"顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンFcフラグメントが共有結合した治療学的有効量の持続型顆粒球コロニー刺激因子結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む持続型顆粒球コロニー刺激因子G-CSF結合体の液剤。前記マンニトールが、液剤の総体積比で1~20w/vの濃度を有するものである請求項1に記載の液剤。前記緩衝溶液が、クエン酸、リン酸、酒石酸、炭酸、コハク酸、乳酸及び酢酸緩衝溶液からなる群から選択されるものである請求項1に記載の液剤。前記緩衝溶液が、5~100mMの濃度を有するものである請求項1に記載の液剤。前記緩衝溶液が、4~8のpHを有するものである請求項1に記載の液剤。前記アルブミンフリー安定化剤が、等張化剤、多価アルコール、糖類、非イオン性界面活性剤、中性アミノ酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択された成分をさらに含むものである請求項1に記載の液剤。前記等張化剤が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択された塩である請求項6に記載の液剤。前記等張化剤が、5~200mMの濃度を有するものである請求項6に記載の液剤。前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート系又はポロキサマー系非イオン性界面活性剤である請求項6に記載の液剤。前記ポリソルベート系非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60及びポリソルベート80からなる群から選択されるものである請求項9に記載の液剤。前記非イオン性界面活性剤が、液剤の総体積比で0.001~0.05w/vの濃度を有するものである請求項6に記載の液剤。前記糖類が、マンノース、グルコース、フコースfucose、キシロースxylose、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デキストラン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項6に記載の液剤。前記糖類が、液剤の総体積比で1~20w/vの濃度を有するものである請求項6に記載の液剤。前記多価アルコールが、プロピレングリコール、低分子量ポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量ポリプロピレン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項6に記載の液剤。前記多価アルコールが、液剤において1~15w/vの濃度を有するものである請求項6に記載の液剤。前記中性アミノ酸が、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項6に記載の液剤。前記中性アミノ酸が、液剤において0.1~10w/vの濃度を有するものである請求項6に記載の液剤。前記アルブミンフリー安定化剤が、pH5~8で5~100の濃度のクエン酸緩衝溶液、1~20w/vの濃度のマンニトール、5~200mMの濃度の塩化ナトリウム、及び0.001~0.05w/vの濃度のポリソルベート80を含むものである請求項1に記載の液剤。前記G-CSFが、野生型G-CSFから1つもしくは複数のアミノ酸が置換、除去もしくは挿入されることにより変異した変異体G-CSFタンパク質、又は野生型G-CSFと同程度の活性を示すペプチド類似体である請求項1に記載の液剤。前記G-CSF誘導体が、野生型G-CSFの17番目の位置でシステイン残基がセリンに置換された形態17Ser-G-CSFである請求項19に記載の液剤。前記持続型G-CSF結合体が、7~22μg/mlの濃度を有するものである請求項1に記載の液剤。前記免疫グロブリンFcフラグメントが、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項1に記載の液剤。前記免疫グロブリンFcフラグメントが、IgG、IgA、IgD、IgE及びIgMからなる群からの異種由来のドメインからなるハイブリッドhybridフラグメントである請求項22に記載の液剤。前記免疫グロブリンFcフラグメントが、同種由来のドメインからなる一本鎖免疫グロブリンで構成される二量体又は多量体形態である請求項22に記載の液剤。前記免疫グロブリンFcフラグメントがIgG4Fcフラグメントである請求項22に記載の液剤。前記免疫グロブリンFcフラグメントがヒト非グリコシル化IgG4Fcフラグメントである請求項25に記載の液剤。前記非ペプチドポリマーが、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項1に記載の液剤。