"式Iの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよく;およびWは薬物である。を調製する方法であって:a式Aの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよく;およびLG1は好適な脱離基である。を提供するステップ;およびb前記式Aの化合物をアミン含有薬物と反応させて、式Iの化合物を形成するステップ;を含む方法。式IIの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;およびAlkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよいを調製する方法であって:a式Aの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよく;およびLG1は好適な脱離基である。を提供するステップ;およびb前記式Aの化合物をインスリン分子と反応させて、式IIの化合物を形成するステップ;を含む方法。Xの各出現が同じリガンドである、請求項2に記載の方法。LG1が-OSuである、請求項2に記載の方法。式IIの化合物が図1に示すものから選択される、請求項2に記載の方法。式Aの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよく;およびLG1は好適な脱離基である。を調製する方法であって:a式Bの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;およびAlkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよい。を提供するステップ;およびb式Bの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Aの化合物を形成するステップ;を含む方法。式Bの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;およびAlkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよい。を調製する方法であって:a式Cの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC2-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよく;PG1はカルボン酸保護基である。を提供するステップ;およびb式Cの化合物を脱保護して、式Bの化合物を形成するステップ;を含む方法。式Cの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよい;およびPG1はカルボン酸保護基である。を調製する方法であって:a式Dの化合物:式中:PG1はカルボン酸保護基であり;およびAlkはC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよい。を提供するステップ;およびb式Dの化合物をアミン含有リガンドH2N-XEと反応させて、式Cの化合物を形成するステップ;を含む方法。式Dの化合物:式中:PG1はカルボン酸保護基であり;およびAlkはC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよい。を調製する方法であって:a式Fの化合物:式中:Alk1はC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよい。を提供するステップ;およびb化合物Fのカルボン酸部分を保護して、式Dの化合物を与えるステップ;を含む方法。式Aの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよい;およびLG1は好適な脱離基である。を調製する方法であって:a式Fの化合物:式中:AlkはC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよい。を提供するステップ;b化合物Fのカルボン酸部分を保護して、式Dの化合物:式中:AlkはC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよく;およびPG1はカルボン酸保護基である。を与えるステップ;c式Dの化合物をアミン含有リガンドH2N-XEと反応させて、式Cの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよく;およびPG1はカルボン酸保護基である。を形成するステップ;d式Cの化合物を脱保護して、式Bの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;およびAlkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は-O-または-S-によって置き換えられていてもよい。を形成するステップ;およびe前記式Bの化合物のカルボン酸を活性化して、式Aの化合物を形成するステップ;を含む方法。式Iの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよい;およびWは薬物である。を調製する方法であって:a式Fの化合物:式中:AlkはC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよい。を提供するステップ;b化合物Fのカルボン酸部分を保護して、式Dの化合物:式中:AlkはC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよく;およびPG1はカルボン酸保護基である。を与えるステップ;b式Dの化合物をアミン含有リガンドH2N-XEと反応させて、式Cの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよい;およびPG1はカルボン酸保護基である。を形成するステップ;d式Cの化合物を脱保護して、式Bの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;およびAlkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよい。を形成するステップ;e式Bの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Aの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよい;およびLG1は好適な脱離基である。を形成するステップ;およびf式Aの化合物をアミン含有薬物と反応させて、式Iの化合物を形成するステップ;を含む方法。式IIの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;およびAlkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよい。を調製する方法であって:a式Fの化合物:式中:AlkはC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよい。を提供するステップ;b化合物Fのカルボン酸部分を保護して、式Dの化合物:式中:AlkはC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよく;およびPG1はカルボン酸保護基である。を与えるステップ;c式Dの化合物をアミン含有リガンドH2N-XEと反応させて、式Cの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよく;およびPG1はカルボン酸保護基である。を形成するステップ;d式Cの化合物を脱保護して、式Bの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;およびAlkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよい。を形成するステップ;e式Bの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Aの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置き換えられていてもよく;およびLG1は好適な脱離基である。を形成するステップ;およびf式Aの化合物をインスリン分子と反応させて、式IIの化合物;を形成するステップ。式Fの化合物:式中:AlkはC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン基は、-O-または-S-によって置換され得る。。式Fの化合物がである、請求項13に記載の化合物。式Dの化合物:式中:AlkはC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン基は、-O-または-S-によって置換され得て;およびPG1はカルボン酸保護基である。。式Dの化合物がである、請求項15に記載の化合物。式Cの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換され得て;およびPG1はカルボン酸保護基である。。式Cの化合物がである、請求項17に記載の化合物。式Bの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;およびAlkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換されていてもよい。。式Bの化合物がである、請求項19に記載の化合物。式Aの化合物:式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は、-O-または-S-によって置換され得て;およびLG1は好適な脱離基である。。式Aの化合物がである、請求項21に記載の化合物。式のコンジュゲート:式中、はインスリン分子であり、GlyA1に結合して示されているNH-基は、インスリン分子のA1位置におけるグリシン残基のアルファアミノ酸からであり、およびLysB29に結合して示されているNH-基は、インスリン分子のB29位置におけるリジン残基のイプシロンアミノ酸からである。。が野生型ヒトインスリンである、請求項23に記載のコンジュゲート。本明細書に記載する場合、本発明は、インスリンなどの薬物の薬物動態PKおよび/または薬力学PDプロフィールを、グルコースなどの糖類の全身濃度に応答する方法で制御することができる薬物-リガンドコンジュゲートを調製する方法を提供する。このようなコンジュゲートは、式Iのコンジュゲート:またはその医薬的に許容される塩を包含し、式中:Xの各出現は独立してリガンドであり;Alkの各出現は独立してC1-C12アルキレン鎖であり、1つ以上のメチレン単位は-O-または-S-によって置き換えられていてもよく;Wは薬物である。本発明は、このようなコンジュゲートを調製するのに有用な合成中間体も提供する。ある実施形態において、薬物-リガンドコンジュゲートの調製に有用な例示的中間体は、式Aのコンジュゲートであり:式中、X、AlkおよびLG1は、定義されている通りであり、本明細書の実施形態に記載されている。本発明は、Wのような薬物の代わりに、検出可能な標識を包含するコンジュゲートを調製する方法も提供する。定義本明細書全体を通じて使用する具体的な官能基、化学用語および一般用語の定義を、以下でより詳細に記載する。本発明の目的のために、化学元素は、PeriodicTableoftheElements,CASversion,HandbookofChemistryandPhysics,75thEd.,内表紙に従って明示されるものであり、具体的な官能基は一般にその中に記載されているように定義されている。加えて、有機化学の一般原理ならびに具体的な官能部分および反応性は、OrganicChemistry,ThomasSorrell,UniversityScienceBooks,Sausalito,1999;SmithandMarchMarch’sAdvancedOrganicChemistry,5thEdition,JohnWileySons,Inc.,NewYork,2001;Larock,ComprehensiveOrganicTransformations,VCHPublishers,Inc.,NewYork,1989;Carruthers,SomeModernMethodsofOrganicSynthesis,3rdEdition,CambridgeUniversityPress,Cambridge,1987に記載されている。アシル-本明細書で使用する場合、アシルという用語は、一般式-C=ORXI、-C=OORXI、-C=O-O-C=ORXI、-C=OSRXI、-C=ONRXI2、-C=SRXI、-C=SNRXI2および-C=SSRXI、-C=NRXIRXI、-C=NRXIORXI、-C=NRXISRXIならびに-C=NRXINRXI2式中、RXIは、水素;ハロゲン;置換もしくは非置換ヒドロキシル;置換もしくは非置換チオール;置換もしくは非置換アミノ;置換もしくは非置換アシル;環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分枝もしくは非分枝脂肪族;環式もしくは非環式、置換もしくは非置換,分枝もしくは非分枝ヘテロ脂肪族;環式もしくは非環式、置換もしくは非置換,分枝もしくは非分枝アルキル;環式もしくは非環式,置換もしくは非置換,分枝もしくは非分枝アルケニル;置換もしくは非置換アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、モノ-もしくはジ脂肪族アミノ、モノ-もしくはジヘテロ脂肪族アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、モノ-もしくはジヘテロアルキルアミノ、モノ-もしくはジアリールアミノ、またはモノ-もしくはジヘテロアリールアミノであるか;または2個のRXI基がひとまとめにされて、5から6員複素環式環を形成する。を指す。例示的なアシル基としては、アルデヒド-CHO、カルボン酸-CO2H、ケトン、アシルハライド、エステル、アミド、イミン、カーボネート、カルバメートおよび尿素が挙げられる。