"少なくとも、下記1~3の要件を具備することを特徴とする誘導肝幹細胞;1胚性幹細胞のマーカー遺伝子である下記表1の遺伝子群の中から選択される少なくとも15種の遺伝子を発現し、2肝細胞としての性質を有していると共に、33日以上増殖培養又は継代培養可能である。前記誘導肝幹細胞で発現している前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して18から8倍である、請求項1に記載された誘導肝幹細胞。前記誘導肝幹細胞で発現している前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して14から4倍である、請求項2に記載された誘導肝幹細胞。前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子として、NANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子及びSALL4遺伝子が発現していることを特徴とする、請求項1~3の何れかに記載された誘導肝幹細胞。前記2肝細胞としての性質に関連する遺伝子として、下記表2の遺伝子群から選択される15種以上が発現している、請求項1~4の何れかに記載された誘導肝幹細胞。前記2肝細胞としての性質に関連する遺伝子として、AFP遺伝子、TTR遺伝子、TF遺伝子、APOA2遺伝子、APOA4遺伝子、AHSG遺伝子、FGA遺伝子、AGT遺伝子、FABP1遺伝子、SERPINA1遺伝子及びRBP4遺伝子が発現している、請求項1~5の何れかに記載された誘導肝幹細胞。更に、中内胚葉系幹細胞及び又は内胚葉系幹細胞に特徴的なSOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子、TCF2遺伝子から選択される少なくとも1種の遺伝子を発現している、請求項1~6の何れかに記載された誘導肝幹細胞。更に、被検物質により、下記表3の遺伝子群の中から選択される少なくとも1種の遺伝子について、その発現が抑制又は誘導され、若しくは、該遺伝子の遺伝子産物の活性が促進又は阻害される、請求項1~7の何れかに記載された誘導肝幹細胞。1カ月以上増殖培養又は継代培養可能である、請求項1~8の何れかに記載された誘導肝幹細胞。哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程を含む誘導肝幹細胞の製造方法であって、該行程が、前記哺乳動物の細胞を、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように、誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が存在する状態におく行程であることを特徴とする、請求項1に記載された誘導肝幹細胞の製造方法。前記行程が、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物を使用すると共に、SOX2遺伝子又は該遺伝子の遺伝子産物に対するPOU5F1遺伝子又は該遺伝子の遺伝子産物の使用比率が1より大きい工程であることを特徴とする、請求項10に記載された誘導肝幹細胞の製造方法。前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の使用比率が、POU5F1遺伝子>KLF4遺伝子>SOX2遺伝子の関係を満たす、請求項11に記載された誘導肝幹細胞の製造方法。前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の使用比率が421である、請求項12に記載された誘導肝幹細胞の製造方法。前記哺乳動物の細胞が、成体由来の細胞、新生仔由来の細胞、新生仔皮膚由来の細胞、発がん個体の細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、又は、胚性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞から分化した細胞である、請求項10~13の何れかに記載された誘導肝幹細胞の製造方法。前記哺乳動物がヒトである、請求項10~14の何れかに記載された誘導肝幹細胞の製造方法。請求項1に記載された誘導肝幹細胞を用いる試験方法であって、該試験方法が安全性試験方法、毒性試験方法、代謝試験方法、薬物相互作用試験方法、抗ウイルス活性試験方法、医薬品のスクリーニング試験方法の中から選択された試験方法であることを特徴とする試験方法。前記医薬品のスクリーニング試験方法が、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、又は、抗体医薬のスクリーニング試験方法である、請求項16に記載された試験方法。請求項1に記載された誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする創薬標的スクリーニング方法。請求項1に記載された誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする動物モデル作製方法。請求項1に記載された誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする肝細胞産生タンパク質の生産方法。請求項1に記載された誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする、哺乳動物を対象とする治療方法。従って本発明の第1の目的は、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現するにもかかわらず、肝細胞に特徴的な遺伝子を発現する誘導肝幹細胞を提供することにある。本発明の第2の目的は、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現するにもかかわらず、肝細胞に特徴的な遺伝子を発現する誘導肝幹細胞を作製する方法を提供することにある。本発明の第3の目的は、本発明の誘導肝幹細胞を用いた、安全性試験方法、毒性試験方法、代謝試験方法、薬物相互作用試験方法、抗ウイルス活性試験方法、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、抗体医薬などの医薬品のスクリーニング試験方法、創薬標的スクリーニング方法、動物モデル作製方法、肝細胞産生タンパク質の生産方法、及び再生医療等の方法を提供することにある。即ち本発明の第1の発明は、少なくとも、下記1~3の要件を具備することを特徴とする誘導肝幹細胞である請求項1。1胚性幹細胞のマーカー遺伝子である下記表1の遺伝子群の中から選択される少なくとも15種の遺伝子を発現している。2肝細胞としての性質を有する。33日以上増殖培養又は継代培養可能である。本発明の誘導肝幹細胞で発現している前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して18~8倍であることが、誘導肝幹細胞の性質維持又は長期培養継続の観点から好ましく請求項2、特に、14~4倍であることが好ましい請求項3。本発明の誘導肝幹細胞は、前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子として、NANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子及びSALL4遺伝子が発現していることが好ましい請求項4。前記2肝細胞としての性質に関連する遺伝子として、下記表2の遺伝子群から選択される15種以上が発現していることが好ましい請求項5。また前記2肝細胞としての性質に関連する遺伝子として、AFP遺伝子、TTR遺伝子、TF遺伝子、APOA2遺伝子、APOA4遺伝子、AHSG遺伝子、FGA遺伝子、AGT遺伝子、FABP1遺伝子、SERPINA1遺伝子及びRBP4遺伝子が発現していることが好ましい請求項6。本発明の誘導肝幹細胞は、更に、中内胚葉系幹細胞及び又は内胚葉系幹細胞に特徴的なSOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子、TCF2遺伝子から選択される少なくとも1種を発現していることが好ましく請求項7、被検物質により、下記表3の遺伝子群の中から選択された少なくとも1種の遺伝子について、その発現が抑制又は誘導され、若しくは、該遺伝子の遺伝子産物の活性が促進又は阻害されることが好ましい請求項8。更に本発明の誘導肝幹細胞は、1カ月以上増殖培養又は継代培養可能であることが好ましい請求項9。本発明の第2の発明は、哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程を含む誘導肝幹細胞の製造方法であって、該行程が、前記哺乳動物の細胞を、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように、誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が存在する状態におく行程であることを特徴とする、誘導肝幹細胞の製造方法である請求項10。該行程は、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物を使用すると共に、SOX2遺伝子又は該遺伝子の遺伝子産物に対するPOU5F1遺伝子又は該遺伝子の遺伝子産物の使用比率が1より大きい行程であることが好ましい請求項11。前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要な前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の使用比率が、POU5F1遺伝子>KLF4遺伝子>SOX2遺伝子の関係を満たすことが好ましく請求項12、特に、4:2:1であることが好ましい請求項13。前記哺乳動物の細胞として、成体由来の細胞、新生仔由来の細胞、新生仔皮膚由来の細胞、発がん個体の細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、又は、胚性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞から分化した細胞を用いることが好ましく請求項14、前記哺乳動物がヒトであることが好ましい請求項15。更に本発明の第3の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いる試験方法であり請求項16、この試験方法としては、安全性試験方法、毒性試験方法、代謝試験方法、薬物相互作用試験方法、抗ウイルス活性試験方法、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、抗体医薬などについての医薬品のスクリーニング試験方法請求項17がある。本発明の第4の発明は創薬標的スクリーニング方法請求項18、第5の発明は動物モデル作製方法請求項19、第6の発明は肝細胞産生タンパク質の生産方法請求項20、第7の発明は哺乳動物を対象とする治療方法である請求項21。本発明によれば、人種、性、年齢、遺伝的背景が異なるドナーからヒト誘導肝幹細胞を作製することが可能であるため、本発明は、新薬の臨床試験に先立つ安全性試験、毒性試験、代謝試験、薬物相互作用試験などの非臨床試験に有効である。また、ヒト誘導肝幹細胞を用いた非臨床試験は、新薬開発の効率化に寄与する創薬ツールとなる。