"膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとしてのタンパク質ミオフェリン、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2、タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3、タンパク質アスポリン、タンパク質テネイシン、タンパク質ペリオスチン、タンパク質ガレクチン、タンパク質フィブロネクチン、タンパク質プロラルギン、タンパク質タンパク質-グルタミンγ-グルタミルトランスフェラーゼ2、タンパク質アグリン、タンパク質脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質1、タンパク質アネキシンA6、タンパク質ラミニンα2サブユニット、タンパク質ラミニンサブユニットα4、タンパク質ミメカン、タンパク質Ras関連タンパク質Rap-2b、タンパク質コラーゲンα1XIV鎖、タンパク質コラーゲンα3VI鎖、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質1、タンパク質V型プロトンATPアーゼ触媒サブユニットA、タンパク質ラミニンα4及びタンパク質膜貫通タンパク質62の1つ又は複数の使用。1つ又は複数のタンパク質ミオフェリン、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2、タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3、タンパク質アスポリン、タンパク質テネイシン、タンパク質ペリオスチン、タンパク質ガレクチン、タンパク質フィブロネクチン、タンパク質プロラルギン、タンパク質タンパク質-グルタミンγ-グルタミルトランスフェラーゼ2及びタンパク質アグリンが、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1に記載の使用。タンパク質ミオフェリンが、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1又は2に記載の使用。タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2が、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1又は2に記載の使用。タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3が、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1又は2に記載の使用。タンパク質アスポリンが、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1又は2に記載の使用。タンパク質テネイシンが、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1又は2に記載の使用。タンパク質ペリオスチンが、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1又は2に記載の使用。タンパク質ガレクチンが、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1又は2に記載の使用。タンパク質フィブロネクチンが、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1又は2に記載の使用。タンパク質プロラルギンが、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1又は2に記載の使用。タンパク質タンパク質-グルタミンγ-グルタミルトランスフェラーゼ2が、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1又は2に記載の使用。タンパク質アグリンが、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項1又は2に記載の使用。被験体の膵臓がんの状態を決定する方法であって、a被験体由来の物質のサンプルを準備する工程と、b前記サンプルにおける請求項1~13のいずれか一項に記載のバイオマーカーの1つ又は複数のレベルを決定する工程と、cbで決定されたレベルを同じ被験体又は異なる被験体による1つ又は複数の参照値と比較する工程と、を含む、方法。被験体における膵臓がんの診断、被験体が膵臓がんを起こす可能性の評価、膵臓がんが見られる被験体の予後についてのアドバイス、膵臓がんの疾患進行のモニタリング、及び膵臓がんの治療に対する有効性又は被験体の応答のモニタリングのいずれか1つ又は複数において用いられる、請求項14に記載の方法。前記サンプルが膵生検材料である、請求項14又は15に記載の方法。決定された前記バイオマーカーのレベルと比較される前記参照値が、1つ又は複数の正常サンプルにおいて観察される同じタンパク質のレベルである、請求項14~16のいずれか一項に記載の方法。前記参照値が、特定の被験体について得られた特定のバイオマーカーの以前の値である、請求項14~16のいずれか一項に記載の方法。前記バイオマーカーのレベルの上昇が、膵臓がんの指標となるか又は診断に役立つ、請求項14~18のいずれか一項に記載の方法。膵臓がんの進行のモニタリング及び/又は被験体に対して適用される治療の効果のモニタリングにおいて用いられる、請求項14~18のいずれか一項に記載の方法。膵臓がんの治療的治療及び/又は予防的治療において使用される、請求項1~13のいずれか一項に記載のバイオマーカーに指向性を有するリガンド。前記バイオマーカーの細胞外部分に指向性を有する、請求項21に記載のリガンド。前記バイオマーカーが、タンパク質ミオフェリン及びタンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3からなる群から選択される、請求項21又は22に記載のリガンド。前記バイオマーカーがタンパク質ミオフェリンである、請求項21又は22に記載のリガンド。被験体の膵臓がんの状態の決定において使用されるキットであって、被験体によって提供されるサンプルにおける請求項1~13のいずれか一項に記載のバイオマーカーのレベルを決定するための少なくとも1つの作用物質を含む、キット。前記バイオマーカーがタンパク質ミオフェリン、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2、タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3、タンパク質アスポリン、タンパク質テネイシン、タンパク質ペリオスチン、タンパク質ガレクチン、タンパク質フィブロネクチン、タンパク質プロラルギン、タンパク質タンパク質-グルタミンγ-グルタミルトランスフェラーゼ2及びタンパク質アグリンからなる群から選択される、請求項25に記載のキット。前記バイオマーカーが、タンパク質ミオフェリン及びタンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3からなる群から選択される、請求項25に記載のキット。前記バイオマーカーがタンパク質ミオフェリンである、請求項25に記載のキット。本発明の目的は、診断目的及び治療目的で有用かつ信頼性がある可能性が最も高いタンパク質を標的とする潜在的バイオマーカーを同定する方法を提供することである。本発明にとって興味深いバイオマーカーは接近可能accessibleなバイオマーカー、すなわち細胞外マトリックス中又は細胞外膜上に見られるバイオマーカーである。これらのタンパク質は、全身に送達される特定の作用物質、例えば放射標識するか又は薬理化合物と連結することができる抗体によって到達可能であるため、特に興味深い。有効なバイオマーカーの同定における主な制限は、バイオマーカーを回収する必要がある組織の希少性である。これは、ごく少量でしか分析に利用可能でないヒト病理組織、例えばがん病変に特に当てはまり、これらのサンプルを非常に貴重なものにしている。そのように限られた量の組織からの接近可能なタンパク質の分析を可能にする現在利用可能なプロテオミクス方法は、十分に改善の余地がある。この利用可能な技法は、主に対象のバイオマーカーの物理的位置を利用することによってこの問題に取り組むものでありCelisJEetalMolCellProteomics3327344、それほど化学的妥当性に焦点を置いてはいない。この目的で、ストレプトアビジン親和性クロマトグラフィーと併用した、接近可能なタンパク質をそれらの遊離アミン基を介して標識する化学的に修飾したビオチンの使用が有効な方法であることが実証されているCastronovoVetalProteomics711881196。しかしながら、かかる遊離アミン基を有しない接近可能なタンパク質は更なる研究から除外される。本発明の方法では、外膜に結合したタンパク質及び細胞外タンパク質の大半が糖タンパク質であるという事実が利用される。第1の態様によると、本発明は、乳がん又はその素因に対するバイオマーカーとしてのミオフェリン、CD276、マクロファージマンノース受容体2CD280、9回膜貫通型スーパーファミリーメンバー3EP70-P-iso、EMILIN1、脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質1、アグリン、コラーゲンα1XII鎖、ラミニンα5、ロイシンリッチリピート含有タンパク質15、ネクチン様タンパク質2、オルファクトメジン様1、イノシトールモノホスファターゼ3及びトランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3IHCの1つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、乳がん又はその素因に対するバイオマーカーとしての、脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質1、アグリン、コラーゲンα1XII鎖、マクロファージマンノース受容体2CD280及びネクチン様タンパク質2の使用を提供する。好ましくは、乳がん又はその素因に対するバイオマーカーとしての、アグリン、コラーゲンα1XII鎖、マクロファージマンノース受容体2CD280及びネクチン様タンパク質2の使用を提供する。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアグリン、ラミニンα5、ミオフェリン及びオルファクトメジン様1の1つ又は複数である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質1である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアグリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はCD276である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はコラーゲンα1XII鎖である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はラミニンα5である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はロイシンリッチリピート含有タンパク質15である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はマクロファージマンノース受容体2CD280である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はミオフェリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はネクチン様タンパク質2である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はオルファクトメジン様1である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は9回膜貫通型スーパーファミリーメンバー3EP70-P-isoである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はイノシトールモノホスファターゼ3である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はトランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3IHCである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はEMILIN1である。