"細胞における内因性細胞遺伝子の発現を阻害する方法であって、該方法は、以下の工程:該内因性細胞遺伝子における第1の標的部位を、第1のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここで該ジンクフィンガータンパク質のKdは、約25nM未満である工程であって;これにより少なくとも約20該内因性細胞遺伝子の発現を阻害する工程、を含む、方法。従って、本発明は、内因性細胞遺伝子の発現を調節する初めての方法を提供する。ここで、その内因性遺伝子は、細胞内で一過的に発現されている遺伝子とは対称的に、その天然のクロマチン環境下にあるか、ゲノム内に外因的に組込まれた遺伝子である。さらに、本発明は、発生的にサイレントな内因性遺伝子の初めての活性化を提供する。1つの好ましい実施態様において、調節方法は、約25nM未満のKdを有するZFPを使用して、遺伝子転写を活性化するかまたは抑制する。従って、本発明のZFPを使用して、20以上まで内因性細胞遺伝子の転写を抑制し得、そして約1.5倍以上まで内因性細胞遺伝子の転写を活性化するために使用し得る。1つの実施態様において、本発明は、細胞における内因性細胞遺伝子の発現を阻害する方法であって、この方法は、以下の工程:この内因性細胞遺伝子における第1の標的部位を、第1のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここでこのジンクフィンガータンパク質のKdは、約25nM未満である工程であって;これにより少なくとも約20この内因性細胞遺伝子の発現を阻害する工程、を含む、方法を提供する。1つの局面において、本発明は、細胞中の内因性細胞遺伝子の発現を阻害する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する:その内因性細胞遺伝子における第一の標的部位を第一のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここで、そのジンクフィンガータンパク質のKdは、約25nM未満である、工程であって;これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を少なくとも約20まで阻害する工程。別の局面において、本発明は、細胞中の内因性細胞遺伝子の発現を阻害する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する:その内因性細胞遺伝子における標的部位を6つのフィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここで、そのジンクフィンガータンパク質のKdは、約25nM未満である、工程であって;これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を少なくとも約20まで阻害する工程。1つの実施態様において、内因性細胞遺伝子の発現は、少なくとも約75~100まで阻害される。別の実施態様において、遺伝子発現の阻害は、遺伝子の活性化を妨げる。別の局面において、本発明は、内因性細胞遺伝子の発現を活性化する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する:その内因性細胞遺伝子における第一の標的部位を第一のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここで、そのジンクフィンガータンパク質のKdは、約25nM未満である、工程であって;これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を少なくとも約150まで活性化する工程。別の局面において、本発明は、内因性細胞遺伝子の発現を活性化する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する:その内因性細胞遺伝子における標的部位を6つのフィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここで、そのジンクフィンガータンパク質のKdは、約25nM未満である、工程であって;これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を少なくとも約150まで活性化する工程。1つの実施態様において、内因性細胞遺伝子の発現は、少なくとも約200~500に活性化される。別の実施態様において、遺伝子発現の活性化は、遺伝子発現の抑制を妨げる。別の局面において、本発明は、細胞中の内因性細胞遺伝子の発現を調節する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する:その内因性細胞遺伝子における第一の標的部位を第一のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、;これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を調節する工程。1つの実施態様において、ジンクフィンガータンパク質は、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのフィンガーを有する。別の局面において、本発明は、細胞中の内因性細胞遺伝子の発現を調節する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する:その内因性細胞遺伝子における標的部位を6つのフィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって;これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を調節する工程。1つの実施態様において、その接触工程は、その内因性細胞遺伝子における第二の標的部位を第二のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程をさらに包含する。別の実施態様において、第一の標的部位および第二の標的部位は隣接する。別の実施態様において、第一のジンクフィンガータンパク質および第二のジンクフィンガータンパク質は、共有結合される。別の実施態様において、第一のジンクフィンガータンパク質は、調節ドメインを含む融合タンパク質である。別の実施態様において、第一のジンクフィンガータンパク質は、少なくとも2つの調節ドメインを含む融合タンパク質である。別の実施態様において、第一および第二のジンクフィンガータンパク質は、融合タンパク質であり、各々は調節ドメインを含む。別の実施態様において、第一および第二のジンクフィンガータンパク質は、融合タンパク質であり、各々は少なくとも2つの調節ドメインを含む。1つの実施態様において、内因性細胞遺伝子は、以下からなる群より選択される;VEGF、EGα、IGF-I、c-myc、c-myb、ICAM、Her2/Neu、FAD2-1、EPO、GM-CSF、GDNFおよびLDL-R。別の実施態様において、内因性遺伝子は、発生的にサイレントであるか、さもなければ不活性な遺伝子である例えば、EPO、GATA、インターロイキンファミリータンパク質、GM-CSF,MyoD、ユートロフィンeutrophin、および胎児ヘモグロビンγおよび胎児ヘモグロビンδ。別の実施態様において、調節ドメインは、以下からなる群より選択される;転写リプレッサー、転写活性化因子、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼ。1つの実施態様において、細胞は、以下からなる群より選択される;動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生生物細胞、または真菌細胞。別の実施態様において、その細胞は、哺乳動物細胞である。別の実施態様において、その細胞は、ヒト細胞である。1つの実施態様において、その方法は、そのジンクフィンガータンパク質を含む送達ビヒクルをその細胞に最初に投与する工程をさらに含み、ここで、その送達ビヒクルは,リポソームまたは膜輸送translocationポリペプチドを含む。1つの実施態様において、そのジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されたジンクフィンガータンパク質核酸によりコードされ、そしてこの方法は、その核酸を脂質:核酸複合体で、または裸の核酸として細胞に最初に投与する工程をさらに包含する。別の実施態様において、そのジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されたジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによりコードされ、そしてこの方法は、その発現ベクターを細胞に最初に投与する工程をさらに包含する。別の実施態様において、その発現ベクターは、ウイルス発現ベクターである。別の実施態様において、その発現ベクターは、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、DNAプラスミド発現ベクター、またはAAV発現ベクターである。1つの実施態様において、そのジンクフィンガータンパク質は、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる。別の実施態様において、そのジンクフィンガータンパク質は、弱いプロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる。1つの実施態様において、その細胞は、約1.5×106コピー未満のジンクフィンガータンパク質を含む。1つの実施態様において、その標的部位は、その内因性細胞遺伝子の転写開始部位の上流である。別の実施態様において、その標的部位は、その内因性細胞遺伝子の転写開始部位に隣接する。別の実施態様において、その標的部位は、その内因性細胞遺伝子の転写開始部位の下流のRNAポリメラーゼ停止部位に隣接する。別の実施態様において、ジンクフィンガータンパク質は、SP-1骨格を含む。1つの実施態様において、ジンクフィンガータンパク質は、調節ドメインを含み、かつヒト化されている。別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで前記接触工程が、内因性細胞遺伝子における第2の標的部位を、第2のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程をさらに含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1の標的部位および第2の標的部位が隣接している、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1のジンクフィンガータンパク質および第2のジンクフィンガータンパク質が共有結合する、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が少なくとも2つの調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法をい提供する。別の実施態様において、本発明は、第1のジンクフィンガータンパク質および第2のジンクフィンガータンパク質が、それぞれ調節ドメインを含む、融合タンパク質である、請求項2に記載の方法。別の実施態様において、本発明は、上記第1のジンクフィンガータンパク質および第2のジンクフィンガータンパク質が、少なくとも2つの調節ドメインをそれぞれ含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞または真菌細胞からなる群から選択される、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞が哺乳動物細胞である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞がヒト細胞である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子の発現が少なくとも約75~100まで阻害される、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がVEGF、ERα、IGF-I、c-myc、c-myb、ICAMおよびHer2/Neuからなる群から選択される、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がVEGFである、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、遺伝子発現の上記阻害が遺伝子活性化を妨げる、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記調節ドメインが、転写リプレッサー、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼおよびヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここでこの方法が上記ジンクフィンガータンパク質を含む送達ビヒクルを上記細胞に最初に投与する工程をさらに含み、ここでこの送達ビヒクルは、リポソームまたは膜輸送ポリペプチドを含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記方法であって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸によりコードされ、かつここで、この方法は、脂質:核酸複合体でまたは裸の核酸として上記細胞にこの核酸を最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記記載の方法であって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによりコードされ、かつここで、この方法は、上記細胞にこの発現ベクターを最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、ウイルス性発現ベクターである、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、レトロウイルス性発現ベクター、アデノウイルス性発現ベクター、またはAAV発現ベクターである、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、弱いプロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞が上記ジンクフィンガータンパク質の約1.5×106未満のコピーを含む、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の上流である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位に隣接する、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の下流のRNAポリメラーゼ停止部位に隣接する、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、SP-1骨格を含む、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含み、かつヒト化されている、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、細胞における内因性細胞遺伝子の発現を阻害する方法であって、この方法は、以下の工程:この内因性細胞遺伝子における標的部位を、6フィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここでこのジンクフィンガータンパク質のKdは、約25nM未満である、工程であって;これにより少なくとも約20この内因性細胞遺伝子の発現を阻害する工程、を含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、内因性細胞遺伝子の発現を活性化する方法であって、この方法は、以下の工程:この内因性細胞遺伝子における第1の標的部位を、第1のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここでこのジンクフィンガータンパク質のKdは、約25nM未満である工程であって;これにより少なくとも約150までこの内因性細胞遺伝子の発現を活性化する工程、を含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子が、発生的にサイレントまたは不活性である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子が、EPO、GATA、ヘモグロビンγ、ヘモグロビンδ、インターロイキン、GM-CSF、エウトロフィンまたはMyoDである、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで上記接触工程が、上記内因性細胞遺伝子における第2の標的部位と、第2のジンクフィンガータンパク質を接触させる工程をさらに含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1の標的部位および第2の標的部位が隣接している、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1のジンクフィンガータンパク質および第2のジンクフィンガータンパク質が、共有結合する、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1のジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1のジンクフィンガータンパク質が少なくとも2つの調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1のジンクフィンガータンパク質および第2のジンクフィンガータンパク質が、それぞれ調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1のジンクフィンガータンパク質および第2のジンクフィンガータンパク質が、少なくとも2つの調節ドメインをそれぞれ含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞または真菌細胞からなる群から選択される、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞が哺乳動物細胞である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞がヒト細胞である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子の発現が少なくとも約200~500まで活性化される、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がFAD2-1、EPO、GM-CSF、GDNF、VEGFおよびLDL-Rからなる群から選択される、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がVEGFである、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、遺伝子発現の上記活性化が遺伝子発現の抑制を妨げる、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記調節ドメインが、転写活性化因子、またはヒストンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここでこの方法が上記ジンクフィンガータンパク質を含む送達ビヒクルを上記細胞に最初に投与する工程をさらに含み、ここでこの送達ビヒクルは、リポソームまたは膜輸送ポリペプチドを含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸によりコードされ、かつここで、この方法は、脂質:核酸複合体で、または裸の核酸として上記細胞にこの核酸を最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記の方法をであって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによりコードされ、かつここで、この方法は、上記細胞にこの発現ベクターを最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、ウイルス性発現ベクターである、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、またはAAV発現ベクターである、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、弱いプロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞がジンクフィンガータンパク質の約1.5×106コピー未満を含む、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の上流である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位に隣接する、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の下流のRNAポリメラーゼ停止部位に隣接する、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、SP-1骨格を含む、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含み、かつヒト化されている、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、内因性細胞遺伝子の発現を活性化する方法であって、この方法は、以下の工程:この内因性細胞遺伝子における標的部位を、6フィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここでこのジンクフィンガータンパク質のKdは、約25nM未満である工程であって;これにより少なくとも約150までこの内因性細胞遺伝子の発現を活性化する工程、を含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、細胞における内因性細胞遺伝子の発現を調節する方法であって、この方法は、以下の工程:この内因性細胞遺伝子における第1の標的部位を、第1のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって;これによりこの内因性細胞遺伝子の発現を調節する工程、を含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで上記接触工程が、上記内因性細胞遺伝子における第2の標的部位と第2のジンクフィンガータンパク質を接触させる工程をさらに含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1標的部位および第2標的部位が隣接している、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1のジンクフィンガータンパク質および第2のジンクフィンガータンパク質が、共有結合している、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、少なくとも2つの調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1のジンクフィンガータンパク質および第2のジンクフィンガータンパク質が、それぞれ調節ドメインを含む、融合タンパク質である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記第1のジンクフィンガータンパク質および第2のジンクフィンガータンパク質が、少なくとも2つの調節ドメインをそれぞれ含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞または真菌細胞からなる群から選択される、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞が哺乳動物細胞である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞がヒト細胞である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がVEGF、ERα、IGF-I、c-myc、c-myb、ICAM、Her2/Neu、FAD2-1、EPO、GM-CSF、GDNFおよびLDL-Rからなる群から選択される、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がVEGFである、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記調節ドメインが、転写リプレッサー、転写活性化因子、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼおよびヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここでこの方法が上記ジンクフィンガータンパク質を含む送達ビヒクルを上記細胞に最初に投与する工程をさらに含み、ここでこの送達ビヒクルは、リポソームまたは膜輸送ポリペプチドを含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸によりコードされ、かつここで、この方法は、脂質:核酸複合体で、または裸の核酸として上記細胞にこの核酸を最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによりコードされ、かつここで、この方法は、上記細胞にこの発現ベクターを最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、ウイルス発現ベクターである、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス性発現ベクター、またはAAV発現ベクターである、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、弱いプロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記細胞が上記ジンクフィンガータンパク質の約1.5×106コピー未満を含む、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の上流である、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位に隣接する、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の下流のRNAポリメラーゼ停止部位に隣接する、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、SP-1骨格を含む、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含み、かつヒト化されている、上記の方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、細胞において内因性細胞遺伝子の発現を調節する方法であって、この方法は、以下の工程:この内因性細胞遺伝子における標的部位を、6フィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって;これによりこの内因性細胞遺伝子の発現を調節する工程、を含む、方法を提供する。