"担子菌から得ることができるアスパラギナーゼ酵素。前記担子菌が担子菌フラムリナベルティペスFlammulinavelutipesである、請求項1に記載のアスパラギナーゼ酵素。下記アミノ酸配列を有するアスパラギナーゼ酵素。固体形態、液体形態、又は固体と液体との中間の形態の、請求項1~3のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼ酵素。請求項1~4のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼ酵素と、ラクトース、グリセロール又はアルブミンのいずれか1種から選択される賦形剤と、の組み合わせ。L-アスパラギン又はL-グルタミンの少なくとも1種を加水分解する方法であって、L-アスパラギン又はL-グルタミンの少なくとも1種を含む物質を、請求項1~5のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼ酵素で処理する工程を含む方法。前記L-アスパラギン又はL-グルタミンの少なくとも1種を含む物質は、ヒトが摂取可能な製品又は動物が摂取可能な製品の少なくとも1種である、請求項6に記載の方法。前記物質は、飲料、カカオ豆、チーズ、コーヒー豆、菓子類、デザート、パン生地、ドレッシング、フライドポテト、ドリンク、肉製品、メディカルサプリメント、栄養補助食品、ペットフード、ポテトチップ、ソース、スナック又はスープの少なくとも1種から選択される、請求項6又は7に記載の方法。L-アスパラギンを含む食品物質におけるアクリルアミドの形成を低減する方法であって、前記L-アスパラギンを含む食品物質に、請求項1~5のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼ酵素を適用する工程と、前記L-アスパラギンを含む物質を加熱する工程と、を含む方法。加熱が少なくとも120°Cまで行われる、請求項9に記載の方法。L-アスパラギンの供給源は、ヒトが摂取可能な製品又は動物が摂取可能な製品の少なくとも1種である、請求項9又は10に記載の方法。請求項6~11のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる製品。以下の実施例において、使用した材料及び方法の概略は以下に説明する通りである。[材料及び方法]フラムリナベルティペスの培養:すべての培地及び機器は使用前にオートクレーブにかけ、実験全般を通じて標準的な滅菌方法を適用した。標準的な寒天培地グルコース一水和物:30.0g/L;アスパラギン一水和物:4.5g/L;KH2PO4:1.5g/L;MgSO4:0.5g/L;酵母抽出物:3.0g/L;寒天:15.0g/L;CuSO45H2O0.005g/L、FeCl36H2O0.08g/L、ZnSO47H2O0.09g/L、MnSO4H2O0.03g/L及びEDTAエチレンジアミン四酢酸0.4g/Lを含む微量金属溶液:1.0mL/L上でフラムリナベルティペスを維持した。滅菌処理前に培地のpHを1MNaOHでpH6に調整した。ウルトラタラックスUltraTurraxMiccraD-9,Art,ドイツ,ミュールハイムを用いて、100mLの滅菌標準栄養液中、フラムリナベルティペスの菌糸体を有する10×10mmの寒天プラグをホモジナイズすることによって、前培養液を調製した。液内培養液を24°C及び150rpmで維持した。5日間の培養後、前培養液50mlを、最少培地KH2PO4:1.5g/L;MgSO4:0.5g/L;微量金属溶液:1.0ml/L及びグルテン40g/L又はグルタミン10mMからなる本培養液250mlにそれぞれ移した。フラムリナベルティペスからのアスパラギナーゼ酵素の調製:18日間の培養後、培養液を濾過し、細胞外のアスパラギナーゼ酵素含有上清200mLを逆さまにして泡立てた[1]。10,000kDaのMWCOMillipore,米国マサチューセッツ州ベッドフォードを用いた限外濾過によって保持液を濃縮し、200mMTris/HClpH7.5を用いたSuperose6のサイズ排除クロマトグラフィーによって両タンパク質を分離した。活性試験:0.1Mリン酸カリウムpH7.0中の10mML-グルタミン又は10mML-アスパラギンをそれぞれ37°Cまで予熱した。アッセイは、合計反応体積150μLに天然酵素50μl又は組み換え酵素10μlの添加によって開始し、10~20分の後に3TCA20μLの添加又は95°Cでの10分間の加熱によって停止させた。