"PCSK9に結合する抗PCSK9抗体又は抗体断片であって、iX1はS又はTであり;X2はG,R又はSであり;X3はH,T又はYであり;X4はA又はTである、GFTFX1X2X3X4IH配列番号28を含むHVR-H1;iiRISPANGNTNYADSVKG配列番号4を含むHVR-H2;iiiWIGSRELYIMDY配列番号5を含むHVR-H3;ivX1はS又はTである、RASQDVSX1AVA配列番号29を含むHVR-L1;vX1はF又はSである、SASX1LYS配列番号30を含むHVR-L2;及びviX1はP,R又はTであり;X2はA,I,S又はTであり;X3はL,P又はQであり;X4はA,H,P又はSである、QQSYX1X2X3X4T配列番号31を含むHVR-L3からなる群から選択される少なくとも一、二、三、四、五、又は六の超可変領域HVR配列を含む可変ドメインを含むPCSK9に結合する抗PCSK9抗体又は抗体断片。次の6つのHVR配列:iX1はS又はTであり;X2はG,R又はSであり;X3はH,T又はYであり;X4はA又はTである、GFTFX1X2X3X4IH配列番号28を含むHVR-H1;iiRISPANGNTNYADSVKG配列番号4を含むHVR-H2;iiiWIGSRELYIMDY配列番号5を含むHVR-H3;ivX1はS又はTである、RASQDVSX1AVA配列番号29を含むHVR-L1;vX1はF又はSである、SASX1LYS配列番号30を含むHVR-L2;及びviX1はP,R又はTであり;X2はA,I,S又はTであり;X3はL,P又はQであり;X4はA,H,P又はSである、QQSYX1X2X3X4T配列番号31を含むHVR-L3を含む可変ドメインを含むPCSK9に結合する抗PCSK9抗体又は抗体断片。抗体が、a配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR-H1、b配列番号4のアミノ酸配列を含むHVR-H2、及びc配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、請求項1に記載の抗体。a配列番号6又は配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L1;b配列番号8又は配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及びc配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR-L3を更に含む、請求項3に記載の抗体。a配列番号6又は配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L1;b配列番号8又は配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及びc配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項1に記載の抗体。抗体が、a配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR-H1、b配列番号4のアミノ酸配列を含むHVR-H2、及びc配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、請求項5に記載の抗体。抗体が、1配列番号1のアミノ酸配列を含むHVR-H1;2配列番号4のアミノ酸配列を含むHVR-H2;3配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-H3;4配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L1;5配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び6配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む請求項1又は2に記載の抗PCSK9抗体。抗体が、1配列番号1のアミノ酸配列を含むHVR-H1;2配列番号4のアミノ酸配列を含むHVR-H2;3配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-H3;4配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L1;5配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び6配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む請求項1又は2に記載の抗PCSK9抗体。