"有効量のhVEGFアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む、浮腫を有する哺乳動物の治療方法。発明の詳細な説明本発明は、hVEGFの一または複数の生物学的活性を阻止、封鎖又は中和し得るhVEGFのアンタゴニストを提供する。hVEGFのアンタゴニストは、hVEGFと細胞レセプターの結合を妨げ、hVEGFによって活性化されている細胞を無能力化もしくは死滅させ、またはhVEGFと細胞レセプターの結合後に血管内皮細胞活性化を妨げることによって作用する。hVEGFアンタゴニストによるかかる介入点は全て、本発明の目的に対しては等価であると考えるべきである。よって、hVEGF、hVEGFレセプターまたはhVEGFレセプターと会合したhVEGFを含む複合体と結合する抗体、モノクロール抗体及びヒト化抗体、またはそれらのフラグメントが本発明の範囲内に含まれる。更に、hVEGFレセプターと結合するが天然hVEGFの生物学的活性を示さないhVEGFのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体も本発明の範囲内に含まれる。さらに、hVEGFを結合し得るhVEGFレセプターおよびそれらのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体も本発明の範囲内に含まれる。ここで使用するhVEGFという用語は、リュング等、Science24613061989年、及びフック等、Mol.Endocrin.518061991年に記載されているような、165-アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子、および関連のある121-、189-および206-アミノ酸血管内皮細胞増殖因子と、これら増殖因子の天然に生じる対立遺伝子体およびプロセシングを受けた形態を意味する。ここで使用するhVEGFレセプターまたはhVEGFrという用語は、hVEGFの細胞レセプターで、通常は血管内皮細胞に見られる細胞表面レセプター、並びにhVEGFを結合する能力を保持しているそれらのフラグメントと変異体を意味する。典型的には、hVEGFアンタゴニストであるhVEGFレセプターおよびそれらのフラグメント及び変異体は、天然での場合のように細胞膜中に組み入れられるかまたは細胞表面に固定されているというよりむしろ単離された形態であろう。hVEGFレセプターの一例は、fms様チロシンキナーゼflt又はflt-1、即ちチロシンキナーゼ属の膜貫通レセプターである。デブリーズDeVries等、Science2559891992年;シブヤShibuya等、Oncogene55191990年。全長fltレセプターは、チロシンキナーゼ活性を持つ細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含んでいる。細胞外ドメインはhVEGFの結合に関与しているが、細胞内ドメインはシグナル伝達に関与している。hVEGFレセプターのもう一つの例はflk-1レセプターKDRとも称されるである。マシューズMatthews等、Proc.Nat.Acad.Sci.8890261991年;ターマンTerman等、Oncogene616771991年;ターマン等、Biochem.Biophys.Res.Commun.18715791992年。hVEGFとfltレセプターの結合によって、見かけ上の分子量が205000と300000ダルトンである少なくとも2つの高分子量複合体が形成される。300000ダルトンの複合体はhVEGFの1分子にレセプター2分子が結合したものを含む二量体であると考えられる。hVEGFrの変異体も本発明の範囲内に含まれる。代表的な例には、少なくとも膜貫通および細胞質ドメインが全長レセプター分子から欠失しているレセプターの切断型、および非hVEGFrポリマーまたはポリペプチドがhVEGFrと抱合している融合タンパク質、または好ましくはそれらの切断型が含まれる。このような非hVEGFポリペプチドの例は免疫グロブリンである。その場合には、例えば、hVEGFrの細胞外ドメイン配列は免疫グロブリン軽鎖または好ましくは重鎖のFvドメインと置換しており、レセプターの細胞外ドメインのC末端は重鎖のCH1、ヒンジ、CH2または他のフラグメントのアミノ末端と共有結合している。このような変異体は既知のイムノアドヘシンと同じようにして製造される。例えば、ガスコインGascoigne等、Proc.Nat.Acad.Sci.8429361987年;カポンCapon等、Nature3375251989年;アルフォAruffo等、Cell6113031990年;アシュケナジAshkenazi等、Proc.Nat.Acad.Sci.88105351991年;ベネットBennett等、J.Biol.Chem.266230601991年参照。種々のflt-IgG融合タンパク質の例を以下の実施例3に記載する。本発明において使用を意図しているhVEGFレセプターの細胞外ドメインの切断された形態には、ECDフラグメント例えば、欠失したECD配列において一又は複数のアミノ酸を有するもの及び欠失したECDにおいて一又は複数の免疫グロブリン様ドメインを有するECD形態のものが含まれる。例えば、実施例3Bには、Fc-IgGに融合したfltの最初の3つの免疫グロブリン様ドメインのみを含有する切断された形態のECDが記載されている。好ましくは、アンタゴニスト分子の作製に使用される切断された形態のECDは、hVEGFに対する所望の結合を確実にするのに十分な免疫グロブリン様ドメインを含む。他の実施態様では、hVEGFr又はそれらのフラグメント又は変異体は、ポリエチレングリコールPEGのような非タンパク様ポリマー例えば、デービスDavis等、米国特許第4179337号;グッドソンGoodson等、BioTechno1ogy83433461990年;アバチョウスキーAbuchowski等、J.Biol.Chem.25235781977年;アバチョウスキー等、J.Biol.Chem.25235821977年参照または炭水化物例えば、マーシャルMarshall等、Arch.Biochem.Biophys.167771975年参照と抱合している。これは、hVEGFrの生物学的半減期を延ばし、レセプターが投与される哺乳動物で免疫原性である可能性を減少させるのに役立つ。hVEGFrは、アンタゴニストの親和性およびhVEGFに対するその原子価を考慮して、hVEGFの抗体と実質的に同じ態様で使用される。hVEGFレセプター自体または免疫グロブリンポリペプチドもしくは他の担体ポリペプチドと融合したhVEGFレセプターの細胞外ドメイン配列は、宿主中に存在しているが細胞表面のhVEGFrと結合していないhVEGFを隔離する能力によって、hVEGFのアンタゴニストとして特に有用である。hVEGFrとそのフラグメント及び変異体は、hVEGFのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するスクリーニングアッセイにも有用である。例えば、hVEGFr例えば、fltまたはflk-1をコードするDNAでトランスフェクションされた宿主細胞は細胞表面でレセプターポリペプチドを過剰発現し、このような組換え体宿主細胞を、試験化合物例えば、小分子、線形もしくは環状ペプチドまたはポリペプチドのhVEGFrとの結合能の分析に理想的に適したものとする。hVEGFrおよびhVEGFr融合タンパク質、例えばhVEGFr-IgG融合タンパク質は類似の態様で使用することができる。例えば、融合タンパク質を固定支持体に結合させ、試験化合物が融合タンパク質のhVEGFrドメインから放射標識hVEGFを追い出す能力を測定する。hVEGF、hVEGFレセプター、抗体または他のタンパク質に関して使用される用語組換え体は、宿主細胞中で組換え体DNA発現によって産生されるタンパク質を意味する。宿主細胞は原核細胞例えば、大腸菌のような細菌細胞または真核細胞例えば、酵母または哺乳動物細胞でありうる。アンタゴニスト抗体ここで使用するモノクローナル抗体という用語は実質的に同種の抗体集団から得られる抗体、即ち、少量で存在することがある天然に生じうる突然変異を除いて、特異性および親和性が同一の集団を構成する個々の抗体を意味する。このような天然に生じる突然変異等の結果として、hVEGF、hVEGFrまたはhVEGFrと会合したhVEGFを含む複合体hVEGF-hVEGFr複合体と特異的に結合し得る抗体を主として含有する本発明のモノクローナル抗体組成物は少量の他の抗体も含有する可能性があることは理解されなければならない。よって、モノクローナルという修飾語は、このような実質的に同種の抗体集団から得られるような抗体の特徴を示すものであって、何か特別の方法で抗体が産生されることを要求していると考えるべきでない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、最初にコーラーKohlerおよびミルスタインMilstein、Nature2564951975年に記載されたハイブリドーマ方法を使用して製造することができ、または組換えDNA方法によって製造することができる。カビリCabilly等、米国特許第4816567号を参照されたい。ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適当な宿主動物を皮下、腹腔内、または筋肉内経路で抗原を用いて免疫化して、免疫化に使用されたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘引する。或いは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次に、リンパ球はポリエチレングリコールのような適当な融合剤を使用してミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成させる。ゴーディングGoding、モノクローナル抗体:原理と実際、59103頁AcademicPress、1986年。抗原はhVEGF、hVEGFr、またはhVEGF-hVEGFr複合体でありうる。抗原は、場合によってはhVEGFとそのレセプターの1つとの結合に関与する一又は複数のアミノ酸残基を有するhVEGFまたはhVEGFrのいずれか1つのフラグメントまたは部分又は変異体である。例えば、hVEGFrの細胞外ドメイン配列例えば、少なくとも膜貫通および細胞内ドメインを欠失している切断hVEGFrポリペプチドによる免疫化は、hVEGF結合に関与しているのが細胞外ドメイン内の領域であるので、hVEGFのアンタゴニストである抗体を産生するのに特に有用であろう。