"対象中でmiR-122の発現を阻害するmiRNA阻害剤を発現する、少なくとも1つの導入遺伝子を含んでなる有効量の組換えアデノ随伴ウイルスrAAVを対象に投与するステップを含んでなる、対象中で高コレステロール関連障害を治療する方法。前記miRNA阻害剤がmiR-122結合部位を含んでなる、請求項1に記載の方法。前記miR-122結合部位が2つのステム配列で挟まれる、請求項1または2に記載の方法。前記miR-122結合部位が、前記miR-122と相補的な2つの部分で挟まれる、miR-122と相補的でない非結合中央部分を含んでなる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記miRNA阻害剤が第1のmiR-122結合部位および第2のmiR-122結合部位を含んでなり、第1のステム配列がその5’末端で前記第1のmiR-122結合部位の側面に位置し、第2のステム配列がその3’末端で前記第1のmiR-122結合部位の側面に、そしてその5’末端で前記第2のmiR-122結合部位の側面に位置し、第3のステム配列がその3’末端で前記第2のmiR-122結合部位の側面に位置する、請求項1に記載の方法。前記2つのmiR-122阻害剤結合部位のそれぞれが、miR-122と相補的でない非結合中央部分を含んでなる、請求項5に記載の方法。前記第1のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分が、前記第2のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分と少なくとも部分的に相補的である、請求項6に記載の方法。前記第1のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分が、前記第2のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分と1~5ヌクレオチドで相補的である、請求項6または7に記載の方法。前記第1のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分が、前記第2のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分と3ヌクレオチドで相補的である、請求項6~8のいずれか一項に記載の方法。前記第1のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分が、1~10ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項6~9のいずれか一項に記載の方法。前記第1のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分が、3~5ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項6~10のいずれか一項に記載の方法。前記第1のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分が、4ヌクレオチドの長さを有する、請求項6~11のいずれか一項に記載の方法。前記第2のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分が、1~10ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項6~12のいずれか一項に記載の方法。前記第2のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分が、3~5ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項6~13のいずれか一項に記載の方法。前記第2のmiR-122結合部位の前記非結合中央部分が、4ヌクレオチドの長さを有する、請求項6~14のいずれか一項に記載の方法。前記第1のmiR-122結合および前記第2のmiR-122結合部位が、2~10ヌクレオチド長の配列で相補的である、請求項6~15のいずれか一項に記載の方法。前記第1のmiR-122結合および前記第2のmiR-122結合部位が、4ヌクレオチド長の配列で相補的である、請求項6~16のいずれか一項に記載の方法。前記miRNA阻害剤が、2つ以上のmiR-122結合部位を含んでなる、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。前記miRNA阻害剤が、配列番号1、配列番号5、配列番号21、または配列番号23に記載の配列を含んでなる、またはそれからなる、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。前記rAAVが、配列番号3に記載の配列を有する、AAV9血清型カプシドを有する、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。前記rAAVが、前記AAV9血清型カプシドの変種であるカプシドを有する、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。前記rAAVが、配列番号4に記載の配列を有する、AAV9血清型変種Csp-3カプシドを有する、請求項21に記載の方法。前記rAAVが、肝臓組織を標的とする、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。前記rAAVが、肝臓組織を形質導入する、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。前記rAAVの有効量が、1010、1011、1012、または1013個のゲノムコピーである、請求項1~24のいずれか一項に記載の方法。投与が静脈内に実施される、請求項1~25のいずれか一項に記載の方法。投与が肝臓門脈内への注入によって実施される、請求項1~26のいずれか一項に記載の方法。前記対象が、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または非ヒト霊長類である、請求項1~27のいずれか一項に記載の方法。前記対象がヒトである、請求項1~28のいずれか一項に記載の方法。前記対象が、高コレステロール関連障害の動物モデルである、請求項1~29のいずれか一項に記載の方法。前記高コレステロール関連障害が、I型、IIa型、IIb型、III型、IV型、またはV型高リポタンパク血症である、請求項1~30のいずれか一項に記載の方法。前記高コレステロール関連障害が、糖尿病、代謝症候群、腎臓疾患ネフローゼ症候群、甲状腺機能低下、クッシング症候群、神経性食欲不振症、睡眠剥奪、ジーブ症候群、抗レトロウイルス薬、食餌、高体重、または低身体活動量に付随する、請求項1~31のいずれか一項に記載の方法。前記対象がヒトであり、前記高コレステロール関連障害が200mg/dl以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる、請求項1~32のいずれか一項に記載の方法。前記対象がマウスであり、前記高コレステロール関連障害が100mg/dl以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。前記対象がラットであり、前記高コレステロール関連障害が70mg/dl以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる、請求項1~34のいずれか一項に記載の方法。ai.タンパク質コーディング領域、およびii.試験miRNAの少なくとも1つの結合部位を含んでなる、導入遺伝子と作動的に連結する第1のプロモーター、およびbmiRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第2のプロモーターを含んでなり、前記miRNA阻害剤が前記試験miRNAと特異的に結合する、核酸ベクター。前記第1のプロモーターがRNAポリメラーゼIIプロモーターである、請求項36に記載の核酸ベクター。前記第2のプロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項36または37に記載の核酸ベクター。前記第1のプロモーターと前記タンパク質コーディング領域の少なくとも一部との間の第1の非翻訳領域をさらに含んでなり、前記第2のプロモーターおよび前記miRNA阻害剤コーディング領域が前記第1の非翻訳領域内に配置される、請求項36~38のいずれか一項に記載の核酸ベクター。前記第1の非翻訳領域が、前記完全長タンパク質コーディング領域の5’末端に配置される、請求項39に記載の核酸ベクター。前記第1の非翻訳領域が、前記タンパク質コーディング領域のイントロン内に配置される、請求項39に記載の核酸ベクター。前記導入遺伝子が第2の非翻訳領域をさらに含んでなり、前記試験miRNAの少なくとも1つの結合部位が前記第2の非翻訳領域内にある、請求項36~41の少なくとも1ついずれか一項に記載の核酸ベクター。前記第2の非翻訳領域が、前記完全長タンパク質コーディング領域の3’末端に配置される、請求項42に記載の核酸ベクター。前記第1のプロモーターおよび前記導入遺伝子の側面に位置する1対の逆方向末端反復をさらに含んでなる、請求項36~43のいずれか一項に記載の核酸ベクター。前記1対の逆方向末端反復が、前記第2のプロモーターおよび前記miRNA阻害剤コーディング領域の側面にさらに位置する、請求項44に記載の核酸ベクター。前記タンパク質コーディング領域が、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT、およびβ-ラクタマーゼから選択されるレポータータンパク質をコードする、請求項36~45のいずれか一項に記載の核酸ベクター。a前記miRNA阻害剤コーディング領域が前記miRNA阻害剤をコードする、請求項36~46のいずれか一項に記載の核酸ベクターで、細胞を形質移入するステップと、b前記細胞中の前記タンパク質コーディング領域によってコードされる前記タンパク質の発現レベルを測定するステップとを含んでなり、前記タンパク質の発現レベルが前記miRNA阻害剤の有効性を示す、miRNA阻害剤の有効性を評価する方法。前記細胞を前記試験miRNAに接触させるステップをさらに含んでなる、請求項47に記載の方法。前記細胞が前記試験miRNAを発現する請求項47または48に記載の方法。前記試験miRNAが哺乳類miRNAである、請求項36~48のいずれか一項に記載の方法。前記試験miRNAがヒトmiRNAである、請求項36~50のいずれか一項に記載の方法。前記miRNA阻害剤がmiRNAsponge、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはtoughdecoyRNAである、請求項36~51のいずれか一項に記載の方法。a前記miRNA阻害剤コーディング領域が前記miRNA阻害剤をコードする、請求項36~46のいずれか一項に記載の核酸ベクターで、第1の細胞を形質移入するステップと、b前記核酸ベクターで第2の細胞を形質移入するステップと、c前記第1の細胞中の前記タンパク質コーディング領域によってコードされる前記タンパクの質発現のレベルと、前記第2の細胞中の前記タンパク質コーディング領域によってコードされる前記タンパク質の発現レベルを比較するステップとを含んでなり、前記試験miRNAのレベルが前記第1の細胞と比較して前記第2の細胞中でより低く、cにおける比較の結果が前記miRNA阻害剤の有効性を示す、miRNA阻害剤の有効性を評価する方法。a前記miRNA阻害剤コーディング領域が前記miRNA阻害剤をコードする、請求項36~46のいずれか一項に記載の核酸ベクターで、細胞を形質移入するステップと、b前記細胞中の前記タンパク質コーディング領域によってコードされる前記タンパク質の第1の発現レベルを測定するステップと、c前記細胞を前記試験miRNAに接触させるステップと、d前記細胞中の前記タンパク質コーディング領域によってコードされる前記タンパク質の第2の発現レベルを測定するステップと、e前記タンパク質の前記第1の発現レベルと前記第2の発現レベルを比較するステップとを含んでなり、eにおける比較の結果が前記miRNA阻害剤の有効性を示す、miRNA阻害剤の有効性を評価する方法。請求項36~46のいずれか一項に記載の核酸ベクターを収容する容器を含んでなる、miRNA阻害剤機能を評価するためのキット。分子検出システムの構成要素を収容する容器を含んでなる、miRNA阻害剤機能を評価するためのキット。第1のmiRNA結合部位および第2のmiRNA結合部位を含んでなり、第1のステム配列がその5’末端で前記第1のmiRNA結合部位の側面に位置し、第2のステム配列がその3’末端で前記第1のmiRNA結合部位の側面に、そしてその5’末端で前記第2のmiRNA結合部位の側面に位置し、第3のステム配列がその3’末端で前記第2のmiRNA結合部位の側面に位置し、前記miRNA結合部位の少なくとも1つが複数の標的miRNAの共通配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、miRNA阻害剤。前記2つのmiRNA阻害剤結合部位のそれぞれが、前記miRNA阻害剤によって標的とされる前記複数のmiRNAのいずれとも相補的でない非結合中央部分を含んでなる、請求項57に記載のmiRNA阻害剤。前記第1のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分が、前記第2のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分と少なくとも部分的に相補的である、請求項58に記載のmiRNA阻害剤。前記第1のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分が、前記第2のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分と1~5ヌクレオチドで相補的である、請求項58または59に記載の方法。前記第1のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分が、前記第2のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分と3ヌクレオチドで相補的である、請求項58~60のいずれか一項に記載の方法。前記第1のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分が、1~10ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項58~61のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。前記第1のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分が、3~5ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項58~62のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。前記第1のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分が、4ヌクレオチドの長さを有する、請求項58~63のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。前記第2のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分が、1~10ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項58~64のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。前記第2のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分が、3~5ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項58~65のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。前記第2のmiRNA結合部位の前記非結合中央部分が、4ヌクレオチドの長さを有する、請求項58~66のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。前記第1のmiRNA結合部位および前記第2のmiRNA結合部位が、2~10ヌクレオチド長の配列で相補的である、請求項58~67のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。前記第1のmiRNA結合部位および前記第2のmiRNA結合部位が、4ヌクレオチド長の配列で相補的である、請求項58~68のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。前記miRNA阻害剤が、2つ以上のmiRNA結合部位を含んでなる、請求項57~69のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。前記miRNA阻害剤がTuDである、請求項57~70のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。前記miRNA阻害剤が、複数のlet-7ファミリーメンバーを標的とする、請求項57~71のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。前記miRNA阻害剤が、配列番号18の少なくとも8個の隣接ヌクレオチド配列を含んでなる、請求項71または72に記載のmiRNA阻害剤。前記miRNA阻害剤が、配列番号18の最初の10個のヌクレオチドおよび/または最後の10個のヌクレオチドを含んでなる、請求項73に記載のmiRNA阻害剤。前記miRNA阻害剤が、配列番号18または配列番号20のヌクレオチド配列を含んでなる、またはそれからなる、請求項57~71のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤。複数のmiRNAから共通配列を得るステップと、複数のmiRNAを標的とするmiRNA阻害剤を作成するステップとを含んでなり、miRNA阻害剤が第1のmiRNA結合部位および第2のmiRNA結合部位を含んでなり、第1のステム配列がその5’末端で前記第1のmiRNA結合部位の側面に位置し、第2のステム配列がその3’末端で前記第1のmiRNA結合部位の側面に、そしてその5’末端で前記第2のmiRNA結合部位の側面に位置し、第3のステム配列がその3’末端で前記第2のmiRNA結合部位の側面に位置し、miRNA阻害剤が複数の標的miRNAの共通配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、方法。前記共通配列が5~40ヌクレオチド長である、請求項76に記載の方法。前記miRNAがTuDである、請求項76または77に記載の方法。配列番号22、または配列番号24のヌクレオチド配列を含んでなるmiRNA阻害剤。