"哺乳動物における異常細胞を治療するための方法であって、α2β1を異常細胞への感染性のために認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるウイルスの効果的な量で哺乳動物を治療し、その結果、異常細胞の少なくとも一部がウイルスによって殺されるようにすることを含む方法。ウイルスを用いた多数の治療に哺乳動物を供することを含み、各治療におけるウイルスが同一または異なる請求項1に記載の方法。ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項1に記載の方法。ウイルスが、EV1,EV7,EV8およびEV22からなる群から選択される請求項3に記載の方法。ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項3に記載の方法。ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項5に記載の方法。改変されたエコーウイルスが、EV1,EV7,EV8およびEV22からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項5または6に記載の方法。ウイルスが異常細胞に感染するさらなるウイルスとの組合せで哺乳動物に投与される請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。異常細胞がICAM-1を発現し、さらなるウイルスが異常細胞への感染性のためにICAM-1を認識する請求項8に記載の方法。さらなるウイルスがコクサッキーウイルスまたはその改変された形態である請求項9に記載の方法。コクサッキーウイルスが、A13,A15,A18およびA21からなる群から選択されるコクサッキーウイルス血清型である請求項10に記載の方法。異常細胞がガン細胞である請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項12に記載の方法。異常細胞が、α2β1のアップレギュレーションされた発現を有する請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。ウイルスが、哺乳動物に対して局所的に、全身的に、または腫瘍内に投与される請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。異常細胞の治療のために哺乳動物にウイルスを投与することを評価するために、ウイルスによって誘導される細胞死に対する感受性について哺乳動物に由来する異常細胞のサンプルをスクリーニングする方法であって:a異常細胞のサンプルを提供する工程;bウイルスによる異常細胞への感染を可能にするのに十分な期間にわたって異常細胞をウイルスで治療する工程;およびcウイルスが異常細胞の少なくとも一部に感染し、その死を生じさせたかどうかを明らかにする工程;を含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα2β1を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される方法。ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項16に記載の方法。ウイルスが、EV1,EV7,EV8およびEV22からなる群から選択される請求項16に記載の方法。ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項17に記載の方法。ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項19に記載の方法。改変されたエコーウイルスが、EV1,EV7,EV8およびEV22からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項19または20に記載の方法。異常細胞に感染し、その死を生じさせるウイルスの能力を、異常細胞の別のサンプルを利用して、工程bおよび工程cに供された、α2β1を異常細胞への感染性のために認識する異なるウイルスと比較する工程をさらに含む請求項16~21のいずれか一項に記載の方法。異なるウイルスが異なるエコーウイルスまたはその改変された形態である請求項22に記載の方法。異常細胞がガン細胞である請求項16~23のいずれか一項に記載の方法。ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項24に記載の方法。異常細胞の治療のために哺乳動物にウイルスを投与することを評価するために、哺乳動物に由来する異常細胞に感染し、その死を生じさせる能力についてウイルスをスクリーニングする方法であって:aウイルスを選択する工程;bウイルスによる異常細胞への感染を可能にするのに十分な期間にわたって哺乳動物に由来する異常細胞のサンプルをウイルスで治療する工程;およびcウイルスが異常細胞の少なくとも一部に感染し、その死を生じさせたかどうかを明らかにする工程;を含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα2β1を認識するエコーウイルスおよびその改変された形態から選択される方法。ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項26に記載の方法。ウイルスが、EV1,EV7,EV8およびEV22からなる群から選択される請求項26に記載の方法。ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項27に記載の方法。ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項29に記載の方法。改変されたエコーウイルスが、EV1,EV7,EV8およびEV22からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項29または30に記載の方法。異常細胞に感染し、その死を生じさせるウイルスの能力を、異常細胞の別のサンプルを利用して、工程bおよび工程cに供された、α2β1を異常細胞への感染性のために認識する異なるウイルスと比較する工程をさらに含む請求項26~31のいずれか一項に記載の方法。異なるウイルスが異なるエコーウイルスまたはその改変された形態である請求項32に記載の方法。異常細胞がガン細胞である請求項26~33のいずれか一項に記載の方法。ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項34に記載の方法。α2β1を発現する異常細胞に対して哺乳動物における免疫応答を誘導する方法であって、エコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるウイルスを哺乳動物における異常細胞に感染させることを含み、それにより少なくとも一部の異常細胞の溶解が引き起こされる方法。ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項36に記載の方法。ウイルスが、EV1,EV7,EV8およびEV22からなる群から選択される請求項37に記載の方法。ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項37に記載の方法。ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項39に記載の方法。改変されたエコーウイルスが、EV1,EV7,EV8およびEV22からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項39または40に記載の方法。異常細胞が、α2β1のアップレギュレーションされた発現を有する請求項36~41のいずれか一項に記載の方法。