必要ならばキャリアタンパク質と結合して、少なくとも第1のグラム陰性細菌菌株の外膜タンパク質を認識する免疫応答を引き起こす能力を有する抗原を含有する、免疫原性組成物またはワクチンであって、前記外膜タンパク質は細胞外亜鉛の取り込みに関与するものである、前記免疫原性組成物またはワクチン。前記の第1のグラム陰性細菌菌株がナイセリア菌株でない、請求項1に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記外膜タンパク質が、PCTEP2009052689に記載のNMB0964ポリペプチドもしくはそれに記載のその断片、WO0055327に記載の配列番号2もしくはそれに記載のその断片、WO9957280に記載の配列番号606もしくはそれに記載のその断片、またはWO0011182に記載の配列番号2、4、および6、もしくはそれに記載のそれらの断片のアミノ酸配列で構成されない、請求項1または2に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記外膜タンパク質が、内在性外膜タンパク質である、請求項1~3のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記外膜タンパク質が、6001000アミノ酸長である、請求項1~4のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。細胞外亜鉛の取り込みにおける前記外膜タンパク質の関与は、前記タンパク質を欠失した外膜小胞に対する亜鉛の結合が減少する、およびまたは、前記タンパク質を欠失した細胞で亜鉛の蓄積が減少するということである、およびまたは、前記タンパク質を欠失した細胞が唯一の亜鉛源としてカルプロテクチンの存在下で生育する能力の低下を示すということである、請求項1~5のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記外膜タンパク質の発現が、低い細胞外亜鉛濃度に応答してアップレギュレートされる、請求項1~6のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。低い細胞外亜鉛濃度に応じた、前記外膜タンパク質発現のアップレギュレーションは、前記タンパク質の発現が亜鉛キレート剤の存在下でアップレギュレートされる可能性があるということである、請求項7に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記の第1のグラム陰性細菌菌株が、低い遊離亜鉛レベルを示すヒトおよびまたは動物の身体部分に感染する、請求項1~8のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記の低い遊離亜鉛レベルが、亜鉛のカルプロテクチンとの結合に起因する、請求項9に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記の第1のグラム陰性細菌菌株が、ヒトおよびまたは動物の気道もしくは血液もしくは尿路もしくは腸に感染する、請求項1~10のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記の第1のグラム陰性細菌菌株が、ボルデテラ属Bordetella;百日咳菌Bordetellapertussis;ボレリア属Borrelia;ボレリアブルグドルフェリライム病ボレリアBorreliaburgdorferi;ブルセラ属Brucella;ヤギ流産菌Brucellamelitensis;ヒツジ流産菌Brucellaovis、クラミジア属Chlamydia;クラミジアシタッシオウム病クラミジアChlamydiapsittaci;クラミジアトラコマチストラコーマクラミジアChlamydiatrachomatis;大腸菌属Escherichia;大腸菌Escherichiacoli;ヘモフィルス属Haemophilus;インフルエンザ菌Haemophilusinfluenzae;レジオネラ属Legionella;レジオネラニューモフィラLegionellapneumophila;ナイセリア属Neisseria;淋菌Neisseriagonorrhoeae;髄膜炎菌Neisseriameningitidis;シュードモナス属Pseudomonas;緑膿菌Pseudomonasaeruginosa;エルシニア属Yersinia;エルシニアエンテロコリティカYersiniaenterocolitica;モラクセラ属Moraxella;カタル球菌Moraxellacatarrhalis;赤痢菌属Shigella;シゲラフレックスネリShigellaflexneri;志賀赤痢菌Shigelladysenteriae;シゲラボイディShigellaboydii;コクシエラ属Coxiella;およびコクシエラブルネッティCoxiellaburnetiiからなる一群から選択される細菌属もしくは種に属する、請求項1~11のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記の第1のグラム陰性細菌菌株が、アシドボラックス属Acidovoraxアシネトバクター属Acinetobacter;アシネトバクターバウマンニAcinetobacterbaumannii;アシネトバクターカルコアセティカスAcinetobactercalcoaceticus;AcinetobacterjohnsoniiAcinetobacterjuniiアシネトバクタールオフィイAcinetobacterlwoffii;Acinetobacterradioresistensアクチノバチルス属Actinobacillus;ActinobacillusminorアクチノバチルスプルロニューモニアActinobacilluspleuropneumoniae;アグレガチバクター属Aggregatibacter;アグレガチバクターアクチノミセテムコミタンスAggregatibacteractinomycetemcomitans;Aggregatibacteraphrophilus;AlcanivoraxAlcanivoraxborkumensisアゾアルカス属Azoarcus;アゾトバクター属Azotobacter;アゾトバクタービネランジーAzotobactervinelandii;ボルデテラ属Bordetella;ボルデテラブロンキセプチカ気管支敗血症菌Bordetellabronchiseptica;パラ百日咳菌Bordetellaparapertussis;百日咳菌Bordetellapertussis;Bordetellapetrii;カンピロバクター属Campylobacter;カンピロバクターコリCampylobactercoli;カンピロバクターウプサリエンシスCampylobacterupsaliensis;コマモナス属Comamonas;コマモナステストステローニComamonastestosteroni;デルフチア属Delftia;デルフチアアシドボランスDelftiaacidovorans;Diaphorobacterヘモフィルス属Haemophilus;インフルエンザ菌Haemophilusinfluenzae;ヘモフィルスパラスイスHaemophilusparasuis;ヘモフィルスソムナスHaemophilussomnus;マンヘミア属Mannheimia;ヘモリチカ菌Mannheimiahaemolytica;モラクセラ属Moraxella;カタル球菌Moraxellacatarrhalis;ナイセリア属Neisseria;淋菌Neisseriagonorrhoeae;髄膜炎菌Neisseriameningitidis;パスツレラ属Pasteurella;パスツレラダグマティスPasteurelladagmatis;パスツレラマルトシダPasteurellamultocida;プロテウス属Proteus;プロテウスミラビリスProteusmirabilis;シュードモナス属Pseudomonas;シュードモナススツッツェリPseudomonasstutzeri;およびスフィンゴモナス属Sphingomonasからなる一群から選択される細菌属もしくは種に属する、請求項1~11のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記外膜タンパク質が、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号6;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;配列番号49;配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号60;配列番号61;配列番号62;配列番号63;配列番号64;配列番号65;配列番号66;配列番号67;配列番号68;配列番号69;配列番号70;および配列番号71からなる一群から選択されるアミノ酸配列を含んでいる、請求項1~13のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記抗原が、前記外膜タンパク質に由来するポリペプチドである、請求項1~14のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。抗原を含有する、請求項1~15のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号6;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;配列番号49;配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号60;配列番号61;配列番号62;配列番号63;配列番号64;配列番号65;配列番号66;配列番号67;配列番号68;配列番号69;配列番号70;および配列番号71からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約99、または少なくとも約100の同一性を有するポリペプチドを含んでおり、場合によって、前記抗原は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、そのアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。抗原を含有する、請求項1~15のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチンであって、その抗原は配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号6;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;配列番号49;配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号60;配列番号61;配列番号62;配列番号63;配列番号64;配列番号65;配列番号66;配列番号67;配列番号68;配列番号69;配列番号70;および配列番号71からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含んでおり、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列の7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるものであって、加えて前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、前記免疫原性組成物またはワクチン。前記抗原もしくはポリペプチドもしくは前記免疫原性断片が、PCTEP2009052689に記載のNMB0964ポリペプチドもしくはそれに記載のその断片、WO0055327の配列番号2もしくはそれに記載のその断片、WO9957280の配列番号606もしくはそれに記載のその断片、またはWO0011182の配列番号2、4および6もしくはそれに記載のそれらの断片のアミノ酸配列を有していない、請求項17または18に記載の免疫原性組成物またはワクチン。少なくとも1つの追加の抗原を含有する、請求項1~18のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記抗原もしくはポリペプチドもしくは免疫原性断片がTdfIタンパク質に由来する、請求項1~19のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドが、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号6;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;および配列番号49からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約99、または少なくとも約100の同一性を有するか、または前記ポリペプチドが、前記の一群から選択される配列の免疫原性断片を含んでおり、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列の7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなるが、場合によって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、請求項20に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:GSAVSAVGXPVlMVlGQMLXGSAXRを含む、請求項20または21に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号1の91104位、または配列番号2~49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項22に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:DVAMSA2SGPADHTANVlを含む、請求項20~23のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号1の116126位、または配列番号2~49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項24に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:GLVAlVlNDVlLXDXKlLVPを含む、請求項20~25のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号1の154164位、または配列番号2~49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項26に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:GXGSAYFWVGSTNXQRL3YGLlVLlPGAHDを含む、請求項20~27のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号1の250265位、または配列番号2~49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項28に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:RXDEXRKQDGTSAEQSD3P3lFVL3RAKQ5DNRGYXHXEを含む、請求項20~29のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号1の334363位、または配列番号2~49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項30に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:RXPXAPVTQEMELMYFASYTXGXHXATLSXTSAFYlVEQXGDNQXXLを含む、請求項20~31のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号1の510536、537、538、539、540、541、542、543もしくは544位、または配列番号2~49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項32に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:YXQG2AXFLYlXGXEDGAV3YFHQ8GSATXFSGDXVlRKNAGを含む、請求項20~33のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号1の595628位、または配列番号2~49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項34に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:PARXPSAAPGXRLVASGを含む、請求項20~35のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号1の657665位、または配列番号2~49の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項36に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記の少なくとも1つの追加の抗原が、TdfHタンパク質、またはその免疫原性断片である、請求項19~37のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記TdfHタンパク質が、配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号60;配列番号61;配列番号62;配列番号63;配列番号64;配列番号65;配列番号66;配列番号67;配列番号68;配列番号69;配列番号70;および配列番号71からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約99、または少なくとも約100の同一性を有するか、または請求項42~55のいずれか1つに記載のTdfHタンパク質であり、または前記免疫原性断片が、前記の一群のアミノ酸配列から選択される配列の免疫原性断片であって、その前記免疫原性断片が、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなり、場合によって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、請求項38に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記抗原または前記ポリペプチドまたは前記免疫原性断片がTdfHタンパク質に由来する、請求項1~19のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドが、配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号60;配列番号61;配列番号62;配列番号63;配列番号64;配列番号65;配列番号66;配列番号67