"式Aのカチオン性脂質:式中、R1およびR2は、H、C1~C6アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから独立して選択され、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、R’から選択される1から3個の置換基で置換されていてもよく、またはR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒に4~7員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、窒素に加えて、N、OおよびSから選択される1もしくは2個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、前記単環式複素環は、R’から選択される1から3個の置換基で置換されていてもよく;R3は、HおよびC1~C6アルキルから選択され、前記アルキルは、R’から選択される1から3個の置換基で置換されていてもよく;R’は、ハロゲン、R’’、OR’’、SR’’、CN、CO2R’’またはCONR’’2から独立して選択され;R’’は、HおよびC1~C6アルキルから独立して選択され、前記アルキルは、ハロゲンおよびOHで置換されていてもよく;nは、0、1、2、3、4または5であり;Xは、O、NR’’、C=OO、NR’’C=O、OC=OO、NR’’C=ONR’’、OC=ONR’’およびNR’’C=OOから選択され;L1は、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1個以上の置換基で置換されていてもよく;ならびにL2は、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1個以上の置換基で置換されていてもよいまたはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体。R1およびR2が、それぞれメチルであり;R3が、Hであり;nが、3であり;Xが、C=OOであり;L1が、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択され;ならびにL2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、請求項1に記載の式Aのカチオン性脂質、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体。20Z,23Z-ノナコサ-20,23-ジエン-10-イル4-ジメチルアミノブタノエート化合物1;および18Z-ヘプタコサ-18-エン-10-イル4-ジメチルアミノブタノエート化合物2であるカチオン性脂質、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体。脂質ナノ粒子の調製のための、請求項1に記載のカチオン性脂質の使用。オリゴヌクレオチドの送達用の脂質ナノ粒子の成分としての、請求項1に記載のカチオン性脂質の使用。前記オリゴヌクレオチドが、siRNAまたはmiRNAである、請求項5に記載の使用。前記オリゴヌクレオチドが、siRNAである、請求項5に記載の使用。本発明は、オリゴヌクレオチドを伴う脂質ナノ粒子を形成するために他の脂質成分、例えばコレステロールおよびPEG-脂質、と併用することができる新規カチオン性脂質を提供する。強化された効力とともに、より低い肝臓内脂質レベルの結果としてより低い肝毒性を明示するカチオン性脂質足場を提供することが、本発明の目的である。本発明は、1本の脂質短鎖を有する低分子量カチオン性脂質を用いて、siRNAのinvivo送達の効率および耐容性を向上させる。本発明の様々な態様および実施形態は、オリゴヌクレオチド、特にsiRNAおよびmiRNAを任意の標的遺伝子に送達するための脂質ナノ粒子において有用な新規カチオン性脂質の使用効果に関する。米国特許出願:米国特許出願公開第2006/0083780号、同第2006/0240554号、同第2008/0020058号、同第2009/0263407号および同第2009/0285881号明細書、ならびにPCT特許出願:国際公開第2009/086558号、同第2009/127060号、同第2009/132131号、同第2010/042877号、同第2010/054384号、同第2010/054401号、同第2010/054405号、同第2010/054406号および同第2010/105209号パンフレット参照。SempleS.C.ら,RationaldesignofcationiclipidsforsiRNAdelivery,NatureBiotechnology,2010年1月17日オンライン公開;doi:10.1038/nbt.l602も参照のこと。本発明のカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチド、具体的にはsiRNAおよびmiRNAの送達用の脂質ナノ粒子の有用な成分である。