"重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号82に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号83又は89に示されるいずれか一つのアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号84に示されるアミノ酸配列からなること;及び軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号79、85、86、87又は88に示されるいずれか一つのアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号80に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号81に示されるアミノ酸配列からなること;を特徴とする抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号20に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号16に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。キメラ抗体であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号20に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号16に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項3に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。ヒト化されていることを特徴とする、請求項1に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。抗体又は該抗体の機能性断片であって、a以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列:a1配列番号42に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;a2配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;a3a1又はa2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95の相同性を持つアミノ酸配列;a4a1又はa2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99の相同性を持つアミノ酸配列;a5a1乃至a2から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列;及びb以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列:b1配列番号28に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;b2配列番号52に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;b3配列番号58に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;b4配列番号62に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;b5配列番号66に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;b6b1乃至a5から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも95の相同性を持つアミノ酸配列;b7b1乃至b5から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも99の相同性を持つアミノ酸配列;b8b1乃至5から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列;を含むことを特徴とする、請求項5に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号42に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号28に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号52に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号58に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号62に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号66に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号42に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号28に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号52に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号58に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号62に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号66に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。Fab、Fab’2、Fab’及びFvからなる群から選択される、請求項1乃至16のいずれか一つに記載の抗体の機能性断片。請求項1乃至17のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。癌の治療及び/又は予防のための医薬組成物であることを特徴とする、請求項18に記載の医薬組成物。請求項1乃至17に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つ、並びに、paclitaxel、carboplatin、CPT-11、又はvinblastinからなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防のための医薬組成物。癌が、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、メラノーマ、神経膠芽腫及び血球癌からなる群から選択される、請求項19又は20に記載の医薬組成物。請求項1乃至17に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防方法。請求項1乃至17に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つ、並びに、paclitaxel、carboplatin、CPT-11、vinblastin及び5-FUからなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は連続して投与することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防方法。癌が、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮癌、メラノーマ、繊維肉腫、神経膠芽腫及び血球癌からなる群から選択される、請求項22又は23に記載の治療及び/又は予防方法。請求項2、4又は6乃至16のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。請求項25に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号19に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号15に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。請求項25に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号19に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号15に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。請求項25に記載のポリヌクレオチドであって、a以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド:a1配列番号41に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;a2配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;a3a1又はa2から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列;a4a1又はa2から選択されるヌクレオチド配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列;及びb以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド:b1配列番号27に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;b2配列番号51に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;b3配列番号57に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;b4配列番号61に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;b5配列番号65に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;b6b1乃至b5から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列;b7b1乃至b5から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に1乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列;を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。配列番号41に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号27に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項28に記載のポリヌクレオチド。配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号51に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項28に記載のポリヌクレオチド。配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号57に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項28に記載のポリヌクレオチド。配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号61に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項28に記載のポリヌクレオチド。配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号65に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項28に記載のポリヌクレオチド。配列番号41に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号27に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項28に記載のポリヌクレオチド。配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号51に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項28に記載のポリヌクレオチド。配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号57に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項28に記載のポリヌクレオチド。配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号61に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項28に記載のポリヌクレオチド。配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号65に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項28に記載のポリヌクレオチド。請求項25乃至38に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。請求項25乃至38に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。請求項39に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。請求項40又は41に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む請求項2、4又は6乃至16に記載の抗体の生産方法。配列番号20に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号16に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなる抗体と同じエピトープに結合することを特徴とする抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号20に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号16に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなる抗体と競合することを特徴とする抗体又は該抗体の機能性断片。Papain消化によって調製されたFabフラグメントが、配列番号23に記載の組換え蛋白質の26番目のグリシン残基、34番目のイソロイシン残基、36番目のグルタミン酸残基、37番目のアスパラギン酸残基、38番目のグリシン残基、56番目のアスパラギン酸残基、57番目のロイシン残基、58番目のロイシン残基、59番目のフェニルアラニン残基、61番目のロイシン残基及び62番目のアルギニン残基と4Å以内の距離で隣接していることを特徴とする、請求項43又は44に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。配列番号23に記載の組換え蛋白質を構成する各アミノ酸残基とFabフラグメント間の距離を、X線回折データを用いた複合体構造解析によって決定することを特徴とする、請求項45に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。本発明の課題は、癌に対して治療効果を有する医薬品となる抗体、該抗体の機能性断片、並びに該抗体又は該抗体の機能性断片をコードするポリヌクレオチドを提供することである。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意、検討を行ったところ、細胞に顕著なアポトーシス誘導能を示す抗体を見出して、本発明を完成させた。これにより、既存の抗体では十分な治療効果が得られない患者においても有効な治療効果をもたらす。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。1重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号82に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号83又は89に示されるいずれか一つのアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号84に示されるアミノ酸配列からなること;及び軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号79、85、86、87又は88に示されるいずれか一つのアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号80に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号81に示されるアミノ酸配列からなること;を特徴とする抗体又は該抗体の機能性断片。2配列番号20に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号16に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする1に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。3キメラ抗体であることを特徴とする、1又は2に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。4配列番号20に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号16に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする3に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。5ヒト化されていることを特徴とする、1に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。6抗体又は該抗体の機能性断片であって、a以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列:a1配列番号42に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;a2配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;a3a1又はa2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95の相同性を持つアミノ酸配列;a4a1又はa2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも99の相同性を持つアミノ酸配列;a5a1乃至a2から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列;及びb以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列:b1配列番号28に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;b2配列番号52に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;b3配列番号58に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;b4配列番号62に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;b5配列番号66に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列;b6b1乃至a5から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも95の相同性を持つアミノ酸配列;b7b1乃至b5から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも99の相同性を持つアミノ酸配列;b8b1乃至5から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列;を含むことを特徴とする、5に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。7配列番号42に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号28に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。8配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号52に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。9配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号58に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。10配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号62に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。11配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号66に示されるアミノ酸配列の21乃至134番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。12配列番号42に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号28に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。13配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号52に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。14配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号58に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。15配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号62に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。16配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号66に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする6に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。17Fab、Fab’2、Fab’及びFvからなる群から選択される、1乃至16のいずれか一つに記載の抗体の機能性断片。181乃至17のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。19癌の治療及び/又は予防のための医薬組成物であることを特徴とする、18に記載の医薬組成物。201乃至17に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つ、並びに、paclitaxel、carboplatin、CPT-11、又はvinblastinからなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防のための医薬組成物。21癌が、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮癌、メラノーマ、繊維肉腫、神経膠芽腫及び血球癌からなる群から選択される、19又は20に記載の医薬組成物。221乃至17に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防方法。231乃至17に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つ、並びに、paclitaxel、carboplatin、CPT-11、vinblastin及び5-FUからなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は連続して投与することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防方法。24癌が、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、メラノーマ、神経膠芽腫及び血球癌からなる群から選択される、22又は23に記載の治療及び/又は予防方法。252、4又は6乃至16のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。2625に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号19に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号15に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。2725に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号19に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号15に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。2825に記載のポリヌクレオチドであって、a以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド:a1配列番号41に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;a2配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;a3a1又はa2から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列;a4a1又はa2から選択されるヌクレオチド配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列;及びb以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド:b1配列番号27に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;b2配列番号51に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;b3配列番号57に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;b4配列番号61に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;b5配列番号65に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列;b6b1乃至b5から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列;b7b1乃至b5から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に1乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列;を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。29配列番号41に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号27に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする28に記載のポリヌクレオチド。30配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号51に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする28に記載のポリヌクレオチド。31配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号57に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする28に記載のポリヌクレオチド。32配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号61に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする28に記載のポリヌクレオチド。33配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号65に示されるヌクレオチド配列の61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする28に記載のポリヌクレオチド。34配列番号41に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号27に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする28に記載のポリヌクレオチド。35配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号51に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする28に記載のポリヌクレオチド。