遺伝子のエクソンの変異に起し、かつ、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患の予防改善剤であって、分子量1500以下の化合物を含有することを特徴とする予防改善剤。前記化合物が、スプライシング調節作用を有する化合物であることを特徴とする請求項1に記載の予防改善剤。前記化合物が、変異が含まれるエクソンのスキッピングを誘導促進させる効果を有する化合物であることを特徴とする請求項1又は2に記載の予防改善剤。前記化合物が、Cdc-likeキナーゼ阻害化合物であることを特徴とする請求項1~3のいずれかに記載の予防改善剤。前記Cdc-likeキナーゼ阻害化合物が、一般式1[式中、R1及びR2は各々独立に、直鎖状、分岐鎖状のC1-C10炭化水素基を示し;R3はメトキシ基、エトキシ基、アセトキシ基又はハロゲン原子を示す。]で表される化合物であることを特徴とする請求項4に記載の予防改善剤。前記変異が、ナンセンス変異であることを特徴とする請求項1~5のいずれかに記載の予防改善剤。前記ナンセンス変異が、前記遺伝子におけるエクソンスプライシングエンハンサー活性を抑制し、及び/又は、前記遺伝子におけるエクソンスプライシングサイレンサー活性を上昇させる、ナンセンス変異であることを特徴とする請求項6に記載の予防改善剤。前記遺伝子がジストロフィン遺伝子であり、前記機能性トランケート型タンパク質が機能性トランケート型ジストロフィンタンパク質であり、前記遺伝性疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーであることを特徴とする請求項1~7のいずれかに記載の予防改善剤。前記ジストロフィン遺伝子のエクソンが、ジストロフィン遺伝子のエクソン31又はエクソン27であることを特徴とする請求項8に記載の予防改善剤。前記ジストロフィン遺伝子のエクソン31の変異が、配列番号1のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド番号4303におけるグアニンのチミンへのナンセンス変異であり、エクソン27の変異が、配列番号1のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド番号3613におけるグアニンが欠失したアウトオブフレーム変異であることを特徴とする請求項9に記載の予防改善剤。本発明は、遺伝子のエクソンの変異に起因し、かつ、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患の予防改善剤であって、分子量1500以下の化合物を含有することを特徴とする予防改善剤を提供することを課題とする。本発明者らは、筋ジストロフィー患者400名以上について、そのジストロフィン遺伝子の変異を解析したところ、背景技術記載の読み枠ルールでは、重篤なDMD表現型となることが予想されるナンセンス変異をエクソン31に有するものの、症状はBMD型である患者を発見した。かかる患者のジストロフィン遺伝子のmRNAを分析したところ、エクソン31におけるそのナンセンス変異が、エクソン31のスキッピングを誘導し、それによって、機能性トランケート型ジストロフィンをコードする成熟mRNAを一部生成していることが判明した。そこで、本発明者らは、エクソンスキッピングを促進する低分子化合物を探し求め、Clk特異的阻害剤であるTG003が、内在性ジストロフィン遺伝子のエクソン31やエクソン27のスキッピングを用量依存的に促進し、患者の細胞において機能性トランケート型ジストロフィンの産生を増強させ得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、1遺伝子のエクソンの変異に起因し、かつ、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患の予防改善剤であって、分子量1500以下の化合物を含有することを特徴とする予防改善剤や、2前記化合物が、スプライシング調節作用を有する化合物であることを特徴とする上記1に記載の予防改善剤や、3前記化合物が、変異が含まれるエクソンのスキッピングを誘導促進させる効果を有する化合物であることを特徴とする上記1又は2に記載の予防改善剤や、4前記化合物が、Cdc-likeキナーゼ阻害化合物であることを特徴とする上記1~3のいずれかに記載の予防改善剤や、5前記Cdc-likeキナーゼ阻害化合物が、一般式1[式中、R1及びR2は各々独立に、直鎖状、分岐鎖状のC1-C10炭化水素基を示し;R3はメトキシ基、エトキシ基、アセトキシ基又はハロゲン原子を示す。]で表される化合物であることを特徴とする上記4に記載の予防改善剤や、6前記変異が、ナンセンス変異であることを特徴とする上記1~5のいずれかに記載の予防改善剤や、7前記ナンセンス変異が、前記遺伝子におけるエクソンスプライシングエンハンサー活性を抑制し、及び/又は、前記遺伝子におけるエクソンスプライシングサイレンサー活性を上昇させる、ナンセンス変異であることを特徴とする上記6に記載の予防改善剤や、8前記遺伝子がジストロフィン遺伝子であり、前記機能性トランケート型タンパク質が機能性トランケート型ジストロフィンタンパク質であり、前記遺伝性疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーであることを特徴とする上記1~7のいずれかに記載の予防改善剤や、9前記ジストロフィン遺伝子のエクソンが、ジストロフィン遺伝子のエクソン31又はエクソン27であることを特徴とする上記8に記載の予防改善剤や、10前記ジストロフィン遺伝子のエクソン31の変異が、配列番号1のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド番号4303におけるグアニンのチミンへのナンセンス変異であり、エクソン27の変異が、配列番号1のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド番号3613におけるグアニンが欠失したアウトオブフレーム変異であることを特徴とする上記9に記載の予防改善剤に関する。本発明によれば、遺伝性疾患の要因となる変異が含まれる遺伝子のエクソンのスキッピングを誘導促進させることによって、機能性トランケート型タンパク質の発現を誘導上昇させ、その結果、該遺伝性疾患を予防改善することができる。また、本発明で用いる分子量1500以下の化合物は低分子であり、組織移行性等に優れているため、高分子である従来のAONでは十分な効果が得られなかった心臓等の臓器においても、十分な予防改善効果が期待できる。さらに、本発明が対象とする変異はナンセンス変異に限らないため、遺伝性疾患の要因となる多様な変異への適用も期待できる。1.本発明の予防改善剤本発明の予防改善剤は、遺伝子のエクソンの変異に起因し、かつ、該変異が含まれるエクソン以下、単に変異型エクソンとも表示する。をスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患以下、本発明が対象とする遺伝性疾患とも表示する。の予防改善剤であって、分子量1500以下の化合物以下、本発明における化合物とも表示する。を含有している限り特に制限されないが、分子量1000以下の化合物であることが好ましく、分子量700以下の化合物であることがより好ましく、分子量500以下の化合物であることがさらに好ましく、分子量300以下の化合物であることがさらにより好ましい。また、本発明の予防改善剤には、本発明における化合物を2種類以上併用してもよい。本発明における化合物としては、本発明が対象とする遺伝性疾患に対して予防効果及び/又は改善効果以下、本発明における予防改善効果とも表示する。を発揮する化合物である限り特に制限されないが、好適には、スプライシング調節作用を有する化合物を例示することができ、より好適には、変異型エクソンのスキッピングを誘導及び/又は促進させる効果以下、本発明におけるスキッピング誘導促進効果とも表示する。