"少なくとも一つの相補性決定領域CDRをコードするポリヌクレオチドのライブラリを作製する方法であって、a天然に存在するCDRアミノ酸領域を含む参照抗体ライブラリに存在するCDRアミノ酸配列のバリエーションを、CDRの各アミノ酸残基の位置で決定すること;b標的抗原に対する抗体由来のクエリーCDRペプチド配列と参照抗体ライブラリのCDR配列のアラインメントを行うこと;およびc合成されるライブラリのCDR配列の大部分に関して、iCDR配列内の任意の一つの位置でコードされるアミノ酸残基が、候補抗原に対する抗体由来のクエリーCDRペプチド配列の対応するアラインメントを行った位置のアミノ酸残基と同一であるか;またはiiアラインメントを行った位置においてクエリーCDRペプチド配列と同一のアミノ酸残基が参照ライブラリに存在しない場合は、既定のアミノ酸残基である、CDR配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリを合成することを含み、それによって、一つまたはそれ以上の残基の位置において天然に存在するアミノ酸残基が豊富な、標的抗原に対する抗体由来のクエリーCDRペプチド配列のCDRアナログをコードするポリヌクレオチドのライブラリが提供される、上記方法。アラインメントを行うクエリーCDRのアミノ酸長が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、および25である、請求項1に記載の方法。既定のアミノ酸残基が、グリシンGおよびアラニンAからなる群より選択される小型の側鎖のアミノ酸残基;セリンS、スレオニンT、システインC、およびヒスチジンHからなる群より選択される求核性側鎖のアミノ酸残基;バリンV、ロイシンL、イソロイシンI、メチオニンM、およびプロリンPからなる群より選択される疎水性側鎖のアミノ酸残基;フェニルアラニンF、チロシンY、およびトリプトファンWからなる群より選択される芳香族側鎖のアミノ酸残基;アスパラギン酸Dおよびグルタミン酸Eからなる群より選択される酸性側鎖のアミノ酸残基;アスパラギンNおよびグルタミンQからなる群より選択されるアミド側鎖のアミノ酸残基;またはリジンKおよびアルギニンRからなる群より選択される塩基性側鎖のアミノ酸残基、である、請求項1に記載の方法。アラインメントが、ギャップ導入アラインメント、完全アラインメント、不連続アラインメント、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるプロセスによるものである、請求項1に記載の方法。CDRが、EUインデックス、Kabat、Chothiaに従い、または接触点の定義に基づき規定される、請求項1に記載の方法。請求項1に記載の方法により作製されたライブラリ。少なくとも一つの相補性決定領域CDRを含む抗原結合領域のライブラリであって、ライブラリのCDR配列の大部分において、iCDR配列内の任意の一つの位置のアミノ酸残基が、標的抗原に対する抗体由来のクエリーCDRペプチド配列の対応するアラインメントを行った位置のアミノ酸残基と同一であるか;またはiiアラインメントを行った位置にクエリーCDRペプチド配列と同一のアミノ酸残基が参照ライブラリに存在しない場合は、既定のアミノ酸残基であり、それによって、一つまたはそれ以上の残基の位置において天然に存在するアミノ酸残基が豊富な、候補抗原に対する抗体由来のクエリーCDRペプチド配列のCDRアナログのライブラリが提供される、上記ライブラリ。参照抗体ライブラリの標的抗原がタンパク質、ペプチド、低分子、脂質、多糖類、またはポリヌクレオチドである、請求項6または7に記載のライブラリ。クエリーCDRペプチド配列が合成CDR配列または脊椎動物CDR配列である、請求項6または7に記載のライブラリ。脊椎動物CDR配列がヒト、霊長類、マウス、ラット、ウサギ、またはニワトリ配列である、請求項6または7に記載のライブラリ。クエリーCDRペプチド配列が標的抗原に結合する、請求項6または7に記載のライブラリ。標的抗原がタンパク質、ペプチド、低分子、多糖類、またはポリヌクレオチドである、請求項11に記載のライブラリ。ライブラリ配列の10より多くが既知の天然に存在するCDR配列を含む、請求項6または7に記載のライブラリ。ライブラリ配列の50より多くが既知の天然に存在するCDR配列を含む、請求項6または7に記載のライブラリ。ライブラリ配列の80より多くが既知の天然に存在するCDR配列を含む、請求項6または7に記載のライブラリ。ライブラリが、任意の所定のCDRについて既知の天然に存在する多様性のみを含む、請求項6または7に記載のライブラリ。ライブラリが、ヒトCDRについての全ての既知のCDRの多様性を含む、請求項6または7に記載のライブラリ。ライブラリが、ある抗原クラスについての全ての既知のCDRの多様性を含む、請求項6または7に記載のライブラリ。CDRアナログが、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項6または7に記載のライブラリ。クエリーCDR配列が、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3からなる群より選択される、請求項6または7に記載のライブラリ。二以上のCDRのアラインメントを行い、一つの合成CDRライブラリ配列の多様性が、直線的に連結されたCDRの可変性に基づき規定、拡張、または制限される、請求項6または7に記載のライブラリ。CDR-H1が図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のライブラリ。CDR-H2が図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のライブラリ。CDR-H3が図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のライブラリ。CDR-L1が図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のライブラリ。CDR-L2が図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のライブラリ。CDR-L3が図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のライブラリ。軽鎖CDR-L1ラムダLが図44に示されるアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のライブラリ。軽鎖CDR-L1カッパKが図44に示されるアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のライブラリ。軽鎖CDR-L2が図44に示されるアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のライブラリ。軽鎖CDR-L3が図44に示されるアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のライブラリ。CDRアナログが、図9~31、34~36、または44~61のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項15に記載のライブラリ。CDRアナログが含む多様性は、CDRアナログ内の一つまたはそれ以上の残基を縮重コドン、ウォークスルー型変異誘発、またはルックスルー型変異誘発を用いて示されるものである、請求項6または7に記載のライブラリ。抗体結合領域がさらに、一つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む、請求項6または7に記載のライブラリ。抗原結合領域がさらに、ヒト、霊長類、マウス、ラット、ウサギ、またはニワトリ由来の天然に存在するフレームワーク領域を含む、請求項6または7に記載のライブラリ。天然に存在するフレームワーク領域がVH1、VH3、またはVH4である、請求項6または7に記載のライブラリ。ヒトフレームワーク領域が、軽鎖フレームワーク領域、重鎖フレームワーク領域、交配クローニングされたフレームワーク領域、コンセンサスフレームワーク領域、またはそれらの組み合わせである、請求項35に記載のライブラリ。ヒトフレームワーク領域が、一つまたはそれ以上のヒトCDR領域との直線的接続におけるそれらの出現頻度に従い選択される、請求項37に記載のライブラリ。CDR間のヒトフレームワーク領域をアイソタイプ一致させた、請求項37に記載のライブラリ。ライブラリが発現ライブラリである、請求項6または7に記載のライブラリ。発現ライブラリが、リボソームディスプレイライブラリ、ポリソームディスプレイライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、ウイルスディスプレイライブラリ、細菌発現ライブラリ、酵母ディスプレイライブラリ、および哺乳動物ディスプレイライブラリからなる群より選択される、請求項40に記載のライブラリ。一つまたはそれ以上のフレームワーク領域および一つまたはそれ以上のCDR領域をコードする、既定のポリヌクレオチドを合成することによって作製され、これらの領域をコードするポリヌクレオチドがさらに十分に重複する配列を含み、それによって、ポリメラーゼ連鎖反応PCR条件下でこのポリヌクレオチド配列から完全な抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドが構築され得る、請求項6または7に記載のライブラリ。請求項6または7に記載のライブラリのポリヌクレオチドによりコードされる抗体結合領域。抗体結合領域を生成させるために請求項40に記載の発現ライブラリを発現させること、および所望の結合親和性を有する抗体結合領域を選択するために抗体結合領域をスクリーニングすることを含む、所望の結合親和性を有するポリペプチドの同定方法。スクリーニングが抗原結合領域を標的基質と接触させることを含み、抗体結合領域が抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドと関連付けられている、請求項44に記載の方法。選択された抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドを同定する工程をさらに含む、請求項44に記載の方法。ポリヌクレオチドが、リボソームディスプレイライブラリ、ポリソームディスプレイライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、ウイルスディスプレイライブラリ、細菌発現ライブラリ、酵母ディスプレイライブラリ、および哺乳動物ディスプレイライブラリからなる群より選択される発現ディスプレイを用いて抗体結合領域と関連付けられる、請求項46に記載の方法。請求項45~47のいずれか一項に記載の方法に従い同定される抗体結合領域。一つまたはそれ以上の工程がコンピューター支援により行われる、請求項44~48のいずれかに記載の方法。請求項49に記載の方法の一つまたはそれ以上の工程を実行するための指令を含む、電子機器において使用するのに適した媒体。請求項49に記載の方法の一つまたはそれ以上の工程を実行するための機器。a図または表のいずれかに示される配列を有する一つまたはそれ以上のフレームワーク領域;およびb図または表のいずれかに示される配列を有する一つまたはそれ以上のCDR領域、を含む抗体結合領域をコードし、aのフレームワーク領域およびbのCDR領域が一緒になって既定の抗原に対する抗体結合領域を形成する、ポリヌクレオチドのライブラリ。抗体の設計例えば最適な親和性および最小の免疫原性を有する新規なヒト抗体の設計を向上させるために、参照ライブラリ、例えばユニバーサル抗体ライブラリ内に含まれる天然配列の多様性に関する情報を最適に利用することのできる合理的、効率的なプロセスに対する要望が存在する。本発明は、新規な抗体および/またはそのフラグメントにおいて使用するための新規な候補CDR配列を同定するために、クエリー抗体の少なくとも一つのCDR配列を使用して参照抗体ライブラリ例えばユニバーサル抗体ライブラリを検索するプロセスを提供することによって、上記の課題を解決する。一つの実施態様において、本発明は、任意の選択されたCDR残基において参照ライブラリ例えばユニバーサル抗体ライブラリに存在する既知の、優先的な、天然に存在する多様性のみを提示する少なくとも一つのCDR配列を含む配列ライブラリコホートライブラリを生成させる方法を特徴とする。参照ライブラリのCDRドメインに存在するアラインメントを行った残基ごとの配列多様性は独立してソートされ、このようなコホートCDRライブラリのメンバーとして新規なCDR配列が生成される。本発明のアウトプットコホートCDRライブラリは、主として、参照多様性ライブラリから選択される残基ごとのヒト配列の多様性で構成されるが、本発明の方法はまた、アウトプットライブラリ配列において特定のCDR残基を固定し、その残基の位置において例えばアラインメントを行ったクエリー配列に存在する残基にマッチングさせることもできる。特定のアウトプットコホートライブラリ配列の残基をクエリー配列の残基として固定するには、ギャップ導入アラインメントストラテジーを用いて本発明の方法の実施を伴う場合もある。このようなギャップ導入アラインメントストラテジーはまた、本発明の方法に十分な柔軟性を与え、クエリー配列および参照多様性ライブラリ配列のアラインメントにおいてならびに/またはアウトプットコホートライブラリ配列の生成の際に、一つまたはそれ以上のヌクレオチド長のヌクレオチド挿入および/または欠失in/delの存在を許容するために利用され得る。本発明の方法はまた、アウトプットコホートCDRライブラリの全体的な多様性を合理的な様式で調整するために、クエリー配列とライブラリ配列の残基間の類似比較similaritycomparisonsの使用を可能にする。このような実施態様において、20個の天然に存在する哺乳動物のアミノ酸残基は、側鎖の特徴に基づき7つの別個のグループに割り当てられる。所定のCDRの位置のクエリー残基がヒト多様性ライブラリの同じ位置の残基と一致しない場合、このような類似比較の使用は、一つまたはそれ以上の類似残基が参照多様性ライブラリに存在する場合、このような一つまたはそれ以上の類似残基を、アウトプットコホートライブラリのその残基の位置における構成要素として選択することを可能にする。アウトプットコホートCDRの残基の選択に類似基準を適用することにより、同一基準ある位置におけるクエリー配列の残基と参照多様性ライブラリの残基が非同一であれば、得られるアウトプットコホートライブラリの対応する位置において、参照多様性ライブラリのその位置に存在する全てのCDRの残基を使用することになるものを使用した場合と比較して、複雑度が低下したコホートライブラリが生成させ得る。このような類似基準はまた、任意に選択されるCDR残基の位置において許容的permissiveまたは制限的constrictive様式で適用され得る。特定の実施態様において、類似基準の適用は、アウトプットコホートライブラリ配列のその位置への導入について、対応するクエリー配列の残基と類似する一つのみのアミノ酸残基を参照多様性ライブラリから選択することがある。他の実施態様において、所定の位置においてクエリー配列の残基と類似する二以上の参照多様性ライブラリのアミノ酸残基が、本発明のアウトプットコホートライブラリ配列において使用するために選択され得る。このような実施態様の最も許容的な場合、所定のクエリー配列と参照ライブラリの間で非同一な残基のところで参照多様性ライブラリに存在する全ての類似の残基が、アウトプットコホート配列ライブラリのその残基のところで提示される全類似基準と称する。本発明の方法は、任意に選択される残基の位置において、アウトプットコホートライブラリ配列を生成させるために、上記の基準固定残基/ギャップ導入アラインメント、in/del、任意の許容度の類似基準、および/または同一基準を任意の組み合わせで使用することで実施され得る従ってクエリー配列の一つの残基の位置に適用される基準は同じ配列内の隣の残基に適用される基準とは別個のものであってよい。本発明の選択されたコホートCDRライブラリおよび/またはコホートCDRライブラリから選択された配列は、相互におよび選択されたフレームワークドメインの配列と共に;例えば遺伝子のSOEシングルオーバラップエクステンションを通じて組み合わされ、残基ごとに試験することによって天然に存在するCDRのバリエーションを優先的に組み込んだ、従ってこのような新規抗体またはフラグメントが免疫原性である可能性を最小限に抑えた、少なくとも一つの抗体またはそのフラグメントを含む新規な抗体ライブラリが完全に作製され得る。本発明の任意の選択されたCDRライブラリの複雑度は、ランダム型またはその他の形式の合成CDRライブラリと比較して最小限に抑えられているので、本発明の選択されたCDRライブラリ例えば、独立したVHCDR1、VHCDR2、VHCDR3等のライブラリはまた相互に独立してソートされ、例えば、クエリーCDR配列が任意の参照ライブラリのある位置のCDRアミノ酸の残基と同一ではないアミノ酸残基における全てのCDRの配列を網羅する全てのヒトの多様性を提示するが、それでも現在の技術を用いて容易にスクリーニングできるサイズ例えば約1012~1015未満、より好ましくは10~1012、またはその間もしくは範囲のライブラリの複雑性である、新規な抗体ライブラリが作製され得る。本発明はまた、本発明のプロセスによって作製される組成物および本発明の特徴であるプロセスを実施するための機器を特徴とする。従って本発明は、少なくとも一つの相補性決定領域CDRをコードするポリヌクレオチドのライブラリを作製する方法であって、天然に存在するCDRアミノ酸領域を含む参照抗体ライブラリに存在するCDRのアミノ酸配列のバリエーションを、CDRの各アミノ酸残基の位置で決定し;標的抗原に対する抗体由来のクエリーCDRペプチド配列と参照抗体ライブラリのCDR配列のアラインメントを行い;および合成されるライブラリのCDR配列の大部分において、CDR配列内の任意の一つの位置でコードされるアミノ酸残基が、候補抗原に対する抗体由来のクエリーCDRペプチド配列の対応するアラインメントを行った位置のアミノ酸残基と同一であるか;またはアラインメントを行った位置にクエリーCDRペプチド配列と同一のアミノ酸残基が参照ライブラリに存在しない場合は、既定のアミノ酸残基となるように、CDR配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリを合成することを含み、それによって、一つまたはそれ以上の残基の位置において天然に存在するアミノ酸残基が豊富な、標的抗原に対する抗体由来のクエリーCDRペプチド配列のCDRアナログをコードするポリヌクレオチドのライブラリが提供される、方法を特徴とする。一つの実施態様において、アラインメントを行うクエリーCDRのアミノ酸長は4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25である。別の実施態様において、既定のアミノ酸残基が、グリシンGおよびアラニンAからなる群より選択される小型の側鎖のアミノ酸残基;セリンS、スレオニンT、システインC、およびヒスチジンHからなる群より選択される求核性側鎖のアミノ酸残基;バリンV、ロイシンL、イソロイシンI、メチオニンM、およびプロリンPからなる群より選択される疎水性側鎖のアミノ酸残基;フェニルアラニンF、チロシンY、およびトリプトファンWからなる群より選択される芳香族側鎖のアミノ酸残基;アスパラギン酸Dおよびグルタミン酸Eからなる群より選択される酸性側鎖のアミノ酸残基;アスパラギンNおよびグルタミンQからなる群より選択されるアミド側鎖のアミノ酸残基;またはリジンKおよびアルギニンRからなる群より選択される塩基性側鎖のアミノ酸残基である。特定の実施態様において、アラインメントは、ギャップ導入アラインメント、完全アラインメント、不連続アラインメント、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるプロセスによって行なわれる。別の実施態様において、CDRは、EUインデックス、Kabat、Chothiaに従い、または接触点定義contact-pointdefinitionに基づき定義される。さらなる実施態様は、上記方法により作製されるライブラリを特徴とする。さらなる側面において、本発明は、少なくとも一つの相補性決定領域CDRを含む抗原結合領域のライブラリであって、ライブラリのCDR配列の大部分について、CDR配列内の任意の一つの位置のアミノ酸残基が、標的抗原に対する抗体由来のクエリーCDRペプチド配列の対応するアラインメントを行った位置のアミノ酸残基と同一であるか;またはアラインメントを行った位置にクエリーCDRペプチド配列と同一のアミノ酸残基が参照ライブラリに存在しない場合は、既定のアミノ酸残基となり、それによって、一つまたはそれ以上の残基の位置において天然に存在するアミノ酸残基が豊富な、候補抗原に対する抗体由来のクエリーCDRペプチド配列のCDRアナログのライブラリが提供される、ライブラリを特徴とする。一つの実施態様において、参照抗体ライブラリの標的抗原はタンパク質、ペプチド、低分子、脂質、多糖類、またはポリヌクレオチドである。別の実施態様において、クエリーCDRペプチド配列は合成CDR配列または脊椎動物CDR配列である。さらなる実施態様において、脊椎動物CDR配列はヒト、霊長類、マウス、ラット、ウサギ、またはニワトリ配列である。特定の実施態様において、クエリーCDRペプチド配列は標的抗原に結合する。関連する実施態様において、標的抗原はタンパク質、ペプチド、低分子、多糖、またはポリヌクレオチドである。さらなる実施態様において、ライブラリ配列の10より多く、50より多く、80より多くが既知の天然に存在するCDR配列を含む。一つの実施態様において、ライブラリは、任意の所定のCDRについて既知の天然に存在する多様性のみを含む。別の実施態様において、ライブラリは、ヒトCDRについての全ての既知のCDRの多様性を含む。さらなる実施態様において、ライブラリは、抗原クラスについての全ての既知のCDRの多様性を含む。特定の実施態様において、CDRアナログは、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。他の実施態様において、クエリーCDR配列は、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3からなる群より選択される。さらなる実施態様において、二以上のCDRのアラインメントを行い、一つの合成CDRライブラリ配列の多様性が、直線的に連結されたCDRの可変性に基づき規定、拡張、または限定される。一つの実施態様において、CDR-H1は、図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、CDR-H2は、図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、CDR-H3は、図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、CDR-L1は、図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、CDR-L2は、図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、CDR-L3は、図13または16~27のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、軽鎖CDR-L1ラムダLは、図44に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、軽鎖CDR-L1カッパKは、図44に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、軽鎖CDR-L2は、図44に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、軽鎖CDR-L3は、図44に示されるアミノ酸配列を含む。一つの実施態様において、CDRアナログは、図9~31、34~36、または44~61のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、CDRアナログは、CDRアナログ内の一つまたはそれ以上の残基が縮重コドン、ウォークスルー型変異誘発、またはルックスルー型変異誘発を用いて示される多様性を含む。さらなる実施態様において、抗体結合領域はさらに、一つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を含む。さらなる実施態様において、抗原結合領域はさらに、ヒト、霊長類、マウス、ラット、ウサギ、またはニワトリ由来の天然に存在するフレームワーク領域を含む。特定の実施態様において、天然に存在するフレームワーク領域は、VH1、VH3、またはVH4である。関連する実施態様において、ヒトフレームワーク領域は、軽鎖フレームワーク領域、重鎖フレームワーク領域、交配クローニングにより得たcross-clonedフレームワーク領域、コンセンサスフレームワーク領域、またはそれらの組み合わせである。別の実施態様において、ヒトフレームワーク領域は、一つまたはそれ以上のヒトCDR領域との直線的接続におけるそれらの出現頻度に従い選択されている。別の実施態様において、CDR間のヒトフレームワーク領域はアイソタイプ一致させたものである。一つの実施態様において、本発明のライブラリは発現ライブラリである。特定の実施態様において、発現ライブラリは、リボソームディスプレイライブラリ、ポリソームディスプレイライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、ウイルスディスプレイライブラリ、細菌発現ライブラリ、酵母ディスプレイライブラリ、および哺乳動物ディスプレイライブラリからなる群より選択される。さらなる実施態様において、ライブラリは、一つまたはそれ以上のフレームワーク領域および一つまたはそれ以上のCDR領域をコードする既定のポリヌクレオチドを合成することによって作製され、これらの領域をコードするポリヌクレオチドはさらに十分に重複する配列を含み、それによりポリメラーゼ連鎖反応PCR条件下でこのポリヌクレオチド配列から完全な抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドが構築され得る。本発明の別の実施態様は、本発明のライブラリのポリヌクレオチドによりコードされる抗体結合領域を特徴とする。さらなる実施態様は、抗体結合領域を作製するために本発明の発現ライブラリを発現させること、および所望の結合親和性を有する抗体結合領域を選択するために抗体結合領域をスクリーニングすることを含む、所望の結合親和性を有するポリペプチドの同定方法を特徴とする。一つの実施態様において、スクリーニングは、抗原結合領域を標的基質と接触させることを含み、抗体結合領域は、抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドと関連している。別の実施態様において、この方法は、選択された抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドを同定する工程をさらに包含する。さらなる実施態様において、ポリヌクレオチドは、リボソームディスプレイライブラリ、ポリソームディスプレイライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、ウイルスディスプレイライブラリ、細菌発現ライブラリ、酵母ディスプレイライブラリ、および哺乳動物ディスプレイライブラリからなる群より選択される発現ディスプレイを用いて抗体結合領域と関連付けられる。さらなる実施態様は、上記方法に従い同定される抗体結合領域を特徴とする。一つの実施態様において、本発明の特徴的な方法の一つまたはそれ以上の工程は、コンピューター支援により行われる。関連する実施態様は、本発明の方法の一つまたはそれ以上の工程を実行するための指令を含む、電子機器において使用するのに適した媒体を特徴とする。別の実施態様は、本発明の方法の一つまたはそれ以上の工程を実行するための機器を特徴とする。最後の側面は、図または表のいずれかに示される配列を有する一つまたはそれ以上のフレームワーク領域;および図または表のいずれかに示される配列を有する一つまたはそれ以上のCDR領域、を含む抗体結合領域をコードし、aのフレームワーク領域およびbのCDR領域が組み合わされて既定の抗原に対する抗体結合領域が形成される、ポリヌクレオチドのライブラリを特徴とする。図1は、本発明の特定の実施態様において特徴的なユニバーサル抗体ライブラリの構築をコンピュータ支援データベースバイオマイニングを用いて実行するための概略図を示す。図2は、クエリーmAbCDRプローブをコホートライブラリのインシリコ同定に使用する本発明の選択プロセスを強調したものであり、コホートライブラリはその後に最適化コホートクローンを同定するためのインビトロスクリーニングアプローチに使用され得る。図3は、コホートの調査のおいて使用するために照合ユニバーサル抗体ライブラリを構築するプロセスの概要を示す。図4はCDR1およびCDR2の頻度表を生成させるプロセスの概要を提供する。図5は、UALフレームワークおよびCDR配列の、VH記載順に、それぞれ、配列番号1~5、Vκ記載順に、それぞれ、配列番号68、およびVλ記載順に、それぞれ、配列番号9~12クラス間での分配分類の例を示す。図6は、CDR1およびCDR2フレームワークの交配を可能にするUAL重鎖の構築の例を示す。図7は、CDR1およびCDR2フレームワークの交配を可能にするUALカッパ軽鎖の構築の例を示す。VK-3_CDR1-7、VK-1_CDR2-10、およびVK-3_CDR2-10の配列は、それぞれ、配列番号167、276、および278として開示した。図8は、CDR1およびCDR2フレームワークの交配を可能にするUALラムダ軽鎖の構築の例を示す。VL-1_CDR2-10、VL-2_CDR2-10、およびVL-3_CDR2-10の配列は、配列番号280として開示した。図9は、12残基長のVH-4アイソタイプクラスのCDR2配列について同定された4つのカノニカル構造図9AはCS1-A配列番号636およびCS1-1配列番号637を示し、図9BはCS1-2配列番号638およびCS1-3配列番号639を示すについての位置ごとのアミノ酸残基の集団優先性のヒストグラムを示す。集団優先性の分布は可変性残基の位置において4つのサブクラスの間で変化することが観察される。図10マウスCDR1プローブVHCDR1TNYGMN配列番号13を用いるUALのブラスティングは、VH-1CDR1配列番号14およびVH-3CDR1配列番号15参照ユニバーサル抗体ライブラリに存在するヒトCDR1配列における各CDR1アミノ酸位置に存在する配列多様性を同定するための、マウス抗体由来のCDR1ペプチド配列の使用例を示す。図11マウスCDR2プローブVHCDR2WMGWINTYTGEPT配列番号16を用いるUALのブラスティングは、VH-1CDR2配列番号17およびVH-3CDR2配列番号18参照ユニバーサル抗体ライブラリに存在するヒトCDR2配列における各CDR2アミノ酸位置に存在する配列多様性を同定するための、マウス抗体由来のCDR2ペプチド配列の使用例を示す。図12は、新規な抗体配列を生成させるために参照ライブラリの多様性の独立組み合わせにより生成されたコホートライブラリの多様性を計算した、数量化コホートライブラリの例を示す。図13は、マウスAvastinA4.6.1抗体由来のクエリー配列を用いる重鎖図13A-1~13A-4および軽鎖カッパ、図13B-1~13B-3についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図13A-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号13および15として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号13および14として開示される。図13A-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号16および17として開示される。図13A-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号16および18として開示される。図13A-4において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号19および20として開示される。図13B-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号21および22として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号21および249として開示される。図13B-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号23および24として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号23および25として開示される。図13B-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号26および27として開示される。図14パネルA~Eは、マウス抗HIVgp41モノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリCDR配列の選択を示す。下線は触媒性の三つ組残基である。図14Aにおいて、配列は、それぞれ、記載順に、配列番号28~31として開示される。図14Bにおいて、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号32および33として開示される。図14Cにおいて、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号32および34として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号35および36として開示される。図14Dにおいて、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号30および37として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号30および38として開示される。図14Eにおいて、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号31および39として開示される。図15パネルA~Dは、ヒトHK14抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリCDR配列の選択を示す。図15Aにおいて、配列は、それぞれ、記載順に、配列番号40~43として開示される。図15Bにおいて、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号41および44として開示される。図15Cにおいて、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号42および45として開示される。図15Dにおいて、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号43および46として開示される。図16は、ヒトAAV293MCP-1抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図16A-1~16A-4および軽鎖カッパ、図16B-1~16B-3についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図16A-1において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号47および48として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号49および50として開示される。図16A-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号51および52として開示される。