細胞を請求項57~75および79のいずれか一項に記載のmiRNA阻害剤に接触させるステップを含んでなる方法。miRNAとコレステロールの結びつき、そしてmiRNA機能を調節することによりコレステロール関連障害を治療する有効治療薬の可能性にもかかわらず、コレステロール関連障害の治療におけるmiRNA阻害の有効かつ安全なアプローチの開発は、顕著な科学的および治療上の難題であり続ける例えばCzechMPNEnglJMed35411pg11441145を参照されたい。本発明の態様は、miRNA阻害剤機能のアセスメントおよび特性解析を可能にし、それによって例えばコレステロール関連障害などの疾患の治療および研究に役立つmiRNA阻害剤の発見を促進する、分子検出システムに基づく。本発明のいくつかの態様に従って、miRNA阻害剤は、本明細書で、コレステロール関連障害の治療に役立つものと同定される。いくつかの実施形態では、rAAVベースのmiRNA阻害剤組成物を使用して、対象中で持続性の組織特異的miRNA阻害をもたらす。いくつかの態様では、本発明のrAAVは、対象中でmiR-122の機能、プロセッシングおよび/または発現を阻害する、miRNA阻害剤を発現する少なくとも1つの導入遺伝子を持つ。本発明の例示的なmiRNA阻害剤は、配列番号1に記載の配列を有する。本発明のいくつかの態様に従って、対象中で高コレステロール関連障害を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象中でmiR-122の発現を阻害するmiRNA阻害剤を発現する、少なくとも1つの導入遺伝子を持つ有効量のrAAVを対象に投与することを伴う。いくつかの実施形態では、miRNA阻害剤は、miR-122結合部位を含んでなる。いくつかの実施形態では、miR-122結合部位は、2つのステム配列で挟まれる。いくつかの実施形態では、miR-122結合部位は、miR-122と相補的な2つの部分で挟まれる、miR-122と相補的でない非結合中央部分を含んでなる。いくつかの実施形態では、miRNA阻害剤は第1のmiR-122結合部位および第2のmiR-122結合部位を含んでなり、各結合部位は2つのステム配列で挟まれ、第1のステム配列はその5’末端で第1のmiR-122結合部位の側面に位置し、第2のステム配列はその3’末端で第1のmiR-122結合部位の側面に、そしてその5’末端で第2のmiR-122結合部位の側面に位置し、第3のステム配列はその3’末端で第2のmiR-122結合部位の側面に位置する。いくつかの実施形態では、2つのmiR-122阻害剤結合部位のそれぞれは、miR-122と相補的でない非結合中央部分を含んでなる。いくつかの実施形態では、第1のmiR-122結合部位の非結合中央部分は、第2のmiR-122結合部位の非結合中央部分と少なくとも部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、第1のmiR-122結合部位の非結合中央部分は、第2のmiR-122結合部位の非結合中央部分と1~5ヌクレオチドで相補的である。いくつかの実施形態では、第1のmiR-122結合部位の非結合中央部分は、第2のmiR-122結合部位の非結合中央部分と3ヌクレオチドで相補的である。いくつかの実施形態では、第1のmiR-122結合部位の非結合中央部分は、1~10ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第1のmiR-122結合部位の非結合中央部分は、3~5ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第1のmiR-122結合部位の非結合中央部分は、4ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第2のmiR-122結合部位の非結合中央部分は、1~10ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第2のmiR-122結合部位の非結合中央部分は、3~5ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第2のmiR-122結合部位の非結合中央部分は、4ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第1のmiR-122結合および第2のmiR-122結合部位は、2~10ヌクレオチド長さの配列で相補的である。いくつかの実施形態では、第1のmiR-122結合および第2のmiR-122結合部位は、4ヌクレオチド長さの配列で相補的である。いくつかの実施形態では、miRNA阻害剤は2つ以上のmiR-122結合部位を含んでなる。特定の実施形態では、miRNA阻害剤は配列番号1に記載の配列を有する。特定の実施形態では、rAAVは、配列番号3に記載の配列を有するAAV9血清型カプシドを有する。いくつかの実施形態では、rAAVは、AAV9血清型カプシドの変種であるカプシドを有する。特定の実施形態では、rAAVは、配列番号4に記載の配列を有するAAV9血清型変種Csp-3カプシドを有する。いくつかの実施形態では、rAAVは肝臓組織を標的とする。いくつかの実施形態では、rAAVは肝細胞を形質導入する。特定の実施形態では、rAAVの有効量は、1kgあたり1010、1011、1012、1013、または1014個のゲノムコピーである。特定の実施形態では、rAAVの有効量は、対象あたり1010、1011、1012、1013、1014、または1015個のゲノムコピーである。いくつかの実施形態では、投与は静脈内で実施される。いくつかの実施形態では、投与は肝臓門脈への注入によって実施される。いくつかの実施形態では、対象は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は高コレステロール関連障害の動物モデルである。いくつかの実施形態では、高コレステロール関連障害は、I型、IIa型、IIb型、III型、IV型、またはV型高リポタンパク血症である。いくつかの実施形態では、高コレステロール関連障害は、糖尿病、代謝症候群、腎臓疾患ネフローゼ症候群、甲状腺機能低下、クッシング症候群、神経性食欲不振症、睡眠剥奪、ジーブ症候群、抗レトロウイルス薬、食餌、高体重、または低身体活動量に付随する。いくつかの実施形態では、対象はヒトであり、高コレステロール関連障害は、200mg/dl以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、対象はマウスであり、高コレステロール関連障害は、100mg/dl以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、対象はラットであり、高コレステロール関連障害は、70mg/dl以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる。本発明のいくつかの態様に従って、miRNA阻害剤の機能を評価するために、核酸ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、ai.タンパク質コーディング領域、およびii.試験miRNAの少なくとも1つの結合部位を含んでなる、導入遺伝子と作動的に連結する第1のプロモーターと、bmiRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第2のプロモーターとを含んでなり、miRNA阻害剤は試験miRNAとハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第1のプロモーターは、RNAポリメラーゼIIプロモーターである。いくつかの実施形態では、第2のプロモーターは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターである。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、第1のプロモーターとタンパク質コーディング領域の少なくとも一部の間の第1の非翻訳領域をさらに含んでなり、第2のプロモーターおよびmiRNA阻害剤コーディング領域は、第1の非翻訳領域内に配置される。いくつかの実施形態では、第1の非翻訳領域は、完全長タンパク質コーディング領域の5’末端に配置される。いくつかの実施形態では、第1の非翻訳領域は、タンパク質コーディング領域のイントロン内に配置される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、第2の非翻訳領域をさらに含んでなり、試験miRNAの少なくとも1つの結合部位は第2の非翻訳領域内にある。いくつかの実施形態では、第2の非翻訳領域は、完全長タンパク質コーディング領域の3’末端に配置される。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、第1のプロモーターおよび導入遺伝子の側面に位置する、1対の逆方向末端反復をさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、1対の逆方向末端反復は、第2のプロモーターおよびmiRNA阻害剤コーディング領域の側面にさらに位置する。いくつかの実施形態では、タンパク質コーディング領域は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT、およびβ-ラクタマーゼから選択されるレポータータンパク質をコードする。本発明のいくつかの態様では、分子検出システムが提供される。いくつかの実施形態では、分子検出システムは、miRNA阻害剤の機能を評価するための核酸ベクターを含んでなる。いくつかの実施形態では、分子検出システムの核酸ベクターは、試験miRNAによって調節される導入遺伝子と作動的に連結するプロモーター、およびmiRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結するプロモーターを含んでなる。本発明のいくつかの態様に従って、miRNA阻害剤の有効性を評価する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、amiRNA阻害剤コーディング領域がmiRNA阻害剤をコードする、前述の核酸ベクターのいずれかで、細胞を形質移入するステップと、b細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定するステップを含んでなり、タンパク質の発現レベルはmiRNA阻害剤の有効性を示す。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を試験miRNAに接触させるステップをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、細胞は試験miRNAを発現する。いくつかの実施形態では、方法は、amiRNA阻害剤コーディング領域がmiRNA阻害剤をコードする、前述の核酸ベクターのいずれか1つで、第1の細胞を形質移入するステップと、b核酸ベクターで第2の細胞を形質移入するステップと、c第1の細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルと、第2の細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルを比較するステップを含んでなり、試験miRNAのレベルは第1の細胞と比較して第2の細胞中でより低く、cの比較結果はmiRNA阻害剤の有効性を示す。いくつかの実施形態では、方法は、amiRNA阻害剤コーディング領域がmiRNA阻害剤をコードする、前述の核酸ベクターのいずれか1つで、細胞を形質移入するステップと、b細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の第1の発現レベルを測定するステップと、c細胞を試験miRNAに接触させるステップと、d細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の第2の発現レベルを測定するステップと、eタンパク質の第1の発現レベルと第2の発現レベルを比較するステップを含んでなり、eの比較結果はmiRNA阻害剤の有効性を示す。いくつかの実施形態では、方法は、amiRNA阻害剤コーディング領域がmiRNA阻害剤をコードする、前述の核酸ベクターのいずれか1つで、細胞を形質移入するステップと、b細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の第1の発現レベルを測定するステップと、cタンパク質の第1の発現レベルと対照の発現レベルを比較するステップを含んでなり、cの比較結果はmiRNA阻害剤の有効性を示す。いくつかの態様では、miRNA阻害剤の機能を評価するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、前述の核酸ベクターのいずれかを収容する容器を含んでなる。いくつかの実施形態では、キットは、分子検出システムの構成要素を収容する容器を含んでなる。本発明の限界のそれぞれは、本発明の様々な実施形態を包含し得る。したがって、要素のいずれかまたはその組み合わせを含む本発明の限界のそれぞれは、本発明の各態様に含まれ得ることが予期される。本発明は、その応用において、以下の説明に記載され、または図面に示される、構築の詳細および構成要素の配置に限定されるものではない。本発明は、その他の実施形態が可能であり、様々なやり方で実行され、または実施され得る。本発明の態様は、コレステロール関連障害の治療と研究に役立つ、miRNA阻害剤の発見に基づく。本発明のいくつかの態様では、マイクロRNA阻害剤をコードする核酸は、対象への遺伝子移入のための組換えAAVrAAV内にパッケージされる。本発明のmiRNA阻害剤遺伝子を含んでなる組換えAAVは、治療目的ならびに研究者目的で有用である。本発明のいくつかの態様に従って、対象中でコレステロール関連障害を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象に有効量のrAAVを投与するステップを伴う。rAAVは、対象中でmiR-122の発現を阻害するmiRNA阻害剤を発現する、少なくとも1つの導入遺伝子を収容してもよい。例示的なmiRNA阻害剤は、配列番号1に記載の配列を有する。コレステロール関連障害本明細書の用法では、コレステロール関連障害とは、対象中で、コレステロールレベルの病理学的変化例えば病的に低いまたは病的に高いをもたらす病状または疾患である。対象は、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または非ヒト霊長類であってもよい。対象は、例えばコレステロール関連障害を有する対象などのヒトであってもよい。いくつかの実施形態では、対象は高コレステロール関連障害の動物モデルである。コレステロール関連障害は、総血清コレステロール、血清HDLコレステロール、または血清LDLコレステロールのレベル変化に付随することもある。コレステロール関連障害はまた、血清LDLとHDLの比率例えばLDL/HDL比の変化に付随することもある。異なる種の正常コレステロール範囲を下の表1に提供する。表1から明らかなように、正常な範囲は種に依存する。異常な高レベルのコレステロールに付随するコレステロール関連障害は、本明細書で高コレステロール関連障害と称される。ヒト対象では、高コレステロール関連障害は、200mg/dlを上回る総血清コレステロールレベルによって特徴付けられてもよい。マウス対象では、高コレステロール関連障害は、100mg/dlを上回る総血清コレステロールレベルによって特徴付けられてもよい。ラット対象では、高コレステロール関連障害は、70mg/dlを上回る総血清コレステロールレベルによって特徴付けられてもよい。その他の異常なコレステロールレベルは、当業者には明らかである。本発明の態様に従って治療されてもよいコレステロール関連障害の例としては、I型、IIaおよびb型、III型、IV型、およびV型高リポタンパク血症が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の態様に従って治療されてもよいさらなる障害としては、糖尿病、代謝症候群、腎臓疾患ネフローゼ症候群、甲状腺機能低下、クッシング症候群、神経性食欲不振症、睡眠剥奪、ジーブ症候群、抗レトロウイルス薬、食餌、高体重、または低身体活動に付随する、コレステロール関連障害が挙げられる。その他のコレステロール関連障害は、当業者には明らかである。本発明の態様に従って治療されてもよい特定のコレステロール関連障害は、遺伝的原因の例えば遺伝的で体細胞突然変異に起因する障害である。例えば家族性高コレステロール血症FHII型高リポタンパク血症は、血液中の高コレステロールレベル、具体的には非常に高い低密度リポタンパク質LDLレベルと早発性心血管疾患によって特徴付けられる、遺伝的原因のコレステロール関連障害である。FHがある多数の対象は、常態ではLDLを循環から除去する、LDL受容体タンパク質をコードするLDLR遺伝子に、または受容体に結合するLDLの一部であるアポリポタンパク質BApoBに突然変異を有する;その他遺伝子の突然変異は稀である。LDLR遺伝子の1個の異常なコピー異種接合体を有する対象は、30~40才で早発性心血管疾患を有することもある。miRNA阻害剤マイクロRNAmiRNAは、広範な細胞プロセスを調節する役割を果たすようであり、miRNA発現の変化はヒト疾患と関係があるとされている。マイクロRNAは、特定のコレステロール関連障害の発症と進行に関与するものと理解される。肝臓中の最も豊富なmiRNAであるmiR-122は、未知の機序によってコレステロール代謝を調節し、直接LDLRmRNAを標的としない。miR-122は、高コレステロール関連障害の潜在的治療標的に相当するが、治療的に有効なmiR-122の阻害剤の可能性は、ほとんど実現されていない。本明細書の用法では、miRNA阻害剤という用語は、miRNA発現、プロセッシングおよび/または機能をブロックする作用物質を指す。多様なmiRNA阻害剤が、当該技術分野で開示されている。miRNA阻害剤の非限定的例としては、miRNAとDrosha複合体との反応を阻害する、マイクロRNA特異的アンチセンス、マイクロRNAsponge、toughdecoyRNATuDRNA、およびマイクロRNAオリゴヌクレオチド二本鎖、ヘアピン、短鎖オリゴヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。例えばTuDRNAに関する内容を参照によって本明細書に援用する、EbertMSNatureMethodsEpubAugust122007;TakeshiHaraguchietalNucleicAcidsResearch2009Vol37No6e43を参照されたい。miRNA阻害剤のための分子検出システム分子検出システムをデザインして、異なるmiRNA阻害剤デザインの阻害機能を定量的に評価し、当該技術分野のmiRNA阻害剤と比較して優れた特性を有するmiRNA阻害剤発見をできるようにした分子検出システムの模式図については図1を参照されたい。様々なmiRNA阻害剤を開発し、このシステムを使用して試験した例えば例1を参照されたい。