以下、本発明の誘導肝幹細胞、その製造方法、及び、該細胞の応用について詳細に説明する。本発明の誘導肝幹細胞は、少なくとも、下記1~3の要件を具備することを特徴とする誘導肝幹細胞である。1胚性幹細胞のマーカー遺伝子である前記表1の遺伝子群の中から選択された少なくとも15種の遺伝子を発現している。2肝細胞としての性質を有する。33日以上増殖培養又は継代培養可能である。次に、本発明の誘導肝幹細胞において、胚性幹細胞のマーカー遺伝子として知られている前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現は、本発明の誘導肝幹細胞が、理論的には無限に自己複製し、事実上誘導肝幹細胞のまま長期継代培養可能な性質を有する細胞であることを特定するものである。本発明の誘導肝幹細胞においては、前記表1の遺伝子群の中から選択される少なくとも15種の遺伝子が発現していることが必要である。本発明の誘導肝幹細胞においては、前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子が発現していればよく、特に制限されることはないが、本発明の誘導肝幹細胞が発現している前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して116~16倍であることが好ましく、18~8倍であることがより好ましい。特に、本発明の誘導肝幹細胞が発現している前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較してほぼ同等、すなわち、14~4倍以内であることが、誘導肝幹細胞の状態を維持するため又は長期継代培養の観点から好ましく、12~2倍以内であることが最も好ましい。本発明の誘導肝幹細胞においては、未分化であることを維持する観点から、前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子として、前記表1の遺伝子群の中から選択される少なくとも15種の遺伝子が、本発明の誘導肝幹細胞で発現している遺伝子の発現量と、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量とを比較して12~2倍の範囲で発現していることが好ましく、この範囲内で発現している前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子の数が、20、25以上と増えるほど好ましい。本発明の誘導肝幹細胞においては、前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子として、前記表1の遺伝子群のうち、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して、5種以上の遺伝子の発現量が12~2倍、10種以上の遺伝子の発現量が14~4倍、20種以上の遺伝子の発現量が18~8倍の範囲で発現していることが好ましい。本発明の誘導肝幹細胞においては、前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子として、前記表1の遺伝子群のうち、NANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子を含む5種の遺伝子が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して14~4倍の範囲で発現していることが好ましく、NANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子及びSALL4遺伝子の5遺伝子が、14~4倍の範囲で発現していることがより好ましく、特に、NANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、TDGF1遺伝子、DNMT3B遺伝子、ZFP42遺伝子、TERT遺伝子、GDF3遺伝子、SALL4遺伝子、GABRB3遺伝子の10種類の遺伝子が、14~4倍の範囲で発現しているものが更に好ましい。前記した比較対象となる胚性幹細胞としては、hESH9GSM194390、hESBG03GSM194391、hESES01GSM194392の何れかが用いられる。これらの遺伝子発現データは、データベースであるGeneExpressionOmnibusGEOGeneExpressionOmnibusGEO、online、2010年1月28日検索、インターネット<httpwwwncbinlmnihgovgeo>から取得することが可能である。本発明の誘導肝幹細胞は、前記2肝細胞としての性質を有することが必要である。本発明の誘導肝幹細胞における肝細胞としての性質としては、肝細胞に特徴的な性質であれば、特に制限されることはないが、主に、肝細胞に特徴的なタンパク質遺伝子産物の産生等が挙げられる。具体的には、血清タンパク質AFP、TTR、TF、APOA2、APOA4、AHSG、FGA、AGT、FABP1、SERPINA1、RBP4などの産生、糖類代謝、アミノ酸代謝、脂質代謝、及び鉄代謝関連の酵素の産生、薬物代謝酵素及びトランスポーターの産生などが挙げられるが、これらに制限されることはない。本発明の誘導肝幹細胞は、前記2肝細胞としての性質に関連する遺伝子を発現していることが好ましい。このような遺伝子は、肝細胞で特徴的に発現している遺伝子であり、肝細胞としての性質に関連する遺伝子であればよく、例えば、肝細胞に特徴的なタンパク質の産生などに関連する遺伝子を例示することができる。具体的には、血清タンパク質の産生、糖類代謝、アミノ酸代謝、脂質代謝、及び鉄代謝関連の酵素の産生、薬物代謝酵素及びトランスポーターの産生等に関連する遺伝子を挙げることができるが、これらに制限されるものではない。特に、薬物代謝酵素及びトランスポーターの生産に関連する遺伝子としては、例えば、前記表3の遺伝子群などが挙げられる。このような薬物代謝酵素及びトランスポーターの生産に関連する遺伝子は、本発明の誘導肝幹細胞が取り込んだ、医薬品の候補化合物などの被検物質等により、遺伝子発現、誘導、抑制等を示す。本発明の誘導肝幹細胞の一態様としては、前記2肝細胞としての性質に関連する遺伝子として、肝関連遺伝子である前記表2の遺伝子群から選択された少なくとも15種の遺伝子を発現していてもよい。これらの遺伝子は、ヒト初代培養肝細胞で発現している、肝細胞に特徴的な遺伝子である。各遺伝子シンボルに対するジェンバンクアセッション番号は前記表2の通りである。各遺伝子情報については、NCBIのホームページhttpwwwncbinlmnihgovnucleotideから入手できる。前記2肝細胞としての性質に関連する遺伝子としては、肝細胞に特徴的な性質を強く有する細胞が得られるという観点から、前記表2の遺伝子群のうち50種以上の遺伝子が発現していることが好ましく、特に、80種以上が発現していることが好ましい。本発明の誘導肝幹細胞においては、前記表2の遺伝子群の中でも、AFP遺伝子を発現していることが好ましく、特に、AFP遺伝子、TTR遺伝子、TF遺伝子、APOA2遺伝子、APOA4遺伝子、AHSG遺伝子、FGA遺伝子、AGT遺伝子、FABP1遺伝子、SERPINA1遺伝子及びRBP4遺伝子が発現していることが好ましい。前記遺伝子は、一般に肝細胞で数多く発現している遺伝子であり、逆に胚性幹細胞も含めた肝細胞以外の細胞では、これらの遺伝子の多くは、実質的に発現していないことが知られている。また、本発明の誘導肝幹細胞の別の態様では、前記2肝細胞としての性質に関連する遺伝子として、以下に挙げる遺伝子を発現していてもよい。本発明の誘導肝幹細胞においては、GSTM3遺伝子、SLC22A1遺伝子、GSTA5遺伝子、ALDH1A1遺伝子、CYP27A1遺伝子、CYP1B1遺伝子、ALDH2遺伝子、GSTA2遺伝子、GSTA3遺伝子、GSTA5遺伝子、CYP4A2遺伝子、UGT2B11遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、薬物動態に関わるタンパク質を産生するような肝細胞の性質を示すので、特に、毒性試験方法に有用である。本発明の誘導肝幹細胞においては、GSTM3遺伝子、SLC22A1遺伝子、GSTA5遺伝子、ALDH1A1遺伝子、CYP27A1遺伝子、CYP1B1遺伝子、ALDH2遺伝子、GSTA2遺伝子、GSTA3遺伝子、GSTA5遺伝子、CYP4A2遺伝子、UGT2B11遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、薬物代謝関連酵素に関わるタンパク質を産生するような肝細胞の性質を示すので、特に、代謝試験方法に有用である。本発明の誘導肝幹細胞においては、CD81遺伝子、SCARB1遺伝子、OCLN遺伝子、CLDN1遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、HCVの複製に関するタンパク質を産生するような肝細胞の性質を示すので、特に、抗ウイルス活性試験方法に有用である。本発明の誘導肝幹細胞においては、APOA1遺伝子、APOA2遺伝子、APOA4遺伝子、APOB遺伝子、FABP1遺伝子、AGT遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、脂質代謝、血圧に関するタンパク質を産生するような肝細胞の性質を示すので、特に、高脂血症薬、高血圧治療薬などの医薬品スクリーニング試験に有用である。本発明の誘導肝幹細胞においては、CCL2遺伝子、CDKN1A遺伝子、ICAM1遺伝子、JUNB遺伝子、RGS2遺伝子、CCND1遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には,トランスポーター及び代謝型受容体関連タンパク質を生産するような肝細胞の性質を示すので、特に、低分子化合物、抗体などの医薬品のスクリーニング試験に有用である。本発明の誘導肝幹細胞においては、ALB遺伝子、TTR遺伝子、TF遺伝子、RBP4遺伝子、FGA遺伝子、FGB遺伝子、FGG遺伝子、AHSG遺伝子、AFP遺伝子、FN1遺伝子、SERPINA1遺伝子、PLG遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、血清タンパク質の生産のような肝細胞の性質を示すので、特に、動物モデル作製方法に有用である。本発明の誘導肝幹細胞においては、ALB遺伝子、TTR遺伝子、TF遺伝子、RBP4遺伝子、FGA遺伝子、FGB遺伝子、FGG遺伝子、AHSG遺伝子、AFP遺伝子、FN1遺伝子、SERPINA1遺伝子、PLG遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、血清タンパク質の生産のような肝細胞の性質を示すので、特に、ヒト以外の動物を対象とする治療方法に有用である。本発明の誘導肝幹細胞は、中内胚葉系幹細胞及び又は内胚葉系幹細胞に特徴的な性質を有していてもよく、更に、中内胚葉系幹細胞及び又は内胚葉系幹細胞に発現する遺伝子であるSOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子、TCF2遺伝子から選択される少なくとも1種を発現していてもよい。特に、SOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子及びTCF2遺伝子の全てを発現しているものが好ましい。