"受託番号KCLRF-BP-00264で寄託されたハイブリドーマから生産される、単クローン抗体MD-3。重鎖および軽鎖を含む、ヒトICAM-1に結合する単クローン抗体であって、前記重鎖は、受託番号KCLRF-BP-00264で寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体の重鎖の3つの相補性決定領域CDRを含み、前記軽鎖は、受託番号KCLRF-BP-00264で寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体の軽鎖の3つの相補性決定領域CDRを含む、抗体。受託番号KCLRF-BP-00264で寄託されたハイブリドーマから生産されるMD-3抗体由来のキメラ形態またはヒト化形態である、請求項2に記載の抗体。受託番号KCLRF-BP-00264で寄託された、ハイブリドーマ細胞。請求項1~4のいずれか1項に記載の単クローン抗体を含む、薬学組成物。前記単クローン抗体は、単離された形態である、請求項5に記載の薬学組成物。請求項1~4のいずれか1項に記載の単クローン抗体を有効成分として含む薬学組成物であって、ICAM-1ドメイン2への結合および抗原特異的T細胞寛容の誘導により樹状細胞の分化および機能を調節するための薬学組成物。請求項1~4のいずれか1項に記載の単クローン抗体を有効成分として含む、T細胞媒介免疫疾患を予防または治療するための薬学組成物。前記T細胞媒介免疫疾患は、移植拒絶、移植片対宿主疾患または自己免疫疾患である、請求項8に記載の薬学組成物。ICAM-1ドメイン2への結合および抗原特異的T細胞寛容の誘導により樹状細胞の分化および機能を調節する方法であって、請求項1~4のいずれか1項に記載の単クローン抗体を必要とする患者に投与する段階を含む方法。T細胞媒介免疫疾患を予防または治療する方法であって、請求項1~4のいずれか1項に記載の単クローン抗体を必要とする患者に投与する段階を含む方法。前記T細胞媒介免疫疾患は、移植拒絶、移植片対宿主疾患または自己免疫疾患である、請求項11に記載の方法。ICAM-1ドメイン2への結合および抗原特異的T細胞寛容の誘導により樹状細胞の分化および機能を調節することに用いるための、請求項1~4のいずれか1項に記載の単クローン抗体。T細胞媒介免疫疾患を予防または治療することに用いるための、請求項1~4のいずれか1項に記載の単クローン抗体。前記T細胞媒介免疫疾患は、移植拒絶、移植片対宿主疾患または自己免疫疾患である、請求項14に記載の抗体。本発明の一実施形態は、樹状細胞の機能および分化を調節し、抗原特異的T細胞寛容を誘導することにより、T細胞媒介性免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および/または治療に効果的な、ヒト細胞間接着分子-1ICAM-1のドメイン2に結合する抗体に関するものである。また、本発明は、前記抗体を含む薬学組成物を提供する。また、本発明は、T細胞媒介性免疫疾患を治療するための抗体を含む薬学組成物、T細胞媒介性免疫疾患の治療に用いるための抗体、および前記抗体を用いてT細胞媒介性免疫疾患を治療する方法に関するものである。より具体的には、本発明は、ヒトICAM-1のドメイン2に結合し、免疫機能の一般的な抑制よりむしろ抗原特異的T細胞寛容を誘導することにより、樹状細胞の分化および機能を調節する抗ヒトICAM-1抗体に関するものである。そのため、前記抗体の投与は、免疫抑制に伴う副作用、例えば、感染および癌の発達を最少化する一方でT細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および/または治療に効果的であり得る。また、本発明は、抗体を生産する方法、および抗体またはその断片を生産する細胞に関するものである。また、本発明は、抗体を生産するハイブリドーマ細胞および前記ハイブリドーマ細胞によって生産される抗体を含む。また、本発明は、T細胞媒介性免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および/または治療のための薬学組成物に関するものである。薬学組成物は、次の群より選択される免疫抑制剤を含む:ICAM-1のドメイン2に結合することができ、抗原特異的T細胞寛容を誘導することができ、好ましくは、ハイブリドーマによって生産された抗体;およびICAM-1のドメイン2に結合することができ、抗原特異的T細胞寛容を誘導することができる抗体の断片。