"脊椎動物細胞へRNAをインビボで送達するための非ビリオン粒子であって、ここで、a該粒子は、i送達物質であって、免疫原をコードする自己複製RNA分子を被包している、送達物質、またはii送達物質であって、免疫原をコードする自己複製RNA分子が、該送達物質に吸着させられている、送達物質のいずれかを含み、b該RNAは、改変されていないヌクレオチドを含む、非ビリオン粒子。前記粒子が、リポソームであり、前記RNAが、該リポソーム中に被包されている、請求項1に記載の粒子。前記粒子が、非毒性かつ生分解性のポリマー微粒子であり、前記RNAが、該ポリマー微粒子に吸着させられている、請求項1に記載の粒子。前記粒子が、ポリマー、架橋剤、荷電したモノマーおよび前記RNAを反応させることによって形成された、生分解性の架橋されたオリゴマーのポリマーナノ粒子である、請求項1に記載の粒子。前記リポソームが、カチオン性頭部を有する脂質を含む、請求項2に記載の粒子。前記リポソームが、両性イオン性頭部を有する脂質を含む、請求項2または請求項5に記載の粒子。前記リポソームが、50nm~220nmの範囲の直径を有する、請求項2、請求項5または請求項6に記載の粒子。前記粒子が、ポリD,L-ラクチド-co-グリコリドを含む、請求項3に記載の粒子。前記粒子が、直径30nm~7μmを有する、請求項3または請求項8に記載の粒子。前記自己複製RNA分子が、i該自己複製RNA分子からRNAを転写し得るRNA依存性RNAポリメラーゼ、およびii免疫原をコードする、前述の請求項のいずれかに記載の粒子。前記RNA分子が、2個のオープンリーディングフレームを有し、該2個のオープンリーディングフレームの第1のものが、アルファウイルスレプリカーゼをコードし、該2個のオープンリーディングフレームの第2のものが、前記免疫原をコードする、請求項10に記載の粒子。前記RNA分子が、9000~12000ヌクレオチド長である、前述の請求項のいずれかに記載の粒子。前記免疫原が、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る、前述の請求項のいずれかに記載の粒子。前記免疫原が、RSウイルス糖タンパク質Fに対してインビボで免疫応答を誘発し得る、請求項13に記載の粒子。前述の請求項のいずれかに記載の粒子を含む、薬学的組成物。脊椎動物において防御免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、請求項1~14に記載の粒子、または請求項15に記載の薬学的組成物の有効量を、該脊椎動物に投与する工程を包含する、方法。さらなる改善された核酸ワクチン、特に、核酸ワクチンの送達の改善された方法への必要性が存在している。発明の開示本発明によれば、核酸免疫化は、小粒子内に被包された、および/もしくは小粒子に吸着させられた自己複製RNAを送達することによって達成される。上記RNAは、目的の免疫原をコードし、上記粒子は、天然のウイルスの送達機能を摸倣することによって、このRNAを送達し得る。従って、本発明は、RNAを脊椎動物細胞にインビボで送達するための非ビリオン粒子を提供し、ここで上記粒子は、免疫原をコードする自己複製RNA分子を被包する送達物質を含む。本発明はまた、RNAを脊椎動物細胞にインビボで送達するための非ビリオン粒子を提供し、ここで上記粒子は、免疫原をコードする自己複製RNA分子が吸着させられる送達物質を含む。これら粒子は、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。自己複製RNAを送達するための非ビリオン粒子の利用の組み合わせは、上記免疫原に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘発すると同時に、ごく低用量のRNAを送達する方法を提供する。さらに、これら粒子は、商業スケールで容易に製造され得る。粒子本発明の粒子は、非ビリオン粒子であるすなわち、それらは、ビリオンではない。従って、上記粒子は、タンパク質キャプシドを含まない。キャプシド粒子を作る必要性を回避することによって、本発明は、パッケージング細胞株を必要としないので、商業的生産のための容易なスケールアップおよび危険な感染性ウイルスが偶然に生成されてしまうリスクを最小にすることを可能にする。ビリオン中にRNAを被包する代わりに、本発明の粒子は、送達物質から形成される。種々の物質が、RNAを脊椎動物細胞にインビボで送達し得る粒子を形成するために適している。特に興味深い2つの送達物質は、iリポソームを形成し得る両親媒性脂質、およびii微粒子を形成し得る、非毒性でかつ生分解性のポリマーである。送達がリポソームによる場合、RNAは、被包されるべきである;送達がポリマー微粒子による場合、RNAは、被包もしくは吸着させられ得る。第3の興味深い送達物質は、ポリマー、架橋剤、RNA、および荷電したモノマーの粒状反応生成物である。従って、本発明の粒子の一実施形態は、免疫原をコードする自己複製RNA分子を被包するリポソームを含むのに対して、別の実施形態は、免疫原をコードする自己複製RNA分子を被包するポリマー微粒子を含み、別の実施形態は、免疫原をコードする自己複製RNA分子が吸着したポリマー微粒子を含む。3つすべての場合において、上記粒子は、好ましくは、実質的に球状である。第4の実施形態において、本発明の粒子は、ポリマー、架橋剤、免疫原をコードする自己複製RNA分子、および荷電したモノマーの粒状反応生成物を含む。これら粒子は、型内で形成されるので、任意の形状球が挙げられるが、これらに限定されないで作られ得る。RNAは、上記粒子内に被包され得る特に、上記粒子がリポソームである場合。このことは、上記粒子内部のRNAが、上記送達物質によって任意の外部媒体から天然のウイルスにおけるように分離されることを意味し、被包は、RNAをRNase消化から保護することが見いだされた。被包は、種々の形態をとり得る。例えば、いくつかの実施形態において単層リポソームunilamellarliposomeにおけるように、上記送達物質は、水性のRNA含有コアの周りに外側層を形成するのに対して、他の実施形態において例えば、成形粒子におけるように、上記送達物質は、RNAが内部に埋め込まれるマトリクスを形成する。上記粒子は、いくらかの外部RNAを含み得るが例えば、上記粒子の表面上に、上記RNAのうちの少なくとも半分および理想的には、そのすべては、被包される。リポソーム内の被包は、例えば、参考文献1で開示される脂質/RNA複合体とは異なる。RNAは、上記粒子に吸着させられ得る特に、上記粒子がポリマー微粒子である場合。このことは、天然のウイルスのRNAゲノムとは異なり、RNAが上記送達物質によって任意の外部媒体から分離されないことを意味する。上記粒子は、いくらかの被包されたRNAを含み得るが例えば、粒子のコア中に、上記RNAのうちの少なくとも半分および理想的には、そのすべては、吸着させられる。リポソーム種々の両親媒性脂質は、リポソームとして、RNA含有水性コアを被包するように、水性環境中で二重層を形成し得る。これら脂質は、アニオン性、カチオン性もしくは両性イオン性の親水性頭部headgroupを有し得る。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、1960年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、1990年代以来研究されてきた。いくつかのリン脂質はアニオン性であるのに対して、他のものは、両性イオン性であり、他のものはカチオン性である。リン脂質の適切なクラスとしては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジル-グリセロールが挙げられるが、これらに限定されず、いくつかの有用なリン脂質は、表1に列挙される。有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンDOTAP、1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDSDMA、1,2-ジオレイルオキシ-N,Nジメチル-3-アミノプロパンDODMA、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDLinDMA、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDLenDMA。両性イオン性脂質としては、アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質が挙げられるが、これらに限定されない。有用な両性イオン性脂質の例は、DPPC、DOPCおよびドデシルホスホコリンである。上記脂質は、飽和もしくは不飽和であり得る。リポソームを調製するための少なくとも1つの不飽和脂質の使用は、好ましい。不飽和脂質が2つのテールを有する場合、両方のテールが、不飽和であり得、または上記不飽和脂質は、1つの飽和テールおよび1つの不飽和テールを有し得る。本発明のリポソーム粒子は、単一の脂質から、もしくは脂質の混合物から形成され得る。混合物は、iアニオン性脂質の混合物、iiカチオン性脂質の混合物、iii両性イオン性脂質の混合物、ivアニオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、vアニオン性脂質と両性イオン性脂質との混合物、vi両性イオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、またはviiアニオン性脂質、カチオン性脂質、および両性イオン性脂質の混合物を含み得る。同様に、混合物は、飽和脂質および不飽和脂質の両方を含み得る。例えば、混合物は、DSPC両性イオン性、飽和、DlinDMAカチオン性、不飽和、および/もしくはDMGアニオン性、飽和を含み得る。脂質の混合物が使用される場合、上記混合物中の成分である脂質のすべてが、両親媒性である必要はない例えば、1種以上の両親媒性脂質が、コレステロールと混合され得る。脂質の親水性部分は、PEG化され得るすなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって改変され得る。この改変は、上記リポソームの安定性を増大させ得、そして上記リポソームの非特異的吸着を妨げ得る。例えば、脂質は、参考文献2および3に開示されるもののような技術を使用して、PEGに結合体化され得る。PEGの種々の長さが使用され得る例えば、0.5~8kDa。DSPC、DlinDMA、PEG-DMGおよびコレステロールの混合物が、実施例において使用される。リポソーム粒子は、通常は、3つの群に分けられる:多層小胞MLV;小さな単層小胞SUV;および大きな単層小胞LUV。MLVは、各小胞において複数の二重層を有し、いくつかの別個の水性区画を形成する。SUVおよびLUVは、水性コアを被包する単一の二重層を有する;SUVは、代表的には、直径≦50nmを有し、LUVは、直径>50nmを有する。本発明のリポソーム粒子は、理想的には、50~220nmの範囲の直径を有するLUVである。様々な直径を有するLUVの集団を含む組成物に関しては:i少なくとも80数では、20~220nmの範囲の直径を有するべきであり、ii上記集団の平均直径Zav強度では、理想的には、40~200nmの範囲にあり、そして/またはiii上記直径は、多分散指数<0.2を有するべきである。参考文献1のリポソーム/RNA複合体は、600~800nmの範囲の直径を有し、高い多分散性を有すると予測される。適切なリポソームを調製するための技術は、当該分野で周知である例えば、参考文献4~6を参照のこと。1つの有用な方法は、参考文献7に記載され、i脂質のエタノール溶液、ii核酸の水性溶液、およびiii緩衝液を混合する工程、続いて、混合、平衡化、希釈および精製の工程を包含する。本発明の好ましいリポソームは、この混合プロセスによって得られ得る。ポリマー微粒子種々のポリマーは、本発明に従って、RNAを被包もしくは吸着するように微粒子を形成し得る。実質的に非毒性のポリマーの使用は、レシピエントが上記粒子を安全に受容し得ることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、上記粒子が、長期的な残存を回避するように送達後に代謝され得ることを意味する。有用なポリマーはまた、薬学的グレードの処方物の調製を補助するために、滅菌可能である。適切な非毒性かつ生分解性のポリマーとしては、ポリα-ヒドロキシ酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトンポリカプロラクトンを含む、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン誘導ポリカーボネートもしくはポリエステル-アミド、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記微粒子は、ポリα-ヒドロキシ酸、例えば、ポリラクチドPLA、ラクチドとグリコリドとのコポリマー、例えば、ポリD,L-ラクチド-co-グリコリドPLG、およびD,L-ラクチドとカプロラクトンとのコポリマーから形成される。有用なPLGポリマーとしては、以下の範囲のラクチド/グリコリドモル比、例えば、20:80~80:20例えば、25:75、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、75:25を有するものが挙げられる。有用なPLGポリマーとしては、例えば、5,000~200,000Da例えば、10,000~100,000Da、20,000~70,000Da、30,000~40,000Da、40,000~50,000Daの分子量を有するものが挙げられる。上記微粒子は、理想的には、0.02μm~8μmの範囲の直径を有する。様々な直径を有する微粒子の集団を含む組成物に関して、少なくとも80数では、0.03~7μmの範囲の直径を有するべきである。適切な微粒子を調製するための技術は、当該分野で周知である例えば、参考文献6、8特に、第7章および9を参照のこと。RNAの吸着を促進するために、微粒子は、カチオン性界面活性剤および/もしくは脂質例えば、参考文献10および11に開示されるようにを含み得る。本発明の微粒子は、40~100mVのゼータ電位を有し得る。リポソームに勝る微粒子の1つの利点は、安定な貯蔵のために、微粒子が容易に凍結乾燥されることである。成形粒子第3の興味深い送達物質は、ポリマー、架橋剤、免疫原をコードする自己複製RNA、および荷電したモノマーの粒状反応生成物である。これら4種の成分は、液体として混合され得、型の中に配置され例えば、ペルフルオロポリエーテルを含む、次いで、硬化されて、上記型の形状および寸法に従って上記粒子が形成される。適切な製造法の詳細は、参考文献12に開示される。これら方法は、生分解性の架橋されたオリゴマーのポリマーナノ粒子oligomericpolymernanoparticleを提供する。理想的には、上記粒子は、最大断面寸法≦5μmを有する。それらは、全体的に正電荷を有し得る。適切なポリマーとしては、ポリアクリル酸;ポリスチレンスルホネート;カルボキシメチルセルロースCMC;ポリビニルアルコール;ポリエチレンオキシド;ポリビニルピロリドン;デキストラン;ポリビニルピロリドン-co-ビニルアセテート-co-ビニルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいポリマーは、ポリビニルピロリドンである。上記粒子を形成するためのポリマーの量は、2~75wt例えば、10~60wt、20~60wtであり得る。適切な架橋剤としては、ジスルフィドおよび/もしくはケタールが挙げられ得る。例えば、上記架橋剤は、以下を含み得る:ポリε-カプロラクトン-b-テトラエチレングリコール-b-ポリε-カプロラクトンジメタクリレート、ポリε-カプロラクトン-b-ポリエチレングリコール-b-ポリε-カプロラクトンジメタクリレート、ポリ乳酸-b-テトラエチレングリコール-b-ポリ乳酸ジメタクリレート、ポリ乳酸-b-ポリエチレングリコール-b-ポリ乳酸ジメタクリレート、ポリグリコール酸-b-テトラエチレングリコール-b-ポリグリコール酸ジメタクリレート、ポリグリコール酸-b-ポリエチレングリコール-b-ポリグリコール酸ジメタクリレート、ポリε-カプロラクトン-b-テトラエチレングリコール-b-ポリε-カプロラクトンジアクリレート、ポリε-カプロラクトン-b-ポリエチレングリコール-b-ポリε-カプロラクトンジアクリレート、ポリ乳酸-b-テトラエチレングリコール-b-ポリ乳酸ジアクリレート、ポリ乳酸-b-ポリエチレングリコール-b-ポリ乳酸ジアクリレート、ポリグリコール酸-b-テトラエチレングリコール-b-ポリグリコール酸ジアクリレート、ポリグリコール酸-b-ポリエチレングリコール-b-ポリグリコール酸ジアクリレート、シラン、ケイ素含有メタクリレート、またはジメチルジメタクリロイルオキシ-l-エトキシシラン。上記粒子を形成するための架橋剤の量は、10~25wt例えば、10~60wt、20~60wtであり得る。荷電したモノマーは、カチオン性もしくはアニオン性であり得る。これらとしては、[2-アクリロイルオキシエチル]トリメチルアンモニウムクロリドAETMACおよび2-アミノエチルメタクリレートヒドロクロリドAEM-HClが挙げられるが、これらに限定されない。上記粒子を形成するための荷電したモノマーの量は、2~75wtであり得る。上記粒子を形成するためのRNAの量は、0.25~20wtであり得る。型の中の硬化前pre-cure混合物は、開始剤を含み得る。例えば、上記型は、≦1wtの開始剤、≦0.5wtの開始剤、もしくは≦0.1wtの開始剤を含み得る。