本発明により、内因性細胞遺伝子の発現を調節する初めての方法が提供される。導入本願は、ZEPを使用して、その天然のクロマチン環境下に存在する内因性細胞遺伝子の発現を調節し得ることを初めて実証する。従って、本発明は、高い効率で内因性細胞遺伝子を特異的に認識するよう操作されたジンクフィンガーDNA結合タンパク質を提供する。本明細書に記載される実験により、約10nM未満の標的部位親和性を有する3つのフィンガーのZEPVEGF1を使用して、内因性遺伝子の活性化を効果的に活性化または抑制し得ることが実証される。さらに、6つのフィンガーのZEPVEGF3a/1もまた、内因性遺伝子の活性を効果的に抑制することが示された。最後に、3つのフィンガーのZEPを使用して、内因性のEPO発生的に不活性な遺伝子を活性化し得る。好ましくは、本発明のZFPは、約100nM未満の、好ましくは、約50nM未満の、最も好ましくは、約25nM以下未満のKdで、それらの標的部位に対する高い親和性を示す。結果として、本発明のZFPを使用して、内因性遺伝子の転写の活性化および抑制の両方を通して、内因性遺伝子発現を調節し得る。ZFPをまた調節ドメインに連結し、キメラ転写因子を作製して、転写を活性化または抑制し得る。1つの好ましい実施態様において、調節の方法は、約25nM未満のKdを有するZFPを使用して、遺伝子の転写を活性化または抑制する。従って、本発明のZFPを使用して、20以上まで内因性細胞遺伝子の転写を抑制し得、そして約1.5倍以上まで内因性細胞遺伝子の転写を活性化し得る。このような遺伝子発現の調節の方法は、新規のヒトおよび哺乳動物の治療適用例えば、遺伝病、癌、真菌感染、原生生物感染、細菌感染、およびウイルス感染、虚血、血管疾患、関節炎、免疫学的障害などの処置を可能にし、そして機能的ゲノムアッセイについての方法および変化した表現型病害耐性、果実成熟、糖および油組成、収量、および色を含むを有する植物の開発のための方法。本明細書に記載のように、ZEPは、選り抜きの任意の内因性遺伝子発現の調節のための、任意の適切な標的を認識するよう設計され得る。調節に適切な内因性遺伝子の例としては、以下が挙げられる;VEGF,CCR5、ERα、Her2/Neu、Tat、Rev、HBVC、S、X,およびP,LDL-R、PEPCK、CYP7、フィブリノーゲン、ApoB、ApoE、Apoa、レニン、NF-κB、I-κB、TNF-α、FASリガンド、アミロイド前駆体タンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、ob-レプチン、ucp-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、G-CSF、GM-CSF、Epo、PDGF、PAF、p53、Rb、胎児ヘモグロビン、ジストロフィン、ユートロフィン、GDNF、NGF、IGF-1、VEGFレセプターfltおよびflk、トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、bcl-2、サイクリン、アンギオスタチン、IGF、ICAM-1、STATS、c-myc、c-myb、TH、PTI-1、ポリガラクツロナーゼ、EPSPシンターゼ、FAD2-1、Δ-12デサチュラーゼ、Δ―9デサチュラーゼ、Δ-15デサチュラーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシルACPチオエステラーゼ、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ、デンプン合成酵素、セルロースシンターゼ、スクロースシンターゼ、老化関連遺伝子、重金属キレート剤、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ、ウイルス遺伝子、原生生物遺伝子、真菌遺伝子、および細菌遺伝子。一般に、調節されるに適切な遺伝子は、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、分裂促進因子、走化因子、癌活性onco-active因子、レセプター、カリウムチャネル、G-タンパク質、シグナル伝達分子および他の疾患関連遺伝子を含む。好ましい発生的に不活性な遺伝子としては、EPO、GATA、インターロイキンファミリータンパク質、GM-CSF、MyoD、ユートロフィン、および胎児ヘモグロビンγおよびδが挙げられる。転写因子機能における一般的なテーマは、プロモーターに対する単純な結合および十分な近接が、一般に必要とされる全てのものであることである。プロモーターに対する正確な位置取り、方向、および限界内での距離は、ZFPによる発現調節にそれほど重要な事項でない。この特徴は、人工的な転写因子構築のための部位の選択において相当の柔軟性を可能にする。従って、ZEPにより認識される標的部位は、その標的遺伝子における任意の適切な部位であり得、これはZFP必要に応じて、調節ドメインに連結されるによる遺伝子発現の活性化または抑制を可能にする。好ましい標的部位は、転写開始部位に隣接する領域、転写開始部位の下流の領域、または転写開始部位の上流の領域を含む。さらに、標的部位はまた、エンハンサー領域、リプレッサー部位、RNAポリメラーゼ停止部位、および特定の調節部位例えば、SP-1部位、低酸素応答エレメント、核レセプター認識因子、p53結合部位に位置され得るか、cDNAコード領域中の部位であり得るか、または発現配列タグESTコード領域中の部位であり得る。以下に記載のように、代表的に各々のフィンガーは、2~4塩基対を認識し、2つのフィンガーのZFPは、4~7bpの標的部位に結合し、3つのフィンガーのZFPは6~10塩基対の部位に結合し、そして6つのフィンガーのZFPは、2つの隣接する標的部位各々の標的部位は、6~10塩基対を有するを認識する。本明細書中に記載されるように、2つのZFPは、細胞に投与され、同じ標的の内因性細胞遺伝子か、または異なる標的の内因性細胞遺伝子のいずれかを認識し得る。第1のZEPは、必要に応じて、共有結合的に、または非共有結合的ににいずれかで第2のZFPと結合する。結合したZEPまたは個々のZEPのいずれかによる隣接する標的部位の認識を使用して、ZFPの共同的な結合をもたらし、これは、それらの標的部位に個々に結合される場合ZFPの親和性よりも大きな親和性を生じる。一つの実施態様において、2つのZFPを、アミノ酸リンカーによって連結される融合タンパク質として産生し、そして生じた6つのフィンガーのZFPは、約18塩基対の標的部位を認識する例えば、Liuら、PNAS94;5525-55301997を参照のこと。18塩基対の標的部位は、ヒトゲノムにおける特異性を提供することが予測される。なぜなら、その大きさの標的部位は、3×1010塩基対毎にたった1度生じ、そしてヒトゲノムの大きさは3.5×109塩基対であるはずだからである例えば、Liuら、PNAS94;5525-55301997を参照のこと。別の実施態様において、ZFPは、ロイシンジッパー、STATタンパク質N末端ドメイン、またはFK506結合タンパク質を介して、非共有結合的に結合する例えば、O‘Shea、Science254:5391991、Barahmand-Pourら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.211:121-1281996;Klemmら、Annu.Rev.Immunol.16:569-5921998;Hoら、Nature382:822-8261996を参照のこと。別の実施態様において、ZFPを、以下に記載の少なくとも1以上の調節ドメインに連結する。好ましい調節ドメインとしては、転写因子リプレッサーまたはアクチベータードメイン例えば、KRABおよびVP16、コリプレッサーおよびコアクチベータードメイン、DNAメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、およびエンドヌクレアーゼ例えば、Fok1が挙げられる。遺伝子発現の抑制については、代表的に、その遺伝子の発現は、約20まですなわち、80の非ZFP調節発現、より好ましくは約50まですなわち、50の非ZFP調節発現、より好ましくは約75~100まですなわち、25~0の非ZFP調節発現減少される。遺伝子発現の活性化については、代表的に発現は、約1.5倍まですなわち、150の非ZFP調節発現、好ましくは、2倍すなわち、200の非ZFP調節発現、より好ましくは、約5~10倍すなわち、500~1000の非ZFP調節発現、少なくとも100倍以上まで活性化される。操作されたZEPアクチベーターおよびリプレッサーの発現はまた、tet調節系およびRU-486系例えば、GossenおよびBujard、PNAS89:55471992;Oliginoら、GeneTher.5:491-4961998;Wangら、GeneTher.4:432-4411997;Neeringら、Blood88:1147-11551996;およびRendahlら、Nat.Biotechnol.16:757-7611998を参照のことにより分類化された系により制御され得る。これらは、ZFPアクチベーターおよびリプレッサーの発現に対する低分子の制御を与え、従って、目的の標的遺伝子に対する低分子の制御を与える。この有利な特徴は、細胞培養モデル、遺伝子治療、およびトランスジェニック動物および植物において使用され得る。定義本明細書中で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限りそれらに示された意味を有する。用語ジンクフィンガータンパク質またはZFPとは、ジンクにより安定化されるDNA結合ドメインを有するタンパク質をいう。個々のDNA結合ドメインは、代表的にフィンガーといわれ、1つのジンクフィンガータンパク質は、少なくとも1つのフィンガーを有し、代表的には、2つのフィンガー、3つのフィンガー、4つのフィンガー、5つのフィンガーあるいは6つ以上のフィンガーを有する。各々のフィンガーは、2~4塩基対のDNAに結合し、代表的には3~4塩基対のDNAに結合する。ジンクフィンガータンパク質は、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各々のフィンガーは、代表的に、約30アミノ酸の、ジンクを構成するDNA結合サブドメインを含む。これらのタンパク質の一つのクラスCys2His2クラスを特徴づけする例示的なモチーフは、-Cys-X24Cys-X12-His-X35-His-ここで、Xは任意のアミノ酸である。研究により、このクラスの単一のジンクフィンガーが、単一のβターンの2つのシステイン残基を伴うジンクに結合する2つの無関係なヒスチジン残基を含むαへリックスからなることが実証されている例えば、BergおよびShi、Science271:1081-10851996を参照のこと。標的部位はジンクフィンガータンパク質により認識される核酸配列である。単一の標的部位は代表的に約4~約10以上の塩基対を有する。代表的に、2つのフィンガー化Fingeredジンクフィンガータンパク質は、4~7塩基対の標的部位を認識し、3つのフィンガー化ジンクフィンガータンパク質は、6~10塩基対の標的部位を認識し、6つのフィンガー化ジンクフィンガータンパク質は、2つの隣接した9~10塩基対の標的部位を認識し、そして6つを超えるフィンガーを有するタンパク質も同様である。標的部位は、遺伝子発現の調節を可能にする任意の位置に存在する;例えば、転写開始部位に隣接する位置、転写開始部位の上流の位置、または転写開始部位の下流の位置;エンハンサーまたはリプレッサーのような他の転写調節因子例えば、SP-1結合部位、低酸素応答エレメント、核レセプター認識エレメント、p53結合部位などに近接する位置、RNAポリメラーゼ停止部位;およびイントロン/エキソン境界。用語隣接標的部位とは、0~約5塩基対はなれた非重複の標的部位をいう。Kdとは、化合物の解離定数をいい、すなわち、所定のアッセイ系例えば、米国特許第5,789,538号を参照のことを用いて測定した場合に、所定の条件下すなわち、標的濃度<<Kdの場合でその標的に対する化合物の最大の結合の半分を与えるすなわち、その化合物の分子の半分が、標的に結合する化合物例えば、ジンクフィンガータンパク質の濃度をいう。Kdを測定するために用いるアッセイ系は、それがZFPの実際のKdの最も正確な測定を与えるように選択されるべきである。Kdを測定するためのアッセイ系は、それがZFPの実際のKdの正確な測定を与える限り、任意のアッセイ系を使用し得る。一つの実施態様において、本発明のZFPのKdを、実施例Iおよび本明細書の14ページに記載のように、電気泳動移動度シフトアッセイEMSAを、使用して測定する。ZFPの純度または活性について調整されないかぎり、実施例Iの方法を使用するKdの計算は、所定のZFPの実際のKdの過少評価を生じ得る。好ましくは、内因性細胞遺伝子の転写調節に使用されるZFPのKdは、約100nM未満、より好ましくは、75nM未満、より好ましくは、約50nM未満、最も好ましくは、約25nMである。内因性細胞遺伝子とは、細胞に対してネイティブである遺伝子をいい、この遺伝子は、その正常なゲノム成分およびクロマチン成分中にあり、かつ細胞に対して異種でない。そのような細胞性遺伝子としては、例えば、動物遺伝子、植物遺伝子、細菌遺伝子、原生生物遺伝子、真菌遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、および葉緑体遺伝子が挙げられる。内因性遺伝子とは、微生物感染細胞またはウイルス感染細胞中の天然に存在する微生物ゲノムまたはウイルスゲノムの一部である、微生物遺伝子またはウイルス遺伝子をいう。微生物ゲノムまたはウイルスゲノムは、染色体外であり得るか、宿主染色体に組み込まれ得る。この用語はまた、上記に記載の内因性細胞遺伝子を包含する。天然のクロマチン環境とは、ゲノムDNA例えば、細菌性、動物性、真菌性、植物性、原生生物性、ミトコンドリア性、および葉緑体性とDNA結合タンパク質例えば、ヒストンおよび細菌DNA結合タンパク質IIとの、共に染色体を形成する、天然に存在する構造関係をいう。内因性細胞遺伝子は、天然クロマチン環境下で転写活性状態または転写不活性状態であり得る。発生的にサイレントな遺伝子または不活性遺伝子とは、細胞型の特定の発生段階の間、または細胞型の特定の期間の間で、その発現が特定の細胞型において抑制されるか、または活性化されていないすなわち、ターンオフturnoffされている遺伝子をいう。発生的に不活性な遺伝子の例としては、EPO、GATA、インターロイキンファミリータンパク質、GM-CSF、MyoD、ユートロフィン、ならびに胎児ヘモグロビンγおよびδが挙げられる。語句転写開始部位に隣接するとは、転写開始部位の上流または下流のいずれか約50塩基内にある標的部位をいう。転写開始部位の上流とは、転写開始部位の5’側、約50塩基を超える標的部位すなわち、その遺伝子の非翻訳領域中をいう。句RNAポリメラーゼ休止部位pausesiteは、Uptainら、Annu.Rev.Biochem.66:117-1721997に記載されている。ヒト化とは、代表的には、アミノ酸配列を、そのポリペプチド配列の機能を実質的に変更することなく、変更して既存のヒト配列を模倣することによって、ヒトにおける免疫反応性を最小化するように改変された非ヒトポリペプチド配列をいう例えば、Jonesら、Nature321:522-5251986、および公開英国特許出願第8707252号を参照のこと。。ZFPについてのバックボーンの配列は、好ましくは、既存のヒトC2H2ZFP例えば、SP-1から選択される。機能的ドメインは、好ましくは、既存のヒト遺伝子例えば、NF-κBのp65サブユニットからの活性化ドメインから選択される。可能である場合、認識ヘリックス配列は、ヒトゲノムの配列決定によって提供された数千もの既存のZFPDNA認識ドメインから選択される。可能な限り多数のドメインが、同じ既存のタンパク質から単位として組み合せられる。これらの工程の全てをキメラZFPにおける新たな接合エピトープの導入を最小化し、そして操作されたZFPをさらに免疫原性を少なくさせる。発現ベクター、核酸、ZFPまたは送達ビヒクルを、細胞に投与することとは、形質導入方法、トランスフェクト方法、エレクトロポレーション方法、転座方法、融合方法、食作用方法、シュート方法または弾丸方法など、すなわち、タンパク質または核酸が、細胞膜を横切って、そして好ましくは細胞核へと輸送され得る任意の手段を含む。送達ビヒクルとは、ZFPを投与するために使用される化合物例えば、リポソーム、毒素または膜移行ポリペプチドをいう。送達ビヒクルはまた、ZFPをコードする核酸を投与するために使用され得る例えば、脂質:核酸複合体、発現ベクター、ウイルスなど。用語、遺伝子の発現を調節する、遺伝子の発現を阻害する、および遺伝子の発現を活性化するとは、ZFPが遺伝子の転写を活性化または阻害する能力をいう。活性化には、転写阻害の妨害すなわち、遺伝子発現の抑制の妨害を含み、そして阻害は、転写活性化の予防すなわち、遺伝子活性化の予防を含む。遺伝子発現の抑制を妨害する遺伝子発現の活性化とは、ジンクフィンガータンパク質がリプレッサー分子の結合をブロックまたは妨害する能力をいう。遺伝子活性化を妨害する遺伝子発現の阻害とは、ジンクフィンガータンパク質が、アクチベーター分子の結合をブロックまたは妨害する能力をいう。調節は、その標的遺伝子の発現によって間接的にまたは直接影響を受ける任意のパラメータを決定することによってアッセイされ得る。そのようなパラメータとしては、例えば、RNAまたはタンパク質レベルにおける変化、タンパク質活性における変化、産物レベルにおける変化、下流の遺伝子発現における変化、レポーター遺伝子転写における変化ルシフェラーゼ、CAT、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、GFP例えば、MistiliおよびSpector、NatureBiotechnology15:961-9641997;シグナル伝達における変化、リン酸化および脱リン酸化、レセプター-リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度例えば、cGMP、cAMP、IP3およびCa2、細胞増殖、および新脈管形成が挙げられる。これらのアッセイは、インビトロ、インビボおよびエキソビボであり得る。そのような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段例えば、RNAまたはタンパク質のレベルの測定、RNA安定性の測定、下流またはレポーター遺伝子発現の同定例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導性マーカー、リガンド結合アッセイを介する;細胞内セカンドメッセンジャー例えば、cGMPおよびイノシトール三リン酸IP3における変化;細胞内カルシウムレベルにおける変化;サイトカイン放出などにより測定され得る。ZFPによって遺伝子発現調節のレベルを決定するために、ZFPと接触させた細胞を、コントロール細胞例えば、ジンクフィンガータンパク質なし、または非特異的なZFPを用いると比較して、阻害または活性化の程度を試験する。コントロールサンプルには、100の相対遺伝子発現活性値を与える。遺伝子発現の調節阻害は、そのコントロールに対するその遺伝子発現活性値が、約80、好ましくは50すなわち、そのコントロールの0.5倍の活性、より好ましくは25、より好ましくは5~0である場合に達成される。遺伝子発現の調節/活性化は、そのコントロールに対するその遺伝子発現活性値が、110、より好ましくは150すなわち、そのコントロールの1.5倍の活性、より好ましくは200~500、より好ましくは1000~2000またはそれを超える場合に達成される。転写アクチベーターおよび転写リプレッサーとは、上記のように、転写を調節する能力を有するタンパク質またはタンパク質のエフェクタードメインをいう。そのようなタンパク質としては、例えば、転写因子および補因子例えば、KRAB、MAD、ERD、SID、核因子κBサブユニットp65、初期増殖応答因子1、および核ホルモンレセプター、VP16、VP64,エンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどが挙げられる。アクチベーターおよびリプレッサーとしては、コアクチベーターおよびコリプレッサー例えば、Utleyら、Nature394:498-5021998を参照のことが挙げられる。調節ドメインとは、DNA結合ドメインすなわち、ZFPに係留される場合に、転写調節活性を有するタンパク質またはタンパク質ドメインをいう。代表的には、調節ドメインは、ZFPに共有結合的または非共有結合的に連結されて、転写調節をもたらす。あるいは、ZFPは、単独で、調節ドメインを伴わずに、転写調節をもたらすように作用し得る。用語異種とは、相対的な用語であり、核酸の部分に関して使用される場合は、その核酸が、天然に互いに同じ関係にあるとは見出されない2つ以上のサブ配列を含むことをいう。例えば、組換え産生される核酸は、代表的に、無関連の遺伝子からの2以上の配列を合成的に整列させて有して、新たな機能的核酸を作製する例えば、1つの供給源からの1つのプロモーターおよび別の供給源からのコード領域。従って、2つの核酸は、この状況において互いに異種である。細胞に添加される場合、その組換え核酸はまた、その細胞の内在性遺伝子に対して異種である。従って、染色体において、異種核酸は、染色体に組み込まれた非ネイティブ天然に存在しない核酸、または非ネイティブ天然に存在しない染色体外核酸を含む。対照的に、染色体の天然に転座する部分は、本特許出願の状況においては異種とは考えない。なぜなら、それは、変異された細胞にとってネイティブである内在性核酸配列を含むからである。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然で互いに同じ関係にあるとは見出されない2以上のサブ配列を含むことをいう例えば、2つのサブ配列が単一の核酸配列によってコードされる融合タンパク質。例えば、Ausubel、前出、を、組換え技術への手引きとして参照のこと。用語組換えとは、例えば、細胞または核酸、タンパク質もしくはベクターに関して使用される場合、その細胞、核酸タンパク質またはベクターが異種核酸もしくはタンパク質の導入、またはネイティブの核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されているか、あるいは、その細胞が、そのように改変された細胞に由来することをいう。従って、例えば、組換え細胞は、その細胞のネイティブ天然に存在する形態には見出されない遺伝子を発現するか、または通常では他の様式でもしくは異常に発現されるか、過小発現もしくは全く発現されないネイティブ遺伝子の第二のコピーを発現する。プロモーターとは、転写を指向する一連の核酸制御配列として定義される。本明細書において使用される、プロモーターとしては、代表的には、転写開始部位付近の必要な核酸配列例えば、特定のRNAポリメラーゼII型プロモーターの場合は、TATAエレメント、エンハンサー、CCAATボックス、SP-1部位などが挙げられる。本明細書において使用される場合、プロモーターはまた、必要に応じて、遠位エンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含み、これらエレメントは、転写開始部位から、数千塩基対ほどに位置し得る。このプロモーターはしばしば、ポリペプチド例えば、核レセプター、Gal4、lacリプレッサーなどのようなDNA結合部分によるトランス活性化に応答性であるエレメントを有する。構成性的プロモーターは、殆どの環境条件および発生条件の下で活性であるプロモーターである。誘導性プロモーターは、特定の環境条件または発生条件の下で活性であるプロモーターである。弱いプロモーターとは、EisenbergおよびMcKnight、Mol.Cell.Biol.5:1940-19471985に記載されるように、野生型単純ヘルペスウイルスHSVチミジンキナーゼtkプロモーターまたは変異されたHSVtkプロモーターとほぼ同様の活性を有するプロモーターをいう。用語作動可能に連結とは、核酸発現制御配列例えば、プロモーターまたは一連の転写因子結合部位と第二の核酸との間の機能的連結をいい、ここで、発現制御配列は、その第二の配列に対応する核酸の転写を指向する。発現ベクターとは、組換え産生または合成で生成された、核酸構築物である。この構築物は、一連の特定の核酸エレメントを伴う。このエレメントによって、宿主細胞における特定の核酸の転写が可能となり、そして必要に応じて、宿主細胞における発現ベクターの組込みまたは複製を可能にする。発現ベクターは、ウイルス起源または非ウイルス起源のプラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であり得る。代表的に、発現ベクターは、発現カセットを備え、これは、プロモーターに作動可能に連結された、転写されるべき核酸を含む。用語、発現ベクターはまた、プロモーターに作動可能に連結された裸のDNAを含む。宿主細胞とは、ZFPまたはZFPをコードする発現ベクターもしくは核酸を含む細胞を意味する。この宿主細胞は、代表的に、その発現ベクターの複製または発現を支持する。宿主細胞は、原核生物細胞例えば、E.coliまたは真核生物細胞例えば、酵母、真菌、原生動物、高等植物、昆虫または両生類の細胞、あるいはCHO、HeLa、293、COS-1などのような哺乳動物細胞であり得、例えば培養細胞インビトロ、外植体および初代培養物インビトロおよびエキソビボならびにインビボの細胞であり得る。核酸とは、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。この用語は、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは連結を含む核酸を含み、これは、合成のもの、天然に存在するもの、および天然に存在しないものであり、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される。そのようなアナログの例としては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルのメチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸PNAが挙げられる。他に言及しない限り、特定の核酸配列はまた、保存的改変されたその改変体例えば、縮重コドン置換体およびその相補的配列、ならびに明示的に示された配列を黙示的に包含する。