"水生生物におけるウイルスにより引き起こされるウイルス感染及び感染性疾患の治療のための組成物の製造における脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドPACAPの使用。前記PACAPが、aそれの天然供給源からの単離により、b合成的に、又はc組換えDNA技術により得られるものである、請求項1に記載の使用。前記PACAPが、魚から単離されたポリペプチド配列である、請求項2に記載の使用。前記PACAPが、サケ科、クルマエビ科及び二枚貝からなる群から選択される水生生物において使用される、請求項1~3に記載の使用。前記PACAPが、ヘルペスウイルス科Herpesviridae、パポバウイルス科Papovaviridae、ドガウイルス科Togaviridae、レトロウイルス科Retroviridae、レオウイルス科Reoviridae、ビルナウイルス科Birnaviridae及びピコルナウイルス科Picornaviridaeファミリーのウイルスにより引き起こされるウイルス感染の治療において使用される、請求項1に記載の使用。脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドPACAPを含む、水生生物におけるウイルスにより引き起こされるウイルス性疾患及び感染性疾患の治療のための組成物。前記PACAPが、それの天然供給源からの単離により、b合成的に、又はc組換えDNA技術により得られるものである、請求項6に記載の組成物。経口的に、注射により、又は浸漬水浴により投与されることにより特徴付けられる、請求項6に記載の組成物。前記PACAPが、魚から単離されたポリペプチド配列である、請求項7及び8に記載の組成物。脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドPACAP及び抗ウイルス分子を含む、獣医用組合せ。前記PACAPが、それの天然供給源からの単離により、b合成的に、又はc組換えDNA技術により得られるものである、請求項10に記載の組合せ。前記抗ウイルス分子が、リバビリン又はリバビリン類似体である、請求項10に記載の組合せ。前記PACAP及び前記抗ウイルス分子が、同じ治療の間で、同時に、別個に又は一連で投与される、請求項10に記載の組合せ。水生生物におけるウイルスにより引き起こされるウイルス性疾患及び感染性疾患の治療における使用により特徴付けられる、請求項10~13に記載の組合せ。前記PACAP及び前記抗ウイルス分子が、経口的に、注射により又は浸漬水浴により投与される、請求項14に記載の組合せ。前記抗ウイルス分子が、ウイルス感染の治療のために薬学的に許容された化合物、その類似体、機能的誘導体又は活性断片である、請求項10に記載の組合せ。製剤化された食餌の一部として適用されることにより特徴付けられ、前記PACAPが、50~750μg/kgの食餌の濃度であり、前記抗ウイルス化合物が、100~2000mg/kgの食餌の濃度である、請求項15に記載の組合せ。注射により適用されることにより特徴付けられ、前記PACAPが、体重のグラムgbw当たり0.1~10μgの濃度で適用され、前記抗ウイルス分子が、1~50μg/gbwの濃度での、請求項15に記載の組合せ。浸漬水浴により適用されることにより特徴付けられ、前記PACAPが、水のリットル当たり50~1000μgの濃度で適用され、前記抗ウイルス分子が、100~2000μg/Lの水の濃度で適用される、請求項15に記載の組合せ。PACAP又はPACAPを含む獣医用組合せの養殖された水生生物への投与を含む、水産養殖におけるウイルス感染のコントロールのための方法。水産養殖では、ウイルス感染の制御において用いることができる新規の化合物又は組成物の開発が、それらがこの活動に引き起こすダメージのために、多大な興味となっている。本発明は、水産養殖におけるウイルス感染を制御する新規な代替物を提供するとの上記の課題に対する解決を、水生生物におけるウイルスにより引き起こされるウイルス感染及び感染性疾患の処置用のための組成物の製造におけるPACAPの使用によって、提供する。用語処置は、本発明の文脈において疾患開始の後に病理的発達の希薄化、低減又は減少を含む疾患軽減における任意の有益な効果と関連する。用語抗ウイルス剤は、本発明において使用されるときには、従来技術において抗ウイルス剤として定義された任意の分子若しくはその類似体、機能的誘導体又は活性断片を含む。用語脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドPACAPは、本発明において使用されるときには、この分子であって、任意の改変体PACAP27又はPACAP38にあるもの、それの自然供給源から単離されたか、又は合成か、又は組換えDNA技術により産生されたかのいずれかであるものを含む。本発明の一実施形態では、ニューロペプチドPACAPの改変体は、単独で又は公知の抗ウイルス分子と組み合わせて、魚、甲殻類及び二枚貝へ2-3日の間隔での浸漬水浴によって投与される。飼料添加物として、PACAPもまた単独で又は公知の抗ウイルス分子と組み合わせて処置される。本発明では、浸漬水浴、注射又は経口によって投与されたPACAP含有組成物が、ウイルスにより感染しかつそれらで処置された水生生物の生存度を増加させることに対して効果的であったことが示された。処置された魚の重量の減少は観察されなかった。いくつかの場合には、全体重量増加が、感染しかつ処置されていないものと比較して感染しかつ処置された動物において得られた。