食品調製加工条件下で、窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する少なくとも1つの核酸分子により形質転換された微生物。前記少なくとも1つの核酸分子が、細胞壁アスパラギナーゼをコードする、請求項1に記載の微生物。前記アスパラギナーゼが、ASP3によりコードされる、請求項2に記載の微生物。前記アスパラギナーゼが、Asp3pである、請求項2に記載の微生物。前記少なくとも1つの核酸分子が、アミノ酸輸送体をコードする、請求項1に記載の微生物。前記アミノ酸輸送体が、GAP1、AGP1、GNP1、DIP5、AGP2またはAGP3によりコードされる、請求項5に記載の微生物。前記アミノ酸輸送体が、Gap1p、Agp1p、Gnp1p、Dip5p、Agp2pまたはAgp3pである、請求項5に記載の微生物。前記少なくとも1つの核酸分子が、窒素異化抑制の制御因子の活性を改変する、請求項1に記載の微生物。前記制御因子が、URE2、GAT1、TOR1、TOR2、DAL80、GLN3またはGZF3によりコードされる、請求項8に記載の微生物。前記制御因子が、Ure2p、Gat1p、Tor1p、Tor2p、Dal80p、Gln3pまたはGzf3pである、請求項8に記載の微生物。前記少なくとも1つの核酸分子が、URE2欠失カセットを含む、請求項8に記載の微生物。前記少なくとも1つの核酸が、URE3をコードする、請求項8に記載の微生物。前記微生物が不活性である、請求項1から12のいずれか一項に記載の微生物。真菌または細菌である、請求項1から13のいずれか一項に記載の微生物。前記真菌が酵母である、請求項14に記載の微生物。前記酵母が出芽酵母である、請求項15に記載の微生物。食品調製加工条件下で、アスパラギンを絶えず分解するおよびまたは取り込むよう形質転換された、請求項1から16のいずれか一項に記載の微生物。前記少なくとも1つの核酸分子が、恒常的活性型プロモーターと作動可能に連結している、請求項1から17のいずれか一項に記載の微生物。前記少なくとも1つの核酸分子が、窒素異化抑制を受けないプロモーターと作動可能に連結している、請求項1から17のいずれか一項に記載の微生物。少なくとも2つの核酸分子により形質転換される、請求項1から19のいずれか一項に記載の微生物。Asp3pをコードする第1核酸分子およびGap1pもしくはGat1pをコードする第2核酸分子により形質転換された、請求項1に記載の微生物。Gln3pの発現を改変する第1核酸分子およびUre2pの発現を改変する第2核酸分子により形質転換された、請求項1に記載の微生物。請求項1から22のいずれか一項に記載の微生物を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程を含み、前記微生物が、食品調製または加工中に、窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる、食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる方法。請求項1から22のいずれか一項に記載の微生物を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程を含み、前記微生物が、食品調製または加工中に、窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品製品中のアクリルアミドを減少させる、食品製品中のアクリルアミドを減少させる方法。a窒素異化抑制を減少させるならびにまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する少なくとも1つの核酸分子により微生物を形質転換する工程と、b前記微生物を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程とを含み、窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる、食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる方法。a窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する少なくとも1つの核酸分子により微生物を形質転換する工程と、b前記微生物を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程とを含み、前記微生物が、窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品製品中のアクリルアミドを減少させる、食品製品中のアクリルアミドを減少させる方法。前記少なくとも1つの核酸分子が、細胞壁アスパラギナーゼをコードする、請求項25または26に記載の方法。前記アスパラギナーゼが、ASP3によりコードされる、請求項27に記載の方法。前記アスパラギナーゼが、Asp3pである、請求項27に記載の方法。前記少なくとも1つの核酸分子が、アミノ酸輸送体をコードする、請求項25または26に記載の方法。前記アミノ酸輸送体が、GAP1、AGP1、GNP1、DIP5、AGP2またはAGP3によりコードされる、請求項30に記載の方法。前記アミノ酸輸送体が、Gap1p、Agp1p、Gnp1p、Dip5p、Agp2pまたはAgp3pである、請求項30に記載の方法。前記少なくとも1つの核酸が、前記微生物の窒素異化抑制の制御因子の活性を改変するタンパク質をコードする、請求項25または26に記載の方法。前記制御因子が、URE2、GAT1、TOR1、TOR2、DAL80、GLN3またはGZF3によりコードされる、請求項33に記載の方法。前記制御因子が、Ure2p、Gat1p、Tor1p、Tor2p、Dal80p、Gln3pまたはGzf3pである、請求項33に記載の方法。前記核酸が、URE2欠失カセットを含む、請求項33に記載の方法。前記微生物が不活性である、請求項25から36のいずれか一項に記載の方法。前記微生物が真菌または細菌である、請求項25から37のいずれか一項に記載の方法。前記真菌が酵母である、請求項38に記載の方法。前記酵母が出芽酵母である、請求項39に記載の方法。前記核酸分子が、恒常的活性型プロモーターと作動可能に連結している、請求項23から40のいずれか一項に記載の方法。前記核酸分子が、窒素異化抑制を受けないプロモーターと作動可能に連結している、請求項23から40のいずれか一項に記載の方法。前記食品製品が、植物性食品製品、飲料、ベーカリー製品、穀物製品、果物製品、豆類製品、乳製品または肉製品である、請求項23から42のいずれか一項に記載の方法。請求項1から22のいずれか一項に記載の形質転換微生物を使用して製造される、アクリルアミド濃度が減少した食品製品。請求項23から43のいずれか一項に記載の方法を使用して製造される、アクリルアミド濃度が減少した食品製品。本開示は、食品調製加工条件下で窒素異化抑制を減少させる少なくとも1つの核酸分子により形質転換された微生物を提供する。本開示はまた、食品調製加工条件下で、アスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびまたはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する少なくとも1つの核酸分子により形質転換された微生物を提供する。本開示はまた、食品調製加工条件下で、窒素異化抑制を減少させるならびにあるいはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびまたはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する少なくとも1つの核酸分子により形質転換された微生物を提供する。一実施形態では、微生物は、細胞壁結合型アスパラギナーゼ、Asp3pなどの細胞外アスパラギナーゼをコードする核酸分子により形質転換される。別の実施形態では、微生物は、アスパラギンアミノ酸輸送体、例えば、Gap1p、Agp1p、Gnp1p、Dip5p、Agp2pおよびまたはAgp3pなどのアミノ酸輸送体をコードする核酸分子により形質転換される。別の実施形態では、微生物は、Asp3pおよびGap1pの両方あるいはAsp3pおよびGat1pの両方をコードする核酸分子により形質転換される。