"化学的部分と少なくとも1つのフラボノイドとを含有する送達剤のコンジュゲートであって、前記フラボノイドが、コンジュゲーションの前に単量体形態又は二量体形態で存在し、コンジュゲーションの後に前記単量体形態又は二量体形態を維持する、コンジュゲート。2つのフラボノイドを含み、第1のフラボノイドが、第2のフラボノイドとの会合を受けない、請求項1に記載のコンジュゲート。フラボノイドが、カテキンベースのフラボノイドである、請求項1又は2に記載のコンジュゲート。フラボノイドが、--エピカテキン、--エピガロカテキン、-カテキン、--没食子酸エピカテキン、又は--没食子酸エピガロカテキンである、請求項3に記載のコンジュゲート。フラボノイドが、--没食子酸エピガロカテキンである、請求項4に記載のコンジュゲート。--没食子酸エピガロカテキンが、カルボキシル末端基、アミン末端基、又はスクシンイミド基を含有する、請求項5に記載のコンジュゲート。化学的部分が、遊離アルデヒド基又はアルデヒド基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離カルボキシル基又はカルボキシル基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離アミン基又はアミン基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離スクシンイミド基又はスクシンイミド基への転換が可能な官能基を有するポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択される化学的部分である、請求項1~6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。ポリマーが、アルデヒド末端ポリエチレングリコール、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタールコンジュゲート、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸-チラミン、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタールコンジュゲート-チラミン、シクロトリホスファゼンコアフェノキシメチルメチルヒドラゾノデンドリマー、チオホスホリルコアフェノキシメチルメチルヒドラゾノデンドリマー、カルボキシル末端ポリエチレングリコール、アミン末端ポリエチレングリコール、又はスクシンイミド末端ポリエチレングリコールである、請求項7に記載のコンジュゲート。ポリマーが、アルデヒド末端ポリエチレングリコールである、請求項8に記載のコンジュゲート。送達剤が、フラボノイドのA環のC6位及び/又はC8位においてコンジュゲートされている、請求項1~9のいずれか一項に記載のコンジュゲート。ポリエチレングリコール及び--没食子酸エピガロカテキンPEG-EGCGを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。請求項1~11のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む送達ビヒクル。抗癌剤と請求項1~11のいずれか一項に記載のコンジュゲートとを含む抗癌剤送達ビヒクル。抗癌剤が、タンパク質、核酸、低分子、薬物、ペプチド、抗体、ホルモン、酵素、増殖因子、サイトカイン、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、短鎖ヘアピンRNA、siRNA、抗生物質、化学療法剤、又は血管新生阻害剤である、請求項13に記載の抗癌剤送達ビヒクル。抗癌剤が、ハーセプチントラスツズマブ、TNP470、ドキソルビシン、シスプラチン、パクリタキセル、ダウノルビシン、及びこれらの混合物からなる群から選択される抗癌剤である、請求項14に記載の抗癌剤送達ビヒクル。抗癌剤が、ハーセプチントラスツズマブである、請求項14に記載の抗癌剤送達ビヒクル。抗癌剤が、ドキソルビシンである、請求項14に記載の抗癌剤送達ビヒクル。抗癌剤が、シスプラチンである、請求項14に記載の抗癌剤送達ビヒクル。抗癌剤が、マイクロRNAである、請求項14に記載の抗癌剤送達ビヒクル。請求項13~19のいずれか一項に記載の抗癌剤送達ビヒクルを含む医薬組成物。薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項20に記載の医薬組成物。対象における細胞に抗癌剤を送達するのに用いられるための、請求項13~19のいずれか一項に記載の抗癌剤送達ビヒクル。