前記生分解性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、PLAポリ乳酸,polylacticacid及びPLGAポリ乳酸グリコール酸,polylacticglycolicacidからなる群から選択されるものである請求項27に記載の液剤。よって、本発明は、G-CSF、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンFcフラグメントが共有結合した持続型G-CSF結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む液剤を提供することを目的とする。一実施形態によれば、本発明は、G-CSF、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンFcフラグメントが共有結合した持続型G-CSF結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む液剤を提供する。本発明で使用された持続型G-CSF結合体又は持続型G-CSF結合体という用語は、生理活性の顆粒球コロニー刺激因子、少なくとも1つの非ペプチドポリマー、及び少なくとも1つの免疫グロブリンFcフラグメントが共有結合した形態のタンパク質であって、野生型G-CSFに比べて作用持続期間が増加したものを意味する。本発明で使用された持続型という用語は、作用持続期間が野生型に比べて増加したものを意味する。結合体という用語は、顆粒球コロニー刺激因子、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンFcフラグメントが共有結合した構成を意味する。本発明で使用されるG-CSFは、ヒトG-CSF又はこれに密接に関連する類似体のアミノ酸配列を有する。本発明に有用なG-CSFは、天然に存在するタンパク質でもよく、組換えタンパク質でもよい。また、G-CSFは、本来の生物学的活性に大きく影響を及ぼさない範囲で変異したアミノ酸の置換、除去又は挿入による変異体でもよい。本発明に有用なヒトG-CSF又はその類似体は、脊椎動物から抽出されてもよく、化学的に合成されてもよい。あるいは、G-CSF又はその類似体は、遺伝子組換え手法を用いてG-CSF又はその類似体をコードする遺伝子に形質転換された原核又は真核生物から得てもよい。これに関連して、大腸菌例えば、Ecoli、酵母例えば、Scerevisiae又は哺乳動物細胞例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞を宿主として使用してもよい。使用した宿主に応じて、組換えG-CSF又はその類似体は、哺乳動物又は真核生物の炭水化物とグリコシル化されてもよく、グリコシル化されなくてもよい。発現される場合、組換えG-CSF又はその類似体は初期のメチオニン残基を含んでもよい位置-1。組換えヒトG-CSFHuG-CSFは、CHO細胞を宿主として利用して製造されることが好ましい。本発明においては、大腸菌を宿主細胞として利用して製造した組換えヒトG-CSFHuG-CSFが好ましい。本発明の好適な実施形態においては、野生型の17番目のシステイン残基がセリンに置換された組換えヒトG-CSFの変異体17Ser-G-CSFを韓国特許登録第10-356140号に記載された方法により発現させることができた。本発明で使用される免疫グロブリンFcフラグメントは、ヒト免疫グロブリンFcフラグメント又はこれに密接に関連する類似体のアミノ酸配列を有する。Fcフラグメントは、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット及びモルモットが含まれる動物から分離した天然形態でもよい。また、免疫グロブリンFcフラグメントは、IgG、IgA、IgD、IgE及びIgM由来のもの又はそれらの組み合わせもしくはハイブリッドhybridによるFcフラグメントでもよい。ヒト血液に最も豊富なタンパク質であるIgG又はIgM由来のものが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているIgG由来のものが最も好ましい。ここで、免疫グロブリンFcは、ヒト又は動物の有機体から全免疫グロブリンを分離することにより天然の免疫グロブリンから得てタンパク質分解酵素で処理して製造したものでもよく、形質転換された動物細胞又は微生物から得られた組換え体又はその誘導体でもよい。大腸菌Ecoli形質転換体から製造した組換えヒト免疫グロブリンFcであることが好ましい。一方、IgGもIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4サブクラスに分けられ、本発明にはこれらの組み合わせ又はハイブリッドも含まれる。IgG2及びIgG4サブクラスが好ましく、補体依存性細胞傷害CDC,Complementdependentcytotoxicityなどのエフェクター機能effectorfunctionのほとんどないIgG4のFcフラグメントが最も好ましい。