RT-PCRによる組織サンプル及び受容しやすい器官の分析は、感染しかつ処置された動物におけるウイルス負荷の減少を示した。この発明までは、PACAPが魚、甲殻類及び二枚貝における抗ウイルス性応答及び関与するメカニズムを調整するものであったか否かについての知識は存在しなかった。本発明は、インビトロ及びインビボの両方で、PACAPと、魚、甲殻類及び二枚貝におけるウイルスに対する応答との関係を初めて示すものである。なお、我々は、Mxタンパク質、インターフェロンγIFNγ及びtoll様受容体9TLR9といった抗ウイルス性応答に関与するPACAP分子に対する予期しない陽性効果、並びに、インビトロ及びインビボの両方で、ウイルス及び/又はポリI:Cで処置された、魚の免疫系の細胞におけるこのペプチド及びその受容体の分化制御を初めて記載する。PACAP又はPACAPと魚において公知の抗ウイルス作用を伴う分子との組合せの投与による、魚、甲殻類及び二枚貝におけるウイルス感染の処置は、技術常識において従前は明らかにもされず示唆もされてきていなかった。本発明の文脈では、PACAP及び抗ウイルス性分子の投与は同時単一の製剤ででも、一連のものでも又は時間にわたって別個であってもよい。製剤は、経口経路、注射又は浸漬水浴によって水生生物に投与される。本発明では、魚、甲殻類及び二枚貝は、PACAP及びPACAPと組み合わされた抗ウイルス性分子を含む製剤で処置される。予期せずして、ニューロペプチドPACAPが魚、甲殻類及び二枚貝において抗ウイルス活性を有することが観察された。一方で、PACAPと公知の抗ウイルス活性を伴う物質との組合せが、インビトロ及びインビボの両方で、PACAP単独と比較してより高い抗ウイルス性応答相乗効果を産することが示された。魚では、これまでのところ、抗ウイルス性応答においてPACAPには生物学的機能が何も割り当てられてきていなかった。そして、今日まで、PACAPも、セクレチン及びグルカゴンのスーパーファミリーに属する別のペプチドも、いずれも小エビ又は甲殻類においては単離されてきていなかった。これらの分類群におけるこのペプチドの現在の知識は、組換えの魚PACAPの外因性投与による小エビにおける成長刺激の実験的証拠に基づいているのみである国際的な特許出願公開番号、国際公開第2007/059714号。それゆえに、本発明までの間は、甲殻類及び二枚貝におけるウイルスに対する応答とのそれの可能となる関係についての知識は、何も存在しなかった。本発明の別の目的は、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドPACAPを含む、水生生物におけるウイルスにより引き起こされるウイルス性及び感染性疾患の処置のための組成物である。本発明の一実施形態では、組成物の一部としてのPACAPは、その自然供給源から、合成的に又は組換えDNA技術によるもののいずれかでの単離により得られる。それは、経口で、注射又は浸漬水浴によってのいずれかで投与される。本発明の一実施形態では、PACAPは魚から単離されたポリペプチド配列である。本発明は、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドPACAP及び抗ウイルス性分子を含む獣医用組合せに関する。本発明の一実施形態では、抗ウイルス性分子はリバビリン又はリバビリン類似体である。組合せの一部である要素である、抗ウイルス性分子及びPACAPは、同じ処置中において、同時に、別々に又は一連で投与される。本発明の一実施形態では、組合せは、水生生物においてウイルスにより引き起こされるウイルス性及び感染性疾患の処置において使用される。これらにおいて、PACAP及び抗ウイルス剤は、経口で、注射又は浸漬水浴によって投与される。本発明の一実施形態では、PACAPは、製剤化された食餌として、食餌の50-750mg/kgの濃度で、及び抗ウイルス性分子は食餌の100~2000mg/kgの濃度で、適用される。本発明の第2の実施形態では、PACAPは、体重のグラム当り0.1-10μgの濃度で、及び抗ウイルス性分子は1-50μg/gの濃度で、獣医用組合せの一部として、注射により魚に適用される。この組合せにおける本発明の別の実施形態では、PACAPは水のリットル当りの50-1000μgの濃度で浸漬水浴によって魚又は甲殻類に適用され、及び抗ウイルス剤の濃度は、100-2000μg/Lである。本発明では、PACAPは、抗ウイルス剤として使用される場合、又は公知の抗ウイルス性分子と組み合わせての両方で、種々の水生生物に適用される。例えば、それらはサケ科、クルマエビ科及び二枚貝を包含する。PACAPを含む組成物及び抗ウイルス性分子を伴う組合せは、ヘルペスウイルス科、パポバウイルス科、ドガウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科及びピコルナウイルス科ファミリーのウイルスにより引き起こされるウイルス感染の治療的処置に有用である。本発明では、抗ウイルス剤として使用された時のPACAP及び抗ウイルス性分子との組合せの両方が、IPNV、VHSV及びISAVにより引き起こされる感染を制御するために使用される。それらは、WSSV、YHV、TSV、IHNNV及びMBVにより引き起こされるウイルス感染の治療的処置においてもまた使用される。PACAP又はPACAPを含む獣医用組合せの養殖における水生生物への投与を含む水産養殖投与でのウイルス感染のコントロールのための方法もまた、本発明の一部である。例1.