"サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施するための方法であって、a-0.01から10mm2からなる断面および体積V1を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、-流路と流体連通している検出チャンバーであって、光学的に透明な固体支持体および前記透明な固体支持体の表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を4つ超含むマイクロアレイを有し、高さ1mm未満および体積V2を有し、比率V2/V1は0.001から0.5の間にある検出チャンバー、-温度が調節されている少なくとも2つ、好ましくは3つの異なる温度領域であって、各温度領域は流路の異なる位置に位置しており、1つの温度領域は検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域を含むフローチップデバイスを用意するステップ、b体積がV3であり標的ポリヌクレオチド分子を含有する溶液およびポリヌクレオチド分子増幅用の試薬を流路に導入するステップであって、比率V3/V1V2は0.02より大きく1未満であるステップ、c溶液を少なくとも5回の増幅サイクルに供して標識された標的ポリヌクレオチド分子を得るステップであって、1回の増幅サイクルは流路および異なる温度領域の間にある同じ検出チャンバーを通して溶液を循環させることによって得られ、増幅サイクルは3分未満で実施されるステップ、d光線によって蛍光色素を励起した後に測定される標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光を検出することによって、少なくとも3回、好ましくは少なくとも5回の異なる増幅サイクルにおいて、増幅の異なるタイミングにハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するステップ、e限局部位から得たシグナル値を分析して、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子を検出および/または定量するステップを含む方法。増幅サイクルが2分未満、好ましくは1分未満に実施される、請求項1に記載の方法。検出チャンバーが楕円形、卵形、菱形、六角形、八角形、ダイヤモンド形から選択される形状を有する、請求項1から2のいずれか一項に記載の方法。体積V1V2V3が気相および液相である2つの相を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。比率V2/V1が0.01から0.1の間にある、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。比率V3/V1V2が0.5超、好ましくは0.75超、さらには0.9超であり1未満である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。蛍光シグナルを測定するための増幅の異なるタイミングが増幅サイクルに対応している、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。増幅サイクルがフローチップセンサーのデータ分析によって決定される、請求項7に記載の方法。増幅サイクルがフローチップデバイスの特徴であるV1V2および流速から算出される、請求項7に記載の方法。増幅が変性、アニーリングおよび伸長ステップを含むPCRによって得られる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。蛍光色素標識された増幅前駆体を組み込むことにより、標識された標的ポリヌクレオチド分子が蛍光標識される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光の検出が、固定化された捕捉分子を有する光学的に透明な固体支持体を通して禁制角度内にある観察角でアッセイされる、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。捕捉分子が、好ましくは少なくとも20ヌクレオチド、および好ましくは40ヌクレオチド超の長さの配列である少なくとも6.8nmの長さのスペーサーを有する、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。マイクロアレイが、サイクル1と比較して増幅サイクル35においてその蛍光を50超、好ましくは80超、さらに良くは90超保っている蛍光標識された捕捉分子を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルの測定が気相で実施される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子の蛍光シグナルの測定が、標識された標的ポリヌクレオチド分子を含有する増幅溶液の存在下で実施される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。検出チャンバーの検出部分の液体の高さが、好ましくは10から250μm、好ましくは50から150μmを含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。流路および/または検出チャンバー内の増幅溶液の位置が流路内の液相位置を時間制御することによってわかる、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。液相の位置が、流路の少なくとも1つの位置において気相/液相変化から得られるシグナルの測定からわかり、前記測定が温度シフト、蛍光シグナル変化、電気シグナル、発光または光吸収変化によって得られる、請求項18に記載の方法。累積スポット値が増幅サイクルと共にプロットされて、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子が検出および/または定量化される、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の定量化が、固定値CTに到達するのに必要な増幅サイクル数を参照ポリヌクレオチド分子のCTと比較することによって得られる、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。シグナル値の分析が、増幅前または最初の10増幅サイクルのうちの1サイクルで撮影された画像の画素値によって補正された画素値を有するマイクロアレイ画像で実施される、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。