別の実施形態では、微生物は、Asp3pをコードする第1核酸分子およびGap1pもしくはGat1pをコードする第2核酸分子により形質転換される。さらに別の実施形態では、微生物は、Ure2p、Dal80p、Gzf3p、Gln3p、Gat1p、Tor1pおよびまたはTor2pなどのアスパラギン輸送分解の窒素異化抑制の制御因子の活性を改変する核酸分子により形質転換される。別の実施形態では、微生物は、窒素異化抑制制御因子Gln3pおよびUre2p、両方の活性を改変する核酸分子により形質転換される。さらに別の実施形態では、微生物は、窒素異化抑制を改変する、Gln3pをコードする第1核酸分子およびUre2pの発現を改変する第2核酸分子により形質転換される。一実施形態では、微生物は、真菌または細菌である。真菌は、出芽酵母、サッカロマイセスバヤヌス、サッカロマイセスカールスベルゲンシス、カンジダアルビカンス、カンジダケフィル、カンジダトロピカリス、クリプトコッカスラウレンティ、クリプトコッカスネオフォルマンス、ハンセヌラアノマラ、ハンセヌラポリモルファ、クルイベロマイセスフラジリス、クルイベロマイセスラクティス、クルイベロマイセスマルシアヌス変種ラクティス、ピキアパストリス、ロドトルラルブラ、分裂酵母、ヤロウイアリポリティカまたは菌界に属する任意の酵母種などの酵母を含む任意の真菌であり得る。使用することができる他の真菌には、それだけに限らないが、アスペルギルス属、ペニシリウム属、クモノスカビ属およびケカビ属の種が含まれる。細菌は、エルウィニア属の種、乳酸桿菌属の種、ラクトコッカス属の種、バチルス属の種、ペディオコッカス属の種、シュードモナス属の種、ブレビバクテリウム属の種およびロイコノストック属の種を含む任意の細菌であり得る。一実施形態では、微生物は、不活性酵母などの不活性である。一実施形態では、少なくとも1つの核酸分子は、恒常的活性型プロモーターと作動可能に連結している。別の実施形態では、少なくとも1つの核酸分子は、窒素異化抑制を受けないプロモーターと作動可能に連結している。本明細書ではまた、調製または加工条件下で窒素異化抑制を減少させるあるいはアスパラギン輸送およびまたは分解に関与する遺伝子を過剰発現する、本明細書に開示する微生物を、調製または加工条件下で食品に添加し、それによって食品製品中のアクリルアミドを減少させる工程を含む、前記食品製品中のアクリルアミドを減少させる方法も提供される。本明細書では、窒素異化抑制を減少させるあるいはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびまたはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する少なくとも1つの核酸分子により微生物を形質転換する工程と、前記微生物を、調製または加工条件下で食品に添加する工程とを含み、前記微生物が、窒素異化抑制を減少させるか、アスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびまたはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品製品中のアクリルアミドを減少させる、食品製品中のアクリルアミドを減少させる方法がさらに提供される。別の実施形態では、本明細書に開示する形質転換微生物を使用して製造されるアクリルアミド濃度が減少した食品製品が提供される。さらに別の実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して製造されるアクリルアミド濃度が減少した食品製品が提供される。一実施形態では、食品製品は、それらだけに限らないが、ビスケット、パンおよびクラッカーを含む穀物食品製品、それだけに限らないが、ジャガイモ製品を含む植物性食品製品、それらだけに限らないが、コーヒーもしくはコーヒー代用品を含む飲料、果物製品、豆類製品、乳製品または肉製品である。本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、本開示の精神および範囲内の種々の変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるので、詳細な説明および特定の実施例は、本開示の好ましい実施形態を示しているが、例示のためのみに与えられることを理解すべきである。ここで、本開示を以下の図面に関連して記載する。本発明者等は、アクリルアミドの産生をもたらす食品加工または調製中に産生される律速的前駆物質であるアスパラギンを消費およびまたは分解する能力が増加した酵母株を作製した。微生物一実施形態では、食品調製加工条件下で、窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する少なくとも1つの核酸分子により形質転換された微生物が提供される。別の実施形態では、微生物は、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つまたはそれ以上の核酸分子により形質転換される。本明細書で使用する句アスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびまたはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するとは、核酸分子により形質転換されなかった対照と比較して、細胞膜に輸送または細胞壁に分泌され、アミノ酸アスパラギンの輸送およびまたは分解に関与するmRNAあるいはタンパク質の発現の増加を指す。核酸分子は、アスパラギン輸送に直接的もしくは間接的に関与するタンパク質およびまたはアスパラギン分解に直接的もしくは間接的に関与する細胞外タンパク質をコードする任意の核酸分子であり得る。一実施形態では、核酸分子は、細胞壁アスパラギナーゼまたはアスパラギン分解活性を有するそのフラグメントをコードする。細胞外アスパラギナーゼは、当技術分野で既知の酵素であり、それだけに限らないが、酵母Asp3pまたはその相同体などの、アスパラギンをアスパラギン酸に変換することができ、それだけに限らないが、ASP3またはその相同体を含む細胞壁アスパラギナーゼをコードする任意のアスパラギナーゼ遺伝子によりコードされ得る任意の供給源からの細胞壁などの細胞外のアスパラギナーゼを含む。一実施形態では、細胞壁アスパラギナーゼは、配列番号2に示す核酸分子ASP3またはその相同体もしくはフラグメントによりコードされる、あるいは配列番号1に示すアミノ酸配列Asp3pまたはその相同体もしくはフラグメントを含む。細胞外アスパラギナーゼをコードする核酸分子を含む微生物は、食品調製および加工条件下でアスパラギンを分解することができるだろう。別の実施形態では、核酸分子は、アスパラギンを細胞中に輸送する能力を有するアミノ酸輸送体またはそのフラグメントをコードする。アミノ酸輸送体は、当技術分野で既知であり、それだけに限らないが、酵母Gap1p、Agp1p、Gnp1p、Dip5p、Agp2pおよびAgp3pまたはその相同体などのアスパラギンを微生物中に積極的に輸送することができる任意の供給源からのアミノ酸輸送体を含み、それだけに限らないが、GAP1、AGP1、GNP1、DIP5、AGP2およびAGP3またはその相同体を含む任意のアミノ酸輸送体遺伝子によりコードされ得る。したがって、一実施形態では、アミノ酸輸送体は、それぞれ配列番号4、6、8、10、12もしくは30に示す核酸分子GAP1、AGP3、AGP2、GNP1、AGP1もしくはDIP5、またはその相同体もしくはフラグメントによりコードされる、あるいはそれぞれ配列番号3、5、7、9、11もしくは29に示すGap1p、Agp3p、Agp2p、Gnp1p、Agp1pもしくはDip5pまたはその相同体もしくはフラグメントのアミノ酸配列を含む。アミノ酸輸送体をコードする核酸分子を含む微生物は、食品調製および加工条件下でアスパラギンを消費するまたは取り込むことができるだろう。別の実施形態では、微生物は、細胞壁アスパラギナーゼをコードする核酸およびアミノ酸輸送体をコードする核酸により形質転換される。このような実施形態では、微生物は、アスパラギンを消費および分解することができる。本明細書で使用するアスパラギン輸送分解の窒素異化抑制を減少させるという句は、NCR感受性遺伝子の遺伝子抑制の実際の減少を指す、またはNCR感受性遺伝子の内因性発現もしくは異種発現の増加を指す。例えば、NCRを減少させる核酸分子は、窒素異化抑制の発現を改変する制御因子であり得る、またはNCR感受性遺伝子の過剰発現であり得る。