リアソータントインフルエンザウイルスの回収方法であって、該方法はiリボ核タンパク質複合体を形成でき、ヘルパーウイルスの非存在下でウイルス粒子を組み立てることができるように、Vero細胞内にてゲノムまたはアンチゲノムvRNAセグメント、核タンパク質、およびRNA依存性ポリメラーゼを発現するポリヌクレオチドベクターを用いて前記Vero細胞にエレクトロポレーションすること、ここで、該ポリヌクレオチドベクターの少なくとも1つが、インフルエンザウイルスタンパク質のみをコードするインフルエンザウイルスのゲノムセグメントに対応するウイルスcDNAを含み、該cDNAがRNAポリメラーゼIpolIプロモータエレメントと的確な3’末端を有するvRNAまたはcRNAの合成調節エレメントとの間に挿入されており、該エレメントがRNAポリメラーゼIIpolIIプロモータとポリアデニル化シグナルとの間に挿入されている、ii該エレクトロポレーションしたVero細胞を別の細胞型と、ウイルス複製が許容される条件下で共培養すること、およびiii少なくとも90の回収効率で、インフルエンザウイルスを回収すること、を含む、前記方法。前記Vero細胞が、無血清Vero細胞である、請求項1に記載の方法。前記インフルエンザウイルスが好冷ウイルスである、請求項1または2に記載の方法。前記インフルエンザウイルスが弱毒ウイルスである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターが一組のプラスミドであり、該一組のプラスミドにおける異なるプラスミドの数が8個である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターが一組のプラスミドであり、該一組のプラスミドにおける異なるプラスミドの数が12個である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記別の細胞型がCEK細胞である、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。前記別の細胞型がMDCK細胞である、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。前記インフルエンザウイルスがA型インフルエンザウイルスである、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターがA/PR/8/34に由来する少なくとも一のvRNAセグメントを発現する、請求項9に記載の方法。前記ベクターがMDVAに由来する少なくとも一のvRNAセグメントを発現する、請求項9に記載の方法。MDVAがAAnnArbor660である、請求項11に記載の方法。前記インフルエンザウイルスがB型インフルエンザウイルスである、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターがMDVBに由来する少なくとも一のvRNAセグメントを発現する、請求項13に記載の方法。MDVBがBAnnArbor166である、請求項14に記載の方法。第1の態様において、本発明は細胞培養において、例えばヘルパーウイルスの非存在下すなわち、ヘルパーウイルスの存在しない細胞培養系において、組換えB型インフルエンザウイルスを作製するためのベクターおよび方法を提供する。本発明方法は、B型インフルエンザウイルスの一部をそれぞれ含む複数のベクターをウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団へ導入する工程を含む。ウイルスの増殖を許容する条件下にて宿主細胞を培養し、そしてインフルエンザウイルスを回収する。いくつかの実施形態において、B型インフルエンザウイルスは弱毒ウイルス、好冷ウイルスおよび/または温度感受性ウイルスである。例えば1つの実施形態において、本発明のベクターに由来する組換えB型インフルエンザウイルスは弱毒、好冷、温度感受性ウイルスであり、例えば鼻腔内ワクチン製剤中の弱毒生ワクチンとして投与することに適している。典型的な実施形態において、インフルエンザB/AnnArbor/1/66ウイルスのゲノムcaB/AnnArbor/1/66ウイルスのゲノムなどの全てまたは一部を含む複数のベクターを導入することによって、ウイルスを作製する。例えば、いくつかの実施形態において、B型インフルエンザウイルスは、インフルエンザ株caB/AnnArbor/1/66に特徴的な生物学的特性に影響を及ぼす1つ以上のアミノ酸置換を含む人工的に操作したインフルエンザウイルスである。このようなインフルエンザウイルスはPB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34PB1391K391E、PB1581E581G、PB1661A661T、PB2265N265SおよびNP34D34Gの1つ以上の位置でアミノ酸置換を生じる突然変異を含む。野生型ウイルスと比べて増加した温度感受性、好冷性または弱毒性を個々に、または組合せにおいて生じる任意の突然変異上記位置の1つ以上の位置におけるが、本発明との関連において好適な突然変異である。いくつかの実施形態において、異なるインフルエンザ株の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする1つ以上のゲノムセグメントと共に1つのB型インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントを含む複数のベクターを宿主細胞の集団に導入する。例えば、選択した弱毒、好冷および/もしくは温度感受性B型インフルエンザ株B/AnnArbor/1/66のca、att、ts株などまたは上に挙げた1つ以上の位置にアミノ酸置換を含む人工的に操作したB型インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントを、別のウイルス株に由来する免疫原性抗原をコードする1つ以上のセグメントと共に宿主細胞の集団に導入する。典型的に免疫原性表面抗原は、赤血球凝集素HA抗原および/またはノイラミニダーゼNA抗原のいずれか、または両方を含む。実施形態において免疫原性表面抗原をコードする単一のセグメントが導入される場合、選択したウイルスの7つの相補的なセグメントもまた宿主細胞に導入される。特定の実施形態において、B型インフルエンザウイルスのゲノムセグメントを含む複数のプラスミドベクターを宿主細胞の集団に導入する。例えば、それぞれ異なるゲノムセグメントを含む8つのプラスミドは、完全なB型インフルエンザゲノムを宿主細胞に導入することに有用である。あるいは、ゲノムの一部の小さな配列を含む多数のプラスミドを用いることができる。典型的に、本発明のプラスミドベクターは2方向性発現ベクターである。本発明の2方向性発現ベクターは典型的に、第1プロモータと第2プロモータとを含む。この第1および第2プロモータは、インフルエンザウイルスゲノムのセグメントを含むウイルス核酸をコードする同一の2本鎖cDNAのそれぞれの鎖に機能的に結合している。必要に応じて、この2方向性発現ベクターは、ポリアデニル化シグナルおよび/または終結配列を含む。例えば、ポリアデニル化シグナルおよび/または終結配列は2つのプロモータの内側に、インフルエンザウイルスゲノムのセグメントに隣接して配置することができる。本発明との関連において、1つの好ましいポリアデニル化シグナルはSV40ポリアデニル化シグナルである。本発明の典型的なプラスミドベクターは、図1に例証されているプラスミドpAD3000である。ベクターのプロモータからのインフルエンザウイルスの複製を支持できる宿主細胞にベクターを導入する。宿主細胞の好ましい例としては、Vero細胞、PerC6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞293T細胞などおよびCOS細胞が挙げられる。本明細書中に記載されるpAD3000プラスミドベクターとの組合せにおいては、Vero細胞、293細胞、およびCOS細胞が特に好ましい。いくつかの実施形態において、これら細胞系統の少なくとも2つの混合物COS細胞とMDCK細胞との組合せまたは293T細胞とMDCK細胞との組合せからなる共培養物が宿主細胞の集団を構成する。次に、B型インフルエンザベクターを含む宿主細胞を、ウイルスの複製および組み立てを可能とする条件下にて培養によって増殖させる。典型的に、本発明のB型インフルエンザプラスミドを含む宿主細胞を37°Cよりも低い温度で、好ましくは、35°C以下の温度にて培養する。典型的に、この細胞を32°C~35°Cの温度にて培養する。いくつかの実施形態において、この細胞を約32°C~34°C例えば約33°Cの温度にて培養する。好適な期間培養を行い、ウイルスが複製して高いタイターを得ることができた後、組換えおよび/またはリアソータントウイルスを回収する。必要に応じて、この回収したウイルスを不活性化しうる。本発明はまた、細胞培養にて組換えインフルエンザウイルスを作製するための幅広く適用可能である方法を提供する。この方法は、インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団にインフルエンザウイルスのゲノムを含む複数のベクターを導入し、35°C以下の温度でこの細胞を培養して、そしてインフルエンザウイルスを回収する。特定の実施形態において、インフルエンザウイルスのゲノムセグメントを含む複数のプラスミドベクターを宿主細胞の集団に導入する。特定の実施形態において、宿主細胞に完全なインフルエンザゲノムを導入するために、それぞれ異なるゲノムセグメントを含む8つのプラスミドを利用する。典型的に、本発明のプラスミドベクターは2方向性発現ベクターである。本発明の典型的なプラスミドベクターはプラスミドpAD3000図1に例証である。いくつかの実施形態において、インフルエンザウイルスはB型インフルエンザウイルスに相当する。いくつかの実施形態において、インフルエンザウイルスはA型インフルエンザウイルスに相当する。特定の実施形態において、本方法は組換えおよび/またはリアソータントインフルエンザウイルスを回収する工程を含む。このウイルスは被験体に投与鼻腔内投与などした際に免疫応答を誘導することが可能である。いくつかの実施形態において、このウイルスは投与する前に不活性化され、他の実施形態においては、弱毒生ウイルスを投与する。本発明方法により作製される組換えおよびリアソータントA型インフルエンザおよびB型インフルエンザウイルスもまた本発明の特徴である。特定の実施形態において、ウイルスとしては、弱毒インフルエンザウイルス、好冷インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルス、またはこれらの望ましい特性のいずれかの組み合わせを有するウイルスが挙げられる。1つの実施形態において、インフルエンザウイルスはインフルエンザB/AnnArbor/1/66株ウイルスB/AnnArbor/1/66の好冷性、温度感受性、弱毒性株などを含む。別の実施形態において、インフルエンザウイルスはインフルエンザA/AnnArbor/6/60株ウイルスA/AnnArbor/6/60の好冷、温度感受性、弱毒株などを含む。本発明の別の実施形態において、ウイルスは1つ以上の置換アミノ酸を含む人工的に操作したインフルエンザウイルスである。この置換アミノ酸は例えば、caA/AnnArbor/6/60またはcaB/AnnArbor/1/66に特徴的な生物学的特性に影響を及ぼす。このような置換アミノ酸はcaA/AnnArbor/6/60またはcaB/AnnArbor/1/66に特有のアミノ酸例えば、A株ウイルスにおける:PB1391K391E、PB1581E581G、PB1661A661T、PB2265N265SおよびNP34D34G;ならびにB株ウイルスにおける:PB2630S630R;PA431V431M;PA497Y497H;NP55T55A;NP114V114A;NP410P410H;NP509A509T;M1159H159QおよびM1183M183Vに好ましくは相当する。同様に、温度感受性、好冷性および/または弱毒性を生じる、上記いずれかの位置とは別のアミノ酸置換も本発明のウイルスおよび方法に含む。必要に応じて、ベクターを導入することによってリアソータントウイルスを作製する。このベクターはワクチン製造に関するその好ましい特性により選択したウイルス株の6つの内部遺伝子と、選択した病原性株などの表面抗原HAおよびNAをコードするゲノムセグメントとを組み合わせて含む。例えば、このHAセグメントは、日常的にワクチン製造において行われているように、病原性を有するH1、H3またはB株より好ましくは選択する。同様に、HAセグメントをH2株H2N2など、H5株H5N1などまたはH7株H7N7などのような出現病原性株から選択できる。あるいは、第1株の7つの相補的な遺伝子セグメントをHAまたはNAのいずれかをコードするセグメントと組み合わせて導入する。特定の実施形態において、内部遺伝子セグメントはインフルエンザB/AnnArbor/1/66またはA/AnnArbor/6/60株に由来する。さらに、本発明はワクチン製造に関して望ましい特性を有する新規のインフルエンザウイルス温度感受性、弱毒性、および/または好冷性インフルエンザウイルスなど、ならびにこのような新規のインフルエンザウイルスを含有するインフルエンザワクチンを製造するための方法を提供する。特定の実施形態において、新規A型インフルエンザウイルス株を、温度感受性表現型に重要である本明細書中に示した1つ以上の特定の位置例えば、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34においてアミノ酸置換を生じる突然変異を導入することによって作製する。例えば、特定のアミノ酸位置でアミノ酸置換を生じるヌクレオチド位置PB11195、PB11766、PB12005、PB2821およびNP146、または他のヌクレオチド位置に突然変異を導入する。野生型ウイルスと比較して増加した温度感受性、好冷性または弱毒性を個々に、または組合せにおいて生じる、上記位置の1つ以上の位置における任意の突然変異が本発明との関連において好適な突然変異である。例えば、PB1391K391E、PB1581E581G、PB1661A661T、PB2265N265SおよびNP34D34Gの中から選択した突然変異を野生型A型インフルエンザ株のゲノム例えばPR8に好適に導入し、弱毒生ワクチンのような投与に好適な温度感受性変異体を作製する。望ましい表現型の安定性を増加させるために、典型的に複数の突然変異を導入する。インフルエンザゲノムに選択した突然変異を導入した後、この突然変異したインフルエンザゲノムをウイルスが産生される条件下にて複製する。例えば、この突然変異したインフルエンザウイルスのゲノムを鶏卵中にて複製できる。あるいは、インフルエンザウイルスのゲノムを細胞培養中にて複製できる。細胞培養中にて複製する場合、必要に応じてウイルスを鶏卵中にてさらに増幅させ、タイターを増加させる。本発明方法により作製された温度感受性ウイルス、ならびに必要に応じて、弱毒および/または好冷ウイルスもまた、このようなウイルスを含むワクチンと同じく、本発明の特徴である。同様に、位置PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34に1つ以上の突然変異を含む例えばPB1391K391E、PB1581E581G、PB1661A661T、PB2265N265SおよびNP34D34Gの中から選択される突然変異を含む新規組換えウイルスの核酸ならびに、このようなアミノ酸置換を有するポリペプチドは本発明の特徴である。同様に、本明細書中に提示されている方法は、B型インフルエンザゲノムに1つ以上の特定の突然変異を導入して、温度感受性ならびに、必要に応じて弱毒および/または好冷表現型を有する新規B型インフルエンザ株を作製するように適合されている。例えば、PB2630;PA431;PA497;NP55;NP114;NP410;NP509;M1159およびM1183の中から選択された位置でアミノ酸置換を生じる1つ以上の突然変異をB型インフルエンザ株ゲノムに導入して温度感受性B型インフルエンザウイルスを作製する。典型的なアミノ酸置換としては以下:PB2630S630R;PA431V431M;PA497Y497H;NP55T55A;NP114V114A;NP410P410H;NP509A509T;M1159H159QおよびM1183M183Vが挙げられる。上に示したようなウイルスを含むワクチンならびに上記のような突然変異およびアミノ酸置換を含む核酸およびポリペプチドは全て、本発明の特徴である。従って、本発明の突然変異を含むインフルエンザウイルスは、それらの製造方法にかかわらず、本発明の特徴である。すなわち本発明は、本発明の突然変異を含むインフルエンザ株例えば、野生型に対してPB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の中から選択された1以上の位置にアミノ酸置換を有する任意のA型インフルエンザウイルスまたは野生型に対してPB2630;PA431;PA497;NP55;NP114;NP410;NP509;M1159およびM1183の中から選択される1以上の位置にアミノ酸置換を有する任意のB型インフルエンザウイルスを含むが、ただし、caA/AnnArbor/6/60株およびB/AnnArbor/1/66株は本発明の特徴とは考えない。特定の好ましい実施形態において、A型インフルエンザウイルスはPB1391K391E、PB1581E581G、PB1661A661T、PB2265N265SおよびNP34D34Gの中から選択される複数の突然変異を、B型インフルエンザウイルスはPB2630S630R;PA431V431M;PA497Y497H;NP55T55A;NP114V114A;NP410P410H;NP509A509T;M1159H159QおよびM1183M183Vの中から選択される複数の突然変異を、それぞれ含む。1つの実施形態において、インフルエンザウイルスのゲノムを含む複数のプラスミドベクターを宿主細胞に導入する。例えば、インフルエンザウイルスのゲノムセグメントを少なくとも8つのプラスミドベクターに含むことができる。1つの好ましい実施形態において、インフルエンザウイルスのゲノムセグメントを8つのプラスミドに含むことができる。例えば、8つプラスミドそれぞれが、インフルエンザウイルスの異なるゲノムセグメントを適宜含むことができる。本発明のベクターは2方向性発現ベクターでありうる。本発明の2方向性発現ベクターは典型的に、インフルエンザウイルスのゲノムセグメントを含む同一の2本鎖ウイルス核酸のそれぞれの鎖に機能的に結合している第1プロモータと第2プロモータとを含む。必要に応じて、この2方向性発現ベクターはポリアデニル化シグナルおよび/または終結配列を含む。例えば、ポリアデニル化シグナルおよび/または終結配列を2つのプロモータの内側にあるインフルエンザウイルスのゲノムのセグメントに隣接して配置することができる。本発明との関連において1つの好ましいポリアデニル化シグナルはSV40ポリアデニル化シグナルである。本発明の典型的なプラスミドベクターはプラスミドpAD3000である図1に例証。本発明との関連において、ベクターのプロモータによるインフルエンザウイルスの複製を支持できる任意の宿主細胞が好適である。宿主細胞の好ましい例としては、Vero細胞、PerC6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞293T細胞などおよびCOS細胞が挙げられる。本明細書中に記載されるpAD3000プラスミドベクターとの組合せにおいては、Vero細胞、293細胞、COS細胞が特に好適である。いくつかの実施形態において、少なくとも2つの上記細胞系統の混合物COS細胞とMDCK細胞との組合せまたは293T細胞とMDCK細胞との組合せである共培養物が宿主細胞集団を構成する。本発明の特徴は、本発明のプラスミドを含む宿主細胞を37°Cよりも低い温度で、好ましくは35°C以下の温度で培養することである。典型的に、細胞を32°C~35°Cの温度にて培養する。いくつかの実施形態において、細胞を約32°C~34°C例えば約33°Cの温度にて培養する。本発明の別の態様は、組換えまたはリアソータントA型インフルエンザまたはB型インフルエンザウイルスすなわちA型インフルエンザおよび/またはB型インフルエンザウイルスの野生型または変異株を培養中のVero細胞より回収するための新規方法に関する。インフルエンザウイルスのゲノムを含む複数のベクターをVero細胞の集団にエレクトロポレーションによって導入する。この細胞をウイルスの複製が可能である条件下にて増殖させる。例えば好冷、弱毒、温度感受性ウイルス株の場合には、Vero細胞を37°Cよりも低い温度、好ましくは35°C以下の温度にて増殖させる。典型的に、この細胞を32°C~35°Cの温度にて培養する。いくつかの実施形態において、この細胞を約32°C~34°C例えば約33°Cの温度にて培養する。必要に応じて例えばワクチン製造のために、Vero細胞を動物由来の産生物のない無血清培地中で増殖させる。上記の本発明方法において、インフルエンザゲノムプラスミドを含む宿主細胞を培養した後にウイルスを回収する。いくつかの実施形態において、回収したウイルスは組換えウイルスである。いくつかの実施形態において、このウイルスは1つ以上のウイルスの親株に由来する遺伝的関与を有するリアソータントインフルエンザウイルスである。必要に応じて、回収した組換えまたはリアソータントウイルスをさらに培養細胞における継代によってまたは鶏卵中にて増幅させる。必要に応じて、回収したウイルスを不活性化する。いくつかの実施形態において、回収したウイルスはインフルエンザワクチンを構成する。例えば、回収したインフルエンザワクチンは、選択したA型インフルエンザ株またはB型インフルエンザ株に由来するHAおよび/またはNA抗原を有するリアソータントインフルエンザウイルス例えば6:2または7:1リアソータントウイルスでありうる。特定の好ましい実施形態において、リアソータントインフルエンザウイルスは弱毒表現型を有する。必要に応じて、リアソータントウイルスは好冷および/または温度感受性であり、例えば表17に記載される置換から選択される1つ以上のアミノ酸置換を有する弱毒、好冷または温度感受性B型インフルエンザウイルスである。このようなインフルエンザウイルスは例えば、選択された病原性インフルエンザ株などに特異的な免疫応答の予防的産生のための弱毒生ワクチンとして有用である。本発明方法により作製されたインフルエンザウイルス弱毒リアソータントウイルスなどは本発明の特徴である。別の態様において、本発明は組換えインフルエンザウイルスワクチンを作製するための方法に関する。