少なくとも1つの配列相同領域を共有する少なくとも第1核酸分子と第2核酸分子との間の相同組換えを行うための方法であって、5’3’エキソヌクレアーゼおよびアニーリングタンパク質の存在下で第1核酸分子と第2核酸分子とを接触させることを含む方法において、5’3’エキソヌクレアーゼが、5’3’エキソヌクレアーゼ活性を有する領域および少なくともi配列番号1のアミノ酸564~587またはii配列番号1のアミノ酸564~587に対してその24アミノ酸配列の全長を通して少なくとも70の同一性を有する24アミノ酸配列を含む方法。5’3’エキソヌクレアーゼがRecEである、請求項1に記載の方法。RecEが、配列番号1のアミノ酸564~866またはそのバリアントを含むかまたはそれからなる、または、配列番号1に対して303アミノ酸配列の全長を通して少なくとも70の配列同一性を有する長さ303アミノ酸の配列を含むかまたはそれからなるバリアントである、請求項1または請求項2に記載の方法。RecEが、配列番号1のアミノ酸1~866、141~866、423~866もしくは564~866またはこの群からの配列のバリアントからなる群から選択される配列を含むかまたはそれからなり、前記バリアントが、配列番号1に対して配列の全長を通して少なくとも70の配列同一性を有する、請求項1~3のいずれか1つに記載の方法。RecEが、配列番号1に示されるRecEに対して少なくとも75、80、85、90、95、98または99の配列同一性を有する、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。RecEが完全長RecEである、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。アニーリングタンパク質がRecTである、請求項2~6のいずれか1つに記載の方法。第1および第2核酸分子が線状核酸分子である、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。相同組換えが宿主細胞内で行われる、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。5’3’エキソヌクレアーゼが異種DNAから発現される、請求項9に記載の方法。5’3’エキソヌクレアーゼがRecEであり、かつ組み込まれたプロファージのRecE遺伝子から発現され、RecEの発現が異種プロモーターによって駆動される、請求項1~9のいずれか1つに記載の方法。5’3’エキソヌクレアーゼの発現が、アラビノース誘導性プロモーターまたはラムノース誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターによって駆動される、請求項10または請求項11に記載の方法。第2核酸が、線状化BAC、線状化p15A由来ベクター、線状化pBR322由来ベクター、線状化フォスミド、線状化pUC由来ベクターまたは線状化ColE1由来ベクターなどの線状化クローニングベクターである、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。第1および第2核酸分子が線状であり、方法が、5’3’エキソヌクレアーゼおよびアニーリングタンパク質の存在下で第1および第2核酸分子と第3核酸分子とを接触させることをさらに含み、前記第1核酸分子が前記第2核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第3核酸分子と他の相同領域を共有し、前記第2核酸分子が前記第1核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第3核酸分子と他の相同領域を共有し、前記第3核酸分子が前記第2核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第1核酸分子と他の相同領域を共有する、請求項1~12のいずれか1つに記載の方法。第1および第2核酸分子が線状であり、5’3’エキソヌクレアーゼおよびファージアニーリングタンパク質の存在下で第3核酸分子および第4核酸分子と前記第1および前記第2核酸分子とを接触させることをさらに含み、前記第1核酸分子が前記第2核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第4核酸分子と他の相同領域を共有し、前記第2核酸分子が前記第1核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第3核酸分子と他の相同領域を共有し、前記第3核酸分子が前記第2核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第4核酸分子と他の相同領域を共有し、前記第4核酸分子が前記第3核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第1核酸分子と他の相同領域を共有する、請求項1~12のいずれか1つに記載の方法。第1核酸分子が目的とする配列を含み、第2および第4核酸分子が短いオリゴヌクレオチドであり、第3核酸分子がクローニングベクターである、請求項15に記載の方法。第1核酸分子が長さ2kb以上の目的とする配列を含む、請求項1~16のいずれか1つに記載の方法。第1核酸分子が、遺伝子クラスターである目的とする配列を含む、請求項1~17のいずれか1つに記載の方法。遺伝子クラスターが、二次代謝物経路または脂肪酸合成経路をコードする、請求項18に記載の方法。第1核酸分子がゲノムDNA断片である、請求項1~19のいずれか1つに記載の方法。第1核酸分子が線状化BACであり、方法が、目的とする配列をBACからクローニングベクターにサブクローニングするために用いられる、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。少なくとも第1および第2核酸分子が線状であり、線状環状相同組換えの第2ステップにおいて、RedαおよびRedβまたは短縮型RecEおよびRecTの存在下で少なくとも第1核酸分子と第2核酸分子との線状線状相同組換え反応産物を用いることをさらに含む、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。線状線状相同組換えが完全長RecEおよびRecTの存在下、invitroで行われ、方法が、線状線状相同組換え反応産物と宿主細胞内でさらなる核酸分子とを接触させ、RedαおよびRedβおよび好ましくはさらにRedγの存在下、invivoで線状環状相同組換えを行うことをさらに含む、請求項22に記載の方法。第1核酸分子が、線状であり、その5’末端の近位にホスホロチオエート化を含み、その3’末端の近位にホスホロチオエート化を含む、請求項1~23のいずれか1つに記載の方法。第2核酸分子が、線状であり、その3’末端の近位にホスホロチオエート化を含み、その5’末端の近位にホスホロチオエート化を含む、請求項24に記載の方法。cDNAライブラリーを作成するための、請求項1~25のいずれか1つに記載の方法。第1および第2核酸分子が線状であり、方法が、5’3’エキソヌクレアーゼおよびアニーリングタンパク質の存在下で第1および第2核酸分子と1以上の追加の核酸分子とを接触させ、線状産物を製造することをさらに含む、請求項1~25のいずれか1つに記載の方法。