"配列番号2のアミノ酸配列と[BLASTアルゴリズムで決定した時に]少なくとも75のアミノ酸同一性を表すクリソスポリウムChrysosporiumのグリコシルヒドロラーゼファミリー7に対応するタンパク質、または配列番号2のアミノ酸配列1-246または396-526の対応する部分に同一である少なくとも20個の連続するアミノ酸を有するそれらの部分。配列番号4のアミノ酸配列と[BLASTアルゴリズムで決定した時に]少なくとも70のアミノ酸同一性を表すクリソスポリウムChrysosporiumのグリコシルヒドロラーゼファミリー10に対応するタンパク質、または配列番号4のアミノ酸配列1-133または252-383の対応する部分に同一である少なくとも20個の連続するアミノ酸を有するそれらの部分。配列番号4のアミノ酸配列と[BLASTアルゴリズムで決定した時に]少なくとも65のアミノ酸同一性を表すクリソスポリウムChrysosporiumのグリコシルヒドロラーゼファミリー10に対応するタンパク質、または配列番号4のアミノ酸配列1-383の対応する部分に同一である少なくとも20個の連続するアミノ酸を有するそれらの部分。グリコシルヒドロラーゼファミリー10に対応し、そして配列番号4のアミノ酸配列22-53と少なくとも55のアミノ酸同一性を有し、かつ/またはアミノ酸配列22-53から少なくとも20個の連続するアミノ酸を有し、かつ/または相対位置44にアミノ酸F、WおよびYの1つを有するセルロース-結合ドメインを含んで成るタンパク質。配列番号6の部分的アミノ酸配列と[BLASTアルゴリズムで決定した時に]少なくとも86のアミノ酸同一性を表すクリソスポリウムChrysosporiumのグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼに対応するタンパク質、または配列番号6のアミノ酸配列1-277の対応する部分に同一である少なくとも20個の連続するアミノ酸を有するそれらの部分。請求項1に記載の酵素の使用を含んで成る、βグルコシド結合の加水分解法。請求項2、3または4に記載の酵素の使用を含んで成る、βキシロシド結合の加水分解法。請求項1ないし5のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸配列。配列番号1、3および5の任意の1つの核酸配列の5非コード領域に含まれる少なくとも70のヌクレオチドを含んで成る核酸配列。目的のポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結された配列番号1、3および5の任意の1つの核酸配列の5非コード領域に含まれる、クリソスポリウムChrysosporiumに由来する核酸発現-調節領域を含んで成る核酸構築物。請求項8ないし10のいずれか1項に記載の核酸配列を含み、そしてコード核酸配列によりコードされるポリペプチドを発現することができる、組換え微生物株、好ましくは真菌株。請求項10に記載の構築物または請求項11に記載の微生物株を使用するポリペプチドの生産法。配列番号1、3および5のいずれか1つの核酸配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチド、またはその相補体を含んで成るオリゴヌクレオチドプローブ。プローブが20~50ヌクレオチド長である、請求項13に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。プローブが検出可能な標識により標識されている、請求項13または14に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。クリソスポリウム属Chrysosporium、トリコデルマ属TricodermaおよびトリポクラジウムゲオデスTolypocladiumgeodesを比較した形質転換の例2種の形質転換されないクリソスポリウム属ChrysosporiumのC1株、および1種のトリコデルマレエセイTrichodermareeseiの参照株を、2種の培地GspH6.8およびプリダムPridhamアガー、PA、pH6.8上で試験した。抗生物質耐性レベルを試験するために、胞子を7日齢のPDAプレートから収集した。選択プレートを32°Cでインキュベートし、そして2、4および5日後に記録したscore。