"インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物であって、脂質ベシクルが約50:1~約400:1の範囲内の脂質:抗原重量比を達成する量で組成物中に存在する脂質からなり、脂質が非イオン性界面活性剤を含む、組成物。免疫原性である、請求項1に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物であって、脂質ベシクルが少なくとも約50:1の脂質:抗原重量比を達成する量で組成物中に存在する脂質からなり、脂質が非イオン性界面活性剤を含む、組成物。液体である、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。乾燥している、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む乾燥組成物であって、脂質ベシクルが少なくとも約30:1の脂質:抗原重量比を達成する量で組成物中に存在する脂質からなり、脂質が非イオン性界面活性剤を含み、組成物の水分含量が約2重量未満である、組成物。脂質:抗原重量比が少なくとも約100:1である、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。脂質:抗原重量比が少なくとも約200:1である、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。脂質:抗原重量比が少なくとも約250:1である、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。脂質:抗原重量比が約350:1未満である、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。脂質:抗原重量比が約250:1~約350:1の範囲内である、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。脂質:抗原重量比が約300:1である、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。40°Cで6ヶ月間貯蔵した場合、HAIアッセイによって決定される免疫原性の50未満の変化を示す、請求項1~12のいずれか一項に記載の組成物。免疫原性の10未満の変化を示す、請求項13に記載の組成物。40°Cで6ヶ月間貯蔵した場合、ELISAによって決定される抗原含量の50未満の減少を示す、請求項1~12のいずれか一項に記載の組成物。抗原含量の10未満の減少を示す、請求項15に記載の組成物。40°Cで6ヶ月間貯蔵した場合、脂質ベシクルのない参照組成物よりも安定である、請求項1~16のいずれか一項に記載の組成物。安定性がHAIアッセイによって決定される免疫原性に基づく、請求項17に記載の組成物。安定性がELISAによって決定される抗原含量に基づく、請求項17に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記組成物が、40°Cで6ヶ月間貯蔵した場合、HAIアッセイによって決定される免疫原性の50未満の変化を示す、組成物。免疫原性の10未満の変化を示す、請求項20に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記組成物が、40°Cで6ヶ月間貯蔵した場合、ELISAによって決定される抗原含量の50未満の減少を示す、組成物。抗原含量の10未満の減少を示す、請求項22に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記組成物が、40°Cで6ヶ月間貯蔵した場合、脂質ベシクルのない参照組成物よりも安定である、組成物。安定性がHAIアッセイによって決定される免疫原性に基づく、請求項24に記載の組成物。安定性がELISAによって決定される抗原含量に基づく、請求項24に記載の組成物。脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約50:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、方法によって調製される、請求項1~26のいずれか一項に記載の組成物。溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える、請求項27に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える、請求項27に記載の組成物。脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約10mg/mlの脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる、方法によって調製される、請求項1~29のいずれか一項に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約10mg/ml~約100mg/mlの範囲の脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる、請求項30に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記組成物が、脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約50:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、方法によって調製される、組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約100:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項32に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約200:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項32に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約250:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項32に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約400:1未満の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項32に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約350:1未満の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項32に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約250:1~約350:1の範囲内の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項32に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約300:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項32に記載の組成物。溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える、請求項32~39のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える、請求項32~39のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記組成物が、脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約10mg/mlの脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる、方法によって調製される、組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約10mg/ml~約100mg/mlの範囲の脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる、請求項42に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約50:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項42又は43に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約100:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項44に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約200:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項44に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約250:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項44に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約400:1未満の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項44に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約350:1未満の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項44に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約250:1~約350:1の範囲内の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項44に記載の組成物。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約300:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項44に記載の組成物。溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える、請求項42~51のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える、請求項42~51のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原がインフルエンザA型H1N1株由来である、請求項1~53のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原がインフルエンザA型H3N2株由来である、請求項1~53のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原がインフルエンザB型株由来である、請求項1~53のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原が、インフルエンザA型H1N1株、インフルエンザA型H3N2株、及びインフルエンザB型株の2種以上由来である、請求項1~53のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原が、インフルエンザA型H1N1株、インフルエンザA型H3N2株、及びインフルエンザB型株由来である、請求項1~53のいずれか一項に記載の組成物。各株由来のほぼ等量のインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む、請求項58に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む1つ又は複数の不活化インフルエンザウイルスを含む、請求項1~59のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む1つ又は複数の弱毒化インフルエンザウイルスを含む、請求項1~59のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原がウイルス成分抗原として組成物中に存在する、請求項1~59のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原がサブユニット抗原として組成物中に存在する、請求項1~59のいずれか一項に記載の組成物。非イオン性界面活性剤がエステル連結している界面活性剤である、請求項1~63のいずれか一項に記載の組成物。非イオン性界面活性剤がグリセロールエステルである、請求項64に記載の組成物。非イオン性界面活性剤が1-モノパルミトイルグリセロールである、請求項64に記載の組成物。非イオン性界面活性剤がエーテル連結している界面活性剤である、請求項1~63のいずれか一項に記載の組成物。非イオン性界面活性剤がグリコール又はグリセロールモノエーテルである、請求項67に記載の組成物。非イオン性界面活性剤が1-モノセチルグリセロールエーテル又はジグリコールセチルエーテルである、請求項67に記載の組成物。脂質がイオン性両親媒性物質をさらに含む、請求項1~69のいずれか一項に記載の組成物。イオン性両親媒性物質がジセチルホスフェートである、請求項70に記載の組成物。脂質がステロイドをさらに含む、請求項1~71のいずれか一項に記載の組成物。ステロイドがコレステロールである、請求項72に記載の組成物。脂質が、非イオン性界面活性剤、イオン性両親媒性物質、及びステロイドを含む、請求項1~73のいずれか一項に記載の組成物。脂質が、1-モノパルミトイルグリセロール、ジセチルホスフェート、及びコレステロールを含む、請求項1~73のいずれか一項に記載の組成物。組成物中に存在するインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原の少なくとも一部分が脂質ベシクルと会合している、請求項1~75のいずれか一項に記載の組成物。組成物中に存在するインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原の少なくとも一部分が、脂質ベシクル内に捕捉されている、請求項1~75のいずれか一項に記載の組成物。アジュバントをさらに含む、請求項1~77のいずれか一項に記載の組成物。アジュバントがTLR-4アゴニストを含む、請求項78に記載の組成物。アジュバントが弱毒化リピドA誘導体を含む、請求項79に記載の組成物。アジュバントがリピドAのモノホスホリル誘導体を含む、請求項79に記載の組成物。アジュバントがリピドAの3-デアシルモノホスホリル誘導体を含む、請求項79に記載の組成物。アジュバントがTLR-7/8アゴニストを含む、請求項78に記載の組成物。アジュバントがTLR-9アゴニストを含む、請求項78に記載の組成物。組成物中に存在するアジュバントの少なくとも一部分が脂質ベシクルと会合している、請求項78~84のいずれか一項に記載の組成物。