"aオイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化し、平滑末端化された核酸フラグメントを生成する工程;bオイル中の液滴内で平滑末端化された核酸フラグメントをリン酸化し、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程;cオイル中の液滴内でA-tailをリン酸化された核酸フラグメントに結合させ、A-tail化された核酸フラグメントを生成する工程;およびdオイル中の液滴内で核酸アダプターをA-tail化された核酸フラグメントに結合させ、アダプター結合核酸フラグメントを含む核酸ライブラリーを生成する工程、を含む、オイルと接触した液滴内の核酸ライブラリーの作製方法。aオイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化し、平滑末端化された核酸フラグメントを生成する工程;bオイル中の液滴内で平滑末端化された核酸フラグメントをリン酸化し、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程;およびcオイル中の液滴内で核酸アダプターを平滑末端化された核酸フラグメントに結合させ、アダプター結合核酸フラグメントを含む核酸ライブラリーを生成する工程、を含む、オイルと接触した液滴内での核酸ライブラリーの作製方法。工程1dからのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程1aに入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも5である、請求項1以降のいずれかに記載の方法。工程1dからのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程1aに入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも10である、請求項1以降のいずれかに記載の方法。工程1dからのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程1aに入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも15である、請求項1以降のいずれかに記載の方法。工程1dからのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程1aに入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも20である、請求項1以降のいずれかに記載の方法。工程1dからのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程1aに入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも50である、請求項1以降のいずれかに記載の方法。工程1dからのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程1aに入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも75である、請求項1以降のいずれかに記載の方法。工程1dからのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程1aに入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも90である、請求項1以降のいずれかに記載の方法。工程1dからのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程1aに入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも95である、請求項1以降のいずれかに記載の方法。工程1dからのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程1aに入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも99である、請求項1以降のいずれかに記載の方法。単一の液滴内で、工程1aおよび工程1bが共に行われる、請求項1に記載の方法。単一の液滴内で、工程1bおよび工程1cが共に行われる、請求項1に記載の方法。単一の液滴内で、工程1a、工程1bおよび工程1cが共に行われる、請求項1に記載の方法。工程1bの開始前に、平滑末端化された核酸フラグメントを精製する工程を含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。工程1cの開始前に、リン酸化された核酸フラグメントを精製する工程を含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。工程1dの開始前に、A-tail化された核酸フラグメントを精製する工程を含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。前記精製工程が、オイル中の液滴内でビーズ上に核酸を捕捉する工程およびオイル中で前記ビーズを洗浄する工程を含む、請求項15以降のいずれかに記載の方法。前記ビーズが、電荷スイッチビーズまたは固相可逆固定ビーズを含む、請求項18に記載の方法。前記精製工程が、以下の工程を含む、請求項18以降のいずれかに記載の方法。a洗浄液滴と、前記ビーズを含む液滴とを混合し、混合された液滴を生成する工程;およびb前記ビーズを拘束している間に前記混合された液滴を分割し、前記ビーズを含む娘液滴と、前記ビーズを実質的に含まない娘液滴とを生成する工程。工程20bでのいかなるビーズ損失も、核酸ライブラリーをその意図された目的に不適当とするのに十分なものではない、請求項20に記載の方法。前記核酸フラグメントが、5’-突出および/または3’-突出を有する核酸フラグメントを含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。平滑末端化工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化試薬を含む液滴とを混合する工程を含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。リン酸化工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と、リン酸化試薬を含む液滴とを混合する工程を含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。A-tailを結合させる工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と、A-tail化試薬を含む液滴とを混合する工程を含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。核酸アダプターを結合させる工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と、アダプター結合試薬を含む液滴とを混合する工程を含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。aオイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化およびリン酸化し、平滑末端化/リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程;b結合バッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、オイル中の液滴内で前記平滑末端化/リン酸化された核酸フラグメントを捕捉する工程;c水性バッファーを用いて、オイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズを洗浄する工程;dオイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズから前記平滑末端化/リン酸化された核酸フラグメントを溶離する工程;eオイル中の液滴内で前記リン酸化された核酸フラグメントの両末端にA-tailを結合させ、A-tail化された核酸フラグメントを生成する工程;f結合バッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、オイル中の液滴内で前記A-tail化された核酸フラグメントを捕捉する工程;g水性バッファーを用いて、オイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズを洗浄する工程;hオイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズから前記A-tail化された核酸フラグメントを溶離する工程;iオイル中の液滴内で核酸アダプターを前記A-tail化された核酸フラグメントに結合させ、アダプター結合核酸フラグメントを生成する工程;j結合バッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、オイル中の液滴内で前記アダプター結合核酸フラグメントを捕捉する工程;k水性バッファーを用いて、オイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズを洗浄する工程;lオイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズから前記アダプター結合核酸フラグメントを溶離する工程;およびmオイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズから前記アダプター結合核酸フラグメントを分離する工程、を含む、オイルと接触した液滴内での核酸ライブラリー構築を行う方法。工程27mからの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程27aに入力された核酸フラグメントの少なくとも5である、請求項27以降のいずれかに記載の方法。工程27mからの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程27aに入力された核酸フラグメントの少なくとも10である、請求項27以降のいずれかに記載の方法。工程27mからの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程27aに入力された核酸フラグメントの少なくとも15である、請求項27以降のいずれかに記載の方法。工程27mからの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程27aに入力された核酸フラグメントの少なくとも20である、請求項27以降のいずれかに記載の方法。工程27mからの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程27aに入力された核酸フラグメントの少なくとも50である、請求項27以降のいずれかに記載の方法。工程27mからの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程27aに入力された核酸フラグメントの少なくとも75である、請求項27以降のいずれかに記載の方法。工程27mからのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程27aに入力された核酸フラグメントの少なくとも90である、請求項27以降のいずれかに記載の方法。工程27mからの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程27aに入力された核酸フラグメントの少なくとも95である、請求項27以降のいずれかに記載の方法。工程27mからの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程27aに入力された核酸フラグメントの少なくとも99である、請求項27以降のいずれかに記載の方法。前記核酸ライブラリーを増幅する工程をさらに含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。液滴アクチュエーター上で前記核酸ライブラリーを増幅する工程をさらに含む、請求項27以降のいずれかに記載の方法。自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに含む、請求項27以降のいずれかに記載の方法。核酸増幅工程の介在なく、自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに含む、請求項27以降のいずれかに記載の方法。核酸増幅工程を行わずに、自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに含む、請求項27以降のいずれかに記載の方法。核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、平滑末端化試薬およびリン酸化試薬を含む1つ以上の試薬液滴とを混合し、平滑末端化/リン酸化された核酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する工程を含む、オイルと接触した液滴内での平滑末端化/リン酸化された核酸フラグメントを作製する方法。前記プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、捕捉液滴中で、前記平滑末端化/リン酸化された核酸フラグメントを捕捉する工程をさらに含む、請求項42に記載の方法。洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて、前記固相可逆固定ビーズを洗浄し、前記平滑末端化/リン酸化された核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程をさらに含み、前記洗浄バッファー液滴が実質的に水性バッファーからなる、請求項43に記載の方法。洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離された平滑末端化/リン酸化された核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程をさらに含む、請求項44に記載の方法。前記平滑末端化/リン酸化された核酸フラグメントを前記固相可逆固定ビーズから分離し、オイル中に前記平滑末端化/リン酸化された核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程をさらに含む、請求項45に記載の方法。平滑末端化された核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、核酸および結合試薬を含む1つ以上の試薬液滴とを混合し、結合核酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する工程を含む、オイルと接触した液滴内での平滑末端化された核酸フラグメントに核酸を結合する方法。前記プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、前記結合核酸フラグメントを捕捉する工程をさらに含む、請求項47に記載の方法。洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて、前記固相可逆固定ビーズを洗浄し、前記結合核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程をさらに含み、前記洗浄バッファー液滴が実質的に水性バッファーからなる、請求項48に記載の方法。洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離された結合核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程をさらに含む、請求項49に記載の方法。前記A-tail化された核酸フラグメントを前記固相可逆固定ビーズから分離し、オイル中に前記結合核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程をさらに含む、請求項50に記載の方法。核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、A-tail化試薬を含む1つ以上の試薬液滴とをオイル中で混合し、A-tail化された核酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する工程を含む、オイルと接触した液滴内でA-tail化された核酸フラグメントを作製する方法。前記プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、前記A-tail化された核酸フラグメントを捕捉する工程をさらに含む、請求項52に記載の方法。洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて、前記固相可逆固定ビーズを洗浄し、前記A-tail化された核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程をさらに含み、前記洗浄バッファー液滴が実質的に水性バッファーからなる、請求項53に記載の方法。洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離されたA-tail化された核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程をさらに含む、請求項54に記載の方法。前記A-tail化された核酸フラグメントを前記固相可逆固定ビーズから分離し、オイル中に前記A-tail化された核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程をさらに含む、請求項55に記載の方法。核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、A-tail化試薬を含む1つ以上の試薬液滴とをオイルと接触させて混合し、アダプター結合核酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する工程を含む、オイルと接触した液滴内でアダプター結合核酸フラグメントを作製する方法。前記プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、前記アダプター結合核酸フラグメントを捕捉する工程をさらに含む、請求項57に記載の方法。洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて、前記固相可逆固定ビーズを洗浄し、前記アダプター結合核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程をさらに含み、前記洗浄バッファー液滴が実質的に水性バッファーからなる、請求項57に記載の方法。洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離されたアダプター結合核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程をさらに含む、請求項58に記載の方法。前記アダプター結合核酸フラグメントを前記固相可逆固定ビーズから分離し、オイル中に前記アダプター結合核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程をさらに含む、請求項59に記載の方法。オイルと接触させて以下の工程の実行を含む、オイルと接触した液滴内で核酸フラグメントを精製する方法:a前記核酸フラグメントを含む液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、前記核酸フラグメントを捕捉する工程;b洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて、前記固相可逆固定ビーズを洗浄し、前記核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程;c洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離された平滑末端化/リン酸化された核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程;およびd前記核酸フラグメントを前記固相可逆固定ビーズから分離し、前記精製された核酸フラグメントを含む液滴をオイル中に生成する工程。前記洗浄バッファー液滴が、実質的に水性バッファーからなる液滴を含む、請求項62以降のいずれかに記載の方法。前記水性バッファーが、実質的に結合バッファーからなる、請求項63に記載の方法。前記水性バッファーが、実質的に有機溶媒を含まない、請求項63に記載の方法。前記水性バッファーが、約10以下の有機溶媒を含む、請求項63に記載の方法。前記水性バッファーが、実質的にエタノールを含まない、請求項63に記載の方法。前記水性バッファーが、約10以下のエタノールを含む、請求項63に記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、少なくとも約25の有機溶媒を含む液滴を含む、請求項62以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、少なくとも約50の有機溶媒を含む液滴を含む、請求項62以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、少なくとも約75の有機溶媒を含む液滴を含む、請求項62以降のいずれかに記載の方法。前記有機溶媒が、アルコールを含む、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記有機溶媒が、エタノールを含む、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記有機溶媒が、実質的にエタノールからなる、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、塩と混合される、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、NaClと混合される、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、約0.01~約100mMの量の塩を含む、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、約0.1~約10mMの量の塩を含む、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、洗浄バッファーに可溶な約0.01~約100mMの量の正塩と、混合される、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、洗浄バッファーに可溶な約0.1~約10mMの量の正塩と、混合される、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、洗浄バッファーに可溶な約0.01~約100mMの量の単塩と、混合される、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、洗浄バッファーに可溶な約0.1~約10mMの量の単塩と、混合される、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、NaClと、約0.01~約100mMの量で混合される、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記洗浄バッファー液滴が、NaClと、約0.1~約10mMの量で混合される、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記塩の存在しない前記有機溶媒を含む前記洗浄バッファー液滴に比べて、前記塩が、1つ以上の電気濡れ液滴操作の再現性を向上させる、請求項69以降のいずれかに記載の方法。前記1つ以上の電気濡れ液滴操作が、液滴輸送、液滴分割、および液滴分配からなる群より選択される、請求項85に記載の方法。前記オイルが、シリコーンオイルを含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。前記オイルが、フルオロシリコーンオイルを含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。核酸増幅工程の介在なく、自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。核酸増幅工程を行わずに、自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。前記液滴が、液滴アクチュエーターで制御される、請求項1以降のいずれかに記載の方法。前記液滴アクチュエーターが、電極媒介液滴操作を含む液滴操作を用いて前記工程を制御する、請求項92に記載の方法。電極媒介液滴操作が、電気濡れ媒介液滴操作を含む、請求項93に記載の方法。電極媒介液滴操作が、光電濡れ媒介液滴操作を含む、請求項93に記載の方法。電極媒介液滴操作が、誘電泳動媒介液滴操作を含む、請求項93に記載の方法。前記工程が、オペレーターの干渉なしに、単一の液滴アクチュエーター上で一体的に実行される、請求項1以降のいずれかに記載の方法。オイルと接触した前記液滴が、実質的に前記オイルに囲まれている、請求項1以降のいずれかに記載の方法。オイルと接触した前記液滴が、前記オイルに浮いている、請求項1以降のいずれかに記載の方法。オイルと接触した前記液滴が、前記オイルに沈んでいる、請求項1以降のいずれかに記載の方法。オイルと接触した前記液滴が、分離した2つの基板の間に挟み込まれて、前記オイルを含む液滴操作間隙を形成している、請求項1以降のいずれかに記載の方法。オイルと接触した前記液滴が、分離した2つの基板の間に挟み込まれて、前記オイルで実質的に充填された液滴操作間隙を形成している、請求項1以降のいずれかに記載の方法。核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化試薬を含む液滴とを、オイルに接触させて混合し、平滑末端化反応を行い、平滑末端化された核酸フラグメントを生成する工程を含む、核酸フラグメントを平滑末端化する方法。平滑末端化された核酸フラグメントを含む液滴と、リン酸化試薬を含む液滴とを、オイルに接触させて混合し、リン酸化反応を行い、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程を含む、核酸フラグメントをリン酸化する方法。平滑末端化された核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化およびリン酸化試薬を含む液滴とを、オイルに接触させて混合し、平滑末端化およびリン酸化反応を行い、平滑末端化され、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程を含む、核酸フラグメントを改質する方法。リン酸化された核酸フラグメントを含む液滴と、A-tail化試薬を含む液滴とを、オイルに接触させて混合し、A-tail化反応を行い、A-tail化された核酸フラグメントを生成する工程を含む、核酸フラグメントをA-tail化する方法。第1の核酸を含む液滴と、第2の核酸および結合試薬を含む1つ以上の液滴とを、オイルに接触させて混合する工程を含む、核酸フラグメントを結合する方法。