化学式Iで表される化合物を調製する方法であって、但し、-Xは、ビオチン又は-Yは、ビオチン又は-Zは、ビオチン又は-Vは、ビオチン又は-Bは、NH2又はH、-AAは、BがNH2である場合には3官能分子誘導体であり、BがHである場合には2官能分子誘導体であり、-AA1~AA5は、それぞれ、3官能分子誘導体であり、-G0~G5は、それぞれ、少なくとも1つのCH2CH2Oユニットを備えるアームであり、-n0~n5は、それぞれ、1~8の整数であり、-Tは、リガンドと反応することができる抗リガンド、又は抗リガンドに結合するための反応基であり、前記方法は以下のステップ、すなわち、i化学式W’’0G0OHで表されるn0個の化合物但し、W’’0はアミン保護基であり、n0及びG0は、上述の定義に従うものであるを、化学式IIで表される化合物に対してグラフト化して化学式IIIで表される化合物を得る、ステップと、但し、Rは予め官能化した樹脂であり、W及びW0は相互に異なるアミン保護基を表し、WはW’’0と異なり、AAは上述の定義に従うii化学式IVで表される化合物を化学式IIIで表される化合物とカップリングして化学式Vで表される化合物を得る、ステップと、但し、W1及びW’1は、Wとは異なり、相互に同一のアミン保護基、又は相互に異なり、W0及びW’’0とも異なるアミン保護基であり、AA1は上述の定義に従うiii化学式W’’1G1OHで表される2n1個の化合物但し、W’’1は、Wとは異なり、相互に同一のアミン保護基、又は相互に異なり前記方法に用いられる他の保護基とも異なるアミン保護基であり、G1及びn1は上述の定義に従うを前記ステップiiにて得られた化合物に対してグラフト化して、化学式VIで表される化合物を得る、ステップと、iv化学式IのXがビオチンの場合、ステップvに直接進む、あるいは、化学式IのXがビオチンでない場合、化学式VIIで表される2p1個の化合物を用いてステップii及びiiiを繰り返し、化学式W’’pGpOHで表される化合物但し、pは2~5の整数であり、WpW’pW’’pは、Wとは異なり、相互に同一のアミン保護基、又は相互に異なり、前記方法に使用される他の保護基と異なるアミン保護基であり、AApは3官能分子であるを、以下の順序で2pnp倍とする;-Yがビオチンの場合1回であり、この場合、pは2となる-YがビオチンでなくZがビオチンである場合2回であり、この場合、pは2を経て、3となる-Y及びZがビオチンではなくZがビオチンである場合3回であり、この場合、pは23を経て、4となる-YZ及びVがビオチンではない場合、pは234を経て、5となるv上述のようにして得た化合物のW’’1又はW’’p基pは2~5を脱保護して、ビオチンとカップリングするステップと、vi上述のようにしてポリビオチニル化した化合物のW基を脱保護して、抗リガンド又は抗リガンドTに結合する反応基とカップリングするステップと、vii前記樹脂Rから得た化合物を切断して、化学式Iで表される化合物を得るステップと、を含むことを特徴とする、方法。置換基AA1及びAA2、該当する場合、AA3AA4及びAA5は、同一であり、好ましくはリシン誘導体であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。置換基G0G1、該当する場合、G2G3G4及びG5は同一であり、好ましくは化学式NHCH2CH2OCH2CH2OCH2COで表されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。整数n0n1、該当する場合、n2n3n4及びn5は、同一であり、好ましくは2又は3であることを特徴とする、請求項1~3の何れか一項に記載の方法。W基はメトキシトリチルであることを特徴とする、請求項1~4の何れか一項に記載の方法。W1及びW’1は同一であり、該当する場合、W2及びW’2は同一であり、W3及びW’3は同一であり、W4及びW’4は同一であり、並びに、W5及びW’5は同一であることを特徴とする請求項1~5の何れか一項に記載の方法。アミン保護基W1W’1及び、該当する場合、W2W’2W3W’3W4及びW’4W5及びW’5は、フルオレニルメチルオキシカルボニル基であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。