"以下の:a複数のヌクレオチド種に関するアピラーゼ酵素のヌクレオチド種特異的分解速度を計算し;bそのヌクレオチド種特異的分解速度を用いてそれぞれのヌクレオチド種の濃度を決定し;cポリメラーゼ酵素および鋳型核酸分子の種を含む反応環境においてそれぞれのヌクレオチド種の濃度を反復して提供し、ここで配列決定反応において1以上のヌクレオチド種の分子を新生分子中に組み込み、そしてアピラーゼ酵素を反応環境に導入して組み込まれなかったヌクレオチド種分子を分解し;そしてdヌクレオチド種の組み込みに応じたシグナルを検出する工程を含む、配列決定性能を最適化するための方法。請求項1に記載の方法であって、ここで:それぞれのヌクレオチド種の濃度がポリメラーゼ酵素の組み込み効率と比較したその種特異的分解効率の釣り合いを提供するように決定される、前記方法。請求項1に記載の方法であって、ここで:ヌクレオチド種特異的分解速度がミカエリスメンテンの式を用いて計算される、前記方法。請求項1に記載の方法であって、ここで:それぞれのヌクレオチド種の濃度がそのヌクレオチド種の中で最も低い濃度および活性値を含むdCTP種に対して正規化される、前記方法。請求項1に記載の方法であって、ここで:複数のヌクレオチド種の濃度が互いに異なる、前記方法。請求項1に記載の方法であって、ここで:それぞれのヌクレオチド種の濃度が互いに異なる、前記方法。請求項1に記載の方法であって、ここで:アピラーゼ酵素による分解の前に組み込みが起こるのに十分な時間の間、反応環境中のそれぞれのヌクレオチド種の濃度を維持することによって、組み込み効率が最適化される、前記方法。請求項1に記載の方法であって、ここで:核酸鋳型種に対するヌクレオチド種の相補性に基づいて、ヌクレオチド種の分子が新生分子中に1以上atoneormore組み込まれる、前記方法。さらに以下の:e検出されたシグナルから配列の読みを生成し、ここでその配列の読みは鋳型核酸分子の種の配列組成を含むことを含む、請求項1に記載の方法。以下の:a複数の相対濃度のヌクレオチド種を、ポリメラーゼ酵素、アピラーゼ酵素、および鋳型核酸分子の種を含むあるタイプの反応環境中に導入して、鋳型核酸分子の種の修正されていない配列組成を生成し;bその鋳型核酸分子の種の修正されていない配列組成および参照配列組成からヌクレオチド種のそれぞれに関して完成効率値および繰り越し値を決定し;そしてcそのヌクレオチド種特異的完成効率値およびそのヌクレオチド種特異的繰り越し値を用いて複数の核酸種のそれぞれに関して種特異的濃度を同定し、ここでその種特異的濃度はそのタイプの反応環境における配列決定反応により生成されるエラーを最小限にするように最適化されている工程を含む、配列決定性能を最適化するための方法。さらに以下の:dそのタイプの反応環境を用いて配列決定反応を実行し、ここでその配列決定反応は以下の工程を含む:i.それぞれの核酸種をその種特異的濃度で第2の種の鋳型核酸分子およびポリメラーゼ酵素を含むそのタイプの反応環境に反復して送達し、ここで核酸種の送達の反復の間にアピラーゼ酵素をその反応環境に送達し;そしてii.ポリメラーゼによるその核酸種の組み込みに応じて生じた複数のシグナルを検出することを含む、請求項10に記載の方法。請求項11に記載の方法であって、ここで:アピラーゼが反応環境にヌクレオチド種特異的濃度で送達される、前記方法。請求項10に記載の方法であって、ここで:相対濃度が、Gヌクレオチド種濃度およびCヌクレオチド種濃度の第2の百分率と比較したAヌクレオチド種濃度およびTヌクレオチド種濃度の第1の百分率を含む、前記方法。請求項13に記載の方法であって、ここで:第1の百分率および第2の百分率が鋳型核酸分子の種の配列組成に従って定められ、ここでその配列組成がATに富む、またはGCに富む、前記方法。以下:aその上に記憶された実行可能なコードを含むコンピューター、ここでその実行可能なコードは以下の工程を含む方法を実施する:i.複数のヌクレオチド種に関するアピラーゼ酵素のヌクレオチド種特異的分解速度を計算し;ii.そのヌクレオチド種特異的分解速度を用いてそれぞれのヌクレオチド種の濃度を決定し、ここでそれぞれのヌクレオチド種の濃度はポリメラーゼ酵素の組み込み効率と比較したその種特異的分解効率の釣り合いを提供するように決定される;およびb以下の工程を含む方法を実施する配列決定機器:i.ポリメラーゼ酵素および鋳型核酸分子の種を含む反応環境においてそれぞれのヌクレオチド種の濃度を反復して提供し、ここで配列決定反応においてヌクレオチド種の1以上の分子が新生分子の中に組み込まれ、そしてアピラーゼ酵素を反応環境に導入して組み込まれなかったヌクレオチド種分子を分解し;そしてii.そのヌクレオチド種の組み込みに応じたシグナルを検出するを含む、配列決定性能を最適化するための系。下記でより詳細に記述されるように、ここで記述する発明の態様には、配列決定技術においてヌクレオチド種の濃度をその種特異的酵素効率に合わせる系および方法が含まれる。特に、本発明の態様は、SBS系の酵素、すなわちアピラーゼおよびDNAポリメラーゼの反応速度に基づくヌクレオチド濃度の最適化に関する。a.全般用語フロー図flowgramは一般にSBS法、特にピロホスフェートに基づく配列決定法pyrosequencing法とも呼ばれるにより生成された配列データの図表による表現を指し、より具体的にピログラムpyrogramと呼ばれてもよい。用語読みまたは配列の読みは、本明細書で用いられる際、一般に単一の核酸鋳型分子またはその鋳型核酸分子の複数の実質的に同一のコピーの集団から得られた配列データ全体を指す。用語ランまたは配列決定ランは、本明細書で用いられる際、一般に1種類以上のの鋳型核酸分子の配列決定操作において実施される一連の配列決定反応を指す。用語フローは、本明細書で用いられる際、一般に典型的には鋳型核酸分子を含む反応環境への流体溶液の導入の反復プロセスの一部である単一のサイクルを指し、ここでその溶液には、新生分子への付加のためのヌクレオチド種または他の試薬、例えば緩衝液、洗浄溶液、または配列決定プロセスにおいて、もしくは前のフローのヌクレオチド種からの持ち越しもしくはノイズ作用を低減するために用いられてよい酵素が含まれていてよい。用語フローサイクルは、本明細書で用いられる際、一般にヌクレオチド種を含む流体がそのサイクルの間に一度流される連続的な一連のフローを指すすなわち、フローサイクルにはT、A、C、Gヌクレオチド種の順での連続的な添加が含まれてよいが、他の順序の組み合わせもその定義の一部であると考えられる。典型的には、そのフローサイクルはサイクルからサイクルへのフローの同じ順序を有する繰り返しサイクルである。用語読み取り長readlengthは、本明細書で用いられる際、一般に信頼できる配列決定を行うことができる鋳型分子の長さの上限を指す。系および/またはプロセスの読み取り長に寄与する数多くの要因が存在し、それには鋳型核酸分子中のGC含量の程度が含まれるが、それに限定されない。用語試験断片またはTFは、本明細書で用いられる際、一般に品質管理、較正、または他の関連する目的のために用いることができる既知の配列組成の核酸要素を指す。用語プライマーは、本明細書で用いられる際、一般に核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が適切な緩衝液中で適切な温度において誘導される条件下でDNA合成の開始点の役目をするオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは好ましくは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。新生分子は一般に、鋳型依存性DNAポリメラーゼによりその鋳型分子中の対応するヌクレオチド種に相補的なヌクレオチド種の組み込みにより伸長されているDNA鎖を指す。用語鋳型核酸、鋳型分子、標的核酸、または標的分子は一般に、それから配列データまたは情報が生成される配列決定反応の対象である核酸分子を指す。用語ヌクレオチド種は、本明細書で用いられる際、一般に新生核酸分子中に典型的に組み込まれるプリン類アデニン、グアニンおよびピリミジン類シトシン、ウラシル、チミンが含まれる核酸単量体の同一性を指す。用語単量体の繰り返しまたはホモポリマーは、本明細書で用いられる際、一般に同じヌクレオチド種すなわち、繰り返されるヌクレオチド種を含む2個以上の配列の位置を指す。用語均一な伸長は、本明細書で用いられる際、一般に実質的に同一の鋳型分子の集団のそれぞれのメンバーがその反応において均一に同じ伸長工程を実施している伸長反応の関係または相を指す。用語完了効率は、本明細書で用いられる際、一般に所与のフローの間に正しく伸長された新生分子の百分率を指す。