"表面プラズモン励起増強蛍光分光SPFS測定用流路において、フロー方向に対して上流に精製エリアを配置し、その下流にセンサエリアを配置することを特徴とするSPFS用センサチップ。上記センサエリアが、透明支持体と;該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と;該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜SAMと;該SAMの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と;該親水性高分子層の、該SAMとは接していないもう一方の表面に固定化された生理活性物質と;を含んでなるプラズモン励起センサの表面上に形成されている請求項1に記載のSPFS用センサチップ。上記精製エリアが、検体用精製エリアを含む請求項1または2に記載のSPFS用センサチップ。上記精製エリアが、検体用精製エリアおよび標識抗体用精製エリアを含む請求項1または2に記載のSPFS用センサチップ。上記検体用精製エリアが、透明支持体と;該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と;該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜SAMと;該SAMの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と;を含んでなるセンサ基板の表面上に形成されている請求項3または4に記載のSPFS用センサチップ。上記標識抗体用精製エリアが、透明支持体と;該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と;該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成されたSAMと;該SAMの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と;該親水性高分子層の、該SAMとは接していないもう一方の表面に固定化された生理活性物質と;を含んでなるプラズモン励起センサの表面上に形成されている請求項4に記載のSPFS用センサチップ。上記精製エリアが、検体用精製エリアおよび標識抗体用精製エリアを含み、上記標識抗体用精製エリアが、上記プラズモン励起センサの表面上に形成されている請求項2に記載のSPFS用センサチップ。透明支持体と;該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と;該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成されたSAMと;該SAMの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と;を含んでなるセンサ基板、および透明支持体と;該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と;該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成されたSAMと;該SAMの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と;該親水性高分子層の、該SAMとは接していないもう一方の表面に固定化された生理活性物質と;を含んでなるプラズモン励起センサを備え、該センサ基板に含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子と、該プラズモン励起センサに含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子とが異なっている請求項1~7のいずれか一項に記載のSPFS用センサチップ。上記精製エリアが、上記センサエリアから上流の流路すべてに配置されている請求項1~8のいずれか一項に記載のSPFS用センサチップ。少なくとも、下記工程a~eを含むことを特徴とするアッセイ法;工程a:検体を、請求項3~6のいずれか一項に記載の検体用精製エリアに接触させる工程,工程b:該工程aを経て得られた検体を、請求項1~8のいずれか一項に記載のセンサエリアに接触させる工程,工程c:請求項2および6~8のいずれか一項に記載のプラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを、該工程bを経たセンサエリアと反応させる工程,工程d:該工程cを経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程,ならびに工程e:該工程dで得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。さらに、下記工程xを含む請求項10に記載のアッセイ法;工程x:予め、上記コンジュゲートを、請求項4~7のいずれかに記載の標識抗体用精製エリアに接触させる工程。このような背景から、SPFSにおいても、センサエリア上の非特異吸着を防止する対策が極めて重要であると考えられる。そこで本発明は、SPFS測定において、アッセイシグナルの低下およびアッセイブランクの上昇を抑制することができるセンサエリアを提供することを目的とする。本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、検体に含まれる非特異吸着成分を、センサエリアと接触させる前に、検体用精製エリアと接触させて予め取り除くことができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明のSPFS用センサチップは、表面プラズモン励起増強蛍光分光SPFS測定用流路において、フロー方向に対して上流に精製エリアを配置し、その下流にセンサエリアを配置することを特徴とする。上記センサエリアは、透明支持体と;該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と;該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜SAMと;該SAMの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と;該親水性高分子層の、該SAMとは接していないもう一方の表面に固定化された生理活性物質と;を含んでなるプラズモン励起センサの表面上に形成されていることが好ましい。