"アシル化インスリンを含み、6分子のアシル化インスリン毎に4より多い亜鉛原子をさらに含む可溶性製薬学的組成物。6分子のアシル化インスリン毎に最大約12の亜鉛原子を含む請求項1に記載の製薬学的組成物。6分子のアシル化インスリン毎に約4.3から約12の亜鉛原子を含む請求項1または2に記載の製薬学的組成物。6分子のアシル化インスリン毎に約4.5から約12の亜鉛原子を含む請求項1ないし3の何れか一項に記載の製薬学的組成物。少なくとも85のアシル化インスリンが、アシル化インスリンドデカマー複合体もしくはアシル化インスリンドデカマーより高分子量の複合体として存在する請求項1ないし4の何れか一項に記載の製薬学的組成物。組成物が界面活性剤を含む請求項1ないし5の何れか一項に記載の製薬学的組成物。インスリン分子が、B鎖のN末端アミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリン部分のB鎖中のLys残基のε-アミノ基の何れか一方とアミド結合を介して結合しており、かつ、少なくとも一つの遊離カルボン酸基もしくは中性pHで負に荷電する基と;炭素鎖中に約4から約32の炭素原子を有する脂肪酸部分と;アミド結合を介して側鎖中の個々の成分を結合させる一ないしそれ以上の有り得るリンカーと;を含んでなる側鎖を有する請求項1ないし6の何れか一項に記載の製薬学的組成物。側鎖が少なくとも一つの芳香族基を含んでなる請求項1および7に記載の製薬学的組成物。側鎖が少なくとも一つの二官能性PEG基を含んでなる請求項1および7に記載の製薬学的組成物。インスリン分子が、親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と結合している側鎖であって、一般式:-W-X-Y-Z2[上式中、Wは、そのカルボン酸基のうちの一つと共に、親のインスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になってアミド基を形成する側鎖中のカルボン酸基を有するα-アミノ酸残基;アミドカルボニル結合を介して一緒に連結されている2、3または4のα-アミノ酸残基からなる鎖であって、アミド結合-を介した鎖-は親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と連結しており、Wのアミノ酸残基は、Wが側鎖中にカルボン酸基を有するアミノ酸残基を少なくとも一つ有するように、中性側鎖を有するアミノ酸残基および側鎖中にカルボン酸基を有するアミノ酸残基の群から選択される鎖;もしくは、Xから親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基までの共有結合であり;Xは、-CO-;-CHCOOHCO-;-CO-NCH2COOHCH2CO-;-CO-NCH2COOHCH2CONCH2COOHCH2CO-;-CO-NCH2CH2COOHCH2CH2CO-;-CO-NCH2CH2COOHCH2CH2CONCH2CH2COOHCH2CH2CO-;-CO-NHCHCOOHCH24NHCO-;-CO-NCH2CH2COOHCH2CO-;もしくは-CO-NCH2COOHCH2CH2CO-であって、aWがアミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の鎖であるとき、下線の炭素からの結合を介して、W中のアミノ基とアミド結合を形成するか、あるいは、bWが共有結合であるとき、下線のカルボニル炭素からの結合を介して、親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基とアミド結合を形成し;Yは、mが6から32の範囲の整数である-CH2m-;1、2もしくは3の-CHCH-基と、鎖中に10から32の範囲の合計数の炭素原子を与えるのに十分な数の-CH2-基とを含んでなる二価の炭化水素鎖であり;かつ、Z2は、-COOH;-CO-Asp;-CO-Glu;-CO-Gly;-CO-Sar;-CHCOOH2;-NCH2COOH2;-SO3H;もしくは-PO3Hであるが、ただし、Wが共有結合であってXが-CO-であるならば、Zは-COOHとは異なる]の側鎖を有するもの、およびその任意のZn2錯体である、請求項1ないし7の何れか一項に記載の製薬学的組成物。アシル化インスリンが、式およびその任意のZn2錯体[上式中、Insは、B鎖のN末端アミノ酸残基のα-アミノ基もしくはインスリン部分のB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基を介して、アミド結合を介して側鎖のCO-基と結合している親インスリン部分であり;X4は、nが1、2、3、4、5もしくは6である-CH2n;Rが、水素もしくは-CH2p-COOH;-CH2p-SO3H;-CH2p-PO3H2;-CH2p-O-SO3H2;-CH2p-O-PO3H2;1又2の-CH2p-O-COOH基で置換されたアリーレン;-CH2p-テトラゾリルであるNR{上式中、pは1から6の範囲の整数である};R1およびR2は、互いに独立し、それぞれのqの値からも独立して、H、-COOH、もしくはOHであってよく、qは1-6であり、Rは上記のように定義される-CR1R2q-NR-CO-;R3およびR4は、互いに独立し、それぞれのq1の値からも独立して、H、-COOH、もしくはOHであってよく、q1は1-6であり、Rは上記のように定義される-CR3R4q1-NR-CO2-4-;もしくは、結合であり;W1は、-COOH、-SO3H、および-PO3H2およびテトラゾリルからなる群から選択される一または二の基で置換されていてもよいアリーレンもしくはヘテロアリーレンであるか、あるいはW1は結合であり;mは0、1、2、3、4、5もしくは6であり;X5は、-O-;{Rは上記のように定義される};もしくは結合であり;Y1は、R1およびR2は、互いに独立し、それぞれのqの値からも独立して、H、-COOH、結合もしくはOHであってよく、qは1-6であり、Rは上記のように定義される-CR1R2q-NR-CO-Rが上記のように定義されるNR;R3およびR4は、互いに独立し、それぞれのq1の値からも独立して、H、-COOH、もしくはOHであってよく、q1は1-6であり、Rは上記のように定義される-CR3R4q1-NR-CO2-4-;もしくは結合であり;Q7は、rが4から22の整数である-CH2r-;1、2もしくは3の-CH=CH-基と、鎖中に4から22の範囲の合計数の炭素原子を与えるのに十分な数の-CH2-基とを含んでなる二価の炭化水素鎖;もしくは式-CH2s-Q8-C6H4v1-Q9-CH2W-Q10-C6H4v2-Q11-CH2t-Q12-C6H4v3-Q13-CH2z-{Q8-Q13は、互いに独立して、O;Sもしくは結合であってよく;s、w、tおよびzは、互いに独立して、s、w、tおよびzの合計が4から22の範囲になるように、0もしくは1から10の整数であり、かつ、v1、v2、およびv3は、互いに独立して、0もしくは1であってよいが、ただし、W1が結合であるならば、Q7は式-CH2v4C6H4CH2W1-v4およびw1の合計が6から22の範囲になるように、v4およびw1は整数であるか、あるいは、それらのうちの一つは0であるの二価の炭化水素鎖ではない}の二価の炭化水素鎖であり;かつ、Z1は、-COOH;-CO-Asp;-CO-Glu;-CO-Gly;-CO-Sar;-CHCOOH2;-NCH2COOH2;-SO3H-PO3H2;-O-SO3H;-O-PO3H2;-テトラゾリルもしくはW2が、-COOH、-SO3H、および-PO3H2およびテトラゾリルから選択される一または二の基で置換されているアリーレンもしくはヘテロアリーレンである-O-W2であるが;ただし、W1が結合であり、かつv1、v2およびv3が全て0であり、かつQ8-13が全て結合であれば、Z1はO-W2である]を有する請求項1ないし8の何れか一項に記載の製薬学的組成物。