"標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法であって、架橋DNAを断片化するステップ、断片化された架橋DNAを連結させるステップ、架橋を逆行させるステップ、及び標的ヌクレオチド配列を含む連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び決定した配列を使用して対象のゲノム領域の配列を構築するステップを含む方法。標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法であって、a架橋DNAのサンプルを提供するステップ、b架橋DNAを断片化するステップ、c断片化された架橋DNAを連結させるステップ、d架橋を逆行させるステップ、e場合によっては、好ましくは制限酵素で、ステップdのDNAを断片化するステップ、f場合によっては、少なくとも1つのアダプターとステップd又はeの断片化されたDNAを連結させるステップ、g場合によっては、及び好ましくは、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップd又はeの連結DNA断片を増幅する、又は標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマー、及び少なくとも1つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用してステップfの連結DNA断片を増幅するステップ、h好ましくはハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップd、e、f又はgの増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、i決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む方法。標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法であって、a架橋DNAのサンプルを提供するステップ、b架橋DNAを断片化するステップ、c断片化された架橋DNAを連結させるステップ、d架橋を逆行させるステップ、e場合によっては、好ましくは制限酵素で、ステップdのDNAを断片化するステップ、fステップd又はeのDNAを環状化するステップ、g場合によっては、及び好ましくは、標的ヌクレオチド配列を含む環状化されたDNAを、好ましくは標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用して、増幅するステップ、hハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、i決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む方法。対象のゲノム領域が1つ以上の標的ヌクレオチド配列をさらに含み、増幅ステップgにおいて、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするプライマーを提供し、対応する1つ以上の他の標的ヌクレオチド用の1つ以上のプライマーを提供し、プライマーを使用して、連結DNA断片を増幅し、又は環状化されたDNAを増幅する、請求項2又は3に記載の対象のゲノム領域の配列を決定するための方法。断片化ステップbが超音波処理、次に酵素によるDNA末端修復を含む、請求項2~4のいずれか一項に記載の方法。断片化ステップbが制限酵素による断片化ステップを含む、請求項2~4のいずれか一項に記載の方法。連結ステップcが、断片間にアダプター配列を連結するアダプターの存在下で実施される、請求項5又は6に記載の方法。ステップbにおいて複数のサブサンプルを処理し、それぞれのサブサンプル用に異なる認識部位を有する制限酵素を使用する、請求項6又は7に記載の方法。断片化ステップeが、ステップbの制限酵素の認識配列より長い認識配列を有する制限酵素を含む、請求項8に記載の方法。多重の対象のゲノム領域の配列を決定する、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。ステップgの少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマー中に識別子が含まれる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。増幅ステップgの前又は後にサイズ選択ステップを実施する、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。ゲル抽出クロマトグラフィー、ゲル電気泳動又は密度勾配遠心分離を使用してサイズ選択ステップを実施する、請求項12に記載の方法。20~20,0000塩基対、好ましくは50~10,0000塩基対の間、最も好ましくは100~3,000塩基対の間のサイズのDNAを選択する、請求項12又は13に記載の方法。対象のゲノム領域の細胞における倍数性が1を超える場合、それぞれの倍数性に関して、ステップiにおいてコンティグを構築する、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。コンティグを構築するステップiが、1ステップbの断片を同定するステップ、2ゲノム領域に断片を割り当てるステップ、3ゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。ゲノム領域に断片を割り当てるステップ2が、ステップfの異なる連結産物を同定するステップ、及び同定した断片に異なる連結産物をカップリングさせるステップを含む、請求項16に記載の方法。遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項1~17のいずれか一項に記載のステップa~iを含み、複数のサンプルのコンティグを構築し、以下のさらなるステップ:j複数のサンプルのコンティグをアラインメントするステップ、k複数のサンプル由来の対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、を含む方法。遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項1~17のいずれか一項に記載のステップa~iを含み、以下のさらなるステップ:j参照配列とコンティグをアラインメントするステップ、k対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、を含む方法。遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項1~14のいずれか一項に記載のステップa~hを含み、以下のさらなるステップ:i増幅された連結DNA断片の決定した配列と参照配列をアラインメントするステップ、j決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、を含む方法。遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項1~14のいずれか一項に記載のステップa~hを含み、増幅された連結DNA断片の複数のサンプル配列を決定し、以下のさらなるステップ:i複数のサンプルの増幅された連結DNA断片の決定した配列をアラインメントするステップ、j決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、を含む方法。異種である疑いがある細胞集団から遺伝子突然変異を保有する断片の割合を決定するための方法であって、請求項1~14のいずれか一項に記載のステップa~hを含み、以下のさらなるステップ:iステップbの断片を同定するステップ、j断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、k遺伝子突然変異を保有する断片の数を決定するステップ、l遺伝子突然変異を保有していない断片の数を決定するステップ、m遺伝子突然変異を保有する断片の割合を計算するステップ、を含む方法。