抗体が、1配列番号2のアミノ酸配列を含むHVR-H1;2配列番号4のアミノ酸配列を含むHVR-H2;3配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-H3;4配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L1;5配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び6配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む請求項1又は2に記載の抗PCSK9抗体。抗体が、1配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR-H1;2配列番号4のアミノ酸配列を含むHVR-H2;3配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-H3;4配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L1;5配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び6配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む請求項1又は2に記載の抗PCSK9抗体。抗体が、1配列番号1のアミノ酸配列を含むHVR-H1;2配列番号4のアミノ酸配列を含むHVR-H2;3配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-H3;4配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L1;5配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び6配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む請求項1又は2に記載の抗PCSK9抗体。a配列番号15、配列番号16、配列番号17又は配列番号27のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を持つVH配列;又はb配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22又は配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を持つVL配列を含む、請求項1又は2に記載の抗PCSK9抗体。配列番号15、配列番号16、配列番号17又は配列番号27のVH配列を含む、請求項12に記載の抗PCSK9抗体。配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22又は配列番号23のVL配列を含む、請求項12に記載の抗PCSK9抗体。配列番号15のVH配列及び配列番号19のVL配列を含む、請求項12に記載の抗PCSK9抗体。配列番号27のVH配列及び配列番号20のVL配列を含む、請求項12に記載の抗PCSK9抗体。配列番号16のVH配列及び配列番号21のVL配列を含む、請求項12に記載の抗PCSK9抗体。配列番号17のVH配列及び配列番号22のVL配列を含む、請求項12に記載の抗PCSK9抗体。配列番号27のVH配列及び配列番号23のVL配列を含む、請求項12に記載の抗PCSK9抗体。a配列番号15、配列番号16、配列番号17又は配列番号27のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVH配列;又はb配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22又は配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVL配列を含む抗PCSK9抗体。a配列番号15、配列番号16、配列番号17又は配列番号27のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVH配列;又はb配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22又は配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVL配列を含む、請求項20に記載の抗PCSK9抗体。配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVH配列、及び配列番号19のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVL配列を含む、請求項21に記載の抗PCSK9抗体。配列番号27のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVH配列、及び配列番号20のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVL配列を含む、請求項21に記載の抗PCSK9抗体。