a鋳型核酸を提供する段階b3端にプライマー/鋳型pt領域該鋳型核酸の一部に相補的であるを含み、かつ捕捉領域crを含む、二官能性オリゴヌクレオチドbfoを提供する段階であって、該pt領域および該cr領域がポリメラーゼブロックBにより分離されている、段階c段階a~bの成分を混合する段階、ならびに、該bfoの該pt領域が該鋳型核酸にアニールすることおよび増幅される鋳型核酸の産生を該Bが改善することを可能にする条件を提供する段階dプライマー伸長を可能にする条件の下で、該bfoの該pt領域を伸長させる段階eそれにより、該bfoの該cr領域に対応する一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸dsoを生成する段階を含む方法であって、該ポリメラーゼブロックBが、インターカレーターを含みかつ以下の一般式XLIにより記載され得る、方法:式中、Xは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、またはPNA、またはPNA類似体の主鎖中に組み入れられ得る主鎖モノマー単位であり、Lはリンカーであり、Iは、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングするcostackことができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含むインターカレーターである。前記インターカレーターがピレンである、請求項1記載の方法。前記インターカレーターが、以下の一般構造ZXLI1CI2により記載されるTINAモノマー中に存在する、前記請求項のいずれか一項記載の方法:式中、Xは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、またはPNA、またはPNA類似体の主鎖中に組み入れられ得る主鎖モノマー単位であり、Lはリンカーであり、I1は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第1のインターカレーターであり、Cは、任意の共役部conjugatorであり、かつI2は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第2のインターカレーターである。Xがアルキレンジオールを含み、Lが、アルキル鎖、オキサアルキル鎖、アザアルキル鎖、チアアルキル鎖、カルボキサミド基、チオカルボキサミド基、スルホンアミド基、またはそれらの組み合わせを含む、リンカーであり、かつ0~60を含み、I1が、ベンゼン、ナフタレン、アズレン、および二環式ヘテロ芳香環系からなる群より選択される単環式または多環式の芳香族環系であり、I2が、二環式芳香族環系、三環式芳香族環系、四環式芳香族環系、五環式芳香族環系、およびそれらのヘテロ芳香族類似体、ならびにそれらの置換体の群より選択される、請求項1記載の方法。Cが、炭素1~12個のアルキル、炭素2~12個のアルケニル、炭素2~25個のアルキニル、もしくはジアゾ、または、炭素もしくは/および窒素原子25個以下の長さを有するそれらの組み合わせの群より選択される共役部である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。I1およびI2が、共役系を介して直接連結される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。Zが、以下の式により記載され得る、前記請求項のいずれか一項記載の方法:式中、Rは、アリールエチニル、ピレンエチニル、および1Hフェナントロ910dイミダゾール2イルからなる群より選択される。以下の段階をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法:f段階dの第1の伸長産物に相補的である第2のプライマーを提供する段階g段階dの産物を変性させる段階hプライマー伸長を可能にする条件の下で、第1の伸長産物にアニールさせた第2のプライマーを伸長させる段階。マルチプレックスPCR用の第2のプライマーセットを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。前記dsoの前記捕捉領域crを捕捉プローブにアニールさせる捕捉段階をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。前記捕捉プローブが、固体支持体上に固定化されているか、あるいは固体支持体への固定化に適合している、請求項10記載の方法。アニールした分子をアニールしていない分子から分離するための分画段階をさらに含む、請求項11記載の方法。前記捕捉プローブが、前記請求項のいずれか一項に記載されるようなTINAモノマーを含む、請求項10~12のいずれか一項記載の方法。以下をさらに含む、請求項10~13のいずれか一項記載の方法:a固定化された標的増幅産物が可視化される、検出期、および/またはb該固定化された標的増幅産物が精製される、精製期、および/またはc該固定化された標的増幅産物がさらに操作される、操作期。発明の開示本発明は、以下の段階を含む方法を提供する:a鋳型核酸を提供する段階b3端にプライマー/鋳型pt領域該鋳型核酸の一部に相補的であるを含み、かつ捕捉領域crを含む、二官能性オリゴヌクレオチドbfoを提供する段階であって、該pt領域および該cr領域がポリメラーゼブロックBにより分離されている、段階c段階a~bの成分を混合する段階、および、該bfoの該pt領域が該鋳型核酸にアニールすることを可能にする条件を提供する段階dプライマー伸長を可能にする条件の下で、該bfoの該pt領域を伸長させる段階eそれにより、該bfoの該cr領域に対応する一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸dsoを生成する段階。好ましい態様において、段階bのbfoは、5crBpt3として構築される。別の態様において、段階bのbfoは、XBpt3として構築され、式中、Xは、cr、B、およびptの任意の組み合わせであり得る。