"感染性B型インフルエンザウイルスを細胞培養で生産するためのヘルパーウイルスフリー方法であって、iB型インフルエンザウイルスゲノムの核酸配列を含む複数のプラスミドベクターをVero細胞集団にエレクトロポレーションする段階と;iiVero細胞集団をウイルス複製に許容可能な条件下で培養する段階と;iii複数の感染性B型インフルエンザウイルスを回収する段階を含む前記方法。B型インフルエンザウイルスが弱毒、温度感受性及び低温適応から構成される群から選択される1種以上の表現型属性をもつ請求項1に記載の方法。B型インフルエンザウイルスが弱毒、低温適応、温度感受性インフルエンザウイルスを含む請求項1に記載の方法。B型インフルエンザウイルスが鼻腔内ワクチン製剤で投与するのに適している請求項1に記載の方法。Vero細胞を無血清培地で培養する段階を含む請求項1に記載の方法。ウイルス複製に許容可能な条件がVero細胞を35°C以下の温度で培養する段階を含む請求項1に記載の方法。ウイルス複製に許容可能な条件がVero細胞を33°Cの温度で培養する段階を含む請求項1に記載の方法。複数のプラスミドベクターが8個のプラスミドベクターである請求項1に記載の方法。aPB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159及びM1183から構成される群から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす少なくとも1個の突然変異をB型インフルエンザウイルスゲノムに導入する段階と;bウイルスが産生される条件下で突然変異インフルエンザウイルスゲノムを複製する段階を含む温度感受性tsインフルエンザウイルスの生産方法。PB2630S630R、PA431V431M、PA497Y497H、NP55T55A、NP114V114A、NP410P410H、NP510A510T、M1159H159Q及びM1183M183Vから構成される群から選択される置換アミノ酸をコードする少なくとも1個の突然変異をB型インフルエンザウイルスゲノムに導入する段階を含む請求項9に記載の方法。PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159及びM1183から構成される群から選択される位置にアミノ酸置換をもたらす複数の突然変異をB型インフルエンザウイルスゲノムに導入する段階を含む請求項9に記載の方法。PB2630S630R、PA431V431M、PA497Y497H、NP55T55A、NP114V114A、NP410P410H、NP510A510T、M1159H159Q及びM1183M183Vから構成される群から選択される複数のアミノ酸置換をもたらす突然変異をB型インフルエンザウイルスゲノムに導入する段階を含む請求項9に記載の方法。突然変異インフルエンザウイルスゲノムを鶏卵で複製する段階を含む請求項9又は11に記載の方法。突然変異B型インフルエンザウイルスゲノムを細胞培養で複製する段階を含む請求項9又は11に記載の方法。ウイルスを鶏卵で増幅する段階を更に含む請求項14に記載の方法。細胞を35°C以下の温度で培養する段階を含む請求項14に記載の方法。細胞培養がVero細胞、MDCK細胞、293T細胞及びCOS細胞の1種以上を含む請求項14に記載の方法。pAD3000の構築ウシ成長ホルモンBGHポリアデニル化シグナルをサルウイルス40SV40に由来するポリアデニル化シグナルで置換するようにプラスミドpHW2000Hoffmannら2000ADNAtransfectionsystemforgenerationofinfluenzaAvirusfromeightplasmidsProcNatlAcadSciUSA97:6108-6113を改変した。TaqMasterMixQiagenと以下のオリゴヌクレオチド5’→3’方向で示す:polyA.1:AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT配列番号1polyA.2:TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA配列番号2を使用してSV40に由来する配列を増幅した。プラスミドpSV2Hisを鋳型として使用した。予想175bp産物に一致するフラグメントを取得し、TopoTAクローニングベクターInvitrogenを製造業者の指示に従って使用してpcDNA3.1にクローニングした。得られたプラスミドからSV40ポリアデニル化シグナルを含む所望138bpフラグメントをEcoRVとBstEIIで切り出し、アガロースゲルから単離し、慣用技術例えばAusubel,Berger,Sambrook参照を使用してpHW2000のユニークPvuII-BstEII部位間にライゲーションした。得られたプラスミドpAD3000図1を配列決定した処、正しい方向にSV40ポリアデニル化部位を含むことが判明した。pAD3000のヌクレオチド295-423はSV40株777AF332562の夫々ヌクレオチド2466-2594に対応する。MDV-A生産用8プラスミドシステム低温適応A型インフルエンザウイルス株A/AA/6/60変異体は鼻腔投与インフルエンザAワクチンの生産用マスタードナーウイルスとして一般に使用されている。この株は本発明に関して典型的なマスタードナーウイルスMDVである。簡単にするために、この株A/AA/6/60変異体を本明細書ではMDV-Aと言う。RNeasyミニキットQiagenを使用してMDV-AウイルスRNAを抽出し、表1に示すプライマーを使用してRT-PCRにより8個の対応するcDNAフラグメントを増幅した。HAとPB2をコードするインフルエンザゲノムセグメントはAarI制限酵素認識部位を含むプライマー使用して増幅したが、それ以外の6個の遺伝子はBsmBI制限酵素認識部位を含むプライマーを使用して増幅した。AarI及びBsmBIcDNAフラグメントのいずれもpAD3000ベクターの2個のBsmBI部位の間にクローニングした。シーケンシング分析の結果、クローニングした全cDNAフラグメントはコンセンサスMDV-A配列に対してクローニング段階中に導入されたと思われる突然変異を含んでいた。各遺伝子セグメントに検出された突然変異を表2に要約する。QuikChange部位特異的突然変異誘発キットStratageneと表3に示す合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して全突然変異をコンセンサスMDV-A配列に補正した。感染性組換えMDV-A及びリアソータントインフルエンザウイルスの作製10胎仔ウシ血清FBSを添加した変法イーグル培地MEMにMadin-Darbyイヌ腎MDCK細胞とヒトCOS7細胞を維持した。5FBSを添加したOpti-MEMILifeTechnologiesにヒト胚性腎細胞293Tを維持した。MDCK細胞とCOS7細胞又は293T細胞を6ウェルプレートで1:1の比で共培養し、これらの細胞を約80のコンフルエンシーでトランスフェクションに使用した。293T細胞とCOS7細胞はトランスフェクション効率が高いが、インフルエンザウイルス複製には許容されない。MDCK細胞と共培養すると、組換えウイルスの効率的な複製を確保することができる。トランスフェクションに先立ち、血清添加培地を無血清培地Opti-MEMIに交換し、4~6時間インキュベートした。TransIT-LT1Mirusを使用し、20μlのTransIT-LT1を160μlのOpti-MEMIで希釈して8種のプラスミドDNAPB2,PB1,PA,NP,M,NS,HA及びNA各1μgと混合して総容量200μlとすることによりプラスミドDNAトランスフェクションを実施した。DNA:トランスフェクション試薬混合物を室温で45分間インキュベートした後に800μlのOpti-MEMIを加えた。次にトランスフェクション混合物を共培養MDCK/293T又はMDCK/COS7細胞に加えた。トランスフェクト細胞を35°C又は33°Cで6時間~24時間、例えば一晩インキュベートし、トランスフェクション混合物を各ウェルで1mlのOpti-MEMに交換した。35°C又は33°Cで24時間インキュベーション後に1μg/mlTPCK-トリプシンを添加した1mlのOpti-MEMIを各ウェルに加え、更に12時間インキュベートした。回収したウイルスを次にコンフルエントMDCK細胞で増幅するか又は発育鶏卵で直接増幅した。12ウェルプレート内のMDCK細胞にトランスフェクション混合物0.2mlを1時間室温で感染させた後、混合物を除去し、1μg/mlTPCK-トリプシンを添加した2mlのOpti-MEMIに交換した。細胞を35°C又は33°Cで3~4日間インキュベートした。増幅したウイルスをSPG安定剤の存在下に-80°Cで保存するか又はプラーク精製し、MDCK細胞もしくは発育鶏卵で増幅した。MDV-Aポリメラーゼ蛋白質の機能的発現EGFPレポーター遺伝子をコードするインフルエンザウイルスミニゲノムを複製する能力により4種のMDV-Aポリメラーゼ蛋白質PB2,PB1,PA及びNPの機能活性を分析した。