"サンプルにおける少なくとも1つの標的核酸を検出する方法であって、A.該少なくとも1つの標的核酸を精製することであって、A1.該少なくとも1つの標的核酸を該少なくとも1つの標的核酸に特異的な少なくとも第1の核酸プローブを含むハイブリッドプローブセットとハイブリダイズすることにより、該少なくとも1つの標的核酸の二本鎖核酸ハイブリッドを生成すること、及び、A2.該サンプルから該二本鎖核酸ハイブリッドを分離し、少なくとも1つの精製された核酸を生成する、分離すること、により、該少なくとも1つの標的核酸を精製することと、B.該少なくとも1つの精製された核酸の少なくとも一部分を増幅し、増幅された核酸を生成する、増幅することと、C.該標的核酸を検出することであって、C1.該増幅された核酸を少なくとも1つの検出プローブセットと接触させることであって、C1a.該検出プローブセットの各検出プローブが検出可能な標識を有し、C1b.該検出プローブセットの少なくとも2つの検出プローブが同じ検出可能な標識を保有し、C1c.同じ検出可能な標識を保有する各プローブが同じ標識を有する他のプローブとは異なる融解温度Tmを有する、該増幅された核酸を少なくとも1つの検出プローブセットと接触させること、C2.該増幅された核酸とハイブリダイズした検出プローブの該検出可能な標識を検出及び特定すること、並びに、C3.該検出プローブが該増幅された核酸から解離する温度を検出すること、により、該標的核酸を検出することと、を含み、該標的核酸の同一性を、該検出可能な標識及び該検出プローブが該増幅された核酸から解離する温度の特定により決定することができる、サンプルにおける少なくとも1つの標的核酸を検出する方法。二本鎖核酸ハイブリッドが、該二本鎖核酸ハイブリッドをハイブリッド特異的な分子と接触させることにより該サンプルから分離される、請求項1に記載の方法。ハイブリッド特異的な分子の結合により、該標的核酸が固相に固定される、請求項2に記載の方法。ハイブリッド特異的な分子が固体支持体と結合するか、又は固体支持体と結合するように適合される、請求項2又は3に記載の方法。標的核酸を該固相に固定させたままで増幅する、請求項3又は4に記載の方法。二本鎖核酸ハイブリッドがDNA:RNAハイブリッドであり、該ハイブリッド特異的な分子が抗DNA:RNAハイブリッド抗体又はその断片である、請求項2~5のいずれか一項に記載の方法。標的核酸を等温増幅により増幅する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。等温増幅が、a鎖置換活性を有するポリメラーゼと、bランダムプライマーとを利用する、請求項7に記載の方法。等温増幅が全ゲノム増幅を含む、請求項7又は8に記載の方法。同じ検出可能な標識を含む各プローブがその融解温度に関して、少なくとも0.1°C、又は0.5°C~10°C、又は約1°C~約5°C、又は約5°C異なる、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。検出プローブセットの各プローブが、c1d:365±20nmの励起源により励起し、460±15nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、c1e:470±10nmの励起源により励起し、510±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、c1f:530±5nmの励起源により励起し、555±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、c1g:585±5nmの励起源により励起し、610±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、c1h:625±10nmの励起源により励起し、660±10nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、及び、c1i:680±5nmの励起源により励起し、712nmのロングパス検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、からなる群から選択される少なくとも1つのフルオロフォアを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。検出プローブセットが、プローブの少なくとも3つの群を含み、前記少なくとも3つの群のそれぞれの各プローブが、αc1d~c1iに記載の単一群内のフルオロフォアを含み、β同じ群の他のいかなるプローブとも少なくとも0.1°C異なる融解温度を有する、請求項11に記載の方法。検出プローブセットが、c1d:gyrA、gyrB-1、gyrB-2、parC及びparEからなる群から選択されるシプロフロキサシン耐性標的に特異的な少なくとも1つの検出プローブ、並びに、c1ecapB2、capB4、pXO1、pXO2、PLA、PIM、CAF1、tul4及びfopAからなる群から選択されるゲノム標的又はプラスミド標的に特異的な少なくとも1つの検出プローブ、を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。検出プローブセットが、マイコバクテリウムツベルクロシス、ストレプトコッカス属細菌、シュードモナス属細菌、赤痢菌属細菌、カンピロバクター属細菌、サルモネラ属細菌、A型呼吸器合胞体ウイルス、B型呼吸器合胞体ウイルス;アデノウイルス、HSV1、HSV2、A型/B型インフルエンザウイルス、hMPV、1型~4型パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、ボカウイルス、サイトメガロウイルスCMV、HIV、H1N1ウイルス、クラジミア、ナイセリアゴノレア、トリコモナスバギナリス、スタフィロコッカスアウレウス、SARS関連コロナウイルス、大腸菌、バシラスアンスラシス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エルシニアペスティス、ビブリオコレレ、フランシセラツラレンシス、ブルセラ属細菌、コクシエラバーネッティ、マクポウイルス、コクシジオイデスイミチス、コクシジオイデスポサダシ、バークホルデリアマレイ、バークホルデリアシュードマレイ、赤痢菌亜種細菌、リケッチアリケッチイ、リケッチアプロワツェキイ、クラミドフィラシタッシ、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡からなる群から選択される病原菌から誘導される核酸に特異的な少なくとも1つの検出プローブを含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。増幅された核酸を検出前に及び/又は検出中に断片化する、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。増幅された核酸を、A.該増幅された核酸を制限酵素若しくはヌクレアーゼ、又はその断片に接触させること、B.ランダムリボヌクレオチド一リン酸を該増幅された核酸に組み込むとともに、得られる増幅された核酸をアルカリ処理に供すること、並びに、C.超音波処理、噴霧及び流体力学的剪断からなる群から選択される手法により、該増幅された核酸を物理的に断片化すること、からなる群から選択される少なくとも1つの手法により断片化する、請求項15に記載の方法。増幅と検出とを同時に行う、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。検出プローブが該増幅された核酸から解離する該温度を、該増幅された核酸を二本鎖核酸特異的な色素と接触させることにより決定する、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。二本鎖核酸特異的な色素が、SYBR商標GreenI、SYBR商標Gold、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、PicoGreen、Hoechst33258、YO-PRO-I及びYO-YO-I、SYTO商標9、LCGreen商標、LCGreen商標Plus、並びにEvaGreen商標からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。それぞれが検出可能な標識を含む少なくとも3つの核酸プローブを含む検出プローブセットであって、A.該核酸プローブの少なくとも2つが同じ検出可能な標識を含み、B.各プローブが同じ検出可能な標識を含む他のいかなるプローブとも異なる融点を有する、それぞれが検出可能な標識を含む少なくとも3つの核酸プローブを含む検出プローブセット。融点が少なくとも0.1°C、又は0.5°C~10°C、又は約1°C~約5°C、又は約5°C異なる.請求項20に記載の検出プローブセット。a1:各プローブが、365±20nmの励起源により励起し、460±15nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、a2:各プローブが、470±10nmの励起源により励起し、510±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、a3:各プローブが、530±5nmの励起源により励起し、555±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、a4:各プローブが、585±5nmの励起源により励起し、610±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、a5:各プローブが、625±10nmの励起源により励起し、660±10nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、及び、a6:各プローブが、680±5nmの励起源により励起し、712nmのロングパス検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、からなる群から選択される少なくとも2つのプローブセットを含む、請求項20又は21に記載の検出プローブセット。標的核酸を検出するためのキットであって、A.少なくとも1つのハイブリッド捕捉プローブ、及び、B.請求項20~22のいずれか一項に記載の検出プローブセットを含み、任意で、C.ポリメラーゼ、又は鎖置換活性を有するポリメラーゼ、D.二本鎖核酸特異的な色素、又は少なくとも50、少なくとも80若しくは少なくとも99の飽和度を有する、若しくはSYBR商標GreenI、SYBR商標Gold、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、PicoGreen、Hoechst33258、YO-PRO-I、YO-YO-I、SYTO商標9、LCGreen商標、LCGreen商標Plus、及びEvaGreen商標からなる群から選択される、二本鎖核酸特異的な色素、E.抗DNA-RNAハイブリッド抗体、並びに、F.該抗ハイブリッド抗体に結合するように適合した固体支持体、G.変性試薬、H.ヘリカーゼ、並びに、I.