すなわち、最も好ましい本発明の薬物キャリア用免疫グロブリンFcフラグメントは、ヒトIgG4由来のグリコシル化されていないFcフラグメントである。ヒト生体で抗原として作用し、抗原に対して新たな抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こし得る非ヒト由来のFcフラグメントに比べて、ヒト由来のFcフラグメントが好ましい。本発明に有用な持続型G-CSF結合体は、G-CSFと免疫グロブリンFcフラグメントを共に結合して製造する。これに関連して、G-CSFと免疫グロブリンFcフラグメントは、非ペプチドポリマーにより架橋してもよく、組換え技術を用いて融合タンパク質を形成してもよい。架橋の際に使用される非ペプチドポリマーは、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。生分解性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、PLAポリ乳酸、PLGAポリ乳酸グリコール酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。ポリエチレングリコールが好ましく、ポリエチレングリコールPEGが最も好ましい。また、当該分野で既に知られているこれらの誘導体や、当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体なども本発明の範囲に含まれる。本発明に有用な持続型G-CSF結合体は、韓国特許登録第10-0725315号に記載されているように、遺伝工学的方法を用いて製造することができる。本発明による液剤は、治療学的有効量の持続型G-CSF結合体を含む。一般に、G-CSFの治療学的有効量は、単回使用バイアルsingleusevial1本当たり約300mcgの量である。本発明で使用される持続型G-CSF結合体の濃度は7mg/ml~22mg/ml、好ましくは11mg/ml~22mg/mlである。本発明で使用された安定化剤という用語は、持続型G-CSF結合体が安定して保存されるようにする物質を意味する。安定化という用語は、所定時間の間、保存条件下で、活性成分の損失が特定量未満、一般に10未満であることを意味する。10°Cで2年間、25°Cで6カ月間又は40°Cで1~2週間の保存後にG-CSFが90以上、好ましくは95以上の初期活性を維持する場合、このような製剤は安定しているものと解される。G-CSFなどのタンパク質において、保存安定性は正確な投与量を保証するためだけでなく、G-CSF型の抗原性物質の潜在的な生成を抑制するためにも重要である。保存期間の間、G-CSF活性が約10の損失を示すが、これはG-CSFが組成物内で凝集体やフラグメントになって抗原性物質を形成しない限り、投与の際に許容されるものと解される。本発明における好ましい前記安定化剤は、持続型G-CSF結合体に安定性を付与するために考案された緩衝溶液及びマンニトールを含む。また、本発明による安定化剤は、アルブミンを含有しないことが好ましい。タンパク質の安定化剤として利用されるヒト血清アルブミンは、人体の血液から製造されるので、ヒト由来の病原性ウイルスによる汚染可能性がある。ゼラチンやウシ血清アルブミンは、疾患を引き起こしたり、一部の患者にアレルギー反応を引き起こす可能性がある。本発明のアルブミンフリー安定化剤は、ヒト又は動物由来の血清アルブミンや精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないので、ウイルス感染の恐れがない。前記安定化剤に含まれる緩衝溶液は、液剤のpHが急激に変化しないように溶液のpHを維持し、持続型G-CSF結合体を安定化する役割を果たす。本発明の緩衝溶液は、アルカリ塩リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム又はそれらの水素塩もしくは二水素塩、クエン酸ナトリウム/クエン酸、酢酸ナトリウム/酢酸及びそれらの組み合わせが含まれる薬学的に許容可能なpH緩衝剤を含んでもよい。本発明に好適な緩衝溶液としては、クエン酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、酒石酸緩衝溶液、炭酸緩衝溶液、コハク酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液があり、そのうちリン酸緩衝溶液phosphatebuffer及びクエン酸緩衝溶液citratebufferが好ましく、リン酸緩衝溶液がより好ましい。リン酸緩衝溶液において、リン酸塩は、好ましくは5~100mM、より好ましくは10~50mMの濃度である。緩衝溶液は、好ましくは40~80、より好ましくは50~70、最も好ましくは50~60のpHを有する。一実施形態によれば、使用された緩衝溶液のpH範囲による持続型G-CSF結合体の安定性を評価した。pH5.5において、pH5.5のクエン酸がpH6.0より持続型G-CSF結合体の安定性が増大したことを確認した表2及び表4参照。