"大型哺乳動物において免疫応答を惹起する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、2μg~100μgの用量の免疫原コードRNAを投与する工程を包含する、方法。大型哺乳動物において免疫応答を惹起する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、該哺乳動物の体重1kgあたり0.1μg~1.5μgのRNAを投与する工程を包含する、方法。前記RNAが、骨格筋組織に投与される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記RNAが、注射によって投与される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。注射が、針を介する注射である、請求項4に記載の方法。前記RNAが、送達システムとの組み合わせにおいて投与される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記送達システムが、iリポソーム;ii非毒性かつ生分解性のポリマー微粒子;および/もしくはiiiサブミクロンのカチオン性水中油型エマルジョンを含む、請求項6に記載の方法。前記RNAが、プラス鎖である、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記RNAが、自己複製RNAである、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記RNAが、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対する免疫応答を誘発し得る免疫原をコードする、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記免疫原が、RSウイルス糖タンパク質Fに対してインビボで免疫応答を誘発し得る、請求項10に記載の方法。前記大型哺乳動物が、ウシもしくはヒトである、前述の請求項のいずれかに記載の方法。さらに改善された核酸ワクチンへの必要性が存在している。発明の開示本発明の第1の局面によれば、免疫原をコードするRNAは、2μg~100μgの用量において大型哺乳動物に送達される。以下に示されるように、用量66μgは、ウシにおいて免疫原性である。ウシ成体は、ヒト成人の体重の約10倍の体重を有するので、本発明者らは、5~10μgRNAというヒト用量が現実的であることを示した。本発明の第2の局面によれば、免疫原をコードするRNAは、0.1μg/kg~1.5μg/kgの用量において大型哺乳動物に送達される。以下に示されるように、用量約0.94μg/kgは、ウシにおいて免疫原性である。先行技術の研究では、マウスにおいて100ng~10μgRNAを使用していた約20gの体重では、これは5μg/kg~500μg/kgである。従って、本発明は、大型哺乳動物において免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、上記哺乳動物に、2μg~100μgの用量の免疫原コードRNAを投与する工程を包含する。本発明はまた、大型哺乳動物において免疫応答を惹起するためのインビボでの方法において使用するための免疫原コードRNAを提供し、ここで上記方法は、2μg~100μgの上記RNAを上記哺乳動物に投与する工程を包含する。本発明はまた、大型哺乳動物においてインビボでの免疫応答を惹起するための医薬の製造における免疫原コードRNAの使用を提供し、ここで上記医薬は、単位用量あたり2μg~100μgの免疫原コードRNAを有する。本発明はまた、大型哺乳動物のための薬学的組成物を提供し、上記薬学的組成物は、単位用量あたり2μg~100μgの免疫原コードRNAを含む。0.5mlという代表的投与容積において、上記免疫原コードRNAの濃度は、よって、4μg/ml~200μg/mlである。本発明はまた、大型哺乳動物に投与するための薬学的組成物の単位用量を提供し、ここで上記単位用量は、2μg~100μgの免疫原コードRNAを含む。本発明はまた、大型哺乳動物に投与するための薬学的組成物を含む送達デバイス例えば、シリンジ、ネブライザ、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなどを提供し、ここで上記デバイス中の組成物は、2μg~100μgの免疫原コードRNAを含む。本発明はまた、大型哺乳動物への投与のための薬学的組成物を含む密封シールされたhermeticallysealed容器を提供し、ここで上記容器中の組成物は、2μg~100μgの免疫原コードRNAを含む。本発明はまた、大型哺乳動物において免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、上記哺乳動物に、上記哺乳動物の体重1kgあたり0.1μg~1.5μgのRNAを投与する工程を包含する。本発明はまた、大型哺乳動物において免疫応答を惹起するためのインビボでの方法において使用するための免疫原コードRNAを提供し、ここで上記方法は、上記哺乳動物の体重1kgあたり0.1μg~1.5μgのRNAを投与する工程を包含する。本発明はまた、大型哺乳動物においてインビボでの免疫応答を惹起するための医薬の製造における免疫原コードRNAの使用を提供し、ここで上記医薬は、上記哺乳動物の体重1kgあたり0.1μg~1.5μgの免疫原コードRNAを有する。投与本発明は、大型哺乳動物へのRNAの投与を包含する。投与部位は、通常は、筋組織例えば、骨格筋である。筋肉内投与の代わりとしては、皮内投与、鼻内投与、眼内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、間隙投与、口内投与、経皮投与、もしくは舌下投与が挙げられるが、これらに限定されない。2つの好ましい経路は、皮内投与および筋肉内投与である。投与は、種々の方法で達成され得る。例えば、針例えば、皮下針を介する注射が使用され得、特に、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与、腹腔内投与もしくは静脈内投与のために使用され得る。針なし注射は、代替として使用され得る。筋肉内注射は、本発明に従ってRNAを投与する好ましい方法である。上腕、三角筋もしくは大腿筋例えば、前外側大腿への注射が、代表的である。上記投与部位は、免疫細胞例えば、マクロファージ例えば、骨髄由来マクロファージ、樹状細胞例えば、骨髄由来形質細胞様樹状細胞および/もしくは骨髄由来骨髄樹状細胞、単球例えば、ヒト末梢血単球など、および非免疫細胞例えば、筋細胞これは、多核性であってもよいし、線維の束fascicleへと構成されてもよいおよび/もしくは線維芽細胞の両方を含み得る。上記免疫細胞は、投与時に存在し得るが、通常、投与後、その部位に浸潤する。例えば、侵襲性投与によって引き起こされる例えば、上記投与部位において針によって引き起こされる組織損傷は、上記損傷した領域へと免疫細胞を浸潤させ得る。RNAは、上記免疫細胞および/もしくは上記非免疫細胞の細胞質に入る。進入は、エンドサイトーシスを介してであり得る。免疫細胞のエンドソームの中で、上記RNAは、TLR7ssRNA、TLR8ssRNAもしくはTLR3dsRNAに結合し得、それによって、先天的免疫経路を誘発する。RNAが、免疫細胞および非免疫細胞の上記エンドソームから上記細胞質へと逃れる場合、上記RNAは、RNAヘリカーゼに結合し得例えば、RIG-I様レポーターファミリーすなわち、RLRにおいて、例えば、RIG-IRLR-1、MDA5RLR-2および/もしくはLGP2RLR-3、これもまた、先天的免疫経路を誘発する。上記RNAはまた、上記免疫細胞および/もしくは非免疫細胞において翻訳され得、上記免疫原の発現をもたらし、最終的には、MHCシステムを介して上記発現された免疫原の提示をもたらす。上記細胞はまた、I型インターフェロンおよび/もしくは炎症促進性pro-inflammatoryサイトカインを分泌して、局所的アジュバント効果を提供し得る。上記RNAは、裸のRNAとして例えば、単に、RNAの水性溶液として送達され得るが、免疫細胞および非免疫細胞両方への進入を増強するため、また、その後の細胞内効果を増強するために、そして良好な免疫原性効果に必要とされるRNAの量を低下させるためにも、上記RNAは、好ましくは、送達システム例えば、粒子もしくはエマルジョンの送達システムと組み合わせて投与される。3つの有用な興味深い送達システムは、iリポソーム、ii非毒性でかつ生分解性のポリマー微粒子、iiiサブミクロンのカチオン性水中油型エマルジョンである。リポソームは、好ましい送達システムである。本発明の第1の局面によれば、免疫原をコードするRNAは、2μg~100μgの用量において大型哺乳動物に送達される。例えば、上記用量は、5μg~75μg、6μg~50g、7μg~25μg、8μg~20μg、もしくは9μg~15μgであり得る。具体的な用量は、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、もしくは100μgであり得る。ヒト用量は、5~10μgであり得る。本発明の第2の局面によれば、免疫原をコードするRNAは、0.1μgRNA/kg体重~1.5μgRNA/kg体重の用量において大型哺乳動物に送達される。例えば、上記用量は、0.2μg/kg~1.2μg/kg、0.3μg/kg~1.1μg/kg、0.4μg/kg~1.0μg/kg、0.5μg/kg~1.0μg/kg、もしくは0.5μg/kg~1.5μg/kgであり得る。具体的な用量は、0.1μg/kg、0.15μg/kg、0.2μg/kg、0.25μg/kg、0.3μg/kg、0.4μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、もしくは1.2μg/kgであり得る。リポソーム種々の両親媒性脂質は、リポソームとして、RNA含有水性コアを被包するように、水性環境中で二重層を形成し得る。これら脂質は、アニオン性、カチオン性もしくは両性イオン性の親水性頭部headgroupを有し得る。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、1960年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、1990年代以来研究されてきた。いくつかのリン脂質はアニオン性であるのに対して、他のものは、両性イオン性であり、他のものはカチオン性である。リン脂質の適切なクラスとしては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジル-グリセロールが挙げられるが、これらに限定されず、いくつかの有用なリン脂質は、表1に列挙される。有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンDOTAP、1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDSDMA、1,2-ジオレイルオキシ-N,Nジメチル-3-アミノプロパンDODMA、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDLinDMA、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDLenDMA。両性イオン性脂質としては、アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質が挙げられるが、これらに限定されない。有用な両性イオン性脂質の例は、DPPC、DOPCおよびドデシルホスホコリンである。上記脂質は、飽和もしくは不飽和であり得る。リポソームを調製するための少なくとも1つの不飽和脂質の使用は、好ましい。不飽和脂質が2つのテールを有する場合、両方のテールが、不飽和であり得、または上記不飽和脂質は、1つの飽和テールおよび1つの不飽和テールを有し得る。リポソームは、単一の脂質から、もしくは脂質の混合物から形成され得る。混合物は、iアニオン性脂質の混合物、iiカチオン性脂質の混合物、iii両性イオン性脂質の混合物、ivアニオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、vアニオン性脂質と両性イオン性脂質との混合物、vi両性イオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、またはviiアニオン性脂質、カチオン性脂質、および両性イオン性脂質の混合物を含み得る。同様に、混合物は、飽和脂質および不飽和脂質の両方を含み得る。例えば、混合物は、DSPC両性イオン性、飽和、DlinDMAカチオン性、不飽和、および/もしくはDMGアニオン性、飽和を含み得る。脂質の混合物が使用される場合、上記混合物中の成分である脂質のすべてが、両親媒性である必要はない例えば、1種以上の両親媒性脂質が、コレステロールと混合され得る。脂質の親水性部分は、PEG化され得るすなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって改変され得る。この改変は、上記リポソームの安定性を増大させ得、そして上記リポソームの非特異的吸着を妨げ得る。例えば、脂質は、参考文献6および7に開示されるもののような技術を使用して、PEGに結合体化され得る。PEGの種々の長さが使用され得る例えば、0.5~8kDa。DSPC、DlinDMA、PEG-DMGおよびコレステロールの混合物が、実施例において使用される。リポソームは、通常は、3つの群に分けられる:多層小胞MLV;小さな単層小胞SUV;および大きな単層小胞LUV。MLVは、各小胞において複数の二重層を有し、いくつかの別個の水性区画を形成する。SUVおよびLUVは、水性コアを被包する単一の二重層を有する;SUVは、代表的には、直径≦50nmを有し、LUVは、直径>50nmを有する。本発明で有用なリポソームは、理想的には、50~220nmの範囲の直径を有するLUVである。様々な直径を有するLUVの集団を含む組成物に関しては:i少なくとも80数では、20~220nmの範囲の直径を有するべきであり、ii上記集団の平均直径Zav強度では、理想的には、40~200nmの範囲にあり、そして/またはiii上記直径は、多分散指数<0.2を有するべきである。参考文献1のリポソーム/RNA複合体は、600~800nmの範囲の直径を有し、高い多分散性を有すると予測される。適切なリポソームを調製するための技術は、当該分野で周知である例えば、参考文献8~10を参照のこと。1つの有用な方法は、参考文献11に記載され、i脂質のエタノール溶液、ii核酸の水性溶液、およびiii緩衝液を混合する工程、続いて、混合、平衡化、希釈および精製の工程を包含する。本発明の好ましいリポソームは、この混合プロセスによって得られ得る。RNAは、好ましくは、上記リポソーム内に被包されるので、上記リポソームは、水性のRNA含有コアの周りに外層を形成する。この被包は、RNAをRNase消化から保護することが見いだされた。上記リポソームは、いくらかの外部RNA例えば、上記リポソームの表面にを含み得るが、上記RNAのうちの少なくとも半分および理想的には、そのうちのすべてが被包される。ポリマー微粒子種々のポリマーは、RNAを被包もしくは吸着するように微粒子を形成し得る。実質的に非毒性のポリマーの使用は、レシピエントが上記粒子を安全に受容し得ることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、上記粒子が、長期的な残存を回避するように送達後に代謝され得ることを意味する。有用なポリマーはまた、薬学的グレードの処方物の調製を補助するために、滅菌可能である。適切な非毒性かつ生分解性のポリマーとしては、ポリα-ヒドロキシ酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトンポリカプロラクトンを含む、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン誘導ポリカーボネート、ポリビニル-ピロリジノンもしくはポリエステル-アミド、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記微粒子は、ポリα-ヒドロキシ酸、例えば、ポリラクチドPLA、ラクチドとグリコリドとのコポリマー、例えば、ポリD,L-ラクチド-co-グリコリドPLG、およびD,L-ラクチドとカプロラクトンとのコポリマーから形成される。有用なPLGポリマーとしては、以下の範囲のラクチド/グリコリドモル比、例えば、20:80~80:20例えば、25:75、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、75:25を有するものが挙げられる。有用なPLGポリマーとしては、例えば、5,000~200,000Da例えば、10,000~100,000Da、20,000~70,000Da、30,000~40,000Da、40,000~50,000Daの分子量を有するものが挙げられる。上記微粒子は、理想的には、0.02μm~8μmの範囲の直径を有する。様々な直径を有する微粒子の集団を含む組成物に関して、少なくとも80数では、0.03~7μmの範囲の直径を有するべきである。適切な微粒子を調製するための技術は、当該分野で周知である例えば、参考文献10、12特に、第7章および参考文献13を参照のこと。RNAの吸着を促進するために、微粒子は、カチオン性界面活性剤および/もしくは脂質例えば、参考文献14および15において開示されるとおりを含み得る。ポリマー微粒子を作製するための代替法は、成形する工程および硬化させる工程例えば、参考文献16に開示されるとおりによる。本発明の微粒子は、40~100mVのゼータ電位を有し得る。リポソームに勝る微粒子の1つの利点は、微粒子が安定な貯蔵のために容易に凍結乾燥されることである。RNAは、上記微粒子に吸着させられ得、吸着は、上記微粒子中にカチオン性材料例えば、カチオン性脂質を含むことによって促進される。