"存在する場合、複数の弱毒化した生ウイルス粒子内でウイルス特異的核酸を検出するように適合された組成物であって、a配列番号1、配列番号19、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、および配列番号16からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む約50未満の長さのヌクレオチドの第1のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマー、b配列番号2、配列番号20、配列番号20、配列番号5、配列番号8、配列番号11、配列番号14、および配列番号17からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む約50未満の長さのヌクレオチドの第2のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマー、ならびにc配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、および配列番号18からなる群から選択される標識されたヌクレオチド配列を含む約50未満の長さのヌクレオチドのウイルス特異的検出プローブの少なくとも1つの第1の標識されたウイルス特異的検出プローブを含む、組成物。ウイルス粒子が家畜ワクチン内に含まれる、請求項1に記載の組成物。第1および第2のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーならびに第1の標識されたウイルス特異的検出プローブの1つ以上が約40未満の長さのヌクレオチドである、請求項1または請求項2に記載の組成物。第1および第2のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーならびに第1の標識されたウイルス特異的検出プローブの1つ以上が約30未満の長さのヌクレオチドである、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。第1および第2のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーならびに第1の標識されたウイルス特異的検出プローブの1つ以上が約20未満の長さのヌクレオチドである、請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。第1のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーが、配列番号1、配列番号19、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、および配列番号16からなる群から選択されるヌクレオチド配列から実質的になる、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。第2のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーが、配列番号2、配列番号20、配列番号20、配列番号5、配列番号8、配列番号11、配列番号14、および配列番号17からなる群から選択されるヌクレオチド配列から実質的になる、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。少なくとも1つの第1の標識されたウイルス特異的検出プローブが、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、および配列番号18からなる群から選択される標識されたヌクレオチド配列から実質的になる、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。少なくとも1つの第1の標識されたウイルス特異的検出プローブが、少なくとも1つの発色、蛍光、スピン標識または放射性部分をさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。複数の弱毒化した生ウイルス粒子が、BRSV、BHV-1、PI3、およびBVDVから選択される1種以上のウイルスを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物。複数の弱毒化した生ウイルス粒子が、BVDV-1a、BVDV-1b、およびBVDV-2から選択される1種以上のウイルスを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の組成物。複数の弱毒化した生ウイルス粒子が、BVDV-1bを含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物。第1のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーが、配列番号1または配列番号19のヌクレオチド配列から実質的になり、第2の増幅プライマーが、配列番号2または配列番号20のヌクレオチド配列から実質的になり、少なくとも1つの第1の標識されたウイルス特異的検出プローブが、配列番号3または配列番号21のヌクレオチド配列から実質的になる、請求項1~12のいずれか一項に記載の組成物。家畜起源の生物学的試料から、または多価ウシ輸送熱ワクチン内に含まれる複数の弱毒化した生ウイルス粒子から得たポリヌクレオチドの集団においてウイルス特異的ポリヌクレオチドの存在を検出するのに使用するための、請求項1~13のいずれか一項に記載の組成物。ウイルス特異的核酸を含有していると疑われる生物学的試料中のウイルス特異的核酸配列を検出するための組成物であって、a配列番号1、配列番号19、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、および配列番号16からなる群から選択される第1のウイルス特異的フォワード増幅プライマー、ならびにb配列番号2、配列番号20、配列番号5、配列番号8、配列番号11、配列番号14、および配列番号17からなる群から選択される第1のウイルス特異的リバース増幅プライマーを含む、組成物。ポリメラーゼ連鎖反応PCRにより核酸配列を増幅するのに十分な1種以上の緩衝液、1種以上のポリメラーゼ、および1種以上のdNTPをさらに含む、請求項15に記載の組成物。ポリメラーゼ連鎖反応がリアルタイムで実施される、請求項16に記載の組成物。PCRによりこのように産生された増幅産物に特異的に結合する配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、および配列番号18からなる群から選択される少なくとも1つの第1の標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブをさらに含む、請求項16または請求項17に記載の組成物。第1の標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブが、蛍光、発色、放射性、化学発光、発光、またはスピン共鳴標識を含む、請求項16~18のいずれか一項に記載の組成物。標識された検出プローブが、BVDV-1a-、BVDV-1b-、BVDV-2-、BHV-1-、PI3-またはBRSV-特異的核酸に特異的に結合する、請求項16~19のいずれか一項に記載の組成物。リアルタイムにおけるPCRの間に産生された増幅産物の量を定量するための1種以上のさらなる成分をさらに含む、請求項16~20のいずれか一項に記載の組成物。獣医学的に修飾された生ウイルスワクチンを含む試料からウイルス特異的核酸配列を増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応を実施するための、請求項1~21のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。ポリヌクレオチドの集団におけるウイルス特異的ポリヌクレオチドの存在を検出するための方法であって、少なくとも1つのサイクルステップを実施する工程であって、前記サイクルステップは、少なくとも1つの第1の増幅ステップおよび少なくとも1つの第1のハイブリダイズステップを含み、前記少なくとも1つの第1の増幅ステップは、ウイルス特異的核酸分子が試料中に存在する場合、前記試料を、請求項1~15のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、ウイルス特異的増幅産物を産生することを含み、前記少なくとも1つの第1のハイブリダイズステップは前記試料を前記組成物と接触させることを含む、工程と、得られたハイブリダイゼーション産物を特異的に検出するのに有効な条件下で、このように産生された前記増幅産物を少なくとも1つの第1の標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブと接触させる工程と、を含む、方法。一対のウイルス特異的増幅プライマーが、a配列番号1、配列番号19、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、および配列番号16からなる群から選択される核酸配列を含む、約50未満の長さのヌクレオチドの第1のオリゴヌクレオチド増幅プライマー、ならびにb配列番号2、配列番号20、配列番号5、配列番号8、配列番号11、配列番号14、および配列番号17からなる群から選択される核酸配列を含む、約50未満の長さのヌクレオチドの第2のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを含む、請求項23に記載の方法。少なくとも1つの第1の標識されたウイルス特異的検出プローブが、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、および配列番号18のいずれか1つの核酸配列を含む、約50未満の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む、請求項23または請求項24に記載の方法。ウイルス特異的核酸分子がポリヌクレオチドの集団に存在する場合、第1のサイクルステップが、ポリヌクレオチドの集団を一対のウイルス特異的増幅プライマーと接触させて、増幅産物を産生することを含み、さらに、少なくとも1つの第1のハイブリダイズステップが、このように産生された前記増幅産物を検出するのに有効な条件下で、ポリヌクレオチドの集団を少なくとも1つの第1の標識されたウイルス特異的検出プローブと接触させることを含む、請求項23~25のいずれか一項に記載の方法。検出するステップがリアルタイムで実施される、請求項23~26のいずれか一項に記載の方法。ウイルス特異的検出プローブとウイルス増幅産物との間の融解温度を測定するさらなるステップをさらに含む、請求項23~27のいずれか一項に記載の方法。ポリヌクレオチドの集団が複数の弱毒化した生ウイルス粒子から得られる、請求項23~28のいずれか一項に記載の方法。ポリヌクレオチドの集団が家畜起源の生物学的試料内に含まれる複数の弱毒化した生ウイルス粒子から得られる、請求項23~29のいずれか一項に記載の方法。ポリヌクレオチドの集団が、血液、血漿、細胞、組織、血清、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される生物学的試料から得られる、請求項23~30のいずれか一項に記載の方法。ポリヌクレオチドの集団が、哺乳動物ワクチン内に含まれる複数の弱毒化した生ウイルス粒子から得られる、請求項23~31のいずれか一項に記載の方法。複数の弱毒化した生ウイルス粒子が、BHV-1、PI3、BRSV、およびBVDVからなる群から選択される1種以上のウイルスを含む、請求項23~32のいずれか一項に記載の方法。複数の弱毒化した生ウイルス粒子が、BVDV1a型、BVDV1b型、およびBVDV2型の1つ以上を含む、請求項23~33のいずれか一項に記載の方法。哺乳動物ワクチンがウシBRDCまたは輸送熱ワクチンである、請求項23~34のいずれか一項に記載の方法。標識された検出プローブが、非蛍光クエンチャーまたはマイナーグルーブバインダーをさらに含む、請求項23~35のいずれか一項に記載の方法。検出プローブが、6-カルボキシ-フルオレセインFAMで蛍光標識されている、請求項23~36のいずれか一項に記載の方法。標識された検出プローブが、BVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-2、BHV-1、PI3、またはBRSVウイルス核酸に特異的に結合する、請求項23~37のいずれか一項に記載の方法。生物学的試料から得たポリヌクレオチドの集団内のウイルス特異的ポリヌクレオチドの増幅および検出における、請求項1~21のいずれか一項に記載の組成物の使用。多価ウシ輸送熱ワクチン内に含まれる複数の弱毒化した生ウイルス粒子由来のBVDV1a型、1b型、または2型-特異的ポリヌクレオチドの増幅および検出における、請求項39に記載の使用。本発明は、有益には、試料、特に生物学的または家畜起源の試料中の、またはそれらの試料から得たポリヌクレオチドの集団においてウイルス特異的ヌクレオチド配列を検出するためのシステムおよび方法を提供することによって従来技術に特有のこれらおよび他の欠点を克服する。本発明はまた、有益には、例えば、2種以上の遺伝的に関連するウイルス種、株、型、または亜型から得た核酸を含む、2種以上の遺伝的に関連するポリヌクレオチド集団から得た核酸を特異的に検出し、識別するための組成物および方法を提供することによって別の実施形態における当該技術分野の欠点を克服する。本発明は、初めて、BVDV例えば、1a型、1b型、および2型の既知の遺伝的亜型に特異的なポリヌクレオチドを識別するため、およびウイルス粒子の多価集団に存在する各ウイルス成分を同定し、定量するための特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーおよび標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブおよびそれらを含む診断アッセイキットを提供できる。本発明はまた、有益には、増幅プライマー対および標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブ、ならびに例えば、出願人の同時係属の米国仮特許出願第61/427,361号2010年12月27日に出願され、本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれているに記載されている六価輸送熱ワクチンを含む、多価ワクチン製剤において個々の修飾された生ウイルスMLVの効力をより正確に決定するために利用され得る、感受性の高い、ウイルス特異的検出システムを準備するための種々の実施形態においてこのような組成物を使用する方法を提供できる。このようなウイルス特異的プライマーおよびプローブを含む診断キットを含む、製造品もまた開示される。