"アデノウイルス因子に対して遺伝子が運搬されるべき宿主による中和活性を回避するか、あるいは消滅させる能力を有する、アデノウイルス血清型35因子又はその機能的同等物の少なくとも1つと、興味ある遺伝子とを含有する遺伝子運搬担体。薬剤として使用するためのアデノウイルス血清型35若しくはその機能的相同物又はそれら由来のキメラウイルス、又は、前記ウイルス、その相同物若しくはそのキメラに基づく遺伝子運搬担体。前記因子がアデノウイルス35E3発現産物又はそれらをコードする遺伝子を含む請求項1記載の遺伝子運搬担体。前記因子がアデノウイルス35繊維、ペントン及び/又はヘキソンタンパク質、又はいずれかをコードする遺伝子を含むことを特徴とする請求項1又は3項に記載の遺伝子運搬担体。少なくとも1つの他のアデノウイルスを有するアデノウイルス35のキメラである請求項1,3、又は4のいずれか1項に記載の遺伝子運搬担体。アデノウイルス35と異なるトロピズム向性を有する請求項1、3,4又は5のいずれか1項に記載の遺伝子運搬担体。請求項1又は3~6項のいずれか1項による遺伝子運搬担体、又は請求項2によるウイルス、相同物、又はそのキメラの少なくとも機能的部分をコードする核酸。遺伝子が運搬されるべき宿主によるアデノウイルス因子に対する中和活性を回避するか、あるいは消滅させる能力を有する、アデノウイルス血清型35因子又はその機能的同等物の少なくとも1つをコードし、かつ、その中に興味ある遺伝子を導入するための部位を有する核酸。さらに少なくとも1つのITRを含む請求項7又は8記載の核酸。さらに、相同性組み換え用に設計されるか、または使用可能なヌクレオチドの領域を含む請求項7,8又は9に記載の核酸。核酸の一組が、互いに単一相同組み換え可能であり、機能的遺伝子運搬担体をコードする核酸を誘導することを特徴とする請求項7~10に記載の核酸を含む2つの核酸の少なくとも一組。請求項7~10のいずれか1項に記載の核酸、又は請求項11に記載の1組の核酸を含有する細胞。請求項7~10のいずれか1つによる核酸又は請求項11による核酸の一組を欠くアデノウイルス複製用の必須因子を補足する請求項12記載の細胞。PER.C6細胞ECACC寄託番号96022940由来であることを特徴とする請求項12又は13記載の細胞。請求項12又は13に記載の細胞を培養し、生じた遺伝子運搬担体を収穫することを含む請求項1、又は3~6項に記載の遺伝子運搬担体を生産する方法。適当な培地において請求項12又は13に記載の細胞を培養し、生じた遺伝子運搬担体を収穫することを含む請求項1、又は3~6項に記載の遺伝子運搬担体を生産する方法。請求項15又は16に記載の方法によって得ることが可能な遺伝子運搬担体。アデノウイルス及び組込みウイルスのキメラ由来であることを特徴とする請求項1、3~6、又は17のいずれか1項に記載の遺伝子運搬担体。前記組込みウイルスが、アデノ随伴ウイルスであることを特徴とする遺伝子運搬担体。アデノウイルス16又はその機能的同等物の部分を決定するトロピズム向性を有する請求項1、3~6、又は17~19のいずれか1項に記載の遺伝子運搬担体。薬剤として使用するための請求項1、3~6、又は17~20のいずれか1項に記載の遺伝子運搬担体。請求項1、3~6、又は17~20のいずれか1項に記載の遺伝子運搬担体、及び適当な賦形剤を含む薬剤配合物。請求項2に記載のアデノウイルス、そのキメラ、又はその機能的相同物、及び適当な賦形剤を含む薬剤配合物。これらの特徴に基づき、ヒト目的細胞内への生体内遺伝子運搬用の好ましい方法は、アデノウイルスベクターを遺伝子運搬担体として応用することである。しかしながら、アデノウイルスのヒトにおける治療の使用に関してなお欠点を有する。主な欠点は、アデノウイルスに対して個体間に広範に予め存在する免疫の存在である。野生型アデノウイルスへさらされることは、広範に提供されているように、ヒトに非常に一般的なことである。このさらされることは、大部分のアデノウイルス型、個体が実際にさらされたアデノウイルスに対するもののみならず、同様のエピトープを有するアデノウイルスに対しても免疫反応を生ずる。ヒトに予め存在する抗体のこの現象と、ウイルスに対する強い二次的体液性及び細胞性免疫反応との組み合わせは、組み換えアデノウイルスベクターを使用する遺伝子運搬に深刻な影響を与える可能性がある。現在まで、合計で51の明確なアデノウイルス血清型を含むヒトアデノウイルスの6つの異なるサブグループが、提案されている。血清型は、動物の抗血清に対する質的な中和によって決定されるときその免疫学的示差性に基づき特徴付けられる。もし中和が、2つのウイルス間の交差反応をある程度示すなら、血清型の示差性は、A赤血球凝集素-阻害の交差反応を欠くことによって示されるように、赤血球凝集素が無関係であるか、又はBDNAにおける実質的な制物理学的/生物化学的な違いが存在するかと仮定される。最後に明らかにされた9つの血清型は、最初にHIV感染患者から単離された。十分に理解されていない理由として、大部分の免疫能のない患者は、免疫能のある個体からはほとんどないか一度も単離されていないアデノウイルスを減少させる。大量の個体は、以前にアデノウイルス、とくに十分に調査されたアデノウイルス血清型5及び型2又は免疫学的に関連する血清型にさらされている。重要なことには、これらの2つの血清型はヒト遺伝子治療において使用するために大部分広範に研究もされている。それが、このような欠点が少なく、好ましくはこのような欠点を回避する、アデノウイルス35又はその機能的相同物の因子によってそのような遺伝子運搬担体に対する免疫を導く因子を置き換える限り、他のウイルス由来である。本発明において、遺伝子運搬担体は、宿主細胞に興味ある核酸を運搬する能力を有するいずれかの担体である。本発明によれば、それは、そのような担体に対する免疫反応に関して有益な効果を有していなければならないアデノウイルス35因子又はそのような因子の機能的同等物を含まなければならない。それらが共に興味ある前記核酸を運搬する能力を有する限り、基本的に、担体を造る他の因子は、当業界で既知か、当業界で開発されたいずれの因子とすることができる。原則的に、当業者は、アデノウイルス分野において適用することができるか適用されたいずれかのウイルス産物又は生産系を使用及び/又は生産することができる。典型的に、本発明の生産物は、例えばアデノウイルス5、典型的にはアデノウイルス35に基づくベクターに使用可能なパッケージング細胞において製造することができ、他のアデノウイルス、例えば、アデノウイルス2及び又は5のものと同様の方法で生産及び又は使用する事ができる。最小のベクター、パッケージング系、細胞内増幅、ベクター及びプラスミドベース系の可能性の良好な概要は、ここで参照として組み込む出願人の同時係属出願において見出すことができる。どのウイルス運搬系もウイルス運搬できるような本発明による因子を与えていない。両方の種類の系は、多くの異なるセットアップにおいて当業界において周知であり、それゆえ、ここでさらなる説明は必要としない。多くの異なる系及びそれらの特性に関する概要は、ここで参照により組み込むRobbinsGhivizzani及びPrinceにおいて見出すことができる。典型的に遺伝子運搬担体は、興味ある核酸を含む。興味ある核酸は、遺伝子、又は遺伝子の機能的部分、遺伝子の前駆体、又はいずれかの核酸レベルにおいて転写された遺伝子とすることができる。興味ある遺伝子は、当業界において既知であり、治療タンパク質をコードするもの、例えば、TPA、EPO、サイトカイン、抗体、又はその誘導体などを典型的に含む。遺伝子治療において適用される治療タンパク質の概要を以下にリストする。腫瘍特異的抗原、サイトカインなどの免疫刺激因子、抗血管因子、限定する例ではないが、エンドスタチン、アンジオスタチン、ATFBPTICDT6、優勢なマイナスVEGF突然変異体など。血管因子、限定する例ではないが、VEGF、線維芽細胞増殖因子、一酸化窒素シンターゼ、C型ナトリウム排泄増加ペプチド、など。さらに、炎症促進サイトカインのアンタゴニスト、例えば、IL-1RA、及びsIL-1RI、sIL-IRII、sTNFRI及びsTNFRIIなどの可溶性受容体を使用することができる。可溶性CD40、FasL、IL12、IL10、IL4、IL13等の炎症阻害タンパク質、CD4、CD5、CD7、CD52、Il2、IL1、IL6、TNFなどの分泌された単一鎖抗体又は、自動反応T細胞上のT細胞受容体への分泌した単一鎖抗体。PMLの優勢マイナス突然変異体を免疫反応を阻害するのに使用することができる。さらに、たとえば、IL1RA、及びsIL-1RI、sIL1RII、sTNFRI及びsTNFRIIのような可溶性受容体等の炎症促進サイトカインのアンタゴニストを使用することができる。ceNOSmBc13カクタス、及びIκBα、β、又はγ等の成長及び又は免疫反応阻害遺伝子、鳥貧血ウイルスのVP3タンパク質などのアポトーシス誘導タンパク質も使用することができる。さらに、HSV-TKなどの自殺遺伝子、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、及びレナメラーゼを使用することができる。興味ある核酸は、宿主細胞に存在する核酸配列とハイブリダイズすることが可能な核酸とすることができ、それによって、前記核酸の発現、転写、又は翻訳を抑制する。協調した抑制を通してもブロックすることができる。つまり、興味ある核酸は、それが、その細胞による反応を誘導するために、細胞を生産したいと欲するいずれかの核酸であり、そのような反応は、タンパク質の生産、そのようなタンパク質の阻害、アポトーシス、壊死、増殖、違いなどかもしれない。本発明は、治療用途用のアデノウイルス35又はその機能的相同物を開示するための最初のものであり、したがって、本発明は、薬剤として使用するためのアデノウイルス血清型35、又はその機能的相同物、又はそれら由来のキメラウイルス、又は前記ウイルス、その相同物、又はそのキメラに基づく遺伝子運搬担体を提供する。本発明の血清型は、アデノウイルス35であり、それ自体は当業界において既知である。後天性免疫不全症候群及び他の免疫不全障害を持つ患者から単離するアデノウイルスは、一般的でないグループBである。Ad35は、病原特性に関してより完全に特徴付けられたサブグループCから異なることが示された。Ad35のDNAは、一部クローン化され、マップ化された。34及び35などのB型アデノウイルス血清型は、他の血清型と異なるE3領域を有する。典型的にこの領域は、アデノウイルス産物への免疫反応を抑制することと関係する。したがって、本発明は、本発明による遺伝子運搬担体を提供し、それによって、前記因子は、免疫反応回避又は消滅することに関連して、アデノウイルス35E3発現産物又はそれらをコードする遺伝子又はいずれか若しくは両方の機能的同等物を含有する。免疫反応に関連するアデノウイルスの別の部分は、キャプシド、特にタンパク質及び又はヘキソンタンパク質である。したがって、本発明は、本発明による遺伝子運搬担体を提供し、そのために、因子は、少なくとも1つのアデノウイルス35キャプシドタンパク質又はその機能的部分、例えば、繊維、ペントン、及び又はヘキソンタンパク質、又はそれらの少なくとも1つをコードする遺伝子を含有する。免疫反応に対して関連する全てタンパク質が、アデノウイルス35起源である必要はない。アデノウイルス繊維、ペントン又はヘキソンタンパク質の一部を別の繊維、ペントン、又はヘキソンの中に挿入することも明白に可能である。したがって、キメラタンパク質が得られる。あるアデノウイルスのペントン、別のものからのヘキソン、さらに別のアデノウイルスからの繊維、又はE3領域を有することも可能である。本発明によれば、それらをコードするタンパク質又は遺伝子の少なくとも1つは、アデノウイルス35又はその機能的相同物由来の因子からなり、そのために前記因子は、宿主の免疫反応に効果を有する。したがって、本発明は、少なくとも1つの他のアデノウイルスを有するアデノウイルス35のキメラである本発明による遺伝子運搬担体を提供する。この方法において、生じたウイルスを他の側面において免疫反応のみを変更することもできる。その代わりに有益な因子で感染の効率を高めることができる。パッケージング細胞での複製を高めたり、そのトロピズムを変えることができる。したがって、本発明は、例えば、アデノウイルス35と異なるトロピズムを有する遺伝子運搬担体を提供する。もちろん、トロピズムは、遺伝子運搬担体が、宿主細胞、すなわち、標的細胞の下位集団へ優先的に運搬されるように好ましく変化させるべきである。本発明においてアデノウイルス又は他の遺伝子運搬担体を適用することもできるトロピズムの変更及び他の変更は、ここで参照として組み込む出願の同時係属出願に開示されている。もちろん、本出願は、例えば、本発明の遺伝子運搬担体及び又はキメラになるために必要な及び/又は役立ついかなる全ての基礎的要素も提供する。これは、Ad35又はその機能的相同物に適合されないが、PERC6などの細胞、又はそれを基礎とした細胞などのパッケージング細胞を含む。それは、アデノウイルス35又はその機能的相同物の機能的部分、例えば、ITRなどの興味ある遺伝子を含有するベクターはもちろん、ヘルパー構築物、及びパッケージ構築物などをコードするいずれの核酸も含まれる。典型的には、ここで参照として組み込む出願人の出願は、創作された遺伝子運搬担体を達成するのに必要で有益な因子を開示する。したがって、本発明は、本発明による遺伝子運搬担体、又は本発明によるウイルス、相同物、そのキメラの少なくとも機能的部分をコードする核酸も提供する。本発明によれば、生じた遺伝子運搬担体となるであろう機能をコードする当該因子は、遺伝子が運搬されるべき宿主によるアデノウイルス因子に対する中和活性を回避又は消滅することを担う、アデノウイルス血清型35又はその機能的同等物の少なくとも1つをコードする核酸を含有するか、又は当該核酸によってコードされなければならない。典型的には、興味ある遺伝子は、同様の核酸に存在し、それは、当該核酸がそのような遺伝子を有するか、その中に興味ある遺伝子を導入する部位を有することを意味する。典型的には、当該核酸は、少なくとも1つのITR及びもしそれがパッケージングすべき核酸ならパッケージングシグナルも含有する。しかしながら、以前に述べたように、本発明のための全ての必要で役立つ因子及び又は基礎的要素は、出願人の出願に見出すことができる。アデノウイルス遺伝子運搬担体の分野における更なる改善の一組は、以前にここで述べたPCTNL9900235に開示された出願人のプラスミド系である。この系は、1つの実施態様において、共に遺伝子運搬担体に組み込まれた核酸の全ての因子を含有するアダプタープラスミド及びより長いプラスミドの相同組み換えとして機能する。これらの方法は、本創作遺伝子運搬担体及びそれらの基礎的要素に適用することもできる。したがって、本発明は、好ましくは、本発明による核酸を含有する2つの核酸の少なくとも1組の部分として、さらに相同組み換え用に設計し使用するヌクレオチドの領域を含有する本発明による核酸を提供し、そのために、前記核酸の1組は、互いに単一相同組み換え可能であり、機能的遺伝子運搬担体をコードする核酸となる。パッケージされるべき本発明によるベクターを含む細胞はもちろん、両方のからのパッケージング細胞を提供する。それゆえ、本発明は、本発明による核酸又は本発明による核酸の1組を含む細胞も包含し、好ましくは、パッケージされるべき核酸、又は本発明による核酸の1組から欠くアデノウイルス複製用に必要な因子を補足する細胞である。本発明において、翻訳において、アデノウイルス5タンパク質を与える細胞の複製能を欠く、E1欠如したアデノウイルス35ベクターを見出した。したがって、本発明は、翻訳においてアデノウイルス35E1タンパク質を提供する能力を有する細胞を更に提供する。当該細胞は、典型的には、網膜又は腎臓から引き出したヒト細胞である。羊水細胞などの胚細胞は、E1補足細胞カブの発生に特に適することが示された。そのため当該細胞は、本発明において好ましい。E1タンパク質による血清型特異的相補性は、E1領域によってコードされる1又はそれ以上のタンパク質のためであるということができる。そのため、少なくとも血清型特異的タンパク質を翻訳の際に相補性細胞株を与えることは本質的なことである。E1欠如アデノウイルスの効果的な相補性のために本質的な非血清型特異的E1タンパク質を他のアデノウイルス血清型から引き出すことができる。好ましくは、アデノウイルス35のE1B領域由来の少なくともE1タンパク質を翻訳においてE1欠如アデノウイルス35系ベクターを補足するために提供する。1つの実施態様において、1又はそれ以上の血清型特異的E1タンパク質をコードする核酸を、PERC6細胞又はPERC6細胞由来の細胞、又はAd35又はその機能的相同物由来の因子を補足する同様のパッケージング細胞の中へ導入する。本既に言及したように、本発明は、本発明による細胞において本発明の核酸を発現し、生じた遺伝子運搬担体を収穫することからなる本発明による遺伝子運搬担体を生産するための方法を含む。上記は、からのパッケージング細胞を関連核酸で充填することに関する。充填した細胞の構成は、もちろん本発明の一部であり、本発明による充填したパッケージ細胞を適当な培地で培養し、生じた遺伝子運搬担体を収穫することからなる、本発明による遺伝子運搬担体の製造方法を提供する。本発明によるいかなる方法によって得られた生成遺伝子運搬担体、特に、アデノウイルス及び組込みウイルスのキメラ由来の本発明による遺伝子運搬担体も、もちろん本発明の一部である。アデノウイルス遺伝子運搬担体は、通常宿主ゲノムに組み込まれないのは周知である。長期間の宿主細胞内での遺伝子の発現について、そのような能力を有するキメラを調製することは好ましい。当該キメラは、ここで参照として組み込む、出願人の同時係属出願PCTNL9800731に開示されている。アデノウイルスと組込みウイルスの当該キメラの好適な例としては、前記組込みウイルスが、アデノ随伴ウイルスである。ここで以前に述べたように、上記と組み合わせることもできる他の役立つキメラは、変更したトロピズムを有するキメラである。その好適な例は、おそらく、例えばAd2又はAd5由来の因子を持つAd35及びAd16のキメラであり、Ad16又はその機能的同等物の部分を決定するトロピズムを、遺伝子運搬担体をここで参照として組み込むシノビオサイト及び又は平滑筋細胞へ誘導するのに使用することができる。樹状細胞、造血幹細胞遺伝子運搬担体由来のAd2又はAd5と容易に形質導入しない。本発明は、DC細胞及びHSC細胞の向上した形質導入能力を持つ遺伝子運搬担体を提供する。このような遺伝子運搬担体は、Ad35アデノウイルスの部分を決定する組織トロピズムを含む。それゆえ、本発明は、樹状細胞及び/又は造血幹細胞を形質導入するためのアデノウイルス35キャプシドの部分を決定する組織トロピズムの使用を提供する。他のB型アデノウイルスも適する。組織トロピズム決定部分は、少なくとも繊維タンパク質のノブ及び又はシャフトを含む。もちろん当業者にとって繊維タンパク質中の組織トロピズムを担うアミノ酸配列を決定することは、明白に可能である。当該知識は、このようなアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を構築するのに使用することができる。そのために、このようなキメラタンパク質も本発明の一部である。DC細胞は、細胞を与える非常に有効な抗原である。遺伝子運搬担体を当該細胞に導入することによって、宿主の免疫系を特異的な抗原へ誘発することができる。このような抗原は、DCへ運搬された核酸又はそれ自身で遺伝子運搬担体のタンパク質によってコードすることができる。したがって、本発明は、ワクチンとして宿主免疫系へ上手く達成し得る能力を有する遺伝子運搬担体も提供する。ベクターは、それが標的細胞を効率的に見つけるために十分長い間、免疫系を回避する能力を有し、同時に、特異的抗原を抗原存在細胞へ運搬する能力を有し、それによって、特異的抗原に対する効率的な免疫反応の誘導及び又は刺激を可能とする。免疫反応を効率よく調節するために、遺伝子運搬担体は、免疫反応を調節する能力を有する当該タンパク質をコードするタンパク質及び/又は核酸を含有する。当該タンパク質の限定されない例は、インターロイキン、粘着分子、同時刺激タンパク質、インターフェロンなどのなかに見られる。したがって、本発明は、さらに本発明の遺伝子運搬担体を含有するワクチンを提供する。さらに、本発明は、DC及び/又はHSC、少なくともアデノウイルス血清型35の部分を決定する組織トロピズムを含有する担体を効率的に形質導入する能力を持つアデノウイルスベクターを提供する。さらに、本発明はHSC及び又はDC細胞の形質導入用の遺伝子運搬担体の使用を提供する。同様の組織トロピズムは、他のアデノウイルス血清型B、特に血清型11にも見られ、これもまた本発明の部分である。もちろん、組織トロピズム決定部分を有する他の遺伝子運搬担体を提供することも可能であり、それによって、向上したDC及び又はHSC形質導入能力を有する当該運搬担体を生産する。そのため、そのような遺伝子運搬担体も本発明の一部である。本発明による遺伝子運搬担体は、関心ある遺伝子又は核酸を宿主細胞へ運搬するのに使用することができる。これは典型的に、薬剤的使用であろう。そのような使用も本発明に含まれる。そのような使用に適当な組成物も本発明の一部である。投与当たり又は感染当たりに存在すべき必要な遺伝子運搬担体の量は、治療すべき状況、投与経路、被験者、感染の効率など、に依存する。適量決定研究は、当業界において周知であり、他の遺伝子運搬担体で既に行なわれているものを、本発明の遺伝子運搬担体の適当な投与量を見つけるための案内として典型的に使用する事ができる。典型的には、これは、ある人が適当な賦形剤、適当な投与手段、所望しない担体の感染を防ぐ適当な手段などを見出すことができるということである。したがって、本発明は、本発明によるアデノウイルス、そのキメラ、又はその機能的相同物と、賦形剤とを含有する薬剤配合物はもちろん、本発明による遺伝子運搬担体と、適当な賦形剤とを含有する薬剤配合物も提供する。上述したように、大部分の広範に研究されたアデノウイルスの血清型は、追加の遺伝物質を宿主に運搬するのに理想的に適していない。これは、部分的には、これらの血清型に対する集団の間に予め存在する免疫のためである。ヒトにおいて予め存在する抗体のこのような存在と、ウイルスに対する強い二次的体液性及び細胞性免疫反応との組み合わせは、アデノウイルス遺伝子治療に影響を与えるであろう。本発明は、遺伝子治療ベクターとして非常に適するアデノウイルスの血清型及びその機能ある相同物の少なくとも因子の使用を提供する。本発明は、多くの個体由来の血清に対して自動化高スループットスクリーニングも開示する。驚くべきことに、中和能力は、ある特定の血清型、アデノウイルス35に対して評価されたいずれの血清においても見出されない。これは、ヒトにおける遺伝子治療用ベクター系として極めて有益な本発明の血清型を作る。当該ベクター系は、予め存在する免疫の本来的な問題なしに、遺伝物質を効率的にヒト細胞へ運搬する能力がある。典型的には、ウイルスは、アデノウイルスベクターを使用して生産される。もちろん当該ベクターも、本発明の一部である。本発明は、E1領域を削除するか、不活性化することによって複製欠陥を与えられたアデノウイルス由来ベクターも提供する。もちろん、興味ある遺伝子を例えばベクターが引き出されたオリジナルのアデノウイルスのE1領域の部位で挿入する事もできる。本発明の全ての側面において、アデノウイルスは、E1領域の欠損、及びプロモータにどちらか、あるいはどちらも結合しない異質遺伝子の挿入を含むことができる。さらに、アデノウイルスは、E2、E3、又はE4領域の欠損しているもの。プロモーターに結合した異質遺伝子を挿入しているものも含まれる。この場合において、E2及び又はE4補足細胞株も組み換えアデノウイルスを生成するために要求される。ある者は、遺伝子治療に使用すべき組み換えアデノウイルスの調製用にAd35血清型それ自体を使用して選択することができる。あるいは、ある者は、当該組み換えアデノウイルスにおいて本発明の血清型由来の因子を使用するのに選択する事ができる。ある者は、例えば、異なる血清型から所望の特性を組み合わせたキメラアデノウイルスを開発する事ができる。いくつかの血清型は、幾分宿主の範囲に限定されるが、より少ない免疫源の利益を有し、いくつかはその他の回避法である。いくつかは、限られた病毒性の問題を有するが、広範な宿主範囲及び/又は減少した免疫原性を有する。当該キメラアデノウイルスは、当業界において既知であり、それらは本発明の範囲内にあることを意味する。したがって、1つの実施態様において、本発明は、予め存在する免疫を無くす、少なくとも本発明の血清型のアデノウイルスの一部、及び少なくとも別のアデノウイルス血清型由来のアデノウイルスゲノムを含有するキメラアデノウイルスを提供する。この方法において生産されたキメラアデノウイルスは、本発明の血清型の予め存在する免疫を欠如したものを別の血清型の他の特性へ組み合わせたようなものである。このような特性は、温度安定性、組み立て性、固着性、変更した感染、生産収率、変更又は改善した感染、標的細胞中のDNAの安定性などかもしれない。一般に、パッケージング細胞は、十分な量のアデノウイルスを生産するために必要とされるであろう。遺伝子治療目的の組み換えアデノウイルスの生産のために、いくつかの細胞株を利用することができる。これらは限定されないが、既知の細胞株PERC6、911293、及びE1A549を含む。本発明の重要な特徴は、アデノウイルスを生産する手段である。典型的には、複製コンピタントアデノウイルスを含むために臨床的用途用にアデノウイルスバッチを欲しない。それゆえ、一般的には、アデノウイルスベクターにおいてアデノウイルスゲノムから多量の遺伝子を省略すること、及びベクターがキメラアデノウイルスを生産するのに持ってきた細胞のゲノム中にこれらの遺伝子を供給することが望ましい。当該細胞は通常パッケージング細胞と呼ばれる。したがって、本発明によるアデノウイルスベクターに存在しないアデノウイルス生産用に必要な全ての因子を翻訳において含む、本発明によるアデノウイルスを生産するためのパッケージング細胞も提供する。