36配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号57に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする28に記載のポリヌクレオチド。37配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号61に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする28に記載のポリヌクレオチド。38配列番号69に示されるヌクレオチド配列の58乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号65に示されるヌクレオチド配列の61乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする28に記載のポリヌクレオチド。3925乃至38に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。4025乃至38に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。4139に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。4240又は41に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む2、4又は6乃至16に記載の抗体の生産方法。43配列番号20に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号16に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなる抗体と同じエピトープに結合することを特徴とする抗体又は該抗体の機能性断片。44配列番号20に示されるアミノ酸配列の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号16に示されるアミノ酸配列の21乃至239番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなる抗体と競合することを特徴とする抗体又は該抗体の機能性断片。45Papain消化によって調製されたFabフラグメントが、配列番号23に記載の組換え蛋白質の26番目のグリシン残基、34番目のイソロイシン残基、36番目のグルタミン酸残基、37番目のアスパラギン酸残基、38番目のグリシン残基、56番目のアスパラギン酸残基、57番目のロイシン残基、58番目のロイシン残基、59番目のフェニルアラニン残基、61番目のロイシン残基及び62番目のアルギニン残基と4Å以内の距離で隣接していることを特徴とする、43又は44に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。46配列番号23に記載の組換え蛋白質を構成する各アミノ酸残基とFabフラグメント間の距離を、X線回折データを用いた複合体構造解析によって決定することを特徴とする、45に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。本発明によれば、細胞に対するアポトーシス誘導を主な作用機序とする、癌の治療剤を得ることができる。なお、本明細書中においては、癌と腫瘍は同じ意味に用いている。本明細書中において、遺伝子という語には、DNAのみならずそのmRNA、cDNA及びそのcRNAも含まれるものとする。本明細書中において、ポリヌクレオチドという語は核酸と同じ意味で用いており、DNA、RNA、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。本明細中においては、ポリペプチドと蛋白質は区別せずに用いている。本明細書中において、RNA画分とは、RNAを含んでいる画分をいう。本明細書中において、細胞には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。本明細書中において、細胞の癌化とは、細胞が接触阻止現象への感受性を喪失することや、足場非依存性増殖を示すこと等、細胞が異常な増殖を示すことをいい、このような異常な増殖を示す細胞を癌細胞という。本明細書中における、細胞傷害とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化をもたらすことをいい、直接的な外傷にとどまらず、DNAの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷をいう。本明細書中における細胞傷害活性とは上記細胞傷害を引き起こすことをいう。本明細書中におけるデスドメイン含有受容体とは、ショウジョウバエの自殺遺伝子reaperと相同性を示すデスドメインと呼ばれるアポトーシスシグナル伝達領域を細胞内ドメインに持つ受容体分子Fas、TNFRI、DR3、DR4、DR5及びDR6を含むがこれらに限定されないをいう。本明細書中における抗体の機能性断片とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Fab、Fab’2、scFv等を含む。また、Fab’2を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるFab’も抗体の機能性断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの機能性断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。本明細書におけるFab’とは、上記のようにFab’2を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であり。但し、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて産生されるFab’も本発明におけるFab’に含まれる。本明細書中における単鎖可変部位抗体は、シングルチェインFvscFvと同じ意味で用いられている。本明細書における、エピトープとは、特定の抗体の結合する抗原の部分ペプチド又は部分立体構造を意味する。前記の抗原の部分ペプチドであるエピトープは、免疫アッセイ法等当業者によく知られている方法、例えば以下の方法によって行うことが出来る。まず、抗原の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いることが出来る。例えば、抗原のC末端あるいはN末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することができる。又、特定の抗体の結合する抗原の部分立体構造であるエピトープは、X線構造解析によって前記の抗体と隣接する抗原のアミノ酸残基を特定することによって決定することができる。本明細書における同一のエピトープに結合する抗体とは、共通のエピトープに結合する異なる抗体を意味している。第一の抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に第二の抗体が結合すれば、第一の抗体と第二の抗体が同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、第一の抗体の抗原に対する結合に対して第二の抗体が競合するすなわち、第二の抗体が第一の抗体と抗原の結合を妨げることを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、第一の抗体と第二の抗体が同一のエピトープに結合すると判定することができる。さらに、第一の抗体と第二の抗体が同一のエピトープに結合し、かつ第一の抗体がアポトーシス誘導活性等の特殊な効果を有する場合、第二の抗体も同様な活性を有することが期待できる。本明細書におけるCDRとは、相補性決定領域CDR:Complemetaritydeterringregionを意味する。抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ3箇所のCDRがあることが知られている。CDRは、超可変領域hypervariabledomainとも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ3ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体のCDRについて、重鎖のCDRを重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からCDRH1、CDRH2、CDRH3と表記し、軽鎖のCDRを軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からCDRL1、CDRL2、CDRL3と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。本明細書中における二次抗体とは、抗体分子に特異的に結合して、該抗体分子同士を架橋する抗体をいう。本明細書において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、市販のハイブリダイゼーション溶液ExpressHybHybridizationSolutionクロンテック社製中、68°Cでハイブリダイズすること、又は、DNAを固定したフィルターを用いて0.7-1.0MのNaCl存在下68°Cでハイブリダイゼーションを行った後、0.1-2倍濃度のSSC溶液1倍濃度SSCとは150mMNaCl、15mMクエン酸ナトリウムからなるを用い、68°Cで洗浄することにより同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。本明細書において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列なる記載がある場合の数個とは、2乃至10個の任意の数のアミノ酸残基を示している。より具体的には、10個以下、5乃至6個以下、又は2乃至3個以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加された場合に数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたという記載が使用される。本明細書において、例えば配列番号34の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域なる記載は、配列番号34の20乃至141番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列と同じ意味で使用される。又、例えば配列番号34の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖なる記載は、配列番号34の20乃至471番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列と同じ意味で使用される。1.アポトーシス関連遺伝子について本発明における抗体については、該抗体が特定の抗原に対して結合し、かつ該抗原を介して細胞傷害活性を示すことが要求される。また、正常細胞が殺傷されることを防ぐために、腫瘍細胞特異的に存在する抗原を選択する必要がある。このような抗原群の一例として、腫瘍細胞壊死因子本明細書において以下TNFという関連アポトーシス誘導リガンド本明細書において以下TRAILという受容体群を挙げることができる。TRAILは、TNFファミリー蛋白質のメンバーであり、これは、Fasリガンド及びTNF-αを含むWileySR,etal.Immunity1995Dec;36:673-82。これらの蛋白質は、アポトーシスの強力な誘導因子である。これらのTNFファミリー蛋白質の受容体は、細胞外ドメインのシステインリッチ反復配列により特徴付けられるが、その中でもFasリガンドの受容体であるFas、及びTNFαの受容体であるTNF受容体I本明細書において以下TNFRIというは、ショウジョウバエの自殺遺伝子reaperGolstein,P.,etal.1995Cell.81,185-186,White,K,etal.1994Science264,677-683と相同性を示す領域であるデスドメインと呼ばれるアポトーシスのシグナル伝達に必須の領域を細胞内ドメインに持ち、デスドメイン含有受容体と総称される。TRAILについては5種の受容体が同定されており、これらのうち2種DR4TRAIL-R1及びDR5TRAIL-R2は、アポトーシスシグナルを伝達することが可能であり、他の3種DcR1TRAIL-R3、DcR2TRAIL-R4及びオステオプロテゲリンosteoprotegerin:OPGは、アポトーシスシグナルを伝達しない。Fas及びTNFRIと同様に、DR4及びDR5の両者の細胞内セグメントはデスドメインを含み、そしてFas関連デスドメイン蛋白質本明細書において以下FADDという及びカスパーゼ8を含む経路を介してアポトーシスシグナルを伝達するChaudharyPM,etal.Immunity1997Dec;76:813-20;SchneiderP,etal.Immunity1997Dec;76:821-30。上記の、Fas、TNFRI、DR4、DR5については、該分子に結合してアゴニストとして働く抗体が、該分子を細胞表面に保有する細胞に対して、アポトーシス誘導能を示すことが知られているJournalofCellularPhysiology,209:1221-10282006;Leukemis,Apl;214:805-8122007;Blood,99:1666-16752002;CellularImmunology,Jan;1531:184-1931994。上記のアゴニスト抗体の薬効は、二次抗体又はエフェクター細胞による架橋によって増強されるJournalofImmunology,149:3166-31731992;EouropianJournalofImmunology,Oct;2310:2676-26811993。ヒトDR5deathreceptor5遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、GenBankにGI:22547118アクセッション番号:NM_147187として登録されている。なお、DR5のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR5と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列も、DR5遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる。また、DR5のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、DR5と同等の生物活性を有する蛋白質もDR5に含まれる。2.抗DR5抗体の製造本発明のDR5に対する抗体は、常法を用いて、DR5又はDR5のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原となるDR5の生物種はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するDR5を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種DR5に結合する抗体とヒトDR5との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。また、公知の方法例えば、KohlerandMilstein,Nature1975256,p.495-497、Kennet,R.ed.,MonoclonalAntibodies,p.365-367,PlenumPress,N.Y.1980に従って、DR5に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、抗原となるDR5はDR5遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、DR5遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したDR5を精製すればよい。以下、具体的にDR5に対する抗体の取得方法を説明する1抗原の調製抗DR5抗体を作製するための抗原としては、DR5又はその少なくとも6個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。DR5は、ヒトの腫瘍組織あるいは腫瘍細胞から直接精製して使用することができ、また、DR5をinvitroにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、DR5のcDNAを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってDR5を発現させることにより、抗原を得ることが出来る。また、膜蛋白質であるDR5の細胞外領域と抗体の定常領域とを連結した融合蛋白質を適切な宿主ベクター系において発現させることによって、分泌蛋白質として抗原を得ることも可能である。DR5のcDNAは例えば、DR5のcDNAを発現しているcDNAライブラリーを鋳型として、DR5cDNAを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応以下PCRというSaiki,R.K.,etal.Science1988239,p.487-489参照を行なう、いわゆるPCR法により取得することができる。ポリペプチドのインビトロinvitro合成としては、例えばロシュダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステムRTSを挙げることができるが、これに限定されない。原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌Escherichiacoliや枯草菌Bacillussubtilisなどを挙げることができる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質表現型の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるCOS細胞Gluzman,Y.Cell198123,p.175-182、ATCCCRL-1650、マウス線維芽細胞NIH3T3ATCCNo.CRL-1658やチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO細胞、ATCCCCL-61のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株Urlaub,G.andChasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA198077,p.4126-4220等がよく用いられているが、これらに限定されない。上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、又は細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、大腸菌であれば、例えば、LB培地に必要に応じて、アンピシリン等の抗生物質やIPMGを添加して用いることができる。上記培養により、形質転換体の細胞内又は細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィーゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換え蛋白質に6残基からなるヒスチジンタグを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。あるいは、発現させる組換え蛋白質にIgGのFc領域を繋げることにより、プロテインAカラムで効率的に精製することができる上記方法を組合せることにより容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大量に製造できる。2抗DR5モノクローナル抗体の製造DR5と特異的に結合する抗体の例として、DR5と特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。すなわち、a抗原として使用する生体高分子の精製、b抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、c骨髄腫細胞以下ミエローマというの調製、d抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、e目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、f単一細胞クローンへの分割クローニング、g場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、hこのようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。a抗原の精製抗原としては、前記したような方法で調製したDR5又はその一部を使用することができる。また、DR5発現組換え体細胞より調製した膜画分、又はDR5発現組換え体細胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて、化学合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを抗原として使用することもできる。b抗体産生細胞の調製工程aで得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウス及びラットの系統には特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、RIII、SJL、SWR、WB、129等が、またラットの場合には、たとえば、Wistar、Low、Lewis、Sprague、Dawley、ACI、BN、Fischer等を用いることができる。このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではBALB/c系統が、ラットではWistar及びLow系統が被免疫動物として特に好ましい。また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは5~12週齢、さらに好ましくは6~8週齢である。DR5又はこの組換え体によって動物を免疫するには、例えば、Weir,D.M.,HandbookofExperimentalImmunologyVol.I.II.III.,BlackwellScientificPublications,Oxford1987、Kabat,E.A.andMayer,M.M.,ExperimentalImmunochemistry,CharlesCThomasPublisherSpringfield,Illinois1964等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞又はリンパ球を無菌的に取り出す。その際に抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、RIA法又はELISA法を挙げることができるがこれらの方法に制限されない。被免疫動物の脾臓細胞又はリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法例えば、Kohleretal.,Nature1975256,p.495,;Kohleretal.,Eur.J.Immunol.19776,p.511,;Milsteinetal.,Nature1977,266,p.550,;Walsh,Nature,1977266,p.495に従って行うことができる。c骨髄腫細胞以下、ミエローマという細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているHGPRTHypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のX63-Ag8X63、NS1-ANS/1NS1、P3X63-Ag8.U1P3U1、X63-Ag8.653X63.653、SP2/0-Ag14SP2/0、MPC11-45.6TG1.745.6TG、FO、S149/5XXO、BU.1等、ラット由来の210.RSY3.Ag.1.2.3Y3等、ヒト由来のU266ARSKO-007、GM1500GTG-A12GM1500、UC729-6、LICR-LOW-HMy2HMy2、8226AR/NIP4-1NP41等である。d細胞融合抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法Weir,D.M.,HandbookofExperimentalImmunologyVol.I.II.III.,BlackwellScientificPublications,Oxford1987、Kabat,E.A.andMayer,M.M.,ExperimentalImmunochemistry,CharlesCThomasPublisherSpringfield,Illinois1964等に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。eハイブリドーマ群の選択上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常HATヒポキサンチンアミノプテリンチミジン選択法Kohleretal.,Nature1975256,p.495;Milsteinetal.,Nature1977266,p.550が用いられる。この方法は、アミノプテリンで生存し得ないHGPRT欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをHAT培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。f単一細胞クローンへの分割クローニングハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる例えばBarbara,B.M.andStanley,M.S.:SelectedMethodsinCellularImmunology,W.H.FreemanandCompany,SanFrancisco1980参照。これらの方法のうち、特にメチルセルロース法などの三次元培養法が好適である。例えば、細胞融合により形成されたハイブリドーマ群をClonaCell-HYSelectionMediumDStemCellTechnologies社製03804などのメチルセルロース培地に懸濁して培養し、形成されたハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマの取得が可能である。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清中に安定して抗体価の認められたものをDR5モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。このようにして樹立されたハイブリドーマ株の例としては、DR5ハイブリドーマB273を挙げることができる。なお、本明細書中においては、ハイブリドーマB273が産生する抗体を、B273抗体又は単にB273と記載する。B273抗体の重鎖は、配列表の配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する。また、B273抗体の軽鎖は、配列表の配列番号10に示されるアミノ酸配列を有する。なお、配列表の配列番号8に示される重鎖アミノ酸配列中で、1乃至19番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、142乃至465番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。また、配列表の配列番号10に示される軽鎖アミノ酸配列中で、1乃至19番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、20乃至133番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、134乃至238番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列表の配列番号8に示される重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号7に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号7に示されるヌクレオチド配列の1乃至57番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の重鎖シグナル配列をコードしており、58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして424乃至1395番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の重鎖定常領域をコードしている。配列表の配列番号10に示される軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号9示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号9に示されるヌクレオチド配列の1乃至57番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の軽鎖シグナル配列をコードしており、58乃至399番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして400乃至714番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の軽鎖定常領域をコードしている。gハイブリドーマの培養によるモノクローナル抗体の調製このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。本発明における抗体価の測定は、例えば上記bの項目で説明したELISA法により行うことができる。以上の方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中又は-80°C以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をHT培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清から、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス例えば、上記のBALB/c、あるいはNu/Nuマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド-マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。