A/PR/8/34株H1N1のcDNAを含む8種1組の発現プラスミド例えば表4参照Hoffmannら2001EightplasmidrescuesystemforinfluenzaAvirus;OptionsforthecontrolofinfluenzaInternationalCongressSeries1219:1007-1013と強化緑色蛍光蛋白質をコードするレポーター遺伝子を含むインフルエンザウイルスミニゲノムEGFP,pHW72-EGFPを使用した。インフルエンザAウイルスEGFPミニゲノムに相当するプラスミドpHW72-EGFPと共にMDV-APB1,PB2,PA及びNP又はPB1,PA,NP陰性対照として-PB2を共培養MDCK/293T細胞にトランスフェクトしたHoffmannら2000AmbisenseapproachforthegenerationofinfluenzaAvirus:vRNAandmRNAsynthesisfromonetemplateVirology15:2672:310-7。トランスフェクト細胞をトランスフェクションから48時間後に位相コントラスト顕微鏡又は蛍光顕微鏡で観察した。あるいは、フローサイトメトリーを使用してEGFP発現を検出した。図2に示すように、MDV-AのPB2,PB1,PA及びNPをトランスフェクトした細胞にはEGFPミニゲノムの発現を示す緑色蛍光が観察されたが、ポリメラーゼ蛋白質を3種しかトランスフェクトしなかった細胞には観察されなかった。このことからpAD3000におけるMDV-Aポリメラーゼ蛋白質は機能的であると思われた。他のアッセイでは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT遺伝子を含むミノゲノムpFlu-CATを使用してポリメラーゼ活性を測定する。このようなアッセイでは、ミニゲノム複製の指標として例えばELISAにより蛋白質又はRNAレベルでCAT発現を測定する。単一遺伝子リアソータント実験によるMDV-Aプラスミドの分析pAD3000にクローニングした8種のMDV-Aゲノムセグメントの各々はMDA-Aに由来する単一遺伝子セグメントを対照A/PR/8/34株に由来する相補的な7種のセグメントと共にコトランスフェクトすることによりリアソータント実験で機能的に発現されることが判明した。相補的対照セグメントと併用すると全8種の単一ゲノムセグメントプラスミドから感染性リアソータントウイルスが作製され、感染MDCK細胞に細胞変性効果を生じたので、全8種のプラスミドは機能的MDV-A蛋白質をコードすると思われた。表4。インフルエンザAウイルスのパッケージング制約を更に調べるために、NSセグメントを2個の別個の遺伝子セグメントに分離し、一方がNS1ゲノムセグメントをコードし、他方がNS2ゲノムセグメントをコードするようにした。インフルエンザAのゲノムセグメントを含む9種のプラスミドを上述のようにMDCK/COS細胞にトランスフェクトし、回収したウイルスをMDCK細胞で力価測定する前に発育鶏卵で増幅した。9プラスミドシステムでは上記8プラスミドシステムに比較してプラークサイズの減少が観察された。RT-PCR分析によると、ビリオンにはNS2セグメントしか存在せず、NS1遺伝子セグメントはパッケージングされていないことが判明した。MDV-A及び6:2リアソータントウイルスの回収上記手順に従い、8種のMDV-Aプラスミド組換え又は6個のMDV-A内部遺伝子とA/PR/8/34に由来するHAとNAを組込んだプラスミド6:2リアソータントのトランスフェクションから3日後に、トランスフェクト培養上清を使用して新鮮なMDCK細胞に感染させ、感染細胞を1μg/mlTPCK-トリプシンの存在下に33°Cで3日間インキュベートした。感染MDCK細胞に及ぼす組換えウイルスの細胞変性効果を顕微鏡で観察した。標準血球凝集アッセイHAを使用してウイルスヘマグルチニンの発現をモニターした。HAアッセイは96ウェルプレートで系列2倍希釈培養上清50μlを1ヒヨコ赤血球細胞50μlと混合することにより実施した。トランスフェクトした8種のMDV-Aプラスミドと6:2リアソータントウイルスのどちらに由来する増幅ウイルスにも約1:254~1:1024のHA力価が検出された。E.Hoffman博士から入手した8A/PR/8/34プラスミドを使用するトランスフェクション反応を陽性対照として使用した。表5に示すようにこれらの3種のトランスフェクション反応から感染性インフルエンザウイルスが生産された。回収したウイルスの遺伝子型をマッピングするためにRT-PCRを実施した。RNeasyミニキットQiagenを使用して感染細胞培養上清からウイルスRNAを単離し、各MDV-A遺伝子セグメントに特異的なプライマーとH1及びN1特異的プライマーを使用して8種のインフルエンザウイルスセグメントをRT-PCRにより増幅した。図3に示すように、rMDV-AはMDV-Aに特異的なPB2,PB1,NP,PA,M及びNSとH2及びN2サブタイプに特異的なHA及びNAを含んでいた。6:2リアソータントはMDV-Aに由来する6個の内部遺伝子と、A/PR/8/34H1N1に由来するHA及びNAを含んでいた。このことから、トランスフェクトプラスミドから作製したウイルスは正しい遺伝子型をもつことが確認された。レスキューされたウイルスをMDCK細胞でプラークアッセイにより力価測定した処、プラークはMDV-Aに対するニワトリ血清を使用する免疫染色によりインフルエンザウイルスであることが確認された。12ウェルプラークで100コンフルエントのMDCK細胞に10倍系列希釈ウイルス100μlを室温で温和な振盪下に1時間感染させた。接種材料を除去し、0.8アガロースと1μg/mlTPCK-トリプシンを添加した1XL15を細胞に重層した。プレートを35°C又は33°Cで3日間インキュベートし、100メタノールで固定し、PBS中5ミルクによりブロックし、2000倍希釈ニワトリ抗MDV-A抗血清と共に1時間インキュベートした後、HRP標識ウサギ抗ニワトリIgGと共に1時間インキュベートした。HRP基質溶液DAKOを加えることによりプラークを可視化した。回収された全ウイルスは陽性免疫染色を示した。MDV-Aのca、ts、att表現型の遺伝子基盤のマッピングMDV-Aインフルエンザウイルスワクチン株は低温適応ca,温度感受性ts及び弱毒att等のワクチン例えば生弱毒ワクチンの生産に関連する数種の表現型をもつ。MDV-A株と非tsビルレントwtA/AA/6/60株の配列比較の結果、これらの2種の株の間には最低17ntの差異があることが判明した表6。MDV-A配列における置換のいくつかはGeneBankデータベースで入手可能な全A型インフルエンザウイルスに比較してこの株にユニークであり、これらのアミノ酸置換の1個以上がatt,ca及びts表現型に機能的に関係することを示唆している。PB2821における単一アミノ酸置換はMDV-Aのts表現型の決定基として従来報告されていた唯一のヌクレオチド位置であったSubbaraoら1995AdditionofTemperature-SensitiveMissenseMutationsintothePB2GeneofInfluenzaATransfectantVirusesCanEffectanIncreaseinTemperatureSensitivityandAttenuationandPermitstheRationalDesignofaGeneticallyEngineeredLiveInfluenzaAVirusVaccineJ.Virol.69:5969-5977。MDV-A表現型に関与する最小置換を特定するために、wtA/AA/6/60と相異するMDV-Aクローンのヌクレオチドを個々にwtA/AA/6/60のヌクレオチドに置換した即ち復帰変異させた。次に各復帰変異遺伝子セグメントをMDV-Aの相補的セグメントと共に宿主細胞に導入し、単一遺伝子リアソータントを回収した。更に、復帰変異遺伝子セグメントと対応するMDV-Aセグメントを他の野生型株例えばA/PR/8/34株に由来するセグメントと共にトランスフェクトし、各遺伝子セグメントがウイルス表現型に関与しているか否かを評価することもできる。上記組換えMDV-Aプラスミドシステムを使用して部位特異的突然変異誘発を実施し、非tsリアソータントを作製するように6個の内部遺伝子を更に改変した。表6に示すような組換え野生型A/AA/6/60ゲノムrWt,Flu064に相当するように合計15個のヌクレオチド置換突然変異を6種のMDV-Aプラスミドに導入した。Madin-Darbyイヌ腎MDCK細胞とCOS-7細胞を上述のように維持及びトランスフェクトした。回収したウイルスを次にMDCK細胞で1代継代した後、発育鶏卵の尿膜腔で増幅させた。トランスフェクションとMDCK及び鶏卵でのウイルス増殖は温度選択圧を最小限にするためにca及びwtウイルスの両者に許容される温度である33°Cで実施した。ウイルスRNAから増幅したcDNAフラグメントの配列分析によりウイルス遺伝子型を確認した。例えばその開示内容全体を本明細書に組込む米国特許第6,322,967号Parkin,発明の名称インフルエンザの組換えトリプトファン突然変異体Recombinanttryptophanmutantsofinfluenzaに従来記載されているような当分野で公知の方法により表現型特徴を決定した。