"一般式[1][a]の対応するケトンおよび適切なアミノドナーからの一般式[1][c]の鏡像異性的に濃縮されたR-アミンの酵素的合成のための方法であって、式中、R1およびR2は異なっており、かつ独立して直鎖または分岐鎖脂肪族、芳香族、ヘテロ芳香族であるか、または環式構造を形成するa.配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;b.配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;c.配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;d.配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;e.配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;f.配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;g.配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;h.配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;i.配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;j.配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;k.配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;l.配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;m.配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;n.配列番号30のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;o.配列番号33のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;p.配列番号35のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;q.配列番号38のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;r.配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;s.配列番号43のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;t.配列番号46のアミノ酸配列と少なくとも90の同一性を有するタンパク質;およびu.トランスアミナーゼ活性を有し、かつラーネラアクアティリスRahnellaaquatilis、オクロバクテリウムアンスロピOchrobactrumanthropi、オクロバクテリウムトリティシOchrobactrumtritici、シノリゾビウムモレレンスSinorhizobiummorelense、クルトバクテリウムプシルムCurtobacteriumpusilllum、ペキロマイセスリアシヌスPaecilomyceslilacinus、ミクロバクテリウムゲンセンギソリMicrobacteriumginsengisoli、ミクロバクテリウムトリコテセノリティクムMicrobacteriumtrichothecenolyticum、シュードモナスシトロネロリスPseudomonascitronellolis、エルシニアクリステンセニイYersiniakristensenii、アクロモバクタースパニウスAchromobacterspanius、アクロモバクターインソリタスAchromobacterinsolitus、マイコバクテリウムフォーチュイタムMycobacteriumfortuitum、マイコバクテリウムフレデリクスバーゲンスMycobacteriumfrederiksbergense、マイコバクテリウムサクルムMycobacteriumsacrum、マイコバクテリウムフルオランセニボランスMycobacteriumfluoranthenivorans、バークホルデリアBurkholderia種、バークホルデリアトロピカBurkholderiatropica、コスモスポラエピスファエリアCosmosporaepisphaeria、およびフザリウムオキシスポラムFusariumoxysporumからなる生物の群から選択される生物から得ることができるタンパク質、からなる群から選択されるトランスアミナーゼを使用することによる方法。R1およびR2が異なっており、かつR1およびR2が独立して1~30の炭素原子を含有し、R1およびR2が、独立して、置換または非置換脂肪族;置換または非置換分岐鎖脂肪族;置換または非置換環状脂肪族;少なくとも1つの酸素、イオウ、または窒素原子を含有する置換または非置換ヘテロ環式脂肪族;置換または非置換芳香族;少なくとも1つのイオウ、または窒素原子を含有する置換または非置換ヘテロ芳香族であるか;あるいは一緒になって、置換もしくは非置換環式構造または少なくとも1つの酸素、イオウ、もしくは窒素原子を含有するヘテロ環式構造を形成し;前記置換基が、これらに限定されないが、ハロゲン原子、炭素原子数1~6のアルキル基、ヒドロキシル基、メトキシ基、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、およびトリフルオロメチル基からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記鏡像異性的に濃縮されたR-アミン生成物の最終濃度が、反応混合物の1~50重量の間にあることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。前記トランスアミナーゼが、配列番号1のアミノ酸と少なくとも90の同一性を有するタンパク質である、請求項3に記載の方法。前記アミノドナーが、α-メチルベンジルアミンである、請求項4に記載の方法。前記エミノドナーが、sec-ブチルアミンである、請求項4に記載の方法。前記鏡像異性的に濃縮されたR-アミン生成物の最終濃度が、反応混合物の5~35重量の間にあることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。前記反応混合物が、水相および第2の有機相を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。