"移植可能デバイスであって、大表面を有する生体物質で構成される実質的に平坦な足場と、前記生体物質の前記表面に付着されて、多層の島細胞を形成する個々の島細胞または小型島細胞クラスターであって、前記個々の島細胞または小型島細胞クラスターは、成体無傷島に由来し、前記小型島細胞クラスターが125μm未満の直径を有する、個々の島細胞または小型島細胞クラスターと、を含む移植可能デバイス。植込可能デバイスの生成方法であって、膵臓から無傷島を得ることと、前記無傷島から個々の島細胞または小型島細胞クラスターを取り出すことと、多層の前記個々の島細胞および小型島細胞クラスターを実質的に平坦な植込可能生体物質足場の大表面に付着することと、を包含する方法。細胞を培養するための表面であって、実質的に平坦な上面を含む支持体を含み、前記表面は、複数のディボットを含み、各ディボットは、内部底面および内部側壁面を含み、底面は、丸みを帯ており、各ディボットは、直径100~200μm±20、深さ50~150μm±20であり、細胞は個々のディボット中に分布される、表面。請求項3記載の表面を含む細胞を培養するためのデバイスであって、前記平坦表面を保持するための系をさらに含み、前記系が底面および内部側壁面および内部容積を形成し、前記底および側壁が実質的に液密性であり、細胞および培地が内部容積中に分布される、デバイス。前記細胞が島細胞である請求項3記載のデバイス。前記細胞が非島細胞である請求項3記載のデバイス。前記ディボットが直径100μm±20および深さ60μm±20である請求項3記載のデバイス。前記平坦面がガラス製である請求項3記載の方法。前記平坦面が生体適合性物質であり、ヒト患者における植込みに適している請求項3記載のデバイス。滅菌性である請求項3記載のデバイス。細胞の培養方法であって、複数のディボットを含む表面に細胞を導入すること、を含み、各ディボットは、直径100~200μm±20および深さ50~150μm±20であり、前記デバイスを細胞培養条件に曝露する、方法。前記細胞が島細胞であり、そしてデバイスおよび支持培養条件に曝露後に、前記細胞が小型島に再凝集する請求項11記載の方法。前記細胞が約20~150細胞/1ディボットの速度でディボット中に沈下する請求項11記載の方法。前記細胞が島培養から分散され、化学物質または生物学的分子が結果的に生じる小型島中に組入れられる請求項11記載の方法。前記細胞が非島細胞である請求項11記載の方法。前記ディボットが直径100μm±20および深さ60μm±20である請求項11記載の方法。導入化学物質に対する応答に関して複数の細胞試料を試験するための方法であって、a複数のディボットを含むデバイス中で細胞を培養するステップであって、各ディボットは、直径100~200μm±20および深さ50~150μm±20である、細胞を培養するステップと、b各ディボットに試験化学物質を導入するステップと、c試験化学物質に対する細胞の応答を分析するステップと、を包含する方法。島の単離集団であって、すべての島の少なくとも80は、直径90μmより小さく、前記島がネイティブの大型島に比して低い拡散バリアを有し、前記島は、ネイティブの小型および大型島に比して高い細胞生存度を有し、島インスリン産生は、ネイティブ単離島より10倍以上大きいレベルにより特性化される、集団。島の大多数が球形である請求項18記載の集団。前記島が膵臓アルファ細胞、膵臓ベータ細胞および膵臓デルタ細胞である請求項18記載の集団。前記島の少なくとも85が生存可能である請求項18記載の集団。全島の少なくとも80が直径50μm未満である請求項18記載の集団。前記島の少なくとも50が直径37μm未満である請求項18記載の集団。前記島ベータ細胞が、ネイティブ小型島またはネイティブ大型島から単離されるベータ細胞と比較してより多量にインスリンを産生する請求項18記載の集団。前記島がネイティブ大型島に比して低拡散バリアを有する請求項18記載の集団。大型無傷島の建造に際して出くわす拡散バリアを克服するための試みの1つにおいて、移植のためのポリマー微小球上に多層の島細胞を増殖するために、本発明人等により種々の試みがなされた。図1Aに示した微小球は、無傷島のサイズ範囲内であるよう工学処理された。微小球の外面にベータ細胞を付着することにより、拡散バリアのための細胞死はほとんどまたは全く存在しないはずである、ということが理論化された。懸濁液中の非常に高密度の細胞の使用を含めて、微小球への細胞の付着を最適化するために異なる培養環境を用いて、多数の試みがなされた。しかしながら、この方法は、栄養素の媒質を急速に枯渇させて、細胞生存が乏しくなる。他の技法は、微小球上に徐々に滴下されて、細胞と微小球との物理的相互作用を増大するか、あるいは数日間、極微重力小室中で細胞および微小球を同時培養する細胞を包含した。いくつかのベータ細胞はポリマー微小球に付着するが、一方、それらの分布は不均一であり、多層の付着細胞は一貫して達成されなかった図1B。一実施形態では、本発明は、大表面を有する生体物質で構成される実質的に平坦な足場;ならびに生体物質足場の表面に多層で付着される個々の島細胞または小型島細胞クラスターを含む移植可能デバイスに関する。個々の島細胞または小型島細胞クラスターは、好ましくは、成体無傷島に由来する。細胞接着分子例えば、インテグリン、カドヘリン、セレクチンおよび免疫グロブリンは、個々の細胞または小型島細胞クラスターの足場への付着を促すために足場に付着され得る。さらに、1つ以上の血管形成因子、免疫抑制剤例えば、自己免疫抑圧因子、抗生物質、酸化防止剤、抗サイトカインまたは抗内毒素は、足場から制御可能的に放出されて、島細胞および小型島細胞クラスターの生存度を改善し得る。別の態様では、生体物質足場は柔軟性生体物質であり、生体適合性および/または生分解性ポリマー、例えばポリDL-ラクチド-コ-グリコリドPLG、ポリ乳酸PLAまたはポリ乳酸-コ-グリコール酸PLGAで構成され得る。さらに別の態様では、多層は、インスリン産生ベータ細胞および他の島細胞型の組合せを含む。多層は、好ましくは、約1~5細胞の厚みであり、約10~50μmの厚みの多層を形成する。多層は、好ましくは、細胞厚が生体物質足場の表面を横断して1~2細胞以下だけ変化するよう、実質的に均一な厚みを有する。さらに別の態様では、個々の島細胞または小型島細胞クラスターは、酵素消化を用いて、および/またはカルシウム枯渇培地中で培養して、無傷成体島から獲得される。本発明は、移植可能デバイスを形成する方法も提供する。特に、無傷島から個々の島細胞または小型島細胞クラスターを得るための技術が提供される例えば、酵素消化、カルシウム枯渇またはその組合せ。さらに、個々の島細胞および/または小型島細胞クラスターを付着するための方法、例えば細胞の懸濁液から遠心分離すること、ならびに足場表面への付着を改善するための細胞接着分子の使用を含めた方法が提供される。さらに別の態様では、本発明は、糖尿病の治療として本発明の移植可能デバイスを用いる方法を提供する。デバイスを移植するための方法、ならびに糖尿病の治療のための技法が記載される。一実施形態では、本発明は、実質的に平坦な上面を含む支持体を含む細胞を培養するための表面であって、この場合、その表面は複数のディボットを含む。各ディボットは、内部底面および内部側壁面を含む。底面は丸みを帯ており、各ディボットは直径100~200μm±20、深さ50~150μm±20である。別の実施形態では、本発明は、上記表面を含み、平坦表面を保持するための系をさらに含む細胞を培養するためのデバイスである。系は、底面および内部側壁面および内部容積を形成し、底および側壁は実質的に液密性である。当該デバイスが用いられる場合、細胞および培地は内部容積中に分布される。好ましい一実施形態では、細胞は島細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞は、幹細胞、細胞培養株、新たに分散された細胞または初代細胞からなる群から選択される非島細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞は島細胞であり、ディボットは直径100μm±20および深さ60μm±20である。別の実施形態では、本発明は、細胞の培養方法であって、複数のディボットを含む表面に細胞を導入すること各ディボットは、直径100~200μm±20および深さ50~150μm±20である、そして前記デバイスを細胞培養条件に曝露することを包含する方法である。好ましい一実施形態では、細胞は島細胞であり、そしてデバイスおよび支持培養条件に曝露後に、前記細胞は小型島に再凝集する。好ましい一実施形態では、細胞は約20~150細胞/1ディボットの速度でディボット中に沈下する。別の好ましい実施形態では、細胞は島培養から分散され、そして非ネイティブ分子が結果的生じる小型島に工学処理される。別の好ましい実施形態では、非島細胞は、幹細胞、細胞培養株、新たに分散された細胞または初代細胞からなる群から選択される。別の実施形態では、本発明は、導入化学物質に対する応答に関して複数の細胞試料を試験するための方法であって、a複数のディボット各ディボットは、直径100~200μm±20および深さ50~150μm±20であるを含むデバイス中で細胞を培養するステップ、b各ディボットに試験化学物質を導入するステップ、ならびにc試験化学物質に対する細胞の応答を分析するステップを包含する方法である。別の実施形態では、本発明は、すべての島の少なくとも80が直径90μmより小さい島の単離集団であって、この場合、島はネイティブの大型島に比して低い拡散バリアを有する。好ましくは、島は、ネイティブの小型および大型島に比して高い細胞生存度を有し、そして島インスリン産生は、ネイティブ単離島より10倍以上大きいレベルにより特性化される。好ましい一実施形態では、島の大多数は球形である。好ましい一実施形態では、島は、膵臓アルファ細胞、膵臓ベータ細胞および膵臓デルタ細胞を含む。好ましい一実施形態では、島の少なくとも85は生存可能である。好ましい一実施形態では、全島の少なくとも80は直径50μm未満である。好ましい一実施形態では、島の少なくとも50は直径37μm未満である。好ましい一実施形態では、島ベータ細胞は、ネイティブ小型島またはネイティブ大型島から単離されるベータ細胞と比較してより多量にインスリンを産生する。この特許および出願ファイルは、着色して作成された少なくとも1つの図面を含有する。着色図面単数または複数を伴うこの特許または特許出願公告のコピーは、必要手数料の要求および支払い時に、オフィスOfficeにより提供される。A.概要この明細書中で引用される特許出願、特許および出版物はすべて、これらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。矛盾する場合は、本発明の開示定義を含むが優先される。本明細書中で用いる場合、ランゲルハンス島または島という用語は、ホルモンを製造し、分泌する膵臓中の特殊化細胞の一群を指す。島は、一般的に、以下の細胞型のうちの1つ以上を含有する:1血中のグルコース糖のレベルを上昇させるグルカゴンを製造するアルファ細胞;2インスリンを製造するベータ細胞;3身体中の多数の他のホルモンの放出を抑制するソマトスタチンを製造するデルタ細胞;4PP細胞を産生する膵臓ペプチド;5血管作用性腸ペプチドを分泌するD1細胞;あるいは6セレクチン、モチリンおよびサブスタンスPを分泌するEC細胞。本明細書中で用いる場合、島細胞という用語は、島中に見出される細胞のうちのいずれかを指す。本発明で用いられる島細胞は、好ましくは、インスリン産生ベータ細胞と他の島細胞型の組合せである。本明細書中で用いる場合、小型島細胞クラスターまたは島断片という用語は、クラスターでの通常は約25島細胞未満の、一緒に結合される島細胞の集合体を指す。小型島細胞クラスターは、好ましくは、クラスター内の任意の細胞に関する例えば栄養素、酸素、グルコース等に関する拡散バリアが約7細胞以下であるような形態を有する。典型的には、拡散バリアは約5細胞未満であり、4、3または2細胞と低いこともある。小型島細胞クラスターは、好ましくは、優勢細胞型としてベータ細胞を含み、任意に1つ以上の他の島細胞型を含み得る。小型島細胞クラスターは、種々の形状例えば、一般的には球形か、細長いか、そうでなければ非対称形であるを有し得る。小型島細胞クラスターの例は、図5、ならびに6A、6Bおよび6Cに示されている。小型島細胞クラスターは、好ましくは、ドナー膵臓から単離される無傷大型島を分散することにより得られる。本明細書中で用いる場合、ネイティブ島は、動物膵臓由来の島を指す。ネイティブ島は、125μmより大きい、好ましくは150μmより大きい直径を有するネイティブ大型島、あるいは125μ未満の直径を有するネイティブ小型島として特性化され得る。本明細書中で用いる場合、巨大島という用語は、約300μmより大きい直径を有する再凝集島を指す。本明細書中で用いる場合、成体無傷島という用語は、成体哺乳動物膵臓由来のネイティブ大型島またはネイティブ小型島を指し、この場合、島はばらばらに壊されていない。本明細書中で用いる場合、分散化島細胞という用語は、好ましくは、島細胞が懸濁液中に均一に分布されるよう大型島を崩壊することにより得られる細胞の懸濁液を指す。好ましくは、懸濁液中の島細胞の90以上が単一細胞であり、残りは二連一緒に結合された2個の細胞および三連一緒に結合された3個の細胞、ならびに互いに結合された細胞の非常に少数の大型群を含む。本明細書中で用いる場合、再凝集島という用語は、好ましくは、大型島を単一島細胞に壊して、それらの単一島細胞を一緒に群で培養して島を形成することにより得られる、一緒に結合された島細胞の収集物を指す。好ましくは、島への単一島細胞の再凝集は、微小鋳型中のディボットの物理的寸法により影響を及ぼされる。再凝集島を形成するために用いられる個々の島細胞の数は、島生成物の所望のサイズによって決まる。本明細書中で用いる場合、拡散バリアという用語は、高濃度の領域例えば細胞の外側の酸素またはグルコース濃度から低濃度の領域例えば、細胞の内側の酸素またはグルコース濃度への分子移動の抑制を指す。大型島は、酸素に対する相対的に高い拡散バリアを示し、これが、移植に関するそれらの生存度および有用性を制限する。微小鋳型中に再凝集される島はネイティブ大型島に比して小さく、そして相対的に低い拡散バリアを示し、これが、再凝集島内の細胞生存度に寄与する。本明細書中で用いる場合、細胞生存度という用語は、総細胞試料を基礎にして、生きているかまたは死んでいる細胞の量の測定値を指す。高細胞生存度は、本明細書中で定義される場合、全細胞の85より多くが、好ましくは90~95より多くが生存可能である細胞集団を指し、さらに好ましくは、高細胞生存度により特性化される集団は99より多くの生存可能細胞を含有する。本明細書中で用いる場合、例えば、被験体への植込みまたは移植により生物学的流体または組織と接触するようになるよう意図される物質は、生体物質と呼ばれる。生体物質は物質と生理学的環境との間の最小反応を誘導する、というのが望ましい。生理学的環境に置かれた後、最小の炎症反応、アナフィラキシー反応の証拠なし、ならびに生体物質上での最小度の細胞増殖が認められる場合、生体物質は生体適合性であるとみなされる。宿主哺乳動物における植込み時に、生体適合性生体物質はマイクロカプセルの機能に有害な影響を及ぼすのに十分な宿主応答を引き出さない;このような宿主応答としては、生体物質の上または周囲の繊維性構造の形成、生体物質の免疫学的拒絶、あるいは生体物質から周囲宿主組織への毒性または発熱性化合物の放出が挙げられる。本明細書中で用いる場合、蝕刻という用語は、支持体にディボットを作成するために酸を用いる化学的工程を指す。本明細書中で用いる場合、ディボットという用語は、底および側壁からなる支持体中の局在化ウェルまたは小室すなわち、幅および深さを有する窪みをつけた間隙を意味する。一実施形態では、島の再凝集のために、ディボットは直径100μm未満、深さ60μmである。例えば、ディボットは直径80μm、深さ48μmであり得る。再凝集島を所望する他の実施形態では、ディボットは直径80~120μm、深さ48~72μmである。例えば薬剤試験のために小型の腫瘍を増殖させるといったような他の目的に関しては、最適ディボット直径は100~200μm、深さは60~100μmである。