さらに、本発明はT細胞媒介性免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などを予防および/または治療するための方法であって、必要とする患者に対して抗体または抗体の断片からなる群より選択される1つ以上を投与することを含む方法に関するものである。前記抗体または抗体の断片は、好ましくは、単クローン抗体からなる群より選択され、より好ましくは、ヒトまたは動物由来の抗体である。なおさらに、本発明は、T細胞媒介性免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および/または治療に用いられる、ICAM-1のドメイン2に結合することができ、抗原特異的T細胞寛容を誘導することができ、好ましくは、ハイブリドーマによって生産された抗体、およびICAM-1のドメイン2に結合することができ、抗原特異的T細胞寛容を誘導することができる抗体の断片に関するものである。本発明を、以下の実施例を参考にしてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、いずれの形態であれ本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。本発明は、マウス抗ヒトICAM-1単クローン抗体MD-3例えば、登録番号KCLRF-BP-00264で寄託されたハイブリドーマ細胞によって生産されたMD-3、MD-3の断片、およびT細胞寛容を誘導することができるMD-3のキメラまたはヒト化された形態に関するものである。より具体的には、本発明は、ヒトICAM-1のドメイン2に結合することにより樹状細胞の分化および機能を調節し、免疫機能の一般的な抑制よりもむしろ抗原特異的T細胞寛容を誘導する、登録番号KCLRF-BP-00264で寄託されたハイブリドーマ細胞によって生産された抗ヒトICAM-1抗体に関するものである。そのため、前記抗体の投与は、免疫抑制に伴う副作用、例えば、感染および癌の発達を最少化するのに対しT細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および/または治療に効果的であり得る。また、本発明は、抗体またはその断片を生産する方法に関するものである。抗体またはその断片を生産する方法は、aヒトICAM-1蛋白質GeneBankAccessionNo.NP_000192または蛋白質の断片、あるいはヒトICAM-1を発現する細胞例えば、活性化されたヒト末梢血液単核球および/またはDu145ATCCHTB-81で動物を免疫化する段階と、b免疫化された動物から脾臓細胞splenocyteを抽出する段階と、c動物の脾臓細胞を骨髄腫myeloma細胞株と融合させる段階と、dハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、ICAM-1とLFA-1との間の相互作用を妨げないものの、移植された器官の拒絶反応を抑制することだけでなく、樹状細胞の機能および分化を調節することも可能な、好適なハイブリドーマ細胞を選別する段階とを含む。前記抗体またはその断片は、インビトロ培養によるか、あるいは前記抗体またはその断片を生産する細胞を動物に投与することによって得られる。前記抗体またはその断片は、前記抗体またはその断片を生産する細胞が腹膜内に投与された動物の腹水から得られる。前記抗体またはその断片は、イオン交換クロマトグラフィーまたは親和性カラムクロマトグラフィーによって培養上澄液または腹水から精製することができる。また、本発明は、MD-3抗体を生産するハイブリドーマ細胞を提供し、具体的な一例として、前記ハイブリドーマ細胞は、受託番号KCLRF-BP-00264の細胞である。また、本発明は、T細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および/または治療のための薬学組成物に関するものである。前記薬学組成物は、マウス抗ヒトICAM-1単クローン抗体MD-3受託番号KCLRF-BP-00264のハイブリドーマ細胞から生産される、MD-3の断片、あるいはMD-3のキメラchimericまたはヒト化形態からなる群より選択される免疫抑制剤を含む。