"1,3-プロパンジオールPDOの生産に有用なクロストリジウムアセトブチリカムClostridiumacetobutylicumの集団であって、該集団は表1に示される変異体から選択される少なくとも一つのクロストリジウムアセトブチリカムsp.菌株を含み、前記変異体には相対割合で以下の遺伝子ファミリーが存在してなる、集団:受託番号I4378としてCNCMに寄託されたDG1pSPD5PD0001VE05c01株;受託番号I4379としてCNCMに寄託されたDG1pSPD5PD0001VE05c05株;受託番号I4380としてCNCMに寄託されたDG1pSPD5PD0001VE05c07株からなる群から選択されるクロストリジウムアセトブチリカムの少なくとも一つの菌株を含んでなる、請求項1に記載の集団。前記菌株が、以下の点変異のうち少なくとも一つの変異をさらに有してなる、請求項1または2に記載の集団:真核性のグルコキナーゼ調節遺伝子炭水化物代謝のホモログである推定糖リン酸イソメラーゼをコードする、クロストリジウムアセトブチリカムゲノムのCAC0175遺伝子座locus198989位でCがTに置換されるRNAポリメラーゼシグマ因子RPOD転写および翻訳制御をコードする、クロストリジウムアセトブチリカムゲノムのCAC1300遺伝子座1444099位でGがAに置換されるGlutRNAGlnアミドトランスフェラーゼのサブユニットA転写および翻訳制御をコードする、クロストリジウムアセトブチリカムゲノムのCAC2670遺伝子座2787387位でCがTに置換されるABCトランスポーター2つのATPアーゼドメインのATPアーゼ成分をコードする、クロストリジウムアセトブチリカムゲノムのCAC3339遺伝子座3512658位でCがTに置換される分岐鎖アミノ酸パーミアーゼトランスポーターをコードする、クロストリジウムアセトブチリカムゲノムのCAC1610遺伝子座1752341位でCがTに置換される。唯一の炭素源としてグリセリンを含んでなる培養培地中で請求項1~4のいずれか一項に記載の集団を培養し、かつ、培養培地から産生される1,3-プロパンジオールを回収することを含んでなる、1,3-プロパンジオールの産生方法。1,3-プロパンジオールがさらに精製される、請求項4に記載の方法。培養培地中における前記グリセリン濃度が90と120g/Lグリセリンの間、好ましくは約105g/Lグリセリンである、請求項4または5に記載の方法。前記グリセリンが工業用グリセリンにより提供される、請求項4~6のいずれか一項に記載の方法。前記工業用グリセリンが、バイオディーゼル生産の副産物である、請求項7に記載の方法。前記培養培地が、有機窒素を添加していない合成培地である、請求項5~8のいずれか一項に記載の方法。実施例1発生した集団からのクローンの単離クローンの単離はクロストリジウムアセトブチリカムDG1pSPD5PD0001VE05菌集団株の成育フラスコ培養から開始し寒天培地上で行われた。フラスコ培養に使用された合成培地は、脱イオン水1リットル当たり:グリセリン、30g;KH2PO4、0.5g;K2HPO4、0.5g;MgSO4、7H2O、0.2g;CoCl26H2O、0.01g;酢酸、99.8、2.2ml;NH4Cl、1.65g;MOPS、23.03g、ビオチン、0.16mg;p-アミノ安息香酸、32mg;FeSO4、7H2O、0.028g;レザズリン、1mgおよびシステイン、0.5gを含有するものであった。培地のpHはNH4OH6Nで6.5に調整された。異なる培地が寒天培地での単離のために用いられた:市販のグリセリンまたは粗製グリセリンを含む合成寒天培地上述と同じものとCGMクロストリジウム成育培地ClostridialGrowthMedium寒天培地は、脱イオン水1リットル当たり:市販または粗製グリセリン、30g;酵母エキス、5g;KH2PO4、0.75;K2HPO4、0.75g;MgSO4、7H2O、0.4g;アスパラギン、2g;NH42SO4、2g;NaCl、1g;MnSO4、H2O、10mg;FeSO4、7H2O、10mg;MOPS、23.03g;レザズリン、1mgおよびシステイン、15gを含有するものである。培地のpHはNH4OH3Nで6.6に調整された。細胞は4つの異なる方法でフラスコ培養表2から平板培養された:市販のグリセリンを含む合成培地の寒天平板培養;粗製グリセリンを含む合成培地の寒天平板培養;市販のグリセリンを含む富栄養培地の寒天平板培養;粗製グリセリンを含む富栄養培地の寒天平板培養。