本明細書中で用いる場合、ディボット化支持体という用語は、異なる個々のディボットを含有するよう改質されている固体支持体または任意の物質を指す。本明細書中で用いる場合、微小鋳型という用語は、複数のディボットで構成される表面を含有するデバイスを指し、この場合、ディボットは直径100~200μmを示す。微小鋳型中のディボットの物理的パターンは、微小鋳型の製造により具体的に示され得る。微小鋳型は、好ましくは2つの主要部を含む:iディボット化支持体;ならびにiiディボット化支持体を収容し、その中に細胞および培地を含有するための系。微小鋳型は、その中に配置される細胞の増殖または再凝集を導くかまたは決定するために用いられる。本明細書中で用いる場合、鋳型ハウジングという用語は、ディボット化支持体とそこに付加される液体および細胞物質の両方を保持するための構造を指す。本明細書中で用いる場合、ハウジング足場という用語は、微小鋳型の構築中に物質の形態を支持し、影響を及ぼすために用いられる一時的骨組みを指す。本明細書中で用いる場合、スパッタリングという用語は、支持体上に薄い皮膜コーティングを沈着するために用いられる蒸気沈着の方法を意味する。B.多層として付着される島細胞一実施形態では、本発明は、植込みのための生存可能な個々の島細胞または小型島細胞クラスターを産生するための方法に関する。一態様では、非胎仔ドナー膵臓から単離される個々の島細胞または小型島細胞クラスターは、多層で適切な生体物質足場の表面に付着される。一態様では、個々の島細胞、好ましくはベータ細胞は、生体物質足場に付着される。別の態様では、種々の島細胞型の組合せが生体物質足場に付着される。さらに別の態様では、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の細胞で構成される小型島細胞クラスターが生体物質足場に付着される。さらに別の実施形態では、島細胞の1~2、3、4または5層の多層が生体物質足場に付着される。生体物質足場上の島細胞および小型島細胞クラスターは、約10~50μm厚の、最も好ましくは約20~40μm厚の細胞の多層を形成する。一態様では、多層の島細胞は、好ましくは実質的に均一の厚みを有し、したがって生体物質足場の表面を横断する細胞厚の変化は1~2細胞以下だけである。一態様では、個々の島細胞および/または小型島細胞クラスターは、ドナー成体被験体の膵臓から直接単離され、そして無傷島から分離される。島を個々の細胞および/または小型島細胞クラスターに分けるための適切な方法としては、酵素消化および金属ベースの分散カルシウム枯渇またはその組合せが挙げられる。別の態様では、生体物質足場は、足場との適切な個々の島細胞または小型島細胞クラスター接着を提供する物質で構成される。種々の型の物質、例えば無機および有機物質が、本発明の生体物質足場として用いられ得る、と意図される。これらの物質の非限定例としては、多糖、ポリエステル例えば、ポリ乳酸、ポリL-リシン、ポリグリコール酸およびポリ乳酸-コ-グリコール酸、ポリ乳酸-コ-リシン、ポリ乳酸-グラフト-リシン、ポリ無水物例えば、ポリ脂肪酸二量体、ポリフマル酸、ポリセバシン酸、ポリカルボキシフェノキシプロパン、ポリカルボキシフェノキシヘキサン、これらの単量体のコポリマー等、ポリ無水物-コ-イミド、ポリアミド、ポリオルトエステル、ポリイミノカルボネート、ポリウレタン、ポリオルガノホスファゼン、ポリホスフェート、ポリエチレンビニルアセテート、ならびにその他のアシル置換セルロースアセテートおよびその誘導体、ポリカプロラクトン、ポリカルボネート、ポリアミノ酸、ポリアクリレート、ポリアセタル、ポリシアノアクリレート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリビニルイミダゾール、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、コポリマー、ポリスチレン、およびその配合物またはコポリマーが挙げられる。ある好ましい態様では、生体物質としては、多糖、アルギン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロースHPC、NイソプロピルアクリルアミドNIPA、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールPVA、ポリエチレンイミン、キトサンCS、キチン、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸コンドロイチン、ゼラチン等、ならびにそれらの誘導体、コポリマーおよびその混合物が挙げられる。他の適切な生体物質としては、VatsetalScaffoldsandbiomaterialsfortissueengineeringareviewofclinicalapplicationsClinOtolaryngolAlliedSci2816572;WangetalAnencapsulationsystemfortheimmunoisolationofpancreaticisletsNatBiotechnol1535862;OriveetalCellencapsulationpromiseandprogressNatMed91047これらの記載内容は参照により本明細書中で援用されるに記載されたナイロン、ヒアルロナン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルホルムアミド等が挙げられる。好ましい態様では、生体物質足場は生分解性物質で構成される。適切な生分解性生体物質としては、ポリDL-ラクチド-コ-グリコリドPLO、ポリ乳酸PLAまたはポリ乳酸-コ-グリコール酸PLGAが挙げられる。PLGは、薬剤送達に関して十分に研究されており、多数のinvivo用途に関してFDA認可されているBerklandetalFabricationofPLGmicrosphereswithpreciselycontrolledandmonodispersesizedistributionsJControlReleaseMay18735974これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される参照。別の態様では、生体物質足場は、島およびベータ細胞接着を増大するコーティングで、全部または一部が、被覆される。コーティングの例としては、フィブロネクチン、ポリエチレングリコールアセテート、ラミニン、ポリビニルアルコールPVA、ポリエチレン-アルト-マレイン酸PEMA、およびキトサンCSが挙げられる。足場は、足場への個々の細胞付着および/または小型島細胞クラスター付着を助長するためにそれに付着される1つ以上の島細胞接着分子CAMも有し得る。他の用途では、CAMは、組織工学処理のためにポリマーとの細胞付着を助長することが示されているDunehooetalCelladhesionmoleculesfortargeteddrugdeliveryJPharmSci9518561872。細胞接着分子CAMとしては、インテグリン例えば、avb3、avb5、LFA-1、VLA-4、カドヘリン例えば、E-、P-およびN-カドヘリン、セレクチン例えば、E-、L-およびP-セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー例えば、ICAM-1、1CAM-2、VCAM-1およびMadCAM-1、細胞外マトリックスタンパク質例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲン、ラミニンおよびフォンビレブランド因子、線状および環状細胞接着ペプチドおよびRGDペプチド由来のペプチド模倣物、ICAM-1ペプチド、VCAM-1ペプチド、カドヘリンペプチド、およびLFA-1ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。CAMは、組織再生、細胞形態、移動、有糸分裂、細胞質分裂、食作用、ならびに細胞極性の維持のための必須分子である。CAMは、細胞-細胞および細胞は不細胞外マトリックスECM接着のための受容体として作用する細胞表面に見出される糖タンパク質である。細胞接着分子、例えばRGDペプチドは、組織工学処理、組織再生、創傷治癒、再建手術、神経再生、骨移植および臓器移植のプロセスを手助けし得る、ということが従来示されてきた。さらに、E-カドヘリンは、β細胞接着において重要であることが示されているHaugeEvansetalPancreaticbetacelltobetacellinteractionsarerequiredforintegratedresponsestonutrientstimulienhancedCa2andinsulinsecretoryresponsesofMINEpseudoisletsDiabetes4814021408。一態様では、細胞接着分子は、共有結合単数または複数、例えばペプチド、チオエーテル、ジスルフィドまたはエステル結合これらに限定されないを用いてポリマー上に固定される。スペーサー分子は、細胞接着分子とポリマーとの間に付加されて、ポリマー上の接着分子と細胞表面の細胞接着受容体との間の自由相互作用を可能にし得る。RGDペプチドをちりばめられたポリマーに異なる細胞を付着するための試験はポリマー間の最適スペーサーを示し、そしてRGDポリペプチドは、細胞表面受容体によるRGDペプチドの最適認識のためには、約11~46オングストロームである。スペーサーは、ポリエチレングリコールPEGS、ポリアミノ酸例えば、ポリ-Gly、ポリ-Lys、ポリ-Ala、ポリアミノカプロン酸ポリ-Acaおよび2または3つのアミノ酸反復例えば、ポリ-Aca-Glyの組合せから作られ得るが、これらに限定されない。共有結合のほかに、細胞接着分子は、島細胞を付着する前に、ポリマー上のパッチのポリマー網状構造に吸着され得る細胞接着分子を先ず付着することにより例えば、静電的に、疎水的に、または他の非共有的相互作用により、吸着され得る。別の態様では、生体物質足場は、その表面への個々の島細胞または小型島細胞クラスターの付着を助長する形状を有する。足場は、典型的には、例えばパッチまたは机の上のような実質的に平坦な表面を有する。好ましい実施形態では、生体物質足場は実質的に平坦な柔軟性パッチ物質を含む。生体物質足場は、個々の島細胞または小型島細胞クラスターの付着に適したサイズを有する。例えば、一態様では、平坦なパッチは、典型的には、約0.2~3センチメートルのオーダーの寸法を有する。パッチの厚みは、典型的には、約50μm~1センチメートルのオーダーである。さらに別の態様では、生体物質足場は、1つ以上の成長因子、免疫抑制剤、抗生物質、酸化防止剤、抗サイトカイン、抗内毒素、T細胞接着遮断剤、血管新生因子、栄養素またはその組合せを制御可能的に放出し得る。成長因子の例としては、エピレグリン、上皮成長因子EGF、内皮細胞成長因子ECGF、繊維芽細胞成長因子FGF、神経成長因子NGF、白血病抑制因子LIFおよび骨形態形成タンパク質-4BMP-4、肝細胞成長因子HGF、血管内皮細胞成長因子-AVEGF-A、コレシストキニンオクタペプチド、インスリン様成長因子が、そしてインスリンそれ自体でさえ挙げられる一般的には、MiaoetalInvitroandinvivoimprovementofisletsurvivalfollowingtreatmentwithnervegrowthfactorTransplantationFeb278151924;TaetalThedefinedcombinationofgrowthfactorscontrolsgenerationoflongtermreplicatingisletprogenitorlikecellsfromculturesofadultmousepancreasStemCellsMar23;JohannsonIsletendothelialcellsandpancreaticbetacellproliferationstudiesinvitroandduringpregnancyinadultratsEndocrinologyMay147231524EpubJan26;KuntzetalEffectofepiregulinonpancreaticbetacellgrowthandinsulinsecretionGrowthFactorsDec2328593;VasadavaGrowthfactorsandbetacellreplicationIntJBiochemCellBiol3893150EpubAug31Review;KuntzetalCholecystokininoctapeptideapotentialgrowthfactorforpancreaticbetacellsindiabeticratsJOPNov10546475参照。免疫抑制剤の例はよく知られており、ステロイド系または非ステロイド系であり得る。好ましいステロイド系剤は、プレドニソンである。好ましい非ステロイド系剤としては、いわゆるエドモントンプロトコールにおけるものが挙げられる:シロリムスラパムン、WyethAyerstCanada、タクロリムスプログラフ、FujisawaCanadaおよび抗IL2Rダクリズマブ。他の免疫抑制剤としては、15-デオキシスペルグアリン、シクロスポリン、ラパマイシン、ラパムン、FK506またはリソフィリンLSFが挙げられる。本発明の実行のために有用な抗生物質の例としては、アモキシシリン、ペニシリン、サルファ剤、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クラリスロマイシン、シプロフロザシン、テルコナゾール、アジスロマイシン等が挙げられるが、これらに限定されない。種々の酸化防止剤が、当業者に既知である。特に好ましいのは、チオール基を含む分子、例えば還元グルタチオンGSHまたはその前駆体、グルタチオンまたはグルタチオン類似体、グルタチオンモノエステルおよびN-アセチルシステインである。他の適切な酸化防止剤としては、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ビタミンE、トロロックス、リポ酸、ラザロイド、ブチル化ヒドロキシアニソールBHA、ビタミンKなどが挙げられる。グルタチオンは、例えば、約2~約10mMの濃度範囲で用いられ得る例えば米国特許第5,710,172号;第5,696,109号および第5,670,545号参照。適切な抗サイトカインは当該技術分野でよく知られており、例としては、ジメチルチオ尿素約10mM、シチオロン約5mM、プラバスタチンナトリウムPRAVACHOL、約20mg/kg、L-NG-モノメチルアルギニンL-NMMA、2mM、ラクトフェリン約100μg/m1、4-メチルプレドニソロン約20μg/m1等が挙げられる。抗内毒素も当該技術分野で既知であり、例としては、L-NG-モノメチルアルギニンL-NMMA、約2mM、ラクトフェリン約100ug/m1、N-アセチルシステインNAC、約1mM、アデノシン受容体アンタゴニスト、例えばバミフィリンテオフィリンおよび抗リポ多糖化合物、例えばエキノマイシン約10nM等が挙げられる。さらに別の態様では、T細胞接着遮断剤が、島細胞を含有する植込み生体ポリマーに提供されて、免疫反応を抑圧する。これらの遮断剤の付加は、島移植の拒絶を防止する。T細胞接着遮断剤は、臓器移植および自己免疫疾患におけるT細胞活性化および免疫応答を抑圧することが示されているYusufMakagiansaretalinhibitionofLFA1ICAM1andVLA4VCAMIasatherapeuticapproachtoinflammationandautoimmunediseasesMedicinalChemistryReviews22146167AndersonandSiahaanTargeting1CAM1LFA1interactionforcontrollingautoimmunediseasesDesigningpeptideandsmallmoleculeinhibitorsPeptides24487501参照。