特に、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動FRETベースの検出システムなどの蛍光および発色検出法を含む、1つ以上の検出可能な標識と併せて使用される場合本発明の組成物を利用する定量的および特に、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応qPCRアッセイを使用して提供される迅速な分析および増加した感受性は、本発明が獣医学的臨床検査環境に与え得る多くの利点のうちのただ2つを例示する。第1の実施形態において、本発明は、少なくとも1つの第1のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマー、少なくとも1つの第2のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマー、およびポリヌクレオチドの集団のPCRベースの増幅/検出アッセイを行うのに好適な少なくとも1つの第1の標識されたウイルス特異的検出プローブを含む組成物を提供する。本明細書に記載されているように、このようなウイルス特異的検出プローブは好ましくは、限定されないが、1つ以上の発色、蛍光、スピン標識もしくは放射性部分、またはそれらの任意の組み合わせを含む、少なくとも1つの検出可能な標識を含む。関連した実施形態において、本発明は、水性試料中の1つ以上のウイルス特異的核酸配列を検出するのに使用するための組成物を提供する。好ましくは、試料は、生物学的起源限定されないが、細胞、組織、血液、血漿、血清、およびそれらの任意の組み合わせを含むの試料、あるいは1つ以上のウイルス特異的核酸を含むことが知られているか、または含む疑いのある診断、検査もしくは医薬組成物もしくは製剤である。好ましくは、このような組成物は、哺乳動物家畜の1種以上の種で免疫反応を誘発できる哺乳動物ワクチン製剤、または免疫原性組成物である。好ましくは、このような組成物は、1種以上のウシ病原性ウイルス種、株、型、および/または亜型に特異的である核酸配列に特異的にハイブリダイズし、その核酸配列のポリメラーゼ依存性増幅を容易にする1種以上のフォワード増幅プライマー、および1種以上のリバース増幅プライマーを含む。本発明のさらなる態様は、限定されないが、本明細書に記載され、例示されるこれらのプローブ配列を含む、1種以上の好適な標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブ複数も含むを使用して検出可能および/または定量可能なPCRにより複数の増幅された核酸セグメントを産生するために、好ましくは、適切な条件下で獣医学的に修飾された生ウイルスワクチンを含む試料由来のウイルス特異的核酸配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに好適な上述の組成物のうちの1種以上を含む、本明細書にさらに詳細に記載される診断および/または分子アッセイキットを含む。本発明はまた、生物学的試料から得たポリヌクレオチドの集団における1種以上のウイルス特異的ポリヌクレオチドを増幅および/または検出するための物品の製造における1種以上のこのような組成物の使用を提供する。例示した実施形態において、そのような使用は、1種以上のBVDV粒子、好ましくはMLVと共に含まれる1種以上のこのようなウイルス粒子の増幅、検出、および/または定量を含む。例示的な実施形態において、多価ウシ輸送熱ワクチン内に含まれる複数の弱毒化した生ウイルス粒子由来のBVDV1b型、1b型、および2型特異的ポリヌクレオチドの増幅、検出、および定量におけるこのような組成物についての使用が実証される。ウイルスの種々の種、株、型、または亜型に特異的なプローブ/プライマーの組み合わせを利用することによって、本発明の方法は、ワクチン効力、特にBRDCおよび既知のウイルス起源の病原体を有する関連する輸送熱などの疾患を予防するものなどの多価動物ワクチンの特徴付けにさらに利用され得る。総合的および全体的な要旨において、本発明の方法は、ポリヌクレオチドの集団内由来、特にBRDCおよび関連する輸送熱などの多因子および特に複数の病因起源の疾患の1つ以上の症状の予防、処置、管理、および/または改善に効果的な多価ワクチン製剤由来のウイルス特異的ポリヌクレオチドの迅速、正確、かつ容易な検出を可能にする。このような方法は概して、少なくとも1つのサイクルステップを実施する工程であって、そのサイクルステップは、少なくとも1つの第1の増幅ステップおよび少なくとも1つの第1のハイブリダイズステップを含み、少なくとも1つの第1の増幅ステップは、ウイルス特異的核酸分子が試料に存在する場合、その試料を、本明細書に開示されるプローブ/プライマー組成物と接触させて、ウイルス特異的増幅産物を産生することを含み、少なくとも1つの第1のハイブリダイズステップは、その試料を組成物と接触させること、および得られたハイブリダイゼーション産物を特異的に検出するのに有効な条件下で、そのように産生された増幅産物を、少なくとも1つの第1の標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブと接触させることを含む。例示的な実施形態において、ウイルス特異的増幅プライマーの対は、配列番号1、配列番号19、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、および配列番号16の1つ以上から選択される核酸配列を含むか、それらから実質的になるか、または代替としてそれらからなる、約50未満の長さのヌクレオチドの第1のオリゴヌクレオチド増幅プライマー、ならびに配列番号2、配列番号20、配列番号5、配列番号8、配列番号11、配列番号14、および配列番号17の1つ以上から選択される核酸配列を含むか、またはそれらから実質的になるか、または代替としてそれらからなる約50未満の長さのヌクレオチドの第2のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを含む。特定の実施形態において、組成物は、少なくとも1つの第1の標識されたウイルス特異的検出プローブをさらに含んでもよい。そのような検出プローブは好ましくは、約50未満の長さのヌクレオチドであり、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15および配列番号18の1つ以上から選択される核酸配列を含むか、それらから実質的になるか、または代替としてそれらからなる。好ましい実施形態において、第1のサイクルステップは好ましくは、ウイルス特異的核酸分子がポリヌクレオチドの集団に存在する場合、ポリヌクレオチドの集団を、一対のウイルス特異的増幅プライマーと接触させて、増幅産物を産生することを含み、さらに、少なくとも1つの第1のハイブリダイズステップは、そのように産生された増幅産物を検出するのに有効な条件下でポリヌクレオチドの集団を、少なくとも1つの第1の標識されたウイルス特異的検出プローブと接触させることを含む。特定の実施形態において、検出ステップはリアルタイムで実施されてもよく、さらに必要に応じて、ウイルス特異的検出プローブとウイルス増幅産物との間の融解温度を検出するさらなるステップを含んでもよい。ワクチン効力を決定するための方法および組成物本発明は、ウイルス特異的ポリヌクレオチド配列、具体的には動物ワクチンに存在するものなどのMLVの試料中のBVDV特異的ポリヌクレオチド配列を同定する方法を提供する。本発明はまた、試料中、特に哺乳動物ワクチン中、またはウシおよびワクチン候補から得た獣医学的もしくは生物学的検体のウイルス特異的ポリヌクレオチド配列を特異的に検出するための方法および組成物を提供する。開示される方法は好ましくは、PCR増幅産物を検出し、得られた増幅産物をハイブリダイズしたプライマーにより標識し、PCR、qPCR、RT-qPCR、および特に後の融解曲線例えばCτ分析と併せてPCR/FRETベースのアッセイの1つ以上を使用してそのような増幅産物を定量するための、オリゴヌクレオチドプライマー対および標識されたオリゴヌクレオチドプローブ組成物およびキット、特に本明細書に開示される配列の1つ以上を含むものを利用する。一実施形態において、本発明は、1種以上のウイルス特異的ポリヌクレオチド、またはウイルス由来のタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドの全てもしくは一部をコードする核酸セグメントの存在または非存在を検出するための方法を提供する。特定の態様において、1つ以上の生物学的試料は、個体例えば、ワクチン製剤、または家畜から得た生物学的試料から採取されてもよく、このような配列の存在についてスクリーニングされてもよい。特定の実施形態において、ワクチン製剤または生物学的試料は、例えば、多因子動物ワクチンのMLVウイルス成分の1つ以上に特異的な配列を含む、1つ以上の特定のウイルス配列の存在についてスクリーニングされてもよい。PCRのプロセスは分子生物学的分野における当業者に周知である例えば、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号各々は本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれるを参照のこと。PCRにおいてプライマーの温度依存性伸長は、適切な塩、金属カチオン、およびpH緩衝系からなる反応媒体中の適切な量の4種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸dATP、dGTP、dCTP、およびdTTPの存在下で重合剤により触媒される。適切な重合剤は、鋳型依存性DNA合成を触媒することが知られている酵素である。例えば、鋳型がRNAである場合、RNAを相補的DNACDNA配列に変換する適切な重合剤はニワトリ骨髄芽球症ウイルスRTなどの逆転写酵素RTである。米国特許第5,614,388号本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれるに記載されているように、増幅のための標的がDNAである場合、適切なポリメラーゼとしては、限定されないが、大腸菌DNAポリメラーゼIまたはそのクレノウ断片、T4DNAポリメラーゼ、およびTaqポリメラーゼ微生物、サーマスアクアティカスThermusaquaticusから単離される熱安定DNAポリメラーゼが挙げられる。Taqポリメラーゼとして知られている、後者の酵素は、核酸の増幅およびシークエンシングに広範に使用されており、このようなポリメラーゼを使用するための反応条件は当業者に周知である例えば、SambrookおよびRussell,2001を参照のこと。PCRプロセスの好ましい実施形態において、反応は、TaqDNAポリメラーゼなどの熱安定性DNAポリメラーゼ酵素により触媒され、高温で実施される。好ましい温度は、酵素が熱安定性であり、十分なプライマーが重合の適度な速度を可能にするように鋳型鎖にアニールするように核酸が一本鎖および二本鎖の平衡状態である温度である。鎖分離は、二本鎖の変性を引き起こすが、ポリメラーゼの不可逆的変性を引き起こさないように十分な時間、十分に高温に反応物を加熱することにより達成される。特定の用途において、本発明の方法は、有益には、少なくとも1つの第1のPCRベースの増幅ステップ、および好ましくは、少なくとも1つのサイクルステップこれは、少なくとも1つの第1の増幅するステップおよび少なくとも1つの第1のハイブリダイズするステップを含むを実施することを全体的に含む、少なくとも1つの第1の定量的PCRベースの増幅ステップを利用する。この増幅ステップは、ウイルス標的ポリヌクレオチドが試料中に最初に存在している場合、その試料を、一対のウイルス特異的オリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、増幅産物を産生することを含む反対に、ウイルス標的ポリヌクレオチドが試料中に最初に存在していない場合、特定の産物の増幅はPCRプロセスの間に生じない。ハイブリダイズステップは典型的に、増幅ステップから得た試料を、このように産生された増幅産物に特異的にハイブリダイズすなわち結合する1つ以上の標識されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含む。FRET分析の場合、検出プローブは、ウイルス特異的オリゴヌクレオチドプローブのFRET適合性検出対例えば、約4または5個以下の互いのヌクレオチド内の増幅産物にハイブリダイズするこれらのFRET適合性対を含むの第1および第2のメンバーを含んでもよい。FRET分析の場合、検出プローブの対の第1のプローブは典型的にドナー蛍光部分で標識され、検出プローブの対の第2のプローブは典型的に対応するアクセプター蛍光部分で標識される。これらの検出プローブ、およびハイブリダイズステップに使用するためにそれらに作動可能に連結され得る部分の種類は本明細書上記により詳細に記載している。この方法はまた、少なくとも、適切な標識および典型的にプローブに作動可能に連結するものの使用により増幅産物:プローブハイブリッドの存在または非存在を検出するステップであって、標識されたプローブからの信号の存在が通常、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す、ステップをさらに含む。反対に、産生した増幅産物の非存在下で、プローブハイブリダイゼーションステップ後に検出可能な信号は実質的に得られず、したがって、分析した試料中に最初に存在する核酸配列の集団内の標的ポリヌクレオチドの非存在を示す。特定の実施形態において、増幅および検出ステップはリアルタイムで実施されてもよく、必要に応じて、その方法は、追加の定量または分析ステップ例えば、検出プローブ複数も含むと対応する増幅産物と間の融解温度を決定して、分析した試料中にウイルス由来の標的配列存在する場合を定量またはさらに特徴付けることを含むをさらに含んでもよい。プローブとその対応する標的との間の融解温度を決定するプロセスは概して以下を含む:PCR増幅産物および対応する検出プローブ複数も含むは約40°Cに冷却されて、標的PCR増幅産物複数も含むの相補的配列複数も含むに対するプローブ複数も含むのアニーリングを促進する。存在する場合標的PCR産物に対してプローブ複数も含むをアニールするのに有効な条件下で標識されたプローブ複数も含むが反応混合物と接触すると、次いで検出可能な標識例えば、フルオロフォアなどが、分子生物学の分野における当業者に公知の従来の技術を使用して検出およびその後に定量される。核酸の検出は当業者に周知であり、多くのアプローチの適用により達成され得る。これらの方法は概して、当該技術分野において公知の任意の放射性、蛍光性、生物学的または酵素的タグまたは標識などの標識またはマーカーの検出に基づく例えば、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号および同第4,366,241号それらの各々は本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれるを参照のこと。本発明の実施に利用され得る検出可能な標識のさらなる例としては、クロムIII、マンガンII、鉄III、鉄II、コバルトII、ニッケルII、銅II、ネオジムIII、サマリウムIII、イッテルビウムIII、ガドリニウムIII、バナジウムII、テルビウムIII、ジスプロシウムIII、ホルミウムIIIおよびエルビウムIIIなどの常磁性イオンが挙げられ、ガドリニウムが特に好ましい。