アミノ酸なしで対照実験を行った。HPLCにより生成物の形成を追跡した。37°Cで1分当たり1μMのグルタミン酸又はアスパラギン酸をそれぞれ産生するのに必要とされる酵素の量として、一単位の酵素活性を計算した。C18NucleodurPyramid,5μm,4mmIDのカラム、溶離液Aとしてメタノール、溶離液Bとして0.1M酢酸ナトリウム0.044トリエチルアミンHClでpHを6.5に調整、誘導体化試薬としてo-フタルジアルデヒド、及び蛍光検出器を使用してHPLCを行った。遊離タンパク質:標準としてウシ血清アルブミンを使用し、ローリー法に従って加水分解上清中のタンパク質濃度を測定した。最適温度及びpH:培養中に又は組み換えタンパク質が可溶形態で入手可能になった後に酵素溶液を回収して、アスパラギナーゼ酵素の最適温度及びpHの決定を行った。37°Cにおいて、pH4~90.1M酢酸ナトリウム:pH4、5;0.1Mリン酸カリウム:pH6、7、8;0.1M炭酸ナトリウム:pH9の範囲で最適pHを調べた。最適温度は、最適pHにおいて20~70°Cであった。温度及びpH安定性:pH安定性を決定するために、10μLの組み換え酵素を37°Cで16時間、40μLの上記各緩衝液中でインキュベートした。0.1Mリン酸カリウムpH7中の10mMグルタミン100μLを加え、37°Cで20分間インキュベートした。基質なしで対照実験を行った。反応を95°Cで10分間停止させた。上述のHPLC分析の後、生成したグルタミン酸を計算した。温度安定性の分析のために、10μLの組み換え酵素を、それぞれの温度で1時間、40μLの0.1Mリン酸カリウム緩衝液pH7中でインキュベートした。その後、0.1Mリン酸カリウムpH7中の10mMグルタミン100μLを加え、アッセイ混合物を37°Cで20分間インキュベートした。基質なしで対照実験を行った。反応を95°Cで10分間停止させた。上述のHPLC分析の後、生成したグルタミン酸を計算した。トリプシンペプチドのESI-タンデムMS分析:ペプチダーゼバンドをSDSポリアクリルアミドゲルから切り出し、乾燥し、トリプシン消化した。標準的なプロトコルに従って、得られたペプチドを抽出、精製した。ナノスプレーイオン源及び金コーティングしたキャピラリーを備えたQtofII質量分析計Micromass,英国を用いて、ペプチドのエレクトロスプレーイオン化ESIMSを行った。衝突誘起解離実験のため、多価親イオン衝撃を四重極質量分析計からコリジョンセルへと選択的に伝達した25~30eV。得られた娘イオンを直交飛行時間型質量分析計によって分離した。ESI-タンデムMS分析から得られたペプチドマスフィンガープリントを、公開されているタンパク質一次配列データベースにおける異種間のタンパク質同定に使用した。Native-PAGE及び変性SDS-PAGE:12のポリアクリルアミド分離用ゲルでSDS-PAGE分析を行った。アスパラギナーゼ酵素溶液20μLとローディング緩衝液[0.1MTris/HClpH6.8,0.2MDTT,4SDS,20グリセロール,0.2ブロモフェノールブルー]20μLとを混合、15分間沸騰させることによってサンプルを調製した。ゲル当たり20mAでの電気泳動の後、ゲルを銀又はクマシーブリリアントブルーで染色した。分子定量のために、250~10kDaのマーカータンパク質BioRad,ドイツを使用した。非変性条件下でNative-PAGEを行った。ローディング緩衝液[0.05MTris/HClpH6.8,2SDS,10グリセロール,0.1ブロモフェノールブルー]と1:1v/vで混合することによってサンプルを調製した。ゲル当たり10mA及び8°Cにおける電気泳動の後、ゲルを2.5トリトンX-100で2回洗浄した。染色は、グルタミナーゼによりL-グルタミンが脱アミドして、L-グルタミン酸が生成することに基づいている。グルタミン酸デヒドロゲナーゼによるL-グルタミン酸の酸化は、テトラゾリウム色素の不溶性着色ホルマザンへの還元と共役している。グルタミナーゼ染色液は、L-グルタミン15mM、ウシ肝グルタミン酸デヒドロゲナーゼ0.5g/mL、リン酸カリウムpH70.1M、NAD2mg/mL、フェナジンメトスルファート0.04mg/mL、及びニトロブルーテトラゾリウム2mg/mLを含んでいた。酵素活性は、37°Cでのインキュベーション後に紫色バンドとして現れた。