ポリI:C及びIPNVで処置されたニジマスO.mykiss細胞の前腎からの白血球における、及びインビトロでVHSVで感染させたニジマスO.mykissRTS-11のマクロファージ細胞株におけるPAC-1受容体発現。我々は、9~12グラム及び7箇月の年齢で、VHSV及びIPNVがない、若いjuvenileニジマスO.mykissを使用した。魚は14°Cで水循環により維持された。食物を一日に二度任意で投与した。ウイルスである、VHSV株0771及びIPNV株Spを、ニジマス性腺細胞系RTG-2Sena及びRio1975InfectImmun11:815-22において伝播させた。細胞は、100IU/mLのペニシリン及び100ug/mLのストレプトマイシンを含有する10のウシ胎仔血清FCS、Invitrogenで補充した最小必須培地MEM、Invitrogen、米国の中で増殖させた。ウイルスを、14°Cで抗生物質及び2のFCSを伴うMEMの中で増殖したRTG-2細胞のに接種した。広範囲な細胞変性効果が観察された時に、培養上清を収穫して遠心分離して細胞残屑を除去した。実験のために、我々は清澄化された培養上清を使用した。ウイルス力価は、Reed及びMuenchReed及びMuench1998JHyg27:280-9によって報告されるように96ウェルプレートにおいて決定した。前腎白血球は、Graham及びSecombeGraham及びSecombe1998Immunology65:293-7により記載された方法に従って4匹のマスから分離した。短くいえば、腎臓前部を無菌的に除去し、ペニシリン100IU/mL、ストレプトマイシン100mg/mL、ヘパリン10ユニット/mL及び2のFCSで補充した培地LeibovitzL-15、Gibco、英国を使用して、100μのナイロンメッシュを通して通過させた。結果として生じた細胞浮遊を、51までのPercoll勾配上に注意深く置いた。白血球に対応する細胞の輪を注意深く除去し、0.1でL-15を含有するFCS中で2度洗浄した。細胞を、ml当り5×106細胞の濃度で5のFCSを伴うL-15で再懸濁して、24ウェルプレートにウェル当り1mLで分配した。感染した白血球を、30μg/mLのポリI:CSigmaに曝露させたか又は0.1のMOIでIPNVに感染させて、4時間、24時間及び48時間の期間の間、14°Cでインキュベートした。最後に、全RNAを、Chomczynski及びSacchiChomczynski及びSacchi1987Anal.Biochem.162:156-9により記載された方法を使用して白血球培養物から精製して、ポリI:Cで処置されていない及び処置された又はウイルスで感染させた白血球上のPAC-1受容体の発現レベルを評価した。サンプルをRQ1RNase非含有DNasePromegaで処置して、それによってサンプルの中に存在するゲノムDNAを除去した。相補DNAcDNAの合成のために、逆転写酵素に基づいて市販の試薬SuperScriptIIIInvitrogenを使用した。定量PCR反応qPCRのために、市販供給源からのPCRの混合物、PowerSYBRGreenPCRMasterMixAppliedBiosystemsを使用した。qPCRの結果は、構成的内因性遺伝子発現、具体的には伸長因子1αEF1αに対して標準化し、3連で行った。結果は、2-ΔCtとして表され、ΔCtは、遺伝子Ct値からCt標準化遺伝子EF1αの評価値を差し引いた残部に等しい。結果は、PAC-1のレベルが、実験の4、24及び48時間でポリI:Cで処置された培養白血球において過剰発現したことであり、PAC-1受容体が魚においてウイルスに対する応答に関与することを示唆し、ポリI:Cが二重らせんRNAと構造上同じ分子であることを考慮に入れれば、ウイルス感染と同様な効果である多くのウイルスにはRNAゲノムがあります。これらの結果は図1に示される。ポリI:Cは、B細胞及び樹状細胞の細胞内区画で発現されるtoll様受容体-3TLR3と相互作用する。TLR-3は自然ではウイルスにより刺激される。そして、PAC-1の発現レベルは、無処置の培養物において白血球の検出可能な値から、IPNVで感染した白血球の培養物において感染の後4、24及び48時間で検出不能なレベルへとなり、魚における抗ウイルス性反応でPACAPに特異的に結合するこの受容体の関与を確認することになった図1。ウイルス擬似のポリI:Cの効果とIPNVのそれとの間で観察された相違は、感染細胞におけるウイルスの特異的効果、恐らくそれらの有利点に対するものに、関係することができた。なお、我々は、VHSVで感染させたマクロファージ細胞株マスO.mykissRTS-11におけるPAC-1の発現レベルを評価し、株RTS-11のウイルス感染の方法は、RTG-2株について上述したものと同様であった。同様に、我々は、VHSVによる感染後4及び8日後へのPAC-1の発現レベルの量のダウンレギュレーションを観察した図2。例2.ポリI:C及びVHSVで処置されたニジマスOncorhynchusmykiss細胞の腎臓前部からの白血球におけるVPAC-1受容体の発現VPAC-1受容体の発現のレベルを評価するために、例1において記載されていたものと同様な実験設計が行なわれた。結果は、VPAC-1のレベルがポリI:Cで処置された培養白血球において実験の4、24及び48時間で過剰発現されるというものであり、I:Cはウイルス擬似分子であると考えられることを考慮すれば、PAC-1としてVPAC-1受容体が、魚においてウイルスへの応答に関与することが示唆された図3。