用語不完全伸長率は、本明細書で用いられる際、一般に全ての新生分子の数に対する正しく伸長し損ねた新生分子の数の比率を指す。用語ゲノムライブラリーまたはショットガンライブラリーは、本明細書で用いられる際、一般にある生物または個人のゲノム全体すなわちゲノムの全領域に由来する、および/またはそれを表す分子の集合を指す。用語アンプリコンは、本明細書で用いられる際、一般に選択された増幅産物、例えばポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応技法から生成された増幅産物を指す。用語変種または対立遺伝子は、本明細書で用いられる際、一般にそれぞれが類似の配列組成をコードするが互いにある程度の差異を有する複数の種の内の1つを指す。その差異には関連技術の当業者に既知のあらゆるタイプの変化が含まれてよく、それには多型、例えば一塩基多型SNP、挿入または欠失挿入/欠失事象の組み合わせはインデルindelsとも呼ばれる、繰り返し配列タンデム反復とも呼ばれるの数における違い、および構造的変化が含まれるが、それらに限定されない。用語対立遺伝子頻度または対立遺伝子の頻度は、本明細書で用いられる際、一般に特定の変種からなる集団中の全ての変種の比率を指す。用語キー配列またはキー要素は、本明細書で用いられる際、一般に、鋳型分子から生成された配列データに関する品質管理基準として用いられる、既知の配列組成を含む、既知の位置すなわち、典型的にはライゲーションされたアダプター要素中に含まれるにおいて鋳型核酸分子と結合した典型的には約4個の配列位置、すなわちTGACまたはヌクレオチド種の他の組み合わせの核酸配列要素を指す。その配列データは、それが正しい位置においてキー要素と結合した既知の配列組成を含む場合、品質管理を通過する。用語キーパスkeypassまたはキーパスウェルkeypasswellは、本明細書で用いられる際、一般に反応ウェル中の既知の配列組成の完全長核酸試験配列すなわち、上記で言及したような試験断片またはTFの配列決定を指し、ここでTF配列および/またはTFと結合した、または標的核酸と結合したアダプター中のキー配列に由来する配列の正確さをTFおよび/またはキーの既知の配列組成と比較し、その配列決定の正確さを判定するために、および品質管理のために用いる。典型的な態様において、配列決定ラン中のウェルの総数のある割合がキーパスウェルであると考えられ、それは一部の態様において局所的にregionally分布していてよい。用語平滑末端は、本明細書で用いられる際、関連技術における当業者の理解と一致して解釈され、一般に相補的ヌクレオチド塩基種の対で終結している末端を有する線状二本鎖核酸分子を指し、ここで平滑末端の対は典型的には互いへのライゲーションに適合している。用語粘着末端またはオーバーハングは、本明細書で用いられる際、関連技術における当業者の理解と一致して解釈され、一般にその分子の1つの鎖の末端において1個以上の対合していないヌクレオチド種を有する線状二本鎖核酸分子を指し、ここでその対合していないヌクレオチド種はどちらの鎖に存在していてもよく、単一の塩基位置または複数の塩基位置を含んでいてよい時々相補末端とも呼ばれる。用語SPRIは、本明細書で用いられる際、関連技術における当業者の理解と一致して解釈され、一般に固相可逆固定法SolidPhaseReversibleImmobilizationという特許取得された技術を指し、ここで標的核酸は特定の緩衝条件下でビーズの存在下で選択的に沈降し、ここで前記のビーズはしばしばカルボキシル化されており、常磁性である。その沈降した標的核酸は前記のビーズに固定され、操作者の必要に応じて溶離緩衝液により取り外されるまで結合したままであるVol232247424743それをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。用語カルボキシル化されたは、本明細書で用いられる際、関連技術における当業者の理解と一致して解釈され、一般に物質、例えば微粒子の少なくとも1個のカルボキシルcarboxl基の付加による修飾を指す。カルボキシル基はCOOHまたはCOO-のどちらかである。用語常磁性は、本明細書で用いられる際、関連技術における当業者の理解と一致して解釈され、一般に物質の特徴を指し、ここで前記の物質の磁性は外部の適用された磁場の存在下でのみ生じ、一度その外部の適用された磁場が取り外されたらその磁化を一切保持しない。用語ビーズまたはビーズ支持体は、本明細書で用いられる際、一般にあらゆるタイプのあらゆる都合のよい大きさの、不規則または規則的な形状の固相粒子を指し、それはあらゆる数の既知の物質、例えばセルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル類、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドのコポリマー類、ジビニルベンゼンまたは同様のもので架橋されたポリスチレン例えばMerrifieldBiochemistry1964313851390において記述されているようなもの、ポリアクリルアミド類、ラテックスゲル類、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック類、ニトロセルロース、天然の海綿、シリカゲル類、制御細孔ガラスcontrolporeglass、金属、架橋されたデキストラン類例えばSephadex商標、アガロースゲルSepharose商標、ならびに当業者に既知の他の固相ビーズ担体から製作される。用語反応環境は、本明細書で用いられる際、一般にそこで反応が起こることができ、典型的にはそこに反応物が少なくとも一時的に含有され、または閉じ込められて少なくとも1種類の反応産物の検出を可能にする、ある体積の空間を指す。反応環境の例には、キュベット、チューブ、ボトル、および平面の、または非平面の支持体上の1個以上のくぼみ、ウェル、または室が含まれるが、それらに限定されない。試料の調製および処理、配列データの生成、ならびに配列データの分析と関係する系および方法のいくつかの典型的な態様を下記で一般的に記述し、その一部または全部は本明細書で記述する発明の態様による使用に適用できる。特に、鋳型核酸分子の調製、鋳型分子の増幅、標的特異的アンプリコンおよび/またはゲノムライブラリーの生成のための系および方法、配列決定法および機器、ならびにコンピューターシステムの典型的な態様を記述する。典型的な態様において、実験または診断試料に由来する核酸分子をその未処理の形から調製および処理して高スループット配列決定を適用できる鋳型分子にするべきである。その処理方法は適用ごとに異なっていてよく、結果として様々な特徴を含む鋳型分子をもたらす。例えば、高スループット配列決定の一部の態様において、少なくとも特定の配列決定法が正確に配列データを生成することができる長さと比較可能な配列または読み取り長を有する鋳型分子を生成するのが好ましい。この例において、その長さには約25~30塩基対、約50~100塩基対、約200~300塩基対、約350~500塩基対、約500~1000塩基対の範囲、1000塩基対より大きい長さ、または特定の配列決定の適用を適用できる他の長さが含まれてよい。一部の態様において、試料、例えばゲノム試料からの核酸は、当業者に既知のいくつかの方法を用いて断片化される。好ましい態様において、核酸をランダムに断片化するすなわち特定の配列または領域に関して選択しない方法には、噴霧または超音波処理法と呼ばれる方法が含まれ得る。しかし、他の断片化の方法、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いる消化を断片化の目的のために用いることができることは理解されるであろう。やはりこの例において、いくつかの処理方法は、望まれる長さの核酸断片を選択的に分離するために当技術で既知のサイズ選択法を用いることができる。また、一部の態様において、それぞれの鋳型核酸分子に追加の機能要素を結合させることが好ましい。その要素は様々な機能のために用いることができ、それには増幅および/または配列決定法のためのプライマー配列、品質管理要素すなわちキー要素または他のタイプの品質管理要素、例えば由来の試料または患者との様々な関連付けをコードする独特の識別子多重識別子またはMIDとも呼ばれる、または他の機能要素が含まれるが、それらに限定されない。例えば、記述される発明の一部の態様は、既知の、および同定可能な配列組成を有するMID要素の1個以上の態様を試料と結合させ、そのMID要素の態様をその結合した試料からの鋳型核酸分子と連結することを含む。いくつかの異なる試料からのそのMIDを連結された鋳型核酸分子を単一の多重化された試料または組成物中にプールし、次いでそれを、それぞれのMIDを連結された鋳型核酸分子に関して配列データを生成するために効率的に処理することができる。