典型的には、ベクター及びパッケージング細胞は、それらが全ての必要な因子を有する点で互いに適合されなければならないが、それらは重複因子を有さず、組み換えによって複製コンピタントウイルスを誘導する。それゆえ、本発明によるパッケージング細胞及び本発明による組み換えベクターを含有する部分のキットを提供し、そのため組み換えを導入する配列重複がないことが本質的であり、前記細胞と前記ベクターとの間の複製コンピタントアデノウイルスの生産を生じる。それゆえ、本発明は、適用上で予め存在するヒト免疫を回避するであろうアデノウイルスの製造方法であって、事実上天然の免疫が存在しないアデノウイルス血清型由来の因子を持つベクターを提供し、前記ベクターを本発明によるパッケージング細胞へ移入し、ウイルスの粒子を生産することを可能とする方法を提供する。1つの側面において本発明は、治療用途用に生体内で投与したアデノウイルスに対して、自然に存在するか又は誘導された、中和宿主活性を克服するための本発明のアデノウイルス血清型の使用を記載する。新規血清型への必要性は、1組み換えアデノウイルス血清型5の繰り返しの組織の運搬は、組み換えアデノウイルス血清型5に対する中和抗体の高い力価の形成のために成功しないこと、2予め存在するヒト免疫は個体間に広がっていること、という観察によって抑制される。別の側面において、本発明はワクチン注射目的用の本発明の遺伝子運搬担体の使用又はアデノウイルス血清型35の使用を提供する。このような使用は、少なくともある程度宿主の望ましくない免疫反応を妨げる。所望しない免疫反応の限定しない例は、遺伝子運搬担体又はアデノウイルス血清型に対する免疫反応を呼び起こすこと、及び/又は遺伝子運搬担体又はアデノウイルス血清型35に対する免疫反応の向上である。本発明の別の側面において、別の使用は、異なるサブグループに属するAdベクターからなる。したがって、本発明のこの側面は、遺伝子治療目的用のアデノウイルス投与を繰り返さないようにすることに取り組んでいる。実施例1ヒト血清における中和活性の検出用高スループット測定全てのウイルス血清型に対する、中和抗体の存在のために多量のヒト血清をスクリーニングするために、自動化96ウエル測定を開発した。ヒト血清100個体のパネルを選択した。被験者は、人種に制限されない20~60の間の健康的な個体であった。全ての被験者は同意書にサインをした。アデノウイルス研究に専門的に従事する人々は除外された。約60mlの血液を乾燥チューブ中に引き込んだ。サンプリング後2時間以内に、血液を2500rpmで10分間遠心分離した。約30ml血清をポリプロピレンチューブに移し、さらに使用するまで-20°Cで冷凍保存した。血清を解凍し、56°Cで10分間熱不活性化し、その後、繰り返しの冷凍解凍サイクルを避けるために部分標本とした。部分標本は、約70個の96ウエルプレートを調合するのに十分な量で、培地において2倍希釈の5段階工程を作るのに使用した。希釈していない血清及び希釈した血清の部分標本を深いウエルプレートの中へ滴下し、プログラムされたプレートメートを使用して100μl部分標本を96ウエルプレートの中に分配した。この方法でプレートを、以下のスキームに従いデュプロで8つの異なる血清を満たした。カラム1及び6中のS12~S82は、1×希釈した血清を示し、Sx4、Sx8、Sx16及びSx32は2倍希釈を示す。最後のプレートは、マイナスの対照例として100μl子牛血清を満たした4つのウエルも含む。プレートをさらに使用するまで-20°Cに保持した。ヒトアデノウイルスストックの調製全ての既知ヒトアデノウイルスのプロトタイプを、PERC6細胞で播種したT25フラスコでインキュベーションして、完全なCPEを収穫した。冷凍解凍後、12mlの粗い溶解物をPER.C6細胞をT80フラスコに播種するのに使用し、ウイルスを完全なCPEで収穫した。CPEの接種と出現との間の時間枠、ウイルスの量は、異なる血清型間の新しい培地に再感染するために必要とした。アデノウイルスストックを冷凍解凍によって調製し、34T175cm23層フラスコにPERC6細胞を播種するために使用した。CPEが発生した際に、細胞をフラスコを軽く叩いて収穫し、滴下し、ウイルスを、2段階CsCl勾配によって以下のように単離、精製した。細胞ペレットを50ml10mMNaPO4緩衝液に溶解し、-20°Cで冷凍した。37°Cで解凍後、56mlデオキシコール酸ナトリウムを加えた。溶液を穏やかに混合し、515分間37°Cでインキュベートし完全に細胞を溶解した。溶液を均質化した後、1875μl1MMgCl2を加えた。375μlDNアーゼの添加後、溶液を30分間37°Cでインキュベーションした。細胞残骸を1880xgで30分間RTで停止することなく遠心分離して取り除いた。次に、上清をタンパク質からフレオンを摘出して清浄にした。清浄にした上清を1Mトリス塩酸緩衝セシウムクロライドブロック勾配にのせ、21000rpmで25時間10°Cで遠心分離した。133grmlのセシウムクロライドの1Mトリス塩酸緩衝連続勾配を使用して、第2の精製を行なった後、ウイルスバンドを単離した。その後、ウイルスを17時間55000rpmで10°Cで遠心分離した。ウイルスバンドを単離し、スクロースを1の最終濃度へ加えた。過剰なセシウムクロライドを、CaCl2、MgCl2及び増加させた濃度のサッカロースを補った15ltrPBSに対して透析スライド中で透析によって除去した。透析後、ウイルスを-85°Cで貯蔵して25と100μllの部分に部分標本した後、ウイルスをスライドアライザーから除去した。1ミリリットル当たりのウイルス粒子の数を決定するために、50μlのウイルスバッチを、shabrametalに記載されたように、高速液体クロマトグラフィーにかける。0~600mMの範囲のNaCl勾配を使用してウイルスを溶出した。表1に述べたように、ウイルスは、NaCl濃度で血清型間でかなり異なって溶出した。大部分のヒトアデノウイルスは、2,3の例外を除き、PER.C6細胞によく複製した。アデノウイルス型8及び40を911E4細胞上で成長させた。精製したストックは、5×1010と5×1012ウイルス粒子mlの間で含んでいた。精製したヒトアデノウイルスストックの滴定アデノウイルスをPERC6細胞上で滴定し、5日間の中和測定期間で完全なCPEを得るのに必要なウイルスの量を決定した。これに関して、100μl培地を96ウエルプレートの各ウエルの中へ分配した。104、105、106、107倍に予め希釈した25μlのアデノウイルスストックを96ウエルプレートのカラム2に加え、10回のピペット上げ下げによって混合した。その後、25μlをカラム2からカラム3へ持っていき、再び混合した。これをカラム11から25μlを処分した後、カラム11まで繰り返した。このように5工程でいくつか希釈したものを予め希釈したストックから得られ始めた。その後、3×104PERC6細胞を、100μl体積で加え、プレートを37°Cで、5CO2で5又は6日間インキュベートした。CPEを顕微鏡でモニターした。RoadとMuenschの方法を使用して細胞培養阻害量50を計算した。並行して同一のプレートをセットアップしMTT測定Promegaを使用して分析した。この測定において生存する細胞を、比色分析染色によって定量した。ここに、20μlMTTをウエルに加え、37°Cで、5CO2下2時間インキュベートした。上清を取り除き、100μlの201イソプロパノール/トリトンX100溶液をウエルに加えた。促進させた染色を溶解するのに、プレートを3~5分間96ウエルシェイカー上に置いた。吸光度を540nmと690nmで測定した。この測定によって進行中のCPE又は完全なCPEを有するウエルを区別することができる。中和測定希釈したヒト血清サンプルを有する96ウエルプレートを37°Cで、5CO2下で解凍した。50μl当たり200CCID50へ希釈したアデノウイルスストックを調製し、50μl部分標本を血清を有するプレートのカラム1~11へ加えた。プレートを1時間37°Cで5CO2下でインキュベートした。その後、6×105mlの50μlPER、C6細胞を全てのウエルに調剤して、1日37°Cで5CO2下でインキュベートした。各列に対して清潔なピペットチップを用いて上清を除去し、血清の毒性影響を避けるために200μlの新鮮な培地をすべてのウエルに加えた。プレートを別に4日間37°Cで5CO2下でインキュベートした。加えて、類似の対照例プレートをデュプロにおいて、列A及びBにおいて試験した各血清型に特異的なウサギに発生し希釈したプラスの対照例血清、及び列C及びDにおいてマイナスの対照例血清を用いて、セットアップした。列EHのそれぞれにおいて滴定を、上で述べたように試験すべき各ウイルスの200CCID50で始まる5倍希釈工程で行った。5日目に対照例プレートの1つを顕微鏡とMTT測定で分析した。試験的な力価を顕微鏡観察した対照例滴定プレートから計算した。もしCPEが完全に検出されれば、すなわち、MTTによって分析された対照例力価実験での最初の希釈は、明白な細胞死を示すなら、すべての測定プレートは処理されている。もし違うなら、全てのプレートを進行させた後完全なCPEが明白になるまで1日又はそれ以上の日数処理させた。殆どの場合測定を5日間で終了した。Ad1、5、33、39、42及び43に対して、測定を6日間行い、d2に対して8日間であった。最も高い血清濃度で、血清なしの対照例に比較して40見られたとき、血清サンプルを中和性なしと見なす。100健康被験者からの血清に対して44プロトタイプアデノウイルスの分析結果を図1に示す。予想したように、Ad2及びAd5への中和抗体を含む血清サンプルの割合は非常に高かった。これは、大部分のより低い数のアデノウイルスに対して本当である。驚くべきことに、どの血清サンプルもアデノウイルス血清型35への中和抗体を含まなかった。血清型2634、及び48への中和抗体力価を持つ個体の数は、非常に低かった。そのため、Ad35又は他の上述した血清型に基づく組み換えE1欠如アデノウイルスは、中和抗体によるウイルスの一掃に関してAd5に基づく組み換えベクターに比較して重要な利点を有する。Ad35又は他の血清型の1つの相当するキャプシドタンパク質によって置換した宿主の免疫源反応を伴うキャプシドタンパク質を有するAd5系ベクターは、膨大なヒト血清によって中和され、少ないか等しくはないであろう。表1に見られるように、ml当たりのウイルス粒子から計算したVPCCID50の割合と、実験において各ウイルスに対して得られたCCUD50は、かなり多様であり、04~5logの範囲であった。これは、PER.C6細胞の異なる感染効率及びウイルスの複製効率における違いによっておそらく引き起こされる。さらにバッチの特性も重要な役割を演じるかもしれない。高いVPCCID50率は、多くのウイルスが5日間CPEを得るためにウエル上に置かれたことを意味する。結果として、より多くのウイルス粒子が抗体を防御したので、中和試験の結果は偏るかもしれない。この現象が生じるかどうかをチェックするために、VPCCID50割合を、測定においてプラスに見られた血清サンプルの割合に対してプロットした。図は、測定におけるウイルスの量と血清中の中和との間に否定的な相関関係がないことを明白に示す。実施例2組み換えウイルスの生産用のAd5プラスミドベクターの発生と、アデノウイルス遺伝子の容易な操作pBrAdBamrITRITR配列の平滑末端クローニングを容易にするために、野生型ヒトアデノウイルス型5DNAをクレノウ酵素で過剰のdNTPの存在下で処理した。クレノウ酵素による不活性、フェノール/クロロホルム抽出による精製、次いでエタノール調製の後、DNAをBamHIで消化した。このDNA調製物を、以下のように調製したpBr322由来ベクターDNAとのくくり反応においてさらに精製することなしに使用した。すなわち、pBr322DNAをEcoRV及びBamHIで消化し、TSAP酵素で処理することによって脱リン酸化し、LMPアガロースゲル上で精製した。コンピタントEcoliDH5αの中へ形質転換し、アンピシリン耐性コロニーの分析の後、Ad5のBamHI部位から右のITRへ広がる挿入物に対して予期されたような消化パターンを示す1つのクローンを選別した。右のITRのクローニング境界の配列分析は、ITRの大部分の3‘G残基が間違っていて、ITRの残りは、正しいと判明した。前記間違いのG残基は、他のITRによって複製中に補う。pBrAdSalrITRECACC寄託番号p97082119pBRAdBamrITRをBamHI及びSalIで消化した。アデノウイルス挿入物を含むベクター断片をLMPアガロースで単離し、wtAd5DNA由来の48kbSalI―BamHI断片へくくり、GenecleanIIキットを精製した。1つのクローンを選択し、完全なAd5配列を制限酵素分析によって決定した。クローンpBrAdSalrITRは、bP16746でSaiL部位からアデノ型5配列を含み、rITRを含む。pBrAdClaBamwtアデノ型5DNAを、ClaI及びBamHIで消化し、206kb断片を電気溶出によってゲルから単離した。pBr322を同じ酵素で消化し、アガロースゲルからGenecleanによって精製した。両方の断片をコンピタントDH5αの中へくくり形質転換した。生じたクローンpBrAdCla―Bamを制限酵素消化によって分析し、bp919から21566までのアデノウイルス配列を持つ挿入物を含むように示した。pBrAdAflIIBampBrAdAflII-BamをEcoRIで直線状にし、AflIIで一部消化した。AflIIを20分間65°Cで加熱不活性化後、断片末端をクレノウ酵素で満たした。その後、DNAを、PacI部位を含む平滑二本鎖オリゴリンカーにくくった。このリンカーは、以下の2つのオリゴヌクレオチド、すなわち、5’-AATTGTCTTAATTAACCGC3‘及び5’-AATTGCGGTTAATTAAGAC-3‘をアニーリングすることによって作り、次いでクレノウ酵素で平滑化した。緩衝液を変えるのにくくったDNAが析出した後、くくったものを過剰のPacI酵素で消化し、オリゴの結合を除去した。bp3534から21566までのAd5配列及びベクター配列を含有する22016bp部分的断片をLMPアガロースにおいて単離し、コンピタントDH5αの中へ再びくくり、形質転換した。PacI部位を含むことが見出されて、大きいアデノ断片を有する1つのクローンを選択し、5’末端で配列化し、PacIリンカーのAflII部位における正確な挿入を確かめた。pBrAdBamrITRpac♯2及びpBrAdBamrITRpac♯8クローンpBrAdBamrITRにAd5のITR近くのPacI部位の挿入を可能とするために、約190ヌクレオチドをpBr322骨格のClaI部位と、ITR配列の開始との間で除去した。これを以下のようにした。すなわち、pBr/AdBam-rITRをClaIで消化し、変更した長さの時間ヌクレアーゼBal31で処理した。ヌクレオチド除去の程度は、同一の緩衝液と状態を用いて、pBr322DNAでの分離反応によって従われる。Bal31酵素を75°Cで10分間インキュベーションすることによって不活性化し、より小さい容積のTE緩衝液で沈殿させ、再懸濁した。平滑末端を確実にするために、さらにDNAをT4DNAポリメラーゼで過剰なdNTPの存在下で処理した。pBr322DNAのSalIでの消化後、十分な分解を10分、15分間処理したサンプルにおいて観察した。その後、10分、又は15分処理したpBrAd、BamrITRサンプルを上述した平滑PacIリンカーにくくった。過剰のPacIで消化したくくったものを沈殿によって精製し、リンカーからLMPアガロースゲル上で分離した。くくった後、DNAをコンピタント5αの中へ挿入し、クローンを分析した。およそ所望の長さを欠く10個のクローンを選別し、さらにそれらをTトラックシークエンシングT7シークエンシングキット、PharmaciaBiotechによって分析した。2つのクローンをrITRの丁度下流で挿入したPacIリンカーで見出す事ができる。PacIで消化後、クローン♯2は28bpを有し、クローン♯8はITRに付着した27bpを有する。pWEAdAflIIrITRECACC寄託番号P97082116コスミドベクターpWE15Clontechをより大きいAd5挿入物をクローン化するのに使用した。最初に、特有のPacI部位を含むリンカーを、pWEpacを作製するpWE15のEcoRI部位に挿入した。この末端で、pBrAdAflIIBamHIに対して述べたような二本鎖PacIオリゴを使用したが、なお、そのEcoRI突出末端を有していた。その後、以下の断片、すなわち、PacIで消化したpWEpac、PacIとBamHIで消化したpBrAflII-Bam、及びBamHIとPacIで消化したpBrAflIIBamを電気溶出によって、アガロースゲルから単離した。これらの断片を、製造者のプロトコールによるλファージパッケージング抽出物Stratageneを使用して共にくくった。宿主バクテリアに感染させた後、コロニーをプレート上で成長させて、完全な挿入物の存在を分析した。pWEAdAflIIrITRは、右ITRを含めbp3534からアデノウイルス型5配列を全て含んでいる。pBrAdlITRSalECACC寄託番号p97082115アデノ5wtDNAをクレノウ酵素で過剰なdNTPの存在下で処理し、次いでSalIで消化した。それぞれ、左ITRSal及びSal右ITR設計した生じた断片2つを、LMPアガロースで単離した。PBr322DNAをEcoRV及びSalIで消化しファスファターゼで処理した。Geneclean法を使用して、ベクター断片を単離し、Ad5SalI断片へくくった。94kb断片を有するくくったものだけが、挿入物を持つコロニーを与えた。クローニングの境界を分析し、シークエンシングした後、完全なITR配列を含み、bP9462でSalI部位へ拡張したクローンを選択した。pBrAdlITR-SalECACC寄託番号P97082118pBrAdlITR-SalをSalIで消化して、脱リン酸化した。このクローンをAd5において3番目のSal部位まで延長するために、pBrAdCla-BamをBamHIで直線状にしてSalIで一部消化した。946216746からのアデノウイルス配列を含む73kbSalI断片を、LMPアガロースゲル中で単離し、SalI消化したpBrAdlITRSalベクター断片にくくった。pWEAdAflIIEcoRIpWEpacをClaIで消化し、5’突出末端をクレノウ酵素を使用して満たした。その後、このDNAをPacIで消化し、アガロースゲルから単離した。pWEAflIIrITRをEcoRIで消化し、クレノウ酵素で処理後、PacIで消化した。アデノウイルス配列含有の大きな24kbフラグメントをアガロースゲルから単離し、ClaIで消化および平滑化したpWEpacベクターにクローンテック社ClontechからのリゲーションエクスプレスLigationExpresstmキットを使用して結合した。Stratageneからの超受容能XL10Gold細胞の形質転換の後、期待される挿入断片を含むクローンを確認した。pWEAflIIEcoRIは、bp353427336からのAd5配列を含む。pWEAdAflIIrITRspの生成ベクターpWEAdAflIIrITRの3’ITRは末端Gヌクレオチドを含まない。さらに、PacI部位は右ITRからほぼ30bpに位置している。これらの両特性は、3’ITRにおける複製の開始が非効率なため、ウイルス生成の効率が減少し得る。ウイルス生成の間、アダプタープラスミドにおける左のITRは完全であり、均一な組み換えの後、ウイルスDNAの複製が可能であることに注意を要する。3’ITRにおける複製の開始の効率を改良するために、pWEAdAflIIrITRを以下のように改変した。つまり、先ず、構成pBrAdBamrITRpac2をPacIで消化し、その後、部分的にAvrIIで消化し、178kbのベクター含有フラグメントを単離し、SAP酵素を使用して脱リン酸化した。このフラグメントはヌクレオチド35464から3’ITRまでのアデノ配列が欠けている。pWEAdAflIIrITRからのDNAを鋳型として、さらにプライマーITREPH:5′CGGAATTCTTAATTAAGTTAACATCATCAATAATATACC3′およびAd101:5′TGATTCACATCGGTCAGTGC3′を使用して、630bpPCRフラグメントを3’Ad5配列に対応して生成した。続いて、このPCRフラグメントをベクターpCR21Invitorogenにおいてクローン化し、PCRフラグメント含有クローンを単離し、配列化してDNAの正しい増幅を検査した。その後、PCRクローンをPacIおよびAvrIIで消化し、05kbアデノ挿入断片をPacI/部分的にAvrIIで消化したpBrAdBamrITRpac2フラグメント生成pBrAdBamrITRspに結合した。次に、この構成を使用して、コスミドクローン上記のようにを生成した。これは、アデノ配列3534から35938に対応する挿入断片を有する。このクローンをpWEAflIIrITRspと名付ける。pWEAdAflIIrITRΔE2Aの生成pWEAdAflIIrITRECACC寄託P97082116からE2Aコード配列の除去を、以下のようにして達成した。左および右部位におけるE2Aコード領域をフランキングするアデノウイルス配列をプラスミドpBrAdSalrITRECACC寄託P97082119から製造者のプロトコルに準拠してExpandPCR装置を使用してPCR反応で増幅した。以下のプライマーを使用した。右フランキング配列Ad5ヌクレオチド24033から25180に対応:ΔE2ASnaBI:5′GGCGTACGTAGCCCTGTCGAAAG3′ΔE2ADBP-開始:5′CCAATGCATTCGAAGTACTTCCTTCTCCTATAGGC3′増幅DNAフラグメントをSnaBIおよびNsiIで消化したNsiI部位を、下線を付したプライマーΔE2ADBP-開始において生成する。左フランキング配列Ad5ヌクレオチド21557から22442に対応ΔE2ADBP-停止:5′CCAATGCATACGGCGCAGG3′ΔE2ABamHI:5′GAGGTGGATCCCATGGACGAG3′増幅DNAをBamHIおよびNsiIで消化したNsiI部位を、下線を付したプライマーΔE2ADBP-停止において生成する。次に、消化したDNAフラグメントをSnaBIBamHIで消化したpBrAdSalrITRに結合した。配列は、プラスミドpBrAdSalrITRΔE2AにおけるユニークNsiI部位を使用してDBPコード領域の正確な置換を確認した。ユニークNsiI部位を使用して、組み換えベクターにより導入されるべき遺伝子に対して発現カセットを導入できる。E2Aコード配列の除去を、トップストランドの位置24048における100KエンコードL4-遺伝子のスプライスアクセプター部位が完全に残されるように行った。さらに、E2Aコード配列の左側部位のオリジナルE2ARNAおよびL3RNAのポリアデニル化シグナルは完全に残った。これにより、アデノウイルスライフサイクルの間におけるL3-遺伝子および100KL4-蛋白質エンコード遺伝子の適正な発現が確実になる。次に、プラスミドpWE/Ad.AflII-rITRΔE2Aを生成した。プラスミドpBr/Ad.Sal-rITRΔE2AをBamHIおよびSpeIで消化した。E2Aコード領域がユニークNsiI部位により繰り返される3.9Kbフラグメントを単離した。pWE/Ad.AflII-rITRをBamHIおよびSpeIで消化した。E2Aコード配列含有BamHI/SpeIフラグメントを除去する35KbDNAフラグメントを単離した。このフラグメントを、製造者のプロトコルstratageneにしたがって、λファージ-パッケージング抽出物を使用して、結合しパッケージして、プラスミドpWE/Ad.AflII-rITRΔE2Aを得た。このコスミドクローンは、PacI消化DNAおよび消化アダプタープラスミドの、機能的E2A遺伝子生成物を発現するパッケージング細胞に対するコトランスフェクションにより、E2Aについて欠失されるアデノウイルスベクターを生成するのに使用できる。アダプタープラスミドの構築パッケージング細胞ラインにおける組み換えアデノウイスルおよびE1配列間の配列重複がないことは、安全な、新規な組み換え体のRCAのない生成および増殖について重要である。アダプタープラスミドpMLPI.TKPCT/NL96/00244に記載は、前記発明の改良パッケージング細胞ラインと共に前記発明に従う使用のために設計されたアダプタープラスミドの例である。このプラスミドを出発物質として使用して、特異的なプロモーターを含む核酸分子および遺伝子配列を容易に交換できる新規なベクターを作った。先ず、PCRフラグメントを以下のプライマーを使用してpZipΔMoPyF101N-テンプレートDNAPCT/NL96/00195に記載から生成した:LTR-1:5′-CTGTACGTACCAGTGCACTGGCCTAGGCATGGAAAAATACATAACTG-3′およびLTR-2:5′-GCGGATCCTTCGAACCATGGTAAGCTTGGTACCGCTAGCGTTAACCGGGCGACTCAGTCAATCG-3′PwoDNAポリメラーゼBoehringerMannheimを以下の温度サイクルで製造者プロトコルに従って使用した:95°Cにて5’;55°Cにて3’;72°Cにて1’を1回、および95°Cにて1’、60°Cにて1’、72°Cにて1’を30サイクル、72°Cにて10’を1回。その後、PCR生成物をBamHIで消化し、PvuIIおよびBamHIで消化したpMLP10Levreroら、1991ベクターに結合した。このベクターはbp1からbp454までのアデノウイスル配列、およびそれに続く突然変異体ポリオーマウイルスPyF101からエンハンサーにより置換された野生型エンハンサー配列を有するMo-MuLVLTRの一部からなるプロモーターを含む。このプロモーターフラグメントを設計した、L420。次に、マウスHSA遺伝子のコード領域を挿入した。pLTR10をBstBIを用いて設計し、クレノウ処理し、NcoIで消化した。