そして、VPAC-1の発現レベルは、VHSVに感染させた白血球の培養物において感染後の4、24及び48時間で検出不能であり、PACAP及びVIPと同じ親和性で結合するこの受容体の、魚における抗ウイルス性応答における関与を確認するものであった図3。IPNVに感染させた培養腎臓前部白血球においてPAC-1受容体とともに観察されたように、ポリI:Cでインビトロでの白血球の処置によるVPAC-1の制御と感染VHSVとの観察された相違は、感染した細胞における完全な生物学的存在としてのウイルスの特異的効果、恐らくそれらの有利点に対するものに、関係することができた。例3.VHSVにインビボで感染させたニジマスOncorhynchusmykissの脾臓及び腎臓前部からの白血球におけるPACAP及びPAC-1受容体及びVPAC-1の発現VHSV株0771を細胞系RTG-2において伝播させたSena及びRio1975InfectImmun11:815-22。要約すると、ウイルスを、抗生物質100IU/mLペニシリン及び100ug/mLストレプトマイシン及び2FCS伴うMEM中で14°Cで増殖させたRTG-2細胞株中に接種した。広範囲な細胞変性効果が観察された時、培養上清を収穫して遠心分離して細胞残屑を除去した。マスの感染のために、清澄化された培養上清を使用した。ウイルス力価を、Reed及びMuenchReed及びMuench1998JHyg27:280-9により報告されるように96ウェルプレートにおいて決定した。我々は、9~12グラムで7か月齢でVHSV及びIPNV非含有の若魚ニジマスO.mykissを使用した。魚を水循環で14°Cで維持した。食物を1日に2度任意に投与した。2つの実験群を各群20匹のマスから形成し、1つの群は、ウイルス溶液魚当り100Lの1×107TCID50/mLで注射し、他の群陰性対照として使用したはVHSVで感染させていない培養培地RTG-2で注射した。注射後1、3、7及び10日で、5匹のマスをランダムに取り出し、麻酔性MS-22への過度曝露により犠牲にした。引き続いて、腎臓を除去して上記脾臓をChomczynski及びSacchiChomczynski及びSacchi1987Anal.Biochem.162:156-9により記載された方法に従って、これらの器官から全RNAの精製を進行した。CDNA合成及び定量PCRの反応を例1に記載されるように行なわれた。逆転写RTの反応のために、実験の1、3、7及び10日目でのランダムに選択された各実験群からの5匹の個体からの5つの全RNAをプールした。結果は、脾臓において、PAC-1及びVPAC-1受容体が陰性対照と比較して注射後3日目で過剰発現することであった。発現レベルは、注射後10日目で対照群より低い。腎臓前部では、PAC-1及びVPAC-1受容体は1及び3日目で対照群において発現レベルがより低く、10日目へのVPAC-1の値は検出不能である。7日目で、両方の受容体は、陰性対照群と比較して、それらの発現のレベルを増加させる。両方の受容体はウイルス感染の後の時間を通じて同様の発現パターンを有していることもまた観察された図4及び5。1日目のPACAP発現値は、陰性対照と比較してより低い。7日目では、これらの発現値が優位である。これらの結果は、受容体発現のレベルが陰性対照群と比較してより低くなり1日目及びより高くなる7日目傾向を示したという意味で、それの2つの受容体VPAC-1及びPAC-1のものと連関する。10日目で、PACAPの発現値は、陰性対照群と比較してより低い図4、5及び6。VHSV及びIPNVで実験的に感染させた魚の脾臓及び腎臓前部におけるPACAP及びその受容体PAC-1及びVPAC-1の発現レベルにおける変化は、両方の受容体のインビボでの魚における抗ウイルス応答への関与を示す。このことは、我々がサケ科における抗ウイルス応答におけるPACAPの、感染した魚の生存性を増加させ、ウイルス感染への免疫応答を増強し及びウイルス複製を行なうための能力を有する器官及び流体から清掃させる、との陽性効果を観察したチャレンジ実験において確認された。例4.健康なニジマスOncorhynchusmykissの末梢血白血球及び腎臓前部におけるタンパク質Mx、IFN及びTLR9の転写に対するPACAPの効果我々は、VHSV及びIPNV非含有の約50グラムの若魚ニジマスO.mykissを使用した。魚n=5はメタンスルホン酸塩Sigma、米国で麻酔して、尾静脈そして次に腎臓前部からの第1の末梢血を無菌的に除去した。Graham及びSecombeGraham及びSecombe1998Immunology65:293-7により記載された方法に従って、独立して5匹のマスからの腎臓前部から末梢血白血球を分離した。各魚の末梢血を、ペニシリン100IU/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、ヘパリン10ユニット/mL及び2FCSで補充されたLeibovitzL-15、Gibco、英国の半分を4倍希釈し、51までPercoll勾配に注意深く置かれた。白血球に対応する細胞の輪を注意深く除去し、L-15含有0.1FCSにおいて2度洗浄した。腎臓前部を、ペニシリン100IU/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、ヘパリン10ユニット/mL及び2FCSで補充した100μmLeibovitzL-15、Gibco、英国のナイロンメッシュを通じて通過させた。結果として生じる細胞懸濁を、同じ培地で補充されたL-15中で1:4に希釈し、51までPercoll勾配に注意深く置かれた。