これらの結果から、本発明の持続型G-CSF結合体は緩衝液のpHにより安定化する程度が異なり、特定のpH範囲でより大きな安定性を示すことが分かる。特に、中性のpHで安定性を示すFcが結合した持続型G-CSF結合体の場合、低いpHの緩衝溶液を含む液剤を使用すると、むしろタンパク質の保存安定性が低下することを確認した。市販されているニューラスタNeulastaは、PEGが融合されたG-CSF薬物であり、pH4の酢酸緩衝溶液を含む安定化剤を使用している。しかし、本発明の持続型G-CSF結合体は野生型G-CSFより分子量及び体積が増加しているだけでなく、中性のpH範囲で免疫グロブリンFcが安定化するので、G-CSFの従来の安定化剤の組成及びpHをそのまま適用することは好ましくない。糖アルコールの一種であるマンニトールは、持続型G-CSF結合体の安定性を増大させる役割を果たすので、本発明の安定化剤として使用された。マンニトールは、好ましくは液剤の総体積比で1~20w/v、より好ましくは3~10w/v、最も好ましくは5~7w/vの濃度で使用される。本発明の一実施形態によれば、クエン酸緩衝溶液の存在下でマンニトールを安定化剤として使用すると、持続型G-CSF結合体の保存安定性がソルビトールsorbitolを使用する場合より増加するという結果が確認された表6参照。これらの結果は、他の安定化物質と比較して持続型G-CSF結合体の安定化剤としてのマンニトールの特異性を明らかにし、安定化の対象に応じて異なる安定化剤を適用しなければならないことを示す。前記安定化剤には、マンニトール及び緩衝溶液の組み合わせが持続型G-CSF結合体の安定化効果を低減しなければ、他の種類の糖アルコールをさらに含んでもよい。本発明の他の実施形態において、本発明に有用な安定化剤は、緩衝溶液及びマンニトールに加えて、等張化剤、多価アルコール、糖類、非イオン性界面活性剤及び中性アミノ酸からなる群から選択された少なくとも1つの成分をさらに含んでもよい。等張化剤は、持続型G-CSF結合体を溶液状で体内に投与すると浸透圧を適切に維持するだけでなく、持続型G-CSF結合体を溶液状でより安定化する役割を果たす。前記等張化剤としては水溶性無機塩が挙げられる。それらは、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びそれらの組み合わせである。塩化ナトリウムが最も好ましい。等張化剤の濃度は5~200mMであることが好ましい。この範囲内であれば、等張化剤の濃度は液剤が等張液になるように剤形に含まれる成分の種類及び量に応じて調節することができる。持続型G-CSF結合体の保存安定性を増大させるためにさらに含まれる糖類の好ましい例としては、マンノース、グルコース、フルクトース、キシロースなどの単糖類と、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デキストランなどの多糖類がある。液剤において、前記糖類は、好ましくは1~20w/v、より好ましくは5~20w/vの量で使用される。本発明に有用な多価アルコールの例としては、プロピレングリコール、低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、及び低分子量のポリプロピレングリコールが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。また、前記液剤において、これらの濃度は、好ましくは1~15w/v、より好ましくは5~15w/vである。非イオン性界面活性剤は、タンパク質溶液の表面張力を低減し、疎水性表面へのタンパク質の吸着や凝集を防止する。本発明に好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート系非イオン性界面活性剤及びポロキサマー系非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。ポリソルベート系非イオン性界面活性剤がより好ましい。そのうち、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60及びポリソルベート80が好ましく、ポリソルベート80がより好ましい。前記非イオン性界面活性剤を液剤に高濃度で使用することは好ましくない。非イオン性界面活性剤が高濃度で存在すると、UV分光法や等焦点法などに干渉を誘発し、タンパク質の濃度や安定性の正確な評価が困難になるからである。従って、本発明の液剤には、前記非イオン性界面活性剤が好ましくは0.1w/v又はそれ未満、より好ましくは0.001~0.05w/vの濃度で含まれる。持続型G-CSFの保存安定性について、ポリソルベート20をポリソルベート80と比較した。持続型G-CSF結合体は、ポリソルベート20と比較すると、ポリソルベート80の存在下で安定性が増加することを確認することができる表8参照。PEGが結合したG-CSFの薬物製剤であるニューラスタは、ポリソルベート20を使用する。