親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつL-アスパラギンを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にL-アスパラギンを生成、蓄積させ、該培養物中からL-アスパラギンを採取することを特徴とするL-アスパラギンの製造法。微生物が、親株に比べL-アスパラギン合成活性が増強した微生物である、請求項1記載の製造法。微生物が、親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物である、請求項1または2記載の製造法。微生物が、親株に比べL-アスパラギン排出活性が増強した微生物である、請求項1~3のいずれか1項に記載の製造法。親株に比べL-アスパラギン排出活性が増強した微生物が、以下の[1]~[6]のいずれかに記載のDNAを有する組換え体DNAで親株を形質転換して得られる微生物である、請求項4記載の製造法。[1]配列番号14で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA[2]配列番号14で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA[3]配列番号14で表されるアミノ酸配列と80以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA4配列番号13で表される塩基配列を有するDNA[5]配列番号13で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA[6]配列番号13で表される塩基配列と80以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項1~5のいずれか1項に記載の製造法。本発明の課題は、著量のL-アスパラギンを培養液中に生成、蓄積する能力を有する微生物を用いたL-アスパラギンの製造法を提供することにある。本発明は、以下の1~6に関する。1親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつL-アスパラギンを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にL-アスパラギンを生成、蓄積させ、該培養物中からL-アスパラギンを採取することを特徴とするL-アスパラギンの製造法。2微生物が、親株に比べL-アスパラギン合成活性が増強した微生物である、上記1記載の製造法。3微生物が、親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物である、上記1または2記載の製造法。4微生物が、親株に比べL-アスパラギン排出活性が増強した微生物である、上記1~3のいずれか1項に記載の製造法。5親株に比べL-アスパラギン排出活性が増強した微生物が、以下の[1]~[6]のいずれかに記載のDNAを有する組換え体DNAで親株を形質転換して得られる微生物である、上記4記載の製造法。[1]配列番号14で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA[2]配列番号14で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA[3]配列番号14で表されるアミノ酸配列と80以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA4配列番号13で表される塩基配列を有するDNA[5]配列番号13で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA[6]配列番号13で表される塩基配列と80以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA6微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、上記1~5のいずれか1項に記載の製造法。本発明により、L-アスパラギンを生成、蓄積する能力を有する微生物を用いたL-アスパラギンを製造する方法が提供される。本発明は、親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつL-アスパラギンを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にL-アスパラギンを生成、蓄積させ、該培養物中からL-アスパラギンを採取することを特徴とするL-アスパラギンの製造法に関する。1.本発明の製造法に用いられる微生物本発明の製造法で用いられる微生物としては、以下の1~4のいずれかに記載の微生物をあげることができる。1親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつL-アスパラギンを生産する能力を有する微生物親株に比べL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物は、親株の染色体DNA上に存在するL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、a親株に比べ、該蛋白質の比活性が80以下、好ましくは50以下、より好ましくは30以下、さらに好ましくは20以下、特に好ましくは10以下、最も好ましくは0に低下した微生物、およびb親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が80以下、好ましくは50以下、より好ましくは30以下、さらに好ましくは20以下、特に好ましくは10以下、最も好ましくは0に低下した微生物、をあげることができる。より好ましくは該遺伝子の一部または全部が欠損した微生物をあげることができる。L-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、L-アスパラギンを分解する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の[1]~[12]からなる群より選ばれる遺伝子、[1]配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、[2]配列番号4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、[3]配列番号6で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、[4]配列番号2で表されるアミノ酸配列と80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、[5]配列番号4で表されるアミノ酸配列と80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、[6]配列番号6で表されるアミノ酸配列と80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、[7]配列番号1で表される塩基配列を有する遺伝子、[8]配列番号3で表される塩基配列を有する遺伝子、[9]配列番号5で表される塩基配列を有する遺伝子、[10]配列番号1で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、[11]配列番号3で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、および、[12]配列番号5で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、をあげることができる。本明細書において遺伝子とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域およびプロモーター領域などを含んでもよいDNAである。転写調節領域としては、染色体DNA上におけるコーディング領域の5’末端より上流側100塩基、好ましくは50塩基からなるDNAをあげることができ、プロモーター領域としては、10および35領域に相当する領域をあげることができる。L-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入は、該蛋白質の活性を親株より低下または喪失させる塩基の欠失、置換または付加であれば、塩基の種類および数に制限はないが、塩基の欠失としては、プロモーターおよび転写調節領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは全部の領域の欠失、コーディング領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上、特に好ましくは200塩基以上、最も好ましくはコーディング領域全部の欠失をあげることができる。塩基の置換としては、コーディング領域の5’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基を置換してナンセンスコドンを導入する置換をあげることができる。塩基の付加としては、コーディング領域の5’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基の直後に、50塩基以上、好ましくは100塩基以上、より好ましくは200塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上、特に好ましくは1kb以上のDNA断片を付加することをあげることができ、特に好ましくはクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子などの挿入をあげることができる。また、コーディング領域の5’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内に1~2塩基を付加または欠失して、フレームシフト変異を導入する付加または欠失を挙げることができるJournalofBiologicalChemistry272861186171997、ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA9555115515、JournalofBiologicalChemistry2662083320839。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、KarlinandAltschulによるアルゴリズムBLASTProNatlAcadSciUSA905873やFASTAMethodsEnzymol18363を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている[JMolBiol215403]。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore=100、wordlength=12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGappedBLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法はよく知られている。