好ましくは、本発明は、乳がんの治療バイオマーカーとしての脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質1の使用を提供する。第2の態様によると、本発明は、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとしてのタンパク質ミオフェリンmyoferlin、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2、タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3、タンパク質アスポリン、タンパク質テネイシン、タンパク質ペリオスチン、タンパク質ガレクチン、タンパク質フィブロネクチン、タンパク質プロラルギン、タンパク質タンパク質-グルタミンγ-グルタミルトランスフェラーゼ2、タンパク質アグリン、タンパク質脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質1、タンパク質アネキシンA6、タンパク質ラミニンα2サブユニット、タンパク質ラミニンサブユニットα4、タンパク質ミメカン、タンパク質Ras関連タンパク質Rap-2b、タンパク質コラーゲンα1XIV鎖chain、タンパク質コラーゲンα3VI鎖chain、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質1、タンパク質V型プロトンATPアーゼ触媒サブユニットA、タンパク質ラミニンα4及びタンパク質膜貫通タンパク質62の1つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、本発明は、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとしての1つ又は複数のタンパク質ミオフェリン、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2、タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3、タンパク質アスポリン、タンパク質テネイシン、タンパク質ペリオスチン、タンパク質ガレクチン、タンパク質フィブロネクチン、タンパク質プロラルギン、タンパク質タンパク質-グルタミンγ-グルタミルトランスフェラーゼ2及びタンパク質アグリンの使用を提供する。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質ミオフェリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質アスポリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質テネイシンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質ペリオスチンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質ガレクチンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質フィブロネクチンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質プロラルギンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質タンパク質-グルタミンγ-グルタミルトランスフェラーゼ2である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質アグリンである。第3の態様によると、本発明は、結腸直腸癌CRC肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとしてのCD97、プロラルギン、Thy-1膜糖タンパク質、トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3IHC、成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質、ビグリカン、EPCAM、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2及びEMILIN2の1つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、本発明は、結腸直腸癌CRC肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとしてのトランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3IHC及びCD97の1つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はCD97、Thy-1膜糖タンパク質、トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3IHC、成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質、ビグリカン、EPCAM及びEMILIN2の1つ又は複数である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はCD97である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はThy-1膜糖タンパク質である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はトランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3IHCである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はプロラルギンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はビグリカンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はEPCAMである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質1である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はEMILIN2である。好ましくは、本発明は、結腸直腸癌CRC肝転移に対する治療バイオマーカーとしての潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2及びプロラルギンの1つ又は複数の使用を提供する。CRC肝転移への言及は、原発腫瘍が肝転移を生じる結腸直腸癌である症例に関する。第4の態様によると、本発明は、がん又はその素因に対するバイオマーカーとしての脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質1Uniprotアクセッション番号:Q8IUX7、アグリンUniprotアクセッション番号:O00468、CD276Uniprotアクセッション番号:Q5ZPR3、オルファクトメジン様1、ミオフェリンUniprotアクセッション番号:Q9NZM1、ラミニンα5Uniprotアクセッション番号:O15230、トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3Uniprotアクセッション番号:Q15582、ロイシンリッチリピート含有タンパク質15Uniprotアクセッション番号:Q8TF66、9回膜貫通型スーパーファミリーメンバー3EP70-P-isoUniprotアクセッション番号:Q9HD45、イノシトールモノホスファターゼ3Uniprotアクセッション番号:Q9NX62、EMILIN1Uniprotアクセッション番号:Q9Y6C2、コラーゲンα1XII鎖Uniprotアクセッション番号:Q99715、マクロファージマンノース受容体2CD280Uniprotアクセッション番号:Q9UBG0、ネクチン様タンパク質2Uniprotアクセッション番号:Q9BY67、アネキシンA6Uniprotアクセッション番号:P08133、ラミニンα4Uniprotアクセッション番号:Q16363、コラーゲンA1XIVUniprotアクセッション番号:Q05707、コラーゲンA3VIUniprotアクセッション番号:P12111、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質1Uniprotアクセッション番号:Q14766、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2Uniprotアクセッション番号:Q14767、アスポリンUniprotアクセッション番号:Q9BXN1、ラミニンα2Uniprotアクセッション番号:P24043、Ras関連タンパク質Rap-2bUniprotアクセッション番号:Q9Y3L5、V型プロトンATPアーゼ触媒サブユニットAUniprotアクセッション番号:P38606、タンパク質-グルタミンγ-グルタミルトランスフェラーゼ2Uniprotアクセッション番号:P21980、膜貫通タンパク質62Uniprotアクセッション番号:Q0P6H9、ミメカンUniprotアクセッション番号:P20774、プロラルギンUniprotアクセッション番号:P51888、ビグリカンUniprotアクセッション番号:p2181010、EPCAMUniprotアクセッション番号:P16422、CD97Uniprotアクセッション番号:P48960、Thy-1膜糖タンパク質Uniprotアクセッション番号:P04216及び成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質の1つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、本発明は、がん又はその素因に対するバイオマーカーとしてのオルファクトメジン様1、ミオフェリン、ロイシンリッチリピート含有タンパク質15、9回膜貫通型スーパーファミリーメンバー3EP70-P-iso、イノシトールモノホスファターゼ3、EMILIN1、アスポリン、Ras関連タンパク質Rap-2b、V型プロトンATPアーゼ触媒サブユニットA、膜貫通タンパク質62、ビグリカン、EPCAM、成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質及びEMILIN2の1つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質1である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアグリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はCD276である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