"FKPLフコキナーゼ/GDPLフコースピロフォスフォリラーゼ遺伝子を酵母用発現ベクターにより形質転換した酵母であって、培地中のLフコース、又はLフコースアナログを取り込み、細胞内でGDPLフコース、又はLフコースアナログのGDP糖化合物を合成可能な形質転換酵母。LフコースアナログがDアラビノースであり、そのGDP糖化合物がGDPDアラビノースである、請求項1に記載の形質転換酵母。FKP遺伝子が、Bacteroidesfragilis由来のFKP遺伝子である、請求項1又は2に記載の形質転換酵母。酵母がSaccharomycescerevisiaeである請求項1~3のいずれかに記載の形質転換酵母。請求項1~4のいずれかの形質転換酵母を用い、Lフコース、Dアラビノース、又はLフコースアナログを存在させた培地中で培養することを特徴とする、Lフコース、Dアラビノース、又はLフコースアナログのGDP糖化合物を合成する方法。Lフコースを存在させた培地中で培養することを特徴とする、GDPLフコースを合成する方法である請求項5に記載の方法。Dアラビノースを存在させた培地中で培養することを特徴とする、GDPDアラビノースを合成する方法である請求項5に記載の方法。本発明は、酵母細胞内での効率的なGDPLFucの合成方法を提供することを目的とするものである。さらに、Lフコースと構造的に類似したDアラビノースと共に、Lフコース、Dアラビノースなどのアナログを酵母細胞内で効率的にGDP糖化合物に転換する方法を提供する。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねる中で、Bacteroidesfragilis9343由来のLフコキナーゼ/GDPLフコースピロフォスフォリラーゼFKPという2つの活性をもつ酵素遺伝子を利用することを思いついた。この酵素はLFucを基質としてLFuc1Pに変換し、さらに、そこからGDPLFucを合成することができる非特許文献53。この変換活性はBfragilis9343株内のsalvage経路として観察され、広く細菌Bacteroides一般に保存されている非特許文献53。細菌Bacteroides以外では植物Arabidopsisもsalvage経路としてLFucからLFuc1Pを経由してGDPLFucを合成できる系を有しているが、当該系を有しているのは細菌及び植物のみであり、その理由は明らかになっていない非特許文献54。上記酵素FKPは、アミノ酸配列アラインメントの結果、そのN末端ドメイン1430番目のアミノ酸では、ヒトのGDPLフコースピロフォスフォリラーゼと20の相同性があり、C末端ドメイン584949番目のアミノ酸では哺乳動物のLフコキナーゼと相同性が高い非特許文献55。2つのドメインを150アミノ酸のリンカーで繋ぐ構造となっているが、リンカーの機能は現在のところ不明である。今回、Bfragilis由来FKP遺伝子を導入した酵母Scerevisiae宿主において、FKPが活性型酵素として発現し、培地中に添加したLFucを、salvage経路によりLFuc1Pを経由してGDPLFucにまで変換し、細胞内に蓄積することを確認した。また、LFucと構造的に似ているDAraを培地中に添加した場合でも、同様にGDPDAraを合成することも確認できた。以上の知見を得たことで、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の発明を含むものである。1FKPLフコキナーゼ/GDPLフコースピロフォスフォリラーゼ遺伝子を酵母用発現ベクターにより形質転換した酵母であって、培地中のLフコース、又はLフコースアナログを取り込み、細胞内でGDPLフコース、又はLフコースアナログのGDP糖化合物を合成可能な形質転換酵母。2LフコースアナログがDアラビノースであり、そのGDP糖化合物がGDPDアラビノースである、前記1に記載の形質転換酵母。3FKP遺伝子が、Bacteroidesfragilis由来のFKP遺伝子である、前記1又は2に記載の形質転換酵母。4酵母がSaccharomycescerevisiaeである前記1~3のいずれかに記載の形質転換酵母。5前記1~4のいずれかの形質転換酵母を用い、Lフコース、Dアラビノース、又はLフコースアナログを存在させた培地中で培養することを特徴とする、Lフコース、Dアラビノース、又はLフコースアナログのGDP糖化合物を合成する方法。6Lフコースを存在させた培地中で培養することを特徴とする、GDPLフコースを合成する方法である前記5に記載の方法。7Dアラビノースを存在させた培地中で培養することを特徴とする、GDPDアラビノースを合成する方法である前記5に記載の方法。本発明のBfragilis由来のFKP遺伝子を導入した形質転換酵母は、培地中に基質となるLフコースLFucを添加しておくだけで、salvage経路により直接GDPフコースGDPLFucを効率的に変換することができるため、当該形質転換酵母を用いたGDPフコースGDPLFuc合成方法により、簡便でかつ高効率でGDPLFucを酵母菌体内に蓄積することができる。