;配列番号68;配列番号69;配列番号70;および配列番号71からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約99、または少なくとも約100の同一性を有するか、または前記ポリペプチドが前記の一群から選択される配列の免疫原性断片であって、その前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなり、場合によって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、請求項40に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片がアミノ酸モチーフ:RSTVlPGAFYTQNQVLlDKQGASSQGXVLSVLNVlRGXSNTGFLGRVANSTMQVlDGVlSTQTFを含む、請求項40または41に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の81121位、または配列番号51~71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項42に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:FSNDEGSTAKAGSNGlLVANSTALXGSANLFRKTLlGNSVADNDを含む、請求項40~43のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の156178位、または配列番号51~71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項44に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:SXRKQXVlSLSAQNDYFRKVlGGGを含む、請求項40~45のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の226239位、または配列番号51~71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項46に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:LFALVKLlFVERYXGNDSVDKH4TGNlALQNSFLlYRXLMYXTNXlLVGASSTGRKRNSlLXNRDKNNTYQを含む、請求項40~47のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の333367位、または配列番号51~71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項48に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:PXGSKEQXFlNHKlTSFlVLYFLlDを含む、請求項40~49のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の491503位、または配列番号51~71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項50に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:NHYSVALMSTlMlLFSAXFYLlGDSHDTPYGLFMNSTPFXSTGYFSARHKTSHRMlVAPNlVQKREMYVYFFSTを含む、請求項40~51のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の574608位、または配列番号51~71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項52に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、アミノ酸モチーフ:EDVlKQNLAVFLDRKRLKNYlVMDNPALDYを含む、請求項40~53のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記ポリペプチドまたは免疫原性断片が、配列番号50の846860位、または配列番号51~71の同等位置にある前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含有する、請求項54に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記の少なくとも1つの追加の抗原が、TdfIタンパク質またはその免疫原性断片である、請求項19および請求項40~55のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記TdfIタンパク質が、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号6;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;および配列番号49からなる一群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約99、または少なくとも約100の同一性を有するか、もしくは請求項22~37のいずれか1つに記載のTdfIタンパク質であって、または前記免疫原性断片が、前記の一群のアミノ酸配列から選択される配列の免疫原性断片であって、その前記免疫原性断片は、前記の選択された配列のうち7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなり、場合によって、前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合して、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる、請求項56に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記の少なくとも1つの追加の抗原が、fHbpポリペプチド、Hsfポリペプチド、Hapポリペプチド、NadAポリペプチド、およびlipo28ポリペプチドからなる一群から選択されるか、またはそれらの免疫原性断片である、請求項19~57および272~278のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記抗原を有する細菌外膜小胞標品を含有する、請求項1~58のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記抗原の発現が、前記外膜小胞標品においてアップレギュレートされている、請求項59に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記アップレギュレーションが、同一菌株の野生型細菌由来の外膜小胞標品における前記抗原の発現に対する相対的なものであって、たとえば外膜小胞を調製した野生型細菌と比較される、請求項60に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記アップレギュレーションが、15225335445555665775885995または10倍以上である、請求項60に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記外膜小胞標品をもたらす宿主細胞が、前記抗原の生産について遺伝的に改変されている、請求項59~62のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記外膜小胞標品をもたらす宿主細胞が、内在性タンパク質の機能発現の破壊によって遺伝的に改変されており、このタンパク質は遺伝的改変のない宿主細胞では前記抗原の発現を抑制する、請求項63に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記宿主細胞が、異種の、およびまたは、強力な、およびまたは、亜鉛で制御されない、プロモーターからの前記抗原の発現をもたらすよう遺伝子改変されている、請求項63に記載の免疫原性組成物またはワクチン。内在性タンパク質は、遺伝的改変のない宿主細胞では、内在性プロモーターと結合することによって前記抗原の発現を抑制するが、その内在性タンパク質が、前記の異種の、およびまたは、強力な、プロモーターと結合しない、請求項65に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記異種プロモーターが、宿主細胞内で、前記抗原の内在性プロモーターより強力なプロモーターとなる、請求項65または66に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記の異種の、およびまたは強力なプロモーターが、IPTG誘導性プロモーターである、請求項65~67のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記内在性タンパク質が、ナイセリア菌またはグラム陰性細菌のZurリプレッサーである、請求項64または66に記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記外膜小胞標品が、2つ以上のグラム陰性細菌菌株から分離される、請求項59~69のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記グラム陰性細菌菌株の少なくとも1つは、請求項12または13に記載の一群から選択される細菌属もしくは種に属する、請求項70に記載の免疫原性組成物またはワクチン。製薬上許容される賦形剤を含有する、請求項1~71のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。アジュバントを含有する、請求項1~72のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。亜鉛塩を含有する、請求項1~73のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。抗原および、場合によっては、追加の抗原をコードする、少なくとも1つのポリヌクレオチドを含有する、請求項1~58のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチンであって、前記ポリヌクレオチドが真核生物プロモーターに、機能しうるように連結されている、前記免疫原性組成物またはワクチン。前記免疫原性組成物またはワクチンが、グラム陰性細菌菌株による感染に対する免疫応答、たとえば防御反応を生じさせる能力を有する、請求項1~75のいずれか1つに記載の免疫原性組成物またはワクチン。前記免疫原性組成物またはワクチンが、2つ以上の異なる細菌菌株による感染に対する免疫応答、たとえば防御反応を生じさせる能力を有する、請求項76に記載の免疫原性組成物またはワクチン。1つまたは複数の前記の異なるグラム陰性細菌菌株が、ボレリア属Borrelia;ボレリアブルグドルフェリライム病ボレリアBorreliaburgdorferi;ブルセラ属Brucella;ヤギ流産菌Brucellamelitensis;ヒツジ流産菌Brucellaovis;クラミジア属Chlamydia;クラミジアシタッシオウム病クラミジアChlamydiapsittaci;クラミジアトラコマチストラコーマクラミジアChlamydiatrachomatis;大腸菌属Escherichia;大腸菌Escherichiacoli;レジオネラ属Legionella;レジオネラニューモフィラLegionellapneumophila;エルシニア属Yersinia;エルシニアエンテロコリチカ腸炎エルシニアYersiniaenterocolitica;赤痢菌属Shigella;シゲラフレックスネリShigellaflexneri;志賀赤痢菌Shigelladysenteriae;シゲラボイディShigellaboydii;コクシエラ属Coxiella;コクシエラブルネッティQ熱コクシエラCoxiellaburnetii;Acidovoraxアシネトバクター属Acinetobacter;アシネトバクターバウマンニAcinetobacterbaumannii;アシネトバクターカルコアセティカスAcinetobactercalcoaceticus;AcinetobacterjohnsoniiAcinetobacterjuniiアシネトバクタールオフィイAcinetobacterlwoffii;Acinetobacterradioresistensアクチノバチルス属Actinobacillus;ActinobacillusminorアクチノバチルスプルロニューモニアActinobacilluspleuropneumoniae;アグレガチバクター属Aggregatibacter;アグレガチバクターアクチノミセテムコミタンスAggregatibacteractinomycetemcomitans;Aggregatibacteraphrophilus;AlcanivoraxAlcanivoraxborkumensisアゾアルカス属Azoarcus;アゾトバクター属Azotobacter;アゾトバクタービネランジーAzotobactervinelandii;ボルデテラ属Bordetella;ボルデテラブロンキセプチカ気管支敗血症菌Bordetellabronchiseptica;パラ百日咳菌Bordetellaparapertussis;百日咳菌Bordetellapertussis;Bordetellapetrii;カンピロバクター属Campylobacter;カンピロバクターコリCampylobactercoli;カンピロバクターウプサリエンシスCampylobacterupsaliensis;コマモナス属Comamonas;コマモナステストステローニComamonastestosteroni;デルフチ発明の詳細な説明本発明は、髄膜炎菌Nmeningitidisが亜鉛取り込みに関与する外膜タンパク質を発現するが、その少なくとも1つTdfIは、もっともよく調べられている髄膜炎菌Nmeningitidis菌株、ならびに他の多数のグラム陰性細菌種に見いだされる、という発見に基づく。髄膜炎菌Nmeningitidis血清型BのTdfIは、すべての血清型の髄膜炎菌Nmeningitidis菌株に対する交差殺菌性抗体を誘導することが明らかになったので、これらのタンパク質、および他のグラム陰性種におけるそれらのホモログは、グラム陰性細菌感染を防ぐための有望な抗原となる。本明細書で使用されるTdfIタンパク質およびTdfHタンパク質という用語は、髄膜炎菌Nmeningitidisにおいて同定された個別のタンパク質、ならびにそれらのホモログを表すために使用される。したがって、ある態様において、本発明は、抗原を含む免疫原性組成物もしくはワクチンを提供するが、この抗原は、必要に応じてキャリアタンパク質と結合すると、少なくとも第1のグラム陰性細菌株の外膜タンパク質を認識する免疫応答を生じさせることができるものであって、前記外膜タンパク質は細胞外亜鉛の取り込みに関与する。本明細書で使用される免疫原性組成物またはワクチンは、宿主に投与されたとき、免疫応答を生じさせることができる、少なくとも1つの抗原を含有する組成物を意味する。本明細書で使用される免疫応答は、B細胞抗体反応を意味する。抗原は、本発明の文脈によれば、体内で免疫応答を刺激する任意の物質である。ある実施形態において、抗原は、その抗原によって引き起こされる免疫応答により認識される、第1のグラム陰性菌株の外膜タンパク質に由来するポリペプチドである。この意味において由来するとは、その抗原が、出発点として前記外膜タンパク質を使用し、物質的にたとえば、標的変異、トランケーションなどによって、または知的にたとえば、合成ポリペプチドをデザインするために当該タンパク質の既知の配列を使用して作製されることを意味する。本明細書で使用されるポリペプチドは、ペプチド結合により連結された2つ以上のアミノ酸残基の、任意の鎖を意味する。免疫原性組成物もしくはワクチンは、前記抗原に加えて、1つもしくは複数の追加の抗原を含有することができる。キャリアタンパク質は、典型的には免疫系による抗原の検知を強化または促進するために、抗原が結合する、または付着する、またはコンジュゲートする、任意のタンパク質を意味する。この用語は、小ペプチドおよび大ポリペプチド10kDaをいずれも含むものとする。キャリアは、任意のペプチドもしくはタンパク質とすることができる。それは、1つもしくは複数のTヘルパーエピトープを含んでいてもよい。キャリアタンパク質は、たとえば、破傷風トキソイドTT、破傷風トキソイドフラグメントC、毒性のない破傷風毒素変異体、ジフテリアトキソイドDT、CRM197、ニューモリシンPly、proteinD、PhtD、またはPhtDEとすることができる。抗原によって引き起こされる免疫応答は、第1のすなわち1つの細菌菌株の外膜タンパク質を認識することができるが、2つ以上の菌株に存在する外膜タンパク質を認識する可能性もあり、その場合前記タンパク質は、菌株間で同一である必要はないが、それぞれのタンパク質がいずれも、その抗原によって生じる免疫応答によって認識されるよう、類似したエピトープを共有していなければならない。特に興味深いのは、一定のグラム陰性種の複数菌株、またはすべての菌株を認識する免疫応答を引き起こすことであって、この場合、前記菌株は、血清型群、血清型、血清亜型、または抗原の由来するもとの外膜タンパク質の正確なアミノ酸配列のうち少なくとも1つが異なる。交差防御は、個別の種を越えて広がることもある。本明細書で使用される外膜タンパク質という用語は、グラム陰性細菌の外膜に内在する、または外膜に付着した、または外膜上に発現された、ポリペプチドもしくはタンパク質を意味する。このタンパク質は内在性膜タンパク質であり、すなわち膜の内部に組み込まれているとすることができるが、場合によってはペリプラズムおよびまたは細胞外に露出する部分を有していてもよい。あるいはまた、このタンパク質は外膜の細胞外表面に付着していてもよく、脂質二重層、または内在性タンパク質のいずれかに直接付着することができる。外膜タンパク質は600~1000アミノ酸長の間であることが好適である。タンパク質の亜鉛取り込みへの関与とは、そのタンパク質が、遊離の、または錯体化した、細胞外亜鉛と結合し、必要に応じて、結合した亜鉛を、外膜を越えて輸送することを意味する。グラム陰性細菌外膜タンパク質が、亜鉛の結合、および、場合によってはその輸送に関与するか否かは、当業者が容易に確認できると思われるが、実施例は、これを達成することができるいくつかの方法、たとえば、タンパク質構造のモデリング、亜鉛イオン封鎖競合アッセイ、および外部亜鉛濃度に応じたタンパク質の発現制御アッセイなどを提供する。より詳細には、前記外膜タンパク質の亜鉛取り込みへの関与とは、当該タンパク質を欠損した外膜小胞の亜鉛結合が減少し、かつ当該タンパク質を欠損した細胞における亜鉛の蓄積が減少することであり、ならびにまたは、唯一の亜鉛源としてカルプロテクチンが存在する場合、当該タンパク質を欠損した細胞が増殖能力の低下を示すことである。前記免疫応答により認識される外膜タンパク質が、ある特定の実施形態では、PCTEP2009052689に記載のNMB0964ポリペプチドもしくはそれに記載のその断片、WO0055327の配列番号2もしくはそれに記載のその断片、WO9957280の配列番号606もしくはそれに記載のその断片、またはWO0011182の配列番号2、4および6、もしくはそれに記載のそれらの断片のアミノ酸配列で構成されない可能性があることに留意すべきである。