本発明にかかる抗体またはその断片の投与は、薬学組成物の投与において許容されているあらゆる方式を用いて行われうる。さらに、本発明は、必要とする患者に対して抗体例えば、MD-3またはその断片からなる群より選択される1つ以上を投与する段階を含む、T細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの予防および/または治療方法に関するものである。好ましくは、前記抗体または抗体の断片は、単クローン抗体からなる群より選択されたものであり、より好ましくは、ヒトまたは動物由来のものである。前記方法は、投与する段階に先立ち、T細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの治療および/または予防を必要とする患者を同定する段階を追加的に含むことができる。他の実施形態として、本発明は、T細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの治療および/または予防に用いるか、あるいはT細胞媒介免疫疾患、例えば、移植拒絶、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患などの治療および/または予防のための薬学組成物を調製するために用いられる抗体例えば、MD-3またはその断片を提供する。ヒト化抗体は、供与抗体由来の相補性決定領域complementarydeterminingregion、CDR、およびヒト抗体由来の可変領域フレームワークと不変領域とを有する抗体である。したがって、一般に、ヒト化抗体は、iマウス抗体、例えば、MD-3由来の3つのCDRを含む軽鎖、ヒト抗体由来の可変領域フレームワーク、およびヒト不変領域と、iiマウス抗体、例えば、MD-3由来の3つのCDRを含む重鎖、ヒト抗体由来の可変領域フレームワーク、およびヒト不変領域とを含む。キメラ抗体は、マウスまたは他の齧歯類抗体の可変領域がヒト抗体の不変領域と組み合わされた抗体であって、遺伝工学的手段によるこれらの構築はよく知られている。このような抗体は、マウス抗体の結合特異性を保有するものの、約2/3程度がヒト由来である。マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体内の非ヒト配列の存在割合は、キメラ抗体の免疫原性がマウス抗体とヒト化抗体の中間程度であることを示す。単クローン抗体monoclonalantibody、mAbは、動物例えば、マウス、ラット、ハムスターまたは鶏起源であってもよく、または遺伝子工学的に製作されてもよい。齧歯類の単クローン抗体は、当業界でよく知られている標準的方法によって製造され、その方法は、適切な免疫増強剤と共に、腹腔内、静脈内、または足蹠footpad内にICAM-1を複数回免疫化した後、脾臓またはリンパ節細胞を抽出し、適切な不死化細胞株と融合した後、ICAM-1と結合する抗体を生産するハイブリドーマを選別することを含む例えば下記の実施例を参照のこと。キメラおよびヒト化単クローン抗体が本発明の具体例として好ましい。本発明の本来のnative単クローン抗体は、これらのハイブリドーマから生産することができる。遺伝子工学的に製作された単クローン抗体、例えば、キメラまたはヒト化抗体は、当業界で知られている多様な方法によって発現することができる。例えば、これらの軽鎖および重鎖V領域をコーディングする遺伝子を、オーバーラップするオリゴヌクレオチドから合成し、プロモーター、エンハンサー、ポリA領域などの必須調節領域を提供する発現ベクター例えば、Invitrogenから市販されているもの内に、利用可能なC領域と共に挿入することができる。CMVプロモーター-エンハンサーの使用が好ましい。次に、発現ベクターは、リポフェクションまたは電気穿孔法のような、当業界で知られている多様な方法を用いて、CHOまたはSp2/0およびNS0を含む非生産性骨髄腫細胞のような多様な哺乳動物細胞株に形質移入transfectionすることができ、抗体を発現する細胞は、適切な抗生物質による選別によって選別される。本発明の単クローン抗体その他の抗体が発現されると、精密ろ過、限外ろ過、蛋白質AもしくはG親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および/または有機染料に基づいた他の形態の親和性クロマトグラフィーなどのような、当業界の標準的技術により精製することができる。