前記第1の核酸が、A-tail化された核酸を含み、前記第2の核酸が、アダプターを含む、請求項107に記載の方法。オイル中の液滴内で前記アダプターを結合し、環状核酸を形成する工程をさらに含む、請求項1以降のいずれかに記載の方法。オイル中の液滴内で前記環状核酸をフラグメント化する工程をさらに含む、請求項109に記載の方法。液滴アクチュエーターと、請求項1以降の方法のいずれかを実行するようプログラムされたコントローラーとを含む、システム。請求項1以降の方法のいずれかを実行するようプログラムされたエンコードされたソフトウェアを含む、ストレージ媒体。請求項112のストレージ媒体が装着された液滴アクチュエーター。以下を備える液滴アクチュエーター:a頂部基板および底部基板、当該2つの基板は、高さh1を有する液滴操作間隙を形成するように構成されている;b前記底部基板と前記頂部基板との一方または両方と結合した電極を含み、かつ、高さh1を有する前記液滴操作間隙で液滴操作を実行するために構成された電極通路;およびc前記2つの基板の間に高さh2を有する空隙を形成するように構成された前記頂部基板または前記底部基板の一方に形成された陥凹エリア、ここでh2はh1よりも大きい。液滴が存在するとき電極を非活性化すると液滴が前記電極から前記陥凹エリアに流れるような液滴操作を実行するために構成された電極に、前記空隙が隣接している、請求項114以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーター。液滴のよりエネルギー的に安定なコンホメーションへの変形により引き起こされる移動の結果として、液滴が前記空隙に入る、請求項114以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーター。前記空隙が、前記電極通路の電極の再活性化時に高さh1を有する前記間隙領域に、前記液滴が再突入するのを防止するように選択された寸法を有する、請求項114以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーター。前記陥凹エリアの形状が、h1からh2への階段形状を含む、請求項114以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーター。前記陥凹エリアの形状が、h1からh2へのスロープを含む、請求項114以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーター。前記陥凹エリアが、前記頂部基板、前記底部基板、または両方の基板に形成されている、請求項114以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーター。前記陥凹エリアが、その頂部で開放されている、請求項120以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーター。液滴を液滴アクチュエーター内の電極頂部から移動する方法であって、当該方法は、電極を非活性化して、前記液滴を前記液滴アクチュエーターの隣接領域に移動させ、前記液滴が前記電極頂部でのコンホメーションと比べてよりエネルギー的に安定なコンホメーションをとる工程を含む。液滴アクチュエーター内の初期位置の液滴を移動する方法であって、当該方法は、電極を非活性化して、前記液滴を前記液滴アクチュエーターの隣接領域に移動させ、前記液滴が初期位置でのコンホメーションと比べてよりエネルギー的に安定なコンホメーションをとる工程を含む。a前記液滴アクチュエーターが、以下を備え:頂部基板および底部基板、当該2つの基板は、高さh1を有する液滴操作間隙を形成するように構成されている;電極を含む電極通路、前記間隙が前記電極の領域で高さh1を有する;および前記2つの基板の間に高さh2を有する空隙を形成するように構成された前記頂部基板または前記底部基板の一方に形成された電極に隣接する陥凹エリア、ここでh2はh1よりも大きい;ならびにb前記移動が、高さh1を有する前記間隙領域から、高さh2を有する前記間隙領域までである、請求項123に記載の方法。前記移動が、前記電極の再活性化で前記液滴を前記電極頂部のそれ以前の位置に戻すことができないような永久的なものである、請求項123以降のいずれかに記載の方法。前記移動が、前記電極の再活性化で前記液滴が前記電極頂部のそれ以前の位置に戻るような一時的なものである、請求項123以降のいずれかに記載の方法。移動した前記液滴が、第3電極の活性化で前記液滴が第3電極頂部の位置に移動するような第3電極に隣接する位置にある、請求項123以降のいずれかに記載の方法。前記陥凹エリアの形状が、h1からh2への階段形状を含む、請求項124以降のいずれかに記載の方法。前記陥凹エリアの形状が、h1からh2へのスロープを含む、請求項124以降のいずれかに記載の方法。前記陥凹エリアが、前記頂部基板、前記底部基板、または両方の基板に形成される、請求項124以降のいずれかに記載の方法。前記陥凹エリアが、その頂部で開放されている、請求項124以降のいずれかに記載の方法。aリザーバ電極の区分けされた通路の端で液滴源を収集する工程;b通路電極と通路側面電極とのセットに沿って液滴源を延伸する工程;c前記通路側面電極を非活性化する工程;およびd1つ以上の前記通路電極を非活性化し、分配された液滴と、前記液滴源の残余部分とを生成する工程、を含む、液滴を分配する方法。a前記液滴源が、磁気応答性ビーズを含み;b磁場が、前記磁気応答性ビーズを前記通路電極頂部の液滴領域に引き付ける場所に供給され;c前記非活性化工程が、前記液滴源から多量の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する、請求項132に記載の方法。前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも25の磁気応答性ビーズを有する前記分配された液滴を生成する、請求項133に記載の方法。前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも50の磁気応答性ビーズを有する前記分配された液滴を生成する、請求項133に記載の方法。前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも75の磁気応答性ビーズを有する前記分配された液滴を生成する、請求項133に記載の方法。前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも90の磁気応答性ビーズを有する前記分配された液滴を生成する、請求項133に記載の方法。前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも95の磁気応答性ビーズを有する前記分配された液滴を生成する、請求項133に記載の方法。前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも99の磁気応答性ビーズを有する前記分配された液滴を生成する、請求項133に記載の方法。前記非活性化工程が、前記液滴源から実質的に全ての磁気応答性ビーズを有する前記分配された液滴を生成する、請求項133に記載の方法。前記液滴源が、数千の磁気応答性ビーズを含む、請求項133以降のいずれかに記載の方法。前記液滴源が、数百万の磁気応答性ビーズを含む、請求項133以降のいずれかに記載の方法。以下を備える液滴アクチュエーターアセンブリ:a1つ以上の基板;b前記1つ以上の基板上の一連の反応レーン、各反応レーンは、電極の通路を有する;c前記1つ以上の基板上の液滴分配電極アセンブリの第1セット、当該第1セットの各アセンブリは、他のいずれの前記反応レーンも横切ることなく1の前記反応レーン上にサンプル液滴を分配するように配置されている;d前記1つ以上の基板上の液滴分配電極アセンブリの第2セット、当該第2セットの各アセンブリは、1の前記反応レーン上に試薬液滴を分配するように配置されている。a前記1つ以上の基板が配置され、液滴操作間隙を形成し;およびb前記反応レーンが、前記液滴操作間隙内に位置している、請求項143に記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。流体通路を含み、当該流体通路は、前記液滴操作間隙の外側から前記液滴操作間隙まで延び、かつ、1つ以上の液滴分配電極の前記第1セット近傍に液体を供給するように配置されている、請求項144以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。流体通路を含み、当該流体通路は、前記液滴操作間隙の外側から前記液滴操作間隙まで延び、かつ、1つ以上の液滴分配電極の前記第2セット近傍に液体を供給するように配置されている、請求項144以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。液滴分配電極アセンブリの前記第1セットの各々が、サンプル流体を含むリザーバと結合している、請求項143以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。少なくとも2つの反応レーンを含む、請求項143以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。少なくとも8つの反応レーンを含む、請求項143以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。少なくとも16の反応レーンを含む、請求項143以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。少なくとも24の反応レーンを含む、請求項143以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。少なくとも48の反応レーンを含む、請求項143以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。少なくとも96の反応レーンを含む、請求項143以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。液滴分配電極アセンブリの前記第2セットの各々が、ライブラリー構築試薬を含むリザーバに位置している、請求項143以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。液滴分配電極アセンブリの前記第2セットが、サブセットに分割されていて、各サブセットが、他のいずれの前記反応レーンも横切ることなく同一の一の前記反応レーン上にサンプル液滴を分配するように配置されている2つ以上の液滴分配電極アセンブリを含む、請求項154に記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。液滴分配電極アセンブリの各サブセット内で、斯かるサブセット内の各アセンブリは、異なるライブラリー構築試薬を含むリザーバに結合している、請求項155に記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。前記試薬が、平滑末端化試薬、リン酸化試薬、A-tail化試薬、およびアダプター結合試薬から選択される、請求項156に記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。前記反応レーン周辺の磁場が、前記反応レーンの1つ以上の領域で液滴中の磁気応答性ビーズを固定するのに十分な強さを有するように、前記反応レーンに対して配置された磁石配列をさらに含む、請求項143以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。前記反応レーン周辺の磁場が、前記反応レーンの前記電極により制御された液滴分割反応の間、液滴中の磁気応答性ビーズを拘束するのに十分な強さを有するように前記反応レーンに対して配置された磁石配列をさらに含む、請求項143以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。前記磁石配列が、前記磁場の強化された領域を作り出すように配置された磁石を含み、当該強化された領域が、前記反応レーンにそろって、前記反応レーンで磁気応答性ビーズを固定する、請求項158に記載の液滴7発明の詳細な説明本発明は、核酸ライブラリーを構築する方法を提供する。本発明の方法は、通常、オイル等の非混和性の流体中でサンプル液滴および試薬液滴を使用する。一の実施態様では、本発明の方法は、入力サンプルとしてフラグメント化された核酸を使用し、核酸配列決定方法の次の工程のためのアダプター結合核酸ライブラリーにより終了し、核酸配列決定方法は、FHoffmannLaRoche社、LifeTechnology社、Illumina社、HelicosBioSciences社およびPacificBiosciencesofCalifornia社等から入手可能または開発されているプラットフォーム等の次世代配列決定プラットフォームを使用する。本発明の方法の開始及び終了のいずれにおいても、サイズ分画、核酸フラグメンテーション、逆転写、核酸増幅、二本鎖ヌクレアーゼ処理、ターゲット濃縮、ターゲット配列捕捉、サイズ選択、および核酸出力の定量化例えば、ゲル電気泳動、qPCR、または他の方法による等の追加の工程が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の化学的な手法は、液滴アクチュエーター装置を用いて実行されてもよい。方法全体における収率、特定の工程における収率、結果までの時間、試薬消費量、およびバイアス等のライブラリー構築のパラメーターは、当技術分野の現状を超えて非常に向上している。本発明は、核酸ライブラリー構築を超えた用途を有する新規な装置、手法および検査工程も提供する。7.1ライブラリー構築本発明の典型的なライブラリー構築手順は、いくつかの酵素反応の工程を含む。酵素反応の工程の一部または全部の後に核酸精製を行ってもよい。酵素反応の工程は、1倍、2倍、3倍、4倍サイズの液滴等の単位サイズ化された液滴を用いて行ってもよい。酵素反応の工程は、非混和性または実質的に非混和性の充填流体で、被覆された、部分的に充填された、または実質的に充填された液滴アクチュエーター内の2枚の基板の間で圧迫された液滴のように、液滴が、非混和性または実質的に非混和性の充填流体に浮遊しているまたは沈降している間、あるいは非混和性または実質的に非混和性の充填流体に完全にまたは部分的に囲まれている間に行ってもよい。したがって、本明細書では、液滴操作が記載されるところのいずれでも、液滴が、i非混和性または実質的に非混和性の充填流体内に浮遊しているまたは沈降している間、あるいは、ii非混和性または実質的に非混和性の充填流体に完全にまたは部分的に囲まれている間、または、iii非混和性または実質的に非混和性の充填流体で、被覆された、部分的に充填された、または実質的に充填された液滴アクチュエーター内の2枚の基板の間で圧迫されている間に、液滴操作を行ってもよいことが理解される。さらに、斯かる充填流体は、本明細書で記載されるようなオイル系充填流体であることが好ましいことが理解される。本発明の方法の液滴操作の一部または全ては、液滴アクチュエーターで行ってもよい。本発明のライブラリー作製方法は、フラグメント化された核酸を利用する。フラグメント化された核酸は、物理的せん断方法;超音波処理;制限エンドヌクレアーゼ等の酵素方法;および他の化学的方法と同様に斯かる方法の組み合わせ等のいずれかの核酸フラグメンテーション方法を用いて調製されてもよい。フラグメントサイズは、ランダムまたは非ランダムであってもよい。フラグメントはサイズ分画されていてもよいし、サイズ分画されていなくてもよい。核酸のフラグメンテーションは、液滴アクチュエーターでまたは液滴アクチュエーター外で行われてもよい。液滴アクチュエーターで、非フラグメント化されたサンプルを含む液滴を、フラグメンテーション試薬を含む1つ以上の液滴と共に液滴操作を用いて混合して、フラグメント化された核酸を含む液滴を生成してもよい。フラグメント化された核酸は、次の工程のために液滴アクチュエーターから除去されてもよいし、またはサンプル調製方法の次の工程にかけられてもよいし、もしくは液滴アクチュエーターで次の工程にかけられてもよい。液滴アクチュエーターでの核酸サンプルのフラグメンテーションを促進するために有用な超音波処理の設定の例は、Srinivasanらによる2010年7月15日に出願された題名SystemsforandMethodsofPromotingCellLysisinDropletActuatorsの米国特許出願第61364645号に記載されており、その開示全体がを参照により本明細書に援用される。図1は、フラグメント化された核酸を用いて核酸ライブラリーの構築のための例示的な手順100の工程を示すフローチャートである。手順100は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。平滑末端化工程105では、5’-および/または3’-突出を有する核酸フラグメントが、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性と5’→3’ポリメラーゼ活性の両方を有するT4DNAポリメラーゼを用いて平滑末端化される。液滴アクチュエーターで、平滑末端化工程は、サンプル液滴と、平滑末端化試薬を有する液滴とを分配および混合する液滴操作を用いて達成され得る。平滑末端化工程の後に、核酸を精製して例えば、ビーズ系洗浄手順、続く工程に干渉し得る、酵素および組み込まれなかったdNTPsを除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。平滑末端化工程105は、平滑末端化されたフラグメントを調製するフラグメンテーションスキームが用いられる場合は、省略してもよい。リン酸化工程110では、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、リン酸エステルを平滑末端化された核酸の5’-ヒドロキシ末端に結合してもよい。液滴アクチュエーターで、リン酸化工程は、リン酸化試薬を含む液滴を分配し、当該液滴と、工程105により調製された平滑末端化された核酸を含む液滴とを混合する液滴操作を用いて達成され得る。平滑末端化工程の後に、核酸を精製して例えば、ビーズ系洗浄手順、酵素と、続く工程に干渉し得る過剰な試薬とを除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。平滑末端化工程105とリン酸化工程110は、容易に組み合され得る。例えば、ILLUMINA登録商標対末端DNAサンプル調製キット、およびNEBNEXT登録商標DNAサンプル調製試薬セット1、および他の市販のキット内で、平滑末端化試薬とリン酸化試薬とは一般に組み合わされている。当該組み合わされた工程のための核酸精製は、個々の工程について記載したようにビーズ系混合および分割液滴洗浄手順を用いて達成されてもよい。平滑末端化工程105とリン酸化工程110とが分けられる場合、当該工程の間に洗浄工程を行う必要はない。平滑末端化試薬を含む液滴は、液滴操作を用いて、サンプル液滴と、分配および混合されてもよく;次いで、リン酸化酵素を含む液滴は分配され、液滴操作を用いて、サンプルおよび平滑末端化試薬を含む液滴に混合されてもよい。この工程により調製された液滴中の核酸は、次いで、本明細書に記載のように、捕捉され、精製されてもよい。A-tail化工程115では、クレノウ3’→5’エキソ-DNAポリメラーゼIを用いて、A-tailを、リン酸化され、平滑末端化された核酸フラグメントの両端に付けてもよい。その反応は、好適には約37°Cで起こる。dATPの存在下、クレノウ3’→5’エキソ-DNAポリメラーゼIは、非テンプレート3’付加に触媒作用を及ぼす。液滴アクチュエーターで、A-tail化工程は、液滴操作を用いてA-tail化試薬を含む液滴を分配し、当該液滴と、工程110により調製されたリン酸化された核酸を含む液滴とを混合することにより達成され得る。液滴アクチュエーターで、この反応は、室温と同程度の低い温度、または、37°C程度またはいくつかの場合はさらに高い温度で達成され得る。A-tail化反応後に、クレノウDNAポリメラーゼIは、反応液滴と、不活性化試薬を含む液滴とを混合する液滴操作を行うことにより不活性化例えば、化学的不活性化される、または反応液滴を所望の活性を達成するために選択した温度および時間で保温することにより熱不活性化される等、不活性化されてもよい。温度は、通常、約20~60分間、約35~約75°C等、室温を超えて昇温される。あるいは、核酸は精製され、ビーズ系洗浄手順を用いて酵素除去されてもよく、当該手順で、核酸はビーズ上に捕捉され、当該ビーズは洗浄手順にかけられる。アダプター結合工程120では、T4DNAリガーゼを用いて核酸アダプターをA-tail化された核酸フラグメントに結合してもよい。T4DNAリガーゼは、並列5’-リン酸エステルに存在する付着末端と、二本鎖核酸の3’-ヒドロキシ末端と、の間のリン酸エステル結合の形成に触媒作用を及ぼす。その反応は、所望のアダプター結合を達成するために選択した温度と時間例えば、約20°Cで約30分間で起こり得る。液滴アクチュエーターで、アダプター結合工程は、アダプターと結合試薬とを含む液滴を分配し、当該液滴と、工程115により調製されたA-tail化された核酸を含む液滴と、を混合する液滴操作を用いて達成され得る。結合工程の後に、核酸を精製して例えば、ビーズ系洗浄手順を用いて、続くPCR増幅工程に干渉し得る組み込まれなかったアダプターを除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。いくつかの実施形態では、アダプターの核酸に対する比は、約10:1モルより大きく、または約15:1モルより大きく、または約20:1モルより大きく、または約25:1モルより大きく、または約30:1モルより大きく、またはより高い。さらに他の実施形態では、アダプターの核酸に対する比は、約1:1~約10:1である。放出された核酸は、次いで、いずれかの核酸増幅技術を用いて増幅されてもよい。増幅は、液滴アクチュエーターで、例えば、フロースルー熱サイクル方法を用いて行ってもよく、または核酸は別の装置で増幅のために液滴アクチュエーターから除去されてもよい。しかしながら、本発明の一の実施態様では、本出願人は、本発明の方法が従来のライブラリー構築方法よりもはるかに高い収率をもたらすことを発見した。その結果として、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ライブラリー構築後に増幅工程の介在なく、核酸ライブラリーを配列決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、20以下のサイクル、または15以下のサイクル、または10以下のサイクル、または5以下のサイクル、またはちょうど1または2サイクル等の、最小限の増幅で、ライブラリー構築後に、核酸ライブラリーを配列決定する方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、液滴アクチュエーターからライブラリー液滴を除去する工程と、増幅工程の介在なく、または、最小限の増幅例えば、20以下のサイクル、または15以下のサイクル、または10以下のサイクル、または5以下のサイクル、またはちょうど1または2サイクルと共に、当該ライブラリーを配列決定装置上に装填する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ライブラリー構築後に、濃縮増幅工程の介在なく、核酸ライブラリーを配列決定する方法を提供する。一の実施形態では、アダプター結合工程120は、約15~約24°C、または約17~約23°C、または約19~約21°C、または約20°C等の室温未満の温度で達成され得る。他の代わりの実施形態では、平滑末端化工程105、リン酸化工程110、およびA-tail化工程115は組み合わされてもよい。液滴アクチュエーターで、当該実施形態は、液滴操作を用いて、平滑末端化試薬、リン酸化試薬、およびA-tail化試薬を含む液滴を分配する工程と、分配された液滴と核酸サンプル液滴とを混合する工程とを含み、サンプル核酸の平滑末端化、リン酸化、およびA-tail化を達成する。核酸は、続くアダプター結合工程で精製された核酸を提供するために、例えば、本明細書の他の箇所に記載のように、ビーズに捕捉され、洗浄されてもよい。他の実施形態では、核酸精製工程は、アダプター結合工程の後のみ行われる。さらに他の実施形態では、1つ以上の捕捉工程および溶離工程を、ライブラリー構築方法のいずれかの工程の後に行ってもよい。例えば、平滑末端化工程、リン酸化工程、および/またはA-tail化工程の後に、液滴は、核酸捕捉ビーズを含む液滴と組み合わされてもよい。ビーズは、磁石を用いて拘束されてもよく、ビーズを囲む液滴中の過剰の液体は、液滴をビーズから離れて輸送することによりスナップオフしてもよい。ビーズは、ビーズを囲む最小量の液体を残して留置される。他の液滴をそのビーズと接触させるように輸送して、この最小量の液体と新しい液滴の液体とを混合し、新しく混合された液滴内にビーズを懸濁させることにより、そのビーズを捕捉してもよい。したがって、例えば、新しい液滴は、ビーズから捕捉された核酸を溶離させるための試薬を含んでいてもよい。ビーズは、磁石を用いて再度拘束されてもよく、ビーズを囲む液滴中の過剰の液体は、液滴をビーズから離れて輸送することによりスナップオフしてもよい。この液滴は、溶離した核酸を含み、当該核酸は、次いで、ライブラリー作製方法の次の工程にさらされてもよい。ビーズは、スナップオフプロセスの間、拘束されていてもよく、その後、磁石の移動または電磁石のスイッチを切ることにより、次の液滴内に、放出されて再度懸濁されてもよい。適したスナップオフ技術の例は、本明細書の他の箇所に記載されており、例えば、図8A、8B、および8Cの記載を参照されたい。本発明のこの手順および他の手順で要求されるいずれの温度条件も、液滴操作表面、および/または、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙中の充填流体の領域、を加熱もしくは冷却することにより、形成されてもよい。液滴は、液滴操作を用いて、液滴操作表面または液滴操作間隙の加熱領域または冷却領域に輸送され、必要な時間当該領域に保持されてもよい。あるいは、液滴アクチュエーターカートリッジ全体または液滴を含むカートリッジの領域が、必要な保温時間の間、加熱または冷却されてもよい。さらに、液滴操作間隙の外側または液滴操作表面から離れたところを加熱または冷却するために、液滴を液滴操作表面または液滴操作間隙に存在する流体通路に移動すること等により、液滴は液滴アクチュエーターから除去されてもよい。液滴は、その後、次の工程を行うための冷却後に液滴操作間隙または液滴操作表面に戻されてもよい。対末端ライブラリーの構築のための台上on-bench手順の一例を表1に示す。この例では、各酵素工程、すなわち、平滑末端化工程、A-tail化工程、およびアダプター結合工程のための反応キットを用いたそれぞれ、E1210S、M0212SおよびM2200S、NewEnglandBiolabs社。試薬は、必要に応じて希釈され、検査で使用する最終的な1倍濃度を供給してもよい。平滑末端、A-tail、およびアダプター結合混合物は、i改質されて、iiポリソルベート界面活性剤例えば、0.01~0.1Tween20ポリソルベート20としても公知、または、他の界面活性剤、等等の界面活性剤を、本明細書に記載の濃度で含んでいてもよい。核酸フラグメントライブラリー構築手順の他の一例は、インビトロ転位手順にて高密度である。転位手順では、Tn5トランスポザーゼの活動亢進誘導体を用いて、合成オリゴヌクレオチドすなわち、変更トランスポゾンの高密度でのターゲットDNAへの組み込みに触媒作用を及ぼしてもよい。この例では、NexteraのTransposome商標技術等のトランスポザーゼを用いて、ランダムdsDNA破壊を作り出してもよい。当該Transposome商標錯体は、遊離トランスポゾン末端およびトランスポザーゼを含む。