特に、縮重コドン置換体は、1以上の選択されたまたはすべてのコドンの3位が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基に置換された配列を生成することによって達成され得るBatzerら、NucleicAcidRes.19:50811991;Ohtsukaら、JBiolChem260:2605-26081985;Rossoliniら、Mol.Cell.Probes8:91-981994。用語、核酸は、遺伝子、cDNA,mRNA,オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。用語ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質は、アミノ酸残基の重合体をいうために本明細書において交換可能に使用される。この用語はまた、1以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的な人工模倣物であるアミノ酸重合体、ならびに天然に存在するアミノ酸重合体および天然に存在しないアミノ酸重合体にも適用される。用語アミノ酸とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、および後に改変されたアミノ酸例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学的構造すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびR基を有する化合物例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。このようなアナログは、改変されたR基例えば、ノルロイシンまたは改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能する化学的化合物をいう。アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommissionが推奨するその一般に公知の3文字記号によるか、または1文字記号によるかのいずれかによって言及され得る。ヌクレオチドも同様に、その一般的に受容された一文字コードによって言及され得る。保存的に改変された改変体は、アミノ酸および核酸の配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、または、その核酸は本質的に同一の配列に対して、アミノ酸配列をコードしないことをいう。遺伝子コードの縮重性のために、大多数の機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUは、すべて、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置にて、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、対応する記載されたコドンのいずれかに変更され得る。そのような核酸改変体はサイレント改変体であり、この改変体は、保存的に改変された改変の1種である。ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸配列はまた、その核酸のすべての可能なサイレンと改変体を記載する。当業者は、核酸における各コドン通常、メチオニンについての唯一のコドンであるAUG、および通常、トリプトファンについての唯一のコドンであるTGGを除くを改変して、機能的に同一の分子を得ることができる。従って、あるポリペプチドをコードする核酸の各サイレント改変は、各々記載された配列において黙示的である。アミノ酸配列に関して、当業者は、その変更が、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸置換で生じる場合、コードされた配列におけるアミノ酸の単一のアミノ酸または少数の割合のアミノ酸を変更、付加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失または付加は、保存的に改変された改変体であることを、認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野で周知である。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型性改変体、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えて存在し、そしてこれらを除外しない。以下の8グループは、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む:1アラニンA、グリシンG;2アスパラギン酸D、グルタミン酸E;3アスパラギンN、グルタミンQ;4アルギニンR、リジンK;5イソロイシンI、ロイシンL、メチオニンM、バリンV;6フェニルアラニンF、チロシンY、トリプトファンW;7セリンS、トレオニンT;および8システインC、メチオニンM例えば、Creighton,Proteins1984を参照のこと。ZFPの設計本発明のZFPを、選択した内因性遺伝子において選択した標的部位を認識するように操作する。代表的には、任意の適切なC2H2ZFP例えば、SP-1、SP-1CまたはZIF268からの骨格を、操作されるZFPについての足場として使用する例えば、Jacobs、EMBOJ.11:45071992;DesjarlaisおよびBerg、PNAS90:2256-22601993を参照のこと。次いで、多数の方法を使用して、その標的について高親和性を有するZFP例えば、好ましくは、約25nM未満のKdを有するを設計し、そして選択し得る。上記のように、ZFPは、高親和性を伴って、標的の内因性遺伝子における任意の適切な標的部位に結合するように設計または選択され得る。同時係属中の特許出願USSN09/229,0071999年1月12日出願は、選択された標的部位についてのZFPの設計、構築および発現のための方法を包括的に記載する。当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して、ZFPをコードする核酸を設計および構築し得る例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピュータ/合理的設計、親和性選択、PCR、cDNAまたはゲノムのライブラリーからのクローニング、合成構築など例えば、米国特許第5,786,538号;Wuら、PNAS92:344-3481995;Jamiesonら、Biochemistry33:5689-56951994;RebarおよびPabo、Science263:671-6731994;ChooおよびKlug、PNAS91:11163-111671994;ChooおよびKlug、PNAS91:11168-111721994;DesjarlaisおよびBerg、PNAS90:2256-22601993;DesjarlaisおよびBerg、PNAS89:7345-73491992;Pomerantzら、Science267:93-961995;Pomerantzら、PNAS92:9752-97561995;ならびにLiuら、PNAS94:5525-55301997;GriesmanおよびPabo、Science275:275:657-6611997;DesjarlaisおよびBerg、PNAS91:11099-111031994を参照のこと。好ましい実施態様において、同時係属中の出願USSN09/229,0071999年1月12日出願は、標的遺伝子を選択し、そして1~6またはそれを超えるD可能な部位定義については以下を参照のことを含む遺伝子内の標的部位を同定する方法を提供する。次いで、これらの方法を使用して、ZFPを、所定の部位に結合するように合成し得る。標的部位選択のこれらの方法は、標的セグメントにおける1以上のD可能な部位の存在が、D可能な部位を欠く標的セグメント以下を参照のことに結合するZFPと比較して、その部位に結合するように選択または設計したZFPにおいて、より高い結合親和性についての潜在性を付与するという認識を一部仮定する。この洞察を支持する実験的な証拠は、同時係属中の出願USSN09/229,0071999年1月12日出願における実施例2~9に提供される。D可能な部位またはサブ部位は、単一のジンクフィンガーが、標的部位のうち3塩基ではなく、4塩基に結合するように適切に設計されることを可能にする標的部位の領域である。そのようなジンクフィンガーは、二本鎖標的セグメントのうちの一方の鎖標的鎖における塩基のトリプレットおよび他方の鎖上の第四の塩基に結合する同時係属中の出願USSN09/229,0071999年1月12日出願の図2を参照のこと。単一のジンクフィンガーの4塩基標的セグメントへの結合は、標的鎖の配列上およびジンクフィンガーのアミノ酸配列上の両方の束縛を課す。標的鎖内の標的部位は、D可能な部位のモチーフ5’NNGK3’を含むべきである。ここで、NおよびKは、慣用されるIUPAC-IUBのあいまいコードである。そのような部位への結合のためのジンクフィンガーは、-1位にアルギニン残基、および2位にアスパラギン酸または、あまり好ましくはないがグルタミン酸を含むべきである。-1位のアルギニン残基は、D可能な部位におけるG残基と相互作用する。ジンクフィンガーの2位でのアスパラギン酸またはグルタミン酸残基は、D可能な部位のK塩基と相補的な反対の鎖の塩基と相互作用する。D可能な部位との名称を付与するのは、アスパラギン酸シンボルDと反対の鎖の塩基第四の塩基との間の相互作用である。D可能な部位の式から明らかなように、2つのサブタイプのD可能な部位が存在する:5’NNGG3’および5’NNGT3’。前者の部位について、ジンクフィンガーの2位のアスパラギン酸またはグルタミン酸は、D可能な部位の反対の鎖におけるCと相互作用する。後者の部位において、ジンクフィンガーの2位のアスパラギン酸またはグルタミン酸は、D可能な部位の反対の鎖におけるAと相互作用する。一般的に、NNGGが、NNGTよりも好ましい。3つのフィンガーを有するZFPの設計において、標的部位は、タンパク質の少なくとも1つのフィンガーおよび必要に応じて2または3つすべてのフィンガーがD可能な部位に結合する可能性を有するように選択されるべきである。そのようなものは、式5’-NNxaNybNzc-3’を有するより大きな標的遺伝子内から標的部位を選択することによって達成され得る。ここで、x、a、y、bおよびz、cのセットの各々は、N,NまたはG,Kのいずれかであり;x、a、y、bおよびz、cの少なくとも1つは、G,Kであり、そしてNおよびKは、IUPAC-IUBのあいまいコードである。換言すれば、x、a、y、bおよびz、cの3つのセットの少なくとも1つが、セットG,Kであるとは、そのセットの一位がGであり、そして二位がGまたはTであるという意味である。G,Kではない3つのセットのものある場合は、N,Nであるとは、そのセットの一位が任意のヌクレオチドによって占有され得、そしてそのセットの二位が任意のヌクレオチドによって占有され得ることを意味する。例として、セットx、aは、G,Kであり得、そしてセットy、bおよびz、cは、両方ともN,Nであり得る。式5’-NNxaNybNzc-3’において、NNxaNyおよびbNzcのトリプレットは、ZFPにおける3つのフィンガーによって結合される標的鎖上の塩基のトリプレットを表す。x、yおよびzの1つのみがGであり,そしてこのGにKが続く場合、その標的部位は単一のD可能なサブ部位を含む。例えば、xのみがGであり、そしてaがKである場合、その部位は、5’-NNGKNybNzc-3’ここで、NNGKは、太字ボールド表記であり、ここで、D可能なサブ部位を強調する。xおよびyの両方がGであるがzはGでなく、そしてaおよびbがKである場合、その標的部位は、以下のように2つの重複するD可能なサブ部位を有する:5’-NNGKNGKNzc-3’ここで、NNGKは、太字ボールド表記、KNGKは斜体字表記であり、一方のそのような部位を、ボールドで表し、そして他方を斜体字で表す。x、yおよびzの3つすべてがGであり、そしてa、bおよびcがKである場合、その標的セグメントは、以下のような3つのD可能なサブ部位を含む:5’NNGKNGKNGK-3’ここで、NNGKは、太字ボールド表記、KNGKは斜体字表記、ここで、D可能なサブ部位は、ボールド、斜体字、および下線によって表される。従って、これらの方法は、上記のように、標的遺伝子を選択し、そして式5’-NNxaNybNzc-3’に適合する標的部位についてその遺伝子の可能なサブ配列内を系統的に検索することによって作用する。いくつかのそのような方法において、潜在的な標的遺伝子のいずれかの鎖上の10の連続する塩基の全ての可能なサブ配列を評価して、その配列が上記の式に適合するか否か、およびそうであれば、どれだけのD可能な部位が存在するかを決定する。代表的にはそのような比較は、コンピュータによって実行され、そしてその式に適合する標的部位のリストが出力される。必要に応じて、そのような標的部位は、どれだけ多くのD可能な部位が存在するかに従って、異なるサブセットにおいて出力され得る。変形において、本発明の方法は、第一および第二の標的セグメントを同定する。これら各々は、上記の式に独立して適合する。そのような方法における2つの標的セグメントは、その標的遺伝において互いの近接または近位すなわち、約0~5塩基以内に存在するように束縛される。近位の標的セグメントの選択の基礎をなす戦略は、それぞれ第一および第二の標的セグメントについて特異的な2成分ZFPの結合によって形成されるZFPの設計を可能にすることである。これらの原理は、任意の数の成分フィンガーを有するZFPによって結合されるべき標的部位を選択するように拡張され得る。例えば、9フィンガータンパク質についての適切な標的部位は、3成分セグメントを有し、ここで、各セグメントは、上記の式に適合する。上記の方法によって同定された標的部位は、他の基準による評価にさらに供され得るか、またはこれを、設計または選択必要な場合およびそのような部位について特異的なZFPの産生について直接使用し得る。潜在的な標的部位を評価するためのさらなる基準は、遺伝子内の特定の領域に近位であることである。ZFPがそれ自体における細胞遺伝子を抑制するように使用されるべき場合すなわち、抑制性部分へのそのZFPの結合を伴わない、その最適な位置は、転写開始部位、またはその50bp上流もしくは下流に存在するようであるか、転写複合体の形成を阻害するようであるかKimおよびPabo,J.Biol.Chem.272:29795-296801997、または必須のエンハンサー結合タンパク質と競合するようである。しかし、ZFPが、KRABリプレッサードメインまたはVP16アクチベータードメインのような機能的ドメインと融合される場合、その結合部位の位置は、相当に、より可撓性であり、そして公知の調節領域の外側に存在し得る。例えば、KRABドメインは、KRABが結合する場所から少なくとも3kbpまでにあるプロモーターでの転写を抑制し得るMargolinら、PNAS91:4509-45131994。従って、調節配列のような標的遺伝子を有する実証可能な生物学的意義のセグメントを、必ずしも含まないかまたは重複しない標的部位が選択され得る。標的セグメントをさらに評価するための他の基準は、そのようなセグメントまたは関連するセグメントへのZFPの結合の先行する利用可能性、および/または所定の標的セグメントを結合するような新たなZFPを設計する容易さを含む。標的セグメントが選択された後、そのセグメントに結合するZFPは、種々のアプローチによって提供され得る。アプローチの最も単純なものは、その標的部位へ結合することがすでに公知である既存の収集物からの予備的に特徴付けられたZFPを提供することである。しかし、多くの場合、そのようなZFPは存在しない。既存のZFPのデータベースにおける情報およびそれらのそれぞれの結合親和性を使用する別のアプローチもまた、新たなZFPを設計するために使用され得る。さらなるアプローチは、上記のような置換規則に基づいてZFPを設計することである。なおさらなる別のものは、ファージディスプレーのような経験的なプロセスによって所定の標的に対する特異性を有するZFPを選択することである。いくつかのそのような方法において、ZFPの各々の成分フィンガーは、他の成分フィンガーとは独立して設計または選択される。例えば、各フィンガーは、異なる既存のZFPから得られ得るか、または各フィンガーは、別個のランダム化および選択に供され得る。一旦ZFPが所定の標的セグメントに対して選択され、設計され、または他の方法で提供されると、そのZFPまたはそれをコードするDNAが合成される。ジンクフィンガータンパク質をコードするDNAを合成および発現するための例示的な方法は、以下に記載される。次いで、ZFPまたはZFPをコードするポリヌクレオチドは、発現の調整、またはZFPが結合する標的部位を含む標的遺伝子の分析のために使用され得る。ZFPの発現および精製ZFPポリペプチドおよび核酸は、組換え遺伝学の分野において慣用的な技術を用いて作製され得る。本発明における一般的使用法を開示する基本書は、Sambrookら、MolecularCloning,ALaboratoryManual第2版、1989,Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual1990;およびCurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelら、編、1994を含む。さらに、本質的に任意の核酸を、任意の種々の商業的供給元に特注することが可能である。同様に、ペプチドおよび抗体を、任意の種々の商業的供給元に特注することが可能である。代表的に、2つの代替的方法を用いて、新規に設計したDNA結合ペプチドを発現するために必要とされるコード配列を作製する。1つ目のプロトコルは、6つが重複するオリゴヌクレオチドを利用するPCRに基づく構築手順である図1。3つのオリゴヌクレオチド図1におけるオリゴ1、3、および5は、認識へリックス間のDNA結合ドメインの部分をコードする汎用universal配列に対応する。これらのオリゴヌクレオチドは、全てのジンクフィンガー構築物について一定に保たれる。その他の3つの特異的オリゴヌクレオチド図1における、オリゴ2、4および6は、認識へリックスをコードするように設計される。これらのオリゴヌクレオチドは、認識へリックス上の主に-1位、2位、3位および6位での置換を含み、このことはオリゴヌクレオチドを異なるDNA結合ドメインの各々に対して特異的にさせる。PCR合成は、2つの工程で実行される。第一に、二重鎖DNAの鋳型が、低温度アニーリング工程での4サイクルPCR反応において、6つのオリゴヌクレオチド3つは汎用、3つは特異的を組み合わせることによって作製され、それによってオリゴヌクレオチドをアニーリングし、DNA骨格を形成する。この骨格におけるギャップは、高忠実度熱安定ポリメラーゼTaqおよびPfuポリメラーゼの組み合わせもまた十分であるによって埋められる。構築の第二段階において、ジンクフィンガーの鋳型は、クローニングするためにいずれか一方の末端の制限部位をシャトルベクターか、または直接発現ベクターに組み込むために設計された外部プライマーによって増幅される。新規に設計したDNA結合タンパク質をクローニングする代替的方法は、所望のZFPの特定の領域をコードする相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることに依存する。この特定用途は、オリゴヌクレオチドが最終連結工程の前にリン酸化されることを必要とする。これは、通常、アニーリング反応を準備する前に行われるが、キナーゼ処理はまた、アニーリング後に起こり得る。簡単に言えば、タンパク質の定常領域をコードする汎用オリゴヌクレオチド上記のオリゴ1、2および3は、それらの相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングされる。さらに、フィンガー認識へリックスをコードする特異的オリゴヌクレオチドは、それらのそれぞれに相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングされる。これらの相補的オリゴは、上記のプロトコルにおいてポリメラーゼによって以前に埋められた領域を埋めるために設計される。通常のオリゴ1およびフィンガー3に相補的なオリゴは、選択したベクターへのクローニングに用いられる制限部位に特異的な配列をオーバーハングしたままにするように操作される。第2の構築プロトコルは、以下の局面で最初のプロトコルとは異なる:新規に設計したZFPをコードする骨格は、全体的に合成DNAから成り立っており、それによってポリメラーゼの埋めるfill-in工程を排除する。さらに、ベクターへクローニングされるフラグメントは、増幅を必要としない。最後に、配列特異的にオーバーハングしたままにする設計は、挿入フラグメントの制限酵素消化の必要を排除する。得られた、新規に設計したZFPをコードするフラグメントは、発現ベクターに連結される。一般的に利用される発現ベクターは、改変化pMAL-c2細菌発現ベクターNewEnglandBioLabs,NEBまたは真核生物発現ベクター、pcDNAPromegaを含むがこれらに限定されない。当業者に公知の任意の適切なタンパク質精製の方法は、本発明のZFPを精製するのに用いられ得るAusubel、前出、Sambrook、前出を参照のこと。さらに、任意の適切な宿主が、用いられ得る例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞など。1つの実施態様において、細菌株JM109におけるマルトース結合タンパク質MBP-ZFPと融合されたZFPの発現は、アミロースカラムNEBを通じた簡単な精製を可能にする。ジンクフィンガーキメラタンパク質の高い発現レベルは、IPTGを用いる誘発によって得られ得る。なぜならば、pMal-c2発現プラスミドにおけるMBP-ZFP融合物は、IPTG誘発性tacプロモーターNEBの制御下にあるからである。MBP-ZFP融合プラスミドを含む細菌は、10μMZnCl2、0.02グルコース、および50μg/mlアンピシリンを含む2xYT培地に接種され、そして37°Cで振盪される。指数増殖の中期にIPTGが0.3mM添加され、そして培養物を振盪する。3時間後、細菌は、遠心分離によって収集され、超音波処理によって破壊され、次いで不溶物質が遠心分離によって取り除かれる。MBP-ZFPタンパク質は、アミロース結合樹脂に捕捉され、20mMTris-HClpH7.5、200mMNaCl、5mMDTTおよび50μMZnCl2を含む緩衝液で徹底的に洗浄され、次いで本質的に同じ緩衝液中のマルトースで溶出される精製は、NEBからの標準的プロトコルに基づく。精製したタンパク質は、定量され、そして生化学的分析のために保存される。精製したタンパク質の生化学的特性例えば、Kdは、任意の適切なアッセイによって特徴づけされ得る。1つの実施態様において、Kdは、電気泳動移動度シフトアッセイEMSAを介して特徴づけされるBuratowskiおよびChodosh,CurrentProtocolsinMolecularBiology12.2.1-12.2.7頁Ausubel編、1996;本明細書中で参考として援用される米国特許第5,789,538号、1999年1月12日に出願された米国特許出願第09/229,007、および実施例Iもまた参照のこと。アフィニティーは、低固定量の標識化二重鎖オリゴヌクレオチド標的に対して、精製したタンパク質を滴定することによって測定される。この標的は、天然の配列に見出される3bpに隣接する天然の結合部位配列9または18bpを含む。結合部位および隣接配列に対する外側は、定常配列である。アニーリングしたオリゴヌクレオチド標的は、T4ファージポリヌクレオチドキナーゼを用いて標的の効率的な標識化を可能にする1bpの5’オーバーハングを保有する。アッセイのために、標的は、40nMまたは40nM未満の濃度実際の濃度は、最も低いタンパク質希釈度より、少なくとも10倍より低く保たれるで添加され、そして反応は少なくとも45分間平衡化させておく。さらに、反応混合物はまた、10mMTrispH7.5、100mMKCl、1mMMgCl2、0.1mMZnCl2、5mMDTT、10グリセロール、0.02BSAポリdIdCまたはdAdTPharmaciaはまた、10~100μg/μlで添加され得るを含む。平衡化した反応物は、10ポリアクリルアミドゲル上にロードされる。10ポリアクリルアミドゲルは、Tris/グリシン緩衝液において45分間、前泳動pre-runされており、次いで結合および非結合標識標的は、150Vでの電気泳動によって分離されるあるいは、4ポリアクリルアミドスタッカを含む10~20勾配Tris-HClゲルが用いられ得る。乾燥したゲルは、オートラジオグラフィーかまたはホスホロイメージングphosphoroimagingによって可視化され、見かけ上のKdが、最大の半分の結合を与えるタンパク質濃度を算出することによって決定される。同様のアッセイはまた、タンパク質調製物における活性な画分を決定することを含む。活性な画分は、タンパク質が高濃度の標的DNAに対して滴定される化学量論的ゲルシフトによって決定される。滴定は、100、50、および25の標的通常、μMレベルで行われる。別の実施態様において、ファージ提示ライブラリーを用いて、選択された標的部位に対して高いアフィニティーを有するZFPを選択し得る。この方法は、それが、変異誘発されたZFPの多様なライブラリーの作製、続いて、アフィニティー選択法を用いて所望のDNA結合特性を有するタンパク質の単離を含むという点において直接の設計とは本質的に異なる。この方法を用いるために、この実験は、代表的には以下のように進行する。始めに、ZFPについての遺伝子が変異誘発され、結合特異性および/またはアフィニティーについて重要な領域へ多様性を導入する。代表的な適用において、これは、-1位、2位、3位、および6位で、ならびに1位、5位、8位、または10位のようなおそらくアクセサリー位置での単一のフィンガーの無作為化を介して達成される。次いで、変異誘発された遺伝子は、例えば、コートタンパク質pIIIをコードする糸状ファージの遺伝子IIIを有する融合物としてファージベクターまたはファージミドベクターへクローニングされる。ジンクフィンガー遺伝子は、膜輸出シグナルペプチドをコードする遺伝子IIIのセグメントとpIIIの残余物との間に挿入され、その結果ZFPは、成熟プロセス化タンパク質におけるpIIIとのアミノ末端融合物として発現される。ファージミドベクターが用いられる場合、変異誘発されたジンクフィンガー遺伝子はまた、ファージ粒子へのpIIIの構築に必要とされるC末端領域を最小にコードする、短縮型バージョンの遺伝子IIIへ融合され得る。生じたベクターライブラリーは、E.coliへ形質転換され、そして糸状ファージを産生するために用いられる。糸状ファージは、コートタンパク質pIIIを有する融合物としてそれらの表面上に改変体ZFPを発現するファージミドベクターが用いられる場合、この工程はヘルパーファージとの重感染を必要とする。次いで、ファージライブラリーは、標的DNA部位とインキュベートされ、そしてアフィニティー選択法を用いて、高いアフィニティーで標的に結合するファージを、大量のファージから単離する。代表的には、DNA標的は、固体支持体に固定化される。次いで、これは最も固く結合するファージ以外全てを取り除くのに十分な条件下で洗浄される。洗浄後、支持体上に残存する任意のファージが、ジンクフィンガー-DNA結合を完全に破壊する条件下での溶出を介して回収される。回収したファージを用いて、新鮮なE.coliを感染させる。