"内因性遺伝子中の表2に示す標的部位に結合する非天然存在の亜鉛フィンガー蛋白質を含む単離されたポリペプチド。請求項1に記載の単離されたポリペプチド及び機能性ドメインを含む融合蛋白質。機能性ドメインが活性化ドメイン、リプレッションドメイン又はヌクレアーゼドメインを含む、請求項2に記載の融合蛋白質。機能性ドメインがHLAA、HLAB、HLAC、TAP1、TAP2、タパシン、CTIIA、RFX5、TRAC,又はTRAB遺伝子の1つ以上の発現を調節する、請求項2又は3に記載の融合蛋白質。請求項1~4のいずれか1項に記載の融合蛋白質のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド。請求項1~4のいずれか1項に記載のポリペプチド又は請求項5記載のポリヌクレオチドを含む単離された細胞。細胞が幹細胞、先祖細胞、T細胞、NK細胞、幹細胞の部分分化子孫細胞又は幹細胞の完全分化子孫細胞よりなる群から選択される、請求項6に記載の単離された細胞。細胞におけるHLA又はHLA調節遺伝子1つ以上を不活性化する方法であって、請求項3に記載の融合蛋白質又は請求項5に記載のポリヌクレオチドでHLA又はHLA調節遺伝子を切断し、ここで機能性ドメインはHLA又はHLA調節遺伝子1つ以上が不活性化されるようにヌクレアーゼを含むものであること、を含む、方法。切断がHLA又はHLA調節遺伝子1つ以上の内部に欠失をもたらす、請求項8に記載の方法。対象におけるHLA関連障害を治療する方法であって、a単離された細胞中の内因性HLA又はHLA調節遺伝子を、HLA又はHLA調節遺伝子が不活性化されるように請求項8記載の方法に従って切断すること;及びb対象に細胞を導入し、それによってHLA関連障害を治療又は防止すること、を含む、方法。対象に導入された単離された細胞が更に、細胞のゲノム内への外因性配列の組み込み、追加の1つ以上の遺伝子の不活性化、及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される追加的ゲノム修飾を含む、請求項10に記載の方法。追加のゲノム修飾が外因性配列の組み込みを含み、そして更に、外因性配列が切断されたHLA又はHLA調節遺伝子内に組み込まれる、請求項11に記載の方法。追加のゲノム修飾が外因性配列の組み込みを含み、そして更に外因性配列がポリペプチドである、癌マーカーに対して特異的なキメラ抗原受容体CARをコードする、請求項11又は12記載の方法。追加のゲノム修飾が外因性TCR遺伝子1つ以上の不活性化を含む、請求項11~13のいずれか1項に記載の方法。障害が対宿主性移植片病GVHDである、請求項11~14のいずれか1項に記載の方法。ポリヌクレオチドがmRNA又はDNAである、請求項8~15のいずれか1項に記載の方法。細胞がT細胞又は幹細胞である、請求項16に記載の方法。幹細胞が誘導多能性幹細胞iPSC、ヒト胚性幹細胞hES、間葉性幹細胞MSC又はニューロン幹細胞よりなる群から選択される、請求項17に記載の方法。HLA障害に関するモデル系であって、HLA又はHLA調節遺伝子の1つ以上が、請求項8~18のいずれか1項に記載の方法に従って不活性化される細胞系統又は動物を含む、モデル系。細胞移植片を必要とする患者を治療するための方法であって、請求項13に記載の方法に従って単離された細胞中のHLA又はHLA調節遺伝子の1つ以上を不活性化すること;及び、細胞又は細胞のフラグメントを、それを必要としている患者内に移植すること、を含む、方法。細胞又は細胞フラグメントがT細胞、幹細胞及び血小板よりなる群から選択される、請求項20に記載の方法。HLA遺伝子又はHLAレギュレーターを標的とするための、DNA結合ドメインAcademicPressSanDiego1999及びMETHODSINMOLECULARBIOLOGYVol119ChromatinProtocolsHumanaPressTotowa1999を参照のこと。定義核酸、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドという用語は互換的に使用され、線状又は環状の構造における、そして1本鎖又は2本鎖の形態における、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを指す。本開示の目的のためには、これらの用語は重合体の長さに関して限定的であるとは解釈されない。これらの用語は天然のヌクレオチドの知られている類似体、並びに塩基、糖及び/又はホスフェート部分Nature340245246米国特許5,585,245及びPCTWO9844350を参照のこと。ベクターは遺伝子配列を標的細胞に転移させることができる。典型的には、ベクターコンストラクト、発現ベクター及び遺伝子転移ベクターは目的の遺伝子の発現を指向することができ、そして遺伝子配列を標的細胞に転移することができる任意の核酸を意味する。即ち、この用語はクローニング、及び発現ベヒクル、並びに組み込みベクターを包含する。レポーター遺伝子又はレポーター配列とは好ましくは必ずしも定型的なアッセイにおいてではないが、容易に計測できる蛋白質産物を生産する何れかの配列を指す。適当なレポーター遺伝子は抗生物質耐性NatureBiotechnol20135141Pabo等、AnnRevBiochem70313340Isalan等、NatureBiotechnol19656660Segal等、CurrOpinBiotechnol12632637Choo等、CurrOpinStructBiol10411416米国特許6,453,242;6,534,261;6,599,692;6,503,717;6,689,558;7,030,215;6,794,136;7,067,317;7,262,054;7,070,934;7,361,635;7,253,273;及び米国特許公開番号2005/0064474;2007/0218528;2005/0267061を参照のこと。操作された亜鉛フィンガー結合ドメインは天然に存在する亜鉛フィンガー蛋白質と比較して新規の結合特異性を有することができる。操作方法は合理的設計及び種々の型の選択を包含するがこれらに限定されない。合理的設計は例えばトリプレットNucleicAcidsRes2533793388Dujon等、Gene82115118Perler等、NucleicAcidsRes2211251127JasinTrendsGenet12224228Gimble等、JMolBiol263163180Argast等、JMolBiol280345353及びNewEnglandBiolabscatalogueも参照のこと。更に又、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのDNA結合特異性を、非天然存在の標的部位に結合するように操作できる。例えばChevalier等、MolecCell10895905Epinat等、NucleicAcidsRes3129522962Ashworth等、Nature441656659Paques等、CurrentGeneTherapy74966米国特許公開20070117128号を参照のこと。ある特定の実施形態において、DNA結合ドメインは、HLA遺伝子又はHLA調節遺伝子における標的部位に結合配列特異的な態様においてしてHLAの発現を調節する、操作された亜鉛フィンガー蛋白質である。ZFPは目的の特定のハプロタイプに特異的に結合することができる。米国の集団において発見されたHLAハプロタイプ及び種々の人種によるそれらの頻度の考察に関しては、参照により本明細書に組み込まれるMaiers等、HumanImmunology68779788を参照のこと。更に又、Tap1、Tap2、タパシン、CTFIIA、及びRFX5を包含するがこれらに限定されない機能性HLAレギュレーター遺伝子に結合するZFPを提供する。HLA標的部位は典型的には少なくとも1つの亜鉛フィンガーを包含するが、複数の亜鉛フィンガー例えば2,3,4,5,6つ以上のフィンガーを包含できる。通常は、ZFPは少なくとも3つのフィンガーを包含する。ZFPのある特定のものは4、5又は6つのフィンガーを包含する。3つのフィンガーを包含するZFPは典型的には9又は10ヌクレオチドを包含する標的部位を認識し;4つのフィンガーを包含するZFPは典型的には12~14ヌクレオチドを包含する標的部位を認識し;6つのフィンガーを有するZFPは18~21ヌクレオチドを包含する標的部位を認識することができる。ZFPは又、調節ドメイン1つ以上を含む融合蛋白質であることもでき、そのドメインは転写活性化又は抑制ドメインであることができる。標的化されるZFPの特定の例を表1に開示する。この表の第1の列はZFPに関する内部の参照名称番号であり、表2の列1の同じ名称に対応する。Fはフィンガーを指し、そしてFの後の数はどの亜鉛フィンガーであるかを指している例えばF1はフィンガー1を指す。これらの蛋白質の標的部位に関する配列を表2に開示する。表2は記載の亜鉛フィンガー蛋白質に関する標的配列を示す。ZFP認識ヘリックスが接触する標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示し;非接触ヌクレオチドは小文字で示す。いくつかの実施形態において、DNA結合ドメインは植物病原体XanthomonasBoch等、Science32615091512及びMoscouandBogdanoveScience3261501参照及びRalstoniaHeuer等、AppliedandEnvironmentalMicrobiology7343794384米国特許出願13/068,735及び米国特許公開20110145940参照から誘導したものと同様のTALエフェクターに由来する操作されたドメインである。融合蛋白質本明細書に記載するDNA結合蛋白質例えばZFP又はTALE及び非相同の調節参照核ホルモン受容体例えばTorchia等、CurrOpinCellBiol10373383参照;核因子カッパBのp65サブユニット及びDoyleHuntNeuroreport829372942Liu等、CancerGeneTher5328、又は人工キメラ機能性ドメイン、例えばVP64Beerli等、ProcNatlAcadSciUSA951462333、及びデグロンMolinari等、EMBOJ1864396447を包含する。