当該錯体をdsDNAと共に保温すると、当該DNAは、フラグメント化され、トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの転移鎖は、DNAフラグメントの5’末端に共有結合する。いくつかのプラットフォーム固有アプリケーション例えば、Illumina配列決定プラットフォームでは、トランスポゾン末端は、配列決定プライマー部位に付加してもよい。バッファーと反応条件例えば、Transposome商標錯体の濃度を変えることにより、フラグメント化および標識されたDNAライブラリーのサイズ分布を制御してもよい。Nextera技術を、Roche454またはIlluminaSolexa配列決定プラットフォーム等の配列決定プラットフォームと適合する任意のバーコーディングと共に用いて、2標識ライブラリーを作り出してもよい。トランスポザーゼ触媒ライブラリー構築用のデジタル微小流体手順は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい:核酸は、トランスポザーゼおよび遊離トランスポゾン末端例えば、NexteraのTransposome商標錯体を含むトランスポザーゼ酵素錯体を用いてフラグメント化および標識されてもよい。いくつかのプラットフォーム固有アプリケーション例えば、Illumina配列決定プラットフォームでは、トランスポゾン末端は、配列決定プライマー部位に付加されてもよい。トランスポゾン組み込みと鎖転移は、ターゲット核酸内でのねじれ型dsDNA破壊を経て起こる。ターゲット核酸は、トランスポゾンシークエンスで5’末端で標識されてもよい。反応は、好ましくは55°Cで起こる。液滴アクチュエーターで、この工程は、iサンプル液滴と、iiトランスポザーゼ酵素試薬と反応バッファーとを含む液滴とを、分配し、混合する液滴操作を用いて達成され得る。トランスポザーゼ酵素試薬は、プラットフォーム固有アプリケーション例えば、Illumina適合ライブラリー用のNextera商標EnzymeMix;Roche454適合ライブラリー用のNextera商標EnzymeMixのために選択されてもよい。フラグメンテーションと標識化の後、核酸を精製例えば、ビーズ系洗浄手順して、続く工程に干渉し得る酵素と試薬を除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。4つのプライマー反応と共に抑制PCRを用いて、プラットフォーム固有オリゴヌクレオチドアダプターと任意のバーコードを、フラグメント化され、標識された核酸に付加してもよい。結果として生じる2標識ライブラリーは、両方の標識を含むフラグメントについて濃縮されてもよい。一例では、4つのプライマー反応と共に抑制PCRを用いて、Roche454適合ライブラリー用の付加を行ってもよい。任意のバーコードを、上流PCRアダプターとトランスポゾンとの間に付加してもよい。他の一例では、4つのプライマー反応と共に抑制PCRを用いて、Illumina適合アダプターシークエンスすなわち、ブリッジPCR適合アダプター;bPCRを付加してもよい。任意のバーコードを、下流PCRアダプターと付加されたトランスポゾンとの間に付加してもよい。液滴アクチュエーターで、この工程は、iサンプル液滴と、iiPCR試薬とプラットフォーム固有プライマーカクテル例えば、NexteraのIllumina適合プライマーカクテル、または、NexteraのRoche454適合プライマーカクテルとを含む液滴とを、分配および混合する液滴操作を用いて達成されてもよい。増幅は、液滴アクチュエーターで反応液滴を温度制御ゾーンの間で限られた数のサイクル例えば、約5~約13サイクルで熱サイクルすることにより、行われてもよい。一例では、熱サイクル手順は、72°Cで3分間および95°Cで30秒間、次いで95°Cで10秒間、72°Cで30秒間、および72°Cで3分間を13サイクルの保温を含んでいてもよい。あるいは、核酸は、別の装置での増幅のために液滴アクチュエーターから除去されてもよい。2標識ライブラリーを精製して例えば、ビーズ系洗浄手順、続くPCR増幅工程に干渉し得る、組み込まれなかったアダプターおよびバーコードを除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。濃縮された2標識ライブラリーは、例えば、Roche454プラットフォームでのエマルションPCRemPCR;IlluminaプラットフォームでのブリッジPCRbPCR;液滴アクチュエーター;または他の増幅方法を用いることにより、増幅されてもよい。増幅されたライブラリーは、続いて、適切なプライマーを用いて配列決定されてもよい。他の実施形態では、2標識ライブラリーは、増幅および配列決定の前にサイズ選択例えば、>300bpサイズされてもよい。一例では、2標識ライブラリーは、ゲル電気泳動により液滴アクチュエーターで区分されてもよい。他の一例では、2標識ライブラリーは、Caliper社の微小流体チップ系自動サイズ選択プラットフォーム等の別の装置でのサイズ分離のために液滴アクチュエーターから除去されてもよい。Illumina配列決定プラットフォーム用の標準配列決定ライブラリーは、PCR増幅の使用なしPCRフリーで、結合バイアスを低減するために生み出された。同様の手法をトランスポザーゼ系ライブラリーに用いてもよい。一例では、フローセルブリッジPCRプライマーbPCRシークエンスは、転位反応の間に加えられるアダプターに含められてもよい。転位後、ニックトランスレーション反応を行って、Illumina準備ライブラリーを生成してもよい。PCRフリーのトランスポザーゼ系ライブラリー構築手順は、核酸を配列決定準備フラグメントライブラリーに変換するのに必要な時間を実質的に削減する。PCRフリーのトランスポザーゼ触媒ライブラリー構築用のデジタル微小流体手順は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい:核酸は、トランスポザーゼおよび遊離トランスポゾン末端例えば、NexteraのTransposome商標錯体を含むトランスポザーゼ酵素錯体を用いてフラグメント化および標識されてもよい。Illumina配列決定プラットフォームのために、トランスポソームアダプターシークエンスは、フローセルbPCRシークエンスおよび付加した配列決定プライマー部位を含んでいてもよい。トランスポゾン組み込みと鎖転移は、ターゲット核酸内でのねじれ型dsDNA破壊を経て起こる。ターゲット核酸は、トランスポゾンシークエンスで5’末端で標識されてもよい。反応は、好ましくは55°Cで起こる。液滴アクチュエーターで、この工程は、iサンプル液滴と、iiトランスポザーゼ酵素試薬と反応バッファーとを含む液滴とを、分配および混合する液滴操作を用いて達成され得る。DNAポリメラーゼをニックトランスレーション反応で用いて、フラグメンテーション反応と標識反応で生じた一本鎖ギャップを修復してもよい。液滴アクチュエーターで、この工程は、iサンプル液滴と、iiDNAポリメラーゼと反応バッファー例えば、Epicentre社から入手可能なFailSafePCRMaterMixおよびDNAポリメラーゼとを含む液滴とを、混合する液滴操作を用いて達成され得る。ニックトランスレーション後、DNAを精製して例えば、ビーズ系洗浄手順、続く工程に干渉し得る酵素と試薬を除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。Illuminaプラットフォームでの増幅ブリッジPCRbPCRのための2標識ライブラリーを準備してもよい。増幅されたライブラリーは、続いて、適切なプライマーを用いて配列決定されてもよい。デジタル微小流体ライブラリー構築手順は、メチシリン耐性スタフィロコッカスアウレウスMRSAからの278bp細菌DNAフラグメントを用いて評価した。DNA末端修復平滑末端化、DNAフラグメントのdAtail化、およびアダプター結合は、NewEnglandBioLabs社から入手可能なNEBnextDNAサンプル調製MasterMixセット1を用いて行った。そのセットは、NEBnextEndRepair、dAtailingおよびQuickLigationモジュールを含む。DNAサンプル278bpMRSADNAの1,10,30,100,300,または1000ngおよび試薬が、台上で調製され、続いて、液滴アクチュエーターの流体分配リザーバ内に装填された。その実験を4回行い、4つの別の液滴アクチュエーターで実行した。NEBnextEndRepair2倍の酵素およびバッファー濃度の希釈標準溶液を、EndRepair反応バッファー3μL、EndRepair酵素混合物15μL、05Tween2015μL、および殺菌水9μLを混合し、最終体積15μLとすることにより調製した。NEBnextdAtailing2倍の酵素およびバッファー濃度の希釈標準溶液を、dAtailing反応バッファー3μL、クレノウフラグメントエキソ-18μL、05Tween2015μL、および殺菌水87μLを混合し、最終体積15μLとすることにより調製した。NEBnextQuickLigation3倍の酵素およびバッファー濃度の希釈標準溶液を、QuickLigation反応バッファー9μL、QuickT4DNAリガーゼ45μL、および05Tween2015μLを混合し、最終体積15μLとすることにより調製した。磁気応答性ビーズ溶液を、300μLのAgencourtAMPureXPビーズと3μLの1Tween20とを混合することにより調製した。アダプターを、アダプターとDNAのモル比が10:1で、01Tween20の最終濃度で調製した。アダプターの濃度をDNA濃度に応じて変化させた。DNAサンプルを、278bpMRSADNAの1,10,30,100,300,または1000ng、AgencourtAMPureXPビーズ12μL、ビーズ結合バッファー25μL、5Tween201μL、および殺菌水を混合して、最終体積50μLとすることにより調製した。ビーズおよびDNAサンプルを、撹拌しながら室温で10分間保温した。DNAサンプル278bpMRSADNAの1,10,30,100,300,または1000ngおよび調製した試薬を、液滴アクチュエーターのリザーバに装填した。分配および処理工程の前に、各DNAサンプルを、単一工程のビーズ濃縮手順を用いてアクチュエーターで濃縮した。磁気応答性ビーズ上に結合したDNAを有する磁気応答性ビーズを、サンプル分配リザーバ電極の下に位置する磁石を用いて固定した。上澄み液約50μLを液滴操作を用いて分離し、磁場により保持された固定されたビーズから離して輸送した。次いで、DNAを、1倍DNAサンプル液滴中で磁気応答性ビーズから溶離した。ライブラリー結果収率を評価するために用いたデジタル微小流体手順は、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙での電気濡れ媒介液滴操作を用いて行われた以下の工程を含んでいた:1倍DNAサンプル液滴を、液滴操作を用いて1倍NEBnextEndRepair液滴と混合し、2倍反応液滴を生じた。室温で30分間保温した後、2倍反応液滴を、液滴操作を用いて、4倍磁気応答性ビーズ含有液滴と混合し、6倍DNAサンプル/ビーズ液滴を生じた。室温で10分間保温した後、磁石を用いてビーズを固定し、6倍上澄み液を分離して0倍サンプル/ビーズ液滴を生じた。上澄み液を輸送して廃棄した。末端修復されたビーズを、1倍サンプル液滴中のビーズから溶離した。1倍末端修復されたDNAサンプル液滴を、液滴操作を用いて1倍NEBnextAtailing液滴と混合し、2倍反応液滴を生じた。約37°Cで30分間保温した後、2倍反応液滴を、液滴操作を用いて4倍磁気応答性ビーズ含有液滴と混合し、6倍DNAサンプル/ビーズ液滴を生じた。室温で10分間保温した後、磁石を用いてビーズを固定し、6倍上澄み液を分離して0倍サンプル/ビーズ液滴を生じた。上澄み液を輸送して廃棄した。Atail化されたDNAを、1倍サンプル液滴中のビーズから溶離した。1倍Atail化されたDNAサンプル液滴を、液滴操作を用いて1倍NEBnextQuickLigation液滴および1倍アダプター液滴と混合し、3倍反応液滴を生じた。室温で30分間保温した後、3倍反応液滴を、液滴操作を用いて2倍磁気応答性ビーズ含有液滴と混合し、5倍DNAサンプル/ビーズ液滴を生じた。室温で10分間保温した後、磁石を用いてビーズを固定し、5倍上澄み液を分離して0倍サンプル/ビーズ液滴を生じた。上澄み液を輸送して廃棄した。ビーズを、液滴系ビーズ洗浄手順を用いて2倍洗浄バッファー液滴で3回洗浄した。アダプター結合DNAを、1倍サンプル液滴中のビーズから溶離した。1倍アダプター結合DNAサンプル液滴を、液滴操作を用いて液滴アクチュエーター上のサンプル回収リザーバまで輸送し、ライブラリー構築収率の決定のために液滴アクチュエーターから除去した。表2に、アクチュエーターでのライブラリー構築手順のアガロースゲル分析から計算した収率の結果を示す。ゲル分析のために、ゲルにサンプルを装填する前に、9μLの1,10,30,および100ngの入力サンプル;5μLの300ngの入力サンプル;および15μLの1000ng入力サンプルを、水を用いて10μLに調整した。MRSADNA278bpフラグメントが、09、9、27、90、および150ngでゲルに装填され、標準として使用された。図2は、表2に示したライブラリー出力データを計算するために使用されたアガロースゲルの例示的な写真を示している。ライブラリーサンプルとMRSA標準DNAは、以下の順番でアガロースゲルに装填された左から右へ:1ng入力サンプル、09ngMRSA標準、10ng入力サンプル、9ngMRSA標準、30ng入力サンプル、27ngMRSA標準、100ng入力サンプル、90ngMRSA標準、300ng入力サンプル、150ngMRSA標準、および1000ng入力サンプル。ゲル分析は、ImageJソフトウェアを用いて行い、ライブラリー出力を求めた。その実験を7つの別個の液滴アクチュエーターで追加で7回繰り返された。図3は、10,30,100,300,または1000ngの278bpMRSADNAを用いたアクチュエーターでのライブラリー構築手順の追加の7回の実行のアガロースゲル分析から計算した収率のプロットを示している。図3のデータを表3にまとめた。液滴操作手順、反応生化学、および他のシステムパラメーターをさらに選択して、自動化デジタル微小流体ライブラリー構築手順の性能を向上し得る。生化学反応条件の選択は、例えば、各反応工程の性能評価により容易となり得る。一の実施形態では、手順の各工程後のDNAの定量的な修復または収率は、アクチュエーターで、組み込まれた放射性リン酸エステルまたは組み込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識のいずれかを用いて測定されてもよい。例えば、平滑末端化工程図1の手順を参照では、T4ポリヌクレオチドキナーゼが、リン酸エステルを平滑末端化されたDNAの5’-ヒドロキシ末端に付加する。キナーゼ反応バッファーの放射性標識されたATPγ-32PATPを用いることで、平滑末端化されたDNAに付加した末端リン酸エステルは、放射性標識され、容易にモニターされ得る。同様に、Atail化工程をモニターするため、dATP中のγ-リン酸エステルは、放射性標識されてもよい。アダプターシークエンスの全てのヌクレオチドは、そのα-リン酸エステルで放射性標識されてもよく、アダプター結合工程は高感度で定量的にモニターされ得る。他の実施形態では、アダプター結合シークエンス特性例えば、分解がない、バイアス例えば、挿入サイズ、GC含有量、および再現性が評価されてもよい。この例では、ライブラリー構築は、異なるサイズおよびGC含有量のDNAアンプリコンを用いて行われてもよい。アダプター結合シークエンスの特性は、処理されたフラグメントを回収し、市販のシークエンサーを用いてDNAシークエンスを評価することにより、評価されてもよい。ライブラリー構築方法は、同じDNAサンプルについて複数回手順を実行することにより再現性を評価されてもよい。液滴アクチュエーターの異なるリザーバ間のばらつきは、同じDNAサンプルを異なるアクチュエーターリザーバに装填することで評価されてもよい。保温時間、洗浄サイクル数、液滴輸送速度、および装填試薬体積等のデジタル微小流体操作パラメーターは、本開示の観点から当業者により選択されてもよい。台上のシステムに比べて、デジタル微小流体液滴システムでは、混合長さスケールと体積対表面積比が小さいため、液滴システムの保温時間は実質的に低減され得る。酵素反応についての実質的に減少した保温時間と自動化手順即ち、わずかの時間の操作との組み合わせにより、ライブラリー構築方法の全体時間は減少し得る。7.2核酸精製液滴アクチュエーターでのライブラリー構築の手順は、ビーズ系核酸精製工程を含んでいてもよい。ビーズは、磁気応答性であってもよいし、実質的に磁気応答性でなくともよい。一の実施形態では、本明細書に記載の酵素工程のいずれの後に、ビーズ系核酸精製工程を行ってもよい。核酸精製工程および浄化工程は、しばしば、ライブラリー構築手順における収率を制限する工程である。一例では、CHARGESWITCH登録商標PCR浄化ビーズLifeTechnologyによりInvitrogen社から入手可能等の電荷スイッチビーズを用いてもよい。CHARGESWITCH登録商標PCR浄化ビーズは、常磁性応答ビーズであり、pH5で通常90bp~4kbpの核酸を捕捉することができ、pH>8で捕捉した核酸を放出することができる。一例では、デジタル微小流体ライブラリー構築手順の浄化工程でのCHARGESWITCH登録商標ビーズの使用は、ビーズから結合したDNAを溶離するために用いる溶離バッファーの緩衝能およびpHを調整することにより選択してもよい。表4および5は、溶離バッファー組成と、洗浄回数との、核酸修復のパーセントでの効果を示している。バッファーのpHは、12MのHClを用いて調整された。溶離バッファー化学および洗浄回数を評価するために用いたデジタル微小流体手順は、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙での電気濡れ媒介液滴操作を用いて実行された以下の工程を含むものであった:48ngの278bpMRSAdsDNA138ng/μLを含む350nL以下の液滴を、液滴操作を用いて、緩衝バッファーpH5中にCHARGESWITCH登録商標ビーズ25mg/mLを含む350nL以下の液滴と混合して、700nL以下の液滴を生じた。室温で1分間保温した後、その700nL以下の液滴を、700nL以下の洗浄バッファー液滴と混合し、磁石を用いてビーズを固定し、そして、液滴を分割してビーズ含有液滴と上澄み液滴とを生じた。複数の洗浄サイクル2または6サイクルを行った後に、CHARGESWITCH登録商標ビーズを、350nL以下の洗浄バッファー液滴中で再懸濁した。次いで、そのビーズ含有液滴を350nL以下の溶離バッファー液滴と混合して、700nL以下の溶離液滴を生じた。2分間の保温後、CHARGESWITCH登録商標ビーズを永久磁石の磁場内に固定し、その700nL以下の溶離液滴をビーズから離してアクチュエーターのリザーバ内に輸送した。その700nL以下の溶離液滴を、リザーバから戻し、水を用いて10μL体積に調整した。もしDNAの修復が100だったならば、qPCR検査へのDNAの入力は、48pgのはずである。CHARGESWITCH登録商標ビーズを液滴アクチュエーターから戻し、台上で20μL溶離バッファーを用いた別の溶離を行い、液滴アクチュエーターで溶離しなかったいずれのDNAも溶離させた。定量的なPCRqPCR検査を行い、DNAの修復を評価した。サンプルを100倍、10,000倍および100,000倍に希釈した。各サンプルの5μLを50μLのqPCR検査で分析した。サンプルは、278MRSAアンプリコンの標準曲線に対して分析した。DNA修復の効率が100であったならば、qPCR検査への入力DNAは、240pg、24pgおよび240fgそれぞれ、100倍、10000倍および100000倍希釈溶液のはずである。図4は、台上および液滴アクチュエーターでの溶離工程および核酸浄化工程の実施の比較のプロット400を示している。台上および液滴アクチュエーターで行われた完全な対末端ライブラリー構築手順での溶離条件を用いた。データは、台上と液滴アクチュエーターでの溶離が比較可能であることを示している。図5A~5Mは、液滴アクチュエーターの電極配列500の一部の一例の平面図を表し、ライブラリーの構築用の核酸調製方法を示している。図5A~5Mの方法は、ライブラリー構築手順の一例であり、当該一例で核酸は、磁気応答性ビーズに固定され、可動式の磁石と、一連の混合操作および分割操作とを用いて、ライブラリー構築手順の各工程間で核酸が精製される。電極配列500は、液滴操作電極510例えば、電気濡れ電極の配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上または液滴操作間隙内の液滴操作電極510により行われる。ビーズ固定ゾーン512は、電極配列500と結合していてもよい。可動式磁石514は、ビーズ固定ゾーン512にそろっていてもよく、そしてビーズ固定ゾーン512に向けてまたはビーズ固定ゾーン512から移動されてもよい。磁石514は、磁気応答性ビーズを、液滴操作の間、保持するために用いてもよい。特に、磁石514は、少なくとも1つの液滴操作電極510、および任意に他の電極もが、磁場内にあるように配置されてもよい。磁石514は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい。サンプル液滴516は、液滴操作電極510に沿った液滴操作を用いて輸送されてもよい。サンプル液滴516は、例えば、2倍液滴であってもよい。2倍液滴は、液滴操作間隙での専有面積が、1つの液滴操作電極510の領域の約2倍であることを意味する。サンプル液滴516は、核酸ライブラリー構築のために処理される核酸518を含んでいてもよい。一の実施形態では、核酸サンプルはせん断されてもよく、そしてせん断された核酸は、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙に装填されてもよい。核酸は、例えば、流体力学的せん断もしくは機械的な力によりランダムにフラグメント化されてもよく、または酵素消化によってフラグメント化されてもよい。他の実施形態では、核酸等の核酸サンプルは、液滴アクチュエーターでランダムにフラグメント化されてもよい。一例では、低周波電流を用いて、サンプル液滴中の核酸がせん断されるようにサンプル液滴を撹拌してもよい。他の例では、液滴は、交互に膨張と収縮をさせられて、液滴内に、核酸をせん断するのに十分な流体パターンを形成してもよい。他の例では、低周波電流の適用と、液滴の交互の膨張および収縮とを用いて、核酸をせん断してもよい。アクチュエーターでの核酸のせん断を制御して、予測可能なサイズ範囲のフラグメントを与えてもよい。せん断された核酸518は、核酸フラグメントライブラリーの構築のための処理の前にサイズ選択をされてもよい。一例では、せん断された核酸518は、ゲル電気泳動により分離されてもよい。液滴アクチュエーターでのライブラリー構築用にせん断された核酸を調製する方法の一例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。図5Aは、ビーズ固定ゾーン512と磁石514とから離れて電極通路510に位置しているサンプル液滴516を示している。磁石514は、例えば、液滴アクチュエーターが取り付けられている装置上に位置していてもよく、液滴アクチュエーターそれ自体に取り付けられていてもよく、液滴操作間隙内に位置していてもよく、または本明細書に記載のような液滴系ビーズ洗浄手順の実行の間に液滴内のビーズを固定可能ないずれの位置にあってもよい。図5Bおよび5Cは、保温方法を示しており、当該方法では、試薬液滴520が液滴操作を用いてサンプル液滴516と混合される。図に示したように、試薬液滴520は、その専有面積が、ほぼ1つの液滴操作電極510の面積であることを意味する1倍液滴例えば、約250~約500nLである。図5Cでは、混合されたサンプル液滴516は、いまや3倍液滴である。3倍液滴は、その専有面積が1つの液滴操作電極510の領域の約3倍であることを意味する。試薬液滴520は、平滑末端化試薬等の酵素を含んでいてもよい。混合された液滴516は、核酸フラグメントの平滑末端化を促進するため選択された温度および時間等、必要な温度および必要な時間保温され、所望の反応が達成される。図5Dおよび5Eは、核酸の捕捉を表している。核酸または所定の核酸のサブセットを捕捉するように選択された磁気応答性ビーズ524を含む1倍試薬液滴522が、電極514により制御される液滴操作を用いて3倍混合サンプル液滴516と混合される。混合されたサンプル液滴516は、いまや4倍サンプル液滴である。4倍サンプル液滴は、その専有面積が1つの液滴操作電極510の領域の約4倍であることを意味する。混合されたサンプル液滴516は、所望の核酸フラグメントが磁気応答性ビーズ524と結合するのに十分な期間、室温で保温される。図5F、5Gおよび5Hは、ビーズ洗浄方法を示しており、当該方法では、磁気応答性ビーズ524および当該ビーズに結合した核酸518を有する4倍混合サンプル液滴516が、電極通路510に沿った液滴操作を用いて、ビーズ固定ゾーン512に輸送される。磁石514は、4倍混合サンプル液滴516が、磁石514の磁場内に位置するように、ビーズ固定ゾーン512内の位置に移動される。磁気応答性ビーズ524は、磁石514の磁場により、固定され、あるいは拘束され、または実質的に固定される。2倍上澄み液滴526が、液滴操作を用いて分割され、2倍混合サンプル液滴を形成する。当該2倍混合サンプル液滴は、磁石514の磁場内にある液滴操作電極510で保持される。これは、5つの下部電極を活性化して液滴を5つの電極にわたって伸長し、次いで、中央の電極を非活性化することにより達成され得る。実質的に全ての磁気応答性ビーズが伸長された液滴の一端に配置され、その後の分割で、その磁気応答性ビーズが1つの娘液滴に一緒に残るように、その5つの電極が、磁石と相対的に配置されてもよい。他の娘液滴は、実質的に上澄み液滴からなり、遠ざけられてもよい。同様の操作を他の液滴サイズの分割に用いてもよく、例えば、4倍液滴の下部の4つの電極の3番目を非活性化して、1つの1倍液滴および1つの3倍液滴を生成し、その1倍液滴または3倍液滴のいずれかに磁気応答性ビーズが保持される。図5Gでは、2倍洗浄バッファー液滴528が、液滴操作電極510に沿って輸送され、液滴操作を用いて2倍混合サンプル液滴516と混合され、4倍混合サンプル/洗浄液滴516を形成する。混合されたサンプル/洗浄液滴516は、液滴操作を用いて2つの液滴例えば、2倍/2倍または1倍/3倍に分割されてもよく:1つの液滴がその液滴中に磁気応答性ビーズ524を有し、1つの液滴は実質的に磁気応答性ビーズ524を有しないもの例えば、上澄み液滴であってもよい。図5F、5Gおよび5Hに示された工程は、十分な精製の程度が達成されるまで複数回例えば、6回繰り返されてもよい。図5Iは、任意の工程を示しており、当該工程では、1倍上澄み液滴526が液滴操作を用いて2倍液滴から分割され、1倍サンプル液滴516を形成し、当該1倍サンプル液滴516は、磁石514の磁場内にある液滴操作電極510に保持される。これは、2倍液滴を3つの下部電極に沿って伸長し、当該液滴を伸長し、次いで、中央の電極を非活性化することにより達成され得る。実質的に全ての磁気応答性ビーズが伸長された液滴の一端に配置され、その後の分割で、その磁気応答性ビーズが1つの娘液滴に一緒に残るように、その3つの電極は、磁石と相対的に配置されてもよい。他の娘液滴は、実質的に上澄み液滴からなり、遠ざけられてもよい。図5Jおよび5Kは、保温方法を示しており、当該方法では、1倍溶離バッファー液滴530が、液滴操作を用いて1倍サンプル液滴516と混合される。磁石514は、ビーズ固定ゾーン512から離れて移動される。磁気応答性ビーズ524および溶離した核酸518をその中に有するサンプル液滴516は、液滴操作を用いて、磁石514の磁場内にある液滴操作電極510から離れて輸送され、ビーズ固定ゾーン512から離れる。