"患者の心臓病の治療に使用するためのアデノウイルスベクター注射製剤の製造における、血管形成性タンパク若しくはペプチドをコードするトランスジーンを含む複製欠損アデノウイルスベクターの使用であって、前記心臓病の治療は、前記アデノウイルスベクター注射製剤を、1又は複数の冠状動脈中への冠状動脈内注射によって患者の管腔中に投与し、前記トランスジーンを心筋内で発現させることを含む使用。前記治療が、冠状側副血管発達を促進する、請求項1に記載の使用。前記患者が、心筋虚血を有している、請求項1または2に記載の使用。前記治療が、患者の心臓における収縮機能を増加させる、請求項1~3のいずれか1項に記載の使用。前記治療が、心臓の壁肥厚率を増加させる、請求項4に記載の使用。前記治療が、患者の心臓内の血流を増加させる、請求項1~5のいずれか1項に記載の使用。前記治療が、心筋内の血流を増加させる、請求項6に記載の使用。前記患者が、アテローム性動脈硬化を有する、請求項1~7のいずれか1項に記載の使用。前記患者がヒトである、請求項1~8のいずれか1項に記載の使用。前記冠状動脈内注射を、右冠状動脈の管腔内に、又は左冠状動脈の管腔内に行なう、請求項1~9のいずれか1項に記載の使用。前記冠状動脈内注射を、少なくとも2つの冠状動脈の管腔内に行なう、請求項1~10のいずれか1項に記載の使用。前記冠状動脈内注射を、右冠状動脈の少なくとも1つ、および左冠状動脈の少なくとも1つに行なう、請求項11に記載の使用。前記ベクターの供給が、さらに心筋に血液を供給する伏在静脈グラフトおよびまたは内部乳房動脈グラフトの管腔内への注射を含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の使用。前記冠状動脈内注射が、1または複数の冠状動脈に導入されたカテーテルから行なわれる、請求項1~13のいずれか1項に記載の使用。前記カテーテルが、前記冠状動脈内注射に先立ち、1または複数の冠状動脈の管腔内へ少なくとも1cm導入されている、請求項14に記載の使用。前記トランスジーンの発現が、ベクターに含有されるCMVプロモータまたはベクターに含有される組織特異性プロモータによって誘導される、請求項1~15のいずれか1項に記載の使用。前記組織特異性プロモータが、心室筋細胞特異性プロモータである、請求項16の使用。前記心室筋細胞特異性プロモータが、心室ミオシン軽鎖-2プロモータの配列を有する、請求項17の使用。前記心室筋細胞特異性プロモータが、ミオシン重鎖プロモータの配列を有する、請求項17に記載の使用。前記トランスジーンの発現が主に心臓内で起こる、請求項1~19のいずれか1項に記載の使用。前記トランスジーンの発現が主に心筋内で起こる、請求項20に記載の使用。前記トランスジーンの発現が主に心筋細胞内で起こる、請求項21に記載の使用。末梢欠損血管病を有する患者の血管形成を促進するためのアデノウイルスベクター注射製剤の製造における、血管形成タンパク若しくはペプチドをコードするトランスジーンを含む複製欠損アデノウイルスベクターの使用であって、前記血管形成の促進は、片方または両方の大腿動脈中へ直接大腿動脈内注射を行なうことにより、前記ベクターを患者の末梢血管系に供給し、前記トランスジーンを前記末梢血管系で発現させることを含む使用。前記ベクターが、107~1013アデノウイルスベクター粒子を含有する1単位用量である、請求項1~23のいずれか1項に記載の使用。前記ベクターが、109~1012アデノウイルスベクター粒子を含有する1単位用量である、請求項24に記載の使用。前記ベクターが、1011アデノウイルスベクター粒子を含有する1単位用量である、請求項25に記載の使用。前記血管形成タンパク若しくはペプチドが繊維芽細胞成長因子FGFである、請求項1~26のいずれか1項に記載の使用。前記血管形成タンパク若しくはペプチドがFGF-5である、請求項27に記載の使用。前記血管形成タンパク若しくはペプチドが酸性FGFである、請求項27に記載の使用。前記血管形成タンパク若しくはペプチドが塩基性FGFである、請求項27に記載の使用。前記血管形成タンパク若しくはペプチドが血管内皮成長因子である、請求項1~26のいずれか1項に記載の使用。前記血管形成タンパク若しくはペプチドがシグナルペプチドを含有する、請求項1~31のいずれか1項に記載の使用。以下説明する本発明は、従来技術に伴うこれらおよび他の問題を対処すると共に解消する。発明の要点本発明は心臓病好ましくは心筋虚血および末梢血管病の処置に有用な遺伝子療法に向けられる。本発明の1目的は、血管形成性蛋白もしくはペプチド好ましくはFGF-5が心筋にて治療上顕著な程度まで連続的に持続期間にわたり産生される心臓病を処置する方法を提供し、この方法は前記血管形成性蛋白もしくはペプチドのための遺伝子を含有するベクター構築物好ましくは複製欠損アデノウィルス構築物を冠状動脈内注射により、好ましくは一方もしくは両方の冠状動脈または1本もしくはそれ以上の伏在静脈または内部乳房動脈移植物の小孔を越えて相当深く典型的には少なくとも約1cm導入されたカテーテルにより心臓を標的とする。他面において本発明は心筋虚血を有する患者にて心臓病を処置する方法であり、トランスジーン挿入された複製欠損アデノウィルスベクターを冠状動脈内注射、好ましくはベクターの1回の注射を一方もしくは両方の冠状動脈または移植物に直接行って患者の心筋に供給することにより、罹患した心筋に心臓筋細胞をトランスフェクトし、前記ベクターはたとえばFGF-5、aFGF、bFGFもしくはVEGF血管内皮成長因子のような血管形成性蛋白もしくはペプチドをコードするトランスジーンを含み、このトランスジーンを心臓で発現させることにより、罹患した心筋の領域にて血管形成を促進することからなっている。野生型ウィルスを含まないベクターストックを一方もしくは両方の冠状動脈または移植物の管腔中に、好ましくは右側および左側の両冠状動脈または移植物に、好ましくは光学密度測定により測定して107~1013個のウィルス粒子の量にてより好ましくは109~1011個のウィルス粒子を注射することにより、所望個数の細胞特に心臓筋細胞を罹患した心筋にて血管形成性蛋白もしくはペプチドコード遺伝子で局部的にトランスフェクトし、これにより遺伝子転移の治療効果を最大化させると共に心臓外部位における望ましくない血管形成およびウィルス蛋白に対する炎症反応の可能性を最小化させることができる。たとえば心室筋細胞特異性プロモータを使用すれば、このプロモータは心臓筋細胞に制限された発現を一層確実に可能にして、たとえば網膜のような非心臓組織における血管形成の極めて有害な作用を回避することができる。他面において本発明は濾過されたアデノウィルスベクター注射製剤を提供し、この製剤は好ましくは107~1013個のウィルス粒子の最終ウィルスタイターにてレコンビナントアデノウィルスベクターを含み、このベクターは野生型ウィルスを含まず、しかも複製競合性を付与する1種もしくはそれ以上の所要のアデノウィルス遺伝子たとえばE1A/E1B遺伝子が欠失している部分アデノウィルス配列と、たとえば血管形成性aFGF、bFGFおよびVEGFのような血管形成性蛋白もしくはペプチドをコードするトランスジーンこれは部分アデノウィルス配列に整列したプロモータにより促進されると、医薬上許容しうるキャリヤとで構成される。このアデノウィルスベクター注射製剤を使用することにより、臨床的心筋虚血もしくは末梢血管病の処置に有効なアデノウィルス媒介FGF-5遺伝子転移を何ら望ましくない作用なしに行うことができる。