増幅された核酸を断片化するための試薬、の内の1つ又は複数を含む、標的核酸を検出するためのキット。このため、少なくとも1つの特異的配列を含有する少なくとも1つの標的核酸の特異的かつ感度の高い単離及び分析のための方法及び組成物が必要となる。態様及び実施の形態における本開示は、1サンプルからの標的核酸の配列特異的な単離と、2単離された標的核酸の増幅と、3複数の検出可能に標識された核酸検出プローブを用いる標的核酸の検出であって、各プローブがa他の検出プローブと異なる検出可能な標識を有し、かつ/又はb同じ検出可能な標識を有するプローブと異なる融解温度を有する、複数の検出可能に標識された核酸検出プローブを用いる標的核酸の検出とを含む、少なくとも1つの標的核酸を検出する方法を提供することにより、これらの様々な要求及び課題に対処している。本開示は、かかる方法に使用されるキットにも関する。一態様では、本方法は、A.少なくとも1つの標的核酸を精製することであって、A1.少なくとも1つの標的核酸を少なくとも1つの標的核酸に特異的な少なくとも第1の核酸プローブを含むハイブリッドプローブセットとハイブリダイズすることにより、少なくとも1つの標的核酸の二本鎖核酸ハイブリッドを生成すること、及びA2.サンプルから二本鎖核酸ハイブリッドを分離し、少なくとも1つの精製された核酸を生成する、分離することを含む方法により、少なくとも1つの標的核酸を精製することと、B.少なくとも1つの精製された核酸の少なくとも一部分を増幅することと、C.標的核酸を検出することであって、C1.増幅された核酸を少なくとも1つの検出プローブセットと接触させることであって、C1a.検出プローブセットの検出プローブのそれぞれが検出可能な標識を有し、C1b.検出プローブセットの検出プローブの少なくとも2つが同じ検出可能な標識を保有し、C1c.同じ検出可能な標識を保有するプローブのそれぞれが同じ標識を有する他のプローブとは異なる融解温度Tmを有する、増幅された核酸を少なくとも1つの検出プローブセットと接触させること、C2.標識されたプローブがその核酸配列とハイブリダイズしているか否かを決定することにより、増幅された核酸を検出すること、並びにC3.各検出プローブが、該検出プローブが結合した核酸配列から解離する温度を検出することを含む方法により、標的核酸を検出することとを含む。1つの実施の形態では、二本鎖核酸ハイブリッドは、二本鎖核酸ハイブリッドを二本鎖核酸ハイブリッドと特異的に結合する分子、好ましくは抗DNA:RNAハイブリッド抗体に接触させることを含む方法によりサンプルから分離される。別の実施の形態では、標的を等温増幅、好ましくは全ゲノム増幅を含む方法により増幅する。別の実施の形態では、増幅された核酸を断片化した後で、それらを検出プローブセットと接触させる。別の実施の形態では、標的核酸は、マイコバクテリウムツベルクロシスMycobacteriumtuberculosis、ストレプトコッカス属細菌、シュードモナス属細菌、赤痢菌属細菌、カンピロバクター属細菌、サルモネラ属細菌、A型呼吸器合胞体ウイルス、B型呼吸器合胞体ウイルス;アデノウイルス、HSV1、HSV2、A型/B型インフルエンザウイルス、hMPV、1型~4型パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、ボカウイルス、サイトメガロウイルスCMV、HIV、H1N1ウイルス、クラジミア、ナイセリアゴノレアNeisseriagonorrhoeae、トリコモナスバギナリスTrichomonasvaginalis、スタフィロコッカスアウレウスStaphylococcusaureus、SARS関連コロナウイルス、大腸菌Escherichiacoli、バシラスアンスラシスBacillusanthracis、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エルシニアペスティスYersiniapestis、ビブリオコレレVibriocholerae、フランシセラツラレンシスFtularensis、ブルセラ属細菌、コクシエラバーネッティCoxiellaburnetii、マクポウイルス、コクシジオイデスイミチスCoccidioidesimmitis、コクシジオイデスポサダシCoccidioidesposadasii、バークホルデリアマレイBurkholderiamallei、バークホルデリアシュードマレイBurkholderiapseudomallei、赤痢菌亜種細菌、リケッチアリケッチイRickettsiarickettsii、リケッチアプロワツェキイRickettsiaprowazekii、クラミドフィラシタッシChlamydophilapsittaci、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、大痘瘡Variolamajor及び小痘瘡Variolaminorからなる群から選択される病原菌に特異的である。更なる態様では、少なくともハイブリッドプローブセットと、検出プローブセットとを含む、本明細書に開示される方法を行うためのキットが開示される。本開示は、サンプルにおける少なくとも1つの標的核酸の存在を決定するための方法、組成物、試薬及びキットを含む。この方法、組成物、試薬、システム及びキットを、病原生物の検出及び特定、並びに特定の疾患に対する遺伝的素因の検出を含むが、これらに限定されない臨床診断目的で使用することができる。他の態様では、この方法及び組成物は、法医学的用途又は生体防御用途における使用に適しているとされる。本明細書で使用される場合、プローブという用語は、別の核酸に結合することができる核酸である。本明細書で使用される場合、組織という用語は、乳房、前立腺、血液、血清、脳脊髄液、肝臓、腎臓、乳房、頭頸部、咽頭、甲状腺、すい臓、胃、結腸、結腸直腸colorectum、子宮、子宮頸部、骨、骨髄、精巣、脳、神経組織、卵巣、皮膚及び肺を含むが、これらに限定されないヒト、動物又は植物における任意の組織又は流体を表す。本明細書で使用される場合、プローブセットという用語は、特定の位置で核酸分子と相互作用することができる3つ以上の作用因子、すなわち配列のセットである。本明細書で使用される場合、標識はプローブと共有結合又は非共有結合する部分であり、そこで光学的手段又は他の物理的手段により検出することができるシグナルを発生させることができる。一態様では、サンプルにおいて少なくとも1つの標的核酸を検出する方法であって、1サンプルからの標的核酸の配列特異的な単離と、2単離された標的核酸の少なくとも一部分の増幅と、3複数の検出可能に標識された核酸検出プローブを用いる標的核酸の検出であって、各検出プローブがa他の検出プローブと異なる検出可能な標識を有し、かつ/又はb同じ検出可能な標識を有するプローブと異なる融解温度を有する、複数の検出可能に標識された核酸検出プローブを用いる標的核酸の検出とを含む、サンプルにおいて少なくとも1つの標的核酸を検出する方法が開示される。I.サンプル及びサンプル調製核酸が存在し得る任意のサンプルを出発点として使用することができ、これには臨床生物学的サンプル及び研究用生物学的サンプルを含む検体又は培養物例えば細胞培養物、微生物培養物及びウイルス培養物;環境サンプル、例えば水、粉塵、土及び空気のサンプル;食品サンプル及び農業サンプル;並びに精液、毛髪、血液、皮膚及び唾液のサンプルを含む法医学的サンプルが含まれるが、これらに限定されない。生物学的サンプルはヒトを含む動物由来のもの、流体、固体例えば糞便、又は組織、並びに乳製品、野菜、食肉及び食肉副産物等の液体又は固体の食品及び飼料の製品及び原料、並びに廃棄物であり得る。環境サンプルとしては、表層物質、土壌、水及び産業サンプル等の環境物質、並びに食品及び乳製品の加工用の機器、装置、設備、器具、使い捨て及び使い捨てではないnondisposable製品から得られるサンプルが挙げられる。別の態様では、サンプルは生物学的サンプルから抽出された核酸を含み得るか、これからなり得るか、又はこれから本質的になり得る。生物学的サンプル又は環境サンプルから核酸を抽出する方法が数多く知られており、これにはフェノール/クロロホルム抽出、アニオン交換クロマトグラフィ、塩化セシウム勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィ、及びシリカ/カオトロピック塩抽出が含まれるが、これらに限定されない。特定の核酸サイズを含むサンプルが望ましい場合、抽出した核酸を更に、ゲル電気泳動によりサイズに従って分離し、ゲルから抽出することができる。上で述べられるように、本明細書で開示される方法は、サンプルにおける少なくとも1つの標的核酸の検出及び/又はジェノタイピングに関する。少なくとも1つの標的核酸はDNA若しくはRNA、又はDNA及びRNAの両方であってもよく、一本鎖、二本鎖、又は部分的に一本鎖であってもよい。少なくとも1つの標的核酸はより大きな核酸内に含有されていてもよい。少なくとも1つの標的核酸又は少なくとも1つの標的核酸を含むより大きな核酸のいずれの検出も本開示で企図される。一態様では、核酸は自然発生的な又は合成による核酸であってもよく、これにはRNA、DNA、cDNA相補的DNA、LNAロックド核酸、mRNAメッセンジャーRNA、mtRNAミトコンドリアRNA、rRNAリボソームRNA、tRNAトランスファーRNA、nRNA核RNA、siRNA低分子干渉RNA、snRNA核内低分子RNA、snoRNA核小体低分子RNA、scaRNAカハール小体特異的RNA、マイクロRNA、dsRNA二本鎖RNA、リボザイム、リボスイッチ、ウイルスRNA、dsDNA二本鎖DNA、ssDNA一本鎖DNA、プラスミドDNA、コスミドDNA、染色体DNA、ウイルスDNA、mtDNAミトコンドリアDNA、nDNA核DNA、snDNA核内低分子DNA等、又はサンプルにおいてバルク核酸と区別することができる任意の他のクラス若しくはサブクラスの核酸が含まれるが、これらに限定されない。少なくとも1つの標的核酸は、生物学的サンプル及び環境サンプルを含む検体又は培養物例えば細胞培養物、微生物培養物及びウイルス培養物で見出される核酸を含み得るが、これらに限定されない。少なくとも1つの標的核酸は、ヒトを含む動物に由来する生物学的サンプル、流体、固体例えば糞便、又は組織、並びに乳製品、野菜、食肉及び食肉副産物等の液体又は固体の食品及び飼料の製品及び原料、並びに廃棄物中に見られるものであり得る。少なくとも1つの標的核酸は環境サンプル中に見られるものであってもよく、環境サンプルには表層物質、土壌、水及び産業サンプル等の環境物質、並びに食品及び乳製品の加工用の機器、装置、設備、器具、使い捨て及び使い捨てではない製品から得られるサンプルが含まれる。