"i.配列番号1のヌクレオチド配列又はこの相補体と少なくとも85同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子;ii.配列番号1のヌクレオチド配列又はこの相補体の少なくとも1500個の連続するヌクレオチドのフラグメントを含む核酸分子;iii.配列番号2と少なくとも85同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;iv.配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子であって、フラグメントが、配列番号2の少なくとも500個の隣接するアミノ酸を含む上記核酸分子:及びv.配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドのバリアントをコードする核酸分子であって、核酸分子が、6.0×SSC中、45°Cでのインキュベーションと、それに続く0.2×SSC/0.1SDS中、65°Cでの洗浄の条件下で、配列番号1全体又はこの相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする上記核酸分子からなる群から選択される単離された核酸分子。a配列番号1のヌクレオチド配列を含む核酸、及びb配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子cCD133に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリン又はCD133に結合特異性を有する免疫グロブリンの部分を含有する、請求項1に記載のポリペプチドをコードする核酸分子からなる群から選択される、請求項1に記載の核酸分子。ベクター核酸配列をさらに含む、請求項1又は2に記載の核酸分子。請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。a配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであって、配列番号2の少なくとも600個の隣接するアミノ酸を含む上記フラグメント;b配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドのバリアントであって、6.0×SSC中、45°Cでのインキュベーションと、それに続く0.2×SSC/0.1SDS中、65°Cでの洗浄の条件下で、配列番号1全体又はこの相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされる上記バリアント;c配列番号1のヌクレオチド配列又はこの相補体からなる核酸と少なくとも85同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるポリペプチド;及びd配列番号2と少なくとも85同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、コラーゲン及びCD133タンパク質に同時且つ選択的に結合することができるポリペプチド。配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載のポリペプチド。CD133に結合特異性を有する免疫グロブリンの相補性決定領域を含む、請求項5又は6に記載のポリペプチド。相補性決定領域として配列番号25、26、27、28、29、及び/若しくは30のアミノ酸配列又はこの部分を含む、請求項7に記載のポリペプチド。ヒト起源の免疫グロブリンに由来する免疫グロブリンフレームワーク領域を含む、請求項7又は8に記載のポリペプチド。二量体である、請求項5~9のいずれか一項に記載のポリペプチド。配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生する方法であって、核酸分子が発現される条件下で請求項4に記載の宿主細胞を培養することを含む上記方法。請求項5~9のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。心臓血管疾患の予防又は治療又は診断において使用するための、請求項5~9のいずれか一項に記載のポリペプチド。心臓血管疾患の予防又は治療のための医薬品を製造するための、請求項5~9のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。不安定なプラークの診断マーカーを調製するための、請求項5~9のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。したがって、コラーゲン及びCD133タンパク質に同時且つ選択的に結合することができる小さいサイズのポリペプチドを提供することが本発明の目的であり、これによりタンパク質は、血管壁の内皮細胞へのEPCの分化により直接的に、又は正の調節因子の分泌により間接的に治癒過程を増大させる医薬組成物において有用なように高収量及び高純度で調製することができる。本発明は、特定の融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。融合タンパク質は、露出されたコラーゲンへのEPCのホーミングによる心臓血管疾患の治療若しくは予防において、又は診断目的で使用することができる。第1の態様によれば、本発明は、i.配列番号1のヌクレオチド配列又はこの相補体と少なくとも85同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子;ii.配列番号1のヌクレオチド配列又はこの相補体の少なくとも1500個の連続するヌクレオチドのフラグメントを含む核酸分子;iii.配列番号2と少なくとも85同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;iv.配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子であって、フラグメントが、配列番号2の少なくとも500個の隣接するアミノ酸を含む上記核酸分子;及びv.配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドのバリアントをコードする核酸分子であって、核酸分子が、6.0×SSC中、45°Cでのインキュベーションと、それに続く0.2×SSC/0.1SDS中、65°Cでの洗浄の条件下で、配列番号1全体又はこの相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする上記核酸分子からなる群から選択される単離された核酸分子を提供する。配列番号1の核酸配列は、次の通りである。第2の態様によれば、本発明は、本発明の第1の態様の核酸分子を含有する宿主細胞を提供する。第3の態様によれば、本発明は、a配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであって、配列番号2の少なくとも600個の隣接するアミノ酸を含む上記フラグメント;b配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドのバリアントであって、6.0×SSC中、45°Cでのインキュベーションと、それに続く0.2×SSC/0.1SDS中、65°Cでの洗浄の条件下で、配列番号1全体又はこの相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされる上記バリアント;c配列番号1のヌクレオチド配列又はこの相補体からなる核酸と少なくとも85同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるポリペプチド;及びd配列番号2と少なくとも85同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、コラーゲン及びCD133タンパク質に同時且つ選択的に結合することができるポリペプチドを提供する。第3の態様によるポリペプチドは、心臓血管疾患の予防又は治療における使用に有利である。配列番号2のアミノ酸配列は、次の通りである。第4の態様によれば、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生する方法であって、核酸分子が発現される条件下で第3の態様による宿主細胞を培養することを含む上記方法を提供する。第5の態様によれば、本発明は、本発明の第3の態様によるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。第6の態様によれば、本発明は、心臓血管疾患の予防又は治療のための医薬品を製造するための、第3の態様によるポリペプチドの使用を提供する。本発明は、高効率で哺乳動物細胞培養物において発現され得る本発明による融合タンパク質が、高い親和性で標的CD133及びコラーゲンに結合でき、並びにフローチャンバー実験で示されるような動的条件下でさえ、CD133発現HEK293細胞をコラーゲン被覆表面に固定化できることを示す。GPVI-Fcと化学的に連結されたW6B3H10mAbを含有するWO2008/101700のタンパク質混合物と同程度に、本発明の融合タンパク質は、ヒト臍帯血から単離されたCD133陽性前駆細胞を、マウスモデルにおいて誘発された血管病変に動員することができる。さらに、動員されたEPCは、内皮細胞に分化し、故に内皮壁の再生に直接寄与した。したがって、本発明の融合タンパク質は、再内皮化を増大させ、再生血管医療に有益な価値がある。本発明のポリペプチドは、血管壁の内皮細胞への分化により直接的に、又は正の調節因子の分泌により間接的に治癒過程を増大させるのに有用である。既存の化学的に連結されたコンストラクトより優れて、新規の融合タンパク質は、コラーゲンに対しより高い親和性を有する図9参照。これは、血管病変への局所結合についてより高い有効性を有する医薬品としての使用に利点を示す。融合タンパク質の様々な可能性のうち、scFv-lhのみがCD133に対し同程度の高い親和性を示したのに対し、他の得られたコンストラクトは示さなかった図5参照。血管再生過程のための本発明のポリペプチドの適用のほかに、該ポリペプチドは、化学療法又は放射線療法による骨髄除去後の、移植された幹細胞の骨髄へのホーミングを改善するのに使用することもできる。本発明は、コラーゲン及びCD133タンパク質に同時且つ選択的に結合することができる小さいサイズの配列番号2によるポリペプチドを提供する。本発明によるタンパク質は、高収量及び高純度で調製することができ、このことが、該タンパク質を医薬組成物において高度に有用にしている。本発明によるポリペプチドは、融合タンパク質、すなわち融合遺伝子の翻訳の産物である。融合タンパク質は、一本鎖抗CD133抗体のドメイン、リンカー、Fc部分、及びGPVI部分を含有する。本発明のタンパク質は、二量体の形態にあってもよい。本発明によるポリペプチドは、連結リンカーペプチドにより1つのポリペプチド鎖上で合体される、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の可変配列のみから構成される一本鎖抗体scFvに基づく。この一本鎖抗体は、驚くほど高い親和性で親mAbの抗原に対する特異性を保持する。本発明により使用される親mAbは、市販のクローンW6B3C1Miltenyi、ベルギッシュグラッドバッハのサブクローン、マウスハイブリドーマ細胞クローンW6B3H10により産生することができる。本発明によるポリペプチドの抗体部分は、マウスモノクローナル抗体に由来するため、この部分を含有する融合タンパク質は、マウス-ヒトキメラタンパク質である。組換え抗体ベースの医薬品ではマウス由来配列を置換するのに利用可能な技術があるため、ヒト化されたもの又は完全にヒトのものである治療分子を開発することが最先端になっている。これは、特に反復投与された場合、治療タンパク質に対する免疫応答を低減又は予防する。したがって、本発明のポリペプチドの一本鎖部分は、CDR移植と呼ばれる方法により、ヒト化過程に供することができる。これには、抗体の抗原結合部位を含むマウス由来相補性決定領域CDRが、ヒトフレームワーク残基に移植される。種マウスに由来する融合タンパク質の抗体部分は、ヒトコンセンサスアクセプターフレームワーク配列へのマウスCDRのCDR移植により成功裏にヒト化され得る。