次いでこれを、増幅し、そして新しいファージ粒子のバッチを生成するために用いる。次いで、結合工程および回収工程は、固い結合剤のためのファージプールを十分に富化するのに必要な回数だけ繰り返され、その結果、固い結合剤が、配列決定法および/またはスクリーニング法を用いて同定され得る。調節ドメイン本発明のZFPは、必要に応じて、遺伝子発現の調節のための調節ドメインと結合し得る。ZFPは、1つ以上の調節ドメイン、あるいは、同じドメインかまたは2つの異なるドメインの2つのコピーである2つ以上のドメインを有する、2つ以上の調節ドメインと共有的にかまたは非共有的に結合され得る。この調節ドメインは、ZFPへ共有的に連結され得る例えば、アミノ酸リンカーを介して、融合タンパク質の一部として。ZFPはまた、非共有的二量体化ドメインを介して調節ドメインと結合され得る例えば、ロイシンジッパー、STATタンパク質N末端ドメイン、またはFK506結合タンパク質例えば、O’Shea,Science254:5391991,Barahmand-Pourら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.211:121-1281996;Klemmら、Annu.Rev.Immunol.16:569-5921998;Klemmら、Annu.Rev.Immunol.16:569-5921998;Hoら、Nature382:822-8261996;およびPomeranzら、Biochem.37:9651998を参照のこと。調節ドメインは、ZFPのC末端またはN末端を含む、任意の適切な位置でZFPと結合され得る。ZFPへ付加するための一般的な調節ドメインは、例えば、以下を含む:転写因子由来のエフェクタードメイン活性化因子、リプレッサー、活性化補助因子、コリプレッサー、サイレンサー、核ホルモンレセプター、癌遺伝子転写因子例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、mosファミリーメンバーなど;DNA修復酵素、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子;DNA再配列rearrangement酵素、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子;クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ;およびDNA修飾酵素例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼならびにそれらに関連する因子および修飾因子。調節ドメインを獲得し得る転写因子ポリペプチドは、調節された転写および基礎的な転写に関与するポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは、転写因子、それらのエフェクタードメイン、活性化補助因子、サイレンサー、核ホルモンレセプターを含む例えば、転写に関与するタンパク質および核酸エレメントの総説については、Goodrichら、Cell84:825-301996を参照のこと;一般の転写因子は、BarnesおよびAdcock,Clin.Exp.Allergy25増補.2:46-91995ならびにRoeder,MethodsEnzymol.273:165-711996に総説される。転写因子専用のデータベースは公知である例えば、Science269:6301995を参照のこと。核ホルモンレセプター転写因子は、例えば、Rosenら、J.Med.Chem.38:4855-741995に記載される。C/EBPファミリーの転写因子は、Wedelら、Immunobiology193:171-851995に総説される。核ホルモンレセプターによって転写調節を媒介する活性化補助因子およびコリプレッサーは、例えば、Meier,Eur.J.Endocrinol.1342:158-91996;Kaiserら、TrendsBiochem.Sci.21:342-51996;およびUtleyら、Nature394:498-5021998に総説される。GATA転写因子これは、造血の調節に関与するは、例えば、Simon,Nat.Genet.11:9-111995;Weissら、Exp.Hematol.23:99-107に記載される。TATAボックス結合タンパク質TBPおよびその関連したTAFポリペプチドこれはTAF30、TAF55、TAF80、TAF110、TAF150、およびTAF250を含むはGoodrichおよびTjian,Curr.Opin.CellBiol.6:403-91994ならびにHurley,Curr.Opin.Struct.Biol.6:69-751996に記載される。STATファミリーの転写因子は、例えば、Barahmand-Pourら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.211:121-81996に総説される。疾患に関与する転写因子は、Asoら、J.Clin.Invest.97:1561-91996に総説される。1つの実施態様において、ヒトKOX-1タンパク質由来のKRABリプレッションドメインは、転写リプレッサーとして用いられるThiesenら、NewBiologist2:363-3741990;Margolinら、PNAS91:4509-45131994;Pengueら、Nucl.AcidsRes.22:2908-29141994;Witzgallら、PNAS91:4514-45181994;実施例3もまた参照のこと。別の実施態様において、KAP-1KRABコリプレッサーは、KRABと共に用いられるFriedmanら、GenesDev.10:2067-20781996。あるいは、KAP-1は、ZFPと共に単独で用いられ得る。転写リプレッサーとして作用する他の好ましい転写因子および転写因子ドメインは、MADを含む例えば、Sommerら、J.Biol.Chem.273:6632-66421998;Guptaら、Oncogene16:1149-11591998;Quevaら、Oncogene16:967-9771998;Larssonら、Oncogene15:737-7481997;Lahertyら、Cell89:349-3561997;およびCultraroら、Mol.Cell.Biol.17:2353-23591997;FKHR横紋筋肉腫遺伝子におけるフォークヘッドforkheadinrhapdosarcomagene;Ginsbergら、CancerRes.15:3542-35461998;Epsteinら、Mol.Cell.Biol.18:4118-41301998;EGR-1即時型遺伝子産物-1;Yanら、PNAS95:8298-83031998;およびLiuら、CancerGeneTher.5:3-281998;ets2リプレッサー因子リプレッサードメインERD;Sgourasら、EMBOJ.14:4781-47931995;およびMADsmSIN3相互作用ドメインSID;Ayerら、Mol.Cell.Biol.16:5772-57811996を参照のこと。1つの実施態様において、HSVVP16活性化ドメインは、転写活性化因子として用いられる例えば、Hagmannら、J.Virol.71:5952-59621997を参照のこと。活性化ドメインを供給し得る他の好ましい転写因子は、VP64活性化ドメインSeipelら、EMBOJ.11:4961-49681996;核ホルモンレセプター例えば、Torchiaら、Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-3831998を参照のこと;核因子κBのp65サブユニットBitkoおよびBarik、J.Virol.72:5610-56181998ならびにDoyleおよびHunt、Neuroreport8:2937-29421997;ならびにEGR-1即時型遺伝子産物-1;Yanら、PNAS95:8298-83031998;およびLiuら、CancerGeneTher.5:3-281998を含む。キナーゼ、ホスファターゼ、および遺伝子調節に関与するポリペプチドを修飾する他のタンパク質はまた、ZFPについての調節ドメインとして有用である。このような修飾因子は、しばしば、例えば、ホルモンにより媒介される転写のスイッチを入れることか、または切ることに関与する。転写調節に関与するキナーゼは、Davis,Mol.Reprod.Dev.42:459-671995、Jacksonら、Adv.SecondMessengerPhosphoproteinRes.28:279-861993、およびBoulikas,Crit.Rev.Eukaryot.GeneExpr.5:1-771995において総説される。一方ホスファターゼは、例えば、SchonthalおよびSemin、CancerBiol.6:239-481995において総説される。核チロシンキナーゼは、Wang,TrendsBiochem.Sci.19:373-61994において記載される。記載されるように、有用なドメインはまた、癌遺伝子例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、mosファミリーメンバーの遺伝子産物、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子から得られ得る。癌遺伝子は、例えば、Cooper,Oncogenes,第2版、JonesおよびBartlettSeriesinBiology,Boston,MA,JonesandBartlettPublishers,1995において記載される。ets転写因子は、Waslylkら、Eur.J.Biochem.211:7-181993およびCrepieuxら、Crit.Rev.Oncog.5:615-381994において総説される。myc癌遺伝子は、例えば、Ryanら、Biochem.J.314:713-211996において総説される。junおよびfos転写因子は、例えば、TheFosandJunFamiliesofTranscriptionFactors,AngleおよびHerrlich,編1994において記載される。max癌遺伝子は、Hurlinら、ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.59:109-16において総説される。myb遺伝子ファミリーは、Kanei-Ishiiら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.211:89-981996において総説される。mosファミリーは、Yewら、Curr.Opin.Genet.Dev.3:19-251993において総説される。ZEPは、DNA修復酵素から得られた調節ドメイン、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子を含み得る。DNA修復系は、例えば、Vos,Curr.Opin.CellBiol.4:385-951992;Sancar,Ann.Rev.Genet.29:69-1051995;Lehmann,Genet;Eng.17:1-191995;およびWood,Ann.Rev.Biochem.65:135-671996において総説される。DNA再配列酵素、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子はまた、調節ドメインとして用いられ得る例えば、Gangloffら、Experientia50:261-91994;Sadowski,FASEBJ.7:760-71993を参照のこと。同様に、調節ドメインは、DNA修飾酵素例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子由来であり得る。ヘリカーゼは、Matsonら、Bioessays,16:13-221994において総説され、そしてメチルトランスフェラーゼは、Cheng,Curr.Opin.Struct.Biol.5:4-101995において記載される。ヒストンデアセチラーゼWolffe,Science272:371-21996のような、クロマチンに関連したタンパク質およびそれらの修飾因子例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼはまた、選択したZFPへ付加するためのドメインとして有用である。1つの好ましい実施態様において、調節ドメインは、転写リプレッサーとして作用するDNAメチルトランスフェラーゼである例えば、VandenWyngaertら、FEBSLett.426:283-2891998;Flynnら、J.Mol.Biol.279:101-1161998;Okanoら、NucleicAcidsRes.26:2536-25401998;およびZardoおよびCaiafa,J.Biol.Chem.273:16517-165201998を参照のこと。別の好ましい実施態様において、Fok1のようなエンドヌクレアーゼは、転写リプレッサーとして用いられる。これは、遺伝子切断を介して作用する例えば、WO95/09233;およびPCT/US94/01201を参照のこと。クロマチンおよびDNAの構造、移動および局在を制御する因子、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子;微生物例えば、原核生物、真核生物およびウイルス由来の因子およびそれらに関連するかまたはそれらを修飾する因子はまた、キメラタンパク質を得るために用いられ得る。1つの実施態様において、組換え酵素およびインテグラーゼは、調節ドメインとして用いられる。1つの実施態様において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、転写活性化因子として用いられる例えば、JinおよびScotto,Mol.Cell.Biol.18:4377-43841998;Wolffe,Science272:371-3721996;Tauntonら、Science272:408-4111996;およびHassigら、PNAS95:3519-35241998を参照のこと。別の実施態様において、ヒストンデアセチラーゼは、調節リプレッサーとして用いられ得る例えば、JinおよびScotto,Mol.Cell.Biol.18:4377-43841998;SyntichakiおよびThireos,J.Biol.Chem.273:24414-244191998;Sakaguchiら、GenesDev.12:2831-28411998;およびMartinezら、J.Biol.Chem.273:23781-237851998を参照のこと。ポリペプチドドメインの間例えば、2つのZFP間またはZFPと調節ドメインとの間のリンカードメインが、含まれ得る。このようなリンカーは、代表的には、約5アミノ酸と200アミノ酸との間のポリグリシン配列のようなポリペプチド配列である。好ましいリンカーは、代表的には、可撓性アミノ酸部分配列である。これは、組換え融合タンパク質の一部として合成される。例えば、1つの実施態様において、リンカーDGGGSを用いて2つのZFPを連結する。別の実施態様において、2つのZFPを連結する可撓性リンカーは、配列TGEKPを含むアミノ酸部分配列である例えば、Luiら、PNAS5525-55301997を参照のこと。別の実施態様において、リンカーLRQKDGERPを用いて2つのZFPを連結する。別の実施態様において、以下のリンカーを用いて2つのZFPを連結する:GGRRPomerantzら、1995、前出、G4SnKimら、PNAS93,1156-11601996;およびGGRRGGGS;LRQRDGERP;LRQKDGGGSERP;LRQKDG3S2ERP。あるいは、可撓性リンカーは、DNA結合部位およびペプチド自身の両方をモデリングすることが可能なコンピュータープログラムを用いてDesjarlaisおよびBerg,PNAS90:2256-22601993,PNAS91:11099-111031994か、またはファージ提示方法によって合理的に設計され得る。他の実施態様において、化学的リンカーを用いて合成的にか組換え的に生成されるドメイン配列を接続する。このような可撓性リンカーは、当業者に公知である。例えば、ポリエチレングリコールリンカーは、ShearwaterPolymers,Inc.Huntsville,Alabamaから入手可能である。これらのリンカーは、必要に応じて、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能基結合を有する。調節ドメインへのZFPの共有結合に加えて、非共有法を用いて、調節ドメインと結合するZFPを有する分子を生成する。調節ドメインに加えて、しばしば、ZFPは、精製を容易にするため、発現をモニタリングするため、または細胞および亜細胞の局在をモニタリングするための、マルトース結合タンパク質MBP、グルタチオンSトランスフェラーゼGST、ヘキサヒスチジン、c-myc、およびFLAGエピトープのような融合タンパク質として発現される。ZFPをコードする核酸のための発現ベクター選択のZFPをコードする核酸は、代表的に、複製および/または発現のための例えば、Kdを決定するための原核生物細胞または真核生物細胞中に形質転換するための中間ベクター中にクローニングされる。中間ベクターは、代表的に、ZFPをコードする核酸またはタンパク質の産生の保存または操作のための原核生物ベクター例えば、プラスミドまたはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。ZFPをコードする核酸はまた、代表的には、植物細胞、動物細胞好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞へ投与するための発現ベクター中にクローニングされる。クローニングされた遺伝子または核酸の発現を得るために、ZFPは、代表的には、直接転写するためのプロモーターを含む発現ベクター中にサブクローニングされる。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモーターは、当該分野で周知であり、そして、例えば、Sambrookら、MolecularCloning、ALaboratoryManual第2版、1989;Kriegler、GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual1990;およびCurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelら、編、1994に記載される。ZFP発現のための細菌発現系は、例えば、E.coli、Bacillussp.およびSalmonellaPalvaら、Gene22:229-2351983において利用可能である。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該分野で周知であり、そしてまた市販されている。ZFP核酸の発現を指向するために用いられるプロモーターは、特定の適用に依存している。例えば、強力な構成性プロモーターは、代表的には、ZFPの発現および精製のために使用される。対照的に、ZFPが、遺伝子調節のためにインビボで投与される場合、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかがZFPの特定の使用に依存して、使用される。さらに、ZFPの投与のために好ましいプロモーターは、HSVTKのような弱いプロモーターまたは類似の活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターはまた、代表的には、トランス活性化に応答性の例えば、低酸素症応答エレメント、Gal4応答エレメント、lacリプレッサー応答エレメント、ならびにtet-調節系およびRU-486系のような低分子制御系エレメントを含み得る例えば、GossenおよびBujard、PNAS89:55471992;Oliginoら、GeneTher.5:491-4961998;Wangら、GeneTher.4:432-4411997;Neeringら、Blood88:1147-11551996;およびRendahlら、Nat.Biotechnol.16:757-7611998を参照のこと。プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的に、原核生物または真核生物のいずれかの宿主細胞において核酸の発現に要求される全てのさらなるエレメントを含む、転写単位または発現カセットを含む。従って、代表的な発現カセットは例えば、ZFPをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および例えば、転写、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結を効率的にポリアデニル化するために要求されるシグナルを含む。このカセットのさらなるエレメントは、例えば、エンハンサーおよび異種のスプライシングしたイントロンのシグナルを含み得る。遺伝的情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、ZFPの意図された使用例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関して選択される以下および実施例の節に記載の発現ベクターを参照のこと。標準的な細菌発現ベクターは、pBR322に基づいたプラスミドである、pSKF、pET23Dのようなプラスミド、ならびに市販されているGSTおよびLacZのような融合発現系を含む。好ましい融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質であるMBPである。このような融合タンパク質は、ZFPの精製に使用される。エピトープタグもまた、組換えタンパク質に添加され、発現をモニタリングするため、ならびに細胞および細胞下の局在化をモニタリングするための単離の簡便な方法を提供し得る例えば、c-mycまたはFLAG。真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、しばしば真核生物発現ベクター例えば、SV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン-バーウイルス由来のベクターにおいて使用される。他の例示的な真核生物ベクターは、pMSG、pAV009/A、pMTO10/A、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、およびSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンpolyhedrinプロモーター、または真核生物細胞において効率的な発現を示す他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターを含む。いくつかの発現系は、安定なトランスフェクト細胞株の選択のためのマーカーを有する例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ。高収率発現系はまた、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下でZFPコード配列を用いて、例えば、昆虫細胞へのバキュロウイルスベクターの使用に適切である。代表的に発現ベクターに含まれるエレメントはまた、E.coliにおいて機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域での独特の制限部位を含む。標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を産生し、次いでこのタンパク質は、標準的な技術を使用して精製される例えば、Colleyら、J.Biol.Chem.264:17619-176221989;GuidetoProteinPurification、MethodsinEnzymology、第182巻Deutscherら、1990。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換を、標準的な技術に従って行なう例えば、Morrison,J.Bact.132:349-3511977;Clark-CurtissおよびCurtiss、MethodsinEnzymology101:347-362Wuら編、1983。外来のヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の方法のいずれかを使用し得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび組みこみの両方、および宿主細胞への、クローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNA、または外来の他の遺伝物質の導入のための他の周知の方法のいずれかの使用が挙げられる例えば、Sambrookら、前出を参照のこと。特定の遺伝子操作手順が、選択したタンパク質を発現し得る宿主細胞に少なくとも1つの遺伝子を首尾よく導入し得るように使用されることのみが必要である。ZFPによる遺伝子発現の調節を決定するためのアッセイ種々のアッセイを使用して、ZFPによる遺伝子発現調節のレベルを決定し得る。特定のZFPの活性は、種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して、例えば、タンパク質レベルまたはmRNAレベル、産物レベル、酵素活性、腫瘍増殖;レポーター遺伝子の転写活性化または転写抑制;セカンドメッセンジャーレベル例えば、cGMP、cAMP、IP3、DAG、Ca2;サイトカインおよびホルモンの産生レベル;ならびに新生血管形成を測定することによって、例えば、イムノアッセイ例えば、抗体を用いるELISAおよび免疫組織化学アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ例えば、RNase保護、ノーザン、インサイチュハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ研究、比色定量アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍増殖アッセイ、表現型アッセイなどを使用して、評価され得る。ZFPは、初めに、例えば、293細胞、CHO細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞などの培養細胞を使用して、活性についてインビトロで試験され得る。好ましくは、ヒト細胞が使用される。ZFPは、しばしば、初めに、レポーター遺伝子を用いる一過性の発現系を使用して試験され、次いで標的内因性遺伝子の調節は、インビボおよびエキソビボの両方で、細胞および動物において試験される。ZFPは、細胞中で組換え発現され得るか、動物中に移植された細胞中で組換え発現され得るか、またはトランスジェニック動物中で組換え発現され得、そして以下に記載される送達ビヒクルを使用して動物または細胞にタンパク質として投与され得る。この細胞は、固定化され得るか、溶液中であり得るか、動物に注射され得るか、またはトランスジェニック動物または非トランスジェニック動物において天然に存在し得る。