少なくとも1つの標的核酸は、他のウイルスvirus、細菌、抗酸菌又は変形体、例えばマイコバクテリウムツベルクロシス、ストレプトコッカス属細菌、シュードモナス属細菌、赤痢菌属細菌、カンピロバクター属細菌、サルモネラ属細菌、A型呼吸器合胞体ウイルス、B型呼吸器合胞体ウイルス;アデノウイルス、HSV1、HSV2、A型/B型インフルエンザウイルス、hMPV、1型~4型パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、ボカウイルス、サイトメガロウイルスCMV、HIV、H1N1ウイルス、クラジミア、ナイセリアゴノレア、トリコモナスバギナリス、スタフィロコッカスアウレウス、SARS関連コロナウイルス、大腸菌、バシラスアンスラシス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エルシニアペスティス、ビブリオコレレ、フランシセラツラレンシス、ブルセラ属細菌、コクシエラバーネッティ、マクポウイルス、コクシジオイデスイミチス、コクシジオイデスポサダシ、バークホルデリアマレイ、バークホルデリアシュードマレイ、赤痢菌亜種細菌、リケッチアリケッチイ、リケッチアプロワツェキイ、クラミドフィラシタッシ、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡由来であり得る。一態様では、少なくとも1つの標的核酸は、子宮頸部サンプル例えば子宮頸部スワブから得られるサンプル又は子宮頸部細胞サンプル、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、喀痰、尿及び精液、他のウイルス、細菌、抗酸菌又は変形体、例えばマイコバクテリウムツベルクロシス、ストレプトコッカス属細菌、シュードモナス属細菌、赤痢菌属細菌、カンピロバクター属細菌、サルモネラ属細菌、A型呼吸器合胞体ウイルス、B型呼吸器合胞体ウイルス;アデノウイルス、HSV1、HSV2、A型/B型インフルエンザウイルス、hMPV、1型~4型パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、ボカウイルス、サイトメガロウイルスCMV、HIV、H1N1ウイルス、クラジミア、ナイセリアゴノレア、トリコモナスバギナリス、スタフィロコッカスアウレウス、SARS関連コロナウイルス、大腸菌、バシラスアンスラシス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エルシニアペスティス、ビブリオコレレ、フランシセラツラレンシス、ブルセラ属細菌、コクシエラバーネッティ、マクポウイルス、コクシジオイデスイミチス、コクシジオイデスポサダシ、バークホルデリアマレイ、バークホルデリアシュードマレイ、赤痢菌亜種細菌、リケッチアリケッチイ、リケッチアプロワツェキイ、クラミドフィラシタッシ、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡のいずれか一つに関連する核酸に少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも98、少なくとも99又は100同一である。一態様では、少なくとも1つの標的核酸はHPV核酸である。別の態様では、HPV核酸はHR-HPV型のHPVDNAである。別の態様では、HPV核酸はLR-HPV型のHPVRNAである。別の態様では、少なくとも1つの標的核酸は、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型及び82型のHR-HPVのいずれか一つ、又は2型、3型、6型、7型、10型、11型、13型、27型、28型、30型、32型、40型、42型、43型、53型、54型、55型、61型、62型、67型、69型、70型、71型、72型、74型、81型、83型、84型、85型、86型、87型、89型、90型及び91型のLR-HPVのいずれか一つである。別の態様では、複数の標的核酸が標的となる。一態様では、複数の標的核酸は、異なるヌクレオチド配列を有する2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個又は100個の核酸のセットからなる。標的となる任意の核酸のセットを使用することができる。一態様では、複数の標的核酸はそれぞれが他のものに関連するように選択される。例えば、これに限定されないが、核酸のセットは、構造的に互いに関連するもの例えば遺伝子ファミリーの成員、機能的に互いに関連するもの例えば炎症誘発性サイトカインをコードする核酸、系統発生的に互いに関連するもの例えばウイルスのファミリーの異なる成員、例えばHPVファミリーウイルスに特異的な核酸、異なる細胞型若しくは組織型における差次的発現に関連するもの例えばマクロファージ関連核酸及び前立腺関連核酸、又は疾患状態に関連するもの子宮頸がん関連核酸であり得る。別の態様では、核酸のセットには関連がない。一態様では、標的核酸のセットは、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型及び82型のHR-HPV、又はその任意のサブセットを含むか、これからなるか、又はこれから本質的になる。別の態様では、標的核酸のセットは、2型、3型、6型、7型、10型、11型、13型、27型、28型、30型、32型、40型、42型、43型、53型、54型、55型、61型、62型、67型、69型、70型、71型、72型、74型、81型、83型、84型、85型、86型、87型、89型、90型及び91型のLR-HPV、又はその任意のサブセットを含むか、これからなるか、又はこれから本質的になる。別の態様では、標的核酸のセットは、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型及び82型のHR-HPV、又はその任意のサブセット、並びに2型、3型、6型、7型、10型、11型、13型、27型、28型、30型、32型、40型、42型、43型、53型、54型、55型、61型、62型、67型、69型、70型、71型、72型、74型、81型、83型、84型、85型、86型、87型、89型、90型及び91型のLR-HPV、又はその任意のサブセットを含むか、これからなるか、又はこれから本質的になる。別の態様では、少なくとも1つの標的核酸は、HPV、HPVの遺伝的変異体、HR-HPV型のHPVDNA、又はHR-HPV型のHPVRNAのいずれか一つに関連する核酸に少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも98、少なくとも99又は100同一である。別の態様では、少なくとも1つの標的核酸は、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型及び82型のHR-HPVのいずれか一つ、又は2型、3型、6型、7型、10型、11型、13型、27型、28型、30型、32型、40型、42型、43型、53型、54型、55型、61型、62型、67型、69型、70型、71型、72型、74型、81型、83型、84型、85型、86型、87型、89型、90型及び91型のLR-HPVのいずれか一つに関連する核酸に少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも98、少なくとも99又は100同一である。別の態様では、最大でもnotmorethan35~65のGCATリッチ、40~60のGCリッチ、45~55のGCリッチ、又は50~65のGCリッチである標的核酸が選ばれる。別の態様では、最近接ではない交差反応性の変異体又は種である標的核酸が選択される。サンプルを回収した後で、サンプルを変性試薬で処理し、少なくとも1つの標的核酸をハイブリダイゼーションさせやすくすることができる。一態様では、サンプルはアルカリ溶液を用いて変性させる。限定するものではないが、好適なアルカリとしては、NaOH及びKOHが挙げられる。タンパク質のアルカリ処理により、検体が効率的にホモジナイズされ、所与のサンプルの分析結果の再現性が確保される。このアルカリ処理は、サンプルの粘度を低減し、動態を増大させ、サンプルをホモジナイズし、サンプルにおける任意の内因性の一本鎖RNA核酸、DNA-RNAハイブリッド又はRNA-RNAハイブリッドを破壊することによりバックグラウンドを低減させることもできる。またこのアルカリ処理は、サンプルに存在し得るRNアーゼ及びDNアーゼ等の酵素を不活性化するのを助ける。当業者は、RNAが少なくとも1つの標的核酸である場合DNAではないasopposedto、フェノール抽出及びTCA/アセトン沈殿、並びにチオシアン酸グアニジン-フェノール-クロロホルム抽出用の試薬を含むが、これらに限定されない異なる試薬が好まれ得ることを理解するであろう。加熱工程を利用する、例えばサンプルを約95°Cに加熱して、核酸の鎖を分離するといったような他の変性方法を用いることができる。ヘリカーゼ等の酵素を使用することもできる。II.精製工程一態様では、配列特異的な精製工程は、1少なくとも1つの標的核酸に特異的な少なくとも1つの核酸プローブを標的核酸とハイブリダイズすることにより標的核酸の二本鎖核酸ハイブリッドを生成することと、2サンプルから二本鎖核酸ハイブリッドを分離し、精製された標的核酸を生成する、分離することとを含む。核酸を含むサンプルをハイブリダイゼーションのために調製した後に、この核酸を少なくとも1つのポリヌクレオチドハイブリッド捕捉プローブと、そのハイブリッド捕捉プローブがその相補体とハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させる。少なくとも1つのポリヌクレオチドハイブリッドプローブは完全長DNA、切断DNA若しくは合成DNA、又は完全長RNA、切断RNA若しくは合成RNAであり得る。少なくとも1つの標的核酸がDNAである場合、少なくとも1つのポリヌクレオチドハイブリッドプローブはRNAであってもよい。少なくとも1つの標的核酸がRNAである場合、プローブはDNAであってもよい。一態様では、単一ポリヌクレオチドプローブが精製工程に使用される。単一ポリヌクレオチドハイブリッド捕捉プローブは、単一標的核酸だけに特異的であっても、又はストリンジェントな条件下で複数の標的核酸とハイブリダイズするように設計してもよい。例えば、これに限定されないが、ポリヌクレオチドプローブは関連核酸の属の高度に保存された領域に対して設計することができ、これによりポリヌクレオチドプローブが、ストリンジェントな条件下でこの属の実質的に全ての核酸とハイブリダイズすることが予測される。別の態様では、複数のポリヌクレオチドプローブが精製工程に使用される。複数のポリヌクレオチドプローブは、単一標的核酸だけに特異的であっても、又は複数の標的核酸に特異的であってもよい。例えば、これに限定されないが、単一標的核酸に特異的な複数のポリヌクレオチドプローブを、標的核酸を断片化することにより生成することができる。一態様では、各標的核酸に少なくとも1つのポリヌクレオチドハイブリッドプローブが与えられる。別の態様では、各標的核酸に少なくとも2つのポリヌクレオチドハイブリッドプローブが与えられる。一態様では、ポリヌクレオチドハイブリッドプローブは、HPV、HPVの遺伝的変異体、HR-HPV型のHPVDNA、若しくはHR-HPV型のHPVRNA、又は16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型及び82型のHR-HPVのいずれか一つ、又は2型、3型、6型、7型、10型、11型、13型、27型、28型、30型、32型、40型、42型、43型、53型、54型、55型、61型、62型、67型、69型、70型、71型、72型、74型、81型、83型、84型、85型、86型、87型、89型、90型及び91型のLR-HPVのいずれか一つに関連する核酸に少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも98、少なくとも99又は100同一である核酸とハイブリダイズ又は結合することが可能である。