ボツリヌス神経毒素BoNTの活性を評価するための細胞に基づくアッセイにおいて、遺伝子組み換え細胞を提供するステップであって、前記遺伝子組み換え細胞はBoNT基質を発現し、前記基質はそのC末端にラベルを含んでおり、前記BoNT基質は、BoNTによって切断されると、N末端フラグメントとC末端フラグメントを生成し、前記C末端フラグメントは、前記遺伝子組み換え細胞のユビキチンプロテアソーム経路によって分解されることを特徴とするステップと、BoNTの存在下で前記細胞内のラベルの発現を測定するステップと、を含んでいる、細胞に基づくアッセイ。前記N末端フラグメントがN末端ラベルを含んでおり、前記測定ステップがC末端ラベルとN末端ラベルとの比率を比較するステップを含んでいることを特徴とする、請求項1記載の細胞に基づくアッセイ。前記BoNTが前記遺伝子組み換え細胞の細胞膜を通じて移送されることを特徴とする、請求項1記載の細胞に基づくアッセイ。前記遺伝子組み換え細胞が、前記BoNTを発現するためのベクターをさらに含んでいることを特徴とする、請求項1記載の細胞に基づくアッセイ。前記BoNTの発現が誘導性プロモータによって制御されることを特徴とする、請求項4記載の細胞に基づくアッセイ。前記BoNT基質が、25kDのシナプトソーム関連タンパク質、SNAP25アイソフォーム、小胞関連膜タンパク質、VAMPアイソフォーム、及びこれらと少なくとも80の類似性を有しており、かつ、前記プロテアーゼによって認識される切断配列を有しているペプチドで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項1記載の細胞に基づくアッセイ。前記BoNT基質が、SNAP25、SNAP25アイソフォーム、またはSNAP25に対して少なくとも80の類似性を有しており、BoNTLCAによって認識される切断配列を有しており、かつ、切断によって分解性のフラグメントがもたらされるBoNTLCAが前記BoNTであることを特徴とする、請求項1記載の細胞に基づくアッセイ。前記ペプチドが、VAMP、VAMPアイソフォーム、またはVAMPに対して少なくとも80の類似性を有しており、BoNTLCB、BoNTLCD、またはBoNTLCFによって認識される切断配列を有しており、かつ、切断によって分解性のフラグメントがもたらされるBoNTLCB、BoNTLCD、BoNTLCFで構成される群から前記BoNTが選択されることを特徴とする、請求項1記載の細胞に基づくアッセイ。前記ラベルが、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質BFP、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、及びそれらの蛍光性変異種で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項1記載の細胞に基づくアッセイ。前記ラベルが、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ及びガウシアルシフェラーゼで構成される群から選択される発光性ペプチドであることを特徴とする、請求項1記載の方法。前記N末端ラベルとC末端フラグメントのラベルがFRETペアであることを特徴とする、請求項1記載の細胞に基づくアッセイ。2つのプロテアーゼを区別して識別するための細胞に基づくアッセイにおいて、遺伝子組み換え細胞を提供するステップで、前記遺伝子組み換え細胞は、第1のプロテアーゼによって第1の箇所で切断されて、第1のC末端フラグメント及び第1のN末端フラグメントを生成するプロテアーゼ基質を発現するベクターを有しており、かつ、前記C末端フラグメントは、前記遺伝子組み換え細胞のユビキチンプロテアソーム経路によって分解される可能性があり、前記プロテアーゼ基質は、第2のプロテアーゼによって第2の箇所でも切断されて、第2のC末端フラグメントと第2のN末端フラグメントを生成し、かつ、前記第2のC末端フラグメントは、前記ユビキチンプロテアソーム経路によっては分解されないことを特徴とするステップと、前記プロテアーゼ基質を発現する前記遺伝子組み換え細胞を前記第1のプロテアーゼと接触させて前記ラベルの存在を測定するステップと、前記プロテアーゼ基質を発現する前記遺伝子組み換え細胞を前記第2のプロテアーゼと接触させて、前記ラベルの存在を測定するステップと、そして、前記第1のプロテアーゼとの接触後のラベルの存在と前記第2のプロテアーゼとの接触後の前記ラベルの存在との違いを比較するステップ、とで構成される細胞に基づくアッセイ。前記2つのプロテアーゼがBoNTLCAとBoNTLCEであり、前記プロテアーゼ基質がSNAP25であることを特徴とする、請求項12記載の細胞に基づくアッセイ。