T細胞接着遮断剤としては、aICAM-1、LFA-1、B7、CD28、CD2およびVLA-4に対するモノクローナル抗体、b可溶性タンパク質およびその断片、例えばICAM-1、VCAM-1、MadCAM-1、cRGDペプチドおよびペプチド模倣物、dVCAM-1ペプチドおよびペプチド模倣物、eICAM-1ペプチドおよびペプチド模倣物、ならびにfLFA-1ペプチドおよびペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65GAD65に由来するペプチド例えば、GAD208-217およびGAD二機能性ペプチド阻害剤GAD-BPIは、免疫寛容を誘導し、そしてT細胞による島浸潤膵島炎を抑圧することが示されている。GAD208-217は、T細胞:APC相互作用中のTCR-MHC-Ag複合体形成シグナル-1を調整することにより、非肥満糖尿病NODマウスにおけるベータ細胞を攻撃するT細胞の活性化を遮断することが示されているTischetalInductionofGAD65specificregulatoryTcellsinhibitsongoingautoimmunediabetesinnonobesediabeticmiceDiabetes47894899。好ましいGAD-BPIは、LFA-1ペプチド配列EIAPVFVLLE-[Ac-G-Ac-G-Ac]-ITDGEATDSGの一部分と連結されたGAD208-217を含み、そしてMurrayetal公開米国特許第2005/0107585表題:Signal1signal2bifunctionalpeptideinhibitorsこの記載内容は参照により本明細書中で援用されるに記述されているように、NODにおけるT細胞活性化および膵島炎を遮断することが示されている。したがって、これらの分子は、島移植片の拒絶を防止するために同時投与され得る。これらの分子は、制御放出機序によっても送達されて、島移植片の拒絶を防止し得る。したがって、当該分子が生体物質足場の内側に閉じ込められた後、ベータ細胞が足場に付着される。このような作用物質の制御放出は、RamanetalModelingsmallmoleculereleasefromPLGmicrosphereseffectsofpolymerdegradationandnonuniformdrugdistributionJControlReleaseMar210314958;BerklandetalPrecisecontrolofPLGmicrospheresizeprovidesenhancedcontrolofdrugreleaserateJControlReleaseJul188213747;SchwendemanRecentadvancesinthestabilizationofproteinsencapsulatedininjectablePLGAdeliverysystemsCritRevTherDrugCarrierSyst197398;SershenetalImplantablepolymericsystemsformodulateddrugdeliveryAdvDrugDelivRev55412251235これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用されるに記述されたプロトコールを用いることにより、実施され得る。C.ディボット化微小鋳型上の島の産生本発明は、生存可能な小型島のinvitro産生のための方法にも関する。一態様では、非胎仔ドナー膵臓から単離された分散化島細胞は、群で、微小鋳型の個々のディボットに配置され、培養されて再凝集島を形成するが、その形状およびサイズはディボット寸法の影響を受ける。微小鋳型のディボットは、小型島の形成に適したサイズを有する。例えば、一態様では、微小鋳型は典型的には直径約30~35mmのオーダーの寸法を有するが、しかしこのサイズは産生方法により限定されるものではなく、30×30cmまで勾配をなし得る。ディボットは、典型的には、直径約100~200μm±20および深さ60~100μm±20のオーダーの寸法を有する。好ましくは、島の産生のために、ディボットは、直径100μm±20および深さ60μm±20である。別の態様では、微小鋳型は、移植またはinvitro試験に適した、最適に造形され、サイズ化された島の集団を生成するために用いられ得る。例えば、一態様では、微小鋳型で生成される島の集団は、50μm以下の平均直径を有する。他の態様では、集団は、少なくとも85の生存可能細胞、好ましくは90または95より多い生存可能細胞により特性化され、さらに好ましくは、集団は99より多い生存可能細胞により特性化される。さらに別の態様では、微小鋳型で生成される島の集団は、高レベルのインスリン分泌により特性化され得る。例えば、微小鋳型中で再凝集される小型島は、根意義部小型島に比してより高いレベルのインスリン分泌、好ましくは20倍より多いインスリン分泌、さらに好ましくは100倍より多いインスリン分泌により特性化される。例えば、再凝集島は、図23で示されている約10ng/IEという分泌が測定された。これは、Crimetal2010からの最良算定値の41倍である。実験室間でインスリン分泌データを比較するに際して難しいことの1つは、多くの研究者が島容積当たりのそのインスリン分泌を報告できない、という点である。Crim等の場合、彼等は50個の島当たりのインスリン分泌を報告したが、しかし島の平均サイズを示さなかった。したがって、その50個の島が各々、1島当量IEという前に明示された島容積と等価であった、と推定し得るだけである。IEで割ることにより、島および細胞の総容積に関して正規化されるインスリン分泌を、われわれの実験室は常に報告している。Crim論文に関してなされる推測によれば、本明細書中に記載される再凝集島は、Crim等が報告した最良条件の40倍を超える高グルコースに応答したインスリンを放出する。本発明の一実施形態では、微小鋳型は、invitro試験ならびに他のinvitro用途のために有用な細胞を作製するために用いられる。その実施形態では、微小鋳型表面は、好ましくは、PDMSから作られる鋳型側面ハウジング系を有するガラス製である。別の実施形態では、微小鋳型は植え込み可能であるよう作製され、生体適合性物質から作られる。その実施形態では、好ましい物質は、前に記載された任意数の生体ポリマーである。別の態様では、微小鋳型ディボットは、非島細胞に最適物理的再形成条件を提供する。種々の型の細胞が本発明のディボット中に形成され得る、ということが意図される。非限定例としては、長いニューロン経路、糸球体様フィルター、血管、置換肺胞等が挙げられる。微小鋳型のような小型の良好に限定された形状の幹細胞または再プログラム化細胞の凝集も、本発明の適切な用途である。好ましい細胞型としては、三次元構造が細胞機能に重要であるものが挙げられる。概して、図24は、本発明の方法を示す模式図である。膵臓または他の島供給源から採取されたネイティブ大型島クラスターは、単一島細胞にばらばらにされて、ディボットを有する微小鋳型上に載せられる。分散細胞とは、大多数典型的には少なくとも90の細胞が単一細胞であり、二連物または三連物として一緒に結合される細胞の割合は低い、ということを意味する。分散細胞は、分散細胞の群を各ディボット中に沈積させるように微小鋳型に入れられる。好ましくは、30~150個の細胞が各ディボットに沈積する。実施例5は、島を単一細胞に分散する好ましい方法、ならびに微小鋳型中での細胞のインキュベーションを開示する。好ましくは、解離は、KUDiabetesResearchLaboratoryで処方された培地配合物中である。この配合物は、9部のカルシウム-マグネシウム無含有ハンクス平衡塩溶液と1部のパパイン50単位/mlを含む。これに対比して、ほとんどの島解離は、トリプシンかまたはパパイン以外の酵素を用いて達成される。解離は、撹拌しながら37°Cで実行される。最後に、島を手動でピペット分取して、細胞の少なくとも90が単一細胞に分離されるまで血球計で観察することにより、島は単一細胞に分散される。実施例5は、微小鋳型内での島細胞の再凝集のための好ましい条件も開示する。概して、細胞は、図14で特筆されるように、2日目を終えて、単一細胞として、または細胞の緩く付着された群として残存する。しかしながら、5または6日までに、ディボット中のその同一細胞は、しばしば球形である三次元構造に再編成した例えば、図18~19Aおよび21参照。典型的には、5日目までに、再凝集島は鋳型からの除去に耐えて、独立した島として機能し得る。この期間中に、細胞はネイティブ島の三次元形状をとる。ディボット中に形成される島の平均直径は、50μm未満である。実施例5は、微小鋳型中で形成される小型島の形態学的性質を記載する。本発明の一実施形態では、2または3個という少数の細胞が各ディボット中に在るよう、そしてディボット内の細胞が成長し、分裂し得るよう、低濃度で分散される細胞は微小鋳型に付加され得る。このようにしてディボット中で増殖される細胞化塊の形状およびサイズは、ディボットの物理的寸法により影響を及ぼされる。好ましくは、微小鋳型は島細胞を投入され、2または3個という少数の細胞が各ディボットを占有するよう濃縮されるが、この場合、島細胞は一緒に成長し、凝集して、好ましくは直径30~40μmの小型島を形成する。本発明の別の実施形態では、再凝集の時点で、化学物質または生物学的分子を工学処理島に組入れたい。これらの分子としては、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、DMARD疾患修飾性抗リウマチ薬、抗炎症薬および抗生物質が挙げられる。特に、植込み型微小鋳型支持体が用いられた場合、移植部位での酸素張力を増大するための分子または小型デバイスが、再凝集島中に組み入れられ得た。再凝集の時点で付加され得る分子の他のクラスとしては、インスリン放出を誘導するための薬剤、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体例えば、CD11a、CD11bCD11c、CD18に対する、および核酸例えば、DNAまたはRNAが挙げられるが、これらに限定されない。このような分子は、典型的には、微小鋳型への投入の時点で島に組み入れられ得る。分子は、それらが凝集中に細胞に取り込まれるかまたは細胞に接着するよう、分散細胞を有する培地に付加される。代替的には、細胞は、ユーザーの標的タンパク質の産生の増大または低減を生じる標準トランスフェクション法による再凝集前に修飾され得る。再凝集物の形成後、新規に形成された島は、免疫抑制因子または他の当該分子、例えば成長因子のような化学物質を保有する生体ポリマーで封入され得る。代替的には、植込み可能微小鋳型に関しては、鋳型は選り抜きの分子で充満され得る。本発明の方法は、その後の移植のための、あるいは薬剤またはデバイス試験のための細胞凝集物を形成するよう意図され得る。実施例5は、移植片または薬剤スクリーニングのために細胞を再凝集するための好ましい方法、好ましくはそれを実行するための好ましい方法を記載する。別の態様では、本発明は、薬剤、化学物質または他の小分子の高処理量スクリーニングのための方法にも関する。植込み可能な微小鋳型中に再凝集される細胞は、ディボット化支持体に接着し得るし、そうでないこともある、とわれわれは予見する。invitro研究に関しては、非接着性支持体表面、例えばガラスが好ましい。しかしながら、植込み可能鋳型または生体ポリマーパッチに関しては、接着支持体は、移植プロセスの効率を増強し、移植中および移植後の島の損失を低減する。生体ポリマーへの細胞の接着は、試験され、表1および図8に記載されている。本発明の付加的態様は、それに付随する利点および新規の特徴と一緒に、一部は以下の説明および実施例に記述され、そして一部は以下の検査時に当業者に明らかになる化、あるいは本発明の実行から習得され得る。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される手段および組合せにより実現され且つ獲得され得る。実施例1:島のサイズは生存度および移植成功に影響する本実施例は、ラットにおける移植成功に島サイズが如何に作用するかを調べた。この実施例では、島を単離するための技法が記載されており、細胞生存度が測定された。移植成功に及ぼす島サイズの作用を査定するために、大型島125μmより大きいおよび小型島125μ未満の両方を移植した。以下で考察するように、小型ラット島は、invitro機能およびinvivo移植結果において、大型島より優れている。これらの実験は、MacGregoretalにも記載されている。小型ラット島は、invitro機能および移植結果において、大型島より優れているAmJPhysiolEndocrinolMetabMay290E7719この記載内容は参照により本明細書中で援用される。ラット島単離大型および小型島を単離するために、ケタミンおよびキシラジンの混合物の腹腔内注射により、成体雄DAラットを麻酔した。腹膜腔を露呈し、小腸との膵管連結をクランプした。総胆管を介してinsituで膵臓にカニューレ挿入し、胆管中にコラゲナーゼの冷却溶液をポンプ注入することにより拡張させた。コラゲナーゼCLS-1、WorthingtonBiochemicalCorpLakewoodNJを、450U/mlで20mlのレイボビッツL15中に溶解した。その後、拡張膵臓を切り出して、50ml遠心分離管に移し、37°Cインキュベーター中で静かに回転させながら、約20~30分間インキュベートした。インキュベーション後、遠心管を静かに振盪して、島を追出した。管の内容物を、10の新生仔ウシ血清を含有する希釈氷冷ハンクス平衡塩溶液HBSS中に入れた。消化物を1×gで沈澱させて、上清を取り出した。さらに多くのHBSS/血清を付加し、工程を反復した。洗浄消化物を500ミクロンのステンレススチールスクリーンに通して、冷却遠心分離器で300×gで約1分間沈澱させた。ペレットを10mLの1.110gm/mLヒストパック密度=1.1085、SigmaDiagnosticsIncStLouisMissouriと混合して、800×gで10分間遠心分離した。勾配上に浮遊する島を収集し、別個に沈澱させて、10の胎仔ウシ血清を含有するハムF12培地中に入れて、5CO2を含有する37°C培養小室中に置いた。収率収率測定のために、島の各バッチの三重反復実験試料を検査した。各々は、約2の島分画を含む。個々の島を計数し、それらの直径を測定した。不規則形状島に関しては、島上の異なる位置で3~4つの直径測定値を取って、平均を用いた。島容積を算定し、島および全島分画に関する島等価値に変換した。約125μm以上の直径を有する大型島と比較して、小型島を約125μm未満の直径を有するものと定義した。大型島から小型島を分離するために、新鮮な島または一晩培養した島を沈澱させて、次に、1~2mlのL15培地中に入れた。次いで、L15中の5BSAの一段階勾配上で、島を迅速に層化させた。大型島が管の底に観察されるまで、経験的設定時間の間に1×gで沈澱が起きた。その時点で、勾配の上部2ミリリットルBSA含有せずを捨て、全部ではあるが底の2mlを注意深く取り出して、小島集団を限定した。沈澱島および底2ミリリットル中のものを、大型島分画として併合した。大型および小型島の分離を最適化する必要がある場合には、勾配を反復した。最終島分画を沈澱させて、グルコース感受性実験が実施されるまで、ハムF12およびグルコース無含有RPMI1640の1:1混合物グルコース=5mM中の培養中に入れた。生存度生存度を試験するために、生/死蛍光体、Sytoxおよびカルセインを有するL-15培地500μl中に島を入れて、37°Cで約15~30分間インキュベートした。島を、以下の:137NaCl、2.7KCl、4.3Na2HPO4および1.4KH2PO4mM、pH7.4からなるリン酸塩緩衝生理食塩水PBSですすぎ、DiabetesResearchLaboratoryに収容されたオリンパスFluoview300共焦点顕微鏡上のAttofluorChamberに入れた。40×または60×対物レンズを用いて、像を得た。培地から島を取り出して20分以内に、全画像を収集した。He:Neおよびアルゴンレーザーならびに第三明視野像を用いて、各島に関して3つの同時画像を収集した。図2に示したように、培養中に保持された大型無傷島125μmより大きいは、ヒトでもラットでも、わずか4日後に、有意パーセンテージの壊死12.6およびアポトーシス6.3細胞を示し、細胞死は経時的に増大する。