"膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団であって、前記集団の50超の細胞がPDX1及びNKX6.1を共発現する、細胞集団。前記集団の60超の細胞がPDX1及びNKX6.1を共発現する、請求項1に記載の細胞集団。前記集団の70超の細胞がPDX1及びNKX6.1を共発現する、請求項1に記載の細胞集団。前記集団の80超の細胞がPDX1及びNKX6.1を共発現する、請求項1に記載の細胞集団。前記集団の90超の細胞がPDX1及びNKX6.1を共発現する、請求項1に記載の細胞集団。細胞集団の50超の細胞がPDX1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する前記細胞集団を生成する方法であって、該方法は、a.多能性幹細胞集団を培養する工程と、b.前記多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系definitiveendodermlineageに特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、c.前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する前記細胞集団を、プロテインキナーゼC活性化因子を追加した培地の中で、前記膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を含む方法。前記プロテインキナーゼC活性化因子が、2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニル-2,4-ペンタジエノイルアミノベンゾラクタム、インドラクタムV、ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート、及びホルボール-12,13-ジブチレートからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。前記プロテインキナーゼC活性化因子が、2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニル-2,4-ペンタジエノイルアミノベンゾラクタムである、請求項6に記載の方法。前記2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニル-2,4-ペンタジエノイルアミノベンゾラクタムが、約20nM~約500nMの濃度で使用される、請求項8に記載の方法。プロテインキナーゼC活性化因子を追加した前記培地が、BMP阻害能を有する因子、TGFβ受容体シグナル伝達阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子からなる群からの少なくとも1つの因子を更に追加される、請求項6に記載の方法。BMP阻害能を有する前記因子がノギンである、請求項10に記載の方法。ノギンが、約50ng/mL~約500μg/mLの濃度で使用される、請求項11に記載の方法。ノギンが約100ng/mLの濃度で使用される、請求項11に記載の方法。前記TGFβ受容体シグナル伝達阻害剤がALK5阻害剤である、請求項10に記載の方法。前記ALK5阻害剤がALK5阻害剤IIである、請求項14に記載の方法。ALK5阻害剤IIが、約0.1μM~約10μMの濃度で使用される、請求項15に記載の方法。ALK5阻害剤IIが約1μMの濃度で使用される、請求項16に記載の方法。前記線維芽細胞増殖因子がFGF7である、請求項10に記載の方法。前記線維芽細胞増殖因子がFGF10である、請求項10に記載の方法。前記線維芽細胞増殖因子が、約50pg/mL~約50μg/mLの濃度で使用できる、請求項10に記載の方法。したがって、β細胞に更によく類似する機能性インスリン発現細胞を生成するための、インビトロ法開発の必要性が今も大いに求められているままである。本発明は、細胞集団の50超の細胞がPDX1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成することにより、ヒト胚性幹細胞からの、インスリンを発現する細胞への分化効率を改善させるという代替アプローチを用いた。一実施形態において、本発明は、細胞集団の50超の細胞がPDX1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞集団を、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる方法を提供し、この方法は以下の工程、a.多能性幹細胞集団を培養する工程と、b.多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系definitiveendodermlineageに特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、c.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団をプロテインキナーゼC活性化因子を追加した培地で処理することにより、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を含む。一実施形態において、本発明の方法によって産生された膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の中の50を超える細胞は、PDX-1及びNKX6.1を共発現する。開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、発明を実施するための形態を本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を、説明又は例示する下記の小節に分割する。定義幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し分化して子孫細胞を生成するという、これらの両方の能力で定義される未分化細胞であり、子孫細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉内胚葉、中胚葉及び外胚葉から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞への注入後、全てではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。