異種である疑いがある細胞集団から遺伝子突然変異を有する断片を保有する連結産物の割合を決定するための方法であって、請求項1~14のいずれか一項に記載のステップa~hを含み、以下のさらなるステップ:iステップbの断片を同定するステップ、j断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、k遺伝子突然変異を有する又は有さない断片を保有する連結DNA断片を同定するステップ、l遺伝子突然変異を有する断片を保有する連結DNA断片の数を決定するステップ、m遺伝子突然変異を有さない断片を保有する連結産物の数を決定するステップ、n遺伝子突然変異を保有する連結産物の割合を計算するステップ、を含む方法。ステップjにおいて、参照配列とアラインメントすることによって、及び/又は複数のサンプルの断片配列を比較することによって、遺伝子突然変異の有無を同定する、請求項22又は23に記載の方法。遺伝子突然変異がSNP、欠失、挿入、逆位及び/又は転座である、請求項18~24のいずれか一項に記載の方法。欠失及び/又は挿入を有するサンプルからの断片及び/又は連結産物の数を、参照サンプルと比較することによって、欠失及び/又は挿入を同定する、請求項25に記載の方法。分析した断片における染色体切断部位の存在に基づいて、欠失、挿入、逆位及び/又は転座を同定する、請求項25に記載の方法。DNA断片、連結DNA断片、及び/又は対象のゲノム領域におけるメチル化ヌクレオチドの有無を決定する、請求項1~27のいずれか一項に記載の方法。本発明の一態様によれば、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法であって、架橋DNAを断片化するステップ、断片化された架橋DNAを連結させるステップ、架橋を逆行させるステップ、及び標的ヌクレオチド配列を含む連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び決定した配列を使用して対象のゲノム領域の配列を構築するステップを含む方法を提供する。架橋DNAのサンプルは、架橋に曝されたサンプルDNAを含む。それがサンプル中に存在するときのサンプルDNAの架橋は、DNAの三次元構造の大まかな維持をもたらす。例えば、使用することができる標準的な架橋作用物質はホルムアルデヒドである。サンプルは患者及び/又は疾患組織から得ることができ、他の生物又は同じ生物の別の切片に由来してもよく、例えば、1患者由来のサンプル、健常組織由来の1サンプルと疾患組織由来の1サンプルなどでもよい。したがって、サンプルは本発明により分析し参照サンプルと比較することができ、又は異なるサンプルを分析し互いに比較することができる。例えば、乳癌を有する疑いのある患者から、疑わしい腫瘍から生検材料を得ることができる。別の生検材料は非疾患組織から得ることができる。両方に由来する組織生検材料は本発明により分析することができる。対象のゲノム領域はBRCA1及びBRCA2遺伝子であってよく、これらの遺伝子は83kb長及び86kb長であるMazoyer、2005、HumanMutation25:415~422中に総説される。本発明による対象のゲノム領域の配列を決定すること、及び異なる生検材料のゲノム領域配列及び/又は参照BRCA遺伝子配列をお互いに比較することによって、患者の診断及び/又は患者の治療の決定及び/又は疾患進行予後の予測を手助けする、遺伝子突然変異を発見することができる。架橋DNAのサンプルを断片化することによって、対象のゲノム領域に由来するDNA断片は互いに隣接したままになる。それらは架橋しているからである。これらの架橋DNA断片を後に連結させると、架橋のため互いに隣接した対象のゲノム領域のDNA断片は連結する。この型の連結は近隣連結と呼ぶこともできる。標的ヌクレオチド配列を含むDNA断片は、配列レベルでは広範囲の直線距離内でDNA断片と連結することができる。標的ヌクレオチド配列を含む断片を含む連結断片の配列の少なくとも一部分を決定することによって、対象のゲノム領域の空間周辺内のDNA断片の配列が得られる。それぞれ個々の標的ヌクレオチド配列が、多重の他のDNA断片と架橋する可能性がある。結果として、2つ以上のDNA断片が、標的ヌクレオチド配列を含む断片と連結可能であることが多い。連結した増幅された連結DNA断片の部分的配列と標的ヌクレオチド配列を含む断片を組合せることによって、対象のゲノム領域の配列を構築することができる。標的ヌクレオチド配列を含む断片と連結したDNA断片は、連結DNA断片中に存在し得る任意の断片を含む。DNAを架橋させるステップ、並びにDNA断片を断片化し連結させるステップを含む方法が当技術分野で知られている例えば、国際公開第2007/004057号パンフレット又は国際公開第2008/08845号パンフレット。このような方法は、異なるDNA断片間の相互作用頻度の同定を目的とし、標的ヌクレオチド配列と隣接する断片の主要ヌクレオチド配列の同定は目的としない。相互作用頻度を検出するための4Cを使用する当初の概念は、短い配列読み取り部分のみを必要とした。短い配列読み取り部分が相互作用する頻度を、読み取り部分の染色体位置に対してプロットする。このようなプロットのパターンは、特定の対象のゲノム領域がゲノム中の他の領域と相互作用することができるかどうか、又は例えば、染色体間で転座が起こったことを示す。例えば、標的ヌクレオチド配列を含有する染色体以外の染色体上で、高頻度の読み取り部分が観察される場合、それは転座を示す。本発明では、相互作用の頻度は決定しない。本発明では、架橋DNAを断片化しそのDNA断片をその後連結させることによって、標的ヌクレオチド配列周辺のゲノム領域が実際捕捉され、配列決定すると、ゲノム領域のコンティグを再構築することができることがいまや判明した。一方当技術分野で知られている方法では、標的ヌクレオチド配列を有する短い配列読み取り部分の相互作用頻度の決定に焦点を当てているが、本発明の焦点は、DNA断片の配列及び連結DNA断片のカップリングから、対象のゲノム領域のコンティグを構築することができるような、DNA断片及び標的ヌクレオチドを含む連結DNA断片の配列の全体、又は少なくとも広範囲の一部の決定に当てている。線状連結断片本発明の一実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法であって、a架橋DNAのサンプルを提供するステップ、b架橋DNAを断片化するステップ、c断片化された架橋DNAを連結させるステップ、d架橋を逆行させるステップ、e場合によっては、好ましくは制限酵素で、ステップdのDNAを断片化するステップ、f場合によっては、少なくとも1つのアダプターとステップd又はeの断片化されたDNAを連結させるステップ、g場合によっては、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップd又はeのDNAを増幅する、又は少なくとも1つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも1つの他のプライマーを使用してステップfのDNAを増幅するステップ、h好ましくはハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップd、e、f又はgの増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、i決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む方法を提供する。ステップaにおいて、本明細書の他の箇所に概略するように架橋DNAのサンプルを提供する。架橋DNAのサンプルはステップbにおいて断片化する。架橋DNAを断片化することによって、架橋により1つに保たれたDNA断片が生成する。断片化ステップbは超音波処理を含むことができ、酵素によるDNA末端修復を続けることができる。超音波処理はランダムな部位でのDNAの断片化をもたらし、それは平滑末端であり得るか、又は3’又は5’オーバーハングを有し得るかのいずれかである。これらのDNA切断点はランダムに存在し、後のステップcにおいてアダプターと及び/又は互いの断片の連結を可能にする平滑末端を有するDNA断片が得られるように、DNAを酵素により修復し、生じ得る3’又は5’オーバーハングの充填を行うことができるからである。