C-1株NG7C-19およびUV18-25は、フレオマイシンおよびヒグロマイシン双方に対する低い基礎の耐性レベルを明白に有したということになった。このレベルは、参照のT.レエセイT.reeseiの普遍的に使用される実験室株のものに匹敵する。従って、これら2種の標準的な真菌の選択可能なマーカーを、クリソスポリウム属Chrysosporiumの株で十分に使用することができる明白な表示が存在する。他の標準的な真菌の選択可能なマーカーでの問題は期待されないはずである。Sh-bleフレオマイシン耐性の形質転換されたクリソスポリウム属Chrysosporiumの株の選択を、50μg/mlで成功裏に実施した。これはまたT.レエセイT.reeseiに使用された選択レベルでもあり、かように、示差的選択がクリソスポリウム属Chrysosporiumにおいて容易に達成することができることを示した。同一の批評が、150μg/mlのレベルでヒグロマイシン耐性をもつ形質転換された株について妥当である。プロトプラスト形質転換技術を、最も一般に適用される真菌形質転換技術に基づいて、クリソスポリウム属Chrysosporiumで使用した。1枚の90mmPDAプレートからの全部の胞子を8mlのIC1中に回収し、そして35°Cかつ200rpmで15時間のインキュベーションのため、50mlのIC1培地の振とうフラスコに移した。これの後、培養物を遠心分離し、ペレットをMnPで洗浄し、10mlのMnPおよび10mg/mlのケイラーゼCaylaseC3中の溶液に戻し、そして攪拌150rpmを伴い35°Cで30分間インキュベートした。該溶液を濾過し、そして濾液を3500rpmで10分間の遠心分離にかけた。ペレットを10mlのMnPCa2で洗浄した。これを25°Cで10分間遠心分離した。その後、50マイクロリットルの冷MPCを添加した。混合物を氷上で30分間保ち、その後2.5mlのPMCを添加した。室温で15分後に、500マイクロリットルの処理されたプロトプラストを3mlのMnRSoftに混合し、そして直ちに、選択剤としてフレオマイシンもしくはヒグロマイシンを含有するMnRプレート上でプレート培養した。30°Cで5日間のインキュベーション後に、形質転換を分析したクローンは48時間後に見えるようになる。形質転換効率を、10マイクログラムの参照プラスミドpAN8-119を使用して決定した。結果を以下の表1に提示する。クリソスポリウム属Chrysosporiumの形質転換体の生存率はトリコデルマ属Trichodermaのものより優れている。これらの株の形質転換可能性は比較可能であり、そして、従って、1回の実験で得られた形質転換体の数は、T.レエセイT.reeseiについてよりクリソスポリウム属Chrysosporiumについて4倍より高く存する。従って、クリソスポリウム属Chrysosporiumの形質転換系は、普遍的に使用されるT.レエセイT.reesei系に同等であるのみならず、しかしそれを凌ぎさえする。この改善は、pAN8-1より少なく形質転換が効率的であるベクターにとりわけ有用と判明する可能性がある。こうしたより少なく効率的な形質転換ベクターの例は、一般に10倍より少ない形質転換体を生じさせる非真菌タンパク質の産生のためのタンパク質キャリアベクターである。多数の他の形質転換および発現ベクターを、同種のクリソスポリウム属Chrysosporiumのタンパク質をコードする配列、およびまたクリソスポリウム属Chrysosporiumを用いる形質転換実験での使用のために異種タンパク質をコードする配列を用いて構築した。発現系の例は、キシラナーゼの読取り枠と同じ読み枠でキシラナーゼシグナル配列に連結されたクリソスポリウム属ChrysosporiumのキシラナーゼXyl1プロモーターフラグメント、次いでキシラナーゼターミネーター配列を包含する。形質転換体の選択は、選択可能なベクターを用いる共形質転換を使用することにより実施する。別の例は、ペニシリウム属Penicilliumのエンドグルカナーゼ3の読取り枠と同じ読み枠のペニシリウム属Penicilliumのエンドグルカナーゼ3のシグナル配列に連結されたクリソスポリウムルクノウェンセChrysosporiumlucknowenseのセロビオヒドロラーゼプロモーター、次いでクリソスポリウム属Chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼターミネーター配列である。