別の態様では、プローブは、HPV、HPVの遺伝的変異体、HR-HPV型のHPVDNA、若しくはHR-HPV型のHPVRNA、又は16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型及び82型のHR-HPVのいずれか一つ、又は2型、3型、6型、7型、10型、11型、13型、27型、28型、30型、32型、40型、42型、43型、53型、54型、55型、61型、62型、67型、69型、70型、71型、72型、74型、81型、83型、84型、85型、86型、87型、89型、90型及び91型のLR-HPVのいずれか一つと相補的である。別の態様では、複数のポリヌクレオチドハイブリッドプローブが与えられ、この複数のポリヌクレオチドハイブリッドプローブは標的核酸のセットのそれぞれとハイブリダイズし、標的核酸のセットのそれぞれを精製するように選択される。一態様では、複数のポリヌクレオチドハイブリッドプローブは、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型及び82型のHR-HPVの核酸、又はその任意のサブセットからなる標的核酸のセットの各核酸とハイブリダイズすることが可能である。一態様では、複数のポリヌクレオチドハイブリッドプローブは、2型、3型、6型、7型、10型、11型、13型、27型、28型、30型、32型、40型、42型、43型、53型、54型、55型、61型、62型、67型、69型、70型、71型、72型、74型、81型、83型、84型、85型、86型、87型、89型、90型及び91型のLR-HPV、又はその任意のサブセットからなる標的核酸のセットの各核酸とハイブリダイズすることが可能である。一態様では、複数のポリヌクレオチドハイブリッドプローブは、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型及び82型のHR-HPVの核酸、又はその任意のサブセット、並びに2型、3型、6型、7型、10型、11型、13型、27型、28型、30型、32型、40型、42型、43型、53型、54型、55型、61型、62型、67型、69型、70型、71型、72型、74型、81型、83型、84型、85型、86型、87型、89型、90型及び91型のLR-HPV、又はその任意のサブセットからなる標的核酸のセットの各核酸とハイブリダイズすることが可能である。少なくとも1つの標的核酸を、アルカリ処理を用いて変性させる場合、1つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを中和ハイブリダイゼーションバッファとしても働くことができる塩基性変性試薬を中和するプローブ希釈剤で希釈することができる。DNAプローブ又はRNAプローブに使用されるプローブ希釈剤は、RNAの安定性に対してDNAで必要される要件が異なることから、異なり得る。例えば、プローブがRNAである場合、過度のアルカリ性がRNAを破壊する可能性があるため、初めにサンプルを中和し、次いでプローブを添加するか、又は代替的にRNAプローブと中和剤プローブ希釈剤とを同時にサンプルに添加することが好ましい。プローブ希釈剤を用いて、プローブを溶解させ、希釈し、またサンプルを略中性のpH、例えば約pH6~約pH9に戻すのを助け、ハイブリダイゼーションにより有利な環境を与えることができる。十分な容量のプローブ希釈剤、好ましくは2分の1容量のサンプルを用いて、塩基処理サンプルを中和することができる。完全長プローブでは、加熱したアルカリ溶液をサンプルに添加し、次いでプローブ希釈剤を室温でサンプルに添加した後、サンプルを再加熱するものとする。かかるプロセスは二次構造が形成されるのを抑えることができる。抗体は二次構造を有する構造体と不可逆的に結合する傾向がある。切断プローブ又は合成プローブ等の不完全長プローブを使用する場合、二次構造の問題が存在しないため、溶液又はサンプルの加熱の必要はないとされる。一態様では、切断プローブ又は合成プローブとともに使用する場合、サンプルは加熱しない。変性試薬による処理の後、一定量の中和バッファ、一態様では1つ又は複数のプローブが溶解した記載のプローブ希釈剤を、プローブと少なくとも1つの標的核酸とのハイブリダイゼーション又は結合が起こるのに適切な条件下でサンプルに添加することができる。中和バッファは単一緩衝塩を含有し得る。一態様では、中和バッファは単一緩衝塩以外含有しない。ハイブリダイゼーション条件は、サンプルにおいて1つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを、存在する場合に対応する相補的な核酸配列とアニーリングして、二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分なものである。本明細書に記載される特定のプローブ及び希釈剤に好適なハイブリダイゼーション条件が利用される。例えば、プローブ及びサンプル核酸を、ハイブリダイゼーション時間、好ましくは少なくとも約5分間~約30分間、約5分間~約20分間、又は約7分間~約15分間、又は約10分間、及び1つ又は複数のポリヌクレオチドプローブが対応する相補的な核酸配列とアニーリングするのに十分な上述の範囲内のいずれかの時間number、インキュベートすることができる。ハイブリダイゼーション条件には、少なくとも約65°C、約68.5°C及び約67°C~約70°C、並びに上述の範囲内のいずれかの温度numberのハイブリダイゼーション温度が含まれ得る。所与の少なくとも1つの標的核酸及び所与のプローブでは、当業者は、日常的な実験により所望のハイブリダイゼーション条件を容易に決定することができる。当業者は更に、ハイブリダイゼーションの時間と温度とを互いに最適化させなければならないことを理解するであろう。このため、より高いハイブリダイゼーション温度であれば、より短期間でハイブリダイゼーションを行うことができ、その逆もまた同様である。限定するものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、温度の増大、0.5M超へのイオン条件の増大例えばNaCl、又はPAAの濃度の低減により制御することができる。非限定的な例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、高温、例えば少なくとも約65°C、少なくとも約68.5°C、約67°C~約70°C、及び約69°C~約70°Cの高温でハイブリダイゼーション反応を行うことが含まれ得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、高温、例えば少なくとも約65°C、少なくとも約68.5°C、約67°C~約70°Cの高温も含まれ得る。一態様では、サンプルを回収媒体に懸濁し、少なくとも1つの標的核酸を、変性試薬を用いて変性させ、中和バッファに懸濁した核酸プローブとハイブリダイズする。別の態様では、中和バッファはプローブ希釈剤である。別の態様では、プローブ希釈剤は、2.2MBESN,N-ビス2-ヒドロキシエチル-2-アミノエタンスルホン酸、2.6ポリアクリル酸、0.7NNaOH及び0.05アジ化ナトリウムを含む。一態様では、標的核酸の配列特異的な精製がハイブリッド捕捉を用いて行われる。ハイブリッド捕捉は、DNA:RNAハイブリッドの生成、及びDNA:RNAハイブリッドと特異的に結合する分子を使用することによるDNA:RNAハイブリッドの単離を含む核酸を単離及び分析する方法を表す。ハイブリッド捕捉の様々な態様は、NazarenkoetalAnovelmethodofHPVgenotypingusingHybridCaptureRsamplepreparationmethodcombinedwithGP56PCRandmultiplexdetectiononLuminexRXMAPRJournalofVirologicalMethods1547681及びNazarenkoetalの米国特許第7,601,497号それぞれ、その全体が参照により本明細書に援用されるに記載されている。二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質RNアーゼRNaseH等であるが、これに限定されない、核酸アプタマーを含むが、これに限定されない、又は配列特異的な核酸が挙げられるが、これらに限定されない。アプタマーは、標的とハイブリダイズし、ハイブリダイズしたアプタマーを増幅して、この選抜プロセスを繰り返すことにより、配列のライブラリーから連続的に選択したランダム配列の短いストレッチである。一態様では、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子は、抗ハイブリッド抗体として知られる抗体により捕捉される。別の態様では、抗ハイブリッド抗体を支持体上に固定した後、二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉する。抗体を固体支持体に固定する方法が当該技術分野で既知である。例えば、これに限定されないが、抗体は固体支持体に共有結合的に連結することができる。別の例として、抗体は、例えばタンパク質間相互作用、プロテインGビーズ、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用、カルボキシル基若しくはトシル基等へのEDACの結合、又は例えばアフィニティカラムで配列特異的な核酸を用いた固体支持体上への直接的なハイブリダイゼーションにより支持体上に吸着することができる。別の態様では、抗ハイブリッド抗体を二本鎖核酸ハイブリッドと複合体形成した後、固体支持体上に固定することができる。例えば、これに限定されないが、抗ハイブリッド抗体をビオチン標識にコンジュゲートすることができ、支持体をストレプトアビジン部分にコンジュゲートすることができる。それから抗ハイブリッド抗体/二本鎖核酸ハイブリッド複合体を固体支持体の非存在下で与えることができる。固体支持体を反応混合物に添加する場合、抗ハイブリッド抗体/二本鎖核酸ハイブリッド複合体を、ビオチンコンジュゲートとストレプトアビジン部分との間の相互作用により固体支持体に固定する。支持体としては、ビーズ;磁性ビーズ常磁性ビーズ、反磁性ビーズ、強磁性ビーズを含む、カラム、プレート、ろ紙、ポリジメチルシロキサンPDMS;ディップスティック;コーティングした管、プレート及びディッシュ;並びに樹脂カラムが挙げられるが、これらに限定されない。液相の抽出が可能であり、結合抗体と結合していない抗体とを分離する能力があれば、あらゆる支持体を使用することができる。ビーズを固定するのに、磁場を印加する場合、常磁性ビーズが、溶液中に残り、液相を抽出又はデカンテーションすることができるという点で特に有用である。