調節性白血球細胞を刺激するに有効な量の非変性マイコバクテリアボビスBCG及び15未満の残存水分からなり、前記細菌が凍結乾燥により死滅されている細菌調製物。生存マイコバクテリアボビスBCG細胞の培養物を回収し、水中でマイコバクテリアボビスBCG細胞を洗浄し、水中でマイコバクテリアボビスBCG細胞を凍結し、凍結乾燥機中で、凍結マイコバクテリアボビスBCG細胞を少なくとも34時間乾燥して少なくとも985の水分を除去することによりそれらを死滅させ、凍結乾燥死滅マイコバクテリアボビスBCG細胞を回収することからなる凍結乾燥法により製造される、請求項1に記載の細菌調製物。生存細菌細胞の培養物を回収し、水中で該細菌細胞を凍結し、凍結乾燥機中で少なくとも985の水分を除去するのに充分な時間、凍結細菌細胞を乾燥することによりそれらを死滅させ、そして凍結乾燥死滅細菌細胞を回収することを含む凍結乾燥法により製造される、請求項1に記載の細菌調製物。乾燥による凍結細菌細胞の死滅が約002mBar~02mBarの乾燥チャンバー圧力で実施される、請求項2又は3に記載の細胞調製物。05未満の残存水分を有する請求項1に記載の細菌調製物の有効量、及び医薬上許容される担体、添加物、免疫増強剤、アジュバントおよび請求項1に記載の細菌調製物とは異なる免疫調節物質の1又はそれより多くを含み、生存細菌を含まない医薬組成物。請求項5に記載の医薬組成物及び該医薬組成物の投与用デバイスを少なくとも含むキット。請求項5に記載の医薬組成物及び同時、別々若しくは逐次の使用のための抗ヒスタミン剤、抗炎症剤及び免疫調節剤からなる群より選択される薬剤を含む製品。残存水分の量が1未満である請求項1に記載の細菌調製物。残存水分の量が05未満である請求項1に記載の細菌調製物。長期凍結乾燥により死滅させた非変性マイコバクテリアボビスBCG及び05未満の残存水分を含み、生存マイコバクテリアボビスBCG細胞の培養物を回収し、水又は塩の水溶液中で該マイコバクテリアボビスBCG細胞を凍結し、凍結乾燥機中で、凍結マイコバクテリアボビスBCG細胞を少なくとも34時間乾燥して少なくとも995の水分を除去することによりそれらを死滅させ、凍結乾燥死滅マイコバクテリアボビスBCG細胞を回収することからなる凍結乾燥法により製造され、生存マイコバクテリアボビスBCGを含まない細菌調製物。05未満の残存水分を有する請求項10に記載の細菌調製物の有効量、及び医薬上許容される担体、添加物、免疫増強剤、アジュバントおよび請求項10に記載の細菌調製物とは異なる免疫調節物質の1又はそれより多くを含み、生存マイコバクテリアボビスBCGを含まない医薬組成物。請求項11に記載の医薬組成物及び該医薬組成物の投与用デバイスを少なくとも含むキット。長期凍結乾燥により死滅させた非変性マイコバクテリアボビスBCG及び05未満の残存水分を含み、生存マイコバクテリアボビスBCG細胞の培養物を回収し、水又は塩の水溶液中でマイコバクテリアボビスBCG細胞を洗浄し、水又は塩の水溶液中でマイコバクテリアボビスBCG細胞を凍結し、凍結乾燥機中で、凍結マイコバクテリアボビスBCG細胞を少なくとも34時間乾燥して少なくとも995の水分を除去することによりそれらを死滅させ、凍結乾燥死滅マイコバクテリアボビスBCG細胞を回収することからなる凍結乾燥法により製造され、生存マイコバクテリアボビスBCGを含まない細菌調製物。05未満の残存水分を有する請求項13に記載の細菌調製物の有効量、及び医薬上許容される担体、添加物、免疫増強剤、アジュバントおよび請求項13に記載の細菌調製物とは異なる免疫調節物質の1又はそれより多くを含み、生存細菌を含まない医薬組成物。請求項14に記載の医薬組成物及び該医薬組成物の投与用デバイスを少なくとも含むキット。よって、本発明の一つの目的は、深刻な有害反応なしに、Th1Th2平衡異常のような免疫調節不全、例えば癌、自己免疫疾患およびアレルギー性疾患を含む疾患の治療に有用な、死滅グラム陽性通性細胞内細菌調製物、例えばマイコバクテリア調製物のような、新規な死滅グラム陽性細菌調製物、およびそれを含有する組成物を提供することである。本発明のその他の目的は、免疫調節不全を含む疾患の治療へのその能力の他に、これらの細菌細胞からの活性分子の同定を許容するために細菌細胞からの分子の構造を保存している該死滅グラム陽性細菌調製物を製造する方法を提供することである。驚くべきことに、本発明者らは、細菌細胞からの分子を変性させないソフト法により死滅させたグラム陽性通性細胞内細菌、例えばマイコバクテリアのようなグラム陽性細菌が、喘息またはその他の免疫調節不全を患っている対象に投与された場合に、インビボで白血球調節細胞を賦活化できることを示している。これらの調節細胞の賦活化は、喘息の患者の免疫応答性をつくりなおし、これは長期間にわたって局所的および系統的な効果を有する;結果として、これらの死滅グラム陽性細胞内細菌調製物を用いて処理されたアレルギー患者は、長期間にわたって喘息から防御される。本発明者らは、細菌細胞からの分子の構造が保存されているこれらの死滅細菌調製物が、炎症、貧血、血小板減少、およびTNFα産生の誘導のような有害作用を誘導しないことも示している。本発明は:-細菌細胞からの分子の構造を変性させない方法により得ることができる、死滅グラム陽性細菌を含み、かつ-インビボにおいて、抗原に対する免疫応答の調節を誘導し得ることを特徴とする、細菌調製物に関する。免疫調節調製物とは、いずれの抗原に対する免疫応答の誘導の前または後に、免疫調節細胞および免疫ヘルパー細胞の間の比を変更し得る調製物を意味する。免疫調節細胞は、CD4CD25T細胞および/またはB細胞および/または樹状細胞のような白血球調節細胞を含む。例えば、CD4CD25T細胞は、Schevachら、NatRevImmunol、2002、2、389~400に記載されている。上記の細菌調製物の有利な実施形態によると、それは死滅グラム陽性通性細胞内細菌を含有する。グラム陽性通性細胞内細菌とは、インビトロで合成培地において成育する能力と同時に、哺乳動物または非哺乳動物宿主からの真核細胞にインビボで感染し、かつこれらの細胞、例えばマクロファージにおいて増殖する能力をもつグラム陽性細菌を意味する。上記の細菌調製物の有利な実施形態によると、それは、リステリア種、コリネバクテリウム種、ならびにマイコバクテリア種、ノカルディア種およびロドコッカス種を含む放線菌からなる群より選択される死滅グラム陽性通性細胞内細菌を含む。好ましくは、該細菌調製物はマイコバクテリアボビス、より好ましくはマイコバクテリアボビスBCGを含む。細菌細胞からの分子の構造を変性させない方法とは、分子の空間的立体配置の甚大な変性とならない方法を意味する;好ましくは、該方法は、タンパク質、多糖類および脂質のような、細菌細胞からの巨大分子の3次元構造を保存する。ソフト法と呼ばれるこれらの方法は、限定されないが、その巨大分子成分の構造を保存しながら細菌の細胞膜を破壊する物理的手段の使用を含む。これらの方法は、限定されないが:長期凍結乾燥、シリカまたはジルコニウムビーズの存在下での粉砕、いわゆるフレンチプレスの使用、超音波破砕およびガンマ線照射を含む。上記で定義したような死滅細菌調製物を得るために用いられ得るその他の方法は、当業者に知られている。-例えば、長期凍結乾燥死滅細菌調製物は、該調製物から実質的に全ての水分が除去されていることを意味する;よって、長期凍結乾燥死滅細菌調製物は、15未満、好ましくは1未満、より好ましくは05未満の残存水分を含有する。しかしながら、最適化されていない凍結乾燥の条件では、凍結乾燥細菌の調製物がより多くの残存水分を含有する、すなわち全ての細菌が死滅していない場合、残りの生存細菌の死滅は、代わりに、該調製物を空気と接触させることにより得られる;このような調製物は、上記の長期凍結乾燥死滅細菌調製物と同じ特性および活性を有する。長期凍結乾燥死滅細菌調製物中の残存水分は、例えばカールフィッシャーの比色分析法により測定される。本発明の死滅グラム陽性細菌調製物からの分子の変性がないことは、当該技術において周知のいずれの方法により確かめられる。例えば、タンパク質の構造は、生存細菌から得られたタンパク質抽出物との比較により、Laemmli、Nature、1970、277、680~に従って、変性および非変性条件で、死滅グラム陽性細菌調製物の抽出物のゲル電気泳動により確かめられる;タンパク質は、直接、適切な染料を用いるゲルの染色、またはメンブレンへのタンパク質の移動後に、グラム陽性細菌のタンパク質に対する適切な抗体を用いる染色のいずれかにより視覚化される。