或いは、例えばエキソヌクレアーゼを使用してオーバーハングヌクレオチドを除去することにより、オーバーハングを平滑末端にすることもできる。断片化ステップbは、1つ以上の制限酵素、又はそれらの組合せを用いた断片化を含むこともできる。制限酵素による断片化は有利である。それは平均断片サイズの調節を可能にすることができるからである。形成される断片は、後のステップcにおいて断片の連結を可能にする適合オーバーハング又は平滑末端を有し得る。さらに、架橋DNAの1サンプルを複数のサブサンプルに分けると、それぞれのサブサンプルに、異なる認識部位を有する制限酵素を使用することができる。異なる認識部位を有する異なる制限酵素を使用することによって、それぞれのサブサンプルから異なるDNA断片を得ることができるので、これは有利である。次のステップcでは断片を連結させる。標的ヌクレオチド配列を含む断片は多重の他のDNA断片と架橋させることが可能であるので、2つ以上のDNA断片を、標的ヌクレオチド配列を含む断片と連結させることが可能である。これによって、互いに隣接したDNA断片の組合せが生成し得る。それらは架橋により1つに保たれるからである。連結DNA断片において異なる組合せ及び/又は順序のDNA断片が形成され得る。DNA断片が制限酵素処理によって得られた場合、制限酵素の認識部位が既知であり、それによって、それらの断片を同定することができる。制限酵素認識部位の残り部分又は再構築された制限酵素認識部位が、異なるDNA断片間の分離を示し得るからである。超音波処理及びその後の酵素によるDNA末端修復などのランダムな断片化によってDNA断片を得た場合、一断片を他の断片と区別することがさらに難しくなる可能性がある。どの断片化法を使用するかとは無関係に、連結ステップcはアダプターの存在下で実施することが可能であり、断片間にアダプター配列を連結させることが可能である。或いは、別のステップにおいてアダプターを連結させることが可能である。断片間に位置するアダプター配列を同定することによって、異なる断片を容易に同定することができるので、これは有利である。例えば、DNA断片末端が平滑末端である場合、アダプター配列はDNA断片末端の各々と隣接し、別のDNA断片間の境界を示す。次に、ステップdにおいて架橋を逆行させ、これによって2つ以上の断片を含む連結DNA断片のプールが生成する。連結DNA断片のプールの亜集団は、標的ヌクレオチド配列を含むDNA断片を含む。架橋の逆行によって、DNAの構造的/空間的固定が緩み、DNA配列は後のステップ、例えば増幅及び/又は配列決定に利用可能な状態となる。架橋DNAはこのようなステップに適した基質ではない可能性があるからである。後のステップe及び/又はfは架橋の逆行後に実施することができるが、しかしながら、連結DNA断片が依然架橋状態であるときに、ステップe及び/又はfを実施することもできる。連結DNA断片は、好ましくは制限酵素で、ステップeにおいて場合によっては断片化することができる。第一の断片化ステップ及び任意選択の第二の断片化ステップは、後の増幅ステップ及び/又は配列決定ステップに適合した大きさの連結DNA断片の入手を目的とし得る。さらに、酵素を用いることが好ましい第二の断片化ステップは、ステップfにおけるアダプターの任意選択の連結に適合した連結断片末端を生成することができる。第二の断片化ステップは架橋の逆行後に実施することができるが、しかしながら、DNA断片が依然架橋状態であるときに、第二の断片化ステップe及び/又は連結ステップfを実施することもできる。断片化ステップb及びeが制限酵素を含む場合、ステップeの制限酵素認識部位はステップbの認識部位より長いことが好ましい。したがってeの酵素はステップbより低い頻度で切断する。これは、ステップbの平均DNA断片サイズは、DNA限定後に得たステップeの平均断片サイズより小さいことを意味する。このように、第一の断片化ステップでは、比較的小さな断片が形成され、それらを後に連結させる。ステップeの第二の制限酵素はステップbより低い頻度で切断するので、大部分のDNA断片はステップeの制限酵素認識部位を含むことはできない。したがって、連結DNA断片が第二のステップ中で後に断片化されるとき、ステップbのDNA断片の多くは完全な状態に保たれ得る。ステップbのDNA断片の組合せ配列を使用して対象のゲノム領域のコンティグを構築することができるので、これは有用である。ステップbの断片化がステップcの断片化より低頻度である場合、その結果はステップbの断片が断片化されることであると思われ、これはコンティグを構築するのに有用な比較的大きなDNA配列の消失をもたらす可能性がある。したがって、ステップb及びeにおける断片化にどの方法が使用されるかとは無関係に、ステップbのDNA断片がおおむね完全な状態に保たれ得る、即ちステップeによっておおむね断片化されないように、ステップeと比較してステップbの断片化がより高頻度であることが好ましい。ステップd又はeの得られた連結DNA断片に、少なくとも1つのアダプターを場合によっては連結させる。連結DNA断片の末端は、このようなアダプターの連結に適合している必要がある。ステップd又はeの連結DNA断片は線状DNAであり得るので、アダプターの連結はプライマーハイブリダイゼーション配列をもたらすことができる。標的ヌクレオチド配列を含む連結DNA断片と連結したアダプター配列は、PCRを使用して増幅することができるDNA分子をもたらす。次のステップgでは、標的ヌクレオチド配列を含むステップfのDNAを、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマー、及び少なくとも1つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも1つの他のプライマーを使用して増幅することができる。アダプターを連結させるステップfは任意選択なので、標的ヌクレオチドを含むステップd又はeのDNAは、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ステップgにおいて増幅することもできる。次に、標的ヌクレオチド配列を含むステップd、e、f又はgにおいて得た増幅された連結DNA断片の配列を決定する。配列の決定は、ハイスループット配列決定技術を使用して実施することが好ましい。これは一層便利であり、多重の配列を決定して完全な対象のゲノム領域を網羅することができるからである。これらの決定した配列から、対象のゲノム領域のコンティグを構築することができる。DNA断片の配列を決定すると、重複する読み取り部分を得ることができ、そこから対象のゲノム領域を構築することができる。ランダムな断片化によってDNA断片を得た場合、断片化ステップのランダムな性質はDNA断片を既にもたらす可能性があり、それを配列決定すると重複する読み取り部分をもたらす。サンプルサイズを増大すること、例えば分析する細胞の数を増大することによって、構築される対象のゲノム領域の信頼性は増大し得る。或いは、異なる制限酵素を使用して、ステップbにおいて複数のサブサンプルを分析すると、重複する読み取り部分がさらに得られる。複数のサブサンプルを増大することによって、重複する断片の数が増大し、構築される対象のゲノム領域のコンティグの信頼性は増大し得る。重複し得るこれらの決定した配列から、コンティグを構築することができる。或いは、配列が重複しない場合、例えばステップbにおいて1つの制限酵素が使用された可能性があるとき、参照配列と連結DNA断片のアラインメントは対象のゲノム領域のコンティグの構築を可能にすることができる。環状化連結断片別の実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法であって、a架橋DNAのサンプルを提供するステップ、b架橋DNAを断片化するステップ、c断片化された架橋DNAを連結させるステップ、d架橋を逆行させるステップ、e場合によっては、好ましくは制限酵素で、ステップdのDNAを断片化するステップ、fステップd又はeのDNAを環状化するステップ、g場合によっては、及び好ましくは、標的ヌクレオチド配列を含む環状化されたDNAを、好ましくは標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用して、増幅するステップ、hハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、i決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む方法を提供する。