さらに別の実施形態では、核酸分子は、窒素異化抑制の制御因子の活性を改変する。窒素異化抑制のための制御因子は、当技術分野で既知であり、それらだけに限らないが、配列番号13、15、17、19、21、33もしくは31に示す酵母Gat1p、Ure2p、Tor1p、Dal80p、Gzf3p、Tor2pもしくはGln3pまたはそれらの相同体もしくはフラグメントなどの任意の供給源からの制御因子を含み、配列番号14、16、18、20、22、34もしくは32に示すGAT1、URE2、TOR1、DAL80、GZF3、TOR2もしくはGLN3などの制御因子をコードする任意の遺伝子によりコードされ得る。例えば、もはやUre2p、Tor1p、Tor2p、Dal80pもしくはGzf3pなどの機能的負の制御因子を有さない微生物を産生することができる。これは、例えば、野生型株をURE3株と交配することにより、またはURE2のサイトダクションおよび過剰発現を含む任意の分子生物学手段によりURE3表現型を誘導することにより、URE2遺伝子の欠失、ure2変異表現型の単離および発現をもたらし、もはやGln3pおよびGat1pの活性を下方制御しない核酸分子により達成することができる。機能的Ure2pを欠く細胞の結果は、アンモニアまたはグルタミンなどの高窒素源の存在下でもはや抑制されない、アスパラギン輸送および利用に関与するものなどのNCR感受性遺伝子をもたらすだろう。したがって、一実施形態では、核酸分子は、URE2、TOR1、TOR2、DAL80およびまたはGZF3欠失カセットを含む。機能的Ure2p、Tor1p、Dal80pおよびまたはGzf3pを欠く微生物は、食品調製および加工条件下でアスパラギンを消費および分解することができるだろう。あるいは、これは、Gat1pおよびまたはGln3pなどの機能的正の制御因子の過剰発現をもたらす核酸分子により達成することができる。本明細書で使用する用語遺伝子とは、その通常の定義に従って、核酸配列の作動可能に連結した集団を意味する。本開示の文脈中の遺伝子の改変は、遺伝子中で作動可能に連結している種々に配列のいずれか1つの改変を含み得る。作動可能に連結しているとは、特定の配列が、直接的もしくは間接的に相互作用して、遺伝子発現の媒介または調節などのその所期の機能を行うことを意味する。作動可能に連結している配列の相互作用は、例えば、同様に核酸配列と相互作用するタンパク質により媒介され得る。本開示の種々の遺伝子および核酸配列は、組換え配列であり得る。本明細書で使用する用語組換えとは、組換えられた何かを指し、核酸構造体に関して、この用語は、分子生物学的技術によってある点で結合されたまたは製造された核酸配列で構成された分子を指す。タンパク質またはポリペプチドに関して作られた場合の用語組換えとは、分子生物学的技術によって作成された組換え核酸構造体を使用して発現されるタンパク質またはポリペプチド分子を指す。遺伝子組成物に関して作られた場合の用語組換えとは、天然起源の親ゲノムでは生じなかった新しい組み合わせの対立遺伝子を有する配偶子または子孫または細胞またはゲノムを指す。組換え核酸構造体は、自然では連結しないもしくは自然では異なる位置で連結する核酸配列と、連結するまたは連結するよう操作される核酸配列を含み得る。そのため、核酸構造体を組換えと呼ぶことは、その核酸分子が、遺伝子工学を使用してヒトの介入により操作されたことを示す。核酸分子は、例えば、Itakura他、米国特許第4598049号Caruthers他、米国特許第4458066号ならびにItakura、米国特許第4401796号および第4373071号に開示されているものなどの技術を使用して化学合成することができる。このような合成核酸は、この用語が本明細書で使用される場合には、本質的に組換えである。配列間の相同性の程度は、配列間の完全な一致の発生率を意味する、配列を最適にアラインメントさせた場合の同一性の割合として表すことができる。同一性を比較するための配列の最適アラインメントは、SmithおよびWaterman、1981、AdvApplMath2482の局所相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch、1970、JMolBiol48443の相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman、1988、ProcNatlAcadSciUSA852444の類似性手法のための検索などの種々のアルゴリズムならびにこれらのアルゴリズムのコンピュータによる実行を使用して行うことができる。配列アラインメントはまた、Altschul他、1990、JMolBiol21540310に記載のBLASTアルゴリズムを使用して行うことができる。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターを通して入手可能である。BLASTアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントした際にいくつかの正の値の閾値スコアTに一致または適合する、クエリー配列中の長さWの短いワードを同定することによって、高スコア配列対を同定することを必要とする。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる。最初の隣接ワードヒットは、より長いHSPを発見するための検索を開始するための種として働く。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。以下のパラメータを満たす場合に、各方向でのワードヒットの延長は止まる累積アラインメントスコアが、その達成される最大値から量X減少する1つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積のために、累積スコアが0以下になるまたはいずれかの配列の末端に到達する。BLASTアルゴリズムパラメータW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。核酸については、BLASTプログラムは、デフォルトとして、11のワード長、50のBLOSUM62スコアリング行列アラインメント、10の期待値、M5、N4、および両鎖の比較を使用することができる。タンパク質の比較については、BLASTPは、デフォルトとして、以下のように使用することができるG11E1E10およびW3。BLOSUM行列は、関連するタンパク質内のコンセンサスブロック中に置換が生じることが知られている頻度に基づき、アラインメント中の各位置に確率スコアを割り当てる。BLOSUM62置換行列は、BLAST20でデフォルトにより使用される。BLOSUM62の代替として、PAM30PAM70BLOSUM80BLOSUM62およびBLOSUM45を含む種々の他の行列を使用することができる。BLASTアルゴリズムを使用した2つの配列間の統計的類似性の1つの尺度は、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じると思われる確率を示す、最小合計確率である。代替実施形態では、テスト配列の比較における最小合計確率が約1未満、約01未満、約001未満または約0001未満である場合に、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が実質的に同一であると考えられる。配列間の類似性はまた、同一性パーセントとして表すこともできる。本明細書に記載する核酸およびタンパク質配列は、いくつかの実施形態では、Asp3p、Gap1p、Gnp1p、Agp1p、Agp2p、Agp3p、Gat1p、Tor1p、Tor2p、Dip5p、Gln3p、Dal80p、Gzf3pもしくはUre2pアミノ酸配列またはASP3、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3、TOR1、TOR2、DIP5、GLN3、GAT1、DAL80、GZF3もしくはURE2核酸配列と実質的に同一であるなど、実質的に同一であり得る。このような配列の実質的同一性は、最適にアラインメントした場合の同一性の割合に反映され、これは、遺伝子標的化物質の場合に標的配列の一部と遺伝子標的化物質の一部の同一性を指し、例えば、50超、80~100、少なくとも80、少なくとも90または少なくとも95であり得る。