構造5’Y1L1XL2Y23’を有する第一のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、式中、Y1は、L1に共有結合された3’ホスフェートを有する第一のヌクレオチドN1を含む、4又はそれ以上のDNA又はRNAのヌクレオチドの配列であり、Y2は、L2に共有結合された5’ホスフェートを有する第二のヌクレオチドN2を含む、4又はそれ以上のDNA又はRNAのヌクレオチドの配列を含み、L1及びL2は、各々独立して直結合又はC1-C7アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、シクロアルキル、アルキルアリール又はアルコキシル基であり、Xは、次式、であり、式中、R1は、水素又はC1-C8アルキルであり、また、Mは、消光物質であり、前記第一のオリゴヌクレオチドは、構造3’Y3Y45’を有する第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように調整され、式中、Y3は、第三のヌクレオチドN3を含む、4又はそれ以上のDNA又はRNAのヌクレオチドの配列を含み、またY4は、ヌクレオチドN3に直接結合された第四のヌクレオチドN4を含む、4又はそれ以上のDNA又はRNAのヌクレオチドの配列を含み、第一のオリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするならば、N1塩基は、N3塩基と対を形成し、N2塩基はN4塩基と対を形成して、第二のオリゴヌクレオチドと、構造5’Y1Y23’を有する第三のオリゴヌクレオチドとの間で形成されるデュプレックスのTmより高いTmを有するデュプレックスを形成することを特徴とする組成物。第一のオリゴヌクレオチドが、15-35ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の組成物。L1及びL2が、各々C1-C7アルキルである、請求項1又は2に記載の組成物。L1及びL2が、C2アルキルである、請求項3に記載の組成物。L1と共有結合する3’ホスフェート、及びL2と共有結合する5’ホスフェートが、各々独立してホスホジエステル、ホスホチオエート、ホスホジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロアミダイト又はホスホトリエスエテルである、請求項1-4のいずれかに記載の組成物。Mが、次式、であり、L3が、直結合又はC1-C8アルキル、アルケニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、シクロアルキル又はアルコキシルであり、R2-R6が、各々独立して水素、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシル、電子求引基又は電子供与基であり、更にR2-R6の1つが以下であり、更にPが、縮合多環式芳香族部分である、請求項1-5のいずれかに記載の組成物。電子求引基が、NO2、SO3、SO2、CN、NCS、ケトン、アルコキシル、エーテル、カルボン酸及びスルホニルから成る群から選択される、請求項6に記載の組成物。電子供与基が、アルコキシル、ヘテロアルコキシル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、アルキルアミノ又はアリールアミノから成る群から選択される、請求項6又は7に記載の組成物。Pが、次式、で示され、R7R9が、各々独立して水素、アルコキシル、アルキル、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキル、ヘテロアルコキシル、ヘテロアルキル又はアミノであり、更にR10R13が、各々独立して水素、ニトロ、シアノ、カルボキシレート、スルホニル、スルファモイル、アルケニル、アルキニル、アミノ、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ビアルケニル、ビアルキニル、アルコキシカルボニル又はカルバモイルである、請求項6-8のいずれかに記載の組成物。R9が、である、請求項9に記載の組成物Pが、であり、更にR14R19が、各々独立して水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、電子求引基、又はR1、R2ペア、R3、R4ペア、R4、R5ペア、又はR5、R6ペアから形成される5若しくは6員環構造である、請求項6-8のいずれかに記載の組成物。Mが、L4Pであり、式中L4が、アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、又はアルコキシル基であり、Pが、縮合多環式芳香族部分である、請求項1に記載の組成物。L4が、CH2OCH2CH2NHである、請求項12に記載の組成物。Pが、以下、であり、R7R9が、各々独立して水素、アルコキシル、アルキル、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキル、ヘテロアルコキシル、ヘテロアルキル又はアミノであり、更にR10R13が、各々独立して水素、ニトロ、シアノ、カルボキシレート、スルホニル、スルファモイル、アルケニル、アルキニル、アミノ、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ビアルケニル、ビアルキニル、アルコキシカルボニル又はカルバモイルである、請求項12又は13に記載の組成物。R9が、以下、である、請求項14に記載の組成物第一のオリゴヌクレオチドが、発蛍光団で標識される、請求項1-15のいずれかに記載の組成物。発蛍光団が、6カルボキシフルオレセインFAM、27ジメトキシ45ジクロロ6カルボキシフルオレセインJOE、テトラクロロフルオレセインTET、6カルボキシローダミンR6G、NNNNテトラメチル6カルボキシローダミンTAMRA、6カルボキシXローダミンROX;1ジメチルアミノナフチル5スルホネート、1アニリノ8ナフタレンスルホネート、2pトルイジニル6ナフタレンスルホネート、5アミノナフタレン1スルホン酸EDANS、クマリン染料、アクリジン染料、インドジカルボシアニン3Cy3、インドジカルボシアニン5Cy5、インドジカルボシアニン55Cy55、31カルボキシペンチル3エチル55’ジメチルオキサカルボシアニンCyA;1H5H11H15Hキサンテノ234ij567ijジキノリジン18イウム、92625ジオキソ1ピロリジニルオキシ6オキソヘキシルアミノスルホニル4スルホフェニル236712131617オクタヒドロ分子内塩TR又はテキサスレッド、BODIPYTM染料、ベンゾキサアゾール、スチルベン又はピレンである、請求項16に記載の組成物。発蛍光団が、5’末端に結合される、請求項16又は17に記載の組成物。Y1が、8-12のDNA又はRNAのヌクレオチドの配列を含む、請求項16-18のいずれかに記載の組成物。第一のオリゴヌクレオチドが、第二の消光物質で標識される、請求項16-19のいずれかに記載の組成物。第二の消光物質が、ダブシル、エクリプス消光物質、BHQ1、BHQ2及びBHQ3、アイオワブラックFQ、アイオワブラックRQn1又はアイオワブラックRQn2である、請求項20に記載の組成物。第二の消光物質が、アイオワブラックFQ、アイオワブラックRQn1又はアイオワブラックRQn2である、請求項21に記載の組成物。第一のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする第二のオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項1-22のいずれかに記載の組成物。構造5’Y1L1XL2Y23’を有するオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、式中、Y1は、L1に共有結合された3’ホスフェートを有する第一のヌクレオチドN1を含む、8-12のDNA又はRNAのヌクレオチドの配列を含み、更にY1の5’末端のヌクレオチドは発蛍光団で標識されてあり、Y2は、L2に共有結合された5’ホスフェートを有する第二のヌクレオチドN2を含む、1又はそれ以上のDNA又はRNAのヌクレオチドの配列を含み、L1及びL2は、各々独立して直結合又は、C1-C7アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、シクロアルキル、アルキルアリール又はアルコキシル基であり、Xは、次式、であり、R1は、水素又はC1-C8アルキルであり、更にMは、消光物質である、前記組成物。オリゴヌクレオチドが、15-35ヌクレオチドを含む、請求項24に記載の組成物。L1及びL2が、各々C1-C7アルキルである、請求項24又は25に記載の組成物。L1及びL2が、C2アルキルである、請求項26に記載の組成物。L1と共有結合される3’ホスフェート、及びL2と共有結合される5’ホスフェートが、各々独立してホスホジエステル、ホスホチオエート、ホスホジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロアミダイト又はホスホトリエスエテルである、請求項24-27のいずれかに記載の組成物。Mが、次式、で示される基であり、L3が、直結合又は、C1-C8アルキル、アルケニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、シクロアルキル又はアルコキシルであり、R2-R6が、各々独立して水素、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシル、電子求引基又は電子供与基であり、更にR2-R6の1つが、次式、で示される基であり、更にPが、縮合多環式芳香族部分である、請求項24-28のいずれかに記載の組成物。電子求引基が、NO2、SO3、SO2、CN、NCS、ケトン、アルコキシル、エーテル、カルボン酸及びスルホニルから成る群から選択される、請求項29に記載の組成物。電子供与基が、アルコキシル、ヘテロアルコキシル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、アルキルアミノ又はアリールアミノから成る群から選択される、請求項29又は30に記載の組成物。Pが、次式、で示される基であり、R7R9が、各々独立して水素、アルコキシル、アルキル、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキル、ヘテロアルコキシル、ヘテロアルキル又はアミノであり、更にR10R13が、各々独立して水素、ニトロ、シアノ、カルボキシレート、スルホニル、スルファモイル、アルケニル、アルキニル、アミノ、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ビアルケニル、ビアルキニル、アルコキシカルボニル又はカルバモイルである、請求項29-31のいずれかに記載の組成物。R9が、次式、で示される基である、請求項32に記載の組成物。Pが、次式、で示される基であり、R14R19が、各々独立して水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、電子求引基、又はR1、R2ペア、R3、R4ペア、R4、R5ペア又はR5、R6ペアから形成される5若しくは6員環構造である、請求項29-31のいずれかに記載の組成物。Mが、L4Pであり、式中、L4が、アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、又はアルコキシル基であり、Pが、縮合多環式芳香族部分である、請求項24に記載の組成物。