本発明の第一の実施形態において、カチオン性脂質は、式A:式中、R1およびR2は、H、C1~C6アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから独立して選択され、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、R’から選択される1から3個の置換基で置換されていてもよく、またはR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒に4~7員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、窒素に加えて、N、OおよびSから選択される1もしくは2個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、前記単環式複素環は、R’から選択される1から3個の置換基で置換されていてもよく;R3は、HおよびC1~C6アルキルから選択され、前記アルキルは、R’から選択される1から3個の置換基で置換されていてもよく;R’は、ハロゲン、R’’、OR’’、SR’’、CN、CO2R’’およびCONR’’2から独立して選択され;R’’は、HおよびC1~C6アルキルから独立して選択され、前記アルキルは、ハロゲンおよびOHで置換されていてもよく;nは、0、1、2、3、4または5であり;Xは、O、NR’’、C=OO、NR’’C=O、OC=OO、NR’’C=ONR’’、OC=ONR’’およびNR’’C=OOから選択され;L1は、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1個以上の置換基で置換されていてもよく;ならびにL2は、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1個以上の置換基で置換されていてもよいまたはその任意の薬学的に許容される塩もしくは立体異性体によって説明される。第二の実施形態において、本発明は、R1およびR2が、それぞれメチルであり;R3が、Hであり;nが、3であり;Xが、C=OOであり;L1が、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択され;ならびにL2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、式Aを有する化合物、またはその任意の薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を特徴とする。具体的なカチオン性脂質は、20Z,23Z-ノナコサ-20,23-ジエン-10-イル4-ジメチルアミノブタノエート化合物1;および18Z-ヘプタコサ-18-エン-10-イル4-ジメチルアミノブタノエート化合物2;またはそれらの任意の薬学的に許容される塩もしくは立体異性体である。もう1つの実施形態において、開示するカチオン性脂質は、脂質ナノ粒子の調製に有用である。もう1つの実施形態において、開示するカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドの送達用の脂質ナノ粒子の有用な成分である。もう1つの実施形態において、開示するカチオン性脂質は、siRNAおよびmiRNAの送達用の脂質ナノ粒子の有用な成分である。もう1つの実施形態において、開示するカチオン性脂質は、siRNAの送達用の脂質ナノ粒子の有用な成分である。本発明のカチオン性脂質は、E.L.ElielandS.H.Wilen,StereochemistryofCarbonCompounds,JohnWileySons,NewYork,1994,1119-1190頁に記載されているような不斉中心、キラル軸およびキラル面を有することがあり、ラセミ体として、ラセミ混合物としておよび個々のジアステレオマーとして出現することがあり、それらのすべてのあり得る立体異性体および混合物光学異性体を含むが本発明に含まれる。加えて、本明細書に開示するカチオン性脂質は、互変異性体として存在することがあり、一方の互変異性体構造しか描かれていなかったとしても両方の互変異性体形態が本発明の範囲に包含されると解釈される。本発明のカチオン性脂質の置換基および置換パターンを当業者が選択して、化学的に安定しているカチオン性脂質であって、容易に入手できる出発原料から、下に示す方法ばかりでなく当該技術分野において公知の技術によって容易に合成され得るカチオン性脂質を得ることができることは理解される。置換基自体が1つより多くの基で置換されている場合、これらの多数の基は、結果として安定した構造が生ずるのであれば同じ炭素上にあってもよいし、または異なる炭素上にあってもよいことは理解される。1個以上のSi原子を当業者が本発明のカチオン性脂質に組み込んで、化学的に安定しているカチオン性脂質であって、容易に入手できる出発原料から当該技術分野において公知の技術によって容易に合成され得るカチオン性脂質を得ることができることは理解される。式Aの化合物中の原子は、それらの天然の同位体存在度を呈示することもあり、またはそれらの原子のうちの1個以上が、同じ原子番号を有するが天然に主として見出される原子質量もしくは質量数とは異なる原子質量もしくは質量数を有する特定の同位体に関して人工的に富化されていることもある。本発明は、式Aの化合物のすべての適する同位体を含むことを意図したものである。例えば、水素Hの異なる同位体形態としては、プロチウム1Hおよびジュウテリウム2Hが挙げられる。プロチウムは、天然に見出される水素同位体である。ジュウテリウムの富化は、invivo半減期の増加もしくは投薬必要量低減などの一定の治療的利点をもたらすことができ、または生体試料の特性評価のための標準物質として有用な化合物を生じさせることができる。式Aの範囲内の同位体富化化合物は、過度の実験を伴うことなく、適切に同位体富化された試薬および/または中間体を使用して、当業者に周知の従来の技術によりまたは本明細書中のスキームおよび実施例において説明するものに類似したプロセスにより調製することができる。本明細書において用いる場合、アルキルは、指定数の炭素原子を有する直鎖、環式または分岐飽和脂肪族炭化水素を意味する。