hVEGF-hVEGFr複合体と結合し得るモノクローナル抗体は、特に非会合非複合化hVEGFおよびhVEGFrにも結合しないならば、有用である。よって、このような抗体はhVEGFによって直ぐに活性化を受ける細胞と結合するだけで、従って哺乳動物中に通常見られるような遊離のhVEGFまたはhVEGFrでは隔絶されない。このような抗体は、典型的には、レセプターとhVEGF間の一または複数の接触点に及ぶエピトープと結合する。このような抗体は他のリガンドレセプター複合体に対して産生されており、ここで同じ態様で産生させることができる。これらの抗体は、抗体が非会合hVEGFまたはhVEGFrと結合し得るか否かに拘わらず、非会合hVEGFもしくはhVEGFrの生物学的活性を中和または阻止する必要はなく、中和または阻止することもできない。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻止する一又は複数の物質を好ましくは含有する適当な培養培地に接種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼHGPRTまたはHPRTを欠いている場合、ハイブリドーマ用の培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有しHAT培地、これら物質がHGPRT欠損細胞の増殖を阻止する。好ましいミエローマ細胞は効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル発現を支援し、HAT培地のような培地に感受性であるものである。これらのなかで、好ましいミエローマ細胞株はネズミミエローマ株、例えば、米国カリフォルニア州サンジエゴのソークインスチチュートセルディストリビューションセンターSalkInstituteCellDistributionCenterから入手できるMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍、米国バージニア州マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手できるSP-2細胞、およびイエルトンYelton等がCurr.Top.Microbiol.Immunol.8111978年に記載したP3X63Ag8U.1細胞から誘導されるものである。ヒトミエローマおよびマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生に対して記載されている。コズボルKozbor、J.Immunol.13330011984年;ブロデュアBrodeur等のモノクローナル抗体産生技術と応用、5163頁MarcelDekker,Inc.ニューヨーク、1987年。ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降法またはインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイRIAまたは酵素結合免疫吸着検定法ELISAによって測定される。本発明のモノクローナル抗体は、hVEGF、hVEGFrもしくはhVEGF-hVEGFr複合体を優先的に免疫沈降させるかまたは結合アッセイで上記抗原の少なくとも1つと優先的に結合し、hVEGFの生物学的活性を阻止し得るものである。ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性および活性のアンタゴニスト抗体を産生することを確認した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化し、標準的方法で増殖させることができる。ゴーディング、モノクローナル抗体:原理と実際、59104頁AcademicPress、1986年。この目的に適する培地には、例えば、ダルベッコの修正イーグル培地またはRPMI-1640培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。サブクローンが分泌したモノクローナル抗体は、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーのような慣用の免疫グロブリン精製方法を使用して培地、腹水または血清から適切に分離される。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは容易に単離されそして常套的な方法を使用して例えば、ネズミ抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して配列が決定される。本発明のハイブリドーマ細胞はこのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されると、DNAを発現ベクター中に入れ、次にこれをシミアンCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、または免疫グロブリンタンパク質を産生等しないミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクションして組換え体宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得る。場合によっては、発現によって産生される免疫グロブリンの特性を変えるためにDNAを修飾することができる。例えば、ネズミ抗体のヒト型化形態は、ネズミ抗体可変ドメインの相補性決定領域CDRをヒト抗体の対応する領域で置換することによって産生される。或る実施態様では、ネズミ抗体の選択されたフレームワーク領域FRアミノ酸残基がまたヒト抗体中の対応するアミノ酸残基で置換される。カーターCarter等、Proc.Nat.Acad.Sci.8942851992年;カーター等、BioTechno1ogy101631992年。ネズミ抗体のキメラ形態も、選択したヒト重および軽鎖定常ドメインのコード化配列を同種ネズミ配列の代わりに置換して産生される。カビリ等、米国特許第4816567号;モリソンMorrison等、Proc.Nat.Acad.Sci.8168511984年。本発明において使用が考えられる特定のヒト化抗体には、公開されたPCT出願WO98/453311998年10月15日公開及びWO98/453321998年10月15日公開に記載されているヒト化及び親和成熟抗hVEGF抗体が含まれる。このようなヒト化又は親和成熟抗VEGF抗体はWO98/45331及びWO98/45332に記載されている方法と技術を使用して調製され又は作製されうる。好ましくは、抗hVEGF抗体は、上述したPCT出願において、YO317と命名された親和成熟抗体、又はFab-12と命名されたヒト化Fabを含む。図14A-B及び15A-Bは、YO192;YO238-3;YO239-19;YO313-2;YO243-1;及びYO313-1と命名された他の親和成熟抗VEGF抗体と共に、これらの抗VEGF抗体のアミノ酸配列軽及び重鎖を示している。このような抗VEGF抗体は全てここで記載した方法での使用が考えられるものである。これらのPCT出願に開示されているように、いくつかのヒト化及び親和成熟抗体は異なる種類のインビトロアッセイにおいてVEGF活性を低減又は阻害し、よってVEGFアンタゴニストとして作用することが示された。よって、本発明の範囲内に含まれる抗体には、hVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体、並びに非hVEGFエピトープと結合し得る免疫グロブリン鎖を有するキメラヒト化型を含む抗体およびハイブリッド抗体のような変異体抗体が含まれる。ここでの抗体には、全ての起源種、並びに免疫グロブリンクラス例えば、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMおよびサブクラス、並びに抗体フラグメント例えば、Fab、Fab’2、およびFvが、hVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体と結合可能であり、hVEGFの生物学的活性と拮抗し得る限り、含まれる。本発明の好ましい実施態様では、抗体は、例えば、ムンソンMunsonおよびポラードPollard、Anal.Biochem.1072201980年のスカッチャード分析によって測定して、免疫化抗原に対して少なくとも約109リツトル/モルの親和性を有する。さらに、モノクローナル抗体は典型的には、例えば、WO98/45331及びWO98/45332に記載されたような、又は実施例2に記載されるようなインビトロ細胞生存または増殖アッセイによって測定して、hVEGFの細胞分裂促進活性または脈管形成活性を少なくとも約50、好ましくは80を越えて、そして最も好ましくは90を超えて阻止する。或る治療上および診断上の応用に対しては、モノクローナル抗体がhVEGFの異なる分子形態の全てよりもより少ないものと反応性であることが望ましい。例えば、165-アミノ酸配列hVEGFとは特異的に結合できるが121-または189-アミノ酸配列hVEGFポリペプチドとは結合できないモノクローナル抗体を有することが望ましい。このような抗体は異なったhVEGFポリペプチドの比較ELISAアッセイまたは比較免疫沈降法によって容易に同定される。細胞毒性部分との抱合体或る実施態様では、hVEGF特異的モノクローナル抗体またはhVEGFrと抱合した細胞毒性部分を提供することが望ましい。これらの実施態様では、細胞毒素はhVEGFもしくはそのレセプターを発現または結合している細胞を無力化するかまたは死滅させるのに役立つ。hVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体と結合し得るドメインによって抱合体が細胞に標的とされる。しかして、hVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体と結合できるモノクローナル抗体が細胞毒素と抱合させられる。同様に、hVEGFrが細胞毒素と抱合させられる。モノクローナル抗体は最も望ましくは、hVEGF単独細胞毒素を有していないの活性を中和できるが、この実施態様ではモノクローナル抗体またはレセプターがhVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体ともはや結合できる必要はない。或るクラスの免疫グロブリンの場合には、モノクローナル抗体自体のFcドメインが細胞毒素を提供するようになることがある例えばIgG2抗体の場合には、該抗体は補体を固定し、抗体依存性細胞毒性ADCCに関与することができるが、典型的には、細胞毒素はタンパク質細胞毒素、例えばジフテリア、リシンまたはシュードモナス毒素である。