カチオン性水中油型エマルジョン水中油型エマルジョンは、インフルエンザワクチンへのアジュバントに関して公知である例えば、FLUADTM製品の中のMF59TMアジュバント、およびPREPANDRIXTM製品中のAS03アジュバント。本発明に従うRNA送達は、水中油型エマルジョンを利用し得るが、ただし、上記エマルジョンは、1個以上のカチオン性分子を含む。例えば、カチオン性脂質は、上記エマルジョン中に含まれて、負に荷電したRNAが付着し得る正の液滴表面を提供し得る。上記エマルジョンは、1種以上の油を含む。適切な油としては、例えば、動物供給源例えば、魚類もしくは植物供給源に由来するものが挙げられる。上記油は、理想的には、生分解性代謝可能でありかつ生体適合性である。植物性油の供給源としては、堅果、種子および穀物が挙げられる。落花生油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油最も一般的に入手しやすいは、堅果油を例示する。ホホバ油が使用され得、これは、例えば、ホホバ豆から得られる。種子油としては、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ごま種子油などが挙げられる。穀物群において、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、他の穀類例えば、小麦、オート麦、ライ麦、コメ、テフ、ライコムギなどの油もまた、使用され得る。グリセロールおよび1,2-プロパンジオールの6~10個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油中に天然には存在しないが、上記堅果および種子の油から始まる適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。哺乳動物の乳汁に由来する脂肪および油は、代謝可能であるので、使用され得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段の手順は、当該分野で周知である。大部分の魚類は、容易に採取し得る代謝可能な油を含む。例えば、たら肝油、サメ肝油、および鯨油例えば、鯨蝋は、本明細書で使用され得る魚油のうちのいくらかを例示する。多くの分枝鎖の油は、5炭素のイソプレン単位において生化学的に合成され、テルペノイドと一般に言われる。好ましいエマルジョンは、スクアレン、分枝状、不飽和テルペノイドであるサメ肝油C30H50;[CH32C[=CHCH2CH2CCH3]2=CHCH2-]2;2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエン;CASRN7683-64-9を含む。スクアランスクアレンの飽和アナログもまた、使用され得る。魚油スクアレンおよびスクアランを含むは、市販の供給源から容易に利用可能であるか、または当該分野で公知の方法によって得られ得る。他の有用な油は、トコフェロール特に、スクアレンとの組み合わせにおいてである。エマルジョンの油相がトコフェロールを含む場合、α-トコフェロール、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、δ-トコフェロール、ε-トコフェロールもしくはζ-トコフェロールのうちのいずれかが使用され得るが、α-トコフェロールが好ましい。D-α-トコフェロールおよびDL-α-トコフェロールはともに、使用され得る。好ましいα-トコフェロールは、DL-α-トコフェロールである。スクアレンおよびトコフェロール例えば、DL-α-トコフェロールを含む油の組み合わせが、使用され得る。上記エマルジョン中の油は、油の組み合わせ例えば、スクアレンと少なくとも1種のさらなる油を含み得る。上記エマルジョンの水性成分は、ただの水plainwater例えば、w.f.i.であり得るか、またはさらなる成分例えば、溶質を含み得る。例えば、上記水性成分は、緩衝液を形成するために塩を含み得る例えば、クエン酸塩もしくはリン酸塩例えば、ナトリウム塩。代表的な緩衝液としては、以下が挙げられる:リン酸緩衝液;Tris緩衝液;ホウ酸緩衝液;コハク酸緩衝液;ヒスチジン緩衝液;もしくはクエン酸緩衝液。緩衝化された水相が好ましく、緩衝液は、代表的には、5~20mM範囲において含まれる。上記エマルジョンはまた、カチオン性脂質を含む。好ましくは、この脂質は、上記エマルジョンの形成および安定化を促進し得るように、界面活性剤である。有用なカチオン性脂質は、一般には、生理学的条件下で正に荷電する窒素原子を含む例えば、三級アミンもしくは四級アミンとして。この窒素は、両親媒性界面活性剤の親水性頭部headgroupに存在し得る。有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンDOTAP、3’-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDCコレステロール、ジメチルジオクタデシル-アンモニウムDDA例えば、ブロミド、1,2-ジミリストイル-3-トリメチル-アンモニウムプロパンDMTAP、ジパルミトイルC16:0トリメチルアンモニウムプロパンDPTAP、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパンDSTAP。他の有用なカチオン性脂質は、以下である:塩化ベンザルコニウムBAK、塩化ベンゼトニウム、セトリミドcetramideこれは、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドならびにおそらく少量のデデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含む、セチルピリジニウムクロリドCPC、セチルトリメチルアンモニウムクロリドCTAC、N,N’,N’-ポリオキシエチレン10-N-タロウ-l,3-ジアミノプロパン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチル-アンモニウムブロミド、混合アルキル-トリメチル-アンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシル-アンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドDDAB、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、N,N-ジメチル-N-[22-メチル-4-1,1,3,3テトラメチルブチル-フェノキシ]-エトキシエチル]-ベンゼンメタンアミニウムクロリドDEBDA、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、[l-2,3-ジオレイルオキシ-プロピル]-N,N,N,トリメチルアンモニウムクロリド、1,2-ジアシル-3-トリメチルアンモニオプロパンアシル基=ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル、l,2-ジアシル-3ジメチルアンモニオプロパンアシル基=ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル、l,2-ジオレオイル-3-4’-トリメチル-アンモニオブタノイル-sn-グリセロール、1,2-ジオレオイル3-スクシニル-sn-グリセロールコリンエステル、コレステリル4’-トリメチルアンモニオブタノエート、N-アルキルピリジニウム塩例えば、セチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド、N-アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラ型電解質C12Me6;C12Bu6、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リゾレシチン、L-αジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン、以下が挙げられるが、これらに限定されない、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミンDOGS、ジパルミトイルホスファチジルエタノール-アミドスペルミンDPPES、リポポリ-LもしくはD-リジンLPLL、LPDL、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミンに結合体化したポリLもしくはD-リジン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタメートエステルC12GluPhCnN、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタメートエステルC12GluPhCnN、コレステロールのカチオン性誘導体コレステリル-3β-オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル-3β-オキシスクシンアミドエチレン-ジメチルアミン、コレステリル-3β-カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、およびコレステリル-3β-カルボキシアミドエチレンジメチルアミンが挙げられるが、これらに限定されない。他の有用なカチオン性脂質は、参考文献17および18において記載される。上記カチオン性脂質は、好ましくは、生分解性代謝可能でかつ生体適合性である。上記油およびカチオン性脂質に加えて、エマルジョンは、非イオン性界面活性剤および/もしくは両性イオン性界面活性剤を含み得る。このような界面活性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤一般に、Tweenといわれる特に、ポリソルベート20およびポリソルベート80;エチレンオキシドEO、プロピレンオキシドPO、および/もしくはブチレンオキシドBOのコポリマーDOWFAXTM商品名の下で販売されている例えば、直鎖状のEO/POブロックコポリマー;オクトキシノールこれは、反復するエトキシオキシ-1,2-エタンジイル基の数が変動し得るオクトキシノール-9TritonX-100、もしくはt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールは、特に興味深い;オクチルフェノキシポリエトキシエタノールIGEPALCA-630/NP-40;リン脂質例えば、ホスファチジルコリンレシチン;ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテルBrij界面活性剤として公知例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテルBrij30;ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル;ならびにソルビタンエステル一般に、Spanとして公知例えば、ソルビタントリオレエートSpan85およびソルビタンモノラウレート。上記エマルジョン中に含めるための好ましい界面活性剤は、ポリソルベート80Tween80;ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Span85ソルビタントリオレエート、レシチンおよびTritonX-100である。これら界面活性剤の混合物は、上記エマルジョン中に含まれ得る例えば、Tween80/Span85混合物、もしくはTween80/Triton-X100混合物。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTween80およびオクトキシノール、例えば、t-オクチルフェノキシ-ポリエトキシエタノールTritonX-100の組み合わせもまた、適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス9とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび/またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、10~20の範囲のHLB値を有する界面活性剤例えば、ポリソルベート80HLB15.0を有するおよび1~10の範囲のHLB値を有する界面活性剤例えば、ソルビタントリオレエートHLB1.8を有するを含み得る。最終エマルジョン中の好ましい油の量容積は、2~20例えば、5~15、6~14、7~13、8~12である。約4~6もしくは約9~11のスクアレン含有量は、特に有用である。最終エマルジョン中の好ましい界面活性剤の量重量は、0.001~8である。例えば:ポリオキシエチレンソルビタンエステル例えば、ポリソルベート800.2~4、特に、0.4~0.6、0.45~0.55、約0.5もしくは1.5~2、1.8~2.2、1.9~2.1、約2、もしくは0.85~0.95、もしくは約1;ソルビタンエステル例えば、ソルビタントリオレエート0.02~2、特に、約0.5もしくは約1;オクチルもしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール例えば、TritonX-1000.001~0.1、特に、0.005~0.02;ポリオキシエチレンエーテル例えば、ラウレス90.1~8、好ましくは、0.1~10および特に、0.1~1もしくは約0.5。油および界面活性剤の絶対量、およびそれらの比は、広い制限内で変動し得るとはいえ、エマルジョンをなお形成する制限内で。当業者は、所望のエマルジョンを得るために上記成分の相対的割合を容易に変動できるが、油および界面活性剤について4:1~5:1の重量比が、代表的である油が過剰。エマルジョンの免疫刺激活性を確実にするために特に、大型動物において重要なパラメーターは、油滴サイズ直径である。最も有効なエマルジョンは、サブミクロン範囲にある液滴サイズを有する。適切には、上記液滴サイズは、範囲50~750nmにある。最も有用には、上記平均液滴サイズは、250nm未満例えば、200nm未満、150nm未満である。上記平均液滴サイズは、有用なことには、80~180nmの範囲にある。理想的には、上記エマルジョンの油滴のうちの少なくとも80数では、直径250nm未満であり、好ましくは、少なくとも90がそうである。エマルジョンにおいて平均液滴サイズ、およびサイズ分布を決定するための装置は、市販されている。これらは、代表的には、動的光散乱および/または単一粒子光学検知single-particleopticalsensing、例えば、ParticleSizingSystemsSantaBarbara,USAから入手可能なAccusizerTMおよびNicompTMのシリーズの機器、またはMalvernInstrumentsUK製のZetasizerTM機器、またはHoribaKyoto,Japan製のParticleSizeDistributionAnalyzer機器の技術を使用する。理想的には、液滴サイズの分布数では、唯一の最大を有するすなわち、2つの最大を有するものではなく、平均あたりに分布した液滴の単一集団があるモード。好ましいエマルジョンは、<0.4例えば、0.3、0.2もしくはこれより小さいの多分散性を有する。サブミクロンの液滴および狭いサイズ分布を有する適切なエマルジョンは、マイクロフルイダイゼーションmicrofluidisationの使用によって得られ得る。この技術は、高圧および高速で、幾何的に固定されたチャネルを通る投入成分の流れを推進させることによって、平均油滴サイズを低下させる。これら流れは、チャネル壁、チャンバー壁および互いと接する。結果として得られる剪断力、衝撃力およびキャビテーション力は、液滴サイズの低下を引き起こす。マイクロフルイダイゼーションの反復工程は、所望の液滴サイズ平均および分布を有するエマルジョンが達成されるまで行われ得る。マイクロフルイダイゼーションの代替として、参考文献19で開示されるように、熱的方法が、相反転を引き起こすために使用され得る。これら方法はまた、狭い粒径分布を有するサブミクロンエマルジョンを提供し得る。好ましいエマルジョンは、フィルター滅菌され得るすなわち、それらの液滴は、220nmフィルターを通過し得る。滅菌を提供するだけでなく、この手順はまた、上記エマルジョンにおける任意の大きな液滴を除去する。特定の実施形態において、上記エマルジョン中のカチオン性脂質は、DOTAPである。上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/mlDOTAPを含み得る。例えば、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、DOTAPを、約0.5mg/ml~約25mg/ml、約0.6mg/ml~約25mg/ml、約0.7mg/ml~約25mg/ml、0.8mg/ml~約25mg/ml、約0.9mg/ml~約25mg/ml、約1.0mg/ml~約25mg/ml、約1.1mg/ml~約25mg/ml、約1.2mg/ml~約25mg/ml、約1.3mg/ml~約25mg/ml、約1.4mg/ml~約25mg/ml、約1.5mg/ml~約25mg/ml、約1.6mg/ml~約25mg/ml、約1.7mg/ml~約25mg/ml、約0.5mg/ml~約24mg/ml、約0.5mg/ml~約22mg/ml、約0.5mg/ml~約20mg/ml、約0.5mg/ml~約18mg/ml、約0.5mg/ml~約15mg/ml、約0.5mg/ml~約12mg/ml、約0.5mg/ml~約10mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約2mg/ml、約0.5mg/ml~約1.9mg/ml、約0.5mg/ml~約1.8mg/ml、約0.5mg/ml~約1.7mg/ml、約0.5mg/ml~約1.6mg/ml、約0.6mg/ml~約1.6mg/ml、約0.7mg/ml~約1.6mg/ml、約0.8mg/ml~約1.6mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml、約1.0mg/ml、約1.1mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約12mg/ml、約18mg/ml、約20mg/ml、約21.8mg/ml、約24mg/mlなどにおいて含み得る。