対象がヒトである、抗癌剤を細胞に送達するのに用いられるための、請求項22に記載の抗癌剤送達ビヒクル。注射、手術による植込み、又は局所投与のために製剤される、請求項22又は23に記載の抗癌剤送達ビヒクル。化学的部分を含有する送達剤を、少なくとも1つのフラボノイドにコンジュゲートする方法であって、前記方法が、前記送達剤を前記フラボノイドと反応させるステップを含み、前記フラボノイドが、コンジュゲーションの前に単量体形態又は二量体形態で存在し、コンジュゲーションの後に前記単量体形態又は二量体形態を維持する、方法。送達剤を2つのフラボノイドと反応させるステップを含み、第1のフラボノイドが、第2のフラボノイドとの会合を受けない、請求項25に記載の方法。フラボノイドが、カテキンベースのフラボノイドである、請求項25又は26に記載の方法。フラボノイドが、--エピカテキン、--エピガロカテキン、-カテキン、--没食子酸エピカテキン、又は--没食子酸エピガロカテキンである、請求項27に記載の方法。フラボノイドが、--没食子酸エピガロカテキンである、請求項28に記載の方法。--没食子酸エピガロカテキンが、カルボキシル末端基、アミン末端基、又はスクシンイミド基を含有する、請求項29に記載の方法。化学的部分が、遊離アルデヒド基又はアルデヒド基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離カルボキシル基又はカルボキシル基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離アミン基又はアミン基への転換が可能な官能基を有するポリマー、遊離スクシンイミド基又はスクシンイミド基への転換が可能な官能基を有するポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択される化学的部分である、請求項25~30のいずれか一項に記載の方法。ポリマーが、アルデヒド末端ポリエチレングリコール、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタールコンジュゲート、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸-チラミン、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタールコンジュゲート-チラミン、シクロトリホスファゼンコアフェノキシメチルメチルヒドラゾノデンドリマー、チオホスホリルコアフェノキシメチルメチルヒドラゾノデンドリマー、カルボキシル末端ポリエチレングリコール、アミン末端ポリエチレングリコール、又はスクシンイミド末端ポリエチレングリコールである、請求項31に記載の方法。ポリマーが、アルデヒド末端ポリエチレングリコールである、請求項32に記載の方法。送達剤を、酸触媒の存在下で、フラボノイドと反応させるステップを含む、請求項33に記載の方法。送達剤が、フラボノイドのA環のC6位及び/又はC8位においてコンジュゲートされている、請求項25~34のいずれか一項に記載の方法。フラボノイドが--没食子酸エピガロカテキンであり、化学的部分がポリエチレングリコールである、請求項25~35のいずれか一項に記載の方法。抗癌剤送達ビヒクルを形成する方法であって、化学的部分を少なくとも1つのフラボノイドにコンジュゲートするステップを含み、前記フラボノイドが、コンジュゲーションの前に単量体形態又は二量体形態で存在し、コンジュゲーションの後に前記単量体形態又は二量体形態を維持する、方法。抗癌剤送達ビヒクルに抗癌剤を負荷するステップをさらに含む、請求項37に記載の方法。抗癌剤が、疎水性相互作用及び/又はΠ-Πスタッキング相互作用を介して抗癌剤送達ビヒクルに負荷される、請求項38に記載の方法。抗癌剤を細胞に送達する方法であって、請求項13~19のいずれか一項に記載の抗癌剤送達ビヒクルを細胞と接触させるステップを含む方法。細胞がinvitroである、請求項40に記載の方法。細胞がinvivoであり、前記方法が、抗癌剤送達ビヒクルを、抗癌治療を必要とする対象に投与するステップを含む、請求項40に記載の方法。対象がヒトである、請求項42に記載の方法。投与するステップが、注射するサブステップ、手術により植え込むサブステップ、又は局所適用するサブステップを含む、請求項42又は43に記載の方法。抗癌剤を、抗癌治療を必要とする対象に投与するための医薬を製造するための、請求項1~11のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項12に記載の送達ビヒクル、又は請求項13~19のいずれか一項に記載の抗癌剤送達ビヒクル、又は請求項20若しくは21に記載の医薬組成物の使用。