"配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号2で表されるアミノ酸配列において1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、N176K,N176R、N176E、N176S、N225K、N225E、N259K,N301K、N326K、N326E、N330K、N330S、N355K、N355E、S514GまたはS552C、またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有する蛋白質。さらに、G53A、E166R、T168P、N487S、S490P、N492T、A496E、D500E、V502LおよびA505Nからなる群より選択される1またはそれ以上の変異を有する、請求項1記載の蛋白質。配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、N176K/S490P/D500E/S514G/S552C、N176K/A496E/D500E/S514G/S552C、N176K/S514G/S552C、S514G/S552CおよびG53A/S514G/S552Cからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質。配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、N176K/N301K/N330K/S514G/S552C、N176R/N301K/N330K/S514G/S552C、N176R/N225E/N301K/N326E/N330K/N355E/S514G/S552C、N176K/S490P/D500E/S514G/S552C、およびE166R/T168P/N176R/N301K/N330K/S490P/D500E/S514G/S552Cからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質。配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号4で表されるアミノ酸配列において1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、V149CおよびG190Cのアミノ酸変異を有する蛋白質。真菌由来のグルコース脱水素酵素であって、そのアミノ酸配列を配列番号4で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたときに配列番号4で表されるアミノ酸配列のV149およびG190に相当する位置のアミノ酸が両方ともシステインで置き換えられていることを特徴とするグルコース脱水素酵素。真菌由来のグルコース脱水素酵素であって、配列番号2および5-9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号4で表されるアミノ酸配列のV149およびG190に相当する位置のアミノ酸が両方ともシステインで置き換えられていることを特徴とするグルコース脱水素酵素。配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号2で表されるアミノ酸配列において1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、A150C/T192Cのアミノ酸変異を有する蛋白質。請求項1-8のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子。請求項9に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。請求項9に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。請求項11に記載の形質転換体を培養して、該培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。請求項1-8のいずれかに記載の蛋白質を用いて試料中のグルコース濃度を測定することを特徴とするグルコース分析方法。請求項1-8のいずれかに記載の蛋白質を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキット。請求項1-8のいずれかに記載の蛋白質が電極表面に固定化されている酵素電極。作用極として請求項15に記載の酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサー。配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号2で表されるアミノ酸配列において1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース酸化酵素活性を示さずかつグルコース脱水素酵素活性を有し、キシロースに対する反応性がグルコースに対する反応性の20以下であることを特徴とするグルコース脱水素酵素を用いる、溶存酸素の影響を受けないグルコース計測用のバイオセンサー。本発明は、従来のグルコース脱水素酵素と比較して、さらに高い生産性および/または高い熱安定性を有する新たな酵素を提供することを目的とする。本発明者は、ボトリオチニアフケリアナBotryothiniafuckeliana由来の新規FAD-GDHをコードする遺伝子を単離し、さらにその特定のアミノ酸残基を置換することにより、大腸菌での組換え発現の生産性が顕著に高まることを見いだした。本発明者はまた、真菌由来フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素FAD-GDHの特定のアミノ酸残基を置換することにより、その熱安定性が顕著に高まることを見いだした。すなわち、本発明は、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号2で表されるアミノ酸配列において1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、N176K,N176R、N176E、N176S、N225K、N225E、N259K,N301K、N326K、N326E、N330K、N330S、N355K、N355E、S514GまたはS552C、またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有する蛋白質を提供する。好ましくは、本発明の蛋白質はさらに、G53A、E166R、T168P、N487S、S490P、N492T、A496E、D500E、V502LおよびA505Nからなる群より選択される1またはそれ以上の変異を有する。