ヒト化融合タンパク質は、標的タンパク質CD133及びコラーゲンIに対する結合特性を保持し、マウス一本鎖配列を有する融合タンパク質と比べて類似の親和性で結合する。第2の融合パートナーは、血管の内皮層における病変を認識及び結合することができる。ステント移植などの外科的介入による内皮細胞層の損傷後、又はアテローム性動脈硬化プラークの破裂後、内皮下マトリックスの構成要素、コラーゲンは、血流に暴露される。これは、血小板の急速な付着及び活性化をもたらし、今度は、血栓形成及び最終的に血管の閉塞の原因となる可能性がある。ヒト化融合タンパク質は、血栓形成の面積減少により示されるように、損傷された血管壁への血小板の結合を抑制することができる図22参照。マウス抗体配列を有する前駆体分子と比べて、ヒト化融合タンパク質は、投与後の患者の免疫系の寛容を改善すると期待されている。血小板は、血小板の表面で発現される膜糖タンパク質受容体、糖タンパク質VIGPVIを介してコラーゲンに接着する。該タンパク質の細胞外ドメインに対応するヒト血小板糖タンパク質VIの可溶性部分は、コラーゲンに対する高い結合親和性を示す。GPVIは、ホモ二量体として高い親和性でコラーゲンを結合する。一方では二量体化を、他方では親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を促進するため、ヒトIgGのFc部分が可溶性GPVI部分に付着される。Fcフラグメントは、ヒンジ領域の残りの部分で共有ジスルフィド結合を介して二量体を形成し、このことが、ジスルフィド結合形成により恐らく支持されたGPVIの二量体化を促進する。さらに、Fcタグは、血流中の融合タンパク質の半減期を増加させる。ポリペプチドが、特に本実施例に記載された条件下で、CD133タンパク質とコラーゲンタンパク質の間に架橋を形成する状態で存在し得る場合、該ポリペプチドは、コラーゲン及びCD133タンパク質に同時に結合することができる。それぞれ配列番号1又は配列番号2と約85同一性、好ましくは90、95、又は98同一性を有するアミノ酸又はヌクレオチド配列は、十分に同一であると本明細書に定義される。したがって、用語十分に同一とは、第1及び第2のアミノ酸又はヌクレオチド配列が共通の構造ドメイン及び/又は共通の機能活性を有するように、第2のアミノ酸又はヌクレオチド配列配列番号1又は配列番号2と同一又は同等の例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基アミノ酸残基又はヌクレオチドの十分な数又は最小数を含有する、第1のアミノ酸又はヌクレオチド配列を指す。本明細書では、融合タンパク質は、融合タンパク質活性を発揮するポリペプチドである。本明細書では、融合タンパク質活性、融合タンパク質の生物学的活性、又は融合タンパク質の機能活性とは、コラーゲン及びCD133タンパク質への同時及び選択的結合を指す。核酸分子本発明は、配列番号1に示されたヌクレオチド配列、又はこの相補体と少なくとも8590、95、又は98同一であることにより、十分に同一である核酸分子を特徴とする。本発明は、配列番号1に示されたヌクレオチド配列、又はこの相補体の少なくとも15001600、1800、2000、2200個のヌクレオチドのフラグメントを含む核酸分子を特徴とする。ある実施形態では、本発明による核酸分子は、配列番号1に示されたヌクレオチド配列を有する。また、配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子も、本発明内にある。本発明はまた、ポリペプチドをコードする核酸分子であって、核酸が、ストリンジェントな条件下例えば、6塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSC中、約60°Cでのハイブリダイゼーションと、それに続く0.2SSC、0.1SDS中、65°Cでの1回又は複数回の洗浄で配列番号2からなる核酸分子にハイブリダイズし、且つ核酸が、翻訳後修飾前に及び還元型で約65~85kDの分子量を有する、少なくとも500個のアミノ酸長、好ましくは少なくとも700個のアミノ酸のポリペプチドをコードする、上記核酸分子も含む。本発明の1つの態様は、融合タンパク質又はこの生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子のほか、融合タンパク質コード核酸例えば、融合タンパク質mRNAを同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子、及び融合タンパク質核酸分子の増幅又は変異のためのPCRプライマーとして使用するフラグメントに関する。本明細書では、用語核酸分子は、DNA分子例えば、cDNA又はゲノムDNA及びRNA分子例えば、mRNA、並びにヌクレオチド類似体を用いて生成されたDNA又はRNAの類似体を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。単離された核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されるものである。好ましくは、単離された核酸には、核酸が由来する生物のゲノムDNAにおいて核酸に天然に隣接する配列好ましくはタンパク質コード配列が無い。さらに、cDNA分子などの単離された核酸分子には、組換え技術により産生される場合は他の細胞物質、若しくは培養培地が実質的に無くてもよく、又は化学的に合成される場合は化学的前駆体若しくは他の化学物質が実質的に無くてもよい。本発明の核酸分子、例えば、配列番号1のヌクレオチド配列、又はこのヌクレオチド配列のいずれかの相補体を有する核酸分子は、標準的な分子生物学技術及び本明細書に提供された配列情報を用いて単離することができるSambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual.第2版、ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、N.Y.、1989年。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号1に示されたヌクレオチド配列の相補体である核酸分子、又はこの部分を含む。所与のヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、該ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、これにより安定な二本鎖を形成するほど、所与のヌクレオチド配列に十分に相補的なものである。さらに、本発明の核酸分子は、融合タンパク質をコードする核酸配列の部分、例えばプローブ若しくはプライマーとして使用することができるフラグメント、又は融合タンパク質の生物学的に活性な部分をコードするフラグメントのみを含むことができる。融合タンパク質の生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、融合タンパク質生物学的活性を有するポリペプチドをコードする配列番号1の部分を単離し、融合タンパク質のコードされた部分を発現させ例えば、invitro組換え発現により、及び融合タンパク質のコードされた部分の活性を評価することにより、調製することができる。本発明は、さらに、遺伝暗号の縮重のため配列番号1のヌクレオチド配列とは異なり、故に配列番号1に示されたヌクレオチド配列によりコードされるものと同じ融合タンパク質をコードする核酸分子も包含する。したがって、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも15001600、1800、2000、2200個のヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、配列番号1のヌクレオチド配列、好ましくはコード配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。本明細書では、用語ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするは、互いに少なくとも8595、98同一のヌクレオチド配列が、典型的には互いにハイブリダイズされたままである、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記載することが意図される。このようなストリンジェントな条件は当業者に知られており、CurrentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileySons、N.Y.1989年、6.3.1~6.3.6に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、6塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSC中、約4°Cでのハイブリダイゼーションと、それに続く0.2SSC、0.1SDS中、50~65°C例えば、50°C又は60°C又は65°Cでの1回又は複数回の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、自然発生の核酸分子に対応する。変化は、変異により配列番号1のヌクレオチド配列に導入することができ、これにより融合タンパク質の機能的能力を改変することなく、コードされたタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす。例えば、非必須アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換が、行われてもよい。非必須アミノ酸残基は、生物学的活性を改変することなく、配列番号2の配列から改変することができる残基であるのに対し、必須アミノ酸残基は、融合タンパク質の生物学的活性に必要とされる。したがって、本発明の別の態様は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含有する融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。このような融合タンパク質は、配列番号2とはアミノ酸配列が異なり、それにもかかわらず生物学的活性を保持する。1つの実施形態では、核酸分子は、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも約85、95、又は98同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号1の配列とは異なる配列を有する融合タンパク質をコードする単離された核酸分子は、1つ又は複数のヌクレオチド置換、付加又は欠失がコードされたタンパク質に導入されるように、1つ又は複数のヌクレオチド置換、付加又は欠失を融合タンパク質配列番号1のヌクレオチド配列に導入することにより作製することができる。変異は、部位特異的変異誘発及びPCR変異誘発などの標準的技術により導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、1つ又は複数の予測された非必須アミノ酸残基で行われる。故に、例えば、アミノ酸の1、2、3、5、又は10が保存的置換により置換され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン、酸性側鎖例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、非荷電極性側鎖例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、非極性側鎖例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、ベータ分岐側鎖例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン、及び芳香族側鎖例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンが含まれる。故に、融合タンパク質における予測された非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と置換される。