L4が、CH2OCH2CH2NHである、請求項35に記載の組成物。Pが、次式、で示される基であり、R7R9が、各々独立して水素、アルコキシル、アルキル、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキル、ヘテロアルコキシル、ヘテロアルキル又はアミノであり、更にR10R13が、各々独立して水素、ニトロ、シアノ、カルボキシレート、スルホニル、スルファモイル、アルケニル、アルキニル、アミノ、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ビアルケニル、ビアルキニル、アルコキシカルボニル又はカルバモイルである、請求項35又は36に記載の組成物。R9が、次式、で示される基である、請求項37に記載の組成物Fが、6カルボキシフルオレセインFAM、27ジメトキシ45ジクロロ6カルボキシフルオレセインJOE、テトラクロロフルオレセインTET、6カルボキシローダミンR6G、NNNNテトラメチル6カルボキシローダミンTAMRA、6カルボキシXローダミンROX;1ジメチルアミノナフチル5スルホネート、1アニリノ8ナフタレンスルホネート、2pトルイジニル6ナフタレンスルホネート、5アミノナフタレン1スルホン酸EDANS、クマリン染料、アクリジン染料、インドジカルボシアニン3Cy3、インドジカルボシアニン5Cy5、インドジカルボシアニン55Cy55、31カルボキシペンチル3エチル55ジメチルオキサカルボシアニンCyA;1H5H11H15Hキサンテノ234ij567ijジキノリジン18イウム、92625ジオキソ1ピロリジニルオキシ6オキソヘキシルアミノスルホニル4スルホフェニル236712131617オクタヒドロ分子内塩TR又はテキサスレッド、BODIPYTM染料、ベンゾキサアゾール、スチルベン又はピレンである、請求項24-38のいずれかに記載の組成物。Fが、オリゴヌクレオチドの5’末端の5’ホスフェートに結合される、請求項24-39のいずれかに記載の組成物。オリゴヌクレオチドが、第二の消光物質で標識される、請求項24-40のいずれかに記載の組成物。第二の消光物質が、ダブシル、エクリプス消光物質、BHQ1、BHQ2及びBHQ3、アイオワブラックFQ、アイオワブラックRQn1又はアイオワブラックRQn2である、請求項41に記載の組成物。第二の消光物質が、アイオワブラックFQ、アイオワブラックRQn1又はアイオワブラックRQn2である、請求項41に記載の組成物。構造5’Y1L1XL2Y23’を有するオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、式中、Y1は、L1に共有結合された3’ホスフェートを有する第一のヌクレオチドN1を含む、1又はそれ以上のDNA又はRNAのヌクレオチドの配列を含み、Y2は、L2に共有結合された5’ホスフェートを有する第二のヌクレオチドN2を含む、1又はそれ以上のDNA又はRNAのヌクレオチドの配列を含み、L1及びL2は、各々独立して直結合又は、C1-C7アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、シクロアルキル、アルキルアリール又はアルコキシル基であり、Xは、次式、で示される基であり、R1は、水素又はC1-C8アルキルであり、更にMは、縮合多環式芳香族部分を含む標識である、前記組成物。オリゴヌクレオチドが、15-35ヌクレオチドを含む、請求項44に記載の組成物。L1及びL2が、各々C1-C7アルキルである、請求項44又は45に記載の組成物。L1及びL2が、C2アルキルである、請求項46に記載の組成物。L1と共有結合される3’ホスフェート、及びL2と共有結合される5’ホスフェートが、各々独立してホスホジエステル、ホスホチオエート、ホスホジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロアミダイト又はホスホトリエスエテルである、請求項44-47のいずれかに記載の組成物。Mが、次式、で示される基であり、L3が、直結合又はC1-C8アルキル、アルケニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、シクロアルキル又はアルコキシルであり、R2-R6が、各々独立して水素、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシル、電子求引基又は電子供与基であり、更にR2-R6の1つが縮合多環式芳香族部分を含む、請求項44-48のいずれかに記載の組成物。縮合多環式芳香族部分を含むR2-R6の1つが、次式、で示される基であり、更にPが、縮合多環式芳香族部分である、請求項49に記載の組成物。電子求引基が、NO2、SO3、SO2、CN、NCS、ケトン、アルコキシル、エーテル、カルボン酸及びスルホニルから成る群から選択される、請求項49及び50のどちらかに記載の組成物。電子供与基が、アルコキシル、ヘテロアルコキシル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、アルキルアミノ又はアリールアミノから成る群から選択される、請求項49-51のいずれかに記載の組成物。Pが、次式、で示される基であり、R7R9が、各々独立して水素、アルコキシル、アルキル、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキル、ヘテロアルコキシル、ヘテロアルキル又はアミノであり、更にR10R13が、各々独立して水素、ニトロ、シアノ、カルボキシレート、スルホニル、スルファモイル、アルケニル、アルキニル、アミノ、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ビアルケニル、ビアルキニル、アルコキシカルボニル又はカルバモイルである、請求項50-52のいずれかに記載の組成物。R9が、次式、で示される基である、請求項53に記載の組成物。Pが、次式、で示される基であり、R14R19が、各々独立して水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、電子求引基、又はR1、R2ペア、R3、R4ペア、R4、R5ペア又はR5、R6ペアから形成される5若しくは6員環構造である、請求項50-52のいずれかに記載の組成物。Mが、L4Pであり、式中、L4が、アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、又はアルコキシル基であり、Pが、縮合多環式芳香族部分である、請求項44に記載の組成物。L4が、CH2OCH2CH2NHである、請求項56に記載の組成物。Pが、次式、で示される基であり、R7R9が、各々独立して水素、アルコキシル、アルキル、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキル、ヘテロアルコキシル、ヘテロアルキル又はアミノであり、更にR10R13が、各々独立して水素、ニトロ、シアノ、カルボキシレート、スルホニル、スルファモイル、アルケニル、アルキニル、アミノ、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ビアルケニル、ビアルキニル、アルコキシカルボニル又はカルバモイルである、請求項56及び57のどちらかに記載の組成物。R9が、次式、で示される基である、請求項58に記載の組成物。オリゴヌクレオチドが、発蛍光団で標識される、請求項44-59のいずれかに記載の組成物。発蛍光団が、6カルボキシフルオレセインFAM、27ジメトキシ45ジクロロ6カルボキシフルオレセインJOE、テトラクロロフルオレセインTET、6カルボキシローダミンR6G、NNNNテトラメチル6カルボキシローダミンTAMRA、6カルボキシXローダミンROX;1ジメチルアミノナフチル5スルホネート、1アニリノ8ナフタレンスルホネート、2pトルイジニル6ナフタレンスルホネート、5アミノナフタレン1スルホン酸EDANS、クマリン染料、アクリジン染料、インドジカルボシアニン3Cy3、インドジカルボシアニン5Cy5、インドジカルボシアニン55Cy55、31カルボキシペンチル3エチル55ジメチルオキサカルボシアニンCyA;1H5H11H15Hキサンテノ234ij567ijジキノリジン18イウム、92625ジオキソ1ピロリジニルオキシ6オキソヘキシルアミノスルホニル4スルホフェニル236712131617オクタヒドロ分子内塩TR又はテキサスレッド、BODIPYTM染料、ベンゾキサアゾール、スチルベン又はピレンである、請求項60に記載の組成物。発蛍光団が、オリゴヌクレオチドの末端の5’ホスフェートに結合される、請求項60又は61のどちらかに記載の組成物。オリゴヌクレオチドが、第二の消光物質で標識される、請求項60-62のいずれかに記載の組成物。第二の消光物質が、ダブシル、エクリプス消光物質、BHQ1、BHQ2及びBHQ3、アイオワブラックFQ、アイオワブラックRQn1又はアイオワブラックRQn2である、請求項41に記載の組成物。第二の消光物質が、アイオワブラックFQ、アイオワブラックRQn1又はアイオワブラックRQn2である、請求項64に記載の組成物。請求項1-23のいずれかに記載の組成物とサンプルを接触させる工程、及びサンプル中の第二のオリゴヌクレオチドの存在を表示する蛍光の増加を検出する工程を含む、サンプル中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、前記標的オリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドであり、第一のオリゴヌクレオチドが、発蛍光団で標識され、前記オリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、発蛍光団の蛍光が、消光物質への蛍光共鳴エネルギー伝達によって、又は消光物質による基底状態消光によって減少する、前記標的オリゴヌクレオチドの検出方法。第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、蛍光が蛍光共鳴エネルギー伝達によって減少する、請求項66に記載の方法。第一のオリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、蛍光が基底状態消光によって減少する、請求項66に記載の方法。第一のオリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、蛍光が、蛍光共鳴エネルギー伝達及び基底状態消光の両方によって減少する、請求項66に記載の方法。蛍光の増加が、標識オリゴヌクレオチドの切断から生じる、請求項66-69のいずれかに記載の方法。オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしないとき、前記オリゴヌクレオチドがランダムコイル構造を形成し、その結果、発蛍光団の蛍光が減少する、請求項60-70のいずれかに記載の方法。オリゴヌクレオチドが、自己相補性配列を含み、更に、核酸ポリマーが分子内塩基対形成を経るときに発蛍光団の蛍光が消光物質によって消光されるように、消光物質及び発蛍光団がオリゴヌクレオチドに結合される、請求項66-70のいずれかに記載の方法。前記方法が、PCR生成物の合成が蛍光の増加を生じるPCR反応で用いられる、請求項66-72のいずれかに記載の方法。