線状産物が遺伝子、オペロン、染色体または全ゲノムである、請求項27に記載の方法。請求項1~6のいずれか1つに記載の5’3’エキソヌクレアーゼを発現する宿主細胞。RedαおよびRedβをコードする遺伝子をさらに含み、ここで5’3’エキソヌクレアーゼがRedαおよびRedβとは異なるプロモーターの制御下にある、請求項29に記載の宿主細胞。組み込まれたプロファージ上にrecE遺伝子を含む宿主細胞であって、recE遺伝子が異種プロモーターの制御下にある前記宿主細胞。相同組換え法に使用するための、請求項1~6のいずれか1つに記載の5’3’エキソヌクレアーゼをコードする核酸を含むキット。相同組換え法に使用するための、請求項1~6のいずれか1つに記載の5’3’エキソヌクレアーゼを含むキット。相同組換えを行う核酸分子に対して配列相同性を持たない少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドの存在下で相同組換えを行うことによって相同組換えの効率を改善するための方法であって、少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドの非存在下で相同組換えが行われる場合と比較して相同組換えの効率が改善される前記方法。少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドがDNAを含むかまたはそれからなる、請求項34に記載の方法。少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドが10~100ヌクレオチド長である、請求項34または35に記載の方法。少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドが約40ヌクレオチド長である、請求項36に記載の方法。少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドが各エレクトロポレーションに1~200pmolの濃度で用いられる、請求項34~37のいずれか1つに記載の方法。相同組換えがRecEおよびRecTによって仲介される、請求項34~38のいずれか1つに記載の方法。RecEが短縮型RecEである、請求項39に記載の方法。相同組換え法が、請求項1~28のいずれか1つに記載の方法である、請求項34~39のいずれか1つに記載の方法。相同組換えがRedαおよびRedβによって仲介される、請求項34~38のいずれか1つに記載の方法。相同組換えの実施に使用するための、請求項34~37のいずれか1つに記載の少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドを含むキット。キットが、RecEをコードする核酸を含む宿主細胞を含む、請求項32、33または43のいずれか1つに記載のキット。宿主細胞が、請求項24~26のいずれか1つに記載の細胞である、請求項44に記載のキット。キットが、RedαおよびRedβを発現する宿主細胞を含む、請求項43に記載のキット。宿主細胞が、Redγ、RecA、RedαおよびRedβの1以上をコードする核酸配列をさらに含む、請求項44または請求項45に記載のキット。キットが、1以上の線状化クローニングベクターをさらに含む、請求項32、33および43~47のいずれか1つに記載のキット。少なくとも1つの配列相同領域を共有する少なくとも第1核酸分子と第2核酸分子との間の相同組換えを行うための方法であって、invivoで相同組換えを行う前に、レアカット配列特異的DNA切断酵素を用いてinvivoで少なくとも1つの環状核酸分子を線状化して第1およびまたは第2核酸分子を作成するステップを含む前記方法。レアカット配列特異的DNA切断酵素が、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼから選択される、請求項49に記載の方法。ホーミングエンドヌクレアーゼが、ISceI、ICeuI、ICreI、IChuI、ICsmI、IDmoI、IPanI、ISceII、ISceIII、ISceIV、FSceI、FSceII、PIAaeI、PIApeI、PICeuI、PICirI、PICtrI、PIDraI、PIMavI、PIMflI、PIMgoI、PIMjaI、PIMkaI、PIMleI、PIMtuI、PIMtuHI、PIPabIII、PIPfuI、PiPhoI、PIPkoI、PIPspI、PIRmaI、PISceI、PISspI、PITfuI、PITfuII、PITliI、PITliIIPITspI、PITspII、PIBspI、PIMchI、PIMfaI、PIMgaI、PIMgaII、PIMinI、PIMmaI、PiMshI、PIMsmII、PIMthI、PITagI、PIThyII、INcrI、INcrII、IPanII、ITevI、IPpoI、IDirI、IHmuI、IHmuII、ITevII、ITevIII、FSceI、FSceII、FSuvI、FTevIおよびFTevIIからなる群から選択される、請求項50に記載の方法。相同組換えがRecEおよびRecTによって仲介される、請求項49~51のいずれか1つに記載の方法。相同組換え法が請求項1~28または34~42のいずれか1つに記載の方法である、請求項49~52のいずれか1つに記載の方法。請求項50または請求項51に記載のレアカット配列特異的DNA切断酵素をさらに含む、請求項29~31のいずれか1つに記載の宿主細胞。相同組換え法の実施に使用するためのキットであって、請求項50または請求項51に記載の少なくとも1つのレアカット配列特異的DNA切断酵素を含む前記キット。相同組換え法の実施に使用するためのキットであって、請求項54に記載の宿主細胞を含む前記キット。LLHRの仲介において、RecETはRedβおよびRedαよりも効率的であるLCHRおよびLLHRを仲介する種々のタンパク質の能力をアッセイした。LCHRおよびLLHRは、それぞれ、図1Aおよび図1Bに示した概要に従って行った。LCHRに関しては、kanPCR産物は、両方の末端において、クロラムフェニコール耐性を含むp15Acmプラスミドに対する50bpホモロジーアームを有する。組換え操作に優れたEコリ細胞へのこのプラスミドおよびこのPCR産物の同時エレクトロポレーションとLCHRの成功とによって、クロラムフェニコールカナマイシン抵抗性プラスミドp15Acmkanが生成される。同様に、LLHRアッセイにおいて、kanPCR産物は、線状p15AcmPCR産物に対して2つの50bpホモロジーアームを有する。再び、組換えに優れたEコリ細胞への2つのPCR産物の同時エレクトロポレーションとLLHRの成功とによって、CmKan抵抗性プラスミドp15が生じる。LCHRおよびLLHRにおけるRecETおよびRed系の機能を試験するために、アラビノース誘導性プロモーターの制御下にある温度感受性由来プラスミドに組換え酵素遺伝子をクローニングして一連の発現ベクターを作成した。染色体中でRecETオペロンが欠失したHS996の派生株であるGB2005株を用いて組換えアッセイを行った。研究で用いられた大部分のEコリ株は、GB2005を含めてRecBCDが無傷である。