黄色ブドウ球菌ワクチンであって:挿入されたコンセンサス配列DEXNZSTを含むタンパク質であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい前記タンパク質;該コンセンサス配列に結合された少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖;及び任意に医薬として許容し得る担体又はアジュバント:を含有する、前記黄色ブドウ球菌ワクチン。前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖5型を含む、請求項1記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖8型を含む、請求項1記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、メチシリン耐性耐性黄色ブドウ球菌株を標的化する、請求項1~3のいずれか一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。前記タンパク質が、緑膿菌外毒素である、請求項1~4のいずれか一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌α溶血素である、請求項1~4のいずれか一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌クランピング因子Aである、請求項1~4のいずれか一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、下記構造を含む、請求項5~7のいずれか一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、下記構造を含む、請求項5~7のいずれか一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン:。前記挿入されたコンセンサス配列を2種以上及び前記黄色ブドウ球菌多糖を2種以上含む、請求項1~7のいずれか一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。前記黄色ブドウ球菌多糖が、異なる黄色ブドウ球菌株を標的化する多糖を含む、請求項10記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。前記黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖5型及び莢膜多糖8型を含む、請求項11記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。組換えNグリコシル化タンパク質であって:少なくとも1つの挿入されたコンセンサス配列DEXNZSTを含むタンパク質であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい前記タンパク質;及び該コンセンサス配列に結合された少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖:を含む、前記組換えNグリコシル化タンパク質。前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖5型を含む、請求項13記載の組換えNグリコシル化タンパク質。前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖8型を含む、請求項13記載の組換えNグリコシル化タンパク質。前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、メチシリン耐性耐性黄色ブドウ球菌株を標的化する、請求項13~15のいずれか一項記載の組換えNグリコシル化タンパク質。前記タンパク質が、緑膿菌外毒素である、請求項13~16のいずれか一項記載の組換えNグリコシル化タンパク質。前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌α溶血素である、請求項13~16のいずれか一項記載の組換えNグリコシル化タンパク質。前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌クランピング因子Aである、請求項13~16のいずれか一項記載の組換えNグリコシル化タンパク質。前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、下記構造を含む、請求項17~19のいずれか一項記載の組換えNグリコシル化タンパク質:。前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、下記構造を含む、請求項17~19のいずれか一項記載の組換えNグリコシル化タンパク質:。前記挿入されたコンセンサス配列を2種以上及び前記黄色ブドウ球菌多糖を2種以上含む、請求項13~19のいずれか一項記載の組換えNグリコシル化タンパク質。前記黄色ブドウ球菌多糖が、異なる黄色ブドウ球菌株を標的化する多糖を含む、請求項22記載の組換えNグリコシル化タンパク質。前記黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖5型及び莢膜多糖8型を含む、請求項23記載の組換えNグリコシル化タンパク質。グラム陽性菌由来の少なくとも1種のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列;グラム陰性菌由来の少なくとも1種のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列;タンパク質をコードしているヌクレオチド配列;及びオリゴ糖転移酵素をコードしているヌクレオチド配列:を含む、グラム陰性宿主原核生物。前記グラム陽性菌が、黄色ブドウ球菌である、請求項25記載の宿主原核生物。前記グラム陰性菌が、緑膿菌である、請求項25又は26のいずれか一項記載の宿主原核生物。前記黄色ブドウ球菌が、莢膜多糖5型株である、請求項25~27のいずれか一項記載の宿主原核生物。前記黄色ブドウ球菌が、莢膜多糖8型株である、請求項25~27のいずれか一項記載の宿主原核生物。前記黄色ブドウ球菌が、メチシリン耐性株である、請求項25~29のいずれか一項記載の宿主原核生物。異なるグラム陽性菌株由来の少なくとも2種のグリコシル転移酵素を含む、請求項25~30のいずれか一項記載の宿主原核生物。前記タンパク質が、緑膿菌外毒素である、請求項25~31のいずれか一項記載の宿主原核生物。前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌α溶血素である、請求項25~31のいずれか一項記載の宿主原核生物。前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌クランピング因子Aである、請求項25~31のいずれか一項記載の宿主原核生物。前記宿主生物が、大腸菌である、請求項25~34のいずれか一項記載の宿主原核生物。第一のグラム陰性種の細菌を改変する方法であって:標的としてグラム陽性菌を選択する工程;少なくとも3つのモノマーを含む、該グラム陽性菌により生成された多糖の第一の反復単位を同定する工程;該第一の反復単位と同じモノマーを少なくとも2つ含む第二の反復単位を含む第二のグラム陰性種の細菌により生成された多糖を同定する工程;該第一のグラム陰性種の細菌へ、a該第二の反復単位;及びb該第二の反復単位には存在しない該第一の反復単位のモノマー:を含む三糖を集成するグリコシル転移酵素をコードしている1種以上のヌクレオチド配列を挿入する工程:タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を挿入する工程;並びにオリゴ糖転移酵素をコードしているヌクレオチド配列を挿入する工程:を含む、前記方法。前記タンパク質が、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列DEXNZSTを含み、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい、請求項36記載の方法。前記グラム陽性菌が、黄色ブドウ球菌である、請求項36又は37記載の方法。本発明の実施態様に従い、今回グラム陽性生体由来のLPS多糖は、グラム陰性生体において生成されることが示された。本発明者らは、これは先行技術からの重要で且つ著しい逸脱を表す新規の結果であると考えている。本発明の範囲内の核酸は、配列表に含まれた本発明の核酸により例示されている。宿主細胞における発現が可能である免疫原性成分又はそれらの一部をコードしている核酸はいずれも、本発明において使用することができる。以下の配列の説明は、本出願を通じて使用されるいくつかの用語の理解を促進するために提供されており、且つ本発明の実施態様を限定するものとして構成されるものではない。配列番号1は、EcoRI部位内に緑膿菌PAO103由来のO11O抗原配列を含む、pLAFR1、相補鎖を示す。配列番号2は、相同組換えによりwbjAwzyと交換するcap5HIJ遺伝子を伴うpLAFR1O11に対応するCP5キメラクラスターを含むpLAFR1を示す。挿入された配列は、相同組換えされたクローンの選択のためのcatカセットも含む。配列番号3は、相同組換えによりwbjAwzyと交換するcap5HIJ遺伝子、及びcap5Jとcatカセット間にクローニングされたcap5Kを伴うpLAFR1O11に対応する、cap5Kフリッパーゼ遺伝子を伴うCP5キメラクラスターを含むpLAFR1を示す。配列番号4は、wbjAwzyと交換するcap8KHIJ遺伝子を伴うpLAFR1O11に対応する、フリッパーゼ遺伝子を含むCP8キメラクラスターを含むpLAFR1を示す。挿入された配列は、相同組換えされたクローンの選択のためのcatカセットも含む。配列番号5は、HlaH35L生成のための発現プラスミドを示している。HlaH35LをコードしているORFは、pEC415のNdeISacIにクローニングされている。配列番号6は、HlaH35L部位202生成のための発現プラスミドを示している。このORFは、大腸菌由来のN末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸202位の周りの糖化部位、及びC末端Hisタグをコードしている。この構築体は、pEC415上でNheISalIにクローニングされる。配列番号7は、HlaH35L部位238生成のための発現プラスミドを示している。このORFは、大腸菌由来のN末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸238位の周りの糖化部位、及びC末端Hisタグをコードしている。前述の構築体は、pEC415上でNheISalIにクローニングされる。配列番号8は、HlaH35L部位272生成のための発現プラスミドを示している。このORFは、大腸菌由来のN末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸272位の周りの糖化部位、及びC末端Hisタグをコードしている。前述の構築体は、pEC415上でNheISalIにクローニングされる。配列番号9は、ClfA生成のための発現プラスミドを示している。この遺伝子は、化学的に合成され、且つpEC415発現ベクター内のNdeISacIへクローニングされている。配列番号10は、ClfA部位290生成のための発現プラスミドを示している。このORFは、大腸菌由来のN末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸290位の周りの糖化部位、及びC末端Hisタグをコードしている。前述の構築体は、pEC415上でNheISalIにクローニングされている。配列番号11は、ClfA部位327生成のための発現プラスミドを示している。このORFは、大腸菌由来のN末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸327位の周りの糖化部位、及びC末端Hisタグをコードしている。前述の構築体は、pEC415上でNheISalIにクローニングされている。配列番号12は、ClfA部位532生成のための発現プラスミドを示している。このORFは、大腸菌由来のN末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸532位の周りの糖化部位、及びC末端Hisタグをコードしている。前述の構築体は、pEC415上でNheISalIにクローニングされている。配列番号13は、シグナル配列並びに260位及び402位に2つのグリコシル化部位を有する、遺伝子的に解毒されたEPA組換え体のアミノ酸配列を示している。配列番号14は、シグナル配列を有さず、並びに241位及び383位に2つのグリコシル化部位を有する、遺伝子的に解毒されたEPA組換え体のアミノ酸配列を示している。配列番号15は、NheISalIを介しpEC415へクローニングされたAcrAをコードしているORFを示している。配列番号16は、HlaH35L部位130生成のための発現プラスミドを表している。このORFは、大腸菌由来のN末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸130位の周りの糖化部位、及びC末端Hisタグをコードしている。前述の構築体は、NheISalIでpEC415へクローニングされている。配列番号17は、cap5Kフリッパーゼ、それに続く大腸菌血清型O121のgalFとwbqAの間のインタージーンDNA配列並びにpglBORFからなるpglB発現カセットを伴う、CP5産生遺伝子クラスターを示している。この挿入断片は、pLAFR1のEcoRI部位にクローニングされる。配列番号18は、cap8Kフリッパーゼ、それに続く大腸菌血清型O121のgalFとwbqAの間のインタージーンDNA配列並びにpglBORFからなるpglB発現カセットを伴う、CP8産生遺伝子クラスターを示している。この挿入断片は、pLAFR1のEcoRI部位にクローニングされる。配列番号19は、cap8Kフリッパーゼ、それに続く大腸菌血清型O121のgalFとwbqAの間のインタージーンDNA配列並びにpglBORFからなるpglB発現カセットを伴う、CP8産生遺伝子クラスターを示し、加えてこの配列は、SfaAIBspTIへと、すなわち緑膿菌O11のwzxとcap8Hの間にクローニングされた大腸菌血清亜型O7のwzzの遺伝子を有する。この挿入断片は、pLAFR1のEcoRI部位にクローニングされる。配列番号20は、EPA及びwzzのための発現プラスミドを示している。この骨格は、耐性カセットが交換されているpACT3である。配列番号21は、pext21EcoSalにクローニングされた大腸菌血清型O7のwzzを示している。配列番号22は、実施例に示したペプチド配列を示している。配列番号23は、実施例に示したペプチド配列を示している。配列番号24は、X及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい、タンパク質コンセンサス配列DEXNZSTを示している。配列番号25は、グリコシル化部位を示している。配列番号26は、グリコシル化部位を示している。配列番号27は、EcoRIBamHI部位にクローニングされたpglBORFを含む発現プラスミドを示している。用語及び略語の説明は、本明細書において使用されるように以下に記載し、かつ当業者に公知の用途と一致している。これらの説明は、そのような用語及び略語の理解を促進するために提供され、かつ本発明の実施態様を限定するものとして構成されるものではない。AcrAとは、Cジェジュニ由来の糖タンパク質をいう。能動免疫とは、抗原への曝露後の免疫の誘導をいう。APCとは、抗原提示細胞をいう。Ampとは、アンピシリンをいう。菌血症とは、循環血中の生存可能な細菌の存在をいう。Cとは、補体をいう。CapAは、黄色ブドウ球菌CP5における鎖長の決定因子であると提唱されている酵素である。CapBは、黄色ブドウ球菌CP5における多糖鎖の長さの調節因子であると提唱されている酵素である。CapCは、黄色ブドウ球菌CP5における輸送タンパク質をコードしていると提唱されている酵素である。CapDは、46デヒドラターゼ活性を有する酵素であり、且つ黄色ブドウ球菌CP5において、前駆体UDPGlcNAcを、UDP2アセトアミド26ジデオキシDキシロ4ヘキスロースへ転換する。CapEは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDPDGlcNAcのUDP2アセトアミド26ジデオキシDリキソ4ヘキスロースへのエピマー化を触媒する、46デヒドラターゼ35エピメラーゼである。CapFは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDP2アセトアミド26ジデオキシDリキソ4ヘキスロースからUDPL6dTalNAcへの還元を触媒する、レダクターゼである。CapGは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDPL6dTalNAcからUDPLFucNAcへのエピマー化を触媒する、2エピメラーゼである。黄色ブドウ球菌CP5中のCapHは、Oアセチル転移酵素である。CP8中のCapHは、黄色ブドウ球菌CP5由来のCapIに類似した転移酵素である。黄色ブドウ球菌CP5中のCapIは、UDPManNAcAのキャリア脂質DFucNAcLFucNAcへの転移を触媒し、キャリア脂質DFucNAcLFucNAcManNAcAを生成するグリコシル転移酵素である。CP8中のCapIは、黄色ブドウ球菌CP5中のCapJに類似したポリメラーゼである。黄色ブドウ球菌CP5中のCapJは、ポリメラーゼである。CP8中のCapJは、黄色ブドウ球菌CP5中のCapHに類似したOアセチル転移酵素である。黄色ブドウ球菌CP5中のCapKは、フリッパーゼである。黄色ブドウ球菌CP8中のCapKは、CP5中のCapKに類似したフリッパーゼである。CapLは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDPLFucNAcのDFucNAcキャリア脂質上への転移を触媒し、キャリア脂質DFucNAcLFucNAcを生成する転移酵素である。CapMは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDPDFucNAcのキャリア脂質上への転移を触媒し、キャリア脂質DFucNAcを生成する転移酵素である。CapNは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDP2アセトアミド26ジデオキシDキシロ4ヘキスロースのUDPDFucNAcへの還元を触媒する4レダクターゼである。CapOは、黄色ブドウ球菌CP5における、UDPDManNAcのUDPManNAcAへの転換を触媒するデヒドロゲナーゼである。CapPは、黄色ブドウ球菌CP5における、UDPDGlcNAcのUDPDManNAcへのエピマー化を触媒する2エピメラーゼである。CFUとは、コロニー形成単位を指す。ClfAとは、細胞壁にアンカーされたタンパク質である、黄色ブドウ球菌クランピング因子Aを指す。コンジュゲートワクチンとは、多糖抗原のキャリアタンパク質への共有的結合により作製されたワクチンをいう。コンジュゲートワクチンは、抗菌性免疫反応及び免疫記憶を誘起する。乳児及び高齢者において、多糖抗原に対する防御免疫反応は、これらの抗原が、T細胞依存性反応を誘導するタンパク質とコンジュゲートされた場合に、誘導され得る。コンセンサス配列とは、その配列内に、N結合型糖タンパク質への炭水化物結合部位が認められる、アミノ酸の配列DEXNZSTをいい、ここでX及びZはプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい。莢膜多糖は、その天然の形状において、多糖の厚い粘膜様の層をいい、水溶性であり且つ通常酸性である。天然の莢膜多糖は、1個から数個の単糖モノマーの規則的反復単位からなる。CP5とは、黄色ブドウ球菌5型莢膜多糖又は血清型5型莢膜多糖を指す。CP8とは、黄色ブドウ球菌8型莢膜多糖又は血清型8型莢膜多糖を指す。DFucNAcとは、NアセチルDフコサミンを指す。ECAとは、腸内細菌共通抗原を指す。ELISAとは、試料中の抗体又は抗原の存在を検出するために、主に免疫学において使用される生化学技術である、酵素結合免疫吸着アッセイをいう。