他面において本発明は、心筋にて血管形成性蛋白もしくはペプチドをinvivoで発現しうるレコンビナントベクターを含有するウィルスストックの製造方法をも提供し、この方法は好ましくはたとえばFGF-5、aFGF、bFGFおよびVEGFのような血管形成性蛋白もしくはペプチドをコードするトランスジーンを、プロモータとヒトアデノウィルス5ゲノムの左末端の部分アデノウィルス配列これからは複製競合性を付与する1個もしくはそれ以上の所要のアデノウィルス遺伝子、たとえばE1A/E1B遺伝子が欠失しているに整列したポリリンカーとを含有するプラスミドにクローン化させ;前記プラスミドを欠失複製要求性遺伝子でトランスフォームされた哺乳動物細胞に同時トランスフェクトすると共にプラスミドは、全ヒトアデノウィルス5ゲノムと包封するにはプラスミドを大き過ぎるようにする追加挿入部とを有し、これによりトランスジーン挿入されたプラスミドと全アデノウィルスゲノムを有するプラスミドとの間でレスキュー組換を生ぜしめて複製要求性遺伝子なしにトランスジーンを含むレコンビナントゲノムを形成させ、ここで、前記レコンビナントゲノムは包封されるよう充分小さく;細胞培養物にて良好なレコンビナントを同定し;得られたレコンビナントを不在複製-要求性遺伝子でトランスフォームされた哺乳動物細胞にて増殖させ;増殖したレコンビナントを精製して野生型ウィルスなしにレコンビナントベクターを含有するようにし;精製されたベクターをフィルタ、好ましくは0.1~0.5μmフィルタ、より好ましくは0.3μmフィルタに通過させる各工程を含む。さらに他面において、血管形成性ペプチドもしくは蛋白を発現するレコンビナントアデノウィルスは大腿動脈の近位部分にカテーテルにより供給され、これにより大腿動脈からの血流を受け入れる骨格筋の細胞へ遺伝子転移を行う。これは血管形成刺激を与えて、脚部の骨格筋における血管形成をもたらすと共に末梢血管病すなわち脚の筋肉に対す不充分な血液供給を特徴とする病気の処置として役立つ。さらに他面において、心臓および脚部の他に本発明は他の器官もしくは組織を標的にして所望の器官もしくは組織への部位指向の遺伝子転移をもたらすアデノウィルス媒介のトランスジーン供給および発現をも可能にする。したがって本発明は、特定動脈により給血される任意の組織もしくは器官に向けられたアデノウィルス媒介の遺伝子転移を包含する。たとえばトランスジーン含有アデノウィルスをたとえば腎臓に給血する1本もしくはそれ以上の腎臓動脈または肝臓の肝動脈など所望の動脈における管腔中へ深く注射たとえば約1cmして供給することにより、これら器官に制限された遺伝子転移を行うことができる。この種の手法は血管形成、器官もしくは組織特異性腫瘍の処置、遺伝代謝病の処置などを含め多くの用途に用いることができる。注射の深さは標的器官もしくは組織、患者の動脈解剖構造および当業界で知られた他の因子に応じて変化することができる。好ましくは注射の深さおよび位置はレコンビナントアデノウィルスの局部的であるが全身的でない供給を可能にするよう選択される。当業者はこの種の深さを不当な実験なしに決定することができる。発明の詳細な説明血管形成性蛋白もしくはペプチドをコードするトランスジーン本発明においては、心臓の虚血領域または末梢血管病の場合は骨格筋に対する心筋血流を向上させうる各種の蛋白もしくはペプチド成長因子を使用することができる。発現させるべき血管形成性蛋白もしくはペプチドとしては、たとえばaFGF、bFGFおよびFGF-5のような血管形成性蛋白もしくはペプチドを例示することができる。FGF群の血管形成活性は合理的には蛋白輸液の設定にて良好に確認される。VEGF血管内皮成長因子のための遺伝子、すなわち新たな血管成長の有力な刺激剤も使用することができる。遺伝子転移手法を成功させるには、遺伝子産生物の合成およびトランスフェクト細胞からの分泌の両者を必要とする。この観点からFGF-5をコードする遺伝子が好適であり、好ましくはシグナルペプチドをコードして発現された際に遺伝子産生物が心臓もしくは骨格筋の間質にアクセスすると共に血管形成を誘発するよう指令する配列を含むよう選択される。ヘルパー独立性の複製欠損ヒトアデノウィルス5系一般に、興味ある遺伝子を心臓筋細胞および骨格筋細胞を含む心臓または骨格筋までinvivoにて転移させ、コードされた蛋白の構成的産生を指令する。数種の異なる遺伝子転移手法が可能である。好適なものはヘルパー非依存性の複製欠損ヒトアデノウィルス5系である。この系を用いて、本出願人等は1回の冠状動脈内注射により心筋細胞の60より高いトランスフェクションをinvivoにて示した。非複製レコンビナントアデノウィルスベクターが、冠状動脈内皮および心臓筋細胞をトランスフェクトして冠状動脈内注射の後に極めて効率的なトランスフェクションをもたらすのに特に有用である。同じことが末梢血管系の所望細胞をトランスフェクトする際にも言える。ヒトアデノウィルス5に基づくレコンビナントアデノウィルスベクターは、アデノウィルスゲノム一般にE1A/E1Bから必須早期遺伝子を喪失し、したがってこの喪失遺伝子産生物を許容細胞株で増殖させなければ複製することができない。喪失アデノウィルスゲノム配列の代わりに、興味あるトランスジーンをクローン化させると共に複製欠損アデノウィルスで感染された組織/細胞にて発現させることができる。アデノウィルスに基づく遺伝子転移は宿主ゲノムへのトランスジーンの組込みを与えず0.1未満のアデノウィルス媒介トランスフェクションは宿主DNAへのトランスジーン組み込みをもたらす、したがって安定でないが、アデノウィルスベクターは高タイターで増殖して非複製細胞をトランスフェクトすることができる。トランスジーンは娘細胞まで移行しないが、これは分裂しない成体骨格筋および心臓筋細胞への遺伝子転移につき許容しうる。レトロウィルスベクターは安定な遺伝子転移を与え、高タイターがレトロウィルスプソイドタイピングにより得られる90803380371993。ただし現在のレトロウィルスベクターは非複製細胞成体骨格筋および心臓筋細胞を効率的にトランスジデースすることができない。さらに、宿主DNAへのトランスジーン組込みの強力な被害は短期間の遺伝子転移が充分であれば保証されない。実際に、血管形成性蛋白の制限された時間的発現は実質的な血管形成につき充分であり、心臓血管病および末梢血管病の各過程に関する一時的な遺伝子転移にて治療上充分であることが突き止められた。アデノウィルスE1A/E1B遺伝子でトランスフォームされたヒト胎児腎細胞であるヒト293細胞は有用な許容細胞ラインの典型例である。しかしながら、複製欠損アデノウィルスベクターを増殖させうる他の細胞株、たとえばHeLa細胞も使用することができる。レコンビナントアデノウィルスベクターの作成本発明で使用するアデノウィルスベクターは全て刊行物に記載されたレスキュー組換技術によって作製することができる。要するに、興味あるトランスジーンをプロモータとポリリンカーとE1A/E1B遺伝子が欠失している部分整列アデノウィルス配列とを有するシャトルベクターにクローン化させる。シャトルベクターとしては、ヒトアデノウィルス5ゲノムの左側末端の部分からウィルス複製に必須であるE1AおよびE1B配列をコードする早期蛋白をマイナスした部分をコードするプラスミドpAC1を例示することができる。プラスミドpAC1もしくはACCMVPLPAの使用はクローニング過程を容易化させる。次いでシャトルベクターを、包封するには大き過ぎる長さを持った全ヒトアデノウィルス5ゲノムを含むプラスミドと共に293細胞中へ同時トランスフェクトさせる。同時トランスフェクションは燐酸カルシウム沈澱またはリポフェクションによって行うことができる。プラスミドJM17は全ヒトアデノウィルス5ゲノムアンピシリン耐性のための遺伝子を含むベクターpBR322の部分4.3kbをコードする。JM17は成熟ウィルス粒子を作成するのに必要な全てのアデノウィルス蛋白をコードするが、包封するには大き過ぎる40kb対野生型の36kb。少ない種類の同時トランスフェクト細胞にて、たとえばプラスミドpAC1のようなシャトルベクターを含むトランスジーンと、たとえばプラスミドpJM17のような全アデノウィルス5ゲノムを有するプラスミドとの間のレスキュー組換は、E1A/E1B配列が欠損すると共に興味あるトランスジーンを有するが二次的にたとえば組換に際しpBR322配列のような追加配列を喪失して包封するのに充分小さくなるようなレコンビナントゲノムを与える第1図参照。