遺伝子発現の調節は、本明細書中に記載されるインビトロアッセイまたはインビボアッセイの1つを使用して試験される。サンプルまたはアッセイは、ZFPで処理され、そして試験化合物なしのコントロールサンプルと比較され、調節の範囲を調べる。上記のように、内因性遺伝子発現の調節について、ZFPは、代表的には200nM以下、より好ましくは100nM以下、より好ましくは50nM、最も好ましくは25nM以下のKdを有する。ZFPの効果は、上記の任意のパラメータのいずれかを試験することによって測定され得る。任意の適切な遺伝子発現変化、表現型変化、または生理学的変化を使用して、ZFPの影響を評価し得る。インタクトな細胞または動物を使用して機能的な結果を決定する場合、種々の効果例えば、腫瘍増殖、新生血管形成、ホルモン放出、公知および特徴付けされていない遺伝マーカーの両方の転写変化例えば、ノーザンブロットまたはオリゴヌクレオチドアレイ研究、細胞の代謝における変化例えば、細胞増殖またはpH変化、ならびに細胞内セカンドメッセンジャーの変化例えば、cGMPもまた測定し得る。内因性遺伝子発現のZFP調節についての好ましいアッセイは、インビトロで実行され得る。1つの好ましいインビトロアッセイの形式において、培養された細胞における内因性遺伝子発現のZFP調節は、ELISAアッセイを使用して、タンパク質産生を調べることによって測定される実施例VIおよびVIIを参照のこと。この試験サンプルは、空のベクターまたは別の遺伝子に標的化される無関連なZFPで処理したコントロール細胞と比較される。別の実施態様において、内因性遺伝子発現のZFP調節は、標的遺伝子のmRNA発現のレベルを測定することによってインビトロで決定される。遺伝子発現のレベルは、例えば、PCR、LCR、またはハイブリダイゼーションアッセイ例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、RNase保護、ドットブロッティングを使用する増幅を使用して測定される。RNase保護は、1つの実施態様において使用される実施例VIIIおよび図10を参照のこと。タンパク質またはmRNAのレベルは、本明細書中に記載されるような、標識された検出試薬例えば、蛍光標識核酸または放射性標識核酸、放射性標識抗体または酵素標識抗体などを直接的または間接的に使用して検出される。あるいは、レポーター遺伝子系は、レポーター遺伝子例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、CAT、またはβ-galに作動可能に連結された標的遺伝子プロモーターを使用して考案され得る。レポーター構築物は、代表的には、培養された細胞中に同時にトランスフェクトされる。選り抜きのZFPでの処置の後、レポーター遺伝子の転写、翻訳、または活性の量は、当業者に公知の標準的技術に従って測定される。内因性遺伝子発現のZFP調節をモニターするために有用な好ましいアッセイ形式の別の例は、インビボで実行される。このアッセイは、腫瘍促進遺伝子、新生血管形成のような腫瘍支持に関与する遺伝子例えば、VEGF、または腫瘍サプレッサー遺伝子を活性化する遺伝子例えば、p53の発現を阻害するZFPを調べるために特に有用である。このアッセイにおいて、選り抜きのZFPを発現する培養された腫瘍細胞は、免疫が損なわれたマウス例えば、無胸腺マウス、放射線照射されたマウス、またはSCIDマウスに皮下注射される。適切な長さの時間、好ましくは4~8週間後に、腫瘍増殖は、例えば、容積によってかまたはその2つの最も大きい寸法によって、そしてコントロールと比較されて測定される。実質的に有意な減少例えば、スチューデントt検定を使用を有する腫瘍は、阻害された増殖を有するといわれる。あるいは、腫瘍の新生血管形成の程度もまた測定し得る。内皮細胞特異的抗体を使用するイムノアッセイは、腫瘍において、腫瘍の血管新生および管の数について染色するするために使用される。管の数において、実質的に有意な減少を有する腫瘍例えば、スチューデントt検定を使用は、新生血管形成の阻害を有するといわれる。トランスジェニック動物および非トランスジェニック動物はまた、インビボで内因性遺伝子発現の調節を調べるための好ましい実施態様として使用される。トランスジェニック動物は、代表的に選り抜きのZFPを発現する。あるいは、選り抜きのZFPを一過性で発現する動物、またはZFPが送達ビヒクルにおいて投与されている動物が使用され得る。内因性遺伝子発現の調節は、本明細書中に記載されるアッセイのいずれか1つを使用して試験される。ZFPをコードする核酸および遺伝子治療従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法は、哺乳動物細胞または標的組織に、操作されたZFPをコードする核酸を導入するために使用され得る。このような方法は、ZFPをコードする核酸をインビトロで細胞に投与するために使用され得る。好ましくは、ZFPをコードする核酸は、インビボまたはエキソビボでの遺伝子治療の使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、DNAプラスミド、裸の核酸、および送達ビヒクル例えば、リポソームと複合化した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームであるかまたはゲノムに組み込まれるかのいずれかである、DNAウイルスおよびRNAウイルスを含む。遺伝子治療の手順の概説については、Anderson、Science256:808~8131992;NabelおよびFelgner、TIBTECH11:211~2171993;MitaniおよびCaskey、TIBTECH11:162~1661993;Dillon、TIBTECH11:167~1751993;Miller、Nature357:455~4601992;VanBrunt、Biotechnology610;1149~11541988;Vigne、RestorativeNeurologyandNeuroscience8:35~361995;KremerおよびPerricaudet、BritishMedicalBulletin511:31~441995;Haddadaら、CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunologyDoerflerおよびBohm編1995;ならびにYuら、GeneTherapy1:13~261994を参照のこと。操作されたZFPをコードする核酸の非ウイルス送達方法は、リポフェクション、マイクロインジェクション、バリスティックスBallistics、ビロソームvirosome、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸結合体、裸のDNA、人工ビリオン、および薬剤で増強されたDNAの取り込みを含む。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、米国特許第4,946,787号;および米国特許第4,897,355号に記載され、そしてリポフェクション試薬は、市販されている例えば、TransfectamTMおよびLipofectinTM。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションについて適切であるカチオン性脂質および中性脂質は、Felgner、WO91/17424、WO91/16024のカチオン性脂質および中性脂質を含む。送達は、細胞に対してかエキソビボ投与または標的組織インビボ投与に対してであり得る。免疫脂質複合体のような標的化リポソームを含む、脂質:核酸複合体の調製は、当業者に周知である例えば、Crystal,Science270:404~4101990;Blaeseら、CancerGeneTher.2:291~2971995;Behrら、BioconjugateChem.5:382~3891994;Remyら、BioconjugateChem.5:647~6541994;Gaoら、GeneTherapy2:710~7221995;Ahmadら、CancerRes.52:4817~48201992;米国特許第4,186,183号、同第4,217,344号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、および同第4,946,787号を参照のこと。操作されたZFPをコードする核酸の送達のためのRNAまたはDNAウイルスに基づく系の使用は、身体中の特定の細胞に対してウイルスを標的化して、そして核に搭載されるウイルスの輸送のための高度に発達したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者にインビボで直接投与され得るか、またはウイルスベクターは、インビトロで細胞を処置するために使用され得、そしてこの改変された細胞を患者にエキソビボで投与し得る。ZFPの送達のための従来のウイルスに基づく系は、遺伝子移入のための、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。ウイルスベクターは、現在、標的細胞および標的組織において、遺伝子移入の最も効果的かつ用途の広い方法である。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子移入方法を用いて可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期間の発現を生じる。さらに、高い遺伝子導入効率が、多数の異なる細胞型および標的組織で観察されている。レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化され得、標的細胞の潜在的な標的集団を広げる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し得、そして代表的には高いウイルス力価を生じ得るレトロウイルスベクターである。従って、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、6~10kbまでの外来配列についてパッケージング能力を有するシス作用性の長末端反復から構成される。最少のシス作用性LTRは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いでこれは、標的細胞中に治療用遺伝子を組み込み、永続的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広範に使用されるレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスMuLV、テナガザル白血病ウイルスGaLV、シミアン免疫不全ウイルスSIV、ヒト免疫不全ウイルスHIV、およびそれらの組合せに基づくレトロウイルスベクターを含む例えば、Buchscherら、J.Virol.66:2731~27391992Johannら、J.Virol.66:1635~16401992;Sommerfeltら、Virol.176:58~591990;Wilsonら、J.Virol.63:2374~23781989;Millerら、J.Virol.65:2220~22241991;PCT/US94/05700を参照のこと。ZFPの一過性の発現が好ましい場合の適用において、アデノウイルスに基づく系が、代表的に使用される。アデノウイルスに基づくベクターは、多数の細胞型において非常に高い形質導入効率であり得、そして細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生され得る。アデノ随伴ウイルスAAVベクターはまた、細胞に標的核酸を形質導入するために例えば、核酸およびペプチドのインビトロでの産生のために、およびインビボおよびエキソビボでの遺伝子治療手順のために使用される例えば、Westら、Virology160:38~471987;米国特許第4,797,368号;WO93/24641;Kotin、HumanGeneTherapy5:793~8011994;Muzyczka、J.Clin.Invest.94:13511994を参照のこと。組換えAAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号;Tratschinら、Mol.Cell.Biol.5:3251~32601985;Tratschinら、Mol.Cell.Biol.4:2072~20811984;HermonatおよびMuzyczka、PNAS81:6466~64701984;ならびにSamulskiら、J.Virol.63:03822~38281989を含む、多数の刊行物に記載される。特に、少なくとも6つのウイルスベクターのアプローチが、はるかに最も頻繁に使用される系のレトロウイルスベクターと共に、臨床試験において遺伝子移入に現在利用可能である。全てのこれらのウイルスベクターは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株中に挿入された遺伝子により欠損ベクターの補完を含むアプローチを利用する。pLASNおよびMFG-Sは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例であるDunbarら、Blood85:3048~3051995;kohnら、Nat.Med.1:1017~1021995;Malechら、PNAS94:2212133~121381997。PA317/pLASNは、遺伝子治療試験において使用された初めての治療用ベクターであった。Blaeseら、Science270:475~4801995。50以上の形質導入効率が、MFG-Sパッケージングベクターで観察されている。Ellemら、ImmunolImmunother.441:10~201997;Dranoffら、Hum.GeneTher.1:111~21997。組換えアデノ随伴ウイルスベクターrAAVは、欠損しかつ非病原性のパルボウイルスII型アデノ随伴ウイルスに基づく有望な代替的な遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するAAV145bpの反転した末端反復のみを保持するプラスミド由来である。形質導入された細胞のゲノム中への組込みに起因して、効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特性である。Wagnerら、Lancet351:91171702~31998、Kearnsら、GeneTher.9:748~551996。複製欠損組換えアデノウイルスベクターAdは、主に結腸癌の遺伝子治療に使用される。なぜなら、それらは、高力価で産生され得、そしてそれらは、多数の異なる細胞型に容易に感染するからである。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がAdE1a、E1b、およびE3遺伝子を置換するように操作される;続いて、複製欠損ベクターは、トランスで欠失した遺伝子機能を供給するヒト293細胞中で増殖される。Adベクターを、インビボで複数の型の組織に形質導入し得、これらの組織は、肝臓、腎臓および筋肉系の組織に見出される細胞のような、分裂しない分化した細胞を含む。従来のAdベクターは、大きい運搬能力を有する。臨床試験におけるAdベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いる抗腫瘍免疫化についてのポリヌクレオチド治療を含むStermanら、Hum.GeneTher.7:1083~91998。臨床試験における遺伝子移入についてのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例は、Roseneckerら、Infection24:15~101996;Stermanら、Hum.GeneTher.9:71083~10891998;Welshら、Hum.GeneTher.2:205~181995;Alvarezら、Hum.GeneTher.5:597~6131997;Topfら、GeneTher.5:507~5131998;Stermanら、Hum.GeneTher.7:1083~10891998を含む。パッケージング細胞は、宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする293細胞およびレトロウイルスをパッケージングするΨ2細胞またはPA317細胞が挙げられる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子中に核酸ベクターをパッケージングする産生細胞株により生成される。このベクターは、代表的に、パッケージングおよび宿主中への引き続く組込みに必要とされる最少ウイルス配列、発現されるべきタンパク質についての発現カセットにより置換されている他のウイルス配列を含む。この欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によりトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるAAVベクターは、代表的に、AAVゲノム由来のITR配列を有するのみであり、このITR配列は、パッケージングおよび宿主ゲノム中への組込みに必要とされる。ウイルスDNAは、他のAAV遺伝子、すなわちrepおよびcapをコードするが、ITR配列を欠いている、ヘルパープラスミドを含む、細胞株中でパッケージングされる。この細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスを用いて感染される。このヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミド由来のAAV遺伝子の複製を促進する。ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠損に起因して、有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスの汚染は、例えば、アデノウイルスがAAVよりも感受性である熱処理により減少され得る。多数の遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターが特定の組織型に高い程度の特異性で送達されることが所望される。ウイルスベクターは、代表的には、ウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドをウイルス外表面上に発現することによって所定の細胞型に対して特異性を有するように改変される。このリガンドは、目的の細胞型上に提示されることが公知であるレセプターに対して親和性を有するように選択される。例えば、Hanら、PNAS92:9747~97511995は、Moloneyマウス白血病ウイルスが、gp70に融合されたヒトヘレグリンheregulinを発現するように改変され得、そしてこの組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子レセプターを発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原則は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスおよびレセプターを発現する標的細胞の他の対にまで及び得る。例えば、糸状ファージは、実質的に任意の選択された細胞レセプターに対して特異的な結合親和性を有する抗体フラグメント例えば、FABまたはFvを提示するように操作され得る。上記の記載は、主にウイルスベクターに適用するが、同じ原則が非ウイルスベクターに適用され得る。このようなベクターは、特定の標的細胞により好ましく取り込まれると考えられる特定の取り込み配列を含むように操作され得る。遺伝子治療ベクターは、インビボで、個々の患者に投与することによって、代表的には、以下に記載されるような、全身投与例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内の注射または局所適用によって送達され得る。あるいは、ベクターは、エキソビボで、個々の患者から外稙された細胞例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検または一般のドナー造血幹細胞のような細胞に送達され得、次いで、通常はベクターを組み込んだ細胞について選択した後に、患者に細胞を再移植する。診断、研究、または遺伝子治療のためのエキソビボでの細胞のトランスフェクション例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入を介するは、当業者に周知である。好ましい実施態様において、細胞は、被検生物から単離され、ZFPの核酸遺伝子またはcDNAでトランスフェクトされ、そして被検生物例えば、患者に再注入される。エキソビボでのトランスフェクションに適切な種々の細胞型は、当業者に周知である例えば、Freshneyら、CultureofAnimalCells、AManualofBasicTechnique第3版、1994および患者由来の細胞を単離しそして培養する方法の議論についてその中で引用される参考文献を参照のこと。1つの実施態様において、幹細胞は、細胞のトランスフェクションおよび遺伝子治療についてのエキソビボでの手順に使用される。幹細胞を使用する利点は、幹細胞がインビトロで他の細胞型に分化され得ること、または哺乳動物に導入され得る例えば、細胞のドナーここでこれらは骨髄中に移植させるということである。GM-CSF、IFN-γおよびTNF-αのようなサイトカインを使用して、CD34細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞型に分化させる方法は、公知であるInabaら、J.Exp.Med.176:1693~17021992を参照のこと。幹細胞は、公知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、所望されない細胞例えば、CD4およびCD8T細胞、CD45全てのpanB細胞、GR-1顆粒球、およびIad分化した抗原提示細胞を結合する抗体と骨髄細胞をパニングすることによって、骨髄細胞から単離されるInabaら、J.Exp.Med.176:1693~17021992を参照のこと。治療用ZFP核酸を含むベクター例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなどはまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接的に投与され得る。あるいは、裸のDNAが投与され得る。投与は、血液または組織の細胞との最終的な接触中に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。このような核酸を投与する適切な方法は、利用可能でありかつ当業者に周知であり、そして特定の組成物を投与するために、1以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、しばしば、別の経路よりも迅速かつ効果的な反応を提供する。薬学的に受容可能なキャリアは、投与されている特定の組成物によって、ならびにこの組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。従って、以下に記載されるように、本発明の薬学的組成物の広範な種々の適切な処方物が存在する例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences、第17版、1989を参照のこと。ZFPについての送達ビヒクルポリペプチド化合物例えば、ZFPの投与における重要な因子は、このポリペプチドが細胞の形質膜、または核のような細胞内区画の膜を横切る能力を有することを確実にすることである。細胞膜は、非イオン性の脂溶性低分子に対して自由に透過性であり、かつ極性化合物、巨大分子、および治療剤または診断剤に対して固有に不透過性である、脂質タンパク質の二重層から構成される。しかし、細胞膜を横切るZFPのようなポリペプチドを輸送する能力を有する、タンパク質およびリポソームのような他の化合物が記載されている。例えば、膜輸送ポリペプチドは、膜輸送キャリアとして作用する能力を有する両親媒性または疎水性のアミノ酸部分配列を有する。1つの実施態様において、ホメオドメインタンパク質は、細胞膜を横切って輸送する能力を有する。ホメオドメインタンパク質の最も短い内部移行可能なペプチドであるアンテナペディアAnntennapediaは、タンパク質の第3のヘリックスであることが見出されたアミノ酸43位~58位例えば、Prochiantz、CurrentOpinioninNeurobiology6:629~6341996を参照のこと。別の部分配列である、シグナルペプチドのh疎水性ドメインは、類似の細胞膜輸送の特徴を有することが見出されている例えば、Linら、J.Biol.Chem.270:14255~142581995を参照のこと。細胞中へのZFPの取り込みを促進するための、本発明のZFPに連結され得るペプチド配列の例は、以下を含むがこれらに限定されない:HIVのtatタンパク質の11アミノ酸のペプチド;p16タンパク質のアミノ酸84~103に対応する20残基のペプチド配列Fahraeusら、CurrentBiology6:841996を参照のこと;アンテナペディアの60アミノ酸長のホメオドメインの第3のヘリックスDerossiら、J.Biol.Chem.269:104441994;カポジ線維芽細胞増殖因子K-FGFh領域のようなシグナルペプチドのh領域Linら、前出;またはHSV由来のVP22輸送ドメインElliotおよびO’Hare、Cell88:223~2331997。細胞取り込みの増強を提供する他の適切な化学部分もまた、ZFPに化学的に連結され得る。毒素分子もまた、細胞膜を横切ってポリペプチドを輸送する能力を有する。しばしば、このような分子は、少なくとも2つの部分2要素毒素と呼ばれる:輸送または結合のドメインまたはポリペプチドおよび別々の毒素ドメインまたはポリペプチドから構成される。代表的には、輸送ドメインまたは輸送ポリペプチドは、細胞レセプターに結合して、次いで毒素が細胞中に輸送される。いくつかの細菌毒素ClostridiumPerfringensイオータ毒素、ジフテリア毒素DT、Pseudomonas外毒素APE、百日咳毒素PT、BacillusAnthracis毒素、および百日咳アデニレートシクラーゼCYAを含むは、内部融合物またはアミノ末端融合物として細胞のサイトゾルにペプチドを送達する試みにおいて使用されているAroraら、J.Biol.Chem.268:3334~33411993;Perelleら、Infect.Immun.、61:5147~51561993;Stenmarkら、J.CellBiol.113:1025~10321991;Donnellyら、PNAS90:3530~35341993;Carbonettiら、Abstr.Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.95:2951995;Seboら、Infect.Immun.63:3851~38571995;Klimpelら、PNASU.S.A.89:10277~102811992;およびNovakら、J.Biol.Chem.267:17186~171931992。このような部分配列は、細胞膜を横切ってZFPを輸送するために使用され得る。