アシル化インスリンが、式およびその任意のZn2錯体[上式中、Insは、B鎖のN末端アミノ酸残基のα-アミノ基もしくはインスリン部分のB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基を介して、アミド結合を介して側鎖のCO-基と結合している親インスリン部分であり;それぞれのnは独立して、0、1、2、3、4、5もしくは6であり;Q1、Q2、Q3、およびQ4は、互いに独立して、sが1-20であるCH2CH2Os-;CH2CH2CH2Os-;CH2CH2CH2CH2Os-;CH2CH2OCH2CH2CH2CH2Os-もしくはCH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2Os-;rが4から22の整数である-CH2r-;もしくは、1、2もしくは3の-CH=CH-基と、鎖中に4から22の範囲の合計数の炭素原子を与えるのに十分な数の-CH2-基とを含んでなる二価の炭化水素鎖;tが1から6の整数である-CH2t-もしくは-CH2OCH2t-;R1およびR2が、互いに独立して、H、-COOH、CH21-6COOHであってよく、かつ、R1およびR2が、それぞれの炭素において異なっていてよく、かつ、qが1-6である-CR1R2q-;R3およびR4が、互いに独立して、H、-COOHであってよく、かつ、R3およびR4が、それぞれの炭素において異なっていてよく、かつ、q1が1-6である-CR3R4q11-NHCO-CR3R4q1-NHCO1-2-CR3R4q11もしくは-CR3R4q11-CONH-CR3R4q1-CONH1-2-CR3R4q1--、-CR3R4q11-NHCO-CR3R4q1-CONH1-2-CR3R4q11もしくは-CR3R4q11-CONH-CR3R4q1-NHCO1-2-CR3R4q11;もしくは結合であってよいが;ただし、Q1-Q4は異なっており;X1、X2およびX3は、独立して、O;結合;もしくは{上式中、Rは、水素もしくはそれぞれのpが、残りのpと独立して、1から6の範囲の整数である-CH2p-COOH、-CH2p-SO3H、-CH2p-PO3H2、-CH2p-O-SO3H;-CH2p-O-PO3H2;もしくは-CH2p-テトラゾール-5-イルである}であり;かつZは、-COOH;-CO-Asp;-CO-Glu;-CO-Gly;-CO-Sar;-CHCOOH2;-NCH2COOH2;-SO3H-OSO3H-OPO3H2-PO3H2もしくは-テトラゾール-5-イルである]を有する請求項1ないし7および9の製薬学的組成物。親インスリンがdesB30ヒトインスリンアナログである請求項1ないし12の何れか一項に記載の製薬学的組成物。即効型インスリンをさらに含む請求項1ないし13の何れか一項に記載の製薬学的組成物。少なくとも85の即効型インスリンが、即効型インスリンヘキサマーもしくは即効型インスリンヘキサマーより低分子量の複合体として存在する請求項1および14項に記載の製薬学的組成物。即効型インスリンがAspB28ヒトインスリン、LysB3GluB29ヒトインスリンおよび/またはLysB28ProB29ヒトインスリンである請求項1および14-15に記載の製薬学的組成物。6分子のアシル化インスリン毎に約4より多い亜鉛原子を組成物に添加する、アシル化インスリンを含む製薬学的組成物を製造するための方法。6分子のアシル化インスリン毎に最大約12の亜鉛原子を組成物に添加する、請求項17に記載の方法。6分子のアシル化インスリン毎に約4.3から約12の亜鉛原子を組成物に添加する、請求項17-18の何れか一項に記載の方法。保存料の添加前に、亜鉛を組成物に添加する、請求項17-19に記載の方法。保存料の添加後に、亜鉛を組成物に添加する、請求項17-19の何れか一項に記載の方法。保存料の添加前に亜鉛の一部を添加し、保存料の添加後に亜鉛の一部を添加する、請求項17-21の何れか一項に記載の方法。保存料がフェノールおよび/またはm-クレゾールである、請求項17-22の何れか一項に記載の方法。界面活性剤を製薬学的組成物と混合する、請求項17-23の何れか一項に記載の方法。アシル化インスリンが、親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と結合している側鎖であって、一般式:-W-X-Y-Z2[上式中、Wは、そのカルボン酸基のうちの一つと共に、親のインスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になってアミド基を形成する側鎖中のカルボン酸基を有するα-アミノ酸残基;アミドカルボニル結合を介して一緒に連結されている2、3または4のα-アミノ酸残基からなる鎖であって、アミド結合-を介した鎖-は親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と連結しており、Wのアミノ酸残基は、Wが側鎖中にカルボン酸基を有するアミノ酸残基を少なくとも一つ有するように、中性側鎖を有するアミノ酸残基および側鎖中にカルボン酸基を有するアミノ酸残基の群から選択される鎖;もしくは、Xから親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基までの共有結合であり;Xは、-CO-;-CHCOOHCO-;-CO-NCH2COOHCH2CO-;-CO-NCH2COOHCH2CONCH2COOHCH2CO-;-CO-NCH2CH2COOHCH2CH2CO-;-CO-NCH2CH2COOHCH2CH2CONCH2CH2COOHCH2CH2CO-;-CO-NHCHCOOHCH24NHCO-;-CO-NCH2CH2COOHCH2CO-;もしくは-CO-NCH2COOHCH2CH2CO-であって、aWがアミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の鎖であるとき、下線の炭素からの結合を介して、W中のアミノ基とアミド結合を形成するか、あるいは、bWが共有結合であるとき、下線のカルボニル炭素からの結合を介して、親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基とアミド結合を形成し;Yは、mが6から32の範囲の整数である-CH2m-;1、2もしくは3の-CHCH-基と、鎖中に10から32の範囲の合計数の炭素原子を与えるのに十分な数の-CH2-基とを含んでなる二価の炭化水素鎖であり;かつ、Z2は、-COOH;-CO-Asp;-CO-Glu;-CO-Gly;-CO-Sar;-CHCOOH2;-NCH2COOH2;-SO3H;もしくは-PO3Hであるが、ただし、Wが共有結合であってXが-CO-であるならば、Zは-COOHとは異なる]の側鎖を有するもの、およびその任意のZn2錯体である、請求項17ないし24の何れか一項に記載の方法。アシル化インスリンが、式[上式中、Insは、B鎖のN末端アミノ酸残基のα-アミノ基もしくはインスリン部分のB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基を介して、アミド結合を介して側鎖のCO-基と結合している親インスリン部分であり;X4は、nが1、2、3、4、5もしくは6である-CH2n;Rが、水素もしくは-CH2p-COOH;-CH2p-SO3H;-CH2p-PO3H2;-CH2p-O-SO3H2;-CH2p-O-PO3H2;1又2の-CH2p-O-COOH基で置換されたアリーレン;-CH2p-テトラゾリルであるNR{上式中、pは1から6の範囲の整数である};R1およびR2は、互いに独立し、それぞれのqの値からも独立して、H、-COOH、もしくはOHであってよく、qは1-6であり、Rは上記のように定義される-CR1R2q-NR-CO-;R3およびR4は、互いに独立し、それぞれのq1の値からも独立して、H、-COOH、もしくはOHであってよく、q1は1-6であり、Rは上記のように定義される-CR3R4q1-NR-CO2-4-;もしくは、結合であり;W1は、-COOH、-SO3H、および-PO3H2およびテトラゾリルからなる群から選択される一または二の基で置換されていてもよいアリーレンもしくはヘテロアリーレンであるか、あるいはW1は結合であり;mは0、1、2、3、4、5もしくは6であり;X5は、-O-;{Rは上記のように定義される};もしくは結合であり;Y1は、R1およびR2は、互いに独立し、それぞれのqの値からも独立して、H、-COOH、結合もしくはOHであってよく、qは1-6であり、Rは上記のように定義される-CR1R2q-NR-CO-Rが上記のように定義されるNR;R3およびR4は、互いに独立し、それぞれのq1の値からも独立して、H、-COOH、もしくはOHであってよく、q1は1-6であり、Rは上記のように定義される-CR3R4q1-NR-CO2-4-;もしくは結合であり;Q7は、rが4から22の整数である-CH2r-;1、2もしくは3の-CH=CH-基と、鎖中に4から22の範囲の合計数の炭素原子を与えるのに十分な数の-CH2-基とを含んでなる二価の炭化水素鎖;もしくは式-CH2s-Q8-C6H4v1-Q9-CH2W-Q10-C6H4v2-Q11-CH2t-Q12-C6H4v3-Q13-CH2z-{Q8-Q13は、互いに独立して、O;Sもしくは結合であってよく;s、w、tおよびzは、互いに独立して、s、w、tおよびzの合計が4から22の範囲になるように、0もしくは1から10の整数であり、かつ、v1、v2、およびv3は、互いに独立して、0もしくは1であってよいが、ただし、W1が結合であるならば、Q7は式-CH2v4C6H4CH2W1-v4およびw1の合計が6から22の範囲になるように、v4およびw1は整数であるか、あるいは、それらのうちの一つは0であるの二価の炭化水素鎖ではない}の二価の炭化水素鎖であり;かつ、Z1は、-COOH;-CO-Asp;-CO-Glu;-CO-Gly;-CO-Sar;-CHCOOH2;-NCH2COOH2;-SO3H-PO3H2;O-SO3H;O-PO3H2;-テトラゾリルもしくはW2が、-COOH、-SO3H、および-PO3H2およびテトラゾリルから選択される一または二の基で置換されているアリーレンもしくはヘテロアリーレンである-O-W2であるが;ただし、W1が結合であり、かつv1、v2およびv3が全て0であり、かつQ8-13が全て結合であれば、Z1はO-W2である]を有するもの、およびその任意のZn2錯体である、請求項17ないし24に記載の方法。