はオルファクトメジン様1である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はミオフェリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はラミニンα5である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はトランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はロイシンリッチリピート含有タンパク質15である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は9回膜貫通型スーパーファミリーメンバー3EP70-P-isoである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はイノシトールモノホスファターゼ3である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はEMILIN1である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はEMILIN2である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はコラーゲンα1XII鎖である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はマクロファージマンノース受容体2CD280である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はネクチン様タンパク質2である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアネキシンA6である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はラミニンα4である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はコラーゲンA1XIVである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はコラーゲンA3VIである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質1である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアスポリンである。ラミニンα2.好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はRas関連タンパク質Rap-2bである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はV型プロトンATPアーゼ触媒サブユニットAである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質-グルタミンγ-グルタミルトランスフェラーゼ2である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は膜貫通タンパク質62である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はミメカンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はプロラルギンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はビグリカンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はEPCAMである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はCD97である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はThy-1膜糖タンパク質である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質である。本発明の第1、第2、第3及び第4の態様で言及されたタンパク質及び/又はペプチドは、本明細書中でバイオマーカー単数又は複数と称される。例えば、本発明の第1の態様で言及されたバイオマーカーへの言及は、本発明の第1の態様に挙げた全てのタンパク質に言及することを意図する。更に別の態様によると、本発明は、被験体の乳がんの状態を決定する方法であって、a被験体由来の物質のサンプルを準備する工程と、bサンプルにおける本発明の第1の態様で言及されたバイオマーカーの1つ又は複数のレベルを決定する工程と、cbで決定されたレベルを同じ被験体又は異なる被験体による1つ又は複数の参照値と比較する工程と、を含む、方法を提供する。更に別の態様によると、本発明は、被験体の膵臓がんの状態を決定する方法であって、a被験体由来の物質のサンプルを準備する工程と、bサンプルにおける本発明の第2の態様で言及されたバイオマーカーの1つ又は複数のレベルを決定する工程と、cbで決定されたレベルを同じ被験体又は異なる被験体による1つ又は複数の参照値と比較する工程と、を含む、方法を提供する。更に別の態様によると、本発明は、被験体のCRC肝転移の状態を決定する方法であって、a被験体由来の物質のサンプルを準備する工程と、bサンプルにおける本発明の第3の態様で言及されたバイオマーカーの1つ又は複数のレベルを決定する工程と、cbで決定されたレベルを同じ被験体又は異なる被験体による1つ又は複数の参照値と比較する工程と、を含む、方法を提供する。更に別の態様によると、本発明は、被験体のがんの状態を決定する方法であって、a被験体由来の物質のサンプルを準備する工程と、bサンプルにおける本発明の第4の態様で言及されたバイオマーカーの1つ又は複数のレベルを決定する工程と、cbで決定されたレベルを同じ被験体又は異なる被験体による1つ又は複数の参照値と比較する工程と、を含む、方法を提供する。本発明の先の態様の工程aで言及されたサンプルは、被験体から得ることができる。好ましくは、サンプルを得る工程は本発明の方法の一部を形成しない。本発明のがん状態又は転移状態を決定する方法は、臨床症状の評価と併用することができる。がん状態又は転移状態という表現は、バイオマーカーが対象とする特定のがん又は転移、例えば乳がん、膵臓がん又はCRC肝転移の任意の識別可能な兆候を含む。例えば、がん状態としては、がんの有無、がんを発症する危険性、がんの病期、がんの進行例えば経時的ながんの進行又はがんの寛解及びがんの治療に対する有効性又は被験体の応答が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法は、例えば以下のいずれか1つ又は複数に用いることができる:被験体におけるがんの診断、被験体ががんを発症する可能性の評価、がんが見られる被験体の予後についてのアドバイス、疾患進行のモニタリング、及び治療に対する有効性又は被験体の応答のモニタリング。本発明のバイオマーカーは、診断バイオマーカー、予後バイオマーカー及び治療バイオマーカーの1つ又は複数として使用することができる。好ましい実施の形態では、治療バイオマーカーと明記されないバイオマーカーは、好ましくは診断バイオマーカー若しくは予後バイオマーカーの少なくとも一方、又はその両方である。好ましくは、この方法は、被験体によって提供される又は被験体から得られるサンプルにおける1つ又は複数のバイオマーカーのレベルの分析から、被験体におけるがんの診断を可能にする。本発明の方法は更に又は代替的に、バイオマーカーを標的とする療法を開発するために用いることができる。本明細書での治療バイオマーカーへの言及は、療法の標的として使用することのできるバイオマーカーに言及することを意図し、このバイオマーカーは、診断目的及び/又は予後診断目的で使用されるバイオマーカーに加えて又はその代わりに使用することができる。好ましくは、治療バイオマーカーは、薬物を送達するためにリガンドの標的とすることができるタンパク質を表す。例えば、治療バイオマーカーは抗体-薬物複合体によって認識されることができ、この場合、抗体は治療バイオマーカーを認識し、複合した薬物を送達する。被験体から得られるサンプル物質は全血、血清、血漿、尿、粘液又は組織を含み得る。好ましくは、サンプルは組織のサンプル、好ましくはがんの疑いがある組織のサンプル、例えば乳房組織、膵臓組織又は肝臓組織のサンプル、例えば生検サンプルである。好ましくは、サンプルにおけるバイオマーカーのレベルの決定は、バイオマーカーの公開配列に対して少なくとも65の配列同一性、より好ましくは少なくとも70、75、80、85、90、95又はそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドの検出を含む。タンパク質は、1つ又は複数のポリペプチドを含む生化学的化合物である。ポリペプチドは、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合によって結合したアミノ酸の単一の線状高分子鎖である。タンパク質は、体内及びそれに由来するサンプル中に複数の異なる形態で多数存在する。これらの形態は、翻訳前修飾及び翻訳後修飾の一方又は両方に起因し得る。サンプルにおけるタンパク質のレベルを検出又は決定する場合、タンパク質の異なる形態を区別する能力は、相違の性質及びタンパク質レベルを検出又は測定するために用いられる方法によって決まる。例えば、モノクローナル抗体を使用する免疫測定法によって、抗体の産生対象のエピトープを含有するタンパク質の全ての形態が検出され、異なる形態は識別されない。しかしながら、タンパク質上の異なるエピトープに対して指向性を有する2つの抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法によって、両方のエピトープを含有するタンパク質の形態と一方のみのエピトープを含有するタンパク質の形態とが識別される。本発明の方法では、バイオマーカータンパク質のレベルを決定するために用いられるアッセイ方法によって、好ましくは特定のバイオマーカータンパク質の全ての形態が検出される。好ましくは、バイオマーカータンパク質の少なくとも全ての生物学的に活性な形態が検出される。好ましくは、バイオマーカーの公開アミノ酸配列と少なくとも75以上、好ましくは少なくとも80、85、90又は95以上の配列同一性を有するバイオマーカータンパク質の全ての形態が本発明の方法において検出される。ポリペプチド/タンパク質/核酸の同一性を測定する方法は、当該技術分野で既知である。例えばUWGCGPackageは、同一性を計算するために使用する例えば、そのデフォルト設定で使用することができるBESTFITプログラムを提供しているDevereuxetalNucleicAcidsResearch12p387395。例えばAltschulSFJMolEvol36290300、AltschulSFetalJMolBiol21540310に記載のように、PILEUPアルゴリズム及びBLASTアルゴリズムを通常そのデフォルト設定で相同性又はラインアップ配列lineupsequencesを計算するために用いることもできる。BLAST分析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターhttpwwwncbinlmnihgovにより公的に入手可能である。サンプル中に存在するバイオマーカーのレベルは、酵素アッセイ、免疫測定法、分光測定、質量分析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型MALDI-TOF質量分析、顕微鏡検査、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、サザンブロット法、等電点電気泳動、SDS-PAGE、PCR、定量RT-PCR、ゲル電気泳動、タンパク質マイクロアレイ、DNAマイクロアレイ及び抗体マイクロアレイ、又はこれらの組合せを含む群のいずれかの使用を含み得る任意の好適なアッセイによって決定することができる。