EPA又はEPArとは、無毒の組換え緑膿菌エキソプロテインAをいう。グライココンジュゲートワクチンとは、抗原性又は免疫原性オリゴ糖に結合されたタンパク質キャリアを含むワクチンをいう。グリコシル転移酵素とは、単糖単位の、活性化されたヌクレオチド糖からグリコシルアクセプター分子への転移に関して触媒として作用する酵素をいう。グラム陽性菌株とは、グラム染色により紫色に染まる細菌株をいう。グラム陽性菌は、ペプチドグリカンで生成された厚いメッシュ様の細胞壁を有する。グラム陰性菌株とは、ピンク色に染まる薄い層を有する細菌株をいう。グラム陰性菌は、脂質を含み、且つ細胞膜周辺腔により細胞壁から隔てられている、追加の外膜も有する。Hlaとは、黄色ブドウ球菌の分泌型膜孔形成毒素及び必須病原因子抗原であるα溶血素をいう。HlaH35Lとは、黄色ブドウ球菌由来のHla無毒のα毒素変異体である変異型をいう。ヒスチジンタグ、又はポリヒスチジンタグは、多くはタンパク質のN又はC末端にある、少なくとも5個のヒスチジン残基からなるタンパク質内のアミノ酸の一部分であり、ニッケルアフィニティカラムへの特異的結合により簡便且つ迅速な様式で精製するために使用される。IVとは、静脈内を指す。kDaとは、キロダルトンを指し、これは原子質量単位である。LFucNAcとは、NアセチルLフコサミンを指す。LPSとは、リポ多糖を指す。リポ多糖は、リポグリカンとしても知られ、共有結合により結合された脂質と多糖からなる大型分子であり;これらは、グラム陰性菌の外膜中に認められ、内毒素として作用し、且つ動物において強力な免疫反応を誘発する。ManNAcAとは、Nアセチルマンノサミンウロン酸を指す。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌株とは、より長期の入院、及びより多くの抗生物質投与につながる集中治療室でのより多くの感染症に関連している、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌株をいう。Nグリカン又はN結合型オリゴ糖とは、Nグリコシド結合を介してタンパク質のアスパラギン残基のεアミド窒素に結合されている、変動し得る組成の単糖、オリゴ糖又は多糖をいう。N結合型タンパク質グリコシル化とは、グリカンを、標的タンパク質のアスパラギン側鎖の窒素へ共有結合するプロセス又は経路をいう。O抗原又はO多糖とは、LPS内に含まれる反復グリカン重合体をいう。O抗原は、コアオリゴ糖に結合され、且つLPS分子の最も外側ドメインを構成している。オリゴ糖又は多糖とは、共有結合された炭水化物により形成されたホモ重合体又はヘテロ重合体をいい、且つグリコシド結合により一緒に結合された反復単位を含むが、これらに限定されるものではない。オプソニン食作用活性とは、補体及び特異的抗体の存在下での病原体の食作用をいう。血清抗体のインビトロオプソニン食作用活性は、インビボにおける抗体の機能活性を表し、従って防御免疫と相関していると考えられる。OTase又はOSTとは、新生タンパク質又は折り畳みタンパク質のコンセンサス配列において、オリゴ糖又は多糖のアスパラギン残基への機構的に独自かつ選択的な転移を触媒する、オリゴ糖転移酵素をいう。受動免疫とは、一個体から別の個体への、既に産生された抗体の形での活性のある体液性免疫の移入である。細胞膜周辺腔とは、グラム陰性菌の内側細胞膜と外側外膜の間の空間をいう。PMNとは、ヒト及び多くの哺乳動物の末梢血内で最も豊富な白血球細胞である多形核好中球をいう。タンパク質キャリアとは、それにオリゴ糖又は多糖が結合されるコンセンサス配列を含むタンパク質をいう。RUとは、個々の単糖のオリゴ糖又は多糖への集成により合成された特異的多糖を構成する反復単位を指す。シグナル配列とは、タンパク質を異なる位置へと方向付けるタンパク質のN末端の、短いのペプチドをいう。UDPDManNAcは、UDPNアセチルDマンノサミンである。UDPDManNAcAは、UDPNアセチルDマンノサミンウロン酸である。UDPDQuiNAcは、UDPNアセチルDキノボサミンである。UDPLFucNAcは、UDPNアセチルLフコサミンである。UDPL6dTalNAcは、UDPNアセチルLプノイモサミンである。Undとは、11個のプレノール単位で構成されたウンデカプレニル又はウンデカプレノール脂質である。UndPとは、細菌細胞エンベロープへと輸送される炭水化物重合体のための、グリカン生合成の中間体の普遍的脂質キャリアである、ウンデカプレニルリン酸をいう。UndPPとは、UndPのリン酸化型である、ウンデカプレニルピロリン酸をいう。wbjAは、緑膿菌O11のグルコシル転移酵素である。wbjBは、黄色ブドウ球菌CP5及びCP8の莢膜生合成に必要な酵素に類似した推定エピメラーゼである。wbjCは、緑膿菌O11の推定エピメラーゼである。wbjDは、緑膿菌O11の推定エピメラーゼである。wbjEは、緑膿菌O11の推定エピメラーゼである。wbjFは、緑膿菌O11のグリコシル転移酵素である。wbpLは、緑膿菌O11におけるLPS生合成に参加するグリコシル転移酵素である。wbpMは、緑膿菌O11におけるLPS生合成に参加するグリコシル転移酵素である。本発明の実施態様は、Cジェジュニは原核生物では一般的でない特徴である全般的N結合型タンパク質グリコシル化システムを持っているという発見を、少なくとも一部基にしている。Cジェジュニの様々なタンパク質は、七糖により改変されることが示されている。この七糖は、特異的グリコシル転移酵素により触媒されるヌクレオチド活性化された単糖の段階的付加により、内膜の細胞質側において、キャリア脂質であるUndPP上に集成される。次に脂質結合されたオリゴ糖は、例えばPglKなどのフリッパーゼにより細胞膜周辺腔へとフリッピングされる。N結合型タンパク質グリコシル化の最終段階において、OTaseは、オリゴ糖の、キャリア脂質からコンセンサス配列AspGluXaaAsnZaaSerThr内のAsn残基への転移を触媒し、ここでXaa及びZaaは、Pro以外の任意のアミノ酸であることができる。本発明者らは、七糖のためのグリコシル化クラスターを大腸菌へと巧く転移させることができ、且つカンピロバクターのN結合型糖タンパク質を生成することができた。大腸菌などのグラム陰性宿主細菌を改変するための新規且つ独創的方法は、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌に対するワクチン製品として使用されるグリコシル化タンパク質を生成するために開発された。この方法の開発は、重大で多くの点で予想外の問題点を克服し、並びに従来の英知及び先行技術から実質的に離れることが必要であった。この新規且つ独創的方法において、例えば黄色ブドウ球菌などの標的生体の関心対象の多糖に類似した構造を有する多糖を生成する別のグラム陰性菌が同定された。本発明の目的に関して、構造類似性は、それ自身、同定された他のグラム陰性菌の多糖における反復単位と部分的に同一である標的の多糖における反復単位として現れる。前者の細菌は、宿主、例えば大腸菌生体のようにグラム陰性であるので、本発明者らは、改変された大腸菌生体におけるその生合成経路の使用は、構築されたRU抗原の生合成、及び改変された大腸菌生体の細胞質からペリプラズムへのそのフリッピングを可能にするであろうということを最初に仮定した。更に本発明者らは、この生合成経路を介して生成された多糖のサイズは、グラム陽性黄色ブドウ球菌の生合成経路により生成された多糖よりも、はるかに小さいであろうということを仮定した。結果として、そして以下に考察したように、本発明者らが開発した新規且つ独創的な方法は、前述の困難な問題点を解決した。更に驚くべきことに、以下に詳述するように、グラム陰性生体におけるLPS経路の態様を使用し、例えば黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌に固有の莢膜多糖と同じ反復単位をいくつか含む多糖を生成することができることがわかった。従って、黄色ブドウ球菌のためのグリコシル化タンパク質ワクチンの多糖セクションの製造において、ひとつの驚くべき解決法は、少なくとも部分的に大腸菌のようなグラム陰性菌に固有の多糖を基にした多糖セクションの構築である。本発明者らは更に、それを実行する過程で、黄色ブドウ球菌により生成される関心対象の多糖に可能な限り類似している多糖を生成する細菌を見つけることは、明らかに重要であることを発見した。そのような細菌は、緑膿菌である。図1は、本明細書に照らして当業者に明らかであるように、グラム陰性宿主細胞のO抗原クラスターに提供された酵素によるか、又はハウスキーピング酵素によるかのいずれかの、細胞質におけるヌクレオチド活性化された単糖の調製の具体例の段階的描写を提供している。本プロセスの段階は、図1の描写において左から右へと進む。図1に図示された具体例において、グリコシルリン酸転移酵素は、DFucNAcリン酸をUndPに付加し、UndPPFucNAcを形成する。次に特異的グリコシル転移酵素は、更に反復単位オリゴ糖を形成する単糖の付加により、UndPPDFucNAc分子を伸長する。次にRUは、Wzxタンパク質により細胞膜周辺腔へとフリッピングされる。Wzy酵素は、ペリプラズムRUを重合し、O抗原多糖を形成する。重合体長は、Wzzタンパク質により制御される。多くの細菌性オリゴ糖及び多糖は、UndPP上で集成され、次に他の分子へ転移される。別の表現をすると、UndPPは、細菌における糖に関する全般的結合のプラットフォームである。大腸菌、及び考えられる限りはほとんどの他のグラム陰性菌において、O抗原は、大腸菌酵素WaaLにより、UndPPからリピドAコアへと転移され、リポ多糖を形成する。図2は、本明細書に照らして当業者に明らかであるように、緑膿菌O11のO抗原クラスターにおいて提供された酵素による、グラム陰性宿主細胞のハウスキーピング酵素による、並びにUDPManNAcA生合成に必要であることがわかっている黄色ブドウ球菌及び又は大腸菌酵素による、細胞質におけるヌクレオチド活性化された単糖調製の具体例を図示している。本プロセスの段階は、図2の描写において左から右へと進む。O11生合成のように、WbpL及びWbjEは、コア二糖を合成する。次に黄色ブドウ球菌グリコシル転移酵素Cap5Iは、DManNAcAを付加する。Cap5Hは、アセチル基を2番目のFucNAc残基へ付加する。アセチル化は、図2に示されるように、RU合成の最終段階であることができる。フリッピングは、緑膿菌の組換え発現されたWzx又はCap5Kであるか、又は例えば大腸菌染色体においてコードされたECAクラスターなどの内因性に発現されたWzx様酵素である、本システムにおけるWzxタンパク質の1つ又は全てにより可能である。重合は、Cap5Jポリメラーゼに独占的な活性であり、UndPP上にCP5多糖を形成する。他のUndPP結合された多糖のように、CP5糖質は、大腸菌酵素WaaLにより、リピドAコアに転移され、組換えLPSを形成する。図3は、本明細書に照らして当業者に明らかであるように、緑膿菌O11のO抗原クラスターにおいて提供された酵素による、グラム陰性宿主細胞のハウスキーピング酵素による、並びにUDPManNAcA生合成に必要であることがわかっている黄色ブドウ球菌及び又は大腸菌酵素による、細胞質におけるヌクレオチド活性化された単糖の調製を図示している。本プロセスの段階は、図3の描写において左から右へと進む。O11生合成のように、WbpL及びWbjEは、コア二糖を合成する。次に黄色ブドウ球菌グリコシル転移酵素Cap8Hは、DManNAcAを付加する。Cap8Jは、アセチル基を2番目のFucNAc残基へ付加する。アセチル化が、活性化された糖又はRUへ結合した脂質において生じるかどうかは不明である。フリッピングは、緑膿菌の組換え発現されたWzx又はCap8Kであるか、又は例えば大腸菌染色体においてコードされたECAクラスターなどの内因性に発現されたWzx様酵素である、本システムにおいてWzxタンパク質の1つ又は全てにより可能である。重合は、Cap8Iポリメラーゼに独占的な活性であり、UndPP上にCP8多糖を形成する。次にCP8糖質は、大腸菌において酵素WaaLにより、リピドAコアに転移される。図4は、O11、CP5及びCP8多糖の異なる構造を図示している。図4において、これらのRUは、UndPP及び二糖αDFucNAcLFucNAcからなる同一の基幹構造を共有していることが示されている。黄色ブドウ球菌RUは、中央のLFucNAc残基又はManNAcA残基上のいずれかで、1個のOアセチル基により部分的に修飾され、これは黄色ブドウ球菌RUに特徴的である。黄色ブドウ球菌RUにおける2番目及び3番目の糖の結合性は、それらの間で異なり、更には重合されたRU間の結合性も異なる。右側は、異なる表現の糖構造を示している。後ろ向き矢印の数字は、Oアセチル基により修飾された炭素の位置を示している。RU構造の別の表現を左下側に示している。図4に示したように、緑膿菌に固有の多糖の一部であるO11抗原のRUと、ブドウ球菌の各菌株のCP5及びCP8莢膜のRUとの間には、大きい重複が存在する。特に図4に示すように、RUのLFucNAc>DFucNAc部分は、両方において同一である。別の態様において、本発明は、全体又は一部において、標的多糖によるタンパク質のグリコシル化において使用するための該標的多糖を同定する方法を特徴としている。該標的多糖を含むグリコシル化タンパク質は、例えばワクチン組成物において使用することができる。標的多糖を同定する方法は、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌を標的として同定する工程;少なくとも3つのモノマーを含む該グラム陽性菌により生成された多糖の第一の反復単位を同定する工程;該第一の反復モノマー単位と同じモノマーを少なくとも2つ含む第二の反復単位を含むグラム陰性種の細菌により生成された多糖を同定する工程:を含む。従って本発明の一実施態様において、第一のグラム陰性種の細菌を改変する方法は、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌を標的として同定する工程;少なくとも3つのモノマーを含む該グラム陽性菌により生成された多糖の第一の反復単位を同定する工程;該第一の反復単位と同じモノマーを少なくとも2つ含む第二の反復単位を含む第二のグラム陰性種の細菌により生成された多糖を同定する工程;a該第二の反復単位;及び、b該第二の反復単位には存在しない該第一の反復単位のモノマー:を含む、三糖を集成するグリコシル転移酵素をコードしている1種以上のヌクレオチド配列を、該第一のグラム陰性種の細菌に挿入する工程;少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列DEXNZSTを含むタンパク質であり、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいものなどのタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を挿入する工程;並びに、OTaseをコードしているヌクレオチド配列を挿入する工程:を含む。本発明の実施態様において、本方法は、宿主グラム陰性菌へ、第二の反復単位に存在しない第一の反復単位のモノマーを含む三糖を集成し且つ第二の反復単位を集成するグリコシル転移酵素をコードしている1種以上のヌクレオチド配列を挿入する工程を更に含む。追加の本発明の実施態様は、第一の反復単位由来の少なくとも1つのモノマー単位を集成するグラム陰性菌由来の1種以上のグリコシル転移酵素、及び第二の反復単位由来の少なくとも2つのモノマーを集成する黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌由来の1種以上のグリコシル転移酵素を挿入する工程に関わる。本方法は加えて、グラム陰性宿主細菌へ、タンパク質をコードしているヌクレオチド配列、及びOTaseをコードしているヌクレオチド配列を挿入する工程を含む。少なくとも一つの本発明の実施態様において、構築された反復単位を発達させ、フリッピングし、且つ重合する、黄色ブドウ球菌のCP5株及びCP8株由来の必要な酵素をコードしている対応する核酸を保持しする宿主大腸菌菌株が作製される。実施態様において、必要とされる特異的グリコシル転移酵素は、緑膿菌に固有であるLFucNAc>DFucNAcRUを形成するものに対応し、並びに黄色ブドウ球菌のCP5株及びCP8株の各々に固有であるRUを完成するためにDManNAcA単糖を付加するものに対応しているグリコシル転移酵素に対応していた。そのような実施態様は、核酸を宿主細胞に注入するためのプラスミドの使用を更に含むことができる。追加の実施態様は、1つのプラスミドにおいて、LFucNAc>DFucNAcに対応するグリコシル転移酵素をコードしている核酸を使用し、並びに異なるプラスミドにおいて、DManNAcAに対応するグリコシル転移酵素をコードしている核酸を使用することに関与している。そのような実施態様の恩恵の1つは、先行技術を考慮すると驚くべきことだが、現在黄色ブドウ球菌莢膜の構築されたRU重合体の生成に責任のある緑膿菌の改変されたLPS生合成経路は、黄色ブドウ球菌の莢膜よりもはるかに小さい構造を生じることである。本発明は加えて、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列DEXNZSTであって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの;及び、該コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌由来の少なくとも1つのオリゴ糖又は多糖:を含む、組換えNグリコシル化タンパク質を指向している。別の実施態様において、この組換えNグリコシル化タンパク質は、該挿入されたコンセンサス配列を2種以上含む。更に追加の実施態様において、組換えNグリコシル化タンパク質は、該黄色ブドウ球菌のオリゴ糖又は多糖を2つ以上含む。また更なる実施態様において、組換えNグリコシル化タンパク質は、2種以上の該挿入されたコンセンサス配列、並びに例えば黄色ブドウ球菌莢膜多糖5型株及び莢膜多糖8型株など異なる黄色ブドウ球菌株由来のオリゴ糖又は多糖を含む。本発明は更に、Nグリコシド結合による、黄色ブドウ球菌の改変された莢膜多糖の、同じ生体由来のタンパク質抗原との組合せを指向している。本発明の実施態様は、天然にグリコシル化されたタンパク質を含む。そのような天然にグリコシル化されたタンパク質は、天然のコンセンサス配列を含むが、任意の追加の最適化されたコンセンサス配列は含まない。天然のグリコシル化されたタンパク質は、原核生物及び真核生物のタンパク質を含む。本発明の実施態様は、更に以下のNグリコシル化された部分アミノ酸配列を1種以上含む組換えNグリコシル化タンパク質を含む:DEXNZST、ここでX及びZはPro以外の任意の天然のアミノ酸であってよく、且つここで該Nグリコシル化された部分アミノ酸配列の少なくとも1種が導入されている。特異的部分アミノ酸配列のタンパク質への導入は、導入部位での、例えばカンピロバクター種由来のOTaseなど、例としてCジェジュニ由来のOTaseなどのOTaseにより効率的にNグリコシル化されるタンパク質につながる。同じく本明細書の文脈で使用される用語部分アミノ酸配列は、最適化されたコンセンサス配列又はコンセンサス配列も指すであろう。最適化されたコンセンサス配列は、例えばカンピロバクター種由来のOTaseなど、例としてCジェジュニ由来のOTaseなどのOTaseによりNグリコシル化される。アミノ酸の国際的に承認された1文字コードに従い、略語D、E、N、S及びTは、各々、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、及びトレオニンを意味する。最適化されたコンセンサス配列の導入は、1つ以上のアミノ酸の付加、欠失及び又は置換により実現することができる。最適化されたコンセンサス配列の導入を目的とした1つ以上のアミノ酸の付加、欠失及び又は置換は、固相支援化学ペプチド合成などの当業者に周知の化学合成戦略により実現することができる。あるいは、そして大型ポリペプチドにとって好ましくは、本発明のタンパク質は、1種以上の最適化されたコンセンサス配列をコードしている核酸の、天然にグリコシル化されているタンパク質であるか、又は天然にグリコシル化されていないタンパク質であることができる出発タンパク質の核酸配列への付加による標準の組換え技術により調製することができる。好ましい実施態様において、本発明のタンパク質は、1種以上の、好ましくは少なくとも2種又は少なくとも3種の、及びより好ましくは少なくとも5種の該導入されたNグリコシル化され最適化されたアミノ酸配列を含むことができる。