ここで同一性の程度は、相同的対合および組換えおよびまたは修復を促進し得る。2つの核酸配列が実質的に同一であることの別の兆候は、2つの配列が中程度のストリンジェントな条件または高ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。中程度のストリンジェントな条件下でのフィルター結合配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、65°Cで05MNaHPO4、7ドデシル硫酸ナトリウム、1mMEDTA中および42°Cで02×SSC01SDS中での洗浄で行うことができる、1989、CurrentProtocolsinMolecularBiology、第1巻、GreenPublishingAssociatesInc、およびJohnWileySonsInc、ニューヨーク、2103頁参照。あるいは、高ストリンジェントな条件下でのフィルター結合配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、65°Cで05MNaHPO4、7SDS、1mMEDTA中および68°Cで01×SSC01SDS中での洗浄で行うことができる、1989、上記参照。ハイブリダイゼーション条件は、目的の配列に応じて既知の方法に従って修正することができる。一般的にストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびpHで、特定の配列についての熱融点よりも約5°C低くなるよう選択される。ストリンジェントハイブリダイゼーションのための洗浄は、例えば、少なくとも15分、30分、45分、60分、75分、90分、105分または120分とすることができる。そのペプチドの生物学的機能を実質的に変えることなく、Asp3p、Gap1p、Gnp1p、Agp1p、Agp2p、Agp3p、Gat1p、Tor1p、Tor2p、Dip5p、Gln3p、Dal80p、Gzf3pまたはUre2pなどのポリペプチドの構造にいくつかの修正および変更をして、生物学的に同等のポリペプチドを得ることができることが当技術分野で周知である。一態様では、アスパラギン輸送活性を有するタンパク質は、保存的アミノ酸置換により、天然のGap1p、Gnp1p、Dip5p、Agp1p、Agp2p、Agp3pまたは他のアミノ酸輸送体配列とは異なるタンパク質を含むことができる。同様に、アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質は、保存的アミノ酸置換により、天然のAsp3pまたは他の細胞壁アスパラギナーゼ配列とは異なるタンパク質を含むことができる。本明細書で使用する場合、用語保存されたまたは保存的アミノ酸置換とは、タンパク質中の所与の位置でのあるアミノ酸と別のアミノ酸との置換を指し、ここでは置換は関連する機能の実質的喪失なしに行われ得る。このような変更を行う際、アミノ酸残基などの置換は、側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その大きさ、荷電、疎水性、親水性などに基づいて行うことができ、このような置換は、通例の試験によりタンパク質の機能に対する効果について分析することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基が、類似の親水性値を有する別のものに置換される保存されたアミノ酸置換を行うことができ、以下は、アミノ酸残基に割り当てられているTyrまたはProなどの約16のハイドロパシックインデックスを有するアミノ酸であり得るArgLysAspGluSerAsnGlnGlyProThrAlaHisCysMetValLeuIleTyrPheおよびTrp。代替実施形態では、アミノ酸残基が、類似のハイドロパシックインデックスを有する別のものに置換される保存されたアミノ酸置換を行うことができる。このような実施形態では、各アミノ酸残基に、以下のように、その疎水性および荷電特性に基づいてハイドロパシックインデックスを割り当てることがでるIleValLeuPheCysMetAlaGlyThrSerTrpTyrProHisGluGlnAspAsnLysおよびArg。代替実施形態では、アミノ酸残基が同じクラスの別のものに置換される保存されたアミノ酸置換を行うことができ、ここではアミノ酸は、以下のように非極性、酸性、塩基性および中性のクラスに分けられる非極性Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met酸性Asp、Glu塩基性Lys、Arg、His中性Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr。代替実施形態では、保存的アミノ酸変化は、親水性もしくは疎水性、大きさもしくは体積、または荷電の考察に基づく変化を含む。アミノ酸は、一般的に、主にアミノ酸側鎖の特性に応じて、疎水性または親水性として特徴づけることができる。Eisenberg他の規格化したコンセンサス疎水性等級に基づいて、疎水性アミノ酸は、0を超える疎水性を示し、親水性アミノ酸は、0未満の親水性を示す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸には、Gly、Ala、Phe、Val、Leu、Ile、Pro、MetおよびTrpが含まれ、遺伝的にコードされた親水性アミノ酸には、Thr、His、Glu、Gln、Asp、Arg、SerおよびLysが含まれる。遺伝的にコードされていない疎水性アミノ酸には、tブチルアラニンが含まれ、遺伝的にコードされていない親水性アミノ酸には、シトルリンおよびホモシステインが含まれる。疎水性または親水性アミノ酸は、その側鎖の特性に基づいてさらに細分することができる。例えば、芳香族アミノ酸は、側鎖が少なくとも1個の芳香環もしくは芳香族複素環を含む疎水性アミノ酸であり、OH、SH、CN、F、Cl、Br、I、NO2、NO、NH2、NHR、NRR、CR、COH、COR、CNH2、CNHR、CNRR等アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アルカリール、置換アルカリール、5~20員ヘテロアリール、置換5~20員ヘテロアリール、6~26員アルクヘテロアリールまたは置換6~26員アルクヘテロアリールであるなどの1個または複数個の置換基を含むことができる。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸には、Phe、TyrおよびTrpが含まれる。無極性アミノ酸は、生理学的pHで荷電しておらず、2個の原子により共通に共有されている電子対が、一般的に2個の原子の各々により等しく保持されている結合を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた無極性アミノ酸には、Gly、Leu、Val、Ile、AlaおよびMetが含まれる。無極性アミノ酸は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸である脂肪族アミノ酸を含むようさらに細分することができる。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸には、Ala、Leu、ValおよびIleが含まれる。極性アミノ酸は、生理学的pHで荷電していないが、2個の原子により共通に共有されている電子対が、原子の一方により、より密接に保持されている、一結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた極性アミノ酸には、Ser、Thr、AsnおよびGlnが含まれる。酸性アミノ酸は、7未満の側鎖pKa値を有する親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失のために生理学的pHで負荷電側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸には、AspおよびGluが含まれる。塩基性アミノ酸は、7を超える側鎖pKa値を有する親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合のために生理学的pHで正荷電側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸には、Arg、LysおよびHisが含まれる。