ウイルスが異常細胞に感染するさらなるウイルスとの組合せで哺乳動物に投与される請求項36~42のいずれか一項に記載の方法。異常細胞がICAM-1を発現し、さらなるウイルスが異常細胞への感染性のためにICAM-1を認識する請求項43に記載の方法。さらなるウイルスがコクサッキーウイルスまたはその改変された形態である請求項44に記載の方法。コクサッキーウイルスが、A13,A15,A18およびA21からなる群から選択されるコクサッキーウイルス血清型である請求項45に記載の方法。異常細胞がガン細胞である請求項36~46のいずれか一項に記載の方法。ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項47に記載の方法。ウイルスが、哺乳動物に対して局所的に、全身的に、または腫瘍内に投与される請求項36~48のいずれか一項に記載の方法。哺乳動物における異常細胞を治療するための医薬組成物であって、異常細胞の少なくとも一部がウイルスによって殺されるように異常細胞を治療するためにウイルスを生じさせるための接種物を医薬的に許容され得るキャリアと一緒に含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα2β1を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される医薬組成物。ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項50に記載の医薬組成物。ウイルスが、EV1,EV7,EV8およびEV22からなる群から選択される請求項51に記載の医薬組成物。ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項49に記載の医薬組成物。ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項51に記載の医薬組成物。改変されたエコーウイルスが、EV1,EV7,EV8およびEV22からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項53または54に記載の医薬組成物。異常細胞がガン細胞である請求項50~55のいずれか一項に記載の医薬組成物。医薬組成物が局所投与または注入のためのものである請求項50~56のいずれか一項に記載の医薬組成物。哺乳動物における異常細胞を治療するためのウイルスを生じさせるために哺乳動物に接種物を適用するためのアプリケーターであって、アプリケーターは、接種物が哺乳動物と接触するように接種物を染み込ませた領域を含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα2β1を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるアプリケーター。ウイルスを染み込ませた領域が、哺乳動物と接触した状態で保持されるための詰め物またはパッドを含む請求項58に記載のアプリケーター。異常細胞が異常皮膚細胞であり、アプリケーターが哺乳動物の皮膚に接着するための一つまたはそれ以上の接着性表面をさらに含む請求項58または59に記載のアプリケーター。パッチまたは絆創膏の形態である請求項58~60のいずれか一項に記載のアプリケーター。哺乳動物における異常細胞に対する免疫応答を誘導するための医薬品を製造する際にウイルスを生じさせるための接種物の使用であって、ウイルスが、異常細胞への感染性のためにα2β1を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される使用。哺乳動物における異常細胞に対する免疫応答を誘導するための医薬品を製造する際にウイルスを生じさせるための接種物の使用であって、ウイルスが、異常細胞への感染性のためにα2β1を認識し、かつ細胞を殺すエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される使用。ウイルスが腫瘍の細胞に感染し、その死を生じさせることができるかどうかを明らかにするために、生検試料を腫瘍から採取することができ、細胞の調製物を、従来の技術を使用して調製し、その後、iウイルス受容体の細胞表面発現を確認することができ、また、iiウイルスで細胞を攻撃し、所定のインキュベーション期間、典型的には約2日間しかし、これは、使用されるウイルスに依存して変化し得る、感染および細胞死について細胞をモニターすることができる。α2β1の発現はフローサイトメトリー分析によって容易に確認することができる。数多くのウイルスを、調製された悪性の細胞の種々のアリコートを使用して同時にこの方法でスクリーニングすることができ、そして、より大きな程度の感染性および細胞死を示すウイルスを、生検試料が採取された対象への投与のために選択することができる。同様に、異なる供給源から採取された生検試料に由来する種々の悪性の細胞の調製物を、特定のウイルスを使用するアッセイにおいて用いることができる。生検試料は、一人の個体の異なる部位から、または数多くの個体から採取することができる。本明細書中に記載されるような方法において使用されるウイルスは、望ましくは、受容者において臨床的症状をほとんど生じさせないか、または、ほんの軽微な臨床的症状を生じさせるだけである。そのようなウイルスは、当業者に広く知られている商業的供給源から容易に入手可能であり、上記の様式で本発明の方法におけるその有効性についてスクリーニングすることができる。望ましくは、ウイルスは、通常の場合、エコーウイルスEV1、エコーウイルスEV7、エコーウイルスEV8およびエコーウイルスEV22からなる群から選択されるエコーウイルスである。これらのウイルスはそれぞれが、細胞感染性のためにα2β1を認識する。例えば、EV1は、軽い上部気道疾患、そしてまた胸膜痛に関連しているFieldsB.N.他、2000;McCrackenA.W.他、1969。α2β1の発現は、中皮において遭遇する優勢なI型コラーゲンマトリックスのために卵巣ガン腫ではアップレギュレーションされると考えられている。数多くの悪性黒色腫はまた、アップレギュレーションされたレベルのα2β1を発現することが示されているKramerR.H.およびMarksN、1989;RamosD.M.他、1990。EV1およびコラーゲンは、α2β1サブユニットのドメインIにおいて異なる残基を使用してα2β1に付着するBergelsonJ.H.、1993。インテグリンα2β1はEV1およびコラーゲンを同時に受け入れることができない。しかしながら、ウイルスは、コラーゲンと比較した場合、親和性において10倍の増大でα2β1と結合するXingL、2002。所与のウイルスをスクリーニングして、そのウイルスが、悪性の細胞に感染し、その死を生じさせることができるかどうかを確認する目的のために、生検試料から単離された原発性の悪性の細胞よりもむしろ悪性細胞株を使用することができる。選択されたウイルスは、好ましくは、ウイルスによる腫瘍の潜在的な感染のための領域を最大限にするために、悪性腫瘍上の多数の部位に対して直接的に注入される。完全なウイルスではなく、ウイルスを生じさせるための核酸を含むウイルスプラスミドまたは他のプラスミドまたは発現ベクターを、治療を達成するための腫瘍細胞による取り込みおよび細胞内における完全なウイルスの生成のために腫瘍内に注入することができる。好適な発現ベクターには、ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするDNA例えば、ゲノムDNAまたはcDNAインサートの発現が可能であるプラスミドが含まれる。発現ベクターは、典型的には、挿入された核酸が機能的に連結される転写調節制御配列を含む。機能的に連結されるによって、核酸インサートが、インサートの読み枠の変化を伴うことなく、挿入された配列1つまたは複数の転写を可能にするための転写調節制御配列に連結されることが意味される。