式AWBGH式中、GHは、成長ホルモン化合物を表し、Aは、胆汁酸残基を表し、Bは、GHに共有結合させた親水性スペーサーを表し、Wは、AとBとを連結する化学基であるの成長ホルモンコンジュゲートおよび薬学的に許容される塩。成長ホルモン化合物GHが、配列番号1により定義されるヒト成長ホルモンと比較して、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む、請求項1に記載の成長ホルモンコンジュゲート。成長ホルモン化合物が、ループ部分とヘリックス部分との間を連結する、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む、請求項2に記載の成長ホルモンコンジュゲート。化合物が、配列番号1中に、R16CL117C、A17CE174C、H21CM170C、D26CV102C、D26CY103C、N47CT50C、Q49CG161C、F54CY143C、F54CS144C、F54CF146C、S55CY143C、S57CY143C、I58CQ141C、I58CY143C、I58CS144C、P59CQ137C、P61CE66C、P61CT67C、S71CS132C、L73CS132C、L73CF139C、R77CI138C、R77CF139C、L81CQ141C、L81CY143C、Q84CY143C、Q84CS144C、S85CY143C、S85CS144C、P89CF146C、F92CF146C、F92CT148C、R94CD107C、V102CA105C、L156CF146C、L156CT148C、およびまたはV185CS188Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲート。成長ホルモン化合物が、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含み、そのシステインのうちの少なくとも1つが、配列番号1中のアミノ酸128~154に対応するループ3内に存在する、請求項2から4のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲート。成長ホルモン化合物が、L3を、ヘリックス2またはループ1と連結する、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む、請求項5に記載の成長ホルモンコンジュゲート。胆汁酸残基が、コール酸残基である、請求項1から6のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲート。コール酸残基が、式中、は、Wを介する親水性スペーサーへの結合点を表すから選択される、請求項7に記載の成長ホルモンコンジュゲート。GHが、N末端、Gln40、およびGln141からなる群から選択される野生型アミノ酸残基においてコンジュゲートされる、請求項1から8のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲート。GHが、突然変異体のアミノ酸残基においてコンジュゲートされる、請求項1から8のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲート。突然変異体のアミノ酸基が、システインである、請求項10に記載の成長ホルモンコンジュゲート。cys突然変異体が、ヒト成長ホルモンにおける101位に対応する位置にある、請求項11に記載の成長ホルモンコンジュゲート。請求項1に記載の成長ホルモンコンジュゲートを調製する方法であって、aコール酸リンカーを、成長ホルモン化合物へとコンジュゲートするステップと、b前記成長ホルモンコンジュゲートを得るステップとを含む方法。請求項1から12のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。循環成長ホルモン量の増大から患者が利益を得る、疾患または状態を治療するために成長ホルモン活性を使用することができる疾患を治療する方法であって、有効量の、請求項1から12のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲートまたは請求項14に記載の医薬組成物を患者に投与するステップを含む方法。タンパク質分解に対して耐性であるhGH化合物を開発する必要が明らかに存在する。このような安定化化合物ならば、hGHに所望の生物学的特性を保持する一方で、タンパク質分解による切断に対する安定性を増大させるはずである。このようなGH分子ならば、安定性を増大させ、クリアランスを遅延させ、かつまたはinvivoにおける半減期を延長させるであろう。さらに、タンパク質による治療剤は一般に、経口では十分なアベイラビリティーが得られないため、静脈内投与または皮下投与する必要がある。タンパク質の経口バイオアベイラビリティーが低いのは、部分的には、消化管におけるタンパク質分解に起因する。したがって、また、hGH関連障害を治療するのに経口投与されうるhGH化合物を開発する必要も存在する。天然の胆汁酸は、一連の輸送体タンパク質の作用を介して、腸肝ループ内に厳重に封じ込められている。この腸および肝臓による取り込み機構により、腸内に分泌される胆汁酸のうちの約90が、回腸内で再吸収され、腸肝循環と称し、胆汁塩を腸系から肝臓および胆嚢へと戻す循環において再循環する。天然の胆汁酸と同様の特性を有する成長ホルモン化合物または成長ホルモンコンジュゲートは、経口バイオアベイラビリティーのほか、薬理学的に適切な肝臓レベルおよび高肝対血漿比を示すことが可能であり、したがって、極めて有望な化合物である。本発明は、胆汁酸を共有結合させた成長ホルモンコンジュゲートについて説明する。本明細書で説明される通り、胆汁酸は、プロテアーゼに対して安定化させた成長ホルモン変異体など、多様な成長ホルモン化合物に結合させることができる。ある態様における本発明は、成長ホルモン化合物に連結された胆汁酸残基を包含する成長ホルモンコンジュゲートに関する。このような成長ホルモンコンジュゲートは、式AWBGH式中、GHは、成長ホルモン化合物を表し、Aは、胆汁酸残基を表し、Bは、GHに共有結合させた親水性スペーサーを表し、Wは、AとBとを連結する化学基であるおよび薬学的に許容されるその塩により記載することができる。本発明のさらなる実施形態では、成長ホルモン化合物が、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する、ヒト成長ホルモンまたはその変異体である。さらなる態様における本発明は、成長ホルモン欠損症を治療する方法におけるその使用など、このような成長ホルモンコンジュゲートの任意の使用に関する。さらなる態様における本発明は、成長ホルモン化合物に連結された胆汁酸残基を包含する成長ホルモンコンジュゲートを調製する方法であって、前記胆汁酸残基を、成長ホルモン化合物に共有結合させる方法に関する。定義本文脈では、ペプチドおよびポリペプチドという用語を互換的に用い、同じものを指すことを意図する。ペプチドまたはポリペプチドという用語は、ペプチド結合により接合される2つ以上のアミノ酸による配列を指し、前記アミノ酸は、天然の場合もあり、非天然の場合もある。構成要素であるアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸の群に由来することが可能であり、遺伝子コードによってはコードされない天然アミノ酸であることが可能であるほか、合成アミノ酸であることも可能である。遺伝子コードによりコードされない天然アミノ酸は、例えば、Hyp、yカルボキシグルタミン酸、Orn、ホスホセリン、Dアラニン、およびDグルタミンである。合成アミノ酸は、DアラニンおよびDロイシンなど、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のD異性体、Aad、Aib、Abu、Agl、Asu、Cpa、Chg、Dab、Dap、Hcy、Hpr、Nle、Phg、Hph、1Nal、2Nal、2Palアラニン、3Palアラニン、Pip、Pra、Pyr、Gla、Hci、Nva、Tle、βアラニン、3アミノメチル安息香酸、およびアントラニル酸など、化学合成により作製されるアミノ酸を含む。該用語はまた、タンパク質という用語も包含し、これは、1つのポリペプチド鎖からなる場合もあり、例えば、システインジスルフィド架橋など、非共有結合もしくは共有結合による相互作用を介して併せて保持される2つ以上のポリペプチド鎖からなる場合もある。該用語はまた、例えば、さらなるジスルフィド結合を含むことに加えて、PEG、炭水化物、脂肪酸、アルブミン結合剤、アルキル鎖、親油性基、ビタミン、胆汁酸、またはペプチドの側鎖もしくは主鎖に対するスペーサーなどであるがこれらに限定されない部分を結合させることにより誘導体化させたペプチドを包含することも意図することを理解されたい。ペプチドという用語は、任意の適切なペプチドを包含し、各々のアミノ酸ポリマーを含有する各種の分子が、著明な差違を伴い、これにより、本発明の個々の実施形態を形成しうることを読者が認識すると仮定すれば、別段に言及するか、または文脈によりこれに反する言及を行わない限り、ポリペプチドおよびタンパク質という用語と同義に用いることができる。したがって、本明細書におけるペプチドという用語は、一般に、任意の適切なサイズおよび組成を有する任意の適切なペプチドを指すものと理解すべきである。さらに、本明細書に記載のペプチドは、別段に言及するか、または文脈によりこれに反する言及を行わない限り、非天然アミノ酸残基およびまたは非Lアミノ酸残基を含みうる。別段に言及するか、または文脈によりこれに反する言及を行わない限り、ペプチドという用語はまた、誘導体化されたペプチド分子も包含する。誘導体化されたペプチド分子とは、そのアミノ酸残基のうちの1つまたは複数が、化学修飾されているか、または1つまたは複数のアミノ酸以外の有機およびもしくは無機の原子もしくは分子による置換基基、親油性置換基、LDグルタミン酸、コハク酸などのスペーサー残基またはスペーサー基を介して、該ペプチドのアミノ酸配列へと連結することもできる、フルオロフォア、ビオチン、放射性核種などと会合しているペプチド分子であり、また、あるいは代替的に、別段に言及するか、または文脈によりこれに反する言及を行わない限り、非必須アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、およびまたは非Lアミノ酸残基も含みうると、このような誘導体との任意の種類の等価性を示唆するためではなく、本発明を説明する際の便宜のために行うのであることを、ここでもまた認識されたい。このようなアミノ酸残基の非限定的な例には、例えば、2アミノアジピン酸、3アミノアジピン酸、βアラニン、βアミノプロピオン酸、2アミノ酪酸、4アミノ酪酸、6アミノカプロン酸、2アミノヘプタン酸、2アミノイソ酪酸、3アミノイソ酪酸、2アミノピメリン酸、24ジアミノ酪酸、デスモシン、22ジアミノピメリン酸、23ジアミノプロピオン酸、Nエチルグリシン、Nエチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、3ヒドロキシプロリン、4ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Nメチルグリシン、Nメチルイソロイシン、6Nメチルリシン、Nメチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、プロパルギルグリシン、ならびにスタチンをハロゲン化したアミノ酸が含まれる。本明細書に記載される化合物は、タンパク質の場合もあり、ペプチドの場合もあり、ポリペプチドの場合もあり、ポリペプチドは、それが改変された方法に関わらず、wthGHと同様の所望の生物学的活性を保持する、類似体の場合もあり、変異体の場合もある。ポリペプチドを指す場合に本明細書で用いられる類似体または変異体という用語は、前記ペプチドの改変形を意味し、この場合、該ペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基により置換されており、かつまたは1つまたは複数のアミノ酸残基が、該ペプチドから欠失しており、かつまたは1つまたは複数のアミノ酸残基が、該ペプチドに付加されている。このようなアミノ酸残基の置換または付加または欠失は、該ペプチドのN末端で生じる場合もあり、かつまたは該ペプチドのC末端で生じる場合もあり、かつまたは該ペプチドのN末端もしくはC末端で生じる場合もある。その光学異性体が言及されているわけではないすべてのアミノ酸は、L異性体を意味すると理解されたい。ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋という用語は互換的に用いられ、同じものを指すことを意図する。タンパク質におけるジスルフィド結合またはジスルフィド架橋は、システイン残基のチオール基間で形成される。さらなるシステインまたは導入されるシステインという用語は互換的に用いられ、同じものを指すことを意図する。該用語は、野生型hGHには存在しないシステイン残基を包含することを意図する。構造的変化を最小化するため、通常アミノ酸残基の置換を介してシステイン残基を導入し、これにより、hGHの長さを維持する。ループ部分内、またはヘリックスの周縁部では、付加的cys残基の挿入が許容されるが、ヘリックス内におけるcys残基の導入は、それほど推奨されない。さらなるジスルフィド結合または導入されるジスルフィド結合という用語は互換的に用いられ、同じものを指すことを意図する。該用語は、そのうちの少なくとも1つが野生型hGH内には存在しない2つのシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合を包含することを意図する。本明細書では、単一点突然変異という用語を用いて、突然変異を指す。さらなる単一点突然変異という用語は、単一点突然変異が、成長ホルモン化合物中に導入されるさらなるシステイン突然変異を形成する任意のジスルフィド架橋には関しないことを明記するのに用いることができる。cysによるさらなる単一点突然変異という用語は、システイン残基を導入する点突然変異を特定するのに用いることができる。このような突然変異は、hGHにおけるさらなる単一点突然変異の場合もあり、hGHにおけるなおさらなる突然変異の場合もある。本発明を規定するために本明細書で用いられるコンジュゲートという用語は、ペプチドまたはポリペプチドであって、ペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基が、胆汁酸残基に共有結合しているペプチドまたはポリペプチドを指す。したがって、本発明についてのコンジュゲートという用語は、胆汁酸コンジュゲートを、代替的な誘導体から識別するための用語として用いられる。しかし、他の文献は、コンジュゲートという用語と誘導体という用語とを互換的に用いるので、他の文献を参照する場合は、これらの用語が互換的に用いられうることが注意される。動詞としては、この用語が、部分を、タンパク質またはポリペプチドへと結合させる工程を示すことが意図される。本明細書で用いられる誘導体という用語は、ペプチドまたはポリペプチドを指し、この場合、該ペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基が、PEG、炭水化物部分、アルブミン結合剤、脂肪酸、親油性基、ビタミン、または成長ホルモン化合物の側鎖もしくは主鎖に対するスペーサーなどのポリマーを導入することにより化学改変されている。化学改変はまた、一過性の性格でもありうる、すなわち、それらは、invivoにおいて容易に除去することができる。化学改変は、例えば、細胞自体を介して、または発現後においてペプチドに対して実施される化学改変を介して、翻訳後において導入することができる。本発明の文脈では、ヒト成長ホルモンという語と、hGHwtという語と、野生型hGHという語とが互換的に用いられ、いずれも、配列番号1としてのアミノ酸配列を伴うタンパク質を指す。当技術分野で知られる同一性という用語は、配列を比較することにより決定される、2つ以上のペプチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、同一性はまた、2つ以上のアミノ酸残基の連なりの間のマッチ数により決定される、ペプチド間の配列類似性も意味する。同一性では、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラムにより扱われる、ギャップアライメントを伴う、2つ以上の配列間の同一性のマッチ百分率が測定される。類似ペプチドの同一性は、知られる方法により容易に計算することができる。このような方法には、ComputationalMolecularBiology、LeskAM編、OxfordUniversityPress、NewYork、1988BiocomputingInformaticsandGenomeProjects、SmithDW編、AcademicPress、NewYork、1993ComputerAnalysisofSequenceData、第1部、GriffinAMおよびGriffinHG編、HumanaPress、NewJersey、1994SequenceAnalysisinMolecularBiology、vonHeinjeG、AcademicPress、1987SequenceAnalysisPrimer、GribskovMおよびDevereuxJ編、MStocktonPress、NewYork、1991ならびにCarilloら、SIAMJAppliedMath48、1073頁に記載の方法が含まれるがこれらに限定されない。同一性を決定するのに好ましい方法は、被験配列間で最大のマッチを与えるようにデザインされる。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムにおいて説明されている。2つの配列間の同一性を決定するのに好ましいコンピュータプログラムによる方法には、GAP12、387ウィスコンシン州、マジソン、ウィスコンシン大学、GeneticsComputerGroup、BLASTP、BLASTN、およびFASTA215、403~410頁を含めたGCGプログラムパッケージが含まれる。BLASTXプログラムは、米国立バイオテクノロジー情報センターおよび他の情報源から公開されている。よく知られたSmithWatermanによるアルゴリズムもまた、同一性を決定するのに用いることができる。例えば、コンピュータアルゴリズムであるGAPを用いて、それらの百分率による配列同一性が決定される2つのペプチドを、それら各々のアミノ酸が最適な形でマッチングするように整列させる。ギャップ開始時のペナルティー、ならびにギャップ伸長時のペナルティーのほか、PAM250またはBLOSUM62などの比較行列も、該アルゴリズムと共に用いられる。標準的な比較行列5BLOSUM62比較行列については、Henikoffら、PNASUSA89、10915~10919頁を参照されたいもまた、アルゴリズムによって用いられる。ペプチド配列比較に好ましいパラメータには、以下アルゴリズムNeedlemanら、JMolBiol48、443~453頁比較行列Henikoffら、PNASUSA89、10915~10919頁によるBLOSUM62ギャップペナルティー12ギャップ長ペナルティー4類似性の閾値が含まれる。