それに加えて、またはその代わりに、前記外膜タンパク質を発現する前記の第1のグラム陰性細菌菌株はナイセリア菌株ではない。ある実施形態において、前記外膜タンパク質の発現は、亜鉛の利用可能性が低いことに対応して、アップレギュレートされる。この発現のアップレギュレーションは、トリプティックソイブロスTSBのような亜鉛含有複合培地で増殖させたときのタンパク質発現レベルと比べて、15倍、2倍、25倍、3倍、35倍、4倍、45倍、5倍、55倍、6倍、65倍、7倍、75倍、8倍、85倍、9倍、95倍、10倍、またはそれ以上となり得る。このような発現のアップレギュレーションは、亜鉛キレート剤、たとえば125μMの、TPENNNNNテトラキスエチレンジアミンが適当であるが、これを用いて、またはCatlin培地のような亜鉛の少ない合成培地を用いて達成することができる。ある実施形態において、前記免疫応答によって認識される外膜タンパク質を発現する、前記の第1のグラム陰性細菌菌株は、ヒトおよびまたは動物の、遊離亜鉛レベルの低い身体部分に感染する菌株である。そのような部分としては、たとえば、気道および血液、ならびに尿路および腸がある。前記の第1のグラム陰性細菌菌株は、気道に感染する下記の種に属することが適当である:Brucellasp、Coxiellasp、Pseudomonassp、Acinetobactersp、Moraxellasp、Chlamydiapsittaci、Chlamydiatrachomatis、インフルエンザ菌Haemophilusinfluenzae、Haemophilusparasuis、Haemophilussomnus、Legionellapneumophila、Actinobacilluspleuropneumoniae、百日咳菌Bordetellapertussis、Bordetellaparapertussis、Bordetellabronchoseptica、Mannheimiahaemolytica、Pasteurelladagmatis、およびPasteurellamultocida。ある実施形態において、前記の低レベルの遊離亜鉛は、亜鉛がカルプロテクチンのような分子に結合した結果である。低レベルの遊離亜鉛とは、遊離亜鉛が5、4、3、2、1、09、08、07、06、05、04、03、02、01、005、または001μM未満であることを意味し、誘導結合プラズマ質量分析法で約169μM亜鉛を有するRoswellParkMemorialInstitute培地1640中に存在するような濃度である。本明細書で使用される亜鉛はZn2を指している。特定の実施形態において、前記の第1のグラム陰性細菌菌株は、Bordetella百日咳菌BordetellapertussisBorreliaBorreliaburgdorferiBrucellaBrucellamelitensisBrucellaovisChlamydiaChlamydiapsittaciChlamydiatrachomatisEscherichia大腸菌EscherichiacoliHaemophilusインフルエンザ菌HaemophilusinfluenzaeLegionellaLegionellapneumophilaNeisseria淋菌Neisseriagonorrhoeae髄膜炎菌NeisseriameningitidisPseudomonas緑膿菌PseudomonasaeruginosaYersiniaYersiniaenterocoliticaMoraxellaMoraxellacatarrhalisShigellaShigellaflexneriShigelladysenteriaeShigellaboydiiCoxiellaおよびCoxiellaburnetiiからなる一群から選択される種または属に属する。別の実施形態において、前記の第1のグラム陰性細菌菌株は、AcidovoraxAcinetobacterAcinetobacterbaumanniiAcinetobacterbaumanniiAcinetobactercalcoaceticusAcinetobacterjohnsoniiAcinetobacterjuniiAcinetobacterlwoffiiAcinetobacterradioresistensActinobacillusActinobacillusminorActinobacilluspleuropneumoniaeAggregatibacterAggregatibacteractinomycetemcomitansAggregatibacteraphrophilusAlcanivoraxAlcanivoraxborkumensisAzoarcusAzotobacterAzotobactervinelandiiBordetellaBordetellabronchisepticaBordetellaparapertussis百日咳菌BordetellapertussisBordetellapetriiCampylobacterCampylobactercoliCampylobacterupsaliensisComamonasComamonastestosteroniDelftiaDelftiaacidovoransDiaphorobacterHaemophilusインフルエンザ菌HaemophilusinfluenzaeHaemophilusparasuisHaemophilussomnusMannheimiaMannheimiahaemolyticaMoraxellaMoraxellacatarrhalisNeisseria淋菌Neisseriagonorrhoeae髄膜炎菌NeisseriameningitidisPasteurellaPasteurelladagmatisPasteurellamultocidaProteusProteusmirabilisPseudomonasPseudomonasstutzeriおよびSphingomonasからなる一群から選択される種または属に属する。より詳細には、前記の第1のグラム陰性細菌菌株の外膜タンパク質は、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号6;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;配列番号49;配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号60;配列番号61;配列番号62;配列番号63;配列番号64;配列番号65;配列番号66;配列番号67;配列番号68;配列番号69;配列番号70;および配列番号71からなる一群から選択されるアミノ酸配列を含むが、この配列番号1は、髄膜炎菌NmeningitidisMC58株のTdfIであり、配列番号2~49はそのホモログであって、配列番号50は髄膜炎菌NmeningitidisMC58株のTdfHであり、配列番号51~71はそのホモログである。別の態様において、本発明は、抗原を含有する免疫原性組成物またはワクチンを提供するが、その抗原は、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号6;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;配列番号49;配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号60;配列番号61;配列番号62;配列番号63;配列番号64;配列番号65;配列番号66;配列番号67;配列番号68;配列番号69;配列番号70;および配列番号71からなる一群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約99、または少なくとも約100同一のポリペプチドを含み、場合によって、前記抗原は、必要に応じてキャリアタンパク質と結合したときに、そのアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こす能力を有する。この態様において、抗原を少なくとも一部分において構成するポリペプチドは、少なくとも前記ポリペプチドがある程度アミノ酸配列同一性を共有しているアミノ酸配列を認識する、免疫応答を引き起こすことができる。同一性の程度は、30313233343536373839404142434445464748495051525354555657585960616263646566676869707172737475767778798081828384858687888990919293949596979899または100とすることができる。ある実施形態において、ポリペプチドは、そのポリペプチドがアミノ酸配列同一性を共有するアミノ酸配列と、同一または実質的に同一の免疫原性を有する。同一性は、当技術分野で知られているように、配列を比較することによって決定される、場合によって、2つ以上のポリペプチド配列間の、または2つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係性である。当技術分野では、同一性は、場合によって、ポリペプチド配列、またはポリヌクレオチド配列の間の、一連のそうした配列間のマッチによって決定される配列関連性の程度も意味する。同一性は既知の方法により容易に計算することができ、その方法には、ComputationalMolecularBiologyLeskAMedOxfordUniversityPressNewYork1988BiocomputingInformaticsandGenomeProjectsSmithDWedAcademicPressNewYork1993ComputerAnalysisofSequenceDataPartIGriffinAMandGriffinHGedsHumanaPressNewJersey1994SequenceAnalysisinMolecularBiologyvonHeineGAcademicPress1987およびSequenceAnalysisPrimerGribskovMandDevereuxJedsMStocktonPressNewYork1991ならびにCarilloHandLipmanDSIAMJAppliedMath481073に記載の方法などがあるがこれらに限定されない。同一性を決定する方法は、調べる配列の間で最大のマッチを与えるように考えられている。さらに、同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。二つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラムの方法には、GCGプログラムパッケージの中のGAPプログラム387、BLASTP、BLASTN、およびFASTAなどがあるが、これらに限定されない。BLASTファミリーのプログラムはNCBIおよび他のソースから公開されているBLASTManualAltschulSetaINCBINLMNIHBethesdaMD20894AltschulSetaIJMolBioI215403410。よく知られているSmithWatermanアルゴリズムを用いて同一性を決定することもできる。ポリペプチド配列比較のためのパラメーターは下記を含むことができる:アルゴリズム:NeedlemanandWunschJMolBioI48443453比較行列:BLOSSUM62、HenikoffandHenikoffProcNatlAcadSciUSA891091510919よりギャップペナルティGapPenalty:8ギャップ長ペナルティGapLengthPenalty:2これらのパラメーターとともに使用できるプログラムは、GeneticsComputerGroupMadisonWIから、ギャッププログラムとして公開されている。前記パラメーターは、ペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである末端ギャップにはペナルティは付けない。ClustalWプログラムを用いたペアワイズアラインメントのためのパラメーターは、下記を含むことができる:ギャップ開始ペナルティ1000ギャップ伸長ペナルティ010タンパク質重み行列GonnetシリーズDNA重み行列IUBClustalWプログラムを用いたマルチプルアラインメントのためのパラメーターは、下記を含むことができる:ギャップ開始ペナルティ1000ギャップ伸長ペナルティ020相違配列遅延30DNA遷移重み050タンパク質重み行列GonnetシリーズDNA重み行列IUBネガティブマトリクス使用OFF特に指定のない限り、本明細書で同一性は、テスト配列ではなく基準配列の全長について表示される。配列番号1および50とそれらの同定されたホモログとのマルチプルアラインメントを図10および11に示し、同一性の値を表5および6に示す。この態様の、ある実施形態において、前記の抗原またはポリペプチドは、場合によっては、PCTEP2009052689に記載のNMB0964ポリペプチドもしくはそれに記載のその断片、WO0055327の配列番号2もしくはそれに記載のその断片、WO9957280の配列番号606もしくはそれに記載のその断片、またはWO0011182の配列番号2、4および6もしくはそれに記載のそれらの断片の、アミノ酸配列を有していてもよい。他の態様において、本発明は、抗原を含有する免疫原性組成物もしくはワクチンを提供するが、その抗原は、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号6;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;配列番号49;配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号60;配列番号61;配列番号62;配列番号63;配列番号64;配列番号65;配列番号66;配列番号67;配列番号68;配列番号69;配列番号70;および配列番号71からなる一群から選択される配列の免疫原性断片を含むポリペプチドを含んでおり、前記免疫原性断片は、前記の選択された配列の7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列からなり、さらに前記免疫原性断片は、必要ならばキャリアタンパク質と結合すると、前記の選択された配列を認識する免疫応答を引き起こすことができる。本明細書で使用される免疫原性断片は、本発明のアミノ酸配列すなわち配列番号1~71の1つの全長ではないが一部の長さについて、完全に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、それは少なくとも、そのアミノ酸配列を認識する免疫応答を引き起こすことができるものであり、前記断片はそのアミノ酸配列の断片である。ある実施形態において、免疫原性断片は、アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の免疫原としての活性を有するものであって、前記断片はそのアミノ酸配列の断片である。前記免疫原性断片は、少なくとも一部分は、アミノ酸配列の細胞外部分に由来するものであって、この断片はそのアミノ酸配列の断片である。前記断片は、他には、たとえば、本発明のアミノ酸配列の切断誘導体であってもよく、それはたとえば、アミノもしくはカルボキシ末端アミノ酸配列を含む一連の連続した残基である。本発明のアミノ酸配列の分解型も使用することができる。この態様の、ある実施形態において、前記の抗原もしくはポリペプチドもしくは免疫原性断片は、場合によっては、PCTEP2009052689に記載のNMB0964ポリペプチドもしくはそれに記載のその断片、WO0055327の配列番号2もしくはそれに記載のその断片、WO9957280の配列番号606もしくはそれに記載のその断片、またはWO0011182の配列番号2、4および6もしくはそれに記載のそれらの断片のアミノ酸配列を有していないことがある。前記の抗原もしくはポリペプチドもしくは免疫原性断片は、特に、TdfIタンパク質に由来するものとすることができるが、その場合、前記ポリペプチドがアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、または前記免疫原性断片がその断片であるアミノ酸配列は、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号6;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43;配列番号44;配列番号45;配列番号46;配列番号47;配列番号48;および配列番号49からなる一群から選択される。他の実施形態において、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンの、前記ポリペプチドもしくは免疫原性断片は、次のアミノ酸モチーフの少なくとも1つを含む:91GSAVSAVGXPVlMVlGQMLXGSAXR116DVAMSA2SGPADHTANVl154GLVAlVlNDVlLXDXKlLVP250GXGSAYFWVGSTNXQRL3YGLlVLlPGAHD334RXDEXRKQDGTSAEQSD3P3lFVL3RAKQ5DNRGYXHXE510RXPXAPVTQEMELMYFASYTXGXHXATLSXTSAFYlVEQXGDNQXXL595YXQG2AXFLYlXGXEDGAV3YFHQ8GSATXFSGDXVlRKNAGおよび657PARXPSAAPGXRLVASG。各モチーフに先行する数字は、さらに他の実施形態において、モチーフを含むポリペプチドと配列番号1を並べたときに、そのモチーフに相当する配列番号1配列の最初のアミノ酸の、配列番号1配列中の位置を示す。ある実施形態において、前記ポリペプチドもしくは免疫原性断片は、配列番号1の前記の最初のアミノ酸の位置、または配列番号2~49の同等位置から始まる前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加のアミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に含んでいる。モチーフは標準的なアミノ酸一文字標記を用いて表され、左から右へ、N末端からC末端として表される。たとえば、モチーフの他のアミノ酸に対して特定の位置にあるGは、その位置にグリシン残基が必要であることを示すが、たとえば、SAVは、セリンまたはアラニンまたはバリン残基が優先順位なしでその位置を占めなければならないことを示す。指定のない位置、すなわち、任意のアミノ酸残基とすることができる位置は、Xで表され、複数の連続したそのような残基は、たとえば3で表され、これはXXXを意味する。上記のように、前記抗原または前記ポリペプチドまたは前記免疫原性断片は、具体的にはTdfIタンパク質から得られる。あるいはまた、前記抗原または前記ポリペプチドまたは前記免疫原性断片はTdfHタンパク質から得られ、その場合、前記ポリペプチドがアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、または前記免疫原性断片がその断片であるアミノ酸配列は、配列番号50;配列番号51;配列番号52;配列番号53;配列番号54;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号60;配列番号61;配列番号62;配列番号63;配列番号64;配列番号65;配列番号66;配列番号67;配列番号68;配列番号69;配列番号70;および配列番号71からなる一群から選択される。