置換基AAは、リシン誘導体であり、BはNH2であることを特徴とする、請求項1~7の何れか一項に記載の方法。Xはであり、Yはビオチンであることを特徴とする、請求項1~8の何れか一項に記載の方法。化学式Iで表される化合物であって、但し、-Xはビオチン又は-Yはビオチン又は-Zはビオチン又は-Vはビオチン又は-BはNH2又はH-AAは、BがNH2である場合には3官能分子誘導体であり、BがHである場合に2官能分子誘導体であり、-AA1~AA4は、それぞれ、3官能分子誘導体であり、-G0~G5は、それぞれ、少なくとも1つのCH2CH2Oユニットを備えるアームであり、-n0~n5は、それぞれ、1~8の整数であり、-Tはマレイミド基、カルボン酸基、又は抗リガンドである、ことを特徴とする、化合物。置換基AA1及びAA2、該当する場合、AA3AA4及びAA5は、同一であり、好ましくはリシン誘導体であることを特徴とする、請求項10に記載の、化学式Iで表される化合物。置換基G0G1、該当する場合、G2G3G4及びG5は同一であり、好ましくは化学式NHCH2CH2OCH2CH2OCH2COで表されることを特徴とする、請求項10又は11に記載の、化学式Iで表される化合物。整数n0n1、該当する場合、n2n3n4及びn5は、同一であり、好ましくは2又は3であることを特徴とする、請求項10~12の何れか一項に記載の、化学式Iで表される化合物。Xはであり、Yはビオチンであることを特徴とする、請求項10~13の何れか一項に記載の、化学式Iで表される化合物。AAはリシン誘導体であり、BはNH2であることを特徴とする、請求項10~14の何れか一項に記載の、化学式Iで表される化合物。前記抗リガンドは、Fab’フラグメントであることを特徴とする、請求項10~15の何れか一項に記載の、化学式Iで表される化合物。-Xはであり、-Yはビオチンであり、-AAAA1及びAA2はリシン誘導体であり、-G0G1及びG2は、化学式-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO-を有し-n0n1及びn2は2であり、-BはNH2であり、-Tは抗リガンド、好ましくはFab’フラグメントであることを特徴とする、請求項10に記載の、化学式Iで表される化合物。請求項1~9に記載された方法によって得られる化合物の、診断試験における信号増幅への使用。請求項10~17に記載された化合物の、診断試験における信号増幅への使用。[4つのビオチンを有する化学式Iの化合物の調製]Ado;n0n1n22TマレイミドXYビオチンFmocRINKMBHA樹脂約132μmolを、UV検出器を備える433A自動シンセサイザーAppliedBiosystems社のリアクタ内に配置した。カートリッジあたり1ミリモルの割合で以下のシントンを含有するカートリッジを準備した。-FmocLysOH6408mg-FmocLysOH5907mg-FmocAdoOH3854mg-Nマレオイルβアラニン1691mg-ビオチンMW2443:予め、DMSOに05Mで溶解した溶液カートリッジあたりの溶液は2ml下記の原料を使用した。-NメチルピロリドンNMP-ジクロロメタンDCM-ピペリジン-無水酢酸-メタノール-上記NMP中の2Mジ-イソプロピルエチルアミン、すなわちDIEA溶液-NNジメチルホルムアミドDMFALDRICH社中で、全体で約045MNヒドロキシベンゾトリアゾールSENN社当量のベンゾトリアゾリルテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートHBTUNovabiochem社溶液-上記DCMと同一のDCM中で、1トリフルオロ酢酸TFAACROS社及び25トリイソプロピルシランTISFLUKA社を含有する溶液デフォルト設定で、各シントンについて2つのカートリッジを準備し、コンディショナルダブルカップリングモードで動作するように組み込んだ。シンセサイザーのプログラミングは、一連のサイクルに基づき、サイクルはプログラマブル論理制御装置の一連の主要機能であるモジュールに分割されている。供給元のプログラムをベースに用いて、プログラムを以下の例を準備するために適合させた。以下のモジュールを使用した。