そのような転写調節制御配列には、転写を開始させるためにRNAポリメラーゼの結合を促進させるためのプロモーター、および、転写されたmRNAに対するリボソームの結合を可能にするための発現制御エレメントが含まれる。より詳細には、本明細書中で使用される用語調節制御配列は、所与のDNA配列の転写を行わせ、かつその転写レベルを制御すなわち、調節することに関与する任意のDNAを包含することが理解されなければならない。例えば、5’調節制御配列は、プロモーターおよび5’非翻訳リーダー配列を含み得る、コード配列の上流側に位置するDNA配列である。3’調節制御配列は、1つまたは複数のポリアデニル化シグナルを含む好適な転写終結および/または調節シグナルを含み得る、コード配列の下流側に位置するDNA配列である。本明細書中で使用される用語プロモーターは、転写の開始時にDNA依存性RNAポリメラーゼによって認識され、そのDNA依存性RNAポリメラーゼが直接的または間接的に結合する任意のDNA配列を包含する。プロモーターには、転写開始部位、ならびに、転写開始因子およびRNAポリメラーゼに対する結合部位が含まれ、また、プロモーターは、遺伝子発現調節タンパク質が結合し得る様々な他の部位または配列例えば、エンハンサーを含むことができる。哺乳動物細胞のトランスフェクションのために好適な数多くの発現ベクターがこの分野では知られている。哺乳動物細胞のトランスフェクションのために好適な発現ベクターには、pSV2neo、pEF-PGk.puro、pTk2、ならびに、ポリアデニル化部位および伸長因子1-xプロモーターを含む非複製性のアデノウイルスシャトルベクター、ならびに、サイトメガロウイルスCMVプロモーターを最も好ましくは含むpAdEasy型発現ベクターが含まれる例えば、He他1998を参照のこと。ポリペプチド伸長因子-α2をプロモーターとして用いるプラスミドpEFBOSもまた利用することができる。ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするcDNAは、例えば、Sambrook他1989、MolecularCloning:ALaboratoryManual第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、NewYork、およびAusubel他1994、CurrentProtocolsinMolecularBiology米国、第1巻および第2巻に記載されるようなこの分野で広く知られている組換え技術を使用して、ウイルスRNAゲノムまたはそのフラグメントを逆転写することによって調製し、好適なベクターに組み込むことができる。細胞は、cDNAではなく、精製されたビリオンから抽出されたウイルスRNAでトランスフェクションすることができ、または、例えば、RNA転写物を、Ansardi,D.C.他2001に記載されるように、バクテリオファージT7のRNAポリメラーゼを利用してxDNAテンプレートからインビトロで作製することができる。同様に、単一のプラスミドまたはRNA分子を、ウイルスタンパク質を発現させ、ウイルスを生じさせるために投与することができ、あるいは、ウイルスタンパク質の異なる分子をコードする複数のプラスミドまたはRNA分子を、細胞をトランスフェクションし、ウイルスを生じさせるために投与することができる。プラスミドまたはRNAは、細胞のトランスフェクションを促進させるためのキャリアビヒクルの非存在下で、またはそのようなビヒクルとの組合せでの腫瘍細胞による取り込みのために、局所的によるか、または注入によるかのいずれかで腫瘍に対して直接、投与することができる。好適なキャリアビヒクルには、この分野では従来から知られている油中水型エマルションとして典型的には提供されるリポソームが含まれる。リポソームは、典型的には、脂質特に、リン脂質、例えば、高い相転移温度のリン脂質などと、通常の場合には、膜安定性をリポソームに提供するための1つまたは複数のステロイドまたはステロイド前駆体例えば、コレステロールなどとの組合せを含む。リポソームを提供するために有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシドおよびガングリオシドなどが含まれる。ジアシルホスファチジルグリセロールは、脂質成分が14個~18個の炭素原子より好ましくは16個~18個の炭素原子を含有し、飽和している場合、特に好適である。リポソームと標的細胞との相互作用は受動的または能動的であり得る。能動的な標的化では、標的細胞により発現される対応するリガンドと結合するか、またはそうでない場合には相互作用する特異的なリガンドをリポソーム膜に取り込むことによるリポソームの改変が伴う。そのようなリガンドには、例えば、モノクローナル抗体またはその結合性フラグメント例えば、FabフラグメントまたはFab’2フラグメント、糖成分または糖脂質成分、あるいはウイルスタンパク質が含まれ、α2β1に対して特異的なウイルスタンパク質またはモノクローナル抗体が特に好ましい。通常、腫瘍の周りの組織はまた、悪性の細胞がそのような組織に存在する可能性を考えると、ウイルスが注入されるか、または、そうでない場合にはウイルスで治療される。腫瘍が比較的進行するまで、腫瘍が検出されない場合、周りの組織には、腫瘍自体の外科的切除の後、ウイルスを注入することができる。悪性の腫瘍に対して直接的に注入するのではなく、接種物は、腫瘍への送達のために、腫瘍部位に隣接する位置における受容者の血流内への静脈内注射によって全身投与することができる。同様に、適当であると見なされるならば、接種物は、皮下に、腹腔内に、または、例えば、筋肉内に投与することができる。しかしながら、一般には、完全なウイルスが投与されるときには、ウイルスに対する特異的な抗体が存在する可能性、および、それにより、ウイルス送達の代わりの様式の潜在的な低下した効率を考えると、腫瘍内への直接的な注入が好まれる。接種物はまた、単独、または腫瘍内への接種物の直接的な注入との組合せのいずれかで局所的に適用することができる。腫瘍の局所的治療は、接種物と、悪性の細胞に感染させるために接種物の一体性を維持するための好適な医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物の滴下適用によって、またはそのような組成物を含浸させたアプリケーターで腫瘍をなでることによって達成することができる。アプリケーターは、組成物に浸された好適な材料の詰め物またはパッドを含むことができる。皮膚における黒色腫を治療する場合、接種物は、接種物が皮膚と接触するように治療される悪性部位に対して保持されるために適合化されている、接種物を含浸させたアプリケーターによって塗布することができる。この場合、アプリケーターには、黒色腫の周りの皮膚に接着するために、絆創膏の場合などの接着性表面がさらに提供される、接種物を含浸させたパッチまたは詰め物などを含むことができ、それにより接種物を黒色腫との接触状態に保つことができる。典型的には、完全なウイルスが、治療を達成するために哺乳動物に投与される。一般に、1つまたは複数の小さい切開部が悪性腫瘍および/または周りの組織に作製されて、それらへのウイルスのための進入部位が提供される。卵巣ガンまたは卵巣の近くにおけるガンの場合、エコーウイルスを、カテーテルまたは他の好適な適用器具を使用して、カテーテルまたは選択された器具を対応するファロピウス管に沿って挿入することによって、卵巣または罹患部位に対して直接的に送達することができる。ウイルスおよび/または核酸、または、標的細胞内においてウイルスを生じさせるためのウイルス核酸を含むプラスミドを受容者に接種するために使用される医薬的に許容され得るキャリアは、生理学的食塩水などの液体、または、適切であると見なされる任意の他の従来から知られている生理学的に許容され得る媒体、例えば、薬学的使用のために、また、接種物を治療部位に投与するために好適な市販のゲルなどであり得る。