本発明のいくつかの態様に従って、血清コレステロールレベルを効果的に低下させるmiRNA阻害剤miR-122を同定する。本発明の分子検出システムは、レポーター遺伝子例えばEGFP、ルシフェラーゼなどのタンパク質コーディング遺伝子のRNA転写物を発現するための構成要素を典型的に含み、レポーター遺伝子の発現は、RNA転写物に結合するmiRNAに対して感受性である。典型的に、RNA転写物は、タンパク質をコードするmRNA転写物である。したがってレポーター遺伝子活性は、導入遺伝子のmRNA転写物によってコードされるタンパク質のレベルを検出することで、評価されることが多い。しかし、レポーター遺伝子のRNA転写物それ自体が、導入遺伝子活性のレポーターの役割を果たしてもよい。例えばRNAは、RT-PCRなどの多様な標準RNA検出ストラテジーのいずれかを使用して検出されてもよく、したがって導入遺伝子活性のレポーターの役割を果たしてもよい。典型的に、導入遺伝子のRNA転写物は、1つまたは複数のmiRNA結合部位を有する。したがって細胞中で発現される場合、分子検出システムのRNA転写物は、miRNA結合部位でそれらに結合する細胞のmiRNA分子の存在に対して典型的に感受性である。miRNA結合部位は、典型的に転写物の3’末端にある。しかし、miRNA結合部位は、miRNAが機能性miRNA遺伝子サイレンシング経路を有する細胞中の部位に結合する場合、またはmiRNA活性を再現する生体外システムでは、転写物の発現が阻害されるという条件で、導入遺伝子のコーディング領域内またはあらゆる非翻訳領域内にあってもよい。分子検出システムは、典型的に、試験miRNA阻害剤を発現するための構成要素もまた含んでなる。miRNA結合部位があるmRNA転写物がmiRNA存在下で発現される場合、miRNAは結合部位とハイブリダイズして、mRNAによってコードされるレポータータンパク質の発現を阻害する。しかし、miRNAの機能をブロックするmiRNA阻害剤が発現される場合、レポータータンパク質の発現は阻害されないまたは発現阻害が弱まる。したがって本発明の分子検出システムによって、レポーター遺伝子の発現レベルに基づいて、効果的な阻害特性があるmiRNA阻害剤の効率的なスクリーニングと同定ができるようになる。分子検出システムは、miRNAによって調節される導入遺伝子と作動的に連結するプロモーター、およびmiRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結するプロモーターを含んでなる、核酸ベクターを含むことが多い。核酸ベクターの導入遺伝子は、典型的に、少なくともタンパク質コーディング領域例えばレポータータンパク質コーディング領域、および少なくとも1つのmiRNA結合部位を含む。タンパク質コーディング領域は、例えば蛍光タンパク質例えばGFP、dsRedなど、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT、およびβ-ラクタマーゼなどのレポータータンパク質をコードしてもよい。導入遺伝子のプロモーターおよびmiRNA阻害剤コーディング領域のプロモーターは、同じプロモーターであってもまたは異なるプロモーターであってもよい。導入遺伝子のプロモーターは、典型的にはRNAポリメラーゼIIプロモーターである。miRNA阻害剤のプロモーターは、RNAポリメラーゼIIプロモーターまたはRNAポリメラーゼIIIプロモーター例えばU6プロモーターであってもよい。当業者は、導入遺伝子が、例えば細胞内または生体外転写/翻訳系内などの適切な発現系内で発現できるという条件で、導入遺伝子と作動的に連結するプロモーターが、核酸ベクター内のどこに配置されてもよいことを理解するであろう。同様に、当業者は、miRNA阻害剤コーディング領域が、例えば細胞内または生体外転写/翻訳系内などの適切な発現系内で発現できるという条件で、miRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結するプロモーターが、核酸ベクター内のどこに配置されてもよいことを理解するであろう。例えばmiRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第2のプロモーターは、導入遺伝子と作動的に連結する第1のプロモーターの上流に配置されてもよい導入遺伝子と作動的に連結する第1のプロモーターに対して5’末端側。miRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第2のプロモーターは、導入遺伝子と作動的に連結する第1のプロモーターの下流に配置されてもよい導入遺伝子と作動的に連結する第1のプロモーターに対して3’末端側。miRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第2のプロモーターは、第1のプロモーターと導入遺伝子コーディング領域との間例えばイントロン内に配置されてもよい。miRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第2のプロモーターは、導入遺伝子のあらゆるイントロン内に配置されてもよい。miRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第2のプロモーターは、導入遺伝子コーディング領域上流例えば5’-UTR、または導入遺伝子コーディング領域下流例えば3’-UTRの非翻訳領域内に配置されてもよい。分子検出システムは、例えば試験miRNAによって調節される導入遺伝子と作動的に連結する第1のプロモーターと、miRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第2のプロモーターとを含んでなる、核酸ベクターを含んでもよい。核酸ベクターは、組換えウイルスゲノムであってもよい。例えば核酸ベクターは、組換えAAVベクターであってもよい。したがって核酸ベクターは、導入遺伝子と作動的に連結するプロモーターの側面に位置する、1対の逆方向末端反復をさらに含んでもよい。1対の逆方向末端反復は、miRNA阻害剤コーディング領域と作動的に連結するプロモーターの側面にさらに位置してもよい。本発明の分子検出システムを使用して、miRNA阻害剤の有効性を評価する方法が提供される。方法は、典型的に、aタンパク質コーディング領域と少なくとも1つのmiRNA結合部位とを含んでなる導入遺伝子と作動的に連結する第1のプロモーターと、miRNAとハイブリダイズするmiRNA阻害剤のコーディング領域と作動的に連結する第2のプロモーターとを含んでなる核酸ベクターで、細胞を形質移入するステップと、b細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定するステップとを含む。タンパク質の発現レベルは、miRNA阻害剤の有効性を示す。例えば核酸ベクターがmiRNAを発現する細胞に形質移入された場合、miRNAは、導入遺伝子から転写されたmRNA中のその同族結合部位に結合して、mRNAの発現を阻害する。miRNA阻害剤が効果的であれば、それは例えばmiRNAとハイブリダイズし、mRNAの発現抑制を解除するまたは弱めることで、miRNA活性をブロックするまたは低下させる。mRNAの発現の変化は、典型的に、mRNAによってコードされるレポータータンパク質のレベルを評価することによって、観察される。したがってレポータータンパク質レベルに基づいて、異なるmiRNA阻害剤を比較し得る。当業者には理解されるように、システムを様々なやり方で微調整して、所望レベルの有効性を有する阻害剤を同定し得る。例えば導入遺伝子mRNA上のmiRNA結合部位の質をデザインまたは選択し得る。例えば試験miRNAに高親和性で結合する結合部位などの高品質結合部位をデザインまたは選択し得る。結合部位は、新規にデザインし、または既知の遺伝子のmiRNA結合部位から選択し得る例えばサイクリンG上のmiR-122結合部位を選択してもよい。導入遺伝子mRNA中のmiRNA結合部位の数もまた、変更し得る。例えば複数結合部位を使用し得て、または単一結合部位を使用し得る。miRNAに対するmiRNAの結合親和性および結合部位数などのパラメータを調節することで、miRNA阻害剤がそれによって選択されるストリンジェンシーを増大または低下させることが可能になる。例えば試験miRNAに対して複数の高品質結合部位を有する導入遺伝子を使用して、高品質miRNA阻害剤を選択し得る。分子検出システムは、生外体発現系中または細胞中で使用してもよい。miRNAレベルは、miRNA阻害剤をそれによって選択するストリンジェンシーを増大または低下させるために調節し得るパラメータの別の例である。したがって方法は、細胞をmiRNAに接触させるステップ、またはmiRNAを生体外発現系に添加するステップをさらに含んでなってもよい。異なる用量のmiRNAを使用して、複数の実験を例えば並行して実施して、miRNA阻害剤の用量依存性阻害特性を評価できるようにしてもよい。多様な対照値または対照実験のいずれかを得て、または実施して、試験miRNA阻害剤の有効性を評価してもよい。方法は、amiRNA阻害剤コーディング領域がmiRNA阻害剤をコードする、分子検出システムの核酸ベクターで、第1の細胞を形質移入するステップと、b核酸ベクターで形第2の細胞を質移入するステップと、c第1の細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルと、第2の細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルを比較するステップを含んでなってもよく、試験miRNAのレベルは第1の細胞と比較して第2の細胞中でより低く、cの比較結果はmiRNA阻害剤の有効性を示す。方法は、amiRNA阻害剤コーディング領域がmiRNA阻害剤をコードする、前述の核酸ベクターのいずれか1つで、細胞を形質移入するステップと、b細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の第1の発現レベルを測定するステップと、c細胞を試験miRNAに接触させるステップと、d細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の第2の発現レベルを測定するステップと、eタンパク質の第1の発現レベルと第2の発現レベルを比較するステップを含んでなってもよく、eの比較結果は、miRNA阻害剤の有効性を示す。miRNA阻害剤の構造本発明の態様は、miR-122を標的として、その機能をブロックするmiRNA阻害剤の発見に基づく。例えば本発明の分子検出システムを使用して、高品質miRNA阻害剤が発見された。本発明の典型的なmiRNA阻害剤は、例えばmiR-122結合部位などの少なくとも1つのmiRNA結合部位を含んでなる核酸分子である。miRNA阻害剤は、1つのmiRNA結合部位、2つのmiRNA結合部位、3つのmiRNA結合部位、4つのmiRNA結合部位、5つのmiRNA結合部位、6つのmiRNA結合部位、7つのmiRNA結合部位、8つのmiRNA結合部位、9つのmiRNA結合部位、10のmiRNA結合部位、またはそれ以上のmiRNA結合部位を含んでなってもよい。本明細書の用法では、miRNA阻害剤に関連したmiRNA結合部位という用語は、miRNA中のヌクレオチド配列と十分に相補的でmiRNA阻害剤とmiRNA間に塩基対形成をもたらす、miRNA阻害剤中のヌクレオチド配列を指す。典型的に、miRNA結合部位は、miRNA中のヌクレオチド配列と十分に相補的でmiRNA阻害剤との間に塩基対形成をもたらし、それによってmiRNAの標的mRNAへの結合を阻害する、ヌクレオチド配列を含んでなる。本明細書の用法では相補的または相補性という用語は、伝統的なワトソンクリック塩基対形成またはその他の非伝統的塩基対形成のどちらかによって、核酸が別のRNA配列と水素結合を形成する能力を指す。本発明の核分子に関して、核酸分子とその標的または相補的配列との結合自由エネルギーは、例えばmiRNA阻害などの核酸の該当機能が進行するのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は、当該技術分野で良く知られている例えばTurneretal1987CSHSympQuantBiolLIIpp123133;Frieretal1986ProcNatAcadSciUSA8393739377;Turneretal1987JAmChemSoc10937833785を参照されたい。パーセント相補性は、第2の核酸配列と水素結合を形成し得る例えばワトソンクリック塩基対形成、核酸分子中で隣接する残基の百分率を示す例えば10個の内5、6、7、8、9、10個であれば50、60、70、80、90、および100相補的である。完全に相補的とは、核酸配列の全ての隣接残基が、第2の核酸配列中の同数の隣接する残基と水素結合することを意味する。いくつかの実施形態では、核酸は、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100の相補性を有する。2つのmiRNA結合部位を有するmiRNA阻害剤では、第1のmiRNA結合部位と第2のmiRNA結合部位は、例えば長さ2~10ヌクレオチドの配列で相補的であってもよい。一例では、第1のmiRNA結合と第2のmiRNA結合部位は、長さ4ヌクレオチドの配列で相補的である。miRNA阻害剤の各miRNA結合部位は、多様な長さのいずれであってもよい。例えばmiRNA阻害剤のmiRNA結合部位は、5ヌクレオチド~35ヌクレオチド、10ヌクレオチド~30ヌクレオチド、または15ヌクレオチド~25ヌクレオチドであってもよい。典型的にmiRNA結合部位の長さは、それが結合するmiRNAの長さおよび/または構造に左右される。本発明のmiRNA阻害剤のmiRNA結合部位は、1つまたは複数のステム配列が側面にあることが多い。本明細書の用法では、ステム配列という用語は、分子内塩基対形成をもたらす核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、ステム配列は標的miRNAと相補的でない。分子内塩基対形成は、一般に回文配列であるmiRNA阻害剤の2つのステム配列領域が、塩基対を形成して、不対ループに終わってもよい二重らせんを形成する場合に生じてもよい。したがって塩基対形成は、ステム配列内に、または2つのステム配列間に形成してもよい。ステム配列は、多様な長さであることができる。例えばステム配列は、3ヌクレオチド~200ヌクレオチド、3ヌクレオチド~100ヌクレオチド、3ヌクレオチド~50、3ヌクレオチド~25ヌクレオチド、10ヌクレオチド~20ヌクレオチド、20ヌクレオチド~30ヌクレオチド、30ヌクレオチド~40ヌクレオチド、40ヌクレオチド~50ヌクレオチド、または50ヌクレオチド~100ヌクレオチドの範囲であってもよい。ステム配列は、5ヌクレオチドまで、10ヌクレオチドまで、20ヌクレオチドまで、50ヌクレオチドまで、100ヌクレオチドまで、200ヌクレオチドまで、またはそれ以上であってもよい。リンカー配列もまた、miRNA阻害剤に含まれてもよい。miRNA阻害剤は、第1のmiRNA結合部位および第2のmiRNA結合部位を含んでなってもよく、各結合部位は2つのステム配列で挟まれる。第1のステム配列はその5’末端で第1のmiRNA結合部位の側面に位置してもよく、第2のステム配列はその3’末端で第1のmiRNA結合部位に、そしてその5’末端で第2のmiRNA結合部位の側面に位置してもよく、第3のステム配列はその3’末端で第2のmiRNA結合部位の側面に位置してもよい。当業者は、結合部位および側面のステム配列のその他の立体配置を容易に予測するであろう。本発明のmiRNA阻害剤のmiRNA結合部位は、標的miRNAと相補的な2つの部分で挟まれる、標的miRNA例えばmiR-122と相補的でない非結合中央部分を含んでなってもよい。標的miRNAと相補的でない非結合中央部分は、miRNA結合部位内で完全に中央になくてもよい。例えば非結合中央部分は、異なる長さの標的miRNAと相補的な部分が、どちらの側面にあってもよい。本発明のmiRNA阻害剤は、標的miRNAと相補的でない非結合中央部分を有する、複数のmiRNA結合部位を含んでなってもよい。miRNA結合部位の非結合中央部分は、多様な長さを有してもよい。例えばmiRNA結合部位の非結合中央部分は、1ヌクレオチド~20ヌクレオチド、1ヌクレオチド~10ヌクレオチド、1ヌクレオチド~5ヌクレオチドの範囲であってもよい。miRNA結合部位の非結合中央部分は、3~5ヌクレオチドの範囲の長さを有してもよい。一例では、miRNA結合部位の非結合中央部分は、4ヌクレオチドの長さを有する。非結合中央部分の長さは、典型的にmiRNA結合部位の長さに左右される。阻害剤の第1のmiRNA結合部位の非結合中央部分は、第2のmiRNA結合部位の非結合中央部分と、少なくとも部分的に相補的であることが多い。したがって阻害剤の2つの結合部位は、互いに塩基対形成ハイブリダイズする。阻害剤の第1のmiRNA結合部位の非結合中央部分は、結合部位と非結合中央部分の長さ次第で、例えば2ヌクレオチド~10ヌクレオチドで、阻害剤の第2のmiRNA結合部位の非結合中央部分と相補的であってもよい。阻害剤の第1のmiRNA結合部位の非結合中央部分は、典型的に結合部位と非結合中央部分の長さ次第で、例えば2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、10ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドで、第2のmiRNA結合部位の非結合中央部分と相補的であってもよい。本発明のいくつかの態様は、複数のmiRNAを標的とするmiRNA阻害剤を提供する。いくつかの実施形態では、複数のmiRNAを標的にすることで、個々のmiRNAの阻害が、関連miRNAによって代償される問題を回避する。いくつかの実施形態では、複数のmiRNAは、例えばlet-7ファミリーなどのmiRNAファミリーに属する。いくつかの実施形態では、複数のmiRNAは、少なくともいくつかの配列同一性を有する。例えばいくつかの実施形態では、複数のmiRNAは、それぞれ複数のmiRNAの全てにわたり同一である、少なくとも1つの5ヌクレオチド以上のストレッチを含んでなる。いくつかの実施形態では、複数のmiRNAはそれぞれ、複数の標的miRNAのヌクレオチドストレッチの共通配列と、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、または少なくとも98同一である、少なくとも1つの5ヌクレオチド以上のストレッチを含んでなる。共通配列という用語は、本明細書の用法では、特定位置で、複数ヌクレオチド配列により共有される、最も頻度の高いヌクレオチドを反映するヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、複数のヌクレオチド配列は、例えば同じmiRNAファミリーメンバーの配列などの関連ヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、共通配列は、2つ以上の配列を配列比較して、整合配列中の特定位置で、最も一般的に見られまたは最も豊富なヌクレオチドを判定することによって得られる。