しかしながら、細胞毒素はタンパク質様である必要はなく、例えば腫瘍治療用にこれまでに使用されている化学療法剤を含めることができる。細胞毒素は典型的には、抗体のFcドメイン内でまたはFcドメインの一部もしくは全ての代わりに骨格のアミド結合によってモノクローナル抗体またはそのフラグメントと結合する。標的化機能がhVEGFrによって提供される場合、細胞毒性部分はhVEGF結合に関与しないレセプターの任意のドメイン上に置換され;好ましくは、該部分はレセプターの膜貫通および/または細胞質ドメインの代わりまたは該ドメイン上に置換される。最適な置換部位は日常的な実験によって決定され、十分に通常の技量の範囲内である。タンパク質融合体である抱合体は、抱合体をコードする遺伝子を発現させることによって組換え体細胞培養物中で容易に作成される。或いは、抱合体は、例えば、イミノチオレートやメチル-4-メルカプトブチリマデートを使用して、チオエステル結合によるジスルフィド交換または結合のようなそれ自体既知の方法を使用して、細胞毒性部分を抗体またはレセプターのアミノ酸残基側鎖またはC末端カルボキシルに共有的に交差結合させて製造される。他の部分との抱合体hVEGFのアンタゴニストであるモノクローナル抗体およびhVEGFrもまた、それら自体では細胞毒素として容易には分類されないが、ここでの組成物の活性を増す物質と抱合される。例えば、hVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体と結合し得るモノクローナル抗体またはhVEGFrは、ウイルス配列のような異種ポリペプチド、細胞レセプター、TNF、インターフェロンまたはインターロイキンのようなサイトカイン、凝血促進活性を有するポリペプチドおよび他の生物学的または免疫学的に活性なポリペプチドと融合される。このような融合体は組換え方法によって容易に製造される。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは抗hVEGFもしくは抗hVEGF-hVEGFr複合体抗体の定常ドメイン、またはhVEGFrの膜貫通および/または細胞内ドメインに置換される。或いは、それらは、ここに記載した抗hVEGF抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換される。好ましい実施態様では、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、ここに記載した抗体の定常ドメインと結合されるかまたはそれらに置換される。ベネット等、J.Biol.Chem.26623060230671991年。或いは、上記ポリペプチドは本発明の抗体のFvに置換され、hVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体に対して特異性を有する少なくとも1つの残存抗原結合部位、および出発抗体とは異なる機能または特異性を有する代用抗原結合部位を含むキメラ多価抗体が創製される。異種特異性抗体hVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体と結合し得るモノクローナル抗体は、列挙したエピトープ、典型的には1つの重-軽鎖複合体またはそのフラグメントに対して1つの結合部位を有してさえいれば良い。しかしながら、このような抗体は、場合によってはhVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体のいずれの内部にも見られないエピトープと結合し得る抗原結合ドメインも有している。例えば、hVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体以外の抗原に対して特異性を有する抗体の相補性決定残基および、必要ならば、フレームワーク残基で、天然の抗hVEGF、抗hVEGFrまたは抗hVEGF-抗hVEGFr複合体抗体の対応するアミノ酸配列またはアミノ酸残基を置換することによって、hVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体に対して特異性を有する1つの抗原結合部位と非hVEGF、hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体抗原に対して特異性を有するもう1つの抗原結合部位を含む多特異的抗体が創製される。これらの抗体は少なくとも二価であるが、選択される抗体クラスに所有されている抗原結合部位の数に応じて、多価であることもできる。例えば、IgMクラスの抗体は多価である。本発明の好ましい実施態様では、このような抗体はhVEGFまたはhVEGFrエピトープと、aプロテインCもしくは組織因子のような血液凝固に活性のポリペプチド、b腫瘍壊死因子TNFのような細胞毒性タンパク質、またはcCD4もしくはHER-2レセプターのような非hVEGFr細胞表面レセプターのいずれかと結合することができるマッドンMaddon等、Cell42931985年;コーセンスCoussens等、Science23011371985年。異種特異性の多価抗体は、宿主細胞を両抗体の重鎖および軽鎖をコードするDNAで同時形質転換させ、その後免疫アフィニティークロマトグラフィ等によって回収して簡便に製造され、発現された抗体の部分は所望の抗原結合特性を有している。或いは、このような抗体は単一特異性抗体のインビトロ組換えによって製造される。一価抗体hVEGFrまたはhVEGF-hVEGFr複合体と結合し得る一価抗体はhVEGFのアンタゴニストとして特に有用である。本発明を如何なる特定の生物学的活性のメカニズムにも限定するものではないが、細胞hVEGFレセプターの活性化は、hVEGFと細胞hVEGFレセプターとの結合がレセプターの凝固を誘発し、ついで細胞内レセプターキナーゼ活性を活性化するというメカニズムで進行すると考えられる。一価の抗hVEGFレセプター抗体はこのような凝固を誘発できず、それ故上記メカニズムによってhVEGFレセプターを活性化できないので、上記抗体はhVEGFの理想的なアンタゴニストである。しかしながら、これらの抗体はレセプターのhVEGF結合部位を指向するかまたはそうでない場合、hVEGFレセプターと結合するhVEGFを、例えばレセプターに対するhVEGFの接近を立体的に障害することによって、妨げることが可能でなければならないことに注意すべきである。しかしながら、本願明細書の他の場所で記載したように、hVEGFの結合を妨げることができない抗hVEGFr抗体は、非免疫グロブリン部分、例えば細胞毒素と抱合したとき有用である。一価抗体の調製方法は当該分野で良く知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖および修飾した重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般に重鎖架橋を防止するようにFc領域の任意の点で切断される。或いは、関連システイン残基は、架橋を防止するようにもう一つのアミノ酸残基で置換されるかまたは欠失される。インビトロ方法もまた一価抗体の調製に適している。例えば、Fabフラグメントは無傷の抗体の酵素開裂によって調製される。診断用途診断適用では、本発明の抗体またはhVEGFrは典型的には検出可能部分で標識される。検出可能部分は、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に作りだすことができる任意のものでありうる。例えば、検出可能部分は、3H、14C、32P、35Sもしくは125Iのような放射性同位元素、蛍光イソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリンのような蛍光または化学ルミネセンス化合物、例えば125I、32P、14Cもしくは3Hのような放射性同位元素標識、またはアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼもしくは西洋わさびペルオキシダーゼのような酵素でありうる。抗体またはhVEGFrを検出可能部分と別個に抱合させる当該分野で既知の任意の方法を使用することができ、これらの方法にはハンターHunter等、Nature1449451962年;デービッドDavid等、Biochemistry1310141974年;ペインPain等、J.Immunol.Meth.402191981年;およびニグレンNygren、J.Histochem.andCytochem.304071982年に記載されている方法が含まれる。本発明の抗体およびレセプターは既知の任意のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイを使用することができる。ゾラZola、モノクローナル抗体:技術マニュアル、147158頁CRCPress,Inc、1987年。競合結合アッセイは標識された標準これはhVEGFまたはその免疫学的反応性部分でありえるの一定量の抗体と結合する試験試料分析物hVEGFとの競合能力に依拠している。試験試料中のhVEGF量は、抗体またはレセプターと結合されることになる標準品の量に逆比例する。結合されることになる標準品の量の測定を促進するために、抗体またはレセプターは一般に競合前後に不溶化されるので、抗体またはレセプターと結合する標準品およびアナライトは結合していない標準品およびアナライトから便宜的に分離することができる。サンドイッチアッセイは、検出すべきタンパク質の異なった免疫原性部分またはエピトープとそれぞれ結合し得る2つの抗体またはレセプターを使用することを含む。サンドイッチアッセイでは、試験試料分析物は固形支持体上に固定されている第1の抗体またはレセプターによって結合され、その後第2の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の3つの部分からなる複合体を形成する。デービッドおよびグリーンGreene、米国特許第4376110号。第2の抗体またはレセプターはそれ自体検出可能部分で標識されうるか直接的サンドイッチアッセイ、検出可能部分で標識されている抗免疫グロブリン抗体を使用して測定することができる間接的サンドイッチアッセイ。例えば、サンドイッチアッセイの1つのタイプはELISAアッセイであり、その場合は、検出可能部分は酵素である。ここでの抗体またはレセプターはインビボ画像診断にも有用であり、検出可能部分で標識された抗体またはhVEGFrが患者の好ましくは血流に直接投与され、患者内の標識抗体またはレセプターの存在と位置がアッセイされる。この画像診断技術は、例えば、新生物の段階付けおよび治療に有用である。抗体またはhVEGFrは、核磁気共鳴であろうと、放射学であろうと、それとも当該分野で知られている他の検出手段であろうと、哺乳動物において検出可能である任意の部分で標識される。