-A:アミノ酸パウダーカートリッジを回収する-B:ピペリジンによりFmocN末端基を脱保護する-C:無水酢酸により未反応アミンをキャッピングマスキングする-D:NMPにより樹脂をリンスする-E:アミノ酸溶液を活性化して樹脂に移す-F:攪拌してカップリングさせる-G:第1リシンの側鎖のモノメトキシトリチルを脱保護する-I:リアクタを断続的に30分間攪拌する-a:カートリッジの回収、樹脂のリンス、及び活性化/リアクタへの移動のための条件モジュール-b:ピペリジンによる追加の脱保護のための条件モジュール-c:DCMにより樹脂をリンスする-d:NMPにより樹脂をリンスする他のモジュール-f:攪拌によってロングカップリングする条件モジュール-i:未使用カートリッジを排出する条件モジュール以下の表2に示すサイクルに従って、シンセサイザーをプログラムした。Fmocの脱保護中に、装置はテストを実施した。得られた結果に従って、上記プログラムによってシングル又はダブルカップリングを生成したそれぞれ、備えられたカートリッジのうち1つ又は2つのみを使用。[1.1第1リシンAAのカップリング]樹脂を脱保護し、FmocLysOHを以下のようにしてカップリングしたサイクル1:装置は、条件テストの結果に従って1つ又は2つのFmocLysOHアミノ酸カートリッジのみを使用した。又は:以下によって表すこともできる。[12骨格構築]以下の何れかによる:a疎水性スペーサーアームAdo2のグラフト化b分岐シントン=FmocLysOHのカップリング上述の1に対してi疎水性スペーサーアームAdo2のグラフト化ステップaサイクル2及び3:装置は、各サイクルで条件テストの結果に従って1つ又は2つのFmocAdoOHアミノ酸カートリッジのみを使用したiiFmocLysOHによる分岐サイクル4:装置は、条件テストの結果に従って1つ又は2つのFmocLysOHアミノ酸カートリッジのみを使用した3に対してiiiステップa、bを繰り返して、骨格を完成させる-サイクル5及び6:装置は、条件テストの結果に従って、1つ又は2つのFmocAdoOHアミノ酸カートリッジのみを使用した。-サイクル7:装置は、条件テストの結果に従って、1つ又は2つのFmocLysOHアミノ酸カートリッジのみを使用した。-サイクル8及び9:装置は、条件テストの結果に従って、1つ又は2つのFmocAdoOHアミノ酸カートリッジのみを使用した。[1.34つの分岐の末端へのビオチンのカップリング]サイクル10:装置は、条件テストの結果に従って、1つ又は2つのビオチンカートリッジのみを使用した。[1.4Mmtの脱保護及びマレイミドのグラフト化]サイクル11:この際、プログラムは条件テストによらず、2つのNマレオイルβアラニンのカートリッジを使用する保護基Mmtは、15TFAトリフルオロ酢酸及び15TISトリイソプロピルシランを含むDCMジクロロメタン溶液の反復的な作用により選択的に切断された。よって、ステップ1で挿入されたリシン側鎖のアミンは自由になり、マレイミドの酸性型であるNマレオイルβアラニンとカップリングされた。又は:[1.5クリーベッジ]合成後、樹脂を窒素ブランケットして乾燥させた。シンターを含む20mlプラスチックシリンジに移して、室温で1時間30分にわたり攪拌し、10mlのTFA水溶液と接触させた。そして、クリーベッジ溶液を収集して、シリンジ中のシンターを介したフィルタリングによりガラスフラスコに回収した。樹脂をTFA5mlでリンスし、さらに、約5mlのDCMで3回リンスする。フラスコに樹脂をすべて加えた。未処理のクリーベッジ混合物を、バスを室温としたロータリーエバポレーターで、数十分間低圧で蒸発させた。最終的に、オイリーなオレンジ色の残留物が得られた。この生成物を数ミリリットルの脱イオン水に溶解し、分析及び生成に使用した。アリコット分割量を脱イオン水で再希釈し、HPLC及びHPLCに連結された質量分析計で分析した。直径54mm長さ250mmのVYDACC18逆相クロマトグラフィーカラムを有する、BECKMANアナリティカルHPLCを使用した。この逆相クロマトグラフィーカラムは、溶離剤A01TFAを含む水、及びBアセトニトリルACNと01TFAを含む水の混合物各955を含有した。流速は1ml分とした。試料を注入して、0~80の濃度勾配を30分間実施した。そのような条件の下、約3分後のデッドボリュームピーク後に、テトラビオチン化分子/マレイミドが約15分前後に放出された。