そのそれぞれの鋳型核酸に関する配列データをデコンボリューションしてde-convoluted連結されたMID要素の配列組成を同定し、由来の試料との関連を同定する。この例において、多重化された組成には約384個の試料、約96個の試料、約50個の試料、約20個の試料、約16個の試料、約12個の試料、約10個の試料、または他の数の試料からの代表が含まれていてよい。それぞれの試料は研究の状況において異なる実験条件、処理、種、または個人と関係している可能性がある。同様に、それぞれの試料は診断の状況において異なる組織、細胞、個人、条件、薬物または他の処置と関係している可能性がある。当業者は、上記で列挙した試料の数は例の目的のためであり、従って限定するものと考えられるべきでないことを理解しているであろう。好ましい態様において、それぞれのMID要素の配列組成は容易に同定可能であり、配列決定プロセスから導入されるエラーに耐性がある。MID要素の一部の態様は、天然起源配列に対する最小限の配列の類似性を有する核酸種の独特の配列組成を含む。あるいは、MID要素の態様には天然起源配列に対するある程度の配列の類似性が含まれていてよい。また、好ましい態様において、それぞれのMID要素の位置は、鋳型核酸分子および/またはその鋳型分子に連結されたアダプター要素のいくつかの特徴と比較して既知である。それぞれのMIDの既知の位置を有することは、配列データ中のそのMID要素の発見ならびに可能性のあるエラーに関するそのMID配列組成およびその後のその由来の試料との関連の解釈のために有用である。例えば、MID要素への位置的な関係のためのアンカーとして有用ないくつかの特徴には、鋳型分子の長さすなわち、そのMID要素はその5’または3’末端からこれだけの数の配列の位置にあると知られている、MID要素に隣接して位置する識別可能な配列マーカー、例えばキー要素および/または1個以上のプライマー要素が含まれてよいが、それらに限定されない。この例において、そのキーおよびプライマー要素は一般に、典型的にはその多重組成中で試料ごとに異ならず、そのMID要素を探すための位置の基準として用いることができる、既知の配列組成を含む。適用135により実施される分析アルゴリズムは、コンピューター130上で実行されて、それぞれのMIDを連結された鋳型に関して生成された配列データを分析して、より容易に識別可能なキーおよび/またはプライマー要素を同定し、それらの位置から外挿してそのMID要素の配列が含まれると推定される配列領域を同定することができる。次いで適用135はその推定された領域およびおそらくその両側の領域においていくらかの距離離れた所までの配列組成を処理し、そのMID要素およびそれの配列組成を明確に同定することができる。記述された機能要素の一部または全部を、特定の処理工程においてヌクレオチド配列に連結されるアダプター要素中に組み合わせることができる。例えば、一部の態様は、増幅および/または配列決定のために用いられるプライマー配列に相補的な配列組成を含むプライミングpriming配列要素または領域を結合させることができる。さらに、その同じ要素を、鎖選択と呼ぶことができる方法および核酸分子の固相支持体への固定のために用いることができる。一部の態様において、2セットのプライミング配列領域以下プライミング配列Aおよびプライミング配列Bと呼ぶを鎖選択のために用いることができ、ここで1コピーのプライミング配列Aおよび1コピーのプライミング配列Bを有する単一の鎖のみが選択されて調製された試料として含まれる。代わりの態様において、そのアダプター要素の設計特徴は鎖選択の必要性を排除する。その同じプライミング配列領域を増幅および固定のための方法において用いることができ、ここで例えば、プライミング配列Bを固体支持体上に固定することができ、増幅産物をそれから伸長させる。断片化、鎖選択、ならびに機能要素およびアダプターの付加のための試料処理の追加の例が、2004年1月28日に出願された一本鎖DNAライブラリーを調製するための方法と題された米国特許出願一連番号10/767,894;2008年5月29日に出願された多重混合物からの個々の試料の同定のための系および方法と題された米国特許出願一連番号12/156,242;および2009年2月23日に出願された配列決定可能なライブラリーの生成のための核酸の向上した処理のための系および方法と題された米国特許出願一連番号12/380,139において記述されており、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。実質的に同一のコピーの集団を生成するための鋳型核酸分子の増幅を実施するための系および方法の様々な例を記述する。SBSの一部の態様において、1種類以上のヌクレオチド種が1コピーの鋳型分子と結合したそれぞれの新生分子の中に組み込まれる際、より強いシグナルを生成するために、それぞれの核酸要素の多くのコピーを生成することが望ましいことは、当業者には明らかであろう。例えば細菌ベクターのローリングサークル増幅と呼ばれる方法上記で援用した米国特許第6,274,320号および第7,211,390号において記述されているおよびポリメラーゼ連鎖反応PCR法を用いる増幅のような、核酸分子のコピーを生成するための当技術で既知の多くの技法が存在し、その技法のそれぞれが本明細書で記述する発明による使用に適用可能である。高スループット適用に特に適用できるあるPCR技法には、エマルジョンPCR法と呼ばれる方法emPCR商標法とも呼ばれるが含まれる。エマルジョンPCR法の典型的な態様には、その内部で反応が起こることができる水性の液滴を作り出す2種類の不混和性物質の安定なエマルジョンを作り出すことが含まれる。特に、PCR法における使用に適用できるエマルジョンの水性の液滴には、別の流体、例えば典型的にはあるタイプの油が含まれる疎水性の流体連続相とも呼ばれる内で液滴不連続相とも呼ばれるとして懸濁または分散されている第1の流体、例えば水に基づく流体が含まれてよい。用いることができる油の例には、鉱油、シリコンに基づく油、またはフッ素化油が含まれるが、それらに限定されない。さらに、一部のエマルジョンの態様はそのエマルジョンを安定化するように作用する界面活性剤を用いることができ、それは特定の処理方法、例えばPCRに特に有用である可能性がある。界面活性剤の一部の態様には、シリコンまたはフッ素化界面活性剤の1種類以上が含まれてよい。例えば、1種類以上の非イオン性界面活性剤を用いることができ、それにはソルビタンモノオレエートSpan商標80とも呼ばれる、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTween商標80とも呼ばれる、または一部の好ましい態様において、ジメチコンコポリオールAbil登録商標EM90とも呼ばれる、ポリシロキサン、ポリアルキルポリエーテルコポリマー、ポリグリセロールエステル類、ポロキサマー類、およびPVP/ヘキサデカンコポリマー類UnimerU-151とも呼ばれる、またはより好ましい態様において、シクロペンタシロキサン中の高分子量シリコンポリエーテルDC5225Cとも呼ばれ、DowCorningから入手可能が含まれるが、それらに限定されない。そのエマルジョンの液滴は、区画compartments、マイクロカプセル、マイクロ反応器、微小環境とも呼ばれてよく、または関連技術で一般的に用いられる他の名前で呼ばれてよい。その水性の液滴は、そのエマルジョン構成要素または組成物の組成、その中に含有される内容物、および用いられる形成技法に応じて大きさに幅があってよい。記述されたエマルジョンは、その中で化学反応、例えばPCRを実施することができる微小環境を作り出す。例えば、鋳型核酸および望ましいPCR反応を実施するために必要な全ての試薬をそのエマルジョンの液滴中に封入しencapsulated、化学的に分離することができる。上記で記述したような液滴の追加の安定性を促進するために、一部の態様において追加の界面活性剤または他の安定化剤を用いることができる。PCR法に典型的な熱サイクル操作をその液滴を用いて実行して封入された核酸鋳型を増幅することができ、それは結果としてその鋳型核酸の多くの実質的に同一のコピーを含む集団の生成をもたらす。一部の態様において、その液滴内の集団はクローン的に分離された、区画化された、隔離された、封入された、または局在化された集団と呼ぶことができる。やはりこの例において、その記述された液滴の一部または全部はさらに、鋳型およびその鋳型の増幅されたコピー、その鋳型に相補的な増幅されたコピー、またはそれらの組み合わせの付着のためのビーズのような固体支持体を封入することができる。