配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVH配列、及び配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVL配列を含む、請求項21に記載の抗PCSK9抗体。配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVH配列、及び配列番号22のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVL配列を含む、請求項21に記載の抗PCSK9抗体。配列番号27のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVH配列、及び配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも99の配列同一性を持つVL配列を含む、請求項21に記載の抗PCSK9抗体。配列番号15、配列番号16、配列番号17又は配列番号27のVH配列を含む、請求項21から26の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体。配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22又は配列番号23のVL配列を含む、請求項21から27の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体。抗体がモノクローナル抗体である、請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体。抗体がヒト化されている、請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体。抗体がヒト型である、請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体。抗体が、Fab,Fab’-SH,Fv,scFv又はFab’2断片から選択される、請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体。フレームワーク配列の少なくとも一部分がヒトコンセンサスフレームワーク配列である、請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体。請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体をコードする単離された核酸。請求項34に記載の核酸を含むベクター。ベクターが発現ベクターである、請求項35に記載のベクター。請求項35又は36に記載のベクターを含む宿主細胞。宿主細胞が原核生物である、請求項37に記載の宿主細胞。宿主細胞が真核生物である、請求項37に記載の宿主細胞。前記方法が、請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体をコードする核酸の発現に適した条件下で、請求項37に記載の宿主細胞を培養することを包含する、抗PCSK9抗体を作成するための方法。宿主細胞から抗PCSK9抗体を回収することを更に含む、請求項40に記載の方法。請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。被検体においてLDLコレステロールのレベルを減少させる方法であって、該方法が請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体の有効量を被検体に投与することを含む方法。被検体においてコレステロール関連疾患を治療する方法であって、該方法が請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体の有効量を被検体に投与することを含む方法。被検体において高コレステロール血症を治療する方法であって、該方法が請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体の有効量を被検体に投与することを含む方法。抗PCSK9抗体が第一医薬であり、第二医薬の有効量を被検体に投与することを更に含む、請求項43、44又は45に記載の方法。第二医薬がLDLRのレベルを上昇させる、請求項46に記載の方法。第二医薬がLDLのレベルを低減する、請求項46に記載の方法。第二医薬がスタチンを含む、請求項46に記載の方法。スタチンが、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、およびそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項49に記載の方法。第二医薬がHDLコレステロールのレベルを上昇させる、請求項46に記載の方法。