RecBCDによる線状DNA分子の分解を防ぐために、GB2005内でRedγタンパク質を一時的に発現させてEコリ内のRecBCDを不活化した。各DNA分子200ナノグラムをエレクトロポレーションによって形質転換した。baRedβ、RedαgbaRedγ、Redβ、RedαET完全長RecE、RecTETg完全長RecE、RecT、Redγを含むオペロンのアラビノース誘導によって、タンパク質をpSC101BADから発現させた。組換えの成功および形質転換を、Cmおよびkan抵抗性コロニーの数によって測定した。図1Cに示すように、LCHRは、λRed系ならびに、Redα、βおよびγの発現によって最も効率的に仲介される。対照的に、図1Dに示すように、RecET系は、LLHRの仲介においてλRed系よりもはるかに優れており、おおよそ60倍多いコロニーを生じる。RecETを用いるLLHRによって生じるコロニー数は、RedβおよびRedαを用いるLCHRによって生じるコロニー数よりも一桁多いことに注目することも重要である。両方の系において、Redγの追加の発現によって効率は改善された。効率的なLLHRのためには、完全長RecEおよびRecTが必要であるLCHRにはRecEのC末端領域のみが必要であり、短縮型RecEはLCHRの効率を増加させることが知られている。本明細書においては、LLHRを仲介する短縮型RecEと完全長RecEの能力をアッセイした。LCHRおよびLLHRのアッセイは、実施例1の記載と同様に行った。アラビノース誘導後に、pSC101BADプラスミドからすべてのタンパク質を発現させた。RecT、Redγおよび種々のRecE構築物を発現させた。実施例1のアッセイを用い、カナマイシン抵抗性コロニーを計測した。RecE構築物における数は、短縮型RecEが開始される残基を示す。LLHRの仲介において、完全長RecEは短縮型構築物のいずれよりも優れている。これはLCHRとはまったく対照的である。LCHRに関しては、完全長RecEは最も効率が低く、短縮型RecE構築物の効率は短縮化の増加と共に増加する。図2Cおよび2Dは、ウサギ抗RecE602および抗recT抗血清を用いるウェスタンブロットによるRecEおよびRecTの検出を示す。誘導なしおよびアラビノース誘導タンパク質抽出物に関してSDSPAGEを行った。すべてのRecEバージョンは最終264アミノ酸を含む。完全長RecE、RecE141、RecE282、RecE423、RecE564およびRecE602の分子量は、それぞれ964、808、656、501、346および304kDaである。RecTの分子量は297kDaである。RecEおよびRecTは、Lアラビノース誘導後にのみ発現されたことがわかる。これらのデータは、Lアラビノース誘導性BADプロモーターが厳密に制御されていることを裏付けている。さらにまた、これらのデータは、完全長RecEによって達成されるLLHR効率の改善が発現の変動によってもたらされるものではなく、短縮型RecEがタンパク質またはRecTの不安定性を引き起こすものでもないことを明らかにしている。LLHRにおいて、C末端断片よりも完全長RecEのほうが効率的であることが同定されたので、N末端RecE断片が活性を有するかどうか、あるいはN末端およびC末端断片が一緒に発現された場合に活性を有するかどうかを調べた。GB2005において実施例1のLLHRアッセイを用い、RecTおよびRedγに加えて、アミノ酸1~アミノ酸601を含むC末端短縮型RecをpSC101BADから発現させた。組換えはほとんど観察されず、タンパク質の誘導と誘導なしとの間で有意差はなかった。組換え体はバックグラウンド組換えの結果である。従って、N末端RecE単独ではLLHR活性を有さない。RecEのN末端およびC末端断片が互いに補完することができるかどうかを調べるために、HS996の染色体におけるrecETオペロンのrecE602の前にBADプロモーターを挿入し、アミノ酸602からのRecEのC末端およびRecTの染色体からの発現を活性化した。この株はHS996recE602Tである。図3に関する同じ発現プラスミドであるpSC101BADETgをHS996BADE602T株に用いた。Redγ発現ベクター、pSC101BADgamtetを用いて達成されるレベルをLLHRと比較した。RecE1601によって移される有意な効果は観察されなかった。誘導後、この株はRecTおよびC末端RecEを発現する。さらに、RedGamまたはRecETgがpSC101プラスミドから発現された。N末端RecEおよびC末端RecEの相補的な発現がLLHRを仲介することができないことをこれらのデータは示している。RecEは1つのポリペプチドとして発現されなければならない。最後に、図3Cは、完全長RecEおよびRedγ発現によって仲介される、Eコリ株GB2005におけるLLHRとRedγ発現単独によって仲介されるLLHRとを、共にRecTの非存在下で比較している。これらのデータは、何らかのLLHRが起こることを示しているが、おそらくは、何らかの内因性RecT様活性が存在するためと考えられる。しかしながら、完全長RecEはRecTの発現なしには高い効率のLLHRを仲介することができない。LLHR効率に対する相同性の長さの効果LCHRおよびLLHR効率に対するホモロジーアームの長さの効果を調べるために、両方の末端に異なる長さのホモロジーアームを有する一連の線状分子を用いて実施例1記載のアッセイを行った。ホモロジーアームの長さが増加するに従って、Red組換え酵素によって仲介されるLCHRおよびRecETによって仲介されるLLHRの両方の効率が増加する。ホモロジーアームの最少長さに関してLLHRとLCHRとの間に差異が存在する。RecETによって仲介されるLLHRは、2つの分子間にわずか20bpの相同性を必要とするだけである。λRedによって仲介されるLCHRは、2つの分子を結合させるのに少なくとも30bpの相同性を必要とする。しかしながら、これらの最少必要量は類似しており、LCHRおよびLLHRは、共に効率とホモロジーアームの長さとの間に線形関係を示す。recA欠損Eコリ株におけるRecAの一過性発現によるLLHRの改善LLHRにおいて、JC8679はJC9604よりも効率的であることならびに、recA欠損宿主におけるRecAの一過性発現は、RedETリコンビニアリングまたはLCHRには寄与しないが、形質転換効率を増加させることによってLCHRを改善することは既に報告されている。LLHRに対するRecAの一過性発現の効果を試験するために、実施例1のLLHRアッセイを用いて、RecEおよびRecTの発現によるLLHRの効率と、RecE、RecTおよびRedγの発現によるLLHRの効率およびRecE、RecT、RedγおよびRecAの発現によるLLHRの効率とを比較した。タンパク質は、それぞれ、pSC101BADETtet、pSC101BADETgtetおよびpSC101BADETgAtetから発現させた。RecAの発現によってLLHR効率は改善され、3倍のコロニー数増加が引き起こされた。YZ2005は、構成的にRecA、RecEおよびRecTを発現する。RecETの過剰発現は、Eコリ細胞の形質転換効率を低下させ、増殖の低下および死を引き起こすことを我々は観察した。