請求項24-43のいずれかに記載の組成物とサンプルを接触させる工程、及びサンプル中の第二のオリゴヌクレオチドの存在を表示する蛍光の増加を検出する工程を含む、サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、オリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリダイズするように調整され、前記オリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、発蛍光団Fの蛍光が、消光物質への蛍光共鳴エネルギー伝達によって、又は消光物質による基底状態消光によって減少する、前記標的核酸の検出方法。第一のオリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、蛍光が、蛍光共鳴エネルギー伝達によって減少する、請求項74に記載の方法。第一のオリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、蛍光が、基底状態消光によって減少する、請求項74に記載の方法。第一のオリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、蛍光が、蛍光共鳴エネルギー伝達及び基底状態消光の両方によって減少する、請求項74に記載の方法。蛍光の増加が、標識オリゴヌクレオチドの切断から生じる、請求項74-77のいずれかに記載の方法。オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしないとき、前記オリゴヌクレオチドがランダムコイル構造を形成し、その結果、発蛍光団の蛍光が減少する、請求項74-78のいずれかに記載の方法。オリゴヌクレオチドが自己相補性配列を含み、更に、核酸ポリマーが分子内塩基対形成を経るときに発蛍光団の蛍光が消光物質によって消光されるように、消光物質及び発蛍光団がオリゴヌクレオチドに結合される、請求項74-78のいずれかに記載の方法。前記方法が、PCR生成物の合成が蛍光の増加を生じるPCR反応で用いられる、請求項74-80のいずれかに記載の方法。請求項44-65のいずれかに記載の組成物とサンプルを接触させる工程、及びサンプル中の第二のオリゴヌクレオチドの存在を表示する蛍光の増加を検出する工程を含む、サンプル中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、オリゴヌクレオチドが、標的核酸とハイブリダイズするように調整され、前記オリゴヌクレオチドが、発蛍光団で標識され、更に前記オリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、発蛍光団の蛍光が、消光物質への蛍光共鳴エネルギー伝達によって、又は消光物質による基底状態消光によって減少する、前記標的オリゴヌクレオチドの検出方法。第一のオリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、蛍光が蛍光共鳴エネルギー伝達によって減少する、請求項82に記載の方法。第一のオリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、蛍光が基底状態消光によって減少する、請求項82に記載の方法。第一のオリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、蛍光が蛍光共鳴エネルギー伝達及び基底状態消光の両方によって減少する、請求項82に記載の方法。蛍光の増加が、標識オリゴヌクレオチドの切断から生じる、請求項82-85のいずれかに記載の方法。オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしないとき、前記オリゴヌクレオチドがランダムコイル構造を形成し、その結果、発蛍光団の蛍光が減少する、請求項82-86のいずれかに記載の方法。オリゴヌクレオチドが、自己相補性配列を含み、更に、核酸ポリマーが分子内塩基対形成を経るときに発蛍光団の蛍光が消光物質によって消光されるように、消光物質及び発蛍光団がオリゴヌクレオチドに結合される、請求項82-86のいずれかに記載の方法。前記方法が、PCR生成物の合成が蛍光の増加を生じるPCR反応で用いられる、請求項82-87のいずれかに記載の方法。本開示は、オリゴヌクレオチド配列の内部のヌクレオチドの間に配置される、改変化合物を有するオリゴヌクレオチドを含む多様な組成物を提供する。驚くべきことに、改変オリゴヌクレオチドのいくつかは、非改変オリゴヌクレオチドとその相補性オリゴヌクレオチドとの間で形成されるデュプレックスの安定性と比較して、同等に安定であるか又はより高い安定性すら有するデュプレックスをそれらの相補性オリゴヌクレオチド配列との間で形成する。いくつかの改変化合物がデュプレックスに安定性を付与するメカニズムは不明である。特に驚くべきことでかつ予期せぬことには、これらの化合物によるオリゴヌクレオチド内の隣接する残基の改変は、二重らせんで試薬のどちらかの側において2つのリン酸基がすぐ近くに存在することを条件にデュプレックスの安定性を高める。改変基は、非常に高い消光能力を有するDLPの設計を可能にする蛍光消光物質ただし前記に限定されないを含む多様な標識を含むことができる。前記標識基は改変塩基ではないので、同じ改変化合物を任意のオリゴヌクレオチド配列何の任意の位置に挿入することができる。本開示はまた前記オリゴヌクレオチド組成物を使用及び作製する方法を提供する。本開示の組成物は、各々一般構造5’Y1L1XL2Y23’を有するオリゴヌクレオチドを含み、式中、Y1は1つ又は2つ以上のDNA及び/又はRNAのヌクレオチドの配列L1に共有結合された3’ホスフェートを有する第一のヌクレオチドN1を含むを含み;Y2は1つ又は2つ以上のDNA及び/又はRNAのヌクレオチドの配列L2に共有結合された5’ホスフェートを有する第二のヌクレオチドN2を含むを含み;L1及びL2は、各々独立して直結合又は、C1-C7アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、シクロアルキル、アルキルアリール又はアルコキシル基であり;Xは以下であり;R1は水素又はC1-C8アルキルであり;更にMは標識である。図1は、隣接ヌクレオチド間に挿入される、改変化合物を有する改変オリゴヌクレオチドの非限定的な例示リストを提供する。これらの改変オリゴヌクレオチドは所望される任意の数のヌクレオチド、好ましくは10-50ヌクレオチド、より好ましくは15-35ヌクレオチドを含むことができる。更にまた、用途に応じて、標識されるオリゴヌクレオチドはDNA、RNA又はDNAとRNAの両残基を含むキメラオリゴヌクレオチドであり得る。改変ヌクレオチド、例えばLNA塩基、2’OメチルRNA、並びにプリン及びピリミジンアナローグもまた配列内に含むことができる。プローブ又はプライマーとして使用するためには、オリゴヌクレオチドの長さは典型的には15から35残基の間である。標識は隣接残基の間に挿入されるので特定のヌクレオチドに標識が結合されるのとは対照的に、同じ改変化合物を本質的に任意の配列の標識に用いることができる。いくつかの実施態様では、L1及びL2は、各々C1-C7アルキル、好ましくはC2アルキルであり得る。改変オリゴヌクレオチドとその標的配列とのハイブリダイゼーション時に形成されるデュプレックスの安定性の増加が達成され得る実施例1を参照されたい。L1と共有結合する3’ホスフェート、及びL2と共有結合する5’ホスフェートは、各々独立してホスホジエステル、ホスホチオエート、ホスホジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロアミダイト又はホスホトリエスエテルであり得る。より大きな安定性すら与える改変中性荷電亜リン酸基も用い得よう。いくつかの実施態様では、Y1は4つ又は5つ以上のDNA及び/又はRNAのヌクレオチドの配列を含み、Y2は4つ又は5つ以上のDNA及び/又はRNAのヌクレオチドの配列を含み、Mは第一の消光物質であり、更にオリゴヌクレオチドは構造3’Y3Y45’を有する第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように調整され、前記式中、Y3は4つ又は5つ以上のDNA及び/又はRNAのヌクレオチド第三のヌクレオチドN3を含むを含み、Y4は4つ又は5つ以上のDNA及び/又はRNAのヌクレオチドの配列ヌクレオチドN3に直接結合された第四のヌクレオチドN4を含むを含む。第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするならば、N1とN3との塩基対及びN2とN4との塩基対は、第二のオリゴヌクレオチドと構造5’Y1Y23’を有する第三のオリゴヌクレオチドとの間で形成されるデュプレックスのTmより高いTmを有するデュプレックスを形成する。そのような実施態様では、第一のオリゴヌクレオチドは発蛍光団で標識できる。例えば、発蛍光団はオリゴヌクレオチドの5’末端の最後のヌクレオチドに結合させることができ、好ましい実施態様では、Y1は、以下で考察する理由のために、8-12のDNA又はRNAのヌクレオチド配列を含むことができる。第一のオリゴヌクレオチドを含む組成物はまた第二のオリゴヌクレオチドを含むことができる。本開示はまた、DLPにおいて発蛍光団に対して最適化された消光物質の配置を提供する。いくつかの実施態様では、発蛍光団はオリゴヌクレオチドの5’末端のヌクレオチド例えば5’ホスフェートと結合させることができ、更に消光物質は、前記発蛍光団から約8から12塩基の間、例えば発蛍光団から約10塩基の配列の内部に配置することができる実施例3参照。したがって、いくつかの実施態様では、Y1は8-12のDNA及び/又はRNAのヌクレオチド配列、例えば10DNA及び/又はRNAヌクレオチド配列を含み、Y1の5’末端のヌクレオチドは発蛍光団で標識され、Mは消光物質である。いくつかの実施態様では、Mは縮合多環式芳香族部分を含む。いくつかの実施態様では、Mは以下であり、式中、L3は、直結合又は、C1-C8アルキル、アルケニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、シクロアルキル又はアルコキシルであり、R2-R6は、各々独立して水素、アルキル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルコキシル、リガンド例えばアミノ酸、ペプチド、抗体、発蛍光団、ビオチン、酵素結合物、ビタミン、ステロイド及び他の脂質、炭水化物、ジゴキシゲニン並びに他のハプテンなど、電子求引基、又は電子供与基であることができ、更にR2-R6の1つはNNPであり、ここでPは縮合多環式芳香族部分である。電子求引基は、NO2、SO3、SO2、CN、NCS、ケトン、アルコキシル、エーテル、カルボン酸及びスルホニルから成る群から選択できる。電子供与基は、アルコキシル、ヘテロアルコキシル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、アルキルアミノ又はアリールアミノから成る群から選択できる。いくつかの実施態様では、MはL4Pであり、式中L4は、アルキル、アルキニル、アルケニル、ヘテロアルキル、置換アルキル、又はアルコキシル基であることができ、Pは縮合多環式芳香族部分である。例えばL4は、CH2OCH2CH2NH又は任意の他の適切なリンカーであり得る。本明細書に記載した多様なオリゴヌクレオチドは縮合多環式芳香族部分Pを含む。