他の実施形態において、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンの、前記ポリペプチドもしくは免疫原性断片は、下記のアミノ酸モチーフの少なくとも1つを含む:81RSTVlPGAFYTQNQVLlDKQGASSQGXVLSVLNVlRGXSNTGFLGRVANSTMQVlDGVlSTQTF156FSNDEGSTAKAGSNGlLVANSTALXGSANLFRKTLlGNSVADND226SXRKQXVlSLSAQNDYFRKVlGGG333LFALVKLlFVERYXGNDSVDKH4TGNlALQNSFLlYRXLMYXTNXlLVGASSTGRKRNSlLXNRDKNNTYQ491PXGSKEQXFlNHKlTSFlVLYFLlD574NHYSVALMSTlMlLFSAXFYLlGDSHDTPYGLFMNSTPFXSTGYFSARHKTSHRMlVAPNlVQKREMYVYFFSTおよび846EDVlKQNLAVFLDRKRLKNYlVMDNPALDY。各モチーフに先行する数字は、さらに他の実施形態において、モチーフを含むポリペプチドと配列番号50を並べたときに、そのモチーフに相当する配列番号50配列の最初のアミノ酸の、配列番号50配列中の位置を示す。ある実施形態において、前記ポリペプチドもしくは免疫原性断片は、前記の配列番号50の最初のアミノ酸の位置、または配列番号51~71の同等位置から始まる前記モチーフに隣接する配列から、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上の追加アミノ酸を、前記モチーフのNおよびまたはC末端に有する。このモチーフは、TdfIモチーフに関連して、上記のように表される。上記のように、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンは、上記の他に1つもしくは複数の抗原を追加して含有することができる。前記免疫原性組成物もしくはワクチンがTdfIタンパク質を認識する免疫応答を引き起こすことができる抗原を含有するような実施形態において、少なくとも1つの前記追加抗原は、本明細書に記載のTdfHタンパク質を認識する免疫応答を引き起こすことができる抗原とすることができる。反対に、前記免疫原性組成物もしくはワクチンがTdfHタンパク質を認識する免疫応答を引き起こすことができる抗原を含有するような実施形態では、少なくとも1つの前記追加抗原は、本明細書に記載のTdfIタンパク質を認識する免疫応答を引き起こすことができる抗原とすることができる。その代わりに、またはそれに加えて、このような追加抗原には、任意の抗原が含まれる可能性があり、その抗原は、第1の抗原と同じグラム陰性菌株もしくは種に対して、またはグラム陰性細菌もしくはその分類群に対しても、免疫応答を引き起こすことがあるが、引き起こさないこともある。少なくとも1つの前記追加抗原は、たとえば、髄膜炎菌Nmeningitidis由来のfHbpポリペプチド、またはHsfポリペプチド、またはHapポリペプチド、またはNadAポリペプチド、またはlipo28ポリペプチドであることが適当である。fHbpはナイセリアNeisseria属のGNA1870タンパク質を意味し、HsfはナイセリアNeisseria属のNMB0992タンパク質WO9931132;WO9958683の配列番号2および4BASB029、HapはナイセリアNeisseria属のNMB1985WO9955873BASB006タンパク質、NadAはナイセリアNeisseria属のNMB1994タンパク質、lipo28はナイセリアNeisseria属のGNA2132もしくはNMB2132タンパク質を意味する。ここに記載されるGNAおよびNMBの数字は、それぞれ、髄膜炎菌NeisseriameningitidisA群およびB群でコードされるポリペプチドを表し、ゲノム配列はwwwneisseriaorgから入手できる。さらに、タンパク質が本明細書で具体的に言及される場合、それは未変性の全長タンパク質、およびその天然バリアントへの言及とするのが適切であるが、その抗原性断片が含まれることもある。これらは、そのタンパク質のアミノ酸配列から連続して取り出された、少なくとも15アミノ酸を含有する、または少なくとも15アミノ酸からなる断片多くの場合、本明細書に具体的に記載されるであるが、適切なのは、少なくとも20アミノ酸、少なくとも30アミノ酸、少なくとも40アミノ酸、または少なくとも50アミノ酸である。抗原性断片は、免疫原性断片であるともいえる。さらに、本明細書のタンパク質およびタンパク質配列への言及は、前記タンパク質配列、言い換えると、前記タンパク質のアミノ酸配列に由来する、7、10、12、15、20、30、40もしくは50個またはそれ以上の連続アミノ酸の免疫原性断片を含んでなるポリペプチドを包含すると考えられる場合によっては、この前記免疫原性断片は、必要ならばタンパク質キャリアと結合して、前記タンパク質もしくは前記タンパク質配列を認識することができる免疫応答を引き起こす能力を有する。Hsf:Hsfは、オートトランスポータータンパク質に共通する構造を有する。たとえば、髄膜炎菌NmeningitidisH4476株由来のHsfは、アミノ酸151で構成されるシグナル配列、成熟タンパク質のアミノ末端にあるヘッド領域アミノ酸52479これは表面が露出しており、可変領域アミノ酸52106、121124、191210、および230234を含む、ネック領域アミノ酸480509、疎水性αヘリックス領域アミノ酸518529、および4つの膜貫通ストランドが外膜の両側をつなぐアンカードメインアミノ酸539591からなる。全長Hsfは、本明細書の免疫原性組成物に使用することができるが、さまざまなHsfトランケートおよび欠失型も、免疫原性組成物もしくはワクチンのタイプに応じて使用することができる。Hsfがサブユニット組成物もしくはワクチンに使用される場合、可溶性パッセンジャードメイン部分;たとえば、アミノ酸52479の完全なドメイン、もっとも適切なのはその保存部分、たとえば、アミノ酸134479の配列を使用することができる。適当な形のHsfは、WO0155182に記載のタンパク質の可変領域を欠失させるように、トランケートされていてもよい。適当なバリアントは、WO0155182に記載の、1、2、3、4、または5つの可変領域の欠失を含むと考えられる。上記配列および下記の配列は、NもしくはC末端のいずれか一方、または両方で、1、3、5、7、10、もしくは15個以下のアミノ酸だけ伸長させる、またはトランケートすることができる。したがって、Hsfの適当な断片は、Hsfのヘッド領域全体を含むが、これはアミノ酸52473を含有することが適切である。さらに他のHsfの適当な断片は、ヘッドの表面露出領域を含み、これは下記のアミノ酸配列のうち1つもしくは複数を含む:5262、7693、116134、147157、157175、199211、230252、252270、284306、328338、362391、408418、430440、および469479。Hsfが外膜小胞標品中に存在する場合、それは、全長タンパク質として、またはアミノ酸151および134591の融合物からなるバリアントとしてアミノ酸配列134からC末端までの成熟外膜タンパク質を生じる、発現される可能性がある。適当な形のHsfは、WO0155182に記載のタンパク質の可変領域を欠失させるようにトランケートされていてもよい。適当なバリアントは、WO0155182に記載の、1、2、3、4、または5つの可変領域の欠失を含むと考えられる。ある態様では、第1および第2の可変領域が欠失している。適当なバリアントは、アミノ酸配列52から237まで、または54から237までのアミノ酸配列の間から残基を欠失していると考えられるが、より適切には、アミノ酸52から133まで、または55から133までの間から残基を欠失する。成熟タンパク質はシグナルペプチドを欠いたものである。Hap:髄膜炎菌Neisseriameningitis由来のHap様タンパク質のコンピューター解析は、少なくとも3つの構造ドメインを明らかにする。H4476株由来のHap様配列を基準と見なすと、アミノ酸142を含むドメイン1は、オートトランスポーターファミリーに特徴的なSec依存性シグナルペプチドをコードしており、アミノ酸43950を含むドメイン2は、表面が露出しやすく免疫系にアクセスしやすいパッセンジャードメインをコードするが、951からC末端1457までの残基を含むドメイン3は、βストランドをコードすると予想され、このβストランドは、バレル様構造を構築して、外膜の中にアンカーとして固定される可能性が高い。ドメイン2および3は、表面露出しやすく、よく保存されておりテストした全菌株で80を越える、大腸菌Ecoliにおいてサブユニット抗原として作製することができるので、興味深いワクチン候補となるPizzaetalScience28718161820も参照されたい。本明細書の免疫原性組成物は、全長Hapタンパク質を含有することができるが、OMV標品に組み込まれていれば好適である。本明細書の免疫原性組成物は、Hapのパッセンジャードメインを含有してもよく、これはH4476株においてアミノ酸残基43950で構成される。このHap断片は、本明細書のサブユニット組成物に用いるのが特に有利であると思われる。Hapのパッセンジャードメインの上記配列は、NもしくはC末端のいずれか一方、または両方で、1、3、5、7、10、15、20、25、もしくは30個以下のアミノ酸だけ伸長させる、またはトランケートすることができる。本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンは、ある実施形態において、細菌外膜小胞標品を含有し、この標品が、組成物もしくはワクチンの抗原を含んでいる。このような組成物もしくはワクチンは、本発明の別の態様として与えられる方法によって作製することが可能であり、その方法は、前記抗原を産生する少なくとも1つの第1のグラム陰性細菌菌株を培養することを含むが、この前記抗原は、被験体に投与されたとき、少なくとも前記の第1のグラム陰性細菌菌株による感染に対して、防御反応を引き起こす外膜小胞の生産をもたらすのに十分なレベルで、産生される;さらにこの方法は、培養株から外膜小胞を調製すること;ならびに前記外膜小胞と製薬上許容される担体もしくは賦形剤を組み合わせて、被験体への投与に適した免疫原性組成物を作製することを含む。被験体に投与されたとき、少なくとも前記の第1のグラム陰性細菌菌株による感染に対して、防御反応を引き起こす外膜小胞の生産をもたらすのに十分なレベルとは、前記抗原を含有する外膜小胞の投与時に免疫応答が誘導され、その免疫応答が、前記第1のグラム陰性菌株によって引き起こされる疾患を予防し、その発症を遅らせ、もしくはその重症度を下げるものである、またはその疾患の症状を軽減、もしくは完全になくすものであるような、十分な抗原が産生されることを意味する。実施例で示すように、TdfIの発現は、遊離亜鉛濃度に応じて制御され、遊離亜鉛レベルの減少は、TdfI発現のアップレギュレーションと相関する。TdfHの発現も、それほどではないが、遊離亜鉛レベルに影響されると考えられている。したがって、前記方法において、前記細菌株の培養は、前記抗原の発現をアップレギュレートするために、亜鉛キレート剤を含有する培地中で行うことができるが、濃度は001100、0110、035、または051μMが適当である。前記亜鉛キレート剤は、たとえば、TPENとすることができる。亜鉛キレート剤の使用に代わるものとして、本発明による前記の培養をCatlin培地中で行うことができる。方法に関するある実施形態において、抗原は、前記第1のグラム陰性細菌株において、前記抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターから発現される。それに加えて、またはその代わりに、前記抗原は、異種の、およびまたは強力な、プロモーターからの発現によって生産されるが、すなわち、ある実施形態においてこのようなプロモーターは、遺伝子操作で前記細菌株の染色体に入れられ、前記抗原をコードするポリヌクレオチド配列と、機能しうるように連結される。当業者には周知のとおり、異種という用語は、天然では一緒に存在することのない2つの生物学的成分のことをいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子、またはプロモーターなどの制御領域とすることができる。異種成分は天然では共存しないが、遺伝子に対して異種であるプロモーターが機能しうるように遺伝子に連結される場合のように、いっしょに機能することはできる。強力なプロモーターは、機能しうるように連結されたポリヌクレオチド配列の高レベルな発現を駆動するプロモーターである。特定の種に属する細菌株に関して高レベルをもたらすものは、そうした菌株において強力なプロモーターがなんであるか知られているように、当業者によく知られていると考えられる。さらに、前記方法に関して、培養株から外膜小胞を調製するステップは、界面活性剤抽出によって行うことができるが、他の方法によって行うこともできる。前記の場合、前記抽出は、005、00204、00403、00602、008015または01の界面活性剤の使用を伴うことができる。好ましくは、界面活性剤はデオキシコール酸である。上記のように、前記抗原の発現は、前記第1のグラム陰性細菌株から生成される外膜小胞において、たとえば、遊離亜鉛の低い条件下での培養の結果として、アップレギュレートすることができる。したがって、前記抗原の発現は、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンに含まれる外膜小胞標品においてアップレギュレートすることが可能であって、これらはそのような標品を含んでいる。このようなアップレギュレーションは、同一菌株の野生型細菌由来の外膜小胞標品中の前記抗原の発現と比較することができる。具体的には、前記抗原の発現は、15、2、25、3、35、4、45、5、55、6、65、7、75、8、85、9、95、10倍またはそれ以上アップレギュレートすることができる。遊離亜鉛の低い条件で培養する代わりに、またはそうした条件で培養することに加えて、このような前記抗原発現のアップレギュレーションを達成するために、前記外膜小胞標品をもたらす宿主細胞を、前記抗原の産生について遺伝子改変することができる。このような改変は、内在性タンパク質の機能的発現の破壊を含んでおり、このタンパク質は遺伝子改変されていない宿主細胞において前記抗原の発現を抑制するものである。したがって、このような、内在性リプレッサータンパク質の標的化された破壊の後、前記抗原の発現はもはや抑制されず、すなわち相対的にアップレギュレートされる。ある実施形態において、内在性リプレッサータンパク質は、ナイセリアまたはグラム陰性細菌のZurリプレッサーである。リプレッサータンパク質発現の破壊の代わりに、またはそれに加えて、宿主細胞は、抗原をコードするポリヌクレオチドと、機能しうるように連結された、異種の、およびまたは、強力な、プロモーターの導入によって改変されていてもよい。このようなプロモーターは上記で述べた。前記の導入プロモーターは誘導性であって、すなわちプロモーターは、たとえばIPTGもしくは熱などの、それぞれ、化学的もしくは環境的刺激に応じて、スイッチオンにするまたはアップレギュレートすることができる。本発明はさらに、もう1つの態様において、遺伝子操作されたグラム陰性細菌株を提供するが、この菌株から、外膜小胞標品を含む本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンのこのような標品を得ることができる。ある実施形態において、免疫原性組成物もしくはワクチンは、2つ以上のグラム陰性細菌株から分離された外膜小胞標品を含有する。もう1つの実施形態において、前記菌株のうち少なくとも1つは、下記からなる一群から選択される細菌種もしくは属に属する;ボレリア属Borrelia;ボレリアブルグドルフェリライム病ボレリアBorreliaburgdorferi;ブルセラ属Brucella;ヤギ流産菌Brucellamelitensis;ヒツジ流産菌Brucellaovis;クラミジア属Chlamydia;クラミジアシタッシオウム病クラミジアChlamydiapsittaci;クラミジアトラコマチストラコーマクラミジアChlamydiatrachomatis;大腸菌属Escherichia;大腸菌Escherichiacoli;レジオネラ属Legionella;レジオネラニューモフィラLegionellapneumophila;エルシニア属Yersinia;エルシニアエンテロコリチカ腸炎エルシニアYersiniaenterocolitica;赤痢菌属Shigella;シゲラフレックスネリShigellaflexneri;志賀赤痢菌Shigelladysenteriae;シゲラボイディShigellaboydii;コクシエラ属Coxiella;コクシエラブルネッティQ熱コクシエラCoxiellaburnetii;アシドボラックス属Acidovoraxアシネトバクター属Acinetobacter;アシネトバクターバウマンニAcinetobacterbaumannii;アシネトバクターカルコアセティカスAcinetobactercalcoaceticus;AcinetobacterjohnsoniiAcinetobacterjuniiアシネトバクタールオフィイAcinetobacterlwoffii;Acinetobacterradioresistensアクチノバチルス属Actinobacillus;ActinobacillusminorアクチノバチルスプルロニューモニアActinobacilluspleuropneumoniae;アグレガチバクター属Aggregatibacter;アグレガチバクターアクチノミセテムコミタンスAggregatibacteractinomycetemcomitans;Aggregatibacteraphrophilus;AlcanivoraxAlcanivoraxborkumensisアゾアルカス属Azoarcus;アゾトバクター属Azotobacter;アゾトバクタービネランジーAzotobactervinelandii;ボルデテラ属Bordetella;ボルデテラブロンキセプチカ気管支敗血症菌Bordetellabronchiseptica;パラ百日咳菌Bordetellaparapertussis;百日咳菌Bordetellapertussis;Bordetellapetrii;カンピロバクター属Campylobacter;カンピロバクターコリCampylobactercoli;カンピロバクターウプサリエンシスCampylobacterupsaliensis;コマモナス属Comamonas;コマモナステストステローニComamonastestosteroni;デルフチア属Delftia;デルフチアアシドボランスDelftiaacidovorans;Diaphorobacterヘモフィルス属Haemophilus;インフルエンザ菌Haemophilusinfluenzae;ヘモフィルスパラスイスHaemophilusparasuis;ヘモフィルスソムナスHaemophilussomnus;マンヘミア属Mannheimia;ヘモリチカ菌Mannheimiahaemolytica;モラクセラ属Moraxella;カタル球菌Moraxellacatarrhalis;ナイセリア属Neisseria;淋菌Neisseriagonorrhoeae;髄膜炎菌Neisseriameningitidis;パスツレラ属Pasteurella;パスツレラダグマティスPasteurelladagmatis;パスツレラマルトシダPasteurellamultocida;プロテウス属Proteus;プロテウスミラビリスProteusmirabilis;シュードモナス属Pseudomonas;緑膿菌Pseudomonasaeruginosa;シュードモナススツッツェリPseudomonasstutzeri;およびスフィンゴモナス属Sphingomonas。