幹細胞は、発生能によって、1全ての胚種及び胚体外細胞型を生じさせ得る能力を意味する全能性、2全ての胚細胞型を生じさせ得る能力を意味する多能性、3細胞系の小集合を生じさせ得るが、全て特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じさせ得る能力を意味する複能性例えば、造血幹細胞HSCは、HSC自己再生、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素例えば、血小板を含む子孫を産生できる、4複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系の小集合を生じさせる能力を意味する少能性、並びに51つの細胞系例えば、精子形成幹細胞を生じさせる能力を意味する単能性に分類される。分化は、特殊化されていないunspecialized未拘束のuncommitted又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化を誘導された細胞は、細胞系内でより特殊化された拘束された状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語拘束されたは、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化し又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて又は拘束されていない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞から由来したか、またどの細胞を生じさせることができるかを規定する。細胞系は、発生及び分化の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものである。系特異的マーカーとは、対象とする系の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、拘束されていない細胞の対象とする系への分化を評価するために使用することができる。本明細書で使用するとき、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞又はステージ1細胞又はステージ1とは、以下のマーカー、即ち、SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、短尾奇形、Mix-様ホメオボックスタンパク質、FGF4、CD48、eomesoderminEOMES、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99、又はOTX2のうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。本明細書で使用するとき、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞とは、以下のマーカー、即ち、PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9、又はPROX1のうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。本明細書で使用するとき、胚体内胚葉は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーを発現する:HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、グースコイド、C-Kit、CD99、及びMIXL1。本明細書で使用するとき、マーカーは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。本明細書で使用するとき、膵臓内分泌細胞又は膵臓ホルモン発現細胞又は膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞とは、以下のホルモン、即ち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することが可能な細胞を指す。多能性幹細胞の単離、増殖及び培養多能性幹細胞の特徴付け多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原SSEA3及び4、並びにTra-1-60及びTra-1-81と呼ばれる抗体を使用して検出可能なマーカーのうちの1つ以上を発現することができるThomsonetal.、Science282:1145,1998。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、SSEA-4、Tra-1-60、及びTra-1-81の発現が減少し存在する場合、SSEA-1の発現が上昇する結果になる。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を4パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者VectorLaboratoriesBurlingameCalif.によって記載されるようにVectorRedを基質として現像することによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有する。未分化の多能性幹細胞はまた、RT-PCRにより検出されるように、一般にOCT4及びTERTも発現する。増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、3つの胚葉の全て、即ち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化し得るものである。多能性幹細胞の多能性は、例えば細胞を重症複合型免疫不全症SCIDマウスに注入し、4パラホルムアルデヒドを使用して形成した奇形腫を固定した後、それらを3つの胚葉からの細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を3つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なGバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は正常な核型を有する細胞を獲得することが望ましく、正常な核型とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体が全て揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性幹細胞の供給源使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期必ずしもではないが、通常は妊娠約10~12週よりも前に採取した前胚性組織例えば胚盤胞など、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚性幹細胞株H1、H7及びH9WiCellなどのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株である。