いくつかの実施態様では、Pは、下記式を有するアントラキノン消光物質であることができ:式中、R7-R9は、各々独立して水素、アルコキシル、アルキル、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキル、ヘテロアルコキシル、ヘテロアルキル又はアミノであり、更にR10-R13は、各々独立して水素、ニトロ、シアノ、カルボキシレート、スルホニル、スルファモイル、アルケニル、アルキニル、アミノ、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ビアルケニル、ビアルキニル、アルコキシカルボニル又はカルバモイルである。好ましい実施態様では、R9は以下である:いくつかの実施態様では、Pは下記式を有するアゾ消光物質であり:式中、R14R19は、各々独立して水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、電子求引基、電子供与基、又はR1、R2ペア、R3、R4ペア、R4、R5ペア又はR5、R6ペアから形成された5若しくは6員環構造であり、R20は、好ましくは電子求引基、もっとも好ましくはNO2である。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいくつかは発蛍光団を含み、前記発蛍光団には、6カルボキシフルオレセインFAM、2’7’ジメトキシ4’5’ジクロロ6カルボキシフルオレセインJOE、テトラクロロフルオレセインTET、6カルボキシローダミンR6G、NNNN’テトラメチル6カルボキシローダミンTAMRA、6カルボキシXローダミンROX;1ジメチルアミノナフチル5スルホネート、1アニリノ8ナフタレンスルホネート、2pトルイジニル6ナフタレンスルホネート、5アミノナフタレン1スルホン酸EDANS、クマリン染料、アクリジン染料、インドジカルボシアニン3Cy3、インドジカルボシアニン5Cy5、インドジカルボシアニン55Cy55、31カルボキシペンチル3’エチル55’ジメチルオキサカルボシアニンCyA;1H5H11H15Hキサンテノ234ij567i’j’ジキノリジン18イウム、92625ジオキソ1ピロリジニルオキシ6オキソヘキシルアミノスルホニル4スルホフェニル236712131617オクタヒドロ分子内塩TR又はテキサスレッド、BODIPYTM染料、ベンゾキサアゾール、スチルベン及びピレンが含まれ得るが、ただし前記に限定されない。いくつかの実施態様では、発蛍光団は5’末端、例えばオリゴヌクレオチドの5’末端のホスフェートに結合させることができる。本明細書で開示するオリゴヌクレオチドのいくつかは、2つ以上の消光物質、例えば第一の内部消光物質上記に記載及び第二の消光物質を含むことができる。第二の消光物質は、オリゴヌクレオチドの内部に配置するか、又はオリゴヌクレオチドの末端に配置することができる。第二の消光物質には、アゾ消光物質及びアントラキノリン消光物質が含まれ得るが、ただしいずれの消光物質も使用することができる。アゾ消光物質の例には、上記に示したアゾ消光物質、ダブシル、エクリプスEclipse消光物質、BHQ1、BHQ2及びBHQ3が含まれるが、ただしこれらに限定されない。アントラキノン消光物質の例には、上記に示したアントラキノン消光物質、アイオワブラックFQIowaBlackFQ、アイオワブラックRQn1IowaBlackRQn1又はアイオワブラックRQn2IowaBlackRQn2例えば以下を参照されたい:Laikhterら、米国特許出願20040110308が含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。複数の消光物質のプローブへの結合によって、消光効率が強化されるだけでなく、広域スペクトルの蛍光を生じる多様な発蛍光団の効果的な消光もまた提供され得る実施例7参照。本開示組成物は、サンプル中の標的核酸を検出する多様なアッセイで用いることができる。そのような方法は、標的核酸とハイブリダイズするように調整したオリゴヌクレオチドとサンプルを接触させる工程及びサンプル中の第二のオリゴヌクレオチドの存在を表示する蛍光の増加を検出する工程を含み、ここで、前記オリゴヌクレオチドは内部消光物質及び発蛍光団を含み、更に、前記オリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないとき、発蛍光団の蛍光は、消光物質への蛍光共鳴エネルギー伝達によって、及び/又は消光物質による基底状態消光によって減少する。いくつかのアッセイでは、例えば5’ヌクレアーゼ加水分解アッセイでは、蛍光の増加は標識オリゴヌクレオチドの切断から生じる。いくつかのアッセイでは、オリゴヌクレオチドは、当該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしないときにはランダムコイル構造を形成し、その結果、発蛍光団の蛍光は減少する。いくつかのアッセイでは、オリゴヌクレオチドは自己相補性配列を含み、更に、核酸ポリマーが分子内塩基対形成を経るときには発蛍光団の蛍光が消光物質によって消光されるように、消光物質及び発蛍光団は前記オリゴヌクレオチドに結合される。これらのアッセイは、PCR反応モニタリングを含むただし前記に限定されない多くの用途を有する前記反応では、PCR生成物の合成は蛍光の増加をもたらす。5’ヌクレアーゼ加水分解アッセイにおける二重標識プローブの機能は、発蛍光団が消光物質によって効果的に消光されることを必要とし、更に用いられた化学改変物質染料及び消光物質がヌクレアーゼ切断を妨げないこともまた要求する。切断が化学的改変の存在によって妨げられるか又は無効にされる場合、発蛍光団及び消光物質はPCRサイクル中に連結されたままであり、検出可能なシグナルは発生しない。本明細書で開示する化学組成物は発蛍光団を効率的に消光するように機能し、5’ヌクレアーゼ陽性DNAポリメラーゼTaqDNAポリメラーゼのようなDNAポリメラーゼを用いるプローブ加水分解に適合する。最良の結果は、消光を最大にするために内部消光物質が発蛍光団に可能な限り近接して配置され、しかもなお生成蛍光シグナルを最大にするために染料と消光物質の間で核酸塩基の効率的切断を許容するときに得られる。多くの蛍光消光基が内部に配置され、効率的消光が達成され得るが、これらの化学基の多くは大半ではないとしても、特に発蛍光団と消光物質との間の距離が12ヌクレオチド未満であるときにはプローブの切断を妨げる。この原則は実施例3で示されているが、前記実施例では、ある種の消光物質例えばBHQ1は、5’発蛍光団例えばフルオレセイン6FAMの非常に効率的な消光を達成することができるが、それでもリアルタイムPCRで発生する実際の蛍光シグナルの規模は小さく、実際の性能及びアッセイの感度は損なわれる。対照的に、本明細書で提供する消光物質の同様な内部配置はプローブの加水分解に完全に適合し、しかも最終的な機能性シグナル発生も大きい。プローブの長さが30ヌクレオチドに近いか又は30ヌクレオチドntを超えるときには、古くから用いられている5’発蛍光団及び3’消光物質を有するDLPは十分に機能しない。なぜならば、消光状態であってもなおプローブが相対的に輝きを維持する点まで消光効率が低下するからである。本開示は、発蛍光団に実質的により接近した内部消光物質を有する、長さが30nt、長さが35nt又は的確な用途のために要求される前記より長いプローブを提供する。本開示の組成物の消光は、内部消光物質がプローブの長さにも関わらず発蛍光団から同じ距離に挿入できるので高い有効性を維持する。したがって、品質が高く、有効な長さが延長され効率的に消光されるプローブが可能になる。前記は、ATが非常に豊富な核酸を用いて作業するときには特に重要であり得る。ATが豊富な配列は融解温度が低く、典型的にはPCRに必要な温度範囲で機能するためにはより長いプローブを用いる必要がある。文献では多様な反応性蛍光レポーター染料が知られており、それらが的確な消光基又は用いられる複数の消光基の組合せによって消光される限り、本開示の組成物で用いることができる。二重標識プローブで用いられる的確な発蛍光団/消光物質ペアは、通常は発蛍光団の発光波長及び消光物質の吸収波長を基準にし、共同で良好に機能する比較的小さなペアセットから慎重に選択される。本明細書で提供されるように、末端標識プローブで達成可能な位置よりも発蛍光団に更に近い内部位置に消光物質を配置することによって、通常は良好に共同機能しない発蛍光団/消光物質ペアでさえも効率的な消光が可能になり、消光物質の有用性はより広範囲の発蛍光団との使用が可能になることによって高められる。第二の消光物質のプローブへの結合によって有用なスペクトル域を更に拡張できる。本明細書で提供するオリゴヌクレオチドプローブは1つ又は2つ以上の発蛍光団を取り込むことができる。発蛍光団は、内部に又は5’若しくは3’末端に結合させることができる。典型的には、発蛍光団は芳香族又は複素芳香族化合物であり、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、ベンゾインドール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、シアニン、カルボシアニン、サリチレート、アントラニレート、クマリン、フルオロセイン、ローダミン又は他の類似化合物であり得る。適切な蛍光レポーターは、キサンテン染料、例えばフルオレセイン又はローダミン染料を含み、前記には6カルボキシフルオレセインFAM、2’7’ジメトキシ4’5’ジクロロ6カルボキシフルオレセインJOE、テトラクロロフルオレセインTET、6カルボキシローダミンR6G、NNNN’テトラメチル6カルボキシローダミンTAMRA、6カルボキシXローダミンROXが含まれる。適切な蛍光レポーターにはまた、アルファ又はベータ位にアミノ基を有するナフチルアミン染料が含まれる。例えば、ナフチルアミノ化合物には、1ジメチルアミノナフチル5スルホネート、1アニリノ8ナフタレンスルホネート及び2pトルイジニル6ナフタレンスルホネート、5アミノナフタレン1スルホン酸EDANSが含まれる。他の蛍光レポーター染料には、クマリン、例えば3フェニル7イソシアナトクマリン;アクリジン、例えば9イソチオシアナトアクリジン及びアクリジンオレンジ;Nフェニルマレイミド;シアニン、例えばインドジカルボシアニン3Cy3、インドジカルボシアニン5Cy5、インドジカルボシアニン55Cy55、31カルボキシペンチル3’エチル55’ジメチルオキサカルボシアニンCyA;1H5H11H15Hキサンテノ234ij567i’j’ジキノリジン18イウム、92625ジオキソ1ピロリジニルオキシ6オキソヘキシルアミノスルホニル4スルホフェニル236712131617オクタヒドロ分子内塩TR又はテキサスレッド;BODIPYTM染料;ベンゾキサアゾール;スチルベン;ピレンなどが含まれる。更に別の発蛍光団の例については、例えば以下を参照されたい:HauglandMolecularProbesHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals。本開示の改変化合物をオリゴヌクレオチドに取り込むための試薬は以下の一般構造を有することができる:式中、R13は酸素原子上の保護基、もっとも一般的にはトリチル基、好ましくはジメトキシトリチル基であり、R22は、合成中に伸長するオリゴヌクレオチド鎖に試薬を連結するために用いられるホスホロアミダイト、リン酸基又はリン酸水素塩である。ホスホロアミダイトが好ましい。NNジイソプロピルβシアノエチルホスホロアミダイトがもっとも好ましい反応基である。本明細書で用いられるように、核酸及びオリゴヌクレオチドはポリデオキシリボヌクレオチド2デオキシDリボースを含む、ポリリボヌクレオチドDリボースを含む、及びプリン又はピリミジン塩基のNグリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチドを指す。