HSA遺伝子を以下のプライマーを使用してpUC18-HSAKayら、1990年でPCR増幅により得た:HSA1、5’-GCGCCACCATGGGCAGAGCGATGGTGGC-3′およびHSA2、5’-GTTAGATCTAAGCTTGTCGACATCGATCTACTAACAGTAGAGATGTAGAA-3′。269bp増幅フラグメントを、NcoIおよびBglII部位を使用してシャトルベクターにおいてサブクローン化した。TAG停止コドンの直後のエキストラTAG挿入を有するが、HSA遺伝子の正しいコード配列の確実な取り込みの配列化。その後、TAG重複を含むHSA遺伝子のコード領域を、NcoIスティッキー-SalI平滑フラグメントとして除去し、pLTR10からの3.5kbNcoIスティッキー/BstBI平滑フラグメントにクローン化し、pLTR-HSA10を得た。最後に、pLTR-HSA10をEcoRIおよびBamHIで消化し、その後、左のITR、パッケージングシグナル、L420プロモーターおよびHSA遺伝子含有フラグメントを、同じ酵素で消化したベクターpMLPI.TKに挿入し、これにより、プロモーターと遺伝子配列を置換した。これにより、プロモーターおよび遺伝子配列付近の種々の制限酵素に対する便利な認識部位を含む新規なアダプタープラスミドpAd/L420-HSAを得た。SnaBIおよびAvrIIは、プロモーター配列を交換するために、HpaI,NheI,KpnI,HindIIIと組み合わせることができる。しかし、後者の部位は、この構成において遺伝子を置換するために、HSAコード領域からClaIまたはBamHI部位3’と組み合わせることができる。核酸分子を容易に交換可能にするように設計された別のアダプタープラスミドを、pAd/L420-HSAにおけるプロモーター、遺伝子、ポリA配列とCMVプロモーター、多重クローニング部位、イントロン、ポリAシグナルを置換することにより作った。この目的のために、pAd/L420-HSAをAvrIIおよびBglIIで消化し、クレノウで処理し、平滑末端を得た。pBr322ベクターおよびアデノウイルス配列を有する5.1kbフラグメントを単離して、HhaIおよびAvrIIで消化しT4DNAポリメラーゼで処理することにより得たpcDNA/ampInvitrogenからの平滑1570bpフラグメントに結合した。このアダプタープラスミドをpAd5/CLIPと呼んだ。pAd5/Clipにおける左のITRからベクター配列の除去を可能にするために、このプラスミドを部分的にEcoRIで消化し、リニアフラグメントを単離した。配列5’TTAAGTCGAC-3’のオリゴをそれ自体アニールし、SalI部位およびEcoRIオーバーハングを有するリンカーを得た。このリンカーを部分的に消化したpAd5/Clipベクターに結合し、pAd5/Clipにおける左のアデノウイルスITRの23bp上流のEcoRI部位に挿入されたリンカーを有するクローンを選択し、pAd5/Clipsalを得た。同様に、pAd5/ClipにおけるEcoRI部位を配列5′-AATTGTCTTAATTAACCGCAATT-3′のリンカーの挿入によりPacI部位に変えた。pAd5/Clipベクターを部分的にEcoRIで消化し、脱リン酸化し、EcoRIオーバーハングを有するPacIリンカーに結合した。結合混合物をPacIで消化し、コンカテマーを除去し、アガロースゲルから単離し、再結合した。得られたベクターをpAd5/Clippacと呼んだ。これらの変化により、プラスミドベクター配列から左のITRを遊離する融通性がより高くできる。また、ベクターpAd5/L420-HSAを改変し、左のITRの上流にSalIまたはPacI部位を作った。これについて、pAd5/L420-HSAをEcoRIで消化し、上記のPacIリンカーに結合した。この結合混合物をPacIで消化し、アガロースゲルからリニアDNAの単離後、再結合し、コンカテマー化リンカーを除去した。これにより、アダプタープラスミドpAd5/L420-HSApacを得た。この構成を使用して、pAd5/L420-HSAsalを以下のように、生成した:pAd5/L420-HSApacをScaIおよびBsrGIで消化し、ベクターフラグメントを、同じ酵素でpAd5/Clipsalを消化した後単離した0.3kbフラグメントに結合した。アダプタープラスミドpAdMireおよびpAdAptの生成ポリリンカー配列のみ含み、プロモーターまたはポリA配列を含まないアダプタープラスミドを作るために、pAd5/L420-HSApacをAvrIIおよびBglIIで消化した。ベクターフラグメントを同じ制限酵素で消化したインカーオリゴヌクレオチドに結合した。リンカーを以下の配列のオリゴをアニールすることにより作った:PLL-1:5′-GCCATCCCTAGGAAGCTTGGTACCGGTGAATTCGCTAGCGTTAACGGATCCTCTAGACGAGATCTGG-3′およびPLL-2:5′-CCAGATCTCGTCTAGAGGATCCGTTAACGCTAGCGAATTCACCGGTACCAAGCTTCCTAGGGATGGC-3′。このアニールしたリンカーをAvrIIおよびBglIIで消化し、カラム精製Qiaquickヌクレオチド除去キットにより小さい末端から製造者推薦にしたがって分離した。その後、リンカーをAvrIIおよびBglIIで消化したpAd5/L420-HSApacフラグメントに結合した。組み込まれたリンカーを有し、挿入の完全性をチェックするために配列されたAdMireと呼ぶクローンを選択した。アダプタープラスミドpAdMireは完全な発現カセットの容易な挿入を可能にする。ヒト細胞中で高い発現レベルを仲介するヒトCMVプロモーターを含むアダプタープラスミドを以下のように構築した:pAd5/L420-HSApacをAvrIIで消化し、5’突出末端をクレノウ酵素を使用して満たした。HindIIIでの第2の消化により、L420プロモーター配列を除去した。ベクターフラグメントを単離してCMVプロモーター配列を含むPCRフラグメントに結合した。このPCRフラグメントを、以下のプライマーでpCMVLacIStratageneからのCMV配列の増幅後に得た:CMVplus:5′-GATCGGTACCACTGCAGTGGTCAATATTGGCCATTAGCC-3′およびCMVminA:5′-GATCAAGCTTCCAATGCACCGTTCCCGGC-3′PCRフラグメントを先ずPST1CMVplusにおいて下線を付すで消化し、その後、3’-突出末端をT4DNAポリメラーゼで処理することにより除去した。その後、DNAをHindIIICMVminAにおいて下線を付すで消化し、上記のAvrIIおよびHindIIIで消化したpAd5/L420-HSApacベクターフラグメントに結合した。得られたプラスミドをpAd5/CMV-HSApacと呼んだ。その後、このプラスミドをHindIIIおよびBamHIで消化し、ベクターフラグメントを単離し、HindIIIおよびBglIIでAdMireを消化した後に得られたポリリンカー配列に結合する。得られたプラスミドをpAdAptと呼んだ。アダプタープラスミドpAdAptはヒトCMVプロモーターBoshartら、1985年のヌクレオチド-735から95を含む。左のITRの上流のPacI部位の代わりにSalI部位を含むこのアダプタープラスミドの第2のバージョンを、pAd5/Clipsalからの0.7kbScaI-BsrGIフラグメントをScaIで消化しかつBsrGIで部分的に消化したpAdAptに挿入することにより作った。このクローンをpAdAptと呼んだ。Ad5に基づく組み換え体アデノウイルスの生成RCAのない組み換え体アデノウイルスを非常に効率的に上記アダプタープラスミドおよびpWE/Ad.AflII-rITRまたはpWE/Ad.AflII-rITrsp構造を使用して生成できる。一般に、所望の発現カセットにおける所望のトランスジーンを含むアダプタープラスミドは適当な酵素で消化され、3’および/または5’末端のベクター配列から挿入断片を遊離する。アデノウイルス相補性プラスミドpWE/Ad.AflII-rITRまたはpWE/Ad.AflII-rITRspはPacIで消化され、アデノ配列をベクタープラスミドから遊離する。非制限的な例として、AdApt-LacZの生成を説明する。E.coliLacZ遺伝子をプラスミドpMLP.nlsLacZEP95-202213からプライマー5′-GGGGTGGCCAGGGTACCTCTAGGCTTTTGCAA-3′および5′-GGGGGGATCCATAAACAAGTTCAGAATCC-3′を用いてPCRより増幅した。PCR反応を以下の増幅プログラムにて供給者プロトコルに従ってExTagTakaraを用いて行った:5分94°C、1サイクル;45秒94°Cおよび30サイクル60°Cおよび2分72°C、5サイクル;45秒94°Cおよび30秒65°Cおよび2分72°C、25サイクル;10分72;45秒94°Cおよび30秒60°Cおよび2分72°C、5サイクル、1サイクル。次に、PCR生成物をKpnIおよびBamHIで消化し、消化されたDNAフラグメントをKpnI/BamHI消化pcDNA3Invitrogenに結合し、pcDNA3.nlsLacZを増加させた。その後、構成pcDNA3.nlsLacZをKpnIおよびBamHIで消化し、3kbLacZフラグメントをジーンクリーンスピンキットBio101社を使用してゲルから単離した。また、pAdAptをKpnIおよびBamHIで消化し、リニアベクターフラグメントを上記のようなゲルから単離した。両単離フラグメントを結合し、LacZ挿入断片含有の1方のクローンを選択した。構成pAdApt-LacZをSalIで消化し、ジーンクリーンスピンキットで精製し、続いて、PacIで消化した。pWE/Ad.AflII-rITRspをPacIで消化した。両消化混合物を65°Cだけで30’間処理し、酵素を不活性化した。試料をゲル上におき、その濃度を見積もった。2.5×106PER.C6細胞ECACC寄託番号96022940を10FCSおよび10mMMgClのDMEMのT25フラスコにまいた。次の日、各プラスミドの4マイクログラムをPER.C6細胞ECACC寄託番号96022940に、リポフェクトアミントランスフェクションリエイジェンスLifeTechnoloiesIncを使用して、製造者の指示にしたがってトランスフェクトした。次の日、培地を新たな培養培地で置換し、さらに細胞を37°C、10CO2で培養した。再び、24時間後の細胞をトリプシンで処理し、T80フラスコにまき、37°C、10CO2で培養した。T80フラスコにまいた後6日で充分なCPEを得た。細胞を培地中でハーベストし、1回冷凍/解凍サイクルに付した。粗ライゼート取得本方法を使用してウイルス混合物のプラーク精製を行った。10のプラークを拾い、24ウェルプレートに拡げ、A549細胞感染の後LacZ発現について試験した。全て10プラークからのウイルスがLacZを発現した。実施例3キメラ組み換え体アデノウイルスの生成ヒト血清中で抗体を中和するヘキソンキメラAd5基アデノウイルスの生成は主にヘキソン蛋白質を指向し、ペントン蛋白質にあまり拡張しない。異なる血清型からのヘキソン蛋白質は、ウイルスの外側でさらされるべきことを予定されるループ中に存在する高可変領域を示すAthappillyら、1994、JMolBiol242430455。殆どの型の特異的なエピトープはこれらの高可変領域にマップされているToogoodら、1989JGenViol7032033214。こうして、異なる血清型からの相当する配列と一部のヘキソン配列との置換は、Ad5に対する抗体の先在中和を回避する効果的な方法である。アデノウイルス血清型5のヘキソンコード配列はヌクレオチド18841と21697間に位置する。アデノウイルス血清型5バックボーンへの二者択一のアデノウイルスからのヘキソンコード配列の容易な交換を促進するために、先ずシャトルベクターを生成した。このサブクローン、コード化pBr/Ad.Eco-PmeIを、先ずプラスミドpBr322をEcoRIおよびEcoRVで消化することにより、かつpWE/Ad.AflII-Ecoからの14kbPmeI-EcoRIフラグメントを挿入することにより生成した。このシャトルベクターでは、1430bpSanDIフラグメントの除去は、SanDIでの消化によりなされ、再結合してpBr/Ad.Eco-PmeIΔSanDIを得た。除去されたフラグメントはユニークSpeIおよびMunI部位を含む。pBr/Ad.Eco-PmeIΔSanDIからアデノウイルス血清型5DNAエンコードヘキソンを除去した。ヘキソンフランキング配列をPCR増幅し、一緒に結合し、これにより、ユニーク制限部位を生成し、ヘキソンコード領域を置換した。これらのPCR反応について、4つの異なるオリゴヌクレオチドが必要である:Δhex1-Δhex4。Δhex1:5′-CCTGGTGCTGCCAACAGC-3′Δhex2:5′-CCGGATCCACTAGTGGAAAGCGGGCGCGCG-3′Δhex3:5′-CCGGATCCAATTGAGAAGCAAGCAACATCAACAAC-3′Δhex4:5′-GAGAAGGGCATGGAGGCT-3′オリゴヌクレオチドΔhex1およびΔhex2を使用して得られた±1100bpの増幅DNA生成物をBamHIおよびFseIで消化した。オリゴヌクレオチドΔhex3およびΔhex4を使用して得られた±1600bpの増幅DNA生成物をBamHIおよびSbfIで消化した。次に、これらの消化PCRフラグメントをアガロースゲルから精製し、トリ-パートリゲイション反応を、FsaIおよびSbfIで消化したpBr/Ad.Eco-PmeIΔSanDIに結合したT4リガーゼ酵素を使用して行った。得られた構造はコード化pBr/Ad.Eco-PmeIΔHexonであった。この構成は部分的に配列され、正しいヌクレオチド配列およびユニーク制限部位MunIおよびSpeIの存在を確認した。pBr/Ad.Eco-PmeIΔHexonは、それぞれヘキソン配列の5’および3’末端におけるユニーク制限部位MunIおよびSpeIを導入するプライマーを使用して、異なる血清型からのウイルスDNAから増幅された異種ヘキソン配列を導入するシャトルベクターとして役立つ。健康な個人が全くないかまたは非常に低い力価のNABを有する血清型からのヘキソン配列を含むAd5基ベクターを生成するために、Ad35、Ad34、Ad26、およびAd48のヘキソン配列を以下のプライマーを使用して増幅した:Hex-up2:5′-GACTAGTCAAGATGGCYACCCCHTCGATGATG-3′およびHex-do2:5′-GCTGGCCAATTGTTATGTKGTKGCGTTRCCGGC-3′これらのプライマーを、公開されたヘキソンコード領域例えば、Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad7、Ad16、Ad40、Ad41のヘキソン配列は、Genbannkにより得ることができるの配列を使用して消化した。生成したヌクレオチドを、血清型間の変化を示す位置にて結合した。PCR生成物をSpeIおよびMunIで消化し、同じ酵素で消化したpBr/Ad.Eco-PmeIΔHexon構成にクローン化した。次に、ヘキソン改変配列を、pWE/Ad.AflII-rITRHexXXここで、XXはヘキソン配列を増幅するのに使用した血清型を表すを生成するAscIフラグメントの交換により、構成pWE/Ad.AflII-rITRに導入した。その後、pWE/Ad.AflII-rITRHexXX構成を使用して、Ad5組み換え体ウイルスについての上記と同じ方法でウイルスを作った。ペントンキメラAd5基組み換え体ウイルスの生成アデノウイルス型5ペントン遺伝子は、配列14156および15869間に位置する。ペントンベースは、目標細胞へのウイルスのインターナリゼイションを媒介するアデノウイルスキャプシド蛋白質である。少なくとも幾つかの血清型C型およびB型は、ペントン中のRGD配列と細胞表面上のインテグリンとの相互作用によりこのことを達成することが示された。しかし、F型アデノウイルスはRGD配列を持たず、AおよびDグループの殆どのウイルスに対してペントン配列は未知である。このため、ペントンは目標細胞特異性に含まれ得る。さらに、キャプシド蛋白質として、ペントン蛋白質はアデノウイルスの免疫原性に含まれるGaherySegardら、1998。このため、Ad5ペントン配列と無か低い力価のNABある血清型からのペントン配列と置換およびヘキソン配列の置換は、ヘキソン単独の置換よりも効果的にアデノウイルスベクターのクリアランスを防止する。ペントン配列の置換は感染特異性に影響する。Ad5中に異種のペントン配列を導入可能にするために、我々は上記のプラスミド基システムを使用した。先ず、ペントン配列に対するシャトルベクターを、構成pWE/Ad.AflII-EcoRIからの7.2kbNheI-EcoRVフラグメントを同じ酵素で消化したpBr322に挿入することにより作った。得られたベクターをpBr/XNと呼ぶ。これより、プラスミドAd5ペントン配列を除去し、他の血清型からの新規なペントン配列を導入のに使用されるユニーク制限部位により置換した。pBr/XNのペントンの左のフランキング配列は以下のプライマーを使用してPCR増幅された:DP5-F:5′-CTGTTGCTGCTGCTAATAGC-3′およびDP5-R:5′-CGCGGATCCTGTACAACTAAGGGGAATACAAG-3′DP5-Rは右フランキング配列に結合するためのBamHI部位下線を有し、前者Ad5ペントン領域の5’末端におけるユニークBsrGI部位括弧を導入する。右フランキング配列を、DP3-F:5′-CGCGGATCCCTTAAGGCAAGCATGTCCATCCTT-3′およびDP3-3R:5′-AAAACACGTTTTACGCGTCGACCTTTC-3′を使用して増幅した。DP3-Fは、左のフランキング配列に結合するためのBamHI部位下線を有し、前者Ad5ペントン領域の3’末端におけるユニークAflII部位括弧を導入する。得られた2つのPCRフラグメントをBamHIで消化し、一緒に結合した。この結合混合物をAvrIIおよびBglIIで消化した。pBr/XNをAvrIIおよびBglIIで消化し、ベクターフラグメントを消化結合PCRフラグメントに結合した。得られたクローンをpBr/Ad.Δpentonと呼ぶ。Ad35、Ad34、Ad26、およびAd48からのペントンコード配列を、5’および3’末端がそれぞれBsrGIおよびAflII部位を含むように、PCR増幅した。これに対して、以下のプライマーを使用した:Ad34およびAd35に対して:P3-for:5′-GCTCGATGTACAATGAGGAGACGAGCCGTGCTA-3′P3-rev:5′-GCTCGACTTAAGTTAGAAAGTGCGGCTTGAAAG-3′Ad26およびAd48に対して:P17F:5′-GCTCGATGTACAATGAGGCGTGCGGTGGTGTCTTC-3′P17R:5′-GCTCGACTTAAGTTAGAAGGTGCGACTGGAAAGC-3′増幅PCR生成物をBfrIおよびBsrGIで消化し、同じ酵素で消化したpBr/Ad.Δpentonにクローン化した。pBr/Ad.Δpenton中のこれら異種ペントン配列はpBr/Ad.pentonXXXXは挿入されたペントン配列を増幅するのに使用する血清型に相当する血清型の数を表すと呼ぶ構成を生成した。次に、新規なペントン配列を改変ヘキソンを有するpWE/Ad.AfllII-rITRベクターに導入した。例えば、Ad35からのペントン配列を構成pWE/Ad.AfllII-rITRHex35に普通のFseIフラグメントの交換により導入した。ペントンおよびヘキソン配列の他の組み合わせも作った。改変ペントンおよびヘキソン配列を有するウイルスをPER.C6細胞ECACC寄託番号96022940のアダプタープラスミドを用いたコトランスフェクションを使用して上記のようにして作った。さらに、ペントン配列をpWE/Ad.AfllII-rITR構成に導入した。後者の構成は、改変ペントンのみを含み、これらの構成から生成したウイルスはペントン配列のアデノウイルスの中和への寄与および感染効率および特異性の可能な変化の解析を研究するのに使用した。繊維キメラAd5基ウイルスの生成アデノウイルス感染を2つのキャプシド蛋白質繊維およびペントンにより媒介される。細胞に対するウイルスの結合は、突出繊維蛋白質と細胞表面上のリセプターとの相互作用により達成される。インターナリゼイションをペントン蛋白質と細胞表面上のインテグリンとの相互作用後に行う。CおよびBサブグループからの少なくとも幾つかのアデノウイルスは、細胞結合に対する異なるリセプターを使用することを示され、このため、異なる細胞型で異なる感染効率を有する。したがって、キャプシドの繊維を変えることによりアデノウイルスの感染スペクトルを変えることが可能である。アデノウイルス血清型5の繊維コード配列はヌクレオチド31042および32787間に位置する。アデノウイルス血清型5DNAエンコード繊維を除去するため、我々は、構成pBr/Ad.Bam-rITRについて開始した。先ず、NdeI部位をこの構成から除去した。この目的のため、pBr322プラスミドDNAをNdeIで消化し、その後、突出末端をクレノウ酵素を使用して満たした。このpBr322プラスミドを再結合し、NdeIで消化し、E.coliDH5αに形質転換した。得られたpBr/ΔNdeIプラスミドをScaIおよびSalIで消化し、得られた3198bpベクターフラグメントをpBr/Ad.BamrITR由来の15349bpScaI-SalIフラグメントに結合し、プラスミドpBr/Ad.Bam-rITRΔNdeIを得た。これは、ユニークNdeI部位を含む。次に、PCRをオリゴヌクレオチドNY-up:5′-CGACATATGTAGATGCATTAGTTTGTGTTATGTTTCAACGTG-3′およびNY-down:5′-GGAGACCACTGCCATGTT-3′で行った。増幅の間、NdeI括弧およびNsiI制限部位下線の両方を導入して増幅繊維DNAのクローン化を促進した。増幅は、94°Cで各45秒25サイクル、60°Cで1分、および72°Cで45秒からなった。PCR反応は25pmolのオリゴヌクレオチドNY-upまたはNY-down、2mMdNTR,1.5mMMgCl2を含むPCR緩衝液、および1ユニットのエロンガーゼElongase熱安定性ポリメラーゼGibco、オランダを含んだ。1/10の生成物をアガロースゲルに適用し、±2200bpの予期したDNAフラグメントを増幅したことを示した。次に、このPCRフラグメントをジーンクリーンキットシステムBio101Incを使用して精製した。その後、構成pBr/Ad.Bam-rITRΔNdeIおよびPCR生成物の両方を制限酵素NdeIおよびSbfIで消化した。次にPCRフラグメントをT4リガーゼ酵素を使用してNdeIおよびSbfIで消化したpBr/Ad.Bam-rITRΔNdeIにクローン化し、pBr/Ad.BamRΔFibを得た。このプラスミドにより、除去された繊維配列の代わりに挿入されたユニークNdeIおよびNsiI部位を介してPCR増幅繊維配列の挿入が可能になる。ウイルスは、特許PCT/NL96/00244に記載されたパッケージング細胞において、アダプタープラスミド、PacIおよびEcoRIで消化した構成pBr/Ad.AflII-EcoRI、および異種繊維配列が挿入されたpBr/Ad.BamRΔFib構成を使用して、2つの同種の組み換え体により生成できる。ウイルス生成効率を上げるために、構成pBr/Ad.BamRΔFibを改変して右ITRをフラッンキングするPacI部位を生成した。pBr/Ad.BamRΔFibをAvrIIで消化し、5kbアデノフラグメントを単離し、相当するAvrIIフラグメントを置換して上記ベクターpBr/Ad.Bam-rITR.pac8に導入した。得られた構成をpBr/Ad.BamRΔFib.pacと呼ぶ。一旦、異種繊維に配列をpBr/Ad.BamRΔFib.pacに導入し、繊維改変右側アデノウイルスクローンをpBr/Ad.AflII-rITRに対して上記した大きいコスミドクローンに導入する。このような大きいコスミドクローンにより、たった1つの同種の組み換え体によりアデノウイルスの生成が可能になる。改変繊維を有するAd5基ウイルスを作り、説明したNo.98204482.8および99200624.7。さらに、本発明からの血清型からのヘキソンおよびペントン配列を、所望の繊維配列と組み合わせて、効率的に選択して目標細胞を感染するウイルスを生成する。例えば、平滑な筋肉細胞、内皮細胞または滑膜細胞等ヒト起源の細胞は、Bサブグループウイルス、特にアデノウイルス16型からの繊維を有するAd5基ウイルスで非常によく感染される。特異的な配列がプラスミドのAd5バックボーンから除去でき、他の血清型からの相当する配列により置換されうる上記の例は、システムの融通性を示す。上記方法により、異なる血清型からのキャプシド遺伝子のいかなる組み合わせをも作ることができることは明らかである。したがって、中和に対して感受性の低いウイルスを作る所望のヘキソンおよびペントンを有し、特異的な目標組織に効率的に感染できる所望の繊維配列を有するキメラ組み換え体Ad5基アデノウイルスを設計する。実施例4Ad35組み換え体ウイルスを生成するプラスミド基システムの構築Ad35の部分的な制限マップは、以前に公表されたValderramaLeonら、1985Kangら、1989Liら、1991。Ad35に基づく組み換え体アデノウイルスを生成する機能的なプラスミド基システムの例は、以下の要素からなる1.左のITRおよびAd35由来パッケージング配列および異種発現カセットの挿入断片に対する少なくとも1つの制限部位からなりE1配列がないアダプタープラスミド。さらに、このアダプタープラスミドは、pIXプロモーターを含む領域をコードし、第2のヌクレオチドを有するアダプタープラスミドの同種組み換え体を媒介するのに充分な配列をコードするE1BからのAd35配列3’を含む。2.