要約すると、組換えウイルスの温度感受性をMDCK細胞でプラークアッセイにより33、38及び39°Cで測定した。6ウェルプレート内のMDCK細胞に10倍系列希釈ウイルス400μlを感染させ、室温で60分間吸着させた。接種材料を除去し、1アガロースと1μg/mlTPCK-トリプシンを添加した1xL15/MEMに交換した。33°CでCO2インキュベーター又は38±0.1°C又は39±0.1°Cに維持した循環水浴に沈めた5CO2を収容する水密容器で感染細胞をインキュベートしたParkinら1996TemperaturesensitivemutantsofinfluenzaAvirusgeneratedbyreversegeneticsandclusteredchargedtoalaninemutagenesis.Vir.Res.46:31-44。3日間インキュベーション後、ニワトリ抗MDVポリクローナル抗体を使用して単層を免疫染色し、プラークを計数した。各温度で得られたプラークカウントを比較し、各ウイルスのts表現型を評価し、各アッセイを最低3回ずつ実施した。シャットオフ温度は33°Cに比較して力価低下が100倍以上となる最低温度として定義した。8種のプラスミドpMDV-PB2,pMDV-PB1,pMDV-PA,pMDV-NP,pMDV-HA,pMDV-NA,pMDV-M,及びpMDV-NSをトランスフェクトした共培養COS-7/MDCK細胞から得られた感染性ウイルスを発育鶏卵で増幅させた処、非組換え生物由来MDV-Aの特徴的ts表現型を示すことが判明した表7。MDV-AとrMDV-Aのどちらも39°Cでは明白なプラークを形成しなかったが、どちらも33°Cでは容易に目に見えるプラークを形成した。MDV-Aのts表現型の遺伝子基盤の系統的な詳細分析を実施するために、caA/AA/6/60に対して7~48ntの変異をもつ数種の近縁非ts、非attwtA/AA/6/60株高度関連単離株wtA/AA/6/60E10SE2を含むの配列を比較のために使用した。E10SE2とMDV-Aの間には合計19ntの変異が存在する表6。E10SE2はフェレットで非ts表7及び非attであることが判明した。組換え非tsウイルスを作製するために、MDV-Aプラスミドを部位特異的突然変異誘発により改変し、10個のアミノ酸置換に相当する19個の変異のうちの15個を組込んだ。MDV-AとE10SE2の間で相異するヌクレオチド位置のうちPB2-1182,1212,PB1-123、及びNP-1550の4個はA/AA/6/60の他の非ts単離株で観察され、従って、ts表現型の発現に関与するとは予想されないので、MDV-A配列から改変しなかったHerlocherら1996SequencecomparisonsofA/AA/6/60influenzaviruses:mutationswhichmaycontributetoattenuation.VirusResearch42:11-25。8種1組のプラスミドpWt-PB2,pWt-PB1,pWt-PA,pWt-NP,pWt-M,pWt-NS,pMDV-HA,及びpMDV-NAをトランスフェクトした共培養COS-7/MDCK細胞から15個のヌクレオチド置換をコードする組換えウイルスrWt,Flu064が得られた。シーケンシング分析の結果、rWtは指定遺伝子変異を含み、39°Cで非tsであり、生物由来wtA/AA/6/60に一致することが判明した。これらの知見から、ts表現型はこれらの15nt変異のサブセットにマッピングすることが立証された。ウイルスts表現型への6個の内部遺伝子セグメントの関与組換え単一遺伝子リアソータント表7を作製することにより、MDV-Ats表現型に及ぼす各wt遺伝子セグメントの効果を調べた。wtPB2をrMDV-Aに導入すると、38°Cでは非tsのウイルスしか得られなかったが、39°Cではtsが維持された。MDCK細胞でプラークアッセイにより測定した場合、33°Cに対して38°Cと39°Cのウイルス力価の低下は夫々0.6log10と2.7log10であった。wtPB1遺伝子セグメントを含むリアソータントは38°Cと39°Cの両者でそのプラーク形成能に関して非tsであった。しかし、この組換え体のプラークサイズは温度上昇により変化し、39°CではrWtに比較して有意に減少した。wtNP遺伝子セグメントをrMDV-Aに導入すると、同様に38°Cでは非tsのウイルスとなったが、wtPB2組換え体と異なり、wtNP遺伝子セグメントを含むウイルスは39°Cでプラークを形成しなかった。wtPA,M又はNS遺伝子セグメントを個々にrMDV-Aに導入すると、ts表現型は変化せず、これらの3種の遺伝子セグメントはこの表現型の維持に最小限の役割を果たすと思われた。MDV-Aバックグラウンドに個々に発現されたwtPB1,wtPB2又はwtNPはいずれも非tsrWTと同一のプラーク効率とプラークサイズプロフィルを生じることができなかったので、これらの遺伝子セグメントを種々に組合せてMDV-Aに導入した。wtPB1とwtPB2を組合せると、38°Cと39°Cのどちらでも非tsのウイルスになった表7。プラークサイズはどちらの単一遺伝子リアソータントよりも大きかったが、rWtより有意に小さかった。rMDV-AにwtPB1/PB2/NPの三重組合せを導入すると、39°Cでそのプラーク効率とプラークサイズにおいてrWtに類似又は一致するウイルスが得られた。従って、個別に導入した場合にはwtPB2,PB1及びNP遺伝子セグメントはts表現型を一部だけ復帰変異させたが、全3種のwt遺伝子セグメントを組合せると、ts表現型をrWtと同一の非ts表現型に完全に復帰変異させることができた。これらの3種の遺伝子セグメントが特徴的MDV-Ats表現型をrWtに付与することができたか否かを調べるために、MDV-Aに由来する6種の内部遺伝子セグメントを個別又は組合せてrWtに導入した。単一PB1,PB2,又はNP遺伝子セグメントをrWtに導入すると、38°Cのウイルス力価は低下し、39°Cでは更に低下したが、これらの単一遺伝子リアソータントのうちでrMDV-Aのように高温で制限されるものは皆無であった図10。mMDV-Aに由来するPA,M及びNS遺伝子セグメントはrWtの非ts表現型に影響を与えなかった。上記リアソートメントに一致して、MDV-APB1及びPB2遺伝子の両方をrWtバックボーンに導入すると、38°Cでウイルスts表現型は著しく増加したが、ウイルスts表現型の完全な復帰変異にはNPを加える必要があることが立証された。従って、MDV-Aに由来するPB1,PB2及びNP遺伝子セグメントは完全なts表現型の付与に重要であった。MDV-Ats表現型を決定した遺伝子座のマッピングrWt及びrMDV-AのPB1,PB2及びNP遺伝子セグメント間の特異的変異を系統的に検討し、ts表現型に有意な役割を果たした変異を同定した。rMDV-AのNP遺伝子はnt146のみがrWtNPと相異していたG34D,表6。rMDV-AのPB2遺伝子は3部位がrWtと相異していたが、nt821のみがアミノ酸置換を伴いN265S,表6、PB2遺伝子セグメントに位置するts遺伝子座に相当すると予想された。MDV-AのPB1遺伝子は6nt位置がwtPB1と相異し、そのうち4個はコーディング変異であった表6。wtアミノ酸残基置換の各々を個々にrMDV-AのPB1遺伝子セグメントに置換し、ts表現型におけるその役割を調べた。1395GGlu-457と2005GAlaはMDV-Ats表現型に影響がなかった。1195ALys-391と1766AGlu-581は各々38°Cでts表現型を僅かに低下させたが、39°Cでは影響がなかった表8。これらのデータから、1195Aと1766AがPB1遺伝子セグメントにおけるts遺伝子座ではないかと予想された。しかし、1195Aと1766Aを併用してもwtPB1に類似するts表現型は生じなかった表6。1395Aでなく2005GをPB1-1195A/1766Aに加えると、39°Cでウイルスts表現型は更に低下し、2005AもMDV-AのPB1セグメントにより特定されるts表現型の発現に役割を果たすことが立証された。次に、PB1単一部位突然変異をwtPB2及びwtNPと共にrMDV-Aに導入した。wtPB2/NP及びrMDV-Aリアソータントは38°Cで非tsであり、39°Cで力価低下が1.25log10であったが、そのプラークサイズはrWtに比較して著しく減少した。PB1-1195A又は1766Aを加えてもwtPB2/NPリアソータントの表現型は有意に変化しなかった。PB1-1195A及び1766AをwtPB2及びwtNPと併用した場合のみにwtPB1/PB2/NP及びrMDV-Aリアソータントと同一の非ts表現型をもつウイルスが得られた表8。PB1-1395G又は2005GをwtPB1-1766/PB2/NPに加えてもウイルスは特徴的rWt非ts表現型に変換しなかった。従って、これらのデータから3種のPB1,PB2及びNP遺伝子に分配された4種のアミノ酸がMDV-Ats表現型を完全に復帰変異させることができることが立証された。