核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴマー又はオリゴという用語間に意図的な長さの区別は存在せず、これらの用語は互換的に用いられるであろう。これらの用語は分子の一次構造にのみ関係する。したがって、これらの用語は二本鎖及び一本鎖RNAと同様に二本鎖及び一本鎖DNAを含む。オリゴヌクレオチドはまた、塩基、糖又はホスフェートが改変されてあるヌクレオチドアナローグを、非プリン又は非ピリミジンヌクレオチドのオリゴヌクレオチド前記は天然に存在するヌクレオシド又は化学的に改変されたヌクレオシドを含むことができると同様に含むことができる。いくつかの実施態様では、前記化合物は、改変された糖部分、改変されたヌクレオシド間結合、又は改変されたヌクレオ塩基部分を含む。本明細書で用いられる塩基という用語はプリン、ピリミジン及び非天然塩基、並びに当分野で周知の改変物を含む。プリンにはアデニン、グアニン及びキサンチン並びに改変プリン、例えば8オキソN6メチルアデニン及び7デアザキサンチンが含まれる。ピリミジンにはチミン、ウラシル及びシトシン並びにそれらのアナローグ、例えば5メチルシトシン及び44エタノシトシンが含まれる。非天然塩基には、5フルオロウラシル、5ブロモウラシル、5クロロウラシル、5ヨードウラシル、ヒポキサンチン、4アセチルシトシン、5ウラシル、5カルボキシメチルアミノメチル2チオウリジン、5カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータDガラクトシルケオシン、イノシン、N6イソペンテニルアデニン、1メチルグアニン、1メチルイノシン、22ジメチルグアニン、2メチルアデニン、2メチルグアニン、3メチルシトシン、5メチルシトシン、N6アデニン、7メチルグアニン、5メチルアミノメチルウラシル、5メトキシアミノメチル2チオウラシル、ベータDマンノシルケオシン、5’メトキシカルボキシメチルウラシル、5メトキシウラシル、2メチルチオN6イソペンテニルアデニン、ウラシル5オキシ酢酸v、ウィブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2チオシトシン、5メチル2チオウラシル、2チオウラシル、4チオウラシル、5メチルウラシル、ウラシル5オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル5オキシ酢酸v、5-メチル2チオウラシル、3ウラシル、w、ニトロインドール及び26ジアミノプリンが含まれる。塩基という用語は時にモノマーと互換的に用いられ、この関係では、前記用語は、核酸鎖において単一核酸ユニット又は単一オリゴマーユニットを指す。本明細書で用いられるプローブという用語は、標的との相互反応に際して検出可能な応答を生じる核酸オリゴヌクレオチドを指す。プローブは少なくとも1つの検出可能部分、結合パートナーとのプローブの相互作用への応答でプローブの状態における何らかの変化に際して検出可能なエネルギー伝達ペアを形成する一対の部分、又は3つ以上の部分、例えば1つの発蛍光団及び2つ以上の消光物質を含む。本明細書で用いられるプライマーという用語は、適切な条件下でDNA合成の開始点として作用する能力を有するオリゴヌクレオチドを指す。そのような条件は、核酸鎖と相補的なプライマー伸長生成物の合成が、異なる4つのヌクレオシド三リン酸及び伸長因子例えばDNAポリメラーゼ又は逆転写酵素の存在下で適切な緩衝液及び適切な温度にて誘導される条件を含む。プライマーは好ましくは一本鎖DNAである。プライマーの適切な長さはプライマーの使用目的に左右されるが、典型的には6から50ヌクレオチド、好ましくは15-35ヌクレオチドの範囲である。一般的には、短いプライマー分子は、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体の形成により低温を要求する。プライマーは鋳型核酸の正確な配列を再現する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補性でなければならない。与えられた標的配列の増幅のために適切なプライマーの設計は当分野で周知であり、本明細書に引用した文献に記載されている。プライマーは、プライマーの検出又は固定を可能にするが当該プライマーの基本的特性を変化させない更に別の造作、DNA合成の開始点として作用するものを取り込むことができる。例えば、プライマーは、標的核酸とハイブリダイズしないが増幅生成物のクローニング又は検出を促進する、5’末端の追加の核酸配列を含むことができる。鋳型とハイブリダイズするために十分に相補性であるプライマーの領域は、本明細書ではハイブリダイズ領域と称される。本明細書で用いられるハイブリダイゼーションという用語は、相補性塩基の対合による一本鎖核酸のデュプレックス構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは完全に相補的な核酸間又は小さなミスマッチ領域を含む実質的に相補的な核酸鎖間で生じ得る。完全に相補的な核酸鎖のハイブリダイゼーションが強力に優先される条件はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件又は配列特異的ハイブリダイゼーション条件と称される。実質的に相補的な配列の安定なデュプレックスは、ストリンジェンシーが緩和されたハイブリダイゼーション条件下で達成できる。許容されるミスマッチ度は、ハイブリダイゼーション条件を適切に調節することによって管理できる。核酸技術分野において習熟する者は、多数の可変要件例えばオリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対組成、イオン強度並びにミスマッチ塩基対の頻度を含むを考慮しつつ当該技術によって提供される指針にしたがい、デュプレックスの安定性を経験的に決定できる例えば以下を参照されたい:Sambrooketal1989MolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNewYorkWetmur1991CriticalReviewinBiochemandMolBiol26227259andOwczarzyetal2008Biochemistry4753365353前記文献は参照により本明細書に含まれる。増幅反応という用語は、鋳型核酸配列のコピー増加をもたらすか、又は鋳型核酸の転写をもたらす任意の化学反応酵素反応を含むを指す。増幅反応には、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応PCRリアルタイムPCRを含む以下を参照されたい:USPatNos4683195及び4683202;PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplicationsInnisetaleds、及びリガーゼ連鎖反応LCR以下を参照されたい:BaranyetalUSPatNo5494810が含まれる。例示的な増幅反応条件又は増幅条件は典型的には2又は3工程サイクルを含む。2工程サイクルは、高温変性工程とそれに続くハイブリダイゼーション/伸長又は連結工程を有する。3工程サイクルは変性工程、その後のハイブリダイゼーション工程、その後の分離させた伸長又は連結工程を含む。以下の実施例は本発明を更に例証するが、もちろんのこといかなる場合においても本発明の範囲を制限するものと解されるべきではない。本実施例は、他の化合物を選択した場合と比較して本開示の改変を含むプローブの安定性の改善を示す。オリゴヌクレオチドの合成及び精製:DNAオリゴヌクレオチドは固相ホスホロアミダイト化学反応を用いて合成し脱保護し、更に日常的技術にしたがってNAP5カラムAmershamPharmaciaBiotechPiscatawayNJで脱塩したCaruthersetalMethodsEnzymol1992211320。前記オリゴマーは逆相高速液体クロマトグラフィーRPHPLCによって精製した。各オリゴマーの純度はベックマンBeckmanPACEMDQ系BeckmanCoulterIncFullertonCAで実施されるキャピラリー電気泳動CEによって決定した。全ての一本鎖オリゴマーが少なくとも90の純度を有していた。オリゴヌクレオチドのエレクトロスプレー‐イオン化液体クロマトグラフィー質量分析法ESILCMSは、OligoHTCS系NovatiaPrincetonNJを用いて実施された。前記の系は、サーモフィンニガンThermoFinniganTSQ7000、エックスカリバーXcaliburデータ系、プロマスProMassデータ処理ソフト及びパラダイムParadigmMS4TMHPLCMichromBioResourcesAuburnCAから成っていた。製造業者が推奨するプロトコルにしたがった。全ての一本鎖オリゴマーの実験的モル質量は予想モル質量の15gmol内にあった。これらの結果によってオリゴマーの実体が確認された。DNAサンプルの調製:溶解実験は、387°mMNaH2PO4、613°mMNa2HPO4、1°mMNa2EDTA及び1000°mMNaClを含む緩衝液中で実施した。1MのNaOHを用いて各溶液をpH70に滴定した。総ナトリウム濃度は1020mMと概算した。DNAサンプルは、28ウェルのマイクロダイアリシス系MicrodialysisSystem;LifeTechnologiesCarlsbadCAにて製造業者の推奨プロトコルにしたがい、溶解緩衝液に対して完全に透析した。DNAオリゴマーの濃度は、各オリゴマーの吸光係数を用い、分光光度計BeckmanCoulterIncFullertonCAでサンプルの260nmにおけるUV吸収から概算した吸光係数は吸光係数計算用隣接ヌクレオチドモデルを用いて概算した以下を参照されたい:WarshawetalJMolBiol196620293。試験した内部改変:図1A-1Cは、本実施例及び実施例2で調べた多様な改変オリゴヌクレオチドの改変部分の構造を示す。FQIntegratedDNATechnologiesInc;本出願では時にiFQと称するは、合成時にホスホロアミダイト試薬を用いてオリゴヌクレオチドに導入した。ホスホロアミダイトの合成については実施例10を参照されたい。第一のデュプレックスシリーズでは、iFQ基は、10塩基の上部鎖が10塩基の下部鎖とアニールし、かつiFQ基は塩基と並ばないようにデュプレックス内の塩基の間に挿入物として配置された。更に別に、C3スペーサーが挿入された10merのオリゴヌクレオチドもまた合成し、試験した。C3スペーサーは、リン酸基とプロパンジオールの線状挿入物が塩基間に配置されたコントロール前記はナフチレンアゾ環構造をもたないiFQと類似するを表す。260nmにおけるiFQの吸光係数は13340であると概算された。C3スペーサーはUV吸収に寄与しない。類似する設計の2つの20塩基及び2つの25塩基もまた試験した。10塩基デュプレックスの第二のセットを試験したこの場合、10塩基の上部鎖5塩基iFQ5塩基が11塩基の下部鎖とアニールし、その結果iFQ基が塩基の代用又は置換として機能するようにiFQ基が配置されていた。この設計の4つのデュプレックスを試験したiFQ基とペアを形成する4塩基AGCTの各々を含む。溶解曲線の測定:各サンプルについて少なくとも2回オリゴマーの濃度を測定した。任意のサンプルについて概算濃度が4を超えて異なった場合、結果を捨てて新しく吸収測定を実施した。オリゴヌクレオチドデュプレックスを調製するために、相補性DNAオリゴマーを1:1のモル比で混合し、367Kすなわち94°Cに加熱し、更にゆっくりと周囲温度に冷却した。各デュプレックスDNA溶液を溶解緩衝液で2μMの総DNA濃度CTに希釈した。