限定されないが、ローダミン、フルオレセインおよびレノグラフィンを含む蛍光部分も使用されてもよく、発色基質と接触すると有色産物を生成する酵素が特に好ましい。分子生物学の分野における当業者に知られているような二次結合リガンド限定されないが、二次抗体および/またはビオチン/アビジンリガンド結合構成を含むも使用されてもよい。上記のように、任意の標識が上述の要件を満たし、それが核酸特異的標識と相互作用する限り、オリゴヌクレオチドプローブの標識として任意の標識が使用されてもよい。例としては、限定されないが、LightCycler登録商標RED640、LightCycler登録商標RED705、TAMRAおよびAlexa633が挙げられる。標識は、取り付けがオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに影響を与えない限り任意の位置においてオリゴヌクレオチドに取り付けられてもよい。特定の用途において、標識は通常、オリゴヌクレオチドプローブ分子の5’または21末端のいずれかにおいて作動可能に連結すなわち結合、取り付け、連結などされる。本明細書に具体的に記載されるオリゴヌクレオチドに加えて、本明細書に記載されるウイルス効力アッセイに使用するための増幅プライマーまたは検出プローブのいずれかとして、例えば、OLIGO[MolecularBiologyInsightsInc.,Cascade,CO,USA]などのコンピュータプログラムを使用してさらなる核酸が設計され、合成されてもよい。典型的に、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、約7もしくは8から約60もしくは80程度の長さのヌクレオチド例えば、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49などの長さのヌクレオチドである。本明細書で使用する場合、ウイルス特異的プライマー複数も含むとは、特定の選択されたウイルスのゲノム内に存在する核酸配列に特異的にアニールし、適切な条件下でそこから増幅産物のポリメラーゼ合成の開始を促進するオリゴヌクレオチドプライマー複数も含むを指す。同様に、ウイルス特異的プローブ複数も含むとは、適切な条件下でハイブリダイズしたプライマー対を使用した適切なポリメラーゼにより増幅される核酸配列に特異的にアニールし、従来のオリゴヌクレオチド検出アッセイなどを使用して順次に、付随して、連続して、および/または後で検出可能および好ましくは定量可能であるオリゴヌクレオチドプローブ複数も含むを指す。オリゴヌクレオチド組成物一実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブおよびウイルス特異的ポリヌクレオチドに特異的なプライマー配列ならびにそれらから産生された増幅産物を提供し、その増幅産物は、対応する相同ウイルスポリヌクレオチド配列、特に動物ワクチンに存在する修飾された生ウイルス粒子の配列に対するハイブリダイゼーション、およびそれらの増幅に有用である。例示的な実施形態において、BVDV特異的核酸配列の特定の遺伝子株、型、および亜型を検出および増幅するのに有用である例示的なオリゴヌクレオチドプライマー配列が開示される。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ウイルス特異的核酸セグメント、および特にBVDV特異的ポリヌクレオチドおよびそれらから誘導される増幅産物の選択的増幅および検出のために設計される。開示されるプライマー配列は、ハイブリダイゼーション法、およびPCR商標ベースの増幅法例えば、RT-PCR/FRETベースの遺伝分析におけるリアルタイム-pPCR、RT-PCRを含むなどのDNA増幅法における使用に適切である。同様に、開示されるオリゴヌクレオチド検出プローブは、本明細書に開示されるウイルス特異的増幅プライマーの1つ以上の対を使用した核酸の増幅から得られる産物を検出および定量するのに適切な標識手段を用いて標識するのに好適である。適切なマーカーで標識される場合、オリゴヌクレオチド検出プローブは特に、例えば、PCR、リアルタイムPCR、定量的PCRqPCR、FRETベースの分析などを含む、蛍光ベースの検出に適している。例えば、FRETで標識された検出法が特に、マイクロボリュームmicrovolume蛍光分析に基づいた蛍光検出に有用である。開示された増幅および検出オリゴヌクレオチド対の1つ以上の使用は特に、組み合わせたRT-PCR商標/マイクロボリューム蛍光分析FRETベース法RT-PCR商標/FRET、および特にIdahoTechnology,Inc.により開発され、現在、RocheMolecularSystemsにより製造され、市販されているLightCycler登録商標機器により容易にされる分析において意図される。ほとんどの実施形態に関して、本発明者は、本発明の選択されるプローブおよびプライマー組成物の長さが好ましくは、約50~60未満などの長さのヌクレオチドであり、より好ましくは約40~45未満などの長さのヌクレオチドであるのに対して、本発明の他のプローブおよびプライマーは、約30~35程度の長さのヌクレオチドであってもよいことを意図する。一部の実施形態において、選択されるオリゴヌクレオチドプライマー配列例えば、フォワードおよびリバースプライマーの長さおよび/または選択される検出プローブ配列例えばアンカーおよびセンサープローブの長さは、可能な場合、約20~30程度の長さのヌクレオチドであるが、一部の場合、特定のプローブおよびプライマー配列のサイズは、約60~70程度以上の長さのヌクレオチドであってもよい。あるいは、一部の実施形態において、より短いプローブおよび/またはプライマー配列を利用することが所望され得、例えば、本発明を実施するために選択されるオリゴヌクレオチドは、約15~20程度の長さのヌクレオチドまたは一部の実施形態においてさらに短くてもよい。本出願に関して、本明細書に記される種々の範囲内の全ての中間のオリゴヌクレオチドの長さは、本発明の範囲内に明確に含まれることを意図することが理解される。そのため、約XX未満のヌクレオチドの長さであるオリゴヌクレオチドはその範囲内の全ての整数を含む。例えば、約60未満のオリゴヌクレオチドの長さであるオリゴヌクレオチドは、59、58、57などから4、3、2、または1のヌクレオチドの長さであるオリゴヌクレオチドを含み、各々は明確に本開示の範囲内である。本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト化学例えば、BeaucageおよびIyer,1992および米国特許第4,980,460号、同第4,725,677号、同第4,415,732号、同第4,458,066号、および同第4,973,679号などを参照のことを含む、標準的な方法を使用した当業者に公知である多くの従来のアプローチ例えば、Ozakiら,1992;Agrawalら,1990などを参照のことにより合成されてもよい。ホスホロチオエート、ホスホラミデートなどの非天然の骨格基が得られる、代替の化学もまた、得られるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率に有害な影響を与えないならば、利用されてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約10~約120の長さのヌクレオチドの範囲、より好ましくは約15~約100の長さのヌクレオチドの範囲、さらにより好ましくは約20~約80の長さのヌクレオチドの範囲であるが、結合位置および長さが、特定の実施形態について適切なアニーリングおよび融解特性を達成するために変化し得るので、オリゴヌクレオチドの正確な配列および長さは、とりわけ、それがハイブリダイズする標的核酸配列の性質に依存する。このような設計選択を得るための指針は、以下の実施例で利用され、またHollandら1991に詳細に記載されているTaqman登録商標型アッセイを記載している多くの上記に引用した参照文献に見出され得る。上述の参照文献の各々は本明細書に対する参照を示すことによってその全体は本明細書に具体的に組み込まれる。ウイルス特異的増幅プライマー本発明の実施において、ウイルス特異的ポリヌクレオチド配列、および特にBVDVをコードするポリヌクレオチド配列の増幅に使用するためのフォワードおよびリバース増幅プライマーは好ましくは、配列番号1、配列番号19、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、もしくは配列番号16に開示される少なくとも約6~少なくとも約25それらの間の各整数を含むまたはそれ以上のフォワードオリゴヌクレオチドプライマー配列または配列番号2、配列番号20、配列番号5、配列番号8、配列番号11、配列番号14、もしくは配列番号17に開示されるリバースオリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれかから、あるいは配列番号1、配列番号19、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、もしくは配列番号16に開示されるフォワードオリゴヌクレオチドプライマー配列または配列番号2、配列番号20、配列番号5、配列番号8、配列番号11、配列番号14、もしくは配列番号17に開示されるリバースオリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれかに対して少なくとも約90同一であるオリゴヌクレオチド配列から、あるいはさらに配列番号1、配列番号19、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、もしくは配列番号16に開示されるフォワードオリゴヌクレオチドプライマー配列または配列番号2、配列番号20、配列番号5、配列番号8、配列番号11、配列番号14、もしくは配列番号17に開示されるリバースオリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれか1つに対して少なくとも約95同一であるオリゴヌクレオチド配列から隣接する核酸を含むか、それらから実質的になるか、または代替としてそれらからからなる。他の実施形態において、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドフォワードおよびリバース増幅プライマー配列は、配列番号1、配列番号19、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、もしくは配列番号16に開示されるフォワードオリゴヌクレオチドプライマー配列または配列番号2、配列番号20、配列番号5、配列番号8、配列番号11、配列番号14、もしくは配列番号17に開示されるリバースオリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれか1つを含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらからなってもよいのに対して、他の実施形態において、配列番号1、配列番号19、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、もしくは配列番号16に開示されるフォワードオリゴヌクレオチドプライマー配列、または配列番号2、配列番号20、配列番号5、配列番号8、配列番号11、配列番号14、もしくは配列番号17に開示されるリバースオリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれか1つから実質的になるプライマー配列を利用することが望まれ得るのに対して、さらに他の実施形態において、配列番号1、配列番号19、配列番号4、配列番号7、配列番号10、配列番号13、もしくは配列番号16に開示されるフォワードオリゴヌクレオチドプライマー配列、または配列番号2、配列番号20、配列番号5、配列番号8、配列番号11、配列番号14、もしくは配列番号17に開示されるリバースオリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれか1つからなるプライマー配列を利用することが望まれ得る。なおさらなる実施形態において、本発明の方法を実施するのに好適なフォワードおよびリバース増幅プライマー組成物は、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つに開示される約6~約25その間の各整数を含むもしくはそれ以上のヌクレオチドの隣接核酸配列を表す核酸配列を含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらからなってもよい。同様に、本発明の増幅方法を実施するのに好ましいプライマー組成物は、約6~約25それらの間の各整数を含むの隣接核酸配列、または配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つに開示される多くのヌクレオチドに対して約90同一である核酸配列を含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらから実質的になってもよい。さらに、本発明の増幅方法を実施するのに好適な増幅プライマー組成物は、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16もしくは配列番号17のいずれか1つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも約95同一である核酸配列を含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらからなってもよい。他の実施形態において、本発明を実施するのに好適なプライマー組成物は、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか1つから選択される少なくとも約6~少なくとも約25再び、それらの間の互いの整数を含むもしくはそれ以上の隣接核酸である核酸配列を含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらからなってもよく、あるいは配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも約90同一であるオリゴヌクレオチド配列から実質的になってもよいか、あるいはさらに、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも約95同一であるオリゴヌクレオチド配列から実質的になってもよい。特定の実施形態において、本発明の例示的な増幅プライマーは、少なくとも約50の長さのヌクレオチドであり、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つに開示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、もしくはそれらからなる。