0.1~0.5の開始剤は、有用である。光開始剤例えば、DEAPおよびDPTは、例えば、紫外線硬化での使用に有用である。本発明は、siRNA成分が、本明細書のように自己複製RNAによって置換されることを除いて、参考文献12の表1もしくは実施例1~15に開示される材料のうちのいずれかを使用し得る。RNA本発明の粒子は、siRNAとは異なり免疫原をコードする自己複製RNA分子を含む。上記粒子のインビボ投与の後、RNAは、上記粒子から放出され、細胞内で翻訳されて、上記免疫原をインサイチュで提供する。参考文献13とは異なり、本発明の粒子中のRNAは、自己複製する。自己複製RNA分子レプリコンは、あらゆるタンパク質なしで脊椎動物細胞に送達される場合でも、上記自己複製RNA分子自体からの転写によって上記自己複製RNA分子自体から生成するアンチセンスコピーを介して、複数の娘RNAの生成をもたらし得る。自己複製RNA分子は、従って、代表的には、細胞へ送達された後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳は、RNA依存性RNAポリメラーゼを提供し、次いで、これは、上記送達されたRNAからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を生成する。従って、上記送達されたRNAは、複数の娘RNAの生成をもたらす。これら娘RNA、ならびに同一線上collinearのサブゲノム転写物は、それ自体が翻訳されて、コードされた免疫原のインサイチュ発現を提供し得るか、または転写されて、上記送達されたRNAと同じセンスのさらなる転写物上記免疫原のインサイチュ発現を提供するように翻訳されるを提供し得る。この一連の転写の全体的な結果は、上記導入されたレプリコンRNAの数における非常に多くの増幅であり、よって、上記コードされた免疫原は、上記細胞の主なポリペプチド生成物になる。この様式で自己複製を達成するための1つの適切なシステムは、アルファウイルスベースのレプリコンを使用することである。これらのレプリコンは、細胞への送達後に、レプリカーゼもしくはレプリカーゼ-転写酵素の翻訳をもたらすプラス鎖RNAである。上記レプリカーゼは、上記送達されたプラス鎖RNAのゲノムマイナス鎖コピーを作り出す複製複合体を提供するように自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらマイナス鎖転写物は、これ自体が、上記プラス鎖親RNAのさらなるコピーを与え、そしてまた、免疫原をコードするサブゲノム転写物を与えるように転写され得る。従って、上記サブゲノム転写物の翻訳は、上記感染した細胞による上記免疫原のインサイチュ発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用し得る。変異型ウイルスもしくは野生型ウイルスの配列が使用され得る例えば、VEEVの弱毒化TC83変異体は、レプリコンにおいて使用されてきた[14]。好ましい自己複製RNA分子は、従って、i上記自己複製RNA分子からRNAを転写し得るRNA依存性RNAポリメラーゼ、およびii免疫原をコードする。上記ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ例えば、アルファウイルスタンパク質nsP1、nsP2、nsP3およびnsP4のうちの1種以上を含むであり得る。天然のアルファウイルスゲノムが、上記非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて、構造的ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明の自己複製RNA分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。従って、好ましい自己複製RNAは、細胞においてそれ自体のゲノムRNAコピーの生成をもたらし得るが、RNA含有ビリオンの生成はもたらさない。これらのビリオンを生成できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、上記自己複製RNA分子が、感染性形態においてそれ自体を永続させられないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続に必要な上記アルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製RNAには存在せず、それらの位置は、上記目的の免疫原をコードする遺伝子によってしめられている。その結果、上記サブゲノム転写物は、上記構造的アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく、上記免疫原をコードする。従って、本発明で有用な自己複製RNA分子は、2個のオープンリーディングフレームを有し得る。第1の5’側オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし;第2の3’側オープンリーディングフレームは、免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、上記RNAは、例えば、さらなる免疫原以下を参照のことをコードするために、もしくは補助ポリペプチドをコードするために、さらなる例えば、下流のオープンリーディングフレームを有し得る。好ましい自己複製RNA分子は、5’キャップ例えば、7-メチルグアノシンを有する。このキャップは、上記RNAのインビボ翻訳を増強し得る。いくつかの実施形態において、上記自己複製RNA分子の5’配列は、上記コードされたレプリカーゼとの適合性を確実にするように選択されなければならない。自己複製RNA分子は、3’ポリ-Aテールを有し得る。それはまた、その3’末端付近にポリAポリメラーゼ認識配列例えば、AAUAAAを含み得る。自己複製RNA分子は、種々の長さを有し得るが、それらは、代表的には、5000~25000ヌクレオチド長例えば、8000~15000ヌクレオチド、もしくは9000~12000ヌクレオチドである。従って、上記RNAは、siRNA送達において認められるものより長い。自己複製RNA分子は、代表的には、一本鎖である。一本鎖RNAは、一般には、TLR7、TLR8、RNAヘリカーゼおよび/もしくはPKRに結合することによってアジュバント効果を開始し得る。二本鎖形態dsRNAにおいて送達されたRNAは、TLR3に結合し得、このレセプターはまた、一本鎖RNAの複製の間に、もしくは一本鎖RNAの二次構造内のいずれかで形成されるdsRNAによって駆動され得る。上記自己複製RNAは、便宜上、インビトロ転写IVTによって調製され得る。IVTは、細菌においてプラスミド形態において作られ、増やされたか、または合成で作製された例えば、遺伝子合成および/もしくはポリメラーゼ連鎖反応PCR操作法によってcDNAテンプレートを使用し得る。例えば、DNA依存性RNAポリメラーゼ例えば、バクテリオファージT7、T3もしくはSP6RNAポリメラーゼは、DNAテンプレートから自己複製RNAを転写するために使用され得る。適切なキャッピングおよびポリA付加反応は、必要時に使用され得るしかし、上記レプリコンのポリAは、通常、上記DNAテンプレート内にコードされる。これらRNAポリメラーゼは、転写される5’ヌクレオチドについてストリンジェントな要件を有し得、いくつかの実施形態において、これらの要件は、上記IVT転写RNAが、自己がコードするレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、上記コードされたレプリカーゼの要件とマッチしなければならない。参考文献15において考察されるように、上記自己複製RNAは、任意の5’キャップ構造に加えて改変された核酸塩基を有する1個以上のヌクレオチドを含み得る。従って、上記RNAは、以下を含み得る:m5C5-メチルシチジン、m5U5-メチルウリジン、m6AN6-メチルアデノシン、s2U2-チオウリジン、Um2’-O-メチルウリジン、m1Al-メチルアデノシン;m2A2-メチルアデノシン;Am2’-O-メチルアデノシン;ms2m6A2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン;i6AN6-イソペンテニルアデノシン;ms2i6A2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン;io6AN6-cis-ヒドロキシイソペンテニルアデノシン;ms2io6A2-メチルチオ-N6-cis-ヒドロキシイソペンテニルアデノシン;g6AN6-グリシニルカルバモイルアデノシン;t6AN6-スレオニルカルバモイルアデノシン;ms2t6A2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン;m6t6AN6-メチル-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン;hn6AN6.-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;ms2hn6A2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;Arp2’-O-リボシルアデノシンホスフェート;Iイノシン;m111-メチルイノシン;m’Im1,2’-O-ジメチルイノシン;m3C3-メチルシチジン;Cm2T-O-メチルシチジン;s2C2-チオシチジン;ac4CN4-アセチルシチジン;f5C5-ホルミルfonnylシチジン;m5Cm5,2-O-ジメチルシチジン;ac4CmN4アセチル2TOメチルシチジン;k2Cリシジン;m1G1-メチルグアノシン;m2GN2-メチルグアノシン;m7G7-メチルグアノシン;Gm2’-O-メチルグアノシン;m22GN2,N2-ジメチルグアノシン;m2GmN2,2’-O-ジメチルグアノシン;m22GmN2,N2,2’-O-トリメチルグアノシン;Grp2’-O-リボシルグアノシンホスフェート;yWワイブトシン;o2yWペルオキシワイブトシン;OHyWヒドロキシワイブトシン;OHyW改変下undermodifiedヒドロキシワイブトシン;imGワイオシン;mimGメチルグアノシン;Qキューオシン;oQエポキシキューオシン;galQガラクトシルgaltactosyl-キューオシン;manQマンノシル-キューオシン;preQo7-シアノ-7-デアザグアノシン;preQi7-アミノメチル-7-デアザグアノシン;Gアルカエオシンarchaeosine;Dジヒドロウリジン;m5Um5,2’-O-ジメチルウリジン;s4U4-チオウリジン;m5s2U5-メチル-2-チオウリジン;s2Um2-チオ-2’-O-メチルウリジン;acp3U3-3-アミノ-3-カルボキシプロピルウリジン;ho5U5-ヒドロキシウリジン;mo5U5-メトキシウリジン;cmo5Uウリジン5-オキシ酢酸;mcmo5Uウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル;chm5U5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン;mchm5U5-カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル;mcm5U5-メトキシカルボニルメチルウリジン;mcm5UmS-メトキシカルボニルメチル-2-O-メチルウリジン;mcm5s2U5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン;nm5s2U5-アミノメチル-2-チオウリジン;mnm5U5-メチルアミノメチルウリジン;mnm5s2U5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン;mnm5se2U5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン;ncm5U5-カルバモイルメチルウリジン;ncm5Um5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン;cmnm5U5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン;cnmm5Um5-カルボキシメチルアミノメチル-2-L-Oメチルウリジン;cmnm5s2U5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン;m62AN6,N6-ジメチルアデノシン;Tm2’-O-メチルイノシン;m4CN4-メチルシチジン;m4CmN4,2-O-ジメチルシチジン;hm5C5-ヒドロキシメチルシチジン;m3U3-メチルウリジン;cm5U5-カルボキシメチルウリジン;m6AmN6,T-O-ジメチルアデノシン;rn62AmN6,N6,O-2-トリメチルアデノシン;m2’7GN2,7-ジメチルグアノシン;m2’2’7GN2,N2,7-トリメチルグアノシン;m3Um3,2T-O-ジメチルウリジン;m5D5-メチルジヒドロウリジン;f5Cm5-ホルミル-2’-O-メチルシチジン;m1Gm1,2’-O-ジメチルグアノシン;m’Am1,2-O-ジメチルアデノシンイリノメチルウリジン;tm5s2US-タウリノメチル-2-チオウリジン;imG-144-デメチルグアノシン;imG2イソグアノシン;もしくはac6AN6-アセチルアデノシン、ヒポキサンチン、イノシン、8-オキソ-アデニン、7-置換されたその誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-アミノウラシル、5-C1-C6-アルキルウラシル、5-メチルウラシル、5-C2-C6-アルケニルウラシル、5-C2-C6-アルキニルウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、5-クロロウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシシトシン、5-C1-C6-アルキルシトシン、5-メチルシトシン、5-C2-C6-アルケニルシトシン、5-C2-C6-アルキニルシトシン、5-クロロシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、N2-ジメチルグアニン、7-デアザグアニン、8-アザグアニン、7-デアザ-7-置換グアニン、7-デアザ-7-C2-C6アルキニルグアニン、7-デアザ-8-置換グアニン、8-ヒドロキシグアニン、6-チオグアニン、8-オキソグアニン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,4-ジアミノプリン、2,6-ジアミノプリン、8-アザプリン、置換された7-デアザプリン、7-デアザ-7-置換プリン、7-デアザ-8-置換プリン、または無塩基ヌクレオチド。例えば、自己複製RNAは、1つ以上の改変されたピリミジン核酸塩基例えば、シュードウリジンおよび/もしくは5-メチルシトシン残基を含み得る。しかし、いくつかの実施形態において、上記RNAは、改変された核酸塩基を含まず、改変されたヌクレオチドを含まなくてもよいすなわち、上記RNA中のヌクレオチドのすべては、標準的なA、C、GおよびUというリボヌクレオチドである任意の5’キャップ構造を除く。これは、7’-メチルグアノシンを含み得る。他の実施形態において、上記RNAは、7’-メチルグアノシンを含む5’キャップを含み得、最初の1個、2個もしくは3個の5’リボヌクレオチドは、リボースの2’位においてメチル化され得る。本発明で使用されるRNAは、理想的には、ヌクレオチド間にホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態において、それは、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、および/もしくはメチルホスホネート結合を含み得る。1粒子あたりのRNAの量は変動し得、1粒子あたりの個々の自己複製RNA分子の数は、使用される粒子の特徴に依存し得る。一般に、粒子は、1~500個のRNA分子を含み得る。リポソームに関しては、上記RNA分子の数は、代表的には、1リポソームあたり≦50個例えば、<20個、<10個、<5個、もしくは1~4個である。ポリマー微粒子に関しては、RNA分子の数は、上記粒子直径に依存するが、1粒子あたり≦50個例えば、<20個、<10個、<5個、もしくは1~4個または1粒子あたり50~200であり得る。理想的には、粒子は、10より少ない数の異なる種のRNA例えば、5種、4種、3種、もしくは2種の異なる種を含み;最も好ましくは、粒子は、単一のRNA種を含む。すなわち、上記粒子におけるすべてのRNA分子が、同じ配列および配列長さを有する。免疫原本発明で使用される自己複製RNA分子は、ポリペプチド免疫原をコードする。上記粒子の投与後に、上記免疫原は、インビボで翻訳され、レシピエントにおける免疫応答を誘発し得る。上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してあるいは、いくつかの実施形態において、アレルゲンに対して;および他の実施形態において、腫瘍抗原に対して免疫応答を誘発し得る。上記免疫応答は、抗体応答通常は、IgGを含むおよび/もしくは細胞媒介性免疫応答を含み得る。上記ポリペプチド免疫原は、代表的には、対応する細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物またはアレルゲンもしくは腫瘍ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物のサッカリドを認識する免疫応答を誘発するように、ミモトープとして作用し得る。