溶解実験は、単一ビームベックマンBeckmanDU650分光光度計BeckmanCoulterミクロTmアナリシス付属装置、ベックマンハイパフォーマンスペルティヤーコントローラーBeckmanHighPerformancePeltierController温度調節用及び1cmのパス長のキュベット付きで実施した。溶解データはPC仲介分光光度計を用いて記録した。268nm波長でのUV吸収値は383Kから368Kすなわち10-95°Cの温度範囲で01°Cずつ上昇させて測定した。加熱すなわち変性及び冷却すなわち再生の両遷移曲線を各サンプルについて温度変化速度を制御しながら249±03°C時間記録した。サンプル温度は、ペルティヤーホルダー内に配置した内部プローブから収集し、各サンプルのUV吸収データとともに記録した。緩衝液のみオリゴヌクレオチド無しのサンプルについての溶解プロフィールもまた記録し、これらのブランクプロフィールもDNAサンプルの溶解曲線から数値として差し引いた。システムエラーを最小限にするために、少なくとも2つの溶解曲線を異なるキュベット及びペルティヤーホルダー内の異なる位置で各サンプルについて収集した。溶解温度の決定:各サンプルの溶解温度を決定するために、以前に記載された方法を用いて溶解プロフィールを解析した以下を参照されたい:DoktyczetalBiopolymers199232849864OwczarzyetalBiopolymers199744217239OwczarzyRBiophysChem2005117207215。簡単に記せば、デジタルフィルターを用いて各サンプルの実験データを簡略にし、サンプルのUV吸収図表をその温度の関数として得た。続いて一本鎖オリゴヌクレオチド分子の割合、θを前記図表から計算した。サンプルの溶解温度又はTmは、θ=05の場合の温度と規定した。表1は、試験した配列、使用した内部消光物質及び得られた溶解温度を列挙する。表1:内部消光物質部分を含む核酸の溶解温度iFQ=内部FQアゾ消光物質、及びiSpC3=C3スペーサー異なる3つの挿入の配置部位を10merのオリゴヌクレオチドの足場を用いて調べた。より短い配列の使用はTmに対する潜在的な影響をもっとも明瞭に示し、種々の配置部位の試験はTmへの影響が配列内容依存性であり得ることを示す。非改変10mer配列に対する改変10mer配列の相対的ΔTmシフトを平均し、下記の表2に要約する。表2:内部改変を有する3つの10mer配列の平均ΔTmシフト表1及び2に示すように、プロパンジオールC3スペーサーのように小さくかつ立体的妨害又は不安定化を与えない改変によるDNA配列の混乱は、デュプレックスのTmに対して顕著な負の影響を与えるΔTmは87°C。対照的に、調査したナフチレンアゾクラスの消光物質iFQはiC3コントロールと比較してデュプレックスを顕著に安定化させた。iFQを塩基置換として配置iSpC3と比較してΔTmは81°CしたときよりもiFQを挿入として配置iSpC3と比較してΔTmは125°Cしたときに、極めて大きな安定化度が認められた。予期に反して、塩基間の挿入としてのiFQ基を使用は、非改変親デュプレックスと比較して当該デュプレックスを安定化させたが非改変デュプレックスと比較してΔTmは38°C、塩基置換はわずかな不安定化をもたらした非改変デュプレックスと比較してΔTmは06°C。したがって、DNAデュプレックス内へのナフチレンアゾ基の内部取り込みは、塩基間の挿入として配置されるときデュプレックスを安定化させる。ある種のアントラキノン基は、末端に配置したときデュプレックスを安定化させることができるがJAmChemSoc13112671126812009、この作用はこれまで内部配置に関して又はナフチレンアゾ化合物の使用に関して報告されたことはなかった。したがって、内部ナフチレンアゾクラス消光物質の使用はデュプレックスの安定化の維持に好ましいであろう。以下の実施例は、10merのオリゴヌクレオチドの種々の位置に種々の改変挿入を含む10塩基対のデュプレックスセットを比較する。種々の改変オリゴヌクレオチドの改変部分の構造は図1A-1Cに示されている。以前に記載したように、FQホスホロアミダイトの合成は実施例10に記載されている。構造IB11はFQと同じ態様で合成されるが、ただしアミノアントラキノン試薬が4ニトロ1ナフチルアミンの代わりに用いられる。IBRQ消光物質はアントラキノン系化合物米国特許出願20040110308であり、一般的に前記は赤色波長蛍光染料とともに用いられる。DNAサンプルの調製、溶解曲線の測定及び溶解温度の決定は実施例1のように実施した。表3では、調査した各デュプレックスのTmデータの結果が、未改変オリゴヌクレオチドで形成したデュプレックスと比較したΔTmと併せて列挙されている。表3:図13A、13B、13C、13D及び13Eは棒線図で、各々はヌクレオチド内の個々の位置におけるそれぞれの改変によって生じたΔTmを示している。図14A及び14Bは、オリゴヌクレオチド内の挿入位置に対するΔTmの依存性を種々の改変化合物の各々について示す図である。一般的には、オリゴヌクレオチドの末端近くへの改変の挿入は、オリゴヌクレオチドの中央に向けて挿入するときよりも不安定化は緩和される。スペーサー改変は全て不安定化を示し、不安定化の程度はスペーサーのサイズの増加とともに増加する。FQ改変は、デュプレックスの末端近くであろうと中央であろうと、安定化に対して正の影響を示した。IB11はFQと同じ安定化プロフィールを示した。iRQn2改変もまたデュプレックスの安定化に対して正の影響又は無視できる程度の影響を示した。本実施例は内部消光物質を含むオリゴヌクレオチドの予測モデリングを詳述する。内部FQアゾ消光物質iFQ改変の熱力学的影響は、改変デュプレックスDNAと天然デュプレックスDNAとの間の相違から決定された。溶解実験は2μMのDNA濃度Ct及び1MのNa緩衝液で実施した。転移エンタルピーΔHo及びエントロピーΔSoは個々の溶解プロフィールとの適合から得たPetersheimMTurnerDHBiochemistry22256263。平衡定数Kaは、以下のように各温度における破壊塩基の割合から計算した:Ka=2/θ2C11lnKa対1Tのグラフは直線に対して最小二乗適合であった。更に熱力学的パラメーターは勾配及び切片から以下のように計算した:lnKa=ΔHo/RT-ΔSo/R2適合は015から085の範囲のθに限定され、この範囲でθ及びKaはもっとも正確である。記号Rは、理想気体定数である19865cal。ΔHo及びΔSoの提示値は、少なくとも4つの加熱及び冷却プロフィールの平均である。この熱力学解析では、転移エンタルピー及びエントロピーは温度非依存性であり、溶解遷移は二状態態様で進行すると仮定される。結果は表4にまとめられている。挿入FQアザ消光物質の平均熱力学的影響は以下の関係から概算できた:ΔHo改変オリゴ=ΔHo天然オリゴ-1272calmolΔSo改変オリゴ=ΔSo天然オリゴ-144calこれらの等式を用いて、20及び25塩基対デュプレックスの溶解温度を予測したとき表5、予想の平均誤差は07°Cであった。表4:内部FQ消光物質の熱力学的影響a相補性DNA鎖は5’TAGCAACGAT3’であった。計算は四捨五入しない値を用いて実施した。表5:等式1及び2の誘導に用いられなかった内部FQ消光物質を含む2つのデュプレックスDNAのTm予想の正確さa融解温度は隣接モデルSantaLuciaJJrProcNatlAcadSciUSA9514601465並びに等式1及び2を用いて計算した。低い予想誤差は、内部消光物質のオリゴヌクレオチドへの付加の影響の一定性及び予測性を示している。本実施例は、本明細書で開示した新規な内部消光物質を含むプローブを用いる定量的リアルタイムPCRqPCRにおける機能的性能を示す。有効性を立証済みのqPCRアッセイを用いて、種々の設計の蛍光消光プローブの性能を判定した。用いたプライマー配列はヒトHPRT遺伝子NM00194に特異的であった。プローブ及びプライマー配列は下記の表6に列挙されている。表6:qPCRアッセイで用いた配列全てのオリゴヌクレオチドをIDTIntegratedDNATechnologiesCoralvilleIAによって合成した。プローブオリゴヌクレオチドはHPLCで精製した。全てのオリゴヌクレオチドの質量同一性は質量分析法によって実証した。全ての標的アンプリコンをクローニングして配列を確認した。標的プラスミドを制限エンドヌクレアーゼ消化によって線状化し、10倍連続希釈を実施して標準曲線を作成した。HPRTqPCR反応は、04UのインモラーゼImmolaseDNAポリメラーゼ480プラットフォームで実施した。プラスミドコピー数の標準物は、2x107で出発して2x102まで10倍増加トリプリケートで実施した。用いたサーモサイクリングプロフィールは、951000-x40であった。データ解析は、製造業者が提供したソフトを用いて実施した。内部FQiFQ配置の影響:5’FAMレポーター染料及び内部iFQ消光物質を有するオリゴヌクレオチドプローブシリーズは、iFQ基の相対的配置が変動するHPRTプローブ配列を用いて合成した。あるセットでは、iFQ基は塩基置換として配列内で塩基と置換される配置された。別のセットでは、iFQ基は残基間の塩基挿入として配置された。5’染料からのiFQの距離は変動し、5’末端から6、8、10又は12位を含む。したがって、6位の挿入として配置された改変はi6と示され、8位の置換はs8などのように示される。プローブは、HPRTプライマー配列番号:97及び98及び2x106コピーのHPRTアンプリコンプラスミド標的クローンを用いる上記概略qPCRで用いられた。置換プローブシリーズ配列番号:100-103の増幅図表は図2Aに示され、基準線標準化図表は図2Bに示されている。挿入シリーズ配列番号:104-107の増幅図表は図3Aに示され、基準線標準化図表は図3Bに示されている。プローブ内のiFQ基の正確な配置はプローブの性状に影響を与え、基準線蛍光、シグナル発生の規模及び定量サイクル数Cq、増幅シグナルが初めて検出されるサイクル数に変化が認められることは明白である。増幅図表からプローブの品質を判定する相対的測定法は表7に報告されている表7は、qPCR装置で測定した消光効率の測定値として基準線蛍光及びΔRnqPCRの開始と終了の間の蛍光強度の相違発生シグナルの規模の測定値としてを含む。低い基準線蛍光と高い相対的ΔRnシグナル発生を一組みにすることによってプローブの性能の改善がもたらされる。表7:FAM標識プローブにおけるiFQの内部配置HPRTアッセイ全てのプローブの設計は上記のqPCRアッセイで機能し、iFQ基は、塩基置換としても又は塩基間挿入としても本開示の方法で用いることができる。iFQ基の塩基置換としての配置は、塩基間挿入として用いたときよりもわずかに良好な消光をもたらしたが、置換基プローブはより低いシグナル発生を示した。更にまた、塩基置換として配置されたiFQはわずかに不安定であるがTmの低下、塩基挿入として配置されたiFQは安定であるTmの増加上記実施例1を参照されたい。より良好なシグナル発生及びデュプレックス安定化の改善が与えられるとしたら、挿入としてのiFQの配置はより好ましい実施態様と考えられ、以降の全ての実施例はiFQ挿入プローブのみを用いて実施されるであろう。5’FAMレポーター染料からのiFQ基の相対的距離は、基準線蛍光及びシグナル発生に対して顕著な影響を有した。図3Aでは、バックグラウンド蛍光レベルはi6<i8<i10<i12であった。消光基をレポーター染料にいっそう接近させて配置することによって、バックグラウンド蛍光は減少した。この影響は、FRETによる消光がレポーターと消光物質の接近とともに改善するので予期された。予期に反して、iFQ基の相対的配置はまた増幅実施時のシグナル発生の規模に影響を与え、更に最終的機能性蛍光陽性シグナルはi10>i8>i12>>i6であった図3B。