また、本発明の誘導肝幹細胞は、被検物質により、薬物代謝酵素及びトランスポーターの産生に関連する遺伝子である前記表3の遺伝子群の中から選択される少なくとも1種について、その発現が抑制又は誘導され、若しくは、該遺伝子の遺伝子産物の活性が促進又は阻害されるものであってもよい。ここで被検物質とは、医薬品の候補物質のことであり、本発明の誘導肝幹細胞がこのような被検物質を取り込むと、本発明の誘導肝幹細胞の薬物代謝酵素及びトランスポーターの産生に関連する遺伝子の発現が抑制又は誘導され、これら遺伝子の遺伝子産物の活性が促進又は阻害される。このような細胞は、薬物代謝試験などの創薬応用に有用である。トランスポーター遺伝子、核レセプター遺伝子を含む薬物代謝遺伝子の発現については、個人差があることが知られており、本発明の誘導肝幹細胞は、多種多様の細胞から誘導できるため、このような個人差を網羅した多数の誘導幹細胞を得ることが可能である。従って、被検物質により、本発明の誘導肝幹細胞において前記表3に記載された遺伝子の発現が抑制誘導及び遺伝子産物の活性が誘導阻害されるものであれば、創薬開発ツールとして有用である。従って、本発明の誘導肝幹細胞は、薬物動態試験、安全性試験、毒性試験、代謝試験、薬物相互作用試験等に有用な細胞である。本発明の誘導肝幹細胞は、多様な肝細胞の性質を示すので、各種医薬品化合物の代謝、作用機構の解析、肝臓の形成と機能を制御する分子の探索及び解析等に非常に有用である。従って、安全性試験、毒性試験、代謝試験、薬物相互作用試験、抗ウイルス活性試験特にB型C型肝炎、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、抗体医薬等の医薬品のスクリーニング試験、創薬標的のスクリーニング肝繊維化、肝硬変、脂肪肝炎、メタボリックシンドローム、造血など、肝細胞産生タンパク質の生産、動物モデル作製、再生医療等に用いることができる。また、本発明の誘導肝幹細胞は3日以上増殖培養又は継代培養が可能であるが、1カ月以上、半年或いは1年以上という長期に渡って増殖可能な誘導肝幹細胞であり、この事は理論的には無限に自己複製が可能であることを意味する。本発明の誘導肝幹細胞を増殖培養又は継代培養する培地としては、胚性幹細胞、多能性幹細胞等を増殖培養又は継代培養することが可能な培地であれば、特に制限されることはないが、胚性幹細胞、多能性幹細胞等の培養に適した培地が好ましく用いられる。このような培地としては、例えば、ES培地40ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、40のF12培地シグマ社製、2mMLグルタミン又はGlutaMAXシグマ社製、1のnonessentialaminoacidシグマ社製、01mMのβメルカプトエタノールシグマ社製、15~20のKnockoutSerumReplacement、10μgmlのゲンタマイシンインビトロジェン社製、4~10ngmlのFGF2因子以下ES培地という、01mMのβメルカプトエタノールを除いたES培地で、マウス胚性繊維芽細胞以下MEFを24時間培養した上清である馴化培地に、01mMのβメルカプトエタノール及び10ngmlのFGF2を加えた培地以下MEF馴化ES培地、iPS細胞用最適培地iPSellon社製、フィーダー細胞用最適培地iPSellon社製、StemPro登録商標hESCSFMインビトロジェン社製、mTeSR1ステムセルテクノロジーベリタス社製、アニマルプロテインフリーのヒトESiPS細胞維持用無血清培地TeSR2ST05860ステムセルテクノロジーベリタス社製、霊長類ESiPS細胞用培地リプロセル社、ReproStemリプロセル社、ReproFFリプロセル社などを例示することができるが、これらの培地に制限されることはない。ヒトの細胞を用いる場合には、ヒト胚性幹細胞の培養に適した培地を用いてもよい。本発明の誘導肝幹細胞を増殖培養又は継代培養する手法については、胚性幹細胞、多能性幹細胞等の培養において当業者が通常用いる方法であれば、特に制限されることはない。例えば、細胞から培地を除きPBSで洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、細胞剥離液を除き、1X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を加えて遠心分離し、更に、上清を除去した後、1X抗生物質抗真菌剤、mTeSR及びY27632を加え、MEFが播種してあるゼラチンコート又はコラーゲンコートに細胞懸濁液を播種することによって、継代培養する方法などを具体的に例示することができる。更に、本発明の誘導肝幹細胞においては、遺伝子導入から1カ月以上長期培養した場合でも、分化しないように、TGFbetaなどの活性を阻害又は中和する各種の阻害剤又は抗体、HGF、FGF1~21等の線維芽細胞増殖因子、アクチビンなどを培地に添加してもよく、線維芽細胞増殖因子としては、特に酸性線維芽細胞増殖因子であるFGF1aFGFともいう。以下FGF1と記載する。、塩基性線維芽細胞増殖因子であるFGF2bFGFともいう。以下FGF2と記載する。、FGF4、FGF7が好ましく用いられる。このような抗体としては、例えば、これら増殖因子に対するポリクローナル又はモノクローナル中和抗体などを例示することができる。また、microRNA、siRNAやアンチセンスRNAを用いて、TGFbetaなどの遺伝子の発現を抑制してもよい。TGFbetaなどに対する低分子化合物の阻害剤を用いることも可能である。例えば、TGFbetaシグナリングの阻害剤としてはALK阻害剤A8301など、TGFbetaRI阻害剤、TGFbetaRIキナーゼ阻害剤などが挙げられる。なお、上記した線維芽細胞増殖因子は、誘導される体細胞の種類に応じて選択され、ヒト、マウス、牛、馬、豚、ゼブラフィッシュ等を由来とする線維芽細胞増殖因子を用いることができる。更に、Rhoassociatiedkinaseの阻害剤であるY27632、Fasudilなどを培地中に添加することもできる。その他にも、FGFreceptortyrosinekinase、MEKmitogenactivatedproteinkinaseERKextracellularsignalregulatedkinases1and2経路、及びGSK3の三つの低分子阻害剤SU5402、PD184352及びCHIR99021、MEKERK経路及びGSK3の二つの低分子阻害剤PD0325901及びCHIR99021、ヒストンメチル化酵素G9aの阻害剤である低分子化合物BIX01294BIX、アザシチジン、トリコスタチンATSA、7hydroxyflavone、lysergicacidethylamide、kenpaullone、TGFβreceptorIkinaseactivinlikekinase5ALK5の阻害剤EMD616452、TGFβreceptor1TGFBR1kinaseの阻害剤E616452及びE616451、Srcfamilykinaseの阻害剤EI275、thiazovivin、PD0325901、CHIR99021、SU5402、PD184352、SB431542、抗TGFβ中和抗体、A8301、Nr5a2、p53阻害化合物、p53に対するsiRNA、p53経路の阻害剤等を培地に添加することもできる。また、本発明の誘導肝幹細胞は、公知の方法により凍結及び解凍することが可能である。凍結方法としては、例えば、細胞から培地を除きPBSで洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、細胞剥離液を除き、1X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を加えて遠心分離し、次いで、上清を除去した後、凍結用保存液を加えてセラムチューブに分注し、80°Cで一晩凍結させた後、液体窒素にて保管する方法等を例示することができる。また、解凍方法としては、37°Cの恒温槽中で解凍し、1X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地に懸濁させて用いる方法等が例示できる。第2の発明である、哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程を含む誘導肝幹細胞の製造方法において、対象となる哺乳動物としては、哺乳動物であれば特に制限されることはなく、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ミニブタなどのブタ、ウシ、ウマ、カニクイザルなどのサル等の霊長類、ヒト等を挙げることができるが、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ミニブタ、ウマ、カニクイザル、ヒトが好ましく、特にヒトが好ましく用いられる。また、前記哺乳動物の細胞としては、哺乳動物の細胞であれば何れも使用可能である。例えば、脳、肝臓、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、結腸、膵臓、腎臓、肺などの各臓器や、骨髄液、筋肉、脂肪組織、末梢血、皮膚、骨格筋の細胞などを例示することができるが、これらに制限されることはない。中でも、内胚葉性の肝臓、胃、十二指腸、小腸、大腸、結腸、膵臓、肺等由来の細胞が好ましく、特に、胃、結腸由来の細胞が好ましく用いられる。これらの細胞は、がん治療の手術時に、医療廃棄物として容易に入手することが可能である点からも好ましい。また、臍帯組織臍帯、臍帯血、羊膜、胎盤、羊水由来細胞などの出産時に付随する組織、体液由来の細胞も用いることが可能であり、特に新生仔の各組織のような、出生直後の組織新生仔の皮膚等由来の細胞を用いてもよい。また、動物の胎仔の細胞なども利用可能である。また、前記哺乳動物の細胞として、成体由来の細胞、新生仔由来の細胞、新生仔皮膚由来の細胞、発がん個体の細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞から分化した細胞などを用いることができる。発がん個体のがんの種類は特に制限されることはなく、悪性腫瘍、固形がん、癌種、肉腫、脳腫瘍、造血器がん、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫等の、何れのがんも使用することができる。例えば、口腔がん、咽頭がん、上気道がん、肺がん、肺細胞がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、膵がん、肝がん、胆のうがん、胆道がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、乳がん、甲状腺がん、子宮体がん、子宮けいがん、卵巣がん、精巣がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん、皮膚がん、悪性黒色腫、脳腫瘍、骨肉腫、血液のがん等が挙げられるが、これらに制限されることはない。中でも、内胚葉系である、胃がん、乳がん、結腸がん、大腸がん個体の非がん組織又はがん組織由来の細胞が好ましく用いられる。本発明の製造方法において、前記哺乳動物の細胞として哺乳動物から採取された細胞を用いることもできる。哺乳動物から採取した細胞は、直ちに使用しても、公知の方法で保存、培養等した後使用することも可能である。培養する場合には、継代数は特に制限されるものではないが、初代培養から第4継代培養までの細胞が好ましく、初代培養から第2継代培養までの細胞を用いることが特に好ましい。