MDV-A及びリアソータントウイルスの宿主細胞制限上述のようにMDV-Aウイルスと1個以上のMDV-A由来セグメントをもつリアソータントウイルスは温度感受性及び弱毒表現型を示すが、MDV-Aウイルスは更にMDCK細胞に比較してPer.C6細胞における増殖の低下から明らかように宿主細胞制限も示す。図20A及びBに示すように、MDV-AとMDV-A由来PB1及びPB2セグメントをもつリアソータントウイルスはMDCK細胞に比較してPer.C6細胞で有意増殖低下を示した。温度感受性、弱毒ウイルス株の構築MDV-AのPB1,PB2及びNP遺伝子セグメントで同定された5種のアミノ酸がMDV-Aのts及びatt表現型を再現するか否かを調べるために、PB1-391E,581G,661T,PB2-265S,NP-34Gを分岐野生型ウイルス株A/PR/8/34;PR8に導入した処、得られたウイルスは38°Cで1.9log10のウイルス力価の低下を示し、39°Cでは4.6log10の低下を示し、rMDV-Aと非常によく似ていた図11。caA/AA/6/60MDV-A及びA/PR/8/34のPB1,PB2及びNP遺伝子の配列比較の結果、MDV-AのPB1及びPB2遺伝子で同定された4種の置換アミノ酸はユニークであることが判明した。NP34はMDV-AとPR8の間で保存されている。従って、MDV-AのPB1遺伝子で同定された3個のts部位PB1391K391E、PB1581E581G及びPB1661A661TをA/PR/8/34のPB1に部位特異的突然変異誘発により導入し、PB2265N265SをA/PR/8/34のPB2に導入した。PB1及びPB2遺伝子に導入された突然変異をシーケンシング分析により確認した。突然変異誘発反応に使用したプライマー対を表9に示す。これらのウイルスを図16に模式的に示す。PR8のPB1及びPB2遺伝子に導入されたts突然変異がts表現型をinvitro付与するか否かを調べるために、ミニゲノムアッセイを実施した。インフルエンザミニゲノムレポーターpFlu-CATはアンチセンスCAT遺伝子をpolIプロモーターの制御下にクローニングしたものである。CAT蛋白質の発現はインフルエンザPB1,PB2,PA,及びNP蛋白質に依存した。要約すると、HEp-2細胞にPB1,PB2,PA,NP及びpFlu-CATミニゲノム各1μgをリポフェクタミン2000Invitrogenによりトランスフェクトした。33°C又は39°Cで一晩約18時間インキュベーション後に、細胞抽出物のCAT蛋白質発現をCATELISAキットRocheBioscienceにより分析した。CATmRNAレベルをプライマー伸長アッセイにより測定した。トランスフェクションから48時間後に全細胞RNAをTRIzol試薬Invitrogenで抽出し、水6μl中にてその5’末端を[r-32P]-ATPで標識した過剰のDNAプライマー5’-ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG及びT4ポリヌクレオチドキナーゼとRNAの1/3を混合した。95°Cで3分間変性後、0.5mMdNTPを添加した反応緩衝液にスーパースクリプト逆転写酵素Invitrogen50Uを添加後に1時間42°Cでプライマー伸長を実施した。TBE緩衝液中8M尿素を加えた6ポリアクリルアミドゲルで転写産物を分析し、オートラジオグラフにより検出した。図12A及びBに示すように、3個のアミノ酸置換PR8-3s,PB1391K391E、PB1581E581G及びPB1661A661TをもつPB1遺伝子はPR8対照に比較して33°Cの活性が低下していた。この突然変異体では39°CでCAT蛋白質発現の大幅な低下が観察され図12A、3個のMDV-Ats部位を導入したPB1遺伝子がこのinvitroアッセイで温度感受性複製を示すことが示唆された。PB2265N265SをPR8に導入しても許容温度33°Cと非許容温度39°Cのいずれでもその活性に殆ど影響がなかった。PB1-3sとPB2-1sを併用すると蛋白質活性は大きく低下しPR8-4s、MDV-Aよりも更にtsであると思われた。予想通り、MDV-Aに由来するPB1,PB2,PA,NP遺伝子をトランスフェクトした細胞ではwtA/AA/6/60wtA/AAに比較して39°Cで低レベル活性15が検出された。PR8突然変異体ウイルスを上述のように作製及び回収した。要約すると、PR8に由来するPR8HA,NA,PB1,PB2,PA,NP,M及びNS遺伝子をコードする8種のプラスミドを共培養cos7及びMDCK細胞にトランスフェクトした。4個のts遺伝子座PR8-4sをもつウイルスを作製するために、nt1195K391E,nt1766E581G及びnt2005A661T位に3個のPB1変異を含むPB1-3sと、821N265S位に1個のPB2変異を含むPB1-1sを使用した。更に、3個のPB1突然変異PR8-3s又は1個のPB2突然変異PR8-1sを含むPR8ウイルスも別に回収した。これらのウイルスを図16に模式的に示す。全4個の組換え突然変異体PR8ウイルスは発育鶏卵で非常に高力価まで増殖し、表10に示すように9.0log10pfu/ml以上の力価に達した。感染細胞におけるウイルス蛋白質合成を試験するために、MDCK細胞にウイルスをm.o.i=5で感染させ、感染から7時間後に細胞を35S-Transで1時間標識した。SDSを添加した1.5ポリアクリルアミドゲルで標識細胞溶解液を電気泳動し、オートラジオグラフにかけた。蛋白質合成をウェスタンブロッティングでも試験した。感染から8時間後にウイルス感染細胞を回収し、4-15勾配ゲルで電気泳動した。ブロットを抗M1抗体又はニワトリ抗MDV-Aポリクローナル抗体でプローブした後、HRP標識二次抗体と共にインキュベートした。抗体と結合した蛋白質バンドをChemiluminescentDetectionSystemInvitrogenにより検出した後、X線フィルムに露光した。図19に示すように、いずれも33°Cで同等の蛋白質合成レベルであったが、39°Cでは蛋白質合成レベルはPR8-1sがやや低下し、PR8-3s及びPR8-4s感染細胞では大幅に低下した。ウェスタンブロッティング分析からもPR8-4s>PR8-3s>PR8-1sの順で蛋白質合成が低下することが分かった。従って、ts突然変異体の複製低下は非許容温度で複製が低下するためであると思われた。33°C,37°C,38°C及び39°CにてMDCK細胞でプラークアッセイによりPR8突然変異体ウイルスの温度感受性を測定した。回収したウイルスを上述のように発育鶏卵で増幅させ、細胞に導入した。ウイルス感染細胞を指定温度で3日間インキュベーション後、ニワトリ抗MDVポリクローナル抗体を使用して細胞単層を免疫染色し、プラークを計数した。各温度で得られたプラークカウントを比較し、各ウイルスのts表現型を調べた。シャットオフ温度は33°Cに比較して力価低下が100倍以上となる最低温度として定義した。表10及び図17に示すように、ウイルス力価の僅かな低下が観察されたが、全突然変異体は33°Cで良好に複製した。38°Cでは全突然変異体にウイルス力価の有意低下が観察された。39°CではPB1遺伝子に3個のts遺伝子座をもつウイルスPR8-3s及びPR8-4sで4.0log10を上回るウイルス力価の低下が観察された。PR8-1sも39°Cでtsであった。PR8-4sのts表現型は33°Cに比較して39°Cで4.6log10低下したMDV-Aに非常によく似ていた。全3種のPR8突然変異体は37°Cでウイルス力価の低下が2.0log10以下であったが、それらのプラーク形態は33°Cの形態と相違していた。図18に示すように、各突然変異体のプラークサイズは33°CではPR8に比較して僅かしか減少しなかった。PR8-3sでは37°Cでプラークサイズの有意減少が観察され、PR8-4sでは更大幅な減少が観察された。PR8-1sは37°Cでプラークサイズが有意に減少しなかった。39°Cでは、PR8-3sとPR8-4sのいずれにも非常に小さいサイズのプラークが数個しか観察されなかった。PR8-1sにはwtPR8の約30のプラークサイズが観察された。突然変異体PR8ウイルスの弱毒をフェレットで試験した。要約すると、9-10週齢雄フェレットを使用して動物宿主の気道におけるウイルス複製を評価した。フェレットを1匹ずつ檻に入れ、ウイルス8.5log10pfuを鼻腔内接種した。感染から3日後にフェレットをケタミン-HCLで麻酔し、肺と鼻甲介NTを摘出した。肺組織ホモジネートを無菌希釈し、10日齢発育鶏卵で力価測定した。肺におけるウイルス力価log10EID50/mlをKarber法により計算した。NTにおけるウイルス複製をプラークアッセイにより測定し、log10pfu/mlとして表した。肺と鼻甲介におけるウイルス複製レベルをEID50又はプラークアッセイにより測定した表11。感染から3日後に、PR8は5.9log10EID50/g肺組織のレベルまで複製した。しかし、PR8-1sはフェレット肺の複製の3.0log10低下を示し、PR8-3には殆ど複製が検出されなかった。個々に得られたウイルスを感染させた2群で試験したPR8-4sでは全く複製が検出されなかった。EID50アッセイによるフェレット肺のウイルス検出限界は1.5log10であるので、PR8-4sに1.5log10EID50の力価を割当てた。