"間葉細胞の集団をexvivoで拡大させる方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法:a前記細胞の増殖を可能にする条件下で前記細胞をexvivoで培養し;そしてb添加されたニコチンアミドを前記細胞にexvivoで提供し、それにより細胞集団をexvivoで拡大する。前記ニコチンアミドが1.0mM~10mMの量で添加されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。前記細胞が間葉幹細胞であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。前記条件は、栄養素及び増殖因子を含む培養培地を提供することを含むことを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記条件は、血清を提供することを含むことを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。前記添加されたニコチンアミドの存在下で前記細胞を培養することは、3週間までの期間の間であることを特徴とする、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。前記添加されたニコチンアミドの存在下で前記細胞を培養することは、7~10週間までの期間の間であることを特徴とする、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。前記細胞は、1.0mMの添加されたニコチンアミドの存在下で培養されることを特徴とする、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。前記細胞は、5.0mMの添加されたニコチンアミドの存在下で培養されることを特徴とする、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。前記細胞は、10.0mMの添加されたニコチンアミドの存在下で培養されることを特徴とする、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。請求項1~10のいずれか一項の方法によってexvivoで培養された間葉細胞の拡大された集団と、薬学的に許容可能なキャリアとを含むことを特徴とする、単離された移植可能な細胞の調製物。細胞移植のための、請求項11の単離された移植可能な細胞の調製物の使用。本発明は、幹細胞集団を拡大させると同時にexvivoおよび/またはinvivoで細胞分化を実質的に阻害する方法である。1つの実施形態では、本発明は、分化が阻害される一方で細胞拡大が増大する、再生可能な幹細胞の拡大された巨大集団を含む治療用のexvivo培養細胞調製物としての有効利用を促す。詳細には、これに関して、本発明を使用して、造血細胞の移植および遺伝子操作に適切な幹細胞の作製での適用に使用することができる幹細胞のexvivoでの拡大集団を得ることができる。これは、細胞遺伝子治療に使用することができる。さらなる適用には、養子免疫治療、複数の疾患例えば、β-異常血色素症などの治療、invivoでのシス分化およびトランス分化環境への幹細胞の移植、およびシス分化およびトランス分化環境へのexvivoでの組織操作が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明は、さらに、拡大させられた幹細胞調製物およびこれを調製するための製品に関する。本発明は、CD38発現および/または活性を妨害し、それにより幹細胞集団のexvivoでの拡大が誘導する種々の分子本明細書中では薬剤ともいうの使用を開示する。これにより、例えば、造血幹細胞に適用した場合には、多数の未分化のCD34/Lin-CD33、CD14、CD15、CD4など細胞、さらにはCD34/CD38-細胞特にCD34dim/Lin-細胞が得られる。この新規の用途の広い技術は、幹細胞の大きな集団を必要とするinvivoまたはexvivoでのあらゆる適用のための、その自己再生能力を維持している造血系に起源するおよび他の起源の幹細胞のexvivoおよび/またはinvivoでの拡大に使用することができる。本発明の実施に至るまでに、CD38の発現および/または活性を妨害することができる一連の分子が、exvivoで、幹細胞の分化プロセスを抑制し、活発な細胞の増殖および拡大期を刺激し、これを16~18週まで延長することを予想外に見出した。拡大の約16~18週間後、細胞は分化し始める;すなわち、これらの分子の効果は可逆的である。言い換えれば、本明細書に記載するようなexvivoでの細胞の処理によっては、細胞の細胞株への転換は生じない。この予想外の効果は、驚いたことに、細胞の供給源がCD34富化造血細胞幹細胞および初期先祖細胞である場合に、最も驚いたことには、単核の血球の全画分幹細胞、先祖細胞およびある系統への分化増殖能力を獲得した細胞を含む白血球の全画分を含む細胞の供給源を使用した場合にも得られた。背景のセクションで記載したように、現在のところ、富化させていない幹細胞を拡大させるための技術は開示されていない。さらに、RARおよびRXRスーパーファミリーのレチノイン酸受容体アンタゴニストなどの薬剤と共にインキュベートした初代肝細胞培養物で、α-フェトプロテインを産生し、それにより初期肝細胞集団の増殖が誘導される細胞集団の増加が明らかとなった。サイトカインを用いずに増殖させたアンタゴニストで処理処置した肝細胞培養物は培養物中で少なくとも3週間維持された。このことは、特にサイトカインが存在しない場合には長期間にわたって培養物中で初代肝細胞を増殖させることがほとんど不可能であることを示した以前のデータとは全く対照的であったWickM,etal.ALTEX.1997;142:51~56;HinoH,etal.BiochemBiophysResCommun.1999Mar5;2561:184~91;andTatenoC,andYoshizatoK.AmJPathol.1996;1482:383~92。成長因子のみの補充では肝細胞の増殖を刺激するには不十分であり、肝細胞培養物のRARアンタゴニストのみでの処理では初期肝細胞集団が増殖し、その培養を継続すると、その後の第1回目および第2回目の継代でさらに顕著になる。以下にさらに詳述し、以下の実施例の節で例示するように、本発明の状況で使用することができる分子のこの新規に発見された効果を、種々の型の細胞のexvivoでの拡大の最大化に使用した。本発明の原理および操作は、図面および以下の説明および実施例を参照してより深く理解することができる。本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載されているか実施例に例示されている構成の詳細および構成要素の並べ方へのその適用に制限されないと理解すべきである。本発明は、他の実施形態または種々の方法で実施または実行することができる。また、本明細書中で使用した表現および専門用語は説明を目的とし、制限とみなすべきではないと理解すべきである。CD38は、サイトゾルおよびその基質がニコチンアミドアデニンジヌクレオチドNADである膜結合酵素のエマージングファミリーのメンバーである。CD38によって産生される2つの代謝産物であるcADPRおよびNAADPは、植物、無脊椎動物、および哺乳動物の組織から単離された細胞中で細胞内カルシウムの放出を誘導することが示されており、これらの代謝産物がカルシウム応答の広範な調節因子であることが示唆されているLeeetal.1999Biol.Chem.380;785~793。最近、ヒト腫瘍細胞株HL-60細胞の顆粒球への分化をレチノイン酸によって誘導することができ、これには大量のCD38発現が伴うことが報告された。CD38発現と同時にcADPRが蓄積し、いずれの経時変化も分化が生じるより前に起こり、CD38の原因としての役割が示唆されている。これと一致して、CD38の透過インヒビターニコチンアミドでのHL-60細胞の処理により、CD38の活性と分化の両方が阻害された。そのmRNAをターゲティングするモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によりCD38発現はさらに特異的に遮断された。このモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用はさらに、これに対応する分化も阻害したMunshiCB,GraeffR,LeeHC,JBiolChem2002Dec20;27751:49453-8。他の研究では、先祖細胞の分化に対するCD38シグナル伝達の反対の作用が示された。短期間のcADPRでのヒト先祖細胞の処理により、コロニーサイズおよびコロニー量の顕著な増加が媒介された。これは、CD38シグナル伝達とexvivoでの幹細胞の拡大との間の直接的な相関関係を意味しているPodesta2000FASEBJ.14:680-690。同グループによって報告されたより最近の研究では、放射線を照射したNOD/SCIDマウスへの造血幹細胞の移植に対するcADPRの作用が研究されたPodesta2002FASEBJ.Dec3epubaheadofprint。この研究では、ヒト造血先祖細胞に対するcADPRの2つの作用本質的に、短期移植の改良のためのある系統への分化増殖能力を獲得した先祖細胞の増殖の強化と、二次レシピエント中に長期間ヒト組織を植えつけた状態でのヒト幹細胞の拡大がinvivoで証明された。したがって、これらの結果は、ヒト幹細胞の長期拡大を達成するためのcADPRの使用を示唆する。したがって、先行技術の研究はヒト幹細胞について行われており、今までのところ、ヒト幹細胞のexvivoまたはinvivoでの拡大のためのcADPRCD38触媒に起因する産物の使用が教示されている。本発明の実施に至るまでに、本発明者らは、驚いたことに、CD38の活性または発現の阻害によりヒト幹細胞のexvivoでの拡大が生じると同時に細胞分化が制限されることを発見した。明らかに、上記の先行技術は、本発明と異なる教示をしている。RAR、RXR、およびVDRなどのレチノイド受容体ならびにそのアゴニストビタミンAおよびその活性な代謝産物ならびにビタミンDおよびその活性な代謝産物などは、細胞の増殖および分化に関連する遺伝子発現経路の調節に関与している。ビタミンDは、骨髄単球の分化誘導因子であることが示されており、RXR-VDRレチノイド受容体のヘテロ二量体形成の誘導によってそのシグナルを伝達し28、RAR-RXRまたはRXR-RXRヘテロ二量体はレチノイドが誘導する顆粒球の分化に不可欠である。レチノイドは多数の組織における正常な分化の維持に不可欠であることが示された。例えば、上皮系では29、レチノイドが不十分な組織は前癌状態表現型となり、これは、分裂活性の増大および分化の喪失によって特徴付けられる30。RAR-β遺伝子は正常な上皮組織中で発現され、その発現は、レチノイン酸での処理によってアップレギュレート上方制御される31,32。種々の癌腫由来の多数の悪性細胞株では、RAR-β2mRNAレベルは低下しているかまたは検出できず33~37、このことは、RAR-β2mRNAの発現の特異的喪失は、腫瘍形成における重要な事象であり得ることを示している。レチノイン酸受容体RAR活性の破壊は、ヒト急性前骨髄球性白血病APLの特徴であり、顆粒球分化の遮断に関連している。このことは、RARが正常な骨髄分化の重要な調節因子であることを示している。さらに、レチノイン酸受容体が欠損しているノックアウトマウスは、invitroで顆粒球分化の遮断を示す38,39。上記証拠は骨髄造血の調節におけるRARの重要な役割を明確に示すが、いくつかの重要な問題が未解決なままである。RAR活性がリガンド濃度に依存する場合に、RAR活性が、おそらくは血液および骨髄中に存在する均一な生理学的濃度のレチノイドに曝露された細胞の骨髄分化を調節する機構は、何であろうか臨床的観点から最も重要なことは、なぜ急性前骨髄球性白血病APLのみがレチノイドに劇的な応答を示し、一方で、他の急性骨髄性白血病は正常なRARを発現するにもかかわらず、他の90の急性骨髄性白血病は示さないのかである40。正常な非白血病性造血幹細胞に対するレチノイドおよびレチノイド受容体の生物学的効果はPurtonetal.によって報告されている41。Purtonetal.41は、薬理学的レベル1μmolのオールトランス型レチノイン酸ATRAによりLin-c-kitSca-1マウス造血前駆体の液体懸濁培養物中でコロニー形成細胞CFCおよびコロニー形成単位-脾臓CFU-Sの生成が増加することを明らかにした。Purtonetal.41は、さらに、移植可能な細胞pre-CFU-S、短期再生幹細胞short-termrepopulatingcell:STRC、および長期再生幹細胞long-termrepopulatingcell:LTRCを含むの生成に対する、ATRAの、ならびにRARアンタゴニストであるAGN193109の作用を調査した。Purtonetal.41は、ATRAにより液体懸濁液中で14日間培養したLin-c-kitSca-1細胞由来の競合する再生STRCおよびLTRCのexvivoでの維持および産生が増大することを明らかにした。さらに、ATRAにより14日の培養の間、これらの原始幹細胞のより成熟したpre-CFU-Sへの分化が妨げられた。非常に対照的に、AGN193109RARアンタゴニストと共に7日間培養したLin-c-kitSca-1細胞は、事実上短くない、すなわち長期の再生能力を示したが、約6倍増のpre-CFU-S集団を示した。これらの研究によるPurtonetal.41の結論は、RARに対するアゴニスト、すなわち、レチノイン酸は、短期および長期再生幹細胞の維持および自己再生を増大させるということであった。対照的に、RARアンタゴニストであるAGN193109は再構築能力を消滅させ、これは原始幹細胞の分化の促進による可能性が最も高い。Purtonetal.41は、これらの結果が、造血幹細胞分化の調節におけるレチノイドの重要且つ予想外の役割を意味すると主張している41。レチノイドは、精製されたCD34細胞のサイトカインで刺激した培養物においては顆粒球先祖細胞の増殖および分化を促進する一方で42、幹細胞レベルでは、反対の効果を示す。非造血組織ではあるが、Purtonetal.41に基づいて、Kameiもまた、レチノイド特に、オールトランス型レチノイン酸が前脂肪細胞の分化を阻害することを明らかにした43。したがって、造血系では、核レチノイド受容体は、ある系統への分化増殖能力を獲得した細胞の下流分化を制御および促進する経路に強く関与していた。分化の骨髄芽細胞または前骨髄細胞段階で遮断されるある系統への分化増殖能力を獲得した細胞であるいくつかの白血病細胞株モデルHL-60、NH4、および32Dなどについて詳述したように、特異的アンタゴニスト、アンチセンスまたは短型受容体での形質導入によるこれらの受容体の不活化は、顆粒球および単球の分化の誘導の阻害に関与する。正常な細胞とは対照的に、白血病では、細胞の増殖および分化を制御する調節経路の間が破壊される。これらの経路は、正常な細胞においては厳密に連携している。これら2つのプロセス増殖および分化への方向付けが連携していない唯一の例外は、幹細胞の自己再生増殖経路である。したがって、上記の全研究は、幹細胞レベルでのレチノイド受容体の役割については何ら教示していない19,22,64。本発明の実施により、限られた短期間の間にexvivo造血培養物または肝細胞培養物に添加された場合に、レチノイン酸アンタゴニストは、自己再生可能な幹細胞の拡大を長期化することができることが明らかになった。アンタゴニストは、短期間の培養においては、細胞全体およびCD34細胞拡大に対して有意なポジティブまたはネガティブな作用のいずれも示さなかった。さらに、CD34抗原は、ある系統への分化増殖能力を獲得した細胞ならびに多能性幹細胞上で発現する。全CD34細胞集団のごく一部の割合CD34/CD38-およびCD34/Lin-細胞のみが、幹細胞および初期先祖細胞の区分に属する。2週間のexvivo培養物中でのこれら2つの稀な小集団の含有率の分析により、RARアンタゴニストを補充した培養物は、初期作用性サイトカインであるトロンボポイエチンTPO、インターロイキン-6IL-6、FLT-3リガンド、および幹細胞因子SCFのみで処理した培養物と比較してCD34/CD38-細胞およびCD34/Lin-細胞の比率が高いことが明らかとなった。アンタゴニストは、CD38抗原の発現を完全に消滅させた。種々の他の系統特異的Lin抗原も阻害した。アンタゴニストの効果は特異的であり、自己再生および分化の決定への方向付けのチェックポイントに存在する重要な調節遺伝子を明らかにターゲティングしている。これらの結論は、本明細書中の実施例の節に記載する結果から導いた。実施例では、RARアンタゴニストは分化関連抗原の発現のみをダウンレギュレートするが、CD34抗原などの幹細胞表現型に関連する抗原ではダウンレギュレートが起こらないことを示している。CD34細胞の比率および絶対数は、短期間の培養においてはアンタゴニストによっては影響を受けなかった。自己再生および分化への方向付けの調節事象に対するアンタゴニストの特異的作用は、初代肝細胞培養物と継代肝細胞培養物を用いて本明細暑中で行った実験によってさらに支持される。アンタゴニストと共にインキュベートした初代培養物により、α-フェトプロテイン産生細胞の比率および組織学的に明らかな楕円形細胞数初期肝細胞集団の増殖に関連する事象の増加が明らかとなった。これらの初期肝細胞集団は、サイトカインを補充しなくとも、少なくとも3週間の培養で持続した最も前例のない所見。さらに、培養物への成長因子の補充では初期肝細胞集団の増殖に対する作用はなかったが、RARアンタゴニストでの処理により第1回目の継代後にもなおこの集団を拡大させることができ、これは第2回目の継代後において有意に肝細胞集団を拡大させた。このことは、細胞の自己再生能力におけるアンタゴニストの役割をさらに示している。短期間の培養に対するその作用に加えて、本発明の実施により、アンタゴニスト分子での短期間の処理により、幹細胞例えば、CD34/Lin-細胞およびCD34/CD38-細胞の長期間のexvivoでの拡大および自己再生も可能であることが明らかにされた。興味深いことに、幹細胞のFACS分析および機能的LTC-CFUによって示すように、アンタゴニストへの限定的な曝露は長期および延長された長期の培養物の有意且つ顕著な延長を生じるに十分であった。長期および延長した長期培養の間、CFUおよびCFU-混合物の含有量は、サイトカインのみで処理した培養物におけるCFUの含有量と比較して顕著に増加し、実際は、長期間の培養の間に減少する。実際、多数のコントロール培養物は長期および延長した長期培養においてCFU能力を全く維持できなかった。延長した長期培養期間でCFU-混合物の劇的且つ継続的な増加を示した、アンタゴニストで3週間処理した培養物とは対照的に、サイトカインのみで処理した培養物は、全培養期間で混合物コロニーを拡大できないだけでなく維持さえもできなかった。表現型特徴づけから明らかなように、幹細胞の拡大は、機能的LTC-CFUアッセイによって測定した長期自己再生能に完全に一致する。いずれのアッセイも、アンタゴニスト分子でパルスした培養物中での自己再生幹細胞の優れた長期拡大を示している。RARアンタゴニストによりある系統への分化増殖能力を獲得した前骨髄細胞HL-60細胞のRA誘導顆粒球分化が阻害されることが示された25。短型RARの遺伝子トランスフェクションによりマウス由来骨髄性白血病細胞株32DのG-CSFに対する応答が阻害されることも示された22。しかし、これらの研究は白血病系統への分化増殖能力を獲得した細胞株を用いて行われており、特に、RAまたはG-CSFによって誘導された顆粒球分化の阻害のみを示している。したがって、上記研究から幹細胞レベルでの調節を結論付けることはできない。本明細書中に記載の研究は、RARアンタゴニスト分子が正常な幹細胞のexvivoで分化のプロセスを調節できることを最初に明らかにするものである。その技術について上記に記載したPurtonetal.41とは対照的に、レチノイド受容体に対するアンタゴニスト分子およびヒト幹細胞培養物を使用して、レチノイド受容体が幹細胞自己再生の調節に関与していることが本明細書中で明らかにされる。限られた短期間の間のexvivo培養培地へのこれらの分子の添加により、長期間その表現型を変化させずに幹細胞を継続的に増殖させることができることが本明細書中でさらに明らかにされた。さらに、レチノイン酸受容体アンタゴニストのこれらの作用は、いかなる細胞形質転換にも関与せず、いかなる細胞株も形成しない。短型のドミナントネガティブRARでの形質導入によって偶然に得られる細胞株とは対照的に22-23、最初の2~3週間のみまたは培養期間全体にわたって継続的にアンタゴニストを補充するかのいずれにしても、全ての培養細胞は正常な骨髄性細胞、赤血球、およびリンパ球への分化を受け、培養開始から16~18週間後には細胞増殖能力を完全に喪失することを本明細書中に示す。遺伝子発現および細胞機能形質導入遺伝子が遮断されない場合の不定変化を誘導する形質導入手順によって得られた遺伝子操作とは対照的に、RARアンタゴニストでの継続的処理によりCD34/Lin-表現型が不定に拡大または維持されなかった。したがって、ドミナントネガティブ受容体活性の機構は、RARアンタゴニスト分子の機構と非常に異なる。異なる作用様式のさらなる裏づけとなるデータは、ドミナントネガティブRARで形質導入した細胞は分化誘導因子の存在下でさえも未熟なままであることを示している実験から得られる22。これは、RARアンタゴニストで処理した正常な非白血病性細胞を用いた場合とは明確に異なっている。正常なマウス由来の骨髄BM細胞を用いて開始し、その後の短型RAR受容体での形質導入により、Collins23は、偶然にマウス幹細胞株を得た。しかし、同一のマウス由来細胞およびRARアンタゴニストを使用して、Purtonetal.41は、RARアンタゴニストが幹細胞分化を促進する一方で、レチノイン酸は幹細胞のexvivoでの拡大を補助することを明らかにした41。Purtonetal.41およびCollins23によって得られたこれらのデータは、本明細書中で考察するように、2つの異なる関連のない機構の存在を支持する。造血組織に対するレチノイド受容体の作用に加えて、レチノイド受容体ファミリーに属する受容体は正常な胚形成および成体組織発達を制御する分化経路に関与していることが明らかにされた。ビタミンAが不足している動物およびレチノイン酸受容体遺伝子ノックアウトマウスで多数の胚奇形が生じる。このことは、レチノイン酸ビタミンAの活性代謝産物が正常な発達におけるいくつかの不可欠な機能を果たすことを示している。レチノイドはまた、皮膚の形態に影響を与えることが以前より知られている。妊娠後期受胎14日後dpcにRARに対するアンタゴニストが投与された場合、これらはマウスの胚の皮膚および毛包の分化および成熟を遅延させる65。RXR-αの除去により、皮膚の炎症反応を伴うケラチノサイト過剰増殖および異常な末端分化が起こる表皮性毛包内過形成を発症する。RXR-α/VDRヘテロ二量体は、毛周期調節で主要な役割を果たすことがさらに示されており、他の核受容体とヘテロ二量体形成したRXR-αによって媒介されるさらなるシグナル伝達経路が、出生後の毛包の成長に関与していることが示唆されている66。上記データをまとめると、幹細胞レベルで、レチノイド受容体ファミリーに属する受容体を介した正および負のシグナルが正常な造血幹細胞および非造血幹細胞の自己再生と分化への方向付けとの間の生理学的均衡を制御すると結論付けられる。細胞分化の新規のexvivoダウンレギュレーション方法により、胚および成体の造血および非造血幹細胞を大きく拡大させることができ、これを造血細胞の移植、遺伝子治療、細胞置換療法、または幹細胞数の増加を必要とする任意の他の適用に使用することができる。幹細胞を大きく拡大させるための小分子の使用は、実行可能で経済的且つ安全な方法である。それ故、本研究の過程で、レチノイン酸、レチノイドXおよび/またはビタミンD受容体に結合する一連の化学物質が適切な受容体シグナル伝達を妨害することが見出された。この妨害は、幹細胞のexvivoでの分化プロセスを可逆的に阻害し遅延させる、それにより活発なexvivo幹細胞拡大を刺激および延長させることができる。この新たに発見された受容体アンタゴニスト適用の効果は、造血細胞、肝細胞、および胚性幹細胞を含む種々の細胞型のexvivoでの拡大の最大化に使用することができる。このようなexvivoで拡大させた細胞を、いくつかの臨床状況で適用することができる。以下にいくつかを列挙する。造血細胞の移植:造血細胞の移植は、種々の遺伝病または悪性疾患に最適な治療となりつつある。初期の移植手順は骨髄BM集団全体を使用していたが、最近では、幹細胞CD34細胞を富化させたより顕著な特性を有する集団が使用されている44。骨髄に加えて、このような細胞は、末梢血PBおよび新生児臍帯血CBなどの他の供給源から得ることもできる45。BMと比較して、PB細胞の移植により、汎血球減少の期間が短くなり、感染および出血のリスクが低くなる46-48。移植にPBを使用するさらなる利点は、その利用しやすさである。PBの移植を制限する要因は、循環している多能性幹細胞/先祖細胞数が少ないことである。移植に十分なPB由来の幹細胞を得るためには、これらの細胞を、化学療法およびサイトカインでの治療による骨髄から循環へのその動員後に、ロイコフォレシスを繰り返すことによって採取する46-47。このような処置は、正常なドナーには明らかに適切ではない。移植へのexvivoで拡大した幹細胞の使用は以下の利点を有している49-50。成体造血系の再構成に必要な血液量を減少させ、動員およびロイコフォレシスの必要性を回避することができる46。将来使用する可能性のために少数のPBまたはCB幹細胞を保存することができる。悪性疾患のレシピエントの自己移植の場合には、自己輸液への腫瘍細胞の混入が、多くの場合、疾患の再発の一因となる46。CD34幹細胞を選択し拡大させることにより、最終的な移植片中の腫瘍細胞の負荷量が減少する。培養によりTリンパ球が有意に減少し、これは移植片対宿主病の軽減のための同種異系移植の状況に有用であり得る。臨床試験は、少数のPBCD34細胞に由来するexvivoで拡大させた細胞の移植により、高用量の化学療法で処置したレシピエントの造血を回復させることができることが示されるにもかかわらず、結果は依然としてこれらの培養細胞の長期間にわたるinvivo造血能力について結論を得ていない46-47。移植の成功のためには、血球減少期間の短縮ならびに長期間の植え付けが重大である。移植片に中期および後期先祖細胞を含めることにより、ドナー由来の成熟細胞の産生が促進され、それにより血球減少期間を短縮することができる。したがって、exvivoで拡大させた細胞には、幹細胞に加えて、短期間での回復および造血の長期間にわたる修復を最適にするためのより分化した先祖細胞が含まれることが重要である。幹細胞の拡大を同時に生じる、中期および後期先祖細胞特に、好中球および巨核球系統に方向付けられたものの拡大はこの目的に役立つはずである51。このような培養物は、骨髄が完全に取り除かれたレシピエントの造血の回復、さらには従来の放射線治療および化学療法後のレシピエントの骨髄回復を早めるための支援手段の獲得に有用であり得る。稀な細胞における遺伝的欠損の出生前診断:出生前診断は、妊婦由来の子宮内の胚細胞の採取および遺伝的欠損の分析を含む。好ましい非侵襲性の胚細胞採取手段としては、末梢母体循環系に浸潤した胚性有核赤血球前駆体の分離が挙げられる。しかし、これらの細胞の量は非常に少ないので、さらに本発明を適用して、分析の前に、本明細書中に記載の方法によりこのような細胞を拡大させる。したがって、本発明は、出生前診断に適用するための胚細胞の拡大手段を提供する。遺伝子治療:長期間にわたる遺伝子治療の成功のためには、そのゲノム内に安定に組み込まれた導入遺伝子で遺伝子が改変された幹細胞が高頻度で存在することが絶対に必要である。BM組織では、大部分の細胞は、循環している先祖細胞および前駆細胞であり、幹細胞は細胞集団の小さい割合を構成するにすぎず、そのほとんどが休止した循環していない状態にある。