"T細胞の標的抗原を同定する方法であって、a以下の細胞aaおよびabを接触させ:aa以下を発現する細胞:i所定の対合するT細胞受容体α鎖およびβ鎖を含有する機能性T細胞受容体複合体;およびiiT細胞活性化のリードアウト系ab以下を保有する抗原提示細胞:iiiランダム核酸配列にコードされるペプチドライブラリー;およびiviのT細胞受容体によって認識されるMHC分子b該リードアウト系を用いてT細胞の活性化を評価し;cリードアウト系がT細胞活性化を示している細胞と接触している抗原提示細胞を単離し;d標的抗原または該標的抗原をコードする核酸分子を同定することを含む上記方法。dの標的抗原の同定が該標的抗原をコードする核酸分子のシーケンシングを含む、請求項1記載の方法。dの標的抗原の同定が、抗原の少なくとも1つのミモトープの同定を含む、請求項1または2記載の方法。抗原提示細胞がペプチドライブラリーを増幅する能力がある細胞である、請求項1から3のいずれかに記載される方法。リードアウト系がレポータータンパク質の活性化を含む、請求項1から4のいずれかに記載される方法。レポータータンパク質が蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物から成る群から選択される、請求項5記載の方法。T細胞受容体β鎖の可変領域、超可変領域、および/または結合領域をコードする核酸分子を同定する方法であって、SEQIDNO:1-9のプライマーから選択されるプライマーまたはプライマーセットを用いてαβT細胞受容体を発現するT細胞から得た該核酸分子を増幅することを含む、上記方法。SEQIDNO:15-38のプライマーから選択されるプライマーまたはプライマーセットを用いて該核酸分子を増幅させることによって、対合するT細胞受容体α鎖の可変領域、超可変領域、および/または結合領域をコードする核酸分子を同定することを更に含む、請求項7記載の方法。該方法が以下の段階:i以下を含むプライマーセットを用いて核酸分子を増幅し:aSEQIDNO:1-9のプライマー;および/またはbSEQIDNO:15-38のプライマー;iiSEQIDNO:39-47のプライマーを含むプライマーセットを用いてiaの反応産物を増幅し;そして/またはiii-a以下を用いてiiの反応産物を増幅し:aSEQIDNO:13のプライマー;およびbSEQIDNO:14のプライマー;そして/またはiiib以下を用いてibの反応産物を増幅する:aSEQIDNO:48-83のプライマーセット;およびbSEQIDNO:12のプライマー;ことを含む、請求項7または8に記載される方法。患者特異的T細胞抗原を同定する方法であって、A該患者から得たサンプルからT細胞を単離し;BAで単離したT細胞から、対合するT細胞受容体α鎖およびβ鎖を同定し;そしてC請求項1から6のいずれかに記載される方法に従ってT細胞抗原を同定し、ここで、機能性T細胞受容体およびT細胞活性化のリードアウト系を含有する細胞は、Bで同定された、対合するT細胞受容体α鎖およびβ鎖を発現する、ことを含む、上記方法。段階Bにおいて、請求項7から9のいずれかに記載される方法に従って該T細胞受容体α鎖およびβ鎖の可変領域、超可変領域、および/または結合領域をコードする核酸分子を同定することによって、対合するT細胞受容体α鎖およびβ鎖を同定する、請求項10記載の方法。請求項1から6のいずれかに記載される方法によって同定されたT細胞抗原および/または請求項10もしくは11記載の方法によって同定された患者特異的T細胞抗原を含有する組成物。該組成物が医薬組成物である、請求項12記載の組成物。ガン、感染、および自己免疫疾患から成る群から選択される疾病の治療に使用するための、請求項13記載の医薬組成物。該組成物が診断用組成物である、請求項12記載の組成物。ガン、感染、および自己免疫疾患から成る群から選択される疾病の診断に使用するための、請求項15記載の診断用組成物。ペプチドをコードする核酸配列を含有する複数のベクターを含有するペプチドライブラリーであって、該ペプチドはT細胞の標的抗原である可能性があるペプチドであり、該核酸配列はランダムな核酸配列である、上記ペプチドライブラリー。請求項17記載のペプチドライブラリーで細胞をトランスフェクトまたは形質転換することを含む、抗原提示細胞の作製法。SEQIDNO:1-9および/またはSEQIDNO:39-47および/またはSEQIDNO:11および14から成る群から選択されるプライマーまたはプライマーセット。請求項17記載のペプチドライブラリーおよび/または請求項19記載のプライマーもしくはプライマーセットおよび/または請求項18記載の抗原提示細胞を含むキット。この必要性は、特許請求の範囲に記載する態様の規定によって対処される。従って、本発明は、T細胞の標的抗原を同定する方法に関し、該方法はa以下の細胞aaおよびabを接触させ:aa以下を発現する細胞:i所定の対合するT細胞受容体α鎖およびβ鎖を含有する機能性T細胞受容体複合体;およびiiT細胞活性化のリードアウト系ab以下を保有する抗原提示細胞:iiiランダム核酸配列にコードされるペプチドライブラリー;およびiviのT細胞受容体によって認識されるMHC分子b該リードアウト系を用いてT細胞の活性化を評価し;cリードアウト系がT細胞活性化を示している細胞と接触している抗原提示細胞を単離し;d標的抗原または該標的抗原をコードする核酸分子を同定することを含む。本発明に従って使用するT細胞の標的抗原という用語は、T細胞によって認識され、これと結合する抗原に関連する。T細胞への抗原の結合により、該T細胞の活性化が起こる。T細胞標的抗原は、T細胞受容体TCRおよびCD3複合体から成る機能性T細胞受容体複合体によって認識される。T細胞標的抗原は、抗原提示細胞APCの表面上に存在する主要組織適合抗原複合体MHC分子によって提示される。本発明によれば、T細胞の標的抗原はペプチドエピトープをいう。ペプチドエピトープがMHC分子と複合体を形成している場合は、本明細書では抗原-MHC複合体と記載する。MHCクラスI分子によって提示される標的抗原は、CD8T細胞によって認識され、一般的に、細胞内に由来する例えばウイルス標的抗原。MHCクラスII分子によって提示される標的抗原は、CD4T細胞によって認識される。それらは一般的に、食作用を受けた、細胞外に由来するペプチド例えば、微生物由来のペプチドである。T細胞の標的抗原は、ホスト生物にとって外因性のものに由来してもよい例えばウイルスまたは微生物ペプチド。標的抗原は、自己由来、例えば腫瘍関連抗原、または、ホスト生物において自己免疫応答を引き起こす自己抗原であってもよい。好ましい態様では、T細胞の標的抗原は、CD8T細胞の標的抗原である。本明細書で使用する機能性T細胞受容体複合体という用語は、T細胞の活性化を引き起こす能力を有する複合体をいう。T細胞受容体複合体は、6つのサブユニットから成る。T細胞受容体は、2つのサブユニット本明細書では、鎖とも記載する、すなわちTCRαおよびβから成り、これらはジスルフィド結合によってヘテロダイマーを形成しており、TCR受容体複合体の可変領域、超可変領域、および結合領域を含有し、これが抗原/MHC複合体と相互作用し、それによって単一の抗原結合部位が形成される。T細胞の亜群では、T細胞受容体はTCRγおよびδサブユニットから成る。更に、TCRのα鎖およびβ鎖は保存定常領域を有し、それらの領域はCD3複合体タンパク質と相互作用してTCRを膜に固定する。T細胞受容体複合体は、4つのCD3サブユニットを更に含有する。各CD3複合体は、1つのCD3γサブユニット、1つのCD3δサブユニット、および2つのCD3εサブユニットを含有する。CD3εサブユニットの一方はCD3γサブユニットとヘテロダイマーを形成し、他方のCD3εサブユニットはCD3δサブユニットとヘテロダイマーを形成する。抗原の結合によって、それらのTCRヘキサマーが架橋され、活性化される。その後、;MurphyらJanewaysImmunobiology2008第7版。本発明によれば、所定の対合するT細胞受容体α鎖およびβ鎖という用語は、単一分子タイプのT細胞受容体に由来するα鎖およびβ鎖、すなわち、対を成すα鎖およびβ鎖をいう。言い換えると、それらの鎖は、対合して、機能性T細胞受容体のヘテロダイマーを成す。これに関して使用する所定のという用語は、目的のT細胞受容体を示すT細胞受容体鎖の意図的な選択をいい、本発明の方法によってこれに対して該当する抗原が同定される。好ましくはT細胞受容体は脊椎動物T細胞受容体であり、より好ましくは哺乳動物T細胞受容体である。更に好ましくは、T細胞受容体はウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、または霊長類動物由来のT細胞受容体である。最も好ましくは、T細胞受容体はヒトT細胞受容体である。T細胞受容体鎖は、当該分野で公知の任意の方法によって得ることができる。それらには、例えばSeitzら2006に報告されている方法があり、該方法では、形態学的に特性決定されている単一細胞からTCR鎖をクローニングする。それらの細胞は、例えば生検組織のレーザーマイクロダイセクションによって、患者から採取したサンプルから得てもよい。更に、配列が既知であるT細胞受容体を使用してもよく、その場合は、細胞aaを、該T細胞受容体鎖をコードする核酸分子でトランスフェクトすることによって鎖を得てもよい。本発明によれば、T細胞活性化のリードアウト系という用語は、T細胞受容体の活性化の際に測定可能なシグナルを生ずる系をいう。通常、T細胞受容体の活性化により、該T細胞受容体を発現する個別のT細胞の活性化が起こる。従って、リードアウト系によってシグナルが得られれば、これは、抗原提示細胞によって提示された抗原とT細胞受容体との結合を介してT細胞の活性化が起こったことを示す。細胞aaにおいて発現されたT細胞受容体の該活性化により、シグナル例えばレポータータンパク質の発現が生じる。T細胞の活性化に際して測定可能なシグナルを得るのに好適なレポーター遺伝子の非制限的な例として、酵素、例えばβ-ガラクトシダーゼ、CAT、β-グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼ、β-キシロシダーゼ、カテコールジオキシゲナーゼXylE、トレハラーゼTreA、アルカリホスファターゼ、または分泌型アルカリホスファターゼ、並びに、蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物がある。それらのリードアウト系は当該分野で公知であり、例えばSuterCrazzolaraら1995またはShanerら2005に報告されている。このように、細胞aaは、機能性T細胞受容体複合体、および、T細胞の活性化を示すリードアウト系の発現を特徴とする。それらの細胞は、T細胞受容体複合体を含有する任意の細胞例えば、T細胞受容体複合体を天然に発現する細胞、または、T細胞受容体もしくはT細胞受容体複合体で形質転換もしくはトランスフェクトした細胞であることができる。それらの細胞も、T細胞受容体トランスフェクタントと称する。それらの細胞の非制限的な例として、T細胞、T細胞ハイブリドーマ、リンパ腫、および人工的に不死化したT細胞があるKatakuraら1998。好ましくは、細胞aaはT細胞ハイブリドーマである。T細胞ハイブリドーマは当該分野で公知であり、Ozakiら1988;Shirahataら1998;Chenら2007に報告されている方法、または以下の実施例に記載する方法によって得てもよい。好ましくは、細胞aaは、単一分子タイプのT細胞受容体のみを発現する。それらの細胞は、例えば野生型T細胞であるか、または、内因性T細胞受容体を有さず、目的のT細胞受容体でトランスフェクトもしくは形質転換されたT細胞ハイブリドーマであってもよい。別の態様では、既に内因性T細胞受容体を発現している細胞を、目的の、更なるT細胞受容体でトランスフェクトまたは形質転換することができる。その場合、目的のT細胞受容体を改変して、内因性T細胞受容体の鎖と目的のT細胞受容体の鎖との間でヘテロ2量体化が起こらないようにする。それらの改変は当該分野で公知であり、それらに限定される訳ではないが、目的のT細胞受容体鎖の定常領域の接合部分への変異型アミノ酸の導入、または、不均一性が非常に低いT細胞例えばオリゴクローナルまたはモノクローナルT細胞集団をレシピエントとして選択するVossら2008;Cohenら2007;Kuballら2007;Weinholdら2007;vanLoenenら2010;Bendleら2010。好ましくは、種々の分子タイプのT細胞受容体を発現する細胞を本発明の方法に使用する場合、種々の細胞例えば、目的のT細胞受容体を単一の内因性T細胞受容体と共に発現する細胞で、該内因性T細胞受容体が第1のラウンドの、または先のラウンドのスクリーニングで細胞中に含有されていたT細胞受容体と異なるものを用いて、更なるラウンドのスクリーニングを行う。好ましくは、それらの更なるラウンドのスクリーニングで使用する細胞は、同定される抗原が目的のT細胞受容体の抗原であって内因性T細胞受容体の抗原ではないことを確かにするために、目的のT細胞受容体のみを発現するものとする。本明細書で使用する抗原提示細胞という用語は、抗原を、主要組織適合抗原複合体MHCとの複合体としてその表面上に提示する細胞をいう。MHCを発現し、抗原を提示するものであれば、いずれの細胞も、本発明にかかる抗原提示細胞として好適である。インビボにおいて抗原提示細胞として作用する可能性のある細胞としては、例えば、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、または活性化された上皮細胞が挙げられるが、線維芽細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、または血管内皮細胞も挙げられる。それらの細胞は、以下に記載するペプチドライブラリーでトランスフェクトまたは形質転換した後、本発明に従って使用することができる。また、MHCを内因的に発現しない細胞を使用してもよく、その場合、好適なMHCを該細胞に形質転換またはトランスフェクトする。本発明にかかるランダム核酸配列にコードされるペプチドライブラリーという用語は、ペプチドの集合体、すなわちライブラリーをいい、ここで、ペプチドは無作為な配列を有する核酸配列にコードされている。言い換えれば、それらの核酸配列は、ランダムに選択された、可能性のある様々な配列バリエーションを示す。すなわち、ペプチドライブラリーが、例えば9アミノ酸長のペプチドを表す場合、コードする核酸配列は27ヌクレオチド長であり、つまり、それぞれの可能性のあるヌクレオチドの組み合わせは合計42718x1016の異なる核酸配列に相当する。好ましくは、ペプチドライブラリーは、少なくとも103個の異なる核酸配列、例えば少なくとも104個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、少なくとも1011個、少なくとも1012個、少なくとも1013個、少なくとも1014個、少なくとも1015個、または少なくとも1016個の異なる核酸配列を有する核酸配列群にコードされる。最も好ましくは、ペプチドライブラリーは、所定のペプチド長についての、全ての可能な順列に相当する核酸配列群にコードされるものである。更に、種々の長さのペプチドを含むペプチドライブラリーも本明細書で企図され、該ライブラリー中にも上記の数の核酸配列群が準用される。更に、MHC複合体の標的抗原の多くで、いわゆるアンカー部位が抗原およびMHC間の結合に必要であることが知られている。これらのアンカー部位が知られている場合は、それらの位置に一定のアミノ酸を導入し、それ以外の位置だけをランダム化することによって、ランダム核酸配列を作製することができる。種々のMHCのアンカー部位が知られている。その中には、例えば実施例に記載するHLA-A2があり、アンカー部位は2位のイソロイシン、6位のバリン、および9位のロイシンであるRammenseeら1999。更なるアンカーも当該分野で公知であり、例えばRammenseeら1999に報告されている。本明細書に使用するペプチドという用語は、最大50個のアミノ酸から成る一群の分子を指す。ペプチドは、2量体、3量体、およびそれ以上のオリゴマーを形成していてもよい、すなわち、1つより多い分子から成ってもよく、それらの分子は同一であっても、同一でなくてもよい。それに伴い、対応するより高次の構造は、ホモ2量体またはヘテロ2量体、ホモ3量体またはヘテロ3量体等と称する。ペプチドという用語はペプチドがタンパク質と同義に使用される場合、天然に修飾されたペプチドを意味し、修飾は、例えばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などによってなされる。