hVEGFのアンタゴニスト変異体ここに記載した抗体に加えて、hVEGFの他の有用なアンタゴニストには、hVEGFレセプターと結合するが天然hVEGFの生物学的活性を示さない天然hVEGFのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体が含まれる。例えば、このようなアンタゴニストには、hVEGFのレセプター結合ドメインを含むが生物学的活性を与えるドメインを欠いているかまたはそうでない場合、細胞hVEGFレセプターの活性化が不完全なフラグメントおよびアミノ酸配列変異体、例えば、細胞hVEGF-レセプターの凝集または活性化誘発能力を欠いているフラグメントまたはアミノ酸配列変異体の場合が含まれる。レセプター結合ドメインという用語は、hVEGFレセプター結合に関与するhVEGF中のアミノ酸配列を意味する。生物学的活性ドメインまたは生物学的活性付与ドメインという用語は、細胞分裂促進活性、脈管形成活性、又は血管透過活性のような、因子の特定の生物学的活性をもたらすhVEGF中のアミノ酸配列を意味する。hVEGFが細胞表面上の2つまたはそれ以上のhVEGFr分子と複合体を形成できるように思われるという知見は、hVEGFがhVEGFrへの少なくとも2つの別個の結合部位を有しており、成長ホルモン、プロラクチン等の態様で活性化が生じる前に、hVEGFが連続的な態様で、最初に1つの部位で、その後他の部位で上記細胞レセプターと結合することを示唆している例えば、カニングハムCunningham等、Science2648211991年;ディブオスdeVos等、Science2553061992年;フーFuh等、Science25616771992年を参照されたい。従って、hVEGFの1つのレセプター結合部位典型的にはhVEGFとhVEGFrの初期結合に関与している部位が修飾されないまま残っているまたは修飾されている場合、結合を高めるように変えられている一方、hVEGFの第2のレセプター結合部位が典型的には、該結合部位を無効にするために、非保存的アミノ酸残基置換または欠失で修飾されているhVEGFのアンタゴニスト変異体が選択される。hVEGF中のレセプター結合ドメインおよびhVEGFr中のhVEGF結合ドメインはX線試験、突然変異分析および抗体結合実験を含む当該分野で既知の方法によって測定される。突然変異方法には、逸脱突然変異体の選択と組み合わせた無作為飽和突然変異誘発および挿入突然変異誘発の技術が含まれる。リガンド内のレセプター結合ドメインの同定に適する他の方策はアラニンAlaスキャンニング突然変異誘発として知られている。カニングハム等、Science244、108119851985年。この方法は、荷電アミノ酸側鎖を含む領域の同定を含んでいる。同定された各領域中の荷電残基即ち、Arg、Asp、His、LysおよびGluはAlaで置換され突然変異体1分子当たり1つの領域、得られたリガンドのレセプター結合が試験されて、レセプター結合における特定の領域の重要性を評価する。レセプター結合ドメインを局在化させるさらに強力な方法は抗hVEGF抗体の中和の使用によるものである。キムKim等、GrowthFactors7531992年。通常、これら方法と類似方法を組み合せて、レセプター結合に関与するドメインの局在化に使用する。hVEGFに関して使用されるアミノ酸配列変異体という用語は、hVEGFの天然形態のアミノ酸配列と或る程度異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、アンタゴニストアミノ酸配列変異体は天然のhVEGFの少なくとも1つのレセプター結合ドメインと少なくとも約70の相同性を有しており、好ましくは天然hVEGFのレセプター結合ドメインと少なくとも約80、さらに好ましくは少なくとも約90の相同性を有している。アミノ酸配列変異体は、hVEGFレセプターと結合する能力を保持するその結果、hVEGFレセプターとの結合に関して天然hVEGFと競合するが、内皮細胞増殖、脈管形成または血管透過性のようなhVEGFの1つまたは複数の生物学的効果を誘発できないように、天然hVEGFのアミノ酸配列内の或る位置での置換、欠失および/または挿入を有している。相同性は、いかなる保存的置換も配列相同性パーセントの一部とはみなさずに、配列を整列させ、必要な場合には最大パーセントの相同性を達成するために間隙を導入した後に、天然hVEGFのレセプター結合ドメインのアミノ酸配列中の残基と同一であるアミノ酸配列変異体中の残基のパーセントとして定義される。整列の方法およびコンピュータープログラムは当該分野で良く知られている。一つのこのようなコンピュータープログラムはジェネンテックGenentechInc.の著作のAlign2であり、これは1991年12月10日に20559ワシントンDCの米国著作権庁に使用者用説明書と共に提出された。当業者であれば、日常的な技量を使用して、比較されている配列の長さにわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。置換変異体は、天然配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基を除去し、同じ位置の場所に別のアミノ酸が挿入されているものである。置換は単一で、分子中の一つのアミノ酸だけが置換されているか、多重で、2つもしくはそれより多いアミノ酸が同じ分子内で置換されている。挿入変異体は天然配列の特定の位置のアミノ酸に直ぐに隣接して挿入された一又は複数のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に直ぐに隣接するとは、アミノ酸のα-カルボキシまたはα-アミノ官能基のいずれかと結合することを意味する。欠失変異体は、天然配列の一又は複数のアミノ酸残基が除去されているものである。通常、欠失変異体は分子の特定の領域で1つまたは2つのアミノ酸残基が欠失している。hVEGFのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体は当該分野の既知の方法、例えば天然因子をコードするDNAの部位特異的突然変異誘発によって容易に製造される。突然変異DNAを適当な発現ベクター中に挿入し、ついで宿主細胞を組換えベクターでトランスフエクションする。組換え宿主細胞と適当な培地で増殖させ、その後宿主細胞で発現された所望のフラグメントまたはアミノ酸配列変異体をクロマトグラフィーまたは他の精製方法で組換え細胞培養物から回収する。或いは、当該分野で既知の他の等価な化学合成法を使用することができるが、hVEGFのフラグメントおよびアミノ酸変異体を、例えば、天然hVEGFのタンパク質分解によって、またはメリーフィールドMerrifieldJ.Am.Chem.Soc.8521491963年が記載した標準的な固相ペプチド合成方法を使用する合成によってインビトロで製造される。固相合成は、保護されたα-アミノ酸を適当な樹脂に結合させてペプチドのC末端から開始される。アミノ酸は、ペプチド結合の形成に対して当該分野で周知の技術を使用してペプチド鎖と結合される。治療用途ここで使用される治療する、治療、療法及び治療的という用語は、治癒治療、予防prophylactic治療及び防止preventative治療を意味する。治療用途では、本発明のアンタゴニストは哺乳動物、好ましくはヒトに、大量瞬時投与ボーラスとして静脈内にまたは一定期間の連続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、硬膜内、くも膜下内、経口、局所もしくは吸入経路でヒトに投与されるようなものを含む、許容できる投与形態で投与される。アンタゴニストはまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内または病変周囲経路で適切に投与されて局所的並びに全身的治療効果を発揮する。腹膜内経路は、例えば、卵巣腫瘍の治療に特に有用である。静脈注入は、例えば脳浮腫の治療に、特に有用であると予想される。このような投与形態は、本来的に非毒性で非治療的な担体を含む。このような担体の例には、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩類または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質およびポリエチレングリコールが含まれる。アンタゴニストの局所用またはゲル系形態用の担体には多糖類、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウムまたはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびモクロウアルコールが含まれる。慣用的なデポー形態を適切に使用することができる。このような形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラスター、吸入形態、鼻用スプレー、舌下錠および徐放製剤が含まれる。アンタゴニストは典型的には、約01mg/mlから100mg/mlの濃度でこのようなビヒクル中に処方される。徐放製剤の適当な例には、アンタゴニストを含有する固形の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、これらマトリックスは成形物、例えば膜またはマイクロカプセルの形態である。徐放製剤マトリックスの例にはポリエステル、ヒドロゲル例えば、ランガーLanger等、J.Biomed.Mater.Res.151671981年およびランガー、Chem.Tech、1298~1051982年に記載されているポリ2-ヒドロキシエチル-メタクリレートまたはポリビニルアルコール、ポリラクチド米国特許第3773919号、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタメートのコポリマーシドマンSidman等、Biopolymers、225471983年、非分解性エチレン-ビニルアセテートランガー等、上掲、ルプロンデポーLupronDepot登録商標のような分解性乳酸-グリコール酸コポリマー乳酸-グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注入可能な微小球体並びにポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-ビニルアセテートおよび乳酸-グリコール酸のようなポリマーは100日間以上にわたって分子を放出させることができるが、或るヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。