この方法はインフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団にインフルエンザウイルスのゲノムを含む複数のベクターを導入する工程、この宿主細胞を35°C以下の温度にて培養する工程、そして被験体に投与した際に免疫応答を誘発することができるインフルエンザウイルスを回収する工程を含む。本発明のワクチンはA型インフルエンザウイルス株またはB型インフルエンザウイルス株のいずれかでありうる。いくつかの実施形態において、インフルエンザワクチンウイルスとしては弱毒インフルエンザウイルス、好冷インフルエンザウイルス、または温度感受性インフルエンザウイルスが挙げられる。特定の実施形態において、ウイルスは上記の望ましい特性の組合せを有する。1つの実施形態において、インフルエンザウイルスはインフルエンザA/AnnArbor/6/60株ウイルス含む。別の実施形態において、インフルエンザウイルスはインフルエンザB/AnnArbor/1/66株ウイルスを含む。あるいは、ワクチンは人工的に操作したA型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含む。これらのウイルスは、caA/AnnArbor/6/60株またはca/B/AnnArbor/1/66株に特有のアミノ酸のように、これらの株の特徴的な生物学的特性に影響を及ぼす少なくとも1つの置換アミノ酸を含む。例えば、本発明に含まれるワクチンとしては、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の中から選択された位置にアミノ酸置換を生じる少なくとも1つの突然変異を含む人工的に操作した組換えおよびリアソータントA型インフルエンザウイルス、ならびにPB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP509、M1159およびM1183の中から選択された位置にアミノ酸置換を生じる少なくとも1つの突然変異を含む人工的に操作した組換えおよびリアソータントB型インフルエンザウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態において、ウイルスは、1種以上のインフルエンザウイルス株に由来するウイルスゲノムセグメントを有するリアソータントインフルエンザウイルス例えば6:2または7:1リアソータントを含む。例えばリアソータントインフルエンザウイルスワクチンとは好ましくは、ワクチン製造に関する望ましい特性について選択したウイルス株の内部ゲノムセグメントと組み合わせて、A型インフルエンザまたはB型インフルエンザより選択した株に由来するHAおよび/またはNA表面抗原を含む。多くの場合、HAおよび/またはNAをコードするセグメントの由来となるインフルエンザ株は、病原性株上記のものなどの局所的または世界的な流行予測に基づいて選択することが望ましい。いくつかの場合、この内部ゲノムセグメントに関与するウイルス株は、例えば望ましい表現型を生じる1つ以上のアミノ酸置換を有するA/AnnArbor/6/60、B/AnnArbor/1/66、または人工的に操作したインフルエンザ株の弱毒、好冷および/または温度感受性インフルエンザ株である。それは例えば、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の中から選択される位置にアミノ酸置換を生じる少なくとも1つの突然変異を含むA型インフルエンザウイルスならびにPB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP509、M1159およびM1183の中から選択される位置にアミノ酸置換を生じる少なくとも1つの突然変異を含むB型インフルエンザウイルスである。例えば、好ましいリアソータントウイルスとしては、PB1391K391E、PB1581E581G、PB1661A661T、PB2265N265SおよびNP34D34Gの中から選択される1つ以上のアミノ酸置換を有する人工的に操作したA型インフルエンザウイルス;ならびにPB2630S630R;PA431V431M;PA497Y497H;NP55T55A;NP114V114A;NP410P410H;NP509A509T;M1159H159QおよびM1183M183Vの中から選択される1つ以上のアミノ酸置換を有する人工的に操作したB型インフルエンザウイルスが挙げられる。必要な場合には、インフルエンザワクチンウイルスを回収の際に不活性化する。本発明方法により製造される、弱毒生ワクチンを含むインフルエンザウイルスワクチンもまた本発明の特徴である。特定の好ましい実施形態において、インフルエンザウイルスワクチンはリアソータントウイルスワクチンである。本発明の別の態様では、2方向性発現ベクターのプラスミドを提供する。本発明の2方向性発現ベクターは、第2プロモータとポリアデニル化部位SV40ポリアデニル化部位などの間に挿入された第1プロモータを含む。1つの実施形態において、第1プロモータと第2プロモータは少なくとも1つのクローニング部位に、反対向きに隣接して配置することができる。本発明の典型的なベクターはプラスミドpAD3000図1に例証である。いくつかの実施形態において、インフルエンザウイルスのゲノムの少なくとも1つのセグメントは、例えば2本鎖核酸としてクローニング部位に挿入されている。例えば、本発明のベクターは第2プロモータとSV40ポリアデニル化部位との間に挿入されている第1プロモータを有するプラスミドを含む。この第1プロモータと第2プロモータはインフルエンザウイルスの少なくとも1つのセグメントに、反対向きに隣接して配置されている。本発明の1つ以上の発現ベクターを含むキットもまた本発明の特徴である。典型的に、キットはまた1つ以上の:インフルエンザウイルスの複製を支持することができる細胞系統、緩衝液、培養培地、取扱説明書、包装材料、および容器を含む。いくつかの実施形態において、キットはそれぞれが少なくとも1つのインフルエンザウイルスのゲノムセグメントを含む複数の発現ベクターを含む。例えば、ワクチンの製造または投与に関する望ましい特性について選択されるウイルス株の1つの内部ゲノムセグメントをそれぞれ含む複数の発現ベクターを含むキットは本発明の特徴である。例えば、選択したウイルス株は弱毒、好冷および/または温度感受性株でありうる。それは例えば、A/AnnArbor/6/60もしくはB/AnnArbor/1/66、または所望される特性を有するオルターナティブな株本明細書中例えば表17に記載されるような1つ以上のアミノ酸置換を有する人工的に操作した株などでありうる。1つの実施形態において、キットは変異HA抗原および/または変異NA抗原をコードする核酸ライブラリーの一部を組み込んだ発現ベクターを含む。インフルエンザウイルスのゲノムを組み込んだ複数のベクターを含む少なくとも1つの細胞を含む、35°C以下の温度にて生産的に増殖する細胞培養物もまた本発明の特徴である。この組成物は細胞培養培地も含みうる。いくつかの実施形態において、複数のベクターは例えば第2プロモータとSV40ポリアデニル化部位との間に挿入されている第1プロモータを含んでなる2方向性発現ベクターを含む。例えば、第1プロモータおよび第2プロモータを、インフルエンザウイルスの少なくとも1つのセグメントに、反対向きに隣接して配置することができる。本発明の細胞培養物を35°C以下約32°C~35°Cなど、典型的に、約32°C~約34°C、例えば、約33°Cの温度に維持する。本発明はまた細胞培養系を含む。この細胞培養系は上記のようなインフルエンザウイルスのゲノムを組み込んだ複数のベクターを含む少なくとも1つの細胞からなる生産的に増殖する細胞培養物、および35°C以下の温度にこの培養を維持するためのレギュレータを含む。例えば、このレギュレータは好ましくは約32°C~35°C、典型的に約32°C~約34°C例えば約33°Cの温度に細胞培養を維持する。本発明の別の特徴は温度感受性、好冷性および/または弱毒性に影響を及ぼす1つ以上のアミノ酸置換を含む人工的に操作した組換えインフルエンザウイルスまたはリアソータントインフルエンザウイルスである。例えば、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の中から選択される位置に1つ以上のアミノ酸置換を有する人工的に操作したA型インフルエンザウイルスならびにPB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP509、M1159およびM1183の中から選択される位置に1つ以上のアミノ酸置換を有する人工的に操作したB型インフルエンザウイルスが本発明の好ましい実施形態である。典型的な実施形態としては:PB1391K391E、PB1581E581G、PB1661A661T、PB2265N265SおよびNP34D34Gのいずれか1つ以上のアミノ酸置換を有するA型インフルエンザウイルス;ならびに:PB2630S630R;PA431V431M;PA497Y497H;NP55T55A;NP114V114A;NP410P410H;NP509A509T;M1159H159QおよびM1183M183Vのいずれか1つ以上のアミノ酸置換を有するB型インフルエンザウイルスが挙げられる。特定の実施形態において、ウイルスは上に示した位置に、例えば1、2、3、4、5、6、7、8または9つのアミノ酸置換を有するような複数の突然変異を含む。従って、上に示した5つの全ての位置例えばPB1391K391E、PB1581E581G、PB1661A661T、PB2265N265SおよびNP34D34Gにアミノ酸置換を有する人工的に操作したA型インフルエンザウイルスならびに、上記の8つまたは9つ全ての位置例えばPB2630S630R;PA431V431M;PA497Y497H;NP55T55A;NP114V114A;NP410P410H;NP509A509T;M1159H159QおよびM1183M183Vにアミノ酸置換を有する人工的に操作したB型インフルエンザウイルスを、本発明に含む。さらに、ウイルスは上に列挙していない1つ以上のさらなるアミノ酸置換を含みうる。特定の実施形態において、人工的に操作したインフルエンザウイルスは温度感受性インフルエンザウイルス、好冷インフルエンザウイルスおよび/または弱毒インフルエンザウイルスである。例えば、本発明による温度感受性インフルエンザウイルスは典型的に、39°Cにおける増殖において野生型インフルエンザウイルスと比べて約20~50log10減少を示す。例えば、温度感受性ウイルスは好ましくは、39°Cにおける増殖において野生型インフルエンザウイルスのそれと比べて少なくとも約20log10、少なくとも約30log10、少なくとも約40log10、または少なくとも約45log10減少を示す。温度感受性インフルエンザウイルスは33°Cにて力強い増殖特性を保持することは、典型的であるが必ずしも必要ではない。典型的に、本発明の弱毒インフルエンザウイルスはフェレットを用いた弱毒性アッセイにおける増殖について、野生型インフルエンザウイルスと比べて約20~50log10減少を示す。例えば、本発明の弱毒インフルエンザウイルスはフェレットを用いた弱毒性アッセイにおける増殖について、野生型インフルエンザウイルスと比べて少なくとも約20log10、しばしば約30log10、好ましくは少なくとも約40log10減少を示す。本発明はまた細胞および発育鶏卵におけるインフルエンザウイルスの複製に影響を及ぼすHAおよびNAのアミノ酸残基の同定および操作にも関する。さらに本発明は発育鶏卵および/または細胞における改善された複製を有するHAおよびNAインフルエンザウイルスワクチン変異体を作製するための逆遺伝子技術の使用に関する。さらに本発明はHA受容体結合活性および/またはNAノイラミニダーゼ活性を改変するための方法に関する。さらに、本発明は発育鶏卵および/または細胞において増強された複製能力を有するインフルエンザウイルスを提供する。1つの実施形態において、本発明は発育鶏卵および/または細胞におけるインフルエンザウイルスの複製能力を増加させるためにHAおよび/またはNAのアミノ酸残基を操作するための方法を提供する。この方法はHAおよび/またはNAにアミノ酸残基の置換を導入することを含み、インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団にインフルエンザウイルスのゲノムを組み込んだ複数のベクターを導入し、この細胞を培養して、そしてインフルエンザウイルスを回収することによって、細胞培養においてインフルエンザウイルスを作製する方法を用いる。好ましくは、回収したインフルエンザウイルスは発育鶏卵および/または細胞において増加した複製能力を有する。別の実施形態において、本発明は、改変されていないインフルエンザウイルス株と比べた場合、発育鶏卵において増加した複製能力を有するインフルエンザウイルス変異体本明細書中では複製能が増強されたインフルエンザ変異体として言及されるを提供する。本発明はさらに、改善された回収方法を含む。この方法においてエレクトロポレーションした例えば本発明のポリヌクレオチドプラスミドおよびベクターなどを用いてエレクトロポレーションした動物SFVERO細胞を、トリ胚腎臓CEK細胞、トリ胚繊維芽細胞、トリ腎臓プライマリー細胞、および発育鶏卵の漿尿膜より単離した細胞を含むがこれらに限定されない群から選択される別の細胞と共培養する。この回収方法に有用である他の細胞としては、インフルエンザウイルスの複製を支持し、規制認可についての許容基準を満たす任意の細胞が挙げられる。細胞の供給源としては、例えばSPFトリ群に由来するものが挙げられる。本明細書中の実施例9および10を参照のこと。本発明の1つの好ましい実施形態において、ウイルスの回収効率は少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも2倍、少なくとも3倍、または少なくとも5倍ほど改善される。本発明の別の好ましい実施形態において、ウイルスの回収効率は少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または少なくとも99である。効率は例えば、回収されるウイルスを注射した卵数Xとその後HAタイターを検出することができた卵数Yを計測し、YをXで割り算することによって測定できる。実施例9および10のような上記の方法は、本明細書中または米国特許出願第09/396539号、同上第09/844517号、PCT/US0113656、PCT/US00/09021、US03012728;米国特許第6649372号;WO03/091401、US200201677などこれらは本明細書中に参考として援用されるに記載されるポリヌクレオチド例えばプラスミドおよびベクターをエレクトロポレーションするために用いることができる。本発明の好ましい実施形態はインフルエンザウイルスの回収方法である。この方法において動物細胞Vero細胞などにインフルエンザRNAポリメラーゼと核タンパク質をコードするプラスミドをエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションした動物細胞を別の細胞型と共培養する。本発明の好ましい実施形態はインフルエンザウイルスA型インフルエンザウイルス、好冷ウイルス、弱毒ウイルスなどの回収方法である。この方法において動物細胞Vero細胞などにインフルエンザRNAポリメラーゼと核タンパク質をコードするプラスミドをエレクトロポレーションする。エレクトロポレーションされるプラスミドの数は例えば、8または12個でありうる。本発明の好ましい実施形態はインフルエンザウイルスA型インフルエンザウイルス、好冷ウイルス、弱毒ウイルスなどの回収方法である。この方法において動物細胞Vero細胞などにインフルエンザRNAポリメラーゼと核タンパク質をコードするプラスミドをエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションした動物細胞を別の細胞型CEK細胞などと共培養する。エレクトロポレーションされるプラスミドの数は例えば、8または12個でありうる。本発明の別の好ましい実施形態はインフルエンザウイルスの回収方法である。この方法において、a動物細胞に、この細胞内にてゲノムまたはアンチゲノムvRNAセグメント、および核タンパク質、およびRNA依存性ポリメラーゼを発現する細胞発現ベクターをエレクトロポレーションして、そしてリボ核タンパク質複合体を形成することができ、ウイルス粒子をヘルパーウイルスを用いてまたは用いることなく組み立てることができる;そしてbウイルス粒子がパッケージされ、回収される上記細胞を培養する。本発明の別の好ましい実施形態はインフルエンザウイルスの回収方法である。この方法において動物細胞に、例えばインフルエンザウイルスのゲノムセグメントに相当するウイルスcDNAを含む発現プラスミド米国特許出願第09/396539号、同上第09/844517号、PCT/US0113656、PCT/US00/09021、US03012728;米国特許第6649372号;WO03/091401、US200201677これらは本明細書中に参考として援用されるを参照のことをエレクトロポレーションする。この方法において、cDNAをRNAポリメラーゼIpolIプロモータと的確な3’末端を有するvRNAまたはcRNAの合成調節エレメントとの間に挿入し、同様にRNAポリメラーゼIIpolIIプロモータとポリアデニル化シグナルとの間に挿入する。このcDNAはインフルエンザウイルスタンパク質のみをコードしている。本発明の他の実施形態は、本明細書中に記載される方法実施例9および10などによって製造されるインフルエンザウイルスならびにこのウイルスを含んでなるワクチンを含む。本発明の他の好ましい実施形態は、クローン化ウイルスcDNAより感染性インフルエンザウイルスを産生する組成物を含む。この組成物はそれぞれのプラスミドが1つのウイルスゲノムセグメントを含んで成る1組のプラスミドをエレクトロポレーションしたSFVero細胞を含む。このゲノムセグメントに相当するウイルスcDNAは、RNAポリメラーゼIpolIプロモータと的確な3’末端を有するvRNAまたはcRNAの合成調節エレメントとの間に挿入されており、ウイルスmRNAおよび対応するウイルスタンパク質の発現を生じ、フルセットのvRNAまたはcRNAおよびウイルスタンパク質の発現によって、感染性インフルエンザウイルスの組み立てを生じる。詳細な説明多くの病原性インフルエンザウイルス株は組織培養において、不十分に増殖するだけで、弱毒生ウイルスワクチンの製造に好適な株温度感受性、好冷および/または弱毒インフルエンザウイルスなどは、商業的生産にかなうほど培養細胞中にて首尾よく増殖しなかった。本発明は、標準的な細胞培養条件下での増殖に適合していないインフルエンザウイルス株の増殖および回収を可能とする多重プラスミドトランスフェクション系を提供する。インフルエンザワクチンの開発および製造におけるさらなる課題は1種以上の循環インフルエンザ株が発育鶏卵では十分に複製することができないことである。本発明はHAおよびNAタンパク質の活性に影響を及ぼす複数のアミノ酸残基を発見し、そのような活性を調節できる特定のアミノ酸置換をつきとめた。本発明はHA受容体結合活性および/またはNAノイラミニダーゼ活性の調節によって、卵および/または宿主細胞Vero細胞もしくはMDCK細胞などにおけるインフルエンザの複製を高めることができることを開示する。特に本発明は卵および/または細胞におけるウイルスの複製を高めることができるHAおよび/またはNAにおけるアミノ酸置換の組み合わせを開示し、これらのアミノ酸置換が組換えインフルエンザウイルスの抗原性に重大な影響を与えないことを示す。従って、本発明はインフルエンザウイルスワクチンの製造を改善するための逆遺伝子技術の使用を提供する。第1の態様において、本発明方法は、細胞培養中にて、もっぱらクローン化ウイルスDNAより組換えB型インフルエンザウイルスを作製するためのベクターおよび方法を提供する。別の態様において、本発明方法は、ワクチン製造に関して望ましい特性弱毒病原性または弱毒表現型、好冷性、温度感受性などを有するウイルス株A株およびB株インフルエンザウイルスの両方のinvitroにおける培養細胞での増殖を支持する組織培養条件の開発に一部基づく。宿主細胞にクローン化ウイルスゲノムセグメントを組み込んだ複数のベクターを導入し、この細胞を35°Cを超えない温度で培養することによって、インフルエンザウイルスを製造する。インフルエンザウイルスのゲノムを含むベクターをトランスフェクトした場合、ワクチンとして好適な組換えウイルスを標準的な精製方法によって回収できる。本発明のベクター系および方法を用いて、ワクチン製造に関する望ましい特性によって選択された株の6つの内部遺伝子セグメント、および選択された病原性株などに由来する免疫原性HAおよびNAセグメントを含むリアソータントウイルスを組織培養において迅速かつ効率的に製造することができる。従って、本明細書中に記載される系および方法は、細胞培養における組換えおよびリアソータントA型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルスの迅速な製造に有用である。これらのウイルスは、鼻腔内投与に好適なワクチンなどの弱毒生ワクチンを含むワクチンとして用いるのに好適なウイルスを含む。典型的に、単一の主要ドナーウイルスMDV株をAサブタイプおよびBサブタイプのそれぞれから選択する。弱毒生ワクチンの場合、主要ドナーウイルス株を典型的に、ワクチン製造に関してその好ましい特性温度感受性、好冷性および/または弱毒性などによって選択する。例えば、典型的な主要ドナー株としてはA/AnnArbor/6/60およびB/AnnArbor/1/66それぞれの、温度感受性株、弱毒株および好冷株などが挙げられる。本発明は、上記ウイルス株のca、tsおよびattの表現型を生じる根本的な突然変異を解明し、組換えおよびリアソータントワクチンの製造に関連して、ドナー株として用いることに好適なインフルエンザの新規株を作製するための方法を提供する。例えば、選択した主要ドナーA型ウイルスMDVA、または主要ドナーB型ウイルスMDVBを、ウイルスゲノムからなる複数のクローン化ウイルスcDNAより作製する。典型的な実施形態において、組換えウイルスを8つのクローン化ウイルスcDNAより作製する。PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、MおよびNSから成る選択したMDVAまたはMDVB配列のいずれかを表す8つのウイルスcDNAをプラスミド例えばPAD3000のような2方向性発現ベクターにクローン化し、そしてウイルスゲノムRNAが1つの鎖のRNAポリメラーゼIpolIプロモータより転写され得、そしてウイルスmRNAが他方の鎖のRNAポリメラーゼIIpolIIプロモータから合成できる。必要に応じて、いずれかの遺伝子セグメントが、例えば多塩基性切断部位multibasiccleavagesiteを取り除くために、改変され、HAセグメントを含みうる。