キャリアは、典型的には生理学的pHに緩衝化され、好適な保存剤および/または抗生物質を含有することができる。接種物は、一般に、1mlの接種物あたり約1×102プラーク形成ユニット~約1×1010プラーク形成ユニットを含有する。好ましくは、接種物は1mlの接種物あたり約1×105プラーク形成ユニット以上を含有する。患者に投与される接種物の量は、患者の全体的な状態、悪性腫瘍の段階および存在位置を、ウイルスで治療される領域の全体的なサイズおよび分布と一緒に考慮に入れて、受け入れられている医療行為に従って主治医または外科医によって容易に決定することができる。典型的には、患者は、最初の用量のウイルスで治療され、続いて、ウイルスの最初の投与に対する患者の応答、ならびに、最初の治療から生じるウイルス感染および悪性細胞の死の程度などの要因が決定されるまで、好適な期間にわたってモニターされ、その後、さらなるウイルスを患者に投与するための決定がなされる。望ましくは、個体は、所定の間隔で一定の期間、ウイルスで治療される。間隔は、それぞれの状況において適切であると決定されるように、毎日であり得るか、あるいは24時間~72時間以上までに及び得る。異なるウイルスを、以前に投与されたウイルスに対する何らかの免疫応答の影響を回避または最小限にするために毎回、投与することができ、そして、治療の経過期間は、主治医によって決定され得るように、1週間~2週間以上に及び得る。最も好ましくは、哺乳動物が以前にさらされてないウイルス、または、哺乳動物が、標準的な技術によって決定され得るような比較的軽微な免疫応答を生じるウイルスが投与される。容易に入手可能な知られているエコーウイルスが本発明の方法において好適に用いられ得るが、従来の技術を使用して改変または操作されたウイルスもまた利用することができる。例えば、ウイルスは、さらなる細胞接着分子を細胞受容体として用いるために改変することができる。一例として、ウイルスは、ペプチドモチーフRGDがウイルスのキャプシド表面に発現されるように部位特異的変異誘発を使用して改変することができる。RGDモチーフはαvインテグリンヘテロ二量体によって認識され、そして、このキャプシド改変は、例えば、ウイルスがインテグリンα2β1α2β1を有するような黒色腫病巣においてアップレギュレーションされることが示されている細胞接着分子;NataliaP.G.、1997と結合することを可能にすることができ、これは、潜在的には、標的細胞によるウイルスの高まった取り込みを生じさせる。本発明の本質がより明確に理解され得るために、次に、その好ましい形態が、下記の非限定的な実施例を参照して記載される。実施例1:材料および方法1.1.細胞株IGROV-1、A2780、DU145、PC3、AsPC-1、PANC-1、T47-D、MDA-MB361、MDA-MB453、MDA-MB231およびMCF-7のガン細胞株をGarvanInstituteSydney、NewSouthWales、オーストラリアから得た。BT-20、MDA-MB157、SK-BR-3、ZR-75-1、HCT116、LIM2537、SW480、SW620、2008、JAM、OVCA-429、OVCAR-3、OVHS-1、OWA-42、SKOV-3およびDOV13のガン細胞株をPeterMacCullumCancerInstituteMelbourne、Victoria、オーストラリアから得た。SkMel28細胞をRalph博士DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology、MonashUniversity、Victoria、オーストラリアから得た。HeLa細胞をMargeryKennettEntero-respiratoryLaboratory、FairfieldHospital、Melbourne、Victoria、オーストラリアから得た。α-MEM培地で培養されるBT-20細胞、ならびに、DMEM培地で培養されるSkMel28細胞およびHeLa細胞を除いて、すべての細胞が、2~5のウシ胎児血清FCSおよび抗生物質を含有するRPMIにおいて標準的な条件5CO2雰囲気下で37°Cのもとで培養された。使用された細胞はすべてが、ELISARocheMolecularSystems、CA、米国によってマイコプラズマの存在について定期的に検査された。1.2.ウイルスコクサッキーウイルスA21CAV21プロトタイプ株Kuykendall、コクサッキーウイルスB3CVB3プロトタイプ株Nancy、エコーウイルスEV1プロトタイプ株Farouk、エコーウイルスEV7プロトタイプ株Wallace、およびポリオウイルス1PV1プロトタイプ株MahoneyをMargeryKennett博士EnterorespiratoryLaboratory、FairfieldHospital、Melbourne、Victoria、オーストラリアから得た。すべてのウイルスはHeLa細胞において増殖させられ、力価測定された。1.3.モノクローナル抗体MAb抗DAFMAbのVIIIA7これはDAFの3番目のSCRを認識するはT.Kinoshita博士大阪大学、大阪、日本から得られ、抗DAFmAbのIH4はBruceLoveland博士AustinResearchInstitute、Heidelberg、Victoria、オーストラリアからの譲渡物であった。抗CARMAbのRmcBはJ.M.Bergelson博士DanaFarberCancerInstitute、Boston、Massachusettsから得られた。抗β2-ミクログロブリンMAb918はP.Minor博士NIBSC、Hertfordshire、英国から得られた。抗α2β1MAbのAK7これはα2サブユニットを認識するおよびコントロール抗体の抗GPIV血小板膜糖タンパク質MAbPTA-1はGordonBurns教授DepartmentofMedicalBiochemistryandCancerResearch、UniversityofNewcastle、NSW、オーストラリアから得られた。抗ICAM-1MAbのIH4はAndrewBoyd博士QueenslandInstituteforMedicalResearch、Queensland、オーストラリアから得られた。1.4.フローサイトメトリー分析ガン細胞におけるエンテロウイルス受容体の表面発現がフローサイトメトリーによって分析された。分散された細胞1×106個を、氷上で20分間、適切なMAbPBSにおいて希釈された5μg/mlと20分間インキュベーションした。細胞をPBSで洗浄し、遠心分離によってペレット化し、その後、ヤギ抗マウス免疫グロブリンのR-フィコエリトリンコンジュゲート化Fab’2フラグメントDako,A/S、デンマークの1:50希釈物の100μlに再懸濁した。細胞を再び氷上で20分間インキュベーションし、洗浄し、ペレット化して、PBSに再懸濁し、その後、フローサイトメトリー分析を行った。細胞表面での受容体の発現が、FACStarAnalyserBectonDickenson、Sydney、オーストラリアを使用して分析された。1.5.ウイルス感染性アッセイガン細胞株のコンフルエントな単層物に、1ウシ胎児血清FCSを含有するDMEMにおけるCAV21、CVB3、EV1、EV7またはPV1の10倍連続希釈物100μl/ウエルを三連または四連でを接種し、これらを5のCO2環境において37°Cで72時間インキュベーションした。細胞の生存を測定するために、プレートを100μl/ウエルのクリスタルバイオレットメタノール溶液0.1クリスタルバイオレット、20メタノール、20ホルムアルデヒド、リン酸塩緩衝化生理的食塩水PBSと24時間インキュベーションして、蒸留水において洗浄した。限界希釈アッセイの終点は、50の試験ユニットに影響を及ぼすウイルスの希釈度である。統計学的手法が、ReedおよびMuenchの方法参考文献を使用して終点を計算するために用いられた。