小型島125μm未満は、生存可能性延長を示したが、しかし依然として、その後の時点で1週間を超えると急勾配の細胞死を示した。これらの小型島の生存度を、1週間までの間、追跡調査したが、それらは99~86の高生存度パーセンテージを維持する、ということが判明した。これは、10個の無傷大型島と比較した場合で、大型島の生存度レベルは、培養中で数日後、50より低くなった。図2に示したように、ここの分散島細胞は、小型無傷島と同様に培養中で高い生存度プロフィールを維持する。視野中の島を同定し、当該領域を丸く囲むことにより、生/死分析を完了した。バックグラウンド蛍光を、全画像から差し引いた。当該視野からフォトショップAdobeを用いて色相ヒストグラムを展開して、緑色相生および赤死における総ピクセルを算定することにより、生存度パーセンテージを算定した。生細胞を総島面積で割って得られる比率を生値として算定した。サイオンScionソフトウェアを用いて、島直径および周囲の長さを算定して、生存度値を島のサイズに従って類別した。移植試験移植成功に及ぼす島サイズの作用も調べた。実験では、ストレプトゾトシン65mg/kgを腹腔内に注射1回することにより、レシピエント動物に糖尿病を誘導した。血糖値が3連続日間に250mg/dlより高くなったら、ラットは糖尿病とみなされた。ラットを、ペントバルビタール45mg/kgで麻酔した。ラットを剃毛し、ベタジンスクラブで清浄化して、左脇腹の体壁を切開した。腎臓を傷口に取り出して、腎臓被膜を小さく切開した。小穴ピペットを用いて、大型または小型島をその被膜下に置いた。腎臓を元の位置に戻して、切開部を創傷クリップで閉じた。食肉用ウシ/ブタ亜鉛-インスリンNPI-1イレチンI注射2回/日を島移植後3日間、レシピエントに投与して、新規移植島における高血糖のストレスを低減した。大型または小型ラット島の移植を完了したn=10移植/群。ストレプトゾトシン誘導性糖尿病DAラットは、限界質量1000IEの大型150μmより大きいまたは小型125μmより小さい同系島を腎臓被膜下に受容した。血糖レベルを、8週間モニタリングした。図3Aおよび3Bは、各軍に関する最初の5つの移植片からの結果を示す。大型島のレシピエントはすべて、移植後に高血糖のままであった10匹中10匹。これに対比して、小型島の10匹のレシピエントのうちの8匹は、移植の7~10日後に、正常レベルに近いかまたは正常レベルの血糖レベルを有し、これは全8週間中、正常のままであった。腎臓被膜からの島移植片を、移植の8週間後に取り出した。組織を固定し、インスリンに関して免疫標識した。図4左パネルは、小型島移植を受けて、8週間正常血糖であった動物からの移植片を示す。移植片中のインスリンに関する実質的染色が認められた。これに対比して、図4右パネルでは、大型島の移植を受けた動物は、8週間高血糖を継続し、移植片中のインスリンに関する免疫標識をほとんど示さなかった。同時に前記の実験は、小型島125μm未満が、生存度、invivo機能検定において、ならびに移植片結果において、大型島125μmより大きいより優れている、ということを示す。さらに、平均的膵臓は大型島より約3倍多い小型島を産生死、小型島は約20以上生存可能であった。最も重要なのは、糖尿病動物に移植された場合、小型島が大型島よりはるかに優れていたことである。実施例2:個々の島細胞または小型島細胞クラスターへの大型島の変換この実施例は、無傷島を小型島細胞クラスター例えば、図5に示したクラスターおよび個々の島細胞に断片化するかまたは分散するための方法を例証する。慣用的酵素消化を用いて図6Aにおける小型島細胞クラスターを作製したが、一方、図6Bにおける小型島細胞クラスターは段階的カルシウム枯渇により形成した。図6Aの画像が示すように、酵素的分散は島を小型島細胞クラスターに壊すが、しかし、それはクラスターを散開せず、したがってクラスター内部の細胞は数細胞厚みである拡散バリアを有する。これに対比して、カルシウム枯渇を用いて形成された小型島細胞クラスター図6Bに関しては、小型島細胞クラスターの各細胞に対する小型拡散バリアが存在するよう、クラスターは散開形態を有する。酵素消化とカルシウム枯渇の組合せを用いても、無傷島を小型島細胞クラスターに変換し得る図6C、と予測される。a.酵素消化異なる酵素カクテルを用いて、無傷島を小型島細胞クラスターおよび個々の島細胞に断片化し得る。例示的酵素消化方法は、米国特許第6,783,954号この記載内容は参照により本明細書中で援用されるに開示されている。この実施例では、12の酵素カクテル、例えばパパインを含む一カクテルを用いて、種々の程度に成功した。膵島を単離するために、SpragueDawleyラットをケタミンおよびキシラジンの腹腔内注射により麻酔した。腹膜腔を露呈し、小腸との膵管連結をクランプした。総胆管を介してinsituで膵臓にカニューレ挿入し、胆管中にコラゲナーゼの冷却溶液をポンプ注入することにより拡張させた。その後、拡張膵臓を切り出して、遠心分離管に移し、37°Cで静かに回転させながら、約30分間インキュベートした。洗浄消化物をスクリーンに通して、冷却遠心分離器中で沈澱させた。ペレットをヒストパック密度=1.1085、SigmaDiagnosticsIncStLouisMOと混合して、遠心分離した。次いで、10の胎仔ウシ血清を含有するハムF12培地中に入れて、5CO2を含有する37°C培養小室中に置いた。ベータ細胞単離のための標準プロトコールは、4.8mMのHepesを有するハンクス平衡塩溶液HBSS中で無傷島本明細書中に記載の技法を用いて単離をインキュベートすることを包含したBalamuruganetalFlexiblemanagementofenzymaticdigestionimproveshumanisletisolationoutcomefromsuboptimaldonorpancreataAmJTransplant3113542参照。酵素消化のために、最終9mlのハンクス平衡塩溶液1mlのパパイン50単位/mlを含有を島に付加した。島を最初にピペットで静かに上下させて、完全なすすぎを確保した。島を管の底に沈澱させて、上清のほとんどを除去した。酵素中の島を、37°Cで約30分間、ゆっくり回転した。この時点で、小型島クラスターが多少の単一分散細胞を伴って形成されたので、溶液から取り出した。典型的には、細胞を、最終培地としてのCMRL1066またはMemphisSMFに移した。図5および6A酵素で一般的に示したように、細胞をジチゾンで染色して、クラスター内のベータ細胞を同定した。b.金属ベースの断片化金属ベースの断片化アプローチを用いても、無傷島を小型島細胞クラスターおよび個々の島細胞に断片化し得る。金属ベースの断片化の興味深い知見は、結果的に生じる小型島細胞クラスターがあまり密でなく、散開形態を有する、という点である。細胞接着分子、例えばE-カドヘリンは、島を一緒に保持するが、しかし機能するために二価金属を要するHaugeEvansetalPancreaticbetacelltobetacellinteractionsarerequiredforintegratedresponsestonutrientstimulienhancedCa2andinsulinsecretoryresponsesofMIN6pseudoisletsDiabetes4814028参照。したがって、カルシウム無含有培地中で約1時間、島を培養すると、酵素単独密な島構造を生じる図6A参照を利用する場合と比較して、島構造は弛緩しならびに破砕する図6B参照。さらに、カルシウム枯渇を用いて島を弛緩した後、ベータ細胞の残りの集塊は、伝統的酵素によってより容易に分散される図6C参照。金属ベースの断片化の詳細を、以下に示す。個々の島細胞および小型島細胞クラスターを得るために、島は、カルシウム-マグネシウム無含有ハンクス平衡塩溶液4.8mMHepes中に存在した。約37°Cで約30分間インキュベーション後、細胞をピペット分取して、それらを小型島細胞クラスターまたは単一細胞中に分散した。細胞を、最終培地としてのCMRL1066に移した。必要な場合、小型島細胞クラスターまたはベータ細胞をジチゾンで同定したMythilietalCulturepriortotransplantationpreservestheultrastructuralintegrityofmonkeypancreaticisletsJElectronMicrosc52399405参照。図6Bに示すように、カルシウム枯渇単独により得られる小型島細胞クラスターは不規則な管状配置を有し、これがクラスターのコアの還流のために最適であり得る。さらに、金属ベースの分散から得られるクラスターは、産生するのに約1時間掛かるだけであるが、一方、断片化への酵素アプローチは48時間までを要し得る。c.酵素消化および金属分散液の組合せ分散技法として酵素消化および金属枯渇の組合せを用いる実験も実施した。無傷島を、4.8mMHepesを伴うハンクス平衡塩溶液カルシウムまたはマグネシウムを含有しない9mlですすいだ。島を最初にピペットで静かに上下させて、完全なすすぎを確保した。島を管の底に沈澱させて、上清のほとんどを除去した。島を繰り返し洗浄して、すべてのカルシウムおよびマグネシウムを除去し得た。最終9mlのカルシウムおよびマグネシウム無含有ハンクス平衡塩溶液1mlのパパイン50単位/mlを含有を島に付加した。酵素中の島を、約30分間ゆっくり10rpm回転した。この時点で、小型島クラスターを溶液から取り出した。中等度の速度で2~3回、強くピペッティングすると、単一細胞を生じた。細胞を、25°Cで1500rcfで5分間、遠心分離した。適切な培地その後の検定によってを用いて、単一細胞を再懸濁した。細胞を、37°Cおよび5CO2でインキュベーター中に保存した。図6Cに示したように、酵素およびカルシウム枯渇法の組合せは、小型島細胞クラスターまたは単一細胞を生じる。さらに、組合せは、全体的により迅速な分散プロトコールであったが、しかし、細胞を過剰に消化および損傷しないよう、用心しなければならない。これらの実験において、YO-PRO-1およびヨウ化プロピジウムVibrantApoptoticAssaysMolecularProbesを用いて、壊死およびアポトーシス細胞を確定した。検定のために、細胞を、オリンパスFluoview300レーザー共焦点顕微鏡上のAttofluorChamber中にPBSとともに入れた。培地から島を取り出して20分以内に、全画像を収集した。He:Neおよびアルゴンレーザーならびに第三明視野像を用いて、各島に関して3つの同時画像を収集した。透過光を用いて視野中の細胞を同定することにより、生/死分析を完了した。緑色細胞はアポトーシスを示し、一方、黄色/赤色は壊死細胞死を示す。蛍光発光を欠く細胞は、生きていた。蛍光画像に、透過光画像を被せた灰色。実施例3:パッチ生体物質足場上での個々の島細胞および小型島クラスターの調製前記の実施例は、小型島細胞クラスターが、そして個々のベータ細胞でさえ、酸素、グルコース等を運搬するための最高に達成可能な自由表面積を表すはずであることを示している。したがって、この実施例では、個々の島細胞または小型島細胞クラスターを、生体物質足場物質、例えば図7に一般的に示したようなパッチ上に鋳型化して、多層の島細胞を形成した。足場物質のスクリーニングこの実施例では、生体物質への島細胞の相対的接着を測定することにより、本発明の足場を調製するために有用な種々の生体物質の最適化を調べた。足場物質が、組織および生体物質を解離し戻すことなく取扱い易く、容易な植込みを可能にする、というのが好ましい。表1は、ベータ細胞との相互作用に関して選択された広範な種々の生体物質を示す。これらの物質のいくつかは、植込物としての使用の歴史を保有する。典型的一実験では、列挙生体物質の1ストック溶液を先ず調製した。ほとんどの物質が、中性pHで脱イオン水中に溶解した。キトサンは、溶解する塩酸を用いたために約5.5という低pHを要し、そして他の物質は、有機溶媒を要した;例えば、エタノール中のセルフォーム商標、およびジクロロメタン中のポリDL-乳酸-コ-グリコール酸PLGA。常態で水に溶解するポリマー例えば、硫酸デキストラン、ある儀ネート等は、架橋して、皮膜マトリックスを形成し得る。約25μLの各ストック溶液を96ウェルプレート中の3つの個々のウェルに付加して、放置蒸発させるか、または真空乾燥し、したがって、各ウェルの底に薄い生体物質皮膜を沈澱した。残留溶媒内容物は微量で、細胞中で毒性を誘導しなかった。ウェルプレート例えば、フィブロネクチン、ラミニン等上の細胞接着を促進するために商業的に提供されるいくつかのタンパク質を、同様に細胞接着のために予備スクリーニングした。ベータ細胞の希釈懸濁液を、96ウェルプレート中で一晩インキュベートし、3回洗浄して、非結合ベータ細胞を除去した。ベータ細胞懸濁液は均質であった。等アリコート/ウェルは、同様の量のベータ細胞を含有すると推定された。全細胞数を、生体物質皮膜を含まないウェルからの細胞数に正規化した。概して、軽度疎水性ポリマーは、ベータ細胞を接着するために良好に働いた表1。生体物質上にプレートかし、その後、3回洗浄した後、付着細胞の数を計数することにより、細胞接着を確定した。以下のケイ酸を用いて、生体物質を欠いているウェル底空ウェル、対照を参照に付着する細胞の数に、計数を正規かした:当該ウェルに付着した細胞数/空ウェル中の細胞数。各実験を、三重反復実験で反復した。概して、軽度疎水性ポリマーは、ベータ細胞を接着するために良好に働いた。光学顕微鏡写真は、細胞形態が生体物質によっても影響される、ということを示した。キトサンMW=100kDa上のベータ細胞は、平滑な丸みのある表面を示したが、一方、ラミニン上のベータ細胞は、広がった、しわくちゃの形態を実証した図8参照。ラミニン支持体上のベータ細胞中のアクチンの蛍光染色は、強固な細胞接着を示唆する強蛍光性細胞骨格焦点を明示した。島細胞パッチの調製この実施例では、PLGAを含む島細胞を生体物質足場パッチに結合した。血管新生化ランゲルハンス島では、ベータ細胞の血管からの距離は25μm以下であるWaylandMicrocirculationinpancreaticfunctionMicroscResTech3741833参照。ベータ細胞は直径約10μmであるため、約3つの細胞の細胞層厚はネイティブベータ細胞環境をほとんど正確に模倣する、と予測される。概して、島は、前記のように、ラット膵臓から単離され、単一細胞または小型細胞クラスターに分散された。HBSS培地0.5ml中の島細胞および小型島細胞クラスターを各ウェルに付加し、3~4時間、生体物質上で培養させた。ウェル中の生体ポリマーを有するプレートを、室温で3500rpmで約10分間、遠心分離管中で回転して、細胞が生体ポリマーに付着するのを手助けした。培地の半分を各ウェルから除去して、新鮮な島細胞または小型島細胞クラスター懸濁液を含有する培地に取り替えて、付着させた重力により、または遠心分離により。これを3回反復した。これらの実験の結果を、図9に示す。遠心分離せずにポリマー上で培養される細胞と比較して、遠心分離法を用いた場合、反復洗浄後に、島細胞のさらなる層をポリマーのパッチに付着し得る。約3~4層の細胞が、繰り返し培地を変えながら、0.58dL/gHFIP中または0.9dL/gポリマーで、50:50PLGAに一貫して付着されたままである。ベータ細胞層の厚みを制御するために、反復沈着サイクル中の各ウェルに付加される細胞培養の容積および/または各ウェルに付加されるアリコートの数を制御し得る。実施例4:生体物質足場上の島細胞の予測試験この実施例では、それに付着される多層の島細胞を有する生体物質パッチをさらに調べる。生存度測定およびインスリン産生検定を実施する。さらに、糖尿病の治療のための植込み可能なデバイスとしてのデバイスを調べる。生存度測定値前記のように、アポトーシス対壊死実験を完成する。3つの試料に関して、0、1、3、7、14および30日目に、ネイティブ島との比較のために、ベータ細胞層の横断面積当たりで、生細胞パーセンテージを算定する。生存可能細胞パーセント対時間としてデータをプロットして、t検定を用いて、異なる数のベータ細胞層に関する生存度傾向間に統計学的有意差が存在するか否かを確定する。