上記方法に関し、本出願人等は成功した結果を報告した。アデノウィルスHCMVSP1lacZをコードするCMV促進されたβ-ガラクトシダーゼを使用して、X-gal処理により遺伝子転移の効率を評価することができる。遺伝子転移の初期方式は上記したようなアデノウィルスベクターを使用する。これらベクターの利点は、高効率の遺伝子転移invivoにてトランスフェクトされた標的器官細胞の60以上を行う能力、高タイターのウィルスストックを得る容易さ、およびたとえば分裂しない心臓筋細胞のような細胞への遺伝子転移を行うこれらベクターの能力を包含する。組織特性プロモータさらに本発明は、たとえば冠状動脈もしくは大腿動脈へトランスジーンを供給することを目標とする細胞の使用だけでなく、組織特異性プロモータの使用をも包含する。たとえば左側心室ミオシン軽鎖-2MLC2vもしくはミオシン重鎖MHCの組織特異性転写制御配列をたとえばアデノウィルス構築物におけるFGF-5遺伝子のようなトランスジーンに融合させることにより、トランスジーン発現を心室心臓筋細胞に制限する。遺伝子発現の効果、並びにlacZでMLC2vおよびMHCプロモータにより示される特異性の程度を、本発明のレコンビナントアデノウィルス系を用いて決定した。心臓特異性発現はリー等により従来報告されている。MLC2vプロモータは250bpからなり、アデノウィルス-5パッキング範囲内に容易に適合する。転写の強力プロモータであることが知られたミオシン重鎖プロモータは合理的な代案の心臓特異性プロモータを与え、300bp未満からなっている。極めて効果的かつ充分小さい、たとえばトロポニン-Cプロモータのような他のプロモータは充分な組織特異性を欠如する。MLC2vもしくはMHCプロモータを使用すると共にトランスジーンをinvivoで供給することにより、心臓筋細胞単独すなわち内皮細胞、平滑筋細胞および心臓内の繊維芽細胞における同時発現を伴わないはたとえばFGF-5のような血管形成性蛋白の充分な発現を与えて血管形成を促進すると思われる。心臓筋細胞に発現を制限することも、臨床的心筋虚血を処置すべく遺伝子転移の有用性に関し利点を有する。発現を心臓に限定することにより、たとえば網膜のような非心臓組織における血管形成の強力な有害作用が回避される。さらに、心臓における細胞のうち、筋細胞は細胞が急速ターンオーバーを受けないので最長のトランスジーン発現を与えると思われ、したがって発現は内皮細胞で生ずるような細胞分裂および死滅によって減少しない。内皮特異性プロモータはこの目的で既に入手しうる。本発明においては、心臓病の処置に関し高タイターのベクターを冠状動脈内注射して心臓を目標にすると共に、全細胞種類をトランスフェクトすることが現在好適である。アデノウィルスベクターの増殖および精製好適なレコンビナントベクターは標準的方法により精製されたプラークとすることができる。得られるウィルスベクターを、intransでE1AおよびE1B機能を与える293細胞において、好適には1010~1012個のウィルス粒子/mL範囲のタイターまで増殖させる。細胞を80融合にて感染させ、48時間後に回収することができる。3回の凍結-解凍サイクルの後、細胞残骸を遠心分離によりペレット化させ、ウィルスをCsCl濃度勾配超遠心分離二重CsCl濃度勾配超遠心分離が好適であるにより精製する。invivo注射に先立ち、ウィルスストックをたとえばG25セファデックスのようなセファロースカラムでのゲル濾過によって脱塩する。次いで生成物を0.3μmフィルタで濾過することにより、未濾過ウィルスの冠状動脈内注射の悪作用生命に危険な心臓不整脈を減少させると共に、効率的な遺伝子転移を促進させる。得られるウィルスストックは1010~1012個ウィルス粒子/mLの範囲の最終ウィルスタイターを有する。レコンビナントアデノウィルスは野生型強力な複製性ウィルスを含まないよう高度に精製せねばならない。不純な構築物は宿主動物にて強力な免疫反応をもたらしうる。この観点から、増殖および精製は、たとえば適するプライマーを用いるPCRで良好なレコンビナントを同定し、2回のプラーク精製と二重CsCl濃度勾配超遠心分離とを行うことにより、夾雑物と野生型ウィルスとを排除するよう行うことができる。さらに、患者へのアデノウィルスベクター注射により誘発される心臓不整脈に伴う問題は、冠状動脈内注射に先立つ適する寸法のフィルタによるレコンビナントアデノウィルスの濾過により回避することができる。この手法は遺伝子転移および発現をも相当に向上させると思われる。レコンビナントアデノウィルスベクターの供給ウィルスストックは、たとえば塩水のような医薬上許容しうるキャリヤを必要に応じ含有する注射製剤の形態とすることができる。注射製剤におけるベクターの最終タイターは好ましくは、効果的な遺伝子転移を可能にする107~1013個のウィルス粒子の範囲である。他の医薬キャリヤ、処方および投与量につき以下説明する。アデノウィルストランスジーン構築物は、X線透視検査指針の下で標準的な経皮カテーテルに基づく方法を用い、極めて効果的な療法を可能にする程度までトランスジーンを発現させるのに充分な量にて、直接に冠状動脈内または移植血管注射によって心筋に供給される。注射は冠状動脈または移植血管の管腔内へ深く動脈管腔内の約1cm行うべきであり、好ましくは両冠状動脈にて行うべきである。何故なら、側副血管の成長は個々の患者にて極めて変動しうるからである。この物質を冠状動脈カテーテルにより冠状動脈の管腔中へ直接に注入することにより、遺伝子をかなり効果的に標的としかつ注射に際し近位動脈に対するレコンビナントベクターの損失を最少化させることができる。このように供給されると遺伝子発現は肝細胞では生ぜず、ウィルスRNAは冠状動脈内注射後の任意の時点で尿中に見出しえないことが判明した。たとえば任意の種類の冠状動脈カテーテルまたはスタック輸液カテーテルを本発明で使用することができる。さらに、当業者に知られた他の技術を動脈壁への遺伝子の転移につき使用することができる。末梢血管病、すなわち脚部への不充分な血液供給を特徴とする病気の処置には、血管形成性ペプチドもしくは蛋白を発現するレコンビナントアデノウィルスを大腿動脈の近位部分に挿入されるカテーテルによって供給し、これにより大腿動脈から血流を受ける骨格筋の細胞に遺伝子転移を行う。これは血管形成刺激を与えて、脚部の骨格筋における血管形成をもたらす。他の器官-もしくは組織-特異性の病気の処置には、治療ペプチドもしくは蛋白たとえば血管形成性ペプチドもしくは蛋白を発現するレコンビナントアデノウィルスを器官もしくは組織給血動脈の近位部分に充分深く挿入されるカテーテルなどの装置によって供給し、遺伝子転移を標記器官もしくは組織の細胞にのみ実質的に行う。心筋虚血の動物モデル遺伝子療法に関する満足な研究のための重要な前提は、a臨床心筋虚血に適用して心筋虚血の設定における血管形成のメカニズムに関する有用なデータを与えうる動物モデルの構成、並びにb遺伝子転移の効果の正確な評価である。この観点から、従来技術はいずれも満足しえない。本発明は臨床的冠状動脈病に類似した心筋虚血症のブタのモデルを利用した。左側回旋LCx冠状動脈の周囲にアメロイド収縮器を設置して、最小の梗塞で徐々に完全閉鎖させる設置の7日以内左心室の1、LCxベッドの4±1。心筋機能および血流は側副血管発達に基づき閉塞動脈虚血領域と称するにより予め灌流された領域にて休息/時に正常であるが、血流保持は心筋酸素要求が増大すると虚血を防止するのに不充分となる。したがってLCxベッドは臨床的狭心症に類似した重症虚血を受ける。側副血管発達および血流機能の関係はアメロイド設置の21日以内にて安定であって、4か月にわたり不変化に留まる。動物が重症ベッドにて期間虚血機能不全を1日中有して、輸血の際の心搏数の上昇の阻止、人員による輸血中断などに関連すること未公開データが遠隔測定により示されている。