さらに、構成発現された組換え酵素は、反復配列を有するDNA分子の再配列をもたらす。LLHRのための適切な宿主を作成するために、BADプロモーターの制御下にあるETgAをGB2005染色体に組み込み、Redαに類似する推定上のエキソヌクレアーゼをコードするybcCと置換した。新規宿主GB2005dirは、ETgAのアラビノース誘導発現後においてLLHRに優れている。LLHRを試験したとき、GB2005dirはYZ2005よりも優れたLLHR効率を示した。GB2005dirとYZ2005では電気ショック後の増殖速度および生存率が異なるため、図5BにおけるLLHR効率は、エレクトロポレーションと1時間の回復後に生存細胞に対する組換え体の比率によって測定した。pUC19プラスミド5ngを形質転換することによって、両方の宿主からの形質転換効率を試験した。図5Bの場合のように、生存細胞に対する形質転換細胞の比率によって形質転換効率を測定した。誘導後のGB2005dirは、YZ2005よりも優れた形質転換効率を有していることをこれらのデータを示している。RecAは、組換え効率よりはむしろ形質転換効率を改善することが、この実験から明らかである。非相同一本鎖DNAオリゴヌクレオチドはLLHRを促進する驚くべきことに、非相同一本鎖DNAオリゴヌクレオチドがLLHRの効率を改善することが測定された。このことは、追加の組換え酵素の発現なしにGB2005における組換えの非効率的バックグラウンドレベルに依存する場合と、RedおよびRecET系の発現を伴う場合の両方において確認された。図3A左カラムおよび図6A左カラムに示すように、野生型EコリK12株において、LLHRは低い効率で生じる。実施例1で説明したLLHRアッセイを用いて一本鎖DNAオリゴヌクレオチド添加の効果を評価した100pmolを両方の線状DNA基質に添加オリゴあり。これを、任意のssDNAオリゴヌクレオチド添加なしと比較した。追加の組換え酵素は発現されず、ここで観察される大変非効率的なレベルの組換えは、GB2005における未知の内因性機構によって仲介された。2つの線状分子と共に非相同DNAオリゴを同時形質転換することによって、RecETまたはRed発現なしのGB2005においてLLHR効率を10倍増加させる。用いた40ntssDNAは、LLHRのための2つの線状分子または宿主の染色体DNAに対して相同性を有さない。非相同ssDNAはまた、組換え酵素の存在下でLLHRを改善する。GB2005において、Red系ならびにRecET系RecTおよびRedγ、ETgを発現させた。LLHRのために、2つの線状分子と共に非相同オリゴを同時エレクトロポレーションすることによって、E564Tgに関して少なくとも45倍、ETgに関して少なくとも約5倍効率が増加した。Red系またはRecEE602が用いられる場合、LLHRは大変非効率的である。しかしながら、非相同ssDNAが用いられた場合、改善が見られた。40ヌクレオチド長の非相同オリゴヌクレオチドを、1回のエレクトロポレーションにつき100pmolで用いる場合に最良の結果が得られることが測定された。組換え酵素発現に用いる誘導性プロモーターの比較Eコリにおいて、多くの場合、4つの誘導性プロモーターが用いられる。これらの異なる誘導性プロモーターを用いてRedおよびRecET系の発現を駆動し、プロモーターによって駆動される組換え効率を評価した。すべてのプロモーターをpSC101プラスミド上にクローニングした。LCHRおよびLLHRに用いたモデルは、実施例1に記載のものと同じものを用いた。図6Cに示すように、LCHRには、gbaを駆動するBADプロモーターが最もよく適していた。LLHRには、アラビノースおよびラムノース誘導性プロモーターが最も適していた。tetRtetOテトラサイクリン誘導性プロモーターは、LCHRおよびLLHRの両方に、最も効果が低かった。このことは、EコリにおいてはtetRtetOプロモーターが弱いプロモーターであること、あるいは誘導物質テトラサイクリンがEコリ細胞には毒性であることが原因である可能性がある。オリゴの線状相同組換えRedET組換え技術には、3つの主要な用途がある。a環状標的へのDNA配列の挿入または組み込みb環状標的からのDNA配列のサブクローニングまたは線状標的からのDNA配列のクローニングおよびcオリゴ修復法である。LLHRおよびLCHRにおいて、図1~6のデータは、RecET系の性能とRed系の性能との間に有意差が存在することを示している。この差異は、オリゴ修復法にも適用できる。オリゴ修復法は、2つの作用に分類することができる。オリゴを線状化ベクターに組換えて、そのベクターを再環状化することおよびオリゴを組換えて環状ベクターに組み込むことである。合成オリゴは、親二本鎖DNAの上鎖または下鎖のいずれであることもできる。本明細書においては、我々は、オリゴを、標的分子の複製方向に従って、リーディング鎖またはラギング鎖として区別する。図7Cにおける実験において、2つの相補的オリゴからアニーリングさせた二本鎖DNAもまた対照として用いた。第1実験において、BamH1を用いてプラスミドを線状化し、この線状化プラスミドに対してホモロジーアームを有するオリゴを用いてそれを再環状化してEcoR1部位を導入した。p15AcmプラスミドをBamHIで線状化し、ssDNAオリゴヌクレオチドと共に、GB2005に同時エレクトロポレーションした。このオリゴは長さ106ntであり、p15AcmのBamH1部位のどちらかの側に2つの50nt配列同一性領域を有し、その中央にEcoRI部位を有する。組換え後、新規p15Acmプラスミドは、BamHI部位の代わりにEcoRI部位を有していた。図7Cに示すように、この組換えの仲介には、RecET系が最も効率的であった。RecAの一過性発現もまた、効率を改善した。第2実験において、フレームシフトによって引き起こされた変異したカナマイシン耐性遺伝子を含む環状エピゾームBACMll1neoであるBACを用いた。長さ100ntのオリゴによって変異を修正し、それでカナマイシン耐性を復帰させることができる。オリゴの取り込みの成功によって、カナマイシン耐性が引き起こされた。図7Dに示すように、この組換えの仲介に、Red系が最も効率的であった。RecAの一過性発現によってもまた効率が改善された。両方の系に関して、リーディング鎖オリゴの使用よりも、ラギング鎖オリゴの使用のほうが効率を改善した。これらの結果は、実施例1、2および5の実験から引きだされる結論を強固にし、1つの線状基質がdsDNAよりはむしろssDNAである場合を含むようにその結論を拡大させている。RecETオペロンは、すべてのEコリK12株に存在するが、sbcAバックグラウンドを有する株においてのみ発現されるEコリK12ゲノムは、組み込まれ無力化された、RecETオペロンを有するracプロファージの部分コピーを含む。RecTはこのオペロンから発現されるが、EコリK12はRecEを発現しない。この実験によって、EコリK12はRecEを発現しないことが確認され、Eコリゲノムに組み込まれたRecEを活性化してLLHRを仲介させることが可能であることが明らかとなった。EコリK12由来の3つの株、GB2005、HS996およびDH10Bを用いた。HS996のゲノムからrecETオペロンを欠失させることによってGB2005を作成した。