さらに、その固体支持体は他のタイプの核酸、試薬、標識、または他の目的の分子の付着を可能にすることができる。エマルジョンの破壊およびビーズの回収の後、典型的な態様において、その上に固定された鋳型核酸分子の実質的に同一のコピーのうまく増幅された集団を有するビーズに関して濃縮することも望ましい可能性がある。例えば、DNA陽性ビーズに関して濃縮するためのプロセスには、プライマー種をその固定された増幅されたコピーの遊離末端上の領域典型的にはアダプター配列中に見出されるにハイブリダイズさせ、そのプライマーをポリメラーゼに仲介される伸長反応を用いて伸長し、濃縮支持体、例えば磁気またはセファロースビーズにそのプライマーを結合させることが含まれてよい。そのビーズを含む溶液に選択条件、例えば磁場または遠心分離を適用することができ、ここでその濃縮ビーズはその選択条件に応答し、DNA陰性すなわち固定されたコピーが無い、またはほとんど無いビーズから分離される。本明細書で記述する発明に有用なエマルジョンの態様には、記述した化学反応を大量に並行した方式で行うことを可能にする非常に高密度の液滴またはマイクロカプセルが含まれ得る。増幅のために用いられるエマルジョンおよび配列決定適用のためのそれらの使用の追加の例が米国特許第7,638,276号;第7,622,280号;第7,842,457号;および第7,927,797号;ならびに米国特許出願一連番号11/982,095において記述されており、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。時々ウルトラディープ配列決定Ultra-DeepSequencingと呼ばれる態様も配列決定のための標的特異的アンプリコンを生成し、それを本明細書で記述する発明と共に用いることができ、それには特異的核酸プライマーのセットを用いて標的核酸を含む試料から選択された標的領域単数または複数を増幅することが含まれる。さらに、その試料には、研究または診断の有用性と関係する配列組成を含む配列変種を含有することが既知である、または疑われる核酸分子の集団が含まれてよく、ここでそのプライマーを用いてその試料中の配列変種を増幅してその試料中の配列変種の分布を見抜くことができる。例えば、核酸試料中の複対立遺伝子の特異的な増幅および配列決定により配列変種を同定するための方法を実施することができる。まずその核酸に対して、目的の領域またはその核酸集団に一般的な区域segmentの周囲の領域を増幅するように設計されたPCRプライマーの対による増幅を施す。そのPCR反応の産物のそれぞれ第1アンプリコンを続いてさらに別々の反応容器、例えば上記で記述したエマルジョンに基づく容器中で個々に増幅する。その結果として得られたアンプリコン本明細書において第2アンプリコンと呼ぶはそれぞれが第1のアンプリコンの集団の1つのメンバーに由来し、それを配列決定して、その配列の集合を用いて存在する1種類以上の変種の対立遺伝子頻度を決定する。重要なことだが、その方法は存在する変種を前もって知っていることを必要とせず、典型的には核酸分子の集団中に1未満の頻度で存在する変種を同定することができる。記述した標的特異的増幅および配列決定法のいくつかの利点には、以前に達成されていたよりも高いレベルの感度が含まれる。さらに、高スループット配列決定機器を用いる態様、例えば454LifeSciencesCorporationにより提供されるウェルのPicoTiterPlate登録商標アレイと呼ばれるもの時々PTP商標プレートまたはアレイとも呼ばれるを用いる態様において、記述された方法を用いてランまたは実験あたり100,000を超える、300,000を超える、500,000を超える、または1,000,000を超える核酸領域に関する配列組成を生成することができ、それは少なくとも部分的に使用者の好み、例えばガスケット等の使用により可能になるレーン構成に依存する可能性がある。また、記述した方法は、その対立遺伝子変種の1未満に相当する可能性のある存在比の低い対立遺伝子の検出の感度を提供する。その方法の別の利点には、その分析されている領域の配列を含むデータを生成することが含まれる。重要なことだが、分析されている部位の配列の事前知識を有する必要はない。配列決定のための標的特異的アンプリコンの追加の例が、2005年4月12日に出願されたウルトラディープ配列決定を用いて配列変種を決定するための方法と題された米国特許出願一連番号11/104,781;2008年3月14日に出願されたHIV薬物耐性変種の検出のための系および方法と題されたPCT特許出願一連番号US2008/003424;および2009年6月17日に出願されたHIV向性変種の検出のための系および方法と題された米国特許第7,888,034号において記述されており、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。さらに、配列決定の態様には、サンガー型の技法、一般にハイブリダイゼーションによる配列決定SBH、ライゲーションによる配列決定LBH、または組み込みによる配列決定SBI技法と呼ばれる技法が含まれてよい。さらに、その配列決定技法には、ポロニーpolony配列決定技法と呼ばれる方法;ナノポア、導波waveguideおよび他の単一分子検出技法;または可逆的終結剤技法が含まれてよい。上記で記述したように、好ましい技法には合成による配列決定の方法が含まれてよい。例えば、一部のSBSの態様は核酸鋳型の実質的に同一のコピーの集団を配列決定し、典型的には試料鋳型分子の予め決められた相補的位置またはその鋳型分子に結合した1個以上のアダプターにアニールするように設計された1種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。そのプライマー/鋳型複合体に、核酸ポリメラーゼ酵素の存在下でヌクレオチド種を与える。そのヌクレオチド種がそのオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端に直接隣接する試料鋳型分子上の配列位置に相当する核酸種に相補的である場合、そのポリメラーゼはそのヌクレオチド種を用いてそのプライマーを伸長するであろう。あるいは、一部の態様において、そのプライマー/鋳型複合体に複数の目的のヌクレオチド種典型的にはA、G、C、およびTを一度に与え、そのオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端に直接隣接する試料鋳型分子上の対応する配列位置において相補的であるヌクレオチド種が組み込まれる。記述した態様のいずれにおいても、そのヌクレオチド種はさらなる伸長を妨げるように例えば3’-Oの位置において化学的にブロッキングされていてよく、合成の次のラウンドの前に脱ブロッキングされる必要がある。ヌクレオチド種を新生分子の末端に付加するプロセスはプライマーの末端への付加に関して上記で記述した方法と実質的に同じであることも理解されるであろう。上記で記述したように、ヌクレオチド種の組み込みは当技術で既知の様々な方法により、例えば光を生成する酵素反応プロセスを用いてピロホスフェートPPiの放出を検出することにより、またはpHの変化の検出により米国特許第6,210,891号;第6,258,568号;および第6,828,100号において記述されている例、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する、またはそのヌクレオチドに結合させた検出可能な標識により検出することができる。検出可能な標識のいくつかの例には、質量タグおよび蛍光または化学発光標識が含まれるが、それらに限定されない。典型的な態様において、組み込まれなかったヌクレオチドは例えば洗浄により除去される。さらに、一部の態様において、その組み込まれなかったヌクレオチドに、例えば2008年6月27日に出願された核酸配列決定における適応性Adaptive試薬制御のための系および方法と題された米国特許出願一連番号12/215,455;および2009年1月29日に出願された核酸配列決定における向上したシグナル検出のための系および方法と題された米国特許出願一連番号12/322,284そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用するにおいて記述されているようなアピラーゼまたはピロホスファターゼ酵素を用いる分解のような酵素的分解を施すことができる。検出可能な標識が用いられる態様において、それらは典型的には次の合成のサイクルの前に例えば化学的開裂または光退色により不活性化されなければならないであろう。次いでその鋳型/ポリメラーゼ複合体における次の配列の位置を、上記で記述したように別のヌクレオチド種、または複数の目的のヌクレオチド種を用いて照会することができる。