次に、適切な宿主細胞例えばVero細胞、共培養されたMDCK/293細胞またはMDCK/COS細胞に8つのウイルスcDNAを有するプラスミドをトランスフェクションした後に、感染性組換えMDVAウイルスまたはMDVBウイルスを回収する。本明細書中に記載されるプラスミドおよび方法を用いた場合、本発明は例えば、選択したウイルス例えばMDVA、MDVBの6つの内部遺伝子PB1、PB2、PA、NP、MおよびNSをA型またはB型に対応する別の型のインフルエンザウイルスに由来するHAおよびNAと一緒にコトランスフェクションすることによって、6:2リアソータントインフルエンザワクチンを製造することに有用である。例えば、HAセグメントを、ワクチン製造について日常的に行われているように、病原性に関連するH1、H3またはB株より適宜選択する。同様に、HAセグメントを病原性株H2株例えばH2N2、H5株例えばH5N1またはH7株例えばH7N7などのように関連性を示している株から選択できる。MDVの7つのゲノムセグメントと選択した株のHAまたはNA遺伝子のいずれかを組み込んだリアソータント7:1リアソータントもまた作製できる。さらに、この系はワクチン製造に関する表現型特性弱毒att、好冷ca、および温度感受性ts表現型の分子基盤を決定することに有用である。別の態様において、本発明はHAおよび/またはNAのアミノ酸残基を操作して、発育鶏卵および/または細胞におけるインフルエンザウイルスの複製能力を高めるための方法を提供する。例えば、本発明方法はHA受容体結合活性および/またはNAノイラミニダーゼ活性を調節して、卵および/または細胞におけるインフルエンザウイルスの複製能力を高めるために用いることができる。さらに、本発明は発育鶏卵および/または細胞における増強された複製能力を有するインフルエンザウイルスを提供する。定義別途定義されない限り、全ての科学的および技術的用語は、当該分野において一般に用いられているのと同一の意味を有するものとして理解される。本発明の目的に関して、以下の用語を以下に定義する。核酸、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列および核酸配列という用語は、1本鎖または2本鎖のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体、それらのキメラもしくは類似体をいう。本明細書中で用いられた場合、この用語は必要に応じて、天然に生じるヌクレオチド類似体の重合体を含む。この重合体は、天然のヌクレオチドが天然に生じるヌクレオチドにある程度類似した1本鎖核酸ペプチド核酸などにハイブリダイズする際に重要な性質を有する。別途示されない限り、本発明の特定の核酸配列は相補的な配列、さらに、明示的に示される配列を含む。遺伝子という用語は、生物学的機能に関連する任意の核酸をいうために広く用いられる。従って遺伝子とは、コード配列および/またはそれらの発現に必要とされる調節配列を含む。遺伝子という用語を特定のゲノム配列、およびそのゲノム配列によってコードされるcDNAまたはmRNAに適用する。遺伝子はまた、例えば他のタンパク質の認識配列を形成する発現されない核酸セグメントを含む。発現されない調節配列としてはプロモータおよびエンハンサーが挙げられる。これらに対して転写因子のような調節タンパク質が結合し、隣接配列または近くの配列の転写を生じる。組織特異的プロモータまたはエンハンサーは特定の組織型または細胞型における転写を調節するものである。ベクターという用語は、核が生物、細胞、または細胞構成要素間で増幅および/または移動することを可能とする手段をいう。ベクターとしてはプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、および人工染色体などが挙げられ、これらは自立的に複製するか、または宿主細胞の染色体に組み込むことができる。ベクターはまた、ネイキッドnakedRNAポリヌクレオチド、ネイキッドDNAポリヌクレオチド、同一の鎖の中でDNAとRNAの両方からなるポリヌクレオチド、ポリリシン結合DNAまたはRNA、ペプチド結合DNAまたはRNA、リポソーム結合DNAなどでありうる。これらは自立的に複製しない。最も一般的には、本発明のベクターはプラスミドである。発現ベクターとはプラスミドなどのベクターであり、組み込まれている核酸の発現および複製を促進することが可能である。典型的に、発現される核酸はプロモータおよび/またはエンハンサーに機能的に結合されており、プロモータおよび/またはエンハンサーによる転写調節制御の対象となる。2方向性発現ベクターは典型的に、2つのオルタナティブなプロモータがこれらプロモータ間に配置されている核酸に関して反対向きに配置されており、その結果両方向に発現が開始され、例えばプラスまたはセンス鎖RNA、およびネガティブ-またはアンチセンス鎖RNAの転写を生じることが可能であることを特徴とする。あるいは、2方向性発現ベクターとは、ウイルスmRNAとウイルスゲノムRNA例えばcRNAを同一の鎖から発現する両方向性ベクターでありうる。本発明との関連において、単離された物質という用語は、核酸またはタンパク質の天然に生じる環境下にて、それらと普通は共にあるかまたは相互作用する構成要素が実質的に存在しない核酸またはタンパク質などの生物学的物質をいう。必要に応じて、単離された物質とは、その天然の環境例えば細胞において、この物質と共に見出されない物質を含む。例えば、この物質がその天然の環境細胞などにある場合、この物質はその環境下で見出される物質が産生されない細胞内の位置ゲノムまたは遺伝子エレメントなどに配置されている。例えば、天然に生じる核酸例えばコード配列、プロモータ、エンハンサーなどは、その核酸が産生されないゲノムの位置例えばベクタープラスミドベクターもしくはウイルスベクターなどまたは単位複製配列に天然に生じない手段によって導入されている場合、単離された状態となる。このような核酸はまた異種性核酸として言及される。組換え体という用語は物質核酸またはタンパク質などがヒトによる処理によって人工的にまたは合成的に非天然に変えられていることを示す。この変化を天然の環境または状態にある物質またはそれらから取り出した物質にて行いうる。特にウイルス例えばインフルエンザウイルスについていう場合、組換え核酸の発現によって産生される場合そのウイルスは組換え体である。ウイルスについていう場合、リアソータントという用語は、1種以上の親ウイルス株または供給源に由来する遺伝子および/またはポリペプチド構成要素を含むウイルスを示す。例えば、7:1リアソータントは、第1の親ウイルスに由来する7つのウイルスゲノムセグメントまたは遺伝子セグメントと第2の親ウイルスに由来する単一の相補的なウイルスゲノムセグメント例えば赤血球凝集素またはノイラミニダーゼをコードするを含む。6:2リアソータントは6つのゲノムセグメント最も一般的に第1の親ウイルスに由来する6つの内部遺伝子と別の親ウイルスに由来する2つの相補的なセグメント赤血球凝集素およびノイラミニダーゼなどを含む。導入という用語は異種性または単離した核酸についていう場合、真核細胞または原核細胞への核酸の組み込みをいう。これら細胞においてこの核酸は細胞のゲノム染色体、プラスミド、色素体もしくはミトコンドリアDNAなどに組み込まれるか、自立的なレプリコンに変えられるか、または一過的に発現され得るトランスフェクトmRNAなど。この用語は感染、トランスフェクション、形質転換および形質導入などの方法を含む。本発明との関連において、原核細胞に核酸を導入するためにエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、脂質媒介トランスフェクションリポフェクションなどを含む種々の方法を用いることができる。宿主細胞という用語は、ベクターなどの異種性核酸を含み、その核酸の複製および/または発現、ならびに必要に応じてポリペプチドおよび/またはウイルスを含む1つ以上のコードされた生成物の産生を支持する細胞を意味する。宿主細胞はEcoliなどの原核細胞または酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、鳥類細胞またはヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞でありうる。本発明との関連において、典型的な宿主細胞としてはVeroアフリカミドリザル腎臓細胞、PerC6細胞ヒト胎児網膜細胞、BHK乳呑みハムスター腎臓細胞、トリ腎臓初代PCK細胞、MadinDarbyイヌ腎臓MDCK細胞、MadinDarbyウシ腎臓MDBK細胞、293細胞例えば293T細胞、およびCOS細胞例えばCOS1細胞、COS7細胞が挙げられる。宿主細胞という用語は例えば、様々な細胞型または細胞系統の混合培養物を含む細胞の組合せまたは混合物を含む。温度感受性、好冷および弱毒という用語は当該分野において周知である。例えば、温度感受性tsという用語は、A型インフルエンザ株について、33°Cと比べて39°Cにおけるタイターが100倍かまたはそれ以上の減少を示すウイルスを示し、B型インフルエンザウイルス株について、33°Cと比べて37°Cにおけるタイターが100倍かまたはそれ以上の減少を示すウイルスを示す。例えば、好冷caという用語は、25°Cにおける増殖が33°Cにおける増殖の100倍以内であるウイルスを示す。例えば、弱毒attという用語は、フェレットの上気道では複製するが、肺組織においては検出されず、動物にインフルエンザ様疾患を引き起こさないウイルスを示す。中間の表現型を有するウイルス、すなわちA株ウイルスについて39°Cにて、またはB株ウイルスについて37°Cにて100倍未満のタイター減少を示し、25°Cにおける増殖が33°Cにおける増殖の100倍以上200倍、500倍、1000倍、10000倍未満などであり、ならびに/またはフェレットの上気道における増殖と比べて肺における減少した増殖すなわち部分的弱毒、および/もしくは動物における減少したインフルエンザ様疾患を示すウイルスであって、本明細書中に記載される1つ以上のアミノ酸置換を有するウイルスもまた、本発明に含まれる有用なウイルスであることがわかる。増殖は、タイター、プラークのサイズもしくは形態、粒子密度または当業者に公知である他の測定法によって示されるようなウイルスの量を示す。人工的に操作したという語句は、組換え法例えば部位特異的変異誘発、PCR変異誘発などによって導入した少なくとも1つの突然変異を含むウイルス、ウイルス核酸またはウイルス性コード産物例えばポリペプチド、ワクチンを示すために本明細書中に用いられる。人工的に操作したという語句は1つ以上のヌクレオチド突然変異および/またはアミノ酸置換を含むウイルスまたはウイルス構成要素もしくは産生物をいう場合、ウイルスまたはウイルス構成要素もしくは産生物をコードするウイルスゲノムまたはゲノムセグメントが、天然に生じたか、非組換え方法25°Cにおける進行的継代などによって作製された研究室の既存のウイルス株例えば野生型または好冷性A/AnnArbor/6/60またはB/AnnArbor/1/66株のような天然源に由来しないことを示す。インフルエンザウイルスインフルエンザウイルスのゲノムは8つのセグメントからなる線状-鎖リボ核酸RNAからなり、これらは免疫原性赤血球凝集素HAおよびノイラミニダーゼNAタンパク質および6つの内部核ポリペプチド:ヌクレオカプシド核タンパク質NP;マトリックスタンパク質M;非構造タンパク質NS;3つのRNAポリメラーゼPA、PB1、PB2タンパク質をコードする。複製の間にゲノムウイルスRNAは宿主細胞の核内において鎖メッセンジャーRNAおよび-鎖ゲノムcRNAに転写される。8つのゲノムセグメントの各々はリボ核タンパク質複合体にパッケージされる。このリボ核タンパク質複合体はRNAに加えて、NPおよびポリメラーゼ複合体PB1、PB2、およびPAを含む。本発明において、8つのセグメント各々に相当するウイルスゲノムRNAをインフルエンザウイルスの操作および作製のために組換えベクターに挿入する。ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージ、および人工染色体を含む種々のベクターを本発明との関連において用いることができる。典型的に操作を容易にするために、ウイルスゲノムセグメントを、プラスミドベクターに挿入する。このプラスミドベクターは細菌細胞および真核細胞において機能する1つ以上の複製起点、および必要に応じて、プラスミド配列を含む細胞をスクリーニングまたは選択することに都合が良いマーカーを提供する。典型的なベクターであるプラスミドpAD3000を図1に例証する。最も一般的には、本発明のプラスミドベクターは、いずれかの向きで挿入されているウイルスゲノムセグメントの転写を開始すること、すなわち鎖および-鎖のウイルスRNA分子の両方をもたらすことができる2方向性発現ベクターである。2方向性の転写をもたらすために、各ウイルスゲノムセグメントを少なくとも2つの独立したプロモータを有するベクターに挿入し、その結果ウイルスゲノムRNAのコピーが第1のRNAポリメラーゼプロモータ例えばPolIによって一方の鎖より転写され、ウイルスmRNAが第2のRNAポリメラーゼプロモータ例えばPolIIより合成される。従って2つのプロモータを、ウイルスゲノムRNAセグメントの挿入に好適な少なくとも1つのクローニング部位すなわち、制限酵素認識配列好ましくは特有のクローニング部位に隣接して反対向きに配置する。あるいは、鎖mRNAおよび-鎖ウイルスRNAcRNAのようなをベクターの同一鎖から転写する場合、両方向性ベクターを用いることができる。発現ベクター発現されるべきインフルエンザウイルスのゲノムセグメントを、mRNA合成を導くために適切な転写制御配列プロモータに機能的に結合する。種々のプロモータは、インフルエンザウイルスのゲノムセグメントの転写を調節するために発現ベクターに用いることに適している。特定の実施形態において、例えばベクターがプラスミドpAD3000である場合、サイトメガロウイルスCMVDNA依存性RNAポリメラーゼIIPolIIプロモータを利用する。必要な場合には、例えば条件発現を調節するために、特定の条件下、または特定の組織もしくは細胞においてRNA転写を引き起こす他のプロモータを代わりに用いることができる。多数のウイルスおよび哺乳動物ヒトなどのプロモータが利用可能であるか、または意図される特定の用途により単離することができる。例えば、動物およびヒトのウイルスのゲノムから得た代替的なプロモータとしては、アデノウイルスアデノウイルス2型など、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルスおよびサルウイルス40SV40などのプロモータ、ならびに種々のレトロウイルスのプロモータが挙げられる。哺乳動物のプロモータとしては、アクチンプロモータ、免疫グロブリンプロモータ、熱ショックプロモータなどが挙げられる。さらに、バクテリオファージプロモータを同種のRNAポリメラーゼと共に用いることができる例えばT7プロモータ。必要に応じて、エンハンサー配列を含めることによって転写を増加できる。典型的にエンハンサーは、転写を増加させるためにプロモータと共に作用する短い例えば10~500bpシスアクチンgDNAエレメントである。多くのエンハンサー配列は、哺乳動物遺伝子ヘモグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、およびインスリン、ならびに真核細胞のウイルスから単離された。エンハンサーを異種性コード配列の5’側または3’側位置にてベクターに結合させることができるが典型的には、プロモータの5’側部位に挿入する。典型的に、プロモータおよび、必要な場合にはさらなる転写増強配列を、異種性DNAが導入される宿主細胞型における発現を最適化するために選択するScharfら1994HeatstresspromotersandtranscriptionResultsProblCellDiffer20:12562;Krieglerら1990AssemblyofenhancerspromotersandsplicesignalstocontrolexpressionoftransferredgenesMethodsinEnzymol185:51227。必要に応じて、単位複製配列にはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位または内部リボソーム侵入部位IRESも含むことができる。本発明のベクターはまた、転写の終結およびmRNAを安定化させるために必要な配列ポリアデニル化部位または終結配列などを適宜含む。このような配列は一般に、真核生物DNAもしくはウイルスDNAの5’側、しばしば3’側の非翻訳領域またはcDNAより得ることができる。例えばプラスミドpAD3000を含む1つの実施形態において、SV40ポリアデニル化配列はポリアデニル化シグナルを提供する。さらに、上記のような発現ベクターは、形質転換した宿主細胞を選択するための表現型の形質を与えるために1つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を必要に応じて含み、先に挙げた遺伝子に加えて、ジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性などのマーカーが真核細胞培養における選択に好適である。上記のような適切なDNA配列、および適切なプロモータ配列または制御配列を含むベクターを、タンパク質の発現を可能とする宿主細胞を形質転換するために用いることができる。本発明のベクターは細菌細胞にて複製され得るが、最も頻繁には発現のために、哺乳動物細胞Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、COS細胞などにベクターを導入することが望ましい。さらなる発現エレメント最も一般的には、インフルエンザウイルスタンパク質をコードするゲノムセグメントは、機能的ウイルスタンパク質への翻訳を含む、その発現に必要ななんらかのさらなる配列を含む。別の状況において、ミニ遺伝子またはウイルスタンパク質HAもしくはNAタンパク質などをコードする他の人工構築物を用いることができる。この場合においては、異種性コード配列の効率的な翻訳を補助する特定の開始シグナルを含むことがしばしば望ましい。これらのシグナルは、例えばATG開始コドンおよび隣接配列を含むことができる。全挿入物の翻訳を確実にするために、開始コドンをウイルスタンパク質に関して正しいリーディングフレーム内に挿入する。外来性転写エレメントおよび開始コドンは、天然と合成の両方のさまざまな起源のものでありうる。発現の効率は用いる細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって増強することができる。必要な場合には、シグナル配列、分泌配列または局在化配列などのさらなる発現エレメントをコードするポリヌクレオチド配列を、所望される細胞区画、膜もしくは細胞小器官でのポリペプチドの発現を目的として、ベクター、通常は目的のポリヌクレオチド配列を含むインフレームに含むか、または細胞培養培地に含むことができる。このような配列は当業者に公知であり、分泌リーダーペプチド、細胞小器官標的配列核局在化配列、ER保留シグナル、ミトコンドリア移行配列など、膜局在化/アンカー配列例えばストップトランスファー配列、GPIアンカー配列などを含む。インフルエンザウイルスワクチン歴史的に、インフルエンザウイルスワクチンは発育鶏卵において、関連株についての経験的予測に基づいて選択したウイルス株を用いて作製していた。ごく近年、認可された弱毒温度感受性主株との関連において、選択された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ抗原を含むリアソータントウイルスが作製された。鶏卵において継代を重ねたウイルス培養の後、インフルエンザウイルスを回収し、そして必要に応じて、ホルムアルデヒドおよび/またはβ-プロピオラクトンなどを用いて不活性化する。しかし、この方法によるインフルエンザワクチンの製造は多くの重大な欠点を有する。鶏卵から残存する汚染物質は高い抗原性、発熱性のものであり、しばしば投与の際に重大な副作用を生じる。さらに重大なことには、製造用に用意される株は、インフルエンザワクチンの製造および不活性化のための時間を得るために、典型的に次のインフルエンザ時期の数ヶ月前には選択および供給しなければならない。組換えおよびリアソータントワクチンを細胞培養にて製造する試みは、ワクチン製造用に認可された何れの株も標準的な細胞培養条件下にて効率的に増殖することができないことによって妨げられていた。本発明は、培養にて組換えおよびリアソータントウイルスを作製するためのベクター系および方法を提供する。これらは選択した1つ以上のウイルスの抗原性株に対応するワクチンを迅速に製造することが可能である。特に、細胞培養において多重プラスミド系よりウイルスの効率的な産生を生じる、条件および株が提供される。必要に応じて、所望される場合には、ウイルスを鶏卵にてさらに増幅することが可能である。例えば、標準的な細胞培養条件下例えば37°Cでは、B型インフルエンザ主要株B/AnnArbor/1/66を増殖することは不可能であった。本発明方法においては、インフルエンザウイルスのゲノムのセグメントをそれぞれ含む多数のプラスミドを好適な細胞に導入し、35°C以下の温度にて培養中に維持する。典型的に、培養物を約32°C~35°C、好ましくは約32°C~約34°C例えば約33°Cにて維持する。典型的に、培養物を、制御された湿度およびCO2の下、温度レギュレータ温度が35°Cを超えないことを保証するサーモスタットなどを用いた一定の温度にて、細胞培養インキュベーターのような系内に維持する。リアソータントインフルエンザウイルスを、目的の株目的の抗原性変異体などに由来する相補的なセグメントと組み合わせて主要インフルエンザウイルスのゲノムセグメントに対応するベクターのサブセットを導入することによって容易に得ることができる。典型的に、主要株はワクチン投与に関する望ましい特性に基づいて選択する。例えばワクチン製造に関して弱毒生ワクチンの製造に関してなど、主要ドナーウイルス株を弱毒表現型、好冷および/または温度感受性によって選択できる。この関連において、A型インフルエンザ株caA/AnnArbor/6/60;B型インフルエンザ株caB/AnnArbor/1/66;またはその望ましい表現型特性によって選択した別の株弱毒性、好冷性、および/もしくは温度感受性株、例えば、実施例4に記載されるような人工的に操作したA型インフルエンザ株;あるいは表17に挙げられた1つ以上のアミノ酸置換を含む人工的に操作したB型インフルエンザ株が、主要ドナー株として適宜選択される。1つの実施形態において、インフルエンザ主要ウイルス株の6つの内部遺伝子すなわちPB1、PB2、PA、NP、NB、M1、BM2、NS1およびNS2を含むプラスミドを、望ましい抗原性株例えば、局所的または世界的に重大なインフルエンザ感染を引き起こすことが予測される株の赤血球凝集素およびノイラミニダーゼセグメントと組み合わせて好適な宿主細胞にトランスフェクトする。