上記精製エリアは、検体用精製エリアを含むことが好ましく、該検体用精製エリアは、透明支持体と;該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と;該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜SAMと;該SAMの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と;を含んでなるセンサ基板の表面上に形成されていることが好ましい。上記精製エリアは、上記検体用精製エリアおよび標識抗体用精製エリアを含むことがより好ましく、該標識抗体用精製エリアは、上記プラズモン励起センサの表面上に形成されていることが好ましい。上記センサ基板に含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子と、上記プラズモン励起センサに含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子とが異なっていることがこのましい。上記精製エリアは、上記センサエリアから上流の流路すべてに配置されていてもよい。また、本発明のアッセイ法は、少なくとも、下記工程a~eを含むことを特徴とする。工程a:検体を、上記検体用精製エリアに接触させる工程,工程b:該工程aを経て得られた検体を、上記センサエリアに接触させる工程,工程c:上記プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを、該工程bを経たセンサエリアと反応させる工程,工程d:該工程cを経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程,および工程e:該工程dで得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。さらに、下記工程xを含むことが好ましい。工程x:予め、上記コンジュゲートを、上記標識抗体用精製エリアに接触させる工程。本発明は、SPFS測定において、アッセイシグナルの低下およびアッセイブランクの上昇を抑制することができる精製エリアとセンサエリアとの組み合わせを提供することができる。また、本発明は、リガンド夾雑物と蛍光色素とのコンジュゲートの混合物を精製しリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートの純度を高くすることができることから、さらにアッセイシグナルの低下およびアッセイブランクの上昇を抑制することができる精製エリアとセンサエリアとの組み合わせを提供することができる。次に、本発明のSPFS用センサチップおよびこれらを用いたアッセイ法について具体的に説明する。<SPFS用センサチップ>本発明のSPFS用センサチップは、表面プラズモン励起増強蛍光分光SPFS測定用流路において、フロー方向に対して上流に精製エリアを配置し、その下流にセンサエリアを配置することを特徴とする。すなわち、SPFS用センサチップは、フロー方向に対して順に精製エリアとセンサエリアとを直列に配置したものである。[センサエリア]本発明に用いられるセンサエリアは、透明支持体と;該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と;該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜SAMと;該SAMの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と;該親水性高分子層の、該SAMとは接していないもう一方の表面に固定化された生理活性物質と;を含んでなるプラズモン励起センサの表面上に形成されていることが好ましく、図1に示すように、精製された検体40、すなわち、濃縮されたアナライトを捕捉し、SPFS測定に供されるエリアである。透明支持体本発明で用いられる透明支持体としては、石英製やガラス製であっても、ポリカーボネートPC,シクロオレフィンポリマーCOPなどのプラスチック製であってもよく、屈折率ndが好ましくは1.40~2.20であり、厚さが好ましくは0.01~10mm、より好ましくは0.5~5mmであれば、大きさ縦×横は特に限定されない。なお、ガラス製の透明支持体は、市販品として、ショット日本株製のBK7屈折率nd152およびLaSFN9屈折率nd185,株住田光学ガラス製のK-PSFn3屈折率nd1.84,K-LaSFn17屈折率nd1.88およびK-LaSFn22屈折率nd1.90,株オハラ製のS-LAL10屈折率nd1.72などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。透明支持体は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および/またはプラズマにより洗浄することが好ましい。酸による洗浄処理としては、0.001~1Nの塩酸中に、1~3時間浸漬することが好ましい。プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナーヤマト科学株製のPDC200中に、0.1~30分間浸漬させる方法が挙げられる。金属薄膜上記透明支持体の一方の表面に形成された金属薄膜としては、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも1種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。なお、透明支持体としてガラス製平面基板を用いる場合に限り、ガラスと金属薄膜とをより強固に接着することができることから、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。透明支持体上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および/または金属薄膜を形成することが好ましい。金属薄膜の厚さとしては、金:5~500nm、銀:5~500nm、アルミニウム:5~500nm、銅:5~500nm、白金:5~500nm、およびそれらの合金:5~500nmが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、1~20nmが好ましい。