ゲルろ過または質量分析法のようなその他の方法も、本発明の死滅グラム陽性細菌調製物から精製される分子の構造を確かめるのに用いることができる。上記の細菌調製物のその他の有利な実施形態によると、それは、長期凍結乾燥法により得ることができる長期凍結乾燥死滅細菌を含有する。好ましくは、該長期凍結乾燥死滅細菌調製物は:生存細菌細胞の培養物を回収し、水またはホウ酸塩のような塩の水溶液中で細菌細胞を洗浄し、水またはホウ酸塩のような塩の水溶液中で細菌細胞を凍結し、少なくとも985の水分、好ましくは少なくとも99の水分、より好ましくは少なくとも995の水分を除去するのに充分な時間、凍結乾燥機中で、凍結した細菌細胞を乾燥することによりそれらを死滅させ、そして長期凍結乾燥死滅細菌細胞を回収することにより製造される。代わりに、該長期凍結乾燥死滅細菌調製物は、の細菌細胞の洗浄を省略すること以外は上記で定義したのと同じ方法により製造される。好ましくは、工程は、約002mBar~02mBar;より好ましくは006mBar~01mBarの乾燥チャンバー圧力で、少なくとも10~12時間、より好ましくは数日にわたって、少ない熱の供給および低い冷却蒸気トラップの温度で、乾燥の間じゅう乾燥死滅細菌調製物が低温であることを確実にして行う。凍結乾燥法において、長期凍結乾燥状態は、凍結乾燥機における空気の漏れがない場合に、氷冷却器および真空ポンプを真空チャンバーから数秒間分離しても真空チャンバーの圧力がもはや変動を示さない時に達成される;これは、凍結乾燥細菌からもはや水分が除去され得ないことを意味する。例えば、冷却トラップが52°Cである場合、長期凍結乾燥死滅細菌を効率的に得るためには、乾燥チャンバー中の圧力は、006~0120mBar、通常は約009mBarの範囲内であることが可能である。本発明は:-リン脂質を除去する、該死滅細菌調製物の有機溶媒抽出物からなる画分A、-ペプチドグリカンのような糖由来成分を除去する、死滅細菌調製物のグリコシダーゼ処理抽出物からなる画分B、-核酸を除去する、死滅細菌調製物のDNアーゼおよび/またはRNアーゼ消化抽出物からなる画分C、-タンパク質を除去する、死滅細菌調製物のプロテアーゼ処理抽出物からなる画分D、-有機溶媒、グリコシダーゼ、DNアーゼおよび/またはRNアーゼ、および最後にプロテアーゼにより連続的に処理された死滅細菌調製物の抽出物からなる画分Eからなる群より選択される、本発明の死滅細菌調製物の異なる画分にも関する。好ましくは:-画分Aが、メタノール/クロロホルム混液を用いる抽出により得られる。-画分Bが、リゾチームを用いる消化により得られる。-画分Cが、DNアーゼIおよび/またはRNアーゼAを用いる消化により得られる。-画分Dが、ズブチリシンを用いる消化により得られる。上記の画分の有利な実施形態によると、これらは上記で定義したような、長期凍結乾燥細菌調製物から単離される。上記の画分の有利な実施形態によると、これらはマイコバクテリア画分、好ましくはマイコバクテリアボビス画分、より好ましくはマイコバクテリアボビスBCG画分からなる。本発明は、死滅細菌調製物、および/または上記で定義したような少なくとも1つのそれらの画分の有効量、医薬上許容される担体および/または添加物、および/またはアジュバント、および/または免疫増強剤、および/または本発明のの細菌調製物とは異なる免疫調節物質を含む、Th1Th2平衡異常のような免疫調節不全を含む疾患の予防または治療のための医薬組成物にも関する。アジュバントとは、抗原と組み合わせて投与された場合に、該抗原への特異的免疫応答を可能にする天然または合成の物質を意味する。免疫増強剤とは、抗原と共同して投与された場合に、非特異的免疫応答を誘導する天然または合成の物質を意味する。本発明によると、上記の組成物は、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、クローン病および真性糖尿病のような自己免疫疾患、喘息、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎のようなアレルギー疾患、ならびに癌の治療に有利に用いることができる。該組成物の有利な実施形態によると、それは、マイコバクテリア、好ましくはマイコバクテリアボビス、より好ましくはマイコバクテリアボビスBCGからなる。該組成物のその他の有利な実施形態によると、それは、上記で定義したような長期凍結乾燥法により得ることができる長期凍結乾燥死滅細菌からなる;好ましくは、該長期凍結乾燥死滅細菌は、上記で定義したような凍結乾燥法により得られる。該組成物のさらに他の有利な実施形態によると、それは鼻腔内経路により投与されるのに適した形態にある。該組成物のさらに他の有利な実施形態によると、それは経口または舌下経路により投与されるのに適した形態にある。一般に、本組成物は、非経口注射、鼻腔内、経口、舌下、または皮膚を介するか、もしくは直腸を介しての局所により投与され得る。明示したように、ある実施形態においては、本発明の組成物は、気管支肺の粘膜表面への送達に適した形態にある。例えば、該組成物は、喘息の治療に現在用いられているものに類似のエアロゾルの形態または噴霧器により、患者への送達のための液体製剤に懸濁され得る。明示したように、その他の実施形態においては、本発明の組成物は経口投与に適した形態にある。例えば、該組成物は、経口投与のための錠剤、通常のカプセル、ゼラチンカプセルまたはシロップの形態であり得る。これらのゼラチンカプセル、通常のカプセルおよび錠剤の形態は、スターチ、ガムおよびゼラチンのようなアジュバントまたは結合剤、リン酸カルシウムのようなアジュバント、コーンスターチまたはアルギン酸のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、甘味剤または呈味剤のような、医薬製剤に通常用いられる医薬品添加剤を含有し得る。溶液または懸濁液は、薬理学的に影響のない溶媒の添加により、水性または非水性媒質中に製造し得る。これらは、グリコール、ポリグリコール、プロピレングリコール、ポリグリコールエーテル、DMSOおよびエタノールを含む。本組成物は、本発明の細菌細胞またはその画分を含有するリポソームのように、医薬上許容される担体および/または添加物および/または免疫増強剤および/またはアジュバントを付加的に含むことができる;医薬組成物の製造に用いられる上記の1以上の添加物は、抗凝集剤、抗酸化剤、色素、呈味剤、または滑沢、結着もしくは分離剤、ならびに一般に、製薬業において通常用いられるいずれの医薬品添加物の中から選択され得る。当業者に周知のいずれの適切な担体を本発明の医薬組成物に用い得るが、担体の種類は、投与の形態に応じて多様である。皮下注射のような非経口投与については、担体は、水、食塩緩衝液、ラクトース、グルタメート、油脂またはワックスを含むのが好ましい。経口投与については、上記の担体のいずれか、またはマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムのような固体担体を用いることができる。生分解性のマイクロスフェアも、本発明の医薬組成物の担体として用いることができる。適切な生分解性マイクロスフェアは、例えば米国特許4897268および5075109号に開示されている。いずれの種類のアジュバントを本発明の組成物に用いて、免疫応答を増強することができる。ほとんどのアジュバントが、水酸化アルミニウムまたはミネラルオイルのような、迅速な代謝から抗原を守るか、または制御された炎症反応を創るように設計された物質、およびリピドA、ボルデテラペルツシストキシンのような、免疫応答の非特異的促進物質を含む。適切なアジュバントは、例えば、ヒトへの注射に用いることができないフロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバントのように、市場で入手可能である。ヒトに用いることができるその他の適切なアジュバントは、水酸化アルミニウム、生分解性マイクロスフェア、モノホスホリルAおよびQuilAを含む。好ましい投与の頻度および有効な投与量は、種によって、そして対象によって多様である。例えば、長期凍結乾燥マイコバクテリア調製物またはその画分の量は、マウスにおいて約1μg~10000μg;好ましくは10μg~約1000μg;より好ましくは約10μg~100μgの物質に等しい投与量範囲である。