を有する化合物を例示することができ、さらに好適には、変異型エクソンのスキッピングを誘導及び/又は促進させて、機能性トランケート型タンパク質の発現を誘導及び/又は上昇させる効果以下、本発明における機能性トランケート型タンパク質の発現誘導上昇効果とも表示する。を有する化合物を例示することができ、さらにより好適には、Clk阻害化合物を例示することができる。かかるClk阻害化合物の中でも、上記一般式1[式中、R1及びR2は各々独立に、直鎖状、分岐鎖状のC1-C10炭化水素基を示し;R3はメトキシ基、エトキシ基、アセトキシ基又はハロゲン原子を示す。]で表される化合物を好適に例示することができ、中でも、TG003上記一般式1において、R1及びR2がメチル基であり、R3がメトキシ基である化合物を特に好適に例示することができる。上記一般式1で表される化合物は、前述の特許文献1に記載の方法等により合成することができる。本発明が対象とする遺伝性疾患に対する予防効果以下、本発明の予防効果とも表示する。とは、その遺伝性疾患の発症を抑制する効果や、発症を遅延させる効果を含み、本発明が対象とする遺伝性疾患に対する改善効果以下、本発明の改善効果とも表示する。とは、その遺伝性疾患の症状を改善する効果の他、本発明の予防改善剤を投与しない場合と比較して症状の悪化の速度を遅延させる効果を含む。ある化合物が、本発明の予防改善効果を有しているかどうかは、例えば、本発明が対象とする遺伝性疾患のモデル哺乳動物すなわち、本発明が対象とする遺伝性疾患の要因となる変異を有するモデル哺乳動物好ましくはモデル非ヒト哺乳動物にその被検化合物を投与する工程A;そのモデル哺乳動物における前記遺伝性疾患の症状を確認する工程B;前記工程Bにおける遺伝性疾患の症状の程度と、被検化合物を投与しなかった場合の症状の程度とを比較する工程C;前記工程Bにおける遺伝性疾患の症状の程度が、被検化合物を投与しなかった場合の症状の程度と比較して低い場合に、該被検化合物を本発明の予防改善効果を有する化合物と評価する工程D;を有する方法により、確認することができる。また、ある化合物が、本発明におけるスキッピング誘導促進効果を有しているかどうかは、例えば、変異型エクソンと、該エクソンに隣接する領域エクソン領域又はイントロン領域を含むDNA断片ミニ遺伝子を適当な哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで組換えベクターを作製する工程;かかる組換えベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクションする工程;トランスフェクションにより得られた形質転換細胞以下、本発明における形質転換細胞とも表示する。と、被検化合物とを接触させた状態で、該形質転換細胞を培養する工程:培養した形質転換細胞からRNAを単離し、RT-PCRによりミニ遺伝子に対応するRNAを増幅する工程;増幅産物を解析例えば電気泳動や配列決定することによって、変異型エクソンのスキッピングが誘導及び/又は促進されているかどうかを確認する工程;変異型エクソンのスキッピングが誘導及び/又は促進されている場合に、その被検化合物を、本発明におけるスキッピング誘導促進効果を有する化合物と評価する工程;を含む、本発明におけるスキッピング誘導促進効果を有する化合物の判定方法により、確認することができる。さらに、ある化合物が、トランケート型タンパク質の発現誘導上昇効果を有しているかどうかは、本発明における形質転換細胞と、被検化合物とを接触させた状態で、該形質転換細胞を培養する工程;培養した形質転換細胞中に発現するタンパク質を解析することによって、トランケート型タンパク質の発現が誘導及び/又は上昇しているかどうかを確認する工程;トランケート型タンパク質の発現が誘導及び/又は上昇している場合に、その被検化合物を、トランケート型タンパク質の発現誘導上昇効果を有する化合物と評価する工程;を含む、トランケート型タンパク質の発現誘導上昇効果を有する化合物の判定方法により、確認することができる。トランケート型タンパク質の検出は、変異型エクソンにコードされるペプチドに対する抗体や、それ以外のエクソンにコードされるペプチドに対する抗体を用いたウエスタンブロッティング解析において、変異型エクソンにコードされるペプチドに対するシグナルが検出されず、かつ、それ以外のエクソンにコードされるペプチドに対するシグナルが検出されることを確認すること等によって行うことができる。また、そのトランケート型タンパク質が機能性トランケート型タンパク質であるかどうかは、本発明が対象とする遺伝性疾患のモデル哺乳動物においてそのトランケート型タンパク質を発現させたときに、その遺伝性疾患の症状が改善されること等を指標にして確認することができる。なお、本発明における機能性トランケート型タンパク質とは、遺伝性疾患の要因となる遺伝子のエクソンが少なくとも1つ欠失した成熟mRNAによりコードされたトランケート型タンパク質であって、かつ、その遺伝子に対応する正常遺伝子の全長タンパク質の機能特に、遺伝性疾患に関連する機能が少なくともある程度残存しているタンパク質を意味する。また、ある化合物が、Clk阻害化合物であるかどうかは、被検化合物の存在下で、Clkのリン酸化活性を測定する工程;測定の結果得られたリン酸化活性の値を、被検化合物の非存在下におけるClkのリン酸化活性の値と比較する工程;被検化合物の存在下におけるClkのリン酸化活性の値が、被検化合物の非存在下におけるClkのリン酸化活性の値より低い場合に、その被検化合物をClk阻害化合物と評価する工程;を有する方法により、容易に確認することができる。上記のClkは、公知のClkの配列情報に基づいて、所望の哺乳動物からClk遺伝子を単離し、該遺伝子を適当な発現ベクターにインテグレイトして発現させた後、そのClkを単離することによって容易に入手することができる。Clkのリン酸化活性は、Clkの基質であるSRタンパク質がリン酸化されたリン酸化SRタンパク質に特異的に結合する抗体等を用いて測定することができる。また、Clk遺伝子の由来となる前述の哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。本発明が対象とする遺伝性疾患における変異の種類としては、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る限り特に制限されず、ナンセンス変異、スプライシング異常の他、正常な野生型の遺伝子と比較してアミノ酸の読み枠がずれるアウトオブフレーム変異などを例示することができ、中でも、ナンセンス変異やアウトオブフレーム変異を好適に例示することができ、中でも、該遺伝性疾患の要因となる遺伝子におけるエクソンスプライシングエンハンサー活性を抑制し、及び/又は、該遺伝子におけるエクソンスプライシングサイレンサー活性を上昇させる、ナンセンス変異やアウトオブフレーム変異をより好適に例示することができ、中でも、そのナンセンス変異やアウトオブフレーム変異が含まれるエクソンのスキッピングが誘導促進されるようなナンセンス変異やアウトオブフレーム変異を特に好適に例示することができる。なお、前述のアウトオブフレーム変異としては、遺伝子の欠失、重複又は逆位であって、かつ、正常な野生型の遺伝子と比較してアミノ酸の読み枠がずれる変異を例示することができる。本発明においてスキッピングさせる対象となる該変異が含まれるエクソンとは、かかる変異が含まれる1個のエクソンに限らず、そのエクソンを含む隣接した複数個好ましくは2~8個、より好ましくは2~5個、さらに好ましくは2~3個、より好ましくは2個のエクソンであってもよく、かかるエクソンの好ましい個数や範囲は、かかるエクソンをスキッピングさせたときに残りのエクソンがインフレームとなるように連結されることや、残りのエクソンにより構成される成熟mRNAがコードするトランケート型タンパク質が機能性トランケート型タンパク質となることを指標にして、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、遺伝子がジストロフィン遺伝子である場合は、公知のエクソン情報図7に基づいて、スキッピングさせるエクソンの個数や範囲を決定することができる。