複数の配列から共通配列を得るための配列アラインメントの方法およびアルゴリズムは、当業者に良く知られており、本発明はこの点において限定されるものではない。いくつかの実施形態では、複数のmiRNAを標的にするmiRNA阻害剤は、複数のmiRNAの共通配列に相補的な少なくとも1つのmiRNA結合部位を含んでなるTuDである。いくつかの実施形態では、共通配列は、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、miRNA阻害剤は、第1のmiRNA結合部位および第2のmiRNA結合部位を含んでなり、第1のステム配列はその5’末端で第1のmiRNA結合部位の側面に位置し、第2のステム配列はその3’末端で第1のmiRNA結合部位の側面に、そしてその5’末端で第2のmiRNA結合部位の側面に位置し、第3のステム配列はその3’末端で第2のmiRNA結合部位の側面に位置し、miRNA結合部位の少なくとも1つは、複数の標的miRNAの共通配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第1および第2のmiRNA結合部位は、複数の標的miRNAの共通配列に相補的である。いくつかの実施形態では、第1および/または第2のmiRNA結合部位は、少なくとも7-、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、または少なくとも98、複数の標的miRNAの共通配列に相補的である。いくつかの実施形態では、第1のmiRNA結合部位が相補的な共通配列は、第2のmiRNA結合部位が相補的な共通配列に直接隣接する。いくつかの実施形態では、複数のlet-7ファミリーメンバーmiRNAを標的とする、miRNA阻害剤が提供される。いくつかの実施形態では、miRNA阻害剤は、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、または26個の、配列番号18の隣接ヌクレオチド配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、miRNA阻害剤は、配列番号18、配列番号20、配列番号22、または配列番号24のヌクレオチド配列を含んでなり、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、細胞をmiRNA阻害剤に接触させるステップを含んでなる方法が提供される。細胞は、生体外であってもまたは生体内であってもよい。したがっていくつかの実施形態では、方法は、miRNA阻害剤を生体外細胞培養物に添加するステップを伴う。別の実施形態では、方法は、miRNA阻害剤を対象に投与するステップを伴う。本発明のいくつかの態様は、複数のmiRNAを標的にするmiRNA阻害剤を作成する方法を提供し、方法は、複数の標的miRNAの共通配列を得るステップと、共通配列に結合できるmiRNA結合部位を含んでなる、例えば本明細書に記載されるmiRNA阻害剤例えばTuDなどのmiRNA阻害剤を生成するステップと、ひいては複数のmiRNAを標的にするステップを含んでなる。いくつかの実施形態では、このように作成されたmiRNA阻害剤は、第1のmiRNA結合部位および第2のmiRNA結合部位を含んでなり、第1のステム配列はその5’末端で第1のmiRNA結合部位の側面に位置し、第2のステム配列はその3’末端で第1のmiRNA結合部位の側面に、そしてその5’末端で第2のmiRNA結合部位の側面に位置し、第3のステム配列はその3’末端で第2のmiRNA結合部位の側面に位置し、miRNA阻害剤は複数の標的miRNAの共通配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、方法は、複数のmiRNAを標的にするmiRNA阻害剤を合成するステップをさらに含んでなる。組換えAAV組換えAAVベクターから発現される場合、本発明のmiRNA阻害剤は、対象中で長期miRNA阻害効果を達成することが発見されている。例えばrAAVを使用して正常対象コレステロール関連障害を有さないに送達された、miR-122に対するmiRNA阻害剤は、例えば少なくとも14週間までなどの持続期間にわたり、対象中で総血清コレステロールを顕著に低下させることが発見されている。rAAVを使用して高コレステロール関連障害を有する対象に送達された、miR-122に対するmiRNA阻害剤もまた、例えば少なくとも14週間までなどの持続期間にわたり、対象中で総血清コレステロールを顕著に低下させることもさらに発見されている。AAVは、哺乳類中の天然生物である。哺乳類、特に非ヒト霊長類から単離されたAAVは、臨床開発およびヒト遺伝子療法応用のための遺伝子移入ベクターを作成する上で有用である。本発明の態様では、組換えAAV9は、最適化miR-122阻害剤本明細書でmiR-122拮抗薬Antagとも称されるを発現することにより、正常なC57BL/6マウス中で、効率的かつ安定したmiR-122拮抗作用を達成する。miR-122阻害剤rAAV9-miR-122AntagをコードするrAAVベクターを含んでなるrAAV9の単回静脈内注射は、成熟miR-122のレベルの顕著な低下と、miR-122標的遺伝子の顕著な上方制御を生じた。普通食を与えた正常対象では、総血清コレステロール、HDL、およびLDLの約50までの低下が観察された。いくつかの態様では、本発明は単離AAVを提供する。本明細書の用法では、AAVに関する単離という用語は、その天然環境から例えば宿主細胞、組織、または対象から単離され、または人工的に生成されたAAVを指す。単離AAVは、組換え法を使用して生成されてもよい。このようなAAVは、本明細書で組換えAAVと称される。組換えAAVrAAVは、好ましくはrAAVの導入遺伝子が、具体的には1つまたは複数の規定の組織に送達されるように、組織特異的標的能力を有する。AAVカプシドは、これらの組織特異的標的能力を判定する上で、重要な要素である。したがって標的とされる組織に適したカプシドを有するrAAVを選択し得る。典型的にrAAVは、肝臓組織、具体的には肝臓組織の肝細胞に対する向性を有するそれを標的とするカプシドを有する。例えばrAAVカプシドは、配列番号3に記載の配列またはその変種を有する、AAV9血清型であってもよい。rAAVは、配列番号4に記載の配列を有する、AAV9血清型変種Csp-3のカプシドを有する。AAV9血清型変種の例は、AAVカプシド配列に関する内容を参照によって本明細書に援用する、2009年5月28日に出願された、米国仮特許出願第61/182,084号明細書で開示される。なおも、いくつかの実施形態では、AAV血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAVrh.10から選択される。別の実施形態ではAAV血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAVrh.10から選択される、AAV血清型の変種である。>gi|46487805|gb|AAS99264.1|カプシドタンパク質VP1[アデノ随伴ウイルス9]配列番号3MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYRPIGTRYLTRNL>カプシドタンパク質VP1[アデノ随伴ウイルス]CSp3配列番号4MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTIASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKRISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIRVKEVTDNNGVKTITNNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTRNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGVKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYRPIGTRYLTRNL組換えAAV:生成方法所望のカプシドタンパク質を有する組換えAAVを得る方法は、当該技術分野で良く知られている。例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第2003/0138772号明細書を参照されたい。典型的に、方法は、以下を含有する宿主細胞を培養するステップを伴う:AAVカプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列;機能性rep遺伝子;AAV逆方向末端反復ITRと導入遺伝子とから構成される組換えAAVベクター;および組換えAAVベクターをAAVカプシドタンパク質内にパッケージングできるようにするのに十分なヘルパー機能。宿主細胞中で培養され、AAVカプシド内にrAAVベクターをパッケージする構成要素は、宿主細胞にトランスに提供されてもよい。代案として、当業者に知られている方法を使用して遺伝子改変され、必要構成要素の1つ以上を含有する安定宿主細胞によって、必要構成要素例えば組換えAAVベクター、rep配列、cap配列、および/またはヘルパー機能のいずれか1つ以上を提供してもよい。最も適切には、このような安定宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下にある必要構成要素を含有する。しかし、必要構成要素は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。適切な誘導性および構成的プロモーターの例は、本明細書で、導入遺伝子と共に使用するのに適した調節要素の考察において、提供される。なおも別の代案では、選択された安定宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された構成要素、および1つまたは複数の誘導性プロモーターの制御下にあるその他の選択された構成要素を含有してもよい。例えば誘導性プロモーターの制御下にあるrepおよび/またはcapタンパク質を含有するが、293細胞構成的プロモーターの制御下にあるE1ヘルパー機能を含有するに由来する、安定宿主細胞を作成してもよい。なおも別の安定宿主細胞が、当業者によって作成されてもよい。本発明のrAAVの生成に必要な組換えAAVベクター、rep配列、cap配列、およびヘルパー機能は、あらゆる適切な遺伝要素ベクターを使用して、包装宿主細胞に送達されてもよい。選択された遺伝要素は、本明細書に記載されるものをはじめとする、あらゆる適切な方法によって送達されてもよい。本発明のいずれかの実施形態を構築するのに使用される方法は、核酸操作の当業者に知られており、遺伝子操作、組換え遺伝子操作、および合成技術が挙げられる。例えばSambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborPressColdSpringHarborNYを参照されたい。同様に、rAAVビリオンを生成する方法は良く知られており、適切な方法の選択は本発明を制限しない。例えばKFisheretalJVirol70520532、および米国特許第5,478,745号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、組換えAAVは、三つ組み形質移入法を使用して生成されてもよい米国特許番号第6,001,650号明細書で詳述される。典型的に、組換えAAVは、AAV粒子中にパッケージされる組換えAAVベクター導入遺伝子を含んでなる、AAVヘルパー機能ベクター、およびアクセサリー機能ベクターで、宿主細胞を形質移入することにより生成される。AAVヘルパー機能ベクターは、生産的なAAV複製およびカプシド形成のためにトランスに機能する、AAVヘルパー機能配列すなわちrepおよびcapをコードする。好ましくはAAVヘルパー機能ベクターは、いかなる検出可能な野生型AAVビリオンすなわち機能性repおよびcap遺伝子含有AAVビリオンを生じることなく、効率的なAAVベクター生成を支援する。本発明で使用するのに適するベクターの非限定的例としては、どちらもその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第6,001,650号明細書に記載されるpHLP19、および、米国特許第6,156,303号明細書に記載されるpRep6cap6ベクターが挙げられる。アクセサリー機能ベクターは、それにAAVが複製のために依存する、非AAV由来ウイルス機能および/またはセルラーゼ機能すなわちアクセサリー機能のためのヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能としては、制限なしに、AAV遺伝子転写活性化、段階特異的AAVmRNAスプライシング、AAVDNA複製、cap発現産物合成、およびAAVカプシドアセンブリーに関与する部分をはじめとする、AAV複製に必要な機能が挙げられる。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス単純ヘルペスウイルス1型以外、およびワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスルのいずれかに由来し得る。いくつかの態様では、本発明は形質移入宿主細胞を提供する。形質移入という用語は、細胞による外来性DNAの取り込みを指すのに使用され、外来性DNAが細胞膜内に導入された場合に、細胞は形質移入されている。いくつかの形質移入技術が、当該技術分野で一般に知られている。例えばGrahametalVirology52456、SambrooketalMolecularCloningalaboratorymanualColdSpringHarborLaboratoriesNewYork、DavisetalBasicMethodsinMolecularBiologyElsevier、およびChuetalGene13197を参照されたい。このような技術は、適切な宿主細胞に、ヌクレオチド組み込み型ベクターやその他の核酸分子などの1つまたは複数の外来性核酸を導入するのに使用し得る。形質移入は、例えば細胞に、rAAVベクターを持つrAAVを感染させることで達成されてもよい。宿主細胞は、対象物質を収容し、または収容できる、あらゆる細胞を指す。宿主細胞は、哺乳類細胞であることが多い。宿主細胞は、AAVヘルパーコンストラクト、例えばmiRNA阻害剤と作動的に連結するプロモーターを含んでなるAAV導入遺伝子プラスミド、アクセサリー機能ベクター、または組換えAAV生産に関連したその他のトランスファーDNAの受容体として使用してもよい。本用語は、形質移入された最初の細胞の子孫を含む。したがって宿主細胞は、本明細書の用法では、外来性DNA配列で形質移入された細胞を指してもよい。単一親細胞の子孫は、自然変異、偶発的変異、または意図的変異の理由から、形態学的にまたはゲノムDNAまたは全DNA補体中で、最初の親細胞とは必ずしも完全に同一でなくてもよいものと理解される。本明細書の用法では、細胞系という用語は、生体外で連続的または長期成長および分裂ができる細胞集団を指す。細胞系は、単一前駆細胞に由来するクローン集団であることが多い。このようなクローン集団の保存または導入中に、核型中で自然発生的または誘導性変化が生じ得ることが、当該技術分野でさらに知られている。したがって言及される細胞系に由来する細胞は、祖先細胞または培養物と正確に同じでないこともあり得て、言及される細胞系はこのような変種を含む。本明細書の用法では、組換え細胞という用語は、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはRNAなどの生物学的に活性な核酸の生成をもたらすDNA断片などの外来性DNA断片が、その中に導入された細胞を指す。本明細書の用法では、ベクターという用語は、適切な制御要素との結合時に複製可能であり、細胞間に遺伝子配列を導入し得る、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどのあらゆる遺伝要素を含む。したがって本用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、有用なベクターは、転写される核酸断片が、プロモーターの転写調節下に置かれるベクターであることが検討された。プロモーターは、細胞の合成機構、または導入合成機構によって認識される、遺伝子の特異的転写を開始するのに必要なDNA配列を指す。作動可能に位置する、制御下または転写制御下という語句は、プロモーターが核酸に対して正しい位置と配向にあり、RNAポリメラーゼ開始および遺伝子発現を制御することを意味する。発現ベクターまたはコンストラクトという用語は、その中で、核酸をコードする配列の一部または全部が転写されることができる、核酸を含有するあらゆるタイプの遺伝子コンストラクトを意味する。いくつかの実施形態では、発現は、例えば転写された遺伝子から、生物学的活性ポリペプチド生成物または阻害RNA例えばshRNA、miRNA、miRNA阻害剤を生じる、核酸の転写を含む。組換えベクターを所望のAAVカプシド内にパッケージングして、本発明のrAAVを生成する前述の方法は、制限を意図するものでなく、その他の適切な方法は当業者には明らかである。組換えAAVベクター本発明の組換えAAVrAAVベクターは、典型的に、少なくとも、例えばmiRNA阻害剤または分子検出システムの核酸をコードする導入遺伝子と、その制御配列と、5’および3’AAV逆方向末端反復ITRとから構成される。カプシドタンパク質内にパッケージされ、選択された標的細胞に送達されるのは、この組換えAAVベクターである。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、miRNA阻害剤をコードするベクター配列とは異種の核酸配列である。核酸コード配列は、標的組織細胞中における、導入遺伝子の転写、翻訳、および/または発現を可能にする様式で、調節構成要素と作動可能に結合している。miRNA阻害剤を肝臓組織に標的指向化してmiR-122の機能を妨げ、コレステロールレベルを低下させるために、組換えAAVベースのベクターを開発してもよい。また細胞中のmiRNA阻害剤を評価またはスクリーニングするために、分子検出システムの核ベクターを細胞に標的指向化するために、組換えAAVベースのベクターを開発してもよい。ベクターのAAV配列は、典型的に、シス作用5’および3’逆方向末端反復配列を含んでなる例えばBJCarterinHandbookofParvovirusesedPTijsserCRCPresspp155168を参照されたい。ITR配列は、長さが約145bpである。好ましくは、実質的に、ITRをコードする配列全体を分子中で使用するが、これらの配列のある程度の軽微な修正は許容できる。これらのITR配列を修飾する能力は、当該分野の技術範囲内である。例えばSambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual2dedColdSpringHarborLaboratoryNewYork;およびKFisheretalJVirol70520532などの教科書を参照されたい。