例えば、X=3ptBcr5B5crであるこの場合、この特定のbfoの式は3ptBcr5B5crBpt3となる。好ましくは、段階dにおける伸長は、以下からなる群より選択される反応の一部としてなされる:指数関数的標的増幅例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リガーゼ連鎖反応LCR、ローリングサークル増幅、等温指数関数的標的増幅例えば、核酸配列ベース増幅NASBA、鎖置換増幅SDA、転写媒介増幅TMA、線形標的増幅例えば、逆転写、ジデオキシ塩基配列決定法。一つの態様において、鋳型核酸はRNAであり、そのためポリメラーゼは逆転写酵素である。PCR方法がPCRである時、方法が以下の段階をさらに含むことが、認識されるであろう:f段階dの第1の伸長産物に相補的である第2のプライマーを提供する段階g段階dの産物を変性させる段階hプライマー伸長を可能にする条件の下で、第1の伸長産物にアニールさせた第2のプライマーを伸長させる段階。段階f~hは、第2の鎖合成と呼ばれてもよい。一つの態様において、第2のプライマーもまたbfoである。従って、第2のbfoのpt領域は、第2の鎖合成のプライマーとして働く。第2のbfoは、典型的に、pt領域の配列および/またはcr領域の配列が第1のbfoとは異なる。長さ、ヌクレオチド類似体の含量、および修飾されたヌクレオチド、ならびにポリメラーゼブロックの特徴もまた、異なってもよいことを理解されたい。第1および第2のプライマーの両方がbfoである時、本方法の二本鎖産物単位複製配列は、両端に一本鎖オーバーハング捕捉領域を有する。ポリメラーゼは、典型的に、変性、アニーリング、および伸長の複数回反復できるように、熱安定性である。さもなければ、ポリメラーゼを各変性段階後に添加しなければならないであろう。通常、2~45回、より好ましくは5~35回、および最も好ましくは10~30回の反復が実施される。反復の回数は、典型的に、第1のサイクルにおける鋳型核酸の量、最終産物の望ましい量、および過程の効率に依存することを理解されたい。マルチプレックスPCRに関連する上述の態様において、2個のプライマーが使用される。プライマー1はbfoであり、プライマー2はbfoであってもよいし、または典型的なPCRプライマーであってもよい。いずれにしても、2個のプライマーは、共にある特定の配列の増幅を可能にしてPCR産物単位複製配列を生成する、プライマーセットまたはプライマー対と呼ばれてもよい。単に1組のプライマー対を使用する代わりに、方法は、PCR反応がマルチプレックスPCRであるように複数のプライマー対を使用してもよい。プライマーセット2については、1個または両方のプライマーがbfoであってもよく、追加的なプライマーセットについても同様である。各プライマーセットにおけるプライマーの1個のみがbfoである態様において、プライマーセット1のbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のbfoの捕捉領域と同一であってもよい。すなわち、2個の単位複製配列が、同一の配列/部分で捕捉プローブにより捕捉されてもよい。より好ましい態様において、プライマーセット1のbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のbfoの捕捉領域と同一ではない。すなわち、2個の単位複製配列が、異なる配列/部分、すなわち固体表面上の2個の別々の領域例えば、別々のビーズまたはアレイ上の別々の位置へで捕捉プローブにより捕捉されてもよく、追加的なプライマーセットについても同様である。各プライマーセットにおける両方のプライマーがbfoである別の態様において、プライマーセット1のその後の捕捉のために使用されるbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のその後の捕捉のために使用されるbfoの捕捉領域と同一であってもよい。すなわち、2個の単位複製配列が、同一の配列/部分で捕捉プローブにより捕捉されてもよい。より好ましい態様において、プライマーセット1のその後の捕捉のために使用されるbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のその後の捕捉のために使用されるbfoの捕捉領域と同一ではない。すなわち、2個の単位複製配列が、異なる配列/部分、すなわち固体表面上の2個の別々の領域例えば、別々のビーズまたはアレイ上の別々の位置へで捕捉プローブにより捕捉されてもよく、追加的なプライマーセットについても同様である。各プライマーセットにおける両方のプライマーがbfoであるこの態様において、プライマーセット1のその後の検出/操作のために使用されるbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のその後の検出/操作のために使用されるbfoの捕捉領域と同一であってもよい。すなわち、2個の単位複製配列が、同一の配列/部分でプローブにより検出/操作されてもよい。より好ましい態様において、プライマーセット1のその後の検出/操作のために使用されるbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のその後の検出/操作のために使用されるbfoの捕捉領域と同一ではない。すなわち、2個の単位複製配列が、異なる配列/部分でプローブにより検出/操作されてもよく、追加的なプライマーセットについても同様である。方法における使用のための二官能性オリゴヌクレオチドbfoプライマー/鋳型領域通常、二官能性オリゴヌクレオチドのプライマー/鋳型領域は、完全に天然のヌクレオチドからなる。従って、最も多くの場合、排他的にDNAモノマーからなると考えられる。ある特定の態様において、DNAおよびRNAモノマーの混合物を含んでもよく、または、排他的にRNAからなってもよい。他の態様において、bfoのプライマー/鋳型領域は、依然としてpt領域がポリメラーゼにより伸長されることが可能である限り、1個または複数の修飾されたモノマー/核酸類似体/主鎖修飾体を含んでもよい。