LCMS分析HPLC及びTHERMOELECTRON質量ディテクタによって、再計算した分子量が36177gモル理論上は361826であると予想される化合物を同定した。未処理混合物の残余物を、BECKMAN分取HPLCの、直径20mm、長さ250mmのVYDACC18逆相カラム上に注入し、流速を22ml分として精製して、少なくとも3当量体積equivalentvolumeとした。溶離剤A及びBは、アナリティカルHPLCに使用したものと同一であった。一般的な精製プログラム:注入後、5の溶離剤Bで10分間休ませ、5~23の溶離剤Bに1分間通し、さらに、23~31の濃度勾配の溶離剤Bで30分間精製した。このような条件の下、約21分から約30分までに、チューブあたり0.33分の速度でチューブ25本について、所望の産物のバルクの到達後すぐに、精製フラクションを回収した。各チューブの分割量をアナリティカルHPLCで、アイソクラチックモードで分析した26溶離剤Bで10分間無勾配処理isocrateしたこと以外は上述と同条件。最も純粋なフラクションをガラスフラスコに回収して、溶液を凍結乾燥させた。凍結乾燥後に重量を計測し、重量に従って凍結乾燥物lyophilisateを1mgmlで脱イオン水に溶解した。このストック溶液を1~数ミリリットルずつ褐色ガラスボトルに分配した。そして、ボトルを再度凍結乾燥し、700ミリバールアルゴンの不活性雰囲気で閉塞した。分割量を用いて、HPLCBECKMAN社、上述の濃度勾配を使用する第1分析と同一条件、LCMS上述と同一条件、及びAgilent1100システムシリーズの製造元手順に従う蛍光検出を伴うアミノ酸分析により、最終分析を実施した。このようにして、開発された方途により、図1のようなテトラビオチニル化化合物13が得られた。[4つのビオチンを有する化学式Iの化合物の調製]Adon0n1n23TマレイミドXYビオチン本例では、樹脂以外は実施例1と同一の試薬を使用した。本例の樹脂は、HRINKChemMatrix樹脂MATRIXInnovation社の、Fmoc基を有さない遊離アミン型の148個のミクロ粒子をABI433Aシンセサイザーのリアクタに配置した。[2.1第1リシンAAのカップリング]実施例1とは異なり、FmocLysOHを手動でカップリングした。樹脂は既にアミン型であり、脱保護は不要である。FmocLysOHの137個のミクロ粒子をNMP中の溶液に溶解し、HBTUHOBtカップリング剤1当量と共にリアクタに手動で送った。試薬を最終的に体積が6mlとする。そして、同様のDIEA2MNMPの溶液を05mlリアクタに送り、カップリング反応を開始させた。樹脂は若干過剰であった。断続的にボルテックスしながら、実験室温で反応を2時間実施する。そして、以下の表3に示すプログラムに従う全自動モードで合成を再開した。このプログラムの第1サイクル後、実施例1の化合物Iと同一タイプの構造が得られる。[2.2骨格構築]セクション1.2のステップiに記載の手順を繰り返す。ただし、本例では、ステップiを3回反復し、その結果3つのFmocAdoOH2つではないを連続してカップリングして、以下の構造とするステップ22i。ステップ12iiと同様に、FmocLysOHをカップリングして、分岐を生成し、以下を得たステップ22ii。以下に示す2つの分岐を有する分子を得るために、ステップ22i及び22iiを同じように繰り返した。さらに、上述のステップ22i及び22iiを同じように繰り返して、Fmocにより保護された4つの分岐を有する中間分子を生成した。セクション13及び14に記載の手順に従って、マレイミドを有するテトラビオチニル化分子を得た。実施例1と同様の条件下で、担体から分子をクリーベッジし、分析及び精製した。アナリティカルHPLC同一の実験条件により、15分前後で3つのAdoアームを有するテトラビオチニル化分子/マレイミドの流出が確認された。LCMS分析同一の実験条件により、再計算した分子量が4634gモル理論上は463437であると予想される化合物の存在を確認した。精製濃度勾配22~32の溶離剤Bを通過させたこと以外は、実施例1と同一条件の下、30分間で分子を精製した。実施例1と同様に、最も純粋なフラクションを回収して、混合物を凍結乾燥させる。