アシル置換基としては、これに限定されるわけではないが、安定性部分の形成を生じる、本明細書に記載する置換基のいずれかたとえば脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族,複素環式、アリール、ヘテロアリール、アシル、オキソ、イミノ、チオキソ、シアノ、イソシアノ、アミノ、アジド、ニトロ、ヒドロキシル、チオール、ハロ、脂肪族アミノ、ヘテロ脂肪族アミノ、アルキルアミノ、ヘテロアルキルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アルキルアリール、アリールアルキル、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、アシルオキシなど、そのそれぞれはさらに置換されていても、または置換されていなくてもよい。が挙げられる。脂肪族-本明細書で使用する場合、脂肪族または脂肪族基という用語は、直鎖すなわち非分枝、分枝または環式炭素環式であり得る、および完全に飽和され得るまたは1単位以上の不飽和を含有し得るが、芳香族ではない、置換されていてもよい炭化水素部分を示す。別途規定しない限り、脂肪族基は1-12個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態において、脂肪族基は1-6個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態において、脂肪族基は1-4個の炭素原子を含有して、また他の実施形態において、脂肪族基は1-3個の炭素原子を含有する。好適な脂肪族基としては、これに限定されるわけではないが,直鎖または分枝アルキル、アルケニルおよびアルキニル基、ならびにたとえばシクロアルキルアルキル、シクロアルケニルアルキルまたはシクロアルキルアルケニルなどのそのハイブリッドが挙げられる。アルケニル-本明細書で使用する場合、アルケニルという用語は、単一の水素原子の除去により少なくとも1個の炭素間二重結合を有する直鎖または分枝鎖脂肪族部分から誘導された置換されていてもよい1価基を示す。ある実施形態において、本発明で用いられるアルケニル基は2-6個の炭素原子を含有する。ある実施形態において、本発明で用いられるアルケニル基は2-5個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態において、本発明で用いられるアルケニル基は2-4個の炭素原子を含有する。別の実施形態において、用いられるアルケニル基は2-3個の炭素原子を含有する。アルケニル基としては、たとえばエテニル、プロペニル、ブテニル、1-メチル-2-ブテン-1-イルなどが挙げられる。アルキル-本明細書で使用する場合、アルキルという用語は、単一の水素原子の除去により1から6個の間の炭素原子を含有する脂肪族部分から誘導された置換されていてもよい飽和、直鎖または分枝鎖炭化水素ラジカルを指す。いくつかの実施形態において、本発明で用いられるアルキル基は1-5個の炭素原子を含有する。別の実施形態において、用いられるアルキル基は1-4個の炭素原子を含有する。なお他の実施形態において、アルキル基は1-3個の炭素原子を含有する。また別の実施形態において、アルキル基は1-2個の炭素を含有する。アルキルラジカルの例としては、これに限定されるわけではないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソ-ブチル、sec-ブチル、sec-ペンチル、イソ-ペンチル,tert-ブチル、n-ペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、sec-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-デシル、n-ウンデシル、ドデシルなどが挙げられる。アルキニル-本明細書で使用する場合、アルキニルという用語は、単一の水素原子の除去により少なくとも1個の炭素間三重結合を有する直鎖または分枝鎖脂肪族部分から誘導された置換されていてもよい1価基を指す。ある実施形態において、本発明で用いられるアルキニル基は2-6個の炭素原子を含有する。ある実施形態において、本発明で用いられるアルキニル基は2-5個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態において、本発明で用いられるアルキニル基は2-4個の炭素原子を含有する。別の実施形態において、用いられるアルキニル基は2-3個の炭素原子を含有する。代表的なアルキニル基としては、これに限定されるわけではないが、エチニル、2-プロピニルプロパルギル、1-プロピニルなどが挙げられる。アリール-本明細書で使用する場合、アリールという用語は、単独でまたはアラルキル、アラルコキシまたはアリールオキシアルキルにおけるようにより大型の部分の一部として使用され、5から10環員を有する置換されていてもよい単環式または二環式環系であって、系の少なくとも1個の環が芳香族であり、系の各環が3から7個の環員を含有する単環式または二環式環系を指す。アリールという用語は、アリール環という用語と互換的に使用され得る。本発明のある実施形態において、アリールは、これに限定されるわけではないが、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなどを包含し、1個以上の置換基を担持し得る芳香環系を指す。アリールアルキル-本明細書で使用する場合、アリールアルキルという用語は、アリール基たとえば芳香族またはヘテロ芳香族基によって置換されたアルキル基を指す。アルキレン鎖-本明細書で使用する場合、アルキレン鎖単にアルキレンとも呼ばれるという用語は、ポリメチレン基、すなわち-CH2Z-であり、式中、zは、1から30の、1から20の、1から12の、1から8の、1から6の、1から4の、1から3の、1から2の、2から30の、2から20の、2から10の、2から8の、2から6の、2から4の、または2から3の正の整数である。置換二価炭化水素鎖は、1つ以上のメチレン水素原子が置換基によって置き換えられているポリメチレン基である。置換脂肪族基のための好適な置換基は下記の置換基を包含する。メチレン単位-CH2-も-O-、-S-、-NH-、-NHCO-、-CONH-、-CO-、-SO-、-SO2-などの他の二価基によって置き換えられていてもよい。カルボニル-本明細書で使用する場合、カルボニルという用語は、炭素-酸素二重結合を含有する一価または二価部分を指す。カルボニル基の非制限的な例としては、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、アシルハライド、無水物、尿素、カルバメート、カーボネート、チオエステル、ラクトン、ラクタム、ヒドロキサメート、イソシアネートおよびクロロホルメートが挙げられる。脂環式-本明細書で使用する場合、脂環式、炭素環、または炭素環式は、単独でまたより大型の部分の一部として使用され、3から10個の環員を有する、本明細書に記載されているような、置換されていてもよい飽和または部分不飽和の、環式脂肪族単環式または二環式環系を指す。脂環式基としては、制限なく、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニルおよびシクロオクタジエニルが挙げられる。いくつかの実施形態において、シクロアルキルは3-6個の炭素を有する。ハロゲン-本明細書で使用する場合、ハロおよびハロゲンという用語は、フッ素フルオロ、-F、塩素クロロ、-Cl、臭素ブロモ、-Brおよびヨウ素ヨード、-Iから選択される原子を指す。ヘテロ脂肪族-本明細書で使用する場合、ヘテロ脂肪族またはヘテロ脂肪族基という用語は、直鎖すなわち非分枝、分枝または環式複素環式であり得る、および完全に飽和され得るまたは1単位以上の不飽和を含有し得るが、芳香族ではない、炭素原子に加えて1から5個のヘテロ原子を有する、置換されていてもよい炭化水素部分を示す。別途規定しない限り、ヘテロ脂肪族基は1-6個の炭素原子を含有し、1-3個の炭素原子は、酸素、窒素および硫黄から選択されるヘテロ原子によって独立して置き換えられていてもよい。いくつかの実施形態において、ヘテロ脂肪族基は1-4個の炭素原子を含有して、1-2個の炭素原子は、酸素、窒素および硫黄から選択されるヘテロ原子によって独立して置き換えられていてもよい。また他の実施形態において、ヘテロ脂肪族基は1-3個の炭素原子を含有して、1個の炭素原子は、酸素、窒素および硫黄から選択されるヘテロ原子によって独立して置き換えられていてもよい。好適なヘテロ脂肪族基としては、これに限定されるわけではないが、直鎖または分枝ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよびヘテロアルキニル基が挙げられる。ヘテロアラルキル-本明細書で使用する場合ヘテロアラルキルという用語は、ヘテロアリールによって置換され、アルキルおよびヘテロアリール部分が独立して置換されていてもよいアルキル基を指す。ヘテロアリール-本明細書で使用する場合、単独でまたはより大型の部分の一部、たとえばヘテロアラルキルもしくはヘテロアラルコキシとして使用されるヘテロアリールという用語は、5から10個の環原子、好ましくは5、6または9個の環原子を有する;環式アレイ内で共有される6、10または14個のπ電子を有し;および炭素原子に加えて、1から5個のヘテロ原子を有する、置換されていてもよい基を指す。ヘテロアリール基としては、制限なく、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルおよびプテリジニルが挙げられる。ヘテロアリールおよびヘテロアル-という用語は、本明細書で使用する場合、ヘテロ芳香族環が1つ以上のアリール環、炭素環式環または複素環式環に縮合され、ラジカルまたは結合点がヘテロ芳香族環上にある基も包含する。非制限的な例としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、4H-キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニルおよびテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。ヘテロアリール基は単環式または二環式であり得る。ヘテロアリールという用語は、ヘテロアリール環、ヘテロアリール基またはヘテロ芳香族という用語と互換的に使用され得て、その用語のいずれも置換されていてもよい環を包含する。ヘテロ原子-本明細書で使用する場合、ヘテロ原子という用語は、窒素、酸素または硫黄を指し、窒素または硫黄のいずれの酸化形および塩基性窒素のいずれの四級化形も包含する。窒素という用語は置換された窒素も包含する。複素環式-本明細書で使用する場合、複素環、ヘテロシクリル、複素環式ラジカルおよび複素環式環という用語は、互換的に使用され、飽和または部分不飽和のどちらかであり、炭素原子に加えて1個以上の上で定義したようなヘテロ原子を有する、安定な、置換されていてもよい5から7員単環式または7から10員二環式複素環式部分を指す。複素環式環は、安定な構造を生じるいずれのヘテロ原子または炭素原子にてそのペンダント基に結合することができ、環原子のいずれも置換されていてもよい。このような飽和または部分不飽和複素環式ラジカルの例としては、制限なく、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニルおよびキヌクリジニルが挙げられる。複素環、ヘテロシクリル、ヘテロシクリル環、複素環式基、複素環式部分および複素環式ラジカルという用語は、本明細書で互換的に使用され、ヘテロシクリル環がインドリニル、3H-インドリル、クロマニル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロキノリニルなどの1個以上のアリール環、ヘテロアリール環または炭素環式環に縮合され、ラジカルまたは結合点がヘテロシクリル環上にある基も包含する。ヘテロシクリル基は単環式または二環式であり得る。ヘテロシクリルアルキルという用語は、アルキル基がヘテロシクリルによって置換されたアルキル基を指し、アルキル部分およびヘテロシクリル部分は独立して、置換されていてもよい。不飽和-本明細書で使用する場合、不飽和という用語は、部分が1個以上の二重または三重結合を有することを意味する。部分不飽和-本明細書で使用する場合、部分不飽和という用語は、少なくとも1つの二重または三重結合を含む環部分を指す。部分不飽和という用語は、複数の不飽和部位を有する環を含むことを意図するが、本明細書で定義するようなアリールまたはヘテロアリール部分を包含することは意図しない。置換されていてもよい-本明細書に記載する場合、本発明の化合物は置換されていてもよい部分を含有し得る。概して、置換されたという用語は、されていてもよいという用語に先行されていてもいなくても、指示された部分の1個以上の水素が好適な置換基によって置き換えられていることを意味する。別途指摘しない限り、置換されていてもよい基は、基の各置換可能な位置に好適な置換基を有し得て、所与の構造中の1を超える位置が規定された群より選択された1を超える置換基によって置換され得る場合、置換基は、各位置にて同じであり得るか、または異なり得るかのいずれかである。本発明により想定される置換基の組合せは、好ましくは安定な、または化学的に実現可能な化合物の形成を生じる組合せである。安定なという用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に開示した目的の1つ以上のための、その生成、検出、ならびにある実施形態において、その回収、精製および使用を可能にする条件に供されたときに、実質的に改変されない化合物を指す。