組成物中に存在するアジュバントの少なくとも一部分が脂質ベシクルと会合していない、請求項78~84のいずれか一項に記載の組成物。脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含み、アジュバントを脂質と一緒に融解する、方法によって調製される、請求項78~84のいずれか一項に記載の組成物。脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含み、アジュバントを溶融脂質、及びインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせる、方法によって調製される、請求項78~84のいずれか一項に記載の組成物。脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化し、次いで乾燥するステップとを含み、アジュバントを、乾燥ステップの前に、得られる生成物に加える、方法によって調製される、請求項78~84のいずれか一項に記載の組成物。温度制御条件下で組成物を貯蔵することを伴わない方法によって調製された、請求項1~89のいずれか一項に記載の組成物。少なくとも一時的に8°Cを超える温度で組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製された、請求項1~89のいずれか一項に記載の組成物。少なくとも一時的に15°Cを超える温度で組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製された、請求項1~89のいずれか一項に記載の組成物。少なくとも一時的に20°Cを超える温度で組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製された、請求項1~89のいずれか一項に記載の組成物。少なくとも一時的に25°Cを超える温度で組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製された、請求項1~89のいずれか一項に記載の組成物。乾燥形態の組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製された、請求項1~94のいずれか一項に記載の組成物。インフルエンザ感染症に罹患している、又はその危険性のある対象を治療する方法であって、乾燥形態の請求項1~95のいずれか一項に記載の組成物を用意するステップと、前記組成物を再水和するステップと、治療有効量の再水和した組成物を前記対象に投与するステップとを含む、方法。再水和した組成物を筋肉内注射によって投与する、請求項96に記載の方法。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物を調製する方法であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記方法が、脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約50:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約100:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項98に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約200:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項98に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約250:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項98に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約400:1未満の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項98に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約350:1未満の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項98に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約250:1~約350:1の範囲内の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項98に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約300:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項98に記載の方法。溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える、請求項98~105のいずれか一項に記載の方法。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える、請求項98~105のいずれか一項に記載の方法。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物を調製する方法であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記方法が、脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約10mg/mlの脂質濃度を達成する相対量で及び体積で合わせる、方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約10mg/ml~約100mg/mlの範囲の脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる、請求項108に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約50:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項108又は109に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約100:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項110に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約200:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項110に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約250:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項110に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約400:1未満の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項110に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約350:1未満の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項110に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約250:1~約350:1の範囲内の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項110に記載の方法。溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約300:1の脂質:抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項110に記載の方法。溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える、請求項108~117のいずれか一項に記載の方法。インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える、請求項108~117のいずれか一項に記載の方法。0131以下の実施例は、本明細書に記載するある組成物を作製し、実践するいくつかの例示の様式を記載するものである。これらの実施例は説明の目的にすぎず、本明細書に記載する組成物及び方法の範囲を制限しようとするものではないことを理解されたい。実施例1:熱安定性の凍結乾燥免疫原性組成物0132本実施例は、筋肉内IM注射用の熱安定性の凍結乾燥免疫原性組成物を調製するための方法を記載する。非イオン性界面活性ベシクルNISV組成物は全て、逆融解法によって調製した。以下の脂質を用いた:1-モノパルミトイルグリセロール非イオン性界面活性剤、コレステロールステロイド、及びジセチルホスフェートイオン性両親媒性物質。具体的に述べると、モル比5:4:1の脂質1-モノパルミトイルグリセロールMPG496mg、コレステロールCHO464mg、及びジセチルホスフェートDCP164mgを、ガラス製ビーカーの側面に粉末が確実に付着しないように、ガラス製平底ビーカー中に配置した。この例示の組成物中、12mg投与量節約型組成物に対して又は4mg投与量等価組成物に対していずれかのリン酸化ヘキサアシル二糖アンモニウム塩PHAD、図1に示す例示のTLR-4アゴニストアジュバント、アラバマ州、アラバスターのAvantiPolarLipid,Inc.から入手できるを任意選択によって加え、他の脂質と一緒に同時融解した。ビーカーを固定し、アルミニウム製ホイルで覆い、120~125°Cに加熱した油浴中、ガラス棒を用いて時折かき混ぜながら脂質を融解した。脂質を融解する間に、濃縮リン酸バッファーを以下の通り調製した:ラミナーフローフード中、Na2HPO45.980g及びNaH2PO41.363gを滅菌水20ml中に溶解し、pHを測定し、溶液を0.45μm滅菌フィルターを通してろ過し、このバッファー0.796mlをフルゾン登録商標インフルエンザワクチン2009~2010季節性;SanofiPasteur40mlに加えた。フルゾン登録商標インフルエンザワクチン2009~2010季節性;SanofiPasteurは、45μg/0.5mlの濃度のインフルエンザHA抗原を含む、不活化3価インフルエンザ成分ワクチンである。各0.5mlは以下のインフルエンザウイルス株の各々からHA抗原15μgを含む:H1N1、A/Brisbane/59/2007;H3N2、A/Brisbane/10/2007、及びB/Brisbane/60/2008。緩衝した抗原保存液を30~35°C、8000rpmで均質化し、溶液を均質化しながら迅速に結晶化を防ぐために溶融脂質をビーカー中に移し、この点で8000rpmの均質化を30~35°Cで10分間続けた。得られた脂質-抗原懸濁液を、30~35°C、220±10rpmで1~2時間振盪した。このステップの後、工程中の試料を採取してpH及び粒子サイズ分布PSDを決定した。最後に400mMショ糖水溶液40mlをNISV-抗原溶液40mlに加え、30~35°C、220±10rpmで5分間振盪した。アリコートを採取し投与量節約型組成物に対して0.5ml/バイアル、及び投与量等価組成物に対して1.5ml/バイアル、終夜又はそれより長く-80°Cで凍結し、引き続き以下の表2に概略する凍結乾燥サイクルにおける標的の凍結乾燥パラメーター、及び様々な充填体積に対して以下の表3に示す主な乾燥時間設定点にしたがって凍結乾燥した。0133NISVと調合されないが抗原及びアジュバントを含む対照試料は、以下の手順にしたがって調製した:PHAD12mg投与量節約型組成物又は4mg投与量等価組成物を400mMショ糖溶液40ml中に再懸濁し、この懸濁液を引き続きフルゾン登録商標インフルエンザワクチン2009~2010季節性;SanofiPasteurと混合し、30~35°C、220±10rpmで5分間振盪した。この非調合の抗原-アジュバント溶液をバイアル中に分注し投与量節約型組成物に対して0.5ml/バイアル、及び投与量等価組成物に対して1.5ml/バイアル、終夜又はそれより長く-80°Cで凍結し、上記表2において概略した凍結乾燥サイクル、及び様々な充填体積に対して上記表3に記載した主な乾燥時間設定点において、標的の凍結乾燥パラメーターにしたがって引き続き凍結乾燥した。0134凍結乾燥組成物を全て、投与前にWFI0.75ml中で再水和した。以下により詳しく論じる通り、いくつかの試験は、対照として液体形態において提供されるフルゾン登録商標インフルエンザワクチンを用いた即ち、凍結乾燥を含まない調合ステップなしで。実施例2:免疫原性組成物でのマウスのインフルエンザ免疫化0135実施例1に記載した通りに調製した組成物を、6~8週齢BALB/Cメスマウスにおいて試験した1試験グループあたり最低8動物。マウスを、対照又は再水和組成物50μlで、0日目に1回及び14日目に1回の2回、筋肉内免疫化した。免疫化前、次いで第1及び第2の免疫化後の試験グループにおいて全てのマウスから採血して体液性免疫反応を評価した。以下の表4に概略する通り、10.1×標準のヒト単位投与量に等しい標準マウス単位投与量は0.1×標準のヒト単位投与量、即ち、ヒトとマウスとの間のサイズの違いを考慮に入れた後投与量等価フルゾン登録商標陽性対照;非調合及びアジュバント非添加グループ/試験品1;2NISV及びアジュバントのPHAD0.005mgと調合した1/30×標準のヒト単位投与量に等しい投与量節約型フルゾン登録商標グループ/試験品2;又は3NISVなしでアジュバントのPHAD0.005mgと調合した1/30×標準のヒト単位投与量に等しい投与量節約型フルゾン登録商標グループ/試験品3のいずれかを動物に投与した。実施例3:免疫原性組成物の効力の赤血球凝集抑制アッセイ0136効力試験に対して、HAIアッセイを用いて動物における免疫学的反応を測定した。HAIアッセイは、インフルエンザウイルスの感染又はワクチン接種に起因する血清中のHA抗体を検出するのに用いられる血清学的技術である。HAI力価はヒトにおけるインフルエンザからの防御に相関する。HAI抗体力価は、4赤血球凝集単位を用いて完全な赤血球凝集を示す血清の最高希釈の逆数として表される。HAI力価が1:40又はそれを超えると血清保護的seroprotectiveであると考えられ、ワクチン接種の後及び前に採取した試料中のHAI力価における4倍の増大は抗体陽転の分類に必要と考えられる最小の増大である。結果は、HAI力価の逆関数及びHAI力価の相乗平均として表される。HAIアッセイは以下の通りに行った。簡潔に述べると、免疫化したマウス由来の血清のPBS中2倍希釈の系列を96ウェルV底プレートにおいて調製し、4赤血球凝集単位HAUのA/Brisbane/59/07H1N1又はA/Brisbane/10/2007H3N250μlと30分間、室温でインキュベートした。次に、ニワトリ赤血球0.5v/v希釈CanadianFoodInspectionAgency、カナダ、オタワ50μlをプレート上の全ウェルに加え、室温で1.5時間インキュベートした。