その後、凍結乾燥物の重量を計測し、水可溶性に溶解して、1~数ミリリットルのフラクションに分配し、順に凍結乾燥して、700ミリバールアルゴンの不活性雰囲気で閉塞した。実施例1のように、分割量を用いて同様の最終分析を実施した。[8つのビオチンを有する化学式Iの化合物の調製]Adon0n1n23TマレイミドYZビオチン8つの分岐を有する本構造を得るために、実施例1にて用いた方法に若干の変更を加えて繰り返した。ABI433Aシンセサイザーで使用したプログラムを以下の表4に示す。448マイクロモルの樹脂FmocRINKMBHAを自動充填し、FmocLysOHを80マイクロモルのみ用いて、実施例1の樹脂I上で化合物を得た。樹脂上の過剰のアミンはアセチル化によってマスクした。そして、実施例2のように、構造17を得るステップまで合成を継続した。以降、実施例2のステップ22i及び22iiを同じように繰り返し、Fmoc基で保護される8つの分岐を有する中間分子を得た。そして、実施例1のように、実施例1のセクション13及び14を実施して、マレイミドを有するオクトビオチニル化分子を得た。実施例1のセクション1.5と同様の条件の下、担体から分子をクリーベッジし、分析及び精製した。アナリティカルHPLC同一の実験条件により、16分前後でブロードなピークとして3つのAdoアームを有するオクトビオチニル化分子/マレイミドの流出が確認された。LCMS分析同一の実験条件により、再計算した分子量が9535gモル理論上は953606であると予想される化合物の存在を確認した。精製濃度勾配25~35の溶離剤Bを通過させたこと以外は、実施例1と同一条件の下、30分間で分子を精製した。実施例1と同様に、最も純粋なフラクションを回収して凍結乾燥した。その後、凍結乾燥物の重量を計測し、水可溶性に溶解して、1~数ミリリットルのフラクションに分配し、順に凍結乾燥して、700ミリバールアルゴンの不活性雰囲気で閉塞した。実施例1のように、分割量を用いて同様の最終分析を実施した。得られた3Adoアームを有するオクトビオチニル化分子マレイミドは、以下の分子であった22。[SHタンパク質と化学式Iの化合物とのカップリング][4.1内容]従来、ビオチンのSHタンパク質例えば、Fab’フラグメント、DTTで抑制した抗原、トラウト試薬によって改変したタンパク質へのカップリングは、ビオチンBMCCPierce参照番号21900:1ビオチンアミド44シクロヘキサンカルボキシアミドブテンを、SHタンパク質の遊離スルフヒドリル官能基へ結合させることにより、実施されてきた。しかし、遊離スルフヒドリル官能基は少量では多数のビオチンを結合することができないので、ビオチンSHタンパク質結合体を診断に使用する場合、検出信号は弱く、結合体1つ当たりビオチンが1つ存在することを表す。したがって、信号を強調することが重要である。本発明による化合物に対して、2~32個のビオチンが結合しており、出願人は、すべての期待に反して、多数のビオチンが結合していることに起因する立体障害にもかかわらず、SHタンパク質を遊離スルフヒドリルラジカルにカップリングした後に、存在するビオチンの数に比例する信号を維持することを証明した。カップリング手順を以下のセクションで説明する。[4.2試薬]使用した市販の試薬を表5に挙げる。さらに、ビオメリュー社フランスから取得した使用したSHタンパク質は、以下の通りである。-Fab’フラグメント:抗ListeriamonocytogenesFab’フラグメント、サルモネラ壁の抗抗原、HIVクローンA及びクローンBの抗p24、及び抗ヒトカリクレイン2-HIVのgp160、HBVのHBsAd、HBVのHBsAy-抗体:サルモネラ壁抗抗原抗体サルモネラのFab’フラグメントの間接ELISAアッセイに使用される抗原を、Salmonellabergedorf株、Salmonellatyphimurium株、及びSalmonellaenteritidis株をペプトン培地で37°Cで24時間培養し、100°Cで15分間加熱して得た。最終的に、実施例1に従って調整された化学式Iの化合物を使用した。[4.3Fab’上でのビオチンBMCC及び実施例1の化合物に対するカップリング]以下のようなカップリングにより結合体を得た。