本発明のタンパク質内の1種以上のNグリコシル化され最適化されたアミノ酸配列の存在は、それらの抗原性を増大し、それらの安定性を増大し、それらの生物活性に影響を及ぼし、それらの生物学的半減期を延長し、及び又はそれらの精製を簡便化するという利点をもたらし得る。前述の最適化されたコンセンサス配列は、X位及びZ位にプロリン以外の任意のアミノ酸を含むことができる。用語任意のアミノ酸とは、一般的な及び稀な天然のアミノ酸に加え、最適化されたコンセンサス配列をOTaseによりNグリコシル化させることが依然可能である合成アミノ酸誘導体及び類似体を包含することを意味する。天然の一般的な及び稀なアミノ酸が、X及びZについて好ましい。X及びZは、同じであっても異なってもよい。X及びZは、本発明のタンパク質における各々最適化されたコンセンサス配列について異なることができることに留意されたい。前述の最適化されたコンセンサス配列に結合されるNグリカンは、特異的グリコシル転移酵素、及びOTaseによる転移のために脂質キャリア上にオリゴ糖が集成する際のそれらの相互作用により決定されるであろう。当業者は、所望の宿主細胞に存在する特異的グリコシル転移酵素の種類及び量を変動することにより、Nグリカンをデザインすることができる。、NIHPAAuthorManuscript1571925に最終版掲載;Reevesらの論文、細菌多糖の合成及び遺伝子命名、TrendsinMicrobio449550349798;並びに、WhitfieldC及びISRobertsの論文、1999、大腸菌における莢膜の構造、集成及び発現調節、MolMicrobiol31130719。本明細書において使用される多糖は、少なくとも2つの単糖を含む糖類を含む。多糖は、オリゴ糖、三糖、1種以上の単糖を含む反復単位、及び当業者により多糖として認められる他の糖類を含む。Nグリカンは、本明細書において、Nグリコシド結合を介してタンパク質内のアスパラギン残基のεアミド窒素に結合されている様々な組成の単糖、オリゴ糖、又は多糖として定義される。本発明の実施態様の多糖は、CP5及びCP8などの黄色ブドウ球菌多糖を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の実施態様は更に、黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株を標的とする多糖などの、細菌を標的とする黄色ブドウ球菌多糖を含む。本明細書において、多糖が細菌株を標的とすることが言及される場合、そのような多糖は、それに対する免疫反応又は抗原反応が望まれる細菌に由来する多糖を含み、且つ更にそれに対する免疫反応又は抗原反応が望ましい細菌と同じ、それを基にした、それに由来する、それに固有の或いは操作されている多糖を含む。本発明の組換えタンパク質の起源に制限はない。一実施態様において、該タンパク質は、哺乳動物、細菌、ウイルス、真菌、又は植物のタンパク質に由来する。更なる実施態様において、本タンパク質は、哺乳動物に由来し、最も好ましくはヒトタンパク質に由来する。本発明の抗原性組換えタンパク質の調製に関して、好ましくはワクチン中の活性成分として使用するための組換えタンパク質は、細菌、ウイルス、又は真菌のタンパク質に由来することが好ましい。様々な起源のタンパク質のグリコシル化が、当業者に公知である。Kowarikらの論文、細菌のNグリコシル化部位コンセンサス配列の定義、EMBOJ110。実施態様の例において、遺伝子的に解毒された緑膿菌外毒素は、好適なタンパク質キャリアである。グリコシル化され得るEPA型の作製のためには、EPAをコードしている核酸が先に考察されたようにグリコシル化部位の挿入により改変されることを必要とする。本発明の実施態様における使用が意図されたタンパク質キャリアは、好ましくはある免疫学的及び薬学的特徴を有さなければならない。免疫学的観点からは、好ましくはタンパク質キャリアは:T細胞エピトープを有し;免疫系において抗原を抗原提示細胞へ送達することが可能であり;強力且つ耐久性があり;並びに、抗原特異的な全身性のIgG反応を生じることが可能でなければならない。薬学的観点からは、タンパク質キャリアは好ましくは:無毒であり;並びに、抗原を無傷の上皮障壁を越えて効果的に送達することが可能でなければならない。より好ましくは、これらの免疫学的及び薬学的特徴に加え、細菌性バイオコンジュゲートの製造に使用されると考えられるタンパク質キャリアは:細胞膜周辺腔へ容易に分泌され;並びに、ループ又は線状配列としてそれへ容易に導入される抗原エピトープを有することが可能でなければならない。本開示及び当業者の知識により情報が与えられるように、当該技術分野の実践者は、特に本発明の実施態様において使用することができる好適なタンパク質キャリアを慣習的に考察し且つ確定することができる。本発明の実施態様において、カンピロバクタータンパク質AcrAは、タンパク質キャリアである。更なる本発明の実施態様において、遺伝子的に解毒された緑膿菌外毒素は、ワクチンが望まれる標的生体が黄色ブドウ球菌である場合のタンパク質キャリアである。天然のグリコシル化部位を含むAcrAとは異なり、EPAは、そのような天然のグリコシル化部位を含まず、グリコシル化部位の挿入により改変されることが必要である。追加の実施態様において、EPAは、黄色ブドウ球菌抗原によるグリコシル化が可能である2つのグリコシル化部位を導入するように改変される。また更なる実施態様においては、2つのコンセンサス配列が、WO2009104074の実施例10において考察されたように導入される。EPAのアミノ酸配列は、本発明の実施態様において2つのグリコシル化部位を含む様に改変された場合、配列番号13及び配列番号14として提供される。配列番号13のグリコシル化部位は、でのである。配列番号14のグリコシル化部位は、でのである。EPAなどのキャリアタンパク質は、Nグリコシル化部位が細菌性バイオコンジュゲートの製造において追加され得るタンパク質である。Nグリコシル化部位は、先に考察したコンセンサス配列の導入、すなわちDEXNZST配列の挿入を必要とし、ここでX及びZはプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい。本発明者らは、そのようなコンセンサス配列は、突然変異、及び追加的に挿入されたフランキング残基の使用による、及びNグリコシル化部位の機能を最適化するためのフランキング残基の突然変異によるよりは、挿入により表面ループへ導入されることが好ましいことを発見した。一部の良く特徴付けられた黄色ブドウ球菌のタンパク質サブユニット抗原は、α溶血素、クランピング因子α、IsdB、及びパントンバレンタイン型ロイコシジンである。Hlaは、黄色ブドウ球菌肺炎のマウスモデルにおけるMRSAの分泌型膜孔形成毒素及び必須の病原因子である。独立した黄色ブドウ球菌株によるHla発現のレベルは、それらの毒力と直接相関する。膜孔を形成することができないHlaの突然変異型による能動免疫、InfectImmun64183941;JurschR、AHildebrand、GHobom、JTranumJensen、RWard、MKehoe及びSBhakdiの論文、1994、重合及び膜孔形成に重要であるレポーター領域としてのブドウ球菌α毒素のN末端近傍のヒスチジン残基、InfectImmun62224956は、抗原特異的免疫グロブリンG反応を生じ、且つブドウ球菌肺炎に対する防御をもたらすことが示された。Hla特異的抗体の移入は、黄色ブドウ球菌チャレンジに対しナイーブな動物を保護し、且つ感染症時のヒト肺上皮細胞の損傷を防ぐ、JInfectDis198116670。ワクチンとして使用するためには、HlaのH35L変異は、そのタンパク質の毒性を除去する必要がある、InfectImmun6218437。ClfAは、免疫付与に使用されるプロテアーゼ耐性ドメインを含む。マウスの抗ClfA抗体及び抗CP5抗体による受動免疫は、乳腺感染症モデルにおいて乳腺を効果的に無菌化した、InfectImmun76573844。更なる本発明の実施態様は、黄色ブドウ球菌に固有のタンパク質、例えばHla及びClfAのグリコシル化を含む。本発明の実施態様の追加の実施例において、使用されるタンパク質キャリアは、Hlaタンパク質、例えばHlaH35Lであるよう選択されることができる。別の本発明の実施態様の追加の実施例において、タンパク質キャリアは、ClfAタンパク質である。本発明は更に、グラム陽性種などの第一の原核生物種の1種以上のグリコシル転移酵素;グラム陰性種などの異なる原核生物種の1種以上のグリコシル転移酵素:をコードしているヌクレオチド配列;タンパク質をコードしているヌクレオチド配列;並びに、OTaseをコードしているヌクレオチド配列:を含む、組換え宿主原核生物を指向している。加えて本発明は、グラム陽性原核生物にのみ固有であるグリコシル転移酵素をコードしている導入されたヌクレオチド配列;タンパク質をコードしているヌクレオチド配列;及び、OTaseをコードしているヌクレオチド配列:を含む、組換え宿主原核生物を指向している。本発明はまた、例えば宿主原核生物とは異なる第一の原核生物種に固有のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列;該第一の原核生物種とは異なり、且つ例えば該宿主とは異なる、第二の原核生物種に固有のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列:を含む、組換え又は操作された宿主原核生物も指向している。この操作された原核生物はまた、例えば、グラム陽性種である第一の原核生物種も含むことができる。この操作された原核生物はまた、例えば、グラム陰性種である第二の原核生物種も含むことができる。本発明は更に、例えば該宿主原核生物とは異なるグラム陰性原核生物種に固有のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列;黄色ブドウ球菌に固有のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列;タンパク質をコードしているヌクレオチド配列;及び、OTaseをコードしているヌクレオチド配列:を含む、組換え又は操作されたグラム陰性宿主原核生物を含む。本発明は更に、緑膿菌に固有のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列;黄色ブドウ球菌CP5株及び又は黄色ブドウ球菌CP8株に固有の1種以上のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列;緑膿菌EPA、黄色ブドウ球菌α溶血素、又は黄色ブドウ球菌クランピング因子Aのタンパク質キャリアをコードしているヌクレオチド配列;並びに、OTase、例えばCジェジュニに固有のOTaseをコードしているヌクレオチド配列:を含む、組換え又は操作された大腸菌宿主を含む。改変された宿主大腸菌生体における他のグラム陰性生体の生合成経路の使用に加え、更なる実施態様において、同じく宿主大腸菌生体に含まれるのは、他のグラム陰性生体の多糖の反復単位構造の構築のためのグリコシル転移酵素、並びに、他のグラム陰性生体の関連する多糖において認められない、標的グラム陽性黄色ブドウ球菌生体の関心対象の多糖の単位の構築のためのグリコシル転移酵素、並びに、黄色ブドウ球菌莢膜様多糖を形成するために、標的グラム陽性黄色ブドウ球菌生体の関心対象の構築されたRUのフリッピング及び重合のための酵素:をコードしている核酸である。特に、本実施態様において、及びをコードしている核酸は、標的グラム陽性黄色ブドウ球菌生体を起源とするのに対し、をコードしている核酸は、他のグラム陰性菌を起源とした。本発明の別の態様は、iグラム陽性原核生物種に固有のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列;iiタンパク質をコードしているヌクレオチド配列;及び、iiiOTaseをコードしているヌクレオチド配列:を含み、ここで該グラム陽性原核生物種のトランスポーター遺伝子をコードしている配列は欠失されている、操作された宿主原核生物を指向している。そのような実施態様は、グラム陽性グリコシル転移酵素のみをコードしている導入された核酸構築体に関与している。1つ以上の他の実施態様において宿主に挿入される他の核酸に関して、AcrA、Hla、ClfA又はEPAなどのタンパク質をコードしている核酸、及びその生体のグリコシル化機構の一部であるCジェジュニのオリゴ糖転移酵素をコードしている核酸が、緑膿菌及び黄色ブドウ球菌の各々に由来したグリコシル転移酵素をコードしている核酸に加え、宿主に注入される。結果として、この改変された大腸菌生体は、黄色ブドウ球菌及び他のグラム陰性菌由来のグリコシル転移酵素の作用により、AcrAタンパク質を、その生体中で生成された多糖によりグリコシル化することができる。本発明の一実施態様は、i宿主原核生物とは異なる第一の原核生物種に固有のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列;ii宿主原核生物とは異なる、第二の原核生物種、例えばグラム陽性原核生物種に固有のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列;iiiタンパク質をコードしているヌクレオチド配列;及び、ivOTaseをコードしているヌクレオチド配列:を含む、操作された宿主原核生物に関与している。本発明の実施態様において、第一の原核生物種は、グラム陰性種、例えば緑膿菌である。本発明の状況において、宿主細胞とは、任意の宿主細胞、例えば真核生物又は原核生物の宿主細胞をいう。他の実施態様において、宿主細胞は、原核生物宿主細胞、例えばエシェリキア種、カンピロバクター種、サルモネラ種、シゲラ種、ヘリコバクター種、シュードモナス種、又はバチルス種である。より更なる実施態様において、宿主細胞は、大腸菌、カンピロバクタージェジュニ、サルモネラティフィムリウムなどである。本発明は更に、黄色ブドウ球菌の1種以上のグリコシル転移酵素;第二の原核生物種の1種以上のグリコシル転移酵素、タンパク質;及びOTase:をコードしている核酸を、宿主原核生物へ導入することを含む、バイオコンジュゲートワクチンの製造方法を指向している。加えて本発明は、グラム陰性菌においてウンデカプレノール上で改変された莢膜多糖を生成すること、及び選択されたタンパク質キャリアへこれらの多糖抗原を結合することによる、バイオコンジュゲートワクチンの製造を指向している。本発明は更に、第一の原核生物に固有のグリコシル転移酵素をコードし、且つ同じく第一の原核生物とは異なる第二の原核生物に固有のグリコシル転移酵素もコードしているヌクレオチド配列を含む宿主原核生物における、グリコシル化タンパク質の製造方法を指向している。本発明は加えて、異なる生体由来の異なるグリコシル転移酵素の組合せにより合成される、グラム陽性菌の莢膜多糖によりNグリコシル化されたタンパク質の生成を指向している。本発明は更に、グラム陽性原核生物にのみ固有のグリコシル転移酵素をコードしている導入されたヌクレオチド配列を含む宿主原核生物におけるグリコシル化タンパク質の生成を指向している。当該技術分野において公知であるように、異なる多糖の生合成は、細菌細胞において保存されている。多糖は、規定された特異性を持つ異なるグリコシル転移酵素により、細胞膜で、共通の前駆体からキャリア脂質上に集成される、MolMicrobiol31130719。グラム陰性におけるO抗原多糖生成及びグラム陽性におけるI型莢膜多糖に関する生合成経路は、保存されている。これらのプロセスは、多糖集成のために、同じ脂質キャリア、すなわちUndPを使用する。これは、膜の細胞質側での、単糖1リン酸のキャリア脂質UndPへの付加で始まる。この抗原は、異なるグリコシル転移酵素による、活性化された糖ヌクレオチドからの単糖の逐次付加により発達される。次に脂質結合されたオリゴ糖又はRUは、フリッパーゼにより、膜を通じてフリッピングされる。RUは、細胞膜周辺腔において酵素Wzyにより重合され、グラム陰性菌においていわゆるO抗原を、又はグラム陽性菌において莢膜多糖を形成する。グラム陰性菌は、Wzz酵素を使用し、重合体の長さを調節し、これは次にリピドAコアへ転移され、LPSを形成する。LPSは更に、外側にO抗原を露出している外膜に転位される。対照的にグラム陽性菌は、異なる特定された酵素機構を使用する更なる輸送により、この脂質結合された前駆体から莢膜を形成する。これらの多糖の生合成経路は、タンパク質キャリア上にペリプラズム内の多糖を捕獲することにより、インビボにおいてバイオコンジュゲートを製造することが可能である。この多糖構築のプロセスは、莢膜多糖について、莢膜多糖は重合後にキャリア脂質から放出され、表面へ輸送される点が異なる。ペリプラズムコンパートメントを持たない黄色ブドウ球菌のようなグラム陽性菌において、抗原の重合は、膜の外側で生じる。加えて黄色ブドウ球菌における長さの調節は、莢膜集成に責任のある3種の酵素の機構に含まれる。この集成体において、多糖は、キャリア脂質から放出され、且つ酵素的プロセスにより表面へと輸送される。黄色ブドウ球菌における機能的莢膜発現に必要とされる遺伝子クラスターに認められる遺伝的要素は、wzy依存型O抗原合成クラスターにおいて認められる遺伝子機構に類似している、JBacteriol18142754284。驚くべきことにグラム陽性菌の多糖構築とグラム陰性菌の多糖構築の間のこれらの差異にもかかわらず、グラム陰性生体におけるLPS経路の局面を使用し、例えば黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌に固有の莢膜多糖と同じ反復単位の一部を含む多糖を生成することができることが発見され且つ検証された。そのような多糖は、グラム陰性宿主においてLPS経路機構により生成されるので、そのような多糖の構造は、LPS多糖前駆体においてと同じである。従って本発明のグラム陰性システムにおいて生成されたそのような多糖は、本出願の目的に関して改変された莢膜多糖又はLPS莢膜として特徴付けることができる。更にこの新たに合成された発現システム及び生合成経路は、LPSと莢膜の生合成経路を組合せているが、これは本出願の目的に関して改変されたLPS生合成経路であるとして特徴付けられる。本発明の一実施態様において、改変されたLPS生合成経路により生成された改変された多糖は、下記を含む:更なる本発明の実施態様において、改変されたLPS生合成経路により生成された改変された多糖は、下記を含む:本発明の技術を使用し、免疫原性である細菌のバイオコンジュゲートを製造することができる。遺伝子修飾は、望ましいタンパク質において且つ望ましい位置で細菌性多糖がインビボでコンジュゲートできるようにすることができる。本発明の別の態様は、前述のように改変されたLPS生合成経路を使用し、タンパク質キャリアにコンジュゲートされたLPS莢膜又は改変されたLPSの生成に関する。更なる本発明の実施態様は、Cap5及びCap8の完全多糖生合成クラスターをコードしているヌクレオチド配列の構築を含み、ここで欠失されたトランスポーター遺伝子は、黄色ブドウ球菌のcapA、capB及びcapCである。追加の本発明の実施態様は、CP5O11キメラクラスター又はCP8O11キメラクラスターを、宿主細胞のゲノムへ組込むことを含む。更なる本発明の実施態様は、CP5O11キメラクラスター又はCP8O11キメラクラスター;OTaseをコードしている核酸;及び、導入されたコンセンサス配列を含む又は含まないタンパク質をコードしている核酸:を、宿主細胞のゲノムへ組込むことに関与している。本発明の別の実施態様は、例えば、配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号17;配列番号18及び配列番号19の1つ以上を含むプラスミドなどの、プラスミドに関する。本発明はまた、配列番号13;配列番号14及び配列番号15の1つ以上を含むプラスミドを含む。本発明はまた、配列番号16;配列番号6;配列番号7及び配列番号8の1つ以上を含むプラスミドに関する。本発明はまた、配列番号10;配列番号11及び配列番号12の1つ以上を含むプラスミドに関する。更に本発明は、配列番号20;配列番号21及び配列番号27の1つ以上を含むプラスミドに関する。本発明の実施態様は更に、例えば、配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号20;配列番号21及び配列番号27の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞などを含む、形質転換された細菌細胞に関する。