本発明のもう1つの態様において、免疫原性組成物もしくはワクチンを作製するための方法が与えられ、これは下記を含む:前記抗原をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有する宿主細胞を、前記抗原を生産するための条件下で、それに十分な時間、培養し、培養液から抗原を回収すること;必要に応じて、硫安沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーからなる一群から選択される方法で前記抗原を精製すること;ならびに、前記抗原を、製薬上許容される担体もしくは賦形剤とともに製剤化すること。このような方法に関連して、抗原は宿主細胞にとって内在性であってもよいが、宿主細胞が外因性抗原の導入によって遺伝的に改変されていてもよい。前記抗原を作製するための宿主細胞の遺伝子改変には、上記のように、内在性リプレッサータンパク質の破壊、ならびに異種の、およびまたは強力なプロモーターの使用などがある。本発明は、与えられた方法によって作製される免疫原性組成物もしくはワクチンにまで及ぶ。前記抗原、および、状況に応じて、1つもしくは複数の追加の抗原に加えて、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンは、1つもしくは複数の製薬上許容される賦形剤、アジュバント、および亜鉛塩を含有することができる。本発明の他の態様において、抗原、ならびに、必要に応じて上記のような追加の抗原をコードする、少なくとも1つのポリヌクレオチドを含有する、免疫原性組成物もしくはワクチンが与えられるが、この場合前記ポリヌクレオチドは、真核生物プロモーターに、機能しうるように連結されている。このような態様において、抗原それ自体は投与されないが、コードするポリヌクレオチドの投与後にinvivoで生成される。このような技術は当技術分野で知られており、たとえば、WolffetalScience24714658を参照されたい。このようなポリヌクレオチドでの抗原の発現は、哺乳動物細胞内で発現を駆動する能力を有する、真核生物プロモーターの制御下にあると考えられる。ポリヌクレオチドは、他の抗原をコードする配列を追加して含んでいてもよい。このような真核生物プロモーターの例には、宿主として哺乳動物細胞を使用するウイルス由来のプロモーターがあり、これにはアデノウイルスプロモーターおよびレトロウイルスプロモーターが含まれる。あるいはまた、哺乳動物プロモーターを使用することもできるだろう。上記の免疫原性組成物もしくはワクチンは、ある実施形態において、グラム陰性細菌株による感染に対する防御反応を生じさせることができる。本明細書で使用される防御反応は、グラム陰性細菌株によって引き起こされる疾患を予防し、その発症を遅らせ、もしくはその重症度を下げる免疫応答、またはその疾患の症状を軽減し、もしくは完全に取り除く免疫応答を意味する。他の実施形態において、前記組成物もしくはワクチンは、2つ以上の異なる細菌株による感染に対する、防御反応を生じさせることができる。前記の1つもしくは複数の異なるグラム陰性細菌株は、下記からなる一群から選択される細菌属もしくは種に属することが適当である:ボレリア属Borrelia;ボレリアブルグドルフェリライム病ボレリアBorreliaburgdorferi;ブルセラ属Brucella;ヤギ流産菌Brucellamelitensis;ヒツジ流産菌Brucellaovis;クラミジア属Chlamydia;クラミジアシタッシオウム病クラミジアChlamydiapsittaci;クラミジアトラコマチストラコーマクラミジアChlamydiatrachomatis;大腸菌属Escherichia;大腸菌Escherichiacoli;レジオネラ属Legionella;レジオネラニューモフィラLegionellapneumophila;エルシニア属Yersinia;エルシニアエンテロコリチカ腸炎エルシニアYersiniaenterocolitica;赤痢菌属Shigella;シゲラフレックスネリShigellaflexneri;志賀赤痢菌Shigelladysenteriae;シゲラボイディShigellaboydii;コクシエラ属Coxiella;コクシエラブルネッティQ熱コクシエラCoxiellaburnetii;Acidovoraxアシネトバクター属Acinetobacter;アシネトバクターバウマンニAcinetobacterbaumannii;アシネトバクターカルコアセティカスAcinetobactercalcoaceticus;AcinetobacterjohnsoniiAcinetobacterjuniiアシネトバクタールオフィイAcinetobacterlwoffii;Acinetobacterradioresistensアクチノバチルス属Actinobacillus;ActinobacillusminorアクチノバチルスプルロニューモニアActinobacilluspleuropneumoniae;アグレガチバクター属Aggregatibacter;アグレガチバクターアクチノミセテムコミタンスAggregatibacteractinomycetemcomitans;Aggregatibacteraphrophilus;AlcanivoraxAlcanivoraxborkumensisアゾアルカス属Azoarcus;アゾトバクター属Azotobacter;アゾトバクタービネランジーAzotobactervinelandii;ボルデテラ属Bordetella;ボルデテラブロンキセプチカ気管支敗血症菌Bordetellabronchiseptica;パラ百日咳菌Bordetellaparapertussis;百日咳菌Bordetellapertussis;Bordetellapetrii;カンピロバクター属Campylobacter;カンピロバクターコリCampylobactercoli;カンピロバクターウプサリエンシスCampylobacterupsaliensis;コマモナス属Comamonas;コマモナステストステローニComamonastestosteroni;デルフチア属Delftia;デルフチアアシドボランスDelftiaacidovorans;Diaphorobacterヘモフィルス属Haemophilus;インフルエンザ菌Haemophilusinfluenzae;ヘモフィルスパラスイスHaemophilusparasuis;ヘモフィルスソムナスHaemophilussomnus;マンヘミア属Mannheimia;ヘモリチカ菌Mannheimiahaemolytica;モラクセラ属Moraxella;カタル球菌Moraxellacatarrhalis;ナイセリア属Neisseria;淋菌Neisseriagonorrhoeae;髄膜炎菌Neisseriameningitidis;パスツレラ属Pasteurella;パスツレラダグマティスPasteurelladagmatis;パスツレラマルトシダPasteurellamultocida;プロテウス属Proteus;プロテウスミラビリスProteusmirabilis;シュードモナス属Pseudomonas;緑膿菌Pseudomonasaeruginosa;シュードモナススツッツェリPseudomonasstutzeri;およびスフィンゴモナス属Sphingomonas。ある態様において、本発明は、グラム陰性細菌性疾患もしくは感染症の治療または予防のための方法を提供するが、その方法は、防御用量もしくは有効量の上記本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンを投与することを含む。別の態様において、グラム陰性細菌性疾患もしくは感染症の治療または予防に用いるための、上記免疫原性組成物もしくはワクチンが与えられる。本明細書で使用される疾患は、細菌感染症、または細菌感染によって引き起こされる、もしくは細菌感染に関係するなんらかの疾患、たとえば上気道感染症、ならびに侵襲性細菌性疾患、たとえば菌血症および髄膜炎を意味する。前記グラム陰性細菌性疾患は、任意のグラム陰性細菌株によって引き起こされる感染症もしくは疾患とすることができるが、適当な当該菌株は、下記からなる一群から選択される細菌属もしくは種に属する:ボレリア属Borrelia;ボレリアブルグドルフェリライム病ボレリアBorreliaburgdorferi;ブルセラ属Brucella;ヤギ流産菌Brucellamelitensis;ヒツジ流産菌Brucellaovis;クラミジア属Chlamydia;クラミジアシタッシオウム病クラミジアChlamydiapsittaci;クラミジアトラコマチストラコーマクラミジアChlamydiatrachomatis;大腸菌属Escherichia;大腸菌Escherichiacoli;レジオネラ属Legionella;レジオネラニューモフィラLegionellapneumophila;エルシニア属Yersinia;エルシニアエンテロコリチカ腸炎エルシニアYersiniaenterocolitica;赤痢菌属Shigella;シゲラフレックスネリShigellaflexneri;志賀赤痢菌Shigelladysenteriae;シゲラボイディShigellaboydii;コクシエラ属Coxiella;コクシエラブルネッティQ熱コクシエラCoxiellaburnetii;Acidovoraxアシネトバクター属Acinetobacter;アシネトバクターバウマンニAcinetobacterbaumannii;アシネトバクターカルコアセティカスAcinetobactercalcoaceticus;AcinetobacterjohnsoniiAcinetobacterjuniiアシネトバクタールオフィイAcinetobacterlwoffii;Acinetobacterradioresistensアクチノバチルス属Actinobacillus;ActinobacillusminorアクチノバチルスプルロニューモニアActinobacilluspleuropneumoniae;アグレガチバクター属Aggregatibacter;アグレガチバクターアクチノミセテムコミタンスAggregatibacteractinomycetemcomitans;Aggregatibacteraphrophilus;AlcanivoraxAlcanivoraxborkumensisアゾアルカス属Azoarcus;アゾトバクター属Azotobacter;アゾトバクタービネランジーAzotobactervinelandii;ボルデテラ属Bordetella;ボルデテラブロンキセプチカ気管支敗血症菌Bordetellabronchiseptica;パラ百日咳菌Bordetellaparapertussis;百日咳菌Bordetellapertussis;Bordetellapetrii;カンピロバクター属Campylobacter;カンピロバクターコリCampylobactercoli;カンピロバクターウプサリエンシスCampylobacterupsaliensis;コマモナス属Comamonas;コマモナステストステローニComamonastestosteroni;デルフチア属Delftia;デルフチアアシドボランスDelftiaacidovorans;Diaphorobacterヘモフィルス属Haemophilus;インフルエンザ菌Haemophilusinfluenzae;ヘモフィルスパラスイスHaemophilusparasuis;ヘモフィルスソムナスHaemophilussomnus;マンヘミア属Mannheimia;ヘモリチカ菌Mannheimiahaemolytica;モラクセラ属Moraxella;カタル球菌Moraxellacatarrhalis;ナイセリア属Neisseria;淋菌Neisseriagonorrhoeae;髄膜炎菌Neisseriameningitidis;パスツレラ属Pasteurella;パスツレラダグマティスPasteurelladagmatis;パスツレラマルトシダPasteurellamultocida;プロテウス属Proteus;プロテウスミラビリスProteusmirabilis;シュードモナス属Pseudomonas;緑膿菌Pseudomonasaeruginosa;シュードモナススツッツェリPseudomonasstutzeri;およびスフィンゴモナス属Sphingomonas。特定の実施形態において、前記菌株はナイセリア属菌株でないこともある。本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンは、添加物を添加して、または添加せずに、経口で、経鼻で、鼻咽頭に、非経口で、経腸で、経胃で、局所に、経皮で、皮下に、筋肉内に、錠剤、固体、粉末、液体、エアロゾルの形で、局部的もしくは全身的に、投与することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際的方法は、当業者に知られており、すなわち明らかであって、RemingtonsPharmaceuticalScience15thedMackPublishingCompanyEastonPennsylvaniaのような出版物に詳細に記載されている。経口投与は、組成物を消化から守ることが必要であると認識されている。これは典型的には、酸加水分解および酵素的加水分解に対して抵抗性にする薬剤と組成物を組み合わせることによって、または適当な抵抗性のある担体の中に組成物をパッケージすることによって達成される。消化から守る手段は当技術分野で周知のことである。組成物は、グラム陰性細菌性疾患に罹る危険にさらされている動物に投与され、疾患およびその合併症の発症を予防し、または少なくともある程度、阻止する。これを達成するのに十分な量が、治療上有効な量と定義される。治療に使用するために有効な量は、たとえば、免疫原性組成物もしくはワクチン、投与法、患者の体重および全身健康状態、ならびに処方医師の判断によって決まる。免疫原性組成物もしくはワクチンの単回投与もしくは複数回投与は、患者に必要とされ、しかも許容される投与量および頻度、ならびに投与経路に応じて、行うことができる。免疫原性組成物もしくはワクチンは、宿主において免疫応答、特に液性免疫応答を引き起こすのに有効な量で投与される。免疫化のための量は概して、70kgの患者あたり約0001mgから約10mg、より一般的には70kgの患者あたり0001mgから約02mgまでの幅がある。特に、抗原が血流中にではなく、体腔、または臓器内腔などの孤立した部位に投与される場合、患者あたり1日0001から約10mgまでの投与量を使用することができる。実質的にもっと高い投与量10から100mgまで、またはそれ以上は、経口、経鼻、または局所投与では可能である。初回投与後、同じく別の組成物で追加免疫を行うことができるが、少なくとも1回、より一般的には2回の追加免疫が好ましい。免疫原性組成物もしくはワクチンは、典型的には、所与のグラム陰性細菌株もしくは種に関して免疫学的にナイーブな哺乳動物に投与される。特定の実施形態において、哺乳動物は、約5歳未満、好ましくは約2歳未満のヒト乳幼児であり、抗原組成物は、次の時点のいずれか1つもしくは複数の時点で、投与される:生後2週間、1ヶ月、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは11ヶ月、もしくは1年、または15、18、もしくは21ヶ月、または2、3、4、もしくは5歳。概して、いかなる動物への投与も、最初に病徴が兆す前に、またはグラム陰性細菌株もしくは種に暴露した可能性のある、もしくは実際に暴露した、最初の兆候の時点で、開始することが好ましい。他の実施形態において、本発明は、たとえば、グラム陰性細菌性疾患の予防もしくは治療に使用するために免疫グロブリンを調製する方法を提供するが、その方法は本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンを用いてレシピエントを免疫化するステップ、ならびにそのレシピエントから免疫グロブリンを取り出すステップを含む。このようにして得られる免疫グロブリン標品は、製薬上許容される賦形剤を追加して含有する医薬製剤の形で与えられることもある。ポリクローナル抗体生産のための接種材料は、典型的には、免疫原性組成物もしくはワクチンを、生理食塩水などの生理学的に許容される希釈剤、または水性組成物を生成するための、ヒトの使用に適した他のアジュバント中に分散させることにより調製される。免疫を刺激する量の接種材料を、哺乳動物に投与し、接種された哺乳動物は、その後、免疫原性組成物もしくはワクチンが防御抗体を誘導するのに十分な時間、維持される。抗体は、アフィニティクロマトグラフィーなどのよく知られた方法によって望ましい程度まで分離することができる。抗体は、通常使用されるさまざまな動物、たとえば、ヤギ、霊長類、ロバ、ブタ、ウマ、モルモット、ラットもしくはヒトから得られる、抗血清標品を含めることができる。動物から採血し、血清を回収する。本発明にしたがって作製される免疫グロブリンは、全抗体、抗体フラグメント、またはサブフラグメントを含む可能性がある。抗体は、任意のクラスの全免疫グロブリン、たとえば、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、キメラ抗体、またはTdfIタンパク質およびTdfHタンパク質に対する二重特異性を有するハイブリッド抗体とすることができる。それらは、フラグメント、たとえばF2、Fab、Fab、Fvなどであってもよく、ハイブリッドフラグメントを含むことができる。免疫グロブリンには、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより、抗体のように作用する、天然タンパク質、合成タンパク質、または遺伝子操作タンパク質も含まれる。本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンは、レシピエントに投与することができ、このレシピエントは次に、該特定の免疫原性組成物もしくはワクチンのチャレンジに応じて産生される免疫グロブリンの供給源となる。このようにして処置された被験体は血漿を提供することになるが、この血漿からは高力価免疫グロブリンが、従来の血漿分画法によって得られるであろう。高力価免疫グロブリンは、所定のグラム陰性細菌種もしくは菌株による感染に対して抵抗性を与え、またはこれを治療するために、別の被験体に投与されることになる。本発明の高力価免疫グロブリンは、特に、乳幼児や免疫力の低下した個体において、または治療が必要であるがその個体がワクチン接種に反応して抗体を産生する時間がない場合に、グラム陰性細菌性疾患の治療または予防に有用である。本発明のもう1つの態様は、TdfIタンパク質およびまたはTdfHタンパク質に対して反応するモノクローナル抗体、ならびに製薬上許容される賦形剤を含有する医薬製剤であって、これはグラム陰性細菌による感染症を治療または予防するために使用することができる。このような医薬製剤は、任意のクラスの全免疫グロブリン、たとえば、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、キメラ抗体、またはTdfIタンパク質およびTdfHタンパク質に対する二重特異性を有するハイブリッド抗体とすることができるモノクローナル抗体を含有する。それらは、フラグメント、たとえばF2、Fab、Fab、Fvなどであってもよく、ハイブリッドフラグメントを含むことができる。モノクローナル抗体を作製する方法は当技術分野でよく知られており、脾細胞と骨髄腫細胞との融合が挙げられるKohlerandMilstein1975Nature256495AntibodiesalaboratorymanualHarlowandLane1988。