カプセルに入れたポリペプチドアンタゴニストが体内に長時間留まると、37°Cで水分に暴露された結果として変性または凝集し、その結果、生物学的活性の消失が生じ、おそらく免疫原性の変化が生じることがある。関与するメカニズムに応じて安定化のために合理的な方策を工夫することができる。例えば、凝集メカニズムがチオ-ジスルフィド交換による分子内S-S結合形成であることが発見された場合は、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を制御し、適当な添加剤を使用し、特定なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成することができる。徐放hVEGFアンタゴニスト組成物にはリポソームとして取り込まれたアンタゴニスト抗体又はhVEGFrも含まれる。アンタゴニストを含有するリポソームは、エプスタインEpstein等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、8236881985年;フワングHwang等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、7740301980年;米国特許第4485045号;米国特許第4544545号に記載されたような当該分野で既知の方法で製造される。通常、リポソームは小さい約200~800オングストローム単層タイプであり、脂質含量は約30モルのコレステロールより多く、選択された割合は最適のHRG療法のために調節される。循環時間が長くなったリポソームが米国特許第5013556号に開示されている。本発明のもう一つの用途は成形物中にhVEGFアンタゴニストを導入することを含む。このような物品は、例えば内皮細胞増殖および脈管形成の調節に使用することができる。加えて、腫瘍浸潤および転移をこれら物品で調節することができる。アンタゴニストの適切で有効な投与量は、ここで特定した治療される疾病又は病状のタイプ、疾病又は病状の重症度および経過、アンタゴニストが予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の臨床的履歴およびアンタゴニストに対する応答、並びに担当医の自由裁量に依存する。アンタゴニストの有効な投与量は、典型的には、投与されるアンタゴニストにより、最も効果的な所望量のVEGF生物学的活性の阻害が達成される量である。アンタゴニストは適切には、1回でまたは一連の治療にわたって患者に投与される。hVEGFアンタゴニストは、種々の新生物および非新生物疾病および病状の治療に有用である。治療を受けられる新生物および関連状態には乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、莢膜細胞種、男性胚腫、頚部癌、子宮内膜癌、子宮内膜過形成、子宮内膜症、繊維肉腫、絨毛癌、頭部および頚部癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、メラノーマ、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管腫、血管芽腫、膵臓癌、網膜芽腫、星状細胞腫、神経膠芽細胞、シュワン鞘腫、寡突起膠腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウイルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に関連した異常な血管増殖、並びにメーグス症候群が含まれる。一実施態様では、腫瘍の血管形成を併用療法で攻撃する。一又は複数のhVEGFアンタゴニストを腫瘍を持つ患者に、例えば腫瘍または存在するならば、その転移病巣の壊死を観察して決定される治療的に有効な投与量で投与する。この治療は、もはや更なる有益な効果が観察されないかまたは臨床検査で痕跡量の腫瘍も示されないかもしくはどんな転移病巣も示されないようなときまで継続される。他の補助的薬剤は、例えば腫瘍壊死因子TNF、α-、β-もしくはγ-インターフェロン、抗HER2抗体、ヘレグリン、抗ヘレグリン抗体、D因子、インターロイキン-1IL-1、インターロイキン-2IL-2、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、または、抗プロテインC抗体、抗プロテインS抗体もしくはC4b結合タンパク質1991年2月21日に公開されたエスモン等のPCT公開特許第WO91/01753号参照のような腫瘍の微小血管凝固を促進する薬剤、または加熱もしくは照射である。補助的薬剤は有効性が変わるので、常套的な形でマトリックススクリーニングによってそれらが腫瘍に与える影響を比較することが望ましい。hVEGFアンタゴニストおよび例えばTNFの投与は、所望の臨床効果が達成されるまで繰り返すことができる。或いは、hVEGFアンタゴニストは、TNFと場合によっては補助的薬剤と一緒に投与される。固形腫瘍が四肢または全身循環から隔離し易い他の場所に見られる場合、ここに記載した治療薬剤は隔離された腫瘍または器官に投与する。他の実施態様では、FGFまたは血小板由来増殖因子PDGFアンタゴニスト、例えば抗FGFまたは抗PDGF中和抗体がhVEGFアンタゴニストと一緒に患者に投与される。hVEGFアンタゴニストによる治療は、最適には外傷治癒または所望の血管新形成の期間中中止することができる。治療を受けられる非新生物状態には関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生性緑内障、加齢性黄斑変性、甲状腺過形成バセドウ病を含む、角膜および他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心膜滲出液例えば、心膜炎に関連したもの、および胸膜滲出液が含まれる。加齢性黄斑変性AMDは、年輩者において程度の酷い視覚喪失に至る第1の原因である。AMDの滲出形態は脈絡膜新血管形成及び網膜色素内皮細胞剥離により特徴付けられる。脈絡膜新血管新生が予後の劇的悪化に関連しているため、本発明のVEGFアンタゴニストは、AMDの重症度を低減させるのに特に有用であると予想される。治療可能な他の病状には浮腫が含まれる。ここで、浮腫という用語は一般的な意味で使用され、遊離の細胞外水単独のため、もしくは増加した細胞内水と組み合わされるために生じる血管外組織水含量の増加により特徴付けられる体の症状または付随する脳卒中又は頭部損傷を含む。浮腫は体内の種々の組織中に存在し得る。特に、hVEGFアンタゴニストは、典型的には脳容積の増加により特徴付けられる脳浮腫、並びに脊髄又は脊髄管浮腫又は頭蓋内圧の増加に至る他の病状例えば、局所的脊髄損傷を含む中枢神経系CNS浮腫の治療に使用することができると考えられる。例えば、脳容積の増加は、脳血液量の増加及び/又は組織水分量の増加の結果でありうる。ここで使用する浮腫という用語は、当該技術において、血管原性浮腫及び細胞毒性浮腫と称される病状を含む。典型的には、血管原性浮腫と称される病状は血液脳関門BBBの崩壊を伴うものとして特徴付けられており、細胞毒性浮腫は無傷のBBBを伴うものとして特徴付けられている。脳浮腫は、一般的に概説文献であるハリリHariri、NeurosurgicalIntensiveCare56871994年に記載されている。哺乳動物における浮腫は、限定されるものではないが、急性高血圧、髄膜炎、脳炎、膿瘍、新生物疾患例えば上述したもの特に固形腫瘍、外傷例えば頭部損傷、出血、ウイルス感染、脳マラリア症、脳卒中、放射、多発性硬化症、後心停止、出生時仮死、グルタミン酸毒性、脳症、低酸素症、虚血及び腎臓透析を含む種々の病状または刺激を伴うか又はこれらから生じるものである。特に、本発明は、脳内における新生物に付随する脳浮腫、及び脳卒中に付随する脳浮腫を含む浮腫を治療するために、hVEGFアンタゴニストを用いて療法を意図している。脳組織内に新生物を有する哺乳動物において、哺乳動物に脳浮腫が発症し又はこれを被ることはよくあることである。本発明のhVEGFアンタゴニストは、単独で又は脳新生物を治療するために施される化学療法又は放射線療法等の他の療法と組み合わせて投与され、脳内におけるこのような浮腫を低減し又は阻害することを意図している。また、脳卒中を発症しているか、これを発症したことがある哺乳動物においても、脳浮腫が発症しているか、またはこれを被っていることがよくある。本出願における脳卒中という用語は一般的な意味に使用され、虚血性脳卒中及び出血性脳卒中として当業者に周知の臨床状態を含む。患者の脳卒中は、例えば血流妨害の原因又は病原、病気に襲われている細胞又は組織の種類、及び組織例えば脳組織への管外滲出の存在性に依存して、様々な特定の種類の脳卒中に特徴付けされ又は分類されることが当該分野において認められる。臨床的に特徴付けられている種々の種類の脳卒中には、限定するものではないが、血栓性脳卒中、塞栓性脳卒中、血行力学的脳卒中、陰窩性脳卒中、及び脳内、くも膜下、脳室内、又は硬膜下出血に誘導されるか、又はこれらの結果生じる出血性脳卒中が含まれる。医療従事者であれば、このような脳卒中状態の種類を素早く認識して理解し、患者にこのような病状が存在するのか、又はその徴候があるのか検出し診断できるであろう。本発明の方法は、hVEGFアンタゴニスト分子が、全てのこのような脳卒中症状の治療において、特に浮腫を低減又は阻害し、細胞及び組織ダメージを保護するために使用できることを意図している。hVEGFアンタゴニストは脳卒中の開始に続く急性治療として投与され、例えば脳浮腫を低減又は阻害し、よって哺乳動物の脳卒中からの回復性を高める。hVEGFアンタゴニストを使用することにより、この治療で哺乳動物における手術開頭術の実施を防止又は回避し、脳組織内の過度の水分蓄積による頭蓋内圧を低減又は緩和するといった恩恵がある。また、hVEGFアンタゴニストによりこのような浮腫が低減又は防止されて、典型的に頭蓋内圧及び浮腫によりダメージを受けるおそれのある脳及びニューロン組織の量が低減するであろうすなわち保護効果。治療される疾病又は病状のタイプおよび重症度に応じて、例えば、1回または複数回の分割投与によるかそれとも連続注入によろうとも、約1μg/kgから15mg/kgのアンタゴニストが患者に投与する初期候補投与量である。典型的な1日投与量は、上述の要因に依存して約1μg/kgから100mg/kgまたはそれ以上までの範囲であろう。数日間またはそれより長い反復投与では、病状に依存して、治療は疾病徴候の所望の抑制が生じるまで繰り返される。しかしながら、他の投与計画が有用であることがある。例えば、脳浮腫又は脳卒中の治療方法においては、損傷又は脳卒中の始まりから数時間内、もしくは1~4日以内に、検出又は診断の際に直ぐにhVEGFアンタゴニストを患者に投与することが望ましい。