或いは、変異は、飽和変異誘発によるなど、融合タンパク質コード配列の全て又は部分に沿ってランダムに導入してもよく、得られた変異体は、融合タンパク質生物学的活性をスクリーニングして活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発後、コードされたタンパク質は組換え的に発現され得、タンパク質の活性が決定され得る。変異体融合タンパク質は、CD133及びコラーゲンに同時且つ選択的に結合する能力をアッセイされ得る。本発明はまた、本発明のヒト化免疫グロブリン例えば、一本鎖抗体をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子のほか、ヒト化免疫グロブリン軽鎖例えば、配列番号12、13、14、若しくは15のアミノ酸配列をコードする配列及び/又は配列番号111、116のアミノ酸若しくはこの部分をコードする配列又は重鎖例えば、配列番号17、18、19、若しくは20のアミノ酸配列をコードする配列及び/又は配列番号110、114のアミノ酸配列若しくはこの部分をコードする配列をコードする配列を含む単離された核酸分子にも関する。さらに、本発明は、CD133に結合特異性を有するヒト以外の抗体に由来する免疫グロブリン例えば、一本鎖抗体の相補性決定領域CDR例えば、配列番号25、26、27、28、29及び/若しくは30を含むアミノ酸配列又はこの部分をコードする配列、及びヒト起源の免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域例えば、配列番号23のアミノ酸配列又はこの部分をコードする配列を含むヒト化免疫グロブリンをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子に関する。本発明は、さらに、CD133に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリン又はこのような免疫グロブリンの鎖の部分を含有する融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。例えば、CD133に結合特異性を有するヒト以外の抗体の軽鎖に由来するCDR例えば、配列番号25、26、及び/若しくは27を含むアミノ酸配列又はこの部分をコードする配列、及びヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターが提供される。CD133に結合特異性を有するヒト以外の抗体の重鎖に由来するCDR例えば、配列番号28、29、及び/若しくは30を含むアミノ酸配列又はこの部分をコードする配列、及びヒト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターは、このようなコンストラクトの別の例である。1つの実施形態では、発現ベクターは、CD133に結合特異性を有するヒト以外の抗体の軽鎖に由来するCDR及びヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域をコードする第1の核酸配列、並びにCD133に結合特異性を有するヒト以外の抗体の重鎖に由来するCDR及びヒト起源の重鎖由来のフレームワーク領域例えば、配列番号17、20、又は24を含むアミノ酸配列をコードする配列を含む重鎖可変領域をコードする第2の核酸配列を含むヒト化免疫グロブリンをコードする核酸を含むことができる。1つの実施形態では、発現ベクターは、例えば、配列番号1nt61~381由来の軽鎖可変領域をコードする第1の核酸配列を含む軽鎖をコードする核酸、及び例えば配列番号1nt427~798又はこの部分由来の重鎖可変領域をコードする第2の核酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、本明細書に記載された軽鎖をコードする核酸、及び本明細書に記載された重鎖をコードする核酸を含むことができる。単離された融合タンパク質及び抗融合タンパク質抗体本発明はまた、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも85、好ましくは95又は98同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドにも関する。本発明の1つの態様は、単離された融合タンパク質、及びこの生物学的に活性な部分のほか、抗融合タンパク質抗体を惹起する免疫原としての使用に適したポリペプチドフラグメントに関する。1つの実施形態では、融合タンパク質は、組換えDNA技術により産生される。組換え発現の代わりに、融合タンパク質又はポリペプチドは、標準ペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。単離された又は精製されたタンパク質又はこの生物学的に活性な部分には、融合タンパク質が由来する細胞又は組織起源由来の細胞物質又は他の夾雑タンパク質が実質的に無い、或いは化学的に合成される場合は化学的前駆体又は他の化学物質が実質的に無い。用語細胞物質が実質的に無いには、タンパク質が単離される又は組換え産生される細胞の細胞成分からタンパク質が分離される、融合タンパク質の製剤が含まれる。故に、実質的に細胞物質が無い融合タンパク質には、約30、20、10、又は5未満乾燥重量での非融合タンパク質本明細書では夾雑タンパク質とも呼ばれるを有する融合タンパク質の製剤が含まれる。融合タンパク質又はこの生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、融合タンパク質又はこの生物学的に活性な部分には、培養培地も好ましくは実質的に無い、すなわち、培養培地は、タンパク質製剤の容積の約20、10、又は5未満に相当する。融合タンパク質が化学合成により産生される場合、融合タンパク質には化学的前駆体又は他の化学物質が好ましくは実質的に無い、すなわち、融合タンパク質は、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離される。したがって、融合タンパク質のこのような製剤は、約30、20、10、5未満乾燥重量での化学的前駆体又は非融合タンパク質化学物質を有する。融合タンパク質の生物学的に活性な部分には、完全長の融合タンパク質より少ないアミノ酸を含み、及び少なくとも融合タンパク質活性を示す、融合タンパク質のアミノ酸配列例えば、配列番号2に示されたアミノ酸配列と十分に同一の又は該アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。典型的には、生物学的に活性な部分は、少なくとも融合タンパク質活性を有するドメイン又はモチーフを含む。融合タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、少なくとも500、550、600、650、又は700個のアミノ酸長であるポリペプチドであってもよい。好ましい生物学的に活性なポリペプチドは、1つ又は複数の融合タンパク質構造ドメイン、特にCD133に選択的に結合する一本鎖抗体、リンカー、Fc部分、及びGPVI部分に由来するドメインを含む。有用な融合タンパク質は、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも約85、好ましくは95又は99同一のアミノ酸配列を含み、及び配列番号2の融合タンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。融合タンパク質の抗体部分はマウスモノクローナル抗体に由来するため、融合タンパク質はマウス-ヒトキメラタンパク質であり、抗原認識に関与するものを除いてマウス配列は、抗体ヒト化によりヒト配列に対して置換され得る。一般に、部分的ヒト抗体及び完全ヒト抗体は、他の抗体よりもヒト体内でより長い半減期を有する。したがって、より低用量及びより頻度の低い投与がしばしば可能である。脂質化などの修飾は、抗体を安定化させ、且つ取り込み及び組織透過性例えば、脳へのを増加させるのに用いることができる。抗体の脂質化の方法は、Cruikshankら1997年J.AcquiredImmuneDeficiencySyndromesandHumanRetrovirology14:193により記載されている。2つの配列間のパーセント相同性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。2つの配列を比較するのに利用される好ましい数学的アルゴリズムの非限定例は、KarlinandAltschul1990年Proc.Nat’lAcad.Sci.USA87:2264~2268頁のアルゴリズム、KarlinandAltschul1993年Proc.Nat’lAcad.Sci.USA90:5873~5877頁のように改変されたアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschulら1990年J.Mol.Biol.215:403~410頁のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12で行って、本発明の核酸分子に類似又は相同なヌクレオチド配列を得ることができる。比較目的のギャップアラインメントを得るには、Altschulら1997年NucleicAcidsRes.25:3389~3402頁に記載のGappedBLASTを利用することができる。BLAST及びGappedBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム例えば、XBLAST及びNBLASTのデフォルトパラメーターを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許す又は許さない、上記技術に類似の技術を用いて決定することができる。パーセント同一性の計算では、典型的には完全な一致がカウントされる。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術により産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントは、従来技術に従って、例えばライゲーションのための平滑末端又は付着末端stagger-endedterminiの使用、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた付着末端cohesiveendsの充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的ライゲーションにより、インフレームで共にライゲートされる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む従来技術により合成することができる。単離された融合タンパク質、又はこの部分若しくはフラグメントは、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製のための標準的技術を用いて、融合タンパク質に結合する抗体を生成する免疫原として使用することができる。完全長融合タンパク質は免疫原として使用することができ、又は、代わりに、本発明は、免疫原として使用するための融合タンパク質の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。融合タンパク質の抗原性ペプチドは、配列番号2に示されたアミノ酸配列の少なくとも8好ましくは10、15、20、又は30個のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して惹起された抗体が、融合タンパク質を有する特定の免疫複合体を形成するように、融合タンパク質のエピトープを包含する。本発明はまた、CD133に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの可変領域を含有するポリペプチドも提供する。具体的には、本発明は、CD133に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンフラグメントを含有する、本発明の融合タンパク質のポリペプチドにも関し、免疫グロブリンは、ヒト以外の起源例えば、齧歯類の抗原結合領域、及びヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも部分例えば、ガンマ型のヒトフレームワーク領域、ヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、さらに、ヒト起源の定常領域の全部又は部分、例えば、ヒト重鎖定常領域及び/又はヒト軽鎖定常領域の全部又は部分を含むことができる。