あるいはまた、モノクローナルFvフラグメントを、適当なファージディスプレイライブラリーのスクリーニングで得ることができるVaughanTJeta11998NatureBiotechnology16535。モノクローナル抗体は、当技術分野で周知の技法を用いて、ヒト化、または部分的にヒト化することもできる。本発明は、免疫グロブリンもしくはモノクローナル抗体を含有する、有効量の上記医薬製剤を患者に投与するステップを含む、グラム陰性細菌性疾患の治療または予防のための方法、ならびにそうした疾患の予防または治療に使用するための上記製剤に及ぶ。本特許明細書の中で引用されるあらゆる参考文献もしくは特許出願は参考として本明細書に組み入れられる。実施例本明細書に記載の実施例および実施形態は、説明のみを目的としており、それらを考慮してさまざまな修正または変更が当業者に示唆されるが、それは本出願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきものであることが認められている。本明細書に引用されたあらゆる刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために、参考としてその全体を本明細書に含めるものとする。TdfIのアップレギュレーションを示すOMVの免疫原性TdfIは、髄膜炎菌Nmeningitidisが血液中に存在するときに発現すると考えられる遺伝子である。したがって、TdfIは、菌株を通常の培地中で培養すると、普通は発現されないが、たとえば、野生株H4476は、特別な培養条件ヘミンを添加したRPMI培地でこのタンパク質を発現させるようにすることができる。以下の実験は、TdfI発現が組み換えによってIPTGの使用による誘導性となった、H4476株の使用を詳述する。これは、この菌株から作られたOMVワクチンの表面上でのTdfIの過剰発現を可能にするが、加えて、この抗原を発現する菌株を培養して、TdfIに対して生じた抗体が通常の培養条件IPTG下でTdfIを発現するこのような改変株を死滅させることができるかどうかを立証する簡単な方法を提供する。SBAに使用される細胞上のTdfI発現に及ぼすIPTGの影響を図7に示す。10匹のマウスからなる群を、筋肉内経路で、0、21、および28日目にOMVで3回免疫化した。各接種は、MPLとともにAlPO4で製剤化された5μgタンパク質含量のOMVからなるものであった。OMVは、莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレートされ、LOS免疫型がgalE型となるよう操作された、髄膜炎菌NeisseriameningitisH4476株から得られた。TdfIがアップレギュレートされている、またはアップレギュレートされていないOMVの比較を行ったIPTG誘導プロモーターの制御下でのアップレギュレーション。42日目に、培地中にIPTGを添加後、または添加せずにTdfIを発現する、または発現しない同型株H4476を用いて血清殺菌アッセイで分析するために、血液サンプルを採取した。髄膜炎菌Nmeningitidis株は、ペトリ皿の10μgmlクロラムフェニコールを含有するGC寒天上で、37°C5CO2で一晩培養した。それを、1000μMIPTG添加または無添加の液体TSB培地中で3時間、継代培養した。個々の血清は、56°Cで30分間、不活化した。血清サンプルは、05HBSSBSAで希釈した後、平底マイクロプレート中の25μlの容量で、2倍希釈した。細菌は、05HBSSBSAで希釈して8103CFUmlが得られ、この希釈液125μlを血清希釈液に加えた。さらにウサギ補体を各ウェルに加えた。振とう条件下で37°Cにて75分間インキュベーション後、この15μlの混合物を、37°CCO2で一晩インキュベートされた、あらかじめ加温されたGC寒天プレート上に広げた。CFUを計数し、死滅率を算出した。SBA力価は、50の死滅率を与える希釈度である。SBA力価:標的細胞によるTdfI発現の影響IPTGなしでは、TdfIは標的細胞上に発現せず、この細胞はアップレギュレートされたTdfIOMVで免疫化されたマウス由来の血清によって死滅しない。TdfI発現がIPTGにより特異的に誘導されると、標的細胞はTdfIを発現し、抗TdfIOMVマウス血清によって死滅する。ワクチンとなり得る髄膜炎菌Neisseriameningitisの新規亜鉛制御型外膜タンパク質要約ヒト宿主において遊離鉄の濃度は低いので、効率的な鉄獲得機構は、病原性細菌の重要な病原性因子となる。グラム陰性細菌では、TonB依存性外膜受容体が、鉄の獲得に関与する。しかしながら、ヒト宿主において同様に不足している他の金属の、細菌外膜を越える輸送は、ごくわずかしか明らかになっていない。本研究では、髄膜炎菌Neisseriameningitisの新規TonB依存性外膜受容体の特性を明らかにした。本研究者らは、細菌が亜鉛制限下でこのタンパク質を生産し、それが亜鉛取り込みに関与することを示す。さらに、このタンパク質は分離株の間で高度に保存されており、しかも殺菌性抗体を誘導する能力を有するので、これまで有効な万能ワクチンが得られていない髄膜炎菌Nmeningitidisに対するワクチンを開発するための新たな候補となる。TdfIと呼ばれるこのタンパク質のホモログは、気道内に常在する他の多くの病原体にも見いだされるので、受容体を介した亜鉛の取り込みが、この生態学的適所での生存に特に重要であることが示唆される。序論グラム陰性細菌の細胞表層は、内膜および外膜の2つの膜からなり、これら2つの膜は、ペプチドグリカン層を含むペリプラズムによって隔てられている。外膜は環境からの有害化合物に対するバリアを形成する。ほとんどの栄養分は、ポリンと総称される大量のチャンネル形成外膜タンパク質を介した受動拡散で、外膜を通過することができる。しかしながら、栄養分の細胞外濃度が低い場合は、拡散という選択肢はない。これが、たとえば、鉄の場合である。鉄がラクトフェリンおよびトランスフェリンなどの鉄輸送および鉄貯蔵タンパク質によって捕捉されているヒト宿主の体内で、病原体は遊離鉄の低濃度に直面する。したがって、効率のよい鉄獲得機構は、重要な病原性因子となるので、多くの病原体で広範に研究されてきた1、2。鉄制限条件下で培養すると、グラム陰性細菌は、宿主の鉄結合タンパク質、ヘム、またはシデロフォアの受容体として機能する、外膜タンパク質の合成を誘導するが、このシデロフォアは、鉄制限条件下で細菌が生産して分泌する小さな鉄キレート化合物である。このような受容体の分析された結晶構造は、22ストランドのβバレルを示し、これは開口チャネルを形成せずにN末端プラグドメインによって閉じられている3。リガンドが受容体に結合した後、それに続く取り込みは、内膜内外のプロトン勾配のエネルギーを必要とする能動過程であって、それは3つのタンパク質からなる複合体であるTonB複合体を介して、外膜内の受容体と共役する4、5。鉄獲得機構は、多くのグラム陰性細菌で広く研究されているが、細菌外膜を通過する亜鉛およびマンガンなどの他の必須重金属の輸送については、まだほとんど知られていない。これらの微量元素の濃度も、ヒト宿主体内で低く、ヒト宿主はたとえば、感染に対応してメタロチオネインおよびカルプロテクチンを生産することによって、侵入病原体の金属利用可能性を低下させる6、7。したがって、グラム陰性病原体は、これらの金属のための効果的な獲得機構を有する可能性があり、それは鉄獲得機構と類似しているかもしれないが、そうでない可能性もある。髄膜炎菌Neisseriameningitisは、鼻咽頭粘膜に無症候性に定着しうるヒトの偏性病原体である。時に、その細菌が血流に入り、死亡率の高い髄膜炎および敗血症を引き起こす可能性がある8。髄膜炎菌Nmeningitidisのほとんどの病原性血清型については莢膜多糖に基づいてワクチンが利用可能であるが、血清型B株髄膜炎菌に対するワクチンは十分でない。血清型B株の多糖莢膜は、それがヒトの糖タンパク質と類似しているため、免疫原性に乏しい9。したがって、莢膜下抗原が、代替ワクチン成分として研究されている;しかしながら、こうした研究は、主要な外膜タンパク質の抗原変異性が高いことにより頓挫した。したがって、関心は、TonB依存性受容体を含むマイナー抗原にシフトしている。鉄制限条件下で培養したとき、髄膜炎菌Nmeningitidisは、いずれも鉄の取り込みに関与するラクトフェリン10、トランスフェリン11、ヘモグロビン12、13、およびエンテロバクチン14のためのTonB依存性受容体を生産する。ホモロジー検索に基づいて、Turnerら15は、3つのナイセリア菌株の、入手可能なゲノム配列の中で、推定TonB依存性ファミリーTdfメンバーに対する7つの追加の遺伝子を特定した。興味深いことに、これらのtdf遺伝子のうち一部の発現は、さまざまなマイクロアレイ研究16、17において、鉄の利用可能性によって影響されないようであったが、そのことは、それらの産物が鉄以外の金属の輸送に関与する可能性があることを示している。そこで本発明者らは、これらのうち1つの受容体の、合成の調節、機能、およびワクチンとなる可能性を研究し、この受容体が亜鉛の取り込みに関与することを示す。結果TdfIはヘム受容体ではない。TdfI髄膜炎菌Nmeningitidis血清型A株Z2491および血清型B株MC58の配列決定されたゲノム中のローカスタグ、それぞれNMA1161およびNMB0964は、ナイセリアゲノム中に存在する7つの新規推定TonB依存性受容体のうちの1つとして、あらかじめ特定された15が、これはナイーブなヒト血清の存在下でアップレギュレートされることが判明した18。今まで研究されたほとんどすべてのTonB依存性受容体は鉄獲得に関与するので、TdfIは鉄複合体を輸送すると推測した。この考えは、NMA1161のアミノ酸配列を用いたblast検索19が、ヘム取り込み用の外膜受容体、たとえばカタル球菌MoraxellacatarrhalisのHumA、に対して高い配列相同性を示し、同一性は41、相同性は58であったという事実によって強められた。TdfIの機能を評価するために、HB1と称される血清型B株H4476の無莢膜性派生株のtdfI欠失変異株を構築した。ドットブロット解析での評価によって、HB1およびtdfI変異株に対して同様のヘムの結合が見られ、tdfI変異株は、唯一の鉄源としてヘムを用いてプレート上でなお増殖することが可能であった。TdfIを発現する大腸菌Escherichiacoli細胞によるヘム結合の増加も見られなかった。また、大腸菌ヘム要求株を補完することもできなかったデータ不記載。したがって、TdfIはヘム受容体と相同的ではあるが、ヘム受容体としては機能しないとの仮説を立てた。亜鉛によるtdfIの制御TdfIはヘム受容体でなく、鉄による制御も見られないので、髄膜炎菌NeisseriameningitisH4476莢膜欠損株HB1においてtdfIの発現を検出することができる条件を探した。富栄養の複合培地であるトリプティックソイブロスTSBで細菌を培養すると、ウェスタンブロットでTdfIを検出することはできなかった図1A、レーン1。しかしながら、化学的に組成の明らかな合成培地RPMI培地中で細菌を培養すると、TdfIは細菌溶解物中で検出可能であった図1A、レーン2。検出されたシグナルの特異性は、RPMI中で培養したtdfIノックアウト株中にそれが存在しないことによって実証された図1A、レーン3。本発明者らは、RPMIに添加された小量のTSBが存在するだけで、TdfI合成にマイナスの影響を及ぼすことに気づいた図1B;TSBはtdfIの転写を抑制する化合物を含有すると思われる。RPMIは微量金属源を含有しないことに気づいたので、コバルト、モリブデン、マンガン、銅、および亜鉛を含有する微量金属混合物の添加が、tdfI発現を抑制するかどうか調べることを決定したが、これは実際そういうことであると思われた。次に、上記すべての金属を別々にテストし、亜鉛が特異的に、μMを下回る濃度でもtdfIの発現抑制を引き起こすことが明らかになった図1C。標準的なRPMI培地は特別な亜鉛源を添加していないので、細菌の増殖に必要な、利用可能な亜鉛はおそらく、水、およびまたは培地作製に使用された塩に含まれる微量成分に由来する。誘導結合プラズマ質量分析法ICPMSでRPMI培地中の亜鉛濃度を測定し、それが約110ppb約169μMであると判明した。tdfIの亜鉛による調節は、RPMI培地に特異的な亜鉛キレート剤NNNNテトラキスエチレンジアミンTPENを添加すると、さらにいっそう明白になった。培地にTPENを添加すると、TdfI合成が用量依存的に増加した図1D。しかしながら、1μMTPENを上回る濃度は、おそらく培地から全亜鉛が枯渇するため、細胞増殖を完全に阻害した。増殖は亜鉛の添加によって回復させることができたデータ不記載。tdfIの亜鉛による制御は、500nM亜鉛もしくは05μMTPENを添加した、または添加しない、RPMI中で増殖させた培養物から得られた全RNAを用いた、定量的リアルタイムPCRRTqPCRによって確認された。データから、亜鉛の存在下で138倍の抑制が示され、TPENの存在下で38倍のアップレギュレーションが示された。TPENおよび亜鉛添加の間の倍数差は526倍であった。tdfI発現における転写制御因子Zurの役割大腸菌では、亜鉛取り込み制御因子ZurはznuACB遺伝子の発現を制御することが判明しているが、この遺伝子は、ペリプラズム結合タンパク質、ATPアーゼ、および内在性内膜成分をコードしており、これらはペリプラズムから細胞質への亜鉛輸送に必要とされる23。亜鉛存在下で、Zurは、znuACBオペロンのプロモーター中のZur結合要素コンセンサスGAAATGTTATANTATAACATTTCと結合し、それによって転写をブロックする。髄膜炎菌NmeningitidisMC58株のゲノム配列中で、大腸菌zur遺伝子のホモログ、すなわちNMB1266、ならびにznuCBAのホモログ、すなわちNMB0588、NMB0587、およびNMB0586を特定した。さらに、ナイセリアtdfIの上流の領域中に大腸菌Zur結合コンセンサスに類似した配列GtAATGTTATATaATAACAaact、およびznuCcAAAcGTTATACagTAtCATaTC大腸菌コンセンサスと同一のヌクレオチドは大文字とするを見いだした。tdfI発現の制御にZurが関与することを確認するために、HB1株のzur変異株を作製したが、この変異株は実際に、TdfIを構成的に生産した図2。また、RTqPCRから、いずれも亜鉛存在下で培養されたzur変異株ではその親株と比べて、znuAおよびtdfIの発現レベルが、それぞれ5倍および34倍に増加するので、znuAおよびtdfIの発現にZurが関与することが実証された。TdfIは亜鉛獲得を促進するtdfIの発現は、亜鉛の利用可能性によって制御されるので、TdfIは亜鉛の受容体、または亜鉛含有複合体として機能する可能性が高い。本発明者らは、まず、アミノ酸配列を解析し、wwwrostlaborgのPROFtmbプログラムを用いてTdfIのトポロジーモデルを構築した図3。TdfIは、推定される細胞外ループL3に2つのシステイン残基を含有する。これらのシステインがジスルフィド結合を形成しているならばこのことは、DTTあり、またはDTTなしのSDSPAGEによる、細菌の膜画分の解析により支持されるが、このサンプルと還元剤とのインキュベーションは結果として、おそらくはジスルフィド結合の破壊に起因する、電気泳動移動度の変化をもたらした、それらは、2つのごく近接した、ヒスチジンおよびアスパラギン酸残基に富む、アミノ酸残基のストレッチをもたらすが図3、これら2つのストレッチは、大腸菌のペリプラズムZnuAタンパク質においても、HisおよびAsp残基のストレッチが亜鉛との結合に関与している25ので、機能的に重要であると考えられる。したがって、本発明者らは、TdfIが遊離亜鉛と結合し、これをペリプラズムに輸送する可能性を考慮した。この仮説を調べるために、まずTdfIが亜鉛と結合するかどうか判定した。亜鉛に対して外膜小胞が4レゾルシノールPARと競合する能力について、外膜小胞のTdfIの有無で比較した。TdfIを含有する外膜小胞は、TdfIを含有しない小胞と比べて、約40の亜鉛結合の増加を示した図4A。亜鉛の輸送を調べるために、ICPMSを用いて、tdfIノックアウト、tonBノックアウト、およびそれらの親株を、細胞内亜鉛の蓄積について比較した。HB1はtdfI変異株もしくはtonB変異株より約33多くの亜鉛を蓄積したが、それは、TdfIが遊離亜鉛を輸送すること、ならびにこの輸送にTonB系が必要であることを示す図4B。TdfIが実際に遊離亜鉛の取り込みに関与するならば、tdfI変異株では、野生株より高い外部亜鉛濃度でznu遺伝子発現の脱抑制が生じることが予想される。この考えを検証するために、tdfI変異株および親株を、500nM亜鉛を追加したRPMI培地で培養したが、この追加された亜鉛は、野生株においてtdfI発現をほとんど抑制するものの完全には抑制しない図1C。つぎに、tdfIおよびznuAmRNAの相対レベルを、RTqPCRで測定した。tdfI変異株は、遺伝子発現を検出するために使用された、tdfI遺伝子の最初の437ヌクレオチドをまだ含有している。tdfI変異株において、186倍多くのtdfIおよび74倍多くのznuAが発現されていたが、そのことは、tdfI変異株の細胞内亜鉛濃度が、使用された培養条件下では親株より低いことを示す。また、znuAノックアウト株は、亜鉛存在下で高レベルのTdfIを発現したが、これによって、細胞内で十分な亜鉛レベルを維持するためにZnuAが必要であることが確認された図4C。したがって、TdfIおよびZnuAはいずれも、亜鉛の輸送に関与する。TdfIの保存TdfIの機能に加えて、TdfIが、髄膜炎菌万能ワクチンのためのワクチン候補となるかどうかも調べる必要がある。基準の1つは、この抗原が保存されていなくてはならないということである。まず、入手可能な髄膜炎菌Nmeningitidisゲノムを調べ、TdfIが、その成熟タンパク質について9799という顕著なアミノ酸同一性を有することが判明した図8。配列の相違は、タンパク質全体にわたって散在していて、予想される細胞外ループ領域に集中してはいないが、ナイセリア外膜タンパク質では、この領域が抗原変異性となることが多い図8。次に、異なる血清型および異なるクローン系統に由来する32個の異なる髄膜炎菌Nmeningitidis分離株のパネルで、TdfIの存在を分析した。500nM亜鉛添加もしくは無添加のRPMI培地中で各菌株を培養し、H4476株のTdfIに対する抗血清を用いて、ウェスタンブロットで分析した。全菌株が、亜鉛存在下でTdfIの抑制を示した図5。次に、他の病原性細菌に対するTdfIの相同性を知る必要がある。まず、TdfIを淋菌Ngonorrheaと比較し、これら2つのナイセリア菌株間で96同一性、および97相同性を見いだした。次に、NCBIのblastプログラムを、アミノ酸レベルで40同一性のカットオフで使用して、他の病原性細菌のTdfIホモログを検索した。カタル球菌Mcatarrhalis、ヘモフィルスパラスイスHaemophilusparasuis、ヘモリチカ菌Mannheimiahaemolytica、アシネトバクターバウマンニAcinetobacterbaumannii、パスツレラマルトシダPasteurellamultocida、百日咳菌Bordetellapertussis、およびアクチノバチルスプルロニューモニアActinobacilluspleuropneumoniaeなどの、他の病原性細菌においてホモログを特定したが、平均するとアミノ酸レベルで41同一性および59相同性となり、TdfIホモログはすべて、HisAsp領域を有する図9。