抗体を使用する場合、1つ又は複数の抗体が合成抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であってもよい。キメラ抗体は異なる動物に由来する部分を含む。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する1つ又は複数の相補性決定領域とヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域とを有する、非ヒト種に由来する抗体である。キメラ抗体及びヒト化抗体は、当該技術分野で既知の組換え法によって作製することができる。1つ又は複数の抗体は、放射性、蛍光性、化学発光性、色素、酵素若しくはヒスチジンのタグ若しくは標識、又は当該技術分野で既知の任意の他の好適な標識若しくはタグを含む群から選択されるタグ若しくは標識を含み得る。好ましくは、決定されたバイオマーカーのレベルを比較する参照値は、1つ又は複数の正常サンプルにおいて観察される同じタンパク質のレベルである。正常サンプルは、好ましくは試験される潜在的な病理/罹患組織に対応する正常/非罹患位置から採取された組織のサンプルを指す。対応する正常/非罹患組織は、疑わしい病理/罹患組織と同じ又は異なる個体から採取することができる。組織が同じ個体から採取される場合、組織は例えば薬物治療、放射線治療又は外科治療等の医療の間に採取することができる。代替的には、正常サンプルは疑わしい病理/罹患組織とは異なる組織である正常/非罹患組織のサンプルであってもよく、この場合も組織は同じ又は異なる個体から採取することができる。例えば、乳がんの疑いがある患者については、サンプルを疑わしいがんから採取することができ、正常サンプルを同じ又は異なる個体に由来する非罹患乳房組織から採取することができる。代替的には、参照値は特定の被験体について得られた以前の値であり得る。この種の参照値は、この方法ががんの進行をモニタリングするか、又は特定の治療に対する被験体の応答をモニタリングするために用いられる場合に使用することができる。決定されたバイオマーカーのレベルを参照値と比較する場合、バイオマーカーのレベルの上昇又は低下は被験体のがん状態の指標となり得る。より具体的には、バイオマーカーのレベルの上昇は、がんの指標となるか又は診断に役立つ場合がある。代替的には、同じ個体において以前に測定されたレベルと比較したバイオマーカーのレベルの低下は、特定の療法が効果的であったか、又は効果的であることの指標となり得る。本発明の方法は、がん進行をモニタリングする及び/又は被験体に対して適用される治療の効果をモニタリングするために用いることもできる。これは、初期診断後の様々な時点で被験体から採取されたサンプルを分析し、バイオマーカーのレベルの変化をモニタリングし、これらのレベルを正常値及び/又は参照値と比較することによって達成することができる。この場合、参照レベルは被験体におけるバイオマーカーの初期レベル、若しくは最後に試験した時点での被験体におけるバイオマーカーのレベル、又はその両方を含み得る。好ましくは、本発明の方法はinvitroで行われる。被験体は哺乳動物とすることができ、好ましくはヒトであるが、代替的にサル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ウサギ又は齧歯類であってもよい。更なる態様によると、本発明は、療法の適用後の患者における有益な応答の有無を検出する方法であって、a患者に由来する生体サンプルを準備することと、bサンプルにおけるバイオマーカーの発現レベルを測定することと、cbにおけるレベルをバイオマーカーのレベルの対照値と比較することと、dサンプルと対照との間のレベルの相違が患者における有益な応答を反映しているか否かを決定することと、を含み、バイオマーカーが本発明の第1、第2、第3又は第4の態様において特定されたものから選択される、方法を提供する。本発明のこの態様では、患者は乳がん、膵臓がん、CRC肝転移又は任意の他のがんの1つ又は複数を患っている場合がある。本発明のこの方法は、特定の治療剤が特定の病態の治療に有効であるか否かを決定することを可能にし得る。好ましくは、対照値は、特定の療法の適用の前又は適用期間中の患者における特定のバイオマーカーのレベルである。好ましくは、bにおけるレベルが対照値よりも低い場合、これは適用される療法が有効であることの指標となる。本発明の全ての態様において、サンプルを準備する工程は、好ましくはサンプルを個体/患者/被験体から得る/採取する工程を含まない。本発明の別の態様によると、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び/又は予防的治療用の薬剤の製造のための、本発明によるバイオマーカーに指向性を有するリガンド、好ましくは高親和性リガンドの使用が提供される。好ましくは、薬剤は特定のリガンド、好ましくは抗体又は抗体-薬物複合体の使用に基づく。本発明との関連で、リガンドという用語は抗体、抗体フラグメント、薬物、プロドラッグ、リガンド、ビオチン、並びにそれらの誘導体及び複合体、好ましくは抗体又は抗体フラグメントと薬物又はプロドラッグとの複合体に関する。好ましくは、リガンドはバイオマーカーの細胞外ドメインに指向性を有する。バイオマーカーの細胞外ドメインとは、がん細胞の外側に位置するバイオマーカーのドメインを意味する。例えば、バイオマーカーの細胞外ドメインは、バイオマーカーの一部又は全体を表し得る。一部とは、バイオマーカーの全体の1、2、3、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98若しくは99、又はその端数を意味する。更なる態様によると、本発明は、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び/又は予防的治療において使用される、本発明によるバイオマーカーに指向性を有するリガンド、好ましくは高親和性リガンドを提供する。好ましくは、リガンドは抗体又は抗体-薬物複合体である。本発明のまた更なる態様によると、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び/又は予防的治療の方法であって、本発明によるバイオマーカーに指向性を有する治療的又は予防的に効果的な量のリガンド、好ましくは高親和性リガンドを投与することを含む、方法が提供される。好ましくは、リガンドは抗体又は抗体-薬物複合体である。本発明の別の態様によると、被験体のがん状態又は転移状態の決定において使用されるキットであって、被験体によって提供されるサンプルにおける本発明による1つ又は複数のバイオマーカーのレベルを決定するための少なくとも1つの作用物質を含む、キットが提供される。作用物質は酵素、核酸、タンパク質プローブ、代謝産物、抗体等のリガンド、又は任意の他の好適な組成物であり得る。キットは、レベルを決定するバイオマーカーを捕捉するための1つ又は複数の捕捉剤を含んでいてもよい。捕捉剤は1つ又は複数の抗体であり得る。キットは、ラベル又は折込みの形態の好適な操作パラメータに関する説明書を含んでいてもよい。説明書は、消費者にサンプルを収集する方法及び/又は捕捉剤を洗浄する方法についての情報を与えるものであり得る。更なる態様によると、本発明は、個体におけるがん状態を評価する手段としての本発明による1つ又は複数のバイオマーカーのレベルの決定の使用を提供する。別の態様によると、本発明は、被験体においてがんを治療する方法であって、被験体における本発明によるバイオマーカーのレベルを調節することが可能な作用物質を被験体に投与することを含む、方法を提供する。作用物質は転写レベル、翻訳レベル及び/又は翻訳後レベルで作用し得る。更なる態様によると、本発明は、がんを治療するための化合物を同定する方法であって、本発明による1つ又は複数のバイオマーカーのレベルを調節する1つ又は複数の化合物をスクリーニングすることを含む、方法を提供する。本発明の別の態様によると、サンプル中の接近可能なタンパク質を分析するinvitro方法であって、サンプルを準備することと、サンプル中の接近可能なタンパク質を標識試薬で標識することと、サンプルから標識試薬で標識されたタンパク質を単離し回収することと、サンプル中の残りの非標識タンパク質を消化することと、消化されたサンプルから糖ペプチドを単離し回収することと、標識されたタンパク質又は糖ペプチドの単離の際に回収されなかった非グリコシル化ペプチドを回収することと、回収されたタンパク質/ペプチドを分析することと、を含む、invitro方法が提供される。驚くべきことに、本発明の方法における工程の組合せは、工程のいずれかを単独で実行する場合と比較して、サンプルから接近可能なタンパク質が同定される可能性を顕著に増大させる。本発明の方法は、病理/罹患組織サンプル、例えば組織生検材料から接近可能なバイオマーカーを同定する改善された方法を提供する。接近可能なバイオマーカー/タンパク質は、膜結合タンパク質又は細胞外空間/マトリックスに分泌されるタンパク質であり得る。好ましくは、接近可能なタンパク質は、全身に送達される作用物質、例えば全身に送達される抗体によって到達することができる。好ましくは、これは接近可能なタンパク質が他のタンパク質よりも間質液に曝されているために達成される。本発明の方法は好ましくは、接近可能なタンパク質のみを考慮に入れたまま、貴重なサンプル、例えば生検材料において同定されるバイオマーカーの数を最大にすることを可能にする。接近可能なタンパク質を分析することにより、この方法によって疾患の診断、疾患の予後診断、疾患進行のモニタリング、治療の効果のモニタリングの1つ又は複数を含む多数の目的、及びバイオマーカーを発現する細胞又は組織に対する潜在的療法の標的化に使用することのできるバイオマーカーを同定することが可能となる。潜在的療法の例としては、特定のバイオマーカーを標的とすることができる抗体、抗体フラグメント、薬物、プロドラッグ又は他のリガンドが挙げられる。好ましくは、本発明の方法は、組織サンプル又は細胞サンプル中の細胞外空間から接近可能な、特定の疾患に対するバイオマーカーをスクリーニング/同定するために用いることができる。本発明の方法は、好ましくは使用する材料の量を最小にすることを可能にし、希少な生検組織の定量分析に好適である。この方法は、貴重なサンプルから同定される有益なバイオマーカーの数を、これらのタンパク質の品質を維持しながら最大にすることを可能にし、それにより潜在的に接近可能な、したがって関連性のあるバイオマーカーを同定することを可能とし得る。標識試薬は、特徴的な官能基によってタンパク質を標識することが可能な任意の試薬であり得る。これにより標識試薬は標識されたタンパク質の濃縮を可能にする。好適な標識試薬の例は、サンプル中のタンパク質/ペプチドの第一級アミンを標識するために使用することのできる反応性ビオチン、好ましくはビオチン反応性エステル誘導体である。本発明の方法では、サンプルは好ましくは細胞が実質的に無傷であり、実質的に無傷な膜を有する組織サンプルであるため、標識試薬を添加しても試薬が細胞に浸透することができず、したがって実質的に細胞外タンパク質又は膜結合タンパク質のみが標識される。ビオチンを標識試薬として使用する場合、アビジンに対するビオチンの高い親和性をビオチン標識タンパク質を単離し回収するために利用することができる。接近可能なタンパク質を標識するための他の好適な試薬としては、タンパク質又はペプチドの糖部分に結合する試薬、及び糖部分又は第一級アミンと反応する官能基が結合した磁性ビーズが挙げられる。本発明の方法は、グリコシル化ペプチドを回収することによって接近可能なタンパク質を濃縮することを更に含む。グリコシル化ペプチドは膜結合性又は分泌性であることが多く、したがって接近可能である。グリコシル化とは、本明細書中では糖類基が結合したタンパク質又はペプチドに言及するために使用される。糖タンパク質/糖ペプチドという用語は、本明細書中ではグリコシル化タンパク質/グリコシル化ペプチドと区別なく使用され、同じ意味を有することが意図される。