ZFPは、このような配列と都合よく融合され得るか、またはこれを用いて誘導体化され得る。代表的には、この輸送配列は、融合タンパク質の一部として提供される。必要に応じて、リンカーは、ZFPおよび輸送配列に連結するために使用され得る。任意の適切なリンカー例えば、ペプチドリンカーが使用され得る。ZFPはまた、リポソームおよびイムノリポソームのようなリポソーム誘導体を介して、動物細胞に、好ましくは哺乳動物細胞中に導入され得る。用語リポソームとは、水相を包み込む、1以上の同心性の状態の脂質二重層から構成される小胞をいう。水相は、代表的に、細胞に送達されるべき化合物すなわち、ZFPを含む。リポソームは、形質膜と融合して、それによってサイトゾル中に薬物を放出する。あるいは、リポソームは、食細胞化されるかまたは輸送小胞の状態で細胞によって取り込まれる。リポソームは、一旦エンドソームまたは食胞において、輸送小胞の膜を分解するか、またはこれと融合するかのいずれかであり、そしてその内容物を放出する。リポソームを介する薬物送達の現在の方法において、リポソームは、最終的には透過性になり、そして包み込まれた化合物この場合は、ZFPを、標的組織または標的細胞で放出する。全身送達または組織特異的送達のために、これは、例えば、受動的な様式ここでこのリポソーム二重層は、身体中の種々の因子の作用を介して経時的に分解するにおいて達成され得る。あるいは、能動的な薬物放出は、リポソーム小胞において透過性の変化を誘導する因子を使用する工程を含み得る。リポソーム膜は、リポソーム膜の近くの環境が酸性になる場合、不安定になるように、構築され得る例えば、PNAS84:78511987;Biochemistry28:9081989を参照のこと。リポソームが、標的細胞によってエンドサイトーシスされる場合、例えば、リポソームは、不安定になり、そしてそれらの内容物を放出する。この不安定化は、フゾジェネシスfusogenesisと呼ばれる。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPEは、多数のフゾジェネシス系の基礎である。このようなリポソームは、代表的には、ZFPおよび脂質成分例えば、中性脂質および/またはカチオン性脂質、必要に応じて、所定の細胞表面レセプターまたはリガンドに結合する抗体のような、レセプター認識分子例えば、抗原を含むを包含する。以下に記載されるようなリポソームを調製するための種々の方法が利用可能である:例えば、Szokaら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:4671980、米国特許第4,186,183号、同第4,217,344号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、同第4,946,787号、PCT公開番号WO91/17424、DeamerおよびBangham、Biochem.Biophys.Acta443:629~6341976;Fraleyら、PNAS76:3348~33521979;Hopeら、Biochim.Biophys.Acta812:55~651985;Mayerら、Biochim.Biophys.Acta858:161~1681986;Williamsら、PNAS85:242~2461988;LiposomesOstro編、1983、第1章;Hopeら、Chem.Phys.Lip.40:891986;Gregoriadis、LiposomeTechnology1984およびLasic、Liposemes:fromPhysicstoApplications1993。適切な方法は、例えば、超音波破砕、排出、高圧/ホモジネーション、微量流動化、洗剤透析、小さなリポソーム小胞のカルシウム誘導性融合およびエーテル融合方法これらの全ては、当該分野において周知であるを含む。本発明の特定の実施態様において、特定の細胞型、組織などに特異的な標的部分を使用して、本発明のリポソームを標的化することが所望される。種々の標的部分例えば、リガンド、レセプター、およびモノクローナル抗体を使用するリポソームの標的化は、以前に記載されている例えば、米国特許第4,957,773号および同第4,603,044号を参照のこと。標的部分の例は、新生物に関連した抗原例えば、前立腺癌特異的抗原およびMAGEに特異的なモノクローナル抗体を含む。腫瘍はまた、癌遺伝子例えば、rasまたはc-erbB2の活性化または過剰発現から生じる遺伝子産物を検出することによって診断され得る。さらに、多数の腫瘍は、胎児組織により通常発現される抗原例えば、αフェトプロテインAFPおよび癌胎児性抗原CEAを発現する。ウイルス感染の部位は、種々のウイルス抗原例えば、B型肝炎コア抗原および表面抗原HBVc、HBVs、C型肝炎抗原、エプスタイン-バーウイルス抗原、1型ヒト免疫不全ウイルスHIV1およびパピローマウイルス抗原を使用して診断され得る。炎症は、インテグリン例えば、VCAM-1、セレクチンレセプター例えば、ELAM-1などのような、炎症の部位で発現される表面分子により特異的に認識される分子を使用して検出され得る。リポソームを標的剤と共役させるための標準的な方法が使用され得る。これらの方法は、一般に、標的因子、または誘導体化された脂溶性化合物例えば、脂質誘導体化ブレオマイシンの付着に対して活性化され得る、リポソーム脂質成分例えば、ホスファチジルエタノールアミン中への組込みを含む。抗体標的化リポソームは、例えば、プロテインAを組み込むリポソームを使用して構築され得るRenneisenら、J.Biol.Chem.265:16337~163421990およびLeonettiら、PNAS87:2448~24511990を参照のこと。ZFPの用量ZFPの治療的適用のために、本発明の状況において患者に投与される用量は、経時的に患者において有益な治療的応答をもたらすのに充分であるべきである。さらに、特定の投与レジメが、実験設定例えば、機能的ゲノム研究における設定、および細胞または動物モデルにおける設定における表現型の変化を決定するために有用であり得る。用量は、用いられる特定のZFPの効力およびKd、標的細胞の核の容量、および患者の状態、ならびに処置される患者の体重または表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の患者における特定の化合物もしくはベクターの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。標的部位に対する約99の結合のための、治療的に有効なZFPの最大の投与量は、細胞1個あたり特異的なZFP分子の約1.5×105~1.5×106コピーより少ない範囲にあると計算される。この結合のレベルのための細胞1個あたりのZFPの数は、以下のように、HeLa細胞核の容量約1000μm3または1012L;CellBiology、AltmanおよびKatz、編1976を用いて計算される。HeLa核は比較的大きいので、この投与量の数は、必要な場合、標的細胞の核の容量を使用して再計算される。この計算はまた、他の部位によるZFP結合との競合を考慮しない。この計算はまた、基本的にすべてのZFPが核に局在化されると仮定している。100×Kdの値が、標的部位に対する約99の結合を計算するために使用され、そして10×Kdの値が、標的部位に対する約90の結合を計算するために使用される。例えば、Kd=25nMでは、ZFPをコードする発現ベクターの適切な用量はまた、プロモーターからのZFP発現の平均速度および細胞内のZFP分解の平均速度をを考慮することによって計算され得る。好ましくは、野生型または変異体HSVTKのような弱いプロモーターが、上記のように使用される。マイクログラムのZFPの用量は、利用される特定のZFPの分子量を考慮に入れることによって計算される。疾患の処置または予防において投与されるZFPの有効量を決定するうえで、医師は、ZFPまたはZFPをコードする核酸の循環の血漿レベル、潜在的なZFP毒性、疾患の進行、および抗ZFP抗体の産生を評価する。投与は、単回用量、または分割した用量で達成され得る。薬学的組成物および投与ZFPおよびZFPをコードする発現ベクターは、遺伝子発現の調節のために、そして治療的または予防的適用例えば、癌、虚血、糖尿病性網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチ、乾癬、HIV感染、鎌状赤血球貧血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管疾患、嚢胞性線維症、発作などのために、患者に直接的に投与され得る。ZFP遺伝子治療によって阻害され得る微生物の例は以下を含む:病原性細菌例えば、クラミジア、リケッチア属細菌、ミコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌およびconococci、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、シュードモナス属、レジオネラ属、ジフテリア菌、サルモネラ菌、バシラス属、コレラ菌、破傷風菌、ボツヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ菌、およびライム病細菌;感染性真菌例えば、Aspergillus種、Candida種;胞子虫のような原生動物例えば、Plasmodia、根足虫例えば、Entamoebaおよび鞭毛動物Trypanosoma、Leishmania、Trichomonas、Giardiaなど;ウイルス性疾患例えば、肝炎A型、B型、またはC型、ヘルペスウイルス例えば、VZV、HSV-1、HSV-6、HSV-II、CMV、およびEBV、HIV、エボラ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、ECHOウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルスcornovirus、RSウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ならびにアルボウイルス性脳炎ウイルスなど。治療的に有効な量の投与は、ZFPを導入して、処置される組織に最終的に接触させるために、通常使用される経路のいずれかによる。ZFPは、任意の適切な様式で、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアとともに投与され得る。このような調節物の適切な投与方法は、当業者に利用可能でありかつ周知であり、そして1を超える経路が特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路は、別の経路よりもより直接的な、そしてより効果的な反応をしばしば提供し得る。薬学的に受容可能なキャリアは、部分的には、投与される特定の組成物、および、その組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、本発明の薬学的組成物の種々の広範な適切な処方が存在する例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences、第17版、1985を参照のこと。ZFPは、単独でまたは他の適切な組成物と組み合わせて、吸入を介して投与されるためのエアロゾル処方物すなわち、それらは霧状にされ得るに作られ得る。エアロゾル処方物は、加圧した受容可能な噴霧剤例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など中に配置され得る。非経口的投与例えば、静脈内、筋肉内、皮内および皮下経路によるようなのための適切な処方物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図されたレシピエントの血液と等張性である処方物を与える溶質を含み得る、水溶性および非水溶性の等張性滅菌注入溶液、ならびに懸濁剤、溶解剤、濃化剤、安定剤、および保存剤を含み得る水溶性および非水溶性滅菌懸濁液を含む。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注入、経口的、局所的、腹腔内、膀胱内、または鞘内によって投与され得る。化合物の処方は、単位用量または多用量を封入した容器例えば、アンプルまたはバイアル中に提供され得る。注入溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。植物における遺伝子発現の調節ZFPは、例えば、病気に対する抵抗力の増加、構造的ポリサッカライドおよび貯蔵ポリサッカライドの改変、香り、タンパク質、および脂肪酸、果実成熟、収量、色、栄養的特性、貯蔵能の改善などのような形質について植物を操作するために使用され得る。特に、油脂産生の増強のための作物種の操作例えば、脂肪種子において産生される脂肪酸の改変が、目的のものである。脂肪種子は、主に脂肪酸のグリセロールエステルであるトリアシルグリセロールTAGからなる。これらの植物性油脂の商業的生産は、主に6つの主要な油脂作物ダイズ、油ヤシ、アブラナ、ヒマワリ、綿実、およびピーナッツによって占められる。植物性油脂は、マーガリン、ショートニング、サラダオイル、およびフライ用オイルとして、人間が消費するために優勢的に90使用される。残りの10が、非食料的な適用例えば、潤滑剤、油化学物質oleochemical、化石燃料、洗剤、および他の工業的適用のために使用される。これらの適用のそれぞれにおいて使用されるオイルの所望の特性は、特にTAGを形作る脂肪酸において存在する鎖の長さおよび二重結合の数によって広範に変動する。これらの特性は、膜の流動性および温度感受性を制御するために植物によって操作される。これらの同じ特性は、ZFPを使用して、食料用途および工業的用途のために改善された特性を有するオイルを産生するように制御され得る。脂肪種子作物のTAGにおける主要な脂肪酸は、16~18炭素長であり、そして0~3つの二重結合を含む。パルミチン酸16:0[16個の炭素:0個の二重結合]、オレイン酸18:1、リノール酸18:2、およびリノレン酸18:3が優勢である。二重結合の数、または飽和の程度は、得られるオイルの融点、反応性、料理の効率、および健康特性を決定する。オレイン酸18:1のリノール酸18:2次いでこれは、18:3形成のための前駆体であるへの転換の原因である酵素は、ω-6デサチュラーゼとも呼ばれるΔ12-オレイン酸デサチュラーゼである。脂肪酸不飽和化経路のこの段階のブロックは、ポリ不飽和油脂の支出におけるオレイン酸の蓄積を生じるはずである。1つの実施態様において、ZFPは、ダイズにおけるFAD2-1遺伝子の発現を調節するために使用される。ミクロソームのΔ6デサチュラーゼをコードする2つの遺伝子が、最近ダイズからクローニングされ、そしてFAD2-1およびFAD2-2と呼ばれるHeppardら、PlantPhysiol.110:311~3191996。FAD2-1Δ12デサチュラーゼは、ダイズ種子中のオレイン酸不飽和化の大部分を制御するようである。従って、ZFPは植物においてFAD2-1の遺伝子発現を調節するために使用され得る。具体的には、脂肪種子中のオレイン酸18:1の蓄積を増加させるために、ZFPが使用され、ダイズにおけるFAD2-1遺伝子の発現を阻害し得る。さらに、ZFPは、例えば以下のような任意の他の植物遺伝子の発現を調節するために使用され得る:Δ9-デサチュラーゼ、他の植物由来のΔ-12デサチュラーゼ、Δ-15デサチュラーゼ、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、アシル-ACP-チオエステラーゼ、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ、デンプンシンターゼ、セルロースシンターゼ、スクロースシンターゼ、老化関連遺伝子、重金属キレート因子、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、EPSPシンターゼ、植物ウイルス遺伝子、植物真菌病原体遺伝子、および植物細菌病原体遺伝子。植物細胞の形質転換に適切な組換えDNAベクターはまた、植物細胞に本発明のZFPを送達するために使用される。広範な種々の高等植物種を形質転換するための技術は周知であり、そして技術的および科学的文献に記載されている例えば、Weisingら、Ann.Rev.Genet.22:421~4771988を参照のこと。所望のZFPをコードするDNA配列は、形質転換植物の意図された組織中でのZFPの転写を方向付ける、転写および翻訳開始調節配列と組み合わせられる。例えば、再生された植物のすべての組織におけるZFPの発現を方向付ける植物プロモーターフラグメントが使用され得る。このようなプロモーターは、本明細書中では構成的プロモーターといい、そして大部分の環境条件下および発生または細胞分化の状態で活性である。構成的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルスCaMV35S転写開始領域、AgrobacteriumtumefaciensのT-DNA由来の1’-または2’-プロモーター、および当業者に公知の種々の植物遺伝子由来の他の転写開始領域を含む。あるいは、植物プロモーターは、特定の組織中でZFPの発現を方向付け得るか、またはさもなくばより正確な環境的または発生的制御のもとにあり得る。このようなプロモーターは、本明細書では誘導性プロモーターという。誘導性プロモーターによって転写をもたらし得る環境条件の例としては、嫌気的条件または光の存在が挙げられる。発生的制御のもとでのプロモーターの例としては、特定の組織例えば、果実、種子、または花においてのみ転写を開始するプロモーターが含まれる。例えば、ポリガラクツロナーゼプロモーターの使用は、果実においてZFPの発現を方向付け得、CHS-Aペチュニア由来のカルコンシンターゼAプロモーターは、植物の花におけるZFPの発現を方向付け得る。ZFP配列を含むベクターは、代表的には、植物細胞上で選択可能な表現型を与えるマーカー遺伝子を含む。例えば、このマーカーは、殺生物剤耐性、特に抗生物質耐性例えば、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシンに対する耐性または除草剤耐性例えば、クロロスルホロンまたはBastaに対する耐性をコードし得る。このようなDNA構築物は、種々の従来の技術によって所望の宿主植物のゲノムに導入され得る。例えば、このDNA構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような技術を使用して、植物細胞のゲノムDNAに直接導入され得るか、またはこのDNA構築物は、DNA粒子ボンバードメントのような弾道的方法を使用して、植物組織に直接導入され得る。あるいは、このDNA構築物は、適切なT-DNA隣接領域と組み合わせられ得、そして従来のAgrobacteriumtumefaciens宿主ベクターに導入され得る。細胞が細菌によって感染される場合、Agrobacteriumtumefaciens宿主の病原性機能が、この構築物および隣接するマーカーの植物細胞DNAへの挿入を方向付ける。マイクロインジェクション技術は当該分野で公知であり、そして科学的文献および特許文献において充分に記載されている。ポリエチレングリコール沈澱を使用するDNA構築物の導入は、Paszkowskiら、EMBOJ.3:2717~27221984において記載されている。エレクトロポレーション技術は、Frommら、PNAS82:58241985において記載されている。弾道的形質転換技術は、Kleinら、Nature327:70~731987において記載されている。Agrobacteriumtumefaciens媒介形質転換技術は、科学文献に充分に記載されている例えば、Horschら、Science233:496~4981984;およびFraleyら、PNAS80:48031983を参照のこと。上記の形質転換技術のいずれかによって得られる形質転換された植物細胞は、培養されて、形質転換された遺伝子型、従って所望のZFP制御表現型を有する植物全体が再生され得る。このような再生技術は、組織培養増殖培地への特定の植物ホルモンの操作に頼っており、代表的には、ZFPヌクレオチド配列とともに導入された殺生物剤および/または除草剤マーカーに頼っている。培養されたプロトプラストからの植物の再生は、Evansら、ProtoplastsIsolationandCulture,HandbookofPlantCellCulture、124~176頁1983;およびBinding、RegenerationofPlants、PlantProtolasts、21~73頁1985に記載される。再生はまた、植物カルス、外植体、器官、またはそれらの一部から得られ得る。このような再生技術は、一般的には、Kleeら、Ann.Rev.ofPlantPhys.38:467~4861987において記載される。機能的ゲノムアッセイZFPはまた、表現型の結果および遺伝子発現の機能を決定するためのアッセイについての使用を有する。分析技術における近年の進歩は、集中された大量の配列決定focussedmasssequencingの努力と合わせて、以前に利用可能であったものよりもずっと多い分子標的を同定および特徴付ける機会を作り出した。遺伝子およびそれらの機能に関するこの新しい情報は、基礎的な生物学的な理解とともに加速し、そして治療的介入のための多くの新しい標的を提供する。いくつかの場合において、分析の手段は、新しいデータの生成と歩調を合わせない。1つの例は、全体の示差的な遺伝子発現の測定における近年の進歩によって提供される。これらの方法は、遺伝子発現マイクロアレイ、示差的cDNAクローニング頻度、差引きハイブリダイゼーションおよびディファレンシャルディスプレイ法によって代表され、異なる組織でアップレギュレートされるか、またはダウンレギュレートされる遺伝子、あるいは特定の刺激に応答する遺伝子を非常に迅速に同定し得る。このような方法は、形質転換、腫瘍の進行、炎症応答、神経障害などのような生物学的プロセスを探索するためにますます使用されつつある。所定の生理学的な現象と相関する、示差的に発現された遺伝子の長いリストを今や非常に容易に生成し得るが、これは、個々の示差的に発現された遺伝子とその現象との間の原因となる関係が難しいということを実証する。今日まで、示差的に発現された遺伝子に機能を割り当てる簡単な方法は、示差的な遺伝子発現をモニタリングする能力と歩調を合わせてこなかった。従来の分子的アプローチを使用して、候補遺伝子の過剰発現は、全長cDNAをクローニングすること、それを哺乳動物発現ベクターへサブクローニングすること、およびその組換えベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすることによって達成され得る。このアプローチは、直線的であるが労働集約的である特に最初の候補遺伝子が単純な発現配列タグESTによって表された場合。従来的な方法による候補遺伝子の発現のもとでは、なおより問題である。アンチセンス手法および標的化されたリボザイムに頼る方法は信頼できず、選択された標的の小さな画分のみについて成功する。相同組換えによる遺伝子ノックアウトは、組換えを生じる幹細胞においてかなり良好に機能するが、体細胞由来の細胞株においては非常に非効率的である。いずれの場合においても、同系のゲノムDNAの大きなクローン10kbのオーダーが、効率よく機能する組換えのために単離されるべきである。ZFP技術は、示差的遺伝子発現研究を迅速に分析するために使用され得る。操作されたZFPは、任意の内因性標的遺伝子をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするために容易に使用され得る。非常に少ない配列情報が、遺伝子特異的なDNA結合ドメインを作製するために要求される。このことは、ZFP技術を、特徴付けが乏しい示差的に発現された遺伝子の長いリストの分析のために理想的にする。各々の候補遺伝子についてジンクフィンガーに基づくDNA結合ドメインを単に築き得、キメラをアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションする人工の転写因子を作製し得、そしてモデル系において一度に候補遺伝子をオンまたはオフにスイッチングすることによる研究形質転換、サイトカインに対する応答などのもとでの表現型のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの結果を試験し得る。操作されたZFPを使用してゲノムデータに機能的な情報を追加するこの特異的な例は、単なる例示に過ぎない。遺伝子単数または複数の特異的なアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションから利益を得る任意の実験的状況は、操作されたZFPの信頼度および使用の容易さから利益を受け得る。さらに、より従来的な方法によって達成され得るものよりもより大きい実験的制御が、ZFPによって与えられ得る。これは、操作されたZFPの産生および/または機能が、低分子制御の下に置かれ得るからである。このアプローチの例は、Tet-Onシステムエクジソンによって調節されるシステムおよび変異プロゲステロンレセプターを含むキメラ因子を組み込んだシステムによって提供される。これらのシステムはすべて、低分子制御下にあるZFPレギュレーターの機能および/または発現を配置することによって、任意の内在性の目的の遺伝子および任意の導入遺伝子上の低分子制御を間接的に与え得る。トランスジェニックマウスZFP技術のさらなる適用は、トランスジェニック動物における遺伝子発現を操作することである。細胞株を用いる場合、内在性遺伝子の過剰発現または異種遺伝子のトランスジェニック動物例えば、トランスジェニックマウスへの導入は、かなり直線的なプロセスである。ZFP技術は、これらの型の方法の改善である。なぜなら、研究対象の遺伝子の全長cDNAクローンを産生する必要性を回避し得るからである。同様に、細胞に基づく系を用いる場合、トランスジェニック動物における遺伝子発現の従来的なダウンレギュレーションは、技術的な困難さによって悩まされる。相同組換えによる遺伝子ノックアウトは、現在最も一般的に適用される方法である。この方法は、ノックアウトされる遺伝子の比較的長いゲノムクローン約10kbを必要とする。代表的には、選択マーカーは、遺伝子の破壊をもたらすために目的の遺伝子のエキソンに挿入され、そして第2のカウンター選択マーカーが、非相同組換え体に対して相同組換え体を選択するための相同性領域の外側に提供される。この構築物は、胚性幹細胞にトランスフェクトされ、そして培養中に組換え体が選択される。組換え幹細胞は、非常に初期の胚と組合わせて、キメラ動物を生成する。キメラ現象が生殖系列にまで及ぶ場合、ホモ接合性のノックアウト動物は、戻し交配によって単離され得る。この技術が首尾よく適用される場合、ノックアウト動物は約1年間で生成され得る。不運にも2つの共通した問題がしばしばノックアウト技術の首尾よい適用を妨害する;胚の致死性および発生的補償である。胚の致死性は、ノックアウトされる遺伝子が発生において本質的な役割を果たす場合に生じる。これは、それ自体がキメラ現象の欠如、生殖系列の伝達の欠如、またはホモ接合性の戻し交配を生成することの不可能性を明らかにし得る。遺伝子は、成体の動物に対して、発生の期間中に有意に異なる生理学的役割を果たし得る。従って、胚の致死性は、成体における治療的介入のために有用な標的としての遺伝子標的を退けるための理論的根拠とは考えられない。