興味深いことに、百日咳菌Bpertussisでは、tdfIホモログはznuABCおよびzur遺伝子のホモログに隣接した位置にあり、やはり、これらの遺伝子間の機能的関連性を示している。さらに、これらのTdfIホモログはすべてHisおよびAspリッチストレッチを含有する図9。TdfIは殺菌性抗体を誘導するTdfIがワクチンとなり得る可能性を検討するために、過剰発現レベルのこのタンパク質を含有するナイセリア外膜小胞を用いてマウスを免疫し、得られた血清で殺菌性抗体の有無を調べた。通常、血清殺菌アッセイはTSB培地で培養した細菌で行われる;しかしながら、こうした条件下ではtdfIは発現されない。したがって、血清の殺菌活性は、イソプロピルβD1チオガラクトピラノシドIPTG誘導性プロモーターからTdfIを発現する菌株でテストし、IPTGあり、およびIPTGなしで増殖させた培養物を比較した。細菌の培養中にIPTGが存在しない場合、血清の殺菌力価は50死滅を生じる血清の最大希釈度として定義した。参考文献1RatledgeC2007IronmetabolismandinfectionFoodNutrBull28S5155232WandersmanCandPDelepelaire2004BacterialironsourcesfromsiderophorestohemophoresAnnuRevMicrobiol586116473WienerMC2005TonBdependentoutermembranetransportgoingforBaroqueCurrOpinStructBiol153944004PostleK1993TonBproteinandenergytransductionbetweenmembranesJBioenergBiomembr255916015BraunV2006EnergytransferbetweenbiologicalmembranesACSChemBiol13523546DeSKMTMcMasterandGKAndrews1990EndotoxininductionofmurinemetallothioneingeneexpressionJBiolChem26515267152747CorbinBDEHSeeleyARaabJFeldmannMRMillerVJTorresKLAndersonBMDattiloPMDunmanRGeradsRMCaprioliWNackenWJChazinandEPSkaar2008MetalchelationandinhibitionofbacterialgrowthintissueabscessesScience3199629658StephensDSandSMZimmer2002PathogenesistherapyandpreventionofmeningococcalsepsisCurrInfectDisRep43773869FinneJMLeinonenandPHMakela1983AntigenicsimilaritiesbetweenbraincomponentsandbacteriacausingmeningitisImplicationsforvaccinedevelopmentandpathogenesisLancet235535710PetterssonAAMaasandJTommassen1994IdentificationoftheiroAgeneproductofNeisseriameningitidisasalactoferrinreceptorJBacteriol1761764176611LegrainMVMazarinSWIrwinBBouchonMJQuentinMilletEJacobsandABSchryvers1993CloningandcharacterizationofNeisseriameningitidisgenesencodingthetransferrinbindingproteinsTbp1andTbp2Gene130738012LewisLAEGrayYPWangBARoeandDWDyer1997MolecularcharacterizationofhpuABthehaemoglobinhaptoglobinutilizationoperonofNeisseriameningitidisMolMicrobiol2373774913StojiljkovicIVHwaLdeSaintMartinPOGaoraXNassifFHeffronandMSo1995TheNeisseriameningitidishaemoglobinreceptoritsroleinironutilizationandvirulenceMolMicrobiol1553154114CarsonSDPEKlebbaSMNewtonandPFSparling1999FerricenterobactinbindingandutilizationbyNeisseriagonorrhoeaeJBacteriol1812895290115TurnerPCCEThomasIStojiljkovicCElkinsGKizelDAAlaAldeenandPFSparling2001NeisserialTonBdependentoutermembraneproteinsdetectionregulationanddistributionofthreeputativecandidatesidentifiedfromthegenomesequencesMicrobiology1471277129016DuceyTFMBCarsonJOrvisAPStintziandDWDyer2005IdentificationoftheironresponsivegenesofNeisseriagonorrhoeaebymicroarrayanalysisindefinedmediumJBacteriol1874865487417GrifantiniREFrigimelicaIDelanyEBartoliniSGiovinazziSBalloniSAgarwalGGalliCGencoandGGrandi2004CharacterizationofanovelNeisseriameningitidisFurandironregulatedoperonrequiredforprotectionfromoxidativestressutilityofDNAmicroarrayintheassignmentofthebiologicalroleofhypotheticalgenesMolMicrobiol5496297918DoveJEKYasukawaCRTinsleyandXNassif2003Productionofthesignallingmoleculeautoinducer2byNeisseriameningitidislackofevidenceforaconcertedtranscriptionalresponseMicrobiology1491859186919AltschulSFTLMaddenAASchafferJZhangZZhangWMillerandDJLipman1997GappedBLASTandPSIBLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprogramsNucleicAcidsRes253389340220FuranoKandAACampagnari2004IdentificationofaheminutilizationproteinofMoraxellacatarrhalisInfectImmun726426643221MazoyRandMLLemos1996IdentificationofhemebindingproteinsinthecellmembranesofVibrioanguillarumFEMSMicrobiolLett13526527022GhigoJMSLetoffeandCWandersman1997AnewtypeofhemophoredependenthemeacquisitionsystemofSerratiamarcescensreconstitutedinEscherichiacoliJBacteriol1793572357923PatzerSIandKHantke1998TheZnuABChighaffinityzincuptakesystemanditsregulatorZurinEscherichiacoliMolMicrobiol281199121024FergusonADEHofmannJWCoultonKDiederichsandWWelte1998SiderophoremediatedirontransportcrystalstructureofFhuAwithboundlipopolysaccharideScience2822215222025YatsunykLAJAEastonLRKimSASugarbakerBBennettRMBreeceVorontsovIIDLTierneyMWCrowderandACRosenzweig2008StructureandmetalbindingpropertiesofZnuAaperiplasmiczinctransporterfromEscherichiacoliJBiolInorgChem1327128826BentleySDGSVernikosLASnyderCChurcherCArrowsmithTChillingworthACroninPHDavisNEHolroydKJagelsMMaddisonSMouleERabbinowitschSSharpLUnwinSWhiteheadMAQuailMAchtmanBBarrellNJSaundersandJParkhill2007MeningococcalgeneticvariationmechanismsviewedthroughcomparativeanalysisofserogroupCstrainFAM18PLoSGenet3e2327DempseyJAWLitakerAMadhureTLSnodgrassandJGCannon1991PhysicalmapofthechromosomeofNeisseriagonorrhoeaeFA1090withlocationsofgeneticmarkersincludingopaandpilgenesJBacteriol1735476548628ParkhillJMAchtmanKDJamesSDBentleyCChurcherSRKleeGMorelliDBashamDBrownTChillingworthRMDaviesPDavisKDevlinTFeltwellNHamlinSHolroydKJagelsSLeatherSMouleKMungallMAQuailMARajandreamKMRutherfordMSimmondsJSkeltonSWhiteheadBGSprattandBGBarrell2000CompleteDNAsequenceofaserogroupAstrainofNeisseriameningitidisZ2491Nature40450250629TettelinHNJSaundersJHeidelbergACJeffriesKENelsonJAEisenKAKetchumDWHoodJFPedenRJDodsonWCNelsonMLGwinnRDeBoyJDPetersonEKHickeyDHHaftSLSalzbergOWhiteRDFleischmannBADoughertyTMasonACieckoDSParkseyEBlairHCittoneEBClarkMDCottonTRUtterbackHKhouriHQinJVamathevanJGillVScarlatoVMasignaniMPizzaGGrandiLSunHOSmithCMFraserERMoxonRRappuoliandJCVenter2000CompletegenomesequenceofNeisseriameningitidisserogroupBstrainMC58Science2871809181530ChenCYandSAMorse2001IdentificationandcharacterizationofahighaffinityzincuptakesysteminNeisseriagonorrhoeaeFEMSMicrobiolLett202677131AmmendolaSPPasqualiCPistoiaPPetrucciPPetrarcaGRotilioandABattistoni2007ThehighaffinityZn2uptakesystemZnuABCisrequiredforbacterialzinchomeostasisinintracellularenvironmentsandcontributestovirulenceofSalmonellaentericaInfectImmun755867587632StewartAJCABlindauerSBerezenkoDSleepandPJSadler2003InterdomainzincsiteonhumanalbuminProcNatlAcadSciUSA1003701370633WuHJKLSeibYNSrikhantaSPKiddJLEdwardsTLMaguireSMGrimmondMAApicellaAGMcEwanandMPJennings2006PerRcontrolsMndependentresistancetooxidativestressinNeisseriagonorrhoeaeMolMicrobiol6040141634NanamiyaHGAkanumaYNatoriRMurayamaSKosonoTKudoKKobayashiNOgasawaraSMParkKOchiandFKawamura2004ZincisakeyfactorincontrollingalternationoftwotypesofL31proteinintheBacillussubtilisribosomeMolMicrobiol5227328335HagenTAandCNCornelissen2006NeisseriagonorrhoeaerequiresexpressionofTonBandtheputativetransporterTdfFtoreplicatewithincervicalepithelialcellsMolMicrobiol621144115736BosMPBTefsenPVoetVWeynantsJPMvanPuttenandJTommassen2005FunctionofneisserialoutermembranephospholipaseAinautolysisandassessmentofitsvaccinepotentialInfectImmun732222223137VoulhouxRMPBosJGeurtsenMMolsandJTommassen2003RoleofahighlyconservedbacterialproteininoutermembraneproteinassemblyScience29926226538DatsenkoKAandBLWanner2000OnestepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK12usingPCRproductsProcNatlAcadSciUSA976640664539TommassenJPVermeijMStruyveRBenzandJTPoolman1990IsolationofNeisseriameningitidismutantsdeficientinclass1andclass3outermembraneproteinsInfectImmun581355135940DekkerNKMerckJTommassenandHMVerheij1995InvitrofoldingofEscherichiacolioutermembranephospholipaseAEurJBiochem23221421941WeynantsVECMFeronKKGorajMPBosPADenoelVGVerlantJTommassenIRPeakRCJuddMPJenningsandJTPoolman2007AdditiveandsynergisticbactericidalactivityofantibodiesdirectedagainstminoroutermembraneproteinsofNeisseriameningitidisInfectImmun755434544242LimKHCEJonesRNvandenHovenJLEdwardsMLFalsettaMAApicellaMPJenningsandAGMcEwan2008MetalbindingspecificityoftheMntABCpermeaseofNeisseriagonorrhoeaeanditsinfluenceonbacterialgrowthandinteractionwithcervicalepithelialcellsInfectImmun7635693576。表1.配列決定されたナイセリア菌株における成熟TdfIタンパク質配列の保存ZnuD髄膜炎菌Neisseriameningitisの一価および万能ワクチンとなりうるワクチン候補概要髄膜炎菌Neisseriameningitis血清型Bは、若年集団の細菌性敗血症および髄膜炎の主な原因である。利用可能なワクチンは野生株から得られた外膜小胞に基づいている。しかしながら、乳幼児では、そうしたワクチンは、変異しやすい主要外膜タンパク質である、相同PorAを発現する菌株に対してしか防御をもたらさない。若年集団の髄膜炎菌感染を予防することができるワクチンの開発を可能にするワクチン抗原を特定するために、ZnuDTdfIを可能性のある候補として認定した。そこで、本発明者らは、ZnuDの潜在的価値の分析を拡張して、それが、亜鉛制限下で増殖させた時に、テストしたすべての髄膜炎菌Nmeningitidis血清型B菌株によって発現される、非常によく保存された抗原であること、血清型にかかわらずテストした菌株の大半に対して交差殺菌性抗体を誘導すること、ならびに感染時およびほぼ確実に保因時にも発現されることを示した。さらに、抗ZnuD抗体は、抗ヒト補体H因子結合タンパク質fHbpで死滅させられなかった菌株の補体死滅をもたらすことができる。序論髄膜炎菌Neisseriameningitisはグラム陰性の莢膜に包まれた細菌である。それは、成人人口の約10の上気道に無症状で定着している、ヒト偏性病原菌である。時として、それが血流に移行すると、菌血症となり、髄膜炎に進行して死に至る可能性がある。髄膜炎菌Nmeningitidisは、急速に進行し、流行を引き起こしやすいことから、もっとも恐れられている細菌感染症の一つである。この細菌は、莢膜多糖の化学組成に基づいて、13の血清型に分類される。しかしながら、血清型A、B、C、Y、およびW135だけが病気に関与しており、Xもわずかに関与していた。ヒトにおいて有効な免疫を与える複合多糖体ワクチンは、血清型A、C、Y、およびW135について利用可能となっている。残念ながら、複合物アプローチが血清型BMenBに容易に適用できなかったのは、その莢膜多糖が、神経細胞接着分子のような、宿主のポリシアル酸化された糖タンパク質と構造的類似性を共有するためである。第1世代のMenBワクチンは、リポオリゴ糖LOS含量を減らすために界面活性剤で抽出後、精製された外膜小胞OMVに基づくものであった。PorAは、もっとも大量に存在する外膜タンパク質OMPであり、これらのOMVにおいて免疫優性の成分である。しかしながら、PorAは、OMVに基づくワクチンの有効性を制限する高い抗原変異性を、特に年齢24年未満で示すが、これは総計で欧州におけるMenB症例の約50となる年齢群であり、1歳未満の乳児で約16100000の発生率である。