他の実施形態において、本発明の例示的な増幅プライマーは、少なくとも約40の長さのヌクレオチドであり、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つに開示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる。さらなる実施形態において、本発明の例示的な増幅プライマーは、少なくとも約30の長さのヌクレオチドであり、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つに開示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる。本発明のなおさらなる態様において、本発明の例示的な増幅プライマーは、少なくとも約25の長さのヌクレオチドであり、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つに開示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなるのに対して、他の実施形態において、本発明の例示的な増幅プライマーは、少なくとも約20などの長さのヌクレオチドであり、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つに開示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる。特定の例示的な実施例において、本発明のオリゴヌクレオチドプライマー組成物は、約50未満の長さのヌクレオチドであり、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むのに対して、他の例示的な実施例において、本発明のオリゴヌクレオチドプライマー組成物は、約40未満の長さのヌクレオチドであり、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つのヌクレオチド配列を含み、さらに他の実施例において、本発明のオリゴヌクレオチドプライマー組成物は、約30未満の長さのヌクレオチドであり、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。本発明の一部の態様において、約45未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つのヌクレオチド配列から実質的になる、本明細書に開示される方法を実施する際のオリゴヌクレオチドプライマー組成物、または約35未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つのヌクレオチド配列から実質的になる組成物を利用することが望まれ得るのに対して、さらに他の実施例において、約25未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号1、配列番号19、配列番号2、配列番号20、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、もしくは配列番号17のいずれか1つのヌクレオチド配列から実質的になるオリゴヌクレオチドプライマー組成物を利用することが望まれ得る。ウイルス特異的検出プローブ本発明の実施において、本明細書に記載されるRT-qPCR商標分析を使用するウイルス特異的ポリヌクレオチド配列および特にBVDV特異的ポリヌクレオチド配列の検出に使用するためのオリゴヌクレオチドプローブは好ましくは、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18に開示されるオリゴヌクレオチドプローブ配列のいずれか1つに由来するか、または配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18に開示されるオリゴヌクレオチド検出プローブ配列のいずれか1つに対して少なくとも約90同一であるオリゴヌクレオチド配列に由来するか、またはさらに配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18に開示されるオリゴヌクレオチドプローブ配列のいずれか1つに対して少なくとも約95同一であるオリゴヌクレオチド配列に由来する少なくとも約6~少なくとも約25それらの間の各々の整数を含むまたはそれ以上の隣接核酸を含む。他の実施形態において、本発明の好ましいオリゴヌクレオチド検出プローブは、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18に開示されるオリゴヌクレオチドプローブ配列のいずれか1つを含んでもよいか、それらから実質的になってもよいか、または代替としてそれらからなってもよく、一方、他の実施形態において、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つから実質的になる検出プローブ核酸セグメントを利用することが望ましくなり得、一方、さらに他の実施形態において、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18に開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか1つからなるプローブ配列を利用することが望ましくなり得る。なおさらなる実施形態において、特に、FRET分析がそのように産生された増幅産物を検出するために利用され、本発明の検出プローブは好ましくは一対のプローブを含み、その第1はアンカープローブであり、その第2はセンサープローブである。本発明の方法を実施するのに好ましいプローブ組成物は、一対の検出プローブを含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらからなってもよく、その第1および第2のメンバーは、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18のいずれか1つに開示される約6~約25それらの間の各々の整数を含むもしくはそれ以上のヌクレオチドの隣接核酸配列を表す核酸配列からなってもよい。同様に、FRETベースの検出法を実施するのに好ましいプローブ組成物は、一対の検出プローブを含んでもよいか、それらから実質的になってもよいか、またはそれらからなってもよく、その第1のメンバーは、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18のいずれか1つに開示される約6~約25それらの間の各整数を含むもしくはそれ以上のヌクレオチドの隣接核酸配列に対して約80、少なくとも約81同一、少なくとも約82同一、少なくとも約83、少なくとも約84もしくは少なくとも約85同一である核酸配列からなってもよく、一方、その一対の検出プローブの第2のメンバーは好ましくは、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18のいずれか1つに開示される約6~約25それらの間の各整数を含むもしくはそれ以上のヌクレオチドの隣接核酸配列に対して約90、少なくとも約91同一、少なくとも約92同一、少なくとも約93、少なくとも約94もしくは少なくとも約95同一である核酸配列を含んでもよいか、それらから実質的になってもよいか、または代替としてそれらからなってもよい。さらに、増幅産物のFRETベースの分析が望まれる場合、本発明の方法を実施するのに好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、一対のFRET検出プローブ含んでもよいか、それらから実質的になってもよいか、または代替としてそれらからなってもよく、その第1および第2のメンバーは、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18のいずれか1つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも約95、少なくとも約96同一、少なくとも約97同一、または少なくとも約98もしくは99同一である核酸配列を含んでもよい。他の実施形態において、本発明を実施するのに好ましいプローブ組成物は、一対のFRETアンカー/センサープローブを含んでもよいか、それらから実質的になってもよいか、または代替としてそれらからなってもよく、その第1および第2のメンバーは、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18のいずれか1つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか1つから選択される少なくとも約6~少なくとも約25それらの間の各整数を含むもしくはそれ以上の隣接核酸である核酸配列から実質的になってもよいか、あるいは配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18のいずれか1つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも約90同一であるオリゴヌクレオチド配列から実質的になってもよいか、あるいはさらに、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18のいずれか1つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも約95、少なくとも約96同一、少なくとも約97同一、または少なくとも約98もしくは99同一であるオリゴヌクレオチド配列から実質的になってもよい。特定の実施形態において、本発明の例示的なウイルス増幅産物特異的オリゴヌクレオチド検出プローブ組成物は好ましくは、少なくとも約50などの長さのヌクレオチドであり、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる。他の実施形態において、本発明の例示的な検出プローブ組成物は好ましくは、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる少なくとも約40など長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。他の実施形態において、検出プローブ組成物は、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらかなる少なくとも約30などの長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよく、一方、さらに他の実施形態において、適切な検出オリゴヌクレオチドは、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる少なくとも約20などの長さのヌクレオチドであってもよい。特定の例示的な例において、本発明のオリゴヌクレオチド検出プローブ組成物は、約50未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18のいずれか1つのヌクレオチド配列を含み、一方、他の例示的な例において、オリゴヌクレオチド検出プローブ組成物は、約40未満の長さのヌクレオチドであり、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、または配列番号18のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。他の適用において、適切なオリゴヌクレオチド検出プローブは、約30未満の長さのヌクレオチドであってもよく、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。本発明の一部の態様において、約45未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18のいずれか1つのヌクレオチド配列から実質的になる、本明細書に開示される方法を実施する際のオリゴヌクレオチドプローブ組成物、あるいは代替として、約35未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18のいずれか1つのヌクレオチド配列から実質的になるオリゴヌクレオチドプローブを利用することが望まれ得、一方、さらに他の例において、約25未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号3、配列番号21、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、もしくは配列番号18のいずれか1つのヌクレオチド配列から実質的になるオリゴヌクレオチド検出プローブ組成物を利用することが望まれ得る。例示的な実施形態において、本発明は好ましくは、配列番号1から配列番号18に開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか1つもしくは複数に対して、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、もしくは少なくとも約99またはそれ以上同一である核酸配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなるウイルス特異的増幅プライマーおよび検出プローブを提供する。特定の実施形態において、本発明は、ウイルス増幅産物の1つ以上の部分に対するそれらの特異的結合に基づいて設計されるプライマーおよびプローブのセットを提供する。それらのプローブおよびプライマーは特に、生物学的試料中のウイルス特異的ポリヌクレオチド配列を迅速に検出し、同定するための方法に有用である。特定の実施形態において、これらの方法は、限定されないが、定量的PCTqPCR、逆転写酵素-PCRRT-PCR、および/またはRT-PCR/蛍光共鳴エネルギー移動FRETRT-PCR/FRETベースの増幅、検出、ならびに/あるいは定量方法を含む、リアルタイム定量を含む。本発明の例示的な実施形態を以下に記載する。明確さの目的のために、実際の実施の全ての特徴を本明細書に記載しているわけではない。もちろん、任意のこのような実際の実施形態の開発、多数の実施に特有の決定が、ある実施から別の実施へと変更する、システムに関連し、ビジネスに関連する制約の順守などの開発者の特定の目標を達成するためになされなければならないことは理解されるだろう。さらに、そのような開発の試みは、複雑であり、時間を消費する場合もあるが、本開示の利益を受ける当業者には慣用であることは理解されるだろう。ペスチウイルスPestivirusペスチウイルスは世界中で動物に経済的に重要な疾患を引き起こす。フラビウイルス科内のペスチウイルス属は、3種の一本鎖プラスセンスRNAウイルス:ウシウイルス性下痢ウイルスBVDV、古典的ブタ熱ウイルスCSFV、ボーダー病ウイルスBDVを含む。