上記分類は絶対的なものではないこと、およびアミノ酸を、2つ以上のカテゴリーに分類することができることが当業者により認識されるだろう。さらに、アミノ酸を、既知の挙動および特定の分析に基づく特徴的な化学的、物理的もしくは生物学的特性に基づいて、あるいは以前同定したアミノ酸と比較して分類することができる。微生物は、それらだけに限らないが、真菌およびまたは細菌を含む、食品製品中への添加に適した任意の微生物であり得る。本開示中の有用な真菌には、それらだけに限らないが、クロコウジカビ、コウジカビ、アカパンカビ、ニューロスポラインターメディア変種オンコメンシス、ペニシリウムカマンベルティ、ペニシリウムカンディダム、ペニシリウムロックフォルティ、リゾプスオリゴスポラス、リゾプスオリザエが含まれる。別の実施形態では、真菌は、出芽酵母、サッカロマイセスバヤヌス、サッカロマイセスカールスベルゲンシス、カンジダアルビカンス、カンジダケフィル、カンジダトロピカリス、クリプトコッカスラウレンティ、クリプトコッカスネオフォルマンス、ハンセヌラアノマラ、ハンセヌラポリモルファ、クルイベロマイセスフラジリス、クルイベロマイセスラクティス、クルイベロマイセスマルシアヌス変種ラクティス、ピキアパストリス、ロドトルラルブラ、分裂酵母、ヤロウイアリポリティカまたは菌界に属する任意の株などの酵母である。LallemandInc、ABMauriおよびLesaffreなどの、酵母株のための種々の商業的供給源が存在する。別の実施形態では、細菌は、エルウィニア属の種、乳酸桿菌属の種、ラクトコッカス属の種、バチルス属の種、ペディオコッカス属の種、シュードモナス属の種、ブレビバクテリウム属の種およびロイコノストック属の種を含む任意の細菌であり得る。一実施形態では、微生物は、不活性酵母などの不活性である。本明細書で使用する用語不活性とは、その栄養含量および他の特性をまだ保持している不活性の、生存不能のおよびまたは死んだ微生物の組成物を指す。例えば、酵母を、所望のタンパク質の過剰発現を可能にする条件下で培養することができる。次いで、この酵母を使用して、例えば、それだけに限らないが、高温短時間殺菌を含む種々の殺菌法、それだけに限らないが、湿性加熱照射を含む種々の滅菌法、それだけに限らないが、高圧、光触媒およびパルス光、光増感、RFおよびパルス化を含む電界、細胞破砕、超音波処理、均質化、自己融解、ならびにそれだけに限らないが、ホルムアルデヒド、チメロサール、クロラミン、二酸化塩素、ヨウ素、銀、銅、抗生物質およびオゾンを含む化学的不活性化を含む種々の不活性化法を通して不活性酵母を産生することができる。組換え核酸構造体は、例えば、形質転換により微生物宿主細胞に導入することができる。このような組換え核酸構造体は、単離され、宿主種の細胞に再導入された、同じ宿主細胞種または異なる宿主細胞種由来の配列を含むことができる。組換え核酸配列は、宿主細胞の最初の形質転換の結果としてあるいは後の組換えおよびまたは修復事象の結果として、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。あるいは、組換え配列は、染色体外因子として維持され得る。このような配列は、例えば、突然変異、集団交配またはプロトプラスト融合により実行される株改良手段のための開始株として、形質転換酵母株などの生物を使用することにより複製することができる。本発明の組換え配列を保存する得られた株は、その用語が本明細書で使用される場合、それ自体組換えと考えられる。形質転換は、細胞により運ばれる遺伝物質が、1種または複数の外因性核酸の細胞への組込みにより変えられる過程である。例えば、酵母は、種々のプロトコルを使用して形質転換することができる。このような形質転換は、細胞の遺伝物質への外因性核酸の組込みにより、または外因性核酸への細胞の曝露の結果として生じる細胞の内因性遺伝物質の変化によって起こり得る。形質転換体または形質転換細胞は、外因性核酸の取り込みを通して機能的に強化された細胞または細胞の子孫である。これらの用語を本明細書で使用する場合、これらの用語は、その後の世代の細胞中にも存在し得る他の突然変異または変化にかかわりなく、その後の細胞世代を通して所望の遺伝子変異が保存された、形質転換細胞の子孫に適用する。一実施形態では、ポリペプチドの制御された発現を媒介する異種性プロモーター配列の制御下で、アスパラギナーゼもしくはアミノ酸輸送体もしくは正のNCR制御因子もしくは突然変異による負のNCR制御因子コード配列またはこれらの相同体を有する組換え核酸分子を含むベクターを提供することができる。このようなベクターを提供するため、オープンリーディングフレーム、例えば、宿主微生物由来のものを、発現カセットを含むプラスミドに挿入することができ、これが組換え遺伝子の発現を制御するだろう。あるいは、核酸分子は、負のNCR制御因子を欠失させるための欠失カセットであり得る。組換え分子を選択された微生物に導入して、アスパラギン輸送および分解活性が変化した形質転換株を提供することができる。代替実施形態では、宿主中の天然のアスパラギナーゼもしくはアミノ酸輸送体もしくはNCR制御因子コード配列または相同体の発現を、天然のプロモーターを別のプロモーターに置換することにより行うこともできる。内因性コード配列を利用して、追加の制御因子を使用して、組換え発現カセットを構築することもできる。組換え遺伝子または発現カセットを、宿主の染色体DNAに組み込むことができる。一実施形態では、微生物は、食品調製加工条件下でアスパラギンを絶えず分解するおよびまたは取り込むよう形質転換される。例えば、核酸分子は、恒常的活性型プロモーターと作動可能に連結され得る。恒常的活性型プロモーターは当技術分野で既知であり、それだけに限らないが、PGK1プロモーター、TEFプロモーター、短縮型HXT7プロモーターを含む。あるいは、核酸分子は、ADH1、GAL1、CUP1、PYK1またはCaMV35Sなどの窒素異化抑制を受けないプロモーターと作動可能に連結され得る。本明細書で使用する用語プロモーターとは、転写制御領域が目的の配列と作動可能に連結している場合に、所望の空間もしくは時間パターンでかつ所望の程度に目的のヌクレオチド配列の転写を媒介または調節することができるヌクレオチド配列を指す。目的の転写制御領域および配列は、転写制御領域により媒介または調節される目的の配列の転写を可能にするためにこれらの配列が機能的に連結されている場合、操作可能または作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、操作可能に連結するために、転写制御領域は、目的の配列と同じ鎖上に位置することができる。転写制御領域は、いくつかの実施形態では、目的の配列の5に位置することができる。このような実施形態では、転写制御領域は、直接目的の配列の5に存在してもよいし、これらの領域の間に介在配列が存在してもよい。転写制御配列は、いくつかの実施形態では、目的の配列の3に位置することができる。転写制御領域および目的の配列の操作可能な連結は、転写制御領域に結合するための適当な分子を必要とし得るので、本開示は、インビボまたはインビトロのいずれかでこのような分子が提供される実施形態を包含する。使用するためのプロモーターには、それだけに限らないが、PGK1プロモーターなどの適当な天然の出芽酵母プロモーターから選択されるものが含まれる。このようなプロモーターは、PGK1ターミネーターなどの追加の制御因子と共に使用することができる。種々の天然のまたは組換えのプロモーターを使用することができ、ここでプロモーターは、食品調製加工条件などの選択された条件下で、Asp3p活性などのアスパラギン分解活性の発現を媒介するよう選択または構築される。種々の恒常的プロモーターは、例えば、コード配列と作動可能に連結され得る。一実施形態では、核酸分子は、LEU2遺伝子座に挿入されるASP3またはGNP1またはAGP2またはAGP3またはGAT1遺伝子カセットを含む。別の実施形態では、核酸分子は、URA3遺伝子座に挿入されるGAP1またはAGP1またはASP3カセットを含む。別の実施形態では、核酸分子は、URE2遺伝子座に挿入されるure2Δカセットを含む。方法別の態様では、本明細書に記載する微生物を、調製または加工条件下で食品に添加する工程を含み、前記微生物が、窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって前記食品製品中のアスパラギンを減少させる、食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる方法が提供される。