終点は50組織培養感染用量/ミリリットルTCID50/mlとして表された。抗受容体モノクローナル抗体で前処理された細胞単層物が要求される場合、細胞は100μlの抗α2β1AK7MAbPBSにおいて希釈された20μg/mlと37°Cで1時間インキュベーションされた。その後、細胞単層物は適切なウイルス希釈物の二連のサンプルに接種され、5のCO2環境において37°Cで72時間インキュベーションされ、その後、上記のように染色された。顕微鏡写真が、倒立型顕微鏡を使用して100倍の倍率OlympusIX-FLAで、24時間、48時間または72時間において撮影された。1.6.ウイルス精製DOV13細胞のコンフルエントな単層物を含有する6ウエル組織培養プレートに500μlのEV1感染多重度[moi]=105TCID50/mlを37°Cで1時間にわたって接種した。非結合のウイルスを、メチオニン/システインを含まないDMEMICNBiomedical、Ohio、米国で3回洗浄することによって除き、細胞単層物を1.3mlのこの培地において37°Cでさらに2時間インキュベーションし、その後、300μCiの[35S]-メチオニントランスラベルICNBiomedical、Ohio、米国を加えた。感染した単層物を5のCO2環境において37°Cで一晩インキュベーションした。3回の凍結/融解サイクルの後、ウイルス溶解物をBeckmanXL-90超遠心分離器SW41tiローターにおける36,000rpmでの95分間の速度遠心分離によって5~30スクロースグラジェントで精製した。分画物を各チューブの底から集め、液体シンチレーション計数Wallac1450MirobetaTRILUX、フィンランドによってモニターして、ウイルス結合アッセイにおいて使用される160Sウイルス最大画分を捜し出した。放射能標識されていないEV1ビリオンを、プールされ、リン酸塩緩衝化生理的食塩水PBSに対して透析された最大感染画分を用いた並行するグラジェントで精製した。紫外UV光で不活性化されたEV1を、6ウエルプレートにおいて、PBSにおける精製EV1の1.0ml/ウエル5×105TCID50を15ワットのUV光に30秒間さらすことによって作製した。ウイルスの不活性化はマイクロタイタープレートでの溶解感染性の細胞アッセイによって評価された。1.7.放射能標識されたウイルスの結合アッセイ1ウシ血清アルブミンBSAを含有する800μlのRPMIに再懸濁された約1×106個の細胞を、20μg/mlのMAbPBSにおいて希釈された抗α2β1または抗DAFの存在下、4°Cで1時間インキュベーションし、その後、300μl1×106個の[35S]-メチオニン標識された160SEV1を加えた。4°Cで2時間インキュベーションした後、細胞を血清非含有培地で4回洗浄し、細胞ペレットを200μlの0.2MNaOH-1SDSに溶解し、その後、結合した[35S]-メチオニン標識ウイルスのレベルを三連サンプルからの液体シンチレーション計数によって測定したWallac1450MirobetaTRILUX、フィンランド。結果が平均値±SEとして表された。1.10.ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGE[35S]-メチオニン標識されたウイルス画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGEによって分析し、オートラジオグラフィーによって可視化した。[35S]-メチオニン標識された160SEV1画分をサンプル還元緩衝液250mMTRIS、0.2gw/vSDS、20v/vグリセロール、10v/v2-メルカプトエタノール、および0.01w/vブロモフェノールブルー、pH6.8と95°Cで10分間インキュベーションし、ビリオンを変性させた。変性処理された160Sウイルス最大画分を、その後、180Vで45分間、Benchmark染色済み中範囲タンパク質ラダーGIBCO、米国と一緒に15Tris-HClプレキャストゲルBIORADReady-Gel、CA、米国において分離した。主な構造タンパク質の可視化およびウイルス純度の分析が、96時間の感光を行った後のHyperfilmMPAmershamInternational、英国におけるオートラジオグラフィーによって行われた。1.11.細胞の細胞傷害性アッセイヒト末梢血リンパ球OVHS-1細胞およびDOV-13細胞の細胞懸濁物をEV1で攻撃しmoi=1.0TCID50/細胞、37°Cで24時間インキュベーションした。細胞の細胞溶解のレベルを、製造者の説明書に従ってCyto-Tox96キットPromegaCorp.、Maddison、WI、米国を使用することによって評価されるLDH細胞溶解時に放出される安定な細胞質ゾル酵素の放出の関数として計算した。1.12.スフェロイドの培養およびスフェロイド感染性アッセイDOV-13細胞を、24ウエルプレートにおいて、5FCSを含有する1mlのRPMI1640においてウエルあたり500個または5000個の細胞で半固体の0.5寒天層に接種した。細胞は、スフェロイドを形成させるために5のCO2環境において37°Cで48時間インキュベーションされ、その後、EV1が添加された105TCID50。1.13.SCIDマウスにおける腹腔内腫瘍異種移植片モデル6週齢~8週齢のオスBALB/cSCIDマウスを、ニューカッスル大学動物管理倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って病原体非含有条件で飼育した。OVHS-1細胞を、0.05トリプシンを用いて集め、10FCSを含有するRPMIに再懸濁し、遠心分離によってペレット化した。細胞を洗浄し、PBSに再懸濁し、その後、マウスに1×106個の細胞を200μlにおいて腹腔内i.p.注射した。14日後、マウスを3つの群n=5に分け、リン酸塩緩衝化生理的食塩水PBSで、またはUV不活性化EV1もしくは感染性EV1のいずれかの105TCID50でi.p.治療した。動物は、毎週、体重測定され、腫瘍がその体重の20を越えた時に屠殺された。治療されたマウスの体重が、腫瘍を有さない健康なBALB/cSCIDマウスと比較された。1.14.リアルタイムPCRによるウイルス血症の決定感染マウスから得られた血清を、リアルタイム定量的RT-PCRを使用してウイルス血症について分析した。簡単に記載すると、ウイルスRNAを、製造者の説明書に従って、QIAampウイルスRNAミニキットQiagen、CliftonHill、Victoria、オーストラリアを使用して10μlの血清から抽出し、40μlの最終体積で溶出した。EV1のウイルスRNAレベルを測定するためのプライマーおよびプローブは、PrimerExpressTM1.5ソフトウエアAppliedBiosystems、FosterCity、CA、米国を使用して設計され、以前に発表されたEV1配列Genbankアクセション番号AF029859に基づいていた:フォワードプライマー5’-CAAGACAGGGACCAAAGAGGAT-3’、リバースプライマー5’-CCACTCGCCTGGTTGTAATCA-3’および6-FAM標識のMGBプローブ5’-CCAATAGCTTCAACAATT-3’。ワンステップRT-PCRが、ABI7000配列検出装置においてPlatinum登録商標QuantitativeRT-PCRThermoScriptTMOne-StepSystemを使用して行われた。標準曲線を作製するために、EV1ウイルスのストック物1×106TCID50/mlの10倍希釈物が、最適化された濃度のプライマーおよびプローブを用いて増幅された。25μlの体積において、反応混合物は、1×ThermoScriptTM反応混合物、500nMのフォワードプライマー、900nMのリバースプライマー、250nMのプローブ、500nMのROX、0.5μlのThermoScriptTMPlus/PlatinumTaqMix、および5μlの抽出されたRNAを含んだ。