それらの修飾は当該分野で公知である。好ましくは、ペプチドは最短で少なくとも4アミノ酸長、例えば、少なくとも5アミノ酸長、少なくとも6アミノ酸長、少なくとも78アミノ酸長、少なくともアミノ酸長、少なくとも9アミノ酸長、または、少なくとも10アミノ酸長である。また、好ましくは、ペプチドは最大50アミノ酸長、例えば最大45アミノ酸長、最大40アミノ酸長、最大35アミノ酸長、最大30アミノ酸長、最大25最大アミノ酸長、最大20アミノ酸長である。明記していないそれらの中間の数も、本明細書で企図される。より好ましくは、MHCクラスI分子によって提示されるペプチドは、4から20アミノ酸長である。従って、該ペプチドは4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸長であってもよい。また、好ましくは、MHCクラスII分子によって提示されるペプチドは、4から50アミノ酸長である。クラスIIペプチドは、両端がMHC結合溝の外側に伸長しうるため、原理上は、どれだけ長くてもよい。エピトープ自体は、通常、8から10アミノ酸長である。従って、該ペプチドは4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50アミノ酸長であってもよい。更に好ましくは、本発明のペプチドは8から10アミノ酸長である。最も好ましくは、ペプチドは9アミノ酸長である。本発明にかかる核酸配列には、DNA例えばcDNAまたはゲノムDNAおよびRNAが含まれる。理解されるように、本明細書で使用するRNAという用語は、全ての形態のRNAを含み、好ましくはmRNAをいう。更に、当該分野で公知の核酸様配列、例えばDNAまたはRNAの合成または半合成誘導体、および混合ポリマーは、センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれも含まれる。本発明にかかるそれらの核酸様分子または核酸誘導体には、ホスホロチオエート核酸、ホスホルアミダイト核酸、2’-O-メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸HNA、およびロックト核酸LNAがあるBraaschおよびCoreyChemBiol81参照。LNAはRNA誘導体であり、リボース環が、2’-酸素および4’-炭素間のメチレン結合によって拘束されている。それらが更なる非天然型または誘導型ヌクレオチド塩基を含有してもよいことは、当業者に容易に認識されるところである。核酸配列のランダム性により、既知の標的配列に基づく考慮は必要とされない。従って、本発明に使用するペプチドライブラリーは、従前技術とは異なる。従前技術では、遺伝子の既知の配列に従って核酸配列を設計しなければならなかったが、本発明のライブラリーでは、完全にランダムな異なるペプチドの集団それらの配列を事前に知る必要はないによるスクリーニングによってT細胞の標的抗原を探索する。好ましい態様では、ペプチドライブラリー単数または複数をコードするランダム核酸配列は、野生型遺伝子をコードしない。つまり、ランダム核酸配列という用語は、特定のタンパク質またはcDNA例えばmRNA由来のcDNAをコードする完全長遺伝子を含まない。好ましくは、ペプチドライブラリーのペプチドをコードする核酸配列をベクターに導入する。好ましくは、ベクターはプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または、それ以外の例えば遺伝子操作で慣例的に使用されるベクターである。本発明の核酸配列を市販のベクターに挿入してもよい。非制限的な例として、以下のような、哺乳動物細胞での発現に適合するベクターが挙げられる:pREPInvitrogen社、pcDNA3Invitrogen社、pCEP4Invitrogen社、pMC1neoStratagene社、pXT1Stratagene社、pSG5Stratagene社、EBOpSV2neo、pBPV1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIRClontech社、pIRESEGFPClontech社、pEAK10EdgeBiosystems社、pTriExHygroNovagen社、およびpCINeoPromega社。ベクターの改変法は、SambrookおよびRussel2001を参照されたい。一般にベクターは、クローニングまたは発現のための1つまたはそれ以上の複製起点oriおよび遺伝システム、ホストにおける選択のための1つまたはそれ以上のマーカー例えば抗生物質耐性、および1つまたはそれ以上の発現カセットを含有することができる。好適な複製起点oriには、例えばColE1複製起点、SV40ウイルス複製起点、およびM13複製起点がある。ベクターに挿入されるコード核酸配列は、例えば標準的な方法によって合成するか、または天然の供与源から単離することができる。コード配列の転写調節要素および/または他のアミノ酸コード配列へのライゲーションは、確立された方法を用いて実施することができる。真核細胞において確実に発現させるための転写調節要素発現カセットの一部は、当業者に公知である。これらの要素は、転写を開始させる調節配列例えば翻訳開始コドン、プロモーター、エンハンサー、および/またはインスレーター、内部リボソーム侵入部位IRESOwensProcNatlAcadSciUSA9814711476、および、必要により、転写の停止および転写物の安定化のためのポリAシグナルを含有する。更なる調節要素には、転写エンハンサー、翻訳エンハンサー、および/または、天然で結合している、もしくは非相同のプロモーター領域を含んでもよい。好ましくは、本発明の核酸配列は、それらの発現制御配列に機能的に結合し、それによって真核細胞における発現が可能となる。ベクターは、更なる調節要素として、分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列を更に含んでもよい。それらの配列は当業者に公知である。更に、使用する発現系によって、発現されたポリペプチドを細胞内コンパートメントに誘導する能力を有するリーダー配列を、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に付加してもよい。それらのリーダー配列は当業者に公知である。転写開始を確実にするための調節要素の例として考えられるものには、サイトメガロウイルスCMVプロモーター、SV40プロモーター、RSVラウス肉腫ウイルスプロモーター、LacZプロモーター、Gal10プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーター、CMVエンハンサー、CaMキナーゼプロモーター、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルスAutographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirusAcMNPV多角体プロモーター、またはSV40エンハンサーがある。真核細胞における更なる調節要素の例として、核酸配列の下流に位置する転写終了シグナル例えばSV40ポリA部位またはtk-ポリA部位またはSV40、lacZ、およびAcMNPVの核多角体病ウイルスpolyhedralポリアデニル化シグナルがある。更に、好ましくは、本発明のベクターは選択マーカーを含有する。選択マーカーの例として、ネオマイシン、アンピシリン、およびハイグロマイシン耐性などがある。特異的に設計したベクターにより、異なるホスト例えば細菌-真菌細胞または細菌-動物細胞間でDNAをシャトルすることが可能となる。本発明の発現ベクターは、本発明の核酸配列およびコードされるペプチドの複製および発現を引き起こす能力を有する。記載した調節要素を含有する好適な発現ベクターは当該分野で公知であり、例えばOkayamaBergcDNA発現ベクターpcDV1Pharmacia社、pRcCMV、pcDNA1、pcDNA3Invitrogene社。別記の実施例で使用したもの、pSPORT1GIBCOBRL社、GatewayプラスミドInvitrogen社、またはpGEMHEPromega社がある。上記の本発明の核酸配列は、直接、または、以下を介して細胞内に導入されるように設計することができる:エレクトロポレーション例えばMultiporatorEppendorf社またはGenepulserBioRadを使用、PEIPolysciences社米国ウォリントン、ドイツエッペルハイム、Ca2によるトランスフェクション、または、リポソーム例えばリポフェクタミンInvitrogen社、非リポソーム化合物例えばFugeneRoche社、リポソーム、ファージベクター、またはウイルスベクター例えばアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス。更に、バキュロウイルス系、または、ワクシニアウイルスもしくはセムリキ森林熱ウイルスに基づく系を、本発明の核酸配列の真核生物発現系として使用してもよい。本明細書では、MHCという用語はHLAと同義に使用する。本発明にしたがえば、T細胞受容体によって認識されるMHC分子を使用することが必要条件である。従って、CD8T細胞標的抗原のスクリーニングを行う場合、細胞abによって発現されるMHCは、MHCクラスIでなければならず、また、CD4T細胞標的抗原のスクリーニングでは、MHCはMHCクラスIIでなければならない。更に、細胞aaによって発現されるT細胞受容体によって認識される、特定のMHCを使用する必要がある。検討を行っているT細胞受容体によって認識されるMHCをコードする特定のHLA遺伝子が未知の場合、予備実験を実施し、被験体例えば患者の全対立遺伝子から発現させた一連のMHCHLA分子全てを、当該分野で十分確立されている方法を用いてスクリーニングしてもよい。それらの方法は、例えば以下に報告されている:RobinsonJら2003httpwwwebiacukimgthlacitationshtml参照;Bettinottiら2003;Marshら2010。従って、目的のT細胞受容体を発現する細胞aaは、該T細胞受容体の抗原を提示する細胞abと接触すると、活性化される。T細胞の活性化はリードアウト系によって観察することができ、これによって、abとaaとの細胞複合体の単離、または、活性化細胞abのみの単離を便宜に行うことができる。細胞の単離方法は、当該分野で公知であり、それらには、限定される訳ではないが、手作業による細胞の選別採取、または、ロボット、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、またはFACS蛍光活性化セルソーティングの使用による自動化選別採取がある。それらの方法は、例えばMurray2007またはTungら2007、並びに、以下の実施例に報告されている。抗原提示細胞abの単離後、該個別細胞に含有されるペプチドライブラリーのペプチド単数または複数をコードする核酸分子を単離する。核酸分子の単離法は当該分野で公知であり、また、代表的な方法を以下の実施例に記載する。標的抗原またはそれをコードする核酸分子を同定する前に、該核酸分子を増幅してもよい。増幅には、例えばPCR法更なる詳細は後述する、および/または、細菌細胞への核酸分子のトランスフェクションおよびその後の細菌培養による核酸分子の増幅がある。その後、増幅された核酸分子またはそれらの核酸分子にコードされるペプチドを同定する。本発明に関して使用する同定という用語は、標的抗原単数または複数のアミノ酸配列または核酸配列を決定することをいう。核酸分子の同定法には、それに限定される訳ではないが、核酸シーケンシングがある。その後、標的抗原または該標的抗原をコードする核酸分子を同定する。本発明によれば、T細胞の標的抗原を決定するための、偏りがなく、直接的な方法が提供される。以下の実施例に示すように、短鎖ペプチドをコードする組換えコンビナトリアルライブラリーおよび好適なMHCI分子を細胞例えばCOS細胞に共トランスフェクトすることにより、複雑なタンパク質プロセシングを回避することができる。ライブラリーは、短鎖ペプチドをコードするランダムヌクレオチド配列を含有するプラスミドを含有する。それらのプラスミドは容易に回収できる。トランスフェクトしたCOS細胞を、例えば以下の実施例に示すように、細胞を用いてスクリーニングする。それらの細胞は、機能性CD3および下流シグナリング分子を保有し、活性化T細胞核因子NFATを保有する細胞中、NFATの応答要素の制御下で、TCRα鎖およびβ鎖T細胞受容体トランスフェクタント、ヒトCD8α鎖およびβ鎖、そしてsGFPで共トランスフェクトしたものであるFieringra1990;KarttunenおよびShastri1991。好ましくは、これらの細胞はTCRでトランスフェクトしたT細胞ハイブリドーマである。これは、それらの細胞では無限数の再生revivedT細胞を得ることができ、より問題の多い本物のT細胞クローンを構築する必要がないためである。ライブラリーを提示するCOS細胞の集密単層に、TCRトランスフェクタントを積層する。特定の単一TCRトランスフェクタントがライブラリーからのペプチドによって活性化されると緑色が発生し、蛍光顕微鏡下、マイクロマニピュレーターを用いて、下部の該COS細胞を選択採取することができる。この高スループット法によれば、数百万のライブラリーペプチドを数時間以内で試験することができる。この方法は、これまでに報告されている方法、すなわち、プラスミドをトランスフェクトしたAPCのプールで細胞毒性または分泌されたサイトカインを測定する、または、数ラウンドのFACSソーティングによって行うものより、効率的であるVanderBruggenら1991;Smithら2001;NinoVasquezら2005;Crawfordら2006。その後、回収されたCOS細胞からのライブラリープラスミドを単離し、新たなラウンドのスクリーニングを行い、最後にシーケンシングを行うことができる。その後、T細胞受容体活性化モチーフを解析し、データベース内の既存のタンパク質と比較することができる。この方法の実行可能性は別記の実施例に記載しているが、ここでは、十分研究が行われているTCRJM22Gotchら1987;StewartJonesら2003;Ishizukaら2008を使用しており、このTCRはHLA-A2およびインフルエンザ基質タンパク質ペプチドflu58-66に特異的である。本発明の方法の主な利点は、短鎖ペプチドをコードするプラスミドベクターを提供することによって、抗原提示細胞の抗原プロセシング機構に依存しないことである。実施例に示すように、多数の抗原提示細胞がプラスミドpcDNAでのトランスフェクション後、コードされたペプチド例えばflu58-66を効率的に提示する図2c、e。また、実施例で実証するように、ペプチド例えばflu58-66は発現後、それらのHLA-A0201への負荷が起こる場所である小胞体内腔に、効率的に輸送される。特筆すべきことに、完全長タンパク質flu1-252は認識されなかった図2g。これは、完全長タンパク質がCOS7細胞によって正確にプロセシングされないことを示唆しており、cDNAライブラリーの一般的な問題、すなわち、それらが選択したAPCのプロセシング機構に依存することを示している。患者病変中の抗原提示に全く類似した状態をインビトロで得ることは不可能であると考えられ、それにはいくつかの理由がある:第1に、多くの場合、いずれの細胞がインサイチューで自己抗原を提示するかということさえ知られていない。第2に、例え知られたとしても、元のAPCを回収および増殖することは、ほとんど不可能であるか、少なくとも非常に困難である。第3に、炎症組織における抗原のプロセシングは、健常組織に比較して、変更されている可能性があるMartinonら2009。このため、同一の親タンパク質から、全く異なるペプチドスペクトラムが得られうる。第4に、抗原、すなわちcDNAライブラリーを初代細胞に導入しなければならないが、そのトランスフェクション効率および形質転換効率は非常に低いことが知られている。本明細書に開示する方法は抗原のプロセシングに全く依存しないため、これらの問題は全て解決される。更に、COS細胞は高い有効性でトランスフェクトすることができ、そのサイトゾル中でプラスミドベクターを増幅し、それによって回収および分析が可能となる。本明細書に開示する結果は、ミモトープを同定し、それによって、天然に存在する親ペプチドを簡単なデータベース検索によって明確に同定できることを実証している。本発明の方法によって得られる、同定済みミモトープのリストは不完全でありうる。