被検体においてLDLRに対するPCSK9の結合を阻害する方法であって、該方法が請求項1から28の何れか一項に記載の抗PCSK9抗体の有効量を被検体に投与することを含む方法。サンプル中のPCSK9タンパク質を検出する方法であって、a請求項1から28の何れか一項に記載の抗体とサンプルを接触させ;及びb抗PCSK9抗体とPCSK9タンパク質の間の複合体の形成を検出することを含む方法。PCSK9に結合する抗PCSK9抗体又は抗体断片であって、該抗体又は抗体断片が、iヒトPCSK9のR194及びE195からなる群から選択される少なくとも一残基、iiヒトPCSK9のD238及びA239からなる群から選択される少なくとも一残基、iiiヒトPCSK9のA341及びQ342からなる群から選択される少なくとも一残基、及びivヒトPCSK9のE366,D367,I369,S376,T377,C378,F379,S381及びH391からなる群から選択される少なくとも一残基を含むPCSK9のエピトープに結合する、PCSK9に結合する抗PCSK9抗体又は抗体断片。PCSK9のエピトープがE366,D367又はH391の一以上を含む、請求項54に記載の抗体。PCSK9のエピトープがE366,D367及びH391を含む、請求項55に記載の抗体。以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。実施例1:抗PCSK9抗体の生成残基番号付けは、Kabatに従う。抗PCSK9抗体を同定するためのライブラリ選別とスクリーニング社内で生成されたビオチン化ヒトPCSK9を、ライブラリ選別のための抗原として用いた。ファージライブラリは溶液相におけるビオチン化PCSK9に対して5ラウンドを選別した。選別の第一ラウンドにおいて、20μg/mLのビオチン化PCSK9が、ファージブロッキング緩衝液PBSTリン酸緩衝化生理食塩水PBS及び1w/vのウシ血清アルブミンBSA及び0.05v/vのTween20で予めブロックされた、抗体ファージライブラリのVHとVLドメイン例えばLeeetalJImmunolMeth2841191322004を参照とVH/VLLiangetalJMB3668158292007を参照へと添加され、室温で一晩インキュベートされた。翌日、120μlのPBST/BSA事前吸収DYNABEADS登録商標MyOneTMストレプトアビジンT1Invitrogen,Carlsbad,CAを各ライブラリに加え、室温で1時間インキュベートした。次いで、ビーズをPBT0.05のTween20を含むPBSで3回洗浄し、結合したファージを30分間1mLの50mMのHCl及び500mMのNaClで溶出させ、1Mのトリス塩基液pH7.5を400μLで中和した。回収されたファージを、大腸菌XL-1Blue細胞中で増幅した。その後の選択ラウンドの間に、ビオチン化PCSK9を持つ抗体ファージのインキュベーションを2~3時間に短縮し、ファージ結合した抗原は、ニュートラアビジンコーティングカタログ89890,10μg/ml,FisherScientific,Waltham,MA又はストレプトアビジンでコーティングカタログ21125,10μg/ml,FisherScientific,Waltham,MAされたNunc96ウェルマキシソープイムノプレートで30分間捕捉した。プレートの洗浄のストリンジェンシーを徐々に増加した。5ラウンドのパンニングpanningの後、有意な濃縮が観察された。96クローンがVH及びVH/VLライブラリ選別からそれぞれ採取され、それらがヒトPCSK9に結合したいるかどうかを決定した。これらのクローンの可変領域は、固有のシーケンスクローンを同定するためにPCR配列決定した。バックグラウンドより少なくとも5倍ヒトPCSK9に結合する固有のファージ抗体が選択され、インビトロでの細胞アッセイにおける評価のために完全長IgGに再編成されたreformatted。目的のクローンは、個々のクローンのVL及びVH領域をそれぞれLPG3及びLPG4ベクターにクローニングし、哺乳動物CHO細胞で一過性に発現させ、プロテインAカラムで精製することにより、IgGに再編成された。VHライブラリに由来するクローンの親和性向上のためのライブラリー構築全てCDR-L3の位置に終止コドンTAAを含み、かつM13バクテリオファージの表面に一価のFabを表示する、ファージミドpW0703ファージミドpV0350-2bLeeetalJMolBiol34010731093に由来するが、親和性成熟のためにVHライブラリから目的のクローンの重鎖可変ドメインVHを移植するためのライブラリテンプレートとしての機能を果たした。ハード及びソフトの両方のランダム化戦略あg、親和性成熟のために使用された。ハードランダム化のために、3つの軽鎖CDRの選択された位置を含む一つの軽鎖ライブラリが、天然のヒト抗体を模倣するように設計されたアミノ酸を用いて無作為化され、その設計されたDNAの縮退は、Leeetalに記載されている。