さらに、本発明のポリペプチドは、1つ又は複数の変異、例えば、Fc受容体への結合及び/又は補体を固定する能力を低減する1つ又は複数の変異を有するヒト定常領域の全部又は部分を含むヒト化免疫グロブリンを含んでもよい。融合タンパク質免疫原は、適切な対象、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、又は他の哺乳動物を、免疫原で免疫して抗体を調製するのに使用することができる。免疫原性融合タンパク質製剤による適切な対象の免疫は、ポリクローナル抗融合タンパク質抗体反応を誘導する。したがって、本発明の別の態様は、抗融合タンパク質抗体に関する。ポリクローナル抗融合タンパク質抗体は、適切な対象を融合タンパク質免疫原で免疫することにより調製することができる。融合タンパク質に対する抗体分子は、哺乳動物から例えば、血液から単離することができ、さらに、タンパク質Aクロマトグラフィーなどのよく知られた技術により精製してIgG分画を得ることができる。免疫後適切な時期に、抗体産生細胞は対象から得ることができ、及びKohlerandMilstein1975年Nature256:495~497頁に記載されているハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術Kozborら1983年ImmunolToday4:72頁、又はEBV-ハイブリドーマ技術Coleら1985年、MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy、AlanR.Liss、Inc.、77~96頁などの標準的技術によりモノクローナル抗体を調製するのに使用することができる。組換え発現ベクター及び宿主細胞本発明の別の態様は、融合タンパク質又はこの部分をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書では、用語ベクターとは、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。1つのタイプのベクターはプラスミドであり、別のDNAセグメントがライゲートされ得る環状二重鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、別のDNAセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。ベクターは、ベクターが導入される宿主細胞において自律複製することができ得る例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター。他のベクター例えば、非エピソーム哺乳動物ベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、ベクターが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、好ましくはプラスミドベクターの形態にある。しかし、本発明はまた、ウイルスベクター例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどの他の形態の発現ベクターも含む。本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含む。したがって、組換え発現ベクターは、発現される核酸配列に作動可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づき選択された1つ又は複数の制御配列を含む。組換え発現ベクター内で、作動可能に連結されるは、対象のヌクレオチド配列が、例えば、invitro転写/翻訳系又はベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現を可能にする形で、制御配列単数又は複数に連結されることを意味することが意図される。用語制御配列は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント例えば、ポリアデニル化シグナルを含むことが意図される。このような制御配列は、例えば、Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185、AcademicPress、SanDiego、Calif.1990年に記載されている。制御配列には、多くのタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、及び特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示する配列例えば、組織特異的制御配列が含まれる。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されて、これにより本発明の核酸にコードされた融合タンパク質又はペプチドを産生することができる。本発明の組換え発現ベクターは、原核又は真核細胞、例えば、大腸菌E.coliなどの細菌細胞、昆虫細胞バキュロウイルス発現ベクターを用いる、酵母細胞、又は哺乳動物細胞での融合タンパク質の発現のために設計することができるGoeddel、GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185、AcademicPress、SanDiego、Calif.1990年。或いは、組換え発現ベクターは、例えばT7プロモーター制御配列及びT7ポリメラーゼを用いてinvitroで転写及び翻訳することができる。原核生物でのタンパク質の発現は、タンパク質の発現を指示する構成的又は誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌で行われてもよい。融合ベクターは、この中にコードされたタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には3つの目的、すなわち、1組換えタンパク質の発現を増加させること、2組換えタンパク質の可溶性を増加させること、及び3親和性精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けることに適合する。多くの場合、融合発現ベクターでは、タンパク質分解切断部位が融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入されて、融合タンパク質の精製後の融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。このような酵素、及びこの同族認識配列には、因子Xa、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、pGEXPharmaciaBiotechInc;SmithandJohnson1988年Gene67:31~40頁、pMALNewEnglandBiolabs、ベバリー、Mass.、及びpRIT5Pharmacia、ピスカタウェイ、N.J.が含まれ、それぞれ、グルタチオンS-トランスフェラーゼGST、マルトースE結合タンパク質、又はタンパク質Aを標的組換え融合タンパク質に融合する。適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrcAmannら1988年Gene69:301~315頁及びpET11dStudierら、GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185、AcademicPress、SanDiego、Calif.1990年60~89頁が含まれる。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存する。pET11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現ウイルスRNAポリメラーゼT7gn1により媒介されるT7gn10-lac融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、lacUV5プロモーターの転写制御下にあるT7gn1遺伝子を内部に有する常在ラムダプロファージから、宿主株BL21DE3又はHMS174DE3により供給される。大腸菌での組換えタンパク質発現を最大化する1つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた細菌においてタンパク質を発現させることであるGottesman、GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185、AcademicPress、SanDiego、Calif.1990年119~128頁。別の戦略は、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌で優先的に利用されるものであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変することであるWadaら1992年NucleicAcidsRes.20:2111~2118頁。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的DNA合成技術により行うことができる。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロマイセスセレビシエS.cerivisaeでの発現のためのベクターの例には、pYepSec1Baldariら1987年EMBOJ.6:229~234頁、pMFaKurjanandHerskowitz、1982年Cell30:933~943頁、pJRY88Schultzら1987年Gene54:113~123頁、pYES2InvitrogenCorporation、サンディエゴ、Calif.、pGBT9Clontech、パロアルト、Calif.、pGAD10Clontech、パロアルト、Calif.、pYADE4及びpYGAE2及びpYPGE2BrunelliandPall1993年Yeast9:1299~1308頁、pYPGE15BrunelliandPall1993年Yeast9:1309~1318頁、pACT11Dr.S.E.Elledge、BaylorCollegeofMedicine、並びにpicZInVitrogenCorp、サンディエゴ、Calif.が含まれる。或いは、本発明の融合タンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞で発現され得る。培養昆虫細胞でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、pAc系列Smithら1983年Mol.CellBiol.3:2156~2165頁及びpVL系列LucklowandSummers1989年Virology170:31~39頁が含まれる。別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、pCDM8Seed1987年Nature329:840頁、pCIPromega、及びpMT2PCKaufmanら1987年EMBOJ.6:187~195頁が含まれる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス制御エレメントにより提供されることが多い。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、及びシミアンウイルス40由来である。原核及び真核細胞の両方に対する他の適切な発現系については、Sambrookら上記の第16章及び第17章を参照のこと。別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプで優先的に核酸の発現を指示することができる。組織特異的制御エレメントは当技術分野で知られている。