前記反応混合物が、水相および第2の有機相を含み、水相:有機相の容積比が100~0.01の間にある、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。前記反応混合物が、水相および第2の有機相を含み、水相:有機相の容積比が20~0.1の間にある、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。前記反応混合物が、水相および第2の有機相を含み、水相:有機相の容積比が20~1の間にある、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。ラーネラアクアティリスRahnellaaquatilisDSM23797として寄託された、オクロバクテリウムアンスロピOchrobactrumanthropiDSM23793として寄託された、オクロバクテリウムトリティシOchrobactrumtriticiDSM23786として寄託された、シノリゾビウムモレレンスSinorhizobiummorelenseDSM23794として寄託された、クルトバクテリウムプシルムCurtobacteriumpusilllumDSM23787として寄託された、ペキロマイセスリアシヌスPaecilomyceslilacinusDSM23771として寄託された、ミクロバクテリウムゲンセンギソリMicrobacteriumginsengisoli、ミクロバクテリウムトリコテセノリティクムMicrobacteriumtrichothecenolyticumDSM23788として寄託された、シュードモナスシトロネロリスPseudomonascitronellolisDSM23795として寄託された、エルシニアクリステンセニイYersiniakristenseniiDSM23792として寄託された、アクロモバクタースパニウスAchromobacterspaniusDSM23791として寄託された、アクロモバクターインソリタスAchromobacterinsolitusDSM23790として寄託された、マイコバクテリウムフォーチュイタムMycobacteriumfortuitumDSM23789として寄託された、マイコバクテリウムフレデリクスバーゲンスMycobacteriumfrederiksbergenseDSM23798として寄託された、マイコバクテリウムサクルムMycobacteriumsacrumDSM23785として寄託された、マイコバクテリウムフルオランセニボランスMycobacteriumfluoranthenivoransDSM23796として寄託された、バークホルデリアBurkholderia種、バークホルデリアトロピカBurkholderiatropicaDSM23799として寄託された、コスモスポラエピスファエリアCosmosporaepisphaeriaDSM23772として寄託されたおよびフザリウムオキシスポラムFusariumoxysporumDSM23770として寄託されたからなる生物の群からのR-トランスアミナーゼ活性を有する酵素を含む微生物。R-トランスアミナーゼ活性を有する前記酵素が、Cpu-TA1[配列番号30]、Cpu-TA2[配列番号33]、Cpu-TA3[配列番号35]、Raq-TA2[配列番号38]、Raq-TA3[配列番号40]、Asp-TA1[配列番号43]、およびMgi-TA1[配列番号46]からなる群から選択されるか、またはこれらのアミノ酸配列のいずれかと少なくとも90、好ましくは少なくとも91、好ましくは少なくとも92、好ましくは少なくとも93、好ましくは少なくとも94、好ましくは少なくとも95、好ましくは少なくとも96、好ましくは少なくとも97、好ましくは少なくとも98、好ましくは少なくとも99の同一性を有するタンパク質である、請求項12に記載の微生物。ラーネラアクアティリスRahnellaaquatilisDSM23797として寄託された、オクロバクテリウムアンスロピOchrobactrumanthropiDSM23793として寄託された、オクロバクテリウムトリティシOchrobactrumtriticiDSM23786として寄託された、シノリゾビウムモレレンスSinorhizobiummorelenseDSM23794として寄託された、クルトバクテリウムプシルムCurtobacteriumpusilllumDSM23787として寄託された、ペキロマイセスリアシヌスPaecilomyceslilacinusDSM23771として寄託された、ミクロバクテリウムゲンセンギソリMicrobacteriumginsengisoli、ミクロバクテリウムトリコテセノリティクムMicrobacteriumtrichothecenolyticumDSM23788として寄託された、シュードモナスシトロネロリスPseudomonascitronellolisDSM23795として寄託された、エルシニアクリステンセニイYersiniakristenseniiDSM23792として寄託された、アクロモバクタースパニウスAchromobacterspaniusDSM23791として寄託された、アクロモバクターインソリタスAchromobacterinsolitusDSM23790として寄託された、マイコバクテリウムフォーチュイタムMycobacteriumfortuitumDSM23789として寄託された、マイコバクテリウムフレデリクスバーゲンスMycobacteriumfrederiksbergenseDSM23798として寄託された、マイコバクテリウムサクルムMycobacteriumsacrumDSM23785として寄託された、マイコバクテリウムフルオランセニボランスMycobacteriumfluoranthenivoransDSM23796として寄託された、バークホルデリアBurkholderia種、バークホルデリアトロピカBurkholderiatropicaDSM23799として寄託された、コスモスポラエピスファエリアCosmosporaepisphaeriaDSM23772として寄託されたおよびフザリウムオキシスポラムFusariumoxysporumDSM23770として寄託されたからなる生物の群から選択される生物から得ることができるR-トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド。Rトランスアミナーゼ活性およびR-トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドと少なくとも90、好ましくは少なくとも91、好ましくは少なくとも92、好ましくは少なくとも93、好ましくは少なくとも94、好ましくは少なくとも95、好ましくは少なくとも96、好ましくは少なくとも97、好ましくは少なくとも98、好ましくは少なくとも99の配列同一性を有し、かつラーネラアクアティリスRahnellaaquatilisDSM23797として寄託された、オクロバクテリウムアンスロピOchrobactrumanthropiDSM23793として寄託された、オクロバクテリウムトリティシOchrobactrumtriticiDSM23786として寄託された、シノリゾビウムモレレンスSinorhizobiummorelenseDSM23794として寄託された、クルトバクテリウムプシルムCurtobacteriumpusilllumDSM23787として寄託された、ペキロマイセスリアシヌスPaecilomyceslilacinusDSM23771として寄託された、ミクロバクテリウムゲンセンギソリMicrobacteriumginsengisoli、ミクロバクテリウムトリコテセノリティクムMicrobacteriumtrichothecenolyticumDSM23788として寄託された、シュードモナスシトロネロリスPseudomonascitronellolisDSM23795として寄託された、エルシニアクリステンセニイYersiniakristenseniiDSM23792として寄託された、アクロモバクタースパニウスAchromobacterspaniusDSM23791として寄託された、アクロモバクターインソリタスAchromobacterinsolitusDSM23790として寄託された、マイコバクテリウムフォーチュイタムMycobacteriumfortuitumDSM23789として寄託された、マイコバクテリウムフレデリクスバーゲンスMycobacteriumfrederiksbergenseDSM23798として寄託された、マイコバクテリウムサクルムMycobacteriumsacrumDSM23785として寄託された、マイコバクテリウムフルオランセニボランスMycobacteriumfluoranthenivoransDSM23796として寄託された、バークホルデリアBurkholderia種、バークホルデリアトロピカBurkholderiatropicaDSM23799として寄託された、コスモスポラエピスファエリアCosmosporaepisphaeriaDSM23772として寄託されたおよびフザリウムオキシスポラムFusariumoxysporumDSM23770として寄託されたからなる生物の群から選択される生物から得ることができるポリペプチド。Cpu-TA1[配列番号30]、Cpu-TA2[配列番号33]、Cpu-TA3[配列番号35]、Raq-TA2[配列番号38]、Raq-TA3[配列番号40]、Asp-TA1[配列番号43]、およびMgi-TA1[配列番号46]からなる群から選択されるR-トランスアミナーゼ活性を有する請求項14または15に記載のポリペプチド、またはこれらのアミノ酸配列のいずれかと少なくとも90、好ましくは少なくとも91、好ましくは少なくとも92、好ましくは少なくとも93、好ましくは少なくとも94、好ましくは少なくとも95、好ましくは少なくとも96、好ましくは少なくとも97、好ましくは少なくとも98、好ましくは少なくとも99の同一性を有するタンパク質。請求項14~16のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。[実施例][全般][微生物増殖培地]LBLuriaBertani培地10g/lBactoTryptonBD,LePontdeClaix,France5g/lBactoYeastExtractBD,LePontdeClaix,France5g/lNaClSigma-Aldrich,Steinheim,Germany15g/lBactoAgar固体培地用、BD,LePontdeClaix,France成分を脱イオン水に溶解し、必要に応じてpHを7.0に調整した。培地は、121°Cで20分間高圧蒸気滅菌した。固体培地のために、高圧蒸気滅菌前に寒天を加えた。高圧蒸気滅菌した培地を60°Cまで放冷した後、抗生物質を加えた。[選択増菌培地SEM]10g/lDifcoYeastCarbonBaseYCB,BD,Sparks,MD,USA55mMグリセロールMerck,Darmstadt,Germany10mMピルビン酸Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany5mMR-アミン基質15g/lDifcoAgarNobleBD,LePontdeClaix,FranceYCB培地100g/l、550mMグリセロール、および100mMピルビン酸の原液は、MilliQ水Millipore,Billerica,MA,USAで調製し、0.22μm滅菌フィルターを通す濾過により滅菌した。液体増菌培地は、R-2-アミノブタン、R-3,3-ジメチル-2-アミノブタン、R-α-メチルベンジルアミン、R-α-エチルベンジルアミン、R-1-アミノインダン、およびR-1-アミノテトラリンの群から選択されるR-アミン基質を、滅菌MilliQ水で希釈した増菌培地の原液に1:10の割合で加えることにより調製した。固体増菌培地は、最終濃度15g/lになるように、AgarNobleを含有する高圧蒸気滅菌したMilliQ水を用いて適宜調製した。[抗生物質]カルベニシリンまたはネオマイシンneomycineを100μg/mlの最終濃度で含有するLB培地を、[配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26]を含む発現ベクターを含有する組換えエシェリキアコリEscherichiacoli株を選択し培養するために使用し、これらのプラスミドを維持した。カルベニシリンおよびネオマイシンの原液50mg/mlは、0.22μm滅菌フィルターを通す濾過により滅菌した。[分子および遺伝子の手法]標準的な遺伝子および分子生物学の手法については、当技術分野で一般に知られており、以前に記載されているManiatisetal.1982Molecularcloning:alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.;Miller1972Experimentsinmoleculargenetics,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor;SambrookandRussell2001Molecularcloning:alaboratorymanual3rdedition,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress;F.Ausubeletal,eds.,Currentprotocolsinmolecularbiology,GreenPublishingandWileyInterscience,NewYork1987。