-ペプシン処理によりFab’フラグメントを得て、2bMEで抑制し、Superdex200pgでの精製後に、バッファーPO450mMNaCl150mMEDTA5mM、pH68中で2mgmlに調節した-DMSO中85mMでビオチンBMCC溶液を新たに調製した-脱イオン水25mgmlを含む実施例1の組成物の混合物を新たに調製した-Fabを1モル46000ダルトンあたり、ビオチンBMCC又は実施例1の化合物を5モルの割合で、Fabにカップリングした-実験室温で、褐色ガラスボトル中でロータリー攪拌しながら2時間培養した-ビオチンBMCC又は実施例1の化合物に対してモル当量のヨードアセトアミドを添加してブロックした-新たに調製したPBSバッファー中10mMヨードアセトアミド溶液を使用した-実験室温で、ロータリー攪拌しながら1時間培養した-PBSバッファーアジドに対して透析した-透析をやめ、280nmでODを測定して結合体の濃度を測定した[4.4トラウト試薬で改変した抗体に対する実施例1の化合物のカップリング]結合体は、以下のようなカップリングにより得た。-抗体1モルあたり20モルのトラウト試薬を添加して抗体を改変し、バッファーPO450mMNaCl150mMEDTA5mM、pH68中で透析した-脱イオン水中、25mgmlで実施例1の化合物361826gモルの溶液を新たに調製した-抗体1モル160000ダルトンあたり、実施例1の化合物を20モルの割合で改変抗体をカップリングした-実験室温で、褐色ガラスボトル中でロータリー攪拌しながら2時間培養した-実施例1の化合物に対してモル当量のヨードアセトアミドを添加してブロックした-新たに調製したPBSヨードアセトアミド溶液を使用した-実験室温で、ロータリー攪拌しながら1時間培養した-PBSバッファーアジドに対して透析した-透析をやめ、280nmでODを測定して結合体の濃度を測定した[4.5トラウト試薬で改変した抗体に対する実施例1の化合物のカップリング]以下のようにして結合体を得た。-トラウト試薬4モルを抗原1モルに加えて抗原を改変し、バッファーPO450mMNaCl150mMEDTA5mM、pH68中で透析した-脱イオン水中、1mgmlで実施例1の化合物361826gモルの溶液を新たに調製した-抗原1モルMW25000ダルトンあたり、実施例1の化合物を1モルの割合で改変抗原に対してカップリングした-実験室温で、褐色ガラスボトル中でロータリー攪拌しながら2時間培養した-実施例1の化合物に対してモル当量のヨードアセトアミドを添加してブロックした-新たに調製したPBSヨードアセトアミド溶液を使用した-実験室温で、ロータリー攪拌しながら1時間培養した-PBSバッファーアジドSDSドデシル硫酸ナトリウムに対して透析した-透析をやめ、280nmでODを測定して結合体の濃度を測定した[4.6抗原又は抗体に対するビオチンNHsのカップリング]以下のようなカップリングにより結合体を得た。-pH83の01MNaHCO3バッファー中で抗体又は抗原を透析した-抗体をカップリングするための、ビオチンNHs溶液DMSO中1136gl、及び抗原をカップリングするためのビオチンNHs溶液DMSO中20glを新たに調製した-抗体1モル160000ダルトンあたり、ビオチンNHsを20モルの割合で抗原に対してカップリングし、抗原1モル25000ダルトンあたり、ビオチンNHsを1モルの割合で抗原に対してカップリングした-実験室温で、褐色ガラスボトル中でロータリー攪拌しながら1時間培養した-ビオチンNHsに対してモル当量の1Mリシンを添加してブロックした-実験室温で、ロータリー攪拌しながら1時間培養した-抗体は、PBSバッファーアジドで透析し、抗原は、PBSバッファーアジドSDSで透析した-透析をやめ、280nmでODを測定して結合体の濃度を測定した[4.7DTTで抑制した抗体に対する実施例1の化合物及びビオチンBMCCのカップリング]以下のようなカップリングにより結合体を得た。