更に本発明に含まれるのは、配列番号19及び配列番号20の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞である。加えて含まれるのは、配列番号13、配列番号19及び配列番号21の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞である。本発明は更に、配列番号16、配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号10;配列番号11及び配列番号12の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞に関する。本発明は加えて、例えば配列番号3;配列番号4;配列番号17;配列番号18;及び配列番号19の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞であって、並びにここで該細菌細胞は、緑膿菌に固有のグリコシル転移酵素並びに黄色ブドウ球菌CP5及び又はCP8に固有のグリコシル転移酵素を発現する前記細菌細胞を含むものなどの、形質転換された細菌細胞に関する。更に本発明に含まれるのは、配列番号17;配列番号18及び配列番号19の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞であって、ここで該細菌細胞が、緑膿菌に固有のグリコシル転移酵素、黄色ブドウ球菌CP5及び又はCP8に固有のグリコシル転移酵素、並びにPglBを発現するものである。なお更に本発明に含まれるのは、配列番号19を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞であり、ここで該細菌細胞が、緑膿菌に固有のグリコシル転移酵素、黄色ブドウ球菌CP8に固有のグリコシル転移酵素、大腸菌血清亜型O7のWzz及びPglBを発現するもの;配列番号19及び配列番号20の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞であり、ここで該細菌細胞が、緑膿菌に固有のグリコシル転移酵素、黄色ブドウ球菌CP8に固有のグリコシル転移酵素、Wzz、EPA及びPglBを発現するもの;並びに、配列番号16;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号10;配列番号11及び配列番号12の1つ以上を含む細菌細胞である。本発明の実施態様は加えて、例えばヒトなどの哺乳動物においてグラム陽性菌及び他の細菌により引き起こされた感染症に対し免疫反応を誘導する方法を指向している。一実施態様において、本方法は、該哺乳動物へ、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列DEXNZSTを含むタンパク質であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの;並びに、該コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌由来の1種以上のオリゴ糖又は多糖であって、この1種以上のオリゴ糖又は多糖が、該1種以上のオリゴ糖又は多糖のうちの他のものと同じか又は異なる、前記1種以上のオリゴ糖又は多糖:を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む。更なる本発明の実施態様は、哺乳動物へ、挿入されたコンセンサス配列DEXNZSTであって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの;CP5多糖などの少なくとも1種の黄色ブドウ球菌オリゴ糖又は多糖;並びに、医薬として許容し得るアジュバント:を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む、該哺乳動物において黄色ブドウ球菌により引き起こされた感染症に対する免疫反応を誘導する方法を含む。別の本発明の実施態様は、哺乳動物へ、挿入されたコンセンサス配列DEXNZSTを含むタンパク質であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの;少なくとも1種の黄色ブドウ球菌CP8多糖;並びに、医薬として許容し得るアジュバント:を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む、該哺乳動物において黄色ブドウ球菌により引き起こされた感染症に対する免疫反応を誘導することを指向している。より更なる実施態様は、2種以上のコンセンサス配列を伴うタンパク質、並びに異なるグラム陽性菌株由来のオリゴ糖又は多糖を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む、哺乳動物において黄色ブドウ球菌により引き起こされた感染症に対する免疫反応を誘導することを指向している。なお更なる実施態様は、2種以上のコンセンサス配列を伴うタンパク質、並びに黄色ブドウ球菌CP5及び黄色ブドウ球菌CP8を含む多糖を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む、哺乳動物において黄色ブドウ球菌により引き起こされた感染症に対する免疫反応を誘導することを指向している。特異的ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が注目されるような本明細書の事例において、本発明は、注目された配列と同じ機能性をなお具体化している相同配列を包含することは理解されるであろう。本発明の実施態様において、そのような配列は、少なくとも85相同である。別の実施態様において、そのような配列は、少なくとも90相同である。また更なる実施態様において、そのような配列は、少なくとも95相同である。2つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間の同一性の割合の決定は、当業者に公知である。本明細書に添付された配列表に記載されたものなどの、本明細書に記載された核酸配列は、単なる例証であり、且つこれらの配列は、様々な方法で組み合わせることができることは当業者には明らかであろう。本発明の追加の実施態様は、核酸の変種を含む。核酸の変種は、と実質的に同一であり、すなわち、これらと少なくとも70同一、例えば75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は995同一であることができる。核酸変種は、を含む配列のものである。を含む配列、又はそれらの一部から1個以上のヌクレオチドの置換、変動、改変、変換、欠失及び又は付加を伴う核酸を含む。そのような変種は、原核生物のグリコシル転移酵素をコードしている核酸、並びにi大腸菌などの宿主細胞において発現され、且つii配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号17、配列番号18及び又は配列番号19、並びに又はそれらの一部と実質的に同一である核酸を含む。本明細書に記載の核酸は、組換えDNA及び合成DNAを含む。核酸は、二本鎖又は一本鎖であることができる。一本鎖核酸の場合核酸は、センス鎖又はアンチセンス鎖であることができる。核酸は、本明細書に照らして当業者に公知のように、オリゴヌクレオチド類似体又は誘導体を使用し合成することができる。本明細書に記載の核酸を含むプラスミドは、発現のために宿主細胞に形質転換されることができる。形質転換の技術は、本明細書に照らして当業者に公知である。追加の本発明の実施態様は、LPS莢膜又はタンパク質キャリアにコンジュゲートされた改変されたLPSを含む、グラム陽性バイオコンジュゲートワクチンの製造に関与している。更なる本発明の実施態様は、新規バイオコンジュゲートワクチンに関与している。更なる本発明の実施態様は、免疫原性又は抗原性バイオコンジュゲートを直接生成する組換え細菌細胞を使用する、そのようなバイオコンジュゲートワクチンを製造するための新規アプローチに関与している。一実施態様において、バイオコンジュゲートワクチンは、下痢、院内感染症及び髄膜炎などの細菌性疾患を治療又は予防するために使用することができる。更なる実施態様において、バイオコンジュゲートワクチンは、癌又は他の疾患に対する治療的及び又は予防的潜在力を有し得る。別の本発明の実施態様において、多糖及びタンパク質の合成された複合体は、黄色ブドウ球菌感染症などの感染症に対し防御するための、コンジュゲートワクチンとして使用することができる。一実施態様において、グラム陽性ワクチンなどのバイオコンジュゲートワクチンは、挿入された核酸コンセンサス配列を含むタンパク質キャリア;コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌由来の少なくとも1種のオリゴ糖又は多糖、及び任意にアジュバント:を含む。本発明は更に別の実施態様において、挿入された核酸コンセンサス配列を含むタンパク質キャリア;コンセンサス配列に結合された、莢膜多糖又はLPS莢膜などのグラム陽性菌由来の少なくとも1種のオリゴ糖又は多糖、並びに任意にアジュバントを含む、黄色ブドウ球菌ワクチンなどの、グラム陽性バイオコンジュゲートワクチンを指向している。別の本発明の実施態様において、黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲートワクチンは、これらの挿入されたコンセンサス配列を2種以上含む。更なる実施態様において、黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲートワクチンは、黄色ブドウ球菌のオリゴ糖又は多糖を2種以上含む。より更なる実施態様は、2種以上の該挿入されたコンセンサス配列、並びに異なる黄色ブドウ球菌株、例えば黄色ブドウ球菌莢膜多糖5型株及び莢膜多糖8型株由来のオリゴ糖又は多糖を含む。追加の本発明の実施態様は、改変された莢膜多糖又はLPS莢膜の生成を含む、改変されたLPS経路を使用するグリコシル化システムにより製造された黄色ブドウ球菌ワクチンに関する。更なる追加の実施態様は、グラム陰性原核生物種のグリコシル転移酵素をコードしていない導入された核酸からの改変された莢膜多糖の生成を含む、改変されたLPS経路を使用するグリコシル化システムにより製造された黄色ブドウ球菌ワクチンに関する。更なる実施態様は、i緑膿菌に固有のO11抗原のRUのLFucNAc>DFucNAcの生成に責任のある1種以上のグリコシル転移酵素;ii黄色ブドウ球菌のCP5株又はCP8株のいずれかに固有のRUを含むDManNAcAの生成に責任のある1種以上のグリコシル転移酵素;iiiCP5又はCP8の構築されたRUのフリッピング及び重合に責任のある1種以上の酵素、iv導入されたコンセンサス配列を含む組換えタンパク質;並びに、vCジェジュニ由来のオリゴ糖転移酵素:をコードしている核酸を含むグリコシル化システムにより製造された黄色ブドウ球菌ワクチンに関する。この実施態様において、宿主生物は、グラム陰性菌、例えば大腸菌であってよい。追加の本発明の実施態様は、i緑膿菌に固有のO11抗原のRUのLFucNAc>DFucNAcの生成に責任のあるグリコシル転移酵素;ii黄色ブドウ球菌のCP5株又はCP8株のいずれかに固有のRUを含むDManNAcAの生成に責任のあるグリコシル転移酵素;iiiCジェジュニのAcrAタンパク質;並びに、ivCジェジュニ由来のオリゴ糖転移酵素:をコードしている核酸を含むグリコシル化システムにより製造された黄色ブドウ球菌ワクチンに関与している。この実施態様において、宿主生物は、グラム陰性菌、例えば大腸菌であってよい。本発明のワクチンは、治療的及び予防的有用性を有する。本発明のワクチンは、臨床医薬品及び獣医用医薬品の分野において有用であることは理解されるであろう。従って免疫付与される対象は、ヒト、又は例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ及び家禽を含む家畜、並びにイヌ及びネコなどの伴侶動物などの他の動物であってよい。別の態様において、本発明は、グラム陽性菌などの細菌に対する哺乳動物の免疫付与のためのワクチンの製造方法を指向している。この方法は、グラム陽性の多糖、例えば黄色ブドウ球菌多糖、及び医薬として許容し得る担体を含有するバイオコンジュゲートのようなバイオコンジュゲートにより、対象に免疫付与することを含む。この本発明はまた、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌による感染症に対する防御のための、又は黄色ブドウ球菌感染症などのグラム陽性感染症の治療のためのワクチン組成物を特徴としている。一実施態様において、本ワクチン組成物は、黄色ブドウ球菌由来の多糖又はそれらの断片若しくは部分などの、1種以上の免疫原性成分を含有する。更なる実施態様において、本ワクチン組成物は、グラム陰性菌又はグラム陽性菌由来のタンパク質又はそれらの断片若しくは部分などの1種以上の免疫原性成分を含有する。本発明の一態様は、黄色ブドウ球菌多糖の少なくとも1つの免疫原性成分又は断片並びに医薬として許容し得る担体を含有する、黄色ブドウ球菌による感染症を防御するためのワクチン組成物を提供する。そのような免疫原性成分又は断片は、例えば、長さが少なくとも約2つのモノマー又は長さが少なくとも約3つのモノマーの黄色ブドウ球菌多糖を含むことができる。本発明の更なる態様において、黄色ブドウ球菌RUは、該モノマーを含む。そのような反復単位は、例えば、長さが少なくとも1つの黄色ブドウ球菌RUを含むことができる。本発明の免疫原性成分又は断片は、例えば、組換え的に又は化学合成により生成された多糖若しくはポリペプチドのスクリーニングによるか、又は例えば、多糖及びタンパク質を含有するバイオコンジュゲートのスクリーニングにより得ることができる。本発明の免疫原性成分又は断片のスクリーニングは、1種以上のいくつかの異なるアッセイを使用し実行することができる。例えば、スクリーニングアッセイは、ELISA及び当業者に公知の他のアッセイを含む。一実施態様において、免疫原性成分又は断片は、例えば、グライココンジュゲートワクチン候補CP5EPAに対する特異的抗CP5抗体の測定、並びに当業者に公知の他の手段で、マウス及びウサギにおいて得られた免疫反応により決定されるような、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8多糖などのグラム陽性菌多糖に対するIgG抗体を刺激する多糖及び又はタンパク質の能力により同定される。一実施態様において、免疫原性成分又は断片は、例えば、ウサギ抗CP5EPA抗体による黄色ブドウ球菌死滅によるか、並びに他の当業者に公知の手段により、決定されるような、オプソニン食作用死滅などのオプソニン活性を刺激する多糖及び又はタンパク質の能力により同定される。また更なる実施態様において、免疫原性成分又は断片は、例えば、CP5EPAによるマウスにおける能動免疫を使用する細菌感染に対する防御によるか、並びに他の当業者に公知の手段により、決定されるような、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌に対する体液性及び又は細胞性免疫を刺激する多糖及び又はタンパク質の能力により同定される。本発明の実施態様において、本発明のワクチン組成物は、本発明の黄色ブドウ球菌多糖の免疫原性成分又は断片を含有し、且つ任意に医薬として許容し得る担体又はアジュバントを更に含有する糖タンパク質を基にすることができる。更なる本発明の実施態様において、ワクチン組成物は、本発明の黄色ブドウ球菌タンパク質の免疫原性成分又は断片を含有し、且つ任意に医薬として許容し得る担体又はアジュバントを更に含有する糖タンパク質を基にすることができる。また更なる本発明の態様において、ワクチン組成物は、本発明の緑膿菌タンパク質の免疫原性成分又は断片を含有し、且つ任意に医薬として許容し得る担体及び又はアジュバントを更に含有する糖タンパク質を基にすることができる。当業者は、例えばマウスなどの1つの哺乳動物型へ投与するためのワクチンを、例えばヒトなどの別の哺乳動物型へ投与するために、どのように改変するかは良く知っている。例えば当業者は、マウスにおけるワクチン組成物中で使用される糖タンパク質のタンパク質キャリアからのヒスチジンタグの欠失は、この糖タンパク質をヒトにおけるワクチン組成物での投与に適したものとすることを容易に理解するであろう。例えば、例としてEPA、ClfA、及びHlaなどのタンパク質キャリア内のヒスチジンタグの欠失は、ヒトへの投与のために糖タンパク質中でそれを使用することに関して認められるであろう。グラム陽性、例えば黄色ブドウ球菌、又は他の細菌の感染症又は疾患の症状の何らかの改善は、例えば黄色ブドウ球菌が引き起こした感染症又は疾患、又は他の細菌が引き起こした感染症又は疾患などの、グラム陽性が引き起こした感染症又は疾患のために使用される薬物療法の用量の減量、或いは患者の血清又は粘膜中の抗体産生の増加を含む、望ましい臨床の目的であることは理解されなければならない。当業者には、本発明のワクチン組成物の一部は、グラム陽性感染症、例えば黄色ブドウ球菌感染症、又は他の細菌感染症の予防に有用であり、一部はグラム陽性感染症、例えば黄色ブドウ球菌感染症、又は他の細菌感染症の治療に有用であり、且つ一部はそのような感染症の予防及び治療の両方に有用であることは明らかであろう。ワクチン及び他の医薬品などの本発明の実施態様は任意に、当該技術分野において周知であり且つ本明細書に照らして自明であるように、好適で且つ医薬として許容し得る担体、賦形剤、希釈剤及び又はアジュバントを使用し調製されてよい。賦形剤、希釈剤又はアジュバントは、活性成分のビヒクル又は媒体として利用することができる固形、半固形又は液体の材料であってよい。本明細書に照らして組成物調製分野の業者は、選択された製品の特定の特徴、治療される疾患又は状態、疾患又は状態の段階、並びに他の関連状況に応じ、適切な投与の形態及び様式を容易に選択することができる、MackPublishingCo、。医薬として許容し得る希釈剤、賦形剤又はアジュバントの割合及び性質は、選択された医薬活性化合物の溶解度及び化学特性、選択された投与経路及び標準の医薬の実践により決定される。従って本発明の実施態様において、ワクチン組成物は、免疫原性成分又は断片、例えば黄色ブドウ球菌の多糖又はそれらの断片、及び又は黄色ブドウ球菌若しくは緑膿菌のタンパク質若しくはそれらの断片を含有し、並びに任意に医薬として許容し得る担体を含む。用語医薬として許容し得る担体とは、無毒である担体をいう。好適な医薬として許容し得る担体としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの1種以上に加え、それらの組合せが挙げられる。医薬として許容し得る担体は更に、抗体の貯蔵寿命又は有効性を増強する、湿潤剤又は乳化剤、保存剤又は緩衝剤などの少量の補助物質を含んでよい。そのような医薬として許容し得る担体は、例えば、医薬ビヒクル、賦形剤、又は媒体として利用する液体、半固体、又は固体の希釈剤を含む。当該技術分野において公知の任意の希釈剤を使用することができる。希釈剤の例は、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル、タルク、アルギン酸、デンプン、乳糖、ショ糖、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、アカシアゴム、リン酸カルシウム、鉱油、カカオバター、及びカカオ脂を含むが、これらに限定されるものではない。更に本発明の追加の実施態様において、本ワクチン組成物は任意に、アルミニウム塩;水中油型などの、エマルション;AS04などの脂質と塩の組合せ;油中水型;ISCOMS、リポソームウイロソーム;ナノ粒子及びマイクロ粒子など;ペプチドなど粒子でないもの;サポニン;MPLA;サイトカイン;DNA誘導体;細菌毒素;などの特定のアジュバントを含むが、これらに限定されるものではない、アジュバント又はアジュバントの組合せを含むことができる。更なる実施態様は、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント、ミコレートベースのアジュバント、細菌リポ多糖、ペプチドグリカン、プロテオグリカン、ブドウ球菌調製品、DEAEデキストラン、中性油、植物油、プルロニック、Ribiアジュバントシステム又はインターロイキン、特に細胞媒介性免疫を刺激するものなど、動物において使用されるアジュバントを含む。使用されるアジュバントは、一部、グライココンジュゲートワクチンの組成及び種類によって決まるであろう。投与されるアジュバントの量は、哺乳動物の種類及びサイズによって決まるであろう。