GAPプログラムは、上記のパラメータにより有用となる。上述のパラメータは、GAPアルゴリズムを用いてペプチド比較を行うためのデフォルトのパラメータである。プロテアーゼとは、加水分解によるペプチド結合の切断を触媒する能力を保有するすべての酵素を包含することを意図する。プロテアーゼは、細胞内プロテアーゼ、細胞内プロテイナーゼ、または細胞内ペプチダーゼの場合もあり、細胞外プロテアーゼ、細胞外プロテイナーゼ、または細胞外ペプチダーゼの場合もあり、膜結合プロテアーゼ、膜結合プロテイナーゼ、または膜結合ペプチダーゼの場合もあり、哺乳動物の腸管内におけるプロテアーゼ、ならびに哺乳動物の血漿中に存在するプロテアーゼを包含する。プロテアーゼは、エンドプロテアーゼおよびエクソプロテアーゼのいずれの種類でもありうる。プロテアーゼは、以下の種類セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼでありうるがこれらに限定されない。プロテアーゼの特定の例は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、因子VIIa、因子Xa、プロテイナーゼK、カルボキシペプチダーゼ、DPPIV、中性エンドペプチダーゼ、グランザイムB、プロリンエンドペプチダーゼ、テルモリシン、トロンビン、ArgCプロテイナーゼ、AspNエンドペプチダーゼ、カスパーゼ1~10、クロストリパイン、エンテロキナーゼ、グルタミルエンドペプチダーゼ、LysC、LysN、およびブドウ球菌属ペプチダーゼIである。タンパク質分解に対して耐性、またはタンパク質分解に対する安定性の増大、またはタンパク質分解による切断に対する安定性の増大、またはタンパク質分解に対する安定性の改善、またはタンパク質分解に対する安定性という用語は互換的に用いられ、同じものを指すことを意図する。本発明のhGH化合物との関連で用いられる該用語は、特定の条件下におけるプロテアーゼによる前記hGH化合物のポリペプチド鎖の切断が、野生型hGHと比較してより遅い速度でなされることを示すことを意図する。タンパク質分解によるタンパク質の切断の速度は、当業者に知られる複数の技法により測定することができる。hGHまたはhGH化合物の分解速度を測定するアッセイの例については、実施例5に記載する。invivoにおける機能的半減期という用語は、その通常の意味、すなわち、ペプチド、例えば、成長ホルモン化合物の生物学的活性の50が、体内標的器官中になおも存在する時間、またはペプチド、例えば、成長ホルモン化合物の活性が、その初期値の50となる時間の意味で用いられる。invivoにおける機能的半減期の決定に対する代替法として、invivoにおける血漿半減期および持続的作用を決定すること、すなわち、除去される前にペプチドの50が血流中を循環する時間を決定することもできる。血漿半減期の決定は、機能的半減期の決定より簡単であることが多く、血漿半減期の大きさは、通常、invivoにおける機能的半減期の大きさについての良好な指標である。アルカンまたはアルキルという用語は、直鎖状、分枝状、およびまたは環状の飽和炭化水素を指すことを意図する。別の炭素原子数で明記されない限り、この用語は、1~20など、1~10、例えば、1~5など、1~30の炭素原子を伴う炭化水素を指すことを意図する。アルキルおよびアルキレンという用語は、それぞれ、対応するラジカルおよびビラジカルを指す。C1~6アルキルという用語は、両端を包含する1~6個の炭素原子を有する、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素を指す。このような基の例には、メチル基、2プロピル基、1ブチル基、2ブチル基、2メチル2プロピル基、2メチル1ブチル基、およびnヘキシル基が含まれるがこれらに限定されない。C3~10シクロアルキルという用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、およびシクロデカニルを指すことが典型的である。アルケンという用語は、少なくとも1つの炭素間二重結合を含む直鎖状、分枝状、およびまたは環状の炭化水素を指すことを意図する。別の炭素原子数で明記されない限り、この用語は、2~20など、2~10、例えば、2~5など、2~30の炭素原子を伴う炭化水素を指すことを意図する。アルケニルおよびアルケニレンという用語は、それぞれ、対応するラジカルおよびビラジカルを指す。アルキンという用語は、少なくとも1つの炭素間三重結合を含む直鎖状、分枝状、およびまたは環状の炭化水素を指すことを意図し、場合によって、1つまたは複数の炭素間二重結合を含みうる。別の炭素原子数で明記されない限り、この用語は、2~20など、2~10、例えば、2~5など、2~30の炭素原子を伴う炭化水素を指すことを意図する。アルキニルおよびアルキニレンという用語は、それぞれ、対応するラジカルおよびビラジカルを指す。ホモ環状芳香族化合物という用語は、ベンゼンおよびナフタレンなど、芳香族炭化水素を指すことを意図する。ヘテロ環状化合物という用語は、そのうちの1、2、3、または4つが、N、O、およびまたはSから選択されるヘテロ原子である、5、6、または7つの環原子を含む環状化合物を指すことを意図する。例には、チオフェン、フラン、ピラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジンのほか、ピペリジン、ピラゾリジン、ピロリジン、ピロリン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペラジン、およびモルホリンなど、それらの部分的または完全な水素化同等物など、ヘテロ環状芳香族化合物が含まれる。ヘテロアルカン、ヘテロアルケン、およびヘテロアルキンという用語は、1つまたは複数のヘテロ原子またはヘテロ基が、前記部分の構造中に挿入されている、上記で定義されたアルカン、アルケン、およびアルキンを指すことを意図する。ヘテロ基およびヘテロ原子の例には、O、S、S、S2、C、C、およびN式中、Rは、水素、またはC1~6アルキルを表すが含まれる。ヘテロアルカンの例には、が含まれる。ラジカルまたはビラジカルという用語は、そこから、それぞれ、1つまたは2つの水素原子が除去されている化合物を指すことを意図する。具体的に言及する場合、ラジカルはまた、化合物から大型の原子団、例えば、ヒドロキシル基をホルマール除去することにより形成される部分も指す場合がある。ハロゲンという用語は、周期表の第7主族のメンバー、例えば、F、Cl、Br、およびIを指すことを意図する。本発明の文脈では、アリールという用語が、炭素環式芳香環ラジカルまたは縮合した芳香環系ラジカルを指すことを意図し、この場合、環のうちの少なくとも1つは芳香環である。典型的なアリール基には、フェニル基、ビフェニリル基、ナフチル基などが含まれる。本明細書で用いられる、単独または組合せにおけるヘテロアリールまたはヘタリールという用語は、例えば、5~7つの環員原子を伴う芳香環ラジカル、または、例えば、7~18の環員原子を伴う縮合した芳香環系ラジカルを指し、この場合、少なくとも1つの環が、1つまたは複数のヘテロ原子を、窒素ヘテロ原子、酸素ヘテロ原子、または硫黄ヘテロ原子から選択される環原子として含有する芳香環であり、Nオキサイド、ならびに一酸化硫黄および二酸化硫黄が、許容可能なヘテロ芳香族置換基である。例には、フラニル、チエニル、チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリル、およびインダゾリルなどが含まれる。モチーフという用語は、スペーサーなど、大型部分内の小型の化学部分を記載するのに用いられ、この場合、このようなモチーフは、1つまたは複数の化学基により形成されうる。残基という用語は、アミノ酸との関連における通常の使用と同等の化学的単位、例えば、共有結合したアミノ酸残基からなるタンパク質またはペプチドについて用いられる。特に、残基という用語は、胆汁酸残基との関連で用いられ、これは、化学的な連結基を介してスペーサーに共有結合させた胆汁酸を指す。本発明の文脈では、薬学的に許容される塩という用語が、患者に対して有害ではない塩を指すことを意図する。このような塩には、薬学的に許容される酸添加塩、薬学的に許容される金属塩、アンモニウム塩およびアルキル化アンモニウム塩が含まれる。酸添加塩には、無機酸の塩ならびに有機酸の塩が含まれる。適切な無機酸の代表的な例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸などが含まれる。適切な有機酸の代表的な例には、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデリン酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモン酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、EDTA、グリコール酸、pアミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、pトルエンスルホン酸などが含まれる。薬学的に許容可能な無機酸添加塩または有機酸添加塩のさらなる例には、参照により本明細書に組み込まれる、JPharmSci66、2において列挙されている、薬学的に許容される塩が含まれる。金属塩の例には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などが含まれる。アンモニウム塩およびアルキル化アンモニウム塩の例には、アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、エチルアンモニウム塩、ヒドロキシエチルアンモニウム塩、ジエチルアンモニウム塩、ブチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩などが含まれる。成長ホルモンコンジュゲート本発明の態様は、成長ホルモン化合物に共有結合させた胆汁酸残基を含む成長ホルモンコンジュゲートに関する。一実施形態では、コンジュゲートを、式AWBGH式中、GHは、成長ホルモン化合物を表し、Aは、胆汁酸残基を表し、Bは、GHに共有結合させた親水性スペーサーを表し、Wは、AとBとを連結する化学基であるおよび薬学的に許容されるその塩により記載することができる。本明細書の下記で説明される通り、このようなコンジュゲートの構成要素は、成長ホルモン受容体に対する刺激効果を維持しながら、さらなる機能性をもたらす、異なる成長ホルモン変異体または成長ホルモン誘導体を組み入れることにより変化させることができる。加えて、成長ホルモンコンジュゲートでは、ヒト成長ホルモンの主要な機能性が通常維持される。ヒト成長ホルモンコンジュゲートのinvitroおよびinvivoにおける活性は、任意の成長ホルモン化合物として調べることができる。成長ホルモン化合物本発明によれば、成長ホルモン化合物が、ヒト成長ホルモンの主要な機能性を保持し、一実施形態では、ヒト成長ホルモンと同一でありうる。本発明の一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1に対して、少なくとも20、少なくとも30など、例えば、少なくとも40、少なくとも50など、例えば、少なくとも60、少なくとも70など、例えば、少なくとも80、少なくとも90などの同一性、例えば、少なくとも95、少なくとも96など、例えば、少なくとも97、少なくとも98などの同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドである。一実施形態では、成長ホルモン化合物のinvitroにおける活性は、配列番号1により定義されるhGHのinvitroにおける活性と同等である。invitroにおける成長ホルモン化合物の活性は、本明細書の方法5で記載されるBAFアッセイで測定することが好ましい。本明細書の下記で記載されるさらなる実施形態では、成長ホルモン化合物の成長ホルモン活性が、BAFアッセイで決定されるhGH活性、およびまたは下垂体切除ラットにおいて決定されるhGH活性の少なくとも5、例えば、少なくとも25など、少なくとも10など、少なくとも1である。一実施形態では、化合物のinvitroにおける活性が、invitroにおけるhGH活性とは異なりうる。上記した通り、invitroにおける活性が低下しても、他の機能性により補完されうる。一実施形態では、invitroにおける活性が、hGH活性の少なくとも1など、少なくとも5など、例えば、少なくとも10、少なくとも25などでありうる。さらなる実施形態では、配列番号1により定義される野生型hGHと比べた化合物のEC50比が、10を超えず、8を超えず、6を超えず、4を超えず、2を超えない。ある実施形態では、配列番号1により定義される野生型hGHと比較した前記化合物のEC50比が、5~001、または3~001など、または2~001などである。代替法では、本発明によるEC50を、方法7で記載する表面プラズモン共鳴解析により測定することができる。対応する実施形態では、SPRにより決定される、invitroにおける活性が、hGH活性の少なくとも1など、少なくとも5など、例えば、少なくとも10、少なくとも25などでありうる。さらなる実施形態では、SPRにより決定される、配列番号1により定義される野生型hGHと比べた化合物のEC50比が、10を超えず、8を超えず、6を超えず、4を超えず、2を超えない。一実施形態では、配列番号1により定義される野生型hGHと比較した前記化合物のEC50比が、5~001、または3~001など、または2~001などである。疑念を回避する目的で述べると、成長ホルモン化合物の活性はまた、これらのアッセイにおいてhGHより高い場合もある。ある方法で成長ホルモン化合物を誘導体化する一実施形態では、誘導体化により活性が顕著に変化しうるので、hGHと比べた成長ホルモンの活性を、誘導体化されていない成長ホルモン化合物において測定することができる。例えば、成長ホルモン化合物のinvivoにおける機能的半減期を延長させる特性修飾基により誘導体化された成長ホルモン化合物の場合、誘導体化された成長ホルモン化合物の活性は、hGHの活性よりはるかに低い場合があるが、この低下は、滞留時間の延長により相殺される。代替的な実施形態では、成長ホルモン活性を、誘導体化されたホルモン化合物において測定することもできる。ならびに、さらなる実施形態では、成長ホルモン活性を、成長ホルモンコンジュゲートおよび任意のさらなる特性修飾的な化学修飾において測定し、このようなコンジュゲーションおよびまたは修飾が、受容体の相互作用に干渉しないことを確認する。試験は、モルベースで、または相対タンパク質ペプチド含量によりhGHと比較されうること、例えば、任意の誘導体またはコンジュゲーションの重量を包含しないことに注意すべきである。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、このようなポリペプチドの断片であり、この断片が、顕著な量の、上記で説明した成長ホルモン活性を保持している。本発明の一実施形態では、成長ホルモン化合物が、hGHの切断形である、すなわち、1つまたは複数のアミノ酸残基が、配列番号1に対応するN末端およびまたはC末端から欠失しているが、前記化合物は、野生型hGHの所望の生物学的特性を保持している。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、invivoにおける半減期を延長させている。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、保管寿命を延長させている。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、融合タンパク質でありうる。本発明の一実施形態では、成長ホルモン化合物が、PEG、炭水化物、アルブミン結合剤、脂肪酸、アルキル鎖、親油性基、ビタミン、またはその側鎖もしくは主鎖に対するスペーサーなどであるがこれらに限定されない部分を結合させることにより化学修飾されている。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、化学修飾されていないhGHまたはhGH変異体と比較した場合、上皮を介する輸送を容易とするために化学修飾されている。化学修飾は、本明細書で説明されるコール酸残基のコンジュゲーションなどでありうる。Caco2細胞アッセイまたはMDCK細胞アッセイなどの異なるアッセイを用いて、細胞層を介する成長ホルモン化合物の輸送を推定することができる。一実施形態では、本発明の成長ホルモン化合物が、invivoにおける作用の持続を延長させるために化学修飾されている。本発明の一実施形態では、成長ホルモン化合物が、invivoにおける機能的半減期の持続を延長させるために化学修飾されている。一実施形態では、成長ホルモン化合物の化学修飾が、一過性の性質でもありうる、すなわち、invivoにおいてそれらはまた、容易に除去することもできる。一実施形態では、成長ホルモン化合物の修飾が、成長ホルモン化合物とヒト成長ホルモン受容体との結合を妨げない任意のアミノ酸残基において生じうる。本明細書の下記で記載されるさらなる実施形態では、コンジュゲーションを、wthGH残基および突然変異体残基から選択される異なる位置で発生させることができる。一実施形態では、コンジュゲーションを、N末端またはC末端を介して結合させる。一実施形態では、コンジュゲーションを、Gln40、およびGln141などのGln残基を介して結合させる。胆汁酸リンカーまたは代替的な誘導体を、突然変異体の残基を介してGHに結合させる、さらなる実施形態では、コンジュゲートのGHが、GHのN末端領域、H1領域、L1領域、H2領域、L2領域、またはH3領域におけるCysによる単一突然変異のうちのいずれか1つから選択される、Cysによる単一突然変異を有しうる。さらなるこのような実施形態では、Cysによる単一突然変異を、N末端に位置させ、突然変異をhGHのT3C、P5C、S7Cのうちのいずれか1つなどとするか、H1に位置させ、突然変異をhGHのD11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35Cのうちのいずれか1つなどとするか、L1に位置させ、突然変異をhGHのQ40C、K41C、Y42C、S55C、S57C、S62Cのうちのいずれか1つなどとするか、H2、L2、またはH3に位置させ、突然変異をhGHのE88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、およびG126Cのうちのいずれか1つなどとする。Cysによる単一突然変異をhGH変異体内に存在させる場合、突然変異は、対応するアミノ酸残基に配置される。さらなる実施形態は、GHコンジュゲートであって、GHにおけるCysによる単一突然変異が、Q40C、S62C、およびL101Cのうちのいずれか1つなど、hGHのT3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Q40C、S55C、S57C、S62C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、およびG126Cのうちのいずれか1つから選択されるGHコンジュゲートを包含する。