1倍溶離バッファー液滴530は、液滴操作を用いてサンプル液滴516と混合され、2倍混合サンプル/溶離液滴を形成する。混合されたサンプル/溶離液滴516は、磁気応答性ビーズ524から結合した核酸518が溶離するのに十分な期間例えば、約1分、室温で保温される。図5Lは、磁気応答性ビーズ524と、結合した核酸518とをその中に有する2倍混合サンプル/溶離液滴516を示しており、当該液滴は、液滴操作を用いて磁石514の磁場内にある液滴操作電極510にすなわち、ビーズ固定ゾーン512に輸送される。磁石514は、2倍混合サンプル/溶離液滴516が磁石514の磁場内にあるように、ビーズ固定ゾーン512内の位置に移動される。磁気応答性ビーズ524は、磁石514の磁場により固定される。図5Mは、2倍サンプル液滴516を示しており、当該液滴は、液滴操作を用いて分割された実質的に全ての平滑末端化された核酸518を含みすなわち、全てのビーズがスナップオフされた、磁石514の磁場内にある液滴操作電極510から離れて輸送され、磁石514から離れている。磁気応答性ビーズ524は、磁石514の磁場により、磁石514の磁場内にある少なくとも1つの液滴操作電極510上に固定されたままである。平滑末端化された核酸518を含むサンプル液滴516は、さらなる処理、すなわち、A-tail化およびアダプター結合のために輸送されてもよい。他の液滴が輸送され、残ったビーズに接触し得る。当該ビーズは、通常当該ビーズを囲む少量の液体を有する;前記液滴は、この少量の液体と混合し、ビーズは輸送され得る。任意に、この操作の間、ビーズを輸送するために、磁石は、非活性化または離れて移動されてもよい。図5B~5Mに示される工程は、ライブラリー構築手順の、A-tail化およびアダプター結合等の次の処理反応のために繰り返されてもよい。図5Bおよび5Cに関して、実質的に全ての平滑末端化された核酸518を含む2倍サンプル液滴516は、液滴操作を用いて第2の1倍試薬液滴520と混合され、3倍混合サンプル液滴を形成する。この工程では、試薬液滴520は、A-tail化反応のための酵素および反応成分を含む。混合サンプル液滴516の保温は、37°Cで約30分間行われる。混合サンプル液滴516は、図5D~5Mに関して記載したように処理すなわち、酵素およびビーズ保温ならびにビーズ洗浄されてもよい。A-tail化された核酸518を含むサンプル液滴516は、さらなる処理、すなわち、アダプター結合のために輸送されてもよい。図5Bおよび5Cに関して、実質的に全てのA-tail化された核酸518を含む2倍サンプル液滴516は、液滴操作を用いて第3の1倍試薬液滴520と混合され、3倍混合サンプル液滴を形成する。この工程では、試薬液滴520は、アダプター結合のための酵素および反応成分を含む。混合サンプル液滴516の保温は、室温で約5分~約30分間行われる。混合サンプル液滴516は、図5D~5Mに関して記載したように処理すなわち、酵素およびビーズ保温ならびにビーズ洗浄されてもよい。実質的に全てのアダプター結合核酸518を含むサンプル液滴516は、さらなる処理のために輸送されてもよい。一例では、サンプル液滴516の核酸518は、PCRにより増幅されてもよい。用いられるPCR増幅サイクルの数は、十分に制限されて例えば、約8~15サイクル、増幅手順のシークエンスバイアスを最小化してもよい。他の例では、サンプル液滴516の核酸518は、続く定量PCRおよびゲル電気泳動による分析のために、そして、いくつかの実施形態では、次世代配列決定方法への入力用の回収のために、出力リザーバに輸送されてもよい。一の実施形態では、充填流体または液滴に、染料を添加して、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙からの除去のために液滴の可視化を容易にしてもよい。一の実施形態では、処理されたサンプル液滴は、液滴アクチュエーターの開口部を通じて液滴操作間隙から除去され、斯かる開口部は、ガスケットの開口部を経た流体通路のように、頂部基板、底部基板、または当該2つの基板の間にあってもよい。一の実施形態では、本発明のライブラリー作製手順は、第1のpHで核酸に結合し、第2のpHで核酸を溶離し得るビーズを利用してもよい。例えば、本発明のライブラリー作製手順のいずれかの酵素工程から出力される第1の液滴は、第1のpHで核酸に結合し得るビーズを含む第2の液滴と混合され、核酸がビーズに捕捉された混合された第3の液滴を生成してもよい。必要に応じて、1つ以上の追加の液滴が、第3の液滴と混合され、ビーズ上の核酸の捕捉を確実にしてもよい。第3の液滴は、次いで、液滴系ビーズ洗浄手順にかけられてもよい。洗浄液滴は、第3の液滴と混合されてもよく;あるいは、第3の液滴は、洗浄液滴の導入の前に分割され、ビーズ含有液滴と上澄み液滴とを生成してもよく;そして洗浄液滴は、ビーズ含有液滴と混合されてもよい。いずれの場合でも、ビーズは固定されてもよく、混合された液滴は、分割され、上澄み液滴とビーズ含有液滴とを生成してもよい。ビーズ含有液滴は、好適には全てのまたは実質的に全てのビーズを含む。必要に応じて、混合-固定および分割技術は、繰り返され、好適には当該方法で全てのまたは実質的に全てのビーズを保持しながら、生成するビーズ含有液滴の異物の所望の低減が達成されてもよい。洗浄液滴は、ビーズに核酸を保持するのに好ましいpHを有するバッファーを含んでいてもよい。洗浄後、洗浄されたビーズを含む液滴は、液滴操作を用いて、ビーズから核酸を溶離するために選択したpHを有する1つ以上の液滴と混合されてもよい。ビーズは拘束され、拘束されたビーズから液滴を離して輸送することにより、囲んでいる上澄み液がビーズから引き離されてもよい。別の実施形態では、この方法を用いて、RNA、タンパク質、ペプチド、巨大分子、または小さな分子等の他の目的とする分子が分離されてもよい。重要なことに、発明者らは、この方法がオイルに囲まれた液滴を用いて効果的に実行され得ることを見出した。一の実施形態では、当該方法を達成するために必要な液滴操作の一部または全てが、電気濡れ媒介液滴操作を用いて達成される。物理的バリアもしくは障害物を用いて、ビーズを拘束してもよく、および/または、磁石を用いて、ビーズを拘束して、磁気応答性ビーズを拘束してもよい。この方法への使用に好適なビーズの例は、Bakerによる2005年7月5日に発行された題名Isolationofnucleicacidsの米国特許第6914137号に記載されており、斯かるビーズの組成、ならびに、斯かるビーズを用いてDNA等の物質を捕捉および溶離するための条件に関する教示が、参照して援用される。上述したCHARGESWITCH登録商標ビーズが斯かるビーズの一例である。他の実施形態では、本発明の核酸精製技術は、精製のための核酸を含む液滴と、可逆的な方法で核酸分子を吸収例えば、非共有結合するビーズを含む液滴と混合する工程を含む。斯かるビーズの例は、McKernanらによる2003年3月18日に特許付与された題名Solidphasetechniqueforselectivelyisolatingnucleicacidsの米国特許第6534262号に記載されたビーズを含み、核酸を捕捉するためのビーズ当該特許では粒子といわれているおよび斯かるビーズから核酸を溶離するための化学に関する開示を参照してその開示全体を本明細書に援用する。例えば、SPRI登録商標ビーズAgencourtNioscience社から入手可能等の固相可逆固定ビーズを用いてもよい。SPRI登録商標ビーズは、コア-シェル方法を用いて構成され、当該方法は、ポリスチレンコアから始まり、ポリスチレンコアがはじめにマグネタイト鉄の層で被覆され、次いで最終的にカルボキシル官能基を含むポリマー層でカプセル化される。一の実施形態では、SPRI登録商標ビーズは、約0.01~約0.1Tween20を含むバッファー液滴、または約0.01~約0.1Tween20を含むTEバッファー、または約0.01~約0.1Tween20を含むトリスバッファーで供給されてもよい。これらのバッファーは、SPRI登録商標ビーズを洗浄するのに用いられてもよい。SPRI登録商標ビーズは、Iiリザーバ内で動き回る試薬液滴の移動、iiリザーバからの試薬液滴の出入り、もしくはiii外部のリザーバから液滴操作間隙に延びる流体通路を通じての前後の試薬液滴の輸送、を生じる電気濡れ電極の活性化および非活性化等により、リザーバ内で定期的に混合して懸濁に保たれてもよく、または、II液滴を少なくとも部分的に流体通路に入れる毛管力、および、流体通路から液滴を引っ張り出す電気濡れ力を用いる等、流体通路の内外に輸送されてもよい。本発明のライブラリー構築手順は、当該手順における各精製工程での一貫した、そして効率的な核酸の修復を提供する。一の実施形態では、核酸は、磁気応答性ビーズに固定され、可動式の磁石と、一連の混合および分割操作とが、ライブラリー構築手順の各工程間の核酸の精製に用いられる。他の実施形態では、核酸は、磁気応答性ビーズ例えば、SPRI登録商標ビーズに固定され、磁石と、アルコール洗浄液滴を用いた一連の液滴混合および分割洗浄工程とが、ライブラリー構築手順の各工程間の核酸の精製に用いられる。有機洗浄液滴は、約1~約100、または約10~約90、または約30~約80、または約50~約75の何らかの極性プロトン性溶媒を含んでいてもよく、残りは水および本明細書に記載のような界面活性剤を含む他の物質でもよい。一の実施形態では、液滴の溶媒部分は、アルコールおよび/またはカルボン酸である。他の実施形態では、溶媒は、1~8の炭素、または1~6の炭素を有するアルコールおよび/またはカルボン酸である。アルコールおよび/またはカルボン酸は、環状、直線状、または分岐状であってもよい。例は、ヘキサノール、ペンタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸を含む。洗浄液滴は、少なくとも約50v/v、60v/v、または80v/vのアルコールを含んでいてもよい。アルコールは、例えば、1~8の炭素、または1~6の炭素を有していてもよい。アルコールは、環状、直線状、または分岐状であってもよい。好適なアルコールの例は、ヘキサノール、ペンタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、およびメタノールを含む。洗浄液滴は、約0.01~約1v/vの界面活性剤、約0.01~約0.1v/vの界面活性剤を含んでいてもよい。好適な界面活性剤は、胆汁塩等のアニオン性界面活性剤;四級アンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤;アルカノイル-N-ヒドロキシエチルグルカミド、アルカノイル-N-メチルグルカミド、アルキルグリコシド、シクロアルカノイルヒドロキシエチルグルカミド、シクロアルキルグリコシド、ポリオキシエチレン等の非イオン性界面活性剤;およびアルキルベタイン、アルキルホスホコリン、アルキルスルホベタイン、シクロアルキルホスホコリン、ホスホエタノールアミン、非洗浄スルホベタイン、スルホベタイン等の双性イオン界面活性剤を含む。ポリソルベート界面活性剤が好ましい。洗浄液滴は、任意に、無機塩および/または有機塩等の1つ以上の塩を含んでいてもよい。1つ以上の塩は、例えば、1つ以上の、アルミニウム、アンモニウム、バリウム、ベリリウム、カルシウム、セシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ルビジウム、ナトリウム、またはストロンチウム、の塩を含む。1つ以上の塩は、例えば、1つ以上の、クロリド、フルオリド、オキシド、オキソアニオン、炭酸塩、重炭酸塩、ヒドロキシド、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩を含む。1つ以上の塩は、液滴アクチュエーターでの洗浄液滴としての使用に対する洗浄液滴溶液の適合性を害さない限り、いかなる濃度の洗浄液滴溶液で供給されてもよい。例えば、1つ以上の塩は、約0.001~約100mM、または約0.001~約10mM、または約0.001~約1mMの範囲の濃度の洗浄液滴溶液で供給されてもよい。図6は、核酸ライブラリー作製方法600のフローチャートを表し、当該方法は、磁気応答性ビーズ例えば、SPRI登録商標ビーズおよびアルコール系ビーズ洗浄手順を用いる手順に応じて、反応液滴体積での単位サイズ化された液滴の数は、異なっていてもよい。せん断された核酸サンプル例えば、20~50μLは、液滴アクチュエーターのサンプル入力リザーバに装填されてもよい。核酸サンプルは、処理の前にアクチュエーターで濃縮されてもよい。サンプル濃縮は、例えば、リザーバ内濃縮inreservoirconcentration手順または一連の分配濃縮serialdispensingconcentration手順を用いて行われてもよい。2倍サンプル液滴は、分配され、液滴操作を用いて1倍試薬液滴例えば、300nL/サンプルと混合され、3倍混合サンプル液滴を生成してもよく、当該1倍試薬液滴は、せん断された核酸フラグメントの平滑末端化のための酵素例えば、T4DNAポリメラーゼおよび試薬を含む。いくつかの実施形態では、この工程で、ポリヌクレオチドキナーゼおよび試薬が、反応液滴に含まれてもよい。混合3倍サンプル液滴は、平滑末端化反応が完了するのに十分な期間、例えば、約30分、室温で保温されてもよい。平滑末端化された核酸は、図7を参照して記載したように、捕捉され5倍サンプル/SPRI登録商標ビーズ液滴、洗浄され0倍サンプル/ビーズ液滴、および溶離2倍溶離サンプル液滴されてもよい。実質的に全ての平滑末端化された核酸を含む2倍溶離サンプル液滴は、液滴操作を用いて第2の1倍試薬液滴300nL/サンプルと混合されて、3倍混合サンプル液滴を形成してもよい。この工程では、1倍試薬液滴は、A-tail化反応のための酵素および反応3倍バッファーおよび酵素成分を含む。混合サンプル液滴の保温は、約37°Cで約30分間行われてもよい。処理された核酸は、図7を参照して記載したように、捕捉され5倍サンプル/SPRI登録商標ビーズ液滴、洗浄され0倍サンプル/ビーズ液滴、および溶離2倍溶離サンプル液滴されてもよい。実質的に全てのA-tail化された核酸を含む2倍溶離サンプル液滴は、液滴操作を用いて第3の1倍試薬液滴と混合されて、3倍混合サンプル液滴を形成する。この工程では、1倍試薬液滴300nL/サンプル以下は、アダプター結合のための酵素および反応成分例えば、アダプター、リガーゼ、およびリガーゼバッファーを含む。3倍混合サンプル液滴の保温は、室温で約5~約30分間行われてもよい。処理された核酸は、図7を参照して記載したように、捕捉され5倍サンプル/SPRI登録商標ビーズ液滴、洗浄され0倍サンプル/ビーズ液滴、および溶離2倍溶離サンプル液滴されてもよい。一の実施形態では、実質的に全ての処理された核酸を含む2倍溶離サンプル液滴は、液滴操作を用いて、サンプル回収および除去リザーバに輸送されてもよい。2倍溶離サンプル液滴は、サンプル回収および除去リザーバに約4~約10°Cで保管されてもよい。他の実施形態では、処理された核酸例えば、アダプター結合DNAは、サンプル回収および除去リザーバへのサンプル液滴の輸送前に、PCR例えば、10~15サイクルを用いて増幅されてもよい。図7は、ビーズ系洗浄/溶離方法700のフローチャートを表している。3倍液滴例えば、その中に核酸を含む3倍サンプル液滴は、液滴操作を用いて、磁気応答性ビーズ例えば、SPRI登録商標ビーズを含む2倍試薬液滴と混合され、5倍混合サンプル/ビーズ液滴を生成してもよい。混合サンプル/ビーズ液滴は、核酸フラグメントが磁気応答性ビーズに結合するのに十分な期間例えば、約5分、室温で保温されてもよい。5倍混合サンプル/ビーズ液滴は、ビーズ洗浄手順を用いて洗浄されてもよいが、液滴操作を用いて5倍上澄み液滴が分割され、0倍サンプル/ビーズ液滴すなわち、核酸に結合したビーズを生成することは除く。2倍洗浄液滴すなわち、エタノールは、液滴操作を用いて液滴操作電極に沿って輸送され、結合した核酸を有する0倍サンプル/ビーズ液滴を通過してもよい。2倍溶離バッファー液滴例えば、水液滴は、液滴操作を用いて輸送され、洗浄0倍サンプル/ビーズ液滴と混合され、2倍溶離バッファー液滴を生成してもよい。溶離バッファー液滴は、磁気応答性ビーズから結合した核酸を溶離するのに十分な期間例えば、約1分、室温で保温されてもよい。実質的に全ての分割された核酸すなわち、全てのスナップオフビーズを含む2倍溶離サンプル液滴。核酸を含む2倍溶離サンプル液滴は、さらなる処理、すなわち、ライブラリー構築手順でのA-tail化反応およびアダプター結合のために輸送されてもよい。本発明の方法は、さらに応用して、大例えば、約400bp~約10kbp小例えば、約200bpの核酸ライブラリーの全自動化構築を提供してもよい。一の実施形態では、本発明の方法は、応用して、液滴アクチュエーターでの核酸、すなわち、RNAまたはDNAの自動フラグメンテーションを含んでもよい。一例では、本発明の方法は、応用して、RNA系ライブラリー用のRNAのフラグメンテーションおよび逆転写を含んでもよい。この例では、核酸フラグメンテーションは、バッファー系フラグメンテーションを用いて行われてもよい。他の例では、核酸のフラグメンテーション例えば、細菌性または真核性は、酵素系フラグメンテーション反応を用いて行われてもよい。例えば、NEBNext商標dsDNAFragmentase商標等のフラグメンターゼを用いて時間依存手法によりdsDNA破壊を生じさせ、約100~800bpのDNAフラグメントを生成してもよい。NEBNextdsDNAFragmentaseは、2つの酵素を含み、一方の酵素は、dsDNAにランダムに切れ目を生じさせ、他方の酵素は、切れ目部位を認識し、その切れ目から反対のDNA鎖を切って、dsDNA破壊を作り出す。他の例では、NexteraのTransposome商標技術等のトランスポザーゼを用いてdsDNA破壊を生じさせてもよい。Transposome商標錯体は、遊離トランスポゾン末端およびトランスポザーゼを含む。当該錯体をdsDNAと共に保温すると、当該DNAは、フラグメント化され、トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの転移鎖は、DNAフラグメントの5’末端に共有結合する。Transposome錯体の濃度を変えることにより、フラグメント化され、標識されたDNAライブラリーのサイズ分布が制御されてもよい。サンプル液滴は、液滴操作間隙でフラグメンテーション試薬を含む液滴と混合されてもよく、生成する液滴は、保温されてフラグメント化された核酸を生成してもよい。必要な液滴操作は、充填流体中で行われてもよい。他の実施形態では、本発明の方法は、入力核酸未処理サンプルおよび出力核酸処理サンプルの定量化を含むように適応してもよい。一例では、qPCRを用いて各処理ライブラリーサンプルのDNA濃度を決定してもよい。qPCRデータを用いて、各処理サンプルは、そのまま、またはアクチュエーターでの希釈手順を用いて希釈されて、またはアクチュエーターでのPCR手順を用いてさらに増幅されて、サンプルの貯蔵前に適切な濃度範囲を達成してもよい。他の実施形態では、本発明の方法は、構築されたライブラリーの品質保証テストを提供するように適応してもよい。一例では、TaqManまたはMolecularBeacon等のプローブ系ハイブリダイゼーション分析を用いて、完了したライブラリーの質を検証してもよい。TaqManおよびMolecularBeaconプローブは、リアルタイムまたはPCR分析の完了点で用いられてもよい。デジタル微小流体の柔軟性とプログラム可能性のため、本発明のライブラリー構築手順は、多数の異なる次世代配列決定プラットフォームでの使用に容易に適応され得る。次世代配列決定プラットフォームの例は、これらに限定されないが、Illumina、454、SOLiD、PacBioおよびIonTorrentを含む。図8A、8B、および8Cは、液滴アクチュエーターの電極配列800の一部の一例の平面図を表し、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフする方法を示す。電極配列800は、液滴操作電極810例えば、電気濡れ電極の配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極810頂部で行われる。一例では、電極配列800は、液滴操作電極810A、810B、810C、810D、810E、および810Fを含み、これらの電極は、一直線にまたは通路で配置されている。さらに、磁石812は、例えば、液滴操作電極810Aがその磁場内にあるように位置している。磁石812は、永久磁石または電磁石であってもよい。本発明のビーズをスナップオフする方法の一態様では、液滴の専有面積よりも大きい電気濡れ表面領域を使用し、このことが、可能な限り最小量の液体でビーズを留置することの鍵となる。一例では、液滴が1倍液滴のとき、ビーズをスナップオフする方法で使用される電気濡れ表面領域は、2倍である。他の例では、液滴が2倍液滴のとき、ビーズをスナップオフする方法で使用される電気濡れ表面領域は、3倍である。他の例では、液滴が3倍液滴のとき、ビーズをスナップオフする方法で使用される電気濡れ表面領域は、4倍、等である。例として、図8A、8B、および8Cは、3倍電気濡れ表面領域を用いて、2倍液滴からビーズがスナップオフされるシナリオを示している。この例では、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフする方法は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。図8Aに関して、この工程では、一定量の磁気応答性ビーズ816を含む2倍液滴814は、液滴操作電極810Aおよび810Bの頂部に位置している。これは、この工程では、液滴操作電極810Aおよび810Bがオンになっていて、一方、液滴操作電極810C、810D、810E、および810Fがオフになっているからである。液滴操作電極810Aが磁石812の磁場内にあるため、2倍液滴814内にある磁気応答性ビーズ816は、液滴操作電極810Aに引き付けられる。図8Bに関して、この工程では、液滴操作電極810A、810Eおよび810Fがオフになっていて、一方、液滴操作電極810B、810Cおよび810Dがオンになっている。これが、2倍液滴814に3つの液滴操作電極810にわたって伸びさせる。この伸びた2倍液滴814の末端が、磁石812のほぼ端にあり、まだ磁気応答性ビーズ816を保持している。磁石812の磁場のため、磁気応答性ビーズ816は、この伸びた2倍液滴814の末端に保持される。2倍液滴814が3倍電気濡れ表面領域である3つの液滴操作電極にわたって伸びる動作は、2倍液滴814の末端にやや尖った形状をとらせる。事実上、磁気応答性ビーズ816を保持したまま、磁石812の端から液体を引きはがす。図8Cに関して、この工程では、液滴操作電極810A、810Bおよび810Fがオフになっていて、一方、液滴操作電極810C、810Dおよび810Eがオンになっている。これが、2倍液滴814に、3倍電気濡れ表面領域にわたって伸ばされながら、磁石812からさらに離れる移動を引き起こしている。これが、磁気応答性ビーズ816に、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、磁石812のほぼ端にスナップオフされることを引き起こしている。未だ3倍電気濡れ表面領域にわたって伸ばされている2倍液滴814は、実質的にビーズがない。液滴マイクロアクチュエーターでのライブラリー作製化学ワークにおける重要な挑戦は、有機溶媒洗浄液滴を用いた液滴操作を行うことに対する特有な要求を伴う。様々な実施形態では、有機洗浄液滴は、約1~約100、または約10~約90、または約30~約80、または約50~約75の何らかの極性プロトン性溶媒で構成され、残りは水および本明細書に記載のような界面活性剤を含む他の物質であってもよい。一の実施形態では、溶媒は、1つ以上のアルコールおよび/またはカルボン酸である。他の実施形態では、溶媒は、1~8の炭素または1~6の炭素を有する、1つ以上のアルコールおよび/またはカルボン酸である。アルコールおよび/またはカルボン酸は、環状、直線状、または分岐状であってもよい。例は、ヘキサノール、ペンタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸を含む。液滴アクチュエーターの改良、分配技術、および、斯かる溶媒を用いた液滴操作の実行技術は、本明細書の他の箇所で検討される。7.3液滴アクチュエーターの構成およびアセンブリ液滴アクチュエーターは、例えば、底部基板および頂部基板を含んでいてもよい。電極は、いずれかまたは両方の基板に供給され、液滴操作の実行のために配置されてもよい。液滴アクチュエーターは、多重ライブラリー構築および特別なライブラリー構築手順の用途のために適応してもよい。例えば、充填流体の組成および添加界面活性剤の濃度は、本開示に基づいて核酸ライブラリー構築手順で用いられる試薬に伴う性能のために選択されてもよい。液滴輸送電圧および周波数も、本開示に基づいてライブラリー構築手順で用いられる試薬に伴う性能のために選択されてもよい。一例では、液滴アクチュエーターは、並列での10,20,30,40,50またはそれ以上の異なるライブラリーの構築のために構成される。アクチュエーターでのリザーバの数および配置、独立した電極接続の数、異なるリザーバの大きさ体積、磁石/ビーズ洗浄領域の配置、電極サイズ、電極間の間隔、および間隙高さ頂部基板と底部基板との間等の設計パラメーターは、本開示の観点から当業者により異なっていてもよい。液滴アクチュエーターは、i磁気応答性ビーズの固定のための1つ以上の磁石およびii所定の反応ゾーンおよび/または洗浄ゾーン内で温度を制御するための1つ以上のヒーターアセンブリ等、の液滴アクチュエーターについて有用な所定の部材を囲う装置のデッキに適合するように設計されてもよい。装置のデッキに結合した磁石は、永久磁石であってもよい。磁石は、位置固定されていてもよいし、または移動可能であってもよい。図9は、多重ライブラリー構築手順の実行での使用に適した液滴アクチュエーター900の一例の平面図を表している。液滴アクチュエーター900は、液滴操作間隙図示せずにより分離された底部基板910と頂部基板912を含んでいてもよい。底部基板910は、例えば、プリント基板PCBであってもよい。頂部基板912は、例えば、ガラス、射出成型プラスチック、ケイ素から作られていてもよい。頂部基板912は、導電性インクまたはインジウムスズ酸化物ITO等の導電体で液滴操作間隙に面した側面を被覆されていてもよく、さらにフルオロポリマーコーティング等の疎水性のコーティングで被覆されていてもよい。図9の頂部基板912に関して、頂部基板912は、多量の液体を受け入れるようにそれぞれ設計された、様々な大きさおよび形状の一連の液体リザーバ916を含む。液体は、例えば、本発明のライブラリー構築手順の実行に必要な様々な試薬を含んでいてもよい。例は、平滑末端化試薬、リン酸化試薬、A-tail化試薬、アダプター結合試薬、洗浄バッファー、核酸捕捉ビーズ、および核酸増幅試薬を含む。各リザーバは、リザーバから液滴操作間隙への流体通路を構築する開口部を含む。試薬は、開口部915を通って液滴操作間隙内に流れ、そこで試薬は電気濡れ媒介液滴操作等の電極媒介液滴操作にかけられてもよい。電気濡れ媒介液滴操作または誘電泳動媒介液滴操作等の液滴操作を用いて、試薬は、サブ液滴に分配され、ライブラリー構築手順等の液滴操作手順に従って輸送され、他の試薬液滴および/またはサンプル液滴と接触してもよい。頂部基板912は、任意に磁気応答性ビーズに固定されたせん断された核酸等のサンプル液滴のような液体の注入のための1つ以上のピペット注入開口部914も含んでいてもよい。底部基板910は、電気濡れ電極配列922を含む。電極配列922は、開口部915またはピペット注入部位914を経て液滴操作間隙に流れた液体を受け入れるように配置された分配電極を含む。電極配列922の分配電極は、例えば、液滴操作電極例えば、電気濡れ電極の通路、ライン、および/または配列を通じて相互接続されている。電極は、電気接点910に配線されている。