例示的実施形態において、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml~約1.6mg/mlDOTAP例えば、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/mlもしくは1.6mg/mlを含む。特定の実施形態において、上記カチオン性脂質は、DCコレステロールである。上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約5mg/mlDCコレステロールにおいてDCコレステロールを含み得る。例えば、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約5mg/ml、約0.2mg/ml~約5mg/ml、約0.3mg/ml~約5mg/ml、約0.4mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.62mg/ml~約5mg/ml、約1mg/ml~約5mg/ml、約1.5mg/ml~約5mg/ml、約2mg/ml~約5mg/ml、約2.46mg/ml~約5mg/ml、約3mg/ml~約5mg/ml、約3.5mg/ml~約5mg/ml、約4mg/ml~約5mg/ml、約4.5mg/ml~約5mg/ml、約0.1mg/ml~約4.92mg/ml、約0.1mg/ml~約4.5mg/ml、約0.1mg/ml~約4mg/ml、約0.1mg/ml~約3.5mg/ml、約0.1mg/ml~約3mg/ml、約0.1mg/ml~約2.46mg/ml、約0.1mg/ml~約2mg/ml、約0.1mg/ml~約1.5mg/ml、約0.1mg/ml~約1mg/ml、約0.1mg/ml~約0.62mg/ml、約0.15mg/ml、約0.3mg/ml、約0.6mg/ml、約0.62mg/ml、約0.9mg/ml、約1.2mg/ml、約2.46mg/ml、約4.92mg/mlなどのDCコレステロールを含み得る。例示的実施形態において、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.62mg/ml~約4.92mg/mlDCコレステロール例えば、2.46mg/mlを含む。特定の実施形態において、上記カチオン性脂質は、DDAである。上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約5mg/mlDDAを含み得る。例えば、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、DDAを、約0.1mg/ml~約5mg/ml、約0.1mg/ml~約4.5mg/ml、約0.1mg/ml~約4mg/ml、約0.1mg/ml~約3.5mg/ml、約0.1mg/ml~約3mg/ml、約0.1mg/ml~約2.5mg/ml、約0.1mg/ml~約2mg/ml、約0.1mg/ml~約1.5mg/ml、約0.1mg/ml~約1.45mg/ml、約0.2mg/ml~約5mg/ml、約0.3mg/ml~約5mg/ml、約0.4mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.6mg/ml~約5mg/ml、約0.73mg/ml~約5mg/ml、約0.8mg/ml~約5mg/ml、約0.9mg/ml~約5mg/ml、約1.0mg/ml~約5mg/ml、約1.2mg/ml~約5mg/ml、約1.45mg/ml~約5mg/ml、約2mg/ml~約5mg/ml、約2.5mg/ml~約5mg/ml、約3mg/ml~約5mg/ml、約3.5mg/ml~約5mg/ml、約4mg/ml~約5mg/ml、約4.5mg/ml~約5mg/ml、約1.2mg/ml、約1.45mg/mlなどにおいて含み得る。あるいは、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、DDAを、約20mg/ml、約21mg/ml、約21.5mg/ml、約21.6mg/ml、約25mg/mlにおいて含み得る。例示的実施形態において、上記カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.73mg/ml~約1.45mg/mlDDA例えば、1.45mg/mlを含む。患者に投与するための本発明の特定の好ましい組成物は、スクアレン、span85、ポリソルベート80、およびDOTAPを含む。例えば:スクアレンは、5~15mg/mlにおいて存在し得る;span85は、0.5~2mg/mlにおいて存在し得る;ポリソルベート80は、0.5~2mg/mlにおいて存在し得る;そしてDOTAPは、0.1~10mg/mlにおいて存在し得る。上記エマルジョンは、span85およびポリソルベート80を同じ量で含み得る容積で。上記エマルジョンは、界面活性剤より多くのスクアレンを含み得る。上記エマルジョンは、DOTAPより多くのスクアレンを含み得る。RNA本発明は、免疫原をコードするRNAのインビボ送達を包含する。上記RNAは、先天的免疫経路を誘発し得、また、翻訳され、上記免疫原の発現をもたらす。上記RNAは、プラス鎖であるので、それは、任意の介在複製工程interveningreplicationstep例えば、逆転写を必要とせずに、翻訳され得る。好ましいプラス鎖RNAは、自己複製性である。自己複製RNA分子レプリコンは、あらゆるタンパク質なしで哺乳動物細胞に送達される場合でも、上記自己複製RNA分子自体からの転写によって上記自己複製RNA分子自体から生じるアンチセンスコピーを介して、複数の娘RNAの生成をもたらし得る。自己複製RNA分子は、従って、代表的には、細胞への送達後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳は、RNA依存性RNAポリメラーゼを提供し、次いで、このことから、上記送達されるRNAからのアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方が生じる。従って、上記送達されるRNAは、複数の娘RNAの生成をもたらす。これら娘RNA、および同一線上collinearのサブゲノム転写物は、コードされる免疫原のインサイチュ発現を提供するためにそれ自体が翻訳されてもよいし、送達されたRNAと同じセンスのさらなる転写物上記免疫原のインサイチュ発現を提供するように翻訳されるを提供するように転写されてもよい。この一連の転写の全体的な結果は、上記導入されたレプリコンRNAの数の非常に多くの増幅であるので、上記コードされた免疫原は、上記細胞の主なポリペプチド生成物になる。自己複製を達成するための1つの適切なシステムは、アルファウイルスベースのRNAレプリコンを使用することである。これらプラス鎖レプリコンは、細胞への送達後に翻訳されて、レプリカーゼもしくはレプリカーゼ-転写酵素を与える。上記レプリカーゼは、上記送達されるプラス鎖RNAのゲノムマイナス鎖コピーを作り出す複製複合体を提供するように自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらマイナス鎖転写物は、これ自体が、上記プラス鎖親RNAのさらなるコピーを与え、そしてまた、上記免疫原をコードするサブゲノム転写物を与えるように転写され得る。従って、上記サブゲノム転写物の翻訳は、上記感染した細胞による上記免疫原のインサイチュ発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用し得る。変異型ウイルスもしくは野生型ウイルスの配列が使用され得る例えば、VEEVの弱毒化TC83変異体は、レプリコンにおいて使用されてきた[20]。好ましい自己複製RNA分子は、従って、i上記自己複製RNA分子からRNAを転写し得るRNA依存性RNAポリメラーゼ、およびii免疫原をコードする。上記ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ例えば、アルファウイルスタンパク質nsP1、nsP2、nsP3およびnsP4のうちの1種以上を含むであり得る。天然のアルファウイルスゲノムは、上記非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて、構造的ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明の自己複製RNA分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。従って、好ましい自己複製RNAは、細胞においてそれ自体のゲノムRNAコピーの生成をもたらし得るが、RNA含有ビリオンの生成はもたらさない。これらビリオンを生成できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、上記自己複製RNA分子が、感染性形態においてそれ自体を永続させられないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続に必要な上記アルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製RNAになく、それらの位置は、上記目的の免疫原をコードする遺伝子によってしめられている。その結果、上記サブゲノム転写物は、上記構造的アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく、上記免疫原をコードする。従って、本発明で有用な自己複製RNA分子は、2個のオープンリーディングフレームを有し得る。第1の5’側オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし;第2の3’側オープンリーディングフレームは、免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、上記RNAは、例えば、さらなる免疫原以下を参照のことをコードするために、もしくは補助ポリペプチドをコードするために、さらなる例えば、下流のオープンリーディングフレームを有し得る。自己複製RNA分子は、上記コードされるレプリカーゼと適合性である5’配列を有し得る。自己複製RNA分子は、種々の長さを有し得るが、それらは、代表的には、5000~25000ヌクレオチド長例えば、8000~15000ヌクレオチド、もしくは9000~12000ヌクレオチドである。従って、上記RNAは、siRNA送達において認められるものより長い。本発明で有用なRNA分子は、5’キャップ例えば、7-メチルグアノシンを有し得る。このキャップは、上記RNAのインビボ翻訳を増強し得る。本発明で有用なRNA分子の5’ヌクレオチドは、5’トリホスフェート基を有し得る。キャップされたRNAにおいて、これは、5’から5’への架橋を介して、7-メチルグアノシンに連結され得る。5’トリホスフェートは、RIG-I結合を増強し得る。RNA分子は、3’ポリ-Aテールを有し得る。それはまた、その3’末端付近にポリAポリメラーゼ認識配列例えば、AAUAAAを含み得る。本発明で有用なRNA分子は、代表的には、一本鎖である。一本鎖RNAは、一般には、TLR7、TLR8、RNAヘリカーゼおよび/もしくはPKRに結合することによってアジュバント効果を開始し得る。二本鎖形態dsRNAにおいて送達されたRNAは、TLR3に結合し得、このレセプターはまた、一本鎖RNAの複製の間に、もしくは一本鎖RNAの二次構造内のいずれかで形成されるdsRNAによって誘発され得る。本発明に有用なRNA分子は、便宜上、インビトロ転写IVTによって調製され得る。IVTは、細菌においてプラスミド形態において作られ、増やされたか、または合成で作製された例えば、遺伝子合成および/もしくはポリメラーゼ連鎖反応PCR操作法によってcDNAテンプレートを使用し得る。例えば、DNA依存性RNAポリメラーゼ例えば、バクテリオファージT7、T3もしくはSP6RNAポリメラーゼは、DNAテンプレートからRNAを転写するために使用され得る。適切なキャッピングおよびポリA付加反応は、必要時に使用され得るしかし、上記レプリコンのポリAは、通常、上記DNAテンプレート内にコードされる。これらRNAポリメラーゼは、転写される5’ヌクレオチドについてストリンジェントな要件を有し得、いくつかの実施形態において、これらの要件は、上記IVT転写RNAが、自己がコードするレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、上記コードされたレプリカーゼの要件とマッチしなければならない。参考文献21において考察されるように、上記自己複製RNAは、任意の5’キャップ構造に加えて改変された核酸塩基を有する1個以上のヌクレオチドを含み得る。従って、上記RNAは、以下を含み得る:m5C5-メチルシチジン、m5U5-メチルウリジン、m6AN6-メチルアデノシン、s2U2-チオウリジン、Um2’-O-メチルウリジン、m1Al-メチルアデノシン;m2A2-メチルアデノシン;Am2’-O-メチルアデノシン;ms2m6A2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン;i6AN6-イソペンテニルアデノシン;ms2i6A2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン;io6AN6-cis-ヒドロキシイソペンテニルアデノシン;ms2io6A2-メチルチオ-N6-cis-ヒドロキシイソペンテニルアデノシン;g6AN6-グリシニルカルバモイルアデノシン;t6AN6-スレオニルカルバモイルアデノシン;ms2t6A2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン;m6t6AN6-メチル-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン;hn6AN6.-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;ms2hn6A2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;Arp2’-O-リボシルアデノシンホスフェート;Iイノシン;m111-メチルイノシン;m’Im1,2’-O-ジメチルイノシン;m3C3-メチルシチジン;Cm2T-O-メチルシチジン;s2C2-チオシチジン;ac4CN4-アセチルシチジン;f5C5-ホルミルfonnylシチジン;m5Cm5,2-O-ジメチルシチジン;ac4CmN4アセチル2TOメチルシチジン;k2Cリシジン;m1G1-メチルグアノシン;m2GN2-メチルグアノシン;m7G7-メチルグアノシン;Gm2’-O-メチルグアノシン;m22GN2,N2-ジメチルグアノシン;m2GmN2,2’-O-ジメチルグアノシン;m22GmN2,N2,2’-O-トリメチルグアノシン;Grp2’-O-リボシルグアノシンホスフェート;yWワイブトシン;o2yWペルオキシワイブトシン;OHyWヒドロキシワイブトシン;OHyW改変下undermodifiedヒドロキシワイブトシン;imGワイオシン;mimGメチルグアノシン;Qキューオシン;oQエポキシキューオシン;galQガラクトシルgaltactosyl-キューオシン;manQマンノシル-キューオシン;preQo7-シアノ-7-デアザグアノシン;preQi7-アミノメチル-7-デアザグアノシン;Gアルカエオシンarchaeosine;Dジヒドロウリジン;m5Um5,2’-O-ジメチルウリジン;s4U4-チオウリジン;m5s2U5-メチル-2-チオウリジン;s2Um2-チオ-2’-O-メチルウリジン;acp3U3-3-アミノ-3-カルボキシプロピルウリジン;ho5U5-ヒドロキシウリジン;mo5U5-メトキシウリジン;cmo5Uウリジン5-オキシ酢酸;mcmo5Uウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル;chm5U5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン;mchm5U5-カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル;mcm5U5-メトキシカルボニルメチルウリジン;mcm5UmS-メトキシカルボニルメチル-2-O-メチルウリジン;mcm5s2U5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン;nm5s2U5-アミノメチル-2-チオウリジン;mnm5U5-メチルアミノメチルウリジン;mnm5s2U5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン;mnm5se2U5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン;ncm5U5-カルバモイルメチルウリジン;ncm5Um5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン;cmnm5U5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン;cnmm5Um5-カルボキシメチルアミノメチル-2-L-Oメチルウリジン;cmnm5s2U5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン;m62AN6,N6-ジメチルアデノシン;Tm2’-O-メチルイノシン;m4CN4-メチルシチジン;m4CmN4,2-O-ジメチルシチジン;hm5C5-ヒドロキシメチルシチジン;m3U3-メチルウリジン;cm5U5-カルボキシメチルウリジン;m6AmN6,T-O-ジメチルアデノシン;rn62AmN6,N6,O-2-トリメチルアデノシン;m2’7GN2,7-ジメチルグアノシン;m2’2’7GN2,N2,7-トリメチルグアノシン;m3Um3,2T-O-ジメチルウリジン;m5D5-メチルジヒドロウリジン;f5Cm5-ホルミル-2’-O-メチルシチジン;m1Gm1,2’-O-ジメチルグアノシン;m’Am1,2-O-ジメチルアデノシンイリノメチルウリジン;tm5s2US-タウリノメチル-2-チオウリジン;imG-144-デメチルグアノシン;imG2イソグアノシン;もしくはac6AN6-アセチルアデノシン、ヒポキサンチン、イノシン、8-オキソ-アデニン、7-置換されたその誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-アミノウラシル、5-C1-C6-アルキルウラシル、5-メチルウラシル、5-C2-C6-アルケニルウラシル、5-C2-C6-アルキニルウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、5-クロロウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシシトシン、5-C1-C6-アルキルシトシン、5-メチルシトシン、5-C2-C6-アルケニルシトシン、5-C2-C6-アルキニルシトシン、5-クロロシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、N2-ジメチルグアニン、7-デアザグアニン、8-アザグアニン、7-デアザ-7-置換グアニン、7-デアザ-7-C2-C6アルキニルグアニン、7-デアザ-8-置換グアニン、8-ヒドロキシグアニン、6-チオグアニン、8-オキソグアニン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,4-ジアミノプリン、2,6-ジアミノプリン、8-アザプリン、置換された7-デアザプリン、7-デアザ-7-置換プリン、7-デアザ-8-置換プリン、または無塩基ヌクレオチド。