等電点電気泳動法:3500Vh2000V,6mA,12WでpH3~10の固定化pH勾配Serva,ドイツを備えるセルバライトServalyt商標プレコートPrecotes商標プレキャストゲルを用いて、MultiphorIIシステムPharmaciaLKB,スウェーデンでIEFポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。pI3.5~10.7のタンパク質試験混合物Serva,ドイツを用いてアスパラギナーゼの等電点を5と推定した。ゲルを上述のようにクマシー染色、銀染色又は活性染色した。RNAの調製:ヌクレオスピンNucleoSpin登録商標RNAプラントキットMacherey-Nagel,ドイツ,デューレンを用いて、RNAレイターRNALater登録商標Invitrogenに保管した菌糸体500mgからRNAを調製した。cDNAの合成:全RNA5μgを3’PCRATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG30TVN25pmolと混合し、DEPC処理したH2Oで11μlになるまで満たした。混合物を70°Cで5分間インキュベートし、その後、氷上で2分間冷却した。5×反応緩衝液4μl、dNTPミックス10mM当量2μl、リボロックRiboLock商標0.5μl及びSMARTIIAAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG20pmolを加えて混合し、37°Cで5分間インキュベートした。リバートエイドRevertAid商標HマイナスM-MuLV逆転写酵素200Uの添加後、混合物を42°Cで60分間インキュベートした。70°Cで5分間加熱することによって停止反応を行った。10×ロングPCR緩衝液2.5μl、dNTPミックス2.5mM当量2μl、5’PCRAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT25pmol、3’PCR25pmol、DMSO1μl、ロングPCR酵素ミックス1U、sscDNA3μlを加え、さらに25μlになるまでddH2Oを加えて混合することによって、第二鎖合成を行った。反応混合物を94°Cで5分間インキュベートし、その後、94°Cで20秒間及び68°Cで6分間のインキュベーションを30サイクル行い、最終的な伸長を68°Cで20分間行った。酵素及び試薬は、ドイツ,ザンクトレオン=ロートのFermentasから購入した。オリゴヌクレオチドは、ドイツ,エーバースベルクのEurofinsMWGOperonによって合成された。配列探索:ペプチド配列から変性プライマーを推定した。10×トゥルースタートTrueStart商標Taq緩衝液2.5μl、dNTPミックス2.5mM当量2μl、25mMMgCl22μl、フォワードプライマー25pmol、リバースプライマー25pmol、DMSO0.8μl、トゥルースタートTaqDNAポリメラーゼ0.625U、dscDNA1μlを加え、さらに25μlになるまでddH2Oを加えて混合することによって、PCRを行った。反応混合物を95°Cで5分間インキュベートし、その後、95°Cで30秒間、72°C~1°C/サイクルで60秒間、及び72°Cで90秒間のインキュベーションを12サイクル行うことによって、タッチダウンPCR[2]を行った。60°Cのアニーリング温度で別の25サイクルを行った。最終的な伸長を72°Cで20分間行った。TAE緩衝液40mMTris,20mM酢酸,1mMEDTApH8中で加熱したアガロースゲル電気泳動1アガロースServa,ドイツ,ハイデルベルクによってPCRを分析した。DNA検出のために、約50°Cまで冷却後、0.05‰SYBRSafe商標Invitrogenを溶液に添加した。NucleoSpinExtractIIキットMacherey-Nagelを用いてアガロースゲルからDNAの抽出を行った。ベクター1μl、10×T4DNAリガーゼ緩衝液1μl、T4DNAリガーゼ5U、5mMATP0.5μl及びインサートDNA6.5μlを混合することによって、DNA断片をpCR2.1登録商標TAベクターInvitrogenに連結させた。反応混合物を25°Cで2時間インキュベートした。形質転換のために、連結反応混合物5μlを化学的コンピテント大腸菌TOP10Invitrogen50μlに加えて氷上で20分間インキュベートし、42°Cで45秒間熱ショックを与え、氷上に再び戻した。SOC培地Invitrogen500μLをすぐに添加した。細胞を200rpm及び37°Cで60分間振とうし、その後、アンピシリン50μg/ml及びX-GalRoth20μg/mlを含むLB寒天上に置いた。