アシル化インスリンが、式[上式中、Insは、B鎖のN末端アミノ酸残基のα-アミノ基もしくはインスリン部分のB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基を介して、アミド結合を介して側鎖のCO-基と結合している親インスリン部分であり;それぞれのnは独立して、0、1、2、3、4、5もしくは6であり;Q1、Q2、Q3、およびQ4は、互いに独立して、sが1-20であるCH2CH2Os-;CH2CH2CH2Os-;CH2CH2CH2CH2Os-;CH2CH2OCH2CH2CH2CH2Os-もしくはCH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2Os-;rが4から22の整数である-CH2r-;もしくは、1、2もしくは3の-CH=CH-基と、鎖中に4から22の範囲の合計数の炭素原子を与えるのに十分な数の-CH2-基とを含んでなる二価の炭化水素鎖;tが1から6の整数である-CH2t-もしくは-CH2OCH2t-;R1およびR2が、互いに独立して、H、-COOH、CH21-6COOHであってよく、かつ、R1およびR2が、それぞれの炭素において異なっていてよく、かつ、qが1-6である-CR1R2q-;R3およびR4が、互いに独立して、H、-COOHであってよく、かつ、R3およびR4が、それぞれの炭素において異なっていてよく、かつ、q1が1-6である-CR3R4q11-NHCO-CR3R4q1-NHCO1-2-CR3R4q11もしくは-CR3R4q11-CONH-CR3R4q1-CONH1-2-CR3R4q1--、-CR3R4q11-NHCO-CR3R4q1-CONH1-2-CR3R4q11もしくは-CR3R4q11-CONH-CR3R4q1-NHCO1-2-CR3R4q11;もしくは結合であってよいが;ただし、Q1-Q4は異なっており;X1、X2およびX3は、独立して、O;結合;もしくは{上式中、Rは、水素もしくはそれぞれのpが、残りのpと独立して、1から6の範囲の整数である-CH2p-COOH、-CH2p-SO3H、-CH2p-PO3H2、-CH2p-O-SO3H;-CH2p-O-PO3H2;もしくは-CH2p-テトラゾール-5-イルである}であり;かつZは、-COOH;-CO-Asp;-CO-Glu;-CO-Gly;-CO-Sar;-CHCOOH2;-NCH2COOH2;-SO3H-OSO3H-OPO3H2-PO3H2もしくは-テトラゾール-5-イルである]を有するもの、およびその任意のZn2錯体である、請求項17ないし24に記載の方法。親インスリンがdesB30ヒトインスリンアナログである請求項17ないし27の何れか一項に記載の方法。即効型インスリンを組成物と混合する請求項17ないし28の何れか一項に記載の方法。即効型インスリンがAspB28ヒトインスリン、LysB3GluB29ヒトインスリンおよび/またはLysB28ProB29ヒトインスリンである請求項46および80に記載の方法。糖尿病の治療のための医薬の製造のための、請求項1-16の何れか一項に記載の組成物の使用。請求項1-16に記載の製薬学的組成物の治療的有効量を製薬学的に許容される担体と共に含む、治療の必要がある患者における糖尿病の治療のための製薬学的組成物。請求項1-16に記載の製薬学的組成物の治療的有効量を製薬学的に許容される担体と共に患者に投与することを含む、治療の必要がある患者における糖尿病の治療方法。糖尿病の肺性治療のための、請求項33に記載の方法。1型糖尿病、2型糖尿病および高血糖を引き起こす他の状態の治療において使用するための製薬学的組成物の製造のための、請求項1-16の何れか一項に記載の組成物の使用。実施例中に記載した組成物。実施例実施例1A:インスリンアスパルト600μM、3Zn/6インスリン、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾール、7mMのtrisヒドロキシメチルアミノメタン、10mMのNaCl、pH7.5および8mlの体積:31mgのインスリンアスパルトを2mlの水に懸濁し、30μLの1NのHClを加えて、溶液を得た。その後、240μLの10mMのZnAcO2を加え、続いて、3200μLの4グリセロール、400μLの0.32Mフェノール、800μLのm-クレゾール、560μLの0.1Mtrisヒドロキシメチルアミノメタン、160μLの0.5MのNaClを加え、その後、1NのNaOHによりpHを調整し、最終的に、水で体積を8mlまで調整した。溶液を0.22μmの滅菌フィルターを通して濾過した。B:LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン1200μM、3Zn/6ins、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾール、7mMのtrisヒドロキシメチルアミノメタン、10mMのNaCl、pH7.5および7mlの体積:58mgのLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンを2mlの水に懸濁し、溶解し、続いて、420μLの10mMのZnAcO2、2800μLの4グリセロール、350μLの0.32Mフェノール、700μLのm-クレゾール、490μLの0.1Mtrisヒドロキシメチルアミノメタン、140μLの0.5MのNaClを加え、最終的に1NのNaOHの添加によりpH7.5に調整し、水を加え、7mlを得た。溶液を0.22μmの滅菌フィルターを通して濾過した。C:インスリンアスパルト600μM、4Zn/6ins、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾール、7mMのtrisヒドロキシメチルアミノメタン、10mMのNaCl、pH7.5および15mlの体積:製剤は、製剤Aと同様に調製した。D:LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン1200μM、4Zn/6ins、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾール、7mMのtrisヒドロキシメチルアミノメタン、10mMのNaCl、pH7.5および20mlの体積:製剤は、製剤Bと同様に調製した。E:インスリンアスパルト600μM、6Zn/6ins、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾール、7mMのtrisヒドロキシメチルアミノメタン、10mMのNaCl、pH7.5:製剤は、製剤Cと同様に調製し、最終的に、1ml当たり20μLの10mMのZnAcO2を加え、pHを7.5に調整した。F:LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン1200μM、6Zn/6ins、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾール、7mMのtrisヒドロキシメチルアミノメタン、10mMのNaCl、pH7.5:製剤は、製剤Dと同様に調製し、最終的に、1ml当たり40μLの10mMのZnAcO2を加え、pHを7.5に調整した。