対照として、MDV-Aはフェレット肺で複製せず、wtA/AA/6/60は力価4.4log10まで複製した。鼻甲介NTにおけるウイルス複製をMDCK細胞でプラークアッセイにより試験した。PR8は鼻で力価6.6log10pfu/gまで複製した。PR8-1sとPR8-3sではウイルス力価の僅かな低下しか観察されなかった。PR8-4sAでは2.2log10の低下が観察され、PB1遺伝子に変異E390GをもつPR8-4sBでは4.3log10の低下が観察された。PR8-4sBの大幅な複製低下は37°Cでのそのts表現型と良好に相関した。ここではMDV-A由来インフルエンザワクチンの弱毒表現型を評価するために通常使用した7.0log10pfuの代わりに8.5log10pfuの感染用量を使用した。この結果、MDV-Aに由来する4個のts遺伝子座をもつPR8はフェレットの下気道における複製で弱毒されたことが判明した。ts及びattアッセイの両者でPR8突然変異体ウイルスはMDV-Aと非常によく似たts及びatt表現型を示した。これらのデータから、MDV-Aのユニークアミノ酸置換を分岐インフルエンザウイルス株に導入すると、例えば生弱毒ワクチンの生産に望ましい温度感受性及び弱毒表現型を示すウイルスが得られると思われる。更にts,att,PR-8ウイルスは生弱毒又は不活化インフルエンザワクチンの生産にマスタードナーウイルスとして使用するのに適した高力価まで増殖した。これらの結果から、5種のMDV-A突然変異:PB1-391E,PB1-581G,PB1-661T,PB2-265S,及びNP-34Gは任意インフルエンザA株にts及びatt表現型を付与できると思われる。同様に、MDV-B株の突然変異をインフルエンザB株ウイルスに導入することによりワクチン生産に適した新規ts,attB株も生産できる。生弱毒ウイルスワクチンの生産に加え、これらの突然変異をドナー株に導入すると、より安全な不活化ワクチンを生産できると思われる。MDV-Bの生産用8プラスミドシステムRNeasyキットQiagen,Valencia,CAを使用して典型的インフルエンザBマスタードナー株MDV-BであるインフルエンザB/AnnArbor/1/66の低温適応変異体ca/MasterAnnArbor/1/66P1Aviron10/2/97に由来するウイルスRNAを感染発育鶏卵由来尿膜腔液100μlから抽出し、RNAをH2O40μlに溶出させた。1ステップRT-PCRキットQiagen,Valencia,CAを添付プロトコールに従って使用し、各反応に抽出RNA1μlを使用してゲノムセグメントのRT-PCRを実施した。RT反応は50分間50°Cの後に15分間94°Cで実施した。PCRは94°C1分、54°C1分、及び72°C3分を25サイクル実施した。BsmBI部位をもつセグメント特異的プライマーを使用してP遺伝子を増幅し、2個のフラグメントを作製した表12。インフルエンザ配列に相補的な配列を太字で示す。5‘末端は制限エンドヌクレアーゼBsmBIBm又はBsaIBaの認識配列をもつ。プラスミドのクローニング上述のようにPCRフラグメントを単離し、BsmBI又はNPはBsaIで消化し、pAD3000アンチセンスvRNA及びセンスmRNAの転写を可能にするpHW2000の誘導体のBsmBI部位に挿入した。得られたプラスミド各2~4個を配列決定し、RT-PCRフラグメントの直接配列決定に基づくMDV-Bのコンセンサス配列と比較した。コンセンサス配列と相異するアミノ酸変異をもたらすヌクレオチド置換をもつプラスミドをプラスミドのクローニング又はQuikchangeキットStratagene,LaJolla,CAの使用により修復した。得られたB/AnnArbor/1/66プラスミドをpAB121-PB1,pAB122-PB2,pAB123-PA,pAB124-HA,pAB125-NP,pAB126-NA,pAB127-M,及びpAB128-NSと命名した。この両方向転写システムを使用して全ウイルスRNA及び蛋白質を細胞内で産生させると、感染性インフルエンザBウイルスが作製される図4。コンセンサス配列に比較してpAB121-PB1とpAB124-HAは2個、pAB128-NSは1個のサイレントヌクレオチド置換をもつことに注目すべきである表13。これらのヌクレオチド置換はアミノ酸変異を生じず、ウイルス増殖とレスキューに影響しないと予想される。これらのサイレント置換は組換えウイルスのゲノタイピングを容易にするために維持されている。PA,NP及びM1遺伝子にヌクレオチド置換をもつプラスミドを構築するために、プラスミドpAB123-PA,pAB125-NP,pAB127-Mを鋳型として使用した。ヌクレオチドをQuikchangeキットStratagene,LaJolla,CAにより置換した。あるいは、所望突然変異を含むプライマーを使用して2個のフラグメントをPCR増幅し、BsmBIで消化し、3フラグメントライゲーション反応でpAD3000-BsmBIに挿入した。作製されたプラスミドを配列決定し、cDNAが不要な突然変異を含んでいないことを確かめた。ローダミン又はジクロロローダミン色素ターミネーターサイクルシーケンシングレディ反応キットとAmpliTaq登録商標DNAポリメラーゼFSPerkin-ElmerAppliedBiosystems,Inc,FosterCity,CAを使用して鋳型DNAの配列を決定した。サンプルを電気泳動により分離し、PE/ABIモデル373、モデル373Stretch、又はモデル377DNAシーケンサーで分析した。別実験で、増幅を94°C30秒、54°C30秒、及び72°C3分の25サイクルで実施した以外はMDV-B株について上述したようにインフルエンザB/Yamanshi/166/98に由来するウイルスRNAを増幅し、pAD3000にクローニングした。NP及びNAセグメントの増幅に夫々以下のプライマー:MDV-B5 ́BsmBI-NP:TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGTG配列番号75及びMDV-B3 ́BsmBI-NP:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACAGCATTTTTTAC配列番号76とBm-NAb-1:TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCA配列番号77及びBm-NAb-1557R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTT配列番号78を使用した以外はB/Yamanashi/166/98株セグメントの増幅にも同一のプライマーを使用した。B/Yamanashi/166/98プラスミドをAB251-PB1,pAB252-PB2,pAB253-PA,pAB254-HA,pAB255-NP,pAB256-NA,pAB257-M,及びpAB258-NSと命名した。組換え及びリアソータントB/Yamanashi/166/98ウイルスのPA助長ゲノタイピングで3個のサイレントヌクレオチド変異が同定された。感染性組換えインフルエンザB及びリアソータントインフルエンザウイルスの作製ヘルパーフリーウイルス細胞培養システムでインフルエンザBを増殖させようとする際に遭遇する問題を解決するために、本発明は組換え及びリアソータントB株インフルエンザウイルスの生産用新規ベクターとプロトコールを提供する。インフルエンザBウイルスのレスキューに使用されるベクターシステムはインフルエンザAウイルスの作製に開発されたシステムに基づくHoffmannら2000ADNAtransfectionsystemforgenerationofinfluenzaAvirusfromeightplasmidsProcNatlAcadSciUSA97:6108-6113;HoffmannWebster2000UnidirectionalRNApolymeraseI-polymeraseIItranscriptionsystemforthegenerationofinfluenzaAvirusfromeightplasmidsJGenVirol81:2843-7。293T細胞は5FBS細胞を添加したOptiMEMI-AB培地に維持し、COS-7細胞は10FBSを添加したDMEMI-A培地に維持して293T又はCOS-7細胞トランスフェクション効率とpolI活性の高い霊長類細胞をMDCK細胞インフルエンザウイルスに許容可能と共培養した。MDCK細胞は抗生物質と抗カビ剤を添加した1×MEM,10FBSに維持した。ウイルスゲノムベクターのトランスフェクションに先立ち、細胞をPBS又はFBS非添加培地5mlで1回洗浄した。75cm2フラスコでコンフルエント細胞にトリプシン-EDTA10mlを加えたMDCK細胞は20~45分間インキュベートし、293T細胞は1分間インキュベートした。細胞を遠心し、OptiMEMI-AB10mlに再懸濁した。次に各懸濁細胞株1mlをOptiMEMI-AB18mlで希釈し、混合した。次に細胞3ml/ウェルを6ウェルプレートに分注した。6~24時間後に各プラスミド1μgを1.5mlエッペンドルフチューブでOptiMEMI-ABと混合したxμlプラスミドxμlOptiMEMI-ABxμlTransIT-LT1=200μl;プラスミドDNAμg当たり2μlTransIT-LT1。