1つ以上の遺伝子操作された細胞を有するサンプルを未同定のプロテアーゼを含むサンプルと接触させ、前記細胞内のラベルの分解を測定することによって前記未同定のプロテアーゼを同定するステップをさらに含む、請求項12記載の細胞に基づくアッセイ。前記接触ステップが、前記遺伝子組み換え細胞をサンプル中の前記プロテアーゼに曝露させるか、または、ベクターから前記細胞中に前記プロテアーゼの生成を誘導するステップを含んでいることを特徴とする、請求項12記載の細胞に基づくアッセイ。ボツリヌス神経毒素抑制因子を同定する方法において、遺伝子組み換え細胞を提供するステップで、前記遺伝子組み換え細胞がBoNTを発現するベクターであって、BoNTによって切断されると、ラベルを有する分解性C末端フラグメントを生成するBoNT基質を発現するベクターを含むことを特徴とするステップと、前記BoNT及びBoNT基質を発現するステップと、前記遺伝子組み換え細胞をテスト用分子と接触させるステップと、前記ラベルの存在を測定するステップと、前記ラベルの信号の増大がBoNT抑制を示すステップを含んでいることを特徴とする方法。さらに、前記ユビキチンプロテアソーム経路抑制に関してテスト用分子をスクリーニングするステップを含んでいる、請求項16記載の方法。前記BoNT基質が、SNAP25、SNAP25アイソフォーム、またはSNAP25と80の類似性を有しており、BoNTLCAによって認識される切断配列を有しており、かつ、前記切断によって分解性のフラグメントがもたらされるBoNTLCAが前記BoNTであることを特徴とする、請求項16記載の方法。前記ペプチドが、VAMP、VAMPアイソフォーム、またはVAMPと80の類似性を有しており、BoNTLCB、BoNTLCD、またはBoNTFによって認識される切断配列を有しており、かつ、前記切断によって分解性のフラグメントがもたらされるBoNTLCB、BoNTLCD、BoNTLCFで構成される群から前記BoNTが選択されることを特徴とする、請求項16記載の方法。前記ラベルが、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、及びガウシアルシフェラーゼで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項16記載の方法。本発明の1つの具体的な実施の形態に関する以下の説明は人が本発明を実施できるようにするためのもので、本発明の好ましい実施の形態を限定することは意図していない。当業者であれば、本発明と同じ目的を達成するために本発明を修正したり、他の方法を設計するための根拠としてここに開示されている概念と具体的な実施の形態を容易に用いることができるであろう。当業者であれば、同じようなアセンブリが広い意味での本発明の精神と範囲から逸脱しないことも分かるであろう。本願で用いられるタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドという用語はこの技術分野ではよく理解されており、入れかえも可能である。本発明のいつくかの実施の形態は、当業者がよく理解しているようなペプチド及びそうしたペプチドの変種に関係している。当業者であれば、本発明のいくつかの実施の形態が本明細書に開示されている特定のペプチド配列及びそうしたフラグメントの変種、そして開示されているペプチド配列と類似物及び又は誘導物に関係するものであることは容易に分かるであろう。特定のペプチド配列変種は少なくとも1つの生物学的機能あるいはその特殊なタンパク質配列の活性を有していることが好ましい。これらペプチドの変種は、1つ以上のアミノ酸残基が保存あるいは非保存アミノ酸残基好ましくは保存アミノ酸残基と置換されており、それらの置換されたアミノ酸残基がその遺伝子配列によってコードされた場合とコードされていない場合があるもの、1つ以上のアミノ酸残基、例えば置換基の取り付けによって修正されている残基、本発明のペプチドの交互スプライシングであるもの、それらペプチドのフラグメント及び又はポリペプチドが以下に説明するような別のポリペプチド、例えば、GFPかルシフェラーゼと融合しているもの、などであってよい。それらの変種には、最初の配列のタンパク質分解による切断複数の箇所でのタンパク質分解を含むを介して発生されるペプチドも含まれる。これらの変種は翻訳後に、あるいは化学的に修飾されたものであってもよい。そうした変種のいずれも当業者によって本発明の範囲内にあるとみなされるものである。この分野で知られているように、2つのペプチドの類似性とは、Davydovら特許7608682が述べているように、アミノ酸及びその保存されているアミノ酸残基と第2のペプチドとの比較によって決められる。前記特許はここで触れたので、その全体が本明細書に組み入れられる。