遊離型ビタミンDの存在について血液または血液成分のサンプルをアッセイする方法であって、25OHビタミンD用の固定化結合タンパク質または抗体をサンプルに加えるステップ前記サンプルを希釈液と混合するステップであって、前記希釈液はフルオロアルキル界面活性剤を含むステップ所望の量のビタミンDを前記結合タンパク質に結合させるのに有効な時間量の間、前記サンプルをインキュベートするステップ洗浄によって、結合していない血清および血清成分を除去するステップ結合した捕捉ビタミンDを含む前記固定化結合タンパク質または抗体を、標識化ビタミンD化合物との競合的結合に供するステップ前記結合タンパク質に結合した標識化ビタミンD化合物の濃度を測定するステップを含む方法。前記フルオロアルキル界面活性剤がペルフルオロカルボン酸であり、好ましくは、ペルフルオロオクタン酸、ペルフルオロヘプタン酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。前記界面活性剤の濃度が、005~05重量、好ましくは01~025重量である、請求項1または2に記載の方法。前記希釈液が、60~80の範囲の緩衝pHを有する緩衝液である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。前記結合タンパク質が抗体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。前記結合タンパク質が、ビタミンD結合タンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。前記サンプルが、ヒトの血清または血漿である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。前記結合タンパク質が、磁性粒子上にコーティングされた形態で提供される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。前記標識化ビタミンD化合物が、放射性標識、蛍光標識、発光標識、ビオチン標識、金標識、酵素標識からなる群より選択される標識を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。前記濃度が、遊離型25OHビタミンDの標準物質濃度を基準にして測定される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。第1のステップにおいて、ビタミンD用の固定化結合剤上にビタミンDを捕捉し、その後のステップにおいて、前記捕捉ビタミンDを標識化ビタミンD変異型に対する競合結合アッセイに供することを含む、遊離型ビタミンDの存在について血液または血液成分のサンプルをアッセイする方法であって、遊離型ビタミンDの捕捉が、反復試験を満たすように制限されたある量の結合ビタミンDを隔離することによって達成され、ビタミンDが捕捉された前記サンプルを、ビタミンDを捕捉し、前記捕捉ビタミンDを同じ競合結合アッセイに供する同じステップに供し、両方の競合結合アッセイ後の遊離型ビタミンDの測定濃度が実質的に同じである、方法。請求項1から10のいずれか一項に記載の方法に従って行われる、請求項11に記載の方法。隔離されたビタミンDの割合が、前記サンプル中に存在する全ビタミンDの01~10重量であり、好ましくは全ビタミンDの5重量以下である、請求項11または12に記載の方法。請求項1に記載のステップ、、、および、ならびに、捕捉ビタミンDを質量分光アッセイによる定量分析に供するステップを含む、血清または血漿サンプルから遊離型ビタミンDを定量する方法。請求項1から14のいずれか一項に記載の方法を使用する、血液または血液成分中の遊離型ビタミンDを決定するためのイムノアッセイ。固相上に固定化されたビタミンDのための結合タンパク質、および標識化ビタミンD化合物を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法を使用してイムノアッセイを行うためのキット。先行技術文献はいずれも、遊離型ビタミンDの状態を反映したビタミンD測定用のアッセイを明確に提供していない。遊離型ビタミンD用のアッセイは、数十年間にわたり知られているが、それらアッセイは基礎としての平衡透析または速度透析のような方法を使用していることに留意されたい。このような方法は、高度な訓練を受けた技術スタッフを有する研究者には受け入れられるが、財政目標に到達するためには高スループットの自動化試験を必要とする日常的な研究室にとっては不適当である。