適切な組織特異的プロモーターの非限定例には、アルブミンプロモーター肝臓特異的;Pinkertら1987年GenesDev.1:268~277頁、リンパ特異的プロモーターCalameandEaton1988年Adv.Immunol.43:235~275頁、特にT細胞受容体のプロモーターWinotoandBaltimore1989年EMBOJ.8:729~733頁、及び免疫グロブリンBanerjiら1983年Cell33:729~740頁;QueenandBaltimore1983年Cell33:741~748頁が含まれる。本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクター又は本発明の単離された核酸分子が導入された宿主細胞に関する。この用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫又は潜在的な子孫も指す。変異又は環境の影響によって特定の修飾が後続世代で生じる可能性があるため、このような子孫は、実際は親細胞と同一でない場合があるが、本明細書では該用語の範囲内に依然として含まれる。宿主細胞は、いずれの原核又は真核細胞であってもよい。例えば、融合タンパク質は、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母又は哺乳動物細胞チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO又はCOS細胞などで発現されてもよい。本発明のベクターDNA又は単離された核酸分子は、従来の形質転換又はトランスフェクション技術を介して原核又は真核細胞に導入することができる。本明細書では、用語形質転換及びトランスフェクションは、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションを含む、外来核酸例えば、DNAを宿主細胞に導入するための様々な技術を指すことが意図される。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする適切な方法は、Sambrookら、及び他の実験室マニュアルに見出すことができる。これらの組み込み体を同定及び選択するには、選択可能なマーカー例えば、抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が、一般に、対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、G418、ハイグロマイシン、及びメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与えるものが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、融合タンパク質をコードするものと同じベクターで宿主細胞に導入されてもよく、又は別個のベクターで導入されてもよい。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定することができる。培養下の原核又は真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞は、本発明による融合タンパク質を産生するのに使用することができる。したがって、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いて融合タンパク質を産生す方法を提供する。1つの実施形態では、方法は、融合タンパク質が産生されるように適切な培地で本発明の宿主細胞組換え発現ベクター又は融合タンパク質をコードする単離された核酸分子が導入されたを培養することを含む。別の実施形態では、方法は、さらに、培地又は宿主細胞から融合タンパク質を単離することを含む。医薬組成物本発明の核酸分子及びポリペプチド本明細書では活性化合物とも呼ばれるは、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、典型的には、核酸分子、融合タンパク質、又は抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書では言葉薬学的に許容可能な担体には、薬学的投与に適合する溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤が含まれる。追加の活性化合物が、組成物に組み込まれてもよい。本発明の医薬組成物は、意図された投与経路に適合するように処方される。好ましい投与経路には、非経口、例えば、静脈内又は動脈内投与が含まれる。非経口投与に使用される溶液又は懸濁液:注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤;ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;アセテート、シトレート、又はホスフェートなどの緩衝液、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性を調整する薬剤。pHは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス若しくはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、又は複数回投与バイアル中に封入することができる。注射用途に適した医薬組成物には、滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に関して、適切な担体には、生理食塩水、CremophorELBASF;パーシッパニー、N.J.、又はリン酸緩衝生理食塩水PBSが含まれる。全ての場合において、組成物は滅菌されなければならず、容易に注射できるeasysyringability程度に流動性であるべきである。組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物を含有する溶媒又は分散媒体であってもよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコールマンニトール、ソルビトールなどの、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。滅菌注射溶液は、活性化合物例えば、融合タンパク質又は抗融合タンパク質抗体を、必要に応じて、上に列挙された成分の1つ又はこの組み合わせと共に、適切な溶媒に必要とされる量で組み込むことと、それに続く濾過滅菌により調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体及び上に列挙されたものの中から必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込んで調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分プラス前もって滅菌濾過されたこの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥である。投与の容易さ及び投与量の均一性のため、投与単位形態で経口又は非経口組成物を処方することは特に有利である。投与単位形態は、本明細書では、治療される被験者に対する単一投与量として適した物理的に別々の単位を指す。各単位は、必要とされる医薬担体と共同して所望の治療効果を生むように計算された活性化合物の所定量を含有する。本発明の核酸分子は、ベクターに挿入することができ、且つ遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与US-A5,328,470により、又は定位的注射例えば、Chenら1994年Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054~3057頁参照により被験者に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含んでもよく、又は遺伝子送達ビヒクルが包埋された徐放性マトリックスを含んでもよい。或いは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターからインタクトに産生され得る場合、医薬製剤は、遺伝子送達システムを産生する1つ又は複数の細胞を含むことができる。医薬組成物は、投与のための説明書と共に容器、パック、又はディスペンサーに含めることができる。本発明の使用及び方法本明細書に記載された核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、及び抗体は、1つ又は複数の以下の方法、a処置例えば、治療的及び予防的の方法。bスクリーニングアッセイ;c予測医療例えば、診断アッセイ、予後アッセイにおいて使用することができる。融合タンパク質は、他の細胞タンパク質、特に幹細胞と相互作用し、故に血管壁の内皮細胞へのEPCの分化により直接的に、又は正の調節因子の分泌により間接的に治癒過程を増大させるのに使用することができる。本発明の単離された核酸分子は、融合タンパク質を発現するのに例えば、遺伝子治療適用において宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して使用されてもよい。さらに、融合タンパク質は、融合タンパク質活性又は発現を調整する薬剤又は化合物をスクリーニングするため、及び障害を治療するために使用されてもよい。さらに、本発明の抗融合タンパク質抗体は、融合タンパク質活性を調整するのに使用することもできる。処置の方法本発明は、心臓血管障害のリスクがある又は罹患しやすい、又は露出された内皮下コラーゲンに関連した心臓血管障害を有する被験者を治療する予防的及び治療的方法の両方を提供する。予防的方法1つの態様では、本発明は、被験者における、露出された内皮下コラーゲンに関連した疾患又は状態を予防する方法を提供する。露出された内皮下コラーゲンに起因し又は寄与される疾患のリスクがある被験者は、例えば、高LDLコレステロールレベル、動脈性高血圧、糖尿病、喫煙などの心臓血管イベントのリスクがある被験者を同定する従来の方法により、且つコントラストNMR画像法におけるプラーク増加などの不安定な動脈プラーク、トロポニンT及びI、又はRGDペプチドに対する既存及び新規のバイオマーカーにより、同定することができる。具体的には、本発明によるポリペプチドは、心臓血管疾患の治療に有用である。特定の心臓血管障害は、血小板に対しコラーゲンを露出させる内皮病変に関連する。本発明によるポリペプチドは、このような障害を治療するのに使用することができる。これらの障害には、心筋梗塞などの急性冠症候群などのアテローム性動脈硬化、一過性脳虚血発作TIA又は脳卒中などの急性若しくは慢性脳血管障害、経皮的カテーテルインターベンションPCIによる心臓及び冠状動脈インターベンション、並びに心臓手術の全ての合併症が含まれる。さらに、融合タンパク質と共に造血幹細胞のプレインキュベーション、及び融合タンパク質の糖タンパク質VI成分を介した骨髄コラーゲンの結合により、移植後の幹細胞による骨髄の再増殖が改善され得る。治療的方法本発明のポリペプチドは、心臓血管疾患の予防又は治療のための治療的方法において使用されてもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは、二量体の形態において使用される。特に、本発明のポリペプチドは、血管修復を改善するための前駆細胞のホーミングに使用されてもよい。ポリペプチドの投与の投与レジメンは、年齢、体重、性別、及び治療される被験者の状態に依存する。投与量は、好ましくは、患者1人当たり、1日0.01~2gの本発明のポリペプチドの範囲にあってもよい。ポリペプチドは、好ましくは非経口的に投与されてもよい。投与は、1日1~5回であってもよい。1つの実施形態では、さらなる1つの薬剤、又は薬剤の組み合わせと併用して、本発明のポリペプチドを投与することを含む。さらなる薬剤の例は、GPVI-Fc、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子などの血栓溶解剤、ADP受容体ブロッカークロピドグレル、チカグレロール、カングレロール等などの抗血小板剤、トロンビンアンタゴニストダビガトラン等、又は因子Xアンタゴニストリバロキサバンなどの、又はヘパリンである。材料以下の方法セクションで言及されるキット及び材料のほか、以下の物質を使用した。オリゴヌクレオチドは、EurofinsMWGOperonエーバースベルク、ドイツから購入した。HerculaseポリメラーゼStratagene、ラホヤ、カリフォルニアをPCR増幅に使用した。