腹腔内に投与する場合には、事前3~7日前に2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン2,6,10,14-tetramethylpentadecaneプリスタン等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。たとえば、ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、T細胞を不活性化した後、20日後に106~107個のハイブリドーマクローン細胞を、血清を含まない培地中に浮遊0.5mlさせて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹水がたまったところでマウスより腹水を採取する。この方法により、培養液中に比べて約100倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。上記方法により得たモノクローナル抗体は、例えばWeir,D.M.:HandbookofExperimentalImmunology,Vol.I,II,III,BlackwellScientificPublications,Oxford1978に記載されている方法で精製することができる。かくして得られるモノクローナル抗体は、DR5に対して高い抗原特異性を有する。hモノクローナル抗体の検定かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニーOuchterlony法、ELISA法、又はRIA法を挙げることができる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ELISA法又はRIA法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット例えば、マウスタイパーキット;バイオラッド社製等を利用することもできる。さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び280nmにおける吸光度[1.4OD280=イムノグロブリン1mg/ml]より算出する方法により行うことができる。さらに、2のa乃至hの工程を再度実施して別途に独立してモノクローナル抗体を取得した場合においても、B273と同等の細胞傷害活性を有する抗体を取得することが可能である。このような抗体の一例として、B273抗体と同一のエピトープに結合する抗体を挙げることができる。新たに作製されたモノクローナル抗体が、B273抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該モノクローナル抗体がB273抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、B273抗体のDR5に対する結合に対して該モノクローナル抗体が競合するすなわち、該モノクローナル抗体が、B273抗体とDR5の結合を妨げることを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該モノクローナル抗体がB273抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、該モノクローナル抗体がB273と同等の細胞傷害活性を有していることが強く期待される。また、実施例4に示されるように、抗体のFabフラグメントとDR5の複合体のX線回折データから、Fabフラグメントに近接したDR5側のアミノ酸残基を特定することが可能である。具体的には、任意の抗体に由来するFabフラグメントが、配列表の配列番号23に記載のアミノ酸配列の26番目のグリシン残基、34番目のイソロイシン残基、36番目のグルタミン酸残基、37番目のアスパラギン酸残基、38番目のグリシン残基、56番目のアスパラギン酸残基、57番目のロイシン残基、58番目のロイシン残基、59番目のフェニルアラニン残基、61番目のロイシン残基及び62番目のアルギニン残基と4Å以内の距離で隣接している場合に、該抗体はB273と同一のエピトープ特異性を有すると判断することができる。3その他の抗体本発明の抗体には、上記DR5に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラChimeric抗体、ヒト化Humanized抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができるProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,1984参照。マウス抗ヒトDR5抗体B273由来のキメラ抗体は、配列番号20の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号16の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体であり、任意の定常領域を有していて良い。このようなキメラ抗体の一例として、配列表の配列番号20の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号16の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。なお、配列表の配列番号20に示される重鎖配列中で、1乃至19番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、142乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。また、配列表の配列番号16に示される軽鎖配列中で、1乃至20番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、135乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列表の配列番号20に示される重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号19に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号19に示されるヌクレオチド配列の1乃至57番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の重鎖シグナル配列をコードしており、58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして424乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の重鎖定常領域をコードしている。配列表の配列番号16に示される軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号15に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号15に示されるヌクレオチド配列の1乃至60番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の軽鎖シグナル配列をコードしており、61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして403乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の軽鎖定常領域をコードしている。ヒト化抗体としては、相補性決定領域CDR;complementaritydeterminingregionのみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体Nature1986321,p.522-525参照、CDR移植法によって、CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体国際公開パンフレットWO90/07861を挙げることができる。但し、B273抗体由来のヒト化抗体としては、B273の6種全てのCDR配列を保持し、細胞にアポトーシスを誘導する活性を持つ限り、特定のヒト化抗体に限定されない。なお、B273抗体の重鎖可変領域は、配列表の配列番号82に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1GYFMN、配列番号83に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2RFNPYNGDTFYNQKFKG、及び配列番号84に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3SAYYFDSGGYFDYを保有している。また、B273抗体の軽鎖可変領域は、配列表の配列番号79に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1RSSQSLVHSNGNTYLH、配列番号80に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2KVSNRFS、及び配列番号81に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3SQSTHVPWTを保有している。さらに、上記CDRに1個乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加された配列を、B273抗体に由来するCDR改変抗体の有するCDR配列として使用することができる。CDRL1の1アミノ酸残基置換体の例として、配列表の配列番号85に示されるアミノ酸配列からなる配列RSSQSLVHSNENTYLH、配列番号86に示されるアミノ酸配列からなる配列RSSQSLVHSNFNTYLH、配列番号87に示されるアミノ酸配列からなる配列RSSQSLVHSNKNTYLH、又は配列番号88に示されるアミノ酸配列からなる配列RSSQSLVHSNLNTYLHを挙げることができる。又、CDRH2の1アミノ酸残基置換体の例として、配列番号89に示されるアミノ酸配列からなる配列RFNPYNEDTFYNQKFKGを挙げることができる。一般に蛋白質のアスパラギン脱アミド化は、C末端側に隣接するアミノ酸との間で、環状コハク酸イミド遷移状態を形成して、進行するGeiger,T.andClarke,S.1987Deamidation,Isomerization,andracemizationatasparaginylandaspartylresiduesinpeptides.Succinimide-linkedreactionsthatcontributetoproteindegradation.J.Biol.Chem.262,785-794。環状コハク酸イミド遷移状態形成に律速となるのは隣接アミノ酸の側鎖の大きさであり、従って、もっとも脱アミド化が早いのは側鎖が最も小さなグリシンである。反対にC末端側隣接基を大きな側鎖を有するアミノ酸に置換することで、脱アミド化速度を抑制することが可能である。B273抗体はCDRL1及びCDRH2に脱アミド化されやすい-N-G-アスパラギン-グリシン配列を有している。そこで、本発明者らは、隣接基を、グリシンから、より大きな側鎖を有する、リジン、フェニルアラニン、ロイシン、グルタミン酸に変更した点変異体を作製した。即ち、CDRH2については-N-G-アスパラギン-グリシン配列を-N-E-アスパラギン-グルタミン酸配列に変異させ、CDRL1については-N-G-アスパラギン-グリシン配列を-N-L-アスパラギン-ロイシン配列、-N-F-アスパラギン-フェニルアラニン配列、-N-K-アスパラギン-リジン配列、-N-E-アスパラギン-グルタミン酸配列にそれぞれ変異させることによって、抗体の脱アミド化が抑制される。上記のCDRを含む抗体の実例として、配列表の配列番号82に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号83に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、及び配列番号84に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖可変領域、並びに配列表の配列番号79に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号80に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列番号81に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖可変領域を含むことからなる抗体、配列表の配列番号82に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号89に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、及び配列番号84に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖可変領域、並びに配列表の配列番号85に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号80に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列番号81に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖可変領域を含むことからなる抗体、配列表の配列番号82に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号89に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、及び配列番号84に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖可変領域、並びに配列表の配列番号86に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号80に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列番号81に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖可変領域を含むことからなる抗体、配列表の配列番号82に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号89に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、及び配列番号84に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖可変領域、並びに配列表の配列番号87に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号80に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列番号81に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖可変領域を含むことからなる抗体、又は配列表の配列番号82に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号89に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、及び配列番号84に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖可変領域、並びに配列表の配列番号88に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号80に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列番号81に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖可変領域を含むことからなる抗体を挙げることができる。マウス抗体B273のヒト化抗体CDR改変抗体を含むの実例としては、配列表の配列番号34、36、38、40、42、44、46、48、50、又は70の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列のいずれか一つからなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号28、30、32、52、58、62又は66の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列いずれか一つからなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。好適な組合せとしては、配列番号34の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号28の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号34の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号30の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号34の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号32の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号36の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号28の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号36の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号30の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号36の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号32の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号38の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号28の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号38の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号30の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号38の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号32の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号40の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号28の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号42の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号28の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号44の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号28の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号46の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号28の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号48の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号28の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号50の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号28の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号70の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号52の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号70の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号58の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号70の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号62の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、又は配列番号70の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号66の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体を挙げることができる。さらに好適な組合せとしては、配列番号34の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号28の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号34の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号30の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号34の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号32の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号36の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号28の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号36の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号30の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号36の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号32の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号38の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号28の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号38の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号30の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号38の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号32の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号40の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号28の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号42の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号28の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号44の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号28の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号46の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号28の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号48の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号28の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号50の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号28の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号70の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号52の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号70の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号58の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号70の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号62の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、又は配列番号70の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号66の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、を挙げることができる。より好適な組合せとしては、配列番号42の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号28の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号70の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号52の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号70の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号58の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、配列番号70の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号62の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、又は配列番号70の20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号66の21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体、を挙げることができる。最も好適な組合せとしては、配列番号42の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号28の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号70の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号52の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号70の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号58の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号70の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号62の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、又は配列番号70の20乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号66の21乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、を挙げることができる。上記の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列と高い相同性を示す配列を組み合わせることによって、上記の各抗体と同等の細胞傷害性活性を有する抗体を選択することが可能である。このような相同性は、一般的には80以上の相同性であり、好ましくは90以上の相同性であり、より好ましくは95以上の相同性であり、最も好ましくは99以上の相同性である。また、重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列に1乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の細胞傷害性活性を有する抗体を選択することが可能である。置換、欠失又は付加されるアミノ酸残基数は、一般的には10アミノ酸残基以下であり、好ましくは5乃至6アミノ酸残基以下であり、より好ましくは2乃至3アミノ酸残基以下であり、最も好ましくは1アミノ酸残基である。二種類のアミノ酸配列間の相同性は、Blastalgorithmversion2.2.2Altschul,StephenF.,ThomasL.Madden,AlejandroA.Schaffer,JinghuiZhang,ZhengZhang,WebbMiller,andDavidJ.Lipman1997,GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms,NucleicAcidsRes.25:3389-3402のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Blastalgorithmは、インターネットでwww.ncbi.nlm.nih.gov/blastにアクセスすることによっても使用することができる。