植菌したプレートを37°Cで一晩インキュベートした。コロニーPCRによって陽性クローンの選択を行った。反応混合物は上記のように構成されていたが、プライマーM13uni-21TGTAAAACGACGGCCAGT及びM13rev-29CAGGAAACAGCTATGACCを使用した。反応混合物に白色コロニー物質を再懸濁することによってテンプレートを加えた。反応混合物を95°Cで5分間インキュベートし、その後、95°Cで30秒間、55°Cで1分間及び72°Cで1分間/kbのインキュベーションを40サイクル行った。最終的な伸長を72°Cで20分間行った。ヌクレオスピンプラスミドDNAキットMacherey-Nagelを用いてプラスミドDNAを単離した。EurofinsMWGOperonドイツ,エーバースベルクにより配列決定を行った。配列を完成させるために、同定されたアスパラギナーゼDNA断片から特異的プライマーを得、それぞれ、プライマー5’PCR又は3’PCRと対を形成させた。55°Cでのアニーリング及び72°Cで1分間の伸長工程において上述のようにPCRを行った。55°Cでのアニーリング及び72°Cでの1分間の伸長工程において、プライマーFvNase_5’ATGAAATCTTTTGCCCTCTTCG及びFvNase_3’TCAAGCAAAGTGATGAAGGを用いて全アスパラギナーゼ配列の増幅を達成した。配列を確認するために、ゲノムのDNA精製キットFermentasを用いて菌糸体からゲノムDNAを調製した。全アスパラギナーゼ配列を増幅し、配列を決定した。DNA及びアミノ酸配列の分析:シグナルP3.0を用いた分析によってN末端シグナル配列の同定を行った[3]。BLASTを用いたGenBankデータベース検索によって配列相同性を調べた[4]。大腸菌における異種発現:アスパラギナーゼをクローニングするために、プラスミドDNAからその遺伝子を、両末端に隣接する制限部位EcoRI及びBamHIに対してプライマーFvNase_EcoRIATAGAATTCATGAAATCTTTTGCCCTCTTC及びFvNase_BamHIATAGGATCCTCAAGCAAAGTCGATGAAを使用したPCRによって増幅した。遺伝子カセットを消化し、X-ZymeのpCTP2発現ベクターにライゲーションして、発現構築体pCTP2-Aspaを得た。OD600nmが0.7になるまで、37°Cで、pCTP2-Aspaで形質転換された大腸菌株DH5α及びJM105をLB培地で増殖し、0.5mMIPTGを用いて誘発し、さらに一晩培養した。細胞をトリス緩衝液pH7.5に再懸濁し、超音波処理により溶解させ、遠心分離により細胞破壊片を除去した。硫酸アンモニウムを用いてアスパラギナーゼの精製を促進させた。バチルスサブティリス由来の組み換えアスパラギナーゼ:細菌からのタンパク質の分泌はATP依存性プロセスであり、これは、プレタンパク質の転座、及びそれに続く膜外表面におけるプレタンパク質のタンパク質分解的切断による成熟酵素の生成を含む。シグナル配列は、転座のために膜にタンパク質を標的化するのに必要なすべての情報を含む。バチルスサブティリスにおける分泌は大腸菌における分泌ほどは理解されていないが、同一の機構によって進行するものと一般に考えられているSaier,M.H.,Jr.,Werner,P.K.及びMuller,M.,1989,Microbiol.Rev53:333-366;Overhoff,B.,Klein,M.,Spies,M.及びFreudl,R.,1991,Mol.Gen.Genet.228:417-423。二組の分泌タンパク質間の差異の1つはシグナルペプチドの長さであり、グラム陽性菌では対応するグラム陰性菌と比較して最大で20アミノ酸長い傾向にある。よって、バチルスサブティリスなどのグラム陽性菌において異種タンパク質を発現させるための一般的な戦略は、宿主の分泌器官に標的タンパク質を結合させることを含むMountain,A.,1989,Bacillus,C.Harwood編,PlenumPress,NewYork,73-114。上記方法を用いた標準的なプロトコルは当技術分野で知られているが、それを、バチルスサブティリスによる組み換えアスパラギナーゼの過剰発現に使用した。[実施例1-フラムリナベルティペスの培養]すべての培地及び機器は使用前にオートクレーブにかけ、実験全般を通じて標準的な滅菌法を適用した。