[プラスミドおよび株]E.コリE.coli株TOP10Invitrogen,Carlsbad,CA,USAを、すべてのクローニング手順に使用した。E.コリE.coliはまた、タンパク質発現のためにも使用した。遺伝子発現の誘導のために、L-アラビノースを最終濃度0.02w/vで使用した。[標的遺伝子のクローニング][配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26]の標的遺伝子を、国際公開第08000632号パンフレットに記載の手順に従って、コドン対最適化を行った。Gateway技術Invitrogen,Carlsbad,CA,USAを使用するクローニングを容易にするために、すべての遺伝子に対して、リボソーム結合部位および開始コドンの上流、ならびに停止コドンの下流にattB部位を付加した。合成遺伝子は、GeneartRegensburg,Germanyから入手した。これらの遺伝子構築物を、Gateway技術Invitrogenを使用し、導入したattB部位および製造業者のプロトコールwww.invitrogen.comに記載のエントリーベクターとしてのpDONR201Invitrogenを介してpBAD/Myc-HisCInvitrogen,Carlsbad,CA,USA由来の発現ベクターにクローニングした。このようにして、pBAD発現ベクターをそれぞれ得た。化学的にコンピテントなE.コリE.coli細胞を、それぞれのpBAD-発現ベクターにより形質転換して、対応する発現株を得た。[プラスミドの同定]相異なる遺伝子を保持するプラスミドを、形質転換細胞の抗生物質に対する抵抗性、形質転換細胞のPCR診断分析またはプラスミドDNAの精製、精製プラスミドDNAの制限酵素分析またはDNA配列分析などの当技術分野で一般に公知の遺伝的、生化学的、および/または表現型手段によって同定した。[溶液中のタンパク質濃度の測定]無細胞抽出物CFEなど、溶液中のタンパク質濃度は、Anal.Biochem.72:248-2541976でBradfordが記載するような改変タンパク質色素結合法を使用して測定した。適切に希釈した各試料50μlを、試薬エタノール46mlに溶解した100mgのブリリアントブルーG250および85オルトリン酸100mlをmilli-Q水で1,000mlにした950μlと共に、室温で少なくとも5分間インキュベートした。各試料の波長595nmにおける吸収を、PerkinElmerLambda20またはLambda35UV/VIS分光光度計で測定した。既知濃度のウシ血清アルブミンBSA、0.0125mg/ml~0.20mg/mlの範囲を含有する溶液を用いて決定した検量線を使用して、試料中のタンパク質濃度を計算した。[分析][高圧液体クロマトグラフィーHPLC分析]芳香族基を含有するケトンおよびアミンは、PrevailC18の15cmカラム上で分析した。α-メチルベンジルアミン、α-エチルベンジルアミン、2-アミノテトラリンの鏡像異性体の分離および定量については、CrownpakCrカラムDaicelに加えて、o-フタルアルデヒドおよびメルカプトエタノールを使用するアミンのポストカラム誘導体化ならびに蛍光検出を使用した。1-アミノテトラリンおよび1-アミノインダンの鏡像異性体の分離および定量ついては、PrevailC1815cmおよびCrownpakCrカラムに加えて、o-フタルアルデヒドおよびメルカプトエタノールを使用するアミンのポストカラム誘導体化を使用し、蛍光検出を使用した。[ガスクロマトグラフィー]2-ブタノン、2-アミノブタン、3,3-ジメチル-ブタノン、および3,3-ジメチル-2-アミノブタンなどのアルキルケトンおよびアルキルアミンは、アミンカラム用のCP-Sil8CBカラムVarian上で、市販の参照物質Sigma-Aldrichを使用して分析した。R-およびS-アルキルアミンの分離および定量については、Chiralsil-CBカラムAgilentを使用した。[実施例1-唯一の窒素源としてのR-アミン上での微生物の増菌]オランダおよびドイツの様々な場所からの土壌試料を100mMリン酸カリウムKPi緩衝液pH7.0に懸濁し、180の毎分回転数rpmで振盪させながら、28°Cで1時間インキュベートした。この懸濁液をワットマン濾紙に通して濾過した。濾液100μlをそれぞれ使用して、R-2-アミノブタン、R-3,3-ジメチル-2-アミノブタン、R-α-メチルベンジルアミン、R-α-エチルベンジルアミン、R-1-アミノインダン、およびR-1-アミノテトラリンの群から選択される6種のR-アミンの1つを含有するSEM10mlが入っている100mlの三角フラスコに接種した。このフラスコを、オービタリーシェーカーorbitaryshaker上にて180rpmで振盪させながら、28°Cでインキュベートした。微生物増殖が顕著な培地濁度または細胞凝集物の形態で得られた場合に、この培地100μlを使用して、同じR-アミン5mMを含有するSEMに接種した。このような継代接種を2回した後に、1:100希釈した最後の培地100μlを、対応するR-アミン5mMを含有するSEM寒天プレート上に播種した。さらに、無希釈培養物約10μlを、対応するR-アミン5mMを含有するSEM寒天プレート上に画線した。接種した寒天プレートを、増殖が観察されるまで、28°Cでインキュベートした。種々の形態のコロニーを、新たなSEMプレート上に再画線し、異なる微生物種を分離した。均一形態を有する純粋培養物が28°Cのインキュベーションおよび4°Cでの保存の後に得られるまで、再画線接種を継続した。選択された微生物は、MicroSEQ商標登録AppliedBiosystems,Carlsbad,CA,USAIdentificationのために、BaseClearLeiden,TheNetherlandsに送った。細菌または真菌の16SまたはD2-LSUリボソームRNAの得られた配列を、検証済みMicroSEQ登録商標配列データベースBaseClear,Leiden,TheNetherlandsにおけると比較し、99を超える同一性が得られない場合は、NCBIBlastホームページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上のBlastNアルゴリズムを使用して、非重複性nrヌクレオチドデータベースと比較した。