-抗原1モルあたり800モルのDTTで抗原を抑制し、実験室音で30分間攪拌した-抑制した抗原をPBSbufferEDTApH75中で、SephadexG25ゲルにより脱塩した-DMSO中435mM232glでビオチンBMCC53369gモル溶液を新たに調製した-脱イオン水中、25mgmlで実施例1の化合物361826gモルの溶液を新たに調製した-抗原1モル160000ダルトンあたり、ビオチンBMCC又は実施例1の化合物を20モルの割合で抑制抗原に対してカップリングした-実験室温で、褐色ガラスボトル中で攪拌又はボルテックスしながら2時間培養した-抗原1モルあたり20モルのNEMを添加してブロックした-PBSバッファー中、10mMNEMの溶液を新たに調製して使用した-結合体をPBSMIT中で透析した-透析を終了した[直接及び間接ELISA検出試験の応用][5.1直接ELISA試験]本発明によるテトラビオチニル化化合物又は単一のビオチンを含む結合体の活性を、結合体をマイクロプレートに固定してペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンによって信号を生じさせて、ELISA試験で比較した。本発明の一実施形態では、ELISA試験によって、ポリビオチニル化化合物のカップリングレベルをモノビオチニル化化合物と比較した。[手順]抗体フラグメント及び全抗体を堆積させるためのMaxisorpウェルストリップ、又は抗原を堆積させるためのPolysorpウェルストリップを使用した。モノビオチニル化又はテトラビオチニル化結合体を、pH96の50mMCO3バッファーに005μgml~05μgmlの範囲で希釈して、倍数希釈した。各希釈液を100μlウェルで堆積した。実験室温度で一晩培養した。PBStweenで3回洗浄した。100μlウェルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ堆積物を、PBSで16000°に希釈した。オーブンで37°Cで15分間培養した。PBStweenで3回洗浄した。100μlウェルのOPDを堆積した。実験室温度で30分間暗黒で培養した。100μlウェルの18NH2SO4でブロックした。492nmでODを読み取った。[5.2抗サルモネラFab’結合体/テトラビオチニル化又はモノビオチニル化化合物を用いた間接ELISA試験]この目的のために、サルモネラの3つの株の培養物に由来する抗原をPolysorpマイクロプレートにまいた。そして、以下のステップを実施した。-PBS中1glBSAで、37°Cのオーブンで1時間パッシベーションした-PBStweenで3回洗浄した-PBSで2倍希釈した結合体を37°Cで30分間培養し、PBStweenで3回洗浄したストレプトアビジンを堆積させるステップから、直接ELISA試験と同様の手順に従った。間接ELISA法により、結合体と、抗原又は抗体との間のカップリングレベル及び生物学的反応を試験した。[5.3結果]以下のように、結果を図2~8に示す。-図2は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、ビオチンBMCCによりモノビオチニル化した抗リステリアモノサイトゲネスLMOFab’結合体、又は本発明の実施形態に従う化合物によりテトラビオチニル化した抗LMOFab’結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。-図3は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、ビオチンBMCCによりモノビオチニル化した抗サルモネラFab’結合体、又は本発明の実施形態に従う化合物によりテトラビオチニル化した抗サルモネラFab’結合体についての直接ELISA試験と、これらの結合体についての間接ELISA試験のサルモネラ抗原によるOD測定結果を示すグラフである。-図4は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、ビオチンBMCCによりモノビオチニル化した抗HIVFab’結合体、又は本発明の実施形態に従う化合物によりテトラビオチニル化した抗HIVFab’結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。-図5は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、ビオチンBMCCによりモノビオチニル化した抗カリクレインFab’結合体、又は本発明の実施形態に従う化合物によりテトラビオチニル化した抗カリクレインFab’結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。