効率的な回収に適した温度例えば、35°C以下、約32°C~35°C、例えば約32°C~約34°C、または約33°Cにおける細胞培養中にてリアソータントウイルスを複製した後、リアソータントウイルスを回収する。必要に応じて、回収したウイルスをホルムアルデヒドまたはβプロピオラクトンのような変性剤を用いて不活性化できる。弱毒、温度感受性および好冷インフルエンザウイルスワクチン1つの態様において、本発明はウイルスの好ましい主要ドナー株におけるts表現型の基礎をなす突然変異の決定に基づく。MDV株ゲノムにおける単一のヌクレオチド変化の機能的重要性を決定するために、A/AA/6/60系統内の非常に関連のある株に由来するリアソータントウイルスを温度感受性について調べた。2つの親株の同質遺伝子的性質によって、ts表現型における単一のヌクレオチド変化を評価することができる。従って、PB1、PB2およびNP内の特定のアミノ酸残基にヌクレオチドレベルでMDVAのts表現型に関する遺伝子基盤が与えられる。caA/AA/6/60のts表現型の遺伝子基盤を調べるこれまでの試みは、古典的な同時感染/リアソータント技術を利用して、A/AA/6/60と無関係のwt株との間の単一および多重遺伝リアソータントを作製した。これらの研究はPB2とPB1の両方がts表現型に関与することを示唆したKendalら1978Biochemicalcharacteristicsofrecombinantvirusesderivedatsuboptimaltemperatures:evidencethattslesionsarepresentinRNAsegments1and3andthatRNA1codesfortheviriontranscriptaseenzymep734743InBWJMahyandRDBarryedNegativeStrandVirusesAcademicPress;Kendalら1977Comparativestudiesofwildtypeandcoldmutanttemperatureinfluenzaviruses:genealogyofthematrixMandthenonstructuralNSproteinsinrecombinantcoldadaptedH3N2virusesJGenVirol37:145159;Kendalら1979Comparativestudiesofwildtypeandcoldmutanttemperaturesensittiveinfluenzaviruses:independentsegregationoftemperaturesensitivityofvirusreplicationfromtemperaturesensitivityofviriontranscriptaseactivityduringrecombinationofmutantA/AnnArbor/6/60withwildtypeH3N2strainsJGenVirol44:4434560;Snyderら1988FourviralgenesindependentlycontributetoattenuationofliveinfkuenzaA/AnnArbor/6/60H2N2coldadaptedreassortantvirusvaccinesJVirol62:48895。しかし、これらの研究の解釈はコンステレーション効果により妨げられた。このコンステレーション効果は多岐にわたるA型インフルエンザ株の2つに由来する遺伝子セグメントを混合することによって生じた。A/AA/6/60とA/AA/6/60バックグラウンドのts表現型の発現に関与するもの以外のwt遺伝子セグメントとの間の変化により弱められた相互作用が生じた。M遺伝子セグメントとatt表現型との関連を解釈することを妨げるコンステレーション効果示されたSubbaraoら1992TheattenuationphenotypeconferredbytheMgeneoftheinfluenzaA/AnnArbor/6/60coldadaptedvirusH2N2ontheA/Korea/82H3N2reassortantvirusresultsfromageneconstellationeffectVirusRes25:3750。本発明において、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の位置でアミノ酸置換を生じる突然変異が、MDVA株ウイルスに温度感受性表現型を与えることに機能的に重要であるとして同定された。当業者に理解されるように、ヌクレオチドのPB11195、PB11766、PB12005、PB2821およびNP146位置における突然変異は、PB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34におけるアミノ酸置換をそれぞれ示す。従って、これらの位置で置換アミノ酸を生じる任意のヌクレオチド置換が本発明の特徴である。典型的な突然変異であるPB1391K391E、PB1581E581G、PB1661A661T、PB2265N265SおよびNP34D34Gは単独で、より好ましくは組合せにおいて、温度感受性表現型を生じる。これらの突然変異の野生型への復帰突然変異が同時に起こることによってts表現型が消失するが、これらの突然変異を野生型バックグラウンドに導入することによってts表現型を有するウイルスを生じる。ウイルスの継代の間これら表現型の安定性は一貫しており、単一の変化では、得られたウイルスの温度感受性プロフィールを野生型の温度感受性プロフィールに戻すことはできない。むしろ、これらの変化はts表現型を完全に発現するために相互に協力して作用するようである。この発見によって、弱毒生インフルエンザワクチン製造用の主要ドナーウイルスに好適な温度感受性A型インフルエンザウイルスのさらなる株の作製を可能とする。同様に、主要ドナーウイルスB株における個々のアミノ酸置換は、表17に例証するようにts表現型に関連する。従って、B型インフルエンザゲノムの1つ以上の特定の突然変異を導入することによって、温度感受性、必要に応じて弱毒および/または好冷表現型を有する新規B型インフルエンザ株を作製するために本明細書中に示される方法を適合する。例えば、PB2630;PA431;PA497;NP55;NP114;NP410;NP509;M1159およびM1183の中から選択される位置にアミノ酸置換を生じる1つ以上の突然変異を、温度感受性B型インフルエンザウイルスを作製するためにB型インフルエンザ株のゲノムに導入する。典型的なアミノ酸置換としては、PB2630S630R;PA431V431M;PA497Y497H;NP55T55A;NP114V114A;NP410P410H;NP509A509T;M1159H159QおよびM1183M183Vが挙げられる。本発明の突然変異を含むインフルエンザウイルスは、それらの作製方法にかかわらず本発明の特徴である。すなわち、本発明は、本発明の突然変異を含むインフルエンザ株、例えば、野生型に関してPB1391、PB1581、PB1661、PB2265およびNP34の中から選択される1つ以上の位置にアミノ酸置換を有するA型インフルエンザウイルスまたは、PB2630;PA431;PA497;NP55;NP114;NP410;NP509;M1159およびM1183の中から選択される1つ以上の位置にアミノ酸置換を有するB型インフルエンザウイルスを含むが、ただしcaA/AnnArbor/6/60株およびB/AnnArbor/1/66株は本発明の特徴とはみなさない。特定の好ましい実施形態においてそれぞれ、A型インフルエンザウイルスはPB1391K391E、PB1581E581G、PB1661A661T、PB2265N265SおよびNP34D34Gの中から選択される複数の突然変異例えば、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の突然変異を含み;そしてB型インフルエンザウイルスは、PB2630S630R;PA431V431M;PA497Y497H;NP55T55A;NP114V114A;NP410P410H;NP509A509T;M1159H159QおよびM1183M183Vの中から選択される複数の突然変異を含む。例えば、ワクチン製造に関して所望される表現型を有するウイルスを提供することに加えて、一部の突然変異例えば、選択された突然変異にうちの1つ、2つ、3つ、4つ、または5つを有するウイルスは、ウイルスの表現型へのさらなる突然変異の関与を明らかにすることに有用である。特定の実施形態において、インフルエンザウイルスは少なくとも1つのさらなる非野生型ヌクレオチド例えば、おそらくさらなるアミノ酸置換を生じるものを含み、このヌクレオチドが必要に応じて所望される表現型を減じたり、または別の所望される表現型特性を与える。ウイルスの増強された複製本発明はまた、発育鶏卵および/または宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの複製能力を増加するために、HAおよび/またはNAに少なくとも1つのアミノ酸残基置換を導入する方法を提供する。本発明はさらに、HAおよび/またはNAが置換されていないインフルエンザウイルスと比べた場合、発育鶏卵および/または宿主細胞において増加された複製能力を有するインフルエンザウイルス変異体本明細書中では複製増強された変異体というを提供する。本発明方法を宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの複製を増強するために利用することができ、また複製増強された変異体が鶏卵および/または宿主細胞において増強された複製を有し得るということが特に意図される。インフルエンザウイルスの複製に好適な宿主細胞としては、例えばVero細胞、PerC6細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞およびCOS細胞293T細胞、COS7細胞を含むが挙げられる。1つの実施形態において、本発明方法はHAおよび/またはNAに少なくとも1つのアミノ酸置換を導入し、これによって、卵および/または宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの複製能力を、改変していないインフルエンザウイルスと比べて、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500増強する。HAおよびNAの両方にてアミノ酸置換がなされる得ることが特に意図される。好ましくは本発明方法は、置換されていないウイルスと比べて、置換されたインフルエンザウイルスの抗原性を顕著に変化させない。特定の実施形態において、本発明方法は置換されていないウイルスと比べて、置換されたインフルエンザウイルスの抗原性を10未満、20未満、30未満、40未満、50未満、60未満、70未満、80未満、90未満、または100未満減少させる。ウイルス抗原性を決定するための方法は当該分野において周知である実施例11も参照のこと。1つの実施形態において、本発明方法は弱毒インフルエンザウイルス、好冷インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルス、またはこれらの望ましい特性のいずれかを組み合わせで有するウイルスをさらに含む。好ましくは、本発明方法により組み込まれるウイルスとしては、インフルエンザB/AnnArbor/1/66株ウイルス、インフルエンザA/AnnArbor/6/60株ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明方法は、ワクチン製造に関するその好ましい特性によって選択されたウイルス株の6つの内部遺伝子を、望ましく操作したHAおよびNA表面抗原をコードするゲノムセグメントと組み合わせて含むベクターを導入して、発育鶏卵および/または宿主細胞において増強された複製能力を有するインフルエンザウイルスを作製する上記および実施例11を参照のこと。別の実施形態において、本発明方法は非弱毒インフルエンザウイルスをさらに含む。1つの実施形態において、本発明方法はHAの受容体結合活性を改変する少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。HAの受容体結合活性としては、細胞表面糖タンパク質または糖脂質上に存在するシアル酸残基例えば、26結合シリアルガラクトシル部分Siaα26Galおよび23結合シリアルガラクトシル部分Siaα23GalへのHAの結合が挙げられるが、これらに限定されない。HA結合をアッセイするための1つの方法は実施例11下記に示されており、他の方法は当該分野にて周知である。別の実施形態において、本発明方法は、Siaα26Gal部分および/またはSiaα23Gal部分に対するHAの受容体結合特異性を改変するアミノ酸置換を導入する。好ましくは本方法は、Siaα23Gal部分に対するHAの結合を増強する。1つの実施形態において、本発明方法はHAの受容体結合活性を増強する少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、または少なくとも200増加させる。別の実施形態において、本発明方法はHAの受容体結合活性を減少させる少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、または少なくとも200減少させる。好ましい実施形態において、本方法はHAの位置183、186および/または226に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、アミノ酸置換を位置183および226または位置186および226にて行う。最も好ましくは、位置183がロイシンであり、位置226がアラニンであるか、または位置186がバリンであり、位置226がイソロイシンであるようにアミノ酸置換を行う。1つの実施形態において、本発明方法はNAのノイラミニダーゼ活性を改変する少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。NAのノイラミニダーゼ活性としては、αケトシド結合ketosidicallylinkedNアセチルノイラミン酸Neu5Acを含む基質の加水分解が挙げられるが、これに限定されない。ノイラミニダーゼ活性を測定する方法は当該分野にて周知である下記実施例11をまた参照のこと。1つの実施形態において、本発明方法はNAのノイラミニダーゼ活性を増強する少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、または少なくとも200増加させる。別の実施形態において、本発明方法はNAのノイラミニダーゼ活性を減少させる少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、ノイラミニダーゼ活性を少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、または少なくとも200減少させる。好ましい実施形態において、本方法はNAの位置119および/または136に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入する。好ましくは、位置119がグルタミン酸であり、位置136がグルタミンとなるように、アミノ酸置換を行う。当業者は、時としてHAおよび/またはNAタンパク質が前記の1つ以上の位置に好ましいアミノ酸残基を既に有することがわかる。この状況において、置換を残りの非適合の位置にだけ導入する。同類アミノ酸置換を、上記のHAの位置183、186および/または226ならびにNAの位置119および/または136におけるアミノ酸置換について行い得ることが特に意図される。同類アミノ酸置換とは、機能的に同等のアミノ酸に置換するアミノ酸置換をいうことが当該分野において周知である。同類アミノ酸変化によって、得られるペプチドのアミノ酸配列にサイレンとな表現型として無変化の変化を生じる。例えば、良く似た極性を有する1つ以上のアミノ酸は機能的に同等に作用し、かつペプチドのアミノ酸配列にサイレントな変化を生じる。電荷中性であり、残基がより小さな残基に置き換わる置換はたとえ残基が別のグループのものであっても、同類アミノ酸置換と考えることができる例えば、フェニルアラニンとより小さなイソロイシンとの置換。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野において明らかにされている。同類アミノ酸置換のファミリーとしては、非極性のものTrp、Phe、Met、Leu、Ile、Val、Ala、Proなど、電荷は持たないが極性を有するものGly、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys、酸性/負電荷のものAsp、Gluなど、塩基性/陽電荷のものArg、Lys、Hisなど、β分枝のものThr、Val、Ile、鎖の配向性に影響を及ぼす残基Gly、Proなどおよび芳香族Trp、Tyr、Phe、Hisなどが挙げられるが、これらに限定されない。同類アミノ酸置換という用語はまた、アミノ酸の類似体または変異体の使用をいう。どのようにして表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するのかについての手引きが、BowieらDecipheringtheMessageinProteinhairetuSequens:TolerancetoAminoAcidSubstitutions1990Science247:130610に提供される。1つの実施形態において、本発明は改変インフルエンザウイルスを提供し、このウイルスは本明細書中において複製が増強されたインフルエンザ変異体として言及され、HAおよび/またはNAに少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。このアミノ酸置換は改変していないインフルエンザウイルスと比べて、発育鶏卵および/または宿主細胞におけるウイルスの複製を増強する。好ましくは、改変していないインフルエンザウイルスと比べて、卵および/または宿主細胞における複製が増強されたインフルエンザ変異体の能力を、改変していないインフルエンザウイルスと比べて、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なくとも500増強した。特定の実施形態において、複製が増強されたインフルエンザ変異体にはさらに、弱毒インフルエンザウイルス、好冷インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルス、またはこれらの望ましい特性を任意の組み合わせで有するウイルスを含む。好ましくは、複製が増強されたインフルエンザ変異体に含まれるウイルスとしては、インフルエンザB/AnnArbor/1/66株ウイルス、インフルエンザA/AnnArbor/6/60株ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。複製が増強されたインフルエンザ変異体を、ワクチン製造に関するその好ましい特性によって選択したウイルス株の6つの内部遺伝子と、望ましく置換されたHAおよびNA表面抗原をコードするゲノムセグメントとを組み合わせて含むベクターを導入することによって作製することが特に意図される上記および実施例11を参照のこと。1つの実施形態において、複製が増強されたインフルエンザ変異体はHAに少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、これはHAの受容体結合活性を改変する上記参照のこと。好ましくは、本方法はSiaα23Gal部分に対するHAの結合を増強する。特定の実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はHAの受容体結合活性を増強する少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、または少なくとも200増加させる。卵増強インフルエンザ変異体は置換されていないインフルエンザウイルスと比べて、顕著に変化したウイルス抗原性を有さないことが特に意図される。特定の実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体は置換されていないウイルスと比べて、10未満、20未満、30未満、40未満、50未満、60未満、70未満、80未満、90未満、または100未満減少した抗原性を有する。ウイルス抗原性を測定する方法は、当該分野において周知である実施例11をまた参照のこと。別の実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はHAの受容体結合活性を減少させる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、または少なくとも200減少させる。好ましい実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はHAの位置183、186および/または226に少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、アミノ酸置換は位置183および226または位置186および226に存在する。最も好ましくは、位置183がロイシンであり、位置226がアラニンであるか、または位置186がバリンであり、位置226がイソロイシンであるように、アミノ酸置換が存在する。1つの実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はNAのノイラミニダーゼ活性を改変する少なくとも1つのアミノ酸置換を含む上記参照のこと。1つの実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はNAのノイラミニダーゼ活性を増強する少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、受容体結合活性を少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、または少なくとも200増加させる。別の実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はNAのノイラミニダーゼ活性を減少させる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、ノイラミニダーゼ活性を少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、または少なくとも200減少させる。