最近、ペスチウイルスの4番目の異なる群が、遺伝学的にBVDVに関連し、ウシウイルス性下痢ウイルス2型BVDV-2として文献に参照されていると確認された例えば、Thielら,1996;およびBecherら,1995それらの各々は本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれるを参照のこと。したがって、ここで、同じ文書で、2種を識別するために元の種のBVDVをBVDV-1と表す。ペストウイルス種の型はBVDV1型BDVD-1であり、そのゲノムは、長さが約12.5kbであり、1つの大きなオープンリーディングフレームORFを含有するCollettら,1998本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。約450kDaの大きなポリタンパク質のためのORFコードは、宿主またはウイルスプロテアーゼにより同時翻訳で、および翻訳後に処理される。標準的なBVDVポリプロテインのN末端は、非構造タンパク質p20Npro、カプシドタンパク質p14C;エンベロープ糖タンパク質gp48E0、gp25E1、gp53E2;非構造タンパク質p125NS23、p10NS4A、p32NS4B、p58NS5Aおよびp75NS5Bを生じる例えば、Tautzら,1997;Xuら,1997;Elbersら,1996;およびWiskerchenら,1991それらの各々は本明細書に対する参照を示すことによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれるを参照のこと。BVDV-1は2つのバイオタイプ、細胞変性cpと指定または非細胞変性ncpに存在し、それらは典型的に、細胞変性変異において単一の80kDaポリペプチド非構造タンパク質p80、NS3の産生が異なる例えば、Gillespieら,1960本明細書に対する参照を示すことによってその全体が具体的に組み込まれるを参照のこと。複数のBVDV単離株の系統発生解析に基づいて、BVDV-1は少なくとも13の異なる亜遺伝子型BVDV-1aからBVDV-11と指定を含むことが示されており、一方で、2つの亜遺伝子型BVDV-2aおよびBVDV-2bがBVDV-2について同定されている例えば、Pellerinら,1994;Ridpathら,1994、およびXueら,2010それらの各々は本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれるを参照のこと。過去30年において、畜牛産業で市販されている、BVDVについてのほぼ100および50のワクチン、修飾された生ウイルスMLVおよび不活性化された弱毒化したウイルスまたはウイルス粒子の両方は成功度が異なり、市販ワクチン製剤の広範な利用および使用にも関わらず、年間ベースでBVDVの発生が依然として報告されている。疾患管理に対する現在のアプローチは、畜牛に対してワクチンの反復される毎年の接種を含み、追加のステップが一般に、PIキャリアとして子ウシが生まれないことを保証するために試みられる。いくつかの異なる試験法がBVDVを検出するために開発されており、および/またはBVDVに感染した動物の検出は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR、酵素結合免疫測定法ELISA、標準的なウイルス単離技術、および種々の免疫組織化学的分析を含む。ウイルス効力アッセイ所与のワクチンに対する認可の主な障害となるのは多くの場合、適した効力試験の開発である。歴史的に、BVDV効力試験が、ワクチン中のウシウイルス性下痢ウイルスを滴定するための補足アッセイ法SupplementalAssayMethodfortheTitrationofBovineViralDiarrheaVirusinVaccineSAM101に従って行われている。SAM101のような方法は、感染性細胞株を接種する前にBHV、PI3およびBRSV画分を中和するために単一特異的な中和抗血清を利用する。細胞変性効果CPEのために培養物を観測し、次いで特定のウェル希釈が、BVDV1型または2型について陽性または陰性であるかを決定するために直接蛍光抗体FAおよび/または間接FAIFA染色を使用する。次いでCPE/FAについて陽性であると決定したウェルに基づいて力価を算出する。しかしながら、主にBVDV-1a、BVDV-1bおよびBVDV-2についての既存の抗体は、これらの遺伝子型と亜遺伝子型との個々の力価を正確に識別するのに必要とされる特異性を欠くため、上記のような従来の方法はBVDVの亜遺伝子型を識別するのに十分に適していない。この問題はペスチウイルスゲノムの非翻訳領域に存在する相違を識別することによって克服できる。これらの相違は、ペスチウイルスを遺伝子型と亜遺伝子型に分離するために使用されているPaton,1995;およびHofmannら,1994。RidpathおよびBolin1998は、BVDV-1a、BVDV-1bおよびBVDV-2を識別するためのポリメラーゼ連鎖反応PCR法を報告している。逆転写-定量的PCRRT-qPCRアッセイはヒト生物学に増加しつつあり、麻疹ウイルスSchalkら,2004;アデノウイルスベースのワクチンWangら,2005、ロタウイルスワクチンRanheimら,2006、および三価はしかおたふく風邪風疹MMRワクチンSchalkら,2005の効力を決定するために使用される。上述の参照文献の各々は本明細書に対する参照を示すことによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。BovineViralDiarrheaVirusType1bVaccineCompositionsandMethods本明細書と同時に出願され、本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれるという発明の名称の同時係属の米国仮特許出願第61/427,361号において、本発明者は、多価ワクチンにおける個々のウイルス成分の直接ウイルス定量すなわち効力を得るのに有用な修飾された遺伝的に基づいたアッセイプロトコルの開発を報告している。本発明は、個々のアッセイウェルすなわち希釈物における特定のウイルス種、型、または亜型の存在または非存在を決定するために従来のFA/IFAアッセイ現在のSAM101アッセイに記載されたものをRT-qPCRアッセイと置き換える。本明細書に記載される六価MLVワクチンなどの多価ワクチンの個々の成分についての効力試験はまた、CPEの目視観測を個々のウェルのRT-qPCR/qPCR分析に置き換えることによって、より客観的にすることができる。例えば、ウイルス力価アッセイにおけるCPEの観測はむしろ主観的であり得、多くの場合、試験設備間でのMLVワクチン力価の相違の源であるとみなされる。しかしながら、アッセイの客観性を増加させることによって、実験室間の再現性も増加するはずである。PI3についての効力試験は、パラインフルエンザ3ウイルスワクチンMVSAM102.01を滴定するための修飾された補足アッセイ法を使用して実施できる。BRSVについての効力試験は、ワクチンにおけるウシ呼吸器合胞体ウイルスを滴定するための修飾された補足アッセイ法MVSAM0129.01を使用して実施できる。これらのアッセイは、CPEの視覚観測を、個々のウェルのリアルタイムqPCR分析に置換することによって修飾される。BHV画分の力価は、ワクチンにおけるウシ伝染性鼻気管炎ウイルスを滴定するための修飾された補足アッセイ法MVSAM105.01を使用して実施する。このアッセイにおいて、多価ワクチン分析についてのアッセイを標準化するために標準的な6ウェルフォーマットの代わりに96ウェルフォーマットが使用されてもよい。重要なことには、このプロトコルは、目視観測を個々のウェルのqPCR分析に置き換え、BHVプラークを計数して、より正確かつ確実なアッセイを提供することを含む。核酸増幅増幅のための鋳型として使用される核酸は標準的な方法Sambrookら,1998に従ってウイルスまたは細胞から単離され得る。核酸はゲノムDNAまたは断片化もしくは全細胞RNAであってもよい。RNAが使用される場合、RNAを相補的DNAに変換することが望まれ得る。一実施形態において、RNAは全細胞RNAであり、増幅のための鋳型として直接使用される。ウイルス特異的ポリヌクレオチドまたは保存された隣接領域に対応する核酸と選択的にハイブリダイズするプライマー対は、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、単離核酸と接触する。本明細書に定義されるように、プライマーという用語は、鋳型依存性のプロセスにおいて発生核酸の合成をプライミングできる任意の核酸を包含することを意味する。典型的に、プライマーは、8または10個から40個程度の長さの塩基対bpのオリゴヌクレオチドであるが、より長い、または短い配列が特定の実施形態において利用されてもよい。プライマーは二本鎖または一本鎖形態で提供されてもよいが、一本鎖形態が好ましい。一旦ハイブリダイズすると、核酸:プライマー複合体は鋳型依存性核酸合成を促進する1種以上の酵素と接触する。十分な量の増幅産物が産生されるまで、サイクルとも称される、複数の増幅ラウンドが実施される。次に増幅産物が検出される。特定の用途において、検出は視覚手段によって実施されてもよい。あるいは、検出は、化学発光、組み込まれた放射性標識もしくは蛍光標識の放射性シンチグラフィーによる、またはさらに、電気もしくは熱衝撃信号を使用するシステムによる生産物の間接同定を含んでもよい。所与の鋳型試料中に存在するマーカー配列を増幅させるために複数の鋳型依存性プロセスが利用可能である。最もよく知られている増幅法の1つはポリメラーゼ連鎖反応PCRであり、それは米国特許第4,683,195号、米国特許第4,683,202号、および米国特許第4,800,159号それらの各々はその全体が本明細書に参照として組み込まれるに詳細に記載されている。手短に述べると、PCR商標において、反対のマーカー配列の相補鎖における領域に相補的である2つのプライマー配列を調製する。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、DNAポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼと共に反応混合物に加える。マーカー配列が試料中に存在する場合、プライマーはマーカーに結合し、ポリメラーゼにより、プライマーはヌクレオチドに加えることによりマーカー配列に沿って伸長する。反応混合物の温度を上昇させ、低下させることによって、伸長したプライマーはマーカーから解離して反応産物を形成し、過剰なプライマーはマーカーおよび反応産物に結合し、プロセスが反復される。増幅したmRNAの量を定量するために逆転写PCR商標増幅手順が実施されてもよい。RNAをcDNAに逆転写する方法は周知であり、Sambrookら1989に記載されている。逆転写のための代替の方法は熱安定性のRNA依存性DNAポリメラーゼを利用する。得られたジ-オリゴヌクレオチドの配列を有する核酸の存在下での2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドのライゲーションに基づいた方法、それによるジ-オリゴヌクレオチドの増幅もまた、本発明の増幅ステップに使用されてもよい。任意の増幅後、特異的増幅が発生したかどうかを決定する目的のために鋳型および過剰なプライマーから増幅産物を分離することが望まれ得る。一実施形態において、増幅産物は、標準的な方法例えば、Sambrookら,1989これは本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれるを参照のことを使用してアガロース、アガロース-アクリルアミドまたはポリアクリルアミゲル電気泳動により分離される。あるいは、増幅産物および/またはハイブリダイズした増幅産物:標識されたプローブ二本鎖の分離を行うためにクロマトグラフ法が利用されてもよい。限定されないが、吸着、分離、イオン交換クロマトグラフ、分子篩、ならびにカラム、紙、薄層およびガスクロマトグラフィーを含むこれらを使用するための多くの特殊な技術を含む、本発明の増幅産物の分析に関連して使用され得る多くの種類のクロマトグラフィーが存在する。マーカー配列の増幅を確認するために増幅産物は可視化されなければならない。1つの典型的な可視化法は、エチジウムブロマイドを用いるゲルの染色およびUV光下での可視化を含む。代替として、増幅産物が放射性または蛍光定量的に標識されたヌクレオチドで完全に標識される場合、増幅産物はx線フィルムに曝露されるか、または分離後、適切な刺激スペクトル下で可視化される。特定の実施形態において、可視化は間接的に達成され得る。増幅産物の分離後、標識された核酸プローブは増幅されたマーカー配列と接触される。プローブは好ましくは発色団とコンジュゲートされるが、放射性標識されてもよい。別の実施形態において、プローブは抗体またはビオチンなどの結合パートナーにコンジュゲートされ、結合対の他のメンバーは検出可能な部分を保有する。一実施形態において、検出は、適切に標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブを用いたサザンハイブリダイゼーションブロッティングによる。サザンブロッティングに関する技術は当業者に周知であり、分子プロトコルに関する多くの標準的な書籍に見出され得る。Sambrookら1989を参照のこと。手短に述べると、増幅産物はゲル電気泳動により分離される。次いでゲルはニトロセルロースなどの膜と接触し、核酸の移動および非共有結合を可能にする。続いて、膜は、標的増幅産物とハイブリダイズできる発色団がコンジュゲートしたプローブと共に培養される。検出は、x線フィルムまたはイオン放出検出装置に対する膜の曝露による。上述の一例は、自動化電気泳動および核酸の移動のための装置および方法を開示している、米国特許第5,279,721号本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれるに記載されている。その装置は、ゲルの外部操作を用いずに電気泳動およびブロッティングを可能にし、本発明に係る方法を実施するのに理想的に適している。ポリヌクレオチド増幅キット本発明はまた、ウイルス由来核酸、特に、限定されないが、BVDV-1a、BVDV-1b、およびBVDV-2を含む、BVDVについての1つ以上の特定の株、型、または亜型に特異的な核酸を増幅するためのキットを提供する。このようなキットは典型的に、ポリヌクレオチドの集団から1種以上のウイルス核酸を増幅するのに必要な2つ以上の成分を含む。例えば、キット内の1つの容器が第1のプライマーを含んでもよく、一方、キット内の第2の容器が第2のプライマーを含んでもよい。キット内の第3の容器は、1種以上のハイブリダイゼーションおよび/または検出プローブ、ならびに/あるいは1種以上のそのような検出プローブを標識するための1種以上の試薬を含んでもよい。さらに、本発明のキットはまた、本明細書に記載される増幅および/または検出反応においてプライマーを使用するための指示書、ならびに1種以上の蛍光分子複数も含む、または必要に応じて、限定されないが、例えば、緩衝酵素、ポリメラーゼ、RNAsesなどを含む、他の試薬を含んでもよい。