"対象における急性脳損傷の診断を補助するための方法であって、i前記対象由来の試料における、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1からなる群から選択される少なくとも1つの酸化ストレスポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、iiパネルAから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、iiii及びiiの濃度を標準試料におけるポリペプチドの濃度と比較し、前記ポリペプチドについての量比を決定するステップとを含み、iv前記試料においてアッセイしたそれぞれのポリペプチドの前記標準試料中のポリペプチドに対する量比の結果が1.3を超えると、急性脳損傷が前記対象において生じている可能性の増加を示す、方法。ステップiiが、パネルBから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。ステップiiが、パネルCから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。ステップiiが、パネル1から選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。ステップiiが、パネル1Hから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。ステップiiが、パネル1Cから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。ステップiiが、パネル1Aから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。ステップiiが、パネル1Bから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。ステップiiが、パネル2から選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。ステップiiが、パネル2Aから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。ステップiiが、パネル2Bから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。ステップiが、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1からなる群から選択される少なくとも2つの酸化ストレスポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1~11のいずれかに記載の方法。ステップiが、酸化ストレスポリペプチドPRDX1、PRDX6、及びGSTP1のそれぞれの濃度をアッセイすることを含む、請求項1~11のいずれかに記載の方法。ステップiiが、前記パネルから選択される少なくとも2つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項1~11のいずれかに記載の方法。ステップiiが、前記パネルから選択される少なくとも4つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む、請求項14に記載の方法。急性脳損傷が、脳卒中である、請求項1~15のいずれかに記載の方法。試料が、脳微小透析液、脳脊髄液、又は血液である、請求項1~16のいずれかに記載の方法。試料が、血液である、請求項17に記載の方法。ステップiが、対象由来の試料におけるPRDX1の濃度をアッセイすることを含む、請求項1~18のいずれかに記載の方法。タンパク質が、ウエスタンブロッティングによって検出される、請求項1~19のいずれかに記載の方法。タンパク質が、ビーズサスペンションアレイ又は平面アレイによって検出される、請求項1~19のいずれかに記載の方法。タンパク質が、アイソバリックタンパク質タギング又は同位体タンパク質タギングによって検出される、請求項1~19のいずれかに記載の方法。タンパク質が、質量分析計ベースのアッセイによって検出される、請求項1~19又は請求項22のいずれかに記載の方法。第1及び第2のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質の、急性脳損傷に関連する診断応用又は予後判断応用のための使用であって、前記第1のポリペプチドが、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1から選択され、前記第2のポリペプチドが、パネルAから選択される、使用。ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質の、脳卒中に関連する診断応用又は予後判断応用のための使用であって、前記ポリペプチドが、パネル2から選択される、使用。各々1つ又は2つ以上のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有するそれぞれの物質の組み合わせの、請求項24又は25に記載の使用。物質又はそれぞれの物質が、抗体又は抗体チップである、請求項24~26のいずれかに記載の使用。物質が、1つ又は2つ以上のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントに対して特異性を有する抗体である、請求項22に記載の使用。急性脳損傷の診断において使用するためのアッセイデバイスであって、第1及び第2のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質を含有する位置を有する固体基質を含み、前記第1のポリペプチドが、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1から選択され、前記第2のポリペプチドが、パネルAから選択される、アッセイデバイス。脳卒中の診断において使用するためのアッセイデバイスであって、ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質を含有する位置を有する固体基質を含み、前記ポリペプチドが、パネル2から選択される、アッセイデバイス。物質が、抗体又は抗体チップである、請求項29又は30に記載のアッセイデバイス。それぞれの抗体について固有のアドレス指定可能な位置を有し、それによって、それぞれの個々のポリペプチド又はポリペプチドの任意の組み合わせについてアッセイの読み取りを可能にする、請求項31に記載のアッセイデバイス。脳卒中の診断において使用するためのキットであって、請求項29~32のいずれかに記載のアッセイデバイス、及び対象から採取される体液の試料における1又は2以上のポリペプチドの量を検出するための手段を含む、キット。対象における急性脳損傷の診断又は予後モニタリングの方法であって、a個体由来の適切な組織試料からタンパク質を得、抽出するステップと、b前記タンパク質を消化してペプチドの集団を産生するステップと、c表15において列挙される1又は2以上のトランジションの選択反応モニタリングを使用して、表14において列挙される1又は2以上の前記ペプチドの存在量を決定するステップと、d前記1又は2以上のペプチドの存在量を、急性脳損傷の診断に関連する、あらかじめ決定されたペプチドの存在量と比較するステップと、e前記1又は2以上のペプチドの存在量の差異に基づいて、前記対象が急性脳損傷を患っているかどうか及び/又は急性脳損傷が悪化している若しくは改善していることを決定するステップとを含む、方法。あらかじめ決定されたペプチドの存在量が、表14から選択される対応する合成ペプチドの既知の量を使用して決定される、請求項34に記載の方法。表14において列挙される群から選択される1又は2以上の合成ペプチドを含む、急性脳損傷の診断又は急性脳損傷を有する対象の予後モニタリングを行うための調製物。1又は2以上の合成ペプチドが、GSTP1TFIVGDQISFADYNLLDLLLIHEVLAPGCLDAFPLLSAYVGRMPPYTVVYFPVRDDYVKDQQEAALVDMVNDGVEDLRFQDGDLTLYQSNTILRASCLYGQLPKAFLASPEYVNLPINGNGKMLLADQGQSWKLSARPKTLGLYGKEEVVTVETWQEGSLKALPGQLKPFETLLSQNQGGKYISLIYTNYEAGKPRDX1HGEVCPAGWKPGSDTIKPDVQKQGGLGPMNIPLVSDPKADEGISFRDISLSDYKLVQAFQFTDKIGHPAPNFKLNCQVIGASVDSHFCHLAWVNTPKYVVFFFYPLDFTFVCPTEIIAFSDRMSSGNAKTIAQDYGVLKATAVMPDGQFKPRDX6GMPVTARMPGGLLLGDVAPNFEANTTVGRDFTPVCTTELGRVVFVFGPDKLIALSIDSVEDHLAWSKELAILLGMLDPAEKLSILYPATTGRVATPVDWKNFDEILRLPFPIIDDRVVISLQLTAEKDINAYNCEEPTEKLAPEFAKDGDSVMVLPTIPEEEAKFHDFLGDSWGILFSHPRDDAH1ALPESLGQHALRDENATLDGGDVLFTGRDYAVSTVPVADGLHLKGAEILADTFKGEEVDVARQHQLYVGVLGSKTPEEYPESAKCYTBHDELTYFSQVVAGTNYFIKVFQSLPHENKPLTLSNYQTNKVHVGDEDFVHLRACBPMSQAEFEKAAEEVRQATVGDINTERPGMLDFTGKTKPSDEEMLFIYGHYKWDAWNELKMWGDLWLLPPASANPGTGTEAEFEKMPAFAEFEKCSRP1GFGFGQGAGALVHSEGLESTTLADKGYGYGQGAGTLSTDKMT3GGEAAEAEAEKMDPETCPCPSGGSCTCADSCKSCCSCCPAECEKPEPB1GNDISSGTVLSDYVGSGPPKLYEQLSGKLYTLVLTDPDAPSRNRPTSISWDGLDSGKVLTPTQVKYVWLVYEQDRPLKから選択される、請求項36に記載の調製物。それぞれのペプチドが、水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄から選択される1又は2以上の安定した重同位体を含有する、請求項36又は37に記載の調製物。合成ペプチドが、同位体タグ又はアイソバリックタグにより標識される、請求項36又は37に記載の調製物。急性脳損傷の診断又は予後モニタリングのための、請求項36~39のいずれかに記載の調製物。急性脳損傷が、虚血性脳卒中又は一過性脳虚血発作である、請求項40に記載の調製物。実質的に本明細書において記載される方法、使用、デバイス、又はキット。損傷を受けた組織のすぐ近くのリアルタイムのモニタリング及び試料採取を可能にすることにより、ヒト脳微小透析液は、脳特異的バイオマーカーの発見のための非常に有益な供給源材料である。ヒト脳微小透析試料のプロテオミクス分析は、脳卒中などの脳血管障害の診断及び予後判断のための革新的な分子を見出すために、本発明者らによって適用された。これらの研究は、特定のバイオマーカーの同定を可能にし、それらを脳卒中との関連について調べることをさらに可能にした。バイオマーカーは、損傷を受けた領域の中心の近く又は他のそのような特性などの外傷の特定の形態又は要素とのそれらの関連の点からさらに特徴づけることができた。これらの大変な研究から得られた見識は、脳卒中などの急性脳外傷についてのある種のバイオマーカーの同定を可能にした。したがって、本発明者らは、本明細書において詳述されるように、状態の診断を補助するための方法を発明することができた。したがって、一態様では、本発明は、対象における急性脳損傷braindamageの診断を補助するための方法であって、i前記対象由来の試料における、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1からなる群から選択される少なくとも1つの酸化ストレスポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、iiパネルAから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、iiii及びiiの濃度を標準試料におけるポリペプチドの濃度と比較し、前記ポリペプチドについての量比を決定するステップとを含み、iv前記試料においてアッセイしたそれぞれのポリペプチドの前記標準試料中のポリペプチドに対する量比の結果が1.3を超えると、急性脳損傷が前記対象において生じている可能性の増加を示す方法に関する。酸化ストレスポリペプチドは、酸化ストレス関連ポリペプチドと呼ぶことができる。任意選択で、iのうちの少なくとも1つの酸化ストレスポリペプチドは、酸化ストレスタンパク質S100Bと組み合わせてアッセイすることができる。ポリペプチドは、適切には、酸化ストレスポリペプチドである。ポリペプチドは、適切には、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1からなる群から選択される。この群は、酸化ストレスタンパク質となる共通の特性を共有する。これらのタンパク質は、抗酸化酵素である。それらは、それぞれ活性酸素種の排除への関与によって関連している。したがって、これらのポリペプチドは、概念的に関連づけられる。さらに、それらは、機能的に関連づけられる。これらのポリペプチドは、脳卒中の診断に役立つものとして、初めて、群として教示される。したがって、本発明によって当技術分野に対して成された1つの貢献は、ポリペプチドのこの生物学的に関連する群を、脳卒中の診断インジケータとなる単一の群に、ともに分類することである。任意選択で、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1の群は、酸化ストレスによって誘発される他のタンパク質を含んでいてもよい。例えば、群は、酸化ストレスにおいて誘発されるタンパク質S100Bを含んでいてもよい。これらのポリペプチドは、脳卒中の診断に役立つものとして、初めて、群として教示される。上記に述べられる共通の特性に加え、また、この群について初めて本明細書で教示された特異的な共通の有用性に加え、また、ポリペプチドのこのクラスターの小さく、定められたサイズに加えて、それらがまた、互いに、直接的な相互作用物質として証拠づけられることによっても関連することに注目することは重要である。例えば、これらのタンパク質は、単一の生物学的複合体の一部であることが実証されている。例えば、PRDX1及びGSTP1は、同様のレドックス防御メカニズムに関係する。さらに、それらは、ともに相互作用することが証拠づけられているKrapfenbauerKEngidaworkECairnsNFountoulakisMandLubecGAberrantexpressionofperoxiredoxinsubtypesinneurodegenerativedisordersBrainRes967152160。さらに、GSTP1は、酸化PRDX6を再活性化することが示されているSchreibeltGvanHorssenJHaseloffRFReijerkerkAvanderPolSMANieuwenhuizenOKrauseEBlasigIEDijkstraCDRonkenEanddeVriesHEProtectiveeffectsofperoxiredoxin1attheinjuredbloodbrainbarrierFreeRadicBiolMed45256264。さらに、複合体の形成は、生化学的に実証されているKimYJLeeWSIpCChaeHZParkEMandParkYMPrx1suppressesradiationinducedcJunNH2terminalkinasesignalinginlungcancercellsthroughinteractionwiththeglutathioneStransferasePicJunNH2terminalkinasecomplexCancerRes6671367142。共通の生物学的機能のこれらの強力な指標に加えて、GSTP1は,酸化PRDX6を再活性化すると示されているManevichYFeinsteinSIandFisherABActivationoftheantioxidantenzyme1CYSperoxiredoxinrequiresglutathionylationmediatedbyheterodimerizationwithpiGSTProcNatlAcadSciUSA10137803785。さらに、これらのポリペプチドの間の複合体形成もまた、証明されているRalatLAManevichYFisherABandColmanRFDirectevidencefortheformationofacomplexbetween1cysteineperoxiredoxinandglutathioneStransferasepiwithactivitychangesinbothenzymesBiochemistry45360372。したがって、少なくともこれらの理由で、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1からなる群は、一つの発明を形成し、この非常に小さな群のそれぞれのメンバーは、一つの発明概念を形成するように関連づけられる。この概念は、脳卒中のインジケータとしての酸化ストレスタンパク質のアッセイとして特徴づけることができる。その代わりに、この概念は、一つの生物学的集合体つまり上記に記載のペルオキシレドキシン複合体についてのアッセイが、脳卒中の診断を補助することができるということを教示するとして特徴づけることができる。最も明確な用語において本発明を定義するために、複合体の個々の異なる分子メンバーは、個々に詳述される。しかしながら、これらの個々のポリペプチドが、上記に示される理由で技術的な関係性を共有することに注意されたい。したがって、言及される個々のタンパク質のそれぞれは、同じ生物学的複合体中にあり、同じ生物学的機能に寄与し、同じインビボ巨大分子集合体中にあるという特有の技術的特徴及び記載される他の共通の特性を共有する。したがって、本出願は、この複合体のメンバーを脳卒中の診断に関連させる新しい教示によって特徴づけられる一つの発明に関する。適切には、ステップiは、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1からなる群から選択される少なくとも2つの酸化ストレスポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiは、酸化ストレスポリペプチドPRDX1、PRDX6、及びGSTP1のそれぞれの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、他の機能を有するタンパク質と組み合わせた、より大きなパネルの一部としての、上記に記載の酸化ストレス関連タンパク質のパネルの1又は2以上の測定値を含んでいてもよい。例えば、これは、脳微小透析液において発見された他のタンパク質を含む。適切には、ステップiiは、パネルBから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、パネルCから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、拡大パネルABCから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、パネル1から選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、パネル1Hから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、パネル1Cから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、パネル1Aから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、パネル1Bから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、パネル2から選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、パネル2Aから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、パネル2Bから選択される少なくとも1つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、前記パネルから選択される少なくとも2つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、ステップiiは、前記パネルから選択される少なくとも4つのさらなるポリペプチドの濃度をアッセイすることを含む。適切には、前記パネルからの少なくとも1つのさらなるマーカーの濃度のアッセイが、実行される。適切には、急性脳外傷は、脳卒中である。適切には、試料は、脳微小透析体液、脳脊髄液、又は血液である。最も適切には、試料は、血液である。適切には、ステップiは、前記対象由来の試料におけるPRDX1の濃度をアッセイすることを含む。適切には、タンパク質は、ウエスタンブロッティングによって検出される。適切には、タンパク質は、ビーズサスペンションアレイ又は平面アレイによって検出される。適切には、タンパク質は、アイソバリックタンパク質タギングisobaricproteintagging又は同位体タンパク質タギングisotopicproteintaggingによって検出される。適切には、タンパク質は、質量分析計ベースのアッセイによって検出される。