細胞の濃度の培養培地条件へ植えつけられた。その容器は暗やみにおいて180rpmで旋回撹拌器で24プラスマイナス1°Cで保温培養された。処理された培養物は試料になりおよびいろいろな時間点で実施例5において記載された方法を使用して分析がされた。蒸発分は滅菌された蒸留水の周期的な間隔の付加により補正された。全液の試料すなわち細胞外および細胞内のタキサンの両方は周期的な間隔で得られ、および実施例5において概説された方法にしたがってHPLCにより処理および分析がされた。表13はTaxuschinensis細胞培養においてタキサン生合成の増加因子として34メチレンジオキシニトロ桂皮酸の使用により獲得されたデータを要約した。これらのデータはMDNAは一般的にタキサン生合成の基本的な増加をもたらすということを示す。培地IIにおいて、すなわちMDNAおよび銀の存在においての培養は、タキサンの生産をより増加させる。いかなる所定の場合において観察された特別な産物の側面は細胞の系統および培養培地の特性を反映する。これらの生産の濃度は増加されない培養において観察された生産の濃度その生産濃度は実施例7において詳しく述べられているよりも重大に高い。実施例13増加因子の組み合わせの使用のタキサン生産の増加いろいろな増加因子は、タキサン生産においては組み合わせにおいて使用され、重大および協同性の改良を与えた。培地P、培地O、培地I、培地Mこれらの培地の組成物は表2において記載されてあるにおいて培養されたTaxuschinensis懸濁液培養の7日たった細胞はMIRACLOTHフィルターにあわせた滅菌したブフナー漏斗の使用で無菌的に吸引濾過された。細胞は20の新鮮な重量の濃度の表14において指し示されている培養培地へ植えつけられた。その培養物は暗やみにおいて180rpmで旋回撹拌器で24プラスマイナス1°Cで保温培養された。蒸発分は滅菌された蒸留水の周期的な間隔の付加により補正された。全液の試料すなわち細胞外および細胞内のタキサンの両方は周期的な間隔で得られ、および実施例5において概説された方法にしたがってHPLCにより処理および分析がされた。表14はTaxuschinensis細胞培養においてタキソール、バッカチンIII、およびタキサン生合成の増加因子のいろいろな組み合わせの使用により獲得されたデータを要約した。そのデータは増加因子の組み合わせにより個々の因子でみられるタキサン生産の増加、および増加されない条件においての生産濃度その生産濃度は実施例7において詳しく述べられているよりたくさんのタキサン生産の増加を立証する。実施例14培地交換によるタキサン生産の増加この実施例は培地において高い生産性は培地成分の補充および消費された培地の除去により維持されるのも可能であるということを立証する。細胞は最初は培地M、培地I、および培地Iにおいて培養された。これらの培養培地の詳しい組成物は表2において記載されている。これらの細胞系統の7日たった細胞はMIRACLOTHフィルターにあわせた滅菌したブフナー漏斗の使用で無菌的に吸引濾過された。新鮮な約15グラム重量の細胞は表15において指し示されたそれぞれの培養培地の45m1へ植えつけられた。その容器は暗やみにおいて120rpmで旋回撹拌器で24プラスマイナス1°Cで保温培養された。蒸発分は滅菌された蒸留水の周期的な間隔の付加により補正された。培地交換処理のために、容器において後ろの細胞を残して、消費された産生培地は一回分の培養の10から11日後に滅菌したピペットを使用して吸引して取り除かれた。その消費された上清は実施例5において記載された方法を使用して細胞外タキサンの分析がされた。最初の1回分の培養と同じ組成物の新鮮な培養培地は生産力のある細胞を含む容器に加えられた。その細胞は上で記載された同じ環境条件下で培養された。培地交換の周期は培養のさらに10から11日後に繰り返された。一回分の生産の全細胞外タキサンは表15において培地交換の生産の全細胞外タキサンと比較されている。培地交換濃縮の値は細胞懸濁液培養の体積すなわち、575mlにより分けられた細胞外培地において生産されたタキサンの全量を意味する。表15は細胞は延長期間に生産力のある状態を維持されることも可能であるということを指し示し、および実際に、細胞の生産性は繰り返された培地交換により増加されるということを指し示す。繰り返された培地交換による増加は異なる増加条件の集まり、および細胞培養の多様性に便利である。そのデータは増加されない条件においての生産濃度その生産濃度は実施例7において詳しく述べられているよりたくさんのタキサン生産の増加を立証する。実施例15給餌バッチ操作によるタキサン生産の増加培地I、および培地Lこれらの培地の組成物は表2において記載されているにおいて培養された細胞系統の7日たった細胞はMIRACLOTHフィルターにあわせた滅菌したブフナー漏斗の使用で無菌的に吸引濾過された。新鮮な約1グラム重量の細胞は表16a.において指し示された所定の組成物の培養培地の4m1へ植えつけられた。