アダプタープラスミドに同種の配列、複製、およびパッケージング細胞中には存在せず速い、中間の、遅い遺伝子である、組み換え体ウイルスのパッケージングに必要なAd35配列を含む第2のヌクレオチド。3.Ad35のE1機能を補うことができる少なくとも機能的E1蛋白質を提供するパッケージング細胞。Ad35DNAを精製ウイルスバッチから以下のように単離した。100μlのウイルスストックAd35:3.26×1012VP/mlに10μlの10×DNAアーゼ緩衝液130mMトリス-HCl,pH7.5;1,2MCaCl2;50mMMgCl2を添加した。10μlの10mgr/mlのDNAアーゼIRocheDiagnosticsの添加後、この混合物を1時間、37°Cでインキュベートした。2.5μlの0.5MEDTAの添加の後、3.2μlの20SDSおよび1.5μlのプロテイナーゼKRocheDiagnostics20mgrml試料を50°Cで1時間インキュベートした。次に、ウイルスDNAをジーンクリーンスピンキットを使用して、製造者の指示にしたっがって単離した。DNAをスピンカラムから25μlの無菌MilliQ水で溶離した。以下のDNAフラグメントのサイズにおいて、フラグメントナンバリングはKangら1989に従った。Ad35DNAをEcoRIで消化し、3つのフラグメント約22.3A、7.3B、6kbCをゲルからジーンクリーンキットBio101Incを使用して単離した。pBr322をEcoRIで、またはEcoRIおよびEcoRVで消化し、消化したフラグメントをゲルから単離し、Tsap酵素GibcoBRLを使用して脱リン酸化した。次に、6kbAd35CフラグメントをpBr322xEcoRIフラグメントに結合し、ITR含有Ad35フラグメントEcoRI-BをpBr322xEcoRI/EcoRVフラグメントに結合した。連結反応を16°Cで一晩インキュベートし、DH5α能力バクテリアLifeTechn.に形質転換した。得られたクローンのミニプレプminiprepsをAd35フラグメントの正しい挿入断片について制限分析により解析した。6kbおよび7.3kbのAd35フラグメントの両方がpBr322に正しく挿入されたことがわかった。6kbフラグメントをpBr/Ad35-Eco6.0およびpBr/Ad35-Eco6.0-の両配向において単離した。これにより、はpBr322に対して5’から3’の配向を表す。pBr/Ad35-Eco7.3と呼ぶ7.3kbのAd35B挿入断片を有するクローンを部分的に配列化し、3’ITRの正しい結合をチェックした。ITRは低ストランド中配列5’-CATCATCAAT...-3’を有する。その後、pBr/Ad35-Eco7.3を5’末端に6kbAd35フラグメントの挿入断片により拡張した。pBr/Ad35-Eco7.3をEcoRIで消化し、脱リン酸化した。フラグメントをゲルから単離し、6kばd35EcoRIフラグメントに結合した。形質転換後、クローンを挿入断片の正しい配向について試験し、1つのクローンを選択し、pBr/Ad35-Eco13.3と呼んだ。その後、このクローンを、SalIでwtAd35の消化の後に得られた~5.4kbSalIDフラグメントを用いて拡張する。pBr322バックボーンのsalI部位を、SalIを用いたpBr/Ad35-Eco13.3の部分的な消化により除去し、クレノウ処理および再結合によりスティッキー末端を満たす。アデノウイルス挿入断片のシグナルSalI部位を含む1つのクローンを選択する。その後、pBrΔsal/Ad35-Eco13.3と呼ぶこのクローンをpBr322バックボーンに存在するAatIIでリニア化し、AatII相補末端でSakIリンカーに結合する。その後、DNAを過剰のSakIで消化し、このリニアフラグメントを単離し、Ad35からの5.4kbSalI-Dフラグメントに結合する。pBr/Ad35-Eco13.3に正しい配向に挿入されたSalIフラグメントを含む1つのクローンを選択する。得られたクローン、pBr/Ad35.Sal2-rITRは、右ITRを含む3’~17kbのAd35を含む。ウイルス精製の際にベクター配列から右ITRの遊離を可能にするために、右ITRをフランキングNotI部位をPCRにより導入する。また、22.3kbのAd35EcoRI-AフラグメントをpBr322xEcoRI/EcoRVでクローン化した。5’末端の約7kbが明らかに除去されたpBr/Ad35-EcoA3’と呼ぶ1つのクローンを選択した。それは、Ad35wtDNAの9.4kbおよび配列上流の約1.5kbにおいてSalI部位を含む。pBr322バックボーンのユニークNdeI部位およびこのSalI部位を使用して、このクローンを、NotI制限部位をリンカーの挿入断片によりAd35の5’末端において作る方法で、Ad35の第1SalIからの約5kbのAd35フラグメント5’の挿入断片により5’末端に拡張する。pBr/Ad35.pIX-EcoAと呼ぶこのクローンは左の末端配列ITR,パッケージング配列およびE1を含まず、3’末端にてクローンpBr/Ad35.Sal2-rITRを伴う約3.5kbのオーバーラップを有する。アダプタープラスミドを作るために、Ad35をSalIで消化し、~9.4kbの左の末端Bフラグメントを単離した。pBr322をEcoRVおよびSalIで消化し、ゲルから単離し、Tsap酵素で脱リン酸化した。両フラグメントを結合し、正しい挿入断片を有するクローンおよび左ITRの正しい配列を選択する。ウイルス生成の際にベクター配列からの左のITRの遊離を可能にするために、左のITRをフランキングするNotI部位をPCRにより導入する。このクローンから、E1配列を除去しPCRを使用してポリリンカーにより置換する。ポリリンカー配列を使用して発現カセットを選択遺伝子に対して導入する。組み換え体Ad35クローンを、図3に示すように、アダプタープラスミド、pBr/Ad35.pIX-EcoAおよびpBr/Ad35.Sal2-rITRを用いたPER.C6細胞のトランスフェクションにより生成する。同種の組み換えにより組み換え体ウイルスが増加する。実施例5Ad35に対する中和活性NAの優勢が異なる地理的位置からのヒト血清において低い。実施例1において、我々は、ベルギーの一位置からヒト血清の中和活性NAの分析を説明した。試験した44アデノウイルス血清型のパネルのうち、一血清型Ad35はアッセイした100の血清のいづれかにおいて中和されなかった。さらに、幾つかの血清型Ad26、Ad34、Ad48が試験された血清のうち8以下において中和されることがわかった。この分析は、さらに以前には試験されていないアデノウイルスの他の血清型に対して拡張され、第1スクリーンからの血清型の選択を使用して、異なる地理的一からの血清にも拡張した。アデノウイルスを増殖し、精製し、実施例1で説明したようにCPEインヒビションアッセイにおいて中和について試験した。実施例1と同じバッチからの血清を使用して、アデノウイルス血清型7B、11、14、18、44/1876を中和に対して試験した。これらのウイルスは、それぞれ59、13、30、98および54の血清で中和されることがわかった。こうして、このシリーズのうち、Ad11は比較的低い頻度で中和される。ヒト組織からのアデノウイルス血清型単離の頻度およびアデノウイルス血清型に対するNAの優勢は、異なる地理的位置で異なり得ることがわかるので、我々は、さらに、異なる場所からの血清に対するアデノウイルス血清型の選択を試験した。ヒト血清をヨーロッパの2つの付加的な場所英国のブリストル、およびオランダのライデンおよびアメリカ合衆国の2つの場所カリフォルニアのスタンフォードおよびニュウヨークのグレートネックから得た。第1スクリーンの20以下の血清で中和されることがわかったアデノウイルスおよびAd2、Ad5、Ad27、Ad30、Ad38、Ad43を、英国からの血清における中和について試験した。これらの実験の結果を図4に示す。アデノウイルス血清型2および5を再び高い白分率のヒト血清で中和した。さらに、第1スクリーンの低い百分率の血清で中和した血清型の幾つかを高い百分率の英国からの血清で中和する例示:Ad267対30、Ad2813対50、Ad345対27、Ad488対32。第1スクリーンの比較的低い百分率の血清で見出されたAd11およびAd49に対する中和活性は、この第2スクリーンの低い百分率の血清で見出されるそれぞれ13対5、および20対11。第1スクリーンの血清のいづれかで中和された血清型Ad35は、英国からの低い百分率8の血清で中和されることがわかる。英国からのヒト血清のNAの優勢は、血清型Ad11およびAd35に対して最も低い。さらなる分析に対して、血清をアメリカ合衆国の2つの場所カリフォルニアのスタンフォードおよびニュウヨークのグレートネックおよびオランダライデンから得た。図5はこれらの血清について得られたデータおよび以前のデータの概観を表す。全てではないウイルスをAd5、Ad11、Ad35を除く全ての血清において試験した。ヒト血清の総合的なスクリーンからの全体的な結論は、Ad35に対する中和活性の優勢が、西部の国々において最も低い全血清型であるということである:平均7のヒト血清が中和活性を含む5つ異なる場所。また、別のBグループアデノウイルス、Ad11を、低い百分率のヒト血清で中和する5つの異なる位置からの血清で平均11。アデノウイルス型5を5つの異なる位置から得た56のヒト血清で中和する。全ての血清を試験したわけではないが、Dグループ血清型49をアメリカ合衆国の一位置からおよびヨーロッパからの試料において比較的低い頻度で中和する平均14。上記の中和実験で、最も高い血清濃度のウェルにおいてCPEの最大保護が血清なしでコントロールに対して40であるとき、血清を非中和と判定する。保護を以下のようにして計算する:実施例1で説明したように、血清を、4×から64×までの希釈範囲で、5つの異なる希釈中にプレートする。したがって、低い力価すなわち、最も高い血清濃度のみにおける中和と高い力価すなわち、最も低い血清濃度のウェルでも中和間を区別可能である。Ad5に対する中和活性を含むことがわかった我々のスクリーンで使用されたヒト血清のうち、70が高い力価を有することがわかったが、Ad35に対するNAを含む血清のうち、15のみが高い活性を有した。Ad11に対するNAについて陽性であった血清のうち、8のみが高い力価を有した。Ad49に対してこれは5であった。したがって、Ad35、Ad11、Ad49に対するNAの頻度が、Ad5に対するようにずっと低いのみならず、これらのウイルスに対するNAを含む血清のうち、多くが低い力価を有する。Ad11、Ad35、またはAd49に基づくアデノウイルスベクターは、感染効率が中和活性により妨げられる適用で、またはインビボで予防接種ベクターまたは遺伝子治療伝達体として使用される場合、Ad5基ベクターに対して明らかな利点を有する。以下の例で、安全で、RCAフリーなAd35基ベクターの生成に対するベクターシステムの構成を説明する。実施例6ヒトアデノウイルス型35の配列Ad35ウイルスをPER.C6細胞で増殖し、DNAを実施例4に記載したように単離した。全配列をQiagenSequenceServiceにより生成した。全ウイルスDNAを超音波処理で剪断し、DNA末端をT4DNAポリメラーゼで平滑化した。剪断平滑化フラグメントは、アガロースゲル上でサイズ分画され、1.8から2.2kbのDNAフラグメントに対応するゲルスライスを得た。DNAをQIAquickゲル抽出プロトコルによりゲルスライスから精製し、pUC19プラスミドクローニングベクターのショットガンライブラリーにサブクローン化した。目標DNA8/-2倍をカバーする96ウェルプレートのクローンのアレイを使用して、全配列を生成した。配列化を、PerkinElmer9700thermocyclersで、BigDyeTerminatorchemistryndAmpliTagFSDNAポリメラーゼを使用して行い、その後、QIAGENDyeEx96technologyを使用して配列化反応の精製を行った。その後、配列化反応生成物をABI377XL96lanesequencersでフラグメントの自動分離および検出に付した。イニシャル配列コンティグ配列およびギャップを、目標DNA上のプライマーウオーキングリードにより、またはPCR生成物の直接配列化により満たした。ウイルス末端は、ショットガン中にないことがわかった。おそらくウイルスDNAのプロテイナーゼK消化後にITR配列に結合しているpTPのアミノ酸から得られたクローニングが困難なためである。付加的な配列は、これらの領域における配列の殆どを解決するウイルスDNA上をランするが、殆どのターミナルヌクレオチドの明確な配列を得ることは困難であった。5’末端で得られた配列は、5’-CCAATAATATACCT..-3’であった。しかし、3’末端で得られた配列は、5’-AGGTATATTATTGATGATGGG-3’であった。殆どのヒトアデノウイルスは、末端配列5’-CATCATCAATAATATACC-3’を有する。さらに、pBr322へのターミナル7kbAd35EcoRIフラグメントのクローニング後に得たAd35DNAの3’末端を表すクローン参照:実施例4は、典型的なCATCATCAATAAT...配列を有することがわかった。しかし、Ad35は典型的な末端配列を有し、ウイルスDNA上に直接配列化する際に得た相違は、ラン-オフ配列ランに関連するアーチファクトおよびpTPの残りのアミノ酸の存在のためである。訂正したターミアル配列を有するAd35の全配列を、図6に示す。基礎になるAd5genbankM72360およびAd7部分的配列genbankX03000を有する配列ホモロジーおよびオープンリーディングフレームの位置に、ウイルスの体制は殆どのヒトアデノウイルス、特にサブグループBウイルスの一般的な体制に一致する。ゲノムの全長は34794塩基対である。実施例7組み換え体Ad35基ウイルスを生成するプラスミド基ベクターシステムの構成組み換え体アデノウイルスベクターを生成する機能的プラスミド基ベクターシステムは以下の成分からなる:1.左のITRおよびAd35由来パッケージング配列および異種発現カセットの挿入断片に対する少なくとも1つの制限部位からなりE1配列がないアダプタープラスミド。さらに、このアダプタープラスミドは、pIXプロモーターを含む領域をコードし、第2の核酸分子を有するアダプタープラスミドの同種組み換え体を媒介するのに充分な配列をコードするE1BからのAd35配列3’を含む。2.アダプタープラスミドに同種の配列、複製、およびパッケージング細胞中には存在せず速い、中間の、遅い遺伝子である、組み換え体ウイルスのパッケージングに必要なAd35配列を含む第2の核酸分子。3.Ad35のE1機能を補うことができる少なくとも機能的E1蛋白質を提供するパッケージング細胞。相補パッケージング細胞での組み換え体アデノウイルスの生成に対する他の方法は、当業界でしられており、発明から解離することなくAd35ウイルスに適用可能である。例として、先に概略を示したプラスミド基システムの構成を以下に詳述する。1Ad35アダプタープラスミドの構成アダプタープラスミドpAdApt図7、実施例2に記載を、先ず改変して、拡張されたポリリンカーを含み、左のITRをフランキングする便利なユニーク制限部位を有するアダプタープラスミドおよび3’末端におけるアデノウイルス配列を得て、プラスミドベクター配列からのアデノウイルス挿入断片の遊離を可能にした。これらのプラスミドの構成を以下に詳細に説明する:アダプタープラスミドpAdApt実施例2をSalIで消化し、シュリンプアルカリフォスファターゼで処理し、再結合を減少させた。以下の2つのリン酸化およびアニール化オリゴからなるリンカー:ExSalPacF5′-TCGATGGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGTTCGAATTAATTAA-3′およびExSalPacR5′-TCGATTAATTAATTCGAACCCATAATACCCATAATAGCTGTTTGCCA-3′;を、消化した構成に直接結合し、これにより、Pi-PspI,SwaIおよびPacIによりSalI制限部位を置換した。この構成をpADAPTExSalPacリンカーと呼ぶ。さらに、pAdAptの左ITRの一部を以下のプライマーを使用して、PCRにより増幅した:PCLIPMSF5′-CCCCAATTGGTCGACCATCATCAATAATATACCTTATTTTGG:およびpCLIPBSRGI:5′-GCGAAAATTGTCACTTCCTGTG-3′。増幅したフラグメントをMunIおよびBsrGIで消化し、pAd5/Clip参照:実施例2にクローン化し、EcoRIで部分的に消化し、精製後、BsrGIで消化した。これにより、左のITRおよびパッケージングシグナルを再挿入した。制限酵素分析の後、この構成をScaIおよびSgrAIで消化し、800bpフラグメントをゲルから単離し、ScaI/SgrAI消化pADAPTExSalPacリンカーに結合した。pIPspSalAdaptと呼ぶ得られた構成をSalIで消化し、脱リン酸化し、上記のリン酸化ExSalPacF/ExSalPacRダブルストランドリンカーに結合した。PacI部位がITRに最も近いクローンを、制限分析により同定し、配列を配列分析により確認した。pIPspAdapt図8と呼ぶこの新規なpAdApt構成は、PacI、PI-PspIおよびBstBIに対する認識配列を含む2つのExSalPacリンカーを有し、アデノウイルスアダプター構成のアデノウイルス部分を囲み、プラスミドDNAをリニア化するに使用でき、その後アデノウイルスヘルパーフラグメントを用いたコトランスフェクションが可能である。トランスジーンクローニング順序をさらに増加するために、多くのポリリンカー変異型をpIPspAdaptに基づいて構成した。この目的のために、pIPspAdaptを先ずEcoRIで消化し、脱リン酸化した。以下の2つのリン酸化およびアニール化オリゴからなるリンカー:Ecolinker:5′-AATTCGGCGCGCCGTCGACGATATCGATAGCGCCCGC-3′およびEcolinker-:5′-AATTGCGGCCGCTATCGATATCGTCGACGGCGCGCCG-3′;を、この構成に結合し、これによりAscI,SalI,EcoRV,ClaIおよびNotIに対する制限部位を作った。このリンカーの両配向を得て、配列を制限分析および配列分析により確認した。オーダー5’HindIII,KpnI,AgeI,EcoRI,AscI,SalI,EcoRV,ClaI,NotI,NheI,HpaI,BamHIおよびXbaIにおけるリンカーを含むプラスミドをpIPspAdapt1図9と呼び、オーダー5’HindIII,KpnI,AgeI,NotI,ClaI,EcoRI,SalI,AscI,EcoRI,NheI,HpaI,BamHIおよびXbaIにおけるリンカーを含むプラスミドをpIPspAdapt2と呼ぶ。他のセンスまたはアンチセンス構成のクローニングを促進するために、以下の2つのオリゴヌクレオチドからなるリンカーを設計し、pIPspAdaptのポリリンカーを逆にした:HindXba5′-AGCTCTAGAGGATCCGTTAACGCTAGCGAATTCACCGGTACCAAGCTTA-3′;HindXba-5′-CTAGTAAGCTTGGTACCGGTGAATTCGCTAGCGTTAACGGATCCTCTAG-3′。このリンカーをHindIII/XbaI消化pIPspAdaptに結合し、正しい構成を単離した。制限酵素分析および配列化により確認した。この新規な構成pIPspAdaptAをEcoRIで消化し、上記エコリンカーをこの構成に結合した。このリンカーの両配向を得て、pIPspAdapt3図10を得た。これは、オーダーXbaI、BamHI、HpaI,NheI,EcoRI,AscI,SalI,EcoRV,ClaI,NotI,AgeI,KpnI,およびHindIIIポリリンカーを含む。全配列を制限酵素分析および配列化により確認した。Ad35基アダプタープラスミドを以下のように構成した:左のITRおよびAd35wt配列ヌクレオチド1~464図6に対応するパッケージング配列をPCRにより、以下のプライマーを使用してwtAd35DNAについてのPCRにより増幅した:プライマー35F1:5′-CGGAATTCTTAATTAATCGACATCATCAATAATATACCTTATAG-3′プライマー35R2:5′-GGTGGTCCTAGGCTGACACCTACGTAAAAAGAG-3′増幅により、配列の5’末端のPacI部位および3’末端のAvrII部位を導入した。増幅のために、白金PfxDNAポリメラーゼ酵素LTIを製造者の指示にしたがって使用したが、3の最終濃度に0.6μMのプライマーおよびDMSOを添加した。増幅プログラムは以下のようである:つまり、30サイクルに対して94°Cで2分94°Cで30秒、56°Cで30秒、68°Cで1分、次に68°Cで10分。PCR生成物を、製造者の指示にしたがってpcr精製キットLTIを使用して精製し、PcaIおよびAvrIIで消化した。その後、消化したフラグメントをジーンクリーンキットBio101を使用してゲルから精製した。Ad5基アダプタープラスミドpIPspAdApt-3図10をAvrIIで消化し、その後、PcaIで部分的に消化し、5762bpフラグメントをLMPアガロースゲルスライスで単離し、同じ酵素で消化した上記PCRフラグメントで結合し、電子受容能electrocompetentDH10B細胞LTIに形質転換した。得られたクローンをpIPspAdApt3-Ad35lITRと呼ぶ。並行的に、Ad35DNAの第2のピースを以下のプライマーを使用して増幅した:35F3:5′-TGGTGGAGATCTGGTGAGTATTGGGAAAAC-3′35R4:5′-CGGAATTCTTAATTAAGGGAAATGCAAATCTGTGAGG-3′このフラグメントの配列は、wtAd35図6のnucl.3401から4669に対応し、E1B55kコード配列から直接3’から開始する1.3kbの配列を含む。増幅および精製を、左のITRおよびパッケージング配列含有フラグメントに対して上記のようにして行った。その後、PCRフラグメントをPacIで消化し、SamIおよびPacIで消化したpNEB193ベクターNewEnglandBiokabsにサブクローン化した。得られたクローンの配列の完全性を配列分析により確認した。そしてpNEB/Ad35pF3R4をBglIIとPacIによって消化し、QIAExIIキットQiagenを用いてAd35挿入物をゲルから単離した。pIPspAdApt3-Ad35lITRはBglIIにより、そしてPacIにより部分的に消化された。3624bpの断片ベクター配列、ad35ITR及びパッケージ配列のみならずCMVプロモーター、複合的なクローニング領域及びポリAシグナルを含んでいるもまた、QIAExIIキットQiagenを用いて単離された。両断片はライゲートされて、コンピーテントなDH10B細胞LTIの中へ形質転換された。得られたクローンであるpAdApt35IP3図11は、pIPspAdApt3に由来する発現カセットを有しているが、Ad35レフトITR及びパッケージ配列及びAd35に由来する塩基3401から4669に対応する第二の断片を含んでいる。複合的なクローニング部位を反対の方向性で有しているAd35アダプタープラスミドの第二のバージョンは、下記の様にして作られた。pIPspAdApt1図9はNdeIとBglIIによって消化され、CMVプロモーターの一部分を含んでいる0.7kbpのバンド、MCSとSV40ポリAは単離され、pAdApt35IP3の対応する部位に挿入されて、pAdApt35IP1を生成する図12。そしてpAdApt35.LacZ及びpAdApt35.Lucアダプタープラスミドを、pcDNA.LacZKpnI及びBamHIにより消化されたとpAdApt35.LucHindIII及びBamHIにより消化されたに由来するトランス遺伝子を、pAdApt35IP1中の対応部位へ挿入することにより生成した。pcDNA.LacZ及びpAdApt35.Lucの生成は、WO99/55132に述べられている。2pWE.Ad35.pXI-rITRコスミドの構築図13は、Ad35配列の3401bpから34794ライトITRの末端を含んでいるコスミドクローンの構築を保証する種々の工程を表し、それを下記に詳しく述べる。第一のPCR断片pIX-NdeIを下記のプライマーセットを用いて生成した。35F5:5’-CGGAATTCGCGGCCGCGGTGAGTATTGGGAAAAC-3’35R6:5’-CGCCAGATCGTCTACAGAACAG-3’DNAポリメラーゼPwoロシュを、製造者の指示に従って使用したが、両プライマーの終濃度は0.6μMとし、50ナノグラムのwtAd35のDNAを鋳型として使用した。下記の様にして増幅を行った。即ち、94°Cで2分、94°Cで30秒、65°Cで30秒、そして72°Cで1分45秒を30サイクル、続いて68°Cで8分である。TAクローニングベクターPCR2.1でのクローニングを可能とするために、1ユニットのsuperTaqポリメラーゼHTBiotechnologyLTDによる最後のインキュベーションを、72°Cで10分間行った。3370bpの増幅された断片は、5’末端に付加されたNotI部位を有する、3401から6772bpまでのAd35配列を含む。PCR精製キットLT1を用いて断片を精製した。第二のPCR断片NdeI-rITRを下記のプライマーを用いて作製した。35F7:5’-GAATGCTGGCTTCAGTTGTAATC-3’35R8:5’-CGGAATTCGCGGCCGCATTTAAATCATCATCAATAATATACC-3’pfxDNAポリメラーゼLTIを用いて、製造者の指示に従って、鋳型として10ナノグラムのwtAd35のDNAを使用して増幅を行ったが、0.6μMの両プライマーと3のDMSOを用いた。プログラムは下記の通りである。即ち、94°Cで3分、94°Cで30秒、40°Cで45秒、68°Cで2分45秒を5サイクル、続いて94°Cで30秒、60°Cで30秒、68°Cで2分45秒を25サイクルである。