該投与量は、種または対象の体表面積、および投与の頻度に依存してより高いか、またはより低いことが可能である。例えば、2ヶ月に1度の1または2投与量の投与は、喘息の治療においてより効果的であろう。本発明は、免疫調節不全を含む疾患の予防および/または治療における同時の、別々のもしくは逐次の使用のための組み合わせ製剤としての、本発明の細菌調製物またはそれらの画分、ならびに抗癌剤、抗糖尿病薬および免疫調節剤から選択される剤を含有する物質にも関する。好ましくは、該剤は抗ヒスタミン剤および抗炎症剤から選択される。本発明は、アレルゲン暴露の通常の期間の少なくとも2週間前に開始して、2ヶ月間隔で、マウスにおいて1μg~10000μg、好ましくは10μg~1000μg、最も好ましくは10μg~100μgに等しい投与量範囲で、経口、舌下、非経口または鼻腔内の経路により投与される、喘息の治療用の医薬品の製造のための、本発明の細菌調製物またはそれらの画分の使用にも関する。本発明は、マウスにおいて1μg~10000μg、好ましくは10μg~1000μg、最も好ましくは10μg~100μgに等しい投与量範囲で、経口、舌下、非経口または鼻腔内の経路により投与される、ヒトの乳児の喘息の予防用の医薬品の製造のための、本発明の細菌調製物またはそれらの画分の使用にも関する。本発明は、少なくとも:生存細菌細胞の培養物を回収し、水またはホウ酸塩のような塩の水溶液中で細菌細胞を洗浄し、水またはホウ酸塩のような塩の水溶液中の細菌細胞を凍結し、少なくとも985の水分、好ましくは少なくとも99の水分、より好ましくは少なくとも995の水分を除去するのに充分な時間、凍結乾燥機中で、凍結した細菌細胞を乾燥することによりそれらを死滅させ、そして長期凍結乾燥死滅細菌細胞を回収する工程を含むことを特徴とする、上記の長期凍結乾燥死滅細菌調製物の製造方法にも関する。上記の長期凍結乾燥死滅細菌調製物の製造の代替方法は、工程、、およびを含み;工程の細菌細胞の洗浄が省略される。好ましくは、工程は、少なくとも985の水分を除去するために、約002mBar~02mBar;より好ましくは006mBar~01mBarの乾燥チャンバー圧力で、少なくとも10~12時間、凍結細菌の融解を防止し、そして乾燥死滅細菌を細菌細胞分子変性温度より低く保ちながら行うことにより調製される。該方法の有利な実施形態によると、これは長期凍結乾燥死滅マイコバクテリアの調製物からなる。本発明は、Th1Th2平衡異常、例えば多発性硬化症、真性糖尿病およびクローン病のような自己免疫疾患、喘息、アレルギー性鼻炎またはアトピー性皮膚炎のようなアレルギー疾患、癌のような免疫調節不全を含む疾患の予防および/または治療のための医薬品の製造のための、上記の細菌調製物またはそれらの画分の使用にも関する。上記の使用によると、上記の死滅細菌調製物またはそれらの画分は、上記で定義したような医薬上許容される担体、および/または免疫増強剤、および/またはアジュバント、および/または上記で定義したようないずれの通常の添加剤と関連させる。本発明の有利な実施形態によると、マイコバクテリア、好ましくはマイコバクテリアボビス、より好ましくはマイコバクテリアボビスBCGを用いる。本発明のその他の有利な実施形態によると、長期凍結乾燥法により得ることができる長期凍結乾燥死滅細菌を用いる。本発明の死滅細菌調製物は、次の利点を有する:-これらは、対象をTh1Th2平衡異常のような免疫調節不全、例えば喘息を含む疾患から防御する、-これらは、感染性ではなく、免疫不全の対象に投与し得る、-これらは、炎症性の有害作用に導かず、これはおそらく、特にこれらが毒性および壊死活性に導き得るTNFαの産生を導かないという事実による。加えて、これらは貧血および血小板減少を含む他の副作用を導かない、-これらは、BCG精製蛋白誘導体に対する遅延型過敏を誘導することなく用いることができるので、結核の診断に干渉しない、-そして、これらは、細菌細胞からの分子の構造を保存する方法により製造されるので、上記死滅細菌調整物からの免疫調節分子の同定を許容する。本発明は、少なくとも本発明の医薬組成物、該医薬組成物の投与の手段、および/または処方された治療へのコンプライアンスを確実にする手段を含むことを特徴とする、免疫調節不全を含む疾患の治療のためのキットにも関する。本発明は、次に続く付加的な記載および図によりさらに説明され、これは、マウスにおける喘息への長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果、長期凍結乾燥死滅BCG、熱死滅BCGおよび生存BCGにより誘導される免疫応答、または長期凍結乾燥死滅BCGおよびそれらの画分の製造の分析を例証する実施例に言及する。しかしながら、これらの実施例は、本発明の例証のためにのみ示され、その限定をいずれにしても構成するものではないことが理解されるべきである。-図1は、凍結乾燥生存BCGワクチンの製造の標準的な方法を、本発明による、長期凍結乾燥死滅BCGの製造方法との比較により説明する:ミリバールでの圧力、および°Cでのサンプルまたはトレーの温度は、時間の期間に対して示す。-図2は、呼吸の減少により分析された、特にストリンジェントな喘息のBP2マウスモデルでの気管支肺反応亢進に対する、長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果を説明する。マウスのBP2株は、Th2喘息軸に高度に感受性である。マウスは、Th2促進剤として知られるミョウバンと組み合わせたオボアルブミンでも感作される。比較すると、このストリンジェントなマウスモデルにおいて、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理された群では、有意な効果は観察されない。カーブの下の面積を示す:個体、マウスの群当たりの平均±SEM。-図3は、気管支肺の抵抗性により分析された、アレルゲンとしてOVAを用いた、喘息のBP2マウスモデルでの気管支肺反応亢進に対する、長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理された群では、有意な効果は観察されない。1分間の間隔で測定された増強された休止期を示す:個々のデータ、マウスの群当たりの平均±SEM。長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群における、気管支肺反応亢進に対する統計的に有意な防御的効果。-図4は、気管支肺胞洗浄の細胞計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルの肺での好酸球の増加に対する、長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理された群では、有意な効果は観察されない。個々のデータ、マウスの群当たりの平均±SEMを示す。-図5は、気管支肺胞洗浄の細胞計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルの肺での好中球の増加に対する、長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理されたマウスでは、有意な効果は観察されない。個々のデータ、マウスの群当たりの平均±SEMを示す。長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群における、好中球の数の統計的に有意な減少。-図6は、気管支肺胞洗浄中の非常に低いレベルのフィブロネクチンにより分析された、喘息のBP2マウスモデルにおける長期凍結乾燥死滅BCGでの肺の炎症または組織損傷の有利な非存在を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理された群では、BAL中のかなり高いレベルのフィブロネクチンが観察される。データは、IUmlで表される;個々のデータ、マウスの群当たりの平均±SEM。長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群における、フィブロネクチンのレベルの統計的に有意な減少。-図7は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCGで処理されたか、または未処理のマウスの群からの気管支肺胞洗浄中のIL5レベルを説明する。データは、pgmlで表される;個々のデータ、マウスの群当たりの平均±SEM。