ステップaにおいて、本明細書の他の箇所に概略するように架橋DNAのサンプルを提供する。架橋DNAのサンプルはステップbにおいて断片化する。架橋DNAを断片化することによって、架橋により1つに保たれたDNA断片が生成する。断片化ステップbは超音波処理を含むことができ、酵素によるDNA末端修復を続けることができる。超音波処理はランダムな部位でのDNAの断片化をもたらし、それは平滑末端であり得るか、又は3’又は5’オーバーハングを有し得るかのいずれかである。これらのDNA切断点はランダムに存在し、後のステップcにおいてアダプターと又は互いの断片の連結を可能にする平滑末端を有するDNA断片が得られるように、DNAを酵素により修復し、生じ得る3’又は5’オーバーハングの充填を行うことができるからである。或いは、例えばエキソヌクレアーゼを使用してオーバーハングヌクレオチドを除去することにより、オーバーハングを平滑末端にすることもできる。断片化ステップbは、1つの制限酵素、又はその組合せを用いた断片化を含むこともできる。制限酵素による断片化は有利である。それは平均断片サイズを調節することができるからである。さらに、形成される断片は、さらなる修飾を必要とせずに後のステップcにおいて断片の連結を可能にする適合オーバーハング又は平滑末端を有するであろう。さらに、架橋DNAの1サンプルを複数のサブサンプルに分けると、それぞれのサブサンプルに、異なる認識部位を有する制限酵素を使用することができる。異なる認識部位を有する異なる制限酵素を使用することによって、それぞれのサブサンプルから異なるDNA断片を得ることができるので、これは有利である。次のステップcでは断片を連結させる。DNA断片が制限酵素処理によって得られる場合、制限酵素の認識部位が既知であり、それによって、それらの断片を同定することができる。制限酵素認識部位の残り部分又は再構築された制限酵素認識部位が、異なるDNA断片間の分離を示し得るからである。超音波処理及びその後の酵素によるDNA末端修復などのランダムな断片化によってDNA断片を得た場合、一断片を他の断片と区別することがさらに難しくなる可能性がある。どの断片化法を使用するかとは無関係に、連結ステップcはアダプターの存在下で実施することが可能であり、断片間にアダプター配列を連結させることが可能である。或いは、別のステップにおいてアダプターを連結させることが可能である。断片間にあるアダプター配列を同定することによって、異なる断片を容易に同定することができるので、これは有利である。例えば、DNA断片末端が平滑末端である場合、アダプター配列はそれらのDNA断片末端と隣接しており、別のDNA断片を示すであろう。次に、ステップdにおいて架橋を逆行させ、これによって2つ以上の断片を含む連結DNA断片のプールが生成する。連結DNA断片のプールの亜集団は、標的ヌクレオチド配列を含むDNA断片を含む。架橋の逆行によって、DNAの構造的/空間的固定が緩み、DNA配列は後のステップ、例えば増幅及び/又は配列決定に利用可能な状態となる。架橋DNAはこのようなステップに適した基質ではない可能性があるからである。後のステップe及び/又はfは架橋の逆行後に実施することができるが、しかしながら、連結DNA断片が依然架橋状態であるときに、ステップe及び/又はfを実施することもできる。連結DNA断片は、好ましくは制限酵素で、ステップeにおいて場合によっては断片化することができる。断片化は架橋の逆行後に実施することができるが、第二の断片化を架橋の逆行前に実施することも想定される。断片化のため制限酵素を使用することが好ましい。制限酵素は断片化ステップの調節を可能にし、適切な制限酵素を選択した場合、適合末端の連結に好ましい連結DNA断片の適合末端をもたらし、ステップfにおいて得られる環状化連結DNA断片をもたらすからである。しかしながら、他の方法、例えばせん断及び/又は超音波処理及び平滑末端二本鎖DNAを形成するようなその後の酵素によるDNA末端修復を使用した断片化も、連結させて環状化されたDNAを形成させることが可能である。第一の断片化ステップ及び任意選択の第二の断片化ステップは、後の環状化、増幅ステップ及び/又は配列決定ステップに適合した連結DNA断片の入手を目的とする。断片化ステップb及びeが制限酵素を含む場合、断片化ステップeは、断片化ステップbにおいて得られるような、より長い断片を平均してもたらすことが好ましい。断片化ステップb及びeが制限酵素を含む場合、ステップeの制限酵素認識部位はステップbの認識部位より長いことが好ましい。したがってeの酵素はステップbより低い頻度で切断する。これは、ステップbの平均DNA断片サイズは、DNA限定後に得たステップeの平均断片サイズより小さいことを意味する。このように、第一の断片化ステップでは、比較的小さな断片が形成され、それらを後に連結させる。ステップeの第二の制限酵素はステップbより低い頻度で切断するので、大部分のDNA断片はステップeの制限酵素認識部位を含むことはできない。したがって、連結DNA断片が第二のステップ中で後に断片化されるとき、ステップbのDNA断片の多くは完全な状態に保たれ得る。ステップbのDNA断片の組合せ配列を使用して対象のゲノム領域のコンティグを構築することができるので、これは有用である。ステップbの断片化がステップcの断片化より低頻度である場合、その結果はステップbの断片が断片化されることであると思われ、これはコンティグを構築するのに有用な比較的大きなDNA配列の消失をもたらす可能性がある。したがって、ステップb及びeにおける断片化にどの方法が使用されるかとは無関係に、ステップbのDNA断片がおおむね完全な状態に保たれ得る、即ちステップeによっておおむね断片化されないように、ステップeと比較してステップbの断片化がより高頻度であることが好ましい。その架橋が逆行しているステップd又はeの得られた連結DNA断片を、次にステップfにおいて環状化する。環状化前に架橋を逆行させることは有利であり得る。架橋状態の架橋DNAを環状化することは望ましくない可能性があるからである。しかしながら、連結DNA断片が架橋されたまま環状化を実施することもできる。連結ステップ中、環状化連結DNA断片が既に形成されており、したがって環状化ステップfがステップcと同時に存在するであろうから、追加的環状化ステップは必要とされないことも可能であり得る。しかしながら、追加的環状化ステップを実施することは好ましい。環状化は、閉環が形成されるような連結DNA断片の末端の連結を含む。標的ヌクレオチド配列を含む連結DNA断片を含む環状化されたDNAは、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用して後に増幅することができる。増幅ステップのため、架橋の逆行が必要とされる。架橋DNAは増幅を阻害又は妨害する可能性があるからである。インバースPCR反応において標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする2つのプライマーを使用することが好ましい。この方法で、標的ヌクレオチド配列を含むDNA断片と連結する環状化されたDNAのDNA断片を増幅することができる。次に、標的ヌクレオチド配列を含むステップd、e、f又はgにおいて得た増幅された連結DNA断片の配列を決定する。配列の決定は、ハイスループット配列決定技術を使用して実施することが好ましい。これは一層便利であり、多重の配列を決定して完全な対象のゲノム領域を網羅することができるからである。これらの決定した配列から、対象のゲノム領域のコンティグを構築することができる。DNA断片の配列を決定すると、重複する読み取り部分を得ることができ、そこから対象のゲノム領域を構築することができる。ランダムな断片化によってDNA断片を得た場合、断片化ステップのランダムな性質はDNA断片を既にもたらす可能性があり、それを配列決定すると重複する読み取り部分をもたらす。