従って、一つの態様において、pt領域の3端から数えて最初の2、3、4、6、8、または10ヌクレオチドは、非修飾DNAモノマーまたは非修飾RNAモノマーのいずれかであることが好ましい。二官能性オリゴヌクレオチドの鋳型/プライマー領域の長さは、典型的に、5~40ヌクレオチド長であり、より好ましくは8~30ヌクレオチド長であり、最も好ましくは10~25ヌクレオチド長である。鋳型/プライマーは、必ずしもその全長にわたって鋳型核酸に相補的である必要はないことが、認識されるべきである。例えば、ポリメラーゼブロックと、鋳型核酸に相補的である領域との間に追加的な配列を有してもよい。そのような追加的な配列は、例えば制限酵素部位を含んでもよい。捕捉領域捕捉領域は、5~40ヌクレオチド長であることが好ましく、より好ましくは8~30ヌクレオチド長であり、最も好ましくは10~25ヌクレオチド長である。捕捉領域は、天然のヌクレオチド両方非修飾DNAモノマーおよび非修飾RNAモノマーを含んでもよく、かつまた、修飾されたモノマーおよび/またはヌクレオチド類似体を含んでもよい。モノマーは、例えば、糖で、および/またはヌクレオチド間結合で、および/または塩基で修飾されてもよい。特に好ましいモノマーは、2Oアルキル、2Oフルオロなどの2O修飾ヌクレオチド、LNAロックド核酸およびBNAなどの二環式ヌクレオチド、モルフォリノ、FANAなどである。一つの態様において、捕捉領域は、PNAペプチド核酸を含むか、またはそれからなってもよい。別の態様において、捕捉領域は、標準的なオリゴヌクレオチドホスホロアミダート化学を用いて組み入れられ得るヌクレオチド類似体および修飾されたヌクレオチドのみからなってもよい。この態様において、PNAは使用されない。捕捉領域は、典型的に、アプタマーおよび一本鎖捕捉配列からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドである。本明細書において使用されるアプタマーという用語は、三次元構造をとり、かつこの構造を介してリガンドに結合するハイブリダイゼーションによる結合とは対照的にオリゴヌクレオチドを指す。従って、アプタマーを、ある特定のタンパク質に結合するようにSELEXにより進化させていてもよい。アプタマーはまた、抗体に結合してもよく、その場合アプタマーは、エピトープ抗体結合部位と呼ばれうる。これらの場合のいずれにおいても、捕捉領域は、リガンド、例えば、抗体などのタンパク質と、または、捕捉領域にアニールすることが可能である一本鎖オリゴヌクレオチドの形態のリガンドと、相互作用することができる。bfoの他の官能性本発明の方法における使用のためのbfoは、追加的な官能性を含んでもよい。bfoは例えば、開裂可能なリンカー、例えば、ジスルフィド架橋または光開裂性部分などの放出基を含んでもよい。bfoはまた、例えばビオチンなどの捕捉基を含んでもよい。一つの態様において、bfoは、捕捉基および放出基の両方を含む。また、一つまたは複数のプライマーセットの他方のプライマーが、他の官能性を含んでもよい。ポリメラーゼブロックB二官能性領域のどれがプライマー/鋳型領域であり、どれが捕捉領域であるかに関して、プライマー/鋳型領域は、容易に捕捉領域から区別される。なぜなら、プライマー/鋳型領域は、例えばPCRの際の伸長反応においてbfoが鋳型として使用される場合には、bfoの3端から、それ以降のプライマー伸長が不可能な最初のヌクレオチドまたは他の部分まで伸長するからである。従って、それ以降のプライマー伸長が不可能な最初のヌクレオチドまたは他の部分が、ポリメラーゼブロックであり、該ブロックは、上記の修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の一つであってもよい。ポリメラーゼブロックは、プライマー/鋳型領域の鋳型領域の3端から少なくとも5、6、10、12、15、18、21、24または27ヌクレオチドに位置することが好ましい。従って、対応する態様において、プライマー/鋳型領域は、そのため少なくとも5、6、10、12、または15、18、21、24、または27ヌクレオチドの長さである。該ブロックBは、核酸の主鎖構造に組み入れられた場合には、ポリメラーゼに遭遇するとDNAまたはRNAポリメラーゼのさらなる伸長を阻止すると考えられる、任意の成分であり得る。該ブロックは、典型的に、ヌクレオチド類似体、修飾されたヌクレオチド、連結部分、およびインターカレーターからなる群より選択される。核類似体は、例えば、LNA、モルフォリノ、FANA、HNAであってもよい。好ましい連結部分は、ポリエチレングリコールリンカーPEGなどのポリアルキレングリコールリンカーである。他のリンカーを使用してもよい。インターカレーター一つの態様において、ポリメラーゼブロックは、インターカレーター、すなわち、DNAまたはRNAの塩基間にインターカレートすることができる部分を含むことが好ましい。インターカレーターは、典型的に、芳香族環系を含む。bfoにおいて使用されるインターカレーターは原則的に、インターカレーションを可能にするリンカーによりbfoのモノマーへ付加されてもよく、またはインターカレーターは、追加的なモノマーとして含まれてもよい。最も広範な態様において、そのようなモノマーは、XLIと記載されてもよく、式中、Xは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、またはPNA、またはPNA類似体の主鎖中に組み入れられ得る主鎖モノマー単位であり、Lはリンカーであり、I1は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングするcostackことができる、少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第1のインターカレーターである。好ましくは、主鎖モノマー単位Xは、例えばグリコンglyconなどの環系に部分的に含まれるアルキレンジオールを任意で有する、エチレングリコールまたは1Oメチレングリセロールなどのアルキレンジオールを含む。例えば、主鎖モノマーXは、窒素、硫黄、リン、および酸素より選択されるヘテロ原子を最終的に有する、四員環、五員環、または六員環の一部であってもよい。