ウイルスベースの例えば、レトロウイルスベクターは、宿主ゲノム中に導入遺伝子を組み込むために活発な細胞分裂を必要とする。したがって、新鮮なBM幹細胞への遺伝子導入はあまり効果がない。精製された幹細胞集団を拡大させ、その細胞分裂をexvivoで調節する能力により、その遺伝子を改変する可能性が増大する52。養子免疫療法:exvivoで拡大させ、顕著な特性を有するリンパ系小集団が研究されており、種々の悪性疾患、免疫不全疾患、ウイルス性疾患、および遺伝性疾患の養子免疫療法に使用されてきた53-55。この処置により、必要な免疫応答が増強されるか、または欠損機能が置き換えられる。このアプローチは、非常に多数の自己のexvivoで拡大させられた非特異的キラーT細胞を、続いて、exvivoで拡大させられた特異的腫瘍浸潤性リンパ球を使用して、Rosenbergetal.56によって最初に行われた。同様に、機能的に活性な抗原提示細胞を、サイトカインを維持させた培養物中のCD34PB細胞の出発集団から成長させることができた。これらの細胞は、invitroで、自己T細胞に対する可溶性タンパク質抗原を提示することができるので、高用量の免疫治療の投与後に残っている極小さい病変の免疫療法に新しい見通しを与える。同様に、抗原を提示する樹状細胞のexvivoでの拡大も研究されており、これは現在提案されている技術のさらなる有望な適用である57-59。非造血幹細胞および先祖細胞のexvivoでの拡大:本明細書中で提案されている技術のさらなる適用には、非造血幹細胞および先祖細胞例えば、神経幹細胞、乏突起膠細胞前駆体などが含まれるのexvivoでの拡大の可能性が含まれる。ミエリン障害は、今までのところは不治である、ヒト神経疾患の重要な群を形成する。動物モデル、特に乏突起膠細胞系統の細胞移植の進歩により、有意な病巣再髄鞘形成が起こり、機能回復が生理学的証拠が得られている60。将来的な治療は、移植および内因性修復の促進を含み、2つのアプローチをドナー組織のexvivoでの操作と組み合わせることができる。米国特許第5,486,359号は、単離されたヒト間葉幹細胞を1つ以上の組織型例えば、骨、軟骨、筋肉、または骨髄基質へと分化させることができ、培養物中のヒト間葉幹細胞の単離、精製、および拡大方法を提供することを例示している。米国特許第5,736,396号は、最適な系統への幹細胞の分化の誘導に有効な生物活性因子での間葉幹細胞の接触を含む単離した培養拡大ヒト間葉幹細胞のinvitroまたはexvivoでの特定の系統方向への誘導方法を提供する。間葉組織の再生または修復のための、元の自己宿主への培養-拡大された特定の系統方向へと誘導した間葉幹細胞の導入を含む方法がさらに開示されている。米国特許第4,642,120号は、軟骨および骨の欠損を修復するための組成物を提供する。これらを、ゲル形態そのまま、または天然もしくは人工の骨に包埋された形態で提供される。ゲルは、一定の型の細胞を含む。細胞は、方向性胚軟骨細胞または典型的には、フィブリノゲン、抗タンパク質分解酵素、およびトロンビンと組み合わせて軟骨形成誘導因子を含むことによって、機能的な軟骨細胞に変換することができる能力を有している任意の間葉起源の細胞であり得る。米国特許第5,654,186号は、動物モデルによって証明されるように、血行性間葉細胞が培養およびinvivoで増殖し、血液から創傷部位へ移動して皮膚を形成することができることを明らかにしている。米国特許第5,716,411号は、動物またはヒトにおける創傷または火傷の皮膚再生方法を示す。この方法は、最初にコラーゲングリコサミノグリカンGCマトリクスで創傷を被覆する工程と、移植したGCマトリクス内の健常な基底組織からの間葉細胞および血管浸潤を促進する工程とを含む。その後、動物またはヒトの無創傷部位から採取した上皮細胞から成長させた培養した上皮自家移植片を、体表に適用する。得られた移植片は優れた封入速度を有し、正常な皮膚の外観、成長、成熟、および分化を有する。米国特許第5,716,616号は、骨、軟骨、または肺の欠損によって特徴付けられる疾患、障害、または病態を罹患したレシピエントの治療方法を提供する。本方法は、正常な同系個体から単離した間質細胞の静脈内投与または単離細胞の遺伝子欠損の修復後にレシピエントから単離した間質細胞の静脈内投与を含む。レシピエント個体への遺伝子の導入方法も開示する。本方法は、レシピエント個体または適合する同系ドナーのいずれかから骨髄サンプルを得る工程と、前記サンプルから接着細胞を単離する工程とを含む。一旦単離すると、ドナー接着細胞を遺伝子でトランスフェクトし、レシピエント個体に静脈内投与する。調節配列に作動可能に連結された外因性遺伝子を含む単離した間質細胞を含む組成物を同様に開示している。上記例のそれぞれでは、非造血幹細胞および先祖細胞を、器官の喪失および損傷した細胞の補充のための外部細胞供給源として使用する。このような使用は、提案される治療の成功のためには、高レベルの幹細胞および先祖細胞の拡大が必要である。多数の拡大幹細胞および先祖細胞の集団がこのように差し迫って必要とされているので、本発明の方法および適用は、上記米国特許に開示の任意の方法の重要部分に取り組んだ。exvivoおよびinvivoでの適用についてのさらなる例:幹細胞および先祖細胞の拡大のさらなる適用には、骨粗鬆症への適用のための皮膚再生、肝臓再生、筋肉再生、および骨成長の刺激が含まれる。骨髄幹細胞の末梢血への動員末梢化:レチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンD受容体アンタゴニストの作用を、さらにinvivoで適用する。上記のように、移植のためのPB由来幹細胞を、化学療法およびサイトカインでの治療による骨髄から循環へのその動員後に、ロイコフォレシスを繰り返すことによって採取する46-47。勿論、化学療法の使用は、正常なドナーには適切ではない。ドナーへのアンタゴニストの投与により、骨髄幹細胞のプールを増大させることができ、次いでこれを、内因性または注射したG-CSFによって抹消に動員する。胎児ヘモグロビン産生の刺激:胎児ヘモグロビンの増加によって鎌状赤血球貧血およびβ-サラセミアなどのβ-異常血色素症を罹患したレシピエントの臨床症状を改善することが示された61。通常は総ヘモグロビンの1である胎児ヘモグロビンにより、赤血球生成促進が高められる例えば、急性溶血もしくは出血またはエリスロポイエチン投与後62。この現象は赤血球前駆体の成熟/分化プロセスの加速に関連することが示唆されている63。β-異常血色素症のレシピエントへのレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンD受容体アンタゴニストの投与により、前駆体分化の遮断によってその初期赤血球前駆体プールを最初に増加および同期化させることができる。薬物の投与および体内からのその除去の停止後、この初期集団は次いで成熟が促進されて、胎児ヘモグロビンの産生が増大し得る。本発明の特定の態様および実施形態に関して以下により詳細に説明する。本発明の1つの態様により、幹細胞集団をexvivoで拡大すると同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する方法を提供する。本発明のこの態様による方法を、exvivoでの細胞増殖のための条件であり、同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与える工程と、それにより幹細胞集団を拡大させると同時に幹細胞分化をexvivoで実質的に阻害する工程によって行う。本明細書中で使用される場合は、句幹細胞は、正しい増殖条件を与えると、その細胞を得た生物中に存在するあらゆる細胞系統へと発達することができる多能性細胞をいう。本明細書中で使用される場合は、この句は、組織または身体中に細胞塊の生成を担う最初期の再生可能な細胞集団およびいくらかより分化しているが依然として方向付けられておらず、且つ最初期の再生可能な細胞集団の一部になるように容易に復帰することができる極めて初期の先祖細胞の両方をいう。異なる組織から得た幹細胞のexvivoでの培養方法は、細胞培養の分野で周知である。これを行うためには、例えば、テキストブックCultureofAnimalCells-AManualofBasicTechniquebyFreshney,Wiley-Liss,N.Y.1994,ThirdEditionその教示が本明細書中で参考として援用されているを参照のこと。本明細書中で使用される場合は、用語阻害は、減速、減少、遅延、防止、または廃止をいう。本明細書中で使用される場合は、用語分化は、発達の間の比較的一般化または特殊化した変化をいう。種々の系統の細胞分化は、十分に報告されたプロセスであり、本明細書中でさらに説明する必要はない。本明細書中で使用される場合は、用語分化は、多くの場合に細胞分裂に関与しているが、機能するための特定の細胞型へと成熟し、次いで例えばプログラムされた細胞死によって死滅するプロセスである、成熟とは異なる。句細胞の拡大は、実質的に細胞分化を欠く細胞増殖プロセスを説明するために本明細書中で使用する。したがって、拡大される細胞は、その細胞再生特性を維持し、多くの場合は、本明細書中で再生可能な細胞例えば、再生可能な幹細胞をいう。本明細書中で使用される場合は、用語exvivoは、生きた生物から細胞を取り出し、生物外例えば、試験管内で増殖させるプロセスをいう。しかし、本明細書中で使用される場合は、用語exvivoは、種々の細胞株例えば、HL-60、MEL、HeLaなどなどのinvivoでのみ増殖することが公知の細胞を培養するプロセスについてはいわない。言い換えれば、本発明によってexvivoで拡大された細胞は、これらが最終的に分化するという点で、細胞株に転換していない。exvivoでの細胞増殖のための条件をexvivoで増殖させた細胞に与えることは、栄養素、好ましくは1つ以上のサイトカイン以下にさらに詳述するを細胞にあてがうことを含む。上記のように、幹細胞をexvivoで増殖させる条件での細胞の処理と同時に、CD38の発現および/または活性を低下させるために細胞を短期間または長期間処理する。CD38活性を阻害する薬剤すなわち、CD38インヒビターを細胞に与えることによって、CD38活性を低下させる。本明細書中で使用される場合は、CD38インヒビターは、幹細胞中でCD38活性をダウンレギュレートまたは抑制することができる薬剤をいう。本発明のこの態様のCD38インヒビターは、CD38内因性活性を阻害する直接的インヒビターまたはCD38シグナル伝達成分例えば、cADPRおよびリアノジンシグナル伝達経路またはCD38活性に影響を受ける他のシグナル伝達経路の活性または発現を阻害する間接的インヒビターであり得る。本発明のこの態様の現在公知の実施形態によれば、ニコチンアミドは好ましいCD38インヒビターである。したがって、1つの実施形態では、本発明のこの態様による方法を、ニコチンアミド自体、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物のいずれかを細胞に与えることによって行う。本明細書中で使用される場合は、句ニコチンアミドアナログは、ニコチンアミドと同様に作用することが公知の任意の分子をいう。ニコチンアミドアナログの代表例には、ベンズアミド、ニコチンチオアミドニコチンアミドのチオールアナログ、ニコチン酸、およびα-アミノ-3-インドールプロピオン酸が含まれるが、これらに限定されない。句ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体は、ニコチンアミド自体の、またはニコチンアミドのアナログの任意の構造誘導体をいう。このような誘導体の例には、置換ベンズアミド、置換ニコチンアミド、およびニコチンチオアミド、およびN置換ニコチンアミドおよびニコチンチオアミドが含まれるが、これらに限定されない。句ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物は、ニコチンアミドまたはそのアナログ由来の生成物例えば、NAD、NADH、およびNADPHなどをいう。あるいは、本発明のこの態様のCD38インヒビターは、例えばCD38触媒ドメインに結合することによってCD38触媒活性を阻害する活性な中和抗体であり得る。それにもかかわらず、CD38が細胞内タンパク質であるので、原形質膜を介して送達することができるインヒビターの使用手段がとられることが認識される。これに関して、Fabフラグメント以下に記載などの断片化抗体を使用することが好ましい。本発明で使用される、用語抗体には、完全な分子ならびにマクロファージに結合することができるその機能的フラグメントFab、Fab’2、およびFvなどが含まれる。これらの機能的抗体フラグメントを以下のように定義する:Fab:抗体分子の1価の抗原結合フラグメントを含み、完全な軽鎖および1つの重鎖の一部を得るために酵素パパインでの完全な抗体の消化によって産生される、フラグメント;Fab’:完全な軽鎖および重鎖の一部を得るためにペプシンでの完全な抗体の処理およびその後の還元によって得ることができる抗体分子のフラグメント;抗体分子あたり2つのFab’フラグメントが得られる;Fab’2:その後に還元することなく酵素ペプシンでの完全な抗体の処理によって得ることができる抗体のフラグメント;Fab’2は、2つのジスルフィド結合により互いに結合した2つのFab’フラグメントの二量体である;Fv:2つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される;および単鎖抗体SCA:適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む、遺伝子融合された1本鎖分子としての遺伝子操作された分子。これらのフラグメントの作製方法は、当該分野で公知である例えば、HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1988本明細書中で参考として援用されているを参照のこと。本発明の抗体フラグメントを、E.coliまたは哺乳動物細胞例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系でフラグメントをコードするDNAを発現させることによって調製することができる。従来の方法による完全な抗体のペプシンまたはパパイン消化によって、抗体フラグメントを得ることができる。例えば、Fab’2と呼ばれる5Sフラグメントを得るためのペプシンでの抗体の酵素分解によって抗体フラグメントを産生することができる。チオール還元剤、および必要に応じて、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基をブロックする基を使用してこのフラグメントをさらに切断して、1価の3.5SFab’フラグメント産生することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素切断により、2つの1価のFab’フラグメントおよびFcフラグメントを直接産生する。これらの方法は、例えば、Goldenberg、米国特許第4036945号、および同第4331647号ならびにこれらに記載の参考文献これらの特許は、その全体が本明細書中で参考として援用されているによって記載されている。Porter,R.R.,Biochem.J.,73:119-126,1959もまた参照のこと。フラグメントが完全な抗体によって認識される抗原に結合する限りは、1価の軽鎖-重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素技術、化学的技術、または遺伝子技術などの抗体を切断するための他の方法を使用することもできる。Fvフラグメントは、VH鎖およびVL鎖の結合を含む。Inbaretal.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA69:2659-62,1972に記載のように、この結合は非共有結合であり得る。あるいは、可変鎖は、分子内ジスルフィド結合によって結合するか、グルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋することができる。好ましくは、Fvフラグメントは、ペプチド結合によって連結したVH鎖およびVL鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質sFvを、オリゴヌクレオチドによって連結されたVHおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子の構築によって調製する。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、その後E.coliなどの宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。sFvの産生方法は、例えば、WhitlowandFilpula,Methods,2:97-105,1991;Birdetal.,Science242:423-426,1998;Packetal.,Bio/Technology11:1271-77,1993;andLadneretal.,米国特許第4946778号その全体が本明細書中で参考として援用されているによって記載されている。抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域CDRをコードするペプチドである。CDRペプチド最小認識単位を、目的の抗体のCDRをコードする遺伝子の構築によって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用して調製する。例えば、LarrickandFry,Methods,2:106-10,1991を参照のこと。非ヒト例えば、マウス抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むそのフラグメントFv、Fab、Fab’、Fab’2、または抗体の他の抗原結合配列などのキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域CDRを形成する残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどのヒト以外の種ドナー抗体のCDR由来の残基に置換されたヒト免疫グロブリンレシピエント抗体が含まれる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基に置換する。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体、取り込まれたCDR、またはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、全てまたは実質的に全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である、実質的に全て、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域Fc典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むJonesetal.,Nature,321:522-5251986;Riechmannetal.,Nature,332:323-3291988;andPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-5961992。非ヒト抗体のヒト化方法は、当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源由来のアミノ酸残基に導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。典型的には導入可変ドメインから採取されるこれらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば導入残基といわれる。本質的に、げっ歯類CDRまたはCDR配列の対応するヒト抗体配列との置換によるWinterandco-workersの方法Jonesetal.,Nature,321:522-5251986;Riechmannetal.,Nature332:323-3271988;Verhoeyenetal.,Science,239:1534-15361988にしたがってヒト化を行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全ではないヒト可変ドメインがヒト以外の種由来の対応配列に置換されているキメラ抗体である米国特許第4816567号。実際には、ヒト化抗体は一般に、いくつかのCDR残基およびおそらくいくつかのFR残基がげっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。当該分野で公知の種々の技術ファージディスプレイライブラリーを含むを使用してヒト抗体を産生することもできるHoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.,227:3811991;Marksetal.,J.Mol.Biol.,222:5811991。ヒトモノクローナル抗体の調製のためのColeetal.andBoerneretal.の技術も利用可能であるColeetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.771985およびBoerneretal.,J.Immunol.,1471:86-951991。同様に、トランスジェニック動物例えば、外因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているマウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によってヒトを作製することができる。チャレンジにより、ヒト抗体産生が認められる。これは、遺伝子の再配置、構築、および抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトで認められる非常に類似している。このアプローチは、例えば、米国特許第5545807号、同第5545806号、同第5569825号、同第5625126号、同第5633425号、同第5661016号、および以下の科学刊行物:Marksetal.,Bio/Technology10,779-7831992;Lonbergetal.,Nature368856-8591994;Morrison,Nature368812-131994;Fishwildetal.,NatureBiotechnology14,845-511996;Neuberger,NatureBiotechnology14,8261996;LonbergandHuszar,Intern.Rev.Immunol.1365-931995に記載されている。あるいは、本発明のこの態様による方法を、exvivoで培養した幹細胞にCD38発現をダウンレギュレートする薬剤を与えることによって行うことができる。CD38発現をダウンレギュレートする薬剤とは、mRNAレベルまたはタンパク質レベルのいずれかでCD38合成遅延または分解加速に影響を与える任意の薬剤をいう。例えば、本発明のこの態様にしたがって、CD38発現をダウンレギュレートするようにデザインした干渉性低分子ポリヌクレオチドを使用することができる。CD38発現をダウンレギュレートすることができる干渉性低分子ヌクレオチドの例は、干渉性低分子RNAまたはsiRNA例えば、Munshietal.MunshiCB,GraeffR,LeeHC,JBiolChem2002Dec20;27751:49453-8によって記載された、以前に記載されたRNA干渉RNAi機構HutvagnerandZamore2002Curr.Opin.GeneticsandDevelopment12:225-232によってmRNAの配列特異的分解を指示する、二重鎖オリゴヌクレオチドを含むモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書中で使用される場合は、句二重鎖オリゴヌクレオチドは、1つの自己相補性核酸鎖または少なくとも2つの相補性核酸鎖のいずれかによって形成されたオリゴヌクレオチド構造またはその模倣物をいう。本発明の二重鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖RNAdsRNA、DNA-RNAハイブリッド、一本鎖RNAssRNA、単離RNAすなわち、部分精製されたRNA本質的に純粋なRNA、合成RNA、および組換えRNAから構成され得る。好ましくは、本発明の特異的干渉性低分子二重鎖オリゴヌクレオチドは、主にリボ核酸から構成されるオリゴリボヌクレオチドである。RNA干渉を媒介することができる二重鎖オリゴヌクレオチドの作製説明書は、www.ambion.comに記載されている。したがって、本発明の干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、RNAi分子干渉性RNA分子であり得る。あるいは、干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、以下にさらに記載されているCD38特異的アンチセンス分子またはリボザイム分子などのオリゴヌクレオチドであり得る。本発明の教示にしたがってデザインしたオリゴヌクレオチドを、当該分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド合成方法酵素合成または固相合成などにしたがって作製することができる。固相合成を実施するための装置および試薬は、例えば、AppliedBiosystemsから市販されている。このような合成のための任意の他の手段も使用することができる;オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に当業者の能力の範囲内である。本発明のこの実施形態で使用したオリゴヌクレオチドは、10~約200塩基、好ましくは15~150塩基、より好ましくは20~100塩基、最も好ましくは20~50塩基の範囲から選択される長さを有するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、3’~5’ホスホジエステル結合で結合したプリン塩基およびピリミジン塩基からなる複素環式ヌクレオシドを含み得る。好ましくは、使用するオリゴヌクレオチドは、以下で広く説明するように、骨格、ヌクレオシド間結合、または塩基のいずれかで修飾されたものである。このような修飾は、しばしばオリゴヌクレオチド取り込みおよび細胞内条件に対する抵抗性を促進させることができる。本発明のこの態様で有用な好ましいオリゴヌクレオチドの特定の例には、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド内結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドとして、米国特許第687808号、同第4469863号、同第4476301号、同第5023243号、同第5177196号、同第5188897号、同第5264423号、同第5276019号、同第5278302号、同第5286717号、同第5321131号、同第5399676号、同第5405939号、同第5453496号、同第5455233号、同第5466677号、同第5476925号、同第5519126号、同第5536821号、同第5541306号、同第5550111号、同第5563253号、同第5571799号、同第5587361号、および同第5625050号に開示の骨格中にリン原子を保持するものが挙げられる。