置換されていてもよい基の置換可能な炭素原子上の好適な一価置換基は独立して、ハロゲン;-CH20-4R○;-CH20-4OR○;-O-CH20-4COOR○;-CH20-4CHOR○2;-CH20-4SR○;-CH20-4PhR○によって置換され得る;-CH20-4OCH20-1PhR○によって置換され得る;-CH=CHPhR○によって置換され得る;-NO2;-CN;-N3;-CH20-4NR○2;-CH20-4NR○COR○;-NR○CSR○;-CH20-4NR○CONR○2;-NR○CSNR○2;-CH20-4NR○COOR○;-NR○NR○COR○;-NR○NR○CONR○2;-NR○NR○COOR○;-CH20-4COR○;-CSR○;-CH20-4COOR○;-CH20-4COSR○;-CH20-4COOSiR○3;-CH20-4OCOR○;-OCOCH20-4SR-;SCSSR○;-CH20-4SCOR○;-CH20-4CONR○2;-CSNR○2;-CSSR○;-SCSSR○、-CH20-4OCONR○2;-CONOR○R○;-COCOR○;-COCH2COR○;-CNOR○R○;-CH20-4SSR○;-CH20-4SO2R○;-CH20-4SO2OR○;-CH20-4OSO2R○;-SO2NR○2;-CH20-4SOR○;-NR○SO2NR○2;-NR○SO2R○;-NOR○R○;-CNHNR○2;-PO2R○;-POR○2;-OPOR○2;-OPOOR○2;SiR○3;-C1-4直鎖もしくは分枝アルキレンO-NR○2;または-C1-4直鎖もしくは分枝アルキレンCOO-NR○2であり、式中、各R○は、下で定義するように置換され得て、独立して水素、C1-6脂肪族、-CH2Ph、-OCH20-1Ph、または窒素、酸素もしくは硫黄より独立して選択される0-4個のヘテロ原子を有する5-6員飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、または上の定義にかかわらず、R○の2つの独立した出現は、その介在原子とひとまとめにされて、下で定義されるように置換され得る、窒素、酸素、または硫黄より独立して選択される0-4個のヘテロ原子を有する3-12員飽和、部分不飽和またはアリール単環式または二環式環を形成する。R○またはR○の2つの独立した出現をその介在原子とひとまとめにすることによって形成された環上の好適な一価置換基は、独立してハロゲン、-CH20-2R●、-ハロR●、-CH20-2OH、-CH20-2OR●、-CH20-2CHOR●2;-OハロR●、-CN、-N3、-CH20-2COR●、-CH20-2COOH、-CH20-2COOR●、-CH20-2SR●、-CH20-2SH、-CH20-2NH2、-CH20-2NHR●、-CH20-2NR●2,-NO2、-SiR●3、-OSiR●3、-COSR●、-C1-4直鎖または分枝アルキレンCOOR●または-SSR●であり、式中、各R●は非置換であるか、またはハロに先行されている場合は1つ以上のハロゲンでのみ置換されており、C1-4脂肪族、-CH2Ph、-OCH20-1Ph、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される0-4個のヘテロ原子を有する5-6員飽和、部分不飽和もしくはアリール環から独立して選択される。R○の飽和炭素原子上の好適な二価置換基としては、=Oおよび=Sが挙げられる。置換されていてもよい基の飽和炭素原子上の好適な二価置換基としては、以下の:=O、=S、-NNR2、=NNHCOR、=NNHCOOR、=NNHSO2R、=NR、=NOR、-OCR22-3O-または-SCR22-3S-が挙げられ、Rの各独立した出現は、水素、下で定義するように置換され得るC1-6脂肪族、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される0-4個のヘテロ原子を有する非置換5-6員飽和、部分不飽和もしくはアリール環から独立して選択される。置換されていてもよい基の近接した置換可能な炭素に結合されている好適な二価置換基としては:-OCR22-3O-が挙げられ、Rの各独立した出現は、水素、下で定義するように置換され得るC1-6脂肪族、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される0-4個のヘテロ原子を有する非置換5-6員飽和、部分不飽和もしくはアリール環から独立して選択される。Rの脂肪族基上の好適な置換基としては、ハロゲン、-R●、-ハロR●、-OH、-OR●、-OハロR●、-CN、-COOH、-COOR●、-NH2、-NHR●、-NR●2、または-NO2が挙げられ、各R●は非置換であるか、またはハロに先行されている場合は1つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、C1-4脂肪族、-CH2Ph、-OCH20-1Ph、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される0-4個のヘテロ原子を有する5-6員飽和、部分不飽和もしくはアリール環である。置換されていてもよい基の置換可能な窒素上の好適な置換基としては、-R†、-NR†2、-COR†、-COOR†、-COCOR†、-COCH2COR†、-SO2R†、-SO2NR†2、-CSNR†2、-CNHNR†2、または-NR†SO2R†が挙げられ;各R†は独立して、水素、下で定義するように置換され得るC1-6脂肪族、非置換-OPh、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される0-4個のヘテロ原子を有する非置換5-6員飽和、部分不飽和、もしくはアリール環であり、または上の定義にかかわらず、R†の2つの独立した出現は、その介在原子とひとまとめにされて、窒素、酸素、または硫黄より独立して選択される0-4個のヘテロ原子を有する非置換3-12員飽和、部分不飽和またはアリール単環式または二環式環を形成する。R†の脂肪族基上の好適な置換基は、独立して、ハロゲン、-R●、-ハロR●、-OH、-OR●、-OハロR●、-CN、-COOH、-COOR●、-NH2、-NHR●、-NR●2、または-NO2であり、各R●は非置換であるか、またはハロに先行されている場合は1つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、C1-4脂肪族、-CH2Ph、-OCH20-1Ph、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される0-4個のヘテロ原子を有する5-6員飽和、部分不飽和もしくはアリール環である。好適な保護基-本明細書で使用する場合、好適な保護基という用語は、化合物内の位置に応じてアミノ保護基またはカルボン酸保護基を指し、ProtectingGroupsinOrganicSynthesis,T.W.GreeneandP.G.M.Wuts,3rdedition,JohnWileySons,1999に詳細に記載されている保護基を含む。好適なカルボン酸保護基としては、シリル-、アルキル-、アルケニル-、アリール-およびアリールアルキル-保護カルボン酸が挙げられる。好適なシリル基の例としては、トリメチルシリル、トリエチルシリル、t-ブチルジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリル、トリイソプロピルシリルなどが挙げられる。好適なアルキル基の例としては、メチル、ベンジル、p-メトキシベンジル、3,4-ジメトキシベンジル、トリチル、t-ブチル、テトラヒドロフラン-2-イルが挙げられる。好適なアルケニル基の例としては、アリールが挙げられる。好適なアリール基の例としては、置換されていてもよいフェニル、ビフェニル、またはナフチルが挙げられる。好適なアリールアルキル基の例としては、置換されていてもよいベンジルたとえばp-メトキシベンジルMPM、3,4-ジメトキシベンジル、O-ニトロベンジル、p-ニトロベンジル、p-ハロベンジル、2,6-ジクロロベンジル、p-シアノベンジル、ならびに2-および4-ピコリルが挙げられる。化学可変部たとえばR基が環の結合と交差している結合に結合して示されているいずれの場合においても、このことは1つ以上のこのような可変部が交差している結合を有する環に結合されていてもよいことを意味する。このような環上の各R基は、いずれの好適な位置にも結合することができ、このことは該基が、親環上の水素原子の代わりに結合されていることを意味すると一般に理解される。このことは2つのR基が同じ環原子に結合できる可能性を包含する。さらに、1つを超えるR基が環上に存在する場合、各R基は環に結合されている他のR基と同じであり得るか、または異なり得て、各基は、それらが同じ識別子名で表され得る場合でも、同じ分子上の別の箇所に結合され得る他の基とは独立して定義される。生体分子-本明細書で使用する場合、生体分子という用語は、天然発生型であるか、または人工的に生成されたかにかかわらずたとえば合成もしくは組換え方法、細胞内および組織内に普通に見出される分子たとえばポリペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、多糖類、糖類、脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイド、代謝産物などを指す。生体分子の具体的なクラスとしては、これに限定されるわけではないが、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、成長因子および化学走化性因子などの細胞応答修飾因子、抗体、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス剤、プラスミド、DNAおよびRNAが挙げられる。薬物-本明細書で使用する場合、薬物という用語は、生物学的事象を改変する、阻害する、活性化する、またはそうでなければ影響を及ぼす小分子または生体分子を指す。たとえば薬物としては、これに限定されるわけではないが、抗AIDS物質、抗癌物質、抗生物質、抗糖尿物質、免疫抑制薬、抗ウイルス物質、酵素阻害薬、神経毒、オピオイド、催眠薬、抗ヒスタミン薬、潤滑薬、精神安定薬、抗痙攣薬、筋弛緩薬および抗パーキンソン病物質、チャネルブロッカー、縮瞳薬および抗コリン作用薬を含む鎮痙薬および筋収縮薬、抗緑内障化合物、抗寄生虫および/または抗原虫化合物、細胞増殖阻害薬および抗接着分子を含む細胞-細胞外マトリックス相互作用の調節薬、血管拡張剤、DNA、RNAまたはタンパク質の合成阻害薬、抗高血圧薬、鎮痛薬、解熱薬、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、抗血管形成因子、抗分泌因子、抗凝固薬および/または抗血栓剤、局所麻酔薬、眼科用薬、プロスタグランジン、抗鬱薬、抗精神病物質、制吐薬、ならびに造影剤が挙げられ得る。本発明における使用に適した例示的な薬物のより完全な列挙は、PharmaceuticalSubstances:Syntheses,Patents,ApplicationsAxelKleemannandJurgenEngel著、ThiemeMedicalPublishing,1999;theMerckIndex:AnEncyclopediaofChemicals,Drugs,andBiologicals,SusanBudavarietal.編、CRCPress,1996、およびtheUnitedStatesPharmacopeia-25/NationalFormulary-20,theUnitedStatesPharmcopeialConvention,Inc.刊,RockvilleMD,2001に見出され得る。外因性の-本明細書で使用する場合、外因性の分子は、患者に投与されない限り、有意なレベルで患者に存在しない分子である。ある実施形態において、患者は哺乳動物、たとえばヒト、イヌ、ネコ、ラット、ミニブタなどである。本明細書で使用する場合、分子は、その種類の患者の正常血清が0.1mM未満の分子を包含する場合、分子は有意なレベルで患者に存在しない。ある実施形態において、患者の正常血清は、0.08mM未満、0.06mM未満、または0.04mM未満の分子を包含し得る。正常血清-本明細書で使用する場合、正常血清は、5名以上の非糖尿病患者による凝固全血の液体部分をほぼ等しい量を貯留することにより得られる血清である。非糖尿病ヒト患者は、血液が採取されるときに糖尿病症状を呈していない、無作為に選択される18歳から30歳の患者である。ポリマー-本明細書で使用する場合、ポリマーまたはポリマー構造は、共有結合された一連のモノマーを包含する構造である。ポリマーは1種類のモノマーまたは1を超える種類のモノマーから作製することができる。ポリマーという用語はしたがって、異なる種類のモノマーがポリマー全体内で個別にグループ化されているブロックコポリマーを包含するコポリマーを含む。ポリマーは直鎖または分枝であることができる。ポリヌクレオチド-本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドのポリマーである。ポリヌクレオチド、核酸およびオリゴヌクレオチドという用語は、互換的に使用され得る。ポリマーとしては、天然ヌクレオシドすなわちアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン、ヌクレオシド類似体たとえば2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、C5-ブロモウリジン、C5-フルオロウリジン、C5-ヨードウリジン、C5-プロピニル-ウリジン、C5-プロピニル-シチジン、C5-メチルシチジン、7-デアザアデノシン、7-デアザグアノシン、8-オキソアデノシン、8-オキソグアノシン、O6-メチルグアニン、4-アセチルシチジン、5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン、ジヒドロウリジン、メチルプソイドウリジン、1-メチルアデノシン、1-メチルグアノシン、N6-メチルアデノシンおよび2-チオシチジン、化学修飾塩基、生物学的修飾塩基たとえばメチル化塩基、インターカレート塩基、修飾糖類たとえば2’-フルオロリボース、リボース、2’-デオキシリボース、2’-O-メチルシチジン、アラビノースおよびヘキソース、または修飾リン酸基たとえばホスホロチオエートおよび5’-N-ホスホルアミダイト結合が挙げられ得る。ポリペプチド-本明細書で使用する場合、ポリペプチドはアミノ酸のポリマーである。ポリペプチド、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチドという用語は、互換的に使用され得る。ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸すなわち天然には存在しないが、ポリペプチド鎖内に組み込むことができる化合物および/または当分野で公知であるようなアミノ酸類似体を含有し得る。