変種は最初の配列とは違ったペプチド配列、好ましくは問題の箇所の残基の40未満、より好ましくは問題の箇所の残基の25未満、より好ましくは問題の箇所の残基の10未満、最も好ましくは問題の箇所あたりに数個の残基だけが違っており、同時に最初の配列の機能性を保持し、あるいはN末端ルール経路を介してユビキチル化する点では元の配列と同じであるペプチド配列を含むものと定義される。本発明はここで述べられているアミノ酸配列に対して少なくとも60、65、70、72、74、76、78、80、90、あるいは95の類似性あるいは同一性を示すタンパク質配列を含んでいる。種々のプロテアーゼによって認識される好ましい箇所も本発明の範囲内にある。こうした部分はプロテアーゼにより認識され切断されるアミノ酸残基を少なくとも10、25、50、100、150、あるいは200個含んでいる。当業者であれば、本発明がここで述べられている基質の変種を含み、それらがN末端ルールユビキチル化経路によって分解される場合があることは理解できるであろう。本発明の他の実施の形態は、これらのペプチドあるいはその変種と1つ以上の生物学的経路のその他の成分との相互作用による生成物に関係している。さらに別の実施の形態は、これらのペプチド、ペプチドの変種、あるいはそれらペプチドと相互作用する酵素を調整し、抑制し、あるいは増強する生物学的活性を有する物質を識別する方法に関係している。これらのペプチドは医薬品組成物におけるこれら活性物質の使用とも関係している。本発明の他の実施の形態は、これらのペプチド、その関連する生物学的活性、あるいはそれらのペプチドと相互作用する酵素やプロテアーゼの測定を伴う診断方法に関係している。さらに、本発明の他の実施の形態は、以下に述べる方法の実行に役立つ試薬、キット、あるいはアッセイ用組成物に関係している。本発明の1つの実施の形態において、本出願人はN末端ルールに従うプロテアーゼのペプチド基質を同定した。本願では、分解を示すペプチド残基はNデグロンと称する。分解を促進する残基は不安定性残基と称され、分解を促進しない残基は安定性残基と呼ばれる。従って、Nデグロンはペプチドフラグメントにおいては不安定である。本出願人らは細胞内のユビキチンプロテアソーム経路によって分解される種々のプロテアーゼフラグメントを同定している。本発明のいくつかの実施の形態で示されているように、プロテアーゼはそのペプチド基質をそれぞれ新しいN末端と新しいC末端を有する2つのフラグメントに切断する。C末端フラグメントはユビキチン分解経路によってN末端ルール分解を受ける。本願で述べられているように、ペプチド基質とは特定のプロテアーゼが識別して2つ以上のフラグメントに切断し、そのうちの少なくとも1つがNデグロンを有していて細胞のユビキチンプロテアソーム系によって分解されることを意味する。そのプロテアーゼが3つ以上のフラグメントを発生させたら、そうしたフラグメントの少なくとも1つがNデグロンを含んでいると考えられる。本発明の1つの実施の形態で、プロテアーゼのペプチド基質がそのC末端にタグあるいはラベルを有している。タグ、ラベル、あるいはインジケータという用語は本願においては同じ意味で用いられており、ペプチドに取り付けられてサンプル中のペプチドあるいはペプチドフラグメントの検出を可能にしてくれるレポーター分子である。本発明のいくつかの実施の形態で用いられるラベルは放射性同位元素、蛍光性[蛍光偏光、黄色蛍光性タンパク質YFP、青色蛍光性タンパク質BFP、緑色蛍光性タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、及びそれらの蛍光発光突然変種などを含む]、燐光性、発光性[ホタル、ウミシイタケ、ガウシア海洋生物ルシフェラーゼなどを含む]、化学発光性及び又は電気化学発光性ECL化合物、酵素、あるいは好ましくはラベルされた結合相手[例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、エピトープタグ、親和性タグHis6など、フレウオレセイン、ハプテン、免疫源、GST及び又はGFPなど]を含んでいてもよく、これらの物質はこの技術分野ではよく知られている。プロテアーゼ基質のC末端にラベリングを行うと、ラベルされた分解する可能性のあるフラグメントが発生する。本発明のさらなる実施の形態においては、プロテアーゼ基質はそのN末端に1つのラベルを有しており、そのC末端に第2のラベルを有している。それぞれの末端のこれらラベルはサンプル中での各フラグメントの存在を判定するために用いられる。FRETペアもペプチド基質用のラベルとして使用できる。FRETアッセイはラベルされたペプチドの各末端上のラベル間の近接性に依存している。この方法はペプチド基質の切断及び2つのラベルの分離から生じる信号の変化に基づいている。従来のFRETアッセイは、切断されたフラグメントが溶液中あるいは混合物中に残留していて、誤った否定的結果に導いてしまうことが時々ある。切断されたフラグメントの両方が溶液混合物内に残留して相互作用を続けると、切断が起きていなかったように見える結果をもたらす場合が時々ある。