熱サイクル条件は、60°Cで30分、その後、95°Cで5分、次いで、95°Cで15秒および60°Cで1分の40サイクルに供された。実施例2:ガン細胞のウイルス媒介による腫瘍崩壊2.1.乳ガン細胞の表面におけるエンテロウイルス受容体の発現エンテロウイルスによって使用される選択されたエンテロウイルス細胞表面受容体の相対的な発現レベルを明らかにするために、フローサイトメトリー分析が行われた。選択された受容体群は、CAV21によって用いられるICAM-1;EV7、CAV21、CVB3によって用いられるDAF;CVB3によって使用されるCAR;および、EV1によって使用されるインテグリンα2β1からなった。PVR受容体に対するMabを得ることができなかったため、PVRの発現レベルは測定されなかった。9個の乳ガン細胞株が分析され、これらには、BT-29、MCF-7、MDA-MB157、MDA-MB231、MDA-MB361、MDA-MB453、SK-BR-3、T47-DおよびZR-75-1が含まれる。これらの細胞株は、抗ICAM-1IH4、抗CARRmcB、抗DAFVIIIA7または抗α2β1AK7のいずれかとインキュベーションされた。ICAM-1の発現は9個の系統のうちの6個において顕著であり、一方、DAFは、これらすべての細胞株において相対的に低いレベルで発現しているようであった。中程度のレベルのCAR発現が9個の系統のうちの7個において明らかであり、一方、非常に小さいレベルのα2β1発現がこれらの乳ガン細胞株のうちの8個の表面に存在した図1。2.2.選択されたエンテロウイルスによる乳ガン細胞の腫瘍崩壊溶解感染性アッセイが、選択されたエンテロウイルス群CAV21、CVB3、EV1、EV7およびPV1に対するそれらの感受性を明らかにするために、9個すべての乳ガン細胞株に対して行われた図2。細胞株は、1ミリリットルあたり50パーセント終点での組織培養感染用量TCID50/mlが104以上であると計算された場合、腫瘍崩壊を非常に受けやすいと見なされた。CAV21およびCVB3は9個の乳ガン細胞株のうちの6個において著しい溶解を誘導した。一般に、乳ガン細胞は、EV1に対する相当の感受性を明らかにした1つの細胞株T47-Dを除いて、エコーウイルスEV1およびEV7による溶解感染に対する感受性がなかった。PV1は9個の乳ガン細胞株のうちの8個において実質的な腫瘍崩壊を引き起こした図2。2.3.結腸直腸ガン細胞の表面におけるエンテロウイルス受容体の発現4つの結腸直腸ガン細胞株HCT116、LIM2537、SW480およびSW620が、フローサイトメトリーによって、ICAM-1、CAR、α2β1およびDAFの発現について分析された。著しいレベルのICAM-1発現およびDAF発現がこれらの細胞株のうちの2つにおいて観測された。中程度のレベルのCARが4つすべての系統において発現しているようであり、一方、著しいレベルのα2β1発現は観測されなかった図3。2.4.選択されたエンテロウイルスによる結腸直腸ガン細胞の腫瘍崩壊CAV21、CVB3、EV1、EV7およびPV1が、4つすべての結腸直腸ガン細胞株において力価測定された。CVB3およびPV1による著しいレベルの腫瘍崩壊がこれらの細胞株のすべてにおいて観測された図4。しかしながら、CAV21により誘導される著しい細胞溶解が4つの細胞株のうちの1つLIM2573のみにおいて生じた。この細胞株は最大レベルのICAM-1発現を示した。α2β1の非常に低い発現レベルにもかかわらず、EV1はこれらの細胞株のうちの3つに溶解感染し、一方、すべての細胞がEV7感染に対して治療抵抗性があった。2.5.前立腺ガン細胞および膵臓ガン細胞の表面におけるエンテロウイルス受容体の発現DU145およびPC3を含む前立腺ガン細胞株、ならびに、AsPC-1およびPANC-1を含む膵臓ガン細胞株が、ICAM-1、DAF、CARおよびα2β1の発現について分析された。著しいレベルのICAM-1が両方の前立腺ガン細胞株および一方の膵臓ガン細胞株において発現していた。中程度のCAR発現およびDAF発現がこれらの細胞株の4つすべてにおいて見出され、一方、α2β1発現は非常に小さいようであった図5。2.6.前立腺ガン細胞および膵臓ガン細胞の腫瘍崩壊エンテロウイルスのCAV21、CVB3、EV1、EV7およびPV1に対する2つの前立腺ガン細胞株および2つの膵臓ガン細胞株の感受性が、マイクロタイタープレートでの溶解感染において調べられた。前立腺ガン細胞株は、DU145の場合、EV7を除くすべてのウイルスに対して感受性があった。PANC-1はCAV21およびPV1によって感染しただけであった。これに対して、もう一方の膵臓ガン細胞株AsPC-1は、EV7を除くすべてのウイルスによる腫瘍崩壊を示した図6。2.7.卵巣ガン細胞の表面におけるエンテロウイルス受容体の発現卵巣ガン細胞株が、エンテロウイルス受容体のICAM-1、CAR、DAFおよびα2β1の発現について調べられた。9個の細胞株がこの研究では含まれた:A2780、DOV13、IGROV-1、JAM、OVCA-429、OVHS-1、OWA-42、SKOV-3および2008。著しいレベルのICAM-1が9個の細胞株のうちの2個において発現し、一方、中程度のレベルのCAR発現が9個のうちの6個に存在した。DAFは、1個の卵巣ガン細胞株を除くすべてにおいて高レベル~中程度のレベルで発現していた。9個の卵巣ガン細胞株のうちの8個がα2β1の中程度のレベル~高レベルの発現を示し図7、さらなる卵巣ガン細胞株OVCAR-3は著しいレベルのα2β1を発現していたデータは示されず。2.8.卵巣ガン細胞株の腫瘍崩壊CAV21、CVB3、EV1、EV7およびPV1の腫瘍崩壊能力が9個の卵巣ガン細胞株のそれぞれにおいて評価された図8。CAV21の感受性が9個の細胞株のうちの2個において認められ、一方、CVB3は9個の細胞株のうちの7個において著しい溶解を生じさせた。卵巣ガンは、感染したとき、エコーウイルスに対して特に感受性があるようであり、EV7は9個のガン細胞株のうちの4個において死を生じさせ、EV1は10個の細胞株のうちの7個を著しく溶解させた図9a、図9bおよび図10。PV1に対する攻撃されやすさが9個すべての卵巣ガン細胞株にわたって明らかにされた。顕微鏡写真が、EV1に感染した10個すべての系統について撮影され図9aおよび図9b、そして、EV1を用いた10個の卵巣ガン細胞株のマイクロタイタープレートでの溶解感染もまた観測された図10。2.9.卵巣ガン細胞株に対するEV1の結合卵巣ガン細胞株はEV1による腫瘍崩壊を非常に受けやすかったので、EV1の細胞付着の性質を評価するためのさらなる研究が始められた。細胞を抗α2β1AK7モノクローナル抗体または抗DAFVIIIA7モノクローナル抗体のいずれかとプレインキュベーションし、その後、放射能標識されたEV1を加えて、EV1の宿主細胞結合におけるこれらの受容体の関与を明らかにした。EV1の結合は、試験された10個すべての細胞株において明らかであった。α2β1インテグリンを抗受容体抗体で阻止することによって、EV1の細胞付着が著しく阻害された。モノクローナル抗体VIIIA7を用いた細胞表面受容体DAFの阻止はEV1結合の著しい阻害を生じさせなかった図11。2.10.α2β1インテグリンの抗体阻止は卵巣ガン細胞株のEV1感染を阻害するEV1感染におけるα2β1の機能を評価するために、細胞単層物が抗α2β1AK7モノクローナル抗体とプレインキュベーションされた溶解アッセイが行われた。OWA-42およびIGROV-1の卵巣ガン細胞株が分析された。ウイルス感染後の72時間後、細胞単層物は、MAbによる阻止が存在しない場合、EV1の溶解感染に対して非常に感受性があった。α2β1インテグリンのMAb阻止の後では、細胞株における腫瘍崩壊は、EV1の最も低い希釈度においてさえ全く示されなかった図12。顕微鏡写真が、OWA-42細胞株の感染後の24時間、48時間および72時間において撮影された図13。