ニワトリ赤血球を凝集させることができる最高希釈を、次いで決定した。0137相乗平均、中央値、及び平均値の標準誤差を決定した。ソフトウエアグラフパッドプリズム5SoftwareGraphPadPrism5を用いて統計学的分析を行った。対応のあるt検定によって対応する標本を評価し、スチューデントのt検定によって対応のない標本を評価した。p値≦0.05を統計的に有意であるとみなした。免疫化前に得られた値に比べて最終の免疫化後14日後のワクチン接種反応の≧2倍の増大によって陽性の反応を示した。これらのアッセイの結果を以下に記載する。0138このマウスの試験において、本発明者らは、実施例2、表4に記載する3つの組成物の効力を評価した。試験13日目P1Vd13及び29日目P2Vd15にマウスから得た血液に対してHAIアッセイを行った。0139図3は、最初の免疫化13日後のH1N1A/Brisbane/59/07に対する平均HAI力価を示すP1Vd13。グループ2の動物表4;アジュバント添加した投与量節約型NISVフルゾン登録商標組成物に対して、H1N1に対する平均HAI力価はグループ3の動物表4;NISVなしのアジュバント添加した投与量節約型フルゾン登録商標組成物よりも有意に高く、また対照のグループ1の動物よりもやはり高かったことが分かる表4;アジュバント非添加及び非調合の投与量等価フルゾン登録商標。アジュバント添加した投与量節約型NISVフルゾン登録商標組成物グループ2は、対照のアジュバント非添加及び非調合の投与量等価フルゾン登録商標グループ1よりも単位投与量の3分の1効力が高かったが、NISVなしのアジュバント添加した投与量節約型フルゾン登録商標組成物グループ3は高くなかったことも観察された。0140図4は、第1の免疫化13日後のH3N2A/Brisbane/10/07に対する平均HAI力価を示すP1Vd13。グループ2の動物表4;アジュバント添加した投与量節約型NISVフルゾン登録商標組成物に対して、H3N2に対する平均HAI力価は、グループ3の動物表4;NISVなしのアジュバント添加した投与量節約型フルゾン登録商標組成物よりも有意に高く、また対照のグループ1の動物表4;アジュバント非添加及び非調合の投与量等価フルゾン登録商標よりもやはり高かったことが分かる。繰り返すと、アジュバント添加した投与量節約型NISVフルゾン登録商標組成物グループ2は、対照のアジュバント非添加の非調合の投与量等価フルゾン登録商標グループ1よりも単位投与量の3分の1効力が高かったが、NISVなしのアジュバント添加した投与量節約型フルゾン登録商標組成物グループ3は高くなかったことも観察された。第2の免疫化後P2Vd15様々なグループにおける動物の免疫反応において同様の傾向が観察された。一般的に、第2の免疫化15日後P2Vd15に測定したHAI力価は、最初の免疫化13日後に観察されたHAI力価よりもおよそ4~5倍高かった。0141例示のTLR-4アゴニストアジュバントのPHADの免疫反応に対する投与量依存性を決定するために、陽性対照、及び実施例1において記載した方法他の脂質と同時融解したPHADを増大させたことを除いてによって調製した5つの異なるNISV組成物を、6~8週齢のBALB/Cメスマウスにおいて試験した1試験グループあたり最低8動物。6試験グループを以下の表5において概略する。マウスを、対照又は再水和した組成物50μlで、0日目に1回、及び14日目に1回の2回筋肉内免疫化した。予め免疫化した試験グループ、並びに次いで第1及び第2の免疫化後の試験グループにおける全てのマウスから血清試料を採取し、実施例3に記載した通りHAIアッセイを用いて分析した。0142図5は、第2のワクチン接種15日後に採取した血清試料を用いて、実施例3のHAI力価アッセイによって決定した、マウスにおける効力投与量反応を示す。図5において見られる通り、PHAD5μgグループ5は、投与量節約型NISVフルゾン登録商標組成物の効力を、対照のアジュバント非添加及び非調合の投与量等価フルゾン登録商標グループ1の効力におよそ適合するまで増大し、より高投与量のPHAD15μg及び50μgそれぞれグループ4及び3は、効力を対照のおよそ3倍に増大した。図5A及びBは、例示のTLR-4アゴニストアジュバントであるPHADアジュバントは、H1N1及びH3N2の両方に対して投与量依存性の様式で効力を増大したことを示すものである。実施例4:凍結乾燥した免疫原性組成物の熱安定性試験0143実施例1にしたがって調製した、凍結乾燥した免疫原性組成物NISVの安定性を、3つの貯蔵温度条件5°C±3°C、25°C±2°C、及び40°C±2°Cで最高6ヶ月間評価した。生物学的製剤の安定性の特徴をプロファイルする、安定性を指摘するアッセイ又はパラメーターは1つも存在しない。FDAによって規定される通りFDAGuidanceforIndustry.ContentandFormatofChemistry,ManufacturingandControlsInformationandEstablishmentDescriptionInformationforaVaccineorRelatedProduct、生物学的製剤に対する安定性試験は、一般に、効力;水分含量凍結乾燥の場合、pH、無菌性、又は生物汚染度のコントロールを示す安定性である物理化学的測定値;発熱原性、及び全般的な安全性に対して試験しなければならない。その結果、数々のアッセイを用いた安定性を指摘するプロファイルは、生物学的製剤の同一性、純度、及び効力における変化を典型的に検出する保証を提供する。0144本明細書で用いられる効力の語は、その意図する効果を達成し、適切なinvivo又はinvitroの定量方法によって決定される生成物の特定の性能又は能力を意味する。invivoのマウス効力アッセイを、長時間及び3つの異なる貯蔵温度で、貯蔵した組成物の効力を評価するのに用いた。以下の表6に示す通り、対照の組成物及び凍結乾燥組成物を様々な温度で最高6ヶ月間貯蔵し、その後これらを再水和し凍結乾燥組成物の場合、マウスにIM投与した実施例2に記載した通り。次いで、免疫反応を、実施例3のHAIアッセイを用いて決定した。0145組成物を、外観色及び乳白度に対してやはり分析し、その後の再水和を粒子サイズ分布PSD及びpHに対して分析した。再水和した試料のアリコートを、4°Cで20分間、24000rpmの超遠心機で遠心分離し、上清及びペレット分画を除去し、抽出し、sELISAによって分析して抗原含量invitro効力とも記載するを決定した。再水和した材料の安定性を、再水和後4~6時間にわたって試験した。特定の時間点で、凍結乾燥組成物中の脂質を、HPLCを用いて純度及び分解に対して分析した。凍結乾燥組成物中の水分含量を、カールフィッシャーアッセイを用いて評価した。安定性試験に用いた組成物は無菌ではなかった。しかし、調合方法は、脂質を>100°Cに加熱し、無菌のフルゾン登録商標を含む無菌ろ過したバッファー溶液に溶融脂質を加えることを伴っていた。調合方法を、ラミナーフローフード中、及び凍結乾燥の間Tyvek滅菌バッグの使用、及び滅菌窒素を用いた戻し充填など、低微生物含量生物汚染度条件下で行った。生物汚染度は、試料をトリプトソイ寒天TSA上に塗抹し、30~35°Cで3~5日間インキュベートすることによって総好気性微生物数1グラムあたりのCFUとして、並びに試料をサブロー寒天SDA上に塗抹し、20~25°Cで5~7日間インキュベートすることによって総真菌数TotalCombinedYeastsandMoldsCount1グラムあたりのCFUとして評価した。0146ICH三極調和ガイドラインICHHarmonizedTripartiteGuideline:安定性試験ガイドラインStabilityTestingofNewDrugSubstancesandProductsQ1AR2に概略される通り、全体的な勧告を、安定性試験を実施する間に続けた。