本発明で用いられるこのような分子の一例は、その中で選択された導入遺伝子配列と結合調節要素が5’および3’AAVITR配列で挟まれる、導入遺伝子を含有するシス作用プラスミドである。AAVITR配列は、目下同定されている哺乳類AAV型をはじめとする、あらゆる既知のAAVから得られてもよい。組換えAAVベクターについて上で同定された主要要素の他に、ベクターは、プラスミドベクターで形質移入しまたは本発明によって生成されたウイルスで感染させた細胞中における、転写、翻訳および/または発現を可能にする様式で、導入遺伝子と作動的に連結する、必要な従来の制御要素もまた含む。本明細書の用法では、作動的に連結する配列は、関心のある遺伝子に隣接する発現調節配列、および関心のある遺伝子とトランスにまたはそれから離れて作用する発現調節配列の双方を含む。発現調節配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列;スプライシングおよびポリアデニル化ポリAシグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を高める配列すなわちコザック共通配列;タンパク質安定性を高める配列;および所望ならば、コードされる生成物の分泌を高める配列以下を含む。天然、構成的、誘導性および/または組織特異的であるプロモーターをはじめとする多数の発現調節配列が当該技術分野で知られており、利用してもよい。本明細書の用法では、核酸配列の発現または転写が、制御配列の影響または調節下に置かれるように、核酸配列例えばコード配列と制御配列が共有結合する場合、それらは作動可能に結合すると言われる。核酸配列を機能性タンパク質に翻訳することが所望される場合、2つのDNA配列は、5’制御配列中のプロモーターの誘発がコード配列の転写をもたらす場合、そして2つのDNA配列間の結合の性質が、コード配列の転写を導くプロモーター領域の能力を妨げず、または対応するRNA転写物の機能を妨げない場合に、作動的に連結するとされる。したがってプロモーター領域がそのDNA配列の転写をもたらすことができる場合、得られた転写物が機能性RNA分子例えば適切に折りたたまれたmiRNA阻害剤になってもよいように、プロモーター領域は核酸配列と作動的に連結する。いくつかの実施形態では、制御配列は、組織特異的遺伝子発現能力を与える。場合によっては、組織特異的制御配列は、組織特異的様式で転写を誘導する組織特異的転写因子と結合する。このような組織特異的制御配列例えばプロモーター、エンハンサーなどは、当該技術分野で良く知られている。miRNA阻害剤は、例えばU6プロモーターなどのポリメラーゼIIIプロモーターから発現されることが多い。しかし、例えばRNAポリメラーゼIIプロモーターなどのその他の適切なプロモーターが使用されてもよい。組換えAAV投与法rAAVは、当該技術分野で既知のあらゆる適切な方法に従った組成物中で、対象に送達されてもよい。好ましくは生理学的適合性キャリアに懸濁されたすなわち組成物中のrAAVは、例えばヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または非ヒト霊長類例えばマカクなどの対象に投与されてもよい。rAAVは、過度の悪影響なしに、所望の組織の細胞を形質移入し、十分なレベルの遺伝子移入と発現を提供するのに十分な量で投与される。従来のそして薬学的に許容できる投与経路としては、選択された臓器への直接送達例えば肝臓への門脈内送達、経口、鼻腔内および気管内送達をはじめとする吸入、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、およびその他の非経口投与経路が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定状況では、rAAVベース治療用コンストラクトは、皮下、膵臓中、鼻腔内、非経口的、静脈内、筋肉内、クモ膜下腔内、または経口的、腹腔内、または吸入のいずれかによって、本明細書で開示される適切に調合された医薬組成物中で送達することが望ましいであろう。いくつかの実施形態では、米国特許第5,543,158号明細書;米国特許第5,641,515号明細書、および米国特許第5,399,363号明細書個々にその内容全体を参照によって本明細書に援用するに記載されるような投与法を使用して、rAAVを送達してもよい。哺乳類対象へのrAAVの送達は、静脈内注射によってもよい。いくつかの実施形態では、rAAVの投与様式は門脈注射による。血流内投与は、静脈、動脈、またはあらゆるその他の脈管内への注射によってもよい。いくつかの実施形態では、rAAVの血流内投与は、外科技術分野で良く知られている技術である分離式肢灌流の手段により、本方法は本質的に、当業者がrAAVビリオンの投与前に、四肢を体循環から分離できるようにする。米国特許第6,177,403号明細書に記載される分離式肢灌流技術の変法もまた当業者によって用いられて、rAAVが分離四肢血管系に投与され、筋肉細胞または組織内への導入を潜在的に高め得る。投与経路は、所望ならば組み合わせてもよい。さらに場合によっては、ビリオンを対象のCNSに送達することが望ましいことがある。CNSとは、脊椎動物の脳および脊髄の全ての細胞および組織を意味する。したがって本用語には、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液CSF、間質腔、骨、軟骨などが含まれるが、これに限定されるものではない。組換えAAVは、定位的注入などの脳神経外科技術分野で知られている技術を使用して、注射針、カテーテルまたは関連機器を用いて、例えば脳室領域、ならびに線条体例えば線条体の尾状核または被殻、脊髄神経筋接合部、または小脳葉内への注射によって、CNSまたは脳に直接送達されてもよい。例えばSteinetalJVirol73342434291999;DavidsonetalPNAS97342834322000;DavidsonetalNatGenet32192231993;およびAliskyandDavidsonHumGeneTher11231523292000を参照されたい。本発明の組成物は、1つのrAAVのみを含んでなってもよく、または1つまたは複数のその他のウイルス例えば1つまたは複数の異なるmiRNA阻害剤など、例えば1つまたは複数の異なる導入遺伝子をコードする有する第2のrAAVが組み合わさっていてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、それぞれが1つまたは複数の異なる導入遺伝子を有する、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上の異なるrAAVを含んでなる。適切なキャリアは、当業者によって、rAAVが対象とする適応症を考慮して容易に選択されてもよい。例えば1つの適切キャリアは、多様な緩衝溶液例えばリン酸緩衝食塩水と配合されてもよい、生理食塩水を含む。その他の例示的なキャリアとしては、無菌生理食塩水、乳糖、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ゴマ油、および水が挙げられる。キャリアの選択は、本発明を制限しない。任意選択的に、本発明の組成物は、rAAVおよびキャリアに加えて、保存料、または化学安定剤などのその他の従来の医薬品成分を含有してもよい。適切な例示的保存料としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。特定の治療効果を達成するのに必要なrAAVビリオンの用量、例えばゲノムコピー/キログラム体重GC/kgの用量単位は、AAVビリオン投与経路、治療効果の達成に必要な遺伝子またはRNA発現レベル、治療される特定疾患または障害、および遺伝子またはRNA生成物の安定性をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの要素に基づいて変動する。当業者は、前述の要素、ならびに当該技術分野で良く知られているその他の要素に基づいて、特定の疾患または障害を有する対象を治療するためのrAAVビリオンの用量範囲を容易に判定し得る。rAAVの有効量は、動物への感染を標的とし、所望の組織を標的とするのに十分な量である。いくつかの実施形態では、rAAVの有効量は、安定した体細胞遺伝子導入動物モデルを生成するのに十分な量である。有効量は、主に対象の種、年齢、体重、健康、および標的とされる組織などの要素に左右され、したがって動物および組織間で変動してもよい。例えばrAAVの有効量は、概して、約109~1016個のゲノムコピーを含有する、約1ml~約100mlの溶液の範囲内である。場合によっては、約1011~1012のrAAV個のゲノムコピーの投与量が適切である。特定の好ましい実施形態では、1012rAAV個のゲノムコピーが、心臓、肝臓、および膵臓組織を標的とするのに有効である。特定の実施形態では、rAAVの投与量は、1kgあたり1010、1011、1012、1013、または1014個のゲノムコピーである。特定の実施形態では、rAAVの投与量は、対象あたり1010、1011、1012、1013、1014、または1015個のゲノムコピーである。場合によっては、安定遺伝子導入動物は、rAAVの複数回投与によって作られる。いくつかの実施形態では、rAAV組成物は、特に高rAAV濃度が存在する例えば約1013GC/ml以上場合に、組成中のAAV粒子凝集を低下させるように配合される。rAAVの凝集を低下させる方法は、当該技術分野で良く知られており、例えば界面活性剤添加、pH調節、塩濃度調節などが挙げられる例えばその内容を参照によって本明細書に援用する、WrightFRetalMolecularTherapy12171178を参照されたい。薬理的に許容可能な賦形剤およびキャリア溶液の処方は、当業者に良く知られており、多様な治療計画において、本明細書に記載される特定の組成物を使用するための適切な用量と治療計画の開発についても同様である。典型的に、これらの製剤は、少なくとも約0.1以上の活性化合物を含有してもよいが、活性成分の百分率はもちろん変動してもよく、好都合には全製剤の重量または体積の約1または2~約70または80またはそれ以上であってもよい。必然的に、治療に有用な各組成物中の活性化合物の量は、化合物のあらゆる所与の単位用量中で、適切な投与量が得られるように調製されてもよい。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命、ならびにその他の薬理学的考察などの要素が、このような医薬製剤を調製する当業者によって検討され、したがって多様な投与量および治療計画が望ましくあってもよい。注射用途に適した医薬品形態としては、無菌水溶液または分散体、および無菌注射液または分散体を即時調合するための無菌粉末が挙げられる。分散体はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中で、そして油中で調製されてもよい。通常の保存および使用条件下では、これらの調製品は微生物の成長を妨げる保存料を含有する。多くの場合、形態は、無菌であり、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性を有する。その形態は製造条件および保存条件下で安定していなくてはならず、細菌や真菌などの微生物汚染作用から保護されていなくてはならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど、それらの適切な混合物、および/または植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合は必要な粒度の維持によって、そして界面活性剤の使用によって、適切な流動性を保ってもよい。微生物作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌性および抗真菌性作用物質によってもたらし得る。多くの場合、例えば糖類または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延作用物質組成物中で使用することで、もたらし得る。注射用水溶液を投与するために、例えば溶液は必要ならば適切に緩衝してもよく、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースによって等張にしてもよい。これらの特定の水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に適する。これに関連して、用い得る無菌水性培地は、当業者には既知である。例えば、1回投与量を1mlの等張NaCl溶液に溶解し、1000mlの皮下注入流体に添加してもよく、または提案される輸液部位に注入してもよい例えばRemingtonsPharmaceuticalSciences15thEditionpages10351038および15701580を参照されたい。投与量のいくらかの変動は、宿主の病状に応じて必然的に起きる。投与の役割を担う個人は、いずれにしても個々の宿主のための適切な用量を判定するであろう。無菌注射液は、必要に応じて本明細書に列挙されるその他の様々な成分と共に、必要量の活性rAAVを適切な溶媒に組み込み、それに続いて濾過滅菌することで調製される。一般に、分散体は、基礎的分散媒と、上に列挙したものからの必要なその他の成分とを含有する無菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を組み込むことで調製される。無菌注射液調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それによって、あらゆる追加的な所望成分が添加された活性成分の粉末が、あらかじめ無菌濾過されたその溶液からもたらされる。本明細書で開示されるrAAV組成物はまた、中性形態または塩形態で調合されてもよい。薬理的に許容可能な塩としては、タンパク質の遊離アミノ基で形成された酸付加塩、および例えば塩酸またはリン酸などの無機酸によって、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸によって形成されたものが挙げられる。遊離カルボン酸基で形成される塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基から、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも誘導し得る。ひとたび処方されると、溶液は、用量剤形に適合する様式で、および治療的有効量で投与される。製剤は、注射液、薬剤放出カプセルなどの多様な剤形で、容易に投与される。本明細書の用法では、キャリアは、あらゆる全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌性および抗真菌性作用物質、等張吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬理的活性物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当該技術分野で知られている。補給的活性成分もまた、組成物に組み込み得る。薬理的に許容可能と言う語句は、宿主に投与した際に、アレルギーまたは類似の有害反応を生じない、分子実体および組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、微小球、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルもまた、本発明の組成物を適切な宿主細胞に導入するために使用してもよい。特にrAAVベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノ球体、またはナノ粒子などの中でカプセル化して、送達のために調合されてもよい。このような製剤はまた、本明細書で開示される核酸またはrAAVコンストラクトの薬学的に許容できる製剤を導入する上で、好ましくあってもよい。リポソームの形成および使用は、当業者に一般に知られている。最近、血清安定性と循環半減期が改善されたリポソームが開発された米国特許第5,741,516号明細書。さらに潜在的薬剤キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製品の様々な方法について、記載されている;米国特許第5,567,434号明細書;米国特許第5,552,157号明細書;米国特許第5,565,213号明細書;米国特許第5,738,868号明細書、および米国特許第5,795,587号明細書。リポソームは、常態ではその他の手順による形質移入に抵抗性である、いくつかの細胞型で成功裏に使用されている。これに加えて、リポソームには、ウイルスベース送達系に典型的なDNA長さの制約がない。リポソームは、多様な培養細胞系および動物に、遺伝子、薬剤、放射線治療薬、ウイルス、転写因子、およびアロステリック効果剤を導入するのに、効果的に使用されている。これに加えて、リポソーム媒介薬物送達の有効性を調べる、いくつかの成功裏の臨床試験が完了している。リポソームは、水性媒体中に分散するリン脂質から形成され、自然発生的に多層同心性二重層小胞多重膜小胞MLVとも称されるを形成する。MLVは、一般に25nm~4μmの直径を有する。MLVの超音波処理は、コアに水溶液を含有する、直径が200~500Åの範囲内の小型単層小胞SUVの形成をもたらす。代案としては、rAAVのナノカプセル製剤を使用してもよい。ナノカプセルは、一般に、物質を安定かつ再現可能な様式で封入し得る。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、このような超微粒子サイズ約0.1μmは、生体内で分解可能なポリマーを使用してデザインされるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子の使用が検討される。上述の送達方法の他に、以下の技術もまた、rAAV組成物を宿主に送達する代替え方法として検討される。ソノフォレーシス例えば超音波が、薬剤の循環系への浸透と通過の速度および有効性を高める機器として使用されており、米国特許第5,656,016号明細書に記載される。検討されるその他の薬物送達代替案は、骨内注射米国特許第5,779,708号明細書、マイクロチップ機器米国特許第5,797,898号明細書、点眼剤Bourlaisetal1998、経皮マトリックス米国特許第5,770,219号明細書および米国特許第5,783,208号明細書、およびフィードバック制御送達米国特許第5,697,899号明細書である。キットおよび関連組成物本明細書に記載される作用物質は、いくつかの実施形態では、医薬または診断または研究キットに仕上げて、治療、診断または研究用途におけるそれらの使用を容易にしてもよい。キットは、本発明の構成要素と使用説明を収容する、1つまたは複数の容器を含んでもよい。具体的には、このようなキットは、本明細書に記載される1つまたは複数の作用物質を、これらの作用物質の意図される用途および適切な使用を記載する使用説明と共に含んでもよい。特定の実施形態では、キット中の作用物質は、作用物質の特定用途および投与方法に適した、製剤処方および剤形であってもよい。研究用キットは、様々な実験を実施するのに適した濃度または量で、構成要素を含有してもよい。