TAクローニングベクターPCR2.1におけるクローニングを可能とするために、1ユニットのsuperTaqポリメラーゼを用いて72°Cで10分間、最後のインキュベーションを行った。Ad35の塩基33178からライトITRの末端までの範囲である、1.6kbの増幅された断片を、PCR精製キットLT1を用いて精製した。両方の精製されたPCR断片を、TA-クローニングキットInvitrogenのPCR2.1ベクターへライゲートし、STBL-2コンピーテント細胞LT1へ形質導入した。予期された挿入を含むクローンの配列を決定して増幅が正しいことを確認した。次に、NotIとNdeIを用いた消化により両断片をベクターから切り出し、ジェネクリーンキットBIO101,Inc.を用いてゲルから精製した。コスミドベクターpWE15クローンテックをNotIにより消化し、脱リン酸化し、やはりゲルから精製した。これらの3つの断片をライゲートし、STBL2コンピーテント細胞LT1中へ形質導入した。両方のPCR断片を含んでいる正しいクローンの一つを、その後NdeIによって消化し、そして平滑断片をジェネクリーンキットを用いてゲルから精製した。Ad35のwtDNAをNdeIを用いて消化し、、製造者の指示に従って、26.6bpの断片をアガロースエンザイムロシュを用いてLMPゲルから精製した。これらの断片を共にライゲートし、製造者のプロトコールに従って、λファージパッケージングエクストラクトストラタジーンを用いてパッケージした。STBL-2細胞へ感染させた後、コロニーをプレート上で生育して完全な挿入物の存在を解析した。正しい方向性で挿入された大きな断片を持ち、また3つの酵素NcoI,PvuIIとScaIを用いたイナエペナエントinaepenaentな消化の後に正しい制限パターンを有している、一つのクローンが選抜された。このクローンはpWE.Ad35.pIX-rITRと名付けられた。それはAs35配列をbp3401から末端まで含み、NotI部位によってフランキングされている図14。3PER.C6におけるAd35に基づく組み換えウイルスの産生野生型Ad35ウイルスは、非常に高いタイターまでPER.C6パッキング細胞において生育することができる。しかし、PER.C6に存在しているAd5-E1領域が、E1が欠損したAd35組み換えウイルスを補うことが可能であるかどうかについては知られていない。これを試験するために、PER.C6細胞を、上記のアダプタープラスミドpAdApt35.LacZと大きな骨格backbone断片pWE.Ad35.pIX-rITRにより、共トランスフェクションを行った。最初に、pAdApt35.LacZをPacIによって消化し、そしてpWE.Ad35.pIX-rITRをNotIによって消化した。それ以上の精製は行わずに、各構築物の4マイクログラムをDMEMLT1と混合し、PER.C6細胞へトランスフェクトし、製造者の指示に従ってリポフェクタミンLT1を使用しながら、T25フラスコ中へ5×106細胞個の密度で前日に播種を行った。陽性コントロールとして、PacIにより消化された6マイクログラムのpWE.Ad35.pIX-rITRのDNAを6.7kbのNheI断片と共トランスフェクトし、その断片はE1領域を含むウイルスゲノムの左末端を含んでいるAd35wtのDNAから単離された。次の日に培地10FBSと10mMのMgCl2を含むDMEMを新たにし、更に細胞を培養した。トランスフェクションに続いた2日目に、細胞をトリプシン処理してT80フラスコに移した。陽性コントロールフラスコは、トランスフェクションに続く5日目でCPEを示し、それはpWE.Ad35.pIX-rITR構築物は、少なくともAd35-E1蛋白質の存在下で機能していることを示している。Ad35LacZアダプタープラスミドとpWE.Ad35.pIX-rITRによるトランスフェクションは、CPEを引き起こさなかった。これらの細胞は10日目に培地中で回収され、細胞からウイルスを放出させるために一度凍結/解凍を行った。回収された材料の4mlを、PER.C6細胞80コンフルエントと共にT80フラスコへ添加し、更に5日間培養した。この回収/再感染は2回繰り返されたが、ウイルスに関連したCPEについての証拠は何もなかった。この実験から、Ad5-E1蛋白質はAd35組み換えウイルスを補うことができないか、あるいは不十分であるようだが、しかし、アダプタープラスミドとpWE.Ad35.pIX-rITR骨格プラスミドの配列の重複が、効率的に組み換えて組み換えウイルスゲノムを生じさせるには不十分であるということかもしれない。陽性コントロールのトランスフェクションが6.7kbの左末端断片を用いて行われ、そのために配列重複は約3.5kbであった。アダプタープラスミド及びpWE.Ad35.pIX-rITR断片は1.3kpの重複配列を有していた。1.3kpの重複が効率的な相同性組み換えに小さ過ぎるかどうかをチェックするために、PacIで消化されたpWE.Ad35.pIX-rITRと、上記の35F1と36R4によって生成したAd35wtのDNAのPCR断片と共に、前に述べたのと同様の方法を用いて共トランスフェクトが行われた。そこでPCR断片はbp4669までの左配列を含み、そしてそのためにアダプタープラスミドpAdApt35.LacZと同様の、pWE.Ad35.pIX-rITRとの重複配列を有しているが、Ad35E1配列を有している。PCRカラム精製に続いて、無傷であるかもしれない鋳型配列を除去するために、DNAをSalIで消化した。消化されたPCR産物単独とのトランスフェクションは、陰性コントロールとして役立った。トランスフェクションの4日後に、PCR産物及びAd35pIX-rITR断片によってトランスフェクトされた細胞でCPEが起こったが、陰性コントロールにおいては起こらなかった。これは、1.3kbの重複配列は、Ad35E1蛋白質があるところでウイルスを生成するのに十分であることを示している。これらの実験より、少なくとも一つのAd35.E1配列蛋白質の存在が、Ad35を相補する細胞系列で、組み換えAd35に基づくベクターをプラスミドDNAから生成するのに必要である、と我々は結論した。実施例81Ad35.E1発現プラスミドの構築PER.C6中でAd5-E1蛋白質は効率的にAd35組み換えウイルスを相補することができなかったので、Ad35E1蛋白質はAd5を相補をしている細胞において発現されなければならず例えば、PER.C6、あるいは2倍体初代ヒト細胞又はアデノウイルスE1蛋白質を発現していない確立された細胞系列から始めて、Ad35E1蛋白質を発現している新たなパッケージ細胞系列を作らなければならない。最初の可能性に取り組むために、下記に示す様にAd35E1領域を発現プラスミド中でクローン化した。最初に、bp468からbp3400までのAd35E1領域を、下記のプライマーセットを用いてwtAd35DNAから増幅した。35F11:5’-GGGGTACCGAATTCTCGCTAGGGTATTTATACC-3’35F10:5’-GCTCTAGACCTGCAGGTTAGTCAGTTTCTTCTCCACTG-3’このPCRは、5’末端にKpnIとEcoRI部位を導入し、更に3’末端にSbfIとXbaI部位を導入する。製造者の指示を用いてPwoDNAポリメラーゼロシュにより、5ナノグラムの鋳型DNAにおける増幅を行ったが、しかし、両プライマーは最終濃度0.6μMを用いた。プログラムは下記の通りである。即ち、94°Cで2分、94°Cで30秒、56°Cで30秒及び72°Cで2分を5サイクル、続いて94°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで2分を25サイクル、続いて72°Cで10分である。PCR生成物をPCR精製キットLTIによって精製し、KpnIとXbaIによって消化した。そして消化されたPCR断片を、発現ベクターpRSVhbvNeo下記を見よへライゲーションし、またKpnIとXbaIによって消化した。ライゲーションされた物は製造者のマニュアルに従ってコンピーテントなSTBL-2細胞LTIへ形質導入され、コロニーについて、Ad35E1配列がRSVプロモーターとHBVポリAの間のポリリンカーへ正しく挿入されているか解析した。得られたクローンをpRSV.Ad35-E1と名ずけた図15。RSV.Ad35-E1中のAd35配列を、配列解析によってチェックした。pRSVhbvNeoを以下の様に生成した。pRc-RSVインビトロゲンをPvuIIで消化し、RSAP酵素LTIによって脱リン酸化し、3bpベクター断片を低融点アガロースLMP中で単離した。WO96/35798において述べられたプラスミドpPGKneopA図16をSspIで完全に消化してそのプラスミドを平滑化し、PvuIIによる部分消化を促進した。PvuIIによる部分消化に続き、得られた断片をLMPアガロースゲルで分離し、PGKプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子及びHBVpolyAを含む2245bpのPvuII断片を単離した。両者の単離された断片はライゲートされて発現ベクターpRSV-pNeoを与え、それは今はPGKprom-neo-HBV-polyAカセットによって置換された、元来のSV40prom-neo-HBV-polyA発現カセットを有している図17。このプラスミドは更に改変され、下記の様にBGHpAがHBVpAで置換されている。即ち、pRSVpNeoはScaIによって平滑化され、XbaIによって更に消化された。Amp遺伝子の一部とRSVプロモーター配列とポリリンカー配列を含んでいる1145bp断片は、ジェネクリーンキットBioInc.101を用いてゲルから単離された。次にpRSVpNeoはScaIによって平滑化され、更にEcoRIによって部分的に消化され、PGKneoカセット及びベクター配列を含んでいる3704bp断片は、上記の様にゲルから単離された。XbaIとEcoRIによって5’と3’末端においてそれぞれフランキングされたHBVpolyA配列を含む第三の断片は、下記のプライマーセットを用いてpRSVpNeoでのPCR増幅によって生成された。HBV-F;5’-GGCTCTAGAGATCCTTCGCGGGACGTC-3’及びHBV-R;5’-GGCGAATTCACTGCCTTCCACCAAGC-3’増幅は、エロゲナーゼ酵素LTIによって製造者の指示に従って、下記の条件で行われた。即ち、94°Cで2分,そして94°Cで45秒、42°Cで1分、68°Cで1分を5サイクル、続いて94°Cで45秒、65°Cで1分、及び68°Cで1分を30サイクル、続いて68°Cで10分である。そして625bpのPCR断片をQiaquickPCR精製キットを用いて精製し、EcoRIとXbaIで消化し、ジェネクリーンキットを用いてゲルから精製した。3つの精製された断片はライゲートされ、pRSVhbvNeo構築物を与えるために、DH5αコンピーテント細胞LTI中へ形質導入された図18。この構築物において、RSV発現カセットの転写制御領域及びネオマイシン選抜マーカーは改変され、CMVとSV40転写制御配列をしばしば含む、アデノウイルスベクターとの重複が減少した。2Ad35-E1発現構築物と共トランスフェクトされたPER.C6細胞でのAd35組み換えウイルスの生成PER.C6細胞は5×106細胞の密度でT25フラスコ中に播種され、次の日に以下を含むDNA混合物によりトランスフェクトされた。-PacIによって消化されたpAdApt35.LacZ1μg-消化されていないpRSV.Ad35E15μg-NotIによって消化されたpWE.Ad35.pIX-rITR2μgトランスフェクションは、製造者の指示に従ってリポフェクタミンを用いて行った。トランスフェクション混合物を細胞に添加して5時間後、培地を取り除いて新鮮な培地に置き換えた。2日後に細胞をT80フラスコへ移して、更に培養した。トランスフェクションの1週間後、1mlの培地をA549細胞に加え、次の日に細胞を染色してLacZ発現をみた。染色して2時間後に青い細胞が明らかに見えるようになり、それは組み換えLacZを発現しているウイルスが作製されたことを示している。細胞は更に培養されたが、明らかなCPEの出現は見られなかった。しかし12日後に細胞の塊が単層で現れ、続く18日後にトランスフェクション細胞は剥がされた。そして細胞と培地を回収し、一度凍結融解し、1mlの粗ライゼイートを用いて6穴プレートでPER.C6細胞を感染させた。感染して2日後に、LacZ活性をみるために細胞を染色した。2時間後に15の細胞が青く染色された。wt及び/又は複製しているコンピーテントなウイルスの存在を試験するために、A549細胞をこれらのウイルスで感染し、更に培養した。CPEの兆候は見られず、それは複製能力のあるウイルスが存在しないことを示している。これらの実験は、組み換えAdApt35.LacZウイルスが、Ad35-E1発現構築物と共トランスフェクトされたPER.C6細胞で作られたことを示している。3Ad5ウイルスの中和活性を含むヒト血清の中でAd35組み換えウイルスは中和を逃れるそしてAd5ウイルスの中和活性を含むヒト血清の存在下での感染を検討するために、AdApt35.LacZウイルスをを使用した。精製したAd5に基づくLacZウイルスを、NAの陽性コントロールとして使用した。ここで、PER.C6細胞を2×105細胞/ウェルの密度で、24穴のプレートに播種した。次の日に、Ad5を中和する高い活性を有するヒト血清サンプルを、培養培地中で5段階で5倍希釈した。そして0.5mlの希釈された血清を、0.5mlの培地に入ったAdApt5.LacZウイルスの4×106のウイルス微粒子と混合し、そして37°Cで30分間インキュベーションした後、0.5mlの混合物を2重の系列でPER.C6細胞に添加した。AdApt5.LacZウイルスについて、0.5mlの希釈された血清サンプルをAdApt5.LacZウイルスを含んでいる0.5mlの粗ライゼートと混合し、そしてインキュベーションの後にこの混合物の0.5mlを、2重の系列でPER.C6細胞に添加した。血清がない培地中でインキュベートされたウイルスサンプルを、感染の陽性コントロールとして使用した。37°Cで2時間感染した後、培地を添加して最終容量を1mlとし、細胞を更にインキュベートした。感染の2日後、細胞を染色してLacZ活性を見た。結果を表IIに示す。これらの結果から、AdApt5.LacZウイルスは効果的に中和されたが、ヒト血清が存在しているにも関わらずAdApt35.LacZウイルスが感染性を残していることは、明らかである。これは、組み換えAd35に基づくウイルスは、Ad5に基づくウイルスへのNAを含むヒト血清中で中和を逃れることを証明するものである。実施例9ネモポエティックnemopoieticなCD34Lin幹細胞に対する細胞型特異性を有するAd5/ファイバー35キメラベクター実施例3において、我々は他の血清型の繊維蛋白質を有するアデノウイルスに基づくAd5のライブラリーの生成について述べた。このライブラリーの使用方法のための限定的ではない実施例として我々はここで、血液幹細胞の感染が改善されたことを示す、繊維組織で改変されたアデノウイルスの同定について述べる。CD34抗原が陽性であって、早期の分化マーカーであるCD33、CD38そしてCD71linが陰性であるというフローサイトメーター上における表現型を有する、ヒト骨髄、臍帯血、又は動員された末梢血から単離された細胞は、一般的に血球幹細胞HSCと呼ばれている。全ての造血性系統はこれらの細胞から得られるためにこれらの細胞の遺伝的改変は非常に興味深く、そしてそのためにHSCは、多くの後天的又は先天的なヒト血液疾患の治療の標的細胞である。HSCの遺伝的な改変で治癒可能な病気の例としては、これらに限られるものではないが、ハーラー病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、ゴーシュ病、ファーバー病、ニーマンピック病、クラッベ病、異染性白質萎縮症、I-細胞病、重症免疫不全症候群、Jak-3欠損症、フコシダーゼ欠損症、サラセミア、及び赤血球産生ポリフィリン症が含まれる。これらの造血疾患の患者の他に、後天性免疫不全症候群AIDS及び血液癌を予防又は治療しようとする戦略もまた、HCS又はAIDSの場合のCD4陽性Tリンパ球の様なHSCから得られた細胞の遺伝的改変に基づいている。上記で挙げられた例は、よって、欠損している遺伝子と蛋白質の遺伝的レベルを補うために、HSCへDNAを導入することを目的としている。AIDS又は癌のための戦略の場合、HSCに導入するべきDNAは、抗ウイルス遺伝子又は自殺遺伝子であることができる。上記で挙げた例に加えて、アデノウイルスのベクターを用いたHSCの効率的な形質導入が重要な役割を果たす、いくつかの他の分野がある。例えば組織工学の分野がある。この分野において、HSCを特異的な系統へと分化させることは重要である。いくつかの例は、限定するものではないが、T細胞前駆体又は内皮細胞前駆体の生成のみならず、エクスビボでの骨生成、軟骨生成、皮膚生成である。バイオリアクターにおける骨、軟骨、又は皮膚の生成は、骨折、又は骨髄損傷、又は重症な火傷の後の移植のために用いることができる。自然に、形質転換された細胞を患者に直接的にも再注入されることもできる。HSCから多数の内皮細胞前駆体を生成することは興味深いが、それはこれらのHSCは、再注入の後に、虚血の様な心血管系障害の部位に回帰できるからである。同様に、HSCから多数のT細胞を生成することは興味深いが、それはこれらのT細胞前駆体はエクスビボでプライム化され、プライム化されたT細胞を再注入した後にヒト体内で特定の標的を根絶することができるからである。ヒト体内における好ましい標的は、癌又はウイルスに感染した細胞であることができる。上記で述べた例から、HSCへの効率的な遺伝子送達は、遺伝子治療の分野における主要な興味であると結論できる。そこで、アデノウイルス血清型5宿主細胞が、インビトロのみならずインビボにおいてもHSCを標的とできるように及ぶように改変することは、本発明の主要な目的である。ヒトHSCにとって好ましい感染特性を有するキメラアデノウイルスを同定するために、我々は代わりの血清型血清型8、9、13、16、17、32、35、45、40-L、51に由来する繊維分子を運搬する、Ad5に基づくウイルスのライブラリーを作製した。繊維により改変されたこのライブラリーの生成は、実施例3において述べられている。Ad5は対照として用いられた。ヒトTF-1赤白血病、ATCCCRL-2003に関してこのライブラリーの小さなパネルを試験し、一方ヒト初代間質細胞とヒトHSCに関して、生成した全てのキメラウイルスを試験した。10FCSと50ng/mlのIL-3サンドス、バーセル、スイスを添加したDMEM中で、ヒトTF-1細胞を日常的に維持した。骨髄吸入物から単離されたヒト初代繊維芽細胞様の間質を、DMEM/10FCS中で日常的に維持した。24穴プレートのウェルあたり1×105細胞の濃度で間質を播種した。播種して24時間後に、全てマーカーとして緑色蛍光蛋白質GFPを有している、Ad5、Ad5.Fib16、Ad5.Fib17、Ad5.Fib35、Ad5.Fib40-L、又はAd5.Fib51の細胞あたり1000個のウイルス微粒子に細胞を2時間曝した。2時間後に細胞をPBSで洗浄し、ウイルスを加えない培地に再播種を行った。TF-1細胞を24穴プレートのウェルあたり2×105細胞の濃度で播種し、そしてまた異なったキメラアデノウイルスの1000ウイルス微粒子に2時間曝した。2時間曝した後に細胞を洗浄することにより、ウイルスを除去した。ウイルスに曝した48時間後に両細胞型を回収し、フローサイトメーターを用いてGFPの発現を解析した。図19に示されるTF-1の結果は、血清型16、35又は51全てアデノウイルスサブタイプBに由来するに由来する繊維組織を運んでいるキメラアデノウイルスは、Ad5サブタイプC、Ad5.Fib17サブタイプD又はAd5.Fib40-LサブタイプFと比較して好ましい感染特性を有すことを示す。初代ヒト間質について試験したが、それはこれらの細胞はエクスビボの培養条件下でHSCの増殖及び維持を可能とするフィーダー細胞として一般的に使用されているからである。TF-1細胞への形質導入と比較して、繊維キメラアデノウイルスはいずれも、ヒト初代間質へ効率的な形質導入を行うことができなかった図20。ヒト繊維芽細胞様初代間質の適度な感染はAd5においてのみ観察されたが、一方既知のレセプター分子のいずれもこれらの細胞において発現していないと観察されている表IIIを見よ。キメラウイルスを用いてヒト間質が感染しないことは有利であるが、それは共培養の設定においては、キメラアデノウイルスは間質のフィーダー細胞によって本来吸収されないと思われるからである。フィーダーキメラウイルスの形質導入能力を試験するために、臍帯血3個体のプールを幹細胞の単離に用いた。MACSラボラトリー分離システムMiltenyiBiotechにより、製造者によって提供されたプロトコールを用いて、単核細胞調製物からCD34細胞を単離した。CD34細胞の2×105個を150μlの容量のDMEM血清なし;Gibco,Gaitherburg,MDの中に播種し、10μlのキメラアデノウイルス最終的なウイルス微粒子/細胞比が1000となるようにを添加した。試験したキメラアデノウイルスは、Ad5、Ad5.Fib16、Ad5.Fib35、Ad5.Fib17、Ad5.Fib51であり、全てマーカーとして緑色蛍光蛋白質GEFを含んでいる。10CO2の湿度の高い雰囲気下で、37°Cで2時間細胞をインキュベートした。その後に、500μlのDMEMによって細胞を一回洗浄し、500μlのStemPro-34SF培地LifeTechnologies,GrandIsland,NY中に再懸濁した。そして細胞を、24穴のプレートGreiner,Frickenhausen,Germany中で5日間、照射20Gyして予め確立しておいたヒト骨髄間質文献1上で、10CO2の湿度の高い雰囲気中で37°Cで培養した。5日後に全細胞集団を、0.25トリプシン-EDTAギブコ100μlを用いたトリプシン処理によって回収した。5日間の培養前後の細胞数を、ヘモサイトメーターを用いて測定した。各サンプル中のCD34及びCD34CD33、38、71細胞の数を回収した全細胞数から計算し、全集団中におけるCD34CD33、38、71細胞の頻度をFACS解析によって測定した。別個のサブ集団において、GEFを発現している細胞の頻度のみならず、個々の細胞あたりのGEFの強度を観察している間に、FACS解析によって形質導入効率を測定した。図21に示されているこの実験の結果は、アデノウイルス血清型5又はキメラアデノウイルスAd5.Fib17はCD34Lin細胞に感染しないことを示しており、それはGFPが発現しないことによって見られたとおりである。対照的に、血清型16、51又は35の繊維組織分子を有しているキメラウイルスにつき、この細胞集団において高いパーセンテージのGFP陽性細胞が記録された。CD33、CD38及びCD71もまた発現しているCD34細胞においてはGFPの発現はほとんど見られなかったため、CD34Linについて特異性が示された。細胞の早期分化マーカーCD33骨髄、CD71赤血球及びCD38共通した早期分化マーカーについて陽性の度合いが高くなる時に、Ad5.Fib16、Ad5.Fib35又はAd5.Fib51を用いて、CD34Lin細胞のサブ分画図22により、GFPが陽性である細胞のパーセンテージが減少することが示された。そこでこれらの結果は、キメラアデノウイルスAd5.Fib16、Ad5.Fib35及びAd5.Fib51の、HSCに対する特異性を示している。図23はAd5繊維組織と、Ad16、35及び51に由来するキメラBグループ繊維蛋白質との配列の一致を示している。形質導入処理の後に回収された細胞の数を測定することにより、アデノウイルスの毒性を決定することができる。CD34Linの数のみならず、CD34細胞が回収された数は図24、1000個のアデノウイルス微粒子に2時間曝すことは、回収された細胞の数に影響しないことを示している。実施例10樹状細胞のための細胞型特異性を有するAd35/ファイバー35キメラベクター樹状細胞は抗原提示細胞APCであり、初期免疫反応を開始する様に特殊化されていて記憶型の免疫反応を促進することが可能である。それらの発達の段階に依存して、DCは異なった機能を果たし、未成熟なDCは、主要組織適合性複合体MHCクラスI及びクラスII分子による提示のための、抗原の取り込みとプロセシングにおいて非常に有効であり、それに対して成熟DCは、抗原獲得とプロセシングにおける有効性は低いが、細胞表面におけるMHC分子と共刺激分子の発現が高いために、記憶していないnaive及び記憶したCD4及びCD8T細胞をより良く刺激する。未成熟なDCは抗原を取り込んだ後にインビボで成熟し、リンパ系器官のT細胞区域へ移動し、そしてT細胞活性化をプライムする。DCは免疫反応の惹起を担っている細胞なので、DCを免疫刺激性蛋白質、ペプチドまたはこれらをコードする遺伝子にロードして免疫システムを引き起こすことについて、長い間興味が持たれてきた。この戦略の適用は、ワクチン接種の分野のみならず癌治療の分野でもある。これまで癌に対する戦略は主として、DCを抗原蛋白質又はペプチドと共にエクスビボでロードすることに焦点が置かれてきた。この方法は細胞障害性T細胞活性を誘導する結果となるということが、これらの研究により明らかとなってきた。細胞をロードするのに用いられる抗原は、一般的には癌特異的であるとして同定されている。この様な抗原のいくつかの例として、限定をするものではないが、GP100、mage、メラノーマに対するMart-1がある。癌の治療に加えて、ワクチン接種によって現在予防される可能性があるヒトの疾患が他に多くある。ワクチン接種の戦略において、不活化された病原体が、抗原提示細胞即ち未成熟DCの活性を介して免疫システムへ提示される。ワクチン接種の戦略を介する疾患予防の良く知られた例には、肝炎A、B及びC、インフルエンザ、狂犬病、黄熱病、麻疹が含まれる。