さらに、Lフコースと構造的に類似したDアラビノースDAlaなどの糖類、及びLフコース、Dアラビノースのアナログである化学修飾体に対しても、酵母細胞内で効率的にGDP糖化合物に転換することができる。そして、当該形質転換酵母に対してさらに外来タンパク質遺伝子と共にOフコース転移酵素遺伝子群特許文献2を導入してやることにより、またはこれら遺伝子が導入された形質転換酵母と掛け合わせることにより、salvage経路を経由したOフコース含有タンパク質合成系を有する形質転換酵母を作出でき、Oフコース含有タンパク質を効率よく製造することができる。1.FKP形質転換酵母について原核生物、真核生物は、2つの異なる代謝経路denovo経路とsalvage経路を利用してGDPLFuc合成を行っている非特許文献2が、酵母にはGDPLFucの合成能力がない。本発明では、酵母にFKPLフコキナーゼ/GDPLフコースピロフォスフォリラーゼ酵素遺伝子を導入することでsalvage経路を移植した図1A参照。本実施例ではBfragilis9343株由来のFKP酵素遺伝子を用いているが、FKP酵素は広くBacteroides類に分布しており、高等植物にも存在することが知られている非特許文献53、54。いずれも、Bfragilis9343株由来FKP酵素と同様にLフコキナーゼ及びGDPLフコースピロフォスフォリラーゼ作用を有している酵素であって、Bfragilis9343株由来FKP酵素に代えて用いることができる。酵母に導入された外来遺伝子であるBfragilisのFKP遺伝子の過剰発現により、酵母菌体内でもsalvage経路が働き、GDPLFucの合成を可能にすることができる。Bfragilis9343株由来のFKP酵素遺伝子の塩基配列配列番号2及び対応するアミノ酸配列配列番号1の情報は、それぞれアクセッション番号CR626927、CAH08307としてGENBANKデータベースから入手できる。Bfragilis9343株以外のBacteroides類又は植物由来の酵素遺伝子は、配列番号1に示されるアミノ酸配列とは80以上、好ましくは90以上、さらに好ましくは95以上のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードし、又は配列番号2に示される塩基配列とも80以上、好ましくは90以上、さらに好ましくは95以上のホモロジーを有している。そして、配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失置換付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は配列番号2に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる遺伝子などと表現することもできる。酵母細胞はGDPLFuc合成に必要な酵素を持っていないので、導入した遺伝子の機能発現を容易にモニターすることができる非特許文献50、非特許文献49。Bfragilis由来などのFKPの関与するsalvage経路を選択したことの理由の1つには、GDPLFucと構造や生合成ステップが似ているGDPLAraの生合成を行える点にある非特許文献47、非特許文献56。当該遺伝子を酵母用の発現ベクターに繋いで酵母を形質転換する。宿主の酵母としては、本実施例ではSaccharomycescerevisiaeを用いたが、Pichia酵母など他の酵母でもよく、発現ベクターについても酵母菌体内で発現可能なプロモーターを有するベクターであればいずれでも良い。ただし、酵母細胞内でsalvage経路を働かせる必要があるため、分泌シグナルを含む分泌ベクターは不適切である。2.本発明が対象とする糖ヌクレオチドGDP糖化合物本発明におけるFKP形質転換酵母は、典型的には細胞内でのFKP酵素作用によりLフコースをそのGDP糖化合物であるGDPLフコースに転換するが、Lフコースに構造的に類似しているいわゆるLフコースアナログを、そのGDP糖化合物に転換することができる。Lフコースアナログとしては、Dアラビノースなどの糖類の他、Lフコース又はDアラビノースなど糖類のアジドやアルキンなどの化学修飾体が含まれる。本実施例では具体的にDアラビノースをGDPDアラビノースに転換できることを実証している。3.FKP形質転換酵母による糖ヌクレオチド合成方法1本発明のFKP形質転換酵母によるGDPLFuc合成FKP形質転換後、細胞数が十分に増えるまでロイシンを欠失させた酵母用培地で培養し、次いで培地中にLFuc又はLFucアナログ例えばDAlaを培地に1mM以上、好ましくは7.5mM以上、より好ましくは15mM以上で480mM以下添加してさらに培養をする。その際には振とう培養を行うことが好ましい。2GDPLFuc生産物の確認方法又は定量法本実施例では以下の及びの方法でGDPLFuc生産物の確認及び定量した。MSまたはMSMSスペクトルによる方法質量分析でGDPLFucに典型的なmz588の位置のピークの存在を確認することで、精製しない状態でも系にGDPLFucが存在しているかどうかを確認することができる。例えばESI1TOFMSMS解析エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析装置、micrOTOFQによるMSMSスペクトル法を用いることができる。標準GDPLFucのデータと比較することでより正確に確定することができる。HPLC分析精製されたGDPLFucをHPLC分析用溶媒に溶かし、MonoQカラムなどの陰イオンカラムにより分析することができる。MonoQカラムの場合には、A液として10mMKH2PO4、B液として05MKH2PO4を使用してGDPLFucの分析をすることができる。標準GDPLFucの資料が市販されているので、そのデータと比較することで精製度も、また定量解析をすることもできる。このほか、キャピラリー電気泳動、NMRによりGDPLFucが生産されているかどうかを確認することができる。3GDPLFucなどの回収、精製方法GDPLFucは酵母の細胞質内で合成され、蓄積されているため、GDPLFucを回収するためには、酵母菌体を破砕後遠心分離などで細胞を除去し、糖ヌクレオチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過法などを単独又は組み合わせて用いることができる。4.酵母によるOフコース含有糖タンパク質の製造方法酵母の細胞質内に蓄積されたGDPLFucを回収せずに、そのままOフコース含有糖タンパク質の製造のために利用することができる。すなわち、特許文献2に記載されたOフコース結合型タンパク質合成系遺伝子群Oフコース転移酵素遺伝子群が導入されている形質転換酵母に本発明のFKP形質転換酵母を掛け合わせることにより、Oフコース結合型タンパク質を合成可能な形質転換酵母を得ることができる。5.FKP形質転換酵母による他の糖ヌクレオチド合成について本発明のFKP形質転換酵母は、LFucと構造的に類似しているDAlaに対しても、培地中に基質として添加しておくことで、酵母菌体内でGDPDAlaを合成することができた図12。Bfragilis由来のFKP酵素は基質特異性が低いため、原理的には、Lガラクトースのような他の単糖にも応用できる可能性がある。さらに、天然の糖でなくてもLFucに構造が類似していればよく、LFucのアナログを用いた糖ヌクレオチド合成に応用することで、糖ヌクレオチドアナログを高純度で合成することも可能である。<式1>FKP形質転換酵母細胞におけるGDPLFucとGDPDAra合成。以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は特にこれら実施例に限定されるものではない。なお、本発明で使用されている技術的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解されている意味を持つ。また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、本明細書の記載として組み入れるものとする。実施例1形質転換酵母Saccharomycescerevisiaeの調製1-1形質転換用宿主酵母株の調整糖ヌクレオチドのインビボ合成のために形質転換用の宿主酵母として、SaccharomycescerevisiaeW3031A株MATaleu23112his31115ade21ura31trp11can1100を用いた。W3031A株の培養は、Scerevisiaeの通常の生育培地であるYPAD培地2バクトペプトン、1酵母エキス、2グルコース、40μlml硫酸アデニンを用いた。形質転換後はロイシン欠失培地SD:0.67バクト酵母ニトロゲンベースアミノ酸不含、2グルコース、0.69glアミノ酸混合物ロイシン不含を用いた。1-2FKP遺伝子を含む酵母用発現ベクターの調製FKP遺伝子はBacteroidesfragilis9343ATCC25285染色体DNAからPCR増幅し、pCMVTag2Bベクターストラタジーン社のEcoRI-XhoI部位に挿入した。PCR増幅し、塩基配列を確認したFKP遺伝子全長及び部分遺伝子truncatedversionを酵母用のYep352GAPIIベクター非特許文献52に導入し、発現に使用した。