追跡リアルタイムPCRサイクル用マイクロ流体デバイス内の相変化のアッセイ方法であって、a-0.01から10mm2からなる断面および体積V1を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、-流路と流体連通している検出チャンバーであって、光学的に透明な固体支持体の表面の限局部位に固定化されている少なくとも1つの捕捉分子を含む前記透明な固体支持体を有し、高さ1mm未満および体積V2を有する検出チャンバー、-温度が調節されている少なくとも2つ、好ましくは3つの異なる温度領域であって、各温度領域が流路の異なる位置に位置しており、1つの温度領域が検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域を含むフローチップデバイスを用意するステップ、b液体/空気および/または空気/液体の相変化を検出するためのフローチップセンサー、c体積がV3であり標的ポリヌクレオチド分子を含有する溶液およびポリヌクレオチド分子増幅用の試薬を流路に導入するステップであって、比率V3/V1V2が0.02より大きく1未満であるステップ、d溶液を少なくとも5回の増幅サイクルに供して標識された標的ポリヌクレオチド分子を得るステップであって、1回の増幅サイクルは流路および異なる温度領域の間にある同じ検出チャンバーを通して溶液を循環させることによって得られ、増幅サイクルは3分未満で実施されるステップ、eフローチップセンサーのデータを分析することによって増幅サイクルを決定するステップ、f光線によって蛍光色素を励起した後に測定される標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光を検出することによって、少なくとも3回、好ましくは少なくとも5回の異なる増幅サイクルにおいて、増幅の異なるサイクルにハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するステップ、g増幅サイクルを通じて限局部位から得たシグナル値を分析して、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子を検出および/または定量するステップを含むアッセイ方法。サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施するためのフローチップデバイスであって、-基体内に配置された流路であって、0.01から10mm2からなる断面および体積V1を有し、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、-流路に接続された検出チャンバーであって、その表面の1つに、前記表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を4つ超含むマイクロアレイを固定しており、高さ1mm未満および体積V2を有し、比率V2/V1は0.001から0.5の間にある検出チャンバー、-温度が調節されている少なくとも2つ、好ましくは3つの異なる温度領域であって、各温度領域は流路の異なる位置に位置しており、1つの温度領域は検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域、-流路と流体連通している入口であって、これを通って溶液が流路に導入される入口を含み、捕捉分子は屈折率1.3超、厚さ少なくとも0.5mm、好ましくは少なくとも3mmを有する光学的に透明な固体支持体の表面S1上に固定化されており、前記固体支持体は、上に捕捉分子が固定化されている支持体の表面に対して傾斜している2つの表面S2およびS3を有しており、一方の表面S2は光学的に透明であり捕捉分子の限局部位から放射される光を集光するために使用され、固体支持体表面と対比して90から60°の間の角度まで傾斜しており、向かい合っている他方の表面S3は黒色であるまたは黒色になる色で覆われているもしくは放射光の波長に対応する吸収を有する色で覆われているフローチップデバイス。基体が不透明なポリマーを含む、請求項24に記載のフローチップ。サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施するための装置であって、a-0.01から10mm2からなる断面および体積V1を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように流路が構成されている流路、-流路に接続された検出チャンバーであって、その表面の1つに、前記表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を4つ超含むマイクロアレイを固定しており、高さ1mm未満および体積V2を有し、比率V2/V1は0.001から0.5の間にある検出チャンバー、-温度が調節されている少なくとも2つ、好ましくは3つの異なる温度領域であって、各温度領域は流路の異なる位置に位置しており、1つの温度領域は検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域を含むフローチップデバイス、bフローチップデバイス用ホルダ、c少なくとも2つの異なる温度領域の前の加熱システム、d少なくとも2つの異なる温度領域内の温度を調節するために配置された温度制御装置、e場合によってフローチップセンサー、f照射光源、g流路を通して流体を輸送するために作動的に配置されたシステム、hハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するための検出器であって、限局部位の発光表面が約0.1mm2から約75mm2からなり、標的ポリヌクレオチド分子がハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光の検出は、固定化された捕捉分子を有する光学的に透明な固体支持体を通して禁制角度内にある観察角でアッセイされる検出器を含み、異なる部品が同じ装置へと集積化され、フローチップデバイスの位置が検出器と比較して固定されている装置。請求項26に記載の装置であって、捕捉分子が屈折率1.30超、厚さ少なくとも0.5mm、好ましくは少なくとも3mmを有する光学的に透明な固体支持体の表面上に固定化されており、前記固体支持体が、上に捕捉分子が固定化されている支持体の表面S1に対して傾斜している2つの表面S2およびS3を有しており、一方の表面S2は光学的に透明であり捕捉分子の限局部位から放射される光を禁制角度θobinで集光するために使用され、固体支持体表面と対比して90から60°の間の角度まで傾斜しており、向かい合っている他方の表面S3は黒色であるまたは黒色になる色で覆われているまたは放射光の波長に対応する吸収を有する色で覆われており、デバイスが装置上に置かれて、禁制角度θobinで放射される光が傾斜表面S2を通して検出器に達している、装置。フローチップセンサーが熱検出器、蛍光検出器または光吸収検出器である、請求項26から27のいずれか一項に記載の装置。請求項26から28のいずれか一項に記載の装置であって、-異なる測定のデータを格納するための記憶装置、-照射、検出および記憶のステップを繰り返す制御装置、-フローチップデバイス内の液体の位置を決定するフローチップセンサーのデータ分析、-データを処理して、増幅の前に溶液中に存在しているポリヌクレオチド分子の量を検出および/または定量化するためのプログラムをさらに含む、装置。