本願で述べられているような、それらフラグメントのうちの1つのN末端ルール分解は、FRETペアのうちの1つの構成要素を完全に取り除いてしまうことでこの問題を解決し、正確な結果をもたらす。本発明の1つの実施の形態においては、プロテアーゼ基質に対して特異性を示すプロテアーゼの存在あるいはその活性のレベルを測定するための方法が述べられている。この方法の第1のステップでは、そのプロテアーゼによって切断されたフラグメントの一方を分解させることができる混合物内にプロテアーゼ基質が入れられる。この方法の第2のステップで、1つのプロテアーゼがその混合物に加えられる。第3のステップで、そのラベルの存在が測定される。別の実施の形態においては、そのプロテアーゼを混合物に加える前に、ラベルの存在についての測定が行われる。さらに別の実施の形態においては、プロテアーゼ基質はそのN末端とC末端のそれぞれにラベルを有している。この別の実施の形態の第2のステップにおいては、プロテアーゼがその混合物に加えられてから、第3のステップで、N末端ラベルとC末端ラベルの存在の違いについての測定が行われる。ラベルの存在を測定する方法はこの技術分野ではよく理解されている。放射性同位元素ラベルを用いる場合は、例えば、細胞溶解物をゲル中で流動させ、その放射能ラベルがそのラベルされた標的が位置する帯域を示してくれる。こうした例においては、比較対象と比較した場合のその帯域の欠如がそのラベルの喪失を示す。他の例では、そのラベルに対して特異性を示す抗体を使ったウェスターンブロットが用いられる。この場合も比較対象と比較してウェスターンブロット内での1つの帯域が消滅した場合に、そのフラグメントの分解が示される。一方、生きた細胞を用いたアッセイでは、生体発光性、蛍光性、及びその他のラベルを用いてリアルタイムでラベルの存在の評価が行われる。この生きた細胞を用いたアッセイでは、本願においては、ラベルはプロテアーゼがその基質に働きかける前に蛍光顕微鏡で測定される。異なった時間でそれらの細胞を評価することで、そのラベルが発現されたかどうか、それが一定の時間後にも発現され続けるかどうかが判定される。例えば、プロテアーゼの発現がない比較対象ではそのラベルが24時間後も存在し続ける。一方、そのプロテアーゼが発現されるか、その基質との相互作用ができるようにされると、その蛍光性ラベルはもはや存在しない。しかし、ラベルの存在の測定の他の例ではルシフェラーゼの活性を測定するためにルミノメータが用いられる。当業者であれば、混合物内でのラベルの存在を測定するための他の手段があること、及びそうした方法も本発明の範囲内にあることは容易に理解できるであろう。本発明のさらに別の実施の形態においては、Davydovら特許第7608682が述べているウサギ網状赤血球溶解物とRNAポリメラーゼSP6あるいはT7を含んでいる転写-翻訳反応混合物内で、プラスミドDNAから、ラベルされたプロテアーゼ基質がつくりだされる。このペプチド基質はそのペプチド基質に特異性を示すプロテアーゼが存在していない場合に産出される。1つの別の実施の形態においては、そのプロテアーゼが上記混合物に加えられて、そして、ラベルの存在が測定される。さらに別の実施の形態では、プロテアーゼが加えられる前にラベルの存在が測定あるいは同定され、プロテアーゼが加えられた後のラベルの存在の減少度が測定される。この方法の別の実施の形態においては、2つのラベルが用いられ、分解するフラグメント内のラベルのN末端フラグメントのラベルとの相対的な変化を測定して、そのプロテアーゼの活性が判定される。本発明のさらに別の実施の形態においては、サンプル中の標的プロテアーゼの存在を判定するために、上に述べた方法が用いられる。例えば、毒性プロテアーゼに対する露出が疑われる場所での環境性サンプルをテストするために、その方法が用いられる。そうした実施の形態においては、上に述べたペプチド基質がそのラベル信号がすでに測定されている多重ウェルアレイ内に入れられる。次に、サンプルを各ウェルに加えて、分解性フラグメントの消失が測定される。別の方法ではそのプロテアーゼ基質のN末端内とC末端でのラベルの違いが測定される。N末端ラベルのC末端ラベルに対する違いが増大すると、そのプロテアーゼの活性が示される。上に述べた方法のさらに別の実施の形態は、プロテアーゼ抑制因子を識別するために用いられる。この方法は、ラベルされたプロテアーゼ基質を、N末端分解性フラグメントを分解させることができる混合物に入れる第1のステップを含んでいる。第2のステップで、プロテアーゼ抑制因子あるいはライブラリをその混合物に加える。第3のステップで、単一ラベル化あるいは二重ラベル化した基質に関してフラグメントの分解が上に述べたような方法で評価される。第4のステップで、この技術分野でよく知られている方法でプロテアーゼ抑制活性に関してポジティブな結果がスクリーニングされる。