至適用量は、慣習的方法により容易に決定することができる。本発明の更なる態様は、本発明の糖タンパク質を少なくとも1種含有する医薬組成物に関する。糖タンパク質を含有する医薬品の調製は、当該技術分野において周知である。最終の医薬組成物の調製スキーム並びにその投与の様式及び詳細は、使用されるタンパク質、宿主細胞、核酸及び又はベクターにより決まるであろう。当業者には、本発明の多糖又は糖タンパク質の治療的有効量は、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗体の単位投与量、多糖又は糖タンパク質が他の治療薬と組合せて投与されるかどうか、患者の免疫状態及び健康状態、並びに特定の多糖又は糖タンパク質の治療活性によって決まることは明らかであろう。本発明のワクチン組成物及び又は医薬調製品は、経口、非経口又は局所使用に適合されてよく、且つ錠剤、カプセル剤、坐剤、液剤、懸濁剤の形、又は任意の他の好適な手段若しくは剤形で患者へ投与されてよい。本発明の更なる態様において、ワクチン組成物及び又は医薬調製品は、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、若しくは皮下の注射によるか;又は、経口、舌下、経鼻、経肛門、又は経膣の送達によるなどを含む任意の公知の方法により、免疫付与されるべき対象に導入されてよい。本発明の医薬活性化合物は、それら自身有効であるが、安定性、結晶化の簡便性、溶解度の増加などを目的として、酸付加塩又は塩基付加塩などの、それらの医薬として許容し得る塩の形状で製剤し投与することができる。本発明の実施態様におけるワクチン組成物は、例えば、皮下又は筋肉内のいずれかの注射により、非経口的に投与される。筋肉内免疫付与の方法は、Wolffらの論文及びSedegahらの論文に説明されている。他の投与様式は、経口及び経真皮を含む。本発明のワクチンは、例えば成人又は小児において一次予防薬として、感染した宿主における黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌の根絶が成功した後の二次防御として、又は黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌による感染症を予防するため宿主において免疫反応を誘導する目的で治療薬として投与することができる。本発明のワクチンは、当業者により容易に決定される量で投与する。治療は、単回投与量又はある期間にわたる反復投与量からなる。例えばいくつかの実施態様において、本発明のワクチンのヒトに関する典型的用量は、タンパク質キャリアに結合されたオリゴ糖抗原約1~25μgであり、更なる実施態様において多糖抗原約1μg~約10μg、並びにまた更なる実施態様において多糖抗原約2μgであると予想される。追加の実施態様において、グライココンジュゲート又はワクチン内の糖タンパク質の比は、約1:5~約1:10である。任意に、本発明のバイオコンジュゲートワクチンなどのワクチンは、アジュバントを含んでよい。当業者は、至適用量は、患者の体重、疾患、投与経路、及び他の要因に応じ、増減され得ることを認めるであろう。当業者は、適量レベルは、公知のワクチンによる結果を基に得ることができることも認めるであろう。投与回数は、疾患、製剤、及び臨床試験の有効性データにより決まるであろう。本ワクチン組成物は、送達に都合の良い形状で、包装することができる。免疫原性成分又は断片のレシピエント哺乳動物への進入に適合性がある送達の形状が好ましい。本発明の一実施態様は概して、改変されたLPS生合成経路を使用することによる、グラム陰性生体におけるグラム陽性生体のためのワクチンの組換え製造を指向している。これは、オリゴ糖転移酵素及びタンパク質をコードしている核酸並びに少なくとも2つの異なる生体に起源があるグリコシル転移酵素をコードしている核酸を含む宿主への挿入により達成される。この実施態様は、タンパク質;オリゴ糖転移酵素、及び少なくとも2種の異なる生体由来のグリコシル転移酵素:をコードしている核酸が挿入される天然の生体を基にした生体の遺伝子操作を指向している。そのような実施態様の一例において、グリコシル化されたタンパク質生成物は、黄色ブドウ球菌のためのワクチンとして使用するために生成される。本発明のワクチン製品は、遺伝子改変された大腸菌宿主において生成される。黄色ブドウ球菌は、グラム陽性菌であり、且つ多糖莢膜を有する。この生体に関するワクチン製品は、その糖セクションがこの莢膜多糖に類似した構造を有するグリコシル化されたタンパク質を基にすることができる。別の態様において、本発明は、古典的化学コンジュゲート法に勝る利点を提供する免疫原性コンジュゲートワクチンを製造する新規バイオエンジニアリング的アプローチを指向している。ある実施態様において、本アプローチは、細菌細胞、例えば大腸菌などのグラム陰性細胞における糖タンパク質のインビボ生成に関与している。当業者に公知のように、グライココンジュゲートの生成及び精製は、ワクチン候補及び使用されるプラスミドの組合せに応じて変動することができる。例えば、選択されるその精製手順は、タンパク質キャリア、グライココンジュゲートの糖成分、及び例えば動物又はヒトにおけるなどの精製されたワクチン候補の意図された用途を基にしていることは知られている。例えばヒトにおける使用に関して、他の場合には精製を促進するものであるHisタグは除去されることが知られている。本明細書において言及した全ての刊行物は、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。本明細書において使用される用語又はは、適切ならば組合せることができる代替を意味し;すなわち、用語又はは、個別に各々列記された代替に加え、それらの組合せを含むことは理解されるべきである。本明細書において使用されるように、状況を別所で明確に指摘しない限りは、単数形などの単数はその複数を含み、複数の言及はその単数を含む。本発明は更に、本発明の組成物及び方法に加え、その利用性を更に説明する下記実施例を参照し規定される。本発明の範囲内である組成物及び方法の両方に対する改変を実施することができることは当業者には明らかであろう。本発明の実施態様の目的は、大腸菌におけるCP5及びCP8抗原性多糖の生成である。前述のように、本発明者らは、先行技術の観点から驚くべき、CP及びO抗原の生成経路は機能的に重複しているという事実、RUの構造において表されている事実を、新規方法において活用した。CP5及びCP8の莢膜グリカンは、2アセトアミド2デオキシDマンヌロン酸並びにD及びL立体配置を持つ2つの2アセトアミド26ジデオキシガラクトース残基の類似した三糖RUからなる重合体である。ManNAcA残基は、2つの血清型において異なるように結合され;加えて、重合されたグリカン内のRU間の結合は異なる。加えて、これら2つの抗原内の異なる位置に免疫優性Oアセチル改変が存在する、CarbohydrRes3401097106。緑膿菌LPSのO11抗原は、3αLFucNAcβDFucNAcβDG1c、緑膿菌LPSのO11抗原は、その構造がCP5及びCP8に類似している、CarbohydrRes1795160。この三糖RUは、黄色ブドウ球菌のDManNAcAがグルコース単位により交換される点、緑膿菌O11LPSにはOアセチル改変が存在しない点のみが異なり、RUにおける2番目と3番目の単糖間の結合型に違いは存在しない。本発明者らは、UndPP上でCP5及びCP8グリカンを合成することができる遺伝子システムを作製するために、Deanらの方法、JBacteriol18142754284を使用し、PA103株から緑膿菌O11O抗原遺伝子クラスターを改変した。UndPPDFucNAcLFuncNAcからなる基幹構造を合成するための生合成機構をコードしている遺伝子は、黄色ブドウ球菌グリカンの完成のために必要な黄色ブドウ球菌酵素により代償され、これは本プロセスの新たな用途でもあった。従ってDeanらの方法を使用し、UndPPFucNAcFucNAc生合成に必要とされる緑膿菌PA103由来の全ての遺伝要素を発現した。3番目の糖を付加するグリコシル転移酵素をコードしている遺伝子を欠失させ、且つわずかな改変を伴う黄色ブドウ球菌Mu50及びMW2由来のcap5又は8クラスターの対応する遺伝子と交換した。黄色ブドウ球菌莢膜多糖のための特異的残基を合成する酵素をコードしている遺伝子は、Sauらにより予想されたこれらの遺伝子の機能に従い、O11のバックグラウンドへ段階的に組み込んだ、Microbiology1432395405;ORiordanK及びJCLeeの論文、2004、黄色ブドウ球菌莢膜多糖、ClinMicrobiolRev1721834。そのような段階を以下に説明する。cap5Icap8H遺伝子産物は、ManNAcAを、RUのUndPPDFucNAcLFuncNAcへ付加し、各血清型に特異的な結合を形成するグリコシル転移酵素であると予測した、Microbiology1432395405。このことを証明するために、Cap5I及びCap8Hの活性を、緑膿菌O11O抗原の生成をもたらすプラスミドの存在下で、大腸菌において分析した。O11クラスターを発現している細胞は、最初にUndPP上にO11O抗原を合成し、そこからこれはO抗原リガーゼである大腸菌酵素WaaLによりリピドAコアへ転移され、O11特異的リポ多糖を形成する、ProcNatlAcadSciUSA891071620。このリポ多糖を合成するために、緑膿菌PA103由来のO11O抗原クラスターを、pLAFR1へクローニングした。次に3番目の糖をO11RUへ付加する酵素であるグルコシル転移酵素をコードしているwbjA遺伝子を、トランスポゾン変異誘発により欠失した。変異されたクラスターを、相同組換えにより更に改変し、wzy遺伝子のポリメラーゼ活性を除去し、O11wbjATn50<dhfr1>wzycatを形成し、これを変異された配列番号1と記し、ここではO11遺伝子クラスターのグリコシル転移酵素wbjA及びwzyポリメラーゼの遺伝子は失活された。この改変されたクラスターを、W3110ΔwecA細胞において発現させ、抽出物をプロテイナーゼKで処理し、且つTasiらの論文に明らかにされた方法に従い、SDSPAGE及び銀染色により分析した、AnalBiochem1191159。結果を図5Aに示し、これは本明細書に記載のpLAFR1由来の変異されたO11クラスターを発現しているW3110ΔwecA抽出物の銀染色を示している。第二のレーンは、誘導性プラスミドpEXT22から発現された遺伝子を示している。アスタリスクは、合成され且つコドン最適化された遺伝子を示す。異なる関連グリコフォームは矢印で示している。分析は、ゲルの2本の大きいバンドを生じた。シグナルは、未改変のリピドAコア、並びに切断型O11RUにおいて予想されるようなリピドAコアと2つのFucNAc残基からなるLPSに対応している。個別のIPTG誘導性プラスミド由来のwbjA野生型コピーの発現時に、上側バンドは、より遅い電気泳動移動度にシフトし、このことは切断型O11LPSへのグルコース残基の付加を示している。予想された黄色ブドウ球菌グリコシル転移酵素Cap5I及びCap8Hは、WbjAの代わりにトランスで発現された場合、グリコシル化されたリピドAコアシグナルの同様のシフトが認められ、これは単糖の、恐らくグルコースより更に大きい、最も可能性のあるのはManNAcAの付加を示している。このデータは、黄色ブドウ球菌グリコシル転移酵素は、緑膿菌酵素の活性により合成されるUndPPDFucNAcLFuncNAc糖脂質を伸長することができることを証明している。この方法で、UDPManNAcAの生合成機構は、黄色ブドウ球菌CP58クラスターには存在するが、緑膿菌のO11O抗原クラスターには存在しないので、大腸菌における黄色ブドウ球菌RU集成の必須条件は、UDPManNAcAの供給であることも確認した。全ての他の必要とされるヌクレオチド活性化された糖は、大腸菌のハウスキーピング機能及び緑膿菌のO11O抗原クラスターのいずれかにより提供される。大腸菌は、wecB及びwecCの発現により、ManNAcAグリコシル転移酵素の基質であるUDPManNAcAを生成することがわかっている。これらの遺伝子は、腸内細菌共通抗原生合成に責任のあるクラスターにおいて構成的に発現される、JBiolChem2651349013497。黄色ブドウ球菌のCPクラスターにおいて認められるUDPManMAcA生合成の機能的ホモログは、先に報告されたようにwecBCの活性を代償することがわかった、JBacteriol181481824。これは、大腸菌におけるCP抗原の生成は、宿主株におけるwecBC遺伝子の機能的発現に頼っていることを示している。従って、組換えシステムにおいてCap5I及びCap8Hの基質としてUDPManNAcAを提供するためには、WecB及びWecCが発現されるべきであることが確認された。そのようなシステムにおいて、例えばwecA欠失を伴う又は伴わず且つ追加のwzzE欠失を伴う又は伴わないW3110ベースの細胞型などの、大腸菌野生型株のように腸内細菌共通抗原を発現する任意の原核生物株を使用することができる。黄色ブドウ球菌莢膜多糖の更なる伸長は、グリカンの最大の免疫活性に必要であると考えられる。cap5Jcap8I遺伝子は、反復単位を重合するwzyホモログをコードし、且つcap5Kcap8Kは、UndPP結合型三糖を膜の細胞質側からペリプラズム側へと移行するフリッパーゼをコードしている。cap5Hcap8Jは、LFucNAcをRUの3位で、又はManNAcAを4位で修飾するOアセチル転移酵素をコードしている、黄色ブドウ球菌5型莢膜多糖のOアセチル化に必須の遺伝子の同定、MolMicrobiol27921。このアセチル化は、多糖の免疫反応性を識別する重要な決定因子である。これらのRUは伸長及びアセチル化されることができることを示すために、重合及びOアセチル化に責任のある黄色ブドウ球菌酵素を、変異されたO11クラスターの存在下で、個別のプラスミドから発現した。O11wbjATn50<dhfr1>wzycatクラスター及びCP5クラスターの異なる遺伝子を発現しているW3110ΔwecA細胞からの抽出物を、プロテイナーゼKで処理し、SDSPAGE、電気転写させ、引き続き抗CP5糖を用い免疫ブロッティングすることにより分析した。図5Bは、抗CP5抗血清を使用する、SDSPAGE及び電気転写により分離した、プロテイナーゼK処理した大腸菌抽出物の免疫検出の結果を示している。分析した全ての抽出物は、本明細書に記載のpLAFRプラスミドから発現されたwbjA遺伝子及び部分的にwzy遺伝子の欠失を伴う緑膿菌O11クラスター、並びにこれらの細胞におけるCP5重合及びOアセチル化を可能にする異なるCap5タンパク質を発現する更に2つのプラスミドを含んだ。誘導因子濃度及び発現培養インキュベーション温度などの実験の詳細を記している。図5Bにおいて、結果は、はしご状シグナルが比較的高い分子量範囲においてO抗原重合体の典型であることを示している。異なるバンドは、両方共プロテイナーゼK消化に対し安定しているLPS又はUndPP上の異なる数の鎖状重合されたRUを表している。Oアセチル転移酵素の存在下又は非存在下で、はしご状構造の異なる強度が認められた。cap5Hの存在下で強力なシグナルが検出されたのに対し、これらはcap5Hの存在しないレーンにおいては事実上存在しなかった。このことは、Oアセチル化がいずれか特異的抗血清による認識を増大すること、又はこれが、フリッピングの促進若しくはより効率的な重合形成によるか、又はより多くのRU生成を誘導することのいずれかにより、重合活性を増強することを意味する。cap5H遺伝子は、異なる骨格のプラスミドから発現された場合に機能するが、シグナル強度は、cap5Hが個別のプラスミドから単独で発現された場合の方がより強力である。黄色ブドウ球菌遺伝子の誘導により少ないIPTGを使用すると、より強力なシグナルとなることは、驚くべきであり注目に値する。cap5特異的遺伝子の高い発現はより少ない重合体形成に繋がるので、この問題に対処するために、組換えグリカンの代替発現システムを構築した。詳細には、先行技術を考慮し予想外の新規アプローチにおいて、緑膿菌グルコシル転移酵素及びO11のポリメラーゼを、黄色ブドウ球菌Mu50MW2の莢膜遺伝子クラスター由来のCP58特異的要素をコードしている遺伝子と交換し、緑膿菌O11及び黄色ブドウ球菌CP5又はCP8遺伝子で構成された単独のキメラ遺伝子クラスターを作製した。この構築体は、黄色ブドウ球菌の特異的遺伝子を含んだ。Datsenkoらの方法、ProcNatlAcadSciUSA9766405に従い、各々に、発現検出のためにタグを付け、且つ各々は、導入されたリボソーム結合部位を含み、引き続き組換えクローンの選択のためのクロラムフェニコール耐性カセットを含み、配列番号2、配列番号3、及び配列番号4を生じた。図6は、本発明のキメラO11CP5及びO11CP8遺伝子クラスターを構築するための本発明の戦略の実施態様を示す。黄色ブドウ球菌CP5及びCP8CPクラスター及び緑膿菌PA103rfbクラスターは、文献として示されている、JBacteriol181427584;SauS、NBhasin、ERWann、JCLee、TJFoster及びCYLeeの論文、1997、共通遺伝子に隣接された型特異的遺伝子を含む血清型5型及び8型莢膜発現のための黄色ブドウ球菌対立遺伝子座、Microbiology1432395405。これらの遺伝子の相同な機能は、以下に説明されている。右上がり実斜線は、2種の生体においてUndPP上のDFucNAcLFucNAc二糖の合成に責任のある遺伝子を示し;点付きは、3番目の単糖をRUに付加するグリコシル転移酵素の遺伝子を示す。Wzx様フリッパーゼ遺伝子は、右上がり破斜線により示され、wzy様RUポリメラーゼ遺伝子は、右下がり破斜線により示される。CP5クラスターは、Wzz長さ調節因子を含まないが、3つの遺伝子セットは、黄色ブドウ球菌における長さ調節因子機能を含む莢膜多糖に関するエクスポート機構を構成する。右上がり実斜線により示されたOアセチル転移酵素遺伝子は、CPクラスターに特有である。黄色ブドウ球菌におけるUDPManNAcA生合成に必要な遺伝子は、黒色で示した。これらは、緑膿菌O抗原の生成には不要である。O11、CP5及びCP8多糖の構造上の差異の原因となる遺伝子は、各々の遺伝子クラスターの始まり又は中央において一緒にクラスター化されている。CP8クラスターは、長さ及びDNA配列を考慮すると、構造特異性を付与する中央部分以外は、CP5クラスターとほとんど同一である。キメラクラスターは、相同組換え及び古典的クローニングによる、CP5クラスターの特異性部分及び白矢印で標示されたcatにより表されたクロラムフェニコールアセチル転移酵素のカセットと、プラスミド媒介性O11クラスターのwbjA及びwzy遺伝子の交換により構築され、配列番号2、配列番号3、及び配列番号4を生じた。破線矢印のアスタリスクは、相同組換えに使用した不完全な遺伝子配列を示している。得られた2つのキメラクラスターは、下側パネルに示し、配列番号3及び配列番号4のDNAを表している。本発明のキメラCP5及びCP8は驚くべきことにUndPP上に正確なRUを集成し、且つこれらの反復単位が重合されることを確実にすることを証明するために、この完全長キメラクラスターを含む大腸菌細胞のプロテイナーゼK消化物を、SDSPAGEにより分離した。具体的には、pLAFRプラスミド上にキメラCP5遺伝子クラスター又はキメラCP8遺伝子クラスターを含むか又は欠くかのいずれかであるプラスミドを持つ細胞を、プロテイナーゼKにより処理し、SDSPAGEにより分離し、脂質を銀染色によるか、又はニトロセルロースメンブレンへの電気転写後の抗CP5若しくはCP8抗血清による免疫検出により可視化した。フリッパーゼ遺伝子cap5Kを欠く構築体及び含む構築体を試験した。前者は、CP5LPS生成において活性が低いことがわかった。電気転写及び抗CP5特異的血清による免疫検出後、キメラCP5クラスター全体を発現している抽出物は、それらの自家血清によりプロービングされた大腸菌由来の内在性O抗原構造に類似したはしご状のシグナルを示している。これは、CP5反復単位は重合されること、好ましい重合体長が存在すること、及びCP5抗原はこれらの細胞内でリピドAコアに転移されたことを強力に示唆している。同じ抽出物を、SDSPAGE後、銀染色により可視化し、キメラCP5及びキメラCP5と標示した右側の2本のレーンは、実際CP5O抗原様構造で装飾された大腸菌のリピドAコアからなるLPSが形成されたことを示している。cap5Kフリッパーゼ遺伝子を持つ又は持たないCP5キメラクラスターを発現した細胞を起源とする抽出物から、強度の差が得られた。これら2つの抽出物の比較は、Cap5K発現はこの重合体生成をかなり増大することを示している。