単離されたクローンは、寒天平板培地上で3回連続の継代培養の後に純粋と考えられた。さらに、純粋なクローンは市販または粗製グリセリンのいずれかを含んだ液体富栄養培地に移された表2。続いて、成育液体培地はさらなる特性解析までグリセリン20、-80°Cで保存された。クローンは、その後、以下の方法で特徴付けられた:保存後の生存能力の測定:合成培地での成長率の評価;増殖と代謝の評価:培養の間のOD620nmおよび合成培地におけるPDO/グリセリン収率の測定遺伝的評価:菌株の遺伝子型の確認のためのPCR解析;単離されたクローンと集団との能力を比較するためのケモスタット培養実施例2;クローンの配列解析のためのgDNA抽出実施例3。実施例2粗製グリセリンを高濃度で含むケモスタット培養におけるクローンc08の性能微生物の菌株単離されたクローンC.アセトブチリカム株DG1pSPD5PD0001VE05菌株は1/pSOL1から保存可能な状態になり、2/dhaB1、dhaB2およびdhaT遺伝子、すなわち、1,3-プロパンジオールオペロン、が含まれているプラスミドpSPD5で形質転換され、そして、3/高濃度の粗製グリセリンに移行される。この単離プロトコールは実施例1に記載した。培養培地クロストリジウムのバッチ培養に用いられる合成培地は、脱イオン水1リットル当たり:グリセリン、30g;KH2PO4、0.5g;K2HPO4、0.5g;MgSO4、7H2O、0.2g;CoCl26H2O、0.01g;H2SO4、0.1ml;NH4Cl、1.5g;ビオチン、0.16mg;p-アミノ安息香酸、32mgおよびFeSO4、7H2O、0.028gを含有するものであった。培地のpHはNH4OH3Nで6.3に調整された。シグマから購入された市販のグリセリン純度99.5がバッチ培養に用いられた。連続培養の添加培地は、水道水1リットル当たり:粗製グリセリン、105g;KH2PO4、0.5g;K2HPO4、0.5g;MgSO4、7H2O、0.2g;CoCl26H2O、0.026g;NH4Cl、1.5g;ビオチン、0.16mg;p-アミノ安息香酸、32mg;FeSO4、7H2O、0.04g;消泡剤、0.05ml;ZnSO4、7H2O、8mg;CuCl2、2H2O、4mg;MnSO4、H2O、40mg;H3BO3、2mg;Na2MoO4、2H2O、0.8mgを含有するものであった。この場合には培地のpHは調整しなかった。バイオディーゼルのためのエステル交換から得られる粗製グリセリンは、NovanceVenetteFranceから供給され、以下の純度を有していた。:グリセリン84.8w/w。実験設定:連続培養は5lバイオリアクターTrytonPierreGuerinFranceで、作業容量2000mlで行われた。培養容量は培養レベルの自動制御により2000mlで一定に保たれた。培養は200RPMで攪拌され、温度は35°Cに設定され、NH4OH5.5Nの自動添加によりpHは6.5に一定に維持された。POR測定mVは全培養に渡って制御された。嫌気性条件を作り出すために、容器中の滅菌された培地は60°Cで1時間、滅菌無酸素窒素でフラッシュされ、さらに、35°Cに達するまでフラッシュされた2時間の間のフラッシュ。バイオリアクターのガス出口はピロガロールを準備することにより酸素から保護されたVasconcelosetal1994。滅菌後、添加培地もまた室温に到達するまで滅菌無酸素窒素でフラッシュされ、酸素が入らないように200mbarの窒素圧下で維持された。バッチおよび連続培養プロセス:評価のためのプロセスは特許出願PCT/EP2010/056078実施例2に記載されている。合成培地上記のバッチ培養培地と同じものに酢酸、2.2g.L-1およびMOPS、23.03g.L-1の添加を行ったものにおいて100mlフラスコ中で増殖中の培養物で対数増殖期終了時に採取されたものが接種材料5v/vとして用いられた。培養物はまずバッチ式で増殖された。対数増殖期初期に市販のグリセリンをパルスで行った:105g.L-1の粗製グリセリンを添加したパルス合成培地バッチ培養で記載されたものと同じものが3時間の間、静的流速で加えられたすなわち、18g.L-1のグリセリンの添加。その後、連続バッチ式増殖を続け、対数増殖期の終了前に希釈率0.025h-1での連続的添加が開始した。添加培地は105g.L-1の粗製グリセリンを含む。