これらの良く知られたワクチン接種プログラムに加えて、マラリア、エボラ、リバーブラインドネス、HIV及び他の多くの病気の治療のための研究プログラムが開発されてきた。上記の病原体の多くは、不活化された病原体の生成において危険であると考えられている。そこでこの後者は各病原体の蛋白質の単離及び特性解析を求めることとなり、それによって完璧な免疫反応を起こすことを可能とし、それによって野生型病原体の挑戦に対して完璧に防御するという結果となる。この免疫刺激性蛋白質又はペプチドと共にDCをロードするという戦略を、治療的に実現可能とするために、少なくとも2つの別個の基準に合わなければならない。1DCを多量に単離することであって、そのDCは単離され、操作され、また方法を自己移植的とするために患者への再注入が可能である。今日までに、その様に多量の未成熟DCを、任意に与えられたドナーに由来する、培養した末梢血単球から得ることが可能である。2DCに効率的に形質導入できるベクターであって、免疫刺激性の蛋白質をコードするDNAを運搬できる様なもの。後者は非常に重要であり、なぜならばDCがリンパ系器官へと移動することが必要となる時には多くの蛋白質又はペプチドは既にDCから放出され、不完全な免疫プライミングが起こるという結果となっていることが、明らかとなっているからである。DCは最終的に分化しておりそのために分裂しない細胞であるので、組み換えたアデノウイルスベクターは、抗原をコードしているDNAをDCへ運搬すると考えられている。理想的にはこのアデノウイルスベクターは樹状細胞への高い親和性を有するべきであるが、加えてインビボにおけるDCの形質導入を達成する様な宿主の、中和抗体によって認識されるべきではない。この後者により、DCのエクスビボ操作に対する必要性は除外されるが、現在主として行われているワクチン接種プログラムである、筋肉注射又は皮下注射と同等の医学的な手段を用いるという結果となるであろう。そこで、免疫原性の蛋白質をコードしているアデノウイルスベクターにより形質導入されたDCは、免疫治療とワクチン接種のための天然アジュバントとして役立つことに適していることが理想的である。上記の例より、DCへの効率的な遺伝子送達は遺伝子治療の分野における主要な興味であると結論することができる。そこで、アデノウイルス血清型5宿主細胞の範囲をインビトロのみならずインビボで標的化できるように改変することは、本発明の主要な興味である。キメラアデノウイルスをヒトDCにとって好ましい感染特性で同定するために、代わりの血清型血清型8、9、13、16、17、32、35、45、40-L、51に由来する繊維組織分子を有している、Ad5に基づくウイルスのライブラリーを構築した。対照としてAd5を用いた。我々は、未熟及び成熟DC由来のヒト単球の、異なった繊維組織が発現している組み換えキメラアデノウイルスへの感受性を評価した。健康なドナー由来のヒトPBMCを、フィコールハイパクー密度遠心分離によって単離した。FITCラベルした抗ヒト14モノクローナル抗体BectonDickinsonによる染色、抗FITCマイクロビーズ及びMACS分離カラムMiltenyiBiotecを用いてCD14細胞を増やすことにより、PBMCから単球を単離した。この操作は通常、FACSによって解析される様に、90未満のCD14細胞の細胞集団であるという結果となる。細胞を、10ウシ胎児血清ギブコ、200ng/mlのrhuGM-CSFRD/ITKdiagnostics、100ng/mlのrhuIL-4RD/ITKdiagnosticsを含んでいるRPMI1640培地ギブコを用いた培養液中に置き、サイトカインを含んでいる新鮮な培地によって一日おきに培養液を給餌しながら7日間培養した。この方法によって7日後に得られる未成熟なDCは、FACS解析によって示される様に、CD83、CD14low又はCD14、HLA-DRの表現型を発現する。未成熟なDCを、100ng/mlのTNF-aを含んでいる培地中でその細胞を3日間培養することによって成させ、その後にはそれらは細胞表層にCD83を発現した。パイロット実験において、5×105個の未成熟なDCを24穴プレートのウェルに播種し、各々の繊維組織組み換えウイルスの細胞あたり100から1000のウイルス微粒子に24時間曝した。試験されたウイルスはアデノウイルス血清型5Ad5、及びAd5に基づく繊維組織キメラウイルスである、Ad5.Fib12、Ad5.Fib16、Ad5.Fib28、Ad5.Fib32、Ad5.Fib40-L血清型40の長い繊維、Ad5.Fib49、及びAd5.Fib51ここで、Fibxxは繊維組織分子が由来する血清型を表すであり、これらのウイルスはそれぞれ、サブグループC,A,B,D,D,F,D及びBから得られた。24時間後に細胞を溶解し1トライトンX-100/PBS、製造者によって提供されたプロトコールを用いて、ルシフェラーゼ活性を測定したPromega、Madison,WI,USA。図25に示されるこの実験の結果は、Ad5は未成熟DCにあまり感染しないことを示しており、それは導入遺伝子の発現レベルが低いことによって見られたとおりである。対照的に、Ad5.Fib16とAd5.Fib51両者ともBグループの繊維組織キメラウイルスであるそしてAd5.Fib40-LサブグループFもまた、ルシフェラーゼ導入遺伝子発現に基づいた効率的な感染を示した。第二の実験において、5×105個の未成熟及び成熟DCを、全てマーカーとしてLacZ遺伝子を有している、Ad5、Ad5.Fib16、Ad5.Fib40-L、及びAd5.Fib51の細胞あたり、10000のウイルス微粒子によって感染させた。CM-FDGキットシステムと製造者によって提供された指示Molecularprobes,Leiden,オランダを使いて、フローサイトメトリー解析によりLacZの発現を観察した。図26に示されているこの実験の結果は、Ad5.Fib16とAd5.Fib51は、成熟及び未成熟のヒトDCに形質導入することにおいてAd5より勝っている、という前の実験と一致している。またこの実験は、Ad5.Fib40-Lは、Ad5.Fib16とAd5.Fib51程には良くないが、Ad5よりは良いことを示している。これらの結果に基づき、Bグループウイルスの繊維組織を含んでいる他のキメラアデノウイルス、即ちAd5.Fib11とAd5.Fib35について、それらがDCに感染する能力を試験した。我々は未成熟なDCに焦点を絞ったが、なぜならば、これらは発現した導入遺伝子産物がMHCクラスIとIIが提示可能なペプチドとなる過程の細胞であるからである。未成熟なDCを5×105個/ウェルの細胞密度で24穴プレートコースターに播種し、細胞あたり1000及び5000ウイルス微粒子で感染させ、その後に、細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を測定するまで、未成熟DCのための条件下で細胞を48時間培養した。図27に示されるこの実験の結果は、グループBウイルスの繊維組織を含んでいるAd5に基づくキメラウイルスは未成熟DCに効率的に感染する、ということを示している。第四の実験において、前で述べた実験と同様にして我々は再び未成熟DCを感染させたが、この時にはAd5、Ad5.Fib16、及びAd5.Fib35を用いて、マーカー遺伝子として緑色蛍光蛋白質GFPをのせた。ウイルス暴露の48時間後にフローサイトメーターを用いて測定したGFP発現の結果が図28に示され、これまでに得られたデータと相関している。そこで、これまでに得られた結果は、主として35、51、16及び11の繊維組織である、サブグループBから得られた代替のアデノウイルス由来の繊維組織を有しているAd5に基づくベクターは、ヒトDCに形質導入するにあたってAd5より優れている、という点で一致している。ここで開示されたアデノウイルスは動物のワクチン接種にも非常に適している。これを明らかにするために、マウス及びチンパンジー由来のDCについて我々は試験を行い、これらのウイルスをこれらの動物モデルにおいて使用することが可能であるかを確認した。サブグループB由来のヒトアデノウイルスについてのレセプターは今日まで知られておらず、そのためにこの蛋白質は種の間で保存されているかどうか未知であるために、この後者については格別に検討した。両者の種について、24穴のプレートの1ウェルあたり105個の未成熟なDCを播種した。続いて、マウスDCの場合にはAd5、Ad5.Fib16及びAd5.Fib51、そしてチンパンジーDCの場合にはAd5及びAd5.Fib35の細胞あたり、1000ウイルス微粒子に48時間曝した図29を見よ。マウスの実験は、マーカーとしてルシフェラーゼを有するウイルスを用いて行われ、Ad5と比較しておよそ10-50倍のルシフェラーゼ活性の増加が示された。チンパンジーDCをGFPウイルスによって感染させて、フローサイトメーターを用いて解析を行った。図29にも示されているこれらの結果は、Ad5.Fib3566.5と比較して、Ad53はチンパンジーDCへの形質導入が少ないことを示している。実施例11Ad11に基づく組み換えウイルスと生成するためのプラスミドに基づくベクターシステムの構築実施例5において述べた中和実験の結果は、Ad35と同様にAd11もまた、ヒト血清サンプルの大部分においては中和されないことを示している。そこで、Ad11に基づく組み換えアデノウイルスは、遺伝子治療処置及びワクチン接種のためのベクターとして、一般的に使用されるAd2及びAd5に基づくベクターよりも好ましい。Ad35とAd11の両者はBグループのウイルスであり、DNAホモロジークラスター2に属するウイルスとして分類されているWadell,1984。そこで、Ad35とAd11のゲノムは非常に似通っている。Ad11に基づく組み換えウイルスの作製ためプラスミドに基づくシステムを生成するために、実施例7において生成したアダプタープラスミドpAdApt35IP1を下記の様に改変した。構築物pAdApt35IP1をAvrIIにより、そしてPacIにより部分的に消化した。消化混合物をゲル上で分離し、発現カセットとベクター骨格を含んでいる4.4kbの断片をジェネクリーンキットBIO101,Inc.を用いて単離した。そして、PwoDNAポリメラーゼを製造者の指示に従って使用しながら、プライマー35F1と35R2実施例7を見よを用いて、wtAd11のDNAのPCR増幅を行った。PCR精製キットLTIを用いながら得られた0.5kbのPCR断片を精製し、上記で作製されたpAdApt35IP1の断片へライゲートした。これにより構築物pAdApt11-35IP1が与えられ、その中では5’アデノウイルス断片はAd11の対応する配列へと変換されている。次に、pAdApt11-35IP1はBglIIによって、そして部分的にPacIによって分解される。得られた断片をゲル上で分離し、ベクター配列、5’アデノウイルス断片及び発現カセットを含んでいる3.6kb断片を、上記のようにゲルから精製する。次に、プライマー35F3と35R4実施例7を見よを用いて、wtAd11のDNAのPCR断片を生成する。増幅は上記と同様に行われ、得られた1.3kb断片を精製し、BglIIとPacIによって消化する。そして単離された断片をライゲートし、構築物pAdApt11IP1を与える。このアダプタープラスミドは今、Ad35配列の代わりにAd11配列を含む。PCRによって増幅されたAd11配列の増幅が正確であることは、このクローンの配列を、Ad11のDNAの対応する配列と比較することによって実証された。示されたPCRプライマーを用いて、Ad11のDNAの配列を直接決定することによって、後者は得られる。Ad11骨格を含んでいる大きなコスミドクローンは、以下の様にして生成される。最初に、実施例7でAd35のDNAについて述べた様に、PwoDNAポリメラーゼによりプライマー35F5と35R6を用いて、Ad11のDNAのPCR断片を増幅する。その後PCR精製キットLTIを用いて断片PCR断片を精製し、NotIとNdeIにより消化する。ジェネクリーンキットBio101,Incを用いて、得られた3.1kb断片をゲルから単離した。PwoDNAポリメラーゼと共に製造者のマニュアルに従って用いて、プライマー35F7と35R8実施例7を見よを使用してAd11のDNAの第二のPCR断片を生成し、PCR精製キットLTIを用いて精製した。この増幅された断片もまたNdeIとNotIを用いて消化し、得られた1.6kbの断片を上記の様にしてゲルから精製した。2つの消化されたPCR断片を、その後共にコスミドベクターpWE15にライゲートし、pWE15は予めNotIで消化してTsap酵素を用いて製造者のマニュアルに従って脱リン酸化しておいた。両断片が1コピー挿入された、一つのクローンが選抜された。正しいクローンを解析的なNotI消化によって選抜し、その消化は4.7kbの断片を与える。同じサイズの断片を与える35F5と35R8プライマーを用いたPCR反応により、確認を得た。正しいクローンをその後NdeIにより平滑化し、ゲルから単離した。次にwtAd11のDNAをNdeIにより消化し、製造者の指示に従いアガロース酵素ロシュを用いながら、低融点アガロースゲルから大きな27kb断片を単離した。両者の断片をその後ライゲートして、製造者のプロトコールに従ってλファージパッケージング抽出物ストラタジーンを用いてパッケージした。STBL-2細胞LTIへ感染させた後、コロニーをプレート上で生育して完全な挿入物の存在を解析した。選抜されたクローンの機能性を、その後にPER.C6での共感染によって試験した。これに関して、DNAをNotIで消化し、6マイクログラムを、プライマー35F1と35R4実施例7を見よによってAd11のDNAにつき生成したPCR断片の2マイクログラムと共トランスフェクトした。トランスフェクションに続く一週間の内に、正しいクローンはCPEを与える。正しいクローンをpWE.Ad11.pIX-rITRと名づけた。上記の方法を用いてプラスミドに基づくシステムが生成し、そのシステムは、外来遺伝子の挿入に適したアダプタープラスミド及びウイルス骨格を含んでいる大きなヘルパー断片からなる。組み換えAd11に基づくウイルスは、Ad35に基づく組み換えウイルスにおいて述べた方法を用いて作製した。実施例12患者から得られたサンプルの中のウイルスの中和実施例1と5の中で述べた中和実験において、全てのサンプルは健康なボランティアから得た。非中和ベクターの適用の一つは遺伝子治療の分野であり、遺伝子治療の処置の候補者である患者群において、Ad35はやはり中和頻度が低く、力価も低いかどうかを検討することは興味深い。心血管疾患患者26のペア血清と心嚢液pericardialfluid:PFのサンプルを、心不全を有する患者から得た。これらを、実施例1において述べた中和アッセイを用いて、Ad5とAd35について試験した。この結果は、健康なボランティアに由来するサンプルについての先のデータを確認するものであった。血清サンプルの70はAd5のためのNAを含み、そして4はAd35のためのNAを含んでいた。心嚢液サンプルでの力価はより低く、全体の40がAd5のためのNAを有し、Ad35のためのNAを有するものはなかった。PF中のNAと血清の間には良い相関があり、即ち、ペア血清サンプル中にNAを有さない陽性PFサンプルはなかった。これらの結果は、Ad35に基づく非中和ベクターは、心血管疾患の治療の目的において、Ad5ベクターより好ましいことを示している。この適応における全ての形態の非中和ベクターについて正しいことであるが、ベクターは非中和血清型のゲノムに基づくか、又はAd5又は他の血清型に基づくことができるが、しかし、少なくとも非中和活性型の主要なカプシド蛋白質ヘキソン、ペントン及び随意的に繊維組織を提示している。リューマチ関節炎患者関節炎のもとにある分子決定因子はまだ知られていないが、関節におけるT細胞機能不全と成長因子産生の不均衡が、滑膜組織の炎症と過形成を引き起こすことが知られている。滑膜細胞cynoviocyteの増殖が開始し、軟骨と骨に侵入し、これらの組織を破壊する結果となる。現在の治療は初期段階の時は抗炎症剤抗TNF,IL1-RA、IL-10及び/又は従来の薬物例えばMTX、スルファサラジンの投与から始まる。リューマチ関節炎の後期段階においては、外科手術に基づく滑膜切除術、放射線照射、又は化学的な治療が行われる。替わりの又は付加的な選択は遺伝子治療を介した処置であり、そこでアデノウイルスベクターは患者の関節に直接に運搬され、抗炎症剤又は自殺遺伝子が発現する。コラーゲンによって誘導された関節炎に罹っているアカゲザルで行われた前の研究は、マーカー遺伝子を有するAd5に基づくベクターは、滑膜細胞cynoviocyteに形質導入することができることを示している。ヒトの場合において、アデノウイルスの運搬はNAの存在によって妨げられるかどうかは知られていない。リューマチ関節炎患者の心嚢液SF中にNAが存在しているかを調べるために、リューマチ関節炎RAに罹っている患者からランダムに選ばれた53人のパネルからSFサンプルを得た。実施例1で述べた中和アッセイを用いて、いくつかのwtアデノウイルスについてこれらを試験した。このスクリーニングの結果を表IIIに示す。72のSFサンプルで、アデノウイルス5型は中和されることが見出された。これらのサンプルの大部分は高い力価のNAを含み、そこで試験した最も高いSFサンプルの希釈率64×でもAd5ウイルスは中和された。これは、リューマチ関節炎患者の関節において滑膜細胞cynoviocyteへアデノウイルスベクターを運搬しても、非常に無効であろうことを示している。更に、SF中での力価は非常に高いために、ベクターの注入に先立っての洗浄はNAを十分に除去するかどうかは疑わしい。試験された他の血清型の中で、Ad35はサンプルの4だけを中和することが示された。そのために、これらのデータは健康な患者由来の血清サンプルで得られた結果を確認するものであり、Ad35に由来するカプシド蛋白質の少なくともいくつかを提示しているAd35に基づくベクター又はキメラベクターは、リューマチ関節炎の治療において好ましいベクターであることを示している。実施例13Ad35に基づくウイルスの骨格の修飾1pBr/Ad35.Pac-rITR及びpBr/Ad35.PRnの作製実施例4は、Ad35サブクローンpBr/Ad35.Eco13.3の作製について述べている。このクローンはAd35の配列をbp21943からEcoRIへクローン化されたライトITRの末端まで、そしてpBr322のEcoRVを含む。これらの配列をAd35においてbp18137に位置しているPacI部位まで伸長するために、pBr/Ad35.Eco13.3実施例4を見よをAatIIとSnaBIで消化し、そして断片を含んでいる大きなベクターをQIAEXIIゲル抽出キットQiagenを用いてゲルから単離した。Ad35wtのDNAをPacIとSnaBIで消化し、上記のようにして4.6kb断片を単離した。そしてこの断片を、PacIとAatIIの突出を含んでいる二本鎖dsリンカーへライゲートした。下記のオリゴヌクレオチドをアニールした後にこのリンカーが得られた。A-P1:5’-CTGGTGGTTAAT-3’A-P2:5’-TAACCACCAGACGT-3’dsリンカーとAd35のPacI-SnaBI断片を含んでいるライゲーション混合物を、ライゲートされていないリンカーから、LMPゲル上で分離した。4.6kbのバンドをゲルから切り出して65°Cで融解し、そしてAatIIとSnaBIで消化した精製pBr/Ad35.Eco13.3ベクター断片とライゲートした。ライゲーションを電気コンピーテントなDH10B細胞LifeTechnologiesInc.へ形質導入した。得られたクローンであるpBr/Ad35.Pac-rITRはAd35配列を、PacI部位のbp18137からライトITRまで含んでいた。次に、ベクター配列からITRを遊離させることを可能とするために、特異な制限部位をライトITRの3’末端に導入した。これにつき、Ad35配列のbp33165におけるNdeI部位からライトITRまでをカバーするPCR断片が用いられ、ライトITRは、rITRへ取り付けられたSwaI,NotI及びEcoRI制限部位を有している。プライマー35F7と35R8実施例7で述べられているを用いてPCR断片を作製した。精製の後、PCR断片をATクローニングベクターインビトロゲンへクローン化し、正しい増幅を証明するために配列を決定した。正しく増幅されたクローンをその後にEcoRIで消化し、クレノフklenow酵素で平滑化し、続いてNdeIで消化してPCR断片を単離した。平行して、pBr/Ad35.Pac-rITRでのpBrベクターにおけるNdeIを下記の様にして除去した。NdeIを用いた消化、クレノフ処理及び再ライゲーションによってNdeI部位を除去したpBr322ベクターを、AatIIとNheIによって消化した。ベクター断片をLMPゲルで単離し、やはりLMPゲルで単離したpBr/Ad35.Pac-rITR由来の16.7kbのAd35.AatII-NheI断片とライゲートした。これにより、pBr/Ad35.Pac-rITR.△NdeIを作製した。次にpBr/Ad35.Pac-rITR.△NdeIをNdeIによって消化し、クレノフ酵素を用いて末端を充填し、そしてDNAをNdeIによって消化した。ベクターとAd35配列を含んでいる大きな断片を単離した。このベクター断片とPCR断片のライゲーションの結果、pBr/Ad35.PRnを得た。このクローンにおいて、繊維組織、E2A,E3,E4又はヘキソンをコードする特異的な配列を操作することができる。加えて、例えばE4蛋白質又はE2を駆動するプロモーターを、異種のプロモーターへと変異、欠損又は改変することができる。2異なった血清型に由来する繊維組織蛋白質を有するAd35に基づくウイルスの産生アデノウイルスはヒト細胞に異なった効率で感染する。感染は以下を含む2つの過程を伴っている。1.ウイルスと細胞上の特異的なレセプターへの結合を仲介する繊維組織蛋白質、及び2.例えばRGD配列と細胞表層に存在するインテグリンへの相互作用による、インターナリゼーションを仲介するペントン蛋白質。Ad35がメンバーであるサブグループBのウイルスについては繊維蛋白質のための細胞間レセプターは知られていない。ヒト細胞の感染効率において、Ad5の様なサブグループCのウイルスと比較して、サブグループBのウイルスには大きな差があるWO00/03029とEP99200624.7を見よ。一つのサブグループ内でさえも、特定のヒト細胞の感染効率は種々の血清型の間で異なることがある。例えば、Ad16の繊維組織は、Ad5に基づく組み換えウイルス上に存在するとき、ヒト及びアカゲザル由来の初代内皮細胞、平滑筋細胞及び滑膜細胞cynoviocyteに、Ad35又はAd51の繊維組織を有するAd5キメラウイルスよりも良く感染する。そこで、Ad35に基づくウイルスの高い感染活性を得るために、繊維蛋白質を異なった血清型の繊維蛋白質に変えることが必要かもしれない。その様な繊維キメラの技術が、実施例3においてAd5に基づくウイルスについて述べられており、下記においてAd35ウイルスについて例示されている。最初に、構築物pBr/Ad35.PRnにおいて多くの繊維組織配列がAd35骨格より下記の様に除去されている。左フランキング配列と、Ad35の繊維蛋白質の一部分である特異なMluI部位の上流であるbp30225から繊維組織の尾部のbp30872図6に開示したwtAd35配列による番号までの範囲を、以下のプライマーを用いて増幅した。DF35-1:5’-CACTCACCACCTCCAATTCC-3’及びDF35-2:5-CGGGATCCCGTACGGGTAGACAGGGTTGAAGG-3’このPCR増幅によって繊維組織遺伝子の尾部に特異なBsiWI部位が導入される。繊維組織蛋白質の末端のbp31798から、特異なNdeI部位の3’から得たbp33199wtAd35配列による番号、図6までの範囲の右フランキング配列を、以下のプライマーを用いて増幅した。DF35-3:5’-CGGGATCCGCTAGCTGAAATAAAGTTTAAGTGTTTTTATTTAAAATCAC-3’及びDF35-4:5’-CCAGTTGCATTGCTTGGTTGG-3’このPCRは、繊維組織配列の代わりに特異なNdeI部位を導入する。PCR増幅は製造者の指示に従って、PwoDNAポリメラーゼロシュを用いて行われた。増幅の後、PCR産物をPCR精製キットを用いて精製し、断片をBamHIで消化してライゲートした。2kbのライゲートされた断片をゲルから精製し、PCRScriptAmpベクターStratageneへクローン化した。増幅の正確さを配列決定によってチェックした。そしてPCR断片をMluI/NdeI断片として切り出し、同じ酵素によって消化したpBr/Ad35.PRnへクローン化した。これによりpBr/Ad35.PR△fibが生成し、pBr/Ad35.PR△fibは替わりの血清型の繊維組織配列を導入するのに適したシャトルベクターである。この戦略は、WO00/03029に開示された、Ad5に基づくウイルスのための繊維改変の戦略と類似している。その出願の表Iに挙げられたプライマーを、アデノウイルスの種々のサブグループの繊維組織配列を増幅するのに用いた。pBr/Ad35.PR△fibにおいてクローン化された繊維組織の増幅のために、同じ宿重した:degenerateプライマー配列を使用することができるが、しかし、順方向プライマー尾部オリゴヌクレオチドAからEのNdeI部位はBsiWI部位へ変えられるべきであり、逆方向オリゴヌのNsiI部位knobオリゴヌクレオチド1から8はNheI部位へ変えられるべきである。そこで、下記の宿重プライマーを用いて16の繊維組織配列を増幅した。5’-CCKGTSTACCCGTACGAAGATGAAAGC-3’及び5’-CCGGCTAGCTCAGTCATCTTCTCTGATATA-3’そして増幅された配列はBsiWIとNheIによって消化され、同じ酵素によって消化されたpBr/Ad35.PR△fibへクローン化され、pBr/Ad35.PR△fib16を生成した。そして後者の構築物をPacIとSwaIによって消化し、挿入物をゲルから単離した。