しかし、本発明の液剤は、ポリソルベート20よりもポリソルベート80を使用したときに持続型G-CSF結合体の保存安定性がより増大した。これらの結果から、安定化対象薬物に応じて異なる界面活性剤を適用しなければならないことが分かる。本発明の一実施形態によれば、持続型G-CSF結合体は、非イオン性界面活性剤として001w/vポリソルベート80を含む液剤より、0005w/vポリソルベート80を含む液剤において、40°C、4週間の保存期間の間、より安定して維持されることを確認した表10参照。前記液剤の安定化剤として使用できるアミノ酸は、溶液状態でG-CSFの周辺により多くの水分子を引き寄せ、G-CSFの最外部の親水性アミノ酸分子をより安定化するWangIntJPharm1851291881999。これに関連して、電荷を有するアミノ酸は、G-CSFとの静電気的結合を誘導することができ、G-CSFの凝集を促進することができる。従って、一般にグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシンなどの中性アミノ酸を安定化剤として添加して使用する。液剤において、中性アミノ酸は、好ましくは01~10w/vの濃度である。本発明の一実施形態によれば、液剤の総体積比で3~12w/vの濃度のマンニトールを含む安定化剤は、大きな分子量のFcを有する持続型G-CSFを、中性アミノ酸を添加していない4週間の保存においても安定させた表12参照。従って、持続型G-CSF結合体に高い安定性を付与する液剤は、中性アミノ酸を添加しなくても、高濃度のマンニトールを利用することにより製作することができる。しかし、20w/v以上のマンニトール濃度は等張範囲を超える。従って、液剤において、マンニトールは1~20w/v、好ましくは3~10w/v、より好ましくは5~7w/vの濃度で使用される。緩衝溶液、等張化剤、糖アルコール、中性アミノ酸及び非イオン性界面活性剤が含まれる前述した成分以外にも、本発明の液剤には、本発明の効果を失わない範囲内で当業界で公知の他の成分が選択的にさらに含まれてもよい。本発明の好ましい一実施形態において、液剤は、アルブミンを含有せず、緩衝溶液、マンニトール、等張化剤及び非イオン性界面活性剤を含む。より具体的には、本発明は、持続型G-CSF結合体及び安定化剤を含む液剤を提供するが、前記安定化剤はリン酸又はクエン酸緩衝溶液、マンニトール、等張化剤及びポリソルベート80を含み、前記等張化剤は塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。前記液剤は、5~100mMの濃度でpH5~7のリン酸又はクエン酸緩衝溶液、1~20w/vの濃度のマンニトール、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択される5~200mMの濃度の等張化剤、並びに0.001~0.05w/vの濃度のポリソルベート80を含むことが好ましい。前記液剤は、5~100mMの濃度でpH5~6のクエン酸緩衝溶液、1~10w/vの濃度のマンニトール、100~200mMの濃度の塩化ナトリウム、及び0.001~0.05w/vの濃度のポリソルベート80を含むことがより好ましい。前記液剤は、20mMの濃度のクエン酸緩衝溶液pH5.2~5.8、3~7w/vの濃度のマンニトール、100~200mMの濃度のナトリウム、及び0.001~0.05w/vの濃度のポリソルベート80を含み、中性アミノ酸を含まないことが最も好ましい。本発明の一実施形態によれば、クエン酸ナトリウムNaCitrate緩衝溶液pH5.5、5w/vのマンニトール、150mMの塩化ナトリウム、及び0.005w/vのポリソルベート80を含む持続型G-CSF結合体の液剤におけるG-CSFの保存安定性を、公知のG-CSF製剤であるアムジェン社のニューラスタNeulastaと比較した。G-CSFは、pH4のクエン酸ナトリウム緩衝溶液を含む商業的に利用可能な製剤より、本発明の液剤のほうが安定していることを確認した表14参照。本発明の他の実施形態によれば、本発明によるpH5.5のクエン酸緩衝溶液、マンニトール、塩化ナトリウム及びポリソルベート80を含む持続型G-CSF結合体の液剤の長期保存安定性を分析し、その結果、持続型G-CSF結合体が6カ月間安定して維持され、加速条件下の6カ月後ですら、少なくとも96.6の活性を有することを確認した表16参照。これらの結果から、pH5~6の緩衝溶液及び1~20w/vの濃度のマンニトールを含む液剤は、持続型G-CSF結合体を前記製剤内で12カ月以上安定して保存できることが分かる。前述したように、本発明による緩衝溶液及びマンニトールを含む安定化剤は、持続型G-CSF結合体に特異的である。ヒト血清アルブミン及び他の人体に潜在的に有害な因子を含まないので、本発明による持続型G-CSF結合体の液剤はウイルス感染の恐れがなく、G-CSFと免疫グロブリンFcフラグメントの結合からなり、G-CSFの野生型に比べて分子量が大きく、作用持続期間が増加した持続型G-CSF結合体の優れた保存安定性を提供する。