そのプロテアソームを抑制しない結果はBoNT抑制因子の存在を示している。例として言えば、その標的抑制因子は特定のラベルを有するプロテアソーム基質を分解させる細胞系を用いてスクリーニングすることができる。そうした抑制因子の例の1つはGFPCL1で、その抑制因子がそのプロテアソーム経路に作用すると、そのGFPCL1の信号が保持される。別の実施の形態で、プロテアソーム抑制因子を識別するためにその方法が用いられる。プロテアーゼ抑制因子をユビキチンプロテアソーム経路抑制因子と区別するために、プロテアーゼとプロテアーゼ基質の存在下と、そのプロテアーゼによる切断作用を受けないユビキチンプロテアソーム感作性基質の存在下で、候補となる抑制因子をテストする。非限定的な例として言えば、その抑制因子はBoNTLCA及び以下に述べるSNAP25構成物の存在下とユビキチンプロテアソームペプチドマーカーGFPCL1の存在下でテストされる。その抑制因子がBoNTLCAに対して特異性を示す場合は、SNAP25構成物は切断されず、そのラベル信号が一定の状態のままである。他方、GFPCL1構成物に関するラベル信号は、プロテアソームによって分解されるので消失するであろう。その他のユビキチンプロテアソームマーカーにはGFPCL1UbG76VGFP、UbRGFPなどがある。当業者であれば、ラベルはGFP、β‐ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼで構成される群から選択できることは分かるであろう。本発明のさらに別の実施の形態は標的プロテアーゼを細胞質内に移入できる遺伝子加工した細胞系を提供する。この細胞系は、そのC末端にラベルを有するプロテアーゼのペプチド基質を発現する。そのペプチド基質を発現するのに適した細胞系としては、HEK293、CHO、BHK、HeLa、COS、及びNeuro2A、M17、PC12、N18などの神経芽腫細胞などがある。当業者であれば、ここに述べられているプラスミドの発現を可能にしてくれる他の細胞タイプも本発明の範囲内であることは容易に分かるであろう。同様に、1つのプロテアーゼを認識してそれを細胞膜を通じて移送してその細胞内で発現されているプロテアーゼ基質を切断できるようにする細胞タイプが本発明の範囲内にあることは分かるであろう。さらに別の実施の形態では、このペプチド基質はそのC末端及びN末端の両方にラベルを含んでいる。このペプチド基質は生体発光、化学発光、蛍光、あるいは上に述べたような技術分野の当業者が知っているその他の方法での測定を可能にしてくれる。本発明の1つの実施の形態で、プロテアーゼがない場合にそのラベルを測定可能にしてくれるペプチド基質を構成的に発現できるように、細胞株が遺伝子操作される。別の実施の形態で、ペプチド基質発現はこの技術分野の当業者が理解しているような方法で調整される。1つの非限定的な例で、そのペプチドが誘導性ベクターによって細胞内に誘導される。この誘導性ベクターは、誘導因子が存在している場合にのみ、そのペプチドを発現する。そうした誘導性ベクターはこの技術分野ではよく知られている。ペプチド基質が一度発現されると、細胞はそのペプチドラベルの測定を可能に出来るような安定した発現状態に達することができ、その遺伝子組み換え細胞を用いて、その基質を特異的に切断するプロテアーゼの活性をテストする。本発明による方法の1つの実施の形態で、上記標的プロテアーゼがその遺伝子操作された細胞に提供され、そのペプチド基質信号に対するその影響が測定される。そのプロテアーゼ基質が単一のラベルを有しているような本発明の1つの実施の形態で、上に述べたような安定状態が達成された後、その信号の減少が測定される場合がある。ラベルの減少レベルが活性を有するプロテアーゼの存在を示している。別の実施の形態では、そのペプチド基質が2つのラベルを含んでいる場合、N末端ラベルのC末端ラベルに対する比率の違いが測定される。C末端ラベルのN末端ラベルに対する比率の減少は、そのプロテアーゼの活性を示している。さらに別の実施の形態で、特定のプロテアーゼの存在に関して環境性サンプルをテストするために、その細胞系が用いられる。別の実施の形態で、プロテアーゼを細胞質内に移送できる細胞が提供される。この細胞は、そのプロテアーゼに対するペプチド基質を誘導するベクターでトランスフェクトされる。このベクターは、そのプロテアーゼで切断されてN末端フラグメントとC末端フラグメントをもたらすペプチド基質を発現する。上に述べたペプチド基質はN末端フラグメントとC末端フラグメント上にラベルを有している。このプロテアーゼが前記ペプチド基質を切断すると、そのフラグメントの1つが分解される。C末端ラベルのN末端ラベルの比率はそのプロテアーゼの活性を示している。本発明の1つの実施の形態で、同じ基質を2つの異なった領域で切断する2つのプロテアーゼの活性が測定され、この場合、2つの部分のうちの一方がN末端ルール分解の影響を受ける。