化学的部分及び少なくとも1つのフラボノイドが、ナノメートル寸法である、請求項1~11のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項12に記載の送達ビヒクル、又は請求項13~19のいずれか一項に記載の抗癌剤送達ビヒクル、又は請求項20若しくは21に記載の医薬組成物。緑茶の主要な成分である--没食子酸エピガロカテキンEGCGは、多くの生物学的効果及び薬理学的効果を示す。以下の例では、酸触媒によるアルデヒドを介する縮合反応を用いて、ポリエチレングリコールのEGCGとのコンジュゲートを合成した。実施例1:ドキソルビシン及びPEG-EGCGコンジュゲートを含む送達ビヒクルの形成一実施形態では、薬物分子をドキソルビシンDoxと略記するとする。図1は、Doxを負荷したPEG-EGCGコンジュゲートのセルフアセンブリーによる送達ビヒクルの形成を例示するスキームを示す。この実施形態では、送達ビヒクルが、ミセルの形態である。この送達ビヒクルは、水性環境において、PEG-EGCGコンジュゲートがミセルへとセルフアセンブリーすることに基づき、これは、PEG-EGCGコンジュゲートのPEG鎖が親水性であることから生じる。EGCG部分の多環構造とDoxの多環構造との類似により、EGCG部分が、疎水性相互作用及びπ-πスタッキング相互作用を介してDoxを封入するように設計する。単純な混合及び透析により、Doxを送達ビヒクル内に封入することに成功した。本送達ビヒクルが、当技術分野において知られる他の送達ビヒクル系例えば、ポリマーミセル系と比較して、例外的に高いDox負荷率を示すことが判明して有利である。動的光散乱DLS測定はまた、送達ビヒクルの大きさが、EPR効果を介する腫瘍のパッシブターゲティングに理想的であることも示した。この例では、有機溶媒であるジメチルホルムアミドDMF中に溶解させたPEG-EGCGコンジュゲートとDoxとの混合物を、蒸留水に対して透析することにより、送達ビヒクルを調製した。異なる濃度のPEG-EGCGコンジュゲートそれぞれ、0、0.5、1、3、6、12、24mg/mlを用いて、12mg/mlで濃度を固定したDoxを封入した。透析時には、有機溶媒が水で段階的に置換されることにより、送達ビヒクルのセルフアセンブリー及びアセンブリーされた構造へのDoxの封入が誘発された。図2に示す通り、0、0.5、及び1mg/mlのPEG-EGCG濃度を用いたところ、透析時に沈殿物が得られたことから、送達ビヒクルの形成が有効でないことが示された。これに対し、PEG-EGCGの濃度を3、6、12、及び24mg/mlとしたところ、均一な溶液が達成されたことから、送達ビヒクルへのDox封入の成功が裏付けられた。この例は、Dox/PEG-EGCG送達ビヒクルが効果的にセルフアセンブリーされるには、Dox対PEG-EGCGコンジュゲートの適切な比を注意深く選択すべきであることを示す。実験材料:アルデヒド末端PEGPEG-CHO、分子量:5000は、日油株式会社日本から購入した。EGCGは、栗田工業株式会社日本から購入した。塩酸ドキソルビシンDoxHClは、BoryungPharmaceuticalsInc.、Koreaから購入した。PEG-EGCGコンジュゲートの合成:アルデヒド末端PEG0.35gと、EGCG0.65gとを、酢酸、水、及びジメチルスルホキシドDMSOの混合物中で個別に溶解させた。窒素雰囲気下、20°CpH2で、48時間にわたり、PEG-CHO溶液を滴下によって添加することで、反応を開始させた。結果として得られる生成物を透析し分子量カットオフMWCO=3500、凍結乾燥させて、PEG-EGCGコンジュゲートをもたらした。送達ビヒクルの合成:1mlのDMF中に、DoxHCl12mg、21μmolを溶解させた。次いで、この溶液に、トリエチルアミン29μl、210μmolを添加し、この塩酸塩を中和した。次に、この溶液に、DMF中に異なる濃度で溶解させたPEG-EGCGコンジュゲート1mlを添加し、結果として得られる混合物を、20分間にわたりボルテックスした。次いで、各試料溶液を、MWCOを3500Daとする透析チューブへと移した。このチューブを、12時間ごとに水を替えながら2日間にわたり、蒸留水に対して透析した。試料溶液を凍結乾燥させて、固体のミセルを得た。薬物負荷率の決定:乾燥させた試料をDMF中で溶解させた後、HitachiU2810UV-Vis分光光度計を用いて、480nmにおいて、試料溶液の吸光度を測定した。各試料におけるDoxの量は、Doxの基準物質と比較することにより推定した。薬物負荷率は、送達ビヒクル内のDox量と、乾燥させた送達ビヒクル試料の重量とから計算した。