よって、自動化することができ、かつ、ポイントオブケア検査における使用に適した、遊離型ビタミンDのアッセイを提供することが求められている。前述の番号を付した参考文献は、以下の通りである1HollisBWMeasuring25hydroxyvitaminDinaclinicalenvironmentchallengesandneedsAmJClinNutr2008Aug88507S510S2HolickMFVitaminDextraskeletalhealthEndocrinolMetabClinNorthAm2010Jun393814003MendelCMThefreehormonehypothesisaphysiologicallybasedmathematicalmodelEndocrRev1989Aug10232744BikleDGeeEHalloranBHaddadJFree125DihydroxyvitaminDLevelsinSerumfromNormalSubjectsPregnantSubjectsandSubjectswithLiverDiseaseJClinInvest198474196619715BikleDGeeEHalloranBKowalskiMARyzenEHaddadJAssessmentofthefreefractionof25hydroxyvitaminDinserumanditsregulationbyalbuminandthevitaminDbindingproteinJClinEndocrinolMetab1986Oct6395496LauridsenALVestergaardPHermannAPBrotCHeickendorffLMosekildeLNexoEPlasmaconcentrationsof25hydroxyvitaminDand125dihydroxyvitaminDarerelatedtothephenotypeofGcacrosssectionalstudyon595earlypostmenopausalwomenCalcifTissueInt2005Jul7715227vanHoofHJSwinkelsLMRossHASweepCGBenraadTJDeterminationofnonproteinboundplasma125dihydroxyvitaminDsymmetricdialysisAnalBiochem1998Mayl25817683前述の要望の1つ以上に対してより良く対処するために、本発明は、1つの態様において、遊離型ビタミンDの存在について血液または血液成分のサンプルをアッセイする方法を提示し、この方法は、25OHビタミンD用の固定化結合タンパク質または抗体をサンプルに加えるステップ前記サンプルを希釈液と混合するステップであって、前記希釈液はフルオロアルキル界面活性剤を含むステップ所望の量の25OHビタミンDを前記結合タンパク質と結合可能にするのに有効な時間量の間、前記サンプルをインキュベートするステップ洗浄によって、結合していない血清および血清成分を除去するステップ結合した25OHビタミンDを含む前記固定化結合タンパク質または抗体を、標識化ビタミンD化合物との競合的結合に供するステップ前記結合タンパク質に結合した標識化ビタミンD化合物の濃度を測定するステップを含む。別の態様においては、本発明は、前述の方法を行うためのキットに属する。さらなる態様においては、本発明は、第1のステップにおいて、25OHビタミンD用の固定化結合タンパク質または抗体などの固定化結合剤上にビタミンDを捕捉し、その後のステップにおいて、前記捕捉25OHビタミンDを、標識化ビタミンD変異型に対する競合結合アッセイに供することを含む、遊離型ビタミンDの存在について血液または血液成分のサンプルをアッセイする方法であって、遊離型ビタミンDの捕捉は、反復試験を満たすように制限されたある量の結合ビタミンDを隔離することによって達成され、また、ビタミンDが捕捉された前記サンプルを、ビタミンDを捕捉し、前記捕捉ビタミンDを同じ競合結合アッセイに供するという同じステップに供し、両方の競合結合アッセイ後の遊離型ビタミンDの測定濃度は実質的に同じである方法に関する。さらなる態様では、本発明は、第1のステップにおいて、25OHビタミンD用の固定化結合タンパク質または抗体などの固定化結合剤上にビタミンDを捕捉し、その後のステップにおいて、前記捕捉された25OHビタミンDを標識化ビタミンD変異型に対する競合結合アッセイに供することを含む、遊離型ビタミンDの存在について血液または血液成分のサンプルをアッセイする方法であって、結合ビタミンDの05~5重量が捕捉される方法に関する。