マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を、マンニトールを含む培地中で培養することを含む、マンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の1~3の少なくとも1つの特性を有する酵母である、請求項1記載のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法:1エタノール耐性を有する;2アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び3グルコース存在下での凝集能を有する。マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、Saccharomycesparadoxus、Debaryomyceshansenii、Kuraishiacapsulata、Ogataeaglucozyma及びOgataeaminutaからなる群から選択される、請求項1又は2に記載のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、SaccharomycesparadoxusNBRC0259株、DebaryomyceshanseniiNBRC0794株、KuraishiacapsulataNBRC0721株、KuraishiacapsulataNBRC0974株、OgataeaglucozymaNBRC1472株及びOgataeaminutaNBRC1473株からなる群から選択される、請求項3記載のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を培養することにより、培地中に01以上のエタノールが蓄積し得る、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を培養することにより、培地中に3以上のエタノールが蓄積し得る、請求項5記載の方法。アルギン酸資化能を有しアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を用いて、褐藻原料からエタノールを産生させたときの原料残渣に、マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を添加し、培養し、残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の1~3の少なくとも1つの特性を有する酵母である、請求項7記載の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法:1エタノール耐性を有する;2アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び3グルコース存在下での凝集能を有する。マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomycesparadoxusである、請求項7又は8記載の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomycesparadoxusNBRC0259株である、請求項9記載の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。アルギン酸資化能を有しアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を褐藻原料を用いて培養し、アルギン酸からエタノールを産生させ、の培養の原料残渣に、マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を添加し、培養することを含む、褐藻原料からエタノールを生産する方法。マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の1~3の少なくとも1つの特性を有する酵母である、請求項11記載の褐藻原料からエタノールを生産する方法:1エタノール耐性を有する;2アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び3グルコース存在下での凝集能を有する。マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomycesparadoxusである、請求項11又は12に記載の褐藻原料からエタノールを生産する方法。マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomycesparadoxusNBRC0259株である、請求項13記載の褐藻原料からエタノールを生産する方法。本発明は、酵母によるマンニトールからのエタノールの生産方法及びマンニトールからエタノールを生産する酵母株の提供を目的とする。本発明者らは、褐藻類由来バイオマスのエタノール生産への有効利用には、エタノール生産性A1株によるアルギン酸からのエタノール発酵残渣に含まれるマンニトール及びラミナリンから、マンニトール及びラミナリン資化性酵母を用いてエタノールを生産する二段階発酵の実現が有効であると考え、この実現を目指して、まずマンニトールから高いエタノール生産能を示す酵母の探索を行った。