このRecETオペロンの除去によっては、残りのLLHRには効果は示されず、GB2005とHS996の間に差異はなかった。LLHRがRecBCDによってブロックされていた可能性があるので、我々はまた、pSC101BADgamtetを導入し、アラビノースでRedγ発現を誘導することによって、RecBCDインヒビターであるRedγの存在下でのLLHRを評価した。再度、RecET欠失株であるGB2005とその親であるHS996との間にほとんど差異はなかった。このことによって、Eコリゲノムに組み込まれたRecEは活性化されておらず、観察される任意のバックグラウンドLLHRは、RecET経路によって仲介されないことが確認された。HS996におけるRecETオペロンを活性化するために、HS996におけるrecE遺伝子の前のカセットの一部としてBADアラビノース誘導性プロモーターを挿入し、HS996BADETを作成した。実施例1のアッセイを用いて測定したとき、アラビノース誘導によってLLHRは増加し、これによって、組み込まれたRecEはRecETLLHRを仲介したことが示された。Redγの発現によって効率がさらに改善された。三重組換え2つの線状分子を環状ベクターへRedET組換え技術は、一連のDNA分子を設計するために広く使用されてきた。主な用途は、選択マーカー遺伝子を有するカセットを標的分子に挿入または組み込むことである。多くの場合、カセットは前もって選択マーカーを有していない。smを有するカセットを作成するための最も一般的な方法は、RedET組換え技術を用いて非smおよびsm構築物を結合させて1つの大分子を作成するかまたは、オーバーラッピングPCRを用いて非smsmの大分子を作成するかである。この手順を簡単にするために、本明細書において、三重組換えと呼ばれる戦略を提供する。三重組換えは、RedET系および完全長RecEの効率を利用して、3つの分子、例えば1つの環状標的2つの線状分子を、3分子中に存在する短い相同配列を用いてinvivoで結合させる。本実施例においては、図9Aの記載に従って、2つの線状DNA分子は50bpのオーバーラッピング領域を有し、そのそれぞれは標的ベクターに対してホモロジーアームを有する。通常は、線状分子の1つは選択マーカー遺伝子である。組換え事象後、2つの線状分子は標的ベクターに組み込まれる。三重組換えを仲介する、Redオペロンおよび完全長RecETの能力を比較するためのこの実験において、カナマイシン耐性遺伝子をPCRによって増幅し、その中央が50bpの配列同一性によってオーバーラップする2つの断片にした。各PCR産物の他の末端に、プラスミドに対する50bpホモロジーアームを導入した。標的プラスミドであるParaBAD24および、RedgbaまたはRecETのどちらかが発現されるpSC101BADプラスミドをすでに含むGB2005に、これらの2つのPCR産物をエレクトロポレーションした。どちらかのPCR産物は、保護鎖がアニールするように配置されるように、対称脱リン酸化末端または非対称ホスホチオエート化末端を有していた。ホスホロチオエート化を有するPCR産物を用いる三重組換えは、ホスホロチオエート化を有さないPCR産物を用いるものよりもはるかに効率的であることを図9Bのデータは示している。完全長RecE、RecTおよびRedγによって仲介される三重組換えは、Redα、RedβおよびRedγのRed系によって仲介されるものと比較して効率は同等である。このことは、完全長RecEが、一定量のLCHRを必要とする用途に有用であることを明らかにしているので、注目に値する。最適には、RedおよびRecET系の両方の協調した適用によってより良い結果を得ることができる。四重組換え2つのオリゴ大きな断片を環状ベクターへ大きなカセットの組み込みには、PCRの限界による問題がある。PCRは、大きなカセットを扱うことはできないし、変異が導入される場合がある。本明細書においては、本方法は、隣接する相同領域を有するカセットを最初に作成し、次いでそれを標的ベクターに組換える二重相同性組換え技術戦略を用いる。組換え操作の1ステップを省くために、標的ベクターに大きな線状分子を繋ぐために2つのオリゴを用いることによる四重組換えを開発した。オリゴは、線状分子に対する相同領域と標的ベクターに対する相同領域とを含む。線状分子の各末端に対するホモロジーアームばかりでなく、ベクターにおける標的領域に対するホモロジーアームも有する100ntのオリゴヌクレオチドを合成した。故に、線状分子はPCR増幅する必要はなく、従って長いものであることができ、それに加えて、PCRベースの変異誘発の問題もない。機能性カセットを含む大きな線状分子は、既存のプラスミド、理想的には、通常のEコリ株内で複製することができないR6K由来プラスミドから放出されることができる。標的ベクターを含むRedETに優れた細胞内にこれら3つの分子の同時形質転換後、この大きな線状分子はオリゴ架橋によってベクターに組換えされる。ここで、この技術を用い、マウスゲノム工学のための遺伝子トラッピングカセットを用いて、マウスゲノムクローンに挿入した。四重組換えにおいて、完全長RecEはRedgbaよりも効率的である。多重組換え2以上の線状分子を線状ベクターへRecET系および完全長RecEによって仲介される相同組換えによって、線状分子を、高い効率で線状ベクターに組換えることができる。RecET系もまた、例えば、多重遺伝子またはオペロンの作成において、複数の線状分子と線状ベクターとの組換えに適用することができる。図11Aは、この戦略の図であり、図11Bは、哺乳動物の発現構築物を作成するための例示的な実験である。各PCR産物は、点線矢印によって示されるように、その隣接分子とオーバーラップする配列同一性領域を有する。最終組換え産物はプラスミド複製起点および選択遺伝子を含むだろう。PCRによって、1つの線状ベクター異なるサイズを有する3つの機能性カセットを作成し、RecETのLアラビノース誘導後にGB2005pirpSC101BADETgAに同時形質転換した。各分子の末端における短いホモロジーアームを用い、invivoで、RecETによって4つの線状分子を組換えた。3回のエレクトロポレーションから、カナマイシンプレート上で34コロニーを選択した。制限酵素分析によって32クローンを検証した。RecET系を用いるcDNAライブラリーの構築通例、cDNAライブラリーの構築は、線状ベクターへの二本鎖cDNA分子のライゲーションに依存する。RecET系においては、LLHRは、エレクトロポレーション当たり3x106コロニーを超える絶対効率を有する。この高い効率に基づいて、LLHRを用いるcDNAライブラリーの構築戦略が提供される。図12Aに示すように、i5’末端におけるホモロジーアームおよび3’末端におけるTのストレッチで構成される3’オリゴヌクレオチドは、mRNAポリA鎖にアニールし、MMLVベースRT逆転写酵素による第一鎖cDNA合成をプライミングするiimRNA5’末端において、RTは、新しく合成された第一鎖cDNAの3’末端に非鋳型ヌクレオチドを付加し続けるiii5’末端におけるホモロジーアームおよび、3’末端におけるGのストレッチ3’ホスフェートで構成される第2オリゴヌクレオチドは、Cトラックにアニールし、第2鎖合成をプライミングする。