細胞培養のための培地及びPBSは、Biochromベルリン、ドイツ製であった。化学物質はRothカールスルーエ、ドイツ及びSigma-Aldrichゼールツェ、ドイツ製であった。ウシコラーゲンIは、BDBiosciencesサンノゼ、カリフォルニアから購入した。ハイブリドーマ細胞系W6B3H10の軽鎖及び重鎖の可変配列の増幅及び同定mRNAは、製造者のプロトコールに従い、OligotexDirectmRNAキットQIAGEN、ヒルデン、ドイツを用いて、4×106及び1.4×107細胞のハイブリドーマ細胞系W6B3H10から単離した。18μl単離mRNAを、製造者のプロトコールに従い、SuperscriptIIIキットInvitrogen、カールスバッド、カリフォルニアを用いたcDNA合成に用いた。W6B3H10抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする配列を増幅するために、種々のプライマー組み合わせ、すなわち、カッパ軽鎖可変配列の増幅にはBi7/Bi5、Bi8/Bi5、Bi3/Bi4、ガンマ重鎖可変配列にはBi3d/Bi4をテストしたプライマーはDubelSら、1994年に記載されている。得られたバンドを、アガロースゲルから切除し、GFXゲルバンド精製キットGEHealthcare、ピスカタウェイ、ニュージャージーを用いて精製し、且つ軽鎖配列決定のためBi5seq5’GGGAAGATGGATCCAGTTG3’;配列番号7、Bi5fwd5’CCATGTCCATGTCACTTG3’;配列番号8,及びBi5rev5’GGTTTCTGTTGATACCAG3’;配列番号9を用いて配列決定した。重鎖配列は、配列決定プライマーBi4seq5’CAGGGGCCAGTGGATAGA3’;配列番号10、Bi4fwd5CTGACCTGATGAAGCCTG3’;配列番号11,及びBi4rev5’TTCACCCAGTGCACGTAG3’;配列番号12を用いて得た。一本鎖抗体並びに融合タンパク質の発現及び精製一本鎖抗体をコードするDNAコンストラクトは、遺伝子合成により作製し、哺乳動物発現ベクターpcDNA5-FRTInvitrogen、カールスバッド、カリフォルニアにクローニングしたGeneart、レーゲンスブルク、ドイツ。CHO細胞の一過性トランスフェクションは、製造者のプロトコールに従い、AttracteneQIAGEN、ヒルデン、ドイツ又はリポフェクトアミン2000トランスフェクション試薬Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニアのどちらかを用いて行った。コンストラクトscFv-hlで検出できた発現はなく、且つCHO細胞でのscFv-lhの発現は極めて乏しかったため、両方のコンストラクトのDNAを、Ncol/Xholを介して細菌発現ベクターpET22bMerck、ダルムシュタット、ドイツにサブクローニングした。配列を配列決定により制御し、且つ発現株BL21DE3Merck、ダルムシュタット、ドイツの大腸菌を、これらのDNAを用いて形質転換した。一本鎖抗体の発現は、0.2mMIPTGを用いて導入した。タンパク質の単離は、製造者のプロトコールに従い、Strep-Tactin親和性精製IBABioTagnology、ゲッティンゲン、ドイツを介して行った。pcDNA5-FRT中にscFv-lh-GPVI-FcIgG2をコードするDNAコンストラクトは、Geneartレーゲンスブルク、ドイツから注文した。安定に発現するCHO細胞系を、同封されたプロトコールに従い、リポフェクトアミン2000Invitrogen、カールスバッドカリフォルニアを用いて生成した。融合タンパク質をより大規模に作製するために、CHO細胞を、T500トリプルフラスコNUNC、ロチェスター、ニューヨークで培養した。融合タンパク質を単離するために、細胞上清を回収し、1mlHiTrapタンパク質GHPカラムGEHealthcare、ピスカタウェイ、ニュージャージーを用いて精製した。単離されたタンパク質をPBSに対してo/n透析した。細胞ELISAによるHEK293細胞で発現されたCD133抗原への一本鎖抗体の結合のテストポリ-L-リシン96ウェルプレートBDBiosciences、サンノゼ、カリフォルニアを、CD133発現細胞系AC133/293で以下の通りに被覆した。0.2mlの培地中、1×105細胞を各ウェルに添加し、37°C、5CO2でo/nインキュベートして細胞がプレートの表面に付着できるようにした。翌日、ウェルを0.2mlPBSで1回洗浄し、0.1ml2パラホルムアルデヒドPBS中、pH7.4で10~20分、RTで固定した。ウェルをPBS-TPBS0.1Tween-20で洗浄し、1×RotiBlock又はPBS-T中3乳のどちらかで1時間、RTでブロックした。PBS-Tで洗浄後、それぞれの抗体の連続希釈物をウェルに添加し、振とうしながらRTで少なくとも1時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄後、0.1mlのStrepMAb-Classic-HRPPBS-T中1:10000、IbaBioTagnology、ゲッティンゲン、ドイツ又は0.1mlの西洋ワサビペルオキシダーゼ連結抗マウスIgGPBS-T中1:10000、Dianova、ハンブルク、ドイツを添加し、振とうしながらRTで1時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄後、0.1mlの1-StepUltraTMB-ELISA基質ThermoScientific、ブラウンシュバイク、ドイツを添加し、十分な青色染色が現れるまでインキュベートした。反応を停止するために、0.1ml1MH2SO4を各ウェルに添加し、参照として450nm及び595nmでの吸光度を、インフィニットF200プレートリーダーTECAN、メンネドルフ、スイスで測定した。結合の特異性をテストするために、競合ELISAを300ng/ml2nMW6B3H10親mAb及び漸増量のコンペティタータンパク質を用いて行った。シグナルを抗マウスIgG-HRP抗体PBS-T中1:10000、Dianova、ハンブルク、ドイツを用いて検出した。固定化コラーゲンIによる結合ELISAImmulon2HB96ウェルプレートNUNC、ロチェスター、ニューヨークを、15mMNa2CO3、35mMNaHCO3、pH9.6中、0.1ml1μg/mlウシコラーゲンIで、o/n、4°Cで被覆した。ウェルをPBS-Tで洗浄し、PBS-T中、0.1ml1×RotiBlockRoth、カールスルーエ、ドイツで1時間ブロックし、融合タンパク質の3倍希釈液0.1mlを添加する前に再度洗浄した。振とうしながらRTで1時間インキュベートした後、ウェルをPBS-Tで洗浄した。ウェルを、0.1ml抗ヒトIgG-HRPDianova、ハンブルク、ドイツPBS-T中1:10000と共に、振とうしながらRTで1時間インキュベートした。プレートをPBS-Tで洗浄し、0.1ml1-StepUltraTMB-ELISAPIERCE、ロックフォード、イリノイと共にインキュベートした。青色染色が十分に現れた後、反応を、0.1ml1MH2SO4の添加により停止した。吸光度を、インフィニットF200プレートリーダーTECAN、メンネドルフ、スイスを用いて、参照波長として450nm及び595nmで測定した。EC50値を、4パラメーターロジスティックを用いてSigmaPlot11により計算した。せん断力下でのコラーゲンへのCD133発現細胞の接着ガラススライドを、Langerら2005年に従い、10μg/mlコラーゲンIで被覆し、フローチャンバーOligene、ベルリン、ドイツに挿入した。スライドのコラーゲン被覆表面を、10μg/mlの融合タンパク質で30分間前処理した。結合のCD133依存性を示すために、スライドを、W6B3H10mAbと共に同様にインキュベートした。AC133/293細胞を添加し、2000s-1のせん断力下でインキュベートした。実験はビデオ録画し、オフライン評価した。マウスにおける頸動脈結紮及び生体顕微鏡法によるEPC接着の評価CD133細胞は、記載されているようにBueltmannAら、2003年、ヒト臍帯血から単離した。invivoでのEPC動員に対する融合タンパク質の効果を評価するために、本発明者らは、記載されているようにMassbergら、2002年、生体蛍光顕微鏡法を使用した。実験前、EPCを5-カルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステルDCFで染色し、融合タンパク質20μg/ml/100nM又はGPVI-Fc15μg/ml/100nMと共に30分間インキュベートした。野生型C57BL/6JマウスCharlesRiverLaboratoriesを、ミダゾラム5mg/kg体重;Ratiopharm、メデトミジン0.5mg/kg体重;Pfizer、及びフェンタニル0.05mg/kg体重、CuraMed/PharamGmbHの溶液の腹腔内注射により麻酔した。ポリエチレンカテーテルPortexを右頸静脈に移植し、蛍光EPC5×104/250μlを静脈内注射した。総頸動脈を自由に切開し、5分間強くvigorously結紮して血管損傷を誘発した。血管損傷の前後で、蛍光EPCと損傷した血管壁との相互作用を、落射照明用の100-WHBO水銀ランプを備えたZeissAxiotech顕微鏡20×水浸対物レンズ、W20×/0.5;CarlZeissMicroImaging,Inc.を用いて、総頸動脈のinsitu、invivoビデオ顕微鏡法により可視化した。接着EPCの数は、15秒以内に内皮表面から動かない又は剥離しない細胞をカウントして評価した。この数は、細胞/mm2内皮表面として示される。NOD/Scidマウスでの心筋梗塞MyocardinfarctionモデルNOD/Scidマウスを上記のように麻酔した。管を人工呼吸のため気管に挿入した。開胸後、左冠動脈下行枝をフィラメントで45分間結紮した。結紮の開放により再灌流を促進した後、胸部及び気管の両方を縫合した。その直後及び48時間後に、融合タンパク質20μg/ml又は等モル量のFc対照タンパク質で30分間前処理した単離ヒトCD34前駆細胞を、尾静脈を通じて静脈内に適用した。別の対照群は、術後に前駆細胞を全く得なかった。分画面積変化fractionalareachangeFACを、介入後7及び28日目に心エコーにより決定して、左心室機能を評価した。この後、マウスを殺処分し、梗塞領域のサイズをエバンズブルー及びTTC染色により分析した。CDR移植によるマウス一本鎖抗体のヒト化マウス配列に由来する融合タンパク質の一本鎖部分は、CDR移植によるヒト化に供した。開始材料としての、一本鎖抗体の配列を内部に有する細菌発現ベクターpET22b-scFv-lhのほか、CD133発現HEK293細胞系AC133/293及びHEK293対照細胞を使用した。ヒト化手順に使用した方法を以下詳細に列挙する。ファージディスプレイライブラリーをパッキングするプロトコール1.ヘルパーファージを調製するヘルパーファージは、対数期TG1細菌細胞を、37°C、30分間、種々の希釈でヘルパーファージに感染させ、2TYプレートのトップアガーに播種して調製した。小さいプラークを、3mL液体2TY培地でTG1の30μL一晩培養物と共にインキュベートし、37°Cで2時間増殖させた。この培養物を1L2TY培地で希釈し、1時間増殖させた。カナマイシンを50μg/mLまで添加した後、培養物を37°Cで16時間増殖させた。細胞を遠心分離5000gで10分により取り除き、0.25volのファージ沈殿剤を添加してファージを上清から沈殿させた。氷上で30分インキュベーション後、ファージ粒子を5000gで10分間、遠心分離により回収し、この後5mLPBSにペレットを再懸濁し、0.22μmフィルターを通じて滅菌した。ヘルパーファージを、100μLTG1飽和培養物及びファージの希釈液を含有するトップアガー層を用いて2TYプレートでプラーク形成単位pfuの数を決定して滴定した。ファージストック溶液は、1×1013pfu/mLまで希釈し、-20°Cで、小アリコートで貯蔵した。2.オリジナルのライブラリーファージを調製するライブラリーファージは、500ml2TY-Gにライブラリーグリセロールストックを接種し、600nmの光学密度0.8~0.9まで250rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートして調製した。