キットは、本明細書に記載される方法を研究者が使用するのを容易にするようにデザインされてもよく、多数の形態を取り得る。キットの各組成物は、当てはまる場合、液体形態例えば溶液で提供されても、または固体形態例えば乾燥粉末で提供されてもよい。特定例では、組成物のいくつかは、例えば、キット中で提供されてもされなくてもよい、適切な溶媒またはその他の化学種例えば水または細胞培地の添加によって戻すことができ、または別のやり方で例えば活性形態に加工できる。本明細書の用法では、使用説明は、説明および/または広報宣伝の構成要素を定義し得て、典型的に、本発明の包装上の、またはそれに付随する、書面による使用説明を含む。使用説明はまた、例えば音響と映像例えばビデオテープ、DVDなど、インターネット、および/またはウェブベースのコミュニケーションなど、使用者が、使用説明がキットに付随することを明らかに認識するようなあらゆる様式で提供される、あらゆる口頭のまたは電子使用説明をも含み得る。書面による使用説明は、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する行政機関によって規定される形態であってもよく、その使用説明はまた、当局による、動物に投与するための製造、使用または販売の認可も反映し得る。キットは、1つまたは複数の容器内に、本明細書に記載される構成要素のいずれか1つまたは複数を含有してもよい。一例として、一実施形態では、キットは、キットの1つまたは複数の構成要素を混合するための、および/またはサンプルを単離し混合して対象に適用するための使用説明を含んでもよい。キットは、本明細書に記載される作用物質を収容する容器を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは分子検出システムの作用物質構成要素を収容する容器を含んでなる。作用物質は、液体、ゲルまたは固形粉末の形態であってもよい。作用物質を無菌的に調製して、シリンジ内に包装し、冷蔵輸送してもよい。代案としては、それはバイアルまたはその他の保存容器内に収容されてもよい。第2の容器は、無菌的に調製されたその他の作用物質を有してもよい。代案としては、キットは、予備混合された活性薬剤を含み、シリンジ、バイアル、チューブ、アンプルまたはその他の容器内で輸送されてもよい。特に特定の体細胞動物モデルを作成するためのキットの場合、キットは、シリンジ、局所適用機器、または点滴用針管材料およびバッグなど、動物に作用物質を投与するのに必要な構成要素の1つまたは複数または全てを有してもよい。例1:マイクロRNAスカベンジャーのrAAV媒介送達は、同族のマイクロRNAの効率的かつ安定したノックダウン、それらの天然標的遺伝子の上方制御、およびマウスの表現型の変化をもたらす成体マウス中における、miRNA拮抗薬miR-Antags送達のためのrAAVの使用を検討した。特定のmiRNAの効率的な体細胞阻害について、異なるデザインのベクター主鎖ss対sc、プロモーターPolII対PolIII、およびmiRNA拮抗薬Sponge、Zip、TuDなどを評価した。例えばbulged結合部位、多重縦列コピーspongeなどの異なるデザインのmiRNA拮抗薬阻害剤もまた、評価した。肝臓中でコレステロール生合成を調節することが報告されているMiR-122、および抗発がん性miRNAであるLet-7を阻害標的として使用した。高機能阻害剤を選択するために、化学発光miRNAセンサーを開発した図1参照。化学発光miRNAセンサーはポリメラーゼIIプロモーターを含有し、rAAVベクター中のレポーター遺伝子の発現を駆動した。レポーター遺伝子は、プロモーターのすぐ下流にイントロンを、ポリA尾部上流に一連のmiRNA結合部位spongeを有した。ポリメラーゼIIプロモーターおよびレポーター遺伝子は、逆方向末端反復配列で挟まれた。試験miRNA阻害剤の発現を駆動するU6プロモーターは、レポーター遺伝子のイントロン中に存在した。したがってmiRNAセンサーは、レポーター遺伝子の逐次抑制および抑制解除と、標的検証のための二重miRNA制御因子を含んでなる。miR-122toughdecoyRNAデザインの有効性を評価した。β-ガラクトシダーゼをコードして、miR122toughdecoyRNAを発現するmiRNAセンサーで、293細胞を感染させた。miR122decoysRNAを発現しない対照miRNAセンサーもまた、形質移入した。試験および対照miRNAセンサーは、それぞれ3つのmiR-122結合部位を有した。293細胞は、0ng、50ng、100ng、200ng、および400ngで形質移入した。標準技術を使用してLacZ染色を実施し、レポーター遺伝子の発現を評価した。対照miRNAセンサー中では、レポーター遺伝子発現の用量依存的阻害が観察された。しかし、miR122阻害剤を発現した試験miRNAセンサーは、全ての用量において、レポーター遺伝子発現阻害の顕著な減衰を示した。対照的に、β-ガラクトシダーゼをコードしてmiR122spongeRNAを発現するmiRNAセンサーで感染させた細胞は、対照miRNAセンサーと比較して、レポーター遺伝子発現を減衰させなかった。したがってTuDmiR122デザインは、spongeデザインよりも優れていた。細胞あたり約1.6×104個のmiR-122分子の定常状態レベルを発現したHuh-7細胞中で、同様の実験を実施した。Huh-7細胞中で、miRNA結合部位数の効果を評価した。試験および対照miRNAセンサーは、それぞれ1つまたは3つのmiR-122結合部位のどちらかを有した。TuDmiR-122RNA配列番号1は、Huh-7細胞中のLacZレポーター遺伝子の後にある1コピーのmiR-122結合部位に関係する下方制御を、完全にレスキューしたことが分かった。プロモーターPolIIおよびPolIIIとmiRNA阻害剤の異なる組み合わせもまた、評価した。ポリメラーゼIIIが駆動するTuDmiR-122阻害剤の発現は、293およびHuh-7細胞の双方において優れた結果を有する図2AおよびB。ホタルルシフェラーゼFlucレポーター遺伝子を有する同様のmiRNAセンサーを開発して、Huh-7細胞中で試験した。この場合も、TuDmiR-122RNAは、Huh-7細胞中のmiR-122結合部位によって媒介されるFlucの下方制御を、効率的にレスキューした。TuDmiR-122阻害剤遺伝子を持つrAAV血清型9型を感染させたマウス成体B6は、感染後7週目まで肝臓酵素レベルによる評価で、肝機能に対する悪影響を示さなかった。TuDmiR-122阻害剤遺伝子を持つrAAV血清型9型を感染させたマウス中では、感染の1ヶ月後に、スクランブル阻害剤を持つrAAV9を感染させた対照マウスと比較して、miR-122標的遺伝子の効果的な誘導が観察された。評価された標的遺伝子には、アルドラーゼA、サイクリンG1、Tmed3、およびHfe2が含まれる。rAAV9によって送達されるmiR-122阻害剤は、その細胞がmiR122を発現しないマウス心臓中では、これらの標的遺伝子に対する効果を有さなかった。C57BL/6マウスへのrAAVmiR-122-Antagの単回IV注射は、成熟miR-122図2Cレベルの80の低下と、miR-122標的遺伝子のmRNAレベルの3倍の増大を生じた。miR-122の阻害は、普通食を与えたマウスで、総血清コレステロール、HDL、およびLDLを50低下させた。TuDmiR-122阻害剤の配列および二次構造をそれぞれ図3Aおよび3Bに示す。同様の実験を実施して、Let-7のmiRNA阻害剤を評価した。7コピーまでのLet-7sponge配列Let-7結合部位によって媒介される、ルシフェラーゼ発現を抑制解除し得る、TuDlet-7阻害剤を同定した。Let-7の標的である、DicermRNAの発現における2倍の増大もまた観察された。同様にTuDlet-7もHeLa細胞中でDicerタンパク質レベルを誘発したが、Let-7spongeはしなかった。Dicer遺伝子発現誘導はまた、TuDlet-7阻害遺伝子を持つrAAV血清型9型を感染させたマウス肝臓および心臓中でも、肝機能への悪影響が観察されることなく感染後7週目まで観察された。rAAV-Let-7-Antagの投与は、pre-miRNAからmiRNAを生成する酵素であって常態ではLet-7によって抑制される、DicerのmRNAレベルを2倍に増大させた。この研究の結果は、rAAV-miR-Antagsが効率的かつ安定したmiRNAの体細胞阻害を媒介し、miRNA機能を研究する効率的なツールと、miR122の場合は異脂肪血症、およびmiRNA調節解除によって引き起こされる他の疾患の潜在的治療との双方を提供することを示す。例2:miR-122のrAAV媒介治療的サイレンシングは、DLDR-/-/Apobec1-/-マウス中でLDLに迅速かつ顕著な低下をもたらすFH遺伝子療法の代案として、マイクロRNAmiRNA調節を評価した。miRNAは、ほとんどの細胞プロセスを調節する上で重要な役割を果たす。肝臓中の最も豊富なmiRNAであるmiR-122は、未知の機序によってコレステロール代謝を調節し、直接LDLRmRNAを標的としない。最適化miRNA-122拮抗薬Antagを発現させることで、正常C57BL/6マウス中の効率的かつ安定したmiR-122拮抗作用について、組換えAAV9を調べた。rAAV9-miR-122Antag配列番号1の単回静脈内注射は、普通食を与えたオスマウス図4A、4B、および4C中で、成熟miR-122レベルを80低下させ、4つのmiR-122標的遺伝子を3倍に上方制御し、ならびに総血清コレステロール、HDL、およびLDLを50低下させた。アラニンアミノトランスフェラーゼALTおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAST遺伝子発現レベルで評価される肝機能に対する顕著な影響なしに、この阻害は感染後14週間にわたり観察された。ALTおよびASTは、肝臓細胞中に位置する酵素であり、肝細胞が損傷した際、全身循環中に漏出する。miR-122阻害剤の治療的可能性を評価するために、ヒトFHに最も比較できるマウスモデルである、成体オスおよびメスのLDLR-/-/Apobec1A-/-マウスに、普通固形飼料と共に同一ベクターを投与したPowellBraxtonLetalNatureMedicineVolume4Number8August1998。投与の1週間後、オスとメスの双方で、総血清コレステロールに20の低下が観察された。興味深いことに、オスにおける低下がHDL画分に限定されたのに対し、メスにおける低下はLDLに限定された。第2週目には、処理メス中の総コレステロールおよびLDLは、約30低下したが、HDLレベルは変化がないままであった。図5A、5B、および5C参照。オス中の総コレステロールの低下は20のままであり、1週目のマウスと比較して、HDLの50増大およびLDLの13低下が反映された。miR-122阻害で観察された性別特異的相違は、先に報告されたメスマウスにおけるrAAV媒介肝臓形質導入の低い効率の反映であってもよく、FHを治療するためのmiR-122のrAAV媒介治療的阻害のために、用量が最適化されてもよいことが示唆されるDavidoffAMetalBlood2003102480488。この研究結果は、rAAVが効率的かつ安定した体細胞miRNA阻害を達成し得ることを示し、miRNA調節解除によって引き起こされる、異脂肪血症およびその他の疾患の治療法の原理を提供する。例3:高脂血症を治療するためのAAVベクター媒介生体内miRNA拮抗作用miRNA遺伝子の遺伝子破壊は、miRNA機能を研究する強力なストラテジーに相当するが、多くのmiRNA遺伝子は同一シード配列、すなわちその標的レパートリーを確定する6~8ntのmiRNA領域を共有し、したがってmiRNAファミリーの1メンバーが、他のメンバーの損失を代償し得る。miRNAファミリーの全メンバーが消去された動物モデルの作成は、困難である。さらにヒトとマウスは276を超えるmiRNAを共有し、成体マウスで、各保存miRNAの機能と、疾患への寄与を評価するには、数百の条件付きノックアウト系統が必要である。成熟miRNAに相補的な化学修飾抗miRNAオリゴヌクレオチドAMOは、生体外および生体内miRNA阻害のための一般的に利用可能なツールである3~9。効果的なAMOでは、典型的に2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル、または2’,4’-メチレンロックド核酸;LNAなどの高価なまたは独自仕様の化学修飾が用いられ、現行の化学および製剤は、多数の組織または臓器に、AMOを安全かつ有効に送達できない。さらにAMOによるmiRNA阻害では、同族のmiRNAの発現を抑制するために、反復投与が必要である3,7~11。AMOの代案として、miRNA機能を競合的に阻害するようにデザインされ、RNAポリメラーゼIIプロモーターから発現される、複数タンデムmiRNA結合部位であるmiRNAspongeを発現する、プラスミドDNAベクターを使用して、培養細胞中12およびハエの生体内13で、miRNA機能が研究されている。生体外で造血幹細胞を安定して修飾するための、sponge発現レンチウイルスベクターを使用した造血細胞中のmiR-223の枯渇と、それに続くマウス中の骨髄再建からは、遺伝子miRNAノックアウトで観察されたのと同様の表現型が生じた14。しかし、挿入変異誘発のリスクと生体外操作の必要条件によって、機能性ゲノムの研究および治療用途のための、レンチウイルスベクターベースのmiRNA阻害の使用が制限されることもある。より最近では、そのどちらも培養細胞および生体内におけるmiRNAの安定した恒久的阻害を可能にする、ToughDecoyTuDRNAおよびmiRZipsをはじめとする、コンパクトなRNAポリメラーゼIII駆動性miRNAdecoyが報告されている16。それでもなお、成体哺乳類中でmiRNA標的相互作用を研究するために、miRNAを安定して効率的に拮抗する方法は、未だに開発されていない。4.7kbの一本鎖DNAパルボウイルスアデノ随伴ウイルス17AAVは、ヒトをはじめとする霊長類にまん延する非病原性常在ウイルスである18,19。過去10年間に、新しい組換えAAVrAAVベクターが天然AAV血清型から作り出されており、マウスおよび非ヒト霊長類中の多様な組織を標的とする、効率的な遺伝子移入ビヒクルが提供されている20~23。ここでは、肝臓中の高度に豊富なmiRNAであるmiR-12224と、がんおよび発育における機能を有するmiRNAであるlet-725とを阻害するための、マウス中におけるrAAVベクターの使用を報告する。異なるプロモーターRNAポリメラーゼII対RNAポリメラーゼIIIおよびmiRNA拮抗薬のデザインsponge、TuD、およびmiRZipが培養細胞中で評価され、RNAポリメラーゼIII駆動性TuDが最も強力なmiRNA拮抗薬として同定された。抗miR-122および抗let-7TuDRNAを発現するようにrAAV9ベクターを遺伝子改変して使用し、生体内で効率的かつ持続性の標的特異性miR-122またはlet-7阻害を達成した。各miRNA阻害剤は、成体マウス中で、対応するmiRNA標的遺伝子の発現を増大した。処理マウスからの肝臓miRNAのハイスループット配列決定によって、標的miRNAは枯渇したが、他のmiRNAは枯渇しなかったことを確認した。さらに生体内miRNA枯渇は、非鋳型ヌクレオチドの3’付加、ならびに3’から5’へのmiRNAの短縮を伴い、これは先にキイロショウジョウバエDrosophilamelanogaster生体内で、および生体外形質転換培養ヒト細胞中で観察された分解経路である33。重要なことに、抗miR-122発現rAAV9で処理した野生型C57BL/6マウスと低密度リポタンパクLDL受容体欠乏症マウスの双方で、血清コレステロールプロフィール中で持続性の表現型変化が観察されたが、抗let-7TuDRNAでは変化が観察されなかった。本明細書で提供されるデータは、rAAV-発現TuDRNAが、miRNA発現によって引き起こされる、高コレステロール血症およびその他の障害のための、安定した治療法を可能にし得ることを示唆する。培養細胞中の転写されたmiRNA拮抗薬の評価異なる転写されたmiRNA拮抗薬を試験するために、肝臓中でコレステロール生合成を調節する高度に豊富なmiRNAであるmiR-122、および抗発がん性miRNAであるlet-7を阻害標的として選択した。miRNAsponge、TuDRNA図6、およびmiRZips12,15をはじめとする、一連のmiR-122およびlet-7拮抗薬をデザインしたwww.systembio.com/microrna-research/microrna-knockdown/mirzip/表2。RNAポリメラーゼIIサル空胞化ウイルスSV40プロモーター、または肝臓特異的ヒト甲状腺ホルモン結合グロブリンTBGプロモーター、または代案としてはRNAポリメラーゼIIIU6プロモーターを使用して、miRNAspongeを発現させ;U6プロモーターは、TuDおよびmiRZipの発現を駆動するために使用した図7aおよびb。各miRNA拮抗薬の効率を評価するために、発現コンストラクトが、3’非翻訳領域UTR内に1または3コピーの完全相補的miR-122結合部位を含有する核標的大腸菌E.coliβ-ガラクトシダーゼnLacZレポーターmRNAを抑制解除する能力を試験した。様々なmiR-122阻害剤コンストラクトまたは対照プラスミドと共に、nLacZレポータープラスミドを細胞あたり約16,000個のmiR-122分子を発現するヒト肝細胞腫細胞系27であるHuH-7細胞27に、同時形質移入した。予期されたように、nLacZ3’UTR中に1つのmiR-122結合部位が存在する場合、レポーター発現は約50低下し、3つの部位が存在する場合は>80低下した図7c。RNAポリメラーゼII駆動性抗miR-122spongeの中で、強力肝臓特異的プロモーターであるTBGプロモーターだけが、単一miR-122結合部位を保有するnLacZの発現を検出可能に増大させ、spongeがmiR-122を部分的に阻害したことが示された。しかし、レポーターが3つのmiR-122結合部位を含有する場合、nLacZ発現はこのspongeによって顕著に増大せず図7c、3つのmiRNA標的部位によって与えられるより大きな抑制を克服するには、miR-122の活性または濃度の変化が小さすぎることが示唆された。対照的に、1および3部位レポーターのどちらも、RNAポリメラーゼIII駆動性抗miR-122TuDRNAによって抑制解除された。1部位レポーターでは、TuDは、レポーター中にmiR-12標的部位が存在しない場合に観察された発現に、nLacZ発現を復元する図7c。TuDRNAのより大きな有効性は、RNAポリメラーゼIIと比較して、RNAポリメラーゼIIIによって可能なより高い転写レベル、TuDデザインによるより大きなmiRNA阻害、またはその双方を反映してもよい。これらの可能性を識別するために、3つの異なるU6駆動性miR-122拮抗薬コンストラクトであるsponge、TuD、およびmiRZipが、3つのmiR-122結合部位を含有するnLacZレポーターを抑制解除する能力を比較した。この場合もまた、TuDだけが、HuH-7細胞中のmiR-122によるnLacZ抑制を顕著にp値≦0.001抑制解除した図7d。