薬学的用途のためには、少なくとも約90または95の均質性を有する実質的に純粋な抗体が好ましく、98または99、あるいはそれ以上の均質性のあるものがより好ましい。好ましい具体例として、本発明は、本願に開示された抗体を含む薬学製剤を提供する。つまり、前記抗体は、疾患を治療するための医薬の製造に使用できる。前記抗体の薬学製剤つまり、医薬は、凍結乾燥または水性溶液の形態で、生理学的に許容される担体中において、任意で添加剤または安定化剤を伴って、単クローン抗体を含む。許容可能な担体、添加剤または安定化剤は、使用される用量および濃度において受容者に毒性がなく、一般に、pH5.0~8.0、より一般には、pH6.0~7.0におけるリン酸、クエン酸、または酢酸のような緩衝液;等張性を作るための塩化ナトリウム、塩化カリウムなどのような塩;抗酸化剤、保存剤、低分子量ポリペプチド、蛋白質、ポリソルベート80のような親水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖、および当業者に知られているその他の標準的成分を含む。単クローン抗体は、一般に、1~100mg/mlの濃度、例えば、10mg/mlで存在する。本発明の抗体は、一般に、望ましくない混入物を排して実質的に純粋である。これは、その抗体は、干渉する蛋白質または混入物が実質的にないことだけでなく、少なくとも約50w/w以上の純度であることを意味する。好ましくは、前記抗体は、少なくとも90、95または99以上の純度である。他の好ましい具体例として、本発明は、薬学製剤中の抗ICAM-1単クローン抗体を用いて、疾患を有する患者を治療する方法を提供する。薬学製剤中に調製された単クローン抗体は、任意の適切な経路、特に、静脈注入もしくはボーラス注射による非経口投与、筋肉内投与または皮下投与により、患者に投与することができる。静脈注入は、15分間程度の短時間行うこともできるが、より一般的には、30分間、または1時間、2時間、もしくは3時間以上に渡って行われうる。単クローン抗体は、疾患例えば、腫瘍部位に直接注射されてもよいし、リポソームのような運搬体内にカプセル化されてもよい。投与量は、治療対象の状態を緩和させるのに十分な量とし治療的有効量、体重kgあたり0.1~5mg、例えば、1、2、3または4mg/kgであると思われるが、10mg/kg、あるいは15または20mg/kgほどまで高くなることもありうる。固定単位投与量、例えば50、100、200、500または1000mgで投与されてもよく、または、前記投与量は、患者の表面積に基づいていてもよい例えば100mg/m2。単クローン抗体は、毎日、週ごとに、週2回ずつ、隔週ごとに、月ごとに、あるいは、例えば単クローン抗体の半減期に依存してその他の間隔で、1週間、2週間、4週間、8週間、3~6ヶ月間またはそれ以上の期間に渡って投与されうる。慢性投与のように反復的な治療も可能である。合併症、および疾患の発達過程における中間的病理表現型を含む、疾患の症状生化学的、組織学的および/または臨床学的を緩和させ、あるいは少なくとも部分的に中断させる投与量および投与間隔の投与療法を、治療学的に有効な投与療法という。本発明は、下記の実施例を参照してより詳細に説明される。しかし、このような実施例は、いずれの形態であれ本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。[実施例1.抗ヒトICAM-1単クローン抗体を生産可能なハイブリドーマ細胞の分離]ヒト末梢血液単核細胞を、フィコール-パックGEHealthcare密度勾配遠心法によって健康な供与者から分離した。ICAM-1/Fc蛋白質を製造するために、フィトヘマグルチニンphytohemagglutinin、PHA活性化されたヒト末梢血液単核細胞からmRNAを抽出し、ヒトICAM-1の細胞外ドメインに相応するcDNA断片の5’および3’末端にそれぞれNheIおよびEcoRIサイトを導入し、重合酵素連鎖反応PCRで増幅した。次のプライマーを用いて重合酵素連鎖反応PCRを行った。5’プライマー:GCTAGCGCAACCTCAGCCTCGCTATGGCTC配列番号13’プライマー:GAATTCATCTCATACCGGGGGGAGAGCAC配列番号2ICAM-1およびヒトIgGFcの融合構造体を製造するために、上記断片を、ヒトIgG1Fc領域を含む、EcoRIおよびXhoI-制限酵素処理されたpSecTagプラスミドInvitrogen内に連結させた。