加えて、このベクターは、選択マーカー、すなわちアセトアミダーゼS遺伝子AmdS遺伝子を含む第二の発現カセットを担持する。さらなる一例は、黒色アスペルギルスAspergillusnigerのグルコアミラーゼのシグナル配列に連結されたクリソスポリウム属Chrysosporiumのグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素1のプロモーター、およびヒトインターロイキン6の読取り枠に融合されたグルコアミラーゼの読取り枠を含んで成る。加えて、このベクターは、選択マーカー、すなわちAmdS遺伝子を含む第二の発現カセットを担持する。なおさらなる一例は、エンドグルカナーゼ5の読取り枠に連結されたアスペルギルスニズランスAspergillusnidulansのグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素Aのプロモーター、次いでアスペルギルスニズランスAspergillusnidulansのターミネーター配列である。クリソスポリウム属Chrysosporiumの形質転換体の異種および同種発現の例C1株NG7C-19および/もしくはUV18-25を、多様な異種タンパク質、すなわち、細菌タンパク質ストレプトアロテイクスヒンズスタヌスStreptoalloteichushindustanusのフレオマイシン耐性タンパク質、Shble、真菌タンパク質トリコデルマレエセイTrichodermareeseiのキシラナーゼII、XYN2およびヒトタンパク質ヒトリゾチーム、HLZを分泌するそれらの能力について試験した。トリコデルマレエセイTrichodermareeseiのキシラナーゼIIXYN2のC1分泌。C1株UV18-25をプラスミドpUT1064およびpUT1065により形質転換した。pUT1064は2種の以下の真菌発現カセットを与える。すなわち、第一のカセットはフレオマイシン耐性の形質転換体の選択を可能にする:ニューロスポラクラサNeurosporacrassaの交差経路制御遺伝子1cpc-1プロモーター14ストレプトアロテイクスヒンズスタヌスStreptoalloteichushindustanusのフレオマイシン耐性遺伝子Shble4アスペルギルスニズランスAspergillusnidulansのトリプトファン合成酵素trpCターミネーター5第二のカセットはキシラナーゼ産生カセットである:T.レエセイT.reeseiのTR2株のcbh1プロモーター15T.レエセイT.reeseiのTR2株のxyn2遺伝子そのシグナル配列を包含する16T.レエセイT.reeseiのTR2株のcbh1ターミネーター15該ベクターはまた、プラスミドpUC19からの大腸菌E.coliの複製起点も担持する6。該プラスミドの詳述された地図を図1に提供する。pUT1065は以下の真菌発現カセットを与える:A.ニズランスA.niculansのグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素gpdAプロモーター2合成のT.レエセイT.reeseiのセロビオヒドロラーゼIcbh1シグナル配列13キャリアタンパク質10として使用されるS.ヒンズスタヌスS.hindustanusのフレオマイシン耐性遺伝子Shble4KEX-2様プロテアーゼ切断部位を特徴とするリンカーペプチドSGERK1T.レエセイT.reeseiのTR2株のxyn2遺伝子シグナル配列を含まない16A.ニズランスA.nidulansトリプトファン合成酵素trpCターミネーター5該ベクターはまた、β-ラクタマーゼ遺伝子bla、およびプラスミドpUC18からの大腸菌E.coliの複製起点も担持する6。該プラスミドの詳述された地図を図2に提供する。C1プロトプラストを、上の例で既に記述されたと同一の手順に従って、プラスミドpUT1064もしくはpUT1065で形質転換した。プラスミドpUT1065中の融合タンパク質Shble::XYN2はフレオマイシン耐性に関して機能的であり、従ってC1形質転換体の容易な選択を可能にする。さらに、フレオマイシン耐性のレベルはxyn2発現のレベルとおおまかに相関する。pUT1064において、xyn2をそれ自身のシグナル配列とともにクローン化した。