特に好ましくは、本発明の蛋白質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、N176K/S490P/D500E/S514G/S552C、N176K/A496E/D500E/S514G/S552C、N176K/S514G/S552C、S514G/S552C、G53A/S514G/S552Cからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。さらに好ましくは、本発明の蛋白質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、N176K/N301K/N330K/S514G/S552C、N176R/N301K/N330K/S514G/S552C、N176R/N225E/N301K/N326E/N330K/N355E/S514G/S552C、N176K/S490P/D500E/S514G/S552C、およびE166R/T168P/N176R/N301K/N330K/S490P/D500E/S514G/S552Cからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。別の観点においては、本発明は、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号4で表されるアミノ酸配列において1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、V149CおよびG190Cのアミノ酸変異を有する蛋白質を提供する。また別の観点においては、本発明は、真菌由来のグルコース脱水素酵素であって、そのアミノ酸配列を配列番号4で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたときに配列番号4で表されるアミノ酸配列のV149およびG190に相当する位置のアミノ酸が両方ともシステインで置き換えられていることを特徴とするグルコース脱水素酵素を提供する。好ましくは、本発明の真菌由来のグルコース脱水素酵素は、配列番号2および5-9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号4で表されるアミノ酸配列のV149およびG190に相当する位置のアミノ酸が両方ともシステインで置き換えられている。さらに別の観点においては、本発明は、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号2で表されるアミノ酸配列において1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、A150C/T192Cのアミノ酸変異を有する蛋白質を提供する。また別の観点においては、本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、ならびに該組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体を提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクターで形質転換した形質転換体を培養して、該培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする、グルコース脱水素酵素の製造方法を提供する。さらに別の観点においては、本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素を用いて試料中のグルコース濃度を測定することを特徴とするグルコース分析方法を提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキットを提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素が電極表面に固定化されている酵素電極、ならびに該酵素電極を作用極として用いることを特徴とするグルコースセンサーを提供する。さらに別の観点においては、本発明は、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号2で表されるアミノ酸配列において1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース酸化酵素活性を示さずかつグルコース脱水素酵素活性を有し、キシロースに対する反応性がグルコースに対する反応性の20以下であることを特徴とするグルコース脱水素酵素を用いる、溶存酸素の影響を受けないグルコース計測用のバイオセンサーを提供する。ボトリオチニアフケリアナ由来FAD-GDH本発明においては、ボトリオチニアフケリアナのもつFAD-GDHが同定された。そのアミノ酸配列は配列番号1に示される。ボトリオチニアフケリアナのゲノム配列は公開されているが、ボトリオチニアフケリアナがFAD-GDHを有するという報告はこれまでになく、またFAD-GDHとしてアノーテーションされた遺伝子もなかった。配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、従来はグルコースオキシダーゼGODであると推定されていたがRolkeetalMolPlantPathol5p17272004、本発明者は、この蛋白質はGODではなくGDHであることを初めて明らかにした。GDHは、GODと異なり、グルコース測定において溶存酸素の影響を受けないため、グルコース計測用のバイオセンサーの認識素子として有用である。配列番号1で示されるアミノ酸配列は、既知の真菌由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列と約30~60の配列同一性を有し、例えば、アスペルギルスオリゼTI株由来グルコース脱水素酵素GenBankACW047791とは約57のアミノ酸同一性を有する。本発明においては、大腸菌で効率よく組換え発現させるために、配列番号1で示されるボトリオチニアフケリアナ由来の天然のFAD-GDHの推定シグナル配列であるN末端から17番目のSerまでを除去してMetを付加したアミノ酸配列配列番号2を作製した。ボトリオチニアフケリアナ由来改変型FAD-GDH本発明者は、配列番号2で表されるアミノ酸配列のN176KS514GまたはS552Cの変異、またはS514G/S552Cの二重変異およびN176KS514G/S552Cの三重変異を有する改変型FAD-GDHが、野生型FAD-GDHと比較して大腸菌における高い生産性を示し、特にN176KS514G/S552Cの三重変異を有する改変型FAD-GDHは、高い生産性とともに高い酵素活性を示すことを見いだした。