その理由は、一部のペプチドはCOS細胞のサイトゾル中でエンドペプチダーゼもしくはエキソペプチダーゼによって更に消化されるかもしれず、あるいは、他のペプチドは、その化学的特性のゆえに消失するかもしれない、すなわち、疎水性であって膜内に挿入されるか、または、タンパク質もしくは他の細胞成分に結合するかもしれないためである。実際に、化学的に合成したペプチドライブラリーに基づく方法が存在し、これによって、特定のTCRの多特異性について包括的な概要が得られているNinoVasquezら2005。しかしながら、未知の抗原の同定に関する報告は稀である。これはおそらく、化学的に合成されたペプチドを、膨大な数の他のペプチドのプール中でしか分析できないためである。従って、正しいペプチドはライブラリー中に存在するかもしれないが、その濃度が低すぎて検出できない。これに対して、本発明の高スループット法では、数百万個の陰性細胞から単一の活性化細胞を選別採取し、その後、陽性プラスミドを増幅することができる。従って、本発明の方法は実際的である:たとえミモトープのリストが不完全な可能性があっても、データベースで親ペプチドを発見するのに十分なミモトープを得ることができる。本発明の方法は、ファージライブラリーのスクリーニング法、または、検出手段としてオリゴマー化した可溶性T細胞受容体を使用する方法Crawfordら2006を連想させるが、根本的な違いがある。それは、本発明はTCR-MHC/ペプチド相互作用の親和性の高さに依存しないことである。ファージライブラリーのスクリーニングはいくつかの選別段階を伴うため、相応の親和性が必要とされる。ファージライブラリーの一般的な適用、すなわち、抗体または受容体とリガンドの相互作用の検討では、確かに親和性の高さは十分である。これに対して、T細胞受容体は、周知の通り親和性が低い。それらは一般に、抗体で観察されるものより数桁低い。TCRのオリゴマー化によってもこの欠点は解決できず、それは、そのようなアッセイのリードアウトも、感度が中度である結合アッセイであるためである。おそらくこれが、上記のように、未知のT細胞抗原がこの方法によって未だ発見されていない理由である。これに対し、本発明は非常に高感度のバイオアッセイを使用する:細胞例えばT細胞ハイブリドーマの活性化を測定するが、該細胞は、その抗原提示細胞に弱く結合するだけでよい。このアッセイの驚異的な感度によって、MHC/ペプチド複合体に対するT細胞受容体の結合親和性の低さは相殺される。本発明の方法は、科学的目的のみならず、医学的適用にも関連する。第1に、これは、一般的に適用できる方法である、すなわち、興味の対象であるあらゆるT細胞に適用しうる。これはヒトT細胞に限定されず、任意の種由来の任意のTCRの抗原認識特性を研究できる。これはもちろん、T細胞が関与する多くの科学的疑問に関して非常に興味深いものである。技術的には、唯一の条件は、特定のMHCクラスI分子が知られているか、または特定のMHCクラスII分子が知られていることである。そうでない場合は、当該分野で確立された方法RobinsonJら2003;httpwwwebiacukimgthlacitationshtml;Bettinottiら2003;Marshら2010を用いて、候補となる対立遺伝子の全てから成る完全なセットを予備実験で同定しなければならない。その後、全ての候補HLA対立遺伝子を、本明細書に開示する方法で試験することができる。更に、多くの場合に特にヒト由来サンプルを研究する場合に大きな問題となる初代細胞の作製は、T細胞についても抗原提示細胞についても、必要としない。しかしながら、最も重要な観点は医学分野である。T細胞は多くの疾病に関与している。それらは感染および腫瘍を撃退し、自己免疫疾患では自己組織を攻撃する。ほとんどの場合、その正確な抗原は知られていない。これらのエピトープを知ることにより、科学者はその知識を診断および治療に利用することができる。このように、抗原は、感染および腫瘍を検出し、多くの自己免疫疾患の診断を改善するためのバイオマーカーとなりうる。更に、それらのバイオマーカーは、疾病の進行の予測に大きな価値を有するものでありうる。また、抗原を知ることは、治療的アプローチにも有益である。それらを感染または腫瘍に対するワクチン接種に用いることができる可能性があるBoonら2006。また、それらによって、多くの自己免疫疾患例えばCD8T細胞が重要な役割を果たすことが知られている疾患、すなわち、多発性硬化症、乾癬、炎症性筋疾患、および他の多くの疾患において、自己攻撃性T細胞クローンを選択的に除去または調節することが可能となりうるFrieseおよびFugger2009;Dalakas2006;WalterおよびSantamaria2005。更に、抗原についての知見を得ることにより、その標的抗原への親和性を向上させるように操作した、新規の改善型T細胞受容体の合理的設計および開発が可能となる。それらの改善型T細胞受容体は、部位特異的変異導入による相補性決定領域中のアミノ酸の置換または導入によって作製することができる。改善型T細胞受容体を、科学的、診断的、および治療的目的で、インビトロおよびインビボにおけるその抗原の検出に使用することができる。それらを使用して、ある種の抗原を提示する細胞を検出、阻害、または除去毒性物質をカップリングさせることによってしてもよい。必要により、T細胞受容体をオリゴマー化して親和性を向上させてもよい。従って、別の態様では、本発明は遺伝子操作したT細胞受容体に関し、ここで、アミノ酸は野生型T細胞受容体と比較して改変されており、該改変によって、改変されていないT細胞受容体に比較して標的抗原への親和性が増加している。更に、特定の抗原の知見を得ることにより、目的とする特定のT細胞受容体の改変型ペプチドリガンドの設計が可能になりうる。それらの改変型抗原は、T細胞寛容を誘導し、特定の抗原ワクチンの免疫原性を向上するのに重要でありうる。改変型および/または改善型T細胞抗原を合理的に設計する方法は、当該分野で公知であるFontouraら;BielekovaおよびMartin。好ましい態様では、本発明の方法は、上記方法の段階aからcを、単一タイプの抗原をコードする単一分子タイプの核酸分子が単離されるまで反復することを含む。従って、段階aからcを、少なくとも更に1回、例えば更に2回、更に3回、更に4回、更に5回、更に6回、更に7回、更に8回、更に9回、または更に10回反復してもよい。更に多くの回数での段階aからcの反復も、本明細書で企図される。標準的な方法を用いてペプチドライブラリーを抗原提示細胞abに導入することによって、該細胞内に、コード核酸分子が1コピーより多く存在することになる。更に、培養液中に存在する核酸分子は、段階cにおける該細胞の単離の際、抗原提示細胞と共に移動される。従って、本発明の方法の段階aからcまでを1ラウンドだけ実施すると、種々の抗原ペプチドをコードする核酸分子の多種多様なコピーを保有する抗原提示細胞、または、種々の抗原ペプチドをコードする核酸分子の多種多様なコピーが結合する対象となる抗原提示細胞が単離される。段階aからcを反復することにより、正確な標的抗原をその後の段階dで同定してもよい。理解されるように、段階aを反復する際、抗原提示細胞は、前ラウンドのスクリーニングの段階cで単離された抗原提示細胞から単離された核酸分子を保有する細胞である。以下の図6に、単一タイプの抗原をコードする単一分子タイプの核酸分子を得るための、これらの反復法の好ましい実施方法についての概略を示す。簡潔に記載すると、第1の段階で、活性化された緑色蛍光TCRトランスフェクタントを、その下部にある、活性化プラスミドを保有する抗原提示細胞と共に選別採取する。プラスミドの挿入断片をクローニングし、細菌にトランスフェクトする。細菌クローンを計数するために、細菌クローンの画分を寒天プレート上に播種する。その後、500個の独立した細菌クローンを含有する細菌のサブプールを、30またはそれ以上作製する。それらをCOS-7細胞にトランスフェクトし、再び試験する。陽性サブプールから更なるサブプールを作製する。それらの各サブプールには、より少ないクローンが含有される。最後に、単一細菌クローンを解析する。陽性クローンのシーケンシングを行い、抗原性ミモトープを解明する。別の好ましい態様では、細胞aaは、CD8鎖、より好ましくはCD8α鎖およびβ鎖を更に発現する。細胞aa上でのCD8の更なる発現は、T細胞受容体TCRの共受容体としての役割を果たす。CD8-αの細胞外IgV様ドメインは、MHCクラスI分子のα3部分と相互作用する。この相互作用により、抗原特異的活性化の際、T細胞受容体発現細胞は、結合する標的細胞と近接した状態に保たれる。従って、本発明によれば、細胞aa上にCD8を更に発現させることにより、2つの細胞間の相互作用が更に向上する。本発明の方法の別の好ましい態様では、dにおける標的抗原の同定は、該標的抗原をコードする核酸分子のシーケンシングを含む。シーケンシング法には、限定される訳ではないが、直接シーケンシング、自動DNAシーケンサーでの蛍光SSCP、およびパイロシーケンシングによる配列解析法がある。これらの方法は当該分野で公知である。例えば以下参照:Adamsら編AutomatedDNASequencingandAnalysisAcademicPress1994;AlpheyDNASequencingFromExperimentalMethodstoBioinformaticsSpringerVerlagPublishing1997;RamonらJTranslMed19;MengらJClinEndocrinolMetab9034193422。より好ましい態様では、該標的抗原をコードする核酸分子を、シーケンシングの前に増幅する。核酸分子の増幅法には、限定される訳ではないが、PCRおよびその変法、例えばRT-PCR逆転写PCRとも呼ばれるがある。PCRは当該分野で公知であり、標的配列の多数のコピーを作製するのに使用される。これは、自動サイクラー装置によって行われ、この装置は、非常に短時間で反応液を含有する容器を加熱および冷却できる。PCRは一般的に、以下から構成されるサイクルを多数回反復することから成る:a変性段階DNA分子の両鎖を融解させ、前段階の全ての酵素反応を停止させる;bアニーリング段階融解したDNA分子鎖にプライマーを特異的にアニーリングさせる;およびc伸長段階テンプレート鎖からの情報を用いて、アニールしたプライマーを伸長させる。一般的に、PCRは、例えば以下を含有する50μlの反応液中で行うことができる:5μlの10xPCRバッファー、1.5mMのMgCl2、200μMの各デオキシヌクレオチド3リン酸、0.5μlの各プライマー10μM、約10-100ngのテンプレートDNA、および1-2.5ユニットのTaqポリメラーゼ。増幅のためのプライマーは、標識されていても、未標識であってもよい。DNAの増幅は、例えばモデル2400サーマルサイクラーAppliedBiosystems社、カリフォルニア州フォスターを用い、以下の条件で行うことができる:94°Cで2分間、次いで、アニーリング例えば50°C、30秒間/伸長使用するDNAテンプレートの長さおよび酵素により、例えば72°C、1分間/変性例えば94°C、10秒間から成るサイクルを30-40サイクル、そして、最終アニーリング段階55°C、1分間並びに最終伸長段階72°C、5分間。DNAテンプレート共に使用するのに好適なポリメラーゼには、例えばEcoliDNAポリメラーゼIまたはそのクレノウ断片、T4DNAポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、好熱菌から単離された熱安定性DNAポリメラーゼであるVent、Amplitaq、iProof、Pfu、およびKODがあり、これらの一部は、校正proofreading機能および/または異なる至適温度を有する。しかしながら、特定の核酸分子を増幅するために異なる長さおよび/もしくは組成のプライマーを使用してPCR条件を最適化する方法、または、反応混液の容量をスケールダウンもしくはスケールアップするための方法は、当業者に公知である。増幅すべき核酸がRNAから成る場合は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRを使用する。逆転写酵素という用語は、デオキシリボヌクレオシド3リン酸の重合化を触媒し、リボ核酸テンプレートに相補的なプライマー伸長産物を生成する酵素を意味する。RT-PCRは、RNAウイルスを用いて本発明の方法に使用するためのライブラリープラスミドをコードさせる場合に、特に適している。酵素により、プライマーの3’末端で合成が開始され、テンプレートの5’末端に向かって、合成が停止するまで進行する。RNA標的配列を相補的DNAcDNA配列に変換する好適な重合化剤の例として、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素および高度好熱菌ThermusthermophilusDNAポリメラーゼPerkinElmer社から販売されている、逆転写酵素活性を有する熱安定性DNAポリメラーゼがある。一般に、最初の逆転写段階の後、第1の変性段階でゲノムRNA/cDNAデュプレックステンプレートを熱変性させ、DNA鎖を増幅テンプレートとして使用できる状態にする。高温RTにより、プライマーの特異性が高くなり、効率が向上される。米国特許出願第07746121号1991年8月15日出願は、ホモジニアスRT-PCRについて開示しており、このPCRでは、逆転写およびPCR増幅段階の両方を同じプライマーおよびポリメラーゼで行うことができ、反応条件は、試薬を変更せずに両反応が起こるように最適化する。高度好熱菌DNAポリメラーゼ逆転写酵素としても機能する熱耐性DNAポリメラーゼは、テンプレートにかかわらず、全てのプライマー伸長段階に使用することができる。両過程を、試薬を変更または添加するためにチューブを開けることなく、行うことができる;ただし、温度プロファイルは、第1のサイクルRNAテンプレートと残りの増幅サイクルDNAテンプレート間で調整する。RT反応は、例えば以下を含有する20μlの反応液中で行うことができる:4μlの5xAMV-RTバッファー、2μlのオリゴdT100μg/ml、2μlの10mMdNTP、1μlの総RNA、10ユニットのAMV逆転写酵素、およびH2O最終容量を20μlに調整。反応は、例えば以下の条件を用いて行うことができる:反応液を70°Cで15分間保持し、逆転写を行わせる。次いで、反応温度を上昇させ、95°Cで1分間、RNA-cDNAデュプレックスを変性させる。その後、95°Cで15秒間/60°Cで20秒間から成るサイクルを2サイクル行った後、90°Cで15秒間/60°Cで20秒間から成るサイクルを38サイクル行う。最後に、反応温度を60°C4分間保持して最終の伸長段階を行い、15°Cに冷却して、増幅したサンプルを更に処理するまでこの温度を維持する。上記の反応条件はいずれも、特定の状況の必要に応じてスケールアップしてもよい。当業者は、十分確立された方法を用いて、核酸分子のシーケンシングおよび増幅の両方に好適なプライマーを構築することができる。例えば、プライマーの配列は、ペプチドライブラリーをコードするランダム核酸配列の上流および下流隣接領域、例えば、該核酸配列を挿入したプラスミドバックボーン、ペプチドの発現に使用されるプロモーター配列、または他の調節配列エンハンサー配列などに関する知見に基づいて構築してもよい。本発明の方法の更なる好ましい態様では、dの標的抗原の同定は、抗原の少なくとも1つのミモトープを同定することを含む。本発明によれば、ミモトープという用語は、抗原エピトープの構造を模倣した分子を指す。該分子は、例えばペプチドであってもよい。その模倣性により、ミモトープは、野生型抗原エピトープによって引き起こされるのと同じT細胞受容体応答を誘導する。従って、特定の抗原エピトープを認識するT細胞受容体は、その抗原エピトープを模倣するミモトープも認識する。好ましくは、ミモトープは、特定のT細胞受容体の天然の標的抗原エピトープと、そのアミノ酸構造例えばアミノ酸配列および組成において、例えばアミノ酸構造中の40個未満のアミノ酸、例えば30個未満のアミノ酸、20個未満のアミノ酸、15個未満のアミノ酸、10個未満のアミノ酸、5個未満のアミノ酸、4個未満のアミノ酸、3個未満のアミノ酸、そして最も好ましくは1個のアミノ酸が異なっている。本明細書で使用する少なくとも1つのミモトープとは、所定の抗原に関する任意数の可能なミモトープをいう。これには、例えば少なくとも2個のミモトープ、例えば少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、または少なくとも10個のミモトープが含まれる。また、少なくとも15個、例えば少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも75個、少なくとも100個、少なくとも150個、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、または少なくとも500個のミモトープも含まれる。