-図8は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCGで処理されたか、または未処理のマウスの群からの血清中のIL5レベルを説明する。データは、pgmlで表される;個々のデータ、マウスの群当たりの平均±SEM。-図9は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCGで処理されたか、または未処理のマウスの群からの肺培養物中のIFNγのレベルを説明する;培養物は、インビトロで、精製BCG分泌タンパク質または抗CD3抗体で賦活化される。個々のデータ、マウスの群当たりの平均±SEMを示す。-図10は、治療的プロトコルにおいて生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCGで処理されたか、または未処理のマウスの血清中のOVA特異的IgEのレベルを説明する。個々のデータ、マウスの群当たりの平均±SEMを示す。-図11Aおよび12Aは、熱死滅BCG、または長期凍結乾燥死滅BCGのいずれかによりインビトロで賦活化された、それぞれ、BP2およびOVAで免疫化されたBALBcマウスからの肺胞のマクロファージによるIL12の産生を説明する。データは、100000細胞当たりのpgmlで示す。-図11Bおよび12Bは、熱死滅BCGにより賦活化されたマウスからのマクロファージ中のTNFαのかなりのレベルに比較した、長期凍結乾燥死滅により刺激されたマウスからのマクロファージ中のTNFαの産生の欠如を説明する。データは、100000細胞当たりのngmlで示す。-図13は、長期凍結乾燥死滅BCGで処理されたマウスでのBCG精製蛋白誘導体に対する遅延型感覚過敏の欠如を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGのいずれかで処理されたマウスでは、DTHが観察される。個々のデータ、マウスの群当たりの平均±SEMを示す。長期凍結乾燥死滅BCG処理された群における、足踵部膨張の統計的に有意な欠如。-図14は、喘息のモルモットにおける、ヒスタミンへの気管支肺反応亢進についての長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果を説明する。OVA免疫化動物の群を、長期凍結乾燥死滅BCGの10μgもしくは100μgで処理するか、または処理しない。各動物について、OVAのエアロゾル投与の前および後で、気管支収縮を創生し得るヒスタミンの濃度を示す。長期凍結乾燥死滅BCG10μgまたは100μgで処理した群における、統計的に有意な防御的効果。-図15Aは、気管支肺胞洗浄の細胞計数により評価される、喘息のBP2マウスモデルでの、肺における好酸球の増加に対する長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果を説明する。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理した群では、有意な効果は観察されない。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され;各群についてn7である。長期凍結乾燥死滅BCG処理群における、好酸球の数の統計学的に有意な減少。-図15Bは、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCGで処理されたか、または未処理のマウスの群からの気管支肺胞洗浄中のIL5のレベルを説明する。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され;各群についてn7である。-図16は、SDSPAGEおよびPVDFメンブレン上に移した後の、抗マイコバクテリア抗体での染色、またはアウロダイでの染色により評価される、長期凍結乾燥死滅BCG調製物中のタンパク質の構造の保存を説明する。タンパク質は、スメアしていない分離したバンドとして現れる。-図17は、気管支肺反応亢進により分析される、水溶性レイグラス花粉抽出物をアレルゲンとして用いる、喘息のBP2マウスモデルにおける気管支肺反応亢進への長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果を説明する。メタコリン投与後3~8分の間に測定される増強された休止期を示す:データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され;各群についてn8である。長期凍結乾燥死滅BCG処理群における、気管支肺反応亢進に対する統計的に有意な防御的効果。-図18AおよびBは、気管支肺胞洗浄の細胞計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルの肺での多形核および好酸球の増加に対する、長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果を説明する。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表される。長期凍結乾燥死滅BCG1mgおよび10mgで処理した群における、多形核数の統計的に有意な減少;好酸球数の統計的に有意な減少:100μg、1mgおよび10mgの長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群において、それぞれp<001、p<005およびp<005。-図18Cは、気管支肺胞洗浄中の細胞およびサイトカイン分析により評価された、長期凍結乾燥BCG処理群での、多形核および好酸球の数の減少と、IL4産生の減少との間の関係を説明する。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表される。10μg、100μg、1mgおよび10mgの長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群における、IL4のレベルの統計的に有意な減少。-図19は、肺細胞浸潤計数により分析された、喘息のBP2マウスモデルでの長期凍結乾燥死滅BCG処理群における肺の白血球浸潤の予防を説明する。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され;各群についてn5である。長期凍結乾燥死滅BCG10μgで処理した群における、細胞数の統計的に有意な減少。-図20は、マクロファージ、多形核細胞および樹状細胞のフローサイトメトリー分析により分析された、喘息のBP2マウスモデルでの長期凍結乾燥死滅BCG処理群における肺の白血球浸潤の予防を説明する。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され;各群についてn5である。長期凍結乾燥死滅BCGで処理した全ての群における、マクロファージおよび樹状細胞、ならびに長期凍結乾燥死滅BCG100μg、1mgおよび10mgで処理した群だけでの多形核の数の統計的に有意な減少。-図21は、生存BCG、熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCGで処理されたか、または未処理であり、かつOVAで攻撃されたか、またはされなかったマウスの群からの肺培養物中のIFNγおよびIL10のレベルを説明する;培養物は、インビトロにて精製BCG分泌タンパク質で賦活化される。データは、マウスの群当たりの平均±SEMで表され;各群についてn4である。長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群だけでのIL10産生の統計的に有意な増加。-図22は、長期凍結乾燥死滅BCGの静脈内投与後の、同じ経路での生存BCGおよび熱死滅BCGの投与に比較した、貧血および血小板減少の欠如を説明する。-図23は、注射後10週間にわたって毎週測定した足踵部の増大により評価された、長期凍結乾燥死滅BCGの皮下注射後の、生存BCGおよび熱死滅BCGとの比較による、注射部位での最小限の炎症反応を説明する。矢印は、注射の日を示す;EFDおよび熱死滅BCGについてD0およびD36、生存BCGについてD0のみ。-図24は、長期凍結乾燥死滅BCGの静脈内注射後18日での、同じ経路での生存BCGおよび熱死滅BCGの注射に比較した、肺外植片のLPS刺激後の減少したTNFαの産生を説明する。