標準的な寒天培地グルコース一水和物:30.0g/L;アスパラギン一水和物:4.5g/L;KH2PO4:1.5g/L;MgSO4:0.5g/L;酵母抽出物:3.0g/L;寒天:15.0g/L;CuSO45H2O0.005g/L、FeCl36H2O0.08g/L、ZnSO47H2O0.09g/L、MnSO4H2O0.03g/L及びEDTA0.4g/Lを含む微量金属溶液:1.0mL/Lでフラムリナベルティペスを維持した。滅菌処理前に培地のpHを1MNaOHでpH6に調整した。ウルトラタラックスMiccraD-9,Art,ドイツ,ミュールハイムを用いて、100mLの滅菌標準栄養液中、フラムリナベルティペスの菌糸体を有する10×10mmの寒天プラグをホモジナイズすることによって、前培養液を調製した。液内培養液を24°C及び150rpmで維持した。5日間の培養後、前培養液50mlを、最少培地KH2PO4:1.5g/L;MgSO4:0.5g/L;微量金属溶液:1.0ml/L及びグルテン40g/L又はグルタミン10mMからなる本培養液250mlにそれぞれ移した。[実施例2-フラムリナベルティペスからの酵素の調製]18日間の培養の後、培養液を濾過し、細胞外の酵素含有上清200mLを逆さまにして泡立てた。アスパラギナーゼ及びもう一種類のタンパク質のみが上清に残った。限外濾過MWCO10,000により残りの液体を濃縮し、Superose6のサイズ排除クロマトグラフィーにより両タンパク質を分離した。最初に存在した加水分解活性のほとんどが回復した。このことは、このプロトコルがわずか二工程を通じて有用な酵素濃縮物を生じさせたことを示している。[実施例3-天然酵素を用いたL-アスパラギンの加水分解]0.1MK2HPO4/KH2PO4緩衝液pH7.0中の10mMアスパラギン100μLを37°Cで5分間予熱した。酵素溶液50μLを加えて反応を開始させた。37°C及び400rpmのサーモシェーカーで20分間のインキュベーションの後、TCA20μLを加えることによってアッセイを停止させた。基質なしで対照実験を行った。OPA誘導体化後にHPLCによりアスパラギン酸含量を定量的に測定し、サンプルと対照の差異を利用して酵素の活性を計算した。分析的証拠は、基質であるL-アスパラギンの迅速な酵素加水分解を示している。[実施例4-天然酵素を用いたL-グルタミンの加水分解]0.1MK2HPO4/KH2PO4緩衝液pH7.0中の10mMグルタミン100μLを37°Cで5分間予熱した。酵素溶液50μLを加えて反応を開始させた。37°C及び400rpmのサーモシェーカーで20分間のインキュベーションの後、TCAトリクロロ酢酸20μLを加えることによってアッセイを停止させた。基質なしで対照実験を行った。OPA誘導体化後にHPLCによりグルタミン酸含量を定量的に測定し、サンプルと対照の差異を利用して酵素の活性を計算した。この分析的証拠は、基質であるL-グルタミンに関するアスパラギナーゼの有用な副活性を示している。[実施例5-組み換え酵素を用いたL-アスパラギンの加水分解]0.1MK2HPO4/KH2PO4緩衝液pH7.0中の10mMアスパラギン140μLを37°Cで5分間予熱した。水で200倍に希釈した組み換え酵素溶液10μLを加えて反応を開始させた。37°C及び400rpmのサーモシェーカーで10分間のインキュベーションの後、95°Cで10分間加熱することによってアッセイを停止した。基質なしで対照実験を行った。OPA誘導体化後にHPLCによりアスパラギン酸含量を定量的に測定し、サンプルと対照の差異を利用して酵素の活性を計算した。アスパラギンに関する組み換えアスパラギナーゼ酵素の活性を計算すると43.3kU/Lであった。[実施例6-組み換え酵素を用いたL-グルタミンの加水分解]0.1MK2HPO4/KH2PO4緩衝液pH7.0中の10mMグルタミン140μLを37°Cで5分間予熱した。水で200倍に希釈した組み換え酵素溶液10μLを加えて、反応を開始させた。37°C及び400rpmのサーモシェーカーで10分間のインキュベーションの後、95°Cで10分間加熱することによってアッセイを停止した。基質なしでブランクを調製した。OPA誘導体化後にHPLCによりグルタミン酸含量を定量的に測定し、サンプルとブランクの差異を利用して酵素の活性を計算した。グルタミンに関する組み換えアスパラギナーゼの活性を計算すると4.3kU/Lであった。本発明について詳細に説明してきたが、詳細な説明は、その発明の範囲を限定することを意図したものではないことが理解されよう。特許証により保護されるのが望ましいものは、以下の特許請求の範囲に記載の通りである。"