海洋バイオマスからのバイオ燃料生産には、その主要成分アルギン酸、マンニトール、及びラミナリンからエタノールを生産する技術が不可欠である。エタノール生産性SphingomonasspA1株を用いたアルギン酸からのエタノール生産系は確立されている。本株によるアルギン酸からのエタノール発酵後の残渣に含まれるマンニトールやラミナリンのエタノールへの変換は、褐藻類主要成分の有効利用法の一つである。本発明者らは、保存酵母株の中から、マンニトール資化性エタノール生産株6株を見出した。うち、SaccharomycesparadoxusNBRC0259株のみは、ラミナリンからのエタノール生産性は示さないものの、グルコース及びマンニトールからの高いエタノール生産性、エタノール耐性、及びアルギン酸からのエタノール発酵残渣における生育性といった望ましい特性を示した。他の5株はラミナリンからのエタノール生産性を示したが、他の特性がNBRC0259株より劣った。NBRC0259株は、95strokesperminの振とうによって得られる微好気環境において、10マンニトールから最大376glのエタノールを生産した。エタノール発酵に対するNaClの影響は小さかった。また、アルギン酸からのエタノール発酵残渣中のマンニトールからもエタノールを生産した。本菌は、海洋バイオマスからのエタノール生産に有用と考えられた。すなわち、本発明は以下のとおりである。1マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を、マンニトールを含む培地中で培養することを含む、マンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。2マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の1~3の少なくとも1つの特性を有する酵母である、1のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法:1エタノール耐性を有する;2アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び3グルコース存在下での凝集能を有する。3マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、Saccharomycesparadoxus、Debaryomyceshansenii、Kuraishiacapsulata、Ogataeaglucozyma及びOgataeaminutaからなる群から選択される、1又は2のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。4マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、SaccharomycesparadoxusNBRC0259株、DebaryomyceshanseniiNBRC0794株、KuraishiacapsulataNBRC0721株、KuraishiacapsulataNBRC0974株、OgataeaglucozymaNBRC1472株及びOgataeaminutaNBRC1473株からなる群から選択される、3のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。5マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を培養することにより、培地中に01以上のエタノールが蓄積し得る、1~4のいずれかの方法。6マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を培養することにより、培地中に3以上のエタノールが蓄積し得る、5の方法。7アルギン酸資化能を有しアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を用いて、褐藻原料からエタノールを産生させたときの原料残渣に、マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を添加し、培養し、残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。8マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の1~3の少なくとも1つの特性を有する酵母である、7の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法:1エタノール耐性を有する;2アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び3グルコース存在下での凝集能を有する。9マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomycesparadoxusである、7又は8の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。10マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomycesparadoxusNBRC0259株である、9の残渣中のマンニトールを原料としてエタノールを生産する方法。