ヌクレオチドの添加、伸長、シグナルの獲得、および洗浄の繰り返されるサイクルは、結果として鋳型鎖のヌクレオチド配列の決定をもたらす。この例を続けることにより、信頼できる検出のために十分に強いシグナルを獲得するために、多数の実質的に同一の鋳型分子、または実質的に同一の鋳型分子の集団例えば103、104、105、106または107個の分子が典型的にはあらゆる1つの配列決定反応において同時に分析される。加えて、一部の態様において、ペアエンドpaired-end配列決定戦略と呼ばれ得る方法を用いることにより配列決定プロセスの読み取り長能力および質を向上することが好都合である可能性がある。例えば、配列決定法の一部の態様は、それから高品質で信頼できる読みを生成することができる分子の全長において制限を有する。言い換えると、信頼できる読み取り長のための配列位置の総数は、用いられる配列決定の態様に依存して、25、50、100、または500塩基を超えることができない。ペアエンド配列決定戦略は、それぞれの末端に中央でリンカー配列により連結された本来の鋳型核酸分子の断片を含む分子のそれぞれの末端時々タグ末端と呼ばれるを別々に配列決定することにより、信頼できる読み取り長を拡張する。その鋳型断片の本来の位置的関係は既知であり、従ってその配列の読みからのデータを再度組み合わせてより長い高品質読み取り長を有する単一の読みにすることができる。ペアエンド配列決定の態様のさらなる例が、ペアエンド配列決定と題された米国特許第7,601,499号において;および2009年1月28日に出願されたペアエンド配列決定と題された米国特許出願一連番号12/322,119において記述されており、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。SBS装置のいくつかの例は上記で記述した方法の一部または全部を実施することができ、それには検出装置、例えば光学的検出のための電荷結合素子すなわちCCDカメラまたは共焦点型構造、イオンまたは化学的検出のための構造のためのイオン感応性電界効果トランジスタISFETとも呼ばれるまたは化学感応性電界効果トランジスタChemFETとも呼ばれる、微少流体チャンバーまたはフローセル、反応支持体、および/またはポンプおよびフローバルブの内の1種類以上が含まれてよい。ピロホスフェートに基づく配列決定の例では、装置の態様は本質的に低いレベルのバックグラウンドノイズをもたらす化学発光検出戦略を用いることができる。一部の態様において、配列決定のための反応支持体には平面の支持体、例えばスライド型の支持体、ISFET、または導波型の反応支持体が含まれてよく、それは一部の態様においてウェル型の構造を含んでいてよい。さらに、その反応支持体には上記で記述したような454LifeSciencesCorporationから入手可能なPTP商標アレイと呼ばれるものが含まれてよく、それは光ファィバーフェースプレートから形成され、数十万またはより多くの非常に小さいウェルを生じるように酸でエッチングされており、それぞれが実質的に同一の鋳型分子の集団を保持することが可能であるすなわち、一部の好ましい態様は、70×75mmPTP商標アレイ上に35μmのウェル間ピッチで約330万個のウェルを含む。一部の態様において、それぞれの実質的に同一の鋳型分子の集団を固体支持体、例えばビーズの上に配置することができ、そのそれぞれを前記のウェルの1個の中に配置することができる。例えば、装置にはそのPTPプレートホルダーに流体試薬を提供するための試薬送達要素およびそのPTPプレート上のそれぞれのウェルから放射された光の光子を集めることが可能なCCD型検出装置が含まれていてよい。向上したシグナル認識のための特徴を含む反応支持体の例が、2005年8月30日に出願された薄膜でコートされたマイクロウェルアレイおよび同じものを作る方法と題された米国特許第7,682,816号において記述されており、それをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。SBS型配列決定およびピロホスフェート配列決定を実施するための装置および方法のさらなる例が米国特許第7,323,305号および第7,575,865号において記述されており、その両方が上記で援用されている。加えて、1つ以上の試料調製プロセスを自動化する系および方法、例えば上記で記述したemPCR商標プロセスを用いることができる。例えば、自動化された系を用いて、emPCR処理のためのエマルジョンを生成するための効率的な溶液を提供する、PCR熱サイクル操作を実施する、および配列決定のための核酸分子のうまく調製された集団に関して濃縮することができる。自動化された試料調製系の例が、2005年1月28日に出願された連続的フローエマルジョンを用いた核酸増幅と題された米国特許第7,927,797号において記述されており、それをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。また、本明細書で記述する本発明の態様の系および方法には、コンピューターシステム上での実行のために記憶されているコンピューターで読み取り可能な媒体を用いるいくつかの設計、分析、または他の操作の実施が含まれてよい。例えば、検出されたシグナルを処理する、および/またはSBS系および方法を用いて生成されたデータを分析するためのいくつかの態様が下記で詳細に記述されており、ここでその処理および分析の態様はコンピューターシステム上で実施可能である。本明細書で記述する発明と共に使用するためのコンピューターシステムの典型的な態様には、あらゆるタイプのコンピュータープラットフォーム、例えばワークステーション、パーソナルコンピューター、サーバー、またはあらゆる他の現在または未来のコンピューターが含まれてよい。しかし、本明細書で記述するような前記のコンピュータープラットフォームは記述される発明の特殊化された操作を実施するように特別に設計されており、汎用コンピューターとは考えられないことは当業者には理解されるであろう。コンピューターには典型的には既知の構成要素、例えば処理装置、オペレーティングシステム、システムメモリー、メモリー記憶装置、入出力制御装置、入出力デバイス、および表示装置が含まれる。関連分野の当業者には、コンピューターの多くの可能性のある構成および構成要素が存在し、それにはキャッシュメモリー、データバックアップユニット、および多くの他の装置も含まれてよいことも理解されるであろう。表示装置には視覚情報を提供する表示装置が含まれてよく、この情報は典型的にはピクセルのアレイとして論理的におよび/または物理的に組織化されていてよい。インターフェイス制御装置も含まれていてよく、それは入出力インターフェイスを提供するための様々な既知の、または未来のソフトウェアプログラムのいずれかを含んでいてよい。例えば、インターフェイスには一般にグラフィカルユーザーインターフェイスしばしばGUIと呼ばれると呼ばれるものが含まれてよく、それは使用者に1種類以上のグラフ表現を提供する。インターフェイスは典型的には、関連技術における当業者に既知の選択または入力の手段を用いて使用者の入力を受け入れることが可能になっている。同じまたは代わりの態様において、コンピューター上でのアプリケーションにはコマンドラインインターフェイスしばしばCLIと呼ばれると呼ばれるものが含まれてよい。CLIは典型的にはアプリケーションと使用者の間のテキストに基づく相互作用を提供する。典型的には、コマンドラインインターフェイスは表示装置を通して出力を与え、テキストの列として入力を受ける。例えば、一部の実施には関連技術における当業者に既知のUnixシェル、またはオブジェクト指向型プログラミングアーキテクチャ、例えばMicrosoft.NETフレームワークを用いるMicrosoftWindowsPowershellのようなシェルと呼ばれるものが含まれてよい。関連技術における当業者は、インターフェイスには1個以上のGUI、CLIまたはそれらの組み合わせが含まれてよいことを理解しているであろう。処理装置には、商業的に入手可能な処理装置、例えばIntelCorporationにより作られたCeleron登録商標、Core商標、またはPentium登録商標処理装置、SunMicrosystemsにより作られたSPARC登録商標処理装置、AMDcorporationにより作られたAthlon商標、Sempron商標、Phenom商標、またはOpteron商標処理装置が含まれてよく、またはそれは入手可能な、または入手可能になるであろう他の処理装置の1つであってよい。処理装置の一部の態様には、マルチコア処理装置と呼ばれるものが含まれてよく、および/または単独またはマルチコア設計において並列処理技術を用いることが可能にされていてよい。