サンプルは細胞サンプル又は組織サンプルであり得る。好ましくは、サンプルは組織サンプルである。組織サンプルは病理組織サンプルであり得る、すなわち罹患組織に由来し得る。代替的には、組織サンプルは正常な非罹患組織のサンプルであり得る。組織サンプルが病理組織サンプルである場合、組織は腫瘍組織、炎症組織、アテロームatheromatatic組織、及び変性疾患、代謝性疾患又は遺伝性疾患によって生じる組織から選択することができる。好ましくは、サンプルは組織生検材料である。本明細書中の正常/非罹患組織への言及は、同じ個体又は異なる個体に由来する病理/罹患組織に対応する正常/非罹患組織を指す。この正常及び病理の2つの組織サンプルは、同じ若しくは異なる個体の同じ位置から採取されても例えばどちらも肝臓である、若しくはどちらも乳房である、又は異なる位置から採取されてもよい。例えば、病理組織が乳房組織であり、正常組織が同じ個体に由来する非罹患乳房組織のサンプル、又は異なる個体に由来する非罹患乳房組織のサンプル、又は同じ若しくは異なる個体に由来する異なる組織のサンプルであり得る。好ましくは、正常/非罹患組織は病理/罹患組織と同じタイプの組織のサンプルである。バイオマーカーという用語は、本明細書中では本発明の方法に関連して、病理組織におけるその発現レベルが病理組織を正常組織から識別することを可能にする任意のタンパク質又はペプチド修飾、例えばグリコシル化されていてもよいに言及するために使用される。好ましくは、サンプル中のタンパク質は、標識試薬を含む溶液にサンプルを浸漬することによって標識試薬で標識される。好ましくは、浸漬によって接近可能なタンパク質が標識試薬で標識される。ビオチン誘導体等の標識試薬は、タンパク質中の接近可能な第一級アミンと共有結合することが可能であることが好ましい。これにより接近可能な第一級アミンを有するタンパク質のみが標識される。好ましくは、接近可能なタンパク質を標識するために、サンプルを反応性ビオチンエステル誘導体の溶液に浸漬する。標識試薬を含有する溶液に浸漬されるサンプルは、好ましくは接近可能なタンパク質のみが標識され、接近可能でないタンパク質が標識されていないか又は基本的に標識されていない天然サンプルである。天然サンプルとは、標識試薬を含有する溶液への浸漬前にサンプルが変性又は固定されていないことを意味する。好ましくは、標識試薬を含有する溶液へのサンプルの浸漬の際に、接近可能なタンパク質の多くが標識試薬で標識される。しかしながら、全てのタンパク質を標識することが可能ではないため、更なるタンパク質/ペプチド回収工程を本発明の方法に追加し、同定されるバイオマーカーを最大限にする。標識工程の後、サンプルを好ましくは可溶化工程に供するが、ここでは可溶性画分のみを保管しておき、方法の残りの部分で使用する。好ましくは、不溶性画分は捨てられる。タンパク質をビオチン又はビオチン誘導体で標識した場合、標識されたタンパク質はストレプトアビジン、好ましくはストレプトアビジンビーズを用いて回収することができる。ビオチン化タンパク質/ペプチドは、ビオチンとストレプトアビジンとの間の極めて特異的な相互作用のために容易に精製される。強力な洗剤を含有する溶解バッファーの存在下であっても、この相互作用は強力であるため、精製時の非特異的結合が最小限に抑えられる。ビオチン化タンパク質はDTTを用いてストレプトアビジンビーズから溶出させることができる。次いで、溶出したタンパク質を例えばトリプシンで消化して、質量分析による分析のためのペプチドフラグメントを得ることができる。好ましくは、非標識タンパク質を任意のプロテイナーゼトリプシン等を用いて消化し、より短いペプチドを生成した後にグリコシル化ペプチドを回収する。残りのタンパク質/ペプチド中の糖タンパク質/糖ペプチド、好ましくは糖ペプチドは、初めにタンパク質/ペプチドの糖部分を酸化することによって単離することができる。糖部分は過ヨウ素酸塩溶液を用いて酸化することができ、次いで酸化された糖部分を有する任意のタンパク質/ペプチドを、例えばヒドラジド樹脂を用いて単離する。結合したタンパク質/ペプチドは、PNGアーゼFを用いてヒドラジドから放出させることができる。糖タンパク質/糖ペプチドを単離する他の方法が既知であり、本発明の方法に使用することができる。次いで、残りの非標識及び非グリコシル化タンパク質/ペプチド、好ましくはペプチドを回収し、同様に例えば質量分析によって分析する。好ましくは、残りの非標識及び非グリコシル化ペプチドは、グリコシル化タンパク質/ペプチドを回収するために用いられる方法のフロースルー画分で回収される。好ましくは、回収されたタンパク質/ペプチドを分析して、それらの配列、したがってそれらが由来するタンパク質の同一性を決定する。回収されたタンパク質/ペプチドは質量分析によって分析することができる。好ましくは、質量分析によってタンパク質/ペプチドに関する配列情報が得られ、これを次いでタンパク質/ペプチド配列データベースと比較して、タンパク質/ペプチドを同定することができる。好ましくは、質量分析を用いる場合、質量分析はタンデム質量分析によるシークエンシングを含む。好ましくは、回収された非グリコシル化ペプチドの分析によって、グリコシル化ペプチドのみの分析では確信を持って特定のタンパク質に割り当てることができないグリコシル化ペプチド本発明の方法の先の工程で回収されるの同定が可能となる。より具体的には、グリコシル化タンパク質中に見られる非グリコシル化ペプチドの同定によって、単離されたグリコシル化ペプチドを、より確信を持って特定のグリコシル化タンパク質に割り当てることが可能となり得る。非グリコシル化ペプチドの分析は、接近可能な非グリコシル化タンパク質を同定することも可能にし得る。好ましくは、グリコシル化ペプチド及び非グリコシル化ペプチドを全て質量分析によって分析する。本発明の方法は、病理組織サンプルから回収されたタンパク質/ペプチドを正常組織サンプルから回収されたタンパク質/ペプチドと比較する更なる工程を含み得る。好ましくは、病理組織サンプルから回収されたタンパク質/ペプチドの差次的発現を正常サンプルと比較することによって、病理組織サンプルの疾患に対する潜在的バイオマーカーを同定することができる。好ましくは、正常組織サンプルと比較して、病理組織サンプルにおいてより高い発現を有する回収されたタンパク質/ペプチドを同定することによって、特定の疾患に対する1つ又は複数のバイオマーカーを同定することができる。同定されたバイオマーカーは、本発明の方法の性質のために、好ましくはinvitro及びinvivoで細胞外空間から接近可能である。本発明の方法は、任意の組織及び任意の病態/疾患に適用することができ、接近可能なタンパク質を考慮に入れるため、バイオマーカーを同定するだけでなく、極めて接近可能な標的を標的とするカスタム療法を開発することができる。例えば、抗体に基づいた治療によってバイオマーカーを標的とすることができる。本発明の好ましい実施の形態では、標識工程及び回収工程は病理組織サンプル及び正常組織サンプルを用いて行われ、回収されたタンパク質/ペプチドの差次的発現を比較する。より好ましくは、この方法は、正常組織のサンプル及び病理組織のサンプルを準備する工程と、各々のサンプル中の接近可能なタンパク質を標識試薬で別個に標識する工程と、標識されたタンパク質を各々のサンプルから単離し回収する工程と、各々のサンプル中の残りの非標識タンパク質を消化する工程と、各々の消化されたサンプルから糖ペプチドを単離し回収する工程と、標識されたタンパク質又は糖ペプチドの単離の際に回収されなかった非グリコシル化ペプチドを各々のサンプルから回収する工程と、回収された全てのタンパク質及びペプチドを分析する工程と、正常サンプルと比較した、病理サンプルにおける回収されたタンパク質/ペプチドの差次的発現パターンを決定する工程と、正常組織サンプルと比較して、病理組織サンプルにおいてより高い発現を有するか、又は正常組織サンプルと比較して、病理組織サンプルにおいてより頻繁に発現されるタンパク質/ペプチドを同定する工程と、を含む。これらのタンパク質/ペプチドは病理組織に対するバイオマーカーとして使用することができ、好ましくは高親和性リガンドが細胞外空間から接近可能である。好ましくは、バイオマーカーは病理組織において発現され、正常組織においては発現されない。精製した標識タンパク質を精製後により小さいペプチドへと切断した後、更なる分析を行ってもよい。切断は好ましくはタンパク分解によるものであり、トリプシンを用いて達成することができる。更なる態様によると、本発明は本発明の方法によって同定されるバイオマーカーを提供する。本発明の別の態様によると、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び/又は予防的治療用の薬剤の製造のための、本発明の方法によって同定されるバイオマーカーに指向性を有するリガンド、好ましくは高親和性リガンドの使用が提供される。好ましくは、薬剤は特定のリガンド、好ましくは抗体又は抗体-薬物複合体の使用に基づく。更なる態様によると、本発明は、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び/又は予防的治療において使用される、本発明の方法によって同定されるバイオマーカーに指向性を有するリガンド、好ましくは高親和性リガンドを提供する。好ましくは、薬剤は特定のリガンド、好ましくは抗体又は抗体-薬物複合体の使用に基づく。本発明のまた更なる態様によると、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び/又は予防的治療の方法であって、本発明の方法によって同定されるバイオマーカーに指向性を有する治療的又は予防的に効果的な量のリガンド、好ましくは高親和性リガンドを投与することを含む、方法が提供される。好ましくは、リガンドは抗体又は抗体-薬物複合体である。本発明の1つの態様又は実施形態に適用可能な任意の特徴は、任意の組合せ及び任意の数で用いることができる。さらに、これらの特徴は、本発明の他の態様又は実施形態のいずれかとともに任意の組合せ及び任意の数で用いることもできる。これには、本願の特許請求の範囲において、任意の請求項の従属請求項を任意の他の請求項の従属請求項として用いることが含まれるが、これに限定されない。ここで、本発明の実施形態を、ほんの一例として添付の図面を参照して本明細書中で説明する。乳がんに対するバイオマーカー以下の研究は、本発明、すなわち本発明の方法及び新規の乳がんバイオマーカーの両方を説明するものである。この研究では、接近可能なタンパク質バイオマーカーを乳がん生検サンプルから単離し、乳がんに対するバイオマーカーとしてのそれらの使用を実証した。本研究に参加する全ての個体個人に研究の目的に関して詳細な情報を与え、書面による同意を得た。この計画の目的及び実施した実験は、リエージュ大学Belgiumの規定及び倫理指針に従うものであった。この研究は以下の2つのパートに分けられる:i技術的パート方法の価値、再現性及び精度の実証及びii生物学的パート新規のバイオマーカーの発見及び検証のための概念研究の証明。技術的パートには、MS分析に関わる全組織サンプル全ての個体、腫瘍試料及び正常試料の両方の等量のプールとして調製した1つのマスターサンプルを用いた。生物学的パート、具体的には調節タンパク質の発見は、技術的パートで単離したタンパク質を用いて行った。最後に、選択した差次的に発現されるタンパク質の検証を、別個の乳がん患者群25人の腫瘍個体及び13人の正常個体に対して行った。免疫組織化学検証研究に参加する全ての患者は、乳管腺癌と診断され、臨床グレードが少なくとも2であり、外科手術の時点では転移を示していなかった。この研究に関わる反復試験の回数及び形式に関して、i技術的パートにおいて行った全ての分析が、別々の日に行われ、マスターサンプルを使用するそれぞれ3回の完全な技術的反復試験組織の可溶化からMS分析までを含んでいたこと、ii生物学的パートにおいて行った調査、具体的にはMSを用いた発見段階が、5人の個体に由来するマッチングした腫瘍サンプル及び正常サンプルの単一の反復試験であることに留意されたい。