HEK293細胞ATCCCRL-1573に前記プラスミドを一時的に形質移入させ、蛋白質Gカラムを用いてICAM-1/Fc蛋白質を培養上澄液から精製した。Balb/cマウス雌、6~8週、17~25g;KOATECH、韓国に対し、完全フロイントFreund’s免疫増強剤で乳化されたICAM-1/Fc蛋白質100μgを用いて腹腔内免疫し、次に、ICAM-1/Fc蛋白質100μgを不完全フロイント免疫増強剤と共に用いて、2週間隔で2回免疫化した。2週間後、免疫化されたマウスにICAM-1/Fc蛋白質100μgを追加接種した。脾臓細胞懸濁液を製造するために、最終投与から3日後にBalb/cマウスの脾臓を摘出した。単クローン抗体は、9-アザグアニンに抵抗性のあるSP2/0-Ag14マウス骨髄腫細胞ATCCCRL-1581と、ヒトICAM-1/Fcで免疫化されたBalb/cの脾臓細胞とを融合することによって製造した。細胞融合方法は、KoelerおよびMilsteinの方法に従ったKoelerMilsteinNature、1975、256、495-497。108の脾臓細胞を、50ポリエチレングリコール4000Rocheを用いて107の骨髄腫細胞と融合した。細胞を洗浄し、20ウシ胎仔血清FBS、100μMヒポキサンチン、0.44μMアミノプテリン、および16μMチミジンHATmedia、Sigmaを含むDMEM培地Dulbeco’smodifiedEagle’smediumに再懸濁させた。前記細胞を4つの96ウェルプレートに導入し、37°C、5CO2培養器内で培養した。2週間後コロニーが形成された時、ヒトICAM-1形質移入したHEK293T細胞を用いて上澄液をスクリーニングした。ICAM-1形質移入したHEK293T細胞および野生型HEK293T細胞を両方とも培養上澄液で染色し、ICAM-1形質移入した293T細胞に反応するものの、野生型293T細胞には反応しない上澄液を生産する細胞を選別した。高反応性抗体を生産する安定したハイブリドーマクローンを製造するために、陽性ウェルから取った細胞を、限界稀釈法抗体:ALaboratoryManual.EditedbyEDHARLOWandDAVIDLANE;ColdSpringHarbor:ColdSpringHarborLaboratory.NewYork.1988によってウェルあたり0.5細胞にサブクローニングした。前記実験によって得られた1つのハイブリドーマ細胞株は、ヒトおよびサル抗原ともに結合するIgG1抗体を生産し、これをMD-3と名づけた。MD-3と名づけられたハイブリドーマは、大韓民国、ソウル、鍾路区、蓮建洞28番地所在のソウル大学医科大学郵便番号110-744に位置する韓国細胞株研究財団theKoreanCellLineResearchFoundation、KCLRFに2011年5月4日付で寄託し、受託番号KCLRF-BP-00264を受けた。[実施例2.ヒトICAM-1のMD-3結合ドメインのマッピング]ICAM-1は、5つの免疫グロブリン様Ig様ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインで構成された構造を有するCell.1992、68:71-81。具体的なICAM-1Ig様ドメインへのMD-3の結合サイトの位置を知るために、ヒトおよびマウスICAM-1cDNAクローンを用いて、ヒトドメイン1/マウスの膜貫通および細胞質ドメインを含むマウスドメイン2~5をコーディングするcDNAh1m2345、ならびに、ヒトドメイン1~2/マウスドメイン3~5をコーディングするcDNAh12m345の2種類のキメラcDNAを製造した。これらのキメラ突然変異体を製作するためにオーバーラッピングPCR技術を用いた。まず、次のプライマーを用いてヒトドメイン1h1を含むcDNAを増幅した:5’プライマーGAATTCATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCCGCGCT配列番号3;3’プライマーAGGTCTCAGCTCCACCCGTTCTGGAGTCCAGTACACGGTGAGGAAG配列番号4。