VCSM13ヘルパーファージを5×109pfu/mlの最終濃度まで培養物に添加し、培養物を振とうせずに37°Cで30分間、次いで200rpmでの静かな振とうにより30分間インキュベートしてファージを感染させた。細胞を2,200g、15分間遠心分離して回収し、ペレットを同じ容量の2TY-AKに再懸濁した。この培養物は、急速振とう300rpmにより30°Cで一晩インキュベートした。細胞を、4°C、15分間、7000gで遠心分離してペレット化し、ファージを含有する上清を、予冷した1Lボトルに回収した。0.3volのファージ沈殿剤を上清に添加し、混合し、氷上で1時間インキュベートしてファージを沈殿させた。ファージを、同じボトルで4°C、15分間、7000gで2回遠心分離してペレット化した。できるだけ多量の上清を回収し、ペレットを8mLPBSに再懸濁した。ファージは、10分間、12,000g、より小さい管で再遠心分離し、出現する可能性がある細菌ペレットを妨害することなく、ファージを上清を介して回収した。最後に、TG1細胞をファージストックの希釈液で感染させ、2TY-AGに播種し、インキュベートし、且つ出現するアンピシリン耐性コロニーの数を係数することにより、ファージストックを滴定した。ファージは、次いで4°Cで、アリコートで貯蔵した。パンニングファージディスプレイライブラリーのプロトコールマイクロタイターパンニングプレートのウェルを、37°Cで2時間インキュベートしてCD133発現AC133/293細胞から直接得たCD133組み込み膜製剤で被覆し、4°C、一晩、ブロッキング緩衝液2乳を含有するPBSでブロックした。ブロックしたウェルを、0.1PBST0.1~0.3Tween20V/Vを含むPBSで6回洗浄し、0.5mLの合計容量中、等容量のファージライブラリーの混合物及び4PBSMを対照ウェルに添加した[プレブロックした]。初回のスクリーニング中、ファージ粒子の数は、ライブラリーサイズより少なくとも100×高くなるべきである例えば、1010クローンのライブラリーに対して1012cfu。初回後、多様性は106に低下し、故にスクリーニングのこの後の回にこのような要件は無い。プレートを、室温で30分間インキュベートして結合部位をブロックした。インプットファージミックスを、パンニングpanningウェル[標的タンパク質で被覆した]に添加し、室温で60分間インキュベートし、PBSMT2乳を含有するPBSで10~20回洗浄した。ファージを、200μL酸性溶出緩衝液と共に室温で5分間インキュベートして溶出した。ファージを含有する上清を新たな管に移し、Tris-HCl緩衝液で中和した。大腸菌TG1の新鮮な指数関数的に増殖する培養物を、溶出したファージに感染させ、これらの半分を選択のさらなる回のため増幅させた。残りの溶出液は4°Cで貯蔵した。品質管理qualitycontrolファージFACSのプロトコールAC133/293細胞を、5microMEDTA10マイクロリットルの0.5Mストックを含有する1mlPBSに回収し、直ちに混合して凝固を回避し、氷上で維持した。細胞を、FACS緩衝液1BSA又は5FBSのどちらかが補充された、0.05NaN3を含有するPBSで2~3×洗浄し、最終洗浄からの細胞ペレットを、50マイクロリットルFACS緩衝液に懸濁した。10マイクロリットルのファージ溶液を、50マイクロリットルの細胞懸濁液に添加し、静かに混合し、氷上で30分間インキュベートした。細胞を、FACS緩衝液で2~3×洗浄し、50マイクロリットルFACS緩衝液に懸濁した。10マイクロリットルの抗体[ウサギ抗M13pAb-FITC]溶液を50マイクロリットルの細胞懸濁液に添加し、静かに混合し、氷上で30分間インキュベートした。細胞を、FACS緩衝液で2~3×洗浄し、分析のため200~300マイクロリットルFACS緩衝液に懸濁した。ファージFACS方法及びGraphpadPrism4.0ソフトウェアによる親和性測定のプロトコール対象のファージディスプレイscFvは、アッセイ前に同じ力価に標準化し、種々の力価に希釈し、上記のようにアッセイした。ファージFACSのアウトプットは、GraphPadPrism4.0ソフトウェアのユーザーマニュアルに例示されているように、段階的に対象のscFvの親和性を計算するために使用した。ヒト化融合タンパク質の発現及び精製ヒト化一本鎖抗体クローン26の配列情報を受け取った後、ヒト化融合タンパク質の配列をinsilicoでアセンブルし、合成し、哺乳動物発現ベクターpcDNA5-FRTInvitrogen、カールスバッド、カリフォルニアにクローニングしたGeneart、レーゲンスブルク、ドイツ。安定な細胞系を、前述したプロトコールに従い生成し、融合タンパク質が、発現され、CHO細胞の上清に分泌され、1mlHiTrapタンパク質GHPカラムGEHealthcare、ピスカタウェイ、ニュージャージーを用いて精製された。単離されたタンパク質をPBSに対してo/n透析した。細胞ELISAによるHEK293細胞で発現されたCD133抗原へのヒト化融合タンパク質の結合のテストポリ-L-リシン96ウェルプレートを、1ウェル当たり6~7×104AC133/293細胞のみで被覆したことを除く、上記のような方法。左総頸動脈の結紮後の血小板凝集を決定するための生体顕微鏡法生体顕微鏡実験のため、オスC57BI/6Jマウスを使用した。血小板リッチ血漿は、タイロード緩衝液、pH6.5で2mlに調整していたドナーマウスの1mlクエン酸血から、10分間、120×gでの遠心分離により調製した。血小板を含有する上清を分離し、血小板を、20μl5-カルボキシ-フルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステルInvitrogenの添加、及び暗所で、RTで5分間のインキュベーションにより蛍光標識した。容量をタイロード、pH6.5で4mlまで満たし、血小板を12分間、900×gでの遠心分離により沈降させた。血小板を250μlのタイロード、pH6.5、及びタイロード、pH7.4にそれぞれ再懸濁し、アリコートをカウントし、血小板数を2.8×1010/mlに調整した。実験マウス24±2gを、メデトミジン0.5mg/kg体重;Pfizer、ミダゾラム5mg/kg体重;Roche、及びフェンタニル0.05mg/kg体重、Janssen-Cilagの溶液の腹腔内注射により麻酔した。術中の体温は、恒温ブランケットシステムHarvardApparatusを用いて38.5°Cで一定に維持した。ポリエチレンカテーテルPortexを左尾静脈に移植し、左総頸動脈の切開後、250μl7×109標識血小板を尾静脈に静脈内注射した。この後、1mg/kg体重のヒト化融合タンパク質、又は等モル量のFcIgG2対照タンパク質を静脈内に適用した。左総頸動脈を、フィラメント7-0Prolene、Ethiconで5分間強く結紮して血管損傷を誘発した。結紮の領域は、結紮後種々の時間間隔で、落射照明用の100WHBO水銀ランプを備えた蛍光顕微鏡Axioskop2FSmot、CarlZeiss及びs/w-CCDカメラBC71HornImagingを用いてモニターした。血小板凝集は、PhotoshopCS5ソフトウェア血小板凝集により生じたより高い光強度を有する領域のサイズがピクセルで測定され、次いで規定のグリッドを用いてμm2に移されるによる3つの固定画像の平均の分析により決定した。結果及び考察モノクローナル抗体W6B3H10をコードする可変配列の同定及びコンストラクト設計各プライマー組み合わせを有する生成物をもたらしたPCR増幅後、バンドをゲルから切除し、精製し、配列決定した。各々3つの異なるプライマーを有する、配列決定から得られた配列をアセンブルし図1、NCBIのIGBIasthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/を用いてIgGデータベースと比較した。2つの可能性のある配向軽-重又は重-軽での一本鎖抗体scFvの配列を確立するために、各々リーダー配列をデータベースV-Basehttp://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk参照からランダムに選択して、哺乳動物細胞培養物の培地への抗体の分泌を促進した。重鎖及び軽鎖の配列は、GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer配列番号13をコードするGly-Serリンカーにより連結した。親和性精製による一本鎖抗体の単離を可能にするために、StrepTagIIをコードする配列をC末端に付加した。scFv-lh及びscFv-hlと名付けられたコンストラクトの確立配列を、図2に示す。一本鎖抗体の発現及びCD133への結合のテスト一本鎖コンストラクトによるCHO細胞の一過性トランスフェクション後、弱い発現をscFv-lhで検出することができた図3参照。大規模トランスフェクション後、細胞ELISAでCD133への結合をテストするのに十分なタンパク質を単離することができた。同時に、タンパク質は、十分なストック作製のため大腸菌でも発現させた。CHO細胞で発現させることができなかったScFv-hlは、大腸菌からのみ作製及び精製した図4参照。一本鎖抗体がこれらの抗原CD133を認識するかテストするために、一本鎖抗体の3倍希釈系列を、表面でCD133抗原を発現している固定されたAC133/293細胞でインキュベートした。低ナノモル範囲で高い親和性でのscFv-lhの明らかな結合があったのに対し、驚くべきことに、CD133に対するscFv-hlの親和性図5A参照は検出されなかった。大腸菌から精製したscFv-lhが、哺乳動物細胞培養物から単離したものと同じ結合特性を示したため、この所見は、異なる発現系によるものではなかった。CD133とのscFv-lhの相互作用の特異性をテストするため、固定されたAC133/293細胞におけるCD133への2nMのW6B3H10mAbの結合を、漸増量の一本鎖抗体と競合させた。これは、scFv-lhが、3.1nMのIC50値で、抗原CD133へのモノクローナル抗体の結合を効率的にブロックできることを明らかに実証した図5B。この予想外に高い親和性は、より大きいmAbよりもscFv-lhに対して固定化CD133を近づけさせる、はるかに小さいサイズの分子に起因している可能性がある。融合タンパク質の設計、発現及び特徴付け融合タンパク質の成分としてscFv-lhを同定した後、GPVI-FcIgG2を二官能性タンパク質の第2の部分として選択した。GPVIがコラーゲンへの結合を媒介するはずである一方、IgG2のヒトFc部分は、一方で親和性精製を促進するため、他方でより一般的に使用されるFcIgG1に関連した望ましくないエフェクター機能を回避するために選択した。したがって、融合タンパク質は、一本鎖抗体成分scFv-lhの後に可溶性糖タンパク質VI及びFcIgG2が続き、より柔軟性を持たせるため3つのアミノ酸GGRリンカーにより分離されるように設計した図6。融合タンパク質は、T500トリプルフラスコで安定にトランスフェクトしたCHO細胞の接着培養で発現させた。上清は、タンパク質G親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。融合タンパク質の典型的な収量は、2~2.7mg/lの範囲にあった。タンパク質の同一性及び純度は、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結した抗ヒトIgG抗体を用いるウェスタンブロットデータ不図示、及びクーマシーブリリアントブルー染色ポリアクリルアミドゲル図7により制御した.還元条件下の融合タンパク質の分離は、約90kDのバンドサイズをもたらした。非還元条件下の分子量は、約180kDであり、タンパク質が二量体として存在することを明らかに示した。79.1kDの単量体タンパク質の理論的分子量は、タンパク質が、最も好ましくはグリコシル化により、翻訳後修飾されなければならないことを示している。血小板糖タンパク質VIについて、唯一のN連結グリコシル化部位は、アミノ酸92に記載されているKunickiら、2005年。一本鎖抗体部分がN連結グリコシル化のコンセンサス配列を持たないのに対し、IgG2のFc部分も1つのN連結グリコシル化部位を内部に有する。これら2つのグリコシル化部位は、観察されたサイズ差を説明するのに十分でないため、融合タンパク質は、さらなるO連結グリコシル化部位を含有している可能性がある。