この態様は、本発明の方法によってミモトープを同定できるという知見に基づき、その後、それをデータベース検索に使用して野生型抗原を同定することができる。このように、本発明の方法によって実際の抗原が直接同定されなくても、後述する実施例のように、該ミモトープを介して間接的に同定できる。本発明の方法の別の好ましい態様では、抗原提示細胞は、ペプチドライブラリーを増幅する能力を有する細胞である。本明細書で使用するペプチドライブラリーを増幅する能力を有する細胞という用語は、核酸配列またはベクターを複製する能力のある細胞を指す。それらの細胞は当該分野で公知である。非制限的な例として以下がある:上記のSV40起点を有するプラスミドを使用する場合、大型T抗原を含有する細胞;Durocherら2002に報告されるEBNA系を含む細胞、またはウイルス例えばレトロウイルス、アデノウイルス、またはレンチウイルスで形質転換するのに好適な細胞で、それらのレトロウイルスベクターのホストとなり、それらを増幅しうるものSmithら2001。また、該系を内因的に発現しない細胞を使用してもよく、この場合、細胞は、単に、それぞれの系に必要とされる成分、例えば大型T抗原でトランスフェクトまたは形質転換してもよい。本発明によれば、好適な程度の増幅は、最初に該細胞内にトランスフェクトまたは形質転換されたものより、多くのコピーの核酸配列が存在する場合に、達成される。従って増幅が達成されるのは、核酸配列コピーの量が少なくとも2倍、例えば、1つの分子種の核酸配列のコピーが少なくとも5多く、例えば少なくとも10多く、例えば少なくとも20多く、例えば少なくとも30多く、例えば少なくとも50多く、例えば少なくとも100多く、例えば少なくとも200多く、例えば少なくとも500多く、例えば少なくとも1,000多く、例えば少なくとも2,000多く、例えば少なくとも3,000多く、例えば少なくとも4,000多く、例えば少なくとも5,000多く、例えば少なくとも10,000多く、例えば少なくとも15,000多く、例えば少なくとも50,000多く、例えば少なくとも100,000多く、例えば少なくとも250,000多く、例えば少なくとも500,000多く、細胞に存在する場合である。特定の細胞がペプチドライブラリーを増幅する能力を有するか否かを確認するために、該細胞の一部を用いて、トランスフェクション/形質転換の直後に、1つの分子タイプの核酸配列のコピー数について分析することができる。更に、同じ分析を、後の時点単数または複数に回収した細胞で反復し、測定されたコピー数を比較してもよい。所定の核酸配列のコピー数の定量または半定量の方法は当該分野で公知であり、それらには、限定される訳ではないが、本明細書に別途記載するPCR法がある。より好ましい態様では、抗原提示細胞は以下から成る群から選択される:COS-7、HEK、Hela、H9、Jurkat、NIH3T3、C127、COS-1、CV1、QC1-3、マウスL細胞、マウスC2C12細胞およびチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、Wi-38、MRC-5、昆虫細胞例えばSf9細胞、Hi-5細胞。別の好ましい態様では、リードアウト系はレポータータンパク質の活性化を含む。本明細書で使用するレポータータンパク質という用語は、研究対象であるある種の刺激に応答して発現され、容易に検出されるタンパク質をいう。従って、本発明によれば、レポータータンパク質がT細胞活性化の際に発現されるのが好ましい。好ましくは、レポータータンパク質は、容易に検出されるタンパク質であり、より好ましくは、研究を行う細胞中に通常存在しないタンパク質である。レポータータンパク質の非制限的な例として、以下がある:β-ガラクトシダーゼ細菌遺伝子、lacZにコードされる、ルシフェラーゼ例えば細菌ルシフェラーゼluxAB、ホタルルシフェラーゼ、およびウミシイタケルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT;細菌由来、GUSβ-グルクロニダーゼ;通常、植物で使用される、並びに、緑色蛍光タンパク質GFP;クラゲ由来およびその改変体、例えばCFP、YFP、EGFP、GFP。更なる非制限的例として、以下がある:アルカリホスファターゼまたは分泌型アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β-キシロシダーゼ、XylEカテコールジオキシゲナーゼ、TreAトレハラーゼ、並びに、サンゴ由来発光タンパク質、例えばDSRed、HcRed、AmCyan、ZsGreen、ZsYellow、AsRed。更に、レポータータンパク質は、抗生物質耐性を与えるタンパク質であってもよい。この場合、好ましくは、細胞を抗生物質の存在下で培養し、レポータータンパク質を発現するクローンだけが増殖できるようにする。一般に、タンパク質は以下のような抗生物質に対する耐性に関与する:ハイグロマイシン、ジェネティシンG418、ピューロマイシン、ブラスチサイジン、ゼオシン、ヒスチジノール、メトトレキサート、キサンチン/ヒポキサンチン-アミノプテリン-ミコフェノール酸含有培地Gpt選択、HAT選択、トリプトファン未含有インドール培地、またはフレオマイシンRVileMethMolBiol84960。より好ましい態様では、レポータータンパク質は、蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物から成る群から選択される。より好ましくは、レポータータンパク質は、以下から成る群から選択される:GFPおよびGFPの改変体、例えばCFP、YFP、EGFP、GFP、sGFP、細菌ルシフェラーゼluxAB、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、およびサンゴ由来発光タンパク質、例えばDSRed、HcRed、AmCyan、ZsGreen、ZsYellow、AsRed。本発明は更に、T細胞受容体β鎖の可変領域、超可変領域、および/または、結合領域をコードする核酸分子を同定する方法に関し、該方法は、αβT細胞受容体を発現するT細胞から得た該核酸分子を、SEQIDNO19に示すプライマーから選択されるプライマーまたはプライマーセットを用いて増幅することを含む。本発明の他の方法に関する上記の定義および好ましい態様は、このT細胞受容体β鎖をコードする核酸分子の同定法、並びに、以下に記載するそれらの好ましい態様にも準用される。好ましくは、T細胞は単一のT細胞、すなわち、個別のT細胞または個別のT細胞をクローン増殖したものである。すなわち、T細胞は単一の分子タイプの細胞のみを示す。本発明の方法によれば、当該分野で公知の方法例えば、本明細書に記載する方法を用いて、T細胞から核酸分子を得る。本明細書で使用するセットという用語は、プライマーを組み合わせたものをいう。本発明のプライマーセットは、1つより多い分子種のプライマーが存在することを必要とする。従って、SEQIDNO19のプライマーから選択される、少なくとも2つの異なるプライマー、例えば少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、または少なくとも9つの異なるプライマーが、プライマーセットに含まれる。本発明によれば、T細胞受容体のVβプライマーを、種々の機能性Vβ遺伝子ファミリーの配列相同性に基づいて同定した。プライマー位置は、直接シーケンシングによってそれぞれのTCRVβ遺伝子を同定できるようなものである。更に、PCR増幅の際に起こりうる相互作用を最小限にするように、Vβレパートリーのプライマー間での調整および24個のVαプライマーとの調整を行った。9個のVβプライマーのセットVp19。表1は、全ての機能性Vβ遺伝子を網羅する。リーダーセグメントに位置するVp1以外は、全てのプライマーがVβ遺伝子セグメントに位置する。CβoutプライマーSEQIDNO11と組み合わせ、これらのプライマーのそれぞれから、対応する再構成Vβ遺伝子が効率的に増幅されたことが、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって明らかとなった図8A。T細胞受容体β鎖をコードする核酸分子の同定法の好ましい態様では、増幅は、CβoutプライマーSEQIDNO11の使用を更に含む。T細胞受容体β鎖をコードする核酸分子の同定法の更なる好ましい態様では、この方法は、対合するT細胞受容体α鎖の可変領域、超可変領域、および/または結合領域をコードする核酸分子を同定することを更に含み、同定は、SEQIDNO1538のプライマーから選択されるプライマーまたはプライマーセットを用いて該核酸分子を増幅することによって行う。SEQIDNO1538に示す24個のT細胞受容体Vαプライマーは、最近、TCRVαレパートリーの増幅に関して報告されたものであるがSeitzSchneiderら2006、それらを表3に示す。好ましい態様では、増幅はCαoutプライマーSEQIDNO10の使用を更に含む。T細胞受容体β鎖をコードする核酸分子の同定法のより好ましい態様では、この方法は以下の段階:iaSEQIDNO19のプライマー;および/もしくはbSEQIDNO1538のプライマーを含有するプライマーセットを用いて核酸分子を増幅し;iiSEQIDNO3947のプライマーを含有するプライマーセットを用いて、iaの反応産物を増幅し;そして/または、iiiaaSEQIDNO13のプライマー;およびbSEQIDNO14のプライマーを用いてiiの反応産物を増幅し;そして/または、iiibaSEQIDNO4883のプライマーセット;およびbSEQIDNO12のプライマーを用いてibの反応産物を増幅することを含む。上記の方法により、第1段階段階iにおいて、24個のVα特異的プライマーおよび9個のVβ特異的プライマーVp1Vp9これらは、機能性αおよびβTCR可変領域遺伝子の全てを網羅するを含有するプライマーのプールを用いて、目的の細胞から単離したcDNAから、全てのVα鎖および/またはβ鎖を同時に増幅することが可能となる。第2の段階、すなわち段階iiでは、前増幅産物から、個別の再構成TCRVβ鎖を増幅する。23個という多数の異なるVβ遺伝子サブファミリーを使用して1つのサンプル中でVβ特異的ネステッドPCRを行うことはできないため、段階iiでは、ユニバーサルプライマー配列をTCRβ鎖PCR産物の5’末端に導入する。これを行うために、ユニークな21ヌクレオチド長配列を、プライマー相互作用またはヒト遺伝子との相同性を有さないように設計し、9個の異なるVpVp1-9プライマーの5’末端に付加した本明細書ではVpプライマーと称する。前増幅産物の一部を用い、それらの伸長型プライマーを使用してランオフrunoffPCRを行った後、第3のセミネステッドPCRを行う。これは、ユニバーサルプライマーをネステッドCβ2プライマーSEQIDNO14と共に使用し、TCRVβ遺伝子ファミリーから独立した、個別の単一細胞再構成TCRVβを増幅する段階iiia。このPCR法を、図9に示す。これと同時に、またはこれに続いて、対応する再構成TCRVαを、異なるネステッドPCRすなわち、段階iiibにおいて多重PCRで前増幅すなわち、段階iから増幅する。好ましくは、Seitzらが報告する個別反応ではなく、表5に示す5つのVαプライマープールを用いて、5つだけの異なるネステッドPCRを行う。その後、増幅された再構成TCRα鎖およびβ鎖を直接シーケンシングによって特性決定する。好ましい態様では、上記の方法を行う前に、細胞好ましくは単一細胞またはクローン増幅した単一タイプの細胞のmRNAからcDNAへの逆転写段階を行う。それらの逆転写法は公知であり、例えば、ワンステップRT-PCRキット例えばQIAGEN社製および遺伝子特異的Cαおよびβプライマーを用いて行ってもよい。単一T細胞の再構成αβ-TCRペアの分子解析は、約70個のTCRVα領域遺伝子および約50個のTCRVβ領域遺伝子の完全なスペクトラムを包含しなければならない。本発明では、最近TCRVαレパートリーの同時増幅に関して報告された24個のTCRVαプライマーのセットSeitzSchneiderら2006と共に、TCRβ鎖レパートリーの種々のVβ遺伝子ファミリーの全てを増幅できるPCR法を構築した。この方法の複雑さは、特異的増幅に干渉しうる、多数のプライマー間で起こりうる相互作用に起因する。本発明では、1つの反応で全てのTCRVα遺伝子およびVβ遺伝子を前増幅することが可能な多重RT-PCRから開始する、PCRプロトコルを確立した。その後、TCRVα-およびVβ-PCR産物を別々に処理する。更に本発明は、患者特異的T細胞抗原の同定法に関し、この方法は、A該患者から得たサンプルからT細胞を単離し;BAで単離したT細胞から対合するT細胞受容体α鎖およびβ鎖を同定し;そして、C本発明の方法に従って、T細胞抗原を同定し、ここで、機能性T細胞受容体およびT細胞活性化のリードアウト系を含有する細胞は、Bで同定された、対合するT細胞受容体α鎖およびβ鎖を発現する、ことを含む。本発明の方法に関連する上記の定義および好ましい態様は、この患者特異的T細胞抗原同定法にも準用される。この患者特異的T細胞抗原同定法では、T細胞を患者から単離する。患者からT細胞を単離する方法は当該分野で公知であり、それらに限定される訳ではないが、以下によるT細胞の単離がある:凍結組織生検サンプルからのレーザーマイクロダイセクション;手作業またはマイクロマニピュレーターによる、生細胞を有する新鮮な生検標本からの生細胞または死細胞の選択採取;FACSソーティング装置を用いる細胞の単離;限界希釈によるエクスビボクローニング細胞は、あらかじめ好適な腫瘍細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞とするか、または、融合を行わないBurgemeisterRJHistochemCytochem5340912;EricksonHSらMethodsMolBiol42443348;DainiakMBらAdvBiochemEngBiotechnol106118;TungJWらClinLabMed2745368。次の段階では、該細胞内で発現したヘテロ2量体T細胞受容体を同定する。T細胞からのT細胞受容体の同定法は当該分野で公知であり、それらに限定される訳ではないが、以下がある:クローン特異的プライマーを使用するPCRによるT細胞受容体α鎖およびβ鎖の増幅例えば鎖の一方の配列が知られている場合。例えばCDR3スペクトラタイピングPannetierら1995またはTCRの可変領域上のエピトープを認識する抗体を使用する免疫組織化学による、または、多数の異なる例えば未知のTCR鎖を増幅させることができる1つもしくはそれ以上のPCRプライマーセットを用いるPCRによるT細胞受容体α鎖およびβ鎖の増幅。それらの方法には、それに限定される訳ではないが、T細胞受容体α鎖およびβ鎖の可変領域、超可変領域、および/または結合領域をコードする核酸分子を同定する上記の本発明の方法があり、例えば、α鎖にはSeitzら2006が開示するプライマー、β鎖の可変領域、超可変領域、および/または結合領域には本明細書に開示するVβプライマーを使用する。これ以外に、T細胞からのT細胞受容体の同定法に好適なプライマーセットには、限定される訳ではないがGenevee1992;Monteiroら1996;Roersら2000;Gagneら2000、またはZhouら2006に開示されるものがある。その後、このようにして同定されたT細胞受容体を、本発明にかかるT細胞標的抗原の同定法の細胞aaに使用し、本発明の方法を上記のように実施する。好ましい態様では、患者から単離したT細胞は、単一の分子タイプのT細胞を示す。更に、好ましくは、それらの細胞から単離したT細胞受容体は、単一の分子タイプのT細胞受容体を示す。更に好ましくは、態様は、単一細胞中で発現される2つの異なるT細胞受容体、すなわち、2つの異なるVα鎖と1つのVβ鎖、およびその逆を有するT細胞受容体に関連してもよい。本発明の患者特異的抗原探索法の主な利点は、非常に複雑なインビボの状態を、インビトロ条件に直接移行できることである。これは非常に興味深いことであり、なぜなら、多くの異なる細胞タイプおよび多くの異なるT細胞が炎症性病変に存在するが、それらのごく一部しか、疾病の発症または進行に関係しないからである。炎症性自己免疫病変において特定の目的の個別T細胞を分析する方法が近年報告されたSeitzら2006。これによって、種々のインビボ条件において、関連T細胞と非関連T細胞を識別することが可能となる:例えば、関連T細胞は、自己免疫疾患における自己攻撃性T細胞、腫瘍性疾患における腫瘍浸潤性T細胞、または感染性疾患における抗ウイルスT細胞であってもよい。