マウスドメイン2-5、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインm2345の製造のためのプライマーは次の通りである:5’プライマーCTGGACTCCAGAACGGGTGGAGCTGAGACCTCTGCCAGCCTGGCAG配列番号5;3’プライマーGGATCCGGGAGGTGGGGCTTGTCCCTTGAGTTTTATGGC配列番号6。これら2種類のcDNAを混合し、配列番号3および配列番号6のプライマーを用いて再増幅し、最終産物h1m2345をpcDNA3.1ベクターにクローニングした。h12m345をコーディングする変異体は、次のプライマーを用いて、h1m2345に対するものと類似の方式でクローニングした:h12に対する5’プライマーGAATTCATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCCGCGCT配列番号7;h12に対する3’プライマーGGTAGCTGGAAGATCAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGGCCGAGGT配列番号8;m345に対する5’プライマーCAGCTCCAGACCTTTGATCTTCCAGCTACCATCCCAAAGCTCGACACC配列番号9;m345に対する3’プライマーGGATCCGGGAGGTGGGGCTTGTCCCTTGAGTTTTATGGC配列番号10。修正された連結部が得られたかを確認するために構造体全体を配列分析し、次に、プラスミドDNAを、カルシウムホスフェート沈殿法を用いてHEK293T細胞に形質移入させた。カルシウムホスフェートおよびプラスミドDNAの共沈物とともにHEK293Tを16~20時間インキュベートした後に、培地を10mlの新たな溶液に代替し、さらに24時間細胞をインキュベートした。次に、形質移入体を氷中でMD-3で染色した。30分間のインキュベーション後に、細胞を5ウシ胎仔血清fetalcalfserumおよび0.1アジドを有するリン酸緩衝食塩水phosphatebufferedsaline、PBSで3回洗浄し、FITC結合されたヤギ抗マウスIg抗体二次抗体と30分間インキュベートした。3回さらに洗浄した後に、各抗体と反応する能力をテストするためにフローサイトメトリー分析を行った図1。陰性対照として、ベクターでのみ形質移入された細胞を用いた。図1に示されているように、全長ヒトICAM-1形質移入体は、MD-3抗体で陽性的に染色されたのに対し、その抗体は全長マウスICAM-1形質移入体には反応せず、これは、MD-3抗体がマウスICAM-1と交差反応しないことを示す。キメラ変異体の場合、MD-3抗体は、ヒトICAM-1のドメイン2を含む変異体h12m345にのみ反応し、これは、MD-3抗体がドメイン2上のエピトープに特異的であることを示す。[実施例3.単核球由来の樹状細胞の分化過程におけるMD-3抗体の阻害効果]末梢血液単核細胞を、フィコール-ハイパック密度勾配遠心法によって健康な供与者の血液から分離した。PBSで2回洗浄した後に、細胞を1x108cells/mlの濃度でMACSバッファーMilteny-Biotech中に再懸濁させ、次に、氷中で15分間、抗CD14マグネチックビーズ20μl/107cells;MiltenyiBiotec、BergischGladbach、Germanyと共にインキュベートし、次に、MACSMilteny-Biotechを用いて磁性分離した。精製されたCD14単核球を、10v/vFBSが含まれているRPMIInvitrogen内に再懸濁し、大食細胞コロニー刺激因子GM-CSF、1000U/mlおよびIL-41000U/mlと共に6日間培養した。培養0日目および3日目に培地にMD-3または同アイソタイプの対照抗体10mg/mlを追加し、6日目にLPSを培養培地に追加した。1日経過後に、培養した細胞を収集し、MHCクラスI、MHCクラスII、CD80、CD86、およびCD40の発現を、フローサイトメトリーにより平均蛍光強度MFIとして測定した図2A。培養培地内のIL-12p70、IL-6、IFN-γ、およびTNF-αの量を測定するためにELISAも行った図2B。CD14単核球をGM-CSFおよびIL-4の存在下で培養すると、未成熟樹状細胞に分化することができ、LPSの処理は、未成熟樹状細胞の成熟を誘導して、結果的に、MHCおよび共刺激分子の表面発現の上方調節ならびにサイトカインの産生をもたらした。