ウイルス特異的ヌクレオチドを検出し、定量するためのキット診断キットは本発明の別の態様を表す。このようなキットはまた、プローブ、プライマー、蛍光標識、または反応緩衝液、ポリメラーゼなどのためのキット内に1つ以上の別の容器手段を含んでもよい。キットはまた、限定されないが、PCR、qPCR、RT-PCR、RT-PCR/FRETなどを含む、1つ以上のポリメラーゼ連鎖反応に基づいた方法においてキット内に含まれる組成物を使用するための指示書をさらに含んでもよい。1種以上の株、型、もしくは亜型またはBVDV限定されないが、BVDV-1a、BVDV-1b、およびBVDV-2を含むなどのウイルス、あるいは限定されないが、このような1種以上のウイルス特異的ポリヌクレオチドを含む疑いのある試料中のBHV-1、PI3、BRSVなどの1種以上のさらなる哺乳動物ウイルス病原体を検出するためのキット内に含まれる試薬を使用するための指示書がまた、提供されてもよい。特定の実施形態において、本発明の診断アッセイキットはまた、好ましくは、例えばリアルタイムqPCRを含む、本明細書に記載されるPCR、qPCR、RT-PCR、RT-PCR/FRETアッセイにおいてこのようなキット内に含まれる物品を使用するための指示書を含んでもよい。上述のキットのいずれかは、さらに必要に応じて、検出アッセイについての標準曲線を調製するのに使用するための、1種以上の陽性または陰性対照因子複数も含む標識されているかまたは標識されていないかに関わらずを含んでもよい。キットの成分は、例えば、水性媒体中で、または乾燥、凍結乾燥、もしくは凍結乾燥成分としてなどの従来の方法でパッケージ化されてもよい。キットの容器手段は概して、少なくとも1つのウイルス、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器を含み、それらの中にアッセイの成分が配置されてもよく、好ましくは、1つ以上のアリコート複数も含むに適切に分配される。さらなる成分が提供される場合、キットはまた、全体的に、第2、第3または他の追加の容器を含み、それらの中にこの成分が配置されてもよい。キットはまた、多価ワクチン製剤などの試料内に含まれるMLVを識別し、定量し、または特徴付けるのに使用するための他の診断試薬を含んでもよい。本発明のキットはまた典型的に、市販のための厳重な管理下でプローブ複数も含む、プライマー複数も含む、および/またはアッセイ試薬複数も含むを含むための手段を含む。このような容器は例えば、1つ以上の注射またはブロー成形プラスチック容器複数も含むを含んでもよく、それらの中に所望の試薬容器例えばバイアル、試験管、注射器などが保持される。例示的な定義本発明によれば、ポリヌクレオチド、核酸セグメント、核酸配列などは、限定されないが、DNA例えば限定されないが、ゲノムまたはゲノム外DNAを含む、遺伝子、ペプチド核酸PNA、RNA例えば限定されないが、rRNA、mRNAおよびtRNAを含む、ヌクレオシド、および天然源から得、化学的に合成され、修飾され、またはそうでなければヒトの手により完全にもしくは部分的に調製され、もしくは合成された適切な核酸セグメントを含む。他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等しい任意の方法および組成物が本発明を実施または試験するのに使用され得るが、好ましい方法および組成物が本明細書に記載される。本発明の目的のために以下の用語が以下のように定義される。本明細書で使用する場合、約およびおよそという用語は、交換可能であり、全体的に、所与の数に近い数の範囲、および列挙した範囲の数の全ての数例えば、約5~15は他に記載しない限り約5~約15を指すと理解されるべきである。さらに、本明細書における全ての数値範囲は、その範囲内の各整数全部を含むと理解されるべきである。本明細書で使用する場合、PCR試薬という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを実施するのに必要とされる標的核酸配列以外の化学物質を指す。これらの化学物質は概して5つのカテゴリーの成分:a水性緩衝液;b水溶性マグネシウム塩;cデオキシリボヌクレオチド三リン酸dNTP;dフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマー対;ならびにe熱安定性DNAポリメラーゼすなわち、その酵素活性のほぼ半分より多くを損失させずに少なくとも約10分間、約80から約100°Cの温度を許容できるDNAポリメラーゼを含む。4つの従来のdNTPは、チミジン三リン酸dTTP、デオキシアデノシン三リン酸dATP、デオキシシチジン三リン酸dCTPおよびデオキシグアノシンdGTPであるが、それらは、従来の塩基例えば、デオキシウリジン三リン酸[dUTP]などの1つと同様のようにワトソン-クリック形態の塩基対の塩基類似体を含有する1つ以上のdNTPによりPCR反応において補足または置換されてもよい。本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドという用語は、モノマー間相互作用の規則正しいパターンにより例えば、ワトソン-クリック塩基対などにより標的核酸に特異的に結合できるデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどを含む、天然または修飾されたモノマーまたは連結の線形オリゴマーを含む。モノマーは典型的に、ホスホジエステルまたは等価物結合により連結されて、少数の単量体単位から数十の単量体単位までのサイズの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。本開示の全体にわたって、オリゴヌクレオチドが一連の文字例えば、TTACGCAGにより表わされるときはいつでも、ヌクレオチドが左から右に読んで5’→3’の順で示されることは理解される。このような表現において、AはアデノシンまたはDNAの場合、デオキシアデノシンを意味すると理解されるのに対して、C、G、T、およびUはそれぞれ、シチジン/デオキシシチジン、グアノシン/デオキシグアノシン、デオキシチミジン、およびウリジンを示す。ホスホジエステル結合の類似体としては、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデートなどが挙げられる。本明細書で使用する場合、に実質的に対応する、実質的に相同、または実質的に同一という用語は核酸またはアミノ酸配列の特性を示し、選択された核酸またはアミノ酸配列は、選択された参照核酸またはアミノ酸配列と比較して少なくとも約70または約75パーセントの同一性を有する。より典型的に、選択された配列および参照配列は、少なくとも約76、77、78、79、80、81、82、83、84またはさらに85パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも約86、87、88、89、90、91、92、93、94、または95パーセントの配列同一性を有する。さらにより好ましくは、高い相同配列は多くの場合、選択された配列と、比較される参照配列との間で少なくとも約96、97、98、または99パーセントの配列同一性を共有する。配列同一性のパーセンテージは、比較される配列の全長にわたって算出され得るか、または選択される参照配列の合計約25パーセント未満程度である少しの欠失もしくは付加を除外することによって算出され得る。参照配列は、遺伝子もしくは隣接配列、または染色体の反復部分の一部などのより大きな配列のサブセットであってもよい。しかしながら、2つ以上のオリゴ-またはポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合、参照配列は典型的に、少なくとも約10~15ヌクレオチド、より典型的に少なくとも約16~25ヌクレオチド、さらにより典型的に少なくとも約26~35ヌクレオチド、少なくとも約40ヌクレオチド、少なくとも約45ヌクレオチド、少なくとも約50ヌクレオチド、または少なくとも約60、70、80、90、もしくはさらに少なくとも約100程度のヌクレオチドを含む。好ましくは、高い相同断片が望まれる場合、2つの配列多くの場合、標的とプローブ配列と称されるの間の同一性パーセントは、少なくとも約80同一、好ましくは少なくとも約85同一、より好ましくは少なくとも約90同一、少なくとも約92同一、少なくとも約93同一、少なくとも約94同一、またはさらに少なくとも約95、96、97、98、もしくは99もしくはそれ以上である。2以上のオリゴ-またはポリヌクレオチド配列間の相同性のパーセンテージまたは同一性のパーセンテージは、例えば、PearsonおよびLipman1988により記載されているFASTAプログラム分析などの標準的な配列比較アルゴリズムの1つ以上を使用して、当業者により容易に決定され得る。本明細書で使用する場合、天然に発生するという用語は、対象物が天然に見出され得るという事実を指す対象物に適用される。例えば、天然源から単離され得、ヒトの手によって意図的に修飾されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然に発生する配列である。アミノ酸または核酸配列のいずれかを規定するために使用される場合、実質的に相補的という用語は、特定の対象配列、例えばオリゴヌクレオチド配列が、選択される配列の全てまたは一部と実質的に相補的であり、それにより、選択される配列をコードするmRNAの一部と特異的に結合することを意味する。したがって、典型的に配列はmRNA標的配列に体して高い相補性であり、配列の相補性部分にわたって約1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以下の塩基ミスマッチを有さない。実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応する標的核酸配列に対して約80超の相補性、約85超の相補性、約90超の相補性、またはさらに約95超の相補性または完全一致のであり、より好ましくはオリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応する核酸配列に対して約96超またはそれより高い相補性である。特定の態様において、上記のように、本発明の実施に使用するためにさらにより実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有することが望ましく、そのような場合、オリゴヌクレオチド配列は、設計したオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが特異的に結合する標的核酸配列の全てまたは一部に対して約96超、97超、98超、99超、またはさらに100相補的である。開示される配列のいずれかの類似性パーセントまたは相補的パーセントは、例えば、UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroupUWGCGから入手可能であるGAPコンピュータプログラム、バージョン6.0を使用して配列情報を比較することにより決定されてもよい。GAPプログラムはNeedlemanおよびWunschのアラインメント法を利用する。手短に述べると、GAPプログラムは、2つの配列の短い方の記号の全数で割った、類似している並べられた記号すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸の数として類似性を定義する。GAPプログラムについての好ましいデフォルトパラメータには以下が挙げられる:1ヌクレオチドについての単項比較マトリクス同一性について1および非同一性について0の値を含む、およびGribskovらの加重比較マトリクス、2各ギャップについて3.0のペナルティおよび各ギャップにおける各記号について追加の0.10のペナルティ、ならびに3エンドギャップについてペナルティなし。多くの場合、配列が正確に一致する、すなわちオリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列に完全に相補的であり、したがって、相補的ストレッチに沿ってミスマッチがないことが望まれ得る。したがって、高い相補的プライマーまたはプローブ配列は典型的に、複数のポリヌクレオチドの標的配列領域とかなり特異的に結合するので、PCR、qPCR、RT-qPCR、またはRT-qPCR/FRETなどによる標的配列の増幅を誘導するのに非常に効果的である。増幅反応混合物とは、1つ以上の選択された標的核酸配列複数も含むを増幅するのに必要な1種以上の種々の試薬を含む水溶液を指す。そのような混合物としては、限定されないが、1種以上の酵素、1種以上の水性緩衝液、1種以上の塩、1つ以上の標的核酸複数も含む、および複数の慣用のヌクレオチド三リン酸が挙げられる。文脈に応じて、混合物は完全または不完全のいずれかの増幅反応混合物であってもよい。増幅反応は、標的核酸配列の集団を生成するためにそのような配列を増幅させる任意のインビトロ法を指す。慣用の増幅方法としては、限定されないが、PCR、DNAリガーゼ、Qβレプリカーゼ、RNA転写ベースの増幅システムなどが挙げられる。本明細書で使用する場合、増幅試薬という用語は、選択された増幅反応を実施するために使用される種々の緩衝液、酵素、プライマー、ヌクレオシド三リン酸慣用および非慣用の両方、プローブを指す。本明細書で使用する場合、増幅するまたは増幅とは典型的に、標的核酸の指数関数的増加を指し、本明細書で使用される場合、核酸の選択標的配列の数の直線的および指数関数的の両方の増加を表す。実質的に結合するとは、オリゴヌクレオチド間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、PCRポリメラーゼの所望のプライミングを達成するためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを減少させることによって調整され得るわずかなミスマッチを包含する。本明細書で使用する場合、ビオチン化とは、検出アッセイにおけるストレプトアビジンとの反応のためにオリゴヌクレオチドの5’末端に共有結合したビオチン部分を指す。核酸に関して、結合する、結合している、結合および結合したという用語は、相補的なワトソン-クリック塩基対による2つ以上の核酸配列のハイブリダイゼーションを指す。本明細書で使用する場合、核酸とは、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、他に限定しない限り、天然に発生するヌクレオチドと同様の方法で機能し得る天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。ヌクレオチドポリメラーゼは、ヌクレオシド三リン酸前駆体の集団由来のDNAまたはRNAの合成を触媒できる酵素である。本発明の増幅反応において、ポリメラーゼは、鋳型依存性であり、典型的に形成されるポリマーの21端部から伸長する。好ましい適用において、利用されるポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼである。本明細書で使用する場合、プライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマー複数も含むとは、天然または合成に関わらず、適切な緩衝液中および適切な温度で、核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成が開始される条件下すなわち、4つの異なるヌクレオチド三リン酸、およびDNAポリメラーゼもしくは逆転写酵素などの重合のための因子の存在下でDNA合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドを指す。本発明に関して、プライマーは好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチド、好ましくは増幅の最大効率のための一本鎖である。当業者に公知のように、このようなプライマーは標的鋳型の正確な配列を反映することを必要としないが、配列に対して十分に相補的であるが、適切な反応条件下で鋳型に対するハイブリダイゼーションすなわち結合を可能にするべきである。本明細書で使用する場合、修飾された生ワクチンは、典型的に、疾患を生じるその能力を弱めるが、後で哺乳動物に投与される場合、疾患または感染に対して防御するその能力を保持するために組織培養細胞中で継代することによって変更されるウイルスを含むワクチンである。病原体という用語は、例えば、ウイルス、プリオン、原生動物、寄生生物、および細菌、酵母、カビ、真菌などの微生物を含む、任意の種類の感染因子として本明細書に定義される。本明細書で使用する場合、個体また交換可能に宿主、被験体、レシピエント、患者などとも称されるという用語は、1種以上の医薬組成物または本明細書に開示されるワクチン製剤を受容できる任意の動物を指す。好ましくは、被験体は、任意の動物種および好ましくは哺乳動物種を示すことを意図する脊椎動物である。特定の実施形態において、個体は好ましくは、限定されないが、家畜、動物標本、外来動物、およびコンパニオンアニマル、ペット、および獣医師の介護の下での任意の動物を含む、非ヒト霊長類、ウシ、イヌ、ヤギcaprines、ケビンcavines、カラス、エピネepines、ウマ、ネコ科、ヤギhircines、ウサギlapines、ウサギleporines、オオカミ、ヒツジ、ブタ、ラシーヌracines、キツネを含む、任意の哺乳動物宿主である。本明細書で使用する場合、ワクチンという用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの動物に投与できる形態の本発明の免疫原性組成物を含有する組成物または製剤を指す。典型的に、本発明のワクチンは、本明細書に開示され、それを必要とする動物に投与するために製剤化される免疫原性組成物1種以上の修飾された生ウイルス粒子またはその複数のうちの1つ以上を含む。そのような組成物は、限定されないが、水性ビヒクル中で調製されたもの、および後で、投与前に慣用の薬学的に許容可能なビヒクル例えば無菌食塩水または同様の緩衝化水溶液中で再水和または懸濁される凍結、フリーズドライ、凍結乾燥、または脱水形態を含む、任意の適切な製剤であってもよい。このような形態において、本発明のワクチン組成物は、感受性動物におけるウイルスおよび/または微生物感染の1つ以上の病態または1つ以上の症状を予防、管理または処置するための本明細書に開示される方法またはワクチン接種レジメンの1つ以上において容易に利用され得る簡便な単回または複数回アリコートで製造され得る。本明細書で使用される場合、例えばという用語は、例示のためだけに使用され、限定することを決して意図せず、したがって、本明細書中で明確に列挙されたそれらの項目のみに言及していると解釈されるべきではない。本明細書で使用する場合、標的配列または標的ヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ活性を有する酵素がプライマー配列を伸長でき、それにより、相補鎖を複製できる条件下で前記プライマー配列の1つがハイブリダイズする任意のヌクレオチド配列を含む。核酸分子典型的にDNAからなるは宿主細胞内で複製でき、および/または結合したセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントに作動可能に連結され得る。プラスミド、コスミド、またはウイルスが例示的なベクターである。プライマーまたはプライマー配列は、相補的鋳型核酸鎖標的配列と選択的にハイブリダイズし、鋳型鎖を複製するためのヌクレオチドの付加のための開始点として機能する任意の核酸配列またはセグメントを含んでもよい。本発明のプライマー配列は、標識されてもよいか、または増幅産物の検出および/もしくは分析を可能にする他の修飾を含有してもよい。標的DNA配列のポリメラーゼにより媒介される複製のための開始因子として機能することに加えて、プライマー配列はまた、鋳型RNAの対応するDNAへの逆転写のために使用されてもよい。本明細書で使用される場合、蛍光共鳴エネルギー転移対またはFRET対とは、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアを含むフルオロフォアの対を指し、そのドナーフルオロフォアは共鳴エネルギーをアクセプターフルオロフォアに転移できる。好ましい蛍光共鳴エネルギー転移対において、ドナーフルオロフォアの吸収スペクトルは実質的にアクセプターフルオロフォアの吸収スペクトルと重複しない。本明細書で使用される場合、ドナーオリゴヌクレオチドプローブとは、FRET対のドナーフルオロフォアで標識されるオリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、アクセプターオリゴヌクレオチドプローブとは、FRET対のアクセプターフルオロフォアで標識されるオリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、FRETオリゴヌクレオチド対は典型的に、アンカーまたはドナーオリゴヌクレオチドプローブおよびアクセプターまたはセンサーオリゴヌクレオチドプローブを含み、そのような対は、ドナーオリゴヌクレオチドプローブおよびアクセプターオリゴヌクレオチドプローブの両方がそれらの相補的標的核酸配列とハイブリダイズする場合、FRET関係を形成する。FRET対として使用するための許容可能なフルオロフォア対は当業者に周知であり、限定されないが、フルオレセイン/ローダミン、フィコエリトリン/Cy7、フルオレセイン/Cy5、フルオレセイン/Cy5.5、フルオレセイン/LCRed640、およびフルオレセイン/LCRed705を含む。長年の特許法の慣例によれば、一つのaおよび一つのanという単語は、特許請求の範囲を含む本明細書に使用される場合、一つ以上も示す。以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を示すために含まれる。実施例中に開示された技術は本発明の実施において十分に機能するように発見された代表的な技術に従うので、本発明の実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができることが、当業者により理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲を逸脱せずに、多くの変更を開示された特定の実施形態において行うことができ、同じ結果または類似する結果が依然として得られることを、理解するべきである。多価ワクチンの成分についての効力アッセイプロトコル本実施例は、多価改変された生ウイルスMLVワクチンの個々のウイルス成分の効力を首尾よく決定するための定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応qPCRアッセイの使用を実証する。本発明者の同時係属の米国仮特許出願第61/427,361号において、本発明者は、BRDCおよび輸送熱に対して有効な6通りsix-wayすなわち、六価改変された、生ウイルスMLVワクチンを開発した。本実施例は、このようなワクチンの個々のウイルス成分を定量するのに有用なアッセイを説明する。本発明者は、このアッセイが、多価multivalentすなわち、多価polyvalentまたは多成分ワクチンにおいて遺伝的に関連のある株の個々の効力を決定する既存の方法に対して、特に有利であることを示す。六価MLVBRDCワクチンをモデルとして使用して、本発明者は、ワクチンが単一型のウイルスの3つの亜遺伝子型を含有した場合でさえも、このアッセイが個々のワクチン成分の効力を識別し、定量するのに効果的であることを実証した。このようなアッセイは、多価polyvalentワクチン製剤中のBVDV-1a、BVDV-1b、およびBVDV-2の存在を正確に定量するための新規かつより信頼できる方法を提供する。材料および方法細胞培養全ての培養物は、Freshney1987に記載されている従来の技術および供給物を用いて調製する。培養物中で典型的な上皮様形態を示すTVL-ウシ腎細胞株を、全ての培養アッセイに用いる。BVDV-1bMasterSeed培養物出願人の同時係属の米国仮特許出願第61/427,361号において指定されたTVLBVDV1bMS04/27/2007DW3-095を、米国特許規則第1.14条および米国特許法第122条下で権限が与えられた米国特許商標庁の長官により決定された者に対して、この特許出願の係属中にその培養物を利用する機会を得られることを保証するという条件で寄託した。この寄託物は、対象の出願の対応出願またはその派生出願が提出される国における外国特許法による要求に応じて入手可能である。ただし、寄託物の入手可能性は、政府の措置により付与された特許権を逸脱して対象の発明を実施するライセンスを構成するものではないことが、理解されるべきである。対象の培養寄託物は保管され、微生物の寄託に関するブタペスト条約の規定に従って公衆が入手可能のようにされる。すなわち、対象の培養寄託物は、寄託物の試料を片付ける最新の要求の後の少なくとも5年の期間、およびいずれの場合でも、寄託日の後または寄託された培養物を開示することが発令され得るあらゆる特許の実施可能期間の後の少なくとも30三十年の期間、それが生存可能でかつ汚染されずに維持するのに必要な細心の注意をはらって保管される。寄託者は、寄託物の状態が原因で、寄託物が要求された際に試料を播種できない状態にある場合、寄託物を交換する義務を認める。対象の培養寄託物の公衆への入手可能性に関する全ての制限は、特許付与により培養寄託物を開示する際に、決定的に解除される。TVLBVDV1bMS04/27/2007DW3-095ウイルスの寄託物は、10801UniversityBlvd.,Manassas,VA,20110-2209,USAにあるアメリカンタイプカルチャーラボラトリーAmericanTypeCultureLaboratoryの特許寄託物の永久コレクションへと、ブタペスト条約の条件下で2010年12月21日に、登録された。ここで、TVLBVDV1bMS04/27/2007DW3-095ウイルスの寄託物は、貯蔵所によりアクセッション番号ATCCPTA-11553が割り当てられた。プライマー/プローブセットの特異性RNAを、以下の米農務省USDA認定ウイルス種の各々からのウイルス性液体より抽出する:BVDV-1aシンガー株、BVDV-1bTGAC株、BVDV-2125、PI3ライジンガーSF-4、およびBRSVN375それがDNAウイルスであるため、抽出プロセスはBHV-1[クーパー株]については行われない。RNAqueous登録商標-4PCRAmbion;Austin,TX,USAを用いて抽出を行う。RNAウイルス試料の各々を、TaqMan登録商標ワンステップRT-PCR化学を用いて、6つのプライマー/プローブセットの各々について別個のRT-qPCR反応において鋳型試料として用いる。DNAウイルスBHV-1をまた、上述の6つのプライマー/プローブセットの各々との別個のqPCR反応において鋳型試料として用いる。六価ワクチンの6つのウイルス画分全てに対するBRSVプライマー/プローブセットの分析は、他のウイルス画分のいずれかとのプライマー/プローブセットの各々の交差反応がないことを示す。qPCRアッセイqPCRアッセイをAppliedBiosystems7500リアルタイムPCRシステムを用いて実施する。オリゴヌクレオチドプライマーおよび標識された分子プローブ以下のカスタムTaqMan登録商標プローブおよびウイルス特異的なフォワードおよびリバースプライマー対を、AppliedBiosystemsFosterCity,CA,USAにより製造した。BVDV-1b第1:フォワードプライマー:5’-CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC-3’配列番号1;リバースプライマー:5’-TGCCCACAGCACATCTTAACC-3’配列番号2;およびBVDV-1b検出プローブ:5’-TCACCTGGACGACCC-3’配列番号3。BVDV-1b第2:第2のフォワードプライマー:5’-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3’配列番号19;第2のリバースプライマー:5’-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3’配列番号20;および第2のBVDV-1b検出プローブ:5’-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3’配列番号21。BVDV-1b第1が受容可能な結果を提供している一方、BVDV-1b第2はより良好な結果を示した。BRSV:フォワードプライマー:5’-GCAATGCTGCAGGACTAGGTATAAT-3’配列番号4;リバースプライマー:5’-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT-3’配列番号5;およびBRSV検出プローブ:5’-AAGACTTGTATGATGCTGCCAA-3’配列番号6。BVDV-1a:フォワードプライマー:5’-GGTCGCCCAGGTAAAAGCA-3’配列番号7;リバースプライマー:5’-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3’配列番号8;およびBVDV-1a検出プローブ:5’-AACCGACTGTTACGAATAC-3’配列番号9。BVDV-2:フォワードプライマー:5’-GCTAGCCATGCCCTTAGTAGGAC-3’配列番号10;リバースプライマー:5’-GACGAGTCCCCTGTACTCAGG-3’配列番号11;およびBVDV-2検出プローブ:5’-CAGTGAGTCCATTGGATGG-3’配列番号12。PI3:フォワードプライマー:5’-GGAGACCAAGACCAAGGAGATG-3’配列番号13;リバースプライマー:5’-CGTCTGCCCATGCATAAGG-3’配列番号14;およびPI3検出プローブ:5’-ACCTCGGTCATCCATAG-3’配列番号15。