以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明するが、下記実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。実施例1持続型G-CSF結合体の製造<1-1>免疫グロブリンを利用した免疫グロブリンFcフラグメントの製造本実施例に有用な免疫グロブリンFcフラグメントは、ヒト非グリコシル化IgG4Fcフラグメントであり、韓国特許登録第725314号に記載された方法により大腸菌形質転換体から発現されたものである。<1-2>組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子の製造本実施例に使用された組換えヒトG-CSFは、野生型G-CSFの17番目のシステイン残基がセリンに置換された形態17Ser-G-CSFであり、韓国特許登録第356140号に記載された方法により大腸菌形質転換体から発現されたものである。<1-3>免疫グロブリンFcフラグメントを利用した持続型G-CSF結合体の製造本実施例における持続型G-CSF結合体は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子と免疫グロブリンFcフラグメントを非ペプチドポリマーで共有結合して製造した。また、前記結合体は、韓国登録特許第725314号及び第775343号に記載された方法により得られた。実施例2緩衝液のpHによる持続型G-CSF結合体の安定性評価実施例1で製造された前記G-CSF結合体の安定化のための液剤を製造するために、各種pHの緩衝溶液が持続型G-CSF結合体の安定性に及ぼす影響を試験した。分析のために、表1の持続型G-CSF結合体の液剤は、安定化剤としてマンニトール、界面活性剤としてポリソルベート80を使用し、緩衝溶液としてpH5.0、pH5.5又はpH6.0のクエン酸ナトリウム溶液を含む安定化剤組成で製造した。これらを40°Cで2週間保存し、その後サイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表2に示す。SE-HPLCは初期値に対する持続型G-CSF結合体の残存率を示す。表2に示すように、クエン酸ナトリウム緩衝溶液のpHが5.0の場合は1週間後にタンパク質の沈殿が発生した反面、pH5.5やpH6.0のクエン酸ナトリウム緩衝溶液を使用した場合は沈殿が検出されなかった。pH6.0よりpH5.5のクエン酸ナトリウム緩衝溶液下で持続型G-CSF結合体の安定性がより増大したことも確認された。緩衝溶液のpH値を細分化して下記実験を行った。下記表3の安定化剤組成で持続型G-CSF結合体の液剤を製造して40°Cで2週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーSizeexclusionchromatography,SE-HPLCで分析した。結果を下記表4に示す。表4のSE-HPLCは初期値に対する持続型G-CSF結合体の残存率を示す。表4に示すように、pH5.2~5.5のクエン酸ナトリウム緩衝溶液下で2週間の保存後に、持続型G-CSF結合体は初期活性が約90又はそれ以上維持されることを確認した。これらの結果から、本発明による持続型G-CSF結合体は使用される緩衝液のpH値により安定化する程度が異なり、特定のpH範囲で大きな安定性を示すことが分かる。特に、中性のpHで安定したFcがG-CSFと結合した持続型G-CSF結合体の保存安定性は、低いpHの緩衝溶液を含む液剤において減少することを確認した。実施例3糖アルコールによる持続型G-CSF結合体の安定性評価ソルビトールやマンニトールなどの糖アルコールが持続型G-CSF結合体の安定性に及ぼす影響を試験するために下記実験を行った。糖アルコールとしてマンニトール又はソルビトールを、等張化剤として塩化ナトリウムを、界面活性剤としてポリソルベートを含む下記表5の安定化剤組成で持続型G-CSF結合体の液剤を製造して40°Cで4週間保存し、その後サイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表6に示す。SE-HPLC面積/初期面積は初期値に対する持続型G-CSF結合体の残存率を示す。表6に示すように、安定化剤としてソルビトールに代えてマンニトールを使用すると、持続型G-CSF結合体がより安定して維持されることを確認した。実施例4非イオン性界面活性剤の種類による持続型G-CSF結合体の安定性評価クエン酸ナトリウム緩衝溶液の存在下で、各種非イオン性界面活性剤が持続型G-CSF結合体の安定性に及ぼす影響を試験するために下記実験を行った。分析のために、2種類の非イオン性界面活性剤であるポリソルベート80及びポリソルベート20を比較したが、後者は市販されているPEG融合G-CSFの液剤であるニューラスタNeulastaに含まれるものである。実施例2及び3において持続型G-CSF結合体に安定性を付与することが確認されたpH5.5のクエン酸ナトリウム緩衝溶液及びマンニトールを含む他の製剤を適宜組み合わせて使用した。