送達ビヒクルサイズの決定:Brookhaven90PlusParticleSizeAnalyzerを用いるDLSにより、送達ビヒクル試料のサイズを決定した。蒸留水を用いて各試料溶液を調製し、10μg/mlのDoxをもたらしてから、25°CでDLS測定を実施した。結果:送達ビヒクルの特徴実施例1の送達ビヒクルの特徴を、以下の表1にまとめる。薬物負荷率が、送達ビヒクルにおけるDoxの重量百分率として定義されるのに対し、薬物負荷効率は、当初導入された遊離Doxと比較した、封入Doxの重量百分率として定義される。PEG-EGCGの初期濃度を3mg/ml及び6mg/mlとする試料は、それぞれ、85重量及び68重量という、例外的に高い薬物負荷率を示した。達成された最高のDox負荷率は85重量は、他の研究グループH.M.Aliabadiら、ExpertOpiniononDrugDelivery、2006、3、139~162により開発されたブロックコポリマーによる送達ビヒクルにおける平均のDox負荷率10~20重量の4倍超に対応した。特定の機構に限定されるものではないが、このように高い薬物負荷率はおそらく、EGCG部分とDoxとの強力な疎水性相互作用及び/又はπ-πスタッキング相互作用によるものであり、おそらくこのために、EGCG部分は、報告された他のPEGブロックコポリマーの疎水性鎖よりはるかに小さいが、セルフアセンブリー工程におけるDoxの封入が増強されるのであろう。送達ビヒクルのサイズは、78.5~192.4nmの範囲であった表1を参照されたい。薬物負荷率が増大するにつれてサイズも増大したが、PEG-EGCGの初期濃度が増大するにつれてサイズは減少した。EGCG部分は、Doxの封入において重要な役割を果たしたので、サイズの増大は、封入効率と相関しているはずである。したがって、サイズだけでなく、任意の標的化薬物送達系に重要な側面である、薬物放出プロファイル及び送達ビヒクルの安定性もまた、導入されるPEG-EGCGの初期濃度により制御することができるであろう。送達ビヒクルのナノメートル寸法200nm未満は、EPR効果を介して腫瘍組織を標的化する能力を付与した。同時に、このナノメートル寸法は、送達ビヒクルのオプソニン化及び腎によるクリアランスを回避する一助となったので、血中における貯留時間の延長を可能とした。aPEG及びbPEG-EGCGそれぞれのエレクトロスプレーイオン化飛行時間質量分析スペクトルESI-TOFMSを、図3に示す。2つのピーククラスター間におけるm/z差は、5の電荷を考慮し、各ピーク間における0.2m/zの差から計算される、PEG及びPEG-EGCG両方についてのPEG反復単位=44例えば、1037.26-1028.43×5=44.15として観察された。しかし、PEG-EGCGのピークは、PEGのピークと比較して、EGCG2つ分の分子量だけ例えば、1211.09-1028.65×5=912.36高値側へシフトしたことから、PEG-EGCGコンジュゲートが、PEG鎖の一方の端部に結合した、2つのEGCG反復単位を含むこと、すなわち、各EGCG反復単位が、コンジュゲーション後においても単量体を維持し、EGCGオリゴマーは形成されないことが裏付けられた。この実施形態では、化学的部分PEGの一方の端部に2つの単量体フラボノイドEGCGがコンジュゲートされていることが示されたが、化学的部分の一方の端部に3つの単量体フラボノイドがコンジュゲートされていること、又は化学的部分の一方の端部に1又は複数の二量体フラボノイドがコンジュゲートされていることなど、他のコンジュゲート構成もまた意図されることを了解及び理解されたい。実施例2:シスプラチン及びPEG-EGCGコンジュゲートを含む送達ビヒクルの形成別の実施形態では、薬物分子をシスプラチンとする。図4は、シスプラチンを負荷したPEG-EGCGコンジュゲートのセルフアセンブリーによる送達ビヒクルの形成を例示するスキームを示す。この実施形態では、送達ビヒクルが、キレート錯体の形態でありうる。シスプラチンとPEG-EGCGコンジュゲートとの相互作用はおそらく、EGCGのOH部分による、Pt白金のキレート化による。このキレート錯体は、PEG-EGCGコンジュゲートが、中央のシスプラチンの周囲にクラスター化し、これにより、クラスター内にシスプラチンを閉じ込めるキレート化の結果として形成される。本例では、i水、又はii有機溶媒であるジメチルホルムアミドDMF中に溶解させたPEG-EGCGとシスプラチンとの混合物を、蒸留水に対して透析することにより、シスプラチン/PEG-EGCG錯体を調製した。異なる濃度のPEG-EGCGコンジュゲート1.2、2.4、6、及び/又は12mg/mlを、1.2mg/mlで濃度を固定したシスプラチンに対して用いた。