さらに別の態様では、本方法は、ポイントオブケア検査に用いることができる。後者は、血液サンプルを採取し、それらを診断研究所に送るのではなく、患者の治療の場所またはその近くで検査することを指し、サンプルは、ステップの数を可能な限り制限し、かつ、手動操作を可能な限り制限したアッセイを行うことが可能な、携帯用デバイス、好ましくはハンドヘルドデバイスに迅速に取り込むことができる。別の態様では、本発明は、遊離型ビタミンDの測定のためのイムノアッセイにおけるビタミンDの溶解促進剤としての、フルオロアルキル界面活性剤、好ましくはペルフルオロカルボキシレート界面活性剤、さらに好ましくはペルフルオロオクタン酸の使用に関連する。広い意味で、本発明は、血液または血液成分、とりわけ血清または血漿に由来する、タンパク質に結合していない25ビタミンDを免疫吸着し、その後、吸収されたビタミンDを測定することを含む、遊離型ビタミンDの測定のための2段階アッセイに関係する。これらのサンプルは、血中の遊離型25OHビタミンDの存在を検査することが所望される対象、特にヒトから、当技術分野で知られているいずれかの方法で採取することができる。遊離型ビタミンDとは、ビタミンDの血液循環する非結合画分のことを指す。これは、ビタミンD2、ビタミンD3、およびその代謝産物である25ビタミンD2、25ビタミンD3、1252ビタミンD2、および1252ビタミンD3を含むビタミンDのいずれかの形態に関する。前記アッセイは、単独でまたは組み合わせて、これらの形態の遊離型ビタミンDのいずれかを測定するのに使用することができる。好ましくは、本発明のアッセイを、遊離型25ビタミンDの測定に使用して、25ビタミンD2および25ビタミンD3の測定をもたらす。遊離型および非結合という用語は、ビタミンD結合タンパク質を主として含むいずれのタンパク質にも結合していない画分のことを指す。サンプルは、好ましくは、結合タンパク質の添加前、添加の間、または添加後に希釈する。サンプル希釈液は、水性であってよく、好ましくは緩衝液であろう。好ましくは、緩衝pHは、60~80の範囲である。緩衝液には、フルオロアルキル界面活性剤が含まれる。緩衝液とサンプルとの混合は、希釈液をサンプルに加えることによって、サンプルを希釈液に加えることによって、または、緩衝液とサンプルを互いに同時に加えることによって実施できることが理解されよう。実用的な理由から、サンプルに希釈液を加えることが好ましい。理論に縛られることなく、本発明者らは、界面活性剤が、ビタミンDの限定された隔離をもたらすような方法で、ビタミンDの溶解性を高めると考えている。別の態様では、本発明は、遊離型ビタミンDをアッセイするための新しい概念に関連する。遊離型ビタミンDのアッセイに伴う問題は、遊離型ビタミンDの初期濃度が非常に低く、既存のイムノアッセイでは測定できないことである。この問題を解決するための既存の試みは、DBPからのビタミンDの解離を回避したいという欲求に基づいているか、遊離型のDBPはアッセイできないという事実に屈することに関するものであり、これらのアッセイは、DBPからのビタミンDの置換にのみ関与している。本発明では、ビタミンDの限定された隔離が予測され、隔離されたビタミンDの割合は、初期の遊離型ビタミンDの濃度を反映するのに十分に低い濃度であり、好ましくは前記サンプル中に存在する全ビタミンDの01~10、好ましくは全ビタミンDの5以下である。このことは、トリチウム化ビタミンDおよび希釈緩衝液を加えることによって、サンプルにおける過度の実験を行うことなく、確認することができる。ビタミンD結合タンパク質に結合したビタミンDは、5を超える割合で低下しないはずである。あるいは、サンプルは、抗体をコーティングしたウェルの壁に吸収させてもよい。サンプルの除去後、ビオチン化ビタミンDを加え、抗体に吸収された遊離型ビタミンDを定量する。初期量のビタミンDを取り除いたサンプルを、第2のウェルに導入し再度、インキュベートし、定量する。遊離型ビタミンDの測定濃度は、第1のインキュベーションから得られた結果と同じはずである。ビタミンDの限定された隔離は、好ましくは、005~05重量、好ましくは01~025のフルオロアルキル界面活性剤を加えることによって達成する。好ましくは、フルオロアルキル界面活性剤は、ペルフルオロアルキル界面活性剤であり、さらに好ましくは、ペルフルオロカルボキシレート界面活性剤、最も好ましくはペルフルオロオクタン酸である。好ましくは01~02、さらに好ましくは015のPFOAを用いる。これらの条件下で、全ビタミンDの濃度は同じであるが、さまざまな濃度のDBPを含むサンプルの応答は、対称透析によって測定される遊離型ビタミンDの濃度と相関していた。