11アルギン酸資化能を有しアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を褐藻原料を用いて培養し、アルギン酸からエタノールを産生させ、の培養の原料残渣に、マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母を添加し、培養することを含む、褐藻原料からエタノールを生産する方法。12マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母が、以下の1~3の少なくとも1つの特性を有する酵母である、11の褐藻原料からエタノールを生産する方法:1エタノール耐性を有する;2アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び3グルコース存在下での凝集能を有する。13マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomycesparadoxusである、11又は12の褐藻原料からエタノールを生産する方法。14マンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母がSaccharomycesparadoxusNBRC0259株である、13の褐藻原料からエタノールを生産する方法。本発明のマンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母株を用いることにより、マンニトールを原料としてエタノールを生産することができる。海域由来のバイオマス、とりわけ褐藻類に多量含有される多糖アルギン酸からのエタノール生産の残渣には、大量のマンニトールが含まれており、該残渣をエタノール生産に有効に利用することができる。以下、本発明を詳細に説明する。本発明の酵母株は、マンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得るマンニトール資化性酵母株である。マンニトールからエタノールを生産する反応を図1に示す。本発明のマンニトールからエタノールを生産し得る酵母株の例として以下の株が挙げられる。SaccharomycesparadoxusNBRC0259、DebaryomyceshanseniiNBRC0794、KuraishiacapsulataNBRC0721、KuraishiacapsulataNBRC0974、OgataeaglucozymaNBRC1472及びOgataeaminutaNBRC1473。これらの株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門NBRCに保存されており、該機構より入手することができる。さらに、本発明のマンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株は、好ましくはエタノール耐性を有する。エタノール耐性はエタノール耐性化又はエタノール寛容化することによって付与される。例えば、エタノールを含有する培地中で馴養培養、及び紫外線照射によりランダム変異を誘発することにより、エタノール耐性株を得ることができる。本発明の酵母株は、085以上、好ましくは17以上、さらに好ましくは3以上、さらに好ましくは5以上、さらに好ましくは6以上、さらに好ましくは7以上、さらに好ましくは8以上、特に好ましくは85以上のエタノール存在下で生育することができる。さらに、本発明のマンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株は、好ましくは、アルギン酸からのエタノール発酵残渣における生育性を有する。エタノール発酵残渣における生育性は、生育阻害物質に対する耐性能が関与していると予測される。ここで、アルギン酸からのエタノール発酵残渣とは、アルギン酸を含む褐藻等の原料からアルギン酸資化能を有する微生物を用いてエタノールを生産した場合の、原料の残渣をいう。該残渣には、アルギン酸以外の褐藻の主要成分であるマンニトールやラミナリンが含まれる。アルギン酸資化能を有する微生物として、SphingomonasspA1株が挙げられ、該A1株にZymomonasmobilis等の細菌等のエタノール産生に関する酵素ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を導入したエタノール生産性SphingomonasspA1株によりアルギン酸からエタノールを産生し得る。エタノール生産性SphingomonasspA1株は、Takedaetal2011EnergyEnvironSci425752581や第WO2011024858号国際公開パンフレットに詳述されている。本発明のマンニトール資化性を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株は、上記のエタノール生産性SphingomonasspA1株を用いて褐藻を原料にしてエタノールを生産した後に残るマンニトールを含む残渣を原料として用いてさらにエタノールを生産することができるので、海洋バイオマスである褐藻を有効利用して大量のエタノールを生産することができる。