好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、通常の3’-5’結合を有するホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルのホスホネート3’アルキルホスホネートおよびキラルなホスホネートを含む、ホスフィナート、ホスホラミデート3’-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネートを含む、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェート、これらの2’-5’結合アナログ、およびヌクレオシド単位の隣接対が3’-5’から5’-3’または2’-5’から5’-2’で結合している逆の極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も使用することができる。あるいは、その中にリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド内結合、混合へテロ原子、およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド内結合、または1つ以上の短鎖へテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド内結合によって形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ結合一部がヌクレオシドの糖部分から形成される;シロキサン骨格;スルフィド、スルフォキシド、およびスルホン骨格;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファマート骨格;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格;スルホネートおよびスルホンアミド骨格;アミド骨格;および混合N、O、S、およびCH2成分を有する他の骨格を有するものが含まれ、これらは、米国特許第5034506号、同第5166315号、同第5185444号、同第5214134号、同第5216141号、同第5235033号、同第5264562号、同第5264564号、同第5405938号、同第5434257号、同第5466677号、同第5470967号、同第5489677号、同第5541307号、同第5561225号、同第5596086号、同第5602240号、同第5610289号、同第5602240号、同第5608046語、同第5610289号、同第5618704号、同第5623070号、同第5663312号、同第5633360号、同第5677437号、同第5677439号に開示されている。本発明で使用することができる他のオリゴヌクレオチドは、糖およびヌクレオシド内結合の両方が修飾されたものであるすなわち、ヌクレオチド単位の骨格が新規の基に置換されている。適切なポリヌクレオチド標的との相補性のために塩基単位は維持される。このようなオリゴヌクレオチド模倣物の例には、ペプチド核酸PNAが含まれる。PNAオリゴヌクレオチドは、糖-骨格がアミド含有骨格特に、アミノエチルグリシン骨格に置換されたオリゴヌクレオチドをいう。塩基が保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する米国特許には、米国特許第5539082号、同第5714331号および同第5719262号それぞれ本明細書中で参考として援用されているが含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用することができる他の骨格修飾は、米国特許第6303374号に開示されている。本発明のオリゴヌクレオチドには、塩基の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用される場合は、非修飾または天然の塩基には、プリン塩基であるアデニンAおよびグアニンGならびにピリミジン塩基であるチミンT、シトシンC、およびウラシルUが含まれる。修飾塩基には、5-メチルシトシン5-me-C、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、および2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシン、およびチミン、5-ウラシル偽ウラシル、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、および他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンなどの他の合成および天然の塩基が含まれるが、これらに限定されない。さらなる塩基としては、米国特許第3687808号に開示の塩基、TheConciseEncycloipediaOfPolymerScienceAndEngineering,pages858-859,Kroschwitz,J.I.ed.JohnWileySons,1990に開示の塩基、Englischetal.,AngewandteChemie,InternationalEdition,1991,30,613に開示の塩基、およびSanghvi,Y.S.,Chapter15,AntisenseResearchandApplications,pages289-302,Crooke,S.T.andLebleu,B.ed.,CRCPress,1993に開示されている塩基を挙げることができる。このような塩基は、特に、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性の増大に有用である。これらには、5置換ピリミジン、6-アザピリミジン、およびN-2、N-6、およびO-6置換プリン2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、および5-プロピニルシトシンが含まれるが含まれる。5-メチルシトシン置換により、核酸二重鎖の安定性が0.6~1.2°C増大することが示されておりSanghviYSetal.1993AntisenseResearchandApplications,CRCPress,BocaRaton276-278、これが現在好ましい塩基置換であり、特に2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせるとさらに好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増大させる1つ以上の部分もしくは抱合体へのオリゴヌクレオチドの化学結合を含む。このような部分には、米国特許第6303374号に開示のコレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミン、またはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。所与のオリゴヌクレオチド分子中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、1つの化合物または1つのオリゴヌクレオチド内の1つのヌクレオシドに1つ以上の上記修飾を組み込むことができる。上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくはキメラ分子であるアンチセンス分子である。キメラアンチセンス分子は、それぞれが少なくとも1つのヌクレオチドから構成される2つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解耐性の増大、細胞取り込みの増大、および/または標的ポリヌクレオチドに対する結合親和性の増大を付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された少なくとも1つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素の基質として作用することができる。このような酵素の例には、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼであるRNアーゼHが含まれる。したがって、RNアーゼHの活性化により、RNA標的が切断され、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率が非常に増大する。したがって、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合、同一の標的領域とハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して短いオリゴヌクレオチドを使用して類似の結果をしばしば得ることができる。必要に応じて、当該分野で公知の核酸ハイブリッド形成技術と組み合わせたゲル電気泳動によってRNA標的の切断を日常的に検出することができる。上記のように2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの複合構造修飾オリゴヌクレオチドとして本発明のキメラアンチセンス分子を形成することができる。このようなハイブリッド酵素の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第5013830号、同第5149797号、同第5220007号、同第5256775号、同第5366878号、同第5403711号、同第5491133号、同第5565350号、同第5623065号、同第5652355号、同第5652356号、および同第5700922号それぞれ全体が本明細書中で参考として援用されているが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドは、リボザイム配列をさらに含み得る。リボザイムは、mRNAの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害のために使用されつつある。いくつかのリボザイム配列を、本発明のオリゴヌクレオチドに融合することができる。これらの配列には、VEGF-R血管内皮成長因子受容体の形成を特異的に阻害するANGIOZYME血管形成経路における重要成分、およびHEPTAZYMEC型肝炎ウイルスHCVRNAを選択的に破壊するようにデザインされたリボザイムRybozymePharmaceuticals,Incorporated-WEBホームページが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、本発明の干渉性低分子ポリヌクレオチドは、DNAzymeであり得る。DNAzymeは、一本鎖の触媒性核酸分子である。DNAzymeの一般的なモデル10-23モデルが提案されている。10-23DNAzymeは、それぞれ7から9個のデオキシリボヌクレオチドの2つの基質認識ドメインに隣接した15個のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。このDNAzyme型は、プリン:ピリミジン連結点でその基質RNAを有効に切断することができるSantoro,S.W.Joyce,G.F.Proc.Natl.Acad.Sci.USA199;DNAzymeの概説については、Khachigian,LMCurrOpinMolTher2002,4:119-21を参照のこと。一本鎖および二本鎖標的切断部位を認識する合成された操作DNAzymeの構築および増幅の例は、Joyceetal.に付与された米国特許第6326174号に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に指向する類似のデザインのDNAzymeは、最近、ウロキナーゼ受容体発現を阻害し、invivoで結腸癌細胞転移を首尾よく阻害することが認められたItohetal.,20002,Abstract409,AnnMeetingAmSocGenTherwww.asgt.org。別の適用では、bcr-ab1癌遺伝子に相補的なDNAzymeは、白血病細胞中での癌遺伝子の発現を首尾よく阻害し、CMLおよびALLの場合には、自己骨髄移植における再発率を低下させた。あるいは、上記のように、レチノイド受容体の活性および/または発現をダウンレギュレートまたは抑制するレチノイド受容体スーパーファミリーインヒビター例えば、アンタゴニスト、siRNA分子、アンチセンス分子、抗体などを使用して、CD38発現をダウンレギュレートすることができる。簡単に述べれば、上記のように、RAR、RXR、およびVDRなどのレチノイド受容体は、細胞の増殖および分化ならびに特にCD38発現の調節に関連する遺伝子発現経路の調節に関与していることが報告されている24,25。したがって、本発明のCD38発現をダウンレギュレートする好ましい薬剤には、RARアンタゴニスト、RXRアンタゴニスト、およびVDRアンタゴニスト、あるいは、幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのアンタゴニストが含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語アンタゴニストは、受容体のアゴニストまたは天然のリガンドの効果を反作用または消滅させる薬剤をいう。このようなアンタゴニストに関するさらなる特徴を以下に詳述する。上記の各薬剤は、CD38の発現または活性をそれぞれ低下させることができる。しかし、本発明はまた、これらの薬剤の任意の組み合わせの使用を含むことを目的とする。以下にさらに記載するように、本発明のタンパク質薬例えば、抗体を、これをコードするポリヌクレオチドから発現させ、適切な遺伝子送達媒介物/方法および核酸構築物を使用してexvivoした培養幹細胞に提供することができることが明らかである。適切な構築物の例には、pcDNA3、pcDNA3.1/-、pGL3、PzeoSV2/-、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cytoそれぞれ、InvitrogenCo.www.invitrogen.comから市販されているが含まれるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターおよびパッケージング系の例は、Clontech,SanDiego,Calif.から販売されているもの多クローニング部位にクローニングすることができ、導入遺伝子がCMVプロモーターから転写される、Retro-XベクターpLNCXおよびpLXSNが含まれるである。導入遺伝子が5’LTRプロモーターから転写されるMo-MuLV由来のベクターpBabeなどもまた含まれる。本発明のこの態様にしたがって、幹細胞集団をexvivoで拡大すると同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する方法を、上で詳述するように、RAR、RXR、またはVDRアンタゴニストまたはニコチンアミドおよびそのアナログなどのCD38インヒビターを使用してタンパク質レベルまたは遺伝子操作技術による発現レベルのいずれかでCD38発現および/または活性を調節し本発明にしたがって、いくつかの好ましい幹細胞集団のexvivoでの拡大方法をさらに提供する、同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害することによって行う。1つの特定の実施形態では、幹細胞集団をexvivoで拡大すると同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する方法を、exvivoでの細胞増殖のための条件であり、同時に幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与える工程と、それにより幹細胞集団を拡大させると同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する工程によって行う。細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDまたはレチノイン酸、レチノイドX、および/またはビタミンD受容体のシグナル伝達に対する応答能力を、例えば、受容体アンタゴニストを含む化学的インヒビターの投与によって低下させることができる。別の特定の実施形態では、幹細胞集団をexvivoで拡大すると同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する方法を、exvivoでの細胞増殖のための条件であって、同時に幹細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を含むシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与える工程と、それにより幹細胞集団を拡大させると同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する工程によって行う。細胞のレチノイン酸、レチノイドX、および/またはビタミンD受容体のシグナル伝達事象に対する応答能力を低下させることには、細胞の連続的または短いパルス期間で供給するアンタゴニストでの処理を含み、これは、そのそれぞれの同族受容体による細胞シグナル伝達経路の縮小または破壊によって行われる。アンタゴニストの最終濃度は、特定の適用に依存してμMまたはmMの範囲であり得る。例えば、約0.1μM~約100mMの範囲内または約4μM~約50mMの範囲内、より好ましくは約5μM~約40mMの範囲内である。さらに別の特定の実施形態では、幹細胞集団をexvivoで拡大すると同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する方法を、exvivoでの細胞増殖のための条件であって、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を含むexvivo培養条件を幹細胞に与える工程と、それにより幹細胞集団を拡大させると同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する工程によって行う。ニコチンアミドまたはそのアナログ、誘導体、または代謝産物の最終濃度は、好ましくは、特定の適用に依存して、mM範囲である。例えば、約0.1mM~約20mMの範囲内、好ましくは約1mM~約10mMの範囲内、より好ましくは約5mM~約10mMの範囲内である。上記の特徴による幹細胞集団のexvivoでの拡大を、再生可能な造血幹細胞集団のexvivoでの拡大に使用することができる。したがって、本発明の別の態様により、再生可能な造血幹細胞集団をexvivoで拡大する方法を提供する。成体または新生児臍帯全白血球当該分野で単核細胞画分としても公知サンプルまたは全骨髄細胞サンプルを得る工程と、幹細胞exvivoでの細胞増殖のための条件であって、同時に上記のようにCD38の発現および/または活性を低下させるためのexvivo培養条件をサンプル中の細胞に与え、それによりサンプル中の再生可能な幹細胞集団を拡大させる工程によってこの方法を行う。本発明のこの態様の1つの特定の実施形態では、成体または新生児臍帯全白血球サンプルまたは全骨髄細胞サンプルを得る工程と、幹細胞exvivoでの細胞増殖のための条件であって、同時に幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのexvivo培養条件をサンプル中の細胞に与えることによりサンプル中の再生可能な幹細胞集団を拡大させる工程によってこの方法を行う。本発明のこの態様の別の特定の実施形態では、成体または新生児臍帯全白血球サンプルまたは全骨髄細胞サンプルを得る工程と、幹細胞exvivoでの細胞増殖のための条件であって、同時に幹細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を含むシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのexvivo培養条件をサンプル中の細胞に与える工程と、それによるサンプル中の再生可能な幹細胞集団を拡大させる工程によってこの方法を行う。本発明のこの態様のさらに別の特定の実施形態では、成体または新生児臍帯全白血球サンプルまたは全骨髄細胞サンプルを得る工程と、幹細胞exvivoでの細胞増殖のための条件であって、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を含むexvivo培養条件をサンプル中の細胞に与える工程と、それによるサンプル中の再生可能な幹細胞集団を拡大させる工程によってこの方法を行う。本発明にしたがってinvivoの環境で幹細胞集団の拡大をさらに使用することができ、その結果、本発明のさらに別の態様によって、幹細胞集団がinvivoで拡大すると同時に幹細胞の分化をinvivoで実質的に阻害する方法を提供する。本発明のこの態様により、上記の特徴にしたがって、治療有効量のCD38の発現および/または活性を低下させるように作用する薬剤をそれを必要としている被検体に投与する工程によってこの方法を行う。本発明のこの態様の1つの特定の実施形態では、上記で定義するように、治療有効量の幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるように作用する薬剤をそれを必要としている被検体に投与する工程によってこの方法を行う。本発明のこの態様の別の特定の実施形態では、上記定義のように、治療有効量の幹細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を含むシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるように作用する薬剤をそれを必要としている被検体に投与する工程によってこの方法を行う。本発明のこの態様のさらに別の特定の実施形態では、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物からなる群より選択される治療有効量の薬剤をそれを必要としている被検体に投与する工程によってこの方法を行う。本明細書全体で使用される、句治療有効量または有効量は、幹細胞拡大を誘導するが依然としてその分化を制限する薬剤の投与量をいう。幹細胞集団のexvivoでの拡大のための上記の方法により、特に、幹細胞集団を拡大させることができる。したがって、さらに本発明の態様により、3~20の細胞が再選択可能なCD34細胞であり、そのうちの少なくとも40の細胞がCD34dimでありすなわち、FACS分析における強度の中央値まで低下する、再選択可能なCD34細胞のうち、Lin-である大部分の細胞はまたCD34dim細胞でもあることによって特徴付けられる複数の細胞を含む、造血幹細胞のexvivoで拡大させた集団を提供する。1つの実施形態では、造血幹細胞は、骨髄、末梢血、および新生児臍帯血からなる群より選択される供給源に由来する。別の実施形態では、細胞集団は単一の遺伝的背景を有する。さらに別の実施形態では、造血幹細胞のexvivoで拡大させた集団は、単一ドナー由来の少なくともN個の細胞N=新生児臍帯血、骨髄、または末梢血の単一サンプル由来のCD34細胞の平均数×1000を含む。CD34および/またはLinマーカーの細胞表面発現は、例えば、FACS分析または免疫組織学的染色技術によって決定することができる。幹細胞の自己再生能力は、以下の実施例でさらに例示される長期コロニー形成LTC-CFUcまたはSCID-Huマウスモデルでのinvivo移植によって決定することができる。SCID-Huマウスモデルは、ヒト胎児胸腺および肝臓組織または胎児BM組織を移植したC.B.-17scid/scidSCIDマウスを使用し、推定のヒト造血幹細胞の評価のための適切なモデルを提供する。ヒト胎児組織を用いてSCIDマウスを再構築できるので、このモデルは幹細胞を増殖させこの場合は、ヒト造血幹細胞を増殖させ、そしてこれはヒト起源の造血微小環境下で機能する。マウスは、典型的には、放射線照射され、その後、幹細胞が移植され、再生した器官のFACSおよび免疫組織化学を含む任意の方法によって再構築が測定されるHumeauL.,etal.Blood199790:3496。さらに、上記の方法を使用して、移植可能な造血細胞調製物を産生することができ、その結果、本発明のさらに別の態様にしたがって、上記のようにCD38の発現および/または活性を低下させると同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する有効量の薬剤および薬学的に許容可能なキャリアの存在下でexvivoで増殖させた、造血幹細胞の拡大集団を含む、移植可能な造血細胞調製物を提供する。したがって、本発明の細胞集団を含む滅菌生理食塩水および緩衝液などの薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を投与することができる。このようなキャリアおよび希釈剤の使用は、当該分野で周知である。本発明のこの態様の特定の実施形態では、移植可能な造血細胞調製物は、幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させると同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する有効量の薬剤および薬学的に許容可能なキャリアの存在下でexvivoで増殖させた、造血幹細胞の拡大集団を含む。本発明のこの態様の別の特定の実施形態では、移植可能な造血細胞調製物は、幹細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体のシグナル伝達に対する応答能力を低下させると同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する有効量の薬剤および薬学的に許容可能なキャリアの存在下でexvivoで増殖させた、造血幹細胞の拡大集団を含む。本発明のこの態様のさらに別の特定の実施形態では、移植可能な造血細胞調製物は、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、およびニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物からなる群より選択される有効量の薬剤および薬学的に許容可能なキャリアの存在下でexvivoで増殖させた造血幹細胞の拡大集団を含む。本発明の薬剤の幹細胞分化を阻害する能力は、種々の技術的適用でさらに使用することができる。本発明のさらなる態様により、幹細胞の保存方法を提供する。1つの実施形態では、以下の工程の少なくとも1つで幹細胞を操作する工程によってこの方法を行う:有効量のレチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、および/またはビタミンD受容体アンタゴニストの存在下での採取、単離、および/または保存。あるいは、以下の工程の少なくとも1つで幹細胞を操作する工程によってこの方法を行う:有効量のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物の存在下での採取、単離、および/または保存。本発明のなおさらなる態様により、細胞回収/培養用バッグを提供する。本発明の細胞回収/培養用バッグには、細胞分化を実質的に阻害する有効量のレチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、および/またはビタミンD受容体アンタゴニストが補充される。あるいは、本発明の細胞回収/培養用バッグには、有効量のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物が補充される。本発明によれば、細胞分離および/または洗浄用緩衝液もまた提供する。分離および/または洗浄用緩衝液に、細胞分化を実質的に阻害して細胞拡大を誘導する有効量のレチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、および/またはビタミンD受容体アンタゴニストが補充される。