しかし、LPS刺激に先立ち、MD-3抗体で前処理した場合には、遮断ブロッキング抗体で樹状細胞を処理した場合とは異なり、樹状細胞における表面分子発現の上方調節およびサイトカインの生成が顕著に抑制された図5。したがって、このような結果は、MD-3抗体が単核球由来の樹状細胞の成熟を抑制する能力を有することを示すものである。[実施例4.ヒト化マウスの製造]抗ICAM-1抗体のインビボinvivo効果を調査するために、Ito,M.etal.,Blood.2002、100:3175-82に記載の方法により、免疫欠乏マウスにヒト造血幹細胞を移植してヒト化マウスを製造した。満期正常分娩の間に臍帯血細胞を収集し、フィコール-ハイパック遠心分離によって単核細胞を分離した。分離された単核細胞は、2mMEDTAおよび5FBSを含有するPBS内で3.3x108cells/mlで懸濁し、Fc遮断抗体Milteny-Biotechと共に30分間氷中でインキュベートし、次に、抗CD34マグネチックビーズMilteny-Biotechと共に30分間氷中でインキュベートした。2回洗浄した後、MACSを用いて、ビーズが付着した細胞を磁性分離した。2回にわたる磁性分離後、フローサイトメトリーによって純度を評価した結果、収集した細胞の95以上がCD34であった。8~12週齢のNOD.SCID/γcnullマウスCentralInstituteforExperimentalAnimals、Japanに、コバルト放射線源を用いて240cGyで放射線処理し、1日後に、1x105のCD34細胞を尾静脈を通して各マウスに注射した。移植後4週間から20週間の間に、順次、眼窩静脈叢retro-orbitalvenousplexusから末梢血液を取り、フローサイトメトリー分析のために抗ヒトCD45および抗ヒトCD3抗体BDBiosciencesで染色した。図3Aは、細胞移植後の表示された週におけるマウスの末梢血液中のヒトCD3T細胞再増殖の動態を示す。ヒトT細胞は、臍帯血細胞移植後8週間目に現れ、その後急速に増加した。また、ヒトCD4T細胞、CD8T細胞、CD19B細胞、CD14単核球、CD11cの従来型樹状細胞、およびCD123形質細胞様樹状細胞が、ヒト化マウスの膵臓から確認された図3B。[実施例5.ブタ膵島移植モデルにおける、MD-3抗体のインビボ投与による移植拒絶反応の抑制]移植拒絶反応を抑制するMD-3抗体の効果を実証するために、膵島異種移植モデルを用いた。ブタ膵島を得るために、温虚血時間なしで膵臓全摘術を行い、先に開示された修正Ricordi方法CellTransplant2010、19:299-311により膵島を分離した。精製された膵島を、10ブタ血清、10mMニコチンアミド、および1ペニシリン-ストレプトマイシンが添加された199培地Gibco、BRL、LifeTechnologiesLtd、Paisley、Scotland、UKで37°Cにて一晩培養し、その後、ヒト化マウスの腎臓被膜下で培養した。携帯用血糖測定器Accu-Chek、RocheDiagnostics、ソウル、韓国を用いて血中グリコース水準を測定するために、眼窩副鼻腔retro-orbitalsinusから週ごとに末梢血液試料を得て、血清内のブタC-ペプチド水準は放射線免疫分析radioimmunoassay、Linco、St.Charles、MO、USAで測定した。ブタC-ペプチド>0.5ng/mlの場合、成功した移植と定義された。移植拒絶反応は、第1日目のブタC-ペプチド<0.1ng/mlの場合と定義し、移植片の組織学的分析histologicalanalysisにより確認した。対照群において、組織生存期間の中央値は21日間であり、抗ICAM-1遮断抗体R6-5-D6の投与は、生存期間の中央値を40日間まで延長させた図4。しかし、移植された膵島は、結局、2つの群のいずれでも拒絶反応が現れた。これと対照的に、MD-3処理されたマウスは、実験期間全体を通して移植拒絶反応が現れなかった。膵島移植の42日後、または病的状態を示した時、マウスを犠牲にして、腎臓切除試料を移植拒絶反応に関して組織学的に分析した。各マウスから得られた腎臓切除試料は、10中性ホルマリン中で固定させ、パラフィン包埋後、4μmの厚さに連続的に切片化した。免疫組織化学分析のためには、組織切片をキシレンxyleneで脱ワックス化し、段階化されたアルコールシリーズを用いて再水和し、内因性ペルオキシド遮断溶液endogenousperoxide-blockingsolution中で5分間インキュベートした。