一例では、核酸サンプルは、例えば、手動でまたは自動でサンプルをサンプル注入部位を経て液滴操作間隙に注入する等、サンプル注入部位914を経て液滴操作間隙に装填されてもよい。異なる核酸サンプルは、液滴アクチュエーター900上の異なる電極レーンで処理され、サンプル間の汚染の可能性を低減してもよい。他の実施形態では、各サンプルは、固有のレーンを含んでいてもよく、そしてサンプルが共通の開口部から抽出される必要がないように、各レーンは、当該レーンからサンプルを抽出するための開口部を含んでいてもよい。したがって、ライブラリー構築手順の終了時には、レーンの各々からのアダプター結合核酸は、異なる出口または出口リザーバ図示せずで浄化および回収されてもよい。図10は、核酸ライブラリーの構築用の核酸サンプルを処理するために構成された電極配列1000の他の例の平面図を表している。この例では、電極配列1000は、12の異なる核酸ライブラリー構築用に上限12の異なる核酸サンプルを並行して処理するために構成されている。電極配列1000は、分配電極1010および1012と同様に、一連のサンプル回収電極1014を含む。液滴操作間隙で、i外部リザーバ例えば、図9に関して記載したようなに結合した開口部もしくは流体通路から液体を受け入れる、または、ii当該開口部もしくは流体通路に液体を流すことができるように、分配電極1010および1012ならびにサンプル回収電極1014は、配列されてもよい。操作では、分配電極1010は、試薬の分配に用いられてもよい。例は、平滑末端化試薬、リン酸化試薬、A-tail化試薬、アダプター結合試薬、洗浄バッファー、核酸捕捉ビーズ、および核酸増幅試薬を含む。分配電極1012は、サンプルを分配するために用いられ、ここに示すように、12の核酸サンプルのための12のサンプル入力分配電極1012である。サンプル出力回収電極1014は、サンプル流体を受け入れるために用いられ、ここに示すように、液滴操作間隙から回収される処理核酸ライブラリーを受け入れるための12のサンプル出力回収電極である。試薬分配電極1010、サンプル入力分配電極1012、およびサンプル出力回収電極1014は、液滴操作電極1018例えば、電気濡れ電極の通路または配列等の配列を通じて相互接続される。各サンプル入力分配電極1012およびその対応するサンプル出力回収電極1014から延びる液滴操作電極1018の通路は、専用電極レーン1020例えば、12の専用電極レーン1020を形成する。専用電極レーン1020は、異なる核酸サンプルを処理するための別個の反応ゾーンを提供する。サンプル液滴に専用のレーンを使用することにより、異なる核酸の間での相互汚染が最小化される。各核酸サンプルは、他のいずれのサンプルの通路とも交差しない液滴操作間隙内の通路を横断するため、相互汚染の可能性が最小化される。さらに、試薬液滴がサンプル通路を横断する間に、サンプル液滴が同じ通路を横断する前に、試薬液滴が常にサンプル通路を横断するように、手順が実行され得るため、試薬液滴が、サンプルレーン間での核酸汚染の源となり得る可能性を低減する。電極配列1000は、1つ以上の温度制御ゾーン1022と共に提供されてもよい。一例では、3つの温度制御ゾーン1022すなわち、温度制御ゾーン1022a、1022b、および1022cを用いてもよい。温度制御素子図示せずが、温度制御ゾーン1022での充填流体図示せずの領域の温度を定める。他で述べたように、温度制御素子は、いくつかの実施形態では、デッキに結合されてもよく、当該デッキは、液滴アクチュエーターカートリッジを搭載し、液滴操作および検出等のカートリッジの働きを制御するシステムにカートリッジを電気的に結合させる。温度制御ゾーンは、約37°Cで提供されてもよく、当該温度は、A-tail化反応での酵素活動に十分に適した温度である。温度制御ゾーンは、核酸サンプルまたは生成物の増幅を実行するのに適した温度で構築されてもよい。3つの温度制御ゾーン1022が示されたが、他の任意の好適な数の温度制御ゾーン1022が、電極配列1000と結合されてもよい。液滴アクチュエーターは、1つ以上の磁石1024を含んでいてもよく、または1つ以上の磁石1024に結合されていてもよく、当該磁石は、磁気応答性ビーズを保持するため個々の専用電極レーン1020に近接して位置してもよい。各磁石1024は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい。一の実施形態では、磁石1024は、対応する専用電極レーン1020に近接するようにおよび当該専用電極レーンから離れるように移動可能であってもよい。各磁石1024は、酵素反応間の洗浄の間の核酸が付着したビーズの空間的な固定と、処理核酸の溶離後のビーズ除去とを確実にするように位置している。いくつかの実施形態では、混合および保温は、磁石から離れた専用電極レーン1020で行われてもよい。この筺体では、基板のいずれかまたは両方が、1以上の液滴操作の実行のために配置された電極を含んでいてもよい。液滴操作は、例えば、電気濡れ媒介液滴操作、誘電泳動媒介液滴操作、および/または光電濡れ媒介液滴操作であってもよい。液滴操作は、代わりに、または付加的に、以下の他のメカニズムにより媒介されてもよい:流体力学的な流体圧を誘起する装置等、機械的原理例えば、外部シリンジポンプ、空気圧膜ポンプ、振動膜ポンプ、真空装置、遠心力、圧電ポンプ/超音波ポンプ、および音響力に基づく操作を行う装置;電気的原理または磁気的原理例えば、電気浸透流、動電学的ポンプ、強磁性流体プラグ、電気流体力学ポンプ、磁力を利用した引力または斥力、および電磁流体力学ポンプに基づく操作を行う装置;熱力学的原理例えば、気泡発生/相転移体積膨張に基づく操作を行う装置;他の種類の表面湿潤原理例えば、電気濡れ、および光電濡れと同様に化学的な、熱的な、構造的なおよび放射性の誘起表面張力勾配に基づく操作を行う装置;重力に基づく操作を行う装置;表面張力例えば、毛細管現象に基づく操作を行う装置;静電力例えば、電気浸透流に基づく操作を行う装置;遠心力コンパクトディスク上に配置され、回転された基板に基づく操作を行う装置;磁力例えば、振動イオンが引き起こす流れに基づく操作を行う装置;電磁流体力学的な力に基づく操作を行う装置;および真空差または加圧差等に基づく操作を行う装置等。いくつかの実施形態では、上記技術の2つ以上の組み合わせを用いて、本発明の液滴アクチュエーターでの液滴操作を行ってもよい。図11は、核酸ライブラリーの構築のために液滴アクチュエーターでの核酸の処理のために構成された電極配列1100の他の一例の平面図を表している。この例では、試薬分配電極が、電極配列の中央領域に位置し、12の各サンプル入力分配電極およびサンプル処理電極の2セットが各端に位置している。分配電極、液滴操作電極例えば、サンプル処理電極、および回収電極の配列は、試薬液滴が分配され、専用サンプル処理領域すなわち、専用ライブラリー構築レーンに輸送される配列である。反応生成物すなわち、処理核酸および廃棄生成物例えば、洗浄液滴は、専用ライブラリー構築レーン上をそれぞれ、専用サンプル回収リザーバおよび廃棄物回収リザーバに輸送される。電極配列1100は、24の異なる核酸ライブラリー構築のために専用反応レーンで並行して上限24の異なる核酸サンプルを処理するために構成されている。各核酸ライブラリーを識別する固有のアダプターバーコード標識は、ライブラリー作製方法の間に、各核酸サンプルに結合されてもよい。電極配列1100は、複数の分配電極を含む。例えば、電極配列1100は、11の試薬分配電極1110等、異なる試薬流体例えば、平滑末端化試薬、A-tail化試薬、アダプター結合試薬、ビーズ溶液、洗浄バッファー、溶離バッファーを分配するための1つ以上の試薬分配電極1110を含んでいてもよい。電極配列1100は、サンプル流体を分配するための1つ以上のサンプル入力分配電極1112も含んでいてもよい例えば、核酸を分配するための24のサンプル入力分配電極1112。電極配列1100は、アダプターバーコード標識を分配するための1つ以上のアダプター分配電極1114例えば、24のアダプター分配電極1114も含んでいてもよい。分配電極1110,1112,および1114の各配列は、専用試薬輸送レーン1111,1112,および1115を含んでいてもよく、当該専用試薬輸送レーンは、試薬が他のいずれの反応レーンを横断する必要なく、分配された試薬液滴を分配電極1110,1112,および1114から当該分配電極の個々の反応レーン1124まで輸送するように配置された電極を含む。組立液滴アクチュエーターでは、分配電極1110,1112,および1114は、流体通路と結合され、当該流体通路は、試薬を分配電極の十分近傍に流し、分配電極は、試薬の液滴を液滴操作表面上または液滴操作間隙内に分配するために用いられてもよい。例えば、流体通路は、頂部基板リザーバから液滴操作間隙内への通路であってもよい。分配電極1110は、液滴を配列のいずれかの側から分配するように配置されている。したがって、独立して、試薬を専用輸送レーン1111に沿って2方向に、専用反応通路1124まで供給する。電極配列1100は、複数の回収電極も含んでいてもよい。例えば、電極配列1100は、サンプル流体を受け入れるための1つ以上のサンプル出力回収電極1116例えば、処理核酸液滴を受け入れるための24のサンプル出力回収電極1116を含んでいてもよい。電極配列1100は、廃棄流体を回収するための1つ以上の廃棄物回収電極1118例えば、24の廃棄物回収電極1118も含んでいてもよい。回収電極1116および1118の各配列は、それぞれ、専用試薬輸送レーン1117および1119と接触していてもよく、当該レーンは、液滴が他のいずれの反応レーンを横断する必要なく、反応レーン1124から回収電極1116および1118まで分配された試薬液滴を輸送するように配置された電極を含む。サンプル出力回収電極1116および/または廃棄物回収リザーバ1118は、流体通路と結合されてもよく、当該流体通路は、回収のために試薬を当該回収電極から流体通路またはリザーバまたは液滴アクチュエーター外に流す。例えば、流体通路は、回収電極から液滴操作間隙外のリザーバまで、または液滴操作間隙の領域内のリザーバまでの通路であってもよい。試薬分配電極1110、サンプル入力分配電極1112、アダプター分配電極1114、サンプル出力回収電極1116、および廃棄物回収電極1118は、液滴操作電極1120例えば、電気濡れ電極の通路または配列等の配列を通じて相互接続されている。液滴操作電極1120の配列は、反応ゾーン1122を提供する。特に、各サンプル入力分配電極1112、アダプター分配電極1114ならびにそれらの対応するサンプル出力回収電極1116および廃棄物回収電極1118から延びる液滴操作電極1120の配列は、各サンプル入力についての2つの専用電極レーン1124等の専用電極レーン1124を形成する。反応ゾーン1122内の専用電極レーン1124は、i異なる核酸サンプルを処理するための別個の反応レーンすなわち、ライブラリー構築、および、ii所定の反応工程例えば、ビーズ除去工程の間、反応液滴を往復するための遮断レーンを提供する。サンプル液滴用の専用レーンおよび集中型試薬分配を用いることにより、異なる核酸間の相互汚染を最小化する。1つ以上の磁石図示せずは、磁気応答性ビーズを保持するために専用電極レーン1124近傍に位置されてもよい。磁石は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい。一例では、磁石は、各専用電極レーン1124に近接するようにおよび当該専用電極レーンから離れるように移動可能であってもよい。各磁石は、酵素反応間の洗浄の間の核酸が付着したビーズの空間的な固定と、処理核酸の溶離後のビーズ除去とを確実にするように位置している。混合および保温は、磁石から離れた専用電極レーン1124で行われてもよい。反応ゾーン1122は、1つ以上の温度制御ゾーン図示せずも含んでいてもよい。温度制御素子は例えば、ヒーターまたはヒートシンク、図示せず、反応ゾーン1122内の専用電極レーン1124近傍に位置してもよい。温度制御素子を用いて、温度制御ゾーン周辺で充填流体図示せずの温度を制御してもよい。一の実施形態では、サンプル入力分配電極は、小さなサンプル入力体積用に設計されてもよい。例えば、1μLサンプル体積は、液滴アクチュエーターに装填され、660nL液滴として処理されてもよい。他の実施形態では、サンプル入力分配電極およびリザーバは、大きなサンプル入力体積用に設計されてもよい。一例では、ビーズ濃縮手順を用いて、アクチュエーター外のサンプルリザーバでのサンプル体積から核酸を濃縮および回収してもよい。磁気応答性ビーズを、液滴アクチュエーターでサンプルリザーバにサンプルを装填する前に、約10~約20μL等の大きなサンプル体積に添加してもよい。大容量サンプルは、次いで、ビーズ濃縮手順を用いてアクチュエーターで330nL液滴に処理されてもよい。他の例では、大きなサンプル体積は、アクチュエーターのサンプルリザーバで濃縮されてもよい。この例では、一連の660nL液滴が、順次、磁気応答性ビーズと共に、アクチュエーターのサンプルリザーバで保温されてもよい。混合電極を用いてビーズの混合を促進してもよい。デジタル微小流体の柔軟性とプログラム可能性により、サンプル処理手順は、アクチュエーターで、アクチュエーター外で、または、サンプル処理のいずれの組み合わせでも容易に応用され得る。他の実施形態では、各核酸ライブラリー例えば、図示した電極配列1100を用いて上限24の異なる核酸ライブラリーは、個々の専用サンプル出力回収電極1116で回収されてもよい。サンプル出力回収リザーバは、例えば、バッファー溶液で満たされて、リザーバからの処理核酸サンプルの除去を容易にしてもよい。一例では、サンプル出力回収リザーバは、バッファーを用いて手動で充填例えば、手動のピペット操作されてもよい。他の例では、サンプル出力リザーバは、ロボット装置を用いてバッファーで充填されてもよい。サンプル回収は、例えば、各サンプル出力回収リザーバ図示せずから処理サンプルを手動で除去例えば、手動のピペット操作することで行われてもよい。他の例では、サンプル回収は、ロボット装置を用いて行われ、個々の出力回収リザーバ図示せずから各処理サンプルを除去してもよい。他の実施形態では、1つ以上の異なる核酸ライブラリーは、当該ライブラリーが、サンプル出力回収電極での回収前に、液滴アクチュエーターで貯蔵されるように、液滴操作を用いて混合されてもよい。1つ以上の核酸ライブラリーの貯蔵前に、各サンプルの処理核酸の量を決定して、貯蔵する全ての個々のサンプルの濃度を等量に確実にしてもよい。一例では、qPCRを用いて各処理サンプルの核酸の濃度を決定してもよい。qPCRデータを用いて、各処理サンプルは、そのまま、またはアクチュエーターでの希釈手順を用いて希釈されて、またはアクチュエーターでのPCR手順を用いてさらに増幅されて、サンプルの貯蔵前に適切な濃度範囲を達成してもよい。他の例では、核酸サンプルを処理する前に、アクチュエーターでの核酸定量手順を用いてもよい。この例では、各サンプルについての入力核酸の濃度が、決定され、必要であれば各サンプルについて核酸ライブラリー構築手順での処理前に調整される。図12は、核酸ライブラリーの構築用に液滴アクチュエーターで核酸を処理をするように構成された電極配列1200の他の一例の平面図を表している。この例では、電極配列1200は、上限24の異なる核酸ライブラリーのために2つの別個の処理モジュールの各々で、並行して上限12の異なる核酸サンプルを処理するように構成されている。一の実施形態では、処理モジュールは、一の処理モジュールが、他の処理モジュールとは独立して用いられてもよいように、液滴アクチュエーター上で物理的に分離されている。例えば、一のライブラリー処理モジュールを含む液滴アクチュエーターの一部は、充填流体例えば、シリコーンオイルで充填され、上限12の異なる核酸ライブラリーの処理のために用いられてもよい。第2のライブラリー処理モジュールを含む液滴アクチュエーターの他の一部は、今後の使用のために未使用のままでもよい。一の実施形態では、電極配列1200は、2つのサンプル処理モジュール1210aおよび1210bを含んでいてもよい。2つのサンプル処理モジュール1210を示したが、サンプル処理モジュールは、任意の数および組み合わせで用いられてもよい。各サンプル処理モジュール1210は、複数の電極を含む。例えば、各サンプル処理モジュール1210は、異なる試薬流体例えば、平滑末端化試薬、A-tail化試薬、アダプター結合試薬、ビーズ溶液、洗浄バッファー、溶離バッファーを分配するために、12の試薬分配電極1212等の1つ以上の試薬分配電極1212を含んでいてもよい。各サンプル処理モジュール1210は、サンプル流体を分配するため、1つ以上のサンプル入力分配電極1214例えば、核酸を分配するための12のサンプル入力分配電極1214も含んでいてもよい。各サンプル処理モジュール1210は、サンプル流体を受け入れるため、1つ以上のサンプル出力回収電極1216例えば、処理核酸液滴を受け入れるための12のサンプル出力回収電極1216も含んでいてもよい。他の実施形態では、サンプル出力回収電極1216は、アダプター分配電極として使用されてもよい。試薬分配電極1212、サンプル入力分配電極1214、およびサンプル出力回収電極1216は、液滴操作電極1218例えば、電気濡れ電極の通路または配列等の配列を通じて相互接続されている。各サンプル入力分配電極1214およびその対応するサンプル出力回収電極1216から延びる液滴操作電極1218の通路は、12の専用電極レーン1220等の専用電極レーン1220を形成する。専用電極レーン1220は、異なる核酸サンプル処理のための別個の反応ゾーンを提供する。サンプル液滴に専用のレーンを使用することにより、異なる核酸の間での相互汚染が最小化される。電極配列1200は、1つ以上の温度制御ゾーン1222を含んでいてもよい。一例では、3つの温度制御ゾーン1222すなわち、温度制御ゾーン1222a、1222b、および1222cが用いられてもよい。温度制御素子図示せずが、温度制御ゾーン1222近傍での充填流体図示せずの温度を制御する。1つ以上の磁石例えば、12の磁石1224が、磁気応答性ビーズを保持するために個々の専用電極レーン1220近傍に位置されてもよい。専用電極レーン1220に関する磁石1224の位置決めは、所定の反応工程例えば、ビーズ除去工程の間、反応液滴を往復するための遮断領域を提供する。各磁石1224は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい。各磁石1224は、各専用電極レーン1220に近接するようにおよび当該専用電極レーンから離れるように移動され得る可動式磁石であってもよい。各磁石1224は、酵素反応の間の洗浄時における核酸が付着したビーズの空間的な固定と、処理核酸の溶離後のビーズ除去と、を確実にするように位置している。混合および保温は、磁石から離れた専用電極レーン1220で行われてもよい。図13Aおよび13Bは、それぞれ、多重核酸ライブラリー構築手順の実行での使用に適した組立液滴アクチュエーター1300の平面図および斜視図を表している。液滴アクチュエーター1300は、液滴操作間隙で分離された底部基板1310および頂部基板1312を含んでいてもよい。底部基板1310は、例えば、PCB、プラスチックまたはシリコンチップであってもよい。底部基板1310は、核酸ライブラリーの構築用の核酸を処理するために構成された電極配列1314を含んでいてもよい。電極配列1314の詳細は、図14を参照して記載される。液滴操作は、液滴操作表面上の電極配列1314頂部で行われる。好適な実施形態では、底部基板1310は、PCBであり、当該PCBは、厚み約0.03125インチであり、銅フラッドがなくすなわち、電極間のPCB上に銅層がない製造されており、これにより、底部基板1310と頂部基板1312との間の液滴操作間隙での液滴中の磁気応答性ビーズを制御するために用いられる磁場との干渉を低減し、底部基板を通じた熱エネルギーの透過を低減する。他の実施形態では、底部基板1310は、厚み約0.0625インチのPCBであってもよい。頂部基板1312は、例えば、ポリカーボネート等の射出材料で形成されてもよい。複数の流体分配リザーバが頂部基板1312に組み込まれてもよい。例えば、頂部基板1312は、異なる試薬流体例えば、平滑末端化試薬、A-tail化試薬、アダプター結合試薬、ビーズ溶液、洗浄バッファー、溶離バッファーを分配するための1つ以上の試薬分配リザーバを含んでいてもよい。一例では、頂部基板1312は、試薬分配リザーバ1317A、1317B、1317C、1317D、および1317Eに沿って、試薬分配リザーバ1316A、1316B、1316C、および1316Dを含む。頂部基板1312は、サンプル流体を分配するための1つ以上のサンプル入力リザーバを含んでいてもよい。例えば、頂部基板1312は、サンプル入力リザーバ1318A~1318Fの第1列またはカラムおよびサンプル入力リザーバ1318G~1318Lの第2列またはカラムを含む。頂部基板1312は、アダプターバーコード標識を分配するための1つ以上のアダプター分配リザーバも含んでいてもよい。例えば、頂部基板1312は、アダプター分配リザーバ1320A~1320Fの第1列またはカラムおよびアダプター分配リザーバ1320G~1320Lの第2列またはカラムを含む。頂部基板1312は、複数の回収リザーバも含んでいてもよい。例えば、頂部基板1312は、処理核酸液滴を受け入れるための2列またはカラムの6つのサンプル出力回収リザーバ1322等の処理サンプル流体を受け入れるための1つ以上のサンプル出力回収リザーバ1322を含んでいてもよい。頂部基板1312は、廃棄物回収リザーバ1324Aおよび1324B等の廃棄流体を回収するための1つ以上の廃棄物回収リザーバ1324も含んでいてもよい。試薬分配リザーバ1316、サンプル入力リザーバ1318、およびアダプター分配リザーバ1320は、開口部または流体通路に結合し、当該開口部または流体通路は、流体を流体分配電極近傍に流すために配置され、当該電極は図14を参照して記載したように底部基板1310上に配置されている。サンプル出力回収リザーバ1322および廃棄物回収リザーバ1324は、実質的に開口部または流体通路に結合し、当該開口部または流体通路は、流体を流体回収電極からサンプル出力回収リザーバ1322および廃棄物回収リザーバ1324に流すように配置され、当該電極は図14を参照して記載したように底部基板1310上に配置されている。底部基板1310の周辺の少なくとも約1cmの広さの領域は、底部基板1310を頂部基板1312に結合するための結合領域を提供する。加えて、底部基板1310を頂部基板1312に機械的に取り付けるために、1つ以上の熱支柱heatstakeを用いられてもよい。熱支柱法または熱可塑性支柱法は、周知の機械的結合方法である。一例では、接着剤層は、幅約1cm未満および高さ約425ミクロンであってもよい。図13Cは、液滴アクチュエーター1300の頂部基板1312の一実施例の平面図を表している。頂部基板1312の開口部は、頂部基板にリザーバがないため、ピペット操作による装填のためのものである。この図は、試薬分配リザーバ1316A、1316B、1316C、および1316D;試薬分配リザーバ1317A、1317B、1317C、1317D、および1317E;サンプル入力リザーバ1318A~1318F;サンプル入力リザーバ1318G~1318L;アダプター分配リザーバ1320A~1320F、およびアダプター分配リザーバ1320G~1320L、の開口部を示している。図13A、13B、および13Cに関して、液滴アクチュエーター1300のリザーバのための装填体積および液滴の例を表6に示す。図14は、図13Aおよび13Bの液滴アクチュエーター1300の底部基板1310の一例の平面図を表し、当該底部基板は、当該基板上に形成された電極配列1314を有する。この例では、試薬分配電極は、電極配列1314の中央部に位置し、電極配列1314の各側面に6つのサンプル入力分配電極のセットと、6つのサンプル処理電極のセットとが位置している。電極配列1314は、複数の分配電極を含む。例えば、電極配列1314は、異なる試薬流体例えば、平滑末端化試薬、A-tail化試薬、アダプター結合試薬、ビーズ溶液、洗浄バッファー、溶離バッファーを分配するための9つの試薬分配電極1410等の1つ以上の試薬分配電極1410を含んでいてもよい。電極配列1314は、サンプル流体を分配するための1つ以上のサンプル入力分配電極1412を含んでいてもよい例えば、核酸を分配するための2列またはカラムの6つのサンプル入力分配電極1412。電極配列1314は、アダプターバーコード標識を分配するための1つ以上のアダプター分配電極1414例えば、2列またはカラムの6つのアダプター分配電極1414を含んでいてもよい。電極配列1314は、複数の回収電極を含んでいてもよい。例えば、電極配列1314は、処理サンプル流体を受け入れるための1つ以上のサンプル出力回収電極1416例えば、処理核酸液滴を受け入れるための2列またはカラムの6つのサンプル出力回収電極1416を含んでいてもよい。電極配列1314は、廃棄流体を回収するための1つ以上の廃棄物回収電極1418例えば、廃棄物回収電極1418aおよび1418bを含んでいてもよい。試薬分配電極1410、サンプル分配電極1412、アダプター分配電極1414、サンプル出力回収電極1416、および廃棄物回収電極1418は、実質的に流体リザーバにそろっていて、当該リザーバは、図13A、13B、および13Cの液滴アクチュエーター1300の頂部基板1312に組み込まれている。試薬分配電極1410、サンプル入力分配電極1412、アダプター分配電極1414、サンプル出力回収電極1416、および廃棄物回収電極1418は、液滴操作電極1420例えば、電気濡れ電極の配列を通じて相互接続されている。例えば、各サンプル入力分配電極1412およびその対応するサンプル出力回収電極1416から延びる液滴操作電極1420の通路は、13の専用電極レーン1422等の専用電極レーン1422を形成する。専用電極レーン1422は、ライブラリー構築手順での異なる核酸サンプル処理のための別個の反応レーンを提供する。サンプル液滴用の専用レーンおよび集中型試薬分配を用いることにより、異なる核酸間の相互汚染を最小化する。所定の処理工程を行うために1つ以上のビーズ固定ゾーン1424例えば、ビーズ固定ゾーン1424aおよび1424bが、電極配列1314に関連して提供されてもよい。例えば、ビーズ固定ゾーン1424は、Halbach配列等の磁石の配列により形成されてもよく、ビーズ固定ゾーンは、液滴アクチュエーターに十分に近接して設置され、その結果の磁場は、液滴操作間隙内の液滴中の磁気応答性ビーズを、斯かる液滴を用いた液滴操作の間、実質的に拘束する。磁石により作られる、ビーズ固定ゾーン1424での磁場は、磁気応答性ビーズを保持するのに用いられてもよい。一例では、磁石の配列は、可動式配列であってもよく、当該可動式配列は図23A、23B、および24に関して記載したように、ビーズ固定ゾーン1424に近接するようにまたは離れるように移動されてもよい。磁石配列は、iサンプル濃縮、ii酵素反応間の洗浄、およびiii処理核酸の溶離後のビーズ除去、等の所定の処理工程の間に、磁気応答性ビーズの保持を確実にするように位置している。いくつかの処理工程を行うために、1つ以上の温度制御ゾーン1426例えば、温度制御ゾーン1426a~1426dが、液滴アクチュエーター内に提供されてもよい。例えば、加熱棒等の1つ以上の加熱素子図示せずが、組立液滴アクチュエーターに近接して提供され、液滴操作間隙内で1つ以上の温度制御ゾーン1426を作り出してもよい。加熱棒は、i液滴アクチュエーター1300の液滴操作間隙内の充填流体の温度制御、および、ii温度制御ゾーン1426を通じて液滴アクチュエーターの電極通路に沿って輸送される液滴の加熱または冷却のために用いられてもよい。1つ以上の加熱パッド1428を用いて温度制御ゾーン1426での熱の流れを制御してもよい。図15は、液滴アクチュエーターの底部基板1500の一例の平面図を表し、当該底部基板は、最適化された液滴輸送と作業行程時間のための、前記基板上に形成された電極配列1510を有する。