好ましくは、アルキレンジオールは、オリゴヌクレオチドの隣接するモノマー単位を直接連結し、かつ、この態様において、アルキレンジオールが例えばグリコンなどの環系の一部であり続けてもよいことが、理解されるべきである。一つの態様において、モノマーのリンカーLは、0~60個の原子を含む。別の態様において、Lは、鎖もしくは環、またはそれらの組み合わせ、および/あるいはそれらの置換体を含む。また別の態様において、Lは、アルキル鎖、またはオキサアルキル鎖、またはアザアルキル鎖、またはチアアルキル鎖、またはカルボキサミド基、またはチオカルボキサミド基、またはスルホンアミド基、またはそれらの組み合わせを含む。好ましい態様において、リン原子を含む主鎖モノマー単位Xの単位長は原子6個未満であり、ここで、主鎖単位長とは、1個のモノマーから隣までの最短距離である。追加的なモノマーとして添加される、ブロックとしての使用のために好ましいインターカレーターは、国際公開公報第2006125447号参照により本明細書に組み入れられるに記載されているTINAモノマー、国際公開公報第2003052134号および国際公開公報第2003052133号、国際公開公報第2003051901号参照により本明細書に組み入れられるに記載されているINAモノマー、NarayananSetalNAR20043229012911参照により本明細書に組み入れられるに記載されている5付加アシルアミドキャップからなる群より選択することができる。TINATINAねじれたインターカレーティング核酸は、捕捉領域をプライマー/鋳型領域モノマーから離れさせるようであるため、bfoのある特定の用途に特に好ましいことが分かっている。従って、TINAモノマーがブロックとして使用される時、捕捉領域は、プライマー/鋳型領域と相互作用する傾向がほとんどないであろう。TINAモノマーは、一般構造ZXLI1CI2により記載されてもよく、式中、Xは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、またはPNA、またはPNA類似体の主鎖中に組み入れられ得る主鎖モノマー単位であり、Lはリンカーであり、I1は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第1のインターカレーターであり、Cは、任意の共役部conjugatorであり、かつI2は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第2のインターカレーターである。好ましい態様において、主鎖Xは、DNA、RNA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、INA、CeNA、TNA、TNA、TNA、αLリボLNA、αLキシロLNA、βDリボLNA、βDキシロLNA、321LNA、ビシクロDNA、6アミノビシクロDNA、5エピビシクロDNA、αビシクロDNA、トリシクロDNA、ビシクロ430DNA、ビシクロ321DNA、ビシクロ430アミドDNA、βDリボピラノシルNA、αLリキソピラノシルNA、2RRNA、2ORRNA、2AERNA、αLRNA、βDRNA、およびそれらの組み合わせならびにそれらの修飾体のオリゴヌクレオチド中に組み入れることができる。別の態様において、主鎖モノマー単位Xは、グリコンなどの環系に部分的に含まれるアルキレンジオールを任意で有する、エチレングリコールまたは1Oメチレングリセロールなどのアルキレンジオールを含む。例えば、主鎖モノマーXは、窒素、硫黄、リン、および酸素より選択されるヘテロ原子を最終的に有する、四員環、五員環、または六員環の一部であってもよい。好ましくは、アルキレンジオールは、オリゴヌクレオチドの隣接しているモノマー単位を直接連結させる。この態様において、アルキレンジオールが依然として例えばグリコンなどの環系の一部であってもよいことが、理解されるべきである。一つの態様において、柔軟な塩基スタッキングモノマーのリンカーLは、0~60個の原子を含む。別の態様において、Lは、鎖もしくは環、またはそれらの組み合わせ、および/またはそれらの置換体を含む。また別の態様において、Lは、アルキル鎖、またはオキサアルキル鎖、またはアザアルキル鎖、またはチアアルキル鎖、またはカルボキサミド基、またはチオカルボキサミド基、またはスルホンアミド基、またはそれらの組み合わせを含む。好ましい態様において、I1は、ベンゼン、ナフタレン、アズレン、二環式ヘテロ芳香環系、およびそれらの置換体の群より任意で選択される、単環式または多環式の芳香族環系である。好ましい態様において、I1は、単環式または多環式の芳香族環系の1、2位にLおよびCを有して配置される。さらに別の態様において、I1は、単環式または多環式の芳香族環系の1、3位にLおよびCを有して配置される。別の態様において、I1は、単環式または多環式の芳香族環系の1、4位にLおよびCを有して配置される。より好ましい態様において、I1は、オルト位にLおよびCを有する1、2位にLおよびCまたはパラ位にLおよびCを有する1、4位にLおよびCベンゼン環である。柔軟な塩基スタッキングモノマーのCは、任意の共役部である。Cが任意でない好ましい態様において、Cは、炭素1~12個のアルキル、炭素2~12個のアルケニル、炭素2~25個のアルキニル、もしくはジアゾ、または、炭素原子もしくは/および窒素原子25個以下の長さを有するそれらの組み合わせの群より選択される。代替的な態様において、柔軟な塩基スタッキングモノマーは、共役部を全く含有しない。従って、I1およびI2は、例えば共役系を介して直接連結されてもよい。別の態様において、Cは、直鎖または分岐鎖または単環式芳香族環、および、窒素、硫黄、リン、および酸素より選択されるヘテロ原子を最終的に有するそれらの置換体からなる群より選択される。また別の態様において、Cのアルケニルは、アセチレンまたは反復アセチレンである。好ましい態様において、リン原子を含む主鎖モノマー単位Xの単位長は、原子6個未満であり、ここで、主鎖単位長とは、1個のモノマーから隣までの最短距離である。好ましい態様において、連結部分Lは、少なくとも原子2個の長さを有し、かつ、窒素、硫黄、リン、および酸素より選択されるヘテロ原子を最終的に有する。