白血球に対応する細胞の輪を注意深く除去し、L-15含有0.1FCSにおいて2度洗浄した。細胞をml当り5×106細胞の濃度で5FCSを伴うL-15で懸濁して24ウェルプレートにウェル当り1mLで分配した。白血球を、化学合成により得られたClariasgariepinusからのPACAP3810-10M、10-9M及び10-8Mの3用量で2連で処置し、陰性対照として2連で分配した無処置の白血球を使用した。Mx、IFN及びTLR9のレベルを処置の48時間後に評価した。そのようにするために、全RNAを、Chomczynski及びSacchiChomczynski及びSacchi1987Anal.Biochem.162:156-9により記載された方法にりPACAPで処置された白血球培養物から精製した。Mx、IFNγ及びTLR9を増幅するために設計されたプライマーは、cDNAとゲノムDNAとを区別せず、異なる組織からの全RNAを、サンプルの中に存在し得るゲノムDNAを除去するために、DNAヌクレアーゼで、具体的にはRQ1RNase非含有DNasePromegaで処置した。cDNAの合成のために、SuperScriptIII逆転写酵素Invitrogenを使用する市販の試薬キットを使用した。最後に、定量PCR反応qPCRのために、市販の供給源、PowerSYBRGreenPCRMasterMixAppliedBiosystemsからのPCRの混合物を使用した。定量PCR反応qPCRのために、市販供給源からのPCRの混合物、PowerSYBRGreenPCRMasterMixAppliedBiosystemsを使用した。qPCRの結果は、構成的発現遺伝子、具体的には伸長1αEF1αに対して標準化し、3連で行った。結果は、2-ΔCtとして表され、ΔCtは、遺伝子Ct値からCt標準化遺伝子EF1αの評価値を差し引いた残部に等しい。Mxタンパク質レベルは、10-10MPACAP38で処置された末梢血白血球の培養物における処置の48時間の後に増加する。10-9Mの用量では、陰性対照と対比してMxタンパク質の転写に対してPACAP38の刺激性作用も存在するが、検出された発現レベルは10-10Mの用量で得られたレベルを下回った。10-8Mの用量は陰性対照に対してMxタンパク質発現のレベルにおいて相違しなかった。これらの結果は、10-9~10-10Mの範囲において低濃度でのMxタンパク質の転写に対するPACAP38の陽性効果を示す図7A。前腎白血球では、Mxタンパク質に対するPACAP38の効果が末梢血白血球においてよりも穏やかであり、服量10-9Mで刺激性作用を示す図7B。なお、我々は、範囲10-10~10-8MにおけるPACAP38で刺激された培養物における検知できるレベルでのPACAPで刺激された培養末梢血白血球における検出不能なレベルのTLR9から、TLR9の発現におけるPACAP38の刺激性作用を観察した。最高値は10-10Mの用量で得られた図8A。前腎白血球において、以前にMxタンパク質発現で観察されたように、結果はより穏やかであった。TLR9発現レベルは、10-9Mの中間用量で、陰性対照より統計的に高かった図8B。IFNγレベルは末梢血白血球の無処置培養物において検出不能であった。培養物を3用量のPACAP38で処置して、10-9Mの中間用量で最高レベルを伴う検知可能なレベル発現の結果となった図9A。そして、培養された腎臓前部白血球において、我々は、PACAP38がIFNγの転写を刺激することを観察した。IFNγの発現レベルは10-9及び10-8Mの用量で、対照群より統計的に高く、10-9Mの最高用量において最良の結果を得た図9B。例5.リバビリンと組み合わせてのPACAP投与のIPNV感染に対するインビトロ効果我々は、単離されたウイルスとしてIPNVに感染した細胞培養物株ATCCVR-299からの上清を使用した。ウイルスの確認は特異的なPCRを通じてなされた。インビトロ分析のために、我々は細胞株CHSE-214マスノスケ胚ECACC番号00/F/031を使用した。これを、Eagle塩、10ウシ胎仔血清FBS、2mMグルタミン及び抗生物質で補充したMEM培地中で18°Cで維持した。ウイルス接種原は15°C及び2FBSで増殖させて、分析の前に、培養上清におけるウイルス力価TCID50を、Reed及びMuenchReed及びMuench1938TheAmericanJournalofHygiene27:493-497の技術により決定した。ウイルス接種原から、0.1moiの稀釈液を調製した。96ウェルのプレートに、10FBS、2mMグルタミン及び抗生物質で補充したMEMEagleの塩で18°Cで維持したCHSE-214で播種した。我々は、異なる濃度のリバビリン及び3つの異なる濃度のPACAP0.1、1及び10nMを評価した。感染の前24時間で、細胞を抗ウイルス剤又はPACAP-抗ウイルス薬の組合せで処置し、陽性対照ウイルスに感染させて抗ウイルス性処置のない細胞及び陰性感染させず無処置の細胞、及び抗ウイルス剤又は異なる用量のPACAPで処置された非感染細胞を確立した。細胞をウイルスの接種原に30分の期間の吸着で感染させた。次いで、細胞をPBSで洗浄した。これらの処置を2FBS及び抗生物質で補充したMEMで希釈し、再度添加した。いったん我々が陽性対照中で細胞変性効果CPEを観察したならば、その試験は終結した。その評価は、顕微鏡検査により、及びクリスタルバイオレットで染色すること550nmの吸光度読書により行なった。陽性対照におけるCPEは伝染後3日で観察した。クリスタルバイオレット染色の吸光度から得られた、処置されず感染させた対照細胞に関してのCPE阻害の結果を、図10に示した。