さらに、壊死またはアポトーシスに起因すると考えられる細胞死のパーセンテージを記録する。インスリン産生検定低グルコース3mM、高グルコース30mMおよび高グルコース/減極25mMKDean1989の条件下で、静的インキュベーションELISAを用いて、インスリン産生を測定する。12ウェルプレート中の各ウェルを、37°Cおよび5CO2で、新鮮な培地を用いて予備インキュベートする。実験的測定のために、3または30mMグルコースを含有する新鮮な培地中で2時間、種々のベータ細胞パッチをインキュベートする。NaClを適切に減少させ、25mMのKClを含有する30mMグルコース中で、ウェルの付加的一群をインキュベートする。各パッチ型を、試験される各条件に関して、三重反復実験で評価する。ELISAイムノアッセイを用いて、インスリン含量に関して培地試料を検定する。標準偏差を用いた三重反復実験資料の平均として結果を表し、統計学的有意に関してt検定を用いて比較するMacGregoretalSmallratisletsaresuperiortolargeisletsininvitrofunctionandintransplantationoutcomesAmJPhysiolEndocrinolMetab290E771779。パッチおよび島の植込み糖尿病を、成体レシピエントにおいて誘導する。糖尿病耐性BioBreedingDRBBWorcesterラットは、ヒトにおけるI型糖尿病に対応する自己免疫性糖尿病の一モデルである。4週齢ラットを、BiomedicalResearchModelsIncから購入する。動物を無作為に2つの群に分ける:パッチレシピエントと島レシピエント6匹/群。糖尿病の誘導のために、DRBBラットを、抗RT6モノクローナル抗体DaleLGreiner博士マサチューセッツ大学医療センター:UniversityofMassachusettsMedicalCenterの御厚意により提供されたおよび非特異的免疫系活性剤ポリI:CSigma;5ug/体重1g、週3回注射の組合せで処置する。3週間に亘って注射を施す。反復高血糖血糖レベル>250mg/dl;3連続日間の日に、糖尿病とみなされ、処置は終わるSemis2004。この方法を用いて、ラットの95が第3週の終わりまでに糖尿病になる。ベータ細胞パッチおよび島の植込みを、腎臓被膜下で実行する。DADarkAgoutiラットは、ベータ細胞ドナーとして役立てる。ラットをペントバルビタール45mg/kgで麻酔して、左脇腹の体壁に作った傷口に腎臓を取り出した。中等度の切開を腎臓被膜に作って、ベータ細胞パッチを被膜下に置いた。可変性生体物質および/または細胞層厚を有する最低4つのパッチを植込む。島移植片は典型的には、小穴ピペットを通したより小さい切開および注入を要する。レシピエント群は、移植用の1000または2000IEの島、または等価量のパッチ支持体上ベータ細胞を施される。性能の有意の改善パッチ型対島は、成功のために最低限必要な島1000IEが移植され、高島容積2000IEと比較される場合、検出可能であるはずである。食肉用ウシ/ブタ亜鉛-インスリンNPI-1イレチンI注射2回/日を島移植後3日間、レシピエントに投与して、高血糖のストレスを低減する。糖血症のinvivo確定ラットの血糖を4週間モニタリングして、パッチまたは島植込片が正常血糖を誘導し得るか否かを確定する。動物の糖血制御の後には、毎日血糖測定を行なう。Freestyleグルコース計TheraSenseを用いて、最初の3週間は毎日、次いで2回/週で、尾から血液試料を得ることにより、血漿グルコースレベルをモニタリングする。一般的に、糖尿病の回復は、島移植の24時間以内に達成され、同様の結果は、パッチを用いて達成されるはずである。外植ベータ細胞パッチの分析パッチまたは島は、免疫染色インスリンおよびグルカゴン、生存度測定およびアポトーシスの検出のために、14または30日後に回収される。いくつかの場合、正常血糖を達成しているラットを8週間保持した後、分析する。インスリンおよびグルカゴンに関して、抗体を用いて、切片に関する免疫組織化学検定を成し遂げる。比色分析を用いて画像を処理して、染色の各々に関して陽性である横断領域を確定する。陰性対照スライドを調製し、分析する。最初に、ジチゾン染色を用いて、ベータ細胞を同定する。末端でオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼTdT媒介性dUTPニック末端標識TUNEL検定を用いて、細胞アポトーシスを示すDNA断片化を成し遂げる。従来実行しているように、10ホルマリンを用いてパラフィン包埋、組織学検査のためにパッチまたは島を調製する。TUNELキットinsitu細胞死検出キット;RocheDiagnosticsを用いて、組織学的切片を標識する。研究者には上方を伏せて、TUNEL細胞の数および分布に関して、パッチおよび島をともに分析する。組織学的切片の画像を、島の完全3D画像に再構築する。このようにして、単一島全体のアポトーシス細胞を同定し得る。切片をヘマトキシリンで対比染色して、光学顕微鏡下で可視化する。島内のインスリン分泌細胞を同定するために、抗インスリン抗体を用いて、試料を標識して、ローダミン二次抗体で検出する。アポトーシス分析のために移植後に最低で10島/ラットを収集すると予測する。陰性対照スライドを、必要な場合は調製する。TUNEL分析のほかに、コア顕微鏡設備を用いたその後の電子顕微鏡検査のために、パッチを固定する。ベータ細胞層の、ならびに浸潤細胞の同定を、このようにして実施する。実施例5:微小鋳型を用いた最適サイズ化細胞の調製この実施例では、細胞を再凝集するための付加的デバイスを開発し、設計した。そして支持体の表面に蝕刻された多数の個々のディボットを有する微小鋳型を生成するための方法を記載する。概して、膵臓をネイティブ大型島150μmより大きいおよびネイティブ小型島125μm未満にばらばらにする。大型および小型島を分離し、小型島を培養中に入れるいくつかの実施形態では、小型島クラスターは、後に、新規再凝集島に付加し戻される。大型ネイティブ島は、単一細胞懸濁液に分散されて、微小鋳型中に沈澱させられる。微小鋳型中に投入した細胞の数により、生成される島のサイズを操作し得る。細胞懸濁液によって、典型的には20~100/-20細胞が各ディボット中に落ちて、互いに結合して、新規の再凝集小型島を形成する。個々のディボット中の単一細胞を、ネイティブ小型島に似た3D構造の形成を促すための条件下で培養するが、この場合、再凝集島のサイズおよび形状は、ディボットのサイズおよび形状により影響を及ぼされる。濃縮懸濁液中の細胞密度を測定することによるによりディボット中の細胞の数を変える能力は、非常に小型30μm以下の、または中サイズ50~90μmの再凝集島を生成させる。この制御は、化学療法試験のためのミニ腫瘍のような他の3D細胞構造を形成する場合に、重要であることが分かる。上記実施例3の生体物質足場パッチと違って、この実施例で記載されるディボット化微小鋳型は、支持体表面に付着するために細胞を必要としない。以下で考察するように、微小鋳型中に再凝集される島細胞は、最適にサイズ化され、生存可能であり、微小鋳型由来の細胞集団は、高生存度パーセンテージおよび高レベルのインスリン分泌により特性化される。微小鋳型の開発物理的再凝集環境としてのディボット最適サイズ化小型島に単一細胞を再凝集しようと努力して、物理的に制約された環境における島の形成が再凝集中の島塊の形状を誘導する、と仮定した。この終わりまで、最適物理的再凝集環境は、所望の細胞最終生成物の形状およびサイズの両方に類似する、と確定した。われわれの最初の実験に用いた寸法範囲直径100μm、深さ60μmは、直径50μm以下平均の再凝集島の生成のために最適である。深さ60μmは、それらをより小さい片に壊すことなく、再凝集島を容易に回復させる。各再凝集環境における丸底は、ほぼ球形への細胞塊の再凝集を誘導した。ディボットとしての丸底を含めた特定寸法を有するこれらの物理的再凝集環境に言及する。ディボットの寸法および配置は、ユーザーの要求に従って変更し得る。微小鋳型設計最適サイズ化小型島の集団を生成しようと努力して、多数のディボットを含む表面を含有する微小鋳型を設計した。この微小鋳型中のディボットの寸法、ならびに微小鋳型内のそれらの互いの空間的関係は、ユーザーにより特定された。オートキャドソフトウェアを用いて、微小鋳型の電子テンプレートを作成した。テンプレートは、鋳型表面のディボットのサイズ、形状および分布を正確に叙述する。ディボット化支持体は、鋳型ハウジングとして本明細書中でも言及される漏出を伴わずに液体を含有し得る大型ハウジング内に設定される図10。微小鋳型および微小鋳型内のディボットの両方の寸法は、ユーザーの要求に従って変更され得る。例えば、目標が薬剤試験のために鋳型を用いることである場合、ディボット当たり大容量の試験化合物を保持するために、より大型のまたはより深いディボットが試験され得る。当該細胞が島でない場合、ディボットの寸法は、当該細胞型に関する最適再凝集または成長判定基準を満たすよう、別の方法で特定され得る。ディボット化表面のための支持体支持体を選択する場合に重要であるいくつかの物理的特性が存在する。二酸化ケイ素SiO2ベースの支持体の使用は、緩衝化フッ化水素HF酸溶液での湿式蝕刻のために好ましい。HF酸は、SiO2分子を反応させることにより、支持体を蝕刻する。さらに、微小鋳型のinvitro使用に関しては、細胞が接着せず、ディボットから再凝集島を容易に除去し得る支持体を選択するのが好ましい。透明支持体は、別のプレートに移さずに、顕微鏡下でディボット内の内容物を見ることを可能にする。滅菌可能な支持体は、再利用可能な鋳型を提供する。ガラスは、これらの特質のすべてを示すので、非植込み式微小鋳型のための理想的支持体として選択された。さらに、ユーザーは、製造中のガラスの厚みおよび寸法を特定して、微小鋳型をさらにカスタマイズし得る。ガラスは、低経費溶液も提供するが、しかしこの物質は植込み可能でない。鋳型ハウジングを開発するために、支持体におけるいくつかの特性が必要である。鋳型ハウジングを造るために選択される物質は、ユーザー明細事項に従って成形される能力を有するべきである。これは、それが、鋳型に注ぎ入れ得る液体として出発し、時間および温度に伴って固まって、蝕刻支持体周囲に固体特徴を形成する、ということを意味する。ポリマーは、好ましくは、滅菌可能である。それは、典型的には、鋳型から液体が漏出するのを防止するために、疎水性である。Sylgard184ポリジメチルシロキサンPDMSは、これらの鋳型のために理想的である。それは、滅菌され得るし、疎水性であり、鋳型に容易に注入され得て、固体生成物に硬化し得る。さらに、それは、長時間に亘って、-45~200°Cの範囲の温度で用いられて、凍結および蒸気滅菌の両方を可能にする。PDMSは、約2時間の作用時間を有し、次いで、室温で硬化されるかまたは熱硬化約200°Cまでされ得る。明細事項を製造するために混合されるPDMSは、ガラス支持体に張り付く能力を有して、さらに鋳型中から液体が漏出するのを防ぐMataetal2005。ガラスおよびPDMSを用いて設計される微小鋳型は、具体的には、invitro実験のために設計され、invivo使用には適していない。光蝕刻法を用いないが、しかしむしろ先ず陰型スタンプを製造することにより作られる、invivo目的のために用いられる植込み可能鋳型を、以下に記載する。ここまで生成された微小鋳型フォトタイプは、ディボットが蝕刻されたガラス支持体で構成された。ディボット支持体は、ユーザーの要求を満たすよう切断され得る。例えば、支持体は、標準顕微鏡スライドのサイズに切断され得た。ここまで作製された一原型では、ソーダ石灰ガラス支持体が、直径33mmおよび厚み3mmの円形に切断された。支持体表面の調製ディボット処理されるべき支持体の表面を、窒素ガスで清浄にして、大型粒子を除去した。酸および塩基ピランハ溶液を用いて、支持体を深いところまで清浄にして、有機化合物ならびに金属沈着および光蝕刻を妨害し得る物質を除去した。その後、支持体を30~60分間、焼き固めた。大型粒子および有機化合物を表面支持体から除去するための他の方法が、当業者により用いられ得る。一旦支持体表面が清浄にされたら、金属の層300nmクロムを、Lesker薄皮膜沈着系を用いて、支持体にスパッタリングした。支持体に薄い金属層を適用するための代替的技法は、当該技術分野で既知であり、利用され得る。光蝕刻法AZ1518ポジティブフォトレジスト1mlの被膜を、スピンコーターBrewerCEE100ProgrammableSpinCoaterを用いて、沈着金属の上部に適用した。スピンコーターを、フォトレジストの1.8ミクロン層を生じるよう設定し、その後、100°Cで2分間、穏やかに焼き固めた。冷却後、フォトマスクを有するガラスを紫外線ABMUVFloodMaskAlignmentSystemに4秒間曝露した後、AZ300MIF現像液中に30秒間浸漬した。支持体を軽く掻き混ぜた。次いで、支持体を100°Cで8~10分間焼き固めた。その後、蝕刻工程を手助けするために掻き混ぜながら、CR7Sクロム蝕刻液中に浸漬することにより、フォトレジストにおける展開パターンをクロム層に蝕刻した。画像を出現させるためには、30~45秒の浸漬を要する。支持体を水で軽く洗浄し、窒素で乾燥して、湿式蝕刻法の準備をした。これにより、クロムおよびフォトレジストで層化されたガラス片が生じたが、クロムまたはフォトレジストが存在しない場合には、表面に開口スポットを含入する。これらの非被覆スポットはガラス表面を湿式蝕刻工程に曝露するが、一方、クロムおよびフォトレジストで覆われた領域は蝕刻溶液からガラス表面を防護する。これにより、非被覆領域のディボットが蝕刻される。それぞれ20:14:66の比のHF:HNO3:H2Oの溶液中で、湿式蝕刻を成し遂げた。オービタルシェーカーで低速で振盪しながら、支持体を溶液中に18分間浸漬した。この浸漬中、SiO2と反応することにより酸がガラスを攻撃し、したがってクロムおよびフォトレジストマスクで覆われていないガラスの可視部分を溶解して、表面上に均一ディボットを作製した図11。この溶液は、4~5μmの深さ/分溶液の鮮度によってというおよその蝕刻率を生じる。オービタルシェーカーでの撹拌は、表面の均一蝕刻を保証する。その後、支持体を炭酸カルシウムで、次いで水で洗浄して中和し、余分量の酸を除去して、最後に窒素で乾燥した。余分量のクロムが支持体上に残存した場合、クロム蝕刻液中にさらに浸漬し、アセトンおよび水で洗浄して、あらゆる残存物を除去することが必要である。最後に、支持体を窒素で乾燥した。粗面計を用いて、ディボット深度および直径を測定した図12。これまで作製されたフォトタイプでは、ディボットサイズの可変性は問題ではなかった;原型ディボットは、特定寸法の/-10を示した。鋳型を作製するために用いられ得る2つの他の予測的方法を考えてみる:SU-8陰型鋳型:この実施形態では、ガラスを再び支持体として用いる。ガラスは前記と同様の光蝕刻工程を受けるが、しかし元の設計を変更して、陰テンプレート鋳型を作製し、これは次に微小鋳型に変換され得るが、しかし、列挙された生体ポリマーのうちの1つをスタンプ上に注いで、それを硬化させる。要するに、SU-8フォトレジストを、厚い層で回転被覆する層の厚みはディボットの所望の深さと等しいはずである。それは次に穏やかに焼き固められ、フォトマスクで被覆されて上記と同様、紫外線に曝露され、曝露後再び焼き固められ、SU-8現像液中で現像されて、最後に現像後焼きされる。これにより、設計明細事項に基づいてディボットの負の突出部を有するガラス片が生じる。次にこの陰テンプレートを用いて、硬化時に鋳型印プリントを作製することにより、所定の生体ポリマーまたはPDMSで鋳型を成型する。完成ポリマーはPDMS/ガラス微小鋳型に似ており、限定寸法のディボットを有する。この手法の一利点は、薬剤試験または他の用途のために、各ディボットは独特の識別子例えば、字句、番号により設計段階中に標識され、各ディボットにより可視的インプリントとして完成鋳型中に存在する、という点である図28参照。さらに詳細な工程は、メーカーの加工処理ガイドラインSU82000PermanentEpoxyNegativePhotoresistMicroChemNewtonMAに記載されている。