なお、上記のBlastalgorithmによってIdentity又はIdentities及びPositivity又はPositivitiesの2種類のパーセンテージの値が計算される。前者は相同性を求めるべき二種類のアミノ酸配列の間でアミノ酸残基が一致した場合の値であり、後者は化学構造の類似したアミノ酸残基も考慮した数値である。本明細書においては、アミノ酸残基が一致している場合のIdentity同一性の値を持って相同性の値とする。なお、配列表の配列番号34、36、38、40、42、44、46、48、50、又は70に示される重鎖アミノ酸配列中で、1乃至19番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、20乃至141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、142乃至471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。また、配列表の配列番号28、30、32、52、58、62、又は66に示される軽鎖アミノ酸配列中で、1乃至20番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、21乃至134番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、135乃至239番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。配列表の配列番号34、36、38、40、42、44、46、48、50、又は70に示される重鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号33、35、37、39、41、43、45、47、49、又は69に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。各ヌクレオチド配列の1乃至57番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の重鎖シグナル配列をコードしており、58乃至423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして424乃至1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の重鎖定常領域をコードしている。配列表の配列番号28、30、32、52、58、62、又は66に示される軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号27、29、31、51、57、61、又は65に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。各ヌクレオチド配列の1乃至60番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の軽鎖シグナル配列をコードしており、61乃至402番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして403乃至717番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は抗体の軽鎖定常領域をコードしている。これらのヌクレオチド配列と他の抗体のヌクレオチド配列との間の相同性についてもBlastalgorithmによって決定することができる。本発明の抗体としては、さらに、B273抗体と同一のエピトープに結合する、ヒト抗体を挙げることができる。抗DR5ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗DR5ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法Tomizuka,K.etal.,NatureGenetics199716,p.133-143,;Kuroiwa,Y.et.al.,Nucl.AcidsRes.199826,p.3447-3448;Yoshida,H.et.al.,AnimalCellTechnology:BasicandAppliedAspectsvol.10,p.69-73Kitagawa,Y.,Matsuda,T.andIijima,S.eds.,KluwerAcademicPublishers,1999.;Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA200097,p.722-727等を参照。によって取得することができる。このようなヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体Yeastartificialchromosome,YACベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製、及びこれらの動物同士を掛け合わせることにより作り出すことができる。また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするcDNA、好ましくは該cDNAを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはCHO細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法Wormstone,I.M.et.al,InvestigativeOphthalmologyVisualScience.2002437,p.2301-2308;Carmen,S.et.al.,BriefingsinFunctionalGenomicsandProteomics2002,12,p.189-203;Siriwardena,D.et.al.,Ophthalmology20021093,p.427-431等参照。も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体scFvとしてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法NatureBiotechnology2005,23,9,p.1105-1116を用いることができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができるWO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol199412,p.433-455、NatureBiotechnology2005239,p.1105-1116。新たに作製されたヒト抗体が、B273抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該ヒト抗体がB273抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、B273抗体のDR5に対する結合に対して該ヒト抗体が競合するすなわち、該ヒト抗体が、B273抗体とDR5の結合を妨げることを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該ヒト抗体がB273抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、該ヒト抗体がB273と同等の細胞傷害活性を有していることが強く期待される。また、実施例4に示されるように、抗体のFabフラグメントとDR5の複合体のX線回折データから、Fabフラグメントに近接したDR5側のアミノ酸残基を特定することが可能である。具体的には、任意の抗体に由来するFabフラグメントが、配列表の配列番号23に記載のアミノ酸配列の26番目のグリシン残基、34番目のイソロイシン残基、36番目のグルタミン酸残基、37番目のアスパラギン酸残基、38番目のグリシン残基、56番目のアスパラギン酸残基、57番目のロイシン残基、58番目のロイシン残基、59番目のフェニルアラニン残基、61番目のロイシン残基及び62番目のアルギニン残基と4Å以内の距離で隣接している場合に、該抗体はB273と同一のエピトープに結合すると判断することができる。以上の方法によって得られたキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体は、実施例3に示された方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。実施例10で示された示差走査カトリメトリーDSCは、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点Tmを素早く、また正確に測定することができる装置である。DSCを用いてTm値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られておりLoriBurton,et.al.,PharmaceuticalDevelopmentandTechnology200712,p.265-273、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリンsinglechainimmunoglobulinを取得する方法も知られているLee,H-S,et.al.,MolecularImmunology199936,p.61-71;Shirrmann,T.et.al.,mAbs2010,2,1p.1-4。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体singledomainantibody:sdAb又はナノボディnanobodyと呼ばれており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されているMuyldemansS.et.al.,ProteinEng.199479,1129-35,Hamers-CastermanC.et.al.,Nature19933636428446-8。上記の抗体は、本発明における抗体含まれる。また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節することによって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等が知られているが、これらに限定されるものではない。抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、1哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるCOS細胞Gluzman,Y.Cell198123,p.175-182、ATCCCRL-1650、マウス線維芽細胞NIH3T3ATCCNo.CRL-1658やチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO細胞、ATCCCCL-61のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株Urlaub,G.andChasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.198077,p.4126-4220を挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をinvitroで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。本発明の抗体のアイソタイプとしての制限はなく、例えばIgGIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAIgA1、IgA2、IgDあるいはIgE等を挙げることができるが、好ましくはIgG又はIgM、さらに好ましくはIgG1又はIgG2を挙げることができる。また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の機能性断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の機能性断片と呼ぶことができる。抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞傷害活性、補体依存性細胞傷害活性及び補体依存性細胞性細胞傷害活性を挙げることができる。本発明における抗体の機能性断片が保持する機能は、DR5に対する結合活性であり、好ましくは細胞にアポトーシスを誘導する活性であり、より好ましくは癌細胞に対するアポトーシスの誘導を介した細胞傷害活性である。但し、本発明の抗体は、細胞にアポトーシスを誘導する活性に加えて、抗体依存性細胞傷害活性、補体依存性細胞傷害活性及び/又は補体依存性細胞性細胞傷害活性を併せ持っていても良い。例えば、抗体の断片としては、Fab、Fab’2、Fv、又は重鎖及び軽鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFvscFv、diabodydiabodies、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、Fab’2を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるFab’も抗体の断片に含まれる。さらに、本発明の抗体は少なくとも2種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は2種類の抗原に結合するものであるが即ち、二重特異性抗体bispecificantibody、本発明における多特異性抗体は、それ以上例えば、3種類の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、又はそのような抗体の断片例えば、Fab’2二重特異性抗体でもよい。二重特異性抗体は2種類の抗体の重鎖と軽鎖HL対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができるMillsteinetal.,Nature1983305,p.537-539。本発明の抗体は一本鎖抗体scFvとも記載するでもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られるPluckthun,ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,113Rosenberg及びMoore編、SpringerVerlag,NewYork,p.269-3151994、NatureBiotechnology2005,23,p.1126-1136。また、2つのscFvをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるBiscFv断片を二重特異性抗体として使用することもできる。一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である例えば、米国特許第4,946,778号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,455,030号等を参照。このscFvにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結されるHuston,J.S.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1988,85,p.5879-5883。scFvにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば12~19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。scFvをコードするDNAは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするDNA、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするDNA、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってscFvを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、1種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、IgGCH3ドメインと2つのscFvとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン‐へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗DR5抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、CDRが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来るWO2004/061104号参照。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコールPEG等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているものImmunoconjugateでもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができるNatureBiotechnology200523,p.1137-1146。得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができるStrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual,DanielR.Marshaketal.eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress1996;Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlowandDavidLane,ColdSpringHarborLaboratory1988が、これらに限定されるものではない。クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。これらのクロマトグラフィーは、HPLCやFPLC等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムを挙げることができる。例えばプロテインAカラムを用いたカラムとして、HyperD,POROS,SepharoseF.F.ファルマシア等を挙げることができる。また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。4その他の抗DR5抗体の具体例例えば、国際公開パンフレット、WO98/51793、WO2001/83560、WO2002/94880、WO2003/54216、WO2006/83971、WO2007/22157にDR5発現細胞にアポトーシスを誘導する抗DR5抗体が記載されている。また、TigatuzumabCS-1008、LexatumumabHGS-ETR2、HGS-TR2J、DrozitumabAPOMAB、ConatumumabAMG-655、LBY135と呼ばれる抗DR5抗体について、臨床試験が継続中であるか、あるいは過去に臨床試験が実施されていた。本出願の出願日当時も臨床試験が継続中であるのは、Tigatuzumab、Lexatumumab、Conatumumabである。本明細書に記載の新規抗DR5抗体は、上記のTigatuzumab、Lexatumumab、Conatumumab及びDrozitumabと比較した場合に、より優れたinvitro及び/又はinvivoにおける抗腫瘍活性を有している。3.抗DR5抗体を含有する医薬上述の2.抗DR5抗体の製造の項に記載された方法で得られる抗体は、生体内でのDR5のアポトーシス関連受容体に対してアゴニストとして働き、受容体を介して癌細胞に対してアポトーシスを誘導し細胞傷害活性を示すことから、医薬として、特に癌に対する治療剤及び/又は予防剤として用いることができる。invitroでの抗体による殺細胞活性は、アポトーシス関連受容体を過剰発現している細胞における細胞の増殖の抑制活性で測定することができる。例えば、DR5を過剰発現している癌細胞株を培養し、培養系に種々の濃度で抗体を添加し、フォーカス形成、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。invivoでの実験動物を利用した抗体の癌に対する治療効果は、例えば、DR5を高発現している腫瘍細胞株を移植したヌードマウスに抗体を投与し、癌細胞の変化を測定することができる。癌の種類としては、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮内膜癌を含む子宮癌、メラノーマを含む黒色腫、繊維肉腫、神経膠芽腫、血球癌白血病、リンパ腫等等を挙げることができるが、治療対象となる癌細胞がDR5を発現している限りこれらに限定されない。また、DR5に対する抗体は炎症性細胞に対してアポトーシスを誘導することが知られているJ.Clin.Invest.1996,982,271-278;Int.Immunol.1996,810,1595-1602。従って、本発明の抗体は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療剤として用いることも可能である。この自己免疫又は炎症性の疾患としては、例として、全身性エリテマトーデス、橋本病、関節リウマチ、宿主移植片病、シェ-グレン症候群、悪性貧血、アジソン病、硬皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫溶血性貧血、生殖不能症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、血栓不足紫斑病、インスリン依存糖尿病、アレルギー、喘息、アトピー疾患、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球腎炎、再生不良性貧血、臓器移植後の拒絶反応が挙げることができる。本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。本発明の医薬組成物は、pH、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない:グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス-塩酸Tris-Hcl溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸EDTA等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β-シクロデキストリンやヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルベート20やポリソルベート80等のポリソルベート、トリトンtriton、トロメタミンtromethamine、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトールソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、賦形剤、及び/又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗DR5抗体の重量に対して0.01~100倍、特に0.1~10倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはpH7.0-8.5のTrisバッファー、pH4.0-5.5の酢酸バッファー、pH3.0-6.2のクエン酸バッファーを含むことができる。また、これらのバッファーにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物には抗DR5抗体を含む医薬組成物並びに、抗DR5抗体及び少なくとも一つの癌治療剤を含む医薬組成物を挙げることができ、本発明の医薬組成物は選択された組成と必要な純度を持つ薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。抗DR5抗体を含む医薬組成物並びに、抗DR5抗体及び少なくとも一つの癌治療薬剤を含む医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。上記の医薬組成物において、抗DR5抗体と共に含まれる癌治療剤は、抗DR5抗体と同時に、別々に、あるいは連続して投与されても良いし、それぞれの投与間隔を変えて投与しても良い。このような癌治療剤として、abraxane、carboplatin、cisplatin、gemcitabine、irinotecanCPT-11、paclitaxel、pemetrexed、sorafenib、vinblastin、5-FU又は国際公開第WO2003/038043号パンフレットに記載の薬剤等を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば、上記の薬剤に限定されない。本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、抗DR5抗体のDR5に対する親和性、即ち、DR5に対する解離定数Kd値に対し、親和性が高いKd値が低いほど、ヒトへの投与量を少なくしても薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。投与量は、ヒト型抗DR5抗体をヒトに対して投与する際には、約0.1~100mg/kgを1~180日間に1回投与すればよい。本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、モレキュラークローニングMolecularCloningSambrook,J.,Fritsch,E.F.及びManiatis,T.著、ColdSpringHarborLaboratoryPressより1989年に発刊に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。マウス抗体B273の作製1-1ヒトDR5蛋白質ヒトDR5細胞外領域ヒトFc融合体の作製1-1-1ヒトDR5細胞外領域発現ベクターの作製ヒトDR5蛋白質アイソフォーム2:NP_671716を発現させるベクターは、CMVプロモーターの下流にヒトDR5細胞外領域とヒトIgG1/Fc領域を融合させた遺伝子を配置することにより構築した。1-1-2ヒトDR5蛋白質の作製293FreeStyle細胞への発現ベクターの導入及び培養上清の回収はインビトロジェン社現ライフテクノロジーズジャパン株式会社にて実施した。1-1-3ヒトDR5蛋白質の精製上記bで得られた培養上清を、ProteinAアフィニティカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。培養上清5L分をPBSで平衡化したHitrapProteinAFFGEヘルスケアジャパン株式会社Cat.no.17-5079-01にアプライし、PBSで洗浄した。次に2Mアルギニン溶液pH4.0を添加し、ヒトDR5蛋白質の含まれる画分を集めた。その画分をCentrifugalFilterDeviceAmiconUltra4、分画分子量10K、ミリポア社に添加し、PBSへの液置換及び濃縮をおこなった。最終的な容量を6mlとし、精製サンプルrDR5-hFcとした。精製品の蛋白定量はMicroBCAProteinAssayKitPIERCE23235を用いて定量した。標準品はキットに含まれるAlbuminStandardを用いた。1-2免疫5~6週齢のBALB/cAJclマウス日本クレア社を使用した。0日目に1-1-3で調製した50μgのrDR5-hFcとFreundCompleteAjuvant和光純薬社製を混合体積比で1:1したものをマウス首筋付近に皮下投与した。14日目と28日目に50μgのrDR5-hFcとFreundIncompleteAjuvant和光純薬社製を混合体積比で1:1したものをマウス背部に皮下投与した。42日目に50μgのrDR5-hFcをマウス腹腔内に投与し、45日目にマウス脾臓を採取してハイブリドーマ作製に用いた。1-3ハイブリドーマの作製脾臓細胞とマウスミエローマP3X63Ag8U.1細胞とをPEG4000免疫生物研究所社製を用いて細胞融合し、ClonaCell-HYSelectionMediumDStemCellTechnologies社製03804に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清用いて抗DR5抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。1-4Cell-ELISA法による抗体スクリーニング1-4-1ヒトDR5変異体発現ベクターpcDNA3.1-DR5Mの構築ヒトDR5蛋白質アイソフォーム2:NP_671716をコードするcDNAをpcDNA3.1ベクターにクローニングし、デスドメイン内にある334番目のアミノ酸であるLをDに置換して発現するようデザインしたデスドメイン改変発現ベクターpcDNA3.1-DR5Mを構築した。1-4-2抗原遺伝子発現細胞の調製HEK293細胞を10FBS含有DMEM培地中7.5x105細胞/mlになるよう調製した。それに対し、Lipofectamine2000ライフテクノロジーズジャパン社製を用いて、デスドメイン改変DR5発現ベクターpcDNA3.1-DR5MもしくはコントロールとしてpcDNA3.1-mockを導入し、96穴ハーフエリアマイクロプレートコーニング社製に50μlずつ分注し、10FBS含有DMEM培地中で37°C、5CO2の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Cell-ELISAに使用した。1-4-3Cell-ELISA1-4-2で調製した発現ベクター導入HEK293細胞の上清を除去後、pcDNA3.1-DR5MとpcDNA3.1-mock導入HEK293細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、4°Cで1時間静置した。ウェル中の細胞を5FBS含有PBSで1回洗浄後、5FBS含有PBSで500倍に希釈したGoatanti-MouseIgG,PeroxidaseConjugatedChemicon社製AP181Pを加えて、4°Cで1時間静置した。