追加の例となる活性化ドメインはOct1、Oct-2A、Sp1、AP-2及びCTF1Seipel等、EMBOJ1149614968並びにp300、CBP、PCAF、SRC1PvALF、AtHD2A及びERF-2を包含する。例えば、Robyr等、MolEndocrinol14329347Collingwood等、JMolEndocrinol23255275Leo等、Gene245111ManteuffelCymborowskaActaBiochimPol467789McKenna等、JSteroidBiochemMolBiol69312Malik等、TrendsBiochemSci25277283及びLemon等、CurrOpinGenetDev9499504を参照のこと。追加の例となる活性化ドメインは、OsGAI、HALF-1、C1、AP1、ARF-5,-6,-7及び-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP及びTRAB1を包含するがこれらに限定されない。例えばOgawa等、Gene2452129Okanami等、GenesCells18799Goff等、GenesDev5298309Cho等、PlantMolBiol40419429Ulmason等、ProcNatlAcadSciUSA9658445849SprengerHaussels等、PlantJ2218Gong等、PlantMolBiol413344及びHobo等、ProcNatlAcadSciUSA961534815353を参照のこと。当業者には明白であるように、DNA結合ドメインと機能性ドメインとの間の融合蛋白質又はそれをコードする核酸の形成においては、活性化ドメイン又は活性化ドメインと相互作用する分子の何れかが機能性ドメインとして適している。活性化複合体及び/又は活性化活性例えばヒストンアセチル化を標的遺伝子まで動員できる本質的に如何なる分子も、融合蛋白質の活性化ドメインとして有用である。融合分子における機能性ドメインとしての使用に適するインシュレータードメイン、局在化ドメイン及びクロマチンリモデリング蛋白質、例えばISWI含有ドメイン及び/又はメチル結合ドメイン蛋白質は例えば共有米国特許出願2002/0115215及び2003/0082552及び共有WO02/44376に記載されている。例となる抑制ドメインはKRABA/B、KOX、TGF-ベータ-誘導初期遺伝子TIEG、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMTファミリーのメンバー例えばDNMT1、DNMT3A、DNMT3B、Rb及びMeCP2を包含するがこれらに限定されない。例えばBird等、Cell99451454Tyler等、Cell99443446Knoepfler等、Cell99447450及びRobertson等、NatureGenet25338342を参照のこと。追加の例となる抑制ドメインはROM2及びAtHD2Aを包含するがこれらに限定されない。例えばChem等、PlantCell8305321及びWu等、PlantJ221927を参照のこと。融合分子は当該分野で良く知られているクローニング及び生化学的コンジュゲーションの方法により構築される。融合分子はDNA結合ドメイン及び機能性ドメイン例えば転写活性化又は抑制ドメインを含む。融合分子は又、場合により、核局在化シグナル例えばSV40mediumT抗原及びエピトープタグ例えばFLAG及びヘマグルチニンを含む。融合蛋白質及びそれをコードする核酸は翻訳読み枠が融合物の成分間で温存されるように設計される。一方では機能性ドメインのポリペプチド成分又はその機能性フラグメント、そして他方では非蛋白質DNA結合ドメイン例えば抗生物質、インターカレーター、マイナーグルーブバインダー、核酸との間の融合物は当該分野で知られている生化学的コンジュゲーションの方法により構築される。例えばPierceChemicalCompanyCatalogueを参照のこと。マイナーグルーブバインダーとポリペプチドの間の融合物を作成するための方法及び組成物はMapp等、ProcNatlAcadSciUSA9739303935に記載されている。ある特定の実施形態において、亜鉛フィンガー蛋白質により結合される標的部位は細胞クロマチンの接触可能な領域中に存在する。接触可能な領域は例えば共有の国際公開WO01/83732に記載される通り測定できる。標的部位が細胞クロマチンの接触可能な領域中に存在しない場合は1つ以上の接触可能な領域を共有のWO01/83793に記載される通り作成できる。追加の実施形態において、融合分子のDNA結合ドメインは、その標的部位が接触可能な領域にあるか否かに関わらず、細胞クロマチンと結合することができる。例えば、そのようなDNA結合ドメインはリンカーDNA及び/又はヌクレオソームDNAに結合できる。パイオニアDNA結合ドメインのこの型の例は特定のステロイド受容体中、及び、肝細胞核因子3HNF3中に存在する。Cordingley等、Cell48261270Pina等、Cell60719731及びCirillo等、EMBOJ17244254。融合分子は当該分野で知られる通り、製薬上許容しうる担体と共に製剤してよい。例えばRemingtonsPharmaceuticalSciences17thed1985;及び共有のWO00/42219を参照のこと。融合分子の機能性成分/ドメインは、融合分子がそのDNA結合ドメインを介して標的配列に結合すれば、遺伝子の転写に影響できる種々異なる成分の何れかから選択できる。従って、機能性成分は、種々の転写因子ドメイン、例えばアクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー及びサイレンサーを包含することができるがこれらに限定されない。追加の例となる機能性ドメインは例えば共有の米国特許6,534,261及び米国特許出願公開2002/0160940に開示されている。外因性の小分子又はリガンドにより調節される機能性ドメインもまた選択してよい。例えばRheoSwitch商標登録技術を用いてよく、その場合、機能性ドメインは、外部のRheoChemTMリガンドの存在下のみで、その活性な構造を呈する例えばUS20090136465参照。したがって、ZFPは調節可能な機能性ドメインに作動可能に連結して良く、その場合、結果として生じるZFP-TFの活性は外部リガンドにより制御される。ヌクレアーゼある特定の実施形態において、融合蛋白質はDNA結合ドメイン及び切断ヌクレアーゼドメインを含む。したがって、遺伝子修飾はヌクレアーゼ、例えば操作されたヌクレアーゼを用いて活性化できる。操作ヌクレアーゼ技術は天然に存在するDNA結合蛋白質の操作に基づいている。例えばテーラードDNA結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの操作が記載されている。Chames等、NucleicAcidsRes33e178Arnould等、JMolBiol355443458を参照のこと。更に又、ZFPの操作も記載されている。例えば米国特許6,534,261;6,607,882;6,824,978;6,979,539;6,933,113;7,163,824;及び7,013,219を参照のこと。更に又、ZFP及び/又はTALEをヌクレアーゼドメインに融合することによりZFN及びTALENが作成されており、これは、自身の操作されたZFP又はTALEDNA結合ドメインを介して自身の意図する核酸標的を認識し、そしてヌクレアーゼ活性を介してDNA結合部位近傍でDNAが切断されるようにすることができる機能性の実体である。例えばKim等、ProcNatlAcadSciUSA9311561160を参照のこと。より最近では、そのようなヌクレアーゼは種々の生物のゲノムの修飾のために使用されている。例えば米国特許公開20030232410;20050208489;20050026157;20050064474;20060188987;20060063231;及び国際公開WO07/014275を参照のこと。したがって、本明細書に記載する方法及び組成物は広範に適用でき、そして目的の如何なるヌクレアーゼも関与してよい。ヌクレアーゼの非限定的な例はメガヌクレアーゼ、TALEN及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼを包含する。ヌクレアーゼは非相同DNA結合及び切断ドメイン例えば亜鉛フィンガーヌクレアーゼ;非相同切断ドメインを有するメガヌクレアーゼDNA結合ドメインを含み得、又は、天然に存在するヌクレアーゼのDNA結合ドメインを選択された標的部位に結合するように改変してよい例えば同族体結合部位とは異なる部位に結合するように操作されているメガヌクレアーゼ。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼはメガヌクレアーゼホーミングエンドヌクレアーゼである。天然に存在するメガヌクレアーゼは15~40塩基対の切断部位を認識し、一般的には4つのファミリー、即ちLAGLIDADGファミリー、GIY-YIGファミリー、His-Cystボックスファミリー及びHNHファミリーにグループ分けされる。例となるホーミングエンドヌクレアーゼはI-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII及びI-TevIIIを包含する。それらの認識部位は既知である。米国特許5,420,032;米国特許6,833,252;Belfort等、NucleicAcidsRes2533793388Dujon等、Gene82115118Perler等、NucleicAcidsRes2211251127JasinTrendsGenet12224228Gimble等、JMolBiol263163180Argast等、JMolBiol280345353及びNewEnglandBiolabscatalogueを参照のこと。