LeicaBondMaxsystemLeica、Wetzlar、Germanyを用いて、99°Cにおける6mMクエン酸緩衝溶液中で切片を20分間インキュベートすることにより抗原賦活化を行い、非特異的染色を防止するために組織切片をウサギ血清PBS中1で30分間処理した。抗ヒトインスリンDAKO、Carpinteria、CA、USA、CD3F7.2.38;DAKO、CD20L26;DAKO、およびCD68PG-M1;DAKO抗体を30分間反応させた後、VECTASTAINEliteABCkitPK6101;VectorLaboratories、Burlingame、CA、USAを用いて抗体の結合を検出した。図5に示されているように、対照群では、インスリン陽性膵島細胞は完全に破壊され、CD3T細胞およびCD68大食細胞の主要な浸潤細胞により置き換えられた。しかし、MD-3処理群では、膵島近傍における無視できる程度の単核細胞の浸潤と共に、インスリン陽性膵島細胞の大きな群が明確に見られた。MD-3処理したマウスにおける免疫反応欠如が、抗原特異的寛容であるか、または一般的な免疫抑制であるかを調べるために、前記マウス内で移植膵島特異的T細胞と同種allo特異的T細胞の数を比較した。このために、ヒト化マウスの膵臓においてIL-2またはIFN-γを分泌する抗原特異的T細胞の頻度を、Mabtechから購入したELISPOTkitNackaStrand、Swedenを用いて測定した。抗IL-2または抗IFN-γ捕獲抗体でコーティングされたプレートを、滅菌リン酸緩衝食塩水phosphatebufferedsaline、PBS;200μl/wellで4回洗い、10のヒト血清が添加されたRPMI1640培地を用いて常温で30分間ブロッキングした。前記培地を除去した後、ヒト化マウス由来の3×105個の脾細胞を、5×104個のブタ膵島細胞と共に、10のヒト血清が添加されたRPMI1640培地中で、37°Cで40時間、5二酸化炭素CO2インキュベータで培養した。抗原特異的T細胞寛容を評価するために、キーホールリンペットヘモシアニンKLH;0.1mg/ml、または、3人の供与者から集めたT細胞枯渇化γ線照射ヒト末梢血液単核細胞PBMCs;7×105/wellも刺激剤として使用した。1つの陰性対照NCとして、膵島移植していないヒト化マウスの脾臓細胞をブタ膵島により刺激し、抗膵島反応に使用した。これと対比させて、移植を受けたマウスの脾臓細胞を刺激抗原非存在下で培養したものを、抗同種血液単核球allo-PBMCsおよび抗KLHの反応に使用した。40時間培養後、細胞を除去し、プレートをPBS溶液200μl/wellで5回洗った。アルカリホスファターゼコンジュゲート化検出用抗体を、0.5ウシ胎仔血清が含まれているPBS100μl中で、IL-2またはIFN-γについてそれぞれ1:200または1:1000に希釈して加え、常温で2時間インキュベートした。前記プレートをPBSで5回洗い、BCIP/NBP基質100μlを加えた。水道水で洗うことによって発色を停止させた。結果として得られたスポットを、コンピュータ支援によるAIDEliSpotReaderSystemAID、Strassberg、Germanyで数えた。対照マウス由来の全脾臓細胞をブタ膵島で刺激した時、有意な数のIL-2またはIFN-γ分泌T細胞が検出された図6左段。これと対照的に、MD-3で処理したマウスでは、IL-2またはIFN-γ分泌T細胞が検出されておらず、これは、異種移植抗原に対するT細胞反応が完全に抑制されたことを示す。しかし、この系において、ヒト同種血液単核球allo-PBMCsに対するT細胞の反応は対照と同程度であった図6中段。このような結果は、T細胞の無反応は、ブタ膵島抗原に特異的な寛容の誘導を反映していたことを示唆する。この抗原特異的T細胞寛容の誘導は、無関係な抗原によるインビボ負荷によってさらに証明された。移植後28日目に、MD-3が完全に除去された時、マウスを溶解性solubleKLH抗原で免疫化した。2週間後、KLH特異的T細胞の数をELISPOT分析により測定した。図6右段に示されているように、MD-3処理したマウスから得られたT細胞は、IFN-γおよびIL-2を生産する細胞の数という観点において、KLHに対する強い反応を示した。このような結果は、MD-3の投与が、移植膵島抗原に対して特異的なT細胞寛容を誘導したことを示唆している。"