非関連細胞は、非特異的に炎症環境に誘引されるバイスタンダー細胞、血管中の細胞、または免疫サーベイランスの際のパトローリングT細胞であってもよい。選択した個別のT細胞を、例えば凍結組織生検サンプルからのレーザーマイクロダイセクション、または他の上記の単一細胞単離法によって単離し、その対合するTCRα鎖およびβ鎖をクローニングし、58αβT細胞ハイブリドーマ株で発現させることができる。この検出法を本明細書に記載する抗原探索法と併用し、推定される病原性T細胞または有益T細胞の抗原を、直接的で、迅速かつ安価な高スループットアッセイで特性決定することができる。それらのT細胞受容体をトランスフェクトしたハイブリドーマ細胞には、本物のT細胞またはT細胞株を使用する他の方法とは異なり、実質的に細胞数の制限がないという利点があり、これは、ハイブリドーマ細胞が迅速かつ確実に増殖するためである。患者特異的T細胞抗原同定法の好ましい態様では、対合するT細胞受容体α鎖およびβ鎖を段階Bで同定し、これは、該T細胞受容体α鎖およびβ鎖の可変領域、超可変領域、および/または結合領域を上記の本発明の方法に従って同定することによって行う。以下の実施例4に詳述するように、本明細書に開示するプライマーまたはプライマーセットを使用する本発明の方法により、T細胞受容体β鎖の可変領域、超可変領域、および/または結合領域を、対合するα鎖と併せて同定することが可能となる。本発明はまた、本発明の方法によって同定されるT細胞抗原、そして/または、本発明の患者特異的T細胞抗原同定法によって同定されるT細胞抗原を含有する組成物にも関する。本発明に関連して使用する組成物という用語は、本発明に従って同定されたT細胞抗原を少なくとも1つ含有する組成物を指す。必要により、本発明のT細胞抗原の特性を改変する例えばT細胞抗原を安定化する能力を有する分子を更に含有してもよい。組成物は固体、液体、または気体であってもよく、特に、粉末単数または複数、錠剤単数または複数、溶液単数または複数、またはエアロゾル単数または複数であってもよい。上記のように、本発明の方法によって同定されるT細胞抗原は、感染および腫瘍の検出、および自己免疫疾患の診断向上のためのバイオマーカーとしての役割を果たし、疾病進行の予測に非常に有用である。更に、該T細胞抗原は治療的アプローチに有用である:それらを感染または腫瘍に対するワクチン投与に使用することができ、それによって、自己免疫疾患例えば多発性硬化症、乾癬、炎症性筋疾患、および他の多くの疾患において、自己攻撃性T細胞クローンを選択的に除去または調節することが可能となりうる。従って、本発明の組成物は、例えばワクチンに使用するためのT細胞活性化能を有してもよく、または、例えばT細胞クローンの除去に使用するためのT細胞中和能を有してもよい。好ましい態様では、組成物は医薬組成物である。本発明によれば、医薬組成物という用語は、患者好ましくはヒト患者に投与するための組成物をいう。本発明の医薬組成物は、上記の化合物、すなわちT細胞抗原を含有する。本発明の医薬組成物は、必要により、また、付加的に、医薬的に許容されるキャリアおよび/または賦形剤を含有してもよい。医薬的に許容されるキャリアおよび/または賦形剤とは、非毒性の固体、半固体、または液体である充填剤、希釈剤、カプセル化のための物質、または任意のタイプの製剤補助剤を意味する。好適な医薬キャリアおよび/または賦形剤の例は当該分野で公知であり、それらには塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン、例えば油/水エマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、無菌溶液、有機溶媒、例えばDMSOなどがある。好ましくは、キャリア/賦形剤は非経口キャリア/賦形剤であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張の溶液である。キャリア/賦形剤は、少量の添加剤例えば等張性および化学安定性を向上する物質を必要に応じて含有する。それらの物質は、使用する用量および濃度でレシピエントに毒性を示さないものであり、以下がある:バッファー例えばリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはその塩;抗酸化剤例えばアスコルビン酸;低分子量約10残基未満のポリペプチド例えばポリアルギニンまたはトリペプチド;タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン;単糖類、二糖類、および他の糖質例えばセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤例えばEDTA;糖アルコール例えばマンニトールまたはソルビトール;対イオン例えばナトリウム;および/または非イオン性界面活性剤例えばポリソルベート、ポロキサマー、またはPEG。慣例的な賦形剤には、結合剤、充填剤、潤滑剤、および湿潤剤がある。また、保存剤および他の添加剤を含有してもよく、それらには、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどがある。更に、医薬組成物は、企図される医薬組成物の使用法によって、更なる物質を含有してもよい。特に好ましくは、該医薬組成物は、当該分野で公知の、ワクチンに使用する場合はT細胞活性の活性化によって、または、T細胞の中和/除去に使用する場合はT細胞活性の中和によってT細胞活性に作用する物質を更に含有する。本発明の医薬組成物は上記のT細胞抗原に基づくものであるため、上記の更なる物質は、単に補助的に、例えば単剤として使用される場合に推奨される用量より低い用量で使用するか、または必要とされるT細胞の量を低減させるために使用され、それによって、更なる物質またはT細胞抗原にいずれかによってもたらされる副作用を低減するのが好ましい。本明細書で使用する非経口という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および輸液を含む投与方式を指す。それらのキャリアおよび/または賦形剤を含む組成物は、公知の慣例的な方法によって調製できる。一般に、製剤は、医薬組成物の成分を液体キャリア/賦形剤もしくは微粉化した固体キャリア/賦形剤、またはその両方と、均質かつ十分に接触させることによって調製する。その後、必要により、生成物を所望の製剤に成形する。それらの医薬組成物は、好適な用量で被験体に投与できる。投与計画は、担当医および臨床学的因子によって決定される。医学分野で公知のように、各患者への投与量は多くの因子、例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全身の健康状態、および、同時に投与する他の薬剤などに依存する。所定の状況での治療的有効量は、慣例的な試験によって容易に決定され、通常の臨床従事者または医師の技術および判断の範囲内である。一般に、医薬組成物の定期的投与としての治療計画は、1μgから20gユニット/日の範囲である。しかしながら、より好ましい投与量は、001mg-100mg/日、より好ましくは001mg-50mg/日、そして最も好ましくは001mg-10mg/日の範囲である。本発明の医薬組成物の投与は種々の方法によって行うことができ、それらには例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内、または気管支内投与がある。治療のための投与に使用する医薬組成物の成分は無菌でなければならない。滅菌は、滅菌ろ過メンブレン例えば0.2ミクロンのメンブレンを通してろ過することによって、容易に行うことができる。医薬組成物の成分は、通常、単回または多回投与容器例えば密封アンプルまたは密封バイアル中に、水溶液として、または再溶解して使用するための凍結乾燥製剤として保存する。凍結乾燥製剤の例として、10mlバイアルに5mlの滅菌ろ過済み1w/v水溶液を充填し、得られた混合液を凍結乾燥する。凍結乾燥された化合物単数または複数を、注射用静菌水を用いて再溶解し、注射液を調製する。より好ましい態様では、本発明の医薬組成物を使用して、ガン、感染、および自己免疫疾患から成る群から選択される疾病を治療する。本発明にかかるガンとは、細胞の無制御な分裂、および、浸潤を介する隣接組織への直接増殖、または、転移による遠位への移植ガン細胞が血流またはリンパ系を通して輸送されるによる拡散能を特徴とする、一群の疾病または疾患をいう。ガンの非制限的な例として、リンパ腫、黒色腫、肺ガン、および他の腫瘍浸潤リンパ球を伴う腫瘍がある。本明細書で使用する感染という用語は、外来種によるホスト生物への有害な定着をいう。感染において、感染生物はホストの供給源を利用し、通常はホストを犠牲にして、増殖しようとする。感染に対するホストの応答が炎症である。本発明によれば、細菌感染には、それらに限定される訳ではないが、以下がある:細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、リステリア症、百日咳、肺炎球菌性肺炎、サルモネラ症、破傷風、発疹チフス、結核、化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、または、種々の微生物病原体による尿路感染。本発明によれば、ウイルス感染には、それらに限定される訳ではないが、以下がある:単核症、ヒト免疫不全ウイルス感染症HIV、水痘、風邪、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、肝炎、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、ポリオウイルス感染症、狂犬病、天然痘、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、または黄熱病。本発明によれば、真菌感染には、それらに限定される訳ではないが、以下がある:アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症、または足白癬。本発明によれば、自己免疫疾患という用語は、通常身体内に存在する物質および組織に対する、身体の過剰なT細胞介在性免疫応答によって起こる疾病を指す。自己免疫疾患は当業者に公知であり、それらに限定される訳ではないが、以下がある:リウマチ性関節炎、多発性硬化症、炎症性大腸炎、I型糖尿病、乾癬、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性ハシモト甲状腺炎、およびベーチェット症候群。別の好ましい態様では、本発明の組成物は診断用組成物である。本発明によれば、診断用組成物という用語は、各患者の本発明の医薬組成物への応答可能性、または本発明の医薬組成物による治療可能性を診断するための組成物をいう。本発明の診断用組成物は、上記のT細胞抗原を含有する。診断用組成物は、上記のように好適なキャリアおよび/または賦形剤を更に含有してもよい。診断用組成物は、1つまたは複数の容器に入れられてもよい。上記のように、T細胞抗原は、感染および腫瘍の検出、および自己免疫疾患の診断向上のためのバイオマーカーとして、診断用組成物に有用である。更に、それらの疾病の進行をモニタリングするための予後診断としても有用である。このように、更なる好ましい態様では、本発明の診断組成物は、ガン、感染、および自己免疫疾患から成る群から選択される疾病の診断に使用するためのものである。更に本発明はペプチドライブラリーに関し、該ペプチドライブラリーはペプチドをコードする核酸配列を含有する複数のベクターを含み、該ペプチドはT細胞の標的抗原の可能性があるものであり、該核酸配列はランダム核酸配列である。本発明の方法に関する上記の定義および好ましい態様は、このペプチドライブラリーにも準用される。複数のベクターという用語は、1より多い任意数のベクターをいう。従って、複数のベクターは、例えば少なくとも2個のベクター、例えば5個のベクター、少なくとも10個のベクター、少なくとも15個のベクター、少なくとも20個のベクター、少なくとも30個のベクター、少なくとも40個のベクター、少なくとも50個のベクター、少なくとも100個のベクター、少なくとも200個のベクター、少なくとも300個のベクター、少なくとも500個のベクター、少なくとも1,000個のベクター、少なくとも5,000個のベクター、少なくとも104個のベクター、少なくとも105個のベクター、少なくとも106個のベクター、少なくとも107個のベクター、少なくとも108個のベクター、少なくとも109個のベクター、少なくとも1010個のベクター、または少なくとも1011個のベクターであってもよい。本発明はまた、抗原提示細胞の作製法にも関し、この方法は、細胞を本発明のペプチドライブラリーでトランスフェクトまたは形質転換することを含む。この場合も、本発明の方法およびペプチドライブラリーに関する上記の定義および好ましい態様は全て、この抗原提示細胞調製法にも準用される。細胞をトランスフェクトまたは形質転換する方法は当該分野で公知であり、限定される訳ではないが以下がある:エレクトロポレーション例えばMultiporatorEppendorf社、GenepulserBioRad社を使用、ウイルス転移例えばアデノウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクターを使用、カルシウムによるトランスフェクション例えばリン酸カルシウム沈殿、陽イオン性脂質、PEIPolysciences社、米国ウォリントン、ドイツエッペルハイム、リポソーム例えばFugeneRoche社またはLipofectamineInvitrogen社、またはファージベクター。それらの方法は当業界で報告されており、また、以下の実施例にも記載する。従って、この抗原提示細胞の作製法により、それらの抗原提示細胞のライブラリーが得られる。そのようなライブラリーを、例えば本発明の方法に使用してもよい。本発明は更に、本発明の方法によって得られる抗原提示細胞に関する。更に、本発明は、SEQIDNO1-9、および/またはSEQIDNO39-47、および/またはSEQIDNO11および14から成る群から選択されるプライマーまたはプライマーセットにも関する。本発明によれば、個別の細胞または細胞クローンからT細胞受容体β鎖をコードする核酸分子を増幅および同定するのに好適な多くのプライマーが同定されている。上に詳述したように、これらのプライマーは、PCR反応の際に、互いの、またはα鎖のプライマーとの相互作用の可能性が最小限になるように最適化されている。上記のセットという用語は、プライマーの組み合わせをいう。本発明のプライマーセットは、1個より多い分子種のプライマーが存在することを必要とする。従って、少なくとも2個の異なるプライマー、例えば少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、または少なくとも20個の、SEQIDNO19および/またはSEQIDNO3947および/またはSEQIDNO11および14のプライマーから選択される種々のプライマーが、プライマーセットに含有される。本発明は更に、本発明のペプチドライブラリーおよび/または本発明のプライマーもしくはプライマーセットおよび/または本発明の抗原提示細胞単数または複数を含むキットにも関する。キットの種々の内容物は、1つまたはそれ以上の容器例えば1つまたはそれ以上のバイアルに充填することができる。容器またはバイアルは、内容物の他に、保存のための保存剤またはバッファーを含んでもよい。好ましくは、本発明のキットは本発明のペプチドライブラリーおよび本発明のプライマーもしくはプライマーセットを含有する。特に記載しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する分野の通常の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。相反する場合は、定義を含め、本明細書が優先する。実施例1:試料および方法1.1プラスミドおよびトランスフェクション表6に、プラスミド構築に使用したプライマー配列を示す。全ての構築物は、挿入断片全長のシーケンシングを行って確認した。1.1.1発現プラスミドpRSVhygroJM22αおよびpRSVneoJM22βの構築およびTCRトランスフェクトハイブリドーマ細胞58JM22細胞の作製TRIzolRS試薬GibcoInvitrogen社を用いて、ボランティアの末梢血からRNAを調製し、SuperscriptIII逆転写酵素GibcoInvitrogen社およびオリゴdTプライマーを用いてDNAを調製した。