図7Bに示されるように、同じ結果が、CP8キメラクラスターで認められた。pLAFRプラスミド上にキメラCP8遺伝子クラスターを含むか又は欠くかのいずれかであるプラスミドを含む細胞を、プロテイナーゼKにより処理し、SDSPAGEにより分離し、脂質を銀染色によるか、又はニトロセルロースメンブレンへの電気転写後の抗CP8抗血清による免疫検出のいずれかにより検出した。フリッパーゼ遺伝子cap8Kを含むCP8キメラ構築体は、配列番号4に相当している。本発明の更に新規且つ驚くべき伸展が、大腸菌におけるキメラクラスターの維持及び発現のために使用されるプラスミド骨格を変更することにより明らかにされた。キメラCP5クラスターを含むpLAFR1における耐性カセットを、TetからKanへ変更した。加えてcap5Kを含むCP5キメラクラスター全体を、Leeらの方法、BMCMicrobiol9252に従い、プラスミドpDOCCへ及びpACYC177へサブクローニングした。図8A及び8Bに示されるように、これらのプラスミドは全て、SDSPAGE、電気転写、及び抗CP5特異的抗血清による免疫検出により分析されたように、CP5重合体生成をもたらした。図8Aにおいて、異なるキメラクラスターを含む細胞からの総細胞抽出物を、プロテイナーゼKにより処理し、且つSDSPAGE及び銀染色により分析した。これらのプラスミドは、異なる黄色ブドウ球菌特異性遺伝子及び抗生物質選択に使用される異なる耐性遺伝子を含み、以下のように示されている:テトラサイクリン及びHIJ、配列番号2;Tet、HIJK、配列番号3;Tet及び遺伝子なし、空のプラスミド対照。数値は分子量マーカーに対応している。カナマイシンと標示したレーンは、テトラサイクリン耐性カセットがカナマイシン耐性遺伝子により交換された配列番号3の変形を含む。図8Bにおいて、宿主菌株は、図8Aのように、大腸菌W3110ΔwecAである。図8Bの左側レーンは、図8Aのように分子量マーカーに相当している。図8Bにおいて、異なるキメラクラスターを含む細胞からの総細胞抽出物を、プロテイナーゼKにより処理し、且つSDSPAGE及び銀染色及び電気転写後の抗CP5免疫ブロッティングにより分析した。使用したプラスミドは、テトラサイクリンの代わりにカナマイシンカセットを含む改変されたpLAFR1プラスミド骨格内、又はクロラムフェニコール耐性カセットを含むpACYC内のいずれかに存在する、配列番号3で示されたキメラCP5クラスターを含む。加えて異なるプロモーターを、キメラO11CP5LPSを発現するために試験した。これらの試験において、宿主菌株は、キメラCP5クラスターを保持する大腸菌W3110ΔwecAであった。この菌株において、キメラクラスターは、wecAwzzE遺伝子を交換した。pLAFR1から発現された異なるキメラクラスターを含む細胞からの総細胞抽出物を、プロテイナーゼKにより処理し、且つSDSPAGE及び電気転写後の抗CP5免疫ブロッティングにより分析した。これらのプラスミドは、図9のレーン下側図に示されたように異なる黄色ブドウ球菌特異性遺伝子によりwbjAとwzyが交換されたO11クラスターを含んだ。加えて、cap5特異性遺伝子の前のDNAを変更し、且つ脂質グリコシル化に対する作用を分析した。これらの異なるプロモーター領域の作用を、図9に示したように分析した。wzzwzxは、最初の相同組換え後のcap遺伝子の前の当初の遺伝子を示す。これら2つの遺伝子を除去し、且つ強力なプロモーター配列をコードしている大腸菌O121O抗原クラスターの前の06kb領域と交換した。図9においてwzzwzx及びHIJで示されたレーンは、配列番号2を発現する細胞に由来し、wzzwzx及びHIJKで示されたレーンは、配列番号3に由来する。図9において、分子量マーカーは、ゲルフレームの左側に示している。図9に示したように、これらの結果は、関連するプロモーター活性は、wzx遺伝子に備わっていること、及びこれはLPS生成を失うことなく、大腸菌由来の構成的プロモーター、例えば血清亜型O121wbプロモーターにより機能的に交換され得ることを示している。これらの結果はまとめると、本明細書に記載のように、O11O抗原及びCP5莢膜重合体生成のためのO11及び黄色ブドウ球菌の要素は、多くの異なる大腸菌発現システムにおいて組合せることができ、結果的に組換え黄色ブドウ球菌多糖を生成することを意味する。これらの結果は、グラム陽性生体に起源を持つ莢膜多糖構造の大腸菌における生成を最初に示した。これは、先行技術及び従来の予測とは対照的に、キメラ多糖を発達するためのO11クラスターの酵素と、黄色ブドウ球菌capクラスターの酵素の組合せは可能であること、すなわちこの酵素はインビボにおいて同じ構造上で一緒に作用することを意味する。分子レベルでの大腸菌におけるキメラCP5O11クラスターの活性を確認するために、2アミノベンズアミドによる還元末端の糖の蛍光標識を使用することによりUndPP結合された糖の分析を可能にする新規方法を開発した。この分析解像度を増強するために、重合されないRUの量が増加した欠失を含むキメラクラスターを使用した。pLAFR1プラスミドに含まれ且つcap5Kフリッパーゼを欠いているキメラクラスターを発現している異なる大腸菌細胞に由来する糖脂質を、下記のように分析した。UndPP結合されたグリカンを抽出するために、大腸菌細胞を、09NaClで洗浄し、且つ凍結乾燥した。乾燥した細胞を、有機溶媒30mlにより一回抽出した。この凍結乾燥した細胞ペレットを更に、クロロホルム:メタノール:水5mlで2回抽出した。抽出物を、クロロホルム及び水に変え、最終比34847とした。10103抽出物を、水の添加により、2相BlighDyerシステムに変え、CanJBiochemPhysiol379117、最終比10109を生じた。遠心分離により相を分離し、上側の水相を更なる処理のために保持した。抽出された糖脂質を精製するために、水相をtC18SepPAKカートリッジにかけた。このカートリッジは、メタノール10mlで前処理し、その後34847の10mlで平衡とした。試料を装荷した後、カートリッジを、34847の10mlで洗浄し、メタノール5ml及び10103の5mlで溶離した。一緒にした溶離液を、N2下で乾燥した。この乾燥試料をnプロパノール2Mトリフルオロ酢酸の2mlに溶解し、50°Cで15分間加熱し、その後N2下で蒸発乾固させることにより、糖脂質試料を加水分解した、ProcNatlAcadSciUSA102142559。これらの乾燥試料を、2ABにより標識し、既報のようにペーパーディスク法を用いグリカンクリーンアップを行った、AnalBiochem23022938;MerryAH、DCNeville、LRoyle、BMatthews、DJHarvey、RADwek及びPMRuddの論文、2002、ヒドラジン分解による糖タンパク質から放出された無傷の2アミノベンズアミド標識されたOグリカンの回収、AnalBiochem304919。2AB標識されたグリカンは、Royleらの論文に従いGlycoSepN順相カラムを使用するが、3溶媒システムに改変したHPLCにより分離した、AnalBiochem3047090。溶媒Aは、80アセトニトリル中10mMギ酸アンモニウムのpH44であった。溶媒Bは、40アセトニトリル中30mMギ酸アンモニウムのpH44であった。溶媒Cは、05ギ酸であった。カラム温度は30°Cであり、且つ2AB標識されたグリカンは、蛍光により検出した。勾配条件は、流量04ml分で160分間かけて100Aから100Bまで、引き続き流量を1ml分に増加し100Bから100Cまで2分間の直線勾配であった。カラムは、100Cにより5分間洗浄し、2分間かけて100Aに戻し、かつ100Aを流量1ml分で15分間流し、その後5分間流量を04ml分に戻した。水中の試料を注入した。乾燥した画分を、10アセトニトリル、01トリフルオロ酢酸5ul中に再懸濁し、且つ標的プレート上でマトリックス溶液と11で混合した。MS及びMSMSデータを、UltraflexIIMALDIToFToF質量分析計上で陽イオンモードで手動で得た。MSMSは、LIFT法を用いて得た。標準ペプチド混合物を外部較正に使用した。スペクトルは、FlexAnalysisソフトウェアを用いて外挿し、手作業で分析した。キメラクラスターを伴う又は伴わないプラスミドを含む大腸菌W3110ΔwecAからのメタノール抽出物を、tC18カートリッジ上で精製し、順相HPLCにより分析した。37分、40分及び45分の溶離に認められる図10Aに示されたピークに対応する画分を、MALDIMSMSにより分析した。37分及び40分に溶離する試料は、各々、結合したOアセチル基を伴う及び伴わない組換えCP5RUとして同定された。45分に溶離する試料は、1個のデオキシNアセチルヘキソサミンにより伸長されたアセチル化されない黄色ブドウ球菌RU構造として同定された。CP5キメラクラスターにおいて、cap5HIJは、pLAFR上のO11クラスターのwbjA及びwzy遺伝子と交換した。この交換は、cap5HIJ遺伝子に加え、catカセットを含んだ。キメラクラスターを伴う又は伴わないプラスミドを含む大腸菌W3110ΔwecAwzzEからのメタノール抽出物を、tC18カートリッジ上で精製し、順相HPLCにより分析した。図10Bは、キメラクラスターを用いて生成されたCP8の組換えRUのHPLC分析の結果を示している。この組換え糖を発現している細胞に特異的なピークは、23分、32分、38分及び45分の溶離により同定され、収集し、MALDIMS及びMALDIMSMSにより分析した。CP8キメラクラスターにおいて、cap8HJKは、O11クラスターのwbjA及びwzy遺伝子と、すなわちポリメラーゼを伴わない構築体を交換し、分析のための単独のRUを蓄積した。この交換は、cap遺伝子に加え、catカセットを含んだ。図11Aは、37分で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP5クラスターの実施態様の発現により発生した特異的ピークのMALDIMSMS分析の結果を示している。主質量mz772を選択し、且つMSMSにより分析し、これは本明細書に開示された本発明を考慮し予想されたアセチル化されたCP5RU構造と一致する断片化パターンを示す。Oアセチル化された種は、RUの中央位置での単糖FucNAcの質量42の特異的喪失により特徴付けられる。断片イオンは、糖鎖機能研究コンソーシアムの命名法に従い示されている。2ABは、2アミノベンズアミドである。断片イオンの凡例は、図11Aの差込図に示されている。図11Bは、40分で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP5クラスターの実施態様の発現により発生した特異的ピークのMALDIMSMS分析の結果を示している。主要質量mz=730を選択し、且つMSMSにより分析し、これは本明細書に開示された本発明を考慮し予想された非アセチル化CP5RU構造と一致する一連の断片イオンを示す。2ABは、2アミノベンズアミドである。断片イオンの凡例は、図11Bの差込図に示されている。図11Cは、32分で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP8クラスターの実施態様の発現により発生した特異的ピークのMALDIMSMS分析の結果を示している。主要質量mz=794を選択し、且つMSMSにより分析し、これは本明細書に開示された本発明を考慮し予想されたアセチル化されたCP8RU構造と一致する一連の断片イオンを示す。Oアセチル化された種は、RUの最も外側の位置での単糖ManNAcAの質量42の特異的喪失により特徴付けられる。断片イオンは、CFGの命名法に従い示されている。2ABは、2アミノベンズアミドである。断片イオンの凡例は、図11Cの差込図に示されている。図11Dは、38分で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP8クラスターの実施態様の発現により発生した特異的ピークのMALDIMSMS分析の結果を示している。質量mz=730を選択し、且つMSMSにより分析し、これは本明細書に開示された本発明を考慮し予想された非アセチル化CP8RU構造と一致する一連の断片イオンを示す。追加の分析は、より遅く溶離するピークは、CP5及び8のRUの非Oアセチル化三糖を含むことを示した。断片イオンは、CFGの命名法に従い示された。2ABは、2アミノベンズアミドである。断片イオンの凡例は、図11Dの差込図に示されている。MSの結果は、質量及び一連の断片イオンは、中央FucNAc残基でOアセチル化されたCP5RUオリゴ糖又は中央FucNAc残基でOアセチル化されなかったCP5RUオリゴ糖の分子構造と一致することを示した。図10Aにおける45分時点のシグナルは、四糖と同定され、これを更に以下に分析した。同じ分析を、ポリメラーゼ遺伝子を欠いているキメラCP8クラスターで繰り返した。そのような抽出物において、本明細書に開示された本発明を考慮し予想されたOアセチル化されたRU構造と一致するシグナルは、図10B及び11Cに示されたように、23分及び32分の溶離で認められた。MALDIMSMSにより同定された同じグリカン配列に関する2つの異なる溶離時間の存在は、試料調製時に生じるOアセチル移動事象を指摘している。非アセチル化RUは、図11B及びDにおいて示されたように、40分及び38分で、各々CP5及びCP8抽出物について同定された。CP5及びCP8RU構造は、例えば、W3110、W3310ΔwecA、W3110ΔwecAwzzE、及びW3110ΔwecAwzzEΔwaaLを含む、様々な大腸菌株に存在する。キメラCP8クラスターを発現するが、wzyポリメラーゼ遺伝子cap8Iを欠いている大腸菌細胞に由来した、図10Bに示された45分で溶離するHPLCピークも、MALDIMSMSにより分析した。フルスキャンMSにおいて最も強いイオンは、mz=939であり、且つ配列解析は、MSMSにより行った。このMSMS分析の結果は、図11Eに示し、且つ本明細書に開示された本発明を考慮し予想されるように、非還元末端でデオキシNアセチルヘキソサミンの質量だけ延長された非アセチル化黄色ブドウ球菌莢膜RUと一致する一連の断片イオンが存在した。仮定される構造に対応する断片イオンは、これらのピークの上にCFGの命名法に従い示されている。2ABは、2アミノベンズアミドである。断片イオンの凡例は、図11Eの差込図に示されている。図11Eに示された結果は、大腸菌グリコシル転移酵素は、CP8RUのManNAcA残基を改変することができることを示唆した。そのような変更されたRUは、恐らくcap8Iにより重合されることはないであろう。大腸菌宿主W3110におけるグリコシル転移酵素特異性の分析は、ECAクラスター由来の酵素は、この組換え糖と、具体的には推定4Nアセチルフコサミン転移酵素であるwecF遺伝子産物と相互作用し得ることを指摘した。wecFは天然に、4Nアセチルフコサミンを、ECAを構成するManNAcA上に付加し、恐らくはこの酵素は同じくCP8及びCP5RUを伸長するであろう。この問題点を解決するために、別の新規アプローチを開発した。具体的には、wecFを含むwecC遺伝子の下流に位置したECAクラスターの遺伝子を欠失した。これは、Datsenkoらにより説明された方法を用いて実行した、PCR産物を使用する大腸菌K12における染色体遺伝子の一工程不活化、ProcNatlAcadSciUSA、9766406645。様々な大腸菌発現宿主を、waaL及びrmlBwecG遺伝子領域で欠失させ、一部の菌株では更にwecAwzzECAでも欠失させた。ポリメラーゼ変異体CP8キメラクラスターを発現しているこれらの変異細胞からのSepPAK精製された抽出物を、前述のように順相HPLCにより分析した。図11Fは、配列番号4のポリメラーゼ変異体を発現している大腸菌W3110ΔwaaL細胞からのメタノール抽出物のHPLC分析を、ECAクラスター遺伝子rmlBwecGの追加の欠失を伴う細胞からのそれと比較した結果を表している。抽出物は、tC18カートリッジ上で精製し、順相HPLCにより分析した。図11Fに示したように、図10Bにおいて45分で出現した主要ピークは存在せず、アセチル化及び非アセチル化CP8RUに特異的ピークを生じ、これはECAグリコシル転移酵素のひとつ-最も可能性があるのはwecF-が、異常な伸長表現型に責任のあることを指摘している。同様の結果が、このCP5キメラクラスターを異なる菌株で試験した場合に得られた。このことは、大腸菌媒介性グリコシル転移酵素及びヌクレオチド活性化された糖生合成に必要な酵素の欠失は、大腸菌において組換え的に生成された多糖の品質及び量を適正化するための可能性のある戦略であることを暗示している。標的酵素は恐らく、O抗原クラスター、ECAクラスター、及びコラン酸又は莢膜クラスターにコードされているであろう。UndPPに結合された組換え多糖の品質に関する更なる証拠は、前述のように染色体的に最適化された発現宿主からSepPAK精製され蛍光標識された糖脂質抽出物の最適化された順相HPLC分析から得られた。帯電したCP5及びCP8オリゴ糖及び多糖結合された脂質の精製のためのSepPAKカラムの最適性能に関して、tertブチルアンモニウムリン酸を、抽出物へ添加し、その後SepPAKカートリッジに装加した。Trentらの論文に報告されたように、この塩の陽イオンは、疎水性ブチル鎖により負電荷を遮蔽することにより、帯電した化合物のカラム結合を改善する、ポリミキシン耐性サルモネラティフィムリウム及び大腸菌におけるポリイソプレン連結されたアミノ糖の蓄積:構造決定とペリプラズム内のリピドAへの転移、JBiolChem、2764313243144。この最適化された方法は、ポリメラーゼを含むCP5又はCP8キメラクラスターを発現している細胞からのメタノール抽出により得られたCP5及びCP8試料に適用された。図11Gは、大腸菌細胞のUndPP上に存在する完全CP5グリカンレパトアを示すHPLC分析の結果を提供している。キメラCP5クラスター配列番号3又は空のプラスミド対照のいずれかを発現している大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlBwecGcatからのメタノール抽出物を、SepPAKカートリッジ上で固相抽出し、且つ弱酸で処理し、UndPPから糖を加水分解した。得られた物質を、還元的アミノ化により、2ABと反応させ、グリカンの還元末端を標識し、順相HPLCにより分析した。実線には存在するが破線には存在しないシグナルは、CP5特異的物質を表している。大文字は、収集された画分のMALDIMSMSにより同定されたアセチル化及び又は非アセチル化CP5RUの重合体を含むピークを示している。図11G中の凡例は、MSMS分析から推定される提唱された分子構造を示している。MSMSで示されたアセチル化及び非アセチル化RU重合体は、太棒により示されたクロマトグラムにおいて一緒にされた同じ重合度の群の構造を確認したことは注意されなければならない。大文字は、以下の凡例を示している:A及びB:1つのRU;C、D及びE:2つのRU;F及びG:3つのRU;並びに、H:4つのRU。図11Gにおける95分と125分の間の幅広ピークは、恐らく、5つ以上の重合されたRUを表しているであろうが、このカラムによっては分離されない。図11Hは、アセチル化CP5グリカン及びRU均一性を示す、更なるHPLC結果を表している。このHPLC分析を調製するために、キメラCP5クラスター配列番号3を発現している大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlBwecGcatの2AB標識したグリカン試料を、水溶液中のNaOHで処理し、再標識した。図11Hに示すように、アルカリ処理前の試料及び後の試料を、HPLCにより分析した。図11H中の数字は、対応するピーク内のRUの推定数を示している。図11Hにおいて、図11Gに示されたアセチル化されたピークは、非アセチル化重合体からのシグナルと一体化されること、及び脱アセチル化は95分以降の溶離時間にRU単位を分離したことは認められなければならない。図11Iは、大腸菌細胞のUndPP上に存在するCP8グリカンレパトアを示すHPLC分析の結果を提供している。キメラCP8クラスター配列番号4又は空のプラスミド対照のいずれかを発現している大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlBwecGcatからのメタノール抽出物を、SepPAKカートリッジ上で固相抽出し、且つ弱酸で処理し、UndPPから糖を加水分解した。得られた物質を、還元的アミノ化により、2ABと反応させ、グリカンの還元末端を標識し、順相HPLCにより分析した。