これらの配列分析結果の概要を表2に示す。[実施例2-増菌単離物におけるR-トランスアミナーゼ活性の検出]SEM寒天プレート上の増菌単離物の純粋培養物を、微生物が増菌した、5mMのそれぞれのR-アミンを含有するSEM培養液25mlに接種し、培養物が濁るまで、オービタリーシェーカー上で180の毎分回転数rpm、28°Cで培養した。次いで、培養物を50mlの遠心管に移し、BeckmanAvantiJ-20XPI遠心分離機Beckman-Coulter,Woerden,TheNetherlandsにてJA-25.50ローター中、50,000×gで10分間遠心分離した。細胞ペレットを、0.1mMピリドキサル5’-リン酸PLPを含有する、2mlの100mMリン酸カリウムKPi緩衝液pH7.0に再懸濁した。この細胞懸濁液を使用し、40mMのアミノドナーおよびケトン基質を用いて、R-トランスアミナーゼ活性を測定した。増菌単離物3Kb、3Na、3Ba、3Db、および3H1の細胞懸濁液について、アミンドナーとして40mMR-α-メチルベンジルアミン、ケトン基質として1-テトラロンを用い、生成物としてアセトフェノンおよび1-アミノテトラリンを生成させる試験を実施した。増菌単離物5BaBおよび5BaSの細胞懸濁液について、アミンドナーとして40mMR-α-メチルベンジルアミン、ケトン基質として1-アミノインダンを用い、生成物としてアセトフェノンおよび1-アミノインダンを生成させる試験を実施した。増菌単離物2A2、2Ca、2Cb、2M1、2Da、および2K1の細胞懸濁液について、アミンドナーとして40mMR-α-メチルベンジルアミン、ケトン基質としてプロピオフェノンを用い、生成物としてアセトフェノンおよびα-エチルベンジルアミンを生成させる試験を実施した。増菌単離物5BaBおよび5BaSの細胞懸濁液について、アミンドナーとして40mMR-α-メチルベンジルアミン、ケトン基質として1-アミノインダンを用い、生成物としてアセトフェノンおよび1-アミノインダンを生成させる試験を実施した。増菌単離物6Ab、6Bb、6I、および6Fの細胞懸濁液について、アミンドナーとして40mMベンジルアミン、ケトン基質としてアセトフェノンを用い、生成物としてベンズアルデヒドおよびα-メチルベンジルアミンを生成させる試験を実施した。形成されたアミン生成物の濃度および鏡像異性過剰e.e.を、全般の部で記載のようにHPLCにより測定した。HPLC分析の結果を表3に要約する。これらの結果は、増菌された微生物における、良好から優秀なR-選択性を有するトランスアミナーゼの存在を示す。[実施例3-公的データベースからのR-トランスアミナーゼの発現]表4にまとめられている推定上のトランスアミナーゼのポリペプチドをコードするコドン対最適化遺伝子を、全般の部に記載のように、製造業者のプロトコールwww.invitrogen.comに従い、Gateway技術Invitrogenを使用して、pBAD/Myc-HisC由来発現ベクターにクローニングした欧州特許第1513946号明細書に記載のように。さらに、ストレプトミセスアベルミチリスStreptomycesavelmitilis由来のL-スレオニンアルドラーゼLTA_SAV、受託番号Q82N15陰性対照として、ならびにR-トランスアミナーゼABN35871米国特許第7169592号明細書の配列2およびAAN21261米国特許第6413752号明細書の配列1のポリペプチドをコードするコドン対最適化合成遺伝子を注文し、上記のようにクローニングした。コンピテントE.コリE.coliTOP10細胞を形質転換し、100μg/mlの抗生物質を含有する選択的LB寒天プレート上に播種した後、表4に示す、組換えE.コリE.colipBAD株をそれぞれ得た。5mlのLB前培養物および50μg/ml抗生物質の前培養物に、それぞれの寒天プレートから接種し、オービタリーシェーカー上で180rpm、28°Cで一晩培養した。このような前培養物から、発現培養物を、50~100mlのLBおよび50μg/ml抗生物質を含有する三角フラスコに、OD620=0.05の開始細胞密度で接種した。これらの培養物を、オービタリーシェーカー上で180rpm、28°Cでインキュベートした。指数増殖期約0.6のOD620の途中で、培養フラスコに0.02w/vのL-アラビノースを添加して、標的遺伝子の発現を誘導した。誘導後、オービタリーシェーカー上で180rpm、28°Cで一晩約20時間培養を継続した。続いて、細胞を4°Cで10分間、5,000×gで遠心分離して集めた。上清を廃棄し、細胞を再懸濁して秤量した。細胞ペレットは、含水重量の2倍容量となる、0.1mMPLP含有氷冷50mMKPi緩衝液pH7.5に再懸濁した。無細胞抽出物CFEは、氷/アセトン槽で冷却しながら、SonicsMeyrin/Satigny,SwitzerlandVibra-CellVCX130sonifier出力100、10秒オン/10秒オフ、10分間を使用して、細胞懸濁液を超音波処理し、EppendorfHamburg,Germany5415R遠心分離機で4°C、30分間、13,000×gで遠心分離することにより得た。上清=CFEを新たなチューブに移し、直ぐに使用する場合には氷上に保存し、そうでなければ-20°Cに保存した。CFEのタンパク質濃度は、全般の部に記載のようにBradfordに準拠した改変方法を使用して測定した。[実施例4-RS-α-メチルベンジルアミンのラセミ分割]E.コリE.coliで異種性に発現されたトランスアミナーゼXP_001209325およびEDH25885を含む無細胞抽出物CFEを、R-トランスアミナーゼ活性について試験し、E.コリE.coliで異種性に発現された、ストレプトミセスアベルミチリスStreptomycesavelmitilis由来のL-スレオニンアルドラーゼLTA_SAV、受託番号Q82N15陰性対照としてならびにR-トランスアミナーゼABN35871米国特許第7169592号明細書の配列2およびAAN21261欧州特許第987332号明細書の配列1を含有するCFEと、RS-α-メチルベンジルアミンのラセミ分割に関して比較した。全反応容量0.25mlにおいて、CFE0.1mlを、0.1mMPLP含有100mMKPi緩衝液中の80mMRS-α-メチルベンジルアミンMBA、40mMピルピン酸ナトリウムと混合し、28°Cで20時間インキュベートした。停止試薬0.1v/vギ酸を含有するH20中の50v/vアセトニトリル0.9mlを反応容量0.1mlに添加して反応を停止し、全般の部に記載のように、キラル相上でHPLCにより分析した。HPLC分析の結果を表5に示す。これらの結果は、XP_001209325が、S-α-ΜΒΑではなく、R-α-MBAをすべて選択的に変換したので、極めて効率的かつ選択的なR-トランスアミナーゼであることを示す。