主にLAGLIDADGファミリーに属する天然に存在するメガヌクレアーゼに由来するDNA結合ドメインは、植物、コウボ、ショウジョウバエ、哺乳類細胞及びマウスにおける部位特異的ゲノム修飾を促進するために使用されてきたが、この研究法はメガヌクレアーゼ認識配列を保存している相同遺伝子の修飾Monet等、BiochemBiophysicsResCommon2558893又は認識配列が導入されている操作前ゲノムMolCellBiol148096106Chilton等、PlantPhysiology13395665Puchta等、ProcNatlAcadSciUSA93505560Rong等、GenesDev16156881Gouble等、JGeneMed8616622のいずれかに限定されてきた。従って、医学的又は生物工学的に適切な部位において新規な結合特異性を呈するようにメガヌクレアーゼを操作しようとする試みが行われてきたPorteus等、NatBiotechnol2396773Sussman等、JMolBiol3423141Epinat等、NucleicAcidsRes31295262Chevalier等、MolecCell10895905Epinat等、NucleicAcidsRes3129522962Ashworth等、Nature441656659Paques等、CurrentGeneTherapy74966米国特許公開20070117128;20060206949;20060153826;20060078552;及び20040002092。更に又、天然に存在する又は操作されたメガヌクレアーゼ由来のDNA結合ドメインも又、非相同ヌクレアーゼ例えばFokI由来の切断ドメインに作動可能に連結されている。他の実施形態において、ヌクレアーゼは亜鉛フィンガーヌクレアーゼZFN又はTALEのDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合物TALENである。ZFN及びTALENは選択された遺伝子の標的部位及び切断ドメイン又は切断ハーフドメインに結合するように操作されているDNA結合ドメイン亜鉛フィンガー蛋白質又はTALEDNA結合ドメインを含む。上記詳述した通り、亜鉛フィンガー結合ドメイン及びTALEDNA結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作されることができる。例えばBeerli等、NatureBiotechnol20135141Pabo等、AnnRevBiochem70313340Isalan等、NatureBiotechnol19656660Segal等、CurrOpinBiotechnol12632637Choo等、CurrOpinStructBiol10411416を参照のこと。操作された亜鉛フィンガー結合ドメイン又はTALE蛋白質は天然に存在する蛋白質と比較して新しい結合特異性を有することができる。操作方法は合理的設計及び種々の型の選択を包含するがこれらに限定されない。合理的設計は例えばトリプレットNucleicAcidsRes2533793388を参照のこと。DNAを切断する追加的酵素も知られている例えばS1ヌクレアーゼ大豆ヌクレアーゼ;膵臓DNaseI;マイクロコッカスヌクレアーゼ;コウボHOエンドヌクレアーゼ;同様にLinn等、NucleasesColdSpringHarborLaboratoryPress1993も参照のこと。これらの酵素又はその機能性フラグメントの1つ以上を切断ドメイン及び切断ハーフドメインの原料として使用できる。同様に、切断活性のためには2量体化を必要とする上記の様な何れのヌクレアーゼ又はその部分からも、切断ハーフドメインを誘導することができる。一般的に、融合蛋白質が切断ハーフドメインを含む場合には、2つの融合蛋白質が切断のために必要になる。或いは、2つの切断ハーフドメインを含む単一の蛋白質を使用できる。2つの切断ハーフドメインを同じエンドヌクレアーゼ又はその機能性フラグメントから誘導することができ、又は、各切断ハーフドメインを異なるエンドヌクレアーゼ又はその機能性フラグメントから誘導できる。更に又、2つの融合蛋白質に関する標的部位は、2つの融合蛋白質のそれらのそれぞれの標的部位への結合が、切断ハーフドメインが例えば2量体化により機能性切断ドメインを形成できるようになる空間的方向に切断ハーフドメインを配するように、相互に対して好ましく配置される。したがって、ある特定の実施形態において、標的部位の近接端部は5~8ヌクレオチドにより、又は15~18ヌクレオチドにより隔てられている。しかしながら、何れかの整数個数のヌクレオチド又はヌクレオチド対が2つの標的部位の間に介在することができる例えば2~50ヌクレオチド対以上。一般的に切断部位は標的部位の間に存在する。制限エンドヌクレアーゼ制限酵素は多くの種に存在し、DNAに配列特異的に結合認識部位においてすること、及び結合部位又はその近傍においてDNAを切断することができる。ある特定の制限酵素例えばIIS型は認識部位から除去された部位においてDNAを切断し、そして分離可能な結合と切断のドメインを有する。例えばISS型酵素であるFokIは、1つの鎖上ではその認識部位から9ヌクレオチド、そして他方の上ではその認識部位から13ヌクレオチドにおいて、DNAの2本鎖切断を触媒する。例えば米国特許5,356,802;5,436,150及び5,487,994;並びにLi等、ProcNatlAcadSciUSA8942754279Li等、ProcNatlAcadSciUSA9027642768Kim等、ProcNatlAcadSciUSA91883887Kim等、JBiolChem2693197831982を参照のこと。したがって、1つの実施形態において、融合蛋白質は少なくとも1つのIIS型制限酵素に由来する切断ドメイン又は切断ハーフドメイン及び操作されていてもされていなくてもよい1つ以上の亜鉛フィンガー結合ドメインを含む。切断ドメインが結合ドメインから分離可能である、例となるIIS型制限酵素はFokIである。この特定の酵素は2量体として活性である。Bitinaite等、ProcNatlAcadSciUSA951057010575。従って、本開示の目的のために、開示した融合蛋白質において使用されるFokI酵素の部分が切断ハーフドメインとみなされる。したがって、亜鉛フィンガー-FokI融合物を用いた細胞配列の標的化された2本鎖切断及び/又は標的化された置き換えのためには、各々がFokI切断ハーフドメインを含む2つの融合蛋白質を使用することにより触媒的に活性な切断ドメインを再建することができる。或いは、亜鉛フィンガー結合ドメイン及び2つのFokI切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子も使用できる。亜鉛フィンガー-FokI融合物を用いた標的化された切断及び標的化された配列改変のためのパラメーターは本開示において別途記載する。切断ドメイン又は切断ハーフドメインは切断活性を保持しているか、又は、多量体化例えば2量体化することにより機能性切断ドメインを形成する能力を保持している蛋白質の何れの部分でもあることができる。例となるIIS型の制限酵素は参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開WO07/014275に記載されている。追加の制限酵素もまた、分離可能な結合と切断のドメインを含有し、そしてこれらは本開示の企図するものである。例えばRoberts等、NucleicAcidsRes31418420を参照のこと。ある特定の実施形態において、切断ドメインは、例えば全ての開示が参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開20050064474、20060188987及び20080131962に記載されている通り、ホモ2量体化を最小限にするか防止する操作された切断ハーフドメイン2量体化ドメイン突然変異体とも称する1つ以上を含む。FokIの446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537及び538位のアミノ酸残基は、全てFokI切断ハーフドメインの2量体化に影響するための標的である。強制的にヘテロ2量体を形成する、例となるFokIの操作された切断ハーフドメインは、第1の切断ハーフドメインがFokIの490及び538位のアミノ酸残基における突然変異を包含し、そして第2の切断ハーフドメインがアミノ酸残基486及び499における突然変異を含む対を包含する。したがって、1つの実施形態において、490における突然変異はGluEをLysKで置き換え;538における突然変異はIをLysKで置き換え;486における突然変異はQをGluEで置き換え;そして499における突然変異はIsoIをLysKで置き換える。具体的には、本明細書に記載する操作された切断ハーフドメインは、1つの切断ハーフドメインにおいて490E→K及び538I→Kを突然変異させてE490K:I538Kと標記される操作された切断ハーフドメインを形成することにより、及び、もう1つの切断ハーフドメインにおいては486Q→E及び499I→Lを突然変異させてQ486E:I499Lと標記される操作された切断ハーフドメインを形成することにより調製した。本明細書に記載する操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小限とされるか根絶される強制的ヘテロ2量体突然変異体である。例えば参照により開示全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開2008/0131962を参照のこと。