なおさらなる実施形態では、Cysによる単一突然変異が、hGHにおけるアミノ酸93~106内、またはhGH変異体における対応する残基内に配置される。さらなる具体的な実施形態では、Cysによる単一突然変異が、アミノ酸99~106、もしくはアミノ酸99~103などのL2内、または対応する残基内に配置される。invivoにおける貯留時間が延長された成長ホルモンコンジュゲートを得るためには、成長ホルモン化合物の安定性を最適化し、とりわけ、タンパク質分解を受けにくい成長ホルモン化合物を適用することが有望である。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、プロテアーゼに対する安定性を増大させている。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、タンパク質分解に対する安定性を増大させている。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、膵臓プロテアーゼによるタンパク質分解に対する安定性を増大させている。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、消化管内に存在するプロテアーゼによるタンパク質分解に対する安定性を増大させている。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、哺乳動物の血漿中に存在するプロテアーゼによるタンパク質分解に対する安定性を増大させている。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を有する。ジスルフィド結合は、それらの一方または両方が点変異により野生型hGH配列中の導入される、システイン対の間で形成される。変異部位は、導入されるシステイン残基が、フォールドタンパク質の三次元構造内に適切な形で配置され、ジスルフィド結合の形成を可能とするように選択される。ただ1つのシステインを導入する場合、ジスルフィド結合を形成するときのそのパートナーは、野生型hGHに存在する4つのシステイン残基のうちの1つを包含する。さらなるジスルフィド結合を有するフォールドタンパク質は、適切な宿主生物を介して、可溶性形態のhGHの適切なシステイン変異体を発現させることにより得ることもでき、当業者によく知られている10、31~50頁成長ホルモン化合物の標準的なリフォールディング条件を用いて封入体から回収することもできる。例えば、その結合タンパク質の2つのコピーと複合体化させたhGHの、実験的に決定された三次元構造を用いるコンピュータ計算法により、さらなるジスルフィド結合を導入するための候補位置の同定を支援することができる。ジスルフィド結合を導入するのに適切な位置は、DombkowskiAA、Bioinformatics19、1852~1853頁およびPetersenら、ProteinEng12、535~548頁に記載されるジスルフィド結合についての距離および形態についての基準に基づいて選択することができる。システイン変異体は、導入されるジスルフィド結合が、タンパク質の天然構造を破壊せず、hGHと関連する所望の生物学的活性に対して及ぼす負の影響が最小限であるように選択される。したがって、化合物は、導入されるジスルフィド結合が、hGHRとの相互作用を損なわないように構築される。受容体との相互作用に重要なhGH内の領域は、1HWGから同定されている。したがって、1HWG構造を解析することにより、生物学的活性に関しては中性であるジスルフィド結合を導入するのに適切な位置の選択を誘導することができる。システイン変異体は、導入されるジスルフィド結合が、タンパク質分解による切断に対する安定性を増大させるように選択することができる。タンパク質が、タンパク質分解による切断をどの程度受けやすいかは、部分的には、前記タンパク質のアミノ酸一次配列により規定される。プロテアーゼは、比較的非特異的な場合もあり、選択性の程度を変化させながら、アミノ酸一次配列内の特異的モチーフを認識する場合もある。しかし、タンパク質分解に対する安定性には、基質として作用するタンパク質分子の三次元構造および動態が強く影響する。高度に可撓性で動的なループ構造が、プロテアーゼにより触媒される切断に対して特に脆弱であるのに対し、十分に構造化された領域は、一般にそれほど脆弱ではない。したがって、ジスルフィド結合を導入することにより、タンパク質の力動的領域を安定化させることにより、タンパク質分解による切断に対する保護が得られる。2つのシステイン残基間におけるジスルフィド架橋では、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合の形成を容易にするために、本明細書の上記で定義した領域または位置のうちのいずれかにおいて、システイン残基を導入することもでき、これに置換することもできる。アミノ酸残基の置換および挿入は、当業者に知られる標準的な技法により実施することができる。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1により定義されるhGHと比較して、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む。本明細書で上記した通り、本発明による成長ホルモン化合物のポリペプチドは、配列番号1により同定されるヒト成長ホルモンと高レベルの同一性を有することが好ましい。したがって、配列番号1により定義されるhGHに1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を導入することによりタンパク質分解に対して耐性とした、安定なGH化合物は、本明細書に記載の胆汁酸残基のコンジュゲーションにかけられる。一実施形態では、該成長ホルモン化合物が、タンパク質分解に対して安定化されている。一実施形態では、ループ部分とヘリックス構造との間にジスルフィド結合を導入することにより、成長ホルモン化合物のタンパク質分解に対する増大した安定性を達成する。一実施形態では、ループ部分内にジスルフィド結合を導入することにより、成長ホルモン化合物のタンパク質分解に対する増大した安定性を達成する。一実施形態では、ループ部分間にジスルフィド結合を導入することにより、成長ホルモン化合物のタンパク質分解に対する増大した安定性を達成する。一実施形態では、ヘリックス間にジスルフィド結合を導入することにより、成長ホルモン化合物のタンパク質分解に対する増大した安定性を達成する。一実施形態では、導入されるジスルフィド結合のうちの少なくとも1つが、成長ホルモン化合物の2つのシステイン残基を連結し、前記システイン残基のうちの少なくとも1つは、野生型hGH内には存在しない。一実施形態では、成長ホルモン化合物に導入されるジスルフィド結合が、H3とH4とを連結するループを安定化させる、すなわち、導入されるジスルフィド結合内のシステインのうちの少なくとも1つが、残基128~154を含む部分に配置される。一実施形態では、成長ホルモン化合物に導入されるジスルフィド結合が、DombkowskiAA、Bioinformatics19、1852~1853頁およびPetersenら、ProteinEng12、535~548頁に記載されている距離および形態についての基準を用いて選択されるシステイン残基間に配置される。上記した通り、成長ホルモン化合物は、ポリペプチドのループ部分とヘリックス部分との間を連結するか、またはループ部分内を連結するか、またはループ部分間を連結する、またはヘリックス部分間を連結する、さらなるジスルフィド結合を含む。本出願の目的では、任意のこのようなさらなるジスルフィド結合の位置を、配列番号1で定義されるhGHポリペプチドと関連して説明する。ヘリックス間、ループ間、およびループとヘリックスとの間を連結する結合をもたらす、Cysによる突然変異の非限定的な例を、以下の表に列挙する。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、R16CL117C、A17CE174C、H21CM170C、D26V102C、D26Y103C、N47CT50C、Q49CG161C、F54CY143C、F54CS144C、F54CF146C、S55CY143C、S57CY143C、I58CQ141C、I58CY143C、I58CS144C、P59CQ137C、P61CE66C、P61CT67C、S71CS132C、L73CS132C、L73CF139C、R77CI138C、R77CF139C、L81CQ141C、L81CY143C、Q84CY143C、Q84CS144C、S85CY143C、S85CS144C、P89CF146C、F92CF146C、F92CT148C、R94CD107C、V102CA105C、L156CF146C、L156CT148C、およびまたはV185CS188Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、A17CE174C、H21CM170C、D26V102C、D26Y103C、F54CY143C、F54CS144C、F54CF146C、S55CY143C、S57CY143C、I58CQ141C、I58CY143C、I58CS144C、P59CQ137C、S71CS132C、L81CY143C、Q84CY143C、S85CY143C、S85CS144C、F92CT148C、およびまたはR94CD107Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。本発明による一実施形態では、コンジュゲートの成長ホルモン化合物は、システインのうちの少なくとも1つが、L3、またはアミノ酸135~148、もしくは対応するアミノ酸残基により定義されるループの中央領域などに存在する、さらなるジスルフィド結合を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物のさらなるジスルフィド結合のシステインのうちの少なくとも1つが、L3の、配列番号1中のアミノ酸141、アミノ酸142、アミノ酸143、アミノ酸144、アミノ酸145、またはアミノ酸146、好ましくはアミノ酸143またはアミノ酸144に対応する位置に存在する。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、F54CY143C、F54CS144C、F54CF146C、S55CY143C、S57CY143C、I58CQ141C、I58CY143C、I58CS144C、P59CQ137C、S71CS132C、L73CS132C、L73CF139C、R77CI138C、R77CF139C、L81CQ141C、L81CY143C、Q84CY143C、Q84CS144C、S85CY143C、S85CS144C、P89CF146C、F92CF146C、およびまたはF92CT148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、F54CY143C、F54CS144C、F54CF146C、S55CY143C、S57CY143C、I58CQ141C、I58CY143C、I58CS144C、P59CQ137C、S71CS132C、L81CY143C、Q84CY143C、S85CY143C、S85CS144C、およびまたはF92CT148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。本発明による一実施形態は、成長ホルモン化合物が、L3をL1と連結するさらなるジスルフィド結合を含むコンジュゲートに関する。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1のL3内のアミノ酸54、アミノ酸55、アミノ酸56、アミノ酸57、アミノ酸58、またはアミノ酸59に対応するアミノ酸残基を、配列番号1のL1内のアミノ酸143またはアミノ酸144に対応するアミノ酸と連結するさらなるジスルフィド結合を含む。一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、F54CY143C、F54CS144C、F54CF146C、S55CY143C、S57CY143C、I58CQ141C、I58CY143C、I58CS144C、P59CQ137C、およびまたはS71CS132Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。本発明による一実施形態は、L3をヘリックス2などのヘリックス部分と連結するさらなるジスルフィド結合を含む成長ホルモン化合物に関する。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1のH2内のアミノ酸84またはアミノ酸85に対応するアミノ酸残基を、配列番号1のL3内のアミノ酸143またはアミノ酸144に対応するアミノ酸と連結するさらなるジスルフィド結合を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、L73CS132C、L73CF139C、R77CI138C、R77CF139C、L81CQ141C、L81CY143C、Q84CY143C、Q84CS144C、S85CY143C、S85CS144C、P89CF146C、F92CF146C、およびF92CT148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、L81CY143C、Q84CY143C、S85CY143C、S85CS144C、およびまたはF92CT148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。本発明による一実施形態は、L2をヘリックス1と連結するさらなるジスルフィド結合を含む成長ホルモン化合物に関する。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、D26CV102CまたはD26CY103Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。一実施形態では、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む成長ホルモン化合物は、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびまたはエラスターゼなどの消化性プロテアーゼなど、プロテアーゼによる分解に対して安定化されている。本発明の一実施形態では、成長ホルモン化合物が、トリプシン、キモトリプシン、およびまたはエラスターゼによるタンパク質分解に対する安定性を増大させている。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、キモトリプシンおよびまたはエラスターゼによる分解に対して安定化されている。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、H21M170、D26V102C、D26Y103C、F54CY143C、F54CS144C、S55CY143C、S57CY143C、I58CQ141C、I58CY143C、I58CS144C、P59CQ137C、S71CS132C、L81CY143C、Q84CY143C、S85CY143C、およびまたはS85CS144Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、D26V102C、D26Y103C、S57CY143C、I58CS144C、P59CQ137C、S71CS132C、Q84CY143C、S85CY143C、S85CS144C、F92CT148C、およびまたはR94CD107Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、S57CY143C、Q84CY143C、S85CY143C、およびまたはS85CS144Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。さらなる実施形態では、本発明が、式Iの成長ホルモンコンジュゲートであって、成長ホルモン化合物が、ヒト成長ホルモンと比較して、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合、および少なくとも1つのさらなる単一点突然変異を含む成長ホルモンコンジュゲートに関する。少なくとも1つの単一点突然変異を成長ホルモン化合物中に組み入れうるのは、成長ホルモン化合物の機能性と関連する多様な理由による。前記少なくとも1つのさらなる単一点突然変異は、プロテアーゼに対する安定性をさらに増大させること、およびまたは、例えば、化学修飾に適する化学的実体を含むアミノ酸残基を導入することにより、化学修飾に適する部位をもたらすことを目的としうる。したがって、本発明は、成長ホルモン化合物が、配列番号1により定義されるヒト成長ホルモンと比較して、本明細書で上記した1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合、および少なくとも1つのさらなる単一点突然変異を含む、任意の成長ホルモンコンジュゲートに関する。一実施形態では、成長ホルモン化合物の少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、既知のプロテアーゼ部位に存在する。一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1の1~55、57、58、60~63、67~87、89~91、93、95~100、101、102~128、131~132、135~139、141、142、144、148~182、184、185、およびまたは187~191位に対応する位置に存在する。一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異を、hGHの位置T3、P5、S7、D11、H18、Q29、E30、E33、A34、Y35、E88、Q91、S95、A98、N99、S100、L101、V102、Y103、D107、S108、D112、Q122、およびG126に対応する位置に存在させる。一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1の10、40、41、42、55、57、62、101、134、136、139、142、およびまたは144位に対応する位置に存在する。一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1の55、57、62、101、134、136、139、142、およびまたは144位に対応する位置に存在する。一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1の62、101、134、136、139、142、およびまたは144位に対応する位置に存在する。一実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、L1およびまたはL3に存在し、さらなる実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、L1に存在する。