改変された繊維組織を有するPacI/SwaIAd35断片を、その後pWE/Ad35.pIX-rITRの対応する部位へクローン化し、pWE/Ad35.pIX-rITR.fib16を与えた。そしてこのコスミド骨格をAd35に基づくアダプタープラスミドと共に用いて、Ad16の繊維組織を提示するAd35組み換えウイルスを生成した。他の繊維組織配列を上記で述べた宿重したプライマーによって増幅することができる。もし繊維組織配列の一つが内在性のBsiWIとNheI部位を有することが判ったら、PCR断片はその酵素によって部分的に消化されなければならないであろう。3誘導可能であってE1非依存性のE4発現を伴ったAd35に基づくウイルスの生成アデノウイルスE4プロモーターはE1蛋白質の発現によって活性化される。Ad5のE1蛋白質が、Ad35のE4プロモーターの活性化を仲介することが可能であるかどうかは未知である。そこで、PCR.C6細胞においてAd35組み換えウイルスの作製を可能とするために、E1に依存しないE4の発現を作製することは有利であろう。これは、Ad35-E4プロモーターを異種のプロモーター、それに限定するものではないが例えば7xTetOプロモーター、により、によって置き換えることにより達成できる。E1を欠損したAd5に基づく組み換えベクターは、E1が発現しないにも関わらず、標的細胞でベクター骨格に由来するウイルス遺伝子の発現が残ることを示している。ウイルス遺伝子の発現は毒性を増加し、感染された細胞に宿主免疫反応を引き起こすかもしれない。遺伝子治療とワクチン接種の分野における、多くのアデノウイルスベクター適用において、骨格に由来するウイルス遺伝子の発現を減少又は消滅させることが望まれている。これを達成する道の一つは、ウイルス骨格に由来する配列を全て、又はできるだけ多く除くことである。E2A、E2B又はE4遺伝子及び/又は後期遺伝子の機能を除くことにより、作製する間にこれらの機能を補わなければならない。ヘルパーウイルスの手段によって、又はこれらの機能を安定的に付加することのいづれかにより、誘導可能な転写調節を伴い又は伴わず、産生細胞へこの補足を行うことができる。これを達成するための方法はAd5について述べられていて本分野で知られている。一つの特異的な方法は、標的細胞においては活性を有さないプロモーター配列によってE4プロモーターを置換することである。E4蛋白質は、例えばE2プロモーターの活性化を介しアデノウイルスの複製において、またスプライシングの調節と後期遺伝子の転写産物の核輸送を介し後期遺伝子の発現において、役割を果たす。加えて、E4蛋白質の少なくともいくつかは細胞に毒性を有する。そこで、標的細胞においてE4の発現を減少させること又は除くことにより、Ad35に基づくベクターは更に改善されるであろう。これを達成する道の一つは、標的細胞においては不活性である異種プロモーターによってE4プロモーターを置換することである。標的細胞において不活性な異種プロモーター/アクチベーターシステムの一例は、テトラサイクリン誘導性TetOシステムであるGossen及びBujard,1992。他の原核又は合成プロモーター/アクチベーターシステムを使用することもできる。この例において、ウイルスベクターの骨格のE4プロモーターは、tetオペロン7xTetO由来のテトラサイクリン反応性因子の7回繰り返しを含んでいるDNA断片によって置換されている。このプロモーターに対する強いトランスアクチベーターは、tetリプレッサーのDNA結合領域及びVP16の活性化領域Tetトランスアクチベーター蛋白質、Ttaを含んでいる融合蛋白質である。E1発現に依存しない強力なE4発現を、Ttaを発現しているPER.C6細胞において達成することができる。Ttaを発現しているPER.C6細胞は作製されて記載されている実施例15を見よ。7xTetOの制御下であるE4を有するAd5由来のE1欠損ウイルスを産生することは可能であり、これらの細胞において殖やされている。ヒト又は動物起源の細胞Ttaトランスアクチベーターを発現しないにおける感染に続いて、通常のE4プロモーターを有するE1欠損ウイルスと比較して、E4発現が大きく減少していることが見出された。以下に、E4プロモーター置換を有するウイルスを産生するためのコスミドヘルパーベクターであるpWEAd35pIXrITRTetOE4の構築を説明する。まず、pBrAd35PRnDNAを次のプライマーを用いてPCR増幅することによりフラグメントを作製した。355ITR5GATCCGGAGCTCACAACGTCATTTTCCCACG3および353ITR5CGGAATTCGCGGCCGCATTTAAATC3である。このフラグメントは、bp34656wtAd35に従った番号とpBrAd35PRnの右ITRのNoti部位3との間の配列を含み、かつ右ITR配列のSstI部位5を導入する。第2のPCRフラグメントを次のプライマーを用いてpBrAd35PRnDNA上に作製した。35DE45CCCAAGCTTGCTTGTGTATATATATTGTGG3および35F7である。実施例7を参照のこと。このPCRはbp33098と34500wtAd35に従った番号との間のAd35配列を増幅し、かつE4TATAボックスの上流にHindIII部位を導入する。これら2つのPCR反応により、E4プロモーターの右および左フランキング配列を増幅する。増幅には、製造元の説明書に従ってPwoDNAポリメラーゼを用いた。SstIおよびHindIIIで消化して、7xTetOプロモーターを含む第3のフラグメントを構築物pAAOETATA7xTetOから単離した。pAAOETATA7xTetOの作製法を以下に説明する。第1のPCRフラグメント355353をSstIおよびNotIで消化し、7xTetOフラグメントにライゲートした。次に、ライゲーション混合物をHindIIIおよびNotIで消化し、05kbのフラグメントをゲルから単離する。第2のPCRフラグメント35DE435F7をNdeIおよびHindIIIで消化し、ゲルを精製した。次に、これら2つのフラグメントをNdeIおよびNotIで消化したpBrAd35PRn中にライゲートしてpBrAd35PRTetOE4を得た。次いで、E4プロモーターの修飾をAd35ヘルパーコスミドクローンのPacISwaIフラグメントをpBrAd35PRTetOE4から得たPacISwaIフラグメントで交換することによりAd35ヘルパーコスミドクローンに転写して、pWEAd35pIXrITRTetOE4を得る。pAAOETATA7xTetOを次のようにして作製した。2つのオリゴヌクレオチドTATAplus5AGCTTTCTTATAAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGCTTAAG3およびTATAmin5AGCTCTTAAGCAATTTACTAGTCTAACACTGAAAATTTATAAGAA3下線部の配列は修飾TATAボックスを形成するを合成した。このオリゴヌクレオチドをアニールして、HindIIIで消化したDNAと適合する5オーバーハングを有する2本鎖DNAフラグメントを得た。アリーリング反応の生成物を、HindIIIで消化したpGL3エンハンサーベクターPromegaにライゲートして、pAAOETATAを得た。さらにクローニングするために、修復した挿入フラグメントの5末端にHindIII部位を有するクローンを選択した。次に、7量体化tetオペレーター配列を、拡張PCRシステムRocheを用い、製造元の手順に従い、PRC反応内でプラスミドpUHC133から増幅した。次のプライマーを用いた。tet35CCGGAGCTCCATGGCCTAACTCGAGTTTACCACTCCC3およびtet55CCCAAGCTTAGCTCGACTTTCACTTTTCTC3である。増幅したフラグメントをSstIおよびHindIIIこれらの部位は、それぞれtet3およびtet5に存在するで消化し、SstIHindIIIで消化したpAAOETATAにクローンして、pAAOETATA7xtetOを得た。作製したpWEAd35pIXrITRTetOE4コスミドクローンの機能性を調べるために、このDNAをNotIで消化した。次いで、wtAd35DNAの左末端をプライマー35F1および35R4を用いて増幅した。実施例7参照。増幅の後、PCR混合物を精製し、SalIで消化して完全なウイルスDNAを取り出した。次に、消化したpWEAd35pIXrITRTetOE4およびPCRフラグメントの両方の4grを、前日にT25フラスコに播種したPERC6tTA細胞に同時トランスフェクションした。2日後、トランスフェクションした細胞をT80フラスコに移し、その2日後にCPEを得た。この結果、コスミドのバックボーンが機能的であることが分かった。実施例14E1欠損Ad35ウイルスを補完することのできる細胞株の産生pIG135およびpIG270の産生構築物pIGElAElBは、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターPGKおよびB型肝炎ウイルスのpolyA配列と作用的に連結された459~3510のwtAd5配列Genbank寄託番号M72360に対応するAd5のE1領域配列を含む。この構築物の産生についてはWO9700326に記載されている。Ad5のE1配列をAd35の対応する配列で次のように置換する。pRSVAd35E1実施例8において説明をEcoRIおよびSse8387Iで消化し、Ad35E1配列に対応する3kbのフラグメントをゲルから単離した。構築物pIGElAElBをSse8387Iで完全に消化し、EcoRIで部分的に消化した。Ad5E1領域を有しないが、PGKプロモーターを有するベクター配列に対応する42kbのフラグメントをLMPアガロースゲル上の他のフラグメントから分離し、ゲルからコレクトバンドcorrectbandを励起する。得られたフラグメントの両者をライゲートし、pIGAd35Elを得た。このベクターを更に修飾して、pUC119ベクターのバックボーンに存在するLacZ配列を取り出す。ここで、ベクターをBsaAIおよびBstXIで消化し、ゲルから巨大フラグメントを単離する。2本鎖オリゴを次の2つのオリゴをアニールして調製する。BB15GTGCCTAGGCCACGGGG3およびBB25GTGGCCTAGGCAC3である。このオリゴおよびベクターフラグメントのライゲーションにより、構築物pIG135を生じた。オリゴの適正な挿入によりBsaAIおよびBstXI部位を修復し、かつ固有のAvrII部位を導入する。次に、pIG135のAd35E1発現カセットの3末端に固有部位を導入した。ここで、構築物をSapIで消化し、3突出末端をT4DNAポリメラーゼで処理して平滑末端化した。このように処理した線状プラスミドをBsrGIでさらに消化し、巨大ベクターを含有するフラグメントをゲルから単離した。HBVpolyA配列の3末端を修復するため、および固有部位を導入するためにPCRフラグメントを次のプライマーを用いて作製した。270F5CACCTCTGCCTAATCATCTC3および270R5GCTCTAGAAATTCCACTGCCTTCCACC3である。PwoポリメラーゼRocheを用い、製造元の説明書に従ってpIGAd35E1DNAに対してPCRを行った。得られたPCR産物をBsrGIで消化し、かつTsap酵素LTIを用いて脱リン酸した。後者はBsrGI部位における挿入二量体化を防ぐためである。PCRフラグメントおよびベクターフラグメントをライゲーションして、構築物pIG270を得た。ラットのプライマリー細胞の形質転換が可能なAd35E1配列新生WAGRIJラットを妊娠1週で屠殺し、腎臓を取り出した。被膜を慎重に取り除いた後、37°Cのトリプシン/EDTALTI中で複数回インキュベーションし、1FBSを含有する冷PBS中で浮遊細胞を収集することにより腎臓を単細胞懸濁液に分解した。腎臓のほとんどがトリプシン処理されると、10FBSを補ったDMEM中に全細胞を再懸濁し、滅菌チーズクロスで濾過した。1つの腎臓から得た胚ラット腎臓BRK細胞を5つの皿Greiner、6cmに入れた。細胞密度が70~80に達すると、製造元の説明書に従い、CaPO4を用いて細胞を1または5μgDNA/皿でトランスフェクトした。次の構築物を別々のトランスフェクションに用いた。pIGE1AE1BAd5E1部位を発現、pRSVAd35E1、pIGAd35E1およびpIG270後者はAd35E1を発現である。病巣がトランスフェクトした細胞に現れるまで、細胞を37°C、5CO2でインキュベートした。表4は環状または線状DNAを用いた幾つかのトランスフェクション実験から得られた病巣の数を示している。予想通り、Ad5E1部位は効率的にBRK細胞に転換した。効率は低いが、病巣はAd35E1トランスフェクト細胞層にも発現した。Ad35に転換した病巣はより遅い時期に現れた。Ad5E1では7~10日であったのに対し、Ad35ではトランスフェクト後約2週間であった。これらの実験は、BグループウイルスAd35のE1遺伝子がげっ歯類プライマリー細胞を転換することができることを明白に示している。これによりAd35E1発現構築物の機能性が証明され、かつBグループウイルスAd3およびAd7の転換能力に関する初期の発見Dijkema、1979年が追認された。病巣内の細胞が実際に転換されたものであるか否かを調査するために、幾つかの病巣を取り出して増大した。7つの病巣中少なくとも5つが確立した細胞株として増殖することが分かった。プライマリーヒト羊膜由来の新たなパッケージング細胞の作製羊膜穿刺後に得た羊水を遠心分離し、細胞をAminoMax培地LTI中に再懸濁し、組織培養フラスコ内で37°C、10CO2で培養した。細胞が順調に増殖した時点およそ1細胞分裂/24時間で、AminoMax完全培地とGlutamaxI最終濃度4mM、LTI、グルコース最終濃度45gL、LTIおよび10FBSLTIを補ったDMEM低グルコース培地LTIとの1:1混合液に培地を交換した。トランスフェクションのために、約5×105細胞を10cm細胞培養皿に入れた。翌日、CaPO4トランスフェクションキットLTIを用い、製造元の説明書に従って細胞を皿当たり20マイクログラムの環状PIG270でトランスフェクトし、DNAを沈降させながら細胞を一晩インキュベートした。その翌日、細胞をPBSで4回洗浄して沈殿物を除去し、転換細胞の病巣が現れるまで3週間以上さらにインキュベートした。1週間に1回、培地を新しい培地に交換した。他のトランスフェクション剤、例えばLipofectAmineLTIまたはPEIポリエチレンイミン、高分子量、水フリー、Aldrichを用いたが、これに限定されるものではない。これら3つの薬剤のうち、一次ヒト羊膜に対してPEIが最も高いトランスフェクション効率を達成する。すなわちpAdApt35LacZのトランスフェクション後48時間で約1の青色細胞である。病巣を次のようにして分離する。培地を取り除き、PBSに交換した後、ディスポーザブルフィルターのチップを取り付けた50~200μlギルソンピペットを用いて、細胞をそっと擦り取って病巣を分離する。10μlPBSに収容した細胞を15μlトリプシン/EDTALTIを入れた96ウエル皿に移し、ピペットで上下し、室温で短時間インキュベーションすることによって単細胞懸濁液を得た。AminoMax完全培地と補助剤および10FBSを含んだDMEMとの前記1:1混合液を200μl加えた後、細胞をさらにインキュベートした。増殖を続けるクローンを増大し、異なるサブグループのE1欠失アデノウイルスベクター、具体的にはBグループウイルス、特にはAd35またはAd11から誘導されたものの補体増殖に対する能力を分析した。ヒト胚網膜芽細胞からの新たなパッケージング細胞株の作製ヒト網膜細胞を流産した胎児の目から分離し、10FBSLTIを補ったDMEM培地LTI中で培養する。トランスフェクションの前日に、約5×105細胞を6cm皿に入れ、37°C、10CO2で一晩培養する。製造元の説明書に従い、CaPO4沈殿キットを用いてトランスフェクションを行う。環状プラスミドまたは精製フラグメントのいずれかとして、各皿を8~10μgのpIG270DNAでトランスフェクトする。精製フラグメントを得るために、pIG270をAvrIIおよびXbaIで消化しAd35E1発現カセットに対応する4kbのフラグメントをアガラーゼ処理Rocheによりゲルから単離した。翌日、滅菌PBSで4回洗浄して、沈殿物を慎重に洗い流す。次いで、新しい培地を加え、転換細胞の病巣が現れるまでトランスフェクトした細胞を更に培養する。十分に大きくなると>100細胞、病巣を取り出し、前記したようにして96ウエルに入れる。増殖を続けるトランスフォームしたヒト胚網膜芽細胞のクローンを増大し、異なるサブグループのE1欠失アデノウイルスベクター、具体的にはBグループウイルス、特にはAd35またはAd11から誘導されたものの補体増殖に対する能力を分析した。PERC6由来の新しいパッケージング細胞株実施例8で説明したとおり、Ad35E1発現構築物、例えばpRSVAd35E1の同時トランスフェクションと共に、Ad35E1欠失ウイルスをPERC6細胞上に作製および増殖させることができる。しかし、この方法を用いた組換えアデノウイルスの大規模生産は煩雑である。なぜなら、各増幅ステップに対して、Ad35E1構築物のトランスフェクションが必要だからである。さらに、この方法では、プラスミドとウイルスゲノムとの間での非相同的組換えの危険性が増すと同時に、E1配列を組み込んだ組換えウイルスを作製する可能性が高くなり、複製コンピテントウイルスを生じる。これを避けるために、PERC6におけるAd35E1タンパク質の発現を、ゲノム中の発現プラスミドの完全複製により媒介する必要がある。PERC6細胞は既に形質転換されており、かつAd5E1タンパク質を発現しているので、さらにAd35E1発現を加えることは細胞に対して有毒となり得る。しかし、Ad5E1を発現するA549細胞が作られているので、E1タンパク質を有する転換細胞を安定にトランスフェクトすることも不可能ではない。サブグループBウイルスAd7由来の組換えアデノウイルスを作製する試みにおいて、Abrahamsenら1997年はwtAd7に汚染されずにE1欠失ウイルスを293細胞に作製することはできなかった。293ORF6細胞のプラーク精製後に取り出したウイルスBroughら、1996年は、非相同的組換えによりAd7E1B配列が組み込まれたことを示していた。したがって、Ad7組換えウイルスの効率的増殖によりAd7E1B発現およびAd5E4ORF6発現の存在の可能性のみが証明された。E1Bタンパク質はウイルスタンパク質と同様に細胞タンパク質と相互作用することが知られているBridgeら、1993年;White、1995年。おそらく、E1B55Kタンパク質と、ウイルスタンパク質のmRNA放出の増大および細胞mRNAの大半の放出の阻害に必要なE4ORF6との間で形成された複合体は、臨界的かつある程度血清型に特異である。Ad5のE1Aタンパク質はAd7E1A欠失を補完することが可能であり、またアデノウイルスパッケージング細胞自体でのAd7E1B発現は安定な補完細胞株を作製するには十分でないということを前記の実験は示唆している。Ad35E1Bタンパク質の一方または両方がPERC6細胞上でのAd35ベクターの効率的増殖の制限因子であるか否かを調査するために、E1BプロモーターおよびE1B配列を含むが、E1Aに対するプロモーターおよびコード領域を持たないAd35アダプタープラスミドを作製した。ここで、製造元の説明書に従い、wtAd35DNAの左末端を35F1および35R4いずれも実施例7で説明したを用いてPwoDNAポリメラーゼRocheで増幅した。46kbのPCR産物をPCR精製キットLTIを用いて精製し、SnaBIおよびApaI酵素で消化した。続いて、QIAExIIキットQiagenを用いて、得られた42kbフラグメントをゲルから精製した。次に、pAdApt35IP1実施例7をSnaBIおよびApaIで消化し、GeneCleanキットBIO101社を用いて26kbのベクターを含むフラグメントをゲルから単離した。単離したフラグメントの両方をライゲートしてpBrAd35leftITRpIXを得た。PCR中の適正な増幅を次の機能性テストにより確認した。DNAをBstBIで消化して、ベクター配列から挿入したAd35を遊離させ、このDNA4μgをNotI消化pWEAd35pIXrITR実施例7と共にPERC6細胞に同時トランスフェクトした。2日後にトランスフェクトした細胞をT80フラスコに移し、さらに2日後CPEが形成された。これは機能的E1配列を含む新しいpBrAd35leftITRpIX構築物を示している。次いで、pBrAd35leftITRpIX構築物を次のように修飾した。SnaBIおよびHindIIIでDNAを消化し、クレノー酵素を用いて5HindIIオーバーハングを補った。消化したDNAの再ライゲートおよびコンピテント細胞LTIへの転換により構築物pBrAd35leftITRpIXElAを得た。この後者の構築物は、bp450と1341との間のE1A配列を除いて左末端46kbのAd35を有しており、したがってE1AプロモーターおよびE1Aコード配列のほとんどを有していない。次いで、pBrAd35leftITRpIXE1AをBstBIで消化し、この構築物2μgをNotI消化したpWEAd35pIXrITR実施例7と共にPERC6細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクト後1週間でトランスフェクトしたフラスコ内に完全CPEを形成した。この実験から、PERC6細胞内のAd5E1A発現によりAd35E1Aタンパク質が機能的に補完されること、およびPERC6内のAd5E1発現によりAd35E1Bタンパク質の少なくとも1つは補完できないということが示された。さらに、PERC6内のAd35E1Bタンパク質を発現することによりAd35E1欠失ウイルスに対する補完細胞株を作ることができることも示された。PERC6細胞のゲノムの完全複製からのAd35E1B配列の安定的な発現は、E1Bプロモーターによって始まり、例えばHBVpAであるが、これに限定されない非相同的ポリアデニル化シグナルにより終了する。非相同pAシグナルはE1B挿入と組換えベクターとの間の重複を避けるために必要である。天然E1B終結はアデノウイルスベクター上に存在すべきpIX転写単位に位置するからである。あるいは、E1B配列は、例えばヒトPGKプロモーターであるが、これに限定されない非相同プロモーターによって始まり、例えば7xtetOプロモーターであるが、これに限定されない誘導プロモーターにより終了するGossenおよびBujard、1992年。また、これらの場合において、転写終結を非相同pA配列、例えばHBVpA等により仲介する。Ad35E1B配列は、wtAd35配列のヌクレオチド1611と3400との間に位置する、E1B21KおよびE1B55Kタンパク質のコード領域の1つを少なくとも含む。また、挿入断片はwtAd35配列のヌクレオチド1550と1611との間にAd35E1B配列の一部を含んでもよい。実施例15初期領域1および初期領域2Aを欠失した組換えアデノウイルスベクターの生産のための産生細胞株の作製PERC6tTA細胞の作製ここで、初期領域1E1および初期領域2AE2Aを欠失した組換えアデノウイルスベクター産生用の細胞株の作製について説明する。産生細胞株は、それぞれE1およびE2A遺伝子の構成性発現によるトランスでの組換えアデノウイルスベクター由来のE1およびE2A欠失を補完する。予め確立されたAd5E1形質転換ヒト胚網膜芽細胞株PERC6WO9700326にE2A発現カセットをさらに付与した。アデノウイルスE2A遺伝子は、一本鎖DNAと高親和性を有する72kDaDNA結合タンパク質をコードする。この特徴のために、DBPの構成性発現は、細胞毒性を示す。ts125E2A変異体は、アミノ酸413でPro→Ser置換するDBPをコードする。この変異により、DBPをコードするts125E2Aは、32°Cの許容温度で完全に活性であるが、39°Cの非許容温度ではssDNAに結合しない。これにより、39°Cの非許容温度で機能的でなくかつ毒性を示さないが、32°Cの許容温度への温度の変更後機能的になるE2Aを構成性発現する細胞株の作製が可能である。温度が下降するにつれて、温度感受性E2Aは次第に機能的になり、許容温度である32°Cの温度において完全に機能的になる。A.野生型E2Aまたは温度感受性ts125E2A遺伝子を発現するプラスミドの作製pcDNA3wtE2A:完全な野生型初期領域2AE2Aコード領域を、供給元BoehringerMannheimの標準的な手順にしたがって、ExpandTMLongTemplatePCRシステムを用い、プライマーDBPpcr1およびDBPpcr2を用いて、プラスミドpBRAdBamrITRECACC寄託番号P97082122から増幅した。PCRを、次の増幅プログラムを用いてBiometraTrioThermoblockに行った。94°Cで2分間を1サイクル、94°Cで10秒間51°Cで30秒間68°Cで2分間を1サイクル、94°Cで10秒間58°Cで30秒間、68°Cで2分間を10サイクル、94°Cで10秒間58°Cで30秒間68°Cで2分間およびサイクルごとに10秒間の伸長を20サイクル、68°Cで5分間を1サイクルである。プライマーDBPpcr1:CGGGATCCGCCACCATGGCCAGTCGGGAAGAGGAG5から3へは、固有のBamHI制限部位、Kozak配列斜体部の5およびE2Aコード配列の開始コドンを含む。プライマーDBPpcr2:CGGAATTCTTAAAAATCAAAGGGGTTCTGCCGC5から3へは、固有のEcoRI制限部位下線部、E2Aコード配列の終止コドンの3を含む。太字は、E2Aコード領域由来の配列をいう。PCRフラグメントを、BamHIEcoRIで消化し、BamHIEcoRI消化pcDNA3Invitrogenにクローン化し、pcDNA3wtE2Aを得た。