抗miR-122TuD発現コンストラクトはまた、ヒト胚性腎臓HEK293細胞中でも同様に有効であった。HEK293細胞はmiR-122をほとんど発現しないので、pri-miR-122は、3つのmiR-122結合部位があるまたはないnLacZレポーター、およびTuD発現プラスミドで同時形質移入されたプラスミドから発現させた。nLacZ発現を48時間後に評点した。抗miR-122TuDは、miR-122発現プラスミドの存在下でレポーター発現を顕著に抑制解除したが、抗let-7TuDまたは抗miR-122または抗let-7spongeは、抑制解除しなかった図7e。それらの標的と高い相補性を持つmiRNAがArgonaute2タンパク質を誘導してmRNAを切断したのに対し、より低い相補性は一般にmRNA安定性を低下させた。TuDRNAが、その標的と不完全に相補的なmiRNAによって誘導される抑制もまた阻害し得るかどうかを試験するために、その3’UTRに7コピーのbulgedmiR-122結合部位があるホタルルシフェラーゼFlucレポーターmRNAをデザインした;7つの突然変異部位があるFlucが、対照の役割を果たした。形質移入によって、miR-122応答性Flucレポーター、抗miR-122、抗let-7または対照TuDプラスミド、そして内部対照としてウミシイタケRenillareniformisルシフェラーゼRluc発現プラスミドをHuH-7細胞に導入した。抗miR-122TuDは、Fluc発現を完全に抑制解除したが、対照または抗let-7TuDは抑制解除しなかった図7f。TuDRNAは、強力な特異的miRNA阻害剤であると結論される。最終的に、抗let-7TuDはDicermRNAおよびタンパク質の双方の発現を増大させた;dicerは内在性let-7標的である28,29図8a、8b、および図9。総合して、生体外データは、U6プロモーターから転写されたTuDRNAが、調査したmiRNA拮抗薬中で最強であることを示唆する。生きている動物中の特異的内在性miRNA活性のリアルタイムモニタリング生体内でmiRNA機能を阻害するTuDRNAの能力を試験するために、miRNA応答性GaussiaルシフェラーゼGluc30mRNAを発現する一連のrAAVベクターゲノムを構築した図10a。Glucは、生きている動物の血液または尿中のレポーターの検出を可能にする、分泌タンパク質である。7つのbulgedmiR-122またはlet-7標的部位をGlucmRNAの3’UTRに挿入して、それをmiRNA応答性にした。Gluc転写ユニットのイントロン内に、抗miR-122または抗let-7TuDRNAどちらかのためのU6プロモーター駆動性発現カセットを挿入した。7つのmiRNA結合部位またはTuD発現カセットの片方または双方を欠くレポーターが、対照の役割を果たした。miR-122は肝臓中の全miRNAの70を構成し27、最も豊富なmiRNA種であってもその機能を阻害するTuDRNAの能力のためのストリンジェントな試験となる。生体外では、HuH-7細胞および抗miR-122中で、TuDRNAは7つのmiR-122結合部位を保有するGlucレポーターを抑制解除したが、抗let-7中ではしなかった図10b。同様にHeLa細胞中では、抗let-7TuDRNAは、7つのlet-7結合部位を保有するGlucレポーターを抑制解除した図10c。miR-122およびlet-7はどちらも肝臓27中に存在し、let-7は心臓31中にもまた見られる。rAAVゲノムは、肝臓および心臓に優先的に形質導入するAAV9カプシドによって、パッケージされる。形質導入をさらに改善するために、全てのrAAVを自己相補的scゲノムとして調製した32。ベクターを成体オスC57B/6マウスに静脈内投与して、Gluc活性を血液中でモニターした。最初に、Gluc活性は、TuDRNA発現カセットの存在に関わりなく、miR-122調節レポーターを発現するベクターを注射した動物中で同等であった3および7日目。2週目には、抗miR-122TuDを欠くベクターを投与したマウス中でGluc活性が低下したのに対し、抗miR-122TuD発現ベクターで処理されたマウス中ではGluc活性は増大した図10d。同様に、let-7調節レポーターを投与したマウス中でGluc活性は低く、抗let-7TuD発現カセットを含有する同一レポーターを投与したマウス中では高かった。miR-122調節Glucレポーターとlet-7調節Glucレポーター間の1つの顕著な差は、let-7調節レポーターが最も早い時点3日目でサイレンシングされたのに対し、miR-122調節レポーターはサイレンシングを達成する上で初期遅延を示したことであった図10、e。抗miR-122または抗let-7TuDRNAのどちらかによるGluc発現の抑制解除は、18週間の研究期間にわたり持続した図10d、e。マウス肝臓中のscAAV9送達TuDRNA媒介特異的miRNAの枯渇scAAV9ベクター投与の4週間後、定量的RT-PCR使用して、肝臓中でmiRNA発現を分析した。抗miR-122TuD発現ベクターを投与したマウス中では、抗let-7TuD発現ベクターまたはTuDを欠く対照ベクターと比較して、miR-122の約80の低下が観察された図11a。ノーザンブロット分析によって、抗miR-122TuDを投与したマウス中のmiR-122の低下を確認した図11bおよび図12。let-7は、抗let-7TuD発現scAAV9ベクターで処理したマウス中で同様に低下した用いられたlet-7Northernプローブは、8つのマウスlet-7アイソフォームを識別し得ない。対照的に、他の2つの豊富な肝臓miRNAであるmiR-26aまたはmiR-22では、低下は検出されなかった図11bおよび図12。処理肝臓からのmiRNAのハイスループット配列決定は、scAAV9送達TuDRNAが、効果的かつ特異的に相補的miRNAの破壊を引き起こすという見解をさらに指示する。miR-122図7bを標的にするTuDは、完全長23ntmiR-122の存在量を4.3倍図11c低下させ、qRT-PCRの結果図11aと一致する。21および22ntのmiR-122アイソフォームの低下がより少なかったのに対し、20および19ntのアイソフォームは増大し、miR-122のTuD誘発性3’-5’ヌクレオチド末端加水分解トリミングが示唆される図11c。拮抗mirが誘導するヒト細胞培養物中のmiRNA破壊33と同様に、抗miR-122TuDは、miR-122の3’末端への非鋳型ヌクレオチドの付加を促進する図11d。最初はマウスゲノムに一致するが、次に非鋳型ヌクレオチドに終わる接頭辞マッチング読み取り配列は、抗miR-122TuDを発現するマウス中で、対照と比較して倍になる図11d。3’非鋳型ヌクレオチドは、1つまたは複数のアデノシンを含んでなる。TuD不在下であってさえも、miR-122の30はアデノシンでテーリングされ、おそらくはその自然の代謝回転の一部として、miR-122が転写後修飾を被ることが示唆される。マウス肝臓は、全て8つのlet-7アイソフォームを発現する図13。これらのアイソフォームは、それらの共通シード配列の外側の1~4ヌクレオチドが異なる図11e。抗let-7TuDは、TuD配列と完全に相補的な完全長let-7アイソフォームの存在量let-7a、12.1倍、またはTuDに対して単一非シードミスマッチのみを含有するlet-7アイソフォームの存在量を強力に低下させるlet-7c、5.1倍;let-7d、5.0倍;およびlet-7f、11.0倍。対照的に、TuDに対して2つの3’ミスマッチを含有するlet-7b1.6倍およびlet-7g2.7倍、TuDに対して3つの3’ミスマッチを含有するlet-7i1.5倍、およびTuDに対してプリン:プリンミスマッチをシード配列のすぐ側面にある9位に含有するlet-7e3.6倍では、低下はより小さかった図11e、11f。接頭辞マッチング読み取りは、抗let-7TuDに応えて最も低下したlet-7アイソフォームであるlet-7a、c、d、およびfでさらに増大したのに対し、減少が最も小さかったlet-7b、e、g、およびiは、このようなトリムアンドテイルtrimmed-and-tailed種では増大を示さなかった図11g。これらの知見は、抗let-7TuD誘導miRNAdecayが、TuD-RNAとmiRNAの間に、ほぼ完璧な相補性を要求することを示す。抗miR-122および抗let-7TuDのどちらでも、他のmiRNAの全体的存在量に変化はなかった図14。scAAV9が送達する抗miRNATuDRNAは、内在性miRNA調節mRNAの発現を特に増大させるscAAV9を使用して送達された場合、抗miRNATuDRNAもまた、dmiR-122調節内在性mRNAおよびlet-7調節内在性mRNAを抑制解除する図15。qRT-PCRを使用して、TuD-発現scAAV9ベクター注射の4週間後、肝臓および心臓における、検証されたmiR-122およびlet-7標的の発現を分析する。Glucレポーターを発現するscAAV9を注射したが、TuDRNAは注射しなかったマウスが対照の役割を果たした。抗miR-122TuDRNAを発現するベクターで処理したマウスでは、先にmiR-122によって調節されることが示された4つの遺伝子である、アルドラーゼA3.3±0.5;p値≦0.04、Tmed34.2±1.5;p値≦0.01、Hfe23.3±1.0;p値≦0.02、およびサイクリンG12.5±0.4;p値≦0.001mRNA7,34の2.5~3.5倍の増大が肝臓中で検出され;これら4つのmRNAの発現は、miR-122を欠く心臓中では変化しなかった図15。抗let-7TuDRNAを発現するベクターを投与したマウスからの肝臓または心臓のどちらでも、4つのmiR-122調節mRNAの発現に、統計的に有意な変化は見られなかった図15。miRNA-生成酵素Dicer29それ自体は、let-7ファミリーmiRNAによって抑制される。qRT-PCRを使用して、抗miR-122または抗let-7TuDRNAのどちらかを発現するscAAV9ベクターを投与したマウス中のDicermRNAの存在量を測定した図15。let-7が阻害された場合、DicermRNAは肝臓1.9±0.2;p値≦0.001および心臓2.4±0.4;p値≦0.003の双方で増大する。RASファミリー遺伝子、HRAS、NRAS、およびKRASもまた、let-7miRNAによって抑制されることが報告されている35~37。抗let-7発現scAAV9を投与したが、抗miR-122TuDRNAは投与しなかったマウスでは、対照と比較して、Nrasの発現増大は、肝臓1.3±0.1;p値≦0.01および心臓1.3±0.1;p値≦0.02の双方で観察され、Hras11.3±0.1;p値≦0.04の発現増大は、心臓中で観察された図15。抗miR-122TuDRNAはコレステロールレベルを低下させるmiR-122は、正常なコレステロール生合成のために必要である;AMOによるmiR-122の阻害は、成体マウス7,9,11および非ヒト霊長類8,10において、コレステロール代謝を低下させる。野生型マウスでは、抗miR-122RNAを発現するscAAV9の単回静脈内注射が、注射後2週目に始まって、総血清コレステロール45±5;p値≦0.001および高密度リポタンパクHDL、42±5;p値≦0.001レベルを顕著に低下させ、この低下は18週間の研究継続期間にわたって持続した。第3週目にはLDLレベルもまた低下し88±102;p値≦0.05、研究継続期間にわたって持続した。図16a。抗let-7TuDを投与したマウス中では、総血清コレステロール、HDL、およびLDLのレベルは変化しなかった。研究全体を通じて、マウスの体重および肝機能は正常であった:体重減少図17、または血清アラニンアミノトランスフェラーゼALTまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼASTレベルの統計的に有意な増大は、検出されなかった図16b。高コレステロールは、米国における最も一般的な死因および病因である心血管疾患の大きな危険因子である。LDL受容体LDLR遺伝子の突然変異は、一般的遺伝性異脂肪血症、家族性高コレステロール血症38を引き起こす。rAAVが媒介するLDL受容体の置換は、この遺伝障害の処置の有望なアプローチに相当するが、治療遺伝子産物に対する宿主の免疫によって制限されることもある39,40。持続性のmiR-122阻害剤は、家族性高コレステロール血症の代案の治療法を提供し得る。ヒト疾患のマウスモデルを使用して、家族性高コレステロール血症の可能な処置として、scAAV9が送達する抗miR-122TuDRNAを評価した:LDLR-/-、Apobec1A-/-二重変異体マウスは、正常な普通固形飼料を与えられた41。抗miR-122TuDRNAを発現するscAAV9の単回静脈内投与の1ヶ月後、スクランブルTuD対照を投与したマウスと比較して、メスマウスでは、総血清コレステロールが34±3p値≦0.0006低下し、血清HDLが18±2p値≦0.02低下し、家族性高コレステロール血症の治療標的である血清LDLは、53±6p値≦0.006低下した図16c。オスマウスでは、総コレステロールの21±1p値≦0.05の低下、HDLの26±2p値≦0.004の低下、およびLDL20±1p値≦0.02の低下が測定された図16c。LDLR-/-、Apobec1A-/-マウス中のコレステロール低下において観察された性差は、さらなる研究を正当化する。考察哺乳類miRNAは多数あるので、それらの生物学的機能を同定することは難題である。miRNA機能の阻害剤は、特に成体哺乳類におけるmiRNAの生物学の理解を加速させる見込みがある。miRNAを阻害するストラテジーとしては、相補的化学修飾オリゴヌクレオチドおよび転写miRNA結合性競合RNAが挙げられる。効果的なmiRNA阻害剤である化学修飾オリゴヌクレオチドは、目下高価である一方、いくつかの修飾は商業的に利用できず、また長期毒性の危険がある反復投与を要する。さらに多数の組織は、目下オリゴヌクレオチド送達のためにアクセスできない。転写miRNA結合性RNAは、オリゴヌクレオチドの代替物を提供する。それらの転写物の小さなサイズは、それらを多様な遺伝子移入ベクター内に容易に組み込めるようにする。霊長類AAV由来ベクターは、それらのユニークな組織向性、高い形質導入効率、生体内遺伝子移入の安定性、および低毒性のために、本出願の魅力的なツールに相当する22,42。最近、miRNA拮抗薬のいくつかのデザイン、すなわちsponge、TuDRNA、およびmiRZipが開発され、生体外においてレンチウイルスベクター内で12,15、そして生体内において遺伝子ノックアウト動物モデルで13,14,16試験されている。これらのmiRNA拮抗薬を生体外で比較し、最も有効なデザインであるTuDRNAを生体内で使用して、TuD発現カセットをscAVV9に組み込むことで、miR-122およびlet-7を阻害した。本明細書で提供されるデータは、TuDRNAを発現するrAAV9の単回投与が、標的miRNAレベルの安定かつ効率的な低下を提供し図11、その内在性標的mRNAの発現増大をもたらして図8および15、代謝における表現型の変化に相当することを実証する図16。本明細書で提供されるハイスループット配列決定データは、最近遺伝子改変33および内在性mRNA43についてハエで、そして合成オリゴヌクレオチドantagomirsについて培養ヒトHeLa細胞33中で記載されたのと同じ、標的RNA誘発テーリングおよびトリミング経路を通じて、マウス中で、TuDRNAが、それらのmiRNA標的を阻害することを示唆する図11。生きている哺乳類中における、標的RNAが誘導するmiRNAテーリング、トリミング、および破壊の初めての観察である、本明細書で提示されるデータは、この経路が動物で広く保存されていることもあり得ることを示唆する。今まで、生きている成体哺乳類中でmiRNA機能をモニターする方法は、記述されていなかった。本明細書に記載される生体内Glucセンサーシステムは、miRNA阻害剤によって引き起こされるものなどの特定miRNA機能の変化を検出する、単純な手段を提供する図10。このシステムは、生体外細胞系中で、または生体内組織または臓器中で、特定miRNAの活性を評価できるようにし、経時的に生きている動物中におけるmiRNA拮抗薬の有効性の定量的尺度を提供する。遡及的プロファイリングは、異常なmiRNA発現を多様な疾患と関連づけ、miRNAが治療法のための新たな標的を提供してもよいことを示唆した44~48。実際、AMO7~11またはscAAVが送達するTuDRNAによるmiR-122阻害図16は、HDLおよびLDLの双方を低下させる。しかし、HDLが心臓麻痺を防ぐという現在の見解49は、異脂肪血症の治療法はLDL低下させ、HDLレベルを上昇させることであると主張する。最近、miR-33はHDLバイオジェネシスのリプレッサーとして同定された;miR-33阻害は、血清HDLレベルを上昇させる16。おそらくは、単一scAAVベクターから発現される1対のTuDRNAによるmiR-122とmiR-33の同時阻害が、より均衡のとれた健康的なコレステロールプロフィールを達成して、家族性高コレステロール血症に対する長期治療法を提供してもよい。直接的因果関係は確立されていないものの51,52、低いmiR-122レベルは、齧歯類およびヒトにおける肝細胞がんと関連づけされている50~52。AAVベクターの発現は、齧歯類および霊長類モデル中で多年にわたり安定しているので、抗miR-122を発現するscAAV9で処理された動物は、特に肝細胞がんを発症する一般的リスクおよびリスク増加における、長期miR-122阻害の安全性試験を可能にするであろう。材料と方法miRNA拮抗薬およびセンサープラスミドの構築pRNA-U6.1/Neo-siFluc中のsiFluc断片GenScript,Piscataway,NJを先に記載されたhttpwwwsystembiocommicrornaresearchmicrornaknockdownmirzipようにデザインされた12,15、TuDmiR-122、TuDlet-7、miR-122Zip、let-7Zip、miR-122spongeおよびlet-7spongeで置換して、異なるmiRNA拮抗薬の発現のためのU6駆動性発現カセットを作成した。let-7拮抗薬のデザインは、全てのlet-7ファミリーメンバーの共通配列に基づいた。オリゴヌクレオチド対、XbaI-ApaIリンカーF、およびXbaI-ApaIリンカーR表2をアニーリングしてXbaI-ApaIリンカーを作成し、pGL3-対照プラスミド中のFluc遺伝子後のApaI部位へのクローニングが、それに続いた。XbaIおよびApaI部位に挟まれた化学合成miR-122またはlet-7sponge配列を消化して、pGL3-XbaI-ApaIリンカープラスミド中にクローンし、SV40プロモーター駆動性sponge発現カセットを作り出した。次に、pGL3miR-122spongeまたはpGL3let-7spongeから、NcoIおよびApaI二重消化によって、Fluc遺伝子とmiR-122またはlet-7spongeとを含有する断片を単離して、pAAVCBPIベクタープラスミドのKpnI部位、またはpAAVTBGPIベクタープラスミドのPstIおよびMluI部位の間にクローンして、それぞれCBプロモーターおよびTBGプロモーター駆動性sponge発現ベクターを作成した。