ソフトランダム化のために、CDR-L3の91-96、CDR-H1の30-33,35、CDR-H2の50,52,53-54,56,及び58、CDR-H3の95-100,100A,及び100Cが標的とされ;CDRループの3つの異なる組み合わせ、H1/L3,H2/L3,及びH3/L3がソフトランダム化のために選択された。ソフトランダム化条件を獲得するために、選択された位置で約50の突然変異率を導入し、変異原性DNAが、野生型ヌクレオチドを好む塩基の70-10-10-10混合物で合成された。親和性の向上をもたらすためのファージ選別戦略親和性向上選択のために、ファージライブラリーは、ストリンジェンシーを増加させた5ラウンドの溶液選別を受けた。溶液選別の第一ラウンドにおいて、1BSA及び0.05Tween20中で3O.D./mlのファージインプットが、1のスーパーブロックPierceBiotechnologyと0.05のTween20を含有する100μlの緩衝液中で、100nMのビオチン化PCSK9と共に室温で2時間インキュベートされた。混合物は1のスーパーブロックで10Xに更に希釈され、100μl/ウェルをニュートラアビジンでコーティングされたウェル10μg/mlに室温で30分間穏やかに振盪しながら適用した。ウェルをPBS-0.05Tween20で10回洗浄した。バックグラウンド結合を決定するために、ファージを含むコントロールウェルをニュートラアビジンでコーティングされたプレート上に捕獲した。結合ファージを50mMのHCl,500mMのKClの150μl/ウェルで溶出し、続いて1MのTrispH8の50μl/ウェルにより中和し、滴定し、次のラウンドのために増殖された。溶液選別の更なる4回のラウンドが、選別ストリンジェンシーの増加と合わせて実行された。最初の2~3ラウンドは、ビオチン化標的タンパク質濃度を100nMから1nMに減少させることによる会合速度on-rate選択のためであり、最後の2回のラウンドは、室温で弱い結合剤を競合するため、過剰量の非ビオチン化標的タンパク質300から1000倍以上を加えることによる解離速度off-rate選択のためのものであった。ハイスループット親和性スクリーニングELISA単一スポットコンペティションコロニーが第5ラウンドのスクリーニングから採取された。コロニーを96ウェルプレートFalcon中で1E10/mlのKO7と50μg/mlのカルベニシリンを含む2YT培地の150μl/ウェルで、37°Cで一晩増殖させた。同じプレートから、XL-1に感染した親のファージのコロニーをコントロールとして取り上げた。96ウェルNuncマキシソーププレートを一晩4°CでPBS中の100μl/ウェルのニュートラアビジン10μg/mlでコーティングした。プレートは1時間、PBS中で0.05のTween20及び150μlの1のBSAでブロックした。35μlのファージ上清が、15nMのPCSK9の有無によらず、35μlのELISA酵素結合免疫吸着測定法緩衝液0.5BSA、0.05Tween20を含むPBSで希釈され、FプレートNUNC中で室温で1時間インキュベートさせた。3μg/mlのビオチン化PCSK9を35μlがその後各ウェルに添加され、室温で15分間インキュベートした。混合物の95μlをニュートラアビジンでコーティングしたプレートに並べて移した。プレートを穏やかに15分間振とうし、プレートにビオチン化PCSK9が結合したファージの捕捉を可能にした。プレートをPBS-0.05のTween20で10回洗浄した。結合は、ELISA緩衝液1:2500中で西洋ワサビペルオキシダーゼHRP結合抗M13抗体を添加し、室温で30分間インキュベートすることにより定量した。プレートをPBS-0.05Tween20で10回洗浄した。次に、3,3’、5,5’-テトラメチルベンジジンTMBペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液BH2O2Kirkegaard-PerryLaboratoriesGaithersburg,MDの1:1の比の100μl/ウェルをウェルに添加し、室温で5分間インキュベートした。反応を各ウェルに100μlの0.1Mリン酸H3PO4を添加することによって停止させ、室温で5分間インキュベートさせた。各ウェルの黄色のO.D.光学密度を450nmで標準ELISAプレートリーダーを用いて測定した。O.D.減少は次式により算出した:OD450nm減少=[競争相手を含むウェルのOD450nm/競争相手を含まないウェルのOD450nm]100親ファージのウェル100のOD450nm減少と比較して、50未満のOD450nm減少を有するクローンが配列解析用に選択された。ファージ調製のために、親のクローンとの比較によりPCSK9に対する結合親和性ファージIC50を決定するために、ユニークなクローンが選択された。次いで、最も親和性が向上されたクローンは、抗体産生及び更なるビアコアBIAcore結合動態解析及び他のインビトロ又はインビボアッセイのためヒトIgG1に再編成された。図1と2を参照。