あるいは、分離および/または洗浄用緩衝液には、有効量のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物が補充される。以下でさらに詳述するように、幹細胞は、細胞遺伝子治療を実施するために使用することができる。本明細書中で使用される場合は、遺伝子治療は、遺伝病、後天性疾患、または病態もしくは表現型を治療または予防するための宿主への目的の遺伝物質例えば、DNAまたはRNAの導入をいう。目的の遺伝物質は、そのinvivoでの産生が望ましい産物例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能的RNA、アンチセンスをコードする。例えば、目的の遺伝物質は、治療価値のあるホルモン、受容体、酵素、ポリペプチド、またはペプチドをコードすることができる。概説については、一般に、テキストGeneTherapyAdvancedinPharmacology40,AcademicPress,1997を参照のこと。遺伝子治療の2つの基本的なアプローチを以下に記しておく:iexvivoまたは細胞遺伝子治療およびiiinvivoでの遺伝子治療。exvivoでの遺伝子治療では、患者から細胞を取り出し、培養してinvitroで処置する。一般に、機能置換遺伝子を、適切な遺伝子送達媒介物/方法トランスフェクション、形質導入、相同組換えなどおよび必要に応じて、発現系を介して細胞に導入し、改変した細胞を培地で拡大し、宿主/レシピエントに戻す。これらの遺伝的に再移植した細胞は、insituでトランスフェクトされた遺伝物質を発現することが示されている。したがって、本発明のさらなる態様により、外部遺伝子を使用した幹細胞の遺伝子操作方法を提供する。本発明のこの態様にしたがって、a遺伝子操作する幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する工程と、c外部遺伝子で幹細胞を遺伝子操作する工程によってこの方法を行う。bとcの順番を逆にすることができることが明らかである。本発明のこの態様の特定の実施形態では、a遺伝子操作する幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、同時に幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する工程と、c外部遺伝子で幹細胞を遺伝子操作する工程によってこの方法を行う。本発明のこの態様の別の特定の実施形態では、a遺伝子操作する幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、同時に幹細胞のレチノイン酸受容体および/またはレチノイドX受容体および/またはビタミンD受容体を含むシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する工程と、c外部遺伝子で幹細胞を遺伝子操作する工程によってこの方法を行う。本発明のさらに別の実施形態では、a遺伝子操作する幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を含むexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する工程と、c外部遺伝子で幹細胞を遺伝子操作する工程によってこの方法を行う。好ましい実施形態では、外部遺伝子または導入遺伝子を含むベクター例えば、ウイルスベクターまたは核酸ベクターによって細胞の遺伝子の改変を行う。細胞遺伝子治療での使用に適切な多数のウイルスベクターが公知であり、例を以下に示す。同様に、以下にさらに記載するように、一定範囲の核酸ベクターを使用して、本発明の拡大させた細胞の遺伝子を形質転換することができる。したがって、本発明の拡大細胞を、遺伝子産物を発現するように改変することができる。本明細書中で使用される場合は、句遺伝子産物は、タンパク質、ペプチド、および機能的RNA分子をいう。一般に、核酸分子によってコードされる遺伝子産物が被験体への供給に望ましい遺伝子産物である。このような遺伝子産物の例には、通常レシピエント被験体の器官によって産生されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、およびリポタンパク質が含まれる。例えば、遺伝子置換によって膵臓中の欠損器官に供給することができる遺伝子産物には、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼA2、エラスターゼ、およびアミラーゼが含まれ、通常肝臓によって産生される遺伝子には、血液凝固因子第VIII血液凝固因子および第IX因子など、UDPグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、およびシトクロムp450酵素、ならびに血清アデノシンのプロセシングまたは低密度リポタンパク質のエンドサイトーシスのためのアデノシンデアミナーゼが含まれ、胸腺によって産生される遺伝子産物には、血清胸腺因子、胸腺液性因子、サイモポイエチン、およびサイモシンα1が含まれ、消化管によって産生される遺伝子産物には、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロチニン、および物質Pが含まれる。あるいは、コードされる遺伝子産物は、細胞によって所望の遺伝子産物の発現を誘導するものである例えば、導入される遺伝物質は、被験体に供給すべき遺伝子産物の転写を誘導する転写因子をコードする。さらに別の実施形態では、組換え遺伝子により、異種タンパク質例えば、それが発現される細胞にとっては本来有しているものではないを得ることができる。例えば、ヒトレシピエントへの移植を補助するためにヒト以外の細胞に種々のヒトMHC成分を提供することができる。あるいは、導入遺伝子は、通常、微小器官移植片中で発現されるドナーMHC遺伝子産物の発現または作用を阻害するものである。細胞に導入された核酸分子は、核酸によってコードされる遺伝子産物の細胞中での発現に適切な形態である。したがって、核酸分子には、遺伝子またはその一部の転写に必要なコード配列および調節配列が含まれ、遺伝子産物がタンパク質またはペプチドである場合、遺伝子酸分子の翻訳には、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルならびにコードされたタンパク質またはペプチドの輸送に必要な配列例えば、タンパク質またはペプチドの細胞または分泌表面への輸送のためのN末端シグナル配列が含まれる。遺伝子産物が発現される細胞型および遺伝子産物の所望の発現レベルに基づいて、遺伝子産物の発現を調節するヌクレオチド配列例えば、プロモーターおよびエンハンサー配列を選択する。例えば、プロモーターに連結した遺伝子に細胞型特異的発現を付与することが公知のプロモーターを使用することができる。この遺伝子産物の筋肉特異的発現を付与するために、筋芽細胞遺伝子発現に特異的なプロモーターを、目的の遺伝子に連結させることができる。当該分野で公知の筋肉特異的調節エレメントには、ジストロフィン遺伝子Klamutetal.,1989Mol.CellBiol.9:2396、クレアチンキナーゼ遺伝子BuskinandHauschka,1989Mol.CellBiol.9:2627およびトロポニン遺伝子MarandOrdahl,1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85:6404由来の上流領域が含まれる。他の細胞型に特異的な調節エレメントは当該分野で公知である例えば、肝臓特異的発現のためのアルブミンエンハンサー;膵島細胞特異的発現のためのインスリン調節エレメント;神経ジストロフィン、神経エノラーゼ、およびA4アミロイドプロモーターを含む種々の神経細胞特異的調節エレメント。あるいは、種々の異なる細胞型で恒常的な遺伝子発現を指示することができる調節エレメントウイルス調節エレメントなどを使用することができる。一般に遺伝子発現の駆動に使用されるウイルスプロモーターの例には、ポリオーマウイルス、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス40、およびレトロウイルスLTR由来のものが含まれる。あるいは、連結する遺伝子の発現を誘導する調節エレメントを使用することができる。誘導性調節エレメント例えば、誘導性プロモーターの使用により、細胞中での遺伝子産物の産生を調節することができる。真核生物細胞での使用におそらく有用である誘導性の調節システムの例には、ホルモン調節エレメント例えば、Mader,S.andWhite,J.H.1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5603-5607を参照のこと、合成リガンド調節エレメント例えば、Spencer,D.M.etal.1993Science262:1019-1024を参照のこと、および電離放射線調節エレメント例えば、Manome,Y.etal.1993Biochemistry32:10607-10613;Datta,R.etal.1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1014-10153を参照のことが含まれる。将来開発されるであろうさらなる組織特異的または誘導性の調節システムもまた、本発明にしたがって使用することもできる。細胞への遺伝物質の導入のための技術は当該分野において多数存在しており、これらを本発明の細胞の改変に適用することができる。1つの実施形態では、核酸は、裸の核酸分子の形態である。この状況では、改変すべき細胞に導入された核酸分子は、遺伝子産物をコードする核酸および必要な調節エレメントのみからなる。あるいは、遺伝子産物をコードする核酸必要なエレメントを含むは、プラスミドベクター内に含まれる。プラスミド発現ベクターの例には、CDM8Seed,B.1987Nature329:840およびpMT2PCKaufman,etal.1987EMBOJ.6:187-195が含まれる。別の実施形態では、細胞に導入される核酸分子は、ウイルスベクター内に含まれる。この状況では、遺伝子産物をコードする核酸は、ウイルスゲノムまたはウイルスゲノムの一部に挿入される。遺伝子産物の発現を指示する調節エレメントは、ウイルスゲノムに挿入された核酸と共に含められるかすなわち、ウイルスゲノムに挿入された遺伝子に連結した、ウイルスゲノム自体によって得ることができる。リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、DEAE-デキストリン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注射、および受容体媒介取り込みを使用して、裸の核酸を細胞に導入することができる。核酸およびリン酸カルシウムを含む沈殿を形成させることによって、裸の核酸例えば、DNAを細胞に導入することができる。例えば、HEPES緩衝化生理食塩水を、塩化カルシウムおよび核酸を含む溶液と混合して沈殿を形成させることができ、次いで、沈殿を細胞とインキュベートする。グリセロールまたはジメチルスルホキシドショック工程を加えて、一定の細胞によって取り込まれた核酸量を増加させることができる。CaPO4媒介トランスフェクションを使用して、細胞を安定にトランスフェクトすることができる。これは細胞のinvitroでの改変にのみ適用可能である。CaPO4媒介トランスフェクションは、CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausugel,F.M.etal.eds.GreenePublishingAssociates,1989,Section9.1およびMolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,Sambrooketal.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,Sections16.32-16.40または他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。核酸とDEAE-デキストランとの混合物の形成し、そして混合物を細胞とともにインキュベートすることによって裸の核酸を細胞に導入することができる。核酸取り込み量を増加させるためにジメチルスルホキシドまたはクロロキノンショック工程を加えることができる。DEAE-デキストラントランスフェクションは、細胞のinvitroでの改変のみに適用可能であり、これを使用して細胞にDNAを一時的に導入することができるが、安定にトランスフェクトされた細胞の作製には好ましくない。したがって、本方法は、遺伝子産物の短期産生に使用することができるが、遺伝子産物の長期産生に最適な方法ではない。DEAE-デキストラン媒介トランスフェクションのプロトコールは、CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausugel,F.M.etal.eds.GreenePublishingAssociates,1989,Section9.2およびMolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,Sambrooketal.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,Sections16.41-16.46または他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。適切な緩衝液中で細胞および核酸を共にインキュベートし、細胞を高圧電気パルスに供することによって、裸の核酸を細胞に導入することができる。エレクトロポレーションによって細胞に核酸が導入される効率は、印加電場の強度、電気パルスの強度、温度、DNAの高次構造および濃度、ならびに媒体のイオン組成に影響を受ける。エレクトロポレーションを使用して、広範な種々の細胞型を安定にまたは一過性にトランスフェクトすることができ、これは細胞のinvitroでの改変にのみ適用可能である。エレクトロポレーション細胞のプロトコールは、CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel,F.M.etal.eds.GreenePublishingAssociates,1989,Section9.3およびMolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,Sambrooketal.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,Sections16.54-16.55または他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。裸の核酸を細胞に導入することができる別の方法には、リポソーム媒介トランスフェクションリポフェクションが含まれる。核酸を、カチオン性脂質を含むリポソーム懸濁液と混合する。次いで、DNA/リポソーム複合体を、細胞とインキュベートする。リポソーム媒介トランスフェクションを使用して、培養細胞にinvitroで安定にまたは一過性にトランスフェクトすることができる。プロトコールは、CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel,F.M.etal.eds.GreenePublishingAssociates,1989,Section9.4および他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。さらに、リポソームを使用してinvivoでの遺伝子送達を行った。例えば、Nicolauetal.1987Meth.Enz.149:157-176;WangandHuang1987Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7851-7855;Brighametal.1989Am.J.Med.Sci.298:278;およびGould-Fogeriteetal.1989Gene84:429-438を参照のこと。細胞への核酸の直接注入によって、裸の核酸を細胞に導入することもできる。細胞のinvitro培養のためには、微量注入によってDNAを導入することができる。各細胞を個別に微量注入するので、多数の細胞を改変する場合は、このアプローチは非常に大きな労働力を必要とする。しかし、微量注入が最適な方法である状況は、トランスジェニック動物の産生である以下にさらに詳細に考察する。この状況では、DNAは受精した卵母細胞中に安定に導入されて、次いでこれは動物へと発達する。得られた動物は、卵母細胞に導入されたDNAを保有する細胞を含む。裸のDNAの細胞へのinvivoで導入のためには、直接注入も使用されている例えば、Acsadietal.1991Nature332:815-818;Wolffetal.1990Science247:1465-1468を参照のこと。invivoでの細胞へのDNA注入のための送達装置例えば、遺伝子銃を使用することができる。このような装置は市販されている例えば、BioRad。裸の核酸を、受容体媒介エンドサイトーシスによって取り込まれる細胞表面受容体のリガンドに結合するポリリジンなどのカチオンと複合体形成させることができる例えば、Wu,G.andWu,C.H.1988J.Biol.Chem.263:14621;Wilsonetal.1992J.Biol.Chem.267:963-967;および米国特許第5166320号を参照のこと。核酸-リガンド複合体の受容体への結合により、受容体媒介エンドサイトーシスによってDNAの取り込みが促進される。DNA-リガンド複合体をターゲティングした受容体には、トランスフェリン受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体が含まれる。エンドソームを天然に破壊し、それにより細胞質に物質を放出するアデノウイルスキャプシドに連結したDNA-リガンド複合体を使用して、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避することができる例えば、Curieletal.1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8850;Cristianoetal.1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2122-2126を参照のこと。受容体媒介DNA取り込みを使用して、invitroまたはinvivoのいずれかで細胞にDNAを導入することができ、さらに、目的の標的細胞上で選択的に発現する受容体に結合するリガンドの使用によって、DNAを特定の細胞型に選択的にターゲティングすることができるという特徴が加えられる。一般に、裸のDNAを培養細胞に導入する場合は例えば、上記のトランスフェクション技術の1つによって、一般的には、細胞の小画分約105個のうちの1個のみがトランスフェクトされたDNAをそのゲノムに取り込むすなわち、DNAは細胞のエピソーム中に維持される。したがって、外因性DNAを取り込んだ細胞を同定するために、目的の核酸と共に細胞に選択マーカーをコードする核酸を細胞にトランスフェクトすることが有利である。好ましい選択マーカーには、G418、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートなどの薬物に耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーを、目的の遺伝子と同一のプラスミドに導入するか、または異なるプラスミドに導入することもできる。遺伝子産物をコードする核酸の細胞への好ましい導入アプローチは、遺伝子産物をコードする核酸例えば、cDNAを含むウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターでの細胞の感染は、細胞が高い比率で核酸を受け入れるので核酸を受け入れた細胞を選択する必要性を回避することができるという利点を有する。さらに、ウイルスベクター内にコードされる分子例えば、ウイルスベクター中に含まれるcDNAは、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞中で効率的に発現され、従って、ウイルスベクター系はinvitroまたはinvivoで使用することができる。欠損レトロウイルスは、遺伝子治療のための遺伝子導入での使用について十分に特徴付けられている概説として、Miller,A.D.1990Blood76:271を参照のこと。レトロウイルスゲノムに挿入した目的の遺伝子産物をコードする核酸を持たせて、組換えレトロウイルスを構築することができる。さらに、レトロウイルスゲノムの一部を除去してレトロウイルスに複製欠損を付与することができる。次いで、複製欠損レトロウイルスを、ビリオンにパッケージングし、これを使用して標準的な技術により、ヘルパーウイルスを使用して標的細胞に感染させることができる。組換えレトロウイルスの産生およびinvitroまたはinvivoでのこのようなウイルスでの細胞感染のプロトコールは、CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel,F.M.etal.eds.GreenePublishingAssociates,1989,Section9.10-9.14および他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。適切なレトロウイルスの例には、当業者に周知のpLJ、pZIP、pWE、およびpEMが含まれる。適切なパッケージングウイルス株の例には、ΨCrip、ΨCrip、Ψ2、およびΨAmが含まれる。レトロウイルスを使用して、種々の遺伝子がinvitroおよび/またはinvivoで多数の異なる細胞型上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞が含まれるに導入されている例えば、Eglitis,etal.1985Science230:1395-1398;DanosandMulligan1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:6460-6464;Wilsonetal.1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:3014-3018;Armentanoetal.1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6141-6145;Huberetal.1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8039-8043;Ferietal.1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8377-8381;Chowdhuryetal.1991Science254:1802-1805;vanBeusechemetal.1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7640-7644;Kayetal.1992HumanGeneTherapy3:641-647;Daietal.1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10892-10895;Hwuetal.1993J.Immunol.150:4104-4115;米国特許第4868116号;同第4980286号;特許出願WO89/07136号;PCT出願WO89/02468号;同第89/05345号、および同第92/07573号を参照のこと。レトロウイルスベクターには、宿主ゲノム中に組み込まれるレトロウイルスゲノムおよびそれに挿入される外来核酸が細胞内で核酸を安定に導入するためには、標的細胞の分裂が必要である。したがって、標的細胞の複製を刺激する必要があり得る。目的の遺伝子産物をコードしこれを発現するが、正常な細胞溶解性ウイルスの生活環でのその複製能力については不活性であるようにアデノウイルスのゲノムを操作することができる。例えば、Berkneretal.1988BioTechniques6:616;Rosenfeldetal.1991Science252:431-434;およびRosenfeldetal.1992Cell68:143-155を参照のこと。アデノウイルスAd5型株dl324または他のアデノウイルス株例えば、Ad2、Ad3、Ad7などに由来する適切なアデノウイルスベクターが当業者に周知である。細胞分裂を必要としない有効な遺伝子送達媒介物であり、これを使用して広範な種々の細胞型気道上皮Rosenfeldetal.1992前出、内皮細胞Lemarchandetal.1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6482-6486、肝細胞HerzandGerard1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2812-2816、および筋細胞Quantinetal.1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2581-2584が含まれるに感染することができるという点で、組換えアデノウイルスは有利である。さらに、導入されたアデノウイルスDNAおよびその中に含まれる外来DNAは、宿主細胞のゲノム中には組み込まれずエピソームにとどまり、それにより導入されたDNAが宿主ゲノム例えば、レトロウイルスDNAに組み込まれるようになる状況で挿入変異誘発が起こり得るという潜在的問題が回避される。さらに、他の遺伝子送達ベクターと比較してアデノウイルスゲノムの外来DNA保持能力は大きい8kbまでBerkneretal.前出;Haj-AhmandandGraham1986J.Virol57:267。現在使用されているほとんどの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスE1およびE3遺伝子の全部または一部が欠失しているが、80ものアデノウイルス遺伝物質を保持している。アデノ随伴ウイルスAAVは、効率的な複製および産生生活環のためのヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである。概説については、Muzyczkaetal.Curr.TopicsInMicro.AndImmunol.1992158:97-129を参照のこと。そのDNAを分裂していない細胞に組み込み、高頻度の安定な組み込みを示すことができる数少ないウイルスの1つでもある例えば、Flotteetal.1992Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356;Samulskietal.1989J.Virol.63:3822-3828;およびMcLaughlinetal.1989J.Virol.62:1963-1973を参照のこと。わずか300塩基対のAAVを含むベクターをパッケージングして組み込むことができる。外因性DNAのためのスペースは、約4.5kbに限定されている。Tratschinetal.1985Mol.Cell.Biol.5:3251-3260などに記載されているAAVベクターを使用して、細胞にDNAを導入することができる。AAVベクターを使用して、種々の核酸が異なる細胞型に導入されている例えば、Hermonatetal.1984Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6466-6470;Tratschinetal.1985Mol.CellBiol.4:2072-2081;Wondisfordetal.1988Mol.Endocrinol.2:32-39;Tratschinetal.1984J.Virol.51:611-619;およびFlotteetal.1993J.Biol.Chem.268:3781-3790を参照のこと。