なお、本明細書においては、ボトリオチニアフケリアナ由来FAD-GDHのアミノ酸配列中のアミノ酸変異の位置は、配列番号2のアミノ酸配列の1番目のMetを1として番号付けする。また、本明細書においては、アミノ酸の変異ないし置換は、元のアミノ酸残基とアミノ酸の位置と置換後のアミノ酸残基とをこの順序で示すことにより表記し、例えば、S514Gとは、514番目のSがGに置き換えられていることを示す。二重またはそれ以上の変異の組み合わせは/の記号で表す。本明細書において用いる場合、大腸菌における生産性が高い酵素とは、大腸菌を宿主として組換え発現させて、その培養物から酵素を単離したときに、培養液単位容量あたりに得られる酵素の単位容量あたりの活性ULが高いことを特徴とする酵素分子を意味する。生産性が高ければ、より小さい培養装置でより低いコストで、酵素を組換え製造することができる。酵素の生産性には、その酵素が有するアミノ酸配列に基づき、蛋白質としての水溶性の違い、フォルディング効率の違い、さらには単位蛋白質あたりの酵素活性の違い、酵素の安定性の違いなどが総合的に反映される。さらに、培養液単位容量あたりの宿主における組換え発現の速度、インクルージョンボディを形成のしやすさ菌体内および精製工程における酵素の安定性などにも当該酵素のアミノ酸配列が関与している。さらに、ボトリオチニアフケリアナ由来改変型FAD-GDHにおいて、N176K,N176R、N176E、N176S、N225K、N225E、N259K,N301K、N326K、N326E、N330K、N330S、N355K、N355E、S514GまたはS552Cの変異と、G53A、E166R、T168P、N487S,S490P,N492T,A496E,D500E,V502LおよびA505Nからなる群より選択される1またはそれ以上の変異とを組み合わせた多重変異を有することが好ましい。これらの多重変異酵素のうち、好ましいものはN176K/S490P/D500E/S514G/S552C、G53A/N176K/S490P/D500E/S514G/S552C、N176K/A496E/D500E/S514G/S552C、N176K/A496E/D500E/V502L/S514G/S552C、G53A/N176K/A496E/D500E/V502L/S514G/S552C、N176K/S514G/S552C、S514G/S552CおよびG53A/S514G/S552Cであり、特に好ましいものはN176K/S490P/D500E/S514G/S552C、N176K/A496E/D500E/S514G/S552C、N176K/S514G/S552C、S514G/S552CおよびG53A/S514G/S552Cである。とりわけ好ましいものは、N176K/N301K/N330K/S514G/S552C、N176R/N301K/N330K/S514G/S552C、N176R/N225E/N301K/N326E/N330K/N355E/S514G/S552C、N176K/S490P/D500E/S514G/S552C、およびE166R/T168P/N176R/N301K/N330K/S490P/D500E/S514G/S552Cである。また、これらのボトリオチニアフケリアナ由来改変型FAD-GDHは、アスペルギルスオリゼTI株由来のFAD-GDHと比較して、キシロースに対するグルコースの選択性がより高かった。熱安定性が向上した改変型FAD-GDH本発明者は、配列番号4で示されるアスペルギルスオリゼTI株由来FAD-GDHの149番目のアミノ酸残基Vおよび190番目のアミノ酸残基Gの両方をCで置き換えることにより、野生型FAD-GDHと比較して熱安定性が顕著に高くなることを見いだした。アスペルギルスオリゼTI株由来FAD-GDHのアミノ酸配列は配列番号3に示される。本発明においては、大腸菌で効率よく組換え発現させるために、配列番号3で示されるアスペルギルスオリゼ由来の天然のFAD-GDHの推定シグナル配列であるN末端から23番目のLysまでを除去してMetを付加したアミノ酸配列配列番号4を作製した。本明細書においては、アスペルギルスオリゼ由来FAD-GDHのアミノ酸配列中のアミノ酸変異の位置は、配列番号4のアミノ酸配列の1番目のMetを1として番号付けする。本明細書において用いる場合、熱安定性とは、酵素を高温例えば、45°C、50°C、55°C、60°Cなどで所定時間インキュベーションした後に酵素活性を測定したときに、経時的な酵素活性の低減が少ないことをいう。熱安定性は、例えば、所定温度で所定時間インキュベーションしたときの残存活性により、あるいは、インキュベーション時間に対して酵素活性をプロットして得られる曲線失活曲線の傾きから求めた失活の速度定数および/または酵素活性の半減期により表すことができる。本発明の改変型FAD-GDHは、グルコース脱水素酵素活性を有する限り、配列番号4の149番目および190番目のアミノ酸残基の変異に加えて、さらに別の変異を有していてもよい。例えば、配列番号4のアミノ酸残基の1またはそれ以上、例えば1~10個が任意に他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよい。本発明者はさらに、ボトリオチニアフケリアナならびに他の真菌に由来するFAD-GDHについても、アスペルギルスオリゼTI株由来FAD-GDHの149番目および190番目のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を両方ともシステインに置換することにより、同様に熱安定性が高まることを見いだした。真菌由来のいくつかのFAD-GDHのアミノ酸配列のアライメントを図1に示す。この図では、各酵素のアミノ酸配列からN末端のシグナルペプチドであると推定される領域を除去して、N末端にメチオニンが付加された配列が示される。アスペルギルスオリゼTI株由来FAD-GDHの149番目のアミノ酸残基Vおよび190番目のアミノ酸残基Gに相当するアミノ酸残基は太字で示される。本発明においては、これらの酵素すべてについて、記載されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成し、大腸菌で組換え発現させて、GDH活性があることを確認した。また、下記の実施例8に示されるように、これらの酵素についても、アスペルギルスオリゼTI株由来FAD-GDHの149番目のアミノ酸残基Vおよび190番目のアミノ酸残基Gに相当するアミノ酸残基を両方ともCで置き換えることにより、熱安定性が向上した。これらの改変型FAD-GDHの中には、野生型の酵素と比較して酵素活性が低下したものもあるが、熱安定性が高まることにより酵素の精製や保存の間の失活が少なくなるため、工業的規模での生産性の観点からみてなお有益である。