例えば、自己複製RNAは、1つ以上の改変されたピリミジン核酸塩基例えば、シュードウリジンおよび/もしくは5-メチルシトシン残基を含み得る。しかし、いくつかの実施形態において、上記RNAは、改変された核酸塩基を含まず、改変されたヌクレオチドを含まなくてもよいすなわち、上記RNA中のヌクレオチドのすべては、標準的なA、C、GおよびUというリボヌクレオチドである任意の5’キャップ構造を除く。これは、7’-メチルグアノシンを含み得る。他の実施形態において、上記RNAは、7’-メチルグアノシンを含む5’キャップを含み得、最初の1個、2個もしくは3個の5’リボヌクレオチドは、リボースの2’位においてメチル化され得る。本発明で使用されるRNAは、理想的には、ヌクレオチド間にホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態において、それは、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、および/もしくはメチルホスホネート結合を含み得る。理想的には、投与されるRNAは、10種より少ない種の異なるRNA例えば、5種、4種、3種、もしくは2種の異なる種を含み;最も好ましくは、組成物は、単一のRNA種を含むすなわち、上記組成物中の例えば、リポソーム内のすべてのRNA分子は、同じ配列および同じ長さを有する。免疫原本発明で使用されるRNA分子は、ポリペプチド免疫原をコードする。上記RNAの投与後に、上記免疫原は、インビボで翻訳され、レシピエントにおける免疫応答を誘発し得る。上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してあるいは、いくつかの実施形態において、アレルゲンに対して;および他の実施形態において、腫瘍抗原に対して免疫応答を誘発し得る。上記免疫応答は、抗体応答通常は、IgGを含むおよび/もしくは細胞媒介性免疫応答を含み得る。上記ポリペプチド免疫原は、代表的には、対応する細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物またはアレルゲンもしくは腫瘍ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物のサッカリドを認識する免疫応答を誘発するように、ミモトープとして作用し得る。上記免疫原は、代表的には、表面ポリペプチド例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質などである。RNA分子は、単一のポリペプチド免疫原もしくは複数のポリペプチドをコードし得る。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原融合ポリペプチドとして、または別個のポリペプチドとして提示され得る。免疫原が、別個のポリペプチドとして発現される場合、これらのうちの1種以上は、上流のIRESもしくはさらなるウイルスプロモーターエレメントとともに提供され得る。あるいは、複数の免疫原は、短い自己触媒性プロテアーゼ例えば、口蹄疫ウイルス2Aタンパク質に融合された個々の免疫原をコードするポリプロテインから、またはインテインとして発現され得る。参考文献1および22とは異なり、上記RNAは、免疫原をコードする。不確かさを避けるために、本発明は、ホタルルシフェラーゼをコードするRNA、E.coliβ-ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードするRNA、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするRNAを含まない。また、上記RNAは、全マウス胸腺RNAではない。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これら細菌のうちの1種に対して免疫応答を誘発する:Neisseriameningitidis:有用な免疫原としては、膜タンパク質、例えば、アドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、およびH因子結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。3種の有用なポリペプチドの組み合わせが、参考文献23に開示される。Streptococcuspneumoniae:有用なポリペプチド免疫原は、参考文献24に開示される。これらとしては、RrgB線毛サブユニット、β-N-アセチル-ヘキソサミニダーゼ前駆体spr0057、spr0096、一般的なストレスタンパク質generalstressproteinGSP-781spr2021、SP2216、セリン/スレオニンキナーゼStkPSP1732、および肺炎球菌表面アドヘシンPsaAが挙げられるが、これらに限定されない。Streptococcuspyogenes:有用な免疫原としては、参考文献25および26に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。MoraxellacatarrhalisBordetellapertussis:有用な百日咳免疫原としては、百日咳毒素もしくはトキソイドPT、線維状ヘマグルチニンFHA、ペルタクチン、ならびに凝集原2および3が挙げられるが、これらに限定されない。Staphylococcusaureus:有用な免疫原としては、参考文献27に開示されるポリペプチド例えば、溶血素、esxA、esxB、フェリクロム結合タンパク質sta006および/もしくはsta011リポプロテインが挙げられるが、これらに限定されない。Clostridiumtetani:代表的な免疫原は、破傷風トキソイドである。Cornynebacteriumdiphtheriae:代表的な免疫原は、ジフテリアトキソイドである。Haemophilusinfluenzae:有用な免疫原としては、参考文献28および29に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。PseudomonasaeruginosaStreptococcusagalactiae:有用な免疫原としては、参考文献25に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。Chlamydiatrachomatis:有用な免疫原としては、PepA、LcrE、ArtJ、DnaK、CT398、OmpH様、L7/L12、OmcA、AtoS、CT547、Eno、HtrAおよびMurG例えば、参考文献30に開示されるとおりが挙げられるが、これらに限定されない。LcrE[31]およびHtrA[32]は、2つの好ましい免疫原である。Chlamydiapneumoniae:有用な免疫原としては、参考文献33に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。Helicobacterpylori:有用な免疫原としては、CagA、VacA、NAP、および/もしくはウレアーゼ[34]が挙げられるが、これらに限定されない。Escherichiacoli:有用な免疫原としては、腸毒素産生性E.coliETEC、腸管凝集性E.coliEAggEC、分散接着性diffuselyadheringE.coliDAEC、腸病原性E.coliEPEC、腸管外病原性E.coliExPECおよび/もしくは腸管出血性E.coliEHECに由来する免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。ExPEC株としては、尿路病原性E.coliUPECおよび髄膜炎/敗血症関連E.coliMNECが挙げられる。有用なUPECポリペプチド免疫原は、参考文献35および36に開示される。有用なMNEC免疫原は、参考文献37に開示される。いくつかのE.coliタイプに有用な免疫原は、AcfDである[38]。BacillusanthracisYersiniapestis:有用な免疫原としては、参考文献39および40に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これらウイルスのうちの1種に対して免疫応答を誘発する:オルソミクソウイルス:有用な免疫原は、インフルエンザA、BもしくはCウイルスに由来し得る例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼもしくはマトリクスM2タンパク質。上記免疫原がインフルエンザAウイルスヘマグルチニンである場合、それは、任意のサブタイプ例えば、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15もしくはH16に由来し得る。パラミクソウイルス科のウイルス:ウイルス免疫原としては、肺炎ウイルス例えば、RSウイルス、RSV、ルブラウイルス例えば、ムンプスウイルス、パラミクソウイルス例えば、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス例えば、麻疹ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ポックスウイルス科:ウイルス免疫原としては、オルトポックスウイルス例えば、真正痘瘡大痘瘡および小痘瘡が挙げられるが、これらに限定されないに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ピコルナウイルス:ウイルス免疫原としては、ピコルナウイルス例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記エンテロウイルスは、ポリオウイルス例えば、1型、2型、および/もしくは3型のポリオウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、EV71エンテロウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、コクサッキーAもしくはBウイルスである。ブンヤウイルス:ウイルス免疫原としては、オルソブンヤウイルス例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス、フレボウイルス例えば、リフトバレー熱ウイルス、もしくはナイロウイルス例えば、クリミアコンゴ出血熱ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ヘパルナウイルス:ウイルス免疫原としては、ヘパルナウイルス例えば、A型肝炎ウイルスHAVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。フィロウイルス:ウイルス免疫原としては、フィロウイルス例えば、エボラウイルスザイールエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、レストンエボラウイルスもしくはスーダンエボラウイルスを含むまたはマールブルグウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。トガウイルス:ウイルス免疫原としては、トガウイルス例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、もしくはアルテリウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。これは、風疹ウイルスを含む。フラビウイルス:ウイルス免疫原としては、フラビウイルス例えば、ダニ媒介脳炎TBEウイルス、デング1、2、3もしくは4型ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ペスチウイルス:ウイルス免疫原としては、ペスチウイルス例えば、牛ウイルス性下痢BVDV、豚コレラCSFVもしくはボーダー病BDVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ヘパドナウイルス:ウイルス免疫原としては、ヘパドナウイルス例えば、B型肝炎ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、B型肝炎ウイルス表面抗原HBsAgを含み得る。他の肝炎ウイルス:組成物は、C型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、もしくはG型肝炎ウイルスに由来する免疫原を含み得る。ラブドウイルス:ウイルス免疫原としては、ラブドウイルス例えば、リッサウイルス例えば、狂犬病ウイルスおよびベシクロウイルスVSVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。カリシウイルス科:ウイルス免疫原としては、カリシウイルス科例えば、ノーウォークウイルスノロウイルス、およびノーウォーク様ウイルス例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。コロナウイルス:ウイルス免疫原は、SARSコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎IBV、マウス肝炎ウイルスMHV、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルスTGEVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチドであり得る。レトロウイルス:ウイルス免疫原としては、オンコウイルス、レンチウイルス例えば、HIV-1もしくはHIV-2またはスプマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。レオウイルス:ウイルス免疫原としては、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、もしくはコルチウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。パルボウイルス:ウイルス免疫原としては、パルボウイルスB19に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ヘルペスウイルス:ウイルス免疫原としては、ヒトヘルペスウイルス例えば、例示に過ぎないが、単純ヘルペスウイルスHSV例えば、HSV1型および2型、水痘帯状疱疹ウイルスVZV、エプスタインバーウイルスEBV、サイトメガロウイルスCMV、ヒトヘルペスウイルス6HHV6、ヒトヘルペスウイルス7HHV7、およびヒトヘルペスウイルス8HHV8に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。パポバウイルス:ウイルス免疫原としては、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記ヒトパピローマウイルスは、血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63もしくは65のもの例えば、血清型6、11、16および/もしくは18のうちの1種以上に由来するであり得る。アデノウイルス:ウイルス免疫原としては、アデノウイルス血清型36Ad-36に由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、魚類に感染するウイルス例えば:伝染性サケ貧血ウイルスISAV、サケ膵臓病ウイルスSPDV、伝染性膵臓壊死症ウイルスIPNV、アメリカナマズウイルスCCV、魚類リンホシスチス病ウイルスFLDV、伝染性造血器壊死症ウイルスIHNV、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス大西洋サケピコルナ様ウイルスとしても公知、ヤマメウイルスLSV、大西洋サケロタウイルスASR、マスイチゴ病ウイルスTSD、銀ザケ腫瘍ウイルスCSTV、もしくはウイルス性出血性敗血症ウイルスVHSVに対する免疫応答を誘発する。真菌免疫原は、皮膚糸状菌類Dermatophytres以下が挙げられる:に由来し得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Plasmodium属例えば、P.falciparum、P.vivax、P.malariaeもしくはP.ovaleに由来する寄生生物に対する免疫応答を誘発する。