褐藻を原料として用いて上記のアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物を用いてアルギン酸からエタノールを生産した後の残渣を用いて二段階発酵によりマンニトールからエタノールを生産してもよいし、褐藻由来の原料に上記のアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物と本発明のマンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株を同時に添加し、同時にアルギン酸及びマンニトールからエタノールを産生させてもよい。さらに、同時にラミナリン資化性を有し、ラミナリンからエタノールを生産し得る微生物を添加してもよい。また、褐藻を原料として用いて上記のマンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株を用いてマンニトールからエタノールを生産した後の残渣を用いて、上記のアルギン酸からエタノールを産生し得る微生物による二段階発酵によりアルギン酸からエタノールを生産することもできる。さらに、本発明のマンニトール資化能を有し、マンニトールからエタノールを生産し得る酵母株は、好ましくは、グルコース存在下での凝集能を有する。ここで、凝集能とは、細胞どうしが、お互いに可逆的に凝集して凝集物を形成する能力をいう。凝集能を有する株は、酵母菌体の回収が容易になるという利点がある。すなわち、遠心分離等の分離操作を必要としないので、回収にかかるコスト、エネルギー、労力の削減が可能になる。また、凝集能を有するようになった結果、エタノール耐性能が向上した事例も知られている。本発明の酵母株は7未満、好ましくは6以下、さらに好ましくは5以下、特に好ましくは3以下のエタノール存在下でも凝集性を有する。上記のように、本発明のマンニトール資化能を有しマンニトールからエタノールを産生し得る酵母は、さらに、以下の1~3の少なくとも1つの特性、すなわち1の特性、2の特性、3の特性、1及び2の特性、1及び3の特性、2及び3の特定、あるいは1及び2及び3の特性を有し得る:1エタノール耐性を有する;2アルギン酸資化能を有する微生物を用いて褐藻原料からエタノールを生産したときの残渣中で生育し得る;及び3グルコース存在下での凝集能を有する。上記の6株の酵母株のうち、エタノール生産性、エタノール耐性、アルギン酸からのエタノール発酵残渣における生育性及びグルコース存在下での凝集能が良好なSaccharomycesparadoxusNBRC0259株が好ましい。また、エタノール生産性及びエタノール耐性が良好なOgataeaglucozymaNBRC1472株も好ましい。本発明のマンニトール資化能を有する酵母株を培養することにより、エタノールを生産させることができる。該酵母株を培養する方法は、酵母の培養に用いられる通常の方法に従って行われ、公知の培地にマンニトールを添加すればよい。原料となるマンニトールは、終濃度1~10、好ましくは1~5、さらに好ましくは2~5の濃度で添加すればよい。また、培養中に経時的にマンニトールを添加してもよい。培養は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、20~40°C、好ましくは28~32°C、pH56~90、好ましくはpH56~84で数時間~数日間、例えば4~7日間行う。培地のpHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行えばよい。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養の際、酵母株はA600600nmにおける吸光度が培養開始時に005~11になるように、例えば005~5、好ましくは005~02、さらに好ましくは01になるように添加すればよい。上記の条件での培養により、培地中に01以上、好ましくは03以上、さらに好ましくは1以上、さらに好ましくは3以上、特に好ましくは35以上のエタノールが蓄積し得る。例えば、10のマンニトールを含む培地で培養した場合、最終的に3以上、特に好ましくは35以上のエタノールが蓄積し得る。また、培養により酵母も増殖し、培養終了時にA600は、01~33程度まで上昇する。さらに、褐藻等に含まれるアルギン酸からアルギン酸資化能を有する微生物を用いてエタノールを生産した場合に得られる原料の残渣を用いて培養することもできる。該残渣中には、アルギン酸資化能を有する微生物が資化できなかったマンニトールが含まれる。原料となる褐藻Phaeophyceaeとしてはマコンブ、ワカメUndariapinnatiflida、モズクNemacystusdecipiens、ホンダワラ、ヒジキ等が挙げられ、アルギン酸資化能を有する微生物としては、上記のZymomonasmobilis等の細菌等のエタノール産生に関する酵素ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を導入したエタノール生産性SphingomonasspA1株が例示できる。例えば、前記残渣中には、05~2程度の濃度のエタノール、1~10程度のマンニトールが含まれる。このような残渣に本発明のマンニトール資化能を有する酵母株を添加し培養する。この際、酵母株は、A600600nmにおける吸光度が005~11になるように、例えば1~11、好ましくは1~5、さらに好ましくは1~3になるように添加すればよい。培養は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、20~40°C、好ましくは28~32°C、pH56~90、好ましくは56~84で数時間~数日間、例えば4~7日間行う。