さらに、酵素活性や大腸菌における生産性を高める別の変異と組み合わせることにより、工業的規模での生産性の高い改変型FAD-GDHを開発することも可能である。当業者であれば、図1に例示される真菌以外の真菌に由来するFAD-GDHにおいても、定法にしたがってアミノ酸配列のアライメントを作製することにより、アスペルギルスオリゼTI株由来FAD-GDHの149番目のアミノ酸残基Vおよび190番目のアミノ酸残基Gに相当する位置のアミノ酸残基を理解し、これらの残基をCで置き換えることにより、熱安定性が向上したFAD-GDHを得ることができる。本明細書において用いる場合、に相当する位置のアミノ酸残基との表現は、目的とする蛋白質のアミノ酸配列を参照蛋白質のアミノ酸配列とアライメントさせたときに、参照蛋白質の特定のアミノ酸残基に対応する位置に存在するアミノ酸残基を意味する。アライメントは、当該技術分野において知られる多くのソフトウエアのいずれを用いてもよく、例えば、VectorNTIにより提供されるAlignXソフトウエアVectorNTIabalancedallinonesequenceanalysissuiteBriefBioinform537888をデフォルトのパラメータで用いることができる。FAD-GDHの製造方法本発明のFAD-GDHは、当該技術分野においてよく知られる手法を用いて組換え発現により製造することができる。ボトリオチニアフケリアナ由来の天然のFAD-GDHおよびアスペルギルスオリゼTI由来のFAD-GDHをコードする遺伝子の配列は、それぞれ配列番号2および4に記載されるアミノ酸配列に基づいて容易に決定することができる。FAD-GDHをコードする遺伝子は、ボトリオチニアフケリアナまたはアスペルギルスオリゼのゲノムからクローニングしてもよく、一連の化学合成されたオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより製造してもよく、または自動化DNA合成機などを用いて全合成してもよい。遺伝子配列は、用いる宿主生物においてより高い発現レベルが達成されるようにコドンを選択して、適宜設計または改変することが望ましい。特定の宿主生物におけるコドン使用の特徴は、当該技術分野においてよく知られている。本発明の改変型FAD-GDHをコードする遺伝子は、天然のFAD-GDHをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば適切に設計されたプライマーを用いるPCRによって行うことができる。あるいは、改変型のアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成してもよい。本発明のFAD-GDHにおいては、所望のグルコース脱水素酵素活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部またはそれ以上が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。さらに、そのような改変型FAD-GDHは好ましくは天然のFAD-GDHと少なくとも80の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性は少なくとも85であり、より好ましくは少なくとも90であり、さらに好ましくは少なくとも95である。このようにして得た遺伝子を適当な発現のベクターに挿入し、これを適当な宿主例えば大腸菌に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。糖鎖が結合したグルコース脱水素酵素の製造が望ましい場合には、真核生物細胞を宿主として用いる。得られた形質転換体を定法にしたがって培養し、細胞または培養液からFAD-GDHを回収することができる。本発明の1つの好ましい態様においては、大腸菌の形質転換体をFWilliamStudieretalProteinExpressionandPurificationにZYPbrothとして記載されている培地以下A培地にて培養する。すなわち、一般的に大腸菌の培地に用いられるLB培地にさらに05グリセロール、005グルコース、02アルファ-ラクトース、25mM2SO4、100mMKH2PO4、100mMNaHPO4、1mMMgSO4を加えた培地である。A培地で、15°Cから25°C、好ましくは約20°Cで培養して、組換え蛋白質を発現させる。このことにより、慣用のIPTG誘導法を用いた場合よりも、高い生産性を得ることができる。さらに、本発明の変異酵素を、蛋白質のフォールディングを促進することが知られているシャペロンGroELおよびGroESと共発現させることにより、さらに高い生産性を得ることができる。シャペロンとの共発現は、例えば、本発明の変異酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターを、GroELおよびGroES遺伝子をアラビノース誘導下に発現するベクター例えば市販のシャペロンベクターpGro7、TaKaRaとともに大腸菌に導入して培養し、形質転換体がある程度増殖した後にアラビノースを加えてシャペロンの発現を誘導することにより行うことができる。このようにして得られた組換えFAD-GDHは、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、免疫沈殿、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析などの当該技術分野において知られる精製手法の任意のものを用いて精製することができる。酵素活性の測定方法本発明のFAD-GDHは、FADを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。本発明のFAD-GDHのグルコース脱水素酵素活性は、脱水素酵素によるグルコースの酸化に伴って還元されるFADの量を、酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、PMSフェナジンメトサルフェート、DCIP2,6-ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。また、本発明のFAD-GDHのグルコース酸化活性測定は、脱水素酵素と基質の反応により生成する過酸化水素を定量することにより行うことができる。過酸化水素の測定は、例えば、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬、4アミノアンチピリンを用いて、生成する色素の吸光度の経時変化を測定することにより行うことができる。