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される1次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、BG01vBresaGen,Athens,GA等の変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。一実施形態において、ヒト胚性幹細胞は、Thomsonetal.米国特許第5,843,780号;Science282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff.,1998;Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:7844,1995に記載の通りに調製される。多能性幹細胞の培養一実施形態において、多能性幹細胞は、フィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。代替的に、多能性幹細胞は、本質的にフィーダー細胞が存在しないにも関わらず、実質的な分化を受けないで多能性幹細胞の増殖を支持する培養液システム中で培養される。無フィーダー培養液中での分化なしでの多能性幹細胞の増殖は、以前に他の細胞型で培養することによって馴化された培地を使用して支持される。代替的に、無フィーダー培養液中での分化なしでの多能性幹細胞の増殖は、合成培地を使用して支持される。一実施形態において、多能性幹細胞は、ReubinoffらNatureBiotechnology18:399~4042000に開示されている方法に従って、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、ThompsonらScience6November1998:Vol.282.no.5391,pp.1145~1147に開示されている方法に従って、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、RichardsらStemCells21:546~556,2003に開示されているフィーダー細胞層の任意の1つの上で培養されてもよい。一実施形態において、多能性幹細胞は、WangらStemCells23:1221~1227,2005に開示されている方法に従って、ヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。代替実施形態において、多能性幹細胞は、StojkovicらStemCells200523:306~314,2005に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、MiyamotoらStemCells22:433~440,2004に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、AmitらBiol.Reprod68:2150~2156,2003に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、InzunzaらStemCells23:544~549,2005に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。一実施形態において、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2002/0072117号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第6642048号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開特許WO2005014799号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、XuらStemCells22:972~980,2004に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2007/0010011号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0233446号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第6800480号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開特許WO2005065354号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。一実施形態において、多能性幹細胞は、CheonらBioReprodDOI:10.1095/biolreprod.105.046870,October19,2005に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、LevensteinらStemCells24:568~574,2006に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0148070号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0244962号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開WO02005086845号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。多能性幹細胞は、好適な培養基質上で平板培養することができる。一実施形態において、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体-リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養培地は、MATRIGEL登録商標BectonDickensonである。MATRIGEL登録商標は、Engelbreth-HolmSwarm腫瘍細胞からの可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸塩等を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な分布で平板培養されてもよい。これら全ての特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから利益が得られ、かつ当業者により容易に決定可能である。