透析時には、PEG-EGCGコンジュゲートが、中央のシスプラチンの周囲にクラスター化し、クラスター内にシスプラチンを閉じ込める。実験材料:アルデヒド末端PEGPEG-CHO、分子量:5000は、日油株式会社日本から購入した。EGCGは、栗田工業株式会社日本から購入した。シスプラチン[cis-ジクロロジアミン白金II、CDDP]は、Sigma-AldrichPte.Ltd.、Singaporeから購入した。PEG-EGCGコンジュゲートの合成:PEG-EGCGコンジュゲートは、実施例1で説明した通りに合成した。代替的に、ポリマーを、カルボキシル末端ポリエチレングリコールとすることもでき、これを、アミン末端EGCGと反応させて、コンジュゲートを形成することもできるが、この合成は、当業者に明らかである。送達ビヒクルの合成:1mlの水又はDMF中に、CDDP1.2mg、4μmolを溶解させた。次いで、この溶液に、水又はDMF中に異なる濃度で溶解させたPEG-EGCGコンジュゲート1mlを添加し、結果として得られる混合物を、20分間にわたりボルテックスした。次いで、各試料溶液を、MWCOを1000Daとする透析チューブへと移した。このチューブを、12時間ごとに水を替えながら2日間にわたり、蒸留水に対して透析した。次いで、送達ビヒクルを回収した。薬物負荷率の決定:HitachiU2810UV-Vis分光光度計を用いて、280nmにおいて、PEG-EGCG含量について、試料溶液の吸光度を測定した。各試料におけるシスプラチンの量は、PelkinElmerSCIEXICPMassSpectrometerElanDRCIIにより測定した。薬物負荷効率は、送達ビヒクル内に閉じ込められたシスプラチン量と、系に当初添加したシスプラチン量とから計算した。薬物負荷率は、送達ビヒクル中のシスプラチン量と、送達ビヒクルの重量とから計算した。送達ビヒクルサイズの決定:決定のプロトコールは、実施例1で説明したプロトコールと同じである。結果i水中、及びiiDMF中に溶解させたシスプラチンを伴うPEG-EGCGコンジュゲートの特徴を、それぞれ、表2及び表3にまとめる。薬物負荷率が、送達ビヒクルにおけるシスプラチンの重量百分率として定義されるのに対し、薬物負荷効率は、当初導入された遊離シスプラチンと比較した、閉じ込められたシスプラチンの重量百分率として定義される。PEG-EGCG濃度を増大させたとき、試料は、薬物負荷効率の増大傾向を示した。動的光散乱DLSによる測定はまた、送達ビヒクルの大きさが、153~194nmの範囲であることも示した表2及び表3を参照されたいが、これは、EPR効果を介する腫瘍のパッシブターゲティングに理想的である。送達ビヒクルのナノメートル寸法200nm未満は、EPR効果を介して腫瘍組織を標的化する能力を付与した。同時に、このナノメートル寸法は、送達ビヒクルのオプソニン化及び腎によるクリアランスを回避する一助となったので、血中における貯留時間の延長を可能とした。実施例3:ハーセプチン及びPEG-EGCGコンジュゲートを含む送達ビヒクルを用いる試験結果本発明者らはまた、上記の実施例2で概括した合成経路に従い、PEG-EGCGコンジュゲートにハーセプチンHerceptinは、Roche、Switzerlandから購入したを封入することにも成功した。図5に示す通り、コンジュゲートは、BT-474HER2/neuを過剰発現させた乳癌の異種移植片に対する抗癌効果の増強を示した。結果invivoにおける送達ビヒクルの抗癌効果:無胸腺nu/nuマウス5~6週齢を、Harlan、UKから購入し、すべての動物実験を、InstitutionaAnimalCareandUseComitteeIACUCによる手順及びガイドラインを順守して実施した。右脇腹にBT-474細胞120μlのマトリゲルmatrigelBDBioscienceを含む100μlのリン酸緩衝生理食塩液PBS中に1×107個を注射する1日前、各マウスに、17β-エストラジオールペレットInnovativeResearchofAmericaを皮下s.c.挿入した。説明される通りにW.P.McGuireら、N.Engl.J.Med.1996、3441、1268、長さl及び幅wを測定し、容量V=lw2/2を計算することで、腫瘍容量Vmm3を決定した。腫瘍が250mm3の平均サイズを達成したら、実験治療及び対照治療を実施した。マウスを異なる群n=6に無作為化してから、各治療を開始した。用いるハーセプチンは2.5mg/kgとし、用いるPEG-EGCGは100μMとした。治療は、毎週2回ずつ投与した。16日後、動物には、ビヒクルPBS黒丸、PEG-EGCG黒三角、ハーセプチン黒四角、ハーセプチンPEG-EGCGミセル黒逆三角を注射した。