好ましい実施形態において、複製増強されたインフルエンザ変異体はNAの位置119および/または136に少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、位置119がグルタミン酸であり、位置136がグルタミンであるようにアミノ酸置換を行う。細胞培養典型的に、ウイルス増殖は、一般に宿主細胞が培養される培地組成物中で成し遂げられる。インフルエンザウイルスの複製に好適な宿主細胞としては、Vero細胞、PerC6細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞およびCOS細胞293T細胞COS7細胞を含むが挙げられる。一般に上記細胞系統の2つ例えばMDCK細胞と293T細胞またはCOS細胞のいずれかを例えば1:1の割合で含む共培養物を用いて、複製効率を改良する。典型的に、細胞を制御された湿度および中性に緩衝されたpH例えばpH70~72を維持するのに好適なCO2濃度の下、血清例えば10胎児ウシ血清を添加した標準的な市販の培養培地ダルベッコ改変イーグル培地などまたは、無血清培地中で培養する。必要に応じて、培地は細菌の増殖を防ぐための抗生物質ペニシリン、ストレプトマイシンなどおよび/またはさらなる栄養分Lグルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸など、好ましい増殖特性を促進するためのさらなる栄養補給物例えばトリプシン、βメルカプトエタノールなどを含む。培養にて哺乳動物細胞を維持するための方法は多数報告されており、当業者に公知である。一般的なプロトコルは例えば、Freshney1983CultureofAnimalCellss:ManualofBasicTechniqueAlanRLissNewYork;PAul1975CellandTissueCulture第5版LivingstonEdinburgh;Adams1980LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularCellCultureforBiochemistsWorkandBurdonedsElsevierAmsterdamに提供される。invitroにおけるインフルエンザウイルスの作製に特に関係のある組織培養方法に関するさらなる詳細としては、Mertenら1996Productionofinfluenzavirusincellculturesforvaccinepreparation、CohenおよびShaffermanedsNovelStrategiesinDesignandProductionofVaccinesその全体が本明細書中に援用されるが挙げられる。さらに、本発明に適合された上記方法などにおける変更は日常的な実験によって容易に決定できる。インフルエンザウイルス作製のための細胞を血清含有培地または無血清培地中で培養できる。いくつかの場合において、例えば精製したウイルスを調製するために、宿主細胞を無血清条件にて増殖させることが望ましい。小規模例えば25ml未満の培地の培養チューブもしくはフラスコ、または撹拌を伴う大きなフラスコ中で、回転ボトル中で、またはフラスコ、ボトルあるいは反応培地中のマイクロキャリアビーズDEAEデキストランマイクロキャリアビーズDormacellなどPfeiferLangen;スーパービーズFlowLaboratories;スチレン共重合体トリメチルアミンビーズHillex、SoloHill、AnnArborなどにて細胞を培養しうる。マイクロキャリアビーズは小さな球体直径100~200ミクロンの範囲であり、接着性細胞増殖のために細胞培養の容積あたり大きな表面積を提供する。例えば1Lの培地は2000万個以上のマイクロキャリアビーズを含み、8000cm2より大きな増殖表面を提供できる。ウイルスの商業的作製のために例えばワクチン製造のために、バイオリアクターまたは発酵槽中にて細胞を培養することがしばしば望ましい。バイオリアクターは1L未満~100Lを超える容積のものが利用できる例えばCyto3バイオリアクターOsmonicsMinnetonkaMN;NBSバイオリアクターNewBrunswickScientificEdisonNJ;研究室および商業的規模のBBraunBiotechInternationalのバイオリアクターBBraunBiotechMelsungenGermany。培養容積にかかわらず、本発明との関連において、本明細書中に記載される多重プラスミド系を用いた組換えおよび/またはリアソータントインフルエンザウイルスの効率的な回収を確実にするために、35°C以下の温度に培養物を維持することが重要である。例えば、細胞を約32°C~35°Cの温度、典型的に、約32°C~約34°C、普通は約33°Cの温度にて培養する。典型的に、レギュレータ例えばサーモスタットまたは細胞培養系の温度を感知および維持するための他の装置を用いて、ウイルス複製の期間に温度が35°Cを超えないことを確実にする。宿主細胞へのベクターの導入当該分野において周知である真核細胞に異種性核酸を導入するための方法例えばリン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションおよびポリアミントランスフェクション試薬を用いたトランスフェクションなどにより、宿主細胞にインフルエンザゲノムセグメントを含むベクターを導入例えばトランスフェクトする。例えば、ベクタープラスミドなどを製造者の指示に従ってポリアミントランスフェクション試薬TransITLT1Mirusを用いて宿主細胞COS細胞、293T細胞またはCOS細胞もしくは293T細胞とMDCK細胞との組合せにトランスフェクトすることができる。総量200μl中において、160μlの培地好ましくは無血清培地に希釈したおよそ2μlのTransITLT1を用いて、宿主細胞の集団におよそ1μgの各ベクターを導入する。DNA:トランスフェクション試薬混合物を室温にて45分間インキュベートし、その後、800μlの培地を加える。トランスフェクション混合物を宿主細胞に加え、そしてこの細胞を上記のように培養する。このように、細胞培養における組換えまたはリアソータントウイルスの作製のために、8つのゲノムセグメントPB2、PB1、PA、NP、M、NS、HAおよびNAをそれぞれ含むベクターをおよそ20μlのTransITLT1と混合し、そして宿主細胞にトランスフェクトする。必要に応じて、血清含有培地をトランスフェクションの前に無血清培地例えばOptiMEMIに代え、4~6時間インキュベートする。あるいは、エレクトロポレーションを用いて、インフルエンザゲノムセグメントを含むベクターを宿主細胞に導入することができる。例えば、A型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスを含むプラスミドベクターを、以下の手順によりエレクトロポレーションを用いてVero細胞に適宜導入する。簡潔にいえば、5×106個のVero細胞例えば10胎児ウシ血清FBSを添加した改変イーグル培地MEM中で増殖したものを04mlのOptiMEMに再懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに入れる。25μlまでの容積中20μgのDNAをキュベット中の細胞に加え、次にタッピングによって優しく混合する。エレクトロポレーションを製造者の支持に従って例えば、BioRadGenePulserIIwithCapacitanceExtenderPlusconnectedを用いて、28~33m秒の時定数で300ボルト、950マイクロファラッドにて行う。細胞を優しくタッピングして再び混合し、エレクトロポレーションからおよそ1~2分後、07mlの10FBS含有MEMを直接キュベットに加える。次に細胞を2mlMEM、10FBSまたは無血清のOPTIMEMを入れた標準的な6ウェル組織培養ディッシュの2ウェルに移す。残っている細胞を回収するためにキュベットを洗浄し、そして洗浄懸濁液を上記の2ウェルに分配する。最終容積はおよそ35mlである。次に細胞をウイルスの増殖を許容する条件下にて例えば好冷性株についてはおよそ33°Cにてインキュベートする。ウイルスの回収典型的にウイルスを、感染トランスフェクト細胞が増殖していた培養培地から回収する。典型的に、粗製培地をインフルエンザウイルスを濃縮する前に清澄させる。一般的方法としては、濾過、限外濾過、硫酸バリウムへの吸着および溶出、ならびに遠心分離が挙げられる。例えば、感染させた培養物の粗製培地を初めに、例えば1000~2000×gにて、細胞の残骸および他の大きな粒子物質を除去するのに十分な時間例えば10~30分間遠心分離することによって清澄させることができる。あるいは、培地を08μm酢酸セルロースフィルターを通して濾過し、インタクトな細胞および他の大きな粒子物質を除去する。必要に応じて、次に清澄した培地上清を例えば15000×gにておよそ3~5時間遠心分離し、インフルエンザウイルスをペレットにする。適切な緩衝液STE001MTrisHCl;015MNaCl;00001MEDTAまたはリン酸緩衝生理食塩水PBSpH74などにウイルスペレットを再懸濁した後、ウイルスをスクロース60~12または酒石酸カリウム50~10の密度勾配遠心分離によって濃縮する。連続的または段階的勾配例えば12ずつ4段階からなる12~60のスクロース勾配のいずれかが好適である。回収のためにウイルスが目に見えるバンドに濃縮するのに十分なスピード、および時間で勾配を遠心分離する。あるいは、最大規模の商業的用途のために、ウイルスを連続的方法で操作するゾーン遠心分離ローターを用いて、密度勾配により溶出する。組織培養からインフルエンザウイルスを抽出することを当業者にすべて示すのに十分なさらなる詳細は、例えばNicholsonらedsTextbookofInfluenzapp324332におけるFurmingerVaccineProduction;CohenShaffermanedsNovelStrategiesinDesignandProductionofVaccinespp141151におけるMertenら1996Productionofinfluenzavirusincellculturesforvaccinepreparationおよび米国特許第5690937号に提供される。必要な場合には、回収したウイルスを安定剤であるスクロースリン酸グルタミン酸SPGの存在下において-80°Cで保存できる。ワクチンの予防的投与のための方法および組成物本発明の組み換えおよびリアソータントウイルスを、1つ以上のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激するために適切なキャリアまたは賦形剤に入れて予防的に投与することができる。典型的に、キャリアまたは賦形剤は製薬上許容できるキャリアまたは賦形剤滅菌水水溶性生理食塩水、水溶性緩衝生理食塩水、水溶性ブドウ糖溶液、水溶性グリセロール溶液、エタノール、未感染の鶏卵に由来する尿膜液すなわち、正常尿膜液NAFまたはそれらの組み合わせなどである。無菌性、pH、等張性、および安定性を確実にする上記溶液の調製を当該分野において確立されたプロトコルにより行う。一般に、キャリアまたは賦形剤をアレルギーおよび他の望ましくない効果を最小限にするように、および特定の投与経路皮下、筋肉内、鼻腔内などに適するように選択する。一般に、本発明のインフルエンザウイルスを1種以上のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激するのに十分な量で投与する。好ましくは、インフルエンザウイルスの投与により防御的免疫応答を誘発する。1種以上のインフルエンザ株に対する防御的免疫応答を誘発するための投薬量および方法は当業者に公知である。例えば、不活性化インフルエンザウイルスは、投与される1回の用量あたり約1~1000HID50ヒト感染用量、すなわち、約105~108pfuプラーク形成単位の範囲で与える。あるいは、約10~50μg例えば約15μgのHAをアジュバントと共に投与される用量よりも少量で、アジュバントを用いずに投与する。典型的に、用量は年齢、身体の状態、体重、性別、食事、投与時間、および他の医療的要因などに基づいて上記範囲内にて調節する。予防的ワクチン製剤を針とシリンジ、または無針注射装置を用いて、例えば皮下または筋肉内注射により全身投与する。あるいは、ワクチン製剤をドロップ、大きな粒子のエアロゾル約10ミクロンよりも大きい、または上気道に噴霧することによって鼻腔内投与する。上記送達経路のいずれかによって、防御的全身性免疫応答を生じるが、鼻腔内投与はインフルエンザウイルスの侵入部位において粘膜免疫を誘発する付加的利益を与える。鼻腔内投与については、弱毒生ウイルスワクチンがしばしば好まれる例えば弱毒、好冷および/または温度感受性の組換えまたはリアソータントインフルエンザウイルス。単一用量を用いた防御的免疫応答の刺激が好ましいが、望ましい予防的効果を得るために同一または別の経路でさらなる投薬量を投与できる。あるいは、免疫応答を、インフルエンザウイルスを用いた、exvivoまたはinvivoにおける樹状細胞のターゲッティングにより刺激できる。例えば、増殖樹状細胞を十分な量のウイルスに、細胞がインフルエンザ抗原を捕捉するのに十分な時間曝す。次にこの細胞を標準的な静脈内移植方法によってワクチン接種される被験体に移植する。インフルエンザウイルスまたはそのサブユニットを予防的に投与するための製剤はまた、必要に応じて、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強するために1種以上のアジュバントを含む。好適なアジュバントとしては、サポニン、ミネラルゲル水酸化アルミニウムなど、表面活性剤リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルション、バシルカルメットゲランBCG、コリネバクテリウムパルブム、ならびに合成アジュバントQS21およびMF59が挙げられる。必要な場合には、インフルエンザウイルスの予防的ワクチン投与を1種以上の免疫刺激分子の投与と共に行うことができる。免疫刺激分子としては、免疫賦活活性、免疫増強活性、前炎症性活性を有する種々のサイトカイン、リンホカインおよびケモカインインターロイキン例えば、IL1、IL2、IL3、IL4、IL12、IL13;増殖因子例えば、顆粒球マクロファージGMコロニー刺激因子CSF;および他の免疫刺激分子マクロファージ炎症性因子、Flt3リガンド、B71;B72などが挙げられる。免疫刺激分子はインフルエンザウイルスと同一の製剤に入れて投与することも、別々に投与することもできる。上記タンパク質または上記タンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを免疫刺激効果を生じさせるために投与できる。別の実施形態において、インフルエンザゲノムセグメントを含む本発明のベクターを用いて、宿主生物または宿主細胞哺乳動物細胞など例えばヒト被験体に由来する細胞に異種性核酸を好適な上記医薬キャリアまたは賦形剤と組み合わせて導入することができる。典型的に、異種性核酸を遺伝子または遺伝子セグメントの非必須領域例えばセグメント7のM遺伝子に挿入する。異種性ポリヌクレオチド配列はポリペプチドもしくはペプチド、またはアンチセンスRNAもしくはリボザイムのようなRNAをコードすることができる。次に異種性核酸を、異種性核酸を含む組換えウイルスを作製することによって、宿主または宿主細胞に導入する。このウイルスは上記のように投与する。あるいは、異種性核酸を含む本発明のベクターを、インフルエンザウイルスに感染した細胞にこのベクターをコトランスフェクトすることによって導入し、宿主細胞に発現させることができる。必要に応じて、次に細胞を被験体に、典型的にその細胞を得た部位に戻すか、または送達する。いくつかの適用において、細胞を目的の組織、器官、またはシステム部位上記のようなへ、確立された細胞の転移または移植方法を用いて移植する。例えば、造血系統の幹細胞骨髄、臍帯血、または末梢血由来の造血幹細胞などを標準的な送達または注入技術を用いて被験体に送達することができる。あるいは、異種性核酸を含むウイルスをinvivoにおいて被験体の細胞に送達することができる。典型的に、このような方法には、標的細胞集団例えば血液細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、神経脳を含む細胞、腎臓細胞、子宮細胞、筋細胞、腸細胞、子宮頸細胞、膣細胞、前立腺細胞などならびに種々の細胞、組織および/または器官に由来する腫瘍細胞へのベクター粒子の投与を含む。投与は、例えばウイルス粒子の静脈内投与による全身性のものか、または組織、器官または皮膚部位への注射例えば針もしくはシリンジを使用する、無針ワクチン送達、局所的投与、または押し込みを含む種々の方法によって目的の部位に直接的にウイルス粒子を送達することによるものでありうる。例えば、ウイルスベクター粒子を、吸入、経口的、静脈内、皮下subcutaneously、皮下subdermally、皮内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内に送達するか、膣または直腸投与によるか、または身体の腔もしくは他の部位に例えば外科手術中にウイルス粒子を置くことによって送達できる。上記方法は、invitro、exvivoまたはinvivoにおいて標的細胞の集団に治療的または予防的に有効なポリペプチドもしくはペプチドまたはRNA例えばアンチセンスRNAもしくはリボザイムをコードする異種性ポリヌクレオチドを含む本発明のベクターを導入することによって、疾患または障害を治療的および/または予防的に処置することに有用である。典型的に、目的のポリペプチドもしくはペプチド、またはRNAをコードするポリヌクレオチドは、上記発現ベクターおよびさらなる発現エレメントと題されたセクションに記載されるように適切な調節配列に機能的に結合されている。必要に応じて、1種以上の異種性コード配列を単一のベクターまたはウイルスに組み込む。例えば、治療的または予防的に活性なポリペプチドまたはRNAをコードするポリヌクレオチドに加えて、ベクターはまた、さらなる治療的または予防的ポリペプチド例えば、抗原、共刺激分子、サイトカイン、抗体などおよび/またはマーカーなどを含むことができる。本発明の方法およびベクターを、遺伝的および後天的障害を含む広範な種々の障害を治療的または予防的に処置するために例えばウイルス、細菌などによる感染性疾患のためのワクチンとして用いることができる。キット本発明のベクターおよびベクター系の使用を容易にするために、インフルエンザウイルスのパッケージングおよび感染に有用な、ベクターのいずれか共通インフルエンザウイルスプラスミド、変異体インフルエンザポリペプチドプラスミド、インフルエンザポリペプチドライブラリープラスミドなどおよびさらなる構成要素緩衝液、細胞、培養培地などがキットの形態でパッケージされうる。典型的に、キットは上記構成要素に加えて本発明方法をおこなうための解説書、パッケージング物質、および容器などを含みうるさらなる物質を含む。ウイルス核酸およびタンパク質の操作本発明との関連において、インフルエンザウイルスの核酸および/またはタンパク質を周知の分子生物学的技術により操作する。増幅、クローニング、変異誘発、形質転換などを含む多数の方法についての詳細なプロトコルは例えばAusubelらCurrentProtocolsinMolecularBiology2000年に補遺JohnWileySonsNewYorkAusubel;SambrookらMolecularCloning-ALaboratoryManual第2版Vol13ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNewYork1989Sambrook、ならびにBergerおよびKimmelGuidetoMolecularCloningTechniquesMethodsinEnzymologyvolume152AcademicPressIncSanDiegoCABergerに記載される。上記参照に加えて、invitroにおける増幅技術ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リガーゼ連鎖反応LCR、Qβ複製酵素増幅、および例えば本発明のcDNAプローブを増幅するのに有用な他のRNAポリメラーゼ媒介性技術例えばNASBAなどについてのプロトコルは、Mullisら1987米国特許第4683202号;PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplicationsInnisら編者AcademicPressIncSanDiegoCA1990Innis;ArnheimおよびLevinson1990CEN36;TheJournalOfNIHResearch19913:81;Kwohら1989ProcNatlAcadSciUSA861173;Guatelliら1990ProcNatlAcadSciUSA87:1874;Lomellら1989JClinChem35:1826;Landegrenら1988Science241:1077;VanBrunt1990Biotechnology8:291;WuandWallace1989Gene4:560;Barringerら1990Gene89:117、ならびにSooknananおよびMalek1995Biotechnology13:563に見出せる。本発明との関連において、核酸のクローニングに有用なさらなる方法としては、Wallaceらの米国特許第5426039号が挙げられる。PCRによって大きな核酸を増幅するための改良方法はChengら1994Nature369:684およびその参考文献に要約されている。本発明の特定のポリヌクレオチド例えばオリゴヌクレオチドは、モノヌクレオチドおよび/またはトリヌクレオチド系ホスホラミダイト共役化学を含む種々の固相ストラテジーを利用して合成できる。例えば、核酸配列を、ポリヌクレオチド鎖を伸長するために活性化単量体および/または三量体を連続的に付加することによって合成できる。例えばCaruthersMHら1992MethEnzymol211:3を参照のこと。所望される配列を合成する代わりに、基本的に核酸は、TheMidlandCertifiedReagentCompanymcrcoligoscomTheGreatAmericanGeneCompanywwwgencocomExpressGenIncwwwexpressgencomOperonTechnologiesIncwwwoperoncomなどの種々の商業的供給元のいずれかによるオーダーメードでありうる。さらに、ウイルスポリペプチドの選択したアミノ酸残基の置換を、例えば部位特異的変異誘発によって達成できる。