サンプルサイズを増大すること、例えば分析する細胞の数を増大することによって、構築される対象のゲノム領域の信頼性は増大し得る。或いは、異なる制限酵素を使用して、ステップbにおいて複数のサブサンプルを分析すると、重複する読み取り部分がさらに得られる。複数のサブサンプルを増大することによって、重複する断片の数が増大し、構築される対象のゲノム領域のコンティグの信頼性は増大し得る。重複し得るこれらの決定した配列から、コンティグを構築することができる。或いは、配列が重複しない場合、例えばステップbにおいて1つの制限酵素が使用された可能性があるとき、参照配列と連結DNA断片のアラインメントは対象のゲノム領域のコンティグの構築を可能にすることができる。多重の標的配列一実施形態では、2つの標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法を提供する。この方法は、増幅ステップまでは前述したのと同じステップを含むことができる。ここで増幅ステップは、1つの標的ヌクレオチド配列ではなく2つを使用する。2つの標的ヌクレオチド配列用に、1つのプライマーがそれぞれの標的ヌクレオチド配列用である、2つの異なるプライマーをPCR反応中で使用する。2つの標的ヌクレオチド配列由来の2つのプライマー結合部位が連結DNA断片中に存在するとき、プライマー結合部位が正しい配向を有するという条件で、2つのプライマーは2つのプライマー結合部位間の配列を増幅する。環状化連結DNA断片を有することは有利であり得る。正しい配向を有する2つのプライマー結合部位に関する確率は、線状連結DNA断片と比較して高いからである線状連結DNA断片に関する4配向の1つと比較して、4配向ののうち2つが増幅する。さらなる実施形態では、2つの標的ヌクレオチド配列以外に、対象のゲノム領域はさらなる標的ヌクレオチドを含み、それぞれの標的ヌクレオチド用にPCR増幅反応中でプライマーを使用する。一増幅において多重の標的ヌクレオチドと対応するプライマーを組合せることによって、プライマーの組合せがアンプリコンを生成する確率が増大する。例えば、実施例セクション中に記載するように、BRCA1遺伝子に関して5つの異なる標的ヌクレオチドを使用した例えば図2参照。観察点とも呼ぶ1つの標的ヌクレオチド配列、例えば、A及びその他、Bからプライマーを選択することによって、PCRを実施することができる。さらに、それぞれの標的ヌクレオチド配列A、B、C、D及びEからプライマーを使用してPCRを実施することができる。これらの標的ヌクレオチドは互いに物理的に隣接するので、アンプリコンが生成し得るようにプライマー結合部位が連結DNA断片で終結する条件で、このような増幅を実施することによって対象のゲノム領域が富化される。したがって、対象のゲノム領域が1つ以上の標的ヌクレオチド配列をさらに含み、増幅ステップ中、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするプライマーを提供し、対応する1つ以上の他の標的ヌクレオチド用の1つ以上のプライマーを提供し、プライマーを使用して、連結DNA断片を増幅し、又は環状化されたDNAを増幅する、本発明による対象のゲノム領域の配列を決定するための方法を提供する。連結DNA断片の配列の決定連結DNA断片の配列を決定するステップは、ハイスループット配列決定を含むことが好ましい。ハイスループット配列決定法は当技術分野でよく知られており、原則として本発明中での任意の方法の使用を企図することができる。ハイスループット配列決定技術は、例えば、Roche、Illumina又はAppliedBiosystemsによって提供される製造者の説明書に従って実施することができる。一般に、配列決定用アダプターを増幅された連結DNA断片に連結させることが可能である。例えば本明細書に記載するPCRを使用することにより線状又は環状化断片を増幅する場合、増幅産物は線状であり、アダプターの連結が可能である。アダプター配列の連結に適した末端例えば、平滑、相補性付着末端を提供することができる。或いは、PCR又は他の増幅法に使用するプライマー複数可は、増幅ステップg中にアダプター配列を含む増幅産物が形成されるように、アダプター配列を含むことができる。環状化断片が増幅しない場合、標的ヌクレオチド配列を含むDNA断片と連結したDNA断片が完全な状態に保たれるように、例えば好ましくはインバースPCR反応用のプライマー結合部位間の制限酵素を使用することにより、環状化断片を断片化することができる。配列決定用アダプターを、本発明の方法のステップc及びf中に含めることもできる。これらの配列決定用アダプターは、これらのステップ中で既に場合によっては使用された可能性があるアダプターのアダプター配列の一部として含めることができ、及び/又は、別の配列決定用アダプターをこれらのステップ中でさらに提供することができる。使用するハイスループット配列決定法において、長い読み取り部分が生成可能であることが好ましい。長い読み取り部分は、連結DNA断片の多重のDNA断片全体の読み取りを可能にすることができる。このように、ステップbのDNA断片を同定することができる。DNA断片配列は参照配列と比較することができ、及び/又は互いに比較することができる。例えば、本明細書で以後さらに説明するように、このようなDNA断片配列は、遺伝子突然変異を保有する細胞の断片の割合を決定するのに使用することができる。このような配列と隣接するDNA断片のDNA断片配列をさらに配列決定することによって、独自の連結DNA断片を同定することができる。ランダムな断片化によりステップbにおいてDNA断片を得たとき、これは特に当てはまる。2つの細胞が全く同じDNA断片をもたらす確率は非常に低く、それだけではなく、このような断片が連結するDNA断片末端も同様である。したがって、このようにDNA断片を同定することによって、特定の突然変異を含む細胞及び/又は対象のゲノム領域の割合を決定することができる。したがって、連結DNA断片の完全な配列を提供することは必要とされない。DNA断片配列が決定されるような、少なくとも多重のDNA断片にわたる配列が好ましい。さらに短い配列、例えば50~100ヌクレオチドの短い読み取り部分の読み取りも企図することができる。このようなシナリオでは、ハイスループット配列決定法に適した適切なアダプターに後に連結させることが可能であるより小さな断片に、増幅された連結DNAを断片化することが好ましい。標準的な配列決定プロトコールが使用される場合、これは、連結DNA断片に関する情報が消失し得ることを意味し得る。短い読み取り部分に関しては、完全なDNA断片配列を同定することができない可能性がある。このような短い読み取り部分が企図される場合、短い読み取り部分から連結DNA断片のコンティグを構築することができるように、別個の連結DNA断片が断片化時に識別子を連結又は装備するような、追加的処理ステップの提供を想定することができる。短い配列読み取り部分に関するこのようなハイスループット配列決定技術は、対型末端配列決定を含むことができる。対型末端配列決定及び短い配列読み取り部分を使用することによって、そのDNA分子が異なるDNA断片を含み得る配列決定に使用するDNA分子の、両末端からの短い読み取り部分は連結したDNA断片のカップリングを可能にすることができる。これは、両末端から決定した配列と比較して比較的大きなDNA配列にわたり、2つの配列読み取り部分がカップリング可能であるためである。このように、増幅された連結DNA断片のコンティグを構築することができる。しかしながら、DNA断片を同定せずに、短い読み取り部分の使用を企図することができる。特に対象のゲノム領域が増幅されているとき、短い配列読み取り部分から、対象のゲノム領域を構築することができるからである。例えば二倍体細胞のDNA断片及び/又は別個の対象のゲノム領域に関する情報は消失し得るが、DNAの突然変異は依然同定することができる。したがって、増幅された連結DNA配列の配列の少なくとも一部分を決定するステップは短い配列読み取り部分を含むことができるが、DNA断片配列を同定することができるように、より長い配列読み取り部分を決定することが好ましい。