好ましくは、連結部分Lは、原子2~10個の長さ、より好ましくは原子2~5個の長さを有する。最も好ましい態様において、連結部分は、XとI1との間の5結合に対応する原子3個の長さを有する。柔軟な塩基スタッキングモノマーのI2は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第2のインターカレーターである。好ましい態様において、I2は、二環式芳香族環系、三環式芳香族環系、四環式芳香族環系、五環式芳香族環系、およびそれらのヘテロ芳香族類似体、ならびにそれらの置換体の群より選択される。最も好ましいのは、四環式環系、特にピレンである。特定の態様において、I2は、1Hフェナントロ910dイミダゾール2イル基またはピレンである。最も好ましい態様において、Zは、以下の式により記載され得、式中、Rは、アリールエチニル、ピレンエチニル、および1Hフェナントロ910dイミダゾール2イルの群より選択され、かつR基は、ベンゼンのオルト、メタ、またはパラ位で置換されてもよい。より好ましいのは、オルトおよびパラ位である。INAINAインターカレーティング核酸は、以下の一般式XYQにより記載されてもよく、式中、Xは、核酸または核酸類似体の主鎖中に組み入れることができる主鎖モノマー単位であり、好ましくは、Xは、アルキレンジオールを含む。Qは、DNAの核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含むインターカレーターであり、好ましくは、Qは、ベンゼン、ナフタレン、アズレン、および二環式ヘテロ芳香環系、三環式芳香族環系、四環式芳香族環系、五環式芳香族環系、およびそれらのヘテロ芳香族類似体、ならびにそれらの置換体からなる群より選択される、単環式または多環式の芳香族環系由来である。最も好ましいのは、四環式環系、特にピレンである。Yは、前記主鎖モノマー単位および前記インターカレーターを連結するリンカー部分である。QおよびYの全長は、典型的に、5~25Å、より好ましくは、7~20Åである。好ましい態様において、リン原子を含む主鎖モノマー単位Xの単位長は、原子6個未満であり、ここで、主鎖単位長とは、1個のモノマーから隣までの最短距離である。捕捉領域-リガンドの相互作用1つまたは2つの一本鎖オーバーハング捕捉領域を含む二本鎖核酸は典型的に、さらなる操作に供され、好ましくは、dsoの捕捉領域crは、リガンド、例えばオリゴヌクレオチドまたはタンパク質と相互作用する。ナノ構造従って、二本鎖核酸は、例えば、核酸ベースのナノ構造を生成するためのナノ技術において使用されてもよい。そのような態様において、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸を典型的に、第2の二本鎖核酸と、好ましくは同じく一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸と接触させる。両方の一本鎖オーバーハングは典型的に、相補領域を有するように、すなわち互いにアニールできるように設計される。一方の一本鎖オーバーハングが、1つより多い、例えば2つまたは3つの他方の一本鎖オーバーハングへのアニーリングを可能にする長さを有してもよい。このように、剛性二本鎖核酸は、種々の方法で結合されて、ナノ構造を構築することができる。捕捉別の態様において、方法は、dsoの捕捉領域crを捕捉プローブにアニールさせる捕捉段階をさらに含む。本発明において使用されるポリメラーゼブロックB、例えば上述のTINAは、実施例1に示すように捕捉を改善する。理論に束縛されるものではないが、捕捉の改善は剛性のTINA構造に基づくものであり、これが、捕捉領域を二本鎖領域から離れさせ、かつしたがって捕捉領域の接触性を増加させると考えられる。捕捉プローブは通常、固体支持体に固定化されているか、あるいは、捕捉プローブは、固体支持体への固定化に適合している。固体支持体は、例えば、ビーズ、ブロット、またはアレイであってもよい。dsoが捕捉プローブと接触して、捕捉プローブがcrにアニールした後、アニールした分子PCR産物をアニールしていない分子から分離するための分画段階が、典型的に実施される。好ましい態様において、捕捉プローブは、インターカレーター、例えば、上述のようなTINAモノマーまたはINAモノマーを含む。捕捉プローブはまた、2個またはそれより多いインターカレーターを含んでもよい。実施例の節に示すように、インターカレーターを含む捕捉プローブは、捕捉反応の効率を改善する。標的増幅産物が固体表面上に捕捉されている時、その次の段階は典型的に、以下の一つまたは複数となる:a固定化された標的増幅産物が可視化される、検出期b該固定化された標的増幅産物が精製される、精製期c該固定化された標的増幅産物がさらに操作される、操作期。序文本発明の方法において、例えばTINA分子などのポリメラーゼブロックが、二官能性オリゴヌクレオチド中に配置される。TINA分子に対して3側のオリゴヌクレオチドの部分が、従来のPCRプライマーとして機能するのに対して、TINA分子に対して5側のオリゴヌクレオチドの部分は、ナンセンスオリゴヌクレオチド尾部である。このアプローチは、以下に要約することができる複数の利点を有する:iマルチプレックスPCRの有効性の増加、iiマルチプレックスPCR反応の検出時の解析感度の改善、iiiマルチプレックスPCR産物の検出のためのマイクロアレイおよびバイオセンサーアプローチにおける非特異的交差反応性の減少、ならびにivより容易な設計およびより均一なPCR反応。二官能性オリゴヌクレオチドにおけるTINA分子は、依然としてPCR反応の有効性を改善するが、TINA分子はまた、PCRポリメラーゼによる読み過ごしを解消し、これによりナンセンスオリゴヌクレオチド配列を一本鎖オーバーハングとして残す。一本鎖PCRオーバーハングは、PCR産物の変性先行させることなくマルチプレックスPCR反応の検出を可能にし、これにより、PCR単位複製配列の検出の解析感度を増加させる。ナンセンスオリゴヌクレオチドのタグ配列は自由に設計することができるため、複数のPCR単位複製配列間の交差反応性の危険性が減少する。