特定の発現ベクター系の効率および核酸の細胞への導入方法を、当該分野で日常的に使用されている標準的アプローチによって評価することができる。例えば、細胞に導入されたDNAは、フィルターハイブリッド形成技術例えば、サザンブロッティングによって検出することができ、導入されたDNAの転写によって産生されたRNAは、例えば、ノーザンブロッティング、RNアーゼ保護、または逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRによって検出することができる。遺伝子産物は、適切なアッセイ例えば、特異的抗体などを使用した産生タンパク質の免疫学的検出または酵素アッセイなどの遺伝子産物の機能活性を検出するための機能アッセイによって検出することができる。細胞によって発現されるべき目的の遺伝子産物を容易にアッセイできない場合には、使用する調節エレメントおよびベクターに連結されるレポーター遺伝子を使用して発現系を最初に最適化することができる。レポーター遺伝子は、容易に検出可能な遺伝子産物をコードするので、これを使用して系の効率を評価することができる。当該分野で使用される標準的なレポーター遺伝子には、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、およびヒト成長ホルモンをコードする遺伝子が含まれる。細胞集団への核酸の導入に使用した方法により高比率で細胞が改変され、細胞によって遺伝子産物が十分に発現される場合例えば、ウイルス発現ベクターを使用した場合に頻繁に生じるように、集団内の各細胞をさらに単離またはサブクローニングすることなく改変された細胞集団を使用することができる。すなわち、細胞集団によって遺伝子産物を十分に産生することができ、さらに細胞を単離する必要はない。あるいは、遺伝子産物を十分に発現する細胞を単離するために単一の改変された細胞から同じように改変された細胞の均一な集団を増殖させることが望ましい場合もある。このような均一な細胞集団は、限界希釈クローニングによる単一の改変された細胞の単離、その後に標準的な技術によって培養物中で単一細胞をクローン細胞集団へと拡大させることによって調製することができる。上記で詳細に述べたように、幹細胞のexvivoでの拡大を、造血細胞の移植で有利に使用することができる。したがって、本発明の別の態様により、造血細胞の移植方法を提供する。本発明のこの態様の方法を、aドナーから移植すべき造血幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する工程と、cレシピエントに前記幹細胞を移植する工程によって行う。本発明のこの態様の特定の実施形態では、aドナーから移植すべき造血幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、同時に幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する工程と、cレシピエントに前記幹細胞を移植する工程によってこの方法を行う。本発明のこの態様の別の特定の実施形態では、aドナーから移植すべき造血幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、同時に幹細胞のレチノイン酸受容体および/またはレチノイドX受容体および/またはビタミンD受容体を含むシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する工程と、cレシピエントに前記幹細胞を移植する工程によってこの方法を行う。本発明のこの態様のさらに別の特定の実施形態では、aドナーから移植すべき造血幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を含むexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化をexvivoで実質的に阻害する工程と、cレシピエントに前記幹細胞を移植する工程によってこの方法を行う。ドナーおよびレシピエントは、単一の個体または異なる抗体例えば、同種異系個体であり得る。同種異系移植を実施する場合、当該分野で周知の移植片拒絶および/または移植片対宿主病の軽減のための投薬計画に着手すべきである。このような投薬計画は、現在、ヒトの治療で実施されている。最も進んだ投薬計画は、SlavinS.etal.例えば、J.ClinImmunol200222:64およびJHematotherStemCellRes200211:265、GurH.etal.Blood200299:4174、およびMartelliMFetal.SeminHematol200239:48本明細書中で参考として援用されているによる刊行物に開示されている。本発明のさらに別の態様により、養子免疫療法を提供する。本発明のこの態様の方法を、aレシピエントから造血幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する工程と、cレシピエントに前記幹細胞を移植する工程によって行う。本発明のこの態様の別の特定の実施形態では、aレシピエントから造血幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、同時に幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する工程と、cレシピエントに前記幹細胞を移植する工程によってこの方法行う。本発明のこの態様の別の特定の実施形態では、aレシピエントから造血幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、同時に幹細胞のレチノイン酸受容体および/またはレチノイドX受容体および/またはビタミンD受容体を含むシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する工程と、cレシピエントに前記幹細胞を移植する工程によってこの方法行う。本発明のこの態様のさらに別の特定の実施形態では、aレシピエントから造血幹細胞を得る工程と、b細胞増殖のための条件であって、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を含むexvivo培養条件を幹細胞に与えることにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する工程と、cレシピエントに前記幹細胞を移植する工程によってこの方法行う。本発明の状況で使用されるCD38の発現または活性を低下させる薬剤の作用は、exvivo環境に限定されない。したがって、本明細書中に記載の所見に基づいて、これらの薬剤の新規のinvivo適用が想定される。したがって、本発明のさらに別の態様により、細胞採取のためのドナー末梢血への骨髄幹細胞の動員方法を提供する。本発明のこの態様の方法を、aCD38の発現および/または活性を低下させるためにドナーに有効量の薬剤を投与することにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する工程と、bロイコフォレシスによって細胞を採取する工程とによって行う。本発明のこの態様の特定の実施形態では、a幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためにドナーに有効量の薬剤を投与することにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する工程と、bロイコフォレシスによって細胞を採取する工程とによってこの方法を行う。本発明のこの態様の別の特定の実施形態では、a幹細胞のレチノイン酸受容体および/またはレチノイドX受容体および/またはビタミンD受容体を含むシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためにドナーに有効量の薬剤を投与することにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する工程と、bロイコフォレシスによって細胞を採取する工程とによってこの方法を行う。本発明のこの態様のさらに別の特定の実施形態では、aニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物からなる群より選択される有効量の薬剤をドナーに投与することにより幹細胞集団を拡大させ、同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する工程と、bロイコフォレシスによって細胞を採取する工程とによってこの方法を行う。好ましくは、幹細胞の動員方法は、さらに、末梢血への細胞の動員を誘導するために現在使用されている少なくとも1つのサイトカイン、好ましくは少なくとも1つの初期サイトカインをドナーに投与する工程を含む。さらに、本発明の態様により、β-異常血色素症患者の治療のための赤血球前駆体の成熟/分化を減速させる方法を提供する。本発明のこの態様の方法を、CD38の発現および/または活性を低下させるために患者に薬剤を投与することにより赤血球前駆体集団を拡大させ、同時に赤血球前駆体の分化を実質的に阻害する工程によって行い、その結果、身体から薬剤が自然に除去され、細胞はその成熟が加速され、胎児ヘモグロビンの産生が増大する。本発明のこの方法で使用される薬剤は、細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を消滅させるかまたは低下させるための薬剤、細胞のレチノイン酸、レチノイドX、および/またはビタミンD受容体のシグナル伝達に対する応答能力を消滅させるかまたは低下させるための薬剤、またはニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物などの薬剤であり得る。invivo環境では、CD38の発現または活性を低下させる薬剤例えば、レチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンD受容体アンタゴニスト、またはニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、および/またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を、これらの薬剤を含み、増粘剤、キャリア、緩衝液、希釈剤、界面活性剤、防腐剤など全て当該分野で周知であるをさらに含み得る薬学的組成物によって投与することができる。薬学的組成物を、局所治療または全身治療の優先度および処置される範囲に依存して、種々の方法で投与することができる。局所眼内、膣内、直腸内、鼻腔内を含む、経口、吸入、または非経口例えば、点滴または腹腔内、皮下、硬膜下、筋肉内または静脈内注射、または埋め込み型送達デバイスによって投与することができる。局所投与用の処方物としては、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、座剤、ドロップ、液体、スプレー、および粉末を挙げることができるが、これらに限定されない。従来の薬学的キャリア、水溶液、粉末、または油性基剤、および増粘剤などが必要である場合があり、またそれらが望ましい場合もある。経口投与用の組成物としては、粉末、顆粒、懸濁液、または水溶液または非水性媒体の溶液、サシェ、カプセル、または錠剤が挙げられる。増粘剤、希釈剤、香料、分散助剤、乳化剤、または結合剤が望ましい場合もある。非経口投与用の処方物としては、滅菌溶液を挙げることができるが、これらに限定されない。これには、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加物を含めることもできる。埋め込み型送達デバイス用の処方物としても同様に、滅菌溶液を挙げることができるが、これらに限定されない。これには、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加物を含めることもできる。投薬は、治療条件の反応性に依存するが、通常、1日あたり1回または複数回であり、一連の治療を数日から数ヶ月間または必要な効果が得られるまで続ける。当業者は、最適な投薬量、投薬方法、および反復速度を容易に決定することができる。徐放投与計画は、いくつかの適用で有利であり得る。本発明の好ましい実施形態によれば、exvivoでの細胞増殖のための条件を使用した幹細胞の獲得は、栄養素およびサイトカインを使用して細胞を得る工程を含む。好ましくは、サイトカインは、初期作用性サイトカイン幹細胞因子、FLT3リガンド、インターロイキン-1、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-6、インターロイキン-10、インターロイキン-12、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンなどであるが、これらに限定されないである。これに関しては、おそらく新規のサイトカインが発見されつづけ、そのうちのいくつかは本発明の細胞拡大方法で使用することができると認識される。後期作動性サイトカインを使用することもできる。これらには、例えば、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、FGF、EGF、NGF、VEGF、LIF、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子が含まれる。本発明の方法によって拡大される幹細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞であり得る。胚性幹細胞およびその回復方法は、当該分野で周知であり、例えば、TrounsonAOReprodFertilDev200113:523、RoachMLMethodsMolBiol2002185:1、およびSmithAGAnnuRevCellDevBiol200117:435に記載されている。成体幹細胞は、成体組織由来の幹細胞であり、これらもまた当該分野で周知である。成体幹細胞を単離または富化させる方法は、例えば、Miraglia,S.etal.1997Blood90:5013、Uchida,N.etal.2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:14720、Simmons,P.J.etal.1991Blood78:55、ProckopDJCytotherapy20013:393、BohmerRMFetalDiagnTher200217:83、およびRowleySDetal.BoneMarrowTransplant199821:1253,StemCellBiologyDanielR.MarshakEditorRichardL.GardnerEditor,Publisher:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001およびHematopoieticStemCellTransplantation.AnthonyD.HoEditorRichardChamplinEditor,Publisher:MarcelDekker2000に記載されている。現在好ましい成体幹細胞の供給源は、造血系である。したがって、本発明の好ましい実施形態によれば、幹細胞は造血幹細胞である。このような幹細胞は、骨髄、末梢血、および新生児臍帯系から得ることができる。幹細胞から白血球単核細胞を富化させる方法は、当該分野で周知であり、これにはCD34発現細胞の選択が含まれる。CD34細胞には、多能性幹細胞および適切な条件下で幹細胞に戻ることができるこれらはある系統への分化増殖能力を獲得した細胞ではないので極めて初期の先祖細胞が含まれる。本発明の実施により得られた1つの最も驚くべき結果は、血液の単核細胞画分すなわち、白血球中に存在する幹細胞を、血液の幹細胞について富化させたCD34細胞画分と類似の様式で本発明の方法を使用して拡大させることができることであった。したがって、本発明の実施形態によれば、拡大させた幹細胞をある系統への分化増殖能力を獲得した細胞と混合する例えば、分離も富化もしない。細胞のexvivo培養前の細胞分離のために必要な単調で退屈な作業が取り除かれるので、本発明のこの実施形態は特に有利である。別の実施形態では、造血CD34細胞について細胞を富化させ、これを、細胞表面抗原CD38および系統特異的抗原Lin:CD3、CD61、CD19、CD33、CD14、CD15、および/またはCD4が含まれるを発現しないことまたは発現の有意な低下によって特徴づける。開示されたシグナル伝達経路に対する幹細胞の応答能力の低下が可逆的例えば、本質的の可逆的であることを実験によって見出した。いくつかの実験では、培養において16~18週間で細胞は拡大を停止し、分化を始める。言い換えれば、本発明のプロトコールを使用して拡大させた細胞は、細胞株とはならない。したがって、このような細胞を十分な拡大後に、分化が誘導される成長条件に供することによって、細胞に対して、exvivoおよびinvivoでのシスおよびトランス分化を含む所望の方向へのexvivoでの分化を指示することができる。本明細書中で使用される場合は、シス分化は、成体幹細胞が得られた組織への成体幹細胞の分化をいう。例えば、CD34造血細胞の異なる方向性/成熟血球への分化はシス分化に含まれる。本明細書中で使用される場合は、トランス分化は、成体幹細胞が得られたものとは異なる組織への成体幹細胞の分化をいう。例えば、CD34造血細胞の異なる組織起源の細胞例えば、筋細胞への分化はトランス分化に含まれる。本発明の状況において細胞拡大に使用する幹細胞は、動物および植物の両方を含む任意の多細胞成分の任意の組織から得ることができる。幹細胞は、多数の器官および組織に存在することが示されており、全ての動物組織骨髄RowleySDetal.1998BoneMarrowTransplant21:1253、末梢血KoizumiK,2000BoneMarrowTransplant26:787、肝臓PetersenBEetal1998Hepatology27:433、および脳PaganoSFetal2000StemCells18:295が含まれるが、これらに限定されないに存在すると考えられている。全てのこのような細胞は、本発明の方法を使用して拡大させることができると見越している。上記アンタゴニストおよび/または上記受容体のシグナル伝達経路に対する幹細胞の応答能力の低下は、幹細胞の上記のアンタゴニストおよび/または上記の受容体のシグナル伝達経路に対する応答能力の低下が、有効量の少なくとも1つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも1つのレチノイドX受容体アンタゴニスト、および/または少なくとも1つのビタミンD受容体アンタゴニストの存在下で、好ましくは幹細胞の全exvivo培養期間の0.1~50、好ましくは0.1~25、より好ましくは0.1~15の期間、または全期間の間、幹細胞をexvivo培養することによる。これに関して、驚いたことに、アンタゴニストへの最初のパルス曝露が、培養環境からアンタゴニストを除去したずっと後で細胞の拡大を生じるのに十分であることが明らかとなった。RAR、RXR、およびVDRの多数のアンタゴニストが現在公知であり、それらのいくつかを以下に列挙する。本発明の異なる態様および実施形態の状況で使用されるレチノイン酸受容体アンタゴニストは以下であり得る:AGN194310;AGN109;3-4-メトキシ-フェニルスルファニル-3-メチル-酪酸;6-メトキシ-2,2-ジメチル-チオクロマン-4-オン,2,2-ジメチル-4-オキソ-チオクロマン-6-イルトリフルオロメタン-スルホネート;エチル4-2,2ジメチル-4-オキソ-チオクロマン-6-イルエチニル-ベンゾエート;エチル4-2,2ジメチル-4-トリフルオロメタンスルホニルオキシ-2H-チオクロメン-6-イルエチニル-ベンゾエート41;チオクロメン-6-イル]-エチニル]-ベンゾエートイル;p-[E-2-[3’4’-ジヒドロ-4,4’-ジメチル-7’-ヘプチルオキシ-2’H-1-ベンゾチオピラン-6’イル]プロペニル]安息香酸1’1’-ジオキシド;2E,4E,6E-[7-3,5-ジ-t-ブチル-4-n-ブトキシフェニル-3-メチル]-オクタ-2,4,6-トリエン酸;2E,4E,6E-[7-3,5-ジ-t-ブチル-4-n-プロポキシフェニル-3-メチル]-オクタ-2,4,6-トリエン酸;2E,4E,6E-[7-3,5-ジ-t-ブチル-4-n-ペントキシフェニル-3-メチル]-オクタ-2,4,6-トリエン酸;2E,4E,6E-[7-3,5-ジ-t-ブチル-4-n-ヘキソキシフェニル-3-メチル]-オクタ-2,4,6-トリエン酸;2E,4E,6E-[7-3,5-ジ-t-ブチル-4-n-ヘプトキシフェニル-3-メチル]-オクタ-2,4,6-トリエン酸;2E,4E,6E-[7-3,5-ジ-t-ブチル-4-n-オクトキシフェニル-3-メチル]-オクタ-2,4,6-トリエン酸;2E,4E,6E-7-3-t-ブチル-51-フェニル-ビニル-フェニル]-3-メチル-オクタ-2,4,6-トリエン酸;2E,4E,6E-[7-3,5-ジ-t-ブチル-4-{[4,5-3H2]-n-ペントキシ}フェニル-3-メチル]-オクタ-2,4,6-トリエン酸;2E,4E-1RS,2RS-5-[2-3,5-ジ-tert.ブチル-2-エトキシ-フェニル-シクロプロピル]-3-メチル-ペンタ-2,4-ジエン酸エチルエステル;2E,4E-1RS,2RS-5-[2-3,5-ジ-tert.ブチル-2-エトキシ-フェニル-シクロプロピル]-3-メチル-ペンタ-2,4-ジエン酸;2E,4E-1RS,2RS-5-[2-3,5-ジ-tert.ブチル-2-ブトキシ-フェニル-シクロプロピル]-3-メチル-ペンタ-2,4-ジエン酸;2E,4E,6Z-7-[3,5-ジ-tert.ブチル-2-エトキシフェニル]3-メチル-2,4,6-オクタトリエン酸;2E,4E,6Z-7-[3,5-ジ-tert.ブチル-2-ブチルオキシフェニル]3-メチル-2,4,6-オクタトリエン酸;4-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレン-カルボキシアミド安息香酸;2E,4E-3-メチル-5-[1S,2S-2-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-ナフタレン-2-イル-シクロプロピル]-ペンタ-2,4-ジエン酸;p-[E-2-[3’,4’-ジヒドロ-4’,4’-ジメチル-7’-ヘプチルオキシ-2’H-1-ベンゾチオピラン-6’-イル]プロペニル]安息香酸;1’,1’-ジオキシド,4-7,7,10,10-テトラメチル-1-ピリジン-3-イルメチル-4,5,7,8,9,10-ヘキサヒドロ-1H-ナフト[2,3-g]インドール-3-イル-安息香酸;2E,4E,6Z-7-[3,5-ジ-tert.ブチル-2-メトキシフェニル]-3-メチル-2,4,6-オクタトリエン酸;2E,4E,6Z-7-[3,5-ジ-tert.ブチル-2-エトキシフェニル]-3-メチル-2,4,6-オクタトリエン酸;2E,4E,6Z-7-[3,5-ジ-tert.ブチル-2-ヘキシルオキシフェニル]-3-メチル-2,4,6-オクタトリエン酸;2E,4E,6Z-7-[3,5-ジ-tert.ブチル-2-オクチルオキシフェニル]-3-メチル-2,4,6-オクタトリエン酸;2E,4E-1RS,2RS-5-[2-3,5-ジ-tert-ブチル-2-ブトキシ-フェニル-シクロプロピル]-3-メチル-ペンタ-2,4-ジエン酸;2E,4E,6Z-7-3-n-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチルナフタレン-2-イル-3-メチルオクタ-2,4,6-トリエン酸;4-5H-2,32,5ジメチル-2,5-ヘキサノ-5-n-プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン-11-イル安息香酸;4-5H-2,3-2,5-ジメチル-2,5-ヘキサノ-5メチル-8-ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン-11-イル安息香酸;4-{[4-4-エチルフェニル2,2-ジメチル-2H-チオクロメン-6-イル]エチニル}安息香酸;4-[4-2-メチル-1,2-ジカルバ-クロソ-ドデカボラン-1-イル-フェニルカルバモイル]安息香酸;4-[4,5,7,8,9,10-ヘキサヒドロ-7,7,10,10-テトラメチル-1-3-ピリジルメチル-アントラ[1,2-b]ピロール-3-イル]安息香酸;3-ピリジルメチル-]5-チアアントラ[2,1-b]ピロール-3-イル安息香酸;および3-ピリジルメチル-アントラ[2ml-d]ピラゾール-3-イル]安息香酸。本発明の異なる態様および実施形態の状況で使用されるレチノイドX受容体アンタゴニストは以下であり得る:LGN100572;1-3-ヒドロキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチルナフタレン-2-イルエタノン;1-3-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチルナフタレン-2-イルエタノン;3-3-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチルナフタレン-2-イルブト-2-エンニトリル;3-3-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチルナフタレン-2-イルブト-2-エナール;2E,4E,6E-7-3[-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレン-2-イル]-3-メチルオクタ-2,4,6-トリエン酸;4-[3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルカルボニル]安息香酸;4-[1-3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルエテニル]安息香酸;4-[13,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルシクロプロピル]安息香酸;4-[1-3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルエテニル]ベンゼネートトラゾール;2-[1-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルエテニル]ピリジン-5-カルボン酸;2-[1-3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルエチル]ピリジン-5-カルボン酸;エチル-2-[1-3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルエテニル]ピリジン-5-カルボキシレート;5-[1-3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルエテニル]ピリジン-2-カルボン酸;2-[1-3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルシクロプロピル]ピリジン-5-カルボン酸;メチル2-[1-3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルシクロプロピル]ピリジン-5-カルボキシレート;4-[1-3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルエテニル]-N-4-ヒドロキシフェニルベンズアミド;2-[1-3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルエテニル]ピリジン-5-カルボン酸;2-[1-3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルシクロプロピル]ピリジン-5-カルボン酸;4-[3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルカルボニル]安息香酸ブチルオキシム;4-[3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルカルボニル]安息香酸プロピルオキシム;4-[3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルカルボニル]安息香酸シアノイミン;4-[3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルカルボニル]安息香酸アリルオキシム;4-[3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルカルボニル]安息香酸4-3-メチルブト-2-エン酸オキシム;4-[3,5,5,8,8-ペンタメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフチルカルボニル]安息香酸1-アミノエチルオキシム;2E,4E,6Z-7-3-n-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチルナフタレン-2-イル-3-メチルオクタ-2,4,6-トリエン酸;4-5H-2,32,5-ジメチル-2,5-ヘキサノ-5-n-プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン-11-イル安息香酸;および4-5H-2,3-2,5-ジメチル-2,5-ヘキサノ-5m.。