混合物を室温で45分間インキュベートした。次にOptiMEMI-AB800μlを加えた。培地を細胞から除去し、トランスフェクション混合物を細胞t=0に33°Cで6~15時間加えた。トランスフェクション混合物を細胞からゆっくりと除去し、OptiMEMI-AB1mlを加え、細胞を33°Cで24時間インキュベートした。トランスフェクションから48時間後に1μg/mlTPCK-トリプシンを添加したOptiMEMI-AB1mlを細胞に加えた。トランスフェクションから96時間後に1μg/mlTPCK-トリプシンを添加したOptiMEMI-AB1mlを細胞に加えた。トランスフェクション後4日~7日の間に細胞培養上清1mlを回収し、HA又はプラークアッセイによりモニターした。要約すると、上清1mlをエッペンドルフチューブに分注し、5000rpmで5分間遠心した。上清900μlを新しいチューブに移し、例えば12ウェルプレートでMDCK細胞に500μl/ウェルで系列希釈を実施した。上清を細胞と共に1時間インキュベートした後に除去し、1μg/mlTPCK-トリプシンを添加した感染培地1xMEMに交換した。次にHAアッセイ又はプラークアッセイを実施した。例えば、プラークアッセイでは0.8アガロースゲルを重層して3日間33°CでインキュベートしたMDCK細胞で上清の力価を測定した。鶏卵に感染させるために、トランスフェクションから6又は7日後にトランスフェクト細胞の上清を回収し、Opti-MEMI中ウイルス希釈液100μlを11日齢発育鶏卵に33°Cで注入した。インキュベーションから3日後にMDCK細胞でTCID50アッセイにより力価を測定した。MDV-Bを作製するために、共培養293T-MDCK又はCOS-7-MDCK細胞に各プラスミド1μgをトランスフェクトした。トランスフェクションから5~7日後に試験した処、共培養MDCK細胞は細胞変性効果CPEを示し、クローン化cDNAから感染性MDV-Bウイルスが作製されたことが分かった。7種のプラスミドをトランスフェクトした細胞ではCPEは観察されなかった表14。ウイルス作製用DNAトランスフェクションシステムの効率を測定するために、トランスフェクションから7日後に細胞の上清をMDCK細胞で力価測定し、プラークアッセイによりウイルス力価を測定した。共培養293T-MDCKの上清のウイルス力価は5.0×106pfu/mlであり、COS7-MDCK細胞では7.6×106pfu/mlであった。一過的共培養293T-MDCK1,2又は共培養COS7-MDCK細胞3,4に7又は8種のプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから7日後に共培養MDCK細胞で細胞変性効果CPEをモニターした。トランスフェクションから7日後にトランスフェクト細胞の上清をMDCK細胞で力価測定した。pfu/mlのデータは複数例えば3又は4回のトランスフェクション実験の平均を表す。B/Yamanashi/166/98プラスミドベクターを使用したトランスフェクション実験でも同等の結果が得られた。これらの結果は、トランスフェクションシステムが8種のプラスミドからインフルエンザBウイルスを再現可能にdenovo作製できることを示す。組換えインフルエンザBのゲノタイピングMDCK細胞で後続継代後に感染細胞の上清のRT-PCRを使用し、作製されたウイルスの信憑性を確認した。RT-PCRは全8種のセグメントにセグメント特異的プラスミドを使用して実施した表12。図5Aに示すように、全セグメントでPCR産物が作製された。PB1,HA,及びNSセグメントのPCR産物の直接シーケンシングの結果、分析した4種のヌクレオチドはプラスミドpAB121-PB1,pAB124-HA,及びpAB128-NSに存在するものと同一であることが判明した。これらの結果から、作製されたウイルスは所期プラスミドから作製され、陰性対照に加えて親ウイルスによる実験室汚染の可能性がないことが確認された図5B。同様に、B/Yamanashi/166/98プラスミドベクターのトランスフェクション後にウイルスを回収し、PAセグメントのヌクレオチド1280-1290を含む領域を増幅した。シーケンシングの結果、回収したウイルスはプラスミド由来組換えB/Yamanashi/166/98に対応することが確認された図5C及びD。rMDV-BのフェノタイピングMDV-Bウイルスは温度感受性tsと低温適応caの2つの特徴的表現型を示す。定義によると、tsは33°Cに比較した37°Cのウイルス力価の差が2log以上として定義され、caは33°Cに比較した25°Cのウイルス増殖の差が2log未満として定義される。初代ニワトリ腎PCK細胞に親ウイルスMDV-Bとプラスミド由来トランスフェクトウイルスを感染させ、3種の温度でウイルス増殖を測定した。プラークアッセイでは、6ウェルプレートでコンフルエントMDCK細胞ECACCを使用した。ウイルス希釈液を30~60分間33°Cでインキュベートした。細胞に0.8アガロースを重層した。感染細胞を33°C又は37°Cでインキュベートした。感染から3日後に細胞を0.1クリスタルバイオレット溶液で染色し、プラーク数を測定した。ca-ts表現型アッセイは25、33、及び37°CでウイルスサンプルのTCID50力価測定により実施した。このアッセイフォーマットは96ウェル細胞培養プレートで各種温度25°C,33°C,37°Cにて初代ニワトリ腎細胞単層に及ぼすインフルエンザウイルスの細胞変性効果CPEを試験することによりTCID50力価を測定する。このアッセイは温度及びウイルス株と共に変化するプラーク形態に非依存性であり、インフルエンザウイルスが複製してCPEを誘導する能力のみに依存する。一次組織のトリプシン処理により調製した初代ニワトリ腎PCK細胞懸濁液を5FCS添加MEMアール培地に再懸濁した。PCK細胞を96ウェル細胞培養プレートに48時間播種して>90コンフルエントの単層を作製した。48時間後に表現型アッセイ培地PAMと呼ぶ5mML-グルタミン、抗生物質、非必須アミノ酸を添加した無血清MEM培地でPCK細胞単層を1時間洗浄した。PAMを加えた96ウェルブロックでウイルスサンプルの系列10倍希釈液を調製した。希釈したウイルスサンプルを次に96ウェルプレートの洗浄後のPCK単層にプレーティングした。ウイルスサンプルの各希釈液でウェル6個ずつを使用して希釈ウイルスを感染させた。細胞対照として未希釈細胞も各サンプルにつき6ウェルずつ試験した。各ウイルスサンプルを2~4回ずつ力価測定した。25°C、33°C、及び37°Cで予め測定した力価をもつ表現型対照ウイルスも各アッセイに加える。ウイルスサンプルのts表現型を測定するために、プレートを33°Cと37°Cにて5CO2細胞培養インキュベーターで6日間インキュベートした。ca表現型特性決定については、プレートを25°Cで10日間インキュベートした。ウイルス力価をKarber法により計算し、Log10平均n=4TCID50力価/ml標準偏差として報告した。図1~3に示すウイルス力価の標準偏差は0.1~0.3であった。33°Cと37°Cのウイルス力価の差を使用してts表現型を測定し、ウイルスの25°Cと33°Cの力価の差を使用してca表現型を測定した。プラスミド由来組換えMDV-BrecMDV-Bウイルスは予想通り、細胞培養でcaとtsの2種類の特徴的表現型を発現した。25°Cの効率的複製に相当するca表現型はPCK細胞でアッセイした場合に25°Cと33°Cで2log10以下の力価の差として機能的に測定される。親MDV-Bと組換えMDV-Bはいずれもcaを発現し、25°Cと33°Cの差は夫々0.3及び0.4log10であった表15。ts表現型もPCK細胞で2種の温度の力価を観察することにより測定されるが、この表現型では、37°Cの力価が33°Cの力価よりも2log10以上低くなければならない。親MDV-Bと組換えMDV-Bの33°Cと37°Cの差は夫々3.4及び3.7log10であった表15。従って、組換えプラスミド由来MDV-Bウイルスはca及びts表現型の両者を発現した。組換えウイルスの力価は33°Cで7.0log10TCID50/mlであり、37°Cで3.3TCID50/mlであり、25°Cで8.8log10TCID50/mlであった表15。従って、8種のインフルエンザMDV-Bゲノムセグメントプラスミドのトランスフェクションに由来する組換えウイルスはca及びts表現型の両者をもつ。リアソータントB/Yamanashi/166/98ウイルスの生産インフルエンザBの主要系統に相当する数種の異なる株のHA及びNAセグメントをほぼ上述のように増幅し、pAD3000にクローニングした。プライマーはHA及びNAセグメントの同時RT-PCR増幅に最適化させた。セグメント4HAとセグメント6NB/NAの非コーディング領域に相当するvRNAの末端領域を比較した結果、5’末端の20個の末端ヌクレオチドと3’末端の15ヌクレオチドがインフルエンザBウイルスのHA及びNA遺伝子間で一致していることが判明した。