またポリペプチド中のアミノ酸残基の1つ以上が、たとえば炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化または他の修飾のためのリンカーなどの化学的実体の付加によって修飾され得る。このような修飾としては、ペプチドの環化、D-アミノ酸の組み込みなどが挙げられ得る。多糖-本明細書で使用する場合、多糖は糖類のポリマーである。多糖、炭水化物およびオリゴ糖という用語は、互換的に使用され得る。ポリマーとしては、天然糖類たとえばアラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、マンノヘプツロース、セドヘプツロース、オクツロースoctoloseおよびシアロースsialoseおよび/または修飾糖質たとえば2’-フルオロリボース、2’-デオキシリボースおよびヘキソースが挙げられ得る。例示的な二糖としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ゲンチオビオース、イソマルトース、コージビオース、ラミナリビオース、マンノビオース、メリビオース、ニゲロース、ルチノースおよびキシロビオースが挙げられる。小分子-本明細書で使用する場合、小分子という用語は、天然発生型であるか、または人工的に生成されたかにかかわらずたとえば化学合成により、比較的低い分子量を有する分子を指す。通例、小分子は単量体であり、約1500Da未満の分子量を有する。好ましい小分子は、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトにおいて局所または全身効果を産生するという点で生物学的に活性である。ある好ましい実施形態において、小分子は薬物である。好ましくは、必ずしもというわけではないが、薬物は、適切な政府機関または団体によって、使用が安全および有効であるとすでにみなされている薬物である。たとえばFDAにより21C.F.R.§§330.5,331から361および440から460に挙げられたヒトに使用するための薬物;FDAにより21C.F.R.§§500から589に挙げられた動物に使用するための薬物はすべて、本発明による使用に許容され得るとみなされる。処置する-本明細書で使用する場合、処置するまたは処置すること、処置された、処置などという用語は、病気たとえば糖尿病、病気の1つもしくは複数の症状たとえば高血糖または病気への素因を軽減する、緩和する、改変する、回復させる、改善する、または影響を及ぼす目的で、処置を必要とする対象への本開示のコンジュゲートの投与を指す。実施例1アジドエチルグルコースAzEGの合成a.ブロモエチルbromoethyleグルコースの合成ダウエックス50Wx4樹脂アルファエイサー、ワードヒル、マサチューセッツ州を脱イオン水で洗浄して色を除去した。D-グルコース225グラム1.25mol;1当量、アルファエイサーおよびダウエックス50Wx4140グラムの混合物を2-ブロモエタノール2.2L30.5mol、25当量;124.97グラム/mol;1.762グラム/mL;BP=150°C;アルファエイサーで処置して、撹拌混合物を80°Cまで4時間加熱した。反応をTLC20メタノール/ジクロロメタンDCMによって監視した。約4時間後に反応が完了して、これを放冷して室温とした。溶液を濾過して樹脂を除去し、樹脂をエチルアセテートおよびDCMで洗浄した。生じた濾液を回転蒸発器でストリッピング蒸発除去して琥珀色油とした。ストリッピング後には合計400グラムであった。琥珀色油を以下の方式でシリカゲルDCM中で充填されたシリカ4kgによって精製した。粗製物をDCMに溶解させて、カラムに注入し、次に10メタノール/DCM2×4L;15メタノール/DCM2×4L;および20メタノール/DCM3×4Lによって溶離させた。TLCに基づいて画分を含有する生成物をプールして、ストリッピングにより乾固させて、1-α-ブロモエチル-グルコース152グラム42を得た。b.ブロモエチルグルコースのアジドエチルグルコースAzEMへの変換加熱マントル、オーバーヘッドスターラーおよび温度計を装備した5L丸底3口フラスコにブロモエチルグルコース150グラム525mmolを注入した。該油を水2Lに溶解させて、アジ化ナトリウム68.3グラム1.05mol、2当量;65グラム/mol;アルファエイサー、続いてヨウ化ナトリウム7.9グラム52.5mmol、0.08当量;149.89グラム/mol;アルファエイサーで処理して、溶液50°Cまで加温して、一晩撹拌した。溶液を室温まで冷却して、回転蒸発器で濃縮乾固させた。固体残渣を5:1体積のCHCl3:MeOH3×500mLによって40°Cにて消化した。合せた有機部を濾過して、蒸発乾固させて、アジドエチルグルコース86グラムをオフホワイト色固体として得た。TLC20MeOH/DCM;H2SO4による炭化:シングルスポット、開始物質と区別不能。c.アジドエチルグルコースの再精製アジドエチルグルコース32グラムを水100mL中に取った。混濁溶液をガラスマイクロファイバフィルタワットマンGF/Bで濾過した。金色の濾液を回転蒸発器で蒸発固化させた。固体をメタノール100mL中に取り、混濁溶液をガラスマイクロファイバフィルタで再度濾過した。生じた薄黄色濾液を真空下でストリッピングし固体化した。固体を最小量のメタノール50mLに取り、エチルアセテート150mLを撹拌しながらゆっくり添加した。重スラリを冷却および濾過した。固体を空気乾燥させて吸湿性、60°Cの乾燥器に一晩入れた。TLCはごくわずかな最初の物質を有する。収量15.4グラム。母液を真空下で蒸発させて黄色粘性物質とした。この時点でこの物質をさらに精製する試みは行われなかった。実施例2アジドエチルマンノースAzEMの合成a.ブロモエチルマンノースの合成ダウエックス50Wx4樹脂アルファエイサー、ワードヒル、マサチューセッツ州を脱イオン水で洗浄して色を除去する。D-マンノース225グラム1.25mol;1当量、アルファエイサーおよびダウエックス50Wx4140グラムの混合物を2-ブロモエタノール2.2L30.5mol、25当量;124.97グラム/mol;1.762グラム/mL;BP=150°C;アルファエイサーで処理して、撹拌混合物を80°Cまで4時間加熱する。反応をTLC20メタノール/ジクロロメタンDCMによって監視する。約4時間後に反応が完了して、次に放冷して室温とする。溶液を濾過して樹脂を除去し、樹脂をエチルアセテートおよびDCMで洗浄する。生じた濾液を回転蒸発器でストリッピング蒸発除去して琥珀色油とした。琥珀色油を以下の方式でシリカゲルDCM中で充填されたシリカ4kgによって精製する。粗製物をDCMに溶解させて、カラムに注入し、次に10メタノール/DCM2×4L;15メタノール/DCM2×4L;および20メタノール/DCM3×4Lによって溶離させる。TLCに基づいて画分を含有する生成物をプールして、ストリッピングにより乾固させて、1-α-ブロモエチル-マンノース152グラム42を得る。b.ブロモエチルマンノースのアジドエチルマンノースAzEMへの変換加熱マントル、オーバーヘッドスターラーおよび温度計を装備した5L丸底3口フラスコにブロモエチルマンノース150gm525mmolを注入する。油を水2Lに溶解させて、アジ化ナトリウム68.3グラム1.05mol、2当量;65グラム/mol;アルファエイサー、続いてヨウ化ナトリウム7.9グラム52.5mmol、0.08当量;149.89グラム/mol;アルファエイサーで処理して、溶液50°Cまで加温して、一晩撹拌する。溶液を室温まで冷却して、回転蒸発器で濃縮乾固させる。固体残渣を5:1体積のCHCl3:MeOH3×500mLによって40°Cにて消化する。合せた有機部を濾過して、蒸発乾固させて、アジドエチルマンノースをオフホワイト色固体として得る。c.アジドエチルマンノースの再精製アジドエチルマンノース32グラムを水100mL中に取る。混濁溶液をガラスマイクロファイバフィルタワットマンGF/Bで濾過する。金色の濾液を回転蒸発器で蒸発固化させる。固体をメタノール100mL中に取り、混濁溶液をガラスマイクロファイバフィルタで再度濾過する。生じた薄黄色濾液を真空下でストリッピングし固体化する。固体を最小量のメタノール50mLに取り、エチルアセテート150mLを撹拌しながらゆっくり添加する。重スラリを冷却および濾過する。固体を空気乾燥させて吸湿性、60°Cの乾燥器に一晩入れる。母液を真空下で蒸発させて黄色粘性物質とする。実施例3アジドエチルマンノビオースAzEBMの合成実施例2からのAzEM化合物を、ベンゼンジメチルエーテルを使用して選択的に保護して、カラムクロマトグラフィーによって精製し、続いてベンジルブロミドと反応させて、1-α-2-アジドエチル-4,6-ベンズアルデヒドジアセタール-3-ベンジル-マンノピラノシドを得る。続いて生成物を厳密な無水条件下で1-α-ブロモ-2,3,4,6-テトラベンゾイルマンノピラノシドによって銀トリフラート化学作用を使用してグリコシル化して、保護アジドエチルマンノビオース生成物を得る。次に中間体生成物を脱保護してベンゾイル基を除去して、AzEBMを得る。実施例4アジドエチルマンノトリオースAzETMの合成a.1-α-ブロモ-2,3,4,6-テトラベンゾイル-マンノース撹拌棒および窒素入口を含有する500mL3口フラスコにペンタベンゾイルマンノース40グラム60.9mmolおよび塩化メチレン80mLを添加した。生じた溶液を冷浴で5°C未満に冷却して、添加漏斗を介して33HBr-酢酸溶液80mLを10°C未満の反応温度を維持するような速度で添加した。添加完了時に約30分、冷浴を外して、撹拌を3時間継続した。反応溶液を等体積160mLのDCMで希釈して、水2×500mL、飽和重炭酸塩2×50mLおよび塩水1×50mLで続けて抽出し、硫酸マグネシウムで脱水して、溶媒を蒸発させて、固体発泡体41グラム理論収量40.1グラムを得て、冷凍庫にてN2下で貯蔵する。この物質をそれ以上精製せずに使用した。反応をTLCによって監視した:シリカゲルヘキサン/エチルアセテート、7/3、開始物質Rf0.65、生成物Rf0.8、UV描出。1HNMRCDCl3δ8.11d,2H,8.01m,4H,7.84d,2H,7.58m,4H,7.41m,6H,7.28t,2H,6.58s,1H,6.28m,2H,5.8m,1H,4.75dd,1H4.68dd,1H4.5dd,1H。b.1-アジドエチル-2,4-ジベンゾイルマンノース撹拌棒、窒素入口および無水アセトニトリル300mLを含有する1.0L3口フラスコに、1-アジドエチルマンノース25グラム100.4mmolおよびトリエチルオルトベンゾアート50mL220mmol、2.2当量を添加した。生じたスラリを室温にて撹拌して、トリフルオロ酢酸TFA0.8mL10mmolを希釈せずに添加した。溶液は10分以内に清澄となり、撹拌をさらに2時間継続して、次に10TFA水溶液25mLを添加し、撹拌をさらに2時間継続して、中間体を加水分解してエステル異性体とする。溶媒を真空下で蒸発させて粘性油とし、これをDCM50mLによって粉砕して、再度蒸発させて粘性油とした。トルエン70mLを残渣に添加して、粘性溶液に2,4-ジベンゾイルアジドエチルマンノースを種結晶とした。微細沈殿物が15分以内に形成され、撹拌を室温にて一晩継続した。生じた重懸濁物を冷凍庫で2-4時間を固化させて、次に濾過して、固体を氷冷トルエン2×10mLで洗浄した。固体を恒量まで空気乾燥させて、約95異性体純度の21グラム50異性体純度にてTY22.85グラムを得た。生成物をトルエン40mL中に取り、1時間撹拌して、次に冷凍庫でさらに2時間固化させた。固体を濾過して、氷冷トルエンで洗浄し2×10mL、恒量まで空気乾燥させて、単一の異性体生成物2,4-ジベンゾイルアジドエチルマンノース18.5グラムを収率83で得た。母液は望ましくない異性体および少量の所望の異性体を含有していた。反応をTLCによって監視した:SGヘキサン/エチルアセテート7/3、開始物質Rf0.0、オルトエステル中間体Rf0.9。ヘキサン/エチルアセテート:8/2SMRf0.8、所望の異性体Rf0.4、望ましくない異性体Rf0.21HNMR300MHzCDCl3δ8.12t,4H,7.66t,2H,7.5m,4H,5.56t,IH,5.48m,1H,5.14m,1H,4.5dd,1H,4.0m,2H,3.8m,3H,3.56m,1H,3.44m,1H。c.過ベンゾイル化-マンα-1,3-マンα-1.6-α-1-アジドエチルマンノピラノシド撹拌棒、窒素入口を備えた1.0L3口フラスコに、DCM185mL中の粗1-ブロモ-テトラベンゾイルマンノース41グラム60.9mmol、約2.5当量を添加した。これに2,4-ジベンゾイルアジドエチルマンノース11.2グラム24.5mmol、続いて4Aシーブ11.2グラムを添加した。スラリを室温にて10分撹拌して、メタノール/氷浴で-15°Cまで冷却した。別の暗色容器にトルエン190mL、続いて銀トリフルオロメタンスルホナートAgOTf15.1グラム58.8mmol、2.4当量を添加して、暗所で撹拌して溶解させた。この溶液を大型添加漏斗に移し、反応物を光から保護しながら撹拌懸濁物に滴加した。AgOTf添加速度を調整することによって、反応温度を-10°C未満に維持した。反応完了時に約30分、冷浴を取外し、単一生成物がTLCSG、ヘキサン/エチルアセテート:7/3、ブロモRf0.9、アジドRf0.4、トリオス生成物Rf0.5、uv描出によって残存するまで反応物をさらに2時間撹拌した。トリエチルアミン7mL、5.0当量、続いてDCM200mLを添加した。生じたスラリをシリカゲルおよびセライトのパッドで濾過して、DCM2×75mLで洗浄した。溶媒を真空下で蒸発させて、残渣をエチルアセテート中に取り、水2×100mL、重曹2×50mL、塩水1×75mLで順に洗浄して、硫酸マグネシウムで脱水した。溶媒を真空下で蒸発させて、固体発泡体39グラムTY39.5グラムを得た。1HNMR300MHzCDCl3δ8.3d,2H,8.2m,8H,7.85d,4H,7.75dd,4H,7.3-7.65m,30H,7.2t,2H,6.05m,4H,5.9t,2H,5.63m,2H,5.38s,2H,5.18d,1H,4.65m,4H,4.5m,2H,4.35m,4H,3,8m,2H,3.54m,2H。d.