望ましい投与プロトコールは、典型的には医療従事者の裁量の範囲内である。hVEGFアンタゴニスト療法の進捗状況は、損傷又は脳卒中に関連した新生物病状及び浮腫形成については、例えば放射線写真技術特に、磁気共鳴映像法、MRI含む慣用的の技術および検査法によって容易に監視され、また脳浮腫については頭蓋内圧が監視される。本発明の他の実施態様では、疾病又は病状の予防または治療におけるアンタゴニストの効能は、これらの目的に効果的である別の薬剤、例えば、腫瘍壊死因子TNF、酸性もしくは塩基性の線維芽細胞増殖因子FGFもしくは肝細胞増殖因子HGFの脈管形成活性を阻止もしくは中和し得る抗体、組織因子、プロテインCもしくはプロテインSの凝固活性を阻止もしくは中和し得る抗体1991年2月21日に公開されたエスモンEsmon等のPCT公開特許第WO91/01753号参照、HER2レセプターに結合可能な抗体1989年7月27日に公開されたハドジアックHudziak等のPCT公開特許第WO89/06692、または例えば、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の抗代謝物、抗生物質、ピリミジン類似体、5-フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシドもしくはコルチコステロイドのような一または複数の慣用的な治療剤と組み合わせてまたは連続的にアンタゴニストを投与することによって改善することができる。このような他の薬剤は投与される組成物中に存在するかまたは別々に投与することができる。特に、浮腫又は脳卒中の治療では、アンタゴニストは、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は駆虫剤、抗生物質、血栓溶解剤例えばt-PA、浸透圧治療剤例えばマンニトール、又はステロイド類デカドロン又はプレドニゾンと組み合わせてまたは連続して投与されうる。アンタゴニストと組み合わせられるこのような薬剤の使用は、医療従事者の通常の技量の範囲内で行われ、このような薬剤の選択は、例えば治療される疾患又は病状に依存する。本願で提供されるさらなる治療方法では、hVEGFアンタゴニストは、特に脳卒中の治療において、hVEGFと連続して投与されることが考えられる。脳卒中の診断と検出の際には、hVEGFアンタゴニストは脳卒中の開始後直ちに又は約1~4日内に投与され得る。浮腫形成を低減又は阻害するアンタゴニストの投与の完了に続いて、再血管形成を刺激又は促進させるのに十分な量のhVEGFを患者に投与することが有益であると考えられる。好ましくは、hVEGFはhVEGFの組換え形態であり、製薬的に許容可能な担体に投与される。他の用途本発明の抗hVEGF抗体はまたアフィニティー精製剤としても有用である。この方法では、hVEGFに対する抗体を当該分野で周知の方法を使用して、セファデックス樹脂または濾紙のような適切な支持体上に固定する。次に、固定した抗体を精製すべきhVEGFを含有する試料と接触させ、その後、固定された抗体と結合しているhVEGF以外の試料中の物質を全て実質的に除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、抗体からhVEGFを放出させるグリシン緩衝液、pH5.0のような別の適当な溶媒を用いて支持体を洗浄する。以下の実施例は説明のためだけに提供するものであって、決して本発明を限定することを意図するものではない。本明細書における全ての特許と引用文献はその全体が出典明示によってここに取り込まれる。実施例に引用されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明書に従い使用した。次の実施例と本明細書を通してATCC受託番号により特定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクションである。実施例1抗hVEGFモノクローナル抗体の調製免疫化用のキーホールリンペットヘモシアニンKLHと抱合したhVEGFを得るために、組換え体hVEGF165アミノ酸、リュング等、Science24613061989年を005グルタルアルデヒドの存在下4:1の比率でKLHと混合し、その混合物を穏やかに撹拌しながら室温で3時間インキュベートした。次に、この混合物をリン酸緩衝溶液PBSに対して4°Cで一夜透析した。Balb/cマウスを、腹腔内注射によって20μgのKLHと抱合した5μgのhVEGFで2週間毎に4回免疫化し、細胞融合前に4日間KLHと抱合した同一投与量のhVEGFで追加免疫した。免疫したマウスから得た脾細胞を、P3X63Ag8U.1ミエローマ細胞、エルトン等、Curr.Top.Microbiol.Immunol.8111978年と、記載されたようにして35のポリエチレングリコールPEGを使用して融合させた。ヤーマッシュYarmush等、Proc.Nat.Acad.Sci.7728991980年。ハイブリドーマをHAT培地中で選択した。ハイブリドーマ細胞培養物から得た上清を、hVEGF被覆マイクロタイタープレートを使用するELISAアッセイによって抗hVEGF抗体産生のためにスクリーニングした。各ウエル中のhVEGFと結合した抗体を、アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗マウスIgG免疫グロブリンおよび色素産生基質p-ニトロフェニルホスフェートを使用して判定した。ハーローHarlowおよびレーンLane、抗体:実験室マニュアル、597頁ColdSpringHarborLaboratory、1988年。このようにして抗hVEGF抗体を産生すると判定されたハイブリドーマ細胞を限界希釈によってサブクローン化し、A461およびB262と命名した二種のクローンをさらなる実験のために選択した。実施例2抗hVEGFモノクローナル抗体の特徴づけA.抗原特異性A461およびB262ハイブリドーマによって産生された抗hVEGFモノクローナル抗体の結合特異性をELISAで測定した。モノクローナル抗体は、hVEGF、FGF、HGFまたは表皮増殖因子EGFで前もって被覆されたマイクロタイタープレートのウエルに加えた。ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスIgG免疫グロブリンを用いて結合抗体を検出した。これらアッセイの結果、A461およびB262ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体はhVEGFとは結合するが他のタンパク質増殖因子とは検出できるほどには結合しないことが確認された。B.エピトープマッピング競合結合ELISAを使用して、A461およびB262ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体がhVEGF内の同一のエピトープ部位に結合するのかそれとも異なるエピトープ部位に結合するのかを決定した。キム等、Infect.Immun.579441989年。個々の非標識抗hVEGFモノクローナル抗体A461またはB262または無関係の抗HGF抗体IgG1イソタイプを、hVEGFで前もって被覆されたマイクロタイタープレートのウエルに加えた。次に、ビオチン化抗hVEGFモノクローナル抗体BIO-A461またはBIO-B262を加えた。ビオチチニル化抗体対非標識抗体の比率は1:1000であった。ビオチン化抗体の結合は、アビジン抱合ペルオキシダーゼ、続いてo-フェニレンジアミンジヒドロクロリドおよび過酸化水素を添加して視覚化した。結合したビオチン化抗体の量を示す着色反応は、495nmの波長で光学密度ODを測定することにより決定した。図1に示されるように、各々の場合に、ビオチン化抗hVEGF抗体の結合は対応する非標識抗体で阻止されたが、他の非標識抗hVEGF抗体または抗HGF抗体では阻止されなかった。これらの結果は、A461およびB262ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体がhVEGF内の異なったエピトープと結合することを示している。C.イソタイプ決定A461およびB262ハイブリドーマが産生した抗hVEGFモノクローナル抗体のイソタイプをELISAで決定した。各ハイブリドーマが増殖している培地の試料上清をhVEGFで前もって被覆されたマイクロタイタープレートに加えた。捕捉された抗hVEGFモノクローナル抗体を、異なったイソタイプ特異性のアルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗マウス免疫グロブリンと共にインキュベートし、抱合抗体と抗hVEGFモノクローナル抗体との結合をp-ニトロフェニルホスフェートを添加して測定した。着色反応をELISAプレート読取り器を用いて405nmで測定した。上記方法によって、A461およびB262ハイブリドーマの両方で産生したモノクローナル抗体のイソタイプはIgG1であると決定された。D.結合親和性A461およびB262ハイブリドーマが産生した抗hVEGFモノクローナル抗体のhVEGFに対する親和性を競合結合アッセイで測定した。予め定めた最適以下の濃度のモノクローナル抗体を、20000~40000cpmの125I-hVEGF1~2ngおよび種々の既知量の非標識hVEGF1~1000ngを含有する試料に加えた。室温で1時間後、100μlのヤギ抗マウスIg抗血清米国アーカンソー州ロジャーズのPel-Freezを加え、この混合物を室温でさらに1時間インキュベートした。抗体と結合タンパク質の複合体免疫複合体を、4°Cで6ポリエチレングリコールPEG、モル分子量8000を500μl添加し、続いて2000×G、4°Cで20分間遠心分離して沈殿させた。各試料中の抗hVEGFモノクローナル抗体と結合した125I-hVEGFの量を、ペレット化した材料をガンマ計数器で計数することにより測定した。親和性定数はスカッチャード分析によってデータから計算した。A461ハイブリドーマが産生した抗hVEGFモノクローナル抗体の親和性は12×109リットル/モルであると計算された。B262ハイブリドーマが産生した抗hVEGFモノクローナル抗体の親和性は25×109リットル/モルであると計算された。E.hVEGFの細胞分裂促進活性の阻止ウシ副腎皮質毛細血管内皮ACE細胞、フェララ等、Proc,Nat.Acad.Sci.8457731987年を12個のマルチウエルプレート中に104細胞/mlの密度で接種し、25ng/mlのhVEGFを、A461もしくはB262ハイブリドーマが産生した種々の濃度の抗hVEGFモノクローナル抗体または無関係の抗HGFモノクローナル抗体の存在下または不存在下で各ウエルに加えた。