G:インスリンアスパルト600μM、8Zn/6ins、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾール、7mMのtrisヒドロキシメチルアミノメタン、10mMのNaCl、pH7.5:製剤は、製剤Cと同様に調製し、最終的に、1ml当たり40μLの10mMのZnAcO2を加え、pHを7.5に調整した。H:LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン1200μM、8Zn/6ins、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾール、7mMのtrisヒドロキシメチルアミノメタン、10mMのNaCl、pH7.5:製剤は、製剤Dと同様に調製し、最終的に、1ml当たり80μLの10mMのZnAcO2を加え、pHを7.5に調整した。媒質:1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾール、7mMのtrisヒドロキシメチルアミノメタン、10mMのNaCl、pH7.5。LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン600μMおよび3、4、6、および8で変化するZn/6アシル-insの製剤を、上記の製剤B、D、F、およびHを同量の媒質で希釈することにより得た。サイズ排除カラムクロマトグラフィーにより、140mMのNaCl、10mMのtrisヒドロキシメチルアミノメタンpH7.4、および0.01NaN3、37°Cおよび0.25ml/minで溶出したSuperose6HRカラム上での高分子量インスリンの形成能力について、製剤を試験した。高分子量排除限界から開始し、単量体ピークの最後で終わるように、4分毎に、計14フラクションとなるように、フラクションを集めた。インスリンアナログのフラクション濃度を、逆相クロマトグラフィーで定量し、発色性亜鉛キレート剤terpy添加後のpH2.5での偏位で亜鉛濃度をを定量した図3、4、5および6。アルブミンより大きなサイズを有するLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンの相対的な量フラクション[1-8]は、それぞれ、3、4、6、および8Zn/6インスリンについて、67.4、88.9、98.0、および97.9と測定された。さらに、高分子量フラクションでは、亜鉛濃度は、LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンにより、特に高分子量フラクションにおいて、フォローされた。3および6で変化する亜鉛/インスリンのインスリンアスパルト600μMAおよびEからなる製剤は、単量体として溶出されフラクション[12-13]、添加した亜鉛の少しの部分しかフォローしなかった、図面1-2を参照のこと。インスリンアナログおよびアシル化インスリンの混合インスリン180μMアスパルトおよび420μMのLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンおよび3、6、および8Zn/6インスリンで変化する亜鉛濃度からなる製剤を、上記ストック溶液AからHおよび上記媒質を同様に混合することにより得た。亜鉛/6アシル化インスリンの濃度を計算した例としては、3Zn/6インスリンを有するアスパルト180μM、および3Zn/6アシル-insを有するLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン420μMの混合が、4.3Zn/6アシル化インスリン[180×3420×3/420=4.3Zn/アシル-ins]となることが挙げられる。サイズ排除カラムクロマトグラフィーにより、Superose6HRカラム上での高分子量インスリンの形成能力について、製剤を試験し、インスリンアナログと亜鉛の双方を定量するために、フラクションを同様に集めた。図面8から理解できるように、4.3Zn/6アシル-インスリンの製剤に相当する、3Zn/6インスリンと混合したアナログは、高分子量フラクション[1-8]で、主に、LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン72.5のLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンおよび亜鉛を示したが、フラクション[9-14]の残りの平均として、インスリンアスパルトおよびLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンの等価量が計測される形で、インスリンアスパルトも示した図8。6Zn/6insからなるインスリンアスパルトおよびLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンの残りは、それぞれ図2および図5に示される。アスパルト180μMLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン420μMに対し、6Zn/6ins図2および図5の二つの薬剤を混合し、8.6Zn/6アシル-insに相当するものは、高分子量および低分子量のインスリンアスパルトにおいて、LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンの完全に区別されるフラクションを示した図10。インスリンアスパルトおよびLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンの等量を12Zn/6アシル-insに混合したものも、同様に、区別されるフラクションを示した図12。さらに、個々の製剤における8Zn/6insまでの亜鉛の濃度の増加は、LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンについては、図6中に、アスパルト180μMLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン420μMの混合物につちえは、図11に示されている。図面から明確であるように、亜鉛の量の増加は、驚くべきことに、製薬学的処方におけるインスリンアスパルトおよびLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンの分離を引き起こし、そのアナログ間の有意な鈍化を示さなかった。亜鉛の量の増加は、アナログが現実的な鈍化を示さないように、製薬学的処方におけるインスリンアスパルトおよびLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンの分離を引き起こした。実施例22A:フェノールおよびm-クレゾールの前に添加した3Zn/6アシル化インスリンLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン600μM、3Zn/6インスリン、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾール、20mMのNaCl、7mMのリン酸塩、pH7.5、1.5μCiの125I-TyrA14-LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンのトレーサー、および2mlの体積。1.2mgのLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンを400μLの水に溶解し、3μCiの125I-TyrA14-LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリントレーサーを加え、続いて、800μLの4グリセロールを加え、10-15分間減圧遠心処理して、トレーサー溶液に含まれる添加エタノールを除去した。60μLの10mMのZnAcO2を加え、続いて、2分間隔で100μLの0.32Mフェノール、200μLの0.16Mのm-クレゾール、80μLの0.5MのNaCl、および140μLの0.1Mリン酸ナトリウムを加え、pHをpH7.5mMに調整し、合計の体積を2mlに調整した。溶液は、0.22μmの滅菌フィルターを通じて濾過し、ブタでの皮下注射の後の消失実験に用いられた。製剤例2Aから2Dのクロスオーバー研究でのアッセイ下で記載されるように、T50±SEMhは、9.6±0.7hと決定された。