胚の致死性は、最も頻繁には、従来的な方法を用いて、マウスモデル中で目的の遺伝子が容易に研究され得ない、単なる手段である。発生的補償は、ノックアウトされる遺伝子産物の代わりの関連する遺伝子産物の置換である。遺伝子はしばしば、広範なファミリーで存在する。発生の過程の間の選択または誘導は、いくつかの場合において、別の変異体メンバーの代わりに1つのファミリーメンバーの置換を引き起こし得る。この型の機能的置換は、成体動物においては可能でないかもしれない。発生的補償の代表的な結果は、成体におけるこの遺伝子の機能の除去が、さもなければ生理的変化を引き起こす場合の、ノックアウトマウスにおける表現型の欠如である。これは、従来的なノックアウトマウスモデルの解釈をしばしば混乱させる、ある種の間違ったネガティブな結果である。いくつかの新しい方法が、胚の致死性を回避するために開発されてきた。これらの方法は、creリコンビナーゼおよびloxDNA認識エレメントを使用するアプローチによって代表される。その認識エレメントは、発生後の成体マウスにおいて、相同組換え上記のようなおよび誘導されたリコンビナーゼの発現を用いて、目的の遺伝子に挿入される。これは、標的遺伝子の一部の欠失を引き起こし、そして発生的な複雑さを回避する。この方法は、労働集約的であり、そしてリコンビナーゼの非均一的な誘導によるキメラ現象に悩まされる。遺伝子発現を操作するために操作されたZFPの使用は、以前の節に記載された低分子により調節される系を用いて、成体動物に限定され得る。ジンクフィンガーに基づくリプレッサーの発現/機能は、発生の間にスイッチを切り得、そして成体動物において随意にスイッチを入れ得る。このアプローチは、ZFP発現モジュールの付加のみに頼っている;相同組換えは必要とされない。ZFPリプレッサーはトランスでドミナントであるので、生殖系列伝達またはホモ接合性について関係がない。これらの問題は、マウスモデルに対する特徴付けが乏しい遺伝子の候補cDNAまたはESTクローンから出発するために必要とされる時間および労力に劇的に影響する。この能力は、治療的介入のための遺伝子標的を迅速に同定および/または確認し、新規なモデル系を生成し、そして複雑な生理的現象発生、造血、形質転換、神経機能などを分析するために使用され得る。キメラ標的化マウスは、Hoganら、ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboraroryManual、1988;TeratocarcinomasandEmbryonicStemCells:APracticalApproach、Robertson、編、1987;およびCapecchiら、Science244:12881989に従って得られ得る。本明細書中に引用される全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個別に参考として援用されることが示されるように、本明細書中に参考として援用される。前述の発明は、理解の明確さの目的のために例証および実例によっていくぶん詳細に記載してきたけれども、本発明の教示を考慮して、添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、特定の変更および改変が本発明に対してなされ得ることは、当業者にとって容易に明らかである。以下の実施例は、例証の目的のみのために提供され、限定する目的ではない。当業者は、変更または改変されて基本的に類似した結果を生じ得る種々の決定的ではないパラメータを容易に認識する。実施例I:ヒトVEGF遺伝子に対して標的化されるZFPの設計および試験この第1の実施例は、ヒト血管内皮増殖因子VEGF遺伝子のプロモーターに含まれるDNA配列を認識するように設計されるZFPの構築を実証する。VEGFは、約46kDaの糖タンパク質であり、これは低酸素によって誘導される内皮細胞特異的マイトジェンである。VEGFは、癌、種々の網膜症、および他の重篤な疾患に関連する新脈管形成に関連している。選択されたDNA標的部位は、遺伝子の転写開始部位を取り囲む領域であった。選択された2つの9塩基対bp部位は、配列agcGGGGAGGATcGCGGAGGCTtggここで、大文字は、実際の9bpの標的物を表す内に見出される。9bp上流の標的物を標的化するタンパク質をVEGF1と示し、そして9bp下流の標的物を標的化するタンパク質をVEGF3aと示した。VEGFについての主な転写開始部位は、第1の9bp標的物の3’末端のTであり、これは上記配列の下線部である。ヒトSP-1転写因子を前駆体分子として、設計されたZFPの構築のために使用した。SP-1は、よく研究されたマウスZif268に関連する、3フィンガーDNA結合ドメインを有するChristyら、PNAS85:7857-78611988。このドメインを使用した部位特異的変異誘発実験は、Zif268において作動する提案された認識規則が用いられてSP-1を他の標的DNA配列に適応させ得ることを示したDesjarlaisおよびBerg、PNAS91:11099-111031994。ジンクフィンガークローンの構築のために使用されるSP-1配列は、SP-1転写因子におけるアミノ酸533~624に対応した。2つの設計されたZFPである、VEGF1およびVEGF3aの認識らせん体におけるアミノ酸の選択を、表1に要約する。コード配列を、6つの重複オリゴヌクレオチドを利用したPCRに基づくのアセンブリ手順を用いてこれらのペプチドを発現するために、構築した図1。ユニバーサル配列に対応する3つのオリゴヌクレオチド図1中のオリゴ1、3および5は、認識らせん体の間のDNA結合ドメインの一部をコードする。これらのオリゴヌクレオチドは、任意のジンクフィンガー構築物について一定のままである。他の3つの特異的オリゴヌクレオチド図1中のオリゴ2、4、および6は、認識らせん体をコードするように設計された。これらのオリゴヌクレオチドは、認識らせんをそれぞれ異なるDNA結合ドメインに対して特異的にさせるために、その認識らせん上の-1、2、3および6位で置換を含んだ。コドンの偏りを選択して、哺乳動物細胞およびE.coliの両方において発現可能にした。PCR合成を、2つの工程において実行した。第1に、二本鎖DNAの鋳型を、6つのオリゴヌクレオチド3つはユニバーサルオリゴヌクレオチド、3つは特異的オリゴヌクレオチドを組み合わせ、そして低温25°Cのアニーリング工程を有する4サイクルのPCR反応を用いて作製した。この温度で、この6つのオリゴヌクレオチドは結合してDNA骨格を形成する。この骨格におけるギャップをTaqおよびPfuポリメラーゼの組み合わせにより充填した。構築の第2段階において、ジンクフィンガーの鋳型を、pUC19へクローニングするための制限部位を組み入れるために設計された外部プライマーによって、30サイクルで増幅した。VEGFZFPについてのクローニング精度は、DNA配列決定によって確認した。2つの構築物のそれぞれのDNA配列は以下である。設計されたZFPのそれらの標的部位と結合する能力を、E.coli由来の組換えタンパク質を発現および精製、ならびに電気泳動移動度シフトアッセイEMSAを行うことによって確認した。ZFP発現を2つの異なる系で行った。第1の系において、DNA結合ペプチドを、市販のpET15bベクターNovagenに挿入することによりE.coliにおいて発現させた。このベクターは、組換えタンパク質の発現を駆動するためのT7プロモーター配列を含む。この構築物をE.coliBL21/DE3lacIq細胞に導入した。この細胞は、IPTG誘導性T7ポリメラーゼを含む。培養物を、50μMZnCl2で補充し、ODが600nmで0.5~0.6になるまで、37°Cで増殖させ、そしてタンパク質の産生をIPTGを用いて2時間誘導した。ZFP発現は、非常に高いレベルで全細胞性タンパク質の約30見られた図2。これらのタンパク質を非融合ZFPという。部分的に純粋な非融合ZFPを以下のように作製したDesjarlaisおよびBerg、Proteins:Structure、FunctionandGenetics12:101-1041992から改変される。凍結した細胞ペレットを1MNaCl、25mMTrisHClpH8.0、100μMZnCl2、5mMDTTの1/50の容量中に再懸濁した。このサンプルを10分間煮沸し、そして約3,000×gで10分間遠心分離した。この時点で上清中のZFPタンパク質は、クマシーブルーを用いたSDSポリアクリルアミドゲルの染色によって推定すると、50より高い純度であった。そしてこの産物は、約11kDaの推定分子量に移動した図2。ZFPを作製する第2の方法は、それらをE.coliマルトース結合タンパク質MBPとの融合物として発現させることであった。ZFPとのN末端MBP融合物をpET15bクローンのPCR増幅により構築し、そしてTacプロモーターNewEnglandBiolabsの制御下でベクターpMal-c2に挿入した。この融合は、組換えタンパク質の簡単な精製および検出を可能にする。ジンクフィンガーDNA結合タンパク質が、E.coliにおいて高いレベルでこのベクターから可溶形態で発現され得、そして再折り畳みすることなく適切なDNA標的物と効率良く結合し得ることが、以前に報告されたLiuら、PNAS94:5525-55301997。MBP融合タンパク質の生成は、製造者によって記載されたNewEnglandBiolabs。形質転換体を、グルコースおよびアンピシリンを補充したLB培地において増殖させ、そしてIPTGを用いて3時間37°Cで誘導した。この細胞をフレンチプレスによって溶解し、次いでアガロースベースのアミロース樹脂これは、MBP部分に特異的に結合し、従ってこのタンパク質に対する親和性樹脂として作用するに曝露した。MBP融合タンパク質を、10mMマルトース図2Cを用いて溶出させ、50より高い純度のZFPを放出した。いくつかの場合において、このタンパク質を、Centricon30フィルターユニットAmiconを用いてさらに濃縮した。部分精製された非融合およびMBP融合ZFPをEMSAによって試験し、それらの標的DNA配列への結合を評価した。調製物中のタンパク質の濃度をBradfordアッセイBioRadによって測定した。SDSポリアクリルアミドゲルは、いずれかの精製方法によって50より高い均質性を示したので、ZFPの精製度の計算において調整しなかった。さらに、調製物中に有意な量の不活性なタンパク質が存在し得た。従って、EMSAによって生じた以下のデータは、タンパク質の標的物についてのタンパク質の真の親和性の過小評価を示すすなわち、Kdsの過大評価。2つの分離した調製物を、ZFP活性における差異の制御を補助するために各タンパク質について作製した。EMSA実験についてのVEGFDNA標的部位を、29bp二本鎖オリゴヌクレオチドにおける9bpの結合部位を埋め込むことによって生成した。このアッセイにおいて用いられる、認識top鎖の配列およびそれらの相補体bottomは、以下である:VEGF部位1、top:5’-CATGCATAGCGGGGAGGATCGCCATCGATVEGF部位1、bottom:5’-ATCGATGGCGATCCTCCCCGCTATGCATGVEGF部位3、top:5’-CATGCATATCGCGGAGGCTTGGCATCGATVEGF部位3、bottom:5’-ATCGATGCCAAGCCTCCGCGATATGCATGVEGFDNA標的部位は下線部である。9bpの結合部位のいずれかの側上の3bpもまた、実際のVEGFDNA配列由来であった。top鎖の各標的部位をポリヌクレオチドキナーゼおよびγ-32PdATPを用いて標識化した。0.5μMの各オリゴヌクレオチド、10mMTris-HClpH8.0、1mMEDTA、および50mMNaClを含む反応においてtop鎖およびbottom鎖をアニールした。この混合物を95°Cまで5分間加熱し、そして60分間にわたって30°Cまでゆっくりと冷却した。二重鎖の形成を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。標的調製物中に残ったままである遊離標識およびssDNAは、結合反応を干渉しそうではなかった。標的オリゴヌクレオチドへのZFPの結合を、二重鎖基質の固定量に対するタンパク質を滴定することによって行った。20マイクロリットルの結合反応物は、10fモル0.5nM5’-32P標識化二本鎖標的DNA、35mMTrisHClpH7.8、100mMKCl、1mMMgCl2、1mMジチオトスレイトール、10グリセロール、20μg/mlポリdI-dC必要に応じて、200μg/mlウシ血清アルブミン、および25μMZnCl2を含んだ。タンパク質を、200mMNaCl、20mMTrispH7.5、1mMDTT中で作製された連続希釈の1/5の容量として添加した。結合によって室温での30分間の進行が可能になった。前もって作製された10または10~20Tris-HClゲルBioRadおよび標準Tris-グリシン泳動緩衝液0.1mMZnCl2を含むを用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を4°Cで実行した。MBP融合ZFPを用いる代表的なEMSAの結果を図3に示す。この場合、MBP-VEGF1タンパク質の3倍の連続希釈を用いた。移動した産物をphosphorimagerMolecularDynamics上で定量し、そしてタンパク質濃度nMのlog10に対する相対シグナルプラトー値の百分率をプロットした。見かけのKdを、標的部位へのMBP-VEGFの結合の最大の半分を与えるタンパク質濃度を決定することによって見出し、それはこの実験において約2nMであった。VEGFタンパク質について決定された結合親和性は、以下のように要約され得る。VEGF1は、より強力なDNA結合親和性を示した;複数のEMSA分析において、見かけのKdの平均が、VEGF部位1に結合した場合、約10nMであると決定された。そのVEGF3aは、標的部位に良好に結合したが、VEGF1よりも高い見かけのKdを有した;VEGF3aについての平均Kdは、約200nMであった。タンパク質のMBP融合バージョンおよび非融合バージョンは両方の場合において類似の親和性で結合した。Kdをまた、野生型Zif268およびSP-1ZFPのMBP融合についてのこれらの条件下で決定した。これらは、それぞれ60および65nMのKdを生じた。これらの結果は、約2~30nMのZif268について文献中で報告された結合定数と類似している例えば、Jamiesonら、Biochemistry33:5689-56951994を参照のこと。従って、合成VEGFZFPについてのKdは、これらの天然に生じるDNA結合タンパク質について決定したKdと非常に都合よく比較される。要するに、この実施例は、VEGF遺伝子の転写開始に近い特異的標的物に関する2つの新規なDNA結合タンパク質の生成を示す。これらのタンパク質は、それらの標的物に結合する天然に生じる転写因子の親和性と同様の親和性で結合する。実施例II:ヒトVEGF遺伝子において18bp標的物を結合するZFPの連結ZFP設計における重要な考慮は、DNA標的物の長さである。無作為のDNAについて、nヌクレオチドの配列は、0.5×4n塩基対毎に1回生じると期待される。従って、9bpのDNAのみを認識するように設計されたDNA結合ドメインは、130,000bp毎に部位が見出され、従って複雑なゲノムにおける複数の位置に結合し得るヒトゲノム中20,000部位のオーダーにおいて。9bpの推定リプレレッサー結合配列は、5’UTR中のVEGFについて選択され、そしてこれらは直接転写を干渉し得る。しかし、細胞の内部で発現される場合、必要な親和性または特異性を欠失した9bp部位を認識するジンクフィンガードメインの場合において、より大きなドメインが、6フィンガータンパク質を形成するためのリンカー配列を有する別々の3つのフィンガードメインを結合させることによって、18塩基対を認識するために構築された。このことは、リプレッサーが、特に微量のリプレッサーのみが生成されている条件下で、特異的に適切な配列を標的化することを保証すべきである。VEGFにおける9bp標的部位を、ジンクフィンガーが18bp配列を認識するように連結され得るように、互いに隣接して選択した。VEGF1部位およびVEGF3a部位についての場合のように、1つのヌクレオチドギャップによって分離された2つの9bp部位へのZFPの結合を可能にするので、リンカーDGGGSを選択したLiuら、PNAS5525-55301997もまた参照のこと。6-フィンガーVEGF3a/1タンパク質コード配列を以下の様に生成した。VEGF3aを、プライマーSPE75’-GAGCAGAATTCGGCAAGAAGAAGCAGCACおよびSPEamp125’-GTGGTCTAGACAGCTCGTCACTTCGCを用いてPCR増幅し、末端にEcoRIおよびXbaI制限部位を生成した制限部位は下線部。VEGF1を、プライマーSPEamp135’-GGAGCCAAGGCTGTGGTAAAGTTTACGGおよびSPEamp115’-GGAGAAGCTTGGATCCTCATTATCCCを用いてPCR増幅し、末端にStyIおよびHindIII制限部位を生成した制限部位は下線部。合成オリゴヌクレオチドを用いて、以下の配列をXbaIおよびStyI部位間で連結した。ここで、XbaIおよびStyIは、下線部である:TCTAGACACATCAAAACCCACCAGAACAAGAAAGACGGCGGTGGCAGCGGCAAAAAGAAACAGCACATATGTCACATCCAAGG。これは、2つのSP-1ドメイン間でリンカー配列DGGGSを導入した。この連結産物を、プライマーSPE7およびSPEamp11を用いて再増幅し、そしてEcoRI部位およびHindIII部位を用いてpUC19にクローニングした。次いで、連結されたZFP配列を以下のプライマー;1GB19GCCATGCCGGTACCCATACCTGGCAAGAAGAAGCAGCAC2GB10CAGATCGGATCCACCCTTCTTATTCTGGTGGGTを用いて増幅し、上記のように改変されたpMAL-c2発現ベクターにクローニングするためのKpnIおよびBamHI部位を導入した。設計された6-フィンガーZFPVEGF3a/1のKpnIからBamHIのヌクレオチド配列は以下である:VEGF3a/1のアミノ酸翻訳一文字コードを用いては、以下である:18bp結合タンパク質VEGF3a/1をE.coli中でMBP融合物として発現し、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして実施例1に記載のようにEMSA実験で試験した。標的オリゴヌクレオチドを記載のように調製し、そして以下の相補的配列を含んだ:1JVF9AGCGAGCGGGGAGGATCGCGGAGGCTTGGGGCAGCCGGGTAGおよび、2JVF10CGCTCTACCCGGCTGCCCCAAGCCTCCGCGATCCTCCCCGCT。EMSA研究について、20μlの結合反応液は、10fモル0.5nM5’-32P-標識化二本鎖標的DNA、35mMTrisHClpH7.8、100mMKCl、1mMMgCl2、5mMジチオスレイトール、10グリセロール、20μg/mlポリdI-dC、200μg/mlウシ血清アルブミン、および25μMZnCl2を含んだ。3倍の連続希釈の5分の1の容量でタンパク質を添加した。結合は、室温かまたは37°Cのいずれかで60分間進行させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を室温かまたは37°Cのいずれかで、予め作製した10または10~20Tris-HClゲルBioRadおよび標準Tris-グリシン泳動緩衝液を用いて実行した。室温でのアッセイは、このVEGF3a/1タンパク質について、約1.5nMの見かけのKdを生じた。従って、18bp結合ZFPは、高い親和性でその標的部位に結合した。並行実験において、実施例Iに記載のオリゴヌクレオチドを用いて、VEGF1タンパク質をその標的に対して試験し、約2.5nMの見かけのKdを生じた。標的に対して試験したVEGF1についての40nMのKdと比較して、18bp標的物に対して試験した場合、結合および電気泳動を37°Cで実行した場合、VEGF3a/1の見かけのKdは、約9nMであった。このことは、結合親和性における差異がより高温で強調されることを示す。見かけのKdは、そのDNA標的に対するタンパク質の親和性を測定するのに有用である。しかし、インビトロまたはインビボのいずれかでのDNA結合部位について、その占有率は、DNA結合タンパク質のオフ割合によって大きな程度まで決定される。このパラメータは、図4に示されるような競合的実験によって測定され得る。EMSAについての条件を上記に記載した;結合および電気泳動を37°Cで実行した。これらのデータは、タンパク質-DNA複合体の半減期が、VEGF1についてより、VEGF3a/1についての方が10倍より長いことを示す。従って、これらのインビトロ条件下で、標的部位の占有率は、9bp結合タンパク質についてよりも18bp結合タンパク質についての方がずっと高い。実施例III:設計されたZFP配列の哺乳動物発現ベクター中の機能的ドメインへの融合この実施例は、哺乳動物細胞内のZFPの作製、それらの核への移行、およびZFPによって標的DNA配列に局在化される機能的ドメインを提供するための発現ベクターの開発を記載する。使用した機能的ドメインは、Kruppel-関連ボックスKRAB抑止ドメインおよび単純ヘルペスウイルスHSV-1VP16活性化ドメインである。特定のDNA結合タンパク質は、転写リプレッサーとして機能する分離可能なドメインを含む。約20のZFPは、転写リプレッサーとして機能する約90アミノ酸の非DNA結合ドメインを含むThiesen、TheNewBiologist2:363-3741990;Margolinら、PNAS91:4509-45131994;Pengueら、1994、前出;Witzgallら1994、前出。KRABドメインと呼ばれるこのドメインは、モジュラーであり、そして他のDNA結合タンパク質を結合して、標的DNA配列を含む遺伝子の発現をブロックし得るMargolinら、1994;Pengueら、1994;Witzgallら1994前出。KRABドメインは、単独では効果を示さない;KRABドメインは、リプレッサーとして機能するためにDNA結合タンパク質を介してDNA配列に連結される必要がある。KRABドメインは、転写開始をブロックすることが示され、そして転写開始部位から少なくとも3kbまでの距離で機能し得る。ヒトKOX-1タンパク質Thiesen、TheNewBiologist2:363-371990由来のKRABドメインを、本明細書に記載されるような研究のために使用した。この64アミノ酸ドメインは、ZFPに融合され得、そして細胞培養物中で抑制を与えることを示したLiuら、前出。HSV-1のVP16タンパク質は、広く研究されており、そしてC末端の78アミノ酸がDNA結合ドメインに融合される場合、トランス活性化ドメインとして作用し得ることが示されたHagmannら、K.Virology71:5952-59621997。VP16はまた、少し離れておよび配向非依存様式において機能することが示されている。これらの研究について、VP16タンパク質配列におけるアミノ酸413~490を使用した。このドメインをコードするDNAを、以下の配列を有するプライマーを用いて,プラスミドpMSVP16ΔC119からPCR増幅した:1JVF24CGCGGATCCGCCCCCCCGACCGATG、および2JVF25CCGCAAGCTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGCTGCCCCCACCGTACTCGTCAATTCC。下流プライマーJVF25を下流FLAGエピトープコード配列を含むように設計した。3つの発現ベクターをこれらの研究のために構築した。一般的な設計を図5に要約する。このベクターは、pcDNA3.1Invitrogen由来であり、そしてサイトメガウイルスCMVプロモーターの制御下にあるZFP構築物を配置する。このベクターは、それぞれ細菌および哺乳動物細胞培養物における選択のためのアンピシリンおよびネオマイシンマーカーを保有する。適切な翻訳開始のためのコザック配列Kozak、J.Biol.Chem.266:19867-198701991を組み入れた。産物の核局在化を達成するために、SV40の大きなT抗原由来の核局在化配列NLSPro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-ValKalderonら、Cell39:499-5091984を付加した。ZFPコード配列についての挿入部位に、機能的ドメイン配列が続く。このベクターの3つのバージョンは、機能的ドメインにおいて異なる;pcDNA-NKFは、KRAB抑制ドメイン配列を保有し、pcDNA-NVFは、VP16活性化ドメインを保有し、そしてNF-コントロールは、機能的ドメインを保有しない。以下の機能的ドメインは、ZFPの特異的検出を可能にするFLAGエピトープ配列Kodakである。ベクターを以下のように構築した、プラスミドpcDNA-ΔHBを、プラスミドpcDNA3.1InvitrogenをHindIIIおよびBamHIで消化し、Klenowを用いて付着末端を塞ぎ、そして再連結することによって構築した。これは、ポリリンカー中のHindIII部位、KpnI部位、BamHI部位を除去した。ベクターpcDNA3.1は、Invitrogenのカタログに記載される。プラスミドpcDNA-NKFを、1開始コドンを含むKozak配列およびSV40NLS配列を含む、EcoRIからKpnIのセグメントであり、全体として以下のDNA配列:GAATTCGCTAGCGCCACCATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGAATCCATGGGGTAC、ここで、EcoRIおよびKpnI部位は下線部であるを含むセグメント;および2BamHI部位、KOX1アミノ酸は、Thiesen、1990、前出の11~53と同等である由来のKRAB-Aボックス、FLAGエピトープKodak/IBIカタログから、およびHindIII部位を含むKpnIからXhoIまでのセグメントであり、全体として以下の配列を含むセグメント:ここで、KpnI、BamHIおよびXhoI部位は下線部であるを含むpcDNA-ΔHBのEcoRI/XhoI部位へのフラグメントの挿入によって、生成した。VEGF3a/1-KRABエフェクタープラスミドを、ZFP配列を含むKpnI-BamHIカセットをKpnIおよびBamHIで消化されたpcDNA-NKFに挿入することによって生成した。VEGF1-KRAMおよびVEGF3a-KRABエフェクタープラスミドを、プラスミドpLitmus28NewEnglandBiolabsの状況において、ZFP配列を、第1にNLS-KRAB-FLAG配列にクローニングし、そして続いてBglII-XhoIカセットとして、pcDNA3.1のBamHI-XhoI部位まで移動したここで、BglII部位がEcoRI部位の直ぐ上流で置換されるこれらのベクターの発現について実施例IVを参照のこと以外は、同様の方法で構築した。実施例Vにおいて使用されるエフェクタープラスミドを以下のように構築した。プラスミドpcDNA-NVFを、VP16トランス活性化ドメインを上記のようにPCR増幅し、そしてその産物をpcDNA-NKFのBamHI/HindIII部位に挿入し、KRABを置換することによって、構築した。