グルコースに対する選択性本発明のFAD-GDHのグルコースに対する選択性は、基質として、マンノース、ガラクトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。本発明のFAD-GDHはグルコースに対する選択性が高く、特にマルトースおよびガラクトースに対する反応性は測定限界以下であった。したがって、本発明のFAD-GDHを用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーはグルコース測定に関して選択性が高く、被検試料にマルトース等の他の糖が含まれているかその可能性がある場合にも、高感度でグルコースが検出できるという利点を有する。さらに、本発明のFAD-GDHはキシロースに対して反応性が低いという特徴を有する。このことは、キシロース吸収試験を実施している場合においても血糖値が正確に測定できるという利点を提供する。グルコースアッセイキット本発明はまた、本発明に従うFAD-GDHを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うFAD-GDHを少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のFAD-GDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うFAD-GDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。グルコースセンサー本発明はまた、本発明に従うFAD-GDHがその表面に固定化されている酵素電極、ならびにこの酵素電極を用いるグルコースセンサーを提供する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。これらの電極はカーボン電極であればスクリーンプリント印刷等によって作成される電極、および金、白金電極であればスパッタリングにより作成される電極でもよい。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のFAD-GDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート、ルテニウム錯体、などを用いることができる。作用電極として本発明のFAD-GDHを固定化した電極を用い、対極例えば白金電極および必要に応じて参照電極例えばAg/AgCl電極を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。本発明のFAD-GDHは、血糖値のアッセイ装置において用いるのに特に有用である。アッセイ装置は、一般に市販されている血糖値測定用のアンペロメトリーバイオセンサーテストストリップと同様の構造とすることができる。一例として、アッセイ装置は、絶縁体上に装着された2つの電極作用極および参照極、試薬ポートおよびサンプル受容部を有する。試薬ポートには、本発明のFAD-GDHおよびメディエーターを入れる。血液サンプルなどのサンプルをサンプル受容部に加えると、サンプル中に含まれるグルコースがFAD-GDHと反応して電流が生じ、この電流の値から血中グルコース濃度血糖値を求めることができる。電気化学的検出の他、光学センサーを用いてグルコースを測定することもできる。本明細書において用いる場合、を含むcomprisingとの表現により表される態様は、本質的にからなるessentiallyconsistingofとの表現により表される態様、ならびにからなるconsistingofとの表現により表される態様を包含する。本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが,これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例1ボトリオチニアフケリアナ由来グルコース脱水素酵素およびアスペルギルスオリゼ由来グルコース脱水素酵素の組換え遺伝子の調製ボトリオチニアフケリアナ由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号1に示される。N末端から17番目のSerまではシグナルペプチドであると推定できる。例えば、シグナル配列切断部位を予測するための方法としてフリーアクセスサーバSignalP30ServerhttpwwwcbsdtudkservicesSignalP30を活用できる。このサーバはTheCenterforBiologicalSequenceAnalysisattheTechnicalUniversityofDenmarkにおいて運営されており、以下に記す論文に記載された方法論に基づき、任意のアミノ酸配列に対して、シグナル配列の存在の可能性を検索し、その切断部位を予想する。IdentificationofprokaryoticandeukaryoticsignalpeptidesandpredictionoftheircleavagesitesHenrikNielsenJacobEngelbrechtSorenBrunakandGunnarvonHeijneProteinEngineering10161997。SignalP30Serverを用いる予測にしたがえば、N末端から17番目のSerまではシグナルペプチドであると推定されるので、開始メチオニンの下流に18番目のThr以降の配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した。この遺伝子によりコードされる蛋白質以下BfuGDHと称するのアミノ酸配列を配列番号2に示す。アスペルギルスオリゼTI株由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号3に示される。SignalP30Serverを用いる予測にしたがえば、N末端から23番目のLysまではシグナルペプチドであると推定されるので、開始メチオニンの下流に24番目のAsn以降の配列を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を設計して、全合成した。この遺伝子によりコードされる蛋白質以下AoGDHと称するのアミノ酸配列を配列番号4に示す。組換え生産の宿主としては大腸菌BL21[F-ompThsdSBgaldcm;Novagen]を用いた。遺伝子発現ベクターとしてはpET30c[kanlacI;Novagen]を、シャペロン共発現用ベクターとしてはpGro7[GroELGroES;TaKaRa]をそれぞれ用いた。実施例2酵素活性の測定本発明のFAD-GDHのグルコース脱水素酵素活性は、脱水素酵素と基質の反応により還元されるDCIP2,2’-ジクロルジイソプロピルエーテルの退色を600nmでの吸光度の経時変化を定量することにより行った。