この図7において、2つのエクソンの境目が垂直な直線例えばエクソン3とエクソン4の間の直線を参照であればエクソンの境目はコドンの境目と一致しており、2つのエクソンの境目が角度の緩い斜線例えばエクソン1とエクソン2の間の斜線を参照であればエクソンの境目はコドンの1文字目と2文字目の間にあり、2つのエクソンの境目が角度の急な斜線例えばエクソン6とエクソン7の間の斜線を参照であればエクソンの境目はコドンの2文字目と3文字目の間にあることを示している。したがって、例えばアウトオブフレーム変異がエクソン51中に存在する場合は、エクソン51と52をスキッピングさせたり、エクソン50と51をスキッピングさせれば、残りのエクソンはインフレームとなり、また、アウトオブフレーム変異がエクソン53に存在する場合は、エクソン53~58をスキッピングさせたり、エクソン52と53をスキッピングさせれば残りのエクソンはインフレームとなる。本発明におけるエクソンのスキッピングあるいはエクソンをスキッピングさせるとは、遺伝子から転写されて生成したmRNAmRNA前駆体から成熟mRNAにプロセシングされる際に、mRNA前駆体からそのエクソンが消失すること、あるいは、そのエクソンを消失させることを意味する。本発明が対象とする遺伝性疾患の種類としては、遺伝子のエクソン中の変異に起因する遺伝性疾患であって、かつ、該変異が含まれるエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質を生成させ得る遺伝性疾患である限り特に制限されないが、中でも、遺伝子のエクソン中の変異に起因し、かつ、該変異が含まれるエクソンがスキッピングされ、機能性トランケート型タンパク質を一部に生成している遺伝性疾患を好適に例示することができ、より具体的には、前述の遺伝性疾患において、遺伝子がジストロフィン遺伝子であり、前述の機能性トランケート型タンパク質が機能性トランケート型ジストロフィンであるデュシェンヌ型筋ジストロフィーをより好適に例示することができ、中でも、前述のデュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、ジストロフィン遺伝子のエクソンがジストロフィン遺伝子のエクソン31やエクソン27であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーをより好適に例示することができ、中でも、前述のデュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、ジストロフィン遺伝子のエクソン31中の変異が、配列番号1のポリヌクレオチド配列ジストロフィンcDNA配列のヌクレオチド番号4303におけるグアニンのチミンへのナンセンス変異であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーや、ジストロフィン遺伝子のエクソン27中の変異が、配列番号1のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド番号3613におけるグアニンが欠失したアウトオブフレーム変異であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを特に好適に例示することができる。本発明の予防改善剤の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。また、本発明の予防改善剤にClk阻害化合物を用いる場合において、かかるClk阻害化合物が阻害作用を発揮するClkの由来は、本発明の予防改善剤の投与対象となる哺乳動物の種類と一致していることが、本発明の予防効果や改善効果をより多く享受し得ることから好ましい。本発明における化合物が有する本発明におけるスキッピング誘導促進効果の好ましい程度としては、前述の本発明における形質転換細胞と、本発明における化合物30μMとを接触させた状態で、該形質転換細胞を培養する工程:培養した形質転換細胞からRNAを単離し、RT-PCRによりミニ遺伝子に対応するRNAを増幅する工程:増幅産物を解析例えば電気泳動や配列決定することによって、変異型エクソンがスキッピングされていない増幅産物に対する、変異型エクソンがスキッピングされている増幅産物の割合を算出する工程:により算出されるエクソンスキップ/インクルージョンレシオが、本発明における化合物を用いなかった場合のエクソンスキップ/インクルージョンレシオに対して、2倍以上、好ましくは3倍以上、より好ましくは4倍以上、さらに好ましくは5倍以上に上昇していることを好適に例示することができる。また、本発明における化合物を用いなかった場合のエクソンスキップ/インクルージョンレシオが0であったときに、エクソンスキップ/インクルージョンレシオを0より大きい正の値に誘導する効果は、本発明におけるスキッピング誘導促進効果の特に好ましい程度として例示することができる。本発明の予防改善剤は、本発明の予防改善効果が得られる限り、前述の本発明における化合物の他に、他の遺伝性疾患予防改善剤等の任意成分を含んでいてもよい。本発明の予防改善剤に含有される本発明における化合物は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、本発明のより優れた予防改善効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えば本発明における化合物を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明における化合物を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。本発明の予防改善剤に含有される本発明における化合物の量としては、本発明の予防改善効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、本発明の予防改善剤の全量に対して例えば0.0001~99.9999質量、好ましくは0.001~80質量、より好ましくは0.001~50質量、さらに好ましくは0.005~20質量を好適に例示することができる。本発明の予防改善剤の投与方法としては、本発明の予防改善効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を例示することができる。また、本発明の予防改善剤の投与量は、投与対象の遺伝性疾患の状態や投与対象の体重等に応じて、適宜調節することができるが、本発明における化合物換算で成人1人1日当たり、例えば0.1μg~10000mg、より好ましくは1μg~3000mg、さらに好ましくは10μg~1000mgを好適に例示することができる。なお、本発明における化合物を含有する本発明の予防改善剤は、遺伝性疾患の要因となる変異が含まれる遺伝子のエクソンのスキッピングを誘導促進させるエクソンスキッピング誘導促進剤としても使用することができる。また、本発明の他の態様として、本発明の予防改善剤の製造における、本発明における化合物の使用:や、本発明における化合物を、本発明の予防改善剤に使用する方法:や、遺伝性疾患の要因となる変異が含まれる遺伝子のエクソンをスキッピングさせて機能性トランケート型タンパク質の発現を誘導上昇することにおける、本発明における化合物の使用:や、本発明が対象とする遺伝性疾患の予防改善における、本発明の化合物の使用:や、本発明の予防改善剤を対象に投与することにより、本発明が対象とする遺伝性疾患を予防改善する方法や、本発明におけるエクソンスキッピング誘導促進剤を対象に投与することにより、遺伝性疾患の要因となる変異が含まれる遺伝子のエクソンのスキッピングを誘導促進する方法も例示することができる。これらの使用や方法における文言の内容やその好ましい態様は、前述したとおりである。以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。