実施例2:ビアコアによる抗PCSK9抗体の特性評価抗PCSK9抗体の結合親和性は、ビアコア-3000装置を使用して表面プラズモン共鳴SRPで測定した。抗PCSK9ヒト抗体は、CM5バイオセンサーチップ上にコーティングされたマウス抗ヒトFc抗体カタログBR-1008-39,GEHealthcare,Piscataway,NJによって捕捉され、約200応答単位RUを達成した。動態測定のため、ヒト、マウス、アカゲザル及びカニクイザルPCSK9の2倍連続希釈500nMから0.245nMを、25°Cで30μl/分の流量でPBT緩衝液0.05のTween20を含むPBS中に注入した。会合速度kon及び解離速度koffは単純な一対一のラングミュア結合モデルを用いて計算したBIAcore評価用ソフトウェアのバージョン3.2。平衡解離定数KDはkoff/konの比として算出した。図3を参照。実施例3:LDLR-PCSK9結合アッセイ競合結合ELISAを、LDLRに対するヒトPCSK9結合の遮断における抗PCSK9抗体の活性を調べるために行った。簡潔には、可溶性ヒトLDLR細胞外ドメインRDSystems,Minneapolis,MNを1μg/mL、4°Cで一晩384ウェルマキシソーププレートNALGENE登録商標NUNCTMInternational,Rochester,NY上に塗布した。その後、抗PCSK9抗体とコントロール抗体を異なる濃度で事前に混合したビオチン化ヒトPCSK9の0.25μg/mLがプレートに加えられ、室温で2時間インキュベートした。コーティングされたLDLRへのPCSK9の結合が、ストレプトアビジン-HRPGEHealthcare及び基質の3,3’、5,5’-テトラメチルベンジジンTMBE-1000,Moss,Inc.,Pasadena,MDを添加することによって検出された。結合結果ODを、抗体濃度に対してプロットし、IC50値はKaleidaGraphソフトウェアを使用して生成された。図4を参照。実施例4:抗体は、HepG2細胞でLDLRダウンレギュレーションを防ぐHepG2細胞を、48ウェルプレートに1×105で播種した。翌日、培地を、10のリポタンパク質欠乏血清LPDS,Frederick,Marylandに変更した。翌日、15μg/mlのPCSK9プラス/マイナス抗PCSK9抗体を37°Cで4時間細胞に添加した。細胞をPBSで洗浄し、2.5mMのEDTAを用いて剥離した。細胞を、15分間、1:20の抗LDLRProgenBiotechnik,Heidelberg,Germanyとインキュベートし、PBSで洗浄し、そして15分間インビトロジェンからの1:200ヤギ抗マウスAlexaFluor488Carlsbad,CAでインキュベートした。細胞を洗浄し、PBS10μg/mlのヨウ化プロピジウムに再懸濁した。次いで、サンプルをデュアルレーザーフローサイトメーターで分析したFACScan,BectonDickinson,FranklinLakes,NJ.。そのデータは、抗PCSK9抗体の全てが、本明細書に記載されるLDLRのダウンレギュレーションを防ぐことを示唆している。図5を参照。実施例5:マウス肝臓におけるLDLRのダウンレギュレーション正常なC57/BL6マウスCharlesRiver,Wilmington,MAがI.V.注射による3、30、又は60μgのPCSK9により処置された。製造業者の指示に従ってカルビオケムGibbstown,NJからのプロテオエクストラクトネイティブ膜タンパク質抽出キットProteoExtractNativeMembraneProteinExtractionKitを使用し、各マウスからの肝臓を、PCSK9のIV投与後、15分、1時間又は4時間で回収し、タンパク質が抽出された。コントロールとして、5匹のマウスがビヒクルだけで処置され、各肝臓の溶解物の8μgを分析のためにプールした。溶解物を8トリス-グリシンゲル上でSDS-PAGEInvitrogen,Carlsbad,CAによって分析した。タンパク質はiBlotInvitrogenを用いてニトロセルロース膜に移した。膜を1時間、5脱脂乳でブロッキングした後、4°Cで一晩、5脱脂乳中で1:500抗LDLRAbcam,Cambridge,MAと共にインキュベートした。翌日、膜を、TBS-Tで3回洗浄し、1時間1:5000抗ウサギHRPGEHealthcare,Piscataway,NJと共にインキュベートし、TBS-Tで3回洗浄した。タンパク質はECL-プラスGEHealthcareを使用して可視化し、XARフィルムKodak,Rochester,NYに暴露した。一晩の曝露後、膜を、TBS-Tで洗浄し、1時間、1:500抗トランスフェリン受容体抗体Invitrogenと共にインキュベートし、TBS-Tで洗浄し、1時間1:5000抗マウスHRPGEHealthcareと共にインキュベートし、TBS-Tで洗浄し、ECL-Plusで可視化した。抗LDLR抗体を用いたウェスタンブロットは、マウス肝臓において1時間の30μgのPCSK9がLDLRレベルを有意にダウンレギュレートしたことを示している。