電荷の切り替え又はシリカ捕捉を利用する磁場を印加しない他のビーズを使用することもできる。固定された抗ハイブリッド抗体が二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉するのに十分な時間、ハイブリッドを支持体に付着した抗ハイブリッド抗体とインキュベートした。一態様では、支持体はビーズである。抗ハイブリッド抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。一態様では、抗体はモノクローナル抗体である。一態様では、抗体は、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリドEDACリンカーにより支持体に結び付く。一態様では、支持体はポリスチレンビーズである。一態様では、抗体と結び付いた支持体又はビーズをビーズ希釈バッファで希釈する。ビーズ希釈バッファは、ビーズ上のタンパク質変性を最小限に抑えるのに有用である。ビーズ希釈バッファの一例は、6カゼイン、100mMTris-HCl、300mMNaCl及び0.05アジ化ナトリウムを含む。一態様では、抗ハイブリッド抗体をコーティングしたビーズを、約67°C~約70°Cで約30分間、サンプルとインキュベートする。別の態様では、ビーズ及びサンプルを約68°C~約69°Cで約30分間、インキュベートする。更に別の態様では、ビーズ及びサンプルを約68.5°Cで30分間インキュベートする。インキュベーション時間は、約5分間~約60分間、約15分間~約45分間、約20分間~約40分間、又は上述の範囲内のいずれかの時間の範囲とすることができ、一般的に温度とは反比例関係である。インキュベーション時間、温度及び/又は振盪条件を、所望のように代替的な捕捉動態を達成するように変更することができることが、当業者により理解されるであろう。上記のような少なくとも1つの標的核酸/プローブハイブリッドの捕捉の後に、捕捉されていない核酸を洗い流すことにより、残りのサンプルから捕捉されたハイブリッドを分離することができる。III.増幅工程少なくとも1つの標的核酸を精製したら、これを増幅する。この時点で増幅を行い、少なくとも1つの標的核酸の量を増大させることにより、本方法の感度を増大させる。様々な増幅方法を適用することができ、これらは例えば、ローリングサイクル増幅例えば、LiuetalRollingcircleDNAsynthesisSmallcircularoligonucleotidesasefficienttemplatesforDNApolymerasesJAmChemSoc11815871594、等温増幅例えばWalkeretalStranddisplacementamplificationanisothermalinvitroDNAamplificationtechniqueNucleicAcidsRes2016916、リガーゼ連鎖反応例えば、LandegrenetalALigaseMediatedGeneDetectionTechniqueScience241107710801988、又はWiedmannetalLigaseChainReactionOverviewandApplications、PCR方法及び適用ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborLaboratoryNY11994ppS51S64である。核酸増幅は、大きく温度サイクリングtemperaturecycled増幅及び等温増幅の2つのカテゴリーに分けることができる。温度サイクリング増幅では、通常、温度を標的核酸の融点を超えて上昇させ、あらゆる二本鎖部分を融解させてmelt、次いでオリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸の一本鎖部分とアニーリングする温度点まで低下させ、それからプライマーのアニーリングが維持され、かつポリメラーゼが活性である温度まで再び上昇させる。等温増幅では、温度サイクリングなしでの増幅を可能にする作用物質を反応混合物に添加する。例えば、ヘリカーゼ依存的な増幅HDAでは、ヘリカーゼ活性を有する酵素を増幅混合物に添加する。本明細書で使用される場合、ヘリカーゼ又はヘリカーゼ活性を伴う又はヘリカーゼ活性を有する酵素は、二本鎖核酸を解くことが可能な任意の酵素を表す。ヘリカーゼには二本鎖核酸を解く機能があり、このため反復融解サイクルの必要がなくなる。例示的なヘリカーゼとしては、大腸菌ヘリカーゼI、大腸菌ヘリカーゼII、大腸菌ヘリカーゼIII及び大腸菌ヘリカーゼIV、Rep、DnaB、PriA、PcrA、T4Gp41ヘリカーゼ、T4Ddaヘリカーゼ、T7Gp4ヘリカーゼ、SV40ラージT抗原、酵母RADが挙げられる。有用であり得る更なるヘリカーゼには、RecQヘリカーゼ、サーモアナエロバクターテングコンジェンシスTtengcongensis及びサーマスサーモフィラスTthermophilus由来の熱安定性UvrDヘリカーゼ、サーマスアクアティカスTaquaticus由来の熱安定性DnaBヘリカーゼ、並びに古細菌生物及び真核生物由来のMCMヘリカーゼが含まれる。別の例としては、ニック開始性nickinitiated:切れ目開始性増幅NIAでは、ニック誘導剤を用いて、核酸骨格のホスホジエステル結合の破壊を誘導する。それから鎖置換活性を有するポリメラーゼにより、プライマーとして核酸の一方の鎖と、鋳型としてもう一方の鎖とを用いて、ニックの部位で増幅を開始することができる。本明細書で使用される場合、ニック誘導剤は、二本鎖核酸の一方の鎖での2つの隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合の破壊を導入する任意の酵素試薬若しくは化学試薬、又は物理的処理剤を表す。ニック誘導酵素の例としては、Bpu10I、BstNBI、AlwI、BbvCI、BbvCI、BsmI、BsrD及び大腸菌エンドヌクレアーゼIが挙げられる。開示される方法における増幅は温度サイクリング増幅又は等温増幅のいずれかであり得る。増幅の例示的な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、逆転写酵素RT反応、RT-PCR、HDA、RT-HDA、高温thermophilicヘリカーゼ依存的な増幅tHDA、RT-tHDA、全ゲノム増幅WGA、RT-WGA、リガーゼ連鎖反応LCR、RT-LCR、NIA及びRT-NIAが挙げられるが、これらに限定されない。増幅反応を配列依存的な増幅又は配列非依存的な増幅に更に分けることができる。配列依存的な増幅は、標的特異的なプライマーを用いた、サンプルに存在する非標的配列に対する標的配列の特異的な増幅を表す。本明細書で使用される場合、標的特異的なプライマーは、標的核酸上の所定の一本鎖領域と結合し、標的核酸のポリメラーゼ依存的な複製を促進させ、選択的に増大させることが可能な一本鎖核酸を表す。一態様では、増幅は配列特異的な増幅である。別の態様では、一方が各標的核酸内の標的配列の5’側とハイブリダイズし、もう一方が標的配列の3’側とハイブリダイズする標的特異的なプライマー対を用いて、標的配列の指数関数的な増幅を達成する。このため全ての標的核酸が遺伝子型を決定しようとしている可変領域を含み、また可変領域の両側に保存領域が隣接するような配置が有用である。別の態様では、標的特異的な複数のプライマー対を、同時に複数の標的核酸を増幅するために単一反応で利用する。概して、好適な標的特異的なプライマー対は、短い合成オリゴヌクレオチド、例えば10ヌクレオチド長を超え、かつ50ヌクレオチド長未満の合成オリゴヌクレオチドである。標的特異的なオリゴヌクレオチドプライマー設計は、ストリングベースのアラインメントスコア、融解温度、プライマー長及びGC含量等の様々なパラメータを含む。標的特異的なプライマーを設計する場合、重要な要素の一つは、増幅される核酸分子に特異的な標的断片内の配列を選ぶことである。別の重要な要素は、反応のために標的特異的なプライマーの融解温度を算出することである。標的特異的なプライマーの融解温度は、そのオリゴヌクレオチドの長さ及びGC含量により決定される。一態様では、プライマーの融解温度はプライマーのハイブリダイゼーション及び標的の増幅が起こる温度よりも約10°C~30°C高い。プライマーハイブリダイゼーションは、プライマーが鋳型鎖の或る領域でその相補配列とだけ特異的に結合し、鋳型の他の領域とは結合しない条件下での一本鎖核酸鋳型の領域とのオリゴヌクレオチドプライマーの結合を表す。ハイブリダイゼーションの特異性は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さ、ハイブリダイゼーション反応を行う温度、イオン強度及び反応混合物のpHにより影響を受け得る。標的特異的なプライマーはそれぞれ、標的核酸の各末端とハイブリダイズし、鋳型として標的ヌクレオチド配列を用いてポリメラーゼにより3’から5’の方向へと伸長することができる。特異的な増幅を達成するために、相同的な又は完全に一致した標的特異的なプライマーが好ましい。しかしながら、標的特異的なプライマーは、5’末端に標的ヌクレオチド配列複数も可と非相補的な配列を含んでいてもよい。代替的に、標的特異的なプライマーは、全体にわたって標的核酸と正確に相補的ではないヌクレオチド又は配列を含有していてもよい。標的特異的なプライマーは、デオキシリボヌクレオチド塩基A、T、G若しくはCのいずれか、及び/又は1つ若しくは複数のリボヌクレオチド塩基A、C、U、G、及び/又は1つ若しくは複数の修飾ヌクレオチドデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドここで修飾は、核酸とのプライマーのハイブリダイゼーション、又は標的特異的なプライマーの伸長、又は二本鎖分子の変性を防がないものとするを含み得る。標的特異的なプライマーをホスホロチオエート若しくはメチルホスホネート等の化学基で、又は非ヌクレオチドリンカーで修飾し、その性能を高めるか、又は増幅産物の特性化を促進することができる。概して、標的特異的なプライマー-鋳型の認識の特異性を可能にするのに好適な変性、及び続くアニーリングの温度は或る温度範囲、例えば20°C~75°Cにわたるものであり得る。好ましい変性温度は、どのヘリカーゼが融解プロセスで選択されるかに応じて選択することができる。選択されたヘリカーゼの存在下での核酸の増幅に最適な温度を決定する試験を、反応混合物の温度を変更し、ゲル電気泳動を用いて増幅産物を比較することで日常的な実験により決定することができる。更なる態様では、増幅は配列非依存的な増幅である。本明細書で使用される場合、配列非依存的な増幅は、特定の配列を増幅しない任意の増幅を表す。例えば、これに限定されないが、ランダムプライマー混合物又はニック誘導剤を用いて、配列非依存的な増幅を開始することができる。本明細書で使用される場合、ランダムプライマー混合物は、ランダムに生成された短いオリゴヌクレオチド配列の混合物を表す。本明細書で使用される場合、ニック開始性ポリメラーゼ活性は、外因性プライマーの非存在下でのポリメラーゼ活性を表し、これは鋳型における一本鎖破壊により開始する。合成は、外因性の合成プライマーの末端ではなくDNAにおいて一本鎖破壊が起こった場所で開始する。