マンα-1,3-マンα-1.6-α-1-アジドエチルマンノピラノシド過ベンゾイル化マンα-1,3-マンα-1.6-α-1-アジドエチルマンノースピラノシド3.0グラム1.86mmolのメタノール40mLによる撹拌懸濁物に、メタノール中の4.28Mナトリウムメトキシド0.2mLを添加した。生じた懸濁物を室温にて20時間撹拌して、透明溶液を得た。反応完了をTLCによって監視したSG、ヘキサン/エチルアセテート:8/2SMRf0.4、生成物Rf0.0。メタノールを真空下で蒸発させて、油性半固体を得た。残渣をエチルアセテート50mL中に取り、3時間撹拌した。固体を濾過して、新たなエチルアセテート2×20mLで洗浄して、恒量まで空気乾燥させて、生成物1.09グラムTY1.07グラムを得た。母液は残留メチルベンゾアート、脱保護副生成物を含有していた。実施例5アジドエチル糖類AzEG、AzEM、AzEBM、AzETMからのアミノエチル糖類AEG、AEM、AEBM、AETMの合成実施例1から4によるアジド終端化合物を、パラジウム/炭素触媒、少量の酢酸および溶媒としてのエタノールを使用して室温にてただちに水素添加して、対応するアミン終端化合物を得た。AEG、AEM、AEBMおよびAETMの化学構造は本明細書に記載されている。工程は、当業者が試薬、溶媒などの量を水素添加される糖類-リガンドのモル数に合せて変倍するべきことを理解することを除き、以下のAETMについて記載されている工程と同一である。a.マンα-1,3-マンα-1.6-α-1-アミノエチルマンノピラノシドアミノエチルマンノース、AETMマンα-1,3-マンα-1.6-α-1-アジドエチルマンノースピラノシド5.3グラム9.25mmolの水100mLおよびエタノール50mLによる溶液に、5Pd/C0.8gグラムを添加した。激しく撹拌されている懸濁物を30-40psiにて48時間にわたって、または開始物質がTLCSG、メタノール、SMRf0.75、PdtRf0.0、PMA描出によって見えなくなるまで水素添加した。懸濁物をセライトで濾過して、これをエタノール2×50mLですすぎ、濾液を真空下で濃縮した。この物質のHPLCC18、3アセトニトリル/970.1H3PO4、220nm、2ml/分により、ベンゾアートエステルを示す、注入カラム空隙物質のUV吸着、Rt2.5分を得た。濾液を水70mLおよび1NNaOH12mLで希釈して、溶液を室温にて一晩撹拌したHPLC:カラム空隙Rt2.5分にてUV物質なし、Rt10.5分、安息香酸による同時溶離にてUV物質、。脱色炭2グラムを添加して、撹拌混合物を80°Cまで加熱し、室温まで冷却して、セライトで濾過した。濾液pHを2NHClによって8.0まで調整して、無色溶液を真空下で約50の体積まで濃縮した。溶液を樹脂カラムダウエックス50W、50グラム上に添加して、溶離画分が中性からpHになるまで水で洗浄して6×75mL、いずれの残留酸副生成物も除去した。アミン生成物をカラムから0.25N水酸化アンモニウム6×75mLによって洗い流し、アミン生成物-ニンヒドリン検出を含有する画分を合せて、真空下で25-30mLまで濃縮した。この濃縮溶液を撹拌エタノール300mLに滴加して、撹拌をさらに2時間継続した。生成物を濾過して、新たなエタノール2x50mLで洗浄し、恒量まで空気乾燥させた。生じた白色非晶質固体をさらに真空乾燥器で80°Cにて5時間乾燥させて、白色粒状固体4.1グラムTY5.1グラムを得た。NMRには芳香族プロトンがなかった。1HNMR300MHzD2Oδ5.08s,1H,4.87s,1H,4.81s,1H,4.8-3.6m,18H,2.9m,2H。実施例63-{3-[3-ベンジルオキシ-3-オキソプロポキシ]-2,2-ビス[2-カルボキシエトキシメチル]プロポキシ}プロピオン酸2の合成テトラカルボン酸12.025g、4.77mmolをDMF9.5mLに溶解させて、トリエチルアミン665μL、4.77mmolおよび2-ベンジルオキシ-1-メチルピリジニウムトリフレート1.667g、4.77mmolで順に23°Cにてアルゴン雰囲気下で処置した。生じた透明溶液を油浴に入れ83°Cにて24時間加熱した。この時間の間に、溶液は透明から明黄色を経由して暗橙茶色への、色の変化を受けた。24時間後、反応混合物を真空中で濃縮して、揮発性物質を除去し、濃い油性残渣を直接シリカゲルカラム[SiO2150mL、4.0×12.5cm]に加えて、0.5AcOHを含有するエチルアセテート/ヘキサンの段階勾配[50→60→70→80]を用いて溶離させ、1.136g46のモノベンジルエステル2を透明油として得た。Rf0.20EtOAc/ヘキサン/AcOH/H2O、8:2:0.1:0.1;PMAによるダークスポット;1HNMR300MHz,DMSO-d6δ:12.18brs,3H,CO2H,7.35s,5H,PhH,5.09s,2H,CH2Ph,3.60オーバーラッピングt,2H,OCH2CH2CO2Bn,3.49t,J=6.3Hz,6H,OCH2CH2CO2H,3.23s,2H,CquatCH2OCH2CH2CO2Bn,3.20s,6H,CquatCH2OCH2CH2CO2H,2.58t,J=6.0Hz,2H,CH2CO2Bn,2.38t,J=6.3Hz,6H,CH2CO2H。13CNMR75MHz,DMSO-d6δ:176.87,171.92,136.15,128.79,128.45,128.39,69.95,69.77,66.99,66.63,45.38,35.32,35.04ppm;C24H34O12[MH]のMS計算値515.5、実測値515.5。実施例7ベンジル3-{3-3-{[2-α-D-マンノピラノシルオキシエチル]アミノ}-3-オキソプロポキシ-2,2-ビス[3-{[2-α-D-マンノピラノシルオキシエチル]アミノ}-3-オキソプロポキシメチル]プロポキシ}プロピオネート3の合成三酸2200mg、0.389mmolの無水DMF2.4mL溶液にアミノエチルマンノースAEM,391mg、1.75mmolのDI水1.2mLによる溶液を添加すると、透明な無色溶液が生成された。この溶液に23°CのHOBt239mg、1.77mmolを添加して、続いて0°Cまで冷却し、DIPEAジイソプロピルエチルアミン、311μL、1.79mmolおよびEDC339mg、1.77mmolを添加した。生じた透明明黄色溶液を0-5°Cにて1.5時間、次に23°Cにて撹拌した。AEMおよびEDCの追加の分量を20.5時間および25時間どちらの時点も1.0当量に加えた。40.5時間後、溶媒を減圧下、40°Cにて除去して、残留粗物質をFCC[100mL、4.0×8.5cm]によってメタノール/クロロホルム/水の段階勾配[3:7:0→4:6:0→5:5:0→4:5.5:0.5]で溶離させて精製し、489mg不純物のために>100のトリマンノース3を白色固体として得た;Rf0.30MeOH/CHCl3/H2O、5:4.5:0.5;PMAによるダークスポット;1HNMR300MHz,DMSO-d6δ:7.93CONH,7.31brs,5H,Ph-H,5.05s,2H,OCH2Ph,3.923H,H-2,3.893H,H-6,3.793H,H-3,3.773H,H-6,3.673H,H-4,3.62-3.586H,CH2N,3.52-3.37m,6H,OCH2CH2NH,3.39-3.56m,8H,CH2OCH2CquatCH2OCH2,3.16-3.27m,8H,OCH2CquatCH2O,2.58t,2H,CH2CO2Bn,2.38t,6H,CH2CONH。13CNMR75MHz,DMSO-d6δ:171.80CO2Bn,170.99CONH,44.29Cquat,136.88,129.11,128.67,128.56フェニルC,100.63ManC-1,74.63ManC-5,71.61ManC-3,70.92ManC-2,68.01ManC-4,69.55CquatCH2OCH2CH2CONH,67.69OCH2CH2NH,66.09CH2CO2Bn,61.91ManC-6,39.39OCH2CH2NH,35.42CH2CO2Bn;C48H79N3O27[MH]のMS計算値1130.1、実測値1130.5。実施例83-{3-3-{[2-α-D-マンノピラノシルオキシエチル]アミノ}-3-オキソプロポキシ-2,2-ビス[3-{[2-α-D-マンノピラノシルオキシエチル]アミノ}-3-オキソプロポキシメチル]プロポキシ}プロピオン酸4の合成モノベンジルエステル3400mg、0.354mmolを無水メタノール1.5mLに溶解させて透明溶液を生成し、これにパラジウム炭素Pd/C、5重量、20mgを添加した。生じた黒色スラリを水素ガス雰囲気下に置いて、23°Cにて撹拌した。7時間後、Pd/Cの追加の分量20mgを反応物に添加して、撹拌を継続した。24.5時間後、反応混合物をセライトパッドで濾過して、固体をメタノール25mLですすいだ。真空中での濾液の濃縮により粗生成物を得て、これをFCCフラッシュカラムクロマトグラフィー[SiO225mL、2.0×9.0cm;試料の乾燥装填:MeOH25mL、SiO25mL]によってメタノール/クロロホルム/水の段階勾配[4:6:0→5:5:0→6:4:0→4:5.5:0.5]で溶離させて精製し、247mg67のモノカルボン酸4を白色固体として得た:Rf0.10MeOH/CHCl3/H2O、5:4.5:0.5;PMAによるダークスポット;C41H73N3O27[MH]のMS計算値1040.0、実測値1040.0。実施例93-3-{3-[2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシ]-3-オキソプロポキシ}-2,2-ビス[3-{[2-α-D-マンノピラノシルオキシエチルアミノ}-3-オキソプロポキシメチル]プロポキシ-N-[2-α-D-マンノピラノシルオキシエチル]プロパンアミド5の合成カルボン酸454mg、0.052mmolの無水DMF1.70mLによる溶液にアルゴン雰囲気下、23°CにてTSTU15.7mg、0.052mmol、1.0当量を固体として添加した。生じた透明無色溶液を23°Cにて30分撹拌して、この後に反応が完了したと見なしたLC/MS分析。生成物3を以下のように沈殿により単離した:反応溶液を自動ピペットによって、無水アセトン10体積、17.0mLを含有する管に移した。300μLずつ滴加して、続いて静かに撹拌した。生じた白色懸濁物を遠心分離すると3000rpm、5分、15°C、透明上清および白色ペレットが生成した。上清を除去して、粘着性の白色ペレットをアセトン1.0mLで洗浄して、続いて遠心分離して上のように、高真空下で乾燥させて、乾燥白色固体49mgP1を得た。固体をDMF600μLに再溶解させて、上記のようにアセトン10体積、6.0mLによって沈殿させ、遠心分離後に白色固体30mgP2を得て、高真空下で乾燥させた。白色固体をDMF500μLに再び再溶解させて、アセトン10体積、5.0mLによって沈殿させ、遠心分離して、アセトン1.0mLで洗浄し、高真空下で乾燥させて、18mg31のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル5を白色粉末P3として得た:C45H76N4O29[MH]のMS計算値1137.09、実測値1137.1。実施例10および11は、本開示のPLFをアミン担持薬物と有機溶媒または水性溶媒中でそれぞれコンジュゲートする一般的な方法について記載し、実施例12は、コンジュゲーション後の精製の一般的な方法について記載する。実施例10有機溶媒中での前官能化リガンドフレームワークとのアミン官能化薬物コンジュゲーション前官能化リガンドフレームワークPLFを無水DMSO11.1mL中に60mMで溶解して、室温にて10分撹拌する。次にアミン担持薬物を、70mM無水トリエチルアミンを含有する無水DMSO27.6mL中に9.2mMの濃度で別に溶解させる。溶解させたら、PLF溶液をアミン担持薬物/DMSO/TEA溶液に数回に分けて添加して、続いて室温で約1時間混合する。この時点で、反応を分析HPLCによって分析して反応の程度を評価し、この後に必要な場合はさらにPLF溶液を添加して、所望の程度のコンジュゲーションを達成する。PLFのアミン担持薬物に対する所望の程度のコンジュゲーションが達成された場合、エタノールアミンをPLF/アミン担持薬物/DMSO/TEA溶液に添加して、エタノールアミンの最終濃度を195mMとする。反応溶液をRTにてさらに0.5時間撹拌する。生じた溶液を次に水で20×に過希釈して、続いて1NHClおよび必要な場合には0.1NNaOHによりpH調整して、最終pHを2.0とする。生じた水溶液を限外濾過ミリポアペリコンミニTFFシステム、1KDaMWCO膜によりおよそ200mLまで濃縮して、続いて水10-15ダイア容量DVを使用してダイアフィルトレーションミリポアペリコンミニTFFシステム、1KDaMWCO膜を続ける。所望の場合、溶液をアミコン-153kDaMWCOの使用によりさらに濃縮して、およそ10mg/mLとする。水溶液を4°Cにて一晩貯蔵する。実施例11水性溶媒中での前官能化リガンドフレームワークとのアミン官能化薬物コンジュゲーション前官能化リガンドフレームワークPLFを無水DMSO11.1mL中に60mMで溶解して、室温にて10分撹拌する。アミン担持薬物を次に0.1M、pH11.0炭酸ナトリウム緩衝液14.3mL中に17.2mMにて別に溶解させて、続いてpHを1.0N水酸化ナトリウムによって10.8に調整する。溶解させたら、PLF/DMSO溶液をアミン担持薬物/炭酸塩溶液に数回に分けて添加して、続いて室温にて混合する。添加中に、必要ならば希HClまたはNaOHを使用して、生じた混合物のpHを5分ごとに調整して、pHを>10.8に維持する。反応を完了させるために、滴加後に溶液をさらに15分撹拌する。この時点で、反応を分析HPLCによって分析して反応の程度を評価し、この後に必要な場合は追加のPLF溶液を添加して、所望の程度のコンジュゲーションを達成する。生じた溶液を次に水で20×に過希釈して、続いて1NHClおよび必要な場合には0.1NNaOHによりpH調整して、最終pHを2.0とする。生じた水溶液を限外濾過ミリポアペリコンミニTFFシステム、1KDaMWCO膜によりおよそ200mLまで濃縮して、続いて水10-15ダイア容量DVを使用してダイアフィルトレーションミリポアペリコンミニTFFシステム、1KDaMWCO膜を続ける。