提唱される安定性を指摘する試験を以下の表7に列挙するが、表中月はおよそ4週であり、Xは必要とされる試験を示し、Oは任意の試験を示す。0147図6は、投与量節約型のアジュバント添加したNISVフルゾン登録商標組成物グループ2:NISV、TLR-4アゴニストアジュバントのマウスにおけるinvivo効力第2のワクチン接種15日後に採取した血清試料を用いて実施例3に記載した通りにアッセイしたHAI力価対投与量節約型のアジュバント添加したフルゾン登録商標組成物グループ3:NISVなし、TLR-4アゴニストアジュバント及び投与量等価のアジュバント非添加及び非調合のフルゾン登録商標対照グループ1:NISVなし、TLR-4アゴニストアジュバントなしを示す。対照の組成物及び凍結乾燥組成物を4°C又は40°Cで6ヶ月間貯蔵した後、実施例2に記載した通りマウス中にIM注射した。図6において分かる通り、H1N1及びH3N2に対するHAI力価は、投与量節約型のアジュバント添加したNISVフルゾン登録商標組成物グループ2は4°C又は40°Cで最高6ヶ月間貯蔵した場合に同等に強力であったが、投与量等価のアジュバント非添加の非調合のフルゾン登録商標対照グループ1及び投与量節約型のアジュバント添加したフルゾン登録商標組成物グループ3は両方とも、同じ6ヶ月の時間点にわたって40°C対4°Cで貯蔵した場合に効力を失ったことを実証している。0148図7は、投与量等価のアジュバント非添加のNISVフルゾン組成物グループ7:NISV、TLR-4アゴニストアジュバントなし対投与量等価のアジュバント非添加及び非調合のフルゾン登録商標対照グループ1:NISVなし、TLR-4アゴニストアジュバントなしに対するマウスにおけるinvivo効力を示す第2のワクチン接種15日後に採取した血清試料を用いて実施例3に記載した通りにアッセイしたHAI力価。対照の組成物及び凍結乾燥組成物を4°C又は40°Cで6ヶ月間貯蔵した後、実施例2に記載した通りにマウス中にIM投与した。図7において分かる通り、H1N1及びH3N2に対するHAI力価は、投与量等価のアジュバント非添加のNISVフルゾン登録商標組成物グループ7は4°C又は40°Cで最高6ヶ月間貯蔵した場合に同等に強力であったが、投与量等価のアジュバント非添加及び非調合のフルゾン登録商標対照グループ1は同じ6ヶ月の時間点にわたって40°C対4°Cで貯蔵した場合に効力を失ったことを実証している。0149図8は、以下の組成物:A投与量節約型のアジュバント添加NISVフルゾン登録商標組成物グループ2、及びB投与量節約型のアジュバント添加フルゾン登録商標組成物グループ3に対する、様々な貯蔵期間時間点T=0、1、3、及び6ヶ月並びに様々な温度4°C、25°C、及び40°Cの後のinvitroのHA抗原含量を示す。HA抗原含量の値は、上記に記載した通りsELISAによって決定した。組成物を遠心分離し、ペレット及び上清中のHA抗原の量を、示す通り別々に測定した。図8において分かる通り、結果は、フルゾン登録商標をNISVと一緒に調合し、40°Cで最高6ヶ月貯蔵した場合、HA抗原含量の減少は最小であったがグループ2、図8A、フルゾン登録商標をNISVと一緒に調合せず、40°Cで貯蔵した場合にHA含量は着実に減少したグループ3、図8Bことを実証している。0150外観:外観における最も顕著な時間依存性及び温度依存性の変化は凍結乾燥ケークの融解であり、これは凍結乾燥した非-NISV含有対照組成物全てにおいて、40°Cでの貯蔵後に観察され、25°Cの貯蔵後により低い程度で観察された。いかなる理論によっても拘束するつもりはないが、これらの非-NISV凍結乾燥組成物において観察された凍結乾燥ケークの融解は、第2の乾燥の開始前にケークの乾燥が不完全であったことによるものではないと考えられた。凍結乾燥ケークは全て、凍結乾燥後は申し分なかったが、貯蔵時間にわたって温度を次第に上げると収縮し、液化した。0151残留水分:凍結乾燥ケーク中の残留水分を、カールフィッシャーアッセイを用いて決定し、水分重量パーセントによって表した。いかなる理論によっても拘束するつもりはないが、凍結乾燥ケークの残留水分含量は、組成物の安定性と反比例しうると考えられる。時間ゼロ凍結乾燥直後の、凍結乾燥したNISV-非含有組成物グループにおける合計残留水分は、凍結乾燥したNISV-含有組成物中の残留水分よりも高く、それぞれ残留水分約2~4対約1~2であることが観察された。一般的に、凍結乾燥の間にNISVが存在すると、残留水分含量がより低い結果になる。凍結乾燥したNISV-含有組成物を高温例えば、25°C、40°Cで長期間例えば、最高6ヶ月貯蔵した場合、残留水分における観察不可能な変化は極めて少ない~存在しなかったデータは示さず。0152粒子サイズ分布:凍結乾燥のNISV-含有組成物及び非NISV-含有組成物の両方において、40°C及び25°Cではずっと低い程度にで、サイズ分布及び平均粒子サイズにおける明白な変化が存在したデータは示さず。粒子サイズ分布及び平均粒子サイズにおけるこれらの変化は、あらゆるNISV-含有組成物に対して4°Cでは観察されなかった。0153pH:全ての組成物のpHは、4°C、25°C、又は40°Cで貯蔵した場合、およそ同じであり、6ヶ月の試験の経過にわたって観察可能な傾向を示さなかった。実施例5:他のアジュバント及び抗原を有する凍結乾燥免疫原性組成物の熱安定性0154本試験の目的は、様々なタイプのアジュバント及び抗原は、NISVと調合した場合に熱安定性であるか否かを決定することであった。これらの代替のアジュバント及び抗原を試験するために、様々な組成物単数又は複数の最適化例えば、アジュバント濃度の最適化などは完了しなかったことに留意されたい。0155様々なアジュバント:様々なアジュバントを有する非イオン性界面活性剤ベシクルNISV組成物は全て、実施例1に記載した逆融解法によって調製した。詳しく述べると、各組成物に対して、モル比5:4:1の脂質MPG147.59mg、CHO138.25mg、及びDCP49.66mgをガラス製平底ビーカー中に配置した。ビーカーを固定し、覆い、120~125°Cに加熱した油浴中、ガラス棒を用いて時折かき混ぜながら脂質を融解した。実施例1に記載した通りに調製した濃縮リン酸バッファー0.224mlをラミナーフローフード中、フルゾン登録商標インフルエンザワクチン2010~2011季節性;SanofiPasteur11.67mlに加えた。緩衝した抗原保存液を30~35°C、8000rpmで均質化し、溶液を均質化しながら迅速に結晶化を防ぐために溶融脂質をビーカー中に移した。8000rpmの均質化を30~35°Cで10分間続けた。得られた脂質-抗原懸濁液を、30~35°C、220±10rpmで1~2時間振盪した。等体積の400mMショ糖水溶液を各アジュバントアジュバント3.5mgと一緒に、各NISV-抗原溶液に加え、30~35°C、220±10rpmで5分間振盪した。アリコートを採取し0.5ml/バイアル、終夜又はそれより長く-80°Cで凍結し、引き続き表2に概略する凍結乾燥サイクルにおける標的の凍結乾燥パラメーター及び様々な充填体積に対して表3に示す主な乾燥時間設定点にしたがって凍結乾燥した。0156凍結乾燥したアジュバント添加した組成物を4°C又は40°Cで3ヶ月間貯蔵し、次いでWFI0.75ml中で再水和した後、実施例2に記載した通りマウス中にIM注射した。再水和した組成物のinvivoの効力を、第2のワクチン接種15日後にワクチン接種したマウスから採取した血清試料においてアッセイしたH1N1に対するHAI力価を実施例3に記載した通りに測定した。結果を以下の表8に示す。これらの結果は、投与量節約型のアジュバント添加したフルゾン登録商標組成物グループ1及び2は、アジュバントのタイプに関係なく4°C又は40°Cで最高3ヶ月間貯蔵した場合、等しく強力であることを実証するものである。