すなわちモデルは安定であるが不充分な側副血管を持ったベッドを有し、期間性虚血を受ける。モデルの他の明確な利点は、異常に灌流されて機能する領域LCxベッドに隣接した正常に灌流されて機能する領域LADベッドが存在して、各動物内に比較ベッドを与える点である。心筋コントラスト超音波心臓検査技術を用いて領域的心筋灌流を推定した。コントラスト材料はガラクトースの微小凝集物で構成し、画像の超音波度白色度を増大させる。微小凝集体は血流に比例するよう冠状動脈および心筋壁に分配される。コントラストのピーク強度は、微小球により測定される心筋血流と密接に相関することが示されている[SkybaetalCirculation90151315211994。本発明で使用した超音波心臓検査画像がLCxベッドを正確に同定し、しかも心筋コントラスト超音波心臓検査技術を用いて心筋血流を評価しうることを示すため、液圧カフオクルーダをアメロイドに隣接する近位LCxの周囲に設置した。本発明の研究では、動物を殺す際に心臓を灌流固定グルタルアルデヒド、生理学的圧力、insituして、顕微鏡により毛管成長を定量した。PCRを用いて、遺伝子転移を受けた動物からの心筋における血管形成性蛋白、DNAおよびmRNAを検出した。さらに下記するように、遺伝子転移の2週間後、5匹全部のlacZ-感染動物からの心筋試料は組織学的検査にて実質的なβ-ガラクトシダーゼ活性を示す。最後に、血管形成性蛋白に対するポリクローナル抗体を使用して、遺伝子転移を受けた動物からの細胞および心筋における血管形成性蛋白発現を示した。治療研究の手法はトランスジーン供給のタイミング、トランスジーンの投与ルート、および血管形成性遺伝子の選択を含んだ。心筋虚血のアメロイドモデルにおいて、遺伝子転移は安定であるが不充分な側副血管が発達した後に行った。アメロイドモデルを用いる事前の研究は、虚血および側副血管の発生前にアメロイドの閉鎖に際し血管形成性ペプチドを供給することを含んだ。しかしながら、この手法は幾つかの理由で用いなかった。第1に、事前の研究は進行中の心筋虚血の設定にて遺伝子転移が示されるような臨床的心筋虚血の処置に存在する条件を正確に再現するには適しておらず、事前の研究は虚血の予測にてペプチドを供給することに類似し、したがって適切でない。第2に、細胞培養における事前の研究に基づき、ペプチドに関する虚血刺激は血管形成の刺激につき最適な環境であると思われた。これは、心筋虚血が既に存在する時点でトランスジーンを供給して最適に達成することができた。これら判定に連携して、トランスジーン供給を達成する方法を選択した。この技術をその後の冠状動脈病を有する患者の処置に適用すべき範囲は幾つかの手段を不適切にした冠状動脈中へのペプチドの連続的灌流、心臓への直接的プラスミド注入、長期間の徐放をもたらすペプチドを含有した樹脂による心臓の被覆。最後に、ブタモデルは遺伝子供給の前後に領域的血流および機能を追跡する優秀な手段を与えた。同じレコンビナントアデノウィルス構築物を受けたがレポータ遺伝子を有する比較動物の使用をこれら研究の比較とした。当業者が理解するように、ブタにおける下記する結果はヒトにおける結果を予測させる。ブタはヒトに極めて類似した天然の冠状動脈循環系を有し、これは天然の冠状側副血管の不存在を含む。治療用途本発明の複製欠損レコンビナントアデノウィルスベクターは、遺伝子発現の領域にて細胞病理作用もしくは炎症なしにinvivoでの極めて効率的な遺伝子転移を可能にする。これら結果に基づき、下記の実施例でさらに説明するように、invivoの機能変化を行うのに充分な高程度のinvivo遺伝子転移が達成されることが判る。心臓病を処置する場合、冠状動脈内注射による血管形成性蛋白の遺伝子転移は血管形成を促進する。すなわち、虚血の処置は初期の虚血現象が観察された後に行うことができる。さらに、遺伝子転移の後に毛管数と血流と機能とが虚血領域にて増大する。これら技術の使用は臨床的に、特に最初に手術不能の冠状動脈病および不能状態の狭心症を有する患者にて極めて有用である。本発明のデータは、ヒブロブラスト成長因子-5FGF-5を発現するレコンビナントアデノウィルスの遺伝子転移が心筋虚血を実質的に減少させるのに有効であることを示す。本発明の組成物もしくは産生物は便利には冠状動脈内投与に適する組成物として提供することができる。適する投与方式は個々の患者の担当医により最も良く決定することができる。適する医薬上許容しうるキャリヤおよびその処方は標準的処方慣行、たとえばレミントンファーマスーチカルサイエンスに記載されている。本発明のベクターは好ましくは中性pH、たとえば約pH6.5~約pH8.5、より好ましくは約pH7~8における溶液にて賦形薬と共に処方して溶液をほぼ等張性にすべきであり、たとえば4.5のマニトールもしくは0.9の塩化ナトリウムとし、pHを公知の緩衝溶液、たとえば燐酸ナトリウム一般に安全と見られるで緩衝すると共に許容保存料、たとえばメタクレゾール0.1~0.75、より好ましくは0.15~0.4のメタクレゾールを含ませる。所望の等張性は塩化ナトリウムまたは他の医薬上許容しうる薬剤、たとえばデキストロース、硼酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、ポリオールたとえばマニトールおよびソルビトール或いは他の無機もしくは有機溶解質を用いて達成することができる。塩化ナトリウムが、特にナトリウムイオンを含有する緩衝液につき好適である。所望ならば、上記組成物の溶液を使用寿命および安定性を増大させるべく作製することもできる。本発明の治療上有用な組成物は、一般的に認められた手法にしたがい各成分を混合して作成される。たとえば選択された各成分を混合して濃厚混合物を作成し、次いでこれを水および/またはpHを調節する緩衝液または緊張度を調節する追加溶解質の添加により最終的濃度および粘度に調整することができる。医者による使用のため、組成物は1回もしくは複数回の投与にて選択レベルで血管形成を誘発するのに有効である量の本発明によるベクターを含有した投与形態物で提供される。当業者には了解されるように、治療剤の有効量は患者の年令および体重、患者の身体状態および獲得すべき血管形成のレベルおよび他の因子を含む多くの因子と共に変化する。本発明による化合物の有効投与量は典型的には少なくとも約107個のウィルス粒子、好ましくは約109個のウィルス粒子、より好ましくは約1011個のウィルス粒子の範囲である。ウィルス粒子の個数は1013としうるが、好ましくは1013を越えない。注目されるように、投与すべき正確な量は担当医により決定されるが、好ましくは1mLの燐酸塩緩衝塩水にて決定される。心臓病の場合に本発明で好適な投与方式は一方もしくは両方の冠状動脈または1本もしくはそれ以上の伏在静脈または内部乳房動脈移植物に対する適する冠状動カテーテルを用いた冠状動脈内注射である。末梢血管病の場合に本発明で好適な投与方式は大腿動脈の近位部分への適する動脈カテーテルを用いた注射である。他の標的器官もしくは組織の場合に本発明で好適な投与方式も、適する動脈カテーテルの使用による。標的遺伝子発現本発明の予想外の知見は、レコンビナントアデノウィルスがその遭遇する第1血管ベッドにて極めて効率的に取り上げられることである。実際、実施例4の動物モデルにて、冠状動脈内注射後の心臓におけるウィルスの取上効率は98であった。すなわちウィルスの98が心筋血管ベッドに対する最初のウィルスの通過に際し除去された。さらに、注射に際し動物から採取された血清は200倍希釈されるまでウィルスプラークを増殖させることができず、このことは血清因子または結合性蛋白の存在がウィルス増殖を抑制することを示唆する。これら2つの因子ウィルスの効率的な第1通過付着および蛋白を結合する血清の可能性は一緒に作用して、遺伝子発現をウィルスにより遭遇した第1血管ベッドに限定することができる。