他の態様では、本発明は、第1及び第2のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質の、急性脳損傷に関連する診断応用又は予後判断応用のための使用であって、第1のポリペプチドが、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1から選択され、第2のポリペプチドが、パネルAから選択される使用に関する。他の態様では、本発明は、ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質の、脳卒中に関連する診断応用又は予後判断応用のための使用であって、ポリペプチドが、パネル2から選択される使用に関する。他の態様では、本発明は、それぞれ、1つ又は2つ以上の前記ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性をそれぞれが有する物質の組み合わせの、上記に記載の使用に関する。他の態様では、本発明は、物質又はそれぞれの物質が、抗体又は抗体チップである、上記に記載の使用に関する。他の態様では、本発明は、物質が、1つ又は2つ以上の前記ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントに対して特異性を有する抗体である、上記に記載の使用に関する。他の態様では、本発明は、急性脳損傷の診断において使用するためのアッセイデバイスであって、第1及び第2のポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質を含有する位置を有する固体基質を含み、第1のポリペプチドが、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1から選択され、第2のポリペプチドが、パネルAから選択されるアッセイデバイスに関する。他の態様では、本発明は、脳卒中の診断において使用するためのアッセイデバイスであって、ポリペプチド又はその断片、バリアント、若しくはミュータントを認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有する物質を含有する、位置を有する固体基質を含み、ポリペプチドが、パネル2から選択されるアッセイデバイスに関する。上記に記載のアッセイデバイスにおいて、適切には、物質は、抗体又は抗体チップである。適切には、アッセイデバイスは、それぞれの抗体について固有のアドレス指定可能な位置を有し、それによって、それぞれの個々のポリペプチド又はポリペプチドの任意の組み合わせについてアッセイの読み取りを可能にする。他の態様では、本発明は、脳卒中の診断において使用するためのキットであって、上記に記載のアッセイデバイス、及び対象から採取される体液の試料における1又は2以上のポリペプチドの量を検出するための手段を含むキットに関する。より適切には、ポリペプチドは、ペルオキシレドキシンである。より適切には、ポリペプチドは、PRDX1である。他の態様では、本発明は、対象における急性脳損傷の診断又は予後モニタリングの方法であって、a個体由来の適切な組織試料からタンパク質を得、抽出するステップと、b前記タンパク質を消化してペプチドの集団を産生するステップと、c表15において列挙される1又は2以上のトランジションの選択反応モニタリングSelectedReactionMonitoringを使用して、表14において列挙される1又は2以上の前記ペプチドの存在量を決定するステップと、d前記1又は2以上のペプチドの存在量を、急性脳損傷の診断に関連する、あらかじめ決定されたペプチドの存在量と比較するステップと、e前記1又は2以上のペプチドの存在量の差異に基づいて、対象が急性脳損傷を患っているかどうか及び/又は急性脳損傷が悪化している若しくは改善していることを決定するステップとを含む方法に関する。適切には、あらかじめ決定されたペプチドの存在量は、表14から選択される対応する合成ペプチドの既知の量を使用して決定される。他の態様では、本発明は、表14において列挙される群から選択される1又は2以上の合成ペプチドを含む、急性脳損傷の診断又は急性脳損傷を有する対象の予後モニタリングを行うための調製物に関する。適切には、前記1又は2以上の合成ペプチドは、GSTP1TFIVGDQISFADYNLLDLLLIHEVLAPGCLDAFPLLSAYVGRMPPYTVVYFPVRDDYVKDQQEAALVDMVNDGVEDLRFQDGDLTLYQSNTILRASCLYGQLPKAFLASPEYVNLPINGNGKMLLADQGQSWKLSARPKTLGLYGKEEVVTVETWQEGSLKALPGQLKPFETLLSQNQGGKYISLIYTNYEAGKPRDX1HGEVCPAGWKPGSDTIKPDVQKQGGLGPMNIPLVSDPKADEGISFRDISLSDYKLVQAFQFTDKIGHPAPNFKLNCQVIGASVDSHFCHLAWVNTPKYVVFFFYPLDFTFVCPTEIIAFSDRMSSGNAKTIAQDYGVLKATAVMPDGQFKPRDX6GMPVTARMPGGLLLGDVAPNFEANTTVGRDFTPVCTTELGRVVFVFGPDKLIALSIDSVEDHLAWSKELAILLGMLDPAEKLSILYPATTGRVATPVDWKNFDEILRLPFPIIDDRVVISLQLTAEKDINAYNCEEPTEKLAPEFAKDGDSVMVLPTIPEEEAKFHDFLGDSWGILFSHPRDDAH1ALPESLGQHALRDENATLDGGDVLFTGRDYAVSTVPVADGLHLKGAEILADTFKGEEVDVARQHQLYVGVLGSKTPEEYPESAKCYTBHDELTYFSQVVAGTNYFIKVFQSLPHENKPLTLSNYQTNKVHVGDEDFVHLRACBPMSQAEFEKAAEEVRQATVGDINTERPGMLDFTGKTKPSDEEMLFIYGHYKWDAWNELKMWGDLWLLPPASANPGTGTEAEFEKMPAFAEFEKCSRP1GFGFGQGAGALVHSEGLESTTLADKGYGYGQGAGTLSTDKMT3GGEAAEAEAEKMDPETCPCPSGGSCTCADSCKSCCSCCPAECEKPEPB1GNDISSGTVLSDYVGSGPPKLYEQLSGKLYTLVLTDPDAPSRNRPTSISWDGLDSGKVLTPTQVKYVWLVYEQDRPLKから選択される。他の態様では、本発明は、それぞれのペプチドが、水素、炭素、酸素、窒素、又は硫黄から選択される1又は2以上の安定した重同位体を含有する、上記に記載の調製物に関する。他の態様では、本発明は、前記合成ペプチドが、同位体タグisotopictag又はアイソバリックタグisobarictagにより標識される、上記に記載の調製物に関する。他の態様では、本発明は、急性脳損傷の診断又は予後モニタリングのための、上記に記載の調製物に関する。他の態様では、本発明は、急性脳損傷が、虚血性脳卒中又は一過性脳虚血発作である、上記に記載の調製物に関する。他の態様では、本発明は、対象における脳卒中の診断を補助するための方法であって、i前記対象由来の試料における、PRDX1、PRDX6、及びGSTP1からなる群から選択される少なくとも1つの酸化ストレスポリペプチドの濃度をアッセイするステップと、iiiの濃度を、標準試料におけるポリペプチドの濃度と比較し、前記ポリペプチドについての量比を決定するステップとを含み、iii前記試料におけるポリペプチドの前記標準試料中のポリペプチドに対する量比の結果が、1.3を超えると脳卒中が前記対象において生じている可能性の増加を示す方法に関する。本明細書において説明されるある方法ステップは、方法の他の必要条件に加えて、1又は2以上のさらなるポリペプチド複数可のアッセイを必要とする。さらなるポリペプチドは、既にアッセイされることが必要とされている1又は2以上のポリペプチドとは異なるポリペプチドである。本明細書において示されるポリペプチドの群のうちのいくつかが、本明細書において示される他の群に共通のメンバーを含有するので、これは重要である。明確に、さらなるポリペプチドについての言及は、方法の初期の部分によってアッセイされる又は既にアッセイされているあらゆるポリペプチドに加えて、追加のポリペプチドのアッセイを課することが意図される。したがって、方法が、A/B/Cのうちの1つがアッセイされることを必要とし、A/B/D/E/F/Gから選択されるさらなるポリペプチドについてのアッセイを必要とする場合、次いで、単に、Aを2回又はBを2回アッセイすることは、本明細書において説明されるさらなるポリペプチドをアッセイすることを構成せず、A、次いでBをアッセイすることは、さらなるポリペプチドについてのアッセイを構成し、A、次いでDをアッセイすることは、さらなるポリペプチドについてのアッセイを構成するなどとなる。したがって、適切には、さらなるポリペプチドは、追加のポリペプチドであり、適切には、さらなるポリペプチドは、同じ方法においてアッセイされる他のそれぞれのポリペプチドとは異なる。急性脳損傷は、脳に対する任意の急な発病の傷害又は外傷を包含する。急性脳損傷は、外傷性脳障害を含んでいてもよい。急性脳損傷は、虚血発作などの脳卒中から結果として生じる影響を含んでいてもよい。急性脳損傷は、任意の他の急性脳外傷を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、急性脳外傷は、脳卒中であり、最も好ましくは虚血発作である。試料は、試験されることとなる対象由来の任意の適した生物学的試料であってもよい。試料は、脳の微小透析から集められた微小透析体液であってもよい。これは、可能性のある外傷の部位に最も密接に関連するという利点を有する。試料は、脳脊髄液であってもよい。これは、微小透析液よりも容易に採取されるという利点を有する。これは、そのため、患者及び採取を実行する熟練したオペレーターに対してそれほど大変ではない。試料は、血液であってもよい。これは、最小限に侵襲性の様式で容易に採取されるという利点を有する。血液の採取は、通常の一般に入手可能な設備及び採取を実行する医療従事者のわずかな訓練を必要とする。試料は、きれいにされた血液clearedbloodつまり血漿又はきれいにされた血漿clearedplasmaであってもよく、赤血球及び白血球は、例えば遠心分離によって除去されている。これらには、試料を安定させ、それを保存する若しくは扱うのをより容易にする又はさらに分析する/アッセイするのを容易にするという利点がある。適切には、記載される方法複数可は、対象由来の試料の採取の実際のステップを含まない。適切には、試料採取のステップは、本発明の方法から省かれる。適切には、試料は、あらかじめ採取される。適切には、方法は、インビトロの方法である。適切には、方法は、試料があらかじめ採取された対象の物理的な存在を必要としない。適切には、試料は、インビトロの試料である。血漿は、比較的容易に得ることができ、脳を含む他の器官のサブプロテオームを反映してもよい。候補タンパク質パネル及びゲルベースのプロテオミクスの両方は、可能性のあるバイオマーカーを同定するために血漿及び血清において以前に使用され、いくらか成功してきた。質量分析を用いる血漿のプロテオミクス分析に関する課題のうちの1つは、血漿タンパク質の莫大なダイナミックレンジdynamicrangeである。タンパク質レベルは、並はずれた10桁に及び、これは、より少量のタンパク質の調査をほとんど不可能にするAndersonandAnderson2002Jacobsetal2005。短期間で最も目立つピークが断片化のために選ばれるLC/MS/MSにおける機器の設定は、血清アルブミン及び他のタンパク質の高度な存在量により、未分画血漿における少量タンパク質の同定及び定量化を可能にしない。これは、少数の同定されるタンパク質において影響を及ぼされる。ダイナミックレンジを低下させるための1つのアプローチは、最も多量のタンパク質の試料を除去することであり、この場合、本発明者らは、アルブミン、トランスフェリン、IgG、IgA、アンチトリプシン、及びハプトグロビンを除去するために免疫親和性カラムを使用するこのアプローチを例示する。同定可能で定量化できるタンパク質の数は、かなり増加させることができ、相対的タンパク質レベルを、異なる試料の間で比較した。ある種のアッセイ形式については、本発明による試料は、処理された血漿であってもよい。これは、試料が質量分析によって分析されることになっている場合、好都合である。例えば、血漿は、非常に多量のタンパク質を除去し、それによって、検出可能なタンパク質の数を増加させるために又は低度の絶対的濃度で存在するタンパク質の検出性を増加させるために処理することができる。血漿由来の非常に多量のタンパク質の除去のための技術は、当技術分野においてよく知られている。特に、マルチプル親和性除去システムmultipleaffinityremovalsystemは、分析のために血漿を処理するために好都合に使用することができる。さらに、試料は、適切には、濃縮血漿タンパク質などの血漿タンパク質を含んでいてもよい。本実施形態では、血漿は、本明細書において記載されるように処理してもよく、次いで、前記血漿由来のタンパク質を含む試料に至るために、サイズ排除クロマトグラフィー、バッファー交換、又は他のそのような処理にかけてもよく、これは、分析機器における優れた性能などの利点を提供することができる。さらに、脳卒中などの急性脳外傷に関連することが本明細書において教示されるバイオマーカーの多くが、実存の対象由来の血液からの検出又はモニタリングに初めて適用可能であることは、試料が血液又は血液産物である場合に、本発明の実施形態の特定の利点となり、既知の技術は、多くの場合、死亡した対象由来の脳脊髄液のアッセイに依存し、そのため、本明細書において教示されるように、生きている対象における診断を補助するための開示に以前に達していなかった。標準試料標準試料は、典型的に、健康な個体、つまり、急性脳損傷、脳血管発作、又は関連する外傷を患っていない個体由来の試料を指す。標準試料は、並行して分析される実際の試料とすることができる。その代わりに、標準試料は、比較試料、例えば健康な対象由来の試料から以前に導き出された1又は2以上の値とすることができる。そのような実施形態では、単なる数の比較は、対象由来の試料について決定された値を、あらかじめ分析された参照試料の数値と比較することによって行うことができる。この利点は、対象由来の試料が分析されるごとに、並行して、個々の参照試料における濃度を決定することによって分析を再現する必要がないことである。適切には、標準試料は、例えば性別が、例えば年齢が、例えば民族的背景が、又は当技術分野においてよく知られている他の基準が、分析されている対象に一致する。標準試料は、1又は2以上の従来の研究によって得られた絶対的な濃度などの数であってもよい。標準試料は、適切には、特定の患者サブグループ、例えば高齢の対象又は脳卒中に対する素因などの以前の関連する履歴を有する対象又は人生において以前に1若しくは2以上の脳卒中を経験した対象に一致してもよい。適切には、標準試料は、分析されている試料タイプに一致する。例えば、アッセイされているバイオマーカーポリペプチド複数可の濃度は、試料のタイプ又は性質に依存して変化してもよい。標準試料についての濃度値複数可が、本発明の方法複数可において試験されている試料と同じ又は同等の試料についてのものであるはずであることは、当業者に直ちに明らかになるであろう。例えば、アッセイされている試料が血液である場合、標準試料値は、それが、意味のある相互比較が可能である、そのため計算されている意味のある量比であることを確実にするために、血液についてのものであるはずである。特に、試料の性質が2つの間で同一でない、所望の対象について決定される濃度及び標準試料について決定される濃度の間の比較によって推論が試みられる場合、細心の注意が払われなければならない。適切には、標準試料についての試料タイプ及び所望の対象についての試料タイプは、同じである。本発明のいくつかの実施形態については、決定されるポリペプチド濃度が、同じ対象由来の以前の試料と比較できることに注目されたい。これは、対象における脳損傷の進行をモニターするのに有益になり得る。これは、対象の治療の経過及び/又は効力のモニターにおいて有益になり得る。本実施形態では、方法は、所望の試料について決定される量比を、同じ対象について異なる時点で採取される試料などの異なる試料由来の同じポリペプチドについて決定される1又は2以上の量比と比較するさらなるステップ複数可を含んでいてもよい。そのような比較を行うことによって、情報は、特定のポリペプチドマーカーが特定の対象において増加している又は減少しているかどうかに関して集めることができる。この情報は、ある期間にわたる変化又は特定の治療若しくは治療方式によって阻害される若しくは刺激される変化又は所望の任意の他の変化するものを診断する又は予測するのに有用であり得る。したがって、急性脳損傷のポリペプチドバイオマーカーが、同じ対象由来の後の時点からの試料において上昇する又はさらに上昇する場合、次いで、これは、前記対象において進行する又は悪化する脳損傷の可能性を示す。同様に、急性脳損傷のポリペプチドバイオマーカーが、同じ対象由来の後の時点からの試料において減少する場合、これは、前記対象における急性脳損傷の改善又は緩和の可能性を示す。明確に、これらの効果が、脳損傷のための治療を受けている対象において観察される場合、治療の効力に関する対応する推論は、本発明によって同様に得ることができる。言いかえれば、対象が治療を受けている場合、急性脳損傷のポリペプチドバイオマーカーが、同じ対象由来の後の時点からの試料において減少する場合、これは、治療が有効である可能性を示し、急性脳損傷のポリペプチドバイオマーカーが、同じ対象由来の後の時点からの試料において上昇する又はさらに上昇する場合、これは、治療が効果的でない可能性を示す。このように、本発明は、例えば、薬剤若しくは候補の薬剤を用いる患者の治療後に疾患が進行したかどうか又は疾患進行の速度が修正されたmodifiedことを決定するために使用することができる。結果は、疾患の結果についての予後判断を導くことができる。組み合わせ本発明は、よりロバストな診断又は予後判断を提供するためにバイオマーカーのパネルの一部として適用することができる。さらに、本発明は、所与の患者についての疾患状態のより完全な像又は可能性のある結果を提供するためにバイオマーカーのパネルの一部として適用することができる。もちろん、当業者は、本発明の特定のバイオマーカーを、当技術分野において知られている他のマーカーと好都合にも組み合わせてもよいことを十分に理解するであろう。本明細書において説明される特定のバイオマーカー又はバイオマーカーのパネルを含むそのような拡張された群は、もちろん、本発明によって包含されるように意図される。そのような一実施形態において試験するためのさらに知られているマーカーの選択は、適切な供給源によって当業者によって達成することができる。この状況では、さらなるバイオマーカーは、脳卒中に、脳卒中の特異な診断が必要とされる他の急性脳損傷障害に、又は脳卒中を有する患者若しくは患者の症状が脳卒中の症状を模倣する患者と一般に関連する他の疾患に関連してもよい。適切には、前記対象は、ヒトである。適切には、前記対象は、非ヒト哺乳動物である。適切には、前記対象は、げっ歯動物である。位置情報本発明のマーカーポリペプチドは、脳外傷braininjury又は傷害の部位のそれらの近くに直接関連する微小透析体液における濃度の勾配を示すことができる。本発明のいくつかの実施形態については、決定されるポリペプチド濃度が、脳の異なる領域と比較できることに注目されたい。特に、傷害又は外傷の部位のすぐ付近の脳領域におけるポリペプチド濃度は、同じ脳の脳半球内のより遠位の領域と及び/又は無影響の対側脳半球と比較することができる。より適切には、脳外傷のタイプが虚血性脳卒中である場合、付近の領域は、梗塞中心部であり、同じ脳半球内のより離れた領域は、ペナンブラである。検出マーカータンパク質は、その発現を変え得る、つまり、脳卒中などの急性脳損傷を有する患者において量的に増加し得る又は減少し得る。発現が正常対罹患状態において異なる程度は、2D電気泳動ゲルの銀染色、アイソバリック質量タギングisobaricmasstagging及び質量分析を使用する代表的なペプチドイオンの測定、又はウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイELISA,enzymelinkedimmunosorbentassay、若しくはラジオイムノアッセイを含む免疫学的検出方法などの標準的な特徴づけの技術を介して視覚化するのに十分に大きい必要があるのみである。発現差異が視覚化され得る他の標準的な解析技術は、当業者らによく知られている。これらは、画分の連続的クロマトグラフィー分離及びピークの比較、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ上でのものを含むマイクロチャネルネットワークを使用する分離、並びに多重反応モニタリングMRM,multiplereactionmonitoring及びTMTcalibratorを含む質量分析法を含むDayonetal2009。タンパク質レベルが変わる程度は、典型的に、脳損傷の部位からの距離と逆比例の関係で変化する。脳微小透析液の場合には、見られる変化は、比較的大きくなり、また、典型的に、2を超える比は、発現における疾患関連性の変化を示す。脳脊髄液及び/又は血漿などのより遠位の部位では、変化検出されるタンパク質の濃度における変化の程度は、脳微小透析液よりも低くてもよいが、なお、診断又は予後的に有用な情報を提供する。そのような物質例えば脳脊髄液及び/又は血漿において、典型的に、1.3を超える比は、脳損傷を表すと考えられる。クロマトグラフィー分離は、Pharmacia社の文献において記載されるように、高速液体クロマトグラフィーによって実行することができ、クロマトグラムは、分離の時間に対する280nmでの光の吸光度のプロットの形態で得られる。