上記免疫原は、代表的には、表面ポリペプチド例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質などである。自己複製RNA分子は、単一のポリペプチド免疫原もしくは複数のポリペプチドをコードし得る。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原融合ポリペプチドとして、または別個のポリペプチドとして提示され得る。免疫原が、別個のポリペプチドとして発現される場合、これらのうちの1種以上は、上流のIRESもしくはさらなるウイルスプロモーターエレメントとともに提供され得る。あるいは、複数の免疫原は、短い自己触媒性プロテアーゼ例えば、口蹄疫ウイルス2Aタンパク質に融合された個々の免疫原をコードするポリプロテインから、またはインテインとして発現され得る。参考文献1および16とは異なり、上記RNAは、免疫原をコードする。不確かさを避けるために、本発明は、ホタルルシフェラーゼをコードするRNA、E.coliβ-ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードするRNA、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするRNAを含まない。また、上記RNAは、全マウス胸腺RNAではない。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これら細菌のうちの1種に対して免疫応答を誘発する:Neisseriameningitidis:有用な免疫原としては、膜タンパク質、例えば、アドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、およびH因子結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。3種の有用なポリペプチドの組み合わせが、参考文献17に開示される。Streptococcuspneumoniae:有用なポリペプチド免疫原は、参考文献18に開示される。これらとしては、RrgB線毛サブユニット、β-N-アセチル-ヘキソサミニダーゼ前駆体spr0057、spr0096、一般的なストレスタンパク質generalstressproteinGSP-781spr2021、SP2216、セリン/スレオニンキナーゼStkPSP1732、および肺炎球菌表面アドヘシンPsaAが挙げられるが、これらに限定されない。Streptococcuspyogenes:有用な免疫原としては、参考文献19および20に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。MoraxellacatarrhalisBordetellapertussis:有用な百日咳免疫原としては、百日咳毒素もしくはトキソイドPT、線維状ヘマグルチニンFHA、ペルタクチン、ならびに凝集原2および3が挙げられるが、これらに限定されない。Staphylococcusaureus:有用な免疫原としては、参考文献21に開示されるポリペプチド例えば、溶血素、esxA、esxB、フェリクロム結合タンパク質sta006および/もしくはsta011リポプロテインが挙げられるが、これらに限定されない。Clostridiumtetani:代表的な免疫原は、破傷風トキソイドである。Cornynebacteriumdiphtheriae:代表的な免疫原は、ジフテリアトキソイドである。Haemophilusinfluenzae:有用な免疫原としては、参考文献22および23に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。PseudomonasaeruginosaStreptococcusagalactiae:有用な免疫原としては、参考文献19に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。Chlamydiatrachomatis:有用な免疫原としては、PepA、LcrE、ArtJ、DnaK、CT398、OmpH様、L7/L12、OmcA、AtoS、CT547、Eno、HtrAおよびMurG例えば、参考文献24に開示されるとおりが挙げられるが、これらに限定されない。LcrE[25]およびHtrA[26]は、2つの好ましい免疫原である。Chlamydiapneumoniae:有用な免疫原としては、参考文献27に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。Helicobacterpylori:有用な免疫原としては、CagA、VacA、NAP、および/もしくはウレアーゼ[28]が挙げられるが、これらに限定されない。Escherichiacoli:有用な免疫原としては、腸毒素産生性E.coliETEC、腸管凝集性E.coliEAggEC、分散接着性diffuselyadheringE.coliDAEC、腸病原性E.coliEPEC、腸管外病原性E.coliExPECおよび/もしくは腸管出血性E.coliEHECに由来する免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。ExPEC株としては、尿路病原性E.coliUPECおよび髄膜炎/敗血症関連E.coliMNECが挙げられる。有用なUPECポリペプチド免疫原は、参考文献29および30に開示される。有用なMNEC免疫原は、参考文献31に開示される。いくつかのE.coliタイプに有用な免疫原は、AcfDである[32]。BacillusanthracisYersiniapestis:有用な免疫原としては、参考文献33および34に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これらウイルスのうちの1種に対して免疫応答を誘発する:オルソミクソウイルス:有用な免疫原は、インフルエンザA、BもしくはCウイルスに由来し得る例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼもしくはマトリクスM2タンパク質。上記免疫原がインフルエンザAウイルスヘマグルチニンである場合、それは、任意のサブタイプ例えば、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15もしくはH16に由来し得る。パラミクソウイルス科のウイルス:ウイルス免疫原としては、肺炎ウイルス例えば、RSウイルス、RSV、ルブラウイルス例えば、ムンプスウイルス、パラミクソウイルス例えば、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス例えば、麻疹に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ポックスウイルス科:ウイルス免疫原としては、オルトポックスウイルス例えば、真正痘瘡大痘瘡および小痘瘡が挙げられるが、これらに限定されないに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ピコルナウイルス:ウイルス免疫原としては、ピコルナウイルス例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記エンテロウイルスは、ポリオウイルス例えば、1型、2型、および/もしくは3型のポリオウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、EV71エンテロウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、コクサッキーAもしくはBウイルスである。ブンヤウイルス:ウイルス免疫原としては、オルソブンヤウイルス例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス、フレボウイルス例えば、リフトバレー熱ウイルス、もしくはナイロウイルス例えば、クリミアコンゴ出血熱ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ヘパルナウイルス:ウイルス免疫原としては、ヘパルナウイルス例えば、A型肝炎ウイルスHAVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。フィロウイルス:ウイルス免疫原としては、フィロウイルス例えば、エボラウイルスザイールエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、レストンエボラウイルスもしくはスーダンエボラウイルスを含むまたはマールブルグウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。トガウイルス:ウイルス免疫原としては、トガウイルス例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、もしくはアルテリウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。これは、風疹ウイルスを含む。フラビウイルス:ウイルス免疫原としては、フラビウイルス例えば、ダニ媒介脳炎TBEウイルス、デング1、2、3もしくは4型ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ペスチウイルス:ウイルス免疫原としては、ペスチウイルス例えば、牛ウイルス性下痢BVDV、豚コレラCSFVもしくはボーダー病BDVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ヘパドナウイルス:ウイルス免疫原としては、ヘパドナウイルス例えば、B型肝炎ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、B型肝炎ウイルス表面抗原HBsAgを含み得る。他の肝炎ウイルス:組成物は、C型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、もしくはG型肝炎ウイルスに由来する免疫原を含み得る。ラブドウイルス:ウイルス免疫原としては、ラブドウイルス例えば、リッサウイルス例えば、狂犬病ウイルスおよびベシクロウイルスVSVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。カリシウイルス科:ウイルス免疫原としては、カリシウイルス科例えば、ノーウォークウイルスノロウイルス、およびノーウォーク様ウイルス例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。コロナウイルス:ウイルス免疫原は、SARSコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎IBV、マウス肝炎ウイルスMHV、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルスTGEVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチドであり得る。レトロウイルス:ウイルス免疫原としては、オンコウイルス、レンチウイルス例えば、HIV-1もしくはHIV-2またはスプマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。レオウイルス:ウイルス免疫原としては、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、もしくはコルチウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。パルボウイルス:ウイルス免疫原としては、パルボウイルスB19に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ヘルペスウイルス:ウイルス免疫原としては、ヒトヘルペスウイルス例えば、例示に過ぎないが、単純ヘルペスウイルスHSV例えば、HSV1型および2型、水痘帯状疱疹ウイルスVZV、エプスタインバーウイルスEBV、サイトメガロウイルスCMV、ヒトヘルペスウイルス6HHV6、ヒトヘルペスウイルス7HHV7、およびヒトヘルペスウイルス8HHV8に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。パポバウイルス:ウイルス免疫原としては、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記ヒトパピローマウイルスは、血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63もしくは65のもの例えば、血清型6、11、16および/もしくは18のうちの1種以上に由来するであり得る。アデノウイルス:ウイルス免疫原としては、アデノウイルス血清型36Ad-36に由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、魚類に感染するウイルス例えば:伝染性サケ貧血ウイルスISAV、サケ膵臓病ウイルスSPDV、伝染性膵臓壊死症ウイルスIPNV、アメリカナマズウイルスCCV、魚類リンホシスチス病ウイルスFLDV、伝染性造血器壊死症ウイルスIHNV、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス大西洋サケピコルナ様ウイルスとしても公知、ヤマメウイルスLSV、大西洋サケロタウイルスASR、マスイチゴ病ウイルスTSD、銀ザケ腫瘍ウイルスCSTV、もしくはウイルス性出血性敗血症ウイルスVHSVに対する免疫応答を誘発する。真菌免疫原は、皮膚糸状菌類Dermatophytres以下が挙げられる:に由来し得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Plasmodium属例えば、P.falciparum、P.vivax、P.malariaeもしくはP.ovaleに由来する寄生生物に対する免疫応答を誘発する。従って、本発明は、マラリアに対して免疫化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Caligidae科に由来する寄生生物、特に、Lepeophtheirus属およびCaligus属に由来する寄生生物例えば、LepeophtheirussalmonisもしくはCaligusrogercresseyiのようなフナムシに対する免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する:花粉アレルゲン樹木花粉、草本花粉、雑草の花粉、および草の花粉のアレルゲン;昆虫もしくは蛛形類のアレルゲン吸入、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよび小虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲンhymenoptheravenomallergen;動物の毛およびふけのアレルゲン例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどに由来する;ならびに食物アレルゲン例えば、グリアジン。樹木、草および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、Fagales、Oleales、Pinalesの分類学上の目およびスズカケノキ科platanaceaeカバノキBetula、ハンノキAlnus、ハシバミCorylus、シデCarpinusおよびオリーブOlea、シーダーCryptomeriaおよびJuniperus、プラタナスPlatanusが挙げられるが、これらに限定されない、Poalesの目属Lolium、Phleum、Poa、Cynodon、Dactylis、Holcus、Phalaris、Secale、およびSorghumの草が挙げられる、AsteralesおよびUrticalesの目属Ambrosia、Artemisia、およびParietariaの草本が挙げられるから由来するそのようなものである。他の重要な吸入アレルゲンは、属DermatophagoidesおよびEuroglyphusのチリダニ類、コナダニ類storagemite例えば、Lepidoglyphys、GlycyphagusおよびTyrophagus、ゴキブリ、小虫およびノミに由来するもの例えば、Blatella、Periplaneta、ChironomusおよびCtenocepphalides、ならびに哺乳動物例えば、ネコ、イヌおよびウマに由来するもの、毒液のアレルゲン刺咬昆虫stingingorbitinginsectに由来するようなもの、例えば、Hymenopteraの分類学上の目蜂Apidae、スズメバチVespidea、およびアリFormicoidaeが挙げられるが挙げられるに由来するものである。