2.11.非ガン性ヒト細胞はEV1感染に対する感受性がない実験が、ヒト繊維芽細胞にEV1を感染させることによって明らかにされる、EV1が非ガン性ヒト細胞に対して有する効果を調べるために行われた。簡単に記載すると、6ウエル組織培養プレートが組織培養環状インサートとともに準備され、DOV13細胞がリングの内側に置かれ、ヒト繊維芽細胞のHeLa細胞CSLオーストラリアから得られるがリングの外側に入れられ、これらは、コンフルエントな単層物が形成されるまで37°Cでインキュベーションされた。リングが除かれ、細胞に、37°Cで一晩、EV1を感染させた。生存細胞がクリスタルバイオレットのメタノール溶液で染色された。EV1が感染したとき、DOV13卵巣ガン細胞は溶解され、これに対して、HeLa細胞は健全なままであった図14。このことは、EV1に対する卵巣ガン細胞の特異的な感受性を明らかにしている。2.12.黒色腫細胞株SkMel28におけるα2β1の発現黒色腫皮膚のガンは、α2β1の発現をアップレギュレーションすることが知られている。黒色腫細胞株SkMel28が、フローサイトメトリーを使用して発現について調べられた。高レベルのα2β1発現が観測された。しかしながら、低いバックグラウンドレベルの結合がコントロールMAbによって示された図15。2.13.SkMel28に対するEV1の結合SkMel28細胞における表面発現のα2β1に対するEV1付着の性質をさらに調べるために、放射能標識されたウイルスの結合アッセイが行われた。放射能標識されたEV1はこの悪性黒色腫細胞株に著しく結合し、α2β1のMAb阻止は、結合したEV1の量を大幅に激減させた図16。2.14.EV1を用いたSkMel28の感染性アッセイ溶解感染性アッセイが、EV1感染に対するSkMel28の感受性を明らかにするために行われた。この悪性黒色腫細胞株は、EV1が感染したとき、中程度の腫瘍崩壊を示した。クリスタルバイオレット色素は、溶解感染を受けていない細胞によって吸収され、これに対して、染色されないウエルは細胞単層物の完全な溶解を表している図17。2.15.考察卵巣ガン細胞株は、EV1による溶解感染に対して非常に感受性があることが見出され、試験された10個の細胞株のうちの7個が著しい腫瘍崩壊を示した。卵巣ガン細胞株に対するEV1の結合についてのさらなる研究では、α2β1が、EV1によって使用される一次受容体であることが確認された。放射能標識された結合研究では、α2β1がウイルス結合のために要求されたことがさらに示され、MAb阻止アッセイでは、感受性の卵巣ガン細胞をα2β1モノクローナル抗体Mabと前処理することによって、EV1感染が完全に阻害されたことが明らかにされた。DAFMAbのVIIIA7もまた、DAFが、エンテロウイルスのCAV21およびCVB3に関して果たすようにEV1結合において役割を果しているかどうかを明らかにするために、陰性コントロール治療として結合アッセイにおいて使用された。EV1結合の著しい阻止は、抗DAFMAbの前処理によって生じなかった。卵巣ガン細胞をヒト繊維芽細胞と同時培養し、その後、EV1を感染させた場合、ヒト繊維芽細胞は、ウイルスが卵巣ガン細胞を特異的に溶解した環境においてさえ、EV1感染に対して感受性がないことが明らかにされた。黒色腫細胞株に対するEV1媒介による腫瘍崩壊の効果もまた調べられた。データからは、α2β1がSkMel28黒色腫細胞株の表面でアップレギュレーションされたこと、および、この細胞はEV1の溶解感染に対して感受性があったことが明らかにされた。卵巣ガン細胞に対するEV1の結合は、放射能標識された結合アッセイによって示されるように、α2β1相互作用を介してであることが示された。EV1感染について許容性があった残りのガン細胞株は結腸ガン細胞株であり、4つの細胞株のうちの3つが、2つの前立腺ガン細胞株と同様に、非常に感受性があった。これらのガンタイプはともに、卵巣ガン細胞と同じ細胞外マトリックスに遭遇することがあり、従って、腹膜表面に見出されるI型コラーゲンが多い細胞外マトリックスを通過する転移のとき、それらのα2β1発現をアップレギュレーションし得る。数多くの変化および/または改変が、広く記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態において示されるような発明に対してなされ得ることが当業者によって理解される。従って、本発明の実施形態は、すべての点で、限定的ではなく、例示であると見なされるべきである。実施例3:エコーウイルスEV2溶解感染の特異性3.1.EV1の相対的病原性新生物細胞に対して比較される非悪性卵巣細胞のインビトロ培養物に対するEV1の相対的な病原性が調べられた。ヒト乳頭腫ウイルス16E6-E7のオープンリーディングフレームを使用して不死化された正常なヒト卵巣表面上皮HOSE細胞Tsao,S.W.他、1995が、明細胞卵巣ガン腫株OVHS-1および未分化卵巣ガン腫細胞DOV13と一緒に、moi5.0~0.05TCID50/細胞まで及ぶ投入多重度のEV1で攻撃された。感染後48時間において、顕微鏡検査により、両方の卵巣ガン腫株の単層物における全体的な細胞破壊および細胞溶解が、細胞あたり0.05TCID50のEV1もの低いウイルス攻撃においてさえ、明らかにされた。対照的に、HOSE細胞の細胞形態学における検出可能な変化は、最も大きいウイルス攻撃用量においてさえ、観測されなかった。EV1感染の特異性を明らかにするさらなる努力において、正常な末梢血リンパ球PBLならびにOVHS-1細胞およびDOV13細胞がEV1で攻撃されたmoi=1.0。フローサイトメトリー分析により、PBL細胞調製物は表面α2β1をほとんど発現しておらず、一方、両方の卵巣ガン腫細胞株は高レベルのα2β1を発現していることが明らかにされた。PBLおよび卵巣ガン細胞の懸濁物のEV1媒介による細胞溶解が、LDHの放出を測定する細胞の標準的な細胞傷害性アッセイを使用することによって評価された。EV1攻撃は、EV1感染による卵巣培養物の細胞のほとんど完全な細胞溶解をもたらし、一方、バックグラウンドレベルの細胞溶解のみが、同じ負荷用量のEV1にさらされた後のPBLにおいて観測されただけであった。EV1が、検出可能な細胞溶解の非存在下でPBLにおいて増殖感染を開始させたかどうかを明らかにするために、また、バックグラウンドレベルの細胞溶解が非特異的であり、EV1感染により媒介されなかったことを確認するために、PBLおよび2つの卵巣ガン腫株の懸濁物は、EV1が接種されmoi=1.0、子孫ウイルスの産生についてモニターされた。2つの卵巣ガン細胞株OVHS-1およびDOV-13において、EV1力価が最初の細胞結合接種物よりも約104倍増大した。対照的に、子孫ウイルスは48時間のインキュベーションにわたってPBLによって産生されず、観測された感染性は、非特異的に結合した残存する投入接種物と一致した。実施例4:卵巣ガン細胞のエコーウイルスEV1溶解4.1.インビトロ培養された卵巣ガン細胞スフェロイドのEV1溶解卵巣ガン細胞の多くのインビトロ培養物は多次元的スフェロイドとして増殖することができるCasey,R.C.他、2001。多細胞スフェロイドは、進行した段階の卵巣ガン腫を有する患者の腹水に一般的に見出される多細胞の凝集物を刺激する。卵巣細胞の単層培養物はEV1による溶解感染を非常に受けやすいことが明らかにされているので、多卵巣ガン細胞スフェロイドをEV1で攻撃した。フローサイトメトリー分析により、OVHS-1細胞が単層形成またはスフェロイド形成のいずれかで成長したとしても、EV1細胞受容体α2β1の表面発現レベルが比較可能であったことが明らかにされた。EV1105TCID50が、スフェロイドを取り囲む半固体アガロース培地に投与され、スフェロイド形態学の顕微鏡写真画像がウイルス攻撃後の様々な間隔で得られた。図18は、コントロールの非感染スフェロイドが活発に増殖中であり、9日間のインキュベーション期間を通して体積の着実な増大をもたらしていることを示している。