ポリソルベートの種類を変えて下記表7の安定化剤組成で持続型G-CSF結合体の液剤を製造して40°Cで4週間保存し、その後サイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表8に示す。SE-HPLCは初期値に対する持続型G-CSF結合体の残存率を示す。表8に示すように、同一条件では、ポリソルベート80がポリソルベート20より持続型G-CSF結合体の保存安定性をさらに増加させることを確認した。40°Cで2週間の保存期間までは、両者の持続型G-CSF結合体の保存安定性に有意差はなかった。しかし、4週間後には、非イオン性界面活性剤は、その構造が非常に類似するにもかかわらず、保存安定性に有意差を示した。実施例5非イオン性界面活性剤の濃度による持続型G-CSF結合体の安定性評価実施例4において、ポリソルベート80がポリソルベート20より持続型G-CSFを安定化する上で優れることが確認された。本実施例においては、ポリソルベート80の濃度が持続型G-CSF結合体の安定性に及ぼす影響を試験した。このために、下記表9の安定化剤組成で持続型G-CSF結合体の液剤を製造して40°Cで4週間保存し、その後サイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表10に示す。SE-HPLCは初期値に対する持続型G-CSF結合体の残存率を示す。表10に示すように、40°Cで4週間保存した場合、0.01ポリソルベート80を含む液剤より0.005ポリソルベート80を含む液剤において、持続型G-CSF結合体がより安定することが確認された。実施例6アミノ酸による持続型G-CSF結合体の安定性評価安定化剤としてアミノ酸を使用する場合に、持続型G-CSF結合体の保存安定性にいかなる影響を及ぼすか試験した。クエン酸ナトリウム緩衝溶液pH6.0、マンニトール及び中性アミノ酸グリシンを含む安定化剤を用いて持続型G-CSF結合体の保存安定性を評価する実験を行った。下記表11の安定化剤組成で持続型G-CSF結合体の液剤を製造して40°Cで4週間保存し、その後サイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表12に示す。SE-HPLC面積/初期面積は初期値に対する持続型G-CSF結合体の残存率を示す。表12に示すように、中性アミノ酸であるグリシンを添加していない場合も、高濃度5w/vのマンニトールを含む液剤は、中性アミノ酸を添加した場合と同程度に持続型G-CSF結合体に保存安定性を付与することが分かる。実施例7持続型G-CSF結合体の液剤間の保存安定性の比較保存安定性について、実施例2~6で安定化能力を有することが証明された、クエン酸ナトリウム緩衝溶液pH5.5、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート80を含む安定化剤組成からなる液剤を、市販されているアムジェン社のG-CSF液剤であるニューラスタと比較した。本発明の液剤とニューラスタの組成を下記表13に示す。持続型G-CSF結合体の液剤を40°Cで2週間保存し、1週間毎に逆相クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表14に示す。RP-HPLCとSE-HPLCは初期値に対する持続型G-CSF結合体の残存率を示す。表14に示すように、長期保存後の本発明による持続型G-CSF結合体の液剤は、ニューラスタと同等又はより優れた保存安定性を示すことを確認した。これらの結果から、本発明の液剤は、持続型G-CSF結合体に特異的に優れた保存安定性を提供し得ることが分かる。実施例8持続型G-CSF結合体の液剤の長期保存及び加速安定性試験実施例2~6において最も保存安定性があると証明された、クエン酸ナトリウム緩衝溶液pH5.5、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート80を含む安定化剤組成からなる持続型G-CSF結合体の液剤の長期保存及びその加速安定性を分析するために、前記液剤を4°Cで12カ月間、続いて25°Cで6カ月間保存し、試料の保存安定性を分析した。結果を下記表15及び表16に示す。表15及び16のRP-HPLC、SE-HPLC、タンパク質含有量及び生物学的不活性試験は初期値に対する持続型G-CSF結合体の残存率を示す。表15及び表16に示すように、持続型G-CSF結合体は、本発明による安定化剤組成を含む液剤において6カ月間高い安定性を維持し、加速条件で6カ月間保存しても初期活性の92.5を有することが確認された。従って、本発明による持続型G-CSF結合体の液剤の効果的な保存安定性が確認された。本発明の好ましい実施例が例示的な目的で記載されたとしても、当業者であれば添付の請求の範囲に記載された本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、様々な変更、追加又は置換が可能であることを理解するであろう。"