ニック開始性合成では、プライマーの除去が不必要であり、コスト、操作時間、及び産物の喪失又は分解の可能性が低減する。加えて、ニック開始性合成はプライマーの自己伸長により引き起こされる誤った増幅シグナルを低減する。ニックは、認識配列に切れ目を入れる酵素を用いることにより、規定の場所に導入することができるか、又は標的ポリヌクレオチドにランダムに導入することができる。本明細書で使用される場合、ニック誘導剤は、二本鎖核酸の一方の鎖での2つの隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合の破壊を導入する任意の酵素試薬若しくは化学試薬、又は物理的処理剤を表す。ニック誘導酵素の例としては、Bpu10I、BstNBI、AlwI、BbvCI、BbvCI、BsmI、BsrD及び大腸菌エンドヌクレアーゼIが挙げられる。一態様では、少なくとも1つのニック誘導酵素が、反応混合物におけるヘリカーゼの代替物として含まれる。別の態様では、少なくとも1つのヘリカーゼに加えて少なくとも1つのニック誘導酵素を反応混合物に添加する。一態様では、増幅は等温増幅である。別の態様では、等温増幅は全ゲノム増幅WGAである。WGAは、鋳型として標的核酸配列を用いてアンプリコンを生成するのに非特異的なプライマーを用いる等温プロセスである。複数のランダムプライマーを用いるため、WGAを用いると、実質的に標的核酸を含む分子全体を増幅することができる。例えば、Phi29DNAポリメラーゼを非特異的なプライマーと併用して、標的核酸配列を増幅することができる。ポリメラーゼは標的核酸配列に沿って移動しながら、相補的な鎖を置換することができる。置換された鎖は複製のための鋳型となり、これにより生成される高分子量のDNAの収率が高くなる。一態様では、WGA反応を、少なくとも1つのヘリカーゼ、少なくとも1つのニック誘導剤、又はその両方を含むように変更するmodified。WGAの様々な態様は、Nazarenkoetalの米国特許第7,601,497号これはその全体が参照により本明細書に援用されるに記載される。IV.検出工程標的核酸は、1その標的核酸を複数のポリヌクレオチド検出プローブを含む少なくとも1つの検出プローブセットと、検出プローブのそれぞれをその相補体とハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させること、2ポリヌクレオチド検出プローブの少なくとも1つのハイブリダイゼーションを検出すること、及び3標的核酸とハイブリダイズしたポリヌクレオチド検出プローブの融解温度Tmを決定することにより、増幅された核酸のプールから検出される。検出プローブセットのポリヌクレオチド検出プローブは完全長DNA、切断DNA若しくは合成DNA、又は完全長RNA、切断RNA若しくは合成RNAであり得る。少なくとも1つの捕捉プローブは少なくとも1つの標的核酸の同一性とは関係なしにDNA、RNA、synRNA又はPNAであり得る。ポリヌクレオチド検出プローブは、検出可能な標識を受容し得るように検出可能に標識又は適合するものとする。さらに、検出プローブセットは、1複数の検出プローブの内の少なくとも2つが同じ検出可能な標識を有し、2複数の検出プローブの内の少なくとも2つが異なる検出可能な標識を有し、3同じ検出可能な標識を有する複数の検出プローブのいずれもが異なる融解温度Tmを有するように構築されるものとする。本明細書に記載される特定のプローブ及び希釈剤に好適なハイブリダイゼーション条件が利用される。例えば、プローブ及びサンプル核酸を、ハイブリダイゼーション時間、好ましくは少なくとも約5分間~約30分間、約5分間~約20分間、又は約7分間~約15分間、又は約10分間、及び1つ又は複数のポリヌクレオチドプローブが対応する相補的な核酸配列とアニーリングするのに十分な上述の範囲内のいずれかの時間、インキュベートすることができる。ハイブリダイゼーション条件には、少なくとも約65°C、約68.5°C及び約67°C~約70°C、並びに上述の範囲内のいずれかの温度のハイブリダイゼーション温度が含まれ得る。所与の少なくとも1つの標的核酸及び所与のプローブでは、当業者は、日常的な実験により所望のハイブリダイゼーション条件を容易に決定することができる。当業者は更に、ハイブリダイゼーションの時間と温度とを互いに最適化させなければならないことを理解するであろう。このため、より高いハイブリダイゼーション温度であれば、より短期間でハイブリダイゼーションを行うことができ、その逆もまた同様である。限定するものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、温度の増大、0.5M超へのイオン条件の増大例えばNaCl、又はPAAの濃度の低減により制御することができる。非限定的な例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、高温、例えば少なくとも約65°C、少なくとも約68.5°C、約67°C~約70°C、及び約69°C~約70°Cの高温でハイブリダイゼーション反応を行うことが含まれ得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、高温、例えば少なくとも約65°C、少なくとも約68.5°C、約67°C~約70°Cの高温も含まれ得る。本明細書で用いられる全てのプローブハイブリッド捕捉プローブ及び検出プローブを含むは少なくとも1つの標的核酸とだけ特異的に結合する短い合成RNAプローブであり得る。例としては、2009年4月17日付けで出願された米国特許出願第12/426,076号その内容全体が参照により本明細書に援用されるに記載される。一態様では、検出工程は、1増幅された核酸を少なくとも4つの検出プローブを含む検出プローブセットと接触させることであって、a検出プローブのそれぞれが核酸配列に特異的であり、b検出プローブの内の少なくとも2つが同じ標識を保有し、c同じ標識を保有するプローブのそれぞれが加熱によりそれらの標的核酸配列から解離する場合、それらのプローブは同じ標識を有する他のプローブと少なくとも2°C異なる融解温度Tmを有する、増幅された核酸を少なくとも4つの検出プローブを含む検出プローブセットと接触させることと、2標識されたプローブがその核酸配列に結合しているか否かを決定することにより標識核酸を検出することと、3それぞれの所与の標識されたプローブが、それが結合している核酸配列から解離する温度を検出することとを含む。同様の方法が先だって国際公開第2009135832号その全体が参照により本明細書に援用されるに記載されている。一実施形態では、検出プローブセットは少なくとも4つの検出プローブを含み、少なくとも2つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも4つの検出プローブを含み、少なくとも3つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも5つの検出プローブを含み、少なくとも2つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも5つの検出プローブを含み、少なくとも3つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも5つの検出プローブを含み、少なくとも4つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも6つの検出プローブを含み、少なくとも2つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも6つの検出プローブを含み、少なくとも3つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも6つの検出プローブを含み、少なくとも4つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも7つの検出プローブを含み、少なくとも2つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも7つの検出プローブを含み、少なくとも3つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも7つの検出プローブを含み、少なくとも4つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも8つの検出プローブを含み、少なくとも2つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも8つの検出プローブを含み、少なくとも3つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも8つの検出プローブを含み、少なくとも4つの検出プローブが同じ標識を保有する。検出プローブの標識は蛍光標識であり得る。蛍光標識が用いられる場合、2つ以上の標識が0°C~約10°C異なる最大発光波長を有すれば、それらは同じ標識であるとみなす。一実施形態では、同じ標識を有する検出プローブが、少なくとも約2°C、少なくとも約5°C、約5°C~約10°C、約5°C~約8°C、約5°C~約7°C、約5°C~約6°C異なる融解温度を有する。本明細書において温度値との関連で、約という用語は温度値の最大±10の偏差を含むように理解される。一実施形態では、検出工程は、1増幅された核酸を少なくとも2つの検出プローブセットと接触させることであって、a各検出プローブセットが少なくとも3つの検出プローブからなり、b検出プローブのそれぞれが核酸配列に特異的であり、c所与の検出プローブセットにおける検出プローブのそれぞれが異なる標識を保有し、d所与の検出プローブセットにおける検出プローブの全てが加熱によりそれらの標的核酸配列から解離する場合、それらのプローブは同様の又は同一の融解温度Tmを有する、増幅された核酸を少なくとも2つの検出プローブセットと接触させることと、2標識された検出プローブがその核酸配列に結合しているか否かを決定することにより増幅された核酸を検出することと、3それぞれの所与の標識された検出プローブが、それが結合している核酸配列から解離する温度を検出することとを含む。更なる実施形態では、本方法は少なくとも3つの検出プローブセットを含み、各検出プローブセットは少なくとも3つの検出プローブからなる。検出プローブセットは少なくとも3つの検出プローブを含む。検出プローブセットは、共通の標識を共有するそれらの全ての検出プローブだけでなく、共通の融解温度Tmを共有するそれらの全ての検出プローブとして見ることができる。理想的には、同じ標識又は互いに区別することができない標識を有する検出プローブセットにおける検出プローブは異なる融解温度を有する。同一の又は非常に類似した融解温度を有する検出プローブセットにおける検出プローブは異なる標識を有するものとする。本明細書に開示される方法を用いて、20個の異なる標的核酸の多重検出を単一反応で行うことができる。一実施形態では、5つの異なる標識が用いられ、共通の標識を共有する全ての検出プローブはわずかに異なる融解温度を有する。一方で共通の融解温度を共有する全ての検出プローブは異なる標識を有する。