対照的に、EV1感染スフェロイドは、接種後の最初の7日の期間中、体積のわずかな減少を示し、著しい構造的解離および細胞破壊がその後の48時間にわたって生じた。データは、EV1が、最初の接種前スフェロイド体積すなわち、5×102細胞または5×103細胞にもかかわらず、スフェロイドの成長を遅らせることにおいて効果的であるガン性スフェロイド内の細胞溶解感染に対して増殖性細胞を開始させることを示している。4.2.ヒト卵巣ガンの腹水モデルに対するエコーウイルス1の効果転移性卵巣ガンの後期段階において、腫瘍細胞は腹膜腔の至るところに遊走し、かつ/または組織部位から離れてコロニーを形成する。EV1媒介の腫瘍崩壊が、腹膜卵巣ガンの進行した段階に対する効果的な治療であるかどうかを明らかにするために、ヒト卵巣ガン腫の異種移植片を有するSCIDマウス腹水症モデルが用いられた。SCIDマウスには、腹腔内経路によって、2×106個のOVHS-1細胞が、生EV1の投与の14日前に投与された。実験治療様式は、腹腔内経路により注入されたPBS、UV不活性化EV1または生EV1105TCID50のいずれかの1回の投薬からなった。卵巣ガン異種移植片を有さないマウスの体重変化に対する、様々な治療を受けているマウスの体重変化が、腹水症負荷の発症のマーカーとして使用された。治療後3週間目において、PBSまたはUV不活性化EV1が投与されたマウスは体重の著しい増大を示し、しかし、正常なマウスとEV1治療マウスとの間には差が観測されなかった。PBS群またはUV不活性化EV1群の体重は増大し続け、PI4週間目において、腹水の蓄積による実質的な腹部膨満がすべてのマウスにおいて明らかであったが、残りの治療群では明らかではなかった図19A。PI5週間目において、PBSおよびUV不活性化EV1に由来するすべてのマウスが過度の腹膜腹水症のために屠殺され、その一方で、検出可能な体重増大または腹水形成が、EV1治療マウスと、卵巣ガン異種移植片を有さない動物との間には観測されなかった図19B。この研究の経過期間中を通して、劇的な疾患発症の徴候は、ウイルス接種物の用量よりも10倍~100倍多い血清ウイルス負荷量が存在する場合でさえ、生EV1が注入されたマウスでは観測されなかったPI7日目~14日目において;データは示されず。4.3.考察複製可能なウイルスを使用するウイルス腫瘍崩壊法を成功するための主要な必要条件の1つは、新生物細胞に対する大きな好みのほかに、宿主に対する低いウイルス病原性である。本研究では、ヒト卵巣ガン細胞のインビトロ細胞培養物の溶解感染を誘導する代表的なヒトエコーウイルスの能力が評価された。黒色腫細胞について非常に腫瘍崩壊性があるにもかかわらず、CVA21、およびEV7のプロトタイプ株は、多数のヒト卵巣ガン細胞単層物において増殖性の溶解感染を誘導することにおいてEV1ほど強力ではなかった。モノクローナル抗体阻止研究により、卵巣ガン細胞のEV1媒介による溶解感染が、細胞表面に発現したインテグリンα2β1との特異的なウイルスキャプシド結合によって開始されたことが確認された。インテグリンα2β1はEV1およびコラーゲンの両方と同時に結合することができないので、卵巣ガン細胞のEV1溶解感染は迅速な細胞腫瘍崩壊を媒介するだけでなく、1型コラーゲンとインテグリンα2β1との間での相互作用を妨害することができ、それにより、腹膜表面の全域におけるガン細胞の散在を潜在的に低下させることができる。EV1攻撃による多細胞の三次元スフェロイドの破壊は、充実性卵巣腫瘍負荷のインビボ低下におけるEV1媒介による腫瘍崩壊の有用性を反映している。卵巣スフェロイドにおける個々の細胞は、単層形成における細胞よりも強固であるようであり、そのため、放射線および化学物質により誘導されるアポトーシスに対する高まった抵抗性を有するということFrankel,A.他、1997を考えると、EV1による卵巣スフェロイドのこの効率的な溶解は見事である。治療的な腫瘍崩壊性ウイルスは、悪性の細胞を標的化するための識別機構を有さなければならない。選択的なEV1媒介感染が、EV1は正常な上皮卵巣細胞株および末梢血リンパ球PBLの劇的な細胞溶解を誘導することができないことによって強調された。高力価の子孫ウイルスが、PBLの懸濁物からではなく、卵巣ガン細胞から産生することは、非新生物細胞に対するEV1感染の特異性および低い病原性の性質を補強している。卵巣ガン腫に加えて、悪性の黒色腫細胞もまた、アップレギュレーションされたレベルの表面インテグリンα2β1を発現し、それにより、悪性の黒色腫細胞をEV1攻撃に対して感受性にしている。ちょっとした逆説において、卵巣ガン細胞のEV1感染は、黒色腫細胞におけるCVA21に対する細胞標的化受容体であるICAM-1の増大した表面発現を誘導するPietiainen,V.他、2000。従って、生EV1および生CVA21の両方を含有する治療用調製物による卵巣ガンおよび/または黒色腫の悪性腫瘍の攻撃は、より強力な腫瘍崩壊感染をもたらし得る。EV1の腹腔内投与は、SCIDマウスの腹膜腔における卵巣腫瘍異種移植片の発達を抑制することにおいて非常に効果的であった。生EV1が注入されたマウスはすべてが、卵巣ガン異種移植片が注入されていないマウスと比較して増大した体重増加を示さず、また、検出可能な腹膜腹水の発達を示さなかった。新生物性卵巣細胞のインビボ溶解感染によって生じた子孫EV1が、PI7日目にマウスの血液において検出されたデータは示されず。ウイルス血症EV1は、散らばった疾患を抑えるための魅力的なリザーバーと見なすことができ、そして、有意なレベル約106TCID50でのその検出はまた、105TCID50のウイルス投入用量が、腫瘍崩壊能を維持しながら著しく減少させられ得ることを示している。卵巣ガン異種移植片を有さないマウスにおいてウイルス血症EV1をPI7日目に検出できないことデータは示されずは、感受性の新生物細胞が存在しない場合、EV1は全身循環から迅速かつ効果的に排除されつつあることを示唆している。全体として、これらの結果は、EV1による腫瘍崩壊治療が、腹膜卵巣ガンを抑えるためにインビトロおよびインビボにおいて非常に効果的であることを強調している。比較的非浸襲性のEV1治療の使用は、混合化学療法が後に続く外科的減量化を伴う現行の治療様式に対する魅力的な代替法として見なすことができる。EV1治療はまた、手術手技の間に放出された新生物細胞の標的化および破壊に集中する腫瘍減量化手術後の補助治療として用いることができる。EV1腫瘍崩壊治療はまた、高レベルのインテグリンα2β1を発現する他のヒト悪性腫瘍の治療における新規な治療法として使用することができる。その上、EV1およびEV8はインテグリンα2β1上の同じ結合エピトープについて競合するので、EV8は、卵巣ガン腫細胞の迅速な溶解感染を誘導するためのEV1に対する代わりの選択となり得る。2つの別個のウイルス血清型が利用できることにより、最初のウイルス投与の結果として生じた保護免疫応答とは無関係に、インテグリンα2β1の標的化による卵巣ガン腫の逐次攻撃が可能になる。EV1に対する強力な抗エンテロウイルス薬プレコナリルが利用できることPevear,D.C.他、1999は、非特異的なウイルス複製および散らばったウイルス子孫の直接的な抑制をもたらすので、この治療の魅力をさらに高める。プレコナリルとEV1との間での潜在的な相乗作用はまた、非常に大きいウイルス投入多重度の全身注入、それに続く、ウイルスが悪性の細胞を標的化し、その溶解感染を開始した直後における遊離ウイルスを不活性化するためのプレコナリルの投与を可能にし得る。数多くの変化および/または改変が、広く記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態において示されるような発明に対してなされ得ることが当業者によって理解される。従って、本発明の実施形態は、すべての点で、限定的ではなく、例示であると見なされるべきである。"