ウェル中の細胞を5FBS含有PBSで5回洗浄した後、OPD発色液OPD溶解液0.05Mクエン酸3ナトリウム、0.1Mリン酸水素2ナトリウム12水pH4.5にo-フェニレンジアミン二塩酸塩和光純薬社製、H2O2をそれぞれ0.4mg/ml、0.6v/vになるように溶解を25μl/ウェルで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、1MHClを25μl/ウェルを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダーARVO:PerkinElmer社で490nmの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するDR5に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、pcDNA3.1-mock導入HEK293細胞コントロールと比較し、pcDNA3.1-DR5M発現ベクター導入HEK293細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗DR5抗体産生陽性として選択した。1-5フローサイトメトリー法による抗体スクリーニング1-5-1抗原遺伝子発現細胞の調製293T細胞を5×104細胞/cm2になるよう225平方cmフラスコ住友ベークライト社製に播種し、10FBS含有DMEM培地中で37°C、5CO2の条件下で一晩培養した。翌日、pcDNA3.1-DR5MとコントロールとしてpcDNA3.1-mockをそれぞれ293T細胞にLipofectamine2000を用いて導入し、37°C、5CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入293T細胞をTrypLEExpressライフテクノロジーズジャパン社製で処理し、10FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。1-5-2フローサイトメトリー解析1-5-1で調製した293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、pcDNA3.1-DR5M導入293T細胞とpcDNA3.1-mock導入293T細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4°Cで1時間静置した。5FBS含有PBSで2回洗浄した後、5FBS含有PBSで1000倍に希釈したFluorescein-conjugatedgoatIgGfractiontomouseIgGWholeMoleculeCappel社製55493を加えて懸濁し、4°Cで1時間静置した。5FBS含有PBSで3回洗浄した後、2μg/ml7-aminoactinomycinDInvitrogenMolecularProbes社製を含む5FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーターFC500:BeckmanCoulter社で検出を行った。データ解析はFlowjoTreeStar社で行った。7-aminoactinomycinD陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるpcDNA3.1-mock導入293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しpcDNA3.1-DR5M導入293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマを抗DR5抗体産生陽性として選択した。1-6殺細胞作用スクリーニング1-5及び1-6で抗DR5抗体産生陽性として選択したハイブリドーマ培養上清を用いて、ヒトTリンパ腫由来細胞株Jurkatに対する細胞死誘導作用を確認した。50mMTris-HCLで50μg/mlに調製したAfiniPureGoatanti-mouseIgGFcspecificJackson社製115-005-071を96穴ハーフエリアマイクロプレートコーニング社製に25μlずつ分注し4°Cで1晩静置した。ウェル中をPBSで2回洗浄した後、ハイブリドーマ培養上清を加えて、4°Cで1晩静置した。各ウェルをPBSで2回洗浄した後、10FBS含有RPMI1640培地中4.0x104細胞/mlになるよう調製したJurkat細胞を25μl/ウェルで添加し、37°C、5CO2の条件下で20時間培養した。CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssaykitPromega社製G7571を用いて生細胞由来のATP量を定量することによりハイブリドーマ培養上清中に存在する抗DR5モノクローナル抗体の殺細胞作用を評価した。その結果、ハイブリドーマ培養用培地添加と比較し、8割以上のATP量減少を示す5種類のモノクローナル抗体B086、B139、B192、B273、B467を産生するハイブリドーマを樹立した。1-7モノクローナル抗体のアイソタイプ決定モノクローナル抗体のアイソタイプは、MousemonoclonalisotypingkitSerotec社製により決定された。その結果、B086、B139、B192、B273、B467のアイソタイプはIgG1、κ鎖である事が確認された。1-8モノクローナル抗体の調製モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ移植マウスの腹水以下抗体精製原料という。から精製した。マウス腹水は以下のように調製した。まず、7‐8週齢のBALB/cAJcl-nu/nu日本エスエルシーをプリスタンSigma社製処理し、約3週間後に生理食塩水で洗浄したハイブリドーマをマウス1匹あたり1×107細胞で腹腔内に移植した。1‐2週間後に腹腔内に貯留した腹水を採取し0.22μmのフィルターを通して滅菌し抗体精製原料として用いた。抗体はHitrapMabSelectSuReGEHealthcareBio-Sciences社製で精製された。すなわち抗体精製原料をカラムに添加しPBSで洗浄後、2MArginine-HClpH4.0で溶出した。溶出された抗体溶液は中和後、PBSにバッファー置換された。抗体の濃度はPOROSG20μmColumnPEEK,4.6mm×50mm,0.83mlAppliedBiosystemsに結合させた抗体を溶出し、溶出液の吸光度O.D.280nmを測定することにより求めた。具体的には、平衡化バッファー30.6mMリン酸2水素ナトリウム12水、19.5mMリン酸1カリウム、0.15MNaCl、pH7.0で平衡化したPOROSG20μmにPBSで希釈した抗体サンプルを添加し、平衡化バッファーでカラムを洗浄後、カラムに結合した抗体を溶離液0.1v/vHCl、0.15MNaClで溶出した。溶出液の吸光度O.D.280nmのピーク面積を測定し、次式で濃度を算出した。抗体サンプル濃度mg/ml=抗体サンプルのピーク面積/標準品ヒトIgG1のピーク面積×標準品の濃度mg/ml×サンプルの希釈倍率。また、得られた抗体に含まれるエンドトキシン濃度をリムルスES-IIシングルテストワコー和光純薬工業295-51030コントロールスタンダードエンドトキシンを含むと、トキシノメーター和光純薬工業ET-301、又はET-5000を用いて測定し、1EU/mg以下であることを確認し以下の実験に使用した。1-9マウス抗体B273のヒト癌細胞株に対するinvitro殺細胞活性ヒトTリンパ腫由来細胞株Jurkat又はヒト神経膠芽種細胞株U-87MGをそれぞれ10FBS含有RPMI1640培地又は10FBS含有MEMMinimumEssentialMedium培地で4.4x104細胞/mlになるよう調製し、白色透明底96穴マイクロプレートコーニング社製に45μl/ウェルで添加し、37°C、5CO2の条件下で一晩培養した。マウスB273抗体又はマウスIgG1抗体RD社製をAfiniPureGoatanti-mouseIgGFcspecificJackson社製115-005-071と等濃度で混合後、マウスB273抗体又はマウスIgG1抗体の終濃度が10,000~0.01ng/mlとなるように5μl/ウェルで添加し、37°C、5CO2の条件下で24時間培養した。各ウェル中の生細胞由来のATP量をCellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssaykitPromega社製G7571を用いて添付のプロトコールに従いルミノメーターパーキンエルマー社製にて測定し、抗体液の代わりに培地を添加したウェルの値を100として殺細胞活性を評価した図1。各グラフは細胞生存率を平均値±標準偏差n=3で示している。その結果、マウスB273抗体は両細胞株に対して濃度依存的に殺細胞作用を示すことが明らかとなった。マウス抗体B273遺伝子のクローニングとヒトキメラ抗体遺伝子の作製2-1マウス抗体B273のcDNAのクローニングと配列の決定2-1-1マウス抗体B273の重鎖及び軽鎖のN末端アミノ酸配列の決定マウス抗体B273の重鎖及び軽鎖のN末端アミノ酸配列を決定するために、実施例1-8で精製したマウス抗体B273をSDS-PAGEで分離した。分離後のゲルからPVDF膜ポアサイズ0.45μm;Invitrogen社製にゲル中のタンパク質を転写し、洗浄バッファー25mMNaCl、10mMホウ酸ナトリウムバッファーpH8.0で洗浄した後、染色液50メタノール、20酢酸、0.05クマシーブリリアントブルーに5分間浸して染色してから、90メタノールで脱色した。PVDF膜上で可視化された重鎖移動度が小さい方のバンド及び軽鎖移動度が大きい方のバンドに相当するバンド部分を切りとり、Procise登録商標cLCプロテインシーケンサーModel492cLCAppliedBiosystemsを用いて、自動エドマン法Edmanetal.1967Eur.J.Biochem.1,80参照によりそれぞれのN末端アミノ酸配列の同定を試みた。その結果、マウス抗体B273の重鎖に相当するバンドのN末端のアミノ酸配列は、EVQLQQSGPELVKPG配列表の配列番号1であり、軽鎖に相当するバンドのN末端アミノ酸配列は、DVVMTQTPLSLPVSLGDQAS配列表の配列番号2であった。2-1-2マウス抗体B273産生ハイブリドーマからのmRNAの調製マウス抗体B273の重鎖及び軽鎖をコードするcDNAをクローニングするため、マウス抗体B273産生ハイブリドーマよりQuickPrepmRNAPurificationKitGEHealthcare社を用いてmRNAを調製した。2-1-3マウス抗体B273のcDNAのクローニングと配列の決定実施例1-7から、マウス抗体B273の重鎖及び軽鎖のアイソタイプがγ1とκであること、上記2-1-1で決定した重鎖及び軽鎖のN末端アミノ酸配列、及びカバトらにより作成された抗体のアミノ酸配列データベースKabat,E.A.etal.,1991inSequencesofProteinsofImmunologicalInterestVol.I及びII,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices参照を参考にして、抗体遺伝子翻訳領域の5’末端側と終止コドンを含む3’末端部分にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーをいくつか合成し、2-1-2で調製したmRNAとTaKaRaOneStepRNAPCRKitAMVタカラバイオ社を用いて重鎖、及び軽鎖をコードするcDNAを増幅したところ、下記のプライマーセットで抗体の重鎖、及び軽鎖をコードするcDNAを増幅することができた。重鎖用プライマーセット5’-aagaattcatgggatggagctgtatc-3’MH258E1F1:配列表の配列番号35’-aagatatcttatttaccaggagagtgggagag-3’G1EVR1:配列表の配列番号4軽鎖用プライマーセット5’-aagaattcatgaagttgcctgttagg-3’MK19EIF1:配列表の配列番号55’-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3’KEVR1:配列表の配列番号6PCRで増幅された重鎖、及び軽鎖のcDNAをそれぞれpEF6V5HisTOPOTAExpressionKitInvitrogen社を用いてクローニングし、クローニングされた重鎖、軽鎖の各ヌクレオチド配列を遺伝子配列解析装置ABIPRISM3700DNAAnalyzer;AppliedBiosystemsあるいはAppliedBiosystems3730xlAnalyzer;AppliedBiosystemsを用いて決定した。シーケンスの反応は、GeneAmp9700AppliedBiosystems社を用いた。決定されたマウス抗体B273の重鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号7に示し、アミノ酸配列を配列番号8に示した。マウス抗体B273の軽鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号9に示し、アミノ酸配列を配列表の配列番号10に示した。配列番号7及び8の配列は図28に、配列番号9及び10の配列は図29に、それぞれ記載されている。また、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を、抗体のアミノ酸配列のデータベースであるKabatManPROTEINS:Structure,FunctionandGenetics,251996,130-133参照を用いて比較検討した結果、マウス抗体B273の重鎖については、配列表の配列番号8のアミノ酸番号20乃至141に示されるアミノ酸配列が可変領域であることが明らかになった。またマウス抗体B273の軽鎖については、配列表の配列番号10のアミノ酸番号20乃至133に示されるアミノ酸配列が可変領域であることが明らかとなった。2-2キメラ抗体B273発現ベクターの作製2-2-1汎用発現ベクターpEF6KCL及びpEF1FCCUの作製2-2-1-1キメラ及びヒト化軽鎖発現ベクターpEF6KCLの構築プラスミドpEF6/V5-HisBInvitrogen社を鋳型として下記プライマーを用いてPCRを行うことにより、BGHpAの直後SequencePosition2174から、SmaISequencePosition2958までのDNA断片f1originofreplication及びSV40promotorandoriginを含むDNAフラグメント、以下、フラグメントAとする。を取得した。5’-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3’プライマーEFF1:配列表の配列番号115’-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3’プライマーEFsmaR:配列表の配列番号12得られたフラグメントAと、ヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域及びヒトpolyA付加シグナルをコードするDNA配列を含むDNAフラグメント配列番号13以下、フラグメントBとする。をOverlapExtensionPCRにより結合した。得られたフラグメントAとフラグメントBとが結合したDNA断片を制限酵素KpnI及びSmaIで消化し、制限酵素KpnI及びSmaIで消化したプラスミドpEF6/V5-HisBInvitrogen社とライゲーションし、EF1プロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトκ鎖定常領域、及びヒトpolyA付加シグナル配列をもつ、キメラ及びヒト化軽鎖発現ベクターpEF6KCLを構築した。2-2-1-2pEF1/KCLの構築上記の方法で得られたpEF6KCLから制限酵素KpnI及びSmaIで切り出されたDNA断片を、KpnI及びSmaIで消化したpEF1/myc-HisBInvitrogen社とライゲーションし、プラスミドpEF1KCLを構築した。2-2-1-3キメラ及びヒト化重鎖発現ベクターpEF1FCCUの構築ヒトIgG1シグナル配列及び定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片配列番号14を制限酵素NheI及びPmeIで消化し、NheI及びPmeIで消化したプラスミドpEF1KCLと結合し、EF1プロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒト重鎖定常領域、及びヒトpolyA付加シグナル配列をもつキメラ及びヒト化重鎖発現ベクターpEF1FCCUを構築した。2-2-2B273キメラタイプ軽鎖発現ベクターの構築マウス抗体B273の軽鎖をコードするcDNAをテンプレートとして、KOD-Plus-TOYOBO社と下記のプライマーセットで軽鎖の可変領域をコードするcDNAを含む部分を増幅し、制限酵素NdeI及びBsiWIで切り出されるDNA断片を、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpEF6KCLを制限酵素NdeI及びBsiWIで切断した箇所に挿入することにより、B273キメラタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをpEF6KCL/B273Lと命名した。B273キメラタイプ軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号15に示し、アミノ酸配列を配列番号16に示した。配列番号15及び16の配列は、図30に記載されている。なお、配列表の配列番号16に記載のキメラタイプ軽鎖アミノ酸配列の134番目のアミノ酸残基は軽鎖可変領域のカルボキシル末端であり、配列表の配列番号10に記載のマウス抗体B273の軽鎖アミノ酸配列の133番目のアラニン残基に対応するが、配列番号16に記載のアミノ酸配列においては既にヒト抗体軽鎖由来のスレオニン残基に置換されている。軽鎖用プライマーセット5’-aaacatatggcgatgttgtgatgacccaaactccactctcc-3’B273LF:配列表の配列番号175’-aaacgtacgtttgatttccagcttggtgcctccaccgaacg-3’B273LR:配列表の配列番号182-2-3B273キメラタイプ重鎖発現ベクターの構築マウス抗体B273の重鎖をコードするcDNAをテンプレートとして、KOD-Plus-TOYOBO社と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするcDNAを含む部分を増幅し、制限酵素BlpIで切り出されるDNA断片を、キメラ及びヒト化抗体重鎖発現汎用ベクターpEF1FCCUを制限酵素BlpIで切断した箇所に挿入することにより、B273キメラタイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれpEF1FCCU/B273Hと命名した。B273キメラタイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号19に示し、アミノ酸配列を配列番号20に示した。配列番号19及び20の配列は、図31に記載されている。重鎖用プライマーセット5’-aaagctgagcgaggttcagctgcagcagtctggacctgagc-3’B273HF:配列表の配列番号215’-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccagtag-3’B273HR:配列表の配列番号222-3キメラ抗体B273の調製2-3-1キメラ抗体B273の生産1.2×109個の対数増殖期のFreeStyle293F細胞Invitrogen社を新鮮な1.2LのFreeStyle293expressionmediumInvitrogen社に播種し、37°C、8CO2インキュベーター内において90rpmで一時間振とう培養した。PolyethyleneiminePolyscience247653.6mgをOpti-ProSFM培地Invitrogen社20mlに溶解し、次にPureLinkHiPurePlasmidキットInvitrogen社を用いて調製したpEF1FCCU/B273H0.4mg及びpEF6KCL/B273L0.8mgを20mlのOpti-ProSFM培地に懸濁した。Polyethyleneimine/Opti-ProSFM混合液20mlに、発現ベクター/Opti-ProSFM混合液20mlを加え穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle293F細胞に添加した。37°C、8CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposableCapsuleFilterAdvantecCCS-045-E1Hでろ過した。pEF1FCCU/B273HとpEF6KCL/B273Lとの組合せによって取得されたキメラ抗体B273をcB273と命名した。2-3-2cB273の精製上記2-3-1で得られた培養上清を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー4-6°C下とセラミックヒドロキシルアパタイト室温下の2段階工程で精製した。rProteinAアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックヒドロキシルアパタイト精製後のバッファー置換工程は室温下で実施した。最初に、培養上清1100-1200mlを、PBSで平衡化したMabSelectSuReGEHealthcareBioscience社製、HiTrapカラム:容積1ml×2連結にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、PBS15-30mlでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液pH4.0で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラムGEHealthcareBioscience社製、HiTrapDesaltingカラム:容積5ml×2連結で5mMリン酸ナトリウム/50mMMES/20mMNaCl/pH6.5のバッファーへ置換を行った。さらにその置換した抗体溶液を、5mMNaPi/50mMMES/20mMNaCl/pH6.5のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシルアパタイトカラム日本バイオラッド、Bio-ScaleCHT2-1HydroxyapatiteColumn:容積2mlにアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラムGEHealthcareBioscience社製、HiTrapDesaltingカラム:容積5mlx2連結でCBS10mMクエン酸緩衝液/140mM塩化ナトリウム、pH6.0への液置換を行った。最後にCentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20分画分子量30K、Sartorius社、4°C下にて濃縮し、IgG濃度を1.0mg/ml以上に調製し精製サンプルとした。ヒトキメラB273cB273抗体の活性測定invitro3-1cB273抗体のヒトDR5細胞外領域選択的結合性の検討ヒトTRAILR1~R4及びマウスTRAILR2細胞外領域蛋白質RDSystems社製に対するcB273の結合性を以下に示すダイレクトELISA法により検討した。まず、TRAILRsの細胞外領域蛋白質をPBSで1μg/mlに希釈した溶液を、イムノプレートNunc社製442404に50μl/ウェルで分注し、4°Cで一晩静置することでプレートに蛋白質を吸着させた。翌日、ウェル中の液を除去し、PBSで一回洗浄した後、非特異的な蛋白質の吸着を抑えるため、3ウシ胎児血清を含むPBSを200μl/ウェルで分注し、室温で1.5時間静置した。ウェル中の液を除去し、3ウシ胎児血清を含むPBSで希釈したcB273又は可溶性ヒトTRAILALEXIS社製ALX-522-003を50μl/ウェルで添加した。室温で1.5時間静置後、PBSを加えてからウェル中の液を除去し、PBSで2回ウェルを洗浄した。cB273抗体添加ウェルには3ウシ胎児血清を含むPBSで2500倍に希釈したGoatanti-HumanIgG,Fab’2fragmentspecific,PeroxidaseConjugatedJackson社製109-035-097を50μl/ウェル、可溶性TRAIL添加ウェルには2000倍に希釈したAnti-FLAGM2monoclonalantibody-Peroxidaseconjugateを50μl/ウェルで添加し、室温で1時間静置した。PBSを加えてからウェル中の液を除去し、PBSで2回ウェルを洗浄した後、OPD発色液を100μl/ウェルで添加して発色させ、1MHClを100μl/ウェルで添加して発色反応を止め、プレートリーダーで492nmの吸光度を測定した。図2AはcB273、図2Bは可溶性TRAILの結果を示し、グラフは平均値±標準偏差n=3で示した。その結果、cB273はヒトTRAILR2細胞外領域に選択的に結合することが示された。3-2cB273抗体のBiacoreによる結合活性評価3-2-1ヒトDR5細胞外領域蛋白質の調製3-2-1-1DR5細胞外領域蛋白質発現ベクターの作製配列表の配列番号23に示すヒトDR5のアミノ酸番号1-130に示されるアミノ酸配列からなる領域以下sDR5と記す。を発現するベクターを構築するため、sDR5増幅用プライマーセット:DR5Ndefw:5’-gtggcatatggctctgatcacccaacaa-3’配列表の配列番号24及び、DR5Xhorv:5’-cgcctcgagtgattctttgtggacaca-3’配列表の配列番号25、のプライマーセットを用いてヒトDR5細胞外領域をコードするcDNAを鋳型にしてPCR反応を行った。得られたPCR産物をNdeI及びXhoIで切断し、pET21bNovagen社製のNdeI/XhoIサイトにクローニングした以下pET21b-sDR5と略す。また、以下及び図中でpET21b-sDR5によって発現する組換え蛋白質をrsDR5と記す配列表の配列番号26。。3-2-1-2DR5細胞外領域蛋白質rsDR5の作製発現プラスミドpET21b-sDR5で大腸菌OrigamiBDE3Novagen社製を形質転換し、100μg/mlのアンピシリンSigma社製、15μg/mlのカナマイシンWako社製、を添加した2-YT培地で培養を行い、0.5mMIPTG添加でDR5部分蛋白質の発現誘導を行った。6000rpm、20分間遠心して集菌し、結合バッファー50mMTrisHClpH7.5、300mMNaClに懸濁した後、氷上で超音波破砕を行った。25000rpm、20分間遠心して、上清を回収し、Ni-NTAInvitrogen社製に供与した。結合バッファーで洗浄した後に、溶出バッファー50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、300mMImidazoleにて溶出した。溶出サンプルは、透析バッファー50mMTrisHClpH8.0、20mMNaClで透析した後、MONOQに供与し、溶出バッファー50mMTris-HClpH8.0、1MNaClでグラジエント溶出させた。溶出サンプルは、PBSを溶媒としたゲル濾過カラムクロマトグラフィーSuperdex7516/60:GEHealthcareBio-Sciences社製でさらに精製した。得られた組換え蛋白質の濃度はUV280モル吸光度定数;14855で測定した。3-2-2Biacoreによる結合活性測定cB273抗体とrsDR5の解離定数測定は、Biacore3000GEヘルスケアバイオサイエンス株を使用し、固定化した抗ヒトIgGFc抗体に抗体を捕捉キャプチャーし、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒトIgGFc抗体Humanantibodycapturekit、GEヘルスケアバイオサイエンス株は、センサーチップCM5BIAcore,Inc.へアミンカップリング法にて約8,000RU共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてHBS-EP10mMHEPESpH7.4、0.15MNaCl,3mMEDTA、0.05SurfactantP20を用いた。抗ヒトIgGFc抗体を固定化したチップ上に、50nMのcB273抗体溶液を流速10μl/分で60秒間添加した後、rsDR5の希釈系列溶液0.63-20nMを流速30μl/分で60秒間添加し、引き続き300秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、3M塩化マグネシウムを流速10μl/分で30秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェアBIAevaluationsoftware,version3.1の1対1結合モデルを用いて、結合速度定数kon、解離速度定数koff及び解離定数KD;KD=koff/konを算出した。cB273抗体のBiacore測定結果を図3に示す。3-3cB273抗体のヒト癌細胞株に対するinvitro殺細胞作用cB273抗体の種々の癌細胞株に対する殺細胞作用を以下の方法で検討した。A2780、SK-OV-3、SK-CO-1、Caov-3、NIH:OVCAR-5以上、ヒト卵巣癌株、HCT-15、COLO205、HT29、SW480、SW620、DLD-1、COLO201、WiDr以上、ヒト大腸癌株、NCI-H1975、NCI-H292、NCI-H460、NCI-H358、以上、ヒト肺癌株、MDA-MB-231、ZR-75-1以上、ヒト乳癌株をAmericanTypeCultureCollection:ATCCより購入した。これらの細胞株を10ウシ胎児血清ハイクローン社製を含む培地以下培地で1×105cells/mlに調製して白色透明底96穴マイクロプレートコーニング社製に50μl/ウェルずつ播種した。cB273抗体を、1μg/mlの2次抗体溶液Goatanti-humanIgGFc:MPBiomedicals、LLC.社製で20000ng/mlに調製後、培地を用いて2000、200、20、2ng/mlの溶液を調製し、50μlずつ添加した抗体最終濃度10000、1000、100、10、1ng/ml。37°C、5CO2の条件下でプレートを72時間培養後、各ウェル中の生細胞由来のATP量をCellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssaykitPromega社製G7571を用いて添付のプロトコールに従いルミノメーターベルトールド社製にて測定した。培地と細胞懸濁液を添加したウェルを陰性コントロールウェルとし、培地のみを添加したウェルをバックグラウンドウェルとして、被験ウェルの細胞生存率を算出した。図4にcB273抗体処理による由来癌種ごとの細胞生存率の平均値±標準誤差n=3を示した。cB273抗体はSK-CO-1を除く細胞株に対し殺細胞活性を示した。種々の癌細胞株に対するinvitro殺細胞作用について、BxPC-3、MIAPaCa-2以上、ヒト膵臓癌株、A2058、A375以上、ヒトメラノーマ株、U-87MGヒト神経膠芽種細胞株、AN3CAヒト子宮内膜癌株を対象に検討した。