[筋ジストロフィー患者のジストロフィン遺伝子の変異解析]筋ジストロフィー患者400名以上について、以下の方法により、そのジストロフィン遺伝子の変異を解析した。変異解析標準的なフェノール-クロロフォルム抽出法により、患者の血液試料からDNAを単離した。フィコールパーク密度勾配法AmershamBiosciencesAB社製を用いて全血から回収した末梢リンパ球から、或いは凍結筋試料を薄片化した筋切片から、トータルRNAを単離した。逆転写PCRRT-PCR及びRT-nestedPCR法により、骨格筋で発現したジストロフィンmRNAを分析した。骨格筋由来のジストロフィンmRNAについて、内側プライマーセットフォワードc27f:CCTGTAGCACAAGAGGCCTTA配列番号2、及び、リバース2F:TCCACACTCTTTGTTTCCAATG配列番号3を使用してエクソン27~32を含む領域を増幅した。増幅産物を精製し、そのまま、或いはpT7BlueTベクターNovagen社製にサブクローニングしてから、増幅産物の配列を決定した。この配列の決定には、自動DNA配列決定装置モデル310;AppliedBiosystems社製を用いた。解析した筋ジストロフィー患者の一人KUCG797の症例は以下のとおりである。この患者は5歳の男児である。この男児の両親は健常な日本人で筋肉疾患の家族歴はなかった。1歳4ヶ月で一人歩きを始め、運動発達は正常だったが、2歳のときの定期血液検査で血清クレアチンキナーゼCK値が2567IU/l正常値は169IU/l未満を示し、入院した。神戸大学病院で診察を受け、ジストロフィン遺伝子の変異について調べられた。CK値はその後、緩やかに上昇し続けた1331~4740IU/lが、筋力低下や歩行異常は認められなかった。5歳のときに筋バイオプシーを行った。以上の研究は神戸大学倫理委員会の承認を得て実施した。前述のKUCG797のジストロフィン遺伝子には、エクソン31に点変異が認められた。この変異は、ジストロフィンcDNAの4303番目のヌクレオチドがGからTRNAではGからUに置き換わったものであるc.4303G>T:図1a。このヌクレオチドの変更は、グルタミン酸をコードするGAGコドンからストップコドンをコードするTAGへの置換だったためp.Glu1435X、背景技術に記載の読み枠ルールにしたがえば、この症例ではジストロフィンが産生されず、重篤なDMDとなることが予想された。骨格筋バイオプシー、及び、ジストロフィン免疫染色次に、以下の方法で、前記患者5歳に骨格筋バイオプシーを行い、ジストロフィン免疫染色を行った。KUCG797について、大腿直筋のバイオプシーを行い、骨格筋試料を得た。この骨格筋試料を、液体窒素で冷却したイソペンタンで急速凍結した。凍結した骨格筋試料から、厚さ10μmの凍結連続切片を作製し、かかる切片を免疫組織化学染色により分析した。具体的には、前述の厚さ10μmの凍結連続切片を冷却アセトン中に5分間入れて固定した。この切片をヤギ正常血清でブロッキングし、抗ジストロフィン抗体一次抗体の共存下、4°Cにて一晩インキュベートした。抗ジストロフィン抗体としては、DYS2Novocastra社製、DYS3Novocastra社製、及び、MANDYS1GlennEMorris教授博士からの寄贈の3種類を用いた。DYS2は、ジストロフィン遺伝子のエクソン77~79C末端側のエピトープを認識し、DYS3は、ジストロフィン遺伝子のエクソン10~12N末端側のエピトープを認識し、MANDYS1は、ジストロフィン遺伝子のエクソン31/32rodドメインのエピトープを認識する。インキュベート後の切片をPBSで6回洗浄した後、二次抗体としてAlexaFluor488で標識したヤギ抗マウス抗体又はヤギ抗ウサギ抗体の共存下、室温で90分間インキュベートした。切片を洗浄した後、蛍光顕微鏡で切片を観察した。その結果を図1bに示す。図1bのパネルeはDYS2で染色した結果を示し、図1bのパネルfはDYS3で染色した結果を示し、図1bのパネルgはMANDYS1で染色した結果を示す。KUCG797のジストロフィン遺伝子の遺伝子型からすると、重篤なDMDが予想されたが、免疫組織化学染色の結果はその予想に反し、BMDにおける場合と同じように、N末端又はC末端のジストロフィンドメインを認識する抗体に対するまばらで不連続なシグナルが認められた図1bのパネルeやパネルf。また、ジストロフィン遺伝子のエクソン31/32を認識するMANDYS1抗体に対するシグナルは認められなかった図1bのパネルg。なお、ポジティブコントロールとして、健常者由来の骨格筋試料について同様の免疫組織科学染色を行ったところ、DYS2、DYS3、MANDYS1のいずれの抗体に対してもシグナルが確認された図1bのパネルb、パネルc、パネルd。RT-PCR増幅産物の解析KUCG797のジストロフィン遺伝子の遺伝子型DMD型と、免疫染色パターンとの間のこの矛盾を説明するため、本発明者らは、ジストロフィン遺伝子のエクソン31におけるナンセンス変異がエクソンスプライシングエンハンサーESEを破壊し、変異型エクソン変異を含むエクソンのスキッピングをもたらしたと推定した。この推定の可能性を証明するため、KUCG797の骨格筋のジストロフィンmRNAをRT-PCR増幅法で解析した。具体的には、KUCG797から単離したトータルRNAをテンプレートとし、プライマーとして前述のフォワードc27f及びリバース2Fを使用してエクソン27からエクソン32に至る領域を増幅した。その増幅産物を、Tris-ホウ酸塩/EDTA緩衝液中、2アガロースゲル上で電気泳動した結果を図1cに示す。一番右のレーンPatientは、KUCG797由来のトータルRNAをテンプレートとした結果を示し、中央のレーンControlは、健常者由来のトータルRNAをテンプレートした結果を示す。コントロールでは、エクソン27からエクソン32に及ぶ領域の増幅産物は1種類であったが、KUCG797では、驚いたことに、2種類のほぼ同量の増幅産物が得られた。この2種類のうちの一方の増幅産物は予想通りのサイズであり、他方の増幅産物はより小さいサイズであった図1c。この小さいサイズの増幅産物の配列決定を行ったところ、エクソン31がスキッピングされていることが確認された図1d。一方、予想通りのサイズの増幅産物の配列決定を行ったところ、エクソン31のTAGストップコドンを含む、エクソン27~32の配列793ntが示された。他方、小さいサイズの増幅産物ではエクソン31の配列が完全に欠失していたが、他のエクソンは完全なまま残った配列682ntとなっており、変異型エクソン31がスキッピングされたことが示唆された図1c。KUCG797のジストロフィン遺伝子の他のイントロンのスプライシングも調べたが、他のイントロンは全て正しくスプライシングされていたデータは示さず。エクソン31111ntを欠失するジストロフィンmRNA682ntはインフレームであり、トランケート型ではあるが機能は残存するジストロフィントランケート型ジストロフィンを産生する。前述の免疫染色では、N末端又はC末端のジストロフィンドメインを認識する抗体を用いたので、前述のトランケート型ジストロフィンも染色されるはずであった。そこで、エクソン31を含む領域に対するモノクローナル抗体であるMANDYS1を用いて免疫染色を行ったところ、かかるトランケート型ジストロフィンはMANDYS1には認識されなかった図1bのパネルg。以上の結果より、c.4303G>Tp.Glu1435Xの点変異をそのジストロフィン遺伝子にもつ前記患者は、完全長のジストロフィンmRNAと、エクソン31を欠失Δエクソン31したジストロフィンmRNAの2種類を発現することが示された。また、これらの結果からは、この点変異がジストロフィン遺伝子のORFを破壊するだけでなく、エクソン31のスプライスシグナルも破壊することも示唆された。ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析1この仮説をさらに分析するため、細胞におけるスプライシング解析に用いられているH492ベクターMolGenetMetab85213219JMedGenet43924930HumGenet120737742に、変異型エクソン31とその両側の隣接イントロンとを含むジストロフィン遺伝子断片変異型ミニ遺伝子を挿入したプラスミドH492-dysEx31プラスミドを構築し、かかるプラスミドをトランスフェクトしたHela細胞において、その遺伝子断片のmRNAを調べることにした。なお、H492ベクターは、2つのカセットエクソンA及びBとマルチクローニングサイトを含むイントロン配列とをコードしている。H492-dysEx31プラスミドは以下のような方法で構築した。KUCG797のゲノムDNAから、ジストロフィン遺伝子の変異型エクソン31とその両側の隣接イントロン領域とを含む断片をPCRで増幅した。プライマーとして、イントロン30f-NheIGCGGCTAGCGTGATCCACCTGCCTCGAC:配列番号4、及び、イントロン31r-BamHIGCGGGATCCTCAAATCCAATCTTGCCAAT:配列番号5を使用した。前述の増幅産物をNheI及びBamHINewEnglandBiolabs社製で消化した断片を、両酵素で消化したH492に挿入した。これにより、KUCG797由来の変異型エクソン31とその両側の隣接イントロン領域とを含む断片変異型ミニ遺伝子を含むプラスミドH492-dysEx31mプラスミドを構築した図1e。また、健常者のゲノムDNAを利用した同様の方法により、ジストロフィン遺伝子の野生型エクソン31とその両側の隣接イントロン領域とを含む断片野生型ミニ遺伝子を含むプラスミドH492-dysEx31wプラスミドを構築した図1e。H492-dysEx31mプラスミド及びH492-dysEx31wプラスミドのいずれも、プラスミドの全配列の決定を行い、目的断片が含まれていることを確認した。H492-dysEx31mプラスミド、H492-dysEx31wプラスミドを、Hela細胞にそれぞれトランスフェクションし、H492-dysEx31m/Hela及びH492-dysEx31w/Helaを得た。トランスフェクションは、リポフェクタミン2000インビトロジェン社製を製造者マニュアルに従って使用して行った。トランスフェクションにより得られたこれらの細胞内では、CMVプロモーターCMVpからmRNA前駆体が転写される。H492-dysEx31m/Hela又はH492-dysEx31w/Helaから単離したトータルRNAをテンプレートとし、プライマーとして前述のイントロン30f及びイントロン30rを使用してミニ遺伝子を含む領域をRT-PCRで増幅した。その増幅産物を、Tris-ホウ酸塩/EDTA緩衝液中、2アガロースゲル上で電気泳動した結果を図1fに示す。左から3番目のレーンmは、H492-dysEx31m/Hela由来のトータルRNAをテンプレートとした結果を示し、左から2番目のレーンwは、H492-dysEx31w/Hela由来のトータルRNAをテンプレートとした結果を示す。野生型ミニ遺伝子を含む形質転換細胞H492-dysEx31w/Helaでは、エクソンA、31及びBを含む1つのRT-PCR産物が認められた。他方、変異型ミニ遺伝子を含む形質転換細胞H492-dysEx31m/Helaでは2つのPCR産物が検出された図1f。配列決定の結果、小さい方のDNA産物はエクソン31を含まないことが確認されたデータは示さず。なお、ネガティブコントロールとして、逆転写酵素RTを添加しないこと以外は同様にRT-PCR処理したものをアガロースゲルに電気泳動した結果を図1fの一番右のレーンm及び右から2番目のレーンwに示す。以上の結果から、この患者における点変異がジストロフィンのエクソン31のスキッピングを引き起こし、H492ベクターにクローニングしたジストロフィン遺伝子の一部が、患者の筋肉で観察されたエクソン31のスキッピングの再現能力を有することが明らかになった。[エクソン31スプライシングに関与するスプライシング調節因子の解析]前述の実施例1の結果から、KUCG797のジストロフィン遺伝子のエクソン31の点変異が、エクソンスキッピングを引き起こすことが示されたので、エクソン31のスキッピングやインクルージョンinclusionを調節する候補因子の同定を試みた。SpliceAidプログラムによる配列解析ジストロフィン遺伝子の野生型エクソン31と、変異型エクソン31のRNA配列をSpliceAidプログラムhttpwwwintroniitsplicinghtmlBioinformatics2512111213で解析したところ、この変異型エクソン31の点変異は、SRタンパク質のメンバーであるSRp30c/SRSF9SFSR9との結合力を低下させることが分かった図2a。SRタンパク質は、プリンリッチであることが多いエクソンスプライシングエンハンサーESEと結合することが知られている。エクソン31の配列は、SELEXで同定されたSRp30c/SRSF9に対する高親和性結合配列と高い類似性を有する図2bRna1312871300。上記変異型エクソン31の変異は、SRp30c/SRSF9に対する結合部位を破壊するだけでなく、hnRNPA1高親和性結合部位をも生じさせる図2a。つまり、上記変異型エクソン31の変異は、hnRNPA1のSELEXwinner配列と高い相同性をもつRNA配列を生じさせる図2bEmboJ1311971204。hnRNPA1がエクソンスプライシングサイレンサーESSと結合し、エクソンスキッピングを生じさせることはよく知られている。SpliceAidプログラムでの結果から、ジストロフィン遺伝子のエクソン31のESEはSRp30c/SRSF9に認識され、変異によりESEがhnRNPA1に結合するESSに変わることが示唆された。ゲルモビリティシフトアッセイジストロフィン遺伝子のエクソン31のESEはSRp30c/SRSF9に認識され、変異によりESEがhnRNPA1に結合するESSに変わるという仮説を検証するため、先ず、ゲルモビリティシフトアッセイにより、hnRNPA1に対する結合活性を、変異型エクソン31RNAと野生型エクソン31RNAとで比較した。具体的には以下の方法で行った。ヒトhnRNPA1cDNAについてPCR増幅を行い、得られた増幅断片を、GST-pCDNA3のBamHI部位とNotI部位との間に挿入して、GST-hnRNPA1プラスミドを作製した。このプラスミドの全配列の決定を行い、目的断片が含まれていることを確認した。このGST-hnRNPA1プラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクションし、得られた形質転換細胞を培養した。回収した形質転換細胞から、文献MethodsMolBiol488357365記載の方法にしたがって全細胞溶解物を調製した。カラムから溶出する前に緩衝液E20mMHepes-KOHpH7.9、1000mMKCl、0.2mMEDTA、10グリセロール、及び1mMDTTで樹脂を2回洗浄すること以外は基本的に文献TheJournalofbiologicalchemistry27775407545記載のとおりに、抗GST親和性樹脂SIGMA社製を使用して、前述の全細胞溶解物からGST-hnRNPA1タンパク質を精製した。次いで、32Pで標識した変異型エクソン31RNA又は野生型エクソン31RNAを、前述のGST-hnRNPA1タンパク質と混合し、20°Cで30分間インキュベートして得られた複合体についてゲルモビリティシフトアッセイを行った。具体的には以下の方法を用いた。ゲルモビリティシフトアッセイは基本的に文献Nucleicacidsresearch2336383641記載の方法のとおりに行った。すなわち、前述の各複合体を、8天然ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動することによってアッセイを行った。バンドの分析は、オートラジオグラフィーにより行った。