次いで、不完全に分離したピークを生ずる物質に、再度クロマトグラフィーなどを行う。キャピラリー電気泳動は、多くの刊行物において、例えば、それらのPACE5000systemと共にBeckman社によって提供される文献TotalCESolutionsにおいて記載される技術である。この技術は、小さなキャピラリーチューブ中に含有される試料の両端に電位をかけることに依存する。チューブは、負荷電ケイ酸塩ガラスなどの荷電表面を有する。逆に荷電したイオンこの場合、陽イオンは、表面に引きつけられ、次いで、表面と同じ極性の適切な電極この場合、陰極に移動する。試料のこの電気浸透流EOF,electroosmoticflowにおいて、陽イオンは、最も速く動き、これに、無電荷物質及び負荷電イオンが続く。したがって、タンパク質は、本質的にそれらに対する電荷によって分離される。マイクロチャネルネットワークは、いくぶん、キャピラリーのように機能し、ポリマー物質の光剥離によって形成することができる。この技術において、UVレーザーは、適したUV吸収特性を有するポリマー、例えばポリエチレンテレフタレート又はポリカーボネート上への射撃において放たれる高エネルギー光パルスを生成するために使用される。入射光子は、制限された空間を有する化学結合を壊し、内圧の上昇、小さな爆発、及び剥離した物質の放出を導き、マイクロチャネルを形成する空隙を通り過ぎる。マイクロチャネル物質は、キャピラリー電気泳動と同様にEOFに基づいて分離を達成する。それは、それぞれのチップがそれ自体の試料インジェクター、分離カラム、及び電気化学的検出器を有するマイクロチップ形態に適応可能である。JSRossieretal1999Electrophoresis20pages727731を参照されたい。他の方法は、マーカータンパク質について結合アッセイを実行することを含む。任意の適度に特異的な結合剤を使用することができる。好ましくは、結合剤は、標識される。好ましくは、アッセイは、とりわけバイオマーカー及びタンパク質を認識する抗体、とりわけ標識抗体の間のイムノアッセイである。それは、マーカータンパク質の一部又はすべてに対して産生される抗体、例えば、マーカータンパク質に対して高度な特異性のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗ヒト抗血清とすることができる。結合アッセイがイムノアッセイである場合、それは、タンパク質/抗体相互作用の程度を測定することによって実行することができる。イムノアッセイの任意の知られている方法を使用することができる。サンドイッチアッセイは、好ましい。例示的なサンドイッチアッセイにおいて、マーカータンパク質に対する第1の抗体は、プラスチックマイクロタイタープレートのウェルなどの固相に結合し、試料及びアッセイされることとなるタンパク質に特異的な標識二次抗体と共にインキュベートされる。その代わりに、抗体捕捉アッセイを使用することができる。ここで、被検試料は、固相に結合し、次いで、抗マーカータンパク質抗体を添加し、結合させる。非結合物質を洗浄した後に、固相に結合した抗体の量は、第1の抗体に対する標識二次抗体を使用して決定される。他の実施形態では、競合アッセイは、試料及び標識マーカータンパク質又はそれから誘導されるペプチドの間で実行され、2つの抗原は、固体支持体に結合した、限られた量の抗マーカータンパク質抗体について競合する。標識マーカータンパク質又はそのペプチドは、固相上の抗体と共にあらかじめインキュベートすることができ、それによって、試料中のマーカータンパク質は、抗体に結合したマーカータンパク質又はそのペプチドの一部に取って代わる。他の実施形態では、2つの抗原を、抗体との単一の同時インキュベーションにおいて競合させる。洗浄による支持体からの非結合抗原の除去後に、支持体に付加された標識の量が決定され、試料中のタンパク質の量は、あらかじめ確立された標準滴定曲線に対する参照によって測定される。結合アッセイ中の結合剤は、抗体又は他の特異的結合剤であってもよい標識された特異的な結合剤であってもよい。結合剤は、通常、それ自体標識されるが、その代わりに、それは、シグナルが例えば他の標識物質から生成される二次反応によって検出することができる。標識は、酵素であってもよい。酵素に対する基質は、例えば発色、蛍光、又は化学発光基質であってもよい。アッセイの増幅形態を使用することができ、それによって、増強されたシグナルは、比較的低レベルの検出されることとなるタンパク質から産生される。増幅イムノアッセイの1つの特定の形態は、増強化学発光アッセイである。好都合に、抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにより標識され、これは、ルミノール、ペルオキシド基質、並びに放射された光の強度及び持続時間を増強する化合物、典型的に4-ヨードフェノール又は4-ヒドロキシケイ皮酸との化学発光反応に関与する。増幅イムノアッセイの他の形態は、イムノPCRである。この技術において、抗体は、PCRプライマーを含む任意のDNAの分子に共有結合し、それによって、それに付加された抗体を有するDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。ERHendricksonetalNucleicAcidsResearch23522529を参照されたい。シグナルは、従来どおり読み取られる。アッセイに必要とされる時間は、MRobersetalDevelopmentofarapidmicroparticleenhancedturbidimetricimmunoassayforplasmafattyacidbindingproteinanearlymarkerofacutemyocardialinfarctionClinChem19984415641567によって具体化されるタイプなどの急速微粒子増強比濁イムノアッセイの使用によって低下させてもよい。MRobersetal前掲によって記載されるHoffmannLaRoche社からのCOBAS商標MIRAPlussystem又はAbbottLaboratories社からのAxSYMTandemmasstagsAnovelquantificationstrategyforcomparativeanalysisofcomplexproteinmixturesbyMSMSAnalChem7518951904、DayonLHainardALickerVTurckNKuhnKHochstrasserDFBurkhardPRandSanchezJCRelativequantificationofproteinsinhumancerebrospinalfluidsbyMSMSusing6plexisobarictagsAnalChem8029212931。さらに、様々な組織及び体液におけるタンパク質タギングにiTRAQを使用する多数の報告が、過去数年間に公開されてきたAggarwaletal2006。とりわけ、様々な状態におけるバイオマーカーの発見については、iTRAQは、非常に適したツールであることが証明され、癌Mauryaetal2007Garbisetal2008Mattaetal2008Ralhanetal2008及び糖尿病研究Luetal2008において並びにCSF中にもかかわらず神経変性障害におけるバイオマーカーについての探究Abdietal2006において使用されてきた。多重選択反応モニタリングSRM又はMRMMRM/SRMは、最も高度なデューティサイクルdutycycleを有するスキャンタイプであり、高感度で1又は2以上の特異的なイオントランジションをモニターするために使用される。ここで、Q1は、特定の親m/zに対して設定されQ1はスキャンしていない、衝突エネルギーは、その親イオンの最適な診断上の荷電断片をもたらすように設定され、Q3は、その断片の特定のm/zに対して設定される。この正確なトランジションを有するイオンのみが、検出されることになる。薬剤代謝物質などの小分子を定量化するために歴史的に使用されるように、同じ原理は、ペプチド、内因性成分又はタンパク質の酵素消化から産生されるものに対して適用することができる。さらに、歴史的に、実験は、三連四重極質量分析計を使用して実行されたが、イオントラップと四重極を組み合わせるハイブリッド機器設計の最近の導入は、同様の改善された実験が試みられるのを可能にする。そのため、4000QTRAP機器は、多重反応モニタリングMRMを使用して非常に高度な特異性及び感度でペプチド及び生体分子定量化が実行されるのを可能にする。これは、ほとんど、複雑な混合物において多くの特異的なイオン100までの異なるイオンの存在を検出するために、続いて多くのMRMスキャンをともに束ねて1つの実験にすることができるLINAC登録商標CollisionCellの使用によるものである。したがって、単一のクロマトグラフィー分離において多くのタンパク質から多数のペプチドを測定し、定量化することは現在、実現可能である。MRMLCピーク下の面積は、存在する分析物の量を定量するために使用される。典型的な定量化実験において、標準濃度曲線は、所望の分析物について生成される。次いで、未知の試料が同一の条件下で流されると、未知の試料中の分析物についての濃度は、ピーク面積及び標準濃度曲線を使用して決定することができる。診断試料は、イオントラップ質量分析計上のMRMによる分析にかけることができる。下記に記載されるマーカータンパク質の質量分析プロファイルに基づいて、好適なイオン化の特徴を有する、特定の既知の質量及びアミノ酸配列を有する単一のトリプシンペプチドが同定される。次いで、質量分析計は、特定の質量及び配列のペプチドについて特異的に調査し、それらの相対的シグナル強度を報告するようにプログラムされる。MRMを使用して、1回のLC-MSの実行において、5、10、15、20、25、30、40、50、又は100までの異なるマーカータンパク質について調査することが可能である。診断試料中の本発明の特定のバイオマーカーのMRMペプチドの強度は、疾患を有していない対象由来の試料中に見出されるものと比較され、診断又は予後判断が行われるのを可能にする。MRMアッセイは、マーカータンパク質のMRMペプチドに対応する合成絶対的定量AQUA,absolutequantificationペプチドからなる内部標準試料の使用によって、より正確に量的にすることができ、1又は2以上の原子は、炭素13又は窒素15などの安定同位体と置換され、そのような置換により、AQUAペプチドは、診断試料に由来するMRMペプチドの天然の、より軽い形態に対して定められた質量差異を有する。したがって、天然のMRMペプチド及びAQUAペプチドの相対的イオン強度を比較することによって、診断試料中の親タンパク質の真の濃度を決定することができる。そのような同位体希釈法による絶対的な定量化の一般的な方法は、GerberScottAetalAbsolutequantificationofproteinsandphosphoproteinsfromcelllysatesbytandemMSPNASJune102003Vol100No12p69406945において提供されている。いくつかの場合には、SRM実験において絶対的な定量化を提供するために同位体をドープした標準物質を使用することが望ましいが、上記に記載のAQUAアプローチを使用することは可能ではない。そのような場合、1対の同位体質量タグ、つまり、同一の化学構造を有するが、異なるレベルの同位体置換を有し、それぞれの固有の質量を生ずる2つのタグを使用することが可能である。5Daだけ質量が異なるTandemMassTag登録商標TMT登録商標の2つの形態を使用して、アッセイにおいてすべての標的ペプチドについての全般的な基準を形成するために、混合前に軽いタグで標準合成参照SRMペプチドを標識することが可能である。次いで、患者試料はそれぞれ、トリプシン消化にかけられ、結果として生じるペプチドは、重いTMTタグにより標識される。次いで、TMT標識参照ペプチドのアリコートは、試料に添加され、患者試料において測定されることとなる標的範囲に適切な、参照ペプチドの最終濃度を生ずる。次いで、スパイクされた試料は、標準的な同位体希釈SRMアッセイにかけられ、患者試料由来のSRMペプチドの濃度は、軽い方の形態の既知濃度のイオン強度に対して重い形態のイオン強度を比較することによって、計算される。バイオマーカー候補として同定された調節ペプチドの相対的又は絶対的定量化のためのMSベースのアッセイの代替形態は、ProteomeSciencesplc社によって開発されたTMTcalibrator法である。好適なMS/MS反応を有する候補バイオマーカー複数可のトリプシン断片に相当する既知の量の合成ペプチドは、アイソバリック質量タグのTMT6セットの6つの試薬のうちの4つTMT6128~TMT6131により標識され、一定の比で混合される。これは、生理的濃度及び/又は疾患修飾濃度を反映するマルチポイント検量線が素速く設計され、構築されるのを可能にする。続いて、脳卒中などの急性脳外傷に罹患している又は罹患していることが疑われている患者から採取される診断試料は、TMT6126により標識され、キャリブレーション混合物は、研究試料に添加される。個々のペプチドのMS/MSの間に、検量体ペプチドのTMT6レポーターイオンが産生され、検量線を確立するために使用される。次いで、研究試料中のペプチドの絶対量は、検量線に対してTMT6126イオン強度を読み取ることによって容易に導き出される。TMTcalibratorアッセイについてのさらなる情報は、ProteomeSciences社のウェブサイトwwwproteomicscomから得ることができる。診断の好ましい方法は、マーカータンパク質についての結合アッセイを実行するステップを含む。任意の適度に特異的な結合パートナーを使用することができる。好ましくは、結合パートナーは、標識される。好ましくは、アッセイは、とりわけマーカー及びタンパク質を認識する抗体、とりわけ標識抗体の間のイムノアッセイである。それは、その一部又はすべてに対して産生される抗体、最も好ましくは、マーカータンパク質に対して高度な特異性のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗ヒト抗血清とすることができる。したがって、上記に記載のマーカータンパク質は、診断試料中に存在するマーカータンパク質の濃度の増加又は減少を検出するために使用することができる、それに対する抗体を産生するのに有用である。そのような抗体は、免疫診断の分野においてよく知られている方法のうちのいずれかによって産生することができる。抗体は、タンパク質の任意の生物学的に関連する状態に対するものであってもよい。したがって、例えば、それらは、グリコシル化形態で体内に存在するタンパク質の非グリコシル化形態に対して、前駆物質タンパク質の、例えばそのシグナル配列がない、より成熟した形態に対して、又はマーカータンパク質の関連するエピトープを保持するペプチドに対して産生することができる。試料は、哺乳動物又は非哺乳動物対象の任意の有効な体組織、とりわけ体液から採取することができるが、好ましくは血液、血漿、血清、又は尿から採取することができる。他の使用可能な体液は、脳脊髄液CSF、精液、及び涙液を含む。好ましくは、対象は、マウス、ラット、モルモット、イヌ、又は霊長動物などの哺乳動物種である。最も好ましくは、対象は、ヒトである。好ましいイムノアッセイは、タンパク質/抗体相互作用の程度を測定することによって実行される。イムノアッセイの任意の知られている方法を使用することができる。サンドイッチアッセイは、好ましい。この方法において、マーカータンパク質に対する第1の抗体は、プラスチックマイクロタイタープレートのウェルなどの固相に結合し、試料及びアッセイされることとなるタンパク質に特異的な標識二次抗体と共にインキュベートされる。その代わりに、抗体捕捉アッセイを使用することができる。ここで、被検試料は、固相に結合し、次いで、抗マーカータンパク質抗体を添加し、結合させる。非結合物質を洗浄した後に、固相に結合した抗体の量は、第1の抗体に対する標識二次抗体を使用して決定される。他の実施形態では、競合アッセイは、試料及び標識マーカータンパク質又はそれから誘導されるペプチドの間で実行され、2つの抗原は、固体支持体に結合した、限られた量の抗マーカータンパク質抗体について競合する。標識マーカータンパク質又はそのペプチドは、固相上の抗体と共にあらかじめインキュベートすることができ、それによって、試料中のマーカータンパク質は、抗体に結合したマーカータンパク質又はそのペプチドの一部に取って代わる。他の実施形態では、2つの抗原を、抗体との単一の同時インキュベーションにおいて競合させる。洗浄による支持体からの非結合抗原の除去後に、支持体に付加された標識の量が決定され、試料中のタンパク質の量は、あらかじめ確立された標準滴定曲線に対する参照によって測定される。標識は、好ましくは酵素である。酵素に対する基質は、例えば発色、蛍光、又は化学発光基質であってもよい。結合アッセイにおける結合パートナーは、好ましくは、標識された特異的な結合パートナーであるが、必ずしも抗体ではない。結合パートナーは、通常、それ自体標識されるが、その代わりに、それは、シグナルが例えば他の標識物質から生成される二次反応によって検出することができる。アッセイの増幅形態を使用することは非常に望ましく、それによって、増強されたシグナルは、比較的低レベルの検出されることとなるタンパク質から産生される。増幅イムノアッセイの1つの特定の形態は、増強化学発光アッセイである。好都合に、抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにより標識され、これは、ルミノール、ペルオキシド基質、並びに放射された光の強度及び持続時間を増強する化合物、典型的に4-ヨードフェノール又は4-ヒドロキシケイ皮酸との化学発光反応に関与する。MRobersetalDevelopmentofarapidmicroparticleenhancedturbidimetricimmunoassayforplasmafattyacidbindingproteinanearlymarkerofacutemyocardialinfarctionClinChem19984415641567によって具体化されるタイプなどの急速微粒子増強比濁イムノアッセイの使用は、アッセイの時間を著しく減少させる。したがって、MRobersetal前掲によって記載されるHoffmannLaRoche社からのCOBAS商標MIRAPlussystem又はAbbottLaboratories社からのAxSYM商標systemなどの広く使用される臨床化学分析器において企図される任意のイムノアッセイの完全なオートメーションは、可能であり、ルーチン的な臨床診断のために適用されるはずである。その代わりに、診断試料は、マーカータンパク質の位置が分かる、染色ゲルを得るための二次元ゲル電気泳動にかけることができ、ゲル上の適切なスポットでの染色の相対的強度は、濃度測定によって決定し、対応する対照又は比較ゲルと比較することができる。さらなる実施形態では、診断試料は、三連四重極質量分析計上の又はある種のタイプのイオントラップ質量分析計上の多重反応モニタリングMRMなどの質量分析計ベースのアッセイによる分析にかけることができる。それぞれの差次的に発現するタンパク質について、特定の既知の質量親の質量及びアミノ酸配列を有し、断片化に際して、それぞれのタンパク質に特有の特定の質量断片の質量の断片を放出するトリプシンペプチドのセットを同定することが可能である。定められた親の質量イオンからの断片の質量の検出は、トランジションとして知られている。そのようなプロテオタイプペプチドproteotypicpeptideの同定は、バイオマーカー発見の間に見られる、差次的に発現されるタンパク質の質量分析プロファイルに基づいて行うことができ、又は当業者に知られている予測アルゴリズムを使用して、インシリコにおいて設計することができる。次いで、質量分析計は、それぞれのタンパク質について選択される特定の親の質量及び断片の質量のトランジションについてのみ特に調査するようにプログラムされ、それらの相対的シグナル強度を報告する。MRMを使用して、1回のLC-MSの実行において、5、10、15、20、25、30、40、50、又は100までの異なるマーカータンパク質について調査することが可能である。診断試料におけるそれぞれのマーカータンパク質についてのプロテオタイプペプチドの相対的存在量は、脳卒中などの急性脳外傷を有していない対象由来の試料中に見出されるものと比較され、診断が行われるのを可能にする。その代わりに、比較は、同じ患者由来の以前の試料からのタンパク質のレベルを用いて行われ、したがって、前記患者における脳卒中などの急性脳外傷の進行の段階及び/又は速度の予後のアセスメントを可能にしてもよい。本発明のさらなる実施形態では、MRMアッセイは、マーカータンパク質のプロテオタイプペプチドに対応する合成絶対的定量AQUAペプチドからなる内部標準試料の使用によって、より正確に量的にすることができ、1又は2以上の原子は、炭素13又は窒素15などの安定同位体と置換され、そのような置換により、AQUAペプチドは、診断試料に由来する天然のプロテオタイプペプチドに対して定められた質量差異を有する。一度、差次的に発現されるバイオマーカーからのそれぞれのプロテオタイプペプチドと等価なAQUAペプチドが産生されたら、それらは、患者試料のトリプシン消化物にその後スパイクされる標準試料を形成するように混合することができる。その後、組み合わせられた試料は、プログラムされた質量分析計ベースのアッセイにかけられ、天然及びAQUAペプチドからの所定のトランジションの強度が検出される。試料由来の天然ペプチド及びスパイクされたAQUA参照ペプチドの相対的イオン強度を比較することによって、診断試料中の親タンパク質の真の濃度を決定することができる。