例えば、マルチコアアーキテクチャは典型的には2個以上の処理装置の実行コアを含む。この例では、それぞれの実行コアは多数のスレッドの並列実行を可能にする独立した処理装置として機能することができる。加えて、当業者は、処理装置は一般に32もしくは64ビットアーキテクチャと呼ばれるもの、または現在知られている、もしくは将来開発される可能性のある他のアーキテクチャ構成で構成されていてよいことを理解しているであろう。処理装置は典型的にはオペレーティングシステムを実行し、それは例えばMicrosoftCorporationからのWindows登録商標型オペレーティングシステム例えばWindows登録商標XP、WindowsVista登録商標、またはWindows登録商標_7;AppleComputerCorp.からのMacOSXオペレーティングシステム例えばMacOSXv10.6SnowLeopardオペレーティングシステム;多くのベンダーもしくはオープンソースと呼ばれるものから入手可能なUnix登録商標もしくはLinux型オペレーティングシステム;別の、もしくは未来のオペレーティングシステム;またはその何らかの組み合わせであってよい。オペレーティングシステムは周知の方式でファームウェアおよびハードウェアとインターフェイスされており、様々なプログラミング言語で書かれていてよい様々なコンピュータープログラムの機能の調和および実行においてその処理装置を手助けする。オペレーティングシステムは、典型的には処理装置と共同して、コンピューターの他の構成要素の機能を調和させ、実行する。オペレーティングシステムはスケジューリング、入出力制御、ファイルおよびデータの管理、メモリー管理、ならびに通信制御および関連するサービスも提供し、それらは全て既知の技法に従う。システムメモリーには、様々な既知の、または未来のメモリー記憶装置のいずれかが含まれてよい。例には、あらゆる一般的に入手可能なランダムアクセスメモリーRAM、磁気媒体、例えば常在性residentハードディスクもしくはテープ、光学媒体、例えば読み取りおよび書き込み用コンパクトディスク、または他のメモリー記憶装置が含まれる。メモリー記憶装置には、コンパクトディスクドライブ、テープドライブ、取り外し可能なハードディスクドライブ、USBもしくはフラッシュドライブ、またはディスケットドライブが含まれる様々な既知の、または未来の装置のいずれかが含まれてよい。そのようなタイプのメモリー記憶装置は典型的にはプログラム記憶媒体示していない、例えばそれぞれコンパクトディスク、磁気テープ、取り外し可能なハードディスク、USBもしくはフラッシュドライブ、またはフロッピーディスクから読み取り、および/またはそれに書き込む。これらのプログラム記憶媒体、または現在用いられている、または後に開発される可能性のある他のもののいずれも、コンピュータープログラム製品と考えることができる。理解されているであろうように、これらのプログラム記憶媒体は典型的にはコンピューターソフトウェアプログラムおよび/またはデータを記憶する。コンピューター制御論理とも呼ばれるコンピューターソフトウェアプログラムは、典型的にはメモリー記憶装置と合わせて用いられるシステムメモリーおよび/またはプログラム記憶装置中に記憶されている。一部の態様において、その中に記憶された制御論理プログラムコードが含まれるコンピューターソフトウェアプログラムを有する、コンピューター使用可能な媒体を含むコンピュータープログラム製品を記述する。その制御論理は、処理装置により実行される際、処理装置に本明細書で記述した機能を実行させる。他の態様において、一部の機能は主に例えばハードウェア状態の機械hardwarestatemachineを用いてハードウェアにおいて実施される。本明細書で記述した機能を実施するためのそのハードウェア状態の機械の実施は、関連技術における当業者には明らかであろう。入出力制御装置には、ヒトであろうと機械であろうと、手元であろうと遠隔であろうと、使用者からの情報を受け取る、および処理するための様々な既知の装置のいずれかが含まれ得る。そのような装置には、例えば、モデムカード、ワイヤレスカード、ネットワークインターフェイスカード、サウンドカード、または様々な既知の入力装置のいずれかのための他のタイプの制御装置が含まれる。出力制御装置には、ヒトであろうと機械であろうと、手元であろうと遠隔であろうと、使用者に情報を与えるための様々な既知の表示装置のいずれかのための制御装置が含まれ得る。本明細書で記述した態様において、そのコンピューターの機能要素はシステムバスを介して互いと通信する。コンピューターの一部の態様は、ネットワークまたは他のタイプの遠隔通信を用いていくつかの機能要素と通信することができる。関連技術における当業者には明らかであるように、機器制御および/またはデータ処理アプリケーションは、ソフトウェアにおいて実施される場合、システムメモリーおよび/またはメモリー記憶装置中にロードされ、それから実行されてよい。その機器制御および/またはデータ処理アプリケーションの一部または全部がそのメモリー記憶装置の読み取り専用メモリーまたは類似の装置中に存在していてもよく、そのような装置はその機器制御および/またはデータ処理アプリケーションがまず入出力制御装置を通してロードされることを要求しない。関連技術における当業者には、その機器制御および/またはデータ処理アプリケーション、またはその一部が、実行のために好都合である際に、処理装置により既知の方式でシステムメモリーまたはキャッシュメモリーまたは両方の中にロードされてよいことは理解されるであろう。また、コンピューターにはシステムメモリー中に記憶された1個以上のライブラリーファイル、実験データファイル、およびインターネットクライアントが含まれてよい。例えば、実験データには1個以上の実験もしくはアッセイに関連するデータ、例えば検出されたシグナル値、または1個以上のSBS実験またはプロセスと関係する他の値が含まれることができるであろう。加えて、インターネットクライアントにはネットワークを用いて別のコンピューター上の遠隔サービスにアクセスすることが可能になっているアプリケーションが含まれてよく、例えば一般にウェブブラウザーと呼ばれるものを含んでいてよい。この例において、いくつかの一般的に用いられるウェブブラウザーには、MicrosoftCorporationから入手可能なMicrosoft登録商標InternetExplorer8、MozillaCorporationからのMozillaFirefox登録商標3.6、AppleComputerCorp.からのSafari4、Google商標CorporationからのGoogleChrome、または当技術で現在知られている、もしくは将来開発される予定の他のタイプのウェブブラウザーが含まれる。また、その同じまたは他の態様において、インターネットクライアントにはネットワークを介して遠隔情報にアクセスすることが可能にされている特殊化されたソフトウェアアプリケーション、例えば生物学的アプリケーションのためのデータ処理アプリケーションが含まれていてよく、またはインターネットクライアントはそれらの要素であることができるであろう。ネットワークには、当業者に周知の多くの様々なタイプのネットワークの1種類以上が含まれてよい。例えば、ネットワークには、通信のために一般にTCP/IPプロトコルスイートと呼ばれるものを用いるローカルまたはワイドエリアネットワークが含まれてよい。ネットワークには相互接続されたコンピューターネットワークの世界的なシステムを含むネットワークが含まれてよく、それは一般にインターネットと呼ばれ、または様々なイントラネットアーキテクチャも含まれることができるであろう。関連技術における当業者は、ネットワーク化された環境における一部の使用者は、ハードウェアおよび/またはソフトウェアシステムへの、またはそれらからの情報のトラフィックを制御するために一般にファイアーウォールと呼ばれるもの時々パケットフィルターまたは境界保護装置とも呼ばれるを用いることを好む可能性があることも理解しているであろう。例えば、ファイアーウォールはハードウェアもしくはソフトウェア要素またはそれらの何らかの組み合わせを含んでいてよく、それは典型的には例えばネットワーク管理者のような使用者により導入されたセキュリティポリシーを実施するように設計されている。b.本明細書で記述する発明の態様上記で記述したように、記述される発明の態様は、反応環境中に導入されるヌクレオチド種の濃度をDNA配列決定技術において用いられる1種類以上の酵素の種特異的効率に基づいて最適化するための向上した系および方法に向けられている。