PCR単位複製配列は、ナンセンスオリゴヌクレオチドのタグ配列により識別されるため、類似の長さを有するPCR単位複製配列を設計することができる。PCR単位複製配列の長さを同等にすることにより、マルチプレックスPCRの有効性の均一化を達成することができ、これによりマルチプレックスPCRアッセイの最適化が単純になる。本発明の方法の最終的な恩恵とは、マルチプレックスPCRアッセイのアッセイ間の均一性が比較的高いことである。実施例1:実験の目的は、変性PCR産物の固相検出を、BFO修飾PCR産物の検出と比較することである。PCR反応:大腸菌Ecoli由来のeltA遺伝子を標的とするプライマーセットを従来のPCR用に選択したのに対して、rrs遺伝子を標的とするプライマーセットをBFO修飾PCR用に使用した。両方のプライマーセットの配列は、BrandalLTetalJMicrobiolMethods2007Feb6833141に基づく。実施例におけるすべてのオリゴヌクレオチドは、HPLC精製および品質管理を伴い、02μmol合成スケールで、IBAGmbHまたはDNATechnologyASから購入した。臨床上のETECである大腸菌株D2262estA、eltA、およびrrs陽性を、SOSプレート上、37°Cで一晩増殖させた。コロニーの半分を100μLの水に溶かし、95°Cで15分間、細胞を溶解させた。細胞片を2300gで1分間の遠心分離により除去し、上清をPCRに使用した。eltA遺伝子に対する従来のPCR用のプライマー対は以下とした。PCR断片長:322bp。rrs遺伝子に対する二官能性オリゴヌクレオチドPCR用のプライマー対は以下とした。PCR断片長401bp。Xは、パラTINA13ページに記載されるようなZであり、式中、Rは、ピレンエチニルであり、ベンゼンのパラ位で置換されているであり、かつビオチンは、標準的なビオチンである。PCRは、1×PCR緩衝液161gLTrisHCl、688gLTrizma塩基、212gL2SO4、100μLLTween80、5gLFicoll400、02mMの各dNTP、02μMの各プライマー、25mMMgCl2、008BSA、1μL鋳型DNA、および1UKAPA2GORobustHSDNAポリメラーゼを含む25μLの反応容積で実施した。PCRは、以下からなるPCRプログラムを用いて、SensoQuestLabcycler上で行った:段階1:95°Cで4分間;段階2:段階3~5を30サイクル;段階3:950°Cで15秒間;段階4:Y°Cで30秒間;5:720°Cで30秒間、および段階6:72°Cで1分間。Yは、eltAPCRについて595°Cであり、rrsPCRについて531°Cであった。PCR産物を、MachereyNagel由来のMNNucleospinExtractIIkitを用いて精製した。DNA濃度をNanodrop商標上で測定し、eltAPCR反応については183ngμL、およびrrsPCR反応については424ngμLであった。BFO修飾PCR産物のLuminex検出:BFO修飾rrsPCR産物を、各ウェルにおいてeltA、estA、およびrrsを標的とする一連の3種類の磁気ビーズMagPlex商標に結合させた捕捉オリゴヌクレオチドを用いて、Luminex200商標上で検出した。estA用の捕捉オリゴヌクレオチドはビーズ15に、rrsはビーズ29に、およびeltAはビーズ61に結合させた。BFO修飾PCR産物の一本鎖オーバーハングは、従来のDNAオリゴヌクレオチドまたはパラTINA修飾DNAオリゴヌクレオチドに対するワトソンクリックベースの逆平行二重鎖形成により捕捉された。Xは、パラTINAであり、NH2CXは、アミノ修飾シクロヘキサンスペーサーであり、HEGLは、C18ヘキサエチレングリコールスペーサーである。従来のDNA捕捉オリゴヌクレオチドは、Luminexにより推奨されるEDCベースの結合手法を用いて結合させたのに対して、パラTINA修飾オリゴヌクレオチドは、ビーズへの同程度のオリゴヌクレオチドコーティングを保証するためにNHSEDCベースの社内の結合手法を用いて結合させた。Luminexアッセイは、V型マイクロタイタープレートNUNCカタログ番号249952を用いて行った。3種類のビーズ各々の02μLを、PCR産物、ハイブリダイゼーション緩衝液、および滅菌水と混合し、100μLの最終容積にした。05μLのPCR産物から開始して、PCR産物を3倍希釈系列で希釈した。最終的な緩衝液は、20mMNaH2PO4Na2HPO4、400mMNaCl、003TritonX100、pH65からなった。プレートを、35°Cで30分間、900rpmの混合速度でインキュベーションしたThermoScientific由来のiEMSIncubatorshaker商標。プレートを、5mMNaH2PO4Na2HPO4、100mMNaCl、003TritonX100、pH65で3回洗浄し、検出緩衝液を添加した。検出緩衝液は、5μgmLストレプトアビジンRPEPremGradeS21388Invitrogen、100μgmLアルブミンフラクションVK39619718921Merck、20mMNaH2PO4Na2HPO4、400mMNaCl、003TritonX100、pH65からなった。プレートを、35°Cで15分間、900rpmの混合速度でインキュベーションし、5mMNaH2PO4Na2HPO4、100mMNaCl、003TritonX100、pH65で3回洗浄し、Luminex200商標システム上で少なくとも300個の各ビーズを計数して解析した。従来のPCR産物のLuminex検出:eltAPCR産物を、各ウェルにおいてeltA、estA、およびrrsを標的とする三重の磁気ビーズMagPlex商標を用いて、Luminex200商標システム上で検出した。rrs用の捕捉オリゴヌクレオチドはビーズ13に、estAはビーズ15に、およびeltAはビーズ81に結合させた。BFO修飾PCR産物のLuminex検出と同一のプロトコルを用いて、オリゴヌクレオチドをMagPlex商標に結合させた。Xは、パラTINAであり、NH2CXは、アミノ修飾シクロヘキサンスペーサーであり、HEGLは、C18ヘキサエチレングリコールスペーサーである。