絶対的定量化の一般的な方法は、参照によって本明細書において組み込まれるGerberScottAetalAbsolutequantificationofproteinsandphosphoproteinsfromcelllysatesbytandemMSPNASJune102003Vol100No12p69406945において提供されている。本発明のさらなる実施形態では、絶対的定量化は、TMT-SRMアッセイを使用することによって行うことができる。マーカータンパク質のプロトタイプペプチドに対応する標準合成参照SRMペプチドは、アッセイにおけるすべてのマーカータンパク質についての全般的な基準を形成するために、混合前に、同位体置換を有していない軽いTMTタグ軽いタグを用いて標識される。次いで、患者試料はそれぞれ、トリプシン消化にかけられ、結果として生じるペプチドは、5つの同位体置換を有するTMTタグ重いタグを用いて標識される。次いで、軽いTMT標識基準ペプチドのアリコートは、重いTMT標識試料に添加され、患者試料において測定されることとなる標的範囲に適切な、参照ペプチドの最終濃度を生ずる。次いで、スパイクされた試料は、標準的な同位体希釈SRMアッセイにかけられ、患者試料由来のSRMペプチドの濃度は、軽い方の形態の既知濃度のイオン強度に対して重い形態のイオン強度を比較することによって、計算される。本発明は、上記に指定されるマーカータンパク質を認識する、それに結合する、又はそれに対する親和性を有するパートナー物質の診断したがっておそらく予後判断又は治療の目的での使用をさらに含む。したがって、例えば、必要な場合には適切にヒト化される、マーカータンパク質に対する抗体は、治療において使用することができる。パートナー物質は、通常、抗体であり、任意のアッセイ適合形式、好都合には、固定形式で、例えばビーズ又はチップとして使用される。パートナー物質が標識され、又はそれは標識と相互作用することができる。本発明は、脳卒中などの急性脳外傷の診断及び予後モニタリングの方法における使用のためのキットであって、診断試料中に存在するマーカータンパク質との相互作用についての、上記に記載されている、アッセイ適合形式での、上記に記載のパートナー物質を含むキットをさらに含む。i脳卒中などの急性脳外傷において差次的に発現される1又は2以上のタンパク質を検出することができる抗体チップ若しくはチップのアレイ又はビーズサスペンションアレイを使用することが、本発明の範囲内でさらに企図される。方法は、脳卒中などの急性脳外傷を治療するための有効な療法を決定することをさらに含んでいてもよい。さらなる態様では、本発明は、脳卒中などの急性脳外傷の発症又は進行を予防するための、正常な状態において見出されるものに向けて、脳卒中状態などの急性脳外傷において1又は2以上の差次的に発現されるタンパク質の発現を回復させる作用物質の使用による治療の方法を提供する。好ましくは、タンパク質の発現は、正常な状態まで回復する。さらなる態様では、本発明は、脳卒中などの急性脳外傷を有する個体の組織試料又は体液試料において差次的に発現するタンパク質のパターンが、脳卒中などの急性脳外傷を軽減するための最も適切で有効な療法を予測するために使用される方法を提供する。脳卒中などの急性脳外傷を治療する際のその有用性を決定するために作用物質をスクリーニングするための方法であって、aスクリーニングされている作用物質を用いて治療された、脳卒中症状などの急性脳外傷を有する対象から採取される又はそれを代表する適切な組織の試料を得るステップと、b治療された対象由来の又はそれを代表する組織において差次的に発現するタンパク質複数可の存在、非存在、又は発現の程度を決定するステップと、c脳卒中症状などの急性脳外傷を有する、治療された対象において、差次的に発現するタンパク質複数可の発現、活性、又は量を変化させる程度によって作用物質を選択する又は拒否するステップとを含む方法もまた提供される。好ましくは、それが差次的に発現するタンパク質の発現を正常な対象の発現に向けて変換する場合、作用物質が選択される。より好ましくは、それがタンパク質複数可の発現を正常な対象の発現に変換する場合、作用物質が選択される。脳卒中などの急性脳外傷を治療する際のその有用性を決定するために作用物質をスクリーニングするための方法であって、aスクリーニングされている作用物質を用いて治療された、脳卒中症状などの急性脳外傷を有する対象から採取される又はそれを代表する適切な組織又は体液の試料をある期間にわたって得るステップと、b前記試料において差次的に発現するタンパク質複数可の存在、非存在、又は発現の程度を決定するステップと、c作用物質が、脳卒中症状などの急性脳外傷を有する、治療された対象における発現が異なるタンパク質の発現におけるある期間にわたる変化に影響を与えるかどうかを決定するステップとを含む方法もまた、提供される。ある期間にわたって採取される試料は、数週間、数か月間、又は数年間の間隔で採取することができる。例えば、試料は、毎月、2か月ごと、3か月ごと、4か月ごと、6か月ごと、8か月ごと、又は12か月ごとの間隔で採取することができる。ある期間にわたる発現における変化は、対象由来の試料における発現の最初のレベル及び/又は正常な対象由来の試料における発現のレベルと比較した、発現の増加又は減少であってもよい。それがある期間にわたって発現の変化を遅らせる又は停止する場合、作用物質が選択される。上記に記載のスクリーニング方法において、特異なレベルのタンパク質発現を有する対象は、a正常な対象及び脳卒中などの急性脳外傷を有する対象、並びにb作用物質を用いて治療されていない脳卒中症状などの急性脳外傷を有する対象及び作用物質を用いて治療されている脳卒中などの急性脳外傷を有する対象を含む。診断及び予後判断本明細書において使用される用語診断は、患者における脳卒中などの急性脳外傷の存在、非存在、又は可能性に関するあらゆる情報の提供を含む。それは、それに関連して経験する又は経験する可能性がある障害又は症状のタイプ又は分類に関する情報提供をさらに含む。それは、状態の医学的経過の予後判断を包含する。それは、発病年齢に関する情報をさらに包含する。治療治療が関係している場合には、治療が、患者に対する脳卒中などの急性脳外傷の影響を軽減するために医師によって取られるあらゆる手段を含むことが理解されるであろう。したがって、損傷の回復又は脳卒中などの急性脳外傷の損傷若しくは影響の排除が、望ましいゴールであるが、有効な治療はまた、損傷の程度又は影響の深刻さ又は進行における低下を達成することができるあらゆる手段を含む。一態様では、本発明は、脳卒中などの急性脳外傷の発症又は進行を予防するための、正常な状態において見出されるものに向けて、脳卒中状態などの急性脳外傷において1又は2以上の差次的に発現されるタンパク質の発現を回復させる作用物質の使用による治療の方法を提供する。好ましくは、タンパク質の発現は、正常な状態まで回復する。さらなる態様では、本発明は、脳卒中などの急性脳外傷を有する個体由来の試料において差次的に発現するタンパク質のパターンが、神経損傷を軽減するための最も適切で有効な療法を予測するために使用される方法を提供する。抗体本明細書において開示されるマーカータンパク質に対する抗体は、知られている方法を使用して産生することができる。抗体を産生するためのこれらの方法は、タンパク質により哺乳動物例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、又はサルを免疫することを含む。抗体は、当技術分野において知られている様々な技術のいずれかを使用して、免疫された動物から得ることができ、好ましくは所望の抗原に対する抗体の結合を使用してスクリーニングすることができる。動物からの抗体及び/又は抗体産生細胞の単離は、動物を屠殺するステップを伴ってもよい。タンパク質による哺乳動物の免疫の代わり又は補足として、タンパク質に特異的な抗体は、例えばそれらの表面上に機能的な免疫グロブリン結合ドメインを示すラムダバクテリオファージ又は糸状バクテリオファージを使用して、発現免疫グロブリン可変ドメインの組換え産生ライブラリーから得ることができる。例えば国際公開第92/01047号パンフレットを参照されたい。ライブラリーは、ナイーブであってもよく、つまり、タンパク質により免疫していない生物から得られる配列から構築してもよく、又は所望の抗原に暴露された生物から得られる配列を使用して構築されるものであってもよい。抗体は、タンパク質の任意の生物学的に関連する状態に結合してもよく又はそれに対して産生してもよい。したがって、例えば、それらは、グリコシル化形態で体内に存在するタンパク質の非グリコシル化形態に対して、前駆物質タンパク質の、例えばそのシグナル配列がない、より成熟した形態に対して、又はマーカータンパク質の関連するエピトープを保持するペプチドに対して産生することができる。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってもよく、多特異性二特異性を含む、キメラ、又はヒト化抗体であってもよい。本発明による抗体は、多くの方法において修飾することができる。実際、用語抗体は、所定の特異性を有する結合ドメインを有するあらゆる結合物質を包含するとして解釈されるべきである。したがって、本発明は、合成分子及び形状が、それが抗原又はエピトープに結合するのを可能にする抗体の形状を模倣する分子を含む、抗体の抗体断片、誘導体、機能的等価物、及び相同体を包含する。抗原又は他の結合パートナーに結合することができる抗体断片の例は、VL、VH、Cl、及びCH1ドメインからなるFab断片;VH及びCH1ドメインからなるFd断片;抗体の単一のアームのVLドメイン及びVHドメインからなるFv断片;VHドメインからなるdAb断片;単離CDR領域、並びにヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される2つのFab断片を含む二価断片であるFab’2断片である。単鎖Fv断片も含まれる。特異的なエピトープを認識する抗体断片は、知られている技術によって生成することができる。例えば、そのような断片は、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるFab’2断片及びFab’2断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるFab断片を含むが、これらに限定されない。その代わりに、Fab発現ライブラリーを、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の急速で容易な同定を可能にするために構築することができるHuseetal1989Science24612751281。本明細書において使用される用語モノクローナル抗体は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体を指す、つまり、集団を含む個々の抗体は、わずかな量で存在し得る可能性のある天然に存在する突然変異は別として、同一である。モノクローナル抗体は、KohlerandMilsteinNature2564951975によって最初に記載された方法によって産生することができ、又は組換え法によって作製することができる。Cabillyetal、米国特許第4,816,567号明細書又はMageandLamoyiinMonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplicationspages7997MarcelDekkerIncNewYork1987を参照されたい。ハイブリドーマ方法において、マウス又は他の適切な宿主動物は、免疫に使用されるナノ粒子に特異的に結合する抗体を産生する又は産生することができるリンパ球を誘発するために、皮下、腹腔内、又は筋肉内経路によって抗原により免疫される。その代わりに、リンパ球は、インビトロで免疫することができる。次いで、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するためにポリエチレングリコールなどの適した融合剤を使用して、ミエローマ細胞と融合される。GodingMonoclonalAntibodiesPrinciplesandPracticepp59103を参照されたい。したがって、調製されたハイブリドーマ細胞は、非融合親ミエローマ細胞の成長又は生存を阻害する、1又は2以上の物質を好ましくは含有する適した培地に接種し、それにおいて成長させることができる。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼHGPRT又はHPRTを欠く場合、ハイブリドーマのための培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンHAT培地を含み、これらの物質は、HGPRT欠損細胞の成長を予防する。好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択される抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支援し、HAT培地などの培地に感受性のものである。ハイブリドーマ細胞が成長中の培地は、タンパク質に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、結合特異性は、酵素結合免疫吸着アッセイELISA,enzymelinkedimmunoabsorbanceassayによって決定される。本発明のモノクローナル抗体は、タンパク質に特異的に結合するものである。本発明の好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、例えばスキャチャード解析によって決定されるように、マイクロモル以上の親和性を超える親和性つまり10-6モルを超える親和性を有する。MunsonPollardAnalBiochem1072201980を参照されたい。所望の特異性及び親和性の中和抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後に、クローンは、限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させることができる。この目的に適した培地は、ダルベッコ変法イーグル培地又はRPM1-1640培地を含む。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで成長させてもよい。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインAセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなど、通常の免疫グロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から適切に分離される。本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸は、当技術分野においてよく知られている手順を使用して、例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって容易に単離され、配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、抗体又はその断片をコードする核酸の好ましい供給源である。一度単離されたら、核酸は、発現又はクローニングベクターにライゲーションされ、これらは、次いで、モノクローナル抗体が組換え体宿主細胞培養物において産生されるように、培養することができる宿主細胞にトランスフェクトされる。本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、遺伝子突然変異又は他の変化を受けてもよい。モノクローナル抗体は、もとの抗体の特異性を保持する他の抗体、ヒト化抗体、又はキメラ分子を産生するために、組換えDNA技術の技術にかけることができることが当業者らによってさらに理解されるであろう。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域CDR,complementaritydeterminingregionをコードするDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域又は定常領域及びフレームワーク領域に導入することを含んでいてもよい。例えば欧州特許出願公開第0184187A号公報、英国特許出願公開第2188638A号公報、又は欧州特許出願公開第0239400A号公報を参照されたい。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第0120694A号公報及び欧州特許出願公開第0125023A号公報において記載されている。本明細書において記載されるマーカータンパク質に対する抗体は、前記タンパク質に結合する。好ましくは、前記抗体は、前記タンパク質に特異的に結合する。特異的なによって、抗体が、それが他の分子に対して示すよりも著しく高度な親和性により前記タンパク質に結合することを意味する。用語抗体は、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、単鎖及びFab断片などの抗体の断片、並びに遺伝子操作された抗体を含む。抗体は、キメラ又は単一の種のものであってもよい。用語マーカータンパク質又はバイオマーカーは、翻訳後修飾を含めて、同定されるタンパク質の生物学的に関連する形態をすべて含む。例えば、マーカータンパク質は、グリコシル化、リン酸化、多量体、前駆物質の形態で体組織中に存在することができる。用語対照は、正常なヒト対象、つまり、脳卒中などの急性脳外傷に罹患していない対象を指す。用語対照試料と比較して増加した又は減少した濃度は、多くの場合、濃度が異常に高度である又は低度であることは当業者にとって明らかであるので、比較するステップが実際に行われることを意味しない。さらに、脳卒中などの急性脳外傷の段階が連続的にモニターされている場合又は治療の経過がモニターされている場合、行われる比較は、疾患の進行の初期の段階で又は治療の初期の段階で若しくは治療を始める前に同じ対象において以前に見られた濃度とのものとすることができる。用語有効な体組織又は適切な組織は、脳卒中などの急性脳外傷に関連するマーカータンパク質が蓄積するであろうということが合理的に予想され得るあらゆる組織を意味する。それは、脳脊髄液試料又は血液又は血漿若しくは血清などの血液誘導体の試料であってもよい。用語抗体アレイ又は抗体マイクロアレイは、連続的な固体表面上の固有のアドレス指定可能なエレメントのアレイを意味し、それによって、それぞれの固有のアドレス指定可能なエレメントで、抗原に対する定められた特異性を有する抗体は、標的抗原のその続く捕捉及びそのような結合の程度の続く検出を可能にする様式で固定される。それぞれの固有のアドレス指定可能なエレメントは、特異的な抗原の結合及び検出が、あらゆる付近のそのような固有のアドレス指定可能なエレメントに干渉しないように、固体表面上で、他のすべての固有のアドレス指定可能なエレメントから間を置いて配置される。用語ビーズサスペンションアレイは、1又は2以上の同定可能な別個の粒子の水性懸濁液を意味し、それによって、それぞれの粒子は、そのサイズ及び色又は蛍光特性に関連するコーディング特徴を含有し、これに対して、そのようなコーディング特徴の特定の組み合わせのビーズはすべて、標的抗原のその続く捕捉及びそのような結合の程度の続く検出を可能にする様式で、抗原に対する定められた特異性を有する抗体によりコーティングされる。そのようなアレイの例は、Luminex登録商標100商標Systemに対するxMAP登録商標ビーズサスペンションアレイの適用が記載されているwwwluminexcorpcomで見出すことができる。質量分析アッセイは、選択反応モニタリングSRM,selectedreactionmonitoring、多重反応モニタリングMRM、同位体をドープしたペプチドを使用する絶対的定量化AQUA、SRMを用いるTandemMassTagTMTSRM,TandemMassTagswithSRM、及びTMTcalibratorを含むが、これらに限定されない、質量分析の任意の定量的方法を意味する。本発明のポリペプチドバイオマーカーなどのバイオマーカーのミュータントという用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有する。ミュータントは、時にバリアント又は対立遺伝子と呼ばれる。重要なことは、本明細書において説明されているように、バイオマーカーを検出することである。バイオマーカーは、研究されている個体の間で突然変異又は対立遺伝子バリアントの形態の個体差を有していてもよい。そのため、本明細書において提供される例示的な配列番号からある程度の偏りがあってもよい。本明細書において提供される配列番号は、本発明のポリペプチド/バイオマーカーを同定し、扱う際に当業者を助けるためのものであり、アッセイされている個々のポリペプチドの制限された不変の定義として意図されない。したがって、提供される配列番号及び検出されているポリペプチドバイオマーカーの実際の配列の間のわずかな配列差異は、対象の間の正常な差の範囲内であることが予想されるであろう。これは、本発明の作業に影響を与えない。用語含むcomprises含むcomprise、含むcomprisingは、当技術分野におけるその通常の意味を有する、つまり、明示される特徴又は特徴の群が含まれるが、用語が、いかなる他の明示される特徴又は特徴の群も、同様に存在することから除くわけではないことを理解されたい。断片/ペプチド本明細書において説明されるバイオマーカーの詳細、特に、それらについて示される配列は、それらの検出を促進するために示されることが当業者によって十分に理解されるであろう。集められている重要な情報は、研究されている試料におけるバイオマーカーの存在若しくは非存在又は特定のレベルである。