例えば、望ましい表現型特性弱毒表現型、好冷性、温度感受性などと機能的に関連するアミノ酸置換を有するウイルスポリペプチドを、ポリペプチドをコードするウイルス核酸のセグメントに特異的な突然変異を導入することによって作製できる。部位特異的変異誘発の方法は当該分野において周知であり、例えばAusubel、Sambrook、およびBerger上記に記載される。部位特異的変異誘発を行うための多数のキットが商業的に入手可能であり例えばChameleonSiteDirectedMutagenesisKitStratageneLaJolla、製造者の指示に従ってそれを用いて、A型インフルエンザまたはB型インフルエンザのポリペプチドをコードするゲノムセグメントに表6または表17に記載される1つ以上のアミノ酸置換をそれぞれ導入することができる。pAD3000の構築プラスミドpHW2000Hoffmannら2000ADNAtransfectionsystemforgenerationofinfluenzaAvirusfromeightplasmidsProcNatlAcadSciUSA97:61086113を改変して、ウシ成長ホルモンBGHポリアデニル化シグナルとシミアンウイルス40SV40に由来するポリアデニル化シグナル配列を置換した。SV40に由来する配列を以下のオリゴヌクレオチド5’側から3’側方向に示されている:ポリA1:AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT配列番号1ポリA2:TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA配列番号2を使用してTaqMasterMixQiagenを用いて増幅した。プラスミドpSV2Hisを鋳型として用いた。推定175bpの産物と一致する断片を得て、製造者の指示に従ってTopoTAクローニングベクターInvitrogenを使用して、pcDNA31にクローン化した。SV40ポリアデニル化シグナルを含む所望される138bpの断片を得られたプラスミドよりEcoRVとBstEIIとを用いて切り出し、アガロースゲルより単離し、そして従来技術例えばAusubel、Berger、Sambrookを参照のことを用いてpHW2000の唯一のPvuII部位とBstEII部位の間に連結する。得られたプラスミドPAD3000図1を配列決定し、正しい向きでSV40ポリアデニル化部位を含むことを確認した。pAD3000のヌクレオチド295~423はSV40株777AF332562のヌクレオチド2466~2594にそれぞれ対応する。MDVA作製のための8つのプラスミド系好冷A型インフルエンザウイルス株A/AA/6/60変異体は一般に、経鼻投与されるA型インフルエンザワクチン製造のための主要ドナーウイルスとして用いられていた。この株は本発明との関連において、典型的な主要ドナーウイルスMDVである。便宜上、この株A/AA/6/60の変異体を本明細書中においてはMDVAと示す。MDVAウイルスRNAをRNeasyminikitQiagenを用いて抽出し、8つの対応するcDNA断片を表1に挙げたプライマーを用いてRTPCRによって増幅した。AarI制限酵素認識部位を含むプライマーを使用して増幅したHAおよびPB2をコードするインフルエンザのゲノムセグメントを除いて、残りの6つの遺伝子をBsmBI制限酵素認識部位を含むプライマーを用いて増幅した。AarIとBsmBIの両方のcDNA断片をpAD3000ベクターの2つのBsmBI部位の間にクローン化した。配列決定分析によって、クローン化した全てのcDNA断片が、クローニング工程の間に導入されたと思われるコンセンサスMDVA配列に関連した突然変異を含んでいたことが明らかとなった。各遺伝子セグメントに見出された突然変異を表2に要約する。全ての突然変異を、QuikChangeSitedirectedMutagenesisKitStratageneおよび表3に示す合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてコンセンサスMDVA配列に戻して正した。感染性組換えMDVAおよびリアソータントインフルエンザウイルスの作製MadinDarbyイヌ腎臓MDCK細胞およびヒトCOS7細胞を、10胎児ウシ血清FBSを含む改変イーグル培地MEM中に維持した。ヒト胎児腎臓細胞293Tを5FBSを含むOptiMEMILifeTechnologies中に維持する。MDCK細胞とCOS7細胞または293T細胞のいずれかを1:1の割合で6ウェルプレートにて共培養し、この細胞を、およそ80コンフルエントな状態にてトランスフェクションに用いた。293T細胞およびCOS7細胞は高いトランスフェクション効率を有するが、インフルエンザウイルスの複製を許容しない。MDCK細胞との共培養により組換えウイルスの効率的な複製を確実にする。トランスフェクションの前に、血清含有培地を無血清培地OptiMEMIに代え、4~6時間インキュベートした。プラスミドDNAのトランスフェクションを、1μgの8つのプラスミドDNAPB2、PB1、PA、NP、M、NS、HAおよびNAの各々のと160μlのOptiMEMIに希釈した20μlのTransITLT1を全量200μlにて混合し、TransITLT1Mirusを用いて行った。DNA:トランスフェクション試薬混合物を45分間、室温にてインキュベートし、その後800μlのOptiMEMIを加えた。次にトランスフェクション混合物を共培養したMDCK細胞/293T細胞またはMDCK細胞/COS7細胞に加えた。トランスフェクトした細胞を35°Cまたは33°Cにて、6時間~24時間例えば一晩インキュベートし、そしてトランスフェクション混合物を各ウェルにおいて1mlのOptiMEMIと代えた。35°Cまたは33°Cにて24時間インキュベーションした後、1μg/mlのTPCKトリプシンを含有する1mlのOptiMEMIを各ウェルに加え、さらに12時間インキュベートした。次に回収したウイルスをコンフルエントな状態のMDCK細胞にて増幅するか、発育鶏卵において直接的に増幅した。12ウェルプレートに入れたMDCK細胞を室温にて1時間、02mlのトランスフェクション混合物で感染させ、次に混合物を取り除き、1μg/mlのTPCKトリプシンを含有する2mlのOptiMEMIと代えた。細胞を35°Cまたは33°Cにて、3~4日間インキュベートした。増幅したウイルスをSPG安定剤の存在下にて80°Cで保存するか、またはプラーク精製し、MDCK細胞または発育鶏卵にて増幅した。MDVAポリメラーゼタンパク質の機能的発現4つのMDVAポリメラーゼタンパク質PB2、PB1、PAおよびNPの機能的活性を、EGFPレポーター遺伝子をコードするインフルエンザウイルスのミニゲノムを複製するそれらの能力によって分析した。1組8つの発現プラスミド例えば表4を参照のことHoffmannら2001EightplasmidrescuesystemforinfluenzaAvirus;OptionsforthecontrolofinfluenzaInternationalCongressSeries1219:10071013は、A/PR/8/34株H1N1のcDNAと増強された緑色蛍光タンパク質EGFPpHW72EGFPをコードするレポーター遺伝子を含むインフルエンザウイルスミニゲノムを含んでいた。MDVAPB1、PB2、PAおよびNPまたはPB1、PA、NPネガティブコントロールとしてPB2をA型インフルエンザウイルスEGFPミニゲノムを示すプラスミドpHW72EGFPHoffmannらAmbisenseapproachforthegenerationofinfluenzaAvirus:vRNAandmRNAsynthesisfromonetemplateVirology15:2672:31072000と共に、共培養したMDCK細胞/293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をトランスフェクション後48時間にて、位相差顕微鏡または蛍光顕微鏡下にて観察した。あるいは、フローサイトメトリーを用いてEGFPの発現を検出できる。図2に示すように、EGFPミニゲノムの発現を示す緑色の蛍光がMDVAのPB2、PB1、PAおよびNPを用いてトランスフェクトした細胞では観察されたが、3つのポリメラーゼタンパク質のみを用いてトランスフェクトした細胞においては観察されなかった。このことはpAD3000のMDVAポリメラーゼタンパク質が機能的であったことを示した。他のアッセイにおいては、クロラムフェニコールアセチル転移酵素CAT遺伝子を含むミニゲノムpFluCATと示すを利用してポリメラーゼ活性を測定する。このようなアッセイにおいて、CAT発現をミニゲノム複製の指標として、タンパク質レベル例えばELISAによってまたはRNAレベルで測定する。単一遺伝子のリアソータント実験によるMDVAプラスミドの分析pAD3000にクローン化した8つのMDVAゲノムセグメントの各々が、MDVAに由来する単一遺伝子セグメントと共に、対照であるA/PR/8/34株に由来する相補的な7つのセグメントをコトランスフェクトすることによるリアソータントの実験において機能的に発現することを示す。相補的な対照セグメントとの組合せにおいて8つ全ての単一ゲノムセグメントプラスミドは感染性リアソータントウイルスを生じた。これは感染したMDCK細胞において細胞変性効果を生じ、8つ全てのプラスミドが機能的MDVAタンパク質をコードしていることを示す。A型インフルエンザウイルスのパッケージングの抑制をさらに測定するために、NSセグメントを2つの別々の遺伝子セグメント1つはNS1ゲノムセグメントをコードし、もう1つはNS2ゲノムセグメントをコードするに分けた。A型インフルエンザのゲノムセグメントを含む9つのプラスミドを上記のようにMDCK/COS細胞にトランスフェクトし、そして回収したウイルスをMDCK細胞を用いた滴定の前に発育鶏卵にて増幅した。上記の8つのプラスミド系と比べて9つのプラスミド系については縮小したプラークサイズが観察された。RTPCR分析によって、NS2セグメントのみがウイルス粒子に存在したこと、またNS1遺伝子セグメントはパッケージされなかったことが示された。MDVAおよび6:2リアソータントウイルスの回収上記手順に続いて、8つのMDVAプラスミド組換え体、または6つのMDVA内部遺伝子、およびA/PR/8/34に由来するHAとNAを含むプラスミド6:2リアソータントのいずれかを用いてトランスフェクションして3日後、トランスフェクトした培養上清を用いて新しいMDCK細胞を感染させ、そしてこの感染細胞を1μg/mlのTPCKトリプシンの存在下において33°Cにて3日間インキュベートした。感染したMDCK細胞における組換えウイルスの細胞質効果を顕微鏡を使用して観察した。ウイルス赤血球凝集素の発現を標準的な赤血球凝集アッセイHAを用いて調べた。HAアッセイを50μlの連続的に2倍希釈した培養上清と50μlの1トリ赤血球とを96ウェルプレートにおいて混合することによって行った。トランスフェクトした8つのMDVAプラスミドまたは6:2リアソータントウイルスのいずれかに由来する増幅したウイルスについて、およそ1:254~1:1024のHAタイターを検出した。DrEHoffmanより入手した8つのA/PR/8/34プラスミドを用いたトランスフェクション反応をポジティブコントロールとして用いた。感染性インフルエンザウイルスを表5に示すような3つのトランスフェクション反応により作製した。RTPCRを行い回収したウイルスの遺伝子型を調べた。ウイルスRNAを感染細胞の培養上清からRNeasyminiKitQiagenを用いて単離し、そして8つのインフルエンザウイルスセグメントを各MDVA遺伝子セグメントに特異的なプライマーならびにH1およびN1特異的プライマーを用いてRTPCRによって増幅した。図3に示すように、rMDVAはMDVAに特異的であったPB2、PB1、NP、PA、MおよびNSならびに、H2およびN2サブタイプに特異的なHAおよびNAを含んでいた。6:2リアソータントは、MDVAに由来する6つの内部遺伝子とA/PR/8/34に由来するHAおよびNAH1N1とを含んでいた。これによってトランスフェクトしたプラスミドより産生されたウイルスが正しい遺伝子型を有していたことが確認された。回収したウイルスを、MDCK細胞を用いたプラークアッセイによって滴定し、そしてプラークがインフルエンザウイルスであることをMDVAに対して生じたトリ血清を用いた免疫染色によって確認した。12ウェルプレートにおいて100コンフルエントな状態のMDCK細胞を100μlの10倍連続希釈したウイルスを用いて、室温にて1時間、優しく揺らしながら感染させた。接種物を取り除き、そしてこの細胞を08アガロースおよび1μg/mlのTPCKトリプシンを含有する1×L15で覆った。このプレートを35°Cまたは33°Cにて3日間インキュベートし、100メタノールを用いて固定し、5ミルクPBS中を用いてブロッキングし、そして2000分の1に希釈したトリ抗MDVA抗血清と共に1時間インキュベートし、その後HRP結合ウサギ抗トリIgGと共に1時間インキュベートした。HRP基質溶液DAKOを添加してプラークを視覚化した。回収した全てのウイルスは免疫染色にて陽性を示した。MDVAのca、ts、att表現型の遺伝子基盤のマッピングMDVAインフルエンザウイルスワクチン株は、ワクチン製造に関する様々な表現型弱毒生ワクチン:好冷性ca、温度感受性tsおよび弱毒性attなどを有する。MDVA株と非ts病原性wtA/AA/6/60株との配列比較よって、これら2つの株の間で最小17ヌクレオチドの違いが明らかとなった表6。MDVA配列における複数の変化は、GeneBankデータベースにおいて利用可能である全てのA型インフルエンザウイルスと比べて、この株特有のことである。これは1つ以上のこれらのアミノ酸置換がatt、caおよびts表現型に機能的に関連することを示唆している。PB2821における単一のアミノ酸変化は、MDVAのts表現型の決定因子としてこれまでに報告されていた、たった1つのヌクレオチド位置だけであったSubbaraoら1995AdditionofTemperatureSensitiveMissenseMutationsintothePB2GeneofInfluenzaATransfectantVirusesCanEffectanIncreaseinTemperatureSenstivityandAttenuationandPermitstheRationalDesignofaGeneticallyEngineeredLiveInfluenzaAvirusVaccineJVirol69:59695977。MDVA表現型に含まれる最小の置換を示すために、wtA/AA/6/60とは異なるMDVAクローンのヌクレオチドをwtA/AA/6/60のヌクレオチドにそれぞれ変えたすなわち戻した。次に、戻した遺伝子セグメントの各々を、MDVAの相補的なセグメントと組み合わせて宿主細胞に導入し、単一遺伝子リアソータントを回復した。さらに、戻した遺伝子セグメントおよび対応するMDVAセグメントをまた、他の野生型株例えばA/PR/8/34株に由来するセグメントと組み合わせてトランスフェクトし、ウイルス表現型への各遺伝子セグメントの関与を調べることができる。上記組換えMDVAプラスミド系を用いて、部位特異的変異誘発を行い、非tsリアソータントを産生するために6つの内部遺伝子をさらに改変した。全部で15個のヌクレオチド置換型突然変異を6つのMDVAプラスミドに導入し、表6に挙げるような組換え野生型A/AA/6/60ゲノムrWtFlu064を示した。MadinDarbyイヌ腎臓MDCK細胞およびCOS7細胞を維持し、上記のようにトランスフェクトした。次に回収したウイルスをMDCK細胞でいったん継代し、その後発育鶏卵の尿膜腔にて増幅した。MDCKおよび卵におけるトランスフェクションおよびウイルス増殖を33°C、caおよびwtウイルス両方の温度淘汰圧を最小にする温度にて行った。ウイルスの遺伝子型をウイルスRNAより増幅したcDNA断片の配列分析によって確認した。表現型特性をRecombinanttryptophanmutantsofinfluenzaと題されたParkinの米国特許第6322967号その全体が本明細書中に援用されるに以前に記載されたような、当該分野において公知の方法によって決定した。簡潔にいえば、組換えウイルスの温度感受性を33°C、38°Cおよび39°CにおけるMDCK細胞を用いたプラークアッセイによって測定した。6ウェルプレートに入れたMDCK細胞を400μlの10倍連続希釈したウイルスで感染させ、室温にて60分間吸着させた。接種物を取り除き、1アガロースおよび1μg/mlのTPCKトリプシンを含有する1×L15/MEMに代えた。感染細胞をCO2インキュベーターまたは38±01°Cもしくは39±01°Cに維持された循環水槽に浸した5CO2を含む漏水しない容器中で33°CにてインキュベートしたParkinら1996TemperaturesensitivemutantsofinfluenzaAvirusgeneratedbyreveresegeneticsandclusteredchargedtoalaninemutagenesisVirRes46:3144。3日間のインキュベーションの後、単層をトリ抗MDVポリクローナル抗体を用いて免疫染色し、プラークを数えた。各温度にて得られたプラーク数を比較して各ウイルスのts表現型を評価した。各アッセイは最低3回行った。シャットオフshutoff温度とは、33°Cと比べて100倍またはそれ以上のタイター減少を有する最低温度として定義した。8つのプラスミドpMDVPB2、pMDVPB1、pMDVPA、pMDVNP、pMDVHA、pMDVNA、pMDVM、およびpMDVNSを用いてトランスフェクトした共培養されたCOS7/MDCK細胞より得られた感染性ウイルスを発育鶏卵中で増幅し、そしてこのウイルスが、MDVAに由来する非組換え体、すなわち生物学的に派生したMDVAの特徴的なts表現型を示すことが示された表7。MDVAとrMDVAのいずれも39°Cにおいては明瞭なプラークを形成しなかったが、33°Cにおいては共に明瞭なプラークを形成した。MDVAのts表現型の遺伝子基盤を体系的に、詳細に分析するために、caA/AA/6/60非常に関連して単離したものであるwtA/AA/6/60E10SE2を含むとは17~48ヌクレオチドの差異を有する、複数の密接に関連した非ts、非attwtA/AA/6/60株の配列を比較のために利用する。全部で19ヌクレオチドの差異がE10SE2とMDVAとの間に存在する表6。E10SE2はフェレットにおいて非ts表7および非attであることが示された。組換え非tsウイルスを作製するために、MDVAプラスミドを部位特異的変異誘発によって、10アミノ酸変化を示す19のうちの15の差異を含むことによって変化させた。MDVAとE10SE2との間で異なる4つのヌクレオチド位置PB21182、1212、PB1123、およびNP1550はMDVA配列から変えなかった。それはこれらのヌクレオチドがA/AA/6/60の他の非ts単離物には見られず、そのためts表現型の発現に機能を有するとは思われないためであったHerlocherら1996SequencecomparisonsofA/AA/6/60influenzaviruses:mutationswhichmaycontributetoattenuationVirusResearch42:1125。15ヌクレオチド変化をコードする組換えウイルスrWtFlu064を、1組8つのプラスミドpWtPB2、pWtPB1、pWtPA、pWtNP、pWtM、pWtNS、pMDVHA、およびpMDVNAを用いてトランスフェクトした共培養されたCOS7/MDCK細胞から得た。配列決定分析によって、rWtが特定の遺伝子変化を含み、39°Cにおいて非tsであり、生物学的に派生したwtA/AA/6/60と同一であったことを示した。これらの観察によって、ts表現型がこれらの15ヌクレオチドの一部の変化にあることが示された。6つの内部遺伝子セグメントのウイルスts表現型への関与MDVAts表現型への各wt遺伝子セグメントの影響を、組換え体、すなわち単一遺伝子リアソータントを作製することによって調べた表7。rMDVAへのwtPB2の導入によって、38°Cにおいてのみ非tsであったウイルスを生じたが、しかし39°Cにおいてはtsのままであった。33°Cと比較して、38°Cおよび39°Cにおけるウイルスタイターの減少は、MDCK細胞を用いたプラークアッセイによって測定されるように、それぞれ06log10および27log10であった。wtPB1遺伝子セグメントを含むリアソータントは、38°Cと39°Cの両方においてプラークを形成するその能力についていうと、非tsであった。しかし、この組換え体のプラークサイズは上昇した温度によって影響を受け、rWtと比べて、39°Cにおいて顕著に縮小した。rMDVAへのwtNP遺伝子セグメントの導入によって、38°Cにおいても非tsであったウイルスを生じたが、wtPB2組換え体と対照的に、wtNP遺伝子セグメントを含むウイルスは39°Cにおいてプラークを形成しなかった。rMDVAへのwtPA、MまたはNS遺伝子セグメントの独立した導入は、ts表現型を変化させなかった。以上より3つの遺伝子セグメントが、この表現型の維持において最小限の機能を有したことを示す。MDVAバックグラウンドにそれぞれ発現したwtPB1、wtPB2およびwtNPのいずれもが、非tsrWTと同一のプラーク効率およびプラークサイズのプロフィールを作製することができなかったため、これらの遺伝子セグメントを種々の組合せでMDVAに導入した。wtPB1とwtPB2との組合せによって、38°Cと39°Cの両方において非tsであったウイルスを生じた表7。プラークサイズはいずれの単一遺伝子リアソータントのプラークサイズよりも大きかったが、rWtのプラークサイズよりも顕著に小さかった。rMDVAにおけるwtPB1/PB2/NPの3つの組合せによって、39°Cにおけるそのプラーク効率およびプラークサイズがrWtと類似または同一であったウイルスを生じた。従って、wtPB2、PB1およびNP遺伝子セグメントが個々に導入された場合、ts表現型を部分的に元に戻すだけであったが、3つ全てのwt遺伝子セグメントの組合せは、ts表現型をrWtと同一である非tsの挙動に完全に戻すことが可能であった。これら3つの遺伝子セグメントがWtに特徴的なMDVAts表現型を与えることができたか否かを決定するために、MDVAに由来する6つの内部遺伝子セグメントをrWtに、個々にまたは組み合わせて導入した。rWtへのPB1、PB2、またはNP遺伝子セグメントの単一の導入によって、ウイルスタイターが38°Cにおいて減少し、39°Cにおいてより大幅に減少した。しかしこれら単一遺伝子リアソータントのいずれもが、rMDVAのように高温にて通常の速さで増殖できないものではなかった図10。MDVAに由来するPA、MおよびNS遺伝子セグメントはrWtの非ts表現型に影響を及ぼさなかった。