これらの投与量節約型のアジュバント添加したNISVフルゾン登録商標組成物グループ1及び2の全体的な効力は、投与量等価のNISVフルゾン登録商標組成物グループ3の全体的な効力よりも低かった。フラジェリンTLR-5アゴニストアジュバントでも試験を行ったが、試験した投与量はマウスに対して毒性であった。0157様々な抗原:様々なインフルエンザ抗原の非イオン性界面活性剤ベシクルNISV組成物を、実施例1に記載した逆融解法によって調製した。詳しく述べると、各組成物に対して、モル比5:4:1の脂質MPG404mg、CHO378mg、及びDCP134mgをガラス製平底ビーカー中に配置した。ビーカーを固定し、覆い、120~125°Cに加熱した油浴中、ガラス棒を用いて時折かき混ぜながら脂質を融解した。実施例1に記載した通りに調製した濃縮リン酸バッファー0.615mlをラミナーフローフード中、フルゾン登録商標インフルエンザワクチン2010~2011季節性;SanofiPasteur32ml、フルビリン登録商標インフルエンザワクチン2010~2011季節性;Novartis、又はフルラバル登録商標インフルエンザワクチン2010~2011季節性、GSKに加えた。フルゾン登録商標インフルエンザワクチン2010~2011季節性;SanofiPasteurは、不活化3価インフルエンザ成分ワクチンであり、45μg/0.5mlの濃度のインフルエンザHA抗原を含んでいる各0.5mlは、以下のインフルエンザウイルス株の各々からHA抗原15μgを含んでいる:H1N1、A/California/07/2009X-179A、H3N2、A/Victoria/210/2009X-187;及びB/Brisbane/60/2008。フルビリン登録商標インフルエンザワクチン2010~2011季節性;Novartisは、不活化3価インフルエンザ成分ワクチンであり、45μg/0.5mlの濃度のインフルエンザHA抗原を含んでいる各0.5mlは、以下のインフルエンザウイルス株の各々からHA抗原15μgを含んでいる:H1N1、A/California/07/2009X-181;H3N2、A/Victoria/210/2009X-187;及びB/Brisbane/60/2008。フルラバル登録商標インフルエンザワクチン2010~2011季節性;GSKも、不活化3価インフルエンザ成分ワクチンであり、45μg/0.5mlの濃度のインフルエンザHA抗原を含んでいる各0.5mlは、以下のインフルエンザウイルス株の各々からHA抗原15μgを含んでいる:H1N1、A/California/07/2009X-181;H3N2、A/Victoria/210/2009X-187;及びB/Brisbane/60/2008。緩衝した抗原保存液を30~35°C、8000rpmで均質化し、溶液を均質化しながら迅速に結晶化を防ぐために溶融脂質をビーカー中に移し、この点で8000rpmの均質化を30~35°Cで10分間続けた。得られた脂質-抗原懸濁液を、30~35°C、220±10rpmで1~2時間振盪した。等体積の400mMショ糖水溶液を各NISV/抗原溶液の各々に加え、30~35°C、220±10rpmで5分間振盪した。アリコートを採取し1.5ml/バイアル終夜又はそれより長く-80°Cで凍結し、引き続き表2に概略する凍結乾燥サイクルにおける標的の凍結乾燥パラメーター及び様々な充填体積に対して表3に示す主な乾燥時間設定点にしたがって凍結乾燥した。0158組成物を4°C及び40°Cで3ヶ月間貯蔵し、次いでWFI0.75ml中再水和した後、実施例2に記載した通りマウス中にIM注射した。図9は、4°C又は40°Cで3ヶ月間貯蔵した後の組成物のinvitro効力を示すHA抗原含量は、実施例4に記載した通り、sELISAによって決定した。結果は、インフルエンザ抗原フルゾン登録商標、フルビリン登録商標、又はフルラバル登録商標をNISVと調合した場合、40°Cで最高3ヶ月間貯蔵するとHA抗原含量の減少は最小であったが、インフルエンザ抗原フルゾン登録商標、フルビリン登録商標、又はフルラバル登録商標をNISVと調合しなかった場合、HA抗原含量が着実に減少したことを実証している。実施例6:免疫原性組成物でのサルのインフルエンザ免疫化0159非ヒト霊長動物モデルにおいて免疫原性を試験するために、最高6ヶ月間4°C、25°C、及び40°Cのinvitro及びマウスにおけるinvivoで熱安定性が実証された組成物を、アカゲザルにおいても試験した。サルに、a投与量等価量1×標準のヒト単位投与量即ち45μgのアジュバント非添加及び非調合のフルゾン登録商標陽性対照、又はb例示のTLR-4アゴニストアジュバントのPHAD50μgと、又はそれなしで、NISVと調合した、投与量節約型の量1/3×標準のヒト単位投与量即ち15μgのフルゾン登録商標のいずれかの注射を2回0、28日投与した。IM注射前及び後に第2の注射後最大10週間血清試料を採取し、実施例3に記載した通りHAIアッセイによって分析した。HAIアッセイをH1N1及びH3N2に対して行い、H3N2に対するデータを、3治療グループに対して図10に示す。図10に示す通り、PHADでアジュバント添加した、又はアジュバント非添加いずれかの投与量節約型NISVフルゾン登録商標組成物は、アカゲザルにおいて第2のIM投与後最大10週、アジュバント非添加及び非調合のフルゾン登録商標陽性対照に比べて優れた免疫原性を示した。実施例7:熱安定性における脂質:抗原比、脂質濃度、及び脂質含量の役割0160熱安定性において脂質が果たす役割を試験するために、免疫原性組成物を、均質化及び再構成の間、様々な脂質:抗原比、単位投与量あたりの様々な脂質含量、及び様々な脂質濃度での逆融解法実施例1に記載した通りを用いて調合した。試験した様々な組成物を、以下の表9に記載する。この試験の目的は、4°C及び40°Cで貯蔵して3ヵ月後のフルゾン登録商標NISV組成物の熱安定性を決定することであった。0161NISVは以下の脂質からなっていた:1-モノパルミトイルグリセロールMPG、非イオン性界面活性剤、コレステロールCHO、ステロイド、及びジセチルホスフェートDCP、イオン性両親媒性物質。モル比5:4:1の脂質を維持するために、表9に記載する量を量り分け、ガラス製平底ビーカー中に配置し、120°C~125°Cの加熱油浴中で実施例1に記載した通り、ガラス棒を用いて時折かき混ぜながら融解した。脂質を融解する間、表9に示す体積の濃縮リン酸バッファーを表9に示す通り好適な体積のフルゾン登録商標に加えた。次いで、緩衝した抗原保存液を30~35°C、8000rpmで均質化し、溶液を均質化しながら迅速に結晶化を防ぐために溶融脂質をビーカー中に移し、この点で8000rpmの均質化を30~35°Cで10分間続けた。得られたNISV-抗原懸濁液を、30~35°C、220±10rpmで1~2時間振盪した。最後に、等体積の400mMショ糖水溶液をNISV-抗原溶液に加え、30~35°C、220±10rpmで5分間振盪した。アリコートを採取し1ml/バイアル終夜又はそれより長く-80°Cで凍結し、引き続き表2に概略する凍結乾燥サイクルにおける標的の凍結乾燥パラメーター及び様々な充填体積に対して以下の表3に示す主な乾燥時間設定点にしたがって凍結乾燥した。0162組成物表10に記載するを最高3ヶ月4°C又は40°Cで貯蔵し、次いでマウスにIM投与した実施例2に記載した通り。ワクチン接種したマウスにおける免疫反応を、実施例3に記載したHAIアッセイを用いて決定した。Invivoの効力の他に、凍結乾燥ケークの目視検査、sELISAによる抗原含量の測定、及び凍結乾燥ケークの水分含量の測定を含めた、実施例4に記載したいくつかのさらなる安定性試験を組成物に対して行った。0163組成物中の残留水分を、カールフィッシャーアッセイを用いて決定し、水分重量パーセントとして表し、表11に示す。