各細胞株を10FBS含有培地で4.4x104細胞/mlになるよう調製し、白色透明底96穴マイクロプレートコーニング社製に45μl/ウェルで添加し、37°C、5CO2の条件下で一晩培養した。cB273抗体をGoatanti-humanIgGFcMPBiomedicals、LLC.社製と等濃度で混合後、cB273抗体の終濃度が10,000~1ng/mlとなるように5μl/ウェルで添加し、37°C、5CO2の条件下で24時間培養した。各ウェル中の生細胞由来のATP量をCellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssaykitPromega社製G7571を用いて添付のプロトコールに従いルミノメーターパーキンエルマー社製にて測定した。各グラフは細胞生存率を平均値±標準偏差n=3で示している。その結果、cB273抗体は調べた全ての癌細胞株に対して殺細胞作用を示した図5。cB273抗体のエピトープの同定4-1cB273Fabフラグメントの作製cB273はPBSに透析した後、PBSで2mgmlに希釈し、17ml調製した。PBSで0.1mMに調製した、CysteineSigma社製を1.7mlとPBSで0.1mgmlに希釈したpapainSigma社製を2.04ml添加し、37°C、5時間反応させた。5時間後、PBSで120mMに溶解させたN-ethylmaleimide東京化成製を6.33ml添加して反応を停止させた。反応液は50mMTris-HCl、20mMNaClで平衡化させたSuperdex2002660GEヘルスケア社製に添加し、Fabフラグメントに相当するフラクション14mlを回収した。4-2cB273Fabフラグメント、rsDR5複合体試料の調製cB273FabフラグメントをAmiconUltra15MWCO10Kミリポア社製で9.46mgmlに濃縮し、AmiconUltra15MWCO3Kで5.6mgmlに濃縮したrsDR5を2mlずつ混合し、20mMTrisHCl、50mMNaClで平衡化したSuperdex2001660に添加した。複合体に相当する相当するフラクション8mlを回収した。4-3cB273FabフラグメントとrsDR5複合体の結晶化と構造解析得られたrsDR5とcB273Fabの複合体を25mg/mlに濃縮し、結晶化に用いた。結晶化には蒸気拡散法を用いた。タンパク質溶液0.45~1.0μlに沈殿剤溶液6~8w/vpolyethyleneglycol4000、20v/visopropanol、0.1Mlithiumchloride、0.1McitratebufferpH5.6を等量加えた溶液を、0.45mlの沈殿剤溶液を入れた密閉容器に両溶液が触れ合わないように収め、22°Cで静置した。3日後に0.4mm×0.3mm×0.03mmの板状晶が得られた。得られた結晶を30v/vglycerolを加えた沈殿剤溶液に浸し、続いて-180°Cの窒素気流下で凍結した。高エネルギー加速器研究機構放射光科学研究施設のBL17Aにて95K窒素気流下でX線回折データを収集した。得られた回折像からソフトウェアHKL2000HKL社製を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。結晶は単斜晶系で空間群はC2、結晶の単位格子はa=152.0Å、b=75.5Å、c=116.3Å、β=110.2°であった。得られた構造因子とDR5PDBコード:2H9G及びHerceptinのFabPDBコード:1N8Zの三次元構造座標を用いて分子置換法を行い、位相を決定した。計算にはソフトウェアphaserCCP4:CollaborativeComputationalProjectNo.4を使用した。結晶は非対称単位に2複合体を含んでいた。ソフトウェアCNXAccerlysInc.を用いて構造の精密化を行い、ソフトウェアcootを用いてモデルの修正を行った。この操作を繰り返し行い、2.1Å分解能で最終のR値25.0、freeR値28.7を得た。最終のモデルは2複合体から成り、cB273FabのL鎖アミノ酸残基2分子とも1-218、H鎖アミノ酸残基2分子とも1-222、DR5の2分子のうち1分子はアミノ酸残基18-92及び98-127もう1分子はアミノ酸残基21-92及び98-127、及び324個の水分子を含む。DR5のアミノ酸残基93-97、N末の17あるいは20残基、C末の6残基とHisタグ、及びcB273FabL鎖のC末1残基、H鎖のC末5残基はそれぞれ電子密度が明瞭でなかったためモデル構築していない。ラマチャンドランプロットで確認したところ、許容されない領域にあるアミノ酸はL鎖のVal56のみであり、このVal56はCDRのL2で特徴的に見られる構造を取っている。決定されたDR5とcB273Fabの相互作用は、非対称単位中の2分子でほぼ同等であった。cB273Fabから4Å以内にあるDR5のアミノ酸残基各アミノ酸残基の位置は配列番号23に対応しているは以下の通りである:Gly26、Ile34、Glu36、Asp37、Gly38、Asp56、Leu57、Leu58、Phe59、Leu61、Arg62。図6に複合体全体のリボンモデルと表面を、また図7にDR5とcB273FabのH鎖、L鎖との相互作用をそれぞれ示した。cB273抗体のヒト化その15-1B273のヒト化バージョンhB273の設計5-1-1B273の可変領域の分子モデリングB273の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法MethodsinEnzymology,203,121-153,1991によって実行された。ProteinDataBankNuc.AcidRes.28,235-2422000に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の1次配列X線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能であるを、上で決定されたB273の可変領域と比較した。結果として、1T66が、B273の軽鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。また、1XIWが、B273の重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、B273の軽鎖及び重鎖に対応する1T66及び1XIWの座標を組み合わせて、フレームワークモデルを得ることによって作製された。B273のCDRは、Thorntonetal.J.Mol.Biol.,263,800-815,1996の分類に従って、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及びCDRH2は、それぞれクラスター16A、7A、9A、10A、10Aに割り当てられた。CDRH3は、H3ルールFEBSletter399,1-81996を使用して、k11-に分類された。次いで、それぞれのCDRについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。最後に、エネルギーの点でB273の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販の蛋白質立体構造予測プログラムPrime及び配座探索プログラムMacroModelSchrodinger,LLCを使用して行った。5-1-2ヒト化B273に対するアミノ酸配列の設計ヒト化B273抗体の構築を、CDRグラフティングProc.Natl.Acad.Sci.USA86,10029-100331989として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。B273のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のKabatデータベースNuc.AcidRes.29,205-2062001の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、HuMc3抗体がフレームワーク領域についての76の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。HuMc3についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、B273についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築されたB273の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Queenetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,10029-100331989によって与えられる基準によって選択された。選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化B273配列を以下の実施例に記載されるように構築した。5-1-2B273軽鎖のヒト化5-1-2-1hB273_L1タイプ軽鎖:配列表の配列番号16に示されるcB273軽鎖のアミノ酸番号22バリン、27スレオニン、34セリン、35ロイシン、37アスパラギン酸、38グルタミン、70リジン、108ロイシン、110イソロイシン、112フェニルアラニン、125グリシン、129ロイシンをそれぞれイソロイシン、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン、バリン、バリン、チロシン、プロリン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273軽鎖をhB273_L1タイプ軽鎖と命名した。hB273_L1タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号27に記載されている。また、hB273_L1タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号28に記載されている。さらに、配列番号27及び28の配列は、図32にも記載されている。5-1-2-2hB273_L2タイプ軽鎖:配列表の配列番号16に示されるcB273軽鎖のアミノ酸番号37アスパラギン酸、38グルタミン、108ロイシン、110イソロイシン、125グリシン、129ロイシンをそれぞれグルタミン酸、プロリン、バリン、バリン、プロリン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273軽鎖をhB273_L2タイプ軽鎖と命名した。hB273_L2タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号29に記載されている。また、hB273_L2タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号30に記載されている。さらに、配列番号29及び30の配列は、図33にも記載されている。5-1-2-3hB273_L3タイプ軽鎖:配列表の配列番号16に示されるcB273軽鎖のアミノ酸番号37アスパラギン酸、38グルタミン、108ロイシン、110イソロイシン、129ロイシンをそれぞれグルタミン酸、プロリン、バリン、バリン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273軽鎖をhB273_L3タイプ軽鎖と命名した。hB273_L3タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号31に記載されている。また、hB273_L3タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号32に記載されている。さらに、配列番号31及び32の配列は、図34にも記載されている。5-1-3B273重鎖のヒト化5-1-3-1hB273_H1タイプ重鎖:配列表の配列番号20に示されるcB273重鎖のアミノ酸番号20グルタミン酸、24グルタミン、28プロリン、30ロイシン、31バリン、39イソロイシン、56メチオニン、57リジン、59セリン、60ヒスチジン、62リジン、63セリン、67イソロイシン、86リジン、87アラニン、95セリン、96スレオニン、99ヒスチジン、103ロイシン、106スレオニン、110セリン、114フェニルアラニン、116グリシン、136スレオニン、137ロイシンをそれぞれグルタミン、バリン、アラニン、バリン、リジン、バリン、バリン、アルギニン、アラニン、プロリン、メチオニン、グリシン、メチオニン、アルギニン、バリン、スレオニン、セリン、チロシン、セリン、アルギニン、スレオニン、チロシン、アラニン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273重鎖をhB273_H1タイプ重鎖と命名した。hB273_H1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号33に記載されている。また、hB273_H1タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号34に記載されている。さらに、配列番号33及び34の配列は、図35にも記載されている。5-1-3-2hB273_H2タイプ重鎖:配列表の配列番号20に示されるcB273重鎖のアミノ酸番号20グルタミン酸、24グルタミン、28プロリン、30ロイシン、31バリン、39イソロイシン、60ヒスチジン、62リジン、95セリン、96スレオニン、99ヒスチジン、103ロイシン、106スレオニン、110セリン、116グリシン、136スレオニン、137ロイシンをそれぞれグルタミン、バリン、アラニン、バリン、リジン、バリン、プロリン、メチオニン、スレオニン、セリン、チロシン、セリン、アルギニン、スレオニン、アラニン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273重鎖をhB273_H2タイプ重鎖と命名した。hB273_H2タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号35に記載されている。また、hB273_H2タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号36に記載されている。さらに、配列番号35及び36の配列は、図36にも記載されている。5-1-3-3hB273_H3タイプ重鎖:配列表の配列番号20に示されるcB273重鎖のアミノ酸番号24グルタミン、28プロリン、30ロイシン、31バリン、39イソロイシン、60ヒスチジン、95セリン、96スレオニン、103ロイシン、106スレオニン、110セリン、136スレオニン、137ロイシンをそれぞれバリン、アラニン、バリン、リジン、バリン、プロリン、スレオニン、セリン、セリン、アルギニン、スレオニン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273重鎖をhB273_H3タイプ重鎖と命名した。hB273_H3タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号37に記載されている。また、hB273_H3タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号38に記載されている。さらに、配列番号37及び38の配列は、図37にも記載されている。5-2hB273_L1、hB273_L2、及びhB273_L3タイプ軽鎖発現ベクターの構築配列番号28のアミノ酸番号21乃至134、配列番号30のアミノ酸番号21乃至134、及び配列番号32のアミノ酸番号21乃至134にそれぞれ示される、hB273_L1、hB273_L2、及びhB273_L3タイプ軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むDNAを合成しGENEART社、人工遺伝子合成サービス、制限酵素NdeI及びBsiWIで切り出されるDNA断片を、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpEF6KCLを制限酵素NdeI及びBsiWIで切断した箇所に挿入することにより、hB273_L1、hB273_L2、及びhB273_L3タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれpEF6KCL/hB273_L1、pEF6KCL/hB273_L2、及びpEF6KCL/hB273_L3と命名した。5-3hB273_H1、hB273_H2、及びhB273_H3タイプ重鎖発現ベクターの構築配列表の配列番号34のアミノ酸番号20乃至141、配列番号36のアミノ酸番号20乃至141、及び配列番号38のアミノ酸番号20乃至141にそれぞれ示される、hB273_H1、hB273_H2、及びhB273_H3タイプ重鎖可変領域をコードする遺伝子を含むDNAを合成しGENEART社人工遺伝子合成サービス、制限酵素BlpIで切り出されるDNA断片を、ヒト化抗体重鎖発現汎用ベクターpEF1FCCUを制限酵素BlpIで切断した箇所に挿入することにより、hB273_H1、hB273_H2、及びhB273_H3タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれpEF1FCCU/hB273_H1、pEF1FCCU/hB273_H2、及びpEF1FCCU/hB273_H3と命名した。5-4ヒト化抗体の調製5-4-1ヒト化抗体の生産1.2×109個の対数増殖期のFreeStyle293F細胞Invitrogen社を新鮮な1.2LのFreeStyle293expressionmediumInvitrogen社に播種し、37°C、8CO2インキュベーター内で90rpmで一時間振とう培養した。PolyethyleneiminePolyscience247653.6mgをOpti-ProSFM培地Invitrogen社20mlに溶解し、次にPureLinkHiPurePlasmidキットInvitrogen社を用いて調製したH鎖発現ベクター0.4mg及びL鎖発現ベクター0.8mgを20mlのOpti-ProSFM培地に懸濁した。Polyethyleneimine/Opti-ProSFM混合液20mlに、発現ベクター/Opti-ProSFM混合液20mlを加え穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle293F細胞に添加した。3時間後にZ-VAD-FMKPEPTIDEINSTITUTE社を10μMになるように添加し、37°C、8CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposableCapsuleFilterAdvantecCCS-045-E1Hでろ過した。pEF1FCCU/hB273_H1とpEF6KCL/hB273_L1との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H1/hB273_L1、pEF1FCCU/hB273_H1とpEF6KCL/hB273_L2との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H1/hB273_L2、pEF1FCCU/hB273_H1とpEF6KCL/hB273_L3との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H1/hB273_L3、pEF1FCCU/hB273_H2とpEF6KCL/hB273_L1との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2/hB273_L1、pEF1FCCU/hB273_H2とpEF6KCL/hB273_L2との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2/hB273_L2、pEF1FCCU/hB273_H2とpEF6KCL/hB273_L3との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2/hB273_L3、pEF1FCCU/hB273_H3とpEF6KCL/hB273_L1との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H3/hB273_L1、pEF1FCCU/hB273_H3とpEF6KCL/hB273_L2との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H3/hB273_L2、pEF1FCCU/hB273_H3とpEF6KCL/hB273_L3との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H3/hB273_L3と命名した。5-4-2ヒト化抗体の精製上記5-4-1で得られた培養上清を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー4-6°C下とセラミックヒドロキシルアパタイト室温下の2段階工程で精製した。rProteinAアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックヒドロキシルアパタイト精製後のバッファー置換工程は室温下で実施した。最初に、培養上清1100-1200mlを、PBSで平衡化したMabSelectSuReGEHealthcareBioscience社製、HiTrapカラム:容積1ml×2連結にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、PBS15-30mlでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液pH4.0で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラムGEHealthcareBioscience社製、HiTrapDesaltingカラム:容積5ml×2連結で5mMリン酸ナトリウム/50mMMES/20mMNaCl/pH6.5のバッファーへ置換を行った。さらにその置換した抗体溶液を、5mMNaPi/50mMMES/20mMNaCl/pH6.5のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシルアパタイトカラム日本バイオラッド、Bio-ScaleCHT2-1HydroxyapatiteColumn:容積2mlにアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラムGEHealthcareBioscience社製、HiTrapDesaltingカラム:容積5mlx2連結でCBS10mMクエン酸緩衝液/140mM塩化ナトリウム、pH6.0への液置換を行った。最後にCentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20分画分子量30K、Sartorius社、4°C下にて濃縮し、IgG濃度を1.0mg/ml以上に調製し精製サンプルとした。ヒト化B273hB273抗体の活性測定その16-1hB273抗体のBiacoreによる結合活性評価ヒト化抗DR5抗体とrsDR5の解離定数測定は、BiacoreT100GEヘルスケアバイオサイエンス株を使用し、固定化した抗ヒトIgGFc抗体に抗体を捕捉キャプチャーし、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒトIgGFc抗体Humanantibodycapturekit、GEヘルスケアバイオサイエンス株は、センサーチップCM5BIAcore,Inc.へアミンカップリング法にて~10,000RU共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてHBS-EP10mMHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.05SurfactantP20を用いた。抗ヒトIgGFc抗体を固定化したチップ上に、約20nMの抗体溶液を流速10μl/分で60秒間添加した後、rsDR5の希釈系列溶液3.13-50nMを流速30μl/分で120秒間添加し、引き続き180秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、3M塩化マグネシウムを流速10μl/分で30秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェアBiacoreT100Evaluationsoftware,version2.0.1の1対1結合モデルを用いて、結合速度定数kon、解離速度定数koff及び解離定数KD;KD=koff/konを算出した。9種類のヒト化DR5抗体のBiacore測定結果を図8に示す。6-2hB273抗体のヒト癌細胞株に対するinvitro殺細胞活性50mMTris-HCLで50μg/mlに調製したAfiniPureFab’2fragmentGoatanti-HumanIgGFcfragmentspecificJackson社製109-006-098を96穴マイクロプレートコーニング社製に45μlずつ分注し4°Cで1晩静置した。ウェル内をPBSで2回洗浄した後、5-4-1で抗体を生産させた293F培養上清、精製したcB273抗体実施例2-3-2、又は市販ヒトIgGJackson社製009-000-003を150~1.5ng/mlとなるように50μl/ウェルで添加し、4°Cで1晩静置した。各ウェルをPBSで2回洗浄した後、10FBS含有RPMI1640培地中4.0x104細胞/mlになるよう調製したJurkat細胞を50μl/ウェルで添加し、37°C、5CO2の条件下で23時間培養した。CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssaykitPromega社製G7571を用いて生細胞由来のATP量を定量し、抗体液の代わりに培地を添加したウェルの値を100としてhB273抗体の殺細胞作用を評価した。その結果、図9に示すように、B273重鎖ヒト化に関しては、H1シリーズの抗体はH2やH3よりも殺細胞作用がやや弱い傾向が認められた。一方、B273軽鎖ヒト化に関しては、デザインしたL1、L2、L3のいずれの軽鎖を使用した場合においてもほぼ同程度の殺細胞作用を示しうることが明らかとなった。cB273抗体のヒト化その27-1B273のヒト化バージョンhB273の設計7-1-1ヒト化B273に対するアミノ酸配列の設計実施例5及び6に示すヒト化抗体の設計その1の結果を基に、いくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化B273配列を以下の実施例に記載されるように構築した。7-1-2ヒト化B273に対するアミノ酸配列の設計7-1-2-1hB273_H1-1タイプ重鎖:配列表の配列番号20に示されるcB273重鎖のアミノ酸番号20グルタミン酸、24グルタミン、28プロリン、30ロイシン、31バリン、39イソロイシン、57リジン、59セリン、60ヒスチジン、62リジン、63セリン、67イソロイシン、86リジン、87アラニン、95セリン、96スレオニン、99ヒスチジン、103ロイシン、106スレオニン、110セリン、136スレオニン、137ロイシンをそれぞれグルタミン、バリン、アラニン、バリン、リジン、バリン、アルギニン、アラニン、プロリン、メチオニン、グリシン、メチオニン、アルギニン、バリン、スレオニン、セリン、チロシン、セリン、アルギニン、スレオニン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273重鎖をhB273_H1-1タイプ重鎖と命名した。hB273_H1-1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号39に記載されている。また、hB273_H1-1タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号40に記載されている。さらに、配列番号39及び40の配列は、図38にも記載されている。7-1-2-2hB273_H2―1タイプ重鎖:配列表の配列番号20に示されるcB273重鎖のアミノ酸番号24グルタミン、28プロリン、30ロイシン、31バリン、39イソロイシン、60ヒスチジン、62リジン、95セリン、96スレオニン、99ヒスチジン、103ロイシン、106スレオニン、110セリン、116グリシン、136スレオニン、137ロイシンをそれぞれバリン、アラニン、バリン、リジン、バリン、プロリン、メチオニン、スレオニン、セリン、チロシン、セリン、アルギニン、スレオニン、アラニン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273重鎖をhB273-H2-1タイプ重鎖と命名した。hB273_H2-1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号41に記載されている。また、hB273_H2-1タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号42に記載されている。さらに、配列番号41及び42の配列は、図39にも記載されている。7-1-2-3hB273_H2-2タイプ重鎖:配列表の配列番号20に示されるcB273重鎖のアミノ酸番号20グルタミン酸、24グルタミン、28プロリン、30ロイシン、31バリン、39イソロイシン、60ヒスチジン、62リジン、95セリン、96スレオニン、103ロイシン、106スレオニン、110セリン、116グリシン、136スレオニン、137ロイシンをそれぞれグルタミン、バリン、アラニン、バリン、リジン、バリン、プロリン、メチオニン、スレオニン、セリン、セリン、アルギニン、スレオニン、アラニン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273重鎖をhB273_H2-2タイプ重鎖と命名した。hB273_H2-2タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号43に記載されている。また、hB273_H2-2タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号44に記載されている。さらに、配列番号43及び44の配列は、図40にも記載されている。7-1-2-4hB273_H2-3タイプ重鎖:配列表の配列番号20に示されるcB273重鎖のアミノ酸番号24グルタミン、28プロリン、30ロイシン、31バリン、39イソロイシン、60ヒスチジン、62リジン、95セリン、96スレオニン、103ロイシン、106スレオニン、110セリン、116グリシン、136スレオニン、137ロイシンをそれぞれバリン、アラニン、バリン、リジン、バリン、プロリン、メチオニン、スレオニン、セリン、セリン、アルギニン、スレオニン、アラニン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273重鎖をhB273_H2-3タイプ重鎖と命名した。