図16A-3において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号51および53として開示される。図16A-4において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号54および55として開示される。図16B-1において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号56および57として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号56および58として開示される。図16B-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号59および60として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号59および60として開示される。図16B-3において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号59および582として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号61および62として開示される。図17は、マウスACZ885抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図17A-1~17A-4および軽鎖カッパ、図17B-1~17B-3についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図17A-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号63および64として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号63および65として開示される。図17A-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号66および67として開示される。図17A-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号66および68として開示される。図17A-4において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号69および70として開示される。図17B-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号71および72として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号71および73として開示される。図17B-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号74および75として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号74および76として開示される。図17B-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号77および78として開示される。図18は、ヒトgp120ITH52抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図18A-1~18A-4および軽鎖カッパ、図18B-1~18B-3についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図18A-1において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号79および80として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号79および81として開示される。図18A-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号82および83として開示される。図18A-3において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号82および84として開示される。図18A-4において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号85および86として開示される。図18B-1において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、両方の表において、それぞれ、配列番号87および88として開示される。図18B-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号89および90として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号89および91として開示される。図18B-3において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号92および93として開示される。図19は、ヒトscFvgp120ITH52抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図19A-1~19A-4および軽鎖カッパ、図19B-1~19B-2についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図19A-1において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号94および95として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号94および96として開示される。図19A-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号97および98として開示される。図19A-3において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号97および99として開示される。図19A-4において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号100および101として開示される。図19B-1において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号102および103として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号104および105として開示される。図19B-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号104および106として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号107および108として開示される。図20は、ヒト4D5Herceptin抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図20A-1~20A-4および軽鎖カッパ、図20B-1~20B-3についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図20A-1において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号109および110として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号109および111として開示される。図20A-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号112および113として開示される。図20A-3において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号112および114として開示される。図20A-4において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号115および116として開示される。図20B-1において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号117および118として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号117および119として開示される。図20B-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号120および121として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号120および122として開示される。図20B-3において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号123および124として開示される。図21は、ヒトHD37CD19抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図21A-1~21A-4および軽鎖カッパ、図21B-1~21B-3についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図21A-1において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号125および126として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号125および127として開示される。図21A-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号128および129として開示される。図21A-3において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号128および130として開示される。図21A-4において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号131および132として開示される。図21B-1において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号133および134として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号133および135として開示される。図21B-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号136および137として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号136および138として開示される。図21B-3において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号139および140として開示される。図22は、ヒトCD8g10-1抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図22A-1~22A-3および軽鎖カッパ、図22B-1~22B-3についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図22A-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号141および142として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号141および143として開示される。図22A-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号144および145として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号144および146として開示される。図22A-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号147および148として開示される。図22B-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号149および150として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号149および151として開示される。図22B-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号152および153として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号152および154として開示される。図22B-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号155および156として開示される。図23は、マウス5G1.1C5抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図23A-1~23A-3および軽鎖カッパ、図23B-1~23B-3についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図23A-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号157および158として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号157および159として開示される。図23A-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号160および161として、ならびに二番目の表においては、配列番号160および162として開示される。図23A-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号163および164として開示される。図23B-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号165および166として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号165および167として開示される。図23B-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号168および169として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号168および170として開示される。図23B-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号171および172として開示される。図24は、マウスReopro7E3抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図24A-1~24A-4および軽鎖カッパ、図24B-1~24B-3についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図24A-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号173および174として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号173および175として開示される。図24A-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号176および177として開示される。図24A-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号176および178として開示される。図24A-4において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号179および180として開示される。図24B-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号181および182として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号181および183として開示される。図24B-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号184および185として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号184および186として開示される。図24B-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号187および188として開示される。図25は、マウスRaptivaMHM24抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図25A-1~25A-3および軽鎖カッパ、図25B-1~25B-3についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図25A-1において、マウスプローブ配列は、最初の表においては、配列番号189として、ならびにマウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号189および191として開示される。図25A-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号192および193として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号192および194として開示される。図25A-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号195および196として開示される。図25B-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号197および198として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号197および198として開示される。図25B-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号200および201として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号200および202として開示される。図25B-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号203および204として開示される。図26は、マウスOVA抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図26A-1~26A-3および軽鎖カッパ、図26B-1~26B-2についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図26A-1において、マウスプローブ配列は、最初の表においては、配列番号205として、ならびにヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号207および208として開示される。図26A-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号209および210として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号209および211として開示される。図26A-3において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号212および213として開示される。図26B-1において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号214および215として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号216および217として開示される。図26B-2において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号216および218として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号219および220として開示される。図27は、マウスTNF-αモノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖図27A-1~27A-3および軽鎖カッパ、図27B-1~27B-3についてのコホートライブラリCDRの選択表を示す。図27A-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号221および222として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号221および223として開示される。図27A-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号224および225として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号224および226として開示される。図27A-3において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号227および228として開示される。図27B-1において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号229および230として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号229および231として開示される。図27B-2において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号232および233として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号232および234として開示される。図27B-3において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号235および236として開示される。図28は、本発明の例示の実施態様において使用される、側鎖化学に基づき類似するものと分類されたアミノ酸のグループ化を示す。図29は、本発明の方法を用いて、VH4CDR1参照ライブラリとの比較のために、類似基準または同一基準の下で4H6抗DR4CDR1クエリー配列について獲得したコホート配列の比較を示す。最初の表は、記載順に、それぞれ、配列番号237~239を開示する。第二の表は、記載順に、それぞれ、配列番号240~242を開示する。第三の表は、記載順に、それぞれ、配列番号243~245を開示する。図30パネルA~Gは、マウスモノクローナル抗VEGFA4.6.1抗体をプローブ抗体として用いて、類似基準および同一基準の下で獲得されたコホートライブラリ配列を示す。パネルA:マウスプローブVHCDR1TNYGMN配列番号13。類似配列および同一配列は、最初の表においては配列番号14として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号246および15として開示される。パネルB:マウスプローブVHCDR2WMGWINTYTGEPT配列番号16。類似配列および同一配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号247および17として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号248および18として開示される。パネルC:マウスプローブVHCDR3AKYPHYYGSSHWYFD配列番号19。類似配列および同一配列は、配列番号20として開示される。パネルD:マウスプローブVLCDR1SNYLNWY配列番号21。類似配列および同一配列は、最初の表においては、配列番号22として、二番目の表においては、配列番号249として、ならびに三番目の表においては、それぞれ、配列番号250および251として開示される。パネルE:マウスプローブVLCDR2VLIYFTSSLH配列番号23。類似配列および同一配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号252および24として、二番目の表においては、それぞれ、配列番号253および25として、ならびに三番目の表においては、それぞれ、配列番号254および255として開示される。パネルF:マウスプローブVLCDR3QQYSTVPW配列番号26。類似配列および同一配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号256および27として、ならびに類似配列は、二番目の表においては、配列番号257として開示される。パネルG:コンビナトリアルコホートの多様性および類似性減少倍率値図31パネルA~Fは、類似基準および同一基準に加えて全類似基準を使用した場合の抗VEGFA4.6.1抗体について獲得されたコホートライブラリ配列を示す。パネルA:マウスプローブVHCDR1TNYGMN配列番号13。類似配列、同一配列、および全類似配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号14、14、および259として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号246、15、および261として開示される。パネルB:マウスプローブVHCDR2WMGWINTYTGEPT配列番号16。類似配列、同一配列、全類似配列、およびデータベース配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号247、17、263、および264として開示される。類似配列、同一配列、および全類似配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号248、18、および265として開示される。パネルC:マウスプローブVHCDR3AKYPHYYGSSHWYFD配列番号19。類似配列および同一配列は、配列番号20として開示される。パネルD:マウスプローブVLCDR1SNYLNWY配列番号21。類似配列、同一配列、および全類似配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号22、22、および269として開示される。類似配列、同一配列、全類似配列、およびデータベース配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号249、249、271、および272として開示される。類似配列および同一配列は、三番目の表においては、それぞれ、配列番号250および251として開示される。パネルE:マウスプローブVLCDR2VLIYFTSSLH配列番号23。類似配列、同一配列、全類似配列、およびデータベース配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号252、24、275、および276として、二番目の表においては、それぞれ、配列番号253、25、277、および278として、ならびに三番目の表においては、それぞれ、配列番号254、255、279、および280として開示される。パネルF:マウスプローブVLCDR3QQYSTVPW配列番号26。類似配列、同一配列、および全類似配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号256、27、および281として開示される。類似配列および全類似配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号257および283として開示した。図32は、本発明の例証の実施態様を実施するのに適した電子機器500の一例の実施態様を示す。図33は、本発明に従い形成された様々な典型的scFvキメラ分子の概略図を示す。キメラscFv構築物は、細菌ペリプラズムへの輸送および保持のためのN末端リーダー配列を含み得る。代替のscFvC末端キメラ構築物は、scFvタンパク質を保持するGeneIIIアンカーシグナルを利用するものである。図34は、重複非縮重オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる野生型抗VEGFA4.6.1重鎖ライブラリの構築を示し、これはシングルオーバーラップエクステンションポリメラーゼ連鎖反応SOE-PCRを用いて二本鎖核酸に変換され得る。図は配列番号285を開示する。図35は、重複非縮重オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる野生型抗VEGFA4.6.1軽鎖ライブラリの構築を示し、これはシングルオーバーラップエクステンションポリメラーゼ連鎖反応SOE-PCRを用いて二本鎖核酸に変換され得る。図は配列番号286を開示する。図36は、コンビナトリアル有用変異CBMを示すscFvクローンのアレイを示す。試験参照scFvヒト抗体内に導入されたVLおよびVHCDR領域に複数の変異があり、これは優れた標的抗原に対するKoff結合値に関連する。これらのCBMの構築における位置的置換は、高いKoffおよびKon結合特性を有する個別のルックスルー型変異誘発LTMクローンとして予め同定された。L1配列は、記載順に、それぞれ、配列番号287~298として開示される。L2配列は、記載順に、それぞれ、配列番号299~310として開示される。L3配列は、記載順に、それぞれ、配列番号311~322として開示される。H1配列は、記載順に、それぞれ、配列番号323~334として開示される。H2配列は、記載順に、それぞれ、配列番号335~346として開示される。H3配列は、記載順に、それぞれ、配列番号347~358として開示される。図37は、図36からの6つの高親和性CBMクローンについての結合KoffキネティクスのBiacoreによる測定を、その親の野生型クローンのキネティクスと対比させて示す。図38は、試験候補scFvに対するビオチン化標的抗原およびストレプトアビジンFITCの結合を示すFACSプロットである。左パネルのFACSプロットは、LTMライブラリ全体の結合親和性の分布に比べて、標的抗原に対してより高い結合親和性を有するscFv融合物を発現するクローンのみを同定するための選択ゲート台形P2を示す。右のFACSパネルは、ソーティング後のFACS分析を示し、これによりP2未スクリーニングscFvクローンの>25が既定の高標的抗原親和性の基準内であることが確認された。図39は、A4.6.1コホートライブラリから回収された3D5抗VEGFscFvクローンについてのBiacore結合キネティクスを示す左パネル。3D5抗VEGFscFvクローンがVEGFに結合することは、より多くのVEGF抗原の追加に伴って反応単位RUが上昇したことにより実証された。対照的に、非特異的BSAを3D5抗VEGFscFvに添加した場合は、RUの上昇は見られなかった。図40は、実施例2において詳述される、重鎖配列のサブグループプールの選択プロセス、サブグループ配列のサブクラス分類、およびカノニカル構造に基づくサブクラス集団のさらなる分類を示す。図41は、実施例2において詳述される、CDR可変性プロフィールの選択を示すフローチャートを示す。図42は、共通のCDR3ドメインに接続させる、VH1およびVH3CDR1およびCDR2の設計の交配を示す。図43は、共通のCDR3ドメインに接続させる、VK1およびVK3CDR1およびCDR2の設計の交配を示す。VK-1_CDR2-10、VK-3_CDR1-7、およびVK-3_CDR2-10の配列は、それぞれ、配列番号276、167、および278として開示した。図44は、様々な長さの重鎖および軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3ライブラリについての多様性の表を示す。VL1-CDR2、VL2-CDR2、およびVL3-CDR2の配列は、それぞれ、配列番号640、641、および280として開示した。図45は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、VH-1パネルA、VH-3パネルB、およびVH-4パネルCの重鎖由来の長さ6のCDR1の可変性プロフィールの一覧を示す。列挙したCDRの境界は、配列アラインメントの前に、接触点CDR定義に従い線引きした。縦Y軸は、インビボで発現された抗体のCDR位置における特定のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたCDR1可変性プロフィール図44は、宿主種の優先性を模倣するよう各CDR位置で置換できる潜在的多様性を示した。図46は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、VH-1パネルA、VH-3パネルB重鎖由来の長さ13のCDR2、およびVH-4パネルCの重鎖由来の長さ12のCDR2の可変性プロフィールの一覧を示す。列挙したCDRの境界は、配列アラインメントの前に、接触点CDR定義に従い線引きした。縦Y軸は、インビボで発現された抗体のCDR位置における特定のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたCDR1可変性プロフィール図44は、宿主種の優先性を模倣するよう各CDR位置で置換できる潜在的多様性を示した。図47は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ10のVHCDR3パネルAおよび長さ11のVHCDR3パネルBの可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのVHファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、VHCDR3配列のアラインメントを接触点CDR定義に従い行った。縦Y軸は、特定のVHCDR3位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたVHCDR3可変性プロフィール図44は、長さ10および11の各々のVHCDR3の位置において置換できる潜在的多様性を示した。図48は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ12のVHCDR3パネルAおよび長さ13のVHCDR3パネルBの可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのVHファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、VHCDR3配列のアラインメントを接触点CDR定義に従い行った。縦Y軸は、特定のVHCDR3位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたVHCDR3可変性プロフィール図44は、長さ12および13の各々のVHCDR3の位置において置換できる潜在的多様性を示した。図49は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ14のVHCDR3パネルAおよび長さ15のVHCDR3パネルBの可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのVHファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、VHCDR3配列のアラインメントを接触点CDR定義に従い行った。縦Y軸は、特定のVHCDR3位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたVHCDR3可変性プロフィール図44は、長さ14および15の各々のVHCDR3の位置において置換できる潜在的多様性を示した。