さらに、増幅された増幅された連結DNA断片用の異なるハイスループット配列決定戦略の使用、例えば、対型末端配列決定からの短い配列読み取り部分とより長い配列読み取り部分を有する比較的遠い末端の組合せも企図することができ、このように、増幅された連結DNA断片のコンティグを構築することができる。一実施形態では、本発明は、生成された配列情報の品質管理を行うのに使用することができる。ハイスループット配列決定の方法によって与えられる配列の分析では、配列決定誤差が生じ得る。例えばDNA鎖の延長中に配列決定誤差が生じる可能性があり、この場合誤った即ち、鋳型と非相補的塩基がDNA鎖中に取り込まれる。配列決定誤差は突然変異とは異なる。増幅及び/又は配列決定された元のDNAはその突然変異を含まないであろうからである。本発明によれば、DNA断片配列は、それに連結したDNA断片の配列の少なくとも一部分で決定することができ、それらの配列は独自あり得る。それらがステップcにおいて形成されるときの連結DNA断片の独自性によって、ステップhにおいて決定した配列の品質管理を行うことができる。連結DNA断片を増幅し、十分な深さで配列決定するとき、同じ独自の連結DNA断片複数可の多重のコピーが配列決定される。元の同じ連結DNA断片に由来するコピーの配列を比較することができ、増幅及び/又は配列決定誤差を同定することができる。さらなる実施形態さらに本発明の方法に従い、架橋DNAのサンプルから、多重の対象のゲノム領域の配列を決定する。それぞれの対象のゲノム領域用に、それに対応するプライマー複数可を設計することができる標的ヌクレオチド配列を提供する。多重の対象のゲノム領域は重複する可能性もある対象のゲノム領域であってよく、したがって配列を決定することができるその大きさは増大し得る。例えば、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列が1MBを典型的に含み、部分的に重複する対象のゲノム領域と、例えばそれぞれ対応する標的ヌクレオチド配列を含む0.1MBの重複を組合せる場合、5つの対象のゲノム領域の組合せは4.6MB0.93×0.10.80.10.9=4.6MBの配列をもたらし、したがって配列を決定又は他の場合分析することができる対象のゲノム領域の大きさは大幅に増大するであろう。対象のゲノム領域内の明確な距離での多重の標的ヌクレオチド配列を使用して、ゲノム領域全体の平均範囲及び/又は範囲の均一性を増大することもできる。さらに、識別子をステップgの少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーの中に含めることができる。連結ステップc中の断片間の連結に使用するようなアダプター配列中に、識別子を含めることもできる。オリゴヌクレオチドプライマーの中に識別子を含めることによって、架橋DNAの複数のサンプル以上のサブサンプルを同時に分析するとき、それぞれのサンプルの起源を容易に決定することができる。架橋DNAのオリジナルサンプルが同じでありながら、架橋DNAのサブサンプルは異なる処理をされた可能性があるか、及び/又は、DNAのサンプルは例えば異なる生物若しくは患者から得られた可能性がある。サンプルの処理を1つにすることができる、例えば同一手順のステップが実施されるとき、識別子は異なる処理をしたサンプルの組合せを可能にする。配列決定ステップhがハイスループット配列決定を含むとき、このように処理を1つにすることは特に有利であり得る。増幅ステップgの前又は後に、本発明の方法に従い、サイズ選択ステップを実施することができる。このようなサイズ選択ステップは、ゲル抽出クロマトグラフィー、ゲル電気泳動又は密度勾配遠心分離を使用して実施することができ、これらは当技術分野で一般に知られている方法である。20~20,0000塩基対、好ましくは50~10,0000塩基対の間、最も好ましくは100~3,000塩基対の間のサイズのDNAを選択することが好ましい。サイズ分離ステップによって、PCR増幅に最適及び/又は次世代配列決定による長い読み取り部分の配列決定に最適であり得るサイズ範囲で増幅された連結DNA断片を選択することができる。500ヌクレオチドの読み取り部分の配列決定が現在市販されており、PacificBioscienceshttp://www.pacificbiosciences.com/により開発されたSingleMoleculeRealTimeSMRT商標DNA配列決定技術などの企業による近年の進展は、1.000~10,000ヌクレオチドの読み取り部分が到達範囲内であることを示す。対象のゲノム領域の細胞における倍数性が1を超える場合、それぞれの倍数性に関して、本発明による方法のステップhにおいてコンティグを構築する。ゲノム中の任意の所与の標的部位のゲノム環境は、大部分は線状染色体鋳型上の標的配列と物理的に隣接したDNAゲノム配列からなるので、それぞれ個々の染色体鋳型の再構築が可能になる。対象のゲノム領域の倍数性が1を超える場合、多重の対象のゲノム領域又はそれらの相当物が細胞中に存在する。これらの多重の対象のゲノム領域は一般に同じ空間を占めない、即ちそれらは空間中に分離している。細胞中の各対象のゲノム領域由来の、このような細胞の架橋DNAのサンプルが断片化されるとき、標的ヌクレオチド配列を含む対応するDNA断片が形成され得る。これらのDNA断片は、それらの近辺のDNA断片とそれぞれ連結する。したがって連結DNA断片は異なる対象のゲノム領域を表す。例えば、倍数性が2である場合、独自の突然変異をそれぞれ有し1MB離れた2つの断片が、連結DNA断片内で一緒に発見されるとき、これらの2つの断片は同じ対象のゲノム領域に由来すると結論付けることができる。したがってこのシナリオでは、2つの断片を同定し、両方共同じゲノム領域に割り当てる。したがって、同定した断片の配列からコンティグを構築すると、突然変異を保有するこれらの2つの断片は1つの特定ゲノム領域のコンティグを構築するのに使用され、一方で他のゲノム領域に関して構築されるコンティグは突然変異を保有しないであろう。したがって、本発明の方法によれば、コンティグを構築するステップhは、1ステップbの断片を同定するステップ、2ゲノム領域に断片を割り当てるステップ、3断片の配列からゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む。さらに、独自の突然変異を含む3個の断片が存在しA、B及びC、対象のゲノムの倍数性が2であるとき。このとき、2個の突然変異断片を含む連結産物を同定し、1個の連結産物はABを含み1個はACを含む。さらに、非突然変異断片を含む連結産物はBC及びACとして同定する。このシナリオでは、連結DNA断片AB及びACは断片Aによってカップリングし、連結DNA断片BC及びACは断片Cによってカップリングする。このシナリオでは、DNA断片A、B及びCは同じゲノム領域に割り当てられ、一方A、B及びCは他のゲノム領域に割り当てられる。したがってこのように、ゲノム領域に断片を割り当てるステップ2は、異なる連結産物を同定するステップとDNA断片を含む異なる連結産物をカップリングさせるステップを含む。同様に、同じことが異種細胞集団に当てはまる。例えば、異種細胞集団例えば、異なる起源の細胞、又は正常細胞及び遺伝的に突然変異した細胞例えば、癌細胞を含む生物由来の細胞を含む架橋DNAのサンプルが提供される場合、例えば、一細胞中の異なるゲノム環境、又は異なる細胞由来の異なるゲノム環境であってよい異なるゲノム環境に対応するそれぞれの対象のゲノム領域に関して、コンティグを構築することができる。突然変異の同定別の実施形態では、遺伝子突然変異の有無を同定するための方法を提供する。第一の実施形態では、遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、前に記載した本発明のいずれかの方法のステップa~hを含み、複数のサンプルのコンティグを構築し、以下のさらなるステップ:i複数のサンプルのコンティグをアラインメントするステップ、j複数のサンプル由来の対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、を含む方法を提供する。