液滴アクチュエーターは、PCBであってもよい底部基板1500と結合された頂部基板図示せずを用いて形成されてもよく、これらの底部基板1500と頂部基板は間隙によって分離されている。電極配列1510は、リザーバ電極および/または液滴操作電極等の種々の電極で形成されてもよい。本発明の電極配列1510の主な態様は、当該電極配列が、例えば、他方と電気的に独立した2つの部分を有する。例えば、図15は、部分Aと部分Bとに電気的に区分けされていてもよい電極配列1510を示している。例えば、電極配列1510の部分Aで液滴操作が起こり、並行かつ独立して部分Bで液滴操作が起こってもよく、逆でもよい。液滴操作が電極配列1510の部分AとBとで並行かつ独立して起こってもよいため、液滴輸送と作業行程時間が最適化され得る。すなわち、この基板設計は、連続液滴輸送と作業行程操作を要求してもよい。対照的に、部分AとBとで並行かつ独立して、液滴操作が起こり得るため、本発明の底部基板1500および電極配列1510は、液滴輸送と作業行程時間の最小化を可能とする。図15に示された例では、底部基板1500が頂部基板図示せずと組み合わされて、液滴アクチュエーターを形成する場合、電極配列1510は、様々な容量のアクチュエーターの所定の流体リザーバを支持する。例えば、底部基板1500の他の流体リザーバに関して、電極配列1510は、一列になって配置された8つの大容量流体リザーバ1512等の複数の大容量流体リザーバ1512を支持してもよい。一例では、大容量流体リザーバ1512は、サンプル流体および/または廃棄流体を保持するために用いられてもよい。底部基板1500の他の流体リザーバに関して、電極配列1510は、一列になって配置された7つの中容量流体リザーバ1514等の複数の中容量流体リザーバ1514を支持してもよい。一例では、中容量流体リザーバ1514は、洗浄試薬、溶離バッファー試薬、バッファー試薬液滴回収用の、酵素試薬、所定のビーズ含有試薬等を保持するための試薬リザーバであってもよい。底部基板1500の他の流体リザーバに関して、電極配列1510は、一列になって配置された7つの小容量流体リザーバ1516等の複数の小容量流体リザーバ1516を支持してもよい。一例では、小容量流体リザーバ1516は、所定の酵素試薬を保持するための試薬リザーバであってもよい。加えて、底部基板1500の電極配列1510は、これらに限定されないが、8つの回収リザーバ1518の列、8つの一時貯蔵リザーバ1520の列、および、8つのアダプターリザーバ1522の列等の他のリザーバを支持してもよい。一時貯蔵リザーバ1520は、一時液体保持リザーバである。一例では、一時貯蔵リザーバ1520は、一時的なビーズ溶液の保持のために用いられる。一例では、アダプターリザーバ1522は、アダプター溶液の保持のために用いられる。電極配列1510により支持されるアクチュエーターのリザーバの更なる詳細は、図16~21を参照して記載される。液滴操作電極1524例えば、電気濡れ電極の様々なライン、通路、および/または配列が用いられ、大容量流体リザーバ1512、中容量流体リザーバ1514、小容量流体リザーバ1516、回収リザーバ1518、一時貯蔵リザーバ1520、および/またはアダプターリザーバ1522を相互接続する。一例では、図15は、1つ以上の混合閉回路1526を示し、当該閉回路は液滴操作電極1524の所定の配列により形成される。例えば、8つの混合閉回路1526の列が、個々の大容量流体リザーバ1512の近くに実装される。他の例では、図15は、液滴操作電極1524の他の配列により形成される分配閉回路1528を示している。例えば、分配閉回路1528は、中容量流体リザーバ1514および小容量流体リザーバ1516の近傍に実装されている。一例では、溶離液滴は、分配閉回路1528で処理されてもよい。一般的に、回収リザーバ1518、一時貯蔵リザーバ1520、およびアダプターリザーバ1522は、8つの混合閉回路1526と分配閉回路1528との間に配置されている。7つの中容量流体リザーバ1514および7つの小容量流体リザーバ1516が、分配閉回路1528の一方の側面を提供している。8つの大容量流体リザーバ1512が、それぞれ、8つの混合閉回路1526を提供している。底部基板1500は、いくつかの入力/出力I/Oパッド1530も含む。I/Oパッド1530は、PCBに配線することにより電極に電気的に接続されている電気接点である。一例では、I/Oパッド1530は、液滴操作電極1524および/または任意のリザーバ電極に電気濡れ電圧をかけるために用いられる。加えて、図15は、複数の温度ゾーンを含んでいてもよい底部基板1500を示し、当該ゾーンは、所定の温度制御素子図示せずで制御される。一例では、温度ゾーン1540は、混合閉回路1526の領域で提供される。当該ゾーンは、例えば、指定逆転写RTゾーンであってもよい。加えて、温度ゾーン1542は、混合閉回路1526とアダプターリザーバ1522の領域で提供される。当該ゾーンは、例えば、指定加熱ゾーンであってもよい。さらに、温度ゾーン1544は、一時貯蔵リザーバ1520と分配閉回路1528の領域で提供される。当該ゾーンは、例えば、指定装填ゾーンであってもよい。一例では、温度ゾーン1540は、約xx°C~約xx°Cで保持されてもよく、温度ゾーン1542は、約xx°C~約xx°Cで保持されてもよく、そして温度ゾーン1544は、約xx°C~約xx°Cで保持されてもよい。電極配列1510の部分Aおよび部分Bに関して、大容量流体リザーバ1512および混合閉回路1526が部分Aにある。中容量流体リザーバ1514、小容量流体リザーバ1516、回収リザーバ1518、一時貯蔵リザーバ1520、アダプターリザーバ1522、および分配閉回路1528が、部分Bにある。操作では、電極配列1510の部分Aで、酵素および/または結合反応が起こってもよい。混合および/またはサンプル濃縮工程が、大容量流体リザーバ1512で起こってもよく、当該リザーバはサンプル流体および/または廃棄流体を保持していてもよい。加えて、いくつかの保温操作例えば、上限約30分の保温時間が、部分Aで起こってもよい。それと同時に、電極配列1510の部分Bで、いくつかの液滴が、試薬リザーバである中容量流体リザーバ1514および小容量流体リザーバ1516から予備分配されてもよく、次いで、分配閉回路1528での処理を待つ。中容量流体リザーバ1514および小容量流体リザーバ1516から予備分配された液滴は、作動するまでの時間を最小化する輸送および作業行程時間を最小化する。時々、長期間例えば、3時間、ビーズを懸濁に保つことは難しい場合もある。そのため、電極配列1510の部分Bを用いて、ビーズの数滴例えば、8液滴をいずれかのリザーバから一時貯蔵リザーバ1520まで予備分配してもよい。ビーズの体積が小さいほど、懸濁を保つのが容易である。一例では、回収リザーバ1518は、検査手順の最終生成物である処理サンプルの回収のために用いられる。頂部基板図示せずは、図15の底部基板1500に関連して配置され、液滴アクチュエーターを形成する。図16は、電極配列1510により支持されたアクチュエーターの流体リザーバを充填するための頂部基板図示せずの開口部に関連した図15の底部基板1500の平面図を表している。例えば、図16は、複数の開口部1550を示し、この開口部1550は、各流体リザーバに対して1つ設けられる。一例では、大容量流体リザーバ1512、中容量流体リザーバ1514、および小容量流体リザーバ1516のための開口部1550は、約3ミリメートルmmの直径を有していてもよい。回収リザーバ1518およびアダプターリザーバ1522のための開口部は、約2mmの直径を有していてもよい。大容量流体リザーバ1512、中容量流体リザーバ1514、小容量流体リザーバ1516、回収リザーバ1518、一時貯蔵リザーバ1520、およびアダプターリザーバ1522の更なる詳細は、図17,18,19,20、および21を参照して記載される。一の実施形態では、全ての操作は、リザーバ空間内で起こってもよい。例えば、全ての混合および結合は、大容量流体リザーバ1512内で起こってもよい。例えば、大容量流体リザーバ1512の前方部を用いて結合および溶離を行ってもよい。斯かる実施形態では、各サンプルレーンの混合閉回路1526は、追加のユニットセルを装着することができる。図17は、1つの大容量流体リザーバ1512を含む底部基板1500の一部の側面図および平面図を表している。大容量流体リザーバ1512は、複数の別個に制御される電極の配列から形成され、当該電極は、集合的に、図15の電極配列1510内に、大容量流体リザーバ1512を形成する。例えば、大容量流体リザーバ1512の中央に沿って、4つの区分けされたリザーバ電極1560があってもよい。中央のこの4つの区分けされたリザーバ電極1560は、その各側面が4つのより小さなリザーバ側面電極1562と面するように位置してもよい。別個に制御される電極のこの配列は、液滴操作電極1524例えば、電気濡れ電極の通路、ライン、および/または配列に関連して配置される。加えて、液滴操作電極1524のラインは、各側面が1つ以上の通路側面電極1564と面するように位置していてもよい。さらに、装填電極1566は、大容量流体リザーバ1512の開口部1550に関連して配置されてもよい。本発明の大容量流体リザーバ1512の一態様では、当該リザーバが複数の別個に制御される電極に区分けされている。区分けされた電極デザインの利点は、所定の電極活性シークエンスを用いることで、複雑な混合操作を大容量流体リザーバ1512の複数のリザーバ電極頂部で起こし得ることである。区分けされた電極デザインの他の利点は、大容量流体リザーバ1512の区分けにより異なる体積の流体を扱う能力を提供することである。一例では、大容量流体リザーバ1512は、約20マイクロリットルμL~約130μLの範囲の体積の流体を扱ってもよい。実質的に開口部1550に位置している装填電極1566は、流体の意図した最小体積例えば、約20μLを保持する大きさと形状である。一例では、大容量流体リザーバ1512用の開口部1550の直径は、約3mmである。図17の側面図は、頂部基板1570に関連して、底部基板1500を示している。液滴操作電極1524に沿った高さH1の間隙がある。この例では、頂部基板1570の側面に段があり、複数のリザーバ電極の領域での間隙高さH2は、間隙高さH1よりも大きい。頂部基板1570の側面をテーパー状として、間隙高さH2から間隙高さH1への変移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ電極を活性化することなく流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、H1は、約50~約600μm、または約200~約400μm、または約300μmであってもよい。一例では、H2は、約1000~約5000μm、または約2000~約3000μm、または約2800μmであってもよい。図18は、1つの中容量流体リザーバ1514を含む底部基板1500の一部の側面図および平面図を表している。中容量流体リザーバ1514も、複数の別個に制御される電極の配列から形成され、当該電極は、集合的に、図15の電極配列1510内に、中容量流体リザーバ1514を形成する。図17の大容量流体リザーバ1512からは独特の大きさおよび/または形状となっているが、中容量流体リザーバ1514も、区分けされたリザーバ電極1560、リザーバ側面電極1562、液滴操作電極1524、および通路側面電極1564を含む。中容量流体リザーバ1514も、開口部1550に関連した装填電極1566を含む。中容量流体リザーバ1514の区分けされた電極デザインの利点例えば、混合能力および異なる体積の流体を扱う能力は、図17の大容量流体リザーバ1512に関して記載したものと実質的に同じである。一例では、中容量流体リザーバ1514は、約8μL~約100μLの範囲の体積の流体を扱ってもよい。実質的に開口部1550に位置している装填電極1566は、流体の意図した最小体積例えば、約8μLを保持する大きさと形状である。一例では、中容量流体リザーバ1514用の開口部1550の直径は、約3mmである。図18の側面図は、頂部基板1570に関連して、底部基板1500を示している。液滴操作電極1524に沿った高さH1の間隙がある。この例では、頂部基板1570の側面に段があり、複数のリザーバ電極の領域での間隙高さH2は、間隙高さH1よりも大きい。頂部基板1570の側面をテーパー状として、間隙高さH2から間隙高さH1への変移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ電極を活性化することなく、流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、H1は、約50~約600μm、または約200~約400μm、または約300μmであってもよい。一例では、H2は、約500~約1000μm、または約700~約900μm、または約800μmであってもよい。図19は、1つの小容量流体リザーバ1516を含む底部基板1500の一部の側面図および平面図を表している。小容量流体リザーバ1516も、複数の別個に制御される電極の配列から形成され、当該電極は、集合的に、図15の電極配列1510内に、小容量流体リザーバ1516を形成する。図17の大容量流体リザーバ1512からは独特の大きさおよび/または形状となっているが、小容量流体リザーバ1516も、区分けされたリザーバ電極1560、リザーバ側面電極1562、液滴操作電極1524、および通路側面電極1564を含む。小容量流体リザーバ1516も、開口部1550に関連した装填電極1566を含む。小容量流体リザーバ1516の区分けされた電極デザインの利点例えば、混合能力および異なる体積の流体を扱う能力は、図17の大容量流体リザーバ1512に関して記載したものと実質的に同じである。一例では、小容量流体リザーバ1516は、約6μL~約20μLの範囲の体積の流体を扱ってもよい。実質的に開口部1550に位置している装填電極1566は、流体の意図した最小体積例えば、約6μLを保持する大きさと形状である。一例では、中容量流体リザーバ1514用の開口部1550の直径は、約3mmである。図19の側面図は、頂部基板1570に関連して、底部基板1500を示している。液滴操作電極1524に沿った高さH1の間隙がある。この例では、頂部基板1570の側面に段があり、複数のリザーバ電極の領域での間隙高さH2は、間隙高さH1よりも大きい。頂部基板1570の側面をテーパー状として、間隙高さH2から間隙高さH1への変移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ電極を活性化することなく、流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、H1は、約50~約600μm、または約200~約400μm、または約300μmであってもよい。一例では、H2は、約500~約1000μm、または約700~約900μm、または約800μmであってもよい。液滴操作電極1524の側面に位置する通路側面電極1564は、電気濡れ力を増加させ、電気濡れ領域を増加させることによりリザーバから分配領域まで液体を引く働きをする。この例では、液滴操作電極1524に関連した通路側面電極1564のずれが、液体が隣接する電極に進行するのを補助する。図20は、1つの回収リザーバ1518を含む底部基板1500の一部の側面図と平面図を表している。回収リザーバ1518は、液滴操作電極1524の配列から形成される。一例では、回収リザーバ1518用の開口部1550の直径は、約2mmである。図20の側面図は、頂部基板1570に関連して、底部基板1500を示している。液滴操作電極1524に沿って高さH1の間隙がある。この例では、頂部基板1570の側面には段がない。したがって、液滴操作電極1524に沿って実質的に均一な間隙高さH1がある。一例では、H1は、約50~約600μm、または約200~約400μm、または約300μmであってもよい。図21は、1つの一時貯蔵リザーバ1520と1つのアダプターリザーバ1522とを含む底部基板1500の一部の側面図と平面図を表している。一時貯蔵リザーバ1520とアダプターリザーバ1522も、複数の別個に制御される電極の配列から形成され、当該電極は、集合的に、図15の電極配列1510内に、一時貯蔵リザーバ1520とアダプターリザーバ1522とを形成する。図17の大容量流体リザーバ1512からは、独特の大きさおよび/または形状となっているが、一時貯蔵リザーバ1520およびアダプターリザーバ1522も、区分けされたリザーバ電極1560を含む。この例では、区分けされたリザーバ電極1560は、例えば、T型、Y型、H型、および/または他のいずれの形状であってもよいが、電気濡れの向上のために、液体が隣接する電極に接触するのを確実にする、または、少なくとも補助する。一時貯蔵リザーバ1520およびアダプターリザーバ1522の区分けされた電極デザインの利点例えば、混合能力および異なる体積の流体を扱う能力は、図17の大容量流体リザーバ1512に関して記載したものと実質的に同じである。一例では、一時貯蔵リザーバ1520およびアダプターリザーバ1522は、約1μL~約5.5μLの体積の流体を扱ってもよい。図17は、アダプターリザーバ1522に関連して、開口部1550も示している。一例では、アダプターリザーバ1522用の開口部1550の直径は、約2mmである。一時貯蔵リザーバ1520についての開口部1550はない。図21の側面図は、頂部基板1570と関連した底部基板1500を示している。液滴操作電極1524に沿って高さH1の間隙がある。この例では、頂部基板1570の側面には段があり、区分けされたリザーバ電極1560の領域での間隙高さH2は、間隙高さH1より大きい。頂部基板1570の側面をテーパー状として、間隙高さH2から間隙高さH1への変移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ電極を活性化することなく流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、H1は、約50~約600μm、または約200~約400μm、または約300μmであってもよい。一例では、一時貯蔵リザーバ1520でのH2は、約500~約1000μm、または約600~約700μm、または約625μmであってもよく、アダプターリザーバ1522でのH2は、約250~約750μm、または約400~約500μm、または約425μmであってもよい。図15~21に関して、開口部1550を供給するアクチュエーター外の流体リザーバ図示せずは、底部基板1500に関連する頂部基板に組み込まれてもよい。したがって、アクチュエーター外の流体リザーバは、これらに限定されないが、大容量流体リザーバ1512、中容量流体リザーバ1514、小容量流体リザーバ1516、回収リザーバ1518、一時貯蔵リザーバ1520、およびアダプターリザーバ1522等のアクチュエーターの流体リザーバと組み合わせて用いられる。他の実施形態では、電気濡れ装置の液滴操作間隙での液滴操作を実行する方法が提供される。本発明の方法は、CYTOP登録商標東京、旭硝子社から入手可能等のアモルファスフルオロポリマーで被覆された分配領域を有する装置を供給する工程、分配領域で有機溶媒を分配する工程、およびCYTOP登録商標で被覆されていない領域に有機溶媒を輸送する工程を含む。CYTOP登録商標で被覆されていない領域は、例えば、ポリテトラフルオロエチレン例えば、DuPont社から入手可能なTEFLON登録商標コーティング等のフッ化炭素で被覆されていてもよい。有機溶媒は、いずれの有機溶媒でもよいが、好適には極性プロトン性溶媒である。一の実施形態では、溶媒は、アルコールおよび/またはカルボン酸である。他の実施形態では、溶媒は、1~8の炭素、または1~6の炭素を有するアルコールおよび/またはカルボン酸である。アルコールおよび/またはカルボン酸は、環状、直線状、または分岐状であってもよい。例は、ヘキサノール、ペンタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸を含む。2つの基板は、当該2つの基板間に液滴操作間隙を開けたままにするいずれの方法で共に結合されていてもよい。通常、液滴操作間隙は、周囲がシールされるが、これは常に必要ではない。間隙の開口部は、液体を導入または移動するのに有用となり得る。例えば、基板は機械的に結合されてもよく、液滴操作間隙は、ガスケットで周囲をシールされてもよい。液滴操作間隙の結合とシールは、例えば、接着材料を用いて達成されてもよい。PCB基板は、液滴操作間隙の周囲もシールする接着剤を用いてプラスチック頂部基板に結合されてもよい。PCB基板は、液滴操作間隙の周囲もシールする接着剤を用いてアクリル頂部基板に結合されてもよい。PCB基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするウレタンメタクリレートポリマーを用いてプラスチック頂部基板に結合されてもよい。PCB基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするポリマーの接着剤を用いてアクリル頂部基板に結合されてもよい。PCB基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするウレタンメタクリレートポリマーを用いてアクリル頂部基板に結合されてもよい。ウレタンメタクリレートポリマーは、例えば、UV硬化性接着剤のPERMABOND登録商標UV648またはUV632を含む。PCB基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするポリマーの接着剤を用いてガラス頂部基板に結合されてもよい。PCB基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするUV硬化性エポキシ樹脂系ポリマーを用いてガラス頂部基板に結合されてもよい。好ましいUV硬化性エポキシ樹脂系ポリマーの例は、NJ、Hackensack、MasterBond社から入手可能な当該ポリマー例えば、MASTERBOND登録商標UV15x-5を含む。ポリマーの接着剤を用いる場合、ポリマーは、底部基板または頂部基板の周囲のビードラインに堆積され、その後、他の表面PCBまたはプラスチックの位置決めがされてもよい。UV硬化性ポリマーは、次いで、UV硬化のためにUV光に露光されてもよい。いくつかの実施形態では、接着剤が、底部基板と頂部基板との間の液滴操作間隙の周囲をシールする。液滴操作間隙は、シリコーンオイル等の充填流体で実質的に充填されてもよい。他の実施形態では、頂部基板と底部基板は、アクリル接着剤等の接着剤で被覆されたテープ等の接着テープで結合される。接着テープは、液滴操作間隙の周囲の一部または全てをシールするのに好適な形状にカットされてもよい。好適な接着テープの例は、布テープ、ポリエチレン発泡テープ、ウレタンテープ、紙テープ、ポリエステルテープ、ティシューテープ、およびビニルテープを含む。好ましい例は、3M商標300LSE接着剤の接着剤転写テープ、:9453FL、9471FL、9472FL、;および3M商標VHB商標テープを含む。これらのおよび他の好適なテープは、TN、Nashville、CanDoNationalTape社および他の供給業者から入手可能である。いくつかの実施形態では、テープが、底部基板と頂部基板との間の液滴操作間隙の周囲をシールする。液滴操作間隙は、シリコーンオイル等の充填流体で実質的に充填されてもよい。一の実施形態では、PCB材料で作られた底部基板は、例えば、プラスチック頂部基板に、PERMABOND登録商標UV648UV硬化性接着剤等のウレタンメタクリレートポリマーを用いて結合されて、構造を形成してもよい。ポリマーは、底部基板または頂部基板の周囲のビードラインに堆積され、その後、他の表面PCBまたはプラスチックの位置決めおよびUV硬化がされてもよい。他の実施形態では、ウレタンメタクリレートポリマーは、底部基板と頂部基板との間に筺体を形成し、当該筺体はシリコーンオイル等のオイルを含んでいてもよい。他の実施形態では、当該構造は、さらに基板の1つ以上の表面上に電極を含み、電気濡れ媒介液滴操作および/または誘電泳動媒介液滴操作等の液滴操作を実行するために配置されている。さらに他の実施形態では、当該構造は、微小流体装置を含む。本発明者らは、有機溶媒洗浄液滴は、液滴アクチュエーターで電気濡れ分配技術等を用いて確実に分配することが困難であることを発見した。斯かる分配を向上させる溶液は、本明細書に記載の充填流体配合および洗浄液滴配合である。充填流体配合溶液および液滴配合溶液と別個にまたは一緒に用いてもよい他の溶液は、有機溶媒がCYTOP登録商標コーティング東京、旭硝子社から入手可能等のアモルファスフルオロポリマーで被覆された表面により確実に分散するという発見に起因する。一の実施形態では、分配の間有機液滴に接触した液滴アクチュエーター表面例えば、液滴分配領域の液滴操作間隙に面した頂部基板および/または底部基板の表面は、アモルファスフルオロポリマーで被覆される一方、他の領域は非フルオロポリマーコーティングで被覆される。他の実施形態では、分配の間有機液滴に接触した液滴アクチュエーター表面は、CYTOP登録商標フルオロポリマーコーティングで被覆される一方、他の領域は別のフルオロポリマーコーティングで被覆される。同様に、本発明は、アモルファスフルオロポリマーで被覆された分配領域で電気濡れ分配技術を用いて有機溶媒液滴を分配する工程、および分配された有機溶媒液滴をアモルファスフルオロポリマーで被覆されていない領域に輸送する工程を含む。同様に、本発明は、CYTOP登録商標アモルファスフルオロポリマーで被覆された分配領域で電気濡れ分配技術を用いて有機溶媒液滴を分配する工程、および分配された有機溶媒液滴をCYTOP登録商標アモルファスフルオロポリマーで被覆されていない領域に輸送する工程を含む。同様に、本発明は、CYTOP登録商標アモルファスフルオロポリマーで被覆された分配領域で電気濡れ分配技術を用いて有機溶媒液滴を分配する工程、および分配された有機溶媒液滴をTEFLON登録商標アモルファスフルオロポリマーで被覆された領域に輸送する工程を含む。TEFLON登録商標ポリテトラフルオロエチレンコーティングは、DE、Wilmington、EIDuPontdeNemoursCo社から入手可能である。7.4磁石配列液滴アクチュエーターは、磁石の配列を含んでもよく、または磁石の配列と結合されていてもよい。例えば、液滴アクチュエーターは、装置デッキ上に取り付けられてもよく、液滴アクチュエーターは、装置デッキ上に収まるように設計され、当該デッキは、液滴アクチュエーターのいくつかの処理ゾーン内で温度を制御するためのi磁石および、iiヒートシンクのヒーター等の温度制御装置、等の追加の機構を収容する。磁石は、液滴アクチュエーターで磁気応答性ビーズの固定のために用いられてもよい。磁石は、液滴アクチュエーターで液滴操作にかけられる液滴の磁気応答性ビーズの固定のために用いられてもよい。磁石は、液滴アクチュエーターアセンブリの頂部基板に形成されたリザーバ等の液滴アクチュエーターのリザーバ内で磁気応答性ビーズの固定のために用いられてもよい。磁石を用いて、ビーズ洗浄工程の間のビーズの固定等、核酸ライブラリー構築手順での様々な処理工程に必要とされる液滴操作のために磁気応答性ビーズを操作してもよい。磁石を用いて、娘液滴の1つにおける全てのまたは実質的に全てのビーズを保持するための液滴分割操作の間のビーズの固定等、核酸ライブラリー構築手順での様々な処理工程に必要とされる液滴操作のために磁気応答性ビーズを操作してもよい。いくつかの実施形態では、本発明は、可動式磁石を提供する。一例では、可動式磁石は、サンプル濃縮の間に、核酸が付着したビーズの空間的な固定を確実にするように位置されてもよい。サンプル濃縮は、例えば、ビーズ濃縮手順の単一の工程を用いて行われてもよい。サンプル濃縮は、一連の分配ビーズ濃縮手順を用いて行われてもよい。他の例では、可動式磁石は、酵素反応間のビーズ洗浄の間に、核酸が付着したビーズの空間的な固定を確実にするように位置されてもよい。