-図6は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、ビオチンBMCCによりモノビオチニル化した、DTTで抑制したgp160抗原結合体、又は本発明の実施形態に従う化合物によりテトラビオチニル化した、DTTで抑制したgp160抗原結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。-図7は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、ビオチンNHsによりモノビオチニル化したB型肝炎表面抗原結合体、又は本発明の実施形態に従う化合物によりテトラビオチニル化したB型肝炎表面抗原結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。-図8は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、ビオチンNHsによりモノビオチニル化した抗サルモネラ抗体結合体、又は本発明の実施形態に従う化合物によりテトラビオチニル化した抗サルモネラ抗体結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。測定結果により、本発明によるポリビオチニル化分子を使用した場合に、障害があるにもかかわらず、信号が有意に改善されたことが明らかとなった。具体的には、ODが18の場合、以下の表6に示すようなゲインが観察された。[リステリア株を用いた診断試験への応用]本試験の目的は、一実施形態によるテトラビオチニル化結合体とモノビオチニル化結合体のVidas信号を比較して、特異性を損なうことなく応答感受性を増強することである。[6.1材料及び方法][使用した試薬]リステリアモノサイトゲネスbioMerieux社、フランスのFab’抗体フラグメントを用いてテトラビオチニニル化結合体及びモノビオチニル化結合体を調製し、ビオチンBMCC及び実施例1と同様の化合物を調製し、上述のセクション4.3で記載した手順に従った。他の試薬は以下の通りであった。-LMO2コーン及びウェルストリップbioMerieux社、参照番号30704-PALストレプトアビジンBioSPA社、参照番号04566074-モノビオチニル化ストック溶液:Fab’濃度032mgml-テトラビオチニル化ストック溶液:Fab’濃度026mgml-LMO2結合体希釈物bioMerieux社、参照番号50026004-PALストレプトアビジン希釈物bioMerieux社、参照番号50025992-Vidas装置bioMerieux社1台[試験した株]-リステリアモノサイトゲネス4bATCC19115-リステリアモノサイトゲネス3aATCC51782-リステリアモノサイトゲネス12c8309024-リステリアモノサイトゲネス4c8309031-リステリアイノキュア6a8309035-リステリアイバノビ9101014-リステリアウェルシメリ9409074[方法]全株をブロスLXRef42120中で、37°C±1°Cで24時間培養し、95100°Cで5分間加熱した。純粋なリステリアイノキュア、リステリアイバノビ、及びリステリアウェルシメリ株を使用した。これらの株は、結合済みの抗体によって認識されないので、特異性を試験するために役立った。リステリアモノサイトゲネスの4種の株を希釈物中で試験し、計数した。これらの株は被試験物の感受性を試験するために役立つ。2種類の結合体を、Fab’濃度036μgmlに調節した。LMO2ウェルストリップのキットを使用するために、開始結合体をウェルX5から回収した。そのウェルを、生理水600μlでリンスした。そして、生理水を除去した後、試験対象のモノビオチニル化結合体又はテトラビオチニル化結合体を400μl加えた。試料株の希釈物500μlをウェルX0に堆積させて、LMO2Vidas試験を開始した。この試験は約80分間にわたった。[結果]結果を以下の表7に示す。相対蛍光値上記表に示す結果は、本発明の一実施形態によるテトラビオチニル化化合物を有する結合体を使用することで、信号が2倍となって、試験の感度を向上させるのに役立つことを示している。同時に、この場合、信号は同一であったため、本発明の一実施形態によるテトラビオチニル化化合物を有する結合体を使用しても、特異性が変化することは無い。