ここで、初代培養とは、哺乳動物から細胞が採取された直後の培養を意味し、初代培養を1回継代培養すると第2継代培養、更に1回継代培養すると第3継代培養となる。本発明の製造方法における誘導肝幹細胞に誘導する行程は、前記哺乳動物の細胞を、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように、誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が存在する状態におく行程であることをが必要である。なお、ここで状態におくとは、そのような状態になるように調節する場合のみならず、そのような状態になっている細胞を選択して調製する場合をも含む概念である。また本発明の製造方法においては、哺乳動物の細胞から本発明の誘導肝幹細胞への誘導時に、これらの遺伝子の遺伝子産物が特定の比率で細胞内に存在することが必要である。これにより、哺乳動物の細胞に内在される前記1胚性幹細胞のマーカー遺伝子が発現し、最終的に、本発明の誘導肝幹細胞が誘導される。本発明の製造方法においては、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子に係る遺伝子産物の細胞内存在比率が、POU5F1遺伝子>KLF4遺伝子>SOX2遺伝子の関係を満たすことが好ましく、更にPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が、順次、421となるように調節することが、誘導肝幹細胞への高効率誘導の観点から最も好ましい。本発明の製造方法においては、前記哺乳動物の細胞を、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように、誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が存在する状態におくことができればよく、その方法としては、例えば誘導多能性幹細胞の誘導技術として公知の方法などがあるが、これに制限されることはない。例えば、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の発現強度を上昇させることができる遺伝子を、前記哺乳動物の細胞に導入してこれらの遺伝子を強発現させ、細胞に遺伝子産物を生産させたり、このような遺伝子の発現強度を上昇させることができる遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質やmRNAなどを前記哺乳動物の細胞中に導入するなどの方法を例示することができる。必要に応じて、前記哺乳動物の細胞内へ導入するベクターの量、導入する遺伝子の量、培地に添加する遺伝子産物の量などを調節することによって、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように調節することが可能である。本発明の製造方法において、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の発現強度を上昇させることができる遺伝子としては、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子そのものを用いることができる。前記哺乳動物の細胞中における前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子又はSOX2遺伝子の発現が不十分である場合には、該細胞中に不足した遺伝子又は遺伝子産物を導入し、前記細胞中の前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子又はSOX2遺伝子が発現している場合には、それ以外の遺伝子又はその遺伝子産物を、前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の代わりに導入しても良い。上記それ以外の遺伝子としては、誘導多能性幹細胞を誘導することが知られている遺伝子、例えば、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子、TBX3遺伝子、PRDM14遺伝子、LMYC遺伝子、cMYC遺伝子、NMYC遺伝子、SALL1遺伝子、SALL4遺伝子、UTF1遺伝子、ESRRB遺伝子、NR5A2遺伝子、REM2GTPase遺伝子、TCL1A遺伝子、Yesassociatedprotein遺伝子、Eカドヘリン遺伝子、p53ドミナントネガティブ変異体遺伝子、p53shRNA遺伝子等を用いることができる。前記誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の発現強度を上昇させることができる遺伝子は、単独、又は二種以上を組み合わせて使用することができる。また、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子と、これらの遺伝子の代わりに用いられる遺伝子を組み合わせて使用することは、本発明の好ましい実施態様である。例えば、既に、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、cMYC遺伝子又はSOX2遺伝子を強く発現している細胞であれば、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、cMYC遺伝子又はSOX2遺伝子を使用することなく、p53ドミナントネガティブ変異体遺伝子、p53shRNA遺伝子等を組み合わせて使用することにより、本発明の誘導肝幹細胞を誘導することも可能である。前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子及びこれらの遺伝子の代わりに使用される遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質やmRNAなどを、前記哺乳動物の細胞中に導入する方法としては、誘導多能性幹細胞の誘導技術として公知の方法などをあげることができるが、これに制限されることはない。例えば、これらの遺伝子の遺伝子産物である、タンパク質やmRNA等を培地に添加しても良い。本発明の製造方法においては、更に、誘導肝幹細胞への誘導効率を上げるために、誘導多能性幹細胞を誘導することが知られている化合物、例えば、FGFreceptortyrosinekinase、MEKmitogenactivatedproteinkinaseERKextracellularsignalregulatedkinases1and2経路、GSK3の三つの低分子阻害剤SU5402、PD184352及びCHIR99021、MEKERK経路及びGSK3の二つの低分子阻害剤PD0325901及びCHIR99021、ヒストンメチル化酵素G9aの阻害剤である低分子化合物BIX01294BIX、アザシチジン、トリコスタチンATSA、7hydroxyflavone、lysergicacidethylamide、kenpaullone、TGFβreceptorIkinaseactivinlikekinase5ALK5の阻害剤EMD616452、TGFβreceptor1TGFBR1kinaseの阻害剤E616452及びE616451、Srcfamilykinaseの阻害剤EI275、thiazovivin、PD0325901、CHIR99021、SU5402、PD184352、SB431542、抗TGFβ中和抗体、A8301、Nr5a2、p53阻害化合物、p53に対するsiRNA、p53経路の阻害剤等を、本発明の誘導肝幹細胞を誘導する際に用いられる培地中に添加することができる。また、誘導肝幹細胞への誘導効率を上げるため、更に、microRNAを用いることも可能である。具体的には、microRNAを前記哺乳動物の細胞に発現ベクターを用いて導入したり、microRNAを培地に添加したりするなど、当業者が通常行う方法を用いることができる。誘導肝幹細胞への誘導効率を上げるために用いることができるmicroRNAとしては、miR154、miR200、miR368、miR371、miR2913p、miR294、miR295、miR302などを用いることができる。ヒトの細胞を用いる場合には、ヒトのmicroRNAを用いてもよい。具体的にはhsamiR372MI0000780、hsamiR373MI0000781、hsamiR302bMI0000772、hsamiR302cMI0000773、hsamiR302aMI0000738、hsamiR302dMI0000774、hsamiR367MI0000775、hsamiR520MI0003158等が挙げられるが、これらのmicroRNAに制限されることはない。これらのmicroRNAの中から1種、又は、2種以上を組み合わせて用いることができる。これらのmicroRNAの情報については、miRBaseのホームページhttpwwwmirbaseorgから入手することが可能である。かっこ内は、miRBaseのアクセション番号であり、hsaはヒトを表す。前記哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程においては、本発明の誘導肝幹細胞を培養する培地に添加される、TGFbetaなどの活性を阻害又は中和する各々の阻害剤又は抗体、FGF1~21等の線維芽細胞増殖因子などを使用することもできる。線維芽細胞増殖因子としては、特にFGF1、FGF2、FGF4、FGF7が好ましく用いられる。TGFbetaの阻害剤としては、例えば、TGFbetaシグナリングの阻害剤としてはALK阻害剤A8301など、TGFbetaRI阻害剤、TGFbetaRIキナーゼ阻害剤などが挙げられる。これらの成分は、前記哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程において用いられる培地中に添加することが好ましい。前記した誘導肝幹細胞に誘導する行程として、好ましい例としては、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物を使用すると共に、SOX2遺伝子又は該遺伝子の遺伝子産物に対するPOU5F1遺伝子又は該遺伝子の遺伝子産物の使用比率が1より大きいことが好ましい。誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物の使用比率が、POU5F1遺伝子>KLF4遺伝子>SOX2遺伝子の関係を満たすことが好ましく、更にPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物の使用比率が、順次、421であることが、誘導肝幹細胞への高効率誘導の観点から最も好ましい。POU5F1OCT34遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の各遺伝子シンボルに対するジェンバンクアセッション番号は表4の通りである。本発明の製造方法において、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子を使用する場合には、これらの遺伝子を発現ベクターなどを利用して前記哺乳動物の細胞中に導入する方法など、当業者が通常行う方法を用いることができる。誘導肝幹細胞への誘導に必要な前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子のタンパク質やmRNA等の遺伝子産物を使用する場合には、誘導の際に用いる培地に遺伝子産物を添加するなど、当業者が通常行う方法を用いることができる。