バイオリアクターの接種後8-10日および3滞留時間後、希釈率は様々な段階で0.025h-1から0.060h-1に増加した:48時間は0.01h-1ユニットの増加―24時間は変化無し―48時間0.01h-1ユニット増加―24時間変化無し-48時間0.015h-1ユニット増加。その後、以下に記載されたHPLCプロトコルを用いて培養の安定化の後に1,3-プロパンジオールの生産とグリセリンの消費図1が続いた。特に、我々は残留グリセリン濃度が可能な限り低くなるまで待った。C08クローンの総合的な性能は表3で示され、同一条件下での集団の性能およびGonzalezPajueloetalで記載されたようなC.アセトブチリカムDG1pSPD5PD0001VT株の性能と比較される。分析手順:細胞濃度は620nmで比濁分析により測定され、直接測定した細胞乾燥重量と相関させた。グリセリン、1,3-プロパンジオール、エタノール、ブタノール、酢酸および酪酸濃度はHPLC分析により測定された。分離はBioradAminexHPX87Hカラムで行われ、検出は屈折率により達成された。操作条件は下記の通りであった:移動相硫酸0.5mM;流速0.5ml/min、温度、25°C。これらの結果はC.アセトブチリカムDG1pSPD5の適合集団は、GonzalezPajueloetalからの適合されていないC.アセトブチリカムDG1pSPD5PD0001VT株に比べ、より高い濃度の工業用グリセリンにおいて増殖でき、従って、より良い力価および工業用グリセリンでのPDOの生産性を示す。実施例3ゲノムDNA抽出PD0001VT、PD0001VE05、PD0001VE05c01、PD0001VE05c05、PD0001VE05c07およびPD0001VE05c08株からのゲノムDNAはQiagenGenomickit500Gを用いて抽出された。簡単には、細胞はペニシリンバイアル70mLで後期対数増殖期A62015~20まで実施例1および2に記載されたような富栄養または合成グリセリン培地でそれぞれ嫌気的に増殖された。細胞溶解の間を通して厳しい嫌気的条件が維持された。細胞は回収されSETバッファー25スクロース、0.05MTris-HCl、0.05MEDTAで2回洗浄された。細胞ペレットは11mLのB1キットバッファーに44μLのRNase、30mg/mLリゾチームおよび100μg/mLプロテアーゼKと共に懸濁された。その混合物は37°C、45分間培養し、遠心分離され、QiagenDNApurificationkitの使用説明書に従い、上清を用いてDNA抽出が行われた。その次に、DNAは50μLの10mMTris-HClpH8.0に懸濁された。シークエンシング解析天然のDG1pSPD5PD0001VT株のゲノムおよび発生した集団DG1pSPD5PD0001VE05はRocheGSFLXtechnologyを用いてシークエンシングされた。シークエンシングプロジェクトはEurofinsGenomicsMWGOperonにより、各株1毎にロングタグペアエンドライブラリLongTagpairedendlibraries8Kbに行われ、GSFLXTitaniumserieschemistryを半分の稼働最高600000読込、最高180000300000の実際のペアードエンド読込truepairedendreadsさせて、配列の生成およびコンティグの足場組みscaffoldingが行われた。発生した集団から単離されたクローンはNimbleGenにより開発された比較ゲノムシークエンシングcomparativegenomicsequencingCGSを用いて配列決定された。CGS解析は2段階で行われた:第1段階、ゲノムの差異のある領域が天然の株と発生したクローンのDNAの比較ハイブリダイゼーションにより同定された。第2段階、ゲノムの差異のある同定された領域だけが、完全に明らかにされた一連の一塩基変異多型SNPsを作り出すために配列決定された。SNP解析発生した集団のバイインフォマティックスおよびSNP解析はEurofinsGenomicsMWGOperonにより行われた。この解析のために、両方の株の読み込みセットは別々に、ソフトウェアgsMapperを用いてGenbank参照配列にマッピングされた。3つのSNPファイルを適用して、ATCC824とDG1pSPD5PD0001VT、ATCC824とDG1pSPD5PD0001VE05、そしてDG1pSPD5PD0001VE05とDG1pSPD5PD0001VTの比較を行った。