一実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、L1の中央領域に存在する。一実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、配列番号1の40、41、42、55、57、およびまたは62位に対応する位置に存在する。一実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、L3に存在し、さらなる実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、L3の中央領域に存在する。一実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、配列番号1の134、136、139、142、およびまたは144位に対応する位置に存在する。一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異は、配列番号1で定義されるhGHの62位に対応する位置である。一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1で定義されるhGHの62位に対応する位置である。このような一実施形態では、セリンが、トレオニン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、グルタミン、およびグルタミン酸の群から選択されるアミノ酸残基で置換される。一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1で定義されるhGHの55位に対応する位置である。このような一実施形態では、セリンが、トレオニン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、グルタミン、およびグルタミン酸の群から選択されるアミノ酸残基で置換される。一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1で定義されるhGHの57位に対応する位置である。このような一実施形態では、セリンが、トレオニン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、グルタミン、およびグルタミン酸の群から選択されるアミノ酸残基で置換される。本発明によれば、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合が、配列番号1と比較して少なくとも2つのアミノ酸をアミノ酸置換することにより得られる。さらなる実施形態では、化合物が、配列番号1と比較して、正確に1つのさらなるジスルフィド結合を含む。一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物のポリペプチドが、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、少なくとも2つのさらなるシステインを含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドが、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、正確に2つのさらなるシステインを含む。さらなる実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、少なくとも2つのさらなるシステインを含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1と比較して、正確に3つのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、正確に2つのさらなるシステインおよび正確に1つのさらなる単一点突然変異を含む。一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物のポリペプチドが、配列番号1と比較して、最大で合計10カ所のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、最大で7カ所など、最大で6カ所など、最大で5カ所など、最大で4カ所など、最大で合計8カ所のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、正確に3つのさらなるシステインを含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、1つのさらなるジスルフィド結合、およびcysによる単一点突然変異を含む。一実施形態では、Cysによる単一点突然変異が、GHのN末端領域、H1領域、H2領域、L2領域、またはH3領域におけるCysによる単一点突然変異のうちのいずれか1つから選択される。一実施形態では、成長ホルモン化合物は、hGHのT3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Q40C、S55C、S57C、S62C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、およびG126Cに対応する突然変異の群から選択される、Cysによる単一点突然変異を有する。一実施形態では、成長ホルモン化合物は、hGHにおけるアミノ酸99~106、またはアミノ酸99~103など、アミノ酸93~106に対応する位置に配置される、Cysによる単一点突然変異を有する。一実施形態では、cysによるさらなる単一点突然変異が、N99C、S100C、またはL101Cである。一実施形態では、cysによるさらなる単一点突然変異が、hGHにおけるアミノ酸55~62に対応する位置に配置される。一実施形態では、cysによるさらなる単一点突然変異が、S55C、S57C、またはS62Cである。一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物のポリペプチドが、配列番号1と比較して、最大で合計10カ所のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、最大で7カ所など、最大で6カ所など、最大で5カ所など、最大で4カ所など、最大で合計8カ所のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物のポリペプチドが、配列番号1と比較して、正確に3カ所のアミノ酸置換を含む。その中にさらなるジスルフィド架橋を導入しうるGH化合物の他の例には、参照により本明細書に組み込まれる、WO9209690、US6004931、US6143523、US6136536、US6057292、US5849535、WO9711178、WO9004788、WO02055532、US5951972、US20030162949において開示されるGH化合物が含まれる。含まれるさらなる例は、MasudaNら、BiochimBiophysActa949、125~131頁により説明される、20kDaの変異体など、hGHの天然変異体である。本明細書に記載のすべての実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1の120位に対応する位置にGly残基を有することがさらなる選択肢である。本明細書で記載される成長ホルモンポリペプチドは、当業者により、方法1および2に従い、本明細書の下記で説明される通りに調製することができる。ポリペプチドの作製は、当技術分野でよく知られている。例えば、ポリペプチドは、古典的なペプチド合成、例えば、tertBoc化学反応もしくはtertFmoc化学反応を用いる固相ペプチド合成、または他の十分に確立された技法により作製することができる。ポリペプチドはまた、その発現を可能とする条件下にある適切な栄養培地中においてそれをコードするDNA配列を含有し、それを発現させることが可能な宿主細胞を培養するステップを含む方法によっても作製することができる。非天然のアミノ酸残基を含むポリペプチドの場合、例えば、tRNA変異体を用いることにより、該非天然アミノ酸が、ポリペプチド内へと組み込まれるように、組換え細胞を改変すべきである。ポリペプチドはまた、細胞を含まない、invitroにおける転写翻訳系を用いても作製することができる。新規の非天然アミノ酸を含有するポリペプチドはまた、例えば、JAmChemSoc125、11782~11783頁Science301、964~967頁Science292、498~500頁Science303、371~373頁ならびに本明細書の参考文献中に記載される通り、フレームシフト系またはナンセンス抑制系を用いても作製することができる。細胞を培養するのに用いられる培地は、適切な補充物質を含有する最小培地または複合培地など、宿主細胞を増殖させるのに適する、任意の従来の培地でありうる。適切な培地は、市販品の販売元から販売されているか、または公表されているレシピに従い調製することができる。次いで、遠心分離または濾過により宿主細胞を培地から分離するステップを含めた従来の手順により、細胞が生成するペプチドを、培地から回収することができる。細胞外生成物については、対象となるポリペプチドの種類に応じて、濾過、カラムクロマトグラフィー、または沈殿、例えば、精密濾過、限外濾過、等電沈殿、各種のクロマトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを介する精製により、上清のタンパク質成分を単離する。細胞内生成物またはペリプラズム生成物の場合は、培地から単離した細胞を、分解するかまたは透過させて抽出し、生成物であるポリペプチドまたはその前駆体を回収する。ポリペプチドをコードするDNA配列は、適切な形でゲノムまたはcDNAに由来することが可能であり、例えば、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを作製し、標準的な技法に従い、特異的なDNAプローブまたはRNAプローブを用いるハイブリダイゼーションにより、該ペプチドの全部または一部をコードするDNA配列についてスクリーニングすることにより得ることができる。ポリペプチドをコードするDNA配列はまた、確立された標準的な方法、例えば、BeaucageおよびCaruthers、TetrahedronLetters22、1859~1869頁により記載されるホスホルアミダイト法、またはMatthesら、EMBOJournal3、801~805頁により記載される方法を介する合成によっても調製することができる。DNA配列はまた、例えば、US4683202またはSaikiら、Science239、487~491頁に記載される特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によっても調製することができる。発現させるペプチドをコードするDNA配列を、組換えDNA手順にかけることが簡便でありうる任意のベクター内に挿入することができるが、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多い。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その複製が、染色体の複製から独立している染色体外の実体、例えば、プラスミドとして存在するベクターでありうる。代替的に、ベクターは、宿主細胞内へと導入されると、宿主細胞のゲノム内へと組み込まれ、それが組み込まれた染色体と併せて複製されるベクターでもありうる。ベクターは、ポリペプチドをコードするDNA配列が、プロモーターなど、DNAの転写に必要とされるさらなる部分へと作動的に連結される発現ベクターでありうる。プロモーターは、選択される宿主細胞内において転写活性を示す任意のDNA配列であることが可能であり、該宿主細胞と同種または異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。各種の宿主細胞内で発現させるペプチドをコードするDNAの転写を誘導するのに適切なプロモーターの例は当技術分野で知られており、例えば、Sambrookら、前出を参照されたい。発現させるペプチドをコードするDNA配列はまた、必要な場合、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、および翻訳エンハンサー配列にも作動的に連結することができる。本発明の組換えベクターは、対象の宿主細胞内でベクターを複製することが可能なDNA配列をさらに含みうる。ベクターはまた、選択マーカー、例えば、その産物が、宿主細胞内における欠損を補完する遺伝子、または薬物、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートに対する耐性を付与する遺伝子も含みうる。大規模生産の場合、選択マーカーは、例えば、抗生剤耐性ではない場合がある、例えば、ベクター内における抗生剤耐性遺伝子は、該ベクターを大規模生産に用いるときに除去される場合がある。ベクターから抗生剤耐性遺伝子を除去する方法は、当技術分野で知られている。発現させるペプチドを、宿主細胞の分泌経路内へと誘導するために、組換えベクター内に分泌シグナル配列を施すことができる。分泌シグナル配列は、適正なリーディングフレーム内においてペプチドをコードするDNA配列に結合する。分泌シグナル配列は、ペプチドをコードするDNA配列に対して5’側に配置することが一般的である。分泌シグナル配列は、ペプチドと通常の形で会合する配列の場合もあり、別の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来する場合もある。発現させるペプチドをコードするDNA配列、プロモーター、ならびに、場合によって、ターミネーターおよびまたは分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを、複製に必要な情報を含有する適切なベクター内へと挿入するのに用いられる手順は、当業者によく知られている。DNA配列または組換えベクターを導入する宿主細胞は、本ペプチドを生成することが可能な任意の細胞であることが可能であり、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、および高等真核細胞を包含する。当技術分野でよく知られ、用いられている適切な例は、大腸菌細胞株、出芽酵母細胞株、または哺乳動物のBHK細胞株もしくはCHO細胞株であるがこれらに限定されない。発現させるペプチドはまた、当技術分野でよく知られる、invitroにおける転写翻訳系を用いることによっても作製することができる。胆汁酸リンカーある態様における本発明は、胆汁酸リンカーに関する。本発明による成長ホルモンコンジュゲートは、下記の化学反応の節において説明される通りに調製することができる。コンジュゲーションの方法は、胆汁酸リンカーの共有結合を伴うが、これは、用いられる方法に応じて、式AWB1NH2、AWB1CHO、AWB1LG、AWB1CNHCH2CHCH2、および式中、Aは、胆汁酸残基を表し、B1は、親水性スペーサーを表し、Wは、AとB1とを連結する化学基であるにより記載することができる。A、W、およびB1に関するさらなる詳細を、胆汁酸残基、スペーサー、および連結基Wとの関連で下記に示す。B1は、以下AWB1NH2→AWB1NHGH→AWBGHAWB1CHO→AWB1CH2GH→AWBGHAWB1LG→AWB1GH→AWBGHAWB1CNHCH2CHCH2→AWB1CNHCH2CH2CH2GH→AWBGHNHCH2CH2CH2、およびに記載される通り、Bの一部として見ることができる。胆汁酸残基胆汁酸は、天然において多様な形態で生成するが、成長ホルモン化合物にコンジュゲートする前に、さらに修飾にかけることができる。本発明によれば、成長ホルモンコンジュゲートは、コラン酸、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、リトコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、およびタウロケノデオキシコール酸からなる群から選択される胆汁酸残基を含む。一実施形態では、胆汁酸リンカーおよびまたは成長ホルモンコンジュゲートが、式中、は、Wを介する親水性スペーサーへの結合点を表すからなる群から選択される胆汁酸残基を含む。一実施形態では、胆汁酸残基が、コール酸残基であり、このようなコール酸残基が、式中、は、Wを介する親水性スペーサーへの結合点を表すからなる群から選択される。上記から見られる通り、一実施形態では、コール酸残基を、コール酸残基の3位、7位、12位、または24位により、Wを介して親水性スペーサーに連結することができる。一実施形態では、コール酸残基を、3位、7位、または12位により、Wを介して親水性スペーサーに連結することができる。一実施形態では、コール酸残基を、3位により、Wを介して親水性スペーサーに連結することができる。一実施形態では、コール酸残基を、7位により、Wを介して親水性スペーサーに連結することができる。一実施形態では、コール酸残基を、12位により、Wを介して親水性スペーサーに連結することができる。親水性スペーサー胆汁酸リンカーおよびまたは成長ホルモンコンジュゲートは、親水性スペーサーの存在によりさらに特徴づけられる。親水性スペーサーは、胆汁酸リンカーの機能性を最適化するために、成長ホルモン化合物および胆汁酸残基からの適切な距離をもたらすことを目的とする。コンジュゲートのより優れた合成またはより優れた副次的効果などのさらなる機能性は、スペーサー基のほか、個別のリンカーとも関連しうる。親水性スペーサーの可溶性は、そのlogP値により記載することができる。分配係数としてもまた知られるlogPとは、平衡にある2つの不混和性溶媒の混合物の2つの相における化合物の濃度比の対数である。溶媒のうちの1つが水であるのに対し、第2の溶媒は、オクタン1オール、クロロホルム、シクロヘキサン、およびプロピレングリコールジペラルゴネートから選択されることが典型的である。これらの異なる溶媒中で測定されるlogP値は、主に、水素結合の効果のために、差違を示す。オクタノールが、水素結合を与えかつ受け取るのに対し、シクロヘキサンは不活性である。クロロホルムが水素結合を与えうるのに対し、PGDPは水素結合を受け取りうるのみである。本発明の別の実施形態では、親水性スペーサーの、オクタン1オール、クロロホルム、シクロヘキサン、またはプロピレングリコールジペラルゴネートにおけるLogPが、05未満である。さらなる実施形態では、親水性スペーサーの、オクタン1オール、クロロホルム、シクロヘキサン、またはプロピレングリコールジペラルゴネートにおけるLogPが、1未満である。代替的に、公表されているアルゴリズム、86、5175~5180頁、ANewSubstituentConstantDerivedfromPartitionCoefficients、CALipinskiら、AdvancedDrugDeliveryReviews、23、3~25頁、ExperimentalandComputationalApproachestoEstimateSolubilityandPermeabilityinDrugDiscoveryandDevelopmentSettings、ならびにIMoriguchi、SHirono、INakagome、HHirano、ChemPharmBull、42、976~978頁、ComparisonofReliabilityoflogPValuesforDrugsCalculatedbySeveralMethodsを用いて、親水性スペーサー部分のmLogPおよびまたはcLogPとして、LogP値を計算することもできる。