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である:aがん-精巣cancer-testis抗原、例えば、NY-ESO-1、SSX2、SCP1ならびにRAGE、BAGE、GAGEおよびMAGEファミリーのポリペプチド例えば、GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、およびMAGE-12、これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、NSCLC、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用され得る;b変異した抗原、例えば、p53種々の固形腫瘍例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がんと関連、p21/Ras例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連、CDK4例えば、黒色腫と関連、MUM1例えば、黒色腫と関連、カスパーゼ-8例えば、頭頸部がんと関連、CIA0205例えば、膀胱がんと関連、HLA-A2-R1701、β-カテニン例えば、黒色腫と関連、TCR例えば、T細胞非ホジキンリンパ腫と関連、BCR-abl例えば、慢性骨髄性白血病と関連、トリオースホスフェートイソメラーゼ、KIA0205、CDC-27、およびLDLR-FUT;c過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン4例えば、結腸直腸がんと関連、ガレクチン9例えば、ホジキン病と関連、プロテイナーゼ3例えば、慢性骨髄性白血病と関連、WT1例えば、種々の白血病と関連、炭酸脱水酵素例えば、腎がんと関連、アルドラーゼA例えば、肺がんと関連、PRAME例えば、黒色腫と関連、HER-2/neu例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連、マンマグロビン、α-フェトプロテイン例えば、肝がんと関連、KSA例えば、結腸直腸がんと関連、ガストリン例えば、膵臓がんおよび胃がんと関連、テロメラーゼ触媒タンパク質、MUC-1例えば、乳がんおよび卵巣がんと関連、G-250例えば、腎細胞がんと関連、p53例えば、乳がん、結腸がんと関連、ならびにがん胎児性抗原例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん例えば、結腸直腸がんと関連;d共通抗原sharedantigen、例えば、黒色腫-メラノサイト分化抗原、例えば、MART-1/MelanA、gp100、MC1R、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質-1/TRP1およびチロシナーゼ関連タンパク質-2/TRP2例えば、黒色腫と関連;e前立腺関連抗原例えば、PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2例えば、前立腺がんと関連;fイムノグロブリンイディオタイプ例えば、骨髄腫およびB細胞リンパ腫と関連。特定の実施形態において、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、エプスタインバーウイルス抗原、EBNA、ヒトパピローマウイルスHPV抗原E6およびE7を含む、B型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイルスの抗原、ヒトTリンパ球向性ウイルス抗原、Mac-2結合タンパク質/シクロフィリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、TPSなど。薬学的組成物本発明の粒子は、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。これらの組成物は、代表的には、上記粒子に加えて、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアの詳細な考察は、参考文献35において入手可能である。本発明の薬学的組成物は、1種以上の低分子免疫強化因子を含み得る。例えば、上記組成物は、TLR2アゴニスト例えば、Pam3CSK4、TLR4アゴニスト例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート例えば、E6020、TLR7アゴニスト例えば、イミキモド、TLR8アゴニスト例えば、レシキモドおよび/もしくはTLR9アゴニスト例えば、IC31を含み得る。任意のこのようなアゴニストは、理想的には、分子量<2000Daを有する。RNAが被包される場合、いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記RNAとともに被包されるが、他の実施形態において、それらは、被包されない。RNAが粒子に吸着させられる場合、いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記RNAと一緒に吸着させられるが、他の実施形態において、それらは吸着させられない。本発明の薬学的組成物は、上記粒子を、ただの水plainwater例えば、w.f.i.もしくは緩衝液例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液中に含み得る。緩衝塩は、代表的には、5~20mM範囲において含まれる。本発明の薬学的組成物は、5.0~9.5例えば、6.0~8.0のpHを有し得る。本発明の組成物は、張度を与えるために、ナトリウム塩例えば、塩化ナトリウムを含み得る。10±2mg/mlNaClの濃度が代表的である例えば、約9mg/ml。本発明の組成物は、金属イオンキレート化剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速し得るイオンを除去することによって、RNA安定性を延長し得る。従って、組成物は、EDTA、EGTA、BAPTA、ペンテト酸などのうちの1種以上を含み得る。このようなキレート化剤は、代表的には、10~500μM例えば、0.1mMで存在する。クエン酸塩例えば、クエン酸ナトリウムはまた、キレート化剤として作用し得るのと同時に、有利なことには、緩衝化活性も提供し得る。本発明の薬学的組成物は、200mOsm/kg~400mOsm/kg例えば、240~360mOsm/kg、もしくは290~310mOsm/kgの重量オスモル濃度を有し得る。本発明の薬学的組成物は、1種以上の保存剤例えば、チオメルサールもしくは2-フェノキシエタノールを含み得る。水銀非含有組成物が好ましく、保存剤非含有ワクチンが調製され得る。本発明の薬学的組成物は、好ましくは、無菌である。本発明の薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性である例えば、1用量あたり<1EUエンドトキシンユニット、標準尺度、および好ましくは、1用量あたり<0.1EUを含む。本発明の薬学的組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。本発明の薬学的組成物は、単位用量形態において調製され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、0.1~1.0ml例えば、約0.5mlの容積を有し得る。上記組成物は、注射物として調製され得る溶液もしくは懸濁物のいずれかとして。上記組成物は、微細スプレーを使用する、肺投与例えば、吸入器によるのために調製され得る。上記組成物は、鼻、耳もしくは眼への投与例えば、スプレーもしくは滴剤としてのために調製され得る。筋肉内投与のための注射物が、代表的である。組成物は、免疫学的に有効量の粒子、ならびに任意の他の成分必要であればを含む。免疫学的に有効な量とは、個体への投与量が、単一用量においてもしくはシリーズのうちの一部としてのいずれかで、処置もしくは予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体的状態、処置されるべき個体の年齢、分類学上の群例えば、非ヒト霊長類、霊長類など、上記個体が抗体を合成する免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、その処置している医師の医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変動する。上記量は、慣用的な治験を通じて決定され得る比較的広い範囲に入ると予測される。本発明の組成物の粒子およびRNA含有量は、一般に、1用量あたりのRNAの量に関して表される。好ましい用量は、≦100μgRNA例えば、10~100μg例えば、約10μg、25μg、50μg、75μgもしくは100μgを有するが、発現は、遙かに低いレベル、例えば、≦1μg/用量、≦100ng/用量、≦10ng/用量、≦1ng/用量などにおいてみられ得る。本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含む送達デバイス例えば、シリンジ、ネブライザ、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなどを提供する。このデバイスは、上記組成物を脊椎動物被験体に投与するために使用され得る。本発明の粒子は、リボソームを含まない。処置方法および医学的使用参考文献16で開示される粒子とは対照的に、本発明の粒子および薬学的組成物は、目的の免疫原に対する免疫応答を誘発するためのインビボでの使用のためのものである。本発明は、本発明の粒子もしくは薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、脊椎動物において免疫応答を惹起するための方法を提供する。上記免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および/もしくは細胞媒介性免疫を含む。上記方法は、ブースター応答を惹起し得る。本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための方法において使用するための本発明の粒子もしくは薬学的組成物を提供する。本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明の粒子の使用を提供する。これら使用および方法により上記脊椎動物における免疫応答を惹起することによって、上記脊椎動物は、上記で考察されるように、種々の疾患および/もしくは感染から例えば、細菌疾患および/もしくはウイルス疾患から防御され得る。上記粒子および組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防的であるすなわち、感染を妨ぐか、もしくは治療的であるすなわち、感染を処置するのいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。上記脊椎動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトもしくは大型の獣医学的哺乳動物例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタである。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児例えば、幼児もしくは乳児またはティーンエイジャーである;上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、ティーンエイジャーもしくは成人である。小児用に意図されたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。従って、ヒト患者は、1歳未満、5歳未満、1~5歳、5~15歳、15~55歳、もしくは少なくとも55歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者例えば、≧50歳、≧60歳、および好ましくは、≧65歳、若年者例えば、≦5歳、入院患者、ヘルスケアワーカー、軍従事者、および軍職員、妊婦、慢性疾患患者、もしくは免疫不全患者である。しかし、上記ワクチンは、これらの群にのみ適切であるわけではなく、より一般に、集団において使用され得る。本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって達成され得る例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、もしくは組織の間隙空間に;参考文献1とは異なり、舌内intraglossal注射は、代表的には、本発明で使用されない。代替の送達経路としては、直腸、経口例えば、錠剤、スプレー、口内、舌下、膣、局所、経真皮transdermalもしくは経皮transcutaneous、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与が挙げられる。皮内および筋肉内投与は、2つの好ましい経路である。注射は、針を介してであってもよい例えば、皮下針が、針なしの注射が、代わりに使用され得る。代表的な筋肉内用量は、0.5mlである。本発明は、全身免疫および/もしくは粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身免疫および/もしくは粘膜免疫を誘発するために、使用され得る。投与量は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および/もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路例えば、非経口の一次と粘膜のブースト、粘膜の一次と非経口のブーストなどによって与えられ得る。複数用量は、代表的には、少なくとも1週間間隔を空けて例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など投与される。一実施形態において、複数用量は、生後約6週間、10週間、および14週間で例えば、世界保健機関のExpandedProgramonImmunisationEPIにおいてしばしば使用されるように、6週齢、10週齢および14週齢において投与され得る。代替の実施形態において、2回の一次用量が、約2ヶ月間間隔を空けて例えば、約7週間、8週間もしくは9週間間隔を空けて投与され、続いて、1回以上のブースター用量が、2回目の一次用量の約6ヶ月から1年後に例えば、2回目の一次用量の約6ヶ月後、8ヶ月後、10ヶ月後もしくは12ヶ月後投与される。さらなる実施形態において、3回の一次用量が、約2ヶ月間間隔を空けて例えば、約7週間、8週間もしくは9週間間隔を空けて投与され、続いて、1回以上のブースター用量が、3回目の一次用量の約6ヶ月後から1年後に例えば、3回目の一次用量の約6ヶ月後、8ヶ月後、10ヶ月後もしくは12ヶ月後投与される。一般的実施形態本発明のいくつかの実施形態において、上記RNAは、改変なしのヌクレオチドを含む上記を参照のこと。他の実施形態において、上記RNAは、必要に応じて、少なくとも1つの改変ヌクレオチドを含み得るが、以下の特徴のうちの1つ以上既に上記で開示されているもまた、必要とされる:A.上記RNAがリポソームとともに送達される場合、上記リポソームは、DSDMA、DODMA、DLinDMAおよび/もしくはDLenDMAを含む。B.上記RNAがリポソームに被包される場合、上記リポソーム中の脂質の親水性部分は、PEG化される。C.上記RNAがリポソームに被包される場合、上記リポソームの数で少なくとも80が、20~220nmの範囲の直径を有する。D.上記RNAが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子は、非毒性でかつ生分解性のポリマー微粒子である。E.上記RNAが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子は、0.02μm~8μmの範囲の直径を有する。F.上記RNAが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子の数で少なくとも80は、0.03~7μmの範囲の直径を有する。G.上記RNAが微粒子とともに送達される場合、上記組成物は、凍結乾燥される。H.上記RNAは3’ポリAテールを有し、上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る。I.上記RNAは、iリポソーム、ii非毒性でかつ生分解性のポリマー微粒子から選択される送達系を用いて、金属イオンキレート化剤との組み合わせにおいて送達される。一般本発明の粒子は、別段示されなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の、当該分野の技術内の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、参考文献36~42などを参照のこと。用語含むcomprisingは、含むincludingならびにからなるconsistingを包含し、例えば、Xを含むcomprising組成物は、Xから専らなってもよいし、何かさらなるものを含んでいてもよい例えば、XY。数値xに関して用語約とは、選択的であり、例えば、x±10を意味する。語句実質的にとは、完全にを排除せず、例えば、Yを実質的に含まない組成物は、Yを完全に含まない場合もある。必要な場合、語句実質的には、本発明の定義から省略され得る。電荷、カチオン、アニオン、両性性イオンなどへの言及は、pH7において取り扱われる。TLR3は、Toll様レセプター3である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のTLR3アゴニストは、ポリI:Cを含む。TLR3は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:11849である。