反応条件は断りの無い限り以下の条件で行った。酵素溶液を含む反応溶液06mMPMS006mMDCIP濃度は全て終濃度に基質を加えることで反応を開始し、600nmの吸光度変化を測定した。基質には終濃度50mMグルコースを用い、1μmolのDCIPを還元させる酵素量を1Unitとし、以下の式より活性値を算出した。DCIPのpH70におけるモル吸光係数は163mM1cm1とした。ユニットml=ΔABSmin×1163×10本発明のFAD-GDHのグルコース酸化活性測定は、脱水素酵素と基質の反応により生成する過酸化水素を、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬、4アミノアンチピリンを用いて、生成する色素の546nmにおける吸光度の経時変化を測定することにより行った。反応条件は断りの無い限り以下の条件で行った。酵素溶液を含む反応溶液15mM4アミノアンチピリン15mMTODB2Umlペルオキシダーゼ、濃度は全て終濃度に基質を加えることで反応を開始し、546nmの吸光度変化を測定した。基質には終濃度50mMグルコースを用い、1分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Unitとした。TODBのpH70におけるモル吸光定数には38mM1cm1を用いた。以下に吸光度変化から活性値を算出する式を示す。ユニットml=ΔABS/min×238×10ユニットmg=Unit/ml/蛋白質mgml実施例3培養条件の検討及び粗精製酵素標品の調製1.IPTG誘導を用いたBfuGDHの生産BfuGDHをコードする遺伝子を挿入した発現ベクターpET30cを用いて、大腸菌BL21を形質転換した。得られた形質転換体BL21pET30cを3mLLB培地に植菌し、一晩37°Cで振とう培養した。その後、LB培地カナマイシンKm50μgmL100mLに前培養液1mlを植菌し、37°Cでバッフル付三角フラスコを用いて、180rpmで振とう培養を行なった。培養液のOD660が06付近になった時点でIPTGを添加して、BfuGDHの発現誘導を行った。添加後は20°Cで培養を行い、培養開始後14時間で培養を終えた。培養中、数時間ごとに培養液300μlを回収し、集菌した菌体に60μlのバグバスター試薬BugBusterReagentを加え、20分間、4°Cで振盪し、菌体を溶菌させた。その後、10mMリン酸カリウムを60μl加え、遠心して上清を回収し、その上清を粗精製酵素標品として、酵素活性を測定した。酵素活性は菌体の濃度とともに上昇し、培養終了時には培養液1Lあたり65Uとなった。このとき、比活性は015Umgであり、菌体濃度はOD660=40であった。2.A培地を用いるBfuGDHの生産A培地を用いるBfuGDHの生産を行った。BfuGDHをコードする遺伝子を挿入した発現ベクターpET30cを用いて大腸菌BL21を形質転換した。得られた形質転換体BL21pET30cを3mLLB培地に植菌し、一晩37°Cで振とう培養した。その後、下記A培地Km50μgmL100mLに前培養液1mlを植菌し、20°Cで坂口フラスコを用いて、120rpmで振とう培養を行なった。A培地LB培地05グリセロール、005グルコース、02αラクトース、25mM2SO4、100mMKH2PO4、100mMNaHPO4、1mMMgSO4ZYP培地;FWilliamStudieretalProteinExpressionandPurificationして上清を回収し、その上清を粗精製酵素標品としてその活性を測定した。BfuGDHはGDH活性を有する水溶性酵素として発現された。培養、酵素生産曲線を図2に示す。培養開始から24時間後にOD660が大幅に増加し、28時間を過ぎたころには約21で増加は止まった。酵素活性は24時間ごろから増加し、32時間後には培養液1Lあたり約2200Uとなり、増加は止まった。タンパク質濃度は24時間後には22mgmlであり、36時間後には約30mgmlとなり、増加は止まった。A培地で培養することにより得られたボトリオチニアフケリアナ由来グルコース脱水素酵素の粗精製酵素標品の酵素活性を測定した結果、グルコース脱水素酵素活性のみが確認され、グルコース酸化酵素活性は検出されなかった。これまで、ボトリオチニアフケリアナ由来の当該遺伝子は既報の学術論文においてグルコース酸化酵素として報告されているが、本結果により、同遺伝子がコードしている蛋白質はグルコース脱水素酵素であることが初めて示され、実施例4に記されるように、キシロースに対する反応性が低い新しいグルコース脱水素酵素を調製する方法が開示される。培養開始後40時間において菌体量の増加だけではなく、単位タンパク質あたりの酵素の生産性が18Umgタンパク質となり、IPTG系の12倍に達していた。その結果として培養液1Lあたり2200Uの酵素生産量が得られ、IPTG系の34倍であった。すなわち、A培地を用いるとIPTG系よりさらに効率的にBfuGDHを組み換え生産できることがわかった。3.A培地ならびにシャペロンとの共発現によるBfuGDHの生産BfuGDHのコドン修正遺伝子を挿入したpET30cを用いて、シャペロンベクターpGro7が既に導入されている大腸菌BL21pGro7を形質転換した。pGro7は、蛋白質のフォールディングを促進することが知られているシャペロンGroELおよびGroESをアラビノース誘導下に発現するベクターである。得られた形質転換体BL21pET30cpGro7を3mLLB培地に植菌し、一晩37°Cで振とう培養した。その後、Km50μgmL、クロラムフェニコールCm50μgmLを含むA培地100mLに前培養液1mlを植菌し、20°Cで坂口フラスコを用いて、120rpmで振とう培養を行なった。pGro7の発現誘導はアラビノースの添加により行った。アラビノースの添加は培養開始時、培養開始12時間後、培養開始24時間後と添加時間を変えて検討を行った。培養中、任意の時間ごとに培養液300μlを回収し、上記と同様の方法で粗精製酵素標品を調製した。アラビノースを培養開始時、12時間後、24時間後に添加し、それぞれ培養した結果、培養開始から24時間後にOD660が大幅に増加し、32時間を過ぎたころにはOD660はそれぞれ約27、約28、約26となり増加は止まった。また、酵素活性は24時間ごろから増加し、40時間後にはそれぞれ培養液1Lあたり約2500UL、2600UL、1300ULとなり、増加は止まった。タンパク質濃度は24時間後でそれぞれ18mgml、20mgml、19mgmlであった。アラビノースを培養開始時に添加した場合、36時間後には約32mgmlで増加は止まったが、アラビノースを12時間後、24時間後に添加した場合、タンパク質濃度は48時間後まで徐々に増加していた。