未処理群に比べて、長期凍結乾燥死滅BCG群におけるTNFαの有意な産生はない。比較すると、生存BCGおよび熱死滅BCG処理群において、TNFαの有意な産生が観察される。-図25は、90日前にオボアルブミンで免疫化し、45および65日に長期凍結乾燥死滅BCGで処理したかまたは処理せず、そしてオボアルブミンで攻撃したかまたはしなかったBALBcマウスからの脾臓におけるCD11cGr1B220形質細胞様樹状細胞の増加を説明する。処理群においてCD11cGr1B220細胞数の統計学的に有意な増加、処理群においてCD11cCD8α細胞数の増加なし。-図26は、90日前にオボアルブミンで免疫化し、45日および65日に長期凍結乾燥死滅BCGで処理したかまたは処理せず、そしてオボアルブミンで攻撃したかまたはしなかったBALBcマウスからの脾臓におけるCD4CD25IL10細胞数の増加を説明する;脾臓細胞は、白血球集団の分析前に、インビトロでOVAまたはBCG培養上清で賦活化するか、または賦活化しない。処理群においてCD4CD25IL10細胞数の統計学的に有意な増加。-図27は、肺細胞浸潤計数により評価された、喘息のマウスモデルにおける、経口経路により与えられた長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果を説明する。処理群における、肺細胞数の統計的に有意な減少。-図28は、喘息のBALBcモデルでの気管支肺反応亢進の予防により評価された、皮下経路により注射された長期凍結乾燥死滅BCGのある投与量の防御的効果を説明する。-図29は、喘息のBP2モデルでの気管支肺反応亢進の予防により評価された、皮下経路により注射された長期凍結乾燥死滅BCGの作用の遅延を説明する。気管支肺反応亢進の予防は、長期凍結乾燥死滅BCGの投与および攻撃の間に2~3週間の遅延が存在する場合にのみ起こる。-図30は、喘息のBP2モデルでの気管支肺反応亢進の予防により評価された、皮下経路により注射された長期凍結乾燥死滅BCGの作用の持続期間を説明する;長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果は、少なくとも2ヶ月にわたって持続する。実施例1:長期凍結乾燥死滅マイコバクテリアの製造1材料と方法マイコバクテリウムボビスBCG細胞に1978年4月24日に寄託を、滅菌ソートン培地CH2CONH2H2O、4gl;C6H8O7;H2O、2gl;K2HPO4、05gl;MgSO4H2O、050gl;クエン酸第二鉄、005gl;グリセロール、60ml;硫酸亜鉛溶液、240μll、pH7中で培養する。より正確には、1173P2株を、滅菌ソートン培地130mlを含む250mlの球形培養フラスコ中で、37°Cで14日間培養し、これは培養がその対数期で終わる時間に相当する。次いで、培養物を2000×gで10分間、4°Cで遠心分離して、BCG細胞をペレット化する。細胞培養物上清を捨て、ペレットを蒸留水中に充分に洗浄する;各洗浄は、上記細胞を蒸留水中に再懸濁し、細胞を2000×gで10分間、4°Cで遠心分離する。最後の洗浄後、ペレットをペレットの容積と等しいか、または2倍の容積の蒸留水に再懸濁する。水50ml中の細菌20gを、厚さ約1cmの層を形成するために、瓶の壁の上に層状にして凍結する。混合物を60°Cで凍結させる。次いで、水中の細胞の凍結懸濁物を、図1Bに記載の長期凍結乾燥プロトコルの条件下で長期凍結乾燥し、実質的に全ての水分を除去する。簡単に、氷冷却器の温度が約50°C~54°Cで圧力を迅速に0150mBarに減少させ、凍結乾燥プロセスが開始される。サンプルは凍結したままであり、温度は正確にはモニターしていない。次いで、実質的に全ての水分を除去するために、圧力を01mBarで34時間維持する。室温までの連続的な増加がある。乾燥の最後に、室温にて空気で大気圧までゆっくりと圧力を戻し、長期凍結乾燥死滅BCG細胞を回収して室温、大気圧下で保存する。長期凍結乾燥死滅BCG調製物中に存在する残存水分は、カールフィッシャーの比色分析法、および製造業者の使用説明書に基づき756KF比色計を用いて測定する。長期凍結乾燥死滅調製物中の生菌の存在は:-mlあたりのコロニー形成単位の数の測定;長期凍結乾燥死滅調製物の懸濁物02mlをミドルブルック7H10寒天培地上に播種し、プレートを37°Cで1ヶ月インキュベートするか、および/または-生菌のみを染色する蛍光色素CFDASEでの染色;長期凍結乾燥死滅調製物の懸濁物1mlを、CFDA試薬のPBS中の1100希釈100μlと混合する。混合物は、室温で暗所にて60分間インキュベートする。標識された細菌を3000rpmで15分間遠心分離し、PBS中に2回洗浄し、同緩衝液に再懸濁する。次いで、生存細胞の存在を、蛍光顕微鏡により調べたことにより確かめられる。2結果BCG細胞を、材料および方法に記載の長期凍結乾燥プロトコルに従って長期凍結乾燥して死滅させ、図1Bにまとめた。比較すると、BCG細胞を、生BCGワクチンの製造の標準的な方法に従って凍結乾燥させた:BCG細胞を、37°Cでソートン培地中に培養し、対数期の最後に遠心分離により回収し、BCG細胞ペレットを、BCG4mgmlの濃度でグルタミン酸ナトリウム中に再懸濁した。BCG懸濁物をバイアル中に分配し、図1Aに説明されるプロトコルに従って凍結乾燥させ、15±05H2Oを含む各バイアルを、真空下に室温で保存した。種々の調製物でのBCG細胞の生存度を、材料および方法に記載のようにして分析した。次の結果が、カールフィッシャーの比色分析法、培養分析およびCFDASE染色試験により観察された:-長期凍結乾燥死滅BCG調製物200mgは、代表的な測定において1073mgの水分を含んでおり、これは残存水分05未満と等しい、-本発明の方法により製造された長期凍結乾燥死滅BCGサンプルには、生存細菌は検出されなかった、-標準のBCGワクチン製造方法による凍結乾燥死滅BCG調製物には、50~60の生存細菌が検出された。実施例2:長期凍結乾燥死滅マイコバクテリア画分の製造1脱脂画分ホウ酸塩緩衝液に懸濁した約1010の長期凍結乾燥死滅BCG10mgmlを12000×gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットをクロロホルムメタノール1mlに室温で24時間再懸濁して脂質を抽出した。クロロホルムメタノールを10分当たり12000×gでの遠心分離により除去する。クロロホルムメタノール抽出物からの脱脂されたペレットを真空乾燥した。2脱グリコシル画分ホウ酸塩緩衝液に懸濁した約1010の長期凍結乾燥死滅BCG10mgmlを12000×gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、リゾチーム1mgを含む01M酢酸ナトリウム1mlに37°Cで24時間再懸濁して、ペプチドグリカンを除去した。消化産物を96°Cで2分間加熱し、12000×gで1時間の遠心分離により、ペレットを回収した。3DNアーゼおよびRNアーゼ処理画分ホウ酸塩緩衝液に懸濁した約1010の長期凍結乾燥死滅BCG10mgmlを12000×gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、DNアーゼ1mgおよびRNアーゼ1mgおよび5mMMgCl2を含む40mMTrisHCl緩衝液1mlに37°Cで24時間再懸濁し、核酸を除去した。消化産物を96°Cで2分間加熱し、12000×gで1時間の遠心分離により、ペレットを回収した。4プロテアーゼ処理画分ホウ酸塩緩衝液に懸濁した約1010の長期凍結乾燥死滅BCG10mgmlを12000×gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、01mgズブチリシンを含む01M酢酸アンモニウム緩衝液1mlに37°Cで23時間再懸濁した。タンパク質を完全に除去するために、次に反応混合物にズブチリシン01mgを添加して37°Cで7時間インキュベートした。消化産物を96°Cで2分間加熱し、12000×gで1時間の遠心分離により、ペレットを回収した。5連続的な処理約1010の長期凍結乾燥死滅BCG10mgmlを12000×gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、ホウ酸塩緩衝液に再懸濁し、上記のようにして、クロロホルムメタノール、リゾチーム、DNアーゼRNアーゼ混合物およびズブチリシンで、連続的に処理した。