蝕刻金属鋳型陰型:この実施形態では、金属成型鋳型を用いてポリマー鋳型を作製する。金属成型は、CADソフトウェアで3Dモデルを設計することにより、製造し得る。考え得る一デザインを、図27に示す。金属をレーザー蝕刻して、上記のSU-8鋳型と同様の成型鋳型を作製する。ポリマーを金属成型鋳型上に注いで、硬化させて、新規の微小鋳型を作製する。さらにまた、必要な場合は、字句または番号を3Dモデルに組入れて、上記のように各ディボットを標識して、可視的インプリントをあとに残す。SU-8および蝕刻金属テンプレートを開発して、invitroおよびinvivo使用の両方のために所定の物質から鋳型を製造する方法を可能にする。さらに具体的には、これらの方法は、植込み得る鋳型を作製するために生体ポリマーを利用し得る。これらの方法は、より詳細なデザイン例えばディボット標識およびディボット作製、形状およびサイズにおけるより多くの制御ディボット測定の可変性は特定寸法の/-1未満であるべきであるも可能にする。ディボット化支持体に関するハウジングの構築微小鋳型を構築する場合の次の段階は、ディボット化表面を配置し、固定する系を、そして培養のための大型容器として役立つ系を開発することである図10のPDMSハウジング参照。鋳型ハウジングの基部[6]および垂直壁[5]を、DowCorningSylgard184ポリジメチルシロキサンPDMSを用いて造った図13。PDMSを10部塩基対1部硬化剤の比率で、50ml遠心分離管中で混合した~2時間の稼動時間。その管を十分に混合して、塩基および硬化剤を完全に分散した。渦巻き撹拌を用いて、この工程中の混合を手助けした。PDMSを、1000~1500rpmで1分間遠心分離して、空気泡を除去した。PDMS以外の物質を用いて、微小鋳型のための適切なハウジングを構築し得る。例えば、多用途invitro適用を意図される微小鋳型に適した物質としては、が挙げられるが、これらに限定されない。植え込まれるinvivo使用微小鋳型は、生体ポリマーから鋳型のディボット化表面および側面の両方を有して形成される。しかしながら、側面の高さは最低限で、移植物質の総容積を低減するために移植前に除去され得る。invivo適用のために意図される微小鋳型に適した物質としては、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン等が挙げられるが、これらに限定されない。他の非限定的物質としては、例えば、多糖、ポリエステル例えばポリ乳酸、ポリL-リシン、ポリグリコール酸およびポリ乳酸-コ-グリコール酸、ポリ乳酸-コ-リシン、ポリ乳酸-グラフト-リシン、ポリ無水物例えば、ポリ脂肪酸二量体、ポリフマル酸、ポリセバシン酸、ポリカルボキシフェノキシプロパン、ポリカルボキシフェノキシヘキサン、これらの単量体のコポリマー等、ポリ無水物-コ-イミド、ポリアミド、ポリオルトエステル、ポリイミノカルボネート、ポリウレタン、ポリオルガノホスファゼン、ポリホスフェート、ポリエチレンビニルアセテート、ならびにその他のアシル置換セルロースアセテートおよびその誘導体、ポリカプロラクトン、ポリカルボネート、ポリアミノ酸、ポリアクリレート、ポリアセタル、ポリシアノアクリレート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリビニルイミダゾール、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、コポリマー、ポリスチレン、およびその配合物またはコポリマーが挙げられる。ある好ましい態様では、生体物質としては、多糖、アルギン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロースHPC、NイソプロピルアクリルアミドNIPA、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールPVA、ポリエチレンイミン、キトサンCS、キチン、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸コンドロイチン、ゼラチン等、ならびにそれらの誘導体、コポリマーおよびその混合物が挙げられる。他の適切な生体物質としては、Vatsetal;Wangetal;およびOriveetalに記載されたナイロン、ヒアルロナン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルホルムアミド等が挙げられる。鋳型ハウジングの形状は、銅足場を用いて形成された図13。一大型銅管直径1.75インチ[1]を、平坦表面[4]例えば、アルミ箔で包まれた大型正方形のガラス上に開口面を下にして、配置した。2mmの深さに開口して、鋳型ハウジングの基部[6]を形成する管の中心にPDMSを付加した。次に全構造を、炉中で100°Cで45分間、焼き固めた。焼いた後、硬化PDMS基部[6]の上部の銅管破線は、大型銅管に対する蝕刻ガラス[4]の位置を示すの中心に、ディボット側を上にして、ディボット化支持体を配置した。少量のPDMSを、ディボット化支持体の縁に付加して、それを硬化PDMS基部[6]の中心に固定した。次にその構造物を、100°Cで30分間焼き固めた。小型銅管[2]直径1インチを蝕刻支持体の上部で中心に置いて、PDMSを、大型[1]および小型[2]銅管間の間隙に注ぎ入れた。この段階を注意深く実行して、鋳型の中央にPDMSがこぼれないようにした。大型[1]および小型[2]銅管間の間隙に注入されるPDMSの量は、鋳型ハウジング[5]の高さを決定する。鋳型ハウジングの高さおよび幅は、ユーザーにより特定され得る。次いで、微小鋳型銅ハウジング足場を含むを、100°Cで一晩少なくとも12時間焼き固めて、PDMSを完全に硬化する。一晩焼いた後、銅足場枠組みを、以下のように除去した。全構造[1]~[7]を冷却して、PDMSを収縮して、銅管足場からの鋳型の取り出しを可能にした。冷却に要する正確な時間は、温度によって決まる;-20°Cでは、30~60分で十分である。底箔/ガラス層[4]および小型銅管[2]を、注意深く取り出した。次に、大型銅管[1]を、微小鋳型から分離した。微小鋳型の滅菌好ましくは、本発明のディボット含有表面は、滅菌可能である。一実施形態では、完成微小鋳型が足場を有さない場合、それは、そして使用のために必要な場合は、洗浄され、滅菌され得る。エタノールおよび蒸気滅菌が滅菌の好ましい方法であるが、しかし、当業者に既知の他の滅菌方法は適切である。微小鋳型中にPDMSを用いる場合は、アセトンを用いるべきでない。同様に、ディボット化支持体または鋳型俳人具に用いられる物質の完全な状態を危うくする滅菌手法は、用いるべきでない。滅菌は、invitro使用のために微小鋳型を繰り返し使用可能にする。明らかに、invivo植込みに用いられる鋳型はこの要件を有さない。微小鋳型内の細胞再凝集微小鋳型への細胞の送達島を再凝集するために用いられる単一分散島細胞は、島細胞の任意の供給源から得られる。この実施例では、総胆管を介してinsituで動物膵臓にカニューレ挿入し、胆管中にコラゲナーゼWorthingtonLakewoodNJの冷却溶液をポンプ注入することにより拡張させた。その後、拡張膵臓を切り出して、遠心分離管に移し、37°Cで静かに回転させながら、30分間インキュベートした。次いで、洗浄消化物をスクリーンに通して、冷蔵遠心分離機中で沈澱させた。その結果生じたペレットをヒストパック密度=1.1085、SigmaDiagnosticsIncStLouisMOと混合して、遠心分離した。次に、5ウシ血清を有するハンクス平衡塩溶液HBSSを用いて40μスクリーンを通して濾過することにより、島を清浄化して、DMEM/F12培地、10胎仔ウシ血清FBS、EGF20ng/mLおよび1抗生物質を含有するペトリ皿中に入れた。島を、5CO2で37°Cで一晩保持した。島を単一細胞に分散するために、単離島を、50ml遠心分離管中に入れて、遠心分離して、ペレットを1.5mlマイクロ遠心分離管に移すことにより、生存可能細胞懸濁液に消化した。カルシウム-マグネシウム無含有HBSSで2回洗浄後、9部のカルシウム-マグネシウム無含有HBSSおよび1部のパパインの混合物最終濃度5Umlを付加した。回転機上で37°Cで20分間インキュベーション後、島をピペット分取して、それらを単一細胞に分散した。微小鋳型中の細胞のインキュベーション単一分散細胞を、最終培養のために、特殊化凝集培地DMEM/F12培地:10ウシ胎仔血清FBS、EGF20ng/mL、ITS1g/L、BSA2g/L、ニコチンアミド10nmol/L、エキセンジン-45nmol/Lおよび1抗生物質を含有中の微小鋳型に移した。この凝集培地に、島再凝集を増強する高カルシウム条件2~4mMをわれわれは付加している。分散時に、細胞のアリコートを、血球計を用いて顕微鏡検査する。単一細胞対二連または三連物のパーセンテージを確定する。上首尾の細胞分散は、最低で90の生存可能な単一細胞を有し、他の10は二連および三連物を含む、と定義される。血球計を用いて細胞数により分散液中の細胞の密度を知ることにより、ディボット当たりの細胞の数を概算し得る。しかしながら、一旦鋳型が投入されたら、細胞/ディボットも計数したが、これは、培地細胞密度に基づいて、実験によって変化したが、しかし20~150の範囲であった。細胞/ディボットの数は、鋳型中に投入される培地中の細胞の密度に基づいて操作されて、標的3D細胞構造の最終的サイズを制御するためにユーザーに利点を提供する。微小鋳型を静かに振盪し、次いで、15分間放置すると、細胞が個々のディボットに沈澱した。培地を毎日取り替えながら、9日間まで、37°Cで5CO2で島を保持した。微小鋳型60μm深度のディボットを有する中の培地の取替えは、鋳型壁付近から古い培地を静かに除去し吸引により、そして鋳型に新鮮な培地を静かにピペット分取することにより、容易に成し遂げられた。微小鋳型内の細胞クラスターの再凝集最初に、細胞を各ウェルの底に無作為に入れた。各ディボット中に沈澱する細胞の数を、懸濁液中の細胞の密度により設定する。微小鋳型に投入する前に細胞密度を確定するために、島細胞懸濁液のアリコートを取り出して、細胞/容積を、血球計を用いて顕微鏡下で計数する。鋳型中のディボットの数および各再凝集島の標的サイズが分かれば、出発細胞密度によって懸濁液中の細胞の数を濃縮するかまたは希釈する。鋳型が10,000個のディボットを含有し、所望結果が100細胞/ディボットである場合には、微小鋳型中に投入される培地中に1,000,000個の細胞が存在しなければならない。図14は、2日目に開始して5日目まで進んだ微小鋳型中に発育している細胞を示す。3日目と4日目の間に、細胞はネイティブ島の三次元構造を取り始めた。ディボット内に現れた島は、すべて直径90μm平均直径50μm未満に限定された。50μmは島のコア細胞への栄養を保証する臨界サイズであることを示すデータを発表済みであるWilliamsetal2010ので、この直径は重要である。50μmより大きい島はコア細胞死を実証したが、一方、50μm未満のものは、培養中のコア細胞死をめったに実証しなかった。各ディボットの湾曲底は、球形再凝集島の最適形成のために互いの方向に細胞を引っ張るのに役立つ。図14は、粗面計を用いて単一ディボット深度についてなされた測定を示す。この単一ディボットの深度は60μmよりわずかに大きく、底は湾曲しており、これが、凝集のために細胞をディボットの中央方向に押す。最適サイズおよび形状を有する再凝集島を生成するに際しての成功は、早期原型から得られる結果により例示される。この早期原型は、ディボット領域の周囲に非ディボット化支持体表面域を含んだ図15。植えつけた場合、いくつかの細胞は原型微小鋳型の非ディボット化表面に落ちた。非ディボット化表面に落ちた細胞のいくつかは単一細胞の形態で留まるか、あるいは小細胞クラスターに成長し、他のものは巨大島ディボット明細事項により限定されなかった巨大複合体を形成した図15。この早期原型鋳型内で、同一動物から単離され、同一培地中で培養され、同一支持体物質で再凝集された細胞は、2つの異なる細胞再凝集物を生じた:iディボット内に形成されたものは、小型の良好に造形された島を形成し;そしてiiディボットの物理的拘束に制限されない平坦表面に形成されたものは、貧拡散特性に付される細胞の大型丸形団塊を形成した。非制限島のいくつかは、直径400μmのサイズに成長した。これらの結果は、細胞の再凝集を物理的に制限することが最適サイズ化島を生じるという優れた概念実証を提供する。微小鋳型中で再凝集される島は、ネイティブ小型島により示されるものと同様の拡散特性を実証するということを、実験データは示唆している。微小鋳型中で再凝集される島の拡散特性を確定するために、再凝集島を、グルコースの蛍光類似体2-NBDGを含有する培地に10分間曝露した。蛍光グルコース類似体は再凝集島のコアに完全に浸潤したが、これは、グルコースの拡散に対するバリアが相対的に低いということを示している図26。これに対比して、ネイティブ大型島は、2-NBDGへの曝露の数時間後でさえ、島のコアへのグルコースの浸潤および細胞取込みを抑制する拡散に対する有意のバリアを有する、ということを従来の研究は示したWilliamsetal2010。総体的に、これらのデータは、微小鋳型中で再凝集される島細胞がネイティブ大型島に比して低い拡散バリアを有する、ということを示している。微小鋳型中で形成される細胞と市販の多重ウェルプレート中で形成されるものとの比較鋳型中での島再凝集の結果を、市販のマイクロプレート中での島再凝集と比較した。市販のプレートは、直径500μmを示す正方形ウェルを含有した。分散島細胞を、市販のプレート中で培養すると、予測どおり、島様クラスターが生じた。何度か観察を実施した。第一に、市販プレート中で形成した島細胞は、ウェルの角に集合し、互いに結合したが、この場合、それらは壁と接触し得る。図16は、市販ウェルの側面に接触する再凝集島を形成する細胞の典型例を示す。これらの細胞は、接触誘導を用いて再編制される。第二に、サイズを限定せずに、益々多くの細胞が一緒に結合して、貧生存度を有する巨大島直径400μmを上回るものもあるを作った。各ウェル内の細胞の数を限定するために小型微小鋳型を用いず、そして再凝集島の形状を最適に誘導するよう意図された物理的寸法を用いない場合、結果的に生じる島は非常に大きく、且つ高パーセンテージの死細胞を含有した。市販プレート中で再凝集した島からの生存度検定では、50を上回る細胞死が6日の培養で認められた。これらの大型開口部では、細胞はしばしば単一体として残存し、貧細胞生存度を示した。ウェルの壁または隅に沿って群生し得た細胞は、ネイティブ島を示す球形を決して形成せず、貧生存度を有した。第三に、市販鋳型中で生じた細胞のクラスターは、微小鋳型を用いて得ることができた球形島様組織に再凝集しなかった。再凝集島の球形成能力は上首尾のinvitro機能を予測する重要な特徴であると思われる。ほとんどの多重ウェルプレートは、図16に示すように平底ウェルおよび正方形側面を有して製造される。これらのような市販プレート中で再凝集される細胞はネイティブを連想させる球形で互いに付着せず、したがって、ネイティブ島と同じように効率的に機能するとは余り考えられない。丸底を有する1536ウェルプレートは市販されているが、しかし直径500μmの任意のウェル中で形成される島細胞は大きすぎて拡散バリアを乗り越えられない。これらの結果は、一般に市販されている鋳型が最適島形成のために不適当な支持体であるという見解を支持する。鋳型からの再凝集細胞クラスターの除去いくつかの場合には、細胞の完全性または生存度を危うくしないようにして微小鋳型から再凝集島細胞を除去することが望ましい。これは、ディボット上に直接大型ピペットを静かに置いて、吸引を適用することにより、容易に成し遂げられ得る。再凝集島を、培地とともにディボットから取り出す。その後、新鮮な培地で微小鋳型を洗浄し、ディボット上で直接ピペッティングして、鋳型中のほとんどすべての再凝集島を取り出す。微小鋳型中で形成される細胞再凝集物の特性化微小プレートから取り出された島を、サイズおよび生存度に関して測定した。ネイティブラット島は、直径20~350μmの範囲である。微小鋳型のディボット直径100μm、深さ60μm内で再凝集される場合、島の100が90μm未満の直径を有した;再凝集島当たりの平均直径は、36.6±1.2μmであった500を上回る個々の再凝集島の共焦点顕微鏡測定値。