従って、本発明は、マラリアに対して免疫化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Caligidae科に由来する寄生生物、特に、Lepeophtheirus属およびCaligus属に由来する寄生生物例えば、LepeophtheirussalmonisもしくはCaligusrogercresseyiのようなフナムシに対する免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する:花粉アレルゲン樹木花粉、草本花粉、雑草の花粉、および草の花粉のアレルゲン;昆虫もしくは蛛形類のアレルゲン吸入、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよび小虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲンhymenoptheravenomallergen;動物の毛およびふけのアレルゲン例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどに由来する;ならびに食物アレルゲン例えば、グリアジン。樹木、草および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、Fagales、Oleales、Pinalesの分類学上の目およびスズカケノキ科platanaceaeカバノキBetula、ハンノキAlnus、ハシバミCorylus、シデCarpinusおよびオリーブOlea、シーダーCryptomeriaおよびJuniperus、プラタナスPlatanusが挙げられるが、これらに限定されない、Poalesの目属Lolium、Phleum、Poa、Cynodon、Dactylis、Holcus、Phalaris、Secale、およびSorghumの草が挙げられる、AsteralesおよびUrticalesの目属Ambrosia、Artemisia、およびParietariaの草本が挙げられるから由来するそのようなものである。他の重要な吸入アレルゲンは、属DermatophagoidesおよびEuroglyphusのチリダニ類、コナダニ類storagemite例えば、Lepidoglyphys、GlycyphagusおよびTyrophagus、ゴキブリ、小虫およびノミに由来するもの例えば、Blatella、Periplaneta、ChironomusおよびCtenocepphalides、ならびに哺乳動物例えば、ネコ、イヌおよびウマに由来するもの、毒液のアレルゲン刺咬昆虫stingingorbitinginsectに由来するようなもの、例えば、Hymenopteraの分類学上の目蜂Apidae、スズメバチVespidea、およびアリFormicoidaeが挙げられるが挙げられるに由来するものである。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である:aがん-精巣cancer-testis抗原、例えば、NY-ESO-1、SSX2、SCP1ならびにRAGE、BAGE、GAGEおよびMAGEファミリーのポリペプチド例えば、GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、およびMAGE-12、これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、NSCLC、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用され得る;b変異した抗原、例えば、p53種々の固形腫瘍例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がんと関連、p21/Ras例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連、CDK4例えば、黒色腫と関連、MUM1例えば、黒色腫と関連、カスパーゼ-8例えば、頭頸部がんと関連、CIA0205例えば、膀胱がんと関連、HLA-A2-R1701、β-カテニン例えば、黒色腫と関連、TCR例えば、T細胞非ホジキンリンパ腫と関連、BCR-abl例えば、慢性骨髄性白血病と関連、トリオースホスフェートイソメラーゼ、KIA0205、CDC-27、およびLDLR-FUT;c過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン4例えば、結腸直腸がんと関連、ガレクチン9例えば、ホジキン病と関連、プロテイナーゼ3例えば、慢性骨髄性白血病と関連、WT1例えば、種々の白血病と関連、炭酸脱水酵素例えば、腎がんと関連、アルドラーゼA例えば、肺がんと関連、PRAME例えば、黒色腫と関連、HER-2/neu例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連、マンマグロビン、α-フェトプロテイン例えば、肝がんと関連、KSA例えば、結腸直腸がんと関連、ガストリン例えば、膵臓がんおよび胃がんと関連、テロメラーゼ触媒タンパク質、MUC-1例えば、乳がんおよび卵巣がんと関連、G-250例えば、腎細胞がんと関連、p53例えば、乳がん、結腸がんと関連、ならびにがん胎児性抗原例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん例えば、結腸直腸がんと関連;d共通抗原sharedantigen、例えば、黒色腫-メラノサイト分化抗原、例えば、MART-1/MelanA、gp100、MC1R、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質-1/TRP1およびチロシナーゼ関連タンパク質-2/TRP2例えば、黒色腫と関連;e前立腺関連抗原例えば、PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2例えば、前立腺がんと関連;fイムノグロブリンイディオタイプ例えば、骨髄腫およびB細胞リンパ腫と関連。特定の実施形態において、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、エプスタインバーウイルス抗原、EBNA、ヒトパピローマウイルスHPV抗原E6およびE7を含む、B型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイルスの抗原、ヒトTリンパ球向性ウイルス抗原、Mac-2結合タンパク質/シクロフィリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、TPSなど。薬学的組成物RNAは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物における成分として投与される。これら組成物は、代表的には、上記RNAに加えて、しばしば、上記で記載されるように送達システムの一部として薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアの詳細な考察は、参考文献41において入手可能である。本発明の薬学的組成物は、1種以上の低分子免疫強化因子を含み得る。例えば、上記組成物は、TLR2アゴニスト例えば、Pam3CSK4、TLR4アゴニスト例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート例えば、E6020、TLR7アゴニスト例えば、イミキモド、TLR8アゴニスト例えば、レシキモドおよび/もしくはTLR9アゴニスト例えば、IC31を含み得る。任意のこのようなアゴニストは、理想的には、分子量<2000Daを有する。RNAが被包される場合、いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記RNAとともに被包されるが、他の実施形態において、それらは、被包されない。RNAが粒子に吸着させられる場合、いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記RNAと一緒に吸着させられるが、他の実施形態において、それらは吸着させられない。本発明の薬学的組成物は、上記粒子を、ただの水plainwater例えば、w.f.i.もしくは緩衝液例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液中に含み得る。緩衝塩は、代表的には、5~20mM範囲において含まれる。本発明の薬学的組成物は、5.0~9.5例えば、6.0~8.0のpHを有し得る。本発明の組成物は、張度を与えるために、ナトリウム塩例えば、塩化ナトリウムを含み得る。10±2mg/mlNaClの濃度が代表的である例えば、約9mg/ml。本発明の組成物は、金属イオンキレート化剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速し得るイオンを除去することによって、RNA安定性を延長し得る。従って、組成物は、EDTA、EGTA、BAPTA、ペンテト酸などのうちの1種以上を含み得る。このようなキレート化剤は、代表的には、10~500μM例えば、0.1mMで存在する。クエン酸塩例えば、クエン酸ナトリウムはまた、キレート化剤として作用し得るのと同時に、有利なことには、緩衝化活性も提供し得る。本発明の薬学的組成物は、200mOsm/kg~400mOsm/kg例えば、240~360mOsm/kg、もしくは290~310mOsm/kgの重量オスモル濃度を有し得る。本発明の薬学的組成物は、1種以上の保存剤例えば、チオメルサールもしくは2-フェノキシエタノールを含み得る。水銀非含有組成物が好ましく、保存剤非含有ワクチンが調製され得る。本発明の薬学的組成物は、好ましくは、無菌である。本発明の薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性である例えば、1用量あたり<1EUエンドトキシンユニット、標準尺度、および好ましくは、1用量あたり<0.1EUを含む。本発明の薬学的組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。本発明の薬学的組成物は、単位用量形態において調製され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、0.1~1.0ml例えば、約0.5mlの容積を有し得る。上記組成物は、注射物として調製され得る溶液もしくは懸濁物のいずれかとして。上記組成物は、微細スプレーを使用する、肺投与例えば、吸入器によるのために調製され得る。上記組成物は、鼻、耳もしくは眼への投与例えば、スプレーもしくは滴剤としてのために調製され得る。筋肉内投与のための注射物が、代表的である。本発明の組成物のRNA含有量は、RNA/単位用量の量に関して表される。RNAは、利用可能な技術を使用して、容易に定量される。RNAは、リボソームと組み合わせて送達されないので、本発明の薬学的組成物はリボソームを含まない。処置方法および医療的使用本発明に従うRNA送達は、目的の免疫原に対してインビボで免疫応答を誘発するためのものである。上記免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および/もしくは細胞媒介性免疫を含む。上記方法は、ブースター応答を惹起し得る。免疫応答を惹起することによって、上記哺乳動物は、種々の疾患および/もしくは感染に対して例えば、上記で考察されるように、細菌性疾患および/もしくはウイルス性疾患に対して防御され得る。RNA含有組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防的すなわち、感染を妨げるためもしくは治療的すなわち、感染を処置するためのいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。本発明に従って免疫化される哺乳動物は、大型動物例えば、ヒトもしくは大型脊椎哺乳動物例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ、ラクダ、アンテロープ、ゾウである。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児例えば、幼児もしくは乳児もしくはティーンエイジャーである;上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、ティーンエイジャーもしくは成人である。小児用に意図されたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。従って、ヒト患者は、1歳未満、5歳未満、1~5歳、5~15歳、15~55歳、もしくは少なくとも55歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者例えば、≧50歳、≧60歳、および好ましくは、≧65歳、若年者例えば、≦5歳、入院患者、ヘルスケアワーカー、軍従事者および軍職員、妊婦、慢性疾患患者、もしくは免疫不全患者である。しかし、上記ワクチンは、これらの群にのみ適切であるわけではなく、より一般に、集団において使用され得る。本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間隙空間に;参考文献1とは異なり、舌内注射intraglossalinjectionは、代表的には、本発明で使用されない;または粘膜的に例えば、直腸、経口例えば、錠剤、スプレー、膣、局所、経真皮transdermalもしくは経皮transcutaneous、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与達成され得る。注射は、針を介してであってもよい例えば、皮下針が、針なし注射が、代わりに使用され得る。代表的な筋肉内用量は、0.5mlである。本発明は、全身免疫および/もしくは粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身免疫および/もしくは粘膜免疫を誘発するために、使用され得る。投与は、単一単位用量スケジュールもしくは複数単位用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および/もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路例えば、非経口の一次と粘膜のブースト、粘膜の一次と非経口のブーストなどによって与えられ得る。複数用量は、代表的には、少なくとも1週間間隔を空けて例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など投与される。一実施形態において、単位用量は、生後約6週間、10週間、および14週間で例えば、世界保健機関の予防接種拡大計画EPIにおいてしばしば使用されるように、6週齢、10週齢および14週齢において投与され得る。代替の実施形態において、2回の一次単位用量が、約2ヶ月間間隔を空けて例えば、約7週間、8週間もしくは9週間間隔を空けて投与され、続いて、1回以上のブースター単位用量が、2回目の一次用量の約6ヶ月から1年後に例えば、2回目の一次用量の約6ヶ月後、8ヶ月後、10ヶ月後もしくは12ヶ月後に投与される。さらなる実施形態において、3回の一次用量が、約2ヶ月間間隔を空けて例えば、約7週間、8週間もしくは9週間間隔を空けて投与され、続いて、1回以上のブースター用量が、3回目の一次用量の約6ヶ月後から1年後に例えば、3回目の一次用量の約6ヶ月後、8ヶ月後、10ヶ月後もしくは12ヶ月後に投与される。一般的実施形態本発明のいくつかの実施形態において、上記RNAは、改変なしのヌクレオチドを含む上記を参照のこと。他の実施形態において、上記RNAは、必要に応じて、少なくとも1つの改変ヌクレオチドを含み得るが、以下の特徴のうちの1つ以上既に上記で開示されているもまた、必要とされる:A.上記RNAがリポソームとともに送達される場合、上記リポソームは、DSDMA、DODMA、DLinDMAおよび/もしくはDLenDMAを含む。B.上記RNAがリポソームに被包される場合、上記リポソーム中の脂質の親水性部分は、PEG化される。C.上記RNAがリポソームに被包される場合、上記リポソームの数で少なくとも80が、20~220nmの範囲の直径を有する。D.上記RNAが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子は、非毒性でかつ生分解性のポリマー微粒子である。E.上記RNAが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子は、0.02μm~8μmの範囲の直径を有する。F.上記RNAが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子の数で少なくとも80は、0.03~7μmの範囲の直径を有する。G.上記RNAが微粒子とともに送達される場合、上記組成物は、凍結乾燥される。H.上記RNAがエマルジョンとともに送達される場合、上記エマルジョンは、生分解性油例えば、スクアレンを含む。I.上記RNAがエマルジョンとともに送達される場合、上記エマルジョンは、1種以上のカチオン性分子、例えば、1種以上のカチオン性脂質を含む。J.上記RNAは3’ポリAテールを有し、上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る。K.上記RNAは、iリポソーム、ii非毒性でかつ生分解性のポリマー微粒子、iiiカチオン性のサブミクロンの水中油型エマルジョンから選択される送達系を用いて、金属イオンキレート化剤との組み合わせにおいて送達される。一般本発明の粒子は、別段示されなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の、当該分野の技術内の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、参考文献42~48などを参照のこと。