遺伝子転移が冠状動脈内遺伝子転移の後の心臓に制限された程度をさらに評価するため、ポリメダーゼ連鎖反応PCRを用いてウィルスDNAの心臓外の存在につき2匹の処置動物下記実施例4における遺伝子転移の2週間後に証明されるかどうか調べた。各動物はその心臓にウィルスDNAの存在を示したが網膜、骨格筋もしくは肝臓には存在しなかった。PCRの感度は、5,000,000個の細胞当り単一のDNA配列が検出されうるよう支配する。したがって、これらデータは遺伝子供給の2週間後に心臓外の組織にはウィルスDNAが存在しなかったことを示す。この知見は、トランスジーンが心臓における発現を標的とするが、その他のどこも標的としないという概念と一致するので極めて重要である。これは本発明に患者の処置で有用性を増大させる安全性を付与する。何故なら、アデノウィルスの予想外の生物学的性質を利用して、部位指向の遺伝子転移を可能にするからである。これらは、本出願人が知る限り従来記載されておらず、しかもこの方法に関する安全性の利点が当業者には明かでないため重要な観察である。この予想外の知見は他の血管ベッドにも一般化することができ、これによりトランスジーンの供給を特定動脈により給血される特定器官もしくは組織に比較的排他的に行うことを可能にする。本発明の理解を助けるため、以下の実施例を示して一連の実験の結果を説明する。本発明に関するこれら実験は本発明を特定的に限定するものではないことは勿論であり、現在既知または将来開発されるであろう各種の改変も本発明の範囲に含まれることが当業者には了解されよう。実施例アデノウィルス構築物ヘルパー非依存性性の複製欠損ヒトアデノウィルス5系を使用した。対象となる遺伝子はlacZおよびFGF-5とした。ヒトFGF-5のための全長cDNAをプラスミドpLTR122Eから遺伝子の解読枠の981bpを含む1.1kbECOR1断片として遊離させ、CMVプロモータとE1AおよびE1B遺伝子ウィルス複製に必須が欠失している部分アデノウィルス配列に整列したSV40ポリアデニレーションシグナルとを含有するプラスミドACCMVPLPAのポリリンカーにクローン化させた。このプラスミドをプラスミドJM17と共に293細胞に同時トランスフェクトしリポフェクション、プラスミドJM17は全ヒトアデノウィルス5ゲノムと追加4.3kb挿入物とを有してpJM17を包封するには大き過ぎるようにした。相同性レスキュー組換は、E1A/E1B配列の不存在下にトランスジーンを有するアデノウィルスベクターを与えた。これらレコンビナントは哺乳動物細胞にて非複製性であったが、これらはE1A/E1Bでトランスフォームされた293細胞で増殖すると共にこれら必須遺伝子産生物をtransで与えた。トランスフェクトされた細胞を細胞障害効果の証拠につき監視し、一般にトランスフェクトションの10~14日間後に生じた。満足しうるレコンビナントを同定するため、細胞障害効果を示すプレートからの細胞上澄液をプロテナーゼK0.5のドデシル硫酸ナトリウムと20mMのEDTAとを含む50mg/mLにより56°Cで60分間処理し、フェノール/クロロホルム抽出し、次いでエタノール沈澱させた。次いで良好なレコンビナントを、CMVプロモータおよびインサート予想1.1kb断片を増幅するSV40ポリアデニレーション配列に対し相補性のプライマーとアデノウィルス配列を同時に増幅するよう設計されたプライマーとを用いるPCRにより同定した。次いで良好なレコンビナントを2回のプラーク精製にかけた。ウィルスストックを293細胞にて1010~1012個の範囲のウィルス粒子タイターまで増殖させ、使用前に二重CsCl濃度勾配遠心分離によって精製した。全長cDNAを用いて、β-ガラクトシダーゼをコードするレコンビナントアデノウィルスもしくはFGF-5を作製した。レコンビナントアデノウィルスを発生させるべく使用した系は、5kbのトランスジーン挿入物をパッキング限界とした。提案された遺伝子は、CMVプロモータにより促進されると共にSV40ポリアデニレーション配列を有して4kb未満であり、充分パッキング範囲内にあった。レコンビナントベクターを標準法によって精製されたプラークである。得られたウィルスベクターを293細胞にて1010~1012個の範囲のウィルス粒子タイターまで増殖させた。細胞を80コンフレントにて感染させ、36~48時間にて回収した。凍結-解凍サイクルの後、細胞残骸を標準的遠心分離によりペレット化させ、ウィルスを二重CsCl濃度勾配超遠心分離によりさらに精製した[非連続的1.33/1.45CsCl濃度勾配;5mMのトリス、1mMのEDTApH7.8にて作製したセシウム;90,000×g2時間、105,000×g18時間]。invivo注射の前に、ウィルスストックをたとえばG25セファデックスのようなセファロースカラムでのゲル濾過により脱塩した。得られたウィルスストックは1010~1012個のウィルス粒子範囲における最終ウィルスタイターを有した。このアデノウィルス構築物は高度に精製されて、野生型強力な複製性ウィルスを含まなかった。細胞培養物における成体ラット心筋細胞成体ラット心筋細胞を、コラゲナーゼ含有灌流液を用いるランゲンドルフ灌流により標準法にしたがって作製した。棒状細胞をラミニン被覆プレートで培養し、24時間にて上記実施例1で得られたβ-ガラクトシダーゼコード化アデノウィルスを1:1の感染多重度で感染させた。さらに36時間の後、細胞をグルタルアルデヒドで固定し、X-galと共に培養した。常に成体筋細胞の70~90が、レコンビナントアデノウィルスでの感染後にβ-ガラトシダーゼトランスジーンを発現した。1~2:1の感染多重度にて、細胞毒性は観察されなかった。invivoのブタ心筋実施例1で得られたβ-ガラクトシダーゼコード化アデノウィルスベクターを許容しうる293細胞にて増殖させ、CsCl濃度勾配超遠心分離により実施例1の手順に基づき1.5×1010個ウィルス粒子の最終ウィルスタイターにて精製した。麻酔および通気された40kgのブタを開胸術にかけた。26ゲージのバタフライ針を中間左前側下降LAD冠状動脈に挿入し、ベクター1.5×1010個のウィルス粒子を2mL容積で注射した。胸を閉鎖し、動物を回復させた。注射後の4日目に動物を殺した。心臓をグルタルアルデヒドで固定し、切開し、次いでX-galと共に16.5時間にわたり培養した。着床および切開の後、組織をエオシンで対比染色した。組織セクションlacZを含有するアデノウィルスの冠状動脈内注射の96時間後におけるLADベッドの経壁セクションの顕微鏡分析はLAD冠状動脈ベッドで観察される遺伝子転移の顕著な程度を示すと共に、多くの組織セクションは細胞の50~60より多くがβ-ガラクトシダーゼにつきプラスに染色することを示した。LAD循環ベッドから離れた心筋の領域はX-gal染色を示さず、陰性比較として使用した一方、遺伝子の拡散発現が筋細胞および内皮細胞にて観察された。筋細胞の大部分はβ-ガラクトシダーゼ活性青色染色を示し、その後の試験にて閉胸冠状動脈内注射を用い同様な活性が遺伝子転移の14日後に存在したn=8。遺伝子発現の領域には、炎症または壊死の証拠が存在しなかった。ブタ虚血モデル動物は18頭の家畜ブタ30~40kgを含んだ。左側開胸術を機器装備のため無菌条件下で行った。各カテーテルを左心房と大動脈とに挿入し、局部的血流を測定すると共に圧力を監視する手段を設けた。左心房にワイヤーを縫合してECG記録および心房調整を可能にした。最後に、アメロイドを近位LCxの周囲に設置した。安定程度の虚血が発生した後、処理群n=11にはCMVプロモータにより促進されるFGF-5血管形成性遺伝子を含むアデノウィルス構築物を接種した。比較動物n=7にはCMVプロモータにより促進されるレポータ遺伝子すなわちlacZを含むアデノウィルス構築物で遺伝子転移させた。試験をアメロイド設置の35±3日後に開始し、その時点で側副血管の発達および調整誘発の機能不全が安定した。