上記したように前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子、これらの遺伝子産物に加え、更に、上記した本発明の誘導肝幹細胞の誘導効率を上げるために、前記したNANOG遺伝子、LIN28遺伝子、TBX3遺伝子、PRDM14遺伝子、LMYC遺伝子、cMYC遺伝子、NMYC遺伝子、SALL1遺伝子、SALL4遺伝子、UTF1遺伝子、ESRRB遺伝子、NR5A2遺伝子、REM2GTPase遺伝子、TCL1A遺伝子、Yesassociatedprotein遺伝子、Eカドヘリン遺伝子、p53ドミナントネガティブ変異体遺伝子、p53shRNA遺伝子等の遺伝子又はこれらの遺伝子産物、化合物、FGF1~21等の線維芽細胞増殖因子、ALK阻害剤A8301など、TGFbetaRI阻害剤、TGFbetaRIキナーゼ阻害剤などを使用することも可能である。前記哺乳動物の細胞から誘導肝幹細胞を製造するために、前記哺乳動物の細胞に遺伝子を導入する方法としては、公知の方法であれば特に制限されることはないが、ウイルスベクター、プラスミド、人工染色体HAC、エピソーマルベクターEBV、ミニサークルベクター、ポリシストロニック発現ベクター、CreloxPシステムを応用したベクター、ファージインテグラーゼを利用したベクター、ピギーバックなどのトランスポゾンなどのベクター等を用いることができる。前記哺乳動物の細胞に、遺伝子を導入するために使用可能なウイルスベクターとしては、公知のベクターであれば何れも使用することが可能である。例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、サル免疫不全ウイルスベクターディナベック株式会社、アデノ随伴ウイルスベクターディナベック株式会社、ゲノムに外来遺伝子が残存しないセンダイウイルスベクターディナベック株式会社、株式会社医学生物学研究所、センダイミニベクターディナベック株式会社、HVJ等が挙げられるが、これらに制限されることはない。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス由来レトロウイルスベクターなどがある。ウイルスベクタープラスミドとしては、公知のウイルスベクタープラスミドであれば何れも使用することが可能である。例えば、レトロウイルス系としてpMXs、pMXsIB、pMXspuro、pMXsneo但し、pMXsIBはpMXspuroのピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにブラストシジン耐性遺伝子を搭載したベクターであるToshioKitamuraetalRetrovirusmediatedgenetransferandexpressioncloningPowerfultoolsinfunctionalgenomicsExperimentalHematology200331100714が好ましく、他にも、MFGProcNatlAcadSciUSA9267336737、pBabePuroNucleicAcidsResearch1835873596、LLCG、CLCG、CSCG、CLGJournalofVirology7281508157等が挙げられる。また、アデノウイルス系としてはpAdex1NucleicAcidsRes2338163821等を用いることができる。前記哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程において用いられる培地としては、胚性幹細胞、多能性幹細胞等を培養可能な培地であれば特に制限されることはないが、胚性幹細胞、多能性幹細胞等の培養に適した培地を用いて培養することができる。このような培地としては、本発明の誘導肝幹細胞を培養する培地として例示した、ES培地、MEF馴化ES培地、iPS細胞用最適培地、フィーダー細胞用最適培地、StemPro登録商標hESCSFM、mTeSR1、アニマルプロテインフリーのヒトESiPS細胞維持用無血清培地TeSR2ST05860、霊長類ESiPS細胞用培地、ReproStem、ReproFF等が挙げられるが、これらに限定されることはない。ヒトの細胞を用いる場合には、ヒト胚性幹細胞の培養に適した培地を用いることが好ましい。また、由来細胞が線維芽細胞でない場合、例えば、胃又は結腸がん患者由来の細胞のような上皮系細胞を用いる場合には、遺伝子導入後にフィーダー細胞との共培養を行うことが好ましい。第3の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする試験方法である。本発明の試験方法は、安全性試験方法、毒性試験方法、代謝試験方法、薬物相互作用試験方法、抗ウイルス活性試験方法、及び、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、抗体医薬などの医薬品のスクリーニング試験方法として好適である。本発明の誘導肝幹細胞を用いる薬物相互作用試験方法としては、例えば、人種、性、年齢、遺伝的背景多型などが異なるドナーからヒト誘導肝幹細胞を作製し、医薬品の候補化合物と共に培養して、これらの細胞における各種シトクロムP450サブファミリー酵素の遺伝子の発現をDNAマイクロアレイクラボウ社製、多機能ジーンエクスプレッサーGenomeLabTMGeXPベックマンコールター社製等を用いて調べることにより、P450サブファミリー酵素と医薬品の候補化合物の相互作用を明らかにする試験方法などがある。また、シトクロムP450酵素によって代謝された後に蛍光産物を生成する基質を用いる方法によっても、P450サブファミリー酵素と医薬品の候補化合物の相互作用を調べることが可能である。シトクロムP450酵素は、広範な疎水性の化学物質を酸化的に代謝する重要な触媒であり、この酵素の薬物代謝は、薬物クリアランス、毒性、活性化に関わるため、薬物間の有害な相互作用にも影響を及ぼすことがあることが知られている。従って、低分子治療薬等の開発の際には、この酵素と薬物の相互作用を精査することが必要である。本発明の誘導肝幹細胞を用いる抗ウイルス活性試験方法としては、例えば、本発明の誘導肝幹細胞を培養している培養液に、肝炎ウイルスA、B又はCを添加して感染させ、抗ウイルス薬の医薬品の候補化合物を添加することにより、その化合物の薬効を評価する試験方法などを挙げることができる。本発明の誘導肝幹細胞を用いる高脂血症薬のスクリーニング試験方法としては、例えば、本発明の誘導肝幹細胞を培養したプレートに、高脂血症薬の候補化合物を添加して培養した後、培養上清に分泌されるリポタンパク質や脂質を分析することにより、添加した高脂血症薬の候補化合物の薬効を評価する試験方法などが挙げられる。培養液上清に分泌されるリポタンパク質及び脂質の分析としては、例えば、CMカイロミクロン、VLDL超低比重リポタンパク質、LDL低比重リポタンパク質、HDL高比重リポタンパク質等のタンパク質や、FCフリーコレステロール、PLリン脂質、TC総コレステロール等の脂質について、ゲルろ過HPLC法により分析する試験方法LipoSEARCH;スカイライトバイオテック社等が挙げられる。また、UsuiSHaraYHosakiSOkazakiMAnewonlinedualenzymaticmethodforsimultaneousquantificationofcholesterolandtriglyceridesinlipoproteinsbyHPLCJLipidRes20024380514及びMitsuyoOkazakiShinichiUsuiMasatoIshigamiNaohikoSakaiTadashiNakamuraYujiMatsuzawaShizuyaYamashitaIdentificationofUniqueLipoproteinSubclassesforVisceralObesitybyComponentAnalysisofCholesterolProfileinHighPerformanceLiquidChromatographyArteriosclerThrombVascBiolMarch2005に記載されている方法によっても測定可能である。第4の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする創薬標的スクリーニング方法である。第5の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする動物モデルの作製方法である。第6の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする肝細胞産生タンパク質の生産方法である。本発明の誘導肝幹細胞は、肝細胞としての性質を有するため、様々な肝細胞に特徴的なタンパク質を産生することができる。そこで、特定の肝細胞に特異的なタンパク質を生産する本発明の誘導肝幹細胞を培養し、肝細胞に特徴的なタンパク質を生産する方法などを例示することができる。第7の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする、哺乳動物を対象とする治療方法である。本発明の治療方法においては、哺乳動物の細胞から誘導した本発明の誘導肝幹細胞を、哺乳動物の肝臓に移植する治療方法である。例えば、イヌの細胞から誘導した本発明の誘導肝幹細胞を、イヌの肝臓に移植することができる。以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。1.パントロピックレトロウイルスベクターの調製POU5F1pMXs、KLF4pMXs、SOX2pMXsの3遺伝子のレトロウイルスベクタープラスミドを、FugeneHDロシュ社製;Catno4709691を用いて、パントロピックレトロウイルスベクター調製用パッケージング細胞であるPlatGP細胞に導入し、レトロウイルスベクター液を調製した。遺伝子POU5F1pMXs、KLF4pMXs、SOX2pMXsは順に421の比率で使用した。421の比率は、パッケージング細胞に遺伝子を導入する時でもよく、また、別々にPOU5F1pMXs、KLF4pMXs、SOX2pMXsの3遺伝子のレトロウイルスベクター液を作製して、421の比率で混合してもよい。詳細は、以下の通りである。<新生児皮膚組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製>遺伝子POU5F1pMXs、KLF4pMXs、SOX2pMXsは、addgeneのベクターを用いた。各ベクターの量は、POU5F1pMXs2μg、KLF4pMXs1μg、SOX2pMXs05μg、VenuspCS205μg、VSVGpCMV2μg、FuGENEHD18μlとした。<胃がん患者がん組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製>遺伝子POU5F1pMXs、KLF4pMXs、SOX2pMXsは、構築したベクターである。各ベクターの量は、POU5F1pMXs5μg、KLF4pMXs25μg、SOX2pMXs125μg、VenuspCS2125μg、VSVGpCMV5μg、GFPpMXs125μg、FuGENEHD45μlとした。<胃がん患者非がん組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製>遺伝子POU5F1pMXs、KLF4pMXs、SOX2pMXsは、構築したベクターである。