図50は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ16のVHCDR3パネルAおよび長さ17のVHCDR3パネルBの可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのVHファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、VHCDR3配列のアラインメントを接触点CDR定義に従い行った。縦Y軸は、特定のVHCDR3位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたVHCDR3可変性プロフィール図44は、長さ16および17の各々のVHCDR3の位置において置換できる潜在的多様性を示した。図51は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ18のVHCDR3パネルAおよび長さ19のVHCDR3パネルBの可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのVHファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、VHCDR3配列のアラインメントを接触点CDR定義に従い行った。縦Y軸は、特定のVHCDR3位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたVHCDR3可変性プロフィール図44は、長さ18および19の各々のVHCDR3の位置において置換できる潜在的多様性を示した。図52は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ20のVHCDR3の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのVHファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、VHCDR3配列のアラインメントを接触点CDR定義に従い行った。縦Y軸は、特定のVHCDR3位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたVHCDR3可変性プロフィール図44は、長さ20の各々のVHCDR3の位置において置換できる潜在的多様性を示した。図53は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ7のVκ-1上パネルおよびVκ-3下パネルCDR1の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのVκファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、VκCDR1配列のアラインメントを接触点CDR定義に従い行った。縦Y軸は、特定のVκCDR1位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたVκCDR1可変性プロフィール図44、各グラフ下の表は、長さ7の各々のVκCDR1の位置において置換できる潜在的多様性を示した。VK-3_CDR1-7の配列は配列番号167として開示した。図54は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ10のVκ-1配列番号276パネルAおよびVκ-3配列番号278パネルBCDR2の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのVκファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、VκCDR2配列のアラインメントを接触点CDR定義に従い行った。縦Y軸は、特定のVκCDR2位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたVκCDR2可変性プロフィール図44、各グラフ下の表は、長さ10の各々のVκCDR1の位置において置換できる潜在的多様性を示した。図55は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ9のVκパネルAおよびVλパネルBCDR3の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのVκおよびVλサブファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、CDR3配列のアラインメントを接触点CDR定義に従い行った。縦Y軸は、特定のVLCDR3位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたVκおよびVλCDR3可変性プロフィール図44、各グラフ下の表は、長さ9の各々のVLCDR3の位置において置換できる潜在的多様性を示した。図56は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ8のVLカッパおよびラムダの両方CDR3パネルAおよび長さ10のVLCDR3パネルBの可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのVκおよびVλファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、CDR3配列のアラインメントを接触点CDR定義に従い行った。縦Y軸は、特定のVLCDR3位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたVLCDR3可変性プロフィール図44、各グラフ下の表は、長さ8および10の各々のVLCDR3の位置において置換できる潜在的多様性を示した。図57は、Kabatデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ11のVLカッパおよびラムダの両方CDR3の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのVκおよびVλファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、CDR3配列のアラインメントを接触点CDR定義に従い行った。縦Y軸は、特定のVLCDR3位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたVLCDR3可変性プロフィール図44、各グラフ下の表は、長さ11の各々のVLCDR3の位置において置換できる潜在的多様性を示した。図58は、単一の直鎖配列に三つの別個のCDR変異を生成させるために複数のオリゴヌクレオチドを用いて適用されたクンケル型変異誘発法を解説するものである。所望のVLおよびVHCDR変異が全て導入されるまでこれらを繰り返した。図59は、単一のオリゴヌクレオチドアニーリング反応を用いて変異をコードするCDRを生成させるために本発明において適用されたクンケル型変異誘発法を解説するものである。示されるプロセスにおいて、第一修飾型WTM-CDRH3テンプレートを再単離し第二の異なるCDRH1オリゴヌクレオチドと再アニールさせて同じ直鎖配列に二つの別個のWTM-CDR変異を生成させた。これらを所望のCDR変異の全てが導入されるまで繰り返した。図60は、長さ6、カノニカル構造1のVH-1CDR1ユニバーサル抗体ライブラリUALについての位置ごとのアミノ酸残基の頻度のヒストグラムを示す。図61は、長さ13、カノニカル構造2パネルAおよび3パネルBのVH-1CDR2ユニバーサル抗体ライブラリUALについての位置ごとのアミノ酸残基の頻度のヒストグラムを示す。図62A~Jは、本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す記載順に、それぞれ、配列番号359~562。図63は、タンパク質左下パネルおよび非タンパク質右上パネル抗原についてのVHCDR3の長さ分析のヒストグラムを示す。明細書および特許請求の範囲を明確に理解してもらうために、以下の定義を提供する。定義本明細書中で使用する場合、用語ユニバーサル抗体ライブラリは、その内容全体が参照により本明細書で援用される、米国特許出願60/585931に記載される抗体ライブラリを意味する。ユニバーサル抗体ライブラリは、参照ライブラリであり得る。参照ライブラリは、天然に存在するCDRの多様性、例えばヒトCDRの多様性、特に既定の抗原クラスに反応して発現された抗体において見出されるCDRの多様性を提示するインシリコ情報であり得る。用語コホートライブラリcohortlibraryは、本発明の方法に従い構築でき、所定のクエリーCDR配列またはプローブCDR配列を表示および/または含み、かつ好ましくはクエリー/プローブCDR配列とアラインメントを行った場合にアミノ酸位置の大部分でヒトアミノ酸残基が豊富な、CDRの多様性を提示するサブセットライブラリ、サブライブラリ、またはアナログライブラリを意味する。用語候補抗原は、既知の、および典型的にはその抗原に対して結合できる抗体、例えばマウス抗体が入手可能である、十分明確な標的または標的抗原を意味する。このような抗体は、クエリーCDR配列の供給源として利用できる。標的抗原は、例えば特定の抗原クラス、例えばタンパク質抗原クラス、ペプチド抗原クラス、低分子抗原クラス、多糖抗原クラス、脂質抗原クラス、またはポリヌクレオチド抗原クラスに属するものであり得る。抗原クラス、例えばタンパク質またはポリペプチド抗原クラスはさらに、可溶性抗原、細胞表面抗原、細胞外抗原、細胞内抗原等を含むクラスとして定義され得る。用語クエリーCDR配列またはプローブCDR配列は、典型的には、既知の結合特異性を有する抗体由来のCDR配列を意味するが、これらには、ヒトのまたはほぼヒトアナログのCDR配列が望ましい。用語抗体結合領域は、抗原に結合できる免疫グロブリンまたは抗体可変領域の一つまたはそれ以上の部分を意味する。典型的には、抗体結合領域は、例えば、抗体軽鎖VLもしくはその可変領域、抗体重鎖VHもしくはその可変領域、重鎖Fd領域、組み合わせの抗体軽鎖および重鎖もしくはそれらの可変領域、例えばFab、Fab2、単一ドメイン、もしくは単鎖抗体scFv、または全長抗体、例えばIgG例えばIgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4サブタイプ、IgA1、IgA2、IgD、IgE、もしくはIgM抗体である。当然ながら標的抗原に対する抗体由来のクエリーCDR配列は、天然または合成のいずれかの全長抗体または一つのCDRを含む抗原結合性フラグメント、例えばFab、scFv、重鎖、軽鎖、Fd、DAb等から誘導することができる。用語フレームワーク領域は、当該分野で理解されている、多様性のより高いCDR領域間に存在する抗体可変領域の部分を意味する。このようなフレームワーク領域は、典型的には、フレームワーク1~4FR1、FR2、FR3、およびFR4と称され、重鎖または軽鎖の抗体可変領域において見出される三つのCDRが抗原結合表面を形成できるよう三次元空間でそれらを保持するためのスカフォールドを提供する。必要に応じて、本明細書に記載されるようにして決定または獲得された一つまたはそれ以上のCDR配列を支持するのに使用されるフレームワーク領域は、当然ながら例えば天然に存在するものもしくは合成のものまたはその組み合わせであり得、例えばフレームワーク配列は、一部が天然に存在するまたは天然由来であるが全体もしくは一部が、例えば、コンセンサスCDRもしくはカノニカルCDRを可能にし、もしくは収容するためのコンセンサス配列を形成するよう手を加えられたものであるか、または交配クローニング、すなわち天然に存在するものであるが事後的に直鎖上で並置されたものであり得る。用語閾出現頻度thresholdfrequencyofoccurrenceは、参照ユニバーサル抗体ライブラリ内で使用するために選択される配列が、例えば特定の抗原クラスに反応する場合免疫細胞により有利に発現される配列であることが決定されている配列由来であることを要求する、本発明の一定の実施態様の基準を意味する。典型的には、このような閾出現頻度を満たすことが決定された発現された再構成された配列は、約10またはそれ以上のパーセント出現率で発現される配列である。用語閾生殖細胞系起源頻度thresholdfrequencyofgermlineoriginは、参照ユニバーサル抗体ライブラリ内で使用のために選択される配列すなわち発現または再構成された配列が、例えば特定の抗原クラスに反応する場合免疫細胞により有利に発現される生殖細胞系配列であることが決定されている配列由来であることを要求する、本発明の一定の実施態様の基準を意味する。典型的には、この閾生殖細胞系起源頻度を満たすことが決定された配列は、約10またはそれ以上のパーセント出現率で生殖細胞系配列に由来するかまたはそこから発生した配列である。用語既定の抗原クラスまたは抗原のクラスまたは抗原クラスは、それらの基本となる組成に関して構造的/化学的に類似する複数の抗原を意味する。典型的な抗原クラスはタンパク質ポリペプチド類、ペプチド類、多糖類、ポリヌクレオチド類、および低分子類である。用語カノニカル構造は、例えばKabatデータベースにおいて列挙されるような抗体の直鎖配列に関する考え方を含む。Kabatの番号付けスキームは、抗体可変のアミノ酸残基を一貫した様式で番号付けするスタンダードとして広く受け入れられている。さらなる構造上の考慮、例えばChothiaらに記載されるような、Kabatの番号付けによっては十分に反映されない、例えば結晶化および三次元モデリングによって明らかになる相違点もまた、抗体のカノニカル構造を決定するのに使用され得る。従って、所定の抗体配列を、とりわけ適切なアクセプター配列の同定を可能にするカノニカルなクラスに分類することができる。抗体のアミノ酸配列のKabatの番号付けおよび構造的な考慮、例えばChothiaらにより記載されるような、ならびに所定の抗体のカノニカルな側面の構築に関する示唆は、文献に記載されている例えば、以下の材料および方法も参照のこと。用語規定のCDR領域は、結合分子の軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域の結合特性を形成する三つの相補性決定領域CDRを意味する。規定のCDR領域は、抗体分子の機能的活性に寄与し、スカフォールドまたはフレームワークにすぎない領域のアミノ酸配列により分断され得る。CDR領域は、典型的には、EUインデックス、Kabat例えばKabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,1983を参照のこと、Chothia例えばChothiaetal.,J.Mol.Biol.196:901-917,1987、または接触点の定義例えばMacCallumetal.,J.Mol.Biol.262:732-7451996を参照のことに従い定義されるが、当然ながらフレームワーク領域および抗原接触可変領域を同定および区分できるあらゆるその他の系もまた使用することができる。さらに、規定のCDR領域内のアミノ酸残基/位置は、EUインデックスの番号付け、Kabatの番号付け、Chothiaの番号付け、接触点の定義、および直鎖上のアミノ酸残基の位置による番号付けからなる群より選択される慣例に従い番号付けを行うことができる。用語ライブラリは、本発明の方法に従い変異誘発された、本明細書中に記載されるような多様性を有する一つまたはそれ以上のCDRまたは抗体分子またはその抗体フラグメントを意味する。ライブラリの抗体は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、無細胞抽出物中のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの形態、またはファージ、原核細胞、もしくは真核細胞中のポリヌクレオチドおよび/もしくはポリペプチドとして存在し得る。本発明のライブラリ、例えばCDRアナログのライブラリはまた、仮想ライブラリ、すなわち実際のライブラリを設計もしくは合成するのに使用できる、またはインシリコもしくはそれ以外のいずれかでクエリーもしくはモデル化できる、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列情報のライブラリの形態であり得る。用語ポリヌクレオチドは、核酸、例えばDNA分子およびRNA分子ならびにそれらのアナログ例えば、ヌクレオチドアナログを用いてまたは核酸化学を用いて生成されるDNAまたはRNAを意味する。必要に応じて、ポリヌクレオチドは、合成により、例えば当該分野で認識されている核酸化学を用いて、または酵素的に、例えばポリメラーゼを用いて合成され、かつ必要に応じて修飾され得る。典型的な修飾には、メチル化、ビオチン化、およびその他の当該分野で公知の修飾が含まれる。さらに、核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得、必要に応じて検出可能な部分に連結され得る。用語変異誘発は、そうでないことが示されない限り、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を変化させるための、当該分野で認識されているあらゆる技術を意味する。好ましい変異誘発のタイプには、ウォークスルー型変異誘発walk-throughmutagenesisWTM、ウォークスルー型有用変異誘発、ルックスルー型変異誘発look-throughmutagenesisLTM、改良型ルックスルー型変異誘発LTM2、またはそれらの組み合わせが含まれる。用語コンビナトリアル有用変異誘発combinatorialbeneficialmutagenesisは、既定のLTMアミノ酸の変異誘発のスクリーニングから測定可能な特性が変化していることが初めに同定されているVLおよび/またはVHCDRのアミノ酸配列のバリエーションの縮重混合物をコードするコード配列のコンビネーションライブラリを意味する。コンビナトリアル有用変異アプローチにおいて、LTMにより同定されたこれらの有益な変異の組み合わせに相当するオリゴヌクレオチドコード配列が作製される。これらの組み合わせは、単一のCDR内の異なる有益な変異、単一の抗体鎖内の二つもしくはそれ以上のCDR内の変異、または異なる抗体鎖のCDR内の変異の組み合わせであり得る。用語ギャップ導入アラインメントは、少なくとも二つのヌクレオチドまたはペプチド配列のアラインメントであって、アラインメントのアルゴリズムにより比較対象の配列のいずれかにおける配列の挿入または欠失の存在を予測される場合に、一つまたはそれ以上の配列がその配列内に、例えばその配列の最適なアラインメントが得られる場所にギャップを導入することによってその配列のアラインメントが最適化されるものを意味する。ヒト集団においては、挿入/欠失in/del多型は一塩基多型SNPと比較して稀なのでしかしこのような特徴in/delは一定のヒト配列において実在する、ギャップ導入は、最も一般的には種をまたぐ配列比較例えばマウス-ヒトにおいて使用される。本発明の特定の実施態様において、ギャップ導入BLASTアラインメントが行われる。用語ギャップ導入BLASTアラインメントは、本明細書中で使用する場合、クエリーポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一つまたはそれ以上の残基が一つまたはそれ以上のスペーサー残基で示される場合があり一般的には、そのようなアラインメントの配列中のダッシュ記号-で表される、このようなスペーサー残基はアラインメント時に周囲の残基に対する間隔調整spacingを提供する以外に得られるBLASTアラインメントに対して影響を及ぼさない、ギャップ導入アラインメント形式を意味する。本発明の目的上、このようなギャップ導入BLASTアラインメントはしばしば、クエリー配列のギャップ導入部分の残基がアウトプットコホートライブラリ配列においてクエリー配列内の対応する位置に存在する同じ残基で固定される場合に行われる。ギャップ導入アラインメントを生成するのに一般的に使用されるデータベース検索/配列アラインメントツールには、例えば、FASTAWilburandLipman,Proc.NatlAcad.Sci.USA,80:726-730;LipmanandPearson,Science,227:1435-1441;PearsonandLipman,Proc.NatlAcad.Sci.USA,85:2444-2448;Pearson,MethodsEnzymol.,183:63-98およびBLASTAltschuletal.,J.Mol.Biol.,215:403-41;Altschuletal.,NucleicAcidsRes.,25:3389-3402が含まれる。用語不連続アラインメントは、本明細書中で使用する場合、直鎖のクエリー配列の少なくとも一つの残基が固定される固定された残基は参照配列の残基と比較される必要がないことを意味する、少なくとも二つのペプチド配列のアラインメントを意味する。用語部分アラインメントは、直鎖のクエリー配列の少なくとも一つのN末端またはC末端残基が固定され、従って参照配列の残基と比較される必要がなくなる、関連するアラインメント形式を意味する。当業者に認識されることであるが、上記のアラインメント形式はまた、コドンで構成されるヌクレオチド配列に対しても類似の効果を発揮し得、ペプチド配列の直接的なアラインメントの代わりに行われる場合もある。用語類似アミノ酸は、最初のアミノ酸と同じ側鎖化学のクラスのアミノ酸を意味する。本発明の例示的な実施態様において、天然アミノ酸は、その側鎖化学に基づき、以下のクラスに分類される。小型の側鎖:グリシンG、アラニンA求核性:セリンS、スレオニンT、システインC、ヒスチジンH疎水性:バリンV、ロイシンL、イソロイシンI、メチオニンM、プロリンP芳香族:フェニルアラニンF、チロシンY、トリプトファンW酸性:アスパラギン酸D、グルタミン酸Eアミド:アスパラギンN、グルタミンQ塩基性:リジンK、アルギニンR従って、グリシンおよびアラニンは相互に類似アミノ酸であり、セリン、スレオニン、システイン、およびヒスチジン;バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびプロリン;フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン;アスパラギン酸およびグルタミン酸;アスパラギンおよびグルタミン;ならびにリジンおよびアルギニンについても同様である。当業者は、天然アミノ酸および/または合成アミノ酸についての類似性の代替的な分類例えば、電荷、疎水性、活性基、立体構造基準等による分類もまた可能であり、これも本発明の範囲内に含まれることを当然認識するであろう。しかし、本発明の目的上、アミノ酸を類似のグループに分配するには、各グループが少なくとも一つのアミノ酸を含む、少なくとも二つのグループの指定が必要である。総論抗体は、強力な診断治療ツールである。標的に対して容易にスクリーニングできる候補結合分子を含む抗体ライブラリが望ましい。本発明は、少なくとも部分的には、包括的なユニバーサル抗体ライブラリUALを構築するという近年報告されたアプローチの見込みを利用しようとするものである。本発明の方法は、任意の選択されたアミノ酸残基の位置に天然に存在するヒトの多様性を優先的にまたは排他的に含む従って、このような配列は、非免疫原性であり、なおかつ公知のCDRおよび/または抗体配列のみの集団よりも有意に多様性が高い多様なCDRおよび/または抗体のコホートライブラリの合理的な作製を可能にする。従って、本発明の方法および組成物の特徴であるコホートライブラリは、例えば同範囲の配列に対するランダム変異誘発アプローチを通じて作製された合成ライブラリと比較して相対的に小さなサイズのライブラリの中で広範囲に及ぶヒト配列の多様性を例えばCDR配列の残基ごとの多様性の独立した組み合わせを通じて提示するという利点を有する。大部分の合成ライブラリ例えば、ランダム変異誘発を通じて作製されたライブラリには、天然に存在しないノイズおよび過剰な多様性という問題がある。完全ヒトライブラリは、一定の抗原クラスに偏っており、捕捉技術が実現できる程度の多様性しか有さない。本発明は、少なくとも部分的には、参照抗体ライブラリ、例えばユニバーサル抗体ライブラリUALをクエリー抗体のCDR配列でBLASTするBLASTed例えば、アラインメント、場合によりギャップ導入アラインメントを行うことによりヒトコホート抗体ライブラリを同定する方法を提供する。このようなストラテジーの応用には以下のようなものが含まれる:1既存の非ヒト例えばマウスモノクローナル抗体を用いるヒト偏向型モノクローナル抗体コホートライブラリの同定。2既存のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体ファミリーに基づくヒト偏向型コホート抗体ライブラリの合理的な生成再生。その場合、このようなCDRのBLASTしたコホート抗体ライブラリは:1非ヒト抗体を基礎とするヒト様抗体を作製するため、2改善された性質例えば、免疫原性、親和性、特異性、発現、安定性等の特異的選択のために既存のヒト抗体または抗体群からヒトの多様性を再生するため、3参照抗体ライブラリの生産的なサブライブラリを予見的に同定するため例えば、UALサブライブラリ;UALは多くのサブライブラリの複合体であるため、多くの抗原についてのCDRBLAST結果の分析が、生産的なUALサブライブラリに対するデノボスクリーニングの達成努力を誘導するために使用できる、に使用され得る。特定の実施態様において、本発明は、包括的なユニバーサル抗体ライブラリを参照ライブラリとして利用するものであり、従ってこれはこのようなライブラリの包括的性質からの利益を享受するコホートCDRおよび/または抗体ライブラリを同定/生成するのに使用され得る。参照抗体ライブラリ、例えばUALおよび本発明のコホートライブラリの両方は、新規な治療薬を獲得するために、例えばハイスループット法を用いて容易にスクリーニングできる。特に、参照ライブラリ、例えばUALは、あらゆる抗原を認識する可能性を有する。このような参照ライブラリのその他の重要な利点には、より大きな多様性、例えば自己反応性抗体はドナーの免疫系の負の選択により除去されるために発現されたヒトライブラリにおいては通常失われた自己抗原にまで及ぶ多様性が含まれる。本明細書中に記載されるコホートライブラリおよび参照例えばUALライブラリの両方の別の利点は、FACS蛍光活性化セルソーターによる正のクローン選択を用いるこのようなライブラリのスクリーニングが、ハイブリドーマライブラリの作製および上清のスクリーニングという標準的で冗長な手法を回避するということである。なおさらに、参照ライブラリ、例えばUALライブラリは、他の所望の標的に対する追加の抗体を発見するために再スクリーニングすることができる。1.1特徴的な参照抗体ライブラリ本発明の特定の方法において利用する参照抗体ライブラリ、特にユニバーサル抗体ライブラリUALは、所定の抗原クラスに対する望ましい候補抗体の全てを提示することができる。本発明の方法により利用され得る例示的なユニバーサル抗体ライブラリは、ヒト配列から得られ、従って非免疫原性であり、このようなライブラリから選択された抗体を治療用途に、例えばヒトの障害または疾患を予防または処置するためにヒト患者に投与するのに適したものにする。本発明の特徴であるライブラリは、多残基の多様性または単一残基の多様性を所定の部位、例えば一つまたはそれ以上の相補性決定領域CDR内に導入すべき必要があるかどうかに依存して、例えば変異誘発技術、例えばウォークスルー型変異誘発WTMまたはルックスルー型変異誘発LTM例えば、それぞれ、米国特許第6649340号;同第5830650号;同第5798208号;および米国特許出願60/483282を参照のことを用いて効率的に導入される多様性を有する。重要なことは、これらの技術が、生産的な多様性の量を最大化し、かつ非生産的な多様性、すなわちノイズにすぎないかまたはでたらめrandomnessなもの、の量を最小化することである。従って、本発明の特徴である参照ライブラリおよびコホートライブラリの両方は、既存の抗体ライブラリよりも小さいが、候補抗体結合分子をより効率的に同定するためのより大きい合理的な多様性を含むことができる。このような参照抗体ライブラリの効率性は、本発明の方法を用いてコホートCDRおよび抗体ライブラリを作製するのに効果的に利用される。特定の実施態様において、本発明のコホートおよび/または参照ライブラリ例えばユニバーサル抗体ライブラリは、WTMまたはLTM技術を適用して軽鎖および/または重鎖の一つまたはそれ以上のCDRにおける所望の多様性を提示する完全合成ライブラリを作出することにより得られる。参照ライブラリの抗体配列、例えばフレームワークおよびCDRは、一定の基準に従い選択される。参照ライブラリからコホートライブラリを選択する基準は、主としてクエリー配列と参照ライブラリ配列との比較を含み、その後変異誘発アプローチにより本発明のコホートCDR/抗体ライブラリを作出する。このような参照ライブラリは、様々な基準によって選択および/または構築される。例えば、一つの基準は、参照抗体配列が、発現される再構成される、好ましくは特定の抗原クラスに反応して発現される再構成される抗体配列、例えばヒト抗体配列において最小閾出現頻度例えば約10またはそれ以上を有さなければならないことである。場合により、別の基準は、発現される再構成される抗体配列が、最小閾出現頻度約10またはそれ以上で生殖細胞系配列を起源とするまたはそれから誘導されることである。その多様性が同定され、次いで体系的な様式で、PCRによる個々のフレームワークおよびクンケル型変異誘発による多様なCDR配列の完全な構築を可能にするオリゴヌクレオチドを用いて従来の遺伝子形式、例えば単鎖抗体形式scFv、fab、または全長Igに遺伝子操作される。重要なことは、本発明のライブラリが、典型的にはランダムオリゴ縮重法またはエラープローンPCRを用いた場合に起こる保証のないunwarranted変異を回避することによって非機能性タンパク質をもたらし得るどのような変異をも最小限に抑えることである。さらに、WTMを用いた場合に得られる精度のレベルは、ランダム変異誘発および/または遺伝子シャッフリング技術と好対照である。さらに、位置およびアミノ酸タイプの点でフレームワークの選択および配列の多様性のレベルを制御することによって、ライブラリの抗原クラス認識が最適化される。さらに、このインビトロ法は、免疫学的な自己抗原の負の選択、および生物の環境暴露に起因するどのような遺伝的な偏りをも回避する。従って、本発明は、情報が豊富であるが不必要に大きくないサイズのスクリーニングライブラリから出発することができるという利点を提供する。最初のクローンセットを同定した後、その後の親和性成熟ライブラリは、共通のLTMおよび/またはWTMオリゴヌクレオチドセットを共有でき、時間および試薬の費用を抑制できる。なおさらに、参照ライブラリ例えばユニバーサル抗体ライブラリおよび本発明の方法を通じて参照ライブラリから得られたコホートライブラリは、迅速かつ効果的に、様々な抗原、特に例えば他のどのような方法によっても獲得することが困難な自己抗原、に対する非常に特異的な抗体を作製することができる。本発明の参照ユニバーサル抗体ライブラリは、規定の抗体領域または領域群ここでポリヌクレオチドは、集合的に、本明細書中に記載される基準に従って全ての可能性がある変種抗体を示すをコードする個々のポリヌクレオチドを最初に合成することによって、作製およびスクリーニングされ得る。同様に、本発明のコホートCDRおよび抗体ライブラリは、規定の抗体領域または領域群ここでポリヌクレオチドは、集合的に、本発明の基準に従って変種CDR位置の選択を示すをコードする個々のポリヌクレオチドを最初に合成することによって、作製およびスクリーニングされ得る。抗体は、例えば、インビトロ転写および翻訳を用いてならびに/またはディスプレイ技術、例えばリボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、もしくは酵母ディスプレイを用いて発現され得る。あるいは、本発明の参照ユニバーサル抗体ライブラリは、規定の抗体領域または領域群ここでポリペプチドは、集合的に、本明細書中に記載される基準に従って全ての可能性がある変種抗体を示すに対応する個々のポリペプチドを最初に合成することによって、作製およびスクリーニングされ得る。同様に、本発明のコホートCDRおよび抗体ライブラリは、規定の抗体領域または領域群ここでポリペプチドは、集合的に、本発明の基準に従って変種CDR位置の選択を示すをコードする個々ポリペプチドを最初に合成することによって、作製およびスクリーニングされ得る。抗体は、ポリペプチドから作製および/または逆翻訳されreversetranslated、例えばインビトロ転写および翻訳を用いてならびに/またはディスプレイ技術、例えばリボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、もしくは酵母ディスプレイを用いて発現され得る。仮想参照ユニバーサルまたはフィルター処理抗体および/またはCDRライブラリもまた、本発明の方法において使用でき、このようなライブラリはヒトペプチド配列の多様性情報から本発明の仮想参照ライブラリへのマニュアルおよび/またはインシリコ編集insilicocompilationを通じて作製される。このような仮想参照ライブラリの構成要素となる配列例えば単一配列、コホートライブラリ、または全参照ライブラリは、当該分野において広く知られた技術例えば、ペプチド配列をコードする核酸配列の合成ならびにその後のインビボ例えば細胞株による媒介および/もしくはインビトロでの転写および/もしくは翻訳、ならびに/またはディスプレイ技術、例えばリボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、もしくは酵母ディスプレイを用いて発現され得る。次いで、発現された抗体は、機能アッセイ、例えば結合アッセイを用いてスクリーニングおよび選択され得る。例えば、ポリペプチドは、抗体結合分子、例えば単鎖抗体scFvをコードするポリヌクレオチドに関連して発現され、それによってその抗体結合分子例えばscFvをコードするポリヌクレオチド配列の同定を可能にする。抗体はまた、例えばUS20040072740A1;US20030036092A1;およびUS20030100023A1に記載される技術を用いて、原核生物、例えば大腸菌の膜上に分泌および提示され得る。本発明の方法は、新規なまたは改善された抗体またはそのフラグメント、例えば単鎖抗体scFvを開発するためにヒト抗体配列を同定するのに使用できる。さらに、本方法は、例えば本明細書中に記載の基準に従い、例えばWTMまたはLTM変異誘発を用いて多様化しようとする配列の初期サブセットを示す参照ライブラリを調製するのに使用できる、例えばコンピュータモデリングおよび電子データベースのバイオマイニングbiominingを介する、アプリオリな情報の利益を伴なって行うことができる。本発明のその他の利点および側面は、以下の開示および実施例から容易に明らかになるであろう。1.2バイオインフォマティクスを用いるユニバーサル抗体ライブラリの構成要素の同定および選択本発明の特定の実施態様において利用してユニバーサル抗体ライブラリUALを構築する最初の工程は、一定の既定の基準を満たす配列の選択である。例えば、最も頻繁に、特に特定の抗原クラスに対して示される配列について、非重複性の再構成された抗体配列を含む電子データベースであるKabatデータベースへのクエリーがなされ得る。この抗原クラスには、例えば、タンパク質およびペプチド抗原だけでなく低分子、多糖類、およびポリヌクレオチドが含まれ得る。これらの抗体のフレームワーク配列のクラスタリング分析を行い、その後に生殖細胞系配列VBASEデータベースとの比較を行うBLAST検索アルゴリズムを用いてことにより、後に所定の抗原クラス、例えばタンパク質性の抗原または標的を認識する機能性抗体を生成するよう再構成されることになる、最も頻繁に使用される生殖細胞系ファミリーを決定する。次いで、機能性抗体の最も大きく構造的多様性が最も多いグループを示す候補フレームワーク配列を選択し、次いでCDRの長さ、つまりフレームワークに収容され得る多様性を決定するため、CDR1およびCDR2のカノニカル構造を決定する。CDR3については、長さのサイズ分布を行い再構成される抗体配列の頻度分析を確認する。CDRのアミノ酸配列を誘導する方法には、既存の再構成された抗体配列の頻度分析が含まれる。一般に、アミノ酸使用をCDR残基の位置ごとに計算し、ある集団または亜集団例えばデータベース由来のCDR配列のパネルにおいてその位置で最も頻繁に使用される優先的なアミノ酸を、頻度の和が既定の限度に達するまで記録する。次いで、既定の限度に達したら、それらの頻度優先度が既定の閾値と等しいまたはそれを超える場合にのみ、アミノ酸を参照ライブラリに加える。実施例4の参照ライブラリについては、限度を80に設定し、個々のアミノ酸についての優先度の閾値設定は10であった。ユニバーサルライブラリの構築ストラテジーには、フレームワーク配列の選択およびその後の超可変性CDRループの設計が含まれる。フレームワーク配列の選択については、特定の抗原に反応して発現されることが決定された全ての利用可能なフレームワークスカフォールドのサブセットがアレイに配置される。自然界で所定の抗原クラスに反応して最も頻繁に発現されるフレームワークを決定することにより、適切なフレームワークアクセプターが選択される。例えば、タンパク質ベースの抗原に反応して発現される好ましいアクセプターフレームワークを決定するために、タンパク質指向型protein-directedフレームワークについて、Kabatデータベース例えばhttp://www.kabatdatabase.com/からアクセスできるサブスクリプション抗体配列データベースを検索する。異なる抗原クラスに対するCDRを利用するのに好ましいアクセプター配列および/または特定の種のアクセプター配列が必要な場合、適宜、Kabatタンパク質配列フィルターを設定する。例えば、タンパク質ベースの標的に対するヒト治療剤として使用するための配列を決定するため、タンパク質/ペプチド抗原を認識するマウス、ラット、またはニワトリ配列等ではなくヒト抗体配列のみに照準を合わせるようフィルターを設定する。これにより、結果にバイアスをかけるデータセットおよび配列情報における重複性が大きく軽減される。上記の工程は、多くの様々な合成フレームワークスカフォールドを生成する必要性を最小限に抑え、かつ典型的には潜在的アクセプターのデータセットが約600配列またはそれ未満になる。従って、抗原クラスによって選択される再構成された遺伝子配列を生じる生殖細胞系前駆配列を決定するさらなる分析のために得られる配列数を容易に管理することができる。この第二の生殖細胞系起源の決定は、過剰に示された最適なまたは高頻度の生殖細胞系フレームワーク配列が存在する場合に同定することになるため、抗原クラスによって選択される抗体配列の選択に磨きをかける。事実、多数の再構成された抗体配列が生成される、特定の抗原に対するいくつかの多クローン性反応において、わずかなアクセプターフレームワーク配列のみが使用されることが観察されている。このような場合、抗体配列およびその抗原に対する結合の多様性は、主としてフレームワークではなくCDRに局在化する。上記のバイオインフォマティクス解析は、記述の目的上VH遺伝子に着目しているが、VλおよびVκの両方に対する遺伝子も同様に評価されることが当然理解されるであろう。本発明のコホート抗体ライブラリにおいて使用するフレームワーク領域は、本発明によってまたは当該分野で認識されている任意のフレームワーク選択法によって使用される参照抗体ライブラリの設計時に使用されたフレームワーク領域から選択され得る。1.3CDRの多様性を最大化する設計ストラテジー例示の参照ユニバーサル抗体ライブラリUALにおいて使用される候補フレームワークの選択は、CDRのサイズおよびUALの初期のアミノ酸配列の多様性の両方に影響する。抗体配列が、1抗原クラスに対する出現頻度および2生殖細胞系頻度について同定される場合、その配列はそれらのカノニカルクラスに従ってアレイ配置され得る。カノニカルクラスは、Chothiaにより記載された従来法以下の材料および方法を参照のことを用いて決定される。所定の抗体配列のセットの中で、同定された抗体配列の大部分が特定のカノニカルクラスに属し得る。カノニカルクラスは、CDRに収容され得るアミノ酸残基の数に影響する。例えば、カノニカルクラスが1~3の場合、CDR1は5アミノ酸ループを有し、CDR2は17アミノ酸ループを有する。重鎖の可変配列については、Jセグメントの配列の寄与は比較的よく保存されており、典型的には、6つの配列のみのサブセットの中でベストフィットする配列のみが考慮される必要がある。KabatおよびVBASEデータベースのCDRアミノ酸頻度分析は、三つのカテゴリー、すなわち1保存されるべき位置、2多様性を出すのに適した位置、および3体細胞超変異を模倣するために変異を導入できる位置に当てはまるCDRアミノ酸残基の位置を同定する。従って、参照UALのVH-CDR1の多様性を設計する際、CDR内のアミノ酸残基は三つの異なるカテゴリー:1生殖細胞系遺伝子および再構成された遺伝子の両方で保存されており、従って変化せずに残る位置、2生殖細胞系においては保存されているが再構成された遺伝子においては変種である、従って最初は固定するが親和性成熟の間に変異させる位置、および3生殖細胞系配列および再構成された配列において多様性を有する、従って初期ライブラリの構築の間にWTMTMを用いて多様性を導入する位置として同定される位置、にグループ分けされる。VH-CDR2の設計において、VBASEおよびKabatデータベースにおける多様性分析は、上記のVH-CDR1について行われたのと同様の様式で行われる。VHCDR3の多様性の設計においては、Kabatデータベース由来の抗体のCDR3配列をそれらのサイズおよび抗原クラスに従いアラインメントする。非タンパク質抗原およびタンパク質/ペプチド抗原を認識する抗体のCDR3の長さを比較し、頻度分析を行い、そしてCDR3の多様性の設計において使用するのに最も好ましい配列を同定するために10の閾出現頻度を使用する。CDR3のサイズおよびアミノ酸残基の頻度分析は、例えば免疫グロブリンDおよびJ遺伝子の再構成された配列を用いて行われるので、フィルターをかけたKabatとVBASEの直接比較においてはCDR3生殖細胞系の等価物は存在しない。しかし、各々の再構成されたCDR3のサイズについてフィルターをかけたKabatの頻度分析を行うことができ、これにより各サイズの分類についての、CDR3の位置を通して最も頻度の高いアミノ酸が明らかにされ、コンセンサス野生型配列が得られる。驚くべきことに、このコンセンサスアプローチは、高い選択圧を受けた特定のアミノ酸を同定する。従って、これらの残基の位置は、典型的には固定され、多様性はこれらの位置に存在する特定のアミノ酸について同定された優先傾向preferenceを考慮して残りのアミノ酸の位置に導入される。上記のCDRのいずれかについての参照UALまたはそれから得られるコホートCDRもしくは抗体ライブラリの多様性を設計する際、所望の場合は、修飾アミノ酸残基、例えば大部分のポリペプチドにおいて使用される伝統的な20個のアミノ酸以外の残基、例えばホモシステインを、CDRに組み込むことができる。これは、典型的には修飾アミノ酸残基が望まれるポリヌクレオチドのところで、終止コドンを導入する当該分野で認識されている技術を用いて行われる。その場合、この技術は、そのポリペプチドに組み込むべき修飾アミノ酸に連結された修飾型tRNA例えば、終止コドンであるアンバー、オパール、またはオーカーのいわゆるサプレッサーtRNAを提供する例えばKoehreretal.,ImportofamberandochresuppressorstRNAsintomammaliancells:Ageneralapproachtosite-specificinsertionofaminoacidanaloguesintoproteins,PNAS,98,14310-143152001を参照のこと。2.コホート抗体ライブラリおよび参照ユニバーサル抗体ライブラリUALの構築本発明のコホート抗体ライブラリおよび参照ユニバーサル抗体ライブラリの生成およびそれらの構築は、生成させようとする抗体の多様性に関する配列および構造の情報を活用して行われるため、改善された抗体を生成する可能性が高くなっている。モデリング情報もまた、規定の領域、例えばCDRに導入するアミノ酸の多様性の選択をガイドするために使用できる。なおさらに、本発明の抗体によって得られる実際の結果は、反復的な様式で作製およびスクリーニングされるその後の抗体の選択または排除、例えば親和性成熟をガイドすることができる。特定の実施態様において、乏しいまたは望ましくない構造および/または機能を有すると推測されるどのような抗体の作製をも排除するために、モデリングが使用される。この方法で作製される抗体の数を大きく減少させることができ、それによってその後のスクリーニングアッセイにおけるシグナルノイズ比が高くなる。別の個別の実施態様において、モデリングは、仮想特定の態様においては、インシリコデータベースの予測能の精度を向上させるよう、あらゆる関連する供給源から、例えば遺伝子およびタンパク質の配列および三次元データベースならびに/または以前に試験した抗体の結果からの追加情報によって継続的にアップデートされる図1。さらに別の実施態様において、仮想データベースは、アッセイ結果、例えば以前に試験した抗体の結合親和性/アビディティと共に提供され、アッセイ基準または基準群に基づき抗体をレスポンダーまたは非レスポンダーとして、例えば十分結合する抗体または十分に結合しない抗体として分類する。この方法で、本発明の親和性成熟は、特定の配列および構造情報をもつ機能的な応答の範囲を一致させることができ、このような情報を将来試験しようとする抗体の作製をガイドするために使用できる。この方法は特に、例えばBiacoreアッセイを用いて、標的抗原に対する特定の結合親和性について抗体または抗体フラグメントをスクリーニングするのに適している。従って、ある領域内の不連続な残基の変異誘発は、その領域内の特定の残基が所望の機能に関与しないであろうことが、例えばインシリコモデリングを通じて既知である場合に望ましいことがある。規定の領域間、例えば抗体の規定の領域内の機能的なアミノ酸残基間の配位構造および空間的相互関係、例えば導入されている多様性が考慮され、モデル化され得る。このようなモデリングの基準には、例えば、アミノ酸残基の側鎖基の化学、原子間距離、結晶学的データ等が含まれる。従って、作製される抗体の数は、理知的に最小化できる。参照UALの合成については、上記工程の一つまたはそれ以上がコンピューター支援により行われ得る。コンピューター支援により行われる工程には、例えば、Kabatデータベースのマイニング、および場合により、VBASEに対する結果の相互参照が含まれ得、それによって本発明の特定の基準が決定され、所望のCDRの多様性を設計するのに使用される図1。参照ライブラリUALの合成はまた、場合により、コンピューター支援により救出されたクローン集合からの配列情報の編集を伴うものであり得る。本発明の方法により利用される参照ライブラリからのコホートCDRおよび抗体ライブラリの選択もまた、コンピューター支援により行われ得る。このような方法はまた、部分的にまたは全体的に、機器、例えばコンピューターにより駆動される機器により行われるのに適している。例えば、配列のアラインメント、配列の比較、位置特異的な残基の選択、ライブラリの多様性の計算、データベースマイニング抗体配列の選択、多様性の設計、オリゴヌクレオチドの合成、上記のもののPCRによるまたはクンケル型変異誘発による構築、ならびに所定の標的に結合する候補抗体の発現および選択は、部分的にまたは全体的に、インターレース機器により実行できる。さらに、この方法を実行するための指令が、部分的にまたは全体的に、その指令を実行するために電子機器において使用するのに適した媒体に与えられ得る。まとめると、本発明の方法は、ソフトウェア例えばコンピュータ読み取り可能な指令およびハードウェア例えばコンピューター、ロボット、およびチップを含むハイスループットアプローチに変換できる。本発明の特定の実施態様は、本発明の特徴である方法を実行できるおよび/またはその実行を補助できるコンピューターまたはその他の電子機器の使用を通じて補助され得る。本発明の例示の実施態様を実施するのに適した電子機器500の一例となる実施態様を図32に示す。電子機器500は、多くの異なる技術、例えばパーソナルコンピューターPC、ラップトップコンピューター、ワークステーション、携帯情報端末PDA、インターネットアプリケーション、携帯電話等の象徴である。例示の実施態様に置いて、電子機器500は、中央演算処理装置CPU502およびディスプレイ機器504を含む。ディスプレイ機器504は、視覚的な表示を通じてユーザーと電子機器500が直接的に通信を行うことを可能にする。電子機器500はさらに、キーボード506およびマウス508を含む。示されていない他の可能性のある入力機器には、スタイラス、トラックボール、ジョイスティック、タッチパッド、タッチスクリーン等が含まれる。電子機器500は、データおよび指令を保存するための主記憶装置510および二次記憶装置512を含む。記憶装置510および512には、フロッピー登録商標ドライブ、ハードドライブ、テープドライブ、光学ドライブ、読み出し専用メモリROM、ランダムアクセスメモリーRAM等の技術が含まれ得る。ブラウザ、JAVA登録商標仮想マシン等のアプリケーション、ならびに他のユーティリティおよびアプリケーションは、記憶装置510および512の一方または両方に置くことができる。電子機器500はまた、示される電子機器500の外部にある一つまたはそれ以上の電子機器と通信するためのネットワークインターフェース514を含み得る。モデムは、外部の電子機器またはネットワークとの接続を確立するためのネットワークインターフェース514の一形態である。CPU502には、内蔵または外付けのいずれかで、上記コンポーネントの一つまたはそれ以上を装備される。上記のアプリケーションに加えて、Simulink登録商標516等のモデリングアプリケーションが電子機器500にインストールされ、実行され得る。電子機器500は本発明を実施する構造の象徴にすぎないことに留意されるべきである。しかし、当業者は、本発明が記載される機器500による実施に限定されないことを理解するであろう。ユーザーによる入力またはディスプレイ機器が必要ない、部分的にまたは全体的に埋め込まれたコードに基づく実施法を含む他の実施法も利用できる。そうだとしても、プロセッサーは、別のプロセッサーまたは他の機器と直接通信できる。3.選択されたコホートCDRおよび抗体ライブラリの合成一つの実施態様において、本発明の選択されたコホートCDRおよび抗体ライブラリは、スクリーニングのために、ポリペプチドの規定の領域をコードし既定のアミノ酸につき一つのコドンしか有さない個々のオリゴヌクレオチドを合成することによって作製される。これは、オリゴヌクレオチド内の各コドンの位置に、野生型ポリペプチドの合成に必要なコドンまたは既定のアミノ酸に対するコドンのいずれかを組み込むことによって達成され、これはルックスルー型変異誘発LTMと称される例えば米国特許出願60/483282を参照のこと。別の実施態様において、複数のアミノ酸位置において多様性が必要とされる場合、オリゴヌクレオチド縮重法またはウォークスルー型変異誘発WTMが使用され得る例えば米国特許第6649340号;同第5830650号;および同第5798208号;ならびに米国特許出願60/483282を参照のこと。WTMは、最小限の数のオリゴヌクレオチドで作製しようとする複数の変異を可能にする。このオリゴヌクレオチドは、例えばドーピング技術を用いて個別に、バッチで作製され、必要な場合は混合またはプールされ得る。ライブラリ作製のためのオリゴヌクレオチドの混合物は、DNA合成の公知技術を用いて容易に合成できる。好ましい方法は、固相ベータ-シアノエチルホスホルアミダイト化学を使用するものである例えば、米国特許第4725677号を参照のこと。便利なところでは、ヌクレオチド専用の試薬容器を含む全自動DNA合成機が使用できる。ポリヌクレオチド、例えば規定の領域に相当するポリヌクレオチドをより大きな遺伝子コンテクストに導入または構築するのを容易にするために、制限部位またはプライマーハイブリダイゼーション部位を含むポリヌクレオチドも合成され得る。合成されたポリヌクレオチドは、例えば標準的な遺伝子操作技術を用いて、より大きな遺伝子コンテクスト、例えば単鎖抗体scFv、fab、または全長Igに挿入され得る。例えば、制限酵素の認識部位を隣に含むポリヌクレオチドが作製され得る例えば米国特許第4888286号を参照のこと。認識部位は、天然に存在するかまたはその領域をコードするDNAに隣接する遺伝子に導入される認識部位に対応するよう設計され得る。ポリヌクレオチドは、二本鎖形態に変換した後、標準的技術によって遺伝子または遺伝子ベクターにライゲートされる。その遺伝子は、適当なベクター例えばファージベクター、プラスミドを含むを利用して、抗体の発現に適した無細胞抽出物、ファージ、原核細胞、または真核細胞に導入される。あるいは、部分的に重複するポリヌクレオチド、典型的には約20~60ヌクレオチド長、が設計される。次いで、内部ポリヌクレオチドがそれらの相補性パートナーとアニールされ、さらなるアニーリングに有用な一本鎖の余剰部分extensionsを有する二本鎖DNA分子が得られる。次いで、PCRを用いて全長の二本鎖分子を形成するために、アニーリングしたペアを混合し、伸長し、ライゲートする。適切なベクターへのクローニングのために、合成遺伝子の末端付近に都合の良い制限部位が設定され得る。次いで、全長分子は適切なベクターにライゲートされ得る。部分重複ポリヌクレオチドが遺伝子の構築において使用される場合、縮重ヌクレオチドのセットがまた、ポリヌクレオチドの一つの代わりに直接導入され得る。適切な相補鎖は、ポリメラーゼによる酵素的伸長による他方の鎖の部分的に相補的なポリヌクレオチドからの伸長反応の間に合成される。合成段階での縮重ポリヌクレオチドの導入もまた、遺伝子の二以上のドメインまたは規定の領域が多様性を有するよう変異導入されるかまたは遺伝子操作されるクローニングを簡素化する。別のアプローチにおいては、抗体は、一本鎖プラスミド上に存在する。例えば、その遺伝子は、ヘルパーファージを使用することで一本鎖分子の増幅を行うファージベクターまたは繊維状ファージの複製起点を有するベクターにクローニングされ得る。一本鎖テンプレートを、所望の変異を示す縮重ポリヌクレオチドのセットとアニールさせ、伸長し、ライゲートすることで、適切な宿主に導入され得る分子集団に各アナログ鎖を導入できる例えばSayers,J.R.etal.,NucleicAcidsRes.16:791-8021988を参照のこと。このアプローチにより、変異誘発のために複数のドメインが選択される複数回のクローニング工程を回避することができる。ポリメラーゼ連鎖反応PCR法もまた、ポリヌクレオチドを遺伝子に、例えばCDRの多様性をフレームワーク領域に導入するのに使用できる。例えば、ポリヌクレオチド自体を伸長のためのプライマーとして使用することができる。このアプローチにおいて、規定の領域またはその部分に対応する変異原性カセットをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも部分的には、相互に相補的であり、かつポリメラーゼを用いて、例えばPCR増幅を用いて大きな遺伝子カセット例えばscFvを形成するために伸長することができる。ライブラリのサイズは、CDRの長さおよび例えばWTMまたはLTMを用いて提示される必要のあるCDRの多様性の量に依存して変化し得る。好ましくは、ライブラリは、1015、1014、1013、1012、1011、1010、109、108、107未満、より好ましくは106個の抗体またはそれ未満を含むよう設計され得る。上記の記載は、対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを変化させることにより抗体の多様性を提示することを中心にしている。しかし、本発明の範囲は、タンパク質化学を用いる所望のポリペプチド領域の直接合成によって本明細書中に開示される抗体の多様性を提示する方法もまた包含することが当然理解されよう。このアプローチを行う場合、得られるポリペプチドもまた、ポリヌクレオチド中間体の使用を排除できることを除いて、本発明の特徴を包含するものである。上記のライブラリについては、ポリヌクレオチドおよび/または対応するポリペプチドの形態によらず、そのライブラリがまた当然ながら、当該分野で認識されている技術を用いて固相支持体、例えばマイクロチップに付加され得、好ましくはアレイ配置されることが理解されよう。本発明の方法は、親和性成熟により候補抗体分子を修飾するのに特に有用である。抗体の可変領域および/またはフレームワーク定常領域に変化が導入され得る。可変領域の修飾は、より良い抗原結合特性、および所望の場合は触媒特性を有する抗体を生成し得る。フレームワーク領域の修飾もまた、物理化学的特性、例えば溶解性または安定性の改善をもたらし得、これは例えば商業的生産、バイオアベイラビリティ、および抗原に対する親和性において特に有用である。典型的には、変異誘発は、抗体分子のFv領域、すなわち、一方は重鎖VH由来で一方は軽鎖VL由来の二つの鎖の可変領域から構成される抗原結合活性に関与する構造を標的とする。所望の抗原結合特性が同定されれば、可変領域を適切な抗体クラス、例えばIgG、IgM、IgA、IgD、またはIgEに操作することができる。好ましい実施態様において、同定された候補結合分子は親和性成熟に供され、標的/抗原に対する結合分子の親和性/アビディティが高められる。4.発現およびスクリーニング系上記の技術または他の適切な技術のいずれかにより生成されるポリヌクレオチドのライブラリは、所望の構造および/または活性を有する抗体を同定するために発現およびスクリーニングされ得る。抗体の発現は、無細胞抽出物および例えばリボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、原核細胞、または真核細胞例えば酵母ディスプレイを用いて行うことができる。一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、無細胞抽出物において発現させることのできるテンプレートとして機能するよう操作される。例えば米国特許第5324637号;同第5492817号;同第5665563号に記載されるようなベクターおよび抽出物が使用でき、多くは市販されている。ポリヌクレオチドすなわち遺伝子型をポリペプチドすなわち表現型と関連付けるためのリボソームディスプレイおよび他の無細胞系技術、例えばProfusionTMが使用できる例えば米国特許第6348315号;同第6261804号;同第6258558号;および同第6214553号を参照のこと。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、便利な大腸菌発現系において発現させることができ、これらはPluckthunおよびSkerraPluckthun,A.andSkerra,A.,Meth.Enzymol.178:476-5151989;Skerra,A.etal.,Biotechnology9:273-2781991に記載されている。M.BetterandA.Horwitz,Meth.Enzymol.178:4761989に記載されるように、変異タンパク質は、培地におよび/または細菌の細胞質に分泌物を発現させることができる。一つの実施態様において、VHおよびVLをコードする単一ドメインの各々を、シグナル配列、例えばompA、phoA、またはpelBシグナル配列をコードする配列の3’末端に結合させるLei,S.P.etal.,J.Bacteriol.169:43791987。これらの遺伝子融合物は、単一のベクターから発現され大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌され得、そこでリフォールディングされて活性な形態で回収できるよう、二シストロン性の構築物に組み込まれるSkerra,A.etal.,Biotechnology9:273-2781991。例えば、抗体重鎖遺伝子は、抗体軽鎖遺伝子と同時に発現させ、抗体または抗体フラグメントを生成させ得る。別の実施態様において、抗体配列は、例えばUS20040072740A1;US20030100023A1;およびUS20030036092A1に記載されるような分泌シグナルおよび脂質付加部分を用いることで、原核生物、例えば大腸菌の膜表面で発現される。さらに別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、例えば米国特許第6423538号;同第6331391号;および同第6300065号に記載されるような酵母ディスプレイを用いることで、真核細胞、例えば酵母において発現させることができる。このアプローチにおいて、ライブラリの抗体例えばscFvは、酵母の表面上で発現および提示されるポリペプチドに融合される。本発明の抗体の発現のための高等真核細胞、例えば哺乳動物細胞、例えば骨髄腫細胞例えばNS/0細胞、ハイブリドーマ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞もまた使用できる。典型的には、抗体は、哺乳動物細胞において発現させる場合、発現され培養培地に分泌されるよう、またはそのような細胞の表面上で発現されるよう設計される。抗体または抗体フラグメントは、例えば全長抗体分子としてまたは個々のVHおよびVLフラグメント、Fabフラグメント、単一ドメイン、または単鎖sFvとして産生させることができる例えばHuston,J.S.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-58831988を参照のこと。発現された抗体または直接的な合成により作製された抗体のスクリーニングは、適切な手段により行うことができる。例えば、標準的な免疫アッセイおよび/またはアフィニティクロマトグラフィによって結合活性を評価することができる。触媒機能、例えばタンパク質分解機能についての本発明の抗体のスクリーニングは、例えば米国特許第5798208号に記載されるような標準的なヘモグロビンプラークアッセイを用いることで達成することができる。候補抗体が治療標的に結合する能力の測定は、例えば所定の標的または抗原への抗体の結合速度を測定するBiacore機器を用いることでインビトロでアッセイできる。多くの動物モデルのいずれかを用いてインビボアッセイを行うことができ、適切な場合はその後にヒトにおいて試験される。本実施例中、そうでないことが示されない限り、以下の材料および方法を使用した。材料および方法概して、本発明の実施では、そうでないことが示されない限り、当該分野の技術の範囲内であり文献に記載されている、化学、分子生物学、組換えDNA技術、PCR技術、免疫学特に、例えば抗体技術、発現系例えば無細胞発現、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびProfusionTM、ならびに任意の必要な細胞培養の従来技術を利用する。例えばSambrook,FritschandManiatis,MolecularCloning:ColdSpringHarborLaboratoryPress1989;DNACloning,Vols.1and2,D.N.Glover,Ed.1985;OligonucleotideSynthesisM.J.Gait,Ed.1984;PCRHandbookCurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry,Beaucage,Ed.JohnWileySons1999Editor;OxfordHandbookofNucleicAcidStructure,Neidle,Ed.,OxfordUnivPress1999;PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,Innisetal.,AcademicPress1990;PCREssentialTechniques:EssentialTechniques,Burke,Ed.,JohnWileySonLtd1996;ThePCRTechnique:RT-PCR,Siebert,Ed.,EatonPub.Co.1998;AntibodyEngineeringProtocolsMethodsinMolecularBiology,510,Paul,S.,HumanaPr1996;AntibodyEngineering:APracticalApproachPracticalApproachSeries,169,McCafferty,Ed.,IrlPr1996;Antibodies:ALaboratoryManual,Harlowetal.,C.S.H.L.Press,Pub.1999;CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubeletal.,JohnWileySons1992;Large-ScaleMammalianCellCultureTechnology,Lubiniecki,A.,Ed.,MarcelDekker,Pub.,1990.PhageDisplay:ALaboratoryManual,C.BarbasEd.,CSHLPress,2001;AntibodyPhageDisplay,POBrienEd.,HumanaPress2001;Borderetal.,Yeastsurfacedisplayforscreeningcombinatorialpolypeptidelibraries,NatureBiotechnology,156:553-71997;Borderetal.,Yeastsurfacedisplayfordirectedevolutionofproteinexpression,affinity,andstability,MethodsEnzymol.,328:430-442000;米国特許第6348315号においてPluckthunらにより記載されたようなリボソームディスプレイ、および米国特許第6258558号;同第6261804号;および同第6214553号においてSzostakらにより記載されたようなProfusionTMを参照のこと。Kabatの取り決めを用いる抗体配列解析に関するさらなる詳細は、例えば、Johnsonetal.,TheKabatdatabaseandabioinformaticsexample,MethodsMolBiol.2004;248:11-25;Johnsonetal.,PreferredCDRH3lengthsforantibodieswithdefinedspecificities,IntImmunol.1998,Dec;1012:1801-5;Johnsonetal.,SEQHUNT.Aprogramtoscreenalignednucleotideandaminoacidsequences,MethodsMolBiol.1995;51:1-15およびWuetal.,LengthdistributionofCDRH3inantibodies;ならびにJohnsonetal.,Proteins.1993May;161:1-7.Reviewに見出され得る。Chothiaの取り決めを用いる抗体配列解析に関するさらなる詳細は、例えば、Chothiaetal.,Structuraldeterminantsinthesequencesofimmunoglobulinvariabledomain,JMolBiol.1998May1;2782:457-79;Moreaetal.,Antibodystructure,predictionandredesign,BiophysChem.1997Oct;681-3:9-16.;Moreaetal.,ConformationsofthethirdhypervariableregionintheVHdomainofimmunoglobulins;JMolBiol.1998Jan16;2752:269-94;Al-Lazikanietal.,Standardconformationsforthecanonicalstructuresofimmunoglobulins,JMolBiol.1997Nov7;2734:927-48.Barreetal.,Structuralconservationofhypervariableregionsinimmunoglobulinsevolution,NatStructBiol.1994Dec;112:915-20;Chothiaetal.,StructuralrepertoireofthehumanVHsegments,JMolBiol.1992Oct5;2273:799-817Conformationsofimmunoglobulinhypervariableregions,Nature.1989Dec21-28;3426252:877-83;およびChothiaetal.,ReviewCanonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmunoglobulins,JMolBiol.1987Aug20;1964:901-17に見出され得る。Chothia解析に関するさらなる詳細は、例えば、MoreaV,TramontanoA,RusticiM,ChothiaC,LeskAM.ConformationsofthethirdhypervariableregionintheVHdomainofimmunoglobulins.JMolBiol.1998Jan16;2752:269-94;ChothiaC,LeskAM,GherardiE,TomlinsonIM,WalterG,MarksJD,LlewelynMB,WinterG.StructuralrepertoireofthehumanVHsegments.JMolBiol.1992Oct5;2273:799-817;ChothiaC,LeskAM,TramontanoA,LevittM,Smith-GillSJ,AirG,SheriffS,PadlanEA,DaviesD,TulipWR,etal.Conformationsofimmunoglobulinhypervariableregions.Nature.1989Dec21-28;3426252:877-83;ChothiaC,LeskAM.Canonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmunoglobulins.JMolBiol.1987Aug20;1964:901-17;およびChothiaC,LeskAM.Theevolutionofproteinstructures.ColdSpringHarbSympQuantBiol.1987;52:399-405に記載されている。CDRの接触点の考察に関するさらなる詳細は、例えば、MacCallumRM,MartinAC,ThorntonJM.Antibody-antigeninteractions:contactanalysisandbindingsiteTopography.JMolBiol.1996Oct11;2625:732-45に記載されている。本明細書中で言及される抗体配列およびデータベースに関するさらなる詳細は、例えば、TomlinsonIM,WalterG,MarksJD,LlewelynMB,WinterG.TherepertoireofhumangermlineVHsequencesrevealsaboutfiftygroupsofVHsegmentswithdifferenthypervariableloops.JMolBiol.1992Oct5;2273:776-98;LiW,JaroszewskiL,GodzikA.Clusteringofhighlyhomologoussequencestoreducethesizeoflargeproteindatabases.Bioinformatics.2001Mar;173:282-3;[VBDB]www.mrc-cpe.cam.ac.uk/VBASE-ok.phpmenu=901;[KBTDB]www.kabatdatabase.com;[BLST]www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/[CDHIT]bioinformatics.ljcrf.edu/cd-hi/;[EMBOSS]www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/;[PHYLIP]evolution.genetics.washington.edu/phylip.html;および[FASTA]fasta.bioch.virginia.eduに見出される。実施例1参照ユニバーサル抗体ライブラリ配列の同定および選択方法本実施例においては、バイオインフォマティクスおよびその内容全体を参考として本明細書で援用する米国特許出願60/585931に開示される選択基準を用いて、参照ユニバーサル抗体ライブラリ配列を同定および選択した。簡単に説明すると、発現された、すなわち再構成された免疫グロブリン配列を含むKabatの電子データベースを、特定のフィルターアルゴリズムを用いて検索した。特に、フィルターアルゴリズムは、特定の抗原クラスに反応して発現されたヒト配列のみを同定するよう設計した。選択した抗原クラスは、ヒト治療剤の開発において扱い易い標的セットであるという理由でタンパク質ベースの抗原/標的とした。しかし、このデータベースは、他の抗原クラス、例えばペプチド、多糖類、ポリヌクレオチド、および低分子について、ならびに例えば獣医学的用途の治療剤の開発にあっては他の種由来の抗体配列、例えば霊長類、マウス、ラット、またはニワトリ配列等についても容易にクエリーを行えることが当然理解されよう。上記の基準を、3319個のVH配列からなる初期セットに適用したしかし、この配列セットは、さらなる配列がクローニングされデータベースに登録された場合に、数を増やすことができることに留意されたい。上記の検索およびフィルター解析は、タンパク質抗原を認識する非重複の再構成されたヒト抗体クローンを表す約600個のVH遺伝子の配列のデータセットを出力した。次の工程は、これらの再構成された遺伝子配列を生成した生殖細胞系前駆遺伝子の設計、およびそれに続くこれらの候補生殖細胞系配列の頻度分析を含むものであった。言い換えると、タンパク質抗原にとって最適なまたは高頻度の生殖細胞系フレームワーク配列が存在するかどうかの決定であった。Kabat由来のフィルターをかけたVH配列における再構成された遺伝子により利用される生殖細胞系配列を決定するため、VBASEを使用した。VBASEは、GenbankおよびEMBLデータライブラリの最新版例えば、それぞれ、Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.Lipman,D.J.1990Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol.215:403-410およびCentreforProteinEngineeringMRCCentre,HillsRd,Cambridge,UK,CB22QHにより運営されているwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/VBASE-okを参照のことの配列を含む千以上の公開された配列からコンパイルされた、全てのヒト生殖細胞系可変領域配列の包括的なディレクトリである。現在、51の機能的なVHセグメントが7のファミリーすなわちVH1~7に分類され、40の機能的なVKセグメントが7のファミリーすなわちVKI~VIIに分類され、31の機能的なVλセグメントが10のファミリーすなわちVλ1~10に分類されている。フィルターをかけたKabat配列約600のVHによるVBASE生殖細胞系配列のバッチBLASTを行い、発現される再構成される配列に最も高い頻度で寄与するVH生殖細胞系遺伝子およびファミリーを同定した。この解析は、例えば、8つの最も高頻度で現われるフレームワークのうちの6つフレームワーク1、2、および3がVH3生殖細胞系ファミリーに属すること、およびVH4ファミリーのメンバーが中間表示intermediaterepresentationグループを形成することを同定した。フィルターをかけたKabatデータベースにおいて示された生殖細胞系VHフレームワーク1、2、および3の配列について、頻度分析を行った。この分析においては、再構成された配列の生殖細胞系遺伝子への分類の際に、4つまでの体細胞変異を許容した。タンパク質/ペプチド抗原を認識する抗体の再構成された配列に最も高頻度で現われる生殖細胞系遺伝子を同定するための閾値ラインを設定した。最高頻度のVH3フレームワークの同定の結果は、重要である。VH3初期フレームワーク配列の選択は、対応するCDR配列の多様性および標準的なカノニカル構造により規定されるサイズの限界に影響する例えば、Chothia,C.,etal.,StructuralrepertoireofthehumanVHsegments.JMolBiol,1992.2273:p.799-817およびTomlinson,I.M.,etal.,TheStructuralrepertoireofthehumanVkappadomain.EmboJ,1995.1418:p.4628-38を参照のこと。VBASE-フィルターをかけたKabatのBLAST検索もまた、候補分子の親和性成熟の間に変異され得る体細胞超変異のいわゆるホットスポットの位置を同定した。予備的なKabat-VBASEの結果は、6つの高頻度で利用されるVH3フレームワーク;3-07、3-21、3-23、3-30.5、3-48、および3-74を同定した。複数の出発フレームワークを選択する際、潜在的な抗原結合のためにCDRの外側に追加の構造的多様性を作出した。6つ全てのフレームワーク4をコードするJH配列の比較分析は、これらの配列のうちの4つが同一であり、他の二つの配列においては二つのアミノ酸しか相違しないことを示した。この配列の保存は、6つ全てのフレームワークファミリーについて共通のフレームワーク4を使用して、非機能的な多様性の生成を最小限に抑えることを可能にした。従って、本発明の基準を使用し、かつバイオインフォマティクスアプローチおよび既存の抗体データベースを使用することで、取扱い可能な抗体フレームワーク配列セットを合理的に同定できることが実証された。さらに、以下で考察されるように、これらの配列の同定は、ユニバーサル抗体ライブラリおよびそこから選択した本発明のコホートライブラリ内のインテリジェントCDRの多様性を最大にする基礎を提供した。実施例2参照ユニバーサル抗体ライブラリのCDRの多様性を設計する方法本実施例においては、参照ユニバーサル抗体ライブラリのCDRの多様性を最適化する方法を示す。上記のように、候補フレームワークの選択は、導入されるCDRのサイズおよびアミノ酸配列の初期の選択の両方に影響する。6つ全ての選択されたVH3遺伝子ファミリーは、同じ1~3のカノニカル構造を有する。カノニカル構造1~3は、CDR1およびCDR2が、それぞれ5アミノ酸および17アミノ酸のループを有することを必要とする。KabatおよびVBASEデータベースのCDRアミノ酸の頻度分析は、1完全な配列保存、2多様性生成の最初のラウンド、および3体細胞超変異を模倣することによるその後の親和性成熟のためのCDRアミノ酸を同定した。重鎖可変領域および軽鎖可変領域における各CDRの設計については、以下で順次考察する。重鎖の第一CDR、本明細書中以降ではVH-CDR1、を設計するため、上記の基準を以下の通り考慮した:生殖細胞系遺伝子および再構成された遺伝子の両方において保存されているCDRの位置は固定する;生殖細胞系遺伝子においては保存されているが再構成された遺伝子においては変種であるCDRの位置は、初期ライブラリの構築においては固定するが、親和性成熟の間に変異されるのを許容する;ならびに生殖細胞系配列および再構成された配列において多様性を示すCDRの位置は、変異誘発、例えばウォークスルー型変異誘発WTMTMを用いて多様性を導入する位置である。同定した6つのVH3遺伝子ファミリーすなわち3-07、3-21、3-23、3-30.5、3-48、および3-74を出発点とする、生殖細胞系の5アミノ酸CDR1配列の比較VBASE分析は、S31、Y32、およびM34が6つの遺伝子の間で保存されていることを明らかにした。フィルターをかけたKabatデータセットにおける全ての再構成された5アミノ酸CDR1配列の頻度分析は、三つの重要な知見を示した:第一に、Y32は高度に保存されていること、第二に、保存された生殖細胞系のS31およびM34の位置はその後に体細胞変異に供されること、および第三に、CDR1の33および35の位置は生殖細胞系の抗体配列においても再構成された抗体配列においても保存されていないこと。従って、VH-CDR1において、Y32の厳格な保存はその保護のための強い選択圧を示すので、Y32は固定し、いかなる変更にも供さなかった。CDR1の33および35の位置は、変異誘発、例えばWTMTMによる初期CDR1配列の多様性の作出部位とした。S31およびM34の位置は当初は固定したが、あらゆるscFv候補クローンにおいて親和性成熟の間に変異される部位であることが同定された。全ての部位で多様性を作出しない理由は、発現およびディスプレイを容易にするためにライブラリの初期の多様性を制限するためであった。上記のKabat頻度分析から、CDR1は野生型コンセンサス配列SYAMH配列番号563を有した。残基A33およびH35は、それらの頻度が最も高かったために、野生型配列として選択された。その後のアミノ酸の多様性の導入によって、CDR1配列はSYXMXXは変異誘発、例えばWTMを行った位置を意味するとなった。例えば、変異誘発、例えばWTMをCDR1の33および35の位置のチロシン残基に対して行う場合、所望の得られるCDR1配列はSYYMH配列番号564、SYAMY配列番号565、およびSYYMY配列番号566である。この例において、芳香族側鎖の導入の効果を調査した。野生型A33の位置のオリゴヌクレオチドコドン配列はGCXであった。Y33で置換した場合に必要とされる対応するオリゴヌクレオチド配列はTAYとなった。従って、A33→Y33オリゴヌクレオチド混合物についての得られるコドン配列はG/TA/CCであった。この場合、生成されたA33→Y33オリゴヌクレオチドはまた、グリシンGCC、アスパラギン酸GAC、およびセリンTCCをコードするコドン順列を有し得た。これらの追加の副産物は、33の位置における追加の多様性に寄与する。次のWTMTM位置35については、H35の野生型コドン配列はCAYであり、Y35で置換した場合に必要とされるオリゴヌクレオチド配列はTAYであった。従って、H35→Y35混合物についての得られるコドン配列はC/TACであった。この場合、形成される追加のアミノ酸副産物はなかった。別のアプローチにおいては、典型的には各々の所望の変化のためにオリゴヌクレオチドの合成を必要とするがどのような副産物ノイズをも排除するルックスルー型変異誘発LTMを利用することで、副産物を回避した。重鎖の第二CDR以下VH-CDR2というを設計するため、上記のVBASEおよびKabatデータベースにおける配列分析を、上記のVH-CDR1と同様の様式で扱った。VH-CDR2配列について頻度分析を行い、6つの候補フレームワークの生殖細胞系CDR2配列のアラインメントを構築し、10の閾出現頻度を選択した。同じVH3遺伝子ファミリー3-07、3-21、3-23、3-30.5、3-48、および3-74を出発点とする、VBASEおよびフィルターをかけたKabatの頻度分析は、CDR2の位置I51、Y59、A60、およびG65が全ての生殖細胞系遺伝子および大部分の再構成された遺伝子において保存されていることを示し、従って合成されるCDR2において不変でなければならない。上記のKabatの頻度分析は、VH-CDR2が野生型コンセンサス配列GISGGTTYYADSVKG配列番号567を有することを示した。VH-CDR2の位置54、55、58、61、62、63、64は、生殖細胞においては配列保存を示すが、その後に体細胞変異に供されるので、固定したが、親和性成熟の間に変異されるのを許容した。CDR2の初期の多様性については、研究用アミノ酸下線を位置50、52、52a、53、56、および57に組み込みXIXXXGGXXYYADSVKG配列番号568、これを変異誘発、例えばWTMTMにより導入した。WTMは、ランダム変異誘発と異なり、特定のアミノ酸の既定の配置を可能にする。例えば、位置50、52、53、56、および57においてチロシンY残基下線を用いてCDR2のWTMTMを行った場合の、所望の得られるWTMTMCDR2配列は、以下の配列を含むものであった下線は変更箇所である:単一置換YIXXXGGXXYYADSVKG配列番号569、XIYXXGGXXYYADSVKG配列番号570等、二重置換YIYXXGGXXYYADSVKG配列番号571、YIXXYGGXXYYADSVKG配列番号572等、三重置換YIXXYGGYXYYADSVKG配列番号573等、四重置換YIYYYGGXXYYADSVKG配列番号574またはYIXYYGGYXYYADSVKG配列番号575、五重置換YIXYYGGYYYYADSVKG配列番号576、および六重置換YIYYYGGYYYYADSVKG配列番号577。典型的には、CDRごとに2~3置換が好ましく、これは、オリゴヌクレオチド合成ドーピング例えば技術的な詳細についてはUS20040033569A1を参照のことによって容易に達成できた。9つの事前選択したWTMTMアミノ酸を用いるCDR2に対するWTMTMは、9×26のライブラリ多様性すなわち576のメンバーを生成した。比較の目的で、20個全てのアミノ酸を用いるCDR2の6つの位置での飽和変異誘発では206すなわち6.4×107となろう。従って、CDR2のみの12カ所の非固定の位置において飽和変異誘発を実施すれば、ライブラリの多様性は2012または4×1015となり、これは現在のライブラリディスプレイおよびスクリーニング技術の許容範囲を超えるものであろう。このことは、対照的に、より小さく、しかしより表現力の高いライブラリを構築できるという本発明の利点を示している。事実、本発明の方法は、第一世代の結合分子を同定するために、いくつかのCDRの位置において取扱い可能なライブラリを提供した。他のCDRの位置におけるその後の親和性成熟変異誘発は、同定された結合分子を最適化した。VHCDR3の多様性を設計するため、Kabatデータベース由来の抗体のCDR3配列を、それらのサイズおよび抗原クラスに従うアラインメントを行った。非タンパク質抗原およびタンパク質/ペプチド抗原を認識する抗体のCDR3の長さをトレンドラインに適合させた。フィルターをかけたKabatデータセット由来の13アミノ酸CDR3配列の頻度分析も行い、10の閾出現頻度を選択した。CDR3のサイズおよびアミノ酸残基の頻度分析は、例えば免疫グロブリンDおよびJ遺伝子の再構成された配列を用いて行うので、フィルターをかけたKabatとVBASEの直接比較においてはCDR3生殖細胞系の等価物は存在しない。にもかかわらず、フィルターをかけたKabatデータベースを試験したところ、その検索結果は、CDR3のループサイズに関して、正規分布曲線が6~24アミノ酸の範囲であり、ピークがおよそ13アミノ酸にあることを示した。興味深いことは、この分析はまた、他の抗原タイプすなわち、非タンパク質/ペプチドを認識する抗体が二峰性のサイズ分布に近いことを示した。この分裂した分布は、一部の抗体が低分子すなわちハプテンの方にバイアスがかかっており、一部がそれより大きな抗原複合多糖、DNAに対して標的化されているという異種集団であることに起因する。CDR3の位置についてのVBASE-Kabatの並行比較分析を行わずに、各々の再構成されたCDR3のサイズについて、フィルターをかけたKabatの頻度分析を行った。各々のサイズ分類において、そのCDR3の位置において最も高頻度のアミノ酸を列挙することにより、コンセンサス野生型配列を得た。驚くべきことに、このコンセンサスアプローチは、高い選択圧下の特定のアミノ酸を同定した。例えば、13アミノ酸サイズのCDR3において、位置101はアスパラギン酸で高度に保存されていた。従って、VH-CDR1およびVH-CDR2の多様性の設計に関して上述したように、D101は、合成される13アミノ酸のVH-CDR3において固定残基の位置として維持した。しかし、VH-CDR3の位置96、98、100c、および102は、いくつかのアミノ酸に対して高い優先性を示し、従って予備的に固定するが、その後の親和性成熟の間に変異させた。この頻度分布は、CDR3の位置96、97、99、100、100a、100b、100d、および100eがいかなる優先的アミノ酸も示さなかったことを示す。従って、13アミノ酸CDR3配列においては、式XGXSXXXXYXXDY配列番号578が、例えば変異誘発、例えばWTMを用いる多様性の部位である位置下線を表す。同様の分析を、8~20アミノ酸の間の全てのサイズのCDR3配列について行うことができた。このサイズ範囲は、タンパク質性標的/抗原を認識する抗体のCDR3において見出される長さの多様性の大部分を包含した。実施例3完全照合UALレパートリーの構築上記の実施例に記載されるように、CDRの位置的頻度分析は、本発明の方法において使用するための参照ライブラリを構築するのに使用され得る。完全照合UALレパートリーの作製は、まず、このようなCDRの位置的頻度分析から推測される全てのコンビナトリアルCDR配列の生成を必要とする。このような位置的頻度分析を、各々の適用可能な抗体鎖、重鎖または軽鎖軽鎖についてはカッパクラスまたはラムダクラスの各CDRCDR1、CDR2、およびCDR3について行った。次いで、これらのコンビナトリアルCDR配列を、全ての重鎖および軽鎖について個別に、フレームワークおよびアイソタイプを一致させたポリペプチドとして構築した。重鎖のアイソタイプにはVH-1、VH-3、およびVH-4が含まれ、カッパ軽鎖のアイソタイプにはVK-1およびVK-3が含まれ、ラムダ軽鎖のアイソタイプにはVL-1、VL-2、およびVL-3が含まれた。UAL全体のアイソタイプマッチングの代わりに、CDR配列をフレームワークシャッフルframeworkshuffledさせる場合もあり、これは、UALが、あるアイソタイプクラス由来のCDR1が別のアイソタイプクラス由来のCDR2に融合されたもの例えば単一の構築されたUAL内にVk1由来のCDRL1およびVk3由来のCDRL2を含み得ることを意味する。完全照合UALの構築は、次いで、上記のようにして誘導された抗体の重鎖および軽鎖の全ての組み合わせの生成を必要とする図3参照。CDRクラスをその天然のフレームワークにマッチングさせることで、CDR参照ライブラリに示される配列の範囲を画定できた。このようなフレームワークおよび例示のVH、Vκ、およびVλ配列についてのCDR配列のグループ化を図5に示す。次いで、CDR参照ライブラリ配列の組み合わせを行いUALを得た。図6は、CDR1およびCDR2において、VH-1クラスとVH-3クラスの間でフレームワークアイソタイプの混合フレームワーク交配frameworkcrossesと称するを行うプロセスを介する、重鎖配列から重鎖UALを構築する例を示す。同様に、図7は、CDR1およびCDR2において、VK-1クラスとVK-3クラスの間でフレームワーク交配を行うプロセスを用いる、CDR参照配列からのVκ軽鎖UALの構築の例を示す。最後に、図8は、CDR1配列およびCDR2配列においてVL-1クラス、VL-2クラス、およびVL-3クラスの間でフレームワーク交配を行うプロセスを用いる、CDR参照配列からのVκ軽鎖UALの構築の例を示す。抗体配列情報のカノニカルクラスへの細分類も行ったところ、得られるCDR参照ライブラリに示される配列の範囲をさらに変化させる効果があった。例えば、12アミノ酸長のVH-4CDR2ライブラリについては、4つの異なるカノニカル構造が存在し、各カノニカル構造は、その集団におけるばらつきを示す、それらCDR残基の位置についての異なる集団優性値populationprevalencevaluesを明らかにした図9参照。実施例4マウスプローブのCDRドメインからの例示の抗VEGFコホート抗体ライブラリの同定および作製参照ライブラリ、例えばユニバーサル抗体ライブラリUALからのコホートライブラリの選択は、クエリーCDRペプチド配列と参照ライブラリ例えばUALCDRペプチド配列のアラインメントおよび比較を通じて進めた。どのようなモノクローナル抗体複数のモノクローナル抗体を含むも、このようなコホートライブラリの構築のためのクエリーCDR配列を提供することができた。本実施例において、コホート抗体ライブラリの中に構築することができるコホートCDRライブラリを、例としてマウス抗VEGFモノクローナル抗体AvastinA4.6.1を用いて作製した。得られるコホートライブラリの構築の間の、全ての残基の比較において同一基準を使用した。マウスのAvastinA4.6.1モノクローナル抗体のCDR1配列は、TNYGMN配列比較13であることを決定した。この場合のCDR1は、接触点の定義に従って規定した。このCDR1配列を、二つの別個のユニバーサル抗体ライブラリUAL、VH-1およびVH-3に存在するCDR1ドメインの多様性との比較のためのクエリーペプチド配列として使用した。これらの比較の結果を図10ならびに表1および2に要約する。上記表のアラインメントは、二つの参照UAL、VH-1およびVH-3で見られる既知の優先的な配列の多様性とクエリー配列との、個別の、位置ごと比較を行ったものである。表1に示される比較については、マウスクエリー配列マウスプローブTNYGMN配列番号13の各残基が、調査した参照UALにおける対応する位置で見出され、従ってそのCDR1の位置における既知の優先的な残基に相当する。従って、TNYGMN配列番号14配列全体が参照UALに存在し、その比較は、クエリー配列に対応する最適なCDR1コホートライブラリを作製するのにUALから追加の多様性を選択する必要がないという結果を出した。マウスプローブTNYGMN配列番号13配列の各残基はヒトCDR1VH-1UALにおいて同じ位置に存在する既知の残基と同一であったが、この発見はTNYGMN配列番号14配列全体が天然に存在するヒトCDR1配列であることを示すものでなかったことに留意することが重要である。従って、調査した参照UALがクエリー配列との完全一致を含むという発見は、クエリー配列が参照UALの構築前に既知の天然に存在する配列であったということを意味するのではない。クエリー配列TNYGMN配列番号13と参照VH-3CDR1UALの間でも比較を行った表2。この比較において、参照VH-3CDR1UALは、CDR1の最初の位置にスレオニンT残基を含まず、その代わりにセリンSおよびアスパラギンN残基のみを含んでいた。従って、最適なCDR1コホートライブラリの多様性は、配列SNYGMN配列番号246およびNNYGMN配列番号579を用いて得られ、従ってマウスAvastinA4.6.1モノクローナル抗体の参照VH-3CDR1UAL由来のコホートライブラリについては多様性が2であった。さらに、AvastinA4.6.1モノクローナル抗体のCDR2配列WMGWINTYTGEPT配列番号16をクエリー配列として使用してCDR2コホートライブラリを作製した。この配列とVH-1およびVH-3UALに存在するCDR2の多様性とのアラインメントを行い、これらの比較の結果をそれぞれ図11ならびに表3および4に示した。上記の表3に示されるように、マウスAvastinA4.6.1重鎖CDR2とVH-1UALのCDR2ドメインのアラインメントは、CDR2クエリー配列の最初の6つ、8番目、および10番目の残基が、UALにおける同じ位置に同一残基が存在することを明らかにした。UALは、7番目の位置に優先的に使用される残基としてスレオニンTを含まず、その代わりにこの位置にプロリンPおよびアラニンAを含み、この位置における多様性に対する最終的な効果は2であった。CDR2クエリー配列の9番目の位置におけるスレオニンT残基もまた、UALのこの位置に存在する残基と一致せず、UALはその代わり、この位置に共通して存在する残基としてフェニルアラニンF、セリンS、アルギニンN、およびグリシンGを含んでいた。この参照UALからコホートライブラリを作製する目的上、この不一致の多様性への効果は4であった。CDR2クエリー配列の最後の三つの残基を検討したところ、多様性への効果が、それぞれ、5クエリー配列のグルタミン酸Eはこの位置のUALのスレオニンT、アルギニンン、グリシンG、セリンS、またはアスパラギン酸D残基と一致しなかった、2クエリー配列のプロリンPはこの位置のUALのスレオニンTまたはアラニンA残基と一致しなかった、および4クエリー配列のスレオニンTはこの位置のUALのアルギニンN、リジンK、セリンS、またはグリシンG残基と一致しなかったであった。従って、ヒトVH-1CDR2UAL由来の最適なコホートライブラリは、配列W-M-G-W-I-N-P/A-Y-F/S/N/G-G-T/N/G/S/D-T/A-N/K/S/G配列番号17を有し、かつこれはウォークスルー型もしくはルックスルー型の変異誘発または他のこのような技術を用いて生成することができた。このようなコホートライブラリの総多様性は、この配列内の可変性の残基7番目、9番目、および11~13番目の独立組み合わせの結果であり、その積は2×4×5×2×4=320となった。コホートライブラリの構築において本発明の方法を用いてUALまたは関連形式の参照ライブラリに対するクエリーを行う利点は、このコホートライブラリ配列内の5つの可変部位のランダム化が3.2×106の異なる配列を生じ、この10000倍の多様性の増加が潜在的に免疫反応性のCDR2配列の形態においてノイズを追加するにすぎないものである可能性が高いことを考慮すれば理解されよう。マウスAvastinA4.6.1重鎖CDR2のクエリー配列とVH-3UALのCDR2ドメインの比較を行う上で本発明の方法を使用することで、配列W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-E-T/K/I-Y/N/F/H配列番号18を得た。この配列により示されるコホートライブラリは、7056の多様性を有した。この結果を導き出したアラインメントの詳細は上記の表4に示されている。本発明の方法をAvastinA4.6.1重鎖CDR3クエリー配列にも適用して、VHCDR3UALからコホート配列A-K-G/D/E/R/A/H/V/T-P-H-Y-Y-G-S-S-H-W-Y-F-D配列番号20を同定した。このコホート配列は、8の多様性を有した。この結果を導き出したアラインメントの詳細を表5に示す。本発明の方法をAvastinA4.6.1モノクローナル抗体の軽鎖CDR配列に適用することで、全てのこのような軽鎖CDRドメインについてCDRコホートライブラリ配列を得た。マウスAvastinA4.6.1抗体におけるカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の配列は、それぞれ、SNYLNWY配列番号21、VLIYFTSSLH配列番号23、およびQQYSTVPW配列番号26であった。本発明の方法をマウスAvastinA4.6.1カッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALおよびVK-3CDR1UALと比較することにより、それぞれS-N-Y-L-N-W-Y配列番号22多様性なしおよびS-N-Y-L-A-W-Y配列番号249多様性1のコホートライブラリ配列を得た。ヒトVK-1CDR2UALに対してマウスAvastinA4.6.1カッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を利用することで、多様性が20のコホートライブラリ配列L/R-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-S-L-Q/E配列番号24を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により、多様性が2のコホートCDRライブラリ配列L-L-I-Y-G/D-T-S-S-R-A配列番号25を得た。クエリー配列としてマウスACZ885CDR3を使用し、VKCDR3UALとアラインメントを行った場合、コホートライブラリCDR3配列Q-Q-Y-S-T-Y/T/S/L/W/F-P-W配列番号27を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは6の多様性を有した。様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖例えばIgG、IgM、IgA、IgD、IgEおよび軽鎖例えばカッパまたはラムダならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせにより、図12およびマウスAvastinA4.6.1クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについては表6に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。このようなライブラリの合成は、例えばルックスルー型および/またはウォークスルー型の変異誘発等の技術を用いて行うことができ、全長構成鎖および/または抗体の合成には、遺伝子のシングルオーバーラップエクステンションSOEPCR、クンケル型変異誘発、またはこのような融合タンパク質を作製するためのその他の公知の技術等の技術を利用することができる。実施例5マウスプローブ抗HIVgp41モノクローナル41-S-2-LCDRドメインからのカッパ軽鎖CDRコホートライブラリの同定および作製マウス抗HIVgp41モノクローナル抗体41-S-2-Lのカッパ軽鎖配列を獲得した。これらの軽鎖配列における触媒性の三つ組を同定したところ、カッパ軽鎖のCDR1およびCDR3ドメイン内の残基を含んでいた。この抗体のカッパ鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、LYSNGNTYLYWF配列番号29、LLIYRLFHLA配列番号30、およびMQHLEYPYT配列番号31であった下線は触媒性の三つ組の残基である図14A参照。触媒性の三つ組を保存するため、コホートライブラリ配列がこれらの残基下線をCDR1およびCDR3のこれらの位置におけるマウスクエリー配列の残基として固定することを決定した。さらに、ギャップ導入アラインメントは、この抗体のマウスCDR1クエリー配列が、7アミノ酸残基長のヒトカッパ鎖CDR1UAL構成要素と比較した場合に、5残基YSNGN配列番号580の挿入を含むことを明らかにした。マウスCDR1クエリー配列配列に対して本発明の方法を適用し、参照VK-1CDR1-7およびVK-3CDR1-7UALと比較することにより、それぞれ、配列S/R/G/N/Y-YSNGN-N-Y-L-A/N-W-Y配列番号33およびS/G/N-YSNGN-T-Y-L-A-W-Y配列番号34のコホートライブラリを獲得した図14B~C参照。これらのコホートライブラリの多様性は、それぞれ、10および3であった。マウス抗HIVgp41CDR1において見出された挿入はまた、この配列と8ペプチド長のCDR1UAL構成要素との比較を可能にした。マウスCDR1クエリー配列と参照ライブラリVK-3CDR1-8の間の比較により、S-YSNG-N-T-Y-L-A-W-Y配列番号36のコホートライブラリCDR1配列を得た図14C。本発明の方法により、マウス抗HIVgp41カッパ軽鎖CDR2クエリー配列とヒトVK-1およびVK-3CDR2参照ライブラリの比較も行い、それぞれ、配列L-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-I/S/T/N-L-Q/E配列番号37およびL-L-I-Y-G/D-A/T-S-S/T/N-R-A配列番号38のコホートカッパ鎖CDR2ライブラリを得た図14D。これらのコホートライブラリは、それぞれ、40および12の多様性を有した。マウス抗HIVgp41カッパ軽鎖CDR3クエリー配列とヒトVKCDR3-9参照ライブラリの並行比較により、配列Q-Q-H-S/D/Y/N/G-D/G/T/N/S-Y-P-P/L/R/S/T-T配列番号39のカッパ鎖CDR3コホートライブラリを得た触媒性の三つ組を保存するため三番目の位置のヒスチジン残基を固定した;図14E。このヒスチジン残基を固定した場合、クエリー配列と参照ライブラリ配列との間で不連続アラインメントを行ったクエリー配列と参照ライブラリ配列の間の残基1、2、および4~9のみの比較を構成することに留意されたい。CDR3の最初の三残基をクエリー配列の残基M-Q-Hに固定する選択をした場合、クエリーおよび参照ライブラリの残基4~9のみのアラインメントが望ましい、従って部分アラインメントを構成したことにも留意されたい。このCDR3コホートライブラリは125の多様性を有した。本実施例においては、触媒活性は抗体の軽鎖に存在するので、重鎖の残基はコホートライブラリにおいて変化させずに残した。従って、この抗体について作製されたコホートライブラリの全体の多様性の値は、軽鎖の多様性の値により表され、これはK1およびK3コホートについて、それぞれ、50000および4500であった。実施例6ヒトプローブHK14CDRドメインからのカッパ軽鎖CDRコホートライブラリの同定および作製ヒトHK14抗体におけるカッパ軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、IFNLSWY配列番号41、LVLYAASTLQ配列番号42、およびQQSYILPPT配列番号43であった図15A。本発明の方法をこのカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALと比較することにより、S/R/G/N/Y-N-Y/W/D/S-L-A/N-W-Y配列番号581のコホートライブラリ配列を得た。このコホートライブラリ配列は40の多様性を有していた。本発明を用いたIFNLSWY配列番号41のCDR1配列とヒトVK-3CDR1-7UALの比較により、多様性が9のコホート配列S/G/N-S/N/T-N-L-A-W-Y配列番号44を得た図15B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、クエリー配列と同一のコホートライブラリ配列L-L-I-Y-A-A-S-T-L-Q配列番号635を得、VK-3CDR2ライブラリに対する同配列のクエリーにより、多様性が2の配列L-L-I-Y-G/D-A-S-T-R-A配列番号45を得た図15C。クエリー配列としてHK14CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことで、Q-Q-S-Y-S/N/T/G/D-Y/T/S/W-P-P-T配列番号46のコホートライブラリCDR3配列を得た図15D。このカッパ鎖CDR3ライブラリは、20の多様性を有していた。上記の41-S-2-L抗体の場合と同様、触媒活性は抗体の軽鎖に存在するので、重鎖の残基はコホートライブラリにおいて変化させずに残した。従って、この抗体について作製されたコホートライブラリの全体の多様性の値は、軽鎖の多様性の値により表され、これはK1およびK3コホートについて、それぞれ、800および360であった。実施例7プローブCDRドメインからのAAV293MCP-1コホート抗体ライブラリの同定および作製ヒトAAV293MCP-1抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、SHYWMS配列番号47、WVANIEQDGSEKY配列番号51、およびARDLDGYTD配列番号54であった。本発明の方法をこの重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S-S/N/D/T-Y-W-M-S配列番号48多様性4およびS-S/G/N/D-Y-A/Y/G/D-M-S配列番号50多様性16のコホートライブラリ配列を得た図16A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が4320のコホートライブラリ配列W-M-G-W/G/R-I-N/I/S-P/A-I/N/S/Y/G/M-G-G-T/N/G/S/D-T/A-N/K/S/G配列番号52を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が4のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-A-N-I-S/K/W/N-Q-D-G-S-E-K-Y配列番号53を得た。クエリー配列としてAAV293MCP-1CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列A-R-D-L-G/S/V/Y/R/T/N/I/L/Q-G-Y-F/L/G/S/M/A/I/P-D配列番号55を得た。