意識動物を三角巾で懸垂し、LV、LAおよび大動脈からの圧力および心電図をデジタルフォーマットのオンラインで記録した休止時および200bpmにおける心房調整時。二次元およびM-モードの画像をヒューレットパッカード超音波画像システムにより得た。画像を中間乳頭筋レベルにおける右側胸骨傍から得ると共にVHSテープに記録した。各画像を基礎状態における動物および再び右心房調整時HR=200bpmの各動物で記録した。これら試験を遺伝子転移の1日前に行い、さらにその14±1日後に反復した。心搏数-圧力の積および左心房圧力は遺伝子転移の前後におる両群にて同様であり、これは同様な心筋酸素要求および負荷条件を示した。超音波心臓検査測定を標準的基準を用いて行った。末端-拡張期壁厚さEDWThおよび末端-収縮期壁厚さESWThを5回の連続心搏から測定して平均した。壁肥厚WThを計算した[EDWTh-ESWTh/EDWTh]×100。動物が摂取した遺伝子の知識なしにデータを解析した。超音波心臓検査測定値の再現性を示すため、動物n=5を連続2日間にわたり画像形成させ、高い相関関係r2=0.90;p=0.005を示した。アウロイド設置の35±3日後、アウメロイド閉鎖の充分後であるが遺伝子転移の前、コントラスト超音波心臓測定試験を心房調整200bpm時に左心房に注射されたコントラスト材料レボビストを用いて行った。各試験を遺伝子転移の14±1日後に反復した。ピークコントラスト強度を、コンピュータに基づくビデオ分析プログラムカラービューII、ノバマイクロソニックス社、インディアナポリス、インディアナ州を用いてビデオ画像から測定し、これはビデオ強度の目的測定値を与えた。コントラスト試験を、試験動物が摂取した遺伝子の知識なしに解析した。試験の終了後、各動物を麻酔して正中線開胸術を行った。短頭動脈を分離し、カニューレを挿入し、他の大血管を結搾した。各動物には静脈内ヘパリン10,000IUとパパベリン60mgとを接種した。塩化カリウムを投与して拡張期の心搏動停止を誘発させると共に大動脈を縛った。塩水を短頭動脈カニューレを介して供給し圧力120mmHg、これにより冠状動脈に灌流させた。グルタルアルデヒド溶液6.25、0.1Mカコジレート緩衝液を心臓が充分固定するまで10~15min灌流させた圧力120mmHg。次いで心臓を剔出し、左前側下降動脈LAD、左回旋動脈および右冠状動脈を介する着色コード染料を注入したアンテログレードを用いてベッドを同定した。アメロイドを検査して閉鎖を確認した。正常に灌流された虚血領域から採取した試料を三分割し、心内膜および心外膜の1/3をプラスチックに埋めた。毛管数を定量する顕微鏡分析を刊行物に記載されたように行った。4個の厚さ1μmの横セクションを各サブ試料各領域の心内膜および心外膜から採取し、点計数を行って繊維数当りの毛管数の比を400倍の倍率にて測定した。20~25倍の高倍率視野をサブ試料につき計数した。各領域内にて、毛管数と繊維数との比は心内膜および心外膜にて同様であり、したがって1領域当り40~50視野を平均して経壁毛管数と繊維数との比を得た。改善された領域機能および血流がトランスジーン発現から生じたことを確認するため、PCRおよびRT-PCRを用いて、FGF-5遺伝子転移を受けた動物からの心筋におけるトランスジェニックFGF-5DNAおよびmRNAを検出した。CMVプロモータに対するセンスプライマー[GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC]配列番号1および内部FGF-5配列に対するアンチセンスプライマー[GAAAATGGGTAGAGATATGCT]配列番号2を用いて、PCRにより予想500bp断片を増幅させた。FGF-5配列の開始部に対するセンスプライマー[ATGAGCTTGTCCTTCCTCCTC]配列番号3および内部FGF-5配列に対するアンチセンスプライマー[GAAAATGGGTAGAGATATGCT]配列番号2を用いて、RT-PCRにより予想400bp断片を増幅させた。最後にFGF-5に指向するポリクローナル抗体を用いて、FGF-5蛋白発現を、FGF-5で遺伝子転移を受けた動物からの細胞および心筋にてFGF-5遺伝子転移の48時間後および14±1日後に示した。実施例1で作成したヘルパー非依存性の複製欠損ヒトアデノウィルス5系を用いてトランスジーン含有ベクターを作成した。関心ある遺伝子はlacZおよびFGF-5とした。invivo注射した物質は高度に精製し、野生型複製競合性アデノウィルスを含有しなかった。かくして心臓におけるアデノウィルス感染および炎症浸潤は最小化された。この物質を冠状動脈カテーテルにより冠状動脈の管腔中に直接注射することにより、遺伝子を効果的に標的とすることができる。このように供給した際、肝細胞ではトランスジーン発現が存在せず、ウィルスRNAは冠状動脈内注射の後の任意の時点で尿中に見ることができなかった。構築物の注射約1011個のアデノウィルス粒子を含有する4.0mLを行い、その際2.0mLを左側および右側の両冠状動脈に注射したLCxベッドに対する側副流は両血管から来ると思われた。各動物を麻酔すると共に、動脈アクセスをカットダウンにより右頸動脈から得た。5Fコルジスシースを設置した。5FマルチパーパスA2冠状動脈カテーテルを用いて、冠状動脈に係合させた。LCxアメロイドの閉鎖を、左側主冠状動脈にコントラスト注射して確認した。次いでカテーテル先端を動脈管腔内の1cmに設置して、注射に際し近位大動脈へ最少化の物質しか喪失されないようにした。この手順を各ブタにつき行った。遺伝子転移を行った後、3種の手法を用いて遺伝子の組込みおよび発現の成功を確認した。1或る種の構築物はレポータ遺伝子lacZを含み;2該当ベッドからの心筋を採取してFGF-5の存在を定量するため免疫ブロッティングを行い;さらに3PCRを用いてFGF-5mRNAおよびDNAを検出した。第2図における領域的収縮機能データは、lacZを摂取したブタが遺伝子転移の前および14±1日後に虚血領域にて調整誘発の機能不全を同程度で示したことを示す。これに対し、FGF-5遺伝子転移を受けたブタは調整に際し虚血領域にて2.6倍の壁肥厚増加を示したp=0.0001。これらデータは、本発明によるFGF-5遺伝子転移が調整の際に虚血領域にて向上した収縮に関連したことを示す。正常に灌流された領域心室間隔膜における壁肥厚は調整時に正常であって、遺伝子転移により影響を受けなかった壁肥厚:lacZ群:プレ-ジーン、56±11、ポスト-ジーン、51±9;FGF-5群:プレ-ジーン、63±7、ポスト-ジーン、58±5;差なし、2方向変動分析。これら別々の測定からのデータは極めて再現性があった横方向壁肥厚:r2=0.90;p=0.005。経胸腔超音波心臓検査術により測定された機能の低下は、同じモデルにおける心房調整時のソノミクロメトリーにより測定した減少と極めて類似し、虚血機能不全の評価につき超音波心臓検査術の正確性を示す。第2図における棒線は平均値を示し、エラー棒状は1SEを示す。第4A~4C図は心筋コントラスト超音波心臓検査写真に対応する図面である。第4A図は正常ブタにおける急性LCx閉塞を示し、LCxベッドには血流が示されなかったのに対し、隔膜IVSが増大し白色、これは画像がLCxベッドを正確に同定すると共に、減少した血流が減少したコントラスト増大に関連したことを確認する。第4B図はlacZでの遺伝子転移の14日後におけるIVSとLCxベッドとの間のコントラスト増大の差を示し、これは心房調整200bpm時の2つの領域における異なった血流を示す。第4C図において、コントラスト増大はFGF-5での遺伝子転移の14日後にIVSとLCxベッドとで同等であると思われ、これは心房調整時に2つの領域で同様な血流を示す。第3図は全動物からの2つの領域におけるビデオ強度のコンピュータ分析を要約する。第3図において、データは虚血領域LCxベッドにおけるピークビデオ強度心筋血流に相関を心室間隔膜IVS、閉塞されてない左前側下降冠状動脈を流過する正常な血流を受けた領域におけるピークビデオ強度で割算した比として現した。