各ベクターの量は、POU5F1pMXs5μg、KLF4pMXs25μg、SOX2pMXs125μg、VenuspCS2125μg、VSVGpCMV5μg、GFPpMXs125μg、FuGENEHD45μlとした。<成人皮膚組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製>遺伝子POU5F1pMXs、KLF4pMXs、SOX2pMXsは、構築したベクターである。各ベクターの量は、POU5F1pMXs5μg、KLF4pMXs25μg、SOX2pMXs125μg、VenuspCS2125μg、VSVGpCMV5μg、GFPpMXs125μg、FuGENEHD45μlとした。<結腸がん患者のがん組織由来の細胞へ遺伝子導入する、レトロウイルスベクター液の調製>遺伝子POU5F1pMXs、KLF4pMXs、SOX2pMXsは構築したベクターである。各ベクターの量は、POU5F1pMXs5μg、KLF4pMXs25μg、SOX2pMXs125μg、VenuspCS2125μg、VSVGpCMV5μg、GFPpMXs125μg、FuGENEHD45μlとした。レトロウイルスベクタープラスミドを導入したPlatGP細胞を、48時間以上培養した後、24時間毎に3回上清を回収し、ステリフリップHVフィルターユニット045μm径のフィルターミリポア社製;CatnoSE1M003M00でろ過を行った。以上の手順により3遺伝子POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に421のパントロピックレトロウイルスベクター液が調製された。パントロピックレトロウイルスベクターは、様々な細胞に遺伝子導入することが可能であるが、ヒト細胞にも高い効率で遺伝子導入した。2.新生児皮膚組織由来の細胞からヒト誘導肝幹細胞の作製出生直後の組織であるヒト新生児皮膚組織由来の細胞商品名:新生児正常ヒト皮膚繊維芽細胞;初代培養;Lotno7F3956から、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。凍結保存されたヒト新生児皮膚組織由来の細胞初代培養;ロンザ社製;CC2511;Lotno7F39561本を、37°Cの恒温槽中で解凍し、1X抗生物質抗真菌剤インビトロジェン社製;Catno15240062及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地に懸濁し、10mlの細胞懸濁液を得た。次いで、得られた細胞懸濁液を、1000rpm、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去した後、線維芽細胞培地キット22FBS以下登録商標FGM2BulletKitというロンザ社製;CatnoCC313212mlに懸濁して、細胞懸濁液を得た。20μgcm2の濃度のマトリゲルベクトンディクソン社製;Catno356230で、底面を30分以上コーティングされた6ウェルプラスチックシャーレヌンク社製;Catno140675上に、得られた細胞懸濁液を2mlずつ加えて細胞を播種した。3日後に培地を除き、1ウェルあたり2mlの3遺伝子POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に421レトロウイルスベクター液を添加し、37°Cで24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、FGM2BulletKitを2mlずつ加え、37°Cで一日培養した。その後2日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、3遺伝子導入から12、14、17日後にES培地で培地交換を行った。使用したMEF馴化ES培地及びES培地の組成は、下記の通りである。<MEF馴化ES培地MEFマイトマイシンC処理初代マウス胚性繊維芽細胞DSファーマバイオメディカル社製CatnoRPMEFCF馴化ES培地ノックアウトDMEMインビトロジェン社製;Catno10829018500ml20ノックアウト血清リプレースメントインビトロジェン社製;Catno1082802850μgmlゲンタマイシンインビトロジェン社製;Catno157500601XMEM非必須アミノ酸液インビトロジェン社製;Catno1114005010ngmlbFGFぺプロテック社製;Catno10018B01mM2メルカプトエタノールシグマアルドリッチ社製;CatnoM7154<ES培地>ノックアウトDMEMインビトロジェン社製;Catno10829018500ml20ノックアウト血清リプレースメントインビトロジェン社製;Catno1082802850μgmlゲンタマイシンインビトロジェン社製;Catno157500601XMEM非必須アミノ酸液インビトロジェン社製;Catno1114005010ngmlbFGFぺプロテック社製;Catno10018B103Uml組み換えヒトLIF和光純薬社製;Catno1290560101mM2メルカプトエタノールシグマアルドリッチ社製;CatnoM715405μMALK5阻害剤シグマアルドリッチ社製;CatnoA548005μMPD0325901アクソンメディケム社製;Catno14083μMCHIR99021アクソンメディケム社製;Catno1386遺伝子導入から18日後から、フィーダーフリー用ヒトESiPS細胞用培地mTeSR1ピンセットでピックアップし、フィーダー細胞上に移した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞DSファーマバイオメディカル社製;CatnoRPMEFCFであり、誘導肝幹細胞のピックアップ前日に、50×104cellcm2となるようにゼラチンコート24ウエルプレートイワキ社製;Catno11020012に播種した。下記に新生児皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代pとRNA回収用キットのバッファーへ溶解した日dayを示した。<新生児皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞>NFB13day5224well→6wellday556well→10cmday61passageday62BufferRLT処理3.胃がん患者のがん組織由来の細胞からヒト誘導肝幹細胞の作製ヒト胃がん進行がん患者のがん組織から細胞を単離した。得られた細胞に、3遺伝子POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に421レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。手術時に得られた胃がん進行がん:男性、67歳、日本人新鮮組織の一部を、ハンクス平衡塩液フェノールレッドを含まないインビトロジェン社製;Catno14175095で洗浄し、剪刀を用いて約1mm2に細断した。更に、ハンクス平衡塩液フェノールレッドを含まないで上清が透明になるまで洗浄し、上清を除去し、組織沈殿に対して5ml001コラゲナーゼ和光純薬社製;Catno034105331X抗生物質抗真菌剤インビトロジェン社製;Catno15240062を加え、振盪器を用いて、37°Cで60分間攪拌した。組織沈殿が十分消化されたことを確認後、1X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を35ml加えて、1000rpm、4°Cで5分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を40ml加えて、1000rpm、4°Cで5分間再度遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を10ml加え、コラーゲンコートディッシュ60mmに播種した。24時間後に培地を除き、5mlの3遺伝子のレトロウイルスベクター液を添加し、37°Cで1日間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞DSファーマバイオメディカル社製;CatnoRPMEFCF50×104cellcm2を、1X抗生物質抗真菌剤インビトロジェン社製;Catno15240062及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地5mlに懸濁後、胃がん患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞を培養したコラーゲンコートディッシュ60mmに播種し、共培養した。その後3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、遺伝子導入から15日後から、フィーダーフリー用ヒトESiPS細胞用培地mTeSR1、ゼラチンコート24ウエルプレート中のマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞上にピックアップした。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞DSファーマバイオメディカル社製;CatnoRPMEFCFであり、誘導肝幹細胞のピックアップ前日に50×104cellcm2となるようにゼラチンコート24ウエルプレートイワキ社製、Catno11020012に播種した。下記に胃がん患者のがん組織由来ヒト誘導肝幹細胞の継代pとRNA回収用キットのバッファーへ溶解した日dayを示した。<胃がん患者のがん組織由来ヒト誘導肝幹細胞>GC12day3724well→6wellday436well→10cmday56passageday57passageandstockday60BufferRLT処理4.胃がん患者非がん組織由来の細胞からヒト誘導肝幹細胞の作製胃がん患者非がん組織由来の細胞に、3遺伝子POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に421レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子を導入することによって、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。手術時に得られた胃がん進行がん:男性、67歳、日本人患者の非がん新鮮組織の一部を、ハンクス平衡塩液フェノールレッドを含まないインビトロジェン社製;Catno14175095で洗浄し、剪刀を用いて約1mm2に細断した。ハンクス平衡塩液フェノールレッドを含まないで上清が透明になるまで洗浄した後、上清を除去し、組織沈殿に対して5ml001コラゲナーゼ和光純薬社製;Catno034105331X抗生物質抗真菌剤インビトロジェン社製;Catno15240062を加え、振盪器を用いて37°Cで60分間攪拌した。組織沈殿が十分消化されたことを確認した後、1X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を35ml加えて、1000rpm、4°Cで5分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を40ml加えて、1000rpm、4°Cで5分間再度遠心分離した。更に、上清を除去した後、1X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を10ml加え、コラーゲンコートディッシュ60mmに播種した。