本明細書ではまた、食品調製または加工条件中にアスパラギンを減少させるための本明細書に開示する微生物の使用も提供される。別の実施形態では、a窒素異化抑制を減少させるならびにあるいはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびまたはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する少なくとも1つの核酸分子により微生物を形質転換する工程と、b前記微生物を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程とを含み、前記微生物が、窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによってアスパラギンを減少させる、食品調製または加工中にアスパラギンを減少させる方法が提供される。アスパラギンは、食品調製または加工中にアクリルアミドを産生する反応の律速的前駆物質である。したがって、別の実施形態では、本明細書に記載する微生物を、調製または加工条件下で食品に添加する工程を含み、前記微生物が、窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品製品中のアクリルアミドを減少させる、食品製品中のアクリルアミドを減少させる方法が提供される。本明細書ではまた、食品調製または加工条件中にアクリルアミド濃度を減少させるための本明細書に開示する微生物の使用も提供される。別の実施形態では、a窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する、少なくとも1つの核酸分子により微生物を形質転換する工程と、b前記微生物を、食品調製または加工条件下で食品に添加する工程とを含み、窒素異化抑制を減少させ、かつまたはアスパラギン分解に関与する細胞外タンパク質をコードする遺伝子およびもしくはアスパラギン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、それによって食品製品中のアクリルアミドを減少させる、食品製品中のアクリルアミドを減少させる方法が提供される。一実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載する細胞壁アスパラギナーゼをコードし、食品調製または加工条件下で、微生物は、例えば、恒常的発現によりアスパラギナーゼを発現する。別の実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載するアミノ酸輸送体をコードし、食品調製または加工条件下で、例えば、恒常的発現によりアミノ酸輸送体を発現する。別の実施形態では、核酸分子は、細胞壁アスパラギナーゼおよびアミノ酸輸送体の両方をコードする。さらに別の実施形態では、核酸は、本明細書に記載する窒素異化抑制の制御因子を改変し、食品調製または加工条件下で制御因子を発現せず、結果として高窒素源の存在下でNCR感受性遺伝子が発現する。さらに別の実施形態では、形質転換後、微生物は、所望のタンパク質の過剰発現を可能にする条件下で培養され、次いで、微生物は、不活性化され、食品調製または加工条件下で食品に添加するために処理される。このような実施形態では、不活性微生物中のタンパク質は、アスパラギン分解活性を有しており、それによって食品製品中のアクリルアミドが減少する。一実施形態では、食品調製または加工条件は、発酵を含む。例えば、本明細書中の方法および使用は、それだけに限らないが、製パン中の炭水化物、ジャガイモ加工、ビスケット製造、コーヒー製造またはスナック食品製造を含む食品製品の発酵に有用である。別の実施形態では、本開示は、食品調製および加工条件下で所望のレベルのアスパラギン分解活性を有する発酵微生物の天然の突然変異体を選択する方法を提供する。例えば、ASP3、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3、TOR1、TOR2、DIP5、GLN3、GAT1、DAL80、GZF3またはURE2などの、アミノ酸輸送体または細胞壁アスパラギナーゼのNCRを欠く株を選択することができる。酵母のための突然変異および選択プロトコルの例については、参照により本明細書に組み込まれている、2000年10月31日にMortimer他に交付された米国特許第6140108号を参照されたい。このような方法では、酵母株を、塩基対置換により突然変異体を産生するエチルメタンスルホン酸、亜硝酸またはヒドロキシルアミンなどの突然変異原で処理することができる。アスパラギン分解活性が変化した突然変異体は、例えば、適当な培地に蒔くことによりスクリーニングすることができる。別の実施形態では、部位特異的変異誘発を使用して、宿主のアスパラギン輸送またはアスパラギン分解活性のレベルを変えることができる。例えば、部位特異的変異誘発を使用して、酵母AGP1、ASP3、GAP1、DIP5、GAT1、TOR2、DAL80またはGZF3プロモーターなどのプロモーターからNCR媒介エレメントを除去することができる。例えば、それぞれ配列番号23~28、35および36に示す天然のAGP1、ASP3、GAP1、DIP5、GAT1、TOR2、DAL80またはGZF3プロモーター配列中のGATAAボックスを、置換により欠失させるまたは改変することができる。一実施形態では、例えば、GをTで置換して、配列がTATAAになるようにGATAAボックスの1つまたは全てを改変することができる。部位特異的変異誘発の方法は、例えば、Rothstein、1991SimonおよびMoore、1987Winzeler他、1999ならびにNegritto他、1997に開示されている。次いで、NCRを欠く選択されたまたは設計されたプロモーターを、アスパラギナーゼまたはアミノ酸輸送体コード配列と作動可能に連結させて、食品調製および加工条件下でのタンパク質の発現を媒介することができる。代替実施形態では、出芽酵母でNCRを媒介するGln3p、Gat1p、Ure2p、Tor12p、Dal80pまたはGzf3pをコードする遺伝子を突然変異させてNCRを調節することもできる。微生物株の相対的アスパラギン輸送または分解酵素活性は、非形質転換親株に対して測定することができる。例えば、形質転換株は、食品調製および加工条件下で親株よりも高いアスパラギン輸送または分解活性、あるいは親株活性の少なくとも150、200、250、300、400または500などの、同じ発酵条件下で親株活性のいくらか高い割合である活性を有するよう選択することができる。同様に、本開示の組換え核酸により発現またはコードされる酵素の活性は、類似の倍数の活性を使用して、それらが得られる非組換え配列に対して測定することができる。本明細書に記載する方法および使用の実施形態では、微生物は、それだけに限らないが、真菌およびまたは細菌を含む、食品製品中への添加に適した任意の活性または不活性微生物である。本明細書に記載する場合、本方法および使用に有用な真菌には、それだけに限らないが、クロコウジカビ、コウジカビ、アカパンカビ、ニューロスポラインターメディア変種オンコメンシス、ペニシリウムカマンベルティ、ペニシリウムカンディダム、ペニシリウムロックフォルティ、リゾプスオリゴスポラス、リゾプスオリザエが含まれる。別の実施形態では、真菌は、出芽酵母、サッカロマイセスバヤヌス、サッカロマイセスカールスベルゲンシス、カンジダアルビカンス、カンジダケフィル、カンジダトロピカリス、クリプトコッカスラウレンティ、クリプトコッカスネオフォルマンス、ハンセヌラアノマラ、ハンセヌラポリモルファ、クルイベロマイセスフラジリス、クルイベロマイセスラクティス、クルイベロマイセスマルシアヌス変種ラクティス、ピキアパストリス、ロドトルラルブラ、分裂酵母、ヤロウイアリポリティカまたは菌界に属する任意の株などの酵母である。細菌は、エルウィニア属の種、乳酸桿菌属の種、ラクトコッカス属の種、バチルス属の種、ペディオコッカス属の種、シュードモナス属の種、ブレビバクテリウム属の種およびロイコノストック属の種を含む任意の細菌であり得る。