好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地DMEM、GibcoNo.11965-092;ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地KODMEM、GibcoNo.10829-018;ハムF12/50DMEM基礎培地、200mML-グルタミン、GibcoNo.15039-027;非-必須アミノ酸溶液、GibcoNo.11140-050;β-メルカプトエタノール、SigmaNo.M7522;ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF、GibcoNo.13256-029などから調製することができる。多能性幹細胞からの、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を産生するための方法を提供し、この方法は、a.多能性幹細胞集団を培養する工程と、b.多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、c.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、プロテインキナーゼC活性化因子を追加した培地で処理することにより、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を含む。本発明の一態様において、本発明は、集団の50超の細胞がPDX-1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の60超の細胞がPDX-1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の70超の細胞がPDX-1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の80超の細胞がPDX-1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の90超の細胞がPDX-1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、膵内臓分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を形成するために更に処理されてもよい。分化の効率は、所望の細胞型に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する作用剤例えば、抗体などに、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelら、eds.2001年付録参照、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー分析FACS例えば、Harlow及びLane、UsingAntibodies:ALaboratoryManual、ニューヨーク:ColdSpringHarborLaboratoryPress1998年参照が含まれる。多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。例えば多能性幹細胞マーカーとしては、以下のもののうちの1つ以上の発現が挙げられる:ABCG2、CRIPTO、FOXD3、コネキシンCONNEXIN43、コネキシン45、OCT4、SOX2、ナノグNANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、又はTra1-81。多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばCXCR4等のタンパク質マーカーを特異的に認識する作用剤例えば、抗体等に暴露することにより、分化した細胞を精製することができる。本発明における使用に好適な多能性幹細胞は、例えばヒト胚性幹細胞株H9NIHcode:WA09、ヒト胚性幹細胞株HlNIHcode:WA01、ヒト胚幹細胞株H7NIHcode:WA07、及びヒト胚性幹細胞株SA002Cellartis,Swedenを含む。多能性細胞に特徴的な以下のマ-カー、即ち、ABCG2、CRIPTO、CD9、FOXD3、コネキシン43、コネキシン45、OCT4、SOX2、ナノグ、hTERT、UTFI、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60及びTra1-81のうちの少なくとも1つを発現する細胞も本発明での使用に適している。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、ノーダルNodal、FGF8、短尾奇形、Mix様ホメオボックスタンパク質、FGF4、CD48、エオメソダーミンEOMES、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99、及びOTX2からなる群から選択される。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞は本発明での使用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9、及びPROX1からなる群から選択される。膵内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵内胚葉細胞である。膵臓内分泌系に特徴的なマーカーは、NGN3、ニューロDNeuroD、NKX2.2、PDX1、NKX6.1、PAX4、及びPAX6からなる群から選択される。一実施形態では、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモン:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することができる。膵臓内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも1つ発現する細胞は、本発明での使用に好適である。本発明の一態様において、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、以下の、PDX1、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、ニューロD、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4、及びPAX6の転写因子の少なくとも1つとを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。多能性幹細胞の、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより判定することができる。多能性幹細胞は、典型的にはそのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出されることになる。多能性幹細胞は、当技術分野における任意の方法により、又は本発明で提案される任意の方法により、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。