ある特定の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、486,499及び496位野生型FokIに対して付番における突然変異、例えば486位の野生型GlnQ残基をGluE残基で、499位の野生型IsoI残基をLeuL残基で、そして496位の野生型AsnN残基をAspD又はGluE残基それぞれELD及びELEドメインと称するで置き換える突然変異を含む。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、490,538及び537位野生型FokIに対して付番における突然変異、例えば490位の野生型GluE残基をLysK残基で、538位の野生型IsoI残基をLysK残基で、そして537位の野生型HisH残基をLysK残基又はArgR残基それぞれKKK及びKKRドメインと称するで置き換える突然変異を含む。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、490及び537位野生型FokIに対して付番における突然変異、例えば490位の野生型GluE残基をLysK残基で、そして537位の野生型HisH残基をLysK残基又はArgR残基それぞれKIK及びKIRドメインと称するで置き換える突然変異を含む。米国特許出願12/931,660を参照。本明細書に記載する操作された切断ハーフドメインは何れかの適当な方法、例えば米国特許20050064474及び20080131962に記載されるような野生型切断ハーフドメインFokIの部位指向性突然変異誘発により調製できる。或いは、ヌクレアーゼはいわゆるスプリット酵素技術を用いて核酸標的部位においてインビボで組み立ててよい例えば米国特許公開20090068164参照。そのようなスプリット酵素の成分は別個の発現コンストラクト上で発現させてよく、又は、1つのオープンリーディングフレーム中で連結させることができ、その場合、個々の成分は例えば自己切断2Aペプチド又はIRES配列により分離される。成分は個々の亜鉛フィンガー結合ドメイン又はメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってよい。ヌクレアーゼ例えばZFN及び/又はTALENは例えばWO2009/042163及び20090068164に記載の通りコウボ系の染色体系において使用前に活性に関してスクリーニングできる。ヌクレアーゼ発現コンストラクトは当該分野で知られている方法を用いながら容易に設計できる。例えば米国特許公開20030232410;20050208489;20050026157;20050064474;20060188987;20060063231;及び国際公開WO07/014275を参照のこと。ヌクレアーゼの発現は構成プロモーター又は誘導プロモーター、例えばラフィノース及び/又はガラクトースの存在下で活性化脱抑制され、そしてグルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあってよい。送達本明細書に記載する蛋白質例えばZFP、TALE、ZFN及び/又はTALEN、これらをコードするポリヌクレオチド、及び蛋白質及び/又はポリヌクレオチドを含む組成物は例えば蛋白質又はmRNAの注射を包含する何れかの適当な手段により標的細胞に送達してよい。適当な細胞は真核生物及び原核生物の細胞及び/又は細胞系統を包含するがこれらに限定されない。そのような細胞又はそのような細胞から形成される細胞系統の非限定的な例はT-cells、COS、CHO例えばCHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293例えばHEK293-F、HEK293-H、HEK293-T、及びperC6細胞並びに昆虫細胞、例えばSpodopterafugiperdaSf、又はカビ細胞、例えばSaccharomyces、Pichia及びSchizosaccharomycesを包含する。ある特定の実施形態において、細胞系統はCHO-K1、MDCK又はHEK293細胞系統である。適当な細胞は又、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞iPS細胞、造血幹細胞、ニューロン幹細胞及び間葉系幹細胞を包含する。本明細書に記載するDNA結合ドメインを含む蛋白質を送達する方法は例えば全て参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許6,453,242;6,503,717;6,534,261;6,599,692;6,607,882;6,689,558;6,824,978;6,933,113;6,979,539;7,013,219;及び7,163,824に記載されている。本明細書に記載するDNA結合ドメイン及びこのようなDNA結合ドメインを含む融合蛋白質はまた、DNA結合蛋白質1つ以上をコードする配列を含有するベクターを用いて送達してよい。更に又、ドナー核酸もまたこれらのベクターを介して送達してよい。プラスミドベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ポックスウィルスベクター;ヘルペスウィルスベクター及びアデノ関連ウィルスベクターを包含するがこれらに限定されない何れかのベクター系を使用してよい。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許6,534,261;6,607,882;6,824,978;6,933,113;6,979,539;7,013,219;及び7,163,824も参照のこと。更に当然ながら、これらのベクターの何れも1つ以上のDNA結合蛋白質コード配列及び/又はドナー核酸を適宜含んでよい。したがって、本明細書に記載するDNA結合蛋白質1つ以上及び適宜ドナーDNAを細胞内に導入する場合、それらは同じベクター上、又は異なるベクター上に担持されていてよい。多数のベクターを使用する場合、各ベクターは所望に応じて1つ又は多数のDNA結合蛋白質をコードする配列及びドナー核酸を含んでよい。従来のウィルス及び非ウィルス系の遺伝子転移方法を用いて、細胞例えば哺乳類細胞及び標的組織中に操作されたDNA結合蛋白質をコードする核酸を導入し、そして所望によりドナーを同時導入することができる。そのような方法は又、インビトロで細胞にDNA結合蛋白質をコードする核酸を投与するためにも使用できる。ある特定の実施形態において、DNA結合蛋白質をコードする核酸をインビボ又はエクスビボの遺伝子療法用途において投与する。非ウィルスベクター送達系はDNAプラスミド、ネイキッド核酸及びリポソーム又はポロキサマーのような送達ベヒクルと複合体化した核酸を包含する。ウィルスベクター送達系はDNA及びRNAウィルスを包含し、これらは細胞への送達後はエピソーム又は組み込まれたゲノムの何れかを有する。遺伝子療法の操作法の考察に関してはAndersonScience256808813NabelFelgnerTIBTECH11211217MitaniCaskeyTIBTECH11162166DillonTIBTECH11167175MillerNature357455460VanBruntBiotechnology611491154VigneRestorativeNeurologyandNeuroscience83536KremerPerricaudetBritishMedicalBulletin513144Haddada等、CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunologyDoerflerandBohm;及びYu等、GeneTherapy11326を参照のこと。核酸の非ウィルス送達の方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質;核酸コンジュゲート、ネイキッドDNA、人工ビリオン、及びDNAの剤増強取り込みを包含する。例えばSonitron2000システムRich-Marを用いたソノポレーションもまた核酸の送達のために使用できる。追加の例となる核酸送達系はAmaxaBiosystemsCologne、Germany、Maxcyte,Inc.Rockville、Maryland、BTXMolecularDeliverySystemsHolliston、MA及びCopernicusTherapeuticsInc,例えばUS6008336参照により提供されるものを包含する。リポフェクションは例えば米国特許5,049,386、4,946,787及び4,897,355に記載されており、そしてリポフェクション試薬は市販されている例えばTransfectamTM及びLipofectinTM。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適するカチオン性及び中性の脂質はFelgner、WO91/17424、WO91/16024に記載のものを包含する。送達は細胞に対してエクスビボ投与又は標的組織に対してインビボ投与行うことができる。イムノ脂質複合体のような標的化されたリポソームを包含する脂質:核酸複合体の調製は当該分野で良く知られている例えばCrystalScience270404410Blaese等、CancerGeneTher2291297Behr等、BioconjugateChem5382389Remy等、BioconjugateChem5647654Gao等、GeneTherapy2710722Ahmad等、CancerRes5248174820;米国特許4,186,183号、4,217,344号、4,235,871号、4,261,975号、4,485,054号、4,501,728号、4,774,085号、4,837,028号及び4,946,787を参照のこと。送達のさらなる方法はEnGeneIC送達ベヒクルEDV内に送達すべき核酸をパッケージングする使用法を包含する。これらのEDVは、抗体の1つのアームが標的組織に対する特異性を有し、そして他方がEDVに対する特異性を有している二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達される。