組織サンプル調製リエージュ大学病院Belgiumの病理部から入手した新鮮なヒト乳がん生検材料片を即座にスライスし、新たに調製したEZ-linkSulfoNHS-SSビオチン1mg/ml、PierceRockford,IL,USA溶液に浸漬した。次いで、組織サンプルを液体窒素中で急速凍結しsnapfrozen、Mikro-DismembratorUBraunBiotechMelsungen,Germanyを用いて粉砕した。およそ100mgの組織粉末を、プロテアーゼ阻害剤PIカクテルHalt商標、PierceRockford,IL,USA、0.5mM酸化グルタチオンGSSG、及びレベル1の内部標準ミックスウシα2-HS糖タンパク質、ウシカゼイン、及びビオチン化ニワトリ卵白アルブミン卵白アルブミンとEZ-linkSulfoNHS-SSビオチン試薬とのインキュベーションによって行われるからなるIS1;スパイク/サンプル比1/200を含有するPBSバッファー50mMPBS、0.5MNaCl、pH=7に溶解した。次いで、2mmマイクロプローブを用いてホモジネートを超音波処理し2×30秒、4°Cで10分間20000×gで遠心分離した。ヒト血清アルブミンHSA及び免疫グロブリンIgGを、QproteomeHSAandIgGsRemovalKitQiagenValencia,CA,SAを用いて取り除いた。残りのペレットをRIPAバッファーPBS中の1NonidetP40NP40、0.5デオキシコール酸DOC、0.1SDS、0.5mMGSSG及びPIカクテル、pH=7.0に懸濁し、超音波処理し2×30秒、4°Cで10分間20000×gで遠心分離した。サンプルを上記のようなHSA及びIgGの除去に供した。2SDS溶液を残りの不溶性ペレットに添加した後、最後の再可溶化を行った。次いで、サンプルを上述のように遠心分離し、上清を収集した。最後に、3回の可溶化工程による全ての溶解物をプールし、5分間煮沸した。ビオチン化タンパク質の単離総タンパク質抽出物を、100μL/mgのストレプトアビジンSA樹脂PierceRockford,IL,USAと回転条件下、室温で120分間混合した。ストレプトアビジンとのインキュベーションの後、その後のグリコプロテオミクスglycoproteomic分析のために上清を保管しておいた画分1。ストレプトアビジンビーズを0.5mLのバッファーAPBSバッファー中の1NP40、0.1SDS及び0.5mMGSSGで4回、0.5mLのバッファーBPBSバッファー中の0.1NP40、1.5MNaCl及び0.5mMGSSGで4回、0.5mLのバッファーCPBSバッファー中の0.1MNa2CO3及び0.5mMGSSG、pH=11.0で2回、最後にGSSGを含まない0.5mLのPBSバッファーpH=7で2回洗浄した。ビオチン化タンパク質を、0.4mLの100mMジチオスレイトールDTTで2回溶出させ、60°Cで30分間インキュベートした画分2。画分1も100mMDTT中で還元した。両方の画分を、150mMヨードアセトアミドを用いて暗所でintheabsenceoflight30分間アルキル化した。この段階で、レベル2の内部標準ウシβラクトグロブリン1/200からなるIS2を両方の画分に添加した。次いで、タンパク質を20トリクロロ酢酸TCAを用いて4°Cで一晩沈殿させた。タンパク質ペレット画分1及び画分2を50mMNH4HCO3に可溶化し、トリプシンPromegaMadison,WI,USA1:50のプロテアーゼ/タンパク質比を用いて37°Cで一晩消化した。ビオチン化ペプチド画分1をMSを用いて更に処理した。画分2を下記のような糖ペプチドの単離に使用した。糖ペプチドの単離消化されたタンパク質サンプルを30μLの1HClで酸性化し、C18Sep-pakカラムWatersMilford,Massachusettsに移し、3×1mLの0.1ギ酸溶液で洗浄した。ペプチドをアセトニトリル80を用いて溶出させ、蒸発乾固させた。ペプチド含有サンプルを酸化バッファーpH=5.5の100mM酢酸ナトリウム、150mMNaClに溶解し、10mM過ヨウ素酸ナトリウムPierceRockford,IL,USAとともに暗所で1時間インキュベートした。その後、10μLの120mM亜硫酸ナトリウムを添加し、インキュベーションを更に10分間延長した。サンプルをヒドラジド樹脂BioRadHercules,CA,USAにロードし、糖ペプチドを室温で一晩結合させた。糖ペプチドを含まないフロースルーをその後のMS分析のために収集した非グリコシル化タンパク質、NGP又はR。十分な洗浄H2O、1.5MNaCl、メタノール、80ACN及び50mMNH4HCO3で各々2回の後、ヒドラジド樹脂に50mMNH4HCO3溶液をロードし、500単位のPNGアーゼFNewEnglandBiolabsIpswich,MA,USAとともに37°Cで一晩インキュベートした。インキュベーション期間の後、糖ペプチドを含有するフロースルーGを収集し、乾燥させた。MS分析ビオチン化画分、グリコシル化画分、更には非糖ペプチド画分に由来するペプチドを質量分析の前にC18ZipTipピペットチップMilliporeBillerica,MA,USAを用いて脱塩した。その後、5μgのペプチド含有サンプルを18μLの100mMギ酸アンモニウムバッファーに溶解した。溶解したサンプルに、レベル3の内部標準ミックス酵母アルコール脱水素酵素、ウサギグリコーゲンホスホリラーゼb、ウシ血清アルブミン及び酵母エノラーゼの等モルミックスを含有するMassPREPDigestionStandardMixture1商標WatersCorporationからなるIS3;18μLのサンプル中の最終濃度は、酵母アルコール脱水素酵素135fmolに調整したを添加した。2.5μgの推定タンパク質ロードに応じて、調製したサンプルを9μL投入した。MS分析のために、nanoAquity商標UPLCWatersをSYNAPTG1qTOFシステムWatersとオンラインで接続した。UPLCシステムの構成は以下のようにした:トラップカラムSymmetry商標C185μm、180μm×20mmWaters、分析カラムBEH商標C181.7μm、75μm×150mmWaters、溶媒A水中の0.1ギ酸及び溶媒BACN中の0.1ギ酸。流量は300nL/分に設定し、勾配は以下の組成を有するものとした:0分、97のA;90分、60のA。MSの取得パラメータは以下のようにした:データ独立交互スキャンalternatescanningMSEモード、50~1500のm/z範囲、ESI、Vオプティクス、スキャン時間1秒、コーン30V及びロックマスGlu1フィブリノペプチドB[M2H]2785.8426m/z。生データは、ProteinLynxGlobalSERVER商標PLGSv2.4を用いて処理したデコンボリューション、デアイソトープdeisotoped、タンパク質同定、絶対的定量化及び相対的定量化。処理パラメータは以下のようにした:MSTOF分解能及びクロマトグラフピーク幅を自動、低/高エネルギー検出閾値を250/100カウント、同定強度閾値を1500カウント、ロックマスウィンドウを785.8426±0.35Daに設定した。タンパク質同定のために、UniProt商標ヒトデータベースを参照とした20280個のエントリを含む正準配列データ。ペプチド修飾のカルバミドメチル化を固定、酸化Mを可変として設定した。加えて、糖タンパク質分析のために、脱アミド化Nを同様に可変修飾に含めた。ペプチド強度の絶対量への変換のための応答係数2200を、アルコール脱水素酵素酵母、SwissProtP00330消化物の反復投入後に予め推測した。この応答係数を研究の間中一定に維持した。日常的には、IS1、IS2及びIS3を、スパイクした絶対量と測定された絶対量との間の正確な関係及び比較されるサンプル間の相対比について確認した。絶対量及び相対比の両方についてのIS許容差は、データセットを許容可能にし、更なる分析に含めるためには±25偏差内でなければならなかった。PLGS商標ソフトウェアによって、各々個々のタンパク質ヒットについてスコア及び偽陽性率FPRを計算した。本研究では、FPRが96以上かつスコアが80以上である場合にタンパク質が同定されたとみなした。糖タンパク質データ分析糖タンパク質に関して、処理したMSデータデコンボリューションしたスペクトルを、初めにヒドラジドビーズGから得られる画分について別個に、次いでフロースルー画分Rと組み合わせてデータベース検索に供した。その後、ヒドラジドビーズに由来する全ての糖タンパク質を、自作プログラムARACv3.5、要求に応じて利用可能を用いて取り除いた。このプログラムによって、問題のペプチドの各々について、コンセンサス配列部位NXS/T、ここでXをプロリン以外の任意のアミノ酸によって置き換えることができるでの脱アミド化アスパラギンの存在を確認した。この初期段階では、或る特定数の糖ペプチドを、それぞれの糖タンパク質G画分に即座に割り当てることができた。残りの糖ペプチドは十分に特異的でないか、又は明確にタンパク質と関連付けることができないほど低いスコアを有していた。これらのペプチドがタンパク質に割り当てられるように、幾つかの非グリコシル化ペプチドが、グリコシル化ペプチドG画分に由来するとともに顕著なタンパク質同定を可能にする、R画分分析によるペプチドとマッチングした。この新たなプロテオミクス結果の複合プールをGR画分と名付けた。選択されたバイオマーカーの免疫組織化学的検証ラミニンα5及びミオフェリンの発現を、ホルマリンで固定したパラフィン包埋乳房組織切片において免疫組織化学検査によって評価した。25例の腫瘍乳房及び13例の正常乳房に由来するサンプルを、抗ラミニンα5MilliporeBillerica,US、希釈率100倍及び抗ミオフェリンAbcamCambridge,UK、希釈率400倍を用いて免疫染色した。5μm厚の組織切片を5分間、2回のキシレン浴によってパラフィン除去しunparaffined、メタノール勾配100、95、70、50及びH2O中で水和させた。内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを、3H2O2及び90メタノールとの30分間のインキュベーションによって行った。抗原回復を、95°Cの水浴を用いて10mMクエン酸バッファーpH6中で40分間行った。PBS-正常血清溶液10mlのPBS中、150μlの正常ヤギ血清及び20μlのTween20中で30分間のブロッキングに続いて、切片を一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートした。次いで、切片をビオチン化二次抗体とともに30分間、更にはアビジンビオチン複合体キットABCキットとともに更に30分間インキュベートした。5H2O2を加えた3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩二水和物DABを、発色colorizationに使用した。スライドガラスを最後にヘマトキシリンで対比染色した。免疫染色を、サンプルを陽性細胞の割合5つの任意単位/クラス:0=0、1=0~25、2=25~50、3=50~75及び4=75~100及び染色強度4つの任意単位/クラス:0=染色なし、1=弱い染色、2=中程度の染色及び3=強い染色について評価することによって評価した。次いで、これら2つの尺度によって得られた結果を掛け合わせて、スコアと名付けられる単一の値を得た図5のy軸。群間比較のために、対応のない両側スチューデントt検定を用いて統計分析を行った。ガウス分布は、ダゴスティーノ-ピアソン検定によって検証した。ガウス分布及び/又は不均一分散が確認されなかった場合正常サンプルが任意の陽性細胞を示さず、及び/又は染色がなかった場合、両側マン-ホイットニーU検定を用いた。0.05以下のP値を有意であるとみなした。統計分析は、PRISMソフトウェアGraphPadSoftwareSanDiego,California、バージョン4.0bを用いて行った。結果組織サンプルからの接近可能なタンパク質の単離-逐次的方法逐次的方法の概略図を図1に示す。この方法は基本的に、iビオチン化タンパク質の単離、ii糖ペプチドの精製、及びiii残りのペプチドの分析という3つの異なる工程からなる。