例えば、多能性幹細胞は、D’Amourらの、NatureBiotechnology23、1534~15412005年に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。例えば、多能性幹細胞は、Shinozakiらの、Development131、1651~16622004年に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。例えば、多能性幹細胞は、McLeanらの、StemCells25、29~382007年に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。例えば、多能性幹細胞は、D’Amourらの、NatureBiotechnology24、1392~14012006年に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号11/736,908号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号11/779,311号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号60/990,529号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号61/076,889号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号61/076,900号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号61/076,908号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号61/076,915号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を産生するための方法を提供し、この方法は、a.多能性幹細胞集団を培養する工程と、b.多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、c.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、プロテインキナーゼC活性化因子を追加した培地で処理することにより、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を包む。本発明の一態様において、本発明は、集団の50超の細胞がPDX-1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の60超の細胞がPDX-1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の70超の細胞がPDX-1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の80超の細胞がPDX-1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の90超の細胞がPDX-1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。一実施形態では、プロテインキナーゼC活性化因子は、2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニル-2,4-ペンタジエノイルアミノpentadiemoylaminoベンゾラクタム、インドラクタムVILV、ホルボール-12-ミリステート-13-アセテートPMA、及びホルボール-12,13-ジブチレートPDBuからなる群から選択される。一実施形態では、プロテインキナーゼC活性化因子は、2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニル-2,4-ペンタジエノイルアミノpentadiemoylaminoベンゾラクタムである。2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニル-2,4-ペンタジエノイルアミノpentadiemoylaminoベンゾラクタムは、約20nM~約500nMの濃度で使用することができる。2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニル-2,4-ペンタジエノイルアミノpentadiemoylaminoベンゾラクタムは、本明細書でTPBと称される。一実施形態において、プロテインキナーゼC活性化因子を追加した培地は、BMP阻害能を有する因子、TGFβ受容体シグナル伝達阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも1つの因子が追加される。一実施形態では、BMP阻害能を有する因子はノギンである。ノギンは、約50ng/mL~約500μg/mLの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは100ng/mLの濃度で使用される。一実施形態では、TGFβ受容体シグナル伝達阻害剤は、ALK5の阻害剤である。一実施形態では、ALK5の阻害剤は、ALK5阻害剤IIである。ALK5阻害剤IIは、約0.1μM~約10μMの濃度で使用されてもよい。一実施形態では、ALK5阻害剤IIは1μMの濃度で使用される。一実施形態において、線維芽細胞増殖因子はFGF7である。代替実施形態では、線維芽細胞fibpoblast増殖因子はFGF10である。一実施形態において、線維芽細胞増殖因子は、約50pg/mL~約50μg/mLの濃度で使用されてもよい。一実施形態では、線維芽細胞増殖因子は50ng/mLの濃度で使用される。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵臓内分泌系のマーカーを発現する細胞への分化一実施形態において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、当技術分野における任意の方法により、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団に更に分化される。例えば、D’Amouretal,NatureBiotechnology,2006に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を処理することによって、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団に更に分化してもよい。