こうした実施の形態においては、信号の喪失が分解性のフラグメントを発生させるプロテアーゼの存在を示している。そのペプチド基質が切断箇所で分離されるFRETペアによってラベルされていれば、それら2つのプロテアーゼ間の違いの結果を比較することも可能である。従来のFRETアッセイではこれら2つのプロテアーゼを区別することができないが、本願で述べられているN末端ルール方法ではそれが可能である。分解性フラグメントの分解による信号の喪失はFRETペアの各成分を分離するペプチド基質の単純な切断と比較して信号のより大きな変化を示す。さらに別の実施の形態では、C末端ラベルのN末端ラベルに対する公知の比較対象比率と比較した場合に、C末端ラベルのN末端ラベルに対する比率が低下することで、そのプロテアーゼの特異性が確認される。本発明の前記の実施の形態の1つの重要な利点は、プロテアーゼによる特異的な切断による細胞規定システムにおける信号の喪失を、そうした細胞の死など他の要因による信号の喪失と区別することが可能な点である。本発明のさらに別の実施の形態においては、プロテアーゼ抑制因子を識別する方法が提供される。この方法の第1のステップで、そのアッセイを実行するための細胞系が提供される。その細胞を遺伝子操作して、そのC末端に1つのラベルを有していて、ユビキチンプロテアソーム経路を介しての分解を受けるペプチド基質を発現させる。この細胞をさらに遺伝子操作して、ラベルされユビキチンプロテアソーム経路を介しての分解を受けるが、そのプロテアーゼの基質ではない第2のペプチドを発現する。この方法の第2のステップで、プロテアーゼ抑制因子の候補組成物をその細胞と接触させる。その抑制因子のサイズに応じて、その細胞内に受動的に組み込まれる場合もあるし、能動的に組み込まれる場合もある。その方法の第3のステップで、上記第1のペプチドと上記第2のペプチドからのラベルの発現が測定される。プロテアーゼ基質ラベルの存在は、その抑制因子が特異的にそのプロテアーゼを抑制することを示すだけである。本出願人らは、BoNTLCAがSNAP25を切断して分解性のフラグメントを発生させることを示した。小胞関連膜タンパク質VAMP、シナプトブレビンとも呼ばれ、その配列はGebBankCAA88760NCBI基準配列:NP-005047で見ることができるはBoNTLCB、BoNTLCF、及びテタヌス毒素6によって切断され、分解性のフラグメントを発生させる。第3のBoNT基質はシンタキシン1で、これはBoNTC1で切断されるが、この切断は分解性の基質は発生させない。出願人らの観察によれば、BoNTLCEはSNAP25を切断するが、それは分解性のフラグメントを発生させない。SNAP25あるいはVAMPの全配列を含むペプチドは、本発明の1つの実施の形態では4、分解性のフラグメントを発生させる。SNAP25あるいはVAMP、及びSNAP25あるいはVAMPの変種のフラグメントも分解性フラグメントを発生させるが、種々のBoNTLCによって認識されるSNAP25あるいはVAMP内の切断配列は変化しない場合もある。そうした変種はSNAP25あるいはVAMPのアイソフォーム同遺伝子系、それに種々のプロテアーゼによって認識される切断配列を有する公知のSNAP25あるいはVAMPペプチドに対して80の類似性を有するその他のペプチドなどである。本出願人らは、BoNTAによるSNAP25の切断に続いて、細胞内のSNAP25P9C末端の完全な分解が起きることを実証した。さらに、本出願人らはBoNTAによる切断によって発生するC末端フラグメントが急速に分解することを示した。BoNTAが存在する場合と存在しない場合のN末端フラグメントの免疫蛍光から対応するC末端フラグメントのそれへの変化がプロテアーゼの活性を示している。BoNTAによる切断で発生するP9フラグメントは急速に分解されて、細胞内で有意なレベルまで蓄積されることはあり得ないと考えられる。出願人らはBoNTLCAによる切断後にSNAP25のC末端が他の構成物内で完全に分解されることも実証した。図3に示すように、例えば、SBPCFPSNAP25VenusBDNFkB及びBoNTLCAプラスミドによって共トランスフェクトされた293FT細胞の蛍光顕微鏡写真は、Venus蛍光タンパク質を含むC末端フラグメントが切断後に分解されることを示している。図3はCFPを含むN末端フラグメントが24時間後に存在していることを示している。図3はVenusYFPを含むC末端フラグメントでは信号分解が起きないことを示している。さらに、図3は、CFPSNAP25VENUSBDNFkBペプチドOyleretal米国特許出願第12962610参照。この特許は参照することによりその全体が本明細書に組み入れられるが切断されることを示している。