増幅中又は増幅後のいずれかで標識及び融解温度を検出することにより、本発明者らは初めて、例えば1つの管における上記の20個の鋳型の分析を可能にする手段を提供した。原則として、この標識されたプローブがその核酸配列に結合しているか否かを決定することにより増幅された核酸を検出すること及びそれぞれの所与の標識されたプローブが、それが結合している核酸配列から解離する温度を検出することを、所与の反応の終了時に又は反応中に行うことができる。第1の及び第2の又は更なる検出プローブセットにおける検出プローブの標識は、蛍光標識であり、非常に類似した発光波長を有する。このため理想的には、標識は、検出装置により検出することができる波長調整を変えることなく検出することができる。第1の、第2の及び第3の又は更なる検出プローブセットにおけるプローブの標識が同一であることが好ましい。一実施形態では、標識は、FAM5-カルボキシフルオレセイン又は6-カルボキシフルオレセイン、VIC、NED、フルオレセイン、FITC11RD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA1JOE、ROX、BODIPYTMR、OregonGreen、RhodamineGreen、RhodamineRed、TexasRed、YakimaYellow、AlexaFluorPET、BiosearchBlue商標、MarinaBlue商標、BothellBlue商標、AlexaFluor商標350FAM商標、SYBR商標Green1、フルオレセイン、EvaGreen商標、AlexaFluor商標488JOE商標、VIC商標、HEX商標、TET商標、CALFluor商標Gold540、YakimaYellow商標、ROX商標、CALFluor商標Red610、Cy3.5商標、TexasRed商標、AlexaFluor商標568Cy5商標、Quasar商標670、LightCyclerRed640商標、AlexaFluor633Quasar商標705、LightCyclerRed705商標、AlexaFluor商標680、SYTO商標9、LCGreen商標、LCGreen商標Plus、EvaGreen商標の群から選択される蛍光標識である。一実施形態では、同じ標識を保有するプローブは、それらが所与の機器で融点により区別可能であるように融解温度Tmが異なる、典型的に0.1°C、0.2°C、0.3°C、0.4°C、0.5°C、1°C、1.5°C、2°C、2.5°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C又は10°Cを超える融解温度の差異を有する。融解温度の差異が1°C、1.5°C、2°C、2.5°C、3°C、4°C、5°Cを超えるのが好ましい。一実施形態では、二本鎖セグメントの融解転移は、二本鎖核酸特異的なdsNAS色素の蛍光強度をモニタリングすることにより決定することができる。一実施形態では、二本鎖核酸特異的な色素は、SYBR商標GreenI、SYBR商標Gold、臭化エチジウム、臭化プロピジウム、PicoGreen、Hoechst33258、YO-PRO-I及びYO-YO-I、SYTO商標9、LCGreen商標、LCGreen商標Plus、EvaGreen商標からなる群から選択される。これらの飽和色素は、PCRの阻害を最小限に抑えながら、増幅中に又は増幅後にDNAに関して十分に飽和する条件で存在することが可能である。例えば、最大のPCR相溶性濃度で、dsDNA結合色素は少なくとも50の飽和度を有する。他の実施形態では、飽和度は少なくとも80である。更に別の実施形態では、飽和度は少なくとも99である。飽和度は飽和濃度での同じ色素の蛍光と比較した蛍光度であると理解される。飽和濃度は所定の量のdsDNAの存在下で可能な限り最大の蛍光強度を与える濃度である。これらの色素は、或る特定の核酸反応に顕著に干渉することなく顕著に高い濃度で存在し得るため、これらの色素は一本鎖核酸及びdsDNAの立体構造をモニタリングするのに特に有用であり得る。本開示の検出方法の利点の一つOneは、検出を増幅工程と同時に行うことができることである。この特徴により、全方法が閉管フォーマットで実施される。本方法の閉管フォーマットの例示的なワークフローを図1に示す。検出プローブは、様々な標的、例えば疾患マーカー、病原菌、法医学的マーカー又は増幅により対処することができる任意の他の標的に特異的であり得る。本明細書に開示される方法は特に、病原菌の分析に適している。このため、一実施形態では、プライマー及びプローブは1つ又は複数の病原性細菌又はウイルスに特異的である。最も一般的な細菌性疾患は、マイコバクテリウムツベルクロシス細菌により引き起こされ、年間約200万人の死者を出しているほとんどがサハラ以南のアフリカにおけるものである結核症である。病原性細菌は、他の世界的に重大な疾患、例えばストレプトコッカス属細菌及びシュードモナス属細菌等の細菌により引き起こされ得る肺炎、並びに赤痢菌細菌、カンピロバクター属細菌及びサルモネラ属細菌等の細菌により引き起こされ得る食品媒介の病気に寄与する。病原性細菌により、破傷風、腸チフス、ジフテリア、梅毒及びハンセン病等の感染症も引き起こされる。食品又は水を汚染させる主要経路の一つは、未処理の汚水が飲料水供給源へと又は耕作地に放出されることによるものであり、その結果汚染源を口にしたeatordrink人々が感染状態になる。発展途上国では、ほとんどの汚水を環境へと又は耕作地に流している。これがコレラ、A型肝炎、ポリオウイルス及びロタウイルスの感染体の一般的な伝播様式である。多くの呼吸器疾患は、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルスPIV1~PIV3、A型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルス、B型アデノウイルス、並びにA型呼吸器合胞体ウイルス及びB型呼吸器合胞体ウイルスを含む病原性ウイルスにより引き起こされる。更には、例えばバシラスアンスラシス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エルシニアペスティス、ビブリオコレレ、フランシセラツラレンシス、ブルセラ属細菌、コクシエラバーネッティ、マクポウイルス、コクシジオイデスイミチス、コクシジオイデスポサダシ、バークホルデリアマレイ、バークホルデリアシュードマレイ、赤痢菌亜種細菌、リケッチアリケッチイ、リケッチアプロワツェキイ、クラミドフィラシタッシ、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡を含む、一部の病原性細菌及びウイルスは、生物兵器としての使用が考慮される。生物兵器用の病原菌バシラスアンスラシスBanthracisBA、エルシニアペスティスYpestisYP及びフランシセラツラレンシスFTが、軍人及び一般市民の両方を攻撃するのに使用することができる大量破壊兵器となる可能性を有するとして特定されている。これらの3つの生物は、全て感染性の高い病原菌であり、ヒトにとって致命的であるため、生物兵器としての使用に特に好適な病原菌である。これらは全て、エアロゾル形態で送達されることがあり、これによりより致死的な肺疾患状況が引き起こされる。病原性を増大させる、又はワクチン保護を回避するためにバシラスアンスラシスの抗菌剤耐性株又は遺伝的修飾を秘密裏に用いることが可能である。肺ペストを伴うバイオテロ攻撃では、一部その疾患の伝染性により広範な疾患及びパニックが引き起こされる。1969年、世界保健機構は、先進国では500万人の住民がいる大都市圏での50kgの病原性フランシセラツラレンシスのエアロゾル散布により、19000人の死亡を含め、250000人が病気になると予測した。これらの大量破壊兵器の使用の更なる脅威は、診断アッセイを失敗させ、かつ/又は効果的な治療剤の備蓄及び効果的な治療を回避するという目的での意図的な抗生物質耐性株の遺伝子操作である。更には、これらの病原菌の抗生物質耐性株は世界中の地域で自然発生し、秘密裏に行われるローテク方法により単離し、拡散させることができる。そのため一実施形態では、標的核酸は、生物兵器として有用であり得る病原菌に特異的な少なくとも1つのゲノムマーカー又はプラスミドマーカーである。更なる態様では、標的核酸は、バシラスアンスラシスBA、エルシニアペスティスYP又はフランシセラツラレンシスFTに特異的な少なくとも1つのマーカーである。別の実施形態では、標的核酸は少なくとも1つのシプロフロキサシン耐性標的である。例示的な標的を表1に示す。更なる実施形態では、1gyrA、gyrB-1、gyrB-2、parC及びparEからなる群から選択されるシプロフロキサシン耐性標的に特異的な少なくとも1つの検出プローブ、並びに2capB2、capB4、pXO1、pXO2、PLA、PIM、CAF1、tul4及びfopAからなる群から選択されるゲノム標的又はプラスミド標的に特異的な少なくとも1つの検出プローブを含むか、これからなるか、又はこれから本質的になる検出プローブセットが提供される。更なる実施形態では、gyrA、gyrB-1、gyrB-2、parC、parE、capB2、capB4、pXO1、pXO2、PLA、PIM、CAF1、tul4及びfopAのそれぞれに特異的な少なくとも1つの検出プローブを含むか、これから本質的になるか、又はこれからなる検出プローブセットが提供される。上述のように、増幅工程は全ゲノム増幅を含むことができ、これにより典型的には10キロベース長を超えるアンプリコンが生じる。通常、プローブベースの検出には、かなり短いアンプリコン、典型的には100塩基長~250塩基長のアンプリコンが要求される。このため、増幅工程で大きいアンプリコンが生成される場合、検出前にアンプリコンを断片化することが有用となり得る。このようなことを行う方法は当該技術分野で数多く知られており、これには、DNアーゼIをMn2補因子と共に使用する等といった酵素を用いてDNAを断片化する方法の使用AndersonSNucleicAcidsResearch1981Vol9No1330153027参照により本明細書に援用される、及び様々な制限酵素を用いた部分消化SambrookJFritschEFandManiatisT1989MolecularCloningAlaboratorymanual2ndEdp52595932ColdSpringHarborLaboratoryPressNewYork参照により本明細書に援用される;アンプリコンにおけるランダムリボヌクレオシド一リン酸の組込み、それに続くアルカリ消化;並びに超音波処理、噴霧及び流体力学的剪断等による物理的な断片化が含まれるが、これらに限定されない。このため、一実施形態では、増幅された核酸が検出前に断片化される。一実施形態では、ウラシル残基が増幅反応中に組み込まれる。ウラシルDNAグリコシラーゼウラシル-N-グリコシラーゼは、大腸菌のung-遺伝子の産物であり、大腸菌Ecoliでクローニングされ、シークエンシングされ、発現している。ウラシルDNAグリコシラーゼUDGはDNA糖-ホスホジエステル骨格を破壊することなく破壊によりハイブリダイゼーション標的として又はDNAポリメラーゼの鋳型としてのDNAの使用が妨げられる、DNA一本鎖DNA及び二本鎖DNAからこれらのウラシル残基を除去する。