5日間の培養後、各ウエルの細胞数をコールターCoulter計数器で計測した。対照として、hVEGFを添加しないでACE細胞を培養した。図2に示されるように、抗hVEGFモノクローナル抗体は両方とも、添加したhVEGFがウシACE細胞の増殖または生存を支持する能力を阻害した。A461ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体はhVEGFの細胞分裂促進活性を完全に阻止する一方約90以上の阻止、B262が産生したモノクローナル抗体はhVEGFの細胞分裂促進活性を部分的にしか阻止しなかった。F.hVEGF結合の阻止ウシACE細胞を、10の仔ウシ血清、2mMのグルタミンおよび1ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子を含有するダルベッコの修正イーグル培地DMEM中24のウエルのマイクロタイタープレートに25×104細胞/05ml/ウエルの密度で蒔いた。一夜培養した後、細胞を4°Cで結合緩衝液等量のDMEMおよびF12培地プラス25mMのHEPESおよび1のウシ血清アルブミンを用いて1回洗浄した。12000cpmの125I-hVEGF約5×104cpm/ng/mlを、A461、B262またはA261ハイブリドーマ250μlの総容量が産生した抗hVEGFモノクローナル抗体5μgと共に30分間予めインキュベートし、その後この混合物をマイクロタイタープレート中のウシACE細胞に加えた。細胞を4°Cで3時間インキュベートした後、細胞を4°Cで結合緩衝液を用いて3回洗浄し、05mlの02N、NaOHを添加して溶解させ、ガンマ計数器で計数した。図3上に示されるように、A461およびB262ハイブリドーマが産生した抗hVEGFモノクローナル抗体はhVEGFとウシACE細胞の結合を阻止した。対照的に、A261ハイブリドーマが産生した抗hVEGFモノクローナル抗体はhVEGFとウシACE細胞の結合に与える明白な影響はなかった。上記した細胞増殖アッセイで得た結果と一致して、A461ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体はB262が産生したモノクローナル抗体よりさらに強くhVEGFの結合を阻止した。図3下に示されるように、A461ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体は、1:250のhVEGF対抗体のモル比でhVEGFとウシACE細胞の結合を完全に阻止した。G.他のVEGFイソ型との交差反応性A461ハイブリドーマが産生した抗hVEGFモノクローナル抗体がhVEGFの121-および189-アミノ酸形態と反応性であるかどうかを決定するために、これらのポリペプチドを免疫沈降させる能力について抗体をアッセイした。ヒト293細胞を、上記したようにして、121-および189-アミノ酸hVEGFポリペプチドの配列をコードするヌクレオチドを有するベクターでトランスフェクションした。リュング等、Science24613061988年。トランスフェクションして2日後、システインおよびメチオニンを欠く培地に細胞を移した。細胞を上記培地中で30分問インキュベートし、その後100μCi/mlの各35S-メチオニンおよび35S-システインを培地に加え、細胞をさらに2時間インキュベートした。細胞を無血清培地に移し、3時間インキュベートすることによって標識を追跡した。細胞培養培地を集め、溶解緩衝液150mMNaCl、1NP40、05デオキシコレート、01ドデシル硫酸ナトリウムSDS、50mMトリス、pH80中で30分間インキュベートして細胞を溶解させた。細胞屑は、200×Gで30分間遠心分離して溶解物から除去した。細胞培養培地および細胞溶解物の500μl試料を、2μlのA461ハイブリドーマ抗体24mg/mlと共に4°Cで1時間インキュベートし、その後5μlのウサギ抗マウスIgG免疫グロブリンと共に4°Cで1時間インキュベートした。35S-標識hVEGFと抗hVEGFモノクローナル抗体の免疫複合体をプロテインAセファロースPharmaciaで沈殿させ、その後還元条件下でSDS-12ポリアクリルアミドゲル電気泳動を施した。免疫沈降させ、放射標識したタンパク質をオートラジオグラフィーで分析するため、ゲルをX線フィルムに露出させた。上記分析の結果、A461ハイブリドーマが産生した抗hVEGFモノクローナル抗体がhVEGFの121-および189-アミノ酸形態の両方と交差反応性であることが示された。実施例3VEGFレセプター-IgG融合タンパク質の調製A.flthVEGFレセプターのヌクレオチドおよびアミノ酸コード化配列はシブヤ等、Oncogene55195241990年に開示されている。flthVEGFレセプターの全細胞外ドメインのコード化配列を2段階方法でヒトIgG1重鎖のコード化配列に融合させた。部位特異的突然変異誘発を使用して、fltのアミノ酸759のコドンに対して5’部位にfltをコードするDNA中にBstB1制限を導入し、プラスミドpBSSK’FC、ベネット等、J.Biol.Chem.26623060230671991年の独特のBstEII制限部位をBstBI部位に変換した。改変したプラスミドをEcoRIおよびBstBIで消化し、得られたプラスミドDNAの大きいフラグメントを、flthVEGFレセプターの細胞外ドメインアミノ酸1~758をコードするfltDNAのEcoRI-BstBIフラグメントと一緒にライゲートさせた。得られた作成物を、ClaIおよびNotIで消化して約33kbのフラグメントを生成させ、次にこれをライゲーションによって哺乳動物発現ベクターpHEBO2リュング等、Neuron810451992年の複数のクローニング部位に挿入する。33kbのフラグメントの末端を、例えばリンカーを加えて修飾して、正しい発現方向でのベクターへのフラグメント挿入がなされる。哺乳動物宿主細胞例えば、CEN4細胞リュング等、上掲をエレクトロポーレーションによってflt挿入物を含有するpHEBO2プラスミドでトランスフェクションする。トランスフェクションされた細胞を約10のウシ胎児血清、2mMのグルタミンおよび抗生物質を含有する培地中で培養し、約75の集密性で血清不含培地に移した。培地を収集前の3~4日間馴化し、flt-IgG融合タンパク質を、本質的にベネット等、J.Biol.Chem.26623060230671991年に記載されたようにして、プロテインAアフィニティーマトリックスでのクロマトグラフィーにかけて条件培地から精製する。B.ヒトflt-IgGhflt-IgGと称するcDNAを、デービス-スミス等、EMBOJ15491949271996年に記載されているようにして作成した。この切断レセプター型には、Fc-IgGに融合したヒトfltの最初の3つの免疫グロブリン様ドメインのみが含まれていた。フェララ等、NatureMedicine43361998年を参照。ネズミflt-IgGmflt-IgGと称するを、上掲のフェララ等に記載されているプライマーを使用し、マウスの17日齢の胚cDNAをPCR増幅させることにより作成した。3’PCRプライマーの設計により、mflt-11-3の発現がネズミIgG2bFcクローンと同じフレーム内であることが確実になった。得られた1-kbフラグメントを、C1aI-BstEIIフラグメントとしてTAクローニングベクターインビトロゲン、サンティエゴ、CA中に最初にクローニングした。このフラグメントをpRKベクター中でネズミIgG2bFcの5末端にライゲートさせた。哺乳動物細胞中にトランスフェクションしたとき、このプラスミドによりmflt1-3-IgG融合タンパク質の発現が可能になった。CHO細胞中での発現のために、cDNAをdicistronicなベクター中でサブクローン化し、flt誘導融合タンパク質の発現に、マーカーであるジヒドロホラートレダクターゼの発現を関連させる。ルカスLucas等、NucleicAcidれS。24177417791996年を参照。プラスミドをリポフェクションを介して、DP12細胞、エルチャシンLChasinコロンビア大学、ニューヨークにより開発されたCHO-K1DUXB11細胞系の誘導体に導入し、グリシン-ヒポキサンチン-チミジンG-H-T不含培地で増殖させるように選択した。チショルムChisholm等、DNAクローニング4:実用的アプローチ、哺乳動物系edsGloverHames、139頁OxfordPress、1995年。続いて、第1ラウンドの選択からのクローンをメトトレキサートの濃度を増加させて培養した。ついで、クローンをヒト又はネズミFcのELISAによる生産のためにスクリーニングした。最も高い生産性を示したクローンを懸濁培養用にし、無血清培養物を収集し、プロテインA-セファロースで精製した。タンパク質濃度をアミノ酸分析により決定した。最終的に精製された物質のエンドドキシン含有量は0.5eu/mgを超えていなかった。上掲のフェララ等に記載されたように、ネズミflt1-3-IgG融合タンパク質とヒトflt1-3-IgG融合タンパク質は両方とも試験した齧歯動物モデルにおいてVEGFの生物活性を阻害する活性を有していた。実施例4hVEGFアンタゴニストによる腫瘍増殖の阻止培養物中で増殖している様々なヒト腫瘍細胞株をhVEGFの産生についてELISAでアッセイした。卵巣、肺、大腸、胃、乳および脳腫瘍細胞株はhVEGFを産生することが分かった。さらなる試験のために、hVEGFを産生した3つの細胞株、NEG55G55とも称されるG55とも称されるドイツ、ハンブルグのエッペンドル大学病院神経外科部のM.ウエストファルWestphal医師から得たヒト神経膠腫細胞株、A-673細胞株番号CRL1598としてアメリカンタイプカルチャーコレクションATCCから取得したヒト横紋筋肉腫細胞株およびSK-LMS-1細胞株番号HTB88としてATCCから取得した平滑筋肉腫細胞株を使用した。生後6~10週齢の雌ベージュ/ヌードマウス米国マサチューセッツ州ウィルミントンのCharlesRiverLaboratoryに100~200μlのPBS中1~5×106個の腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍増殖を確立した後種々の時間で、種々の投与量のA461抗hVEGFモノクローナル抗体、無関係の抗gp120モノクローナル抗体5B6またはPBSを1週間当たり1回または2回マウスに腹腔内注射した。腫瘍サイズを毎週測定し、試験終結時に腫瘍を切開し重量を測定した。マウスのNEG55腫瘍の増殖に与える種々の量のA461抗hVEGFモノクローナル抗体の効果を図4および図5に示す。図4は、NEG55細胞を接種して1週間後に開始し25μgまたは100μgのA461抗hVEGFモノクローナル抗体で治療したマウスを無関係の抗体またはPBSで治療したマウスと比較したとき、腫瘍増殖速度が大幅に減少していたことを示している。図5は、NEG55細胞を接種して5週間後に、A461抗hVEGF抗体で治療したマウスの腫瘍の大きさが無関係抗体またはPBSで治療したマウスの腫瘍の大きさより約5025μg投与量の抗体で治療したマウスの場合から85100μg投与量の抗体で治療したマウスの場合小さかったことを示している。マウスのSK-LMS-1腫瘍の増殖に与えるA461抗hVEGFモノクローナル抗体治療の効果を図6に示す。SK-LMS-1細胞を接種して5週間後に、A461抗hVEGF抗体で治療したマウスの腫瘍の大きさは、無関係抗体またはPBSで治療したマウスの腫瘍の大きさより約75小さかった。マウスのA673腫瘍の増殖に与えるA461抗hVEGFモノクローナル抗体治療の効果を図7に示す。A673細胞を接種して4週間後に、A461抗hVEGF抗体で治療したマウスの腫瘍の平均的な大きさは、無関係抗体またはPBSで治療したマウスの腫瘍の大きさより約6010μg投与量の抗体で治療したマウスの場合から90以上50~400μg投与量の抗体で治療したマウスの場合小さかった。実施例5培養物中で増殖している腫瘍細胞に与える抗hVEGF抗体の直接的な効果の分析NEG55ヒト神経膠腫細胞またはA673横紋筋肉腫細胞を、10のウシ胎児血清、2mMのグルタミンおよび抗生物質を含有するF12/DMEM培地のマルチウエルプレート12ウェル/プレート中に7×103細胞/ウエルの密度で蒔いた。次に、A461抗hVEGF抗体を最終濃度が0~200μgの抗体/mlになるように細胞培養物に加えた。5日後、ウエル内で増殖している細胞を、トリプシンに暴露して分離させ、コールター計数器で計数した。図8および9はこれらの試験結果を示す。明らかなように、A461抗hVEGF抗体は、培養物中のNEG55またはA673細胞の増殖に対して何ら有意な効果を有していなかった。これらの結果は、A461抗hVEGF抗体が細胞毒性でないことを示しており、抗体の観察された抗腫瘍効果はVEGF媒介性新血管形成の阻止によるものであることを強く示唆している。実施例6内皮細胞走化性に与える抗hVEGF抗体の効果内皮細胞並びに単球およびリンパ球を含む他の細胞の走化性は関節リウマチの病原において重要な役割を果たしている。内皮細胞の遊走および増殖はリウマトイド滑膜内で生じる脈管形成を伴う。血管形成性組織パンヌスは関節軟骨に侵入し、これを破壊する。hVEGFアンタゴニストがこのプロセスを妨げるかどうかを決定するために、我々は、関節リウマチの患者から得た滑液で刺激した内皮細胞の走化性に与えるA461抗hVEGF抗体の効果をアッセイした。対照として、我々は骨関節炎関節リウマチで生じる脈管形成は骨関節炎では生じない患者から得た滑液で剌激した内皮細胞の走化性に与えるA461抗hVEGF抗体の効果もアッセイした。内皮細胞の走化性は確立された方法に従って、変更したボイデンチャンバーを使用してアッセイした。トンプソンThompson等、CancerRes.5126701991年;フィリップスPhillips等、Proc.Exp.Biol.Med.1974581991年。約104個のヒト臍静脈内皮細胞を、01のウシ胎児血清を含有する培養培地の48ウエルのマルチウエルマイクロチェンバー中でゼラチン被覆フィルター08ミクロンの孔サイズに接着させた。約2時間後、チャンバーを逆さにし、試験試料関節リウマチ滑液、骨関節炎滑液、塩基性FGFbFGF1μg/mlの最終濃度までか、またはPBSおよびA461抗hVEGF抗体10μg/mlの最終濃度までをウエルに加えた。2ないし4時間後、遊走した細胞を染色しそして計数した。図10は上記の試験の平均化した結果を示すものである。滑液と表示した欄および対照に関する頁の下部に示された値は滑液、bFGFまたはPBS単独の存在下で遊走した内皮細胞の平均数である。滑膜液mABVEGFと表示した欄の値は、滑液プラス添加したA461-抗hVEGF抗体の存在下で遊走した内皮細胞の平均数である。抑制]と表示した欄の値は、抗hVEGF抗体の添加により生じた滑液誘発内皮細胞遊走の低下パーセントを示す。示されているように、抗hVEGF抗体は、関節リウマチの滑液が内皮細胞の遊走を誘発する能力を有意に阻止する平均5340パーセントの阻止が、骨関節炎の滑液はそうではなかった平均1364パーセントの阻止。実施例7脳浮腫に与えるアンタゴニストの効果インビボアッセイを行い、脳浮腫に与えるflt-IgGアンタゴニストの効果を測定した。BBB完全性の喪失と脳浮腫形成により脳梗塞がしばしば生じる。虚血性脳卒中におけるBBBの破壊は、主として、脳卒中開始の最初の24時間後に生じると考えられている。さらに、急性虚血の発生に続く血流の迅速で十分な復活という有益な効果は、BBBを含む脳微小血管に対する再灌流損傷によって台無しになると信じられており、脳浮腫の形成に寄与する。クラトゾKlatzo等、EdsBrainEdemaTokyoSpringer1984年1~5頁。以下に記載するインビボアッセイは、臨床状態のこれら側面を反映するように計画された。限局性皮質虚血を、チェンChen等、脳卒中177387431986年に過去に記載された方法を使用し、中脳動脈MCAの閉塞によりマウス脳内に誘発した。マウスC57BL-6J;18-25グラムに、酸素中1.5イソフランを用いて麻酔をかけた。右側MCAを開頭術により暴露させ11-0縫合で結紮した。さらに、同側の共通する頸動脈を虚血中に閉塞させた。血管を45分間、閉塞状態のままにした。手術に先だって、動物を無作為に2つの群に分け、ネズミflt-IgG上述した実施例3Bに記載;さらにフェララ等、NatureMedicine43361998年にも記載又はflt-IgGのFcと同じイソタイプに属する無関係対照ネズミ抗GP120抗体[フェララ等、上掲]を、手術の12時間前、再灌流時、及びまた手術後1及び2日後に10mg/kg投与量で腹腔内に投与した。浮腫形成の度合いを、虚血の開始後24時間、T2加重MR画像診断により評価した。梗塞の最終的な大きさを高分解能解剖学用MRIを使用し、8-12週間後に評価した。常套的な組織学的方法を使用して梗塞の大きさを検査するために、動物のサブセットn=12を取り出した。図11に示すように、flt-Igの投与により、虚血開始の1日後に得られたT2加重MRIスキャン上の超強度領域により定められた脳浮腫容積の有意な低減が引き起こされた27低減、p=0.01スチューデントt検定、対照及び治療群のそれぞれにおいてn=15及びn=16。反対側と比べて高信号強度領域として皮質浮腫の出現を示す代表的なT2加重MR画像を図12に示す。このモデルにおいては、虚血ダメージの進行により、空洞形成及び皮質組織の喪失に至る。よって、梗塞の最大容量は、影響を受けていない皮質の量を描き、反対側の半球と比較することにより、高分解能解剖用画像から推定することができる。図13に示すように、皮質梗塞のサイズは、8-12週後に測定したところでは、flt-IgGの投与により有意に低減している梗塞のサイズで26低減、p=0.009ステューデントt検定、対照及び治療群のそれぞれにおいてn=11及びn=14。MRIにより測定された梗塞のサイズと、常套的な組織学を使用して測定された梗塞のサイズとの間には良好な相関関係があったR2=.633。従って、治療された動物では脳浮腫の発達が低減されることが示されており、これはさらに神経保護の増大をもたらす。これらの結果には、VEGFの生物学的活性を阻害することで、虚血-再灌流関連脳浮腫及び損傷を低減可能であることが示されている。実施態様1.有効量のhVEGFアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む浮腫を患っている哺乳動物の治療方法。2.前記浮腫が脳浮腫を含む実施態様1に記載の方法。3.前記哺乳動物がさらに新生物疾患を患っているヒトである実施態様1に記載の方法。4.前記新生物疾患が脳腫瘍を含む実施態様3に記載の方法。5.前記hVEGFアンタゴニストを化学療法又は放射線療法と組み合わせるか又は連続して前記哺乳動物に投与する実施態様4に記載の方法。6.前記哺乳動物が、さらに脳卒中を被っているか、又は被ったことのあるヒトである実施態様1に記載の方法。7.前記hVEGFアンタゴニストが抗hVEGF抗体を含む実施態様1に記載の方法。8.前記抗hVEGF抗体がキメラ抗体を含む実施態様7に記載の方法。9.前記抗hVEGF抗体がヒト化抗体を含む実施態様7に記載の方法。10.前記抗体がモノクローナル抗体を含む実施態様7に記載の方法。11.前記hVEGFアンタゴニストがhVEGFレセプター融合タンパク質を含む実施態様1に記載の方法。12.前記hVEGFレセプター融合タンパク質が、免疫グロブリンに融合したhVEGFレセプターの細胞外ドメイン配列を含む実施態様11に記載の方法。13.前記hVEGFレセプター融合タンパク質がflt-IgG融合タンパク質を含む実施態様12に記載の方法。14.有効量のhVEGFアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む、脳卒中を被っているか、又は被ったことのある哺乳動物の治療方法。15.前記hVEGFアンタゴニストが抗hVEGF抗体を含む実施態様14に記載の方法。16.前記抗hVEGF抗体がキメラ抗体を含む実施態様15に記載の方法。17.前記抗hVEGF抗体がヒト化抗体を含む実施態様15に記載の方法。18.前記抗体がモノクローナル抗体を含む実施態様15に記載の方法。19.前記hVEGFアンタゴニストがhVEGFレセプター融合タンパク質を含む実施態様14に記載の方法。20.前記hVEGFレセプター融合タンパク質が、免疫グロブリンに融合したhVEGFレセプターの細胞外ドメイン配列を含む実施態様19に記載の方法。21.前記hVEGFレセプター融合タンパク質がflt-IgG融合タンパク質を含む実施態様20に記載の方法。22.有効量のhVEGFアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む脳浮腫を患っている哺乳動物の治療方法。23.前記hVEGFアンタゴニストが抗hVEGF抗体を含む実施態様22に記載の方法。24.前記抗hVEGF抗体がキメラ抗体を含む実施態様23に記載の方法。25.前記抗hVEGF抗体がヒト化抗体を含む実施態様23に記載の方法。26.前記抗体がモノクローナル抗体を含む実施態様23に記載の方法。27.前記hVEGFアンタゴニストがhVEGFレセプター融合タンパク質を含む実施態様22に記載の方法。28.前記hVEGFレセプター融合タンパク質が、免疫グロブリンに融合したhVEGFレセプターの細胞外ドメイン配列を含む実施態様27に記載の方法。29.前記hVEGFレセプター融合タンパク質がflt-IgG融合タンパク質を含む実施態様28に記載の方法。"