2つの領域における等しい血流は1.0の比を与える。遺伝子転移前の比は平均して0.5であり、これは隔膜におけるよりもLCxベッドにて血流が相当低いことを示す。第3図は、lacZ遺伝子転移を受けた動物が虚血領域にて持続性血流不足を有することを示す。FGF-5遺伝子転移を受けた動物は2つの領域にて均質コントラスト増大を示し、これは心筋血流の2倍の増加が虚血領域における血流を向上させたことを示すp=0.0018、2方向変動分析。棒線は平均値を示し、エラー棒線は1SEを示す。第5図における棒グラフは顕微鏡分析データを要約し、FGF-5での遺伝子転移を受けた動物の虚血領域および非虚血領域における毛管数と繊維数との比がlacZで遺伝子転移を受けた動物の心臓における同じ領域と比較して増大することを示す。棒線は各群における5~6頭の動物からの平均値を示す。エラー棒線は1SEを示し、p値は遺伝子効果に関する2方向変動分析からの数値である。この分析は処理群の知識なしに行った。PCR増幅に関する電気泳動図は、FGF-5で遺伝子転移してから14日後における3頭のブタのLADおよびLCxベッドにJM17-CMV-FGF-5DNA予想500bp断片が存在することを確認した。RT-PCR増幅に関する電気泳動図は、FGF-5によるがlacZによらない遺伝子転移の14日後のLADおよびLCxベッドにおける心臓FGF-5mRNA予想400bp断片の存在を確認した。さらに遺伝子転移の2週間後、5頭の全lacZ感染動物からの心筋試料は組織学検査にて相当なβ-ガラクトシダーゼ活性を示した。最後に、FGF-5に対するポリクローナル抗体を用いた培養繊維芽細胞からの細胞培地の免疫ブロットは、FGF-5の遺伝子転移の2日後に蛋白発現および細胞外分泌を確認したn=4プレートが、lacZの遺伝子転移後には観察されなかった。さらに蛋白発現はFGF-5の遺伝子転移の14±1日後に心筋試料にて確認されたが、lacZの遺伝子転移後には確認されなかったn=4。上記実験をより多数の家畜ブタで反復した。処理群n=16にはCMVプロモータにより促進されるFGF-5を含む上記アデノウィルス構築物を接種した。比較動物n=7にはCMVプロモータにより促進されたレポータ遺伝子lacZを含む上記アデノウィルス構築物を接種した。5頭の各動物の経過を遺伝子転移後の12週間にわたり追跡した。その結果を第6~8図に示す。第6図は処理動物の領域的収縮機能を図示する。ヒューレットパッカード超音波画像形成システムを用いて二次元およびMモードの画像を得た。画像を乳頭筋レベルにて右胸骨傍から得ると共に、VHSテープに記録した。意識動物を快適な三角巾で懸垂して試験し、身体運動を最小化させた。画像を基礎状態における動物および右心房調整時HR=200bpmにおける動物で記録した。これら試験を遺伝子転移の1日前に行い、その14±1日後に反復した左側パネル、第6a図。5頭の動物を再びFGF-5での遺伝子転移の12週間後に検査して、機能向上に対する作用が持続したかどうかを判定した右側パネル、第6b図。心搏数-圧力の積および左心房圧は遺伝子転移前後の両群にて類似し、これは類似した心筋酸素要求および負荷条件を示す。標準化された基準を用いて超音波心臓検査を行った。末端-拡張期の壁厚さEDWThおよび末端-収縮期壁厚さESWThを5回の連続心搏から測定して平均した。壁肥厚WThを[EDWTh-ESWTh/EDWTh]×100から計算した。超音波心臓検査の再現性を示すため、処理動物n=5を連続2日間にわたり画像形成させた。別々の測定からのデータは極めて再現性があった横方向壁肥厚:r2=0.90;p=0.005。このモデルにて実験室で経胸超音波心臓検査術およびソノミクロメトリーにより測定された機能低下は極めて類似し、これは虚血機能不全の評価につき超音波心臓検査術の正確性を示す。壁肥厚はFGF-5での遺伝子転移の2週間後に虚血領域にて増大した左パネル;p=0.0001、2方向変動分析。作用は12週間にわたり持続した右パネル;p=0.005。棒線は平均値を示し、エラー棒線は1SEを示す。解析は処理群の知識なしに行った。第7図は処理動物の領域的心筋血流をグラフで示す。コントラスト材料ガラクトースの微小凝集物は左心房注射の後に画像のエコジェニシチーを増大させる。微小凝集物は、血流に対し比例するよう冠状動脈および心筋壁に分配される。コントラスト増大のピーク強度は微小球により測定される心筋血流と相関する。アメロイド設置の32±7日間後すなわちアメロイド閉鎖の充分後であるが遺伝子転移の前にコントラスト超音波心臓検査試験を心房調整時200bpmに行った。試験を遺伝子転移の14±1日後に反復し、5頭の動物ではFGF-5での遺伝子転移の12週間後に行った。ピークコントラスト強度をビデオ画像から測定し、これにはビデオ強度の目的測定値を与えるコンピュータに基づくビデオ分析プログラムカラービューII、ノバミクロソニックス社、インディアナポリス、インディアナ州を用いた。データは、虚血領域LCxベッドにおけるピークビデオ強度を心室間隔膜IVS、未閉塞の左前側下降冠状動脈から正常血流を受ける領域におけるピークビデオ強度で割算した比として現した。コントラスト試験を、動物が摂取した遺伝子の知識なしに解析した。コントラスト超音波心臓検査技術により測定された心房焼成時の領域的血流の差は実験室にて同じモデルで微小球により測定された差と類似し、これは領域的心筋血流の評価につき超音波心臓検査術の正確性を示す。lacZ遺伝子転移を受けた動物は、虚血領域にて持続血流不足を示した。FGF-5遺伝子転移を受けた動物は2つの領域で均質コントラスト増大を示し、これは虚血領域における向上した血流を示しp=0.0001、2方向変動分析、すなわち効果は12週間にわたり持続したp=0.001。棒線は平均値を示し、エラー棒線は1SEを示す。コントラスト超音波心臓検査は4頭のFGF-5処置動物にて行わなかった。解析は処理群の知識なしに行った。第8図は処理動物における血管数の評価をグラフで示す。試験の終了後、動物を麻酔して正中線開胸術を行った。短頭動脈を分離し、カニューレを挿入し、他の大血管を結搾した。動物には静脈内ヘパリン10,000IUとパパベリン60mgとを接種した。塩化カリウムを投与して、拡張期心搏動停止を誘発させると共に大動脈を縛った。塩水を短頭動脈カニューレを介して供給し、これにより冠状動脈に灌流させた。グルタルアルデヒド溶液6.25、0.1Mカコジレート緩衝液を心臓が充分固定するまで120mmHg圧力にて灌流させた10~15min。次いで心臓を剔出し、着色コード染料を注射したアンテログレードを左前側下降動脈と左旋回動脈と右冠状動脈とに通してベッドを同定した。アメロイドを検査して閉鎖を確認した。正常に灌流された領域と虚血領域とから採取した試料を三分割し、心内膜および心外膜の1/3をプラスチックに埋めた。毛管数を定量する顕微鏡分析を前記のように行った。4個の厚さ1μmの横セクションを各サブ試料各領域の心内膜および心外膜から採取し、点計数を用いて各ミオ繊維芽細胞成長因子ブリルの周囲の毛管数を測定した。20~25個の高倍率視野400Xをサブ試料につき計数した。左パネル第8a図はこれらデータを要約し、FGF-5での遺伝子転移を受けた動物の虚血領域および非虚血領域における毛管数がlacZでの遺伝子転移を受けた動物の心臓における同じ領域と比較して増加したことを示す。より大きい口径の血管は、FGF-5遺伝子転移の後に、虚血領域に特異性の効果を増大させる傾向を有した右パネル、第8b図。エラー棒線は1SEを示し、p値はFGF-5遺伝子作用に関する2方向変動分析からの数値を示す。各解析は処理群の知識なしに行った。以下、本発明の態様を例挙する。1.