本発明の異なる態様および実施形態の状況で使用されるビタミンD受容体アンタゴニストは以下であり得る:1α,25-OH-D3-26,23ラクトン;1α,25-ジヒドロキシビタミンD3;25-カルボン酸エステルZK159222;23S-25-デヒドロ-1α-OH-D3;23R-25-デヒドロ-1α-OH-D3;1β,25OH2D3;1β,25OH2-3-エピ-D3;23S25-デヒドロ-1αOHD3-26,23-ラクトン;23R25-デヒドロ-1αOHD3-26,23-ラクトン;およびブチル-5Z,7E,22E-1S,7E,22E-1S,3R,24R-1,3,24-トリヒドロキシ-26,27-シクロ-9,10-セココレスタ-5,7,1019,22-テトラエン-25-カルボキシレート。上記に列挙したアンタゴニストは、その各同族受容体に対して高親和性を有することが知られている。しかし、これらの分子を他の受容体に対して活性にすることができる場合もある。本発明のさらなる態様により、特定のレチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、またはビタミンD受容体アンタゴニストが有効な細胞拡大薬であるかどうかを決定するアッセイを提供する。本発明のこの態様のアッセイは、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、またはビタミンD受容体アンタゴニストの存在下で幹細胞集団例えば、CD34造血細胞または実質的に未分化の細胞株の細胞USP-1およびUSP-3SukoyanMA2002BrazJMedBiolRes,355:535、C6、c2、Cr/A-3、DB1、およびB6-26米国特許第6,190,910号、ならびにH9.1およびH9.2OdoricoJ.S.2001StemCell19:193などであるが、これらに限定されないを培養する工程と、長期間例えば、数週間から数ヶ月細胞拡大をモニタリングする工程とを含む。未処理の細胞と比較して拡大が増加し、且つ分化が減少した場合、試験したレチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、またはビタミンD受容体アンタゴニストは、有効な細胞拡大薬である。好ましくは、幹細胞集団または実質的に未分化の細胞株の細胞の培養を、有効量のサイトカイン好ましくは、初期作用性サイトカインまたはこのようなサイトカインの組み合わせ例えば、トロンボポイエチンTPO、インターロイキン-6IL-6、FLT-3リガンド、および幹細胞因子SCFの存在下で行う。当業者は、このアッセイを使用して、以下に列挙したどのアンタゴニストが以下にさらに記載の本発明の種々の方法、調製物、および製品の実施に最も有効であるかを決定することができる。最適な結果のために最も有効な濃度および曝露時間を、異なる起源の幹細胞を使用して得る。本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴は、制限を意図しない以下の実施例の実験によって当業者に自明である。さらに、上記の本発明および以下の特許請求の範囲に記載の各々の種々の実施形態および態様は、以下の実験により支持される。実施例ここでは、上記説明と共に以下の実施例を参照して、非限定的様式で本発明を例示する。一般に、本明細書中で使用した用語および本発明で使用した実験手順には、分子、生化学、微生物学、および組換えDNAの技術が含まれる。このような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、MolecularCloning:AlaboratoryManual、Sambrookら、1989;CurrentProtocolsinMolecularBiology、第I~III巻、Ausubel,R.M.編1994;Ausubelら、CunentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileyandSons、Baltimore、Maryland、1989;Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning、JohnWileySons、NewYork、1988;Watsonら、RecombinantDNA、ScientificAmericanBooks、NewYork;Birrenら編、GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries、第1~4巻、ColdSpringHarborLaboratoryPress、NewYork、1998;米国特許第4666828号、同第4683202号、同第4801531号、同第5129659号、および同第5272057号に記載の方法;CellBiology:ALaboratoryHandbook、第I~III巻、Cellis,J.E.編、1994;CurrentProtocolsinImmunology、第I~III巻、ColiganJ.E.編、1994;Stitesら編、BasicandClinicalImmunology、第8版、AppletonLange、Norwalk,CT、1994;MishellandShiigi編、SelectedMethodsinCellularImmunology、W.H.FreemanandCo.、NewYork、1980を参照のこと;利用可能な免疫アッセイは、特許および化学論文に広く記載されており、例えば、米国特許第3791932号、同第3839153号、同第3850752号、同第3850578号、同第3853987号、同第3867517号、同第3879262号、同第3901654号、同第3935074号、同第3984533号、同第3996345号、同第4034074号、同第4098876号、同第4879219号、同第5011771号、および同第5281521号;OligonucleotideSynthesis、Gait,M.J.編、1984;NucleicAcidHybridization、Hames,B.D.andHigginsS.J.編、1985;TranscriptionandTranslation、Hames,B.D.andHigginsS.J.編、1984;AnimalCellCulture、Freshney,R.I.編、1986;ImmobilizedCellsandEnzymes、IRLPress、1986;APracticalGuidetoMolecularCloning、Perbal,B.、1984およびMethodsinEnzymology、第1~137巻、AcademicPress、PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications、AcademicPress、SanDiego,CA、1990;Marshakら、StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual、CSHLPress、1996その全てが本明細書中に完全に記載されているかのように参照として援用されるを参照のこと。他の一般的引例を、本明細書中に記載する。引例中の手順は当該分野で周知であると考えられ、読者の都合のために記載する。引例中に含まれる全ての情報は、本明細書中で参考として援用される。exvivoでの造血細胞の拡大におけるRARアンタゴニストおよびその使用材料と実験方法高親和性レチノイン酸受容体アンタゴニストRARの合成:RARアンタゴニスト4-{[4-4-エチルフェニル2,2-ジメチル-2H-チオクロメン-6-イル]エチニル}安息香酸AGN194310の合成:RARアンタゴニストAGN194310を、Johnsonによって記載された手順26に一部修正を加えて合成した。3-4-メトキシフェニルチオ-3-メチル-酪酸の合成:肉厚のねじ蓋付きチューブに、3-メチル-2-ブテン酸13.86mg、3,3-ジメチルアクリル酸138.4mmol、4-メトロキシチオフェノール143.2mmol、およびピペリジン41.6mmolAldrichを入れた。混合物を、105~110°Cで32時間加熱し、室温に冷却した。反応混合物を、撹拌しながら酢酸エチルEtOAc700mlに溶解させ、得られた溶液を1MHCl水溶液50ml×2、水50ml、および飽和NaCl水溶液50mlで洗浄した。その後、有機溶液をNaSO4上で乾燥させた。この有機溶液の減圧濃縮によってオイルが得られ、これを-20°Cで2日間インキュベートして結晶性固体を得た。40mlのペンタンを固体に添加し、粉砕し、そして濾過した。固体を、濾紙上でペンタン20ml、2回を用いて洗浄し、淡黄色結晶として生成物3-4-メトキシフェニルチオ-3-メチル-酪酸を得た31.4g、収率94.4、融点62~64°C。[1H-NMRCDCl3:d7.5t,2H,J=8Hz,d6.9t,2H,J=6.7Hz,d3.9s、3H,J=16.1Hz,d2,6s,2H,d1.3s,6H]3-4-メトキシフェニルチオ-3-メチル-ブチリルクロライドの合成:93.62mmolの塩化オキサリルを含む10mlのベンゼンを、3-4-メトキシフェニルチオ-3-メチル-酪酸の100mlベンゼン溶液に室温で30分間かけて添加した。塩化オキサリルの添加時に、溶液は黄色に変色した。反応混合物を室温で4時間撹拌した後、反応溶液を5°Cに冷却し、氷冷した5NaOH水溶液5ml×6で洗浄しこの手順で、大量のガスが発生する、その後、氷冷した水15ml×2、最後に飽和NaCl15mlで洗浄した。有機溶液をNaSO4上で乾燥させ、減圧濃縮して透明な黄色オイルとしてアシルクロライド生成物を得た。この物質を、さらに生成することなく次の工程で使用した。[1H-NMRCDCl3:d3.8s,3H,d3.1s,2H,d1.4s,6H。6-メトキシ-2,2-ジメチル-チオクロマン-4-オンの合成:塩化スズIVの30mlジクロロメタン溶液に、0°Cで、3-4-メトキシフェニルチオ-3-メチル-ブチリルクロライドの180mlジクロロメタン溶液を滴下し、暗赤色溶液を得た。0°Cで2時間の反応混合物の撹拌後、水115mlをゆっくり添加することによって反応を停止させた。暗赤色反応混合物は黄色になった。有機層を、1MHCl水溶液50ml、5NaOH水溶液50ml、および飽和NaCl水溶液50mlで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。得られた有機溶液を減圧濃縮し、真空蒸留して135~142°C、0.6mm/Hg、残留淡黄色オイルとして6-メトキシ-2,2-ジメチル-チオクロマン-4-オンを得た11g、80.7。[1H-NMRCDCl3:d7.6s,1H,d7.1s,1H,d7.0s,1H,d3.8s,3H,d2.86s,2H,d1.46s,6H]。6-ヒドロキシ-2,2-ジメチル-チオクロマン-4-オンの合成:三臭化ホウ素20gを含む80mlジクロロメタンを、20分かけて6-メトキシ-2,2-ジメチル-チオクロマン-4-オンの50mlジクロロメタン溶液に添加した。反応混合物を-23°Cに冷却し、5時間撹拌し、-78°Cに冷却し、その後50mlの水をゆっくり0.5時間添加することにより反応を停止させた。室温への加温後、無色沈殿を濾過した。有機層の分離後、水層を、120mlジクロロメタンで抽出した。混合した有機層を、飽和NaHCO3水溶液50ml、水50ml、および飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4上で乾燥させた。減圧下で有機溶媒を除去して、緑色固体6gの粗生成物を得た。この生成物を、100mlのジエチルエーテルに溶解させ、得られた溶液を300mlの石油エーテルで希釈した。-15°Cでの一晩のインキュベーションにより、結晶性生成物を得た2.3g、収率41、融点122~126°C。濾過物を真空蒸発させ、残渣3.42gを30mlのジエチルエーテルに溶解させた。エーテル溶液を、150mlの石油エーテルで希釈し、得られた混合物を-20°Cのフリーザーの中で一晩保持した。沈殿および溶液の濾過により、1.5gの生成物6-メトキシ-2,2-ジメチル-チオクロマン-4-オンを得た。この化合物を、30mlのジエチルエーテルに溶解させて再度沈殿させ、その後、20mlの石油エーテルで希釈した。4°Cで一晩のインキュベーションにより、1g収率80.7、融点135~142°C、0.6mm/Hgの緑色結晶性生成物6-ヒドロキシ-2,2-ジメチル-チオクロマン-4-オンを得た。[1H-NMRCDCl3:d7.8s,1H,d7.7s,1H,d7.1s,1H,d2.8s,2H,d1.45s,6H]。2,2-ジメチル-4-オキソ-チオクロマン-6-イル-トリフルオロ-メタンスルホネートの合成:6-ヒドロキシ-2,2-ジメチル-チオクロマン-4-オンを含む無水ピリジンの撹拌溶液にトリフルオロメタンスルホン酸無水物を添加した。混合物を、0°Cで4時間撹拌し、室温で一晩撹拌した。高真空下での濃縮により残渣を得、これをジエチルエーテル75mlで処理した。ピリジンとトリフルオロメタンスルホン酸との塩の形成によって生じる沈殿物からエーテル溶液を分離した。エーテル溶液を水で洗浄し、その後NaClで洗浄し、MgSO4上で乾燥させた。エーテルの除去後、残渣を結晶化させた。微量のピリジンを高減圧下で除去した。0.7gの粗生成物が得られ、14gのシリカおよび200ml石油エーテル:酢酸エチル95:5溶液15ml展開液×13を使用してカラムクロマトグラフィによってさらに精製した。生成物画分の蒸発後、無色結晶として0.62gの2,2-ジメチル-4-オキソ-チオクロマン-6-イル-トリフルオロ-メタンスルホネートを得た収率76.5、融点70~74°C。[1H-NMRCDCl3:d7.9s,1H,d7.3s,2H,d2.8s,2H,d1.4s,6H]。2,2-ジメチル-6-トリメチルシラニル-エチニル-チオクロマン-4-オンの合成:2,2-ジメチル-4-オキソ-チオクロマン-6-イル-トリフルオロ-メタンスルホネートを含むトリエチルアミンおよびジメチルホルムアミドの溶液に、アルゴンを10分間吹き込んだ。この溶液にトリメチルシリルアセチレンおよびビス[トリフェニルホスフィン]パラジウムIIクロライドを添加した。反応混合物を95~100°Cの浴中で加熱し、88~90°Cの反応温度を5時間保持した。反応溶液を室温に冷却し、200mlの水で希釈し、100mlの酢酸エチル60m×3で抽出した。得られた有機相を水50ml×2および塩性溶液50mlで洗浄した。最後に、有機溶液をMgSO4上で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、得られた残渣を、42gシリカおよび400ml石油エーテル:酢酸エチル97:3から構成される溶離系を使用してカラムクロマトグラフィによってさらに精製して、2,2-ジメチル-トリメチルシラニル-エチニル-チオクロマン-4-オンを得た1.82g、収率76.4、融点67~70°C;[1H-NMRCDCl3:d7.8s,1H,d7.3s,2H,d2.8s,2H,d1.4s,6H,d0.23s,9H]。6-エチニル-2,2-ジメチルチオクロマン-4-オンの合成:2,2-ジメチル-6-トリメチルシラニル-エチニル-チオクロマン-4-オンを含むメタノールおよび重炭酸カリウムの溶液を、室温で一晩撹拌した。炭酸カリウムを溶解させ、反応物を蒸発させて容量を30~40mlまで減少させ、水で約70~100mlに希釈し、氷水浴で冷却し、ジエチルエーテル60ml×3で抽出した。混合した有機層を、30mlの水および飽和NaCl水溶液30mlで洗浄し、MgSO4上で乾燥させた。減圧下での溶媒の除去により、橙色固体として6-エチニル-2,2-ジメチルチオクロマン-4-オンを得た1.3g、収率97.7、融点63~66°C;[1H-NMRCDCl3:d7.8s,1H,d7.3s,2H,d3.0s,1H,d2.8s,2H,d1.4s,6H]。エチル4-ヨードベンゾエートの合成:4-ヨード安息香酸、25mlエチルアルコール、および20ml乾燥HCl溶液をエチルアルコール中に含む混合液を、2時間還流した。1時間のボイル後、固体を溶解させた。反応溶液を室温に冷却し、減圧下で蒸発させて10mlの容量にした。下部に、酸のエステルへの化学変換により有機層を形成させた。得られた混合物を、氷浴で冷却した。この混合物に80mlのジエチルエーテル、乾燥炭酸水素ナトリウム1g、および50gの氷を添加した。この溶液を撹拌し、飽和重炭酸ナトリウムの50ml水溶液および水を溶解させることによって洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させて、液体オイル生成物としてエチル4-ヨードベンゾエートを得た5.43g、収率96.1;[1H-NMRCDCl3:d7.8s,1H,d7.79s,1H,7.6s,1H,d4.4d,2H,J=7.1Hz,d1.4s,3H]。エチル4-[2,2-ジメチル-4-オキソ-チオクロマン-6-イルエチニル]-ベンゾエートの合成:6-エチニル-2,2-ジメチルチオクロマン-4-オンおよびエチル4-ヨードベンゾエートを含む80mlのトリエチルアミン溶液を、アルゴンで10分間パージした。この溶液に0.7gのPd[PPh3]2Cl2および0.19gのCuIを添加した。溶液をアルゴンをさらに5分間吹き込み、次いで室温で2日間撹拌した。反応混合物をセライトパッドで濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。濾過物を、減圧下で蒸発させた。固体残渣を、カラムクロマトグラフィ40gのシリカ、石油エーテル:酢酸エチル95:5、750ml溶離溶媒系によって精製して、エチル4-[2,2-ジメチル-4-オキソ-チオクロマン-6-イルエチニル]-ベンゾエートを得た1.26g、収率56.5、融点102~104°C。[1H-NMRCDCl3:d8.275s,2H,d7.6s,3H,d7.5s,1H,d7.2s,1H,d4.3t,2H,J=7,d2.8s,2H,d1.48s,3H]。エチル4-[2,2-ジメチル-4-トリフルオロメタンスルホニルオキシ-2H-チオクロメン-6-イル]エチニル]-ベンゾエートの合成:ビストリメチルシリルアミドナトリウム0.6Mトルエン溶液および10mlのテトラヒドロフランの溶液を-78°Cに冷却し、エチル4-[2,2-ジメチル-4-オキソ-チオクロマン-6-イルエチニル]-ベンゾエートを含む10mlテトラヒドロフランTHF溶液をゆっくり添加した。30分後、反応混合物に2-[N,N-ビストリフルオロメタンスルホニルアミノ]ピリジンを含む7mlTHF溶液を添加した。5分後、冷却浴を取り除き、反応溶液を室温に加温し、一晩撹拌し、飽和NH4Cl水溶液20mlの添加によって反応を停止させた。2つの溶媒層が形成された。溶液混合物を、酢酸エチル75mlで抽出した。混合した有機層を、5NaOH水溶液10mlおよび水15ml×2で洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、次いで減圧下で濃縮した。粗生成物1.74gを、35gシリカおよび2酢酸エチル/石油エーテル500ml、20×25ml溶離系を用いてカラムクロマトグラフィによって精製した。混合した溶離生成物の画分の蒸発後、淡黄色固体としてエチル4-[2,2-ジメチル-4-トリフルオロメタンスルホニルオキシ-2H-チオクロメン-6-イルエチニル]-ベンゾエートを得た1.16g、収率71、融点100~104°C。[1H-NMRCDCl3:d8.2s,2H,d7.6s,3H,d7.5s,1H,d7.2s,1H,d6.0s,1H,d4.4t,6H,J=24Hz]。エチル4-[[4-4-エチルフェニル-2,2-ジメチル-[2H]-チオクロメン-6-イル]-エチニル]-ベンゾエートの合成:p-ブロモ-エチル-ベンゼンを含む4mlのTHF溶液-78°Cに冷却に、7.25mlの1.7MLiCCH33を含むペンタンを添加した。658.7mgの塩化亜鉛を含む8mlTHF溶液を添加し、反応混合物を室温に加温し、40分間撹拌し、その後、エチル4-[2,2-ジメチル-4-トリフルオロメチルスルホニル-2H-チオクロメン-6-イル]エチニル]ベンゾエートおよびPdPPh34を含む8mlTHFを含む第2のフラスコに移した。得られた溶液を50°Cで2時間加熱し、室温で一晩撹拌し、飽和NH4Cl水溶液10mlを10分間かけて添加して反応を停止させた。2つの層が形成された。混合物を、75ml酢酸エチルで抽出し、混合した有機層を、水10mlおよび飽和NaClで洗浄した。MgSO4上での有機溶液の乾燥後、溶液を減圧下で濃縮し、24gシリカおよび石油エーテル:酢酸エチル95:5溶離系200mlを使用してカラムクロマトグラフィによって精製して、エチル4-[[4-4-エチルフェニル-2,2-ジメチル-[2H]-チオクロメン-6-イル]-エチニル]-ベンゾエートを得た。[1H-NMRCDCl3:d8.2s,2H,d7.6s,2H,d7.4s,2H,d7.2s,1H,d7.1s,2H,d7.0s,2H,d6.0s,1H,d4.4t,2H,J=24Hz,d2.8t,2H,J=15Hz,d1.6s,6H,d1.4t,3H,J=14Hz]。4-[[4-4-エチルフェニル-2,2-ジメチル-2H-チオクロマン-6-イル]-エチニル]-安息香酸の合成:エチル4-[[4-4-エチルフェニル-2,2-ジメチル-[2H]-チオクロメン-6-イル]-エチニル]-ベンゾエートを含むTHFおよびエタノール溶液に、2mlの2MNaOH溶液を添加した。溶液を40°Cに加熱し、一晩撹拌し、その後室温に冷却した。反応混合物を、1NHCl4mlで酸性化した。プロセスの開始時に、反応混合物は不均一な系を形成した。混合物を酢酸エチル25ml×2で抽出した。混合した有機層を、10ml水、飽和NaCl水溶液で洗浄し、NaSO4上で乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。残存固体0.1gを、減圧下で除去した。残存固体0.31gをアセトニトリル25mlから再結晶させて、無色の固体として4-[[4-4-エチルフェニル-2,2-ジメチル-2H-チオクロマン-6-イル]-エチニル]-安息香酸AGN194310を得た0.236g、70融点210~212°C。[1H-NMRDMSO-d6:d8.2s,2H,d7.8s,2H,d7.6s,2H,d7.4s,2H,d7.2s,2H,d7.0s,1H,d6.0s,1H,d2.6t,2H,J=35Hz,d1.6s,6H,d1.4t,3H,J=46Hz]。単核細胞画分の回収および精製:ヒト血球を、月満ちて生まれた正常な出産後の女性患者の臍帯血から得たインフォームドコンセントを得た。サンプルを回収し、分娩12時間以内に処理した。血液を、3GelatinSigma,St.Louis,MOと混合し、30分間沈殿させてほとんどの血球を除去した。白血球を多く含む画分を採取し、Ficoll-Hypaque勾配1.077g/ml;Sigmaに重層し、400gで30分間遠心分離した。境界層中の単核細胞画分を回収し、3回洗浄し、0.5ウシ血清アルブミンBSA、FractionV;Sigmaを含むリン酸緩衝化生理食塩水PBSBiologicalIndustriesに再懸濁した。単核細胞画分からのCD34細胞の精製:CD34単核細胞を精製するために、画分を、製造業者により推奨されるようにMiniMACS登録商標またはClinimax登録商標CD34先祖細胞単離キットMiltenyiBiotec,Auburn,CAを使用して2サイクルの免疫磁性分離に供した。フローサイトメトリーによって決定したところ以下を参照のこと、得られたCD34集団の純度は、95~98の範囲であった。CD34集団をCD3438-またはCD34Lin-小画分へとさらに精製するために、精製したCD34細胞を、CD38DakoA/S,Glostrup,Denmarkまたは系統抗原BDBiosciences,Erermbodegem,Belgiumについてさらに標識した。ネガティブに標識された画分を測定し、FACSソーターで分離した。CD34-Lin-の精製のために、ネガティブ選択カラムStemCellTechnologies,Vancouver,BC,Canadaを使用して、CD34-画分を系統抗原を発現する細胞から除去した。CD34/-細胞集団のexvivoでの拡大:上記のCD34を発現する精製した細胞、10ウシ胎児血清FBS,BiologicalIndustriesを補充したアルファ培地BiologicalIndustries,BeitHaemek,Israel中で、104細胞/mlの濃度で24ウェルCostar細胞培養クラスターCorningInc.,Corning,NYまたは培養バックAmericanFluorosealCorpにて培養した。以下のヒト組換えサイトカインを添加した:トロンボポイエチンTPO、インターロイキン-6IL-6、FLT-3リガンド、および幹細胞因子SCF最終濃度は全てそれぞれ50ng/mlであるが、20ng/mlの濃度のIL-3をSCFと共にまたはその代わりに添加した。非造血系細胞の分裂には、FGF、EGF、NGF、VEGF、LIF、または肝細胞成長因子HGFを単独または種々の組み合わせで増殖培地に補充して使用した。使用した全てのサイトカインは、PerpoTech,Inc.RockyHill,NJから購入した。培養物を、37°C、5CO2の加湿空気中でインキュベートした。あるいは、単核細胞画分MNC全体を、上記のように単離し、培養し、サイトカインを補充した。1週間間隔で、細胞培養物を減らしtope、細胞数を半分に減らし、新鮮な培地、血清、およびサイトカインを補充するか、または新鮮な成長培地のみを補充した。所定の時点で、細胞を、採取し、トリパンブルーで染色し、計数し、そしてサイトスピンShandon,UKMay-Grunwald/Giemsa溶液で染色した塗抹標本を使用して細胞の形態を決定した。exvivoの造血幹細胞/先祖細胞培養物へのRARアンタゴニストの補充:上記のように精製したCD34培養物および全MNC培養物を調製し、維持した。1×10-3~1×10-11Mまたは410μg/l~4.1×10-5μg/lの範囲の濃度でAGN194310RARアンタゴニストを試験培養物に添加した。