TCRJM22Lehnerら1995のα鎖およびβ鎖のV領域をPCRで増幅した。変異誘発によってNDN領域を挿入した。クローニングカセットとしてC領域を含有するpRSVneoおよびpRSVhygroプラスミドを使用したSeitz2006。具体的には、以下の2つのα鎖PCRフラグメントを作製した:第1のフラグメントはVα10のリーダー領域からJ領域まででありプライマー:JM22ValphaforおよびJM22VJalpharev、第2のフラグメントはJ領域からC領域中のPvuII部位までであるプライマー:JM22JalphaforおよびCalphaPvuIIrev。JM22VJalpharevおよびJM22Jalphafor中のGlyおよびSerをコードするヌクレオチドをサイレント変異で置換し、BamHI部位を導入した。PCR産物をBamHIで消化し、ライゲーションを行い、JM22ValphaforおよびCalphaPvuIIrevを用いる第2のPCRのテンプレートとして使用した。SalIおよびPvuII消化した産物を、クローニングカセットとしてTCRのC領域を既に含有させてあるpRSVhygroに挿入した。JM22β鎖のクローニングでは、Vβ17Jβ27陽性クローンをテンプレートとして使用した。これは、既にpRSVneoにクローニングしてあったものである。プライマーJM22VbetaKpnforおよびJM22VJbetaScarevを用いて、Vβ17のKpnI部位およびJβ2.7中のScaI部位間の領域を増幅させ、PCR産物を上記のプラスミドに導入した。両プラスミドをT細胞ハイブリドーマ株58αβBlankら1993にトランスフェクトし、G418およびハイグロマイシンBSigma社による選択を行い、Seitzら2006が他のTCR鎖に関して報告しているように、個々のクローンを単離した。得られたTCRトランスフェクト細胞株を58JM22と称する。1.1.2pLPChCD8αIRES2hCD8βプラスミドの構築および58JM22CD8細胞の作製プライマー:hCD8aNotfor、hCD8aEcoRIrev、hCD8bMluIfor、およびhCD8bXhorevを用いて、ヒトCD8分子のα鎖およびβ鎖をcDNAから増幅した。α鎖をpQCXIXClontech社のNotI/EcoRI部位に挿入し、β鎖をMluI/XhoI部位に挿入した。pQCXIXClontech社中のpIRES配列を、pIRES2DsRed2BDBiosciences社から切り出したpIRES2で置換した。hCD8αIRES2hCD8βを含有するフラグメントをNotIおよびEcoRVで切り出し、pLPCXClontech社のNotI/平滑ClaI部位に挿入した。得られたプラスミドpLPChCD8αIRES2hCD8βをGPE86パッケージング細胞ATCCにトランスフェクトした。ヒスチジノール選択下においてCD3ξ鎖でトランスフェクトした58JM22ハイブリドーマ細胞をBlankら1993、レトロウイルス発現GPE86CD8αβ細胞と、2日間、共培養した。形質導入した細胞を、1.0μg/mlのピューロマイシンSigma社で選択した。CD8αβ発現を、FACSにより、抗CD8α抗体および抗CD8β抗体、すなわちB9.11および2ST8-5H7BeckmanCoulter社を用いて解析した。得られた、TCRおよびCD8でトランスフェクトされた細胞株を58JM22CD8と称する。1.1.3プラスミドpcDNA6NFATsGFPの構築および58JM22CD8sGFP細胞の作製NFAT応答要素hrGFPSV40splicepA配列を、pNFAThrGFPStratagene社から単離した。まず、AccI消化によって平滑末端を生成し、その後、AatIIで消化した。フラグメントを、PmeIおよびAatIIで消化したpcDNATM6V5HisCにライゲートし、プラスミドpcDNANFAThrGFPを得た。プライマーsGFPEcoforおよびsGFPXhorevを用いてsGFPHeimら1995を増幅し、pcDNANFAThrGFPのEcoRI/XhoI部位にライゲートして、プラスミドpcDNANFATsGFPを得た。58JM22CD8細胞をトランスフェクトし、3μg/mlのブラスチサイジンInvitrogen社で選択し、個々のクローンを選別採取し、抗CD3抗体145-2C11BD社およびHLAA2fluで刺激した後、GFP発現を分析した。得られた、TCR、CD8、およびNFATsGFPでトランスフェクトした細胞株を58JM22CD8sGFPと称する。1.1.4プラスミドpRSVA2およびpHSE3A2の構築HLA-A2重鎖のcDNAを、PCRにより、プライマー5EX1A6および3Aex81MPBettinottiらJImmunolMeth279143148、および患者PM16488由来のcDNASeitz2006を用いて増幅した。SalIおよびBamHI制限部位を伸長するためのプライマーHLAA0101leadおよびHLAA0101endを用いて再増幅した後、PCR産物をpRSVneoおよびpHSE3のSalI/BamHI部位に挿入したPircherら1989。これらのプラスミドを用いて、後述のようにCOS7細胞をトランスフェクトした。1.1.5プラスミドpcDNA6fluの構築基質タンパク質の完全長配列flu1-252を、開始コドン直前のコザック配列CCACC、停止シグナル、およびNheIおよびXbaIオーバーハングを有するように合成したGeneArt。フラグメントをpcDNATM6V5HisAInvitrogen社のNheI/XbaI部位に挿入した。1.1.6プラスミドpcDNA6fluの構築粘着オーバーハング、開始コドン直前のコザック配列CCACC、および停止シグナルを含有する2本鎖合成リンカーによって、flu58-66をコードするヌクレオチド配列をpcDNATM31zeoInvitrogen社のHindIII/XhoI部位に挿入した。フォワード鎖fluCOSforおよびリバース鎖fluCOSrevを、95°Cで5分間インキュベートしてハイブリダイズさせ、徐々に冷却して、pcDNATM31zeoのHindIII/XhoI部位にライゲートさせた。このプラスミドから、NheIXbaIフラグメントをpcDNATM6V5HisAのNheI/XbaI部位にライゲートさせた。1.1.7プラスミドpcDNA6rcspacerの構築プラスミドpcDNArcspacerを、複雑なライブラリーのためのレシピエントプラスミドとして設計した。まず、レア切断酵素、AscIおよびNotIの制限部位をpcDNATM6V5HisAInvitrogen社のマルチクローニング部位に導入した。これを行うために、pcDNATMV5HisAをBamHIおよびNotIで消化し、リンカーオリゴヌクレオチドpcDNArcMCSforおよびpcDNArcMCSrevをpcDNATM6V5HisAのBamHIおよびNotI部位にライゲートしてプラスミドpcDNArcを得たrcはレアカッターrarecutterを意味する。2つの制限部位、AscIおよびNotIは非常に接近しているため、その後のAscI/NotI消化を容易にするために、無関係なDNAフラグメントを挿入した。そのため、AscIおよびNotIでの消化によって、プラスミドpLNCX2Clontech社から2514bpのフラグメントを切り出し、AscI/NotI消化したプラスミドpcDNArcにこれを挿入した。その後、得られたプラスミドpcDNArcspacerを、ライブラリーおよびflu58-66のレシピレントプラスミドとして使用した。1.1.8プラスミドpcDNA6rcfluの構築flu58-66をコードするヌクレオチド配列を、pcDNA6rcのAscI/NotI部位に挿入した。AscIおよびNotIの粘着オーバーハング、開始コドン直前のコザック配列CCACC、および停止シグナルを有する2本鎖合成リンカーを生成した。フォーワード鎖N27fluAscforおよびリバース鎖N27fluNotrevを95°Cで5分間インキュベートしてハイブリダイズさせ、徐々に冷却し、消化したpcDNA6rcspacerにライゲートさせた。pcDNA6rcfluは、全ての試験において、pcDNA6fluと全く同じ挙動を示した。1.1.9プラスミドpcDNArcN27allおよびpcDNArcN27A2269の構築ランダムペプチドライブラリーを作製するために、以下の1本鎖オリゴヌクレオチドを使用した:N27alllibAscfor完全にランダムな9アミノ酸のライブラリー用;およびN27A2269libAscforflu58-66の3つの固定アンカー位置、すなわち2位のイソロイシン、6位のバリン、および9位のロイシンを有する9アミノ酸ライブラリー用。オリゴヌクレオチドは全て、制限部位AscIおよびNotI、開始コドン直前のコザック配列CCACC、および停止配列を含有する。短鎖プラスミドN27Notrevのアニーリングおよびその後のフィルイン反応によって、これらのプラスミドから2本鎖を作製した。ライブラリーをコードしているプラスミドおよびN27Notrevをアニールさせるため、それぞれを5μMの濃度で含有する溶液10mMTrisHCl、15mMMgCl2、50mMKClpH82中を100°Cで5分間インキュベートし、1時間以内に室温まで徐々に冷却した。その後、等量の上記バッファーdNTPおよびTaq-ポリメラーゼ共にRoche社を、それぞれ最終濃度200μMおよび5U/100μlとなるように調整して含有させたものを添加し、混合液を徐々に加熱し、60°Cで5分間、次いで63°Cで4分間、その後65°Cで4分間、最後に68°Cで1時間加熱した。その後、2本鎖をAscIおよびNotIで消化し、pcDNArcspacerのAscI/NotI部位に挿入した。1.1.10プラスミドpcDNAsGFPの構築トランスフェクション法の効率を測定するために、NFAT応答要素を含有しないsGFPのクローニングを行った。pcDNANFATsGFPをEcoRIおよびXhoIで消化し、sGFP配列を単離し、pcDNATM6V5HisAInvitrogen社にライゲートした。1.1.11合成ペプチドインフルエンザ基質タンパク質アミノ酸58-66flu58-66:GILGFVFTLおよびヒトサイトメガロウイルスフラグメントpp65アミノ酸184-192hCMVpp65NLVPMVATVに相当するペプチドを、Fmoc化学によって合成し、C8逆相HPLCで精製した。それらの配列が正確であることを、質量分析で確認した。1.2抗原検出アッセイ1.2.1細胞のトランスフェクション58αβを、JM22α鎖およびβ鎖、そして、CD8またはpcDNAfluまたはpcDNAA2269またはpcDNArcを等モル量で使用した。室温において、0.4cmのエレクトロポレーションキュベットEppendorf社中、マルチポレータートランスフェクション装置Eppendorf社を使用して、1200V、40msで電気パルスを適用した。電気パルスの直後に、加温済みの完全培地に細胞を再懸濁した。いくつかの実験では、細胞を20mMNa-リン酸バッファーpH7.4、150mMNaCl、10mMMgCl2で2回洗浄した。その後、それらを培養プレートに播種し0.5-1x106細胞/3.5cm培養プレート、通常の細胞培養条件下でインキュベートした。Fugene法のプロトコル:FugeneHDトランスフェクション試薬Roche社によるCOS-7細胞の一過性トランスフェクションを、2μgDNA:7μlFugeneの比率で行った。プラスミドpRSVA2およびpcDNAfluまたはpcDNAA2269を等モル量で使用した。残留するトランスフェクション複合体を除去するために、トランスフェクションの24時間後、COS-7細胞をPBSで4回洗浄し、50μg/mlのニシン精子DNAと共に1時間インキュベートしてトランスフェクション複合体中のプラスミドを置換した後、0.2mg/mlのDNaseおよび10mMのMgCl2と共に2時間インキュベートして残存DNAを消化した。COS-7細胞の一過性トランスフェクション効率の測定を、forsGFPまたはpRSVA2をコードするpcDNA6を用いるFACS解析によって行った。陽性細胞を内因性sGFP蛍光、または抗HLA-A2抗体BB7.2Proimmune社での染色によって分析した。最大の発現はトランスフェクション後48時間から72時間の間で観察された。1.2.2T細胞によって認識される抗原を提示する細胞の検出TCRをトランスフェクトしたハイブリドーマ細胞によって認識されるペプチドをコードするライブラリープラスミドを含有するCOS-7細胞を検出するために、ライブラリーをトランスフェクトしたCOS-7細胞を組織培養プレートに約40,000細胞/cm2の密度で播種した。37°Cで2-3日間インキュベートした後、ほぼ集密となった細胞層をRPMI培地で2回洗浄して58JM22CD8sGFPT細胞ハイブリドーマを積層し、更に12-18時間インキュベートした。その後、培養プレートを倒立蛍光顕微鏡AxioVert200M、Zeiss社。CCDカメラCoolSNAPHQ、RoperScientific社、蛍光ランプHXP120、Visitron社、および対物レンズ5xNA015∞0EpiplanNEOFLUAR10xNA045PlanApochromat20xNA04∞015AchroplanKorrPh2を搭載下で観察した。Cy3フィルター励起/発光:545605nm、Zeiss社を用いて自発蛍光を確認し、GFPフィルター励起/発光:472520nm、Semrock社BrightLineを用いてsGFP発現を検出した。手動で検査する代わりに、電動式xy-ステージBioPresision2、Visitron社、ドイツプッフハイムによる自動スキャンシステム、および自動画像取得および解析MetaMorphSoftwareV77を用いる。その後、活性化緑色58JM22CD8sGFPハイブリドーマ細胞と接触したCOS-7細胞を、毛細管Eppendorf社、customTipsTypeI。内径15μmおよびマイクロマニピュレーターMini25、LuigsNeumann社を用いて選別採取した。採取した細胞を7μlの25アンモニア溶液に添加し、プラスミドを保持しDNaseを阻害するために、氷上で最大4時間まで保存した。PCR反応の前に、チューブを開けて室温で30分間放置し、アンモニアを揮発させた。1.2.3抗原をコードするプラスミドの増幅pcDNA挿入断片をPCR増幅するために、2ラウンドのネステッドPCRを行った。第1のPCR反応は、50-100μlで、1UのTaqポリメラーゼRoche社0.2mMdNTP、0.5μMプライマーを用いて行った。いくつかの実験では、インナープライマーまたはアウタープライマーを用いる単回PCRで十分であった。次いで、第1の反応産物の0.01μl相当をテンプレートとし、iProofポリメラーゼBiorad社およびインナープライマーを用いてネステッドPCR反応を行った。MinElutePCR精製キットQuiagen社を用いてPCR産物を精製し、プラスミドpcDNA31DV5HisTOPO登録商標Invitrogen社にクローニングした。ライゲーション産物を、エレクトロポレーションによってDH10BElectroMaxInvitrogen社にトランスフェクトした。1.2.4更なるスクリーニングおよびミモトープの同定濃縮したミモトープを、更なるラウンドの抗原スクリーニングに供した。ここでは、個別の細菌クローンのプールを使用した図6。トランスフェクトした細菌の小画分を寒天培地上で培養し、含まれる細菌数を確認した。画分の大部分をバルク培養した。これから、>30のプールそれぞれ約500個の個別細菌クローンを含有を懸濁培養液中で培養し、プラスミドを調製した後、フレッシュのCOS-7細胞にトランスフェクトした。これらを再び58JM22CD8sGFP細胞の活性について試験した。陽性プールから、>30のサブプールそれぞれ100個の細菌クローンを含有を作製し、上記のように試験した。その後、>30のサブプール20個の個別細菌クローンを含有でこの操作を反復し、更に、寒天培地上で培養した。これらから、個々の細菌コロニーを選別採取し、試験した。この最終ラウンドの分析で陽性であったプラスミドについて、シーケンシングを行った。1.3ワンステップRT-PCRによる単一細胞からのTCRα鎖およびβ鎖cDNAの増幅プロトコル段階1.1、1.2RT-PCR単一細胞のmRNAをRT反応によってcDNAに転写した。反応は50°Cで35分間、ワンステップRT-PCRキットQIAGEN社および遺伝子特異的CαプライマーおよびCβプライマー各0.6μMを使用して行ったCプライマー=CαoutプライマーCβoutプライマー。表2。プロトコル段階1.3第1の多重PCRVα鎖およびVβ鎖の同時増幅のためのプライマープールVプライマーを反応溶液に添加した。