結果は、平均±標準偏差として報告した。BT-474HER2/neuを過剰発現させた乳癌の異種移植片に対する抗癌効果の増強は、腫瘍部位における送達ビヒクルの蓄積により、このため、ハーセプチンだけで治療した動物群と比較して腫瘍サイズを顕著に減少させることが可能であった。送達ビヒクル内にハーセプチンを封入する機構は、実施例1において意図した機構と同様でありうる、すなわち、EGCG部分は、プロリン残基とEGCG部分との間の疎水性相互作用及びπ-πスタッキング相互作用を介して、ハーセプチンを封入する。結論として述べると、本送達ビヒクルは、前出の節で言及した、各種のブロックコポリマーを含む従来の薬物送達ビヒクルポリマーミセル担体が直面していた、低薬物負荷率の難題を克服する。長い疎水性ポリマー鎖を用いる既存の先行技術による送達ビヒクルとは異なり、本送達ビヒクルは、EGCG部分を介する強力な薬物相互作用をもたらして、高薬物負荷率を達成する。本送達ビヒクルによる封入能又は閉じ込め能の増強はまた、それらの構造を改変することなく、他の抗癌薬に拡張することができ、したがって、これは、ハーセプチン及びドキソルビシン、又はパクリタキセル及びダウノルビシンなど、複数の抗癌剤を共送達するための潜在的な系となる。本送達ビヒクルを癌治療において用いるのに特に適したものとする、それらの独自の特性には、iそれらのナノメートル寸法が、10~200nmであること、ii水における可溶性の増大を付与するそれらの両親媒性構造、及びiiiその内部コアに抗癌剤を封入するか又は閉じ込めるそれらの能力が含まれる。薬物負荷率の高い送達ビヒクルの設計は、効率的な癌治療を達成するのに重要である。また、送達ビヒクルの用量は低減しうるので、このような送達ビヒクルであれば、潜在的な非特異的薬物送達により引き起こされる副作用を最小化することも期待される。さらに、担体の抗癌薬負荷率が高ければ、注射の頻度が低下し、これにより、患者の服薬遵守が改善され、患者に対して引き起こされる外傷が軽減される。本送達ビヒクルは、このような独自の特性を提供するように設計されている。実施例4:invitroにおけるsiRNA送達及び細胞内局在化の画像化細胞を、Lab-Tek商標8ウェルチャンバーカバーガラスNunc、USA内に、カバーガラス1枚当たり1×104個の密度で播種した。播種の2日後、培養培地を除去し、チャンバーカバーガラスにPEG-EGCG/siRNAトランスフェクション複合体を添加した。濃度を変化させながらPEG-EGCGを、50nMのSilencer登録商標Cy商標3-LabeledNegativeControl1siRNAAmbion、USAへと添加することにより、上記で説明した複合体を調製した。インキュベーションの、それぞれ、1、4、及び24時間後、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液DPBSにより細胞を洗浄し、室温で20分間にわたり、4のパラホルムアルデヒドPFAで固定した。続いて、DPBSにより洗浄した後、細胞を、4’,6-ジアミジノ-2-フェニリンDAPI、Invitrogen、USAで染色してから、共焦点顕微鏡法により検討した。2つのレーザー[DAPIには、励起最大波長=345nm、発光最大波長=458nm、Cy3には、励起最大波長=547nm、発光最大波長=563nm]を用いるOlympuslx71レーザー走査顕微鏡を用いて、共焦点レーザー走査顕微鏡法を実施した。画像は、FLUOVIEWソフトウェアOlympus、Singaporeを用いて収集した。共焦点顕微鏡法によるsiRNA局在化の観察siRNA担体としてのPEG-EGCGの能力を評価する前に、siRNAを細胞内に送達するPEG-EGCGの能力を調べた。異なるsiRNA対PEG-EGCG比がsiRNAの取り込みに対して及ぼす影響を、50nMのsiRNAに対して異なる濃度のPEG-EGCGを用いて検討した。トランスフェクションの1、4、及び24時間後において、共焦点顕微鏡法により、Cy3で標識した陰性対照siRNAの内部化をモニタリングし、PEG-EGCGを用いるsiRNAのトランスフェクションに最適な時間を決定した。Cy3で標識したsiRNAと関連する赤色の蛍光シグナルが検出されたのは、トランスフェクションの24時間後における細胞集団だけであった。共焦点顕微鏡画像図6は、PEG-EGCGが、siRNAを細胞に送達しうることを示した。さらに、DAPIで染色した核の画像とCy-3で標識したsiRNAの画像とを重ね合せることにより認められる通り、画像は、siRNAの細胞質における部分的局在化を明らかにする。