挿入されたフラグメントのBamHIからHindIIIまでの配列は以下であった:VEGF1-VP16ベクターおよびVEGF3a/1-VP16ベクターを、ZFP配列を含むKpnI-BamHIカセットをKpnIおよびBamHIで消化されたpcDNA-NVFに挿入することによって構築した。実施例VIにおいて使用されたエフェクタープラスミドを以下のように構築した。プラスミドNF-コントロールを、以下の配列:をpcDNA-NKFのEcoRI-XhoI部位に挿入し、それによってNLS-KRAB-FLAG配列をNLS-FLAGのみと置換することによって生成した。VEGF1-NFおよびVEGF3a/1-NFを、ZFP配列を含むKpnI-BamHIカセットをKPnIおよびBamHIで消化したNF-コントロールに挿入することによって構築した。CCR5-KRABを、ZFP配列をVEGF標的物に関連しないDNA標的部位について特異的であるように設計することを除いて、VEGFKRABベクターと同じ方法で構築した。最終的には、KRABおよびVP16発現プラスミドの両方のコントロールバージョンを構築した。プラスミドNKFコントロールを、ジンクフィンガータンパク質配列を有さないNLS-KRAB-FLAGを発現するように設計した;プラスミドNVF-コントロールを、ZFP配列を有さないNLS-VP16-FLAGを発現するように設計した。これらのプラスミドを、BamHIを用いてそれぞれpcDNA-NKFおよびpcDNA-NVFを消化し、Klenowで末端を充填し、そして下流ドメインを適切なリーディングフレームへ配置するために再連結することによって作製した。これらのプラスミドは、細胞培養研究についての厳密なコントロールとして用いる。VEGF操作されたZFPの哺乳動物細胞発現および核局在化を、免疫蛍光研究を通して実証した。293ヒト胚腎臓細胞をNLS-VEGF1-KRAB-FLAGキメラをコードする発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。リポフェクタミンを以下に記載のように使用した。24~48時間後、細胞を固定し、そしてFLAGエピトープに対する一次抗体に曝露した。TexasRedで標識した二次抗体を適用し、そして細胞をDAPIで対比染色した。TexasRed染色によって、DAPI染色の一貫した同時局在化が観察された。このことは、このプラスミドから発現されるZFPが、核局在化したことを示す。実施例IV:同時トランスフェクション実験におけるVEGFレポーターの抑制この実施例は、細胞におけるZFPリプレッサータンパク質の活性を測定するための、一過性の同時トランスフェクトション研究の使用を実証する。このような実験は、ZFP-KRAB発現エフェクタープラスミドと、VEGF標的部位を保有するレポータープラスミドとの同時トランスフェクションを含む。空ベクターコントロールに対するエフェクタープラスミドの存在下のレポーター遺伝子の発現の抑制によって、有効性を評価する。このレポータープラスミド系は、pGL3ホタルルシフェラーゼベクターPromegaに基づいた。pVFR1-4xを作製するために、VEGF標的部位の4つのコピーをプラスミドpGL3-コントロールのSV40プロモーターこれは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を駆動するの上流に挿入した。このプラスミドはSV40エンハンサーを含み、そして多くの細胞型において高レベルでホタルルシフェラーゼを発現する。2つの相補的な42bpのオリゴヌクレオチドの直列コピー実施例IIに記載される、JVF9およびJVF10を共に連結することにより挿入体を作製した。アダプター配列を連結し、そしてこのアセンブリをpGL3-コントロールのMluI/BglII部位に挿入した。これは、それらの部位間の以下の配列の挿入を生じた。示される最初の6ヌクレオチドおよび最後の6ヌクレオチドは、MluI部位およびBglII部位であり;小文字はHindIII部位を示す。VEGF1およびVEGF3aの結合部位は下線である。エフェクタープラスミドの構築を上記に記載する。全てがCMVプロモーターの制御下の、SV40核局在配列、VEGFZFP、KRAB抑制ドメイン、およびFLAGエピトープマーカー融合体を生成するために、VEGF1-KRAB、VEGF3a-KRAB、およびVEGF3a/1-KRAB発現ベクターを設計した。コントロールpcDNAとして、空のpcDNA3.1発現ベクターを使用した。全てのベクターをQiagenDNA精製キットを使用して調製した。図6は、COS-1アフリカミドリザル腎臓細胞を使用する代表的なトランスフェクションのセットを示す。24ウェルプレートの各ウェルに約40,000個の細胞を播種し、そして10ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地D-MEM培地中で5CO2と共に37°Cにて一晩増殖させた。細胞をPBSで洗浄し、そして200μlの血清を含まないD-MEMで重層した。リポフェクタミンGibco-BRLを使用して、プラスミドを導入した。6μlのリポフェクタミンおよび25μlのD-MEMと複合体化されている約0.3μgのエフェクタープラスミド、約0.3μgのレポータープラスミド、および約0.01μgのプラスミドpRL-SV40Promegaで、各ウェルを37°Cにて30分間トランスフェクトした。トランスフェクションを三連で行った。3時間後、10血清を含む1mlの培地を各ウェルに加えた。トランスフェクション後40~48時間で細胞を回収した。DualLuciferaseTMSystemPromegaを使用してルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクトされる第3のプラスミドpRL-SV40は、Renillaルシフェラーゼ遺伝子を有し、そしてトランスフェクション効率についての標準として同時トランスフェクトした。図6に示されるデータは、Renilla活性に対して基準化した三連アッセイの平均である。コントロールレポータープラスミドpGL3-コントロールpGL3-Cについては、ZFP-KRAB発現プラスミドの存在もしくは非存在は、ルシフェラーゼ発現レベルに影響を及ぼさない。しかし、pVFR1-4xVEGF標的部位の4つのコピーを含むレポーターについては、VEGF19bp結合ZFP発現プラスミドもしくはVEGF3a/118bp結合ZFP発現プラスミドの存在は、ルシフェラーゼ発現を、空のpcDNAベクターコントロールに対して2~3倍減少する。VEGF3a9bp結合ZFP発現プラスミドは、ほとんどもしくは全く効果を示さないようである。これらの実験は、ZFPの標的部位が存在する場合、設計されたZFPが細胞内で機能して遺伝子の転写を抑制し得ることを明確に実証する。さらに、特定レベルの親和性が機能に必要とされるようである;すなわち、10nM以下のKdを有するVEGF1およびVEGF3a/1は機能的であるが、200nMのKdを有するVEGF3aは機能的ではない。第2のレポータープラスミドであるpVFR2-4xを、HindIIIを使用してVEGF標的部位の4つのコピーを取り出すことにより構築し、そしてこれらをpGL3コントロールのHindIII部位に挿入した順方向で。これは、SV40プロモーターのための転写開始部位と、ルシフェラーゼ遺伝子の転写開始コドンとの間に標的部位を配置する。記載されるのと同様の同時トランスフェクション実験において、pcDNAコントロールに対して、約3~4倍のルシフェラーゼシグナルの抑制がVEGF1-KRABリプレッサーもしくはVEGF3a/1-KRABリプレッサーで観察されたデータ未掲載。このことは、リプレッサーが、転写の開始部位の上流または下流のいずれかに結合した場合、活性であることを示す。実施例V:同時トランスフェクション実験でのVEGFレポーターの活性化この実施例は、細胞においてZFP転写アクチベーターの活性を測定するための一過性の同時トランスフェクション研究の使用を実証する。この実験の準備は、異なるトランスフェクション法、異なる細胞株、および異なるセットのレポータープラスミドおよびエフェクタープラスミドが使用されたことを除いて、実施例IVの準備と同様である。活性化実験について、レポーターを標識したpVFR3-4xに構築した。このレポーターは、プラスミドpGL3-プロモーターPromegaのMluI/BglII部位に、VEGF標的の4つのコピー上記に示される配列を有するを含む。このベクターは、SV40エンハンサー配列を欠失するので、より低い基底レベルのホタルルシフェラーゼ発現を有する。pVFR1-4xのKpnI/NcoIフラグメントをpGL3-プロモーターのKpnI/NcoI部位と交換することによって、pVFR3-4xを構築した。エフェクタープラスミドの構築は上記される。全てがCMVプロモーターの制御下の、SV40核局在配列、VEGFZFP、VP16トランス活性化ドメイン、およびFLAGエピトープタグを融合体を生成するために、VEGF1-VP16、VEGF3a-VP16、およびVEGF3a/1-VP16発現ベクターを設計した。コントロールとして、空のpcDNA3発現ベクターを使用した。全てのベクターをQiagenDNA精製キットを使用して調製した。図7は、293ヒト胚腎臓細胞を使用する代表的なトランスフェクションのセットを示す。24ウェルプレートの各ウェルに約40,000個の細胞を播種し、そして10ウシ胎児血清を含むD-MEM培地中で5CO2と共に37°Cにて一晩増殖させた。細胞を血清を含まないD-MEMで洗浄し、そして200μlの同じD-MEMで重層した。リン酸カルシウムトランスフェクションキットGibco-BRLを製造者の取扱説明書に従って使用して、プラスミドを導入した。各ウェル中の細胞を、1.5μgのレポータープラスミド、1.5μgのエフェクタープラスミド、および0.5μgのアクチン/β-galプラスミドでトランスフェクトした。プラスミドを15μlのCaCl2と組み合わせ、そしてdH2Oで100μlにした。ボルテックスしている間、100μlのHEPES溶液を滴下して添加した。この混合物を室温にて30分間インキュベートした。次いで、200μlのリン酸カルシウム処理DNAを各ウェル中の培地に添加した。トランスフェクションは三連で行った。5時間後、この培地を除去し、そして1mlの10血清を含む培地を添加した。トランスフェクションの40~48時間後で細胞を回収した。Dual-LightTMシステムTropixを使用して、ルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクトされる第3のプラスミドであるアクチン/β-galは、アクチンプロモーターの制御下でβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を保有し、そしてこのプラスミドをトランスフェクション効率についての標準として同時トランスフェクトした。β-ガラクトシダーゼアッセイもまた、製造業者の取扱説明書Tropixに従って行った。図7に示すデータは、β-ガラクトシダーゼ活性に対して基準化した三連アッセイの平均である。コントロールレポータープラスミドであるpGL3-プロモーターpGL3-Pについては、ZFP-VP16発現プラスミドの存在もしくは非存在は、ルシフェラーゼ発現レベルに有意に影響しない。pVFR3-4xVEGF標的部位の4つのコピーを含むレポーターについては、VEGF19bp結合ZFPの存在は、空のpcDNAベクターコントロールに対してごくわずかな活性化を示す。VEGF3a/118bp結合ZFP発現プラスミドは、非常に実質的にルシフェラーゼ発現を活性化し、これはpcDNAに対して約14倍の増加を示す。これらの実験は、設計したZFPは、VP16活性化ドメインに融合された場合、その標的が存在する場合、細胞内で機能して、伝子の転写を活性化し得ることを明らかに示す。さらに、これらの結果は、18bp結合タンパク質であるVEGF3a/1が、このアッセイにおいて、9bp結合VEGF1タンパク質よりもずっと良いアクチベーターであることを明らかに示す。これは、VEGF3a/1タンパク質の改善された親和性または減少したオフ速度を生じ得る。第4のVEGFレポータープラスミドを、pVFR2-4xのKpnI/NcolIフラグメントをpGL3-プロモーターにクローニングすることにより構築して、プラスミドpVFR4-4xを作製した。このレポーターをVEGF1-VP16およびVEGF3a/1-VP16融合体を発現するエフェクタープラスミドと組み合わせて使用する同時トランスフェクションにおいて、活性化が観察されたデータ未掲載。このことは、これらの人工的なトランスアクチベーターは、転写開始の上流または下流のいずれかに結合した場合に機能性であることを示す。これらの同時トランスフェクションデータは、ZFPを使用してレポーター遺伝子の発現を調節し得ることを示す。このような実験は、内因性細胞遺伝子の発現のモジュレーターとしてのさらなる使用のために、ZFPの同定のための有用な手段として働く。以下に示されるように、調節の結果は、同じZAP構築物を使用する場合でも、同時トランスフェクション実験と内因性遺伝子実験との間で変化し得る。実施例VI:ヒト細胞における内因性VEGF遺伝子の抑制この実施例は、設計したZFPが、天然の状況およびクロマチン構造にある内因性細胞遺伝子の発現を抑制し得ることを例証する。詳細には、KRAB抑制ドメインに融合されたVEGFZFPを発現するエフェクタープラスミドを細胞に導入し、そしてVEGF遺伝子を下方制御することを示した。真核生物発現ベクターを、実施例IIIにおいて上述されるように、VEGF3a/1およびVEGF1ZFPをSV40NLSおよびKRABに融合して構築した。トランスフェクションをリポフェクタミンGIBCO-BRLからの市販のリポソーム調製物を使用して行った。全てのプラスミドDNAを、QiagenMidiDNA精製システムを使用して調製した。総容量1600μlのOpti-MEM中で、10μgのエフェクタープラスミドを100μgのリポフェクタミン50μlと混合した。トランスフェクトション効率についての内部コントロールとして、pCMVβ-galプラスミドPromegaもまたDNA混合物中に含めた。30分のインキュベーションの後、6.4mlのDMEMを添加し、そしてこの混合物を3×106の293細胞上に重層した。5時間後、このDNA-リポフェクタミン混合物を除去し、そして細胞上に10ウシ胎児血清を含む新鮮な培養培地を重層した。トランスフェクションの18時間後、293細胞を100μMDFXデスフェリオキサミンでの処置により誘導した。その結果、VEGF遺伝子の迅速でかつ持続的な転写活性を生じ、そしてまたVEGFmRNA安定性の漸進的な増加を生じたIkedaら,J.Biol.Chem.270:19761-197661995。慣用的な培養条件下で、293細胞は培養培地において低レベルのVEGFを分泌する。この上清をELISAアッセイによるVEGFレベルの決定のために回収する前に、これらの細胞をさらに24時間インキュベートし得る。類似したレベルの抑制を実証した平行の実験において、細胞の生存率をPromegaCelltiter96登録商標AqueousOneSolution細胞増殖キットPromegaを使用してモニターした。18時間のDfx処置の後、2mlの最初の培地から500μLを取り出し、そして上記に記載されるようにしてVEGF発現について分析した。細胞の生存率を評価するために、残りの1.5mlに300μLのPromegaCelltiter96登録商標AqueousOneSolutionReagentを添加した。次いで、細胞を37°Cにて約2時間インキュベートした。各ウェルからの100μLを96ウェルプレートに移し、そしてELISAプレートリーダー上でOD490nmにて読み取った。空のベクターコントロールでトランスフェクトした細胞に対して、VEGF3a/1-KRAB構築物を発現する細胞の生存率において有意な減少は見られなかった。このことは、観察されたVEGF抑制は、一般化された細胞死のためではなかったことを示す。VEGF発現の40~50倍の減少は、VEGF3a/1-KRAB18bp結合VEGF高親和性ZFPをコードする発現ベクターでトランスフェクトされたDFX処置細胞において顕著であった。発現の2倍の減少が、細胞をVEGF1-KRAB9bp結合VEGF高親和性ZFPをコードする発現ベクターでトランスフェクトした場合に観察された。非VEGFZFPCCR5-KRABまたはNKF-コントロールでトランスフェクトされた細胞においては、VEGF発現の有意な減少は観察されなかった図8。3つの独立したトランスフェクション実験において同様の結果が得られた。別に実験において、以下の結果が得られたデータ未掲載。VEGF1-NF機能的ドメインをなしで9bp結合VEGF1ZFPを発現するは、VEGF遺伝子発現に対して効果を及ぼさないことが示された。VEGF発現における有意な減少は、VEGF3a/1-NF機能的ドメインをなしで18bp結合タンパク質を発現するで観察された。この結果は、転写の開始部位への結合が、抑制ドメインなしでさえも、転写を妨害することを示唆する。KRABドメインに融合した場合でさえも、VEGF3aZFPは、発現レベルに影響し得ないプラスミドVEGF3a-KRAB。しかし、KRABに融合されたVEGF1VEGF1-KRABは、劇的な発現の減少を生じる。KRABに融合されたVEGF3a/1VEGF3a/1-KRABは、完全にVEGF発現を妨げる。これらのデータは、設計したZFPが、染色体上のその標的部位を見つけ出し得そして結合し得、そして内因性細胞標的遺伝子の発現を妨げ得ることを示す。特に、これらの結果は、約25nMより低いKdを有するZFP例えば、VEGF1は、約10nMの平均推定Kdを有するが、発現において劇的な減少を提供することを示す。さらに、このデータは、KRAB機能ドメインが遺伝子サイレンシングを増大することを示す。この実験において、VEGFの誘導因子DFXを添加する前にリプレッサーの誘導が生じるので、このデータは、設計したリプレッサーの、既に静止状態の遺伝子の活性化を妨げる能力を示す。さらに、これらの結果は、その標的に対してnMの親和性を有する6フィンガーの操作されたZFPsix-fingerengineeredVEGF3a/1が、転写開始部位に重複する標的に結合する場合、VEGF遺伝子の低酸素応答を阻害し得ることを示す。実施例VII:ヒト細胞における内因性VEGF遺伝子の活性化この実施例は、設計したZFPは、天然の状況およびクロマチン構造にある遺伝子の発現を活性化し得ることを例証する。詳細には、VP16活性化ドメインに融合されたVEGFZFPを発現するエフェクタープラスミドを細胞に導入し、そしてVEGF遺伝子を上方制御することを示した。真核生物発現ベクターを、実施例IIIに記載されるように、VEGF3a/1およびVEGF1ZFPをSV40NLSおよびVP16に融合して構築した。トランスフェクションをリポフェクタミンGIBCO-BRLからの市販のリポソーム調製物を使用して行った。全てのプラスミドDNAを、QiagenMidiDNA精製システムを使用して調製した。総容量1600μlのOpti-MEM中で、10μgのエフェクタープラスミド操作されたエフェクタープラスミドを含むを100μgのリポフェクタミン50μlと混合した。トランスフェクトション効率についての内部コントロールとして、pCMVβ-galプラスミドPromegaもまたDNA混合物中に含めた。30分のインキュベーションの後、6.4mlのDMEMを添加し、そしてこの混合物を3×106の293細胞上に重層した。5時間後、このDNA-リポフェクタミン混合物を除去し、そして細胞上に10ウシ胎児血清を含む新鮮な培養培地を重層した。1日後、新鮮な培地を添加し、そして市販のELISAキットRandDSystemsを使用してVEGFレベルの決定のために、この上清を24時間後に回収した。3フィンガーのVEGF1に特異的なZFPVEGF1-VP16については、コントロールプラスミドNVF-コントロールおよび擬態トランスフェクト細胞と比較した場合、VEGF発現において7~10倍の増加が観察された図9。5つの独立した実験において同様の結果が得られた。VEGF1-VP16トランスフェクト細胞におけるVEGF分泌のレベルが、DFXで処理した細胞におけるレベル以上であったことに注目することが重要である図9。VEGF3a/1-VP16の導入は、VEGFのより適度の誘導を刺激した。この結果は、実施例VIにおける発見機能ドメインなしの18bp結合タンパク質の発現は、ある程度まで活性化を妨げたと一致する。この結果は、このタンパク質の転写の開始部位への密接な結合が、活性化を妨げることを示唆した。これらのデータは、設計したZFPが、染色体上のその標的部位を見つけ出しそして結合して転写活性化ドメインを提示し得、そしてその遺伝子の発現レベルを劇的に増強し得ることを示す。特に、これらの結果は、約25nMより低いKdを有するZFP例えば、VEGF1が、約10nMの平均推定Kdを有するが、発現において劇的な増加を提供することを示す。実施例VIII:RNase保護アッセイ実施例VIおよびVIIの結果をさらに実証するために、リボヌクレアーゼ保護アッセイRPAを行い、VEGFタンパク質の増加レベルをVEGFmRNAレベルの増加実施例VIIと相関させ、そしてVEGFタンパク質の減少レベルをVEGFmRNAレベルの減少実施例VIと相関させた。RNAを、トランスフェクト細胞からRNA単離キットPharmingenを使用して単離した。VEGF特異的プローブを含む放射性標識した多重テンプレートプローブをインビトロ転写によって調製し、そして実験トランスフェクト細胞由来およびコントロールトランスフェクト細胞由来の5μgの各RNAに56°Cにて一晩ハイブリダイズした。このハイブリダイゼーション混合物を、RNaseで処理し、そして保護されたプローブを精製して5変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、そして放射活性をオートラジオグラフィーによって評価した。VEGF1-VP16でトランスフェクトされた293細胞は、NVF-コントロールでトランスフェクトされた細胞と比較した場合、2~4倍の増加したレベルのVEGFmRNAを有した図10、パネルA;実験の詳細については実施例VIIを参照のこと。保護されたプローブのサイズは、RNA整合性のためのコントロールとして提供されたコントロールヒトRNAから生成されたプローブのサイズと同一であった図10、パネルA。別の実験において、VEGF特異的mRNAのレベルもまた、VEGF-KRABエフェクタープラスミドでトランスフェクトした細胞において定量した図10、パネルB;実験の詳細については実施例VIを参照のこと。このトランスフェクションの詳細は、実施例VIに記載される。細胞をVEGF3a/1-KRABエフェクタープラスミドでトランスフェクトした場合、VEGFmRNAのレベルの劇的な減少が観察された。細胞をNKF-コントロールおよび非VEGF特異的ZFPCCR5-5-KRABおよびCCR5-3-KRAB、これらは異なるCCR5標的部位を認識するでトランスフェクトした場合、VEGFmRNAの有意な減少は観察されなかった。この実験は、VEGF1-VP16キメラ転写因子でのトランスフェクションの際に観察されたVEGFタンパク質の増加が、VEGFmRNAレベルの増加によって媒介されることを示す。同様に、VEGF3a/1-KRABキメラ転写因子でのトランスフェクションの際に観察されたVEGFタンパク質の減少は、VEGFmRNAレベルの減少によって媒介される。実施例IX:EPO発生的にサイレントな遺伝子の活性化EPOは30.4kDの糖タンパク質ホルモンであり、赤血球産生の制御に重要な役割を果たす。EPO遺伝子は、通常、低酸素に応じて胎児肝臓および成体腎臓のみで発現される。EPOは、骨髄内の赤血球前駆体細胞上のEPOレセプターと相互作用することによって作用して、それらの細胞の増殖および成熟赤血球への分化を刺激するJelkmann,PhysiologicalReviews72:4491992;Semenza,Hematology/OncologyClinicsofNorthAmerica8:8631994;Ratcliffeら,J.Exp.Bio.1991。組換えヒトEPO遺伝子産物は、貧血および慢性腎不全を処置するために首尾良く使用されてきたEgrie,Pharacotherapy10:3S1990。EPO転写開始部位の853bp上流に位置する9bpDNA結合部位を認識するように、EPO2CZFPを設計した。EPO2Cの設計および構築のための方法は、本明細書およびUSSN09/229,0071999年1月12日出願に記載される。EPO2C結合部位配列は、GCGGTGGCTである。真核生物発現ベクターを、本明細書およびUSSN09/229,0071999年1月12日出願に記載されるようにして、EPO2CZFPをコードする配列をSV40核局在シグナルNLSおよびHSVVP16トランス活性化ドメインに融合することにより構築した。全てのプラスミドDNAを、QiagenMidi精製システムを使用して調製した。2×106Hep3B細胞ヒト肝細胞癌由来細胞株または5×106HEK293細胞ヒト胚腎臓上皮由来細胞株をトランスフェクションの1日前に6ウェルプレートに播種した。500ngのエフェクタープラスミド操作されたZFPをコードするをこれらの細胞にリポフェクタミンGIBCO-BRLを使用して一過的にトランスフェクトした。擬態トランスフェクションおよび空の発現ベクターでのトランスフェクションを、コントロールとして使用した。1日後、増殖培地を除去し、そして新鮮なDMEM培地を添加した。EPOタンパク質発現レベルの決定のために、培養上清を24時間後に回収した。この決定には、市販のELISAキットRDSystemを使用した。図11aの結果は、EPO2CZFPトランス活性化タンパク質をコードするベクターのトランスフェクションが、コントロールベクターpcDNANVFトランスフェクト細胞または擬態トランスフェクト細胞と比較した場合、EPO発現レベルを有意に増大させたことを示す。この活性化は、Hep3B細胞およびHEK293細胞の両方で観察された図11a。Hep3B細胞は、特定の条件下でEPO遺伝子を発現し得ることが公知であるGoldbergら,PNAS84:79721987。これらの細胞は、EPOの胎児供給源である肝細胞に由来する。Hep3B細胞において、低酸素または低酸素の模倣であるCoCl2での処置は、EPO遺伝子の発現を活性化するこの遺伝子は他の状態ではサイレントである図11aを参照のこと。VEGF発現はまた、Hep3B細胞において低酸素によって制御される。低酸素またはCoCl2処置は、HEK293細胞においてVEGF発現を活性化する。このことは、低酸素応答がこれらの細胞株において正常に機能することを示す図8を参照のこと。しかし、低酸素またはCoCl2での処置は、HEK293細胞においてEPO発現を誘導し得ない図11a。この結果は、HEK293細胞が胚腎臓上皮細胞EPOの供給源として作用しない組織に由来するので生じる。これらの細胞でのEPOの不活性化にもかかわらず、キメラEPO2C-VP16ZFPは、EPO遺伝子を活性化し得る図11a。EPO遺伝子発現に対するCoCl2効果およびZFP効果は、EPO転写に影響を及ぼすことが示された。TaqManアッセイPEAppliedBiosystemsとして公知の方法を使用して、定量的なRT-PCRを行った。データを図11bに示す。以上のように、本発明は、組換えジンクフィンガータンパク質を用いる内因性細胞遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。"