後者の画分は、割り当てられていない糖ペプチドのコンピューターによる補足に用いた。加えて、この画分は相当数の接近可能なタンパク質を含有するため、この対象の群を調節タンパク質のプール全体に寄与させることができた。方法の複雑さのために、反復試験間の再現性をモニタリングする幾つかの高速ツールを導入した。これらは主として、i残りのビオチン化タンパク質についてのビオチン工程のフロースルーの検査、及びii残留糖ペプチドのヒドラジド捕捉後のフロースルー画分の測定からなるものであった。更なるプロセス対照は、3つの異なる工程でスパイクした非ヒト起源の合計8個の個別タンパク質である内部標準とした。全体的には、ビオチン化タンパク質及び糖ペプチドの両方の捕捉が効率的であり、ほぼ完璧な特異性及びサンプルの少ない損失が可能となるといえる。このことは、図2Aに示すデータから特に明らかである。ここで、ビオチン化タンパク質画分において、ビオチン化アルブミンの定量的回収及び無視することができるフェチュインの混入が検出されたことは注目に値するIS1。他の2つの画分グリコ画分及び残りの画分に関する限り、フェチュインが両方の画分において再現性よく定量化されグリコシル化ペプチド及び非グリコシル化ペプチドの両方による、純粋なリンタンパク質であるカゼインIS1が残りの画分のみで回収された。タンパク質消化工程及びその後の精製工程の再現性に関して、糖ペプチド画分以外これがグリコシル化タンパク質ではないための全ての画分におけるβラクトグロブリンIS2の良好な回収率から、これらの工程によって導入される量的及び質的な変動性が許容範囲内であることが示される。本研究では、絶対的無標識定量化を行うためにMSe技術を用いた。この方法には極めて再現可能なHPLC及びデータ独立交互スキャンを用いた。加えて、高質量精度測定が直交飛行時間型質量分析計、及びその後の再較正を可能にするロックマスの飛行中取得によって得られる。データを、同じクロマトグラフプロファイルを有する全ての検出可能な前駆イオン及びフラグメントイオンの検出及び相関付けに基づいて処理した。衝突セルに適用される低エネルギー状態と高エネルギー状態との間の急速な変化によって、タンパク質が単一の実験で同時に定量化及び同定された。IS3は逐次的方法の極めて後の工程サンプルをUPLCに投入する前の最後の工程でサンプルにスパイクされることが観察され、これにより定量化アプローチの性能の良好な推定が可能となった。図2A/図2Bに概説されるように、4つのタンパク質の定量化から絶対的定量化が実行可能かつ正確であることが実証された。しかしながら、とりわけアルブミンウシ及びグリコーゲンホスホリラーゼbウサギについてタンパク質量の僅かな過大評価が確かに認められる。このことは、サンプル中に豊富に見られるヒト相同体の存在と関係付けることができた。この変動がタンパク質の差次的発現を主張するための閾値として選ばれる2倍比をはるかに下回るという原理から、この偏差を有意とはみなさなかった。本発明の方法を用いた実際の結果及び見られるペプチドを図18に示す。逐次的アプローチと個別法との比較新たな方法において2つの既知の手順を組み合わせることの正確な利益を決定するために、逐次的技法を個別法のパートのそれぞれと比較した。この目的で、この方法の第2のパートである糖ペプチドの単離を独立型技法として行うことが必要であった。この方法の技術的側面に関する限り、グリコシル化ペプチドの直接的な単離及び残存する残りの画分の分析によって、逐次的方法と同様の結果が得られた。図2A及び図2Bに示されるように、グリコ画分には特にグリコシル化フェチュインが回収され、ビオチン化卵白アルブミン及びカゼインはフェチュインとともに残りの画分中にしか存在しなかった。内部標準2及び内部標準3は再現可能な消化、精製及びMS定量化を示す。接近可能なタンパク質の絶対数に関する限り、組合せ法におけるビオチン化タンパク質画分では平均して310個のタンパク質が単離された。糖ペプチド画分中の接近可能なタンパク質の数逐次的アプローチ及び独立型アプローチの両方では、およそ80であり、コンピューターによる組合せ方法後に110に増加した。このことは、この操作をとりわけ割り当てられていない糖ペプチドについて実行することの価値を明らかに実証している30の増加。残りの画分では、平均して200個の潜在的に接近可能なタンパク質が確信を持って同定された。全ての方法パートの組合せが、逐次的状況で410個を超えるタンパク質ビオチン化単独と比較して30及び糖ペプチド状況単独対応する残りの画分を含むで210個のタンパク質逐次的方法と比較して-50をもたらした。既にビオチン化されたタンパク質の除去の分析手順は、同定される特有のタンパク質の割合45に関して、両方の糖ペプチド及び残りの非グリコシル化及び非ビオチン化タンパク質の分析よりも明らかに優れていた。しかしながら、糖ペプチド単離の追加によって更に約36の特有の潜在的に接近可能なタンパク質がもたらされる。タンパク質の残りのプール残りの画分は、相対的に高い絶対数並びに高い膜タンパク質及び細胞外タンパク質の割合から、更に25の対象の特有タンパク質を有している。免疫組織化学検査を用いたバイオマーカーの検証MSベースの半定量的アプローチを用いて、ラミニンα5及びミオフェリンが乳がんサンプルにおいて差次的に過剰発現されることが見出された。乳がんと診断された25人の患者、及び13人の正常個体の対照群を用いた研究から、ラミニンα5及びミオフェリンの両方がヒト乳がん組織において強力な陽性染色を示すことが実証された。対応する正常乳房組織は、使用したいずれの抗体についても任意の顕著な陽性率を示さなかった図5。膵臓がんに対するバイオマーカー本発明の方法を、膵臓がんに対するバイオマーカーを同定するためにも用いた。用いた方法は、サンプルが膵臓がん組織である以外は乳がんに関して上記したとおりであった。検証及び機能的研究に用いた幾つかの具体的な方法を下記に説明する。MRMベースの相対的タンパク質定量化幾つかのバイオマーカーの検証をMRMを用いて行った。簡潔に述べると、150μgの総タンパク質抽出物バッファー及び条件はサンプル調製の項に詳述するに、2μgのウシβラクトグロブリンサンプル調製の正規化に使用される内部標準IS1をスパイクし、20TCAを用いて沈殿させた。ペレットを150μLの50mM重炭酸アンモニウムバッファーpH8に部分的に溶解し、トリプシン消化タンパク質/プロテアーゼ50/1に供した。MRMイオン選択は、腫瘍サンプル及び正常サンプルの併合されたmerged結果を考慮に入れ、2D-HPLC-MS/MSラン上記のプロテオミクス実験によるに基づくものであった。80を超えるMascot商標スコアを有するペプチドは所与のタンパク質に特有であり、完全に割り当てられたフラグメントを有するそれらのMS/MSスペクトルは、有力な標的であると考えられた。対象のタンパク質の各々を、1つの特異的ペプチド及び幾つかの転移特徴的なフラグメントを用いて標的とした。全ての転移に陽性であるサンプルのみを定量化した。さらに、前駆イオン/生成イオン転移の特異性を、公的に入手可能なアルゴリズム:httpprowlrockefellereduprowlpepfraghtmlを用いて検証した。LC-MSシステムへの投入の前に、合成ペプチドEEEGTTGPDR同位体標識したアルギニン13C及び15N、保持時間1.3分IS2を、各々のサンプルに添加した0.025pg/μL。このペプチドの既知の転移親イオン550.052[H]2及びフラグメント185.2m/z、241.2m/z及び713.5m/zを、異なるサンプルの個々の投入におけるイオン化の相違を正規化するために用いた。およそ20μgの消化サンプルを、MRMモードに設定したMS装置QuattroUltimaPlatinum、Watersと連結したHPLCシステムAlliance2690、WatersMilford,MA,USAに投入した。サンプルの分離を、200μL/分の流量で送液する2.1mm×150mmのC18カラム3μmビーズを含むPolarisC-18A媒体、孔径200ÅVarianIncPaloAlto,CA,USAを用いて行った。線形勾配は以下のように設定した:t=0分、100水0.1v/v酢酸及びt=16分、60水及び40アセトニトリル0.1v/v酢酸。MS装置の関連パラメータは以下のようにした:キャピラリー電圧2.6kV、脱溶媒和温度115°C、コーン脱溶媒和ガス630L/時間、及び衝突セル圧2μバール。データを収集し、MassLynxWatersソフトウェアバージョン4.1を用いて評価した。データ評価の目的で、指定のペプチド及び転移の抽出イオンクロマトグラムXICのピーク面積PAを、IS2を用いて種々の投与間で正規化した。100cpsの閾値を超えるXICのみを、分析の考慮に入れた。その後、正規化したPAの平均を、それぞれのペプチドの全ての転移を用いて計算した。最後に、2回目の正規化をIS1を用いて行った。細胞培養及びsiRNA媒介ノックダウンBxPC3膵臓癌細胞に、MYOF及びTGFBIに対して指向性を有する低分子干渉RNAsiRNAを、リポフェクタミンLipofectamine2000試薬、カタログ番号11668-019、Invitrogenを用いて10nMの濃度でトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後、培養培地を対応する新鮮培地血清を含むと交換した。この時点をt=0とした。ルシフェラーゼに指向性を有するsiRNAを対照として使用した。全てのsiRNAはEurogentecSeraing,Belgiumから購入した。細胞遊走走化性/走触性アッセイトランスフェクションの48時間後、2×105個のトランスフェクトBxPC3細胞を、無血清培地0.1BSA、1ペニシリン/ストレプトマイシンに懸濁し、三連でゼラチン又はラミニン100μg/mlでコーティングしたトランスウェルフィルター直径6.5mm、孔径8μm、CostarCambridge,MA,USAの上部に播種した。トランスウェルフィルタープレートの下部コンパートメントに、6血清、1BSA及び1pen/strepを含有するDMEMを充填した。37°Cで10時間のインキュベーションの後、遊走細胞を固定し、Diff-QuickキットMedionDiagnostics、参照番号130832Switzerlandを用いて染色した。各々のインサートの写真を5倍の倍率で撮影し、遊走細胞の割合をImageJソフトウェアNIHUSAを用いた密度測定によって更に定量化した。1つの条件につき3つのウェルをカウントした。この研究では、3つの正常膵臓組織及び3つの腫瘍病変をプロテオミクス発見段階で分析した。合計で736個及び841個のタンパク質が正常条件及び腫瘍条件のそれぞれで同定された。これらの中でも、18超が3つ全ての正常サンプル157個のタンパク質及び腫瘍サンプル152個のタンパク質中に見られた。さらに、正常サンプルのタンパク質の29超239個のタンパク質及び腫瘍サンプルのタンパク質の29超244個のタンパク質が、3回の生物学的反復試験のうち2回で同定された。このことは、それぞれのサンプルの各々に見られるタンパク質の47が、少なくとも別の反復試験においても観察されることを示唆している。合計で1139個の特有のタンパク質が同定された。それらの調節を、正常条件に対する腫瘍条件におけるそれらの存在又は非存在によって評価した。さらに、emPAI値を両方の条件で見られたタンパク質を半定量化するために用いた。emPAI値は複合混合物中のタンパク質量の推定値である。この値は、MS分析において観察されたペプチドと理論的に観察可能なペプチドとの比率の対数として計算される。本研究では、i腫瘍条件のみで検出される場合、ii両方の条件で見られるが、腫瘍サンプル中でより頻繁に同定される場合、iii2を超えるemPAI腫瘍条件対正常条件の倍数変化率で見られる場合にタンパク質を過剰発現されるとみなした。これらの基準を考慮すると、484個のタンパク質が膵臓腫瘍において過剰発現されるとして見出された。これらの中でも、403個が腫瘍サンプルに限定され、81個が両方の条件で存在していた。差次的に発現されるタンパク質を、それらの潜在的細胞内局在性を決定するためにSwissprot商標/Uniprot商標データベースを用いて分析した。