或いは、遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、前に記載した本発明のいずれかの方法のステップa~gを含み、以下のさらなるステップ:i参照配列とコンティグをアラインメントするステップ、j対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、を含む方法を提供する。1つ又は複数のサンプルが遺伝子突然変異を含む場合、例えば多重のサンプルのコンティグを比較することにより遺伝子突然変異を同定することができ、これによって、他のサンプルの配列と比較してコンティグの配列が異なることを観察することができる、即ち遺伝子突然変異の存在が同定される。サンプルのコンティグ間で配列の違いが観察されない場合、遺伝子突然変異の不在が同定される。或いは、コンティグの配列とアラインメントすることができる参照配列を使用することもできる。サンプルのコンティグの配列が参照配列の配列と異なるとき、遺伝子突然変異が観察される、即ち遺伝子突然変異の存在が同定される。1つ以上のサンプルのコンティグと参照配列の間で配列の違いが観察されない場合、遺伝子突然変異の不在が同定される。遺伝子突然変異の有無を同定するためにコンティグを構築することは必要とされない。DNA断片配列を互いに、又は参照配列とアラインメントすることができる限り、遺伝子突然変異の有無を同定することができる。したがって、本発明の別の実施形態では、コンティグを構築するステップhを含まない前に記載したいずれかの方法による、遺伝子突然変異の有無を同定するための方法を提供する。このような方法は、前に記載したいずれかの方法のステップa~gを含み、以下のさらなるステップ:h増幅された連結DNA断片の決定した配列と参照配列をアラインメントするステップ、i決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、を含む。或いは、遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、増幅された連結DNA断片の複数のサンプル配列を決定し、前に記載したいずれかの方法のステップa~gを含み、以下のさらなるステップ:h複数のサンプルの増幅された連結DNA断片の決定した配列をアラインメントするステップ、i決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、を含む方法を提供する。遺伝子突然変異を保有する対立遺伝子又は細胞の割合既に前述したように、異種細胞集団例えば、異なる起源の細胞、又は正常細胞及び遺伝的に突然変異した細胞例えば、癌細胞を含む生物由来の細胞由来の架橋DNAのサンプルが提供されるとき、例えば、細胞中の異なる対立遺伝子由来の異なるゲノム環境、又は異なる細胞由来の異なるゲノム環境であってよい異なるゲノム環境に対応するそれぞれの対象のゲノム領域に関して、コンティグを構築することができる。さらに、遺伝子突然変異を保有する断片又は連結DNA断片の割合を決定することができ、それは遺伝子突然変異を保有する対立遺伝子又は細胞の割合と相関し得る。DNA断片の連結はランダムなプロセスであり、連結DNA断片の一部であるDNA断片の集結及び順序は独自であってよく、単細胞及び/又は細胞由来の1つの対象のゲノム領域を表す。さらに、断片化ステップbが例えば超音波処理などのランダムな断片化プロセスを含む場合、DNAが破壊された点は、特に独自の断片末端をも有し得るそれと連結する他のDNA断片の文脈内で、他の独自の特徴をもたらす可能性がある。したがって、遺伝子突然変異を有する断片を含む連結DNA断片の同定は、独自の順序及び集結のDNA断片の連結DNA断片の同定も含むことができる。遺伝子突然変異を有する対立遺伝子又は細胞の割合は、治療の評価において、例えば患者が癌治療を施される場合において重要であり得る。癌細胞は特定の遺伝子突然変異を有し得る。このような突然変異を有する細胞の百分率は、治療の成功又は失敗に関する指標となり得る。別の実施形態では、遺伝子突然変異を保有する断片の割合、及び/又は遺伝子突然変異を保有する連結DNA断片の割合を決定するための方法を提供する。この実施形態では、特定の遺伝子突然変異又は特定の遺伝子突然変異の淘汰として遺伝子突然変異を定義する。第一の実施形態では、異種である疑いがある細胞集団から遺伝子突然変異を保有する断片の割合を決定するための方法であって、前に記載したいずれかの方法のステップa~hを含み、以下のさらなるステップ:iステップbの断片を同定するステップ、j断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、k遺伝子突然変異を保有する断片の数を決定するステップ、l遺伝子突然変異を保有していない断片の数を決定するステップ、m遺伝子突然変異を保有する断片の割合を計算するステップ、を含む方法を提供する。別の実施形態では、異種である疑いがある細胞集団から遺伝子突然変異を有する断片を保有する連結産物の割合を決定するための方法であって、前に記載したいずれかの方法のステップa~hを含み、以下のさらなるステップ:iステップbの断片を同定するステップ、j断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、k遺伝子突然変異を有する又は有さない断片を保有するステップfの連結産物を同定するステップ、l遺伝子突然変異を有する断片を有する連結産物の数を決定するステップ、m遺伝子突然変異を有さない断片を有する連結産物の数を決定するステップ、n遺伝子突然変異を有する連結産物の割合を計算するステップ、を含む方法を提供する。これらの実施形態の方法では、ステップjにおいて、参照配列とアラインメントすることによって、及び/又は複数のサンプルのDNA断片配列を比較することによって、遺伝子突然変異の有無を同定することができる。本発明による方法では、同定される遺伝子突然変異はSNP、単一ヌクレオチド多型、挿入、逆位及び/又は転座であってよい。欠失及び/又は挿入が観察される場合、欠失及び/又は挿入を同定するために、欠失及び/又は挿入を保有するサンプル由来の断片及び/又は連結産物の数を参照サンプルと比較することができる。分析した断片における染色体切断部位の存在に基づいて、欠失、挿入、逆位及び/又は転座を同定することもできる。別の実施形態中、前に記載した方法中では、DNA断片、連結DNA断片、及び/又は対象のゲノム領域におけるメチル化ヌクレオチドの有無を決定する。例えば、ステップa~fのDNAは重亜硫酸塩で処理することができる。重亜硫酸塩を用いたDNAの処理はシトシン残基をウラシルに変換するが、5-メチルシトシン残基は影響を受けないままである。したがって、重亜硫酸塩処理は、個々のシトシン残基のメチル化状態に応じてDNA配列の特異的変化をもたらし、DNAセグメントのメチル化状態に関する単一ヌクレオチド解像情報を与える。サンプルをサブサンプルに分けること、サンプルの1つを処理し、他は処理しないことによって、メチル化ヌクレオチドを同定することができる。或いは、重亜硫酸塩で処理した複数のサンプル由来の配列をアラインメントすることもでき、又は重亜硫酸塩で処理した1つのサンプル由来の配列を参照配列とアラインメントすることができる。短い配列読み取り部分の分析時に、使用するプライマーの配列決定を阻止することが対象となる可能性がある。したがって、別の方法では、ハイスループット配列決定ステップの前にプライマー配列を除去することができる。