本明細書において用いる場合、アルケニルは、ジエン、トリエンおよびテトラエン不飽和脂肪族炭化水素を含むしかしこれらに限定されない、指定数の炭素原子を有する直鎖、環式または分岐不飽和脂肪族炭化水素を意味する。環式アルキルまたはアルケニルの例は、である。本明細書において用いる場合、ヘテロシクリルまたは複素環は、O、NおよびSから成る群より選択される1から4個のヘテロ原子を含有する4員から10員芳香族または非芳香族複素環を意味し、二環式の基を含む。したがって、ヘテロシクリルは、次のもの:ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、1,4-ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニルおよびテトラヒドロチエニル、ならびにこれらのNオキシドを含み、それらのすべてが、R’’から選択される1から3個の置換基で置換されていてもよい。本明細書において用いる場合、ポリアミンは、2個以上のアミノ酸基を有する化合物を意味する。例としては、プトレシン、カダベリン、スペルミジンおよびスペルミンが挙げられる。本明細書において用いる場合、ハロゲンは、Br、Cl、FおよびIを意味する。式Aの1つの実施形態において、R1およびR2は、HおよびC1~C6アルキルから独立して選択され、前記アルキルは、R’から選択される1から3個の置換基で置換されていてもよく、またはR1およびR2を、それらが結合されている窒素と一緒に4~7員の単環式複素環を形成していると考えることができ、前記単環式複素環は、窒素に加えて、N、OおよびSから選択される1もしくは2個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、前記単環式複素環は、R’から選択される1から3個の置換基で置換されていてもよい。式Aの1つの実施形態において、R1およびR2は、H、メチル、エチルおよびプロピルから独立して選択され、前記メチル、エチルおよびプロピルは、R’から選択される1から3個の置換基で置換されていてもよく、またはR1およびR2を、それらが結合されている窒素と一緒に4~7員の単環式複素環を形成していると考えることができ、前記単環式複素環は、窒素に加えて、N、OおよびSから選択される1もしくは2個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、前記単環式複素環は、R’から選択される1から3個の置換基で置換されていてもよい。式Aの1つの実施形態において、R1およびR2は、H、メチル、エチルおよびプロピルから独立して選択される。式Aの1つの実施形態において、R1およびR2は、それぞれメチルである。式Aの1つの実施形態において、R3は、Hおよびメチルから独立して選択される。式Aの1つの実施形態において、R3は、Hである。式Aの1つの実施形態において、R’は、R’’である。式Aの1つの実施形態において、R’’は、H、メチル、エチルおよびプロピルから独立して選択され、前記メチル、エチルおよびプロピルは、1個以上のハロゲンおよびOHで置換されていてもよい。式Aの1つの実施形態において、R’’は、H、メチル、エチルおよびプロピルから独立して選択される。式Aの1つの実施形態において、nは、0、1、2、3または4である。式Aの1つの実施形態において、nは、2、3または4である。式Aの1つの実施形態において、nは、3である。式Aの1つの実施形態において、Xは、O、NR’’、C=OO、NR’’C=O、OC=OO、NR’’C=ONR’’、OC=ONR’’またはNR’’C=OOである。式Aの1つの実施形態において、Xは、C=OOである。式Aの1つの実施形態において、L1は、ハロゲンおよびOHで置換されていてもよい、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択される。式Aの1つの実施形態において、L1は、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択される。式Aの1つの実施形態において、L1は、C4~C24アルケニルから選択される。式Aの1つの実施形態において、L1は、C12~C24アルケニルから選択される。式Aの1つの実施形態において、L1は、C19アルケニルである。式Aの1つの実施形態において、L1は、である。式Aの1つの実施形態において、L1は、である。式Aの1つの実施形態において、L2は、ハロゲンおよびOHで置換されていてもよい、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される。式Aの1つの実施形態において、L2は、ハロゲンおよびOHで置換されていてもよい、C5~C9アルキルおよびC5~C9アルケニルから選択される。式Aの1つの実施形態において、L2は、ハロゲンおよびOHで置換されていてもよい、C7~C9アルキルおよびC7~C9アルケニルから選択される。式Aの1つの実施形態において、L2は、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される。式Aの1つの実施形態において、L2は、C5~C9アルキルおよびC5~C9アルケニルから選択される。式Aの1つの実施形態において、L2は、C7~C9アルキルおよびC7~C9アルケニルから選択される。式Aの1つの実施形態において、L2は、C3~C9アルキルである。式Aの1つの実施形態において、L2は、C5~C9アルキルである。式Aの1つの実施形態において、L2は、C7~C9アルキルである。式Aの1つの実施形態において、L2は、C9アルキルである。式Aの1つの実施形態において、ヘテロシクリルは、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。式Aの1つの実施形態において、単環式ヘテロシクリルは、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。式Aの1つの実施形態において、ポリアミンは、プトレシン、カダベリン、スペルミジンまたはスペルミンである。1つの実施形態において、アルキルは、指定数の炭素原子を有する直鎖飽和脂肪族炭化水素である。1つの実施形態において、アルケニルは、指定数の炭素原子を有する直鎖不飽和脂肪族炭化水素である。式Aのカチオン性脂質の遊離形態はもちろん、その薬学的に許容される塩および立体異性体も、本発明に含まれる。本明細書中で例示する単離された特定のカチオン性脂質のいくつかは、アミンカチオン性脂質のプロトン化塩である。用語遊離形態は、非塩形態のアミンカチオン性脂質を指す。包含される薬学的に許容される塩としては、本明細書に記載する特定のカチオン性脂質について例示する単離された塩ばかりでなく、式Aのカチオン性脂質の遊離形態のすべての典型的な薬学的に許容される塩も挙げられる。記載するカチオン性脂質の特定の塩の遊離形態を、当該技術分野において公知の技術を用いて単離することができる。例えば、適する希薄塩基水溶液、例えば希NaOH水溶液、希炭酸カリウム水溶液、希アンモニア水溶液および希重炭酸ナトリウム水溶液、で塩を処理することによって、遊離形態を再生することができる。遊離形態は、それらのそれぞれの塩形態と一定の物理的性質、例えば極性溶媒への溶解度、が多少異なるだろうが、他の点では、それらの酸性または塩基性塩は、本発明の目的のために、それらそれぞれの遊離形態と薬学的に等価である。本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容される塩は、塩基性または酸性部分を含有する本発明のカチオン性脂質から従来の化学的方法によって合成することができる。一般に、塩基性カチオン性脂質の塩は、イオン交換クロマトグラフィーによって、または遊離塩基と理論量のもしくは過剰な所望の塩形成性無機もしくは有機酸とを適する溶媒中でもしくは溶媒の様々な組み合わせの中で反応させることによって調製される。同様に、酸性化合物の塩は、適切な無機または有機塩基との反応によって形成される。したがって、本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容される塩は、塩基性の本カチオン性脂質と無機または有機酸とを反応させることによって形成されるような本発明のカチオン性脂質の従来の非毒性塩を含む。例えば、従来の非毒性塩としては、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸およびこれらに類するもの、から誘導されるもの、ならびに有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ-安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸TFAおよびこれらに類するもの、から誘導される塩が挙げられる。本発明のカチオン性脂質が酸性であるとき、適する薬学的に許容される塩は、無機塩基および有機塩基を含む薬学的に許容される非毒性塩基から調製される塩を指す。無機塩基から誘導される塩としては、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩、第二鉄塩、第一鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、第二マンガン塩、第一マンガン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩およびこれらに類するものが挙げられる。アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩およびナトリウム塩が特に好ましい。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩としては、第一、第二および第三アミン、置換アミン天然に存在する置換アミンを含む、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばアルギニン、ベタインカフェイン、コリン、N,N1-ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、2-ジエチルアミノエタノール、2-ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、N-エチルモルホリン、N-エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミントリプロピルアミン、トロメタミンおよびこれらに類するもの、の塩が挙げられる。上に記載した薬学的に許容される塩および他の典型的な薬学的に許容される塩の調製は、Bergら,PharmaceuticalSalts,J.Pharm.Sci.,1977:66:1-19によって、より十分に説明されている。生理条件下では化合物中の脱プロトン化された酸性部分、例えばカルボキシル基、がアニオン性であり得、そのときこの電荷はプロトン化またはアルキル化された塩基性部分、例えば第四級窒素原子、のカチオン電荷により内部で相殺され得るので、本発明のカチオン性脂質は、分子内塩または双性イオンである可能性があることにも注目されるだろう。提供する実施例は、本発明のさらなる理解を助けるためのものである。用いる特定の材料、種および条件は、本発明をさらに例証するためのものであり、本発明の妥当な範囲を限定するためのものではない。カチオン性脂質の合成に用いる試薬は、市販されているか、または当業者によって容易に調製される。新規カチオン性脂質の合成は、脂質酸iから出発する線形プロセスである。N,O-ジメチルヒドロキシルアミンへのカップリングによって、ワインレブアミドiiを得る。グリニャール付加によってケトンiiiを生成する。ケトンの還元によってアルコールivを生成する。EDCカップリングによるエステル化によって、タイプvのエステルを得る。一般スキーム120Z,23Z-ノナコサ-20,23-ジエン-10-イル4-ジメチルアミノブタノエート化合物111,14-エイコサジエン酸,11Z,14Z-50g、162mmol、塩酸N,O-ジメチルヒドロキシルアミン31.6g、324mmol、HOAt44.1g、324mmol、Et3N45.2mL、324mmolおよびEDC62.1g、324mmolをDCM810mL中で混合し、一晩、周囲温度で撹拌した。その後、反応物を5×700mLの水で洗浄し、その後、1×600mLの1MNaOHで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、セライトに通して濾過し、蒸発させて、53.06g93の11,14-エイコサジエンアミド,N-メトキシ-N-メチル-,11Z,14Zを透明な金色の油として得た。1HNMR400MHz,CDCl3δ5.35m,4H、3.68s,3H、3.18s,3H、2.77m,2H、2.41t,J=7Hz,2H、2.05m,4H、1.63m,2H、1.40-1.26m,18H、0.89t,J=7Hz,3H。11,14-エイコサジエンアミド,N-メトキシ-N-メチル-,11Z,14Z-14g、11.38mmolを250mLフラスコの中で乾燥THF50.0mlに溶解し、その後、1Mノニルマグネシウムブロミド22.76ml、22.76mmolを窒素下、周囲温度で添加した。10分後、過剰な飽和NH4Cl水溶液でゆっくりと反応を停止させた。その反応物を分液漏斗に入れてヘキサンおよび水で洗浄し、振盪し、下の水性層を廃棄し、上の層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗製ケトンを金色の油として得た。そのケトンをそのまま直接次の反応に持ち越した。ケトン6.32g、15.1mmol、1当量をEtOH75mLに溶解し、NaBH42.86g、75mmol、5当量を添加した。室温で15分の撹拌の後、反応物を蒸発させて残留物を得、それをヘキサン200mLおよび水200mLに溶かし、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、20,23-ノナコサジエン-10-オール,20Z,23Z-ivを白色の固体として得、それをさらに精製せずに使用した。1HNMR500MHz,CDCl3δ5.35m,4H、3.58m,1H、2.77m,2H、2.05m,4H、1.48-1.22m,39H、0.89m,6H。4-ジメチルアミノ酪酸塩酸塩3.03g、18.05mmol、1.2当量、20,23-ノナコサジエン-10-オール,20Z,23Z-iv6.33g、15.04mmol、1当量、EDC3.46g、18.05mmol、1.2当量、DMAP0.368g、3.01mmol、0.2当量およびDIEA7.88mL、45.1mmol、3当量をDCM100mL中で併せ、周囲温度で16時間撹拌した。その後、その反応物を1×250mLの飽和NaHCO3で洗浄し、その後、下の有機層を330gシリカカラムに直接注入し、30分かけて0~15MeOH/DCMで溶離することによって精製した。ブタン酸,4-ジメチルアミノ-,11Z,14Z-1-ノニル-11,14-エイコサジエン-1-イルエステル1を黄色の油として回収した。1HNMR500MHz,CDCl3δ5.35m,4H、4.87m,1H、2.77m,2H、2.34-2.26m,4H、2.22s,6H、2.05m,4H、1.79m,2H、1.51m,4H、1.38-1.22m,34H、0.88m,6H。18Z-ヘプタコサ-18-エン-10-イル4-ジメチルアミノブタノエート化合物2化合物2は、上の化合物1について説明したものに類似した手法で調製した。HRMSMH計算値508.5088、実測値508.5091。化合物3は、国際公開第2010/054401号および国際公開第2010/144740号A1パンフレットに記載されているようなMC3である。化合物4は、NatureBiotechnology,2010,28,172-176、国際公開第2010/042877号Al、国際公開第2010/048536号A2、国際公開第2010/088537号A2および国際公開第2009/127060号A1パンフレットに記載されているようなDLinKC2DMAである。LNP組成物本発明の以下の脂質ナノ粒子組成物LNPは、オリゴヌクレオチド、具体的にはsiRNAおよびmiRNAの送達に有用である:カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG56.6/38/5.4;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG60/38/2;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG67.3/29/3.7;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG49.3/47/3.7;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG50.3/44.3/5.4;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-C-DMA/DSPC40/48/2/10;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG/DSPC40/48/2/10;およびカチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG/DSPC58/30/2/10。