興味深いことに、i6プローブは、挿入シリーズ及び置換シリーズの両方について貧弱な蛍光シグナルを示した。このシグナル減少はアッセイの品質を低下させ、これらのプローブのCq点を遅くし、アッセイ感度の低下を示した。我々は、iFQ基を発蛍光団に近づけすぎると、5’ヌクレアーゼアッセイ様式では増幅時にDNAポリメラーゼによって完全には切断されないプローブを生じ、消光物質からレポーター染料の遊離が減少するという仮説を提示する。最高のプローブ性能は消光と切断が折り合う点で認められる消光は消光物質と発蛍光団がより接近して配置されるときに向上し、切断はより多くの核酸塩基によって引き離されているときに向上する。前記の関係が最適である正確な範囲は明確ではなく、異なるレポーター染料/消光物質の組合せで異なる可能性がある。このレポーター染料/消光物質組合せについて、アッセイの最適性能はi8及びi10配置で認められた。これらのプローブについて、バックグラウンド蛍光は低く、シグナル発生は高かった。以下の実施例は、多様な標的濃度における内部消光プローブ設計の有効性を示す。実施例4では、標的核酸の1つの濃度を用いて異なる8つのプローブ設計の性能を調べた。本実施例では、6つの標的濃度をHPRTqPCRアッセイで試験し、実施例4の4つのプローブの性能を比較した。FAMレポーターとともに内部FQiFQ消光物質を用いるHPRT特異的プローブを利用した。前記には置換設計s6及びs10配列番号:103及び101並びに挿入設計i6及びi10配列番号:107及び105が含まれる。増幅反応は実施例3に概略したように実施し、投入標的プラスミドコピー数は2x102、2x103、2x104、2x105、2x106及び2x107を用いた。各反応はトリプリケートで実施した。図4Aは基準線調整置換セットの結果を示し、図4Bは基準線調整挿入セットの結果を示す。投入標的核酸が10倍ずつ変化する毎に予想された相違である約33サイクルに一致する増幅図表曲線の明確な進行が認められるこの場合、曲線は左から右にもっとも高い鋳型濃度から最も低い鋳型濃度に並んでいる。全ての比較可能なデータ点で発生したシグナル規模の向上から明瞭なように、挿入プローブセットの性能は、試験した全ての濃度において置換プローブセットよりも優れていた。更にまた、消光物質のi10配置は消光物質のi6配置シリーズよりも性能が優れていた。したがって、以降の実施例は置換i10プローブ設計の使用を中心にした。以下の実施例は、プローブの3’末端に配置した第二の消光物質とペアにした挿入内部消光物質の使用を示す。HPRT遺伝子を標的とする新規なプローブシリーズを合成した。前記はいずれも、5’発蛍光団レポーター染料6FAM及び種々の位置に配置された消光物質を有し、同じプローブ分子内に2つの消光物質を有する組成物を含んでいた。内部消光物質は、塩基間挿入として加えられた。単一消光物質プローブ3’末端にFQ消光物質、i10位にFQ消光物質を同じ配列の二重消光物質型と比較した。二重消光物質プローブは、FQ化学基又はブラックホールクェンチャー1BlackHoleQuencherTM1、BHQ1下記参照、種々の市販のダーククェンチャーBiosearchTechnologiesNovatoCAを用いて作製した。表8は試験したプローブ配列を列挙する。HPRTqPCRアッセイは実施例4に記載したように実施し、標的としてのプラスミドを含むHPRTアンプリコン2x106コピーを用いた。表8:単一消光プローブ及び二重消光プローブこれら4つのプローブは、HPRTプライマー配列番号:97及び98及びHPRTアンプリコンプラスミド標的クローンの2x106コピーを用いる上記実施例4に概略したqPCRで用いられた。増幅図表は図5Aに示され、基準線標準化図表は図5Bに示されている。増幅図表によるプローブ品質の判定のための相対的測定もまた表8に報告されている。表8は、qPCR装置で測定した基準線蛍光消光効率の測定値として及びqPCR実施の開始から終了の間に観察されるΔRn発生シグナルの規模の測定値としてを含んでいる。高い相対的ΔRnを低い基準線蛍光と一組みにすることによって、プローブの性能向上がもたらされる。古くから用いられている5’レポーター染料及び3’消光物質配列番号:108によるプローブ設計はもっとも高い基準線蛍光すなわちもっとも劣悪な消光を示した。単一消光物質i10内部配置プローブ配列番号:105は顕著に低い基準線蛍光を示し、二重消光物質プローブ配列番号:109、110はもっとも低い基準線蛍光すなわち最良の消光を示した。したがって、図5A及び5Bのこの二重消光プローブはi10FQ消光物質単独よりも顕著に良好な性能を示し、2つの消光物質の存在はそれらの消光特性に負の影響を与えないだけでなく、全体的な消光特性すら向上させることを明らかにした。異なるプローブ設計を用いて発生する相対的蛍光シグナルはまた消光物質のタイプ及び配置により変化する。3つのFQプローブは11-14のΔRnを発生させ、もっとも高い相対的蛍光シグナルが二重消光iFQ3’FQプローブ配列番号:109によって生じた。興味深いことには、代替の市販ダーククェンチャーBHQ1配列番号:110を用いた同じ設計の性能は顕著に劣悪で、ΔRnはわずかに75であった。前記プローブはまた遅いCq値増幅シグナルが最初に検出されるサイクル数を示し、機能的感度が劣ることを示している。このことは、全てのダーククェンチャー化学組成物は機能的に互換性を示さず、ナフチレンアゾ消光物質FQは、本開示の方法を用いるとき優れた態様で性能を発揮することを明瞭に示している。実施例4、5及び6は、ヒトHPRT遺伝子に特異的な単一プローブ配列を用いて実施された。以下の実施例は、実施例4-6で詳述した機能的qPCRの結果は、種々の標的遺伝子について種々のプローブ配列を用い、種々の温度サイクラープラットフォーム及び種々の試薬を用いて実施したときに一致することを例証する。H1N1インフルエンザウイルスSWH1、ブタ流感としても知られているの株に特異的な新規なqPCRアッセイを用いた。プライマー及びプローブは下記の表9に列挙されている。表9:インフルエンザqPCRアッセイで用いられた配列インフルエンザウイルスH1N1特異的SWH1プローブセットを合成し、以下の点を除いて実施例4に記載した方法と同じ方法を用いてqPCRを実施した:アッセイはアプライドバイオシステム7900HT配列検出系AppliedBiosystemsFosterCityCAを製造業者の指示にしたがって用いて実施し、1xTaqMan遺伝子発現マスターミックスLifeTechnologiesCarlsbadCA、250nMプローブ、及び1000nMプライマーを疾病管理センターCenterforDiseaseControlCDCの文書CECREFI007005ブタインフルエンザの検出及び性状決定のためのプロトコル、2009の推奨にしたがって用いた。本実施例の種々のプローブ配列及び標的を用いて実施したアッセイは、本開示のプローブの性能が配列依存性でも装置依存性でも又はポリメラーゼ処方依存性でもないことを示している。アッセイは、使用プラスミド標的の2x106コピーでデュプリケートにて実施された。表10は試験したプローブ配列のリストである。全ての内部消光基は挿入として配置された。増幅図表から得られたプローブ品質判定のための相対的測定もまた表10に示されている。前記には、qPCR装置で測定した基準線蛍光消光効率の測定値として及びqPCR実施の開始から終了の間に観察されるΔRn発生シグナルの規模の測定値としてを含んでいる。報告した数値は相対的蛍光単位であり、更に本実施例は上記実施例4-6で示した図表以外の異なる機械で実施されたことに留意されたい。絶対的数値は機械毎に異なるが、多様なプローブ設計の相対的性能は直接比較が可能である。表10:単一消光及び二重消光インフルエンザSWH1アッセイインフルエンザqPCRアッセイの増幅図表は図6Aに示され、基準線標準化増幅図表は図6Bに示されている。HPRTアッセイについて実施例6に記載した結果と同様に、3’FQ消光物質のみを含むプローブは、内部FQ含有プローブのようには良好に働かなかった。特に、内部消光プローブは顕著に低い基準線バックグラウンド蛍光を示し、二重消光プローブはもっとも低いバックグラウンドを示した。以前のように、二重消光プローブは単一消光プローブより優れた性能を示し、iFQ3’FQの組合せが最良の機能を示した。SWH1プローブは長さが30塩基で、加水分解アッセイの二重消光プローブとしては比較的長いプローブ配列である。前記は、実施例6のHPRTプローブ長さが26塩基であると比較して本実施例の3’消光物質プローブと内部消光物質プローブとの間の相違がより大きいことが原因である。このことは本開示方法のまた別の利点である。長いプローブはAT富裕標的でしばしば要求される3’消光物質設計を用いたとき性能が貧弱であるが、内部消光プローブの性能にプローブの長さは影響しない。上記実施例6で観察された結果と同様に、二重消光物質i10FQ3’FQプローブは試験したセットの中で最良の性能を示し、低い基準線蛍光及び高い陽性シグナル強度の両方を示した。重要なことには、インフルエンザプローブ配列の関係で繰り返せば、二重消光i10BHQ13’BHQ1プローブは、低い基準線蛍光を示しシグナル強度は非常に低くアッセイの性能は貧弱で、他のプローブと比較して遅いCq値を示した。以下の実施例は、多様な発蛍光団を用いたときの本開示の内部消光プローブの有効性を示す。以前の実施例では、全てのプローブが5’フルオレセインレポーター染料6FAMを含んでいた。典型的には、消光物質分子は、限定的サブセットのレポーター染料それらは発蛍光団の蛍光の発光波長が消光物質の吸収波長と良好にオーバーラップするような適合性を示すと併用されて良好な性能を示す。赤色領域での発光を示す染料例えばCy5は、典型的には、より短い波長の発光スペクトルを有する染料例えばフルオレセインとの併用で有用な消光物質以外の消光物質の使用を要求する。本実施例のプローブは広域発光波長を有する種々の発蛍光団を含み表10、二重消光様式の内部消光プローブの使用は広域スペクトル全体で良好に機能することを示す。本実施例の全てのプローブがiFQ消光物質をi10位に挿入として有する。本実施例の二重消光プローブは、3’FQ又は3’IBRQn1RQとも称されると組み合わせてi10FQを用いて作製した。古くから用いられている単一3’消光プローブ様式では、FQ消光物質およそ534nmにピーク吸収を有するは典型的には500-580nm波長域に発光を有するレポーター染料とともに用いられる。RQ消光物質およそ610及び640nmの二様式ピーク吸収を示すは典型的には550-700nm波長域に発光を有するレポーター染料とともに用いられる。表10:蛍光レポーター染料並びにそれらの励起及び発光波長FQ消光物質がi10位に挿入され、更に3’FQ消光物質又は3’RQ消光物質を有する、ヒトHPRT遺伝子に特異的な二重消光プローブシリーズを合成した。プローブ配列は下記の表11に示されている。前記プローブを上記の実施例4に記載したようにqPCRで用い、HPRTプライマー配列番号:97及び98及びHPRTアンプリコンプラスミド標的クローンの2x106コピーを用いた。FAM及びMAXプローブは、アプライドバイオシステムAB7900HT配列検出プラットフォームを用いて機能させた。Cy3プローブは、BIORADiQ5プラットフォームを用いて機能させた。TEX615及びCy5プローブは、ロシュライトサイクラー480プラットフォームを用いて機能させた。実施例6及び7は、二重消光iFQ3’FQ組合せは、iFQ単独よりもFAMレポーター染料プローブについてはわずかに良好な性能を示したが、ただし単一消光iFQもまた良好な性能を示した。