例えば、培養4~7日間で、エタノール濃度は、1~5に達する。残渣中に存在していたアルギン酸から生産されたアルコールを差引いた値が、マンニトール資化能を有する酵母株により新たに産生されたエタノールである。マンニトール資化能を有する酵母株により産生されるエタノールにより、エタノール濃度は残渣中の濃度の15~3倍、好ましくは2倍程度になる。本発明ではこのようにアルギン酸からエタノールを生産させた原料の残渣を用いて残渣中のマンニトールからさらにエタノールを産生し、大量のエタノールを得る方法を二段階発酵という。褐藻を原料として用いてエタノールを生産する場合、褐藻からアルギン酸とマンニトールを抽出し、それを炭素源として用いて培養すればよい。また、褐藻を破砕し、この破砕物そのものアルギン酸とマンニトールを含むを炭素源として用いて培養してもよい。いずれの場合でも、褐藻は木質バイオマスなどとは異なりリグニンを含まないので、木質バイオマスなどの処理と比較すると比較的穏和な条件でアルギン酸とマンニトールを抽出し利用することが可能である。また、トウモロコシデンプンなどと比較しても、トウモロコシデンプンでは糖化行程が必要であるが、アルギン酸とマンニトールからのエタノール生産ではこの糖化行程が不要という利点がある。エタノールは、蒸留により回収することができる。また、エタノールの定量は、公知のアルコール脱水素酵素を用いた方法やガスクロマトグラフィーを用いた方法により行うことができる。上記酵母株を固定化して、エタノールを生産することもできる。微生物の固定化には、包括法、架橋法、担体結合法等がある。包括法とは微生物を高分子ゲルの微細な格子の中に包み込むか、あるいは半透膜性の高分子の皮膜によって被覆する方法であり、架橋法とは微生物を2個又はそれ以上の官能基を持った試薬多官能性架橋剤で架橋する方法であり、担体結合法とは水不溶性の担体に酵素を結合させる方法である。固定化に用いられる固定化担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、寒天、ゼラチン等がある。本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。実験方法培地と培養炭素源非含有培地は、イーストニトロジェンベース067、Leuドロップアウトサプリメント069gl、及びLロイシン100mglを含む。グルコース合成培地、マンニトール合成培地、グリセロール合成培地、及びラミナリン合成培地は、炭素源非含有培地にグルコース終濃度2、マンニトール同2、グリセロール同3、及びラミナリンSigma社製、製品番号L9634、Laminariadigitata由来、同2を加えた培地である。YP培地は、酵母エキス1及びトリプトン2を含む。pHはHClで調整した。YPD培地、YPM培地、及びYPG培地は、YP培地に各々グルコース同2、マンニトール同2、及びグリセロール同3を添加した培地である。炭素源とそれ以外の成分は、別々にオートクレーブ滅菌した後に混合した。特に言及しない場合は、2xYPを用いてこれらの培地を調製した。このとき、YPM培地のpHは57であった。10xYPはオートクレーブ滅菌ではなく、フィルター滅菌した。なお、2xYPを用いた場合のYPM培地のpHは78であった。固体培地では、これらに終濃度2となるように寒天を添加した。なお、培養は30°Cで行った。特に言及しない場合は、液体培地には、A600が01となるように細胞を接種し、YPD、YPM、及びYP液体培地を用いた培養は、50mlの液体培地を含む100mlの三角フラスコで、95strokesperminuteで振とうして行った。固体培地で前培養を行った場合は、培地上の細胞を滅菌水に懸濁してから、液体培地に接種した。酵母を25μgmlのエチジウムブロマイドで処理してミトコンドリアゲノムとYPG固体培地での生育性を欠失したρ0株を作製した。なお、正常なミトコンドリアゲノムを有する株をρ株と称する。嫌気培養は、角形ジャーをアネロパックケンキで嫌気状態にすることにより行った。エタノール生産性形質転換SphingomonasspA1株の培養は、5アルギン酸培地を用いて、既報に従って行った。ただし、培養開始時に粉末マンニトールを2あるいは5となるように添加した。培養3日後の培養液中の上澄み液を遠心分離により調製し、A1株によるアルギン酸からのエタノール発酵残渣とした。菌株本実施例では、マンニトール資化性酵母を探索するために、表1に示す研究室の酵母保存株48株を使用した。SaccharomycesparadoxusNBRC0259及びScerevisiaeBY4742のρ0株はエチジウムブロマイド処理により作製した。これらの酵母株は、YPD液体培地で培養後17グリセロール存在下で80°Cで保存した。エタノール生産性A1株としては、EPv104株を用いた。EPv104株は、SphingomonasspA1株の乳酸脱水素酵素遺伝子欠損株に、Zymomonasmobilis由来ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子8コピー及び同由来アルコール脱水素酵素遺伝子1コピーを広宿主ベクターpKS13を介して導入した、アルギン酸から最も高いエタノール生産性を示す株である。エタノール濃度測定エタノール濃度は、Fキットエタノールを用いて、キットに付属のプロトコルに従い測定した。