siRNAを、担体としてのPEG-EGCGなしで送達したところ図6A、蛍光は観察されなかったことから、siRNA単独では、細胞に侵入できないことが裏付けられた。同様に、PEG単独を用いてsiRNAを複合体化させたところ図6E、蛍光は検出されなかったことから、PEG-EGCG/siRNA複合体をトランスフェクトした細胞において観察される赤色の蛍光は、PEGポリマーによるものではないことが示された。実施例5:invitroにおいてPEG-EGCGと共に送達されたsiRNAによる遺伝子サイレンシングsiRNAによるinvitroにおける遺伝子サイレンシング:Dual-luciferase登録商標レポーターアッセイPromega、USAODM1誘導体により細胞質内に送達されたsiRNAが、機能的であったかどうかを決定するため、本発明者らは、Dual-luciferase登録商標レポーター遺伝子系を用いた。このアッセイでは2つのレポーター酵素であるホタルPhotinuspyralisルシフェラーゼ及びレニラRenillareniformisルシフェラーゼを同時に発現させ、同じ細胞試料から、それらの活性を逐次測定した。pGL3ルシフェラーゼsiRNAの配列は、ホタルルシフェラーゼと完全に及び唯一相補的である。したがって、レニラルシフェラーゼの発現が、siRNAのトランスフェクションにより影響されるべきではない。このため、レニラルシフェラーゼは、二重の目的に用いられる。第1に、レニラルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼの活性を標準化するのに用いうる、トランスフェクション対照である。第2に、レニラルシフェラーゼの活性をモニタリングして、siRNA/PEG-EGCG複合体の任意の非特異的作用を検出することができる。pGL3プラスミドベクター及びpGL4.73プラスミドベクターPromega、USAをトランスフェクトした4時間後に、様々な濃度のPEG-EGCG/siRNA複合体上記の通りに調製したを、96ウェルプレートに播種した細胞に添加した。pGL3ルシフェラーゼのsiRNAPromega、USA及びAllstars陰性対照siRNAQIAGEN、Singaporeにより、トランスフェクションを実施した。48時間後、トランスフェクション培地を除去し、DPBSで細胞をすすいだ。50μlのパッシブ溶解緩衝液Promega、USA中で細胞を溶解させ、室温で15分間にわたり、オービタルシェーカーThermoscientific、USAに取り付けた。製造元のプロトコールに従い、遺伝子の発現を測定するのに用いられる、LuciferaseassayreagentIILARII及びStopGlo登録商標Promega、USAを調製し、細胞溶解物に添加した。LumatLB9507luminometerBerthold、Germanyを用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクション効率は、レニラルシフェラーゼ活性に対するホタルルシフェラーゼ活性の比相対光単位RLUで表されるとして評価した。このアッセイではまた、200nM、50nM、及び10nMのsiRNAがルシフェラーゼ活性に対して及ぼす影響も調べた。いずれのルシフェラーゼの比も、それぞれ、ホタル及びレニラの相対光単位として表したRLU1/RLU2。両方のルシフェラーゼをトランスフェクトしたが、siRNAはトランスフェクトしていない細胞集団において得られる比を用いて、多様なsiRNAトランスフェクション条件から得られる比を標準化した。機能的siRNAは、ホタルルシフェラーゼタンパク質のレベルを低下させ、結果として、その活性を低下させると予測させる。活性の低下は、レニラルシフェラーゼ活性に対するホタルルシフェラーゼ活性の標準化比の低下に置き換えられる。この標準化は、トランスフェクション効率又は細胞生存率の差違により引き起こされる、実験のばらつきを最小化し、これにより、実験データのより信頼できる解釈を可能とする。2つのプラスミドDNAのトランスフェクション効率を検討し、それらの比を最適化するため、細胞に、1:10~1:400の範囲の、レニラルシフェラーゼDNA対ホタルルシフェラーゼDNAの比でトランスフェクトした。実際、レニラルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼを駆動するのに用いられる2つのプロモーターそれぞれ、SV40によるプロモーター及びサイトメガロウイルスによるプロモーターは、互いに影響を及ぼし合うことが可能であったと報告されている。ホタルルシフェラーゼの量は、一定に維持した。それらの活性を測定し、相対比として表した。