3週間までの所定の限られた期間、または全培養期間の間連続してアンタゴニストを添加した。形態学的評価:サイトスピンCytocentrifuge,Shandon,Runcorn,UKによりスライドガラス上に堆積した細胞のアリコートついて、得られた培養集団の形態学的特徴づけを行った。細胞を固定し、May-Gruwald/Giemsa染色液で染色し、顕微鏡で試験した。表面抗原分析:細胞を採取し、1ウシ血清アルブミンBSAおよび0.1アジ化ナトリウムSigmaを含むPBS溶液で洗浄し、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリトリン結合抗体全てImmunoqualityProducts,theNetherlandsを用いて4°Cで60分間染色した。次いで、細胞を同じ緩衝液で洗浄し、FACSキャリバまたはFacstarplusフローサイトメーターによって分析した。シース液として生理食塩水を使用して、細胞を1000細胞/秒の速度で通過させた。488nmのアルゴンレーザビームを励起光源として使用した。対数増幅を使用して10,000個の細胞の発光を測定し、CellQuestソフトウェアを使用して分析した。マウスIgG-PEDakoA/SGlostrup,DenmarkおよびマウスIgG-FITCBDBiosciences,Erembodegem,Belgiumを使用して、細胞のネガティブコントロール染色を行った。CD34および他の造血マーカーの発現の決定:精製したCD34細胞または全MNC画分のいずれかを用いて開始した短期および長期培養物ついて、CD34表面発現を、以下のように決定した:CD34細胞を再度ポジティブ選択しMiltenyiキット、計数した。その後、FACSおよび細胞形態分析によって、純度を確認した。再選択したCD34細胞サブセットを、以下の抗原の組み合わせで染色した:CD34PE/CD38FITCおよびCD34PE/38,33,14,15,3,4,61,19LinFITC。CD34について陽性であり、CD38については陰性である画分を、CD34CD38-と定義した。CD34について陽性でLINについては陰性の画分を、CD34Lin-細胞画分と定義した。細胞集団の計算:FACS分析の結果を、細胞の比率で示す。サブセットの絶対数を、CD34細胞の絶対数から計算する。CD34/CD38-細胞およびCD34/Lin-細胞のベースラインの決定を、以下のように行った:CD34細胞を3つの解凍臍帯血単位から精製し、上記マーカーについて染色した。これらの実験の平均を、ベースライン値と見なした。総細胞数、CD34細胞およびサブセットの数、ならびにCFU数を、培養物が継代されていないということを前提として、累積数すなわち、mlあたりの細胞数×実施した継代の数として示す。コロニー形成単位CFU能力のアッセイ:2IU/mlエリスロポイエチンEprex,CilagAGInt.,Switzerland、幹細胞因子、およびIL-3共に20ng/ml、ならびにG-CSFおよびGM-CSF共に10ng/ml全てPerpoTechを補充した半固体メチルセルロース含有培地中で細胞をクローニングした。培養物を、37°C、5CO2の加湿空気中で14日間インキュベートした。LTC-CFU値の決定:簡単に述べれば、培養物の自己再生を維持する能力を、上記引例に記載されているように、長期および延長した長期培養物におけるコロニー形成単位LTC-CFUの含有量の決定によって測定した。実験結果富化させたCD34集団のRARアンタゴニストでの処理により、表面分化マーカー発現が変化し、短期培養物でほとんど分化していない表現型を示す多数の細胞が得られる:幹細胞のexvivoでの拡大に対するレチノイド受容体アンタゴニストの効果を決定するために、異なる濃度のレチノイン酸受容体アンタゴニストAGN194310を用いて、またはそれを含めずに、4つのサイトカイン組み合わせの存在下でのCD34細胞富化培養を開始した。最初の播種から2週間後、CD34マーカー最も系統が方向付けられた先祖細胞と考えられるを有している細胞の割合ならびにマーカーCD34/CD38-およびCD34Lin-幹細胞および初期先祖細胞画分を示すと考えられるを有している細胞の割合を、FACS分析によって確認した。FACS分析プロットを、図1A~Cに示す。レチノイン酸受容体RARアンタゴニストで処理した培養物は、サイトカインのみで処理した培養物と比較して類似の総細胞数およびCD34細胞数を含んでいた。RARアンタゴニストでの処理によりCD38抗原の発現は完全に消滅し、同時に、さらなる分化に関する抗原CD33、CD14、CD15、CD4、CD3、CD19、およびCD61の発現が有意に阻害された。これは全く予想外の現象であった。以下の表1に、FACSの分析データをまとめる。さらなる実験では、幹細胞および初期先祖細胞のサブセットを、再選択したCD34細胞画分からの2週間の拡大後に測定した。培養2週間後、CD34細胞を再選択し、上記のように、FACSによって表面マーカーCD34CD38-細胞およびCD34Lin-の存在について分析した図2。再選択したCD34細胞のRARアンタゴニストで処理した培養物については、表面発現がCD34CD38-で1000倍、CD34Lin-で500倍増加した。非常に対照的に、サイトカインのみで処理した再選択したコントロール培養物については、CD34CD38-ではわずかに36倍の拡大、CD34Lin-画分ではわずかに8倍の拡大であった。表面抗原発現の顕著な相違にもかかわらず、総細胞数および総CD34細胞数は全ての培養物について類似していた。これらの結果は、RARアンタゴニストにより幹細胞画分を好ましく顕著に増殖させるが、分化は依然として制限することを示す。したがって、RARアンタゴニストは、短期間の培養の間にこれらの稀な細胞を高倍率に拡大させる。アンタゴニストは、より成熟したある系統への分化増殖能力を獲得したCD34細胞に対しては正負のいずれの影響も与えないとも結論付けることができる。富化させたCD34集団のRARアンタゴニストでの処理により、表面分化のマーカーの発現が変化し、長期培養でほとんど分化していない表現型を示す多数の細胞が得られる:RARアンタゴニストが幹細胞画分により高い自己再生能力を与えることができるかを見出すために、CD34細胞およびサブセットの長期拡大に対する、限られた短期2~3週間のRARアンタゴニストでの培養物の処理の効果を、試験した。培養物を、最初の3週間の間だけRARアンタゴニストで処理し、その後さらに8週間アンタゴニストが存在しない状況でインキュベートした。CD34細胞の短期および長期拡大に対するアンタゴニストの効果を決定するために、示した間隔で図3培養物から代表サンプルを採取し、CD34細胞を再選択した。CD34の表面発現を、FACS分析によって再度決定し、その後ポジティブ選択工程を行った図5B。最初の3週間のインキュベーションの間には、CD34を有している細胞数に関してコントロールとRARアンタゴニストで処理した培養物との間に有意差はなかった。さらなる8週間のインキュベーション後培養11週間、RARアンタゴニストで前処理した培養物については、表面CD34抗原発現の持続的な長期間の増大が認められたが図3A、コントロール培養物ではCD34細胞は検出されなかった。3~11週間の間にRARアンタゴニストで処理した培養物で発現が92倍に増加し、この画分は培養開始から1621倍に拡大した。高度に精製したCD34について再選択した画分において、CD34CD38-およびCD34Lin-表面マーカーの発現を検証した図3B-C。培養2週間後、コントロールサンプルでは、CD34Lin-表面発現が小幅な10倍増加であり、RARアンタゴニストで処理した培養物は530倍の顕著な拡大を示した。11週目アンタゴニストでの処理の終了から9週間後には、CD34Lin-発現は16,700倍に増加した。RARアンタゴニストで処理した培養物とコントロール細胞との拡大倍率の比較により、前者のみが延長した長期培養において幹細胞の増殖を有意に持続させることができることが示される。RARアンタゴニストが存在しない状況での幹細胞の拡大の持続は、比較的短いアンタゴニストのパルスでさえも幹細胞応答の改変に十分であることを示している。さらなる実験では、培養物をわずか1週間だけ、サイトカインのみコントロールまたはサイトカインとRARアンタゴニストで処理した。以下の表2に示す結果で証明されるように、13週間のインキュベーションでRARアンタゴニストの顕著な長期効果が認められた。20週間で、RARアンタゴニストで前処理した培養物が劣化し、細胞は正常に分化するが、コントロールよりも速度は遅い。これらの結果は、RARアンタゴニストは幹細胞を一時的に増殖させるが、その自己再生能は依然として保たれるので、exvivo条件での幹細胞の増殖能力の劇的に調節するには1週間のRARアンタゴニストでの処理で十分であることを示している。RARアンタゴニストによって可能となった限られた大量且つ継続的な細胞増殖を別の実験でさらに証明する。ここでは、RARアンタゴニストAGN19431010-7Mまたは0.41μg/lを補充したexvivo培養物が、培養細胞の最初の播種からわずか11週間後までではあるが細胞を増殖させることができることを示す図4。CFU形成能力を同様にアッセイしたが、ピークコロニー形成単位能は、約1週間までにCD34細胞のピーク絶対数を超え、直後に増殖が急激に減少し、その時点で細胞分化が起こり、これは培養物のクローン形成能力CFU形成能の喪失によって証明される。幹細胞の正常な挙動を示すこれらの結果すなわち、大量増殖後の分化は、ドミナントネガティブレチノイド受容体遺伝子の組み込みにより無限の増殖が持続する言い換えれば、細胞株が作製されるMuramatsuM,BiochemBiophysResCommun2001Jul27:2854:891-6reversibleintegrationofthedominantnegativeretinoidreseptorgeneforexvivoexpansionofhematopoieticstem/progenitorcellsという以前の報告とは全く対照的ではあるが、本発明では、延長したexvivoでの増殖後に、細胞は完全に正常に分化することができる。再選択から2週間および11週間後のCD34細胞の代表的なFACSチャートプロットを、図5に示す。発現プロフィールの左側へのシフトによって明らかであるように、コントロール培養物はより分化した状態についてのマーカーを発現し、RARアンタゴニストで処理したサンプルはほとんど分化していない表現型を発現した。これらの所見は、系統ネガティブではないが、RARアンタゴニストで処理した培養物から得られたほとんどのCD34細胞がごくわずかにしか系統に関連する表面マーカーを発現しないことを示している。単核細胞集団のRARアンタゴニストでの処理によりほとんど分化していない表現型を示す細胞集団が拡大する:RARアンタゴニストおよびサイトカインの存在下で培養した単核細胞画分は、同様に、最初の播種から2週間後および5週間後それぞれに再選択した高度に精製したCD34細胞画分からFACS分析で定量したところ、コントロールと比較して、CD34Lin-細胞数の有意な増加を示した78、24表3。しかし、これらの細胞は、CD34集団の精製を先に行わない混合培地条件でもなお、RARアンタゴニストに応答し、未分化の集団を拡大させることが最も顕著である。RARアンタゴニストでの処理は、播種から5週間後で幹細胞/先祖細胞画分の特異的拡大を刺激するのに十分である一方で、コントロールのMNCでは検出可能なCD34集団は得られず、RARアンタゴニストで処理した培養物では有意な数のCD34細胞が得られ、これらは系統マーカーを欠いていた。したがって、コントロールサンプル中でのCD34細胞の生存を抑制するMNC培養細胞によって詳しく調べられた全ての因子では、この画分を詳しく調べるためにRARアンタゴニストによって得られたシグナルを超えるには不十分である。RARアンタゴニストでの処理は長期培養コロニー形成単位LTC-CFUc能力を増大させる:培養物のコロニー形成単位CFUを形成する能力の証明は、高い自己再生能力を有する幹細胞および初期先祖細胞の存在を検証するための別の実用的なinvitro法である。ここでは、延長した長期培養期間の間の漸増数のCFU細胞の存在によって証明されるように、RARアンタゴニストで前処理した培養物が自己再生能力を有する細胞をさらに拡大させることができることを証明する。長期CD34細胞培養物に、種々の所定の濃度のRARアンタゴニストAGN194310とともに、またはそれを含めずに、4つのサイトカインFlt3、TPO、IL-6、およびIL-3の組み合わせを補充した。培養物のRARアンタゴニストでの処理を、3週間に制限するか、または全培養期間継続させた。短いパルスまたは継続した2用量のRARアンタゴニストで処理した長期6週間培養物についてCFUの形成能力を決定し、サイトカインのみで処理したコントロール産物と比較した。アンタゴニストで最初の3週間パルスした長期培養物は、コントロール培養物と比較してCFU含有量が5倍であった図6Aおよび6B。混合コロニーの計数により、コントロール培養物はいかなる混合コロニー形成単位細胞も含まず、アンタゴニストで処理した培養物は非常に多数のCFU混合能力を有する細胞を含むことが示された図7。RARアンタゴニストでの処理は延長した長期培養コロニー形成単位LTC-CFUc能力を増大させる:同様に、RARアンタゴニストで処理した延長した長期8~10週間培養物についてのCFUc形成能力を決定した。この培養期間の間に、CFU含有量の差は顕著に明白になった。RARアンタゴニストでの処理により、コントロール培養物と比較して6週~10週の間にCFUc含有量は顕著に増加し、CFU能力を有する細胞を再生する能力が失われた図6Aおよび6B。RARアンタゴニストでのパルス処理または連続処理により、CFU含有量が15×104まで増加した。同様に、アンタゴニストでのパルス処理により、最も高レベルのCFU混合含有量が得られた図7。exvivoでの肝細胞拡大におけるRARアンタゴニストおよびその使用材料と実験方法初代肝細胞の単離および培養:3つの完全な肝臓を、3週齢のVLVC雌マウスHarlanLaboratories,Jerusalem,Israelから採取し、切断し、DMEMBeitHaemek,Israelで2回洗浄し、0.05コラゲナーゼを含むDMEM中で37°Cで30分間インキュベートし、粉砕して200μmメッシュの篩にかけ、それぞれの肝細胞を得た。細胞を2回洗浄し、トリパンブルーを使用して生存を確認した。コラーゲンをコーティングした35mmの組織培養プレートに、4×104生細胞/mlの密度でF12培地15mMHepes、0.1グルコース、10mM重炭酸ナトリウム、100単位/mlペニシリン-ストレプトマイシン、グルタミン、0.5単位/mlインスリン、7.5mcg/mlヒドロコルチゾン、および10ウシ胎児血清を含むにプレートした。12時間後に培地を交換し、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水PBSで2回洗浄し、新しい培地を加えた。培地を1週間に2回交換した。肝細胞もまた、Schwartzetal.の方法SchwartzRE,ReyesM,KoodieL,JiangY,BlackstadM,LundT,LenvikT,JohnsonS,HuWS,VerfaillieCM.Multipotentadultprogenitorcellsfrombonemarrowdifferentiateintofunctionalhepatocyte-likecells.JClinInvest.2002;10910:1291-302に記載されたように、全培養期間の間、表皮成長因子EGF、血小板由来成長因子β鎖PDGF-BB、線維芽細胞成長因子FGF-4、および肝細胞成長因子HGFそれぞれ20~50ng/mlの存在下で成長させた。肝細胞を、Rungeetal.の方法RungeD,RungeDM,JagerD,LubeckiKA,BeerStolzD,KarathanasisS,KietzmannT,StromSC,JungermannK,FleigWE,MichalopoulosGK.Serum-free,long-termculturesofhumanhepatocytes:maintenanceofcellmorphology,transcriptionfactors,andliver-specificfunctions.BiochemBiophysResCommun.2000;2691:46-53にしたがって、無血清培地中でも成長させた。上記肝細胞培養条件の全てにおいて、細胞を、10-5M~10-9Mの濃度範囲のレチノイン酸アンタゴニストAGN194310の存在下またはそれを含まない条件下で増殖させた。3週間後、10-5Mのアンタゴニストで処理した培養物を、0.25トリプシンで分離し、分割し、1:2の比率で再度プレーティングした。細胞を、下記のように免疫染色するか、またはギムザ染色で視覚化した。EGFおよびHGFを補充したマウス肝細胞培養物を、初代培養物または以下の第1継代物および第2継代物として評価した。下記のように、第1継代培養物を、2週間成長させ、1:2に分割し、8日後にアルブミンの存在について免疫染色した。第2継代培養物を同様に2週間成長させ、1:2に分割し、さらに1週間成長させ、1:4に分割し、4日後に同様に免疫染色した。組織学的特徴づけ:肝細胞およびexvivoで拡大させた細胞を、その細胞培養プレート中で直接メタノールで固定し、各手順を、以下に概説した標準的な手順によって行った。肝細胞の機能のマーカーとして一般的に使用されている培養肝細胞による有機アニオンの細胞取り込みを、インドシアニングリーンICG色素取り込みによって調べた。ICGSigma,Jerusalem,Israelを、DMEM中に溶解させて最終濃度を1mg/mlとしたYamadaT,YoshikawaM,KandaS,KatoY,NakajumaY,IshizakaS,TsunodaY.Invitrodifferentiationofembryonicstemcellsintohepatocyte-likecellsidentifiedbycellularuptakeofindocyaninegreen.StemCells.2002;202:146-54。10日間培養した肝細胞をPBSで2回洗浄し、400μlの色素と共に37°Cで15分間インキュベートした。次いで、サンプルをPBSで3回リンスし、光学顕微鏡で観察した。exvivoで拡大させた細胞および肝細胞を、製造業者Shandon,Pittsburg,PAの説明書に従ってギムザ染色にて室温で4分間染色し、緩衝液中で4分間洗浄し、リンス溶液で3~4回洗浄した。免疫細胞化学:マウス由来のAFPと交差反応するヒト起源の組換えタンパク質に対して惹起されたウサギポリクローナル抗体H-140SantaCruzTechnology,SantaCruz,CAを使用してα-フェトプロテインAFPの発現について、およびマウスアルブミンに対するウサギ抗血清Cappel-ICN,Aurora,Ohioを使用してアルブミンの発現について、肝細胞をプローブした。細胞を、メタノール中で-20°Cで10分間固定し、PBSで5分間リンスし、0.1triton-XSigma,Jerusalem,Israelを含むPBS中に5分間浸した。次いで、細胞を、Tris緩衝生理食塩水TBSで5分間洗浄し、1ウシ血清アルブミンBSAを含むPBSとともに10分間インキュベートした。ペルオキシダーゼブロックEnvision,Dako,Carpinteria,CAとの室温で5分間のインキュベーションによって内因性ペルオキシダーゼを不活化した。細胞を、マウスアルブミン100倍希釈に対して、またはα-フェトプロテイン25倍希釈に対してウサギ中で惹起させた抗体とともに30分間インキュベートした。次いで、サンプルを、ペルオキシダーゼ活性製造業者の説明書にしたがってEnvisionHRP-システムDako,Carpinteria,CAを使用した方法について視覚化し、ヘマトキシリンDako,Carpinteria,CAで対比染色した。実験結果サイトカインを含まない培地で増殖させた3週齢のマウス肝臓由来の初代培養物を、成熟肝細胞のマーカーであるα-フェトプロテインほとんど分化していない先祖細胞に特異的なマーカーおよびアルブミンなどの初期発生マーカーを含む肝細胞特異的マーカーの発現について培養3週間後にプローブした。培養細胞は、α-フェトプロテイン赤褐色沈殿図8Aおよびアルブミンデータ示さずについてポジティブに染色され、これは、機能的肝細胞の存在を示している。10-5Mレチノイン酸アンタゴニストの存在下での培養物のインキュベーションにより、コントロール培地と比較してα-フェトプロテインについてポジティブに染色された細胞画分が増加した図8B。この増加は、初期肝細胞の増殖を示し得る。同様に、培養物のギムザ染色によりレチノイン酸アンタゴニストで処理した培養物において楕円形細胞肝幹細胞先祖細胞は楕円形細胞として定義されるの大きな集団が認められ図9B、一方でこれは、未処理のコントロール培養物ではほとんど認められなかった図9A。アンタゴニストの存在下およびサイトカインを含まない条件下で3週間増殖させた肝細胞培養物を、トリプシン処理し、分割し、再度プレーティングした。細胞は培養プレートに再接着し、典型的な肝細胞形態を示した図9C。これは、特にサイトカインを含まない条件下で長期間の培養において初代肝細胞を増殖させることが困難であることを示す以前のデータとは対照的であるWickM,KoebeHG,SchildbergFW.Newwaysinhepatocytecultures:CellimmobilizationtechniqueALTEX.1997;142:51-56;HinoH,TatenoC,SatoH,YamasakiC,KatayamaS,KohashiT,ArataniA,AsaharaT,DohiK,YoshizatoK.Along-termcultureofhumanhepatocyteswhichshowahighgrowthpotentialandexpresstheirdifferentiatedphenotypes.BiochemBiophysResCommun.1999Mar5;2561:184-91;TatenoC,YoshizatoK.Long-termcultivationofadultrathepatocytesthatundergomultiplecelldivisionsandexpressnormalparenchymalphenotypes.AmJPathol.1996;1482:383-92。RARアンタゴニストで処理した初代肝細胞の培養において成長因子を培養培地に補充することにより、成長因子を補充したがRARアンタゴニストを加えなかったコントロール培養物と比較して、補充した培養物がα-フェトプロテイン産生についてポジティブに染色され図10C、免疫染色が明らかではなかった図10Dという点で補充していない培地と類似の結果が得られた。アルブミンの発現についてのプローブすることによって決定されたバックグラウンド染色は、RARアンタゴニストで処理した培養物図10Aおよび未処理の補充した培養物図10Bにおいてごく僅かであった。したがって、成長因子のみを補充した培養物では、ほとんど分化していない細胞表現型の拡大に不十分である。同様に、成長因子を補充した肝細胞培養物の第1回および第2継代物について、その培養継続能力を評価した。成長因子を補充した第1継代培養物では、RARアンタゴニストで処理した培養物図11Bおよび未処理のコントロール培養物図11Aは、典型的な肝細胞の存在を示したが、RARで処理した培養物図11CおよびDだけは、肝幹細胞集団を示す多数の楕円形細胞の島を示した。成長因子を補充した第2継代培養物は、RARで処理した培養物図11Fと比較してコントロール培地図11Eで肝細胞数が顕著に減少し、これは、成長因子のみの補充では培養において肝細胞を拡大および維持できないことを示す。RARアンタゴニスト処理のみによって、肝細胞集団の発現と長期培養が可能であった。exvivoでの細胞拡大におけるRXRおよびRARRXRアンタゴニストおよびその使用材料と実験方法RXRアンタゴニスト2E,4E,6E-7-[3-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレン-2-イル]-3-メチルオクタ-2,4,6-トリエン酸LGN100754の合成:LGN100754の合成は、以下に基づいて行った:iCanan-Kochetal.J.Med.Chem.39,17,3229-3234反応スキーム、p3231およびiiタイトル二量体選択性RXRモジュレータおよびその使用方法の国際出願番号PCT/US96/14876WO97/12853の合成プロトコール。全ての材料を、LigandPharmaceuticalsInc.から購入した。6-エチニル-1,1,4,4-テトラメチル-7-プロポキシ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレンの合成:室温の窒素雰囲気下でオキシ塩化リン0.234g、0.142ml、1.52mmolをジメチルホルムアミドDMF4mlに滴下した。溶液を30分間撹拌した。橙色溶液に1-3-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチルナフタレン-2-イルエタノンを急激に1回で添加し、反応溶液を、60°Cに加熱し、12時間撹拌した。得られた暗褐色溶液を氷水に注ぎ、水層を固体炭酸水素ナトリウムでpH7に調整した。酢酸エチル抽出によって、橙色/褐色オイルとして粗生成物クロロエナルchloroenal6-[1-ヒドロキシ,2-クロロ-エテニル]-1,1,4,4-テトラメチル-7-プロポキシ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン0.128gが得られた。粗クロロエナルを含むジオキサン:水3:2、5ml溶液を、80°Cで、NaOH0.061g、1.52mmolを含むジオキサン:H2O3:2;20ml溶液に添加し、反応混合物を2時間撹拌して橙色反応溶液を得た。反応溶液を室温に冷却し、塩性溶液中に注ぎ、EtOAcで抽出した。有機相を乾燥させMgSO4、濾過し、濃縮して橙色オイルとした。これをラジアルradialクロマトグラフィ10:1ヘキサン:酢酸エチルによって精製して、黄色オイルとして生成物6-エチニル-1,1,4,4-テトラメチル-7-プロポキシ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン39を得た。[1H-NMR400MHz,CDCl3:d7.38s,1H,Ar-H,6.76s,1H,Ar-H,3.98t,J=6.6Hz,2H,OCH3,3.19s,1H,CH,1.83m,2H,CH2,1.66m,2H,2CH2,1.26s,6H,2CH3,1.23s,6H,2CH3,0.93t,J=7.4Hz,3H,CH3]3-3-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチルナフタレン-2-イルプロピンニトリルの合成:臭化エチルマグネシウム3.33mlの1.0MTHF溶液、3.32mmolを、室温のアセチレンエーテル6-エチニル-1,1,4,4-テトラメチル-7-プロポキシ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン0.450g、1.66mmolを含むTHF10ml溶液に滴下した。溶液を6時間加熱還流し、その後、室温に冷却した。反応溶液にフェニルシアネート0.40g、0.50ml、3.33mmol原液を添加し、さらに2時間還流し続けた。反応溶液を室温に冷却し、飽和塩化アンモニウム溶液で反応を停止させた。水を添加し、その後ラジアルクロマトグラフィ20:1ヘキサン:EtOAcによって、黄色固体として生成物3-5,5,8,8-テトラメチル-3-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-2-イルプロピンニトリル80を得た。