C1形質転換体フレオマイシン耐性クローンのキシラナーゼ産生を、以下のようなキシラナーゼ活性アッセイにより分析した。すなわち、一次形質転換体を、GSフレオマイシン5μg/mlプレート耐性確認に、およびまたXYLANプレート浄化領域の可視化によるキシラナーゼ活性検出17上に、つまようじで移した。プレートを32°Cで5日間成長させた。それぞれの妥当性が確認されたクローンをXYLANプレートにサブクローニングした。形質転換体あたり2個のサブクローンを使用して、液体培養の開始のための胞子を得るためにPDAプレートに接種した。IC15g/lフタル酸カリウム中の液体培養物を27°C180rpmで振とうするで5日間成長させた。その後、培養物を遠心分離5000g、10分した。これらのサンプルから、キシラナーゼ活性を、Millerら18によるDNS技術により測定した。これらのデータは:1実施例2からの点1ないし4が確認される。2C1は異種真菌タンパク質の分泌のための宿主として使用することができる。ことを示す。実施例に対する付録:培地50μg/mlのフレオマイシンもしくは100~150μg/mlのヒグロマイシンを補充された再生培地MnRを使用して、形質転換体を選択する。5μg/mlのフレオマイシンを補充されたGS培地を使用して抗生物質耐性を確認する。PDAは迅速な成長および良好な胞子形成のための完全な培地である。液体培地に、1/20の胞子懸濁液5mlの0.1トゥイーンTween中の1枚の90mmのPDAプレートからの全胞子を接種する。こうした培養物を、振とうフラスコ200rpm中27°Cで成長させる。C1遺伝子の単離および特徴づけ、ならびにCBH1、XYL1およびGPDの遺伝子発現配列UV18-25のBlueSTAR遺伝子ライブラリーの構築UV18-25の染色体DNAをSau3Aで部分的に消化し、12~15kbのフラグメントを単離し、そしてクローニングベクターBlueSTARのBamHI部位に連結した。ライゲーション混合物の20のパッケージングは、4.6×104個の独立したクローンの遺伝子ライブラリーをもたらした。このライブラリーを増やしそして4°Cおよび-80°Cで保存した。ライゲーション混合物の残部もまた4°Cで保存した。cbh1、xyl1およびgpd1の遺伝子の単離のためのUV18-25の遺伝子ライブラリーのスクリーニング多様な遺伝子の単離のため、プローブあたり全体で±7.5×104個の別個のBlueSTARファージを二重でinduploハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、同種条件65°C;0.2×SSCでcbh1およびxyl1のPCRフラグメント国際特許出願第WO00/20555号明細書に記述されるところのを用いて、ならびに異種条件53°C;0.5×SSCで黒色アスペルギルスA.nigerのgpd1遺伝子を用いて実施した。陽性のシグナルの数を表3に示す。陽性クローンを再スクリーニングし、そして各クローンについて、2個の個別のファージをさらなる実験に使用した。異なるクローンのDNAを制限分析により分析して、各遺伝子から単離される異なるクローンの数を決定した結果を表3に示す。3種の遺伝子のそれぞれについて4~6個の異なるクローンが単離されたため、われわれは、一次遺伝子ライブラリー±4~5×104個のクローンがUV18-25のおよそ5×ゲノムを表すことを結論する。この結果から、われわれは、UV18-25の完全なゲノムが9×103個のクローン中に表されることを結論する。13kbという平均のゲノム挿入物に基づけば、これは±120Mbのゲノムの大きさを示すとみられ、それはアスペルギルス属Aspergillusのゲノムの大きさの3倍である。プラスミド上に存在する遺伝子に特異的なプライマー単離されたPCRフラグメントからの以前に配列決定に基づく、ならびにpBlueSTARのポリリンカー中に存在するT7およびT3プライマーを用いるPCR反応、われわれは多数のクローン中での該遺伝子の位置を決定することが可能であった。各遺伝子から、プラスミドを該遺伝子の配列決定のために使用した。表3:cbh1遺伝子およびxyl1遺伝子についてのUV18-25のPCRフラグメント同種条件、ならびに黒色アスペルギルスA.nigerのgpdA遺伝子異種条件を用いる、UV18-25の遺伝子ライブラリーの7.5×104個のファージのスクリーニング。