このアッセイで使用した結合緩衝液は、16mMHepes-KOHpH7.9、80mMKCl、0.16mMEDTA、0.8mMDTT、8グリセロール、100ng/μlのBSA、50ng/μlのEcolitRNASigmaChemicalCo社製、5×104cpmのRNA32Pで標識したジストロフィン遺伝子の変異型エクソン31RNA又は野生型エクソン31RNA、及び、1U/μlのRNasin登録商標Promega社製を含有していた。このゲルモビリティシフトアッセイの結果を図3aに示す。図3aに示すように、hnRNPA1が低濃度のときは、野生型エクソン31RNAと変異型エクソン31RNAの両方にほぼ同様に結合した図3aのレーン3、4及びレーン8、9。これは恐らく、共通のhnRNPA1結合部位が、野生型及び変異型の両方のエクソン31上に存在するからであると考えられるHumMolGenet159991013。しかし、hnRNPA1がより高濃度のときは、hnRNPA1は、野生型エクソン31RNAよりも変異型エクソン31RNAにより効率的に結合し、hnRNPA1マルチマーを含む、より大きな複合体を形成した図3aのレーン5及びレーン10。これらの結果より、前記の患者でみられるエクソン31の点変異は、hnRNPA1に対する新たな高親和性結合部位をエクソン31上に生じさせ、その結果、変異型エクソン31RNA上のhnRNPA1がより多く分布することを容易にしていることが示唆される。この結果から、変異型エクソン31は、hnRNPA1とより強い結合親和性を持つようになったことで、スプライシングの際に、エクソンとして効率的に認識されなかった可能性が強く示唆された。この可能性を調べるため、次に、インビトロでのスプライシングアッセイを行った。インビトロでの転写及びスプライシングアッセイ変異型エクソン31は、hnRNPA1とより強い結合親和性を持つようになったことで、スプライシングの際に、エクソンとして効率的に認識されなかった可能性が考えられたので、この可能性を検証するために、インビトロでのスプライシングアッセイを行った。まず、かかるアッセイのために、ニワトリδクリスタリンCDCmRNA前駆体Molecularcell6673682のイントロン領域に、ジストロフィン遺伝子の野生型エクソン31又は前述の変異型エクソン31を含むmRNA前駆体を調製した図3bのパネルの右側の構築物参照。具体的には、PCRで増幅した野生型エクソン31を、pCDCMolecularcell6673682のSacI部位とStyI部位との間に挿入することにより、pCDC-dysEx31wを作製した。また、野生型エクソン31に代えて変異型エクソン31を用いて、同様の方法でpCDC-dysEx31mを作製した。pCDC-dysEx31w及びpCDC-dysEx31mを、それぞれSmaIで線状化し、インビトロ転写の鋳型とした。文献Molecularcell6673682記載の方法にしたがって、mRNA前駆体が32Pで標識されるようにインビトロで転写を行い、次いで、転写されたmRNA前駆体の精製を行った。また、インビトロスプライシングアッセイは、文献Molecularcell6673682記載の方法にしたがって、10μlスケールでこれらのmRNA前駆体CDC-dysEx31wmRNA前駆体又はCDC-dysEx31mmRNA前駆体とHela細胞核抽出物Cilbiotech社製を混合し、次いで、30°C下でパネル上部に示す時間0、15、30、60、90分、インキュベートすることにより行った。インキュベートして得られたmRNA産物を、6変性ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、次いで、オートラジオグラフィーによりRNAバンドの分析を行った。その結果を図3bに示す。野生型エクソン31を含むCDC-dysEx31wmRNA前駆体を用いた結果図3bのレーン3~5と、変異型エクソン31を含むCDC-dysEx31mmRNA前駆体を用いた結果図3bのレーン8~10を比較したところ、前者と比較して後者では、エクソン31を含むmRNA産物図3bのパネルの右側に黒丸が付された位置の構造のmRNA産物の生成効率が低かった。他方、エクソン31を含まないmRNA産物エクソン14及び15からなるmRNA産物については、変異型エクソン31を含むCDC-dysEx31mmRNA前駆体を用いた場合の方がより効率的に生成していた。ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析2次に、前述の実施例1で作製したH492-dysEx31m/Hela変異型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたHela細胞において、RNA結合タンパク質SRp30c/SRSF9又はSRp75/SRSF4をさらに過剰発現させることによって、変異型ミニ遺伝子のスプライシングパターンにどのような影響が生じるかを調べることにした。SRp30c/SRSF9の過剰発現に用いたプラスミドFlag-SRp30cプラスミドは、PCRで増幅したヒトSRp30cのcDNAを、Flag-pCDNA3TheJournalofbiologicalchemistry27970097013のBamHI部位とXhoI部位との間に挿入して作製し、SRp75/SRSF4の過剰発現に用いたプラスミドFlag-SRp75プラスミドは、PCRで増幅したマウスSRp75のcDNAを、Flag-pCDNA3のBamHI部位とXhoI部位との間に挿入して作製した。また、Flag-hnRNPA1プラスミドは以下のような方法で作製した。ヒトhnRNPA1cDNAについてPCR増幅を行い、得られた増幅断片を、Flag-pCDNA3Nucleicacidsresearch3765156527のBamHI部位とNotI部位との間に挿入して、Flag-hnRNPA1プラスミドを作製した。このプラスミドの全配列の決定を行い、目的断片が含まれていることを確認した。このFlag-hnRNPA1プラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクションし、得られた形質転換細胞を培養した。回収した形質転換細胞から、文献MethodsMolBiol488357365記載の方法にしたがって全細胞溶解物を調製した。カラムから溶出する前に緩衝液E20mMHepes-KOHpH7.9、1000mMKCl、0.2mMEDTA、10グリセロール、及び1mMDTTで樹脂を2回洗浄すること以外は基本的に文献TheJournalofbiologicalchemistry27775407545記載のとおりに、抗Flag-M2親和性樹脂SIGMA社製を使用して、前述の全細胞溶解物からFlag-hnRNPA1タンパク質を精製した。H492-dysEx31mプラスミド及びFlag-SRp30cプラスミドを、リポフェクタミン2000インビトロジェン社製を用いてコトランスフェクションし、H492-dysEx31mFlag-SRp30c/Helaを得た。また、H492-dysEx31mプラスミド及びFlag-SRp75プラスミドを、リポフェクタミン2000インビトロジェン社製を用いてコトランスフェクションし、H492-dysEx31mFlag-SRp75/Helaを得た。さらに、H492-dysEx31mプラスミド及びFlag-hnRNPA1プラスミドを、リポフェクタミン2000インビトロジェン社製を用いてコトランスフェクションし、H492-dysEx31mFlag-hnRNPA1プラスミド/Helaを得た。これらの各形質転換細胞について、前述の実施例1のミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析1と同様のスプライシング解析を行った結果を図3cに示す。図3cの一番左のレーンはマーカーを示し、左から2番目のレーンmockは、H492-dysEx31m/Hela由来のトータルRNAをテンプレートとした結果を示し、左から3番目のレーンSRp30c/SRSF9は、H492-dysEx31mFlag-SRp30c/Hela由来のトータルRNAをテンプレートとした結果を示し、右から2番目のレーンSRp75/SRSF4は、H492-dysEx31mFlag-SRp75/Hela由来のトータルRNAをテンプレートとした結果を示し、一番右のレーンhnRNPAは、H492-dysEx31mFlag-hnRNPA1プラスミド/Hela由来のトータルRNAをテンプレートとした結果を示す。