他の例では、可動式磁石は、処理核酸の溶離後のビーズ除去の間に、ビーズの空間的な固定を確実にするように位置されてもよい。液滴操作電気濡れプログラムのシークエンス、温度制御、および磁石位置は、例えば、調整可能なソフトウェアおよびプログラム可能なソフトウェアインターフェースを用いてプログラムされてもよい。一例では、装置デッキは、液滴アクチュエーターの所定の処理ゾーンにそろって位置している1つ以上の可動式磁石配列例えば、Halbach配列および1つ以上のヒーターアセンブリ例えば、加熱棒と同様に、電極の活性と非活性を制御するための電気的接続、および液滴アクチュエーターの他の電気的機能例えば、センサーも含んでいてもよい。この例は、図22A、22B、および23を参照して記載されている。図22Aおよび22Bは、磁石アクチュエーター2200の斜視図を表している。磁石アクチュエーター2200は、フレーム構造2210を含んでいてもよく、当該フレーム構造は、立方体磁石2214のセットを保持するためにフレーム構造に設置されたスライド可能なプレート2212を有する。ソレノイド2216が、フレーム構造2210に固定される。フレーム構造2210に対するスライド可能なプレート2212の位置が、ソレノイド2216で制御される。すなわち、ソレノイド2216のアクチュエーターが、スライド可能なプレート2212の一部に対して圧力をかけ、立方体磁石2214をフレーム構造2210に対して動かす。スライド可能なプレート2212および立方体磁石2214の直線的な運動を制御するために、調整可能なネジ2218のセット等の所定の機構が提供されてもよい。スライド可能なプレート2122は、溝形状およびスロット形状等のフレーム2210構成要素と組み合わされてもよく、本明細書に記載の機能を達成するためにプレート2122の動きが特定の範囲に制約される。操作では、スライド可能なプレート2212上の立方体磁石2214は、液滴アクチュエーター2220等の液滴アクチュエーターに近接して位置している。ソレノイド2216は、立方体磁石2214を液滴アクチュエーターの表面に近づけるまたは遠ざけるために用いられる。図22Aは、非通電状態のソレノイド2216および、液滴アクチュエーター2220に関して非係合状態の立方体磁石2214を有するスライド可能なプレート2212を示している。図22Bは、通電状態のソレノイド2216および、液滴アクチュエーター2220に関して係合状態の立方体磁石2214を有するスライド可能なプレート2212を示している。図23は、1つ以上の磁石アクチュエーターおよび1つ以上のヒーター機構を保持するための機械的固定具2300の一例の平面図を表している。機械的固定具2300は、核酸ライブラリーの構築のための液滴アクチュエーターでの核酸の処理での使用に好適である。一例では、機械的固定具2300は、立方体磁石2214aのラインlineを含む磁石アクチュエーター2200aおよび立方体磁石2214bのラインを含む磁石アクチュエーター2200b等の2つの磁石アクチュエーター2200を含む。立方体磁石2214の各セットまたは各ラインは、例えば、図24A、24B、25A、および25Bに関して記載したように、Halbach配列であってもよい。立方体磁石2214は、磁石アクチュエーター2200の動作で液滴アクチュエーター図示せずに接近してまたは近傍から離れて移動されてもよい。一例では、立方体磁石2214は、2.25mmの立方体磁石であってもよい。他の例では、立方体磁石2214は、4.5mmの立方体磁石であってもよい。機械的固定具2300は、ヒーター2310a~2310d等の1つ以上のヒーター2310を含んでいてもよい。ヒーター2310は、例えば、加熱棒であってもよい。ヒーター2310を用いて、液滴アクチュエーターの指定温度制御ゾーン内の温度を制御してもよい。例えば、一の温度制御ゾーンは、A-tail化反応のために37°Cを提供してもよく、または、3-温度PCRの実行のために適切な温度を提供してもよい。コントローラー図示せずを用いて、ヒーター2310の出力温度を制御してもよい。他の実施形態では、機械的固定具2300は、iヒートシンク、または、iiペルチェ素子等の熱電冷却装置、等の冷却装置を含んでいてもよい。冷却装置は、周囲の温度よりも低い液滴アクチュエーターの領域の温度を維持するのに用いられてもよい。冷却装置は、液滴アクチュエーターの他の領域の加熱の間、液滴アクチュエーターのある領域が過熱するのを防ぐために用いられてもよい。ヒーターと冷却装置とを組み合わせて用いることで、3-温度PCR反応の実行等の液滴アクチュエーターでの所望の温度プロフィールが達成され得る。コントローラー図示せずを用いて、ヒーター2310およびペルチェ素子を制御してもよい。図23は、アセンブリ上で液滴アクチュエーターを所定位置に保持するためのクリップ2320も示している。操作の間、液滴アクチュエーターアセンブリを傷つけることなく、または操作を他に妨げることなく、液滴アクチュエーターアセンブリをしっかりと所定位置に保持するように配置されている限りは、いずれの種類の拘束要素でも適用可能である。磁石を配置して、液滴アクチュエーターのビーズの固定が要求されている領域で磁場を補強してもよい。磁石を配置して、液滴アクチュエーター内の磁場が所望の操作を別に妨げる領域の磁場を取り消してもまたは消滅させてもよい。磁石を配置して、流束分布を作り出し、液滴アクチュエーター内のビーズの固定が要求されている領域で磁場を補強し、そして液滴アクチュエーター内の磁場が所望の操作を別に妨げる領域の磁場を消滅させてもよい。図24Aおよび24Bは、Halbach磁石配列2400の一例の斜視図を表している。図24Aに関して一例では、Halbach磁石配列2400は、立方体磁石2410a~2410e等の複数の立方体磁石2410を含んでいてもよい。各立方体磁石2410の磁場の方向が、矢印で示されている。立方体磁石2410の配列は、当該配列の一方の側面で磁場が強められるのに対して、配列の他の側面では磁場がほぼゼロにまで取り消されるものである。配列は、任意の回数繰り返されて、任意の長さの磁石配列を提供してもよい。図24Bは、集束磁石2412として役立つ1つ以上のポストを有するHalbach磁石配列2400を表している。集束磁石2412は、Halbach磁石配列2400の特定の位置に磁場をさらに集束させるために用いられる。例えば、Halbach磁石配列2400は、集束磁石2412aおよび2412bを含む。また、各集束磁石2412の磁場の方向が、矢印で示されている。図25Aおよび25Bは、例えば、図24Aおよび24BのHalbach磁石配列2400の、液滴アクチュエーター2500の電極に対する磁場の関係を表している。液滴アクチュエーター2500は、間隙2514で分離された底部基板2510および頂部基板2512を含んでいてもよい。底部基板2510は、液滴操作電極2516例えば、電気濡れ電極の通路または配列等の電極配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極2516頂部で行われる。この例では、Halbach磁石配列2400は、液滴アクチュエーター2500の下に位置している。Halbach磁石配列2400は、複数の立方体磁石2410a~2410nを含んでいてもよい。図25Aおよび25Bで、立方体磁石2410で作られる磁力線は、Halbach磁石配列2400および液滴アクチュエーター2500の頂部にかぶせて表現されている。立方体磁石2410は、例えば、4.5mm立方体磁石であってもよい。図25Aおよび25Bの磁力線は、磁場が一つおきの立方体磁石2410例えば、立方体磁石2410a、2410c、2410e、2410g、2410i、2410k、2410mに集中していることを示している。好ましい実施形態では、これらの集中した磁場領域が、例えば、4.5mm立方体磁石2410について約4.5mmピッチで配置されている周期的な電極レーンに実質的にそろっている。この例では、集中した磁場領域が、約9mmごとにある。他の例では、2.25mm立方体磁石2410が用いられる場合、集中した磁場領域は、約4.5mmごとにある。図26Aおよび26Bは、図24Aおよび24BのHalbach磁石配列2400に関連した図25Aおよび25Bの液滴アクチュエーター2500の他の図すなわち、平面図を表している。例えば、図26Aおよび26Bは、液滴操作電極2516のいくつかのラインに関連したHalbach磁石配列2400の立方体磁石2410を示している。図26Aは、集束磁石2412がないHalbach磁石配列2400を示す一方、図26Bは、集束磁石2412があるHalbach磁石配列2400を示す。Halbach磁石配列2400の配列は、立方体磁石2410の中央が液滴操作電極2516のラインにほぼ位置する配列である。一の用途では、Halbach磁石配列2400は、サンプル濃縮の間等、所定の処理工程の間に、磁気応答性ビーズの空間的な固定を確実にするように位置されている。サンプル濃縮は、例えば、ビーズ濃縮手順の単一の工程を用いて行われてもよい。サンプル濃縮は、一連の分配ビーズ濃縮手順を用いて行われてもよい。サンプル濃縮方法の一例が図27に関して記載される。図27は、液滴アクチュエーターでのサンプル濃縮の方法2700のフローチャートを表している。例えば、方法2700は、図22A、22B、および23の1つ以上の磁石アクチュエーター2200を利用して、液滴アクチュエーターに関連した可動式磁石を提供してもよい。方法2700は、アクチュエーター外で上限50μLのサンプル体積から始め、当該サンプルは、約50~100ナノグラムの核酸を含む。次いで、アクチュエーター外で、サンプルは、結合バッファー溶液50μL中のビーズと混合される。その結果、100μLの流体が、次いで、アクチュエーター外で一定時間例えば、約10分間保温される。保温期間後に、その100μLの流体は、液滴アクチュエーターに装填される。次いで、磁石例えば、1つ以上の磁石アクチュエーター2200の立方体磁石2214がサンプル流体に近接するように移動される。結果として、実質的に全てのビーズが、100μLのサンプル流体から引き抜かれ、立方体磁石2214の磁場内に濃縮される。ビーズは、次いで、洗浄され、溶離される。核酸が溶離され、液滴がビーズをスナップオフしてもよい。バッファー液滴を用いて、ビーズを回収し、ビーズを、例えば、廃棄リザーバまたは電極配列の未使用の領域に除去してもよい。7.5液滴アクチュエーターと共に使用するローラーアセンブリ本発明のローラーアセンブリは、磁石およびヒーター等の液滴アクチュエーターに関連した有用な所定の構成を収納する装置デッキ上に収まるように設計されている。本発明の液滴アクチュエーターは、多数の異なる次世代配列決定プラットフォームでの使用に応用され得るので、異なるライブラリー構築手順のために、装置構成の異なる配列が要求され得る。図28A~28Dは、液滴アクチュエーターに関連した有用な他の構成の配列を含むローラーアセンブリ2800の側面図および断面図を表している。図28Aに関して、ローラーアセンブリ2800は、ローラー本体2810を含んでいてもよい。ローラー本体2810は、例えば、円筒状の形状であってもよい。ローラー本体2810は、取り付け棒または軸2812で装置図示せずに接続されていてもよい。ローラーアセンブリ2800の回転例えば、時計回りまたは反時計回りは、ステッピングモーター等のモーター図示せずで制御されてもよい。図28Aおよび28Bに関して、ローラー本体2810は、スロット2814a~2814d等の1つ以上のスロット2814を含んでいてもよく、当該スロットは、これらに限定されないが、磁石、温度制御装置、および超音波処理装置等の1つ以上の構成を含んでいてもよい。一の実施形態では、磁石2816a~2816dは、スロット2814a~2814dに、それぞれ位置されてもよい。各磁石2816は、永久磁石または電磁石であってもよい。一例では、各磁石2816は、棒磁石であってもよい。他の例では、各磁石2816は、複数のより小さい磁石図示せずであってもよい。他の例では、磁石2816は、異なる磁気の強さを有していてもよい。単一のローラーアセンブリ2800は、異なる磁石、異なる磁気の強さ、異なる磁石の配列等を有する複数の磁石のセットを含んでいてもよい。図28Cおよび28Dに関して、ローラーアセンブリ2800は、液滴アクチュエーター2818に近接して位置されてもよい。液滴アクチュエーター2818は、底部基板2820を含んでいてもよい。底部基板2820は、液滴操作電極2822例えば、電気濡れ電極の配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極2822頂部で行われる。一例では、ローラーアセンブリ2800は、スロット2814aおよび磁石2816aが所定の液滴操作電極2822にそろうように位置されてもよい。操作では、磁気応答性ビーズ2826を含む液滴2824は、所定の液滴操作電極2822上に位置して、ローラーアセンブリ2800の磁石2816aにそろってもよい。磁石2816aの磁力のため、磁気応答性ビーズ2826は、液滴操作電極2822の表面に保持される。ローラーアセンブリ2800は、磁石2816aが液滴2824から離れて移動されるように、例えば、反時計回りに回転されてもよい。ローラーアセンブリ2800および磁石2816aが回転して液滴2824から離れるので、磁石2816aの磁力の低減のため、磁気応答性ビーズ2826は液滴2824内で再び懸濁される。一例では、ローラーアセンブリ2800は、液滴2824が磁石2816aおよび2816bの間に位置するように回転および停止されてもよい。この位置では、液滴2824は、磁石2816aおよび2816bの磁場の外にあってもよいすなわち、磁石2816aおよび2816bの磁場が、基本的に遮断されている。他の実施形態では、スロット2814内の1つ以上の磁石2816は、いくつかの反応ゾーンおよび/または洗浄ゾーン内の温度を制御するために、ヒーターアセンブリまたは冷却アセンブリ例えば、熱電冷却器またはペルチェ素子に置換されてもよい。他の実施形態では、スロット2814内の1つ以上の磁石2816は、細胞分裂および核酸せん断に用いられる音波処理器等の超音波処理装置に置換されてもよい。他の実施形態では、磁石、ヒーター、冷却器、音波処理器、および他の構成の任意の組み合わせが、ローラーアセンブリ2800内で用いられてもよい。ローラーアセンブリ2800の回転により、様々な構成が所定の液滴操作領域に関する位置に対して近づけられ、および離れされ得るため、液滴アクチュエーター上の同じ領域が、デジタル微小流体検査で複数の異なる処理に用いられてもよい。他の実施形態では、異なるローラーアセンブリ2800が、特定の検査要求および/またはアクチュエーターサイズおよび構造に適合する特殊化した構成配列に提供されてもよい。ローラーアセンブリ2800は、一のローラーアセンブリ2800が、装置から容易に除去され、当該装置に異なるローラーアセンブリ2800が容易に挿入されるように設計されていてもよい。7.6廃棄液滴の処分図29Aおよび29Bは、それぞれ、液滴アクチュエーター2900の一部の一例の平面図および断面図を表し、液滴を投棄して廃棄する方法を示している。液滴アクチュエーター2900は、間隙2914で分離された底部基板2910および頂部基板2912を含んでいてもよい。間隙2914は、高さh1を有する。底部基板2910は、例えば、PCBであってもよい。頂部基板2912は、例えば、ガラス、射出成型プラスチック、ケイ素、および/またはITOから作られていてもよい。液滴アクチュエーター2900は、液滴操作電極2916例えば、電気濡れ電極の配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極2916頂部で行われる。本発明の一態様は、頂部基板および/または底部基板に、および液滴操作電極に隣接して、液滴を投棄するための陥凹エリアを含む。一例では、図29Aおよび29Bは、陥凹エリア2918をさらに含む頂部基板2912を示している。陥凹エリア2918で作られる底部基板2910と頂部基板2912との間の空洞は、高さh2を有し、間隙2914の高さh1より大きい。配列は、より大きい間隙高さの領域でよりエネルギー的に安定なコンホメーションへの液滴の変形により引き起こされる移動の結果として、液滴が陥凹エリアに入るように構成されていてもよい。操作では、いくつかの液滴操作電極2916の電源がオンである限り、液滴は電極通路にとどまる。しかしながら、電源がオンになっている液滴操作電極2916がない場合、液滴にとってエネルギー的に安定な位置は、隣接する陥凹エリアにある。すなわち、毛管力のために液滴は、この空間に引き込まれる。したがって、液滴は、もはや不要の場合は、電極通路から投棄され得る。例として、図29Aおよび29Bは、電極が電源オンになっているときに、所定の液滴操作電極2916頂部に位置している所定の液滴2920を示している。図29Aおよび29Bは、通路から投棄され、陥凹エリア2918にある液滴2922も示している。陥凹エリア2918の形状は、例えば、階段状またはスロープ状であってもよく、当該形状が、投棄された液滴が電極通路に干渉しないように、投棄された液滴が電極通路から十分に離れた位置に保持されるのを補助する。同様に、液滴が容易に陥凹領域に移動し過ぎる場合、液滴移動を遅くするために、頂部基板および/または底部基板に突起部または障害物が含まれていてもよい。活性化された電極の存在下では液滴を電極通路に保持するが、移動の結果として、液滴が陥凹領域に入り得るどのような移行領域であっても適用可能である。図30は、図29Aおよび29Bの液滴アクチュエーター2900の他の実施形態の断面図を表している。この実施形態では、陥凹エリア2918が開口している例えば、頂部基板2912の開口部2930。図30は、液滴アクチュエーター2900内の充填流体2932も示している。頂部基板2912内に開口部2930が存在するため、液滴は、毛管誘電泳動または他の処理のために、例えば、ピペットで、または他の装置もしくはこの装置の一部に、回収され得る。7.7PCR増幅および高分解能融解HRM分析1つ以上の目的遺伝子内でのシークエンスバリエーション例えば、単一ヌクレオチド多型、ヌクレオチド反復多型、突然変異走査、および核酸メチル化の評価の検出のために、HRM分析は、PCR増幅と組み合わせて用いられてもよい。PCRアンプリコンは、飽和核酸挿入蛍光染料、5’-標識されたプライマー、または標識されたプローブを用いて、増幅の間、蛍光標識されてもよい。様々な実施形態で、本発明は、液滴アクチュエーター系サンプル調製および同じ液滴アクチュエーターでのシークエンスバリエーションの検出をも提供する。一の実施形態では、本発明の液滴アクチュエーター装置および方法は、i核酸の調製、iiターゲットPCR増幅およびiii脆弱X症候群の遺伝子型決定をするためのHRM分析、に用いられてもよい。目的遺伝子内のシークエンスバリエーション例えば、多型、突然変異、およびメチル化の検出用のデジタル微小流体手順は、ターゲットシークエンスのPCR増幅と、単一の液滴アクチュエーターでのターゲットアンプリコンの高分解能溶融HRM分析とを組み合わせる。HRM分析は、目的遺伝子の二本鎖ターゲットシークエンスすなわち、アンプリコンについての核酸溶融温度の物理的特性に基づいている。生物体の各遺伝子個々のは、通常、2つまたはそれ以上のコピー、すなわち、2つの対立遺伝子が存在する。対立遺伝子は、同一、すなわち同型接合性であってもよく、または異なって、すなわち異型接合性であってもよい。核酸サンプルの増幅の間、両方の対立遺伝子が増幅される。増幅された核酸は、変性され、PCR後にHRM分析のために冷却されるので、アニールされた二本鎖アンプリコンの異なる組み合わせが形成され得る。同型接合性サンプルは、ホモ二本鎖となる。シークエンスの組成の違いのため、異なる同型接合性サンプルは、異なる溶融曲線をもたらす異なる変性温度を有する。異型接合性サンプルは、2つの異なる対立遺伝子を含み、2つの異なる対立遺伝子はホモ二本鎖すなわち、2つのホモ二本鎖生成物とヘテロ二本鎖すなわち、2つのヘテロ二本鎖生成物の両方を形成する。ヘテロ二本鎖は、核酸の非相補鎖のアニーリングから生じ、核酸の非相補鎖は、例えば、サンプルの急冷の間に形成する。ヘテロ二本鎖内の誤対合領域のため、二本鎖アンプリコンは不安定であり、そのため、低温で解離する。低い溶融温度は、異なる溶融曲線プロフィールを作成する。異なる溶融曲線プロフィールが作成されるため、異型接合性サンプルは、同型接合性サンプルから区別され得る。デジタル微小流体手順では、急速なPCR熱サイクルが、各サイクルで反応液滴がオイルが充填された液滴アクチュエーター内の異なる温度ゾーン間を循環的に輸送されるフォーマットを経たフローで行われてもよい。PCR反応のモニターと続くHRM分析のために、ターゲットアンプリコンへの蛍光標識の組み込みを用いてもよい。一の実施形態では、ターゲットアンプリコンは、LCGreenUT、SaltLakeCity、IdahoTechnology社から入手可能、EvaGreenCA、Hayward、Biotium社から入手可能、またはSYTO9CA、Carlsbad、LifeTechnology社のInvitrogen商標から入手可能等の飽和二本鎖核酸挿入染料を用いたPCR増幅の間、蛍光標識されてもよい。他の実施形態では、5-蛍光標識されたプライマーを用いてターゲットアンプリコンを標識してもよい。他の実施形態では、蛍光標識されたプローブを用いてターゲットアンプリコンを標識してもよい。最適な循環パラメーターと試薬濃度とを含む確立されたPCR手順が、各目的遺伝子のために選択されてもよく、当該試薬は、Taqポリメラーゼ、バッファーおよびプライマー順方法のプライマーと逆方向のプライマーを含む。例えば、順方法のプライマーと逆方向のプライマーのシークエンスおよび長さを選択して、対立遺伝子の正確な識別に十分な長さのアンプリコンを作製してもよい。各プライマーの濃度、プライマーアニーリング温度およびマグネシウム濃度を選択して、高収率での目的遺伝子の特有の増幅を提供してもよい。アニーリング時間/延長時間および熱サイクルの数を選択して、高品質アンプリコンとPCR-HRM一体手順での迅速な処理能力を提供してもよい。対立遺伝子識別のための確立されたHRM手順は、液滴アクチュエーター1,2での使用に応用されてもよい。例えば、HRM分析の前に、増幅された核酸は、通常、ヘテロ二本鎖形成を高めるように選択された変性およびアニーリングの最終ラウンドにかけられる。変性と冷却の速度は、ヘテロ二本鎖の実質的な形成のために選択されてもよい。一例では、より高い加熱速度例えば、0.4°C/秒および急速な冷却速度例えば、約0.1°C/秒より大きく、約5°C/秒未満を選択して、対立遺伝子のより正確な識別のためのより多くのヘテロ二本鎖を作製してもよい。他の例では、アニーリングバッファーのイオン強度例えば、低イオン強度が、ヘテロ二本鎖の実質的な形成のために選択されてもよい。直接溶融、すなわち、選択した温度遷移速度例えば、0.05°C/秒での約50°C~約95°Cの核酸アンプリコンの正確な加温を用いて、最終HRM分析が、二本鎖核酸アンプリコンについて行われてもよい。7.8液滴分配電極構成図31は、電極配列3100の一例の一部の平面図および2倍液滴分配のためのリザーバ分配シークエンスを表している。電極配列3100は、流体リザーバの分配電極3110を含んでいてもよく、当該分配電極は、複数の別個に制御される電極に区分けされている。例えば、分配電極3110の中心に沿って、区分けされたリザーバ電極3112A、3112B、3112C、および3112Dがあってもよい。より小さなリザーバ側面電極3114A、3114B、3114C、および3114Dが、区分けされたリザーバ電極3112A、3112B、3112C、および3112Dの一方の側面に配置されていてもよい。より小さなリザーバ側面電極3114AA、3114BB、3114CC、および3114DDが、区分けされたリザーバ電極3112A、3112B、3112C、および3112Dの他の側面に配置されていてもよい。分配電極3110の区分けされたリザーバ電極3112Dは、液滴操作電極例えば、電気濡れ電極の通路、ライン、および/または配列に関連して配置されている;以降、通路電極3116という。加えて、通路側面電極3118Aが、通路電極3116の一方の側面に配置されてもよく、一方、通路側面電極3118Bが、通路電極3116の他の側面に配置されてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上のこれら様々な電極頂部で行われる。複数の別個に制御される電極を含む分配電極3110は、複雑な液滴混合操作および/または液滴分配操作を行うよう設計された流体リザーバを支持する。本発明の区分けされた分配電極3110の一態様は、リザーバが十分に充填されていないとき、様々な大きさの液滴を分配するために、流体のより小さな体積が、分配電極3110の分配末端に移動され得るというものである。加えて、通路電極3116の側面にある通路側面電極3118は、活性化されて、分配電極3110の液体を引き抜き、電極通路上に移すのを補助してもよい。次いで、通路側面電極3118が非活性化され、次いで、通路上の中間電極が非活性化され、分配された液滴を生成する。リザーバ分配シークエンスの例が、図31、32、および33を参照して示されている。再び図31に関して、2倍液滴分配のためのリザーバ分配シークエンスの一例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。工程1では、区分けされたリザーバ電極3112A、3112B、および3112Cが非活性化される;リザーバ側面電極3114A、3114B、3114C、3114AA、3114BB、および3114CCが非活性化される;区分けされたリザーバ電極3112Dが活性化される;そして、リザーバ側面電極3114Dおよび3114DDが活性化される。このようにして、一定量の流体図示せずが、分配電極3110の分配末端に引かれ得る。分配電極3110の分配末端は、通路電極3116のラインに最も近い端である。工程2では、区分けされたリザーバ電極3112A、3112B、および3112Cが非活性化されたままである;リザーバ側面電極3114A、3114B、3114C、3114AA、3114BB、および3114CCが非活性化されたままである;区分けされたリザーバ電極3112Dが活性化されたままである;そして、リザーバ側面電極3114Dおよび3114DDが活性化されたままである。加えて、ラインの初めの4つの通路電極3116が活性化され、通路側面電極3118Aおよび3118Bの両方が活性化される。結果として、所定体積の流体図示せずが、さらに通路電極3116のライン上に引かれ得る。工程3では、区分けされたリザーバ電極3112A、3112B、および3112Cが非活性化されたままである;リザーバ側面電極3114A、3114B、3114C、3114AA、3114BB、および3114CCが非活性化されたままである;区分けされたリザーバ電極3112Dが活性化されたままである;そして、リザーバ側面電極3114Dおよび3114DDが活性化されたままである。ラインの初めの4つの通路電極3116が活性化されたままである。通路側面電極3118Aおよび3118Bの両方が活性化されたままである。加えて、ラインの隣5番目の通路電極3116が、活性化され、所定体積の流体図示せずが、さらに通路電極3116のライン上に引かれる。工程4では、全てのリザーバ側面電極3114が非活性化される;区分けされたリザーバ電極3112Dを除いて、全ての区分けされたリザーバ電極3112が、非活性化される;そして、通路側面電極3118Aおよび3118Bも非活性化される。区分けされたリザーバ電極3112Dおよび5つの通路電極3116のみが活性化されたままである。これにより、所定体積の流体が、5つの通路電極3116のラインに沿って、分配電極3110の区分けされたリザーバ電極3112Dに集中する。工程5では、区分けされたリザーバ電極3112Aおよび3112Bが非活性化される;リザーバ側面電極3114A、3114B、3114AA、および3114BBが非活性化される;区分けされたリザーバ電極3112Cおよび3112Dが活性化される;そして、側面電極3114C、3114D、3114CC、および3114DDが活性化される。