完全長ポリペプチドがスコア化されるという特定の条件はない。実際、本明細書において説明される検出の適した質量分析ベースのモードの多くを介して、検出は、したがって試料における全体的なバイオマーカーポリペプチドの存在を示すために使用される、存在する所望のポリペプチドの特定の断片をアッセイすることによって起こる。そのため、本発明は、ポリペプチドバイオマーカーの断片の検出を包含する。さらに、本発明のキット及びペプチドは、ポリペプチドの断片を含んでいてもよく、本明細書において例示される完全長配列を含む必要はない。適切には、断片は、質量分析によるその固有の同定を可能にするのに十分に長い。したがって、断片は、適切には、長さが少なくとも6のアミノ酸、適切には、長さが少なくとも7のアミノ酸、適切には、長さが少なくとも8のアミノ酸、適切には、長さが少なくとも9のアミノ酸、適切には、長さが少なくとも10のアミノ酸、適切には、少なくとも15のアミノ酸、適切には、少なくとも25のアミノ酸、適切には、少なくとも50のアミノ酸、適切には、少なくとも100のアミノ酸、又は適切には、所望のバイオマーカーポリペプチドの大部分である。適切には、断片は、所望のバイオマーカーポリペプチドの小さな断片を含むが、同定可能な質量を保持するのに十分に長い。所定のポリペプチド又は質量分析ベースのアッセイによって検出されているポリペプチドのセットについて、アッセイは、本明細書において言及されるMRM技術を介して行われてもよい。本実施形態では、ある種の固有のペプチド、特にある種のトランジションは、所望のペプチドを検出するのにとりわけ好都合である。これらは、最高の表示を示すために典型的に選択される又は多数の断片/トランジションが同様のレベルを示す場合、特定のレベルの表示を示す任意の又はすべてのペプチドなどの組み合わせを使用することができる。モニタリングに使用されるとりわけ好ましいトランジションは、添付の実施例及び/又は図面において言及されるものである。配列相同性/同一性配列相同性は、機能的な類似性つまり、類似する化学的特性/機能を有するアミノ酸残基の点から考慮することができるが、本明細書との関連において、配列同一性の点から相同性を表現することが好ましい。配列比較は、眼によって又はより通常では、容易に入手可能な配列比較プログラムの援助によって行うことができる。これらの公的に、また市販で入手可能なコンピュータープログラムは、2つ以上の配列の間の相同性パーセント同一性パーセントなどを計算することができる。同一性パーセントは、連続する配列にわたり計算することができる、つまり、一方の配列は、他方の配列とアライメントされ、一方の配列におけるそれぞれのアミノ酸は、他方の配列における対応するアミノ酸と直接、同時に1つの残基が比較される。これは、アンギャップアライメントと呼ばれる。典型的に、そのようなアンギャップアライメントは、比較的短い数の残基例えば50未満の連続するアミノ酸にわたってのみ実行される。より長い配列にわたる比較については、ギャップスコアリングは、互いに関して、挿入複数可又は欠失複数可を有する関連する配列における同一性レベルを正確に反映するように最適なアライメントをもたらすために使用される。そのようなアライメントを実行するのに適したコンピュータープログラムは、GCGWisconsinBestfitパッケージであるUniversityofWisconsinUSADevereuxetal1984NucleicAcidsResearch12387。配列比較を実行することができる他のソフトウェアの例は、BLASTパッケージ、FASTAAltschuletal1990JMolBiol215403410、及び比較ツールのGENEWORKSスーツを含むが、これらに限定されない。本明細書との関連において、相同なアミノ酸配列は、少なくとも40、50、60、70、80、又は90同一であるアミノ酸配列を含むように解釈される。最も適切には、所望のバイオマーカーに対して少なくとも90の配列同一性を有するポリペプチドは、そのバイオマーカーが存在を示すものとして解釈される;より適切には、アミノ酸レベルで95又はより適切には98同一であるポリペプチドは、そのバイオマーカーの存在を示すように解釈される。適切には、前記比較は、少なくとも、所望のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するためにアッセイされているポリペプチド又は断片の長さにわたり行われる。最も適切には、その比較は、完全長の所望のポリペプチドにわたって行われる。同じ考慮は、核酸ヌクレオチド配列に当てはまる。代替方法本明細書において例示される特定の技術は、所望される場合、同じ効果を達成するための容易に入手可能な代替案を使用して変化させることができることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、血液試料中のバイオマーカーレベルのアッセイは、ウエスタンブロットによって又はアイソバリックタンパク質タギングによって又はELISAによって又は当技術分野において知られている任意の他の適した手段によって実行することができる。量比脳卒中などの急性脳損傷を患っている対象において著しく減少する、本明細書において開示される多くのバイオマーカーがあることが十分に理解されるであろう。添付の実施例の部において説明されるように、これらは、科学的に同様に根拠がある。しかしながら、実際の問題として、分析されている試料中の特定のバイオマーカーの非存在又は減少を決定することは、より技術的に困難である。特に、検出における課題に対して減少した量のマーカーの純粋な検出を制御することは困難である。この理由で、本発明の好ましい実施形態では、使用されるバイオマーカーは、脳卒中などの急性脳損傷において上昇する又は増加するものである。これらは、所望のバイオマーカー複数可の陽性の同定が、診断を積極的に補助することができるという利点を有する。したがって、本明細書において決定される量比が、標準試料における濃度に対する、分析されている対象の試料における濃度の比を記載することに注目されたい。したがって、試料における濃度が標準試料における1.3倍の濃度である場合、1.3の比は、達成される。明確に、比は、他の様式で表現することができるが例えば、反対の方法で、一貫性のために、試料における濃度が、標準物質における濃度よりも30大きいことを1.3の比が意味するように、比は、試料:標準物質として本明細書において説明される。バイオマーカー本発明の方法において1つを超えるバイオマーカーを使用することに利点がある。利点は、本発明の方法に対する特異性及び/又は感度の増加を含む。本発明者らは、本発明の方法複数可において特に好都合なバイオマーカーのパネルを示す。GSTP-1及びペルオキシレドキシン16は、脳卒中の管理のための有用なマーカーを示す。上記に言及される理由で、本発明者らはまた、タンパク質のより大きなパネルをも示す。これらのパネルは、診断の感度及び/又は特異性を改善するなどの技術的な利点をさらに有する。開示されるある種のパネルはまた、予後情報を提供するという利点をも有する。したがって、本発明者らは、脳卒中及び心臓血管バイオマーカーに関連する文献の調査を実行し、53のタンパク質すべてについてのパスウェイ解析pathwayanalysisにより、対側脳微小透析液と比較して、梗塞部及びペナンブラにおいて差次的に発現されることが分かった。この包括的な生物情報学アプローチに従って、バイオマーカーの3つのグループ、パネルA、パネルB、及びパネルCが選択された。これらは、降順の優先度の順に下記に示される。パネルAID説明N°1ACBP_HUMANアシルCoA結合タンパク質N°2CSRP1_HUMANシステイングリシンリッチタンパク質1N°3PEBP1_HUMANホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質1N°4DDAH1_HUMANNG,NG-ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ1N°5MT3_HUMANメタロチオネイン-3MT-3N°6CYTB_HUMANシスタチン-BパネルBID説明N°1PPIA_HUMANペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼAN°2NFM_HUMANニューロフィラメントミディアムポリペプチドneurofilamentmediumpolypeptideN°3UBIQ_HUMANユビキチンN°4B2MG_HUMANベータ-2-ミクログロブリン前駆物質N°5CYTC_HUMANシスタチンC前駆物質シスタチン-3N°6SH3L1_HUMANSH3ドメイン結合グルタミン酸リッチ様タンパク質N°7TPIS_HUMANトリオースリン酸イソメラーゼN°8MBP_HUMANミエリン塩基性タンパク質MBP,MyelinbasicproteinN°9MT2_HUMANメタロチオネイン-2MT-2,Metallothionein2パネルCID説明N°1NFM_HUMANニューロフィラメントミディアムポリペプチドN°2COTL1_HUMANコアクトシンCoactosin様タンパク質N°3THY1_HUMANThy-1膜糖タンパク質前駆物質N°4PROF1_HUMANプロフィリン-1N°5TYB4_HUMANチモシンベータ-4N°6MT1E_HUMANメタロチオネイン-1EN°7FABPB_HUMAN脂肪酸結合タンパク質、脳B-FABP,FattyacidbindingproteinbrainN°8GFAP_HUMANグリア線維酸性タンパク質GFAP,GlialfibrillaryacidicproteinN°9CAH2_HUMANカルボニックアンヒドラーゼ2N°10CERU_HUMANセルロプラスミン前駆物質N°11DCD_HUMANダームシジン前駆物質N°12DEF1_HUMAN好中球デフェンシン1前駆物質HNP-1いくつかの実施形態では、パネルA、B、及びCは、拡大パネルABCと呼ぶことができる、バイオマーカーの単一のまとまりのある群と見なすことができる。定められたパネルA~Cに加えて、バイオマーカータンパク質のより大きなパネルを、本発明の方法において使用することができる。パネル1におけるマーカーの利点は、それらがすべて、罹患対象において増加するということである。言いかえれば、そのようなバイオマーカーのレベルの増加は、急性脳損傷の可能性の増加を示す。これは、陽性の検出を促進し、特定のバイオマーカーが対象において減少するという指標について間違えられる検出の技術的問題による偽陰性から生じる可能性のある問題をなくすのを助ける。特に、パネル1におけるマーカーは、前記ポリペプチドについての量比がそれぞれ1.3を超えるという利点を共有する。これは、実施例の部において証拠づけられる。これは、本発明による方法においてこのパネルから使用されるそれぞれのマーカーにおける統計的に有意な信頼度を提供するという利点を有する。パネル1はまた、それらの統計的に有意な発現の増加が検出される特定のタイプの分析によってマーカーのサブグループを定める。したがって、さらなる詳細のカラムにおける指定IC対CT、IC対P、及びP対CTは、マーカーの3つのさらなるサブグループを提供する。パネル1A-IC対CTパネル1B-IC対Pパネル1C-P対CTパネル1はまた、1つを超えるタイプの分析において統計的に有意なレベルまで上昇すること分かっているマーカーのサブグループを定める。したがって、下線を引いて示す個々のバイオマーカーは、行われる3つのタイプの分析IC対CT、IC対P、及びP対CTのうちの少なくとも2つにおいて、罹患対象において高いレベルで生じることが示される。さらに、行われる3つのタイプの分析IC対CT、IC対P、及びP対CTの3つすべてにおいて、罹患対象において高いレベルで生じることが示される少数のマーカーがある。これらは、3つの処理において下線を引いたバイオマーカーを比較し、上記のパネル1におけるそれらの3つの処理のそれぞれにおいて生じるものに注目することによって容易に同定することができる。したがって、マーカーのさらに4つのサブグループが定められる[パネル1D-IC対CT及びIC対P];[パネル1EIC対CT及びP対CT];[パネル1FIC対P及びP対CT];[パネル1GIC対CT及びIC対P及びP対CT]。パネル1はまた、X対CTとして記載することができるさらなるサブグループをも定め、ここでXは、P又はICである。言いかえれば、このサブグループは、IC対CTパネル1A又はP対CTパネル1C又はその両方にある任意のマーカーを含む。したがって、パネル1Hは、いずれか対CTとして定められる。これは、対照と比較した、罹患試料において増加を示すすべてのマーカーを照らし合わせるという利点を有する。パネル2は、任意の種類の脳損傷に対する、特に脳卒中などの急性脳損傷に対する関連を有することが初めて本明細書において開示されるバイオマーカーポリペプチドを示す。したがって、それらが脳損傷に関連して初めて開示されるのはパネル2の個々のマーカーの利点となる。パネル2Aバイオマーカーは、パネル2のサブグループであり、それらが、実施例の部において示される3つの微小透析研究IC:P、IC:CT、及びP:CTのうちの少なくとも2つにおいて増加するというさらなる特性を有し、脳損傷の部位との関連を示唆する。パネル2Bのバイオマーカーは、パネル2Aのサブグループであり、それらが、実施例の部において示される3つの微小透析研究IC:P、IC:CT、及びP:CTのそれぞれにおいて増加するというさらなる特性を有し、脳損傷の部位との密接な関連を示す。多数のマーカーが、実施例の部など、本明細書において実証される。いくつかのマーカーは、データの表及び図面における1を超える患者/実験において強力な関連を示す。本明細書において2以上の患者/実験について関連を示すマーカーが好ましい。メタロチオネイン-1EMT1E_HUMANに対する言及は、適切には、受託番号P04732の配列を有するタンパク質を指す。定義用語含むcomprises含むcomprise、含むcomprisingは、当技術分野におけるその通常の意味を有する、つまり、明示される特徴又は特徴の群が含まれるが、用語が、いかなる他の明示される特徴又は特徴の群も、同様に存在することから除くわけではないことを理解されたい。以下の略語を本明細書において使用することができる:1-DPAGE、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動;CT、対側;CSF、脳脊髄液;ECF、細胞外液;ELISA、酵素結合免疫吸着アッセイ;GSTP1;グルタチオンS-トランスフェラーゼP;IC、梗塞中心部;HUG、GenevaUniversityHospitals;IEF、等電点電気泳動;LACB、β-ラクトグロブリン;MALDI、マトリックス支援レーザー脱離イオン化;MCA、中大脳動脈;MS、質量分析;MS/MS、タンデム質量分析;PRDX、ペルオキシレドキシン;P、ペナンブラ;RP-LC、逆相液体クロマトグラフィー;SAH、クモ膜下出血;S100B、タンパク質S100-B;TBI、外傷性脳障害;TMT、タンデム質量タグ;TMT2、2連TMT;TMT6、6連TMT;TOF/TOF、タンデム飛行時間。ms/msベースの定量的プロテオミクスを用いる脳卒中患者の脳微小透析液の調査が記載される。微小透析分析タンデム質量タグTMTDayonLHainardALickerVTurckNKuhnKHochstrasserDFBurkhardPRandSanchezJCRelativequantificationofproteinsinhumancerebrospinalfluidsbyMSMSusing6plexisobarictagsAnalChem8029212931、ThompsonASchaferJKuhnKKienleSSchwarzJSchmidtGNeumannTandHamonCTandemmasstagsAnovelquantificationstrategyforcomparativeanalysisofcomplexproteinmixturesbyMSMSAnalChem7518951904は、虚血発作患者の脳微小透析試料を比較するために本明細書において使用した。TMTは、アイソバリック標識のセットを含む。これらのアイソバリック標識は、同じ質量合計を示すが、衡突解離による活性化及び続くタンデム質量分析MS/MS後に異なる質量でレポーターイオンを提供する重い同位体及び軽い同位体により合成される。レポーターイオン存在量は、TMTの異なるバージョンにより標識したペプチドの相対的定量化を実行するために使用され、ひいては、相対的タンパク質量を決定する。脳卒中を患っている患者の梗塞中心部IC、ペナンブラP、及び対側CT脳領域からの試料を調査した。このプロテオミクス研究は、P及びCT微小透析液と比較して、ICにおいて量が増加した43のタンパク質を目立たせた。26のタンパク質は、CT試料と比較して、Pにおいて増加した。候補マーカーとして、グルタチオンS-トランスフェラーゼPGSTP1、ペルオキシレドキシン-1PRDX1、及びS100Bは、脳卒中の症例においてそれらのレベルの増加を最終的に確認した、脳卒中患者の微小透析試料及び/又は血液に対するイムノアッセイによりさらに評価した。ヒト脳微小透析液は、6人の脳卒中患者の2つの脳領域から対で試料採取した。m/z=126.1及び127.1でのレポーターイオンと共に、TMT2による6つの定量的MS/MSベースの比較は、実験Expa~fにおいて実行した表3。IC、P、及びCT微小透析試料の濃度図1に、1-DPAGEにより分離した脳微小透析液ICd、CTd、Pe、及びCTeを示す他の試料の1-DPAGE画像は、図5に示す。10μLの微小透析液中のタンパク質量は、試料ごとに不均一であった。TMTベースの実験についての定量的カットオフの決定TMT2実験についてのタンパク質量における有意な増加及び減少を反映する定量的カットオフは、実験的に評価した図6に示す。TMT6は、実験手順において詳述されるTMT2実験について使用した同じプロトコールに従って、IC、P、及びCT微小透析液の2つの同一の試料を標識するために使用したつまり還元、アルキル化、消化、特異なTMT6標識、オフゲル電気泳動HorthPMillerCAPreckelTandWenzCEfficientfractionationandimprovedproteinidentificationbypeptideOFFGELelectrophoresisMolCellProteomics519681974、RosAFaupelMMeesHvanOostrumJFerrignoRReymondFMichelPRossierJSandGiraultHHProteinpurificationbyOffGelelectrophoresisProteomics2151156、RP-LCMS/MS、同定、及び定量化。定量的データのランダムな混合の後に、所与のカットオフでの偽陽性率を評価した。例えば、偽陽性の1は、1.68及び0.59のカットオフ比で見出された実験手順を参照されたい、また図6に示す。最終的に、0.5及び2.0のカットオフ値を選んだ。これらの値は、実際に実験的に評価したカットオフと比較してより大きな間隔に相当し、偽陽性を見出すためにさらなる危険性を減少させた。さらに、免疫ブロットを用いる検証中にそのような差異を評価することができた。定性的及び定量的MS分析タンパク質試料は、還元し、アルキル化し、トリプシンにより消化し、結果として生じるペプチドは、表3において報告されるようにTMT2により標識した。オフゲル電気泳動を実行した。12の採取したオフゲル画分は、RP-LCMALDITOF/TOFMSを用いて分析した。定量的ワークフローは、以前に特徴づけられているDayonLHainardALickerVTurckNKuhnKHochstrasserDFBurkhardPRandSanchezJCRelativequantificationofproteinsinhumancerebrospinalfluidsbyMSMSusing6plexisobarictagsAnalChem8029212931、DayonLTurckNKienleSSchulzKnappePHochstrasserDFScherlAandSanchezJCIsobarictaggingbasedselectionandquantitationofcerebrospinalfluidtrypticpeptideswithreportercalibrationcurvesAnalChemDOI101021ac901854k。定量的データの品質管理は、スパイクしたLACBタンパク質標準物質により評価した表3。12.1及び17.0Expfの平均及び最大相対的標準偏差は、アイソバリックタギング技術性能と相関した表3DayonLHainardALickerVTurckNKuhnKHochstrasserDFBurkhardPRandSanchezJCRelativequantificationofproteinsinhumancerebrospinalfluidsbyMSMSusing6plexisobarictagsAnalChem8029212931。これらのプロテオミクス分析から、156のタンパク質が、939の固有のペプチドと共に同定された。より正確に、108のタンパク質が、ICにおいて同定され、137が、Pにおいて、134が、CT微小透析液において同定された。TMT2を用いて実行した6つの比較は、94のタンパク質を示し、これらは、比較した試料の対内で増加した比が2.0を超える;53のタンパク質又は減少した比が0.5未満;47のタンパク質表3。要約すると、25のタンパク質は、P試料と比較してICにおいて増加し、24のタンパク質は、CT試料と比較してICにおいて増加し、26のタンパク質は、CT試料と比較してPにおいて増加した表7~9。それぞれの脳領域の間の調節性タンパク質の全リストを表4~6に提供する。