心筋虚血を有する患者にて冠状側副血管の発達を刺激する方法であって、一方もしくは両方の冠状動脈中への直接的な冠状動脈内注射によって患者の心筋に複製欠損アデノウィルスベクターを供給し、ここで前記ベクターは血管形成性蛋白もしくはペプチドをコードするトランスジーンを含み、心筋においてトランスジーンを発現可能にし、これにより冠状側副血管の発達を促進させることを含む方法。2.前記ベクターを1回の注射で供給する、1に記載の方法。3.約107~約1013個のアデノウィルスベクター粒子を注射にて供給する、1に記載の方法。4.約109~約1012個のアデノウィルスベクター粒子を注射にて供給する、1に記載の方法。5.約1011個のアデノウィルスベクター粒子を注射にて供給する、1に記載の方法。6.前記トランスジーンをベクター内に含有されるCMVプロモータにより誘導する、1に記載の心臓病の処置方法。7.前記トランスジーンをベクター内に含有される心室筋細胞特異性プロモータにより誘導する、1に記載の心臓病の処置方法。8.前記心室筋細胞特異性プロモータが心室ミオシン軽鎖-2の配列を有する、7に記載の心臓病の処置方法。9.前記心室筋細胞特異性プロモータがミオシン重鎖プロモータの配列を有する、7に記載の心臓病の処置方法。10.前記血管形成性蛋白もしくはペプチドがaFGF、bFGF、FGF-5およびVEGFよりなる群から選択される、1に記載の心臓病の処置方法。11.前記血管形成性蛋白がFGF-5である、1に記載の方法。12.前記血管形成性蛋白がaFGFである、1に記載の方法。13.前記血管形成性蛋白がbFGFである、1に記載の方法。14.前記血管形成性蛋白がVEGFである、1に記載の方法。15.前記冠状動脈内注射を、左側および右側冠状動脈の管腔中へ約1cmにて行う、1に記載の心臓病の処置方法。16.前記冠状動脈内注射を、冠状動脈の他に伏在静脈移植片および/または内部乳房動脈移植片の管腔中へ約1cmにて行う、1に記載の心臓病の処置方法。17.レコンビナントアデノウィルスベクターを含み、前記ベクターが野生型ウィルスを含有せず、さらに:E1A/E1B遺伝子が欠失している部分アデノウィルス配列と、部分アデノウィルス配列に整列したプロモータにより誘導される血管形成性蛋白もしくはペプチドをコードするトランスジーンと、医薬上許容しうるキャリヤとを含むことを特徴とする濾過されたアデノウィルスベクター注射製剤。18.前記アデノウィルスベクターが0.3μmのフィルタにより濾過されている、17に記載の製剤。19.前記血管形成性蛋白がFGF-5である、17に記載のアデノウィルスベクター注射製剤。20.前記プロモータが、CMVプロモータ、心室筋細胞特異性プロモータおよびミオシン重鎖プロモータよりなる群から選択される、17に記載のアデノウィルスベクター注射製剤。21.血管形成性蛋白もしくはペプチドを心臓にてinvivo発現可能なレコンビナントベクターを含有したウィルスストックの製造方法であって:血管形成性蛋白もしくはペプチドをコードするトランスジーンを、複製欠損ヒトアデノウィルスゲノムの左側末端の部分アデノウィルス配列に整列したプロモータとポリリンカーとを含有するプラスミドにクローン化し;全ヒトアデノウィルスゲノムとプラスミドを包封するには大き過ぎるようにする追加挿入とを含有するプラスミドを用いて、複製競合性を付与する所要のアデノウィルス遺伝子によりトランスフォームされた哺乳動物細胞に前記プラスミドを同時トランスフェクトし、これによりトランスジーン挿入されたプラスミドと全アデノウィルスゲノムを有するプラスミドとの間にレスキュー組換を生ぜしめて、1個もしくはそれ以上の複製競合性付与遺伝子を持たないトランスジーンを含有するレコンビナントゲノムを形成させ、ここで、前記レコンビナントゲノムは包封しうるよう充分小さくし、;良好なレコンビナントを細胞培養物にて同定し;得られたレコンビナントをアブセント複製競合遺伝子でトランスフォームされた哺乳動物細胞にて増殖させ;増殖したレコンビナントを、レコンビナントベクターを含有するが野生型ウィルスを含まないよう精製し;前記精製されたレコンビナントを0.1~0.5μmのフィルタに通過させることを含む方法。22.トランスジーンをクローン化させる前記プラスミドが、プラスミドpAC1またはプラスミドACCMVPLPAである、21に記載のウィルスストックの製造方法。23.前記同定が:トランスフェクトされた細胞を細胞変性効果の証明のためモニターし;細胞変性効果を示す細胞培養物からの細胞上澄液をプロテナーゼKで処理した後、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行い;良好なレコンビナントを、CMVプロモータに対し相補性のプライマーおよびアデノウィルス配列に対し相補性のプライマーを用いて、PCRによって同定し;2回のプラーク精製を行う工程を含む、21に記載のウィルスストックの製造方法。24.前記精製が:得られたレコンビナントを複製競合性付与遺伝子でトランスフォームされた細胞にて1010~1012個のウィルス粒子範囲のタイターまで増殖させ;増殖したレコンビナントを二重CsCl濃度勾配超遠心分離によって精製し;精製されたレコンビナントをセファーロースカラムに流過させる工程を含む、21に記載のウィルスストックの製造方法。25.E1A/E1B配列を持たないトランスジーン挿入複製欠損アデノウィルスプラスミドと;FGF-5をコードするトランスジーンと含み、ここでトランスジーンは、これに連結したCMVプロモータにより誘導されるレコンビナントベクター。26.前記ベクターが、トランスジーンに連結したSV40ポリアデニレーション配列を含む、25に記載のベクター。27.トランスジーン挿入された複製欠損アデノウィルスプラスミドが、トランスジーンがクローン化されるCMVプロモータ及び、SV40ポリアデニレーションシグナルに整列するヒトアデノウィルス型-5である、25に記載のレコンビナントベクター。28.全アデノウィルスゲノムを有するプラスミドが、全ヒトアデノウィルス5-ゲノムとアンピシリン耐性遺伝子を含むベクタ-pBR322の部分とを有するプラスミドである、25に記載のレコンビナントベクター。29.全アデノウィルスゲノムを有するプラスミドと組合せた、25に記載のレコンビナントベクター。30.29に記載のベクター組合せを有する宿主細胞。31.前記細胞がヒト293細胞である、30に記載の宿主細胞。32.25に記載のレコンビナントアデノウィルスベクターを得る方法であって、トランスジーン挿入複製欠損アデノウィルスプラスミドと全アデノウィルスゲノムを有するプラスミドとを、アデノウィルス早期遺伝子領域1E1でトランスフォームされた細胞に同時トランスフェクトし;アデノウィルスベクターを、同時トランスフェクトエ程の細胞と同一もしくは異なる細胞としうるアデノウィルス早期遺伝子領域1E1でトランスフォームされた細胞にて増殖させることを含む方法。33.末梢欠損血管病を有する患者にて血管発達を刺激する方法において、一方もしくは両方の大腿動脈中の直接的な大腿内動脈注射によって患者の末梢血管系に複製欠損アデノウィルスベクターを供給し、ここで前記ベクターは血管形成性蛋白もしくはペプチドをコードするトランスジーンを含み、末梢血管系においてトランスジーンを発現可能にし、これにより末梢血管発達を促進させることを含む方法。34.前記ベクターを1回の注射で供給する、33に記載の方法。35.約107~約1013個のアデノウィルスベクター粒子を注射にて供給する、33に記載の方法。36.約109~約1012個のアデノウィルスベクター粒子を注射にて供給する、33に記載の方法。37.約1011個のアデノウィルスベクター粒子を注射にて供給する、33に記載の方法。38.前記血管形成性蛋白もしくはペプチドは、aFGF、bFGF、FGF-5およびVEGFよりなる群から選択される、33に記載の心臓病の処置方法。39.トランスジーン供給および発現を単一の器官もしくは構造物に制限する方法であって、レコンビナントアデノウィルスを前記器官もしくは構造物の動脈血管供給部へ約1cm挿入されたカテーテルを介し注射する方法。"