元来、単一細胞に完全には消化されなかった、したがってディボットに落ち込まなかった代表的島とわれわれが考えた2~3の大型構造をわれわれは見出した。それ以来、分散手順中はより以上に注意して、細胞の90が単一体で、残りの細胞が主に二連または三連物である島懸濁液を得た。微小鋳型パターンAおよびB図17を用いて、得られた全凝集物の85~90が直径90μm以下であると概算している。未だ理解されない理由のために、ディボット中の細胞のいくつかは、一再凝集島/ディボットを形成するというよりむしろ、多数の島に分かれた。図18は、1つのディボット内に2つの再凝集島の一例を示す。形態学的には、再凝集島は同一サイズのネイティブ島と同一に見える。それらは、図29で分かるように、球形で、島周囲にカプセル様外表面を有する。これに対比して、図15は、微小鋳型なしで凝集する細胞は球または見掛けのカプセルを形成しない、ということを示す。アポトーシス/壊死細胞染色を用いて、再凝集島に関して生存度実験を成し遂げたInvitrogen、Yo-Pro-1およびヨウ化プロピジウムを含有するVybrantアポトーシス検定。この二重標識検定は、膜完全性およびDNAの断片化の両方を測定する。われわれが以前発表した方法を用いて、2つの標識で1時間、再凝集島をインキュベートしたMacGregoretal2006Williamsetal2010。その後、島をPBSですすぎ、Fluoview300共焦点顕微鏡上のAttofluorChamberに入れた。再凝集島を光学的に切断して、島の中心からの画像を後の分析のために保存した。染色を含有する島内の面積を、総島面積のパーセンテージとして算定して、生存度を確定した。5日齢再凝集島の生存度測定値は、細胞内の非常に高い生存度を実証し、非常に少ない死細胞/島を明示した。再凝集島の全体的生存度は、99.76であった。この値は、ネイティブ大型および小型島に関して、ならびに単一島細胞分散液に関して文献で従来報告されたものより高いWilliamsetal2010Songetal2009。図19は、生存度に関して染色された典型的島の例を示す。これらの試験では、赤色染色は壊死による細胞死を示し、緑色細胞染色はアポトーシスによる細胞死を示す。図19Aは、微小鋳型中で再凝集された島で同定された極少数の死細胞の1つを示す。赤色染色細胞は、壊死のために細胞死を受けつつある。単離組織では、細胞絵師は、しばしば、最初に起きる。試験した500の島において、アポトーシス緑色細胞は2つだけであった。これに対比して、同一動物からの細胞が微小鋳型の表面に大型巨体島を形成した場合、塊全体に存在する有意数の死細胞が認められた。図19Bは、23の死細胞を有する図の一平面を捉えている。顕微鏡の焦点面の調整は、塊の全平面内により多くの死島細胞が存在することを示した。したがって、正しい割合の島にディボット中で再凝集される細胞は非常に高い生存度を有したが、一方、ディボットの外側で大型塊に再凝集させられた細胞は有意の細胞死を示した。これらの結果は、微小鋳型の成功を支持するが、それは、ディボットなしの鋳型の領域上に載った細胞がディボット中で形成されたものよりはるかに乏しい生存度を有したためである。微小鋳型中で形成される全細胞の生存度は、同一動物からのネイティブ大型および小型島のものを超えた図20。前記のようにInvitrogenのVybrantアポトーシス検定を用いて、生存度を、ラット大型、小型および再凝集島間で比較した。単離の6日後に、ネイティブ島の2つの群において生細胞のパーセンテージの多少の可変性が認められたが、しかしながら再凝集島における死細胞は少数で、エラーバーは図中で視覚的に表すには小さすぎた。微小鋳型中で再凝集された島は、ネイティブ小型島より約10高い生存度を、そしてネイティブ大型島より約40高い生存度を示した図20。微小鋳型から生成される細胞集団島中の総細胞の約90を含むネイティブ島大型および小型の両方中に存在する細胞には3つの主な型がある。グルカゴンを分泌するアルファ細胞は、島中の細胞の約20を構成する。インスリンを産生するベータ細胞は、総細胞数の60~65を構成し、ソマトスタチンを産生するデルタ細胞は島細胞組成の5~10を構成する。本発明の微小鋳型中で工学処理された島は、アルファ、ベータおよびデルタ細胞を含有することを示している。例えば、図21は、再凝集の6日後に本発明の微小鋳型中で形成された2つの代表的島を示す;ベータ細胞は緑色に染色され、アルファ細胞は赤色に染色され、そしてデルタ細胞は青色に染色されている。これらの工学処理島は、平均ネイティブ島より低いベータ細胞パーセンテージを有すると思われる。しかしながら、ネイティブ小型島と比較した場合、アルファ:ベータ:デルタ細胞の細胞相対組成、ならびにそれらの編成はネイティブ小型島と類似し得る。ネイティブラット大型および小型島は、島の外層に位置するグルカゴン陽性およびソマトスタチン陽性細胞で編成される。インスリン陽性細胞は、中心部に見出される。このようなものとして、インスリン陽性細胞ベータ細胞のパーセンテージは小型島中では低いが、しかし各島は多量のインスリンを含有する。決定的に結論を下すのに十分な再凝集島中のベータ/アルファ/およびデルタ細胞インスリン/グルカゴン/ソマトスタチン陽性細胞のパーセンテージをわれわれは算定していないが、しかし他のすべての細胞と比較してベータ細胞のパーセンテージはネイティブ小型島と類似している、と思われる。重要な差異の1つは、再凝集島中で、アルファ、ベータおよびデルタ細胞は、再凝集島全体に分散される細胞とともに無作為パターンで編成される、という点である。これは、ヒト島において認められる同一編成であるHahnvanDorsheetal1988Boscoetal2010。したがって、再凝集島は、ネイティブヒト島を連想させるより無作為なパターンの細胞編成を実証する。インスリン産生微小鋳型中で工学処理された島は新規のインスリン分子を産生し得る、ということを照明することは重要であった。インスリンは、先ず、プロインスリンと呼ばれる前駆体分子として合成される。6日齢再凝集島をプロインスリンレベルに関して染色して、それらが新規のインスリンを作っていたか否かを確定した。図22は、成熟インスリン緑色およびプロインスリン分子赤色に関して染色された再凝集島の一例を示す。予測どおり、ベータ細胞は二重標識されている。画像は、新規インスリンは培養6日でも、再凝集島中で合成されている、ということを示す。島は、食後の高グルコース曝露に応答した血中へのインスリン放出に関与する。インスリン分泌の欠如は、正常血糖レベルを保持する能力が1型糖尿病を有する人にはないことが原因である。グルコースに対する細胞応答を確定するために、本発明の微小鋳型中で再凝集される島ならびにネイティブ小型島を、低グルコース状態3mMに曝露した。両島型により培地中に分泌されたインスリンを収集し、定量した図23。低グルコース状態30分では、再凝集島は、ネイティブ小型島の100倍のインスリンを放出したネイティブ小型島はネイティブ大型島より多くのインスリンを産生する。高グルコース20mMに曝露されると、再凝集島は、ネイティブ大型または小型島より有意に多いインスリンを分泌し続けた。再凝集島がインスリンを漏出していたというよりむしろインスリンを分泌していたということを確証するために、小さな膜不透過性デキストラン10kDを用いて、さらなる実験を実施した。このサイズの分子は、細胞内の核膜上の核孔複合体を通り抜けるのに十分に小さい。しかしながら、原形質膜は、このサイズの分子を通すことができるタンパク質複合体を含有しない。デキストラン20mMを、再凝集島を含有する培地に付加すると、共焦点画像は、曝露の4時間後でも、デキストランは細胞に進入できないことを捉えたが、これは、細胞が漏出性でも膜が損傷しているのでもなかったことを示唆している。さらに、細胞がインスリンを分泌していたのではなく実際に漏出していた場合には、図22に示した再凝集島における壊死/アポトーシス検定中に高レベルの赤色または緑色染色を観察したはずである。総体的に、これらのデータは、微小鋳型中で再凝集された島は、実際に、それらのネイティブ小型または大型島同等物より多量のインスリンを産生する、ということを示唆している。われわれの知る限り、ネイティブまたは変更島細胞からのこれらのレベルでのインスリン分泌は報告されておらず、われわれの結果を非常に独特なものにしている。高グルクロン酸含量でアルギン酸塩中に小型再凝集島を封入することを、Weirグループが報告したO’Sullivanetal2010。Weirは、単に島を単一細胞に分散し、次いで、制限なしにそれらを再造形させることにより、これらの島再凝集物を作製した。Weirの研究は、正常酸素レベルでは、彼等の小型島はネイティブ島と同じくらい多くのインスリンを放出したが、しかし低酸素では、Weir島はネイティブ島より多くのインスリンを放出した、ということを示した。しかしながら、Weirの最良性能の島が分泌したインスリンは、微小鋳型中で再凝集されたわれわれの島の20分の1であった。高グルコースでのわれわれの再凝集島によるインスリン分泌の相対的減少の理由は、この時点では不明であり、工学処理島が糖尿病動物に移植され得る前に確定されなければならない重要なことである。相対的減少にもかかわらず、ネイティブ島と比較した場合の低および高グルコース状態の両方におけるインスリン分泌の劇的増加は、微小鋳型再凝集方の重要な且つ独特の特性である。島への添加物微小鋳型中で島を再凝集すると言う方法とともに利用され得る代替的方法および物質は、ほぼ無限にある。先ず、再凝集の時点で工学処理島に組み入れられ得る多くの分子が存在する。これらの例としては、成長因子、免疫調節剤、免疫抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、DMARD疾患修飾性抗リウマチ薬、抗炎症薬および抗生物質が挙げられるが、これらに限定されない。特に、植込み型微小鋳型支持体が用いられた場合、移植部位での酸素張力を増大するための分子または小型デバイスが、再凝集島中に組み入れられ得た。再凝集の時点で付加され得る分子の他のクラスとしては、インスリン放出を誘導するための薬剤、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体例えば、CD11a、CD11bCD11c、CD18に対する、および核酸例えば、DNAまたはRNAが挙げられるが、これらに限定されない。考察われわれのディボット化微小鋳型は、細胞を再凝集するために当該技術分野で用いられる他の足場とは異なる。以前に、他の人々が島を形成するために懸滴法の使用を試みた例えば、Lehmannetal2007。懸滴法では、細胞を溶液中に入れて、ペトリ皿の蓋の上に一滴落とし、これを次に上側を下に向けて、したがって細胞を溶液の懸滴の底に落とし、そこでそれらは島を形成し得る。しかしながら、懸滴法は時間が掛かり、そして滴中の培地が変えられ得ないために、汚染しがちである。invitroでの微小鋳型の有用性本発明の微小鋳型は、その後の移植のために、または薬剤またはデバイス試験等の他の用途のために、invitroで細胞凝集物を形成するよう設計し得る。移植のための細胞の生成予測例移植のための細胞を生成するよう設計される好ましい微小鋳型は、滅菌可能な、再利用可能な、そして充填された場合に培地または細胞を漏出しない単一デバイスである図24。先ず、島は、膵臓から単離される必要がある。小型健常島が大型島から分離される。大型島は、単一細胞または二連物に分散され、これらが微小鋳型に投入される。培養中で3~6日後、細胞を取り出して、ネイティブ小型島と混合して、糖尿病レシピエントに移植する。微小鋳型A図17Aは、直径100μm、深さ60μmであるディボットを有して、島再凝集のために設計されている。深さ60μmは、ディボットから再凝集島を用意に取り出せるので、最適である、ということをわれわれは見出した。ディボットは、ディボット間の間隔が最小であるよう、交互パターンで整列される図17A。ディボット間の平均距離は、30μm未満である。図15で観察される非ディボット化表面は、移植のための細胞を生成するための予測微小鋳型中のディボット中で完全に覆われる。この整列は、微小鋳型上の最大間隙をディボットのために用いさせ、鋳型当たりで作製される再凝集物の数を最大にし、効率をさいだいにして、鋳型の表面に浮遊する任意の細胞がディボット中に落ちると思われ、したがって再凝集のための生存可能細胞の損失を制限する。一鋳型上に得られるディボットの数は、鋳型のサイズに伴って変わる。微小鋳型A設計を用いる直径約1.5インチの鋳型図17Aは、10,000~12,000ディボット/鋳型を含有する。ディボットの間隔も、鋳型の必要性によって決まる。移植のための組織の再凝集に関しては、再凝集島の数に対する元の組織の効率が重要である。ディボットに落ちる細胞のパーセンテージが大きいほど、新規島を作製する効率は良好である。そこで、島移植のために設計されるわれわれの鋳型は、20~30μmの間隔のディボットを有する。薬剤スクリーニング予測例微小鋳型を用いる薬剤スクリーニングは、3D構造で整列される細胞、例えばミニ腫瘍または小型島は、皿中で平坦に増殖されるかまたは再凝集される細胞とは別様にそれらの環境に応答する、という概念に基づいている。例えば、ミニ腫瘍または島は、微小鋳型のディボット中で形成され、次いで、考え得る治療薬、例えば抗癌薬が個別に各ディボットに適用されるか、または全プレートに付加され得る。次に3D構造の形成を検査し、試験化学物質の望ましくない作用を示す変化、例えば細胞生存度またはクラスターサイズの低減に注目する。第一例では、多数の異なる薬剤が、長さ約35mmのガラス片上で試験され得る。第二のアプローチでは、単一薬剤が試験されるが、しかし一鋳型では、定量され得る多数の個々の応答が認められる。癌薬試験に関して考え得る一定量は、各腫瘍に関してなされ得る生存度生/死染色である。微小鋳型デザインを用いて考え得る癌薬の試験が興味を引いているが、しかし当該鋳型は3D整列の細胞に関して最良に実行されるすべての薬剤試験のために有用である。微小鋳型B図17Bは、各ウェルへのここの介入の送達のために設計されている。したがって、薬剤試験のために適用可能である。このデザインに関しては、ディボットは直径約180μmで、各ディボット間の間隔は120μmである。間隔は、必要に応じて増減または低減され得る。図11は、個々の空ディボットを有する微小鋳型Bの床の画像を示す。微小鋳型Bは、2,700~3,000ディボット/鋳型を含有し、多くがデザインAの場合より少ない。デザインBにおけるディボット間の間隔は、唯一のディボットへの正確な薬剤送達を保証するためにより大きい。ディボットパターンおよび間隔の明細事項はユーザーにより設定され、そして用いられる薬剤送達系によって決まる。各ディボット中の細胞に関する数千の化合物をシメンするための鋳型の使用により、ユーザーは、直径2インチ未満の鋳型中で2000~3000の異なる薬剤に関する薬剤スクリーニングを実行し得る図24。別個の薬剤のための各鋳型を利用する高処理量薬剤スクリーニングは、数千の個々の細胞クラスターを応答させ、平均応答というよりむしろ個々の応答として測定する。各ディボットが試験のための異なる薬剤を含有し得るよう、ナノ送達系と組み合わせた高処理量薬剤スクリーニングが利用され得る。代替的には、同一処理および培養条件に曝露された数千の試料からデータポイントを収集し得る図24。非島細胞の生成予測例鋳型は、種々の細胞凝集形状、例えば長いニューロン経路、糸球体様フィルター、血管、置換肺胞等これらに限定されないのために設計され得る。小さい、輪郭のはっきりした形状、例えば微小鋳型中での幹細胞または再プログラム化細胞の凝集も本発明の適切な用途である。典型的一適用は、鋳型中での培養細胞株の拡張および凝集である。この場合、懸濁液中の細胞は、ユーザーの要求によって1~50細胞/ディボットの範囲の極低密度で鋳型中に投入される。培養細胞株は、分裂中の細胞を含有し、これは、ユーザーの要求によって決まる時間の長さの間、ディボット中で増殖させられる。他の細胞供給源としては、動物またはヒトから新たに分散された細胞が挙げられる。新たに分散された細胞を投入する工程は、島に関して記載される一般的方法と同様である。