図6を参照。実施例6:抗体は、肝LDLRダウンレギュレーションを防ぐ正常なC17/BL6CharlesRiverマウスに、30μgのPCSK9による処置の24時間前に1時間、ビヒクル又は5mg/kgの抗PCSK9抗体を投与した。各マウスからの肝臓を製造業者の指示に従ってプロテオエクストラクトネイティブ膜タンパク質抽出キットCalbiochemを用いて回収した。溶解物を8ビス-トリスゲル上でSDS-PAGEによって分析した。タンパク質はiBlotInvitrogenを用いてニトロセルロース膜に移した。膜を1時間、5脱脂乳でブロッキングした後、4°Cで一晩、5脱脂乳中で1:500抗LDLRAbcamと共にインキュベートした。翌日、膜を、TBS-Tで3回洗浄し、1時間1:5000抗ウサギHRPGEHealthcareと共にインキュベートし、TBS-Tで3回洗浄した。タンパク質はECL-PlusGEHealthcareを使用して可視化し、XARフィルムKodakに曝露した。抗LDLR抗体によるウエスタンブロットは、すべての5つの抗PCSK9抗体508.20.84,508.20.33,508.20.04,508.20.28,508.20.06が、マウスの肝臓でLDLRダウンレギュレーションを防いだことを示している。図7を参照。実施例7:抗PCSK9抗体の薬物動態マウスPK試験サンプル中の抗PCSK9抗体濃度は、抗ヒトIgGのFcELISAを用いて測定した。簡潔には、ロバ抗ヒトIgGFcJacksonImmunoResearch,WestGrove,PAをアッセイプレートコーティングに使用し、ヤギ抗ヒトIgGのFcHRPコンジュゲートJacksonImmunoResearch,WestGrove,PAを検出抗体として用いた。アッセイは、0.31-20ngの/mLの測定範囲を持つマウス血清マトリクスの10まで、抗PCSK9抗体を測定することができた。図8と9を参照。カニクイザルのPK研究サンプルの血清抗PCSK9抗体濃度を、捕獲抗体として組換えヒトPCSK9Genentech,Inc.SouthSanFrancisco,CAを、そして検出抗体としてヤギ抗ヒトIgGHLHRPを用いる抗PCSK9抗体ELISAにより決定した。アッセイは、0.313-50ng/mLの測定範囲を持つカニクイザル血清マトリクスの2まで、抗PCSK9抗体を測定することができた。図10と11を参照。実施例8:抗体は、マウスにおける血清コレステロールレベルを下げる8週齢の雄性C57BL/6Jマウスはジャクソン研究所から市販で購入した。マウスは、実験開始前まで保持室で一週間箱におかれていた。全てのマウスは麻酔下で事前に採血し、INFINITYTMコレステロール試薬FisherDiagnostics,Middletown,VAを使用して、マウスからの総コレステロールを測定した。マウスは、平均的なコレステロールレベルと同じレベル持つ6つのグループに無作化された。全てマウスは、コントロール抗体または抗PCSK9抗体のいずれかを10mg/kg体重の単回投与を受けた。マウスは3日、7日、10日、及び15日に採血され血清総コレステロールレベルがINFINITYTMコレステロール試薬FisherDiagnostics,Middletown,VAを使用して測定された。全抗PCSK9抗体508.20.04,508.20.06,508.20.28,508.20.33,508.20.84が10mg/kgの単回用量を投与されると、総コレステロールレベルの減少を示した。抗PCSK9抗体の投与は、コントロール抗体を受けるマウスに比較したとき、3日めに於いて及び最大10日まで総コレステロールレベルの著しい減少を生じた。図12を参照。実施例9:スタチンの有効性の増強この実験は、抗PCSK9抗体とスタチンの併用は、抗PCSK9抗体単独またはスタチン単独の治療法に比べて総コレステロールレベルの大きな減少をもたらすことを実証している。例えば図13を参照。8週齢の雄性C57BL/6Jマウスはジャクソン研究所から購入した。マウスは、2つの異なるグループに分類された。非スタチンマウスは、コントロールの食餌を受けたが、一方スタチンのグループは抗体投与前2週間、食餌に0.2のロバスタチンを受けた。全てのマウスは事前に採血され、マウスは等しい平均コレステロールレベルに基づいて無作為化した。マウスは3日に採血され、血清総コレステロールレベルがINFINITYTMコレステロール試薬FisherDiagnostics,Middletown,VAを使用してアッセイされた。抗PCSK9抗体は著しくコレステロールを下げる効果を示した。スタチン単独の治療では、非スタチン群に比べて、総コレステロール値の適度の減少をもたらした。スタチンプラス抗PCSK9抗体の組み合わせは、抗PCSK9単独に比べて、総コレステロール値の更なる低下をもたらした。図13を参照。実施例10:抗PCSK9抗体のFab断片に結合したPCSK9のX線結晶構造タンパク質の精製と結晶化10Lの大腸菌発現からの凍結細胞ペーストの210gを、1Lの溶解緩衝液PBS/25mMのEDTA/1mMのPMSFで解凍した。