脂質:抗原比の低いNISVフルゾン登録商標組成物30:1及び100:1対脂質:抗原比の高いNISVフルゾン登録商標組成物300:1の残留水分を比較すると明白な違いが存在した。一般的に、脂質:抗原比の低いNISVフルゾン登録商標組成物は、脂質:抗原比の高いNISV組成物300:1-1.53又はそれ未満よりも水分含量が高かった30:1-2.87及び100:1-1.81。本発明者らは、均質化の間、脂質濃度に応じた脂質:抗原比300:1のNISVフルゾン登録商標組成物中の残留水分における違いも観察した。このように、均質化の間、より低い脂質濃度で調製した組成物の残留水分含量は1.21~1.53の範囲であったが試験品3、4、6、均質化の間より高い脂質濃度で調製した組成物の残留水分含量は低く、0.54~0.66の範囲であった試験品5及び7。様々な脂質:抗原比及び脂質濃度はまた、凍結乾燥ケーク中の全脂質含量として表すこともできる。脂質含量に対してこの測定を用いることで、脂質含量と残留水分との間の相関が可能となり、脂質含量の低い凍結乾燥ケークの残留水分含量は高く、脂質含量の高い凍結乾燥ケークの残留水分含量は低い。凍結乾燥ケーク中の脂質含量をまた、T=0、4°CでT=3ヶ月、及び40°CでT=3ヵ月後のケークの外観と比べた。T=0では、NISVフルゾン登録商標組成物の凍結乾燥ケークは全て、脂質含量に関係なく、白色の外観で、形成は良好で、マイクロコラプスがなかった。4°CでT=3ヶ月にNISVフルゾン登録商標組成物の凍結乾燥ケーク全てに対しても、同様の観察がなされた。しかし、40°CでT=3ヶ月では、NISVフルゾン登録商標組成物の凍結乾燥ケークの全てはインタクトではないようであり、脂質含量の低い2つの凍結乾燥ケーク、即ち、試験品11.35mg及び試験品24.5mgはコラプスし、メルトバックmeltedbackしていると考えられたが、脂質含量の高い凍結乾燥ケークの全て、即ち、試験品3~76.75mg以上は、この高温で3ヶ月間貯蔵した後でも、依然としてインタクトと考えられた。均質化の間の脂質濃度を脂質含量の代わりに用いた場合に、同じ相関が観察された:試験品12.7mg/ml及び試験品29mg/mlを、試験品3~713.5mg/ml以上と比べられたい。0164図11は、非調合の市販のフルゾン登録商標試験品8対脂質:抗原比300:1のNISVフルゾン登録商標組成物試験品3、脂質:抗原比100:1のNISVフルゾン登録商標組成物試験品2、及び脂質:抗原比30:1のNISVフルゾン登録商標組成物試験品1に対するinvitroのHA抗原含量を示す。再水和した組成物のアリコートを、4°Cで20分間、24000rpmの超遠心機で遠心分離し、上清及びペレット分画を除去し、抽出し、実施例4に記載した通り、sELISAによって分析して抗原含量又はinvitro効力を決定した。抗原含量を、T=0、及び40°Cで3ヶ月間貯蔵後40°CでT=3ヶ月、4つの組成物に対して決定した。非調合のフルゾン登録商標対照試験品8及び脂質:抗原比が最小の30:1NISVフルゾン登録商標組成物試験品1の両方に対して、HA抗原含量の著しい減少が、sELISAによって40°Cで3ヶ月間貯蔵後に検出された。40°Cで3ヶ月間貯蔵後、市販のフルゾン登録商標に対してオリジナルのHA含量の70が残存し、脂質:抗原比が最小の30:1NISVフルゾン登録商標組成物試験品1に対してオリジナルのHA含量の40だけが残存した。これとは対照的に、脂質:抗原比が高い100:1及び300:1NISVフルゾン登録商標組成物は、40°Cで3ヶ月間貯蔵しても、長時間でHA抗原含量の減少を殆んど示さなかった。0165図12は、表10に記載したNISVフルゾン登録商標組成物全てグループ1~7対非調合のフルゾン登録商標対照グループ8に対する、マウスにおけるinvivoの効力を示すHAI力価は、第2のワクチン接種15日後に採取した血清試料を用いて実施例3に記載した通りにアッセイした。示した結果は、AH1N1及びBH3N2に対するものであり、NISVフルゾン登録商標組成物及び非調合のフルゾン登録商標対照は全て、T=0では概ね効力が同じであったことを実証しているH1N1に対するHAI力価の平均-189.9;H3N2に対するHAI力価の平均-177.5。0166図13は、非調合のフルゾン登録商標対照グループ8対脂質:抗原比300:1のNISVフルゾン登録商標組成物グループ3、脂質:抗原比100:1のNISVフルゾン登録商標組成物グループ2、及び脂質:抗原比30:1のNISVフルゾン登録商標組成物グループ1に対する、マウスにおけるinvivoの効力を示すHAI力価は、第2のワクチン接種15日後に採取した血清試料を用いて実施例3に記載した通りにアッセイした。全ての組成物を4°C又は40°Cで3ヶ月間貯蔵した後、マウス中にIM注射した。示した結果は、AH1N1及びBH3N2に対するものであり、脂質:抗原比300:1及び100:1のNISVフルゾン登録商標組成物グループ2及び3は、4°C又は40°Cで最高3ヶ月間貯蔵した場合等しく強力であったが、非調合のフルゾン登録商標対照グループ8及び脂質:抗原比30:1のNISVフルゾン登録商標組成物グループ1は同じ3ヶ月の期間にわたって40°Cで貯蔵した場合効力を失ったことを実証している。0167図13はまた、均質化及び再構成の間、脂質濃度低範囲グループ4、脂質濃度中範囲グループ3、及び脂質濃度高範囲グループ5の異なる3つの脂質濃度での脂質:抗原比300:1のNISVフルゾン登録商標組成物に対する、マウスにおけるinvivoの効力を示すHAI力価は、第2のワクチン接種15日後に採取した血清試料を用いて実施例3に記載した通りにアッセイした。全ての組成物を4°C又は40°Cで3ヶ月間貯蔵した後、マウス中にIM注射した。示した結果は、AH1N1及びBH3N2に対するものであり、NISVフルゾン登録商標組成物の中範囲及び高範囲グループ3及び5は、4°C又は40°Cで最高3ヶ月間貯蔵した場合等しく強力であったが、脂質濃度低範囲のNISVフルゾン登録商標組成物グループ4は同じ3ヶ月の期間にわたって40°Cで貯蔵した場合効力の最小の減少を示したことを実証している。脂質濃度低範囲の脂質:抗原比300:1のNISVフルゾン登録商標組成物均質化の間、脂質濃度13.5mg/mlは、脂質:抗原比30:1のNISVフルゾン登録商標組成物均質化の間、脂質濃度2.7mg/mlほど脂質濃度は低くなかった。0168図13はまた、均質化の間異なる3つの脂質濃度、及び再構成時同じ脂質濃度での、脂質濃度低範囲グループ6、脂質濃度中範囲グループ3、及び脂質濃度高範囲グループ7の脂質:抗原比300:1のNISVフルゾン登録商標組成物に対する、マウスにおけるinvivoの効力を示すHAI力価は、第2のワクチン接種15日後に採取した血清試料を用いて実施例3に記載した通りにアッセイした。全ての組成物を4°C又は40°Cで3ヶ月間貯蔵した後、マウス中にIM注射した。示した結果は、AH1N1及びBH3N2に対するものであり、中範囲及び高範囲のNISVフルゾン登録商標組成物グループ3及び7は、4°C又は40°Cで最高3ヶ月間貯蔵した場合等しく強力であったが、脂質濃度低範囲のNISVフルゾン登録商標組成物グループ6は同じ3ヶ月の期間にわたって40°Cで貯蔵した場合、効力の最小の減少を示したことを実証している。脂質濃度低範囲の脂質:抗原比300:1のNISVフルゾン登録商標組成物均質化の間、脂質濃度13.5mg/mlは、脂質:抗原30:1のNISVフルゾン登録商標組成物均質化の間、脂質濃度2.7mg/mlほど脂質濃度は低くなかった。他の実施形態0169本開示の他の実施形態は、当業者であれば、本明細書を考慮して、又は本明細書に開示する開示を実践すれば明らかであろう。本明細書及び実施例は例示にすぎないとみなされるものとされ、本開示の真の範囲は以下の特許請求の範囲によって指摘される。本明細書に言及されるあらゆる参考文献の内容は、その全文が参照によって本明細書に組み込まれる。"