単一細胞または二連物が懸濁液中に存在するまで、選りすぐりの組織、例えば血管が、消化酵素に曝露される。細胞は、ユーザーにより選択される密度で選択される培地中で、鋳型に投入される。最後に、幹細胞は、種々の成体細胞型を産生するようプログラムされ得る。これらの細胞も微小鋳型中に投入されて、3D構造形成を増強する。invivoでの微小鋳型の有用性予測例本明細書中に記載される微小鋳型は、invitro適用のために有用である。移植のための鋳型中での島の再凝集予測例生体ポリマーから構築される微小鋳型を用いて、植込み可能な生成物を生成し得る図23。このような場合、再凝集島が生体ポリマーに付着し、そして全パッチがレシピエントに移植されるよう、鋳型の微小環境は変更される。上記の生体ポリマーは、このようない植込み可能な微小鋳型を生成するのに適している。鋳型中のディボットは、細胞を先ずディボット中に沈澱させ、次いで、生体ポリマーディボットに接着させるウェルを作製し得る。生体ポリマー中にディボットを作製するために、当該技術分野で既知のプロトコール例えば、Deanetal2007を用いて、蝋陰型が設計される。植込み可能である鋳型に関しては、島は鋳型中に残されて、外科的にレシピエントに入れられる。植込み可能鋳型は、島への神経および血管の浸潤を可能にするディボット間に開口部がある鋳型デザインを有する。さらに、植込み可能物質が、例えばニューロンおよび血管性調印しトともに植え込まれ、鋳型は免疫拒絶から島を防御するための免疫抑制剤も含有する。島を伴う鋳型の植込みは、いくつかの発表済みの方法を用いて実行され得る。微小鋳型は、Qietal2010により公表されたような腹膜腔中に入れられる。腹腔が麻酔下で開けられて、鋳型が筋膜した間隙に静かに置かれる。微小鋳型の植込みのための代替的部位としては、特に、Veriteretal2010により記載されたような領域への血管供給を増大するための予備状態調節後の、皮下挿入が挙げられる。ヒト移植では、島は、門脈を介して肝臓中に入れられるKohetal2010。微小鋳型を用いる場合、門脈を通しての注入は可能でないが、しかし鋳型はより侵襲性の外科手術を用いて、肝臓または腎臓被膜下に入れられ得るMacGregoretal2006。参考文献以下の参考文献は、それらが本明細書中に記述されるものを補足する例示的手法的またはその他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書中で援用される。SU82000PermanentEpoxyNegativePhotoresistMicroChemNewtonMABalmurganANChangYFungJJTruccoMandBottinoRFlexiblemanagementofenzymaticdigestionimproveshumanisletisolationoutcomefromsuboptimaldonorpancreataAmJTransplantation311351142BoscoDArmanetMMorelPNiclaussNSgroiAMullerYDGiovannoniLParnaudGBerneyTUniquearrangementofalphaandbetacellsinhumanisletsofLangerhansDiabetesFeb25EpubaheadofprintChanCBSalehMCPurjeAandMacPhailRMGlucoseinduciblehypertrophyandsuppressionofanioneffluxinratbetacellsJEndocrinol1734552ChanCBandSuretteJJGlucoserefractorinessofbetacellsfromfedfafaratsisamelioratedbynonesterifiedfattyacidsCanJPhysiolPharmacol77934942CrimWSWuRCarterJDColeBKTraceAPMirmiraRGKunschCNadlerJLNunemakerCSAGI1067anovelantioxidantandantiinflammatoryagentenhancesinsulinreleaseandprotectsmouseisletsMolCellEndocrinolMar6EpubaheadofprintCuiYFMaMWangGYDEHVollmarBandMengerMDPreventionofcorecelldamageinisolatedisletsofLangerhansbylowtemperaturepreconditioningWorldJGastroenter11545550DeanetalComparisonofinsulinautoantibodiesindiabetesrelatedandhealthypopulationsbyprecisedisplacementELMDiabetesDeanDMNapolitanoAPYoussefJMorganJRRodstoriandhoneycombsthedirectedselfassemblyofmicrotissueswithprescribedmicroscalegeometriesFASEBJ2140054012DufraneDGoebbelsRMFdilat1GuiotYandGianelloPImpactofporcineisletsizeoncellularstructureandengraftmentaftertransplantationadultversusyoungpigsPancreas30138147HahnvonDorscheHReiherHHahnHJPhasesintheearlydevelopmentofthehumanisletorganAnatAnz1666976HuttonJCandMalaisseWJDynamicsof02consumptioninratpancreaticisletsDiabetologia18395405KaihowTMasudaTSasanoNandTakahashiTThesizeandnumberofLangerhansisletscorrelatedwiththeirendocrinefunctionamorphometryonimmunostainedserialsectionedadulthumanpancreasesTohokuJExpMed149110KawashimaYYamamotoHTakeuchiHandKunoYMucoadhesiveDLlactideglycolidecopolymernanospherescoatedwithchitosantoimproveoraldeliveryofelcatoninPharmDevTechnol57785KeeganMFalconeJLeungTandSaltzmanWMBiodegradablemicrosphereswithenhancedcapacityforcovalentlyboundsurfacelipandsMacromol3797799784KikugawaRHKatsutaetalDifferentiationofCOPASsortednonendocrinepancreaticcellsintoinsulinpositivecellsinthemouseDiabetologia5264552KohASeniorPSalamAKinTImesSDinyariPMalcolmATosoCNilssonBKorsgrenOShapiroAMInsulinheparininfusionsperitransplantsubstantiallyimprovesingledonorclinicalislettransplantsuccessTransplantation8946571KrickhahnMBuhlerCMeyerTThiedeAandUlrichsKThemorphologyofisletswithintheporcinedonorpancreasdeterminestheisolationresultsuccessfulisolationofpancreaticisletscannowbeachievedfromyoungmarketpigsCellTransplant11827838LehmannRZuelligRAKugelmeierPBainningerPBMoritzWPerrenAClaviensPAWeberMSpinasGASuperiorityofSmallIsletsinHumanIsletTransplantationDiabetes56504603MataAFleischmanAJRoySCharacterizationofPolydimethylsiloxanePropertiesforBiomedicalMicroNanosystemsBiomedicalMicrodevices7281293MattsonGJanssonLandCarlssonPODecreasedvasculardensityinmousepancreaticisletsaftertranplantationDiabetes5113621366MengerMDJaegerSWalterPFeifelGHammersenFandMessmerKAngiogenesisandhemodynamicsofmicrovasculatureoftransplantedisletsofLangerhansDiabetes38Suppl199201OSullivanESJohnsonASOmerAHollisterLockJBonnerWeirSColtonCKWeirGCRatisletcellaggregatesaresuperiortoisletsfortransplantationinmicrocapsulesDiabetologia2010Jan26EpubaheadofprintPetropavlovskaiaMandRosenbergLIdentificationandcharacterizationofsmallcellsintheadultpancreaspotentialprogenitorcellsCellTissueRes3105158QiZShenYYanaiGYangKShirouzuYHiuraASumiSTheinvivoperformanceofpolyvinylalcoholmacroencapsulatedisletsBiomaterials31402631RitzLaserBOberholzerJTosoCBrulhartMCZakrzewskaKRisFBucherPMorelPandPhilippeJMoleculardetectionofcirculatingbetacellsafterislettransplantationDiabetes51557561ScharpDWLacyPESantiagoJMcCulloughCWeideLGFalquiLMarchettiPGingerichRJaffeACryerPAndersonCandFlyeWInsulinindependencefollowingislettransplantationintopatientwithType1insulindependentdiabetesmellitusDiabetes39515518ShapiroAMLakeyJRRyanEAKorbuttGSTothEWarnockGLKnetmanNMandRajotteRVIslettransplantationinsevenpatientswithtypeIdiabetesmellitususingaglucocorticoidfreeimmunosuppressiveregimeNewEnglandJMed343230238SongHJXueWJLiYTianXHSongYDingXMFengXSTianPXLiZLImprovedisletsurvivalandfuntionwithratendothelialcellsinvitrococultureTransplantProcDec4143026SutherlandDEGoresPFFarneyACWahoffDCMatasAJDunnDLGruessnerRWandNajarianJSEvolutionofkidneypancreasandislettransplantationforpatientswithdiabetesattheUniversityofMinnesotaAmJSurg166456491SweetIRKhalilGWallenARSteedmanMSchenkmanKAReemsJAKahnSEandCallisJBContinuousmeasurementofoxygenconsumptionbypancreaticisletsDiabetesTechnolTher4661672TatarkiewiczKGarciaMLopezAvalosMBonnerWeirSandWeirGCPorcineneonatalpancreaticcellclustersintissueculturebenefitsofserumandimmobilizationinalginatehydrogelTransplanation7115181526VeriterSMergenJGoebbelsRMAouassarNGregoireCJordanBLevequePGallezBGianelloPDufraneDInVivoSelectionofBiocompatibleAlginatesforIsletEncapsulationandSubcutaneousTransplantationTissueEngPartAFeb11EpubaheadofprintvonMachMASchlosser3WeilandMFeilenFJRingelMHengstlerJGWeilemannLSBeyerJKannPandSchneiderSSizeofpancreaticisletsofLangerhansakeyparameterforviabilityaftercryopreservationActaDiabetol40123129WarnockGLEllisDKCattralMUntchDKnetemanNMandRajotteRVViablepurifiedisletsofLangerhansfromcollagenaseperfusedhumanpancreasDiabetes38136139WilliamsSJWangMacGregorRQSiahaanTStehnoBitelLBerklandCAdhesionofpancreaticbetacellstobiopolymerfilmsBiopolymers91676685WilliamsSJHuangHKoverKMooreWBerklandCSinghMStehnoBittelLReductionofDiffusionBarriersinIsolatedIsletsImprovesSurvivalButNotInsulinSecretionOrganogenesisinpressXuWMcDoughRCLangsdorfBDemas1NandDeGraffBAOxygensensorsbasedonluminescencequenchinginteractionmetalcomplexeswiththepolymersupportsAnalChem6641334141前記から、本発明は、明白なそして本発明に固有のその他の利点とともに、本明細書中に上記したすべての目的および対象物を得るために十分に適合されるものであることが分かる。多くの考え得る実施形態はその範囲を逸脱しない限り本発明によりなされ得るため、本明細書中に記述されるすべての事柄は例証と解釈されるべきものであり、本発明を限定するものではないと理解される。具体的実施形態を示し、考察してきたが、種々の修正は、もちろん、なされ得るし、本発明は、以下の特許請求の範囲に含まれるような制限を除いて、本明細書中に記載される部分および段階の具体的形態または整列に限定されるものではない。さらに、ある種の特徴および部分的組合せは有用性を有し、他の特徴および部分的組合せと関係なく用いられ得る、と理解される。これは、特許請求の範囲により意図され、そしてその範囲内である。"