対象における結腸直腸癌をスクリーニングする方法であって、前記対象から得られた生物学的試料中のNPY、PENKおよびそれらの断片または変異体から選択される遺伝子のうちの少なくとも1つのメチル化度を測定するステップを含む方法。前記断片が、配列番号1および配列番号2の配列から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。前記対象から得られた生物学的試料中のWif1遺伝子またはその断片もしくは変異体のメチル化度を測定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。前記断片が、配列番号3の配列であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。ハウスキーピング遺伝子、好ましくはアルブミン遺伝子、またはそれらの断片もしくは変異体のメチル化度を測定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。前記断片が、配列番号4の配列であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。NPYおよびPENK遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、ならびに/あるいはNPYおよびWif1遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、ならびに/あるいはPENKおよびWif1遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体のメチル化度の同時測定を含むことを特徴とする、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。配列番号1および配列番号2の配列、ならびに/または配列番号1および配列番号3の配列、ならびに/または配列番号2および配列番号3の配列のメチル化度の同時測定を含むことを特徴とする、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。一方でWif1遺伝子およびハウスキーピング遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、他方でNPYおよびPENK遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体のメチル化度の同時測定を含むことを特徴とする、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。前記メチル化度を、1.5から3の間である閾値と比較するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項9に記載の方法。前記閾値が2であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。前記生物学的試料が、前記対象由来の全血、血漿、尿および糞便から選択されることを特徴とする、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。前記生物学的試料が、前記対象由来の全血、血漿および尿から選択されることを特徴とする、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。前記対象の結腸を検査するステップ、続いて、組織学的検査をするステップをさらに含むことを特徴とする、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。したがって、本発明は、マルチプレックスmultiplex方式のメチル化特異的PCRMSP、すなわちMSPMの概念に基づいた分子試験に関する。MSPMは、モノプレックスmonoplex方式に対して、必要なPCRの数を減少させる大きな利点を有する。それ故、マルチプレックス方式は、いくつかのモノプレックスより迅速であるので時間の節約をもたらし、経済的に有利である。血液中に循環するDNAの量は比較的少ないので、遺伝子試験を適用するために選択される生物学的試料が血液である場合、MSPM技術の使用はまた明らかな利点をもたらす。マルチプレックスPCRとは、1つまたは複数の特異的プライマーを使用して、単一ステップにおいて対象とするいくつかの標的の同時増幅を可能にするPCRの形態通常、定量的PCRを意味する。この技術は、いくつかのマーカーの欠失、変異、多型または過剰メチル化の存在を決定するのに非常に有利である。対照的に、モノプレックスPCRという語句は、対象とする単一標的の増幅を可能にするPCRの形態通常、定量的PCRを指す。メチル化特異的PCRとは、遺伝子のメチル化度を測定するための先行技術の従来的技術を意味する。