ヒトTLR3遺伝子のRefSeq配列は、GI:2459625である。TLR7は、Toll様レセプター7である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のTLR7アゴニストは、例えば、イミキモドを含む。TLR7は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:15631である。ヒトTLR7遺伝子のRefSeq配列は、GI:67944638である。TLR8は、Toll様レセプター8である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のTLR8アゴニストは、例えば、レシキモドを含む。TLR8は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:15632である。ヒトTLR8遺伝子のRefSeq配列は、GI:20302165である。RIG-I様レセプターRLRファミリーは、先天的免疫系において重要な役割を果たす種々のRNAヘリカーゼを含む[43]。RLR-1RIG-Iもしくはレチノイン酸誘導性遺伝子Iとしても公知は、そのN末端付近にある2つのカスパーゼリクルートドメインを有する。上記RLR-1ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたHGNC名は、DDX58DEADAsp-Glu-Ala-Aspボックスポリペプチド58DEADAsp-Glu-Ala-Aspboxpolypeptide58についてであり、その特有のHGNCIDは、HGNC:19102である。ヒトRLR-1遺伝子のRefSeq配列は、GI:77732514である。RLR-2MDA5もしくは黒色腫分化関連遺伝子5melanomadifferentiation-associatedgene5としても公知はまた、そのN末端付近にある2つのカスパーゼリクルートドメインを有する。RLR-2ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたHGNC名は、IFIH1ヘリカーゼCドメイン1で誘導されるインターフェロンinterferoninducedwithhelicaseCdomain1についてであり、特有のHGNCIDは、HGNC:18873である。ヒトRLR-2遺伝子のRefSeq配列は、GI:27886567である。RLR-3LGP2もしくは遺伝学および生理学研究室2laboratoryofgeneticsandphysiology2としても公知は、カスパーゼリクルートドメインを有さない。RLR-3ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたHGNC名は、DHX58DEXHAsp-Glu-X-Hisボックスポリペプチド58についてであり、特有のHGNCIDは、HGNC:29517である。ヒトRLR-3遺伝子のRefSeq配列は、GI:149408121である。PKRは、二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼである。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす。EIF2AK2真核生物翻訳開始因子2-αキナーゼ2eukaryotictranslationinitiationfactor2-alphakinase2については、この酵素をコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:9437である。ヒトPKR遺伝子のRefSeq配列は、GI:208431825である。発明を実施するための態様RNAレプリコン種々のレプリコンは、以下で使用される。一般に、これらは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスVEEVに由来する非構造タンパク質、シンドビスウイルス由来のパッケージングシグナル、およびシンドビスウイルスもしくはVEEV変異体に由来する3’UTRを有するハイブリッドアルファウイルスゲノムに基づく。上記レプリコンは、約10kb長であり、ポリAテールを有する。アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドDNA名称:pT7-mVEEV-FL.RSVFもしくはA317;pT7-mVEEV-SEAPもしくはA306;pSP6-VCR-GFPもしくはA50を、インビボでのRNA合成のテンプレートとして供した。上記レプリコンは、RNA複製に必要とされるアルファウイルス遺伝的エレメントを含むが、粒子アセンブリに必要な遺伝子産物をコードするエレメントを欠いている;構造タンパク質は、代わりに、目的のタンパク質レポーター例えば、SEAPもしくはGFPまたは免疫原例えば、全長RSVFタンパク質のいずれかによって置き換えられるので、上記レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導できない。上記アルファウイルスcDNAの上流にあるバクテリオファージT7もしくはSP6プロモーターは、インビトロで上記レプリコンRNAの合成を促進し、上記ポリAテールの直ぐ下流にあるデルタ型肝炎ウイルスHDVリボザイムは、その自己切断活性を介して正確な3’末端を生成する。適切な制限エンドヌクレアーゼで上記HDVリボザイムの下流で上記プラスミドDNAを直線状にした後に、ランオフ転写物run-offtranscriptを、T7もしくはSP6バクテリオファージ由来DNA依存性RNAポリメラーゼを使用して、インビトロで合成した。転写を、製造業者Ambionによって提供される指示書に従って、ヌクレオシドトリホスフェートATP、CTP、GTPおよびUTPの各々の7.5mMT7RNAポリメラーゼもしくは5mMSP6RNAポリメラーゼの存在下で、37°Cにおいて2時間にわたって行った。転写の後、上記テンプレートDNAを、TURBODNaseAmbionで消化した。上記レプリコンRNAを、LiClで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップのないRNAを、ScriptCapm7GキャッピングシステムEpicentreBiotechnologiesを使用して、ユーザーマニュアルに概説されるとおり、ワクシニアキャッピング酵素VCEで転写後にキャップした;このようにキャップしたレプリコンに、vの接頭文字を付ける例えば、vA317は、VCEによってキャップされたA317レプリコンである。転写後キャップされたRNAを、LiClで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。上記RNAサンプルの濃度を、OD260nmを測定することによって決定した。上記インビトロ転写物の完全性を、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。PLG吸着微粒子を、500mgのPLGRG50350:50ラクチド/グリコリドモル比、MW約30kDaおよび20mgのDOTAPを使用して、OmniMacroHomogenizerを使用して作製した。上記粒子懸濁物を、150rpmにおいて一晩振盪し、次いで、2~8°Cで貯蔵するために、40μm滅菌フィルタを通して濾過した。自己複製RNAを、上記粒子に吸着させた。1mLのPLG/RNA懸濁物を調製するために、PLG粒子懸濁物の必要容積をバイアルに添加し、ヌクレアーゼ非含有水を添加して、容積900μLにした。100μLRNA10μg/mLを、一定に振盪しながら上記PLG懸濁物に滴下した。PLG/RNAを、室温において30分間にわたってインキュベートした。再構成懸濁物1mLについて、45mgマンニトール、15mgスクロースおよび250~500μgのPVAを添加した。上記バイアルを-80°Cで凍結し、凍結乾燥した。RNA吸着を評価するために、100μL粒子懸濁物を、10,000rpmにおいて5分間にわたって遠心分離し、上清を集めた。PLG/RNAを、1mLヌクレアーゼ非含有水を使用して再構成した。100μL粒子懸濁物1μgRNAに、1mg硫酸ヘパリンを添加した。上記混合物をボルテックスし、室温において30分間にわたってRNA脱着のために静置させた。粒子懸濁物を遠心分離し、上清を集めた。RNAse安定性に関しては、100μL粒子懸濁物を、6.4mAUのRNaseAとともに室温において30分間にわたってインキュベートした。RNAseを、0.126mAUのプロテイナーゼKで、55°Cにおいて10分間にわたって不活性化した。1mgの硫酸ヘパリンを添加して、上記RNAを脱着させ、続いて、遠心分離した。RNAを含むその上清サンプルを、ホルムアルデヒドローディング色素と混合し、65°Cにおいて10分間にわたって加熱し、1変性ゲル1レーンあたり460ngRNAをローディングを使用して分析した。発現を評価するために、Balb/cマウスを、0日目に、100μL筋肉内注射容積50μL/脚中の1μgRNAで免疫化した。血清を、1日目、3日目および6日目に集めた。タンパク質発現を、化学発光アッセイを使用して決定した。図3に示される様に、発現は、任意の送達粒子なし丸よりも、RNAをPLG三角によって送達した場合に高かった。リポソーム被包RNAを、参考文献7および44の方法によって作製したリポソーム中に被包した。上記リポソームを、10DSPC両性イオン性、40DlinDMAカチオン性、48コレステロールおよび2PEG結合体化DMG2kDaPEGから作製した。これら割合は、総リポソーム中のモルに言及する。DlinDMA1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンを、参考文献2の手順を使用して合成した。DSPC1,2-ジアステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンを、Genzymeから購入した。コレステロールを、Sigma-Aldrichから得た。PEG結合体化DMG1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシポリエチレングリコール,アンモニウム塩、DOTAP1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン,塩化物塩およびDC-chol3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールヒドロクロリドは、AvantiPolarLipidsからであった。簡潔には、脂質をエタノール2ml中に溶解し、RNAレプリコンを、緩衝液2ml,100mMクエン酸ナトリウム,pH6中に溶解し、これらを2mlの緩衝液と混合し、続いて、1時間平衡化させた。上記混合物を6mlの緩衝液で希釈し、次いで、濾過した。得られた生成物は、リポソームを含み、約95の被包効率であった。例えば、1つの特定の方法において、新鮮な脂質ストック溶液を、エタノール中で調製した。37mgのDlinDMA、11.8mgのDSPC、27.8mgのコレステロールおよび8.07mgのPEG-DMGを秤量し、7.55mLのエタノール中に溶解した。新たに調製した脂質ストック溶液を、37°Cにおいて約15分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、755μLの上記ストックを、1.245mLエタノールに添加して、作業脂質ストック溶液2mLを作製した。この脂質量を使用して、250μgRNAを有するリポソームを形成した。RNAの2mL作業溶液をまた、100mMクエン酸緩衝液pH6中の約1μg/μLのストック溶液から調製した。3つの20mLガラスバイアル撹拌子有りを、RNaseAway溶液MolecularBioProductsですすぎ、使用前に多量のMilliQ水で洗浄して、上記バイアルのRNaseの汚染を除去した。上記バイアルのうちの1つを、上記RNA作業溶液に使用し、他のものを脂質およびRNA混合物を集めるために使用した後に記載されるとおり。作業脂質溶液およびRNA溶液を、37°Cにおいて10分間にわたって加熱し、その後、3ccルーアーロックシリンジに入れた。2mLクエン酸緩衝液pH6を、別の3ccシリンジに入れた。RNAおよび脂質を含むシリンジを、FEPチューブフッ素化エチレン-プロピレン;使用したすべてのFEPチューブは、2mm内径および3mm外径を有した;IdexHealthScienceから得たを使用して、TミキサーPEEKTM500μmID接合部,IdexHealthScienceに接続した。上記Tミキサーからの出口もまた、FEPチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第3のシリンジを、別個の1つのチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量7mL/分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、20mLガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した撹拌しながら。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール/水性溶液を、室温へと1時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの4mlを、5ccシリンジに入れ、これを、FEPチューブの1つに接続し、別の5ccシリンジを、等しい長さのFEPチューブに接続し、等量の100mMクエン酸緩衝液pH6を入れた。上記2本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して7mL/分の流量において作動させ、最終の混合物を、20mLガラスバイアルに集めた撹拌しながら。次に、第2の混合工程リポソームから集めた上記混合物を、MustangQ膜PallCorporationから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体を通過させた。上記リポソームに関してこの膜を使用する前に、4mLの1MNaOH、4mLの1MNaClおよび10mLの100mMクエン酸緩衝液pH6が、連続してこの膜を通過した。リポソームを、10分間にわたって37°Cにおいて加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、接線流濾過を使用することによって、リポソームを2mLに濃縮し、10~15容積の1×PBSに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記TFFシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、SpectrumLabsRanchoDominguezから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。100kD孔サイズカットオフおよび8cm2表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、1×PBSで、必要とされるRNA濃度へと希釈した。さらなるリポソーム製造法は、以下で開示される。図2は、これら方法によって調製されるリポソームの例示的な電子顕微鏡写真を示す。これらリポソームは、被包された、全長RSVF抗原をコードするRNAを含む。1つのバッチの動的光散乱は、平均直径141nm強度でもしくは78nm数でを示した。被包されたRNAのパーセンテージおよびRNAの濃度を、Quant-iTRiboGreenRNA試薬キットInvitrogenによって、製造業者の指示書に従って決定した。上記キット中に提供されたリボソームRNA標準を使用して、標準曲線を作成した。リポソームを、1×TE緩衝液キットから中で、10×もしくは100×に希釈し、その後、色素を添加した。別個に、リポソームを、0.5TritonXを含む1×TE緩衝液中で10×もしくは100×に希釈し、その後、色素を添加した上記リポソームを破壊するため。従って、総RNAをアッセイするため。その後、等量の色素を各溶液に添加し、次いで、色素添加後の約180μLの各溶液を、二連において、96ウェル組織培養プレートに入れた。蛍光励起485nm,発光528nmを、マイクロプレートリーダーで読み取った。すべてのリポソーム処方物を、被包されたRNAの量に基づいて、インビボで投与した。リポソームにおける被包は、RNase消化からRNAを保護することを示した。実験では、3.8mAUのRNaseA/μgRNAを使用し、30分間にわたって室温においてインキュベートした。RNaseを、プロテイナーゼKで、55°Cにおいて10分間にわたって不活性化した。次いで、サンプル対25:24:1v/v/v,フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールの1:1v/v混合物を添加して、上記RNAを上記脂質から水相へと抽出した。サンプルを、数秒間にわたってボルテックスすることによって混合し、次いで、12kRPMにおける15分間にわたる遠心分離に置いた。上記水相上記RNAを含むを取り出し、上記RNAを分析するために使用した。ローディング前に400ngRNA/ウェル、上記サンプルすべてを、ホルムアルデヒドローディング色素とともにインキュベートし、10分間にわたって65°Cにおいて変性させ、室温へと冷却した。AmbionMillenniumマーカーを使用して、上記RNA構築物の分子量を概算した。