DNAの単離および制限分析を使用して、異なるクローンの数を決定した。クローン化された遺伝子の配列分析cbh1、xyl1およびgpd1遺伝子について、配列決定の結果をそれぞれ配列番号1、3および5に表す。また、該タンパク質の推定されるアミノ酸配列をこれらの配列番号2、4および6に表す。該タンパク質のいくつかの特性を表4に示す。翻訳の開始およびイントロンの位置は、同一のファミリーからの遺伝子との相同性に基づくすなわち論文遺伝学papergeneticsことが言及されるべきである。CBH1CBH1のアミノ酸配列から、われわれは、該タンパク質が大きさが約63kDであること、および該タンパク質のC末端部分にセルロース結合ドメインCBDが存在することを結論した。興味深いことに、単離された55kDの主要タンパク質中にCBDの存在の証拠は見出されなかった。しかしながら、コードされるCBH1タンパク質配列番号1、2中での、この55kDの主要タンパク質からの単離されたペプチドの存在は、該55kDのタンパク質がクローン化された遺伝子によりコードされることを確認する。これらの結果の可能な説明は、該55kDのタンパク質がCBDを欠くCBH1タンパク質の短縮されたバージョンであることである。セロビオヒドロラーゼCBH1は、MUF-セロビオシド、MUFラクトシド、FPおよびアビセルに対する、また、p-ニトロフェニルβ-グルコシド、セロビオースおよびp-ニトロフェニルラクトシドに対する活性を有する。MUFセロビオシドに対するその活性は、0.4mMの阻害定数を伴い、セロビオースにより阻害される。MUFセロビオシドに対するミカエリス定数は0.14mMであり、MUFラクトシドに対しては4mMであり、そしてCMCに対して3.6g/lであった。pHの至適は4.5から7までである。CMCに対して最大活性の50、およびRBB-CMCに対して80の活性がpH8で保たれる。pH5~8以内の70~80の活性が25時間のインキュベーションの間保たれる。温度の至適は60~70°Cである。CBH1は、セロビオヒドロラーゼファミリー7の1メンバーである。本発明の好ましい一態様である対応するCBHプロモーターを配列番号1に示す。Xyl1Xyl1のアミノ酸配列から、われわれは、またここにCBDが、このタンパク質中でN末端側にすなわち、シグナル配列にもしくはそれから5アミノ酸未満の距離に直接結合されて存在することを結論した。文献では、CBDをもつもう少しのキシラナーゼのみが既知であるフサリウムオキシスポルムFusariumoxysporum、フミコラグリセアHumicolagriseaおよびネオカリマスティクスパトリシアルムNeocallimastixpatriciarum。Xyl1タンパク質の推定される大きさは43kDであり、そして30kDのキシラナーゼから単離されるいくつかのペプチドはこのタンパク質から発する配列番号3、4。いくつかの単離されたペプチドはコードされる配列中で見出すことができなかった。これは、代替のキシラナーゼタンパク質がUV18-25中に存在することを示す可能性がある。以前の分析で、この30kDのタンパク質中でのCBDの存在の証拠は見出されなかった。また、これらの結果から、われわれは、該タンパク質のCBDがタンパク質分解により切断されることを仮定した。この仮説は今後分析されるであろう活性、異なるC1株、すなわちC1野性型、NG7C、UV13-6、UV18-25、およびUV18-25のプロテアーゼ突然変異体中の異なるタンパク質のN末端配列および大きさの決定により。また、酵素活性に対するCBDの存在もしくは非存在の影響を、より詳細に分析する。多様なC1宿主中での完全長の遺伝子の過剰発現を考慮してもよい。セルロース結合ドメインCBDの存在は、この酵素の特定の一特徴である。N末端のCBDを有する唯一の他の既知のファミリー10の解糖酵素キシラナーゼは、フサリウムオキシスポルムFusariumoxysporumXylFである。クリソスポリウムルクノウェンセChrysosporiumlucknowenseのXyl1タンパク質のCBDは、配列:WGQCGGQGWTGPTTCVSGAVCQFVNDWYSQCV配列番号4のアミノ酸22-53を有する。この配列は、米国特許第5,763,254号明細書ノボNovoに記述されるCBDのコンセンサス配列に従わない。