LNPプロセス説明:衝突噴流プロセスにより脂質ナノ粒子LipidNano-Particles:LNPを調製する。アルコールに溶解した脂質とクエン酸緩衝液に溶解したsiRNAとを混合することにより粒子を形成する。脂質のsiRNAに対する混合比の目標を44~55脂質と65~45siRNAに設定する。この脂質溶液は、アルコール例えばエタノール中、9~12mg/mLを目標にして5~15mg/mLの濃度で、本発明の新規カチオン性脂質とヘルパー脂質コレステロールとPEG例えば、PEG-C-DMA、PEG-DMG脂質とDSPCとを含有する。前記脂質の比は、カチオン性脂質については35~65を目標にして25~98のモルパーセント範囲を有し、前記ヘルパー脂質は、30~50を目標にして0~75のモルパーセント範囲を有し、前記PEG脂質は、1~6を目標にして1~15のモルパーセント範囲を有し、および前記DSPCは、0~12を目標にして0~15のモルパーセント範囲を有する。前記siRNA溶液は、3.5~5の範囲のpHを有するクエン酸ナトリウム緩衝塩溶液中、0.3~0.9mg/mLを目標にして0.3から1.0mg/mLの濃度範囲で、1つ以上のsiRNA配列を含有する。30~40°Cを目標にして15~40°Cの範囲の温度に前記2種類の脂質を加熱し、その後、衝突噴流ミキサで混合すると即座にLNPを形成する。そのティーIDは、0.25から1.0mmの範囲を有し、総流量は、10~600mL/分の範囲を有する。流量とチューブIDのこの組み合わせには、LNPの粒径を30nmと200nmの間に制御する効果がある。その後、その溶液をより高いpHの緩衝溶液と、1:2容量:容量を目標にするが1:1から1:3容量:容量の範囲の混合比で混合する。この緩衝溶液は、30~40°Cを目標にして、15~40°Cの範囲の温度である。混合されたLNPを30分から2時間保持した後、アニオン交換濾過段階に付す。恒温放置中の温度は、30~40°Cを目標にして15~40°Cの範囲である。恒温放置後、溶液を0.8umフィルタに通し、これはアニオン交換分離段階を含む。このプロセスは、1mmIDから5mmIDの範囲のチューブID、および10から200mL/分の流量を用いる。LNPを濃縮し、限外濾過プロセスによって透析濾過しdiafiltered、このプロセスにおいてアルコールを除去し、クエン酸緩衝液を最終緩衝溶液、例えばリン酸緩衝食塩液、に交換する。前記限外濾過プロセスは、接線流濾過形式TFFを用いる。このプロセスは、30~500KDの膜名目分子量カットオフ値範囲を用いる。この膜の形式は、中空繊維または平面シートカセットであり得る。正しい分子量カットオフでのTFFプロセスは、残余分中にLNPを保持し、濾液または透過液は、アルコール;クエン酸緩衝液;最終緩衝液廃棄物を含有する。前記TFFプロセスは、初期濃度から1~3mg/mLのsiRNA濃度にする多段階プロセスである。濃縮後、LNP溶液を10~20容量について最終緩衝液で透析濾過してアルコールを除去し、緩衝液交換を行う。その後、その材料をさらに1~3倍濃縮する。LNPプロセスの最終段階は、濃縮LNP溶液の滅菌濾過および生成物のバイアル詰めである。分析手順:1siRNA濃度siRNAデュプレックス濃度は、2996PDA検出器を具備するWaters2695AllianceシステムWaterCorporation、マサチューセッツ州ミルフォードを使用して強アニオン交換高速液体クロマトグラフィーStorngAnion-ExchangeHigh-PerformanceLiquidChromatography:SAX-HPLCによって決定する。LNP他にはRNAi送達ビヒクルRNAiDeliveryVehicle:RDVと呼ばれるを0.5TritonX-100で処理して全siRNAを遊離させ、DionexBioLCDNAPacPA2004×250mmカラムを使用するSAX分離と254nmでのUV検出によって分析する。移動相は、0~15分の線形勾配および1ml/分の流量で、A:25mMNaClO4、10mMTris、20EtOH、pH7.0、およびB:250mMNaClO4、10mMTris、20EtOH、pH7.0から成る。siRNA量をsiRNA標準曲線との比較によって決定する。2封入率蛍光試薬SYBRGoldをRNA定量に用いて、RDVの封入率をモニターする。TritonX-100を用いてまたは用いずにRDVを使用して、遊離siRNAおよび全siRNA量を決定する。MolecularDevicesカリフォルニア州サニーヴェールからのSpectraMaxM5eマイクロプレート分光光度計を使用してアッセイを行う。試料を485nmで励起させ、蛍光発光を530nmで測定した。siRNA量をsiRNA標準曲線との比較によって決定する。封入率=1-遊離siRNA/全siRNA×1003粒径および多分散度1μgsiRNAを含有するRDVを1×PBSで3mlの最終容量に希釈する。ZetaPALS計器BrookhavenInstrumentsCorporation、ニューヨーク州ホルツヴィルを使用して動的光散乱法により試料の粒径および多分散度を測定する。He-Neレーザーを用いて25°Cで90°の散乱角での散乱強度を測定する。4ゼータ電位分析1μgsiRNAを含有するRDVを1mMTris緩衝液pH7.4で2mlの最終容量に希釈する。電極と光源としてのHe-Neとを具備するZetaPALS計器BrookhavenInstrumentsCorporation、ニューヨーク州ホルツヴィルを使用して、試料の電気泳動移動度を決定する。ゼータ電位の計算の際にスモルコフスキーの極限を仮定する。5脂質分析Water2695AllianceシステムWaterCorporation、マサチューセッツ州ミルフォードとコロナ荷電化粒子Coronachargedaerosol検出器CADESABiosciences,Inc.、マサチューセッツ州チェルムズフォードを使用して逆相高速液体クロマトグラフィーReversePhaseHigh-PerformanceLiquidChromatography:RP-HPLCによって個々の脂質濃度を決定する。60°CのCADを有するAgilentZorbaxSB-C1850×4.6mm、粒径1.8μmカラムを使用して、RDV中の個々の脂質を分析する。移動相は、A:H2O中0.1TFA、およびB:IPA中0.1TFAから成る。勾配は、時間0からの60移動相Aおよび40移動相Bから、1.00分の時点で40移動相Aおよび60移動相Bへ;1.00から5.00分へ40移動相Aおよび60移動相Bへ;40移動相Aと60移動相Bの5.00分から、10.00分の時点で25移動相Aおよび75移動相Bへ;25移動相Aおよび75移動相Bの10.00分から、15.00分の時点で5移動相Aおよび95移動相Bへ;そして5移動相Aおよび95移動相Bの15.00分から、20.00分の時点で60移動相Aおよび40移動相Bへと、1ml/分の流量で変化する。RDV中のすべての脂質成分を二次曲線に当てはめて標準曲線と比較することにより、個々の脂質濃度を決定する。各脂質のモル百分率をその分子量に基づいて計算する。上で説明したLNPプロセスを用いて、以下の比を有する特定のLNPを同定した:[組成式]カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG60/38/2;およびカチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG/DSPC58/30/2/10。オリゴヌクレオチド合成は、当該技術分野において周知である。米国特許出願:米国特許出願公開第2006/0083780号、同第2006/0240554号、同第2008/0020058号、同第2009/0263407号および同第2009/0285881号明細書、ならびにPCT特許出願:国際公開第2009/086558号、同第2009/127060号、同第2009/132131号、同第2010/042877号、同第2010/054384号、同第2010/054401号、同第2010/054405号および同第2010/054406号パンフレット参照。実施例において開示し、用いるLNPに組み込まれているLucおよびApoBsiRNAは、標準的な固相手順によって合成した。[LucsiRNA][組成式]カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG60/38/2カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG/DSPC40/48/2/10カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG/DSPC58/30/2/10[ApoBsiRNA]マウスinvivo効力評価すぐ上に記載した組成式の化合物1を用いるLNPをinvivo効力について評価した。siRNAは、ホタルホチヌスピラリスPhotinuspyralisルシフェラーゼ遺伝子アクセッションM15077のmRNA転写産物を標的にする。ルシフェラーゼsiRNAの一次配列および化学修飾パターンは、上に表示した。このinvivoルシフェラーゼモデルには、ホタルルシフェラーゼコーディング配列がすべての細胞に存在するトランスジェニックマウスを用いる。DanaFarberCancerInstituteから使用許諾を受けたROSA26-LoxP-Stop-LoxP-LucLSL-Lucトランスジェニックマウスを、先ず組換えAd-CreウイルスVectorBiolabsでLSL配列を除去することによって、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するように誘導する。前記ウイルスの臓器親和性のため、尾静脈注射によって送達しても発現は肝臓に限定される。ルシフェリン基質CaliperLifeSciencesの投与後にIVISイメージャーXenogenを使用して光出力を測定することによって、肝臓内でのルシフェラーゼ発現レベルを定量する。投薬前発光レベルをRDVの投与前に測定する。PBS中のルシフェリン15mg/mLを150μLの容量で腹腔内IP注射する。4分のインキュベーション時間の後、マウスをイソフルランで麻酔し、IVISイメージャーに配置する。PBSビヒクル中のRDVsiRNAを含有を0.2mLの容量で尾静脈注射した。最終用量レベルは、0.1から0.5mg/kgsiRNAの範囲であった。対照としてPBSビヒクルのみを投薬した。上で説明した方法を用いて、投薬48時間後にマウスを撮像した。ルシフェリン光出力の変化は、ルシフェラーゼmRNAレベルと直接相関し、ルシフェラーゼsiRNA活性の間接的尺度となる。invivo効力の結果を、投薬前発光レベルに対する発光の阻害として表す。ルシフェラーゼsiRNARDVの全身投与は、用量依存的様式でルシフェラーゼ発現を減少させた。オクチル-CLinDMAOCDカチオン性脂質を含有するRDVを投薬したマウスより化合物1含有RDVを投薬したマウスでのほうが、大きい効力が観察された図1。OCDは公知であり、国際公開第2010/021865号パンフレットに記載されている。ラットinvivo効力および毒性評価上に記載した組成式の化合物を用いるLNPをSprague-DawleyCrl:CDSD雌ラットCharlesRiverLabsにおいてinvivo効力ならびにアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ増加について評価した。siRNAは、ApoB遺伝子アクセッションMN019287のmRNA転写産物を標的にする。ApoBsiRNAの一次配列および化学修飾パターンは、上に表示した。PBSビヒクル中のRDVsiRNAを含有を1から1.5mLの容量で尾静脈注射した。注射速度は、おおよそ3ml/分である。各投薬群ごとに5匹のラットを使用した。LNP投与後、ラットを普通食および水が存在するケージに入れる。投薬6時間後、ケージから餌を除去する。LNP投薬24時間後に動物剖検を行う。ラットを5分間イソフルランで麻酔し、その後、ラットをノーズコーン内に置くことにより麻酔下で維持し、瀉血が完了するまでイソフルランの送達を継続する。23ゲージバタフライ型静脈穿刺セットを使用して大静脈から血液を採取し、血清化学分析のために血清分離バキュテナーに等分する。切除した肝尾状葉の穿孔を行い、mRNA分析のためにRNALaterAmbion内に配置する。保存肝組織をホモジナイズし、QiagenビーズミルおよびQiagenmiRNA-EasyRNA単離キットを製造業者の指示書に従って使用して全RNAを単離した。肝臓ApoBmRNAレベルを定量的RT-PCRによって判定した。ラットApoB商用プローブセットAppliedBiosystemsCatRN01499054_m1を用いて精製RNAからメッセージを増幅した。PCR反応は、ABI7500計器と96ウェルFastBlockを用いて行った。ApoBmRNAレベルをハウスキーピングPPIBNM011149mRNAに正規化した。PPIBmRNAレベルは、商用プローブセットAppliedBiosystemsCat.No.Mm00478295_m1を使用してRT-PCRによって判定した。結果をApoBmRNA/PPIBmRNA比として表す。すべてのmRNAデータをPBS対照用量に対して表わす。血清ALTおよびAST分析は、SiemensアラニンアミノトランスフェラーゼCat03039631およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼCat03039631試薬を用いてSiemensAdvia1800ClinicalChemistryAnalyzerで行った。カチオン性脂質DLinKC2DMA化合物4またはMC3化合物3を含有するRDVを投薬したラットに比べて化合物2含有RDVを投薬したラットにおいて同様の効力が観察された図2。加えて、3mg/kgのDLinKC2DMA化合物4で処置した4匹のラットのうち3匹は、48時間生存することができず、3mg/kgのMC3化合物3で処置した4匹のラットのうち2匹は、48時間生存することができなかった。6mg/kgの化合物2で処置した4匹のラットのうち2匹は、投薬後48時間の時点で生存していた。ラット肝臓内のカチオン性脂質レベルの判定肝臓組織を20mlバイアルに計り入れ、GenoGrinder2000OPSDiagnostics、1600ストローク/分、5分を使用して9v/wの水中でホモジナイズした。各組織ホモジネートの50μLアリコートを300μLの抽出/タンパク質沈殿用溶媒500nM内部標準物質を含有する、50/50アセトニトリル/メタノールと混合し、そのプレートを遠心分離機にかけて沈殿タンパク質を沈降させた。その後、各上清の200μL容量を96ウェルプレートの別のウェルに移し、10μlの試料をLC/MS-MSによって直接分析した。未処置ラット肝臓ホモジネート水9容量/肝臓重量に化合物の既知量のメタノール保存溶液を加えることによって標準物質を調製した。各標準物質/肝臓ホモジネートのアリコート50μLを300μLの抽出/タンパク質沈殿用溶媒500nM内部標準物質を含有する、50/50アセトニトリル/メタノールと混合し、そのプレートを遠心分離機にかけて沈殿タンパク質を沈降させた。各上清の200μL容量を96ウェルプレートの別のウェルに移し、10μLの各標準物質をLC/MS-MSによって直接分析した。肝臓ホモジネートから調製し、抽出した標準物質に対する絶対定量を、API4000トリプル四重極質量分析計AppliedBiosystemsに連結されたAriaLX-2HPLCシステムThermoScientificを使用して行った。ランごとに合計10μLの試料を周囲温度でBDSHypersilC8HPLCカラムThermo、50×2mm、3μmに注入した。移動相A:95H2O/5メタノール/10mMギ酸アンモニウム/0.1ギ酸移動相B:40メタノール/60n-プロパノール/10mMギ酸アンモニウム/0.1ギ酸流量は、0.5mL/分であり、勾配溶離プロフィールは、次のとおりであった:80Aで0.25分間保持、1.6分かけて100Bへの直線傾斜、100Bで2.5分間保持、その後、戻して80Aで1.75分間保持。全ラン時間は、5.8分であった。API4000ソースパラメータは、CAD:4、CUR:15、GS1:65、GS2:35、IS:4000、TEM:550、CXP:15、DP:60、EP:10であった。化合物2含有RDVを投薬したラットでは、カチオン性脂質DLinKC2DMA化合物4またはMC3化合物3を含有するRDVを投薬したラットより肝臓レベルが低かった図3。"