消化産物を96°Cで2分間加熱し、12000×gで1時間の遠心分離により、ペレットを回収した。6長期凍結乾燥死滅BCG調製物のタンパク質および多糖類の含量の特性決定a材料および方法長期凍結乾燥死滅BCG調製物の調製物を水中の4ブタノール1mlに懸濁し、ジルコニアシリカビーズ1gを含む2つのエッペンドルフチューブに分配した。次いで、チューブをミキサーミルズに、周波数25で、5、15、30、60、120、180、240、300または470分間入れた。次いで、チューブを10000rpmで30分間遠心分離した;上清を回収し、ろ過し、タンパク質、アミノ酸および多糖類の濃度を次のようにして測定した:-全タンパク質濃度は、マイクロBCAプロテインリエージェントキットを用いて測定した、-アミノ酸濃度測定および分析は、質量分析により行った、-全多糖類濃度は、SMelvin、AnalBiochem1953、25、1656~によるアンスロン法を用いて測定した。5、60または300分で回収した細菌抽出物のアリコートをSDSPAGEにより分離し、タンパク質をPVDFメンブレン上に移し、アウロダイまたはマイコバクテリアのタンパク質に対するポリクローナル抗体のいずれかで染色した。b結果5、60または300分後に回収した細菌抽出物は、それぞれタンパク質280、500および1258μg;アミノ酸190、420および880μg、ならびに多糖類697、1267および1765μgを含む。図16に示す結果は、スメアしないで分離されたタンパク質のバンドの存在により示されるように、長期凍結乾燥法が、死滅BCG調製物中に存在するタンパク質の構造を保存することを示す;長期凍結乾燥死滅BCG調製物の抽出物で観察されるタンパク質プロフィールは、生存BCG調製物で観察されるものに匹敵する。実施例3:マウスモデルにおける喘息への長期凍結乾燥死滅マイコバクテリアの防御的効果1材料および方法a動物雄の成体のBP2マウスは、CentredelevageRJanvierから得て、特定の病原菌のいない状態で、動物施設にて維持した。b喘息様アレルゲン特異的疾患のマウスモデル雄の成体のBP2マウスを、食塩水中のオボアルブミン1μgおよび水酸化アルミニウムアジュバント16mgで、第0日および7日に、皮下経路により免疫化した。アレルギー性応答は、食塩水50μl中のOVA10μgで、第96~98日に鼻腔内での攻撃により誘発する。代わりに、10μgを免疫化に用いる以外は、OVAと同じ条件において、水溶性レイグラス花粉抽出物をアレルゲンとして用いる。cマイコバクテリアの免疫調節性組成物の製造実施例1のようにして製造した長期凍結乾燥死滅BCGを、次のBCG調製物との比較により、BP2マウスにおける喘息ワクチンとして試験した:生存BCGマイコバクテリウムボビスBCGパスツールワクチン1173P2株を、005トリトンWR1339および6グルコースを補ったベックプロスカウアー培地で、分散桿菌として培養した。細菌を対数期に回収し、005トリトンおよび6グリセロールを補ったベックプロスカウアー培地中に70°Cで保存した。ml当たりのコロニー形成単位は、リン酸緩衝食塩水中の適切な希釈をミドルブルック7H10寒天培地上に播種することにより決定した。懸濁物は、PBS中の108、109または1010CFUmlの濃度で、その注射の直前に希釈した。熱死滅BCG上記に記載したようにして製造された生存BCGを、3000rpmで15分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを食塩水、例えばホウ酸塩を含有する緩衝液に再懸濁し、懸濁物を115°Cで15分間オートクレーブした。d喘息のマウスモデルでの長期凍結乾燥死滅マイコバクテリアの投与の治療的プロトコル雄の成体BP2マウスを、上述したようにしてOVAで免疫化する。25匹のマウスの群に、上述のようにして調製したBCG組成物100μlを注射した。皮下経路により、OVAでの最初の免疫化後D42~45およびD65~70に、生存BCGワクチン株1173P2熱死滅BCG、長期凍結乾燥死滅BCG、およびPBS。アレルギー性応答は、食塩水50μl中のOVA100μgでの、第96~98日の鼻腔内での攻撃により誘発する;比較のために、PBS単独を鼻腔内に投与する。e気管支肺分析麻酔をかけられていない動物のBHR研究を許容する気圧体積変動記録用装置を用いた。OVAで免疫化し、種々のBCG調製物で処理したか、または未処理の動物を、OVAまたは水溶性レイグラス花粉抽出物での攻撃後24時間で試験した。動物を、体積変動記録用チャンバー内に置いた。これらの基礎のベンチレーションパラメータを記録し、20秒または1分間の間に、それらは、標準の噴霧器を用いて、H2O中に100mMのメタコリンの吸入を受け、それらのベンチレーションパラメータを、メタコリンエアロゾル投与後10分間記録した。その期間中のベンチレーションの減少が報告され、そして気管支肺抵抗は:製造業者の使用説明書によると緩和時間の401×ピーク呼気流量ピーク吸気流量×067のようにして算出される、増強された休止期として表される。Penhの平均値を毎分記録した。グラフ図としては、各値を毎分について示した。f気管支肺胞洗浄マウスに、致死量のウレタンを用いて腹腔内経路により麻酔をかけた。循環血液を腹部大動脈から除去し、シリンジに接続されたカニューレを気管内に置き、肺をPBS07mlで3回洗浄して、洗浄をチューブに回収し、氷上に保持した。BAL中に存在する細胞の数を、COULTERにより提供される自動計数装置で測定した。種々の細胞タイプのパーセンテージを測定するために、スライドグラス上でサイトスピンしたBAL細胞をDIFFQUICKで染色した。gフィブロネクチンアッセイBALを、1000rpmで10分間、4°Cにて遠心分離し、上清中に存在するフィブロネクチンを、標準の方法に従って、競合酵素免疫分析法により分析した。h肺の外植片の調製および分析肺を、3mmあたり約1mmの小片に切断した。各肺からの4または5つの断片を、AIMV培地1mlを含む組織培養プレートのウェルに入れた。肺の外植片を、基礎のレベルの測定のために培地のみの中で培養した;代わりに、BCG培養物ろ液を培養物に添加してマイコバクテリアの特異的細胞を明らかにするか、または抗CD3モノクローナル抗体を培養物に添加してTリンパ球の反応性を明らかにした。24時間後に、製造業者の使用説明書にしたがって、市販のキットを用いてELISAにより、種々のリンフォカインの存在を分析した。肺全体をコラゲナーゼおよびDNアーゼ媒質中に解離させ、異なる蛍光色素で標識された種々のモノクローナル抗体を用いてフローサイトメーターで浸潤細胞を数えた。i肺の組織病理学的分析肺全体を、緩衝ホルムアルデヒド中に固定し、組織病理学的分析のために処理した。シッフ染色を用いて、粘液および粘液含有細胞を染色した。対比染色として、ヘマトキシエオシン染色を用いた。スライドを検査し、細胞浸潤および粘液含量の評価を、サンプルの起源についての知識なしにスライドを評点する一人の観察者により行った。jサイトカインアッセイ免疫化されたマウスの群からの血清およびBALサンプル中に存在するか、またはこれらのマウスからの肺外植片培養物により分泌されたかのいずれかのサイトカインを、次のようにして分析した:IFNγ、IL10およびIL12を、ELISAにより試験した;TNFαおよびIL5を、EIAにより試験した。kOVA特異的IgEアッセイ血清中に存在するOVA特異的IgEのレベルを、標準の方法に従って、ELISAにより分析した。l統計学的分析群当たりの動物の数は、4<n<8であった。独立事象について、スチューデントの両側検定を行った。2結果a気管支肺分析OVAまたは水溶性レイグラス花粉抽出物で免疫化され、種々のBCG調製物で処理されかまたは未処理の動物を、OVAまたはレイグラス花粉で攻撃後24時間で試験した。フロイント不完全アジュバントよりもアレルギー反応の効力が高いアジュバントである水酸化アルミニウムと結合したオボアルブミンで免疫化された、Th2バックグラウンドのBP2を用いる、これらの研究において選択されるモデルは、したがって前記のCCWandらにより用いられたフロイント不完全アジュバント中のオボアルブミンで免疫化されたBALBcマウスのモデルよりも、ストリンジェントである。