天然と発生した菌株の間の固有のSNPが以下に示すように存在する。低包括度coverage<25および低変異頻度variantfrequency<85は除かれ、ファミリーグループの注釈のために用いられたKEGGデータベースに従って17ファミリーに分布した160の固有のSNPという結果となった。単離されたクローンのSNP解析はNimbleGenによって行われた。SNPファイは、Genbank参照配列を用い、天然のDG1pSPD5PD0001VTと、DG1pSPD5PD0001VE05c01、DG1pSPD5PD0001VE05c05、DG1pSPD5PD0001VE05c07またはDG1pSPD5PD0001VE05c08との比較に適用された。配列結果は表1に示され、以下の情報を含んでいる:RefStart参照配列内のスタート位置で、ここで差異が生じるRefNuc差異位置thedifferencelocationでの参照ヌクレオチド配列VarNuc差異位置での異なるヌクレオチド配列VarFreq差異位置に完全に及ぶ全読込totalreadsに対する異なる読込のパーセンテージタイプSNPが注釈遺伝子内、または注釈遺伝子間で発見されたか否かのリスト。遺伝子中のSNPはコーディングcodingとして指定される。遺伝子間のSNPは遺伝子間intergenicとして指定される。AA変化タンパク質のアミノ酸を変化するか否かに基づいてコーディングSNPを分類する。Sは同義的なSNPアミノ酸変化無しを意味する。Nは非同義的SNPアミノ酸変化ありを意味する。FCフレームチェンジはヌクレオチドの挿入や削除によりタンパク質の翻訳に改変があることを意味する。ORIGAASNP部位に対応する参考配列に関連したアミノ酸SNPAA試験配列に関連したアミノ酸、SNP部位に対応する遺伝子座タグGenbankからの対応遺伝子の遺伝子座タグlocustag機能Genbankに記載の遺伝子の機能ファミリーKEGGからの遺伝子のファミリー参考文献1GonzalezPajueloMMeynialSallesIMendesFAndradeJCVasconcelosIandSoucailleP2005MetabolicengineeringofClostridiumacetobutylicumfortheindustrialproductionof13propanediolfromglycerolMetabolicEngineering73293362GonzalezPajueloMMeynialSallesIMendesFSoucaillePandVasconcelosI2006MicrobialconversionofanaturalproducerClostridiumbutyricumVPI3266andanengineeredstrainClostridiumacetobutylicumDGAppliedandEnvironmentalMicrobiology72961013NollingJBretonGOmelchenkoMVMakarovaKSZengQGibsonRLeeHMDuboisJQiuDHittiJWolfYITatusovRLSabatheFDoucetteStammLSoucaillePDalyMJBennettGNKooninEVSmithDR2001GenomesequenceandcomparativeanalysisofthesolventproducingbacteriumClostridiumacetobutylicumJournalofbacteriology183482348384PapanikolaouSRuizSanchezPParisetBBlanchardFandFickM2000Highproductionof13propanediolfromindustrialglycerolbyanewlyisolatedClostridiumbutyricumstrainJournalofBiotechnology771912085VasconcelosIGirbalLSoucailleP1994RegulationofcarbonandelectronflowinClostridiumacetobutylicumgrowninchemostatcultureatneutralpHonmixturesofglucoseandglycerolJournalofbacteriology17614431450"