S100B、グリア線維酸性タンパク質GFAP、及びミエリン塩基性タンパク質MBPなどの数個のタンパク質が、脳卒中又は他の脳病理に関連することが既に報告されているHerrmannMVosPWunderlichMTdeBruijnCandLamersKJBReleaseofglialtissuespecificproteinsafteracutestrokeAcomparativeanalysisofserumconcentrationsofproteinS100BandglialfibrillaryacidicproteinStroke3126702677、JauchECLindsellCBroderickJFaganSCTilleyBCLevineSRandGrpNrPSSAssociationofserialbiochemicalmarkerswithacuteischemicstrokeTheNationalInstituteofNeurologicalDisordersandStrokerecombinanttissueplasminogenactivatorStrokeStudyStroke3725082513、LamersKJBVosPVerbeekMMRosmalenFvanGeelWJAandvanEngelenBGMProteinS100BneuronspecificenolasemyelinbasicproteinandglialfibrillaryacidicproteinincerebrospinalfluidandbloodofneurologicalpatientsBrainResBull61261264。S100Bタンパク質は、Expbにおいてであるが、1つの固有のペプチドのみによって実際に同定された11.67のPhenyxペプチドスコア。そのIC/P比は、3.38であった。死後CSFにおいて増加することが最初に発見されたタンパク質であるGSTP1LescuyerPAllardLZimmermannIvolCGBurgessJAHughesFrutigerSBurkhardPRSanchezJCandHochstrasserDFIdentificationofpostmortemcerebrospinalfluidproteinsaspotentialbiomarkersofischemiaandneurodegenerationProteomics422342241、BurgessJALescuyerPHainardABurkhardPRTurckNMichelPRossierJSReymondFHochstrasserDFandSanchezJCIdentificationofbraincelldeathassociatedproteinsinhumanpostmortemcerebrospinalfluidJProteomeRes516741681は、Expaにおいて2.79のIC/P比を示した。数個のペルオキシレドキシンもまた、表7において報告されるようにIC試料において増加した。カットオフ未満の比の値のために表において報告されなかったが、PRDX1は、Expbにおいて1.93の比で測定された。P及びCT微小透析試料の比較において、PRDX1及びペルオキシレドキシン-6PRDX6は、Expfにおいて1.24及び1.69の比でそれぞれ測定された。0.5より下の比を有するタンパク質を表10~12に報告する。候補バイオマーカーの検証イムノアッセイ実験は、MS/MSにより得られた定量的測定値を確認するために実行した。評価されることとなる候補バイオマーカーの選択は、市販及び社内で開発したイムノアッセイの有用性に本質的に基づいた。GSTP1タンパク質MW=23kDaは、図2において例証されるように、プールした微小透析液試料n=3において免疫ブロット分析によりプローブした。CTと比較したIC微小透析液における増加は、疑う余地がなく、死後及び死前CSFの以前の研究と同様にTMTベースの発見による結果を確証したLescuyerPAllardLZimmermannIvolCGBurgessJAHughesFrutigerSBurkhardPRSanchezJCandHochstrasserDFIdentificationofpostmortemcerebrospinalfluidproteinsaspotentialbiomarkersofischemiaandneurodegenerationProteomics422342241、BurgessJALescuyerPHainardABurkhardPRTurckNMichelPRossierJSReymondFHochstrasserDFandSanchezJCIdentificationofbraincelldeathassociatedproteinsinhumanpostmortemcerebrospinalfluidJProteomeRes516741681。次に、ELISAは、対照及び脳卒中患者n=28の血清に対してGSTP1、PRDX1、及びS100Bについて実行した。ELISA結果は、図3に示し、表13に要約する。GSTP1は、対照と比較して、脳卒中患者の血液において著しく上昇することが分かったp=0.0002、ウィルコクソン順位和検定。脳卒中患者及び対照の間の血液中の平均比は8.47であった表13、つまり、脳微小透析試料において分かった比IC/Pよりも3倍高かったExpa、表7。ペルオキシレドキシンファミリーの間で、血液PRDX1は、p=0.0001の有意水準で対照と脳卒中患者を区別するのを可能にした。約20倍のそのレベルの増加が、脳卒中集団において観察された。文献において先に記載されている結果に従ってButtnerTWeyersSPostertTSprengelmeyerRandKuhnWS100proteinSerummarkeroffocalbraindamageafterischemicterritorialMCAinfarctionStroke2819611965、MisslerUWiesmannMFriedrichCandKapsMS100proteinandneuronspecificenolaseconcentrationsinbloodasindicatorsofinfarctionvolumeandprognosisinacuteischemicstrokeStroke2819561960、血液S100Bの濃度測定値は、対照よりも脳卒中患者において有意に高度であったp=0.0093。したがって、本発明者らは、虚血発作患者のIC、P、及びCT由来の微小透析試料の比較によって例証した、脳卒中のタンパク質マーカーを開示する。ヒト脳微小透析液は、ペプチド等電点電気泳動分画に連結されられたアイソバリックタギング技術及びRP-LCMS/MS分析を使用して分析した。IC微小透析液中のGSTP1、PRDX1、及びS100Bのレベルの増加は、プールした微小透析試料に対する免疫ブロット並びに/又は対照及び脳卒中患者の血液に対するELISAによりさらに検証した。したがって、本発明者らは、本明細書において示されるマーカー及び方法の有用性及び適用可能性を明確に確立した。微小透析試料中のタンパク質量研究下の異なる微小透析試料の1-DPAGEによる分析は、試料の間のタンパク質の全濃度においてわずかに異なるパターン及び大きな差を明らかにした図1及び図5。これらの差は、おそらく、生物学的差及び/又は脳卒中の重症度に加えて、例えば、微小透析膜を通しての回収の問題から結果として生じ得る。脳卒中患者のCT微小透析液の以前の研究において、18の試料中でタンパク質濃度は、0.083~0.395gL-1に及び、平均含有量は0.21±0.11gL-1であることが決定されたMaurerMHBergerCWolfMFuttererCDFeldmannREJrSchwabSandKuschinskyWTheproteomeofhumanbrainmicrodialysateProteomeScience17。グルタミン酸、グリセロール、乳酸、及びピルビン酸などのより小さな分子は、CT微小透析液において、3.9±0.3μmolL-1、38.9±1.9μmolL-1、2.0±0.1mmolL-1、及び58.4±3.3μmolL-1で、同じ試料採取期間にわたり50の患者においてそれぞれ測定されたのに対して、ICにおいて、同じ分子についての中央値は、それぞれ、196.5μmolL-1126.0~453.0に及ぶ、600.5μmolL-1464.2~1187.1に及ぶ、6.1mmolL-10.1~12.0に及ぶ、及び17.4μmolL-14.2~591.7に及ぶであったBergerCDohmenCMaurerMHGrafRandSchwabSCerebralmicrodialysisinstrokeNervenarzt75113123。手短に言えば、タンパク質濃度は、CT微小透析液において試料ごとにかなり変動したのに対して、小分子の濃度は、CTが均一であったが、ICにおいてより不均一であった。したがって、大きなタンパク質の濃度変化は、IC試料及びP微小透析液において予想され得る。タンパク質濃度変化を本明細書で確認した。全タンパク質濃度における差異のために、試料の均一化は、定量的プロテオミクス研究を実行するために必要であった。比較するための試料は、定量分析の前にそれらのタンパク質量つまり重量によって均一にした。1-DPAGE画像は、濃度測定により試料濃度を比較するために使用した実験手順を参照されたい。この相対的タンパク質定量化に従って、比較するための対の間の等タンパク質量を、TMT2ベースの定量的アセスメントのために使用した。結果として、さらなる標準化をTMT2定量的データに対して実行した。本発明者らは、ほとんどのタンパク質、そのため、ほとんどのペプチド及びレポーターイオンシグナルが、試料の間で等しいはずであることを仮定した図4に示す。したがって、両方のTMT2標識対のペプチド相対的存在量の度数分布の間の共通の面積は、最大となる必要があった。そのうえ、この処理は、1-DPAGE画像から実行した第1の標準化と一貫性があった。タンパク質の増加及び減少本発明者らの知っている限りでは、これは、ヒト脳微小透析液の最も広範囲なプロテオミクス研究であり、脳虚血を標的にする最初のものであるMaurerMHProteomicsofbrainextracellularfluidandcerebrospinalfluidMassSpectromRevDOI101002mas20213。研究を通して、本発明者らは、脳卒中患者の脳におけるECFのモニタリングとして、ヒト脳微小透析液の定量的マップを得た。微小透析によりプローブした脳領域によって、脳卒中の関連タンパク質マーカーを発見した。発見したタンパク質の多くは、CSFにおいて以前に同定されているDayonLHainardALickerVTurckNKuhnKHochstrasserDFBurkhardPRandSanchezJCRelativequantificationofproteinsinhumancerebrospinalfluidsbyMSMSusing6plexisobarictagsAnalChem8029212931、BurgessJALescuyerPHainardABurkhardPRTurckNMichelPRossierJSReymondFHochstrasserDFandSanchezJCIdentificationofbraincelldeathassociatedproteinsinhumanpostmortemcerebrospinalfluidJProteomeRes516741681、ZougmanAPilchBPodtelejnikovAKiehntopfMSchnabelCKurnarCandMannMIntegratedanalysisofthecerebrospinalfluidpeptidomeandproteomeJProteomeRes7386399。より正確には、比較した対内で量が増加した数個のタンパク質表7~9は、死前及び死後CSFの比較研究において以前に同定されているDayonLHainardALickerVTurckNKuhnKHochstrasserDFBurkhardPRandSanchezJCRelativequantificationofproteinsinhumancerebrospinalfluidsbyMSMSusing6plexisobarictagsAnalChem8029212931。これは、例えば、シスタチン-B、GFAP、S100B、PRDX1、及びペルオキシレドキシン-2PRDX2についてのケースであった。その以前の研究において、PRDX1は、死前CSFと比較して、死後CSFにおいて14.74の比で増加した。両方の研究の間の定量的結果の多くの相関は、重症の脳外傷のモデルとして死後CSFを検証しただけではなく、微小透析試料で得られた定量的プロテオームマップの値を強調した。表7~9において、いくつかのタンパク質は、量の増加及び減少を示した。これは、フィブリノゲンアルファ鎖FIBA、血小板塩基性タンパク質、プロフィリン-1、カルボニックアンヒドラーゼ1、及びGFAPについてのケースであった。95kDaの分子量で、FIBAは、透析膜を通して非効率的に回収された可能性がある。差は、他のタンパク質について直接、説明することができなかったが、例えば、GFAP50kDaは、ビメンチン、デスミン、及びアネキシンのような他のタンパク質と二量体化し、オリゴマー形成し、共重合し得るdaSilvaSFCorreaCLTorteloteGGEinickerLamasMMartinezAMBandAllodiSGlialfibrillaryacidicproteinlikeimmunoreactivityinthevisualsystemofthecrabUcidescordatusBiolCell96727734。次いで、その回収が改変された可能性がある。本発明の方法における試料が微小透析液以外である場合、例えば、試料がCSF又は血液である場合、そのような試料を使用する場合に分子量カットオフがないので、そのような問題複数可は、好都合にも回避される。虚血発作は、脳に供給される血流の妨害によって引き起こされる。脳血流は、ペナンブラにおいて減少し、梗塞中心部においてさらにより減少することが示されたKaufmannAMFirlikADFukuiMBWechslerLRJungriesCAandYonasHIschemiccoreandpenumbrainhumanstrokeStroke309399。興味深いことには、IC対P、IC対CT、及びP対CT研究において見つけられる減少したタンパク質のほとんどは表10~12、血液タンパク質例えば血清アルブミン、血清トランスフェリンserotransferrin、ハプトグロビン、ヘモグロビンであり、これらの別個の脳エリアにおける血流の改変についての局所的な差をどういう訳か反映した。図7は、上記の表において報告されるタンパク質についてMDにおいて観察されたタンパク質レベルの進展を示す。ほとんどのこれらのタンパク質は、CTからP及びPからICのMDで増加することが分かった。図8において示されるように、PRDX1及びPRDX6は、CT、P、及びICのMDから増加することが分かった。ほとんどのケースにおいて、CTからICへのタンパク質レベルの進展/上昇は、図7及び8において示されるように、脳損傷の深刻さとの直接的な関係を反映する。これらの結果は、本発明の医学的に関連する態様を強化する、関連する生物学的傾向を示す。バイオマーカーのさらなる検証数個の同定されたタンパク質を、代替の診断ツールつまりELISAの有用性及び/又は脳虚血への関与についての強力な科学的な論理的根拠に基づいて本発明者らの発見アプローチの有効性を実証するために選択した。脳損傷の十分に立証されているバイオマーカーであるS100BはRothermundtMPetersMPrehnJHMandAroltVS100BinbraindamageandneurodegenerationMicroscResTech60614632、脳組織において高度に発現しているカルシウム結合及び成長調節分泌タンパク質であるDonatoRS100amultigenicfamilyofcalciummodulatedproteinsoftheEFhandtypewithintracellularandextracellularfunctionalrolesIntJBiochemCellBiol33637668。S100Bの濃度は、多くの脳傷害及び機能不全において評価されている。S100Bは、脳卒中ButtnerTWeyersSPostertTSprengelmeyerRandKuhnWS100proteinSerummarkeroffocalbraindamageafterischemicterritorialMCAinfarctionStroke2819611965、MisslerUWiesmannMFriedrichCandKapsMS100proteinandneuronspecificenolaseconcentrationsinbloodasindicatorsofinfarctionvolumeandprognosisinacuteischemicstrokeStroke2819561960、SAHWiesmannMMisslerUHagenstromHandGottmannDS100proteinplasmalevelsafteraneurysmalsubarachnoidhaemorrhageActaNeurochir13911551160、及びTBIRomnerBIngebrigtsenTKongstadFandBorgesenSETraumaticbraindamageSerumS100proteinmeasurementsrelatedtoneuroradiologicalfindingsJNeurotrauma17641647において増加した。S100Bは、微小透析技術を使用して、急性脳外傷を有する2人の患者の脳ECFにおいて以前に測定されたSenJBelliAPetzoldARussoSKeirGThompsonEJSmithMandKitchenNExtracellularfluidS100BintheinjuredbrainafuturesurrogatemarkerofacutebraininjuryActaNeurochir147897900。P試料と比較したあるIC微小透析液におけるS100Bの検出及び増加したレベルの決定並びに脳卒中患者の血液におけるその検証は、本明細書で報告される知見を確認し、研究試料の優れた価値を実証した。GSTP1タンパク質は、多くの毒性求電子試薬及び有機過酸化物を不活性化することができる酵素であるSalinasAEandWongMGGlutathioneStransferasesAreviewCurrMedChem6279309。GSTP1は、中枢神経系において記載される3つのグルタチオンS-トランスフェラーゼのうちの1つであるTheodoreCSinghSVHongTDandAwasthiYCGlutathioneStransferasesofhumanbrainEvidencefortwoimmunologicallydistincttypesof26500MrsubunitsBiochemJ225375382。いくつかの研究は、パーキンソン病とのその関連を示唆したShiMBradnerJBammlerTKEatonDLZhangJPYeZCWilsonAMMontineTJPanCandZhangJIdentificationofGlutathioneSTransferasePiasaProteinInvolvedinParkinsonDiseaseProgressionAmJPathol1755465。高レベルのGSTP1は、ヒトアフリカトリパノソーマ症を患っている末期患者のCSFにおいて最近報告されたHainardATibertiNRobinXLejonVNgoyiDMMatovuEEnyaruJCFoudaCNdunguJMLisacekFMullerMTurckNandSanchezJCACombinedCXCL10CXCL8andHFABPPanelfortheStagingofHumanAfricanTrypanosomiasisPatientsPLoSNeglectedTropicalDiseases3e459。このタンパク質は、生きている患者と比較して死亡した患者のCSFにおいて濃度が増加したことが分かったので、初期の脳細胞死に関連することが知られているBurgessJALescuyerPHainardABurkhardPRTurckNMichelPRossierJSReymondFHochstrasserDFandSanchezJCIdentificationofbraincelldeathassociatedproteinsinhumanpostmortemcerebrospinalfluidJProteomeRes516741681。微小透析及び血液試料におけるGSTP1の増加の高度な相関は、脳マーカーの発見のための適切なモデルとしての脳卒中患者の脳微小透析液の得られた定量的プロテオームマップの関連を強調した。ペルオキシレドキシンは、酸素ペルオキシド及び他の活性酸素種の分解に関与する遍在性の酸化防止酵素であるRheeSGYangKSKangSWWooHAandChangTSControlledeliminationofintracellularH2O2RegulationofperoxiredoxincatalaseandglutathioneperoxidaseviaposttranslationalmodificationAntioxidantsRedoxSignaling7619626、WoodZASchroderEHarrisJRandPooleLBStructuremechanismandregulationofperoxiredoxinsTrendsBiochemSci283240。