所望の場合、溶液をアミコン-153kDaMWCOの使用によりさらに濃縮して、およそ10mg/mLとした。水溶液を4°Cにて一晩貯蔵する。実施例12アミン官能化薬物-PLFコンジュゲートのHPLCによる精製ウォーターズC4、7um、50×250mmカラムによる分取逆相HPLCを使用してアミン担持薬物-PLFコンジュゲート溶液をさらに精製して、所望の生成物を得る。緩衝液Aは0.1TFAを含有する脱イオン水であり、緩衝液Bは0.1TFAを含有するアセトニトリルであった。精製前に、ウォーターズデルトラプレップ600HPLCシステムを使用して、カラムを15ml/分で80A/20B移動相により平衡にした。粗溶液およそ16mlを流速50ml/分で2分の間にわたってカラム上に注入して、この後に80A/20Bから75A/25B薬物コンジュゲートの特性に応じて、またはそれ以上までの直線勾配を次の5分にわたって、続いて75A/25Bから70A/30B薬物コンジュゲートの特性に応じて、またはそれ以上までのより低速の多段階勾配を次の70分にわたって用いる。所望のピークの保持時間は、使用した薬物、フレームワークおよびリガンドに応じて変化する。興味のあるピークの溶離の間、画分収集装置およびLC-MSアクイティHPLC、ウォーターズCorp.、ミルフォード、マサチューセッツ州を用いてピーク画分の純度をさらに評価して、所望のレベルの薬物コンジュゲート純度を得るために組合せるべき所望のピークの画分を決定する。溶媒除去溶液を収集したら、回転蒸発させてブッチモデルR-215、ニューキャッスル、デラウェア州、アセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて、純粋なコンジュゲートを得て、この特性をHPLC-MSHTラボラトリーズ、サンディエゴ、カリフォルニア州によって検証する。他の溶媒除去所望の画分を収集したら、画分を大型ガラス容器内に1つの溶液として合せ、限外濾過ミリポアペリコンミニTFFシステム、1KDaMWCO膜によっておよそ200mLまで濃縮する。生じた溶液を高度純水およそ15-20ダイア容量でダイアフィルトレーションするミリポアペリコンミニTFFシステム、1KDaMWCO膜。所望の場合、溶液をアミコン-153kDaMWCOの使用によりさらに濃縮して、およそ10mg/mLとする。水溶液を4°Cにて一晩貯蔵する。実施例13B1置換インスリンコンジュゲートを得るためのインスリンコンジュゲーションNH2-B1-BOC2A1,B29-インスリンの合成代表的な合成では、粉末インスリン4gシグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州を無水DMSO100mlに室温にて溶解させて、続いてトリエチルアミンTEA4mlを添加する。溶液を室温にて30分撹拌する。次に、ジ-tert-ブチル-ジカーボネート/THF溶液シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州1.79ml2.6当量をインスリン-TEA溶液にゆっくり添加して、およそ1時間混合する。DMSO5ml中にエタノールアミン250ulを含有するストック溶液4mlの添加により反応を停止させて、続いて5分混合する。反応停止後、溶液全体をアセトン1600mlに注入して、スパチュラで短時間混合する。次に、18.9HCl:水溶液の一定分量8×400μlを混合物表面上に滴加して、反応したインスリンを沈殿させる。沈殿した物質を次に遠心分離にかけて、上清を第2のビーカーにデカンテーションして、一方で沈殿ケーキは確保しておく。上清溶液に、18.9HCl:水溶液のさらなる一定分量8×400μlを混合物表面上に滴加して、反応したインスリンの第2の沈殿を得る。この第2の沈殿を遠心分離にかけて、上清を廃棄する。2回の沈殿ステップによる混合させた遠心分離ケーキをアセトンで1回洗浄して、続いて真空下室温にて乾燥させて、60の所望のBOC2生成物および40のBOC3物質を通例含有する粗粉末を得る。分取逆相HPLC法を使用して、純BOC2-インスリンを粗粉末から単離する。緩衝液Aは0.1TFAを含有する脱イオン水であり、緩衝液Bは0.1TFAを含有するアセトニトリルである。カラムへの注入前に、粗粉末を70A/30B混合物に25mg/mlで溶解させて、シリンジ濾過した。精製前にウォーターズデルトラプレップ600システムを使用して、カラムウォーターズシンメトリープレップC18、7um、19×150mmを15ml/分で70A/30B移動相により平衡させる。粗粉末溶液およそ5mlをカラム上に流速15ml/分で5分の間にわたって注入して、この後に70/A30Bから62A/38Bの直線勾配を次の3.5分の間にわたって用いて、そこでさらに2.5分維持した。この方法を使用して、所望のBOC2ピークはおよそ10.6分にて溶離して、すぐにBOC3ピークが続く。溶液を収集したら、回転蒸発させてアセトニトリルを除去して、凍結乾燥させて純粋なBOC2インスリン粉末を得る。特性をLC-MSHTラボラトリーズ、サンディエゴ、カリフォルニア州によって検証して、コンジュゲーション部位をN末端シーケンシングウェスタンアナリティカル、セントルイス、ミズーリ州によって決定する。コンジュゲーションNH2-B1-BOC2A1,B29-インスリンを実施例10に従ってPLFにコンジュゲートする。生じたコンジュゲートは次に、実施例12に従って精製され得る。実施例14A1置換インスリンコンジュゲートを与えるためのインスリンコンジュゲーションNH2-A1,B1-BOCB29-インスリンの合成インスリンを100mM炭酸ナトリウム緩衝液pH11およびアセトニトリルの66:37体積:体積混合物に14.7mMの濃度で溶解させる。単官能性保護基活性化エステルたとえばBOC-NHSを別に、アセトニトリル中に467mMにて溶解させる。インスリンが溶解したら、単官能性保護基活性化エステルたとえばBOC-NHSの少量の一定分量をインスリン溶液に添加する。pHを工程の間監視して、0.1M水酸化ナトリウムの添加により10.2-11.0に維持する。反応を逆相HPLCによって監視する。未修飾インスリンすべてが反応されることおよび反応混合物の実質的な部分がB29保護インスリンに変換されたことがHPLCクロマトグラムによって示されるまで、単官能性保護基活性化エステルの一定分量を添加する。通例、保護基は本質的により疎水性となり、インスリン上で反応すると、未修飾インスリンよりも長いHPLC保持時間にて溶離する。コンジュゲーションNH2-A1,B1-BOCB29-インスリンは、実施例10に従ってPLFにコンジュゲートする。生じたコンジュゲートは次に、実施例12に従って精製され得る。実施例15A1,B29置換インスリンコンジュゲートを与えるためのインスリンコンジュゲーションA1,B29インスリンコンジュゲートは、実施例10に従ってPLFを未保護インスリンにコンジュゲートすることによって得られる。生じたコンジュゲートは次に、実施例12に従って精製され得る。ある実施形態において、コンジュゲートは、図1および6に示すような2置換A1,B29TSPE-AEM-3II-6コンジュゲートである。実施例16A1,B1置換インスリンコンジュゲートを与えるためのインスリンコンジュゲーションNH2-A1,B1-BOCB29-インスリンは、実施例14に記載されているように合成される。A1,B1置換インスリンコンジュゲートは、実施例10に従って、ならびに適切な当量のPLFおよび薬物を使用して合成される。生じたコンジュゲートは次に、実施例12に従って精製され得る。実施例17B1,B29置換インスリンコンジュゲートを与えるためのインスリンコンジュゲーションNH2-B1,B29-BOCA1-インスリンの合成NH2-B1,B29-BOCA1-インスリンは、実施例13の手順を使用して、しかしA1,B29-ジBOC-インスリン、A1-BOC-インスリンおよびB29-BOC-インスリン生成物の分布を生じるために、より少ない当量のBOC試薬と反応して調製することができる。NH2-B1,B29-BOCA1-インスリンは、RP-HPLCによって単離されて、N末端シーケンシングにより確認することができる。コンジュゲーションNH2-B1,B29-BOCA1-インスリンを実施例10に従ってPLFにコンジュゲートする。生じたコンジュゲートは次に、実施例12に従って精製され得る。実施例18B29置換インスリンコンジュゲートを与えるためのインスリンコンジュゲーションB29インスリンコンジュゲートは、実施例11に従ってPLFを未保護インスリンにコンジュゲートすることによって得られる。生じたコンジュゲートは次に、実施例12に従って精製され得る。実施例19インビボ試験に備えたインスリンコンジュゲートの製剤組換えヒトインスリン1.5gを実施例11および13に記載された工程によってコンジュゲートおよび精製した後、生じたインスリン-コンジュゲートは精製水中でおよそ760マイクロモルの濃度であり、溶液の総体積はおよそ140mLである。この溶液に、グリセリン1.78mL、m-クレゾール0.22g、フェノール0.09gおよびリン酸ナトリウム0.53gを含むpH7.4製剤緩衝液濃縮物14mLを添加する。生じた溶液の最終体積は154mLである。実施例20コンジュゲートII-1およびII-2のPKおよび生物活性に対するα-MMの効果本実施例において、我々はコンジュゲートII-1およびII-2の薬物動態および薬力学挙動の決定を試みたコンジュゲートの構造については図1を参照。各場合において、同じ用量のコンジュゲート5U/kgを絶食正常非糖尿病ラットオスのスプラーグ-ドーリー、400-500グラム、n=3の頸部の後ろに注射した。15分の遅延の後、α-MM4g/kg用量を腹腔内注射した。血液試料を0分ならびに初期コンジュゲート注射後30、60、90、120、150、180、210、240および300分に尾静脈採血により収集した。血中グルコース値は、市販の試験ストリッププレシジョンエキストラ、アボットラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州を使用して測定した。加えて、各時点の血液を4°Cにて遠心分離にかけて血清を収集した。続いて血清インスリン濃度をを市販のELISAキットイソインスリンELISA、メルコディア、ウプサラ、スウェーデンで測定した。対照は、15分後にα-MMの代わりに食塩水を注射することによって行った。図2は、II-1の皮下注射の15分後にα-MMが腹腔内注射によって投与されたときに得られた結果を示す。図示されているように、α-MMの注射から生じたPK/PDプロフィールの上昇は、食塩水を注射した対照群と比べたときに、II-1について非常に有意であったp<0.05。図3は、II-2の皮下注射の15分後にα-MMが腹腔内注射によって投与されたときに得られた結果を示す。図示されているように、α-MMの注射から生じたPK/PDプロフィールの上昇は、食塩水を注射した対照群と比べたときに、II-2について非常に有意であったp<0.05。実施例21インビボ半減期/排出速度の比較実施例20で得られた結果は、競合する糖類の存在下で混乱することがあるレクチン依存性機構によって例示的なコンジュゲートが体から排出されていることに一致している。この機構をより詳細に調べるために、例示的なコンジュゲートに以下の実験を行って、未コンジュゲートインスリンと比べて、インビボで血清から排除される速度を決定した。各場合において、可溶性コンジュゲートを0.4mgコンジュゲート/kg体重にて両頸静脈にカニューレ挿入されたオスのスプラーグ-ドーリーラットタコニック、JV/JV、350-400g、n=3に投薬した。一方のJVカニューレを介して滅菌コンジュゲート溶液または対照インスリンを静脈内注射して、続いてすぐにヘパリン-食塩水の追加液を注射して、すべてのコンジュゲート用量が動物に投与されるようにした。第2のカニューレを使用して、t=0投薬前、ならびに投薬後1、2、4、8、15、30、60、90、120および180分に血液試料を採取した。血中グルコース値は、市販の試験ストリッププレシジョンエキストラ、アボットラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州を使用して測定した。加えて、各時点の血液を4°Cにて遠心分離にかけて血清を収集した。続いて血清インスリンまたは血清コンジュゲート濃度を市販のELISAキットイソインスリンELISA、メルコディア、ウプサラ、スウェーデンで測定した。RHIまたはコンジュゲートのどちらの血清濃度も静脈内注射後の時間の関数としてプロットした。データは、2コンパートメント双指数関数モデルを使用して、以下の一般式に適合させた:Ct=A0EXP-atB0EXP-bt式中、tは時間であり、Ctは時間の関数としての、血清中の濃度であり、A0は第1コンパートメント濃度定数であり、aは第1コンパートメント指数時間定数であり、B0は第2コンパートメント濃度定数であり、およびbは第2コンパートメント指数時間定数である。以下の表に、試験したRHIおよびコンジュゲートのt1/2パラメータをまとめる:このデータは、例示的なコンジュゲートが未コンジュゲートインスリンよりも高速に血清から排出され、その程度は内因性レクチンへの特定のコンジュゲートの親和性およびコンジュゲート当りの置換されたリガンドの数によって決まるという仮説に一致している。さらに、実施例19で示されたPK/PDプロフィールのα-MMに誘起された上昇は、試験した各コンジュゲートのb相半減期の短縮と十分に相関している。実施例22様々なリガンド親和性および多価性を持つコンジュゲートから調製した長期作用型コンジュゲートの性能本実施例において、我々はコンジュゲートII-1およびII-2の長期作用型製剤の時間作用およびグルコース応答性PKプロフィールの決定を試みたコンジュゲートの構造については図1を参照。以下の長期作用型製剤を各コンジュゲートに使用した。4時間IPグルコース注射4g/kg実験は、上記の各コンジュゲート15U/kg体重グラム/1.87=注射体積のマイクロリットルを投薬することによって行った。図4に示すように、4時間グルコース注射後に、すべてのコンジュゲートは遅延吸収プロフィールを呈し、測定された血清インスリン濃度は多少上昇気味であった。長期作用型TSPE-AETM-3コンジュゲートII-2の注射後の最初の4時間に、多少の有意なコンジュゲート吸収があったと思われる。TSPE-AEM-3コンジュゲートII-1は、平坦な吸収プロフィールを呈した。