また、図3cのバンド濃度を定量して、エクソン31を含むmRNAに対するエクソン31がスキッピングされたmRNAの割合Exonskipinclusionratio:エクソンスキップ/インクルージョンレシオを算出した結果を図3dに示す。図3c及びdの結果から分かるように、SRp30c/SRSF9が過剰発現している場合図3c及びdのSRp30c/SRSF9は、コントロールの場合図3c及びdのmockと比較して、エクソンスキップ/インクルージョンレシオが有意に低下した。他方、hnRNPA1が過剰発現している場合図3c及びdのhnRNPA1は、コントロールの場合図3c及びdのmockと比較して、エクソンスキップ/インクルージョンレシオが有意に上昇した。なお、他のコントロールとして、SRタンパク質の他のメンバーであるSRp75/SRSF4Molecularandcellularbiology1340234028を用いた場合図3c及びdのSRp75/SRSF4は、コントロールの場合図3c及びdのmockとエクソンスキップ/インクルージョンレシオは変わらず、スプライシングパターンに変化はなかった。以上の結果から、ジストロフィンエクソン31は、SRp30c/SRSF9依存性ESEを含み、このESEが変異し、hnRNPA1に結合するESSに変わることで、エクソン31スキッピングが起きていることが強く示唆された。[H492-dysEx31m/Helaの変異型エクソン31のスキッピングに対するTG003の効果]本発明者らは、ジストロフィン遺伝子のエクソン31のスキッピングを促進し得る低分子化合物を見つけるために、様々な低分子化合物を探索した。その代表例として、以下には、TG003とSRPIN340についての結果を記載する。TG003及びSRPIN340はいずれも、オルタナティブスプライシングに影響する低分子化合物として知られている。SRPIN340は、SR蛋白キナーゼSRPKsProcNatlAcadSciUSA1031132911333に対する特異的阻害剤であり、恐らくSRPKによるSRタンパク質のリン酸化阻害を通じて、オルタナティブスプライシングを調節することができるBiochemJ4171527GenomeBiol10242。もう一つは、TG003と命名したClkキナーゼの阻害剤である。TG003は、アデノウイルスE1A、SC35、及びClk自体非特許文献12及び13のオルタナティブスプライシングに影響することも明らかにされている。ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析3H492-dysEx31m/Hela変異型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたHela細胞を、30μMのTG003を含むDMSO溶液又は30μMのSRPIN340を含むDMSO溶液中で24時間インキュベートした。ネガティブコントロールとしてDMSO溶液を用いて同様にインキュベートした。インキュベートした各細胞について、前述の実施例1のミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析1と同様のスプライシング解析細胞抽出したトータルRNAを用いたRT-PCR解析を行った結果を図4aに示す。図4aの一番左のレーンは、φX174-HaeIIIで消化したDNAサイズマーカーを示し、左から2番目のレーンDMSOは、H492-dysEx31m/HelaをDMSO処理した場合の結果を示し、左から3番目のレーンTG003は、H492-dysEx31m/HelaをTG003処理した場合の結果を示し、一番右のレーンSRPIN340は、H492-dysEx31m/HelaをSRPIN340処理した場合の結果を示す。また、図4aのバンド濃度を定量して、エクソンスキップ/インクルージョンレシオを算出した結果を図4bに示す。図4a及びbの結果から分かるように、SRPIN340処理した場合図4a及びbのSRPIN340は、コントロールの場合図4a及びbのDMSOとほとんど変わらないエクソンスキップ/インクルージョンレシオを示したが、TG003処理した場合図4a及びbのTG003は、コントロールの場合図4a及びbのDMSOと比較して、エクソンスキップ/インクルージョンレシオが有意に上昇した。すなわち、SRPIN340はエクソン31のスキッピングには殆ど影響しないが、TG003は、エクソン31のスキッピングを有意に促進することが示された。ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析4ミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析3の結果からは、TG003が、変異型エクソン31のスキッピングだけでなく、野生型エクソン31のスキッピングをも促進する可能性もあった。そこで、H492-dysEx31m/Hela変異型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたHela細胞と共に、H492-dysEx31w/Hela野生型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたHela細胞を用いて、前述のミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析3と同様の方法でスプライシング解析を行った。なお、細胞を処理する溶液としては、種々の濃度0μM、5μM、10μM、20μM、30μM、50μMのTG003を含むDMSO溶液を用いた。その結果を図4cに示す。また、図4cのバンドの濃度を定量して、エクソンスキップ/インクルージョンレシオを算出した結果を図4dに示す。図4c及びdの結果から分かるように、H492-dysEx31m/Hela変異型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたHela細胞では、TG003はエクソン31のスキッピングを用量依存的に促進した。一方、H492-dysEx31w/Hela野生型ミニ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションしたHela細胞では、TG003が50μMであっても、エクソン31のスキッピングを起こさず、図4dのグラフでは横軸にほとんど沿う結果となった。これらの結果より、TG003は、野生型エクソン31ではエクソンスキッピングを促進せず、変異型エクソン31のエクソン31のスキッピングを特異的に促進することが示された。[H492-dysEx27m/Helaの変異型エクソン27のスキッピングに対するTG003の効果]TG003が、ジストロフィン遺伝子のエクソン31以外のエクソンの変異に対してもスキッピングを促進させる効果を発揮するか否かを確認するために、KUCG797の患者とは別の筋ジストロフィー患者由来のジストロフィン遺伝子の変異を解析した。この患者のジストロフィン遺伝子の変異はエクソン27に認められた。この変異は、ジストロフィンcDNA配列番号1の3613番目のグアニンヌクレオチドが欠失したものであるc.3613delG。この変異は、ジストロフィンcDNA配列番号1の読み枠をシフトさせるアウトオブフレーム変異であり、その結果、その変異の少しC末端側ジストロフィンcDNA配列番号1の3641番目から3643番目のヌクレオチド部分にストップコドン終止コドンを生じさせる。本明細書の背景技術に記載の読み枠ルールにしたがえば、この症例ではジストロフィンが産生されず、重篤なDMDとなることがその遺伝子型から予想されたが、実際の症状はそれより軽症であった。