この重鎖CDR3コホートライブラリは80の多様性を有していた。ヒトAAV293MCP-1抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、SSALAWY配列番号56、LLIYDASSLE配列番号59、およびQQFNSYPL配列番号61であった。本発明の方法をこのカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALおよびヒトVK-3CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S-S-Y/W/D/S-L-A-W-Y配列番号57多様性4およびS-S-N/Y-L-A-W-Y配列番号58多様性2のコホートライブラリ配列を得た図16B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、クエリー配列と同一のコホートライブラリ配列L-L-I-Y-D-A-S-S-L-E配列番号60を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により多様性が1のコホートCDR2ライブラリ配列L-L-I-Y-D-A-S-S-R-A配列番号582を得た。クエリー配列としてAAV293CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列Q-Q-Y/S/A/G/R-N-S-Y-P-L配列番号62を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは5の多様性を有していた。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行うことができた。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、ヒトAAV293MCP-1抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表7に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例8マウスプローブCDRドメインからのヒトACZ885コホート抗体ライブラリの同定および作製マウスACZ885抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、SVYGMN配列番号63、WVAIIWYDGDNQY配列番号66、およびARDLRTGPFD配列番号69であった。本発明の方法をマウスACZ885重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S-S/N/D/T-Y-G-M-N配列番号64多様性4およびS-S/G/N/D-Y-G-M-N配列番号65多様性4のコホートライブラリ配列を得た図17A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が216のコホートライブラリ配列W-M-G-W/G/R-I-N/I/S-P/A-I/N/S/Y/G/M-G-D-N-T/A-N/K/S/G配列番号67を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が21のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-A-V/A/N/G/Y/S/T-I-W-Y-D-G-D-N-T/K/I-Y配列番号583を得た。クエリー配列としてマウスACZ885重鎖CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列A-R-D-L-R-G/S/A/D/L/Y/V/I/P/Q-G-P-F-D配列番号70を得た。この重鎖CDR3コホートライブラリは10の多様性を有していた。マウスACZ885抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、GSSLHWY配列番号71、LLIKYASQSF配列番号74、およびHQSSSLPF配列番号77であった。本発明の方法をマウスACZ885カッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALおよびヒトVK-3CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S/R/G/N/Y-S-S-L-A/N-W-Y配列番号72多様性10およびG-S-N/Y-L-A-W-Y配列番号73多様性2のコホートライブラリ配列を得た図17B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が40のコホートライブラリ配列L-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-I/S/T/N-L-Q/E配列番号75を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により多様性が6のコホートCDR2ライブラリ配列L-L-I-Y-G/D-A-S-S/T/N-R-A配列番号76を得た。クエリー配列としてマウスACZ885CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列Q/M-Q-S-S-S-L-P-F配列番号78を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは2の多様性を有していた。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、マウスACZ885抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表8に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例9プローブCDRドメインからのヒトgp120ITH52オリゴコホート抗体ライブラリの同定および作製ヒトgp120ITH52オリゴ抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、SDYGVS配列番号79、WLSGISGGGSTVY配列番号82、およびARDLRTGPFD配列番号85であった。本発明の方法をgp120ITH52オリゴ抗体の重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S-D-Y-G-M-S配列番号80多様性1およびS-D-Y-G-I/M-S配列番号81多様性2のコホートライブラリ配列を得た図18A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が16のコホートライブラリ配列W-M-G-G-I-S-P/A-G-G-G-T-T/A-N/K/S/G配列番号83を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が9のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-S-G-I-S-G-D/S/N-G-S-T-T/K/I-Y配列番号84を得た。クエリー配列としてgp120ITH52オリゴ抗体の重鎖CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列A-R-G-R-G-G-Y-F/L/G/S/M/A/I/P-D配列番号86を得た。この重鎖CDR3コホートライブラリは8の多様性を有していた。ヒトgp120ITH52オリゴ抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、GSYLAWY配列番号87、SLIYAASSLQ配列番号89、およびQQYNSYPI配列番号92であった。本発明の方法をgp120ITH52オリゴ抗体のカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALおよびヒトVK-3CDR1UALと比較することにより、G-S-Y-L-A-W-Y配列番号88多様性なしの同一のコホートライブラリ配列を得た図18B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が2のコホートライブラリ配列L/R-L-I-Y-A-A-S-S-L-Q配列番号90を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により多様性が2のコホートCDR2ライブラリ配列L-L-I-Y-G/D-A-S-S-R-A配列番号91を得た。クエリー配列としてgp120ITH52オリゴ抗体CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、追加の多様性のないコホートライブラリCDR3配列Q-Q-Y-N-S-Y-P-I配列番号93を得た。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、ヒトgp120ITH52オリゴ抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表9に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例10プローブCDRドメインからのヒトscFvgp120コホート抗体ライブラリの同定および作製ヒトscFvgp120抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、SNFVIH配列番号94、WVGWINPYNGNKE配列番号97、およびARVGPYSWDDSPQDNYYMD配列番号100であった。本発明の方法をscFvgp120抗体の重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S-N-Y/A/S-A/G/W/Y-M-H配列番号95多様性12およびS-N-Y-A/Y/G/D-I-H配列番号96多様性4のコホートライブラリ配列を得た図19A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が8のコホートライブラリ配列W-M-G-W-I-N-P-Y-N-G-N-T/A-N/K/S/G配列番号98を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が7056のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-N-K-Y/N/F/H配列番号99を得た。クエリー配列としてscFvgp120抗体の重鎖CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列A-R-V-G-P-Y-S-W-D-D-S-P-Q-D-N-Y-Y-M-D配列番号101多様性なしを得た。scFvgp120抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、RSRRVAWY配列番号102、LLIYGVSNRA配列番号104、およびQVYGASSY配列番号107であった。本発明の方法をscFvgp120抗体のカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-3CDR1UALと比較することにより、S/N-S/N-S/N/T-Y-L-A-W-Y配列番号103多様性12のコホートライブラリ配列を得た。ヒトVK-3CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が2のコホートライブラリ配列L-L-I-Y-G-A/T-S-N-R-A配列番号106を得、ヒトVK-1CDR2UALに対するこの配列の問い合わせにより多様性が2の別個のコホートライブラリ配列L-L-I-Y-G-A-S-N-L-Q/E配列番号105を得た図19B。クエリー配列としてscFvgp120抗体CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列Q-Q-Y-G-S/N/T/H/Q/G-S-P-Y配列番号108を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは6の多様性を有していた。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、scFvgp120抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表10に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例11プローブCDRドメインからのHerceptin4D5コホート抗体ライブラリの同定および作製ヒトHerceptin4D5抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、KDTYIH配列番号109、WIGRIYPTNGYTR配列番号112、およびSRWGGDGFYAMD配列番号115であった。本発明の方法をこの重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S/N-D-Y/A/S-Y-M-H配列番号110多様性6およびT/S-D-Y-Y-I-H配列番号111多様性2のコホートライブラリ配列を得た図20A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が360のコホートライブラリ配列W-M-G-R-I-N/I/S-P-I/N/S/Y/G/M-N-G-T/N/G/S/D-T-N/K/S/G配列番号113を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が9408のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-S/K/W/N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-Y-T-Y/N/F/H配列番号114を得た。クエリー配列としてHerceptin4D5重鎖CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列A-R-G/D/E/R/V/A-G-G-D-G-S/G/Y/L/T/A/R/D/E/N-Y-A-M-D配列番号116を得た。この重鎖CDR3コホートライブラリは60の多様性を有していた。Herceptin4D5抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、NTAVAWY配列番号117、LLIYSASFRY配列番号120、およびQQHYTTPP配列番号122であった。本発明の方法をこのカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALおよびVK-3CDR1UALと比較することにより、それぞれ、N-T-Y/W/D/S-L-A-W-Y配列番号118多様性4およびN-T-N/Y-L-A-W-Y配列番号119多様性2のコホートライブラリ配列を得た図20B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が8のコホートライブラリ配列L-L-I-Y-S-A-S-I/S/T/N-L-Q/E配列番号121を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により多様性が12のコホートCDR2ライブラリ配列L-L-I-Y-G/D-A/T-S-S/T/N-R-A配列番号122を得た。クエリー配列としてHerceptin4D5CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列Q-Q-Y/S/A/G/R-Y-T-T-P-L/Y/W/R/F/I配列番号124を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは30の多様性を有していた。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、Herceptin4D5抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表11に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例12プローブCDRドメインからのCD19HD37コホート抗体ライブラリの同定および作製ヒトCD19HD37抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、SSYWMN配列番号125、WIGQIWPGDGDTN配列番号128、およびARRETTTVGRYYYAMD配列番号131であった。本発明の方法をこの重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S-S-Y-W-M-N配列番号126多様性なしおよびS-S-Y-A/Y/G/D-M-N配列番号127多様性4のコホートライブラリ配列を得た図21A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が36のコホートライブラリ配列W-M-G-W/G/R-I-N/I/S-P-G-F/S/N/G-G-D-T-N配列番号129を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が2352のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-S/K/W/N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-D-T-N配列番号130を得た。クエリー配列としてCD19HD37の重鎖CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、多様性が9のコホートライブラリCDR3配列A-R-R-E-T-T-T-G/S/Y/A/T/D/R/F/W-G-R-Y-Y-Y-A-M-D配列番号12を得た。CD19HD37抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、VTYVSWY配列番号133、LLIYGASNRY配列番号136、およびGQGYSYPY配列番号139であった。本発明の方法をこのカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALおよびVK-3CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S/R/G/N/Y-T-Y-L-A/N-W-Y配列番号134多様性10およびS/G/N-T-Y-L-A-W-Y配列番号135多様性3のコホートライブラリ配列を得た図21B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が2のコホートライブラリ配列L-L-I-Y-G-A-S-N-L-Q/E配列番号137を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により多様性が1のコホートCDR2ライブラリ配列L-L-I-Y-G-A-S-N-R-A配列番号138を得た。クエリー配列としてCD19HD37CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列Q/M-Q-G-Y-S-Y-P-Y配列番号140を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは2の多様性を有していた。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、ヒトCD19HD37抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表12に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例13マウスプローブCDRドメインからのヒトCD8g10-1コホート抗体ライブラリの同定および作製マウスCD8g10-1抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、TDYYMK配列番号141、WIGHINPNNDDTF配列番号144、およびVRDDYDGGWFA配列番号147であった。本発明の方法をこの重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S/N-D-Y-Y-M-S/H/N配列番号142多様性6およびT-D-Y-Y-M-S/H/N配列番号143多様性3のコホートライブラリ配列を得た図22A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が12のコホートライブラリ配列W-M-G-W/G/R-I-N-P-N-N-G-D-T-N/K/S/G配列番号145を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が196のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-N-G/Y/S/Q/W/N/F-N-G/S-D-D-T-F配列番号146を得た。クエリー配列としてCD8g10-1重鎖CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列V-R-D-D-Y-D-G-G-W-F-D/G配列番号148を得た。この重鎖CDR3コホートライブラリは2の多様性を有していた。CD8g10-1抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、NNYLNWY配列番号149、LLIYTSRSSY配列番号152、およびQQGKTLPW配列番号155であった。本発明の方法をこのカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALおよびVK-3CDR1UALと比較することにより、それぞれ、N-N-Y-L-N-W-Y配列番号156多様性なしおよびN-N-Y-L-A-W-Y配列番号151多様性1のコホートライブラリ配列を得た図22B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が10のコホートライブラリ配列L-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-S-L-Q/E配列番号153を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により多様性が4のコホートCDR2ライブラリ配列L-L-I-Y-G/D-A/T-S-S-R-A配列番号154を得た。クエリー配列としてCD8g10-1カッパ鎖CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列Q-Q-G-Y/N/G/S/D/T/L-T-L-P-W配列番号156を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは7の多様性を有していた。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、ヒトCD8g10-1抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表13に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例14マウスプローブCDRドメインからのヒト5G1.1C5コホート抗体ライブラリの同定および作製マウス5G1.1C5抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、SNYWIQ配列番号157、WIGEILPGSGSTE配列番号160、およびARYFFGSSPNWYFD配列番号163であった。本発明の方法をこの重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S-N-Y-W-M-S/H/N配列番号158多様性3およびS-N-Y-A/Y/G/D-I-H/S/N配列番号159多様性12のコホートライブラリ配列を得た図23A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が36のコホートライブラリ配列W-M-G-W/G/R-I-N/I/S-P-G-S-G-S-T-N/K/S/G配列番号161を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が4704のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-S/K/W/N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-S-G-S-T-Y/N/F/H配列番号162を得た。クエリー配列としてマウス5G1.1C5重鎖CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列A-R-D/G/E/A/S/R/T/V/H-R/G/L/P/S/A/T/Q/H/I/K-G/Y/L/R/I/V/A/P/S/D/T/E-G-S-S-P-Y/G/D/S/T/F/A/P/E/L/R-W-Y-F-D配列番号164を得た。この重鎖CDR3コホートライブラリは13068の多様性を有していた。マウス5G1.1C5抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、TGALNWY配列番号165、LLIYGATNLA配列番号168、およびQNVLNTPL配列番号171であった。本発明の方法をこのカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALおよびVK-3CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S/R/G/N/Y-N/S/T/K-Y/W/D/S-L-N-W-Y配列番号166多様性80およびS/G/N-S/N/T-N/Y-L-A-W-Y配列番号167多様性18のコホートライブラリ配列を得た図23B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が2のコホートライブラリ配列L-L-I-Y-G-A-S-N-L-Q/E配列番号169を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により多様性が1のコホートCDR2ライブラリ配列L-L-I-Y-G-A-S-N-R-A配列番号170を得た。クエリー配列としてマウス5G1.1C5カッパ鎖CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列Q-Q-Y/S/A/G/R-L-N-T-P-L配列番号172を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは5の多様性を有していた。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、マウス5G1.1C5抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表14に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例15マウスプローブCDRドメインからのヒトReopro7E3コホート抗体ライブラリの同定および作製マウスReopro7E3抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、KDTYVH配列番号173、WIGRIDPANGYTK配列番号176、およびVRPLYDYYAMD配列番号179であった。本発明の方法をこの重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S/N-D-Y/A/S-Y-M-H配列番号174多様性6およびT/S-D-Y-Y-I/M-H配列番号175多様性4のコホートライブラリ配列を得た図24A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が90のコホートライブラリ配列W-M-G-R-I-N/I/S-P-I/N/S/Y/G/M-N-G-T/N/G/S/D-T-K配列番号177を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が9408のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-S/K/W/N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-Y-T-Y/N/F/H配列番号178を得た。クエリー配列としてマウスReopro7E3重鎖CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列V-R-D/K/G/I/A/E/L/R/N-L-Y-D-Y-Y-A-M-D配列番号180を得た。この重鎖CDR3コホートライブラリは9の多様性を有していた。マウスReopro7E3抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、SSNIGWL配列番号181、GLIYYGTNLV配列番号184、およびVQYAQLPY配列番号187であった。本発明の方法をこのカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALおよびVK-3CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S-S-Y/W/D/S-L-A/N-W-Y配列番号182多様性8およびS-S-N-L-A-W-Y配列番号183多様性1のコホートライブラリ配列を得た図24B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が20のコホートライブラリ配列L/R-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-N-L-Q/E配列番号185を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により多様性が4のコホートCDR2ライブラリ配列L-L-I-Y-G/D-T/A-S-N-R-A配列番号186を得た。クエリー配列としてマウスReopro7E3のカッパ鎖CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列Q/M-Q-Y-Y/N/G/S/D/T/L-Q-L-P-Y配列番号188を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは14の多様性を有していた。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、マウスReopro7E3抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表15に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例16マウスプローブCDRドメインからのヒトRaptivaMHM24コホート抗体ライブラリの同定および作製マウスRaptivaMHM24抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、TGHWMN配列番号189、WIGMIHPSDSETR配列番号192、およびARGIYFYGTTYFD配列番号195であった。本発明の方法をこの重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S/N-S/N/D/T-Y/A/S-W-M-N多様性24およびT-G-Y-A/Y/G/D-M-N配列番号191多様性4のコホートライブラリ配列を得た図25A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が720のコホートライブラリ配列W-M-G-W/G/R-I-N/I/S-P-S-F/S/N/G-G-T/N/G/S/D-T-N/K/S/G配列番号193を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が3136のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-S/K/W/N-G/Y/S/Q/W/N/F-S-G/S-S-E-T-Y/N/F/H配列番号194を得た。クエリー配列としてマウスRaptivaMHM24重鎖CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列A-R-G-I-Y-G/S/T/Y/D/P/I/L/V/R-Y-G-T-G/Y/N/P/S/A/D/R/F-Y-F-D配列番号196を得た。この重鎖CDR3コホートライブラリは90の多様性を有していた。マウスRaptivaMHM24抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、SKYLAWY配列番号197、LLIYSGSTLQ配列番号200、およびQQHNEYPL配列番号203であった。本発明の方法をこのカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALおよびVK-3CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S-K-Y-L-A-W-Y配列番号198多様性なしおよびS-S/N/T-Y-L-A-W-Y配列番号199多様性3のコホートライブラリ配列を得た図25B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が1のコホートライブラリ配列L-L-I-Y-S-A-S-T-L-Q配列番号201を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により多様性が4のコホートCDR2ライブラリ配列L-L-I-Y-G/D-T/A-S-T-R-A配列番号202を得た。クエリー配列としてマウスRaptivaMHM24カッパ鎖CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列Q-Q-Y/S/A/G/R-N-S/N/T/H/Q/G-Y-P-L配列番号204を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは30の多様性を有していた。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、マウスRaptivaMHM24抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表16に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例17プローブCDRドメインからのマウスオボアルブミンコホート抗体ライブラリの同定および作製マウスオボアルブミン抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、TDYNMD配列番号205、WIGDINPSNGYTI配列番号209、およびARSGYGSRHPPGFA配列番号212であった。本発明の方法をこの重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S/N-D-Y-A/G/W/Y-M-S/H/N多様性24およびT-D-Y-A/Y/G/D-M-H/S/N配列番号585多様性12のコホートライブラリ配列を得た図26A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が60のコホートライブラリ配列W-M-G-W/G/R-I-N-P-S-N-G-T/N/G/S/D-T-N/K/S/G配列番号210を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が2352のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-N-G/Y/S/Q/W/N/F-S-G/S-G-Y-T-Y/N/F/H配列番号211を得た。クエリー配列としてオボアルブミン重鎖CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列A-R-S-G-Y-G-S-N/D/A/V/L/Y/T/S/G-V/I/E/P/L/T/A/Y/S/G-P-T/A/W/D/R/N/S/G/Y-G-F-A配列番号213を得た。この重鎖CDR3コホートライブラリは810の多様性を有していた。オボアルブミン抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、DSYGNSFMHWY配列番号586、LLIYLASNLE配列番号587、およびQQNIEDPF配列番号588であった。抗オボアルブミンCDR1は11個のアミノ酸を有するので、挿入分析insertionalanalysisまたはフレームワークが一致する生殖細胞系CDR配列CDR1についてはSNYLAWF589の使用のいずれかを行った。従って、VK-1CDR1については本発明の方法によりコホート配列または多様性情報を生成しなかった。本発明の方法をこのカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-3CDR1UALと比較することにより、S/N-S-S/N/T-Y-L-A-W-Y配列番号215多様性6のコホートライブラリ配列を得た図26B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が2のコホートライブラリ配列L-L-I-Y-G-A-S-N-L-Q/E配列番号217を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により多様性が2のコホートCDR2ライブラリ配列L-L-I-Y-G-A/T-S-N-R-A配列番号218を得た。クエリー配列としてオボアルブミン抗体のカッパ鎖CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列Q-Q-Y-G-S/N/T/H/Q/G-S-P-Y配列番号220を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは6の多様性を有していた。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、オボアルブミン抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表17に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例18マウスプローブCDRドメインからのヒトTNF-αコホート抗体ライブラリの同定および作製マウスTNF-αモノクローナル抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、THYGMN配列番号221、WMGWINTYTGEPT配列番号224、およびARERGDAMD配列番号227であった。本発明の方法をこの重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH-3CDR1UALおよびヒトVH-1CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S/N-S/N/D/T-Y-G-M-N配列番号222多様性8およびT-S/G/N/D-Y-G-M-N配列番号223多様性4のコホートライブラリ配列を得た図27A。ヒトVH-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が320のコホートライブラリ配列W-M-G-W-I-N-P/A-Y-F/S/N/G-G-T/N/G/S/D-T/A-N/K/S/G配列番号225を得、本発明の方法による重鎖CDR2プローブ配列とヒトVH-3CDR2UALの比較により多様性が7056のコホートCDR2ライブラリ配列W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-E-T/K/I-Y/N/F/H配列番号226を得た。クエリー配列としてマウスTNF-α重鎖CDR3を使用し、VHCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、同一の多様性のないコホートライブラリCDR3配列A-R-E-R-G-D-A-M-D配列番号228を得た。マウスTNF-α抗体のカッパ軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ、SNDVVWY配列番号229、MLMYSAFNRY配列番号232、およびQQDYNSPR配列番号235であった。本発明の方法をこのカッパ鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVK-1CDR1UALおよびVK-3CDR1UALと比較することにより、それぞれ、S-N-D-L-A/N-W-Y配列番号230多様性2およびS-N-N/Y-L-A-W-Y配列番号231多様性2のコホートライブラリ配列を得た図27B。ヒトVK-1CDR2UALに対してカッパ鎖CDR2配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が4のコホートライブラリ配列L/R-L-I-Y-S-A-S-N-L-Q/E配列番号233を得、本発明の方法によるカッパ鎖CDR2プローブ配列とヒトVK-3CDR2UALの比較により多様性が2のコホートCDR2ライブラリ配列L-L-I-Y-G/D-A-S-N-R-A配列番号234を得た。クエリー配列としてマウスTNF-αのカッパ鎖CDR3を使用し、VKCDR3UALとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリCDR3配列Q-Q-Y/S/A/G/R-Y-N-S-P-R配列番号236を得た。このカッパ鎖CDR3ライブラリは5の多様性を有していた。ここでも、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。このようなコホートCDRライブラリ配列の独立組み合わせにより、マウスTNF-α抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表18に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび/またはスクリーニングできるサイズ例えば、実質的に約1012未満の多様性のものであった。実施例19コホート配列ライブラリの生成における類似基準の使用本発明の方法は、コホート抗体ライブラリ配列の生成中、CDR配列内の一つまたはそれ以上の残基の位置で異なる選択基準を適用することができる。マウス抗HIVgp41モノクローナル抗体41-S-2-Lの触媒性の三つ組残基について上記の実施例5に記載されるように、クエリーCDR配列の特定残基を固定し、従って参照ライブラリのその残基の位置に存在するアミノ酸使用に関わらずコホートライブラリ配列に組み込む場合がある。本発明の方法はさらに、コホート抗体配列の選択の際に、CDR配列の一つまたはそれ以上の残基の位置において類似性に基づく同一性に基づくのとは対照的な基準を適用し得る。大部分の実施態様における、類似基準similaritycriteriaと同一基準identitycriteriaの違いは以下の点に要約され得る:同一基準の場合、参照ライブラリの同じ位置においても見られるクエリーCDR配列の残基は固定され同一のアミノ酸が得られるコホートライブラリ配列に現れる、対応位置と一致しない残基は、参照ライブラリのその位置の全てのアミノ酸構成要素で置換されるが;それとは対照的に、類似基準の場合、参照ライブラリの同じ位置においても見られるクエリーCDR配列の残基はこちらでも固定されるが、対応位置と一致しない残基は、参照ライブラリの構成要素のアミノ酸がクエリー配列のその残基と類似することが見出された場合、参照ライブラリのその位置のアミノ酸残基のサブセットと置換され得るそのような類似性が認められない残基の位置については参照ライブラリの全ての残基がその位置に導入される。本実施例においては、天然に存在するアミノ酸を、側鎖化学に基づき以下の7つの類似クラスに分類したこのクラスは図28でも表として示されている。小型の側鎖:グリシンG、アラニンA求核性:セリンS、スレオニンT、システインC、ヒスチジンH疎水性:バリンV、ロイシンL、イソロイシンI、メチオニンM、プロリンP芳香族:フェニルアラニンF、チロシンY、トリプトファンW酸性:アスパラギン酸D、グルタミン酸Eアミド:アスパラギンN、グルタミンQ塩基性:リジンK、アルギニンR類似基準と同一基準の違いを、両方の基準をマウス4H6抗DR4抗体に並列で適用することによって説明する。マウス4H6抗DR4モノクローナル抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の配列は、それぞれ、TSYGVH配列番号237、WLGVIWAVGSTN配列番号240、およびAREGEFDYYGSSLLSYHSMN配列番号243であった。類似基準を用いる本発明の方法をこの重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH4_1-1CDR1UALと比較することにより、コホートライブラリ配列T-S-Y-Y/F/S-W-S/T配列番号238多様性6を得た図29。他方、同じCDR1クエリー配列を同一基準の下で用いる本発明の方法を使用することによっては、コホートライブラリ配列T-S-Y-Y/F/S-W-S/T/N配列番号239多様性を得た。従って、類似基準の使用は、コホートライブラリ配列のCDR1の最後の位置におけるアスパラギンの合理的な排除を実現したヒスチジンは参照ライブラリの構成要素であるセリンおよびスレオニンと類似するものとみなされるがアスパラギンと類似であるとはみなされないため。ヒトVH4_1-1CDR2UALに対して重鎖CDR2配列をクエリーするのに類似基準を用いる本発明を適用することにより、多様性が16のコホートライブラリ配列W-I-G-E/Y-I-Y-H/Q/Y/D-S/R-G-S-T-N配列番号241を得、同一性基準の並列適用によっては、多様性が64のコホートライブラリ配列W-I-G-E/Y-I-N/Y/S/D-H/Q/Y/D-S/R-G-S-T-N配列番号242を得た。ヒトVHUALに対して重鎖CDR3配列をクエリーするのに類似基準を使用することにより、多様性が2のコホートライブラリ配列A-R-E-G-D-F-D-Y-F-G-S-S-V-I-S-Y-S-S-M-D/G配列番号244を得、同一基準によっては、多様性が79200のコホートライブラリ配列A-R-E-G-Y/P/G/D/L/R/T/H/S-F-D-Y-S/G/N/D/E/V/T/A/F/I/L-G-S-S-Y/S/G/V/T/D/P/W/A/C-T/G/R/S/A/D/E/F/I-S-Y-Y/D/T/S-S-M-D/G配列番号245を得た。従って、類似基準を用いて得られるコホートライブラリの総重鎖多様性は192であり、並列で同一基準を使用して設計された得られるコホートライブラリの総多様性は45619200であった。従って、類似基準の使用により、200000倍を超える総多様性の減少が合理的に生じた。類似基準および同一基準の比較的適用を、マウス抗VEGFモノクローナル抗体A4.6.1の重鎖および軽鎖のCDR配列についても行った。マウスA4.6.1抗VEGFモノクローナル抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の配列は、それぞれ、TNYGMN配列番号13、WMGWINTYTGEPT配列番号16、およびAKYPHYYGSSHWYFD配列番号19であった。類似基準または同一基準を用いる本発明の方法をこの重鎖CDR1クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトVH1UALと比較することにより、コホートライブラリ配列T-N-Y-G-M-N配列番号14多様性1を得た図30A。類似基準を用いて同じクエリー配列とヒトVH3UALを比較することにより、多様性が1のコホートライブラリ配列S-N-Y-G-M-N配列番号246を得、同一基準を用いる同じ比較によっては、多様性が2のコホートライブラリ配列S/N-N-Y-G-M-N配列番号15を得た。重鎖CDR2に対して類似基準を用いる本発明の方法を適用し、VH1およびVH3参照ライブラリと比較することにより、それぞれ、コホート抗体ライブラリ配列W-M-G-W-I-N-P/A-Y-S-G-D-T/A-S配列番号247多様性4およびW-V-A-Y-I-N-S-D/S/N-S-G-E-I-H配列番号248多様性3を得た図30B。重鎖CDR2に対して同一基準を用いる本発明の方法を並列適用し、VH1およびVH3参照ライブラリと比較することにより、それぞれ、コホート抗体ライブラリ配列W-M-G-W-I-N-P/A-Y-F/S/N/G-G-T/N/G/S/D-T/A-N/K/S/G配列番号17多様性320およびW-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-E-T/K/I-Y/N/F/H配列番号18多様性7056を得た。VHCDR3UALとの比較において、重鎖CDR3に対して類似基準および同一基準を用いる本発明の方法を適用することにより、多様性が8の同一のコホートライブラリ配列A-K-G/D/E/R/A/H/V/T-P-H-Y-Y-G-S-S-H-W-Y-F-D配列番号20を得た図30C。マウスA4.6.1抗VEGFモノクローナル抗体の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の配列は、それぞれ、SNYLNWY配列番号21、VLIYFTSSLH配列番号23、およびQQYSTVPW配列番号26であった。軽鎖CDR1の比較により、類似基準を使用したか同一基準を使用したかによらず、軽鎖CDR1クエリー配列とVLκ1およびVLκ3CDR1UALの比較についてそれぞれ、コホートライブラリS-N-Y-L-N-W-Y配列番号22多様性1およびS-N-Y-L-A-W-Y配列番号249多様性1を得た図30D。クエリー軽鎖CDR1配列をVLλ3CDR1UALと比較した場合、類似基準によってはコホートライブラリS-K/Q/Y/E-Y-V-H/Y/S/C-W-Y配列番号250多様性16が得られ、同一基準によってはコホートライブラリS-K/Q/Y/E-Y-A/V-H/Y/S/C-W-Y配列番号251多様性32が得られた。類似基準および同一基準の下での軽鎖CDR2とVLκ1CDR2UALとの比較によっては、それぞれ、コホートライブラリL-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-S-L-Q/E配列番号252多様性10およびL/R-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-S-L-Q/E配列番号24多様性20が得られた図30E。類似基準および同一基準の両方の下での軽鎖CDR2とVLκ3およびVLλ3CDR2参照ライブラリとの比較によっては、それぞれ、コホートライブラリ配列L-L-I-Y-G/D-T-S-S-R-A配列番号253多様性2およびL-V-I-Y-D/Q/E/K-D/K-S-K/D/E/N-R-P配列番号254多様性40が得られた。軽鎖CDR3については、類似基準および多様性基準を用いてクエリー配列とVLκCDR3参照ライブラリを比較することにより、それぞれ、コホートライブラリ配列Q-Q-Y-S-T-L-P-W配列番号256多様性1およびQ-Q-Y-S-T-Y/T/S/L/W/F-P-W配列番号27多様性6を得た。類似基準および多様性基準を用いてCDR3クエリー配列とVLλCDR3参照ライブラリを比較することによっては、それぞれ、コホートライブラリ配列Q-S/A/T/I/L-Y-D/Y/H/A-S-S/G/N/D-I/L-W配列番号257多様性160およびQ-S/A/T/I/L-Y-D/Y/H/A-S/G/N/R-S/G/N/D-T/A/N/I/S/L/G-W多様性2240を得た図30F。同一基準および類似基準の下でのコホートライブラリ配列の総多様性の値を図30Gおよび以下の表19にまとめた。上記の類似基準を適用すれば、任意の個々の残基の位置においてクエリー配列と参照ライブラリ配列の間で同一一致identitymatchが見出されない場合にのみ、一つまたはそれ以上の類似の残基がコホートライブラリ配列に組み込まれるが、類似基準はまた、クエリー配列と参照ライブラリ配列の間に同一性が存在する位置にも適用できる。このような適用では、参照ライブラリが同一一致および一つまたはそれ以上の類似の残基の両方を含む場合のクエリー配列の残基は、その位置に同一残基および一つまたはそれ以上のそのような類似残基を含むコホート配列を生成する。従って、この全類似allsimilar基準の適用は、コホートライブラリの多様性を合理的な様式で拡張するために使用され得、これは、上記の標準的な類似基準を使用した場合よりも大きな総多様性レベルを達成し、おそらくは同一基準のみを用いて達成される多様性よりもずっと大きな合理的に得られる総多様性をもたらす。本発明の一要素として全類似基準を用いる効果を、同一の上記抗VEGFモノクローナル抗体A4.6.1に対して同一基準、類似基準、および全類似基準を適用することによって検証した。重鎖CDR1配列TNYGMN配列番号13に全類似基準を適用し、クエリー配列とVH1参照ライブラリの間で比較を行った場合、T/S-N-Y-G-M-N配列番号259多様性2のコホートライブラリ配列を得た図31A。つまり、クエリー配列と参照ライブラリの最初の残基Tにおいては完全一致する残基が存在するが、全類似基準は、得られるCDR1コホートライブラリ配列の最初の位置においてTまたは類似のアミノ酸であるSのいずれかを使用した。重鎖CDR1クエリー配列とVH3CDR1参照ライブラリの比較において全類似基準を使用することで、コホートライブラリ配列S-N-Y-G/A-M-N配列番号261を得た。A4.6.1の重鎖CDR2の配列はWMGWINTYTGEPT配列番号16であった。全類似基準を用いる本発明の方法を用いて、このクエリーCDR2配列をVH1およびVH3CDR2参照ライブラリと比較することにより、それぞれ、コホートライブラリ配列W-M-G-W-I-N-P/A-Y-S-G-D-T/A-S配列番号263多様性4およびW-V-A-Y-I-N-S-D/S/N-S-G-E/D-I-H配列番号265多様性6を得た図31B。全類似基準の下で、重鎖CDR3クエリー配列AKYPHYYGSSHWYFD配列番号19をVHCDR3参照ライブラリと比較することで、コホートライブラリ配列A-R/K-G/D/E/R/A/H/V/T-P/V/L-S/T/H-Y/F-Y/W-G/A-S/T-S/T-S/H-Y/W-Y/W-F-D多様性36864;図31Cを得た。A4.6.1軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列それぞれSNYLNWY配列番号21、VLIYFTSSLH配列番号23、およびQQYSTVPW配列番号26に対して全類似基準を適用することで、以下のコホートライブラリ配列を得た:CDR1クエリー配列とVLκ1、VLκ3、およびVLλ3参照ライブラリとの比較においては、それぞれ、S-N-Y/W-L-N-W-Y配列番号269多様性2、S-N-Y-L-A-W-Y配列番号271多様性1、およびS/T-K/Q/Y/E-Y/F-V-H/Y/S/C-W-Y多様性64図31D;CDR2クエリー配列とVLκ1、VLκ3、およびVLλ3参照ライブラリとの比較においては、それぞれ、L-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-S/T-L-Q/E配列番号275多様性20、L-L-I-Y-G/D-T-S-S/T-R-A配列番号277多様性4、およびL-V-I/V-Y-D/Q/E/K/G-D/K-S/T-K/D/E/N-R-P配列番号280多様性160図31E;ならびにCDR3クエリー配列とVLκおよびVLλ参照ライブラリとの比較においては、それぞれ、Q-Q-Y-S/T-S/T/H-L-P-Y/W/F配列番号281多様性18およびQ-S/A/T/I/L-W/Y-H-S-S/G/N/D-I/L-W配列番号283多様性80図31F。これまでに考察した抗体配列の場合と同様、様々なコホートCDRライブラリからの最終的なコホート抗体またはそのフラグメント、例えばFab、scFv等ライブラリの作製は、コホートCDRライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートCDRライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体またはそのフラグメントを構築することによって行った。表20は、マウスA4.6.1モノクローナル抗体のCDR配列に対して同一基準、類似基準、または全類似基準を適用することにより得られた本発明のコホートライブラリおよび抗体についての多様性のデータを要約したものである。実施例20コホート抗体ライブラリの遺伝子操作方法本実施例においては、遺伝子操作技術を用いてコホート抗体ライブラリを作製および構築する工程を記載する。scFv型は、ひとつにつながった機能的抗原結合単位VH領域およびVL領域からなる。簡単に説明すると、抗体のVLフラグメントおよびVHフラグメントを標準的な分子生物学的技術を用いてクローニングした。その可変領域のフレームワークおよびCDRをコードするオリゴヌクレオチドを、シングルオーバーラップポリメラーゼ連鎖反応SOE-PCRによって構築した。次いで、別々のVLフラグメントおよびVHフラグメントをポリ-Gly-Serリンカー典型的にはGGGGSGGGGSGGGGS配列番号590で連結して単鎖抗体scFvを作製した。次いで、発現ディスプレイベクターへのクローニングを容易にする制限部位を含む5’および3’隣接プライマーを用いて全長分子を増幅した。生成されたライブラリの総多様性は、フレームワーク配列の数および変異誘発、例えばWTMを用いる変異誘発のために選択されたCDRの位置の数に依存した。典型的には、完全参照ユニバーサル抗体参照ライブラリの合成においては、VHライブラリの平均多様性は、9アミノ酸を用いてWTMTMを行った場合、3.5×1066フレームワーク×9アミノ酸×CDR1についての22×CDR2についての26×13アミノ酸CDR3についての28であった。VHライブラリの多様性は上限であり、VλライブラリおよびVκライブラリの多様性はそれよりも有意に小さく、従ってそれらを合わせた完全scFvライブラリの多様性は、細菌系の形質転換効率の範囲内である1010~1011に収まった。従って、参照ユニバーサル抗体ライブラリの作製においては、N末端およびC末端にそれぞれHisおよびMyc免疫タグをコードする2オリゴヌクレオチドに沿って様々なVH、Vλ、およびVκライブラリのフレームワーク図62A~62Eを参照のことを含む、90のオリゴヌクレオチドを合成した図33。さらに、この三つのライブラリの各々のCDR1、CDR2、およびCDR3において多様性を表す30~60の縮重オリゴヌクレオチドのサブセットを合成した合計90~180。これらのオリゴヌクレオチドをSOE-PCR法によって構築し、必要なVH-VλおよびVH-Vκの組み合わせを含むライブラリを作製した。次いで、配列の検証およびライブラリの品質の評価のために、各々のライブラリからランダムクローンを選択した。本発明のコホートCDRおよび抗体ライブラリの合成は、UALについて記載したのと同じプロセスによって行った。コホート抗体ライブラリの合成は、このようなコホートライブラリが参照ライブラリよりも低い多様性を有し、従ってコホートライブラリの作製は参照ライブラリよりも簡単であり、多く場合は必要なオリゴヌクレオチドがより少ないという付加的な利点を明らかにした。各々の標的抗体コホートライブラリの作製のために、野生型抗体のサブファミリーのメンバーであるVLおよびVHのCDR1、2、および3の配列のオリゴヌクレオチドのセットを合成した図62G~H。これらのVH、VL、およびCDRオリゴヌクレオチドもまた、SOE-PCRによって構築し、ベースとなるscFv変異誘発テンプレートとして必要なVH-VLの初期の組み合わせを作製した。ポジティブコントロールとしての出発点となる野生型抗体の作製は、本質的に同様の様式で行った。SOE-PCRオリゴヌクレオチド図62G~Iによりコードおよび構築された抗VEGFA4.6.1フレームワークおよびCDRアミノ酸については図34および35を参照のこと。VLおよびVHのCDR1、2、および3への終止コドンの導入以下および図62G~I等を参照のことは、コホートライブラリのスクリーニング効率を上げるのに使用した野生型変異誘発テンプレートのさらなる特徴であった。例えば、VHCDR1H1e_1_VEGF終止コドンオリゴヌクレオチドは、以下に示す通り、野生型配列の対応するCDRの位置において、チロシンおよびグリシンTACGGG残基の代わりに二つのインフレーム終止コドンTAATAAを含んだ。インフレーム終止コドンを使用することで、非変異型VLおよびVH、CDRテンプレートが十分に翻訳されず、および/または細菌細胞膜周辺腔に運搬されない。従って、その後のFACSを機能的なscFvのみに限定することにより、野生型scFvへの抗原の結合のバックグラウンドシグナル対ノイズのレベルを最小化させた。CDRの多様性に関して、抗体のCDRループ内の小さな摂動perturbations例えば一つのループごとに一つの変化を調査するため、LTMを使用した。さらなる改善のために、CDR内に二以上の置換の導入を可能にするWTMをその後使用して、CDRの化学的背景chemicallandscapeを徹底的にスクリーニングした。WTMを用いて、野生型のアミノ酸および所望のアミノ酸変種を、オリゴヌクレオチド合成を操作することにより標的とされたCDRの位置において調査した。特定位置において、あるオリゴヌクレオチドのサブセットが野生型をコードし、別のサブセットが標的の変異をコードするオリゴヌクレオチドの混合プールを合成した。WTM手順における各合成工程において、成長させるオリゴヌクレオチド鎖を二つの塩基の一方によって伸長した。一方の塩基は野生型コドンをコードし、もう一方の塩基は所望の変異に対するコドンに属するものであった。野生型CDRと様々なVHおよびVLフレームワークを統合することによって、LTMおよびWTMCDR変異の多様性を上回る追加の多様性を生成した以下の実施例2Xを参照のこと。コホートライブラリの総多様性は、変異させたCDRの位置の数および可変性プロフィールの一致に基づき置換されたアミノ酸の数の両方に基づき生成された。各々の出発テンプレートの可変性プロフィールは、その周囲のVLおよびVHフレームワークに依存した。実施例21ウォークスルー型変異誘発によるコホートVH、Vλ、およびVκscFvライブラリの作製A.クンケル型変異誘発のためのscFv一本鎖テンプレートの調製scFv一本鎖DNAの調製のために、標的scFv発現構築物をPBSKIIにクローニングした。大腸菌宿主CJ236を、OD600がおよそ0.2~0.5吸光度単位AUに達するまで2YT/Amp液体培地中で増殖させた。この時点で、M13K07ヘルパーファージ1mLを細菌培養物に加え、37°Cでのインキュベーションを継続した。30分後、細菌およびファージ培養物を、0.25μg/mLウリジンを含有する大量の2YT/Amp液体培地30mLに移して一晩培養した。翌日、培養培地を遠心分離10000×gで10分間により清澄にした後、上清を回収し、1/5量のPEG-NaClを30分間加えた。この混合物をさらに二回遠心分離したが、各遠心分離後に上清を廃棄して、PEG/ファージペレットを得た。次いで、このPEG/ファージペレットをPBS1mLに再懸濁し、再遠心分離した14000×gで5分間。その上清を回収し、次いでDNA精製カラムQIAprepSpinM13,Qiagenにアプライし、一本鎖scFvウリジニル化DNAuridinylated-DNAを溶離させた。B.ウォークスルー型変異誘発WTM用オリゴヌクレオチド3900オリゴシンセサイザーSyngenInc.,SanCarlos,Aを製造元の指示書通りに使用して合成オリゴヌクレオチドを合成し、PCRまたはクンケル型変異誘発において使用する前にプライマーの質をPAGE電気泳動により検証した。ウォークスルー型変異誘発WTM用オリゴヌクレオチドをウリジニル化一本鎖テンプレートにアニールさせ、特定の位置を既定のアミノ酸で変異させるよう設計したその全体が参照により本明細書で援用される特許出願PCT/US2004/020306を参照のこと。このアミノ酸置換の正確さおよび制御は、他の確率論的な変異誘発技術と異なり、複数の特定のCDR置換を実現した。WTMを用いて、野生型のアミノ酸および所望のアミノ酸変種を、標的のCDRの位置においてオリゴヌクレオチド合成を操作することにより調査した。特定位置においてあるオリゴヌクレオチドのサブセットが野生型をコードし別のサブセットが標的変異をコードするオリゴヌクレオチドの混合プールを合成した。WTM手順における各合成工程において、成長させるオリゴヌクレオチド鎖を二つの塩基の一方によって伸長させた。一方の塩基は野生型コドンをコードし、もう一方の塩基は所望の変異コドンを挿入するよう設計されたものであった。C.Avastin抗VEGFVHCDRブラスティングblasting由来のCDRオリゴヌクレオチドを用いた超ヒト化変異誘発超ヒト化プロセスのために、特定のCDRの位置を、それらのインビボでの頻度に基づき選択されたアミノ酸により置換した上記実施例4および以下の結果を参照のこと。マウス由来AvastinA4.6.1から第一ヒトVH1フレームワークへのヒト化の間に、対応する可変性プロフィール以下の表に基づくCDR1アミノ酸の置換は行われなかった。オリゴヌクレオチドH1e_1_VEGF01CDR1図XE参照は、配列5-AGGCTTCCGGTGGCACATTCACCAACTACGGGATGAACTGGGTTAGACAGGCACCTGG-3配列番号592からなるものであった。VH1CDR1コード配列5-ACCAACTACGGGATGAAC-3配列番号593は、その周囲のVH1フレームワーク領域に延びる、それぞれ、DNA配列5-AGGCTTCCGGTGGCACATTC配列番号594およびTGGGTTAGACAGGCACCTGG-3配列番号595に隣接するものであった。CDR-フレームワークのシャッフリングを繰り返すため、このヒト化VH1CDR1コード配列をまた、サブファミリー配列特異的なフレームワークの伸長部分の並置によってサブファミリーVH1メンバー、VH3、VH4、またはその他の別のフレームワーク下に組み込んだ。VH1CDR1コード配列は、代わりに、周囲のVH3フレームワーク領域に伸びる上流側のVH3-07フレームワーク配列5-GCCAGCGGCTTTACCTTCTCT配列番号596および下流側のGCTGGGTTAGACAGGCACCT-3配列番号597のエクステンションに隣接させることも可能であった。VH1CDR2AvastinA4.6.1のブラスティングの間に、13の野生型アミノ酸のうちの5つT、T、E、P、およびTを、VH1CDR2の可変性プロフィールに基づき、ヒトの優先アミノ酸それぞれP/A、F/S/N/T、T/N/G/S/D、およびN,K,S,Gで置換した以下の可変性プロフィールの表における背景が白のボックスを参照のこと。ここでは、CDR2の野生型アミノ酸配列WMGWINTYTGEPT配列番号16は、VH1フレームワーク5-CACCTGGTCAGGGCTTGGAG配列番号599およびTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3配列番号600配列に隣接する、5-TTGATGGGATTGATAAACCCATACTTCGGAACAAAC-3配列番号598によってコードされた。このように、P/A、F/S/N/T、T/N/G/S/D、およびN,K,S,GというこれらのA4.6.1VH1CDR2のヒト化置換は、320の可能性のある特有の置換のバリエーションを生成させるために最低でも12のオリゴヌクレオチドを必要とするものであった。上記の表に基づき、実施したCDR2の位置において必要とされたヒト化置換を、イタリック体の縮重塩基混在記号SはCまたはGであり、RはAまたはGであるによって示す以下のH1e_2_VEGF01-12オリゴヌクレオチド配列を参照のこと。VHCDR3については、CDR3を免疫グロブリンDおよびJセグメント遺伝子の組換え接合により形成したため、その由来となるサブファミリーが存在しなかった。上記可変性プロフィール分析を用いて、長さが15のCDR3の一つのみの位置を8つのヒト優先アミノ酸で置換した。特に、CDR3の野生型アミノ酸配列AKYPHYYGSSHWYPD配列番号19を、配列A-K-G/D/E/R/A/H/Y/T-P-H-Y-Y-G-S-S-H-W-Y-P-D配列番号20によりヒト化した。この場合、A4.6.1VH1CDR3ヒト化置換には、4つの縮重オリゴヌクレオチドのみが必要となった以下のH1e_3_VEGF01-4配列を参照のこと。CDR3は、VH1フレームワーク5-ATACCGCCGTGTATTACTGT配列番号619およびTACTGGGGTCAGGGCACTCT-3配列番号620配列に隣接するによりコードされるものであった。CDR3の縮重位置を太字の縮重塩基混在記号で示すSはCまたはGであり、RはAまたはGであり、WはAまたはTである。A4.6.1のVH3CDR1およびCDR2のヒト化についての置換表およびCDRコードオリゴヌクレオチドを以下に列挙する完全なオリゴヌクレオチドのリストについては図62I参照。VH3については、4つの異なるファミリーメンバー3-30、3-07、3-11、および3-23を使用した。従って、それらの各々の出発点のVH3変異原性scFvテンプレートへの正確なアニーリングのため、VH3:3-30、3-07、3-11、および3-23フレームワーク特異的配列を、各々の縮重CDR1およびCDR2コード領域に隣接させた。D.Avastin抗VEGFVLCDRのブラスティング関連する様式で、VLκおよびVLλ軽鎖における超ヒト化置換を、それら各々の可変性プロフィールから確立した。例えば、VLκIおよびVLκIIIのファミリーメンバー、特にVLκ-L1、VLκIII-A27、およびVLκIII-L6の使用を決定した。同定された、得られた超ヒト化VK-1およびVK-3の置換表を以下に示す。VK-1およびVK-3の両方の場合においては、超ヒト化VK-1およびVK-3置換の必要がなかった。同定された、得られたVK-1およびVK-3CDR1オリゴヌクレオチドを各々以下に示すK1_1_VEGF01およびK3_1_VEGF01を参照のこと。K1_1_VEGF01:5-GCAGAGCTTCTCAGGGTATC-AGCAACTACCTGAACTTGTAC-CAACAGAAGCCTGGTAAAGC-3配列番号621K3_1_VEGF01:5-GCAGAGCTTCTCAGTCCGTGAGCAACTACCTGGCCTTGTAC-CAACAGAAACCTGGTCAGGC-3配列番号622VLκIおよびVLκIIICDR2における超ヒト化は、以下に示すようなそれらの各々の可変性プロフィールの置換表から確立した。VK-1およびVK-3の場合においては、4つのCDRの位置でヒト化置換が必要であった。しかし、多様性の表は、同数の置換4つの位置によってであっても、作出される実際のVK-1およびVK-3の多様性はそれぞれ20および2であることを実証した。このことは、同じ投入テンプレートをアラインメントに使用した場合に、異なる可変性プロフィールが異なる多様性レベルを生じるという特性を例証した。VK-1CDR2超ヒト化用オリゴヌクレオチドは以下の通りである表30、配列K1_2_VEGF01-3を参照のこと。CDR2周りの5’および3’隣接フレームワーク配列は、それぞれ、5-AGCCTGGTAAAGCCCCTAAG-3配列番号623および5-TCCGGCGTTCCTAGCAGATT-3配列番号624であった。VK-3CDR2における、CDR2オリゴヌクレオチドヒト化コード配列はであった。しかし、二つのVK-3サブファミリー、特にA27およびL6を使用したので、VK-3CDR2周りの5’および3’隣接フレームワーク配列における違い太字の斜体は、それぞれ、次の通りであった:E.scFVテンプレートの変異誘発抗原結合ポケット内のヒト優先アミノ酸CDR配列の効果を十分に調査するために、コホートライブラリには各々のscFvの多変異型CDRが必要であった。クンケルテンプレートとして野生型標的scFv遺伝子を用いて、第一のWTM-CDRライブラリテンプレートを作製した図59。例として、CDRH3を、各々のCDRH3VH1、VH3、VH4可変性プロフィールから同定された適切なヒト優先アミノ酸で置換した。これらの第一世代WTM-CDRH3scFVをその後のテンプレートとして使用し、二重変異WTM-CDRH1およびWTM-CDRH3領域のコホートライブラリを作製するために適切なWTM-CDRH1オリゴヌクレオチドセットとアニールさせた。次いで、この二重WTM-CDRH1およびWTM-CDRH3ライブラリをテンプレートとして使用して、他の残りのWTM-CDRH2オリゴヌクレオチドを導入し、三重WTM-CDRVHライブラリを作製した。VλおよびVκのいずれかの軽鎖のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3WTMオリゴヌクレオチドの残りを漸進的、反復的に組み合わせることによって、VHVH1、VH3、VH4およびVLVλおよびVκコホートCDRライブラリの複合アレイを開発した。F.scFvCDRの同時のクンケル二重、三重、四重変異単一のWTM-CDRライブラリから二重WTM-CDR構築物に、その後に三重WTM-CDRライブラリへと段階的に構築する代替法が存在する。この代替ストラテジーは、複数のオリゴヌクレオチドが同じ遺伝子構築物の異なる位置において同じscFvテンプレートに同時にアニールできるという最近の実験的観察に基づくものである図58。例えば、二つのCDRH1、CDRH2、およびCDRH3WTMオリゴヌクレオチドのセットが、三つ全てのVHCDRSにアニーリングさせるための反応混合物に加えられ得る。WTM-CDRオリゴヌクレオチドの多重の組み込みが、5つのアニーリング反応を同時に行うのと同じレベルで起こることが観察された。一本鎖テンプレートは、三つのWTM-CDRH1、WTM-CDRH2、およびWTM-CDRH3オリゴヌクレオチドの全てを組み込んだ。しかし、一ラウンドのアニーリング後に、三つのCDRH1、CDRH2、およびCDRH3WTM修飾の全てを達成したscFv産物の回収率は約50であった。典型的には、多変異型CDRscFvの比率を高めるために、第一アニーリング反応からの反応産物を回収し、次いで同じ複数のWTM-CDRオリゴヌクレオチドで再アニーリングさせた。この再アニーリングの後の多変異型CDRscFvの割合は、多変異型CDRを有する計75の集団においてさらに50増加した。この方法は、前の変異型テンプレートに複数のWTM-CDRオリゴヌクレオチドを再導入する能力から、濃縮enrichmentと命名した。このように、二回または三回のさらなる濃縮ラウンドを導入することによって、多変異型CDRscFvテンプレートの集団比率は90に達した。濃縮の一つの驚くべき側面は、複数の隣接するオリゴヌクレオチドのアニーリングが、そのオリゴヌクレオチドの末端が数塩基分重複する場合でさえも所望の置換を導入したことである。ライゲーションプロセスの間、二つのオリゴヌクレオチドの5’末端と3’末端の間のホスフェートジエステル結合は相互に直接隣接しなければ容易に形成されないと考えられていたため、これは予想外のことであった。もし重複部分があれば、一方のオリゴヌクレオチドは、他方の上でめくれ上がるrideupと予期されていた図58参照。G.多様性を増加させるためのVHおよびVLCDRのファミリー間の交配図42および43は、各々のVH1、3およびVLκ、λの可変性プロフィールのCDRマッチング後にヒト抗VEGFA4.6.1scFvを再構築する上で利用できる、様々な可能性のあるCDRの組み合わせを示す。例えば、図42は、ヒト抗VEGFVH1CDR1コホート配列が、期待されるヒトVEGFVH1CDR2コホート配列と黒塗りの矢印、次いで共通のVEGFVH1CDR3コホート配列と組み合わすことができることを実証する。次いで完全な抗VEGFVH1CDR1、2、および3コホート配列をそれらの天然のVH11-eフレームワーク配列との関係で発現させた。回収された抗VEGFVH3CDR1、2、および3コホート配列の場合と同様、これらは、列挙された天然のVH33-07、3-11、3-23、および3-30フレームワーク配列と共に発現させることができた図5。抗体の多様性は、本発明の特徴的なインビトロ遺伝子学的方法に基づき増加させることができた。操作技術と合わせることで、人工CDR-フレームワークの組み合わせを作出することができた。VHの場合、VH3CDRをVH1フレームワークと組み合わせることができ、その逆もまた同様であった。従って、4つの他の構造様式における抗原結合の背景を調査するため、VH1の個別のCDR1、2、および3の可変性プロフィール結果をVH33-07、3-11、3-23、および3-30フレームワークと組み合わせた図42の点線および破線。同様に、VLについては、CDRVλ1、λ2、およびλ3とVκ1およびVκ3の可変性プロフィールを混合および一致させた図43の点線および破線。次いで、合併したCDRを以下のVLフレームワークのいずれかにおいて発現させた:Vλ1-1b、Vλ22a2、およびVλ33r、3lとVκ1L1ならびにVκ3A27およびL20図5。これらのCDR1およびCDR2の交配設計が、完全照合overallcollatedUALライブラリのサブセット図6、7、および8であった。コホートライブラリにおける違いは、野生型抗体のCDR3の長さに基づき一つのみのCDR3サイズが選択されたことであった。実施例22参照ユニバーサル抗体ライブラリの発現およびディスプレイの方法ユニバーサル抗体ライブラリの発現およびディスプレイを実現するためのアプローチは、本発明の参照ライブラリおよびコホート抗体ライブラリのいずれにも容易に適用できる。このようなライブラリは、天然レパートリーの多様性を増加させ、ひとたび構築されれば他の抗原について繰り返しスクリーニングすることが可能になる。scFvライブラリを、標準的な技術を用いてレシピエントの細菌宿主にトランスフェクションした。発現される融合scFvタンパク質を、蛍光標識した抗原の結合が可能な外表面の位置で発現させた。次いで、抗原に効果的に結合する適当なscFvクローンを発現するライブラリメンバーを、FACSを用いて濃縮した。次いでこの細胞集団を再培養し、その後にストリンジェンシーのレベルを上げた選択に供して、高い特異性および親和性で標的を認識するクローンの小サブセットを単離した。このライブラリは、迅速な同定および検証のために、例えばFITC標識抗Myc-tag抗体を用いるハイスループット形式ならびにFACS分析に容易に適合させることができた。次いで、候補クローンを単離し、プラスミド調製を行いscFv配列情報を獲得した。このアプローチは、この抗体のVHおよびVL領域の相補性決定領域CDRにおけるアミノ酸の機能を決定および最適化するのに必要なコドンの仮説に基づく合理的な置換hypothesis-drivenrationalreplacementを実現した。次いで、比較配列分析および個々のクローンの親和性/特異性プロフィールから、どのクローンが親和性成熟を起こしたかを決定した。A.scFvAPExの表面発現このスクリーニングプロセスの本質的な目的は、各細菌細胞にscFv融合タンパク質を発現させることであった。宿主株である大腸菌DH12STMInvitrogenTMを改良型pAPEx1またはpAK200scFv構築物で形質転換した。形質転換細胞を、2グルコースおよびアンピシリンを補充したTerrificBrothに50μg/mlとなるよう接種し、OD600が0.1になるまで培養した。インキュベーション後、細胞の外膜を透過処理した。簡単に説明すると、細胞20OD600が約1mlに相当をペレット化し、0.75Mスクロース/0.1MTrisHCl、pH8.0/100μg/ml鶏卵リゾチームの氷冷溶液350μlに再懸濁した。次いで、氷冷した1mMEDTA700μlを穏やかに加え、細胞懸濁物を氷上に10分間静置し;次いで0.5MMgCl250μlを加え、その混合物を氷上にさらに10分間静置した。得られた細胞を穏やかにペレット化し、室温にて45分間、1×PBSに再懸濁した後、FACSによる評価を行った。次いで、ARIA/FACSscanBectonDickinsonにおいて製造元の指示書に従いCellQuestソフトウェアを用いて細胞を分析した。抗ヒト抗scFvフィコエリトリン抗体を添加することによって、またはMycもしくはHAタグの染色によって全てPharMingen,SanDiego,Calif.、scFvの周辺質での発現を決定した。APExライブラリ細胞におけるscFvのペリプラズムでの発現を確認した後の次の作業は、scFv構築物がそれらの標的抗原に結合できることを検証することであった。機能的な抗原結合は、その後のコホートクローンのFACSに必須であった。調査のため、オリジナルの野生型scFvを発現する大腸菌細胞を上記の通りに回収し、ビオチン、フィコエリトリン、またはFITC蛍光標識タンパク質のいずれかと共にインキュベートした。野生型および機能性のコホート変種は標識タンパク質に結合し、ベクターコントロール細胞と比較して高い蛍光読み取り値を生じた。以下のプロトコルは、VEGFタンパク質のビオチン標識に使用した手順を表すが、直接的なフィコエリトリンまたはFITC複合体もまた可能であった。B.コホートscFv抗体ライブラリの発現およびディスプレイ本実施例においては、標的抗原に対してスクリーニングするためにコホート抗体ライブラリを発現およびディスプレイする方法を記載する。scFvライブラリを、標準的な技術を用いてレシピエントの細菌宿主をトランスフェクションした。簡単に説明すると、ライブラリからのscFv分子の発現に関して信頼性が実証されている細菌発現ディスプレイ系を使用した。細菌細胞膜周辺腔への運搬およびディスプレイのために、scFvを、N末端またはC末端のいずれかにおいて、それぞれ、NlpAリポタンパク質またはM13のファージ遺伝子3GeneIIIマイナーコートタンパク質由来の小リンカーペプチドに連結した図33。大腸菌細菌は、細胞膜周辺腔を二つの膜、内膜および外膜で覆っている。APExにおいては、scFvタンパク質を、NlpAリポタンパク質またはGeneIIIのいずれかによって内膜につなぎ、次いで外膜をリゾチームEDTA処理によって化学的に分解して蛍光タグ標識した標的にアクセスさせた。次いで、標識抗原により効果的に結合するscFvクローンを発現するコホートライブラリのメンバーを、FACSを通じて濃縮した。標的抗原は、二次抗体で直接的にまたはビオチン-ストレプトアビジン結合を通じて間接的にのいずれかで標識した。scFvプラスミドDNAは、標準的なアルカリ溶解型のミニプレッププロトコルSambrooketal.,sections1.25-1.28を参照のことを用いて回収し、再形質転換し、次いで再培養して、その後にストリンジェンシーのレベルを上げた選択に供して、高い特異性および親和性で標的を認識するクローンの小サブセットを単離した。次いで、比較配列分析および個々のクローンの親和性/特異性プロフィールから、どのクローンが親和性成熟を起こしたかを決定した図23参照。C.scFc結合タンパク質の産生および精製:VEGFビオチン標識生物活性を有するVEGFタンパク質は、精製形態のものが市販されているRandDSystem,SanDiego,CA。VEGFタンパク質のビオチン化は様々な方法によって行うことができる;しかし、過剰なビオチニル化は、エピトープ抗体相互作用部位をブロックする可能性があるため望ましくない。使用したプロトコルは、MolecularProbesFluoReporterBiotin-XXLabelingKitcatF-2610に基づくものであった。簡単に説明すると、ストック濃度のVEGFを1M炭酸水素ナトリウム緩衝液およびビオチン-XX溶液DMSO中のストック濃度のビオチン-XXに加えた。この混合物を25°Cで1時間インキュベートした。この溶液を微量遠心分離フィルターチューブに移し、遠心分離し、PBS溶液で繰り返し4回洗浄した。ビオチン化VEGF溶液を回収し、SephadexG-25カラムで精製し、そしてタンパク質濃度をOD280により決定した。D.VEGFFITC標識一つのFITC試薬のバイアルに、溶媒試薬850μlを加えCalbiochem,SanDiego,CA、十分に混合し、それによって得られたFITC溶媒試薬は1mg/mlの濃度となった。次いで、FITC混合物500μlをVEGFタンパク質溶液2.5mg2mg/mlに加え、素早くボルテックスした。この反応混合物は、200μgFITC対1mg抗体/タンパク質の接合比を提供した。このVEGF-FITCを、撹拌中に自然光を遮断するためアルミホイルで覆った容器内で、室温で2時間、上下逆さにしてend-over-end混合した。PBS緩衝液濃縮物を蒸留水で希釈し、次いでVEGF-FITC複合体を透析チューブに移して室温で一晩透析した。次いでVEGF-FITCを透析チューブから取り出し、タンパク質濃度を再測定した。E.ARIA-FACSソーティングおよびscFv変種ライブラリ細胞の回収以下の方法は、コホート結合親和性変種の濃縮および単離のためにscFvライブラリをスクリーニングするFACSに関するものである。培養培地で培養した後、上記の透過処理した大腸菌細胞を、穏やかに回転させならが37°Cで3時間、飽和濃度200ng/mlのビオチン化VEGFと共にインキュベートした。次いで、大腸菌細胞を緩衝液で二度洗浄し、未結合のビオチン化VEGFを除去した。次いで、ARIABectonDickinsonにおいて製造元の指示書に従いCellQuestソフトウェアを用いて細胞をソーティングした。コホート集団のフラクションを集収できるようソーティングゲートを調整した。VEGFは親和性が強いため、ゲートをより高い蛍光シグナルに設定した。FACSゲーティングは、ここで、他の細胞株および関連する結合タンパク質を含む試験系において親和性の高い亜集団を80より多く濃縮することが実証された図38。F.コホートscFvの回収および発現最初のソーティング後に捕捉した大腸菌をフローサイトメーターを通じて直ちに再ソーティングした。その後、ソーティングした細胞懸濁物中のscFv遺伝子を再ソーティングし、回収し、37°Cで再形質転換した。次いで、変異scFv遺伝子をpAPEx1ベクターに再クローニングし、細胞を再形質転換し、寒天プレート上、30°Cで一晩培養した。得られたクローンを、上記のように、第二ラウンドのソーティングおよび再ソーティングに供した。次いで、第二/第三ソーティングを行ったscFv遺伝子を、可溶型scFvタンパク質の産生のための発現プラスミドpBADにサブクローニングした。G.BIAcore分析機能性scFvの結合を評価し、予備的な親和性KD=kd/ka=koff/konを測定するため、BIAcore-2000表面プラズモン共鳴系分析を使用したBIAcore,Inc.Piscatawy,NJ。リガンド、例えばAvastinA4.6.1抗VEGFscFvを、製造元の指示書BIAcore,Incに従い、N-エチル-N-3-ジメチルアミノプロピル-カルボ-ジイミドヒドロクロリドEDCおよびN-ヒドロスクシンイミドNHSを用いた共有結合カップリングによってBIAcoreバイオセンサチップの表面に固定した。ブロッキング剤としてエタノールアミン溶液を注入した。フロー分析のために、リガンドの標的、例えばVEGFを、BIAcore流動緩衝液20mMHepes緩衝生理食塩水pH7.0で希釈し、等濃度、例えば0.010μMの三つのアリコートにした。この標的、例えばVEGFのアリコートを、カイネティクスの測定のために、例えば2μl/分の流速で注入した。解離試薬を含まない流動緩衝液中での解離を観察した。次いで、結合反応のカイネティクスパラメータを、例えばBIAevaluation2.1ソフトウェアを用いて測定した。H.大腸菌におけるpBADの発現コンピテントな大腸菌宿主細胞を製造元の指示書InvitrogenpBAD発現系に従い調製した。簡単に説明すると、40μlLMG194コンピテント細胞および0.5μlpBADscFv構築物およそ1μgDNAをまとめて氷上で15分間インキュベートした後、一分間の42°Cの熱ショックを与えた。次いで、細胞をSOC培地中、37°Cで10分間回復させた後、LB-アンピシリンプレートにプレーティングして37°Cで一晩培養した。次の日に、単コロニーを掻き取り、scFv産生に最適なL-アラビノース誘導濃度を最初に決定するための小スケール液体培養を行った。室温で一晩培養した後、OD600=0.5に達した後の各クローンの複製物を、L-アラビノースの連続1:10滴定0.2~0.00002終濃度により試験誘導した。試験培養物1mlを集収し、ペレット化し、100μl1×PBS緩衝液10mM、160mMNaCl、200mMホウ酸、pH=8.0を加えて細胞を再懸濁した後、リゾチーム溶液50μlを加えて1時間37°C置いた。遠心分離後にリゾチーム消化物の細胞上清を集収し、MgSO4を加えて終濃度を40mMとした。この溶液をPBSで事前に平衡化したNi-NTAカラムにアプライした。Hisタグ結合型scFvサンプルをPBS緩衝液で二度洗浄し、250mMイミダゾールの添加により溶離を完了した。次いで、可溶型scFvの発現をSDS-PAGEにより試験した。I.大スケールの大腸菌培養物からのscFvの精製最適な培養条件を決定した後、大スケール容量の総大腸菌細胞培養ペレットを25°Cでの一晩の培養後に遠心分離により集収した。次いでペレットをPBS緩衝液0.1Tweenに再懸濁し、超音波処理を5ラウンド繰り返してVirtisUltrasoniccellDisrupter細菌細胞膜を溶解させて細胞質内容物を遊離させた。この懸濁物を、さらなる処理のために、最初に高速遠心分離により清澄化して上清を回収した。この上清を、PBSで事前に平衡化したNi-NTAカラムにアプライした。Hisタグ結合型scFvサンプルをPBS緩衝液で二度洗浄し、250mMイミダゾールの添加により溶離を完了した。次いで、上清のpHを、6MHClにより5.5に調整した後、SPSepharoseHP陽イオン交換カラムPharmaciaにロードした。scFvを塩NaCl勾配で溶離させ、scFvを含有するフラクションの濃度を280nmにおける光学密度により決定し、PAGEにより検証した。次いで、scFvを含有するフラクションをプールし、PBSで透析した。J.マウスAvastinA4.6.1-scFvに結合するVEGFタンパク質のBIAcore分析機能性scFvの結合を評価し、予備的な親和性KD=kd/ka=koff/konを測定するため、BIAcore-2000表面プラズモン共鳴系分析を行ったBIAcore,Inc.Piscatawy,NJ。リガンド、マウスAvastinA4.6.1抗VEGFscFvを、製造元の指示書BIAcore,Incに従い、N-エチル-N-3-ジメチルアミノプロピル-カルボ-ジイミドヒドロクロリドEDCおよびN-ヒドロスクシンイミドNHSを用いた共有結合カップリングによってBIAcoreバイオセンサチップの表面に固定した。ブロッキング剤としてエタノールアミン溶液を注入した。フロー分析のために、VEGFをBIAcore流動緩衝液20mMHepes緩衝生理食塩水pH7.0で希釈し、0.010μMの濃度の三つのアリコートにした。VEGFのアリコートを、カイネティクスの測定のために、2μl/分の流速で注入した。解離試薬を含まない流動緩衝液中での解離を観察した。次いで、結合反応のカイネティクスパラメータを、BIAevaluation2.1ソフトウェアを用いて決定した。図39は、A4.6.1抗VEGFscFvに対するVEGFの結合についてのBIAcore結果を示す。これらのプロットから、再構成されたVEGFは、熱変性タンパク質のネガティブコントロールとの比較におけるRUの増加Konにより示されるように、固定されたA4.6.1抗VEGFscFvに結合することが明らかとなった。さらに、RUの増加は、アプライしたA4.6.1抗VEGFscFvタンパク質の濃度に比例した。BIAcoreプロフィールはまた、予想されたVEGFの解離プロフィールを示した。実施例23参照ユニバーサル抗体ライブラリ由来の候補物質のハイスループット親和性成熟を実行する方法。この節では、WTMおよび/またはルックスルー型変異誘発LTM親和性成熟を用いてコホート抗体ライブラリから候補配列を同定しこれをさらに改善するための工程の例について説明する。ルックスルー型変異誘発LTMについては、すでに、その全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願10/877467US20050136428として公開に記載されている。簡単に説明すると、ユニバーサル抗体ライブラリの効力および候補抗体分子を選別しその分子の結合特性を向上させる能力を検証するために、本発明の方法に従い、市販の抗体を試験抗体とし例えば、WTMTM/LTMTM技術を用いて、発現させ、ディスプレイし、改良した。候補試験参照抗体の結合特性をLTM技術を用いて改善する例は、その全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願60/586487に開示されている。試験抗体をscFv型において変異させ、次いで酵母ディスプレイを用いて発現およびディスプレイしたが、上記の任意の細菌ディスプレイ系も使用することができる。scFv酵母ディスプレイライブラリのカイネティクス選択kineticselectionsでは、最初に細胞をビオチン化抗原で標識し、次いで大過剰の非ビオチン化抗原の存在下で時間依存的に追跡した。解離カイネティクスが遅かったクローンを、追跡期間後にSA-PE標識によって同定し、高速FACSソーターを用いてソーティングした。野生型コントロールおよびソーティングゲート、ソーティングゲート内のライブラリおよびクローン数、ならびにソーティング後のライブラリから単離されたクローンのドットプロットを生成させた図38。試験抗体LTM分析から作表した配列データは、その親分子の親和性を1.5倍またはそれ以上増加させた29の別個の変異からなる多様な収集を示した。これらの変異は、試験抗体の六つ全てのCDRにおいて生じることが見出された。これらの変化のうちのいくつか、例えばCDR3における変化を複数単離したところ、三つの別個のSからKへの変化および二つのSからQへの変化が見出された。対照的に、いくつかのCDRの位置における変化は、抗原に対する親和性を向上させることが見出されなかった。次の工程は、全ての発見されたLTM単一変異を単一ライブラリに組み合わせを含んだものであった。この工程の後に、scFvクローンは、CDRあたり一つ以上のLTM変異を導入することができた。一つのCDRに複数の変異を導入するのに加えて、これらのscFvクローンが、各scFvに一つ以上の変異型CDRを有するようにも設計した。この異なる単一のLTM変異を単一の直鎖配列に統合することを、コンビナトリアル有用変異combinatorialbeneficialmutationCBM分析と命名した。このプロセスは、その全体が参考として本明細書で援用される関連する米国特許出願60/585918において詳述されている。全ての発見されたLTM単一変異の一つのライブラリへの組み合わせは、これらの高親和性変異体の中から改善されたアビディティを示すクローンを単離するのを容易にした。このCBMライブラリの発現スクリーニングは、これらの高親和性変異体の中から相乗作用的相互作用を通じて改善されたアビディティを示すクローンを単離するのをさらに容易にした。図36は、CBM分析から回収された候補クローンの例を示す。さらに、図37は、参照野生型scFvおよび6つの高親和性KoffクローンのBIAcorescFv結果を示す。これらのデータを、解離速度定数koffを決定するために一つの指数関数曲線に当てはめた。これらのプロットから、参照野生型scFvが、六つ全てのクローンと比較して、Koffが早いにもかかわらず、顕著に急な傾斜勾配を示すことが明らかとなった。上記の親和性成熟技術は、本発明の選択されたコホートライブラリに容易に適用することができる。実施例24バイオインフォマティクスを用いて抗体のCDRについての位置的可変性プロフィールVPを生成させる方法本実施例では、インビボで発現された抗体のCDRについての位置的可変性プロフィールVPの決定について説明する。位置的可変性プロフィールは、自然界で発現された抗体の配列のアラインメントのデータセットの特定位置に存在する、異なるアミノ酸の一覧およびそれらの各々の出現頻度集団優先性populationprevalenceを表すその全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願60/585931PCT/US2005/024002を参照のこと。UALCDR可変性プロフィールを生成させる主目的は、フレームワーク配列とCDRのカノニカル構造およびそれらの可変配列をベストマッチさせて最も安定かつ機能的な構成を獲得することであった。従って、VPの決定は、二つの工程、例えば工程1:関心のある一つまたはそれ以上の規定の特性を共有するアミノ酸配列のアラインメントのデータセットを収集および選択してデータセットを作製する、を必要とする。典型的な目的においては、別々にアラインメントを行ったVHまたはVLのいずれか由来のCDR1、CDR2、およびCDR3配列が、初期データセットを形成した。工程2においては、対応するVP結果を含むCDRデータセットを獲得する上でいくつかのアプローチが利用可能であった。典型的には、工程2を実行するため、CDRデータセットを、各々のアラインメントを行った位置ごとにアミノ酸の可変性およびそれらの相対的な頻度について列挙した図4。各CDRデータセットについてのVPは、多様性のさらなる導入のための所定のCDRの位置の所望の特性を明らかにした。工程1を実行するため、アラインメントを行った配列のUALデータベースを構築した。出発点のインプットデータベースは、すでに特徴付けおよびグループ分けがなされている配列についての従前の編集物、例えば内因的に発現された成熟抗体のKabatデータベースから得ることができた。Kabatデータベースから、ヒト免疫グロブリン、特にVH配列を、出発点のベースデータセットとして選択的に収集した。典型的には、各々の再構成されたヒトVH配列の生殖細胞起源を、比較配列分析により決定した。この様式で、例えば発現された抗体をVH1、VH2、VH3、VH4、またはVH6等のいずれかのファミリーに帰属させた工程1:構成鎖の選択。対応する特定の生殖細胞の原拠を原始サブファミリーoriginatingSub-Familyと命名した図4の工程1。次いで、この出発点のベースデータセット内で接触点の定義ContactDefinitionにより示されるパラメータを用いてVH配列における追加のCDRを同定および描画することができた。CDRの設計およびそれらに含まれるアミノ酸はまた、Kabat、Chothia、または任意の他の適当な定義によっても表すことができた図4の工程2。出発点のヒトVH配列ベースデータセット内にコンパイルされたVH配列は、依然として大きく異なる特性を有する可能性があった。VHフレームワーク配列は、特に、以下の点で変化する傾向がある:1-ファミリーのグループ化VH1、VH2、VH3、VH4等、2-原始サブファミリー例えばVH33-07、3-11、3-23、3-30、3-CDRの長さ、4-CDRのカノニカル構造のクラス、5-抗原特異性。ベースデータセットメンバーの間で配列が不均一であったため、整合性のある分析をなすプロセスには、一つまたはそれ以上の関心のある選択された特性を共有するデータセットを同定できるよう、出発点のベースデータセットからさらに選択することが必要であった。これらの各々の特性を共有する構成メンバーは、そのサブグループ内での意味のある比較分析に関して標準化された配列セットを形成した。このプロセスを、より関係の強いより小さなデータセットが生成されるまで繰り返し、それを図40に示す。図41は、VHおよびVLのCDR3データベースを得るために使用した類似のプロセスを示す。CDRを以下の通りに分類した。全てのヒトVH配列の非重複性のベースデータセットから出発し、VH1配列を生成する配列のみをさらに選択した図40。非重複性フィルタリングにより、同じ抗原に対して蓄積された重複する抗体配列を除去した。異なる抗体が同じ抗原に対して生じた場合は、これらの配列をデータベースに保持した。VH1サブグループ内で、CDR1およびCDR2配列を同定し、CDR1サブグループまたはCDR2サブグループとしてさらに分類した。VHファミリー内でのCDRの分類において、CDR1またはCDR2サブグループは異なる長さのCDRを含むものであることに留意されたい。VH1CDR2は、13アミノ酸および15アミノ酸の両方の長さで生じた。CDR1およびCDR2については、それぞれ、6アミノ酸および13アミノ酸の長さを選択し、それに応じて、生成したデータセットを、それぞれ、VH-1_CDR1_6およびVH-1_CDR2_13と命名した。よりストリンジェントなUALデータセットが必要な場合であっても、カノニカル構造に基づきグループ分けを行うことができた。例えば、VH1CDR2配列内で、カノニカル構造2CS2またはカノニカル構造CS3のいずれかの構造の間にフィルターをかける別のサブグループ分類を行った。カノニカル構造は、フレームワーク内の重要な位置における特徴的な残基を区別することによって規定できる。例えば、アミノ酸71位にV、A、L、またはTを導入したVH1CDR2配列はカノニカル構造2を示し、同じアミノ酸位置のRはカノニカル構造3を意味する。これらの作業により、それぞれ、VH-1_CDR2_13_CS2およびVH-1_CDR2_13_CS3と命名した可変性プロフィールデータセットが生成された図61。同様に、VH1CDR1は、6アミノ酸残基の長さ要件を有するカノニカル構造1CS1を有するものであった。この場合、CDR1CS1を識別する重要なアミノ酸の特徴には、例えば24位のT、A、V、G、またはS;アミノ酸26位のG;ならびに29位のI、F、L、V、またはSのいずれかが含まれた。従って、いくつかの6アミノ酸CDR変異体は必須の特徴的な配列を有さなかったため、VH-1_CDR1_6データセットはCS1に属さない配列を含んでいる可能性があった。スクリーニングの後、VH1CDR1のカノニカルクラス1CS1についての可変性プロフィールを、VH-1_CDR1_6_CS1として生成した図60。上記の結果は、アクセプターとして使用するために選択されたCDR1およびCDR2の両方のカノニカル構造に依存して、アミノ酸使用が微調整fine-tunedされ得ることを実証した。このような微調整は、発見される可能性が最も高い配列と特定の抗原クラスをマッチングすることによって使用された参照ライブラリの天然の多様性を複製する目的でどのアミノ酸が様々なCDRアミノ酸の位置に導入しようとするかに依存すると考えられる。CDR抗原の分類は以下の様式で行った。収集されたCDR配列メンバーは、構造的分類に基づきグループ分けできれば、抗原の特異性に基づきサブクラス化することもできた図40。所定の抗原クラスについてCDR内の優先アミノ酸に相関関係が存在し、これは特定のフレームワークにおける抗原クラスの優先性について観察されたのと類似した。従って、抗原特異的な可変性プロフィールを生成するために、追加のパラメータである抗原特異性を、CDR配列の分類の間に追加することができる。このプロセスの大きな利点は、多くの異なる選択または収集経路が使用可能であり、各々が異なるデータセット、従って異なる可変性プロフィールVPを生成したことである。これは、CDR1についての可変性プロフィールを別個のVH1、VH3、およびVH4図45のデータセットの間で比較することにより例証された。各棒グラフ下の表は、上記の80パーセントパラメータに基づき利用可能なヒト化置換アミノ酸を列挙する。VH1、VH3、およびVH4サブファミリーにおいてYは30位で固定されるため、全体としてはVPはある程度類似するものであった。しかし、違いも観察された。VH3においては、Sは30位で固定できるが、VH1およびVH4におけるVPは、TおよびSが30位で置換され得ることを示した。他のVPの違いの例は34位で見られた。VH4においてWは固定されたが、VH3においてはMが固定された。対照的に、VH1においては、IおよびMがコホートCDR設計に利用可能であった。これらのCDR1VPはVHサブファミリー間で異なるものであったため、コホートライブラリの設計は、どのVHフレームワークを選択したかに依存して変化させることができる。例えば、33位のCDR1アミノ酸標的抗体がVH1、VH3、またはVH4の列挙されたアミノ酸のいずれとも一致しない場合、それらの各々のVPが代用される。従って、標的抗体CDR1のVH1への導入においては、アミノ酸A、Y、G、およびDが33位への導入において選択された。CDR1のVH3フレームワークへの導入においては、VPはA、G、W、およびYが使用されるべきことを示した。同様に、CDR1のVH4フレームワークへの導入においては、VPはY、F、およびSが33位で置換されるべきことを示した。図44は、コホート抗体ライブラリの生成に利用できる様々なVPを示す。本発明のこの実施態様においては、得られるVPにおいてより幅広い利用可能なアミノ酸のコレクションを収集するため、各々のVPをカノニカル構造に基づき事前にフィルターをかけなかった。例えば、VH-1CDR2の53位のカノニカル構造2において、アミノ酸I、Y、M、S、L、およびEを、VH-1_CDR2_13_CS2VPとして同定した図61。同じ53位のカノニカル構造3においては、VH-1_CDR2_13_CS3のVPは、その代わりにN、G、S、およびKを有していた。従って、カノニカル構造で分けないVH-1_CDR2_13のVPは、I、Y、M、S、E、N、G、およびKを利用可能であった図46の上パネル。Lアミノ酸は、最初の7アミノ酸の出現頻度が80の閾値を満たしたため、VPコレクションの一部にはならなかった。従って、この特別なセットは、選択された同一基準よりもその位置53のコホートライブラリの多様性従って、得られるCDRを9倍増加させるよう機能した。対照的に、類似基準を使用した場合、コホートライブラリの多様性は、置換可能な、既定の例えば脂肪族、極性等グループにも属するアミノ酸を発見する可能性が高くなったために減少した。従って、図46のデータベースは、長さ13のCDR2におけるVH1、VH3、およびVH4の間のVP配列の違いを示す。さらに幅広いVPプロフィールを収集するのに使用した本発明の別の実施態様は、全般的なVHCDR2を得るためのものであった。この基本概念は、様々なVH1、VH3、VH4、およびその他のサブファミリーに基づく事前分類を回避し、その代わりに長さ13の全てのVHCDR2配列を列挙のために単純に集めることであった。次いで、VHCDR2_13のVPを用いたCDRのブラスティングは、ほぼ全ての可能性のある組み合わせが一つの大きなコホートライブラリにおいて生成できるために、様々なVH1、VH3、およびVH4コホートライブラリのCDR2交配設計を実施する必要性を排除した。全般的なVPの構築というこの概念は、VHCDR3において何が起こったのか、どこで最終的に発現されたCDR3配列が原始サブファミリーに明確に割り当てることができなかったのかであった。図47~52は、長さ10~20のVHCDRのVP3を実証する。同じ分析を、VLκおよびλに関しても行った。図53においては、Vκ1とVκ3の間の長さ7のCDR1のVPにおける違いを示す。図54は、Vκ1とVκ3の間の長さ10のCDR2のVPを示す。図55においては、長さ9のCDR3のVPをVκおよびVλについて得た。図56および57はまた、UALデータベースから得た、より幅広い、長さ8、10、および11のCDR3のVλVPを実証する。等価物当業者は、ありふれた実験のみを用いることで、本明細書中に記載される本発明の具体的な実施態様の多くの等価物を認識または確認することができるであろう。このような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。"