電場増強効果の観点から、金:20~70nm、銀:20~70nm、アルミニウム:10~50nm、銅:20~70nm、白金:20~70nm、およびそれらの合金:10~70nmがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、1~3nmがより好ましい。金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ縦×横は特に限定されない。SAMSAMSelf-AssembledMonolayer;自己組織化単分子膜は、金属薄膜の透明支持体とは反対側の面に形成され、生理活性物質、好ましくは親水性高分子を金属薄膜に固定する際の土台としての役割を有する。本発明において、このSAMが含む単分子としては、通常、炭素原子数4~20程度のカルボキシアルカンチオール例えば、株同仁化学研究所、シグマアルドリッチジャパン株などから入手可能、特に好ましくは10-カルボキシ-1-デカンチオールが用いられる。炭素原子数4~20のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたSAMの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。SAMの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜がその表面に形成されたガラス製の透明支持体を、10-カルボキシ-1-デカンチオール株同仁化学研究所製を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、10-カルボキシ-1-デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金属薄膜の表面上で自己組織化し、SAMを形成する。親水性高分子層親水性高分子層は、SAMと生理活性物質との結合を介在するように設けることが好ましい。親水性高分子層を構成する親水性高分子は、多糖類としてカルボキシメチルデキストランCMD等のデキストランが、合成樹脂としてポリアクリル酸が好ましい。親水性高分子層をSAM表面に形成する方法としては、例えば、水溶性カルボジイミドである1-3-ジメチルアミノプロピル-3エチルカルボジイミドEDC単独またはEDCとN-ヒドロキシこはく酸イミドNHSとの併用によって、親水性高分子が有するカルボキシル基を活性化し、SAMが有するアミノ基と反応させる方法などが挙げられるが、本発明はこの方法に限定されず、公知の方法を適宜用いることができる。生理活性物質生理活性物質は、捕捉対象物質と特異的に結合するタンパク質であってもよく、例えば、抗原と特異的に結合する抗体のように、基質補酵素に対する酵素,ホルモンに対するレセプタ,抗体に対するプロテインAプロテインG,ビオチンに対するアビジン類,カルシウムに対するカルモジュリンなどが挙げられ、これらのうち、捕捉対象物質と特異的に結合するタンパク質としては抗体が好ましい。生理活性物質を固定化する方法は、公知の方法、例えば、EDC単独またはEDCとNHSとの併用によって、SAMまたは親水性高分子が有するカルボキシル基を活性化し、アミノ基を有する生理活性物質を固定化する方法などが挙げられる。好ましい生理活性物質としてタンパク質を用いる場合、該タンパク質が失活しない方法であれば、本発明はこれらに限定されない。[精製エリア]精製エリアは、検体用精製エリアを含むことが好ましく、検体用精製エリアおよび標識抗体用精製エリアの両方を含むことがより好ましい。また、精製エリアは、上記センサエリアから上流の流路すべてに配置することが好ましい。[検体用精製エリア]検体用精製エリアは、検体に含まれるアナライト以外の非特異吸着物質、所謂夾雑物を非特異的に吸着付着させるエリアであって、この精製エリアを通過した検体は夾雑物の一部好ましくは全部が除去されている。この非特異的吸着物質とは、例えば、アルブミンなどが挙げられ、アルブミンは検体用精製エリアに優先的に捕捉される。検体用精製エリアは、透明支持体と;該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と;該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜SAMと;該SAMの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と;を含んでなるセンサ基板の表面上に形成されていることが好ましい。すなわち、センサ基板検体用精製エリアは、親水性高分子層に生理活性物質を固定化しない上記プラズモン励起センサセンサエリアと同じ構成を有し、生理活性物質を固定化しない以外はプラズモン励起センサと同様の方法で作製することができる。また、プラズモン励起センサセンサエリアおよび標識抗体用精製エリアに含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子と、センサ基板検体用精製エリアに含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子とは異なっていても、同じであってもよい。異なっている場合、検体に含まれる種々の夾雑物のうちより多くの種類の夾雑物を非特異的に吸着付着でき、その結果アッセイシグナルの低下およびアッセイブランクの上昇をより抑制することができるため好ましい。[標識抗体用精製エリア]標識抗体用精製エリアは、例えば抗体などのリガンドや微量に含まれると考えられる種々の夾雑物非特異吸着物質抗体であってもアナライトを認識しない抗体などに蛍光色素を標識したコンジュゲートの混合物、すなわちリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートと夾雑物と蛍光色素とのコンジュゲートとの混合物のうち、夾雑物と蛍光色素とのコンジュゲートを非特異的に吸着付着させるエリアであって、この精製エリアを通過した該混合物は、主に標識抗体用精製エリアに吸着付着した夾雑物と蛍光色素とのコンジュゲートの一部好ましくは全部が取り除かれている。このような標識抗体用精製エリアは、上記プラズモン励起センサの表面上に形成されている、すなわち、標識抗体用精製エリアとセンサエリアとは同じ構成を有することが好ましい。標識抗体用精製エリアとセンサエリアとは同じ構成を有すると、図2に示すように、センサエリア50と同じ構成を有する標識抗体用精製エリア70を通過した標識抗体液60のうち、主に標識抗体用精製エリアに吸着付着した、夾雑物、すなわちアナライトに結合しない標識抗体や非特異吸着物質の一部好ましくは全部が取り除かれるから、センサエリア50を構成する各部分に夾雑物がほとんど結合せず、アッセイシグナルの低下およびアッセイブランクの上昇をより抑制することができるため好ましい。