約24時間後、培地を除き、5mlの3遺伝子POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に421レトロウイルスベクターを添加し、37°Cで約24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞DSファーマバイオメディカル社製;CatnoRPMEFCF50×104cellcm2を、1X抗生物質抗真菌剤インビトロジェン社製、Catno15240062及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地5mlに懸濁させた後、胃がん患者非がん組織由来の遺伝子導入された細胞が培養されたコラーゲンコートディッシュ60mmへ播種し、共培養した。それ以降、3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、3遺伝子導入から31日後、mTeSR1で毎日培地交換を行った。遺伝子導入から46日後にコロニーの1クローンをピックアップし、ゼラチンコート24ウエルプレート中のマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞上に継代培養した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞DSファーマバイオメディカル社製;CatnoRPMEFCFであり、誘導肝幹細胞のピックアップ前日に50×104cellcm2となるようにゼラチンコート24ウエルプレートイワキ社製;Catno11020012に播種した。下記に胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代pとRNA回収用キットのバッファーへ溶解した日dayを示した。<胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞>NGC12day5224well→6wellday586well→10cmday65passagestockandBufferRLT処理5.結腸がん患者のがん組織由来の細胞からヒト誘導肝幹細胞の作製ヒト結腸がんS字結腸がん患者のがん新鮮組織由来の細胞に3遺伝子POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に421レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。手術時に得られた結腸がんS状結腸がん:男性、55歳、日本人の一部をハンクス平衡塩液フェノールレッドを含まないインビトロジェン社製;Catno14175095で洗浄し、剪刀を用いて約1mm2に細断した。ハンクス平衡塩液フェノールレッドを含まないで上清が透明になるまで洗浄した。次いで、上清を除去し、組織沈殿に対して5ml001コラゲナーゼ和光純薬社製;Catno034105331X抗生物質抗真菌剤インビトロジェン社製;Catno15240062を加え、振盪器を用いて、37°Cで60分間攪拌した。組織沈殿が十分消化されたことを確認した後、1X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を35ml加えて1000rpm、4°Cで5分間遠心分離した。上清を除去した後、1X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を40ml加えて、1000rpm、4°Cで5分間再度遠心分離した。上清を除去した後、11X抗生物質抗真菌剤及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を10ml加え、コラーゲンコートディッシュ100mmに播種した。約24時間後に培地を除き、10mlの3遺伝子のレトロウイルスベクター液を添加し、その5時間後、5mlのLucIRESGFPのレトロウイルスベクター液を添加し、37°Cで約24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったMEF培地10mlに懸濁させた後、結腸がん患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞が培養されたコラーゲンコートディッシュ60mmへ播種し、共培養した。その後、3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、遺伝子導入22日後から、mTeSR1で毎日培地交換を行った。遺伝子導入から31日後に、コロニーの1クローンをピックアップし、ゼラチンコート24ウエルプレート中のマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞DSファーマバイオメディカル社製;CatnoRPMEFCFに継代培養した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞DSファーマバイオメディカル社製;CatnoRPMEFCFであり、誘導肝幹細胞のピックアップ前日に50×104cellcm2となるようにゼラチンコート24ウエルプレートイワキ社製;Catno11020012に播種した。下記に結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代pとRNA回収用キットのバッファーへ溶解した日dayを示した<結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞>CC14day406well→6wellday456well→10cmday51passageandstockday54passageandstockday59passageandstockday63BufferRLT処理p56.成人皮膚組織由来の細胞からヒト誘導肝幹細胞の作製成人皮膚組織由来の細胞商品名:成人正常ヒト皮膚繊維芽細胞;初代培養;ロンザ社製;Lotno76582からヒト誘導肝幹細胞を作製した。凍結保存された成人正常ヒト皮膚繊維芽細胞初代培養;ロンザ社製;Lotno765821本を、37°Cの恒温槽中で解凍し、1X抗生物質抗真菌剤インビトロジェン社製;Catno15240062及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地に懸濁させ、10mlの細胞懸濁液を得た。次いで、1000rpm、4°Cで5分間遠心分離し上清を除去した後、FGM2BulletKit20mlに懸濁させた。20μgcm2の濃度のマトリゲルベクトンディクソン社製で、底面を30分以上コーティングしたディッシュ100mm上に、該細胞懸濁液を10mlずつ加えて細胞を播種した。約24時間後に培地を除き、10mlの3遺伝子のレトロウイルスベクター液を添加し、37°Cで24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、MEF馴化ES培地10mlを加えた。その後3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、遺伝子導入18日後から、mTeSR1、ゼラチンコート24ウエルプレート中のマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞DSファーマバイオメディカル社製;CatnoRPMEFCFにピックアップした。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞DSファーマバイオメディカル社製;CatnoRPMEFCFであり、誘導肝幹細胞のピックアップ前日に50×104cellcm2となるようにゼラチンコート24ウエルプレートイワキ社製;Catno11020012に播種した。下記に成人皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代pとRNA回収用キットのバッファーへ溶解した日dayを示した。<成人皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞>AFB11day5024well→6wellday546well→10cmday59passageday63passageday67passageandstockandBufferRLT処理上記した実施例2~6で実施された継代培養は、以下の通りである。細胞から培地を除きPBSで洗浄した後、細胞剥離液を加えた。37°Cで5分間静置したのち、細胞剥離液を除き、1X抗生物質抗真菌剤インビトロジェン社製;Catno15240062及びFBSを10含むDMEM高グルコース培地を20ml加えて、1000rpm、4°Cで5分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1X抗生物質抗真菌剤インビトロジェン社製;Catno15240062及びmTeSR、10μMY27632を加え、MEF10×106cellsdishが播種してあるゼラチンコート100mmに細胞懸濁液を播種した。継代培養時の細胞剥離液としては、以下の2種類を用いた。1025トリプシン1mMEDTA溶液インビトロジェン社製;Catno25200056210mgmlコラゲネース10ml、100mM塩化カルシウム溶液1ml、PBS59ml、25トリプシン溶液10ml、ノックアウト血清リプレースメント20ml7.ヒト誘導多能性幹細胞とヒト誘導肝幹細胞の長期培養ヒト誘導肝幹細胞を、半年以上の長期に渡って継代培養を行った。培地は、mTeSR1ステムセルテクノロジーベリタス社製、bFGF添加霊長類ESiPS細胞用培地リプロセル社、又はbFGF添加ReproStemリプロセル社などを用いた。MEF使用時にはコラーゲン又はゼラチンコートの培養皿を用いた。MEF非使用時にはマトリゲルコートした培養皿を用いた。その結果、005~05μMA8301TGFβシグナル阻害剤、TGFβtypeIreceptorALK5kinasetypeIactivinnodalreceptorALK4andALK7阻害剤の添加は、ヒト誘導肝幹細胞の自己複製に有用であり、増殖速度、形態とも非常に良好であった。8.マイクロアレイによる肝細胞マーカー遺伝子と胚性幹細胞マーカー遺伝子の定量解析アジレント社製WholeHumanGenomeオリゴDNAマイクロアレイ4X44Kにより、ゲノムワイドな遺伝子発現mRNAのトランスクリプトームを解析した。<試料>実施例2~6のヒト誘導肝幹細胞NFB13GC12NGC12AFB11CC14のtotalRNAとゲノムDNAを、実施例2~6において、事前にBufferRLTで処理した溶液から、AllPrepDNARNAMiniKitキアゲン社製;Catno80204を用いて抽出した。試料として、ヒト誘導肝幹細胞NFB13GC12NGC12AFB11CC14のtotalRNAを使用した。<実験方法>1クオリティーチェックRNA用LabChipキットを用いて、Agilent2100BioanalyzerでtotalRNAの品質のチェックを行ったところ、全てのRNAサンプルのクオリティーは良好であった。また、NanoDropND1000で、RNA濃度及びRNAの純度の評価を行ったところ、何れのサンプルにおいてもcRNA合成に必要なtotalRNA量があることが確認され、純度も高いことが確認された。2cRNAの合成各サンプルのtotalRNAから、QuickAmpLabelingkitアジレント社製を用いて、アジレント社のプロトコールに従って、2本鎖cRNAを合成した。