本発明では、PFOA自体またはその誘導体を用いることが可能であることが考えられる。これらの誘導体は、一般に、ペルフルオロオクタン酸部分を含む誘導体、特に、PFOAアンモニウム塩などのPFOA塩、および、対応するスルホン酸、すなわち、PFOSと略されるPFOAスルホネートを指す。本発明の遊離型ビタミンDを測定する方法の利点は、本方法が、自動化することができるアッセイ形式を提供することである。これにより、本発明のアッセイは、遊離型ビタミンDの測定のための既存のアッセイから顕著に区別される。本発明のアッセイでは、25OHビタミンD用の結合タンパク質を加える。ビタミンDのための結合タンパク質、例えば抗体は、当技術分野で知られており、ビタミンDの既存のイムノアッセイに幅広く用いられている。同じ抗体ならびに他の結合タンパク質も、同様に本発明に用いることができる。例えば、ビタミンDの抗体の代わりに、抗体フラグメント、例えばファージディスプレイ法を用いて生成したものなどを用いることができる。適切な抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。それらは、既知の方法で入手することができ、例えばポリクローナルヤギ抗ビタミンD、ポリクローナルウサギ抗ビタミンD、またはビタミンDのイムノアッセイにおける用途として当技術分野で知られているビタミンDの任意の他の適切な抗体のいずれかである。適切な抗体は、例えば、次の参考文献から知られているHollis、ClinChem3111、18151819Hollis、ClinChem393、529533。結合タンパク質は、好ましくは、固体担体を含む粒子形態で加えられる。典型的には、結合タンパク質は、例えばマイクロタイタープレートなどの固相上にコーティングされる。好ましい実施形態では、結合タンパク質は磁性粒子上にコーティングされ、磁場における分離を促進する。結合タンパク質、例えば抗体などの添加後、サンプルをインキュベートすることができる。必要な時間は、試薬の濃度、結合タンパク質の種類、および、例えば振とうおよび温度などのインキュベーション中の条件などの状況に応じて決まる。一般に、インキュベーション時間は、10秒間から数時間の範囲であり、好ましくは1分間から2時間である。自動化プラットフォームでは、短いインキュベーション時間が好ましい。基本的に、所望される時間、その条件下で、どのくらいの量の遊離型ビタミンDが結合されるかを、較正システムで決定する限りにおいては、時間は特に重要ではない。適正な較正が行われれば、より短時間およびより長時間も明らかに用いることができる。よって、好ましくは、標準物質との比較は、同じ条件下、同じ時間であることを伴う。インキュベーション期間後、サンプルは、既知の方法で、標識化ビタミンD化合物を使用する競合結合アッセイに供することができる。ビタミンDの測定のためのイムノアッセイにおける競合的結合抗原として役立つ多くの標識化化合物が知られている。典型的な標識としては、放射性標識、蛍光標識、発光標識、ビオチン標識、金標識、酵素標識が挙げられる。競合結合アッセイは当業者に知られており、特に、本発明の方法のこの部分は、ビタミンDの測定に適していることが知られている任意の標識を使用して実施できることから、説明は必要ではない。使用できる標識としては、とりわけ、既存のビタミンDイムノアッセイについて前述した参考文献に開示されるものが挙げられる。濃度の測定を可能にする標識を用いて、結果として、サンプル中の遊離型ビタミンDの濃度を測定する。測定値の解釈は、較正測定、すなわち同じアッセイにおける標準物質の応答によって決定されることが理解されよう。あるいは、捕捉ビタミンDは、質量分光測定法を用いた定量分析に供することができる。本発明のアッセイの較正は、所定の濃度の遊離型25OHビタミンDを含む標準物質を準備することによって行うことができる。これらの標準物質における遊離型ビタミンDの割合は、対称透析によって測定することができる。対称透析では、血清サンプルを、透析セルの一側に負荷する。他のコンパートメントには、微量の放射性標識化ビタミンDを加えた同じサンプルを負荷する。1つの透析コンパートメントから他の透析コンパートメントへの放射性標識化ビタミンDの移動率は、ビタミンDの遊離型の割合に正比例する。本発明の遊離型ビタミンDの測定は、上述のように、ビタミンDの限定された隔離に基づいて、遊離型ビタミンDの濃度に実質的に影響を及ぼすことなく、遊離型ビタミンDの濃度を評価することによる。本発明は、別の態様では、血液または血液成分中の25OHビタミンDを測定するためのイムノアッセイの形態をした製品を提示し、ここで、前記イムノアッセイは、上記実施形態のいずれか1つに従う方法を使用する。