所与のタンパク質の潜在的接近可能性を、以下の基準に従って評価した:タンパク質がi細胞膜、ii細胞表面に局在するか、又はiii分泌タンパク質若しくはiv細胞外タンパク質と説明される。血清中に豊富に見られるとして知られる分泌タンパク質を更なる分析から除外した。腫瘍条件で過剰発現される484個のタンパク質の中でも、84個のタンパク質を潜在的に接近可能であるとして同定することができ、310個、18個及び72個がそれぞれ接近不可能なタンパク質、血清タンパク質及び未知のタンパク質と説明された。84個の差次的に発現される接近可能なタンパク質の生物学的プロファイルを、それらの遺伝子オントロジーアノテーションに従って決定した。タンパク質の大半が細胞間連絡及びシグナル伝達30、並びに細胞の成長及び/又は維持30に関与していた。他の生物学的プロセスは目立たなかった:タンパク質代謝9、一般代謝及びエネルギー経路9並びに輸送6。この特有の方法のために、本研究によって潜在的な接近可能な特徴を有する相当な数のタンパク質n=84が明らかになった図7。トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ig-h3TGFBI、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2LTBP2、ミオフェリンMYOF、アスポリンASPN、テネイシンTNXB又はTNC、ペリオスチンPOSTN、ガレクチンLGALS3、フィブロネクチンFN1、プロラルギンPRELP、タンパク質-グルタミンγ-グルタミルトランスフェラーゼ2TGM2及びアグリンAGRNタンパク質は、膵臓がんに対する新規のバイオマーカーである。TGFBIタンパク質、LTBP2タンパク質、MYOFタンパク質及びASPNタンパク質の発現を、免疫組織化学検査を用いて一連の腫瘍膵臓組織n=34及び非腫瘍膵臓組織n=28において研究した図8。非腫瘍組織を正常膵臓及び慢性膵炎に更に細分した。このことは、選択されたタンパク質の腫瘍特異性をより良好に特性化することに役立つ。TGFBIに関する限り図8A、染色は概して導管腺癌組織のECM細胞外マトリックスにおいて見られた。腫瘍上皮細胞は中程度の細胞質染色を示した。これは正常組織では観察されなかった。強力なECM発現が分析した全ての腺癌の50で観察されたが、残りの症例はより低い染色を示した。慢性膵炎の領域に局在する一部の導管が中程度に陽性であった。正常な導管はタンパク質の発現を示さなかった。全体では、腫瘍組織におけるTGFBIの平均的発現は、炎症膵臓組織スコア約2及び正常膵臓組織スコア約2と比較して腫瘍スコア約8において有意に強かったp≦0.0001。慢性膵炎及び正常組織におけるTGFBIレベルは有意に異ならなかった。LTBP2免疫反応性は主に腫瘍導管組織及び導管周囲の間質組織で見られた。50超の腺癌がタンパク質の強力な発現を示し、これは炎症組織スコア約2及び正常組織スコア約2と比較して腫瘍スコア約5において有意に高かったp≦0.0001図8B。正常組織及び膵炎組織におけるLTBP2タンパク質発現は有意に異ならなかった。MYOFの発現パターンも評価した図8C。TGFBI及びLTBP2とは対照的に、MYOF発現は主に腫瘍細胞の細胞膜及び細胞質で得られた。異なる腫瘍グレード間での相違が顕著であり、染色強度はグレード2及びグレード3より進行した腫瘍でより強く現れ、グレード1あまり進行していない腫瘍でより低かった。炎症性のものを含む正常導管は主に陰性であった。要約すると、膵炎及び正常膵臓組織スコア約2と比較して腫瘍組織スコア約6における陽性率は有意に異なっていたp≦0.001。ASPNは細胞外マトリックスECMのみで検出され、正常上皮細胞又は腫瘍上皮細胞のいずれにおいても染色は観察されなかった。ASPN発現図8Dは、染色がないか又は非常に低い染色しか確認されなかった炎症組織スコア約3及び正常組織スコア約2と比較してがん試料スコア約8において有意にp≦0.0001強かった。炎症組織は低い陽性率しか示さなかったが、ASPNのタンパク質レベルは正常試料に対して有意に上昇していたp≦0.05。副腎、脳、子宮内膜、腸、肝臓、胎盤、前立腺腺及び導管の両方、肺静脈及び肺動脈、胸腺、甲状腺及び臍帯に由来する他の正常組織は、ASPNの存在について陰性であると試験された図9。他の正常ヒト組織におけるTGFBIの発現に関しては、組織マイクロアレイ分析によって結腸、脳、乳房、子宮内膜、筋層間神経叢、子宮筋層、前立腺腺、胸腺及び甲状腺が陰性であることが示された。極めて低い陽性率スコア2~4が副腎、心臓、肝臓、食道、舌及び前立腺導管において測定された図9。正常組織におけるLTBP2の発現に関しては、免疫組織化学実験によって、このタンパク質が大部分の組織副腎皮質、脳、乳房、子宮内膜、心臓、腸、筋層間神経叢、腎臓、肝臓、胎盤、前立腺腺、胸腺、甲状腺、臍帯及び静脈中に存在しないことが明らかになった。弱い陽性率スコア≦2が副腎髄質、舌上皮、気管支粘膜及び肺動脈において示された図9。幾つかのバイオマーカーの発現がウエスタンブロット実験によって確認された。図10に示されるように、TNXBTNC、LTBP2、ASPN及びLGALS3が、がんサンプルにおいて独自に発現された。POSTNは全ての腫瘍サンプルで検出可能であったが、このタンパク質は他の個体と比較して患者DI-PT-003ではあまり発現されないことが見出された。非腫瘍試料は検査した全てのタンパク質についてほぼ陰性であったが、ASPNは2人の膵炎患者のうち1人DI-PI-001で陽性であると試験された。さらに、TGFBIは全てのがんサンプルにおいて発現された。MYOFは全ての腫瘍サンプルで検出可能であったが、このタンパク質は他の個体と比較して患者DI-PT-003ではあまり発現されないことが見出された。非腫瘍試料は検査した3つ全てのタンパク質についてほぼ陰性であったが、TGFBIは2人の膵炎患者のうち1人DI-PI-001で陽性であると試験された。好適な抗体が利用可能であったため、ウエスタンブロット法をこれらの7つのタンパク質に用い、他の4つはMRMを用いて定量化した。MRMは、所与のタンパク質の特異的ペプチドフラグメントを検出し定量化する標的MS方法を表す。MRMをFN1、PRELP、TGM2及びAGRNに用い、全てのタンパク質が、正常対応組織と比較してヒト膵臓がんにおいて過剰発現されることが確認された図11。次に、膵臓がん細胞におけるTGFBI及びMYOFの機能的役割を明らかにすることに焦点を置いた。主として、がんの進行及び成長における主要な工程の1つとして、膵臓がん細胞の遊走能走化性/走触性に対するこれらのタンパク質の影響を評価した。この目的で、BxPC3膵臓癌細胞にTGFBI及びMYOFに対するsiRNAをトランスフェクトし、トランスフェクション後48時間に遊走能の変化を評価した図12A及び図12B。siRNAは対応するmRNAの分解を媒介し、したがってそれぞれの細胞における標的タンパク質の除去をもたらす図示せず。図12に示されるように、TGFBIタンパク質及びMYOFタンパク質の除去は、膵臓癌細胞における遊走の顕著な阻害それぞれ-60及び-25をもたらす。結果から、両方のタンパク質が治療用途に好適な標的として役立ち得ることが実証される。CRC肝転移に対するバイオマーカー本発明の方法を、結腸直腸癌の肝転移に対するバイオマーカーを同定するためにも用いた。用いた方法は、サンプルが肝臓がん組織のものである以外は乳がんに関して上記したとおりであった。機能的研究については、以下の方法を使用した。細胞培養及びsiRNA媒介ノックダウンSW1222結腸直腸癌細胞に、MYOFに対して指向性を有する低分子干渉RNAsiRNAを、リポフェクタミンLipofectamine2000試薬、カタログ番号11668-019、Invitrogenを用いて10nMの濃度でトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後、培養培地を対応する新鮮培地血清を含むと交換した。この時点をt=0とした。ルシフェラーゼに指向性を有するsiRNAを対照として使用した。全てのsiRNAはEurogentecSeraing,Belgiumから購入した。細胞遊走走化性/走触性アッセイトランスフェクションの48時間後、2×105個のトランスフェクト細胞を、無血清培地0.1BSA、1ペニシリン/ストレプトマイシンに懸濁し、三連でゼラチン又はラミニン100μg/mlでコーティングしたトランスウェルフィルター直径6.5mm、孔径8μm、CostarCambridge,MA,USAの上部に播種した。ブロッキング抗体に関する実験については、非トランスフェクト細胞を、MYOF又はウサギIgG対照に対して指向性を有するポリクローナル抗体を50μg/mlの濃度で添加したバッファー0.1BSA、1ペニシリン/ストレプトマイシン中、37°Cで90分間プレインキュベートした。トランスウェルフィルタープレートの下部コンパートメントに、6血清、1BSA及び1pen/strepを含有するDMEMを充填した。37°Cで24時間のインキュベーションの後、遊走細胞を固定し、Diff-QuickキットMedionDiagnostics、参照番号130832Switzerlandを用いて染色した。各々のインサートの写真を5倍の倍率で撮影し、遊走細胞の割合をImageJソフトウェアNIHUSAを用いた密度測定によって更に定量化した。1つの条件につき3つのウェルをカウントした。図13に肝臓組織を用いて同定された接近可能なタンパク質の詳細を示す。脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質1AEBP1、EMILIN1、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質2LTBP2、ペリオスチンPOSTN、トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質igh3TGFBI及びミオフェリンMYOFタンパク質は、結腸直腸癌肝転移に対する新規のバイオマーカーである。これらの抗原の発現を更に検証するために、14個の腫瘍サンプル及び正常サンプルマッチングしたに対して免疫組織化学検査を行った。図14は免疫染色の評価を示す。この分析から、AEBP1抗原、EMILIN1抗原及びPOSTN抗原が主に腫瘍間質中に存在する全て顕著に上方制御されるが、腫瘍細胞が主に陰性であることが明らかになった。図14に更に概説されるように、TGFBIは腫瘍間質において顕著な陽性率スコア約8を示した。腫瘍細胞におけるTGFBIの発現スコア約6は間質における発現より低いが、主に陰性である正常肝細胞スコア約2より顕著に高かった。LTBP2に関する限り図14C、このタンパク質の発現は主に腫瘍間質で得られたスコア約4。腫瘍細胞及び正常肝細胞におけるLTBP2の発現は、有意には異ならなかったどちらもスコア約2。正常肝臓組織及び結腸直腸癌肝転移組織におけるAEBP1タンパク質、EMILIN1タンパク質、LTBP2タンパク質、POSTNタンパク質、TGFBIタンパク質及びMYOFタンパク質の発現の検証を、ウエスタンブロット分析を用いて確認した図15。6つ全てのタンパク質が主に転移組織の辺縁及び病変の中央で検出されたが、正常肝臓組織では検出されなかった図15。次に、結腸直腸癌肝転移におけるMYOFの機能的役割を明らかにすることに焦点を置いた。MYOFタンパク質の役割をSW1222結腸直腸癌細胞において機能的に評価した。この目的で、BXPC3膵臓がん細胞において行った機能的分析上記と同様に、遊走走化性/走触性の阻害を、isiRNAを用いたMYOFタンパク質の除去後に、又はii細胞をMYOFタンパク質に指向性を有するポリクローナル抗体とともにインキュベートすることによって評価した。データを図16及び図17に概説する。siRNAによるMYOF発現の阻害及び抗MYOF抗体を用いたこのタンパク質の標的化は、結腸直腸がん細胞に対する遊走阻害効果を発揮した。これらのデータは膵臓がん細胞で得られた結果と一致し、2つ以上の特定の悪性腫瘍におけるこのタンパク質の役割が示唆される。"