これらのチオール特異的酸化防止タンパク質もまた、チオレドキシンペルオキシダーゼと呼ばれる。ペルオキシレドキシンのファミリーは、還元プロセスに関与するシステイン残基の数によって、2つの種類、1-Cys及び2-Cysペルオキシレドキシンに分類することができる6つの別個の群から構成される。ペルオキシレドキシン-6PRDX6は、実際に、唯一の1-Cysメンバーである。脳において、PRDX1及びPRDX6は、星状細胞において主として発現されることが示されたのに対して、PRDX2は、もっぱら、ニューロンにおいて発現したPowerJHTAsadSChatawayTKCheginiFManavisJTemlettJAJensenPHBlumbergsPCandGaiWPPeroxiredoxin6inhumanbrainmolecularformscellulardistributionandassociationwithAlzheimersdiseasepathologyActaNeuropathol115611622、SarafianTAVerityMAVintersHVShihCCYShiLRJiXDDongLPandShauHYDifferentialexpressionofperoxiredoxinsubtypesinhumanbraincelltypesJNeurosciRes56206212。PRDX2は、パーキンソン病患者由来の黒質BassoMGiraudoSCorpilloDBergamascoBLopianoLandFasanoMProteomeanalysisofhumansubstantianigrainParkinsonsdiseaseProteomics439433952並びにダウン症候群、アルツハイマー病、及びピック病を有する患者の前頭皮質及び小脳においてKrapfenbauerKEngidaworkECairnsNFountoulakisMandLubecGAberrantexpressionofperoxiredoxinsubtypesinneurodegenerativedisordersBrainRes967152160、有意に増加した。PRDX1は、脳内皮細胞における酸化ストレスに対する適応応答の一部であり、損傷した血液脳関門で保護効果を有することが実証されたSchreibeltGvanHorssenJHaseloffRFReijerkerkAvanderPolSMANieuwenhuizenOKrauseEBlasigIEDijkstraCDRonkenEanddeVriesHEProtectiveeffectsofperoxiredoxin1attheinjuredbloodbrainbarrierFreeRadicBiolMed45256264。本明細書において、それぞれ、脳卒中患者の脳の損傷した部分の微小透析液及び血液におけるPRDX1の増加した量及び増加した濃度は、そのため、脳血管疾患におけるさらなる調査について高度に関連するように思われた。非常に、興味深いことには、PRDX1及びGSTP1は、同様のレドックス防御メカニズムに関係し、ともに相互作用することが証拠づけられたKimYJLeeWSIpCChaeHZParkEMandParkYMPrx1suppressesradiationinducedcJunNH2terminalkinasesignalinginlungcancercellsthroughinteractionwiththeglutathioneStransferasePicJunNH2terminalkinasecomplexCancerRes6671367142。同様に、GSTP1は、複合体の形成RalatLAManevichYFisherABandColmanRFDirectevidencefortheformationofacomplexbetween1cysteineperoxiredoxinandglutathioneStransferasepiwithactivitychangesinbothenzymesBiochemistry45360372を通して酸化PRDX6ManevichYFeinsteinSIandFisherABActivationoftheantioxidantenzyme1CYSperoxiredoxinrequiresglutathionylationmediatedbyheterodimerizationwithpiGSTProcNatlAcadSciUSA10137803785を再活性化することが示された。本発明者らの研究に含まれる患者のような悪性MCA梗塞患者は、記載されるタンパク質のうちのいくつかの発現パターンを修飾する可能性がある、低体温療法moderatehypothermiaなど、神経疾患集中治療施設でいくつかの治療を受ける、重度に障害性の患者である。他の妨げは、100kDa微小透析プローブによる回収率がほとんどの発見されたタンパク質について未知であるということである。分子量が限られた経路を通して採取されない試料を選ぶことによって、例えば試料としてCSF又は血液を使用することによって、これらの妨げを軽減することは好都合にも可能であり得る。結論として、本発明の研究は、プロテオミクス分析を通して脳卒中患者の脳微小透析液を調査した。質的な結果は、ヒト脳由来の微小透析液及び細胞外液の広範囲なプロテオームマップを提供した。さらに、ヒト虚血脳のいくつかのエリアの微小透析液の定量的比較は、脳血管疾患についてのバイオマーカーの有益な供給源を提供することが示された。増加したタンパク質のいくつかのものは、対照及び脳卒中患者の小さなコホートの血液試料に対して検証された。発見及び初期の検証データの間の相関は、発見されたタンパク質の多くが、脳卒中及び他の急性脳損傷関連障害の診断及び/又は予後判断についてのバイオマーカーに相当することを実証した。脳血流の減少に関連するタンパク質レベルにおける変化急性虚血発作患者のインビボヒト脳細胞外液ECFは、脳血流の減少に関連するタンパク質レベルにおける変化を評価するために調査した。虚血発作を患っている患者の梗塞中心部IC、ペナンブラP、及び無影響の対側CT脳領域からの微小透析液MD,microdialysateは、アイソバリックタギング及び質量分析MSに基づいて、ショットガンプロテオミクスアプローチを使用して比較した。定量分析は、CT試料と比較して、IC又はPにおいて量が増加した53のタンパク質を示した。グルタチオンS-トランスフェラーゼPGSTP1、ペルオキシレドキシン-1PRDX1、及びタンパク質S100-BS100Bは、無関係な対照及び脳卒中患者n=28の血液に対するELISAを用いてさらに評価した。8、20、及び11倍の有意な増加が、それぞれ見出された。まとめると、これらの結果は、虚血性障害に関連するP及びICの間のECFタンパク質レベルにおける明らかな差異を実証した。さらに、PRDX1の評価は、血液脳卒中マーカーをさらに発見するための効率的な供給源としてECFの価値を目立たせた。脳卒中患者の微小透析試料採取は、地域の施設倫理委員会によって承認された。悪性中大脳動脈梗塞患者は、高カットオフ100kDa大脳微小透析カテーテルを用いてモニターした。コンピューター断層撮影は、脳微小透析カテーテルの位置を確認するために使用した。MDは、人工CSF溶液による灌流後に5日間、1時間ごとに得た。プロテオミクス分析は、脳モニタリングの最初の24時間の間に得た脳MDについて実行した。2連アイソバリックTandemMassTagTMT技術DayonLHainardALickerVTurckNKuhnKHochstrasserDFBurkhardPRandSanchezJCRelativequantificationofproteinsinhumancerebrospinalfluidsbyMSMSusing6plexisobarictagsAnalChem8029212931は、脳卒中を患っている6人の患者の2つの脳領域由来のトリプシン消化抽出物を標識するために使用した図9。標識に続いて、プールした試料は、オフゲル電気泳動OGE,offgelelectrophoresisによって最初に分画した。次いで、画分は、逆相液体クロマトグラフィーRP-LC及びマトリックス支援レーザー脱離タンデム飛行時間MALDITOF/TOFMSによって分析した図10。タンパク質の同定及び定量化は、SwissProtヒトデータベースにおいてPhenyx検索を使用して、ストリンジェントな基準を用いて評価した。免疫ブロット検証は、GSTP1について実行した。プールしたIC及びCTMDn=3は、1-DSDSPAGE15を用いて分離した。免疫検出は、抗ヒトGSTP1ウサギポリクローナル抗体を用いて実行した。S100B、GSTP1、及びPRDX1は、対照及び脳卒中患者n=28の血液のELISAを用いてさらに検証した。S100B及びPRDX1は、市販のELISAキットを使用して検証した。GSTP1に関して、現在入手可能な市販のアッセイがなかったので、手製のサンドイッチを、BurgessJALescuyerPHainardABurkhardPRTurckNMichelPRossierJSReymondFHochstrasserDFandSanchezJCIdentificationofbraincelldeathassociatedproteinsinhumanpostmortemcerebrospinalfluidJProteomeRes516741681、HainardATibertiNRobinXLejonVNgoyiDMMatovuEEnyaruJCFoudaCNdunguJMLisacekFMullerMTurckNandSanchezJCACombinedCXCL10CXCL8andHFABPPanelfortheStagingofHumanAfricanTrypanosomiasisPatientsPLoSNeglectedTropicalDiseases3e459において以前に記載されるように開発した。微小透析は、生きている組織において生じる事象を連続的にモニターするための生物分析試料採取ツールである。それは、ECFのプローブに基づき、細胞外空間から内因性物質を採取するのを可能にし、これは、微小透析プローブの先端の半透性膜を通して拡散することができる。そのような技術は、多くの器官においてリアルタイムで生化学的マーカーを検索し、追うのにかなり適切である。ヒト脳MDのプロテオミクス比較は、CT及びPの対応物と比較して、ICにおいて、有意に過剰に示されるタンパク質2を上回る比でを示した図10。グリア線維酸性タンパク質GFAP及びS100Bなどのタンパク質は、脳損傷に関連することが既に報告されており、1つ又はいくつかのICMDにおいて増加するように思われた。図8は、2つのペルオキシレドキシンタンパク質についてMDにおいて観察された、タンパク質レベルの進展の例を示す。多くのタンパク質は、CTからP及びPからICのMDで増加することが分かった。同様に、GSTP1における増加は、図2において例証されるように、プールしたMDn=3における免疫ブロット実験を用いて検証した。血清におけるS100B、GSTP1、及びPRDX1のレベルはまた、14人の脳卒中患者及び14人の対照の血清におけるELISAによっても測定し図3、虚血性脳卒中における血流の低下によって引き起こされた脳損傷の周辺のマーカーとしてそれらの有用性を実証した。GSTP1濃度は、対照と比較して、脳卒中患者の血液において著しく上昇することが分かったp=0.0002、ウィルコクソン順位和検定。脳卒中患者及び対照の間の血液中の平均比は8.47であった。血液PRDX1レベルは、p=0.0001の有意水準で対照と脳卒中患者を区別するのを可能にした。約20倍のそのレベルの増加が、脳卒中集団において観察された。以前の結果ButtnerTWeyersSPostertTSprengelmeyerRandKuhnWS100proteinSerummarkeroffocalbraindamageafterischemicterritorialMCAinfarctionStroke2819611965、MisslerUWiesmannMFriedrichCandKapsMS100proteinandneuronspecificenolaseconcentrationsinbloodasindicatorsofinfarctionvolumeandprognosisinacuteischemicstrokeStroke2819561960に一致して、血液S100Bの濃度測定値は、対照よりも脳卒中患者において有意に高度であったp=0.0093。本実施例は、プロテオミクス分析を用いて脳卒中患者の脳MDを調査した。質的な結果は、ヒト脳由来の微小透析液及びECFの広範囲なプロテオームマップを提供した。さらに、ヒト脳のIC、P、及びCT部分のMDの定量的比較は、脳血管疾患についてのバイオマーカーの有益な供給源を提供することが示された。増加したタンパク質のいくつかのものは、対照及び脳卒中患者の小さなコホートに対して検証された。発見及び初期の検証データの間の相関は、脳卒中及び他の脳損傷関連障害の診断及び/又は予後判断についての本発明の工業的応用を実証した。拡大パネルタンパク質の選択急性虚血発作患者のインビボヒト脳細胞外液ECFは、本明細書に記載されるように、脳血流の減少に関連するタンパク質レベルにおける変化を評価するために以前に調査された。虚血発作を患っている患者の梗塞中心部IC、ペナンブラP、及び無影響の対側CT脳領域からの微小透析液MDn=6は、アイソバリックタギング及び質量分析MSに基づいて、ショットガンプロテオミクスアプローチを使用して比較した。定量分析は、CT試料と比較して、IC又はPにおいて量が増加した53のタンパク質を示した。これらの結果は、虚血性障害に関連するCT、P、及びICの間のECFタンパク質レベルにおける明らかな差異を実証した。グルタチオンS-トランスフェラーゼPGSTP1、ペルオキシレドキシン-1PRDX1、及びタンパク質S100-BS100Bは、無関係な対照n=14及び脳卒中患者n=14の血液に対するELISAを用いてさらに評価した。8p=0.0002、20p=0.0001、及び11倍p=0.0093の有意な増加が、それぞれ見出された。これらは、血液脳卒中マーカーをさらに発見するための効率的な供給源としてECFの価値を目立たせた。GSTP-1及びペルオキシレドキシン1及び6は、脳卒中の管理のための有用なマーカーを示すが、本発明者らは、診断感度及び/若しくは特異性をさらに改善するため並びに/又は予後情報を提供するためのタンパク質のより大きなパネルを構築したかった。そのため、本発明者らは、MDにおいて以前に見つけられた脳卒中バイオマーカー候補の立証及び検証を行った。候補タンパク質の包括的な生物情報学分析に従って、バイオマーカーの3つの群が、降順の優先度順に選択された。パネルAID説明N°1ACBP_HUMANアシルCoA結合タンパク質N°2CSRP1_HUMANシステイングリシンリッチタンパク質1N°3PEBP1_HUMANホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質1N°4DDAH1_HUMANNG,NG-ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ1N°5MT3_HUMANメタロチオネイン-3MT-3N°6CYTB_HUMANシスタチン-BパネルBID説明N°1PPIA_HUMANペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼAN°2NFM_HUMANニューロフィラメントミディアムポリペプチドN°3UBIQ_HUMANユビキチンN°4B2MG_HUMANベータ-2-ミクログロブリン前駆物質N°5CYTC_HUMANシスタチンC前駆物質シスタチン-3N°6SH3L1_HUMANSH3ドメイン結合グルタミン酸リッチ様タンパク質N°7TPIS_HUMANトリオースリン酸イソメラーゼN°8MBP_HUMANミエリン塩基性タンパク質MBPN°9MT2_HUMANメタロチオネイン-2MT-2,Metallothionein2パネルCID説明N°1NFM_HUMANニューロフィラメントミディアムポリペプチドN°2COTL1_HUMANコアクトシン様タンパク質N°3THY1_HUMANThy-1膜糖タンパク質前駆物質N°4PROF1_HUMANプロフィリン-1N°5TYB4_HUMANチモシンベータ-4N°6MT1E_HUMANメタロチオネイン-1EN°7FABPB_HUMAN脂肪酸結合タンパク質、脳B-FABPN°8GFAP_HUMANグリア線維酸性タンパク質GFAP,GlialfibrillaryacidicproteinN°9CAH2_HUMANカルボニックアンヒドラーゼ2N°10CERU_HUMANセルロプラスミン前駆物質N°11DCD_HUMANダームシジン前駆物質N°12DEF1_HUMAN好中球デフェンシン1前駆物質HNP-1ともに、パネルA、B、及びCは、拡大パネルABCと呼ばれる拡大パネルを形成する。上記に報告される53のバイオマーカー候補の中で、NG;NG-ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ1DDAH1_HUMAN、シスタチン-BCYTB_HUMAN、アシルCoA結合タンパク質ACBP_HUMAN、システイングリシンリッチタンパク質1CSRP1_HUMAN、メタロチオネイン-3MT3_HUMAN、並びにホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質1PEPB1_HUMANパネルAを優先させた。脳卒中バイオマーカー候補のシグネチャペプチドを測定するための選択反応モニタリング質量分析法拡大パネルタンパク質の検証をさらに提供するために、単一タンパク質及び多重タンパク質アッセイを、イムノアッセイELISA及び質量分析MRM法を使用して開発する。本実施例は、多重パネルを開発するためのMRMの迅速な能力を実証する。本実施例では、本発明者らは、方法を例証するために使用する実施例7のパネルAからタンパク質を選択した。しかしながら、この方法が、バイオマーカーのその特定のパネルに制限されるように意図されない。検出のある好都合なモードを実行する方法を理解するのを支援するために、バイオマーカーのこのパネルは便利なパネルとして使用されている。検出の同じモードは、単に本明細書で説明される方法に従うが、その代りに、開示される異なるパネル又は群のマーカーを使用することによって、本明細書において開示されるマーカーの任意の他の群について使用することができる。したがって、本実施例は、パネルAの優先された脳卒中バイオマーカー候補のシグネチャペプチドを選択的に検出するための選択反応モニタリングSRMMSに基づく方法の開発及び評価を示す。方法の設計MRM方法の設計は、最初に、それぞれのマーカータンパク質を代表する標的ペプチドプロテオタイプペプチドの選択を必要とする。第2のステップは、タンデム質量分析の間に親ペプチドの衡突解離において生じる特異的なペプチド断片の選択を含む。親及び娘イオンの質量電荷m/z比における差異は、トランジションとして知られている。インシリコアプローチは、それぞれの脳卒中バイオマーカー候補を代表するプロテオタイプトリプシンシグネチャペプチドを選択するために使用した。合計7、4、7、3、3、及び6のプロテオタイプシグネチャペプチドが、DDAH1、CYTB、ACBP3つのアイソフォーム、CSRP1、MT3、及びPEPB1についてそれぞれ選択された。シグネチャペプチド選択は、i手製Proteotypeソフトウェアを用いて決定したヒトタンパク質データベースUniProtSwissProtにおけるペプチド配列の特有性、ii関連するMSの検出のためのペプチド前駆イオンのm/z値、iii可能な場合、配列におけるシステイン及びメチオニン残基の非存在に基づく下記の表14。それぞれのペプチドについての最も適切なトランジションの選択を支援するために、タンデム質量スペクトルの公的なリポジトリPeptideAtlas[httpwwwpeptideatlasorg]中及び/又は前の発見のための作業上記に記載の間のペプチドの以前の経験的観察を再検討した。好ましいが、非限定的な方法として、いわゆる第一及び第二のトランジションの組み合わせからなるインテリジェントSRMintelligentSRMiSRM法を設定した。そのようなアプローチにおいて、所与のペプチドに関連のある第一のトランジションがすべて、定められる閾値を超えて検出される場合、次いで、第二のトランジションは、標的分子の同一性を確認するのを支援するために引き起こされる。本明細書で、アプローチは、アッセイにおいて連続的にモニターされ、かつ特定のマトリックスにおいてペプチド検出レベルを評価するためのトランジションの数を低下させることを目標とした。表15において報告されるように、2つの第一のトランジション及び6つの第二のトランジションを選択した。データが入手可能ではなかった場合、SRMAtlas又はPinpointソフトウェアThermoScientific社からの予測を、トランジションを選ぶために使用した。その場合、表15において報告されるように、4つの第一のトランジション及び4つの第二のトランジションを選択した。それぞれの前駆イオンについてのS-レンズパラメーターは、m/z値及び以前の実験データに従って設定した。衝突エネルギーは、あらかじめ定められた計算を使用してPinpointによって決定した。選んだサイクル時間は、80の第一のトランジションをモニターするために1.6秒とした。合計240のトランジションを、30のシグネチャペプチドをモニターするために使用した。引き起こされたトランジションのスキャン時間は、0.2秒とした。TSQVantage質量分析計ThermoScientific社は、0.7のQ1ピーク幅FWHM及び1.2mTorrの衝突セルにおけるアルゴン圧力を使用して使用した。陽イオン化を使用した。キャピラリー温度、気化器、シースガス、及び補助ガスは、最大のイオン感度のために最適化した。