レーン3はその構成物を125kDa帯域で示しており、レーン4は切断後に57kDaフラグメントを示しているだけで、これはSNAP25のN末端フラグメントに対応する。結果図1aに示されているように、SNAP25はBoNTA及びBoNTEからのタンパク質分解性フラグメントをもたらす。図1はBoNTA及びBoNTE軽鎖の神経細胞内への共局所化を示しており、N末端ルール分解がラベルされたSNAP25からの信号の減少の理由であることを同定するのに役立った。図1は本発明の1つの実施の形態によるBoNTタンパク質分解活性に関するルシフェラーゼレポーターの設計を示している。図1は生体発光アッセイにおけるN末端ルール分解の影響を示している。細胞がルシフェラーゼレポーターとYFP、YFPLCEあるいはYFPLCAでトランスフェクトされ、トランスフェクションから36時間後に発光を発光計で測定した。示されているデータは平均±SEMで、相対的発光単位RLUで示してある。この結果は、SNAP25YFPLCA感作性フラグメントに関する信号がかなり減少していることを示している。図1はルシフェラーゼレポーターと示されたプラスミドによってトランスフェクトされた細胞におけるその効果を示している。細胞をDMSOあるいは20μMMG132で一昼夜処理して、その溶解物を示された抗体でプローブした。クロストリジウム遺伝子のATカウントを高くすると、哺乳動物細胞でそれらが発現される。この問題を克服すると同時に毒素持続性の根拠を調べるためにBoNTALC及びBoNTELCをコードするcDNAを構成した。生きている細胞内でのLCの局所化を視覚化するのを助けるために、それらを黄色あるいは赤色蛍光性タンパク質に融合させた。LCA及びLCEの細胞内での局所化を直接比較するために、N18神経芽腫細胞内にYFPLCE及びRFPLCAを共トランスフェクトした。LCAは神経芽腫細胞内で発現されると、主に原形質膜内に局所化される図1b。LCAはいくつかの細胞内膜及び小胞でも見出すことができる。興味深いことに、LCEも神経芽腫細胞内で同様の分布を示す図1b。共焦点で画像化すると、YFPLCEとRFPLCAが、事実上、これらの細胞内に共局所化されていることが示された図1b。この結果は、BoNTALCの持続性がBoNTELCに対しての安定状態での細胞内局所化における違いによっては説明できないことを示唆している。持続性がSNAP25のBoNTLCAで発生されたより短い方のC末端フラグメントの安定性が増強されていることに由来している可能性について調べるために、FLAGでタグしたネズミのSNAP25のC末端に融合されたルシフェラーゼでできているレポーターを構成した図1c。BoNTAはその構成物を切断して、P197及びルシフェラーゼに融合したP9に対応するC末端生成物を発生させる。本出願人らの観察によれば、BoNTA切断によって発生されたフラグメントを含むP9はN末端Arg。この構成物のN末端に抗体を用いて免疫ブロットを行うと、YFPLCA及びYFPLCEによる全長SNAP25ルシフェラーゼレポーターのタンパク質分解が行われて、2つのフラグメントが発生することが確認された図1e、中央のパネル。このN末端フラグメントは前記の全長レポーターと比較して比較的安定しているように思われた。注目すべき点は、BoNTAタンパク質分解によってつくられたC末端フラグメントがほとんど検出されないのに対して、プロテアソームの抑制因子であるMG132の存在下で蓄積されることである図1e、下側のパネル。BoNTAタンパク質分解からのフラグメントを含むP9の急激な喪失は、他のタンパク質との融合も同様の結果をもたらすから図2、ルシフェラーゼとの融合だけが原因ではなさそうである。これらの結果は、細胞内での我々が用いた遺伝子組み換えBoNTA及びBoNTELCの活性を裏付けるだけでなく、BoNTAによって発生させられたP9フラグメントの寿命が短く、そして、BoNTA活性の優れたインジケータであることも実証している。これらの結果として、上に述べたアッセイはBoNTLCA活性をBoNTLCE活性から区別する上で有用である。素材及び方法プラスミド我々は大腸菌及び哺乳動物細胞に対する好ましいコドン使用法に従って、BoNTA及びE軽鎖LCのための合成遺伝子を構成した。ネズミSNAP25をPCRで発生させ、pcDNA31FLAGベクター内にサブクローンさせた。ルシフェラーゼをpcDNA31SNAP25にサブクローンして、レポーターを構成した。SNAP25Leuヌクレオチド配列を配列番号No1で示し、SNAP25Leu構成物のアミノ酸配列を配列番号No2で示してある。BoNTLCを標的とするユビキノンリガーゼを構成するために、我々は最初にBoNTA及びEタンパク質分解に対して抵抗性を示すSNAP25突然変異種を発生させた。このヌクレオチドを配列番号No3で示し、そのペプチド配列を配列番号No4で示す。