したがって、別の実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための以下の方法であって、a架橋DNAのサンプルを提供するステップ、b架橋DNAを断片化するステップ、c断片化された架橋DNAを連結させるステップ、d架橋を逆行させるステップ、e場合によっては、好ましくは制限酵素で、ステップdのDNAを断片化するステップ、f場合によっては、少なくとも1つのアダプターとステップd又はeの断片化されたDNAを連結させるステップ、g好ましくはIII型制限酵素認識部位を有する5’オーバーハングを含有し2標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用して標的ヌクレオチド配列を含むステップd又はeの連結DNA断片を増幅する、又は1好ましくはIII型制限酵素認識部位を有する5’オーバーハングを含有し2標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマー、及び少なくとも1つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用してステップfの連結DNA断片を増幅するステップ、hIII型制限酵素で対象の増幅ヌクレオチド配列を消化するステップ、次に切り離された二本鎖プライマー配列を除去するためのサイズ選択ステップ、i好ましくは超音波処理によってDNAを断片化するステップ、j場合によっては、次世代配列決定に必要な二本鎖アダプター配列を連結させるステップ、k好ましくはハイスループット配列決定法を使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップd、e、f又はgの増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、l決定した配列から対象のゲノム領域内の遺伝的変異を同定し、対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本明細書に記載するいずれかの方法中、ステップgにおいて、固形担体への結合を介した増幅された連結DNA断片の任意選択の精製用の、例えばビオチンなどの成分を保有するプライマーを使用する。一実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含む連結DNA断片は、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブ又は捕捉用プローブを用いて捕捉することができる。ハイブリダイゼーションプローブは固形担体に直接付けることが可能であり、又はビオチン成分を捕捉するのに適した固形担体例えば、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズとの結合を可能にするため、例えばビオチンなどの成分を含むことができる。いずれの場合も、標的ヌクレオチド配列を含む連結DNA断片を捕捉し、これによって標的ヌクレオチド配列を含まない連結DNA断片から標的ヌクレオチド配列を含む連結DNA断片を分離することができる。したがって、このような捕捉ステップは標的ヌクレオチド配列を含む連結DNA断片を富化することができる。したがって、本発明を通じて、富化ステップでもある増幅ステップを実施し、或いは標的ヌクレオチド配列を対象とするプローブを用いた捕捉ステップを実施することができる。対象のゲノム領域用に、標的ヌクレオチド配列用の少なくとも1つの捕捉用プローブを捕捉に使用することができる。対象のゲノム領域用に、2つ以上のプローブを多重の標的ヌクレオチド配列に使用することができる。例えば、BRCA1遺伝子に関して記載したのと同様に、5標的ヌクレオチド配列の1配列の1プライマーを捕捉用プローブA、B、C、D又はEとして使用することができる。或いは、対象のゲノム領域を捕捉する組合せ形式A、B、C、D及びEで5プライマーを使用することができる。一実施形態では、増幅ステップと捕捉ステップを組合せることができる。例えば最初に捕捉ステップ、及び次に増幅ステップを実施することができ、又は逆も然りである。一実施形態では、増幅された連結DNA断片中に含まれるアダプター配列とハイブリダイズする捕捉用プローブを使用することができる。これは、完全なBrca1遺伝子配列を決定するために使用した、本発明による全遺伝子配列決定手法の一例である。使用した細胞は、Brca1遺伝子座中の位置2288においてTが欠失した、乳癌接着性細胞株のSUM149PT細胞であったElstrodtらCancerRes、2006。図1は、この方法の概略を示す。細胞培養SUM149PT細胞を、RPMI/10FCS/penstrepを含む完全なプレート状態まで150cm2皿において培養する。皿の事前の分割及び計数によって、150cm2皿全体は約20×106個のSUM149PT細胞を含有することを示した。固定及び細胞溶解培養した細胞はPBSで洗浄し、室温において10分間PBS/10FCS/2ホルムアルデヒドで固定する。細胞はその後洗浄及び回収し、溶解バッファー50mMのトリス-HCl、pH7.5、150mMのNaCl、5mMのEDTA、0.5のNP-40、1のTX-100及び1×完全プロテアーゼ阻害剤Roche11245200中に取り込ませ、氷上で10分間インキュベートする。細胞はその後洗浄し、MilliQ中に取り込ませる。断片化1:消化固定した溶解細胞はNIaIIINewEnglandBiolabsR0125で消化する。連結1NIaIII酵素を熱失活させ、その後T4DNAリガーゼRoche、799009を使用して連結ステップを実施する。架橋の逆行このサンプルに、ProtK10mg/mlを加え65°Cでインキュベートする。RNaseA10mg/ml、Roche10109169001を後に加え、サンプルは37°Cでインキュベートする。次に、フェノール-クロロホルム抽出を実施し、DNAを含む上清は沈殿させペレット状にする。ペレットは10mMのトリス-HCl、pH7.5中に溶かす。断片化2:第二の消化消化及び連結サンプルはNspINewEnglandBiolabsR0602Sで消化する。連結2:第二の連結及び精製このサンプルに、ProtK10mg/mlを加え65°Cでインキュベートする。RNaseA10mg/ml、Roche10109169001を後に加え、サンプルは37°Cでインキュベートする。次に、フェノール-クロロホルム抽出を実施し、DNAを含む上清は沈殿させペレット状にする。ペレットは10mMのトリス-HCl、pH7.5中に溶かす。富化鋳型はここで終了し、保存又は直接続行することができる。連結DNA断片の増幅:PCRBrca1遺伝子座のPCR富化に使用するプライマーは、約20kbのプライマーセットの空間、即ち観察点で、NIaIII制限断片の制限部位近辺<50bpにおいて逆方向ユニークプライマーとして設計する図2及び表1参照。表1.使用したプライマー配列の概要。BRCA1遺伝子、配列マップ上の位置を参照してプライマーに名称を名付け例えば50.1kb、プライマーはフォワードfw又はリバースrevプライマーである。vpは観察点を示し、IDは配列番号、即ち配列番号1~10を示す。プライマーが対応するBRCA1遺伝子の配列も示す開始点5’及び終了点3’。プライマーは外側方向、即ちインバースであり、鋳型として正常なDNAを使用して、アンプリコンを形成することができないことに留意されたい。典型的な富化PCR反応は25μlからなる。ExpandLong鋳型ポリメラーゼと共に供給される2.5μlの10×PCRバッファー30.5μlのdNTP10mM1μg/μlのプライマーストックから1/7希釈した0.5μlのフォワードプライマー1μg/μlのプライマーストックから1/7希釈した0.5μlのリバースプライマー0.375μlのExpandLong鋳型ポリメラーゼRoche11759060001100ngの富化鋳型25μlの合計体積までのXμlのMilli-Q増幅された連結DNA断片の配列決定標準SOLiDプロトコールに従い、SOLiD配列決定用のライブラリー調製を進める。結果異なる観察点からの読み取り分布値は、観察点部位周辺で最も高かった。さらなる統計値は表2中に示す。観察点ライブラリーC、D及びEからの配列読み取り値によって2288delT突然変異を同定した。BRCA1遺伝子のどの配列が含まれなかったかも決定し、観察点Aから15807塩基対が含まれず、Bからは50124塩基対が含まれなかった。C、D、及びEから、全てのBRCA1配列が含まれた。表2.観察点当たりの配列読み取りの統計値。観察点ライブラリーvp、A~E当たりの配列読み取りの統計値を示す。MBRCA1に適合する読み取り値、TR読み取り値の合計数、MtT標的に適合する全読み取り値の、平均平均範囲、メディアンメディアン範囲、nt20×20倍を超える範囲であったBRCA1遺伝子由来のヌクレオチドの。したがって、一観察点C、D及びE由来の100kbの完全BRCA1が含まれ、観察点A由来の85kbのBRCA1遺伝子が含まれ、観察点B由来の50kbのBRCA1遺伝子が含まれ、C、D及びE観察点から2288delT突然変異を同定した。"