この患者のゲノムDNAから、ジストロフィン遺伝子の変異型エクソン27とその両側の隣接イントロン領域とを含む断片をPCRで増幅した。プライマーとして、イントロン26fNheIGCGGCTAGCAAATTTATGGAAGAGACTGGAGTTCA:配列番号6、及び、イントロン27rBamHIGCGGGATCCCAAGTTAAGCAAATGGCCCAAA:配列番号7を使用した。この増副産物をNheINewEnglandBiolabs社製、及び、BamHIで消化した断片を、それら両酵素で消化したH492ベクターに挿入した。これにより、この患者由来の変異型エクソン27とその両側の隣接イントロン領域とを含む断片を含むプラスミドH492-dysEx27mを構築した。また、健常者のゲノムDNAを利用した同様の方法により、ジストロフィン遺伝子の野生型エクソン27と、その両側の隣接イントロン領域とを含む断片を含むプラスミドH492-dysEx27wを構築した。H492-dysEx27mプラスミド及びH492-dysEx27wプラスミドのいずれも、プラスミドの全配列の決定を行い、目的断片が含まれていることを確認した。前述のミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析1における方法と同様の方法で、H492-dysEx27m、及び、H492-dysEx27wを、Hela細胞にそれぞれトランスフェクションし、H492-dysEx27m/Hela、及び、H492-dysEx27m/Helaを得た。H492-dysEx31m/Hela、及び、H492-dysEx31m/Helaに代えて、H492-dysEx27m/Hela、及び、H492-dysEx27m/Helaをそれぞれ用いたこと以外は、前述のミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析4における方法と同様の方法でスプライシング解析を行った。その結果を図5aに示す。また、図5aのバンドの濃度を定量して、エクソンスキップ/インクルージョンレシオを算出した結果を図5bに示す。図5a及びbの結果から分かるように、変異型エクソン27を利用したH492-dysEx27m/Helaでは、TG003はそのエクソン27のスキッピングを用量依存的に促進した。一方、野生型エクソン27を利用したH492-dysEx27w/Helaでは、TG003が50μMであっても、エクソン27のスキッピングを起こさず、図5bのグラフでは横軸にほとんど沿う結果となった。すなわち、TG003は、野生型エクソン27ではエクソンスキッピングを促進せず、変異型エクソン27のエクソン27のスキッピングを特異的に促進することが示された。これらの結果より、TG003は、変異型エクソン31だけでなく、変異型エクソン27のスキッピングも促進することが明らかとなった。[KUCG797由来の細胞における、変異型エクソン31のスキッピングに対するTG003の効果]次に、ジストロフィン遺伝子のスプライシングに対してTG003が及ぼす影響を、患者KUCG797由来の筋細胞において調べることとした。KUCG797由来の筋細胞におけるスプライシング解析まず、KUCG797から採取した筋細胞について初代培養を行った。具体的には、以下のような方法で行った。6ウエルプレートGelatinCoatedmicroplate6wellwithLid;IWAKI社製中に、20のFBSGibco社製、4のUltroser登録商標GPALL社製及び1のAntibioticAntimyoticGibco社製をコンフルエントになるまで添加したダルベッコ変法イーグル培地DMEMSigma社製にて、患者由来の筋細胞を培養した。筋細胞を筋管に分化させるため、2ウマ血清Gibco社製及び1AntibioticAntimyoticGibco社製を添加したダルベッコ変法イーグル培地DMEMSigma社製において、種々の濃度1μM、2μM、5μM、7μM、10μMのTG003の存在下又は不在下で、前述の初代筋細胞を2週間培養した。培地とTG003は2日毎に入れ替えた。培養したこれらの筋細胞を用いて、スプライシング解析を行った。その方法としては、イントロン30f-NheI、及び、イントロン31r-BamHIの両プライマーに代えて、前述のフォワードc27f及びリバース2Fの両プライマーを用いたこと以外は、前述のミニ遺伝子を利用した、細胞におけるスプライシング解析3と同様の方法を用いた。前述のフォワードc27f及びリバース2Fの両プライマーは、ジストロフィン遺伝子のエクソン27から32に至る領域を増幅するプライマーセットである。かかるスプライシング解析の結果を図6aに示す。また、図6aのバンドの濃度を定量して、エクソンスキップ/インクルージョンレシオを算出した結果を図6bに示す。図6a及びbの結果から分かるように、KUCG797由来の筋細胞を用いた場合であっても、TG003はエクソン31のスキッピングを用量依存的に促進した。これらの結果から、TG003は、患者細胞の変異型エクソン31のスキッピングを促進し得ることが示唆され、さらには、ジストロフィンの機能がある程度残存したトランケート型ジストロフィンの発現を増加させ得ることも強く期待された。KUCG797由来の筋細胞におけるトランケート型ジストロフィンの発現解析前述のKUCG797由来の筋細胞において、実際にトランケート型ジストロフィンが発現しているかどうかを確認するために、以下のウエスタンブロッティング解析を行った。2ウマ血清Gibco社製及び1AntibioticAntimyoticGibco社製を添加したダルベッコ変法イーグル培地DMEMSigma社製において、前述のKUCG797由来の初代筋細胞を、7μMのTG003の存在下又は不在下で2週間培養した。培地とTG003は2日毎に入れ替えた。培養したこれらの筋細胞をPBSで2回洗浄し、1XCellLysisBufferCellSignalingTechnology社製を用いて回収した。回収した細胞から抽出した総タンパク質を3~10勾配ポリアクリルアミドゲルPAGEL、ATTO社製にアプライした。なお、総タンパク質のアプライ量としては、コントロールについては4μg、変異TG0030μMについては20μg、変異TG0037μMについては60μgとした。ポリアクリルアミドゲルで泳動したタンパク質画分をHYBONDPメンブレンGEHealthcare社製にトランスファーした。ECLadvanceWesternBlottingDetectionkitGEHealthcare社製を製造者マニュアルに従って使用し、前述のメンブレンについてウエスタンブロッティング解析を行った。ジストロフィンのC末端に対する抗体NCL-DYS2、Leica社製、又は、ジストロフィンのエクソン31に対応する部分に対する抗体8H11、SantaCruz社製を、それぞれ1:10及び1:100の希釈倍率にて使用し、前述のメンブレンのインキュベーションを行った。ジストロフィン抗ジストロフィン免疫複合体の検出には、抗マウスIgG抗体GEHealthcare社製を用いた。上述したものと同じプロトコールによって、デスミンのウエスタンブロッティング解析を行った。デスミン抗体H-76、SantaCruz社製は希釈倍率1:50で使用した。デスミン抗デスミン免疫複合体の検出には、抗ウサギIgG抗体GEHealthcare社製を用いた。以上のウエスタンブロッティング解析の結果を図6cに示す。ジストロフィンのC末端に対する抗体を用いた結果Dystrophinから分かるように、TG003を投与すると、ジストロフィンの発現が増加することが示された。ただし、このジストロフィンは、エクソン31に対応する部分に対する抗体では検出できなかったことから図6のDystrophinの結果、このジストロフィンでは、エクソン31に対応する部分エクソン31にコードされるペプチドが欠失していると考えられる。以上の結果から、TG003は、c.4303G>T変異を有するKUCG797由来の細胞においてエクソン31スキッピングを促進することにより、トランケート型ジストロフィンの発現を促進することが示された。