抗体は標的細胞表面にEDVを運び、そして次にEDVがエンドサイトーシスにより細胞内に持ち込まれる。細胞内に入ると、内容物が放出されるMacDiarmid等、NatureBiotechnologyvol27p643参照。操作されたDNA結合蛋白質をコードする核酸及び所望によりドナーの送達のためのRNA又はDNAウィルスに基づく系の使用は、身体の特定の細胞にウィルスを標的化し、そしてウィルス担持物を核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用している。ウィルスベクターは患者に直接投与されることができインビボ、又は、それらはインビトロで細胞を処理して、修飾された細胞を患者に投与するするために使用されることもできるエクスビボ。DNA結合蛋白質及びドナーの送達のための従来のウィルスに基づく系は、遺伝子転移用の、レトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、アデノ関連、ワクシニア及び単純疱疹ウィルスのベクターを包含するがこれらに限定されない。宿主ゲノム中の組み込みはレトロウィルス、レンチウィルス、及びアデノ関連ウィルスの遺伝子転移方法を用いて可能となり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期間の発現がもたらされる。更に又、高い形質導入効率が多くの種々異なる細胞型及び標的組織において観察されている。レトロウィルスの向性を外来性のエンベロープ蛋白質を取り込むことにより改変し、標的細胞の可能性のある標的集団を拡大させることができる。レンチウィルスベクターは非分裂細胞に形質導入又は感染し、そして典型的には高いウィルス力価をもたらすことができるレトロウィルスベクターである。レトロウィルス遺伝子転移系の選択は標的組織に依存する。レトロウィルスベクターは外来性の配列6~10kbまでのパッケージング容量を有するシス作用の長末端リピートを含む。最小のシス作用LTRが、後に治療遺伝子を標的細胞に組み込んで永久的な導入遺伝子発現をもたらすために使用されるベクターの複製及びパッケージングのために十分である。広範に使用されているレトロウィルスベクターはネズミ白血病ウィルスMuLV、テナガザル白血病ウィルスGaLV、サル免疫不全ウィルスSIV、ヒト免疫不全ウィルスHIV、及びこれらの組み合わせに基づくものを包含する例えばBuchscher等、JVirol6627312739Johann等、JVirol6616351640Sommerfelt等、Virol1765859Wilson等、JVirol6323742378Miller等、JVirol6522202224PCTUS9405700参照。一過性の発現が好ましい用途においては、アデノウィルスに基づく系を使用できる。アデノウィルス系ベクターは多くの細胞型において極めて高い形質導入効率を示すことができ、そして細胞分裂を要しない。そのようなベクターを使用して、高い力価及び高い発現レベルが得られている。このベクターは比較的簡素な系において大量に生産できる。アデノ関連ウィルスAAVベクターもまた例えば、核酸及びペプチドのインビトロの生産において、および、インビボ及びエクスビボの遺伝子療法の操作法のために、標的核酸を有する細胞を形質導入するために使用される例えばWest等、Virology1603847米国特許4,797,368WO9324641KotinHumanGeneTherapy5793801MuzyczkaJClinInvest941351を参照のこと。組み換えAAVベクターの構築は多くの公開文献、例えば米国特許5,173,414Tratschin等、MolCellBiol532513260Tratschin等、MolCellBiol420722081HermonatMuzyczkaPNAS8164666470及びSamulski等、JVirol63038223828に記載されている。少なくとも6種のウィルスベクターの手順が臨床治験において遺伝子転移のために使用可能であり、これらは形質導入剤を形成するためにヘルパー細胞系統に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補が関与する手順を利用している。pLASN及びMFGSは臨床治験において使用されているレトロウィルスベクターの例であるDunbar等、Blood853048305Kohn等、NatMed11017102Malech等、PNAS94221213312138。PA317pLASNは遺伝子療法治験において使用された最初の治療用ベクターであるBlaese等、Science270475480。50以上の形質導入効率がMFG-Sパッケージベクターで観察されているEllem等、ImmunolImmunother441020Dranoff等、HumGeneTher11112。組み換えアデノ関連ウィルスベクターrAAVは欠損性及び非病原性のパルボウィルスアデノ関連2型ウィルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターは導入遺伝子発現カセットに隣接するAAV145bp逆位末端リピートのみを保有しているプラスミドから誘導される。形質導入された細胞のゲノム内への組み込みによる効率的な遺伝子転移及び安定な導入遺伝子送達がこのベクター系の重要な特徴であるWagner等、Lancet351911717023Kearns等、GeneTher974855。他のAAV血清型、例えばAAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6,AAV8、AAV9及びAAV10もまた本発明に従って使用できる。複製欠損組み換えアデノウィルスベクターAdは高い力価で生産することができ、そして多くの異なる種類の細胞型に容易に感染する。大部分のアデノウィルスベクターは導入遺伝子がAdE1a、E1b、および/またはE3遺伝子を置き換えるように操作されており;その後、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト293細胞中で複製欠損ベクターを増殖させる。Adベクターは肝臓、腎臓及び筋肉中に検出されるもののような非分裂性の分化した細胞を包含するインビボの組織の多数の方を形質導入することができる。従来のAdベクターは大量の担持容量を有する。臨床治験におけるAdベクターの使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法に関与したSterman等、HumGeneTher710839。臨床治験における遺伝子転移のためのアデノウィルスベクターの使用の追加の例はRosenecker等、Infection241510Sterman等、HumGeneTher9710831089Welsh等、HumGeneTher220518Alvarez等、HumGeneTher5597613Topf等、GeneTher5507513Sterman等、HumGeneTher710831089を包含する。宿主細胞に感染できるウィルス粒子を形成するためにパッケージング細胞を使用する。そのような細胞はアデノウィルスをパッケージする293細胞、及びレトロウィルスをパッケージするψ2細胞又はPA317細胞を包含する。遺伝子療法に使用されるウィルスベクターは通常はウィルス粒子内に核酸ベクターをパッケージするプロデューサー細胞系統により形成される。ベクターは典型的にはパッケージング及びその後の宿主への組み込み適宜のために必要な最小限のウィルス配列を含有し、その他のウィルス配列は発現すべき蛋白質をコードする発現カセットにより置き換えられている。失われたウィルス機能はパッケージング細胞系統によりトランスに供給される。例えば遺伝子療法において使用されるAAVは典型的には、パッケージング及び宿主ゲノム内への組み込みのために必要なAAVゲノム由来の逆位末端リピートITRを保有するのみである。ウィルスDNAは、他のAAV遺伝子、即ちrep及びcapをコードするヘルパープラスミドを含有するがITR配列を欠いている細胞系統中にパッケージされる。細胞系統は又ヘルパーとしてのアデノウィルスによっても感染される。ヘルパーウィルスはAAVベクターの複製及びヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはITR配列を欠いているために意味のある量ではパッケージされない。アデノウィルスの夾雑は例えばAAVよりもアデノウィルスがより感受性である熱処理により低減できる。多くの遺伝子療法用途において、遺伝子療法ベクターは特定の組織型に対して高度な特異性を持って送達されることが望ましい。従って、ウィルスベクターはウィルスの外表面上のウィルス皮膜蛋白質との融合蛋白質としてリガンドを発現することにより所与の細胞型に対する特異性を有するように修飾できる。リガンドは目的の細胞型の上に存在することがわかっている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えばHan等、ProcNatlAcadSciUSA9297479751は、モロニーネズミ白血病ウィルスはgp70に融合したヒトヘレグリンを発現するように修飾でき、そして組み換えウィルスは、ヒト表皮成長因子受容体を発現している特定のヒト乳癌細胞に感染すると報告している。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、そしてウィルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合蛋白質を発現する他のウィルス-標的細胞の対にも拡張することができる。例えば、実質的に如何なる選択された細胞受容体に対しても特異的結合親和性を有する抗体フラグメント例えばFAB又はFvをディスプレイするように糸状ファージを操作することができる。上記は主にウィルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウィルスベクターに対しても適用できる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みに好都合である特異的取り込み配列を含有するように操作されることができる。