Luminexアッセイは、V型マイクロタイタープレートNUNCカタログ番号249952を用いて行った。3種類のビーズ各々の02μLを、PCR産物、TritonX100100μLの反応容積において003の最終濃度、および滅菌水と混合し、80μLの最終容積にした。10μLのPCR産物から開始して、PCR産物を2倍希釈系列で希釈した。プレートを、95°Cで5分間、AccuBlock商標上でインキュベーションし、直ちに氷に移して2分間放置した。冷ハイブリダイゼーション緩衝液を添加して、100μLの全容積にし、最終緩衝液は、10mMNaH2PO4Na2HPO4、200mMNaCl、および003TritonX100、pH65からなった。プレートを、45°Cで15分間、900rpmの混合速度でインキュベーションしたThermoScientific由来のiEMSIncubatorshaker商標。プレートを、10mMNaH2PO4Na2HPO4、200mMNaCl、003TritonX100、pH65で3回洗浄し、検出緩衝液を添加した。検出緩衝液は、5μgmLストレプトアビジンRPEPremGradeS21388Invitrogen、100μgmLアルブミンフラクションVK39619718921Merck、10mMNaH2PO4Na2HPO4、200mMNaCl、003TritonX100、pH65からなった。プレートを、45°Cで10分間、900rpmの混合速度でインキュベーションし、10mMNaH2PO4Na2HPO4、200mMNaCl、003TritonX100、pH65で3回洗浄し、Luminex200商標システム上で少なくとも300個の各ビーズを計数して解析した。結果:図1は、DNAオリゴヌクレオチドおよびパラTINA修飾DNAオリゴヌクレオチドの捕捉による、eltAおよびrrsPCR産物の検出を比較する。両方のPCRについて、パラTINA修飾捕捉オリゴヌクレオチドは、Luminex検出法の感度を増加させた。変性eltAPCR産物の捕捉は、BFO修飾rrsPCR産物の捕捉よりも感度が低かった。多数の要素が、2種類のアッセイ間で異なっていた。本発明者らは、rrsPCR産物の検出については、14merの捕捉オリゴヌクレオチドを35°Cで30分間、および420mMの一価陽イオン濃度で使用したのに対して、eltAPCR産物は、27merの捕捉オリゴヌクレオチドを、210mMの一価陽イオン濃度、ならびに95°Cで5分間の変性、2分間の氷への移行リアニーリングを阻害するため、および45°Cで15分間のインキュベーションリアニーリングが15分後に完了する可能性があるためと共に用いて検出した。両方のアッセイについて、2個の他の捕捉オリゴヌクレオチドに対する交差反応性を検定し、かつ両方のアッセイについて、交差反応性は検出されなかった。結論:本実験において、BFO修飾PCR産物の検出には、Nanodrop商標DNA測定およびPCR断片長を考慮に入れると比較的低ストリンジェントの検出条件比較的高い一価陽イオン濃度および比較的低い温度および比較的高い標的濃度が好都合であるが、他方で、変性PCR産物の検出には、BFO修飾PCR産物の検出用の捕捉オリゴヌクレオチドのほぼ2倍の長さの捕捉オリゴヌクレオチドが非常に好都合である。本発明者らは、これらの要素を踏まえて、BFO修飾PCR産物の検出のための感度は、変性PCR産物の検出と比較して有意に増加していると結論付ける。実施例2本発明者らは、オルトTINAが、実施例1のパラTINAと同様にDNAポリメラーゼを停止させること、およびオルトTINAがPCR反応を改善することを示す。本発明者らは、PCR反応においてオルトTINAを含有するプライマーを、DNAポリメラーゼを停止させるC3スペーサーを含有するプライマー対と比較する。使用したプライマー対を、下記に示す。プライマー:ipaHoTmixv2oTプライマー:ipaHC3mixZは、13ページに記載したとおりであり、式中、Rは、ピレンエチニルであり、ベンゼンのオルト位で置換されている。DEC082FおよびDEC083RプライマーはDNATechnologyで作製され、DEC066FはEuroFinsMWGOperonで作製される。オリゴをddH2Oに溶かし、100μMの濃度にする。PCR反応を、細菌溶解物に対して実施する鋳型遺伝子を含有する細菌のコロニーを水中で15分間煮沸し、1μlの煮沸溶解物を各PCR反応において鋳型として使用する。本実験において使用した細菌株は、ipaH遺伝子を含有する大腸菌fr1368である。PCR反応を、25μlの全容積においてSensoQuestLabcyclerで実施する。PCR反応の成分の最終濃度は以下である:1×EuroOptima緩衝液104mMTrisHCl、568mMTrizma塩基、161mM4SO4、001Tween80、30mMNaCl、2mMdATP、dGTP、dCTP、および066mMdTTP、および133mMdUTP、25mMMgCl2、008BSA、1×SYBRgreenI、025UウラシルDNAグリコシラーゼFermantas、ならびに1UKAPA2GRobustHSDNAポリメラーゼKAPABiosystems。50nM、100nM、200nM、および400nMの4種類の異なるプライマー濃度を使用する。PCR反応を、60~80°Cのアニーリング勾配で検定する。PCRプログラムを、下記に示す。PCRプログラムEuroOptimaMastermix:プレート設定および正確なアニーリング勾配を下記に示す。PCR産物を、比較のためにアガロースゲル上で検定する。5μlの各PCR産物を、ゲル上で検定する。GelRedを含む25アガロースゲルに130ボルト一定を20分間印加する。レーン1は、1μlの分子マーカーGeneRuler100bpPlusDNALadderFermentasSM0323を含有する。レーン2~12は、縦列2~12由来のPCR産物を含有する。各ゲルは、同一濃度での2タイプのPCR反応物を含有する。オルトTINAを含有するPCR反応物を常に最初にロードし横列1、続いてC3スペーサーPCR反応物をロードする横列2。