リバビリンのPACAPと組み合わせての抗ウイルス活性の分析はWindows登録商標のためのプログラムCalcusynBiosoftを使用して行なった。得られたChouの組合せ指数の値は、試験された濃度値についての両方の薬の間の協調性を示した。例6.PACAP及びPACAPリバビリンの組合せの投与のIPNVに実験的に感染したニジマスO.mykissにおける効果実験は、PACAP及びPACAP-リバビリン組合せの投与のIPNVに実験的に感染したニジマスにおける効果を評価するために行なった。我々は、50匹の魚の8つの実験群を各々1.6±0.4gの体重量に順応させた。水温を10~12°Cで維持した。群1:ウイルスに曝露していない無処置の魚群2:ウイルスに曝露した、無処置の魚群3:ウイルスに曝露した、400μg/Lの水の用量でリバビリンで処置された群群4:ウイルスに曝露した、800μg/Lの水の用量でリバビリンで処置された群群5:ウイルスに曝露した、100μg/Lの水の用量でPACAPで処置された群群6:ウイルスに曝露した、200μg/Lの水の用量でPACAPで処置された群群7:ウイルスに曝露した、組合せ1リバビリナribavirina400μg/L-PACAP100μg/Lで処置された群群8:ウイルスに曝露した、組合せ2リバビリナribavirina800μg/L-PACAP200μg/Lで処置された群。動物を、一日に二度、各タンクにおいて全肉体重量の3と等価な量で食餌した。魚を、約105プラーク形成単位pfu/mLのIPNVATCCVR-299を緊張させるを含有する10~12°Cの水に2時間それらを置くことによりウイルスに曝露させた。群1及び2における魚を、抗ウイルス性化合物なしで又はPACAP抗ウイルス組合せなしで、同じストレス処置に供した。群1における魚はウイルスの代わりに細胞培養液と同じ手順を受けた。ウイルス同定は、Lopez-Lastraら1994JournalofFishDiseases17:269-282により記載された方法に従って、腎臓及び脾臓からのRT-PCRによって行なった。PACAPによる又はPACAP抗ウイルス組合せによる処置は、1週に3回、20日間行なった。最初の処置はウイルス感染の2時間後に行なった。実験観察は、処置の最初の20日の間及びそれが終えた後25日間なされた。実験45日の間、魚の死及び異常行動をモニターした。処置されなかったIPNV感染魚は、感染後6日目から感染性膵臓壊死症の特徴的サインを示した。最初の死が、感染後7日に生じ、すべての魚において疾患のサインの悪化が伴い、感染後11、12及び13日目に高い死亡率を伴った。感染してリバビリン又はPACAPで処置された魚では、疾患のサインは8日目で検出された。リバビリン-PACAP組合せで処置されてウイルスに曝露した群は、実験の期間の間疾患のサインが存在しなかった。無処置で感染した魚は、感染後15日目で食欲を回復した。抗ウイルス剤で処置された魚は、13日目で食欲を回復し、片やPACAP及びPACAP-リバビリン組合せで処置した魚は、実験の9日目にそれを示した。感染していない魚の対照は正常挙動を示し、この群においては実験の期間中に死は存在しなかった。無処置の魚及びIPNV感染魚における累積死亡率は50匹のうち40匹の魚20の生存であった。リバビリンで処置され、感染した魚においては、生存度は群3及び4についてそれぞれ68及び70であった。PACAPで処置され、感染した魚においては、生存度は群5及び6についてそれぞれ50及び55であった。PACAP-リバビリン組合せで処置された群では、生存度は群7及び8についてそれぞれ97及び99であった。死んだ魚の組織サンプルにおいて、IPNVの存在が見出された。無処理で感染していない群から得られたサンプルではウイルスが検出されなかった。表1は感染後45日目での平均重量を示す。感染して処置されない魚は、感染していない魚と比較してより低い増量を有していた。重量損失を、処置された群で、さらにはPACAP-リバビリン組合せで処置された群において相殺した。例7.PACAP及びポリラクチド酸共グリコール酸において製剤されたPACAPリバビリン組合の投与の、IPNVに実験的に感染したニジマスO.mykissへの効果実験を、PACAP及びポリ乳酸共グリコール酸PLGAに含有させたPACAP-リバビリン組合せのIPNVに実験的に感染したニジマスへの投与の効果を評価するために行なった。8つの実験群を、各々30±4gの30匹の魚で行ない、10~12°Cでの水で維持した。群1:PLGAを注射して、ウイルスに曝露しなかった魚群2:PLGAを注射してウイルスに曝露した魚群3:4μg/gの魚の用量でリバビリンを注射され、ウイルスに曝露した群群4:8μg/gの魚の用量でリバビリンを注射され、ウイルスに曝露した群群5:0.1μg/gの魚の用量でPACAP注射され、ウイルスに曝露した群群6:0.2μg/gの魚の用量でPACAP注射され、ウイルスに曝露した群群7:組合せ1リバビリン4μg/g-PACAP0.1μg/gを注射され、ウイルスに曝露した群群8:組合せ2リバビリン8μg/g-PACAP0.2μg/gを注射され、ウイルスに曝露した群PACAP又はPACAP-リバビリン組合せを含有するナノ粒子を、ウイルス感染の2時間後に腹腔内注射により投与した。実験観察を30日間行った。例6で記載したものと同様な生存率に関する結果が得られた。