米国特許第5,763,254号明細書のこのコンセンサス配列は:W/Y-G/A-Q-C-GG-Q/I/N-G/N-W/F/Y-S/T/N/QG-P/A/C-T/R/K-T/C/N-CX-X-G/P-S/T/F/L/A/--T/KC-V/T/R/E/K-K/Q/A-Q/I-NQ/D/A-W/F/Y-Y-Y/S/H/A-QC-L/I/Q/V/Tであり、ここでW/YはWもしくはYなどのいずれかを意味し、Xはいかなるアミノ酸も意味し、そして-は非存在を意味する。最も縮重のコンセンサス配列を伴う4つの差異がXyl1中に存在し、それは上の配列7中で下線をつけられる。本発明は、従って、このコンセンサスCBDと異なるN末端CBDを有しかつフサリウムオキシスポルムFusariumoxysporumキシラナーゼ以外のキシラナーゼに関する。より具体的には、本発明のキシラナーゼは、上の配列7と最低55、とりわけ最低65、好ましくは最低75の配列の同一性を有するCBDを有する。好ましくは、CBDは、位置23のアミノ酸Phe、TyrおよびTrpの1種、もしくは4種のアミノ酸、位置20のVal、位置22のGln、位置23のPheおよび位置24のValの最低1種を含有する。好ましい配列は、Cys-Xaa-Phe、Xaa-Phe-Val、Cys-Xaa-Phe-Val、Cys-Gln-Phe、Val-Cys-Xaa-Phe、Gln-Phe-Val、Gln-Trp-Val、Gln-Tyr-Val、Val-Cys-Gln、Val-Cys-Gln-Phe、およびVal-Cys-Xaa-Phe-Valを含んで成り、ここでXaaはいずれかのアミノ酸、または好ましくはVal、Thr、Arg、Glu、GlnもしくはLys、または最も好ましくはGlnもしくはGluである。該キシラナーゼはMUFセロビアーゼ活性を所有せず、そして従って真のキシラナーゼである。それは5から8の広範なpH範囲内で高い活性を所有し、pH9~10で最大活性の65を維持し;それはキシラナーゼFファミリーの1メンバーである。本発明の好ましい一態様である対応するキシラナーゼプロモーターを配列番号3に示す。カバのキシランに対するミカエリス定数は、30kDのキシラナーゼについて4.2g/lである。温度の至適は高く、そして該キシラナーゼについて70°Cに等しい。Gpd1gpd1遺伝子のC末端部分のDNA配列は決定されていない。この遺伝子のプロモーター配列は本発明の好ましい一態様であり、そして配列番号5に描かれる。4種のクリソスポリウム属Chrysosporiumの遺伝子の発現レベルをノーザン分析により研究した。多様な株のC.ルクノウェンセC.lucknowenseを、セルロースおよび乳糖とともにファーメディアpharmediaを含有する豊富培地培地1、もしくはファーメディアおよびブドウ糖を含有する豊富培地培地2中、33°Cで成長させた。48時間後に、菌糸体を収穫しかつRNAを単離した。RNAを、4種の異なるプローブ、すなわちEG5、EG6、Xyl1およびCBHとハイブリダイズさせた。曝露後に、ノーザンブロットを細長い形に切り、そしてブロット上のmRNAの量に対する対照としてリボソームL3に対するプローブと再度ハイブリダイズさせた。大部分の株は、培地1中でCBHに対する非常に高い応答、およびXyl1に対する高い応答を示し;培地2中では、株の半分が全部の遺伝子について高い応答を示し、また、他の半分が低い応答を示した。発現の強さの順序は、これらのデータからCBH>Xyl1>EG5>EG6と推定された。C.ルクノウェンセC.lucknowenseのタンパク質Xyl1は、ジェンバンクGenbankデータベースDATABASE中のその最も近い相同物に67同一72相同である表4。その関係するフミコラグリセアHumicolagrisea相同物に対するCBH1タンパク質の強い相同性74同一/82相同は注目すべきである。全部の場合で、最も近い相同物は、フサリウム属Fusarium、フミコラ属Humicolaもしくは他の核菌類Sordariamycetousの真菌から発する表4一方、クリソスポリウム属ChrysosporiumはNCBIのデータベースによれば不整子嚢菌類Eurotiomycetousの真菌に属する表4こともまた注目される。従って、本発明はまた、不整子嚢菌類の真菌由来のグリカン分解glycanolytic酵素、とりわけCBDを含んで成るセロビオヒドロラーゼおよびキシラナーゼにも関する。参考文献これらの内容は組み込まれる配列表"