ABN35871またはAAN21261のような他のR-トランスアミナーゼもまた選択的であったが、その生成効率は明確に低く、RS-α-MBAのラセミ分割において低いe.e.が得られた。EDH25885もRS-α-MBAに対するR-選択的トランスアミナーゼ活性が低いことを示した。[実施例5-鏡像異性的に濃縮されたR-アミンの合成]100mMリン酸カリウムKPpH7.5で緩衝化された最終容量0.25μlにおいて、等モル量の70mMアミノドナーおよび70mMケトン基質を、CFE0.1mlのトランスアミナーゼの存在下、28°Cで24時間反応させた。トランスアミナーゼXP_001209325、AAN21261、およびABN35871をそれぞれ含むCFEを、4-フェニル-2-ブチルアミンおよびアセトフェノンを生成するベンジルアセトンおよびα-メチルベンジルアミン;α-エチルベンジルアミンおよびアセトフェノンを生成するプロピオフェノンおよびα-メチルベンジルアミン;1-アミノインダンおよびアセトフェノンを生成する1-インダノンおよびα-メチルベンジルアミン;1-アミノテトラリンおよびアセトフェノンを生成する1-テトラロンおよびα-メチルベンジルアミン;2-アミノテトラリンおよびアセトフェノンを生成する2-テトラロンおよびα-メチルベンジルアミン;2-アミノブタンおよびアセトフェノンを生成するブタノンおよびα-メチルベンジルアミン;3,3-ジメチル-2-アミノブタンおよびアセトフェノンを生成する3,3-ジメチル-2-ブタノンおよびα-メチルベンジルアミンのそれぞれと共にインキュベートした。停止試薬0.1v/vギ酸を含有するH2O中の50v/vアセトニトリル0.75mlを反応容量0.25mlに添加して反応を停止した。生成物濃度および鏡像異性過剰を、全般の部に記載のように、HPLCにより分析した。HPLC分析の結果を表6に示す。さらに、トランスアミナーゼYP_955297を含むCFEを、α-エチルベンジルアミンおよびアセトフェノンを生成するプロピオフェノンおよびα-メチルベンジルアミンと共にインキュベートした。停止試薬0.1v/vギ酸を含有するH2O中の50v/vアセトニトリル0.75mlを反応容量0.25mlに添加して反応を停止した。生成物濃度および鏡像異性過剰を、全般の部に記載のように、HPLCにより分析した。28°Cで24時間のインキュベーション後、0.87mmol/lのR-α-エチルベンジルアミンが、99のe.eを伴って得られた。上記の結果は、トランスアミナーゼXP_001209325およびYP_955297が高度に選択的なR-トランスアミナーゼであることを示す。さらに、XP_001209325は、トランスアミナーゼAAN21261およびABN35871とは異なる基質スペクトルを有することが明確になる。すなわち、4-フェニル-2-ブチルアミンは、XP_001209325により顕著な濃度で形成されたが、トランスアミナーゼAAN21261およびABN35871によっては形成されなかった表6。さらに、XP_001209325は、2-ブタノンから鏡像異性的に濃縮されたR-2-アミノブタンを生成したが、ABN35871は、鏡像異性的に濃縮されたS-2-アミノブタンを導いた表6。[実施例6-キラルα-メチルベンジルアミンに対するR-トランスアミナーゼの選択性]R-トランスアミナーゼの鏡像異性選択性を検討するために、α-メチルベンジルアミンMBAの純粋な鏡像異性体形態の変換に関し試験した。実施例3で調製されたトランスアミナーゼを含有する無細胞抽出物について、R-MBAおよびS-MBAそれぞれに対する活性を、ケトン基質としてピルベートを用い、サーモスタット付きPerkinElmerLambda35UV/VIS分光光度計において、波長300nm、30°Cで分光光度法にて個別に試験した。最終反応容量を1mlとして、適切に希釈された、トランスアミナーゼを含有するCFE50μlを、0.1mMPLP含有50mMKP緩衝液pH7.5の存在下で、12.5mMR-またはS-MBAおよび5mMピルビン酸ナトリウムと、使い捨てプラスチックUVまたは石英キュベット中で混合した。光度計中で30°C、5分間プレインキュベートされた他のアッセイ成分に、0.5Mピルピン酸ナトリウム50mMKP緩衝液pH7.5、0.1mMPLP中10μlを添加して反応を開始した。ピルピン酸ナトリウムの添加後、300nmの吸収を記録し、アセトフェノンのモル吸光係数ε=0.28cm2/μmolを使用して、ランバート-ベールの法則に従って試料CFE中のトランスアミナーゼ活性を計算した。トランスアミナーゼ活性の1単位Uは、0.1mMPLP含有50mMKP緩衝液pH7.5中で、12.5mMR-MBAまたはS-MBAおよび5mMピルピン酸ナトリウムから、30°Cで1分間にアセトフェノン1μmolを形成するものとして定義される。一般手順に従って、CFEのトランスアミナーゼ比活性U/mg総CFEタンパク質は、容積活性値U/mlCFEを測定された総タンパク質濃度で割ることにより計算した。S-MBA対するR-MBAのトランスアミナーゼ比活性比が、トランスアミナーゼ鏡像異性選択性値TEVとして定義される。R-選択的トランスアミナーゼとは、TEV値が1を超えるトランスアミナーゼとして定義される。良好なR-選択性とは、S-MBAに対するR-MBAの比活性比であるTEVが5以上であるとして定義される。高度なR-選択性とは、S-MBAに対するR-MBAの比活性比であるTEVが10以上であるとして定義される。これらの実験で測定された、R-およびS-MBAに対する、CFE中のトランスアミナーゼの比活性およびTEVを表7に示す。この実験から明らかになるように、トランスアミナーゼABN35871およびAAN21261と同様に、トランスアミナーゼXP_001209325、XP_002564064、YP_761201、YP_955297、NP_085750、EBP64591、およびEDI73966は、R-選択的トランスアミナーゼである。トランスアミナーゼYP_955297およびNP_085750は、TEVが5を超える良好なR-選択性を示し、一方、XP_001209325およびXP_002564064は、TEVが10を超える高度なR-選択性さえも示した。[実施例7-プールされた寄託物からの微生物の再単離]全般の部および実施例1に記載のように、プールされた寄託物からの個々の微生物の再単離は、6種のR-アミンの1つを唯一の窒素源として含有する選択増菌培地SEM寒天プレート上に、1:1000、1:10,000、およびさらなる希釈のプールされた寄託物を播種することにより達成される。