これらの結果は、これらのコンジュゲートの半減期はすべて実施例21に記載したような未修飾インスリンよりも低く、そのそれぞれが実施例20に記載したようなPK/PDプロフィールのα-MMに誘起された上昇を示すという事実と十分に相関している。実施例23組換えインスリン分子:酵素における産生、タンパク質精製およびインビトロ酵素処理本実施例は、小規模および大規模の両方での2つの異なる酵母株KM71およびGS115における複数の例示的なインスリン分子の組換え産生を示す。これらのインスリン分子のいくつかは、N末端保護アミノ酸配列を包含するように操作された。組換え産生されたインスリン分子は、予想された分子量を有し、抗インスリン抗体によって認識された。本実施例に記載する実験は、酵母において製造されたインスリン分子が商業規模の収量を生成したことを示す。本実施例は、組換え産生されたインスリン分子のインビトロ酵素処理および前官能化リガンドフレームワークとのコンジュゲーションに使用された手順も記載する。KM71インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州を30°CにてYPDブロス1リットルに付き:酵母抽出物10g、ペプトン20gおよびグルコース20g、pH6.5中で培養した。株の復元が成功した後、エレクトロコンピテントKM71をWuおよびLetchworthBiotechniques36:152-4によって記載されたように調製した。エレクトロコンピテントKM71を-80°Cの冷凍庫に貯蔵した。エレクトロコンピテントP.パストリスP.pastorisGS115インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州を同じ手順によって調製した。遺伝子構築物を発現するインスリン分子の調製インスリン分子構築物の遺伝子合成をジーンアートレーゲンスブルク、ドイツにて行った。簡潔には、インスリン分子の発現をコードする対象の遺伝子を表4に挙げる。遺伝子はジーンアートにて合成され、次にBamI5’部位およびEcoRI3’部位酵素によって切断して、次にpPIC3.5Kベクターインビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州の同じ部位に挿入した。生じたプラスミドを次に培養フラスコ内の大腸菌中で増幅して、次に抽出、精製し、プラスミドDNAのTE緩衝液による約1mg/mL溶液を得た。P.パストリスP.pastoris形質転換のためのDNA調製GS115およびKM71を形質転換するために、4つの遺伝子構築物を最初に使用した。電子穿孔による形質転換の前に、各構築物をSalIによって直線化した。各構築物の直線化の完了は、アガロースゲル電気泳動によって確認した。次にキアクイックPCR精製スピンカラムキアジェンを使用して、SalIおよび塩を直線化プラスミドから除去した。直線化プラスミドをスピンカラムから、オートクレーブ処理した脱イオン水を使用して溶離させた。DNAが酵母株に形質転換されたら、生じた遺伝子構築物は、表5に示すアミノ酸配列をコードした。プロ-リーダーペプチド配列は、培地中へのタンパク質分泌の前に、酵母内でKex-2エンドプロテアーゼによって切断されるように設計されているKjeldsenetal,1999,BiotechnolApplBiochem,29:79-86。このため、培地中に分泌された生じたインスリン分子は、[Bペプチド]-[Cペプチド]-[Aペプチド]配列に結合されたリーダーペプチド配列のみを包含する。P.パストリスP.pastoris形質転換直線化プラスミドは、WuおよびLetchworthによって報告された手順Biotechniques36:152-4に従って、エレクトロコンピテントP.パストリスP.pastorisGS115およびKM71に個別に形質転換されたどちらもHis-株。電子穿孔した細胞を氷冷1Mソルビトール1mLに再懸濁させて、最少デキストロース-ソルビトール寒天アンモニウムおよびアミノ酸を含まない、1.34酵母窒素ベース、4×10-5ビオチン、2デキストロース、1Mソルビトールおよび2寒天プレートに播種した。寒天プレートを30°Cにて4-7日インキュベートした。GS115およびKM71ゲノムに組み込まれた発現プラスミドは、His表現型を形質転換体にして、形質転換体をヒスチジン添加なしの最少デキストロース-ソルビトール寒天上で増殖させる。P.パストリスP.pastoris形質転換体の、高コピー数の発現カセットを持つクローンについてのスクリーニング上のステップにおける4つの発現プラスミドを持つP.パストリスP.pastorisの2つの株に由来するクローンを、高コピー数の遺伝子構築物の組み込みについて個別にスクリーニングした。すべての形質転換体をヒスチジン添加なしの最少デキストロース-ソルビトール寒天上で選択した。各形質転換は、500超のHis形質転換体を生成した。P.パストリスP.pastorisでは複数の組み込みイベントが自然に起こるため、これらの形質転換体のいくつかは複数のコピーの発現プラスミドを含有することが予想された。これらの高コピー数形質転換体は、より高いレベルのインスリン分子を産生することができるであろう。したがって、発現プラスミドのすべてがpPIC3.5K誘導体であり、ジェネティシン耐性マーカーを含有するすなわちより高いコピーのクローンはジェネティシン耐性のより高い組み込みをもたらすはずである。ため、最高のコピー数を持つ形質転換体を選択するために、すべての形質転換体をジェネティシンに対するその耐性に基づいてスクリーニングした。以下の手順により、His形質転換体を最少デキストロース-ソルビトール寒天上で培養して、ともにプールしてジェネティシンを含有するYPD寒天1酵母抽出物、2ペプトン、2デキストロースおよび2寒天に播種した:滅菌水1から2mlを、各最少デキストロース-ソルビトールプレート上のHis形質転換体各発現プラスミド-株の組合せからのの上にピペットで移した。滅菌スプレッダを使用して、スプレッダを寒天上面で移動することによって、His形質転換体を水中に再懸濁させる。細胞懸濁物を滅菌された50mlコニカル遠心管に移動プールして、短時間ボルテックス処理する。細胞懸濁物の細胞密度を分光光度計によって決定した1OD600単位≒5×107細胞/ml。105細胞を0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0および4.0mg/mlの最終濃度でジェネティシンを含有するYPDプレート上に播種した。プレートを30°Cにてインキュベートして、毎日チェックした。ジェネティシン耐性コロニーが出現するまで3から5日かかった。YPD-ジェネティシンプレート上で増殖したコロニーを同じ濃度のジェネティシンを含有するYPD寒天上で純度について画線培養して、単離されたコロニーが高濃度のジェネティシンに耐性であることを確認した。次に多様なジェネティシン濃度レベルの複数のクローンを、振とうフラスコでのインスリン分子発現試験のために選択した。振とうフラスコ試験40のジェネティシン耐性クローン4つの発現プラスミド×2株×5つの形質転換体に対して2つの緩衝液条件緩衝対非緩衝培地にて、合計80個の振とう培養フラスコについて振とうフラスコ試験を行った。形質転換体の半分はKM71誘導体であり、これはMuts表現型を有している。上で調製した画線されたプレートから単離したKM71形質転換体コロニーを使用して、100mL非緩衝MGYブロス1酵母抽出物、2ペプトン、1.34酵母窒素ベース、4×10-5ビオチンおよび1グリセロールまたはBMGYブロス100mLMGYと同じであるが、100mMリン酸カリウムを含む、pH6に植菌した。これらの種培養物を30°Cにて、250rpmでオービタル振とうしながら、16時間またはOD600値が2-6に達するまでインキュベートした。次に、わずかな一定分量の各MGY培養物を使用してグリセロールストックを調製した。残りのMGY培養物を次に4000×gにて5分の遠心分離によって集菌した。培養物上清を廃棄して、各細胞ペレットをMMYブロス20mLグリセロールが0.5メタノールで置き換えられていることを除いて、MGYと同じで再懸濁させた。同様に、BMGY種培養物を4000×gにて5分の遠心分離によって集菌した。培養物上清を廃棄して、各細胞ペレットをBMMYブロス20mLグリセロールが0.5メタノールで置き換えられていることを除いて、BMGYと同じで再懸濁させた。MMYおよびBMMYブロス中のメタノールは、タンパク質発現を誘起する。MMYおよびBMMY培養物を30°Cにて250rpmでオービタル振とうしながら96時間インキュベートした。24時間ごとに、メタノールを各培養物に0.5の最終濃度まで添加した。0.5mLの一定分量の培養物も各振とうフラスコから、誘起開始後に24時間ごとに除去した。これらの試料では、細胞を培養物上清から微量遠心分離によって分離して、両方の画分を-80°Cにて貯蔵した。形質転換体のもう1つの半分はGS115誘導体であり、これはMutであることが予想された。先に記載したように調製した画線されたプレートから単離したGS115形質転換体コロニーを使用して、MGYブロス25mLおよびBMGYブロス25mLを植菌した。これらの種培養物を30°Cにて、250rpmでオービタル振とうしながら、16時間またはOD600値が2-6に達するまでインキュベートした。次に、わずかな一定分量の各MGY培養物を使用してグリセロールストックを調製した。開始OD600値が約1であるように、残りの細胞の別の一定分量を、MMYブロス20mLに植菌するために遠心分離によって集菌した。同様に、開始OD600値が約1であるように、BMGY種培養物を使用してBMMYブロス20mLに植菌した。MMYおよびBMMY培養物を30°Cにて250rpmでオービタル振とうしながら96時間インキュベートした。24時間ごとに、メタノールを各培養物に0.5の最終濃度まで添加した。0.5mLの一定分量の培養物を各振とうフラスコから、誘起開始後に24時間ごとに除去した。細胞を培養物上清から微量遠心分離によって分離して、両方の画分を-80°Cにて貯蔵した。96時間の誘起後、すべての培養物を遠心分離によって集菌した。細胞ペレットを廃棄した。最終培養物上清および誘起の間に多様な時点にて収集した培養物上清をインスリン分子発現収率について、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGE、バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア州;標準ラダー:シーブループラス2前染色標準1X;染色:シンプリーブルーセーフステイン;プレキャストゲル:基準プレキャストゲル16.5トリス-トリシン/ペプチド;ランニング緩衝液:1Xトリス/トリシン/SDS緩衝液;ローディング緩衝液:トリシン試料緩衝液または酵素結合免疫吸着測定法ELISA、メルコディアイソ-インスリンELISA、ウプサラ、スウェーデンによって分析した。酵母における大規模インスリン分子発現のための培地BM_Y=BM_Yベース培地テクノバ、カタログ番号B8001BMGY=BM_Y0.1グリセロール体積/体積BMMY=BM_Yメタノール酵母における大規模インスリン分子発現のためのMDS寒天プレートの調製ソルビトール319gおよび寒天35gをジH2O1.4Lに溶解させた。混合物をオートクレーブで30分処理した。開始する前に温度を60°Cまで降下させた。次に、脱イオン水中に硫酸アンモニウムを含有する滅菌13.4重量/体積酵母窒素ベースYNB175mLを添加した。この混合物に、滅菌20グルコースの脱イオン水溶液175mLおよび滅菌0.02ビオチンの脱イオン水溶液3.5mLの一部を添加した。溶液を均一になるまで混合して、次にプレート中に注いだ。酵母におけるインスリン分子の大規模発現および培養滅菌ループを使用して、凍結細胞の一定分量をMDSプレートに移し、単一コロニーを得るために画線培養した。プレートを30°Cにて2-4日インキュベートして、酵母コロニーを明らかにした。1個のコロニーを滅菌ループによって無作為に選び、BMGY培地25mLBM_Y24.17mL30グリセロール0.83mLに植菌するために使用した。この培地をインキュベータ/振とう器約150rpmで30°Cにて24時間インキュベートした。この時間の後、BMGY75mLBM_Y72.5mLおよび30グリセロール2.5mLを培養物に添加して、約100mLの最終体積を得た。インキュベーションを同じ条件下でさらに24時間続けた。翌日、光学密度ODを評価して、1000OD一定分量を得るために前培養物がどれだけ必要かを決定したたとえばOD=15ならば、次に1000OD/150DmL-1→1000ODを得るために、前培養物66.7mLが必要であった。次に、計算した体積の前培養物を遠心分離して4000rpm、4°Cで10分、上清をデカンテーションした。ペレットをBM_Y培地990mL中に再懸濁させた。ODを再チェックしてODはおよそ1.0であるべきである。、培養物の体積を必要ならばそれに従って調整した。生化学グレードメタノール10mLシグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州494437を次にフラスコ添加して、フラスコをインキュベータ/振とう器で約150rpm、30°Cにて24時間インキュベートした。メタノールを所望のタンパク質発現レベルに応じて、2-6日にわたって24時間ごとに添加した。所望の酵母増殖レベルが達成された後、培養物を遠心分離した10,000rpm,4°Cにて30分。上清をデカンテーションして、清浄な容器に保管して、必要となるまで、-80°Cに凍結させた。インスリン分子の大規模精製培養フラスコからの細胞を4000×g、4°Cにて10分の遠心分離により沈降させた。生じた上清を清浄なフラスコ中にデカンテーションした。1NHC1または1NNaOHを使用して上清のpHを約3.3に調整して、続いて上清を等量の脱イオン水ミリQ、ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州によって希釈した。生じた培養物上清を0.2ミクロン低結合フィルタユニットミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州を通じた濾過により浄化した。