典型的な配列決定の態様において、1個以上のプロセス工程を自動化する1種類以上の機器要素が用いられてよい。例えば、配列決定法の態様は、一部または全部のプロセス工程を自動化する、および実行するための機器を用いて実行することができる。図1は配列決定機器100の説明的な例を提供し、それは光学的シグナルの捕捉を必要とする配列決定プロセスのために典型的には反応支持体105上で行われる配列決定反応およびデータの捕捉の実行のための光学サブシステムおよび流体サブシステムを含む。しかし、他のデータの捕捉の方式すなわちpH、温度、電気化学的、等を必要とする配列決定プロセスに関して、関連技術における当業者に既知であるそのデータの捕捉の方式のためのサブシステムを用いてよいことは理解されるであろう。例えば、使用者101または何らかの自動化された態様は鋳型分子の試料を反応支持体105の上に装填し、次いで配列決定機器100を用いて大量に並行した方式で配列決定して、それぞれの鋳型分子の配列組成を表す配列データを生成することができる。重要なことだが、使用者101にはあらゆるそのような使用者が含まれてよく、それには独立した研究者、技術者、臨床家、大学、または企業体が含まれるがそれらに限定されない。配列決定プロセスを実行するために用いられる配列決定機器100の態様には、その流体サブシステム中の様々な流体構成要素、光学サブシステム中の様々な光学的構成要素またはpH検出の場合では電界効果トランジスタ型検出構成要素例えばISFETまたはChemFETおよび関係するサブシステム、ならびに図1において図説されていないが一般的に用いられ、当業者に既知の追加の構成要素いくつかの機能の現場制御のためのマイクロ処理装置および/またはマイクロ制御装置構成要素が含まれ得るが含まれてよい。一部の態様において、試料は場合により機器100を用いる配列決定のための必要な調製の一部または全部を実施するように設計された試料調製機器180を用いる自動化された、または部分的に自動化された様式での配列決定のために調製されてよい。さらに、図1で図説されているように、配列決定機器100は1個以上の外部のコンピューター構成要素、例えばコンピューター130に有効にoperatively連結されていてよく、それは例えばシステムソフトウェアまたはファームウェア、例えばアプリケーション135を実行することができ、それは配列決定機器100または試料調製機器180のような機器の1個以上の指示的制御、および/またはデータ分析機能を提供することができる。コンピューター130は加えてネットワーク150を介して他のコンピューターまたはサーバーに有効に接続されていてよく、それは機器システムの遠隔操作ならびに記憶および処理が可能なシステムへの大量のデータのエクスポートを可能にすることができる。この例において、配列決定機器100および/またはコンピューター130には上記で一般的に記述した態様の構成要素および特徴の一部または全部が含まれてよい。関連技術における当業者は、1種類以上の酵素を用いる典型的な配列決定系の性能はその関係する方法において用いられる様々な酵素の効率、例えばいくつかの合成による配列決定の方法論において用いられるポリメラーゼおよび/またはアピラーゼ酵素の効率に影響されやすいことを理解しているであろう。例えば、一般的なアピラーゼ活性の望ましいレベルを達成するために反応環境中のアピラーゼの濃度を最適に調節することの態様が、2008年6月27日に出願された核酸配列決定における適応性試薬制御のための系および方法と題された米国特許出願一連番号12/215,455において記述されており、それをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。あらゆる特定の酵素の効率は、酵素、特に酵素活性の特性を与える領域のアミノ酸配列組成、および反応環境における周囲の条件が含まれるがそれらに限定されないいくつかの要因に依存する可能性があることも理解されるであろう。例えば、ポリメラーゼは一般に約120,000単位/mgの特異的活性を含む可能性があり、ここで1単位は一般に65°Cにおいて30分間で10nmolのdNTPを酸不溶性物質中に組み込むであろうポリメラーゼ酵素の量を指す。さらに、ヌクレオチドの組み込みに関する様々なポリメラーゼ種の効率、およびヌクレオチドの消化に関するアピラーゼ種の効率は、その反応環境中に存在するヌクレオチドの種に依存して異なり得る。一部の配列決定系の態様において、ヌクレオチド種溶液dTTP、α-チオ-dATPまたは一部の態様においてdATP、dCTPおよびdGTPは典型的には、間でアピラーゼ溶液のフローを用いるサイクル方式で反応環境中に導入されるすなわち、上記で記述したようなフローによる導入。一部の態様において、それぞれのヌクレオチド種に特異的なアピラーゼの定常状態濃度は、その配列決定プロセスの間の反応支持体すなわち、例えば上記で記述したPicoTiterPlate型支持体のウェル上の個々の反応環境中へのヌクレオチド種のフローにより確立される。そのヌクレオチド種特異的な定常状態アピラーゼ濃度は、単純な速度論的条件が存在するという仮定に基づいて酵素の速度論的特徴を数学的に概算するためのミカエリスメンテン速度式と呼ばれるものを用いて算出することができる。そのミカエリスメンテン式はヌクレオチド種により異なる定数値を用い、それには反応環境中の酵素活性のミカエリス定数KMおよび最大速度Vmaxが含まれる。例えば、配列決定系の実施において用いられるアピラーゼに関するその定数値を下記の表1において列挙する。この実施例において、配列決定試薬のフローの反復的な性質のため、アピラーゼは所与の時間で1つのタイプのヌクレオチド種のみに効果的に曝露される。アピラーゼおよびそれぞれのヌクレオチド種の間の反応速度は、以下の式を用いて概算することができる:ここで、[dNTP]はdTTP、dATP、dCTPまたはdGTPの濃度である。この実施例を続けて、dTTP、α-チオ-dATP、dCTPおよびdGTPに関する算出のために用いられたヌクレオチド種濃度は、その反応環境においてそれぞれ40.3、166.1、16.3および19.7μMである。α-チオ-dATPに関する濃度の値は実質的に他のヌクレオチド種の濃度よりも高く、それはポリメラーゼ酵素の組み込み効率に対して阻害作用を有する修飾すなわち、従ってより高い濃度はポリメラーゼの組み込みの可能性を向上するおよび下記でより詳細に説明するようなアピラーゼの増大した処理効率によるものであることは理解されるであろう。一部の態様において、より自然なdATP種をα-チオ-dATPの代わりに用いることができ、それはその種に関するより高い酵素処理の効率を反映してヌクレオチド種濃度に関する異なる値を有していてよい。異なるヌクレオチド種に対するミカエリスメンテンの計算からの概算されたアピラーゼの活性を、下記の表2において示す。表2において説明されているアピラーゼのα-チオ-dATPに対する計算された効率は他の種に関してよりも実質的に高く、従ってアピラーゼはより高い濃度のα-チオ-dATPを効率的な方式で処理することが予想されるであろうことも特筆すべきである。表3は、そのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度およびアピラーゼ活性の値をdCTPの値に基づいてそれはそのヌクレオチド種の中で最も低い濃度および活性の値を有するため正規化することによる、表2からのデータの異なる方法での表現を提供する表3中のヌクレオチド種Aはα-チオ-dATPを指す。記述した態様において、その配列決定プロセスにおいて用いられるそれぞれのヌクレオチド種の濃度は、そのヌクレオチド種に関するアピラーゼ活性の相対的レベルに基づいて調節される。当業者は、アピラーゼはヌクレオチド分子を種特異的速度で消化するため、ヌクレオチド種に関する高いアピラーゼの活性は、組み込みに利用可能なヌクレオチド分子の濃度が組み込みが起こり得る前にそのアピラーゼにより実質的に低減される場合、その種に関するポリメラーゼ酵素の組み込み効率を低減させる可能性があることを理解しているであろう。従って、その種に関するヌクレオチド濃度は、高い種特異的アピラーゼ活性の作用に対抗するためにより高くなければならない。ポリメラーゼおよびアピラーゼ活性の、配列決定反応環境の外で測定されたそれらのそれぞれの速度定数を用いた概算は、反応環境、例えば記述した反応支持体の反応ウェル内で実際に生じる活性のレベルとは異なる可能性があることも理解されるであろう。しかし、それぞれのヌクレオチド種に対するアピラーゼの分解およびポリメラーゼの組み込みの組み合わせに関する全体的な酵素効率は、未処理のすなわちデータ補正計算を適用していない配列決定データから推測することができる。