図2および3に示すデータは、この喘息のストリンジェントなモデルにおいて、未処理のコントロールに比べてメタコリンに対するより低い反応性により示されるように、長期凍結乾燥死滅BCGは、気管支肺について統計的に有意な防御的効果を有する。対照的に、この喘息のストリンジェントなモデルにおいて、生BCGまたは熱死滅BCGで処理された動物において、有意な防御的効果は観察されなかった。喘息について、長期凍結乾燥死滅BCG調製物では、水溶性レイグラス花粉抽出物をアレルゲンとして用いた場合に、同様の統計的な防御効果が観察される。b気管支肺胞洗浄長期凍結乾燥死滅BCG10μg、100μg、1mgまたは10mgで処理したマウスの群において、好酸球および好中球の数の減少が観察される。炎症性応答を反映する、気道滲出液中に存在するフィブロネクチンのレベルは、長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群において、非常に有意な減少を示す。アレルギー性応答の間に好酸球数の増加に影響を与えるリンフォカインであるIL5についてのアッセイは、長期凍結乾燥死滅BCGで処理した群において、BALおよび血液中の両方の減少を示す。Th2サイトカインであるIL4についてのアッセイは、長期凍結乾燥死滅BCG10μg、100μg、1mgまたは10mgで処理したマウスの群からのBALで、統計的に有意な減少を示す。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで処理されたマウスでは、有意な効果は観察されなかった。これらの結果は、肺の炎症性応答の減少により実証されるように、長期凍結乾燥死滅BCGが喘息の症状を治療し得る免疫応答を誘導することができることを示す。Th2バックグラウンドの、この喘息のストリンジェントなモデルにおいて、生存BCGまたは熱死滅BCG処理群のいずれにおいても防御は観察されなかった。c肺の組織病理学および浸潤細胞の分析肺の組織病理学的分析は、長期凍結乾燥死滅BCGでの処理が、肺の白血球の浸潤および気管支上皮の粘膜異形成を防止することを示す。これらの結果は、肺の組織中に存在する細胞のフローサイトメトリー分析により確実にされ、これは長期凍結乾燥死滅BCGでの処理は、肺において、白血球浸潤の統計的に有意な減少を誘導する;異なる白血球の集団の分析は、長期凍結乾燥死滅BCG処理群の肺における、マクロファージ、多核白血球、および樹状細胞の数の減少を示す。dサイトカイン分析種々のBCG調製物で処理されたマウスの群からの肺の生検を、BCGまたは抗CD3mAbにより分泌される未精製のタンパク質の存在下、または非存在下に培養し、上清中のIFNγおよびIL10の産生を分析した。図9および21に示す結果は、IFNγの産生は、BCGでの免疫化を必要とすることを示す。長期凍結乾燥死滅BCG群で観察された、より低いレベルのIFNγは、他のBCG免疫化群で観察されるレベルから統計的に有意ではない。抗CD3抗体でのTリンパ球の非特異的促進は、種々の群でのIFNγのよく似たレベルを示し、BCGでの免疫化が肺に存在するTリンパ球の数を変更しないことを示唆する。図21に示す結果も、生存BCGおよび熱死滅BCG処理群に比べて、長期凍結乾燥死滅BCG処理群において、統計的に有意なより高いIL10のレベルを示す。長期凍結乾燥死滅BCG処理群と、その他のBCG調製物で処理された群との間の、肺におけるサイトカインの発現プロフィールの差異は、長期凍結乾燥死滅BCGの活性が、アレルゲン送達後の肺組織に存在する白血球の集団での修飾に関係することを示す。肺の外植片により放出される多量のIL10および少量のIFNγは、アレルゲン送達後に、長期凍結乾燥死滅BCG群の肺組織中に調節細胞が存在することを明らかにし得る。e抗OVA特異的IgEのレベル種々のBCG調製物で処理する前にOVAでの免疫化を実現したが、抗OVAIgEのレベルは全ての群で同じであり、長期凍結乾燥死滅BCGで観察される防御的効果は、IgE濃度への直接の影響を含まないことを示唆する。実施例4:熱死滅または長期凍結乾燥死滅BCGにより賦活化された肺胞のマクロファージにより産生されるサイトカインの分析1材料および方法実施例3に記載のようにして獲得し、維持されたBP2およびBALBcマウスを、実施例3bに記載のようにしてOVAで免疫化した。OVAの最後の注射後1週間で、ウレタンの致死量を用いて腹腔内経路によりマウスに麻酔をかけた。循環血液を腹部大動脈から除去し、シリンジに接続されたカニューレを気管内に置き、肺を2の胎児ウシ血清を含むHBSS培地05mlで2回、および1mlで5回洗浄した。BAL中に存在するマクロファージの数を、COULTERにより提供される自動計数装置で測定した。マクロファージを1000rpmで20分間、室温にて遠心分離し、その濃度を3胎児ウシ血清、2mMグルタミン、100UImlペニシリンおよび10μgmlストレプトマイシンを含むRPMI1640培地中に340103細胞mlに調整した。次いで、マクロファージを組織培養のための96ウェルプレート中に分配し、5CO2の存在下で37°Cにおいて少なくとも2時間インキュベートした。RPMI培地での数回の洗浄により、非接着細胞を除去した後、マクロファージを熱死滅BCGまたは長期凍結乾燥死滅BCGの存在下で培養した;イーコリリポ多糖類およびOVAを、コントロールとして用いた。細胞培養上清を、種々の調製物の添加後2、4、6、8、12、24、48、72および96時間で回収し、すぐに20°Cで凍結した。2結果図11および12に示す結果は:1Th1細胞の成熟および抗アレルギー性サイトカインの産生に関与するIL12が、長期凍結乾燥死滅および熱死滅BCG調製物により賦活化されたBALBcおよびBP2マウスの肺胞マクロファージにより産生され、2重要な炎症性副作用と関連し得るサイトカインであるTNFαが、熱死滅BCG調製物により賦活化されたBALBcおよびBP2マウスの肺胞マクロファージによってのみ産生される;本実験で用いた濃度での長期凍結乾燥死滅BCG調製物により賦活化された肺胞マクロファージでは、TNFαは産生されないことを示す。これらの結果は、熱死滅および生存BCGの注射後に観察される副作用とは反対に、長期凍結乾燥BCGの注射後に観察される最小限の有害反応を支持する。実施例5:長期凍結乾燥死滅BCGの投与は、BCG精製蛋白誘導体に対する遅延型過敏を誘導しない。1材料および方法実施例3dに記載のようにして、マウスをOVAで免疫化し、種々のBCGの調製物で処理するか、または処理しなかった。種々のBCG調製物での最初の皮下注射後100日で、ヒトでの結核の診断に用いられる、BCG精製蛋白誘導体に対する遅延型過敏を、マウスの種々の群について行った。より精密には、食塩水中のPPD50μlを、マウスの足踵部に注射し、24時間後に足踵部の膨張を測定した。2結果図13に示す結果は、長期凍結乾燥死滅BCGで免疫化されたマウスは、陰性の皮膚試験により示されるように、BCG精製蛋白誘導体に対して遅延型過敏を発生しないことを示す。マウスは、大量の投与量の長期凍結乾燥死滅BCGを注射した後にのみ、PPDに対する感作を少し発生した。比較すると、生存BCGまたは熱死滅BCGで免疫化されたマウスは、低い投与量であっても、陽性の皮膚試験により示されるように、BCG精製蛋白誘導体に対して遅延型過敏を発生する。これらの結果は、特異的賦活化の下で高いレベルのIFNγの産生を示す他のBCG調製物処理群とは反対に、長期凍結乾燥死滅BCG処理群で、特異的刺激の下に少量のIFNγの産生を示す、先行する結果に相関する。同様に、PPDに対するモルモットの反応性は、長期凍結乾燥死滅BCG処理後に下限ぎりぎりである。これらの結果は、長期凍結乾燥死滅BCGでの免疫化に続いて、特異的Tリンパ球の特定のサブタイプが選択されるか、または代わりに特異的T細胞がある特定の組織に固定化されることを示す。結果として、生存BCGまたは熱死滅BCGでの免疫化とは反対に、長期凍結乾燥死滅BCGでの免疫化は、DTH皮膚試験による結核の診断を妨げない。実施例6:モルモットモデルにおける、喘息に対する長期凍結乾燥死滅マイコバクテリアの防御的効果1材料および方法雄の成体モルモットを、食塩水中のオボアルブミン10μgおよびミョウバン1mgで皮下経路により免疫化した。3週間後、該モルモットに、長期凍結乾燥死滅BCG、またはPBSのいずれかを皮内に注射した。気管支肺の反応性を、マウスに用いたのとは異なる方法で、モルモットについて分析する;各動物の敏感度を、アレルゲン攻撃の24時間前の、エアロゾル投与されたヒスタミンの増加する投与量で評価し、上昇したPenh値を与えるヒスタミンの最高濃度を、ヒスタミンへの敏感度の基礎のレベルとみなした。