別にイオン交換カラム1.42cm×1.42cm×5.0cmを、25mMクエン酸塩緩衝液pH3.3ウォッシュバッファ中で調製したSPセファロースファストフロー担体GEヘルスケアを用いて調製した。カラムに適切に充填したら、カラムを蠕動ポンプに連結して、培養物上清をイオン交換カラム上に添加した約10ml/分。すべての培養物上清をカラムに添加したら、蠕動ポンプを使用して、ウォッシュバッファおよそ10カラム容量CVをカラムに通過させた。これを行った後に、溶離緩衝液50mM、pH7.6および200mMNaClおよそ2-5CVを使用して、精製インスリン分子をカラムから溶離させた。生じた精製インスリン分子溶液をマスタフレックスモデル7523-80ポンプコールパーマー、ヴァーノンヒルズ、イリノイ州に連結されたダイアフィルトレーション装置88cm2および0.11m2カセットホルダ、5kDaMWCOペリコン30.11m2カセットフィルタ、ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州を使用して濃縮および脱塩した。溶液を最初に濃縮して、またはおよそ250mLの体積に希釈して、次におよそ8-10ダイア容量のミリ-Q脱イオン水でダイアフィルトレーションした。脱塩した精製インスリン分子溶液を次に、凍結乾燥するか、または続いての酵素処理ステップで直接使用した。インビトロ酵素処理アクロモバクターリティカスAchromobacterlyticusプロテアーゼALPは、酵素2UをMilli-QH2O1mLに溶解させることによって調製した。酵素ストック溶液1:9をミリQH2Oで0.2U/mLの濃度にさらに希釈することによって作用溶液を調製した。すべての10RHI-1ミュータントからのブロスを使用したGS115RHI-1A-EおよびKM71RHI-1A-E。各ブロス試料の200μL一定分量を2つ調製して、2Mトリス40μLの添加によってpH約10に調整した。対照として用いるために、同じ方法で約540μg/mLヒトRHIの一定分量を2つ調製した。作用酵素溶液2.4μLを一定分量各対の一方に添加した。ミリ-QH2O2.4μLを他方に添加して対照として用いた。試料をロッカー上で室温にて4.5時間インキュベートして、次に-80°Cにて分析まで凍結させた。SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング用の試料は、トリシン試料緩衝液バイオラッド20μLを調製ブロス10μLに添加して、5分沸騰させることによって調製した。試料は、ペプチドおよびタンパク質ラダーと共に、125Vで運転されている16.5トリス-トリシンゲル上で室温にて1.75時間分解させた。次にタンパク質を、iブロットドライトランスファーシステムインビトロジェン、プログラムP3を5.5分使用して、ニトロセルロース膜に移した。膜をPBS中0.25グルタルアルデヒドgluteraldehydeによって15分固定させて、次にTBSによって3×5分洗浄した。ブロッキングをPBS0.05ツイン-20PBST中の5粉乳中でロッカー上にて室温で1時間行った。次にブロットをPBST中の1粉乳で1:1000に希釈されたマウス抗ヒトプロ-インスリン/インスリン抗体アブカムで振とう器上で4°Cにて一晩インキュベートした。ブロットをPBSTによって2×10分洗浄して、PBST中1乳中で1:3000に希釈したHRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG中で室温にて2時間インキュベートした。ブロットをPBST中で2×10分洗浄して、続いてdH2O中で2分洗浄した。TMB基質ピアス中で室温にて2時間インキュベートすることによってバンドを展開させて、続いてdH2Oによって徹底的に洗浄した。前官能化リガンドフレームワークとのコンジュゲーションA0/B0上に、A0のみの上に、またはB0のみの上にN末端保護アミノ酸を持つインスリン分子がALPによって処置されると、インスリン分子は末端活性化エステルたとえば-OSuなどを包含する前官能化リガンドフレームワークとコンジュゲートされる。反応は、前官能化リガンドフレームワークをDMSOまたはDMFなどの無水有機溶媒に溶解させること、次に所望の当量数のALP消化インスリン分子を添加すること、続いて室温にて数時間混合することによって行われる。前官能化リガンドフレームワークとALP消化インスリン分子との間のコンジュゲーション反応は、炭酸塩緩衝液中でも起こり得て、B29-コンジュゲートインスリン分子を与える。例示的な合成において、前官能化リガンドフレームワークPLFが無水DMSOに溶解されて、続いてトリエチルアミンTEAが添加される。溶液を室温にて所望の長さの時間にわたって迅速に撹拌する。次にALP消化インスリン分子を17.2mM炭酸ナトリウム緩衝液0.1M、pH11中に個別に溶解させて、続いて1.0N水酸化ナトリウムによってpHを10.8まで調整する。溶解したら、PLF/DMSO/TEA溶液を薬物/炭酸塩緩衝液溶液に滴加する。添加中に、必要ならば希HClまたはNaOHを使用して、生じた混合物のpHを定期的に10.8まで調整する。滴加の後に溶液を所望の長さの時間にわたって撹拌して、完全に反応させる。さらに、炭酸塩緩衝液条件下で、インスリン分子がB0のみにて保護されているある実施形態において、A1,B29-2置換インスリン-コンジュゲートは、上記の条件を使用して、B29-1置換インスリン-コンジュゲート合成と比較して、インスリン分子当りの前官能化リガンドフレームワークの量のおよそ10倍を用いて合成される。N末端アミノ酸保護アミノ酸配列のインビトロ酵素切断コンジュゲートインスリン中間体を次にトリプシンで処置して、表6に下線を付けて示されているN末端保護アミノ酸配列を切断する。簡潔には、0.5重量/重量トリプシンたとえばブタトリプシンをコンジュゲートインスリン中間体に添加する。トリプシンは、反応混合物の体積の10体積/体積から30体積/体積たとえば約20体積/体積に達する体積で水溶物として提供され得る。室温にて約1時間後、反応を終了させる。反応はpHを調整することによって、たとえばpHを酸性pHにたとえば約1、約2、約3、約4、約5または約6のpHにに調整することによって終了され得る。所望の生成物は、たとえば分取逆相HPLCを使用して精製されていてもよい。結果酵母におけるインスリン分子の産生本実施例は、酵母におけるインスリン分子の産生を示す。とりわけ本実施例は、2つの異なる酵母株におけるインスリン分子特にRHI-1、RHI-2、RHI-3およびRAT-1の産生産生を示す。本開示は、これらの手順が他のいずれの組換えインスリン分子を発現および精製するためにも有用であり得るという認識を含む。図11は、緩衝BMMYおよび未緩衝MMY条件下で培養されたGS115株クローンからの未精製培養物上清の収量を示す。図11の左パネルは、ELISA分析イソ-インスリンELISA、メルコディア、ウプサラ、スウェーデンを使用した、多様なクローンCloneは、各種のジェネティシンプレート耐性レベルから得たクローンを指すからのインスリン分子収量mg/Lを示す。図11の右パネルは、クローンのSDS-PAGEを示し、産生されたインスリン分子の分子量を示している。組換えヒトインスリン標準RHI標準を収量比較する目的で、右上ゲルのレーン14および右下ゲルのレーン2に250mg/Lに示す。予想した通り、インスリン分子は、リーダーペプチドおよび結合ペプチドCペプチドのために、RHI標準の分子量よりも高いMWを有する。図12は、緩衝条件下で培養されたKM71株クローンからの未精製培養物上清収量を示す。図12の左パネルは、ELISA分析イソ-インスリンELISA、メルコディア、ウプサラ、スウェーデンを使用した、多様なクローンCloneは、各種のジェネティシンプレート耐性レベルから得たクローンを指すからのインスリン分子収量mg/Lを示す。図12の右パネルは、クローンのSDS-PAGEを示し、産生されたインスリン分子の分子量を示している。組換えヒトインスリン標準RHI標準は、右上ゲルのレーン15-1860-500mg/Lおよび右下ゲルのレーン5-930-500mg/Lに、収率を比較する目的で示されている。予想した通り、インスリン分子は、リーダーペプチドおよび結合ペプチドCペプチドのために、RHI標準の分子量よりも高いMWを有する。図13は、非緩衝条件下で培養されたKM71株クローンからの未精製培養物上清収量を示す。図13の左パネルは、ELISA分析イソ-インスリンELISA、メルコディア、ウプサラ、スウェーデンを使用した、多様なクローンCloneは、各種のジェネティシンプレート耐性レベルから得たクローンを指すからのインスリン分子収量mg/Lを示す。図13の右パネルは、クローンのSDS-PAGEを示し、産生されたインスリン分子の分子量を示している。組換えヒトインスリン標準RHI標準は、右上ゲルのレーン8および9250および100mg/Lおよび右下ゲルのレーン18250mg/Lに、収率を比較する目的で示されている。予想した通り、インスリン分子は、リーダーペプチドおよび結合ペプチドCペプチドのために、RHI標準の分子量よりも高いMWを有する。図11-13に示した結果は、多様なプラスミド構築物によって産生されたインスリン分子が正しいMWの分子であることを示す。加えて、これらのデータは、ヒトインスリンに特異的である抗体を使用する市販のインスリンELISAキットによって測定可能および検出可能であったため、インスリン分子がインスリン様であることを示す。これらのデータは、インスリン分子が酵母において商業的に有用なレベルたとえば>25mg/Lで発現され得ることをさらに示す。最後に、これらのデータは、ELISA測定収量と粗培養物上清からのSDS-PAGE測定収量との間に良好な相関を示した。言い換えれば、SDS-PAGEバンド強度が上昇すると、ELISA測定値も上昇する傾向があった。この相関は、SDS-PAGEゲルで適切な分子量の対象とするバンドが実際にインスリン分子であったことをさらに示す。精製インスリン分子のインビトロ酵素処理本実施例は、Cペプチドおよびリーダーペプチドを除去するための組換え産生インスリン分子のインビトロ酵素処理に使用された手順も記載する。本開示は、これらの手順がたとえば粗細胞培養物ブロスからの、浄化された上清からの、精製インスリン分子生成物などからの産生工程のいずれのステップにおいてもインスリン分子の精製に利用できるという認識を含んでいる。遺伝子RHI-1を含有するメタノール誘起ミュータントからのブロスをアクロモバクターリティカスAchromobacterlyticusプロテアーゼALPによって消化した。ALPはC末端リジンプロテアーゼであり、したがってインスリン分子のAペプチドとBペプチドとの間のペプチドリンカC末端LysがないCペプチドを包含するRHI-2およびRHI-3構築物を除くならびにBペプチドのN末端に結合されているリーダーペプチド配列を切断することが予想された。乾燥膜をスキャンして、図14に示す。2つのバンドがブロスを含有する大半のレーンに存在し、両方のバンドが、酵素消化後には対照と比較してより低い分子量に移動した。各消化対のより低いMWのバンドは、RHI対照とほぼ同じ位置にある。RHI対照は、消化後にMWを変更しなかった。これらの結果は、適切なサイズのインスリン分子が酵素処理後に生成されたことを示す。インスリン分子RHI-1、RHI-4およびRAT-1のALPによる消化は、表6に示す生成物を産生することが予測されるであろう生成物中のAおよびBペプチドは、式XIに示すように、3つのジスルフィドブリッジを介して結合されている。RHI-2およびRHI-3のCペプチドはC末端Lysを包含しないため、CペプチドがArgのC末端側で切断する酵素たとえばトリプシンまたは下で議論するようなトリプシン様プロテアーゼによってさらに処理されるまで、これらはAペプチドのN末端に結合されたままであることが予想されるであろう。RHI-2、RHI-3およびRHI-4はそれぞれ、1つ以上のN末端保護アミノ酸配列表6の配列で下線が付けられているを包含するように設計された。図示されているように、RHI-2はN末端保護アミノ酸配列を位置A0およびB0に包含する上述のように、RHI-2のCペプチドはALPによって切断されず、したがってAペプチドのN末端になお結合されている。RHI-3は、N末端保護アミノ酸配列を位置A0のみに包含する上述のように、RHI-3のCペプチドはALPによって切断されず、したがってAペプチドのN末端になお結合されている。RHI-4は、N末端保護アミノ酸配列を位置B0にのみ包含する。前官能化リガンドフレームワークとのコンジュゲーションRHI-2、RHI-3およびRHI-4がALPによって処置されると、これらは末端活性化エステルたとえば-OSuなどを包含する前官能化リガンドフレームワークとコンジュゲートされる。反応は、前官能化リガンドフレームワークをDMSOまたはDMFなどの無水有機溶媒に溶解させること、次に所望の当量数のALP消化インスリン分子を添加すること、続いて室温にて数時間混合することによって行われる。または反応は、炭酸塩緩衝液中で所望の当量数の前官能化リガンドフレームワークPLFを無水DMSOに溶解させること、続いてのトリエチルアミンTEAの添加によって行われる。溶液を室温にて所望の長さの時間にわたって迅速に撹拌する。次にALP消化インスリン分子を17.2mM炭酸ナトリウム緩衝液0.1M、pH11中に個別に溶解させて、続いて1.0N水酸化ナトリウムによってpHを10.8まで調整する。溶解したら、PLF/DMSO/TEA溶液を薬物/炭酸塩緩衝液溶液に滴加する。添加中に、必要ならば希HClまたはNaOHを使用して、生じた混合物のpHを定期的に10.8まで調整する。滴加の後に溶液を所望の長さの時間にわたって撹拌して、完全に反応させる。N末端アミノ酸保護アミノ酸配列のインビトロ酵素切断コンジュゲートインスリン中間体を次にトリプシンで処置して、表6に下線を付けて示されているN末端保護アミノ酸配列を切断する。簡潔には、0.5重量/重量トリプシンたとえばブタトリプシンをコンジュゲートインスリン中間体に添加する。トリプシンは、反応混合物の体積の10体積/体積から30体積/体積たとえば約20体積/体積に達する体積で水溶物として提供され得る。室温にて約1時間後、反応を終了させる。反応はpHを調整することによって、たとえばpHを酸性pHにたとえば約1、約2、約3、約4、約5または約6のpHにに調整することによって終了され得る。所望の生成物は、たとえば分取逆相HPLCを使用して精製されていてもよい。"