全長FKP遺伝子は、5’GGAGCTCATGCAAAAACTACTATCTTTACCG3’配列番号3と5’GCTCTAGACCCGGGTGATCGTGATACTTGGAATCCC3’配列番号4とをプライマーとし、またネガティブコントロールであるN末端を除去したFKPFKPΔN遺伝子1752番目の塩基から2847番目の塩基は、5’GGAGCTCATTGTTTGGGGACGTAGC3’配列番号5と5’GCTCTAGACCCGGGTGATCGTGATACTTGGAATCCC3’配列番号6をプライマーとして使用し、PCR増幅を行った。両PCR断片はSacIとXbaIで切断し、TDH3プロモーターを持つ発現ベクターYep352GAPIIに挿入した。pHAベクターから3×HAtag3個のインフルエンザヘマグルチニンエピトープ遺伝子をSmaIにより切り出し、FKP或いはFKPΔN遺伝子が挿入されているYep352GAPIIに挿入した。これらのベクターからTDH3プロモーター、FKP3×HAあるいはFKPΔN3×HA、TDH3ターミネーターを含む断片をBamHIにより切り出し、pRS405のBamHI部位に挿入しpRS405FKP3xHA図1AあるいはpRS405FKPΔN3xHA図1Bを構築した。各プラスミドの塩基配列を確認したのち、BstEIIで切断し、直鎖状にし、酵母染色体のLEU2遺伝子領域に組み込んだ。なお、上記で用いた制限酵素、修飾酵素はNewEnglandBiolabs社あるいはロシュダイアグノスティクス社製を用いた。また、プラスミドベクターの構築の際には大腸菌DH5α株を使用した。大腸菌はLuriaBertani培地1バクトトリプトン、0.5酵母エキス、0.5NaCl、0.2グルコースで培養した。1-3酵母Scerevisiaeの形質転換前記1-2で構築した酵母用発現ベクターpRS405FKP3xHAFKP遺伝子及びpRS405FKPΔN3xHAFKPΔN遺伝子と共に何も遺伝子を挿入していないベクターpRS405:Mockのそれぞれを用いて、Itoらの方法ItoHetalJBacteriol153163168により、前記1-1で調整した酵母W3031A株の形質転換を行った。形質転換体はロイシン欠失培地でそれぞれについて数株ずつ選択し、コロニーPCR解析によって確認を行った。1-4Bfragilis由来FKP酵素タンパク質の発現前記1-3において、ロイシン欠失培地で選択した数株ずつの形質転換体FKP遺伝子、FKPΔN遺伝子、Mockをそれぞれ5mlのSD培地で30°Cの条件下で12時間培養した。この条件ではOD600が1.0およそ2x107細胞程度になる。各形質転換細胞を4000×g、5分の遠心分離により集め、1×PBSで2回洗浄した。各々がおよそ2x107細胞となるように100μlのサンプルバッファー006MTrisHCl、10グリセロール、22メルカプトエタノール、025ブロモフェノールブルーに再懸濁した。これらを95°Cで5分インキュベートし、14000×g5分の遠心分離後、上清を10SDSポリアクリルアミド電気泳動に供した。電気泳動後のタンパク質は、PVDF膜ミリポア社に電気的に転写した15V、1時間。膜をブロッキングし、抗HA抗体ロシュ社と室温で1時間反応させた。抗HA抗体は5スキムミルクを含むPBST01Tween20で希釈しておいたものを使用した。HRPHorseradishperoxidaseコンジュゲートウサギ抗マウスIgGZymax社を2次抗体として用い、ECLエンハンストケミルミネッセンスGEヘルスケア社で検出した。その結果、図2に示したように、FKPΔNとFKP遺伝子産物ははっきりと認められた矢じりで示した。予想通り、FKP導入ベクターを用いた場合にはFKP酵素の全長に対応する135kDaの位置にバンドが見られたのに対し、FKPΔN導入ベクターを用いた場合のバンドは43kDaに見られた。一方、mockではバンドは観察されなかった。実施例2形質転換酵母によるGDPLFucの合成2-1形質転換酵母のLFuc含有培地下での培養形質転換酵母細胞を2mMMgCl2を含む25mlあるいは50mlのSD培地pH75でOD600が1.0になるまで培養した。この場合、細胞はおよそ5x108あるいは1x109になる。このとき、培地にあらかじめ15mMのLフコースを含むものと含まないものを用いた。3種類の形質転換体mockpRS405、pRS405FKP3xHA及びpRS405FKPΔN3xHAを導入した形質転換体を32°C、140rpmで振とう培養した。このとき、培地はフラスコの容量の1/5容になるようにした。細胞を4°C、4000×g、5分間の遠心分離で集め、5倍量の氷冷した滅菌水で2回洗浄した。その後、101ブタノールを含む4mlの氷冷1Mギ酸に再懸濁し、穏やかにピペッティングにより撹拌し、氷中に30分間置いた。4°C、6000×g、10分間の遠心分離で夾雑物を除去したあとの上清を凍結乾燥に供した。2-2酵母細胞からのGDPLFucの抽出とESI1TOFMSMS解析による確認酵母細胞質中でのGDPLFuc合成酵素活性を確認するために、細胞抽出物中のGDPLFucの検出を、ブルカダルトニクス社のESIqTOFMSエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析装置を用いたMS解析で行い、さらにmicrOTOFQを用いてMSMSスペクトルを陰イオンモードで取得した。具体的には、前記2-1で得られた乾燥サンプルを0.5mlの滅菌水に溶解し、そのうち1μlを50メタノールで50μlに希釈した。サンプル溶液は0.5barの窒素ガスで、シリンジポンプKdサイエンティフィック社、流速8μlminを用いてESI源にて測定した。乾燥温度は180°C、乾燥用ガスの流速は4lminとした。キャピラリーの電圧は3200V、エンドプレートオフセットを500Vに保持した。GDPLFucに相当するmz588078のMHイオン図6の矢印をESIqTOFMSによるMSMS解析に供した図3。MSMS解析でのmz305のフラグメントイオンは、下記の表1に示されるように、GDPLFucからグアノシンが脱離した値に相当する。<表1>このMSMS解析の結果は、標準GDPLFucの結果と一致した図7参照。さらに、培地にLFucを添加しないで培養したFKP形質転換酵母についても、内在性の糖ヌクレオチドを調べた。その結果、GDPLFucは検出できなかった図8。この結果から、FKP形質転換酵母は、培地にLFucが存在したときのみにGDPLFucを生産すること、すなわち組換えFKPが酵母の発現系において、salvage経路でのGDPLFuc生産機能を発揮することが証明された。2-3GDPLFucのHPLC解析次に、FKP遺伝子を発現する酵母でのGDPLFucの定量解析を試みた。HPLC分析のために、前記2-2で得られた乾燥させたサンプルを0.8mlの水に溶解し、アマシャムファルマシアバイオテク社現GEヘルスケア社のSMARTシステムを用い、MonoQカラムで糖ヌクレオチドを分離した。MonoQカラムは10mMKH2PO4A液で平衡化し、B液には05MKH2PO4を用いた。流速1ml分で分離を行い、サンプル注入後5分から40分で100B液、あるいは、100分で70B液までKH2PO4濃度を上昇させた。UVモニターで254nmの値を計測することにより、溶出液中の糖ヌクレオチドを測定した。標準物質としてカルビオケム社のGDPLフコースを用い、ピーク面積からGDPLフコース量を計算した。なお、本実験では全てのバッファーを0.45μmのポアサイズの膜を通したのちに使用した。MonoQカラムによるHPLC精製を行うと、LFucを含む培地で培養したFKP発現酵母由来のサンプルでは、約17.5分に明らかなピークが観察された図9F。これに対し、LFucを含まない培地を用いた場合には、17.5分に有意なピークは観察されなかった図9C。Mock図9A、9DやFKPΔN図9B,9Eの場合にも、LFucの有無にかかわらず、17.5分に有意なピークは認められなかった。また、FKP形質転換体の場合、培地中のLFuc濃度を低下させると、GDPLFucの収量も低下することが明らかになった図10参照。HPLC解析では、100分で70までB液05MKH2PO4を上昇させることによって検出できた。この条件ではおよそ31分で標準GDPLFucが溶出するが、FKPを発現する酵母をLFuc存在下で培養した場合にも、同様のピークが見られた図4B。コントロールとして行ったLFucを添加しない培地での培養の場合には、同様のピークは見られなかった図4A。標準GDPLFuc25nmolを用いた定量解析図4Cの結果から、15mMLFucを添加した培地でOD600が1.0になるまで培養したFKP形質転換酵母25ml約5x108細胞から230nmol約0.135mgのGDPLFucが合成されると見積もられた。この収量は、Nakayamaらが報告したdenovo合成経路を導入した酵母の収量非特許文献52の25倍に当たる。これらの結果は、LFucの添加なしでFKP発現酵母がGDPLFuc合成活性を示さないのに対し、LFucの添加によって大量のGDPLFucをinvivoで合成できることを表している。実施例3酵母細胞内でのGDPDAraの合成酵母細胞内に移植されたsalvage経路でLFuc以外の基質も利用できるかどうかの検討を行うために、FKP遺伝子形質転換酵母を実施例2-1において培地中に添加するLFucに代えてDAraを用いた以外は同様の方法で培養した。酵母細胞内で合成されたGDPDAraを、前記実施例2-2と同様にESIMS図11の矢印で検出し、MSMSによって確認を行った。MSMSスペクトルのmz291のフラグメントイオンは、GDPDAraのグアノシンが脱離したものと一致する。これらの質量分析の結果から、この酵母の発現系でGDPDAraも合成されることが示された。ただし、GDPDAraは市販されていないため、HPLCによる分析は省略した。MSMS解析でのmz305のフラグメントイオンは、下記の表2で表される。<表2>"