これまでのリアソータントと同じく、rWtバックボーンへのMDVAPB1遺伝子とPB2遺伝子の両方の導入により、38°Cにおけるウイルスts表現型を非常に増加させることが示されたが、しかしウイルスts表現型の完全な復帰突然変異はNP遺伝子の付加を必要とした。従って、MDVAに由来するPB1、PB2およびNP遺伝子セグメントは完全なts表現型を与えることに重要であった。確定したMDVAts表現型の遺伝子座のマッピングrWtとrMDVAのPB1、PB2およびNP遺伝子セグメントの間の特異的な差異を体系的に処理し、ts表現型に重要な機能を果たすこれらの変化を同定した。rMDVAのNP遺伝子はヌクレオチド146においてのみrWtNPと異なったG34D表6。rMDVAのPB2遺伝子は3つの部位でrWtと異なったが、ヌクレオチド821のみがアミノ酸変化を生じN265S表6、PB2遺伝子セグメントに配置されているts遺伝子座をおそらく示した。MDVAのPB1遺伝子は6つのヌクレオチド位置においてwtPB1と異なる。その内4つは翻訳領域の変化であった表6。各wtアミノ酸残基の置換をrMDVAのPB1遺伝子セグメントに個々に置換することによって、ts表現型におけるそれらの機能を調べた。1395GGlu457および2005GAlaは、MDVAのts表現型に影響しなかった。1195ALys391および1766AGlu581の各々は、38°Cにおいてts表現型にわずかな減少を生じたが、39°Cにおいては影響がなかった表8。これらのデータは1195Aおよび1766Aが、PB1遺伝子セグメント内の有望なts遺伝子座であったことを示した。しかし、1195Aと1766Aとの両方の組合せはwtPB1に類似したts表現型を生じなかった表6。1395Aではなく2005GのPB11195A/1766Aへの付加によって、39°Cにおけるウイルスのts表現型がさらに減少した。このことは2005AがまたMDVAのPB1セグメントによって特定されるts表現型の発現において機能を有したことを示す。次にPB1単一部位突然変異を、wtPB2とwtNPと共にrMDVAに導入した。WtPB2/NPおよびrMDVAリアソータントは38°Cにおいて非tsであり、39°Cにおいて125log10のタイター減少を有したが、そのプラークサイズはrWtと比べて非常に減少した。PB11195Aまたは1766Aのいずれかの添加ではwtPB2/NPリアソータントの表現型を顕著に変化させなかった。wtPB2およびwtNPと合わせた、PB11195Aと1766Aとの組合せによってのみ、wtPB1/PB2/NPおよびrMDVAリアソータントと同一の非ts表現型を有するウイルスを生じた表8。PB11395Gまたは2005GのwtPB11766/PB2/NPへの添加によっては、ウイルスを特徴的なrWt非ts表現型に変えなかった。従って、これらのデータはPB1、PB2およびNPの3つの遺伝子に分配される4つのアミノ酸が、MDVAts表現型を完全に戻すことができるということを示した。MDVAおよびリアソータントウイルスの宿主細胞の抑制MDVAウイルスおよび上記の1つ以上のMDVA由来セグメントを有するリアソータントウイルスによって示される温度感受性および弱毒表現型に加えて、MDVAウイルスは、MDCK細胞における増殖と相対的にPerC6細胞における減少した増殖によって示されるような宿主細胞の抑制を示した。MDVAおよびMDVAに由来するPB1およびPB2セグメントを有するリアソータントウイルスはMDCK細胞におけるそれらの増殖と相対的にPerC6細胞において顕著に減少した増殖を示した図20AおよびBに示す。温度感受性、弱毒ウイルス株の操作MDVAのPB1、PB2およびNP遺伝子セグメント中に同定された5つのアミノ酸がMDVAのtsおよびatt表現型を再び生じるか否かを決定するために、PB1391E、581G、661T、PB2265S、NP34Gを多岐にわたる野生型ウイルス株A/PR/8/34;PR8に導入した。得られたウイルスは38°Cにおいて19log10減少のウイルスタイター、および39°Cにおいて46log10減少これはrMDVAの値と非常に近似したを示した図11。caA/AA/6/60MDVAならびにA/PR/8/34のPB1、PB2およびNP遺伝子間の配列比較によって、MDVAのPB1およびPB2遺伝子に同定された4つの置換アミノ酸が特有であることが明らかとなった。NP34はMDVAとPR8との間で保存されており、そのために、MDVAのPB1遺伝子中に同定された3つのts部位PB1391K391E、PB1581E581GおよびPB1661A661TをA/PR/8/34のPB1に導入し、そしてPB2265N265Sを部位特異的変異誘発によってA/PR/8/34のPB2に導入した。PB1およびPB2遺伝子に導入した突然変異を配列決定分析によって確認した。変異誘発反応に用いたプライマー対を表9に列挙する。これらのウイルスを図16に模式的に示す。PR8のPB1およびPB2遺伝子に導入されたts突然変異がinvitroにおいてts表現型を与えるか否かを調べるために、ミニゲノムアッセイを行った。pFluCATと称されるインフルエンザミニゲノムレポーターは対照のpolIプロモータ下にクローン化したネガティブセンスCAT遺伝子を含んでいた。CATタンパク質の発現はインフルエンザPB1、PB2、PA、およびNPタンパク質の発現に依存していた。簡潔にいえば、HEp2細胞にリポフェクトアミン2000Invitrogenを用いて1μgのPB1、PB2、PA、NPおよびpFluCATミニゲノムの各々をトランスフェクトした。33°Cまたは39°Cにて一晩およそ18時間インキュベーションした後、細胞抽出物をCATELISAキットRocheBioscienceによってCATタンパク質の発現について分析した。CATmRNAのレベルをプライマー伸長アッセイによって測定した。トランスフェクションから48時間後に、細胞の全RNAをTRIzol試薬Invitrogenによって抽出し、そして3分の1のRNAを、5’末端をr32PATPを用いて標識した過剰量のDNAプライマー5’ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG配列番号89およびT4ポリヌクレオチドキナーゼと6ulの水中にて混合した。95°Cにて3分間変性した後、50UのsuperscriptreveresetranscriptaseInvitrogenを添加した後に、酵素と共に提供される、05mMdNTPを含む反応緩衝液中にて42°Cにおいて1時間、プライマー伸長を行った。転写産物を、TBE緩衝液中8M尿素を含有する6ポリアクリルアミドゲル上で分析し、オートラジオグラフによって検出した。図12AおよびBに示すように、3つのアミノ酸置換PB1391K391E、PB1581E581GおよびPB1661A661Tを保有するPB1遺伝子PR83sは、PR8対照と比べて33°Cにおいて減少した活性を有した。この変異体については、39°CにおけるCATタンパク質発現について大幅な減少が観察された図12A。これは3つの導入されたMDVAts部位を有するPB1遺伝子が、このinvitroアッセイにおいて温度感受性複製を示したことを示す。PR8へのPB2265N265Sの導入は、ウイルスの複製を許容する温度33°Cおよび許容しない温度39°Cの両方において、その活性にほとんど影響を与えなかった。PB13sとPB21sとの両方の組合せによって、タンパク質活性の、より大幅な減少を生じたPR84s。これはMDVAよりもさらにtsのようであった。予想されたとおり、39°CにおいてwtA/AA/6/60wtA/AAと比べて、低レベルの活性15を、MDVAに由来するPB1、PB2、PA、NP遺伝子を用いてトランスフェクトした細胞において検出した。PR8変異体ウイルスを作製し、上記のように回収した。要するに、共培養したcos7細胞およびMDCK細胞に、PR8に由来するPR8HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、MおよびNS遺伝子をコードする8つのプラスミドをトランスフェクトした。4つのts遺伝子座を保有するウイルスPR84sを作製するために、PB1の3つの位置ヌクレオチド1195K391E、ヌクレオチド1766E581Gおよびヌクレオチド2005A661Tに変化を含むPB13sならびにPB2の1つの位置821N265Sに変化を含むPB11を用いた。さらに、PB1中に3つの突然変異PR83sまたはPB2中に1つの突然変異PR81sのいずれかを保有するPR8ウイルスをまた、別々に回収した。これらのウイルスを図16に模式的に示す。4つ全ての組換え変異PR8ウイルスが、発育鶏卵において非常に高いタイターまで増殖した。これは表10に示すように90log10pfu/mlまたはそれ以上のタイターに達した。感染細胞におけるウイルスのタンパク質合成を調べるために、MDCK細胞を感染効率5にてウイルスに感染させ、感染から7時間後に、細胞を35STransを用いて1時間標識した。標識した細胞の溶菌液を、SDSを含有する15ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフした。タンパク質合成をまたウエスタンブロッティングによって調べた。ウイルス感染細胞を感染から8時間後に回収し、4~15勾配ゲルで電気泳動した。ブロットを抗M1抗体またはトリ抗MDVAポリクローナル抗体を用いて調べ、その後HRP結合二次抗体と共にインキュベートした。抗体結合タンパク質のバンドをChemiluminescentDetectionSystemInvitrogenによって検出し、その後X線フィルムに露光した。図19に示すように、33°Cにおいて、全て同一レベルのタンパク質合成を行ったが、39°Cにおいては、タンパク質合成のレベルは、PR81sについてはわずかに減少したが、PR83sおよびPR84s感染細胞においては大幅に減少した。ウエスタンブロッティング分析によってまた、タンパク質合成の減少量が、PR84s、PR83s、PR81sの順序で小さくなることを示した。従って、ts変異体の減少した複製はおそらく、複製を許容しない温度における減少した複製の結果であった。PR8変異体ウイルスの温度感受性を、33°C、37°C、38°Cおよび39°Cにて、MDCK細胞を用いたプラークアッセイによって測定した。回収したウイルスを発育鶏卵において増幅し、上記のように細胞に導入した。明示した温度にて3日間、ウイルス感染細胞をインキュベーションした後、細胞の単層をトリ抗MDVポリクローナル抗体を用いて免疫染色し、そしてプラークを数えた。各温度にて得られたプラーク数を比較し、各ウイルスのts表現型を調べた。シャットオフ温度とは33°Cと比べて、100倍またはそれ以上のタイター減少を生じた最低温度として定義された。表10および図17に示すように、全ての変異体は33°Cにおいて十分に複製したが、ウイルスタイターにわずかな減少がみられた。38°Cにおいて、全ての変異体についてウイルスタイターにかなりの減少がみられた。39°Cにおいて、PB1遺伝子に3つのts遺伝子座を保有するウイルスPR83sおよびPR84sについては、40log10以上ウイルスタイターの減少がみられた。PR81sはまた39°Cにおいてtsであった。PR84sのts表現型は、33°Cと比べて39°Cにおいて46log10の減少を有するMDVAのts表現型と非常に類似していた。3つ全てのPR8変異体は、37°Cにおけるウイルスタイターにおいて20log10以上の減少を有さなかったが、それらのプラーク形態は33°Cにおける形態とは異なっていた。図18に示すように、各変異体についての33°Cにおけるプラークサイズは、PR8と比べてわずかに減少したのみであった。PR83sについては、37°Cにおけるプラークサイズに大幅な減少がみられ、これはPR84sについての減少よりも大きかった。PR81sは37°Cにおけるプラークサイズに大幅な減少はみられなかった。39°Cにおいて、少数のごく小さなサイズのプラークのみがPR83sとPR84sの両方についてみられた。PR81sについては、wtPR8のプラークサイズのおよそ30のプラークサイズがみられた。変異PR8ウイルスの弱毒性をフェレットにおいて調べた。簡潔にいうと、オスのフェレット9~10週齢を用いて、動物宿主の呼吸器におけるウイルスの複製を調べた。フェレットを別々に飼い、85log10pfuのウイルスを用いて鼻腔内に接種した。感染から3日後、フェレットをケタミンHCLを用いて麻酔し、肺と鼻甲介NTを回収した。肺組織のホモジェネートを連続希釈し、10日齢の発育鶏卵を用いて滴定した。肺におけるウイルスタイターlog10EID50/mlをKarber法によって算出する。NTにおけるウイルス複製をプラークアッセイによって測定し、log10pfu/mlとして表した。肺および鼻甲介におけるウイルス複製のレベルをEID50またはプラークアッセイによって測定した表11。感染から3日後、PR8は肺組織において59log10EID50/gのレベルまで複製した。しかし、PR81sはフェレット肺における複製にて30log10減少を示した。またPR83sについては、ほとんど複製を検出しなかった。PR84sについては複製が検出されなかった別個に得たウイルスに感染させた2つのウイルス群で調べた。EID50アッセイによるフェレット肺におけるウイルスの検出限界は15log10であり、従ってPR84sについては、15log10EID50のタイターを割り当てた。対照として、MDVAはフェレット肺において複製せず、またwtA/AA/6/60は44log10のタイターまで複製した。鼻甲介NTにおけるウイルス複製を、MDCK細胞を用いたプラークアッセイによって調べた。PR8は鼻において66log10pfu/gのタイターまで複製した。PR81sおよびPR83sについては、ウイルスタイターのわずかな減少のみがみられた。PR84sAについては22log10の減少がみられ、一方PR84sBPB1遺伝子に変化を有するE390Gについては43log10減少がみられた。PR84sBの非常に減少した複製は、37°Cにおけるそのts表現型にかなり関係する。MDVAに由来するインフルエンザワクチンの弱毒表現型を評価するために普通用いられていた70log10pfuに代えて、ここでは85log10pfuの感染用量を使用した。この結果は、MDVAに由来する4つのts遺伝子座を保有するPR8がフェレットの下気道における複製において弱毒化されていたことを示した。tsおよびattアッセイの両方において、PR8変異体ウイルスはMDVAと非常に類似したtsおよびatt表現型の両方を示した。これらのデータは、MDVAの特有のアミノ酸置換を多岐にわたるインフルエンザウイルス株に導入することによって、弱毒生ワクチンなどを作製するのに望ましい温度感受性および弱毒表現型を示すウイルスが生じることを示す。さらに、弱毒生インフルエンザワクチンまたは不活性化インフルエンザワクチンを作製するための主要ドナーウイルスとして用いるのに好適なts、att、PR8ウイルスを高タイターになるまで増殖した。これらの結果は、5つのMDVA突然変異PB1391E、PB1581G、PB1661T、PB2265S、およびNP34Gが任意のA型インフルエンザ株にtsおよびatt表現型を与えうることを示す。同様に、ワクチン製造に好適な新規ts、attB株を、MDVB株の突然変異をB型インフルエンザウイルス株に導入することによって作製できる。弱毒生ウイルスワクチンを作製することに加えて、これら突然変異をドナー株へ導入することによって、より安全な不活性化ワクチンの産生を引き起こす。MDVB作製のための8つのプラスミド系典型的なB型インフルエンザ主要ドナー株MDVBであるインフルエンザB/AnnArbor/1/66の好冷変異体ca/MasterAnnArbor/1/66P1Aviron10/2/97に由来するウイルスRNAを、感染した発育鶏卵に由来する100μlの尿膜液よりRNeasyキットQiagenValenciaCAを使用して抽出し、そしてこのRNAを40μlのH2Oに溶出した。各反応に1μlの抽出したRNAを用いて、ゲノムセグメントのRTPCRを提供されたプロトコルの従ってOneStepRTPCRキットQiagenValenciaCAを用いて行った。このRT反応を50°Cにて50分間、続いて94°Cにて15分間行った。PCRを、94°Cにて1分間、54°Cにて1分間、および72°Cにて3分間を25サイクル行った。P遺伝子をBsmBI部位を有するセグメント特異的プライマーを用いて増幅し、2つの断片形成を生じた表12。プラスミドのクローニングPCR断片を単離し、BsmBIまたはNPについてはBsaIを用いて消化し、そして上記のようにpAD3000ネガティブセンスvRNAおよびポジティブmRNAの転写を可能とするpHW2000の派生物のBsmBI部位に挿入した。得られたプラスミドの2~4つを配列決定し、RTPCR断片の直接的な配列決定に基づいてMDVBのコンセンサス配列と比較した。コンセンサス配列と異なるアミノ酸変化を生じるヌクレオチド置換を有するプラスミドを、プラスミドのクローニングによるか、またはQuikchangeキットStratageneLaJollaCAを利用して修復した。得られたB/AnnArbor/1/66プラスミドを、pAB121PB1、PAB122PB2、PAB123PA、PAB124HA、PAB125NP、PAB126NA、PAB127M、およびpAB128NSと称した。この2方向性の転写系を用いて、全てのウイルスRNAおよびタンパク質を細胞内に産生し、そして感染性B型インフルエンザウイルスの産生を生じる図4。注目すべきは、コンセンサス配列と比べてpAB121PB1およびpAB124HAが2つ、pAB128NSが1つ、サイレントなヌクレオチド置換を有することである表13。これらのヌクレオチド変化はアミノ酸変化を生じず、またウイルスの増殖および回収に影響することが予期されない。これらのサイレントな置換を、組換えウイルスの遺伝子型同定を容易にするために維持した。PA、NP、およびM1遺伝子内にヌクレオチド置換を有するプラスミドを構築するために、プラスミドのpAB123PA、PAB125NP、PAB127Mを鋳型として用いた。ヌクレオチドをQuikchangeキットStratageneLaJollaCAによって変えた。あるいは、2つの断片を所望される突然変異を含むプライマーを用いたPCRによって増幅し、BsmBIを用いて消化し、3つの断片の連結反応によってpAD3000BsmBIへ挿入した。作製したプラスミドを配列決定し、cDNAが不必要な突然変異を含まないことを確実にした。鋳型DNAの配列をAmpliTaq登録商標DNAポリメラーゼFsを用いてRhodamineordRhodaminedyeterminatorcyclesequencingreadyreactionkitPerkinElmerAppliedBiosystemsIncFosterCityCAを使用して決定した。試料を電気泳動によって分離し、そしてPE/ABIモデル373、モデル373Stretch、またはモデル377のDNA配列決定装置によって分析した。別個の実験において、インフルエンザB/Yamanshi/166/98に由来するウイルスRNAを増幅し、MDVB株に関しては、上記pAD3000にクローン化した。ただし、増幅を94°Cにて30秒、54°Cにて30秒および72°Cにて3分間、25サイクル行った。B/Yamanashi/166/98株のセグメントを増幅するために、同一のプライマーを用いた。NPおよびNAセグメントを増幅するために以下のプライマーに、それぞれ代えた:MDVB5’BsmBINP:TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGTG配列番号75およびMDVB3’BsmBINP:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACAGCATTTTTTAC配列番号76およびBmNAb1:TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCA配列番号77およびBmNAb1557R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTT配列番号78。B/Yamanashi/166/98プラスミドはpAB251PB1、pAB252PB2、pAB253PA、pAB254HA、pAB255NP、pAB256NA、pAB257M、およびpAB258NSと称される。3つのサイレントなヌクレオチドの差異をPA内に同定し、これにより組換えおよびリアソータントB/Yamanashi/166/98ウイルスの遺伝子型同定を容易にした。感染性組換えB型インフルエンザおよびリアソータントインフルエンザウイルスの作製ヘルパーウイルスの存在しない細胞培養系でB型インフルエンザを増殖する試みにて直面する障害を克服するために、本発明は組換えおよびリアソータントB型インフルエンザウイルス株を作製するための新規ベクターおよびプロトコルを提供する。B型インフルエンザウイルスの回収に用いられるベクター系は、A型インフルエンザウイルス作製のために開発されたものに基づくHoffmannら2000ADNAtransfectionsystemforgenerationofinfluenzaAvirusfromeightplasmidsProcNatlAcadSciUSA97:61086113;HoffmannWebster2000UnidirectionalRNApolymerseIpolymerseIItranscriptionsystemforthegenerationofinfluenzaAvirusfromeightplasmidsJGenVirol81:28437。293T細胞またはCOS7細胞高いトランスフェクション効率とpolI活性とを有する霊長類の細胞をMDCK細胞インフルエンザウイルスの増殖を許容すると共培養した。293T細胞を5FBSを含有するOptiMEMIAB培地中に維持し、COS7細胞を10FBSを含有するDMEMIAB培地中に維持した。MDCK細胞を、抗生物質および抗真菌剤を添加した1×MEM、10FBS中に維持した。ウイルスゲノムベクターを用いたトランスフェクションの前に、細胞をPBSまたはFBSを含まない5mlの培地を用いて1回洗浄した。10mlのトリプシンEDTAを75cm2フラスコ中のコンフルエントな細胞に加えたMDCK細胞を20~45分間インキュベートし、293T細胞を1分間インキュベートした。この細胞を遠心分離し、10mlのOptiMEMIAB中に再懸濁した。次に、1mlの懸濁した各細胞系統を18mlのOptiMEMIABに希釈し、混合した。次に、細胞を1ウェルあたり3mlずつ6ウェルプレートに分けた。6~24時間後、1μgの各プラスミドを15mlエッペンドルフチューブ中にてOptiMEMIABと混合したプラスミドxμlプラスミドxμlOptiMEMIABxμlTransITLT1200μl;1μgのプラスミドDNAにつき2μlのTransITLT1。この混合物を室温にて45分間インキュベートした。次いで、800μlのOptiMEMIABを加えた。培地を細胞から取り除き、そしてトランスフェクション混合物を33°Cにて6~15時間、細胞に加えた。トランスフェクション混合物を細胞から徐々に取り除き、1mlのOptiMEMIABを加え、そして細胞を33°Cにて24時間、インキュベートした。トランスフェクションから48時間後、1μg/mlのTPCKトリプシンを含有する1mlのOptiMEMIABを細胞に加えた。トランスフェクションから96時間後、1μg/mlのTPCKトリプシンを含有する1mlのOptiMEMIABを細胞に加えた。トランスフェクションの後4日~7日の間に、1mlの細胞培養上清を回収し、HAまたはプラークアッセイによって調べた。簡潔にいえば、1mlの上清を1本のエッペンドルフチューブにとり、5000rpmにて5分間遠心分離した。900μlの上清を新しいチューブに移し、そして1ウェルあたり500μlにて、例えば12ウェルプレートにおいてMDCK細胞に対して段階希釈した。この上清を細胞と1時間インキュベートした後に取り除き、そして1μg/mlのTPCKトリプシンを含有する感染培地1×MEMと代えた。次にHAアッセイまたはプラークアッセイを行った。例えばプラークアッセイについては、上清を、33°Cにて3日間08アガロースで覆ってインキュベートしたMDCK細胞を用いて滴定した。卵の感染のために、トランスフェクトした細胞の上清をトランスフェクションから6日後または7日後に回収し、OptiMEMI中のウイルス希釈物100μlを11日齢の発育鶏卵に33°Cにて注射した。接種から3日後にTCID50アッセイによってMDCK細胞におけるタイターを測定した。MDVBを作製するために、共培養した293TMDCK細胞またはCOS7MDCK細胞のいずれかに1μgの各プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから5~7日後に調べたとき、共培養したMDCK細胞が細胞変性効果CPEを示した。これはクローン化cDNAに由来する感染性MDVBウイルスの産生を示す。7つのプラスミドを用いてトランスフェクトした細胞においては、CPEはみられなかった表14。ウイルス産生のためのDNAトランスフェクション系の効率を測定するために、細胞の上清をトランスフェクションから7日後にMDCK細胞を用いて滴定し、ウイルスタイターをプラークアッセイによって測定した。共培養した293TMDCKの上清のウイルスタイターは50×106pfu/mlであり、COS7MDCK細胞では76×106pfu/mlであった。一過的に共培養した293TMDCK細胞12または共培養したCOS7MDCK細胞34に7つまたは8つのプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから7日後共培養したMDCK細胞における細胞変性効果CPEを調べた。トランスフェクションから7日後、トランスフェクトした細胞の上清を、MDCK細胞を用いて滴定した。pfu/mlのデータは多数の例えば3つまたは4つのトランスフェクション実験の平均を示す。B/Yamanashi/166/98プラスミドベクターを用いたトランスフェクション実験において比較可能な結果を得た。これらの結果は、このトランスフェクション系が8つのプラスミドに由来するB型インフルエンザウイルスの再現可能な新規産生を可能とする。組換えB型インフルエンザの遺伝子型同定MDCK細胞での続く継代の後に、感染細胞の上清のRTPCRを用いて、産生したウイルスの出所の確かさを確認した。8つ全てのセグメントについて、セグメント特異的プライマー表12を用いてRTPCRを行った。図5Aに示すように、全てのセグメントについてPCR産物を得た。PB1、HA、およびNSセグメントのPCR産物の直接的配列決定によって、分析した4つのヌクレオチドがプラスミドpAB121PB1、PAB124HA、およびpAB128NSに見出されるものと同一であることが明らかとなった。これらの結果は、産生されたウイルスが特定のプラスミドより産生されたことを裏付け、またネガティブコントロールに加えて親ウイルスによる研究室汚染の可能性を除外する図5B。同様に、B/Yamanashi/166/98プラスミドベクターを用いたトランスフェクションの後、ウイルスを回収し、そしてPAセグメントのヌクレオチド1280~1290を含む領域を増幅した。配列決定によって、回収したウイルスがプラスミド由来の組換えB/Yamanashi/166/98に相当することを確認した図5CおよびD。rMDVBの表現型同定MDVBウイルスは2つの特徴的な表現型:温度感受性tsおよび好冷性caを示す。tsは、33°Cと比べて37°Cにおけるウイルスタイターが2logまたはそれ以上異なるという定義によって規定され、caは33°Cと比べて25°Cにおけるウイルス増殖が2log未満の差であることによって規定される。トリ腎臓プライマリーPCK細胞を親ウイルスMDVBまたはプラスミドに由来するトランスフェクトウイルスに感染させ、3つの温度におけるウイルス増殖を測定した。プラークアッセイのために、6ウェルプレート中コンフルエントなMDCK細胞ECACCを用いた。ウイルス希釈物を33°Cにて30~60分間インキュベートした。この細胞を08アガロースで覆った。感染細胞を33°Cまたは37°Cにてインキュベートした。感染から3日後、細胞を01クリスタルバイオレット溶液を用いて染色し、そしてプラークの数を測定した。cats表現型アッセイを、25°C、33°Cおよび37°Cにおける、ウイルス試料のTCID50滴定によって行った。このアッセイ形式は、異なる温度25°C、33°C、37°Cにおいて、96ウェル細胞培養プレート中のトリ腎臓プライマリー細胞単層における、インフルエンザウイルスによる細胞変性効果CPE調べることによってTCID50タイターを測定する。このアッセイは温度およびウイルス株によって変化するプラーク形態に依存せず、その代わりにインフルエンザウイルスの複製能力およびCPEを生じる能力にのみ依存する。一次組織のトリプシン処理によって調製されたトリ腎臓プライマリーPCK細胞の懸濁液を、5FCSを含有するMEMイーグル培地に懸濁した。PCK細胞を、48時間で90を超えるコンフルエントな状態の単層を調製するために96ウェル細胞培養プレートに播種した。48時間後、PCK細胞の単層を5mMLグルタミン、抗生物質、非必須アミノ酸を含有する無血清MEM培地表現型アッセイ培地PAMと称されるを用いて1時間洗浄した。連続10倍希釈のウイルス試料を、PAMを入れた96ウェルブロック中に調製した。次に、希釈したウイルス試料を96ウェルプレート中の洗浄したPCK単層上に播いた。ウイルス試料の各希釈度において、6ウェルの複製物を希釈したウイルスによる感染に用いた。各試料についての6ウェルの複製物と同様に、細胞対照として非感染細胞を含めた。各ウイルス試料を2~4の複製物を用いて滴定した。25°C、33°C、および37°Cにて予め定めたタイターを有する表現型対照ウイルスを各アッセイに含む。ウイルス試料のts表現型を測定するために、プレートを5CO2細胞培養インキュベーター内において、33°Cまたは37°Cにて6日間インキュベートした。ca表現型の特徴付けのために、プレートを25°Cにて10日間インキュベートした。ウイルスタイターをKarber法によって計測し、Log10平均n4TCID50タイター/ml標準偏差として報告した。図1~3に示されたウイルスタイターの標準偏差は01~03に及んだ。33°Cと37°Cにおけるウイルスタイターの差異をts表現型を決定するために用いて、そして25°Cと33°Cにおけるウイルスタイターの差異をca表現型を決定するために用いた。プラスミドに由来する組換えMDVBrecMDVBウイルスは、予測されたとおり2つの特徴的な表現型caおよびtsを細胞培養において発現した。ca表現型25°Cにおける効率的な複製を、PCK細胞においてアッセイした場合、25°Cと33°Cとの間の2log10以下のタイターの差異として機能的に測定する。親MDVBおよびrecMDVBの両方がcaを発現した;25°Cと33°Cとの間の差異はそれぞれ03と04log10であった表15。ts表現型はまた、2つの異なる温度でのPCK細胞におけるタイターを観察することによって測定する;しかしこの表現型については、37°Cにおけるタイターは33°Cにおけるタイターよりも2log10またはそれ以上小さくなければならない。親MDVBおよびrecMDVBの33°Cと37°Cとの間の差異はそれぞれ34と37log10であった表15。従って、組換えプラスミドに由来するMDVBウイルスはcaおよびts表現型の両方を発現した。組換えウイルスは、33°Cにて70log10TCID50/ml、37°Cにて33TCID50/mlおよび25°Cにて88log10TCID50/mlのタイターを有した表15。従って、8つのインフルエンザMDVBゲノムセグメントプラスミドを用いたトランスフェクションに由来する組換えウイルスはcaおよびts両方の表現型を有する。リアソータントB/Yamanashi/166/98ウイルスの作製B型インフルエンザの主要系統を表す複数の異なる株のHAおよびNAセグメントを、本質的に上記のように増幅し、そしてpAD3000にクローン化した。プライマーをHAおよびNAセグメントの同時RTPCR増幅のために最適化した。セグメント4HAおよびセグメント6NB/NAの非コード領域を示すvRNAの終末領域の比較によって、B型インフルエンザウイルスのHA遺伝子とNA遺伝子との間で、5’末端の20終末ヌクレオチドと3’末端の15ヌクレオチドが同一であることが明らかとなった。RTPCR用のプライマー対下線部の配列はB型インフルエンザウイルス特異的であるBmNAb1:TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCA配列番号87;BmNAb1557R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTT配列番号88を合成し、種々のB型インフルエンザ株よりHAおよびNA遺伝子を同時増幅するために用いた図8。B/Victoria/504/2000、B/Hawaii/10/2001、およびB/HongKong/330/2001のHAおよびNAのPCR断片を単離し、BsmBIを用いて消化し、そしてpAD3000に挿入した。これらの結果は、B型インフルエンザ主要系統を表す複数の様々な野生型ウイルスよりB型インフルエンザのHAおよびNA遺伝子を含むプラスミドを効率的に作製するための上記プライマーの適応性を示した。このRTPCR産物を配列決定および/または発現プラスミドへのクローニングのために用いることができる。種々のB型インフルエンザ系統の抗原を効率的に発現するB/Yamanashi/166/98B/Yamagata/16/88様ウイルスの有用性を示すために、B/Yamanashi/166/98に由来するPB1、PB2、PA、NP、M、NSならびにVictoriaおよびYamagata系統の両方を示す株に由来するHAおよびNAを含むリアソータント62リアソータントを作製した。一過的に共培養したCOS7MDCK細胞にB/Yamanashi/166/98を表す6つのプラスミドと、B/Victoria/2/87系統、B/HongKong/330/2001およびB/Hawaii/10/2001に由来する2つの株およびB/Yamagata/16/88系統、B/Victoria/504/2000に由来する1つの株のHAおよびNAセグメントのcDNAを含む2つのプラスミドを上記方法によりコトランスフェクトした。トランスフェクションから6~7日後、上清を新しいMDCK細胞を用いて滴定した。3つ全ての62リアソータントウイルスは4~9×106pfu/mlのタイターを有した表16。これらのデータはB/Yamanashi/166/98の6つの内部遺伝子が両B型インフルエンザ系統に由来するHAおよびNA遺伝子セグメントと共に、感染性ウイルスを効率的に形成できることを示した。共培養したCOS7MDCK細胞の上清をトランスフェクションから6日または7日後に滴定し、そしてウイルスタイターを、MDCK細胞を用いたプラークアッセイによって測定した。卵における野生型B/Yamanashi/166/98の複製によって、相対的に高タイターが得られる。この特性がこのウイルスの6つの内部遺伝子による固有の表現型であるか否かを決定するために実験を行った。この特性を評価するために、卵中において適度に複製された野生型B/Victoria/504/2000の産生量を、B/Victoria/504/2000のHAおよびNAを発現する62リアソータントの産生量と比較した。野生型および組換えB/Yamanashi/166/98に加えてこのウイルスを3つまたは4つの発育鶏卵に、100または1000pfuのいずれかにてそれぞれ接種した。感染から3日後、尿膜液を卵から回収し、そしてTCID50タイターをMDCK細胞を用いて測定した。62リアソータントは尿膜液中にwtおよび組換えB/Yamanashi/166/98株と同程度の量のウイルスを産生した図9。B/Victoria/504/2000と62組換え体との間のタイターの差異はおよそ16log10TCID5007~25log10TCID50/mL95CIであった。B/Victoria/504/2000と62組換え体との間の差異を、3つの独立した実験において確認したPQ119Y347の順序でNA活性に影響を及ぼしたことを示した。NA変異体のNA活性と発育鶏卵におけるウイルス複製との関係を調べた表21。6つの改変ウイルスが、MDCK細胞において十分に複製し、62~69log10PFU/mlの範囲にあるタイターに達するが、卵における複製は全く異なっていることが示された。A/Fujianの66および99のNA活性を有するFJQ119およびFJ347は、卵においては増殖することができなかった。25のNA活性を有するFJK136は、卵において48log10PFU/mlのタイターまで増殖できるが、A/Sendaiのタイター88log10PFU/mlよりも40log10低かった。意外にも、K136Y347はinvitroにおけるNA活性が著しく減少したが、上記2つの突然変異を有する組換えウイルスFJK136Y347は発育鶏卵において複製することができなかった。52のNA活性を有したQ119Y347は、卵において45log10fpu/mlのタイターまで複製した。A/SendaiのNA活性よりもやや高いNA活性を有するQ119K136は、62log10fpu/mlのタイターまで複製したが、A/Sendaiよりも26log10低いままであった。これらの結果は、A/FujianとA/Sendaiとの間で異なる3つのNA残基の各々がウイルス複製に別々に影響を与えたことを示す。様々なNA突然変異が、A/SendaiのNA活性に近いレベルまでNA活性を減少させることができたが、Q136KおよびE119Qの変化のみが、発育鶏卵におけるウイルス複製に、顕著な改善を生じることができた。Q119K136の二重突然変異が卵においてA/Sendaiウイルスのように効率的に複製しなかったために、Y347残基はまた卵におけるウイルス複製に影響しうる。HA残基のウイルス複製への影響A/Fujianとは異なるA/Wyoming/03/03における4つのHA1残基の変化を、ウイルス複製におけるそれらの役割について調べた。単一または多重の置換突然変異をA/FujianHAcDNAに導入し、改変したHAプラスミドをA/FujianNAのどちらかと共にMDVAに導入した。全ての6:2リアソータントウイルス変異体はMDCK細胞において十分に複製したが、発育鶏卵においては別の様式で増殖した表33。A/FujianHAT128G186S219V226を有する6:2リアソータントは、卵において複製することができなかった。単一のT128A変化は、卵におけるウイルス増殖を改善しなかった。しかし、G186VまたはV226Iの単一の変化によって、卵における増加したウイルス複製を生じた。HAにおけるG186VおよびV226Iの二重の変化によって、卵において効率的に複製した。残基128および/または219におけるさらなる置換は、ウイルスの複製を顕著に増加させなかった。このように、G186VおよびV226Iの最小2つの変化によって、6:2A/Fujianの発育鶏卵における効率的な増殖を可能とした。6:2A/Fujian/411/02の適応6:2A/Fujian株が発育鶏卵における増殖に適応できるか否かを決定するために、ウイルスをMDCK細胞において増幅し、その後卵において継代した表23。30log10PFUのウイルスを卵に接種した場合、20log10PFU/ml未満のウイルスを、回収した尿膜液中に検出した。この材料の継代後には、感染性ウイルスを回収することができなかった。第2の継代実験の間に、発育鶏卵に接種されるウイルスの量を59log10PFUまで増加した。回収した尿膜液FJEP1において39log10PFU/mlのタイターを検出し、そして卵においてさらに継代したものは62log10PFU/mlのウイルスタイターまで増加したFJEP2。卵においてさらに継代したものFJEP3は、ウイルスタイターが82log10PFU/mlまで増加した。FJEP2ウイルスの配列分析によって、HARNAセグメントのヌクレオチド625におけるAからUへの突然変異が明らかとなった。この突然変異はHAタンパク質におけるH183L変化を生じた。さらなる分析によって、この変化がMDCK細胞におけるウイルス増幅の間にも生じることが明らかとなった。H183L突然変異はまた、上記のようにMDCKおよび卵におけるwtA/FujainHAの複製の間にwtA/FujainHAにも見出された。V226A置換を生じるHAのヌクレオチド754におけるUからCへのさらなる突然変異が、FJEP3の増幅されたウイルスに見出された表23。NAセグメントに変化は検出されなかった。HAにおけるH183LおよびV226A突然変異が、卵における6:2A/Fujianの複製増加を実際に招いたか否かを確認するために、H183LおよびV226Aを単独で、または組み合わせてA/FujianHAに導入し、3つの組換えウイルスを得た。FJH183Lについては74log10PFU/ml、FJV226Aについては79log10PFU/ml、およびFJH183L/V226Aについては84log10PFU/mlのタイターまで増殖した表23。従って、H183LおよびV226Aは独立して、発育鶏卵におけるA/Fujianウイルスの改善された複製に関与した。受容体結合特性および組換えウイルスの複製上記研究から、A/FujianのNA活性を減少させるNA変化は、このウイルスが卵にて増殖するのに十分であることを示した。一方、HA変化G186VおよびV226IまたはH183LおよびV226Aが受容体結合親和性を増加させ、A/Fujianの高いNA活性を補うことができる。A/FujianのHAタンパク質における変化がその受容体結合能を増加させるか否かを決定するために、HAV186I226変化を有する6:2A/FujianおよびHAL183A226変化を含む卵に適合した6:2A/Fujianの吸着を、6:2A/FujianA/Sendai、およびA/Wyomingと比較した。各ウイルスを4°Cまたは33°Cにおいて30分間、感染効率10にてMDCK細胞に吸着させ、接種物を取り除き、そして感染細胞を3回洗浄するか、または洗浄しなかった。33°Cにおける6時間のインキュベーションの後、感染細胞の割合を抗NP抗体を用いた免疫蛍光分析によって測定した。図36に示すように、吸着を4°Cにて行った場合、6:2A/FujianおよびA/Sendaiには26~27の細胞が感染したが、大半のウイルスは洗浄工程によって容易に除去された。33°Cにて、洗浄することによって、6:2A/Fujianウイルスの感染を非常に減少させた378に対して62が、6:2A/Sendaiの感染には顕著な効果がなかった517に対して428。対照的に、HAV186I226またはHAL183A226を有する6:2A/Wyoming、A/Fujianは、細胞を4°Cまたは33°Cにて吸着させるとか、洗浄工程の有無にかかわらず、同様の感染効率を有した。これらのデータは、A/FujianおよびA/SendaiHAが、4°Cにおいて結合したウイルスは細胞より容易に洗い流すことができるような低い結合親和性を有することを示した。結合およびウイルス侵入速度は33°Cにおいて速かったため、洗浄工程は6:2A/Sendaiウイルス感染に最小限度の影響を与えた。しかし、大半の結合6:2A/Fujianは、その高いNA活性が33°Cにおいて効率的なウイルス結合を妨げるためにデータは示さない、同様の条件で洗い流された。組換えウイルスの抗原性改変HAおよびNA残基を有するウイルスが、ウイルス抗原性に影響するか否かを調べるために、赤血球凝集阻害アッセイHAIをフェレット抗A/Wyoming血清および抗A/Sendai血清を用いて行った表24。抗A/Wyomingフェレット血清または抗A/Sendaiフェレット血清は6:2A/FujianウイルスまたはA/Sendaiウイルスのいずれかを用いて測定した場合、同様のHAIタイターを有した。6:2A/Wyomingウイルスを用いた場合、やや高いHAIタイターを検出した。おそらくこれは、赤血球上の細胞受容体に対するA/WyomingHAの堅い結合によるものである。2つの改変したウイルスA/FujianHAV186I226およびA/FujianHAL183A226は、いずれかの血清で測定した場合、A/Wyomingと類似したHAIタイターを有した。これらの結果は、A/SendaiとA/Wyomingとの間のアミノ酸の差異および、本研究にて作製された改変HAウイルスが、ウイルス抗原性を変化させなかったことを示した。前述の発明は明瞭性および理解性のために詳細に記述されているが、この開示を読むことによって、本発明の真の目的を離れることなく形態および詳細において種々の変更がなされうることは、当業者にとって明らかである。例えば、上記全ての技術および装置は様々な組合せにおいて用いることができる。全ての出版物、特許、特許出願、または本願に引用されるほかの書類は、個々の出版物、特許、特許出願、または他の書類がすべての目的のために参考として援用されるためにそれぞれ示されるのと同一範囲まで、すべての目的のためにその全体が参考として援用される。特に、以下の特許出願はその全体が参考として援用される:米国仮出願第60/574117号2004年5月24日提出;同上第60/578962号2004年6月12日提出;同上第60/532164号2003年12月23日提出;PCT出願US03/127282003年4月25日提出;および米国特許出願第10/423828号2003年4月25日提出。