RT-PCR用プライマー対下線配列はインフルエンザBウイルス特異的であるBm-NAb-1:TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCA配列番号79;Bm-NAb-1557R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTT配列番号80を合成及び使用してHA及びNA遺伝子を種々のインフルエンザB株から同時に増幅した図8。B/Victoria/504/2000,B/Hawaii/10/2001,及びB/HongKong/330/2001のHA及びNAPCRフラグメントを単離し、BsmBIで消化し、pAD3000に挿入した。これらの結果、これらのプライマーはインフルエンザBの主要系統に相当する数種の異なる野生型ウイルスに由来するインフルエンザBHA及びNA遺伝子を含むプラスミドの効率的な作製に適用できることが立証された。RT-PCR産物はシーケンシング及び/又は発現プラスミドへのクローニングに使用することができる。種々のインフルエンザB系統から抗原を効率的に発現させるためにB/Yamanashi/166/98B/Yamagata/16/88様ウイルスを利用できることを立証するために、B/Yamanashi/166/98に由来するPB1,PB2,PA,NP,M,NSとVictoria及びYamagata系統の両者に相当する株に由来するHA及びNAを含むリアソータント62リアソータントを作製した。上記方法に従い、B/Yamanashi/166/98に相当する6種のプラスミドと、B/Victoria/2/87系統に由来する2株B/HongKong/330/2001及びB/Hawaii/10/2001とB/Yamagata/16/88系統に由来する1株B/Victoria/504/2000のHA及びNAセグメントのcDNAを含む2種のプラスミドを一過的共培養COS7-MDCK細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションから6~7日後に上清を新鮮なMDCK細胞で力価測定した。全3種の62リアソータントウイルスの力価は4~9×106pfu/mlであった表16。これらのデータから、B/Yamanashi/166/98の6個の内部遺伝子は両者インフルエンザB系統に由来するHA及びNA遺伝子セグメントと共に感染性ウイルス効率的に形成できることが立証された。トランスフェクションから6又は7日後に共培養COS7-MDCK細胞の上清を力価測定し、MDCK細胞でプラークアッセイによりウイルス力価を測定した。鶏卵で野生型B/Yamanashi/166/98の複製により比較的高力価が得られた。この特性がこのウイルスの6個の内部遺伝子の固有表現型であるか否かを調べるために実験を行った。この特性を評価するために、鶏卵で中度にしか複製しなかった野生型B/Victoria/504/2000の効率と、B/Victoria/504/2000HA及びNAを発現する62リアソータントの効率を比較した。これらのウイルスを野生型及び組換えB/Yamanashi/166/98に加えて各々3又は4個の発育鶏卵に100又は1000pfuで接種した。感染から3日後に尿膜腔液を鶏卵から回収し、TCID50力価をMDCK細胞で測定した。62リアソータントはwt及び組換えB/Yamanashi/166/98株と同等量のウイルスを尿膜腔液に産生した図9。B/Victoria/504/2000と62組換え体の力価の差は約1.6log10TCID500.7~2.5log10TCID50/mL,95CIであった。B/Victoria/504/2000と62組換え体の差を3回の別個の実験で確認したP<0.001。これらの結果から、鶏卵での複製が不良な株から通常発現されるHA及びNA抗原にB/Yamanashi/166/98の鶏卵増殖特性を付与できることが立証された。caB/AnnArbor/1/66の弱毒の分子基盤MDV-BウイルスcaB/AnnArbor/1/66はヒトで弱毒されており、フェレットで弱毒表現型を示し、細胞培養で低温適応及び温度感受性表現型を示す。BLAST検索アルゴリズムを使用してMDV-Bの内部遺伝子の推定アミノ酸配列をLosAlamosインフルエンザデータベースワールドワイドウェブ:flu.lanl.govの配列と比較した。他の株には存在しないMDV-Bにユニークな8個のアミノ酸が同定された表17。PB1,BM2,NS1,及びNS2をコードするゲノムセグメントはユニーク置換残基を示さない。PA及びM1蛋白質は各々2個、NP蛋白質は4個のユニーク置換アミノ酸をもつ表17。PB2には630位に1個の置換アミノ酸が存在する付加株B/Harbin/7/94AF170572も630位にアルギニン残基をもつ。これらの結果は、遺伝子セグメントPB2,PA,NP及びM1がMDV-Bの弱毒表現型に関与していることを示唆している。MDV-Aについて上述したと同様に、8プラスミドシステムを使用してMDV-Aについて上述したようにヘルパーに依存せずに単に該当プラスミドを培養細胞にコトランスフェクトするだけで組換え及びリアソータント単一及び/又は二重、即ち7:1;6:2リアソータントを作製することができる。例えば、B/Lee/40に由来する6個の内部遺伝子をMDV-Bに由来するHA及びNAセグメントと併用して62リアソータントを作製することができる。8個のユニークアミノ酸変異が特徴的MDV-B表現型に影響を与えるか否かを調べるために、全8個のヌクレオチド位置がwtインフルエンザ遺伝子相補体を表すアミノ酸をコードする組換えウイルスを構築した。表17に示すように野生型アミノ酸を表すようにPA,NP,及びM1遺伝子の8個の残基を部位特異的突然変異誘発により変異させた1組のプラスミドを構築した。構築したプラスミドを共培養COS7-MDCK細胞にコトランスフェクトすることにより全8個の変異をもつ組換え体rec53-MDV-Bを作製した。MDCK細胞の共培養と33°Cでの増殖により、トランスフェクションから6~7日後に上清が高ウイルス力価を含むように確保した。トランスフェクト細胞の上清を力価測定し、MDCK細胞ではプラークアッセイにより力価を測定し、PCK細胞では33°Cと37°Cで力価を測定した。図13に示すように、2回の別個の独立した実験で、recMDV-BはMDCK細胞とPCK細胞の両者でts表現型を発現した。全8個のアミノ酸変異をもつようにデザインした三重リアソータントウイルスrec53-MDV-Bは非ts表現型を発現し、33°Cと37°Cの力価の差はPCK細胞で0.7log10しかなかった。力価はts定義の特徴である必要な2log10差のよりも低く、recMDV-Bで観察される~3log10の差よりも有意に低かった。これらの結果は、PA,NP,及びM1蛋白質内の8個のアミノ酸の変異が相同及び異種の両者の糖蛋白質を使用して非ts野生型様ウイルスを作製するのに十分であることを示している。次に各遺伝子セグメントのts表現型への関与を調べた。PA,NP,又はM遺伝子セグメントと野生型アミノ酸相補体をもつプラスミド由来組換え体をDNAコトランスフェクション法により作製した。全単一遺伝子組換え体はMDCK細胞とPCK細胞で37°Cの増殖制限を示し図14、遺伝子セグメントの変異によりts表現型を復帰変異させることができないと思われた。更に、NP及びM又はPA及びM遺伝子セグメントを併有する組換えウイルスもts表現型を維持した。他方、PA及びNP遺伝子セグメントを併有する組換えウイルスはrec53-MDV-Bと同様に37°Cと33°Cの力価の差が2.0log10以下であった。これらの結果は、NP及びPA遺伝子が主にts表現型に関与することを示している。NP蛋白質の4個のアミノ酸とPA蛋白質の2個のアミノ酸の全てが非tsに関与しているか否かを調べるために、NP遺伝子とPA遺伝子が変異した三重遺伝子及び二重遺伝子組換え体を作製した図15。2個のアミノ酸の置換A114→V114及びH410→P410の結果として非ts表現型となった。ヌクレオプロテインに単一置換H410→P410をもつウイルスはMDCKとPCKで非ts表現型を示した。他方、単一置換A55→T55はts表現型を示した。これらの結果から、NPのP410が37°Cでの効率的増殖に関与していると思われる。これらの結果はPA及びNPの6個のアミノ酸から4個の残基が非ts表現型に関与していることを示す。従来のデータによると、ts表現型と弱毒表現型は高度に相関している。caB/AnnArbor/1/66ウイルスは感染フェレットの肺組織で検出てきないが、鼻腔内感染後に非弱毒インフルエンザBウイルスが肺で検出可能であることはよく知られている。ts及びatt表現型も同一突然変異に基づくのか否かを調べるために、以下の試験を実施した。トランスフェクション後に得られた組換えウイルスを発育鶏卵で継代し、ウイルスストックを作製した。9週齢フェレットに各鼻腔0.5mlのウイルスを力価5.5、6.0又は7.0log10pfu/mlで鼻腔内接種した。感染から3日後にフェレットを屠殺し、その肺と鼻甲介を上述のように試験した。フェレット各群4匹にrecMDV-B又はrec53-MDV-Bを鼻腔内感染させた。ウイルス感染から3日後に鼻甲介と肺組織を摘出し、ウイルスの存在を試験した。