食品製品さらに別の態様では、本開示は、本明細書に開示する形質転換微生物を使用して製造される、アクリルアミド濃度が減少した食品製品を提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示する方法を使用して製造される、アクリルアミド濃度が減少した食品製品を提供する。食品製品は、アスパラギン産生および最終的にはアクリルアミド産生をもたらす調製または加工条件下で製造される任意の食品製品であり得る。アクリルアミド産生をもたらす典型的な調製および加工条件には、高調理温度を伴う調製が含まれ、それだけに限らないが、フライおよびベーキング、トースト、ばい焼、グリル、蒸し煮および網焼きが含まれる。アクリルアミドは、典型的には、ジャガイモ製品、ベーカリー製品および任意のシリアルもしくは穀物製品も参照中に高濃度で見出される。したがって、一実施形態では、食品製品は、ジャガイモ、タロイモなどの野菜、またはオリーブ製品、ベーカリー製品、またはシリアルもしくは穀物製品である。ジャガイモ製品には、それだけに限らないが、フライドポテト、ポテトチップス、フライドベークドポテトスナックおよび形成されたジャガイモ製品が含まれる。ベーカリー製品には、それだけに限らないが、ビスケット、クッキー、クラッカー、パン、無発酵パン製品、バッター製品、トウモロコシおよび小麦粉のトルティーヤ、ペーストリー、パイ皮、ケーキおよびマフィンミックス、ならびにペーストリー生地が含まれる。例えば、パンには、それだけに限らないが、出来たてのおよび冷凍のパンならびに生地、発酵生地、ピザ生地、バンズおよびロールパンおよび種々のパン、ならびにフライドもしくはベークドスナックまたはパン粉などの関連するパン製品が含まれペーストリーには、それだけに限らないが、甘いバンズ、ドーナッツおよびケーキが含まれる。シリアルもしくは穀物製品には、それだけに限らないが、典型的な朝食シリアル、ビール麦芽および乳清製品、コーンチップス、ならびにプレッツェルが含まれる。高温で加工される他の食品には、それだけに限らないが、コーヒー、ローストナッツ、ローストアスパラガス、ビール、麦芽および乳清飲料、チョコレート粉末、魚類製品、肉および家禽製品、オニオンスープおよびディップミックス、ナッツバター、コーティングされたピーナッツ、大豆炒り豆、ローストヒマワリ種子、ファラフェルおよびキッベなどのフライドまたはベークド食品、ならびにチョコレートバーが含まれる。上記開示は、本開示を概括的に説明している。以下の特定の実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、例示のためのみに記載され、本開示の範囲を限定することは意図されていない。状況を示唆または好都合にするように、形の変化および同等物の置換が意図される。本明細書で特定の用語を使用してきたが、このような用語は、説明的意味で意図されており、限定を目的としていない。以下の非限定的実施例は、本開示を説明するものである。出芽酵母の株におけるASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3およびGAT1遺伝子のクローニングおよび恒常的発現ならびにURE2、TOR1、DAL80およびGZF3の欠失クローン選択のために、抗生物質耐性マーカーkanMXを使用した。工業用市販のパン酵母または実験室株を形質転換させて、ASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3もしくはGAT1またはASP3とGAP1の組み合わせもしくはASP3とGAT1の組み合わせを恒常的に発現させた、あるいはURE2、TOR1、DAL80もしくはGZF3遺伝子を欠失させた、またはtor1Δと、ASP3の過剰発現の組み合わせを有するようにした。唯一の遺伝子および代謝改変は、ASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3もしくはGAT1、またはASP3とGAP1の組み合わせもしくはASP3とGAT1の組み合わせの意図した恒常的発現であった、あるいはURE2、TOR1、DAL80およびGZF3遺伝子を欠失させた、またはtor1Δと、ASP3の過剰発現の組み合わせを有するようにした。ASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3もしくはGAT1遺伝子カセットまたはURE2欠失遺伝子カセットによる酵母の形質転換PGK1プロモーターおよびターミネーターシグナルの制御下でASP3、ASP1、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3もしくはGAT1遺伝子を含む組換え核酸により酵母を形質転換した。PGK1プロモーターはNCRを受けない。URE2欠失カセットは、標的となる遺伝子欠失のための5および3URE2フランキング配列を含んでいた。選択マーカーの除去を可能にするセルフクローニングカセット図1~8は、以下に記載するこの実施例で使用される直接反復配列の組換えを通して、設計した遺伝子カセットが形質転換酵母の選択およびその後の抗生物質耐性マーカーの除去をどのように可能にするかを説明している。ASP1セルフクローニングカセットを、他の実施例について説明したのと類似の方法で構築し、形質転換し、抗生物質耐性マーカーを除去した。アクリルアミドまたは律速的前駆物質アスパラギンの減少の発生を確立するためのセルフクローニング酵母を使用したアスパラギンおよびアクリルアミド減少試験図11~20は、ASP3、GAP1、GNP1、AGP1、AGP2、AGP3もしくはGAT1またはASP3とGAP1の組み合わせもしくはASP3とGAT1の組み合わせにより形質転換した、あるいはURE2、TOR1、DAL80もしくはGZF3遺伝子を欠失させた、またはtor1Δと、ASP3の過剰発現の組み合わせを有する酵母についての、アスパラギンおよびまたはアクリルアミドの有意な減少を示している。図11はまた、細胞質ASP1の過剰発現が、細胞壁結合型アスパラギナーゼをコードするASP3の過剰発現と比べて作用しないことを明らかに示している。ASP3、GAP1ASP3およびure2Δなどの形質転換株のいくつかを、パン生地中で試験した。形質転換株および市販のパン酵母対照株の両方を、2つの別々の発酵槽中で同時に培養し、生地試験のために翌日細胞を収集した。酵素分析を使用してアスパラギン消費を監視するために、アスパラギンを生地に添加した。いったん形質転換酵母を生地中に混合したら、アスパラギンレベルは直ちに減少し始めたことに気づいた対照的に、対照株を使用すると、アスパラギンの注目すべき減少は測定されなかった。生地を形成した後、アスパラギン濃度について試験するために、酵母の添加から定期的にサンプルを取り出した。最終的なパン製品中のアクリルアミド濃度を測定するために、これらの実験のいくつかからの生地も使用してベークドサンプルを調製した。この実験のアクリルアミドの結果は、図12および14に示されており、形質転換酵母株が、対照酵母サンプルよりも有意にアクリルアミドを減少させることを明らかにしている。この結果は、生地分析で見出されたアスパラギン減少と一致している。酵母のための環境条件がより高い水分含量を有することができるような工業用加工条件をシミュレートするために、形質転換酵母を液体培地中でも試験した。同細胞数の各株を、種々のレベルのアスパラギンを添加した複合培地または合成実験室培地を含む別々の試験管中に播種した。サンプルを定期的に取り出し、酵素キットを使用してまたはLCMSMSによりアスパラギン濃度を測定した。図16~20は、アスパラギン分解が強化された形質転換酵母株を示している。食品中のアクリルアミドを減少させるために、製造者は、製品の味覚、肌理および外観を損なうことなくその工程およびまたは製品パラメータを変化させる難題に直面する。例として、形質転換酵母および市販のパン酵母対照を使用して、種々のパンを作った。最終製品は、色、大きさまたは肌理において差異を示さなかった。重要なことには、パン中のアクリルアミド形成のこれらの有意な減少を達成するために、ベーキング工程のいかなる変更も要求されなかった。上記実施例のために使用した実験手順1pAC1ASP3、pAC1AGP1、pAC1AGP3、pAC1GNP1およびpAC1GAT1の構築ASP3、AGP1、GNP1およびGAT1を恒常的PGK1プロモーターおよびターミネーターシグナルの制御下におくために、ORFの各々をpAC1にクローニングした。