細胞をTissuemizerにより破壊し30秒、得られたスラリーをマイクロフルイダイザーに2回通過させた。不溶物を遠心分離によりペレット化した。明白なライセート一度に250mLを5mL/分で、プロテインGカラムカタログ番号17-0618-05、GEHealthcareにロードした。次いで、カラムを溶解緩衝液100mLで洗浄し、150mLの溶出緩衝液0.58g酢酸で抗PCSK9抗体の結合したFab断片を溶出した。25mLの画分を溶出中に収集した。抗PCSK9抗体のFab断片を含む画分をSDSPAGE解析後にプールした。5mLのプレパックSPHPカラムGEHealthcare,カタログ17-1152-01が50mlのバッファーA20mMのMESpH5.5で平衡化された。前の工程からのプール画分を3mL/分でカラムにロードした。カラムをバッファーAでベースラインまで洗浄した。結合したFab断片は、20カラム体積中で0から100のバッファーB20mMのMESpH5.5,1MのNaClの勾配を用いてバッファーBで溶出した。2mLの画分を溶出中に収集した。SDS-PAGEを用いて決定されたタンパク質を含む画分を、プールし、5mLまで濃縮し、サイジング緩衝液20mMのHepes7.2,150mMのNaClで事前平衡化した320mLのS75ゲル濾過カラムにロードした。2mLの画分を集めながら、サイジング緩衝液は220分間1.5mL/分で連続的に流された。ピーク画分A280を、SDS-PAGEを用いて分析した。ヒスチジンHis8C末端タグを含有するヒトPCSK9相補デオキシリボ核酸cDNA配列番号32を、標準的な分子生物学技術を用いて、サイトメガロウイルスCMVプロモーターと共に哺乳動物発現ベクターpRK5に挿入した。タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞の一過性トランスフェクションによって発現され、ニッケル-ニトリロ-アガロースカラムQiagenでのアフィニティークロマトグラフィーを用いて条件培地から精製され、その後セファクリルS-200カラムGEHealthcareでゲル濾過した。精製タンパク質の正確な質量は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEによって確認し、アミノ酸配列の精度はN末端配列決定により確認した。抗PCSK9抗体の精製Fab断片および6.9mgのPCSK9タンパク質を、Fab断片の2倍モル過剰で混合し、4°Cで1時間インキュベートし、その後5mLまで濃縮した。濃縮された混合物を、次いで、サイジング緩衝液で予め平衡化したスーパーデックス200サイズ排除カラムカタログ番号17-1071-01、GEHealthcareにロードした。2mLの画分を集めながら、サイジング緩衝液は220分間1.5mL/分で連続的に流された。PCSK9および抗PCSK9抗体のFab断片の両方を含むピーク画分A280SDS-PAGEをプールし、20mg/mLまで濃縮した。濃縮された複合体を結晶化試験を設定するために用いた。初期結晶は、タンパク質と、シッティングドロップを使用してpH7で1.3Mのリン酸カリウム/ナトリウムを含むリザーバーの間での1:1混合物から形成された。結晶は、ハンギングドロップ中でタンパク質:リザーバー比を変えることにより最適化した。選択された結晶は、25グリセロールを補充した母液で処理され液体窒素に貯蔵した。PCSK9:抗PCSK9抗体Fab断片の複合体の構造決定約3.5Åの分解能まで伸びた回折データは、シンクロトロンビームラインSSRL7-1で収集され、積分され、空間群I222にスケールされた。近似位相は、PCSK9の以前に報告された構造HamptonetalPNAS104146099,pdb受託コード2QTW及び抗体のFv断片の以前に報告された構造EigenbrotetalJMolBiol22996995,pdb受託コード1FVCを用いて、分子置換法により得られた。抗PCSK9抗体のFab断片の定常領域は、部分的な精密化が位相を改善した後、以前に報告された相同構造の一部を用いてEigenbrotetalsupra,pdb受託コード1FVD剛体として配置した。最終の精密化構造は結晶学的R値が25及び30である。データ収集と精密化の統計値を以下の表1に示す。X線構造からのPCSK9上のエピトープの決定4Åの基準を分子解析プログラムPyMOLを用いて適用した。抗PCSK9抗体のFab断片の任意の部分の4A以内PCSK9残基をエピトープとして決定した。解析に基づき、エピトープは、次の残基の一つ以上を含む:ヒトPCSK9のR194,E195,D238,A239,A341,Q342,E366,D367,I369,S376,T377,C378,F379,S381及びH391。前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。"