hB273_H2-3タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号45に記載されている。また、hB273_H2-3タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号46に記載されている。さらに、配列番号45及び46の配列は、図41にも記載されている。7-1-2-5hB273_H2-4タイプ重鎖:配列表の配列番号20に示されるcB273重鎖のアミノ酸番号20グルタミン酸、24グルタミン、28プロリン、30ロイシン、31バリン、39イソロイシン、60ヒスチジン、62リジン、95セリン、96スレオニン、99ヒスチジン、103ロイシン、106スレオニン、110セリン、136スレオニン、137ロイシンをそれぞれグルタミン、バリン、アラニン、バリン、リジン、バリン、プロリン、メチオニン、スレオニン、セリン、チロシン、セリン、アルギニン、スレオニン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273重鎖をhB273_H2-4タイプ重鎖と命名した。hB273_H2-4タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号47に記載されている。また、hB273_H2-4タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号48に記載されている。さらに、配列番号47及び48の配列は、図42にも記載されている。7-1-2-6hB273_H2-5タイプ重鎖:配列表の配列番号20に示されるcB273重鎖のアミノ酸番号20グルタミン酸、24グルタミン、28プロリン、30ロイシン、31バリン、39イソロイシン、60ヒスチジン、95セリン、96スレオニン、99ヒスチジン、103ロイシン、106スレオニン、110セリン、136スレオニン、137ロイシンをそれぞれグルタミン、バリン、アラニン、バリン、リジン、バリン、プロリン、スレオニン、セリン、チロシン、セリン、アルギニン、スレオニン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化B273重鎖をhB273_H2-5タイプ重鎖と命名した。hB273_H2-5タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号49に記載されている。また、hB273_H2-5タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号50に記載されている。さらに、配列番号49及び50の配列は、図43にも記載されている。7-2hB273_H1-1、hB273_H2-1、hB273_H2-2、hB273_H2-3、hB273_H2-4、及びhB273_H2-5タイプ重鎖発現ベクターの構築配列表の配列番号40のアミノ酸番号20乃至141、配列番号42のアミノ酸番号20乃至141、配列番号44のアミノ酸番号20乃至141、配列番号46のアミノ酸番号20乃至141、配列番号48のアミノ酸番号20乃至141、及び配列番号50のアミノ酸番号20乃至141にそれぞれ示される、hB273_H1、hB273_H2、及びhB273_H3タイプ重鎖可変領域をコードする遺伝子を含むDNAを合成しGENEART社人工遺伝子合成サービス、制限酵素BlpIで切り出されるDNA断片を、ヒト化抗体重鎖発現汎用ベクターpEF1FCCUを制限酵素BlpIで切断した箇所に挿入することにより、hB273_H1-1、hB273_H2-1、hB273_H2-2、hB273_H2-3、hB273_H2-4、及びhB273_H2-5タイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれpEF1FCCU/hB273_H1-1、pEF1FCCU/hB273_H2-1、pEF1FCCU/hB273_H2-2、pEF1FCCU/hB273_H2-3、pEF1FCCU/hB273_H2-4、及びpEF1FCCU/hB273_H2-5と命名した。7-3ヒト化抗体の調製7-3-1ヒト化抗体の生産1.2×109個の対数増殖期のFreeStyle293F細胞Invitrogen社を新鮮な1.2LのFreeStyle293expressionmediumInvitrogen社に播種し、37°C、8CO2インキュベーター内において90rpmで一時間振とう培養した。PolyethyleneiminePolyscience247653.6mgをOpti-ProSFM培地Invitrogen社20mlに溶解し、次にPureLinkHiPurePlasmidキットInvitrogen社を用いて調製したH鎖発現ベクター0.4mg及びL鎖発現ベクター0.8mgを20mlのOpti-ProSFM培地に懸濁した。Polyethyleneimine/Opti-ProSFM混合液20mlに、発現ベクター/Opti-ProSFM混合液20mlを加え穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle293F細胞に添加した。3時間後にZ-VAD-FMKPEPTIDEINSTITUTE社を10μMになるように添加し、37°C、8CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposableCapsuleFilterAdvantecCCS-045-E1Hでろ過した。pEF1FCCU/hB273_H1-1とpEF6KCL/hB273_L1との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H1-1/hB273_L1、pEF1FCCU/hB273_H2-1とpEF6KCL/hB273_L1との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2-1/hB273_L1、pEF1FCCU/hB273_H2-2とpEF6KCL/hB273_L1との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2-2/hB273_L1、pEF1FCCU/hB273_H2-3とpEF6KCL/hB273_L1との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2-3/hB273_L1、pEF1FCCU/hB273_H2-4とpEF6KCL/hB273_L1との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2-4/hB273_L1、pEF1FCCU/hB273_H2-5とpEF6KCL/hB273_L1との組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2-5/hB273_L1と命名した。7-3-2ヒト化抗体の精製上記7-3-1で得られた培養上清を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー4-6°C下とセラミックヒドロキシルアパタイト室温下の2段階工程で精製した。rProteinAアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックヒドロキシルアパタイト精製後のバッファー置換工程は室温下で実施した。最初に、培養上清1100-1200mlを、PBSで平衡化したMabSelectSuReGEHealthcareBioscience社製、HiTrapカラム:容積1ml×2連結にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、PBS15-30mlでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液pH4.0で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラムGEHealthcareBioscience社製、HiTrapDesaltingカラム:容積5ml×2連結で5mMリン酸ナトリウム/50mMMES/20mMNaCl/pH6.5のバッファーへ置換を行った。さらにその置換した抗体溶液を、5mMNaPi/50mMMES/20mMNaCl/pH6.5のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシルアパタイトカラム日本バイオラッド、Bio-ScaleCHT2-1HydroxyapatiteColumn:容積2mlにアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラムGEHealthcareBioscience社製、HiTrapDesaltingカラム:容積5mlx2連結でCBS10mMクエン酸緩衝液/140mM塩化ナトリウム、pH6.0への液置換を行った。最後にCentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20分画分子量30K、Sartorius社、4°C下にて濃縮し、IgG濃度を1.0mg/ml以上に調製し精製サンプルとした。ヒト化B273hB273抗体の活性測定その28-1hB273抗体のBiacoreによる結合活性評価ヒト化抗DR5抗体とrsDR5の解離定数測定は、BiacoreT100GEヘルスケアバイオサイエンス株を使用し、固定化した抗ヒトIgGFc抗体に抗体を捕捉キャプチャーし、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒトIgGFc抗体Humanantibodycapturekit、GEヘルスケアバイオサイエンス株は、センサーチップCM5BIAcore,Inc.へアミンカップリング法にて~10,000RU共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてHBS-EP10mMHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.05SurfactantP20を用いた。抗ヒトIgGFc抗体を固定化したチップ上に、約20nMの抗体溶液を流速10μl/分で60秒間添加した後、rsDR5の希釈系列溶液3.13-50nMを流速30μl/分で120秒間添加し、引き続き180秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、3M塩化マグネシウムを流速10μl/分で30秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェアBiacoreT100Evaluationsoftware,version2.0.1の1対1結合モデルを用いて、結合速度定数kon、解離速度定数koff及び解離定数KD;KD=koff/konを算出した。6種類のヒト化DR5抗体のBiacore測定結果を図10に示す。8-2hB273抗体のヒト癌細胞株に対するinvitro殺細胞活性50mMTris-HCLで50μg/mlに調製したAfiniPureFab’2fragmentGoatanti-HumanIgGFcfragmentspecificJackson社製109-006-098を96穴マイクロプレートコーニング社製に45μlずつ分注し4°Cで1晩静置した。ウェル中をPBSで2回洗浄した後、7-3-1で抗体を生産させた293F培養上清を150~1.5ng/mlとなるように50μl/ウェルで添加し、4°Cで1晩静置した。各ウェルをPBSで2回洗浄した後、10FBS含有RPMI1640培地中4.0x104細胞/mlになるよう調製したJurkat細胞を50μl/ウェルで添加し、37°C、5CO2の条件下で23時間培養した。CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssaykitPromega社製G7571を用いて生細胞由来のATP量を定量し、抗体液の代わりに培地を添加したウェルの値を100としてhB273抗体の殺細胞作用を評価した。その結果、図11に示すように、B273_H1-1/L1抗体はデザインもとのB273_H1/L1よりも殺細胞活性が強い傾向が認められた。一方、B273_H2-1/L1~B273_H2-5/L1はデザインもとのB273_H2/L1と同程度の殺細胞作用を示した。cB273抗体CDRからのdeamidationsite除去9-1変異体の設計と発現ベクターの構築9-1-1変異体の設計一般に蛋白質のアスパラギン脱アミド化は、C末端側に隣接するアミノ酸との間で、環状コハク酸イミド遷移状態を形成して、進行するGeiger,T.andClarke,S.1987Deamidation,Isomerization,andracemizationatasparaginylandaspartylresiduesinpeptides.Succinimide-linkedreactionsthatcontributetoproteindegradation.J.Biol.Chem.262,785-794。環状コハク酸イミド遷移状態形成に律速となるのは隣接アミノ酸の側鎖の大きさであり、従って、もっとも脱アミド化が早いのは側鎖が最も小さなグリシンである。反対にC末端側隣接基を大きな側鎖を有するアミノ酸に置換することで、脱アミド化速度を抑制することが可能である。B273抗体はL鎖及びH鎖両方に脱アミド化されやすい-N-G-アスパラギン-グリシン配列を有している。そこで、本発明者らは、隣接基を、グリシンから、より大きな側鎖を有する、リジン、フェニルアラニン、ロイシン、グルタミン酸に変更した点変異体を作製した。即ち、H鎖については-N-G-アスパラギン-グリシン配列を-N-E-アスパラギン-グルタミン酸配列に変異させたものを設計し、L鎖については-N-G-アスパラギン-グリシン配列を-N-L-アスパラギン-ロイシン配列、-N-F-アスパラギン-フェニルアラニン配列、-N-K-アスパラギン-リジン配列、-N-E-アスパラギン-グルタミン酸配列にそれぞれ変異させたものを設計した。9-1-2hB273_L1-NEタイプ軽鎖発現ベクターの構築実施例5で作製されたhB273_L1タイプ軽鎖発現ベクターのpEF6KCL/hB273_L1をテンプレートとして、プライマーセットAを用いてPCRを行うことにより得られたDNA断片とプライマーセットBを用いてPCRを行うことにより得られたDNA断片をプライマーセットCを用いたOverlapExtensionPCRにより結合した。得られたDNA断片から制限酵素NheI及びPmeIで切り出されるDNA断片を、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpEF6KCLを制限酵素NheI及びPmeIで切断した箇所に挿入することにより、配列番号28のアミノ酸番号54のグリシンをグルタミン酸に置換したhB273_L1-NEタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをpEF6KCL/hB273_L1-NEと命名した。hB273_L1-NEタイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号51に記載されている。また、hB273_L1-NEタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号52に記載されている。さらに、配列番号51及び52の配列は、図44にも記載されている。プライマーセットA5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’L―F1:配列表の配列番号535’-ccaatgcaggtaagtgttctcattgctatggaccagtgactg-3’L-NE-R2:配列表の配列番号54プライマーセットB5’-cagtcactggtccatagcaatgagaacacttacctgcattgg-3’L-NE-F2:配列表の配列番号555’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’L-R1:配列表の配列番号56プライマーセットC5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’L-F1:配列表の配列番号535’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’L-R1:配列表の配列番号569-1-3hB273_L1-NFタイプ軽鎖発現ベクターの構築実施例5で作製されたhB273_L1タイプ軽鎖発現ベクターのpEF6KCL/hB273_L1をテンプレートとして、プライマーセットAを用いてPCRを行うことにより得られたDNA断片とプライマーセットBを用いてPCRを行うことにより得られたDNA断片をプライマーセットCを用いたOverlapExtensionPCRにより結合した。得られたDNA断片から制限酵素NheI及びPmeIで切り出されるDNA断片を、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpEF6KCLを制限酵素NheI及びPmeIで切断した箇所に挿入することにより、配列番号28のアミノ酸番号54のグリシンをフェニルアラニンに置換したhB273_L1-NFタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをpEF6KCL/hB273_L1-NFと命名した。hB273_L1-NFタイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号57に記載されている。また、hB273_L1-NFタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号58に記載されている。さらに、配列番号57及び58の配列は、図45にも記載されている。プライマーセットA5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’L―F1:配列表の配列番号535’-ccaatgcaggtaagtgttgaaattgctatggaccagtgactg-3’L-NF-R2:配列表の配列番号59プライマーセットB5’-cagtcactggtccatagcaatttcaacacttacctgcattgg-3’L-NF-F2:配列表の配列番号605’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’L-R1:配列表の配列番号56プライマーセットC5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’L-F1:配列表の配列番号535’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’L-R1:配列表の配列番号569-1-4hB273_L1-NKタイプ軽鎖発現ベクターの構築実施例5で作製されたhB273_L1タイプ軽鎖発現ベクターのpEF6KCL/hB273_L1をテンプレートとして、プライマーセットAを用いてPCRを行うことにより得られたDNA断片とプライマーセットBを用いてPCRを行うことにより得られたDNA断片をプライマーセットCを用いたOverlapExtensionPCRにより結合した。得られたDNA断片から制限酵素NheI及びPmeIで切り出されるDNA断片を、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpEF6KCLを制限酵素NheI及びPmeIで切断した箇所に挿入することにより、配列番号28のアミノ酸番号54のグリシンをリジンに置換したhB273_L1-NKタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをpEF6KCL/hB273_L1-NKと命名した。hB273_L1-NKタイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号61に記載されている。また、hB273_L1-NKタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号62に記載されている。さらに、配列番号61及び62の配列は、図46にも記載されている。プライマーセットA5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’L―F1:配列表の配列番号535’-ccaatgcaggtaagtgttcttattgctatggaccagtgactg-3’L-NK-R2:配列表の配列番号63プライマーセットB5’-cagtcactggtccatagcaataagaacacttacctgcattgg-3’L-NK-F2:配列表の配列番号645’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’L-R1:配列表の配列番号56プライマーセットC5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’L-F1:配列表の配列番号535’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’L-R1:配列表の配列番号569-1-5hB273_L1-NLタイプ軽鎖発現ベクターの構築実施例5で作製されたhB273_L1タイプ軽鎖発現ベクターのpEF6KCL/hB273_L1をテンプレートとして、プライマーセットAを用いてPCRを行うことにより得られたDNA断片とプライマーセットBを用いてPCRを行うことにより得られたDNA断片をプライマーセットCを用いたOverlapExtensionPCRにより結合した。得られたDNA断片から制限酵素NheI及びPmeIで切り出されるDNA断片を、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpEF6KCLを制限酵素NheI及びPmeIで切断した箇所に挿入することにより、配列番号28のアミノ酸番号54のグリシンをロイシンに置換したhB273_L1-NLタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをpEF6KCL/hB273_L1-NLと命名した。hB273_L1-NLタイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号65に記載されている。また、hB273_L1-NLタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号66に記載されている。さらに、配列番号65及び66の配列は、図47にも記載されている。プライマーセットA5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’L―F1:配列表の配列番号535’-ccaatgcaggtaagtgttcagattgctatggaccagtgactg-3’L-NL-R2:配列表の配列番号67プライマーセットB5’-cagtcactggtccatagcaatctgaacacttacctgcattgg-3’L-NL-F2:配列表の配列番号685’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’L-R1:配列表の配列番号56プライマーセットC5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’L-F1:配列表の配列番号535’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’L-R1:配列表の配列番号569-1-6hB273_H2-1-NEタイプ重鎖発現ベクターの構築実施例7で作製されたhB273_H2-1タイプ重鎖発現ベクターのpEF1FCCU/hB273_H2-1をテンプレートとして、プライマーセットAを用いてPCRを行うことにより得られたDNA断片とプライマーセットBを用いてPCRを行うことにより得られたDNA断片をプライマーセットCを用いたOverlapExtensionPCRにより結合した。得られたDNA断片から制限酵素NheI及びPmeIで切り出されるDNA断片を、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpEF1FCCUを制限酵素NheI及びPmeIで切断した箇所に挿入することにより、配列番号42のアミノ酸番号75のグリシンをグルタミン酸に置換したhB273_H2-1-NEタイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをpEF1FCCU/hB273_H2-1-NEと命名した。hB273_H2-1-NEタイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号69に記載されている。また、hB273_H2-1-NEタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号70に記載されている。さらに、配列番号69及び70の配列は、図48にも記載されている。プライマーセットA5’-aggtaagcttgctagcgccaccatgaaacacc-3’H―F1:配列表の配列番号715’-ctggttgtagaaggtgtcctcgttgtaggggttgaaccggcc-3’H-NE-R2:配列表の配列番号72プライマーセットB5’-ggccggttcaacccctacaacgaggacaccttctacaaccag-3’H-NE-F2:配列表の配列番号735’-ggatgccacccgtttaaacgggcccgatatctc-3’H-R1:配列表の配列番号74プライマーセットC5’-aggtaagcttgctagcgccaccatgaaacacc-3’H-F1:配列表の配列番号715’-ggatgccacccgtttaaacgggcccgatatctc-3’H-R1:配列表の配列番号749-2hB273抗体CDR改変体の調製9-2-1hB273抗体CDR改変体の生産1.2×109個の対数増殖期のFreeStyle293F細胞Invitrogen社を新鮮な1.2LのFreeStyle293expressionmediumInvitrogen社に播種し、37°C、8CO2インキュベーター内において90rpmで一時間振とう培養した。PolyethyleneiminePolyscience247653.6mgをOpti-ProSFM培地Invitrogen社20mlに溶解し、次にPureLinkHiPurePlasmidキットInvitrogen社を用いて調製したH鎖発現ベクター0.4mg及びL鎖発現ベクター0.8mgを20mlのOpti-ProSFM培地に懸濁した。Polyethyleneimine/Opti-ProSFM混合液20mlに、発現ベクター/Opti-ProSFM混合液20mlを加え穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle293F細胞に添加した。3時間後にZ-VAD-FMKPEPTIDEINSTITUTE社を10μMになるように添加し、37°C、8CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposableCapsuleFilterAdvantecCCS-045-E1Hでろ過した。pEF1FCCU/hB273_H2-1-NEとpEF6KCL/hB273_L1-NEとの組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2-1-NE/hB273_L1-NE、pEF1FCCU/hB273_H2-1-NEとpEF6KCL/hB273_L1-NFとの組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2-1-NE/hB273_L1-NF、pEF1FCCU/hB273_H2-1-NEとpEF6KCL/hB273_L1-NKとの組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK、pEF1FCCU/hB273_H2-1-NEとppEF6KCL/hB273_L1-NLとの組合せによって取得されたcB273のヒト化抗体をhB273_H2-1-NE/hB273_L1-NLと命名した。9-2-2hB273抗体CDR改変体の精製上記9-2-1で得られた培養上清を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー4-6°C下とセラミックヒドロキシルアパタイト室温下の2段階工程で精製した。rProteinAアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックヒドロキシルアパタイト精製後のバッファー置換工程は室温下で実施した。最初に、培養上清1100-1200mlを、PBSで平衡化したMabSelectSuReGEHealthcareBioscience社製、HiTrapカラム:容積1ml×2連結にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、PBS15-30mlでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液pH4.0で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラムGEHealthcareBioscience社製、HiTrapDesaltingカラム:容積5ml×2連結で5mMリン酸ナトリウム/50mMMES/20mMNaCl/pH6.5のバッファーへ置換を行った。さらにその置換した抗体溶液を、5mMNaPi/50mMMES/20mMNaCl/pH6.5のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシルアパタイトカラム日本バイオラッド、Bio-ScaleCHT2-1HydroxyapatiteColumn:容積2mlにアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラムGEHealthcareBioscience社製、HiTrapDesaltingカラム:容積5mlx2連結でCBS10mMクエン酸緩衝液/140mM塩化ナトリウム、pH6.0への液置換を行った。最後にCentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20分画分子量30K、Sartorius社、4°C下にて濃縮し、IgG濃度を1.0mg/ml以上に調製し精製サンプルとした。cB273抗体CDR改変体の活性評価10-1hB273抗体CDR改変体のBiacoreによる結合活性評価ヒト化抗DR5抗体とrsDR5の解離定数測定は、BiacoreT100GEヘルスケアバイオサイエンス株を使用し、固定化した抗ヒトIgGFc抗体に抗体を捕捉キャプチャーし、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒトIgGFc抗体Humanantibodycapturekit、GEヘルスケアバイオサイエンス株は、センサーチップCM5BIAcore,Inc.