この場合、標識抗体用精製エリアはセンサエリアと同様にして作製することができる。標識抗体用精製エリアを用いる場合、流路として例えばY字形検体用精製エリアと標識抗体用精製エリアとが二股に分かれ、センサエリアに合流する形態のものを用いる態様であってもよく、一直線状の流路において、センサ基板検体用精製エリアを用いた後、流路からセンサ基板を外し、同じ個所にプラズモン励起センサ標識抗体用精製エリアを設置するような態様であってもよい。また、検体用精製エリアを通過させた検体と、標識抗体用精製エリアを通過させた標識抗体とを反応させる順序として、精製された検体をセンサエリアに通過した後に、精製された標識抗体をセンサエリアに通過させる態様が好ましい。<アッセイ法>本発明のアッセイ法は、少なくとも、下記工程a~eを含むことを特徴とし、洗浄工程、さらに下記工程xを含むことが好ましい。工程a:検体を、検体用精製エリアに接触させる工程,工程b:該工程aを経て得られた検体を、センサエリアに接触させる工程,工程c:プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを、該工程bを経たセンサエリアと反応させる工程,工程d:該工程cを経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程,および工程e:該工程dで得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。洗浄工程:上記工程bを経て得られたプラズモン励起センサの表面および/または上記工程cを経て得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程,ならびに工程x:予め、上記コンジュゲートを、標識抗体用精製エリアに接触させる工程。[工程a]工程aとは、検体を、検体用精製エリアに接触させる工程である。検体検体としては、例えば、血液血清血漿,尿,鼻孔液,唾液,便,体腔液髄液,腹水,胸水等などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液,血清,血漿,尿,鼻孔液および唾液が好ましい。接触接触は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、センサ基板の親水性高分子層が形成されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、検体用精製エリアと検体とを接触させる態様が好ましい。流路とは、上述のとおり角筒状または丸筒管状のものであって、センサ基板およびプラズモン励起センサ以下、これらをまとめてチップとする。を設置する個所近傍は角筒状構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は丸筒管状を有することが好ましい。その材料としては、チップ部または流路天板ではメチルメタクリレート,スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体;ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、薬液送達部ではシリコーンゴム,テフロン登録商標,ポリエチレン,ポリプロピレン等のポリマーを用いる。チップ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、チップ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に100nm~1mm程度が好ましい。流路にチップを固定する方法としては、小規模ロット実験室レベルでは、まず、チップの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ0.5mmを有するポリジメチルシロキサンPDMS製シートを該チップの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサンPDMS製シートとチップとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。工業的に製造される大規模ロット工場レベルでは、流路にチップを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に基板を形成、または別途作製した基板を固定し、その金属薄膜表面にSAMおよび親水性高分子層等を形成した後、流路天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。送液としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水PBS,トリス緩衝生理食塩水TBS,HEPES緩衝生理食塩水HBSなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常20~40°C×1~60分間、好ましくは37°C×5~15分間である。送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、100μg/mL~0.001pg/mLであってもよい。送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常0.001~20mL、好ましくは0.1~1mLである。送液の流速は、通常1~2000μL/min、好ましくは5~500μL/minである。[工程b]工程bとは、上記工程aを経て得られた検体を、センサエリアに接触させる工程である。上記工程aを経て得られた検体は、種々の夾雑物が検体用精製エリアすなわち、センサ基板の親水性高分子層やSAM,金属薄膜表面に非特異的に吸着付着したため、そのアナライト濃度が高くなっている。接触接触は、流路中に循環する送液にこのような検体が含まれ、プラズモン励起センサの第1のリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、センサエリアと該検体とを接触させる態様が好ましい。[洗浄工程]洗浄工程とは、上記工程bを経て得られたプラズモン励起センサの表面および/または下記工程cを経て得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程である。洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、工程bおよびcの反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に、Tween20,TritonX100などの界面活性剤を溶解させ、好ましくは0.00001~1重量含有するもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を10~500mM含有するものが望ましい。あるいは、低pHの緩衝液、例えば、10mMGlycineHClでpHが1.5~4.0のものであってもよい。洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程bの送液を循環させる温度および流速と同じであることが好ましい。洗浄液を循環させる時間は、通常0.5~180分間、好ましくは5~60分間である。[工程c]工程c:プラズモン励起センサに含まれるリガンド第1のリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンド第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを、上記工程b、好ましくは上記洗浄工程を経たセンサエリアと反応させる工程である。蛍光色素蛍光色素とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該蛍光は、燐光など各種の発光も含む。本発明で用いられる蛍光色素は、金属薄膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計monochromometerよりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークスシフトを有する蛍光色素が好ましい。このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセインファミリーの蛍光色素IntegratedDNATechnologies社製,ポリハロフルオレセインファミリーの蛍光色素アプライドバイオシステムズジャパン株製,ヘキサクロロフルオレセインファミリーの蛍光色素アプライドバイオシステムズジャパン株製,クマリンファミリーの蛍光色素インビトロジェン株製,ローダミンファミリーの蛍光色素GEヘルスケアバイオサイエンス株製,シアニンファミリーの蛍光色素,インドカルボシアニンファミリーの蛍光色素,オキサジンファミリーの蛍光色素,チアジンファミリーの蛍光色素,スクアラインファミリーの蛍光色素,キレート化ランタニドファミリーの蛍光色素,BODIPY登録商標ファミリーの蛍光色素インビトロジェン株製,ナフタレンスルホン酸ファミリーの蛍光色素,ピレンファミリーの蛍光色素,トリフェニルメタンファミリーの蛍光色素,AlexaFluor登録商標色素シリーズインビトロジェン株製などが挙げられ、さらに米国特許番号第6406297号、同第6221604号、同第5994063号、同第5808044号、同第5880287号、同第5556959号および同第5135717号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長nmおよび発光波長nmを表1に示す。また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、例えばEu,Tb等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光色素となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長310~340nm程度と発光波長Eu錯体で615nm付近、Tb錯体で545nm付近との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ATBTA-Eu3が挙げられる。本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属薄膜に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜として金を用いる場合には、金薄膜による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が600nm以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Cy5,AlexaFluor登録商標647等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属薄膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が400nm以上である蛍光色素を使用することが望ましい。これら蛍光色素は1種単独でも、2種以上併用してもよい。第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート本発明で用いられるセンサエリアに含まれるリガンド第1のリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンド第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートは、リガンドとして2次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト標的抗原を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。本発明のアッセイ法において、第2のリガンドは、アナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、上記第1のリガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第1のリガンドとして用いる1次抗体がポリクローナル抗体である場合、第2のリガンドとして用いる2次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該1次抗体がモノクローナル抗体である場合、2次抗体は、該1次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。