本発明の一実施形態では、親水性スペーサーが、mLogP97である。方法3コール酸コンジュゲート化合物の調製方法1一般式をAWB1CHOとする胆汁酸リンカーの、GH化合物のN末端フェニルアラニンへの連結対象の胆汁酸リンカーは、ジアルキルアセタール2として合成されることが典型的であり、コンジュゲーションの前に遊離アルデヒドへと転換することが必要である。これは、以下の通りに行うことができる。胆汁酸リンカーであるジアルキルアセタールを、酸で処理し、蒸発させて乾燥させる。得られた遊離アルデヒドを、さらなる精製なしに用いる。次いで、1NのNaOHを添加することによりpHを70に維持しながら、緩衝液中のGH溶液を少しずつ添加する。次いで、水中で溶解させたNaCNBH3を、5分間隔で少しずつ添加する。1時間にわたる撹拌後に清明な溶液が得られることが典型的である。反応フラスコをスズ箔でラッピングし、反応混合物を、室温で一晩にわたり静かに撹拌する。LCMSにより反応試料を解析して、生成物の形成を検証する。次いで、IEXクロマトグラフィーおよびHICクロマトグラフィー、サイズ除外カラム、ならびに限外濾過の組合せを用いて、hGHコンジュゲートを精製する。通常、純度を95以上とするコンジュゲートが得られる。2一般式をAWB1NH2とする胆汁酸リンカーの、トランスアミノ化および酸化されたGH化合物への連結GHのグルタミン残基にアルデヒドハンドルを結合させるためのトランスグルタミナーゼの使用については、WO2005070468において既に説明されている。この方法は、本発明に従い、式をAWB1NH2とする胆汁酸ベースのリンカーを結合させるのに用いることができる。用いられるTGアーゼは、US5156956によるストレプトバーチシリウムモバラエンスに由来する微生物性トランスグルタミナーゼである。反応は、以下の通りに実施することができる。WO2005070468において説明される通り、まず、GHを、13ジアミノ2プロパノールでトランスアミノ化する。次のステップでは、トランスアミノ化されたGHに、過ヨウ素酸を添加する。酸化は、場合によって、暗所内で、30分間にわたり、4~10°Cなどの低温で行うことが典型的である。過ヨウ素酸は、GHにおけるメチオニン残基を、それらの対応するメチオニンスルホキシド残基へと酸化する可能性がある。この酸化の危険性を最小化するため、過ヨウ素酸による酸化時に、低分子の有機チオエーテルを添加することができる。適切な有機チオエーテルは、3メチルチオプロパン1オールであるが、当業者は、他の有機チオエーテルも示唆することができるであろう。トランスアミノ化されたGH化合物の酸化ナトリウムシアノボロハイドライドを効率的に還元するのに必要とされる酸溶液を得るために、緩衝液の交換を実施することができる。通常、過剰量のAWB1NH2アミンを用い、ナトリウムシアノボロハイドライドを、ある時間にわたり少量で添加することができる。胆汁酸リンカーによるの還元的アミノ化その後の反応は、以下の通りに実施することができる。酸化されたトランスアミノ化GHに、AcOHとpH600の50mMMESとの混合物中の胆汁酸リンカー溶液を添加する。結果として得られる反応混合物をRTで30分間にわたり静かに振とうし、このとき、NaCNBH3溶液中に溶解させた22mgのNaCNBH3を添加する。試料をスズ箔で覆い、RTで一晩にわたり撹拌する。コンジュゲートは、アニオン交換クロマトグラフィーにより以下の通りに単離することができる。AmiconUltra15デバイスを用いて、4000rpm分で3×8分間にわたる遠心分離を介し、純水で緩衝液交換することにより、酢酸を除去する。次いで、AmiconFilterデバイスを用いて、混合物を、20mMのTEA、pH850へと緩衝液交換し、20mMのTEAで50mLの最終容量へと希釈してから、それを、HiLoadQSepharose、2610カラムへとロードした。まず、カラムを20mMのTEA、pH850で洗浄し、次いで、2mL分の流速で、20CVにわたる0~100の勾配を用いて、20mMのTEA、500mMのNaCl、pH850で溶出させる。プールした画分は、AmiconUltra15デバイスを用いて、4000rpm分で3×8分間にわたる遠心分離により、5回にわたり、純水中に10mMの重炭酸アンモニウムへと緩衝液交換した。3一般式をAWB1LGとする胆汁酸リンカーの、単一の内部遊離cysを有するGH化合物への連結1適切な選択的還元剤Hによる、ジスルフィドの還元を介する遊離CysGHの脱離2脱離基で活性化された胆汁酸リンカーで遊離CysGHをアルキル化することにより、CysにおいてコンジュゲートされたGH化合物をもたらすシステイン残基は、場合によって、Rを低分子の有機部分とする混合ジスルフィドとして保護する。混合ジスルフィドの非限定的な例には、シスタミン、システインOHNH2、ホモシステインOHNH2、およびグルタチオンNHCH2COHNHCCH2CH2CHOHNH2とのジスルフィドが含まれる。誘導体化工程では、胆汁酸リンカーであるAWB1LG式中、LGは、Cl、Br、Iなどの無機脱離基、またはメシル酸もしくはトシル酸などの有機脱離基を表すを用いる。GHのAWB1LGとのコンジュゲーションは、求核的置換により発生させる。誘導体化工程で、反応基として、アクリル官能基のマレイミドを用いる場合は、マレイミド官能基またはアクリル酸官能基の二重結合へのスルフィド付加により、コンジュゲーションを発生させる。本明細書で説明される通りに調製されるGHコンジュゲートは、HPLC、サイズ除外クロマトグラフィーなどの標準的な方法により精製することができるが、イオン交換クロマトグラフィーによっても精製することができる。上記で説明された一般的な連結法は、例示的な目的のためだけに用いられるものであり、当業者は、コンジュゲートを調製するために、他の緩衝液、精製法、および反応条件も選択しうることに注意されたい。方法4精製された成長ホルモン化合物に対するタンパク質化学による特徴づけMALDITOF質量分析AutoflexMALDITOF測定器を用いて、分子量を決定した。試料は、αシアノ4ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして用いて調製した。MALDIMSを用いて、完全精製タンパク質を解析した。観察された質量は、アミノ酸配列から推定される理論的質量と符合した。トリプシンおよびAspNによる消化の後、DTTによるジスルフィド結合の還元前および還元後においてこの消化物のMALDIMS解析を用いるペプチドマッピングにより、各化合物中のジスルフィド結合についての結合を裏付けることができる。キャピラリー電気泳動AgilentTechnologies3DCEシステムを用いて、キャピラリー電気泳動を実施した。データ収集およびシグナル処理は、AgilentTechnologies3DCEChemStationを用いて実施した。キャピラリーは、Agilent製で645cmおよび内径50μmのExtendedLightPathCapillaryとした。UV検出は、200nmで実施した。泳動電解質は、pH7の50mMリン酸緩衝液とした。01MのNaOHで3分間にわたり、次いで、MilliQ水で2分間にわたり、さらに、電解質で3分間にわたり、キャピラリーを条件付けした。各泳動後、キャピラリーをMilliQ水で2分間にわたり、次いで、リン酸で2分間にわたり、さらに、MilliQ水で2分間にわたりフラッシュした。流体力学的注入は、50ミリバールで40秒間にわたり行った。電圧は、25kVとした。キャピラリーの温度は、30°Cとし、泳動時間は、105分間とした。RPHPLCRPHPLC解析は、46mm×250mmおよび5μmのVydac218TP54C18シリカカラムを用いるAgilent1100システム上で実施した。検出は、214nm、254nm、280nm、および301nmのUVを介した。カラムは、01のTFAH2Oで平衡化し、試料は、01のTFAH2Oに対して適切な0~90のMeCN勾配により溶出させた。LCMSLCMS解析は、2つのPerkinElmerSeries200Microポンプ、PerkinElmerSeries200オートサンプラー、AppleidBiosystems785AUV検出器、およびSedex75EvapoativeLightsattering検出器を装備したPESciexAPI100質量分析器またはPESciexAP150質量分析器上で実施した。30mm×50mmおよび5μmのWatersXterraC18シリカカラムを、RT、15mL分で溶出させた。このカラムを、5のMeCN01のTFAH2Oで平衡化し、5のMeCN01のTFAH2Oで10分間にわたり、次いで、90のMeCN01のTFAH2Oまでの直線勾配で7分間にわたり溶出させた。検出は、214nmにおけるUV検出およびEvaporativelightScatteringを介した。カラム溶出物の画分は、PESciexAPI100質量分析器のイオンスプレーインターフェースへと導入した。解析中は、300~2000amuの質量範囲を2秒間ごとに走査した。タンパク質の定量化NanoDropND1000UV質量分析器を用いて、280nmにおける吸光度を測定することにより、タンパク質濃度を推定した。誘導体化部位を決定するための酵素的ペプチドマッピング還元およびアルキル化されたタンパク質のAspN消化を用いて、ペプチドマッピングを実施した。まず、標準的な手順により、タンパク質をDTTおよびヨードアセトアミドで処理した。HPLCを用いて、アルキル化された生成物を精製した。続いて、精製されたアルキル化生成物を、酵素基質比を1100とするエンドプロテアーゼAspNにより、一晩にわたり消化した。消化物は、C18カラムおよび標準的なTFAMeCN緩衝液系を用いて、HPLC分離した。結果として得られるペプチドマップを、誘導体化されていないhGHのペプチドマップと比較し、貯留時間の異なる画分を回収し、MALDITOF質量分析を用いてさらに解析した。SDDPAGENuPAGEを4~12とするビストリスゲルを用いて、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。ゲルは、銀染色またはクーマシー染色した。タンパク質クロマトグラフィータンパク質クロマトグラフィーは、GEHealthCare製のAektaExplorerクロマトグラフィーシステムおよびカラム上で実施した。QSepharoseHP2610カラムを用いて、アニオン交換を行った。出発緩衝液は、pH85の20mMトリエタノールアミン緩衝液とし、溶出緩衝液は、出発緩衝液02MNaClとした。化合物は、勾配を0~75とする溶出緩衝液により、15カラム容量にわたり溶出させることが典型的であった。脱塩処理および緩衝液交換は、HiPrep2610カラムを用いて実施した。TNBS試験DMF中に10のDIPEA溶液および1MのTNBS水溶液を調製した。小型の試験管内に数個の樹脂ビーズを入れ、各溶液を1~3滴ずつ添加した。短い混合時間の後、混合物をRTで10分間にわたり放置した後、ビーズを目視した。強い橙色または赤色のビーズは、陽性の結果を示し、黄色またはわずかに橙色のビーズは、弱い陽性を示し、無色のビーズは陰性とする。方法5精製された成長ホルモン化合物の生物学的活性についての解析細胞ベースの受容体能による増殖アッセイ、すなわちBAFアッセイにより、hGH化合物の生物学的活性を測定する。該方法は、hGH化合物に対する一般性を示す。BAF3細胞は、増殖および存続についてIL3依存性である。IL3は、それらが刺激されるとGHが活性化される同一のメディエーターであるJAK2およびSTATを活性化する。BAF3細胞に、hGH受容体を含有するプラスミドをトランスフェクトする。hGHにより刺激されると増殖することが可能なクローンを、本明細書の下記でBAF3GHRと称する、hGH依存性細胞株へと転換する。該細胞株は、用量に比例する増殖パターンによりGHに反応し、したがって、これらを増殖アッセイにおいて用いて、異なるhGH化合物の効果を評価することができる。37°C、5CO2で24時間にわたり、飢餓培地中でBAF3GHR細胞を増殖させた。細胞を遠心分離し、培地を除去し、細胞を飢餓培地中に再懸濁させ、細胞222×105個mlとした。90μlの細胞上清の一部を、マイクロ滴定プレート内に播種する。細胞に、異なる濃度の成長ホルモン化合物を添加し、37°C、5CO2で72時間にわたりプレートをインキュベートする。AlamarBlueは、細胞代謝に生得の反応により還元され、したがって、生細胞数の間接的な測定値を提供する、AlamarBlueという酸化還元指示薬である。AlamarBlueを6倍に希釈し25μlの飢餓培地、30μlの希釈されたAlamarBlueを各ウェルに添加する。次いで、細胞をさらに4時間にわたりインキュベートする。最後に、544nmの励起フィルターおよび590nmの発光フィルターを用いる蛍光プレートリーダーにより、細胞の代謝活性を測定する。所与の化合物についての結果を、前記化合物のEC50と、並行して測定したwthGHのEC50との比として表現する。方法6下垂体切除SpragueDawleyラットにおける、invivo用量反応試験以前の3A雄の下垂体切除SpragueDawleyラットにおいて、invivoの用量反応関係を調べることができる。下垂体切除ラットは、よく知られて認知された、成長ホルモン欠損の動物モデルであり、手術により下垂体を除去した後では、成長ホルモンの生成が生じない。これはまた、ヒトにおける成長ホルモン欠損の別の重要な臨床特徴である、循環インスリン様成長因子1レベルの低下ももたらす。体重90~100gの4週齢の雄ラットに対して、下垂体切除術を実施する。手術の3~4週間後に、体重100~110gの動物を試験に組み入れた。手術後3~4週間の間に、体重が10を超えて増加した動物は、試験に組み入れなかった。通常、下垂体切除SpragueDawleyラット70匹を、各群10匹ずつ7つの投与群に無作為に割り当てる。1つの群には媒体だけを施し、非治療対照群として用いた。3つの群には、被験化合物を、それぞれ33、33、033ナノモルずつ施し、3つの群には、対照薬としてのhGHを50、50、および05ナノモルずつ施した。化合物および媒体のいずれも、頸部での単回の皮下投与として投与した。1週間にわたり、毎日午前8~10時に体重を測定した。0日目の体重を7日目の体重と比較することによって、用量依存的な形での体重の増加の評価を得ることができる。パラメータEmax、E0、およびED50の推定値を計算するため、非線形回帰分析により、S字型用量反応曲線の式により実験データを近似する。該式は、GraphPadPrismversion400forWindowsに内蔵されるS字型用量反応曲線の式である。パラメータ推定値および95信頼区間を含めたデータが通常提示される。パラメータE0およびEmaxの推定値については、hGHQ84C、Y143Cと、hGHとで差が観察されなかった。しかし、hGHQ84C、Y143Cでは、ED50が、hGHと比較して著明に低値であったことは、hGHQ84C、Y143Cのinvivoにおける効力が高いことを示す。方法7表面プラズモン共鳴解析による受容体相互作用試験表面プラズモン共鳴解析を用いて、hGH化合物の受容体相互作用について解析することができる。この方法は、hGH化合物について一般性がある。BiacoreT100測定器を用いる表面プラズモン共鳴により、hGH結合タンパク質との、hGHおよび類似体の相互作用を調べる。製造元の指示書に従い、典型的には5000RUのレベルで、抗hGHmAbを、CM5チップ上へと固定化する。ランニングバッファー中10~25μgmlでwthGHまたは類似体を捕捉し、この結果、250~400RUのリガンドが捕捉された。その後、30ml分で、該表面全体に、0~800nMの濃度のhGHBPを注射する。抗hGHmAbを固定化させているがhGHが捕捉されなかった表面を、基準として用いる。11のラングミュア結合モデルを伴う、BiacoreEvaluationSoftware20により、反応速度データを解析した。方法8プロテアーゼによる野生型hGHおよびGH化合物の分解速度を測定するアッセイ37°Cで最長24時間にわたり、適切な緩衝液中における関与性のプロテアーゼにより、対象の化合物を消化させた。タンパク質分解は、HPLCアッセイにより評価する。タンパク質分解による消化重炭酸アンモニウム緩衝液中1mgmlの被験化合物溶液100μLを、37°Cで最長24時間にわたり、酵素により分解させる。各時点に対応する部分試料を採取し、1TFA中への10倍希釈を介して該試料を酸化させることにより、タンパク質分解反応を停止させる。逆相HPLCによりこれらの希釈試料を解析して、タンパク質分解による消化の程度を推定する。HPLC法水中に01TFA~01TFA含有100MeCNの直線勾配により溶出させる2×150mmのVydacC4逆相カラム上に、30分間にわたり、02ml分の流速で、10μLの上記溶液を注射する。214nmにおけるUV吸収により、ピークの検出を実施する。時点tTにおけるピーク面積と、時点t0におけるピーク面積とから、×100として、時点tTにおける完全化合物を計算する。下記の例に示す結果は、4時間後に得られた。GraphPadPrismソフトウェアver501を用いて、完全化合物を時間に対してプロットする。また、GraphPadPrismソフトウェアにより、1相減衰としてのT12も計算する。実施例で用いられる酵素は、エラスターゼおよびキモトリプシンである。緩衝液は、pH85の50mM重炭酸アンモニウムである。方法9ゲッチンゲンミニブタへの腸内投与および静脈内投与を介する成長ホルモン化合物の薬物動態特性研究では通常、EllegaardGoettingenMinipigsASから得られる、体重約30kgの雄ゲッチンゲンミニブタ8匹を用いる。2週間の馴致期間の後、動物を手術にかけ、各動物に2本ずつの中央静脈カテーテルを挿入する。術後、動物は、それらの通常の個別の檻に収容する。動物の体重は、投与前に測定する。腸内投与を施す動物の場合は、消化管内に異物が存在しないことを確保するために、投与の2日前に檻から藁および寝床材料を除去する。静脈内投与の場合は、短い中央カテーテルを介して20ナノモルkgを施し、投与後、2mLの生理食塩液でフラッシュする。腸内投与の場合は、内視鏡を介して800ナノモルkgを投与する。胃内視鏡は、経口挿入し、食道および胃を経て、幽門を介して、空腸へと通す。空腸に被験処方物を放出し、胃内視鏡を引き抜く。投与手順中は、ミニブタをSedatorおよびPropofolで鎮静させ、手順後は、Antisedanを筋肉内に施す。血液試料は、通常以下の時点静脈内投与投与前、投与の15分間後、30分間後、45分間後、1、15、2、3、4、6、8、24、48、および72時間後腸内投与投与前、投与の5分間後、15分間後、30分間後、45分間後、1、15、2、3、4、6、8、24、48、および72時間後に回収する。各試料採取時には、各動物から2mLずつの血液を採取する。血液試料は、中央カテーテルを介して採取する。