PEG-EGCGを用いて、200nMのLucisiRNAを複合体化させたところ、PEG-EGCGの濃度を5~100μg/mlとしたとき、0.55~0.62の範囲の標準化ルシフェラーゼ活性比の低下図7が観察された。最も目立った低下は、PEG-EGCGを100μg/mlとしたときに観察された。LucisiRNAと混合したとき、PEG担体単独では、ルシフェラーゼ活性の下方制御が誘導されなかったことは、共焦点顕微鏡法から得られた結果と符合し、これより、PEG自体は、機能的siRNAを細胞内に送達することが不可能であったことが示される。蛍光顕微鏡法を用いた遺伝子サイレンシングの解析PEG-EGCGにより細胞内に送達されたsiRNAの機能性及び効率を迅速に評価するため、細胞に、緑色蛍光タンパク質をコードするpEGFP-1プラスミドDNAをトランスフェクトした。4時間後、市販のトランスフェクション剤であるsiPORT商標又はPEG-EGCGとのGFP-22siRNA複合体又は対照のsiRNA複合体を、HCT116細胞に添加した。蛍光顕微鏡法は、GFP発現細胞の迅速な視覚化を可能とした。GFP-22siRNAによるGFPの下方制御は、緑色蛍光を発光する細胞の数の減少のほか、それらの強度の低下にも置き換えられた。GFP-22siRNAは、GFPmRNAの配列における21bpと相補的である。図8A~Dは、GFP-22siRNAをsiPORT商標により送達したときの陽性の下方制御を示した。この研究では、画像を、陽性対照として用いた。上記で説明した複合体を用いた4時間後において、pEGFP-1プラスミドベクターClontech、USAをトランスフェクトした細胞に、GFP-22siRNA及びAllstars陰性対照siRNAQIAGEN、Singaporeをトランスフェクトした。48時間後において、Olympuslx71蛍光顕微鏡Olympus、Singaporeを用いて、蛍光画像を撮像した。画像は、Image-ProPlusソフトウェアMedia-Cybernetics、USAを用いて収集した。フローサイトメトリーを用いる遺伝子サイレンシングの確認蛍光顕微鏡により観察されるGFPの下方制御を定量化するため、Agilent2100bioanalyzerを用いて、PEG-EGCG/siRNA複合体をトランスフェクトした細胞についてのフローサイトメトリーによる解析を実施した。pEGFP-1プラスミドベクターClontech、USAを既にトランスフェクトした細胞にGFP-22siRNAをトランスフェクトした48時間後に、トランスフェクション培地を除去し、ウェル1個当たり50ulずつのアキュターゼaccutase酵素細胞解離培地PAALaboratoriesGmbH、Austriaを添加した。細胞を5分間にわたりインキュベートし、細胞を解離させた後、ウェル1個当たり150ulずつのDPBSを添加し、ウェルの内容物を1.5mlの試験管に移し、3000rpmで3分間にわたりスピンダウンした。上清を除去し、細胞を、1ml当たり2.5×106個の密度で、AgilentCellFluorescentLabChip登録商標KitAgilentTechnologies、Singapore製の細胞蛍光緩衝液中に再懸濁させた。次いで、AgilentCellFluorescentLabChip登録商標Kitに備えられている試薬を用い、製造元のプロトコールに従い、細胞チップに試料を負荷し、調製した。Agilent2100bioanalyzerAgilentTechnologies、Singaporeを用いて、フローサイトメトリー解析を実施し、試料1例当たり約1000~1200回の細胞イベントをカウントした。本発明者らは、PEG-EGCG対照siRNAをトランスフェクトした細胞のうちの65.5が、高蛍光領域にあることを見出した図8E。PEG-EGCGGFP-22siRNAをトランスフェクトした細胞では、高蛍光を示す細胞の数が、46.4へと減少した図8F。したがって、GFP-22siRNAを、PEG-EGCGを介して送達した場合、GFP発現の低下は、約19.1であった。高蛍光強度領域から低蛍光強度領域への細胞イベントのシフトは、ヒストグラムから観察することができる。前出の発明を、例示及び実例を目的とし、1つ又は複数の実施形態に関して、理解を明確にする目的で、ある程度詳細に説明してきたが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲で説明される本発明の精神又は範囲から逸脱しない限りにおいて、本発明にある変化、変更、及び改変をもたらしうることが、当業者には容易に明らかである。さらに、個別の実施形態について論じているが、本発明は、これらの実施形態の組合せを包含しうる。"