プールは24個のVα特異的プライマーおよび9個のVβ特異的プライマーVp1-Vp9各0.075μMを含有し表1および3、これらは機能性αおよびβTCR可変領域遺伝子の全てを網羅している。95°Cで15分間、ホットスタオートポリメラーゼを活性化させた後、PCRサイクル:94°Cで30秒間/60°Cで90秒間/68°Cで60秒間を、10サイクル行った。次いで、PCRサイクル:94°Cで30秒間/53°Cで90秒間/68°Cで60秒間を30サイクル行い、その後、68°Cで15分間の最終伸長段階を行った。プロトコル段階2.1ランオフPCRVβ鎖を増幅するために、前増幅産物の1μl画分のランオフPCR94°Cで5分間/53°Cで150秒間/68°Cで15分間を1サイクル行った。このPCRには、Vpプライマーをベースとし、5’末端にユニバーサルプライマーを含有させたプライマーVpプライマーを使用した。10μLの反応溶液には、1xPCRバッファー、0.25UのDNAポリメラーゼRoche社、0.2mMのdNTP、およびプライマープール各プライマーが0.1μMが含有される。プロトコル段階2.2第2のセミネステッドPCRCβ特異的ネステッドプライマーCβ-inおよびユニバーサルプライマーUPを用いてセミネステッドPCRを行った。PCRは以下から成る:94°Cで2分間の変性段階、94°C30秒間/58°C60秒間/68°C60秒間を50サイクル、および、68°Cで15分間の最終伸長段階。プロトコル段階3Va増幅第2のVα鎖のネステッド増幅を、既に報告されている方法をわずかに改変して行ったSeitzら。簡潔に記載すると、1μlの前増幅プローブを、CαネステッドプライマーCα-inおよびVαネステッドプライマープール各プライマーが0.1μMを含有するPCR溶液に添加した。変性94°Cで2分間後、タッチダウンPCRを、61°C、58°C、および56°Cでのアニーリングを各4サイクル、次いで53°Cでのアニーリングを40サイクルで行った。アニーリングおよび伸長68°Cの時間はそれぞれ1分間、変性時間は30秒間とし、その後、68°Cで15分間の最終伸長を行った。Cβ/Cαネステッドプライマー、および0.5μlのネステッドPCR産物を用いて、TCRβ鎖およびα鎖を直接シーケンシングした。実施例2:リードアウト系の特性TCRJM22のα鎖およびβ鎖、ヒトCD8α鎖およびβ鎖、およびsGFPがNFATによって制御されるレポーターコンストラクトで、T細胞ハイブリドーマ株58αβの安定的トランスフェクションを行った58JM22CD8sGFP細胞と称する図1。これらのトランスフェクタントにおいて、抗原刺激後に緑色蛍光が検出されるか否かを試験するために、COS-7細胞をAPCとして使用した。この細胞は、プラスミドpHSE3’中のHLA-A0201pHSE3’-A2で安定的トランスフェクションを行い、合成ペプチドflu58-66を添加したものである。COS-7接着細胞は、ほぼ集密な単層を形成した。58JM22CD8sGFP細胞を添加し、16時間後に蛍光顕微鏡図2aおよびFACS図3aでsGFP蛍光を観察した。sGFPの明るい蛍光により、58JM22CD8sGFP細胞の50以上が活性化されたことが確認された。HLA-A2でトランスフェクトしていない空のCOS-7細胞を使用した場合図2bおよび図3b、またはflu58-66の代わりに無関係なペプチドhCMV184-192を使用した場合図2hおよび図3h、250,000細胞のうち、陽性58JM22CD8sGFP細胞は1つも観察されなかった。これらの試験は、58JM22CD8sGFP細胞がHLA-ペプチド複合体の特異的検出のための好適なリードアウト細胞となりうることを示している。HLAで安定的にトランスフェクトされたCOS細胞を、検討対象となるHLA対立遺伝子のそれぞれについて作製する必要を回避するために、COS細胞への全てのトランスフェクションを一過性とするようにプロトコルを改変した。第1段階で、flu58-66が合成ペプチドとして添加される必要があるか否か、または、これがHLA-A0201を安定的に発現するCOS細胞にトランスフェクトするプラスミドにコードされていてもよいか否かを試験した。このため、エレクトロポレーションにより、pHSE3A2で安定的にトランスフェクトしたCOS-7細胞を、flu58-66の発現をコードするプラスミドpcDNApcDNAfluで一過性スーパートランスフェクションした図2cおよび図3c;プラスミド挿入断片の配列は表6参照。pcDNAはSV40複製起点を保有し、これによってCOS-7細胞において、プラスミドの細胞内増幅が起こるGluzman1981。蛍光58JM22CD8sGFPの収量は31であり、合成ペプチドを直接添加した試験と比較して、わずかに低かった図2aおよび図3a。注目すべきことに、この試験は、pcDNAにコードされるペプチドをCOS-7細胞の細胞質中で発現することができ、それらは小胞体内腔に効率的に輸送され、そこでMHCクラスI分子に負荷されることを直接的に示している。次に、pRSVA2およびpcDNAfluを1:1の比率でCOS細胞に一過性共トランスフェクトした。56時間後に58JM22CD8sGFP細胞を添加し、更に16時間後にその蛍光を観察した図2eおよび図3e。活性化58JM22CD8sGFPの収量は13であり、安定的トランスフェクタントの場合よりわずかに低かった図2aおよび2d。これは、pcDNA中のpRSVA2およびGFPを共トランスフェクトしたモデル系でのトランスフェクション効率14と同程度であり、いずれもFACSによって容易に定量を行うことができた図4。58JM22CD8sGFP細胞におけるsGFPの発現を、ライブラリーをトランスフェクトしたCOS細胞との共培養を開始してから8時間後に観察したが、発現は16時間以上の間、安定であった。この間、58JM22CD8sGFP細胞は、その抗原を提示するCOS-7細胞と密着したままであった。陰性コントロール試験、すなわち、pRSVA2および挿入断片を有さないpcDNApcDNAemptyを共トランスフェクトした場合図2fおよび図3f、または、pRSVA2無しでpcDNAfluだけをトランスフェクトした場合図2dおよび3dでは、58JM22CD8sGFP細胞の活性化は観察されなかった。pcDNAfluの代わりにpcDNAflu、すなわちインフルエンザ基質タンパク質配列の全長をコードするコンストラクトを使用した場合は、陽性細胞は全く同定されなかった図2gおよび図3g。このことは、COS-7細胞が完全長flu1-252タンパク質を正確にプロセシングできないことを示している。注目すべきことに、本発明の方法は短鎖ペプチドを用いて試験を行うため、抗原に必要とされる全ての細胞内プロテアーゼ開裂を回避できる。実施例3:ランダムペプチドライブラリーのスクリーニングおよびflu58-66ミモトープの同定flu58-66のミモトープを同定するために、ランダムライブラリーを作製した。これらのライブラリーは、5’末端にKozak配列および開始コドン、そして3’末端に停止コドンが隣接した一連のN-ヌクレオチドから成る表6。ライブラリーをプラスミドpcDNArcに挿入し、pRSVA2と共にCOS-7細胞に共トランスフェクトした。HLA-A0201によって提示される抗原は既に研究が行われているため、3つの固定アミノ酸を導入し、2位、6位、および9位にある3個のHLA-A2結合アンカーとしたpcDNAA2269Rammenseeら1999。flu58-66のHLA-A20201アンカー位、すなわち2位のイソロイシン、6位のバリン、および9位のロイシンこれが主要アンカーであるを固定した。他の全ての位置をランダムとした。ライブラリーをpRSVA2と共にCOS-7細胞に共トランスフェクトし、少数の58JM22CD8sGFP細胞の活性化を観察した図5b。蛍光活性化58JM22CD8sGFP細胞と下部にあるCOS-7細胞が直接接触していることが確認できる図5a。活性化58JM22CD8sGFP細胞の頻度は、COS-7細胞100万個当たり、約3個の蛍光細胞であった。活性化ペプチドミモトープをコードするpcDNAプラスミドを回収するために、蛍光顕微鏡下で毛細管を用い、活性化58JM22CD8sGFP細胞を下部のCOS-7細胞と共に選別採取した。COS-7細胞は接着細胞であるが、組織培養プレートの底面から回収することができる。58JM22CD8sGFPと、HLAA2およびpcDNAA2269で共トランスフェクトしたCOS-7細胞との共培養条件下で、蛍光58JM22CD8sGFP細胞および下部のCOS細胞の両方を共に選別採取できる。これを蛍光下、またはより好ましくは透過光下で観察することができる。選別採取した細胞から、ミモトープをコードする配列をPCRで増幅し、クローニングを行い、pRSVA2と共にフレッシュのCOS-7細胞に共トランスフェクトするか、または、予めHLAA2での安定的トランスフェクションを行ったCOS-7細胞にトランスフェクトした。その後、58JM22CD8sGFP活性化について試験した。ほとんどの場合、単一のCOS-7細胞を選別採取することができたが、最初は、多くの異なる挿入断片が回収された。おそらくこれは、トランスフェクション複合体中のプラスミドが培地中で細胞外部に残存し、細胞と共に吸引されるために、一般的に単一のCOS細胞が1つより多いライブラリープラスミドを含有するためであると考えられる。そのため、細菌クローンの個別のプールを、集団が均一になり、プラスミドの挿入断片のシーケンシングができるようになるまで分析した図6。4つのペプチドによって提示される4つの異なるミモトープが同定されたmimo-1からmimo-4;図7。mimo-2は独立して2回同定された。このようにして推定されたアミノ酸配列は、1位、3位、および5位のいくつかのアミノ酸がflu58-66と異なっていることが明らかになった。1位および3位のアミノ酸は、HLAA0201およびJM22のいずれとも強い相互作用を示さないことが知られているStewartJonesら2003。5位のアミノ酸置換mimo-2:フェニルアラニンからトリプトファンへの置換は保存的である。しかしながら、興味深いことに、このアミノ酸はTCR相補性決定領域中のいくつかのループと相互作用する。ミモトープ配列を用い、標準的な条件でBlast検索を行い、親flu58-66配列を明確に同定することができた。実施例4:単一T細胞における再構成αβ-T細胞受容体の解析4.1プライマーの設計およびPCR法単一T細胞の再構成αβ-TCRペアの分子解析は、約70個のTCRVα領域遺伝子および約50個のTCRVβ領域遺伝子の完全なスペクトラムを包含しなければならない。出願人は、近年、TCRVαレパートリーの同時増幅に関して報告された24個のTCRVαプライマーセットと共に、TCRβ鎖レパートリーの全ての異なるVβ遺伝子ファミリーを同時に増幅できるPCR法の開発に取り組んだSeitzSchneiderら2006。この方法の複雑さは、特異的増幅に干渉しうる、多数のプライマー間の相互作用の可能性に起因する。出願人は、1つの反応で全てのTCRVα遺伝子およびVβ遺伝子を前増幅することが可能な多重RT-PCRから開始する、PCRプロトコルを確立した。その後、TCRVα-およびVβ-PCR産物を別々に処理する。4.2再構成αβTCRの前増幅数量を増やさないために、配列アラインメントによって同定された種々のVβ遺伝子ファミリーの配列相同性を利用してTCRVβプライマーを設計した。主要なヌクレオチド配列との1個のミスマッチは許容した。プライマー位置は、それぞれのTCRVβ遺伝子がなおも直接シーケンシングによって同定できるように考慮されなければならない。オリゴ解析ソフトウェアプログラムによって、起こりうる相互作用が最小限となるよう、Vβレパートリーの全てのプライマー間で、また、24個のVαプライマーとの間で調整を行った。30個の異なるVβ遺伝子プライマーを、24個のVαプライマーと種々に組み合わせて試験した。これによって、最終的に9個のVβプライマーから成るセットVp1-9、表1が得られ、これは全ての機能性Vβ遺伝子を網羅する。リーダーセグメント上に位置するVp1以外は、全てのプライマーがVβ遺伝子セグメント上に位置する。Cβ1プライマーと組み合わせ、これらのプライマーのそれぞれから、対応する再構成Vβ遺伝子が効率的に増幅されたことが、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって明らかとなった図8A。VαプライマーセットおよびVβプライマーセットを合一した場合の、単一反応で完全長TCRVβおよびVα遺伝子レパートリーを増幅する能力を、多重RT-PCRにより、末梢血T細胞由来のmRNAを用いて試験した。前増幅の後、種々の再構成TCRVβ遺伝子ファミリーを、23の異なるネステッドPCR反応で多重PCR産物から増幅した。PCRには、種々のTCRVβ遺伝子ファミリーに特異的な23個の異なるプライマーおよびFAM標識したCβ2プライマーを使用し、本質的に報告されている通りに行った。PCR産物のフラグメント長を、遺伝子シーケンサーによるスペクトラタイピングによって解析した。各TCRVβ遺伝子ファミリーの増幅により、期待されたサイズ範囲のPCR産物を得た。それらは、ポリクローナルなT細胞集団に典型的な再構成TCRで、ガウス様のフラグメント長分布を示すものであった図8C。これと同時に、別々の反応で24個の異なるVαプライマーを使用して、多重PCR産物からTCRVαレパートリーを増幅した。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色から明らかなように、そのそれぞれから、増幅された再構成TCRVαを示す独自のPCR産物を得た図8B。このように、出願人がαβTCRレパートリーの前増幅のために構築した多重RT-PCRの条件により、実際に単一反応で完全長TCRVβレパートリーおよびVαレパートリーの両方を増幅することが可能であった。4.3単一細胞の解析次の段階では、単一T細胞の前増幅産物からそれぞれの再構成TCRVβ鎖を増幅することが必要となる。23個という多数の異なるVβ遺伝子サブファミリーを使用して1つのサンプル中でVβ特異的ネステッドPCRを行うことはできないため、ユニバーサルプライマー配列をTCRβ鎖PCR産物の5’末端に導入した。これを行うために、ユニークな21ヌクレオチド長配列を、プライマー相互作用またはヒト遺伝子との相同性を有さないように設計し、9個の異なるVpVp1-9プライマーの5’末端に付加した。1μlの前増幅産物を用い、これらの伸長型プライマーを使用してランオフPCRを行ったPCR容量は10μl。次いで、第3のセミネステッドPCRを行った。これは、ユニバーサルプライマーをネステッドCβ2プライマーと共に使用し、TCRVβ遺伝子ファミリーから独立した、個別の単一細胞再構成TCRVβを増幅する。PCR法を図9に示す。これと同時に、対応する再構成TCRVαを、Seitzらの報告による5つのVαプライマープールを用いる5つの異なるネステッドPCRで、多重PCR前増幅産物から増幅した。その後、増幅された再構成TCRα鎖およびβ鎖を直接シーケンシングによって特性決定した。単一T細胞レベルでのこの方法の効率を試験するために、末梢血T細胞を、CD4モノクローナル抗体またはCD8モノクローナル抗体でコーティングした磁気ビーズで標識し、単一のT細胞を倒立顕微鏡下で2μlピペットを用いて吸引採取し、前増幅バイアルに移した。好適な細胞密度に調整すれば、この方法によって、種々の起源の細胞懸濁液から単一のロゼット形成T細胞を同定および単離することができる図10。この方法で、合計96個のCD4末梢血T細胞および96個の末梢血T細胞を回収し、解析した。82個のCD4T細胞85.4および76個79.2のCD8T細胞で再構成TCRVβが増幅され、PCR産物の直接DNAシーケンシングによって特性決定された。TCRβ鎖増幅の効率は80以上であった。解析した再構成のうち、Vβ16これは、一般的に、まれにしか再構成されない以外の全ての機能性TCRVβ遺伝子ファミリーが提示された。他のTCRVβ遺伝子ファミリーの発生率はTCRVβ遺伝子の平均的な使用量を反映しており、それらのTCRBV遺伝子ファミリーは、一般に単一細胞の解析でもしばしば観察される優位性を示した。再構成β鎖を保有するT細胞のそれぞれから、対応するTCRα鎖を得、直接シーケンシングによって確認することができた。手作業による単一細胞の吸引採取のあらゆる試みが成功していないことから、出願人は、出願人の方法によって実質的に全ての単一αβT細胞から再構成αβTCRペアの分子の特性決定を行うことが可能であると結論づける。4.4乾癬における単一T細胞の再構成αβTCRの解析現在の概念によれば、T細胞が介在する自己免疫疾患は、自己抗原特異的活性化および自己反応性T細胞のクローン性増殖に起因する。