BHV-1:フォワードプライマー:5’-CCATGTTAGCGCTCTGGAACC-3’配列番号16;リバースプライマー:5’-CGTCTTTACGGTCGACGACTCC-3’配列番号17;およびBHV-1検出プローブ:5’-ACGGACGTGCGCGAA-3’配列番号18。一価ワクチンについての効力アッセイ以下のアッセイの各々についてのプロトコルは、AppliedBiosystems7500比較閾値サイクルComparativeThresholdCycleCT法を利用して、滴定プレートの個々のウェルが同等の参照ウェルよりも多くの量のウイルスを含むかどうかを決定する。ほとんどのウイルス試料は、PCRアッセイにより検出できるいくつかの生きられないウイルス分子を含むので、潜在的な偽陽性結果を示す。この問題は、細胞を含まない参照プレートを用いることで解決する。試料を、ウイルス複製の可能性を除外するために細胞を含まないアッセイプレート中でのように正確に参照プレート中に希釈する。参照プレートを使用して、各アッセイにおける各々のウェルについてのベースラインまたはバッググラウンドCT値を生成する。アッセイプレート上のウェルが対応するバッググラウンドウェルよりも高いCT値を有する場合、ウイルス複製は起こり、ウェルは陽性とみなされる。CT値がウェルについて決定されない場合またはCT値がバックグラウンドCT値と同等である場合、ウェルは陰性とみなされる。多価ワクチンについての効力アッセイIBR/BVDV-1a、-1b、-2/PI3/RSV六価ワクチン改変された生ウイルスの試験的連続物を上述のように調製した。手短に述べると、BHV-1クーパー株、BVDV-1aシンガー株、BVDV-1bTGAC株、BVDV-2125、PI3ライジンガーSF-4、およびBRSVN375を、TVL-BK細胞株20代継代中で増殖させた。個々の画分を10代継代で採取し、6通りの生成物中に一緒に混ぜた。6通りのワクチンの各画分についての効力試験は、適切な中和抗血清の添加により本明細書に記載されるように実施してもよい。各ウイルス画分のTCID50を、CPE/FA/IFA結果に基づいて決定し、RT-qPCR/qPCRに基づいた結果と比較する。BVDV-1A、BVDV-1B、およびBVDV-2効力試験一価BVDV-1a、BVDV-1bおよびBVDV-2試料は、ワクチンSAM101中のウシウイルス性下痢ウイルスを滴定するための補足アッセイ法に従って別々に滴定できる。手短に述べると、アッセイを、上述したCPEおよび/またはFA/IFAに基づいた力価計算に使用されているプレートの1つを用いて2連で実施する。他のプレートを、RT-qPCRに基づいた力価を決定するために使用する。各々のウイルスについて上述のように細胞を含まない参照プレートが含まれる。PI3効力試験PI3についての効力試験を、CPEに基づいた力価計算のために使用されているプレートの1つを用いて2連で実施する。他のプレートを、RT-qPCRにより決定した場合のPI3の比較CT値に基づいて力価を決定するために使用する。上述のように細胞を含まない参照プレートが含まれる。BRSV効力試験BRSVについての効力試験を2連で実施し、そのプレートの1つは上記のCPEに基づいた力価計算のために使用し、残りのプレートはRT-qPCRにより決定した場合のBRSVの比較CT値に基づいた力価を決定するために使用する。上記で説明したように、細胞を含まない参照プレートもまた、このアッセイに含まれる。BHV効力試験従来の目視観測およびプラーク計数を個々のウェルのqPCR分析に置き換えることにより、BHVについての効力試験を96ウェルフォーマットで実施する。このアッセイは2連で実施し、そのプレートの1つは個々のウェル希釈物中のCPEの有無に基づいた力価計算のために使用し、一方、残りのプレートはQPCRにより決定した場合のBHVの比較CT値に基づいた力価を計算するために使用する。上記のように細胞を含まない参照プレートが含まれる。試験結果上述の試験からの結果を以下に与える。表1:調査中の6種のウイルスそれぞれからの既知のウイルス試料を、RT-PCRBVD1aプローブ-プライマーセット1Appに対して実行した。BVD1aプローブ-プライマーセットは、調査中の他のウイルスのいずれかとの交差反応を有さなかった。nd=希釈なし、pp=プローブ-プライマーセット表2:RT-PCRBVD1aプローブ-プライマーセットとの反応からのBVD1a1Aの対応するCTスコアでの既知のTCID50でのBVD1a1A対数希釈、および各希釈についての推定TCID50値。nd=希釈なし、pp=プローブ-プライマーセット表3:調査中の6種のウイルスそれぞれからの既知のウイルス試料を、RT-PCRBRSVプローブ-プライマーセットppに対して実行した。BRSVプローブ-プライマーセットは、調査中の他のウイルスのいずれかとの交差反応を有さなかった。nd=希釈なし、pp=プローブ-プライマーセット表4:RT-PCRBRSVプローブ-プライマーセットとの反応からのBRSVの対応するCTスコアでの既知のTCID50でのBRSVの対数希釈、および各希釈についての推定TCID50値。nd=希釈なし、pp=プローブ-プライマーセット表5:調査中の6種のウイルスそれぞれからの既知のウイルス試料を、RT-PCRBVD1bプローブ-プライマーセット1Bppに対して実行した。BVD1bプローブ-プライマーセットは、調査中の他のウイルスのいずれかとの交差反応を有さなかった。nd=希釈なし、pp=プローブ-プライマーセット、=ポジティブコントロール表6:RT-PCRBVD1bプローブ-プライマーセットとの反応からのBVD1b1Bの対応するCTスコアでの既知のTCID50でのBVD1b1Bの対数希釈、および各希釈についての推定TCID50値。nd=希釈なし、pp=プローブ-プライマーセット表7:調査中の6種のウイルスそれぞれからの既知のウイルス試料を、RT-PCRPI3プローブ-プライマーセットに対して実行した。PI3プローブ-プライマーセットは、調査中の他のウイルスのいずれかとの交差反応を有さなかった。nd=希釈なし、pp=プローブ-プライマーセット表8:RT-PCRPI3プローブ-プライマーセットとの反応からのPI3の対応するCTスコアでの既知のTCID50でのPI3の対数希釈、および各希釈についての推定TCID50値。nd=希釈なし、pp=プローブ-プライマーセット表9:調査中の6種のウイルスそれぞれからの既知のウイルス試料を、RT-PCRBHVプローブ-プライマーセットに対して実行した。BHVプローブ-プライマーセットは、調査中の他のウイルスのいずれかとの交差反応を有さなかった。nd=希釈なし、pp=プローブ-プライマーセット表10:RT-PCRBHVプローブ-プライマーセットとの反応からのBHVの対応するCTスコアでの既知のTCID50でのBHVの対数希釈、および各希釈についての推定TCID50値。nd=希釈なし、pp=プローブ-プライマーセット参考文献以下の参考文献は、それらが例示的な手順または本明細書に記載されているものに対する他の詳細な補足を提供する範囲で、本明細書に対する参照を表すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれるCaruthersらによる米国特許第4,415,732号Caruthersらによる米国特許第4,458,066号Mullisらによる米国特許第4,683,195号Mullisらによる米国特許第4,683,202号Kosterらによる米国特許第4,725,677号Caruthersらによる米国特許第4,973,679号Molkoらによる米国特許第4,980,460号Piconeらによる米国特許第5,614,388号Agrawaletal.,Nucl.AcidsRes.,18:5419-5423,1990Baker,J.C.,Theclinicalmanifestationsofbovineviraldiarrheainfection,Vet.Clin.N.Am.FoodAnim.Pract.,11:425-445,1995.Baker,J.C.,Werdin,R.E.,Ames,T.R.,Markham,R.J.,andLarson,V.L.,Studyontheetiologicroleofbovinerespiratorysyncytialvirusinpneumoniaofdairycalves,J.Am.Vet.Med.Assoc.,1891:66-70,1986.Barber,D.M.,Nettleton,P.F.,andHerring,J.A.,Diseaseinadairyherdassociatedwiththeintroductionandspreadofbovinediarrhoeavirus,Vet.Rec.,11718:459-464,1985.BeaucageandIyer,Tetrahedron,48:2223-2311,1992.Becher,P.,Konig,M.,Paton,D.J.,andThiel,H.J.,Furthercharacterizationofborderdiseasevirusisolates:evidenceforthepresenceofmorethanthreespecieswithinthegenuspestivirus,Virology,2091:200-206,1995.Collett,M.S.,R.Larson,S.K.Belzer,andE.Retzel,Proteinsencodedbybovineviraldiarrheavirus:thegehomicorganizationofapestivirus,Virology,1651:200-208,1988.Elbers,K.,N.Tautz,P.Becher,D.Stoll,T.Rumenapf,andH.J.Thiel,ProcessinginthepestivirusE2-NS2region:identificationofproteinsp7andE2p7,J.Virol.,706:4131-4135,1996.Fergen,B.J.,EstimatinganInterventionEffectonOutcomeSeverity,USDACenterforVeterinaryBiologics,Ames,IA,USA;Personalcommunication,2004.Finney,D.J.,Statisticalmethodinbiologicalassay,3rdEd.,CharlesGriffinandCompanyLtd.,London,1978.Flores,E.F.,Ridpath,J.F.,Weiblen,R.etal.,PhylogeneticanalysisofBrazilianbovineviraldiarrheavirustype2BVDB-2isolates:evidenceofsubgenotypewithinBVDV-2,VirusRes.,87:51-60,2002.Freshney,R.I.,CultureofAnimalCells,AManualofBasicTechnique,SecondEdition,DeptofMedicalOncology,UniversityofGlasgow,AlanR.Liss,Inc.,Publisher,NewYork,NY,USA,1987.Fulton,R.W.,Hessmand,B,Johnson,B.J.etal.Evaluationofdiagnostictestusedfordetectionofbovineviraldiarrheavirusandprevalenceofsubtypes1a,1band2ainpersistentlyinfectedcattleenteringafeedlot,J.Am.Vet.Med.Assoc.,2284:578-584,2006.Gillespie,J.H.,J.A.Baker,andK.McEntee,Acytopathogenicstrainofvirusdiarrheavirus,CornellVet.,50:73-79,1960.Hofmann,M.A.,Brechtbuhl,K.,andStauber,N.,RapidcharacterizationofnewpestivirusstrainsbydirectsequencingofPCR-amplifiedcDNAfromthe5’non-codingregion,Arch.Virol.,139:217-229,1994.Hollandetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7276-7280,1991.Liess,B.,H.R.Frey,H.Kittsteiner,F.Baumann,andW.Neumann,Bovinemucosaldisease,animmunobiologicalexplainablelatestageofBVD-MDvirusinfectionwithcriteriaofa‘slowvirusinfection,’Dtsch.Tieraerzti.Wschr.,812:481-487,1974.Malmquist,W.A.,Bovineviraldiarrheamucosaldisease:etiology,pathogenesis,andappliedimmunity,J.Am.Vet.Med.Assoc.,152:763-768,1968.McNultyM.S.,AllanG.M.,Applicationofimmunofluorescenceinveterinaryviraldiagnosis,In:Recentadvancesinvirusdiagnosis,McNultyMS,McFerranJBEds.,pp.15-26.MartinusNijhoff,TheHague,Netherlands,1984.Olafson,P.,A.D.,MacCallum,andF.H.Fox,Anapparentlynewtransmissiblediseaseofcattle,CornellVet.,36:205-213,1946.Ozakietal.,Nucl.AcidsRes.,20:5205-5214,1992.Paton,D.J.,Pestivirusdiversity,J.Comp.Pathol.,1123:215-236,1995.Pellerin,C.,J.vandenHurk,J.Lecomte,andP.Tussen,Identificationofanewgroupofbovineviraldiarrheavirusstrainsassociatedwithsevereoutbreaksandhighmortalities,Virology,2032:260-268,1994.Ramsey,F.K.,andW.H.Chivers,Mucosaldiseaseofcattle,NorthAm.Vet.,34:629-633,1953.Ranheim,T,Mathis,P.K.,Joelsson,D.B.etal.,DevelopmentandapplicationofaquantitativeRT-PCRpotencyassayforapentavalentrotaviru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