2B:フェノールおよびm-クレゾールの前に添加した3Zn/6アシル化インスリンおよび後に添加した3Zn/6アシル化インスリンLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン600μM、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾールの前に添加した3Zn/6アシル化インスリンおよび後に添加した3Zn/6アシル化インスリン、20mMのNaCl、7mMのリン酸塩、pH7.5、1.5μCiヨウ素-I125-TyrA14-LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリントレーサー、2mlの体積。2.2mgのLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンを400μLの水に溶解し、3μCiの125I-TyrA14-LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリントレーサーを加え、続いて、800μLの4グリセロールを加え、10-15分間減圧遠心処理して、トレーサー溶液に含まれる添加エタノールを除去した。60μLの10mMのZnAcO2を加え、続いて、2分間隔で100μLの0.32Mフェノール、200μLの0.16Mのm-クレゾール、80μLの0.5MのNaCl、および140μLの0.1Mリン酸ナトリウムを加え、pHをpH7.5mMに調整し、合計の体積を2mlに調整した。溶液は、0.22μmの滅菌フィルターを通じて濾過し、ブタでの皮下注射の後の消失実験に用いられた。製剤例2Aから2Dのクロスオーバー研究でのアッセイ下で記載されるように、T50±SEMは、11.9±1.0hと決定された。2C:バッファーを含まず、フェノールおよびm-クレゾールの前に添加した3Zn/6アシル化インスリンおよび後に添加した3Zn/6アシル化インスリンLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン600μM、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾールの前に添加した3Zn/6アシル化インスリンおよび後に添加した3Zn/6アシル化インスリン、20mMのNaCl、pH7.5、1.5μCiの125I-TyrA14-LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリントレーサー、および2mlの体積。8.2mgのLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンを400μLの水に溶解し、3μCiの125I-TyrA14-LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリントレーサーを加え、続いて、800μLの4グリセロールを加え、10-15分間減圧遠心処理して、トレーサー溶液に含まれる添加エタノールを除去した。60μLの10mMのZnAcO2を加え、続いて、2分間隔で100μLの0.32Mフェノール、200μLの0.16Mのm-クレゾール、80μLの0.5MのNaClを加え、pHをpH7.5mMに調整し、合計の体積を2mlに調整した。溶液は、0.22μmの滅菌フィルターを通じて濾過し、ブタでの皮下注射の後の消失実験に用いられた。製剤例2Aから2Dのクロスオーバー研究でのアッセイ下で記載されるように、T50±SEMは、14.4±2.4hと決定された。2D:バッファーを含まず、フェノールおよびm-クレゾールの後に添加した6Zn/6アシル化インスリンLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン600μM、1.6グリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾールの後に加えた6Zn/6アシル化インスリン、20mMのNaCl、7mMのリン酸塩、pH7.5、1.5μCiの125I-TyrA14-LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリントレーサー、および2mlの体積。8.2mgのLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンを400μLの水に溶解し、3μCiの125I-TyrA14-LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンを加え、続いて、800μLの4グリセロールを加え、10-15分間減圧遠心処理して、トレーサー溶液に含まれる添加エタノールを除去した。100μLの0.32Mフェノールを加え、続いて、2分間隔で、200μLの0.16Mのm-クレゾール、120μLの10mMのZnAcO2、80μLの0.5MのNaClを加え、pHをpH7.5mMに調整し、合計の体積を2mlに調整した。溶液は、0.22μmの滅菌フィルターを通じて濾過し、ブタでの皮下注射の後の消失実験に用いられた。製剤例2Aから2Dのクロスオーバー研究でのアッセイ下で記載されるように、T50±SEMは、13.5±1.7hと決定された。実施例3LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンの結晶化による単離LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンは、6molのインスリン当たり2-6molの亜鉛の亜鉛含有量および過剰のフェノール様分子好ましくは、フェノールを有するヘキサマー六量体として結晶化され得る。沈殿化剤として、イオン性の塩が用いられ、NaClが好ましい。さらに、結晶化は、少量の有機溶媒エタノールにより促進され得る。タンパク質溶液の調製溶液A:1.5mgの凍結乾燥LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンを、4mlの0.02mol/ltrisヒドロキシメチルアミノメタンバッファーHClを用いてpH7.0に調整に懸濁した。1.8mlのこのLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン溶液に対し、0.010mol/lのZnOAc2を含有する水溶液を69.5μlと、2mol/lのフェノールを含有するエタノール溶液18μlを添加する。沈殿化剤溶液の調製溶液B:5mlの0.1Mtrisヒドロキシメチルアミノメタン含有溶液HClを用いてpH7.5に調整に対し、1.75gNaClおよび1mlのエタノールを加え、終体積を10mlに調整する。結晶化:等量典型的には、500μlの溶液AおよびBをガラスバイアル中で混合する。室温で12時間経過の後に、再結晶化は完全となり、生じた結晶は、濾過もしくは遠心分離により単離することができる。実施例4製剤:B29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリン600μMまでを水に懸濁し、水酸化ナトリウムの添加により溶解し、以下の順で以下のものを添加した:グリセロール1.6、フェノールおよび16mMのm-クレゾール16mM、酢酸亜鉛0から6Zn/6ins、塩化ナトリウム10mM、リン酸塩7mM、pH7.5、および体積調整のための水。SEC法:場合によっては2mMのフェノールを加えた、37°C、pH7.3の等張の10mMのtris緩衝生理食塩水を用いた、20μLの注入体積、0.05ml/minの流量、130minのランタイムでの、Superose6PCカラム0.32×30cm上でのサイズ排除クロマトグラフィーSECによる分析。青色デキストラン≫5MDa、KAV0.0、Tyroglobulinチログロブリン669kDa、KAV0.28、Ferritinフェリチン440kDa、KAV0.39、Ovalbuminオバルブミン44.5kDa、KAV0.56、Ribonucleaseリボヌクレアーゼ13.7kDa、KAV0.69という第一基準およびAlbuminアルブミン66kDa、KAV0.53、CoIIIインスリン-ヘキサマー35kDa、KAV0.61、および単量体インスリンX26kDa、KAV0.73という第二基準。青色デキストランの保持時間は、17.9mint0およびカラムなしでは0.74mintdであり、かつ、アルブミンHSAの保持時間は、約34.1minであった。