実線には存在するが破線には存在しないシグナルは、CP8特異的物質を表している。収集された画分のMALDIMSMSにより同定されたアセチル化及び又は非アセチル化CP8RUの推定構造を示している。図11Gに示されたCP5のHPLC結果のように、図11Hのクロマトグラムにおいて一緒にされた同じ重合度の群のアセチル化及び非アセチル化CP8RU重合体は、太棒により示されていることに注意。110分以降に検出された物質は、より長いCP8重合体を表している。図11Jは、CP8グリカンの脱アセチル化及びRU均一性のHPLC結果を更に表わす。キメラCP8クラスター配列番号4を発現している大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlBwecGcat由来の2AB標識したグリカン試料を、水溶液中のNaOHで処理し、再標識した。アルカリ処理前の試料及び後の試料を、HPLCにより分析した。数字は、対応するピーク内のRUの推定数を示している。アセチル化されたピークは大きく消滅すること、及び非アセチル化重合体のシグナルは増大すること、及び脱アセチル化は110分以降の溶離時間にRU単位を分離したことは注意されなければならない。図11H及び11Jは、オリゴ糖及び多糖からアセチル化修飾を除去するためにこれらのCP5及びCP8試料に対しアルカリ処理が実施された場合に、O抗原の特徴的はしご状バンド形成パターンを指摘するHPLC結果を示している。これらの結果は、溶離時間の増分が一定に減少するにつれ、離散した鋭利なピークを示している。このことは、そのような分析された炭水化物鎖は、同じRUで構成される鎖状重合体であることを暗示している。このデータは、大腸菌により生成された組換えCP5及びCP8糖は、規則的に重合され且つ部分的にアセチル化されることを示している。非アセチル化CP5及びCP8重合体は、それらの構造の類似性から予想されるように、HPLCカラムから同じように溶離する;しかし、順相クロマトグラフィーは、差異も明らかにしている:例えば、CP5は、CP8よりも、より少ない程度重合し、アセチル化はCP5においてより頻度が高く;4以上のRU長においては、CP5は7RUの重合体生成に明確な優先性を有するのに対し、CP8はより広範な程度で重合し;並びに、HPLC及びMSMSの結果により示されるように、CP5はCP8よりもグリカン生成に関してより効率的である。wzy依存性重合経路において、特異的酵素が、実行されるRU重合段階の平均数の決定に責任があることが、Maroldaらにより報告されている、リポ多糖O抗原の移行及びペリプラズム集成におけるWzxトランスロカーゼ及び対応するポリメラーゼ及び鎖長調節タンパク質の相互作用、JBacteriol、18851245135。Wzz酵素は、特異的反復数の平均の、例えば短い、長い及び非常に長い糖重合体を生じ、且つそれらの長さ特異性を外因性多糖経路に転移することがわかっている。CP8糖脂質の長さ及び量は、より長く且つより少ない量のこの糖を生じる生成株において分析された。タンパク質グリコシル化に関して分子の量を増加し、それにより糖転移効率を増加するために、特異的Wzz酵素を使用し、CP8糖の長さのダウンレギュレーションが実行された。Wzzタンパク質の脂質上のCP8糖のサイズ及び量に対する作用を試験するために、大腸菌wzzO7由来のWzzの同時発現を、個別のプラスミドから行った。図11Kは、この試験の結果を表している。キメラCP8クラスター配列番号4及びプラスミド媒介性wzzO7のIPTG誘導性コピー、又は空のプラスミド対照のいずれかを発現している大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlBwecGcatからのメタノール抽出物を、SepPAKカートリッジ上で固相抽出し、且つ弱酸で処理し、UndPPから糖を加水分解した。2AB標識したグリカンを、順相HPLCにより分析した。CP8試料のアルカリ処理は、95分と115分の間の領域の85以上が、CP8の7又は8のRU重合体を表すことを示し、これは多種多様なアセチル化を示している。これらの結果は、キメラCP8クラスターは、a7から8までの最も豊富なグリカンの反復数の増加、及びbクロマトグラム下面積から判断されるより高い全体の蛍光シグナル強度:を誘導したことも示している。アルカリ処理は、図11I及び11Jのように短縮されたグリカンのアセチル化を確認し、これは組換え多糖の長さは、外来性Wzz酵素により調節することができることを示している。同じく、O抗原由来のWzz酵素により莢膜の糖重合体の長さを調節することも可能である。更にキメラクラスターの前の異なるプロモーターは、プラスミド上に存在する場合、異なる発現レベル及び異なる重合度を生じる。キメラクラスターの様々な変種を、バイオコンジュゲート生成について試験した。キメラO11CP5遺伝子クラスターは、O11O抗原クラスター内にwbjA及びwzyの代わりに黄色ブドウ球菌特異性領域の異なる変種を含むが、これらを、宿主株大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzEcatにおいて、PglB及びEPAの存在下で発現した。W3110ΔwaaLΔwecAwzzEcat宿主細胞は、wbjA及びwzy遺伝子が異なるcap5遺伝子セットと交換されているO11O抗原クラスターを持つpLAFR1プラスミドに加え、個別のプラスミドから、2つのグリコシル化部位を伴うEPA及びPglBを発現した。以下を含む、EPAタンパク質が発現される:aペリプラズムへ輸送するためのN末端シグナルペプチド配列、bその全体が引用により本明細書中に組み込まれているWO2009104074の実施例10に示された、タンパク質配列へ操作される2つの細菌Nグリコシル化コンセンサス配列、及びc精製のためのヘキサヒスチジンタグ。細胞は、5Lのエレンマイヤーフラスコ内でLB培地において増殖した。一晩培養物を、OD600nm=005まで希釈した。OD600nmがおよそ05で、PglB発現を、1mMIPTGの添加により誘導し、且つEPA発現を、アラビノースの添加により誘導した。細胞を4時間増殖し、誘導を繰り返し、且つ細胞を更におよそ16時間増殖した。細胞を遠心分離によりペレットとし;これらの細胞を洗浄し、且つ02容量のショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、且つペリプラズムのタンパク質を、Ni2アフィニティクロマトグラフィーに装加した。黄色ブドウ球菌フリッパーゼ遺伝子cap5Kを含まない又は含むEPACP5バイオコンジュゲートを、05Mイミダゾールにより溶離し、溶離されたピークをプールし、SDSPAGEにより分析し、且つクマシー及び銀により染色した。図12は、SDSPAGEの結果を表している。左側パネルはクマシー染色を示し、右側パネルは銀染色を示す。中央の数値は、分子量マーカーのサイズを示す。レーンの下側の文字は、バイオコンジュゲート生成に使用された菌株において発現されたキメラクラスターに存在する遺伝子を示している。宿主菌株は、大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzEcatであった。これらの結果は、恐らくグリコシル化されないEPAに対応する70kDaにタンパク質シグナル、及びその上にはしご状バンドを示した。このはしごは、恐らくCP5組換え黄色ブドウ球菌グリカンによりグリコシル化されたEPAタンパク質に対応している。加えて、これらの結果は、システム中にフリッパーゼ遺伝子を含むことは、糖タンパク質収量を増やすことを示している。別の分析において、CP5EPAバイオコンジュゲートは、キメラCP5遺伝子クラスター、プラスミドpEXT21由来のPglB、及び別のプラスミド由来のEPAの同時発現により、大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzEcatにおいて生成された。バイオコンジュゲート生成のためにより制御されたプロセスを得るために、これらの細胞を、2Lのバイオリアクター内で37°Cで、OD600nm=30まで増殖し、PglB及びEPAの発現を、1mMIPTG及び02アラビノースの添加により誘導した。これらの細胞を、酸素制限条件下、37°Cで18時間増殖した。これらの細胞を、遠心分離によりペレットとし、洗浄し、25ショ糖緩衝液中に再懸濁しOD600nm=200とし、30分間4°Cでインキュベーションした後、この懸濁液をペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、上清に存在するペリプラズムのタンパク質を、Ni2アフィニティクロマトグラフィーに装加した。グリコシル化及び非グリコシル化EPAを、05Mイミダゾールによりアフィニティカラムから溶離し、SourceQ陰イオン交換カラムに装加した。NaCl濃度を増加する勾配を適用することにより、グリコシル化EPAは、非グリコシル化EPAから分離された。図13Aに示されるように、精製されたグリコシル化EPAは、SDSPAGEにより分離し、且つクマシーにより染色するか、又はニトロセルロースメンブレンに転写し、抗CP5抗体又は抗EPA抗体のいずれかと一緒にインキュベーションした。精製されたバイオコンジュゲートは、EPA特異的抗体、更にはCP5特異的ポリクローナル抗血清により認識された。矢印は、そこから切り出され、トリプシン処理され、且つMALDIMSMSにより糖ペプチド分析を施した切片の、ゲルでの位置を示している。図13Bは、Oアセチル化されたRU質量にNグリコシド結合されたトリプシン処理されたペプチド中のグリコシル化部位に関して認められたMZ質量のMALDIMSMSを表している。mz2088のMSMS分析は、指摘したような糖部分の部分的断片化を示している。差込図は、図13Aからの精製されたCP5EPAのトリプシン処理から誘導されたペプチドに結合されたRU構造を図示している。ManNAcA及びアセチル化されたFucNAc、229Daの逐次喪失は、予想されたグリカン構造を裏付けている。図13Cは、Oアセチル化されたRU質量にNグリコシド結合されたトリプシン処理されたペプチド中のグリコシル化部位に関して認められたMZ質量のMALDIMSMSを表している。mz1165のMSMS分析は、CP5RU構造と一致する完全Yイオンの一連の断片イオンを示している。差込図は、図13Aからの精製されたCP5EPAのトリプシン処理から誘導されたペプチドに結合されたRU構造を図示している。ManNAcA、アセチル化FucNAc、229Da、及びFucNAcの逐次喪失は、ペプチド上の予想されたグリカン構造を裏付けている。図13Dにおいて、大腸菌におけるCP8バイオコンジュゲートを、CP5バイオコンジュゲートの生成と同じ戦略を用いて生成した。CP8EPAバイオコンジュゲートは、キメラCP8遺伝子クラスター、PglB、及び2つのグリコシル化部位を含むEPAの同時発現により、大腸菌において生成される。細胞は、バイオリアクター内で、グリセロール、ペプトン及びC源として酵母エキスを含有する半限定培地において、出発容積7Lにおいて増殖した。細胞を、バッチ又はパルスバッチモードで、37°Cで、OD600nm=30まで増殖し、PglB及びEPAの発現を、1mMIPTG及び10アラビノースの添加により誘導した。誘導後細胞を、流加バッチモードで、酸素制限条件下、更に15時間培養した。細胞を、遠心分離によりペレットとし;細胞を洗浄し、02容量ショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni2アフィニティクロマトグラフィーに装加した。グリコシル化及び非グリコシル化EPAを、05Mイミダゾールによりアフィニティカラムから溶離し、SourceQ陰イオン交換カラムに装加した。NaCl濃度を増加する勾配を適用することにより、グリコシル化EPAは、非グリコシル化EPAから分離された。図13Dに図示したように、精製されたタンパク質は、SDSPAGEにより分離し、クマシーにより染色するか、又はニトロセルロースメンブレンに転写し、抗CP8抗体又は抗EPA抗体のいずれかと一緒にインキュベーションした。グリコシル化システムの更なる改善のために異なる戦略を試験した。ひとつの戦略において、追加の抗生物質の負担を減らすために生成システムにおけるプラスミド数を減らし、加えて余分なプラスミドを維持するために、pglBの発現カセットを、CP5キメラクラスター及びCP8キメラクラスターを含むプラスミドへクローニングした。この発現カセットは、大腸菌O121ゲノムのga1FとwbqAの間に存在するインタージーン領域、及びその下流のpglB配列で構成された。この発現カセットを、CP5及びCP8キメラクラスターのすぐ下流でクローニングした。本発明者らは、個別のプラスミド上又は同じプラスミド上のいずれかにキメラCP5クラスター及びpglBを含む大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAcatを試験した。加えて、EPAを、アラビノース誘導性プロモーターの制御下でプラスミドから発現した。これらの細胞を、5Lのエレンマイヤーフラスコ内でLB培地において、37°Cで増殖した。一晩培養物を、OD600nm=005まで希釈した。OD600nmがおよそ05で、PglB発現を、1mMIPTGの添加により誘導し、且つEPA発現を、アラビノースの添加により誘導した。細胞を4時間増殖し、誘導を繰り返し、且つ細胞を更におよそ16時間増殖した。この培養物を遠心分離によりペレットとし;これらの細胞を洗浄し、且つ02容量のショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、且つペリプラズムのタンパク質を、Ni2アフィニティクロマトグラフィーに装加した。EPACP5を、05Mイミダゾールにより溶離し、溶離されたピークをプールし、SDSPAGE及びクマシーにより分析した。図13Eは、SDSPAGEの結果を示している。グライココンジュゲート生成のために3つ又は2つのプラスミドのいずれかを含む細胞を示している。これらの結果は、糖脂質及びCP5EPAのコンジュゲート生成は維持されたことを示している。このシステムの更なる最適化は、タンパク質グリコシル化に使用したプラスミド中のwzzタンパク質配列の組み込みであった。CP8EPAを生成するシステムにより例示されたよう、wzzは、プラスミド媒介性キメラCP8クラスターへ及びキャリアタンパク質の発現プラスミド内のepa遺伝子の下流に組み込まれた。CP8EPAバイオコンジュゲートは、2つのプラスミドを含む大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlBwecGcatにおいて生成され:1つのプラスミドは、キメラCP8遺伝子クラスターに加え、wzzO7遺伝子のコピー及びpglB遺伝子の構成的発現のためのDNAカセットを含み;第二のプラスミドは、最初に2つのグリコシル化部位を含む解毒されたEPAタンパク質の発現及び分泌のための遺伝子、及び第二に同じプロモーターの制御下のwzzO7コピーを含む。前述のプラスミドを含む得られる菌株である大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlBwecGcatは、バイオリアクター内で、グリセロール、ペプトン及びC源として酵母エキスを含有する半限定培地において、出発容積7Lにおいて増殖した。細胞を、バッチ又はパルスバッチモードで、OD600nm=30まで増殖し、PglB及びEPAの発現を誘導した。誘導後、細胞を更に、流加バッチモードで、酸素制限条件下、15時間培養し、遠心分離により収集した。細胞を、遠心分離によりペレットとし;細胞を洗浄し、02容量ショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni2アフィニティクロマトグラフィーに装加した。グリコシル化及び非グリコシル化EPAを、05Mイミダゾールによりアフィニティカラムから溶離した。グライココンジュゲートCP8EPAの形成は、クマシー並びに抗his及び抗CP8抗血清を使用するウェスタンブロットにより、図13Fに示された。図13Fは、精製されたタンパク質のSDSPAGE分離の結果、並びにクマシー染色又はニトロセルロースメンブレンへの転写及び抗hisタグ抗体若しくは抗CP8抗体のいずれかによるプロービングの分析を示している。CP5EPAグライココンジュゲートの特徴を、様々な分析的方法により更に精緻にした。CovalX社は、W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAcatにおいて、図13Aに図示された分析において使用した3プラスミドシステムを使用し生成した精製されたCP5EPA試料の高質量MALDI分析を行った。図14Aは、高質量MALDI結果を示している。A及びBは、それぞれ、非グリコシル化EPA及びグリコシル化EPAに対応する質量タンパク質種を指している。オリゴマー形態は、比較的高い分子量で存在することができ、且つ低MW領域のシグナルは、夾雑物又は分解産物である。図14Aに示された結果は、前記タンパク質調製品は、52反復単位の中間の糖の長さの指標である、EPAタンパク質のみよりも4kDa大きい、大きいモノマー性タンパク質の集団を含むことを示している。これは、SDSPAGE、クマシーブリリアントブルー染色、及び主要なコンジュゲート型中の反復単位の計測により分析されたように、この調製品中の主要なグライココンジュゲート型の5~7の糖長と一致する。CP5EPAは、サイズ排除クロマトグラフィーにより更に特徴付けした。本発明者らは、図13Aに図示した分析において使用したW3110ΔwaaLΔwecAwzzECAcatにおいて3プラスミドシステムを使用した。この試料は、非グリコシル化EPAを除去するために、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。分析は、SupelcoTSKG2000SWXLカラムにおいて行った。図14Bは、精製されたCP5EPA試料のSECHPLC分析の結果を示している。280nmで測定したUVトレースを示している。太実線は、325μgの精製されたCP5EPAの分析に由来し、細線は、5μgの精製した非グリコシル化EPAから得た。115分で溶離した大きい均質なピークが示されたのに対し、非グリコシル化EPAは、129分で溶離した。これら2種の分子の流体力学半径を計算し、非グリコシル化EPAの42kDa及びグリコシル化EPAの166kDaのサイズを得た。これは、グリコシル化EPAは、グリカンの線状構造から予想されたように、溶液中に伸長されたモノマータンパク質として出現することを指摘している。従って本発明者らの分析は、CP5EPAバイオコンジュゲートは、EPAタンパク質及び正確にOアセチル化されたグリカン構造からなることを確認した。これらの結果を基に、CP8EPAバイオコンジュゲートは、EPAタンパク質及び正確にOアセチル化されたグリカン構造からなることが推定された。グライココンジュゲートワクチン候補を製造するためのインビボグリコシル化の多用途性を証明するために、いくつかのキャリアタンパク質をCP5によりグリコシル化される基質として使用した。バイオコンジュゲートワクチンの黄色ブドウ球菌に対する免疫反応を更に増強するために、キャリアタンパク質EPAを、Cジェジュニ由来のAcrAと、黄色ブドウ球菌由来の2つのタンパク質Hla及びClfAと交換した。キャリアタンパク質として使用されるように、Hla及びClfAを、細菌Nグリコシル化部位の挿入により改変した。このプロセスは、WO2006119987に開示されたように実行し、HlaH35Lに関して4型:配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号16を、及びClfAに関して3型:配列番号10、配列番号11、配列番号12を作製した。HlaH35L部位130のグリコシル化に関して、以下の2つの発現プラスミドを含む、大腸菌細胞を使用した:1つは、ペリプラズム分泌のためのN末端シグナルペプチド、1つのNグリコシル化部位及び精製のためのヘキサHisタグを含むHlaH35Lの発現がParaBADプロモーターの制御下にあるHlaH35L生成のためのもの、及び2つ目は、CP5キメラクラスター及びpglBの発現のためのもの。このシステムは、交換されたタンパク質キャリア発現プラスミドを持つ、CP5EPAの既に最適化された2プラスミド発現システムに対応している。細胞は、12Lのバイオリアクター内で富栄養培地において、OD600nm=30となるまで増殖し、Hlaの発現は、02アラビノースの添加により誘導した。