さらに具体的には、このような製品は、イムノアッセイを行うためのキットの形態で提供されよう。このようなキットは、関係する個々の試薬、すなわち結合タンパク質および標識化ビタミンD化合物を含むことができる。これらの試薬は、別々に提供して、本発明のイムノアッセイに使用する際に、キットを形成することができる。試薬は、一緒に提供することが好ましく、パーツで構成される1つのキットとして一緒にパッケージ化されることが好ましい。キットは、任意選択で、血液または血液成分のサンプル用の容器を含むが、慣用通り、別々に提供してもよい。典型的には、キットは、固相に固定化した結合剤、および分離された複合化ビタミンDを含む。標識が異なれば必要とされる試薬も異なりうることから、他のキット構成要素は、当技術分野の慣用通り、選択される標識に応じて決まる。遊離型ビタミンDの測定のためのイムノアッセイではビタミンDの溶解性が高まることから、本発明はまた、フルオロアルキル界面活性剤、好ましくはペルフルオロカルボキシレート界面活性剤、さらに好ましくはペルフルオロオクタン酸およびまたはペルフルオロヘプタン酸の使用にも関連する。好ましい界面活性剤としては、ペルフルオロアルキル界面活性剤が挙げられ、さらに好ましくは、ペルフルオロヘプタン酸またはペルフルオロオクタン酸などのペルフルオロカルボン酸である。最も好ましくは、界面活性剤は、ペルフルオロオクタン酸、またはその誘導体である。これらの誘導体は、一般に、ペルフルオロオクタン部分を含む誘導体、特に、PFOAアンモニウム塩などのPFOA塩、および、対応するスルホン酸、すなわち、PFOSと略されるPFOAスルホネートを指す。他のペルフルオロカルボキシレート界面活性剤の類似の誘導体も使用することができる。本発明は、先に記載された実施形態および式に限定されないことが理解されるべきである。特許請求の範囲において、含むという用語は、他の構成要素またはステップを除外しないことも理解されるべきである。単数名詞を参照して、例えばaまたはan、theなどの不定冠詞または定冠詞が用いられる場合、これは、他のことが具体的に示されない限り、その名詞の複数形を含む。本発明は、後述する非限定的な実施例および添付の非限定的な図に関して例証される。材料コーティングしたマイクロタイタープレートNuncmaxisorpマイクロタイタープレートを、200ngウェルの濃度の抗マウスIgG抗体でコーティングした。その後、モノクローナル抗25ビタミンD抗体の層を、抗マウスIgG層上に2ngウェルの濃度で吸収させた。BSAおよびショ糖を含むホウ酸塩緩衝剤を用いて、プレートをブロッキングした。サンプル希釈液サンプル希釈液は、保存料および015のPFOAを含む、pH80の01MTRIS緩衝液からなる。複合体は、ビオチン化ビタミンDである。この複合体は、01のウシ血清アルブミンおよび保存料を含むpH75の01MTris緩衝液中に25pgmlの濃度で存在していた。ストレプトアビジンHRPおよびTMBは、商業的な供給源に由来するものであった。手順本アッセイは、次のように行う。マイクロタイタープレートのウェルに、90μlのサンプル希釈液をピペットで分注する。次に、希釈液に10μlのサンプルを加える。この混合物を37°Cで90分間インキュベートする。その後、ウェルを洗浄緩衝液で3回洗浄する。100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体をキュベットに加え、30分間インキュベートする。再度、ウェルを洗浄緩衝液で3回洗浄する。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンの添加によって比色シグナルを生成させる。37°Cで20分間インキュベート後、ウェルを洗浄緩衝液で3回洗浄する。その後、100μlのTMB溶液をウェルに加える。室温で20分間、暗所でインキュベートした後、100μlの停止溶液を加え、450nmでの吸光度を読み取る。ウェル内で生じたシグナルは、サンプルまたは標準物質中の遊離型25ビタミンDの濃度に反比例する。最初のサンプル中の遊離型25ビタミンDの濃度は、未知物質のシグナルを標準物質の応答と比較することによって計算できる。結果標準参照サンプルに対して本発明のアッセイを使用して、遊離型25ビタミンDの測定の典型的な較正曲線を作成し、下記Tableに示す。ヒトまたは動物の対象の血液または血液成分のサンプルを、本発明のアッセイに供することができる。ビタミンDの測定量を較正曲線と相関させ、それによって解釈することができる。