さらに、検体中に含有されるアナライト標的抗原と競合する第2のアナライト競合抗原;ただし、標的抗原とは異なるものである。と2次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光信号蛍光シグナル量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートの作製方法としては、第2のリガンドとして2次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミドWSC例えば、1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩EDCなどとN-ヒドロキシコハク酸イミドNHSとにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と2次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法;イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する2次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法;スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する2次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法;ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する2次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法;ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された2次抗体あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された2次抗体とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。このように作製された第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートの送液中の濃度は、0001~10000μg/mLが好ましく、1~1000μg/mLがより好ましい。送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程bの場合と同様である。[工程x]工程xとは、予め、上記コンジュゲートを、標識抗体用精製エリアに接触させる工程である。すなわち、工程xとは、図2に示すように、標識抗体用精製エリア70に標識抗体液60を接触させることで標識抗体60に含まれる標識夾雑物を取り除く工程である。[工程d]工程dとは、上記工程c、好ましくは上記洗浄工程を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量をSPFS検出部により測定する工程である。光学系本発明のアッセイ法で用いる光源は、金属薄膜にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。レーザ光の照射により、全反射減衰条件ATRにおいて、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十~数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明支持体の屈折率、金属薄膜の金属種およびその膜厚に依存するが、通常、金では約10~20倍の増加量となる。蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態準位から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。レーザ光としては、例えば、波長200~900nm,0001~1000mWのLD;波長230~800nm金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。,0.01~100mWの半導体レーザなどが挙げられる。プリズムは、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明支持体と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、60度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述したガラス製の透明支持体の市販品と同様のものが挙げられる。光学フィルタとしては、例えば、減光NDフィルタ,偏光フィルタ,カットフィルタ,集光レンズ,ダイアフラムレンズなどが挙げられる。減光NDフィルタまたは、中性濃度フィルタは、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。偏光フィルタは、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるP偏光とするために用いられるものである。カットフィルタは、外光装置外の照明光,励起光励起光の透過成分,迷光各所での励起光の散乱成分,プラズモンの散乱光励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光などの光学ノイズ,および蛍光色素の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ,色フィルタなどが挙げられる。集光レンズは、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ例えば、株ニコン製またはオリンパス株製等を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、10~100倍が好ましい。SPFS検出部としては、超高感度の観点からは光電子増倍管PMT浜松ホトニクス株製のフォトマルチプライヤーが好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なCCDイメージセンサも好適である。[工程e]工程eとは、上記工程dで得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程である。