この技術は定量的PCRの原理に基づく。典型的に、この技術は、調査されるDNA試料を亜硫酸水素ナトリウムで処理することに基づく。この処理により、処理されたDNAにおいて非メチル化シトシンの各々をウラシルに転換することが可能となる。次いでこのように処理された試料は、処理される遺伝子に特異的なプライマーを用いるPCRを受ける。特異的プライマーの性質の決定は増幅されるヌクレオチド配列に依存する。本発明の状況において、メチル化特異的PCRは好ましくはマルチプレックス方式で利用され、その場合、マルチプレックス方式のメチル化特異的PCR、またはMSPMと呼ばれる。それ故、本発明は、対象における結腸直腸癌をスクリーニングする方法であって、前記対象から得られた生物学的試料中のNPY、PENK遺伝子およびそれらの断片または変異体から選択される遺伝子のうちの少なくとも1つのメチル化度を測定するステップを含む方法に関する。結腸直腸癌をスクリーニングするとは、結腸直腸癌を発症する素因の検出、および対象に既に存在している結腸直腸癌の検出を意味する。メチル化とは、CpGジヌクレオチド中のシトシンの5位炭素へのメチル基の付加を意味する。これらのジヌクレオチドは、CpG島を除いてDNAの構造中には高頻度では存在しない。それらの島は典型的に、遺伝子のプロモーター領域のレベルで表される。それ故、本発明者らが遺伝子のメチル化について言及する場合、前記遺伝子のプロモーター領域のメチル化を指している。正確な部位におけるメチル基の存在は、遺伝子と転写因子との間の相互作用を防ぐ。典型的に、メチル基は、転写因子が増幅部位およびプロモーターに結合することを防ぎ、RNAポリメラーゼが開始部位に結合することを防ぐ。それ故、プロモーター領域のメチル化により、DNA転写の抑制が生じる。遺伝子のメチル化という語句は、遺伝子のヌクレオチド配列のCpG島のメチル化を包含するが、前記語句が適用される遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列のメチル化も包含する。NPY遺伝子とは、神経ペプチドYすなわちNPYをコードする遺伝子を意味する。PENK遺伝子とは、神経ペプチドプロエンケファリンAすなわちPENKをコードする遺伝子を意味する。これらの2つの神経ペプチドは、食物摂取、栄養素の吸収および身体のエネルギー消費の平衡に関与する。それらは、消化機能を調節する神経ペプチドであり、食物摂取および神経性消化挙動neurodigestivebehaviorも調節できる。遺伝子の断片とは、少なくとも50塩基対の長さを有する、好ましくは60から110塩基対の間の長さを有する前記遺伝子の配列を意味する。遺伝子の変異体とは、前記遺伝子または前記遺伝子の断片に対して少なくとも80、好ましくは少なくとも90、より好ましくは少なくとも98の同一性パーセントを有する核酸配列を意味する。2つの核酸配列の間の、または本発明の意味における同一性パーセントとは、最適アラインメントの後に得られた、比較される2つの配列の間のヌクレオチドのパーセントを示し、このパーセントは純粋に統計的であり、2つの配列の間の相違は無作為に、かつそれらの長さ全体にわたって分布する。最良アラインメントまたは最適アラインメントは、下記のように決定された同一性パーセントが最高であるアラインメントを示す。2つの核酸配列の間の配列比較は、それらを最適にアラインメントした後にそれらの配列を比較することによって伝統的に実施され、前記比較は、配列類似性を有する局所領域を識別し比較するために、1つのセグメントごとにまたは1つの比較ウインドウごとに実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手動の他に、SmithおよびWatermanの局所ホモロジーアルゴリズムを使用して、NeddlemanおよびWunschの局所ホモロジーアルゴリズムを使用して、PearsonおよびLipmanの類似性検索法を使用して、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータソフトウェアによって行われてもよい。最適アラインメントを得るために、好ましくはBLASTプログラムが、BLOSUM62マトリクスと共に使用される。2つの核酸配列の間の同一性パーセントは、最適に並べられたこれらの2つの配列を比較することによって決定され、比較される核酸配列は、これらの2つの配列の間の最適アラインメントのための参照配列に対して付加または欠失を含んでもよい。同一性パーセントは、2つの配列の間でヌクレオチドが同一である同一の位置の数を決定すること、同一の位置のこの数を比較された位置の総数で割ること、および得られた結果に100を掛けて、これらの2つの配列の間の同一性パーセントを得ることによって算出される。