へアミンカップリング法にて~10,000RU共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてHBS-EP10mMHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.05SurfactantP20を用いた。抗ヒトIgGFc抗体を固定化したチップ上に、約20nMの抗体溶液を流速10μl/分で60秒間添加した後、rsDR5の希釈系列溶液3.13-50nMを流速30μl/分で120秒間添加し、引き続き180秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、3M塩化マグネシウムを流速10μl/分で30秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェアBiacoreT100Evaluationsoftware,version2.0.1の1対1結合モデルを用いて、結合速度定数kon、解離速度定数koff及び解離定数KD;KD=koff/konを算出した。4種類のヒト化DR5抗体のBiacore測定結果を図12に示す。10-2示差走査カロリメトリーDSCを用いたヒト化抗DR5抗体及びその変異抗体の熱安定性測定重示差走査カロリメトリーDSCを用いた、熱安定性の測定を行なった。サンプルは0.5mg/mlの濃度でCBS緩衝液10mMクエン酸、140mMNaCl、pH6.0に調製に溶解させ、400μlずつ試料溶液としてDSC測定に使用した。DSC測定条件は、以下のように設定した。即ち、初期温度は20°C、最終温度を100°Cとし、昇温速度を200°C/1時間、フィルター時間2秒、フィードバックモードをLowとした。参照液はCBSを使用した。全てのDSC測定装置としては、米国MicroCal社現GEヘルスケアバイオサイエンス株製VP-CapillaryDSCPlatformを使用した。試料溶液から得られたスキャン曲線からベースライン試料セルにも参照溶液を充填して得られたスキャン曲線を差し引いてベースライン補正を行なった。サーモグラム全体のピークトップの温度値をFab領域の熱変性中点Tmとした。4種類のヒト化DR5抗体のDSC測定結果を図13に示す。10-3hB273抗体CDR改変体のヒト癌細胞株に対するinvitro殺細胞活性50mMTris-HCLで50μg/mlに調製したAfiniPureFab’2fragmentGoatanti-HumanIgGFcfragmentspecificJackson社製109-006-098を96穴マイクロプレートコーニング社製に45μlずつ分注し4°Cで1晩静置した。ウェル内をPBSで2回洗浄した後、9-2-1で抗体を生産させた293F培養上清を150~1.5ng/mlとなるように50μl/ウェルで添加し、4°Cで1晩静置した。各ウェルをPBSで2回洗浄した後、10FBS含有RPMI1640培地中4.0x104細胞/mlになるよう調製したJurkat細胞を50μl/ウェルで添加し、37°C、5CO2の条件下で23時間培養した。CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssaykitPromega社製G7571を用いて生細胞由来のATP量を定量し、抗体液の代わりに培地を添加したウェルの値を100としてhB273抗体の殺細胞作用を評価した。4種類のCDR改変抗体の殺細胞活性を図14に示した。10-4hB273_H2-1-NE/L1-NK抗体のヒト癌細胞株に対するcaspase-3/7活性化作用及びinvitro殺細胞活性ヒト大腸癌由来細胞株HCT-15又はヒト神経膠芽種細胞株U-87MGをそれぞれ10FBS含有RPMI1640培地又は10FBS含有MEMMinimumEssentialMedium培地で1.1x105細胞/mlになるよう調製し、白色透明底96穴マイクロプレートコーニング社製に45μl/ウェルで添加し、37°C、5CO2の条件下で一晩培養した。hB273_H2-1-NE/L1-NK抗体、cB273抗体又はヒトIgGJackson社製をAfiniPureGoatanti-humanIgGFcγfragmentspecificJackson社製109-005-098と等濃度で混合後、hB273_H2-1-NE/L1-NK抗体、cB273抗体又はヒトIgGの終濃度が10,000~0.1ng/mlとなるように5μl/ウェルで添加し、37°C、5CO2の条件下で4時間培養した。各ウェル中のCaspase-3/7活性をCaspase-Glo3/7AssaykitPromega社製G8093を用いて添付のプロトコールに従い、室温で30分インキュベーと後にルミノメーターパーキンエルマー社製にて測定し、抗体液の代わりに培地を添加したウェルの値を100としてcaspase-3/7活性を評価した。また、invitro殺細胞活性は、実施例3-3に示す方法に従い、抗体処理24時間後のATP量を測定することにより評価した。その結果、hB273_H2-1-NE/L1-NK抗体はcB273抗体と同程度のcaspase-3/7活性化作用及び殺細胞作用を有することが明らかとなった図15。cB273抗体のinvivo抗腫瘍効果11-1cB273抗体の抗腫瘍活性11-1-1ヒト大腸癌株COLO205移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性2×106cellsのヒト大腸癌株COLO205ATCCより購入をヌードマウスCAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj、日本チャールスリバーより購入の腋窩部皮下に移植した。移植の7、14、21日後にcB273抗体を1、3、10mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与したn=10。移植腫瘍の長径及び短径を週2回、電子デジタルノギス株式会社ミツトヨ製を用いて測定し、以下に示す計算式により腫瘍体積を算出した。腫瘍体積mm3=1/2×短径2mm×長径2mm結果を図16に示した。cB273抗体投与群はすべての個体で腫瘍の完全縮退が認められた。11-1-2ヒト膵臓癌株MIAPaCa-2移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性3×106cellsのヒト膵臓癌株MIAPaCa-2ATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の11、19、26、33日後にcB273抗体を3、10mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与したn=10。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径の測定し腫瘍体積の算出を行った。結果を図17に示した。最終測定日である移植39日後における腫瘍増殖抑制率は、3mg/kg投与群で73.5、10mg/kg投与群で77.4であった。11-1-3ヒト神経膠芽種細胞株U-87MG移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性5×106cellsのヒト神経膠芽種細胞株U-87MGATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の4、11、18、25日後にcB273抗体を1,3,10mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与したn=10。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径の測定し腫瘍体積の算出を行った。結果を図18に示した。最終測定日である移植32日後における腫瘍増殖抑制率は、1mg/kg投与群で99.7、3mg/kg投与群で97.8、10mg/kg投与群で98.0であり、1mg/kg投与群で10匹中2匹、3mg/kg投与群で10匹中5匹、10mg/kg投与群で10匹中3匹が腫瘍の完全縮退を示した。11-1-4ヒト肺癌株NCI-H2122移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性パクリタキセルカルボプラチン併用5×106cellsのヒト肺癌株NCI-H2122ATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の13、20日後にcB273抗体を10mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与した。パクリタキセルは6.25mgkgとなるように移植の13、14、15、16、17日後に皮下投与した。カルボプラチンは100mgkgとなるように移植の13日後に腹腔内投与した。n=10。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径の測定し腫瘍体積の算出を行った。結果を図19に示した。最終測定日である移植41日後における腫瘍増殖抑制率は、cB273抗体投与群で99.6、パクリタキセル、カルボプラチン併用投与群で10.2、cB273抗体、パクリタキセル、カルボプラチン併用投与群で99.7であった。11-1-5ヒト肺癌株NCI-H460移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性パクリタキセルカルボプラチン併用5×106cellsのヒト肺癌株NCI-H460ATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の6日後にcB273抗体を10mg/kgで担癌マウスの腹腔内に投与した。パクリタキセルは6.25mgkgとなるように移植の6、7、8、9、10日後に皮下投与した。カルボプラチンは100mgkgとなるように移植の6日後に腹腔内投与した。n=10。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径の測定し腫瘍体積の算出を行った。結果を図20に示した。最終測定日である移植16日後における腫瘍増殖抑制率は、cB273抗体投与群で43.3、パクリタキセル、カルボプラチン併用投与群で66.4、cB273抗体、パクリタキセル、カルボプラチン併用投与群で79.6であった。11-1-6ヒト大腸癌株DLD-1移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性CPT-11併用5×106cellsのヒト大腸癌株DLD-1ATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の35日後にcB273抗体を10mg/kgで担癌マウスの腹腔内に投与した。CPT-11は80mgkgとなるように移植の35、40、43日後に腹腔内投与したn=10。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径の測定し腫瘍体積の算出を行った。結果を図21に示した。最終測定日である移植55日後における腫瘍増殖抑制率は、cB273抗体投与群で25.9、CPT-11投与群で29.5、cB273抗体、CPT-11併用投与群で72.7であった。11-1-7ヒト大腸癌株HCT-15移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性CPT-11併用5×106cellsのヒト大腸癌株HCT-15ATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の7日後にcB273抗体を10mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与した。CPT-11は80mgkgとなるように移植の7,10,14日後に腹腔内投与したn=10。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径の測定し腫瘍体積の算出を行った。結果を図22に示した。最終測定日である移植31日後における腫瘍増殖抑制率は、cB273抗体投与群で52.8、CPT-11投与群で83.5、cB273抗体、CPT-11併用投与群で97.8であった。11-1-8ヒト大腸癌株HCT-116移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性CPT-11併用1×107cellsのヒト大腸癌株HCT-116ATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の7日後にcB273抗体を10mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与した。CPT-11は65mgkgとなるように移植の7,10,14日後に腹腔内投与したn=10。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径の測定し腫瘍体積の算出を行った。結果を図23に示した。最終測定日である移植28日後における腫瘍増殖抑制率は、cB273抗体投与群で13.9、CPT-11投与群で89.8、cB273抗体、CPT-11併用投与群で99.7であった。11-1-9ヒトメラノーマ株A375移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性ビンブラスチン併用2×106cellsのヒトメラノーマ細胞株A375ATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の10,17,24日後にcB273抗体を10mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与した。ビンブラスチンは10mgkgとなるように移植の10日後に尾静脈投与したn=10。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径の測定し腫瘍体積の算出を行った。結果を図24に示した。最終測定日である移植46日後における腫瘍増殖抑制率は、cB273抗体投与群で53.1、ビンブラスチン投与群で43.6、cB273抗体とビンブラスチン併用投与群で100であり、cB273抗体とビンブラスチン併用投与群ですべての個体が腫瘍の完全縮退を示した。11-2cB273抗体とConatumumabとの抗腫瘍活性の比較11-2-1Conatumumabの調製ConatumumabはWHODrugInformation,Vol.22,No.2,2008,p129-130に記載されている軽鎖、及び重鎖のアミノ酸配列をもとに作製した。11-2-1-1Conatumumabの軽鎖発現ベクターの構築配列番号76のアミノ酸番号21乃至130に示される、Conatumumabの軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むDNAを合成しGENEART社、人工遺伝子合成サービス、制限酵素NdeI及びBsiWIで切り出されるDNA断片を、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpEF6KCLを制限酵素NdeI及びBsiWIで切断した箇所に挿入することにより、Conatumumabの軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをpEF6KCL/Conatumumab_Lと命名した。11-2-1-2Conatumumabの重鎖発現ベクターの構築配列表の配列番号78のアミノ酸番号20乃至141に示される、Conatumumabの重鎖可変領域をコードする遺伝子を含むDNAを合成しGENEART社人工遺伝子合成サービス、制限酵素BlpIで切り出されるDNA断片を、ヒト化抗体重鎖発現汎用ベクターpEF1FCCUを制限酵素BlpIで切断した箇所に挿入することにより、Conatumumabの重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをpEF1FCCU/Conatumumab_Hと命名した。11-2-1-3Conatumumabの生産1.2×109個の対数増殖期のFreeStyle293F細胞Invitrogen社を新鮮な1.2LのFreeStyle293expressionmediumInvitrogen社に播種し、37°C、8CO2インキュベーター内において90rpmで一時間振とう培養した。PolyethyleneiminePolyscience247653.6mgをOpti-ProSFM培地Invitrogen社20mlに溶解し、次にPureLinkHiPurePlasmidキットInvitrogen社を用いて調製したH鎖発現ベクターのpEF1FCCU/Conatumumab_H0.4mg及びL鎖発現ベクターのpEF6KCL/Conatumumab_L0.8mgを20mlのOpti-ProSFM培地に懸濁した。Polyethyleneimine/Opti-ProSFM混合液20mlに、発現ベクター/Opti-ProSFM混合液20mlを加え穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle293F細胞に添加した。37°C、8CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposableCapsuleFilterAdvantecCCS-045-E1Hでろ過した。11-2-1-4Conatumumabの精製上記11-2-1-3で得られた培養上清を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー4-6°C下とセラミックヒドロキシルアパタイト室温下の2段階工程で精製した。rProteinAアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックヒドロキシルアパタイト精製後のバッファー置換工程は室温下で実施した。最初に、培養上清1100-1200mlを、PBSで平衡化したMabSelectSuReGEHealthcareBioscience社製、HiTrapカラム:容積1ml×2連結にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、PBS15-30mlでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液pH4.0で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラムGEHealthcareBioscience社製、HiTrapDesaltingカラム:容積5ml×2連結で5mMリン酸ナトリウム/50mMMES/20mMNaCl/pH6.5のバッファーへ置換を行った。さらにその置換した抗体溶液を、5mMNaPi/50mMMES/20mMNaCl/pH6.5のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシルアパタイトカラム日本バイオラッド、Bio-ScaleCHT2-1HydroxyapatiteColumn:容積2mlにアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラムGEHealthcareBioscience社製、HiTrapDesaltingカラム:容積5mlx2連結でCBS10mMクエン酸緩衝液/140mM塩化ナトリウム、pH6.0への液置換を行った。最後にCentrifugalUFFilterDeviceVIVASPIN20分画分子量30K、Sartorius社、4°C下にて濃縮し、IgG濃度を1.0mg/ml以上に調製し精製サンプルとした。11-2-2ヒト大腸癌株HCT-15移植ヌードマウスにおけるcB273抗体とConatumumabとの抗腫瘍活性の比較1×107cellsのヒト大腸癌株HCT-15ATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の6、13、20日後にcB273抗体及びConatumumabを3、10、30mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与したn=10。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径の測定し腫瘍体積の算出を行った。結果を図25に示した。最終測定日である移植30日後における腫瘍増殖抑制率は、cB273抗体の3mgkg投与群で57.9、10mgkg投与群で56.0、30mgkg投与群で53.6、Conatumumabの3mgkg投与群で27.4、10mgkg投与群で26.9、30mgkg投与群で20.3であった。11-2-3ヒト肺癌株NCI-H1975移植ヌードマウスにおけるcB273抗体とConatumumabとの抗腫瘍活性の比較3×106cellsのヒト肺癌株NCI-H1975ATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の12、19、26日後にcB273抗体及びConatumumabを3、10mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与したn=10。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径の測定し腫瘍体積の算出を行った。結果を図26に示した。最終測定日である移植32日後における腫瘍増殖抑制率は、cB273抗体の3mgkg投与群で71.5、10mgkg投与群で73.3、Conatumumabの3mgkg投与群で13.5、10mgkg投与群で12.6であった。hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体のinvivo抗腫瘍効果12-1hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体のヒト大腸癌株COLO205移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性2×106cellsのヒト大腸癌株COLO205ATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の8、15、22日後にhB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体及びcB273抗体を0.3、3mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与したn=10。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径の測定し腫瘍体積の算出を行った。結果を図27に示した。hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体の3mg/kg投与群及びcB273抗体の0.3mg/kg投与群はすべての個体で腫瘍の完全縮退が認められた。hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体0.3mg/kg投与群の10例中9例、及びcB273抗体3mg/kg投与群の10例中8例で腫瘍の完全縮退が認められた。hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体のヒト癌細胞株に対するinvitro殺細胞活性NCI-N87、KATOIII、SNU-16以上、ヒト胃癌株、Caki-1、ACHN,786-O以上ヒト腎臓癌株、Hep3B、SK-HEP-1、HepG2C3A以上ヒト肝臓癌株、HT-1080ヒト線維肉腫株は、AmericanTypeCultureCollection:ATCCより購入した。GCIYヒト胃癌株は、理化学研究所より購入した。HuH-7ヒト肝臓癌株は、医薬基盤研究所より購入した。各種細胞株に対するinvitro殺細胞活性を以下の方法で測定した。胃癌株、腎臓癌株、線維肉腫株については、適宜継代培養した細胞をトリパンブルー染色法で計数後、10ウシ胎児血清ハイクローン社製を含む培地以下培地で1×105cells/mlに調製した。培地にhB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体を20μg/ml、2次抗体ヤギ抗ヒトIgG抗体、エムピーバイオメディカルズ社製を40μg/mlで混合した。さらに、培地を用いて希釈し、hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体濃度が2000、200、20、2ng/ml、となる溶液を調製した。透明96穴マイクロプレートコーニング社製に各濃度の溶液を一群3連で50μlずつ添加し、細胞懸濁液を50μl5×103cellsずつ播種したhB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体最終濃度10000、1000、100、10、1ng/ml。肝臓癌株については、適宜継代培養した細胞をトリパンブルー染色法で計数後、培地で4×104cells/mlに調製した。培地にhB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体を2μg/ml、2次抗体を4μg/mlで混合した。さらに、培地を用いて、200、20、2、0.2、0.02ng/mlの溶液を調製した。黒色透明底96穴マイクロプレートコーニング社製に各濃度の溶液を一群2連で50μlずつ添加し、細胞懸濁液を50μl2×103cellsずつ播種した抗体最終濃度1000、100、10、1、0.1、0.01ng/ml。37°C、5二酸化炭素存在下でプレートを72時間培養し、各ウェルのATP量を測定した。ATP量測定にはルシフェラーゼ発光試薬CellTiterGlo,プロメガ社製を用い、添付のプロトコールに従って測定を行った。すなわち、細胞溶解成分と発光基質成分からなる試液をプレートの各ウェルに100μlずつ添加し、攪拌後、各ウェルの発光をルミノメーターベルトールド社製にて測定した。胃癌株、腎臓癌株、線維肉腫株については、透明96穴マイクロプレートより、白色96穴マイクロプレートコーニング社製に100μlずつ試液を移してから発光測定を実施した。培地と細胞懸濁液を添加したウェルを陰性コントロールウェル、培地のみを添加したウェルをバックグラウンドウェルとして、被験ウェルの細胞生存率を以下の式により算出した。細胞生存率=被験ウェルの発光強度―バックグラウンドウェルの平均発光強度/陰性コントロールウェルの平均発光強度―バックグラウンドウェルの平均発光強度×100図51に細胞株ごとの各抗体処理濃度における細胞生存率の平均値を示した。胃癌株、腎臓癌株、線維肉腫株については標準誤差をエラーバーで示した。hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体は786-Oを除く細胞株に対して、細胞傷害活性を示した。hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体と化学療法剤の併用によるinvivo活性測定14-1hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体と5-FUの併用によるヒト大腸癌株HCT-15移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性、及びConatumumabとの活性比較1×107cellsのヒト大腸癌株HCT-15ATCCより購入をヌードマウスCAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj、日本チャールスリバーより購入の腋窩部皮下に移植した。移植の7、14、21日後にhB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体又はConatumumabを3mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与した。5-FUは、移植7日後に160mg/kgで尾静脈内投与した。実験はn=6で実施した。移植腫瘍の長径及び短径を週2回、電子デジタルノギス株式会社ミツトヨ製を用いて測定し、以下に示す計算式により腫瘍体積を算出した。腫瘍体積mm3=1/2×短径2mm×長径2mm結果を図52に示した。最終測定日である移植28日後における腫瘍増殖抑制率は、hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体投与群で62、Conatumumab投与群で27、5-FU投与群で54、hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体と5-FU併用群で91、Conatumumabと5-FU併用群で78であった。すなわち、hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体と5-FUの併用効果が認められ、さらに、hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体と5-FU併用群は、Conatumumabと5-FU併用群よりも強い抗腫瘍活性を示した。14-2hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体とパクリタキセルの併用によるヒト非小細胞肺癌株NCI-H1975移植ヌードマウスにおける抗腫瘍活性、及びConatumumabとの活性比較3×106cellsのヒト非小細胞肺癌株NCI-H1975ATCCより購入をヌードマウスの腋窩部皮下に移植した。移植の11、18、25日後にhB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体又はConatumumabを3mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与した。パクリタキセルは、移植11、12、13、14日後に6.25mg/kgで担癌マウスの尾静脈内に投与した。実験はn=6で実施した。上記と同様の方法で移植腫瘍の長径及び短径を測定し、腫瘍体積の算出を行った。結果を図53に示した。最終測定日である移植32日後における腫瘍増殖抑制率は、hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体投与群で66、Conatumumab投与群で40、パクリタキセル投与群で49、hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体とパクリタキセル併用群で91、Conatumumabとパクリタキセル併用群で79であった。すなわち、hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体とパクリタキセルの併用効果が認められ、さらに、hB273_H2-1-NE/hB273_L1-NK抗体とパクリタキセル併用群は、Conatumumabとパクリタキセル併用群よりも強い抗腫瘍活性を示した。"