これらの結果は、シャペロンとの共発現によりBfuGDHの生産性が向上したことを示す。実施例4基質特異性の評価上記実施例3のA培地を用いて得られた酵素について、グルコース、マルトース、キシロースおよびガラクトースを基質として基質特異性を測定した。その結果、基質濃度5mMにおいてグルコースを100とした時のBfuGDHの脱水素酵素活性はマルトース、ガラクトースでは検出できず、キシロースでは13であった。同じ条件でのAoGDHのグルコースを100とした時のキシロースの脱水素酵素活性は21であった。よってBfuGDHは既に報告されているAoGDHよりキシロースに対する酵素活性が低いことが示された。実施例5BfuGDHへの変異導入部位特異的変異導入はQuikChange登録商標法により行った。QuikChange登録商標法では、実施例1で作製したpET30cBfuGDHをテンプレートとし、変異導入用プライマーによりPCR増幅を行った。続いてPCR後の試料にDpnIを加え37°C、60分間インキュベートすることでテンプレートDNAのみを消化し、この試料を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。LB寒天培地により一晩培養後、任意に選んだクローンからプラスミドを抽出し、シークエンス解析により目的の変異が導入されていることを確認した。得られたPCR断片をNdeI、HindIII消化し、同制限酵素消化したpET30cとライゲーションし、この試料を用いて大腸菌BL21を形質転換した。LB寒天培地により一晩培養後、任意に選んだクローンからプラスミドを抽出し、シークエンス解析により変異導入を確認した。このようにして、以下の変異酵素を発現する形質転換体を得た:Bfu-GDHG53A、N176K、N176R、N176E、N176S、S514G、S552C、G53A/S514G、S514G/S552C、G53A/S514G/S552C。さらに、S514G、S552C、またはこれらの二重変異S514G/S552Cと、N176K、N176R、N176E、N176S、N225K、N259K、N301K、N326K、N330K、N355K、N487S、T488E、V489I、S490P、N492T、T494A、E495D、A496E、E497K、F499V、D500E、V502L、T504A、A505Nの変異とを種々に組み合わせた多重変異を設計し、これらの変異酵素を発現する形質転換体を作製した:N176K/S490P/D500E/S514G/S552C、N176K/A496E/D500E/S514G/S552C、N176K/S514G/S552C、S514G/S552C、G53A/S514G/S552C。実施例6変異酵素の生産および活性測定各変異酵素を発現する形質転換体BL21を前培養した。300mlバッフル付きフラスコを用いA培地60mlに対し1量殖菌し、20°C、28時間、125rpmの条件で振とう培養を行った。培地50mlを集菌後、湿菌体1gに5mlの割合でBugBuster登録商標蛋白質抽出試薬Novagenを加え懸濁し、ゆるやかに振とうしながら室温で15分間インキュベートを行った。遠心15Krpm4°C20分間により不溶性分画を除去後、得られた上清を20mMリン酸カリウム緩衝液で4°Cで一晩透析した。透析終了後に遠心を行い、その上清を粗精製酵素標品とした。不溶性分画は、懸濁液2ml分の不溶性分画に対し20mMリン酸カリウム緩衝液を1mの割合で懸濁した。いくつかの多重変異酵素については、小スケールの発現系を用いた。各変異酵素を発現する形質転換体BL21を前培養し、A培地3mlに1vol量を殖菌した。37°Cで4時間振とう培養後、20°Cで20時間振とう培養を行った。培養後2mlの培地を集菌し400μlのBugBuster登録商標を加え懸濁後に室温で15分間振とうした。その後、遠心15000rpm4°C20分間を行い、得られた上清を粗精製酵素標品とした。GDH活性測定はDCIPPMS系で緩衝液は20mMリン酸カリウム緩衝液を使用し、基質としてグルコースGlc;124102040mMキシロースXyl;440mMを使用した。結果を表1に示す。表中の数値は、比活性U/mgおよび生産性U/Lは40mMのグルコースを基質として、同一条件で行った数回分のデータの平均値である。また得られた粗精製酵素を用いて、基質グルコース;124102040mM濃度と活性との相関を観察し、そこから求められる飽和曲線から得られるミカエルリスメンテン定数Km値およびみかけの最大活性Vmaxを求めた。なお、本件の優先権基礎出願の表1および表2に記載される活性の値は吸光度のデータから活性値を求める計算において誤りがあった。下記の表1および2では正しい値が示される。N176K、N176R、N176E、N176S、S514GおよびS552Cの変異体は、対照Bfu-GDHと比較して、生産性、酵素活性ともに増加していた。S514G/S552Cの二重変異体では、さらに高い生産量および酵素活性が得られた。N176K、N176R、N176E、N176S、変異体はS514G/S552Cとの複合変異体では非常に高い生産性が得られた。G53A変異体は、単独変異体およびG53A/S514Gの二重変異体では対照と同等の生産性を示したが、G53A/S514G/S552C複合変異体では非常に高い生産性が得られた。S514GおよびS514G/S552Cとさらに別の変異を組み合わせた多重変異体についての結果を表2に示す。表中の数値は、比活性U/mgおよび生産性U/Lは40mMのグルコースを基質として、同一条件で行った数回分のデータの平均値である。また得られた粗精製酵素を用いて、基質グルコース;1,2,4,10,20,40mM濃度と活性との相関を観察し、そこから求められる飽和曲線から得られるミカエルリスメンテン定数Km値およびみかけの最大活性Vmaxを求めた。表2に示されるように、多くの多重変異体においてS514G単独変異およびS514G/S552Cよりも高い生産性が得られた。特に、N176K/S490P/D500E/S514G/S552C、N176K/A496E/D500E/S514G/S552C、N176K/S514G/S552C、S514G/S552C、G53A/S514G/S552Cについては、非常に高い生産性ならびに酵素活性が認められた。野性型の酵素、ならびにこれらの変異体のグルコースに対する活性とキシロースに対する活性を調べたところ、キシロースへの反応性はグルコースの20以下、あるいは15以下であり、グルコースに対して基質特異性の高い酵素であった。また、これらの酵素のマルトースならびにガラクトースに対する活性は検出されなかった。同様にして、さらなる多重変異体を作成して、その活性を測定した。また、これらの酵素を含む溶液を40°Cで10分放置した後の残存活性を測定することにより、熱安定性を評価した。