KAV=t-t0/V/ftd-t0t:保持時間mint0:青色デキストランの保持時間排除限界td:カラム無しでの青色デキストランの保持時間空隙容量Vt:総カラム容量mLf:流量mL/minデータフォーマット:KAVピーク1x.xx面積ピーク1xxxKAVピーク2x.xx面積ピーク2xxxKAV面積ピーク1は、アルブミンより大きな自己会合に対応するKAV<0.46に対する合計面積の相対的面積として、KAV=0からKAV=0.4632minで計測される。KAVピーク1については、約0.56アルブミンサイズの積分値のカットは、アルブミンサイズとインスリンヘキサマーサイズの中間である。ピークフラクションの特異的検出を用いた、持続型インスリン誘導体および即効型インスリンアスパルトの混合物に対するSEC法:インスリンアスパルト3Zn/6insおよび遷延作用型インスリン誘導体の50:50の混和性は、SECからのフラクションを集め、即効型および遷延作用型のインスリンの高分子量フラクションピーク1および低分子量フラクションピーク2における存在をHPLCにより定量化することにより計測する。フラクションカットは、上述した以下の積分値カットである。溶出液にフェノールの無いSEC法では、ピーク1は、アルブミンより大きな会合形態をを含有し、ピーク2は、インスリンのジヘキサマー、ヘキサマー、ダイマーおよびモノマー形態を含有する。溶出液に2mMのフェノールを含むSEC法では、ピーク1は、インスリンのジヘキサマーおよび他のより大きな形態を含有し、ピーク2は、インスリンのヘキサマー、ダイマーおよびモノマー形態を含有する。双方のアナログに対してインスリンアスパルトを参照物質として用い、4.5min線形、5minの急な初期状態、7minのランタイム、0.5ml/minの流量、14μLの注入体積および276nmでのUV検出で、A:0.2M硫酸ナトリウム、0.04Mリン酸ナトリウム、10アセトニトリル、pH7.2およびB:30°Cの70アセトニトリルを用い、19-34Bの勾配溶出した、ZorbaxEclipseXDB-C182.1×15mm1.8μm上でのHPLC逆相クロマトグラフィーによる、インスリン誘導体およびインスリンアスパルトの特異的な検出。データフォーマット:インスリン誘導体ピーク1面積xxxインスリンアスパルトピーク2面積xxx結果:結論:体温で生理食塩水溶出液を用いたSECサイズ排除クロマトグラフィーは、フェノール性保存料が存在しない場合は、皮下組織への注射の後のインスリン自己会合のモデルとして用いられる。溶出液SECにフェノールを含ませることにより、製薬学的製剤中および注射直後のインスリン自己会合の状態を評価することができる。B29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリン600μMは、一例として、0から6Zn/6insと段階的に増加する亜鉛濃度で製剤化され、亜鉛濃度が5Zn/6insの際には、SEC法によれば、超高分子量への自己会合が示され、かつ90より多くがヒトアルブミン以上の自己会合が示された。SEC溶出液にフェノールを含ませると、二つの鋭いピークが、インスリンジヘキサマーサイズおよびインスリンモノマーサイズに観察され、4Zn/6insの際には、95より多くがジヘキサマーサイズだった。全ての製剤を、インスリンアスパルト3Zn/6insと、等濃度および等体積で混合し、集めたピークの内容を具体的に解析した。4Zn/6insの際には、B29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンの95より多くが、超高分子量で見出され、アスパルトの95より多くがモノマーサイズで見出された。溶出液にフェノールを含ませると、二つのピークが、インスリンジヘキサマーサイズおよびインスリンモノマーサイズに観察され、4Zn/6insの際には、持続型インスリンの95より多くが、モノマーおよびヘキサマーサイズの中間のインスリンアスパルトの95より多くから離れたジヘキサマーサイズだった。持続型アナログ製剤がモノマー形態の5未満を含む場合、等モル製剤混合物の非鈍化が観察された。実施例5.B29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンと、インスリンアスパルトとの混和性:ブタにおける正常血糖クランプ研究製剤B29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンins.誘導体1200μMまでを水に懸濁し、溶解し、グリセロール1.6、および16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾールを加えた。亜鉛添加の前に、水酸化ナトリウムによりpHを7.5に調整し、最大1Zn/6insから3Zn/6insまでadI、5.62Zn/6insまでadII、および6Zn/6insまでIIIの少量ずつ酢酸亜鉛を添加した。その後、塩化ナトリウムを10mMまで加え、水酸化ナトリウムによりpHを7.5に調整し、水により体積を調整した。インスリンアスパルト600μMまでを水に懸濁し、pHを約2.5までの塩酸、3Zn/6insまでの酢酸亜鉛、1.6までのグリセロール、16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾール、10mMまでの塩化ナトリウムを加え、pHを7.5に調整し、および終体積まで水を加えたIV。最終的に、インスリンアスパルトIVは、B29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンと、1:8のモル関係かつ合計の亜鉛濃度が3.38Zn/6ins.誘導体IlowZnmixおよび6Zn/6ins.誘導体IIhighZnmixとなるように混合した。動物実験メスのブタN=8、中間体重80kgを研究の18時間前に絶食させた。インスリンアスパルトおよびB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンの混合の効果を調べるために、それぞれのブタに、lowZnmixIもしくhighZnmixIIもしくは二つのアナログIIIおよびIVの何れかを順不同で与え、同一のブタに別々に投与した。投与量は、0.9nmol/kgのインスリンアスパルトおよび7.2nmol/kgのB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンであった。ブタは、20グルコース溶液の注入により、個々の空腹時血糖値における正常血糖を保たせた。血漿グルコース濃度の変化に応じて、グルコース注入速度の調整が実験的に行なわれた。血液試料は、免疫反応性のインスリンの特異的ELISA血漿分析のために、0-24hで集められ、その薬理学的特性は、図13および図14に示される。結論二つの混合処方における双方のインスリン構成成分の鈍化の程度を調べた。インスリンアスパルトおよびインスリン454の双方の顕著な鈍化は、混合物中に低亜鉛濃度の場合3.38Zn/6ins.誘導体に観察された。しかしながら、亜鉛濃度が6亜鉛/6ins.誘導体まで増加した場合は、薬理学的特性の鈍化は観察されなかった非鈍化が観察された。グルコース注入速度は、個々のインスリンアナログの薬理学的特性の合計とよく匹敵した。実施例6亜鉛バッファーとしてのクエン酸塩B29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンins.誘導体600μMまでを水に懸濁し、溶解し、グリセロール1.6、およびフェノール16mMおよびm-クレゾール16mMを加える。pHを水酸化ナトリウムで7.5に調整し、クエン酸塩を、酢酸亜鉛に関してそれぞれ0.6、1.8および6mMの6亜鉛/6インスリン誘導体の三つの製剤に添加した。その後、塩化ナトリウムを10mMまで加え、リン酸ナトリウムpH7.5を5mMまで加え、続いてpHを水酸化ナトリウムで7.5または7.8まで調整し、体積を水で調整する。2mMフェノールを含む溶出液を用いた実施例4に記載のSEC法により、5°C保存と比較して、37°C2週間保存後で、製剤について研究した。3、5および6Zn/6ins.誘導体でクエン酸塩を有しない対照製剤も含めた。インスリンアスパルト3Zn/6insと、持続性インスリン誘導体との30:70の混和性を、SECからの分画を集め、HPLCにより即効性および持続性のインスリンを、高分子量画分ピーク1および低分子量画分ピーク2で定量化することにより測定した。画分カットと定量化は、実施例4に従った。結果:結論:2mMフェノールを含むSEC生理食塩水溶出液を用いると、持続型インスリン誘導体は、主に、ジヘキサマー形態および、より多く会合した形態に相当するアルブミンのサイズで会合しており、モノマー形態でのインスリン誘導体の量は、3から5および6Zn/6ins.