上記ゲルを、90Vにおいて泳動した。上記ゲルを、室温において1時間にわたって振盪することによって、製造業者のガイドラインに従って、水中の0.1SYBRゴールドを使用して染色した。図1は、被包の非存在下でRNaseがRNAを完全に消化することを示すレーン3。RNAは、被包後に検出不能でありレーン4、これらリポソームがRNaseで処理されても全く変化が認められないレーン4。RNase処理リポソームをフェノール抽出に供した後、消化されていないRNAが認められるレーン6。4°Cにおいて1週間後ですら、上記RNAを、いかなるフラグメント化もなしに認めることができた図4,矢印。インビボでのタンパク質発現は、4°Cにおいて6週間および1回の凍結融解サイクル後にも変化しなかった。従って、リポソーム被包RNAは安定である。上記RNAのインビボ発現を評価するために、免疫原ではなく、レポーター酵素SEAP;分泌型アルカリホスファターゼを、上記レプリコン中にコードさせた。発現レベルを、化学発光アルカリホスファターゼ基質を使用して、1×Phospha-Light希釈緩衝液中で1:4希釈した血清中で測定した。8~10週齢BALB/cマウス5匹/群に、0日目に、0.1μgもしくは1μgRNA用量で50μl/脚を筋肉内に注射した。同じベクターを、1μgにおいて上記リポソームなしでRNase非含有1×PBS中でも投与した。ビリオンパッケージングされたレプリコンもまた、試験した。本明細書で使用したビリオンパッケージングされたレプリコンVRPと呼ぶを、参考文献45の方法によって得た。ここでアルファウイルスレプリコンは、変異VEEVに由来するか、またはシンドビスウイルスの3’UTRおよびシンドビスウイルスパッケージングシグナルPSを含むように操作されたVEEVのゲノムから得られるキメラであり、シンドビスウイルスキャプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする欠損性ヘルパーRNAと共にBHK細胞へと共エレクトロポレーションco-electroporatingすることによってパッケージングした。図5に示されるように、被包は、1μg用量においてSEAPレベルを約1/2対数増大させ、6日目において、0.1μg被包用量からの発現は、1μg非被包用量で認められたレベルに匹敵した。3日目までに、発現レベルは、VRPで達成されたものを超えた四角。従って、発現は、裸のRNAコントロールと比較して、10×低用量においてすら、上記RNAが上記リポソーム中に処方された場合に増大された。発現はまた、上記VRPコントロールと比較して高かったが、発現の動態は、非常に異なっていた図5を参照のこと。エレクトロポレーションを用いた上記RNAの送達は、上記裸のRNAコントロールと比較して増大した発現を生じたが、これらレベルは、リポソームでのものより低かった。さらなるSEAP実験から、インビボで明らかな用量応答が示された。発現は、1ngほどのRNAの送達後にも認められた図6。被包レプリコンからの発現と裸のレプリコンからの発現とを比較するさらなる実験から、0.01μg被包RNAは、1μgの裸のRNAに等しいことが示された。RNAの0.5μg用量において、上記被包物質は、6日目において12倍高い発現を与えた;0.1μg用量レベルでは、6日目において24倍高かった。上記群において平均レベルで調べるだけでなく、個々の動物もまた研究した。いくらかの動物は、裸のレプリコンに対して非応答者であったのに対して、被包は、非応答者を排除した。さらなる実験では、DlinDMAをDOTAPで置換した。DOTAPリポソームは、裸のレプリコンより良好な発現を与えたが、それらは、DlinDMAリポソームより劣っていた1日目において2~3倍の差異。インビボでの免疫原性を評価するために、レプリコンを構築して、RSウイルスRSVに由来する全長Fタンパク質を発現させた。これを、裸1μg、リポソーム中に被包0.1もしくは1μg、またはビリオン中でパッケージング106IU;VRPで、0日目および21日目に送達した。図7は、2回目の用量の2週間後の抗FのIgG力価を示す。上記リポソームは、明らかに免疫原性を増強する。図8は、2週間後の力価を示す。この時点までに、0.1μgの上記被包RNAと、1μgの上記被包RNAと、上記VRP群との間に統計学的差異は何らなかった。中和力価60のプラーク減少として測定,PRNT60は、2回目の用量の2週間後に、これら3群において有意差はなかった図9。図12は、2回目の用量の4週間後のIgG力価およびPRNT力価の両方を示す。図13は、上記RNAが堅調なCD8T細胞応答を誘発することを確認する。さらなる実験において、VRP、0.1μgリポソーム被包RNA、もしくは1μgリポソーム被包RNAを与えられたマウスにおけるF特異的IgG力価を比較した。2回目の用量の後の種々の時点での力価比VRP:リポソームは、以下のとおりであった:従って、上記リポソーム被包RNAは、ビリオン送達で認められるのと本質的に同程度の免疫応答を誘導する。さらなる実験から、優れたF特異的IgG応答が10μg用量で示され、これは、1μgおよび0.1μg用量についての応答と等しく、0.01μg用量ではより低い応答が示された。図11は、3種の異なる用量における裸の形態において、4種の異なる用量におけるリポソームにおいて、もしくはVRP106IUとして、上記レプリコンを与えられた動物におけるIgG力価を示す。1μgリポソーム被包RNAで認められた応答は、VRPと比較した場合に統計的に有意ではなかったANOVAが、10μgリポソーム被包RNAで認められたより高い応答は、これらの群の両方と比較した場合、統計的に有意であったp<0.05。さらなる研究から、上記0.1μgのリポソーム被包RNAは、0.1μgの送達されたDNAより遙かに高い抗FIgG応答を与え2回目の用量の15日後、さらに、エレクトロポレーションElgenTMDNADeliverySystem,Inovioによって送達された、上記F抗原をコードする20μgプラスミドDNAより免疫原性であることが確認された。マウスは、リポソーム被包RNAレプリコンを受けた後に、ごくわずかな視覚的な苦痛の徴候体重減少などを示したが、3~4という一過性の体重減少が、10μgRNAの2回目の用量後に認められた。対照的に、10μgリポソーム被包DNAの送達は、8~10の体重減少をもたらした。作用機構骨髄由来樹状細胞pDCを、野生型マウスもしくはResqrsq1変異系統から得た。上記変異系統は、そのTLR7レセプターのアミノ末端において点変異を有し、これは、リガンド結合に影響を及ぼさずにTLR7シグナル伝達を破壊する[46]。上記細胞を、DOTAP、リポフェクタミン2000で処方したレプリコンRNAもしくはリポソーム内のレプリコンRNAで刺激した。図17に示されるように、IL-6およびINFαは、WT細胞において誘導されたが、この応答は、変異マウスにおいてほぼ完全に排除された。これらの結果は、TLR7が、免疫細胞におけるRNA認識のために必要とされ、そしてリポソーム被包レプリコンが、免疫細胞に高レベルのインターフェロンおよび炎症促進性pro-inflammatoryサイトカインの両方を分泌させ得ることを示す。一般に、リポソーム送達されたRNAレプリコンは、筋肉内注射の24時間以内にいくつかの血清サイトカインIFN-α、IP-10CXCL-10、IL-6、KC、IL-5、IL-13、MCP-1、およびMIP-aを誘導することを示したのに対して、MIP-1のみが、裸のRNAによって誘導され、リポソーム単独は、IL-6のみを誘導した。IFN-αは、リポソーム被包RSV-Fコードレプリコンへの免疫応答に寄与することを示した。なぜなら、抗IFNαレセプターIFNAR1抗体は、2回のワクチン接種後に、F特異的血清IgGを1/10に低下させたからである。リポソーム送達されたRNAレプリコンは、一般に、マウスにおいてバランスのとれたIgG1:IgG2aサブタイププロフィールを誘発することが認められ、ときおり、エレクトロポレーションしたDNA、もしくはタンパク質/MF59免疫化で認められるものより高いIgG2a/IgG1比すなわち、Th1タイプ免疫応答が認められた。リポソーム製造法一般に、8つの異なる方法を、本発明に従うリポソームを調製するために使用した。これらは、方法A~Hとして本文中で言及され、主に濾過およびTFF工程に関連して異なっている。詳細は、以下のとおりである。Aエタノール中の新鮮な脂質ストック溶液を調製した。37mgのDlinDMA、11.8mgのDSPC、27.8mgのコレステロールおよび8.07mgのPEGDMG2000を秤量し、7.55mLのエタノール中に溶解した。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、37°Cにおいて約15分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、上記ストックのうちの755μLを、1.245mLエタノールに添加して、作業脂質ストック溶液2mLを作製した。この量の脂質を使用して、250μgRNAとともにリポソームを形成した。RNAの2mL作業溶液をまた、100mMクエン酸緩衝液pH6中のストック溶液約1μg/μLから調製した。3つの20mLガラスバイアル撹拌子有りを、RNaseAway溶液MolecularBioProducts,SanDiego,CAですすぎ、使用前に多量のMilliQ水で洗浄して、上記バイアルのRNaseの汚染を除去した。上記バイアルのうちの1つを、上記RNA作業溶液に使用し、他のものを脂質およびRNA混合物を集めるために使用した後に記載されるとおり。作業脂質溶液およびRNA溶液を、37°Cにおいて10分間にわたって加熱し、その後、3ccルーアーロックシリンジに入れた。2mLクエン酸緩衝液pH6を、別の3ccシリンジに入れた。RNAおよび脂質を含むシリンジを、FEPチューブフッ素化エチレン-プロピレン;すべてのFEPチューブは、2mm内径×3mm外径を有した;IdexHealthScienceによって供給を使用して、TミキサーPEEKTM500μmID接合部,IdexHealthScience,OakHarbor,WAに接続した。上記Tミキサーからの出口もまた、FEPチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第3のシリンジを、別個の1つのFEPチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量7mL/分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、20mLガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した撹拌しながら。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール/水性溶液を、室温へと1時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの4mlを、5ccシリンジに入れ、これを、FEPチューブの1つに接続し、別の5ccシリンジを、等しい長さのFEPチューブに接続し、等量の100mMクエン酸緩衝液pH6を入れた。上記2本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して7mL/分の流量において作動させ、最終の混合物を、20mLガラスバイアルに集めた撹拌しながら。次に、第2の混合工程リポソームから集めた上記混合物を、MustangQ膜PallCorporation,AnnArbor,MI,USAから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体を通過させた。上記リポソームを通過させる前に、4mLの1MNaOH、4mLの1MNaClおよび10mLの100mMクエン酸緩衝液pH6が、上記Mustang膜を連続して通過した。リポソームを、10分間にわたって37°Cにおいて加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、TFFを使用して、リポソームを2mLに濃縮し、10~15容積の1×PBSに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記TFFシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、SpectrumLabsから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。100kD孔サイズカットオフおよび8cm2表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜部品番号P/N:X1AB-100-20Pを使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、1×PBSで、必要とされるRNA濃度へと希釈した。B振盪後、上記ストックのうちの226.7μLを、1.773mLエタノールに添加して、作業脂質ストック溶液2mLを作製したこと従って、上記脂質:RNA比を改変を除いて、方法Aのとおり。C上記Mustang濾過を省略したので、リポソームが、上記20mLガラスバイアルから上記TFF透析へと向かったことを除いて、方法Bのとおり。D上記TFFが、100kD孔サイズカットオフおよび20cm2表面積を有するポリエーテルスルホンPES中空ファイバー膜部品番号P-C1-100E-100-01Nを使用したことを除いて、方法Cのとおり。E方法AのようにMustang膜を使用したことを除いて、方法Dのとおり。F上記Mustang濾過を省略したので、リポソームが、上記20mLガラスバイアルから上記TFF透析へと向かったことを除いて、方法Aのとおり。GRNAの4mL作業溶液を、100mMクエン酸緩衝液pH6中の約1μg/μLのストック溶液から調製したことを除いて、方法Dのとおり。次いで、4つの20mLガラスバイアルを、同じ方法で調製した。それらのうちの2本を、上記RNA作業溶液各バイアル中2mLに使用し、他のものを、Cのように、上記脂質およびRNA混合物を集めるために使用した。Tミキサーを使用するのではなく、RNAおよび脂質を含むシリンジを、MitosDroplet接合チップSyrrisから得られるガラス製マイクロ流体microfluidicデバイス部品番号3000158に、PTFEチューブ0.03インチ内径×1/16インチ外径を使用して、4ウェイエッジコネクタSyrrisを使用して接続した。2つのRNAストリームおよび1つの脂質ストリームを、シリンジポンプによって作動させ、上記エタノールおよび水相の混合を、上記チップのX接合部100μm×105μmにおいて行った。3つすべてのストリームの流量を、1.5mL/分において維持し、従って、全水性の流量対エタノールの流量の比は、2:1であった。上記チューブ出口を、20mLガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した撹拌しながら。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール/水性溶液を、室温へと1時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を5ccシリンジに入れ、これを、上記PTFEチューブの別の1つにはめた;等しい長さのPTFEチューブ付きの別の5ccシリンジに、等容積の100mMクエン酸緩衝液pH6を入れた。上記2本のシリンジを、3mL/分の流量において、シリンジポンプを使用して作動させ、最終混合物を、20mLガラスバイアルに集めた撹拌しながら。次に、Dにおけるように、TFFを使用して、リポソームを2mLに濃縮し、10~15容積の1×PBSに対して透析した。H上記2mL作業脂質ストック溶液を、120.9μLの上記脂質ストックと1.879mLエタノールとを混合することによって作製したことを除いて、方法Aのとおり。また、上記Tミキサーにおいて混合した後に、上記20mLバイアルからの上記リポソームを、PierceSlide-A-LyzerDialysisCassetteThermoScientific,特に強力,0.5~3mL容量に入れ、オートクレーブしたプラスチック容器中、400~500mLの1×PBSに対して一晩4°Cにおいて透析し、その後、最終生成物を収集した。BHK発現様々な脂質でのリポソームを、BHK細胞とともに一晩インキュベートし、タンパク質発現能力について評価した。RV05脂質でのベースラインから、発現を、101,2-ジフィタノイルdiphytanoyl-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDPyPEを上記リポソームに添加することによって18×に増大させることができ、1018:2cisホスファチジルコリンを添加することによって10×に増大させることができ、そして代わりにRV01を使用することによって900×に増大させることができた。一般に、インビボ研究は、不飽和脂質テールが、コードされた抗原に対して惹起されるIgG力価を増強する傾向にあることを示した。RSV免疫原性RSVFタンパク質をコードするvA317自己複製レプリコンを、0日目および21日目に、上記レプリコン1μg単独で、またはDlinDMARV01もしくはDOTAPRV13とのリポソームとして処方して、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚によって、BALB/cマウス1群あたり4匹もしくは8匹の動物に投与した。