最終二本鎖cDNAは、クローニングベクターを用いる組換えのためのホモロジーアームを有する。最終生成物は、cDNAライブラリーの構築のためのcDNAプールである。ステップivに特異的プライマーを用いれば、この手順は、遺伝子特異的cDNAの作成に容易に変換することができる。ccdB遺伝子を含む標的ベクターを消化し線状ベクターを放出させ、両末端に相同配列を露出させる。ccdBは逆選択遺伝子であり、未消化または再結合ベクターからのバックグラウンドを抑えるために用いられる。ここでは、ベクターは、一連の発現ベクターまたは単純なクローニングベクターであることができる。二本鎖cDNAおよび線状化クローニングベクターが、線状線状組換えのために、RecETgAを発現するGB2005dirに形質転換される。所望のクローンのスクリーニングは、慣用法によるか、あるいは実施例14および14で後述するRedETリコンビニアリング技術を用いて行うことができる。cDNAプール作成後、ライブラリーの構築なしに、特異的cDNAに対する特異的相同配列を有する、図12Bに示すような線状ベクターを用いて特異的cDNAクローンを探し出すことができる。5kbより大きいcDNAクローンが、LLHRによって首尾よくクローニングできた。従来のcDNAライブラリーからはこれをクローニングすることはできなかった。線状断片内の標的配列のクローニング本実施例において、好都合に置かれた制限部位に依存する必要のない標的配列のクローニング方法を提供する。BACまたはゲノムDNAプールは、多くの制限部位で消化されるが、それらは必ずしも標的領域に近くない。標的領域は無傷のままである。線状ベクターは、サブクローニングされる領域を規定するホモロジーアームと共に用いられる。BACDNAおよびベクターは、完全長RecEを発現し、LLHRを行うことができるEコリ株に、同時エレクトロポレーションすることができる。これによって、組換えおよび、目的とするDNA、例えば線状ベクターの選択マーカーを含む環状ベクターの作成が行われる。この例示的な実験において、上記の戦略を用いて、種々のBACから多くの標的配列がクローニングされた。図13Aに示すように、サブクローニングされる領域を含むBACを、サブクローニングされる領域が無傷のままであるように制限酵素で消化される。p15A複製起点および抗生物質耐性遺伝子を含むベクターを、サブクローニングされる領域の末端に対する2つの配列同一性領域を含むように合成されたオリゴヌクレオチドを用いてPCR増幅した。完全長RecE、RecTおよびRedγ遺伝子が発現されるEコリ株に、BACDNAおよびPCR産物を同時エレクトロポレーションし、次いでアンピシリン耐性に関して選択を行った。図13Bに、この実験の結果の概略を示す。LLHRによって、4つの哺乳動物遺伝子をサブクローニングした。これらの遺伝子を含むBACを切断するために用いた制限酵素は、BACにおけるホモロジーアームに対して最も近い制限部位からの距離で示されている。例えば、Swap70に関しては、BACDNAを切断するためにBstZ171が用いられ、サブクローニングされる領域は、5’末端に最も近いBstZ171部位から2778bp、3’末端に最も近いBstZ171部位から2554bpで開始されていた。各インサートに関して、2つの独立した実験を行った。例えば、Swap70に関しては、2つの実験において、プレート上に53および95のアンピシリン抵抗性コロニーが増殖し、そのうちそれぞれ18を制限マッピングで試験し、それぞれ12が適切であることが見出された。制限酵素分析によって、Tmem56クローンを除いては、クローンの大部分は適切であることが確認された。これは、Tmem56クローンが両方の末端に長い異種配列を有するためである可能性がある。誤った産物のすべては、インサートを有さない再環状化ベクターであることが見出された。故に、分子内組換えが主な競合反応であり、バックグラウンドの主な起源である。ゲノムDNAプールからの遺伝子または遺伝子クラスターの直接クローニング小さなゲノム断片は、PCRによって容易にクローニングすることができる。しかしながら、ゲノムDNAからの大きな断片のクローニングは大変難しく、時間がかかる。ゲノムDNA調製、消化、ベクターへの連結、宿主への形質転換、個々のコロニーピッキング、ライブラリースクリーニングおよびサブクローニングを含む多くの異なるステップが必要である。手順を簡単にし、クローニング効率を上げるために、本明細書において、図14Bに示すように、LLHRに基づく直接クローニング戦略を提供する。実施例13Bに示すように、LLHRからの誤った産物は再環状化ベクターである。短い反復配列の組換えまたは、線状ベクターの外側配列の50ヌクレオチド以内に結合する非相同性末端の組換えによって再環状化ベクターの約80が形成される。この問題を解決するために、2つの直接クローニングベクターを作成した。1つは、自殺毒素遺伝子ccdBに基づく。15AampccdBプラスミドはgyrA246宿主内で複製し、PCR産物の鋳型として用いられる。ccdBは、通常のEコリ株内では致死性であるが、gyrA246変異を含むかまたはそのパートナーであるccdAを発現する株においては複製を許容する。末端が再結合すると、ccdBはampプロモーターにより駆動され、野生型ジャイレースを有するGB2005dirにおいては細胞は生存できない。ゲノムDNAからクローニングされた遺伝子または遺伝子クラスターがccdBの前で組換えされる場合、ccdB発現を駆動するプロモーターは存在せず、GB2005dirにおいては、適切なクローンは生存できる。このベクターは、自己環状化プラスミドバックグラウンドをおおよそ80抑えると考えらえる。しかしながら、ccdBを活性化し有効なクローンを殺す、クローン化配列からの潜在的プロモーター活性のリスクが存在する可能性がある。上記の問題に対する代替解決法は、二重選択を利用するベクターである。このベクターは、ベクターの最末端に2つの抗生物質耐性遺伝子を有する。大部分の分子内組換え事象は、これらの2つの遺伝子の1つの一部を欠失させ、従って対応する抗生物質に対して分子内バックグラウンドを感受性にする。従って、自己環状化バックグラウンドは抑えられると考えられる。正しい産物の同定のためのもう1つの戦略を図14Bに示す。この戦略は、LLHRおよびLCHRを用いる。この戦略は、組換え効率が低い場合の、大きな断片の直接クローニングに特に有用である。DNAは消化または切断され、選択マーカーおよび、標的とされる領域を限定するホモロジーアームを有する線状ベクターと共に、完全長RecEおよびRecTを含むLLHRコンピテント宿主に同時エレクトロポレーションされる。例えばアンピシリンまたはアンピシリンブラストサイジンで選択した後、抵抗性コロニーをプールとして採取し、対象とするクローン化領域の一部に対応する、選択遺伝子に隣接するホモロジーアームをコードする線状DNA分子と共にエレクトロポレーションする。最後の選択遺伝子に対する選択後に正しいコロニーが増殖するだろう。本質的にLLHRステップとそれに続くLCHRステップであるこの戦略を容易にするために、コンビナトリアル宿主を開発した。この宿主、GB2005redは、RedgbaAの発現をアラビノースが誘導するように染色体に組み込まれたBADRedgbaRecAオペロンを有する。