CD133及びコラーゲンへの融合タンパク質の結合特性CD133への融合タンパク質及びW6B3H10mAbの結合を、ELISAにより固定されたAC133/293細胞と比較した図8A。観察された、融合タンパク質のEC50値0.21nM及びW6B3H10mAbのEC50値0.12nMは、同じ桁であった。故に抗原CD133への融合タンパク質の結合特性は、一本鎖抗体と比べて改善した。これは、完全長抗体で見出される状態に類似した2つの同一抗原結合部位をもたらす、融合タンパク質の二量体化により部分的に説明され得るのみである。一本鎖ポリペプチドに続くGPVI-FcIgG2ポリペプチドは、一本鎖抗体部分の三次元構造に対するいくらかの安定効果を有している可能性があり、抗原結合に有益であると思われる。結合の特異性を確認するため、競合ELISAを、2nMW6B3H10mAb及び漸増量の融合タンパク質で行った。固定されたAC133/293細胞へのmAbの結合の効率的な抑制は、結合がCD133に媒介されることを裏付けている図8B参照。第2の結合パートナー、コラーゲンIへの融合タンパク質の結合も示された。固定化コラーゲンIを用いたELISAでは、融合タンパク質の結合をGPVI-FcIgG1の結合と比較した。両方について用量依存結合を観察することができたが、驚くべきことに、結合親和性は異なっていた図9A。コラーゲンへの融合タンパク質の結合の特異性を、可溶性コラーゲンIを用いた競合ELISAにより確認した図9B。動的条件下の融合タンパク質の二重特異性結合前の実験では、各結合パートナーへの融合タンパク質の結合は別々に実証した。両方の標的タンパク質への同時結合による分子の二官能性を確認するために、ガラススライドを10μg/mlコラーゲンIで被覆し、フローチャンバーに挿入し、10μg/mlの融合タンパク質と共にプレインキュベートし、且つヒト血流に見られる条件を模した2000/sのせん断力下でCD133発現AC133/293細胞と共にインキュベートした。この実験は、融合タンパク質が、せん断力下でさえコラーゲンへのCD133発現細胞の結合を極めて効率的に媒介することを実証する。結合は、親W6B3H10mAbの添加により逆転することができた。これは、コラーゲン表面でのAC133/293細胞の固定化がCD133依存性であることを示している図10。損傷血管へのEPCのinvivoでの結合CD133発現EPCが効率的に動員され得、且つ損傷血管の壁に付着され得るかをテストするために、EPCをヒト臍帯血から単離し、蛍光標識し、融合タンパク質又は対照タンパク質GPVI-Fcのどちらかと共にプレインキュベートし、次いで麻酔したマウスの頸静脈に静脈内適用した。頸動脈の血管壁の損傷後、付着したEPCの数を漸増時間間隔でカウントした。融合タンパク質は、対照タンパク質と比べて、付着したEPCの数を有意に増加させたことが明らかに示され、最多数の細胞は損傷の5分後であったが、60分後も依然として有意な数の細胞であった図11。対照タンパク質とのEPCプレインキュベーションも、相当量の接着EPCをもたらすという観察は、EPCが血管損傷の部位に接着する血小板により媒介されるという確立された所見により説明することができるAbou-Salehら、2009年。融合タンパク質とのプレインキュベーションは、循環EPCの数が低く且つ同種EPC移植又はexvivo増殖自家EPC移植のどちらかにより治療され得る、冠状動脈疾患のリスク因子を有する患者において特に有益であり得る。NOD/Scidマウスにおける心筋梗塞モデルでの左心室機能及び梗塞領域に対する融合タンパク質の影響梗塞は、左下行冠状動脈の結紮によりNOD/Scidマウスで誘発した。左心室の機能及び梗塞領域のサイズの両方に対する、20μg/mlの融合タンパク質で前処理したCD34前駆細胞の適用の効果を、心エコー及び殺処分後の心臓の染色により分析した。左心室機能に対する効果は、手術7日後では観察することができなかったのに対し、28日目での有意差は、前駆細胞で治療していない動物及びFc対照とインキュベートした前駆細胞で治療した動物と比べて明らかであった図12A参照。融合タンパク質治療は、図12Bに示されているように梗塞領域のサイズの有意な減少ももたらした。観察されたプラスの効果の根底にある機構は、これまで確認されていない。多くの動物試験は、心筋修復のために移植された幹細胞のほんの一部のみが、心筋細胞又は血管細胞に分化したことを示しているが、観察された心臓の改善は、栄養サポートによって、又は前駆細胞により分泌され、且つ隣接細胞に有益な効果を与え得若しくは常在心臓幹細胞を活性化し得るパラクリン因子によって生じる可能性があると考えられているGrecoLaughln、2010年。ヒト化sc抗体を発現するファージの特徴付けCDR配列がヒトサブグループコンセンサスH-Subl-κ及びH-Subl-VHアクセプターフレームワーク配列に移されるCDR移植による抗体ヒト化の手順は、膜結合CD133に著しい親和性を有する3つのファージクローン26、27、29の同定をもたらした。ファージ希釈系列のFACS測定は、クローン26については平均蛍光指数32.19pM、並びにクローン27及び29については50.78pM及び102.9pMのKDをそれぞれ示した図13A、13B。比較すると、オリジナルのマウス一本鎖抗体を内部に有するファージは、2つの独立した実験において25.63及び26.93pMのKDを示した。マウスドナー及びヒトアクセプター配列と比較した、オンラインツールhttp://www.bioinf.org.uk/abs/shab/を用いたクローン26のVL及びVH配列のヒトらしさの評価は、ヒトアクセプター配列の値の方へのZスコアの移行を示し図14参照、ヒト化配列のよりヒト様の特性を裏付けている。これは、マウス又はヒトアクセプター配列を有するヒト化一本鎖抗体のタンパク質配列の比較によっても実証することができる図15参照。ヒト化抗体は、76の配列同一性を示し、違いは異なる相補性決定領域が主な原因であるのに対し、マウス一本鎖抗体は、ヒトアクセプター配列と比べてアミノ酸配列で59同一であるのみである。両方のアラインメントにおいて、連結リンカーペプチド配列は除外した。ヒト化融合タンパク質のヌクレオチド配列と、マウス由来一本鎖部分を有する親分子のアミノ酸配列とのアラインメントは、95の配列同一性をもたらした図16参照。ヒト化融合タンパク質の生成及びこの発現及び特徴付けマウス一本鎖配列と比べて同じ桁であった、膜結合CD133に最も高い親和性を示すヒト化一本鎖抗体の配列クローン26を、ヒト化融合タンパク質hscFv-lh-GPVI-Fcを確立するのに選択した図16参照。タンパク質のバッチを、安定にトランスフェクトしたCHO細胞系により作製し、タンパク質G親和性クロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。タンパク質の同一性は、融合タンパク質のFcフラグメントに結合する抗ヒトIgG抗体を用いてウェスタンブロットにより確認した。純度は、クーマシーブリリアントブルー色素で染色したポリアクリルアミドゲルにおいて制御した。還元及び非還元条件の両方で、ヒト化融合タンパク質は、マウス一本鎖部分を有する融合タンパク質と同じ泳動挙動を示した図18参照。したがって、ヒト化の過程は、分子のグリコシル化パターン又は二量体化のように、翻訳後修飾に関して融合タンパク質を改変しなかったことが最も考えられる。CD133抗原及びコラーゲンへのヒト化融合タンパク質の結合のテスト固定された細胞を用いた細胞ELISAによる、安定な細胞系AC133/293での膜貫通タンパク質CD133へのヒト化融合タンパク質の結合を、親融合タンパク質の結合と比較した図19。シグマプロット11.0により計算した両方の分子のEC50は、0.25~0.3nMの同じ範囲にあった。2nMW6B3H10mAb及びコンペティターとしての融合タンパク質を用いた競合ELISAは、結合の特異性を裏付け、且つヒト化及びマウス融合タンパク質について、それぞれ2.7及び3.1nMのIC50値を示した。融合タンパク質のヒト化は、コラーゲンIに対するGPVI部分の結合特性を改変しなかったはずである。この仮定を証明するために、固定化ウシコラーゲンIを用いてELISAにより結合を測定した。ヒト化及び親融合タンパク質について、それぞれ4.7及び6.3nMのEC50値により、両方のタンパク質の用量依存結合が示され得た図20参照。マウスモデルにおける総頸動脈の損傷後の血小板凝集に対するヒト化融合タンパク質のinvivo効果ヒト化融合タンパク質が総頸動脈の損傷後の血小板凝集に対し何らかの影響を与えるかをテストするために、ドナーマウスの蛍光標識血小板を静脈内投与し、この後、1mg/kgのヒト化融合タンパク質又は等モル量のFc対照タンパク質を注入し、血管を直ちに結紮した。結紮後60分までに形成された血小板凝集のサイズの決定は、ヒト化融合タンパク質で治療した群と対照群との間の高い有意差を示しp<0.005、スチューデントt検定図23参照、invivoでのコラーゲン結合をめぐって血小板結合GPVIと競合するヒト化融合タンパク質の能力を裏付けた。これは、同様に血小板活性化及び凝集体形成の減少をもたらした。参考文献Abou-SalehH、YacoubD、TheoretJF、GillisMA、NeagoePE、LabartheB、TherouxP、SiroisMG、TabrizianM、ThorinE、MerhiY、内皮前駆細胞は血小板に結合し血小板機能及び血栓形成を抑制するEndothelialprogenitorcellsbindandinhibitplateletfunctionandthrombusformation、Circulation1202009年、2230~2239頁BueltmannA、GawazM、MunchG、UngererM、MassbergS、糖タンパク質VIドメインを含むイムノアドヘシンImmunoadhesincomprisingaglycoproteinVIdomain、WO031042822003年DubelS、BreitlingF、FuchsP、ZeweM、GotterS、WelschofM、MoldenhauerG、LittleMJ、プライマーの単純セットによるポリメラーゼ連鎖反応を用いた様々なマウス及びラットハイブリドーマ細胞系からのIgG抗体Fv-DNAの単離IsolationofIgGantibodyFvDNAfromvariousmouseandrathybridomacelllinesusingthepolymerasechainreactionwithasimplesetofprimers。ImmunolMethods1751994年、89~95頁。GrecoN及びLaughlnMJ、心筋修復及び再生のための臍帯血幹細胞Umbilicalcordbloodstemcellsformyocardialrepairandregeneration。MethodsMolBiol.6602010年29~52頁。KunickiTJ、CheliY、MoroiM、FurihataK、血小板糖タンパク質VIの機能に対するN連結グリコシル化の影響TheinfluenceofNlinkedglycosylationonthefunctionofplateletglycoproteinVI、Blood1062005年、2744~2749頁LangerH、MayAE、BultmannA、GawazM、ADAM15は血小板GPIIb-IIIaの接着受容体であり血小板活性化を誘導するADAM15isanadhesionreceptorforplateletGPIIblllaandinducesplateletactivation、ThrombHaemost.94、2005年、555~61頁MassbergS、BrandK、GrunerS、PageS、MullerE、MullerI、BergmeierW、RichterT、LorenzM、KonradI、NieswandtB、GawazM、アテローム性動脈硬化病変形成の開始における血小板接着の重要な役割Acriticalroleofplateletadhesionintheinitiationofatheroscleroticlesionformation、J.Exp.Med.1962002年、887~896頁MoroiM及びJungSM、血小板糖タンパク質VI:その構造及び機能PlateletglycoproteinVI:itsstructureandfunction、ThrombRes.114、2004年、221~33頁。"