その5末端中に構築したMlu1およびBmt1制限酵素部位を含んだプライマーを使用して、開始コドンから終止コドンまでの各ORFを、出芽酵母ゲノムDNAから増幅した。PCR、08アガロースゲル可視化およびPCRクリーンアップ後、PCR産物およびpAC1の両方をMlu1およびBmt1で消化した。消化したベクターを、再環状化を防ぐためにrAPiDアルカリホスファターゼで処理した後、挿入断片および脱リン酸化ベクターを室温で連結した連結混合物を使用して、DH5αコンピテント細胞を形質転換し、その後これを100μgmLアンピシリン補充LBプレート上で培養した。形質転換コロニーの無作為選択からのプラスミドを収集し、Mlu1およびBmt1で消化して、正確な大きさの挿入断片を有するプラスミドを同定した配列決定により、挿入断片がAGP1、AGP3、GNP1またはGAT1に相当することが確認された。2pAC2GAP1、pAC2AGP1およびpAC2ASP3の構築GAP1、AGP1およびASP3を恒常的PGK1プロモーターおよびターミネーターシグナルの制御下におくために、各ORFをpAC2にクローニングした。その5末端中に構築したMlu1およびBmt1制限酵素部位を含んだプライマーを使用して、開始コドンから終止コドンまでの各ORFを、出芽酵母ゲノムDNAから増幅した。PCR、08アガロースゲル可視化およびPCRクリーンアップ後、PCR産物およびpAC2の両方をMlu1およびBmt1で分解消化した。消化したベクターを、再環状化を防ぐためにrAPiDアルカリホスファターゼで処理した後、挿入断片および脱リン酸化ベクターを室温で連結した連結混合物を使用して、DH5αコンピテント細胞を形質転換し、その後これを100μgmLアンピシリン補充LBプレート上で培養した。形質転換コロニーの無作為選択からのプラスミドを収集し、Mlu1およびBmt1で消化して、正確な大きさの挿入断片を有するプラスミドを同定した配列決定により、挿入断片がGAP1、AGP1またはASP3に相当することが確認された。3ure2Δカセットの構築DNA合成によりure2Δカセットを完成させた。4線状カセットの出芽酵母株への形質転換および形質転換体の選択Swa1を使用して各カセットを適当なプラスミドから切断し、08アガロースゲル上で可視化した。ゲルから予想バンドサイズを分割および抽出した。抽出、クリーンアップおよび定量化後、500ngの線状カセットを使用して、出芽酵母株を形質転換した。酢酸リチウムポリエチレングリコールssDNA法を使用して酵母株を形質転換した。形質転換後、500μgmLG418を補充したYPDプレート上に蒔く前に、細胞を30°Cで3時間、YEG中で回復させた。コロニーが現れるまで、プレートを30°Cでインキュベートした。5線状ure2Δカセットの出芽酵母への形質転換および形質転換体の選択Pme1を使用して3149bpのure2ΔカセットをpMrGure2Δから切断し、08アガロースゲル上で可視化した。ゲルから予想3149bpバンドを分割および抽出した。抽出、クリーンアップおよび定量化後、500ngの線状カセットを使用して、出芽酵母株PDMを形質転換した。酢酸リチウムポリエチレングリコールssDNA法を使用して酵母株を形質転換した。形質転換後、500μgmLのG418を補充したYPDプレート上に蒔く前に、細胞を30°Cで3時間、YEG中で回復させた。コロニーが現れるまで、プレートを30°Cでインキュベートした。試験のいくつかを完了するために、tor1Δ、dal80Δ、gzf3Δおよびure2Δについての欠失突然変異実験室酵母株も市販の供給源から得た。6アスパラギンおよびアクリルアミド減少試験以下の成分で、全粒粉パン生地を調製した全粒粉、グルテン粉、塩、植物油、糖蜜、水および酵母。方法は、ノータイム生地法の工程に厳密に従った。また、5時間の時点で、アクリルアミドデータを得るためにサンプルを加熱した。130°C冷凍庫中で液体窒素デュワーを冷却し、液体N2で充填する。2250mLメディアボトル中、Lアスパラギンを50mLの濾水に溶解する。3生地配合に添加する酵母の水分固形含量を測定する。4計算した量の酵母を200mLコニカルファルコンチューブに計り分ける。5添加する酵母により持ち込まれる水分含量を説明することにより、必要とされるRO水の量を決定する。上皿秤上の重量で必要とされる量のRO水を計り分ける。6残っているRO水の23と共に適当な量の酵母を再懸濁する。水洗に残っている13を使用する。7ミキシングボウルの重量を測定する。8乾燥成分をキッチンエイドミキシングボウル中に量り分ける。へらで20~30秒間乾燥成分を攪拌する。へら型アタッチメントをフックに変える。9ミキシングボウルに測定した植物油および糖蜜およびLアスパラギン溶液を添加する。生地が一様な硬さになるまで速度2で混合する。10タイマーを10分に設定する。11混合生地に酵母懸濁液を添加する。直ちにタイマーを開始し、速度2で混合する。酵母添加の時間12残っている水でファルコンチューブをすすぎ、リンスをミキシングボウルに添加する。1310分後にタイマーが鳴るまで混合し続ける。14ミキシングボウル生地の最終重量を計る。15直ちに生地を約10cmの厚さに伸ばし、円形のクッキー型を使用して実験のために適当な数の生地サンプルを切り抜く。1つの生地サンプルを素早く取り出し、ばらばらにし、次いで、液体窒素を乳鉢に注ぎ込んで生地小片を凍結させる。これをT15分サンプルとする。さらなる分析のために、凍結生地小片を、ラベルを付した50mLファルコンチューブ中80°Cで保管する。16残っている生地サンプルをクッキングシート上にのせ、30°Cでインキュベートする。17実験のために所望の時点で生地サンプルを取り出し、より小さい片に分解し、液体窒素で凍結する。凍結片を、ラベルを付した50mLファルコン中80°Cで保管する。18いくつかの実験については、T5時間で、追加のクッキーを取り出し、400°Fで20分間焼き、80°Cで保管する。標準的プロトコルに従って液体培地調製品を作り、種々の量のアスパラギンを添加した。同細胞数の各株を、無菌調製培地を含む別々の試験管中に播種し、サンプルを定期的にとった。酵素キットを使用してまたはLCMSMSにより、アスパラギン濃度を測定した。7アスパラギンおよびアクリルアミドの定量化アスパラギナーゼ活性を止めるために、予め調製した生地サンプルを、調製の時に液体窒素で処理した。次いで、サンプルをひき、分析まで80°Cで保管した。以下の修正を含むベーカリー製品のための抽出プロトコル後に、酵素分析を通して生地サンプル中のアスパラギンの分析を行った均質化した生地サンプルを、素早く秤量し、100mL容量フラスコに移した。酵素活性のあらゆる再発を防ぐために、約90mLの80°CMilliQH2Oを添加し、80°C水浴中で20分間サンプルをインキュベートした。次いで、サンプルを室温まで冷却させ、容積に希釈し、一定分量を分析のために遠心分離でスピンダウンした。実験室調製ベークドサンプル中のアクリルアミドを、ELISA法で分析した。パンサンプルをグラインダーで減らし、均質性も保証した。分析までサンプルを80°Cで保管した。2gのサンプルホモジネートを量り分け、水で30分間抽出した。次いで、サンプルを濾過し、遠心分離し、その後に固相抽出クリーンアップおよびアクリルアミド溶出した。次いで、抽出した分析物を、ELISAアッセイを通して分析した。LCMSMSによるアスパラギンについては、以下のパラメータを使用して、液体培地中で調製した細胞培養サンプルを分析した。2x250mmAquasilカラムならびに12MeOHおよび1mMギ酸アンモニウムからなる二成分移動相、モニタリングアスパラギンイオン変化1330→740および1330→870。001gLの濃度で同位体標識13Cアクリルアミドの内部標準を使用し、清澄化細胞培養上清に直接添加した。好ましい実施例であると現在考えられているものに関連して本開示を記載してきたが、本開示は、開示されている実施例に限定されないことを理解すべきである。逆に、本開示は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の修正および同等のアレンジを包含することが意図されている。全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願の各々が、その全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別的に示されているように、同程度にその全体が参照により本明細書に組み込まれている。参考文献