例えば、D’Amouretal,NatureBiotechnology,2006に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を処理することによって、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団に更に分化してもよい。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル番号11/736,908号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させてもよい。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル番号11/779,311号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させてもよい。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル番号60/953,178号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させてもよい。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル番号60/990,529号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させてもよい。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル番号61/289,671号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させてもよい。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。実施例1本発明の細胞集団の形成ヒト胚性幹細胞株Hl細胞を、0.2のFBS100ng/mLのアクチビンAPeproTech;カタログ120-1420ng/mLのWNT-3aRDSystems;カタログ1324-WN/CFを追加したRPMI培地Invitrogen;カタログ:22400を有する、MATRIGEL登録商標1:30希釈BDBiosciences;カタログ356231をコーティングしたディッシュ上で1日培養した後で、0.5のFBS100ng/mLのアクチビンAを追加したRPMI培地で更に2日間にわたって処理しステージ1、次いで、a.2のFBS及び50ng/mLのFGF7を添加したDMEM/F12で3日間にわたって処理しステージ2、次いでb.1のB270.25μMのシクロパミン-KAAD2μMのレチノイン酸RA100ng/mLのノギンを添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理しステージ3、次いでc.処理1:1のB27を添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理するステージ4-基本培地-BM、若しくはd.処理2:1のB27100ng/mLのノギン1μMのALK5阻害剤IIを添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理するステージ4、又はe.処理3:1のB27100ng/mLのノギン1μMのALK5阻害剤II20nMのホルボール-12,13-ジブチレートPDBuCalbiochem、カタログ524390を添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理したステージ4。ステージ4の4日目に培養液を2回サンプリングし、INCellAnalyzer1000GEHealthcareを用いて撮像した。ウェルあたり100視野の撮像を得て、バイオアッセイ及び続く染色手順の間の任意の細胞ロスを補正した。INCellDeveloperToolbox1.7GEHealthcareソフトウェアを用いて、各ウェルから総細胞数、総PDX1発現細胞、総NKX6.1発現細胞及び総CDX-2発現細胞の測定値を得た。各複製データセットについて平均及び標準偏差を算出した。総PDX1、NKX6.1及びCDX-2の発現細胞を、全細胞集団中の割合として報告した。図2Aに示されるように、ステージ44日目、の終了時の全ての実験集団において、細胞集団のおよそ92±4がPDX1を発現した。しかしながら、PDBuプロテインキナーゼC活性化因子による処理は、基本培地処理1、又はALK5阻害剤IIノギン処理2のいずれかで処理された細胞集団と比較して、PDX1発現集団におけるNKX6.1発現細胞の割合に顕著な増加を引き起こした図2A。PDBuで処理された群では、全集団の88±4.2がNKX6.1を発現し、処理2を受けた細胞の62±8はNKX6.1を発現し、処理1を受けた細胞の46.7±0.2はNKX6.1を発現した。ステージ4のNKX6.1発現細胞のほとんどは、PDX1も発現した。これらの観察結果は、所与の細胞集団から得たPDX1発現とNKX6.1発現との画像をオーバーレイすることによって確認された図1A。これらのデータは、プロテインキナーゼC活性化因子を追加した培地で細胞を処理することによって、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団においてPDX1及びNKX6.1を共発現する細胞の割合が増加したことを示している。処理1を受けた細胞集団では、細胞の10がCDX2腸マーカーを発現した図2A。処理2又は3のいずれかを受けた細胞集団では、細胞の5未満がCDX2を発現した。いずれの場合にも、CDX2発現細胞のほとんどは、PDX1及びNKX6.1を共発現しなかった。ステージ3の細胞の並列集団を、上記処理3におけるPDBuの代わりに、次のプロテインキナーゼC活性化因子、20nMの濃度のホルボール-12-ミリステート-13-アセテートPMACalbiochem524400、又は50nMの濃度の[2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニルpheny-2,4-ペンタジエノイルアミノベンゾラクタム]TPBCalbiochem565740で同様に処理した。ステージ4の終了時に4日目、PMAで処理された細胞集団の91が、及びTPBで処理された細胞集団の90が、NKX6.1を発現した。これら処理の全てにおける総PDX1発現細胞に有意差は観察されなかった。図2Bを参照。この例は、プロテインキナーゼC活性化因子を比較的低濃度で使用して、NKX6.1発現の上方調節を容易にし、かつ膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団内におけるPDX1及びNKX6.1を共発現する細胞の割合を増加させることができることを示している。