初めにその上で培養物が増菌された、それぞれのR-アミンを含有するSEM寒天プレート上に再画線を反復することにより、純粋な培養物が得られる。均一形態のコロニーのみが得られるまで、それぞれのR-アミンを含有する選択的増菌培地上への再画線を反復して実施する。続いて、16SリボソームRNAまたはD2-LSUリボソームRNAの配列決定を、検証済みのMicroSEQ登録商標AppliedBiosystems,Carlsbad,CA,USAシステムを使用して実施し、個々の微生物を再同定する。[実施例8-フェノキシアセトンの酵素的アミノ基転移]実施例3および実施例6のように生成およびアッセイされた、E.コリE.coliで異種性に発現されたR-トランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1]2U/mlを含む無細胞抽出物を、0.1Mのケトン基質であるフェノシキアセトンならびに0.5Mのアミノドナーであるイソプロピルアミン、RS-2-ブチルアミン事実上、0.25MR-2-ブチルアミン、およびRS-α-メチルベンジルアミン事実上、0.25MR-MBAのそれぞれと、0.1mMPLP含有50mMKPi緩衝液pH7.5中で、30°C、24時間インキュベートした。形成された1-フェノキシ-2-プロピルアミンの量をHPLC分析により測定した。HPLCの条件は以下の通りであった。反応混合物50μlを、アセトニトリル/水と0.01v/vギ酸との50:50混合物950μlに加え、13,000rpmで5分間遠心分離した。HPLCの条件:カラム:PurospherStarRPC18250×4.0,5μm溶出液A:0.01ギ酸水溶液溶出液B:アセトニトリル流速:0.8ml/分カラム温度:30°C注入容量:4μl検出:UV210nmまたは254nmこれらの実験結果を表8に示す。アキラル性のアミノドナーであるイソプロピルアミンの0.5Mに対して、R-2-ブチルアミンおよびR-MBAの有効濃度が0.25Mであるので、2-ブチルアミンおよびMBAは、R-選択的トランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1]にとって、イソプロピルアミンよりも事実上良好なアミノドナーである。したがって、アミノドナーのイソプロピルアミンに比較して低いアミノドナー濃度で、同等または良好でさえある変換が、アミノドナーの2-ブチルアミンおよびMBAそれぞれについて得られる。1.0重量の高い生成物濃度も得られたアミノドナーとして2-ブチルアミンを用いて。[実施例9-第2の有機溶媒相の存在下でのベンジルアセトンのアミノ基転移]実施例3および実施例6のように生成およびアッセイされた、E.コリE.coliで異種性に発現されたR-トランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1]2U/mlを含む無細胞抽出物を、0.1Mのケトン基質であるベンジルアセトンおよび0.25MのアミノドナーであるRS-α-メチルベンジルアミンと、0.5mMPLP含有50mMKPi緩衝液pH7.5中で、30°C、24時間インキュベートした。反応は、15v/vの非水混和性有機溶媒シクロヘキサンの存在下および非存在下で実施した。形成された4-フェニル-2-プロピルアミンの量および反応の鏡像異性過剰e.e.は、実施例8に記載のように、HPLC分析により測定した。鏡像異性過剰の測定は、キラル固定相上でHPLC分析により以下のように実施した。反応混合物20μlを、Marfey試薬溶液アセトン中の1w/vN-α-[2,4-ジニトロフェニル5-フルオロフェニル]-L-アラニンアミド50μlおよびNaHCO3の飽和溶液10μlと混合した。この混合物を40°Cで1時間インキュベートした後、2NHClを10μlおよびアセトニトリルを920μl加え、その試料を5分間遠心分離した後注入した。HPLCの条件:カラム:PurospherStarRPC18250×4.0,5μm溶出液A:0.01ギ酸水溶液溶出液B:アセトニトリル流速:1ml/分カラム温度:30°C注入容量:2μl検出:UV338.1nm均一濃度50/50溶出液A/溶出液Bこれらの実験結果を表9に示す。これらの結果は、R-選択的トランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1]が、非水混和性有機溶媒シクロヘキサンの存在に十分耐性であること、およびその存在が、酵素反応の鏡像異性選択性に影響を与えないことを示す。実施例10-増菌された微生物のゲノムに由来する組換えR-トランスアミナーゼ]R-選択的トランスアミナーゼ活性に対する選択培地上で増菌された6株実施例1および2、すなわち、ラーネラアクアティリスRahnellaaquatilis3Kb、ミクロバクテリウムゲンセンギソリMicrobacteriumginsengisoli1A1DSM23784、シノリゾビウムモレレンスSinorhizobiummorelense3H1DSM23794、クルトバクテリウムプシルムCurtobacteriumpusillum5BaBDSM23787、マイコバクテリウムフレデリクスバーゲンスMycobacteriumfrederiksbergense1laDSM23798、およびアクロモバクタースパニウスAchromobacterspanius6lDSM23791から、ゲノムDNAを、製造業者のマニュアルに従い、Easy-DNAキットInvitrogenを用いて単離し、最終的にTE緩衝液で溶出した。DNAの品質は、測光法ならびにBsp143lまたはBamHIFermentas,St.Leon-Rotによる消化とその後のアガロースゲル電気泳動により確認した。ラーネラアクアティリスRahnellaaquatilis3Kb、ミクロバクテリウムゲンセンギソリMicrobacteriumginsengisoli1A1DSM23784、クルトバクテリウムプシルムCurtobacteriumpusillum5BaBDSM23787、アクロモバクタースパニウスAchromobacterspanius6IDSM23791およびミクロバクテリウムゲンセンギソリMicrobacteriumginsengisoli1A1DSM23784から、このようにして単離されたゲノムDNA試料を使用してゲノムの配列決定を行った。これらのゲノム配列をサーバーにアップロードし、公知のR-トランスアミナーゼ配列である配列番号1に対して、またゲノムの1つで見出されたヒットに対してBLAST検索を実施した。種々の類似度を有するいくつかのヒットが同定され、その後のpMS470Δ8Balzeretal,NucleicAcidsResearch,1992,208:1851-1858へのNdel/HindlllクローニングおよびE.