親株に比べ、該蛋白質の活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物を培養し、培養物を超音波等で処理したあと、該処理物にL-アスパラギンを加え、分解されたL-アスパラギン量をHPLCで測定、比較することにより確認できる。親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物であることは、例えば、該遺伝子の転写量を、ノーザンブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタンブロッティングにより、親株と比較することにより確認することができる。上記でいうハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるDNAである。プローブとして用いられるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAをあげることができ、プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAをあげることができる。DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラークローニング第2版、第3版2001年、MethodsforGeneralandMolecularBacteriologyASMPress1994、ImmunologymethodsmanualAcademicpressに記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドDNAラベリングキットロシュダイアグノスティックス社製などをあげることができる。上記のストリンジェントな条件とは、DNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50ホルムアミド、5×SSC750mmollの塩化ナトリウム、75mmollのクエン酸ナトリウム、50mmollのリン酸ナトリウムpH76、5×デンハルト溶液、10の硫酸デキストラン、および20μglの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42°Cで一晩、インキュベートした後、例えば約65°Cの02×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE20×SSCEは、3mollの塩化ナトリウム、02mollのリン酸二水素ナトリウム、002mollのEDTA、pH74、05のSDS、30のホルムアミド、100μglの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で、37°Cで一晩インキュベートした後、50°Cの1×SSC、01SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度例えば5×SSCの溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号1、3または5で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有するDNAをあげることができる。L-アスパラギンを生産する能力とは、本発明に用いる微生物を培地に培養したときに、L-アスパラギンを培養物から回収できる程度に生産する能力をいう。L-アスパラギンを生産する能力を有する微生物は、親株が当該性質を元来有している場合はその性質が強化された微生物であってもよく、親株が当該性質を有していない場合は、当該性質を人工的に付与した微生物をあげることができる。本明細書において親株とは、遺伝子改変、および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。元株及び宿主株は野生株であってもよいし、人為的操作により例えばL-アスパラギンの生産能が野生株より向上した変異株であってもよい。本発明で用いられる微生物は、いずれの微生物であってもよいが、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌、さらに好ましくはエシェリヒアEscherichia属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネア属およびモルガネラ属からなる群より選ばれる属に属する微生物、特に好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、最も好ましくはエシェリヒアコリEscherichiacoliをあげることができる。エシェリヒアコリとしては、エシェリヒアコリK12株、B株、W株およびBr株からなる群より選ばれる野生株またはその変異株を、好ましくは、エシェリヒアコリXL1Blue、エシェリヒアコリXL2Blue、エシェリヒアコリDH1、エシェリヒアコリMC1000、エシェリヒアコリATCC12435、エシェリヒアコリW1485、エシェリヒアコリJM109、エシェリヒアコリHB101、エシェリヒアコリNo49、エシェリヒアコリW3110、エシェリヒアコリNY49、エシェリヒアコリMP347、エシェリヒアコリNM522、エシェリヒアコリBL21、エシェリヒアコリME8415、エシェリヒアコリATCC9637等を挙げることができる。2親株の微生物に比べL-アスパラギン合成活性が増強した微生物本発明の製造法で用いられる微生物としては、1に記載の微生物を親株として、該親株の微生物に比べL-アスパラギン合成活性が増強しており、かつL-アスパラギンを生産する能力を有する微生物をあげることができる。本明細書において、L-アスパラギン合成活性とは、糖からL-アスパラギンを合成する活性、好ましくはL-アスパラギン酸を基質としてL-アスパラギンを合成する活性をいう。親株の微生物に比べL-アスパラギン合成活性が増強した微生物としては、a親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物、ならびにii親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、およびb該蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物を挙げることができる。上記aのiに記載の微生物としては、親株が有する該蛋白質のアミノ酸配列において1アミノ酸以上、好ましくは1~10アミノ酸、より好ましくは1~5アミノ酸、さらに好ましくは1~3アミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異型蛋白質を有する微生物をあげることができる。親株に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、親株および変異型蛋白質を有する微生物を培養し、培養物を超音波等で処理したあと、該処理物にLアスパラギン酸とその他の基質を加え、合成されたL-アスパラギン量をHPLCで測定、比較することにより確認できる。上記aのiiに記載の微生物としては、親株の染色体DNA上に存在する該遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において1塩基以上、好ましくは1~10塩基、より好ましくは1~5塩基、さらに好ましくは1~3塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該遺伝子の発現量が増大した微生物、および親株の染色体DNA上に存在する該遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該遺伝子の発現量が増大した微生物をあげることができる。親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該遺伝子の転写量を、ノーザンブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタンブロッティングにより、親株と比較することにより確認することができる。上記bに記載の微生物としては、該蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより、染色体DNA上において該遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドDNAとして染色体DNA外に該遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。親株の染色体DNA上において該遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドDNAとして染色体DNA外に該遺伝子を保有させた微生物であることは、例えば、微生物が元来、染色体DNA上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてPCRにより増幅産物を確認する方法、および該遺伝子の転写量をノーザンブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタンブロッティングにより、親株と比較する方法等により確認することができる。L-アスパラギン合成活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、具体的には以下の[1]~[6]からなる群より選ばれる蛋白質、[1]配列番号8で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、[2]配列番号10で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、[3]配列番号8で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質、[4]配列番号10で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質、[5]配列番号8で表されるアミノ酸配列と80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質、および[6]配列番号10で表されるアミノ酸配列と80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質、をあげることができる。上記において、1以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン合成活性を有する蛋白質は、後述の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号8または10で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、1個から数十個、好ましくは1~20個、より好ましくは1~10個、さらに好ましくは1~5個である。配列番号8または10で表されるアミノ酸配列において1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、1個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-アルギニン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、L-システインなどが挙げられる。以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2アミノブタン酸、メチオニン、Oメチルセリン、tブチルグリシン、tブチルアラニン、シクロヘキシルアラニンB群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2アミノアジピン酸、2アミノスベリン酸C群:アスパラギン、グルタミンD群:リジン、アルギニン、オルニチン、24ジアミノブタン酸、23ジアミノプロピオン酸E群:プロリン、3ヒドロキシプロリン、4ヒドロキシプロリンF群:セリン、スレオニン、ホモセリンG群:フェニルアラニン、チロシンアミノ酸配列の同一性は、上記11記載のアルゴリズムBLASTやFASTAを用いて決定することができる。配列番号8または10で表されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、アスパラギン合成活性を有する蛋白質であることは、例えばDNA組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製し、培地で培養し、培養物中のL-アスパラギン量を測定することにより確認することができる。L-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNAとしては、該活性を有する蛋白質をコードするDNAであればいずれでもよいが、具体的には以下の[7]~[13]からなる群より選ばれるDNA、[7]上記[1]~[6]のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA、[8]配列番号7で表される塩基配列を有するDNA、[9]配列番号9で表される塩基配列を有するDNA、[10]配列番号7で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNA、[11]配列番号9で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNA、[12]配列番号7で表される塩基配列と80以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNA、および、[13]配列番号9で表される塩基配列と80以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNA、をあげることがでる。上記でいうハイブリダイズするとの記載、DNAのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は、上記11の記載と同じである。上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号7または9で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有するDNAをあげることができる。3親株の微生物に比べL-アスパラギン取込活性が低下、または喪失した微生物本発明の製造法で用いられる微生物としては、上記1または2に記載の微生物を親株として、該親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつL-アスパラギンを生産する能力を有する微生物をあげることができる。本明細書において、L-アスパラギン取込活性とは、細胞外から細胞内にL-アスパラギンを取込む活性をいう。親株に比べL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物は、染色体DNA上に存在する変異が入っていない野生型のL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、a親株に比べ、該蛋白質の比活性が80以下、好ましくは50以下、より好ましくは30以下、さらに好ましくは20以下、特に好ましくは10以下、最も好ましくは0に低下した微生物、およびb親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が80以下、好ましくは50以下、より好ましくは30以下、さらに好ましくは20以下、特に好ましくは10以下、最も好ましくは0に低下した微生物、をあげることができる。より好ましくは該遺伝子の一部または全部が欠損した微生物をあげることができる。L-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、L-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の[1]~[4]からなる群より選ばれる遺伝子、[1]配列番号12で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、[2]配列番号12で表されるアミノ酸配列と80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、[3]配列番号11で表される塩基配列からなる遺伝子、および、[4]配列番号11で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、をあげることができる。L-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入、およびアミノ酸配列や塩基配列の同一性についての記載は、上記11の記載と同じである。親株に比べ、L-アスパラギン取込活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をL-アスパラギンを含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のL-アスパラギン比を比較することにより確認できる。親株に比べ、該蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物であることは、例えば、該遺伝子の転写量を、ノーザンブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタンブロッティングにより、親株と比較することにより確認することができる。上記でいうハイブリダイズするとの記載、DNAのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は上記11の記載と同じである。上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号11で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有するDNAをあげることができる。4親株の微生物に比べL-アスパラギン排出活性が増強した微生物本発明の製造法で用いられる微生物としては、上記1~3のいずれかに記載の微生物を親株として、該親株に比べL-アスパラギン排出活性が増強しており、かつL-アスパラギンを生産する能力を有する微生物をあげることができる。本明細書において、L-アスパラギン排出活性とは、細胞内から細胞外にL-アスパラギンを排出する活性をいう。親株の微生物に比べL-アスパラギン排出活性が増強した微生物としては、a親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物、ならびにii親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、およびb該蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物を挙げることができる。上記aのiに記載の微生物としては、親株が有する該蛋白質のアミノ酸配列において1アミノ酸以上、好ましくは1~10アミノ酸、より好ましくは1~5アミノ酸、さらに好ましくは1~3アミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その活性が増強した変異型蛋白質を有する微生物をあげることができる。親株に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、該蛋白質をコードするDNAで親株を形質転換して得られる形質転換株の培養物とL-アスパラギンとを緩衝液中に存在せしめ、水性媒体中に生成、蓄積したL-アスパラギン量を該親株のそれと比較することにより確認できる。上記aのiiに記載の微生物としては、親株の染色体DNA上に存在する該遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において1塩基以上、好ましくは1~10塩基、より好ましくは1~5塩基、さらに好ましくは1~3塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該遺伝子の発現量が増大した微生物、および親株の染色体DNA上に存在する該遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該遺伝子の発現量が増大した微生物をあげることができる。親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該遺伝子の転写量を、ノーザンブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタンブロッティングにより、親株と比較することにより確認することができる。上記bに記載の微生物としては、該蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより、染色体DNA上において該遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドDNAとして染色体DNA外に該遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。親株の染色体DNA上において該遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドDNAとして染色体DNA外に該遺伝子を保有させた微生物であることは、例えば、微生物が元来、染色体DNA上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてPCRにより増幅産物を確認する方法、および該遺伝子の転写量をノーザンブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタンブロッティングにより、親株と比較する方法等により確認することができる。L-アスパラギン排出活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、具体的には以下の[1]~[3]からなる群より選ばれる蛋白質、[1]配列番号14で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、[2]配列番号14で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質、および、[3]配列番号14で表されるアミノ酸配列と80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質、をあげることができる。上記において、1以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン排出活性を有する蛋白質は、後述の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号14で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、1個から数十個、好ましくは1~20個、より好ましくは1~10個、さらに好ましくは1~5個である。配列番号14で表されるアミノ酸配列において1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、上記12の記載と同じである。アミノ酸配列の同一性は、上記11記載のアルゴリズムBLASTやFASTAを用いて決定することができる。配列番号14で表されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、L-アスパラギン排出活性を有する蛋白質であることは、例えばDNA組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製し、培地で培養し、菌体中のL-アスパラギン排出活性を測定することにより確認することができる。L-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNAとしては、該活性を有する蛋白質をコードするDNAであればいずれでもよいが、具体的には以下の[4]~[7]からなる群より選ばれるDNA、[4]上記[1]~[3]のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA、[5]配列番号13で表される塩基配列を有するDNA、[6]配列番号13で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA、および、[7]配列番号13で表される塩基配列と80以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA、をあげることがでる。上記でいうハイブリダイズするとの記載、DNAのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は、上記11の記載と同じである。上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号13で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有するDNAをあげることができる。2.本発明の製造法で用いられる微生物の造成法1上記11の微生物の造成法上記11の微生物は、例えば、L-アスパラギン分解活性を有する微生物を親株とし、該親株のL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質の活性を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて、低下、または喪失させることにより得ることができる。突然変異処理法としては、例えば、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンNTGを用いる方法微生物実験マニュアル、1986年、131頁、講談社サイエンティフィック社、紫外線照射法等をあげることができる。組換えDNA技術による遺伝子置換法としては、試験管内でL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、相同組換えにより該遺伝子を親株の染色体DNA上の目的の領域と置換する方法をあげることができる。L-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、例えば上記11のL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネア属またはモルガネラ属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒアの染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた、上記微生物の染色体DNAを鋳型としたPCRPCRProtocolsAcademicPressにより取得することができる。また、各種の遺伝子配列データベースに対して上記11記載のL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列と80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の同一性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する微生物の染色体DNA、cDNAライブラリー等から上記した方法によりL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードするDNAを取得することもできる。取得したDNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法ProcNatlAcadSciUSA745463または3700DNAアナライザーアプライドバイオシステムズ社製等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。上記のベクターとしては、pBluescriptIIKSストラタジーン社製、pDIRECTNucleicAcidsRes186069、pCRScriptAmpSKストラタジーン社製、pT7Blueノバジェン社製、pCRIIインビトロジェン社製およびpCRTRAPジーンハンター社製などをあげることができる。組換え体DNAの導入方法としては、宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法ProcNatlAcadSciUSA692110、プロトプラスト法特開昭63248394、エレクトロポレーション法NucleicAcidsRes166127等をあげることができる。塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブバイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを調製することもできる。上記方法で取得することができる遺伝子としては、配列番号2、4または6で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする、配列番号1、3または5で表される塩基配列を有する遺伝子をあげることができる。試験管内でL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法としては、例えばMolecularcloningalaboratorymanual3rdedColdSpringHarborLaboratoryPress以下、モレキュラークローニング第3版と略す、CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySons以下、カレントプロトコールズインモレキュラーバイオロジーと略す、NucleicAcidsResearch106487、ProcNatlAcadSciUSA796409、Gene34315、NucleicAcidsResearch134431、ProcNatlAcadSciUSA82488等に記載されている部位特異的変異導入法に準ずる方法をあげることができる。上記の方法で調製した遺伝子を、相同組換え等により親株の染色体DNA上の目的の領域と置換する方法としては、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドDNAと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができ、エシェリヒアコリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法[ProcNatlAcadSciUSA9766416645]をあげることができる。さらに、変異体DNAと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異rpsL遺伝子を有する大腸菌に野生型rpsL遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法MolMicrobiol55137BiosciBiotechnolBiochem712905等を用いて、親株の染色体DNA上の目的の領域が上記の方法で調製した遺伝子に置換された株を取得することができる。また上記の方法に限らず、微生物の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることができる。親株に比べ、L-アスパラギン分解活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失した微生物であることは、上記11記載の方法で確認することができる。2上記12の微生物の造成法上記12の微生物のうち、a親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、上記21の方法で造成される微生物を親株として、該親株のL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより得ることができる。突然変異処理法は、上記11の方法をあげることができる。組換えDNA技術による遺伝子置換法は、L-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNAに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体DNA上に存在するL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記21の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。L-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNAは、例えば、上記12の該DNAの塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いて、上記21のPCRを用いた方法等により取得することができる。上記のようにして取得されるDNAとして、例えば、配列番号8または10で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA、および配列番号7または9で表される塩基配列を有するDNAをあげることができる。上記方法により取得した微生物が目的の微生物であることは、上記12の方法を用いて、該微生物と親株のL-アスパラギン合成活性を測定し、比較することにより、確認することができる。上記12の微生物のうち、a親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ii親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、上記21の方法で造成される微生物を親株として、該親株のL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。突然変異処理法は、上記21の方法をあげることができる。組換えDNA技術による遺伝子置換法は、親株が有するL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するDNAを試験管内における変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより該DNAに変異を導入した後、親株の染色体DNA上に存在するL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記21記載の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。また、親株のL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。そのようなプロモーターとしては、親株としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、エシェリヒアコリで機能するtrpプロモーターPtrp、lacプロモーターPlac、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、エシェリヒアコリやファージ等に由来するプロモーターを、親株としてバチルス属に属する微生物を用いる場合、バチルスサチルスで機能するSPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またPtrpを2つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロモーターなどの人為的に造成したプロモーターもあげることができる。上記方法にて取得した微生物が、親株の微生物に比べ、L-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、上記12の方法で確認することができる。上記12の微生物のうち、bL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。上記の方法で得られるL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNAをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。該DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製する。該組換え体DNAで、上記21の方法で造成される微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、L-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。原核生物を宿主細胞として用いる場合は、該DNAを有する組換え体DNAは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該DNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。発現ベクターとしては、例えば、宿主細胞にエシェリヒアコリを用いる場合、pColdI、pCDF1b、pRSF1bいずれもノバジェン社製、pMALc2xニューイングランドバイオラブス社製、pGEX4T1ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製、pTrcHisインビトロジェン社製、pSE280インビトロジェン社製、pGEMEX1プロメガ社製、pQE30キアゲン社製、pET3ノバジェン社製、pKYP10特開昭58110600、pKYP200AgricBiolChem48669、pLSA1AgricBiolChem53277、pGEL1ProcNatlAcadSciUSA824306、pBluescriptIISK、pBluescriptIIKSストラタジーン社製、pTrS30エシェリヒアコリJM109pTrS30より調製、pTrS32エシェリヒアコリJM109pTrS32より調製、pTK31APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY、2007、Vol73、No20、p63786385pPAC31、pUC19Gene33103、pSTV28、pUC118タカラバイオ社製、pPA1特開昭63233798等を例示することができる。上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒアコリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、trpプロモーターPtrp、lacプロモーターPlac、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、エシェリヒアコリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また親株としてバチルス属に属する微生物を用いる場合、バチルスサチルスで機能するSPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等も用いることができる。またPtrpを2つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。リボソーム結合配列であるシャイン-ダルガノShineDalgarno配列と開始コドンとの間を適当な距離例えば6~18塩基に調節したプラスミドを用いることが好ましい。L-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。このような組換え体DNAとしては、例えば後述するpTKasnA、およびpTKasnBをあげることができる。また、上記の方法で得られるL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするDNAを、上記21の相同組換え法を用いることで、染色体DNAの任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。上記の方法で取得した微生物が、親株よりもL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物であることは、上記12の方法を用いて確認することができる。3上記13の微生物の造成法上記13の微生物は、例えば、上記21または2の方法で取得できる微生物を親株とし、該親株のL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質の活性を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて、低下、または喪失させることにより得ることができる。突然変異処理法は、上記11の方法をあげることができる。組換えDNA技術による遺伝子置換法としては、試験管内でL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、上記21の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。L-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、例えば上記13のL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いて、上記21のPCRを用いた方法等により取得することができる。上記方法で取得することができる遺伝子としては、配列番号12で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする、配列番号11で表される塩基配列を有する遺伝子をあげることができる。試験管内でL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法、および、上記の方法で調製した遺伝子を、相同組換え等により親株の染色体DNA上の目的の領域と置換する方法は、上記21の方法と同じである。親株に比べ、L-アスパラギン取込活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失した微生物であることは、上記13の方法で確認することができる。4上記14の微生物の造成法上記14の微生物のうち、a親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、上記21~3のいずれかに記載の方法で造成される微生物を親株として、該親株のL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。突然変異処理法は、上記21の方法をあげることができる。組換えDNA技術による遺伝子置換法は、L-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNAに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体DNA上に存在する該蛋白質をコードする遺伝子と、上記21の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。L-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNAは、例えば、上記14に従い、該DNAの塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いて、上記21のPCRを用いた方法等により取得することができる。上記のようにして取得されるDNAとして、例えば、配列番号14で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA、および配列番号13で表される塩基配列を有するDNAをあげることができる。上記方法により取得した微生物が目的の微生物であることは、上記14の方法を用いて確認することができる。上記14の微生物のうち、a親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ii親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、上記21~3のいずれかに記載の方法で造成される微生物を親株として、該親株のL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。突然変異処理法は、上記11の方法をあげることができる。組換えDNA技術による遺伝子置換法は、親株が有するL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するDNAを試験管内における変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより該DNAに変異を導入した後、親株の染色体DNA上に存在するL-アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記21の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。また、親株のL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。そのようなプロモーターとしては、上記22のプロモーターをあげることができる。上記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、L-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、上記14の方法で確認することができる。上記14の微生物のうち、bL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。上記の方法で得られるL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNAをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。該DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製する。該組換え体DNAで、上記21~3のいずれかに記載の方法で造成される微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、L-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。原核生物を宿主細胞として用いる場合は、該DNAを有する組換え体DNAは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該DNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。発現ベクターとしては、例えば、宿主細胞にエシェリヒアコリを用いる場合、上記22の発現ベクターをあげることができる。上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、上記22のプロモーターをあげることができる。リボソーム結合配列であるシャイン-ダルガノShineDalgarno配列と開始コドンとの間を適当な距離例えば6~18塩基に調節したプラスミドを用いることが好ましい。L-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。このような組換え体DNAとしては、例えば後述するpTrsrarD、およびpSTVrarDをあげることができる。また、上記の方法で得られるL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNAを、上記21の相同組換え法を用いることで、染色体DNAの任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。上記の方法で取得した微生物が、親株よりもL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物であることは、上記14の方法を用いて確認することができる。3.本発明のLアスパラギンの製造法上記2の方法で調製することができる微生物を培地に培養し、培養物中にL-アスパラギンを生成、蓄積させ、該培養物からL-アスパラギンを採取することにより、L-アスパラギンを製造することができる。本発明の製造法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩など本発明の微生物の増殖、およびLアスパラギンの生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、例えばグルコース、糖蜜、フラクトース、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類などをあげることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、アミン等の窒素化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、ペプトン、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。無機塩としては、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カルシウム等を用いることができる。その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸を添加することができる。培養は、振とう培養や深部通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は20~50°C、好ましくは20~42°C、より好ましくは28~38°Cである。培地のpHは5~11の範囲で、好ましくは6~9の中性付近の範囲に維持して培養を行う。培地のpHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、pH緩衝液などを用いて行う。培養時間は、5時間~6日間、好ましくは16時間~3日間である。培養物中に蓄積したL-アスパラギンは、通常の精製方法によって採取することができる。例えばL-アスパラギンは、培養後、遠心分離などで菌体や固形物を除いたあと、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、濃縮、結晶分別等の公知の方法を併用することによって採取することができる。微生物が、Lアスパラギンを生成、蓄積する能力を有することは、該微生物を培地に培養し、該培地中に生成、蓄積するLアスパラギンを公知の方法、例えばHPLCを用いた分析またはバイオアッセイ等により容易に確認することができる。以下に本願発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。遺伝子欠損株の造成a遺伝子欠損用マーカー遺伝子の構築相同組換えを用いたエシェリヒアコリの遺伝子欠損および遺伝子置換のためのマーカー遺伝子として用いるcat遺伝子およびsacB遺伝子を以下の方法で単離した。配列番号15および16で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用い、pHSG396を鋳型としてPCRを行い、cat遺伝子の上流約200bpから下流約100bpを含むDNA断片を得た。PCRはKODPlus東洋紡績社製を用いて、添付説明書に従って行った。また配列番号17および18で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用い、常法により調製したバチルスズブチリス168株の野生型株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、sacB遺伝子の上流約300bpから下流約100bpを含むDNA断片を得た。両DNA断片をそれぞれ精製した後、制限酵素SalIで切断した。フェノール/クロロホルム処理、およびエタノール沈殿を行い、両DNA断片を等モルの比率で混合してライゲーションキットタカラバイオ社製を用いて連結した。該連結反応液をフェノールクロロホルム処理、およびエタノール沈殿にて精製したものを鋳型とし、配列番号16および18で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてPCRを行い、得られた増幅DNAを精製し、cat遺伝子およびsacB遺伝子を含むDNA断片を取得した。bansA遺伝子欠損株の造成配列番号19および20で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号22および23で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒアコリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれansA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。精製した両DNA断片と、catsacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号19および23で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片を分離し、catsacB断片が挿入されたasnA周辺領域を含むDNA断片を得た。上記オリゴヌクレオチドのうち、配列番号20で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号16で表される塩基配列と相補的な配列を、配列番号22で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号18で表される塩基配列と相補的な配列を、それぞれその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物が、マーカー遺伝子であるcatsacB断片を挟み込んだ形で連結できるように設計されている。また、配列番号19ならびに21で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号23ならびに24で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、エシェリヒアコリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれansA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。精製した両DNA断片を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号19および23で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約25kbのDNA断片を分離し、ansA遺伝子が欠損したansA周辺領域を含むDNA断片を得た。上記オリゴヌクレオチドのうち、配列番号21で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号24で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列を一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物がこの部分で連結されることでansA遺伝子が欠損するように設計されている。次に、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpKD46[DatsenkoKAWarnerBLProceedingsoftheNationalAcademyofScienceoftheUnitedStatesofAmericaVol97664066452000]を保持するエシェリヒアコリW3110株に、上記で取得したcatsacB断片の挿入されたansA周辺領域を含むDNA断片をエレクトロポレーションにより導入した。得られた形質転換体を、25mgLのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレートLBクロラムフェニコールに塗布して培養し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。相同組換えが生じた株はクロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示すので、選択したコロニーを、6シュクロースを含むLB寒天プレートおよびLBクロラムフェニコールプレートにレプリカし、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した株を選択した。選択した株について、配列番号19および23で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、ansA遺伝子の位置にcatsacB断片が挿入されていることを確認した後、上記で得られたansA遺伝子が欠損したansA周辺領域を含むDNA断片をエレクトロポレーションにより導入した。得られた形質転換体からクロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した株を選択した。選択された株の中からさらにアンピシリン感受性を示す株、すなわちpKD46が脱落した株を選択し、その株について配列番号19および23で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、ansA遺伝子が欠損していることを確認した。上記のようにしてansA遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒアコリW3110ansA株と命名した。cansB遺伝子欠損株の造成配列番号25および26で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号28および29で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒアコリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、ansB遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansB遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。精製した両DNA断片と、catsacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号25および29で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片を分離し、catsacB断片が挿入されたansB周辺領域を含むDNA断片を得た。また、配列番号25ならびに27で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号29ならびに30で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒアコリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、ansB遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansB遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。精製した両DNA断片を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号25および29で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約25kbのDNA断片を分離し、ansB遺伝子が欠損したansB周辺領域を含むDNA断片を得た。上記で取得したDNA断片、およびエシェリヒアコリW3110株にpKD46を形質転換して得られた株を用い、上記2bに準じた方法により、ansB遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒアコリW3110ansB株と命名した。また、エシェリヒアコリW3110ansA株にpKD46を形質転換して得られた株を用い、同様にして、ansB遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒアコリW3110ansAansB株と命名した。diaaA遺伝子欠損株の造成配列番号31ならびに32で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号34ならびに35で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒアコリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれansA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。精製した両DNA断片と、catsacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号31および35で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片を分離し、catsacB断片が挿入されたiaaA周辺領域を含むDNA断片を得た。また、配列番号31ならびに33で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号35ならびに36で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒアコリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれansA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。精製した両DNA断片を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号31および35で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約25kbのDNA断片を分離し、iaaA遺伝子が欠損したiaaA周辺領域を含むDNA断片を得た。上記で取得したDNA断片、およびエシェリヒアコリW3110ansAansB株にpKD46を形質転換して得られた形質転換株を用い、上記2bに準じた方法により、iaaA遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒアコリW3110ansAansBiaaA株と命名した。eansP遺伝子欠損株の造成配列番号37および38で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号40および41で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒアコリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、ansP遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansP遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。精製した両方DNA断片と、catsacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号37および41で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片を分離し、catsacB断片が挿入されたansP周辺領域を含むDNA断片を得た。また、配列番号37ならびに39で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号41ならびに42で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒアコリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、ansP遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansP遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。精製した両DNA断片を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号37および41で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約25kbのDNA断片を分離し、ansP遺伝子が欠損したansP周辺領域を含むDNA断片を得た。上記で取得したDNA断片、およびエシェリヒアコリW3110ansAansBiaaAansP株にpKD46を形質転換して得られた形質転換株を用い、上記2bに準じた方法により、ansP遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒアコリW3110ansAansBiaaAansP株と命名した。fargA遺伝子欠損株の造成配列番号43ならびに44で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号46ならびに47で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒアコリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、argA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびargA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。精製した両DNA断片と、catsacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号43および47で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片をQiaquickGelExtractionKitを用いて分離し、catsacB断片が挿入されたargA周辺領域を含むDNA断片を得た。また、配列番号43ならびに45で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号47ならびに48で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒアコリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、argA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびargA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。精製した両DNA断片を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号43および47で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約25kbのDNA断片をQiaquickGelExtractionKitキアゲン社を用いて分離し、argA遺伝子が欠損したargA周辺領域を含むDNA断片を得た。上記で取得したDNA断片、およびエシェリヒアコリW3110ansAansBiaaAansP株にpKD46を形質転換して得られた形質転換株を用い、上記2bに準じた方法により、argA遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒアコリW3110ansAansBiaaAansPargA株と命名した。表1は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。アスパラギン合成酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドの造成エシェリヒアコリW3110株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号49ならびに配列番号50で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号51ならびに配列番号52で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてPCR反応を行い、それぞれ、asnA遺伝子領域を含む約10kbのDNA断片以下、asnA遺伝子増幅断片という、およびasnB遺伝子領域を含む約17kbのDNA断片以下、asnB遺伝子増幅断片というを得た。上記で得られたasnA遺伝子増幅断片を制限酵素HindIIIおよびFbaIで、asnB遺伝子増幅断片を制限酵素HindIIIおよびBamHIで消化した後、アガロース電気泳動により該当する増幅産物を切り出し、精製した。また、trpプロモーターを含むエシェリヒアコリの発現ベクターpTK31APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY、2007、Vol73、No20、p63786385を制限酵素HindIIIおよびBamHIで消化後、上記と同様の方法により約49kbのDNA断片を精製した。上記のとおり制限酵素処理したasnA遺伝子増幅断片および発現ベクターpTK31をライゲーションキットタカラバイオ社製を用いて連結した。同様に、制限酵素処理したasnB遺伝子増幅断片および発現ベクターpTK31を連結した。得られた各連結DNAを用いてエシェリヒアコリNM522株を形質転換し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を選択した。該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、それぞれの遺伝子発現ベクターが取得されていることを確認し、pTKasnAおよびpTKasnBと命名した。L-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドの造成エシェリヒアコリW3110株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号53および54で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてPCRを行い、約09kbのDNA断片が増幅したことを確認し、該DNA断片を常法に従って精製した。該DNA断片およびtrpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30[エシェリヒアコリJM109pTrS30より調製]をそれぞれ制限酵素HindIII、SacIで消化し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した後、rarD遺伝子を含む約09kbの断片とpTrs30の制限酵素消化断片とをライゲーションキットタカラバイオ社製を用いて連結した。該連結体DNAを用いてエシェリヒアコリNM522株タカラバイオ社製を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、trpプロモーター下流にrarD遺伝子が連結されたプラスミドであるpTrsrarDが取得されていることを確認した。次にpTrsrarDおよびプラスミドpSTV28をそれぞれ制限酵素EcoRIおよびSacIで切断し、trpプロモーターの下流にrarD遺伝子が連結された16kbの断片とpSTV28の制限酵素消化断片を上記と同様の方法で回収した。上記と同様の方法で連結し、得られた連結体DNAを用いてエシェリヒアコリNM522株を形質転換した後、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択した。選択した形質転換体のコロニーを液体培養し、得られた培養液から公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、trpプロモーター下流にrarDが連結された発現ベクターが得られていることを確認し、該発現ベクターをpSTVrarDと命名した。発酵法によるL-アスパラギンの製造法実施例2で造成したプラスミドpTKasnBを用いて、エシェリヒアコリW3110株、実施例1で造成したエシェリヒアコリW3110ansA株、エシェリヒアコリW3110ansB株、エシェリヒアコリW3110ansAansB株、エシェリヒアコリW3110ansAansBiaaA株、エシェリヒアコリW3110ansAansBiaaAansP株、およびエシェリヒアコリW3110ansAansBiaaAansPargA株を形質転換し、それぞれW3110pTKasnB、W3110ansApTKasnB、W3110ansBpTKasnB、W3110ansAansBpTKasnB、W3110ansAansBiaaApTKasnB、W3110ansAansBiaaAansPpTKasnB、W3110ansAansBiaaAansPargApTKasnBを得た。また、実施例2で造成したプラスミドpTKasnAを用いて、実施例1で造成したエシェリヒアコリW3110ansAansBiaaA株を形質転換し、W3110ansAansBiaaApTKasnAを得た。また、プラスミドpTK31を用いて、実施例1で造成したエシェリヒアコリW3110ansAansBiaaA株を形質転換し、W3110ansAansBiaaApTK31を得た。また、上記操作で得られた形質転換体W3110ansAansBiaaApTKasnB、W3110ansAansBiaaAasnPpTKasnB、およびW3110ansAansBiaaAasnPargApTKasnBに実施例3で造成したプラスミドpSTVrarDを形質転換し、W3110ansAansBiaaApTKasnBpSTVrarD、W3110ansAansBiaaAasnPpTKasnBpSTVrarD、およびW3110ansAansBiaaAasnPargApTKasnBpSTVrarDを得た。a試験管培養によるL-アスパラギンの製造上記操作で得られた形質転換体のうち、W3110pTKasnB、W3110anspTKasnB、W3110ansBpTKasnB、W3110ansAansBpTKasnB、W3110ansAansBiaaApTKasnB、W3110ansAansBiaaApTKasnA、およびW3110ansAansBiaaA株pTK31をそれぞれLBプレート上で30°Cにて一晩培養し、LB培地5mLが入った太型試験管に植菌して、30°Cで12時間、振盪培養した。必要に応じて、100mgLのカナマイシン、25mgLのクロラムフェニコールを添加した。試験管生産培地[グルコース30gL、硫酸マグネシウム7水和物05gL、イーストエキストラクト2gL、硫酸アンモニウム20gL、リン酸二水素カリウム2gL、塩化ナトリウム06gL、チアミン塩酸塩100mgL、硫酸第一鉄七水和物20mgL、硫酸マンガン五水和物20mgL、100mgLLイソロイシン、100mgLウラシル、水酸化ナトリウム溶液によりpH75に調整後、炭酸カルシウム30gL、グルコースおよび硫酸マグネシウム7水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合]が5mL入った太型試験管に05mL植菌し、30°Cで48時間、振盪培養した。培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のLアスパラギン濃度をHPLCにて定量した。HPLC分析は、分離カラムにDevelosilODSHG330X100mm、移動相として、クエン酸三ナトリウム二水和物294gL、硫酸ナトリウム無水142gL、1プロパノール167mlL、ラウリル硫酸ナトリウム3gLを硫酸によってpH24に調整した溶液を、反応相として、ほう酸185gL、水酸化ナトリウム107gL、Brij3535mlL、oフタルアルデヒド06gL、Nアセチル-L-システイン49gLを用い、カラム温度は60°Cで行った。アミノ酸の検出、定量は、分離カラムからの移動相溶出液と、反応相溶液とを混合した後、励起波長360nm、吸収波長440nmの蛍光分析により行った。結果を表2に示す。bジャーファーメンター培養によるL-アスパラギンの製造W3110ansAansBiaaApTKasnB、W3110ansAansBiaaApTKasnBpSTVrarD、W3110ansAansBiaaAansPpTKasnBpSTVrarD、およびW3110ansAansBiaaAansPargApTKasnBpSTVrarDを、それぞれ50mgLのカナマイシンおよび25mgLのクロラムフェニコールを含むLBプレート上で30°Cにて一晩培養しW3110ansAansBiaaApTKasnBは50mgLのカナマイシンのみを含むLBプレート、グルコース15gL、イーストエキストラクト10gL、NaCl25gL、CaCO315gL、50mgLカナマイシン、25mgLクロラムフェニコールからなる培地W3110ansAansBiaaApTKasnBは50mgLカナマイシンのみを含む培地200mlが入ったバッフル付き2リットル三角フラスコへ植菌して、30°Cで12時間、振盪培養した。培養終了後、80mLの培養物を600mlの発酵培地[グルコース30gL別途オートクレーブにて調製、コーンスティープリカー3gL、硫酸アンモニウム20gL、リン酸二水素カリウム442gL、硫酸マグネシウム7水和物25gL、硫酸ナトリウム07gL、塩化カルシウム2水和物023gL、硫酸第一鉄七水和物20mgL、硫酸マンガン7水和物10mgL、硫酸亜鉛7水和物2mgL、硫酸銅5水和物2mgL、塩化ニッケル6水和物2mgL、塩化コバルト6水和物2mgL、ベータアラニン50mgL、ニコチン酸50mgL、チアミン塩酸塩40mgL、ビオチン490μgL、100mgLLイソロイシン、100mgLウラシル]が入ったジャーファーメンターに接種し、1200rpmで攪拌しながら35°C、2L分の通気量で培養した。培養中、pHを73に維持するためにアンモニア溶液を加えた。argA欠失株の培養には、上記600mLの発酵培地に1gLのL-アルギニンを添加した。培養物中のグルコースが完全に消費された時点よりフィード培地[グルコース550gL]を流加して、該フィード培地を400ml添加するまで培養を継続した。培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のLアスパラギンの蓄積濃度をHPLCにて定量した。結晶が培養液中に析出している場合は十分に懸濁した状態で希釈するよう留意した。表3にLアスパラギンの蓄積濃度を示す。