遺伝子療法ベクターは典型的には、後述するとおり、全身投与例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、又は頭蓋内の注入又は局所適用による個別の患者への投与によりインビボで送達できる。或いは、ベクターは個別患者から体外移植された細胞例えばリンパ球、骨髄吸引物、組織生検物、又は、ユニバーサルドナーの造血幹細胞のようなエクスビボの細胞に送達することができ、その後、通常はベクターを組み込んだ細胞を選択した後に、患者内に細胞を再移植する。診断、研究、移植又は遺伝子療法のためのエクスビボの細胞トランスフェクション例えば宿主生物内へのトランスフェクトされた細胞の再注入を介するは当該分野で良く知られている。好ましい実施形態においては、細胞を対象生物から単離し、DNA結合蛋白質核酸遺伝子又はcDNAでトランスフェクトし、そして対象生物例えば患者内に再注入により戻す。エクスビボトランスフェクションに適する種々の細胞型は当該分野で良く知られいる患者由来の細胞をどのように単離して培養するかに関する考察については例えばFreshney等、CultureofAnimalCellsAManualofBasicTechnique及びその引用文献を参照。1つの実施形態においては、細胞トランスフェクション及び遺伝子療法のためのエクスビボの操作法において幹細胞を使用する。幹細胞を使用することの利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化することができる、又は、それらが哺乳類例えば細胞のドナー内に導入され、そこでそれらが骨髄中に定着することになることである。GM-CSF、IFN-γ及びTNF-αのようなサイトカインを用いた臨床上重要な免疫細胞型にインビトロのCD34細胞を分化させるための方法は知られている例えばInaba等、JExpMed17616931702参照。幹細胞は知られた方法を用いて形質導入及び分化のために単離できる。例えば幹細胞はCD4及びCD8T細胞、CD45panB細胞、GR-1顆粒球、及びIad分化した抗原提示細胞のような望ましくない細胞に結合する抗体を用いて骨髄細胞をパニングすることにより骨髄細胞から単離されるInaba等、JExpMed17616931702参照。修飾されている幹細胞もまたいくつかの実施形態において使用され得る。例えば、アポトーシスに対して耐性とされているニューロン幹細胞を治療用組成物として使用してよく、その場合、幹細胞も本発明のZFPTFを含有している。アポトーシスに対する耐性は例えば、幹細胞においてBAX-又はBAK-特異的ZFNを用いてBAX及び/又はBAKをノックアウトすること米国特許出願12/456,043参照により生じさせるか、又は例えばここでもカスパーゼ-6特異的ZFNを用いてカスパーゼを撹乱させたものであってよい。このような細胞はHLAを調節することがわかっているZFPTFでトランスフェクトすることができる。治療用DNA結合蛋白質又はそのような蛋白質をコードする核酸を含有するベクター例えばレトロウィルス、アデノウィルス、リポソーム等は又、インビボの細胞の形質導入のために生物に直接投与できる。或いは、ネイキッドDNAを投与できる。投与は注射、注入、局所適用及びエレクトロポレーションを包含するがこれらに限定されない血液又は組織細胞との究極的接触に分子を導くために通常使用される経路の何れかによる。そのような核酸を投与する適当な方法は当業者が使用でき、そして良く知られているものであり、そして特定の組成物を投与するために1つより多い経路を使用できるが、特定の経路が別の経路よりも迅速で効果的な反応を可能にする場合が多い。造血幹細胞にDNAを導入するための方法は、例えば米国特許5,928,638に開示されている。造血幹細胞、例えばCD34細胞内への導入遺伝子の導入に適するベクターはアデノウィルス35型を包含する。免疫細胞例えばT細胞内への導入遺伝子の導入に適するベクターは非組み込みレンチウィルスベクターを包含する。例えばOry等、ProcNatlAcadSciUSA931138211388Dull等、JVirol7284638471Zuffery等、JVirol7298739880Follenzi等、NatureGenetics25217222を参照のこと。製薬上許容しうる担体は部分的には投与される特定の組成物により、並びに組成物を投与するために使用される特定の方法により決定される。従って、後述する通り使用可能な医薬組成物の適当な製剤は広範な種類が存在する例えばRemington’sPharmaceuticalSciences17thed1989を参照のこと。上記の通り、開示した方法及び組成物は、原核生物細胞、カビ細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞及びヒト細胞、例えばT細胞及び何れかの型の幹細胞を包含するがこれらに限定されない細胞の何れかの型においても使用できる。蛋白質発現のための適当な細胞系統は当該分野で知られており、COS、CHO例えば、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293例えば、HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T、perC6、昆虫細胞、例えばSpodopterafugiperdaSf、及びカビ細胞、例えばSaccharomyces、Pichia及びSchizosaccharomycesを包含するがこれらに限定されない。これらの細胞系統の子孫、変異体及び誘導体もまた使用できる。用途開示された組成物及び方法はHLA遺伝子及び/又はHLAレギュレーターを調節することが望ましい何れの用途のためにも使用できる。特に、これらの方法及び組成物は、治療及び研究用途を包含するがこれらに限定されないHLA対立遺伝子の調節又は修飾が望ましい場合に使用できる。HLAに関連する疾患及び状態は、特にアジソン病、強直性脊椎炎、ベーチェット病、バーガー病、セリアック病、慢性活動性肝炎、グレーブズ病、若年性慢性関節リューマチ、乾癬、乾癬性関節炎、慢性関節リューマチ、シェーグレン症候群、及び全身エリテマトーデスを包含する。更に又、HLA遺伝子の修飾は目的の細胞の他の遺伝子修飾と組み合わせて有用である場合がある。例えば標的細胞、例えばCTLの、キメラ抗原受容体を用いたCTLの特異性を変化させるための修飾は、大部分の必要患者で使用し得る細胞治療薬を開発するためにエクスビボのHLA修飾と組み合わせてよい。更に又、本発明の物質及び方法は対宿主性移植片病の治療、予防又は改善において使用できる。対宿主性移植片病GVHDは同種異系T細胞例えば骨髄及び/又は血液の輸液を患者に投与する場合の一般的な合併症である。注入された物質中の機能性免疫細胞はレシピエントを外来性と認識し、免疫学的攻撃を仕掛ける。同種異系T細胞におけるHLA及び/又はTCRの発現を調節することにより、対宿主性移植片病の危険性が低減又は排除されるため、薬物として既製のT細胞例えばCD19-特異的T細胞を要時投与できる。方法及び組成物は又、幹細胞内部のHLA対立遺伝子のコピーがHLA特異的又はHLAレギュレーター特異的なZFNを用いて修飾されている幹細胞組成物を包含する。例えば、HLA修飾された造血幹細胞を骨髄剥離後の患者内に導入できる。これらの改変されたHSCは拒絶に起因する移植片の損失を伴うことなく患者の再コロニー化を可能にする。導入された細胞は又、後の療法例えば化学療法耐性の間、伏在する疾患を治療するために役立つ他の改変も有してよい。本発明の方法及び組成物は又、例えば治療薬として使用するためのHLA修飾血小板の開発のためにも有用である。したがって、HLA修飾血小板は血小板減少性の障害、例えば特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病及び薬物誘導性血小板減少性紫斑病例えばヘパリン誘導性血小板減少症を治療するために使用してよい。本発明のHLA修飾血小板で治療してよい他の血小板障害はゴシェ病、再生不良性貧血、オニアライ、胎児母体同種異型免疫性血小板減少症、ヘルプ症候群、癌及びいくつかの化学療法剤の副作用を包含する。HLA修飾血小板は又、外傷患者の緊急救命室状況における既製治療として使用される。本発明の方法及び組成物は異種移植において使用できる。とりわけ、例示に過ぎないが、ブタMHC遺伝子が欠失及び/又はヒトHLA遺伝子で置き換えられているブタの臓器をヒトへの移植に使用することができる。有用な遺伝子突然変異を含有するブタの系統を発生させることができ内因性MHC遺伝子が撹乱するように自身内に注入されているmRNAによりコードされるHLAターゲティングZFNを有していたブタ胚から、又は、自身のHLA遺伝子を良好にターゲティングされている細胞の核を用いたブタ胚内への体細胞核転移により、これらの動物を最終的臓器採取のために育成してよい。これはヒトにおけるこれらの臓器の拒絶を予防し、そして移植成功の可能性を高めることになる。本発明の方法及び組成物はまた、インビトロ及びインビボのモデル、例えばHLA又は他の障害の研究を可能にするそのような障害の動物モデルの設計及び実施のためにも有用である。実施例1:亜鉛フィンガー蛋白質ヌクレアーゼZFNの設計、構築及び一般の特徴付け本質的にUrnov等、Nature435646651Perez等、NatureBiotechnology26808816に記載の通り、そして米国特許6,534,261に記載の通り、亜鉛フィンガー蛋白質を設計し、そしてプラスミド又はアデノウィルスベクターに取り込んだ。更に又、TRAC及びTRBCに標的化されたZFNに関しては米国特許仮出願61280,863を参照のこと。表1は例となるZFPのDNA結合ドメイン内部の認識ヘリックスを示し、表2はこれらのZFPに関する標的部位を示す。ZFP認識ヘリックスにより接触される標的部位中のヌクレオチドは大文字で示し;非接触ヌクレオチドは小文字で示す。