その容器は暗やみにおいて120rpmで旋回撹拌器で24プラスマイナス1°Cで保温培養された。蒸発分は滅菌された蒸留水の周期的な間隔の付加により補正された。給餌バッチ操作のため、あらかじめ決められた組成物の滅菌した飼料溶液は、たとえば11の培養液当たり1日あたり10mlの飼料溶液のように、あらかじめ決められた飼料を与える速度で培養溶液のなかへ連続的に飼料を与えられた。飼料溶液の組成物および給餌の実験計画案を含む、給餌バッチ操作の詳細は表16b.において記載されている。処理された培養物は実施例5において記載された方法の使用で試料とされおよび分析がされた。表16a.は細胞は延長期間に生産力のある状態を維持されることも可能であるということを指し示し、および実際に、細胞の生産性は給餌バッチ操作により増加されることも可能であるということを指し示し、その結果バッカチンIII、タキソール、およびほかのタキサンの高濃度の蓄積となる。特別なタキサンの関連する量は給餌実験計画案および細胞系統および培養条件の試料の組成物の相互作用を反映する。この表もまたフェニルアラニンの給餌はほかのタキサンと比例してタキソールの生産の増加の結果となるということを指し示す。そのデータは増加されない条件においての生産濃度その生産濃度は実施例7において詳しく述べられているよりたくさんのタキサン生産の増加を立証する。実施例16増加因子の組み合わせの使用のタキサン生合成の増加種々の増加因子が、タキソール、バッカチンIII、およびタキサン生産において組み合わされて使用され、重大および協同性の改良を与えた。培地Mその培地の組成物は表2において記載されてあるにおいて培養されたTaxuschinensis懸濁液培養の7日たった細胞はMIRACLOTHフィルターにあわせた滅菌したブフナー漏斗の使用で無菌的に吸引濾過された。表17において別な方法で記載されることなしに細胞は20の新鮮な重量の濃度の表17において指し示されている培養培地へ植えつけられた。その培養物は暗やみにおいて180rpmで旋回撹拌器1throwで24プラスマイナス1°Cで保温培養された。蒸発分は滅菌された蒸留水の必要に応じたの付加により補正された。全液の試料すなわち細胞外および細胞内のタキサンの両方は周期的な間隔で得られ、および実施例5において概説された方法にしたがってHPLCにより処理および分析がされた。表17はTaxuschinensis細胞培養においてタキソールおよびタキサン生合成の増加因子のいろいろな組み合わせの使用により獲得されたデータを要約した。そのデータは増加因子の組み合わせにより個々の因子でみられるタキサン生産の増加、および増加されない条件その詳細は実施例7において用意されているよりたくさんのタキサン生産の増加を立証する。実施例17給餌バッチ操作によるタキサン生産の増加培地Mこれらの培地の組成物は表2において記載されているにおいて培養された細胞系統の7日たった細胞はMiraclothフィルターにあわせた滅菌したブフナー漏斗の使用で無菌的に吸引濾過された。新鮮な約1グラム重量の細胞は表18a.において指し示された所定の組成物の培養培地の4mlへ植えつけられた。その容器は暗やみにおいて120rpmで旋回撹拌器1throwで24プラスマイナス2°Cで保温培養された。蒸発分は滅菌された蒸留水の付加により補正された。給餌バッチ操作のため、あらかじめ決められた組成物の滅菌した飼料溶液は培養溶液のなかへ連続的に飼料を与えられた。飼料溶液の組成物および給餌の実験計画案を含む、給餌バッチ操作の詳細は表18b.において記載されている。処理された培養物は実施例5において記載された方法の使用で試料とされおよび分析がされた。表18a.は細胞は延長期間に生産力のある状態を維持されうるということを指し示し、および実際に、細胞の容積測定の生産性は給餌バッチ操作により増加されうるということを指し示し、その結果バッカチンIII、タキソール、およびほかのタキサンの高濃度の蓄積となる。特別なタキサンの関連する量は給餌実験計画案および細胞系統および培養条件の試料の組成物の相互作用を反映する。そのデータは増加されない条件においての生産濃度その生産濃度は実施例7において詳しく述べられているよりたくさんのタキサン生産の増加を立証する。ほかの側面、利点および修飾は発明が関係する作品において理解されるかもしれないが、理解の明快の目的のため特別な実施態様の組み合わせにおいて図解および例としたいくつかの詳細において前記の発明が記載された。発明の予知に限界はないが、前記の記載および例は図解される。その作品において理解された目的のような発明を実行するための上記に記載された方法の修飾は発明の余地の中に意味され、このことは追加された請求項によりのみ限られる。この詳述において言及されたすべての刊行物および特許申請はこの発明が関係する作品において理解されたそれらの理解の水準を示す。それぞれ独立した刊行物または特許申請が参考文献により編入されたことを特別におよび独立に指し示されたように全ての刊行物および特許申請は同じ程度の参考文献によりここに編入された。"