ボツリヌス神経毒素血清型A及びE軽鎖LCに関する合成遺伝子を大腸菌及び哺乳動物細胞で好ましいコドンの使用法を用いて新たに発生させた。簡単に言えば、5060ntのオリゴヌクレオチドをペアで設計して、12ntの重複領域をそれらの向き合った末端に導入した。これらのペアを、PCRを用いて延長増幅して約100ntのフラグメントをつくりだし、前のPCR増幅で端部に12ntの重複部分を有するプライマーを用いてPCRを連続的に行いブロックを構成した。このタイプの重複延長を用いて、PCRは完全な合成遺伝子をつくりだした。DNA配列を同定した後、BoNTA及びELCを、独特なXhol及びApal箇所を用いてpEYFPC1、pEGFPC1、mRFPC1、pcDNA31、あるいはpCMVTag2C内にサブクローンした。GFPLCAあるいはLCEをpcDNA5TOFrtにサブクローンすることで、テトラサイクリン誘導性構成物が発生された。レポーター構成物を発生させるために、PCRでFLAGネズミシナプトソーム関連タンパク質25を発生させて、pcDNA31内のBamHIとXhol箇所の間にサブクローンした。SNAP25の停止コドンの前にKpnl箇所を遺伝子操作でつくり、そのKpnIとXholI箇所の間にルシフェラーゼを挿入できるようにした。BoNTLCを標的とするユビキチンリガーゼを構成するために、最初にSNAP25非切断性変異種SNCを発生させたが、これは変異部D179KR198Tを含んでおり、BoNTA及びE両方によるタンパク質分解に対して抵抗性を示すQuickChangeKitInvitrogen。細胞培養及びトランスフェクション。細胞系を標準培養液内で、37°Cの温度下で、5CO2インキュベータを用いて培養した。HEK293細胞を10容積比FBS、2mMグルタミン、及び2ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むDMEM内で成長させた。HEKFlpinTREX293細胞Invitrogenを10容積比テトラサイクリン非含有FBS、2mMグルタミン、2ペニシリン‐ストレプトマイシン、100μgmLゼオシン、及び15μgmLブラスシジンで補強されたDMEM内で成長させた。ヒト神経芽腫SHSY5Y細胞を10容積比FBS、2mMグルタミン、2ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むDMEMF12培養液内で培養した。N18細胞はヒポキサンチン、アミノタンパク質、チミジン培養液、10容積比FBS、2mMグルタミン、2ペニシリン‐ストレプトマイシンで補強したDMEM内で培養した。ネズミ神経芽腫Neuro2a細胞は10以下容積比FBSを含んでいるEMEM内で培養した。細胞培養試薬はInvitrogen社から入手した。トランスフェクションはLipofectamine2000あるいはHiperfectを用いて行った。代謝性ラベリングトランスフェクションから30時間後にパルス追跡分析を行った。簡単に説明すると、細胞をメチオニンシステイン非含有培養液内で1時間飢餓状態に置いてから、100μCimL35SMetCysを用いて45分間ラベルした。ラベリングを行った後、細胞をPBSで3回洗浄して、ラベルされていないMetを10倍過剰に含む追跡用培養液内で培養した。指定された時点で、PBSで細胞を3回洗浄してから、RIPA細胞溶解緩衝液50mMTris、150mMNaCl1容積比TritonX100、05重量比ナトリウムデオキシコレート、01重量比SDS、50μMMG132、及びプロテアーゼ抑制因子を用いて溶解させた。YFPLCはGFP抗体で免疫沈降させた。細胞溶解緩衝液でよく洗浄してから、免疫沈降されたタンパク質を2xサンプル緩衝液内に溶出させて、SDSPAGEで解像して、STORMホスホイメージャーで分析するための処理を行い、ImageQuantソフトウエアGEHealthcareLifeSciencesを用いて分析した。抗体及び試薬。GFP及びRFPに対するウサギポリクローナル抗体はClontech社から、HA抗体はRoche社から、ルシフェラーゼ抗体はPromega社から、FLAGM2抗体はSigma社から、そして、GFP、TRAF2及びユビキノンに対する抗体はSantaCruz社から、それぞれ購入した。Myc抗体は9E10ハイブリドーマの培養上澄み液から得た。特別の記述がない限り、すべての化学薬品はSigmaAldrich社から入手したものである。蛍光顕微鏡分析トランスフェクションから30時間後に、細胞を4パラホルムアルデヒド内に10分間固定してから、PBSで洗浄し、その後で、ZeissLSM510上で画像処理を行った。すべての画像は、保存のために最小限度の処理をしてある。ルシフェラーゼアッセイルシフェラーゼアッセイはトランスフェクションから36時間後に、DualLuchiferaseキットPromegaを用いて、メーカーの指示に従って行った。