例えば、表4は、最高の配列決定性能を達成するために、個々のヌクレオチド種の完了効率および繰り越し値を用いてそれぞれのヌクレオチド種の濃度を最適化することができることを示している。この例において、C.ジェジュニC.jejuniのゲノムのDNAショットガンライブラリーを配列決定して、ポリメラーゼおよびアピラーゼ効率に関して最適化されたヌクレオチド種濃度を計算した。表4の2番目TAおよび3番目CGの縦列は、配列決定ランにおいて用いられるTおよびAのCおよびGヌクレオチド種濃度に対する相対的百分率を示し、ここで100濃度に関する値は表3からの計算され正規化された種相対的比率の値に基づいていてよい。例えば、表3からの数字を用いて、Gヌクレオチド種の100はその濃度比を考慮すればCヌクレオチド種の100よりも1.2倍大きい。当業者は、C.ジェジュニはATに富むゲノムであり、それは一般にそのゲノム組成においてAおよびTヌクレオチド種のCおよびGヌクレオチド種よりも高い出現率が存在することを意味することを理解しているであろう。従って、図4で図説するTAおよびGC濃度に関する相対的百分率はその事実を反映しており、典型的にはGCに富むゲノムすなわち、T.サーモフィラスT.thermophilusのゲノムに関しては異なるであろう。それぞれの個々のヌクレオチド種の平均完了効率すなわち不完全伸長を概算するためおよび繰り越し値を、下記で詳細に記述する方法を用いて推測した。最後の縦列は得られた高品質読み取りの平均読み取り長RLを示し、ここで読み取り長の増大は、アピラーゼの種特異的分解効率に対するポリメラーゼの種特異的組み込み効率に関して釣り合いを取ったそれぞれのヌクレオチド種濃度の組み合わせの最適化のレベルの増大に相関している。当業者には明らかであろうように、表4は、ヌクレオチド種の特定の対の濃度を増大させることはそれぞれの種に関する対応する完了効率を増大させるが、ほとんどの場合、その種に関する対応する繰り越し値も増大させることを説明しているGヌクレオチド種に関する繰り越し値はこの傾向に従わなかった。完了効率および繰り越し値の推測される値は組み合わせた酵素活性を表しており、それはポリメラーゼおよびアピラーゼそれぞれのそれぞれのヌクレオチド種に対する効率に直接関係している。ヌクレオチド種濃度の最適なセットはそれぞれのヌクレオチド種の完了効率を最大化し、繰り越し値を最小化し、それは結果として配列決定性能の尺度である最も長い平均読み取り長をもたらす。フローサイクルの数が増大するにつれて、全てのフローサイクルが一部のタイプのCAFIEエラーが起こる可能性を増大させ、その種特異的な違いがより重要になることも理解されるであろう。個々のヌクレオチド種の平均完了効率および繰り越し値を、ヌクレオチド特異的CAFIE繰り越しおよび不完全伸長当てはめを用いて推測した。例えば、その配列決定プロセスは、典型的には画像およびシグナル処理ソフトウェアの態様、例えばアプリケーション135により処理される未処理の配列の読みを生成する。この例において、アプリケーション135は生成された未処理の配列の読みをその配列決定された試料と関係する参照ゲノム配列、例えばC.ジェジュニのコンセンサス参照配列にマッピングするmaps当業者にはアラインメントとも呼ばれる。当業者には明らかであろうように、その未処理の修正されていない配列の読みの参照配列へのマッピング/アラインメントを用いて、どこでCAFIEエラーが起こっているかおよびヌクレオチド種特異的CAFIEエラーの発生率の決定を決定することができる。本明細書で記述する実施例において、アプリケーション135はフローグラムflowgramsとして表される200個の修正されていない配列の読みを参照ゲノム配列にマッピングし、そのヌクレオチドフローの最初の100回の反復はその完了効率および繰り越し値を推測することによるそのヌクレオチド種のそれぞれの最適濃度の決定に関して考慮される。その4種類のヌクレオチド種のそれぞれの検出されたシグナル強度を、まず全てのヌクレオチド種に関する1マー値1-mervalueの中央値を用いて正規化した。その用語1マー中央値は、本明細書で用いられる際、一般に単一の配列位置におけるヌクレオチド種の組み込みに応じた検出されたシグナルの程度を反映する値を指し、それはそのヌクレオチド種のそれぞれに関して実質的に同じであるべきである。典型的には、この1マー値は、鋳型核酸分子の配列決定ランの開始時に得られた検出されたシグナルから計算するのが最も容易であり、これはアダプター中のキー要素は既知の位置すなわちTCAGキー要素においてキー要素中にそれぞれのヌクレオチド種の1つの代表を含んでおり、従ってそれぞれの種の1個のヌクレオチドのみがその4個の配列位置のそれぞれにおいて組み込まれることが予想されるためである。表4において説明した完了効率および繰り越し値は、それぞれの個々の配列の読みに関する3段階の最小化プロセスを用いて推測することができる。第1段階において、以下の式を最小化してヌクレオチド種に依存しない完了効率および繰り越し値を得ることができる:ここでqは修正されていないフローグラム、vは参照フローグラムその読みの参照配列に由来するに由来する組み込みリスト、λはヌクレオチド種に依存しない完了効率のパラメーター、εはヌクレオチド種に依存しない繰り越し値、MはCAFIE行列、そしてnは平均ノイズである。その組み込みリストvはそのフローグラムの長さのベクトルであり、それはこの例では400フローである。viは、その参照フローグラムがフローiにおいて1個以上の組み込みを示す場合は1であり、その参照フローグラムが組み込みを示さない場合は0である。この工程は、その平均ノイズからの陰性negativeフローすなわちここでヌクレオチド種の組み込みは起こらないの二乗偏差を最小化するパラメーターλ,ε,nのセットを求める。その最小化はλ,ε=0.998,0.005の初期推測値を用いて行われ、nの初期推測値は最初の5回の陰性フローすなわちvi=0であるフローの平均正規化強度に設定される。検索は下限λ,ε,n=0.99,0,0および上限1,0.05,maxqiここでvi=0であるで行われる。第2段階は、ヌクレオチド特異的完了効率および繰り越し値ならびに平均ノイズを推測することである。以下の式を最小化する:その検索は初期推測値λT,λA,λC,λG,εT,εA,εC,εG,n=λ1,λ1,λ1,λ1,ε1,ε1,ε1,ε1,n1を用いて開始され、ここでλ1、ε1およびn1は第1段階から得られた完了効率、繰り越し、および平均ノイズの値である。その検索の下限および上限は0.99,0.99,0.99,0.99,0,0,0,0,0および1,1,1,1,0.05,0.05,0.05,0.05,maxqiここでvi=0であるである。第3および最終段階はそのヌクレオチド特異的完了効率および繰り越し値、平均ノイズならびに位相のずれすなわち、位相の同調における繰り越し変化の不完全伸長を推測することである。以下の式を最小化する:ここでφは位相のずれすなわちCAFIE作用からの位相同調エラーである。その検索は第1段階からの初期推測値λT,λA,λC,λG,εT,εA,εC,εG,n,φ=λT2,λA2,λC2,λG2,εT2,εA2,εC2,εG2,n2,0を用いて開始され、ここでλT2,λA2,λC2,λG2は第2段階で得られたヌクレオチド特異的完了効率の値であり、εT2,εA2,εC2,εG2は第2段階で得られたヌクレオチド特異的繰り越し値であり、n2は第2段階で得られたノイズ値である。その検索の下限および上限はそれぞれ0.99,0.99,0.99,0.99,0,0,0,0,0,0および1,1,1,1,0.05,0.05,0.05,0.05,maxqiここでvi=0,1であるである。上記の表4で列挙したヌクレオチド特異的完了効率および繰り越し値は、第3段階の計算から得られた値のセットであり、200を超える試料を平均したものである。その完了効率および繰り越し値の変化の傾向に従ってヌクレオチド種濃度を調節することにより、ポリメラーゼおよびアピラーゼ酵素の両方ならびに配列決定条件により許容される最適なレベルまで完了効率を最大化し、繰り越し値を最小化するヌクレオチド種濃度の最適なセットを得ることができる。例えば、ヌクレオチド種濃度対CAFIE作用に関して滴定曲線をプロットすることができ、それはその種特異的酵素活性レベルが含まれるその反応環境のパラメーターに関する最適なヌクレオチド種濃度を図式的に説明する。様々な態様および実施を記述したが、前記のものは単に説明的なものであり、限定するものではなく、例としてのみ示されていることは、関連技術における当業者には明らかであるはずである。説明した態様の様々な機能性要素の中の分布している機能に関して多くの他のスキームが可能である。あらゆる要素の機能は、代わりの態様において様々な方法で実施されてよい。"