pcDNA3tsE2A:完全なts125E2Aコード領域を、温度感受性アデノウイルス変異体H5ts125から単離したDNAから増幅した。PCR増幅の手順は、wtE2Aの増幅の手順と同じである。PCRフラグメントをBamHIEcoRIで消化し、BamHIEcoRIで消化したpcDNA3Invitrogenにクローン化して、pcDNA3tsE2Aを得た。wtE2AおよびtsE2Aのコード配列を、配列決定によって確認した。B.32°C、37°Cおよび39°Cで培養した組換えアデノウイルスベクター産生用の産生細胞の増殖特性PERC6細胞を、10CO2雰囲気内、32°C、37°Cまたは39°Cのいずれかの温度で、10ウシ胎児血清FBS、GibcoBRLおよび10mMのMgCl2を補ったダルベッコ改変イーグル培地DMEM、GibcoBRLで培養した。0日目、全体で1×106のPERC6細胞を25cm2組織培養フラスコNuncに播種し、細胞を32°C、37°Cまたは39°Cのいずれかで培養した。1~8日目に細胞を計数した。図30は39°CにおけるPERC6細胞培養の増殖率および最終細胞密度を37°Cの場合と比較して示す。32°CにおけるPERC6培養の増殖率および最終密度は37°Cまたは39°Cのものと比較して僅かに減少した。顕著な細胞死は、いずれのインキュベーション温度でも観察されなかった。したがって、PERC6細胞は、それぞれts125E2Aに対する許容温度および非許容温度である39°Cと32°Cの両方で非常に良好に機能する。C.E2A発現ベクターによるPERC6および293のトランスフェクション、コロニー形成および細胞株の産生トランスフェクション前日に、2×106PERC6細胞を10FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを収容した6cm組織培養皿Greinerに播種し、10CO2雰囲気中、37°Cでインキュベートした。翌日、10CO2雰囲気中、39°Cで細胞をトランスフェクトする以外は供給元GibcoBRLの標準手順に従って、LipofectAMINEPLUSTM試薬キットを用いて組織培養皿あたり3、5または8μgのpcDNA3、pcDNA3wtE2AまたはpcDNA3tsE2AプラスミドDNAを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をts125E2Aの非許容温度である39°Cに一定して保った。3日後、10FBS、10mMのMgCl2、および025mgmlのG418GibcoBRLを補ったDMEMに細胞を入れ、トランスフェクション10日後に最初のG418耐性コロニーが出現した。表1に示すように、pcDNA3のトランスフェクション後に得られたコロニー全数約200コロニーまたはpcDNA3tsE2Aのトランスフェクション後に得られたコロニー全数約100コロニーとpcDNA3wtE2Aのトランスフェクション後に得られたコロニー全数わずか4コロニーとの間には著しい差があった。これらの結果は、構成的に発現されたE2Aの毒性がE2Ats125E2Aの温度感受性突然変異株を用い、かつ細胞を非許容温度である39°Cで培養することによって克服することができることを示している。各トランスフェクションから、いくつかのコロニーをピペットで組織培養皿から細胞を擦り取ることにより採取した。続いて、剥がした細胞を24ウェル組織培養皿Greinerに入れ、10FBS、10mMのMgCl2、および025mgmlのG418を補ったDMEM中で、10CO2雰囲気中、39°Cで培養した。表1に示すように、pcDNA3トランスフェクションコロニーの10044およびpcDNA3tsE2Aトランスフェクションコロニーの823745が安定な細胞株を確立した。対照的に、1個のpcDNA3wtE2Aトランスフェクションコロニーのみが確立することができた。他の3つは採取直後に死滅した。次に、異なる細胞株のE2A発現レベルをウェスタンブロッティングによって決定した。細胞株を6ウェル組織培養皿に播種し、準集密的な培養株をPBSNPBIで2回洗浄し、RIPA1NP40、05デオキシコール酸ナトリウム、および01SDSを含むPBSであって、さらに1mMフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび01mgmlトリプシン阻害剤を補充したPBS中に溶解し、こすり取った。氷上で15分間インキュベーションした後、ライセートを遠心分離によって取り除いた。タンパク質濃度は、供給元BioRadの標準手順に従い、BioRadタンパク質アッセイによって測定した。等量の全細胞抽出物を10ゲル上でSDSPAGEによって分画化した。タンパク質をImmobilonPメンブランミリポアに移し、αDBPモノクローナル抗体B6と共にインキュベートした。2次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体BioRadであった。ウェスタンブロッティング法および抗体のインキュベーションは、ミリポアによって提供された手順に従って実施した。抗体複合体を、製造元Amershamの手順に従ってECL検出システムによって可視化した。図31は、pcDNA3tsE2Aトランスフェクション由来の細胞株全てが72kDaのE2Aタンパク質を発現することを示す左段のパネル、レーン4~14;中段のパネル、レーン1~13;右段のパネル、レーン1~12。対照的に、pcDNAwtE2Aトランスフェクション由来の細胞株のみがE2Aタンパク質を発現することができなかった左段のパネル、レーン2。pcDNA3トランスフェクション由来の細胞株からの抽出物ではE2Aタンパク質が検出されず左段のパネル、レーン1、負のコントロールとして用いた。PERC6細胞の抽出物はpcDNAts125によって過渡的にトランスフェクションされ左段のパネル、レーン3、ウェスタンブロット法の正のコントロールとして用いた。これらのデータは、wtE2Aの構成的発現が細胞毒性を有し、またこの毒性がE2Aのts125突然変異株を用いることによって回避することができることを確証している。D.全長ts125E2Aを構成的に発現するPERC6細胞上のアデノウイルスE2A欠失の補完アデノウイルスAd5dl802は、E2Aコード領域の主要部分が欠失したAd5由来ベクターであり、機能的DBPを産生しない。Ad5dl802を、ts125E2Aを構成的に発現するPERC6細胞のE2Aトランス補完活性を試験するために用いた。親PERC6細胞またはPERC6tsE2Aクローン39を、10FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEM中で、39°C、10CO2で25cm2フラスコ内で培養し、moi5でAd5dl802による擬似感染または感染のいずれかを行った。続いて、感染細胞を32°Cで培養し、細胞を、細胞の形態およびフラスコからの細胞の剥離における変化を測定することで細胞変性効果CPEの発現によってスクリーニングした。2日以内にAd5dl802に感染したPERC6tsE2Aクローン39に完全なCPE発現が行われた。Ad5dl802に感染したPERC6細胞または擬似感染細胞には、CPEは発現しなかった。これらのデータは、ts125E2Aを構成的に発現しているPERC6細胞が許容温度32°CでAd5dl802ベクターのE2A欠失に対してトランスで補完することを示している。E.PERC6tsE2A細胞株の無血清懸濁培養ヒト遺伝子治療のために組換えアデノウイルスベクターを大規模で産生することは、任意のヒトまたは動物構成物質を欠いている培地で、産生細胞株、好ましくは懸濁培養の容易かつ拡張可能な培養方法を必要とする。このために、細胞株PERC6tsE2Ac59c59と表すを39°C、10CO2中で10FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを収容した175cm2フラスコNuncで培養した。準集密性70~80集密で、細胞をPBSNPBIで洗浄し、培地を1倍L-グルタミンGibcoBRLを補った25mlの無血清懸濁培地ExcellTM525JRH以下SFMと示すと交換した。2日後、軽く叩くことで細胞をフラスコから剥離し、この細胞を1000rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを、5mlのSFM中に再懸濁し、05ml細胞懸濁液を12mlの新しいSFMとともに、80cm2組織培養フラスコNuncに移した。2日後、細胞を収穫し全ての細胞が懸濁状態にある、Burker細胞計数器で計数した。次に、20mlのSFMの全容量において3×105細胞/mlの細胞密度で、細胞を125ml組織培養エルレンマイヤーCorningに播種した。細胞を、39°C、10CO2雰囲気内において、125rpmのオービタルシェーカーGFLでさらに培養した。1~6日目に細胞をBurker細胞計数器で計数した。図4では、8つの培養から得た平均増殖曲線を示す。PERC6tsE2Ac59は、無血清懸濁培養で良好に機能する。培養5日以内に1mlあたり約2×106細胞の最大細胞密度が達成された。F.37°Cおよび39°CにおけるPERC6およびPERC6E2Aの増殖特性PERC6細胞またはPERC6ts125E2Ac84細胞を37°CPERC6または39°CPERC6ts125E2Ac84のいずれかの10CO2雰囲気内において、10ウシ胎児血清FBS、GibcoBRLおよび10mMのMgCl2を補ったダルベッコ改変イーグル培地DMEM、GibcOBRLで培養した。0日目、全体で1×106の細胞を25cm2組織培養フラスコNuncに播種し、細胞をそれぞれの温度で培養した。示した時期において、細胞を計数した。37°CにおけるPERC6細胞の増殖は39°CにおけるPERC6ts125E2Ac84の増殖に匹敵した図33。これは、ts125E2AをコードしたDBPの構成的発現は、非許容温度である39°Cにおいて細胞の増殖に対して逆効果を有していないことを示している。G.PERC6ts125E2Aの安定性幾つかの継代に対し、PERC6ts125E2A細胞株クローン84を、39°C、10CO2で、10FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを含む25cm2細胞培養フラスコNuncで、選択圧G418無しで培養した。準集密性70~80集密で、細胞をPBSNPBIで洗浄し、RIPA1NP40、05デオキシコール酸ナトリウム、および01SDSを含むPBSであって、さらに1mMフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび01mgmlトリプシン阻害剤を補充したPBS中に溶解し、こすり取った。氷上で15分間インキュベーションした後、ライセートを遠心分離によって取り除いた。タンパク質濃度は、供給元BioRadの標準手順に従い、BioRadタンパク質アッセイによって測定した。等量の全細胞抽出物を10ゲル上でSDSPAGEによって分画化した。タンパク質をImmobilonPメンブランミリポアに移し、αDBPモノクローナル抗体B6と共にインキュベートした。2次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体BioRadであった。ウェスタンブロッティング法および抗体のインキュベーションは、ミリポアによって提供された手順に従って実施した。抗体複合体を、製造元Amershamの手順に従ってECL検出システムによって可視化した。少なくとも16継代にわたり、ts125E2AをコードしたDBPの発現は安定であった。これはおよそ40細胞倍加に相当する図34。この培養期間においてDBPレベルの減少は観察されず、G418選択圧が無い場合においてさえもts125E2Aの発現が安定であることが示された。実施例16tTA発現パッケージング細胞株の作製A.tTA遺伝子を発現するプラスミドの作製pcDNA31tTa:tTA遺伝子、tetRおよびVP16遺伝子の融合体を、制限酵素BamHIおよびEcoRIを用いた消化により、プラスミドpUHD151から取り除いたGossenとBujard、1992年。まず、pUHD151をEcoRIで消化した。dNTPsの存在下で線状プラスミドをクレノー酵素で処理し、EcoRI付着末端を塞いだ。次に、プラスミドをBamHIで消化した。得られた長さ1025bpのフラグメントをアガロースから精製した。続いて、このフラグメントをBamHIEcoRVで消化したpcDNA31HYGROInvitrogenとのライゲーション反応に用いて、pcDNA31tTAを得た。コンピテントなEColiDH5αLifeTechへの転換、およびアンピシリン耐性コロニーの分析の後、pcDNA31tTAに期待される消化パターンを示す一つのクローンを選択した。B.tTA発現ベクターによるPERC6およびPERC6E2Aのトランスフェクション、コロニー形成および細胞株の作製トランスフェクション前日に、2×106のPERC6細胞またはPERC6E2A細胞を10FBSJRHおよび10mMのMgCl2を補ったダルベッコ改変基本培地DMEM、GibcoBRLを収容した60mm組織培養皿Greinerに播種し、10CO2雰囲気中、37°Cでインキュベートした。翌日、供給元GibcoBRLの標準手順に従って、LipofectAMINEPLUSTMを用いて4~8μgのpcDNA31tTAプラスミドDNAを細胞にトランスフェクトした。この細胞をLipofectAMINEPLUSTMTM-DNA混合物とともに37°C、10CO2で4時間インキュベートした。次いで、20FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを2ml加え、37°C、10CO2で細胞をさらにインキュベートした。翌日、細胞をPBSで洗浄し、10FBSおよび10mMのMgCl2を補った新しいDMEMで、10CO2雰囲気中37°CPERC6または39°CPERC6E2Aのいずれかで3日間インキュベートした。その後、培地を選択培地に交換した。PERC6細胞は10FBS、10mMのMgCl2および50μgmlのハイグロマイシンBGIBCOを補ったDMEMでインキュベートし、一方、PERC6E2A細胞は10FBS、10mMのMgCl2および100μgmlのハイグロマイシンBを補ったDMEM中に維持した。選択耐性のある細胞のコロニーは3週間以内に現れたが、非耐性細胞はこの期間内に死滅した。各トランスフェクションから、ピペットで皿から細胞を擦り取ることによりいくつかの独立のハイグロマイシン耐性細胞のコロニーを採取し、25cm2の皿Greinerに入れ、10FBS、10mMのMgCl2を含み、かつ50μgmlPERC6細胞または100μgmlPERC6E2A細胞のハイグロマイシンを補ったDMEM中で、それぞれ37°Cまたは39°C、10CO2雰囲気で培養した。次に、これらのハイグロマイシン耐性細胞のコロニーが機能的tTAタンパク質を発現するか否かを調べた。すなわち、PERC6tTA細胞またはPERE2AtTA細胞の培養液を7xtetOプロモーターの制御下でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを含有するプラスミドpUHC133でトランスフェクトしたGossensとBujard、1992年。ルシフェラーゼの発現がtTAにより媒介されることを示すため、培養液の半分をドキシサイクリンの入っていない培地中に維持した。残りの半分を8μgmlのドキシサイクリンSigmaを入れた培地中に維持した。後者の薬剤はテトラサイクリンの類似物であり、tTAと結合し、その活性を阻害する。PERC6tTAおよびPERE2AtTAの全ての細胞株が高いルシフェラーゼレベルを生じた。これは、全ての細胞株がtTAタンパク質を発現したことを示している図35。さらに、ドキシサイクリンで細胞を処理した場合、ルシフェラーゼの発現は大幅に抑制された。まとめると、単離され確立されたハイグロマイシン耐性PERC6およびPERE2A細胞クローンは全て機能的tTAを発現したことをデータは示している。実施例1で記載したとおり、中和化実験に用いた全てのヒトアデノウイルスをPERC6細胞ECACC寄託番号96022940に産生しFallauxら、1998年、CsClで精製した。HPLCカラムから異なる血清型が溶出するNaCl濃度を示した。ウイルス粒/mlVPmlをAd5水準から計算した。実施例1で記載したとおり、中和化実験と並行して滴定を行って、実験の力価CCID50をPERC6細胞ECACC寄託番号96022940上で測定した。本実験に用いた44のウイルスに対するCCID50を示した。これは5日後に50のウエルにおいてCPEを得るのに必要なウイルスの希釈率を示している。VPCCID50の比をlog10で示した。これはPERC6細胞ECACC寄託番号96022940の異なるバッチの感染力の測定値である。ヒト血清により中和化を免れたAdApt35LacZウイルスである。異なる血清型のwtアデノウイルスに対する中和活性NAを有する滑液サンプルの割合である。BRK形質転換実験における異なるE1発現構築物で得られた病巣の数である。参考文献1AbrahamsenKKongHLMastrangeliABroughDLizonovaACrystalRandFalckPedersenEConstructionofanadenovirustype7aElAvectorJVirol71no11p894689512AthappillyFKMuraliRRuxJJCaiZandBurnettRMTherefinedcrystealstructureofhexonthemajorcoatproteinofadenovirustype2at29ÅresulutionJMolBiol2424304553BaslerCFDroguettGHorwitzMSSequenceoftheimmunoregulatoryearlyregion3andflankingsequencesofadenovirustype35Gene170249544BridgeEMedghalchiSUbolSLeesongMandKetnerGAdenovirusearlyregion4andviralDNAsynthesisVirology1937948015BrodySLandCrystalRGAdenovirusmediatedinvivogenetransferAnnNYAcadSci716901016BoshartMWeberFJahnGDorschHaslerKFleckensteinBandSchaffnerWAverystrongenhancerislocatedupstreamofanimmediateearlygeneofhumancytomegalovirusCell415215307DijkemaRDekkerBMMvanderFeltzMJMandvanderEbAJTransformationofprimaryratkidneycellsbyDNAfragmentsofweaklyoncogenicadenovirusesJVirol32No39439508FallauxFJBoutAvanderVeldeIvandenWollenbergDJHehirKMKeeganJAugerCCramerSJvanOrmondtHvanderEbAJValerioDandHoebenRCNewhelpercellsandmatchedearlyregion1deletedadenovirusvectorspreventgenerationofreplicationcompetentadenovirusesHumGeneTher9190919179GossenMandHBujardTightcontrolofgeneexpressioninmammaliancellsbytetracyclinresponsivepromotersProcNatlAcadSciUSA895547555110FlomenbergPRChenMMunkGHorwitzMSMolecularepidemiologyofadenovirustype35infectionsinimmunocompromisedhostsJInfectDis15511273411FranckiRIBFauquetCMKnudsonDLandBrownFClassificationandnomenclatureofvirusesFifthreportoftheinternationalCommitteeontaxonomyofvirusesArchVirolSuppl214014412GaherySegardHFaraceFGodfrinDGastonJLengagneRTurszPBoulangerPandGuilletJGImmuneresponsetorecombinantcapsidproteinsofadenovirusinhumansAntifiberandantipentonbaseantibodieshaveasynergisticeffectonneutralisingactivityJVirol722388239713HeTCZhouSDaCostaLTYuJKinzlerKWVogelsteinBAsimplifiedsystemforgeneratingrecombinantadenovirusesProcNatlAcadSciUSA9525092514HierholzerJCWigandRAndersonLJAdrianTandGoldJWMAdenovirusesfrompatientswithAIDSaplethoraofserotypesandadescriptionoffivenewserotypesofsubgenusDJInfectDis15880481314DeJongPJValderramaGSpiglandIandHorwitzMSAdenovirusisolatesfromurineofpatientswithacquiredimmunodeficiencysyndromeLancet11293129615KayRTakeiFandHumphriesRKExpressioncloningofacDNAencodingM169JImmunol1451952195916KangWGBerencsiGTakacsMAscherZFejerGNaszIMolecularcloningandphysicalmappingoftheDNAofhumanadenovirustype35ActaMicrobiolHung36677517KangWGBerencsiGBanreviAAscherZFejerGTakacsMKissANaszIRelationshipofE1andE3regionsofhumanadenovirus35tothoseofhumanadenovirussubgroupsACandDActaMicrobiolHung364455718LevreroMBarbanVMantecaSBallayABalsamoCAvantaggiatiMLNatoliGSkellekensHTiollaisPandPerricaudetMDefectiveandnondefectiveadenovirusvectorsforexpressingforeigngenesinvitroandinvivoGene10119520219LiQGHambraeusJandWadellGGeneticrelationshipbetweenthirteengenomesoftypesofadenovirus1134and35withdifferenttropismsIntervirol3233835020PrinceHMGenetransferareviewofmethodsandapplicationsPathology3033534721RobbinsPDandGhivizzaniSCViralvectorsforgenetherapyPharmacolTher80354722SchnurrDandDonderoMETwonewcandidateadenovirusserotypesIntervirol367983SchulickAHVassalliGDunnPFDongGRadeJJZamarronCandDichekDAEstablishedimmunityprecludesadenovirusmediatedgenetransferinratcarotidarteriesPotentialforimmunosuppressionandvectorengineeringtoovercomebarriersofimmunityJClinInvest992091923ShabramPWGirouxDDGoudreauAMGregoryRJHornMTHuygheBGLiuXNunnallyMHSugarmanBJandSutjiptoSAnalyticalanionexchangeHPLCofrecombinanttype5adenoviralparticlesHumGeneTher845346524Toogoodetal1989JGenVirol7032033214ToogoodCIMuraliRBurnettRMHayRTTheadenovirustype40hexonsequencepredictedstructureandrelationshiptootheradenovirushexonsJGenVirol7032031425ValderramaLeonGFlomenbergPHorwitzMSRestrictionendonucleasemappingofadenovirus35atypeisolatedfromimmunocompromisedhostsJvirol566475026WadellGMolecularepidemiologyofadenovirusesCurrTopMicrobiolImmunol11019122027WhiteERegulationofp53dependentapoptosisbyElaandElbCurrTopMicrobiolImmunol1993458"