miRBase中のアノテートされたmiRNA配列53に基づいて、完璧に相補的なmiRNA標的部位の1または3コピーをデザインし、合成オリゴヌクレオチドを使用して、遍在的に発現したpAAVCB核標的β-ガラクトシダーゼnLacZプラスミドのnLacZ発現カセットの3’UTR中のBstBI制限部位に挿入した表2。miR-122を発現するために、特定オリゴヌクレオチドがあるマウスゲノムDNAから、pri-miR-122断片をPCRによって増幅し表2、pAAVCBFlucプラスミド中のホタルルシフェラーゼcDNA直後のXbaI制限部位にクローンした。pri-miR-122の同一性を配列決定によって確認した。この研究で使用したscAAV9ベクターは、前述18のようにして、作成、精製、および力価測定した。AAVベクターを作り出すために、miR-122またはlet-7のための7コピーのbulged標的部位を合成し、pscAAVCBPIGlucプラスミド中のGlucレポーター遺伝子後のBclI部位にクローンした。pRNA-U6.1/Neo-TuDmiR-122またはpRNA-U6.1/Neo-TuDlet-7プラスミドから、U6-TuDmiR-122またはU6-TuDlet-7発現カセットを持つEcoRIおよびHindIII断片を単離し、miR-122またはlet-7のためのbulged標的部位があるまたはないpscAAVCBPIGlucのイントロン領域中のPpuMI部位にクローンした。細胞培養10FBSおよび100mg/Lのペニシリン-ストレプトマイシンHyClone,SouthLogan,UTを添加した、ダルベッコ改変イーグル培地中で、HEK293、HuH-7、およびHeLa細胞を培養した。細胞は、37°Cで5CO2の加湿インキュベーター内で維持した。リポフェクトアミン2000Invitrogen,Carlsbad,CAを使用して、製造会社の使用説明に従って、プラスミドを細胞中に一過性に形質移入した。ルシフェラーゼレポーターアッセイ細胞を受動的溶解緩衝液Dual-GloLuciferaseAssaySystem,Promega,Madison,WIで溶解し、10μlの溶解物をアッセイのために使用した。Dual-GloLuciferaseAssaySystemPromega,Madison,WIを使用して、製造会社の使用説明に従って、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を評価した。以前記載された手順30に従って、ガウシアルシフェラーゼGlucアッセイを実施した。簡単に述べると、生体外Glucアッセイのために、示される形質移入からの各10μlの培養液を使用した。生体内でGluc発現をモニターするために、AAV9ベクター処理後の異なる時点で、5.5mm動物用ランセットMEDIpoint,Mineola,NJによって作成した顔面静脈の浅い切り込みから、研究動物を出血させた。Glucアッセイのために、各5μlの血液サンプルを使用した。マウスInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeoftheUniversityofMassachusettsMedicalSchoolのガイドラインに準じて、C57BL/6マウスCharlesRiverLaboratoriesおよびLDLR-/-/Apobec1A-/-マウスDr.JamesWilson,UniversityofPennsylvaniaを維持し、研究で使用した。尾静脈注射によって、1×1012個のゲノムコピー/マウスまたは5×1013個のゲノムコピー/kgのAAVベクターで、4~6週齢の野性型C57BL/6オスマウスを処理した。scAAV9TuDmiR122の治療能力を評価するために、尾静脈注射によって、用量3×1011個のゲノムコピー/マウスまたは1.5×1013個のゲノムコピー/kgのTuD-miR-122またはスクランブルベクターで、4~6週齢のLDLR-/-/Apobec1A-/-マウスを処理した。研究動物の脂質プロフィールをモニターするために、AAV9ベクター注射後の異なる時点で血清サンプルを収集し、COBASC111分析器RocheDiagnostics,Lewes,UK上で、総コレステロール、HDL、およびLDLについて分析した。RNA分析のためには、処理の4週間後に動物を解剖した;肝臓および心臓組織をRNA調製のために採取した。qRT-PCR分析RNAは、TrizolInvitrogenCarlsbad,CAを使用して、製造会社の使用説明に従って抽出した。全RNA0.5~1μgをランダムヘキサマーでプライムし、MultiScribe逆転写酵素AppliedBiosystems,FosterCity,CAで逆転写した。StepOnePlusReal-timePCR装置AppliedBiosystems,FosterCity,CA内で、GoTaqqPCRmastermixPromega,Madison,WIを使用して、0.3μMの遺伝子特異的プライマー対を用いて、定量的PCR反応を三連で実施した表2。TaqManmicroRNAAssayAppliedBiosystems,FosterCity,CAを使用して、成熟miR-122およびU6の発現をアッセイした。ノーザンブロット分析全肝臓RNA中のmiR-122、miR-26a、miR-22、およびlet-7を検出するために、10μgの全RNAを変性15ポリアクリルアミドゲルによって分離し、HybondNmembraneAmershamBioSciences,Pittsburgh,PAに転写して、254nm光Stratagene,LaJolla,CAで架橋した。T4ポリヌクレオチドキナーゼNEB,Beverly,MAを使用して、γ-32PATPで5’末端標識した合成DNAオリゴヌクレオチド表2をmiR-122、miR-26a、miR-22およびlet-7およびU6表2のためのプローブとして使用し、Church緩衝液0.5MNaHPO4、pH7.2、1mMEDTA、7[w/v]SDS中で37°Cでハイブリダイズした。1×SSC、0.1w/vSDS緩衝液を使用してメンブランを洗浄し、次にFLA-5100Imager日本国東京の富士フイルムを使用して視覚化した。小型RNA配列決定記載されたようにして33、小型RNAライブラリーを構築し配列決定した。簡単に述べると、mirVanaキットAmbionFosterCity,CAによって50μgの全RNAを単離し、19~29ntの小型RNAを分離して、15ポリアクリルアミド/尿素ゲルSequaGel,NationalDiagnostics,Atlanta,GAを使用して、ゲル電気泳動により単離した。トランケート型T4RNAリガーゼ2NEB,Beverly,MAを使用して、IDTmiRNAクローニングリンカー1を小型RNAの3’にライゲートし、ゲル精製した;T4RNAリガーゼNEB,Beverly,MAによって、5’RNAアダプターを3’ライゲートRNAにライゲートした。ライゲーション生成物を小型RNARTプライマーによる逆転写のための鋳型として使用した。小型RNAPCRプライマー1およびRNAPCRプライマー2で、cDNAを増幅した。PCR産物をゲル精製して、ハイスループット配列決定にかけた。配列決定統計については、表3および4を参照されたい。小型RNA分析は、先に記載されたようにして33実施した。配列データはNCBIShortReadArchivewwwncbinlmnihgovsitessraを通じて、GSE25971として入手できる。ウエスタンブロット分析プロテアーゼ阻害剤混合物を含有するRIPA緩衝液25mMTris-HCl、pH7.6、150mMNaCl、1NP40[v/v]、1デオキシコール酸ナトリウム[w/v]、0.1SDS[w/v]BostonBPで、タンパク質を抽出した。ブラッドフォード法を使用して、タンパク質濃度を測定した。各50μgのタンパク質サンプルを10ポリアクリルアミドゲルに載せて電気泳動し、ニトロセルロースメンブランAmershamBioSciences,に転写した。LI-COR赤外線撮像システムを使用して、免疫ブロット法を実施した。簡単に述べると、メンブランをブロック緩衝液LI-CORで室温で2時間ブロックし、それに続いて抗GAPDHMillipore、抗DicerSantaCruzのどちらかと共に、室温で2時間インキュベーションした。0.1Tween-20v/v添加PBSによる3回の洗浄後、LI-CORIRDyeに対する二次抗体コンジュゲートを使用して、メンブランを室温で1時間インキュベートした。シグナルは、OdysseyImagerLICORを使用して検出した。統計学的分析全ての結果は平均±標準偏差として提示され、マンホイットニー検定を使用してp値が計算された図16c以外は、両側スチューデントのt試験を使用して、実験群間で比較される。参考文献1.LewisBPBurgeCBBartelDPConservedseedpairingoftenflankedbyadenosinesindicatesthatthousandsofhumangenesaremicroRNAtargetsCell12015202.LewisBPShihIHJonesRhoadesMWBartelDPBurgeCBPredictionofmammalianmicroRNAtargetsCell115787983.FabaniMMGaitMJmiR122targetingwithLNA2’OmethyloligonucleotidemixmerspeptidenucleicacidsandPNApeptideconjugatesRNA14336464.HutvagnerGSimardMJMelloCCZamorePDSequencespecificinhibitionofsmallRNAfunctionPLoSBiol2E985.HorwichMDZamorePDDesignanddeliveryofantisenseoligonucleotidestoblockmicroRNAfunctioninculturedDrosophilaandhumancellsNatProtoc31537496.MeisterGLandthalerMDorsettYTuschlTSequencespecificinhibitionofmicroRNAandsiRNAinducedRNAsilencingRNA10544507.KrutzfeldtJetalSilencingofmicroRNAsinvivowith’antagomirs’Nature43868598.ElmenJetalLNAmediatedmicroRNAsilencinginnonhumanprimatesNature45289699.ElmenJetalAntagonismofmicroRNA122inmicebysystemicallyadministeredLNAantimiRleadstoupregulationofalargesetofpredictedtargetmRNAsintheliverNucleicAcidsRes3611536210.LanfordREetalTherapeuticsilencingofmicroRNA122inprimateswithchronichepatitisCvirusinfectionScience32719820111.EsauCetalmiR122regulationoflipidmetabolismrevealedbyinvivoantisensetargetingCellMetab3879812.EbertMSNeilsonJRSharpPAMicroRNAspongescompetitiveinhibitorsofsmallRNAsinmammaliancellsNatMethods4721613.LoyaCMLuCSVanVactorDFulgaTATransgenicmicroRNAinhibitionwithspatiotemporalspecificityinintactorganismsNatMethods689790314.GentnerBetalStableknockdownofmicroRNAinvivobylentiviralvectorsNatMethods663615.HaraguchiTOzakiYIbaHVectorsexpressingefficientRNAdecoysachievethelongtermsuppressionofspecificmicroRNAactivityinmammaliancellsNucleicAcidsRes37e4316.RaynerKJetalMiR33contributestotheregulationofcholesterolhomeostasisScience3281570317.BernsKIGiraudCBiologyofadenoassociatedvirusCurrTopMicrobiolImmunol21812318.GaoGetalAdenoassociatedvirusesundergosubstantialevolutioninprimatesduringnaturalinfectionsProcNatlAcadSciUSA1006081619.GaoGetalNoveladenoassociatedvirusesfromrhesusmonkeysasvectorsforhumangenetherapyProcNatlAcadSciUSA9911854920.GaoGetalErythropoietingenetherapyleadstoautoimmuneanemiainmacaquesBlood1033300221.GaoGetalCladesofAdenoassociatedvirusesarewidelydisseminatedinhumantissuesJVirol786381822.GaoGVandenbergheLHWilsonJMNewrecombinantserotypesofAAVvectorsCurrGeneTher52859723.BishLTetalAdenoassociatedvirusserotype9providesglobalcardiacgenetransfersuperiortoAAV1AAV6AAV7andAAV8inthemouseandratHumGeneTher1913596824.GirardMJacqueminEMunnichALyonnetSHenrionCaudeAmiR122aparadigmfortheroleofmicroRNAsintheliverJHepatol486485625.BussingISlackFJGrosshansHlet7microRNAsindevelopmentstemcellsandcancerTrendsMolMed14400926.NakabayashiHTaketaKMiyanoKYamaneTSatoJGrowthofhumanhepatomacellslineswithdifferentiatedfunctionsinchemicallydefinedmediumCancerRes4238586327.ChangJetalmiR122amammalianliverspecificmicroRNAisprocessedfromhcrmRNAandmaydownregulatethehighaffinitycationicaminoacidtransporterCAT1RNABiol11061328.FormanJJLegesseMillerACollerHAAsearchforconservedsequencesincodingregionsrevealsthatthelet7microRNAtargetsDicerwithinitscodingsequenceProcNatlAcadSciUSA105148798429.TokumaruSSuzukiMYamadaHNaginoMTakahashiTlet7regulatesDicerexpressionandconstitutesanegativefeedbackloopCarcinogenesis292073730.TannousBAGaussialuciferasereporterassayformonitoringbiologicalprocessesincultureandinvivoNatProtoc45829131.SenCKGordilloGMKhannaSRoySMicromanagingvascularbiologytinymicroRNAsplaybigbandJVascRes465274032.McCartyDMSelfcomplementaryAAVvectorsadvancesandapplicationsMolTher1616485633.AmeresSLetalTargetRNAdirectedtrimmingandtailingofsmallsilencingRNAsScience3281534934.GramantieriLetalCyclinG1isatargetofmiR122aamicroRNAfrequentlydownregulatedinhumanhepatocellularcarcinomaCancerRes676092935.JohnsonSMetalRASisregulatedbythelet7microRNAfamilyCell1206354736.YuFetallet7regulatesselfrenewalandtumorigenicityofbreastcancercellsCell13111092337.ChristensenBCetalAlet7microRNAbindingsitepolymorphismintheKRAS3’UTRisassociatedwithreducedsurvivalinoralcancersCarcinogenesis301003738.SoutarAKNaoumovaRPMechanismsofdiseasegeneticcausesoffamilialhypercholesterolemiaNatClinPractCardiovascMed42142539.LebherzCetalGenetherapywithnoveladenoassociatedvirusvectorssubstantiallydiminishesatherosclerosisinamurinemodeloffamilialhypercholesterolemiaJGeneMed66637240.GaoGetalAdenoassociatedvirusmediatedgenetransfertononhumanprimatelivercanelicitdestructivetransgenespecificTcellresponsesHumGeneTher209304241.PowellBraxtonLetalAmousemodelofhumanfamilialhypercholesterolemiamarkedlyelevatedlowdensitylipoproteincholesterollevelsandsevereatherosclerosisonalowfatchowdietNatMed4934842.VandenbergheLHWilsonJMGaoGTailoringtheAAVvectorcapsidf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