実施例2重症複合免疫不全SCID-beigeBgマウスへの、本発明の細胞の移植ヒト胚性幹細胞株H1細胞を、0.2のFBS100ng/mLのアクチビンA20ng/mLのWNT-3aを添加したRPMI培地を有する、MATRIGEL登録商標1:30希釈をコーティングしたディッシュ上で1日培養し、次いで0.5のFBS100ng/mLのアクチビンAを添加したRPMI培地で更に2日間にわたって処理しステージ1、次いでa.2のFBS50ng/mLのFGF7を添加したDMEM/F12で3日間にわたって処理しステージ2、次いでb.1のB270.25μMのシクロパミン-KAAD2μMのレチノイン酸RA100ng/mLのノギンを添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理しステージ3、次いでc.1のB27100ng/mLのノギン1μMのALK5阻害剤II50nMのTPBを添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理したステージ4。5~6週齢のオスのSCID-beigeマウスC.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdcscid-LystbgN7をTaconicFarmsより購入した。滅菌した餌と水を自由に利用できるような状態で、マウスをmicroisolatorケージ内に収容した。外科手術を準備するため、マウスをイヤータグで同定し、体重を測定し、手持ち式glucometerLifeScan;OneTouchを用いて血糖を測定した。マウスにイソフルランisolfluraneと酸素の混合物で麻酔をかけ、手術部位を小動物用はさみで剪毛した。マウスには手術前に皮下に0.1mg.kgBuprenexを投与した。70のイソプロピルアルコール及び10のポビドンヨウ素で連続的に洗浄することで手術部位を準備した。ステージ4の終了時に、1mLのガラス製ピペットを用いて細胞を機械的に回収し、続いて非接着性プレートに移し一晩培養した。マウスの手術前準備の間に、細胞を1.5mL遠心管で遠心し、次いで細胞ペレットを回収するのに必要最低限を残しつつほとんどの上清を除去した。細胞をRainin製Pos-Dポジティブディスプレイスメント式ピペットに回収し、ピペットを反転させて重力により細胞を沈降させた。移植用に充填した細胞調製物を残して過剰な培地を除去した。移植用に24G×1.9cm3/4のI.V.カテーテルを用い、腎臓皮膜を貫通させ、針を除去した。次いで腎臓被膜下でカテーテルを腎臓の遠位極まで前進させた。Pos-Dピペットチップをカテーテルのハブにしっかりと取り付け、腎臓皮膜下でカテーテルを通してピペットから5百万個の細胞を分配し、腎臓の遠位極に供給した。腎臓皮膜を低温焼灼でシールし、腎臓を解剖学的な元の位置に戻した。並行して、Post-Dピペットチップを用い、5百万個の細胞を含有している細胞凝集物を50μLデバイスに充填した。50μLデバイスはTheraCyte,IncIrvine,CAから購入した。細胞充填後にデバイスを医療用接着剤siliconetypeADowCorning,カタログ129109によりシールし、SICD/Bgマウス動物番号3及び4の皮下に移植した。5~0vicrylを用いて連続縫合することで筋を縫合し、皮膚を創傷クリップにより閉じた。マウスには手術後に1.0mg.kgMetacamを皮下投与した。マウスを麻酔から覚めさせ、完全に回復させた。移植後に、マウスを週に1回計量し、週に2回血糖を測定した。移植に続き、マウスには様々な間隔で3g/kgグルコースを腹腔内投与し、グルコース注入の60分後に、ヘパリンを少量含有している遠心管に後眼窩静脈洞から血液を吸引した。血液を遠心分離し、2本目の遠心管中に血漿を配置し、ドライアイス上で凍結させ、その後、ヒトC-ペプチドアッセイを実施するまでの間-80°Cで保管した。製造者による取扱説明書に従い、Mercodia/ALPCODiagnoticsUltrasensitiveC-peptideELISACatNo.80-CPTHU-E01,AlpcoDiagnostics,NHを用いてヒトCペプチドレベルを測定した。移植後4~6週で早くも、腎臓皮膜群及びTheracyte社製デバイスを受けた群の両方の動物血清中でヒトCペプチドが検出され、時間経過に伴って増加した図3A及び図3B。3ヵ月の終わりに、腎臓皮膜及びTheracyte社製デバイスを移植された群の両方の動物の100において、グルコース投与に応答して顕著な量の循環ヒトCペプチドを検出することができた。3ヵ月後の腎臓皮膜群におけるグルコース刺激されたヒトCペプチドの血中濃度は1.7±0.5ng/mLでありn=4、Theracyte社製デバイス移植群では1±0.5ng/mLn=2であった図3C。この実施例は、プロテインキナーゼC活性化因子によって生成されるPDX1及びNKX6.1共発現細胞集団が、インビボでインスリン分泌細胞に更に分化する能力を有することを示している。インスリン分泌細胞への更なる分化の可能性は、局所環境に依存しない。本発明者らは、腎臓皮膜及び皮下部位の中の免疫保護デバイス内の両方において、PDX1及びNKX6.1共発現細胞がインスリン分泌細胞へと更に分化し得ることを示している。実施例3本発明の細胞集団を形成するための代替方法ヒト胚性幹細胞株H1細胞を、0.2のFBS100ng/mLのアクチビンAPeproTech;カタログ120-1420ng/mLのWNT-3aRDSystems;カタログ1324-WN/CFを添加したRPMI培地Invitrogen;カタログ:22400を有する、MATRIGEL登録商標1:30希釈BDBiosciences;カタログ356231をコーティングしたディッシュ上で1日培養した後で、0.5のFBS100ng/mLのアクチビンAを追加したRPMI培地で更に2日間にわたって処理しステージ1、次いで、a.2のFBS50ng/mLのFGF7を添加したDMEM/F12で3日間にわたって処理しステージ2、次いでb.1のB270.25μMのシクロパミン-KAAD2μMのレチノイン酸RA100ng/mLのノギンを添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理しステージ3、続いて又はc.処理4:1のB2720nMのPDBu100ng/mLのノギンを添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理するステージ4、又はd.処理5:1のB27100ng/mLのノギン1μMのALK5阻害剤II20nMのPDBuを添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理するステージ4、又はe.処理6:1のB2750ng/mLのFGF1020nMのPDBuを添加したDMEM高グルコースで4日間処理するステージ4。プロテインキナーゼC活性化因子によって媒介されるPDX1及びNKX6.1を共発現する細胞の割合の増加に与える追加因子の影響を調べた。ステージ4の4日目に培養液を2回サンプリングし、上の実施例1に記載の通りに画像解析を行った。