各血液試料を採取した後は、カテーテルを、生理食塩液中に5mLのヘパリンですすぐ。試料採取時には、最初の1mLの血液を廃棄する。細菌汚染および凝固の危険性を回避するため、血液試料採取時には、滅菌法が必要とされる。血液試料は、8mMのEDTAを含有する試験管内に回収する。血液試料は、最大20分間にわたり氷上に保ってから、遠心分離にかける。即座に血漿を回収し、アッセイするまで20°Cで保存する。被験化合物について、血漿試料を解析する。モルモット抗hGHポリクローナル抗体を捕捉抗体として用い、ビオチニル化hGH結合タンパク質を検出タンパク質として用いる、サンドウィッチELISAにより被験化合物濃度を決定する。アッセイの検出限界を02nMとする。静脈内投与の場合は、化合物を、20mgmLのグリシン、2mgmLのマンニトール、pHを82へと調整した24mgmLのNaHCO3中に06mMまで溶解させる。腸内投与の場合は、化合物を、20mgmLのグリシン、2mgmLのマンニトール、pHを82へと調整した24mgmLのNaHCO3中に6mMまで溶解させる。方法10SpragueDawleyラットへの腸内投与を介する成長ホルモン化合物の薬物動態特性通常、TaconicMBから、約250~300gのSpragueDawleyラット24匹を得る。動物は、各ケージ内の動物を4~5匹ずつとするIV型ケージ内に収容する。研究中、ラットは、飲用水へのアクセスが自由であるが、投与前の18時間にわたり絶食させる。絶食中、動物は、ケージ内の寝床材料または営巣材料なしの格子上に置き、少なくとも18時間にわたる絶食時間を確保するために、投与前日の午後2時に食物を取り去る。絶食時間中、動物は、飲用水へのアクセスが自由である。手術日には、鎮痛剤の用量計算を正確とするため、麻酔の前にラットの体重を測定する。体重測定の直後、動物には、生理食塩液中で50mgmLに希釈したRimadylVetの鎮痛剤前投与を、01mL100gで皮下に施す。研究は滅菌研究ではないが、手術手順は、可能な限り無菌的に実施する。手術部位を、70エタノールで消毒し、手術部位の汚染を最小化するように注意を払う。動物が入眠するまでの初期には、ラットに3のイソフルランで麻酔をかけ、次いで、手術の残りの時間では、イソフルランを2~25へと低減する。手術前に、腹部を剃毛し、70のエタノールで消毒する。手術の直前、各ラットには、生理食塩液中で03mgmLに希釈したTemagesicの皮下投与を、0125mL100gで施す。動物を一晩にわたり静置する場合は、投与の1時間後および投与の6~8時間後に同じ用量を施す。麻酔中は、皮膚の色および呼吸に特に重点を置きながら、ラットを持続的にモニタリングする。オピオイドを用いると、体温の喪失が引き起こされる可能性があるので、研究中は、ラットを、37°Cの温熱ラックに置く。麻酔をかけたラットは、背部が温熱毛布または断熱プレートに接するように寝かせる。皮膚に正中線切開を施す。剣状軟骨の約1cm下方から白線に沿って、腹腔内に2cmの切開を施す。顕著な屈曲をもたらす、幽門から約50~60cmの空腸部分を、腹部脂肪層の下方に同定する。被験化合物を、G27シリンジを用いる腸内注射を介して空腸へと送達する。投与後は、注射針を注意深く引き抜き、注射針の孔は、Histoacrylの滴下により閉止する。30秒後、腸を腹部内に戻し、創傷端がぴったりと縫合されるように、手術用縫合剤により腹部壁を閉止する。創傷用クリップを用いて皮膚を閉止する。創傷を閉止した後、ラットの脇腹の皮下に2mLの生理食塩液を施し、脱水を回避し、加熱ランプ下にある特別回復ケージ内に入れる。麻酔から完全に回復したら、動物を、温熱ラック内の通常ケージに入れる。以下の時点投与前、投与の05、1、2、3、4および6時間後において、全ての動物の尾静脈から200μLずつの血液試料を回収する。血液試料は、8mMのEDTAを含有する試験管内に回収する。血液試料は、最大20分間にわたり氷上に保ってから、遠心分離にかける。即座に血漿を回収し、アッセイするまで20°Cで保存する。被験化合物について、血漿試料を解析する。モルモット抗hGHポリクローナル抗体を捕捉抗体として用い、ビオチニル化hGH結合タンパク質を検出タンパク質として用いる、サンドウィッチELISAにより被験化合物濃度を決定する。アッセイの検出限界を02nMとする。腸内投与の場合は、化合物を、20mgmLのグリシン、2mgmLのマンニトール、pHを82へと調整した24mgmLのNaHCO3中に15mMまで溶解させる。方法11Caco2透過性アッセイCaco2細胞を、細胞の単層を介する被験化合物の輸送を測定するのに用いた。Cako2細胞系は、ヒト結腸直腸癌腫に由来し、ヒト腸を介する薬物吸収の予測に広く用いられている。分化させたCaco2細胞の細胞層は、小腸の円柱上皮に類似しており、このため、化合物の輸送特性を調べるのに有用である。Caco2細胞輸送研究から得られる見かけの透過性係数は、ヒト腸における吸収と相関することが示されている、88、およびPArtursson、JPharmSci、79。アッセイは、半透膜上で細胞を培養して実施する。被験化合物を、細胞層の頂端側に添加し、側底側におけるそれらの出現をある時間にわたり測定すると、計算されたPappにより腸の吸収が表される。材料Caco2細胞は、AmericanTypeCultureCollectionATCCから得た。全ての細胞培養試薬は、別段に注記しない限り、LONZABioWhittakerから購入した。025トリプシンEDTAは、Invitrogen、Gibcoから購入した。MEMは、Invitrogen、Gibcoから、FBSHIは、Invitrogen、Gibcoから、HanksBalancedSaltSolution型番14025およびHEPES型番15630は、Invitrogen、Gibcoから購入した。マンニトール、D13Hは、PerkinElmerDanmarkASから購入した。シンチレーション液であるMicroscint40は、PackardBioScienceから得た。細胞の培養Caco2細胞を、培養フラスコに播種して、10ウシ胎仔血清、ペニシリンストレプトマイシン、および1の非必須アミノ酸で補充した、Ultraglutamineを伴うダルベッコ改変イーグル培地中で継代培養した。細胞を、細胞105個cm2の密度で、組織培養処理されたTranswells上に播種した。続いて、播種の22~24日後に、輸送実験を実施した。Caco2細胞の単層培養物は、5CO295O2で湿度を90とする37°Cの雰囲気中で増殖させた。増殖培地は、隔日で置換した。上皮電圧抵抗計ERS、Millipore、Denmarkを用いて、37°CでΩcm2単位のTEERを測定したところ、成熟Caco2細胞の単層は、輸送実験で用いる前に、TEER600Ωcm2を示した。透過性アッセイマンニトール、D13HによるPappの測定、および2時間の実験時間におけるTEER変化のモニタリングを介して、Caco2細胞の完全性を評価した。実験の前に、増殖培地を、成熟Caco2細胞から除去し、細胞の単層を、37°CのHBSSで1回すすいだ。全ての化合物輸送実験は、200μMの被験化合物溶液を用いて実施し、頂端部容量は400μLであり、側底部容量は1000μLであった。輸送実験では、被験化合物を、pH74の頂端部コンパートメントに添加し、15、30、45、60、および120分間後に200μLを側底部コンパートメントから除去し、次いで、側底部コンパートメントに、200μLのあらかじめ加熱した調製したての緩衝液を再補充した。120分間後、実験終了時における化合物濃度を確立するために、2×10μLの試料を、ドナーコンパートメントから採取した。全ての実験は、37°Cで2時間にわたり実施した。放射性対照化合物であるマンニトール、D13Hを含有する試料を、Pacard製のTopCountNXTを用いて解析する一方で、被験化合物を含有する試料は、同種ビーズベースのアッセイである、LuminescenceOxygenChannelingImmunoassayを用いて解析した。LOCI試薬は、2つのラックスビーズ試薬と、サンドウィッチ内の抗体のうちの1つであるビオチニル化抗体とを包含する。ビーズ試薬のうちの1つは、ストレプトアビジンでコーティングされ、感光性色素を含有する市販試薬とした。第2のビーズ試薬は、サンドウィッチを構成する他の抗体でコーティングした。アッセイ時には、3つの試薬が分析物と組み合わさって、ビーズ凝集物免疫複合体を形成する。複合体を照射すると、ドナービーズから一重項酸素が放出され、これがアクセプタービーズへと導かれて化学発光を誘発し、これを、EnVisionプレートリーダーで測定した。発生した光の量は、被験化合物の濃度に比例した。試料較正物質対照物質を、アッセイ緩衝液中で10倍に希釈した。1μLの希釈した試料較正物質対照物質を、384ウェルのLOCIプレートに適用した。ビオチニル化mAbであるHGH7をコンジュゲートしたアクセプタービーズと、ビオチニル化したmAbであるHGH3A7をコンジュゲートしたアクセプタービーズとの混合物15μLを、各ウェルに添加した。プレートを21~22°Cで1時間にわたりインキュベートした。30μLのストレプトアビジンでコーティングしたドナービーズを各ウェルに添加し、全てを、21~22°Cで30分間にわたりインキュベートした。680nmのレーザーにより励起した後で、バンド幅を520~645nmとするフィルターを伴うEnvisionプレートリーダーにより、21~22°Cでプレートを読み取った。ウェル1つ当たりの全測定時間は、70ミリ秒間の励起時間を包含する210ミリ秒間とした。透過性の計算以下の式PappdQdt×1式中、Aは、フィルターの面積であり、C0は、ドナーコンパートメント内の初期濃度であるを用いてPappを計算するには、ある時間にわたり側底部コンパートメントに出現する被験化合物の蓄積量であるdQdtを用いた。胆汁酸リンカーの調製リンカー1NNAU0087材料固体支持体07~13ミリモルg、100~200メッシュのPAM樹脂、Sigma。Fmoc8アミノ36ジオキサオクタン酸、MSNT3ニトロ124トリアゾール、FmocGluOtBu、FmocGlyOH、コール酸。FmocGlyOHのPAM樹脂への結合PAM樹脂を、乾燥DCM中で1時間にわたり膨潤させた。FmocGlyOH、MSNT、Nメチルイミダゾールを、2~3適のTHFを含有する、乾燥DCM中で溶解させた。次いで、この溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加した。樹脂を、Robbinsscientific製の回転装置内、RTで一晩にわたり回転させた。2時間にわたる反応後、樹脂を、DCMおよびDMFで濾過および洗浄した。同一の条件下で工程を今一度繰り返した。FmocGlyPAMのFmoc基の除去FmocGlyPAMのFmoc基を、20ピペリジンDMF溶液で、それぞれ、5分間および15分間の2回にわたり処理することにより脱保護化した。次いで、樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。Fmoc基の脱保護化は、ニンヒドリン陽性試験により確認した。Fmocアミノ酸リンカーコール酸を逐次的に連結するための一般的な手順Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、Fmocを保護したアミノ酸、HOBt、およびDICの溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで3時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。コール酸コハク酸を連結するための一般的な手順Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、コール酸コハク酸、HOBt、およびDICの溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで16時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。tブチル基のペプチジル樹脂からの切断標的分子を固相へと逐次的に結合させた後で、樹脂をエーテルで洗浄し、一晩にわたり真空デシケーター内で乾燥させた。ペプチドの固体支持体からの切断は、ペプチド樹脂を、RTの95TFA、25TIS、25水からなる切断カクテルで1時間にわたり処理することにより達成した。次いで、樹脂を、DCM、DMF、DCMで洗浄した。乾燥させた、tブチル側鎖を切断したペプチド樹脂を、45°CのCHCl3アミノアセトアルデヒドジメチルアセタールの混合物で26時間にわたり処理した。切断後、樹脂を排出し、DCM、MeOH、H2O、01TFA、HFIP、DCM、MeOH、およびDCMで洗浄した。濾過物を採取し、真空中で蒸発させ、結果として得られる油を、所与容量の蒸留水中に溶解させた。TFAでpHを7に調整し、溶液を凍結乾燥させ、粗生成物をもたらした。粗生成物を、調製的HPLCで精製して263mgの化合物をもたらし、その識別をLCMSで確認した。ペプチドの精製および特徴づけ解析的HPCLカラムZorbaxEclipseXDBC18。温度25°C。溶媒A01TFAH2O。溶媒B9101。流速1mL分。モニタリングされる波長220nm。勾配粗ペプチドは、MeCNH2O混合物中で溶解させた。調製的HPLCカラムZorbaxEclipseXDBC18、94×250mm、5μm。温度25°C。溶媒A0005TFAH2O。溶媒BMeCN。モニタリングされる波長220nm。勾配コール酸tブチルエステルコハク酸の合成ステップ1コール酸からのコール酸tブチルエステルの合成トリフルオロ酢酸無水物を、氷冷水浴温度の乾燥THF中で撹拌されたコール酸溶液へと、5分間にわたり添加した。氷冷水浴を除去し、混合物を80分間にわたり撹拌し、その後、混合物を再冷却し、tertブタノールを添加した。RTで7時間にわたり撹拌した後、アンモニア水を、冷却しながら添加し、温度を20°C未満に保ち、溶液を、RTで12時間にわたり放置した。別分量のアンモニア水を添加し、RTでさらに4時間後、混合物を、ジエチルエーテルと水との間で分割した。有機層は、2NのNaOH溶液、水、ブリンで洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥させた。有機層を濾過し、減圧下で揮発性物質を蒸発させることにより、固体としてのコール酸tertブチルエステルをもたらし、TLCおよび1HNMRにより精製した。ステップ2コール酸tertブチルエステルからのコール酸tブチルエステルONH2の合成コール酸tertブチルエステルをTHF中で溶解させた。トリフェニルホスフィンおよびNヒドロキシフタルイミドを、0°Cの反応混合物に添加した。DEADを、1時間にわたり滴下により添加した。添加の完了後、反応混合物をRTに到達させ、一晩にわたり撹拌した。減圧下で揮発性物質を除去した。残留油をEtOH中で溶解させ、ヒドラジン水和物を添加し、反応混合物を45°Cで3時間にわたり加熱したところ、この時点で、TLCが、反応の完全性を示した。減圧下で揮発性物質を除去し、淡色の固体をもたらし、これを、DCMで洗浄した。減圧下で濾過物を濃縮し、黄色の固体をもたらした。シリカゲルを用いるカラムクロマトグラフィーにより、粗物質を精製した。化合物は、溶離剤としてのDCM中1~2のMeOHで溶出させた。ステップ3コール酸tブチルエステルONH2からのコール酸tブチルエステルコハク酸の合成コール酸tブチルエステルONH2をTHF中で溶解させた。コハク酸無水物、トリエチルアミンを、反応混合物に添加し、RTで3時間にわたり撹拌した。TLCは、反応の完全性を示した。減圧下でTHFを除去し、粘性の油をもたらした。この油を、EtOAc中で溶解させ、クエン酸溶液、水、ブリンで洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗固体をもたらした。この粗生成物を、AcOEtMeOHの共溶媒中で溶解させることを介する再結晶化により精製し、純度を95とする10gの化合物をもたらした。化合物の識別は、LCMSおよびNMRにより確認した。リンカー2上記においてリンカー1との関連で説明したのと同様の方法で、アミノアセトアルデヒドジメチルアセタールの代わりに、44ジメトキシブチルアミンを用いて、以下の化合物を調製した。TOFMS質量97093リンカー3NNAU0090上記においてリンカー1との関連で説明したのと同様の方法で、以下の化合物を調製した。TOFMS質量108728リンカー4上記においてリンカー1との関連で説明したのと同様の方法で、アミノアセトアルデヒドジメチルアセタールの代わりに、44ジメトキシブチルアミンを用いて、以下の化合物を調製した。TOFMS質量111534リンカー5材料固体支持体101ミリモルg、200~400メッシュのクロロトリチルクロリド樹脂。Fmoc8アミノ36ジオキサオクタン酸、FmocLysOH。FmocLysOHのポリマー支持体への結合クロロトリチルクロリド樹脂を、乾燥DCM中で1時間にわたり膨潤させた。FmocLysOHおよびDIPEAを、乾燥DCM中で溶解させた。この溶液を、樹脂に移した。樹脂を、Robbinsscientific製の回転装置内、RTで一晩にわたり回転させた。反応物を、DCMおよびDMFで濾過および洗浄した。CTCLysFmoc樹脂のFmoc基の除去CTCLysFmocのFmoc基を、20ピペリジンDMF溶液で、5分間および15分間の2回にわたり処理することにより脱保護化した。次いで、樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。Fmoc基の脱保護化は、ニンヒドリン陽性試験により確認した。Fmocアミノ酸リンカーを逐次的に連結するための一般的な手順Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、Fmocを保護したアミノ酸、HOBt、およびDICの溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで3時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。脱保護化および連結のサイクルにより、アミノ酸を同様の形で逐次的に連結した。コール酸tブチルエステルコハク酸の連結Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、コール酸tブチルエステルコハク酸、HOBt、およびDICの溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで一晩にわたり回転させた。樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。ペプチジル樹脂からのDdeの脱保護化ペプチジル樹脂のDde基を、DMF中に3のNH2NH2で、5分間および15分間の2回にわたり処理することにより脱保護化した。次いで、樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。Dde基の脱保護化は、ニンヒドリン陽性試験により確認した。ブロモ酢酸の連結遊離アミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、ブロモ酢酸、HOBt、およびDICの溶液を、遊離アミン樹脂に添加し、反応混合物を、RTで3時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。