上記RV01リポソームは、40DlinDMA、10DSPC、48コレステロールおよび2PEG-DMGを有し、異なる量のRNAを伴った。上記RV13リポソームは、40DOTAP、10DPE、48コレステロールおよび2PEG-DMGを有した。比較のために、同じRSV-F抗原を発現する裸のプラスミドDNA20μgを、エレクトロポレーションを使用して、もしくはRV0110リポソーム0.1μgDNAとともに、のいずれかで送達した。4匹のマウスを、ナイーブコントロール群として使用した。リポソームを、方法Dもしくは方法Bによって調製した。方法Dによって作製したいくらかのリポソームに関しては、二倍量もしくは半量のRNAを使用した。上記リポソームのZ平均粒子直径、多分散指数、および被包効率は、以下のとおりであった:血清を、14日目、36日目および49日目に抗体分析のために集めた。脾臓を、49日目に、T細胞分析のためにマウスから採取した。F特異的血清IgG力価GMTは、以下のとおりであった:サイトカイン陽性であり、かつRSVF51-66ペプチドに対して特異的なT細胞の割合は、以下のとおりであり、統計的に有意にゼロを上回る数字のみを示す:従って、上記リポソーム処方物は、増大したF特異的IgG力価およびT細胞頻度によって決定される場合、上記裸のRNAコントロールと比較して免疫原性を顕著に増大した。リポソームとともに処方したか、またはエレクトロポレーションを使用して裸で送達されたプラスミドDNAは、リポソーム処方された自己複製RNAより顕著に免疫原性が低かった。上記RV01RNAワクチンは、上記RV13ワクチンより免疫原性であった。RV01は、頭部の中に三級アミンを有し、これはpKa約5.8を有し、さらに、不飽和アルキルテールも含む。RV13は、不飽和アルキルテールを有するが、その頭部は、四級アミンを有し、非常に強力にカチオン性である。リポソーム-被包についての必要性上記リポソーム群において認められる効果が、上記リポソーム成分にのみ起因していたのか、または上記被包に関連していたのかを評価するために、上記レプリコンを、被包形態2つの異なる精製プロトコルとともに,0.1μgRNAにおいて、またはリポソーム形成後に上記リポソームと混合して非被包リポプレックス,0.1μgRNA、または裸のRNA1μgとして投与した。図10は、上記リポプレックスが、最低レベルの発現を与えたことを示す。このことは、被包がタンパク質発現に必須であることを示す。さらなる実験は、3種の異なるRNAを使用した:iRSV-Fすなわち、RSVの表面融合糖タンパク質を発現するvA317レプリコン;iiGFPを発現するvA17レプリコン;およびiii複製欠損性でありかつGFPをコードするvA336。RNAを、裸で、もしくは方法Dによって作製したリポソームとともに、のいずれかで送達した。空のリポソームを、方法Dによって作製したが、いかなるRNAも有しなかった。4種のリポソーム処方物は、以下の特徴を有した:BALB/cマウス1群あたり5匹の動物に、0日目および21日目に、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた:群1裸の自己複製性RSV-FRNAvA317,0.1μg群2リポソーム中に被包された自己複製性RSV-FRNAvA317,0.1μg群3空のリポソームに添加された自己複製性RSV-FRNAvA317,0.1μg群4Fサブユニットタンパク質5μg。血清を、14日目、35日目および51日目に、抗体分析のために集めた。F特異的血清IgG力価GMTを測定した;個々の動物が力価<25検出限界を有した場合、それには力価5を割り当てた。さらに、51日目にT細胞分析のために脾臓をマウスから採取して、サイトカイン陽性かつRSVF51-66ペプチドCD4もしくはRSVFペプチドF85-93およびF249-258CD8に対して特異的である細胞を決定した。IgG力価は、10群においておよび非免疫化コントロールマウスにおいて以下のとおりであった:51日目でのRSV血清中和力価は、以下のとおりであった:51日目にRSVF特異的CD4脾臓T細胞を示す動物は、以下のとおりであった。ここで数字陽性細胞は、上記刺激された応答が統計的に有意にゼロを上回った場合にのみ与える:51日目にRSVF特異的CD8脾臓T細胞を示す動物は、以下のとおりであった。ここで数字は、上記刺激された応答が統計的に有意にゼロを上回った場合にのみ与える:従って、上記リポソーム内のRNAの被包は、高い免疫原性に必要である。なぜなら、RNAおよび上記リポソームの単純な混合群3は、免疫原性ではなかったからである実際に、裸のRNAより免疫原性が低かった。他の研究において、i全長RSVFタンパク質をコードする自己複製RNAレプリコン、ii自己複製性GFPコードRNAレプリコン、iiinsP4においてノックアウト自己複製を排除するを有するGFPコードRNAレプリコン、iv全長RSVF-タンパク質の種々の組み合わせをマウスに与えた。13群合計でに与えた:図16における結果は、F特異的IgG応答が、単なる共送達ではなく、上記リポソーム中の被包を必要としたことを示す群Cと群Dを比較のこと。群K、群Lおよび群Mの比較から、上記RNAが、共送達したタンパク質に対してアジュバント効果を提供したことが示され、この効果は、複製性および非複製性RNAの両方で認められた。様々なマウス系統におけるRSV免疫原性レプリコンvA142は、RSVの全長野生型表面融合F糖タンパク質をコードするが、その融合ペプチドは欠失しており、その3’末端は、リボザイム媒介性切断によって形成される。これを、3種の異なるマウス系統において試験した。BALB/cマウスに、0日目および22日目に、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた。動物を、8つの試験群1群あたり5匹の動物およびナイーブコントロール2匹の動物へと分けた:群1には、裸のレプリコン1μgを与えた。群2には、40DlinDMA、10DSPC、48Chol、2PEG結合体化DMGを有するリポソームRV0137中で送達した1μgレプリコンを与えた。群3には、群2と同じものを与えたが、0.1μgRNAであった。群4には、RV1710リポソーム40RV17上記を参照のこと、10DSPC、49.5コレステロール、0.5PEG-DMG中において1μgレプリコンを与えた。群5には、RV0511リポソーム40RV07脂質、3018:2PEDLoPE、28コレステロール、2PEG-DMG中において1μgレプリコンを与えた。群6には、RV1710リポソーム中において0.1μgレプリコンを与えた。群7には、水酸化アルミニウムをアジュバント添加した5μgRSV-Fサブユニットタンパク質を与えた。群8は、ナイーブコントロール2匹の動物であった。血清を、14日目、35日目および49日目に、抗体分析のために集めた。F特異的血清IgGGMTは、以下であった:35日目において、F特異的IgG1力価およびIgG2a力価GMTは、以下のとおりであった:35日目および49日目のRSV血清中和抗体力価は、以下のとおりであったデータは、2~5匹のマウスプール1群あたり1プールの60プラーク減少中和力価である:49日目に、T細胞分析のために脾臓を採取した。平均の正味F特異的サイトカイン陽性T細胞頻度CD4もしくはCD8は、以下のとおりであったこれは、統計的に有意にゼロを上回ったCD4についてはRSVペプチドであるF51-66、F164-178、F309-323、またはCD8についてはペプチドF85-93およびF249-258に対して特異的数字のみを示す:C57BL/6マウスを、同じように免疫化したが、第9の群には、RSVの全長野生型表面融合糖タンパク質融合ペプチド欠失を発現するVRP1×106IUを与えた。血清を、14日目、35日目および49日目に、抗体分析のために集めた。F特異的IgG力価GMTは、以下であった:35日目において、F特異的IgG1力価およびIgG2a力価GMTは、以下のとおりであった:35日目および49日目のRSV血清中和抗体力価は、以下のとおりであったデータは、2~5匹のマウスプール1群あたり1プールの60プラーク減少中和力価である:49日目に、T細胞分析のために脾臓を採取した。平均の正味F特異的サイトカイン陽性T細胞頻度CD8は、以下のとおりであったこれは、統計的に有意にゼロを上回ったRSVペプチドF85-93およびF249-258に対して特異的数字のみを示す:C3H/HeNマウスの9群を、同じようにして免疫化した。F特異的IgG力価GMTは、以下であった:35日目において、F特異的IgG1力価およびIgG2a力価GMTは、以下のとおりであった:35日目および49日目のRSV血清中和抗体力価は、以下のとおりであった:従って、3種の異なる脂質RV01、RV05、RV17;pKaは、5.8、5.85、6.1を、3種の異なる近交系のマウス系統において試験した。3種の系統すべてに関して、RV01がRV17より有効であった;BALB/cおよびC3H系統に関しては、RV05は、RV01およびRV17よりも有効性が低かったが、B6系統においては、より有効であった。しかし、すべての場合において、上記リポソームは、並行して試験した2種のカチオン性ナノエマルジョンより有効であった。CMV免疫原性DLinDMAをカチオン性脂質として有するRV01リポソームを使用して、サイトメガロウイルスCMV糖タンパク質をコードするRNAレプリコンを送達した。vA160レプリコンは、全長糖タンパク質HおよびLgH/gLをコードするのに対して、vA322レプリコンは、可溶性形態gHsol/gLをコードする。上記2種のタンパク質は、単一のレプリコン中の別個のサブゲノムプロモーターの制御下にある;2種の別個のベクター1つは、gHをコードし、1つは、gLをコードするの共投与は、良好な結果を与えなかった。BALB/cマウス10匹/群に、0日目、21日目および42日目に、gH/gLを発現するVRP1×106IU、gHsol/gLを発現するVRP1×106IUおよびコントロールとしてPBSを、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚で与えた。2つの試験群に、リポソーム40DlinDMA、10DSPC、48Chol、2PEG-DMG;方法Dを使用するが、150μgRNAバッチサイズを用いて作製した中に処方した、1μgの上記vA160レプリコンもしくはvA322レプリコンを与えた。上記vA160リポソームは、Zav直径168nm、pdI0.144、および87.4被包を有した。上記vA322リポソームは、Zav直径162nm、pdI0.131、および90被包を有した。上記レプリコンは、単一のベクターから2種のタンパク質を発現できた。63日目3wp3に、血清を、免疫学的分析のために集めた。CMV中和力価コントロールと比較して、陽性ウイルスフォーカス/ウェルの数において50減少を生じる血清希釈の逆数は、以下のとおりであった:全長もしくは可溶性形態の上記CMVgH/gL複合体のいずれかを発現するRNAは、従って、上皮細胞でアッセイされる場合、高い力価の中和抗体を誘発した。上記リポソーム被包RNAによって誘発された平均力価は、その対応するVRPについてのものと少なくとも同程度に高かった。反復実験から、上記レプリコンが、単一のベクターから2種のタンパク質を発現できることが確認された。上記RNAレプリコンは、VRPでの3wp3力価5516と比較して、3wp3力価11457を与えた。さらなる実験は、vA160に加えて、異なるレプリコンを使用した。vA526レプリコンは、3種のサブゲノムプロモーターの制御下でCMVペンタマー複合体gH-gL-UL128-UL130-UL-131を発現する:第1のものは、gHの発現を駆動する;第2のものは、gLの発現を駆動する;第3のものは、UL128-2A-UL130-2A-UL131ポリプロテインの発現を駆動するこれは、上記3種のUL遺伝子の間に2つの2A切断部位を含む。vA527レプリコンは、3種のサブゲノムプロモーターおよび2つのIRESを介して、CMVペンタマー複合体を発現する:第1のサブゲノムプロモーターは、gHの発現を駆動する;第2のサブゲノムプロモーターは、gLの発現を駆動する;第3のサブゲノムプロモーターは、UL128の発現を駆動する;UL130は、EMCVIRESの制御下にある;UL131は、EV71IRESの制御下にある。これら3種のレプリコンを、リポソーム方法H,150μgバッチサイズを用いたによって、もしくはVRPによって送達した。BALB/cマウス10匹の動物の10群に、0日目、21日目および42日目に、以下を両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚で与えた:群1gHFL/gLを発現するVRP1×106IU群2ペンタマー、2AVRP1×105IU群3ペンタマー、2AVRP1×106IU群4ペンタマー、IRESVRP1×105IU群5リポソーム中に処方された自己複製RNAvA1601μg群6リポソーム中に処方された自己複製RNAvA5261μg群7リポソーム中に処方された自己複製RNAvA5271μg群8カチオン性ナノエマルジョン中に処方された自己複製RNAvA1601μg群9カチオン性ナノエマルジョン中に処方された自己複製RNAvA5261μg群10カチオン性ナノエマルジョン中に処方された自己複製RNAvA5271μg。血清を、21日目3wp1、42日目3wp2および63日目3wp3に、免疫学的分析のために集めた。21日目、42日目および63日目のCMV血清中和力価は、以下であった:従って、自己複製RNAは、単一のベクターから複数の抗原を発現するために、および強力でかつ特異的な免疫応答を惹起するために使用され得る。上記レプリコンは、5種の抗原CMVペンタマー複合体gH-gL-UL128-UL130-UL-131を発現し得、強力な免疫応答を惹起し得る。リポソーム中で送達された自己複製RNAは、上皮細胞でアッセイされる場合、すべてのアッセイ時点3wp1、3wp2、および3wp3において高い力価の中和抗体を誘発できた。これら応答は、その対応するVRPおよびカチオン性ナノエマルジョンより優れていた。送達容積流体力学的送達は、細胞膜の物理的障壁大きい、膜不透過性の化合物が細胞に入らないようにするを克服するための大きな容積の溶液の迅速な注射によって生じた力を使用する。この現象は、DNAワクチンの細胞内送達に有用であることが以前示された。筋肉内注射にとって代表的なマウス送達容積は、後肢に50μlである。これは、マウスの脚の筋肉に関して、比較的大きな容積である。対照的に、約0.5mlというヒト筋肉内用量は、比較的小さい。マウスにおける免疫原性が容積依存性であれば、上記レプリコンワクチンの効力は、少なくとも一部は、流体力に因り得る。このことは、ヒトおよびより大きな動物において同じワクチンを使用することを促進しない。上記vA317レプリコンを、0日目および21日目に、BALB/cマウス10匹/群に、両側の筋肉内ワクチン接種5もしくは50/脚によって送達した:群1には、裸のレプリコンを50μL/脚において0.2μg与えた。群2には、裸のレプリコンを5μL/脚において0.2μg与えた。群3には、リポソーム処方レプリコン0.2μg,50μL/脚を与えた。群4には、リポソーム処方レプリコン0.2μg,5μL/脚を与えた。14日目および35日目に、血清を、抗体分析のために集めた。F特異的血清IgGGMTは、以下であった:従って、上記処方されたレプリコンの免疫原性は、送達容積に従って変動しなかった。従って、このことは、これらRNAワクチンが、それらの効力に関して流体力学的送達に依存しないことを示す。発現動態ルシフェラーゼレポーター遺伝子lucを発現する自己複製RNAレプリコンvA311を、注射後のタンパク質発現の動態を研究するために使用した。BALB/cマウス1群あたり5匹の動物に、0日目に、以下の両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた:群1エレクトロポレーションを使用して送達される、ルシフェラーゼを発現するDNA10μg群2リポソーム中に処方された自己複製RNA1μg群3カチオン性ナノエマルジョンとともに処方された自己複製RNA1μg群4カチオン性ナノエマルジョンとともに処方された自己複製RNA1μg群5ルシフェラーゼを発現するVRP1×106IU。ワクチン接種の前に、マウスを除毛した。マウスに麻酔をかけ酸素中2イソフルラン、まず、電気カミソリで除毛し、次いで、Nairで化学的に除毛した。次いで、3日目、7日目、14日目、21日目、28日目、35日目、42日目、49日目、63日目および70日目に、生体発光データを、XenogenIVIS200画像化システムCaliperLifeSciencesを使用して取得した。画像化する5分前に、マウスに、8mg/kgのルシフェリン溶液を腹腔内注射した。次いで、動物に麻酔をかけ、上記画像化システムへと移した。生体発光シグナルを冷却CCDカメラで測定する際に、画像取得時間を一定に維持した。視覚的な点から、ルシフェラーゼ発現細胞は、RNA注射の部位において主に保持されていることが認められた。大腿四頭筋quadsを除去した後に画像化した動物は、何らシグナルを示さなかった。定量的な点から、ルシフェラーゼ発現を、70日間の期間にわたる平均輝度p/s/cm2/srとして測定し、結果は、上記5群に関して以下のとおりであった:上記カチオン性ナノエマルジョンとともに処方した自己複製RNAは、3日目に測定可能な生体発光を示した。これは、7日目にピークに達し、次いで、28日目~35日目までにバックグラウンドレベルへと低下した。リポソーム中で処方された場合、上記RNAは、3日目に、測定可能な生体発光を示した。これは、7日目にピークに達し、63日目までにはバックグラウンドレベルへと低下した。