作製したcDNAから、invitrotranscriptionによりcRNAを合成した。この際、Cyanine色素で標識されたCTPCyanine3CTPを取り込ませ、蛍光標識を行った。3ハイブリダイゼーションGeneExpressionHybridizationKitアジレント社製を使用して、ハイブリダイゼーション標識cRNAをハイブリダイゼーションバッファーに加え、アジレント製WholeHumanGenomeオリゴDNAマイクロアレイ4X44K上で17時間ハイブリダイズし、洗浄後、アジレントマイクロアレイスキャナで、DNAマイクロアレイのイメージを読み取り、FeatureExtractionSoftwareを用いて、各スポットの蛍光シグナルを数値化した。<遺伝子の定量解析結果>発現の有無は、全体の遺伝子発現の分布各プローブの蛍光値の分布の中央値を0として評価した。0を超えた発現値を示したプローブを、遺伝子発現を検出したプローブとし、遺伝子発現を有りとして、発現プローブの数として表した。なお、解析ソフトとしては、GeneSpringGX100アジレントテクノロジー株式会社を使用し、ノーマライゼーションは、50thpercentileで行った。比較したヒト胚性幹細胞hESES01のマイクロアレイデーターは、GEOからダウンロードして使用した。1.肝細胞で特徴的に発現している遺伝子下記表6に、本発明のヒト誘導肝幹細胞において発現している、肝細胞で特徴的に発現している遺伝子を示す。肝細胞で特徴的に発現しているアジレント社製WholeHumanGenomeオリゴDNAマイクロアレイ4X44Kの発現プローブ156144遺伝子の内、ヒト誘導肝幹細胞が発現していた発現プローブ数と各々の表にプローブ名Probename、遺伝子シンボルGeneSymbol、ジェンバンクアセッションナンバーGenebankAccessionNoを記載した。下記表7に、実施例3で誘導した胃がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞GC12で発現している遺伝子の表を示した。胃がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞:GC12肝細胞で特徴的な発現プローブ数は138であった。下記表8に、実施例6で誘導した成人皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞AFB11で発現している遺伝子を示した。成人皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞:AFB11肝細胞で特徴的な発現プローブ数は133であった。下記表9に、実施例4で誘導した胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞NGC12で発現している遺伝子を示した。胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞:NGC12肝細胞で特徴的な発現プローブ数は、131であった。下記表10に、実施例2で誘導した新生児皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞NFB13で発現している遺伝子を示した。新生児皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞:NFB13肝細胞で特徴的な発現プローブ数は、96であった。下記表11に、実施例5で誘導した結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞CC14が発現している遺伝子を示した。結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞:CC14肝細胞で特徴的な発現プローブ数は、92であった。2.ヒト胚性幹細胞で特徴的に発現している遺伝子ヒト胚性幹細胞で特徴的に発現している、アジレント社製WholeHumanGenomeオリゴDNAマイクロアレイ4X44Kの発現プローブ数3123の遺伝子;表12の内、31のプローブ数が、実施例2~6のヒト誘導肝幹細胞でヒト胚性幹細胞とほぼ同程度14~4倍以内に発現していた。ヒト胚性幹細胞とその遺伝子のプローブ名Probename、遺伝子シンボルGeneSymbol、ジェンバンクアセッションナンバーGenebankAccessionNoを記載した。以上の結果より、ヒト誘導肝幹細胞は、肝細胞の性質である肝細胞のマーカー遺伝子が発現しているだけでなく、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子がヒト胚性幹細胞と同等に発現していることが実験的に検証された。マイクロアレイの結果をさらに解析すると、本発明の誘導肝幹細胞は中内胚葉系幹細胞及び内胚葉系幹細胞に特徴的な性質を有していた。詳しくは、中内胚葉系幹細胞及び内胚葉系幹細胞で特徴的に発現する遺伝子であるSOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子、TCF2遺伝子の全てを発現していた。実施例2~6のヒト誘導肝幹細胞NFB13、GC12、NGC12、AFB11、CC14の内、肝細胞に特徴的な遺伝子が比較的少なく、低発現のヒト誘導肝幹細胞NFB13、CC14は、SOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子、TCF2遺伝子が他のヒト誘導肝幹細胞GC12、NGC12、AFB11より高発現していた。上記したように、胃がん患者由来非がん組織から作製したヒト誘導肝幹細胞NGC12、及び、成人皮膚組織から作製したヒト誘導肝幹細胞は、肝細胞のマーカー遺伝子であるアルファフェトプロテインAFP、トランスサイレチンTTR、アルブミンALB及びアルファ1‐アンチトリプシンAATを発現し、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子であるPOU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、NANOG遺伝子、ZFP42遺伝子をヒト胚性幹細胞と同等に発現していることが確認された。なお、AATはSERPINA1、トランスサイレチンはプレアルブミン、ZFP42はREX1とも表記されることもある。9.免疫蛍光染色による肝細胞マーカーと胚性幹細胞マーカーの定量検出実施例4で誘導した胃がん患者由来非がん組織から作製したヒト誘導肝幹細胞NGC12と、実施例6で誘導した成人皮膚組織から作製したヒト誘導肝幹細胞を、LabTek登録商標ChamberSlide登録商標SystemNunc社製、Catno177429に播種した。翌日培地を除き、PBSで2回洗浄した後、10ホルマリン溶液を加えて、室温で15分静置した。次いで、10ホルマリン溶液を除き、PBSで3回洗浄した後、01TritonX100を加え、室温で15分静置した。次いで、01TritonX100溶液を除きPBSで3回洗浄した後、ブロッキング溶液TBS系;pH72ナカライテスク社製;Catno0515135を加えて室温で一時間静置した。50倍希釈した一次抗体を、4°C一晩あるいは室温で一時間反応させた。その後、PBSで2回洗浄した後、500倍希釈した二次抗体を室温で30分間反応させた。使用した一次抗体及び二次抗体は、下記の通りである。<一次抗体>ヤギ抗ヒトNANOG抗体RDシステム社製;LotnoKKJ03、マウス抗ヒトSSEA4抗体、マウス抗ヒトCD9抗体RDシステム社製;LotnoJOK04、ウサギ抗ヒトα1Fetoprotein抗体ダコ社製;LotnoA0008、マウス抗ヒトAlbumin抗体シグマアルドリッチ社製;LotnoA6684<二次抗体>ロバ抗ヤギIgG抗体AlexaFluor594標識インビトロジェン社製;CatnoA11058、ヤギ抗マウスIgG抗体AlexaFluor488標識、ヤギ抗マウスIgG抗体AlexaFluor594標識、ロバ抗ウサギIgG抗体AlexaFluor488標識染色した後、蛍光顕微鏡で観察した結果、胃がん患者由来非がん組織から作製したヒト誘導肝幹細胞と成人皮膚組織から作製したヒト誘導肝幹細胞は肝細胞の性質である、アルファフェトプロテインAFP、アルブミンALBタンパク質を産生し、胚性幹細胞に特徴的な糖脂質、NANOG、SSEA4、CD9が発現する細胞であった図なし。10.CD81遺伝子、SCARB1遺伝子、OCLN遺伝子及びCLDN1遺伝子の共発現アジレント社製WholeHumanGenomeオリゴDNAマイクロアレイ4X44Kを用いて、C型肝炎ウイルスHCVの複製に重要な遺伝子であるCD81遺伝子、SCARB1遺伝子、OCLN遺伝子及びCLDN1遺伝子を解析した。解析ソフトは、GeneSpringGX100を使用し、ノーマライゼーションは、50thpercentileで行った。実験手法は実施例8と同様である。<遺伝子の定量解析結果>3種類のヒト胚性幹細胞、hESH9GSM194390、hESBG03GSM194391及びhESES01GSM194392と、誘導多能性幹細胞、iPScells201B7GSM241846のマイクロアレイデーターは、GEOからダウンロードして使用した。ヒト誘導肝幹細胞は、C型肝炎ウイルスHCVの複製に重要な遺伝子であるCD81遺伝子、SCARB1遺伝子、OCLN遺伝子及びCLDN1遺伝子が共発現していることが確認され、実験的に検証された。従って、本発明の誘導肝幹細胞に肝炎ウイルスCを感染させ、複製させながら、抗ウイルス薬の候補化合物を添加することにより、その化合物の薬効を評価する試験が可能であることが示唆された。さらに、ヒト胚性幹細胞、及び、ヒト誘導多能性幹細胞についても同様の用途が示唆された。本発明の誘導肝幹細胞の誘導においては、前記哺乳動物の細胞を、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように、誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が存在する状態におくことが必要がある。本発明においては、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が、POU5F1遺伝子>KLF4遺伝子>SOX2遺伝子の関係を満たすことが好ましく、更にPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が、順次、421であることが、誘導肝幹細胞への高効率誘導の観点から最も好ましい。また、本発明においては、さらに、胚性幹細胞に特徴的に発現するNANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、SALL4遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子などは、様々な生体中の細胞を生体外で自己複製させる自己複製遺伝子として機能する。本発明の誘導肝幹細胞の誘導における、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率は、分化を決定づける重要な要因の一つと考えられ、多能性幹細胞の作製においては、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が111であり、未分化細胞であることが判明した。"