コリE.coliでの発現のために選択された。遺伝子のうちの3つはPCRにより増幅することができず、1つは天然配列中にNdelおよびHindlllを含有していたため、Asp-TA1、Cpu-TA1、Cpu-TA3、Raq-TA2、およびMgi-TA1について、E.コリE.coliにおける発現のために最適化されたコドンをGeneart/lifetechnologiesRegensburg,Germanyに注文した。6つの標的遺伝子を、25°Co/nにて0.5mMIPTGで誘導した後、アンピシリン100μg/ml添加のLB培地中のE.コリE.coliTOP10F’で発現させた。対照として、トランスアミナーゼ遺伝子を挿入していないpMS470ベクターを含有するE.コリE.coliTOP10F’培養物を使用した。細胞を採取し、0.1mMPLP含有50mMKPi緩衝液pH7.5中で超音波処理により溶解し、遠心分離した。溶解物をVivaSpin濃縮器Sartorius,Vienna,Austriaを使用して濃縮した。溶解物のタンパク質濃度は、Bradfordタンパク質アッセイにより測定した。すべての溶解物について、ドナー微生物がその上で増菌した対応するかさ高いアミンをドナーとしてかつピルベートをアクセプターとして使用して、転移反応を試験した。ピルビン酸10mMより5倍過剰量のラセミまたは高光学純度のアミン50mMを、0.1mMPLP含有50mMKPi緩衝液pH7.5中で30°C、24時間反応させた。Mgi-TA1についての反応では、10mMピルビン酸および10mMアミノドナーMBAまたは1-アミノテトラリンをそれぞれ、0.1mMPLP含有50mMKPi緩衝液pH7.5中で30°C、19時間反応させた。対応するケトンの形成は、実施例8および9に記載のように、HPLCで検出した。新しいトランスアミナーゼの選択性は、L-またはD-アラニンの形成およびそれぞれのアミンの異なる鏡像異性体の反応性により決定される。新しいトランスアミナーゼCpu-TA1[配列番号30]、Cpu-TA2[配列番号33]、Cpu-TA3[配列番号35]、Raq-TA2[配列番号38]、Raq-TA3[配列番号40]、Asp-TA1[配列番号43]、およびMgi-TA1[配列番号46]は、R-選択性を示した表11。Cpu-TA2はまた、アミノドナーとしてMBAおよびアラニン、アクセプターケトンとしてフェノキシアセトンおよびアセトフェノンをそれぞれ用いて試験した。これらの2つの反応のアミン生成物はそれぞれ、鏡像異性的に濃縮されたR-1-フェノキシ-2-プロピルアミンおよびR-MBAであった表11。これらの結果は、新しいトランスアミナーゼCpu-TA1[配列番号30]、Cpu-TA2[配列番号33]、Cpu-TA3[配列番号35]、Raq-TA2[配列番号38]、Raq-TA3[配列番号40]、Asp-TA1[配列番号43]、およびMgi-TA1[配列番号46]は、実際、R-選択性であることを示す。[実施例11-非水混和性有機溶媒の存在下における、ベンジルアセトンおよびR-α-メチルベンジルアミンからの4-フェニル-2-プロピルアミンの合成]実施例3および実施例6のように生成およびアッセイされた、E.コリE.coliで異種性に発現されたR-トランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1]を含む無細胞抽出物を、0.08MのアミノドナーR-α-メチルベンジルアミンMBAおよび1.5倍過剰量のケトン基質ベンジルアセトン0.12Mと、0.1mMPLP含有50mMKPi緩衝液pH7.5中で、28°C、20時間インキュベートした。反応は、10v/vの非水混和性有機溶媒シクロヘキサンの存在下および非存在下で実施した。形成された4-フェノキシ-2-プロピルアミンの量を、全般の部で記載のように、HPLC分析により測定した。シクロヘキサノンが無添加の場合、アミノドナーとしてR-MBAを用いて、ベンジルアセトンから42.8mMの4-フェニル-2-プロピルアミンが形成されたが、10v/vシクロヘキサノンの場合は、さらに高い濃度である44.3mMの4-フェニル-2-プロピルアミンが形成された。[実施例12-R-α-メチルベンジルアミンからのR-sec-ブチルアミンの酵素的合成]トランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1]、XP_002564064[配列番号3]、EEU44019[配列番号5]、XP_001402221[配列番号7]、YP_761201[配列番号9]、YP_838940[配列番号11]、YP_955297[配列番号13]、EDI73966[配列番号15]、NP_085750[配列番号17]、EDH25885[配列番号19]、EBP64591[配列番号21]、およびECU93014[配列番号23]、ならびにABN35871およびAAN21261を、実施例3に記載のように生成した。異種性に発現されたトランスアミナーゼを含有する無細胞抽出物を、25mMブタノンおよび50mMR-α-メチルベンジルアミンと、全量1mlの0.1mMPLP含有100mMKPi緩衝液pH7.5中で28°C、24時間、400rpmで振盪させながら反応させた。20時間後、各反応の試料100μlを2-ヘキサノン溶液50μlおよびアセトニトリル850μlに添加して反応を停止し、3000×gで10分間遠心分離した。参照物質として市販のMBA、アセトフェノン、ブタノンおよびsec-ブチルアミンSigma-Aldrichを使用して、アミン用CpSil8カラム30mx0.25x0.5上でGC-FID検出により、試料を分析した。結果を表12にまとめてある。[実施例13-R-MBAおよび3,3-ジメチル-ブタノンからのR-3,3-ジメチル-2-ブチルアミンの酵素的合成]実施例3に記載のように生成された、異種性に発現されたトランスアミナーゼXP_001209325[配列番号1]、YP_955297[配列番号13]、ABN35871、およびAAN21261を含有する無細胞抽出物を、25mM3,3-ジメチル-ブタノンおよび50mMR-α-メチルベンジルアミンと、全量1mlの0.1mMPLP含有100mMKPi緩衝液pH7.5中で28°C、24時間、400rpmで振盪させながら反応させた。20時間後、各反応の試料100μlを2-ヘキサノン溶液50μlおよびアセトニトリル850μlに添加して反応を停止し、3000×gで10分間遠心分離した。参照物質として市販のMBA、アセトフェノン、ブタノンおよびsec-ブチルアミンSigma-Aldrichを使用して、アミン用CpSil8カラム30mx0.25x0.5上でGC-FID検出により、試料を分析した。結果を表13にまとめてある。"