実施例2:HLAクラスI遺伝子に特異的なZFNHLA複合体はゲノムの同じ一般的区域内部に同時局在化する数種のファミリーメンバーを含有する場合が多い。図1はHLAクラスIの主な遺伝子の配置及び染色体6上に観察されるクラスIの遺伝子座の模式図である。HLA遺伝子座に対して指向されたZFNHLAA遺伝子座を標的とするためにZFN対を作成し、いくつかはA2対立遺伝子に対して特異的に作成し、他はA3遺伝子座又は両方を標的とするように作成した。A2及びA3対立遺伝仔に関して、ZFN18889が18881と対になり、そして18889もまた24859と対になるように2つの対を試験した。ZFNの対形成の成功により所望の箇所においてDSBが形成されれば、その部位は非相同末端連結NHEJを用いて頻繁に修復される。このプロセスは頻繁には修復された接合の部位におけるヌクレオチドの少数の挿入又は欠失をもたらし、そのため、接合部周辺のDNAをPCRにより増幅し、そして次にそれぞれのプライマーで増幅された産物を用いて例えば米国特許公開20080015164;20080131962及び20080159996SurveyorTM、Transgenomicに記載の通りCel-Iミスマッチアッセイに付した場合、これらの挿入又は欠失まとめてindelと称するの頻度は、アッセイの産物をゲル電気泳動に付せば計算することができる。したがって、A2/A3特異的対をそれらの標的に対する活性に関してCel-Iアッセイを用いて検査した。示すように細胞をGFP対照又はZFNの対の各々によりトランスフェクトした。DNAはトランスフェクション一日後に細胞から調製し、結果を図2に示す。矢印は、ZFN対を含有する試料のみにおいて切断が観察され、GFPに対して特異的なZFNで細胞をトランスフェクトした対照試料では観察されなかったことを示している。遺伝子修飾率を各レーン下部に示す。HEK293細胞内にZFNをコードするプラスミドをトランスフェクトした場合、18889/18881対は約3の遺伝子修飾を示したのに対し、18889/24859対はHLAA2遺伝子に対して約6のNHEJを示した。A3対立遺伝子に関しては、18889/18881対は9を示し、そして18889/24859対は10NHEJ活性を示した。これらの対はA2及びA3対立遺伝子の両方を切断することができるため、A2/A3ダブルノックアウト細胞系統を形成することが可能である。細胞表面上のHLAAマーカーの存在を標準的なFACS分析により分析した。要するに、A2、A3又はA2、A3が撹乱されるHEK293細胞は染色された。HLA-A2染色は抗HLA-A2PEBDBioSciences、クローンBB7.2により実施した。マウスIgG2bkPEBDBioSciencesをアイソタイプ対照のために使用した。HLA-A3に関しては、本発明者等は先ずこれらの細胞をビオチニル化抗HLA-A3AbAbcam、クローン4i53で、次にSA-PEBDで染色した。各実験の陰性対照は、HLA-A3Ab非存在でのHLA-A2-igG2bKPE、HLA-A3-SA-PE染色とした。これらの実験において、全試料で一定である黒線として図中に結果を示した上記アイソタイプ対照抗体を用いて陽性対照を実施した。次に48時間IFNガンマ600IU/mLTNF10mg/mLを添加することにより培養物のHLA発現を刺激するか、又は刺激非存在下に使用した。図3に示す通り、アイソタイプ対照ピークに最も近い線は刺激を欠く試料であり、シフトしたピークはIFNγ及びTNFの存在下のものである図の凡例参照。左側のコラムの図のセットは全て、抗HLAA2抗体でプローブし、右側コラムのものは抗HLAA3抗体でプローブされている。示すとおり、示されているHLAマーカーは相当するHLA遺伝子が機能的に撹乱されている場合にはもはや検出不可能である。次に、HLAAノックアウトHEK293細胞系統を分析することにより、それらがHLA-A制限CTL細胞系統により溶解できるか調べた。これらの実験のための方法は以下の通りである。標的細胞を2時間0.1mCiの51Crで標識した。10FBS添加氷冷RPMI1640で3回洗浄した後、標識細胞を希釈し、そして96穴のv底プレート中ウェル当たり1x103標的細胞/100μLで分注した。ペプチドの10倍連続希釈物と共に室温で30分間インキュベートした後、示すエフェクター標的比でCTLを添加した。37°Cの5CO2インキュベーターで4時間インキュベートした後、50μLの上澄みを収集し、TopCountPerkinElmer上で計数した。全てのアッセイを3連で実施した。親HEK293細胞系統及びHLAノックダウンHEK293クローンに、アッセイ前48時間、600IU/mLのインターフェロン-γIFN-γ;RDsystems商標登録及び10ng/mLの組織壊死因子-αTNF-α;RDsystems商標登録を投与した。特異的溶解率を以下の通り計算した:実験cpm-自発的cpm/最大cpm-自発的cpm×100。これらの例においては、ペプチド抗原標的を添加することにより、何れかの機能性のHLAクラスI複合体によるディスプレイを行い、そして機能性のHLAA-ペプチド複合体の存在下においては、CTLクローンは細胞を攻撃して溶解を誘発することができる。図4に示す通り、A2又はA3HLAマーカーを欠失しているHEK293クローンは、それらの同族体ペプチド抗原の存在下で、7A7PANE1/A3CTLクローンパネルA又はGAS2B3-5C19ORF48/A2CTLクローンパネルBの何れかにより誘導される溶解に対して耐性であった。ZFN媒介HLAノックアウトを一次T細胞において反復した。18889KKRFokI変異体含有及び24859ELDFokI変異体含有ZFNをコードするmRNAを以下の通りホモ接合のHLAA2遺伝子型の一次T細胞内にヌクレオフェクトした。製造元Lonzaにより供給された100μL中反応当たり各mRNA2.5~10μgを用い、ZFNコードmRNAでAmaxaNucleofector商標登録システムプログラムT20を使用して、5x106の一次T細胞標準的方法により単離をヌクレオフェクトした。これらの細胞を次にFACS分析することにより、HLAA2マーカーが細胞表面上に存在するかどうか、標準的方法により分析した。図5に示す通り、HLA-A発現を欠失している細胞のパーセントはこの投与の後に約19~42の範囲となった。図5Aは標準的投与条件下のHLA-A2欠失細胞のパーセントを示し、図5Bは一過性コールドショック投与条件を用いたHLA-A2欠失細胞のパーセントを示す共有米国特許出願12/800,599参照。更に又、本発明者等はHLA-A2発現の消失は、HLA-A2遺伝子のZFN媒介修飾により誘発されたことを、前述のCel-I分析により確認した。図6はCel-Iのデータを示しており、ここではZFN標的部位で決定されたパーセントNHEJ活性は3~28の範囲であった。この図において、wtは野生型FokIドメインを指し、mutは上記のEL/KKFokI突然変異体対を指す。これらのデータは、本発明の方法及び組成物を、HLAA発現を欠失させ、そしてHLAAヌル細胞系統及び一次T細胞を作成するために使用できることを明らかにしている。HLAAノックアウト細胞を富化することにより存在するHLAAヌル細胞の比率を上昇させることができる。細胞の低比率がHLAAヌルであるZFNにより処理したT細胞の集団を、フィコエリスリンPEをタグ付け下抗HLA-A2抗体BDBioSciencesクローン7.2で処理した。次に抗PE抗体Miltenyiをタグ付けしたビーズを用いて、製造元の指示に従ってHLA-A2を発現する細胞に結合させ、これによりHLA-A2ヌル細胞から分離した。この手法を用いると、細胞集団は、FACS分析でアッセイした場合に、5.1~34HLAAヌル細胞の範囲から92~95HLAA2ヌルの範囲となった。HLAB及びC遺伝子座に指向されたZFNHLAB及びCの遺伝子座を標的とするためにZFNを構築し、そして上記の通りCel-Iアッセイを用いて試験した。図7に示す通り、これらのZFNはこれらの遺伝子の両方の内部において遺伝子修飾を良好に誘導することができたZFN25588/25589を用いたHLACノックアウトはパネルAに示し、パネルBのHLABノックアウトはZFN対25316/25317を用いて作成した。これらの標的は遺伝子配列の内部に所在し、そのため、HLAB及びHLACノックアウトクローンを作成するために使用できる。MHCクラスI複合体の大型欠失ZFNはまた、HLAB及びHLAC遺伝子を同時に欠失させるHLAクラスI遺伝子座による大型欠失を可能にするように設計した。ZFNのこれらのセットは、HLAB遺伝子の上流HLAB-up及びHLAC遺伝子の下流HLAC-downを切断するように設計した。これらのZFN対は、NHEJ活性によりアッセイした場合の切断の程度を調べるために、上記の通りCel-Iアッセイを用いて個別に試験した。図8AはwtFokIドメインwt及びEL/KKFokIドメインmutの両方について、対15296/15298に関するHLAC-downの結果を示す。図8BはK562細胞におけるHLAB-up対15267/15265及び17454/17456に関する同様のセットのデータを示す。遺伝子修飾率をレーン下部に示すNHEJ。これらのZFNを次に使用して、ZFN、これらの2つのセットの組み合わせによりHLAB及びHLAC遺伝子を欠失させることができるかどうかを試験した。図9は使用したアッセイのダイアグラムを示しパネルA、そして又、PCRの結果を示すパネルB。K562細胞を2つのセットのZFNでトランスフェクトし、そして示すようにトランスフェクション後3~10日に細胞からDNAを単離した。図9Aに示す通りHLA-B及びHLA-Cの間の領域に隣接するするプライマーを用いてPCRを実施した。良好な二重欠失により大量のDNA約100Kbが欠失するはずであるため、PCR反応は欠失が生じている場合にのみ成功することとなる。図9Bは2つのZFN対で処理した後のPCR反応によるゲルを示す。ゲルの左側はゲルの右側に存在する欠失PCR産物の量の大まかな定量のために使用するプラスミドの連続希釈物を示す。