ITS58SrDNA塩基配列の解析SparadoxusNBRC0259株のITS58SrDNA塩基配列のPCRによる増幅及び塩基配列の解析は株式会社テクノスルガラボに委託した。結果と考察マンニトール資化性エタノール生産酵母の探索マンニトール資化性エタノール生産酵母の探索の結果を図2に示す。YPD固体培地上で生育させた本発明者の研究室保存酵母48株を滅菌水に懸濁し、懸濁液5μlを合成固体培地へスポットして細胞を5日間培養した。目視で生育を観察した結果、グルコース合成固体培地では全ての株が良好に生育したが、炭素源非含有固体培地では全ての株が殆ど生育しなかった。また、表1で下線を付した14株がマンニトール合成固体培地で、炭素源非含有固体培地よりも良好な生育を示した。液体培地においても同様であった。マンニトール資化能を示さないS288Cの派生株ScerevisiaeBY4742株は、マンニトール合成固体及び液体培地で、炭素源非固体及び液体含有培地よりも良好な生育を示さなかった。なお、14株の内、PpolymorphaIFO0195、PfarinosaNBRC0193、PhaplophilaNBRC0947、PsaitoiIAM4945、HsaturnusIFO0177、DhanseniiIFO0023、及びYlipolyticaNBRC0746の7株では、マンニトール及びグルコース合成液体培地で膜を形成した。SparadoxusNBRC0259株は、グルコース液体培地において凝集性を示した。同株は、マンニトール合成液体培地においても若干の凝集性を示した。次に、BY4742株及びマンニトール資化性酵母14株をマンニトール合成液体培地で3日間静置培養し、培養液上澄みのエタノール濃度を測定した。NBRC0259、KcapsulataNBRC0721、KcapsulataNBRC0974、OglucozymaNBRC1472、OminutaNBRC1473、及びDhanseniiNBRC0794各6株のみが、少なくとも44mgl以上のエタノールを生産した。他の8株は、7mgl以下のエタノール生産性しか示さなかった。マンニトールからのエタノール生産性は、NBRC0259株が他よりも顕著に高かった。同6株及びBY4742株をグルコース合成液体培地、ラミナリン合成液体培地、並びに5及び7エタノールを含むマンニトール合成液体培地で3日間静置培養した。同6株のグルコースからのエタノール生産性は、マンニトールからのそれよりも高かった。とりわけNBRC0259株は、同6株の中で最も高いグルコースからのエタノール生産性を示した。NBRC0259株以外の5株はラミナリンからのエタノール生産性も示した。マンニトール合成培地における3日間の培養では、同6株は7エタノール存在下で生育性を示さなかったが、5エタノール存在下では、NBRC0259株、KcapsulataNBRC0974株、及びOglucozymaNBRC1472株は生育性を示した。5エタノール存在下においても、NBRC0259株は凝集性を示した。マンニトール資化における酸素要求性マンニトール資化における酸素要求性を図3に示す。本実施例で見出したマンニトール資化性エタノール生産酵母6株がマンニトール資化に酸素を必要とするかどうかを調べるため、これらをエチジウムブロマイドで処理して、ρ0株の作製を試みたところ、NBRC0259株のみρ0株が作製できた。そこで、NBRC0259並びにBY4742のρ0及びρ株を用いて嫌気及び好気条件下における合成培地での生育性を調べたところ、既報に一致して、NBRC0259株はマンニトール合成培地での生育に酸素及び呼吸能を必要とすることが分かった。さらに、通常大気条件下並びにYPG及びYPM固体培地において、同株のρ株は生育できたが、ρ0株は生育できなかった。本結果は、YPM固体培地を用いたNBRC0259ρ株の選抜が可能なことを意味した。一方、NBRC0259株以外の5株の嫌気及び好気条件下における合成培地での生育性を調べたところ、いずれも嫌気条件ではマンニトール合成培地及びYPM固体培地で生育性を示さなかった。本結果から、NBRC0259株以外の5株もマンニトールの資化に酸素を必要とすることが明らかとなった。酵母におけるマンニトール資化では、マンニトールがマンニトールデヒドロゲナーゼのはたらきでフルクトースに変換される過程で1分子の余剰NADHが形成されるが、この余剰NADHのNADへの再生に酸素が必要とされるものと考えられている。マンニトール資化性エタノール生産酵母に関しても、同様の理由でマンニトール合成培地やYPD培地での生育に酸素を必要としたと推察された。他方、NBRC0259株以外の5株は、嫌気条件においてグルコース合成培地及びYPD固体培地でも生育性を示さなかった。NBRC0259以外の5株は、NBRC0259とは若干異なる様式でグルコースを資化している可能性が示唆された。マンニトール資化性エタノール生産酵母によるエタノール生産図4は、マンニトール資化性エタノール生産酵母によるエタノール生産を示す図である。マンニトール資化性エタノール生産酵母6株のエタノール生産能を更に詳細に調べた。以降はYPM培地を基本培地とした。同6株はマンニトール培地での生育に酸素を必要としたので、YPM液体培地を用いて、95spmで振とう培養して生育性とエタノール生産性を調べたところ、NBRC0259株とOglucozymaNBRC1472株が高い生産性を示した。ただし、両株、とりわけOglucozymaNBRC1472株は長期間培養すると培養液中のエタノール濃度が著しく低下した。