1H-NMR400MHz,CDCl3:d7.44s,1H,Ar-H,6.78s,1H,Ar-H,3.97t,J=6.5Hz,2H,OCH2,1.83m,2H,CH2,1.67m,2H,2CH2,1.27s,6H,2CH3,1.24s,6H,2CH3,1.03t,J=7.3Hz,3H,CH3。3-3-プロポキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-ナフタレン-2-イルブト-2-エンニトリルの合成:炎で乾燥させたフラスコに、ヨウ化銅I0.057g、0.298mmolを含むTHF5ml懸濁液を入れ、混合物を0°Cで窒素雰囲気下で撹拌した。メチルリチウム0.43mlの1.4Mエーテル溶液、0.596mmolを滴下して、無色の溶液を得た。溶液を-78°Cに冷却し、黄色/褐色物質を得た。アセチレンニトリル3-5,5,8,8-テトラメチル-3-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-2-イルプロピオニトリル0.040g、0.135mmolを含むTHF3.0mlを滴下し、溶液を-78°Cで45分間撹拌し、その後、メタノール5mlで反応を停止させた。水を添加して、黄色オイルとしてシス-アルケンニトリル3-3-プロポキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-ナフタレン-2-イル-ブト-2-エンニトリル97を得た;1H-NMR400MHz,CDCl3:d7.19s,1H,Ar-H,6.78s,1H,Ar-H,5.35s,1H,オレフィン,3.92t,J=6.4Hz,2H,OCH2,2.27s,3H,CH3,1.79m,2H,CH2,1.67s,2H,2CH2,1.28s,6H,2CH3,1.27s、6H,2CH3,1.02t,J=7.4Hz,3H,CH3。2E,4E,6Z-7-3[-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレン-2-イル]-3-メチルオクタ-2,4,6-トリエン酸の合成:N2バブラー、セプタム、および撹拌バーを備えた丸底フラスコに、3-3-プロポキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-ナフタレン-2-イルブト-2-エンニトリル付加化合物を含むヘキサン5mlおよびトルエン5ml溶液を入れ、-78°Cに冷却した。DIBAL3.71mlの1.0Mトルエン溶液、5.6mmolを注射器から一滴ずつ溶液に添加し、その後、-78°Cで1.5時間撹拌し、酒石酸カリウムナトリウム水溶液10mlで反応を停止させ、30分間かけて室温まで加温した。水層を酸性化し1.0MHClでpH=4にする、EtOAc3×10mlで抽出した。混合した有機抽出物を水および塩性溶液で洗浄し、乾燥させ硫酸ナトリウム、濾過し、濃縮して、黄色オイルとしてシス-アルケニル,シス-3-3-プロポキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-ナフタレン-2-イルブト-2-エナールを得た;1H-NMR400MHz,CDCl3:d9.36d、J=8.4Hz,1H,CHO,6.99s,1H,Ar-H,6.79s,1H,Ar-H,6.09s,J-8.4Hz,1H,オレフィン,3.90t,J=6.5Hz,2H,OCH2,2.29s,3H,CH3,1.76m,2H,CH2,1.68s,2H,2CH2,1.3s,6H,2CH3,1.24s,6H,2CH3,1.00t,J=7.4Hz,3H,CH3。次いで、N2バブラー、セプタム、および撹拌バーを備えた、炎で乾燥させた丸底フラスコに、ジエチル3-エトキシカルボニル-2-メチル-プロプ-2-エニルリン酸0.417g、1.58mmol、0.39mlのTHF2.0ml溶液および1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-21H-ピリミジノンDMPU、0.7mlを入れた。溶液を、-78°Cに冷却し、n-ブチルリチウム0.96mlの1.5Mヘキサン溶液、1.44mmolを注射器から一滴ずつ添加した。反応溶液を、0°Cに加温し、15分間撹拌した。得られた溶液を-78°Cに冷却し、シス-3-3-プロポキシ-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-ナフタレン-2-イルブト-2-エナール1.31mmolをカニューレから一滴ずつ添加した。溶液を室温にまで加温した。1.5時間の撹拌後、水15mlで反応を停止させ、水層をEtOAc3×10mlで抽出した。混合した有機層を、CuSO4、水、および塩性溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗エステルとして2E,4E,6Z-7-3[-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレン-2-イル]-3-メチル-オクタ-2,4,6-トリエン酸エチルエステルを得た。粗エステルを、還流温度で、KOH過剰量を含むエタノール7mlで加水分解し、1MHCl5mlで反応を停止させた。溶液を濃縮し、水10mlで希釈し、水層をEtOAc3×15mlで抽出した。混合した有機層を水および塩性溶液で洗浄し、NaSO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、ラジアルクロマトグラフィおよびその後の分取シリカゲルTLCで精製して、淡黄色固体として2E,4E,6Z-7-3[-プロポキシ-5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレン-2-イル]-3-メチルオクタ-2,4,6-トリエン酸]を得た;融点177~179°C;1H-NMR400MHz,CDCl3:6.95s,1H,Ar-H,6.79s,1H,Ar-H,6.62dd,J=15.3,11.0Hz,1H,オレフィン,6.22apppbrd,2H,2オレフィン,5.76s,1H,オレフィン,3.89t,J=6.5Hz,2H,OCH2,2.19s,3H,CH3,2.13s,3H,2CH3,1.77m,2H,CH2,1.68s,4H,2CH2,1.30s,6H,2CH3,1.23s,6H,2CH3,1.01t,J=7.4Hz,3H,CH3。RARRXRアンタゴニスト4-[5H-2,3-2,5-ジメチル-2,5-ヘキサノ-5-メチル-8-ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン-11-イル安息香酸HX531と呼ぶの合成:MasyukiEbisawaetal.,Chem.Pharm.Bull.,4712:1778-17861999に記載の手順に基づいて、RARRXRアンタゴニストHX531の合成を行った。2,5-ジメチル-2,5-ヘキサンジオールの合成:t-ブチルアルコール水溶液285mlまたは3molを含み23mlの硫酸を含む800ml水溶液に30°Cで過酸化水素1.05molおよび硫酸第1鉄1molおよび1molの硫酸溶液を同時に当量で添加した。これにより、収率36で樟脳臭を呈する半固体生成物を単離した。乾燥および再結晶EtOAcによって、2,5-ジメチル-2,5-ヘキサンジオール生成物を精製した融点mp:85~87°C。2,5-ジクロロ-2,5-ジメチルヘキサンの合成:以前に記載のように合成を行ったMayr,H,etal.,Chem.Ber.124:203,1999。2,5-ジメチル-2,5-ヘキサンジオール73.1g、0.500molを、37HCl水溶液250mlと共に1時間撹拌した。最初均一だった混合物から沈殿が生じて結晶性生物が得られた。生成物を、600mlの石油エーテルで抽出し、CaCl2で乾燥させた。溶媒の蒸発によって、81.9g89のNMRスペクトルで純粋な固体が得られ、これを石油エーテルから再結晶させて、2,5-ジクロロ-2,5-ジメチルヘキサンを得た融点:68~68.5°C。6-ブロモ-1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1,4,4-テトラメチルナフタレンの合成:撹拌棒および還流冷却器を備えた200mlの丸底フラスコに、ブロモベンゼン109mmol、17mlおよび2,5-ジクロロ-2,5-ジメチルヘキサン10g、54.6mmolのジクロロメタン30ml溶液を添加した。塩化アルミニウム1.45g、10.9mmolを、自発的還流が弱まるまでゆっくり溶液に添加した。室温で10~15分間の撹拌後、反応物を氷水30mlに注ぎ、層分離させた。水層をEtOAc5×20mlで抽出した。混合した有機層を、水および塩性溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して6-ブロモ-1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1,4,4-テトラメチルナフタレン生成物を得た。6-ブロモ-1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1,4,4-テトラメチルナフタレン30g、100mmol、炭酸カリウム56.1g、41mmol、およびヨウ化銅4.53gを含むo-キシレン300mlの混合物を、150°Cで14時間加熱した。溶媒の除去後、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィEtOAc;n-ヘキサン1:100によって精製して、赤色プレートn-ヘキサンとして生成物2-ニトロ-1-アミノ-[1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1,4,4-テトラメチルナフタレン]-ベンゼンを得た36.09g、収率82の表題化合物、融点118°C。NaOH60、92mg、2.31mmolのDMF1ml懸濁液に2-ニトロ-1-アミノ-[1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1,4,4-テトラメチルナフタレン]-ベンゼン500mg、1.54mmolのDMF10ml溶液を添加し、混合物を30分間撹拌し、その後ヨウ化メチル0.5mlを添加し、さらに1時間撹拌した。溶媒の除去後、残渣を水にとり、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水および塩性溶液で洗浄し、MgSO4上で乾燥させた。減圧下での溶媒の除去により、粗生成物2-ニトロ-1-メチルアミノ-[1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1,4,4-テトラメチル-ナフタレン]ベンゼン543mgを得た。2-ニトロ-1-メチルアミノ-[1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1,4,4-テトラメチル-ナフタレン]ベンゼン540mg、1.53mmolを、20mlのメタンに溶解させ、10のエチルアルコール55mgで1時間水素付加した。濾過および溶媒の除去後、残渣を、シリカゲルEtOAc:n-ヘキサン1:8でのクロマトグラフィにかけ、生成物として2-アミノ-1-メチルアミノ-[1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1,4,4-テトラメチル-ナフタレン]ベンゼンを得た。2-アミノ-1-メチルアミノ-[1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1,4,4-テトラメチル-ナフタレン]ベンゼン420mg、1.3mmolを含むベンゼン10mlおよびピリジン2mlの溶液に、テレフタル酸モノメチルエステルクロライド381mg、1.91mmolを添加した。混合物を4時間撹拌し、2N塩酸に注ぎ、EtOAcで抽出した。有機層を乾燥させ、シリカゲルEtOAc:n-ヘキサン1:8で精製して、2-[アミノ-4-安息香酸メチル-エステル]-1-メチル-アミノ[1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1,4,4-テトラメチル-ナフタレン]-ベンゼン631mgを得た。ポリリン酸6.0gに2-[アミノ-4-安息香酸メチル-エステル]-1-メチル-アミノ[1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1,4,4-テトラメチル-ナフタレン]-ベンゼン630mg、1.30mmolのジクロロメタン溶液を添加し、混合物を110°Cで18時間加熱した。冷却後、反応物に水を添加し、生成物をジクロロメタンで抽出した。有機層を塩性溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィEtOAc:n-ヘキサン1:6で精製して、精製物2-[アミノ-4-安息香酸メチルエステル]-1-メチルアミノ[1,2,3,4-テトラヒドロ1,1,4,4-テトラメチルナフタレン]4-ニトロベンゼン104gを得た。0°Cで2-[アミノ-4-安息香酸メチルエステル]-1-メチルアミノ[1,2,3,4-テトラヒドロ1,1,4,4-テトラメチルナフタレン]4-ニトロベンゼン200mg、0.44mmolの硫酸12ml溶液にKNO373mg、0.72mmolを添加した。2.5時間後、混合物を氷水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を、1NNaHCO3、水、および塩性溶液で連続して洗浄し、MgSO4上で乾燥させた。蒸発後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィEtOAc:n-ヘキサン1:8で精製して、4-5H-2,3-2,5-ジメチル-2,5-ヘキサノ-5-メチル-8-ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン-11-イルベンゾエート100mg、45.5を得て、生成物を回収した84mg。この化合物を、塩基性条件下2NNaOH/EtOHで以下のように加水分解した。4-5H-2,3-2,5-ジメチル-2,5-ヘキサノ-5-メチル-8-ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン-11-イル安息香酸の合成:5H-2,3-2,5-ジメチル-2,5-ヘキサノ-5-メチル-8-ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン-11-イル安息香酸メチルエステル84mgを含むエタノール4mlおよび2NNaOH2mlの溶液を室温で2時間撹拌した。混合液を、2N塩酸に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を塩性溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。蒸発後、粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィジクロロメタン:メタノール20:1、その後8:1で精製して、生成物4-5H-2,3-2,5-ジメチル-2,5-ヘキサノ-5-メチル-8-ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン-11-イル安息香酸すなわち、HX531を得た。exvivoの造血幹細胞/先祖細胞培養物へのRXR、RAR、およびRARRXRアンタゴニストの補充:上記のように培養物を調製し、維持した。RXR、RAR、またはRARRXRアンタゴニストを、希釈濃度1550μg/l~0.155μg/lに相当する10-4Mから10-9Mまで100μM~10-3Mの濃度範囲でいくつかの培養物に添加した。所定の時間、限定期間、3週間まで、または全培養期間継続して、アンタゴニストを添加した。単核細胞画分の回収および精製、単核細胞画分からのCD34細胞の精製、CD34/-集団のexvivoでの拡大、形態評価、表面抗原の分析、CD34および他の造血マーカー発現の決定、ならびに細胞集団の計算を含む全ての他の手順を、上記の実施例1の実験方法の節に記載したように行った。実験結果培養物中の幹細胞および先祖細胞のexvivoでの拡大に対するRAR、RXR、およびRARRXRアンタゴニストならびにRARとRXRアンタゴニストとの組み合わせの効果の比較:種々の濃度の以下のアンタゴニストとともに、またはそれを含めないで、4つのサイトカインTPO、FLT3、IL-6、およびIL-3の組み合わせの存在下でCD34細胞富化培養を開始した:iレチノイン酸受容体RARアンタゴニストAGN194310、iiレチノイドX受容体RXRアンタゴニストLGD100754、およびiiiRARアンタゴニストAGN194310とRXRアンタゴニストLGD100754との組み合わせ。最初の播種から3週間後および5週間後には、CD34マーカーを有している細胞ある系統への分化増殖能力を最も獲得した先祖細胞と考えられるの割合ならびにマーカーCD34/CD38-およびCD34Lin-を有している細胞幹細胞および初期先祖細胞画分を示すと考えられるの割合を、FACS分析によって確認した。細胞集団数、CFU数、およびFACS分析から得られたデータを、図12a~bおよび13a~eに示す。結果は、サイトカインIL-3細胞分化促進物質と共に10-7Mの濃度で培養培地に補充した場合、RXRアンタゴニストは活性を示さず、RARアンタゴニストは中程度の活性を示し、RARアンタゴニストとRXRアンタゴニストとの組み合わせでの処理により、コントロールサイトカインのみ、RARアンタゴニストでの処理、およびRXRアンタゴニストでの処理と比較して実質的に高レベルのCFU、CD34細胞、CD34/38-細胞、およびCD34/Lin-細胞が得られることを示す。明らかに、RARアンタゴニストとRXRアンタゴニストとの組み合わせにより、幹細胞/先祖細胞のexvivoでの拡大に対する相乗効果が発揮されている。さらなる実験では、RARRXRアンタゴニストHX-531すなわち、レチノイン酸およびレチノイドX受容体両方のアンタゴニスト10-6M;MW=483とともに、またはそれらを含まない、4つのサイトカインTPO、FLT3、IL-6、およびIL-3の組み合わせの存在下でCD34細胞富化培養を開始した。CFUおよびCD34細胞のレベルを、培養開始から3、7、9、および11週間後に決定した。この実験の結果を、以下の表4にまとめる。これらの結果は、RARRXRアンタゴニストは、幹細胞画分を好ましく顕著に増殖させることができるが、依然として分化を制限し、それにより短期および長期培養期間の間に幹細胞/先祖細胞を直接高倍率に拡大させることを示している。ビタミンD受容体VDRアンタゴニストである1α,25-OH2D3-26,23-ラクトンの合成:Ishizuka,S.etal.,ArchivesofBiochemistryandBiophysics242:82,1985によって記載された手順、または以下の手順にしたがって、1α,25-OH2D3-26,23-ラクトンの4つのジアステレオマーを合成することができる。メチル-4-ヨード-2-メチル-ブチレートの合成:窒素流下のリチウムの2mlエーテル乾燥懸濁液に、フェニルブロマイドの3mlエーテル溶液を滴下した。リチウムが完全に溶解するまで反応混合物を加熱した。アルゴン流下でヨウ化メチレンのエーテル溶液を調製し、-78°Cに冷却した。フェニルリチウム溶液をこの溶液に、注射器で一滴ずつ0.5時間かけて添加し、さらに、メチルR--3-ブロモ-2-メチルプロピオネートのエーテル5ml溶液をこれに添加した。反応混合物を、25°Cで一晩撹拌した。次いで、DMSO7mlを添加し、エーテルを蒸発させた。反応混合物を100°Cで一晩撹拌した。1α,3β,5E,7E,20R,1’E-1,3-ビス-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-20-メチル2-メチル,1’-ヘプテニレート-9,10-セコプレグナ-5,7,10,19-トリエンの合成:窒素雰囲気下で、リチウム金属の2ml乾燥エーテル懸濁液に、フェニルブロマイドの3ml乾燥エーテル溶液を滴下した。リチウム金属の溶解時に、発熱反応が認められた。リチウム金属が完全に溶解するまで、反応混合物を加熱した。トリフェニルホスフィン991.447g、5.52mmolおよびDMSOを、上記のメチル4-ヨード-2-メチル-ブチレート反応溶液に添加し、得られた混合物を100°Cで18時間加熱した。次いで、混合物を窒素雰囲気下で-30°Cに冷却し、フェニルリチウム溶液を含むエーテルをこれに添加した。この反応混合物を、0°Cで1時間撹拌し、その後アルデヒドCLP-8-β,5E,7E,20R,1’E-1,3-ビス-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-9,10-セコプレグナ-5,7,10,19-トリエン-アルデヒドのヘキサン溶液を添加した。得られた混合物を、100°Cで一晩撹拌した。その後エーテルおよびヘキサンを蒸留させ、反応混合物を60°Cに冷却し、50ml酢酸エチルの75ml水溶液をこれに添加した。有機層を分離し、25mlの水および塩性溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。有機溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させ、展開液としてヘキサン-EtOAc98:2の混合物を使用してシリカゲルカラム60gで精製して、60mgの生成物1α,3β,5E,7E,20R,1’E-1,3-ビス-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-20-2-メチル,1’ヘプテニレート-9,10-セコプレグナ-5,7,10,19-トリエンを得た。1α,3β,5E,7E,20R,1’E-1,3-ビス-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-20-2-メチル-2-ヒドロキシ-1’ヘプテン酸-9,10-セコプレグナ-5,7,10,19-トリエンの合成:1α,3β,5E,7E,20R,1’E-1,3-ビス-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-20-2-メチル-1’-ヘプテニレート-9,10-セコプレグナ-5,7,10,19-トリエン60mgを3mlのTHFに溶解させ、アルゴン流下で溶液を-78°Cに冷却した。LiNiPr2を反応混合物に添加して、リチウム誘導体を得、-78°Cで1時間さらに酸素と反応させる。その後、トリフェニルホスフィンを添加し、反応混合物を30分間撹拌した。次いで、得られた反応混合物を、減圧下で水分を蒸発させた。KOHのメタノール溶液を残渣に添加し、反応混合物を、60°Cで2.5時間加熱し、その後0.5ml1NHClで希釈し、減圧下で蒸発させた。残渣をクロロホルムに溶解させ、生成物を、展開液として97:3ヘキサン-酢酸エチルの混合物2回を使用してシリカゲルプレート20×20上で精製し、画分2Rf=0.81として6.3mgの生成物を得た。次いで、得られた生成物を、ピリジン12mgの存在下で15.2mgのヨウ素の2ml塩化メチレン溶液で処理し、反応混合物を減圧下で、その後高減圧下で蒸発させた。残渣をTHFで溶解させ、n-Bu3SnH29.1mgをこれに添加した。反応混合物を室温で4時間撹拌し、その後、減圧下で蒸発させた。残渣を、触媒量のHClのメタノール溶液で50°Cで5時間処理した。反応混合物を減圧下で蒸発させ、残渣を、展開液として95:5クロロホルム-メタノール混合物を使用してシリカゲルTLCプレート20×20上で精製し、画分1Rf=0.4として2.64mgの所望の生成物9,10-セココレスタ-5,7,1019-トリエン-26-酸、1,3,23,25-テトラヒドロキシ-γ-ラクトンまたは23S,25R-1α,25-ジヒドロキシビタミンD3-26,23-ラクトンを得た;FAB-MS:Calc.426.60、Found426.88。造血幹細胞/先祖細胞のexvivoでの拡大に対するニコチンアミドの効果exvivo造血幹細胞/先祖細胞培養物へのニコチン補充:上記のように培養物を調製し、維持した。3週間までの培養期間に1、5、または10mMの濃度のニコチンアミドを細胞培養物に添加した。単核細胞画分の回収および精製、単核細胞画分からのCD34細胞の精製、幹細胞/先祖細胞集団のexvivoでの拡大、形態評価、表面抗原分析、CD34、CD38、Lin、および他の造血マーカー発現の決定、ならびに細胞集団の計算を含む全ての他の手順は、上記の実施例1の実験方法の説に記載したように行った。実験結果幹細胞および造血先祖細胞のexvivoでの拡大に対するニコチンアミドの効果:異なる濃度のニコチンアミドとともに、またはそれらを含めないで、5つのサイトカインSCF、TPO、FLt3、IL-6、およびIL-3の組み合わせの存在下で造血CD34細胞培養を開始した。3週間のインキュベーション後、CD34細胞を親和性再精製法によって再選択し、計数した。図14に示す結果は、未処理のサイトカインのみコントロールでは1mlあたりわずかに35×104個のCD34細胞であったことと比較して、1mMおよび5mMのニコチンアミドを補充した培養物については、1mlあたり99×104および180×104個のCD34細胞が得られたことを示している。さらに、再選択したCD34細胞画分を、幹細胞/先祖細胞マーカーについてFACS分析した。図15~17および18a~bに示す結果は、ニコチンアミドで処理した培養物における、CD34/CD38-、CD34/Lin-、およびCD34/HLA-DR38-細胞の割合の実質的な増加を示している。図15は、1mMおよび5mMのニコチンアミドを補充した培養物について、未処理のサイトカインのみコントロールと比較してCD34/CD38-細胞の密度がそれぞれ1.7倍および51.7倍に増加したことを示している。図16は、1mMおよび5mMのニコチンアミドを補充した培養物について、未処理のサイトカインのみコントロールと比較してCD34/Lin-細胞密度がそれぞれ10.5倍および205.5倍に増加したことを示している。図17は、5mMのニコチンアミドを補充した培養物について、未処理のサイトカインのみコントロールと比較してCD34/HLA-DR38-細胞密度が11.5倍に増加したことを示している。したがって、ニコチンアミドは、幹細胞および先祖細胞のexvivoでの拡大促進のための非常に有効な薬剤であることが見出された。さらなる実験では、培養物を、5mMおよび10mMのニコチンアミドで処理した。以下の表5は、幹細胞および初期先祖細胞のexvivoでの拡大に対するニコチンアミドの強力な効果を証明する結果を示している。明確にするために異なる実施形態の状況について記載してきた本発明の一定の特徴は、1つの実施形態において組み合わせて得ることもできることが認識される。逆に、簡潔にするために1つの実施形態の状況について記載した本発明の種々の特徴を、個別または任意の適切な組み合わせで得ることもできる。本発明を特定の実施形態と共に記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれるこのような全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。全ての刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願は、その全体が、それぞれの刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願があたかも特別または個別に本明細書中で参考として援用されるように示されるような範囲に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願における任意の引例の引用または識別により、このような引例が先行技術として本発明で利用可能であることを承認すべきではない。"