RecE、RecT、RedgおよびRecAがラムノース誘導後に発現されるプラスミドpSC101RhaETgAtetもまた導入した。従って、最初に示されたLLHRステップはラムノース誘導後に行い、2番目のLCHRステップはアラビノース誘導後に行った。この宿主の構成は、実施例9および10に示されているような三重および四重組換え実験に関しても、効率を上げるために用いることができる。RecETおよびRed系の両方を発現することによってLLHRおよびLCHRが可能なこのような宿主は、細菌ゲノムの大きなセグメント、例えば二次代謝物産生のためのオペロンのクローニングに特に有用であろう。この戦略の有用性は、フォトラブダスルミネッセンスDSM15139からの大きな遺伝子クラスターの直接クローニングにおいて明らかにされた。この種は、昆虫の生物的防除に用いられる昆虫寄生虫である昆虫病原性線虫ヘテロラブディティスバクテリオフォラの共生種である。フォトラブダスルミネッセンスDSM15139のゲノムは配列決定されており、おおよそ57mbである。染色体内には、10のサイレントまたは未知のPKSNRPS遺伝子クラスターを含む30を超えるタンパク質毒素遺伝子が存在する。このような二次代謝物遺伝子クラスターは、ET組換えおよび完全長RecEによって仲介される直接クローニングには適切な標的である。図15Aおよび15Bに、フォトラブダスルミネッセンスDSM15139において同定された10の遺伝子クラスターを示す。遺伝子クラスターのサイズは、各クラスターの右のすぐ隣に数値で示す。クローニングされた領域のサイズは、右端に数値で示す。図15A、15Bに示す10の遺伝子クラスターのうち9つを、ET組換えを用い、1ラウンドのET組換えで直接にクローニングすることに成功した。オリゴの対を用いて、ホモロジーアームを含む線状ベクターを作成した。種々の制限酵素を用いてゲノムDNAを線状化した。YZ2005においてLLHRを行い、各エレクトロポレーションから12コロニーを96ディープウェルプレートに拾い検証した。このセミハイスループット戦略の使用では、遺伝子クラスターの1つのクローニングには成功しなかった。このクラスターはplu3263であり、細菌ゲノムにおいて認められる大きなst遺伝子の1つである。これは、非リボソームペプチド合成酵素の15モジュールで構成される。この大きな領域を直接にクローニングするために、図14Aで前述した戦略を用いた。表1aは、フォトラブダスルミネッセンスからのこの大きな原核DNAクラスターの直接クローニングにおけるベクターと前述の戦略の利用の成功を示す。ATGの有りなしで第1列に示すように、標的は52616bpまたは50485bpであった。図14Aに示すように、第1列は、どちらの線状構築物が用いられたかを示す。第2列は、エレクトロポレーションに用いられたゲノムDNAの量を示し、第3列は、エレクトロポレーションに用いられた時定数を示す。この戦略のLLHRステップは8回行った。この戦略のLCHRステップは、最初の調製物8つのうち7つに関して5回行った。15クローンが挿入を有していた。そのうち12が、制限酵素分析で検証して適切であった。表1bは、真核DNAであるマウス遺伝子hprtの直接クローニングにおけるベクターおよび前述の戦略の利用の成功を示す。第1LLHR段階は、図14Aに記載したベクターで行った。表の下半分においてはccdBベクターを用い、表の上半分においてはBSDベクターを用いた。各調製物に関して、プロトコルのLCHR段階は5回行った。4クローンにおいて、正しいインサートの作成に成功した。表1Aplu3263のクローニング線状線状の8回のエレクトロポレーションと線状環状の35回のエレクトロポレーションコロニー308挿入を有するクローン1542正しいクローン1242表1BhprtのクローニングLLHRは複製に依存しないが、LCHRは複製に依存するRedgbaまたはRecETgを発現するEコリ細胞における形質転換線状分子は、エキソヌクレアーゼRedαまたはRecEによって5’末端から3’末端に消化されて、3’一本鎖末端が暴露される。ドナーは、LCHRおよびLLHRの両方において線状分子であるが、レシピエントは、LCHRにおいては環状の複製可能なベクターであり、LLHRにおいては線状ベクターである。2つの場合の間には、基本的な差異がある。LCHRにおいては、環状分子は無傷であり、RedαまたはRecEで処理された線状分子は、相同配列が暴露される複製フォークに侵入する。LLHRにおいては、線状分子は共にRedαおよびRecEによって処理され、一本鎖相同配列は反応後に暴露される。invivoでの両方の分子のアニーリングは、RecETによって促進される。LCHRとLLHRとのこの差異によって、LCHRが複製に依存し、LLHRが複製に依存しないことを本発明者らが予測することが可能となった。このことを証明するために、R6K複製起点を用いて2つの実験を設計した。R6Kから複製を開始するのに、pir遺伝子のタンパク質生成物が必要である。R6K複製起点とpir遺伝子とは分離することができ、R6K複製起点のみを含む任意のプラスミドは、pir遺伝子を発現する株内で増殖させることができる。GB2005の染色体にpir遺伝子を挿入することによってGB2005pir株を作成した。GB2005はpirを有さず、従ってR6K複製起点を有するプラスミドは複製することができない。図16Aは、LCHRが複製とは独立して起きることができるかどうかを試験するための実験の概略図である。プラスミドpR6Kpircmhygは、pir遺伝子の5’部分のみを有する。このプラスミドは、pir株GB2005内で複製することができない。pirampのPCR産物は、pir遺伝子の3’部分を有する。pir遺伝子のこの2つの部分の間には、組換えを可能にする相同性が存在する。このPCR産物とこのプラスミドの組換えによって、得られたプラスミドpR6Kpiramphygは、pir株GB2005およびpir株GB2005pirの両方において複製することができる。図16Bに示すように、pir株GB2005において組換えは生じなかった。しかしながら、複製が行われているpir株GB2005pirにおいては組換えが生じた。このことは、LCHRが行われるためには、プラスミドの複製が行われていなければならないことを示している。これはLCHRなので、gbaを発現している細胞はRecETgよりもより効率的に組換えを仲介した。図16Cに記載されているように、等価な実験を用いて、LLHRが、複製が行われることを必要とするかどうかを調べた。LLHRのために、同じ線状分子pirampを用いたが、レシピエントは、鋳型としてpR6Kpircmhygを用いるPCRによって作成された線状ベクターR6Khygpirとした。R6KhygpirPCRは5’部分のみのpir遺伝子および複製起点R6Kを有する。pirampのPCR産物はpir遺伝子の3’部分を有する。2つのPCR産物のLLHRによってプラスミドpR6kpiramphygが生じるが、これはpir株GB2005およびpir株GB2005pirの両方において複製される。LLHRを用いたとき、RedgbaおよびRecETgの発現によってGB2005およびGB2005pirの両方において組換えが生じた。従って、LLHRは複製に依存せず、pirなし、かつ複製なしで生じ得る。