この限界を克服するために、保存されているマイナーOMPを探索した。最近、膜内在性OMPのワクチン候補としての可能性が認識された。このタンパク質は、亜鉛取り込み成分Dに関わるZnuDと称され、亜鉛制限下で発現されて、亜鉛の取り込みに関与する。このタンパク質のワクチン候補としての可能性に基づいて、本研究を拡大して、ヒトにおける抗ZnuD抗体の存在、交差殺菌性抗体を誘導するその可能性を探求し、このタンパク質が非常によく保存され、しかもST23クローナルコンプレックス由来の少数の血清型Y株を例外として、テストした髄膜炎菌Nmeningitidisの全菌株で、血清型にかかわらず発現されることを確認した。結果ZnuDは免疫原性であり、ヒトにおいて発現される。ZnuDは、TPENなどの亜鉛キレート剤の添加後でなければ、古典的な寒天培養培地上での髄膜炎菌Nmeningitidisの増殖で発現されないので、ホストでのその発現が疑問となる。ZnuDがヒトにおいて発現されていることを実証する間接的な方法は、回復期の患者およびまたは健康なキャリアの血清中の、抗ZnuD抗体の存在を評価することである。この目的のために、未成熟タンパク質の77をカバーするペプチドアレイ法を使用した。12人の回復期の患者の血清、および11人のキャリアの血清をこのペプチドアレイで3~5回テストした。図10は、2群の被験体間の、個々の反応の強度を示す。ペプチドに対する反応の強度、および血清が認識するペプチドの数はいずれも、回復期患者群の方がキャリア群より多大であった。回復期血清はすべて、少なくとも同じ5つの不連続ペプチドに対して反応したが、それはZnuDが感染時に明確に発現されることを示す。いくつかのペプチドに対して反応するキャリア血清中に抗体が存在することは、上気道定着時にZnuDが発現されることも示唆する。ZnuDのワクチンとしての可能性を評価するための関連培養条件の開発すでに示したように、抗ZnuD抗体は、ZnuDを過剰発現するよう遺伝子改変されたその類似株の補体による死滅をもたらすことができる。大規模な菌株パネルを使用することによるZnuD抗体の交差殺菌能力の評価は、これら全株を遺伝子改変しておくことはできない。ZnuDの発現はZurで制御されるので、Δzur株と同レベルの、野生株によるZnuD発現を達成するのに必要な、亜鉛キレート剤の量を決定した。これはMH寒天プレートで20μMTPENを使用することで達成された図11。ZnuDは非常によく保存された抗原であって、ST23クローナルコンプレックス由来の一部のGerman血清型Y株を除くすべての髄膜炎菌Neisseriameningitis菌株で発現される。ZnuDが、血清型A、B、C、W135、およびYからの132菌株のパネルに関して、1株を除く全菌株で発現されることはすでに示した。これを拡張して、追加の43菌株について確認したが、これには、イギリス、スペインおよびドイツ在住の回復期の患者から2005年以降に分離された、血清型A、C、W135、およびYのそれぞれ2菌株、ならびに血清型Bの30菌株が含まれる。世界的には、テストした175菌株のうち、1株だけがZnuDを発現しなかった。この菌株はドイツの患者で分離された、ST23クローナルコンプレックス由来の血清型Yである。このST23クローナルコンプレックス由来の血清型Y株には特に注意を払った。ドイツで分離された7株をテストして、すべてがZnuDを発現したわけではなかった。配列分析から、4菌株については1つのヌクレオチドの欠失による停止変異が明らかとなった。そのうち3菌株は同一位置で欠失していた。ZnuDは血清型A、B、C、W135、およびYに対する交差殺菌性抗体を誘導する。ヒトにおけるZnuDの発現および免疫原性の実証は、本発明者らに、髄膜炎菌Nmeningitidis万能ワクチン抗原としてZnuDの可能性をより深く評価することを促した。この目的のために、ZnuDを過剰生産する、またはしない2つの菌株からOMVを作製した。これら2つの菌株は、いずれもfHbpファミリーBを発現するH4476株に由来するので、よく似た背景を有する。OMV標品中に残りの莢膜多糖が存在すること、ならびに抗LOSおよびPorA特異的殺菌性抗体が誘導されることを回避するために、galEおよびporA欠失変異を2つの菌株で行った。SDSPAGE分析から、ZnuDは過剰生産株から作製されたOMVのタンパク質含量の約15に相当するが、対照OMV標品中には見られないことが示唆された図12a。fHbpはOMV中に存在すると、きわめて免疫原性であると報告されたので、その含量をELISAでチェックした。ZnuDOMV中のfHbpの量は、対照OMVより4倍高かった図12b。マウスおよびモルモットをAlPO4に吸着されたOMVで3回免疫した。血清サンプルは、3回目の免疫化の2週間後に採取し、群あたり3プールの血清を得るようプールした。ELISAを用いてZnuDおよびfHbpの両者に対する反応を評価した表3。対照OMVを用いた免疫化は、マウスおよびモルモットのいずれにおいても、抗ZnuD抗体をほとんど、もしくはまったく誘導しなかったそれぞれGMT73および10EUml。予想通り、ZnuDOMVで免疫化した動物の血清では、高レベルの抗ZnuD抗体が測定されたそれぞれGMT15096および5893EUml。驚くべきことには、fHbpの免疫原性は、マウスとモルモットとでは異なるように思われる。対照またはZnuDOMVで免疫化したモルモットの血清中の抗fhbp抗体レベルそれぞれ335および2733EUmlは、マウス血清のレベルそれぞれ1342および59314EUmlより明らかに低い。抗対照OMVと抗ZnuDOMV血清との間の、抗fHbp抗体レベルの相違は、対照およびZnuDOMVにおけるfHbp量の相違に沿うものである。プールした血清は、TPENあり、またはなしで培養した髄膜炎菌Nmeningitidis血清型Bの14菌株パネルに対するSBAをテストした。これらの菌株のうち6つは、通常、MenBワクチンの評価のためにHPAで使用される。このパネルには、2つの流行株H4476およびNZ98254、ならびに4つのもっとも流行した英国の血清亜型が含まれており、これらは2000年および2001年のMenB疾患の593の原因となったM01240013、M01240101、M01240149、およびM01240355。TPENの存在下でのZnuDの発現は、上記14株のすべてについてウェスタンブロット分析で確認された。それに加えて、OMVで免疫化した動物の血清中には抗fHbp抗体が存在するため、組換えfHbpBで免疫化したマウスの血清プールも、殺菌性アッセイで検査した表3。抗fHbp抗体の殺菌活性は、細菌によるfHbpの発現レベルと関連しており、ファミリー特異的である。古典的な培養条件を用いると、中程度から高レベルのfHbpBを発現する5株だけが、抗fHbpB血清により死滅した陽性のカットオフは128で固定が、fHbpAもしくは低レベルのfHbpBのいずれか一方を発現する菌株はいずれも死滅しなかった。TPEN存在下で、同じ5つの菌株プラス2株NZ124およびDE1069006は、抗fHbpB抗体により死滅する。TPEN存在下もしくは非存在下で得られるSBA力価は、世界的に類似しており、TPEN存在下でわずかに高い力価が測定される傾向がある。これは、抗体によってもたらされる、補体による死滅に対する菌株の感受性が、キレート剤の存在下で格段に増加するわけではないことを示唆する。対照OMVで免疫化したマウスの血清は、菌株がTPENの非存在下で培養された場合、菌株の補体死滅をもたらすことができない。キレート剤の存在下では、3株だけが、カットオフをわずかに上回るSBAを示した。これらの3株は、抗fHbpB抗体によって死滅したので、抗対照OMV血清で観察された死滅は、ほぼ確実に、抗fHbp抗体の存在に起因し、さらに、TPENとともに培養したとき菌株の補体死滅に対する感受性がわずかに増加することに起因する。これらの抗fHbp抗体の役割は、ΔfHbpH4476株を用いて殺菌性アッセイを行うことによって、上記3株のうち1株について明確に実証された表4。対照OMVで免疫化したモルモットの血清による死滅がないことは予想されており、ELISAの結果によって示唆される通り、この種においてfHbpの免疫原性が低いことに起因する。亜鉛キレート剤の非存在下では、ZnuDOMVで免疫化したマウスの血清は、4株を除いてテストした菌株の補体による死滅をもたらさなかった。これら4株は、抗fHbp抗体によっても死滅した。これらの抗fHbp抗体の役割は、ΔfHbpH4476株を用いて殺菌性アッセイを行うことによって、明確に実証された表4。ZnuDの発現を可能にした殺菌性アッセイでテストした同じ抗ZnuDOMV血清は、テストした14菌株のうち12株の死滅をもたらすことができる。モルモットの血清を用いて、同様の結果が観察された。培地中にTPENが存在しないと、菌株は、3株を除いて、活性のある補体の存在下で死滅しなかった。また、これらの3株の1つであるH4476に関して、抗fHbp抗体の役割は、ΔfHbp菌株を使用することによって実証された。TPENが存在すると、2株を除く全菌株が死滅し、SBA力価はカットオフを明確に上回った。死滅しなかった2株は、マウス血清で死滅しなかったのと同じ菌株である。これらの2菌株760676およびM05024072によるZnuDの発現は、ウェスタンブロット分析によって実証された。第3群のマウスおよびモルモットは、無関係の抗原を過剰発現するH4476株から精製されたOMVで免疫化した。TPEN存在下または非存在下で、血清殺菌性アッセイにおいて、結果は、対照血清について観察された結果と同様であるデータ記載せず。加えて、各血清型、A、C、W135およびY、の1株についても殺菌性アッセイを行い、これらの4つの血清型に対する、抗ZnuD抗体の交差殺菌活性を確認したデータ記載せず。殺菌性抗体の標的としてのZnuDおよびfHbpの確認ZnuDが殺菌性抗体の主要な標的であることを確認するために、そしてTPEN存在下の方が高い殺菌力価が観察される傾向があることから、TPENあり、またはなしの殺菌性アッセイにΔznuDH4476株を使用した表4。TPEN非存在下では、SBA力価は、血清の起源免疫化に使用した動物種およびOMVが何であっても、H4476株とΔznuD株との間で類似していた。この殺菌条件では、ΔfHbp株について死滅は見られなかった。こうした結果は、ZnuD発現がない場合、fHbpが殺菌性抗体の主要な標的であることを示す。TPEN存在下では、ΔfHbp株は、対照動物の血清で死滅せず、ΔznuD株とWTH4476株の両者で同様の力価が測定された。予想通り、抗ZnuDOMV血清を使用すると、殺菌力価はH4476株よりΔznuD株の方が低くなった。これらの結果は、ZnuDOMVが抗fHbpおよび抗ZnuD殺菌性抗体の両者を誘導したが、対照OMVは抗fHbp抗体の産生だけを引き起こしたことを示す。その結果はまた、殺菌性抗体を介した補体死滅を誘導するために、fHbpおよびZnuDの同時発現が必要でないことを示す。考察ZnuDは、MuellerHinton培地、もしくはTrypticSoyBroth培地などの古典的な培地上では発現されない。これらの培地は、偏好性微生物を培養するために開発されたので、少数元素に富んでいる。MH寒天培地中、亜鉛の総量は、メーカーによって200μgから450μgLまでさまざまである。こうした培地中で、遊離亜鉛は、髄膜炎菌Nmeningitidisが、亜鉛獲得専用の外膜受容体を特異的に発現する必要がないような濃度でおそらく利用可能であって、それは、非特異的ポリンを通過する亜鉛の受動拡散が、細菌の増殖を可能にするのにおそらくは十分であるからである。ウシ血清中、遊離亜鉛の量は約001μgL015nMと見積もられ、これは血清中の亜鉛の総量800μgLの約00008に相当する。小児では、全亜鉛濃度は約750μgLと見積もられ、外挿により遊離亜鉛は、やはりおよそ001μgLとなるはずである。脳脊髄液中では、全亜鉛濃度は約111μgLである。ヒトにおけるZnuDの発現は、回復期患者の血清中の抗体の欠如によって間接的に立証された。ペプチドアレイの結果も、保因者における発現を示唆する。ペプチドアレイで測定されたシグナルの強度から、上気道でのZnuD発現が血液中より低いと結論することは間違いに違いない。実際、実験は、微生物の定着によって誘導される粘膜免疫応答を反映しにくい血清IgGを検出するよう計画された。現在行われている研究は、急性期の患者の脳脊髄液中で髄膜炎菌Nmeningitidisの直接染色を実施することによってZnuDのinvivo発現を実証することを目標としている。古典的培地上でZnuDの発現を可能にするために、亜鉛キレート剤の使用が必要である。金属キレート剤の使用は、TbpABなどの鉄結合タンパク質の能力を実証するためにすでに記載されたので、上記は先行例を示すものではない。しかしながら、invivoZnuD発現レベルに相当する濃度を選択するために、ZnuD発現レベルに及ぼすTPEN濃度の影響を検討したデータ記載せず。この目的のために、Δzur株におけるZnuDの発現をベンチマークとして使用した。用量範囲実験から、TPEN20μMの濃度が選択された。キレート剤の使用を回避する試みとして、他の培地が評価段階にあることにも留意すべきである。以前Neisseriaの増殖のために開発された、化学組成の明確な限定培地であるCatlin培地について期待できる結果が得られた。フローサイトメトリー分析は、この培地でのZnuD発現が、MH寒天培地上で生育したΔzur株によるZnuDの発現に類似していることを示唆するデータ記載せず。ZnuDのinvivo発現を再現しうるよう選択した培養条件MH寒天培地20μMTPENを用いて、43株のパネルを、このOMPの発現について評価した。ZnuDは、これらのすべての菌株で検出された。全体として、182株の髄膜炎菌NmeningitidisをそれらのZnuDの発現について分析した。ZnuD発現は、血清型Yの7株を除く全菌株で証明されたが、この7株はすべて最近ドイツにて、ST23クローナルコンプレックスから分離されたものである。それらのうち4株については、発現がないことは停止変異に関連付けられたが、残りの3株については、ヌクレオチド配列分析に基づく説明はなされない。ZnuDの発現は、古いMenY株で実証されたので、血清型Y株でのZnuDの発現を評価するために、いっそう入念な注意を払うつもりである。ZnuDは内在性OMPであるため、本発明者らは、それを免疫系に提示するためにOMVを選択した。これらのOMVは、ΔgalEおよびΔporAH4476株から、05DOCで抽出し、LOS含量を減少させた。このような条件で、本発明者らは、このタイプのOMVがLOSに対する殺菌性抗体の生産を誘導しないことをすでに立証している。対照OMVで免疫化したマウスおよびモルモットは、少数の菌株に対する限定的な殺菌性反応を誘導した。この防御反応は、ほぼ確実に、抗fHbp抗体の生産と関連付けられるものであって、それは、ELISAでのその抗体の存在によって、ならびに殺菌性アッセイでのΔfHbp株の使用によって、実証されるとおりである。その結果から、fHbpは、OMV中でその天然高次構造をとって提示されると、小胞の抽出のために界面活性剤を使用したせいで、こうしたOMV中に小量しか存在しなくても、特にマウスにおいて、免疫原性の高いタンパク質であることも示唆された。ZnuDOMVで免疫化したマウスおよびモルモットはいずれも、抗ZnuD抗体の生産を引き起こした。ELISAデータによれば、これら2種におけるZnuDの免疫原性は、fHbpと比べてきわめて類似しているように思われる。抗ZnuDOMV血清は、血清型にかかわらずテストしたすべての菌株の補体死滅を引き起こすことができたが、それはZnuDの発現を可能にする培養条件でのみである。例外は、血清型Bの2つの菌株であり、これに関して死滅しなかったのは、ZnuD発現の欠如によるものではない。このような死滅の欠如を説明するために、さらに研究が継続中である。死滅した菌株の中で、2株は、最近、5つのタンパク質およびNZ98254由来OMVを基本とする多価ワクチンにより誘導される交差防御を評価する、乳幼児の臨床試験に使用されたので、興味深い。この複合ワクチンで免疫された被験体の血清は、M01240355株の死滅をもたらすことができず、1歳で、乳幼児の50しか、M01240101株に対する交差防御を示さなかった。これら2つの菌株は、英国で分離されたが、それぞれST213およびST269クローナルコンプレックスに由来する。この2つのクローナルコンプレックスは、2008年に英国の症例から分離されたMenB菌株の39に相当する。この前臨床研究において、ZnuDOMVで免疫化したマウスおよびモルモットはいずれも、上記2株に対して高い殺菌性反応を引き起こしたウサギSBA力価1700。M01240355株に関して、上記の死滅は、この菌株がfHbpAを発現するので、抗ZnuD抗体および抗fHbpB抗体の共存によるものではない。さらに、本発明者らは、M01240101株がヒト補体の存在下で抗ZnuD抗体によってやはり死滅することを確認したデータ記載せず。結論として、ZnuDは、あらゆる血清型B株によって発現される、非常によく保存されたタンパク質であり、テストした血清型B株の大半、ならびに血清型A、C、W、およびY株に対しても、交差殺菌性反応をもたらすことができる。ZnuDの利点は、ZnuDが非常によく保存されていること、ならびに、現在までただ1つのファミリーしか報告されていないことである。より包括的なワクチンは、fHbpおよびZnuDの両方を併せ持つ可能性が考えられる。TdfHに対するカルプロテクチンの結合カルプロテクチンは好中球、マクロファージ、および扁平上皮により産生される。それは、炎症性腸疾患に関する糞便中の診断ツールとして使用される。さらに、それは、LPSと接触することでアップレギュレートされ、患者が髄膜炎である場合、脳脊髄液中に見いだすことができる。カルプロテクチンは、ヒトタンパク質S100A8およびS100A9のヘテロ四量体であり、2つの亜鉛もしくはマンガン原子と結合することができる。コンフルエント層にナイセリア菌を蒔いたプレート上にカルプロテクチンをスポットすると、亜鉛およびまたはマンガンを捕捉して隔離するため、初期に生育阻害が生じる。本発明者らは、ナイセリア菌が、結合部位の一方低親和性部位からのみ、亜鉛およびまたはマンガンを得ることができると考える。初期の透明化は、高親和性部位への亜鉛およびまたはマンガンの捕捉から生じることであり、それが生育阻害の原因となる。低親和性部位も亜鉛およびまたはマンガンでいっぱいになった場合、ナイセリア菌は、TdfHを介して取り込むことによって、これらの金属を利用することができる。したがって、初期の透明化の後、透明ゾーンの中で生育が観察される。さらに、透明ゾーン内でTonB変異株が生育しないことによって示されるように、取り込み過程は、TonBによって外膜と行き来する内膜中のプロトン駆動力を必要とする。大量にTdfHを発現するpEN11派生体を用いて、TdfHがカルプロテクチンと結合しうるかどうか調べた。pEN11TdfHターミネーターを有するB2450を、1mMIPTGあり、およびなしの、TSB培地中で培養した。6時間の培養後、1OD550nmの細菌を採取し、HBSSで1回洗浄した。細菌を1mlHBSS中に再懸濁し、4μgのカルプロテクチンを添加した。カルプロテクチンを1時間結合させておき、その後、細胞をHBSSで2回洗浄した。次にペレットをサンプルバッファー中に再懸濁し、10分間煮沸した。その後、溶解物をSDSPAGE、ならびに抗カルプロテクチンによるウェスタンブロットで分析した図15。図15に示すように、シグナルは検出可能であったが、サンプル中に存在するTdfHの量について予想されるより弱かった。そこで、結合ステップに亜鉛またはマンガンを加えると結合がより良好になるかどうかを調べた図16。亜鉛またはマンガンが存在すると、有意に多くのカルプロテクチンがTdfHと結合した。