誘導体へと増加する亜鉛濃度で減少する。6Zn/6ins.誘導体の亜鉛濃度まで1、3もしくは10クエン酸塩当量を添加すると、3Zn/ins.誘導体での対照と比較して、モノマーインスリン誘導体の含有量が減少した。自己会合様式は、37°Cで2週間の貯蔵の後も変化しなかった。クエン酸塩無しで製剤化されたインスリンアスパルト3Zn/6insと、本実施例の上記系に示すように製剤化された持続性インスリン誘導体との30:70の混和性を、5°Cおよび37°C2週間保存後について、表に示す。3つのレベルでのクエン酸塩と6Zn/6insとを含むインスリン誘導体製剤は、37°C2週間保存の後も、インスリンアスパルトと混合可能であることが示され、インスリンアスパルトは、3Zn/6insにおける通常のレベルの亜鉛の高分子量画分に、部分的に含まれた。実施例7クエン酸亜鉛を加える。B29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンins.誘導体600μMまでを水に懸濁し、溶解し、グリセロール1.6、およびフェノール16mMおよびm-クレゾール16mMを加える。pHを水酸化ナトリウムで7.5に調整し、クエン酸亜鉛を0.6mMの亜鉛イオンになるまで添加する。その後、塩化ナトリウムを10mMまで加え、リン酸ナトリウムpH7.5を5mMまで加え、続いてpHを7.5まで調整し、体積を水で調整する。実施例8界面活性剤を添加し、即効性アナログと混合する。B29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンins.誘導体600μMまでを水に懸濁し、溶解し、グリセロール1.6、および16mMのフェノールおよび16mMのm-クレゾールを加える。pHを水酸化ナトリウムで7.5に調整し、酢酸亜鉛で6亜鉛/6インスリン誘導体にする任意によって、クエン酸塩としての亜鉛。その後、塩化ナトリウムを10mMまで加え、界面活性剤、例えばpoloxamer188またはpolysorbate20を約0.002まで加え、リン酸ナトリウムpH7.5を5mMまで加え、続いてpHを7.5まで調整し、体積を水で調整する。インスリンアスパルトAspB28ヒトインスリンもしくはインスリンLisProLysB28ProB29ヒトインスリンもしくはインスリングルリシンLysB3GluB29ヒトインスリン全て600μMを、実施例7または実施例8により製剤化されるB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンと、約3/7から約7/3のモル比で混合する。実施例9表3は、6のインスリン毎に2もしくは6のZnIIを有する実施例4に記載されるようにして測定されたSECを示す。表に記述される化合物の調製については、国際公開第2006/082204号および国際公開第2006/082205号を参照のこと。実施例101,16-ヘキサデカン二酸モノベンジルエステルの調製ヘキサデカン二酸20.0g、69.8mmol、n-オクタンおよびDowex登録商標を懸濁させ、過熱還流する。6時間後、追加のギ酸ベンジル22.0g、162mmolを加える。加熱を50時間続ける。反応混合液を80°Cで濾過する。濾液を20°Cまで冷却し、沈殿を濾過により集める。粗生成物20.2gをジクロロメタン220mlに20°Cで4時間懸濁させる。懸濁液を濾過し、濾液を排出させて20-30°Cで乾燥させる。結果として生じる固体13.9gを2-プロパノール140mlから再結晶する。生成物を濾過により単離し、30-40°Cで減圧下、一定重量まで乾燥させる。収量10.2g39の白色物質。L-2-15-ベンジルオキシカルボニル-ペンタデカノイルアミノ-ペンタン二酸5-ベンジルエステル1-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステルの調製1,16-ヘキサデカン二酸モノベンジルエステル20.0g、53.1mmolを、35-40°Cでアセトンに溶解する。N-ヒドロキシスクシンイミド6.42g/55.8mmolを加える。結果として生じる溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミドDCC12.1g/58.4mmolを加える。反応混合液を35°Cで3-4時間攪拌する。結果として生じた懸濁液に、トリエチルアミン7.40ml、53.1mmologL-グルタミン酸α-ベンジルエステル12.6g/53.1mmolを加える。反応混合液を35-40°Cで8-16時間攪拌する。反応混合液を20-25°Cまで冷却する。メタンスルホン酸3.45mlの/53.1mmolおよびDCC12.1g/53.1mmolを加える。反応混合液を20-25°Cで8-16時間攪拌する。反応混合液を濾過し、濾液を排出させて乾燥させる。残留物を、水100mlおよびトルエン200mlで分画する。トルエン相を水の蒸留により乾燥させた。シリカゲル20gを残留物に加える。懸濁液を20-25°Cで30分間攪拌し、濾過する。濾液の体積を、減圧下のエバポレーションにより約100-120mlまで減少させた。N-ヘプタン150mlを、15-30分間にわたって加える。結果として生じる懸濁液を2時間攪拌する。生成物を濾過により単離し、20-25°Cで減圧下、一定重量まで乾燥させる。収量21g58の白色物質。L-2-15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ-ペンタン二酸5-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステルPC2414の調製L-2-15-ベンジルオキシカルボニル-ペンタデカノイルアミノ-ペンタン二酸5-ベンジルエステル1-2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル5.0g、7.3mmolを、トリフルオロ酢酸95μlを含むアセトン95mlに溶解する。パラジウム炭素、100.50gを加える。30-35°Cで攪拌しながら水素を加える。水素の消費が停止したとき、反応混合液を濾過する。濾液を20°Cに冷却し、n-ヘプタン140mlを15-30分間にわたって加える。結果として生じる懸濁液を2-3時間で0-5°Cに冷却する。生成物を濾過により単離し、20-25°Cで減圧下、一定重量まで乾燥させる。収量3g84の白色物質。生成物は、アセトン-d6を溶媒として用いてプロトンNMRBruker600MHzにより分析した。1DスペクトルからのプロトンNMR帰属内標準は、δ0.0ppmのTMSPC2414を用いたヒトインスリンdesB30の位置B29のリジンのε-アミノ基アシル化4gのdesB30ヒトインスリンを64gの精製水に懸濁する。1.85mlのトリエチルアミンTEAを加えて、desB30ヒトインスリンを溶解させ、pHを11.4-12.0まで上げる。溶液を2-5°Cまで冷却する。448mgのPC2414を、10-15の硫酸で安定化した3.5gのNMPN-メチル-2-ピロリドンに加える。desB30ヒトインスリン溶液を攪拌し、PC2414溶液を、温度を低く保ちながら20分間にわたって加える。PC2414の添加後、反応混合液を、Tris-ヒドロキシメチルアミノメタン20mmol/kg、酢酸アンモニウム30mmol/kg、エタノール42,5w/w、残部精製水、pH7,5からなる2.5重量の溶液で希釈する。希釈後、かき混ぜながら、緩やかに1M酢酸を加えることにより、pHを7.5に調整する。HPLCによる分析により、14,22の残留desB30ヒトインスリンを有する72,11のLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-グルタミルdesB30ヒトインスリンの形成が示される。分析HPLC法:オクチルジメチルシリル置換シリカを充填された、約100Åの孔サイズと約3.5μmの粒径を有する150X4.6mm内径のカラムを、40°Cで1ml/分の流速で、1:7.8w/wを含むNaOH水溶液でpH5.9に調整された20mMのNaH2PO4.H2Oおよび100mmolのNa2SO4バッファー、および2:42,8w/wのアセトニトリルを含むアセトニトリル溶媒からなり、25w/wアセトニトリルとなるように調整した混合液を用いて、平衡化する。LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-グルタミルdesB30ヒトインスリンは、約20分後にカラムから溶出した。