少なくとも80、好ましくは少なくとも90、より好ましくは少なくとも98の同一性パーセントを有する変異体は、参照核酸配列に対して、特定の修飾、例えば特に欠失、切断、伸長、キメラ融合、および/または置換、とりわけ点置換を有し、参照核酸配列との最適アラインメント後に少なくとも80、好ましくは少なくとも90、より好ましくは少なくとも98の同一性を有する核酸配列を示す。特定の実施形態において、本発明による結腸直腸癌をスクリーニングする方法は、配列番号1および配列番号2から選択されるポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つのメチル化度を測定するステップを含む。配列番号1の配列はNPY遺伝子の配列の断片に対応する。配列番号2の配列に関して、それはPENK遺伝子の配列の断片に対応する。対象とは、健康である、または癌を有し得る個体、またはスクリーニング、診断もしくは監視を必要とする個体を意味する。生物学的試料とは、生物学的物質を含有する試料を意味する。より好ましくは、それは、核酸などの遺伝物質を含有する任意の試料を意味する。この試料は、生物ヒト患者、動物、植物で実施される生物学的試料採取に由来してもよい。好ましくは、本発明による生物学的試料は、ヒト対象から得られる全ての体液、例えば全血、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、糞便、または汗から選択される。核酸物質とは、デオキシリボ核酸DNAまたはリボ核酸RNAの任意の配列を意味する。好ましくは、生物学的試料は、メチル化度を測定するステップの前に核酸物質を抽出するステップに供される。核酸物質のこの抽出は、当業者に周知である古典的技術に従って実施される。例えば、この抽出は、生物学的試料から得られた細胞の細胞溶解により実施されてもよい。この溶解は、化学的、物理的、または熱的性質のものであってもよい。この細胞溶解に続いて、通常、他の細胞残屑から核酸を分離し、濃縮するための精製ステップがある。前記抽出および前記精製は、QIAGENおよびZymoResearchタイプの市販のキットを使用して実施されてもよい。当然ながら、関連技術は、試験される生物学的試料の性質に応じて異なる。当業者は、その見識により、これらの溶解および精製ステップを、試験される前記生物学的試料に容易に適合できる。好ましくは、本発明による方法は、前記対象から得られた生物学的試料中のWif1遺伝子、その断片または変異体のうちの1つのメチル化度を測定するステップをさらに含む。特定の実施形態において、本発明による結腸直腸癌をスクリーニングする方法は、配列番号3のポリヌクレオチド配列のメチル化度を測定するステップを含む。配列番号3の配列はWif1遺伝子の配列の断片に対応する。より好ましくは、Wif1遺伝子またはその断片もしくは変異体のメチル化度の測定は、前記対象から得られた生物学的試料中のNPY、PENKおよびそれらの断片もしくは変異体から選択される遺伝子のうちの少なくとも1つのメチル化度の測定と同時に実施される。Wif1遺伝子はWnt経路の阻害因子である。これは結腸直腸癌発生の開始因子であり、APC遺伝子を不活性化し、このAPC遺伝子のタンパク質は腸上皮細胞の増殖、アポトーシスおよび遊走の制御に関連して役割を果たす。この不活性化により、WNT/β-カテニンなどの特定のシグナル伝達経路の活性化、および初期腺腫の形成が引き起こされる。Wif1が、Wntシグナル伝達経路の阻害に関与する遺伝子の1つであることは知られている。それ故、Wif1遺伝子の過剰メチル化は、このWnt経路の阻害を取り除くことを伴う。好ましくは、本発明による方法は、ハウスキーピング遺伝子のメチル化度を測定するステップをさらに含む。好ましくは、ハウスキーピング遺伝子のメチル化度を測定するこのステップは、NPY、PENKおよびそれらの断片または変異体から選択される遺伝子のうちの少なくとも1つのメチル化度の測定と同時に、ならびに/あるいはWif1遺伝子またはその断片もしくは変異体のメチル化度の測定と同時に実施される。特定の実施形態において、本発明による結腸直腸癌をスクリーニングする方法は、配列番号4の配列のメチル化度を測定するステップを含む。配列番号4の配列はアルブミン遺伝子の配列の断片に対応する。ハウスキーピング遺伝子、または構成的遺伝子とは、主に基本的な細胞機能に必須であるタンパク質をコードする構成的遺伝子を意味する。好ましくは、本発明によるハウスキーピング遺伝子の発現は、種々の組織の中で遍在し、安定である。ハウスキーピング遺伝子は好ましくは、アルブミン、βアクチン、αアクチン、βミクログロブリン、好ましくはアルブミンをコードする遺伝子から選択される。これらのハウスキーピング遺伝子が、本発明の状況において主な対象となる。実際に、NPY、PENKおよびWif1遺伝子またはそれらの断片もしくは変異体のメチル化度は、発現が安定であるハウスキーピング遺伝子のメチル化に関して表される。典型的に、本発明の状況において、対象とする遺伝子のメチル化度の測定は、先行技術の古典的技術に従って実施される。好ましくは、前記測定は、メチル化特異的PCR技術に従って実施される。典型的に、Wif1遺伝子の増幅のために、19塩基および3つのCpG部位を有するセンスプライマー配列番号9、ならびに24塩基および2つのCpG部位を有するアンチセンスプライマー配列番号10を使用する。TaqMan-MGBプローブ配列番号11は16塩基および2つのCpG部位を有する。典型的に、NPY遺伝子の増幅のために、20塩基および3つのCpG部位を有するセンスプライマー配列番号12、ならびに23塩基および4つのCpG部位を有するアンチセンスプライマー配列番号13を使用する。TaqMan-MGBプローブ配列番号14は18塩基および3つのCpG部位を有する。典型的に、PENK遺伝子の増幅のために、21塩基および3つのCpG部位を有するセンスプライマー配列番号15、ならびに21塩基および2つのCpG部位を有するアンチセンスプライマー配列番号16を使用する。TaqMan-MGBプローブ配列番号17は18塩基および3つのCpG部位を有する。典型的に、アルブミン遺伝子の増幅のために、22塩基を有し、CpG部位を有さないセンスプライマー配列番号18、ならびに22塩基を有し、CpG部位を有さないアンチセンスプライマー配列番号19を使用する。TaqMan-MGBプローブ配列番号20は17塩基を有し、CpG部位を有さない。メチル化度またはメチル化のレベルとは、標準に対する、標的遺伝子のメチル化CpG部位の数のパーセントを意味する。標的遺伝子とは、本発明者らがメチル化度を測定することを望む遺伝子を意味する。本発明の状況において、これらの標的遺伝子はWif1、NPY、PENK、アルブミンおよびそれらの断片または変異体である。標準とは、前記標的遺伝子の野生型配列またはそうでなければハウスキーピング遺伝子の配列を意味する。メチル化度は当業者に周知である定量化技術により算出される。この定量化は絶対的であっても、または相対的であってもよい。好ましくは、それはいわゆるΔΔCt技術により算出される。この方法は、参照遺伝子で正規化することによって、標的遺伝子のメチル化度を表すための演算式を利用する。まず、標的遺伝子のCtの値と、参照遺伝子のCtの値との間の差ΔCtを、分析する試料および標準DNAについて決定する。標準DNAは典型的に、ユニバーサルなメチル化DNAである。これにより、遺伝子のメチル化度の正規化が可能となる。この種のDNAは例えば、商品参照番号D5011としてZymoResearch社により市販されている。市販のキットであるEZDNAMethylation参照番号D5002、ZymoResearchなどの適切なキットを使用する修飾の後、この標準DNAを参照として使用する。アルブミン、Wif1、NPYおよびPENK遺伝子について得られたCt値は、デフォルトにより100のメチル化コピーに対応する。ΔCt試料=Ct標的試料-Ct参照試料ΔCt標準=Ct標的標準-Ct参照標準次いで標準と試料との間のΔΔCtを算出する:ΔΔCt=ΔCt標準-ΔCt試料ΔΔCt値の算出法は、2つの遺伝子のPCR増幅効率が100に等しいと仮定する。それ故、言い換えれば、この算出法は、生成物の濃度がPCRの対数期の各サイクルで2倍になることを仮定する。したがって、このことから、標的遺伝子の正規化されたメチル化度は以下の式により決定されると推論される2-ΔΔCt=2Ct遺伝子-Ctアルブミン標準-Ct遺伝子-Ctアルブミン試料この方法により、使用された陽性対照標準DNAに応じて相対的なメチル化度が得られる。さらに、それは、使用された参照遺伝子のコピー数の変化を考慮に入れる。それらの変化は、必然的にPCRを実施するために使用されるDNAの量の変化に起因する。それ故、結果は参照遺伝子の性質により歪曲されない。好ましくは、参照遺伝子はハウスキーピング遺伝子である。さらにより好ましくは、それはアルブミン遺伝子である。好ましくは、本発明の方法は、NPYおよびPENK遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、ならびに/あるいはNPYおよびWif1遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、ならびに/あるいはPENKおよびWif1遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体のメチル化度の同時測定を含む。より好ましくは、本発明の方法は、配列番号1および配列番号2の配列、ならびに/または配列番号1および配列番号3の配列、ならびに/または配列番号2および配列番号3の配列のメチル化度の同時測定を含む。