ETg系において、完全長RecEの使用が最も効率的であったが、これによって、このような組換えの仲介に完全長RecEが最も適していることが明らかとなった。組換えは、線状分子における修飾末端に影響されるエキソヌクレアーゼRedaおよびRecEは、二本鎖切断の5’末端に作用する。RecEは、5’末端にリン酸を有さない鎖を5’末端から3’末端に分解するが、Redaは、分解を進行させるためには5’末端リン酸を必要とする。5’末端におけるリン酸なしの線状DNA分子は、Redaがそれを処理する前に、最初に、invivoで5’末端でリン酸化されなければならない。分子の末端の修飾は、エキソヌクレアーゼ活性に影響を有するので、LLHRおよびLCHRに対する線状分子の修飾の効果を試験した。異なる5’末端を有する5つのオリゴを本実験に用いた修飾なしリン酸化ホスホロチオエート化相同性末端、5’末端に修飾なし、ヌクレオチド51に内部ホスホロチオエート化あり5’末端にリン酸化、ヌクレオチド51に内部ホスホロチオエート化。実施例1に記載のモデル実験において、これらのオリゴを用いて対称末端または非対称末端を有するPCR産物を製造したが、相同性はPCR産物における50bpである。線状二本鎖PCR産物において、5’末端修飾のない鎖は、RecEによって直接に消化されるか、またはinvivoでのリン酸化後にRedaによって消化されることができる5’末端リン酸化を有する鎖は、RedaおよびRecEによって直接に消化されることができる5’末端ホスホロチオエート化を有する鎖は、RedaおよびRecEの両方によって消化されることができない5’末端に修飾を有さないが、51ntに内部ホスホロチオエート化を有する鎖は、50塩基までRecEによって消化されて、もう1つの鎖における正確な相同性を暴露することができる5’末端にリン酸化を有し、51ntに内部ホスホロチオエート化を有する鎖は、RedaおよびRecEの両方によって塩基50まで直接に消化されて、もう1つの鎖における正確な相同性を暴露することができる。これらのPCR産物を用いるLCHRおよびLLHRを、RedgbaまたはRecETgの発現を有するGB2005において試験した。LCHRにおいては、線状二本鎖分子は、異なる末端を有する2つの鎖からなる25の可能な組み合わせを有するが、そのうちの9つを試験した。LLHRにおいては、両方の分子が線状であるため、625の組み合わせを製造しうるが、本明細書においては、13のみを試験した。RecETgの発現を用いるLCHRにおいて、iSSiでのPCR産物が最高の効率を示すが、他の修飾および修飾なしのOO産物の間にほとんど差異はない。RecETgの発現を用いるLLHRにおいて、iSSiiSSiを有する2つの線状PCR産物の組み合わせが最高の効率を示す。pSSppSSpおよびOSOSはOOOOと同様な効率を示すが、他の組み合わせは、すべて、より低い効率を示す。LCHRおよびLLHRの両方において、ヌクレオチド51におけるホスホロチオエート化は最高の効率を示すか、あるいは少なくとも効率を低下させない。線状分子が内部ホスホロチオエート化によって保護され、相同配列が3’末端において暴露される場合、これは組換えを促進するという事実によってこのことは説明できる。1つの末端にホスホロチオエート化を含む組み合わせのすべては、LLHRにおいてより低い効率を示す。LLHRにおいてRedgbaの発現を用いた場合、PPPPの組み合わせが最も効率的である。5’末端に内部ホスホロチオエート化を含む組み合わせは、修飾なしの組み合わせよりもよく作用する。すべての他の組み合わせは、OOOOの組み合わせよりも低いかまたは同様な効率を示す。Redgbaの発現を用いるLCHRにおいて、結果はLLHRとは逆である。pSSpを有する線状分子は最も低い効率を示す。iSSiを有する線状分子は、OOよりも低い効率を示す。他の組み合わせは、未修飾OOよりも低いか、あるいはそれと同様な効率を示す。invivoで作成された線状化ベクターを用いることによる組換え頻度の増加アラビノース誘導性プロモーターの制御下のベクターに合成ISceI遺伝子を挿入した。発現プラスミドはR6K由来プラスミドであり、これはBAC、p15AまたはpBR322由来プラスミドと適合性である。ISceIの認識部位は30bp配列の5’AGTTACGCTAGGGATAACAGGGTAATATAG3’である。直接クローニング実験のためのレシピエントプラスミドは、図19Aに示す直接クローニングレシピエントであるp15A複製起点ベースプラスミドであった。このプラスミドにおいて、カナマイシン抵抗性遺伝子は2つのISceI認識部位に隣接する。アンピシリンおよびブラストサイジン抵抗性遺伝子もまたバックボーン中に存在する。ISceI発現プラスミドおよびレシピエントプラスミドをGB2005dir細胞に形質転換したとき、LアラビノースによるISceI発現の誘導後に2つの線状断片が産生された。第1線状断片は、2つのISceI認識部位に隣接するカナマイシン耐性遺伝子を示した。第2線状断片は、カナマイシン耐性遺伝子をコードする断片の切除後に残ったベクターのバックボーンを示す。レシピエントプラスミドの10未満が線状化されたため、invivoでのISceIの活性は低い。しかしながら、この実験は、ISceIは、invivoでもレシピエントプラスミドを線状化することを示している。GB2005dirは、ParaBADプロモーターの制御下にあるETgAオペロンをその染色体上に含むEコリ株である。この株をISceIホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターおよびレシピエントベクターの両方で形質転換した。GB2005dir培養物にLアラビノースを添加したとき、組換えタンパク質およびISceIはすべて発現された。次いで、ISceIはinvivoでレシピエントプラスミドを線状化した。誘導1時間後、エレクトロコンピテント細胞が作成され、標準法を用いて、cmPCR産物によって形質転換された。cmPCR産物は、クロラムフェニコール耐性遺伝子および、両末端におけるレシピエントベクターに対する相同性を有するホモロジーアームを含む。形質転換後、cmPCR産物と線状化レシピエントベクターのLLHRが生じた。図21に、ISceI発現プラスミドの有無による組換え率を示す。このデータは、invivoでのレシピエントベクターの線状化によって、組換え効率が劇的に改善されることを示している。本実験は、invivoでのレシピエントベクターの線状化による直接クローニングの改善のための原理の証拠である。例としてのみ本発明を説明してきたが、本発明の範囲内にあるさらなる修飾を行うことができることは明らかであろう。すべての引用は、参照によりその全体が本願に包含される。表2プラスミドおよび株のリストYZ2000遺伝子型thr1leu6thi1lacY1galK2ara14xyl5mtl1proA2his4argE3str31tsx33supE44recB21recC22sbcA23rpsL31tsx33supE44his328mcrAmcrBCmrrhsdMRSDH10B遺伝子型FmcrAΔΦ80dlacZΔM15ΔlacX74endA1recA1deoRΔ7697araD139galUgalKnupGrpsLλ表3薬剤選択マーカー参考文献