フルオレセイン発光520nmレポーター染料プローブ配列番号:109及び118の増幅図表は図7Aに示され、基準線標準化図表は図7Bに示されている。この比較では、RQ消光物質が赤色波長染料にとって最適であるとしても、性能は、i10FQ3’FQとi10FQ3’RQプローブについてはほぼ同一である。しかしながら、i10FQ3’FQプローブがわずかに良好な良好な性能を示した。MAX発光557nmレポーター染料プローブ配列番号:119及び120の増幅図表は図8Aに示され、基準線標準化図表は図8Bに示されている。基準線消光はi10FQ3’FQとi10FQ3’RQプローブでほぼ同一であったが、ピークシグナル強度はi10FQ3’FQプローブで優れていた。両設計が良好に機能したが、i10FQ3’FQ設計が好ましい。Cy3発光564nmレポーター染料プローブ配列番号:121及び122の増幅図表は図9Aに示され、基準線標準化図表は図9Bに示されている。基準線消光はi10FQ3’RQプローブに対してi10FQ3’FQでわずかに低く、ピークシグナル強度はまたi10FQ3’FQプローブでわずかに優れていた。両設計が良好に機能したが、i10FQ3’FQ設計が好ましい。TEX615発光615nmレポーター染料プローブ配列番号:123及び124の増幅図表は図10Aに示され、基準線標準化図表は図10Bに示されている。基準線消光はi10FQ3’FQに対してi10FQ3’RQプローブでわずかに低かったが、ピークシグナル強度はi10FQ3’FQプローブで優れていた。両設計が良好に機能したが、i10FQ3’FQ設計が好ましい。Cy5発光668nmレポーター染料プローブ配列番号:125及び126の増幅図表は図11Aに示され、基準線標準化図表は図11Bに示されている。基準線消光はi10FQ3’FQに対してi10FQ3’RQプローブで低かったが、ピークシグナル強度は両設計で同一であった。両設計が良好に機能したが、i10FQ3’RQ設計がより低い基準線蛍光を示した。プローブの品質を増幅図表から判定するために相対的測定もまた表12に記載されている。表12は、qPCR装置で測定した基準線蛍光消光効率の測定値として及びqPCR実施の開始から終了の間に観察されるΔRn発生シグナルの規模の測定値としてを含んでいる。高い相対的ΔRnを低い基準線蛍光と一組みにすることによって、プローブの性能向上がもたらされる。種々のリアルタイムPCR装置が種々のプローブペアのために用いられたこと上記参照、及び蛍光強度を報告する任意の蛍光単位はプラットフォーム毎に異なることに留意されたい。表12:多様なレポーター染料及び3’FQ又は3’RQのどちらか併せて内部i10FQを有する二重消光プローブ上記の二重消光プローブで3’消光物質とペアにした内部消光物質の使用は、FAMからCy5の範囲のレポーター染料を有するプローブで単一消光化合物FQを使用することを可能にする。したがって、この新規な様式は、古くから用いられてきた3’消光物質のみのプローブ設計様式で用いるとき共同で機能するには不適切な染料と消光物質との併用を可能にする。以下の実施例は、内部iFQ挿入の配置はCy5レポーター染料とともに変動させ得ることを示す。実施例8で調べたプローブはいずれもi10位の挿入物として配置されたFQ消光物質を利用した。本実施例は、i10FQ又はi12FQを有する二重消光Cy5プローブの機能を比較する。プローブ配列は下記の表13に示されている。上記プローブを実施例4に記載したようにqPCRで用いた。HPRTプライマー配列番号:97及び98及びHPRTアンプリコンプラスミド標的クローンの2x102から2x107コピーを用いた。ロシュライトサイクラー480プラットフォームを用いてCy5プローブを機能させた。表13:Cy5レポーター染料を有する二重消光プローブのi10FQとi12FQの比較両プローブの6希釈全ての曲線の重ね合わせトレースを示す基準線調整増幅図表は図12に示されている。ピークシグナル強度は、i12FQ3’FQプローブよりもi10FQ3’FQプローブがわずかに優れていたが、両プローブは、標的標準曲線稀釈セットの定量的検出では同等に良好な性能を示した。各プローブ/標的希釈について測定した厳密なCq値は下記の表14に示されている。表14では、Cq値は2つのプローブ間でほぼ同一であることが認められる。表14:C5レポーター染料を用いるHPRTアッセイにおけるi10FQ3’FQとi12FQ3’FQの感度比較Cq値種々のプローブについてiFQ挿入の配置位置には範囲が存在し得るが、好ましい位置は種々のレポーター染料で変動し得る。より重要なことには、配置にはある程度の融通性があり、その結果i8-i12の範囲内のいずれにiFQ基を配置しても良好に機能するはずである。本実施例は、本開示の消光物質を用いて誘導されるオリゴヌクレオチドの合成に有用なホスホロアミダイトの合成を示す。合成方法は下記模式図1及び2に示されている。モノDMTフェニルジエタノールアミン2:100mLのピリミジン中のフェニルジエタノールアミン10gの溶液を、ジクロロメタン/ピリジン98:2の溶液150mL中のジメトキシトリチルクロリドDMTCl6gの溶液と室温で3-4時間混合した。反応混合物を真空下で乾燥するまで濃縮した。残留物を200mLの酢酸エチルに溶解し、100mLの脱イオン水で2回洗浄し、有機層をNa2SO4上で乾燥させた。前記有機溶液を濃縮し、300gのシリカゲルカラムを用い酢酸エチル/ヘキサン/トリエチルアミン30655で展開してカラムクロマトグラフィーにより精製して、モノDMTフェニルジエタノールアミン525g20収量を得た。TLCRf0551HNMRδ738727738724712676666374374354351333223。模式図1モノDMT4NNジエタノールアニリン:冷却した濃HCl17mLを、0°Cの冷水6mL中の4ニトロ1ナフチルアミン2gの懸濁液に15分かけて滴々と0°Cで加えた。続いて、冷水4mL中のNaNO216gを15分かけて滴々と0°Cで加え、4ニトロ1ナフチルアミンを攪拌しながら溶解させた。H2O3mL中のLiBF4138gを滴々と0°Cで加えた。前記反応混合物を0°Cで30分攪拌した。ろ過し、冷却した水、メタノール及びエーテルで溶液を洗浄した後で、ナフチル1ニトロ4テトラフルオロボレートアゾニウム塩1の茶黄色の粉末308gを得た。50mLのジメチルスルホキシドDMSO中の4gのモノDMTフェニルジエタノールアミン2の溶液を、10-15分かけて10-15°Cで攪拌しながら、50mLのDMSO中の28gのアゾニウム塩1の冷却溶液に10-15°Cの水浴中で加えた。更に15分攪拌した後、前記反応混合物に3mLのトリエチルアミン、続いて100mLの酢酸エチルを添加した。反応混合物を3x30mLの脱イオン水で洗浄し、有機層をNa2SO4上で乾燥させた。溶媒を除去し、生成物を300gのシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーで精製し、18gのモノDMT4NNジエタノールアニリンを提供した。TLCRf0651HNMRδ904868834796781771739727724719678677388375378368347157。模式図2モノDMT4NNジエタノールアニリンホスホロアミダイト4:02mLのNNジイソプロピルアミノシアノエチルホスホロアミドールクロリドを、20mLの無水THF及び1mLのトリエチルアミン中の03gのアルコール3の溶液に0-5°Cで5分間攪拌添加した。更に15分間攪拌した後、反応混合物を室温に温めた。真空下で溶媒を蒸発させ、残留物を50gのシリカゲルEtOAcPETEA:10855-40555でカラムクロマトグラフィーにより精製した。TLCRf0651HNMRδ90586883479678177173972772471967867638537537637034125812011811711531PNMRδ14839。前記ホスホロアミダイト4は、標準的なホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成技術を用いて合成中にオリゴヌクレオチドに添加することができる。以下の実施例は、開示した挿入物の分子信号プローブとしての有用性を示す。インテグレーテッドDNAテクノロジー社IntegratedDNATechnologiesIncによって、全ての分子信号オリゴヌクレオチドが合成及び精製された。200nMの分子信号オリゴヌクレオチドを160mMの2SO4、670mMトリスHClpH83、001のTween20から成る緩衝液中で、1000nMの相補性オリゴヌクレオチドの存在下及び非存在下でインキュベートした。サンプルをCFX884リアルタイム系BioRadHerculesCAにより30°Cでインキュベートし、更に30-95°Cの温度で上昇速度1°C分の温度上昇に付し、蛍光測定は1°C毎に実施した。蛍光曲線による第一の誘導体の解析によって分子信号単独の融解温度StemTm及びプローブ相補物の融解温度LoopTmが得られた。各サンプルをそれぞれ別個に最小限3回測定した。表15は合成及び試験した配列のリストである。RQはIBRQn1である。表15:分子信号の配列表16は各信号のアッセイ結果を列挙する。表16安定性は、FQ消光物質が3’消光物質、特に3’RQ消光物質の近くの内部に配置されるときに改善される。本明細書に引用した全ての参考文献刊行物、特許出願及び特許を含むは、各々の参考文献が参照により本明細書に含まれることを個々に及び具体的に明記したかのように、更にその全体が本明細書に示されたかのように参照により本明細書に含まれる。本開示の文脈において特に特許請求の範囲の文脈において、a及びan及びthe、並びに類似の該当語の使用は、本明細書において特段の指示がなければ又は文脈から明確に否定されないかぎり、単数及び複数の両方をカバーすると解される。comprising、having、including及びcontainingという用語は、特段の規定がなければ無制限の用語すなわち以下を含むが、ただしこれらに限定されないということを意味すると解されるべきである。本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書で特段の指示がなければ、当該範囲内に含まれる各々別個の値を個々に列挙するための便法として供しようと単に意図されたもので、各々別個の値は、前記が個々に本明細書に列挙されたかのように本明細書に含まれる。本明細書に記載した全ての方法は、本明細書で特段の指示がなければ或いは文脈によって明瞭に否定されないかぎり、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供される、全ての及び任意の例又は例示の言葉例えばsuchasの使用は、単に本明細書に開示する種々の発明をより良好に説明することを意図し、特段の規定がなければ本発明のいずれの範囲をも制限しようとするものではない。本明細書のいずれの言葉も、本発明の実施にとって必須として規定されていない任意の成分を指定するものと解されるべきではない。本発明の好ましい種々の実施態様種々の発明を実施するために本発明者らが知る最良の態様を含むが本明細書に記載されている。これら好ましい実施態様の変型は、前述の記載を熟読すれば当業者には明白となるであろう。本発明者らは、適切な場合にはそのような変型を当業者が利用することを予期し、更に本発明者らは、具体的に本明細書に記載した態様とは異なる態様で種々の発明が実施されることを意図している。したがって、本開示は、適用される法律が許容するように、本明細書に添付した特許請求の範囲に列挙した対象の全ての改変物及び等価物を含む。更にまた、上記記載の成分の全ての可能な変型の任意の組合せが、本明細書に特段の指示がなければ或いは明確に文脈から否定されないかぎり本開示に含まれる。