切断ステップI保護されたペプチドとしての固相からの切断ブロモ酢酸の最終的な連結後に、樹脂をエーテルで洗浄し、一晩にわたり真空デシケーター内で乾燥させた。ペプチドの固体支持体からの切断は、ペプチド樹脂を、RTのヘキサフルオロイソプロパノールDCMの混合物で3時間にわたり処理することにより達成した。濾過により切断混合物を回収し、樹脂を、DCMで洗浄した。過剰な試薬を、窒素下で小容量へと濃縮し、少量のDCMを残留物に添加し、窒素下で蒸発させた。工程を3~4回にわたり繰り返し、大半の揮発性物質を除去した。残留物を0°Cまで冷却し、ジエチルエーテル無水物を添加して、ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離し、上清のジエチルエーテルを除去し、新たなジエチルエーテルをペプチドに添加し、再度遠心分離した。工程を3回にわたり繰り返し、全ての有機物を除去し、純度を40とする粗化合物を30gもたらした。ステップII側鎖保護基の切断tブチル基の最終的な脱保護化は、粗化合物を、25のTFA、およびDCM中に25のTIPCからなる切断カクテルで処理することにより達成した。溶液を30分間撹拌した。過剰な試薬を、窒素下で小容量へと濃縮し、少量のDCMを残留物に添加し、窒素下で蒸発させた。工程を3~4回にわたり繰り返し、大半の揮発性物質を除去した。残留物を0°Cまで冷却し、ジエチルエーテル無水物を添加して、ペプチドを沈殿させた。沈殿物を遠心分離し、上清のジエチルエーテル相を除去し、新たなジエチルエーテルをペプチドに添加し、再度遠心分離した。工程を3回にわたり繰り返し、全ての有機物を除去し、純度を約35とする27gの粗化合物をもたらした。化合物を調製的HPLCによって精製し、純粋な化合物をもたらした。リンカー5の精製および特徴づけ解析的HPCLカラムZorbaxEclipseXDBC18。温度25°C。溶媒A01TFAH2O。溶媒B9101。流速1mL分。モニタリングされる波長220nm。勾配粗ペプチドは、MeCNH2O混合物中で溶解させ、注入した。Rt1545分間調製的HPLCカラムZorbaxEclipseXDBC18、94×250mm、5μm。温度25°C。溶媒A01TFAH2O。溶媒BMeCN。流速7mL分モニタリングされる波長220nm。勾配リンカー6材料固体支持体07~13ミリモルg、100~200メッシュのPAM樹脂。Fmoc8アミノ36ジオキサオクタン酸、MSNT、FmocGluOtBu、FmocGlyOH。FmocGlyOHのPAM樹脂への第1の結合PAM樹脂を、乾燥DCM中で1時間にわたり膨潤させた。FmocGlyOH、MSNT、Nメチルイミダゾールを、2~3適のTHFを含有する、乾燥DCM中で溶解させ、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加した。樹脂を、Robbinsscientific製の回転装置内、RTで一晩にわたり回転させた。2時間の反応後、樹脂を、DCMおよびDMFで濾過および洗浄した。同一の条件下で工程を今一度繰り返した。FmocGlyPAMのFmoc基の除去FmocGlyPAMのFmoc基を、20ピペリジンDMF溶液で、5分間および15分間の2回にわたり処理することにより脱保護化した。次いで、樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。Fmoc基の脱保護化は、ニンヒドリン陽性試験により確認した。Fmocアミノ酸リンカーコール酸を逐次的に連結するための一般的な手順Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、Fmocを保護したアミノ酸、HOBt、およびDICの溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで3時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。tブチル基のペプチジル樹脂からの切断標的分子を固相へと逐次的に結合させた後で、樹脂をジエチルエーテルで洗浄し、一晩にわたり真空デシケーター内で乾燥させた。ペプチドの固体支持体からの切断は、ペプチド樹脂を、RTの95TFA、25トリイソプロピルシラン、25水からなる切断カクテルで1時間にわたり処理することにより達成した。次いで、樹脂を、DCM、DMF、DCMで洗浄した。乾燥させた、tブチル側鎖を切断したペプチド樹脂を、45°CのCHCl3とアミノアセトアルデヒドジメチルアセタールとの混合物で26時間にわたり処理した。切断後、樹脂を排出し、DCM、MeOH、H2O、01TFA、HFIP、DCM、MeOH、およびDCMで洗浄した。濾過物を採取し、真空下で蒸発させた。結果として得られる油を、蒸留水中に溶解させ、TFAでpHを7に調整した。溶液を凍結乾燥させ、粗油をもたらした。粗油を、調製的HPLCで精製して263mgの化合物をもたらした。ペプチドの精製および特徴づけ解析的HPCLカラムZorbaxEclipseXDBC18。温度25°C。溶媒A01TFAH2O。溶媒B9101。流速1mL分。モニタリングされる波長220nm。勾配粗ペプチドは、MeCNH2O混合物中で溶解させ、注入した。Rt1437分間調製的HPLCカラムZorbaxEclipseXDBC18、94×250mm、5μm。温度25°C。溶媒A0005TFAH2O。溶媒BMeCN。モニタリングされる波長220nm。勾配リンカー7材料固体支持体024ミリモルgのTentagelSRAM樹脂2gBoc4アミノ安息香酸、HLysOH、HATU、NMM、DMF、FmocGluOtBu、Fmoc8アミノ36ジオキサオクタン酸、コハク酸無水物、コール酸、DIC、TFA、ピペリジン、DMF、DCM、およびHOBtLtd、India。Bocアミノ安息香酸LysOHの合成Boc4アミノ安息香酸、HATU、およびNMMを、DMF中で溶解させ、反応混合物を、氷冷浴温度で5分間にわたり撹拌した。この混合物に、HLysOHを、氷冷浴温度で添加し、混合物を、RTでさらに3時間にわたり撹拌した。反応の完了後、反応混合物を氷冷水で冷まし、沈殿物を濾過した。得られた沈殿物を、氷冷水およびヘキサンでさらに洗浄した。乾燥後に得られた化合物を、次のステップにおいてさらに精製することなく用いた。Bocアミノ安息香酸LysOHのポリマー支持体への結合TentagelSRAM樹脂を、DCMおよびDMF中で1時間ずつにわたり膨潤させた。Bocアミノ安息香酸LysOH、HOBt、DICを、DMF中で溶解させ、あらかじめ膨潤させた樹脂に移した。樹脂を、RTのRobbinsscientific製の回転装置内で5時間にわたり回転させた。反応物を、DCMおよびDMFで濾過および洗浄した。Bocアミノ安息香酸Lys樹脂のFmoc基の除去上記Bocアミノ安息香酸Lys樹脂のFmoc基を、20ピペリジンDMF溶液で、5分間および15分間の2回にわたり処理することにより脱保護化した。次いで、樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。Fmoc基の脱保護化は、ニンヒドリン陽性試験により確認した。Fmocアミノ酸を逐次的に連結するための一般的な手順Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、Fmocを保護したアミノ酸、HOBt、およびDICの溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで3時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。脱保護化および連結のサイクルにより、アミノ酸を同様の形で逐次的に連結した。コハク酸無水物の連結Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。NMP中にDIPEAを伴うコハク酸無水物の溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで2時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。コール酸ヒドロキシルアミンの連結乾燥DMF中のコール酸tブチルエステルONH2、HOBt、およびDICを、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで24時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF、DCM、およびDMFで濾過および洗浄した。ペプチドの樹脂からの切断標的分子を固相へと逐次的に結合させた後で、樹脂をジエチルエーテルで洗浄し、一晩にわたり真空デシケーター内で乾燥させた。ペプチドの固体支持体からの切断は、ペプチド樹脂を、RTの952525のTFATIS水からなる切断カクテルで3時間にわたり処理することにより達成した。濾過により切断混合物を回収し、樹脂を、DCMで洗浄した。過剰な試薬を、窒素下で小容量へと濃縮し、少量のDCMを残留物に添加し、窒素下で蒸発させた。工程を3~4回にわたり繰り返し、大半の揮発性物質を除去した。残留物を0°Cまで冷却し、ジエチルエーテル無水物を添加して、ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離し、上清のジエチルエーテル相を除去し、新たなジエチルエーテルをペプチドに添加し、再度遠心分離した。工程を3回にわたり繰り返し、全ての有機物を除去し、粗化合物をもたらした。調製的HPLCにより標的化合物を精製し、化合物をもたらした。ペプチドの精製および特徴づけ解析的HPCLカラムZorbaxEclipseXDBC18。温度25°C。溶媒A01TFAH2O。溶媒B9101。流速1mL分。モニタリングされる波長220nm。勾配粗ペプチドは、MeCNH2O混合物中で溶解させ、注入した。Rt746分間調製的HPLCカラムZorbaxEclipseXDBC18、94×250mm、5μm。温度25°C。溶媒A0005TFAH2O。溶媒BMeCN。モニタリングされる波長220nm。勾配リンカー8上記においてリンカー7との関連で説明したのと同様の方法で、FMOCLysOHおよびWang樹脂を用いて、以下の化合物を調製した。TOFMS質量91613リンカー9上記においてリンカー7との関連で説明したのと同様の方法で、FMOCLysOHおよびWang樹脂を用いて、以下の化合物を調製した。TOFMS質量10594HPLCカラムZorbaxEclipseXDBC18。温度25°C。溶媒A01TFAH2O。溶媒B9101。流速1mL分。モニタリングされる波長220nm。Rt1402分。リンカー10材料手順NMP中に05MのHOBt溶液を調製した。樹脂を、DCM中で30分間にわたり膨潤させた。樹脂を、カダベリンDCMの混合物で30分間にわたり処理した。樹脂を、DCM中に5のDIPEA、5のMeOHで30分間にわたり処理した。樹脂を、DCMで洗浄した。FmocOEGOHの連結NMP中に05MのFmocOEGOHDICHOBt溶液を調製し、2分間にわたる混合の後、トリチル樹脂へと添加した。樹脂をRTで45分間にわたり振とうした後、NMPおよびDCMで洗浄した。少量の生成物を樹脂から切断し、LCMSにより解析した。キャッピングAc2ODIPEANMP溶液を添加した。樹脂をRTで10分間にわたり撹拌し、NMPおよびDCMで洗浄した。DeFmoc樹脂を、30ピペリジンNMPで2×10分間にわたり処理した。樹脂を、NMPおよびDCMで洗浄した。第2のFmocOEGOHの連結NMP中に05MのFmocOEGOHDICHOBt溶液を調製し、2分間にわたり混合し、上記の樹脂に添加した。樹脂をRTで45分間にわたり振とうした後、NMPおよびDCMで洗浄した。少量の生成物を樹脂から切断し、LCMSにより解析した。DeFmoc樹脂を、30ピペリジンNMPで2×10分間にわたり処理した。樹脂を、NMPおよびDCMで洗浄した。FmocGlutBuの連結NMP中に05MのFmocGlutBuDICHOBt溶液を調製し、2分間にわたり混合し、樹脂に添加した。樹脂をRTで45分間にわたり振とうし、NMPおよびDCMで洗浄した。少量の生成物を樹脂から切断し、LCMSにより解析した。DeFmoc樹脂を、30ピペリジンNMPで2×10分間にわたり処理した。樹脂を、NMPおよびDCMで洗浄した。コール酸の連結NMP中に05Mのコール酸DICHOBt溶液を調製し、2分間にわたり混合し、樹脂に添加した。樹脂をRTで45分間にわたり振とうした後、NMPおよびDCMで洗浄した。少量の生成物を樹脂から切断し、LCMSにより解析した。樹脂からの切断樹脂を、TFA水Et3SiH混合物で10分間ずつ2回にわたり処理した。混合された濾過物を濃縮し、LCMSにより解析した。LCMSは、生成物およびトリフルオロアセチル化された生成物の形成を示した。次いで、残留油を、2MのNH3MeOH中に溶解させ、RTで1時間にわたり撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、残留物をMeCNとMQとの混合物中で溶解させ、水を用いる調製的HPLCにより濾過および精製した。画分を、真空中で混合および濃縮し、194mgの無色の油をもたらした。TOFMS質量91213上記においてリンカー5との関連で説明したのと同様の方法で、FMOCLysOHおよびWang樹脂を用いて、以下の化合物を調製した。リンカー11リンカー12およびリンカー13コール酸をコンジュゲートした化合物の合成方法31による、N末端のPheにおけるリンカー3の結合化合物ANNC018600000078リンカー3による、N末端における、hGHQ83C、Y143CNNC018600000017の還元的アルキル化。試料凍結乾燥させたhGHQ83C、Y143Cを、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液中に溶解させ、AmiconUltra15デバイスを用いて、4000rpm分、10°Cで3×8分間にわたる遠心分離により、25mMのHEPES、pH70へと緩衝液交換した。手順アルデヒドを脱離させるために、リンカー3をTFAで6分間にわたり処理し、蒸発させた後で、EtOHで2回にわたりストリッピングし、乾燥させた。1NのNaOHを添加することによりpHを約70に保ちながら、上記のhGHQ83C、Y143C溶液を少しずつ添加した。水中に溶解させたNaCNBH3を、5分間隔で少しずつ添加した。反応フラスコをスズ箔でラッピングし、反応混合物を、室温で一晩にわたり静かに撹拌する。1時間にわたる撹拌後に、清明な溶液が得られる。一晩にわたり撹拌した後、LCMSにより試料を解析した。Rt6分間のときに生成物のmz23063であったが、また、出発タンパク質も残存した。IEXクロマトグラフィーおよびHICクロマトグラフィー、G25カラム上における緩衝液の交換、ならびに限外濾過の組合せを用いて混合物を精製し、純度を95とする4mgの化合物を得た。生成物のmz23063M1。化合物BNNC018600000036方法31に従うリンカー6による、N末端における、hGHQ83C、Y143Cの還元的アルキル化。試料凍結乾燥させたhGHQ83C、Y143Cを、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液中に溶解させ、AmiconUltra15デバイスを用いて、4000rpm分、10°Cで3×7分間にわたる遠心分離により、25mMのHEPES、pH700へと緩衝液交換した。最終容量40mL。手順リンカー6を、50のTFAH2O混合物で20分間にわたり処理し、回転蒸発器上で蒸発させて乾燥させ、EtOHでストリッピングした。1NのNaOHを、乾燥させたリンカーに添加して、pHの降下を防止しながら、hGHQ83C、Y143Cを添加した。上記のhGHQ83C、Y143C溶液をリンカーに添加し、1NのNaOHによりpHを700に調整した。反応混合物を添加する間、pHは655に降下した。1NのNaOHによりpHを700に調整した。NaCNBH3を水中に溶解させ、5分間隔で少しずつ添加した。反応混合物をスズ箔でラッピングし、一晩にわたり静かに撹拌しながらインキュベートした。一晩にわたり撹拌した後、LCMS解析はなお、ある量の出発物質も示した。反応混合物を、RTでインキュベートし、静かに撹拌し、4°Cで一晩にわたり静置した。反応混合物のpHを750に調整し、MilliQ水で20mSの伝導率まで希釈してから、Aektaシステム上で精製した。試料容量110mLカラムHiLoad2610QSepharose緩衝液A20mMHEPES、pH75010エチレングリコール緩衝液B20mMHEPES、pH7501MNaCl10エチレングリコール流速6mL分。勾配0~5、1CV、5~40、12CV、40~100、1CV画分のサイズ7mL。流速を5mL分とする試料ポンプを用いて試料を適用した。画分E4において、所望の質量実測値22989十分に純粋でなかった全ての画分は、さらなる精製のためにプールされた。3回にわたる操作において、画分E4を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。カラム5030SephadexG25Fine緩衝液A10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液。流速10mL分。画分のサイズ45mL。1操作画分A2~A3をプールした。166mgの純粋化合物2操作画分A1~A2をプールした。129mgの純粋化合物3操作画分A7~A8をプールした。192mgの純粋化合物LCMSmz実測値22989化合物CNNC018600000050方法32に従う、Gln残基におけるリンカー7の結合。上記で説明した通りに、トランスアミノ化されたhGHQ83C、Y143Cを生成させ、リンカー7とコンジュゲートした。TOFLCMS質量2325399プール1収量128mg。純度100。プール2収量192mg。純度100。化合物DNNC018600000061上記において化合物Cとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー8を用いて、以下の化合物を調製した。化合物ENNC018600000081方法33に従う、101位におけるリンカー5の結合。方法2で説明した通りに得られたhGHQ84C、L101C、Y143Cは、その遊離システインの一部が、グルタチオンおよびシスタミンで保護されていた。TEAEDTA緩衝液中のTSPPを用いて、選択的脱保護を実施した。約01MのNaClを伴う20mMのTEA緩衝液、pH74中のhGHQ84C、L101C、Y143C溶液に、2mMの濃度までEDTAを添加し、6NのNaOHによりpHを85に調整した。TSPPを添加し、結果として得られる混合物を、RTで4時間にわたり静かに撹拌した。LCMSTOF22028は、脱保護されたタンパク質に対応する。リンカーによる連結トリスNaCl中の脱保護されたhGHQ84C、L101C、Y143C溶液に、NMP、NaCl、およびトリシンEDTA緩衝液の混合物中に溶解させたリンカー5溶液を添加した。結果として得られる混合物を、周囲温度で一晩にわたり静かに撹拌した。