desB30ヒトインスリンは約6分後にカラムから溶出した。アッセイIIヒトインスリンに対する本発明のインスリン誘導体の効力実験日の体重が238383gであったSDオスラットを、固定clamp実験に用いた。ラットは、制御された環境条件下で、餌に自由に接近でき、固定実験の前一晩3pmから絶食した。実験プロトコール外科手術の前に少なくとも1週間の間、動物施設でラットを馴養した。固定実験の前に、約1週間、タイゴンTygonカテーテルをハロタン麻酔下で、頚静脈注入用および頚動脈血液採取用に挿入し、首部背面で外面化して固定した。術後のラットにストレプトシリンStreptocilinvetを与え、回復期間の間、動物ケアユニットに置いた。鎮痛のために、アノルフィンAnorphinを、麻酔の間投与し、リマディルRimadylを、麻酔から完全に回復した後に投与し、2日間、日に一度投与した。用いた固定技術は1から適用させた。実験日の7amに、一晩絶食させたラットの体重を量り、サンプリングシリンジおよび注入システムHarvard22BasicpumpsHarvardandPerfectumHypodermicglasssyringeAldrichに接続し、次いで、個々の固定ケージに置き、ここで、実験開始前約45分安静にさせた。ラットは、全実験期間中、それらの通常の土台beddin上で自由に動くことができ、飲料水に自由に接近できた。血漿グルコースレベルが10分間隔で測定される基礎期間30分の後、試験されるインスリン誘導体およびヒトインスリンラット当たりの一つの投与レベル、投与レベル当たりn6~7を一定速度で300分、注入ivした。血漿グルコースレベルは、10分の間隔で終始測定し、20グルコース水溶液の注入は正常血糖を維持するために、これに従って調節された。再懸濁した赤血球のサンプルは、各ラットからプールし、頚動脈カテーテルを介して約12ml容量で戻された。各実験日において、試験される個々のインスリン誘導体およびヒトインスリン溶液の溶液サンプルを、固定実験の前および終了時に採取し、該ペプチドの濃度をHPLCで確かめた。ラットインスリンおよびCペプチド並びに試験されるインスリン誘導体およびヒトインスリンの血漿濃度を、実験の前および終了時の関連する時点で測定した。ラットは、ペントバルビタールを過剰投与して実験終了時に殺した。アッセイIIIブタにおける、本発明のインスリン誘導体のT50の測定T50は、外部γ-カウンターで測定したとき、試験されるインスリンのA14Tyr[125I]標識化誘導体の注入量の50が注入部位から消失する時間である。実験動物ケアの原則に従い、薬物動態学的研究および薬力学的研究のために、特異的病原体の無いLYYD、非糖尿病メスブタ、DanishLandrace、YorkshireおよびDurocの交雑育種を用いたHolmenlund、Haarloev、Denmark。ブタには意識があり、4-5月齢で体重70-95kgであった。動物は実験の前に、一晩18時間絶食させた。125Iを有するTyrA14で標識したインスリン誘導体の処方された製剤を、前述のようにブタに皮下注射したRibelUJorgensenKBrangeJandHenriksenUThepigasamodelforsubcutaneousinsulinabsorptioninmanSerranoRiosMandLefebvrePJ8918961985AmsterdamNewYorkOxfordElsevierSciencePublishers1985。実験の開始において、60nmolの投与量の本発明に係るインスリン誘導体試験化合物と、60nmolの投与量インスリンデテミルdetemir何れもTyrA14で125I標識されているを、それぞれのブタの首の二つの異なる位置で注射した。皮下注射の部位からの放射性標識の消失は、従来の外部ガンマ計測法RibelUSubcutaneousabsorptionofinsulinanaloguesBergerMandGriesFA7077StuttgartNewYorkGeorgThimeVerlagの改変を用いてモニターした。この改変法により、コードレスの携帯型デバイスを用いて、数日間、皮下貯蔵物からの放射能活性の消失を連続的に測定することができるScancysLaboratorieteknikVarloseDK3500Denmark。測定は、1分間隔で行い、計測値はバックグラウンド活性で補正した。全ての図は、LysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリンおよび/またはインスリンアスパルトの製剤の、37°Cで生理食塩水により溶出されたSuperose6HRでのサイズ排除クロマトグラフィーの結果を上図に、高分子量画分から低分子量画分またはインスリンモノマー画分までをカバーするそれぞれ14画分の内容を下図に示したものである。図中、以下の略語が用いられる:アスパルト:インスリンアスパルトZn/6Ins:6分子のインスリン当たりの亜鉛原子Zn/アシル-ins:6分子のアシル化インスリン当たりの亜鉛原子アシル-insアシル化インスリン6分子のインスリンアスパルト毎に3の亜鉛原子を有するインスリンアスパルト600μM6分子のインスリンアスパルト毎に6の亜鉛原子を有するインスリンアスパルト600μM6分子のアシル化インスリン毎に3の亜鉛原子を有するLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン600μM6分子のアシル化インスリン毎に4の亜鉛原子を有するLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン600μM6分子のアシル化インスリン毎に6の亜鉛原子を有するLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン600μM6分子のアシル化インスリン毎に8の亜鉛原子を有するLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン600μM6分子のアシル化インスリン毎に3,6の亜鉛原子の総亜鉛含有量を有するインスリンアスパルト180μMとLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン840μMとの混合物6分子のアシル化インスリン毎に4.3の亜鉛原子の総亜鉛含有量を有するインスリンアスパルト180μMとLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン420μMとの混合物6分子のアシル化インスリン毎に4.5の亜鉛原子の総亜鉛含有量を有するインスリンアスパルト300μMとLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン600μMとの混合物6分子のアシル化インスリン毎に8.6の亜鉛原子の総亜鉛含有量を有するインスリンアスパルト180μMとLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン420μMとの混合物6分子のアシル化インスリン毎に11.4の亜鉛原子の総亜鉛含有量を有するインスリンアスパルト180μMとLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン420μMとの混合物6分子のアシル化インスリン毎に12の亜鉛原子の総亜鉛含有量を有するインスリンアスパルト300μMとLysB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30ヒトインスリン300μMとの混合物別々に提供されたインスリンアスパルトIV、破線、N=8、およびB29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Gluインスリンと混合して提供されたインスリンアスパルトの低亜鉛濃度I、3.38Zn/6ins誘導体、実線、N=8および高亜鉛濃度II、6Zn/6ins誘導体、点線、N=7の血漿特性別々に提供された29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンIII、破線、N=8、およびインスリンアスパルトと混合して提供された29Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-GludesB30インスリンの低亜鉛濃度I、3.38Zn/6ins誘導体、実線、N=8および高亜鉛濃度II、6Zn/6ins誘導体、点線、N=7の血漿特性"