例8.PACAP及びPACAPリバビリン組合せの投与のIPNVに実験的に感染したタイセイヨウサケSalmosalarにおける効果実験を、PACAP及びPACAP-リバビリン組合せの投与のIPNVに実験的に感染したサケSalmosalarに対する効果を評価するために行なった。8つの実験群を50匹の魚で各々1.2±0.3gのサイズで行ない、10~12°Cでの水で維持した。群1:ウイルスに曝露していない無処置の魚群2:ウイルスに曝露した、無処置の魚群3:400μg/Lの水の用量でリバビリンで処置され、ウイルスに曝露した群群4:800μg/Lの水の用量でリバビリンで処置された、ウイルスに曝露した群群5:100μg/Lの水の用量でPACAPで処置された、ウイルスに曝露した群群6:200μg/Lの水の用量でPACAPで処置された、ウイルスに曝露した群群7:リバビリン400μg/L-PACAP100μg/L組合せで処置された、ウイルスに曝露した群群8:リバビリン800μg/L-PACAP200μg/L組合せで処置された、ウイルスに曝露した群。動物に、一日に二度、各タンクにおいて全肉体重量の3と等価な量で食餌した。魚を、約105pfu/mLのIPNV株ATCCVR-299を含有する10~12°Cでの水に2時間それらを置くことによりウイルスに曝露した。処置は週当たり3回20日間行なった。実験観察をこの期間中に及び最後の処置の後25日目になされた。実験の45日の間、魚の死及び異常行動をモニターした。群1及び2における魚を、抗ウイルス性化合物又はPACAP-抗ウイルス剤組合せのない処置によって産生された同じストレスに供した。群1における魚はウイルスの代わりに細胞培養液を伴う手順を受けた。ウイルスの同定は、Lopez-Lastraら1994JournalofFishDiseases17:269-282により記載された方法に従って、腎臓及び脾臓からのRT-PCRにより行なった。IPNVに感染して処置しなかった魚は、感染後6日目から感染性膵臓壊死症の特徴的サインを示した。最初の死が感染後8日目に生じ、すべての魚における疾患のサインの悪化が伴い、及び感染後11日目及び15日目の間で高い死亡率を伴った。この群における生存度の百分率は30であった。PACAP、PACAP-リバビリン組合せで処置された群及び感染していない群を除いて、ウイルスに感染したすべての群において、10及び11日目で食欲の喪失が存在した。感染して両方の用量のリバビリンで処置された魚において、疾患の初期サインが10日目で検出され、低用量及び高用量についてそれぞれ70~76生存度になった。感染してPACAPに処置された魚では、生存度は低用量及び高用量についてそれぞれ56~60であった。リバビリン-PACAP組合せで処置されてウイルスに曝露した群では、生存度は96~98であった。感染させず無処置の群では、生存度の百分率は98であった。死んだ魚の組織サンプルにおいて、IPNVの存在が見出された。表2は感染後45日目での平均重量を示す。感染して無処置の魚は、感染していない魚と比較してより低い重量増加であった。この重量損失は、処置された群において、さらにPACAP及びPACAP-リバビリン組合せで処置された群において相殺された。例9.PACAP及びPACAPリバビリン組合せの投与のISAVに実験的に感染したタイセイヨウサケSalmosalarにおける効果実験を、PACAP及びPACAP-リバビリン組合せの投与のISAVに実験的に感染したサケSalmosalarに対する効果を評価するために行なった。8つの実験群を25匹の魚で各々50±10gで行なった。群を10~12°Cで海水に維持した。群1:処置されず、ISAウイルスに曝露していない魚群2:ISAウイルスに曝露した、無処置の魚群3:400μg/Lの水の用量でリバビリンで処置され、ウイルスに曝露した群群4:800μg/Lの水の用量でリバビリンで処置され、ウイルスに曝露した群群5:100μg/Lの水の用量でPACAPで処置され、ウイルスに曝露した群群6:200μg/Lの水の用量でPACAPで処置され、ウイルスに曝露した群群7:リバビリン400μg/L-PACAP100μg/Lの組合せで処置され、ウイルスに曝露した群群8:リバビリン800μg/L-PACAP200μg/Lの組合せで処置され、ウイルスに曝露した群チャレンジ実験のために十分なウイルスを得るために、SHK-1細胞を培養し、株Glesvaerアクセス番号AJ012285,Krossoyら1999JournalofVirology73:2136-2142で175cm2フラスコにおいて5日間感染させた。魚を、約104pfu/mLのISAVを含有する0.3mLの培地を腹腔内に注射された魚と共同生活させてウイルスに曝露させた。群1:等体積の培地を受けた魚。群1無処置で、ウイルスISAに曝露されていないにおける死のは4であり、群2ウイルス曝露され、無処置であるは92であった。群3及び4では、死はそれぞれ52及び36であり、一方で群5及び6では、それぞれ60及び72であった。PACAP-リバビリン組合せで処置された群7及び8では、死のはそれぞれ8及び4であった。死んだ魚の組織サンプルにおいて、ISAVの存在が見出された。無処置で感染させてない群からのサンプルにおいては、ウイルスが検知されなかった。例10.PACAP及びPACAP-アマンタジン組合せの投与のIHNVに実験的に感染したニジマスO.mykissに対する効果実験を、PACAP及びPACAP-アマンチジンamantidine組合せの投与のIHNVに実験的に感染したニジマスにおける効果を評価するために行なった。8つの実験群を各々50±5gの50匹の魚で行ない、10~12°Cで水中で維持した。