用語含むcomprisingは、含むincludingならびにからなるconsistingを包含し、例えば、Xを含むcomprising組成物は、Xから専らなってもよいし、何かさらなるものを含んでいてもよい例えば、XY。数値xに関して用語約とは、選択的であり、例えば、x±10を意味する。語句実質的にとは、完全にを排除せず、例えば、Yを実質的に含まない組成物は、Yを完全に含まない場合もある。必要な場合、語句実質的には、本発明の定義から省略され得る。電荷、カチオン、アニオン、両性イオンなどへの言及は、pH7において取り扱われる。TLR3は、Toll様レセプター3である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のTLR3アゴニストは、ポリI:Cを含む。TLR3は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:11849である。ヒトTLR3遺伝子のRefSeq配列は、GI:2459625である。TLR7は、Toll様レセプター7である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のTLR7アゴニストは、例えば、イミキモドを含む。TLR7は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:15631である。ヒトTLR7遺伝子のRefSeq配列は、GI:67944638である。TLR8は、Toll様レセプター8である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のTLR8アゴニストは、例えば、レシキモドを含む。TLR8は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:15632である。ヒトTLR8遺伝子のRefSeq配列は、GI:20302165である。RIG-I様レセプターRLRファミリーは、先天的免疫系において重要な役割を果たす種々のRNAヘリカーゼを含む[49]。RLR-1RIG-Iもしくはレチノイン酸誘導性遺伝子Iとしても公知は、そのN末端付近にある2つのカスパーゼリクルートドメインを有する。上記RLR-1ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたHGNC名は、DDX58DEADAsp-Glu-Ala-Aspボックスポリペプチド58DEADAsp-Glu-Ala-Aspboxpolypeptide58についてであり、その特有のHGNCIDは、HGNC:19102である。ヒトRLR-1遺伝子のRefSeq配列は、GI:77732514である。RLR-2MDA5もしくは黒色腫分化関連遺伝子5melanomadifferentiation-associatedgene5としても公知はまた、そのN末端付近にある2つのカスパーゼリクルートドメインを有する。RLR-2ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたHGNC名は、IFIH1ヘリカーゼCドメイン1で誘導されるインターフェロンinterferoninducedwithhelicaseCdomain1についてであり、特有のHGNCIDは、HGNC:18873である。ヒトRLR-2遺伝子のRefSeq配列は、GI:27886567である。RLR-3LGP2もしくは遺伝学および生理学研究室2laboratoryofgeneticsandphysiology2としても公知は、カスパーゼリクルートドメインを有さない。RLR-3ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたHGNC名は、DHX58DEXHAsp-Glu-X-Hisボックスポリペプチド58についてであり、特有のHGNCIDは、HGNC:29517である。ヒトRLR-3遺伝子のRefSeq配列は、GI:149408121である。PKRは、二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼである。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす。EIF2AK2真核生物翻訳開始因子2-αキナーゼ2eukaryotictranslationinitiationfactor2-alphakinase2については、この酵素をコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:9437である。ヒトPKR遺伝子のRefSeq配列は、GI:208431825である。発明を実施するための態様RNAレプリコン種々のレプリコンは、以下で使用される。一般に、これらは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスVEEVに由来する非構造タンパク質、シンドビスウイルス由来のパッケージングシグナル、およびシンドビスウイルスもしくはVEEV変異体に由来する3’UTRを有するハイブリッドアルファウイルスゲノムに基づく。上記レプリコンは、約10kb長であり、ポリAテールを有する。アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドDNA名称:pT7-mVEEV-FL.RSVFもしくはA317;pT7-mVEEV-SEAPもしくはA306;pSP6-VCR-GFPもしくはA50を、インビボでのRNA合成のテンプレートとして供した。上記レプリコンは、RNA複製に必要とされるアルファウイルス遺伝的エレメントを含むが、粒子アセンブリに必要な遺伝子産物をコードするエレメントを欠いている;構造タンパク質は、代わりに、目的のタンパク質レポーター例えば、SEAPもしくはGFPまたは免疫原例えば、全長RSVFタンパク質のいずれかによって置き換えられるので、上記レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導できない。上記アルファウイルスcDNAの上流にあるバクテリオファージT7もしくはSP6プロモーターは、インビトロで上記レプリコンRNAの合成を促進し、上記ポリAテールの直ぐ下流にあるデルタ型肝炎ウイルスHDVリボザイムは、その自己切断活性を介して正確な3’末端を生成する。適切な制限エンドヌクレアーゼで上記HDVリボザイムの下流で上記プラスミドDNAを直線状にした後に、ランオフ転写物run-offtranscriptを、T7もしくはSP6バクテリオファージ由来DNA依存性RNAポリメラーゼを使用して、インビトロで合成した。転写を、製造業者Ambionによって提供される指示書に従って、ヌクレオシドトリホスフェートATP、CTP、GTPおよびUTPの各々の7.5mMT7RNAポリメラーゼもしくは5mMSP6RNAポリメラーゼの存在下で、37°Cにおいて2時間にわたって行った。転写の後、上記テンプレートDNAを、TURBODNaseAmbionで消化した。上記レプリコンRNAを、LiClで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップのないRNAを、ScriptCapm7GキャッピングシステムEpicentreBiotechnologiesを使用して、ユーザーマニュアルに概説されるとおり、ワクシニアキャッピング酵素VCEで転写後にキャップした;このようにキャップしたレプリコンに、vの接頭文字を付ける例えば、vA317は、VCEによってキャップされたA317レプリコンである。転写後キャップされたRNAを、LiClで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。上記RNAサンプルの濃度を、OD260nmを測定することによって決定した。上記インビトロ転写物の完全性を、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。PLG吸着微粒子を、500mgのPLGRG50350:50ラクチド/グリコリドモル比、MW約30kDaおよび20mgのDOTAPを使用して、OmniMacroHomogenizerを使用して作製した。上記粒子懸濁物を、150rpmにおいて一晩振盪し、次いで、2~8°Cで貯蔵するために、40μm滅菌フィルタを通して濾過した。自己複製RNAを、上記粒子に吸着させた。1mLのPLG/RNA懸濁物を調製するために、PLG粒子懸濁物の必要容積をバイアルに添加し、ヌクレアーゼ非含有水を添加して、容積900μLにした。100μLRNA10μg/mLを、一定に振盪しながら上記PLG懸濁物に滴下した。PLG/RNAを、室温において30分間にわたってインキュベートした。再構成懸濁物1mLについて、45mgマンニトール、15mgスクロースおよび250~500μgのPVAを添加した。上記バイアルを-80°Cで凍結し、凍結乾燥した。RNA吸着を評価するために、100μL粒子懸濁物を、10,000rpmにおいて5分間にわたって遠心分離し、上清を集めた。PLG/RNAを、1mLヌクレアーゼ非含有水を使用して再構成した。100μL粒子懸濁物1μgRNAに、1mg硫酸ヘパリンを添加した。上記混合物をボルテックスし、室温において30分間にわたってRNA脱着のために静置させた。粒子懸濁物を遠心分離し、上清を集めた。RNAse安定性に関しては、100μL粒子懸濁物を、6.4mAUのRNaseAとともに室温において30分間にわたってインキュベートした。RNAseを、0.126mAUのプロテイナーゼKで、55°Cにおいて10分間にわたって不活性化した。1mgの硫酸ヘパリンを添加して、上記RNAを脱着させ、続いて、遠心分離した。RNAを含むその上清サンプルを、ホルムアルデヒドローディング色素と混合し、65°Cにおいて10分間にわたって加熱し、1変性ゲル1レーンあたり460ngRNAをローディングを使用して分析した。発現を評価するために、Balb/cマウスを、0日目に、100μL筋肉内注射容積50μL/脚中の1μgRNAで免疫化した。血清を、1日目、3日目および6日目に集めた。タンパク質発現を、化学発光アッセイを使用して決定した。図3に示される様に、発現は、任意の送達粒子なし丸よりも、RNAをPLG三角によって送達した場合に高かった。カチオン性ナノエマルジョン水中油型エマルジョンを、スクアレン、span85、ポリソルベート80、および種々の量のDOTAPをマイクロフルイダイズすることによって調製した。簡潔には、油溶性成分スクアレン、span85、カチオン性脂質、脂質界面活性剤を、ビーカー中で合わせ、脂質成分を有機溶媒中に溶解した。得られた脂質溶液を、油相に直接添加した。上記溶媒を、室温において2時間にわたって、換気フード中で蒸発させ、その後、水相と組み合わせ、上記サンプルをホモジナイズして、均質な供給原料を提供した。第一次エマルジョンを、アイスバス冷却コイル付きのマイクロフルイダイザーに3~5回通した。上記バッチサンプルを、上記ユニットから取り出し、4°Cにおいて貯蔵した。このエマルジョンは、従って、カチオン性ナノエマルジョンCNEを提供するためにカチオン性DOTAPが補充されていることを除いて、市販のMF59アジュバントに類似している。エマルジョンCNE17の最終組成は、10mMクエン酸緩衝液pH6.5中、スクアレン4.3重量、span850.5重量、ポリソルベート800.5重量、DOTAP1.4mg/mlであった。RNAは、これらカチオン性エマルジョン中の油滴の表面に吸着する。RNAを吸着させるために、RNA溶液を、RNase非含有水において適切な濃度へと希釈し、次いで、等容積のエマルジョンに直接添加し、同時に軽くボルテックスする。上記溶液を室温において約2時間静置して、吸着させる。得られた溶液を、投与する前に必要とされるRNA濃度へと希釈する。リポソーム被包RNAを、参考文献11および50の方法によって作製したリポソーム中に被包した。上記リポソームを、10DSPC両性イオン性、40DlinDMAカチオン性、48コレステロールおよび2PEG結合体化DMG2kDaPEGから作製した。これら割合は、総リポソーム中のモルに言及する。DlinDMA1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンを、参考文献6の手順を使用して合成した。DSPC1,2-ジアステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンを、Genzymeから購入した。コレステロールを、Sigma-Aldrichから得た。PEG結合体化DMG1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシポリエチレングリコール,アンモニウム塩、DOTAP1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン,塩化物塩およびDC-chol3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールヒドロクロリドは、AvantiPolarLipidsからであった。簡潔には、脂質をエタノール2ml中に溶解し、RNAレプリコンを、緩衝液2ml,100mMクエン酸ナトリウム,pH6中に溶解し、これらを2mlの緩衝液と混合し、続いて、1時間平衡化させた。上記混合物を6mlの緩衝液で希釈し、次いで、濾過した。得られた生成物は、リポソームを含み、約95の被包効率であった。例えば、1つの特定の方法において、新鮮な脂質ストック溶液を、エタノール中で調製した。37mgのDlinDMA、11.8mgのDSPC、27.8mgのコレステロールおよび8.07mgのPEG-DMGを秤量し、7.55mLのエタノール中に溶解した。新たに調製した脂質ストック溶液を、37°Cにおいて約15分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、755μLの上記ストックを、1.245mLエタノールに添加して、作業脂質ストック溶液2mLを作製した。この脂質量を使用して、250μgRNAを有するリポソームを形成した。RNAの2mL作業溶液をまた、100mMクエン酸緩衝液pH6中の約1μg/μLのストック溶液から調製した。3つの20mLガラスバイアル撹拌子有りを、RNaseAway溶液MolecularBioProductsですすぎ、使用前に多量のMilliQ水で洗浄して、上記バイアルのRNaseの汚染を除去した。上記バイアルのうちの1つを、上記RNA作業溶液に使用し、他のものを脂質およびRNA混合物を集めるために使用した後に記載されるとおり。作業脂質溶液およびRNA溶液を、37°Cにおいて10分間にわたって加熱し、その後、3ccルーアーロックシリンジに入れた。2mLクエン酸緩衝液pH6を、別の3ccシリンジに入れた。RNAおよび脂質を含むシリンジを、FEPチューブフッ素化エチレン-プロピレン;使用したすべてのFEPチューブは、2mm内径および3mm外径を有した;IdexHealthScienceから得たを使用して、TミキサーPEEKTM500μmID接合部,IdexHealthScienceに接続した。上記Tミキサーからの出口もまた、FEPチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第3のシリンジを、別個の1つのチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量7mL/分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、20mLガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した撹拌しながら。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール/水性溶液を、室温へと1時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの4mlを、5ccシリンジに入れ、これを、FEPチューブの1つに接続し、別の5ccシリンジを、等しい長さのFEPチューブに接続し、等量の100mMクエン酸緩衝液pH6を入れた。上記2本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して7mL/分の流量において作動させ、最終の混合物を、20mLガラスバイアルに集めた撹拌しながら。次に、第2の混合工程リポソームから集めた上記混合物を、MustangQ膜PallCorporationから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体を通過させた。上記リポソームに関してこの膜を使用する前に、4mLの1MNaOH、4mLの1MNaClおよび10mLの100mMクエン酸緩衝液pH6が、連続してこの膜を通過した。リポソームを、10分間にわたって37°Cにおいて加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、接線流濾過を使用することによって、リポソームを2mLに濃縮し、10~15容積の1×PBSに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記TFFシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、SpectrumLabsRanchoDominguezから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。100kD孔サイズカットオフおよび8cm2表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、1×PBSで、必要とされるRNA濃度へと希釈した。図2は、これら方法によって調製されるリポソームの例示的な電子顕微鏡写真を示す。これらリポソームは、被包された、全長RSVF抗原をコードするRNAを含む。1つのバッチの動的光散乱は、平均直径141nm強度でもしくは78nm数でを示した。被包されたRNAのパーセンテージおよびRNAの濃度を、Quant-iTRiboGreenRNA試薬キットInvitrogenによって、製造業者の指示書に従って決定した。