得られる脱塩基部位は高温で加水分解的な切断を起こしやすい。このため、ウラシル塩基の除去は通常、DNAの断片化と同時に起こる。当業者は汚染を避けるためにウラシルDNAグリコシラーゼを使用する方法を認識している。リアルタイムPCRには、サーマルサイクラー、コンピュータ、蛍光励起及び蛍光発光の回収並びにデータ収集用の光学部品optics、並びに分析用ソフトウェアからなる機器プラットフォームが要求される。幾つかの製造業者から入手可能なこれらの機械は、サンプル容量96ウェル又は384ウェルの標準的なプレートフォーマットのものもあれば、より少ないサンプルを処理するか、又は専用のガラス製毛細管が要求されるものもあり、ブロックフォーマットのものもあれば、回転式のものもある、励起方法レーザーを使用するものもあれば、波長可変フィルター、又は1つ若しくは複数のダイオードを備える広域スペクトルの光源を使用するものもある、検出方法カメラを使用するものもあれば、光電子増倍管又は光検出系タイプのものを使用するものもある及び全体感度が異なる。ソフトウェアがデータを処理する方法にはプラットフォーム特異的な差異もある。原則として、2つ以上の検出チャネルを有する利用可能な機械が本明細書に開示される方法に適している。V.キット1少なくとも1つのハイブリッド捕捉プローブ、抗DNA-RNAハイブリッド抗体及び固体支持体からなる群から選択される少なくとも1つのハイブリッド捕捉成分と、2少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの検出プローブを含む検出プローブセットとを含むキットも開示される。一実施形態では、キットは少なくとも4つの検出プローブを含み、少なくとも2つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも4つの検出プローブを含み、少なくとも3つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも5つの検出プローブを含み、少なくとも2つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも5つの検出プローブを含み、少なくとも3つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも5つの検出プローブを含み、少なくとも4つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも6つの検出プローブを含み、少なくとも2つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも6つの検出プローブを含み、少なくとも3つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも6つの検出プローブを含み、少なくとも4つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも7つの検出プローブを含み、少なくとも2つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも7つの検出プローブを含み、少なくとも3つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも7つの検出プローブを含み、少なくともatleast4つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも8つの検出プローブを含み、少なくとも2つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも8つの検出プローブを含み、少なくとも3つの検出プローブが同じ標識を保有する。別の実施形態では、キットは少なくとも8つの検出プローブを含み、少なくとも4つの検出プローブが同じ標識を保有する。一実施形態では、ストリンジェントな条件下で、1つ又は複数の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な少なくとも6つのプローブを含むキットであって、a少なくとも3つのプローブの第1の群は第1の標識を保有し、この群のプローブは全て、その融解温度が異なり、b少なくとも3つのプローブの第2の群は第2の標識を保有し、この群のプローブは全て、その融解温度が異なる、ストリンジェントな条件下で、1つ又は複数の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な少なくとも6つのプローブを含むキットが開示される。別の実施形態では、ストリンジェントな条件下で、1つ又は複数の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な少なくとも9つのプローブを含むキットであって、a少なくとも2つのプローブの第1の群は第1の標識を保有し、この群のプローブは全て、その融解温度が異なり、b少なくとも2つのプローブの第2の群は第2の標識を保有し、c少なくとも2つのプローブの第3の群は第3の標識を保有し、この群のプローブは全て、その融解温度が異なり、少なくとも2つのプローブの少なくとも第3の群は第3の標識を保有し、この群のプローブは全て、その融解温度が異なる、ストリンジェントな条件下で、1つ又は複数の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な少なくとも9つのプローブを含むキットが開示される。融解温度Tmが異なるプローブの融解温度は、少なくとも0.5°C、1°C、1.5°C、2°C、2.5°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C又は10°C異なる。融解温度の差異が1°C、1.5°C、2°C、2.5°C、3°C、4°C、5°Cを超えるのが好ましい。理想的にはプローブの融解温度が約5°C異なる。融解温度に関連して用いられる場合、約という語句は、指定の温度に四捨五入してなるroundable温度を全て含む。理想的には、同じ標識を有するプローブは、融解分析により確実に区別することができるように選択された、融解温度Tmの固定の差異間隔、例えば5°Cを有する。かかる実施形態では、例えばフルオレセインで標識されるプローブは、例えば40°C、45°C、50°C及び55°Cの融解温度Tmを有する。別の実施形態では、キットは更に、バッファ、ヌクレオチド及び1つ又は複数の酵素、例えばポリメラーゼを含む。キットはプレミックスとして適合させることができ、ここでは使用者はプローブを添加するだけで十分である。キットは、ヒト診断若しくは獣医学的診断に、食品若しくは水を検査するのに、法医学的用途に、生体防御用途に、又は科学的目的に使用することができる。サンプルにおける少なくとも1つの標的核酸の検出のためのキットであって、i.少なくとも1つのポリヌクレオチドハイブリッド捕捉プローブ、ii.抗ハイブリッド抗体、iii.ポリメラーゼ、iv.検出プローブセット、v.任意で抗ハイブリッド抗体に結合するように適合させた常磁性ビーズ、vi.任意で変性試薬、vii.任意でヘリカーゼ、及びviii.任意で増幅された核酸を断片化するための試薬を含むか、これからなるか、又はこれから本質的になる、サンプルにおける少なくとも1つの標的核酸の検出のためのキットも提供される。一態様では、複数のハイブリッド捕捉プローブ及び複数の検出プローブセットがキットに与えられる。キットには、開示される方法及びアッセイに関連する手法を説明する取扱説明書も含まれ得る。キットには、患者の情報を文字情報にするtranscribing手段も含まれ得る。一態様では、この手段としては、患者の情報を伝達することが可能な紙、コンピュータ又はデバイスが挙げられる。キットには、患者のサンプルを採取したのと同じ場所で方法を完了させるのに必要な成分が全て含まれ得る。一態様では、キットには、検出アッセイに関連する色分けされた試薬が含まれ得る。試薬バイアルは使い易くするために色分けされ、キットに含まれ得る。試薬瓶は、記号、文字又は他の既知の識別子によっても識別され得る。キットの個々の成分が、使用しやすいプラットフォームで一緒になる場合、本明細書に記載のキットの利点の一つは、サンプルの即時検査が与えられることである。これにより、患者の検査結果を迅速に決定することが可能になる。一態様では、本開示の方法は、現場で患者のサンプルを回収し、処理し、精製工程を行うことを含み得る。一態様では、サンプルを回収した後、患者のサンプルを回収したのと同じ場所で本方法の工程の一部を実施する。その場所は、村落、診療所、研究所、又は個人が健康診断及び医学的評価を受ける共用エリアであり得る。その場所は常設又は仮設であってもよい。一態様では、核酸はサンプルを採取する場所とは異なる研究所又は診療所等の場所で検出する。一態様では、キットは発展途上国、又は医療を受ける機会を容易に利用することができない地理的地域で使用するために設計される。この方法は更に、STMサンプル及びPCサンプルに対応可能である。以下の実施例は例示的なものにすぎず、本開示を限定する意図は全くない。この実験では、図2に示されるワークフローの実行可能性を実証する。表2で示されるように反応物を構成し、四重で設定して、表3に示すプロトコルを用いて実施した。この目的で、表4の試薬を使用した。20×プライマーミックス及び50×プローブミックスの組成をそれぞれ、表5及び表6に示す。プライマー及びプローブの配列を表7に示す。PCRにおける鋳型核酸として、ヒト白血球由来のcDNAと、表7に示す各標的のそれぞれのforプライマー及びrevプライマーとを用いて、PCR産物を生成した。PCR産物をQiaQuickQiagenPCR精製キットを用いて精製し、1000倍希釈で使用した。鋳型を表8に示す個々の反応物に添加した。第1の場合IC単独では、内部陽性対照として機能するUbi鋳型だけを添加した。第2の場合では、UbiIC及び標的1であるAlbを添加した。第3の場合では、UbiIC及び標的2であるCmycを使用した。第4の場合では、UbiIC及び標的3であるTBPを導入した。第5の場合では、UbiIC及び標的4であるGAPを添加した。第6の場合では、UbiIC及び標的5であるSRYを鋳型として添加した。リアルタイムPCRを、72箇所のロータを備えるRotorGene6000PCRシステム6チャネルで行った。6つの検出チャネルの詳細を、それぞれのチャネルで検出するのに好適な蛍光色素の例を挙げている表9に示す。PCRサイクリングのパラメータ及びその後の融解曲線を表3に示す。続いて実行データを、適切な機器ソフトウェアを用いて分析した。内部対照IC及びそれぞれの標的のリアルタイムPCRで観察されるCT値を表10に示す。プローブの融点図8に示される融解ピークの最大値を決定し、結果を表11に示す。四重の反応物に対する6つの異なる実験条件表8で観察された融解ピークを図4に示す。全ての反応物は予測された結果を示し、これにより正しい検出チャネルでのCT値及び添加された標的を検出するそれぞれのプローブに関して予測される融点を有する融解ピークが示された。"