ISL1及びNEUROD1の発現も記録した。この研究では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の大部分は、PDX1の発現に陽性であった。PDX1発現細胞のほとんどもまたNKX6.1に共陽性であった。表1に示されるように、PKC活性化因子のみの追加は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団におけるNKX6.1発現細胞の形成を促進した。ステージ4の4日目までに、全集団の93はNKX6.1陽性であり、NKX6.1発現細胞のほとんど全てはPDX1の発現に陽性であった。プロテインキナーゼC活性化因子を追加した培地へのALK5阻害剤IIの添加処理5は、観察されたNKX6.1発現の増加に影響を与えなかった。細胞集団の57.1はニューロD1を発現し、細胞集団の52.4はISL1を発現し、この処理の後に内分泌前駆体細胞集団の割合が増加したことを示唆している。表1を参照されたい。この実施例から得たサンプルのPCR分析は、PDX1、NKX6.1、及びPTF1αの発現が、処理5を受けた細胞と比べて、処理4を受けた細胞集団で増加したことを明らかにした。図4A~図4D参照。その一方で、NGN3の発現の顕著な増加が、ALK5阻害剤2及びPDBuを与えられた処理5細胞で観察された。図4A~図4D参照。プロテインキナーゼC活性化因子を追加した処理6培地に対するFGF10の添加の影響もまた調べた。PDBuと組み合わせた50ng/mLの濃度でのFGF10の添加処理6は、細胞集団の90がNKX6.1を発現する膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成したが、NKX6.1発現細胞の多くはCDX2陽性でもあった。表1参照。PDX1、NKX6.1及びPTF1αのmRNAレベルは、PDBu及びノギンで処理された細胞で観察されるレベルよりも増加しなかった。図4A~図4Dされたい。この実施例は、比較的低濃度約20nMのプロテインキナーゼC活性化因子とBMP阻害剤の組み合わせを使用して、細胞の90超の細胞がPDX1及びNKX6.1を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成することができることを示している。実施例4本発明の細胞集団を形成するための代替方法ヒト胚性幹細胞株H1細胞を、0.2のFBS100ng/mLのアクチビンAPeproTech;カタログ120-1420ng/mLのWNT-3aRDSystems;カタログ1324-WN/CFを添加したRPMI培地をInvitrogen;カタログ:22400有する、MATRIGEL登録商標1:30希釈BDBiosciences;カタログ356231をコーティングしたディッシュ上で1日培養した後で、0.5のFBS100ng/mLのアクチビンAを追加したRPMI培地で更に2日間にわたって処理しステージ1、次いで、a.2のFBS50ng/mLのFGF7を添加したDMEM/F12で3日間にわたって処理しステージ2、次いでb.処理7T7:1のB270.25μMのシクロパミン-KAAD2μMのレチノイン酸RA100ng/mLのノギンを添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理するステージ3、又はc.処理8T8:1のB270.25μMのシクロパミン-KAAD2μMのレチノイン酸RA100ng/mLのノギン50ng/mLのFGF7を添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理するステージ3、次いでd.処理9T9:1のB27100ng/mLのノギン1μMのALK5阻害剤II20nMのPDBuを添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理するステージ4、又はe.処理10T10:1のB2750ng/mLのFGF1020nMのPDBuを添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理するステージ4、又はf.処理11T11:1のB2720nMのPDBu100ng/mLのノギンを添加したDMEM高グルコースで4日間にわたって処理したステージ4。ステージ4の4日目に培養液を2回サンプリングし、INCellAnalyzer1000GEHealthcareを用いて撮像した。ウェルあたり100視野の撮像を得て、バイオアッセイ及び続く染色手順の間の任意の細胞ロスを補正した。INCellDeveloperToolbox1.7GEHealthcareソフトウェアを用いて、各ウェルから総細胞数、総PDX1発現細胞、総NKX6.1発現細胞、及び総CDX2発現細胞の測定値を得た。各複製データセットについて平均及び標準偏差を算出した。総PDX1、NKX6.1及びCDX-2の発現細胞は、全細胞集団の割合として報告された。T7培地及びその後のT9培地で処理された細胞集団では、細胞集団の約80がNKX6.1を発現した。これについては、表2を参照されたい。T7培地及びその後のT10培地で処理された細胞集団では、細胞の90がNKX6.1を発現したが、この処理ではより多くのCDX2発現細胞が観察された。表2を参照されたい。T7培地及びその後のT11培地で処理された細胞集団は、細胞集団の93がNKX6.1を発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成した。その集団におけるほとんどのNKX6.1発現細胞は、PDX1も発現した。T8培地及びその後のT9培地で処理された培養液は、細胞集団の56.7がNKX6.1を発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成した。表2を参照されたい。T8培地及びその後のT10培地で処理された培養液は、細胞集団の63.5がNKX6.1を発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成し、本発明者らはこの処理の後により多くのCDX2発現細胞を観察した。表2を参照されたい。T8培地及びその後のT11培地で処理された培養液は、細胞集団の74がNKX6.1を発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成した。表2を参照されたい。NKX6.1発現細胞のほとんどはPDX1も発現した。ステージ3でレチノイン酸、シクロパミン、及びノギンで処理した後、ステージ4でPKC活性化因子を加えることにより、ステージ4の4日目までにNKX6.1及びPTF1αのmRNAレベルの上昇がもたらされた図5A~図5Dという点で、PCR分析はINCellanalysisも支持した。本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。"