上記キット中に提供されたリボソームRNA標準を使用して、標準曲線を作成した。リポソームを、1×TE緩衝液キットから中で、10×もしくは100×に希釈し、その後、色素を添加した。別個に、リポソームを、0.5TritonXを含む1×TE緩衝液中で10×もしくは100×に希釈し、その後、色素を添加した上記リポソームを破壊するため。従って、総RNAをアッセイするため。その後、等量の色素を各溶液に添加し、次いで、色素添加後の約180μLの各溶液を、二連において、96ウェル組織培養プレートに入れた。蛍光励起485nm,発光528nmを、マイクロプレートリーダーで読み取った。すべてのリポソーム処方物を、被包されたRNAの量に基づいて、インビボで投与した。リポソームにおける被包は、RNase消化からRNAを保護することを示した。実験では、3.8mAUのRNaseA/μgRNAを使用し、30分間にわたって室温においてインキュベートした。RNaseを、プロテイナーゼKで、55°Cにおいて10分間にわたって不活性化した。次いで、サンプル対25:24:1v/v/v,フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールの1:1v/v混合物を添加して、上記RNAを上記脂質から水相へと抽出した。サンプルを、数秒間にわたってボルテックスすることによって混合し、次いで、12kRPMにおける15分間にわたる遠心分離に置いた。上記水相上記RNAを含むを取り出し、上記RNAを分析するために使用した。ローディング前に400ngRNA/ウェル、上記サンプルすべてを、ホルムアルデヒドローディング色素とともにインキュベートし、10分間にわたって65°Cにおいて変性させ、室温へと冷却した。AmbionMillenniumマーカーを使用して、上記RNA構築物の分子量を概算した。上記ゲルを、90Vにおいて泳動した。上記ゲルを、室温において1時間にわたって振盪することによって、製造業者のガイドラインに従って、水中の0.1SYBRゴールドを使用して染色した。図1は、被包の非存在下でRNaseがRNAを完全に消化することを示すレーン3。RNAは、被包後に検出不能でありレーン4、これらリポソームがRNaseで処理されても全く変化が認められないレーン4。RNase処理リポソームをフェノール抽出に供した後、消化されていないRNAが認められるレーン6。4°Cにおいて1週間後ですら、上記RNAを、いかなるフラグメント化もなしに認めることができた図4,矢印。インビボでのタンパク質発現は、4°Cにおいて6週間および1回の凍結融解サイクル後にも変化しなかった。従って、リポソーム被包RNAは安定である。上記RNAのインビボ発現を評価するために、免疫原ではなく、レポーター酵素SEAP;分泌型アルカリホスファターゼを、上記レプリコン中にコードさせた。発現レベルを、化学発光アルカリホスファターゼ基質を使用して、1×Phospha-Light希釈緩衝液中で1:4希釈した血清中で測定した。8~10週齢BALB/cマウス5匹/群に、0日目に、0.1μgもしくは1μgRNA用量で50μl/脚を筋肉内に注射した。同じベクターを、1μgにおいて上記リポソームなしでRNase非含有1×PBS中でも投与した。ビリオンパッケージングされたレプリコンもまた、試験した。本明細書で使用したビリオンパッケージングされたレプリコンVRPと呼ぶを、参考文献51の方法によって得た。ここでアルファウイルスレプリコンは、変異VEEVに由来するか、またはシンドビスウイルスの3’UTRおよびシンドビスウイルスパッケージングシグナルPSを含むように操作されたVEEVのゲノムから得られるキメラであり、シンドビスウイルスキャプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする欠損性ヘルパーRNAと共にBHK細胞へと共エレクトロポレーションco-electroporatingすることによってパッケージングした。図5に示されるように、被包は、1μg用量においてSEAPレベルを約1/2対数増大させ、6日目において、0.1μg被包用量からの発現は、1μg非被包用量で認められたレベルに匹敵した。3日目までに、発現レベルは、VRPで達成されたものを超えた四角。従って、発現は、裸のRNAコントロールと比較して、10×低用量においてすら、上記RNAが上記リポソーム中に処方された場合に増大された。発現はまた、上記VRPコントロールと比較して高かったが、発現の動態は、非常に異なっていた図5を参照のこと。エレクトロポレーションを用いた上記RNAの送達は、上記裸のRNAコントロールと比較して増大した発現を生じたが、これらレベルは、リポソームでのものより低かった。上記リポソーム群において認められる効果が、上記リポソーム成分にのみ起因したのか、または上記被包に関連していたのかを評価するために、上記レプリコンを、被包形態2種の異なる精製プロトコルで,0.1μgRNAにおいて、または上記リポソームの形成後にこれらと混合して非被包リポプレックス,0.1μgRNA、または裸のRNA1μgとして、投与した。図10は、上記リポプレックスが、最低レベルの発現を与えたことを示し、これは、被包が強力な発現に必須であることを示す。さらなるSEAP実験から、インビボで明らかな用量応答が示された。発現は、1ngほどのRNAの送達後にも認められた図6。被包レプリコンからの発現と裸のレプリコンからの発現とを比較するさらなる実験から、0.01μg被包RNAは、1μgの裸のRNAに等しいことが示された。RNAの0.5μg用量において、上記被包物質は、6日目において12倍高い発現を与えた;0.1μg用量レベルでは、6日目において24倍高かった。上記群において平均レベルで調べるだけでなく、個々の動物もまた研究した。いくらかの動物は、裸のレプリコンに対して非応答者であったのに対して、被包は、非応答者を排除した。さらなる実験では、DlinDMAをDOTAPで置換した。DOTAPリポソームは、裸のレプリコンより良好な発現を与えたが、それらは、DlinDMAリポソームより劣っていた1日目において2~3倍の差異。インビボでの免疫原性を評価するために、レプリコンを構築して、RSウイルスRSVに由来する全長Fタンパク質を発現させた。これを、裸1μg、リポソーム中に被包0.1もしくは1μg、またはビリオン中でパッケージング106IU;VRPで、0日目および21日目に送達した。図7は、2回目の用量の2週間後の抗FのIgG力価を示す。上記リポソームは、明らかに免疫原性を増強する。図8は、2週間後の力価を示す。この時点までに、0.1μgの上記被包RNAと、1μgの上記被包RNAと、上記VRP群との間に統計学的差異は何らなかった。中和力価60のプラーク減少として測定,PRNT60は、2回目の用量の2週間後に、これら3群において有意差はなかった図9。図12は、2回目の用量の4週間後のIgG力価およびPRNT力価の両方を示す。図13は、上記RNAが堅調なCD8T細胞応答を誘発することを確認する。さらなる実験において、VRP、0.1μgリポソーム被包RNA、もしくは1μgリポソーム被包RNAを与えられたマウスにおけるF特異的IgG力価を比較した。2回目の用量の後の種々の時点での力価比VRP:リポソームは、以下のとおりであった:従って、上記リポソーム被包RNAは、ビリオン送達で認められるのと本質的に同程度の免疫応答を誘導する。さらなる実験から、優れたF特異的IgG応答が10μg用量で示され、これは、1μgおよび0.1μg用量についての応答と等しく、0.01μg用量ではより低い応答が示された。図11は、3種の異なる用量における裸の形態において、4種の異なる用量におけるリポソームにおいて、もしくはVRP106IUとして、上記レプリコンを与えられた動物におけるIgG力価を示す。1μgリポソーム被包RNAで認められた応答は、VRPと比較した場合に統計的に有意ではなかったANOVAが、10μgリポソーム被包RNAで認められたより高い応答は、これらの群の両方と比較した場合、統計的に有意であったp<0.05。さらなる研究から、上記0.1μgのリポソーム被包RNAは、0.1μgの送達されたDNAより遙かに高い抗FIgG応答を与え2回目の用量の15日後、さらに、エレクトロポレーションElgenTMDNADeliverySystem,Inovioによって送達された、上記F抗原をコードする20μgプラスミドDNAより免疫原性であることが確認された。さらなる研究を、マウスの代わりにコットンラットSigmodonhispidisにおいて行った。1μg用量において、リポソーム被包は、裸のRNAと比較して、F特異的IgG力価を8.3倍に増大させ、PRNT力価を9.5倍に増大させた。上記抗体応答の大きさは、5×106IUVRPによって誘導されたものに等しかった。裸のRNAおよびリポソーム被包RNAはともに、RSVチャレンジ1×105プラーク形成単位から上記コットンラットを防御することができ、肺ウイルス負荷を少なくとも3.5対数減少させた。被包は、減少を約2倍に増大させた。より高いRNA用量での宿主防御応答マウスを使用して、宿主防御応答先天的免疫もしくは適応免疫が、より高いRNA用量において、コードされる抗原への免疫応答を制限し得るか否かを調べた。3種の異なるRNAをこの研究に使用した:iRSV-Fすなわち、RSVの表面融合糖タンパク質を発現するvA317レプリコン;iiGFPを発現するvA17レプリコン;およびiii複製欠損性でありかつGFPをコードするvA336。RNAを、裸で、もしくは40DlinDMA、10DSPC、48Chol、および2PEG-DMG割合は、総リポソームのモルであるで作製されたリポソームとともに、送達した。これらリポソームを、75μgバッチにおいて調製した。エタノール中の新たな脂質ストック溶液を調製した。37mgのDlinDMA、11.8mgのDSPC、27.8mgのコレステロールおよび8.07mgのPEG-DMGを秤量し、7.55mLのエタノール中に溶解した。上記新たに調製された脂質ストック溶液を、37°Cにおいて約15分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、226.7μLの上記ストックを、1.773mLエタノールに添加して、作業脂質ストック溶液2mLを作製した。この量の脂質を使用して、75μgRNAを有するリポソームを形成した。RNAの2mL作業溶液をまた、100mMクエン酸緩衝液pH6中の約1μg/μLのストック溶液から調製した。3本の20mLガラスバイアル撹拌子つきを、RNaseAway溶液MolecularBioProductsですすぎ、使用前に多量のMilliQ水で洗浄して、上記バイアルのRNase汚染を除去した。上記バイアルのうちの1本を、上記RNA作業溶液に使用し、他のものを、上記脂質およびRNA混合物を集めるために使用した後に記載されるとおり。上記作業脂質溶液およびRNA溶液を、37°Cにおいて10分間にわたって加熱し、その後、3ccシリンジに入れた。2mLのクエン酸緩衝液pH6を、別の3ccシリンジに入れた。RNAおよび上記脂質を含むシリンジを、FEPチューブを使用して、TミキサーPEEKTM500μmID接合部に接続した。上記Tミキサーからの出口もまた、FEPチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第3のシリンジを、別個の1つのチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量7mL/分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、20mLガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した撹拌しながら。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール/水性溶液を、室温へと1時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を、5ccシリンジに入れ、これを、FEPチューブの1つにはめ、別の5ccシリンジを、等しい長さのFEPチューブに接続し、等量の100mMクエン酸緩衝液pH6を入れた。上記2本のシリンジを、シリンジポンプを使用して7mL/分の流量で作動させ、最終の混合物を、20mLガラスバイアルに集めた撹拌しながら。次に、TFFを使用して、リポソームを2mLに濃縮し、10~15容積の1×PBSに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記TFFシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、SpectrumLabsから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。100kD孔サイズカットオフおよび20cm2表面積を有するポリエーテルスルホンPES中空ファイバー濾過膜部品番号P-C1-100E-100-01Nを、使用した。インビトロ実験およびインビボ実験に関して、処方物を、1×PBSで必要とされるRNA濃度へと希釈した。上記4種のリポソーム処方物は、以下の特徴を有していた:BALB/cマウス1群あたり5匹の動物に、0日目および21日目に、両側に筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた:群1裸の自己複製RSV-FRNAvA317,0.1μg群2リポソーム中に被包された自己複製RSV-FRNAvA317,0.1μg群3空のリポソームに添加された自己複製RSV-FRNAvA317,0.1μg群4自己複製RSV-FRNAvA317,0.1μgおよび自己複製GFPRNAvA17,10μgの混合物群5自己複製RSV-FRNAvA317,0.1μgおよび複製欠損性GFPRNAvA336,10μgの混合物群6リポソーム中に処方された自己複製RSV-FRNAvA317,0.1μg、および自己複製GFPRNAvA17,10μgの混合物群7リポソーム中に処方された自己複製RSV-FRNAvA317,0.1μg、および複製欠損性GFPRNAvA336,10μgの混合物群8リポソーム中に処方された自己複製RSV-FRNAvA317,0.1μg、およびリポソーム中に処方された自己複製GFPRNAvA17,1μgの混合物群9リポソーム中に処方された自己複製RSV-FRNAvA317,0.1μg、およびリポソーム中に処方された複製欠損性GFPRNAvA336,1μgの混合物群10Fサブユニットタンパク質5μg。血清を、14日目、35日目および51日目に、抗体分析のために集めた。F特異的血清IgG力価GMTを測定した;個々の動物が力価<25検出限界を有した場合、それには力価5を割り当てた。さらに、51日目にT細胞分析のために脾臓をマウスから採取して、サイトカイン陽性かつRSVF51-66ペプチドCD4もしくはRSVFペプチドF85-93およびF249-258CD8に対して特異的である細胞を決定した。IgG力価は、10群においておよび非免疫化コントロールマウスにおいて以下のとおりであった:51日目でのRSV血清中和力価は、以下のとおりであった:51日目にRSVF特異的CD4脾臓T細胞を示す動物は、以下のとおりであった。ここで数字陽性細胞は、上記刺激された応答が統計的に有意にゼロを上回った場合にのみ与える:51日目にRSVF特異的CD8脾臓T細胞を示す動物は、以下のとおりであった。ここで数字は、上記刺激された応答が統計的に有意にゼロを上回った場合にのみ与える:これら結果は、宿主防御応答が、上記送達されるベクターへの免疫応答を制限し得ることを示す。例えば、群2および群6~9は、同じ自己複製抗原コードベクターを使用し、リポソーム中で送達したが、群6~9はまた、100倍もしくは10倍過剰の、裸でもしくはリポソーム内部のいずれかで、および自己複製もしくは複製欠損性のいずれかで送達したGFPコードベクターを有した。上記余分のRNAは、特に、自己複製および/または被包された場合に、抗RSV応答を低下させた。さらなる実験は、RNAに対する宿主応答が、タンパク質発現を制限し得るか否かを調べることを目的とした。従って、発現を、適応応答抗体,T細胞が明らかになる前の6日間のみ追跡した。上記vA306レプリコンは、SEAPをコードする;上記vA17レプリコンは、GFPをコードする;上記vA336レプリコンは、GFPをコードするが自己複製できない;上記vA336は、レプリコンは、vA336と同じであるが、ウリジンのうちの10を5-メチルウリジンで置換して調製した;上記vA336レプリコンは、va336と同じであるが、そのウリジン残基のうちの100が、M5Uである。BALB/cマウスに、0日目に、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた。動物全35匹を、7群に分け1群あたり5匹の動物、以下のように免疫化した:群1ナイーブコントロール。群2には、リポソーム中に処方したRNAvA306,0.1μg,SEAPを、リポソーム中に処方した自己複製RNAvA17,1.0μg,GFPと混合して、0日目に、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた。群3には、リポソーム中に処方したRNAvA306,0.1μg,SEAPを、リポソーム中に処方した非複製RNAvA336,1.0μg,GFPと混合して、0日目に、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた。群4には、リポソーム中に処方したRNAvA306,0.1μg,SEAPを、リポソーム中に処方した非複製RNAvA336,1.0μg,GFPと混合して、0日目に、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた。群5には、リポソーム中に処方したRNAvA306,0.1μg,SEAPを、リポソーム中に処方した非複製RNAvA336,1.0μg,GFPと混合して、0日目に、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた。群6には、リポソーム中に処方したRNAvA306,0.1μg,SEAPを、群2~5と同じ脂質用量における空のリポソームと混合して、0日目に、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた。群7には、リポソーム中に処方したRNAvA306,0.1μg,SEAPを、リポソーム中に処方した自己複製RNAvA17,1.0μg,GFPと混合して、0日目に、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた。0日目、3日目および6日目における血清SEAP活性相対光単位は、以下のとおりであったGMT:複製能のある、GFPをコードするRNAは、複製欠損性GFPRNAより、SEAPの発現を抑制した。このことは、複製RNAに対する強力な宿主防御応答が、SEAP発現の抑制をもたらすことを示唆する。上記GFPRNAに応じて誘導されたインターフェロンが、SEAPの発現を抑制したことは考えられることである。上記宿主応答/抑制モデル下では、RNAの宿主認識をブロックすることは、増大したSEAP発現をもたらすと予測されるが、上記GFPRNAにおけるU残基の5’メチル化は、増大したSEAPと関連しなかった。このことは、RNAの宿主認識は、5’メチル化に反応しなかったことを示唆する。送達容積流体力学的送達は、細胞膜の物理的障壁大きい、膜不透過性の化合物が細胞に入らないようにするを克服するための大きな容積の溶液の迅速な注射によって生じた力を使用する。この現象は、DNAワクチンの細胞内送達に有用であることが以前示された。筋肉内注射にとって代表的なマウス送達容積は、後肢に50μlである。これは、マウスの脚の筋肉に関して、比較的大きな容積である。対照的に、約0.5mlというヒト筋肉内用量は、比較的小さい。マウスにおける免疫原性が容積依存性であれば、上記レプリコンワクチンの効力は、少なくとも一部は、流体力に因り得る。このことは、ヒトおよびより大きな動物において同じワクチンを使用することを促進しない。上記vA317レプリコンを、0日目および21日目に、BALB/cマウス10匹/群に、両側の筋肉内ワクチン接種5もしくは50/脚によって送達した:群1には、裸のレプリコン50μL/脚において0.2μgを与えた。群2には、裸のレプリコン5μL/脚において0.2μgを与えた。群3には、エマルジョン処方したレプリコン0.2μg,50μL/脚を与えた。群4には、エマルジョン処方したレプリコン0.2μg,5μL/脚を与えた。群5には、リポソーム処方したレプリコン0.2μg,50μL/脚を与えた。群6には、リポソーム処方したレプリコン0.2μg,5μL/脚を与えた。血清を、14日目および35日目に、抗体分析のために集めた。F特異的血清IgGGMTは、以下であった:従って、上記処方されたレプリコンの免疫原性は、送達された容積に従って変動しなかった。従って、このことは、これらRNAワクチンは、それらの効力に関して、流体力学的送達に依存しないことを示す。大型哺乳動物研究大型動物研究を、ウシにおいて行った。仔ウシ4~6週齢,約60~80kg,5頭/群を、0日目、21日目、86日目および146日目に、66μgの、全長RSVFタンパク質をコードするレプリコンvA317で免疫化した。上記レプリコンを、リポソーム内部にもしくは上記CNE17エマルジョンとともに処方した。PBS単独を、陰性コントロールとして使用し、承認されたワクチンを、陽性コントロールとして使用したFortDodgeのTriangle4,死滅ウイルスを含む。すべての仔ウシに、146日目に、MF59エマルジョンをアジュバント添加した15μgFタンパク質を与えた。1頭のウシには、86日目に、Triangle4の代わりにCNE17ベースのワクチンを誤ってワクチン接種してしまったので、そのデータは、100日目から排除した。上記RNAワクチンは、ヒトRSVFをコードしたのに対して、上記Triangle4ワクチンは、ウシRSVFを含んだが、上記RSVFタンパク質は、BRSVとHRSVとの間で非常に保存されている。上記リポソームは、上記で言及されるものと同じ割合のDlinDMA、DSPC、コレステロールおよびPEG-DMGを有した。エタノール中の新たな脂質ストック溶液を調製した。37mgのDlinDMA、11.8mgのDSPC、27.8mgのコレステロールおよび8.07mgのPEG-DMGを秤量し、7.55mLのエタノールに溶解した。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、37°Cにおいて約15分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、226.7μLの上記ストックを、1.773mLエタノールに添加して、作業脂質ストック溶液2mLを作製した。RNAの2mL作業溶液もまた、100mMクエン酸緩衝液pH6中に約1μg/μLのストック溶液から調製した。3本の20mLガラスバイアル撹拌子つきを、RNaseAway溶液MolecularBioProductsですすぎ、使用前に多量のMilliQ水で洗浄して、上記バイアルのRNase汚染を除去した。上記バイアルのうちの1本を、上記RNA作業溶液に使用し、他のものを、上記脂質およびRNA混合物を集めるために使用した後に記載されるとおり。上記作業脂質溶液およびRNA溶液を、37°Cにおいて10分間にわたって加熱し、その後、3ccシリンジに入れた。2mLのクエン酸緩衝液pH6を、別の3ccシリンジに入れた。RNAおよび上記脂質を含むシリンジを、FEPチューブを使用して、TミキサーPEEKTM500μmID接合部に接続した。上記Tミキサーからの出口もまた、FEPチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第3のシリンジを、別個の1つのFEPチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量7mL/分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、20mLガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した撹拌しながら。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール/水性溶液を、室温へと1時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を、5ccシリンジに入れ、これを、FEPチューブの1つにはめ、別の5ccシリンジを、等しい長さのFEPチューブに接続し、等量の100mMクエン酸緩衝液pH6を入れた。上記2本のシリンジを、シリンジポンプを使用して7mL/分の流量で作動させ、最終の混合物を、20mLガラスバイアルに集めた撹拌しながら。次に、上記第2の混合工程から集めた混合物リポソームを、MustangQ膜PallCorporation,AnnArbor,MI,USAから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体を通過させた。上記リポソームが通過する前に、4mLの1MNaOH、4mLの1MNaClおよび10mLの100mMクエン酸緩衝液pH6が、上記Mustang膜を連続して通過した。リポソームを、10分間にわたって37°Cにおいて加温し、その後、上記フィルターに通過させた。次に、TFFシステムを使用して、リポソームを2mLに濃縮し、10~15容積の1×PBSに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記TFFシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、SpectrumLabsから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。100kD孔サイズカットオフおよび20cm2表面積を有するポリエーテルスルホンPES中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関して、処方物を、1×PBSで、必要とされるRNA濃度へと希釈した。仔ウシに、2mlの各実験ワクチンを与え、2×1mlとして頸の各側に筋肉内投与した。対照的に、上記Triangle4ワクチンを、頸に単一2ml用量として与えた。0日目、14日目、21日目、35日目、42日目、56日目、63日目、86日目、100日目、107日目、114日目、121日目、128日目、135日目、146日目、160日目、167日目、174日目、181日目、188日目、195日目および202日目に、血清を、抗体分析のために集めた。個々の動物が検出限界未満の力価を有した場合、力価5を割り当てた。図14Aは、最初の63日間にわたるF特異的IgG力価を示す。上記RNAレプリコンは、両方の送達システムを使用して上記ウシにおいて免疫原性であったが、それは、上記認可されたワクチンより低い力価を与えた。すべてのワクチン接種したウシは、2回目の用量後にF特異的抗体を示した。力価は、上記2回目の用量の2~6週間後の期間から非常に安定であったそして上記RNAワクチンに関しては特に安定であった。上記リポソーム送達システムでの力価は、上記エマルジョンでのものより緊密に密集した。図14Bは、210日間にわたるF特異的血清IgG力価GMTを示す。最大202日目までの測定値は、以下のとおりであった:上記エマルジョンアジュバント添加ワクチンは、補体なしでアッセイされる場合に、Triangle4より高い力価で中和応答を誘導したしかし、より変動しやすかった。RSV血清中和抗体力価は、以下のとおりであった:この研究からのデータは、大型動物におけるRNAレプリコンRSVワクチンの構想の証明を提供し、上記エマルジョンアジュバント添加群における5頭の仔ウシのうちの2頭は、上記補体非依存性HRSV中和アッセイによって測定される場合、3回目のワクチン接種の後の良好な中和抗体力価を実証する。上記エマルジョンアジュバント添加ワクチンは、上記リポソームアジュバント添加ワクチンより免疫原性であるようであるが、複雑にする要因の1つは、上記第2のリポソーム用量に使用した材料が、新たに調製されなかったことであり、RNAの同じロットは、マウス免疫原性研究において、効力の低下を示した。従って、上記リポソームアジュバント添加ワクチンは、新たな材料がすべてのワクチン接種で使われたのであれば、より免疫原性であったと考えられる。補体とともにアッセイした場合、中和抗体は、すべてのワクチン接種したウシにおいて検出された。このアッセイにおいて、すべてのワクチン接種した仔ウシは、処方物にかかわらず、2回目のRNAワクチン接種の後に、良好な中和抗体力価を有した。さらに、両方のRNAワクチンが、F特異的血清IgG力価を誘発した。上記F特異的血清IgG力価は、2回目のワクチン接種後に数頭の仔ウシにおいて、および3回目のワクチン接種の後にすべての仔ウシにおいて、検出可能であった。MF59アジュバント添加RSV-Fは、すべての以前にワクチン接種した仔ウシにおいてIgG応答をブーストでき、RNAを以前にワクチン接種した仔ウシの補体非依存性HRSV中和力価をブーストできた。大型動物におけるRNAワクチンの構想の証明は、小動物モデルから大型動物およびヒトへと移行する場合に以前に観察された、DNAベースのワクチンでの効力の喪失を踏まえると、特に重要である。ウシDNAワクチンに代表的な用量は、0.5~1mg[52,53]であるので、免疫応答がわずか66μgのRNAで誘導されたことは、非常に有望である。本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、本発明の範囲および趣旨内に留まりながら、改変が行われ得ることは、理解される。表1:有用なリン脂質DDPC1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDEPA1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDEPC1,2-エルコイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDEPE1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDEPG1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DLOPC1,2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDLPA1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDLPC1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDLPE1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDLPG1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DLPS1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDMG1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDMPA1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDMPC1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDMPE1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDMPG1,2-ミリストイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DMPS1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDOPA1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDOPC1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDOPE1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDOPG1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DOPS1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDPPA1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDPPC1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDPPE1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDPPG1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DPPS1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDPyPE1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDSPA1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDSPC1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDSPE1,2-ジステアロイルDiostearpyl-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDSPG1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DSPS1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンEPC卵-PCHEPC水素化卵PCHSPC高純度水素化ダイズPCHSPC水素化ダイズPCLYSOPCMYRISTIC1-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンLYSOPCPALMITIC1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンLYSOPCSTEARIC1-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンミルクスフィンゴミエリンMPPC1-ミリストイル,2-パルミトイル-sn-グリセロ3-ホスファチジルコリンMSPC1-ミリストイル,2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンPMPC1-パルミトイル,2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンPOPC1-パルミトイル,2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンPOPE1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンPOPG1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...]PSPC1-パルミトイル,2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンSMPC1-ステアロイル,2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンSOPC1-ステアロイル,2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンSPPC1-ステアロイル,2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン"