"環状骨格と、前記環状骨格と炭素-炭素二重結合部位を共有する2つのトリアゾール環とを含む環状化合物。環状ジイン化合物における前記環状骨格の2つの炭素-炭素三重結合部位のそれぞれに、アジド基を有するアジド化合物をダブルクリック反応により付加させて連結することにより形成される前記トリアゾール環を含む請求項1に記載の環状化合物。8員環の前記環状骨格を含む請求項1または請求項2のいずれかに記載の環状化合物。前記環状骨格と炭素-炭素二重結合部位を共有するベンゼン環および/またはヘテロ芳香環をさらに有する請求項1から請求項3のいずれかに記載の環状化合物。前記環状化合物が、下記式1または2で表される請求項1から請求項4のいずれかに記載の環状化合物。式1中、Rはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、nはそれぞれ独立して0から4の整数式2中、Rはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、nはそれぞれ独立して0から4の整数環状ジイン化合物における2つの炭素-炭素三重結合部位のそれぞれに、アジド基を有するアジド化合物をダブルクリック反応により付加させて連結し、2つのトリアゾール環を含む環状化合物を製造する環状化合物の製造方法。プローブとしてのアジド化合物のアジド基と、生体分子に導入したアジド基とを、ダブルクリック反応により、環状ジイン化合物における2つの炭素-炭素三重結合部位のそれぞれに付加させて連結することにより環状化合物を形成する生体分子の修飾方法。前記環状ジイン化合物が、2つの炭素-炭素三重結合部位を含む8員環の環状骨格を有する請求項7に記載の修飾方法。前記環状ジイン化合物が、前記環状骨格と炭素-炭素二重結合部位を共有するベンゼン環および/またはヘテロ芳香環をさらに有する請求項8に記載の修飾方法。前記環状ジイン化合物が、下記式3で表される請求項7から請求項9のいずれかに記載の修飾方法。式3中、Rはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、nはそれぞれ独立して0から4の整数触媒を用いることなしに、前記アジド化合物および前記生体分子の付加反応が進行する請求項7から請求項10のいずれかに記載の修飾方法。前記アジド化合物および前記生体分子が共存した状態で、前記ダブルクリック反応を行う請求項7から請求項11のいずれかに記載の修飾方法。前記環状ジイン化合物に前記生体分子を付加させ、未反応の前記環状ジイン化合物を除いて前記生体分子が付加された前記環状ジイン化合物のみに対して前記アジド化合物を付加させる請求項7から請求項12のいずれかに記載の修飾方法。上述のアジド基とホスフィン誘導体とによる生体分子の修飾反応においては、少なくとも、ホスフィン誘導体をプローブ化させる反応と、アジド基に対するホスフィン誘導体の連結反応を含む複数の工程が必要となる。このため、生体分子を効率的に修飾することは難しい。特に、アジド基とホスフィン誘導体との反応速度は一般に遅いため、修飾反応の迅速化はより困難である。さらにホスフィン誘導体が酸化され易いため、必ずしも高い効率で修飾を行うことができない。また、アルキンに対して単一のアジド化合物を付加させるシングルクリック反応においても、実験目的に応じてその都度、予めアルキン分子をプローブ化させる反応が必要であり、少ない工程数で生体分子を修飾することは困難である。さらに、触媒を用いないシングルクリック反応の場合には基質合成が煩雑であること、また、触媒を用いる場合においては細胞に対して触媒が毒性を示すことなどにより、シングルクリック反応は、生体分子の修飾に幅広く適用できないという欠点を有する。上記の状況下、基質が入手容易で、かつ少ない工程数で効率的に生体分子を修飾する反応であって、幅広く適用可能な反応により得られる環状化合物、およびそのような反応を用いた環状化合物の製造方法、生体分子の修飾方法が求められている。本発明者らは、合成が容易な高歪性ジインを用いたダブルクリック反応を活用することにより、少ない工程数で効率的に生体分子を修飾することができ、かつこの方法が幅広く適用可能であることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。本発明は、以下のように、環状化合物、ダブルクリック反応による環状化合物の製造方法、および生体分子の修飾方法を提供する。<1>環状骨格と、環状骨格と炭素-炭素二重結合部位を共有する2つのトリアゾール環とを含む環状化合物。<2>環状ジイン化合物における環状骨格の2つの炭素-炭素三重結合部位のそれぞれに、アジド基を有するアジド化合物をダブルクリック反応により付加させて連結することにより形成されるトリアゾール環を含む上述の<1>に記載の環状化合物。<3>8員環の環状骨格を含む上述の<1>または<2>のいずれかに記載の環状化合物。<4>環状骨格と炭素-炭素二重結合部位を共有するベンゼン環および/またはヘテロ芳香環をさらに有する、上述の<1>から<3>のいずれかに記載の環状化合物。<5>下記式1または2で表される、上述の<1>から<4>のいずれかに記載の環状化合物。式1中、Rはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、nはそれぞれ独立して0から4の整数、好ましくは0又は1の整数式2中、Rはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、nはそれぞれ独立して0から4の整数、好ましくは0又は1の整数<6>環状ジイン化合物における2つの炭素-炭素三重結合部位のそれぞれに、アジド基を有するアジド化合物をダブルクリック反応により付加させて連結し、2つのトリアゾール環を含む環状化合物を製造する環状化合物の製造方法。<7>プローブとしてのアジド化合物のアジド基と、生体分子に導入したアジド基とを、ダブルクリック反応により、環状ジイン化合物における2つの炭素-炭素三重結合部位のそれぞれに付加させて連結することにより環状化合物を形成する生体分子の修飾方法。<8>環状ジイン化合物が、2つの炭素-炭素三重結合部位を含む8員環の環状骨格を有する、上述の<7>に記載の修飾方法。<9>環状ジイン化合物が、環状骨格と炭素-炭素二重結合部位を共有するベンゼン環および/またはヘテロ芳香環をさらに有する、上述の<8>に記載の修飾方法。<10>環状ジイン化合物が、下記式3で表される、上述の<7>から<9>のいずれかに記載の修飾方法。式3中、Rはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、nはそれぞれ独立して0から4の整数、好ましくは0又は1の整数<11>触媒を用いることなしにアジド化合物および生体分子の付加反応が進行する、上述の<7>から<10>のいずれかに記載の修飾方法。<12>アジド化合物および生体分子が共存した状態で、ダブルクリック反応を行う、上述の<7>から<11>のいずれかに記載の修飾方法。<13>環状ジイン化合物に生体分子を付加させ、未反応の環状ジイン化合物を除いて生体分子が付加された環状ジイン化合物のみに対してアジド化合物を付加させる、上述の<7>から<12>のいずれかに記載の修飾方法。本発明においては、合成容易な高歪性ジインを用いたダブルクリック反応により、少ない工程数で効率的な生体分子の修飾が可能となる。さらに、ダブルクリック反応は様々な化合物に対して適用可能であるため、このような効率的な修飾方法を幅広く利用することができる。1.環状化合物およびダブルクリック反応による環状化合物の製造方法本発明の環状化合物は、環状骨格と、環状骨格と炭素-炭素二重結合部位を共有する2つの1,2,3-トリアゾール環とを含む。このような環状化合物は、ダブルクリック反応により、環状ジイン化合物における2つの炭素-炭素三重結合部位のそれぞれに、アジド基を有するアジド化合物を付加させ、縮合環である2つの1,2,3-トリアゾール環を形成されることにより製造される。1A.ダブルクリック反応環状ジイン化合物における2つの炭素-炭素三重結合部位に対してアジド化合物をそれぞれ付加させるように、1つのジイン化合物に対して、2つのアジド化合物を付加させる反応をダブルクリック反応とよぶ。下記の一般式Iにより示されるダブルクリック反応では、2つの炭素-炭素三重結合部位に異なるアジド化合物をそれぞれ付加させ、3つの分子を自発的に連結させることが可能である。式I中、R、R’、R’’はそれぞれ独立して水素または炭化水素基ダブルクリック反応の基質には、8員環状のジイン化合物を用いる。これは8員環状のジイン化合物が高度に歪んでおり、ダブルクリック反応を促進するためである。このように、環状ジイン化合物の歪みが促進するダブルクリック反応を、SPDC反応StrainPromotedDoubleClickReaction:歪み誘起性ダブルクリック反応とよぶ。SPDC反応を含むダブルクリック反応においては、ジイン化合物に対し、過剰量のアジド化合物を用いる。例えば、ジイン化合物1当量に対して、アジド化合物を2~10当量、好ましくは2~5当量、より好ましくは2~3当量程度用いる。なおダブルクリック反応においては、様々な種類の溶媒が使用可能である。すなわち、アジド化合物および環状ジイン化合物が適度に溶解し得る限り、メタノール、エタノール等の主として低級のアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、N、N-ジメチルホルムアミド、ピリジン、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトン、酢酸エチル、ヘキサンなどの有機溶媒、水、又は適度なpHの緩衝水溶液、あるいはそれらの混合溶媒が使用できる。ダブルクリック反応は、環状ジイン化合物の歪みにより促進されるため、比較的穏やかな条件下で進行する。すなわちダブルクリック反応は、例えばシングルクリック反応を速やかに進めるために使用される銅触媒等の触媒が存在しない、室温付近で行うことが可能である。ただし必要に応じて、例えば150°C程度まで加熱することもでき、また、適切な溶媒を用いれば、例えば、-100°C程度の低温条件下でも反応を行うこともできる。また、ダブルクリック反応の反応時間は、基質およびその濃度、あるいは反応溶媒などによっても異なるが、概ね1分間~一日程度、通常は10分間~2時間程である。1B.環状ジイン化合物上述の一般式IにおけるA環状ジイン化合物は歪みを有することが好ましく、さらに適度な安定性が必要とされる。従って、7員環以下の不安定な環状ジイン化合物よりも、8員環以上の環状ジイン化合物が好ましく、特に、8員環の環状骨格を有する環状ジイン化合物が望ましい。また、環状ジイン化合物として、酸素、窒素、硫黄等を含む複素環化合物を用いることも可能である。なお環状トリイン化合物、環状テトライン化合物、あるいはそれ以上の数の炭素-炭素三重結合を有する環状化合物も、安定に存在し得る場合においては、ダブルクリック反応、トリプルクリック反応、クアドラプルクリック反応などの対象となり得る。例えば、9員環以上の環状骨格においては、トリイン、テトライン化合物も安定に存在する可能性がある。環状ジイン化合物においては、炭素-炭素三重結合を2つ含む、好ましくは8員環である上述の環状骨格と、炭素―炭素二重結合部位を共有するベンゼン環等を有することが好ましい。このようなベンゼン環により、環状ジイン化合物が平面性を有し、1,3-双極子化合物であるアジドとの反応性が良好になり得るからである。環状ジイン化合物は、より好ましくは2つのベンゼン環を有する。なお環状ジイン化合物として、ベンゼン環の他にも、炭化水素基等の置換基を有するベンゼン環、または置換基を有するピリジン環、ピリミジン環、ピラジン環、フラン環、チオフェン環、ピロール環、イミダゾール環、トリアゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、などのヘテロ芳香環、さらにそれらが複数縮環したナフタレン環、アントラセン環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、インドール環、ベンゾイミダゾール環等を含む多環系の環状ジイン化合物をダブルクリック反応SPDC反応に用いることも可能である。また、上述の芳香環を組み合わせて、例えば1つずつ有する環状ジイン化合物を用いることもできる。また、環状ジイン化合物に含まれる置換基上述の一般式IにおけるRとしては、C110アルキル基メチル、エチル、プロピル等、C210アルケニル基エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル等、C210アルキニル基エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル等、C310シクロアルキル基シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル等、C310シクロアルケニル基2-シクロペンテン-1-イル、3-シクロペンテン-1-イル、2-シクロヘキセン-1-イル等、C410シクロアルカジエニル基2,4-シクロペンタジエン-1-イル、2,4-シクロヘキサジエン-1-イル、2,5-シクロヘキサジエン-1-イル等、C614アリール基フェニル、ナフチル、アントリル等、C713アラルキル基ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等、C813アリールアルケニル基スチリル等、C310シクロアルキル-C16アルキル基シクロヘキシルメチル等等の炭化水素基、水酸基、C110アルコキシル基、C110アルコキシカルボニル基、チオール基、C110アルキルチオ基、アミノ基、ジ又はモノC110アルキルアミノ基、カルボキシル基、アミド基、チオアミド基、チオール基、エーテル基、エステル基、スルホン酸基、スルホン酸アミド基、ハロゲン、あるいは置換基を有する、または有していないピリジン環、ピリミジン環、ピラジン環、フラン環、チオフェン環、ピロール環、イミダゾール環、トリアゾール環、オキサゾール環、チアゾール環等のヘテロ芳香環、あるいは上述のヘテロ芳香環、C614アリール基等が複数縮環した多環系、さらに、上述のいずれかの置換基にハロゲン、窒素、酸素、硫黄等のうち少なくともいずれかが含まれる置換基、あるいは上述の置換基に、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、チオアミド基、チオール基、エーテル基、エステル基、スルホン酸基、スルホン酸アミド基等のうち少なくともいずれかがさらに含まれる置換基等が挙げられる。これらのうち、好ましい置換基Rは、C110アルキル基メチル、エチル、プロピル等、C210アルケニル基エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル等、C210アルキニル基エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル等、C310シクロアルキル基シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル等、C310シクロアルケニル基2-シクロペンテン-1-イル、3-シクロペンテン-1-イル、2-シクロヘキセン-1-イル等、C410シクロアルカジエニル基2,4-シクロペンタジエン-1-イル、2,4-シクロヘキサジエン-1-イル、2,5-シクロヘキサジエン-1-イル等、C614アリール基フェニル、ナフチル、アントリル等、C713アラルキル基ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等、C813アリールアルケニル基スチリル等、C310シクロアルキル-C16アルキル基シクロヘキシルメチル等等の炭化水素基等である。より好ましい置換基Rは、C110アルキル基メチル、エチル、プロピル等、C210アルケニル基エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル等、C210アルキニル基エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル等、C310シクロアルキル基シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル等、C310シクロアルケニル基2-シクロペンテン-1-イル、3-シクロペンテン-1-イル、2-シクロヘキセン-1-イル等、C410シクロアルカジエニル基2,4-シクロペンタジエン-1-イル、2,4-シクロヘキサジエン-1-イル、2,5-シクロヘキサジエン-1-イル等である。これらの置換基は、アジド分子の付加反応を妨げる立体障害とならないよう、炭素数が概ね上述の範囲内にあることが好ましい。また、上述の置換基は、環状ジイン化合物に、例えば単一あるいは複数の酸素原子、アミド結合、エステス結合を含むC110アルキルリンカー等を介して結合されており、あるいは直接結合されている。以上のことから、歪み誘起性ダブルクリック反応SPDC反応の基質として好ましい環状ジイン化合物は、sym-ジベンゾ-1,5-シクロオクタジエン-3,7-ジイン5、6、11、12-テトラヒドロジベンゾ[a,e]シクロオクテン,5、6、11、12-テトラヒドロ-1,4,7,10-テトラメチルジベンゾ[a,e]シクロオクテン,5、6、11、12-テトラヒドロ-2,3,8,9-テトラメトキシジベンゾ[a,e]シクロオクテン,1,7-ジブチル-5、6、11、12-テトラヒドロジベンゾ[a,e]シクロオクテン、および6、7、14、15-テトラヒドロシクロオクタ[1,2-b:5、6-b’]ジナフタレン等であり、より好ましい環状ジイン化合物は、例えば、sym-ジベンゾ-1,5-シクロオクタジエン-3,7-ジイン5、6、11、12-テトラヒドロジベンゾ[a,e]シクロオクテンである。1C.アジド化合物上述の一般式IにおけるBダブルクリック反応のアジド化合物としては、有機アジド化合物であればほとんど全てのものが使用可能である。有機アジド化合物は、一般的にジインとの反応性を有するからである。例えば、後述する実施例におけるアジド化合物である、芳香族アジド、脂肪族アジド、アジド糖、アジドタンパク質に加え、アジドアミノ酸、アジドペプチド、アジド核酸、アジド脂質等を用いることもできる。例えば、アジド化合物は、置換基上述の一般式IにおけるR’、R’’として、C110アルキル基メチル、エチル、プロピル等、C210アルケニル基エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル等、C210アルキニル基エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル等、C310シクロアルキル基シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル等、C310シクロアルケニル基2-シクロペンテン-1-イル、3-シクロペンテン-1-イル、2-シクロヘキセン-1-イル等、C410シクロアルカジエニル基2,4-シクロペンタジエン-1-イル、2,4-シクロヘキサジエン-1-イル、2,5-シクロヘキサジエン-1-イル等、C614アリール基フェニル、ナフチル、アントリル等、C713アラルキル基ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等、C813アリールアルケニル基スチリル等、C310シクロアルキル-C16アルキル基シクロヘキシルメチル等、等の炭化水素基、置換基を有するピリジン環、ピリミジン環、ピラジン環、フラン環、チオフェン環、ピロール環、イミダゾール環、トリアゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、などのヘテロ芳香環とC614アリール基を含むそれらが複数縮環した多環系、さらにこれらの置換基にハロゲン、窒素、酸素、硫黄等が含まれる水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、チオアミド基、チオール基、エーテル基、エステル基、スルホン酸基、スルホン酸アミド基等を有する。さらにこれらの他、保護または無保護の糖誘導体、核酸誘導体、脂質誘導体、アミノ酸またはペプチド誘導体等である。これらの置換基は、環状ジイン化合物への付加反応を妨げる立体障害とならないよう、炭素数が概ね上述の範囲内にあることが好ましい。アジド化合物は、より好ましくは、置換基R’、R’’として、C16アルキル基、C26アルケニル基、C26アルキニル基、C610シクロアルキル基、C610シクロアルケニル基、C610シクロアルカジエニル基、C612アリール基、C710アラルキル基、C810アリールアルケニル基、C610シクロアルキル-C36アルキル基等の炭化水素基、等を有する。これらの好ましいアジド化合物の例としては、メチルアジド、エチルアジド、プロピルアジド、アジド酢酸エステル、アジドアダマンタン、フェニルアジドおよびその誘導体、ベンジルアジドおよびその誘導体、シクロヘキシルアジド等が挙げられる。好ましいアジド化合物のより具体的な例としては、メチルアジド、アジド酢酸エチル、1アジドアダマンタン、フェニルアジド、2メチルフェニルアジド、2イソプロピルフェニルアジド、26ジメチルフェニルアジド、26ジエチルフェニルアジド、26ジイソプロピルフェニルアジド、2‐tブチル‐6‐メチルフェニルアジド、26ジブロモフェニルアジド、4メトキシフェニルアジド、4トリフルオロメチルフェニルアジド、35‐ビストリフルオロメチルフェニルアジド、4安息香酸メチル、ベンジルアジド、4ベンジルアルコール等が挙げられる。1D.環状化合物およびトリアゾール環ダブルクリック反応の結果、環状化合物上述の式1、2および一般式IにおけるC、Dが製造される。この環状化合物においては、アジド化合物上述の一般式IにおけるBの付加による2つのトリアゾール環が形成されている。このように、アジド化合物のアジド基由来のトリアゾール環は、いずれも上述の環状骨格と縮合しており、炭素-炭素二重結合部位を共有する。環状化合物は、ダブルクリック反応に使用された環状ジイン化合物とアジド化合物に対応した構造を有する。すなわち、環状化合物のトリアゾール環においては、下記式11~23に示されたようにアジド化合物の置換基R1、R2が導入される。また、反応に用いられた環状ジイン化合物において、環状骨格に縮合された2つのベンゼン環が置換基を有していない場合、環状化合物のベンゼン環も置換基を含まず下記式11および21参照、2つのベンゼン環が置換基R3、R4を有していた場合、環状化合物も対応する置換基R3、R4を有する下記式12および22参照。なお、下記式12および22におけるnは、それぞれ独立して0から4の整数である。さらに、環状ジイン化合物の環状骨格にベンゼン環以外の環A、Bが縮合されていた場合、生じた環状化合物においても、対応する環A、Bが含まれる下記式13および23参照。以上のことから明らかであるように、置換基R1~R4をいずれも有していない環状化合物、置換基R1~R4の一部または全てを有する環状化合物のいずれもが、ダブルクリック反応に使用可能である。なお、上述の式11、21、12、22、13、および23における置換基R1およびR2は上述の一般式IにおけるR’、R’’と同じであり、置換基R3およびR4は一般式IにおけるRと同じである。好ましい環状化合物の具体例としては、上述の好ましい環状ジイン化合物およびアジド化合物のダブルクリック反応により生成されたもの、すなわち、18ジヒドロ18ジメチルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ジヒドロ110ジメチルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ビスエトキシカルボニルメチル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ビスエトキシカルボニルメチル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ジアダマンチル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ジアダマンチル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ジヒドロ18ジフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ジヒドロ110ジフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ジヒドロ18ビス2メチルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ジヒドロ110ビス2メチルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ジヒドロ18ビス2イソプロピルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ジヒドロ110ビス2イソプロピルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ビス26ジメチルフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ビス26ジメチルフェニル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ビス26ジエチルフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ビス26ジエチルフェニル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ビス26ジイソプロピルフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ビス26ジイソプロピルフェニル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ビス2tブチル6メチルフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ビス2tブチル6メチルフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ビス26‐ジブロモフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ビス26‐ジブロモフェニル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ジヒドロ18ビス4メトキシフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ジヒドロ110ビス4メトキシフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ジヒドロ18ビス4トリフルオロメチルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ジヒドロ110ビス4トリフルオロメチルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ビス[35‐ビストリフルオロメチルフェニル]18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ビス[35‐ビストリフルオロメチルフェニル]110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ジヒドロ18ビス4メトキシカルボニルベンジルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ジヒドロ110ビス4メトキシカルボニルベンジルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ジベンジル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ジベンジル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、18ジヒドロ18ビス4ヒドロキシメチルベンジルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス、110ジヒドロ110ビス4ヒドロキシメチルベンジルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス等が挙げられる。なおダブルクリック反応により生成された環状化合物においては、置換基R1およびR2の大きさ等にも左右されるものの、通常、熱力学的により安定なトランス体一般式IにおけるCおよび式11~13が、シス体一般式IにおけるDおよび式21~23よりも多く含まれる。2.ダブルクリック反応による生体分子の修飾方法本発明の生体分子の修飾方法においては、ダブルクリック反応SPDC反応が用いられる。すなわち、環状ジイン化合物における2つの炭素-炭素三重結合部位のそれぞれに、プローブとしてのアジド化合物のアジド基と、予め生体分子中に導入したアジド基とを、ダブルクリック反応SPDC反応により付加、連結させて環状化合物を形成する。こうして生成される、生体分子を含む環状化合物においては、プローブとしてのアジド化合物由来の置換基が導入される。例えば、蛍光プローブ、陽電子放射断層画像撮影法プローブ等の分子イメージングプローブとしての機能を有するアジド化合物等を、環状ジイン化合物を介して、予め調製したアジド基含有タンパク質、アジド基含有複合糖質等に連結させるダブルクリック反応を行うことにより、タンパク質、あるいは生細胞の膜表面の複合糖質などの生体分子を、機能を維持したまま修飾し、標識化することができる。より具体的には、後述の実施例21、22を参照されたい。また、ダブルクリック反応においては、環状ジイン化合物に生体分子を付加させた後にプローブとしてのアジド化合物を逐次的に付加させることもできる。このような逐次的なダブルクリック反応の場合、生体分子の付加反応において未反応のまま残った環状ジイン化合物を除去し、生体分子が付加された環状ジイン化合物のみに対してアジド化合物を付加させることが好ましい。一方、生体分子とアジド化合物とが共存した状態で、これらを環状ジイン化合物に付加させることもできる。この場合、環状ジイン化合物を介して生体分子とアジド化合物とを一工程にて連結させることができ、生体分子の効率的な化学修飾が可能である。2A.生体分子本発明を用いて修飾できる生体分子としては、以下のように、予めアジド基が導入されたタンパク質酵素、抗体、受容体、ホルモン、結合因子、リガンド、細胞構造蛋白質等を含む、糖、核酸、脂質、およびこれらの複合分子等が挙げられる。さらに、試験管内にて調製されるものに限らず、生きた状態の細胞の内側、外側、および表面に存在する生体分子も含まれる。例えば、生体分子として、アクチンチューブリンビメンチンラミン等の細胞骨格タンパク質およびこれらに結合するアクチニンコフィリンプロフィリンArp23ジキシンMRTF等の機能タンパク質、ミオシンダイニンキネシンATP合成酵素等のモータータンパク質、カドヘリンインテグリン等の接着タンパク質、コラーゲンフィブロネクチンテネイシンバイグリカンシンデカンフィブリノーゲントロンビンフィブリンラミニンエンタクチンエラスチンファシクリンペリオスチンbetaigh3バーシカン、デコリン等の細胞外マトリックスタンパク質および細胞外マトリックスに結合するタンパク質トランスグルタミナーゼリシルオキシダーゼコラーゲンC末端切断酵素マトリックスメタロプロテアーゼコラーゲン受容体等ペプチドコラゲリン等糖ヒアルロン酸等、FAKp130CASタリンビンキュリンRap等の細胞間接着複合体構成タンパク質、熱ショックタンパク質カルレティキュリンカルネキシン等の小胞体シャペロンタンパク質、GM130等のゴルジ体構成タンパク質、チトクロム複合体等のミトコンドリア構成タンパク質、プロテアソーム構成タンパク質、増殖因子受容体タンパク質、Toll様受容体、STATMAPKRasRhoRac等のシグナル伝達タンパク質群、上皮成長因子EGF線維芽細胞増殖因子FGF血小板由来増殖因子PDGF神経栄養因子インスリンインリン用増殖因子血管内皮細胞増殖因子VEGF幹細胞因子TGFb等の細胞増殖細胞移動を惹起する分泌性タンパク質、TNFa等の炎症性サイトカイン、セロトニンアドレナリン等の神経伝達物質、副甲状腺ホルモンインヒビンカルシトニン性腺刺激ホルモンメラトニンインスリンプロラクチン甲状腺刺激ホルモン抗利尿ホルモンエピネフリンノルエピネフリンアンドロゲンエストロゲンコルチコイド等のホルモン、NFkappaBcfoscjunSRF熱ショック因子HSF低酸素誘導因子HIFステロール調節エレメント結合タンパク質SREBPHoxファミリーSoxファミリーcmyccmyb等の転写活性化因子、RNAポリメラーゼ等の転写因子複合体構成タンパク質、SAP130等のスプライソソーム複合体構成タンパク質、S6等のリボソーム複合体構成タンパク質、核膜孔複合体構成タンパク質、テロメラーゼヒストン等のDNA結合タンパク質、、死細胞に特異的に結合するアネキシンV等の標識タンパク質、抗体タンパク質、イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン等の発光タンパク質、緑色蛍光タンパク質GFP、青色蛍光タンパク質BFP、黄色蛍光タンパク質YFP、赤色蛍光タンパク質RFP等の蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼ、ウミホタルシフェラーゼ、Renillaシフェラーゼ、Gaussiaシフェラーゼ、Oplophorusシフェラーゼ、BFP等のシフェラーゼ、アジド基を有するリガンドを予め特異的に共有結合させたHaloTagタンパク質、SNAPタグタンパク質、CLIPタグタンパク質等のリガンド共有結合性タンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、デヒドロ葉酸還元酵素、テトラシステインモチーフCCXXCC:Xは任意のアミノ酸ペプチド配列含有タンパク質、テトラセリンモチーフSSXXSS:Xは任意のアミノ酸ペプチド配列含有タンパク質等の低分子リガンド非共有結合性タンパク質等が挙げられる。さらなる生体分子として、プロテインキナーゼCプロテインキナーゼAカルモジュリンDYRKp70S6KClk受容体型リン酸化酵素上皮成長因子受容体血小板由来増殖因子受容体神経栄養因子受容体線維芽細胞増殖因子受容体インスリン受容体インスリン様増殖因子受容体血管内皮細胞増殖因子受容体幹細胞因子受容体等mTOR複合体GSK3MAPキナーゼMosRafキナーゼcdc2等のリン酸化酵素、カルシニューリン脂質脱リン酸化酵素PTENヒスチジン脱リン酸化酵素セリン/トレオニン特異的脱リン酸化酵素チロシン特異的脱リン酸化酵素酸性脱リン酸化酵素アルカリ性脱リン酸化酵素等の脱リン酸化酵素、および上記全ての変異体、予めアジド基を導入したならびに上記の複数のタンパク質それぞれを適当なリンカーを介して融合したタンパク質、アジドチロシン、アジドフェニルアラニン、アジドアラニン、アジドホモアラニン等のアジド基含有非天然アミノ酸を用いて作成されたペプチドおよびタンパク質、予めアジド基を導入したシアル酸、グルコース、グルコサミン、マンノース、マンノサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、リボース、デオキシリボース等の誘導体を含む細胞膜表面等の複合糖質、予めアジド基を導入したオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、モルフォリノヌクレオチド等のヌクレオチド類、アジドアデノシン、アジドグアノシン、アジドチミジン、アジドシトシン、アジドウラシル、などの核酸から合成されるヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチド類、予めアジド基を導入したジアシルグリセロールセラミドスフィンゴリン脂質グリセロリン脂質スフィンゴ糖脂質グリセロ糖脂質スルホ脂質脂肪酸テルペノイドステロイドカロテノイド等の脂質類、および生体由来の培養された細胞等、さらに光クロスリンク法やFITC等の高反応性機能性低分子リガンドで無差別あるいは部位特異的に化学修飾した予めアジド基を導入した上記のあらゆる天然生体分子等、様々なものが挙げられる。また、例えば、大腸菌、昆虫細胞、酵母等を用いて人工的に作製されるタンパク質や、試験管内でアミノ酸から人工合成されたタンパク質などの人工生体分子を含む。これらの生体分子は、いずれも、プローブによって標識することが可能である。次に、実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。環状ジイン化合物の合成方法後述の実施例で、環状ジイン化合物として用いられるジイン3symジベンゾ-1,5-シクロオクタジエン-3,7-ジインsymdibenzo15cyclooctadiene37diyneは、例えば非特許文献aHNCWongPJGarrattFSondheimerJAmChemSoc19749656045605;bAOritaDHasegawaTNakanoJOteraChemEurJ2002820002004cSChaffinsMBrettreichFWudlSynthesis200211911194に記載の方法により容易に合成することができる。各化合物の合成の際に、フラッシュカラムクロマトグラフィーには、シリカゲル関東化学社製37563-85、シリカゲル60N球状、中性、粒径40-50μm又は関東化学社製37565-85、シリカゲル60N球状、中性、粒径63-210μmを用いて行った。薄層クロマトグラフィーTLCは、あらかじめシリカゲルが塗布されたガラスプレートMerck社製105715、シリカゲル60F254を用いて行った。化合物の物性値の測定後述の実施例で生成された化合物の構造解析、物性値の測定は、以下のように行った。融点Mpは、ヤナコYANACO機器開発研究所社製、MP-J3微量融点測定装置を用いて測定した未補正値。1Hおよび13CNMR核磁気共鳴スペクトルは、バリアンVarian社製、Mercury300核磁気共鳴装置を用い、それぞれ300MHzおよび755MHzにて測定するか、または、ブルカーBruker社製、AVANCE500核磁気共鳴装置を用い、それぞれ500MHzおよび126MHzにて測定した。NMRスペクトル測定用溶媒には、CDCl3、DMSOd6、又はCD3ODいずれもCIL社製を使用した。化学シフトδは、テトラメチルシラン4SiCDCl3中での1HNMR測定;δ0ppm、又は測定溶媒由来のピークDMSOd6中での1HNMR測定;δ249ppm、CD3OD中での1HNMR測定;δ330ppm、CDCl3中での13CNMR測定;δ770ppmを内部標準として相対的な値として表し、結合定数JはHzで示した。後述の略号s、d、t、q、m、及びbrはそれぞれ単重線、二重線、三重線、四重線、多重線、及び幅広線を表す。赤外分光IRスペクトルは、DRS-8000A拡散反射測定装置を装着した島津製作所SHIMADZU社製、IRPrestige-21フーリエ変換赤外分光光度計を用いて拡散反射法により測定した。紫外吸収UVスペクトルは、島津製作所SHIMADZU社製、UV-3100紫外可視近赤外分光光度計を用い、石英セル光路長10mm中、25°Cにおいてスキャン速度:高速の条件で測定した。蛍光FLスペクトルは、島津製作所SHIMADZU社製、RF-5300PC分光蛍光光度計を用い、石英セル光路長10mm中、25°Cにおいて励起側バンド幅3nm、蛍光側バンド幅3nm、スキャン速度:中速の条件で測定した。高分解能質量分析スペクトルHRMSは、日本電子JEOL社製、JMS-700を用いた高速原子衝突FAB法又は電子衝撃イオン化EI法、又はブルカーBruker社製、micrOTOF質量分析装置を用いたエレクトロスプレーイオン化ESI法により測定した。FAB法の際のマトリックスには、m-ニトロベンジルアルコールNBAを用いた。結晶のX線は、リガクRigaku社製、イメージングプレート単結晶自動X線構造解析装置RAXISRAPIDIIを用いて測定し、SHELXL97プログラムを用いて構造解析を行った。結晶構造のデータは、CSDに登録されており、ケンブリッジ結晶学データセンターにリクエストすることで入手可能である。実施例1SPDC反応による二重環化付加化合物の調製1上記反応式4で示されるように、ジイン3400mg200μmolのメタノール235mL溶液に、室温にて、ベンジルアジド4a、市販品639mg480μmolのメタノール15mL溶液を加え、そのまま室温にて70分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gジクロロメタンのみからジクロロメタンメタノール61により精製し、二重環化付加生成物の2つの位置異性体であるトランス体6a558mg120μmol599、およびシス体7a352mg754μmol378を得た。それぞれの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC7599006aおよびCCDC7599027a。18ジベンジル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス18Dibenzyl18dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbisnヘキサン/酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp230232°CRf026Rf0691HNMRδ53155069470170972273074075277113CNMRδ521126412701282128712881299130213121326134913511450IR70673176491098410281215125013501454149715143063HRMSmz4671984110ジベンジル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス110Dibenzyl110dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbisnヘキサン/酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp274277°CRf026Rf0441HNMRδ48953169470470471472473673674574575476277213CNMRδ520127212791283128812911298130313071309133613531462IR698729766910984102812111246134414271454149715163061HRMSmz4671982実施例2SPDC反応による二重環化付加化合物の調製2上記反応式5で示されるように、ジイン3400mg200μmolのメタノール235mL溶液に、室温にて、ベンジルアジド4a266mg200μmolのメタノール15mL溶液を加え、そのまま室温にて24時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gジクロロメタンのみからジクロロメタンメタノール61により精製し、二重環化付加生成物の2つの位置異性体であるトランス体6a220mg472μmol236、およびシス体7a190mg407μmol204を得るとともに、出発原料のジイン3227mg113μmol568を回収した。上記実施例1のSPDC反応において、中間体として推定されるモノ環化付加物5a上記反応式4参照は検出されず、単離することもできなかった。また、実施例2のSPDC反応のように、ジイン3とベンジルアジド4aを当量ずつ反応させてもモノ環化付加物5aは得られず、二重環化付加体6aおよび7aとジイン3が回収されるだけであった。出発原料のジイン3を基準にすると、6a、7a、および回収されたジイン3の合計収率が100であった。これらのことは、中間体5aのベンジルアジド4aに対する反応性が、出発物質であるジイン3よりも高いことを示している。このように、SPDC反応の中間体の反応性が出発物質であるジインよりも高いことは、後述する反応の活性化エネルギー等の計算結果によっても支持された。このように、2つのアジド化合物が環状ジイン化合物に付加し、連結されることにより、8員環の環状骨格と炭素―炭素二重結合部位をそれぞれ共有する2つの1,2,3-トリアゾール環が形成される。なおジイン3は、歪みを有するとともに安定で取り扱い易いため、SPDC反応の基質として適している。ジイン3の代わりに、上述の式3で示されたように、ジイン3の2つのベンゼン環のいずれか、あるいは両方に炭化水素基などの置換基を有する環状ジイン化合物を用いることもできる。実施例3SPDC反応による二重環化付加化合物の調製3上記反応式6で示されるように、ジイン3400mg200μmolのメタノール235mL溶液に、室温にて、アジド酢酸エチル4b、市販品550μL480μmolのメタノール15mL溶液を加え、そのまま室温にて60分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gヘキサン酢酸エチル11により精製し、二重環化付加生成物の2つの位置異性体であるトランス体6b419mg915μmol458、およびシス体7b388mg847μmol424を得た。それぞれの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC7599016bおよびCCDC7599037b。18ビスエトキシカルボニルメチル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス18dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbisnヘキサン/酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp204205°CRf0551HNMRδ12341043448750973174875777813CNMRδ138494623125712901291130313151324135314441663IR737766779876910986102211341161121112561348136414181474151617482982HRMSmz4591788110ビスエトキシカルボニルメチル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス110dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbisnヘキサン/酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp214217°CRf0381HNMRδ12642150351373574474775976677613CNMRδ13949362212831290129813019130221308134514561665IR733768799876912986102011321161121112501346136214141474151817482984HRMSmz4591783実施例4SPDC反応による二重環化付加化合物の調製4上記反応式7で示されるように、ジイン3400mg200μmolのメタノール235mL溶液に、室温にて、フェニルアジド4c、非特許文献NDObushakNTPokhodyloNIPidlypnyiVSMatiichukRussJOrgChem20084415221527に記載の方法により合成572mg480μmolのメタノール15mL溶液を加え、そのまま室温にて90分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gヘキサン酢酸エチル41により精製し、二重環化付加生成物の2つの位置異性体であるトランス体6c365mg832μmol417、およびシス体7c461mg105μmol526を得た。それぞれの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC7598986cおよびCCDC7599057c。18ジヒドロ18ジフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス18Dihydro18diphenyldibenzo3478cycloocta12d56dbisnヘキサン/ジクロロメタンで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp300°CRf0231HNMRδ68472172974374878313CNMRδ125012671288129112931300130813131319134213591458IR69273476899712651361149715121595HRMSmz4391667110ジヒドロ110ジフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス110Dihydro110diphenyldibenzo3478cycloocta12d56dbisnヘキサン/ジクロロメタンで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp300°CRf0131HNMRδ68769571272173975175276277778513CNMRδ126112741294129612981303130613141316134113581451IR5276086877347629971069113211751263135814271476149715141595HRMSmz4391670実施例5SPDC反応による二重環化付加化合物の調製5上記反応式8で示されるように、ジイン3400mg200μmolのメタノール250mL溶液を、室温にて、1アジドアダマンタン4g851mg480μmolに加えた。室温にて24時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィーで精製し、トランス体6g275mg496μmol248、およびシス体7g779mg140μmol703を得た。それぞれの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC8109306gおよびCCDC8108377g。18ジアダマンチル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp240242°CRf0791HNMRδ15616520221122122573273874776413CNMR29735742763912761296129813051309132513431465IR7317647778399121011110111251260130613231358145228532909HRMSmz5553237110ジアダマンチル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp>300°CRf0571HNMRδ16817421823473173573674375876313CNMRδ29835844063912841287130213081311132313291472IR7377669081011110113081321145228552914HRMSmz5553257実施例6SPDC反応による二重環化付加化合物の調製6上記反応式9で示されるように、ジイン3100mg500μmolのメタノール500mL溶液を、室温にて、26ジイソプロピルフェニルアジド4h244mg120μmolのメタノール125mL溶液に加えた。室温にて30分間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gジクロロメタンメタノール1001により精製し、トランス体6h、およびシス体7hの混合物289mg476μmol954を得た。トランス体6hとシス体7hの比は、1HNMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC8109316hおよびCCDC8108387h。18ビス26ジイソプロピルフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス18dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp273275°CRf0651HNMRδ0730781410141319626368770671773573874578113CNMRδ223228244262283292123851239212631284129612971307131513251359144114561469IR73375676899513621470286829302965HRMSmz6073525C40H42N6計算値:C7917H698N1385測定値C7909H699N1359110ビス26ジイソプロピルフェニル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス110dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Rf0401HNMRδ04209812913220722169370371273374575577613CNMRδ218225255262290293124261243412771288129213091310013102131113231357145714621479IR7337649911277135414561724286829282964HRMSmz6293348実施例7SPDC反応による二重環化付加化合物の調製7上記反応式10で示されるように、ジイン3400mg200μmolのメタノール220mL溶液を、室温にて、4メトキシフェニルアジド4i716mg480μmolのメタノール300mL溶液に加えた。室温にて20分間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gジクロロメタンのみからジクロロメタンメタノール491により精製し、トランス体6i、およびシス体7iの混合物888mg178μmol892を得た。トランス体6iとシス体7iの比は、1HNMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC8109326iおよびCCDC8108397i。18ジヒドロ18ビス4メトキシフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスdibenzo3478cycloocta12d56dbis6i得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp250251°CRf0471HNMRδ38268368871972474778113CNMRδ555114412641268128812911299130813121321134214571599IR5385927337648339109931028105311031115116911821252130214431464151415891609HRMSmz4991886C30H22N6O2計算値:C7228H445N1686測定値C7209H432N1660110ジヒドロ110ビス4メトキシフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスdibenzo3478cycloocta12d56dbis7i得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp>300°CRf0381HNMRδ38768969569471371973175275777678213CNMRδ556114512651284129212931294130513071316133514641601IR532594733762775831995102010361256130615161611HRMSmz4991876C30H22N6O2計算値:C7228H445N1686測定値C7214H438N1681実施例8SPDC反応による二重環化付加化合物の調製8上記反応式11で示されるように、ジイン3400mg200μmolのメタノール220mL溶液を、室温にて、4トリフルオロメチルフェニルアジド4j898mg480μmolのメタノール300mL溶液に加えた。室温にて24時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィーで精製し、トランス体6jおよびシス体7jの混合物111mg193μmol967を得た。トランス体6jとシス体7jの比は、1HNMRスペクトルに基づいて決定した。18ジヒドロ18ビス4トリフルオロメチルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスdibenzo3478cycloocta12d56dbis6j得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp270272°CRf0191HNMRδ68572874575576678613CNMRδ1234125012621266129413051308131113151316134213861461IR7337648459951043107011301171132313661406152016143065HRMSmz5751399110ジヒドロ110ビス4トリフルオロメチルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスdibenzo3478cycloocta12d56dbis7jMp>300°CRf0131HNMRδ69169672473075675676177877778213CNMRδ1233124912681278129712991302130913141319133213891471IR73376477584399710471063107611191169132913601412152216183071HRMSmz5751412C30H16F6N6計算値:C6272H281N1463測定値C6301H306N1448実施例9SPDC反応による二重環化付加化合物の調製9上記反応式12で示されるように、ジイン3100mg50μmolのメタノール500mL溶液を、室温にて、2メチルフェニルアジド4k160mg120μmolのメタノール125mL溶液に加えた。室温にて24時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gジクロロメタンのみからジクロロメタンメタノール91により精製し、トランス体6k、およびシス体7kの混合物229mg491μmol983を得た。トランス体6kとシス体7kの比は、1HNMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC8109336kおよびCCDC8108407k。18ジヒドロ18ビス2メチルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスdibenzo3478cycloocta12d56dbis6k得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp>300°CRf0361HNMRδ18868671771973774377713CNMRδ1751264126712791286129913001304131213131321135091351013581448IR613719739770908997126713621425146614971514HRMSmz4671958C30H22N6計算値:C7723H475N1801測定値C7719H465N1780110ジヒドロ110ビス2メチルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスdibenzo3478cycloocta12d56dbis7k得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp>300°CRf0221HNMRδ23367568070170370871773774075475977978413CNMRδ18312641272127812921293130113061309131013161343135213571459IR6117187377627819991117113812631287135614291462147314971512HRMSmz4671979C30H22N6計算値:C7723H475N1801測定値C7722H468N1777実施例10SPDC反応による二重環化付加化合物の調製10上記反応式13で示されるように、ジイン3400mg200μmolのメタノール220mL溶液を、室温にて、2イソプロピルフェニルアジド4l774mg480μmolのメタノール30mL溶液に加えた。室温にて24時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィーで精製し、トランス体6lおよびシス体7lの混合物995mg190μmol953を得た。トランス体6lとシス体7lの比は、1HNMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC8109346lおよびCCDC8108417l。18ジヒドロ18ビス2イソプロピルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスdibenzo3478cycloocta12d56dbis6l得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp298300°CRf0701HNMRδ07620769571773574876777713CNMRδ219242278126412681284128512981305131313231337135814461454IR611735766783908995104511111211126913601454149315122967HRMSmz5232587C34H30N6計算値:C7813H579N1608測定値C7790H560N1585110ジヒドロ110ビス2イソプロピルフェニルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスdibenzo3478cycloocta12d56dbis7l得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp>300°CRf0481HNMRδ13514530467267868269169870670771674074975276177978713CNMRδ23125228612601271127512801291129213041307130913101339134514581466IR5236117337589109971028109211341213126113601452149515122965HRMSmz5232585実施例11SPDC反応による二重環化付加化合物の調製11上記反応式14で示されるように、ジイン3100mg50μmolのメタノール500mL溶液を、室温にて、26ジメチルフェニルアジド4m177mg120μmolのメタノール125mL溶液に加えた。室温にて30分間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gジクロロメタンメタノール91により精製し、トランス体6m、およびシス体7mの混合物227mg459μmol919を得た。トランス体6mとシス体7mの比は、1HNMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC8109356mおよびCCDC8108427m。18ビス26ジメチルフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス18dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis6m得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp>300°CRf0491HNMRδ15324168769471972372374377713CNMRδ17318412641284128512861294129913001314132013431357135813611447IR73576478191299511131354142714741512HRMSmz4952276C32H26N6計算値:C7771H530N1699測定値C7795H541N1688110ビス26ジメチルフェニル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス110dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis7m得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp>300°CRf0241HNMRδ17622368769370070370872272975375877477913CNMRδ18418812701282128812911293130213061307131113421348135313731461IR704733764918995113412671290134614741508HRMSmz4952315C32H26N6計算値:C7771H530N1699測定値C7759H533N1673実施例12SPDC反応による二重環化付加化合物の調製12上記反応式15で示されるように、ジイン3100mg50μmolのメタノール500mL溶液を、室温にて、26ジエチルフェニルアジド4n210mg120μmolのメタノール125mL溶液に加えた。室温にて30分間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gジクロロメタンのみからジクロロメタンメタノール241により精製し、トランス体6n、およびシス体7nの混合物257mg467μmol934を得た。トランス体6nとシス体7nの比は、1HNMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC8109366nおよびCCDC8108437n。18ビス26ジエチルフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス18dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis6n得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp255257°CRf0571HNMRδ07314117419225926468570071773073574177613CNMRδ135152240247126451264912657128512941299130313141322133151359141014211446IR733758910995135814661510287629362970HRMSmz5512912C36H34N6計算値:C7852H622N1526測定値C7826H647N1497110ビス26ジエチルフェニル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス110dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis7n得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp>300°CRf0301HNMRδ09113220420922624168368769670170873174075375777477913CNMRδ14915224725312671268126912901291130613071308131213361342140914331459IR7337587839089931061111311281261135214701508287229322965HRMSmz5512940C36H34N6計算値:C7852H622N1526測定値C7849H620N1503実施例13SPDC反応による二重環化付加化合物の調製13上記反応式16で示されるように、ジイン3203mg102μmolのメタノール90mL溶液を、室温にて、2‐tブチル‐6‐メチルフェニルアジド4o454mg240μmolのメタノール35mL溶液に加えた。室温にて24時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gヘキサンのみから酢酸エチルにより精製し、トランス体6oとシス体7oの混合物584mg101μmol997を、それぞれのジアステレオマーの混合物として得た。18ビス2tブチル6メチルフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス18dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis1HNMR主要異性体δ087207677713723726734736739769110ビス2tブチル6メチルフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス110dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis1HNMR主要異性体δ093180698702730742751757763767実施例14SPDC反応による二重環化付加化合物の調製14上記反応式17で示されるように、ジイン3200mg100μmolのメタノール125mL溶液を、室温にて、26‐ジブロモフェニルアジド4p665mg240μmolに加えた。室温にて9時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィーで精製し、トランス体6pおよびシス体7pの混合物743mg987μmol987を得た。トランス体6pとシス体7pの比は、1HNMRスペクトルに基づいて決定した。18ビス26‐ジブロモフェニル18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス18dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis6p得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Rf0071HNMRδ716727746748775782110ビス26‐ジブロモフェニル110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス110dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis7p得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Rf0011HNMRδ716722730753757775779実施例15SPDC反応による二重環化付加化合物の調製15上記反応式18で示されるように、ジイン3204mg102μmolのメタノール90mL溶液を、室温にて、35‐ビストリフルオロメチルフェニルアジド4q612mg240μmolのメタノール35mL溶液に加えた。室温にて20時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィーで精製し、トランス体6qおよびシス体7qの混合物716mg101μmol990を得た。トランス体6qとシス体7qの比は、1HNMRスペクトルに基づいて決定した。18ビス[35‐ビストリフルオロメチルフェニル]18ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスphenyl18dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis6q得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。1HNMRδ684732760775790793110ビス[35‐ビストリフルオロメチルフェニル]110ジヒドロジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス110dihydrodibenzo3478cycloocta12d56dbis7q得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。1HNMRδ700703734738758761775778788799実施例16SPDC反応による二重環化付加化合物の調製16上記反応式19で示されるように、ジイン3400mg200μmolのメタノール235mL溶液に、室温にて、4ベンジルアルコール4d、非特許文献MSmetKMettenWDehaenCollectCzechChemCommun20046910971108に記載の方法により合成783mg480μmolのメタノール15mL溶液を加え、そのまま室温にて60分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gジクロロメタンメタノール291により精製し、二重環化付加生成物の2つの位置異性体であるトランス体6d635mg121μmol603、およびシス体7d409mg777μmol389を得た。それぞれの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC7598996dおよびCCDC7599047d。18ジヒドロ18ビス4ヒドロキシメチルベンジルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスbenzyldibenzo3478cycloocta12d56dbisジクロロメタン/メタノールで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp300°CRf0451HNMRδ33845247052752965266270671371372073875713CNMRδ510624126212651293130113031309132113401345142114451477IR51959477598610281105113212151252131413521422147415141616209728683366HRMSmz5272191110ジヒドロ110ビス4ヒドロキシメチルベンジルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスbenzyldibenzo3478cycloocta12d56dbisジクロロメタン/メタノールで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp300°CRf0391HNMRδ20346649653369070070871672073274075276277013CNMRδ513625126812701271129213021303130713081335133814251450IR7047377649861028113412091248126512871315134614221514163420893360HRMSmz5272205実施例17SPDC反応による二重環化付加化合物の調製17上記反応式20で示されるように、ジイン3400mg200μmolのメタノール235mL溶液に、室温にて、4安息香酸メチル4e、非特許文献EAWydyshSMMedghalchiAVadlamudiandCATownsendJMedChem20095233173327に記載の方法により合成918mg480μmolのメタノール15mL溶液を加え、そのまま室温にて120分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣の固体を桐山ロート上にて酢酸エチルを用いて洗浄し、二重環化付加生成物の2つの位置異性体のうちの一つであるシス体7e361mg619μmol309を純品として得た。ろ液を、エバポレーターを用いて減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gヘキサン酢酸エチル12から酢酸エチルのみにより精製し、二重環化付加生成物のトランス体6e718mg123μmol615を得た。これらの化合物の構造は、それぞれをTHF中LiAlH40°Cから加熱還流75時間を作用させることによりエステルを還元し、対応するジオール6dおよび7dに導くことで決定した。18ジヒドロ18ビス4メトキシカルボニルベンジルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスbenzyldibenzo3478cycloocta12d56dbis得られた無色の固体につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp102104°CRf031Rf0271HNMRδ39053455770370571273975477379180013CNMRδ5105211260126512891293129413011304130713181346140914481656IR5817357467648069101020111111801283135214351516161417192951HRMSmz5832104110ジヒドロ110ビス4メトキシカルボニルベンジルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビス110Dihydro110bis4benzyldibenzo3478cycloocta12d56dbis得られた無色の固体につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp287290°CRf031Rf0271HNMRδ39149853669871173874574675676477279480013CNMRδ517524127112781293130061301413021303130413061335140114631663IR582735750764804910102011111180128314351516161417192951HRMSmz5832092実施例18SPDC反応による二重環化付加化合物の調製18上記反応式21で示されるように、ジイン3400mg200μmolのメタノール22mL溶液に、室温にて、4ベンジルアルコール4d392mg240μmol、および4安息香酸メチル4e459mg240μmolの混合物のメタノール3mL溶液を加え、そのまま室温にて120分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gヘキサン酢酸エチル11to14そして酢酸エチルのみにより精製し、ヘテロ二重環化付加生成物の2つの位置異性体であるトランス体6de218mg393μmol197、およびシス体7de253mg456μmol228を得た。それに加え、二組のホモ二重環化付加生成物トランス体6d/シス体7d292mg555μmol2786d/7d181、およびトランス体6e/シス体7e314mg539μmol2706e/7e121をそれぞれ位置異性体の混合物として得た。異性体混合物における異性体比は、混合物の1HNMRスペクトルにおけるベンジル位のプロトンピークの積分比を求めることにより決定した。また、6de、および7deの構造は、それぞれをテトラヒドロフランTHF中、水素化リチウムアルミニウムLiAlH40°Cから加熱還流75時間を作用させることによりエステルを還元し、対応するジオール6dおよび7dに導くことで決定した。18ジヒドロ14ヒドロキシメチルベンジル84メトキシカルボニルベンジルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスbenzyl84benzyldibenzo3478cycloocta12d56dbis得られた無色の固体につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp116118°CRf0301HNMRδ31639146052854055156166467269270370571272373874276277179079813CNMRδ51652152664812601265126612721278128812891296712971130013011304131013121319132513371347134913991413144614521664IR58374896198610181049110911821215128113521435151416141719206823593389HRMSmz5552150110ジヒドロ14ヒドロキシメチルベンジル104メトキシカルボニルベンジルジベンゾ3478シクロオクタ12d56dビスbenzyl104benzyldibenzo3478cycloocta12d56dbis得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp134136°CRf0381HNMRδ19039046848950453353968869670070471071572473273475476277079279913CNMRδ516519523643127012711274127612801291812922129913006130091303130513061130641307133413371341140414131461146215081664IR471579750984101811111209128113461416151416141715294930613416HRMSmz5552127上記実施例18のSPDC反応のように、2つの異なるアジド化合物を用いることにより、ヘテロ二重環化付加生成物を主生成物として得ることができる。以上の実施例の結果に示されるように、様々なアジド化合物がSPDC反応に適用可能であることが明らかになった。そして、アジド化合物のアジド基に隣接する置換基Rを様々な種類に変更することにより、生成される二重環化付加化合物におけるトリアゾール環上の置換基を、上述の式1または2で表されたように、適宜変更することができる。また、上述の実施例のように、触媒が存在せず、さほど高温でもない穏やかな条件下においても、SPDC反応は速やかに進行する。これは、8員環の環状骨格を含む環状ジイン化合物の歪みによって、アジド化合物との反応が促進され、自発的に進行したためと考えられる。さらに、単一の工程で2つのアジド化合物を環状ジインに付加、連結させることができる点で、SPDC反応は効率的であるといえる。これに対し、生体分子を修飾するために、例えばアジド基とトリアリールホスフィン誘導体とを用いた場合、あるいはアルキンに対して単一のアジド化合物を付加させるシングルクリック反応を用いた場合においては、複数の工程が必要となる。実験目的に合わせてその都度、プローブとしての蛍光標識等の機能性アジド化合物の調製と、機能性アジド化合物を生体分子に付加させる反応とが必要となるためである。上記反応式22に示されるジイン3とメチルアジド4fとのSPDC反応における、活性化エネルギーおよび遷移状態を、汎密度関数法DensityFunctionalTheory:DFTB3LYP631Gを用いて計算した。この結果、図1に示すように、ジイン3に対するメチルアジド4fの環化付加についてのエネルギー障壁は低く、室温下で、ジイン3および中間体であるモノイン5fのいずれに対しても、メチルアジド4fが自発的に反応可能であることが示された。特に、中間体であるモノイン5fに対する第二の環化付加反応の活性化エネルギートランスおよびシス付加それぞれについて、8.8および9.5kcal/molの方が、ジイン3に対する第一の環化付加反応の活性化エネルギー12.4kcal/molよりも小さかった。このことは、モノイン中間体5fが、メチルアジド4fに対してジイン3よりも高い反応性を有することを示している。このため、SPDC反応においては、2つのアジド化合物の付加反応が段階的に進行する際に、二つ目のアジド基も速やかに導入可能である。実施例19SPDC反応と従来のシングルクリック反応の反応性の比較SPDC反応と従来の歪み誘起性シングルクリック反応の反応性を比較するために、競争実験を行った。すなわち、上記反応式23で示されるように、ジイン3200mg100μmolおよびモノイン2а1112didehydro56dihydrodibenzoaecycloocten5ol、非特許文献XNingJGuoMAWolfertGJBoonsAngewChemIntEd20084722532255に記載の方法により合成の混合物のメタノール225mL溶液に、室温にて、ベンジルアジド4a133mg100μmolのメタノール25mL溶液を加えた。そのまま室温にて24時間撹拌し、エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮した。残渣は、ジイン3由来の二重環化付加生成物トランス体6а/シス体7а、およびモノイン2а由来のモノ環化付加生成物23-26の混合物であり、このままではカラムクロマトグラフィーによる分離精製、あるいは1HNMRスペクトルによる両者の生成比を求めることが困難であった。そこで、混合物に酸化剤を加えることでモノイン2а由来のモノ環化付加生成物であるアルコール23-26を、対応する下記反応式24のケトン体27トランス体、28シス体に導くことで解析を容易にすることにした。すなわち、上記残渣のジクロロメタン溶液に、室温にて、デス-マーチンペルヨージナンDessMartinperiodinane372mg877μmolを加え、そのまま室温にて4時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮し、残渣を短いカラムクロマトグラフィー5g酢酸エチルのみに通すことにより、二重環化付加生成物であるトランス体6а/シス体7а、およびモノ環化付加ケトン体であるトランス体27/シス体28の混合物を得た。混合物の1HNMRスペクトルにおけるプロトンピークの積分比を求めたところ、6а/7аと27/28の比がほぼ1:1であった。このことは、ジイン3およびモノイン2аのベンジルアジド4аに対する反応性が同程度であることを示している。なお、上記実施例19において生成したケトン体27トランス体、および28シス体の標品は、上記反応式24で示されるように合成した。すなわち、モノイン2аのメタノール11mL溶液に、室温にて、ベンジルアジド4a163mg122μmolのメタノール4mL溶液を加え、そのまま室温にて2時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gジクロロメタンメタノール1501to91により精製し、モノ環化付加生成物の4つの位置異性体のうちトランスアルコールの混合物23/24Rf014を得た。上記で得られたトランスアルコールの混合物体23/24258mg730μmolのジクロロメタン溶液に、室温にて、デス-マーチンペルヨージナン372mg877μmolを加え、そのまま室温にて21時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣を二度のフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10g酢酸エチルのみさらにシリカゲル10gジクロロメタンのみにより精製し、トランスケトン体27233mg663μmol908を得た。一方、同様にシスアルコールの混合物体25/26223mg631μmolのジクロロメタン溶液に、室温にて、デス-マーチンペルヨージナンを加え、そのまま室温にて21時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣を二度のフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10g酢酸エチルのみさらにシリカゲル10gジクロロメタンのみにより精製し、シスケトン体28205mg583μmol925を得た。それぞれのケトン体の構造は、X線結晶構造解析により決定したCCDC76115727およびCCDC76115628。1ベンジル1Hジベンゾ3478シクロオクタ12d123トリアゾール8オン1Benzyl1Hdibenzo3478cycloocta12d123triazol8onenヘキサン/酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp220222°CRf0551HNMRδ36637655756970371072373773875276480182913CNMRδ48052512541272127512821282912834128812981308130913131330133213381340135014661954IR5426037047357649081013115012071256127913461431145414971597166830631ベンジル1Hジベンゾ3478シクロオクタ12d123トリアゾール9オンonenヘキサン/酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。Mp178180°CRf0671HNMRδ36038156770170971872473073274174375676677481513CNMRδ4945311263127312781285128712891294129512961305131213141324133213451348136114581969IR538604706730766908102811571211125012811352142914541497159716723063実施例20SPDC反応の反応速度解析SPDC反応とシングルクリック反応との反応速度の差をより定量的に比較するために、上記反応式25で示されるSPDC反応の反応速度解析を行った。すなわち、ジイン3に対して過剰量のベンジルアジドを反応させ、ジイン3の時間依存的な減少を測定することで、SPDC反応の第一の環化付加反応の2次反応速度定数を求めた。具体的には、光路長10mmの石英セル中に20mMジイン3のメタノール溶液15mLを入れ、25°Cに保ちながらこれに3種類の異なる濃度20100200mM;それぞれ最終濃度1050100mMのベンジルアジド4aのメタノール溶液15mLを加えた。反応開始直後から、ジイン3に特徴的な吸収波長である3515nmlogε322における吸光度を分光光度計により測定した。ちなみにベンジルアジド4aや二重環化付加生成物6a/7aは、3515nmではほとんど吸収を示さない。上記の測定を、300-3000秒間、上述のベンジルアジド4aの各濃度において3回ずつ行い、吸光度を時間に対してプロットしたところ、図2に示すように指数関数的な減衰曲線が得られた。KaleidaGraphver411を用い、最小二乗法による近似曲線を求めることで反応の擬一次反応速度定数kを算出した。このように、ベンジルアジド4aの各濃度において得られた擬一次反応速度定数kをプロットしたところ、図3に示す直線が得られた。MicrosoftOfficeExcel2007を用いて線形回帰分析を行った結果、この直線の傾き、すなわち、SPDC反応の律速段階である第一の環化付加反応の2次反応速度定数は、×102M1s1、であると求まった。同条件下でのモノイン2aと、ベンジルアジド4aとのシングルクリック反応における2次反応速度定数が、×102M1s1と報告されている非特許文献:AAPoloukhtineNEMbuaMAWolfertGJBoonsVVPopikJAmChemSoc20091311576915776ことから、反応速度論の観点からも両反応はほとんど同じ速度で進行することが示された。実施例21アジド含有生体分子の化学修飾次に、SPDC反応によるアジド含有生体分子の化学修飾についての実施例21を説明する。実施例21では、まず、GSTタンパク質とHaloTagタンパク質の融合タンパク質GSTHaloTagタンパク質を発現する発現ベクターpGEX6P1HaloTagを作製し、これを大腸菌株に導入した。IPTGイソプロピルチオガラクトシドによるGSTHaloTagタンパク質の発現誘導後、GSTが特異的に結合するGSHセファロース樹脂を用いて、大腸菌破砕液よりGSTHaloTagタンパク質を精製した。この精製したGSTHaloTagタンパク質は、GSHセファロース樹脂に固定化した状態で、以下の化学修飾反応に用いた以下、HaloTagセファロース樹脂と記載する。このHaloTagセファロース樹脂と、長鎖クロロアルカンであってアジド基を含むHaloTagリガンドアジドHaloTagリガンド8下記の式26参照との反応により、所望のアジド含有HaloTagセファロース樹脂を得た。こうして得られたアジド含有HaloTagセファロース樹脂、およびTESRA-PEO3-アジド9アジド結合テトラエチルスルホローダミンTESRA誘導体式26参照を含有する溶液にジイン3を添加することによって、SPDC反応によるアジド含有HaloTagセファロース樹脂の蛍光修飾を試みた。まず、上述の反応後のアジド含有HaloTagセファロース樹脂に、還元剤を含むSDSサンプルバッファーを加え、加熱することでGSTとGSHの結合を切断し、修飾されたGSTHaloTagタンパク質を樹脂から切り離した。これらタンパク質を、アクリルアミドゲルを用いて分離しSDSPAGE、その後、蛍光標識されたかどうかを蛍光イメージ解析装置Typhoon7600GEHealthcareを用いて解析した。標識されたGSTHaloTagタンパク質を、クマシーブリリアントブルーCBBで染色することにより可視化した。SDS-PAGE分析は、およそ40の総標識効率でTESRA標識HaloTagタンパク質に対応する蛍光バンド51kDaを示した図4のレーン3参照。この効率は、アジド基を含まないHaloTagセファロース樹脂をTESRA-HaloTagリガンド10式26参照で蛍光修飾した場合をほぼ100として算出している。このTESRA-HaloTagリガンド10によるアジド基を含まないHaloTagセファロース樹脂の蛍光修飾効率がほぼ100であることは、MALDITOFMSを用いた解析により、以下のように確認済みである。TESRA-HaloTagリガンド10によるHaloTagタンパク質の修飾まず、アジド基を含まないHaloTagセファロース樹脂をTESRA-HaloTagリガンド10にて修飾し、修飾されたHaloTagタンパク質をプロテアーゼにより切断してセファロース樹脂より切り離した。こうして切り離されたHaloTagタンパク質の質量をMALDITOFMSにより解析した図5参照。この質量分析の結果を示す図5のライン1相対強度のピークが35082[au]はTESRA-HaloTagリガンド10にて修飾したHaloTagタンパク質の分子量を、ライン2相対強度のピークが34355[au]は未修飾のHaloTagタンパク質の分子量を示している。このように、TESRA-HaloTagリガンド10による修飾によって、ほぼ100のピークのシフトが認められた。この結果は、TESRA-HaloTagリガンド10による修飾効率が、ほぼ100であることを示した。なお、アジド含有HaloTagリガンド8、ジイン3、TESRAPEO3アジド9のどれか一つが欠けても、GSTHaloTagタンパク質が蛍光修飾されなかった。つまり、この蛍光修飾反応は、タンパク質に対して非特異的な反応のほとんどない非常に特異性の高い反応であると言える。また、SPDC反応が予想通り進行しているかを確認するため、上述実施例21のSPDC反応によりTESRA標識されたアジド基含有HaloTagタンパク質の分子量をMALDITOFMSを用いて解析した。プロテアーゼによる限定分解によりGSTとHaloTagタンパク質の接合部分を切り離すことにより、各HaloTagタンパク質をGSHセファロース樹脂から溶出し、その溶出液をそのままMALDITOFMS解析に用いた。この質量分析の結果を図6に示す。図6において、ライン1は未標識のHaloTagタンパク質の分子量を、ライン2はTESRA-PEO3-アジド9とジイン3とを反応させたアジド基不含HaloTagタンパク質の分子量を示す。また、ライン3はアジドHaloTagリガンド8標識したHaloTagタンパク質アジド基含有HaloTagタンパク質を、ライン4はそれぞれアジド含有HaloTagタンパク質とTESRA-PEO3-アジド9とジイン3が反応したアジド含有HaloTagタンパク質の分子量を示している。これらのSPDC反応によるアジド含有HaloTagタンパク質の分子量の変化は、TESRA-PEO3-アジド9とジイン3との共有結合による、予想される分子量の変化35643auとほぼ一致した。よって、アジド含有HaloTagタンパク質に対するSPDC反応は、予想通りに順調に進行していることが示された。上述の反応では、アジド含有HaloTagタンパク質アジド含有HaloTagセファロース樹脂とジイン3、蛍光アジド分子TESRAPEO3アジド9が同一試験管内で共存する状態で反応を進行させた同時SPDC反応ため、SPDC反応の二つのクリック反応の進行を人為的に制御することは困難である。しかし、我々はSPDC反応の二つのクリック反応が制御可能であることを見出した。以下に具体的な実験方法を示す。アジド含有HaloTagセファロース樹脂をジイン3で処理し、その後、バッファーにより未反応のジイン3を素早く洗浄した。この状態では、アジド含有HaloTagセファロースに対してジイン3の片側の三重結合が結合したモノイン中間体が存在していると予想される。上述の同時SPDC反応とは異なり、この状態においてすばやくTESRA-PEO3-アジド9を添加する逐次的手順逐次的SPDC反応によっても、およそ45の効率でアジド含有HaloTagタンパク質の蛍光標識が達成された図4のレーン7参照。つまり、ジイン3の片側のみが反応したモノイン中間体が確かに存在しうることが実証された。さらに、上述の同時および逐次的SPDC反応において、アジド含有HaloTagタンパク質のホモダイマーのシグナルは、殆ど検出されなかった。これらの結果は、アジド含有タンパク質間でのSPDC反応は、少なくとも試みられた条件下では進行しないことを示している。このことは、上述のタンパク質に対するSPDC反応の条件下では、比較的大きい分子であるアジド含有タンパク質のホモダイマーの形成がほぼ確実に防止され、効率的な化学修飾が可能であることを示している。特に、アジド含有HaloTagタンパク質、ジイン化合物、および蛍光アジド分子を共存させる同時SPDC反応においては、アジド含有HaloTagタンパク質と蛍光アジド分子とをジイン化合物に対して一工程にて、実質的に同時に付加させることができるため、化学修飾をより効率化することができる。アジド‐HaloTagリガンド8の合成法アルゴン雰囲気下、N22エトキシエチルカルバメートN22ethoxyethylcarbamate非特許文献YZhangMkSoAMLoeningHYaoSSGambhirJRaoAngewChemIntEd200611849364940に記載の方法により合成のジクロロメタン溶液に、0°Cにて、トリフルオロ酢酸を加え、そのまま0°Cにて2時間撹拌した。TLCにより出発原料である11の消失を確認した後、反応溶液を、エバポレーターを用いて減圧濃縮し、未精製のトリフルオロ酢酸22エトキシエチルアンモニウム22ethoxyethylammoniumtrifluoroacetateを無色油状物質として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。アルゴン雰囲気下、スクシンイミド4ベンゾエートsuccinimido4benzoate非特許文献AGopinSEbnerBAttaliDShabatBioconjugateChem20061714321440に記載の方法により合成のジクロロメタン溶液に、室温にて、トリエチルアミン、および上記で得られた12を順次加え、そのまま室温にて18時間撹拌した。これに水を加え、生成物をジクロロメタンを用いて抽出した。有機層を水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。これをろ過した後、ろ液をエバポレーターを用いて減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gヘキサン酢酸エチル11により精製し、4N22エトキシエチルベンズアミド4N22ethoxyethylbenzamide8を黄色油状物質として得た。Rf0291HNMRδ12815015116616718234635235736236437144067573674277978513CNMRδ25326629332439645054169669970171212751280134413871668IR5576507337548539081018111512001252130013501456150415411614164320992862293630653331HRMSmz3821775TESRA‐PEO3アジド9の合成法アルゴン雰囲気下、リサミンローダミンBスルホニルクロリドlissaminerhodamineBsulfonylchloride非特許文献HYangSVasudevanCOOriakhiJShieldsRGCarterSynthesis2008957961に記載の方法により合成のジクロロメタン溶液に、0°Cにて、トリエチルアミン、および11アジド369トリオキサウンデカン1アミン11azido369trioxaundecan1amineを順次加え、室温に昇温してから22時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣の固体を桐山ロート上にて酢酸エチルを用いて洗浄した後、それをフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル50gジクロロメタンメタノール191により精製し、TESRA‐PEO3アジド9を紫色固体として得た。Rf0611HNMRδ120301332368686707746794806840IR61368310241074113411821197124812811341135214201466152615951647UVλmax5605nmFLλmaxEm577nmHRMSmz7812649TESRA‐HaloTagリガンド10の合成法アルゴン雰囲気下、N22エトキシエチルカルバメートN22ethoxyethylcarbamate非特許文献YZhangMkSoAMLoeningHYaoSSGambhirJRaoAngewChemIntEd200611849364940に記載の方法により合成のジクロロメタン溶液に、0°Cにて、トリフルオロ酢酸を加え、そのまま0°Cにて2時間撹拌した。TLCにより出発原料である11の消失を確認した後、反応溶液を、エバポレーターを用いて減圧濃縮し、未精製のトリフルオロ酢酸22エトキシエチルアンモニウム22ethoxyethylammoniumtrifluoroacetateを無色油状物質として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。アルゴン雰囲気下、リサミンローダミンBスルホニルクロリドlissaminerhodamineBsulfonylchlorideのジクロロメタン溶液に、室温にて、トリエチルアミン、および上記で得られた12のジクロロメタン溶液を順次加え、そのまま室温にて18時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル10gジクロロメタンメタノール151により精製し、TESRA‐HaloTagリガンド10を紫色固体として得た。Rf0541HNMRδ120125140142152162173301342351355370690710745794806840IR5796831026107611361165118212021258127713501396142014661483152415971645UVλmax561nmFLλmaxEm577nmHRMSmz7642834実施例22生きた細胞の表面におけるアジド基含有複合糖質の蛍光標識さらに実施例22において、生きた細胞でSPDC反応による化学修飾を応用するために、細胞表面上に局在するアジド基含有複合糖質の蛍光標識を試みた。実施例22では、細胞表面の複合糖質にアジド基を導入するために、HEK293細胞を、テトラアセチル化されたN-アジドアセチル-D-マンノサミンAc4ManNAzと終濃度10の牛胎児血清を含有する培地を用いて、2日間培養した。その後、血清を含む培養液を新しいものに交換し、この培養液にジイン3を加え、37°Cで5二酸化炭素存在下に、20分間放置したのち、素早く新しい血清含有培養液にて洗浄し、未反応のジイン3を除去した。アジド化合物のみが環状ジイン化合物に付加するといった副反応を防止するためである。その後、即座にTESRA-PEO3-アジド9上述の式26参照を添加し、37°Cで5二酸化炭素存在下に、20分間放置した。細胞の形態や核の位置を確認するために、上記細胞を固定後、細胞骨格染色試薬であるAlexaFluor488標識ファロイジンと核染色試薬であるTOPRO3でさらに染色した。これらの蛍光修飾された細胞を、オリンパス社製共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察し、アドビ社製PhotoshopCS2ソフトウェアを用いて画像化した。その結果、アジド糖が細胞表面の複合糖質に組み込まれた細胞では、細胞間の境界に確かな蛍光シグナルが検出された図7A上側の重ね合わせ像参照。対照的に、アジド糖が細胞表面の複合糖質に組み込まれていない細胞図7A下側のバッファー-参照では、ほとんど無視できる程度のごくわずかな蛍光シグナルしか検出されなかった。つまり、アジド含有複合糖質の存在下でのみ細胞表面を蛍光修飾することが可能であり、また細胞に対する非特異的な修飾はほとんど認められないことが明らかとなった。上記HEK293細胞におけるアジド基含有複合糖質の蛍光修飾実験系において、ジイン3を40~100μMの濃度で使用することにより、最適な結果が得られ、ジイン3の修飾効率の濃度依存性が確認された図7B参照。蛍光修飾効率の測定には、得られた蛍光画像の強度をImageJソフトウェアを用いて数値化し、平均化した数値を用いてグラフ化した。なお各点における標準誤差も同様に記載してある。一方、ジイン3の反応時間を最適化するため、40μMのジイン3を、アジド基含有複合糖質を持つHEK293細胞の血清含有培養液に加え、0~48分間放置した後、上記の通りTESRAPEO3-アジド9を用いた蛍光修飾を行った。得られた蛍光画像を上記方法で定量化し、グラフ化した。その結果、20分前後の反応時間で効率が最大となり、20分以上の反応時間では効率が低下することが判明した図7C参照。この経時的な標識効率の低下は、ジイン3の片側のみがアジド基と反応したモノイン中間体の不安定性を示しており、時間の経過に伴ってモノイン中間体が分解したことに起因すると考えられる。また、我々が独自に合成したTESRAPEO3アジド9のみならず、市販の低分子アジド化合物もSPDC反応に使用できるか否かを検討するために、市販のAlexaFluor488アジドを用いて、アジド基含有複合糖質を持つHEK293細胞の蛍光修飾実験を行った。その結果、図8に示されたように、上述のような逐次的手順のみならず、ジイン3とAlexaFluor488アジドを同時に細胞培養液に加える同時手順においても、同様に効率よく蛍光修飾を行うことが出来た。なお図8では、AlexaFluor488アジドにより修飾されたHEK293細胞アジド基含有の表面と細胞核、および比較例として修飾されていない細胞の表面、細胞核アジド基なしがそれぞれ示されている。以上の結果は、化学修飾に用いる低分子アジド化合物に対する大きな制限はなく、多様な低分子アジド化合物が利用可能であることを示している。さらに我々は、SPDC反応による修飾反応と、既存のモノイン蛍光誘導体を用いたシングルクリック反応による修飾反応との比較、検討を行った。その結果を図9に示す。ここでは、アジド糖を取り込ませたHEK293細胞アジド基含有と、アジド糖を取り込ませていないHEK293細胞アジド基なしのそれぞれに対し、ジイン3とフルオレセイン結合アジド18を用いたSPDC反応と、モノイン2aの蛍光誘導体であるモノイン22反応式31参照を用いたシングルクリック反応によって蛍光修飾を行った。なおSPDC反応においては、同時と逐次的手順による反応の二種類を行った。各反応時間は図に示す。この比較試験の結果、SPDC反応とシングルクリック反応では、同一反応時間における蛍光修飾効率にほとんど違いは認められなかった。この結果は、実施例19に示した競争実験、および実施例20に示した反応速度解析の結果と良い一致を示した上述の段落[0046]~[0048]、図2、3参照。すなわち、ジイン3に対してフルオレセイン結合アジド18を用いたSPDC修飾反応と、モノイン2aに対して上記フルオレセイン結合モノイン22を用いたシングルクリック修飾反応とは、ほぼ同じ速度で進行することが示された。フルオレセイン結合アジド18の合成法アルゴン雰囲気下、2アジドエチルアミン2azidoethylamine非特許文献RSrinivasanLPTanHWuPYangKAKaleshSQYaoOrgBiomolChem2009718211828に記載の方法により合成のジクロロメタン溶液に、室温にて、トリエチルアミン、およびフルオレセインイソチオシアナート異性体fluoresceinisothiocyanateisomerIを順次加え、そのまま室温にて21時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル30gジクロロメタンメタノール91により精製し、13チオウレア13thioureaを橙色固体として得た。TLCRf0611HNMRδ2733563653806546616657187728218258409801060IR459476577600667812851914111111731207129613891458157021082930UVλmax456nm482nmFLλmaxEm5165nmHRMSmz4761024フルオレセイン結合モノイン22の合成法アルゴン雰囲気下、エチレンジアミンのジクロロメタン溶液に、室温にて、トリエチルアミン、および1112ジデヒドロ56ジヒドロジベンゾaeシクロオクテン5イル4ニトロフェニルカルボナート1112didehydro56dihydrodibenzoaecycloocten5yl4nitrophenylcarbonate非特許文献XNingJGuoMAWolfertGJBoonsAngewChemIntEd20084722532255に記載の方法により合成を順次加え、そのまま室温にて2時間撹拌した。TLCにより出発原料である20の消失を確認した後、反応溶液にジクロロメタンを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した後、これをろ過し、ろ液をエバポレーターを用いて減圧濃縮し、未精製の1112ジデヒドロ56ジヒドロジベンゾaeシクロオクテン5イルNカルバメート1112didehydro56dihydrodibenzoaecycloocten5ylNcarbamateを淡黄色油状物質として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。アルゴン雰囲気下、上記で得られた21のDMF溶液に、室温にて、トリエチルアミン、およびアジフルオレセインイソチオシアナート異性体を順次加え、そのまま室温にて17時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーシリカゲル8gジクロロメタンメタノール121により精製し、12オキシカルボニルアミドエチル3チオウレア12oxycarbonylaminoethyl3thioureaを黄色固体として得た。TLCRf0521HNMRδ273320370380528641659670671697756783IR48854656557876085191499310221076111311791207125813171449150615951701293830633287UVλmax455nm481nmFLλmaxEm515nmHRMSmz6961785最後に、ジイン3の生きた細胞に対する毒性試験を行った。培養中のHEK293細胞にジイン3を0-80μMの濃度で加え、そのまま一晩培養した。培養後の細胞の形態を位相差顕微鏡により撮影し、アドビ社のPhotoshopCS2を用いて画像化したものを図10に示す。このように、細胞毒性を示さなかったジイン3は、生きた細胞の化学修飾にも適応可能であると考えられる。以上のように、SPDC反応を活用した、プローブとしての蛍光性官能基等を有する機能性アジド化合物によるアジド基含有生体分子の修飾において、ジイン3が基質として有用であることが明らかになった。特に、ジイン3または類似の構造の環状ジイン化合物と、様々な種類の機能性アジド含有化合物とが容易に入手あるいは合成可能であるため、SPDC反応の適用により、様々な機能性生体分子の調製が可能になる。また、2つのアジド化合物が単一の工程により付加、連結可能である上に、触媒のない穏やかな条件下でも速やかに進行するSPDC反応を利用することにより、生細胞中等において機能を維持したまま機能性生体分子を容易に、かつ効率的に調製することができる。"