アレルゲン攻撃の24時間後に、同様の測定を行った;OVA免疫化モルモットは、ヒスタミン形質転換細胞のより高い敏感度を発生し、よって、同じPenh値を得るのに、攻撃の前よりも少ないヒスタミンが必要である。より精密には:各群の6匹のモルモットを、BCGまたはコントロール物質の注射の後7~10週間で行うヒスタミン試験で、その気管支肺の反応性について試験する。気圧体積変動記録器を用いて、各モルモットについて明確な気管支収縮を誘発するヒスタミンの投与量を測定する。基礎の反応性を、試験の第1日目に測定することがわかっているので、各モルモットはそれ自身のコントロールである。24時間後、オボアルブミンエアロゾルを投与する。第3日にヒスタミン反応性を再び測定する。オボアルブミンの投与は、ヒスタミンへの気管支肺反応亢進を増大させる。2結果図14に示す結果は、それぞれ本発明の長期凍結乾燥死滅BCG10μgまたは100μgで処理した56および66のモルモットが、気管支肺反応亢進に対して防御されているが、コントロール群では、ヒスタミンへの気管支肺反応亢進がかなり増加している。実施例7:長期凍結乾燥死滅BCGの最小限の副作用a貧血および血小板減少がないマウスに、長期凍結乾燥死滅BCGもしくは実施例3dに記載のような種々のBCG調製物を静脈内に注射するか、または処理しなかった。注射後18日で、血液サンプルからの赤血球および血小板の数を測定した。図22に示す結果は、生存BCGおよび熱死滅BCG処理群とは反対に、長期凍結乾燥BCG処理群では貧血も血小板減少も観察されなかったことを示す。b注射部位での最小限の炎症反応第0日に、実施例3dに記載のような種々のBCG調製物をマウスの群に皮下注射した。生存BCGは1回のみ注射し、熱死滅および長期凍結乾燥死滅BCGは2回注射した。こうして、足踵部の増大を10週間にわたって毎週測定した。図23に示す結果は、長期凍結乾燥死滅BCGが、最小限の炎症性副作用を発現することを示す。cLPS賦活化後の減少されたTNFαの産生上述したような種々のBCG調製物で18日前に処理したマウスからの肺の外植片を、インビトロでLPSの存在下または非存在下に維持し、TNFαの産生を、製造業者の使用説明書に従って市販のキットを用いてELISAにより測定した。図24に示す結果は、生存BCGおよび熱死滅BCG処理とは反対に、長期凍結乾燥死滅BCG処理はマクロファージの産生および/または活性化を誘導しない。実施例8:長期凍結乾燥死滅BCGの皮下注射後の、流入領域リンパ節および脾臓での細胞の分析1材料および方法実施例3dに記載のような種々のBCG調製物で皮下経路により48時間前に処理されたマウスの流入領域リンパ節に存在する細胞を、種々の蛍光色素で標識された、種々の白血球集団の細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。長期凍結乾燥死滅BCGで皮下経路により処理されたマウスの脾臓に存在する細胞を、OVAもしくはBCG培養物上清の存在下でインビトロにて賦活化するか、または賦活化しなかった後に、上記のようにして分析した。2結果a流入領域リンパ節流入領域リンパ節に存在する細胞の分析は、生存BCGおよび熱死滅BCG処理群と比較すると、リンパ節に存在する細胞は、長期凍結乾燥死滅BCGの皮下注射の48時間後に、3~5倍の数であったことを示す。長期凍結乾燥死滅BCGの注射後4日での種々の白血球集団の動力学的分析は、48時間での樹上細胞数の一過性の増加とともに、6時間~96時間でのB220およびCD4リンパ球の数の増加を示す。b脾臓脾臓に存在する細胞の分析は:-長期凍結乾燥処理群における、CD11cGr1B220形質細胞様樹状細胞の数のかなりの増加、同じ群でCD8α細胞の数の増加は観察されなかった。-インビトロでOVAもしくはBCG培養物上清で賦活化するか、または賦活化しなかったいずれの長期凍結乾燥処理群におけるCD4CD25IL10細胞の数のかなりの増加を示す。結果は、喘息のマウスモデルにおいて、長期凍結乾燥死滅BCGは、アレルゲンに予め感作されたマウスにおいて、免疫調節細胞を誘導するか、またはそれ自身が免疫調節細胞である細胞の数のかなりの増加を誘発することができ、これが喘息の症状に対する防御的効果となる。実施例9:経口経路による長期凍結乾燥死滅BCGは、活性である実施例3dに記載のようにして、予めOVAで免疫化されたマウスを、第42、44、46および62、64ならびに66日に長期凍結乾燥1mgで経口的に処理したか、または処理せずに、次いで第96日にOVAで攻撃したか、またはしなかった。長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果を、実施例3に記載のようにして肺細胞浸潤の計数により評価した。結果は、未処理の群と比較すると、長期凍結乾燥死滅BCG処理群の肺の全細胞数の有意な減少p<0001を示す。白血球集団の分析は、処理群の肺でのマクロファージ、多核および樹状細胞の数のかなりの減少を示す。実施例10:長期凍結乾燥死滅BCGの有効投与量、投与のリズム、作用の持続期間および遅延の測定長期凍結乾燥死滅BCGを、予め免疫化したマウスに皮下経路により注射し、次いでOVAで攻撃し、そしてその活性を、実施例3に記載のようにして試験した。a有効投与量および投与回数成体のマウスをOVAで第0および7日に感作し、第45日に1回、または第45および65日の2回、長期凍結乾燥死滅BCGで皮下経路により注射して、次いで第96日にオボアルブミンで攻撃した。長期凍結乾燥死滅BCGの活性を、実施例3に記載のようにして、喘息のBP2モデルの気管支肺反応亢進の予防により試験した。最少の投与量は活性であり、100μgより多い投与量は、活性を増加させなかった。防御的効果は、長期凍結乾燥死滅BCGの1回の投与量のみで観察された。b長期凍結乾燥死滅BCGの作用の遅延時間列を決定して長期凍結乾燥死滅BCGの効率を得るために、成体のマウスを、第0および7日にOVAで感作し、第14日に長期凍結乾燥死滅BCG100μgを皮下注射し、次いで第21、28または35日にOVAで攻撃した。長期凍結乾燥死滅BCGの活性を、実施例3に記載のようにして、喘息のBP2モデルの気管支肺反応亢進の予防により試験した。気管支肺反応亢進の予防は、長期凍結乾燥死滅BCGの投与と、攻撃との間に2~3週間の遅延が存在すれば、起こる;この結果は、長期凍結乾燥死滅BCGが活性になる前に、所定の細胞集団の漸加および増殖が必要であることを示す。この結果は、マウスを喘息から防御するには、長期凍結乾燥死滅BCGの1回の投与量で充分であることも確認する。c長期凍結乾燥死滅BCGの作用の持続期間長期凍結乾燥死滅BCGの作用の持続期間の測定のために、成体のマウスを、第0および7日にOVAで感作し、第45および65日に長期凍結乾燥死滅BCG100μgを皮下注射し、次いで第96または42日にOVAで攻撃した。長期凍結乾燥死滅BCGの活性を、喘息のBP2モデルにおける気管支肺反応亢進への防御的効果、および肺細胞浸潤の計数により、実施例3に記載のようにして評価した。結果は、長期凍結乾燥死滅BCGの防御的効果が少なくとも2ヶ月持続することを示す。d長期凍結乾燥BCGの投与の、防御的プロトコルに対する治療的なプロトコル上に示すような、これまでの結果は、治療的プロトコルにおける長期凍結乾燥死滅BCGの効力を実証している。よって、予防的プロトコルにおける長期凍結乾燥死滅BCGの効力を評価するために、マウスを次のようにして処理した:-成体のマウスに、OVA免疫化の前の14、21または28日に長期凍結乾燥死滅BCGで皮下注射し、OVAで第0および7日に免疫化し、次いで第14日にOVAで攻撃した。-新生児のマウスに、OVA免疫化の前の56日に長期凍結乾燥死滅BCGを皮下または鼻腔内に注射し、OVAで第0および7日に免疫化し、次いで第14日にOVAで攻撃した。予防的プロトコルにおける長期凍結乾燥死滅BCGの活性を、実施例3に記載のようにして、喘息のBP2モデルにおける気管支肺反応亢進への防御的効果により評価した。成体のマウスでの結果は、調製物が感作の数日前に注射された場合にのみ、予防的プロトコルにおける、長期凍結乾燥BCGの防御的効果を示す。新生児のマウスでの結果は、皮下投与でのみ、予防的プロトコルにおける、長期凍結乾燥BCGの防御的効果を示す;鼻腔経路は、これらの条件下では活性に乏しい。