結果:図4Aは、アニーリング勾配における50nMでのオルトTINA横列1およびC3スペーサー横列2のPCR産物を示す。オルトTINAPCR反応およびC3スペーサーPCR反応は両方とも、618°Cから、それぞれ709°Cおよび673°Cまでで機能し、50nMのプライマー濃度では、オルトTINAPCR反応がC3スペーサー反応より良好に機能することを示す。図4Bは、アニーリング勾配における100nMでのオルトTINA横列1およびC3スペーサー横列2のPCR産物を示す。オルトTINAPCR反応およびC3スペーサーPCR反応は両方とも、618°Cから、それぞれ727°Cおよび691°Cまでで機能し、100nMのプライマー濃度では、オルトTINAPCR反応がC3スペーサー反応より良好に機能することを示す。図5Aは、アニーリング勾配における200nMでのオルトTINA横列1およびC3スペーサー横列2のPCR産物を示す。オルトTINAPCR反応およびC3スペーサーPCR反応は両方とも、618°Cから、それぞれ800°Cおよび709°Cまでで機能し、200nMのプライマー濃度では、オルトTINAPCR反応がC3スペーサー反応より良好に機能することを示す。しかし、オルトTINAについての最後のPCR反応は、弱いバンドしか生成しない。図5Bは、アニーリング勾配における400nMでのオルトTINA横列1およびC3スペーサー横列2のPCR産物を示す。オルトTINAPCR反応およびC3スペーサーPCR反応は両方とも、618°Cから、それぞれ800°Cおよび727°Cまでで機能し、400nMのプライマー濃度では、オルトTINAPCR反応がC3スペーサー反応より良好に機能することを示す。オルトTINAおよびC3スペーサープライマーを含むPCR結果の総合的な結論。オルトTINAプライマーは概して、C3スペーサーを含有するプライマーより良好に機能する。オルトTINAプライマーは、すべての検定した濃度で、C3スペーサープライマーより高いアニーリング温度で機能する。このことは、オルトTINAプライマーがより低い濃度で使用可能であり、かつC3スペーサーを含有するプライマーと同様に機能できること、または、オルトTINAを含有するプライマーがより高いアニーリング温度で使用可能であり、かつC3スペーサープライマーと同様に機能できることを意味する。これはマルチプレックスPCRにおける大きな利点につながる。なぜなら、より良好な結果が得られる一方で、プライマー濃度を減少させることができ、アニーリング温度を上昇させることができるためである。その次の段階は、CliffHangerプライマーにおけるオルトTINAがDNAポリメラーゼを停止でき、それにより一本鎖オーバーハングを生成できることを示すことである。オルトTINAがDNAポリメラーゼを停止させる能力を検定するために、本発明者らは、一本鎖オリゴでコーティングしたLuminexビーズへのPCR産物の捕捉試験を行う。オルトTINAがDNAポリメラーゼを停止させて一本鎖オーバーハングを生成する能力を有するならば、少なくともC3スペーサー断片と同じくらい良好に、Luminexビーズ上にオルトTINA断片を捕捉することが可能であると考えられる。本発明者らは、5μlのPCR産物を使用したアガロースゲル解析と比較して、Luminex捕捉検定のために、1μlの精製したPCR断片を使用する。本発明者らは、400nMの実験から4種類のアニーリング温度を選択し、それらからPCR産物を精製する下記参照。PCR断片を、プロトコルに従って、MNNucleospinExtractIIkitMachereyNagelで精製する。実験における状況および影響を把握するために、精製したPCR産物を、開始容積と同じ容積中に溶出させる。Luminex捕捉解析を、以下のように実施する:1μlの精製PCR産物を6回にわたり3倍希釈し、希釈系列1;03333;01111;00370;00123;00041;00014μlを生成する。PCR産物を、20mMNaH2PO4Na2HPO4400mMNaCl003Tritonx100、pH694の最終濃度を有するHB緩衝液中、かつ捕捉オリゴを伴うluminexビーズの存在下でウェル当たり02μl、解析する。捕捉混合物を、51°Cおよび900rpmで30分間インキュベーションする。インキュベーション後、反応物を3回、洗浄緩衝液4倍希釈したHB緩衝液で洗浄する。最後の洗浄の後、検出混合物を反応物に添加する。これは、洗浄緩衝液中の100μgmlアルブミンフラクションVMerckおよび5μgmlストレプトアビジンRフィコエリスリンSigmaからなっている。検出混合物を、51°Cおよび900rpmで15分間インキュベーションし、その後洗浄緩衝液で3回洗浄する。Luminex機器は、90秒間にわたってウェル当たり300個のビーズを計数するようにプログラミングされる。結果捕捉解析図6からの結果は、オルトTINAPCR産物が捕捉され得ることを示し、従ってこのことは、オルトTINAがDNAポリメラーゼを停止させて、一本鎖オーバーハングを生成できることを意味している。Luminexの結果は、アガロースゲル解析からの結果を反映している。オルトTINAPCR産物は、アガロースゲル上でC3スペーサー産物よりも高い濃度を有するようであり、かつLuminex解析においてもオルトTINAは、C3スペーサー産物より高いMFIを生じる。これは、オルトTINAが、少なくともC3スペーサーと同程度に良好にDNAポリメラーゼを停止させることを示す。MFIは、アガロースゲル上のPCR産物のバンドの強度と相関する。最少で00014μlのPCR産物を検出できる希釈曲線は良好な直線性を有するので、Luminexアッセイもまた、アガロースゲルより高感度であるようである。アガロースゲルでは2種類のプライマー間の差異がおよそ3°Cであるのに対して、Luminex解析においてはおよそ6°Cであり、このことは、Luminex機器がアガロースゲルよりも高感度でありかつより良好に識別できることを示す。最終結論本発明者らは、オルトTINAが、C3スペーサーと比較してPCR反応を改善すること、およびまた、少なくともC3スペーサーと同程度に良好にDNAポリメラーゼを停止できることを示している。