表3に示されるように、Asn176Lys/Arg,Asn225Glu,Asn326Glu,Asn339Lys/Ser,Asn355Lys/Gluと、S514G/S552Cとの複合変異体が高い生産性および活性を有することが確認された。熱安定性については、Asn176LysArgでは6~8程度、Asn225Gluでは4程度の残存活性が観察された。次にこれらの活性向上に効果があった変異を組み合わせた変異酵素を構築し、生産性活性ならびに安定性について検討した。結果を表4に示す。これらの変異の組み合わせの中で特に、Asn176Lys/Asn301Lys/Asn330Lys/S514G/S552C、Asn176Arg/Asn301Lys/Asn330Lys/S514G/S552CおよびAsn176Arg/Asn225Glu/Asn301Lys/Asn326Glu/Asn330/Asn355Glus/S514G/S552Cの3種が生産性活性も高く、また安定性にも相乗効果が現れていることが確認できた。生産性はいずれの酵素も30000UL程度が達成され、みかけのVmaxKm値も向上している。安定性についても40°C溶液中10分放置後の残存活性は10~13程度まで向上していた。さらに、種々の変異の組み合わせを作成して、生産性活性および安定性を調べたところ、下記の表4に示す複合変異体が特に高い生産性活性および安定性を持っていた。中でも、Glu166Arg/Thr168Pro/Asn176Arg/Asn301Lys/Asn330Lys/Ser490Glu/Asp500Glu/Ser514Glys/Ser552Cysが高いVmax/Km値を示し、かつ高い熱安定性を示した。この酵素は40°C溶液中での10分インキュベーション後の残存活性が100であり、失活が観察されなかった。45°C、10分後でも40弱の残存活性が観察された。実施例7AoGDHへの分子内SS結合の導入酵素の熱安定性の向上を目的として、AoGDHの種々のアミノ酸をシステインに変異させた各種変異体を作製し、その酵素活性および熱安定性を調べた。変異の導入および酵素活性の測定は実施例5と同様にして行った。熱安定性試験は次のようにして行った。45°Cにした20mMリン酸カリウム緩衝液800μlに上記粗精製酵素標品を200μl加え混和し、すぐに、予め45°Cに加熱しておいた20mMリン酸カリウム緩衝液100μlに対して100μlを加えた終濃度10倍希釈。添加後、45°Cで2510152025または30分間のインキュベーションを行った。所定時間経過後、速やかに氷中で冷却した。GDH活性測定は、DCIPPMS系で緩衝液は20mMリン酸カリウム緩衝液を使用し、基質はGlc40mMを使用した。その結果、配列番号4で示されるアスペルギルスオリゼTI株由来FAD-GDHの149番目のアミノ酸残基Vおよび190番目のアミノ酸残基Gが両方ともCで置き換えられている改変型酵素が、特に高い熱安定性ならびに生産性を示すことが見いだされた。図3に示されるように、AoGDHの場合には時間とともに活性が低下していったが、V149C/G190Cは急速に30程度に低下したのち15程度で一定になった。V149CまたはG190Cの単独変異では生産性活性の上昇には寄与しないことから、かかる熱安定性の向上は、分子内でS-S結合が形成されているためであると推定される。図4に、野生型酵素およびV149C/G190C変異酵素ならびに参考としてG190C変異酵素のS-V曲線を示す。また、Km値およびVmax値を下記の表6に示す。これらの結果から、V149C/G190C変異酵素は野生型と比較して酵素活性も高いことがわかる。分子内SS結合の形成により基質ポケットの状態が変わって活性が上昇したのか、あるいは熱安定性が向上したことにより酵素の見かけ上の残存活性が向上したのかは、現在のところ不明である。実施例8BfuGDHおよび他の真菌由来GDHへの分子内SS結合の導入実施例7の結果に基づいて、配列番号2で示されるボトリオチニアフケリアナ由来FAD-GDHの150番目のアミノ酸残基Aおよび192番目のアミノ酸残基Tが両方ともCで置き換えられている改変型酵素A150CT192Cを作製したところ、高い熱安定性を示すことが見いだされた。さらに、かかる変異と、実施例6で高い生産性を示したいくつかの変異とを組み合わせた多重変異体を作製し、これらの変異体についても同様にして酵素活性および熱安定性を評価した。図5にBfuGDHのA150CT192C変異体の熱安定性を示す。BfuGDHにA150CT192Cおよびこの変異を含む多重変異を導入すると、酵素活性は同等もしくは低下していたが、熱安定性の向上が認められた。45°Cで熱処理すると、直後にはすべて活性が下がったが、その後活性低下速度が遅くなった。なお、これらの変異の導入によりグルコース/キシロースの選択性には影響が見られなかった。さらに、図1に示す配列を有するスクレノチニアスクレロチオラムSclenotiniasclerotiorumおよびアスペルギルスニガーAspergillusnigar40715のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を合成しそれぞれ配列番号7および8、大腸菌で発現させた。また、それぞれA150CT191CおよびY150CG191Cの変異を導入した変異酵素も作製し、同様にして酵素活性および熱安定性を評価した。作製した各変異体の熱安定性を、所定の測定時間における失活曲線から導き出される失活の速度定数kおよびそこから計算される半減期t12で表した結果を表7に示す。実施例6酵素センサーの作製および評価アスペルギルスオリゼTI株由来V149C/G190C変異酵素およびボトリオチニアフケリアナ由来S514G/S552C変異酵素を用いて酵素電極を作製した。5ユニットの本発明の改変型FAD-GDHにカーボンペースト20mgを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約40mg充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を1のグルタルアルデヒドを含む10mMMOPS緩衝液pH7.0中で室温で30分間処理した後、20mMリジンを含む10mMMOPS緩衝液pH7.0中で室温で20分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を10mMMOPS緩衝液pH7.0中で室温で1時間以上平衡化させた。電極は4°Cで保存した。作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型FAD-GDHを固定化した酵素センサーを用いて、0.1mM-5mMの範囲でグルコースの定量を行うことができた。"