7.0log10pfurecMDV-Bを感染させたフェレットの肺組織にウイルスは検出されなかった。rec53-MDV-Bウイルスを力価7.0log10pfuで感染させた4匹のうち3匹から肺組織にウイルスが検出されたこの群の1匹の原因は不明。rec53-MDV-Bを低用量5.5logpfu/mlで感染させた4匹の肺組織のうち2匹で肺組織からウイルスを単離することができた。従って、PA,NP,及びM1蛋白質の8種のユニークアミノ酸の野性型残基への変異はatt表現型を非att表現型に変換するために十分であった。細胞培養データによるとPAとNPがts表現型の要因であることがわかったので、第2の実験では、rec53-MDV-BPA,NP,M、rec62-MDV-BPA、NPrec71-MDV-BNPを6logpfuでフェレットに感染させた。rec53-MDV-Bを感染させた4匹のうちの2匹が肺にウイルスをもっていた。単一及び二重リアソータントウイルスを感染させたフェレットの肺組織のうちでウイルスレベルが検出可能なものは皆無であった。従って、PA及びNP蛋白質のアミノ酸に加え、M1蛋白質もatt表現型に重要である。wtPA及びNPをもつウイルスはフェレット肺で複製せず、弱毒に関与する突然変異のサブセットがts表現型に関与することが示唆された。従って、B/AnnArbor/1/66のts表現型は最大3種の遺伝子により決定される。PA,NP,及びM1蛋白質の8個のアミノ酸が野性型残基に変換すると、37°Cで効率的に複製する組換えウイルスが得られた。同様に、MDV-Bの6個の内部遺伝子とB/HongKong/330/01に由来するHA及びNAセグメントに相当する62組換えウイルスはts表現型を示し、三重組換え体は非tsであった。インフルエンザA株について上述したように、上記残基の置換、例えばPB2630S630R、PA431V431M、PA497Y497H、NP55T55A、NP114V114A、NP410P410H、NP510A510T、M1159H159Q及びM1183M183Vはts及びatt表現型を付与する。従って、これらのアミノ酸置換の1個以上をもつインフルエンザB株の人工構築変異体はts及びatt表現型を示し、弱毒生インフルエンザウイルスワクチンの生産で例えばマスタードナー株ウイルスとして使用するのに適している。Vero細胞のエレクトロポレーションによる8種のプラスミドからのインフルエンザのレスキュー組換えインフルエンザAをVero細胞からレスキューできることは従来示唆されているFodorら1999RescueofinfluenzaAvirusfromrecombinantDNAJ.Virol.73:9679-82;Hoffmannら2002Eight-plasmidsystemforrapidgenerationofinfluenzavirusvaccineVaccine20:3165-3170。報告されている方法は脂質試薬を使用する必要があり、インフルエンザAの高度複製コンピテント実験室株の単一株A/WSN/33及びA/PR/8/34についてしか立証しておらず、ワクチン生産に適した生弱毒ウイルスの生産では適用が限られている。本発明はエレクトロポレーションを使用してVero細胞から組換えインフルエンザウイルスを回収するための新規方法を提供する。これらの方法はインフルエンザA及びインフルエンザB株両者のウイルスの生産に適しており、例えば鼻腔内ワクチン製剤で投与するのに適した生弱毒ワクチンの製造を容易にする無血清条件下で増殖させたVero細胞から例えば低温適応、温度感受性、弱毒ウイルスを回収することができる。エレクトロポレーションはウイルス株に広く適用できることに加え、細胞基質用増殖培地以外の付加的試薬を必要としないので望ましくない汚染の危険が少ない。特に、この方法は無血清条件下での増殖に適したVero細胞例えば病原体フリーとみなされるワクチン生産に適切なVero細胞単離体を使用して組換え及びリアソータントウイルスを作製するのに有効である。この特徴により、DNAを細胞基質に商業的に導入するのに適した方法としてエレクトロポレーションを選択することができる。多数の脂質試薬を使用するトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法及び細胞マイクロインジェクション等のDNAをVero細胞に導入するための種々の方法にエレクトロポレーションを比較した。インフルエンザAのレスキューに脂質試薬を使用した場合にはある程度成果が得られたが、インフルエンザAだけでなくインフルエンザBもVero細胞からレスキューすることが実証されたのはエレクトロポレーションのみであった。エレクトロポレーションの1日前に90~100コンフルエントVero細胞を分割し、ペニシリン/ストレプトマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸及び10FBSを添加したMEMMEM,10FBS中にT225フラスコ当たり細胞9×106個の密度で播種した。翌日、細胞をトリプシン処理し、T225フラスコ当たり50mlのリン酸緩衝食塩水PBSに再懸濁した。次に細胞をペレット化し、T225フラスコ当たり0.5mlのOptiMEMIに再懸濁した。場合により、ヒト又は動物由来成分を含まない特注OptiMEM培地を使用してもよい。例えば血球計で40倍希釈液をカウントすることにより細胞密度を測定後、細胞5×106個を0.4cmエレクトロポレーションキュベットにOptiMEMI最終容量400μlで加えた。次にMDV-A又はMDV-Bゲノムを組込んだ容量25μl以下の8種のプラスミドの等モル混合物から構成されるDNA20μgをキュベット内の細胞に加えた。細胞をタッピングにより温和に混合し、BioRadGenePulserIIにCapacitanceExtenderPlusBioRad,Hercules,CAを接続して300V、950μFでエレクトロポレーションした。時定数は28~33msecの範囲にすべきである。キュベットの内容物をタッピングにより温和に混合し、エレクトロポレーションから1~2分後にMEM,10FBS0.7mlを1mlピペットで加えた。ピペットを数回上下させることにより細胞を再び温和に混合した後、MEM,10FBS2ml/ウェルを加えた6ウェル皿の2個のウェルに分割した。次にキュベットをMEM,10FBS1mlで洗浄し、2個のウェルに分割し、最収容量約3.5ml/ウェルとした。代替実験では、例えばOptiProSFMInvitrogen,Carlsbad,CA中でVero細胞を無血清増殖条件に適応させ、OptiMEMI中でエレクトロポレーション後に細胞をOptiProSFMで希釈した後、ウイルスレスキューのために培養した以外は上述のようにエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を次に、導入したウイルスの複製と回収に適した条件下即ち低温適応マスタードナー株には33°Cで培養した。翌日例えばエレクトロポレーションから約19時間後、培地を除去し、細胞をOptiMEMI又はOptiProSFM3ml/ウェルで洗浄した。ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したOptiMEMI又はOptiProSFM1ml/ウェルを各ウェルに加え、培地を交換することにより上清を毎日採取した。上清を-80°CでSPGに保存した。ピークウイルス生産は一般にエレクトロポレーションから2~3日後に観察された。遺伝子送達用インフルエンザウイルスベクターシステム本発明のベクターは遺伝子送達システムとして遺伝子治療用にも使用することができる。このような用途には、組換えインフルエンザウイルス、例えば外来蛋白質を発現する組換えインフルエンザA又はBを作製することが望ましい。例えば、インフルエンザBウイルスのセグメント7はスプライスされないので、異種核酸配列の挿入に好都合な遺伝子エレメントとなる。mRNAはM1及びBM2蛋白質をコードする2個のオープンリーディングフレームをもつ2個のシストロンを含む。BM2又はM1のオープンリーディングフレームを目的異種核酸、例えば強化緑色蛍光蛋白質EGFPをコードする遺伝子で置換する。本発明のプラスミドベクターシステムを使用して、M1-EGFPのオープンリーディングフレームをコードするcDNAとBM2を2種の異なるプラスミドにクローニングする。オープンリーディングフレームは複製と転写に必要なシグナルを含むセグメント7の非コーディング領域の間に挿入する。あるいは、一方がM1ORFを含み、他方がEGFP-BM2を含む2種のプラスミドを構築する。得られた9種のプラスミドのコトランスフェクションの結果、異種遺伝子配列を含む組換えインフルエンザBウイルスが作製される。同様に、インフルエンザAのNS1セグメントからEGFPを発現させることができる。典型的緑色インフルエンザBウイルスは微量中和アッセイ等のウイルスアッセイで標準化に使用することができる。プラスミド技術と蛋白質発現の単純な検出図2に示すように、EGFPに由来する蛍光をモニターすることができるを組合せることにより、蛋白質発現を最適化することができる。以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。"