逆相液体クロマトグラフィーRP-LC分離は、MSの前に実行した。ペプチド分離は、30CH3CNの13.25分間の勾配により100μL/分で50×1mmのカラム上で生じた。FinniganSurveyorMSPumpPlusLCsystemThermoScientificを使用した。方法の試験より容易に入手可能な試料中の標的タンパク質の存在を実証するために、開発したMRM方法は、トリプシンを用いて消化したヒト血漿試料に対して評価した。手短に言えば、30μLの容量の血漿DadeBehring社を、1680μLトリエチルアンモニウム炭酸水素バッファーTEAB100mM及び90μL硫酸ドデシルナトリウム1に添加した。還元は、トリス2-カルボキシエチルホスフィンハイドロクロライド20mM95.4μLを用いて1時間、55°Cで実行した。次いで、90μLの容量のヨードアセトアミド150mMを、室温で、暗中で、1時間の反応のために添加した。180μLの容量の、TEAB中0.4μg/μLのトリプシンPromega社を添加した。消化は、37°Cで一晩実行した。試料精製は、HypersepC18500mgThermoScientific社を用いて最初に実行した。強力な陽イオン交換カートリッジは、さらなる精製のために使用した。試料は、3つのアリコートに分割した。アリコートは、RP-LCSRM分析前に500μL3CH3CN、0.2ギ酸、0.2mg/mlグルカゴン中で再懸濁した。RP-LCiSRM分析につき、20μLを使用した。データ分析は、Pinpointを使用して実行した。図11~16は、タンパク質DDAH1、CYTB、CSRP1、及びPEBP1を代表するシグネチャペプチドDENATLDGGDVLFTGR、TPEEYPESAK、SQVVAGTNYFIK、GYGYGQGAGTLSTDK、GLESTTLADK、及びLYEQLSGKのトランジションのiSRMシグナルのクロマトグラムを示す。したがって、本明細書において開発したSRM法は、6つの脳卒中バイオマーカー候補を代表する30のシグネチャペプチドのモニタリングを可能にすることが実証される。方法応用可能性の原理証明は、トリプシンを用いて消化した血漿試料において実証した。方法は、いくつかの試料マトリックスに応用することができ得る。本実施例における実証は、パネルAのマーカーを使用して実行した。上記に述べるように、これは、検出のこのモードの例証となる。検出のこのモードは、本文において開示される任意の他のマーカー又はマーカーの群に同様に適用することができる。検出のこのモードに従ってそれらの他のマーカーを使用して、本発明を使用するために、当業者は、上記に示される手引きに単純に従うが、パネルAのマーカーを彼らが選択した他のマーカーと置き換えるであろう。参考文献1FoerchCMontanerJFurieKLNingMMandLoEHInvitedArticleSearchingfororaclesBloodbiomarkersinacutestrokeNeurology733933992PocaMASahuquilloJVilaltaADelosRiosJRoblesAandExpositoLPercutaneousimplantationofcerebralmicrodialysiscathetersbytwistdrillcraniostomyinneurocriticalpatientsDescriptionofthetechniqueandresultsofafeasibilitystudyin97patientsJNeurotrauma23151015173HutchinsonPJOConnellMTKirkpatrickPJandPickardJDHowcanwemeasuresubstratemetaboliteandneurotransmitterconcentrationsinthehumanbrainPhysiolMeas23R75R1094ReinstrupPStahlNMellergardPUskiTUngerstedtUandNordstromCHIntracerebralmicrodialysisinclinicalpracticeBaselinevaluesforchemicalmarkersduringwakefulnessanesthesiaandneurosurgeryNeurosurgery477017095TisdallMMandSmithMCerebralmicrodialysisresearchtechniqueorclinicaltoolBrJAnaesth9718256MaurerMHProteomicsofbrainextracellularfluidandcerebrospinalfluidMassSpectromRevDOI101002mas202137MaurerMHHauxDUnterbergAWandSakowitzOWProteomicsofhumancerebralmicrodialysateFromdetectionofbiomarkerstoclinicalapplicationProteomicsClinAppl24374438HelmyACarpenterKLHSkepperJNKirkpatrickPJPickardJDandHutchinsonPJMicrodialysisofCytokinesMethodologicalConsiderationsScanningElectronMicroscopyandDeterminationofRelativeRecoveryJNeurotrauma265495619DonatoRS100amultigenicfamilyofcalciummodulatedproteinsoftheEFhandtypewithintracellularandextracellularfunctionalrolesIntJBiochemCellBiol3363766810AfinowiRTisdallMKeirGSmithMKitchenNandPetzoldAImprovingtherecoveryofS100BproteinincerebralmicrodialysisImplicationsformultimodalmonitoringinneurocriticalcareJNeurosciMethods181959911MaurerMHBergerCWolfMFuttererCDFeldmannREJrSchwabSandKuschinskyWTheproteomeofhumanbrainmicrodialysateProteomeScience1712MaurerMHHauxDSakowitzOWUnterbergAWandKuschinskyWIdentificationofearlymarkersforsymptomaticvasospasminhumancerebralmicrodialysateaftersubarachnoidhemorrhagePreliminaryresultsofaproteomewidescreeningJCerebBloodFlowMetab271675168313DayonLHainardALickerVTurckNKuhnKHochstrasserDFBurkhardPRandSanchezJCRelativequantificationofproteinsinhumancerebrospinalfluidsbyMSMSusing6plexisobarictagsAnalChem802921293114ThompsonASchaferJKuhnKKienleSSchwarzJSchmidtGNeumannTandHamonCTandemmasstagsAnovelquantificationstrategyforcomparativeanalysisofcomplexproteinmixturesbyMSMSAnalChem751895190415LescuyerPAllardLZimmermannIvolCGBurgessJAHughesFrutigerSBurkhardPRSanchezJCandHochstrasserDFIdentificationofpostmortemcerebrospinalfluidproteinsaspotentialbiomarkersofischemiaandneurodegenerationProteomics42234224116TuckMKChanDWChiaDGodwinAKGrizzleWEKruegerKERomWSandaMSorbaraLStassSWangWandBrennerDEStandardoperatingproceduresforserumandplasmacollectionearlydetectionresearchnetworkconsensusstatementstandardoperatingprocedureintegrationworkinggroupJProteomeRes811311717BradfordMMRapidandsensitivemethodforquantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingprincipleofproteindyebindingAnalBiochem7224825418BlumHBeierHandGrossHJImprovedsilverstainingofplantproteinsRNAandDNAinpolyacrylamidegelsElectrophoresis8939919TowbinHStaehelinTandGordonJElectrophoretictransferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheetsprocedureandsomeapplicationsProcNatlAcadSciUSA764350435420BurgessJALescuyerPHainardABurkhardPRTurckNMichelPRossierJSReymondFHochstrasserDFandSanchezJCIdentificationofbraincelldeathassociatedproteinsinhumanpostmortemcerebrospinalfluidJProteomeRes51674168121HainardATibertiNRobinXLejonVNgoyiDMMatovuEEnyaruJCFoudaCNdunguJMLisacekFMullerMTurckNandSanchezJCACombinedCXCL10CXCL8andHFABPPanelfortheStagingofHumanAfricanTrypanosomiasisPatientsPLoSNeglectedTropicalDiseases3e45922HorthPMillerCAPreckelTandWenzCEfficientfractionationandimprovedproteinidentificationbypeptideOFFGELelectrophoresisMolCellProteomics51968197423RosAFaupelMMeesHvanOostrumJFerrignoRReymondFMichelPRossierJSandGiraultHHProteinpurificationbyOffGelelectrophoresisProteomics215115624DayonLTurckNKienleSSchulzKnappePHochstrasserDFScherlAandSanchezJCIsobarictaggingbasedselectionandquantitationofcerebrospinalfluidtrypticpeptideswithreportercalibrationcurvesAnalChemDOI101021ac901854k25HerrmannMVosPWunderlichMTdeBruijnCandLamersKJBReleaseofglialtissuespecificproteinsafteracutestrokeAcomparativeanalysisofserumconcentrationsofproteinS100BandglialfibrillaryacidicproteinStroke312670267726JauchECLindsellCBroderickJFaganSCTilleyBCLevineSRandGrpNrPSSAssociationofserialbiochemicalmarkerswithacuteischemicstrokeTheNationalInstituteofNeurologicalDisordersandStrokerecombinanttissueplasminogenactivatorStrokeStudyStroke372508251327LamersKJBVosPVerbeekMMRosmalenFvanGeelWJAandvanEngelenBGMProteinS100BneuronspecificenolasemyelinbasicproteinandglialfibrillaryacidicproteinincerebrospinalfluidandbloodofneurologicalpatientsBrainResBull6126126428ButtnerTWeyersSPostertTSprengelmeyerRandKuhnWS100proteinSerummarkeroffocalbraindamageafterischemicterritorialMCAinfarctionStroke281961196529MisslerUWiesmannMFriedrichCandKapsMS100proteinandneuronspecificenolaseconcentrationsinbloodasindicatorsofinfarctionvolumeandprognosisinacuteischemicstrokeStroke281956196030BergerCDohmenCMaurerMHGrafRandSchwabSCerebralmicrodialysisinstrokeNervenarzt7511312331ZougmanAPilchBPodtelejnikovAKiehntopfMSchnabelCKurnarCandMannMIntegratedanalysisofthecerebrospinalfluidpeptidomeandproteomeJProteomeRes738639932daSilvaSFCorreaCLTorteloteGGEinickerLamasMMartinezAMBandAllodiSGlialfibrillaryacidicproteinlikeimmunoreactivityinthevisualsystemofthecrabUcidescordatusBiolCell9672773433KaufmannAMFirlikADFukuiMBWechslerLRJungriesCAandYonasHIschemiccoreandpenumbrainhumanstrokeStroke30939934RothermundtMPetersMPrehnJHMandAroltVS100BinbraindamageandneurodegenerationMicroscResTech6061463235WiesmannMMisslerUHagenstromHandGottmannDS100proteinplasmalevelsafteraneurysmalsubarachnoidhaemorrhageActaNeurochir1391155116036RomnerBIngebrigtsenTKongstadFandBorgesenSETraumaticbraindamageSerumS100proteinmeasurementsrelatedtoneuroradiologicalfindingsJNeurotrauma1764164737SenJBelliAPetzoldARussoSKeirGThompsonEJSmithMandKitchenNExtracellularfluidS100BintheinjuredbrainafuturesurrogatemarkerofacutebraininjuryActaNeurochir14789790038SalinasAEandWongMGGlutathioneStransferasesAreviewCurrMedChem627930939TheodoreCSinghSVHongTDandAwasthiYCGlutathioneStransferasesofhumanbrainEvidencefortwoimmunologicallydistincttypesof26500MrsubunitsBiochemJ22537538240ShiMBradnerJBammlerTKEatonDLZhangJPYeZCWilsonAMMontineTJPanCandZhangJIdentificationofGlutathioneSTransferasePiasaProteinInvolvedinParkinsonDiseaseProgressionAmJPathol175546541RheeSGYangKSKangSWWooHAandChangTSControlledeliminationofintracellularH2O2RegulationofperoxiredoxincatalaseandglutathioneperoxidaseviaposttranslationalmodificationAntioxidantsRedoxSignaling761962642WoodZASchroderEHarrisJRandPooleLBStructuremechanismandregulationofperoxiredoxinsTrendsBiochemSci28324043PowerJHTAsadSChatawayTKCheginiFManavisJTemlettJAJensenPHBlumbergsPCandGaiWPPeroxiredoxin6inhumanbrainmolecularformscellulardistributionandassociationwithAlzheimersdiseasepathologyActaNeuropathol11561162244SarafianTAVerityMAVintersHVShihCCYShiLRJiXDDongLPandShauHYDifferentialexpressionofperoxiredoxinsubtypesinhumanbraincelltypesJNeurosciRes5620621245BassoMGiraudoSCorpilloDBergamascoBLopianoLandFasanoMProteomeanalysisofhumansubstantianigrainParkinsonsdiseaseProteomics43943395246KrapfenbauerKEngidaworkECairnsNFountoulakisMandLubecGAberrantexpressionofperoxiredoxinsubtypesinneurodegenerativedisordersBrainRes96715216047SchreibeltGvanHorssenJHaseloffRFReijerkerkAvanderPolSMANieuwenhuizenOKrauseEBlasigIEDijkstraCDRonkenEanddeVriesHEProtectiveeffectsofperoxiredoxin1attheinjuredbloodbrainbarrierFreeRadicBiolMed4525626448KimYJLeeWSIpCChaeHZParkEMandParkYMPrx1suppressesradiationinducedcJunNH2terminalkinasesignalinginlungcancercellsthroughinteractionwiththeglutathioneStransferasePicJunNH2terminalkinasecomplexCancerRes667136714249ManevichYFeinsteinSIandFisherABActivationoftheantioxidantenzyme1CYSperoxiredoxinrequiresglutathionylationmediatedbyheterodimerizationwithpiGSTProcNatlAcadSciUSA1013780378550RalatLAManevichYFisherABandColmanRFDirectevidencefortheformationofacomplexbetween1cysteineperoxiredoxinandglutathioneStransferasepiwithactivitychangesinbothenzymesBiochemistry45360372上記の本明細書において言及される刊行物はすべて、参照によって本明細書において組み込まれる。本発明の記載される態様及び実施形態の様々な変更及び差異は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者らに明らかになるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載したが、特許請求に係る本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されないことを理解されたい。実際、当業者らに明らかな、本発明を実行するための記載されるモードの様々な変更は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。"