より具体的には、工程eは、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のアナライト標的抗原量もしくは標的抗体量を測定シグナルから算出する工程である。アナライトアナライトとしては、第1のリガンドに特異的に認識されまたは、認識し結合し得る分子または分子断片であって、このような分子または分子断片としては、例えば、核酸一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA,RNA,ポリヌクレオチド,オリゴヌクレオチド,PNAペプチド核酸等,またはヌクレオシド,ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子,タンパク質ポリペプチド,オリゴペプチド等,アミノ酸修飾アミノ酸も含む。,糖質オリゴ糖,多糖類,糖鎖等,脂質,またはこれらの修飾分子,複合体などが挙げられ、具体的には、AFPαフェトプロテインなどのがん胎児性抗原や腫瘍マーカー,シグナル伝達物質,ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。アッセイシグナル変化量さらに、工程eは、上記工程bの前に測定したシグナルをブランクシグナル、としたとき、下記式で表されるアッセイシグナル変化量を算出することができる。シグナル変化量=|アッセイ蛍光シグナル-ブランク蛍光シグナル|次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。作製例1センサエリア標識抗体用精製エリアとして用いるプラズモン励起センサの作製:まず、屈折率nd1.72,厚さ1mmのガラス製の透明支持体株オハラ製のS-LAL10をプラズマ洗浄し、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは1~3nm,金薄膜の厚さは44~52nmであった。得られた支持体を、11-アミノ-1-ウンデカンチオールを1mM含むエタノール溶液に24時間以上浸漬し、金薄膜の片面にSAMを形成した。支持体を該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。この支持体表面に、N-ヒドロキシコハク酸イミドNHS0.5mMと、水溶性カルボジイミドEDC0.5mMと、CMD-500-06I4名糖産業株製:平均分子量50万,置換度0.511mgmlとを含む25mMのMES緩衝生理食塩水、および10mMのNaCl溶液pH6.0を0.8mL滴下し、90分間反応させた後、1N水酸化ナトリウム溶液を30分間反応させて、SAM上にCMDを固相化した。さらに、支持体表面に、NHS100mMと、EDC100mMを含む25mMのMES緩衝生理食塩水、および10mMのNaCl溶液を0.8mL滴下し、20分間反応させた後、抗αフェトプロテインAFPモノクローナル抗体1D5,50mg/mL;株日本医学臨床検査研究所製を含むMES溶液0.8mLを30分間反応させることで、CMD上に1次抗体を固相化した。次いで、50mMのTrispH7.40.8mLを15分間反応させることで、未反応の活性化エステル基をブロッキングし、1重量牛血清アルブミンBSAを含むTBS緩衝生理食塩水にて30分間反応させることで、非特異的吸着防止処理を行った。[作製例2]検体用精製エリアとして用いるセンサ基板の作製:抗αフェトプロテインAFPモノクローナル抗体1D5を含まないMESを用いた以外は作製例1と同様にして、支持体表面にCMDが固相化されたセンサ基板を作製した。[実施例1]工程a~eのアッセイ法の実施:はじめに、センサ基板作製例2の表面上に形成された検体用精製エリアを、Tween20を005重量含むTBS溶液0.8mLで3回洗浄した。工程aとして、0.1ngmlのAFPを添加した市販ウシ血漿コージンバイオ株製0.8mLを、検体用精製エリアに25分間接触させ、このウシ血漿中のCMD吸着成分を取り除いた。工程bとして、工程aを経て得られたウシ血漿検体0.8mLを、プラズモン励起センサ作製例1の表面上に形成されたセンサエリアに25分間接触させた。次いで、Tween20を005重量含むTBS溶液0.8mLで、センサエリアを3回洗浄した。工程cとして、AlexaFluor登録商標647を標識した2次抗体1μg/mLとなるように調製した1BSA/PBS溶液0.8mLを、センサエリアに添加し、20分間反応させた。その後、Tween20を005重量含むTBS溶液0.8mLで3回洗浄した。工程dとして、プラズモン励起センサに、ガラス製の透明支持体の金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムシグマ光機株製を経由してレーザ光633nm,10μWを照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を光電子増倍管PMTで測定したときのシグナル値を計測しアッセイ測定シグナルとした。なお、ウシ血漿中のCMD吸着成分を取り除いた溶液、すなわちAFPが0ng/mL時のSPFS測定シグナルをブランクシグナルとした。工程eとして、アッセイシグナルを以下の式で評価した。アッセイシグナル=|アッセイ測定シグナル-ブランクシグナル|得られた結果を図5に示す。実施例2工程x,a~eのアッセイ法の実施:はじめに、プラズモン励起センサ作製例1の表面上に形成された標識抗体用精製エリアを、Tween20を005重量含むTBS溶液0.8mLで3回洗浄した。工程xとして、Alexafluor登録商標647を標識した2次抗体1000ng/mLとなるように調製した1BSA/PBS溶液を、標識抗体用精製エリアに0.8mL添加し、20分間接触させた。反応液を回収し、精製標識抗体溶液とした。検体として、0.1ngmlのAFPを添加した1重量BSAを含むPBS溶液を用い、2次抗体を含有した溶液として、精製標識抗体溶液を用いた以外は実施例1と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を図6に示す。比較例1検体を精製しないアッセイ法の実施:未精製のウシ血漿を用いた以外は実施例1と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を図5に示す。比較例2抗体を精製しないアッセイ法の実施:検体として、0.1ngmlのAFPを添加した1重量BSAを含むPBS溶液を用いた以外は実施例1と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を図6に示す。"