群1:ウイルスに曝露していない無処置の魚群2:ウイルスに曝露した、無処置の魚群3:400μg/Lの水の用量でアマンタジンで処置され、ウイルスに曝露した群群4:800μg/Lの水の用量でアマンタジンで処置され、ウイルスに曝露した群群5:100μg/Lの水の用量でPACAPで処置され、ウイルスに曝露した群群6:200μg/Lの水の用量でPACAPで処置され、ウイルスに曝露した群群7:組合せ1アマンチジナamantidina400μg/L-PACAP100μg/Lで処置され、ウイルスに曝露した群群8:組合せ2アマンチジナamantidina800μg/L-PACAP200μg/Lで処置され、ウイルスに曝露した群実験条件は前出の例で記載した実験と同様であった。魚を、20Lの水の中の5.9×103pfu/mlウイルスで通気を伴って1時間浸漬することにより、チャレンジさせた。実験の結果、26の生存度が無処置でIHNVで感染した魚において観察された。アマンタジンで処置されてIHNVに感染した魚では、生存度は46であった。PACAPで処置されIHNVに感染した魚では、生存度は36であった。PACAP-アマンチジンamantidine組合せで処置された群では、生存度は96~98であった。例11.PACAP及びPACAPリバビリン組合せの投与の白点症候群WSSVのウイルスに実験的に感染した太平洋の白小エビLitopenaeusvannameiに対する効果実験を、PACAP及びPACAP-リバビリン組合せの投与のWSSVに実験的に感染した太平洋白小エビLitopenaeusvannameiに対する効果を評価するために行なった。4つの実験群を各々5±0.5gの50匹の小エビから形成し、28°Cで海水中で維持した。小エビには、日当たり2回、群当たりバイオマスの合計の8と等価な量で食餌した。実験群は下記のとおりである:群1:無処置、ウイルスWSSVに曝露されていない群2:無処置、ウイルスWSSVに曝露した群3:リバビリンで処置され、ウイルスWSSVに曝露した群4:PACAPで処置され、ウイルスWSSVに曝露した群5:リバビリン-PACAP組合せで処置され、ウイルスWSSVに曝露した単離及びウイルス拡散のために、Orconecteslimosusカニを使用した。WSSVを、新鮮に抽出されたリンパから、VanHultenetalin2001VanHultenら2001Virology285:228-33により記載されるようにショ糖勾配遠心分離によって精製した。ウイルスサンプルは、使用まで-80°Cで貯蔵した。WSSVでの感染の自然経路を最小化させ、そして再現可能なプロトコールを達成するために、浸漬を実験的ウイルス感染を誘導するために使用した。ウイルス感染に先立ち、75の死を引き起こすために必要とされるウイルス力価及び量を決定した。それをするために、小エビを、異なる稀釈のウイルスで、7時間のインキュベーション期間の間実験的に感染させた。ウイルス感染に続いて、小エビを、ウイルス非含有の海水で洗浄して、上記された実験群のデザイン従って新しいコンテナーに置いた。処置は、感染後、週当たり3回で30日間、500μg/Lの水の抗ウイルス剤又は500μgの抗ウイルス剤PACAP200μg/Lの水の用量で投与した。PACAPで処置された群については、使用した用量は200μg/Lの水であった。群1及び2における小エビを、同じストレスの処置投与に供した。実験の30日の間に各実験群における死がモニターされた。群2無処置、ウイルスに曝露されたにおける死のは60であり、群1無処置、ウイルスに曝露していないにおける死のは0であり、群3リバビリンで処置、ウイルスに曝露されたにおける死のは16であり、一方でPACAP処理群の死は26であった。PACAP-リバビリン組合せで処置された群では死が2であった。死んだ小エビの組織サンプルにおいては、WSSVがRT-PCRにより検出された。例12.PACAP及びPACAPリバビリン組合せの投与のIPNVに実験的に感染した種Pectenmaximusのカキにおける効果実験を、PACAP及びPACAP-リバビリン組合せの投与のIPNVに実験的に感染した種Pectenmaximusのカキにおける効果を評価するために行なった。8つの実験群を各々30個の成体カキで行ない、250Lのろ過した海水において10°Cで維持した。ウイルスは、実験の開始に先立って集められた肝膵臓サンプルにおいては検出されなかった。実験群は下記のとおりであった。群1:無処置、ウイルスに曝露していない群2:無処置、ウイルスに曝露した群3:400μg/Lの水の用量でリバビリンで処置され、ウイルスに曝露した群群4:800μg/Lの水の用量でリバビリンで処置され、ウイルスに曝露した群群5:100μg/Lの水の用量でPACAPで処置され、ウイルスに曝露した群群6:200μg/Lの水の用量でPACAPで処置され、ウイルスに曝露した群群7:組合せ1リバビリナribavirina400μg/L-PACAP100μg/Lで処置され、ウイルスに曝露した群群8:組合せ2リバビリナribavirina800μg/L-PACAP200μg/Lで処置され、ウイルスに曝露した群処置は、週当たり3回で20日間行なった。カキは、107TCID50mL-1を含有する25Lの水へ80Lのタンクの中で曝露することによりチャレンジさせた。6時間後、水を1L/分の遅い流量で入れ替え、12時間で流量を3L/分へと増加させた。2週間後チャレンジ肝膵臓サンプルを採取し、ウイルス力価を決定した。結果は、リバビリン及びPACAPで処置された動物においてウイルス負荷の減少を示した。この減少は組合せで処置された群においてより大きかった表3。"