細胞を、遠心分離によりペレットとし;細胞を洗浄し、02容量ショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、上清中のペリプラズムのタンパク質を、Ni2アフィニティクロマトグラフィーに装加した。グリコシル化Hla及び非グリコシル化Hlaを、05Mイミダゾールによりアフィニティカラムから溶離し、陰イオン交換クロマトグラフィーに装加した。CP5HlaをHlaから分離するために、タンパク質を0Mから07MのNaClの直線勾配により溶離した。得られたタンパク質を、SDSPAGEにより分離し、クマシー染色するか、又はニトロセルロースメンブレンに転写し、指示されたように抗His抗血清、抗Hla抗血清、又は抗CP5抗血清のいずれかによりプロービングした。図14Cの結果は、クマシー、並びに抗His抗血清及び抗Hla抗血清及び抗CP5抗血清を使用するウェスタンブロットにより、グライココンジュゲートの形成を示している。操作されたグリコシル化部位130を持つHlaH35Lの同一性は、ゲル内トリプシン処理及びMALDIMSMSにより確認した。キャリアタンパク質がCP5及びCP8によるグリコシル化のために交換可能であることを更に示すために、CジェジュニAcrAタンパク質を、グリコシル化のアクセプターとして使用した。3プラスミドシステムを使用する、このコンジュゲートの産生株は、個別のプラスミド上にCP5キメラクラスター、IPTGにより誘導されたPglBタンパク質及びアラビノース誘導下のAcrAを収容するW3110ΔwaaLであった。細胞は、バイオリアクター内で、グリセロール、ペプトン及びC源として酵母エキスを含有する半限定培地において、出発容積7Lにおいて増殖した。細胞を、バッチ又はパルスバッチモードで、OD600nm=30まで増殖し、PglB及びAcrAの発現を、1mMIPTG及び10アラビノースの添加により誘導した。誘導後、細胞を更に、流加バッチモードで、酸素制限条件下、15時間培養し、遠心分離により収集した。細胞を、遠心分離によりペレットとし;細胞を洗浄し、02容量ショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni2アフィニティクロマトグラフィーに装加した。CP5AcrA糖タンパク質を、05Mイミダゾールによりアフィニティカラムから溶離した。この精製されたタンパク質を、SDSPAGEにより分離し、且つ図14Dに示されるように、クマシー染色するか、又はニトロセルロースメンブレンに転写し、抗AcrA抗血清又は抗CP5抗血清のいずれかによりプロービングした。ClfA中の細菌Nグリコシル化部位の挿入は、WO2006119987に開示されたように実行し、配列番号10;配列番号11;配列番号12を作製した。これらのキャリアタンパク質は、アラビノース誘導性プロモーターから大腸菌細胞において発現された。これらの遺伝子は、ペリプラズム分泌のためのN末端シグナルペプチド、いくつかのNグリコシル化部位及び精製のためのヘキサHisタグを生成するようにデザインした。精製は、大腸菌細胞のペリプラズム抽出物から開始した。ClfA327のグリコシル化のために、CP5EPAの既に最適化された発現システムを使用した。2プラスミドシステムを使用し、CP5キメラクラスター及びpglB、更にはClfA327の発現プラスミドを含む大腸菌細胞を、1Lのエレンマイヤーフラスコ内でLB培地において増殖した。一晩培養物を、OD600nm=005まで希釈した。OD600nmがおよそ05で、ClfA発現を、アラビノースの添加により誘導した。細胞を20時間増殖した。細胞を、遠心分離によりペレットとし;細胞を洗浄し、02容量ショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni2アフィニティクロマトグラフィーに装加した。ClfACP5を、05Mイミダゾールにより溶離し、SDSPAGEにより分離し、クマシー染色するか、又はニトロセルロースメンブレンに転写し、抗His抗血清又は抗CP5抗血清のいずれかによりプロービングした。図14Eは、タンパク質のアミノ酸327位に挿入されたグリコシル化部位を持つClfA変種を用いて得られた結果を示している。これらは、クマシー染色及び抗HisウェスタンブロットによりClfAの形成を、並びに抗CP5抗血清を使用するウェスタンブロットによりグライココンジュゲートの形成を示している。内側にcap5Kを持つCP5キメラクラスター、PglBタンパク質及びpEC415上の2グリコシル化部位のシグナルを持つEPAを含むW3110ΔwaaLΔwecAwzzECAcat細胞を、1Lのエレンマイヤーフラスコ内でLB培地において増殖した。一晩培養物を、OD600nm=005まで希釈した。OD600nmがおよそ05で、EPA及びPglBの発現を、各々、アラビノース及び1mMIPTGの添加により誘導した。細胞を20時間増殖した。細胞を、遠心分離によりペレットとし;細胞を洗浄し、02容量ショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni2アフィニティクロマトグラフィーに装加した。グリコシル化及び非グリコシル化EPAを、05Mイミダゾールによりアフィニティカラムから溶離し、SourceQ陰イオン交換カラムに装加した。NaCl濃度を増加する勾配を適用することにより、グリコシル化EPAは、非グリコシル化EPAから分離された。溶離されたタンパク質量を、BCAアッセイにより、及びクマシーにより染色されたSDSPAGEで得られたバンドのサイズを基にし決定し、この糖の理論的質量を計算した。このタンパク質の決定と一緒に、多糖抗原の量を、調製物中で概算した。これは、高質量MALDIMS法により確認した。生存動物におけるCP5EPAの免疫原性を測定するために、精製したグライココンジュゲート1μgを、アジュバントとしての水酸化アルミニウムの存在下で、マウスへIP経路で、1日目、21日目、及び56日目に注射した。第2回及び第3回注射の2週間後である各々35日目及び61日目に、IgG反応を、コーティングのためにポリLリシン改変されたCP5を使用するELISAにより測定した、JImmunol28187192。CP5バイオコンジュゲートを免疫付与したマウスからの血液を、CP5莢膜多糖に対する特異的IgG抗体について分析した。図15Aは、マウスにおいてCP5EPAにより生じたIgG力価を示している。ELISAプレートは、ポリLリシン改変したCP5によりコーティングし、CP5EPAにより2回免疫付与したマウス又は3回免疫付与したマウスにおけるIgG反応を、3つ組みで測定した。対照としての免疫前血清で得られたシグナルは、各希釈で3本目のバーにより示した。マウスのIgG反応は、アルカリホスファターゼコンジュゲートされたプロテインGにより測定した。図15Aに示したように、CP5EPAバイオコンジュゲートは、血清抗体力価64×103を誘発した。図15Aに示された結果は、CP5EPAは、マウスにおいてCP5特異的抗体を生じることを示している。本実験は、大腸菌において生成されたバイオコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であることを示している。同様の実験を、宿主生物としてのウサギにおいて行った。CP5EPAを、ウサギへ、1日目にフロイント完全アジュバントの存在下で皮内注射し、20、30及び40日目にフロイント不完全アジュバントの存在下で皮下注射した。61日後に、IgG反応を、コーティングのためのポリLリシン改変されたCP5を使用するELISAにより測定した、JImmunol28187192。図15Bは、ウサギにおいてCP5EPAにより生じたIgG力価を示している。図15Bに示された結果は、CP5EPAは、ウサギにおいてCP5特異的抗体を生じることを示している。CP5EPAバイオコンジュゲートの免疫反応は、各希釈において2本目のバーである。対照血清は、死滅黄色ブドウ球菌に対し生じたCP5特異的吸着された血清及び免疫前血清を含む。様々な抗原で免疫付与したウサギ由来の血清を精製したCP5に対する特異的抗体について分析した。プレートは、ポリLリシン改変したCP5によりコーティングした。対照としての免疫前血清で得られたシグナルは、各希釈で3本目のバーにより示した。ウサギのIgG反応は、アルカリホスファターゼコンジュゲートされたプロテインGにより3つ組みで測定した。CP5EPAバイオコンジュゲートは、力価1×106を誘発し、これは対照血清よりも4倍高かった。この実験は、このバイオコンジュゲートは、高い力価のCP5特異的IgG反応を誘発することができたことを示している。実施例7に説明されたように生じたウサギポリクローナル抗血清を、IgG特異的抗体を濃厚化するために、プロテインAアフィニティカラムにより精製した。黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲートCP5EPAにより免疫付与したウサギ由来のIgGを、古典的インビトロオプソニン食作用性死滅アッセイにおいて機能活性について試験した、InfectImmun6651835189。黄色ブドウ球菌を、Columbia寒天2NaCl上で24時間培養した。細菌を、最小必須培地1BSA中に懸濁した。PMNを、新鮮なヒト血液から分離し、洗浄し、計数し、MEMBSA中に懸濁した。黄色ブドウ球菌CP5EPA又は対照としてのWO2009104074に開示されたように精製した赤痢菌O1EPAで免疫付与したウサギ由来の精製IgG調製品のいずれかにより免疫付与したウサギ由来の精製IgG調製品を、MEMBSA中に10倍連続希釈することで調製したアッセイ液に添加した。モルモット血清を、C給源として使用した。各アッセイは、~5×106個PMN、1×106個CFU黄色ブドウ球菌、05~1モルモット血清、及び140μgmlから1μgmlまで変動する濃度のIgGを含んだ。対照試料は、1C及びPMNを含み、抗体を含まずインキュベーションした黄色ブドウ球菌;2IgG及びCを含むが、PMNを含まずにインキュベーションした黄色ブドウ球菌;並びに、3黄色ブドウ球菌単独:を含んだ。試料は、37°Cで2時間、転倒回転した。試料希釈物を、滅菌水中で激しく攪拌し、細菌死滅を、希釈した試料のTSA上に2つ組みで播種することにより推定した。死滅率は、2時間後の0時点と比べた、CFUmlの減少と定義された。第一の実験セットにおいて、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌株Reynolds株、プロトタイプCP5単離株のオプソニン食作用性死滅を試験し、結果を図16Aに示した。ウサギにおいて生じたCP5EPAに対する抗体のオプソニン活性を、黄色ブドウ球菌5型血清型Reynolds株に対して試験した。CP5EPA抗体は、濃度14μgmlまでオプソニンを低下したのに対し、O1EPA抗体は、140μgmlでオプソニン活性をほとんど示さなかった。黄色ブドウ球菌全細胞抽出物に対して生じた陽性対照血清は、抗CP5EPA血清と同様の活性を示した。図16Aに示されたように、CP5EPAに対する抗体及び補体活性を持つ1モルモット血清と一緒にインキュベーションした場合に、黄色ブドウ球菌Reynoldsの65~75は、PMNにより死滅した。抗血清は、アッセイ中最終的に1で使用し、黄色ブドウ球菌接種材料の89は、これらの条件下で死滅した。黄色ブドウ球菌をC単独又は抗体とCでPMNを含まずにオプソニン化した場合に、死滅はほとんど認められなかった。示されたデータは、2~5回の実験の平均を示している。グラフに記した全ての試料は、モルモット血清Cを含有し、Cが存在しない場合には死滅は認められなかった。抗体単独も、補体単独も、オプソニン性ではなく、この性質は、莢膜に囲まれた細菌性病原体の特徴である。対照的に、対照ワクチンにより誘発された抗体は、Cが存在する場合であっても、オプソニン活性を示さなかった。このアッセイにおける陽性対照として、本発明者らは、CP5特異的ウサギ抗血清も試験した。これらのデータは、CP5EPAバイオコンジュゲートに対して生じた抗体は、文献によるとオプソニン活性を持つCP5抗体、InfectImmun、6651835189に匹敵する、莢膜に囲まれた黄色ブドウ球菌に対するオプソニン活性を示したことを示している。CP5EPAに対する抗体のオプソニン活性を、CP5EPAのMRSA株USA100に対して試験した。図16Bは、CP5分離株であり、NRS382と称される、黄色ブドウ球菌USA100株に対して試験したIgG及びCのオプソニン活性の結果を表している。示したデータは、2~5回の実験の平均である。グラフに記した全ての試料は、モルモット血清Cを含有し、Cが存在しない場合には死滅は認められなかった。図16Bに示されたように、USA100接種材料の~60は、05モルモット補体及び100~1μgmlの範囲の濃度のCP5EPAIgGと一緒にインキュベーションしたPMNにより死滅した。最小死滅は、PMNが存在しない場合又はIgGがアッセイから省かれた場合に認められた。O1EPAコンジュゲートワクチンに対して生じたIgGがPMNCに添加された場合には、死滅は達成されなかった。黄色ブドウ球菌がC単独又はPMNを含まない抗体とCによりオプソニン化された場合には、ほとんど死滅は認められなかった。従って、CP5EPA抗体は、濃度範囲100~1μgmlでオプソニン性であるのに対し、O1EPA抗体は、100μgmlでほとんどオプソニン活性を示さなかった。この実験は、CP5EPA抗体は、MSSA株及びMRSA株の両方に対しオプソニン活性を発揮することを示す。バイオコンジュゲートCP5EPAワクチンに対して生じたIgGのオプソニン活性が、ブドウ球菌感染症のマウスモデルにおいて防御すると予想できるかどうかを決定するために、受動免疫実験を行った。最初の研究において、SwissWebster雄のマウスに、CP5EPA又は赤痢菌O1EPAで免疫付与したウサギ由来のIgGの14~2mgをIV注射した。24時間後、マウスを、黄色ブドウ球菌Reynolds株~36×107CFUにより腹腔内経路でチャレンジした。菌血症レベルは、チャレンジ後2時間で測定し、菌血症の抗体が媒介したクリアランスを評価した。培養物の検出下限は、5CFUml血液であった。図17Aは、結果の菌血症レベルを示している。各点は、細菌接種の2時間後に、個々のマウスにおいて尾静脈穿刺により実行された定量的血液培養物を表す。水平線は、CFUml中央値を表す。白丸は、抗CP5EPA抗体を得たマウス由来の血液試料であり、黒丸は、異なるグリカンO1にコンジュゲートされたEPAに対して生じた対照抗体調製品を得た動物からの試料である。図17Aの結果は、CP5抗体を与えたマウスは、O1特異的抗体が与えられたマウスと比べ、菌血症レベルの有意な減少を示したことを表している。実際、CFUml血液の低下は、O1EPAIgG投与マウスに対し、CP5EPAにより受動免疫されたマウスにおいて98であった。引き続きの受動免疫実験において、マウスを、黄色ブドウ球菌Reynolds株のより少ない接種材料でIPチャレンジした。CP5EPA抗体による受動免疫を、5~6×106CFU黄色ブドウ球菌Reynolds株でIPチャレンジしたマウスにおいて試験した。マウスには、細菌チャレンジの24時間前に、2mgCP5EPAIgG又はO1EPAIgGを静脈内注射した。図17Bは、結果の菌血症レベルを示している。各点は、細菌接種の2時間後に、個々のマウスにおいて尾静脈穿刺により実行された定量的血液培養物を表す。水平線は、CFUml中央値を表す。白丸は、抗CP5EPA抗体を得たマウス由来の血液試料であり、黒丸は、異なるグリカンにコンジュゲートされたEPAに対して生じた対照抗体調製品を得た動物からの試料である。図17Bに示したように、2mgCP5EPAIgGを受け取ったマウスは、2mgのO1EPAIgGを受け取った動物と比べ、有意に低い菌血症レベルを有した。実際、CP5EPA抗体で受動免疫したマウス7匹のうち6匹は、無菌の血液培養物を有した。CP5抗体が原因である菌血症レベルの低下は、O1EPAIgG投与対照マウスと比べ、98であった。菌血症に対する防御が、低レベルのIgGで付与されるかどうかを決定するために、引き続きの実験を行い、ここではマウスを、300μgのCP5EPA又はO1EPAIgGにより、IV経路で受動免疫した。24時間後、マウスに、6×106CFU黄色ブドウ球菌Reynolds株をIP接種した。培養による検出下限は、13~67CFUml血液であった。図17Bは、結果の菌血症レベルを示している。各点は、細菌接種の2時間後に、個々のマウスにおいて尾静脈穿刺により実行された定量的血液培養物を表す。水平線は、CFUml中央値を表す。白丸は、抗CP5EPA抗体を得たマウス由来の血液試料であり、黒丸は、異なるグリカンにコンジュゲートされたEPAに対して生じた対照抗体調製品を得た動物からの試料である。図17Bに示したように、図17Cの結果は、菌血症に対するCP5抗体が媒介した防御は、この低い抗体投与量で達成されたことを示している。菌血症レベルの98の低下が、CP5バイオコンジュゲートワクチンにより誘発された抗体により達成され、9匹のマウス中8匹は、無菌の血液培養物を有し、これは赤痢菌O1EPA抗体投与マウスでは8匹中0匹であった。バイオコンジュゲートCP5EPAによるマウスのワクチン接種は、受動免疫アッセイのように細菌チャレンジに対する防御を媒介することを示すために、能動免疫試験を行った。CP5EPAバイオコンジュゲートは、キメラCP5遺伝子クラスター、プラスミドpEXT21由来のPglB及び別のプラスミド由来のEPAの同時発現により、大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzEcatにおいて生成した。細胞は、バイオリアクター内で、グリセロール、ペプトン及びC源として酵母エキスを含有する半限定培地において、出発容積7Lで増殖した。細胞を、バッチ又はパルスバッチモードで、OD600nm=30まで増殖し、PglB及びEPAの発現を、1mMIPTG及び10アラビノースの添加により誘導した。誘導後、細胞を更に、流加バッチモードで、酸素制限条件下、15時間培養し、遠心分離により収集した。細胞を洗浄し、25ショ糖緩衝液中にOD600nm=200に再懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni2アフィニティクロマトグラフィーに装加した。グリコシル化及び非グリコシル化EPAを、05Mイミダゾールによりアフィニティカラムから溶離し、SourceQ陰イオン交換カラムに装加した。NaCl濃度を増加する勾配を適用することにより、グリコシル化EPAは、非グリコシル化EPAから分離された。CP5EPAは、CP5黄色ブドウ球菌株に対する防御のためのコンジュゲートワクチンとして使用されることが意図されている。そのような能動免疫が機能するかどうかを試験するために、本発明者らは、CP5EPAの3つの異なる投与量により、雌のSwissWebsterマウスの異なる群を免疫付与し、この免疫付与を菌血症モデルを用い分析した。3つの投与量は、0、14及び28日目に皮下注射した。図18に示したように、マウスは、42日目に黄色ブドウ球菌株JL278により腹腔内チャレンジした。5群のマウスを、X軸の下側に記したように、3つの異なる投与量のCP5EPAにより免疫付与した。2つの対照群は、アジュバント又はPBS単独のいずれかを受け取った。各点は、1匹のマウスからの血液試料を表している。最も低いワクチン投与量は、その群の全てのマウスにおいて防御を誘発した。チャレンジの2時間後、血液試料を、cfu形成について、及びコーティングのためにポリLリシン改変されたCP5を使用するELISAにより抗CP5抗体について分析した。CP5EPAで免疫付与した全ての群において、血液中のcfuの平均減少が認められた。しかし、ワクチンの最低投与量を受け取った群においてのみ、5匹のマウス全てにおいて菌血症の全体的防御が存在した。抗CP5抗体に関する血液の分析は、異なるマウス群において、防御と平均ELISA力価の正の相関を生じた。図18に示した結果は、この抗体は、免疫付与したマウスにおいて菌血症の防御を誘発したことを指摘している。これらの研究は、CP5EPAバイオコンジュゲートワクチンは、黄色ブドウ球菌をヒトPMNによる食作用死滅に関してオプソニン化し、且つポジティブな能動免疫試験において菌血症に対しマウスを防御する抗体を誘発したことを指摘している。これらのデータは、示されたバイオコンジュゲートは、複数の黄色ブドウ球菌株により引き起こされた疾患に対し防御するであろうことの強力な証拠を提示している。本発明は、それらの実施態様を参照し特に示され且つ説明されているが、請求項により包含される本発明の精神から逸脱しないそれらの形態及び詳細における様々な変更を行うことができることは当業者には明らかであろう。