加えて、通路側面電極3118Aおよび3118Bが、非活性化されたままである。さらに、ラインの3番目の通路電極3116が非活性化されるのに対し、1番目、2番目、4番目、および5番目の通路電極3116は活性化されたままである。中間通路電極3116の1つが電源オフになり、2倍液滴図示せずが例えば、4番目と5番目の通路電極3116頂部に残されるため、結果として、液滴分割操作が起こる。図32は、図31の電極配列3100の平面図および1倍液滴を分配するためのリザーバ分配シークエンスを表している。1倍液滴分配のためのリザーバ分配シークエンスの一例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。工程1では、区分けされたリザーバ電極3112A、3112B、および3112Cが非活性化される;リザーバ側面電極3114A、3114B、3114C、3114AA、3114BB、および3114CCが非活性化される;区分けされたリザーバ電極3112Dが活性化される;そして、リザーバ側面電極3114Dおよび3114DDが活性化される。このようにして、一定量の流体図示せずが、分配電極3110の分配末端に引かれ得る。分配電極3110の分配末端は、通路電極3116のラインに最も近い端である。工程2では、区分けされたリザーバ電極3112A、3112B、および3112Cが非活性化されたままである;リザーバ側面電極3114A、3114B、3114C、3114AA、3114BB、および3114CCが非活性化されたままである;区分けされたリザーバ電極3112Dが活性化されたままである;そして、リザーバ側面電極3114Dおよび3114DDが活性化されたままである。加えて、ラインの初めの4つの通路電極3116が活性化され、通路側面電極3118Aおよび3118Bの両方が活性化される。さらに、ラインの5番目の通路電極3116が非活性化される。結果として、所定体積の流体図示せずが、さらに通路電極3116のライン上に引かれ得る。工程3では、全てのリザーバ側面電極3114が非活性化される;区分けされたリザーバ電極3112Dを除いて、全ての区分けされたリザーバ電極3112が、非活性化される;そして、通路側面電極3118Aおよび3118Bも非活性化される。区分けされたリザーバ電極3112Dおよび5つの通路電極3116のうち初めの4つのみが活性化されたままである。これにより、4つの通路電極3116のラインに沿って、所定体積の流体が、分配電極3110の区分けされたリザーバ電極3112Dに集中する。工程4では、区分けされたリザーバ電極3112Aおよび3112Bが非活性化される;リザーバ側面電極3114A、3114B、3114AA、および3114BBが非活性化される;区分けされたリザーバ電極3112Cおよび3112Dが活性化される;そして、側面電極3114C、3114D、3114CC、および3114DDが活性化される。加えて、通路側面電極3118Aおよび3118Bが、非活性化される。ラインの1番目、2番目、および4番目の通路電極3116は活性化されたままである。さらに、ラインの3番目の通路電極3116が非活性化されるのに対し、ラインの1番目、2番目、および4番目の通路電極3116は活性化されたままである。中間通路電極3116の2つが電源オフになり、1倍液滴図示せずが例えば、4番目の通路電極3116頂部に残されるため、結果として液滴分割操作が起こる。図33は、図31の電極配列3100の他の実施形態の平面図および1倍液滴を分配するための他のリザーバ分配シークエンスを表している。電極配列3100のこの実施形態では、示したように、通路側面電極3118Aおよび3118Bの大きさと、分配電極3110の区分けされたリザーバ電極3112Dに関連した通路電極3116の位置が、若干変更されている。より詳細には、通路電極3116に関連した通路側面電極3118Aおよび3118Bのずれが、液体が隣接する電極に進行するのを補助する。すなわち、1倍液滴を分配するためのリザーバ分配シークエンスの他の例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。工程1では、区分けされたリザーバ電極3112Aおよび3112Bが非活性化される;リザーバ側面電極3114A、3114B、3114AA、および3114BBが非活性化される;区分けされたリザーバ電極3112C、3112Dが活性化される;そして、側面電極3114C、3114D、3114CC、および3114DDが活性化される。加えて、通路側面電極3118Aおよび3118Bが非活性化される。さらに、通路電極3116が非活性化される。このようにして、一定量の流体図示せずが、分配電極3110の分配末端に引かれ得て、分配電極3110の分配末端は、通路電極3116のラインに最も近い端である。工程2では、区分けされたリザーバ電極3112A、3112B、および3112Cが非活性化される;リザーバ側面電極3114A、3114B、3114C、3114AA、3114BB、および3114CCが非活性化される;区分けされたリザーバ電極3112Dが活性化されたままである;そして、リザーバ側面電極3114Dおよび3114DDが活性化されたままである。加えて、ラインの初めの2つの通路電極3116が活性化され、通路側面電極3118Aおよび3118Bの両方が活性化される。結果として、所定体積の流体図示せずが、さらに通路電極3116のライン上に引かれ得る。工程3では、区分けされたリザーバ電極3112A、3112B、および3112Cが非活性化されたままである;リザーバ側面電極3114A、3114B、3114C、3114AA、3114BB、および3114CCが非活性化されたままである;そして、区分けされたリザーバ電極3112Dが活性化されたままである。リザーバ側面電極3114Dおよび3114DDが今度は非活性化される。加えて、今度はラインの初めの3つの通路電極3116が活性化される。これにより、流体図示せずが、通路電極3116のラインに集中し、同様に、分配電極3110の区分けされたリザーバ電極3112D上ならびにリザーバ側面電極3114Dおよび3114DD上にも集中する。工程4では、全てのリザーバ側面電極3114が非活性化される;区分けされたリザーバ電極3112Dを除いて、全ての区分けされたリザーバ電極3112が、非活性化される;そして、通路側面電極3118Aおよび3118Bも非活性化される。区分けされたリザーバ電極3112Dおよび初めの3つの通路電極3116が活性化されたままである。これにより、所定体積の流体が、初めの3つの通路電極3116に沿って、分配電極3110の区分けされたリザーバ電極3112Dに集中する。工程5では、区分けされたリザーバ電極3112Aおよび3112Bが非活性化される;リザーバ側面電極3114A、3114B、3114AA、および3114BBが非活性化される;区分けされたリザーバ電極3112Cおよび3112Dが活性化される;そして、側面電極3114C、3114D、3114CC、および3114DDが活性化される。加えて、通路側面電極3118Aおよび3118Bが非活性化されたままである。さらに、通路電極3116のラインの2番目の通路電極3116が非活性化されるのに対し、1番目および3番目の通路電極3116は活性化されたままである。中間通路電極3116の1つが電源オフになり、1倍液滴図示せずが例えば、3番目の通路電極3116頂部に残されるため、結果として液滴分割操作が起こる。図34A~34Eは、液滴アクチュエーターの電極配列3400の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別のためのPCR増幅およびHRM分析を一体化する方法を示している。図34A~34Eの本発明の方法は、増幅およびHRM分析手順の一例であり、ここでターゲットアンプリコンは、LCGreen等の飽和二本鎖核酸挿入染料を用いたPCR増幅の間、蛍光標識されてもよい。挿入染料は、二本鎖核酸に特異的に結合する。挿入染料が二本鎖核酸に結合すると、蛍光シグナルが作られる。HRM分析の間、二本鎖核酸が加熱され、核酸の二本鎖が溶離し、二本鎖核酸の存在が減少し、その結果として蛍光シグナルが少なくなる。蛍光の減少速度は、通常、PCR生成物の溶融温度Tm近くで最大である。溶融温度は、GC-含有量TmはGCリッチなPCR生成物でより高い、長さ、およびシークエンス含有量を含むPCR生成物特性の関数である。データは、取得し、相対的な蛍光対温度、および/または、派生溶融ピークを示す溶融曲線としてプロットしてもよい。電極配列3400は、PCR増幅とHRM分析用に構成された液滴操作電極3410の配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極3410頂部で行われる。温度制御ゾーン3412aおよび3412b等の2つの温度制御ゾーン3412は、電極配列3400と関連してもよい。温度制御素子図示せずは、温度制御ゾーン3412aおよび3412b周辺の充填流体図示せずの温度を制御する。例えば、温度制御ゾーン3412aは、約95°Cまで加熱されてもよく、当該温度は、二本鎖核酸の変性に十分な温度である。温度制御ゾーン3412bは、例えば、約55°Cまで加熱されてもよく、当該温度は、プライマーアニーリングと延長に十分な温度である。一例では、温度制御ゾーン3412aおよび3412bは、PCR熱サイクルのために用いられてもよい。他の例では、温度制御ゾーン3412bの熱条件は、HRM分析用の溶融曲線の取得のために調整されてもよい。2つの温度制御ゾーン3412を示したが、任意の数の温度制御ゾーン3412が、電極配列3410と関連してもよい。検出スポット3414は、温度制御ゾーン3412b内の液滴操作電極3410Dに近接して配置されてもよい。PCR増幅およびHRM分析の一般的な方法の一例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。一の工程では、図34Aは、温度制御ゾーン3412a内の所定の液滴操作電極3410に位置しているサンプル液滴3416を示している。サンプル液滴3416は、例えば、増幅のための核酸テンプレート核酸ターゲットを含んでいてもよい。一例では、核酸テンプレートは、特定遺伝子用の目的変異領域を含んでいてもよい。サンプル液滴3416が温度制御ゾーン3412a内にあるため、核酸テンプレートは変性一本鎖される。他の工程では、図34Bおよび34Cは、保温方法を示し、当該方法で、試薬液滴3418が、液滴操作を用いて温度制御ゾーン3412a内のサンプル液滴3416と混合され、反応液滴3420を生成する。試薬液滴3418は、ターゲット増幅用のプライマーおよびPCR試薬例えば、dNTPs、バッファー、DNAポリメラーゼを含んでいてもよい。試薬液滴3418は、LCGreen等の蛍光飽和DNA挿入染料を含んでいてもよい。反応液滴3420は、液滴操作を用いて温度制御ゾーン3412b内の特定の液滴操作電極3410に輸送される。反応液滴3420は、温度制御ゾーン3412bで、プライマーアニーリング/延長および蛍光挿入染料の組み込みに十分な期間保温される。反応液滴3420は、ターゲット核酸のPCR増幅のために、温度反応ゾーン3412bおよび3412aの間を液滴操作を用いて任意の数のサイクルを前後して繰り返し輸送されてもよい。図34Cに関して、反応液滴3420は、液滴操作を用いて液滴操作電極3410Dに輸送されてもよく、当該電極は、検出スポット3414の範囲内にある。検出スポット3414に近接して配置された画像化装置例えば、蛍光光度計、図示せずを用いて、反応液滴3420の蛍光の量を捕捉および定量化してもよい。増幅された核酸は、任意の数の増幅サイクル後すなわち、リアルタイムまたは完了点に検出されてもよい。図34Dは、PCR増幅の完了後に、液滴操作を用いて温度制御ゾーン3412a内の特定の液滴操作電極3410に輸送された反応液滴3420を示している。この工程では、反応液滴3420内の増幅された核酸の最終変性および冷却が行われ、対立遺伝子のより正確な識別のための多数のヘテロ二本鎖を生成する。一例では、温度制御ゾーン3412a内の温度を調整して、ヘテロ二本鎖の形成を高める、より高い加熱速度例えば、0.4°C/秒および急速な冷却速度例えば、約0.1°C/秒より大きく、約5°C/秒未満を提供してもよい。図34Eは、液滴操作を用いて温度制御ゾーン3412b内の液滴操作電極3410Dに輸送された反応液滴3420を示し、当該電極は、検出スポット3414の範囲内にある。この工程では、HRM分析が行われる。一例では、温度制御ゾーン3412b内の温度は、傾斜速度0.2°C/秒で約50°C~約95°Cで調整されていてもよい。検出スポット3414に近接して配置された画像化装置例えば、蛍光光度計、図示せずを用いて、温度の上昇に伴い反応液滴3420の蛍光の量を連続して捕捉および定量化する。本発明は、液滴アクチュエーターでの脆弱X症候群の検出用の一体化されたPCR増幅およびHRM分析方法を提供する。脆弱X症候群は、X染色体上の脆弱なX-精神遅滞1FMR1遺伝子の5’-未翻訳領域での単一CGGトリヌクレオチド反復の延長と関連している。この遺伝子でエンコードされたFMR1タンパク質は、正常な神経発達に要求される。脆弱X突然変異がない人々の間で、CGG反復の数は、6~約40まで異なる。脆弱X突然変異は、増大したCGG反復の数を伴う。順列と呼ばれる約55~約200のCGG反復の増大が、影響を受けないキャリアで見られる。約40~約55の反復は、正常な大きさの範囲および順列の大きさの範囲が重なるグレーゾーンと考えられる。完全順列と呼ばれる200反復を超える増大は、核酸のその領域の増大したメチル化に関連し、当該メチル化はFMR1タンパク質の発現を効果的に抑制する。一の実施形態では、本発明は、液滴系の一体化された、PCR増幅およびHRM検査のための方法を提供する。当該一体化されたHRM検査は、FRM1アンプリコン溶融点とCGG反復ドメインの長さとが相互に関連する。核酸分子の溶融温度は、核酸分子の長さと、核酸分子の特定のヌクレオチドシークエンス構成例えば、より高いTmは、より高いGC含有量と関連するとの両方に依存する。一例では、PCRプライマーを選択して、脆弱X症候群と関連することが示されたFMR1対立遺伝子のCGG反復ドメインの領域を増幅してもよい。プライマー対順方向のプライマーおよび逆方向のプライマーを選択して、多型CGG領域内での対立遺伝子の正確な識別のための十分な長さのアンプリコンを作製してもよい。PCR増幅およびHRM分析は、図1に関して記載したように行われてもよい。他の実施形態では、本発明は、液滴系の一体化された、PCR増幅およびHRM検査用の方法を提供する。当該一体化されたHRM検査は、FRM1アンプリコン溶融点とFRM1対立遺伝子のメチル化とが相互に関連する。メチル化固有溶融曲線分析による、高メチル化されたFMR1対立遺伝子の検出に基づく脆弱X症候群のための既存の検査は、液滴アクチュエーター3での使用に適応されてもよい。一般的に、メチル化固有溶融曲線分析は、PCR増幅の前に、分離された核酸の亜硫酸水素ナトリウム処理を用いる。亜硫酸水素塩処理は、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換するのに用いられるが、メチル化されたシトシンは未変化4のままである。続くPCR増幅の間、ウラシルは、次いでチミンに変換されるのに対し、メチルシトシンは、シトシンとして増幅される。メチルシトシンの異なる含有量を有する亜硫酸水素塩処理された核酸テンプレートから生成したPCR生成物は、溶融温度で違いを示し、その違いは、溶融分析で解決され得る。溶融プロフィールを用いて、4つの異なるメチル化状態を区別してもよい:メチル化されていない対立遺伝子は、単一の低い溶融ピークを生成し、完全メチル化対立遺伝子は、単一の高い溶融ピークを生成し、メチル化されていない対立遺伝子と完全メチル化対立遺伝子との混合物は、低い溶融ピークと高い溶融ピークの両方を生成し、そして、不均一にメチル化された対立遺伝子は、低い溶融ピークと高い溶融ピーク3の間に位置する幅広の溶融ピークを生成する。一例では、シリカ超常磁性応答ビーズSSBs5を用いた核酸メチル化の単一チューブ分析は、液滴アクチュエーター上での使用に適応されてもよい。メチル化固有溶融曲線分析のためのデジタル微小流体手順の一例は、これに限定されないが、以下を含んでいてもよい:核酸は、口腔内擦過物からの液滴アクチュエーターで、CHARGESWITCH登録商標ビーズ等の超常磁性応答ビーズを用いて調製されてもよい。磁気応答性ビーズ上の精製された核酸と共に磁気応答性ビーズを含むサンプル液滴は、液滴操作を用いて、分配され、温度制御ゾーンまで輸送され、精製された核酸は、例えば、42°Cでのアルカリ処理NaOHを用いて変性される。その中に変性された核酸を有するサンプル液滴は、液滴操作を用いて亜硫酸水素塩試薬液滴と混合され、反応液滴を生成する。反応液滴は、例えば、55°Cで、メチル化されていないシトシンがウラシルに変換するのに十分な期間保温される。亜硫酸水素塩変換の後、反応液滴は、液滴操作を用いて磁石のある所まで輸送され、混合および分割洗浄手順を用いて洗浄されて、変換された核酸が精製される。精製された核酸は、次いで、CHARGESWITCH登録商標ビーズから、10mMのトリスHCl、1mMのEDTAを用いてpH74で溶離される。CHARGESWITCH登録商標ビーズを囲む液滴に含まれる溶離核酸は、次いで、液滴系の一体化されたPCR増幅およびHRM分析を行うために、ビーズから離して輸送されてもよい。図1に関して記載したように、変換されたサンプル液滴についてPCR増幅およびHRM分析が行われてもよい。PCR増幅のために、メチル化非感受性増幅用またはメチル化感受性増幅用のプライマーが選択されてもよい。7.9システムライブラリー構築カートリッジに関して、ユーザーは、カートリッジを再使用しようと試みることがあり、または、24のサンプルが入手可能な場合、ユーザーは、いくつかのサンプルを今実行し、残りのサンプルを後で実行しようとすることがある。このことは、品質保証等の多くの理由から、望ましいことではない場合がある。一の実施形態では、PCBで、またはカートリッジ内でヒューズが飛ぶことがある。ヒューズは、PCBにはんだづけされた電子部品であったり、またはPCB上の配線例えば、銅以外の材料で形成されたかもしれない。ヒューズは、例えば、装置全体で物理的に好ましい頂部プレートへの通路に置かれてもよい。装置の物理的な無力化に代わる手段として、ヒューズは少しのデータを保存するのに用いられることがある。この場合、制御者は、運転を進める前に、ヒューズの状態を調べる。この場合、ヒューズは、制御者に書かれたまたは読まれたその電気状態を有することがあり、例えば、静電容量の変化は、状態を表す開路/ショートの代わりに用いられることがある。他の実施形態では、装置は、金属化されたブリスターパックであってもよく、または、他の使い捨ての特徴を有していてもよく、使用状態またはカートリッジの耐久性を検出するのに用いられる電気的痕跡を生成し得る。この場合、書き込みは、カートリッジの通常の使用を通じて作製され、装置は検出機能のみを実行する。他の実施形態では、複数のデータがカートリッジ内でエンコードされてもよい。例えば、カートリッジは、他のデータと同様に、カートリッジの使用状態をエンコードするのに用いられEEPROMを含み得る。一の実施形態では、EEPROM認証システムは、カートリッジの再使用を避けるように設計され、ユーザーの次善策としてのEEPROMのクローン作製および置換にも抵抗する。使用状態以外の他の多くの種類のデータがEEPROMに含まれ得る。1つの特徴は、バーコードナンバーを含んでいてもよい。カートリッジのバーコードステッカーは、バーコードリーダーで、研究所の自動システムに対してカートリッジを同定するために用い得る。他の実施形態では、核酸用途について追加の代替策は、再使用を防ぐためにカートリッジ内部表面を意図的に汚染することである。例えば、最終工程として、高濃度の核酸を含む液滴を、以前に未使用の領域も含めてカートリッジ全体を送ることができる。したがって、意図的にカートリッジ内部表面を汚染し、再使用を防ぐ。1999年8月19日に出願された題名IndicatorComponentsForMicrofluidicSytemsの米国特許第6495104号明細書の開示全体を参照して、カートリッジが使用されたか否かを特定するために有用で好適な指示素子に関する教示が参照により本明細書に援用される。本発明の様々な態様が、方法、システム、コンピューターで読み取り可能な媒体、および/またはコンピュータープログラム製品として実施されてもよいことが理解される。本発明の態様は、ハードウェアの実施形態、ソフトウェアの実施形態ファームウェア、常駐ソフトウェア、マイクロコード等を含む、または通常、本明細書で回路、モジュールまたはシステムとして言及した全てのソフトウェアおよびハードウェアの態様を組み合わせた実施形態を取り得る。さらに、本発明の方法は、コンピューターで使用可能なストレージ媒体でのコンピュータープログラムプロダクトの形態を取ってもよく、当該媒体は、当該媒体で実施されるコンピューターで使用可能なプログラムコードを有する。本発明のソフトウェアの態様について、任意の好適なコンピューターで使用可能な媒体が利用されてもよい。コンピューターで使用可能なまたはコンピューターで読み取り可能な媒体は、例えば、これらに限定されないが、電気的、磁気的、光学的、電磁気的、赤外線の、もしくは半導体の、システム、機器、装置、または伝播媒質であってもよい。コンピューターで読み取り可能な媒体は、一時的および/または持続的実施形態を含んでいてもよい。コンピューターで読み取り可能な媒体のより詳細な例非包括的なリストは、以下の一部または全部を含む:1つ以上の配線を有する電気的接続、ポータブルコンピューターディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリRAM、リードオンリーメモリーROM、イレーザブル消去可能プログラマブルリードオンリーメモリーEPROMまたはフラッシュメモリー、光ファイバー、ポータブルコンパクトディスクリードオンリーメモリーCD-ROM、光学ストレージデバイス、インターネットまたはイントラネットをサポートする伝送媒体等の伝送媒体、または磁気ストレージデバイス。プログラムが、例えば、紙または他の媒体の光学スキャンを経て電子的に保存され、次いで蓄積され、読み取られ、または好適な手法で他に処理され、必要ならば、次いでコンピューターのメモリーに保存されるので、コンピューターで使用可能なまたはコンピューターで読み取り可能な媒体は、紙またはプログラムが印刷された他の好適な媒体であってもよい。本文書の文脈では、コンピューターで使用可能なまたはコンピューターで読み取り可能な媒体は、指示実行システム、機器、もしくは装置により、または、指示実行システム、機器、もしくは装置に関連して、使用プログラムを含み、保存し、通信し、伝搬し、または伝送し得るいずれの媒体であってもよい。本発明の操作を実行するためのプログラムコードは、Java、Smalltalk、C等のオブジェクト指向プログラム言語で書かれていてもよい。しかしながら、本発明の操作を実行するためのプログラムコードは、Cプログラム言語または同様のプログラム言語等の従来の手続のプログラム言語で書かれていてもよい。プログラムコードは、プロセッサー、特定用途向け集積回路ASIC、またはプログラムコードを実行する他の構成で実行されてもよい。プログラムコードは、メモリー上述したコンピューターで読み取り可能な媒体等に保存されるソフトウェアアプリケーションと単に呼ばれるものであってもよい。プログラムコードは、プロセッサーまたは他のプロセッサー制御装置にグラフィカルユーザーインターフェースGUIを生成させてもよい。グラフィカルユーザーインターフェースは、ディスプレイ装置に視覚的に生成されてもよく、さらにグラフィカルユーザーインターフェースは、可聴式特徴を有していてもよい。しかしながら、プログラムコードは、コンピューター、サーバー、携帯情報端末、電話、テレビ、またはプロセッサーおよび/またはデジタル信号プロセッサーを利用するいずれのプロセッサー制御装置等のいずれのプロセッサー制御装置内で操作してもよい。プログラムコードは、局所的または遠隔的に実行されてもよい。プログラムコードは、例えば、全体または一部がプロセッサー制御装置のローカルメモリーに保存されてもよい。しかしながら、プログラムコードは、少なくとも部分的に、プロセッサー制御装置に、遠隔的に、保存され、アクセスされ、およびダウンロードされてもよい。ユーザーのコンピューターは、例えば、プログラムコードを全て実行してもよいし、またはプログラムコードを一部のみ実行してもよい。プログラムコードは、少なくとも一部がユーザーのコンピューターにあるスタンドアローンソフトウェアパッケージであってもよく、および/または、リモートコンピューターで部分的に実行されてもよいし、またはリモートコンピューターもしくはサーバーで全て実行されてもよい。後者の状況では、リモートコンピューターは、ユーザーのコンピューターにコミュニケーションネットワークを通じて接続されていてもよい。本発明は、ネットワーク環境に関わらず適用してもよい。コミュニケーションネットワークは、無線周波数ドメインおよび/またはインターネットプロトコルIPドメインのケーブルネットワーク操作であってもよい。しかしながら、コミュニケーションネットワークは、インターネット時々、代替的にワールドワイドウェブとして知られている、イントラネット、ローカルエリアネットワークLAN、および/または広域ネットワークWAN等の分散コンピューティングネットワークを含んでいてもよい。コミュニケーションネットワークは、同軸ケーブル、銅線、光ファイバー線、および/またはハイブリッド同軸線を含んでいてもよい。コミュニケーションネットワークは、電磁気スペクトルのいずれかの部分およびシグナリング標準標準のIEEE802ファミリー、GSMCDMATDMAまたはセルラー方式標準、および/またはISM帯等のいずれかを利用する無線部分を含んでいてもよい。コミュニケーションネットワークは、電力線部分を含んでいてもよく、そこで信号は電気配線を通じて伝えられる。本発明は、物理的構成部品、物理的構成、またはfunctionコミュニケーション標準に関わらず、いずれの無線/有線コミュニケーションネットワークに適用してもよい。本発明のいくつかの態様は、様々な方法および方法の工程を参照して記載されている。各方法の工程が、プログラムコードにより、および/または機械命令により実施され得ることが理解される。プログラムコードおよび/または機械命令は、方法に固有の機能/動作を実施するための手段を作り出してもよい。プログラムコードは、コンピューターで読み取り可能なメモリーに保存されてもよく、当該メモリーは、コンピューターで読み取り可能なメモリーに保存されたプログラムコードが、様々な方法の工程の態様を実施する指示手段を含む製品を作成または変換するように、プロセッサー、コンピューター、または他のプログラム可能なデータを処理する機器を特定の方法で機能するように指示することができる。プログラムコードは、コンピューターまたは他のプログラム可能なデータを処理する機器に搭載され、プログラムコードが本発明の方法で規定された様々な機能/動作を実施するための工程を提供するように、プロセッサー/コンピューターが実施する処理を生成するように行われる一連の操作工程を引き起こしてもよい。8結び実施形態のこれまでの詳細な説明は、添付の図面を参照し、当該図面は、本発明の特定の実施形態を表し、説明のためのみのものである。本発明の範囲から逸脱しない異なる構造および操作を有する他の実施形態は、本記載の観点から当業者に容易に理解される。用語発明等は、本明細書で説明した出願人の発明の多くの代替の態様または実施形態のいくつかの特定の例を参照して用いられ、その使用または欠如が出願人の発明の範囲またはクレームの範囲を限定する意図ではない。本明細書は、読者の便宜のためのみにセクションに分割されている。見出しは、発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。定義は本発明の記載の一部として意図されている。本発明の範囲を逸脱することなく本発明の様々な詳細を変更してもよいことが理解される。"