出願人は、開示する試験法によって、炎症組織病変からそれらの病原性クローンT細胞を同定し、推定される自己抗原に対する特異性をコードする再構成αβTCRペアを特性決定することができるかどうかを試験した。出願人は、T細胞が介在する皮膚の自己免疫疾患である尋常性乾癬に着目した。従前の、病変生検由来TCRcDNAのランダム増幅、クローニング、およびシーケンシングによる乾癬病変部T細胞浸潤のTCRβ鎖レパートリーの解析によって、優占なオリゴクローナルなT細胞の増殖は示唆されていたが、個々のT細胞の推定されるクローン性およびサブタイプは未だ不明確である。病原性自己免疫T細胞クローンは、exvivoで、病原性T細胞浸潤中で同一の再構成αβ-TCRを有する複数のT細胞として認識できるものでなければならない。この前提に基づき、単一細胞レベルで、乾癬病変T細胞クローンを同定し、組織病変内でのその存在を確認するための、段階的なプロトコルを構築した。慢性乾癬斑から生検を採取し、2つの切片に分割した。一方はTCRβ鎖cDNAの作製に使用し、他方は培養して、炎症性浸潤からT細胞を遊出させた。遊出は24から48時間以内に観察された。T細胞を回収し、CD4特異的磁気ビーズまたはCD8特異的磁気ビーズで標識し、個別のCD4またはCD8T細胞を単離し、TCRβ鎖解析を行った。単一T細胞の再構成TCRα鎖は、T細胞クローン中でのみ、すなわち、特定の再構成TCRVβ鎖が、複数のT細胞の両方で同定されるか、および、他方の生検標本内で同定されるかについて解析した。4名の患者からの病変生検をこのようにして試験した。患者1ではCD4T細胞を、患者2ではCD8T細胞を解析した。40個のCD4のうちの2個1、または37個のCD8T細胞のうちの2個2は、それぞれ、同一の再構成TCRVβおよび再構成TCRVαを有した表7。再構成特異的プライマーを、対応するVβリーダープライマーと共に使用し、PCR産物を直接シーケンシングして、再構成TCRVβのそれぞれを、対応する生検サンプルから増幅することができ、これによって、組織病変内で対応するT細胞のクローナルな増殖が起きていることが裏付けられた。患者3では、CD4およびCD8T細胞を解析した。この患者は、反復性連鎖球菌性アンギーナ感染性乾癬を引き起こす主な要因であるに伴う乾癬炎症が持続していたため、扁桃摘出を受けていた。血中リンパ球および扁桃腺断片も、同様に解析を行うことができた。1つの特定の再構成αβ-TCRが、82個のCD4T細胞のうち2個で確認され表7、3個の再構成αβTCRが、41個のCD8T細胞のうちそれぞれ2個または3個で反復して確認された。これらの再構成TCRは全て、対応する生検サンプル他方の切片中でも同定された。最も興味深いことは、CD4T細胞およびCD8T細胞で繰り返し観察された再構成TCRVβはいずれも、患者のPBLおよび/または扁桃腺組織からも増幅され、このことは、対応するT細胞クローンが全身に分布することを示している。4.5表皮および真皮におけるCD8T細胞クローンの示差的分布T細胞浸潤物の多くは乾癬皮膚病変の真皮コンパートメントに局在するが、乾癬の発症は表皮内のT細胞の蓄積に強く依存し、それらの多くはCD8である。従って、実際に病原性を示すT細胞はCD8T細胞であると言うことができ、これが表皮に侵入して乾癬皮膚病変を促進する必要がある。次の2人の患者では、表皮および真皮内のCD8T細胞クローンの示差的クローン分布を解析した。このため、真皮と表皮を剥離し、個別に培地中に播種した。単一CD8T細胞のコンパートメントに関する解析で、どちらの患者でも、CD8T細胞クローンは真皮コンパートメントより表皮コンパートメントで強く示されることが実証された表8。患者4では、8個の異なる再構成αβ-TCRが52個の表皮CD8T細胞のうち2個または3個で確認され、4個の再構成αβ-TCRが、表皮および真皮T細胞の両方で反復して観察された。患者5では、3個の異なる再構成αβ-TCRが33個の表皮CD8T細胞のうち3、4、または7個で選択的に提示され、2つの表皮再構成αβ-TCRが真皮T細胞でも同様に観察された。真皮では、同一の再構成αβ-TCRを示すT細胞クローンは1個患者4または2個患者5のみであった。従って、表皮T細胞は、真皮T細胞に対してクローン優位性を示した。4.6TCRハイブリドーマの作製クローン増殖したCD8T細胞の再構成αβTCRペアは、乾癬病変部T細胞応答の抗原特異性を有すると考えられる。それらを、可能性のある乾癬抗原の同定に使用するために、いくつかの病変CD8T細胞クローンの再構成TCRで、組換えTCRハイブリドーマを作製した。これを行うために、3個の異なるCD8クローンの再構成α鎖およびβ鎖をクローニングし、組換えαβ-TCRクローンとして、マウス58-/-T細胞ハイブリドーマ株において、ヒトCD8分子および緑色蛍光タンパク質と共に、NFATの制御下で安定発現させた。CD3モノクローナル抗体によって活性化すると、これらのハイブリドーマは十分な量のインターロイキン2IL-2を生成しIL-2Elisaで測定、UV顕微鏡下で緑色蛍光を示した。更に、それらのハイブリドーマは、ケラチノサイト細胞株の細胞、HaCaTをHLA-Cw6乾癬への罹病性を与える主なリスク対立遺伝子でトランスフェクトすると、これらの細胞株の細胞によって活性化された。参考文献BendleGMetalNatureMed16565570BettinottiMPetalJImmunolMeth279143148BielekovaandMartinJMolMed2001Oct7955265AntigenspecificimmunomodulationviaalteredpeptideligandsBlankUBoitelBMegeDErmonvalMandAcutoOAnalysisoftetanustoxinpeptideDRrecognitionbyhumanTcellreceptorsreconstitutedintoamurineTcellhybridomaEurJImmunol2330573065BoonTCouliePGVandenEyndeBJandVanderBruggenPHumanTcellresponsesagainstmelanomaAnnuRevImmunol24175208ChenEHetalFEBSLetters58121812193CohenCJetalCancerRes6738983903CoxALSkipperJChenYHendersonRADarrowTLShabanowitzJEngelhardVHHuntDFandSingluffCLIdentificationofapeptiderecognizedbyfivemelanomaspecifichumancytotoxicTcelllinesScience264716719CrawfordFHusebyEWhiteJMarrackPandKapplerJWMimotopesforalloreactiveandconventionalTcellsinapeptideMHCdisplaylibraryPLoSBiology2523533CrawfordFJordanKRStadinskiBWangYBHusebyEMarrackPSlanskyJEandKapplerJWUseofbaculovirusMHCpeptidedisplaylibrariestocharacterizeTcellreceptorligandsImmunolRev210156170DalakasMCSporadicinclusionbodymyositisdiagnosispathogenesisandtherapeuticstrategiesNatureClinicalPracticeNeurology2437447DurocherYetalNuclAcidRes30e9FieringSNorthropJPNolanGPMattilaPSCrabtreeGRandHerzenbergLASinglecellassayofatranscriptionfactorrevealsathresholdintranscriptionactivatedbysignalsemanatingfromtheTcellantigenreceptorGenesDev418231834FissoloNHaagSDeGraafKLDrewsOStevanovicSRammenseeHGandWeissertRNaturallypresentedpeptidesonmajorhistocompatibilitycomplexIandIImoleculeselutedfromcentralnervoussystemofmultiplesclerosispatientsMolCellProteomics820902101FontouraetalIntRevImmunol2005SepDec2441546AntigenspecifictherapiesinmultiplesclerosisgoingbeyondproteinsandpeptidesFrieseMAandFuggerLPathogenicCD8TcellsinmultiplesclerosisAnnNeurol66132141GluzmanYSV40transformedsimiancellssupportthereplicationofearlySV40mutantsCell23175182GotchFRothbardJHowlandKTownsendAandMcMichaelACytotoxiclymphocytesTrecognizeafragmentofinfluenzavirusmatrixproteininassociationwithHLAA2Nature326881HeimRCubittABandTsienRYImprovedgreenfluorescenceNature373663664IshizukaJStewartJonesGBEVanderMerweABellJIMcMichaelAJandJonesEYThestructuraldynamicsandenergeticsofanimmunodominantTcellreceptorareprogrammedbyitsVbdomainImmunity28171182KarttunenJandShastriNMeasurementsofligandinducedactivationinsingleviableTcellsusinglacZreportergeneProcNatlAcadSciUSA8839723976KatakuraYetalMethCellBiol576991KuballJetalBlood10923312338LehnerPJWangECYMossPAHWilliamsSPlattKFriedmanSMBellJIandBorysiewiczLKHumanHLAA0201restrictedcytotoxicTlymphocyterecognitionofinfluenzaAisdominatedbyTcellsbearingtheVb17genesegmentJExpMed1817991MarshSGetalTissueAntigens75291455MartinonFMayorAandTschoppJTheinflammasomesGuardiansofthebodyAnnuRevImmunol27229265MurphyKetalJanewaysImmunobiology20087thEditionGarlandScienceNewYorkISBN9780815341239MurrayGIActaHistochemica109171176NinoVasquezJJAllicottiGBorrasEWilsonDBValmoriDSimonRMartinRandPinillaCApowerfulcombinationtheuseofpositionalscanninglibrariesandbiometricalanalysistoidentifycrossreactiveTcellepitopesMolImmunol4010631074OzakiSetalJImmunol1417178PannetierCetal1995ImmunolToday16176181PircherHMakTWBallhausenWRuediEHengartnerHZinkernagelRMBurkiKTcelltolerancetoMlsaencodedantigensinTcellreceptorVb81chaintransgenicmiceEMBOJ8719727RammenseeHGBachmannJEmmerichNPNBachorOAandStevanovicSSYFPEITHIDatabaseforMHCligandsandpeptidemotifsIG50213219RobinsonJetalNucleicAcidsResearch31311314RudolphMGStanfieldRLandWilsonIAHowTCRsbindMHCandcoreceptotrsAnnuRevImmunol24419466SeitzSSchneiderCKMalotkaJNongXEngelAGWekerleHHohlfeldRandDornmairKReconstitutionofpairedTcellreceptoraandbchainsfrommicrodissectedsinglecellsofhumaninflammatorytissuesProcNatlAcadSciUSA1031205712062ShanerNCetalNatMethods2905909ShirahataSetalMethCellBiol52111145SmithESMandokhotAEvansEEMuellerLBorrelloMASahasrabudheDMandZaudererMLethalitybasedselectionofrecombinantgenesinmammaliancellsApplicationtoidentifyingtumorantigensNatureMed7967972SmithGarvinJEKoretzkyGAandJordanMSTcellactivationAnnuRevImmunol27591619StewartJonesGBEMcMichaelAJBellJIStuartDIandJonesEYAstructuralbasisforimmunodominanthumanTcellreceptorrecognitionNatureImmunol4657663StoneJDetalImmunology126165176SuterCrazzolaraCetalMethCellBiol50425438TungJWetalClinLabMed27453468VanderBruggenPTraversariCChomezPLurquinCDePlaenEVandenEyndeBKnuthAandBoonTAgeneencodinganantigenrecognizedbycytolyticTlymphocytesonahumanmelanomaScience25416431647vanLoenenMMetalProcNatlAcadSciUSA1071097210977VossRHetalJImmunol180391401WalterUandSantamariaPCD8TcellsinautoimmunityCurrOpinImmunol17624631WangYBRubtsovAHeiserRWhiteJCrawfordFMarrackPandKapplerJWUsingabaculovirusdisplaylibrarytoidentifyMHCclassImimotopesProcNatlAcadSciUSA10224762481WeinholdMetalJImmunol17955345542WongFSKarttunenJDumontCWenLVisintinIPilipIMShastriNPamerEGandJanewayCAIdentificationofanMHCclassIrestrictedautoantigenintypeIdiabetesbyscreeninganorganspecificcDNAlibraryNatureMed510261031WucherpfennigKWAllenPMCeladaFCohenIRDeBoerRGarciaKCGoldsteinBGreenspanRHaflerDHodgkinPHusebyESKrakauerDCNemazeeDPerelsonASPinillaCStrongRKandSercarzEEPolyspecificityofTcellandBcellreceptorrecognitionSeminImmunol19216224"