VRPを使用して送達されたRNAは、上記処方されたRNAと比較した場合、21日目に増強された生体発光を示したが、発現は、28日目までにバックグラウンドレベルへと低下した。エレクトロポレーションしたDNAは、測定したすべての時点において最高レベルの生体発光を示し、生体発光のレベルは、実験の70日間内でバックグラウンドレベルへは低下しなかった。送達経路HIVgp140をコードするリポソーム被包RNAを、マウスの筋肉内、皮内、もしくは皮下に送達した。3つの経路すべてが、HIV特異的抗体の高い血清IgGレベルをもたらした図15、このレベルは、エレクトロポレーションされた筋肉内DNAに応じて認められた力価を超えていた。コットンラットマウスの代わりに、コットンラットSigmodonhispidisにおいて研究を行った。1μg用量において、リポソーム被包は、裸のRNAと比較して、F特異的IgG力価を8.3倍に増大させ、PRNT力価を9.5倍に増大させた。上記抗体応答の程度は、5×106IUVRPによって誘導されるものに等しかった。裸のRNAおよびリポソーム被包RNAはともに、RSVチャレンジ1×105プラーク形成単位から上記コットンラットを防御することができ、肺のウイルス負荷を少なくとも3.5対数低下させた。被包は、低下を約2倍に増大させた。コットンラットにおけるさらなる研究は、4種の異なるレプリコンを使用した:vA317は、全長RSV-Fを発現する;vA318は、短縮型膜貫通および細胞質テールが除去されたRSV-Fを発現する;vA142は、その融合ペプチドが欠失した、RSV-Fを発現する;vA140は、やはり上記ペプチドなしで上記短縮型RSV-Fを発現する。コットンラット1群あたり4~8匹の動物に、0日目および21日目に、方法Dによるが、150μgRNAバッチサイズで作製されたリポソーム中に処方された、2種の用量1.0μgおよび0.1μgにおける、上記4種の異なるレプリコンの筋肉内ワクチン接種1本の脚において100μLを与えた。コントロール群に、アラムalumをアジュバント添加したRSV-Fサブユニットタンパク質ワクチン5μg8匹の動物/群、全長RSV-Fを発現するVRP1×106IU,8匹の動物/群、もしくはナイーブコントロール4匹の動物/群を与えた。0日目、21日目および34日目に、血清を、抗体分析のために集めた。21日目および34日目のF特異的血清IgG力価およびRSV血清中和抗体力価は、以下であった:この研究において評価した4種のレプリコンvA317、vA318、vA142、vA140はすべて、リポソームによって送達される場合に、コットンラットにおいて免疫原性であったが、血清中和力価は、アジュバント添加したタンパク質ワクチンによってもしくはVRPによって誘導されたものの少なくとも1/10に低下した。上記リポソーム/RNAワクチンは、1回目のワクチン接種の後に、血清F特異的IgGおよびRSV中和抗体を誘発し、2回目のワクチン接種は、上記応答を効率的にブーストした。1μgレプリコンでの上記2回目のワクチン接種の後のF特異的IgG力価は、0.1μgレプリコンでの上記第2回目のワクチン接種後より2~3倍高かった。上記4種のレプリコンは、同等の抗体力価を誘発した。このことは、全長および短縮型のRSV-F各々、融合ペプチドありもしくはなしが、コットンラットにおいて同様に免疫原性であることを示唆する。コットンラットにおけるさらなる研究は、上記vA317、vA318およびvA142レプリコンを再び使用した。コットンラット1群あたり2~8匹の動物に、0日目および21日目に、方法Dによるが、150μgRNAバッチサイズで作製したRV01リポソーム中に被包した上記レプリコン0.1μgもしくは1μgでの筋肉内ワクチン接種1本の脚において100μLを与えた。コントロール群に、アラムでアジュバント添加したRSV-Fサブユニットタンパク質ワクチン5μgもしくは全長RSV-Fを発現するVRP1×106IU,8匹の動物/群を与えた。これらの動物すべてに、アラムでアジュバント添加したRSV-Fサブユニットタンパク質ワクチン5μgでの3回目のワクチン接種56日目を与えた。さらに、ナイーブコントロールが存在した4匹の動物/群。さらに、追加の群に、0日目および56日目に、リポソーム中の1μgvA317RNAでの両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えたが、上記サブユニットタンパク質ワクチンでの3回目のワクチン接種を与えなかった。0日目、21日目、35日目、56日目、70日目に、加えて、追加の群に関しては14日目、28日目および42日目に、血清を、抗体分析のために集めた。F特異的血清IgG力価GMTは、以下のとおりであった:血清中和力価は、以下のとおりであった1群あたり3~4匹の動物の2プールに関して、60RSV中和力価、1群あたりこれら2プールのGMT:上記追加の群に関する血清力価および中和力価は、以下のとおりであった:従って、上記レプリコンは、コットンラットにおいて免疫原性であると確認され、上記1回目のワクチン接種後に血清F特異的IgGおよびRSV中和抗体を誘発する。2回目のワクチン接種は、上記応答を効率的にブーストした。1.0μgレプリコンでの上記2回目のワクチン接種後のF特異的IgG力価は、0.1μgレプリコンでの上記2回目のワクチン接種後より1.5~4倍高かった。上記3回目のワクチン接種56日目にタンパク質は、Fトリマーサブユニットアラムを以前にワクチン接種したラットにおいて力価をブーストしなかったが、レプリコンを以前にワクチン接種したコットンラットにおいて大きな力価のブーストを提供した。大部分の場合において、2回のレプリコンワクチン接種、続いて、タンパク質ブーストの後の上記RSV血清中和力価は、2回もしくは3回の連続的なタンパク質ワクチン接種によって誘導された力価に等しいかもしくはこれより大きかった。この研究はまた、1.0μgvA317への抗体応答の動態を評価した。1回のワクチン接種によって誘導されるF特異的血清IgGおよびRSV中和力価は、21日目あたりにそのピークに達し、少なくとも56日目まで維持されたF特異的IgG力価において50~70低下,RSV中和力価においてはほとんど変化なし。同族の2回目のワクチン接種を、56日目にこれらの動物に与えたところ、上記2回目のワクチン接種が21日目に投与された場合に達成されたものに少なくとも等しいレベルへと抗体力価をブーストした。さらなる実験は、ウイルスチャレンジを伴った。上記vA368レプリコンは、RSVの全長野生型表面融合糖タンパク質融合ペプチドは欠失されており、発現は、上記EV71IRESによって駆動されるをコードする。コットンラット7匹/群に、0日目および21日目に、方法H、175μgRNAバッチサイズにより調製されたリポソーム中のvA368、もしくは同じレプリコンを有するVRPでの筋肉内ワクチン接種100μL/脚を与えた。コントロール群に、5μgアラムアジュバント添加タンパク質を与え、ナイーブコントロール群もまた、含めた。すべての群に、最終免疫化の4週間後に、1×106PFURSVでの鼻内チャレンジi.n.を与えた。0日目、21日目、35日目に、血清を、抗体分析のために集めた。ウイルス肺力価を、チャレンジの5日後、測定した。結果は以下のとおりであった:従って、上記RNAワクチンは、非ワクチン接種コントロールコットンラットにおける約106PFU/gから、ワクチン接種したコットンラットにおける103PFU/g未満へと、3対数を超えて、上記肺ウイルス負荷を低下させた。大型哺乳動物研究大型動物研究を、ウシにおいて行った。仔ウシ4~6週齢、約60~80kg、5頭/群を、0日目、21日目、86日目および146日目に、66μgの、全長RSVFタンパク質をコードするレプリコンvA317で免疫化した。上記レプリコンを、リポソームの中に処方した。PBS単独を、陰性コントロールとして使用し、認可されたワクチンを陽性コントロールとして使用したFortDodgeのTriangle4,死滅ウイルスを含む。すべての仔ウシに、146日目に、MF59エマルジョンをアジュバント添加した15μgFタンパク質を与えた。1頭のウシに、86日目に、Triangle4の代わりに間違ったワクチンで誤ってワクチン接種してしまったので、そのデータは、100日目から排除した。上記RNAワクチンは、ヒトRSVFをコードしたのに対して、上記Triangle4ワクチンは、ウシRSVFを含むが、上記RSVFタンパク質は、BRSVとHRSVとの間で高度に保存されている。上記リポソームを、1.5mgRNAバッチサイズを使用したことを除いて、方法Eによって作製した。仔ウシに、2mlの各実験ワクチンを与え、2×1mlとして頸の各側に筋肉内投与した。対照的に、上記Triangle4ワクチンを、頸に単一2ml用量として与えた。0日目、14日目、21日目、35日目、42日目、56日目、63日目、86日目、100日目、107日目、114日目、121日目、128日目、135日目、146日目、160日目、167日目、174日目、181日目、188日目、195日目および202日目に、血清を、抗体分析のために集めた。個々の動物が検出限界未満の力価を有した場合、それには、力価5を割り当てた。図14Aは、最初の63日間にわたるF特異的IgG力価を示す。上記RNAレプリコンは、リポソームを介して上記ウシにおいて免疫原性であったが、それは、上記認可されたワクチンより低い力価を与えた。すべてのワクチン接種したウシは、2回目の用量後にF特異的抗体を示した。力価は、上記2回目の用量の2~6週間後の期間から非常に安定であったそして上記RNAワクチンに関しては特に安定であった。図14Bは、210日間にわたるF特異的血清IgG力価GMTを示す。最大202日目までの測定値は、以下のとおりであった:RSV血清中和抗体力価は、以下のとおりであった:上記2回目のリポソーム用量に使用した物質は、新たに調製せず、同じロットのRNAは、マウス免疫原性研究において効力の低下を示した。従って、上記ワクチンは、新鮮な物質をすべてのワクチン接種のために使用した場合に、より免疫原性であった可能性がある。補体とともにアッセイされる場合、中和抗体は、すべてのワクチン接種したウシにおいて検出された。このアッセイにおいて、すべてのワクチン接種した仔ウシは、上記2回目のRNAワクチン接種後に良好な中和抗体力価を有した。さらに、上記RNAワクチンは、上記2回目のワクチン接種後に数頭の仔ウシにおいて、および上記第3回目の後にすべての仔ウシにおいて検出されたF特異的血清IgG力価を誘発した。MF59アジュバント添加したRSV-Fは、以前にワクチン接種したすべての仔ウシにおいてIgG応答をブーストでき、RNAで以前にワクチン接種された仔ウシの補体非依存性中和力価をブーストできた。大型動物におけるRNAワクチンの構想の証明は、小動物モデルから大型動物およびヒトへと移行する場合に以前に観察された、DNAベースのワクチンでの効力の喪失を踏まえると、特に重要である。ウシDNAワクチンに代表的な用量は、0.5~1mg[47,48]であるので、免疫応答がわずか66μgのRNAで誘導されたことは、非常に有望である。本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、本発明の範囲および趣旨内に留まりながら、改変が行われ得ることは、理解される。表1:有用なリン脂質DDPC1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDEPA1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDEPC1,2-エルコイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDEPE1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDEPG1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DLOPC1,2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDLPA1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDLPC1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDLPE1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDLPG1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DLPS1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDMG1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDMPA1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDMPC1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDMPE1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDMPG1,2-ミリストイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DMPS1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDOPA1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDOPC1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDOPE1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDOPG1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DOPS1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDPPA1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDPPC1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDPPE1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDPPG1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DPPS1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDPyPE1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDSPA1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDSPC1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDSPE1,2-ジステアロイルDiostearpyl-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDSPG1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DSPS1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンEPC卵-PCHEPC水素化卵PCHSPC高純度水素化ダイズPCHSPC水素化ダイズPCLYSOPCMYRISTIC1-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンLYSOPCPALMITIC1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンLYSOPCSTEARIC1-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンミルクスフィンゴミエリンMPPC1-ミリストイル,2-パルミトイル-sn-グリセロ3-ホスファチジルコリンMSPC1-ミリストイル,2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンPMPC1-パルミトイル,2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンPOPC1-パルミトイル,2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンPOPE1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンPOPG1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...]PSPC1-パルミトイル,2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンSMPC1-ステアロイル,2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンSOPC1-ステアロイル,2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンSPPC1-ステアロイル,2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン"