"明細書中に記載の発明。発明の概要本明細書中には、ヒトGPCRの内因性および非内因性型およびその使用を開示する。本発明はまた、以下の項目を提供する。項目1配列番号2のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目2項目1のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目3配列番号1のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目4項目3のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目5配列番号4のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目6項目5のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目7配列番号3のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目8項目7のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目9配列番号6のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目10項目9のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目11配列番号5のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目12項目11のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目13配列番号8のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目14項目13のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目15配列番号7のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目16項目15のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目17配列番号10のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目18項目17のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目19配列番号9のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目20項目19のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目21配列番号12のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目22配列番号84のアミノ酸配列を含んでなる項目21のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目23配列番号11のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目24項目23のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目25配列番号14のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目26配列番号88のアミノ酸配列を含んでなる項目25のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目27配列番号13のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目28項目27のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目29配列番号16のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目30配列番号92のアミノ酸配列を含んでなる項目29のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目31配列番号15のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目32項目31のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目33配列番号18のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目34項目33のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目35配列番号17のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目36項目35のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目37配列番号20のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目38項目37のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目39配列番号19のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目40項目39のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目41配列番号22のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目42項目41のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目43配列番号21のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目44項目43のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目45配列番号24のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目46項目45のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目47配列番号23のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目48項目47のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目49配列番号26のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目50項目49のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目51配列番号25のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目52項目51のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目53配列番号28のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目54項目53のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目55配列番号27のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目56項目55のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目57配列番号30のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目58項目57のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目59配列番号29のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目60項目59のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目61配列番号32のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目62配列番号96のアミノ酸配列を含んでなる項目61のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目63配列番号95のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目64項目63のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目65配列番号34のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目66項目65のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目67配列番号33のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目68項目67のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目69配列番号36のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目70項目69のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目71配列番号35のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目72項目71のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目73配列番号38のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目74項目73のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目75配列番号37のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目76項目75のプラスミドを含んでなる宿主細胞。項目77配列番号40のアミノ酸配列によりコードされるGタンパク質共役型受容体。項目78項目77のGタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。項目79配列番号39のベクターおよびcDNAを含んでなるプラスミド。項目80項目79のプラスミドを含んでなる宿主細胞。発明の詳細な記述受容体に関連して作成された科学文献は、受容体に関して種々の作用を有するリガンドに関する多数の用語を採用している。明白さおよび統一のために、下記の定義を本特許明細書中を通じて使用する。これらの定義がこれらの用語のための他の定義と矛盾する場合には、下記の定義が優先する。アゴニストは、物質が受容体と結合した場合に細胞内反応を活性化するか、または膜にへのGTP結合を増強する物質例えばリガンド、候補化合物を意味するものとする。本明細書中に使用されるアミノ酸の略字を表Aに記載する。表AアラニンALAAアルギニンARGRアスパラギンASNNアスパラギン酸ASPDシステインCYSCグルタミン酸GLUEグルタミンGLNQグリシンGLYGヒスチジンHISHイソロイシンILEIロイシンLEULリシンLYSKメチオニンMETMフェニルアラニンPHEFプロリンPROPセリンSERSトレオニンTHRTトリプトファンTRPWチロシンTYRYバリンVALV部分アゴニストは、これらが受容体に結合された場合にアゴニストの作用よりも低い程度/範囲で細胞内反応を活性化するか、またはアゴニストの作用よりも低い程度/範囲で膜へのGTP結合を増強する物質例えばリガンド、候補化合物を意味するものとする。アンタゴニストは、アゴニストと同じ部位で受容体に競合的に結合するがしかし受容体の活性形により開始された細胞内反応を活性化せず、そしてこれによりアゴニストまたは部分アゴニストによる細胞内反応を阻害できる物質例えばリガンド、候補化合物を意味するものとする。アンタゴニストは、アゴニストまたは部分アゴニストが存在しない場合に基準細胞内反応を低下させない。候補化合物は、スクリーニング技術に適用できる分子例えば化学化合物であり、これに限定はされないを意味するものとする。好ましくは、語句候補化合物は、あらかじめ間接同定過程により決定されたもの間接同定された化合物であって、受容体に対して逆アゴニスト、アゴニストまたはアンタゴニストからなる群から選ばれた化合物として一般的に知られている化合物を含まず、さらに好ましくは、少なくとも1種の哺乳動物内において治療効力を有すると以前に決定された間接同定された化合物を含まず、そして最も好ましくは、ヒトにおいて治療効力を有すると以前に決定された間接同定された化合物を含まない。組成物は、少なくとも1種の成分を含んでなる物質を意味する。薬剤組成物は、組成物の一例である。化合物効力は、受容体結合親和性に対抗して、受容体機能性を阻害または刺激するための化合物の能力の尺度を意味するものとする。化合物効力を検出するための例示的な手段は、本明細書の実施例の部分に開示される。コドンは、一般に、リン酸基に結合し、そして翻訳されるとアミノ酸をコードするヌクレオシドアデノシンA、グアノシンG、シチジンC、ウリジンUおよびチミジンTを含んでなる3個のヌクレオチドまたはヌクレオチドの等価基の群を意味するものとする。構成的活性化受容体は、構成的受容体活性化を受ける受容体を意味するものとする。構成的活性化受容体は内因性または非内因性であることができる。構成的受容体活性化は、受容体とその内因性リガンドまたはその化学的等価物との結合以外の手段により活性状態にある受容体の安定化を意味するものとする。接触または接触するは、生体外系または生体内系のいずれでも、少なくとも2個の部分を一緒にすることを意味するものとする。語句候補化合物に関連する直接同定するまたは直接同定は、構成的活性化受容体、好ましくは構成的活性化オーファン受容体、そして最も好ましくは構成的活性化Gタンパク質共役細胞表面オーファン受容体に対して候補化合物をスクリーニングし、そしてこの化合物の化合物効力を評価することを意味するものとする。この語句は、いかなる場合でも、語句間接同定するまたは間接同定されたにより包含されまたはこれらを包含するとは解釈または理解されない。内因性は、哺乳動物が本来的に産生する物質を意味するものとする。例えば、限定ではないが用語受容体に関する内因性は、哺乳動物例えば、限定ではないがヒトまたはウイルスにより本来的に産生されるものを意味するものとする。反対に、この範囲内での用語非内因性は、哺乳動物例えば、限定ではないがヒトまたはウイルスにより本来的には産生されないものを意味するものとする。例えば、限定ではないが、その内因性形では構成的活性ではないが、しかし操作されると構成的活性となる受容体は、本明細書内では非内因性、構成的活性化受容体と呼ばれるのが最も好ましい。両方の用語は、インビボおよびインビトロ系の両方を記述するために使用できる。例えば、限定ではないが、スクリーニング法において、内因性または非内因性受容体は、生体内スクリーニング系に関連してもよい。別の例であって限定ではないが、哺乳動物のゲノムが非内因性、構成的活性化受容体を含むように操作された場合に、生体内系の手段による候補化合物のスクリーニングが適用可能である。Gタンパク質共役型受容体融合タンパク質およびGPCR融合タンパク質は、本明細書中で開示する本発明の範囲内で、それぞれ、少なくとも1種のGタンパク質、最も好ましくはこのようなGタンパク質のアルファαサブユニットこれはGTPを結合するサブユニットであるに融合された内因性、構成的活性化GPCRまたは非内因性、構成的活性化GPCRを含んでなる非内因性タンパク質を意味し、ここでGタンパク質は、好ましくは内因性オーファンGPCRと本来的に共役するGタンパク質と同じ種類である。例えば、限定ではないが、内因性状態において、Gタンパク質GsαがGPCRと共役する優勢なGタンパク質である場合に、特定のGPCRに基づくGPCR融合タンパク質はGsαに融合したGPCRを含んでなる非内因性タンパク質であろう。ある場合には、以下に記載するように、非-優勢Gタンパク質はGPCRに融合できる。Gタンパク質は、構成的活性GPCRのc-末端に直接融合できるかまたはこれら2者の間にスペーサーがあってもよい。宿主細胞は、その中にプラスミドおよび/またはベクターを組み込まれることができる細胞を意味するものとする。原核生物宿主細胞の場合に、プラスミドは、典型的には、宿主細胞複製物として自律性分子として複製される従って一般に、プラスミドは、真核生物宿主細胞内への導入のために単離される。真核生物宿主細胞の場合には、プラスミドは真核生物宿主細胞が複製された場合にプラスミドが複製されるように、宿主細胞の細胞DNA中に組み込まれる。好ましくは、本明細書中に開示する本発明の目的のためには、宿主細胞は真核生物であり、さらに好ましくは、哺乳動物であり、そして最も好ましくは293、293TおよびCOS-7細胞からなる群より選ばれる。間接同定または間接同定されたは、内因性受容体に特異性の内因性リガンドの同定、リガンド-受容体相互作用を妨害および/またはこれと競合するものの決定のための受容体に対する候補化合物のスクリーニング、および活性化受容体と関連する少なくとも1種の第二メッセンジャー経路に影響するための化合物の効力の評価を含む薬剤発見過程への伝統的な接近方法を意味する。阻害または阻害するは、用語反応に関連して、化合物が存在しない場合の反対に、化合物が存在する場合には反応が低下または防止されることを意味するものとする。逆アゴニストは、受容体の内因性形または受容体の構成的活性化形のいずれかに結合し、そしてアゴニストまたは部分アゴニストが存在しない場合に観察される正常の活性基準レベル以下の受容体の活性形により開始される基礎細胞内反応を阻害し、または膜へのGTP結合を低下させる物質例えばリガンド、候補化合物を意味するものとする。好ましくは、基礎細胞内反応は、逆アゴニストが存在しない場合の基準反応と比較して、逆アゴニストの存在においては少なくとも30、さらに好ましくは少なくとも50、そして最も好ましくは少なくとも75が阻害される。既知受容体は、当該受容体に特異性の内因性リガンドが同定されている内因性受容体を意味するものとする。リガンドは、内因性で本来的に存在する受容体に特異性の内因性で本来的に存在する分子を意味するものとする。内因性受容体の核酸および/またはアミノ酸配列に関する変異体または変異は、内因性、非構成的活性化受容体の変異形が受容体の構成的活性化を明らかにするような内因性配列への特定の変化または多数の変化を意味するものとする。特定の配列の等価体に関して、aヒト受容体の次の変異した形の構成的活性化のレベルが受容体の最初の変異により明らかにされたものと本質的に同じであり、そしてb受容体の次の変異形と受容体の最初の変異体との間の配列アミノ酸および/または核酸相同性の割合が少なくとも約80、さらに好ましくは少なくとも約90そして最も好ましくは少なくとも約95である場合に、ヒト受容体の次の変異形は、ヒト受容体の最初の変異に等価と考えられる。理想的には、そして構成的活性化を達成するために本明細書中で開示した最も好ましいカセットがGPCRの内因性と非内因性形との間の単一アミノ酸および/またはコドン変化を含むという事実のために、配列相同性の割合は少なくとも98でなければならない。非オーファン受容体は、受容体へのリガンドの結合が分子内シグナル伝達経路を活性化する、内因性で本来的に存在するリガンドに特異性の内因性で本来的に存在する分子を意味するものとする。オーファン受容体は、その受容体に特異性の内因性リガンドが同定されていないかまたは既知ではない内因性受容体を意味するものとする。薬剤組成物は、少なくとも1種の活性成分を含んでなる組成物を意味するものとし、ここで組成物は哺乳動物例えば、限定ではないがヒトにおいて特定の効力的な成果のための試験が可能である。通常の当該技術分野の熟練者は、活性成分が、熟練者の要求に基づいて所望の効力的な成果を有するかどうかを決定するために適当な技術を理解しそして認めるであろう。プラスミドは、ベクターおよびcDNAの組合せを意味するものとする。一般に、プラスミドは、タンパク質としてのcDNAの複製および/または発現の目的で宿主細胞内に導入される。第二メッセンジャーは、受容体活性化の結果として生成した細胞内反応を意味するものとする。第二メッセンジャーは、例えば、イノシトール三リン酸IP3、ジアシルグリセロールDAG、サイクリックAMPcAMP、およびサイクリックGMPcGMPを含むことができる。第二メッセンジャー反応は、受容体活性化の決定のために測定できる。さらに、第二メッセンジャー反応は、例えば逆アゴニスト、アゴニスト、部分アゴニストおよびアンタゴニストを含む候補化合物の直接同定のために測定できる。刺激または刺激するは、用語反応に関連して、反応が化合物の存在下で、これが存在しない場合の反対に増加することを意味するものとする。cDNAの関連するベクターは、少なくとも1種のcDNAを組み込むことが可能でそして宿主細胞内に組み込むことが可能な環状DNAを意味するものとする。以下の各セクションの順序は、説明の効率のために決定したものであり、下記の開示または請求の制限を意図せず、そしてそのように解釈してはならない。A.はじめに受容体の伝統的な研究は、発見が受容体に影響できるアンタゴニストおよびその他の分子を発見できるまで進行する前に内因性リガンドが最初に同定されなければならないというアプリオリな仮定歴史に基づくから常に前進していた。アンタゴニストが最初に判明した場合でも、探索は直ちに内因性リガンドの探索に進んだ。この思考の様式は、構成的活性化受容体の発見の後でも受容体研究で継続された。これまで認められていなかったことは、受容体のアゴニスト、部分アゴニスト、および逆アゴニストの発見に最も有用なことは受容体の活性状態であることである。過剰活性の受容体または不足活性の受容体からもたらされる疾患に対して、治療薬剤に望まれるものは、それぞれ、受容体の活性状態を低下するかまたは受容体の活性を増強する化合物であり、必ずしも内因性リガンドに対するアンタゴニストである薬剤ではない。これは、活性受容体状態の活性を低下または増強する化合物は、内因性リガンドとして同じ部位に結合する必要はないためである。従って、本発明の方法により教示されるように、治療化合物のためのあらゆる探索もリガンドに依存しない活性状態に対する化合物をスクリーニングすることにから開始すべきである。B.ヒトGPCRの同定ヒトゲノムプロジェクトの研究は、ヒトゲノム内に位置する核酸配列に関する極めて多数の情報の同定をもたらした。この研究の場合に、ゲノム配列情報は、特定のゲノム配列がヒトタンパク質を翻訳するオープンリーディングフレーム情報を含むかまたは含まないかどうかに関する理解または認識を伴わずにに提供された。ヒトゲノム内の核酸配列を同定する数種の方法は、通常の当該技術分野を有する熟練者の認識範囲内にある。例えば、限定ではないが、本明細書中で開示される種々のヒトGPCRは、ジーンバンクTMデータベースを調査して発見された。下記の表Bは、我々が発見した数種類の内因性GPCRを、開示GPCRに相同である他のGPCRと共に表示する。受容体相同性は、ヒト身体内の受容体の役割の評価を得るために有用である。本明細書の記載の進行に応じて、我々は、これらの受容体の非内因性、構成的活性化型を確立するためにこれらの受容体を変異するための技術を開示するであろう。本明細書中に開示される技術は、当該技術分野では既知の他のヒト、オーファンGPCRにも適用され、これは本明細書の記載の進行に従って明らかとなるであろう。C.受容体スクリーニング本明細書中で開示されるヒトGPCRの非内因性、構成的活性化型に対する候補化合物のスクリーニングは、受容体の内因性リガンドの使用を必要としないで、この細胞表面受容体に作用する候補化合物の直接同定を可能とする。慣用でしばしば商業的に利用できる技術を用いて、本明細書中で開示されるヒトGPCRの内因性型が発現および/または過剰発現される身体内の領域を決定できる。受容体の発現および/または過剰発現と関連する関連疾患/障害状態を決定するためにこれらの技術を用いることも可能であり、このような方法は、本特許明細書中に開示される。本明細書中で開示されるヒトGPCRの構成的活性化を明らかにするであろう変異の創成に関しては、GPCRのTM6内に位置すると想定されるプロリン残基からの距離に基づいている。このアルゴリズム技術は、2000年4月20日付けWO00/22129として公開された同時係属および共通して譲渡された特許明細書PCT出願番号PCT/US99/23938号中に開示されており、これは本明細書中に表示する他の特許文献と一緒に引用することにより本明細書中に編入される。このアルゴリズム技術は、従来の配列整列に基づいては断定されず、上記のTM6プロリン残基または、当然ではあるがこのようなプロリン残基の内因性構成的置換からの指定の距離によりで決定される。この残基から16アミノ酸残基に位置するアミノ酸推定すると受容体のIC3領域内に位置するを最も好ましいリシン残基に変異することにより、このような活性化が得られるであろう。その他のアミノ酸残基は、この目的を達成するためにこの位置における変異に有用であろう。D.疾患/障害同定および/または選択以下に詳細に記載するように、最も好ましくは非内因性、構成的活性化GPCRに対する逆アゴニストおよびアゴニストは、本発明の方法論により同定できる。このような逆アゴニストおよびアゴニストは、本受容体に関連する疾患を治療するための薬剤発見プログラムにおけるリード化合物として理想の候補である。GPCRに対する逆アゴニストを直接同定するための能力、これによる薬剤組成物の開発を可能とすることにより、GPCRに関連する疾患および障害の探索が可能である。例えば、GPCRの存在に関する疾患および正常組織試料の両方のスキャニングは、学問的な実験または特定のGPCRへの内因性リガンドを同定するための経路に沿って追跡する程度を越えてきている。組織スキャンは、健康および疾患組織の広い範囲にわたって行うことができる。このような組織スキャンは、特定の受容体を疾患および/または障害と関連させる場合の好ましい第一段階を提供する。好ましくは、ヒトGPCRのDNA配列は、a組織-mRNAに対するドット-ブロット分析、および/またはb組織試料中の受容体の発現のRT-PCT同定のためのプローブを作製するために使用される。組織採取元内の受容体の存在、または疾患組織、または正常組織と比較して疾患組織内の高い濃度にある受容体の存在は、限定はされないが治療方針とその疾患と関連する疾患との相関を同定するために好んで使用できる。受容体は、この技術により器官の領域に同様に良く定位できる。受容体が局在する特定組織の既知機能に基づいて、受容体の推定される機能的役割が推論できる。E.候補化合物のスクリーニング1.包括的GPCRスクリーニングアッセイ技術Gタンパク質受容体が構成的活性となった場合に、これはGタンパク質例えばGq、Gs、Gi、Gz、Goに結合しそしてGタンパク質へのGTP結合を刺激する。従ってGタンパク質はGTPアーゼとして作用し、そしてゆっくりとGTPをGDPに加水分解し、これにより正常の条件下で受容体は脱活性化する。しかし構成的活性化受容体は、GDPをGTPに交換することを続ける。GTPの非加水分解性類似体である35SGTPγSは、構成的活性化受容体を発現する膜への増強された結合を測定するために使用できる。35SGTPγSが、リガンドが存在しないかまたは存在する場合に膜へのGタンパク質共役を測定するために使用できることが報告されている。当該技術分野の熟練者に周知で使用できるその他の例の中でも、この測定の例は、TraynorおよびNahorskiにより1995年に報告された。このアッセイ系の好ましい使用は、候補化合物の最初のスクリーニングであり、それは、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のGタンパク質にかかわらずすべてのGタンパク質共役型受容体に系が包括的に適用できるからである。2.特異的GPCRスクリーニングアッセイ技術候補化合物が包括的Gタンパク質共役型受容体アッセイすなわち、アゴニスト、部分アゴニスト、または逆アゴニストである化合物を選択するためのアッセイを用いて同定され、さらに化合物が受容体部位で相互作用したことを確認するためのスクリーニングをすることが好ましい。例えば、包括的アッセイで同定された化合物は、受容体に結合しないであろうが、しかし細胞内ドメインからのGタンパク質を単に脱共役するであろう。a.Gs、GzおよびGiGsは、酵素アデニル酸シクラーゼを刺激する。GiおよびGzおよびGoは、反対にこの酵素を阻害する。アデニル酸シクラーゼは、ATPからcAMPへの変換に触媒作用する。従って、Gsタンパク質に共役する構成的活性化GPCRは、cAMPの増加した細胞レベルと関連する。反対に、GiまたはGz、Goタンパク質に共役する構成的活性化GPCRは、cAMPの低下した細胞レベルと関連する。一般的にはシナプス伝達の間接機序第8章NicholsJGetaledsSinauerAssociatesInc参照。従って、cAMPを検出するアッセイは、候補化合物が例えば受容体に対して逆アゴニストであるかどうかを決定するために使用できるすなわちこのような化合物はcAMPのレベルを低下するであろう。cAMPを測定するために当該技術分野で既知の種々の方法が使用できる。最も好ましい方法は、ELISAに基づくフォーマットでの抗-cAMP抗体の使用による。使用できる別のアッセイの種類は、全細胞第二メッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子をコードするタンパク質の発現を駆動する。サイクリックAMPは、cAMP反応性DNA結合タンパク質または転写因子CREBの結合を促進して遺伝子発現を駆動し、転写因子は次いでcAMP反応因子と呼ばれる特定部位でプロモーターに結合しそして遺伝子の発現を駆動する。レポーター遺伝子、例えばβ-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前の多重cAMP反応因子を含むプロモーターを有するレポーター系が構築できる。従って、構成体活性化されたGs-連結受容体は、次いで遺伝子を活性化するcAMPの蓄積およびレポータータンパク質の発現を起こす。レポータータンパク質、例えばβ-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼは、次いで標準生物化学アッセイを用いて検出できる。b.GoおよびGqGoおよびGqは、酵素ホスホリパーゼCの活性化と関連し、これは次いでリン脂質PIP2を加水分解し、2個の細胞内メッセンジャー、ジアシクログリセロールDAGおよびイノシトール1,4,5-トリリン酸IP3を遊離する。IP3の増加した蓄積は、GqおよびGo関連受容体の活性化と関連する。一般的にはシナプス伝達の間接機序第8章NicholsJGetaledsSinauerAssociatesInc参照。IP3蓄積を検出するアッセイは、候補化合物が、例えばGqまたはGo関連受容体に対する逆アゴニストであるかどうかを決定するために使用できるすなわち、このような化合物がIP3のレベルを低下する。Gq関連受容体は、Gq依存性ホスホリパーゼCがAP1因子を含む遺伝子の活性化を起こすAP1レポーターアッセイを用いてでも試験できる。従って、活性化Gq関連受容体は、この遺伝子の発現の増加を明らかにし、これによりその逆アゴニストはこの発現の低下を明らかにし、そしてアゴニストはこの発現の増加を明らかにする。このアッセイのために商業的に利用できるアッセイが利用できる。3.GPCR融合タンパク質逆アゴニスト、アゴニストおよび部分アゴニストの直接同定のための候補化合物のスクリーニングに使用するための内因性、構成的活性オーファンGPCRまたは非内因性、構成的活性化オーファンGPCRの使用は、その定義により、結合する内因性リガンドが存在しない場合でも受容体が活性であるという興味あるスクリーニング問題を提供する。従って、例えば候補化合物の存在における非内因性受容体と、その化合物が存在しない場合の非内因性受容体との間を区別するために、このような化合物が逆アゴニスト、アゴニスト、部分アゴニストであるかどうかまたはこのような受容体に影響しないかどうかに関する理解を可能とさせるこのような区別の目的で、このような区別を増強できる方法を使用することが好ましい。好ましい方法は、GPCR融合タンパク質の使用である。一般に、非内因性オーファンGPCRが上記のアッセイ技術ならびのその他のものを用いて構成的に活性化されたことが一旦決定されると、内因性GPCRと共役する優勢なGタンパク質を決定できる。GPCRへのGタンパク質の共役は、評価できるシグナル伝達経路を提供する。スクリーニングが哺乳動物発現系を用いて行われることが最も好ましいので、このような系は、その中に内因性Gタンパク質を有すると期待される。従って、定義により、このような系内で、非内因性、構成的活性化オーファンGPCRは、連続的にシグナル発生する。この点に関して、例えば受容体への逆アゴニストの存在下でこのシグナルが増強されることが好ましく、特にはスクリーニングの範囲内で、逆アゴニストと接触した受容体の間でさらに容易に区別できる可能性があるようにシグナルが増強されることがさらに好ましい。GPCR融合タンパク質は、非内因性GPCRと共役したGタンパク質の効力を増強することを意図する。GPCR融合タンパク質は、非内因性、構成的活性化GPCRを用いるスクリーニングに好ましく、それは、このような方法がこのスクリーニング技術で最も好ましく使用される信号を増加するからである。これは、有意の信号対雑音比を容易に得るために重要である。このような有意の比は、本明細書中に開示する候補化合物のスクリーニングに有利に導入される。GPCR融合タンパク質の発現のために有用な構築物の構築は、当該技術分野の通常の熟練を有する者の認識範囲内である。商業的に利用できる発現ベクターおよび系は、研究者の特定の要求を満足できる各種の方法を提供する。このようなGPCR融合タンパク質構築物のために重要な基準は、内因性GPCR配列およびGタンパク質配列の両方がインフレームであり好ましくは、内因性GPCRの配列がGタンパク質配列の上流にあるそしてGPCRの終止コドンが、GPCRの発現の際にGタンパク質も発現できるように欠失または置換されていなければならないことである。GPCRは、Gタンパク質に直接連結してもよく、または2個の間のスペーサー残基があることもできる好ましくは、約12個を越えず、この数は当該技術分野の通常の熟練者には容易に確認できるものである。我々は、使用されない幾つかの制限部位が、効果的に発現の際にスペーサーとなるスペーサーの使用を好む便利さのために。最も好ましくは、非内因性GPCRに共役するGタンパク質は、GPCR融合タンパク質構築物の創成の前に同定される。同定されたGタンパク質は僅かしかないので、Gタンパク質の配列を含んでなる構築物すなわち汎用Gタンパク質構築物は、本明細書内の内因性GPCR配列の挿入のために利用できる。これは、異なる配列を有する種々の異なる内因性GPCRの大規模スクリーニングの範囲内で効率を与える。上記のように、Gi、GzおよびGoに共役する構成的活性化GPCRは、cAMPの形成を阻害すると期待され、問題のGPCRのこれらの種類に基づくアッセイを興味あるものとするすなわちcAMPシグナルは活性化の際に低下し、従って例えば逆アゴニストの直接同定を行うこれはこのシグナルをさらに低下させるであろう。本明細書中で開示するように、受容体のこれらの種類に対して、使用可能なシクラーゼに基づくアッセイを確立する研究において、内因性GPCRの内因性Gタンパク質には基づかないGPCR融合タンパク質を創成することが可能であることを我々は確認した。従って、例えば、内因性Gi共役型受容体はGsタンパク質に融合でき、我々はこのような融合構築物が発現されると、内因性GPCRを、本来的なGiタンパク質ではなくて、例えばGsと共役するように駆動または強制し、シクラーゼに基づくアッセイを確立できると信じる。このように、Gi、GzおよびGo共役型受容体に対して、我々は、GPCR融合タンパク質が使用されそしてアッセイがアデニル酸シクラーゼ活性の検出に基づく場合に、融合構築物がGsまたは酵素アデニル酸シクラーゼの形成を刺激する等価Gタンパク質を用いて確立されることを好む。Gs、Gi、GzまたはGoタンパク質と融合したGqタンパク質を用いるGタンパク質融合構築物も同様に有効である。最も好ましい融合構築物は、Gqタンパク質を用いて達成でき、ここで、Gタンパク質α-サブユニットGαqの最初の6個のアミノ酸が欠失しそしてGαqのC-末端の最後の5個のアミノ酸が、関係するGタンパク質のGαの相当するアミノ酸を用いて置換される。例えば、融合構築物は、Giタンパク質と融合したGqアミノ酸6個欠失を有するとができ、Gq/Gi融合構築物をもたらす。我々は、この融合構築物が内因性Gi共役型受容体を非内因性Gタンパク質、Gq、に共役させて、第二メッセンジャー、例えばイノシトール三リン酸またはジアシルグリセロールがcAMP産生の代わりに測定できるように強制すると信じる。4.シグナルエンハンサーGs共役型GPCRを用いる標的Gi共役型GPCRのコトランスフェクションcAMPに基づくアッセイGi共役型受容体はアデニル酸シクラーゼを阻害するとして知られており、従ってcAMP産生のレベルを低下し、これはcAMPレベルの評価を興味深くさせることができる。活性化の際に主としてGiに共役する受容体の構成的活性化の指標としてcAMPの産生の低下を測定する有効な手段は、シグナルエンハンサー、例えば、Gi連結GPCRを用いる活性化の際にGsと主として共役する非内因性、構成的活性化受容体例えば以下の開示するTSHR-A623Iをコトランスフェクションして達成できる。明らかなように、Gs共役型受容体の構成的活性化は、cAMPの産生の増加に基づいて決定できる。Gi共役型受容体の構成的活性化は、cAMP産生の低下に導く。従って、コトランスフェクション法は、これらの反対効果を有利に活用することを意図する。例えば、非内因性、構成的活性化Gs共役型受容体シグナルエンハンサーと内因性Gi共役型受容体標的受容体とのコトランスフェクションは、基準cAMPシグナルを与えるすなわち、Gi共役型受容体はcAMPレベルを低下するけれども、この低下は、構成的活性化Gs共役型受容体シグナルエンハンサーにより確立されるcAMPレベルの本質的な増加と関連する。その際、シグナルエンハンサーと標的受容体の構成的活性化型とのコトランスフェクションにより、cAMPは、Gi標的の増加した機能的活性すなわち、これはcAMPを低下するによりそれ以上に低下基準に対するすると予想される。cAMPに基づくアッセイを用いる候補化合物のスクリーニングは、次いで2条件下で達成できる。第一条件は、Gi共役標的受容体に関して、反対効果をもたらし、すなわちGi共役標的受容体の逆アゴニストは測定されるcAMPシグナルを増加し、一方Gi共役標的受容体のアゴニストはこのシグナルを低下する。第二条件は、明らかなように、この方法を用いて直接同定される候補化合物は、これらがシグナルエンハンシング受容体を標的としないことを確認するために独立して評価されるべきであることであるこれはコトランスフェクションした受容体に対するスクリーニングの前または後に行うことができる。F.薬剤化学必ずではないが一般的には、候補化合物の直接同定は、好ましくは、組合せ化学技術を介して生成された化合物と関連して行われ、これにより数千の化合物がこの分析のためにランダムに調製される。一般に、このようなスクリーニングの結果は、独自のコア構造を有する化合物である。その後、これらの化合物は、好ましくは、これらの薬剤的性質をさらに増強するために好ましいコア構造の周囲に追加の化学修飾が行われる。このような技術は、当該技術分野の熟練者には公知でありそして本明細書中では詳細には取り扱わない。G.薬剤組成物さらに開発するために選択された候補化合物は、当該技術分野の熟練者には周知の技術を用いて薬剤組成物に調剤できる。適当な薬剤的に許容できるキャリヤーは、当該技術分野の熟練者には利用できる。例えば、レミントンの薬剤科学参照。H.その他の効用本明細書に開示したヒトGPCRの非内因型の好ましい使用は、逆アゴニスト、アゴニストまたは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定のためであるが好ましくは薬剤としての使用のため、ヒトGPCRのこれらの型は、研究設定にも使用できる。例えば、GPCRを組み込んだ生体内および生体外系は、正常および疾患の両方のヒトの状態においてこれら受容体が演じる役割をさらに解明および理解するため、ならびにシグナル伝達カスケードを理解するめに適用された構成的活性化の役割を理解するために使用できる。非内因性ヒトGPCRの価値は、これらの独自の特徴により、非内因性ヒトGPCRが、内因性リガンドが同定される前にヒト身体内のこれら受容体の役割を理解するために使用できることにより、研究手段としてのこれらの有用性が高くなることである。開示された受容体のその他の利用は、なかでも本明細書を検討すると当該技術分野の熟練者には明らかとなるであろう。以下の実施例は、本発明の説明の目的で提示するものであり、これを制限するものではない。特定の核酸およびアミノ酸配列が本明細書中で開示されるが、当該技術分野の通常の熟練者は、これらの配列に小さい変更を加えて以下に報告すると同じかまたは実質的に同様の結果を得る能力を有する。一つの配列から他のものへの配列カセットの適用または理解の従来の方法例えば、ラット受容体からヒト受容体へ、またはヒト受容体Aからヒト受容体Bへは、一般に配列整列技術に基づいて断定され、その際、配列は、共通の領域を決定するため研究において整列される。本明細書中に開示する変異法はこの方法にはよらないが、しかしその代わりにアルゴリズム法およびヒトGPCRのTM6領域内に位置する保存されたプロリン残基からの位置的距離に基づく。この方法が確立されると、当該技術分野の熟練者は、本明細書中に開示されると本質的に同じ結果すなわち構成的活性化を得るためにこれに小さい変更を加える能力を有すると信じられる。このような変更方法は、本開示の範囲内にあると考える。実施例1内因性ヒトGPCR1.ヒトGPCRの同定開示される内因性ヒトGPCRは、ジーンバンクTMデータベース情報の調査に基づいて同定された。データベースを調査する間に、下記のcDNAクローンが下記に明らかなように同定された表C2.全長クローニングa.hRUP8配列番号1および2開示されるヒトRUP8は、ESTデータベースdbEST情報の使用に基づいて同定された。dbESTを調査する間に、アクセッション番号AL121755を有するcDNAクローンが、新規のGPCRをコードすると同定された。下記のPCRプライマーがヒト精巣マラソン-レディーcDNAを用いるRT-PCRのために鋳型として用いられた。5’-CTTGCAGACATCACCATGGCAGCC-3’配列番号41、センスおよび5’-GTGATGCTCTGAGTACTGGACTGG-3’配列番号42、アンチセンスPCRはアドヴァンテージcDNAポリメラーゼClontech、製造指針に従うを用い、50ul反応物中で下記のサイクルにより行った:30秒間94°C、10秒間94°C、20秒間65°C、1.5分間72°C、および7分間72°C。サイクル2~4を35回反復した。1.2kbPCR断片を単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて配列決定した。配列番号1参照、RUP8の推定アミノ酸配列を配列番号2に記載する。b.hRUP9配列番号3および4開示されるヒトRUP9は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC011375を有するcDNAクローンが、染色体5からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP9をプライマー5’-GAAGCTGTGAAGAGTGATGC-3’配列番号43、センス、5’-GTCAGCAATATTGATAAGCAGCAG-3’配列番号44、アンチセンスおよびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。タックプラスプレシジョンポリメラーゼを5DMSOを用いる100μl反応物中で、下記のサイクルでステップ2~ステップ4の35回反復による増幅のために使用した:1分間94°C、30秒間94°C、30秒間56°C、2分間72°C、および5分間72°C。1.3KbPCR断片を単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中に1アガロースゲルからクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。配列番号3参照、RUP8の推定アミノ酸配列を配列番号4に記載する。ヒトゲノムDNAから単離したRUP9クローンの配列は、データベースから得た配列と一致した。c.hRUP10配列番号5および6開示されるヒトRUP10は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC008754を有するcDNAクローンが、染色体19からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP10をプライマー5’-CCATGGGGAACGATTCTGTCAGCTACG-3’配列番号45、センスおよび5’-GCTATGCCTGAAGCCAGTCTTGTG-3’配列番号46、アンチセンスおよびヒト白血球マラソンレディーcDNAを鋳型として用いるRT-PCRによりクローニングした。アドヴァンテージcDNAポリメラーゼを50μl反応物中で下記のサイクルでステップ2~ステップ4の35回反復による増幅のために使用した:30秒間94°C、10秒間94°C、20秒間62°C、1.5分間72°C、および7分間72°C。1.0KbPCR断片を単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。新規のヒト受容体RUP10の核酸配列を配列番号5に記載し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号6に記載する。d.hRUP11配列番号7および8開示されるヒトRUP11は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC013396を有するcDNAクローンが、染色体2からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP11をプライマー5’-CCAGGATGTTGTGTCACCGTGGTGGC-3’配列番号47、センス、5’-CACAGCGCTGCAGCCCTGCAGCTGGC-3’配列番号48、アンチセンスおよびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。タックプラスプレシジョンDNAポリメラーゼを50μl反応物中で下記のサイクルでステップ2~ステップ4の35回反復による増幅のために使用した:3分間94°C、20秒間94°C、20秒間67°C、1.5分間72°C、および7分間72°C。1.3KbPCR断片を単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。新規のヒト受容体RUP11の核酸配列を配列番号7に記載し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号8に記載する。e.hRUP12配列番号9および10開示されるヒトRUP12は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AP000808を有するcDNAクローンが、ラットRTAおよびヒトmas1腫瘍遺伝子GPCRと著しい相同性を有する新規のGPCRをコードすると同定された。全長RUP12をプライマー5’-CTTCCTCTCGTAGGGATGAACCAGAC-3’配列番号49、センス5’-CTCGCACAGGTGGGAAGCACCTGTGG-3’配列番号50、アンチセンスおよびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。タックプラスプレシジョンDNAポリメラーゼを下記のサイクルでステップ2~ステップ4の35回反復による増幅のために使用した:3分間94°C、20秒間94°C、20秒間65°C、2分間72°C、および7分間72°C。1.0kbPCR断片を単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した核酸配列に関しては配列番号9そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号10参照。f.hRUP13配列番号11および12開示されるヒトRUP13は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC011780を有するcDNAクローンが、GPCRサカナGRPX-ORYLAと著しい相同性を有する新規のGPCRをコードすると同定された。全長RUP13をプライマー5’-GCCTGTGACAGGAGGTACCCTGG-3’配列番号51、センス5’-CATATCCCTCCGAGTGTCCAGCGGC-3’配列番号52、アンチセンスおよびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。タックプラスプレシジョンDNAポリメラーゼを下記のサイクルでステップ2~ステップ4の35回反復による増幅のために使用した:3分間94°C、20秒間94°C、20秒間65°C、2分間72°C、および7分間72°C。1.35kbPCR断片を単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した核酸配列に関しては配列番号11そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号12参照。g.hRUP14配列番号13および14開示されるヒトRUP14は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AL137188を有するcDNAクローンが、染色体13からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP14をプライマー5’-GCATGGAGAGAAAATTTATGTCCTTGCAACC-3’配列番号53、センス5’-CAAGAACAGGTCTCATCTAAGAGCTCC-3’配列番号54、アンチセンスおよびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。タックプラスプレシジョンポリメラーゼおよび5DMSOを下記のサイクルでステップ2およびステップ3の35回反復による増幅のために使用した:3分間94°C、20秒間94°C、2分間58°C、10分間72°C。1.1KbPCR断片を単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した核酸配列に関しては配列番号13そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号14参照。ヒトゲノムDNAから単離したRUP14クローンの配列は、データベースから得た配列と一致した。h.hRUP15配列番号15および16開示されるヒトRUP15は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC016468を有するcDNAクローンが、ヒトゲノム配列として同定された。全長RUP15をプライマー5’-GCTGTTGCCATGACGTCCACCTGCAC-3’配列番号55、センス5’-GGACAGTTCAAGGTTTGCCTTAGAAC-3’配列番号56、アンチセンスおよびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。タックプラスプレシジョンポリメラーゼを下記のサイクルでステップ2~4の35回反復による増幅のために使用した:3分間94°C、20秒間94°C、20秒間65°C、2分間72°Cおよび7分間72°C。1.5KbPCR断片を単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号15そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号16参照。ヒトゲノムDNAから単離したRUP15クローンの配列は、データベースから得た配列と一致した。i.hRUP16配列番号17および18開示されるヒトRUP16は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AL136106を有するcDNAクローンが、染色体13からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP16をプライマー5’-CTTTCGATACTGCTCCTATGCTC-3’配列番号57、センス、開始コドンの5’5’-GTAGTCCACTGAAAGTCCAGTGATCC-3’配列番号58、アンチセンス、終止コドンの3’およびヒト骨格筋マラソンレディーcDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。アドヴァンテージcDNAポリメラーゼを50ul反応物中で下記のサイクルでステップ2~4の35回反復による増幅のために使用した:30秒間94°C、5秒間94°C、15秒間69°C、1分間72°Cおよび5分間72°C。1.1KbPCR断片を単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてT7シーケナーゼキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号17そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号18参照。RUP16クローンの配列は、AL136106の4個の不規則断片と一致し、これはRUP16cDNAが4個のエキソンからなることを示す。j.hRUP17配列番号19および20開示されるヒトRUP17は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC023078を有するcDNAクローンが、染色体11からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP17をプライマー5’-TTTCTGAGCATGGATCCAACCATCTC-3’配列番号59、センス、開始コドンを含む5’-CTGTCTGACAGGGCAGAGGCTCTTC-3’配列番号60、アンチセンス、終止コドンの3’およびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。アドヴァンテージcDNAポリメラーゼミックスを5DMSOを含む100ul反応物中で下記のサイクルでステップ2~4の30回反復による増幅のために使用した:1分間94°C、15秒間94°C、20秒間67°C、1分30秒間72°Cおよび5分間72°C。970bpPCR断片を1アガロースゲルから単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号19そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号20参照。k.hRUP18配列番号21および22開示されるヒトRUP18は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC008547を有するcDNAクローンが、染色体5からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP18をプライマー5’-GGAACTCGTATAGACCCAGCGTCGCTCC-3’配列番号61、センス、開始コドンの5’、5’-GGAGGTTGCGCCTTAGCGACAGATGACC-3’配列番号62、アンチセンス、終止コドンの3’およびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。タックプラスプレシジョンDNAポリメラーゼを5DMSOを含む100ul反応物中で下記のサイクルでステップ2~4の35回反復による増幅のために使用した:5分間95°C、30秒間95°C、30秒間65°C、2分間72°Cおよび5分間72°C。1.3kbPCR断片を1アガロースゲルから単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号21そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号22参照。l.hRUP19配列番号23および24開示されるヒトRUP19は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC026331を有するcDNAクローンが、染色体12からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP19をプライマー5’-CTGCACCCGGACACTTGCTCTG-3’配列番号63、センス、開始コドンの5’5’-GTCTGCTTGTTCAGTGCCACTCAAC-3’配列番号64、アンチセンス、終止コドンを含むおよびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。タックプラスプレシジョンDNAポリメラーゼを5DMSOを用い下記のサイクルでステップ2~4の35回反復による増幅のために使用した:1分間94°C、15秒間94°C、20秒間70°C、1分30秒間72°Cおよび5分間72°C。1.1kbPCR断片を1アガロースゲルから単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号23そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号24参照。m.hRUP20配列番号25および26開示されるヒトRUP20は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AL161458を有するcDNAクローンが、染色体1からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP20をプライマー5’-TATCTGCAATTCTATTCTAGCTCCTG-3’配列番号65、センス、開始コドンの5’、5’-TGTCCCTAATAAAGTCACATGAATGC-3’配列番号66、アンチセンス、終止コドンの3’およびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。アドヴァンテージcDNAポリメラーゼミックスを5DMSOを用い下記のサイクルでステップ2~4の35回反復による増幅のために使用した:1分間95°C、15秒間95°C、20秒間60°C、1分30秒間72°Cおよび5分間72°C。1.0kbPCR断片を1アガロースゲルから単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号25そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号26参照。n.hRUP21配列番号27および28開示されるヒトRUP21は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC026756を有するcDNAクローンが、染色体13からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP21をプライマー5’-GGAGACAACCATGAATGAGCCAC-3’配列番号67、センス5’-TATTTCAAGGGTTGTTTGAGTAAC-3’配列番号68、アンチセンスおよびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。タックプラスプレシジョンポリメラーゼを5DMSOを含む100ul反応物中で下記のサイクルでステップ2~4の30回反復による増幅のために使用した:1分間94°C、15秒間94°C、20秒間55°C、1分30秒間72°Cおよび5分間72°C。1,014bpPCR断片を1アガロースゲルから単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号27そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号28参照。o.hRUP22配列番号29および30開示されるヒトRUP22は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC027026を有するcDNAクローンが、染色体11からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP22をプライマー5’-GGCACCAGTGGAGGTTTTCTGAGCATG-3’配列番号69、センス、開始コドンを含む5’-CTGATGGAAGTAGAGGCTGTCCATCTC-3’配列番号70、アンチセンス、終止コドンの3’およびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。タックプラスプレシジョンDNAポリメラーゼを5DMSOを含む100ul反応物中で下記のサイクルでステップ2~4の30回反復による増幅のために使用した:94°C、1分間94°C、15秒間55°C、20秒間72°C、1.5分間72°C、5分間。970bpPCR断片を1アガロースゲルから単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号29そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号30参照。p.hRUP23配列番号31および32開示されるヒトRUP23は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC007104を有するcDNAクローンが、染色体4からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP23をプライマー5’-CCAGGCGAGCCGCTAGCGCCATG-3’配列番号71、センス、開始コドンとしてのATC5’-ATGAGCCCTGCCAGGCCCTCAGT-3’配列番号72、アンチセンス、終止コドンとしてのTCAおよびヒト胎盤マラソンレディーDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。アドヴァンテージcDNAポリメラーゼを50ul反応物中で下記のサイクルでステップ2~4の35回反復による増幅のために使用した:30秒間95°C、15秒間95°C、20秒間66°C、1分20秒間72°Cおよび5分間72°C。1.0kbPCR断片を単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号31そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号32参照。q.hRUP24配列番号33および34開示されるヒトRUP25は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC026331を有するcDNAクローンが、染色体12からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP25をプライマー5’-GCTGGAGCATTCACTAGGCGAG-3’配列番号73、センス、開始コドンの5’5’-AGATCCTGGTTCTTGGTGACAATG-3’配列番号74、アンチセンス、終止コドンの3’およびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。アドヴァンテージcDNAポリメラーゼミックスを5DMSOを用い、下記のサイクルでステップ2~4の35回反復による増幅のために使用した:1分間94°C、15秒間94°C、20秒間56°C、1分30秒間72°Cおよび5分間72°C。1.2kbPCR断片を1アガロースゲルから単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号33そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号34参照。r.hRUP25配列番号35および36開示されるヒトRUP25は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC026331を有するcDNAクローンが、染色体12からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP25をプライマー5’-GCTGGAGCATTCACTAGGCGAG-3’配列番号75、センス、開始コドンの5’5’-AGATCCTGGTTCTTGGTGACAATG-3’配列番号76、アンチセンス、終止コドンの3’およびヒトゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。アドヴァンテージcDNAポリメラーゼミックスを5DMSOを用い、下記のサイクルでステップ2~4の35回反復による増幅のために使用した:1分間94°C、15秒間94°C、20秒間56°C、1分30秒間72°Cおよび5分間72°C。1.2kbPCR断片を1アガロースゲルから単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号35そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号36参照。s.hRUP26配列番号37および38開示されるヒトRUP26は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC023040を有するcDNAクローンが、染色体2からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP26をRUP26特異性プライマー5’-AGCCATCCCTGCCAGGAAGCATGG-3’配列番号77、センス、開始コドンを含む5’-CCAGACTGTGGACTCAAGAACTCTAGG-3’配列番号78、アンチセンス、終止コドンを含むおよびヒト胎盤マラソンレディーcDNAを鋳型として用いるRT-PCRによりクローニングした。アドヴァンテージcDNAポリメラーゼミックスを5DMSOを含む100ul反応物中で下記のサイクルでステップ2~4の35回反復による増幅のために使用した:5分間94°C、30秒間95°C、30秒間65°C、2分間72°Cおよび5分間72°C。1.1kbPCR断片を1アガロースゲルから単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号37そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号38参照。t.hRUP27配列番号39および40開示されるヒトRUP27は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号AC027643を有するcDNAクローンが、染色体12からのヒトゲノム配列として同定された。全長RUP27をRUP17特異性プライマー5’-AGTCCACGAACAATGAATCCATTTCATG-3’配列番号79、センス、開始コドンを含む5’-ATCATGTCTAGACTCATGGTGATCC-3’配列番号80、アンチセンス、終止コドンの3’およびヒト成人脳マラソンレディーcDNAを鋳型として用いるPCRによりクローニングした。アドヴァンテージcDNAポリメラーゼミックスを5DMSOを含む50ul反応物中で下記のサイクルでステップ2~4の35回反復による増幅のために使用した:1分間94°C、10秒間94°C、20秒間58°C、1分30秒間72°Cおよび5分間72°C。1.1kbPCR断片を1アガロースゲルから単離し、そしてpCRII-TOPOベクター中にクローニングし、そしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号35そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号36参照。ヒト脳から単離されたRUP27cDNAクローンの配列は,AC027643の5個の不規則断片と一致することが決定され、RUP27cDNAが5個のエキソンからなることを示す。実施例2非内因性、構成的活性化GPCRの調製当該技術分野の熟練者は、核酸配列の変異のための技術を選択する能力を有すると信じられる。下記は、以上に開示した数種のヒトGPCRの非内因性型を創成するために使用される方法である。以下に開示される変異は、保存されるプロリンまたはこれの内因性の保存性置換基残基TM6/IC3界面近くのGPCRのTM6領域内に位置するから16番目のアミノ酸GPCRのIC3領域内に位置するが、好ましくはアラニン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基に、最も好ましくはリシンアミノ酸残基に変異されるアルゴリスム法に基づく。1.トランスフォーマーサイトディレクテッドTM変異誘発非内因性ヒトGPCRの調製は、製造者の指針に従って、トランスフォーマーサイトディレクテッドTM変異誘発キットを用いて、ヒトGPCRについて行ってもよい。2個の変異誘発プライマーを使用し、最も好ましくはリシン変異を創成するリシン変異誘発オリゴヌクレオチド、および選択マーカーオリゴヌクレオチドを用いる。便宜のために、ヒトGPCR内に組み込まれるべきコドン変異も標準形で記録する表D。2.クイクチェンジTMサイトディレクテッドTM変異誘発非内因性ヒトGPCRの調製は、クイクチェンジTMサイトディレクテッドTM変異誘発キット中で混合して調製した。管Bは、24μlリポフェクタミンを0.5mlの血清を含まないDMEM中で混合して調製した。管AおよびBを倒置数回により混合し、次いで室温で30~45分間インキュベーションした。この混合物をトランスフェクション混合物と呼ぶ。プレーティングした293細胞を1XPBSを用いて洗浄し、次いで0.5mlの血清を含まないDMEMを加えた。トランスフェクション混合物1mlを細胞に加え、次いで37°C/5CO2で4時間インキュベーションした。トランスフェクション混合物を吸引して取り出し、次いでDMEM/10ウシ胎児血清の10mlを加えた。細胞を37°C/5CO2でインキュベーションした。48時間インキュベーションした後、細胞を採取しそして分析に使用した。b.安定細胞株:Gs融合タンパク質約12x106293細胞を15cm組織培養プレート上にプレーティングした。10ウシ胎児血清および1ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、および抗生物質を含むDMEハイグルコース媒体中で培養した。プレーティングした24時間後に293細胞は約80集密度となり、細胞をDNA12μgを用いてトランスフェクションした。DNA12μgを、リポフェクタミン60ulおよび血清を含まないDMEハイグルコース媒体2mLと混合した。媒体をプレートから吸引しそして細胞を血清を含まない媒体を用いて一回洗浄した。DNA、リポフェクタミン、および媒体混合物を血清を含まない媒体10mLと一緒にプレートに加えた。37°Cで4~5時間のインキュベーションの後に、媒体を吸引し、そして血清を含む媒体25mlを加えた。トランスフェクションの24時間後に媒体を再度吸引し、そして血清を含む新しい媒体を加えた。トランスフェクションの48時間後に、媒体を吸引しそして血清を含みゲネチシンG418薬剤を含む媒体を加え、最終濃度500μg/mLまで加えた。トランスフェクションした細胞は、ここでG418耐性遺伝子を含む陽性にトランスフェクションされた細胞に関して選択する。選択が起きる度に媒体を4~5日毎に交換した。選択の間に、細胞は安定なプールを創成するために増殖するか、または安定クローン選択のためにスプリットする。実施例4非内因性GPCRの構成的活性の決定のためのアッセイ種々の方法が非内因性ヒトGPCRの構成的活性の評価のために利用される。以下は例示である。当該技術分野の通常の熟練者は、熟練者の要求に優先的に役立つこのような技術を決定する能力を有すると信じられる。1.膜結合アッセイ:35SGTPγSアッセイGタンパク質共役型受容体がその活性状態にある場合に、リガンド結合または構成的活性化のいずれかの結果として、受容体はGタンパク質に結合しそしてGDPの遊離およびその後のGタンパク質へのGTPの結合を刺激する。Gタンパク質共役型受容体複合体のαサブユニットは、GTPアーゼとして作用しそしてGTPをGDPにゆっくりと加水分解し、その時点で受容体は通常は脱活される。構成的活性化受容体はGTPをGDPへ交換することを続ける。非-加水分解性GTP類似体である35SGTPγSは、構成的活性化受容体を発現する膜への35SGTPγSの増強された結合を証明するために使用できる。構成的活性化を測定するために35SGTPγS結合を用いる利点は、aこれがすべてのGタンパク質共役型受容体に包括的に適用される、bこれが、膜表面の近くで細胞内カスケードに影響する分子を取り上げることを困難とすることである。このアッセイは、関係する受容体を発現する膜に結合する35SGTPγSを刺激するGタンパク質共役型受容体の能力を利用する。従って、このアッセイは、既知のオーファンおよび構成的活性化Gタンパク質共役型受容体への候補化合物をスクリーニングするための直接同定法に使用できる。アッセイは包括的であり、そしてすべてのGタンパク質共役型受容体における薬剤発見に適用される。35SGTPγSアッセイは、20mMHEPESおよび1~約20mMMgCl2この量は、20mMが好ましいけれども、結果の最適化のために調節できるpH7.4、約0.3~約1.2nM35SGTPγSこの量は、1.2が好ましいけれども、結果の最適化のために調節できるを含む結合緩衝液および12.5~75μg膜タンパク質例えばGs融合タンパク質を発現する293細胞、この量は最適化のために調節できるおよび10μMGDPこの量は最適化のために調節できる中で1時間インキュベーションした。次いでコムギ胚芽凝集素ビーズ25μl、Amershamを加えそして混合物をさらに30分間、室温でインキュベーションした。次いで管を1500xgで5分間、室温で遠心分離し次いでシンチレーションカウンターでカウントした。2.アデニル酸シクラーゼ細胞に基づくアッセイのために設計されたフラッシュプレートTMアデニル酸シクラーゼキットNewEnglandNuclearカタログ番号SMP004Aは、粗血漿膜と共に用いるために変更できる。フラッシュプレートウエルは、cAMPを認識する特定の抗体も含むシンチラントコーティングを含むことができる。ウエル内で産生されたcAMPはcAMP抗体に対する放射性cAMPトレーサーの結合に関する直接競合により定量できる。以下の記載は、受容体を発現する全細胞内のcAMPレベル内の変化の測定のための簡単なプロトコールとして役立つ。トランスフェクションされた細胞を一過性トランスフェクションの約24時間後に採取した。媒体を注意して吸引して取り出し廃棄した。PBS10mlを細胞のそれぞれの皿におだやかに加え次いで注意して吸引した。Sigma細胞分離緩衝液1mlおよびPBS3mlをそれぞれのプレートに加えた。細胞を皿からピペットで取り出しそして細胞懸濁液を50ml円錐型遠心分離管内に集めた。次いで細胞を室温、1,100rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを注意して適当な体積のPBS約3ml/プレート内に再懸濁した。次いで細胞を血球計数器を用いて計数しそして追加のPBSを加えて細胞の概略数を与えた最終体積約50μl/ウエル。cAMP標準および検出緩衝液検出緩衝液11mlにトレーサー125IcAMP50μlの1μCiを含んでなるを調製し、そして製造者の指示に従って維持した。アッセイ緩衝液をスクリーニングのために新たに調製しそしてこれは刺激緩衝液50μl、試験化合物3ul12uMの最終アッセイ濃度および細胞50μlを含み、アッセイ緩衝液は使用するまで氷上に保管した。アッセイは、適当なウエルにcAMP標準50μlの添加から始まり、次いでウエルH-11およびH-12へPBSA50ulを加えた。刺激緩衝液50μlをすべてのウエルに加えた。DMSOまたは選択した候補化合物を化合物溶液3μlの供給ができるピン器具を用いて適当なウエルに加え、12μM試験化合物の最終アッセイ濃度および全アッセイ体積100μlとした。次いで細胞をウエルに加えそして60分間、室温でインキュベーションした。次いでトレーサーcAMPを含む検出混合物100μlをウエルに加えた。次いでプレートをさらに2時間インキュベーションし、次いでウオラックマイクロベータシンチレーションカウンター内で計数した。次いでcAMP/ウエルの値をそれぞれのアッセイプレート内に含まれる標準cAMP曲線から外挿した。3.Gi共役型標的GPCRのための細胞に基づくcAMPTSHRは、活性化の際にcAMPの蓄積を起こすGs共役型GPCRである。TSHRは、アミノ酸残基623を変異することすなわち、アラニン残基をイソロイシン残基に変化するにより構成的に活性化される。Gi共役型受容体は、アデニル酸シクラーゼを阻害すると予想され、そして、そのために、cAMP産生のレベルを低下し、これはcAMPレベルの問題の評価を可能とする。Gi共役型受容体の構成的活性化の指標としてのcAMPの産生の低下を測定するために有効な技術は、cAMPの基準レベルを確立するためのGi連結標的GPCRを用いるシグナルエンハンサーとして、最も好ましくは非内因性、構成的活性化TSHRTSHR-A6231または内因性、構成的活性Gs共役型受容体を同時トランスフェクションすることにより達成できる。Gi共役型受容体の非内因性型が創成されると、次いで標的GPCRのこの非内因性型は、シグナルエンハンサーと一緒に同時トランスフェクションされ、そしてスクリーニングに使用できるのはこの物質である。我々は、cAMPアッセイを使用する場合にシグナルを効率的に発生するためにこの方法を使用した。この方法は、好ましくはGi共役型受容体に対する候補化合物の直接同定に使用される。この方法を使用した場合に、Gi共役型受容体にとって標的GPCRの逆アゴニストはcAMPシグナルを増加しそしてアゴニストはcAMPシグナルを低下するであろう。第一日目に、2X104293および293細胞/ウエルをプレートアウトする。第二日目に、2個の反応管を調製するそれぞれの管についての下記の比率はプレートあたりである。管Aは、哺乳動物細胞内にトランスフェクションされたそれぞれの受容体の2μgDNAを、1.21の血清を含まないDMEM中で全体で4μgDNA例えばpCMVベクター、変異THSRTHSR-A6231Iを含むpCMVベクター、THSR-A6231IおよびGPCRなどと混合して調製する。管Bは、120μlリポフェクタミンを1.2mlの血清を含まないDMEM中で混合して調製する。次いで、管AおよびBを倒置数回してよく混合し、次いで室温で30~45分間インキュベーションした。混合物をトランスフェクション混合物と呼ぶ。プレーティングした293細胞を1XPBSを用いて洗浄し、次いで血清を含まないDMEM10mlを加える。次いでトランスフェクション混合物2.4mlを細胞に加え、次いで4時間、37°C/5CO2でインキュベーションする。次いでトランスフェクション混合物を吸引して取り出し、次いでDMEM/10ウシ胎児血清25mlを加える。次いで細胞を37°C/5CO2でインキュベーションする。24時間インキュベーションの後、細胞を採取しそして分析に使用する。しかし、細胞に基づくアッセイのために設計されたフラッシュプレートTMアデニル酸シクラーゼキットNewEnglandNuclearカタログ番号SMP004Aは、熟練者の要求に従って粗血漿膜と用いるために変更できる。フラッシュプレートウエルは、cAMPを認識する特定の抗体も含むシンチラントコーティングを含むことができる。ウエル内で産生されたcAMPはcAMP抗体に対する放射性cAMPトレーサーの結合に関する直接競合により定量できる。以下の記載は、受容体を発現する全細胞内のcAMPレベル内の変化の測定のための簡単なプロトコールとして役立つ。トランスフェクションされた細胞を一過性トランスフェクションの約24時間後に採取する。媒体を注意して吸引して取り出して廃棄する。PBS10mlを細胞のそれぞれの皿におだやかに加え次いで注意して吸引する。Sigma細胞分離緩衝液1mlおよびPBS3mlをそれぞれのプレートに加える。細胞を皿からピペットで取り出しそして細胞懸濁液を50ml円錐型遠心分離管内に集める。次いで細胞を室温、1,100rpmで5分間遠心分離する。細胞ペレットを注意して適当な体積のPBS約3ml/プレート内に再懸濁する。次いで細胞を血球計数器を用いて計数しそして追加のPBSを加えて細胞の概略数を与える最終体積約50μl/ウエル。cAMP標準および検出緩衝液検出緩衝液11mlにトレーサー125IcAMP50μlの1μCiを含んでなるを調製し、そして製造者の指示に従って維持する。アッセイ緩衝液をスクリーニングのために新たに調製しなればならずそしてこれは刺激緩衝液50μl、試験化合物3ul12uM最終アッセイ濃度および細胞50μlを含み、アッセイ緩衝液は使用するまで氷上で保管できる。アッセイは、適当なウエルにcAMP標準50μlの添加から始めることができ、次いでウエルH-11およびH-12へPBSA50ulを加える。刺激緩衝液50μlをウエルに加える。選択した化合物例えばTSHを化合物溶液3μlの供給ができるピン器具を用いて適当なウエルに加え、12μM試験化合物の最終アッセイ濃度および全アッセイ体積100μlとする。次いで細胞をウエルに加えそして60分間、室温でインキュベーションする。次いでトレーサーcAMPを含む検出混合物100μlをウエルに加える。次いでプレートをさらに2時間インキュベーションし、次いでウオラックマイクロベータシンチレーションカウンター内で計数する。次いでcAMP/ウエルの値をそれぞれのアッセイプレート内に含まれる標準cAMP曲線から外挿する。4.レポーターに基づくアッセイa.Gre-LucレポーターアッセイGs-関連受容体293および293t細胞をウエルあたりに2x104細胞の密度で96ウエルプレート上にプレートアウトし、そして製造者の指示に従って次の日にリポフェクタミン試薬を用いてトランスフェクションした。DNA/脂質混合物をそれぞれ6ウエルトランスフェクション物について次のように調製した:DMEM100μl中のプラスミドDNA260ngをDMEM100μl中の脂質2μlとおだやかに混合した8xCRE-Lucレポータープラスミド200ng、内因性受容体または非内因性受容体を含んでなるpCMVまたはpCMV単独の50ng、およびGPRS発現プラスミドpcDNA3中のGPRS10ngから成るプラスミドDNA260ng。8XCRE-Lucレポータープラスミドは、以下のようにして調製した:ベクターSRIF-β-galは、pβgal-ベーシックベクター中のBglV-HindIII部位でラットソマトスタチンプロモーター-71/51をクローニングして得られた。cAMP反応因子の8個のコピーは、アデノウイルス鋳型AdpCF126CCRE8参照からPCRにより得られそしてKpn-BglV部位でSRIF-β-galベクター内にクローニングすると、8xCRE-β-galレポーターベクターが得られた。8xCRE-Lucレポタープラスミドは、8xCRE-β-galレポーターベクター中のベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子をHindIII-BamHI部位におけるpGL3-ベーシックベクターから得たルシフェラーゼ遺伝子と置換して生成した。30分、室温でのインキュベーションの後に、DNA/脂質混合物をDMEM400μlを用いて希釈し、そして希釈混合物100μlをそれぞれのウエルに加えた。10FCSを含むDMEM100μlを、細胞カルチャーインキュベーター中での4時間のインキュベーションの後にそれぞれのウエルに加えた。次の日に、トランスフェクションした細胞を10FCSを含むDMEM200μl/ウエルに交換した。8日後に、PBSを用いる洗浄1回の後にフェノールレッドを含まないDMEM100μl/ウエルにウエルを交換した。ルシフェラーゼ活性は、ルクライトTMレポーター遺伝子アッセイキットを用い製造者の指示に従いそして1450マイクロベータTMシンチレーションおよび蛍光カウンターを用いて読み取って次の日に測定した。b.AP1レポーターアッセイGq-関連受容体Gq刺激を検出するための方法は、これらのプロモーター中にAP1因子を含む遺伝子の活性化を起こすGq-依存性ホスホリパーゼCの既知の性質に依存する。パスデテクトTMAP-1cis-レポーティングシステムが、CREBレポーターアッセイに関して以上に記載したプロトコールにしたがって使用できるが、リン酸カルシウム沈降物の成分が410ngpAP1-Luc、80ngpCMV-受容体発現プラスミド、および20ngCMV-SEAPであった点が異なる。c.Srf-LucレポーターアッセイGq-関連受容体Gq刺激を検出するための一つの方法は、そのプロモーター中に血清反応因子を含む遺伝子の活性化を起こすGq依存性ホスホリパーゼCの既知の性質に依存する。パスデテクトTMSRF-Luc-レポーティングシステムが、例えばCOS7細胞中のGq共役活性のアッセイに使用できる。細胞を系のプラスミド成分を用いてトランスフェクションしそして哺乳動物トランスフェクションTMキットを製造者の指示に従って使用して内因性または非内因性GPCRをコードする発現プラスミドを示す。要約すると、410ngSRF-Luc、80ngpCMV-受容体発現プラスミド、および20ngCMV-SEAP分泌されたアルカリホスファターゼ発現プラスミド。アルカリホスファターゼ活性は試料間のトランスフェクション効果における変動を制御するためにトランスフェクションされた細胞の媒体中で測定するを、製造者の指示に従ってリン酸カルシウム沈降物中に混和する。沈降物の半分を96-ウエルプレート中の3ウエル上に均等に分布させ、血清を含まない媒体中の細胞上に24時間保持する。最後の5時間に、指示された場合に、細胞を1μMアンギオテンシンを用いてインキュベーションする。次いで、細胞を溶解しそしてルシライトTMキットおよびトリラックス1450マイクロベータ液体シンチレーションおよび蛍光カウンターを用いて、製造者の指示に従ってルシフェラーゼ活性をアッセイする。データはグラフパッドプリズムTM20aを用いて分析できる。d.細胞内IP3蓄積アッセイGw-関連受容体第一日目に、受容体内因性および/または非内因性を含んでなる細胞を24ウエルプレート上に、通常は1x105細胞/ウエルでプレーティングできるこの数は最適化できるが。第二日目に、細胞を最初、血清を含まないDMEM50μl/ウエル中の0.25μgDNAおよび血清を含まないDMEM50μl/ウエル中の2μlリポフェタミンと混合してトランスフェクションできる。溶液をおだやかに攪拌しそして15~30分間、室温でインキュベーションする。細胞を0.5mlPBSを用いて洗浄し、血清を含まない媒体400μlをトランスフェクション媒体と混合しそして細胞に加える。次いで細胞を3~4時間、37°C/5CO2でインキュベーションし次いでトランスフェクション媒体を除きそして通常の増殖媒体1ml/ウエルで置き換えた。第三日目に、細胞を3H-ミオ-イノシトールを用いて標識する。要約すると、媒体を除きそして細胞を0.5mlPBSを用いて洗浄する。次いで、0.5mlイノシトール不含/血清不含媒体を、ウエルあたりに3H-ミオ-イノシトールの0.25μCiと一緒にウエルあたりに加えそして細胞を16~18時間、37°C/5CO2でインキュベーションする。第四日目に、細胞を0.5mlPBSで洗浄し、そしてイノシトール不含/血清不含媒体10μMパルジリン10mM塩化リチウムを含むアッセイ媒体0.45mlもしくはアッセイ媒体0.4mlおよび10xケタンセリン管内に溶解物を移しそしてクロロホルム/メタノール1:21mlを管当たりに加える。溶液を15秒間ウズ攪拌し、上相をバイオラドAG1-X8TMアニオン交換樹脂100~200メッシュに加える。最初に樹脂を1:1.25W/Vの水を用いて洗浄しそして上相0.9mlをカラム上に加える。カラムを5mMミオ-イノシトール10mlおよび5mMホウ酸Na/60mMギ酸Na10mlを用いて洗浄する。イノシトール三リン酸が0.1Mギ酸/1Mギ酸アンモニウムの2mlを含むシンチレーションカクテル10mlを含むシンチレーションバイアル内で溶離する。カラムを0.1Mギ酸/3Mギ酸アンモニウムの10mlを用いて洗浄しそして2回、ddH2Oを用いてリンスしそして4°C水中で保管する。例示的な結果を以下の表Gに示す。上記の実施例41で開示した構成的活性化を検出するためのGTPγSアッセイの例示的な結果は、ヒトRUP13およびRUP15上でのGs:融合タンパク質構築物を用いて達成された。下記の表Hは、このアッセイから生成されたシグナルおよび示したようなシグナルの相違を表示する。実施例5融合タンパク質調製a.GPCR:Gs融合構築物構成的活性化GPCR-Gタンパク質融合構築物の設計は、以下のように行った:ラットGタンパク質Gsα長形;Itohetal83PNAS3776の5’および3’末端の両方を、この上にHindIII5’-AAGCTT-3’配列を含むように操作した。正しい配列近接するHindIII配列を含むの確認の後に、全配列を、そのベクターのHindIII制限部位を用いてサブクローニングしてpcDNA3.1-中にシャトルした。Gsα配列の正しい方向は、pcDNA3.1-中へのサブクローニングの後に決定した。HindIII配列で変更したラットGsα遺伝子を含むpcDNA3.1-を次いで確認した。これでこのベクターは、汎用Gsαタンパク質ベクターとして利用できた。pcDNA3.1-ベクターは種々の周知の制限部位をHindIII部位の上流に含み、従ってGsタンパク質の上流に、内因性、構成的活性GPCRのコーディング配列を挿入する能力を有利に与える。この同じ方法は、他の汎用G-タンパク質ベクターを創成するためにも利用でき、そして当然ながら、その他の商業的に利用可能、または熟練者に既知の独自のベクターも使用可能であり、その際、重要な基準は、GPCRの配列がGタンパク質のものの上流でそしてインフレームであることである。RUP13は、Gsを介して共役する。下記の例示的GPCR融合タンパク質について、Gsαへの融合が達成された。RUP13-Gsα融合タンパク質構築物を以下のようにして作製した。プライマーは以下のように設計した。5’-gatcTCTAGAATGGAGTCCTCACCCATCCCCCAG-3’配列番号97、センス5’-gatcGATATCCGTGACTCCAGCCGGGGTGAGGCGGC-3’配列番号98、アンチセンス小文字のヌクレオチドはGタンパク質とRUP13との間の制限部位括弧内に示す内のスペーサーとして含まれる。センスおよびアンチセンスプライマーは、スペーサー制限部位に帰属するがGタンパク質とRUP15との間に存在するように、それぞれXbaIとEcoRVのための制限部位を含んでいた。次いで、上記に開示したGsα汎用ベクター内の融合ためのそれぞれの受容体配列を確保するためにPCRを使用し、それぞれ下記のプロトコールを用いた。RUP15のための100ngcDNAを、それぞれプライマーセンスおよびアンチ-センス2μl、10mMdNTP3μL、10XタックプラスTMプレシジョン緩衝液10μL、タックプラスTMプレシジョンポリメラーゼ1μL、および水80μLを含む別々の管に加えた。RUP15のための反応温度およびサイクル時間は、サイクルステップ2~4の35回反復を含んで下記であった。1分間94°C、30秒間94°C、20秒間62°C、1分40秒間72°C、および5分間72°C。PCR産物を1アガロースゲル上を流し次いで精製したデータは記載しない。精製した産物をXbaIおよびEcoRVを用いて消化しそして所望の内挿物を精製しそしてそれぞれの制限部位でGs汎用ベクター内に連結した。陽性クローンを形質転換の後に単離しそして制限酵素消化により決定した。293細胞を用いる発現が、本明細書内に記載したプロトコールを用いて達成された。RUP15-Gs融合タンパク質のそれぞれの陽性クローンを正確さを確認するために配列決定した。核酸配列に関しては配列番号99、そしてアミノ酸配列に関しては配列番号100参照。RUP15は、Gsを介して共役する。下記の例示的GPCR融合タンパク質について、Gsαへの融合が達成された。RUP15-Gsα融合タンパク質構築物を以下のようにして作製した。プライマーは以下のように設計した。5’-TCTAGAATGACGTCCACCTGCACCAACAGC-3’配列番号101、センス5’-gatatcGCAGGAAAAGTAGCAGAATCGTAGGAAG-3’配列番号102、アンチセンス小文字のヌクレオチドはGタンパク質とRUP15との間の制限部位内のスペーサーとして含まれる。センスおよびアンチセンスプライマーは、スペーサー制限部位に帰属するがGタンパク質とRUP15との間に存在するように、それぞれEcoRVとXbaIのための制限部位を含んでいた。次いで、上記に開示したGsα汎用ベクター内の融合ためのそれぞれの受容体配列を確保するためにPCRを使用し、それぞれ下記のプロトコールを用いた。RUP15のための100ngcDNAを、それぞれプライマーセンスおよびアンチ-センス2μl、10mMdNTP3μL、10XタックプラスTMプレシジョン緩衝液10μL、タックプラスTMプレシジョンポリメラーゼ1μL、および水80μLを含む別々の管に加えた。RUP15のための反応温度およびサイクル時間は、サイクルステップ2~4の35回反復を含んで下記であった。1分間94°C、30秒間94°C、20秒間62°C、1分40秒間72°C、および5分間72°C。PCR産物を1アガロースゲル上を流し次いで精製したデータは記載しない。精製した産物を消化した。精製した産物をEcoRVおよびXbaIを用いて消化しそして所望の内挿物を精製しそしてそれぞれの制限部位でGs汎用ベクター内に連結した。陽性クローンを形質転換の後に単離しそして制限酵素消化により決定した。293細胞を用いる発現が、本明細書内に記載したプロトコールを用いて達成された。RUP15-Gs融合タンパク質のそれぞれの陽性クローンを正確さを確認するために配列決定した。核酸配列に関しては配列番号103、そしてアミノ酸配列に関しては配列番号104参照。b.Gq6アミノ酸欠失/Gi融合構築物Gq欠失/Gi融合構築物の設計は、以下のようにして達成できた。N-末端の6個のアミノ酸TELSIMの配列配列番号129Gαq-サブユニットを有する2~7のアミノ酸を欠失しそして配列EYNLB配列番号130を有するC-末端の5個のアミノ酸を、配列DCGLF配列番号131を有するGαIタンパク質の相当するアミノ酸と置き換える。この融合構築物は、下記のプライマー5’-gatcaagcttcCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG-3’配列番号132および5’-gatcggatccTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3’配列番号133およびマウスGαq-野生型を含むプラスミド63313を用い、鋳型として血球凝集素タグを用いるPCRにより得られる。小文字のヌクレオチドはスペーサーとして含まれる。タックプラスプレシジョンDNAポリメラーゼは、ステップ2~4の35回反復を含む下記のサイクルによる複製に使用される。2分間95°C、20秒間95°C、20秒間56°C、2分間72°C、および7分間72°C。PCR産物をpCRII-TOPOベクター内にクローニングしそしてABIビッグダイターミネーターキットを用いて配列決定した。融合構築物の配列を含むTOPOクローンからの挿入物を発現ベクターpcDNA3.1中に、HindIII/BamHI部位で2段クローニング法によりシャトルした。実施例6開示したヒトGPCRの組織分布:RT-PCR数種の新規のヒトGPCRの発現を確認しそして組織分布を決定するためにRT-PCRを適用した。使用したオリゴヌクレオチドは、鋳型としてGPCR特異性そしてヒト多重組織cDNAパネルMTC、Clontechであった。タックDNAポリメラーゼを製造者の指示に従う40μl反応物内の増幅のために使用した。反応物20μlを1.5アガロースゲル上に加えてRT-PCR産物を分析した。下記の表Jは、受容体、サイクル条件および使用したプライマーを表示する。実施例7プロトコール:逆アゴニストおよびアゴニストの直接同定A.35SGTPγSアッセイ我々は内因性、構成的活性GPCRを候補化合物、例えば逆アゴニストの直接同定のために完全には理解されていない理由から使用したけれども、アッセイ内の変動が大きくなることがある。次いで好ましくは、以上に公開したようにGPCR融合タンパク質も非内因性、構成的活性化GPCRと一緒に使用される。我々は、このようなタンパク質を使用する場合にアッセイ内変動が本質的に安定化され、これにより効果的な信号対騒音比が得られるように見えることを認めた。これは候補化合物のさらに強固な同定を可能とする有利な結果を有する。このように、直接同定のためにGPCR融合タンパク質が使用されそして利用する場合には下記のアッセイプロトコールを利用することが望ましい。1.膜調製関係する構成的活性オーファンGPCR融合タンパク質を含んでなりそして逆アゴニスト、アゴニストまたは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定に使用するための膜は、好ましくは下記のように調製される。a.材料膜スクレープ緩衝液は20mMHEPESおよび10mMEDTA、pH7.4を含んでなる。膜洗浄緩衝液は20mMHEPESおよび0.1mMEDTA、pH7.4を含んでなる。結合緩衝液は20mMHEPES、100mMNaCl、および10mMMgCl2、pH7.4を含んでなる。b.操作操作の間を通じてすべての材料を氷上に保持する。第一に、媒体を細胞の集密単層から吸引し、次いで10ml冷PBSを用いてリンスし、次いで吸引する。その後、膜スクレープ緩衝液5mlをスクレープ細胞に加える、これに続いて、50ml遠心分離管内に細胞抽出物を移す20,000rpmで17分間、4°Cで遠心分離する。その後、上清を吸引しそしてペレットを膜洗浄緩衝液30ml中に再懸濁し、次いで20,000rpmで17分間、4°Cで遠心分離する。次いで、上清を吸引しそしてペレットを結合緩衝液内に再懸濁する。次いでこれをブリンクマンポリトロンTMホモジナイザーを用いてホモジナイジングするすべての材料が懸濁するまで15~20秒間バースト。これを本明細書中では膜タンパク質と呼ぶ。2.ブラドフォードタンパク質アッセイホモジナイゼーションに次いで、膜のタンパク質濃度をブラドフォードタンパク質アッセイを用いて決定するタンパク質は約1.5mg/mlまで希釈し、アリコートに入れ、以後の使用のために冷凍-80°Cできる。冷凍した場合に、使用のためのプロトコールは以下である:アッセイの日に、冷凍した膜タンパク質を室温で解凍し、次いでウズ攪拌しそして約12x1.000rpmで約5~10秒間ポリトロンを用いてホモジナイズする。複数の調製のためには、異なる調製物のホモジナイゼーションの間でホモジナイザーを完全に清浄化することに注意することa.材料結合緩衝液上記の通り、ブラドフォード染色試薬、ブラドフォードタンパク質標準を製造者の指示に従って使用する。b.操作2本の管を調製し、一方は膜を含みそして他方は対照のブランクとする。それぞれは結合緩衝液800ulを含む。その後、ブラドフォードタンパク質標準1mg/ml10μlをそれぞれの管に加え、次いで膜タンパク質10μlを一本の管ブランク以外を除いて加える。その後、ブラドフォード染色試薬200μlをそれぞれの管に加え、次いでそれぞれウズ攪拌する。5分後に、管を再びウズ攪拌しそしてその中の材料をキュベットに移す。次いでキュベットをCECIL3041分光光度計を用いて波長595で読み取る。3.直接同定アッセイa.材料GDP緩衝液は、37.5ml結合緩衝液および2mgGDPから成り、次いで結合緩衝液中の一連の希釈により0.2μMGDPが得られるそれぞれのウエル内のGDPの最終濃度は、0.1μMGDP。候補化合物を含んでなるそれぞれのウエルは100μlDPG緩衝液最終濃度、0.1μMGDP、結合緩衝液中の膜タンパク質50ul、および結合緩衝液中の35SGTPγS0.6nM50μl10ml結合緩衝液あたり2.5μl35SGTPγSから成る200ulの最終体積を有する。b.操作候補化合物は、好ましくは96ウエルプレートフォーマットを用いてスクリーニングされるこれらは-80°Cで冷凍できる。膜タンパク質または対照としてGPCR融合タンパク質を含まない発現ベクターを有する膜を懸濁するまで短時間ホモジナイズする。次いで、タンパク質濃度を上記のブラドフォードタンパク質アッセイセットを用いて決定する。次いで膜タンパク質および対照を結合緩衝液中で0.25mg/mlまで希釈する最終アッセイ濃度、12.5μgウエル。その後、GDP緩衝液100μlをウオラックシンチストリップTMのそれぞれのウエルに加えた。次いで候補化合物5ulをこのウエル内に移すために5ulピン器具を用いるすなわち200μlの全アッセイ体積中の5ulは、候補化合物の最終スクリーニング濃度が10μMであるような1:40の比である。再度、汚染を防ぐために、それぞれの移動ステップの後、水1X、エタノール1Xおよび水2Xを含んでなる3基の容器内でピン器具を洗浄すること。過剰の液体をそれぞれのリンスの後に器具から振り払いそして紙およびキムワイプを用いて乾燥すること。その後、膜タンパク質50μlをそれぞれのウエルに加えGPCR融合タンパク質を含まない膜を含んでなる対照ウエルも使用する、そして5~10分間、室温で予備インキュベーションする。その後、結合緩衝液中の35SGTPγS0.6nM50μlをそれぞれのウエルに加え、次いで振とう器内で60分間、室温でインキュベーションするこの実施例でもプレートをフォイルで覆う。次いで、プレートを400rpmで15分間、22°Cで回転してアッセイを停止する。次いでプレートを8チャンネルマニホルドを用いて吸引しそしてプレートカバーを用いてシールする。次いで、ワラック1450で設定Prot.37を用いてプレートを読み取る製造者の指定に従うB.サイクリックAMPアッセイ候補化合物を直接同定するための別のアッセイ方法は、シクラーゼに基づくアッセイを用いて達成される。直接同定に加えて、このアッセイ法は、上記のような35SGTPγS法からの結果の確認を与えるための独立した方法としても使用できる。変更したフラッシュプレートTMアデニル酸シクラーゼキットが、下記のプロトコールに従う構成的活性化オーファンGPCRに対する逆アゴニストおよびアゴニストとしての候補化合物の直接同定のために好ましくは使用された。トランスフェクションされた細胞をトランスフェクションの約3日後に採取した。20mMHEPES、pH7.4および10mMMgCl2を含む緩衝液中に懸濁した細胞のホモジナイゼーションにより膜を調製した。ホモジナイゼーションは、ブリンクマンポリトロンTMを約10秒間使用して氷上で行った。得られたホモジネートを49,000Xgで15分間、4°Cで遠心分離する。次いで得られたペレットを20mMHEPES、pH7.4および0.1mMEDTAを含む緩衝液中に再懸濁し、10秒間ホモジナイズし、次いで49,000Xgで15分間、4°Cで遠心分離した。次いで得られたペレットを-80°Cで、使用するまで保管した。直接同定スクリーニングの日に、膜ペレットを室温でゆっくりと解凍し、20mMHEPES、pH7.4および10mMMgCl2を含む緩衝液中に再懸濁すると、0.60mg/mlの最終タンパク質濃度が得られた再懸濁した膜は使用まで氷上に置く。cAMP標準および検出緩衝液検出緩衝液11mlにトレーサー12IcAMP100μlの2μCiを含んでなるを調製しそして製造者の指示に従って維持した。アッセイ緩衝液をスクリーニングのために調製し、これは20mMHEPES、pH7.4、10mMMgCl2、20mMホスホクレアチン、0.1単位/mlクレアチンホスホキナーゼ、50μMGTP、および0.2mMATPを含んでいた。次いでアッセイ緩衝液を使用まで氷上で保管した。上記のようにして同定された候補化合物冷凍された場合には、室温で解凍を、40μl膜タンパク質30μg/ウエルおよびアッセイ緩衝液50μlと一緒に、好ましくは96プレートウエルに加えた3μl/ウエル、12μM最終アッセイ濃度。次いでこの混合物を30分間、室温で穏やかに振とうしてインキュベーションした。インキュベーションの後、検出緩衝液100μlをそれぞれのウエルに加え、次いで2~24時間インキュベーションした。次いでプレートをワラックマイクロベータTMプレートリーダーでProt31を用いて計数した製造者の指示に従う。代表的なスクリーニングアッセイプレート96ウエルフォーマット結果を図12に示す。それぞれの棒は、それぞれのウエル内の種々の化合物と、上記の実施例5aで調製したRUP13-GαA融合タンパク質に対する結果を示す。図12に示した代表的な結果は、それぞれのプレートの平均結果mに基づいた標準偏差および平均も与え、そして一次スクリーンからリードとしての逆アゴニストの選択のための平均プラス2個の任意選択は、少なくとも平均プレート反応による反応百分率から標準偏差の二倍を差し引いて減らした候補化合物の選択を含む。反対に、一次スクリーンからリードとしてのアゴニストの選択のため任意選択は、少なくとも平均プレート反応による反応百分率に標準偏差の二倍を加えて増加した候補化合物の選択を含む。これらの選択手順に基づいて、以下のウエル内の候補化合物は、ウエルA2およびG9それぞれの中のRUP13に対する推定逆アゴニスト化合物Aおよびアゴニスト化合物Bとして直接同定された。図12参照。明確化のために以下を記す。これらの化合物はこのGPCRのための内因性リガンドのいかなる知識も持たないで直接同定された。受容体機能に基づくアッセイ技術を中心とし、そして化合物結合親和性ではなくて、我々はこの受容体の機能的活性を低下でき化合物Aならびに受容体の機能的活性を増加できる化合物B化合物を確認できる。肺組織内のこれら受容体の位置に基づいて例えば実施例6のhRUP13およびhRUP21参照、薬剤が肺ガンの可能な治療処置のために開発できる。本明細書内で引用された文献は、同時係属および関連特許を含み、特に断らない限り、引用することにより全体を本明細書中に編入される。熟練者の判断の範囲内にある開示された本発明の変更および延長は、上記の開示および特許請求範囲の範囲内に包含される。種々の発現ベクターが当該技術分野の熟練者により利用可能であるが、内因性および非内因性ヒトGPCRの両者のための使用の目的で、使用されるベクターがpCMVであることが最も好ましい。このベクターは、1998年10月13日付けで、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づいてアメリカンタイプカルチャーコレクションATCCに寄託された。DNAはATCCDにより試験されそして利用可能と決定された。ATCCは、pCMVに下記の寄託番号を割り当てた:ATCC203351。"