より好ましくは、本発明の方法は、一方でWif1遺伝子およびハウスキーピング遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体のメチル化度、他方でNPYおよびPENK遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体のメチル化度の同時測定を含む。好ましくは、ハウスキーピング遺伝子はアルブミンである。本発明者らは、一方でWif1およびアルブミン遺伝子またはそれらの断片もしくは変異体でのマルチプレックスMSPの適用、他方でNPYおよびPENK遺伝子またはそれらの断片もしくは変異体でのマルチプレックスMSPの適用が、結腸直腸癌についてのスクリーニング試験の感度を増加させることを有効に実証した。それ故、NPY、PENK、Wif1およびそれらの断片または変異体から選択される遺伝子のうちの2つでのメチル化度の同時測定により、先行技術の古典的技術に従って陰性と検出されたが結腸直腸癌を有する対象を回収できる。好ましくは、本発明の方法は、メチル化度を閾値と比較するステップをさらに含む。NPYおよびPENKまたはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、NPYおよびWif1またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、ならびにPENKおよびWif1またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体からなる群から選択される2つの遺伝子の組合せのメチル化度の合計が、この閾値を超える場合、試験されたその試料が得られた対象は結腸直腸癌について陽性であるとみなされる。好ましくは、本発明の方法は、一方でWif1遺伝子およびハウスキーピング遺伝子またはそれらの断片もしくは変異体のメチル化度、他方でNPYおよびPENK遺伝子またはそれらの断片もしくは変異体のメチル化度を、特異度および感度に関する要件に応じて特定される閾値と比較するステップをさらに含む。許容可能な試験を得るために、この閾値は約2である。それ故、一方でWif1遺伝子およびハウスキーピング遺伝子のメチル化度を閾値と比較し、他方でNPYおよびPENK遺伝子のメチル化度を前記閾値と比較する必要がある。感度とは、結腸直腸癌を有する対象における陽性試験の割合を意味する。特異度とは、結腸直腸癌を有さない対象における陰性試験の割合を意味する。カットオフまたは閾値とは、標的遺伝子のメチル化度の限界値を意味し、その閾値を超える試料、したがってその試料が得られた対象は、本発明の方法による結腸直腸癌の診断について陽性であるとみなされる。本発明者らは246人の対象の群で広範な研究を行い、そのうちの23人が結腸直腸癌と診断され、44人が別の種類の癌を有し、179人が健康であった。対象の血清由来の標的遺伝子の組合せにマルチプレックス遺伝子試験を適用することによって、本発明者らは、閾値その閾値を超える対象を、結腸直腸癌について陽性であると正確にスクリーニングするを所与の感度および特異度で決定できた。したがってスクリーニング試験の感度および特異度は選択される閾値に依存する。それ故、この閾値は、適切な感度および特異度に関して調節されなければならない。感度および特異度の関連値は、通常、診断される集団に応じていくつかの基準に依存する。好ましくは、この閾値は、1から5の間であり、好ましくは1から3.5の間であり、好ましくは1.5から3の間であり、好ましくは2から3の間であり、さらにより好ましくはこの閾値は2である。本発明者らは、2の閾値により、スクリーニング試験が65.2の感度および95の特異度を有し得ることを示した。本発明者らがこの閾値を低くした場合、感度は増加するが、特異度は減少する。段階的なアプローチを採用することにより、本発明者らは、結腸直腸癌の遺伝子マーカーに対する感度、ならびに偽陽性および偽陰性を除外するのに十分な特異度がある試験を開発するための最も信頼性ある閾値を同定することに成功した。それ故、標的集団および結腸直腸癌に対する前記集団の素因に応じて、本発明の試験は異なる閾値で適用でき、それ故、改良された感度および特異度で適用できる。実際に、標的集団が、対象が結腸直腸癌を発症する可能性の高い高リスクの集団である場合、試験の感度および特異度を調節するために閾値を変更することが可能である。好ましくは、本発明の方法は、前記対象の全血、血漿、尿および糞便から選択される生物学的試料を使用する。より好ましくは、前記生物学的試料は、前記対象の全血、血漿および尿から選択される。したがって、本発明の方法は、対象の糞便で試験を実施する必要がなくなるので、非常に有利である。それ故、本発明の方法は非侵襲性であり、結腸直腸癌のためのスクリーニング試験を必要とする対象にとっての妨げとはならない。好ましくは、本発明の方法は、前記対象の結腸を検査するステップをさらに含む。好ましくは、この検査ステップは視覚的な結腸内視鏡検査に対応する。代替として、この検査ステップは、結腸スキャナとも呼ばれている仮想的な結腸内視鏡検査に対応する。結腸スキャナ技術は、スキャナによる結腸の検査および3次元での消化管の内部画像の再構築に基づく。この結腸内視鏡検査により、本発明の方法による結腸直腸癌の診断について陽性とみなされた対象における結腸直腸癌の存在を検証可能となる。好ましくは、癌組織の検出が次いで、組織学的検査により確認される。候補遺伝子の選択1.生物学的物質およびゲノムDNAの抽出スクリーニング状況とは別にヒトで行われた研究において、本発明者らは、結腸内視鏡検査の前に糞便、血液、および尿を採取し、これらの流出物からDNAを抽出した。組織から抽出されたDNAも、結腸内視鏡検査の間の内視鏡バイオプシーによって、または外科的検体からのいずれかで正常粘膜および病的粘膜腺腫性ポリープ、癌から得た。これらの対象は、専門的な診察の後に結腸内視鏡検査を受けていたしたがって、それは明確な病因を有さない機能障害または貧血を有する集団である。この研究の目的は、潜血試験と比較して糞便分子試験を検証することであった。合計で、648人の患者を含み、本発明者らは577個の異なる試料を分析した。いくつかの分子マーカー点変異、メチル化を調査した。本発明者らはマーカーメチル化アプローチを優先し、それ故、マルチプレックス試験を考案するために使用されるいくつかの遺伝子NPY、PENKを選択する戦略を採用した。結腸内視鏡検査の前に、生物学的試料血液、尿、糞便および組織試料正常粘膜、腺腫ポリープ、浸潤癌を、QiAmpミディキットQiagenを使用してDNA抽出に供した。これは、正常な対象N=10、および癌を有する対象N=10から得られた糞便由来のDNAであった。2.メチル化チップIllumina社USAにより市販されている、ゴールデンゲートメチル化チップを、807個の遺伝子そのうちの28.6は1つの遺伝子につき1つのCpG部位を含有し、57.3は1つの遺伝子につき2つのCpG部位を含有し、14.1は少なくとも3つの部位を含有するに対応する、1505個のCpG部位のメチル化を分析するために使用できる。DNA試料を、EZDNAMethylationキット参照番号D5002、ZymoResearchを使用して、亜硫酸水素ナトリウム溶液で処理し、次いでDNA鎖のメチル化ベータおよび非メチル化アルファ形態を別々に標的とする2つの蛍光プローブでタグを付け、遺伝子増幅PCRに供した。調査中の遺伝子のメチル化度を、0非メチル化~1全てメチル化の範囲のベータ/アルファベータの比の値に基づいて確立した。報告された各値に関して、対応するp値が存在したが、これはメチル化度の不十分な推定の可能性を示す。記述的バイオインフォマティクス分析を、閾値p<0.01に基づいて実施した。3.関連遺伝子を選択するためのアプローチ本発明者らによって採用されたアプローチにより、組織正常および腫瘍に関して異なる生物学的流出物血液、糞便、尿中の関連標的を識別することが可能となった。一方で組織または同じ生物学的流出物についての最良の集団間の差異的なマーカー正常対癌の識別に基づいた戦略、他方で異なる生物学的流出物の間のシグナルの一致に基づいた戦略を用いて集団間比較を実施した。メチル化を受けている可能性があるとみなされた1015個の遺伝子の中から、過剰メチル化遺伝子専門用語でp<0.0001の値を用いて癌-正常≧20のリストを組織について確立し、それは146個の過剰メチル化標的を含有していた。同じように、同じ基準に従った過剰メチル化遺伝子のリストは、排泄物中で134個の標的および血液中で122個の標的を含有していた。次いで、個々の値に基づいてリストを互いに合わせることにより、組織と血液との間に34個の共通の標的および糞便と血液との間に46個の標的が見出された。最終的に、本発明者らは、関連遺伝子としてNPY、PENKおよびWif1遺伝子、特に、それらの遺伝子の断片、それぞれ配列番号1、2および3を同定した。このように、本発明者らは、3個の候補遺伝子Wif1、NPY、およびPENKを同定した。本発明者らは、マルチプレックスメチル化特異的PCRMSPを実施することに基づいた遺伝子試験を開発するためのこれらの遺伝子の利点を実証した。4.MSP技術によるリアルタイムでの遺伝子増幅DNAの修飾を考慮に入れて、TaqMan-MGBプライマーおよびプローブAppliedBiosystemsを生成した。以下の表は、ハウスキーピング遺伝子:アルブミンに対応するプライマーおよびプローブの配列ならびに3個の遺伝子NPY、PENKおよびWif1の断片のものそれぞれ配列番号1、2および3をまとめている。以下の表は、ハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子の増幅産物のヌクレオチド配列を示す。以下の表は、使用されたセンスプライマー、アンチセンスプライマーおよびTaqManプローブの配列を示す。qPCRと適合性のある光学グレードフィルムABgeneで密封された96ウェルプレート中で増幅を実施する。5.8μlの修飾DNA10ngの標準DNAおよび患者由来のDNAを、最終濃度400nmolの各プライマーセンスおよびアンチセンスおよび最終濃度250nmolのTaqMan-MGBプローブおよび1倍のPCR溶液AppliedBiosystemsで加える。反応体積は20μlである。増幅条件は以下の通りである:ホットスタート:15分間、94°C、48サイクルまで:15秒間、94°C、変性ステップ、60秒間、60°C、ハイブリダイゼーションアニーリングおよび伸長ステップ。標準DNAは、ユニバーサルにメチル化されているDNA参照番号D5011、ZymoResearchである。EZDNAMethylationキット参照番号D5002、ZymoResearchを使用する修飾に続いて、それを参照としてMSPにおいて使用する。アルブミン、Wif1、NPYおよびPENK遺伝子の断片で得られたCt値は、デフォルトにより100のメチル化コピーに対応する。aΔΔCt法に従ったメチル化パーセントΔΔCt=2-Ct遺伝子-Ctアルブミン試料Ct遺伝子-Ctアルブミン標準の方法に従ってメチル化度を定量する。この方法は、使用された陽性対照標準DNAに応じてメチル化度の相対値を与える。それは、MSPを実施するために使用されたDNAの量の変化にのみ起因し得るアルブミン遺伝子のコピー数の変化を考慮に入れる。b組織DNAでのMSPM分子試験の評価段階16個の腫瘍DNAおよび16個のいわゆる正常自己組織DNAを含む32個のヒト組織DNAを使用して評価段階を実施した。cメチル化特異的PCRによる血清DNAでの遺伝子試験の性能の決定本発明者らは、組織DNAに基づいてマルチプレックスMSPを開発した。マルチプレックス試験の非常に良好な性能が特異度および感度に関して組織試料で得られたことにより、血清試料についての検証に取りかかった。i.生物学的物質本発明者らは、マルチプレックス試験プロトコールを受けた入院患者から得られた246個の血清の試料でのマルチプレックス遺伝子試験の適合性を評価した。ii.血清DNAの抽出:抽出キットの選択本発明者らは、Qiagen社により市販されているDNA抽出キットである、QiAmpミディキット、およびZymoResearch社により市販されているZRSerumKit参照番号D3013の適合性を評価した。採用されたのはZRSerumKitの方である。組合せ[Wif1アルブミンおよびNPYPENK]において実施される2つのデュプレックスに対応する4回のMSPの適用に必要な十分な量の核酸分子を得るため、4ml体積の血清8~10mlの全血が推奨される。d検証最初に試料採取された246個の血清でマルチプレックス試験の検証段階を行った。これらの246個の血清のうち、23個は結腸または直腸の癌を有する個体由来であり、44個は別の種類の癌を有する個体由来であり、179個は癌を有さない個体由来であった。特異度および感度に関して考慮すると、組合せ2つのMSPのデュプレックスにおいて3つの候補遺伝子を標的とするマルチプレックスMSPの性能を以下の表に示す。デュプレックス1はWif1およびアルブミンのマルチプレックスMSPに対応し、一方、デュプレックス2はNPYおよびPENKのマルチプレックスMSPに対応する。特異度および感度は最初に選択された閾値に依存するようである。このように、3の閾値またはカットオフは56.5の感度および98.3の特異度を与えるのに対して、2の閾値は65.2の感度および95の特異度を与える。このように、閾値は診断される個体の集団に応じて調節されるべきである。e性能の比較:マルチプレックス試験対モノプレックス試験本発明によるマルチプレックス試験の検証段階は、この試験の性能を、感度65.215個の結腸直腸癌CRCが合計23個の中から検出されたに関して、および特異度に関して95と決定した。以下の表は、モノプレックス方式で得られた結果と比較して、マルチプレックス方式およびマルチプレックスの組合せ方式において結腸直腸癌および陽性を有する15の個体の結果を示す。デュプレックス1はWif1およびアルブミンの断片のマルチプレックスMSPに対応し、一方、デュプレックス2はNPYおよびPENKの断片のマルチプレックスMSPに対応する。このように、本発明者らは、マルチプレックスデュプレックスMSPを実施することにより試験の感度値を増加させることモノプレックスMSPにおいて陰性と分類された結腸直腸癌を有する対象の回収を実証した。本発明者らはまた、マルチプレックスMSPの組合せ特に、デュプレックス1とデュプレックス2との組合せが、より良好な結果を与えることを実証した。結腸直腸癌を有する15の個体は試験において全て陽性である。