この図において、wtは野生型のFokIドメインを指し、mutはEL/KKFokI突然変異体対を指す。結果は存在するDNAの約5が欠失を含有していたことを示している。この実験から誘導されたクローンを、クラスI複合体全体、及び特にHLAB及びCの遺伝子に特定して発現を観察するために、FACS分析に付した。これはクラスIの発現を分析するためには抗クラスI抗体を、そしてHLABCを分析するためには抗HLABC抗体を用いて上記の通り実施した。結果によれば、親K562細胞系統においては、細胞の9.02が全般的にクラスI複合体を発現しており、そして細胞の15.98がHLAB及びCを発現していた。1つのノックアウト系統においては、クラスI発現レベルは3.88であり、そしてHLABC発現は7.82であった。この系統はHLABC対立遺伝子の両方に関してノックアウトを含有しているのではない可能性が高く、従って、発現が消失するのではなく単に減少するということは意外ではない。実施例3:HLAクラスIレギュレーター遺伝子に特異的なZFNクラスIHLA遺伝子に特異的なZFNの作用を検討することに加えて、本発明者等は、可能性のあるクラスIレギュレーター、即ちTAP1、TAP2及びタパシンに指向したZFNの作用も試験した。これらの遺伝子標的に対してZFNを作成し、そしてそれらの設計の詳細を表1及び2に示す。ZFNをHEK293細胞にトランスフェクトし、そして上記のCel-Iアッセイにより遺伝子修飾活性に関して試験した。図10及び11に示す通り、ZFN対はそれらの標的を修飾した、図10Aはデータが約39の遺伝子修飾活性を示しているTAP1に特異的なZFN対28386/28385の結果を示す。図10BはZFN対28394/28393が約49の効率でTap2を修飾することを示している。図11はタパシン遺伝子に対して特異的なZFN対28406/28405及び対28404/28403に関する同様の結果を示しており、ここではデータはそれぞれ約34及び64の遺伝子修飾を示している。実施例4:HLAクラスII遺伝子に対して特異的なZFNクラスI遺伝子に関して上の実施例2で記載した通り、クラスII遺伝子クラスターにおいても大型欠失を作成した。それぞれDBP2遺伝子の上流15872及び15873及びDRA遺伝子の下流15909及び15910の標的DNAを切断する2つのZFN対を特定した。各対を上記の通りK562細胞におけるCel-I分析により分析した。図12に示すCel-I分析によれば、15872/15873対に関しては、野生型wtFokIドメインを含有するZFNバージョンを用いた場合に13のNHEJが観察されたのに対し、前述の通りEL/KKFokI対mutを用いて対を作成した場合にはNHEJ活性は約28であった。15909/15910対に関しては、野生型wtFokIドメインを含有するZFNを用いた場合に6及び11NHEJ活性が観察されたのに対し、EL/KKFokIドメイン対mutの場合は14のNHEJ活性が観察された。2つのZFN対を共に用いながらDBP2及びDRAの間のDNAのセクションを欠失させ、そして次に上の実施例2において記載した通り欠失に隣接するプライマーによるPCRを実施した。PCR産物を分析し、連続希釈物と比較することにより存在する欠失のパーセントを推定した。図13に示す通り、存在する対立遺伝子の約0.04が欠失の証拠を示していた。接合セクションに渡る接合を配列決定し、そして結果を図14に示す。6行はDPB2の上流のZFN15873の標的部位におけるゲノム参照配列を示すZFN結合部位そのものは下線。5行はDRAの下流のZFN15909の結合部位付近のゲノム参照配列を示すZFN結合部位そのものは下線。1~4行は上記のPCR産物の4つの別個のサブクローンの配列を示し、両方の標的配列が存在することを明らかにしており、欠失後にZFN切断部位において2末端が接合していることを示している。7行は欠失産物のコンセンサスを示す。これらの結果は、HLAクラスII複合体の部分を欠失させるために大型欠失約700Kbを生じさせることができることを示している。実施例5:HLAクラスIIレギュレーター遺伝子に対して特異的なZFN前述の通り、クラスII複合体はマスター調節分子CIITAにより調節されると考えられる。したがって、CIITA遺伝子を撹乱又は操作した場合、全体としてHLAクラスII発現を撹乱又は改変する可能性があり得る。したがって、CIITA遺伝子を標的とするようにZFN対を作成した。更に又、RFX5遺伝子産物はクラスIIエンハンスソームの部分であると考えられ、そのため、この遺伝子の撹乱もまたHLAクラスII発現を撹乱又は改変し得る。従って、この遺伝子を標的とするZFN対も作成して試験した。ZFNの両方のセットをK562細胞において上記の通りCel-Iアッセイを用いて試験した。図15に示す通り、Cel-Iミスマッチアッセイの結果は、CIITAを標的とするZFN対が対立遺伝子の約15において遺伝子修飾を誘発することができ、RFX5を標的とするZFN対は対立遺伝子の約2において遺伝子修飾を誘発したことを示している。対照反応はDNA無添加の擬似トランスフェクション及びGFP発現プラスミドを用いたトランスフェクションを包含する。次に、CIITAターゲティングZFN対をRAJI細胞内へのトランスフェクションにより試験した。これらの細胞はHLAクラスIIを発現することがわかっているリンパ芽球様細胞系統である。図16に示したゲルはK562細胞とRAJI細胞のCel-I活性を対比させたものである。KはK562細胞における結果を示し、RはRAJI細胞における結果を示す。n.c.はトランスフェクション中に如何なるZFNも添加しなかった細胞における陰性対照を示す。結果によれば、K562細胞においては約12~15の遺伝子修飾活性が観察され、そしてRAJI細胞においては約1であり、RAJI細胞におけるトランスフェクション効率が乏しいことを反映していると考えられた。実施例6:別の一般的に修飾と組み合わせたHLAノックアウト細胞の使用CD19マーカーは全てのB細胞悪性疾患の95上で発現される細胞表面マーカーである。これは造血幹細胞上やB直系外の正常組織上では発現されず、B細胞から成熟プラズマ細胞への分化時に消失する。したがって、CD19はB細胞リンパ腫及びB-ALL細胞の治療のための標的化免疫療法のための興味深い標的となっている。CD19に特異的なキメラ抗原受容体CARを含有するT細胞が、トランスポゾン支援ゲノム挿入を介して作成されているDavies等、CancerRes70391524参照。HLAマーカーの欠失は、そのような細胞療法製品を、マッチしたHLAハプロタイプを有する者のみではなく多くの患者のために使用可能とする。したがって、実施例2において上記の通りCAR-19修飾T細胞をHLAA特異的ZFNで処理した。次に細胞を上記の通りFACS分析により分析した。図17に示す通り、陰性アイソタイプ対照抗体マウス抗IgG2BDBioScienceを用いた細胞の分析によれば、HLA-A2上記発現に関しては0.3の陰性非特異的結合シグナルが観察された。擬似トランスフェクト細胞をHLA-A2抗体を用いて分析した場合mRNA非存在、細胞の1.6がHLA-A2を発現しなかった。ZFN処理したT細胞のバルク集団が、細胞の17.6がHLA-A2ヌルであることを示していたが、上の実施例2に記載のHLA-A2非発現体に関して富化した後は、細胞の95.3が図17においてHLA-A2ヌル富化をHLA-A.ZFNバルクと比較であった。次にHLA-A2ヌルT細胞をHLA-A2特異的CTLで処理した。図18に示す通り、HLA-A2ヌルであった細胞はCTLによる溶解に対して耐性であった。これらの実験は前述したとおり実施した。使用したCTLは前述の通りGAS2B3-5C19ORF48/A2細胞CIPPDSLLFPAエピトープであり実施例2参照、そして、HLA-A2に対して特異的なものである。これらのデータによれば、ZFP媒介HLAノックアウトは別の有用な遺伝子修飾を担持している細胞においてもたらすことができ、そしてそのため、これらの治療薬の広範な使用を可能にする。実施例7:TCRノックアウト上の実施例6において記載のCAR-19修飾T細胞の使用は、内因性TCRαβ発現のため、同種異系の状況においては妨害される可能性があり得る。したがって、TCRα又はTCRβ定常領鎖の何れかを撹乱するように設計されたZFN試薬を一次T細胞において試験した。ZFN対25539/25540をTCRαノックアウトのために使用し、そしてZFN対16783/16787をTCRβノックアウトのために使用した。これらの実験において、百万個の一次T細胞を上記の通りZFNコードmRNAを用いてAmaxa系を用いたヌクレオフェクションに付した。次に細胞をFACS及びCel-I分析の両方に付した。図19に示す通り、CD3発現を欠失する細胞は、ヌクレオフェクトTCRZFNmRNAの非存在下の2.4から10μgTCRβ特異的ZFNmRNAの存在下では9.4まで増大する。10μgのTCRα特異的ZFNmRNAの存在下では、CD3陰性細胞のパーセントは28.1まで上昇する。FACSデータは、TRCβデータを上部TRBCターゲティングZFN、そしてTCRαデータを下部TRACターゲティングZFNとして示す。TCRα又はTCRβ鎖の何れかの発現の欠失を、細胞表面上の安定な提示のためには機能性TCRが必要になるCD3複合体の存在によりアッセイする。図20は一過性の低温又は標準的条件下にインキュベートした試料に対して上記の通り実施したCel-I分析の結果と共にゲルを示しており、遺伝子修飾活性パーセントデータ各レーンの下部に示すは、37°Cでインキュベートした細胞に対して実施したFACS分析と概ね合致している。本明細書において言及した全ての特許、特許出願及び公開は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。開示は理解の明確化を目的として説明及び例示により幾分詳細に提示したが、当業者の知る通り、開示の精神又は範囲から外れることなく種々の変化及び変更を行うことができる。従って、上記説明及び例は限定的と捉えてはならない。"