DhanseniiNBRC0794株のエタノール生産性は最も低かった。次に、A1株によるアルギン酸からのエタノール発酵残渣からのエタノール生産を目的として、2マンニトールを含む発酵残渣における同6株の生育性とエタノール生産性を調べた。同発酵残渣のpHは864と弱アルカリ性を示した。これに、10xYPを110容量添加して培養を開始した。なお、初期エタノール濃度は96glであった。しかしながら、生育性を示したのはNBRC0259株とDhanseniiNBRC0794株のみであった。培養7日後の培養液上澄みのエタノール濃度は全て初期エタノール濃度を下回った。さらにNBRC0259株は凝集性を示した。発酵残渣での生育性が弱い理由として、同6株ともにpH78の弱アルカリ性YPM培地では生育したことから、同残渣のpHが原因ではなく、発酵残渣に含まれる何らかの成分が生育を阻害したと推察された。DhanseniiNBRC0794株は同発酵残渣で生育性は示したが、マンニトールからのエタノール生産性が最も低い株であった。以上の結果より、NBRC0259株は、ラミナリンからのエタノール生産性こそ示さないものの、グルコース及びマンニトールからの高いエタノール生産性、エタノール耐性、及びA1株によるアルギン酸からのエタノール発酵残渣における生育性を示したため、6株の中では最も優良な株と判断された。次に優良な株として、ラミナリンからのエタノール生産性、グルコース及びマンニトールからの高いエタノール生産性、及びエタノール耐性を示した、OglucozymaNBRC1472株が考えられた。ただし、本NBRC1472株は、長時間の培養により培養液のエタノール濃度が激減すること、及び発酵残渣での生育性を示さないという望ましくない特性を示した。さらに、マンニトールからのエタノール生産性が報告されているScerevisiaeプロピロイドBB1株及びPangophoraeの、マンニトールからのエタノール生産に関しては、本実施例ほど詳細に報告されていない。さらに、エタノール耐性やアルギン酸からのエタノール発酵残渣における生育性も不明である。これらの理由から、NBRC0259株を以降の研究に用いることにした。本研究で用いているNBRC0259株のITS58SrDNA塩基配列は、データベースに登録されているSparadoxusNBR0259株の同配列と100の相同性を示した。一方で、ScerevisiaeS288C株の同配列とは989の相同性を示した。NBRC0259株によるマンニトールからのエタノール生産図5は、NBRC0259株によるマンニトールからのエタノール生産を示す図である。NBRC0259株のマンニトール資化能を更に調べた。BY4742ρ株を対照として用いた。YPD及びYPM固体培地で前培養したNBRC0259株はマンニトール合成液体培地で生育したが、BY4742株は生育できなかった。また、NBRC0259株は2グルコース液体培地では凝集性を示した。次に、YPM液体培地を用いてエタノール生産条件を調べた。YPD固体培地上で形成されたNBRC0259株のシングルコロニーは、高い頻度でYPM固体及び液体培地での生育能を喪失した。これは、NBRC0259株がYPD固体培地上ではミトコンドリアゲノムを欠失あるいは損傷しやすい特性を持つことを示唆した。そこで、以降はYPM固体培地上で選抜したNBRC0259ρ株を用いた。同株はマンニトールの資化に酸素を要求したため、同株をYPM液体培地で0spmで静置培養、並びに95及び145spmで振とう培養して、生育性とエタノール生産性に対する培養中の通気量の影響を調べた。その結果、既報に一致して、通気量が多いほど生育性も高くなった。しかし、エタノール生産性は95spmで適度な酸素を供給した場合に最も高く、0及び145spmで培養した場合には殆どエタノール生産性が見られなかった。一方で、グルコースを基質とした場合、すなわちYPD液体培地では、0及び95spm両方において、マンニトールの場合よりもより高い生産性を示した。また、YPD液体培地でも明瞭な凝集性が観察された。振とう速度を95spmとして、マンニトール濃度の影響を調べたところ、10マンニトールから最大376glののエタノールが生産された。これは、マンニトールからのエタノール生産量としては最大であった。また、2及び5のNaCl存在下でエタノール生産性の顕著な低下は見られなかった。次に、NBRC0259株の前培養条件の、生育性とエタノール生産性に対する影響を調べた。すなわち、YPM固体培地で前々培養した同株をYPM又はYPD液体培地で2日間前培養して得られた菌体を洗浄後YPM液体培地に接種したところ、YPM液体培地で前培養した菌体を用いた方が、YPD液体培地で前培養した場合よりも高い生育性とエタノール生産性を示した。すなわち、エタノール生産性は、前者が培養6日で67glであったが、後者は6日でわずか035glであり培養12日でようやく52glに達したに過ぎなかった。5マンニトールを含むアルギン酸からのエタノール発酵残渣45mlに2xYPを5ml添加した培地にNBRC0259株を初期A600が20となるよう添加して培養したところ、培養4日で培養液上澄みのエタノール濃度は169gl、培養7日では140glとなった。すなわち、二段階発酵により残渣中のマンニトールから94glのエタノールが新たに生産された。二段階発酵の条件の改善による、さらなるエタノール生産性の向上が期待された。