LCMSTOFRt66分間のときに実測値23010粗生成物についてのHPLC約92の純度総量138mg。化合物FNNC018600000087上記において化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー5およびGH化合物であるhGHS62C、Q84C、Y143Cを用いて、以下の化合物を調製した。タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850へと緩衝液交換した。緩衝液交換カラムHiPrep2610Desalting緩衝液A20mMTEA、pH85010エチレングリコール流速8mL分。画分A3およびA5を、精製のためにプールした。精製カラムHiLoad2610QSepharoseHP緩衝液A20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850緩衝液B20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH8501MNaCl勾配11CVにわたり0~10の緩衝液B勾配212CVにわたり10~40の緩衝液B勾配31CVにわたり40~100の緩衝液B流速6mL分。温度RT画分7mL画分D11~D8をプールおよび緩衝液交換し、画分C12およびD12をプールおよび緩衝液交換した画分D11~D8の緩衝液交換カラムHiPrep2610Desalting緩衝液A10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液流速8mL分。画分A2、A4、A6、およびB6を、回収およびプールして、純度を100とする475mgの化合物を得た。C12およびD12の緩衝液交換カラムHiPrep2610Desalting緩衝液A10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液流速8mL分画分B4を、回収およびプールして、純度を90とする119mgの化合物を得た。LCMSTOF2303662M1化合物GNNC018600000088方法32に従う、hGHQ83C、Y143CのGln40位におけるリンカー10の結合。胆汁酸リンカーであるAWB1NH2およびmTGアーゼによるGH化合物の直接的なトランスアミノ化で説明した。緩衝液反応緩衝液20mMのトリエタノールアミン、pH85イミダゾール緩衝液pH74の20mMイミダゾール緩衝液、10mMのCaCl2、10のグリセロール、002のTween80。溶液A反応緩衝液中に227uMのhGHQ84C、Y143C溶液B反応緩衝液中に291mMのリンカー10溶液D20mMのイミダゾール緩衝液、pH74、10mMのCaCl2、10のグリセロール、002のTween80中のAjinomotoTGaseC60mgmL114μM。以下のスキームに従い、25°Cで溶液Aと溶液Bとを混合し、溶液Dを添加した。結果として得られる混合物を、RTで42時間にわたり撹拌した。以下の表に記載される操作条件を用いて、反応混合物を、Aekta100システム上で精製した。40mL中に9~18の緩衝液B1により、3つのピークを溶出させた。標的分子を含有する画分を回収した。化合物H化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー11およびGH化合物であるhGHQ84C、L101C、Y143Cを用いて、以下の化合物を調製した。タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850へと緩衝液交換した。緩衝液交換カラムHiPrep2610Desalting緩衝液A20mMTEA、pH85010エチレングリコール流速8mL分。画分を、精製のためにプールした。精製反応混合物は、Aektaシステムで精製した。20mMTEA、pH85010エチレングリコールにより、01MNaClの塩濃度へと希釈した。カラムHiLoad2610QSepharoseHPCIP1MのNaOH緩衝液A20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850緩衝液B20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH8501MNaCl勾配11CVにわたり0~14の緩衝液B勾配210CVにわたり14~19の緩衝液B勾配31CVにわたり19~100の緩衝液B流速5mL分温度RT画分画分1つ当たり7mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて試料を適用した。極めて幅の広いピーク。画分E12、E7、F3、F8、G2、G5を、HPLCで解析した。画分E7~G7を、プールした。容量190mLHPLCで脱塩する前に定量化および点検を行う。実測面積3624836、注入量5μL、励振係数1000000072mgmL×190mL137mgRTにおける生成物1436分後。脱塩Aekta上で、生成物を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。カラムHiPrepG25Fine5020desalting緩衝液A10mMの重炭酸アンモニウム流速8mL分操作15CV温度RT画分画分1つ当たり45mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて、2回にわたる操作により試料を適用した。1回目の操作に由来する画分A3~A5を、2回目の操作に由来する画分A2~A4と併せてプールした。容量270mLプールは、カットオフを10kDaとするAmiconFilterデバイスを用いて濃縮した。4000rpm6分間で遠心分離した。総容量375mLHPLCで定量化した実測面積16576155、注入量5μL、励振係数1000000332mgmL×375mL1245mgLCMSRt6分間のときにmz229784HPLCRt1423分間化合物I化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー12およびGH化合物であるhGHQ84C、L101C、Y143Cを用いて、以下の化合物を調製した。タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850へと緩衝液交換した。緩衝液交換カラムHiPrep2610Desalting緩衝液A20mMTEA、pH85010エチレングリコール流速8mL分。精製反応混合物は、Aekta上で精製した。20mMTEA、pH85010エチレングリコールにより、01MNaClの塩濃度へと希釈した。カラムHiLoad2610QSepharoseHPCIP1MのNaOH緩衝液A20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850緩衝液B20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH8501MNaCl勾配11CVにわたり0~15の緩衝液B勾配210CVにわたり15~25の緩衝液B勾配31CVにわたり25~100の緩衝液B流速5mL分温度RT画分画分1つ当たり7mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて試料を適用した。幅の狭いピークによる良好な分離。画分C10、C12、D9、およびD7を、解析した。すべて純粋で、生成物を含む。画分C10~D7を、プールした。容量63mL脱塩Aekta上で、生成物を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。カラムHiPrepG25Fine5020desalting緩衝液A10mMの重炭酸アンモニウム流速8mL分操作15CV温度RT画分画分1つ当たり45mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて、1回の操作により試料を適用した。画分A3~A5を、プールした。容量135mLプール画分は、カットオフを10kDaとするAmiconFilterデバイスを用いて濃縮した。4000rpm6分間で遠心分離した。容量213mLHPLCで定量化した実測面積16991257、注入量5μL、2×FF、励振係数1000000680mgmL×213mL1445mg純度100HPLCRt1365分間LCMSRt6分間のときにmz229945。化合物J化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー13およびGH化合物であるhGHQ84C、L101C、Y143Cを用いて、以下の化合物を調製した。タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850へと緩衝液交換した。緩衝液交換カラムHiPrep2610Desalting緩衝液A20mMTEA、pH85010エチレングリコール流速8mL分。精製反応混合物は、Aekta上で精製した。20mMTEA、pH85010エチレングリコールにより、01MNaClの塩濃度へと希釈した。カラムHiLoad2610QSepharoseHPCIP1MのNaOH緩衝液A20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850緩衝液B20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH8501MNaCl勾配11CVにわたり0~14の緩衝液B勾配210CVにわたり14~25の緩衝液B勾配32CVにわたり25~100の緩衝液B流速5mL分温度RT画分画分1つ当たり7mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。画分C2、C11、およびD8はTOFで点検し、画分B1、C3、C6、C9、C12、D10はHPLCで解析した。画分B1~D5の全てを、プールした。脱塩Aekta上で、プールした画分を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。カラムHiPrepG25Fine5020desalting緩衝液A10mMの重炭酸アンモニウム流速8mL分操作13CV温度RT画分画分1つ当たり45mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて、2回の操作により試料を適用した。1回目の操作に由来する画分A4、A5、およびA6を、2回目の操作に由来する画分A3、A4、およびA5と併せてプールした。プールは、カットオフを10kDaとするAmiconFilterデバイスを用いて濃縮した。4000rpm6分間で遠心分離した。容量30mLHPLCで定量化した実測面積17898813、注入量5μL、2×FF、励振係数1000000358mgmL×295mL1055mg。Rt1363分間のときに純度96LCMSmz22994化合物K化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー5およびGH化合物であるhGHL101Cを用いて、以下の化合物を調製した。タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850へと緩衝液交換した。緩衝液交換カラムHiPrep2610Desalting緩衝液A20mMTEA、pH85010エチレングリコール流速8mL分。1回目の精製反応混合物は、Aekta上で精製した。20mMTEA、pH85010エチレングリコールにより、01MNaClの塩濃度へと希釈した。カラムHiLoad2610QSepharoseHPCIP1MのNaOH緩衝液A20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850緩衝液B20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH8501MNaCl勾配11CVにわたり0~15の緩衝液B勾配210CVにわたり15~30の緩衝液B勾配32CVにわたり30~100の緩衝液B流速5mL分温度RT画分画分1つ当たり7mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。画分D5、D4、D1、E3、およびE4はHPLCで解析した。全ての画分において、所望の生成物の直前のピークを検出した。全ての画分を、異なる勾配を用いる第2の精製のためにプールした。2回目の精製プーリングされた画分は、Aekta上で精製した。20mMTEA、pH85010エチレングリコールにより、01MNaClの塩濃度へと希釈した。カラムHiLoad2610QSepharoseHP緩衝液A20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850緩衝液B20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH8501MNaCl勾配11CVにわたり0~xxの緩衝液B勾配210CVにわたりxxの緩衝液B勾配32CVにわたりxx~100の緩衝液B流速5mL分温度RT画分画分1つ当たり7mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。脱塩Aekta上で、生成物を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。カラムHiPrepG25Fine5020desalting緩衝液A10mMの重炭酸アンモニウム流速8mL分操作13CV温度RT画分画分1つ当たり45mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。画分A3、A4、およびA5と併せてプールした。プール画分は、カットオフを10kDaとするAmiconFilterデバイスを用いて濃縮した。4000rpm6分間で遠心分離した。容量18mLHPLCで定量化した実測面積11570188、注入量5μL、2×FF、励振係数1000000231mgmL×2462mgmL×177mL82mgRt1370分間。LCMSTOFRt6分間のときに質量実測値23097化合物L化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー5およびGH化合物であるhGHQ40C、Q84C、Y143Cを用いて、以下の化合物を調製した。タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850へと緩衝液交換した。緩衝液交換カラムHiPrep2610Desalting緩衝液A20mMTEA、pH85010エチレングリコール流速8mL分。精製反応混合物は、Aekta上で精製した。20mMTEA、pH85010エチレングリコールにより、01MNaClの塩濃度へと希釈した。カラムHiLoad2610QSepharoseHPCIP1MのNaOH緩衝液A20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH850緩衝液B20mMトリエタノールアミン10エチレングリコール、pH8501MNaCl勾配11CVにわたり0~15の緩衝液B勾配211CVにわたり15~25の緩衝液B勾配32CVにわたり25~100の緩衝液B流速5mL分温度RT画分画分1つ当たり7mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。画分C2、C3、C5、C7、C9、C11、D12、D10、D8、およびD6を解析した。全ての純粋な画分をプールしたが、2つのプールを作製し、個別に脱塩した。プールIC2~C10。プールIIC11~D8脱塩Aekta上で、2つのプールを、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。プールIカラムHiPrepG25Fine5020desalting緩衝液A10mMの重炭酸アンモニウム流速8mL分操作13CV温度RT画分画分1つ当たり45mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。プールIIカラムHiPrepG25Fine5020desalting緩衝液A10mMの重炭酸アンモニウム流速8mL分操作13CV温度RT画分画分1つ当たり45mL流速を5mL分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。画分A3、A4、およびA5と併せてプールした。プールは、カットオフを10kDaとするAmiconFilterデバイスを用いて濃縮した。4000rpm6分間で遠心分離した。容量31mLHPLCで定量化したプール1実測面積8819533、注入量5μL、励振係数1000000176mgmLプール2実測面積8974748、注入量5μL、励振係数1000000179mgmL両方のプールを混合し、31mLの全容量をもたらした。総量55mgLCMSRt7分間のときにmz229956HPLCRt1372分間上記のBAFアッセイおよびタンパク質分解による消化を介する、選択された化合物についての解析さらなるジスルフィド結合を含む成長ホルモン化合物を調製し、invitroにおける活性およびプロテアーゼに対する安定性をアッセイした。以下に示す結果は、4時間後に得られた。方法5および8に記載したBAFアッセイおよびタンパク質分解による消化を介する、選択された化合物についての解析方法5および8に従い、成長ホルモン化合物を調べた。BAF3hGH受容体アッセイを用いて、invitroにおける胆汁酸コンジュゲートの効力を解析した。本発明の化合物のプロテアーゼに対する安定性は、一般的方法において説明した通り、化合物を、キモトリプシンまたはエラスターゼと共に4時間にわたりインキュベートすることにより決定した。完全GH化合物の百分率を測定し、結果を、以下の表に組み入れる。CACO2アッセイにおけるGH化合物の透過性腸のCaco2細胞の単層を介して輸送されるGH化合物の能力を、上記の方法11で説明した通りに決定した。吸収方向における見かけの透過性を測定し、一連のGH化合物について計算されたPappを、以下の表に列挙する。計算されたPappは、プロテアーゼに対して安定化させたGH化合物およびまたはコール酸をコンジュゲートしたGH化合物が、Caco2細胞単層を介して輸送されることを裏付ける。ある化合物については高値のPappが得られる一方で、他の化合物は、Papp値が05×108cm秒を下回る低度の輸送を示す。GH化合物の薬物動態特性ミニブタにおける、hGH、hGH、およびコール酸誘導体を伴うhGHの薬物動態特性を、内視鏡による投与および静脈内投与後において探索した。上記で説明した手順に従い、hGH、hGH、およびコール酸誘導体を伴うhGHについて解析した。計算された薬物動態パラメータを、以下の表に組み入れる。さらなる研究では、上記で説明した通り、SpragueDawleyラットにおける、hGH、hGH、およびコール酸誘導体を伴うhGHの薬物動態特性を、腸内注射後において探索した。上記で説明した手順に従い、hGHおよびコール酸誘導体を伴うhGHについて解析した。計算された薬物動態パラメータを、以下の表に組み入れる。