発明の要旨本方法は、増幅に必要な異なる温度を通過する循環フローチップ溶液中での増幅および特異的捕捉分子からなるマイクロアレイ上でのリアルタイムな検出によって、可能性がある他の標的に混じって生体試料中に存在する少なくとも1つのポリヌクレオチド標的化合物を同定および/または定量化するための方法に関する。請求項1に詳述したように、本発明はサンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施する方法であって、a-0.01から10mm2からなる断面および体積V1を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、-流路と流体連通している検出チャンバーであって、光学的に透明な固体支持体および前記透明な固体支持体の表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を4つ超含むマイクロアレイを有し、高さ1mm未満および体積V2を有し、比率V2/V1が0.001から0.5の間にある検出チャンバー、-温度が調節されている少なくとも2つ、好ましくは3つの異なる温度領域であって、各温度領域が流路の異なる位置に位置しており、1つの温度領域が検出チャンバーを含み標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域を含むフローチップデバイスを用意するステップ、b体積がV3であり標的ポリヌクレオチド分子を含有する溶液およびポリヌクレオチド分子増幅用の試薬を流路に導入するステップであって、比率V3/V1V2が0.02より大きく1未満であるステップ、c溶液を少なくとも5回の増幅サイクルに供して標識された標的ポリヌクレオチド分子を得るステップであって、1回の増幅サイクルは流路および異なる温度領域の間にある同じ検出チャンバーを通して溶液を循環させることによって得られ、増幅サイクルが3分未満で実施されるステップ、d光線によって蛍光色素を励起した後に測定される標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光を検出することによって、少なくとも3回、好ましくは少なくとも5回の異なる増幅サイクルにおいて、増幅の異なるタイミングにハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するステップ、e限局部位から得たシグナル値を分析して、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子を検出および/または定量するステップを含む方法に関する。本発明は、そのような方法を実施するためのデバイスにも関する。本デバイスは、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施するためのフローチップデバイスであって、-基体内に配置された流路であって、0.01から10mm2からなる断面および体積V1を有し、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、-流路に接続された検出チャンバーであって、その表面の1つに、前記表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を4つ超含むマイクロアレイを固定しており、高さ1mm未満および体積V2を有し、比率V2/V1が0.001から0.5の間にある検出チャンバー、-温度が調節されている少なくとも2つ、好ましくは3つの異なる温度領域であって、各温度領域が流路の異なる位置に位置しており、1つの温度領域が検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域、-流路と流体連通している入口であって、これを通って溶液が流路に導入される入口を含み、捕捉分子が屈折率1.3超、厚さ少なくとも0.5mm、好ましくは少なくとも3mmを有する光学的に透明な固体支持体の表面S1上に固定化されており、前記固体支持体は、上に捕捉分子が固定化されている支持体の表面に対して傾斜している2つの表面S2およびS3を有しており、一方の表面S2は光学的に透明であり捕捉分子の限局部位から放射される光を集光するために使用され、固体支持体表面と対比して90から60°の間の角度まで傾斜しており、向かい合っている他方の表面S3は黒色であるまたは黒色になる色で覆われているまたは放射光の波長に対応する吸収を有する色で覆われているフローチップデバイスである。本発明は、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のリアルタイム増幅および検出を実施するための装置であって、a-0.01から10mm2からなる断面および体積V1を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように流路が構成されている流路、-流路に接続された検出チャンバーであって、その表面の1つに、前記検出チャンバーの表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を4つ超含むマイクロアレイを固定しており、高さ1mm未満および体積V2を有し、比率V2/V1が0.001から0.5の間にある検出チャンバー、-温度が調節されている少なくとも2つ、好ましくは3つの異なる温度領域であって、各温度領域が流路に対応した異なる位置に位置しており、1つの温度領域が検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域を含むフローチップデバイス、bフローチップデバイス用ホルダ、c少なくとも2つの異なる温度領域の前の加熱システム、d少なくとも2つの異なる温度領域内の温度を調節するために配置された温度制御装置、e場合によってフローチップセンサー、f照射光源、g流路を通して流体を輸送するために作動的に配置されたシステム、hハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するための検出器であって、限局部位の発光表面が約0.1mm2から約75mm2からなり、標的ポリヌクレオチド分子がハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光の検出が、固定化された捕捉分子を有する光学的に透明な固体支持体を通して禁制角度内にある観察角でアッセイされる検出器を含み、異なる部品が同じ装置へと集積化され、フローチップデバイスの位置が検出器と比較して固定されている装置も保護する。以下は、ほんの一例として図を参照して与えられる本発明の様々な実施形態の説明である。図は、正確に描画されたものではなく、単に例示的な目的を意図するだけである。定義定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される用語と同じ意味を有する。用語ヌクレオチド配列、マイクロアレイ、標的および捕捉ヌクレオチド配列、実質的な結合、特異的にハイブリダイズする、バックグラウンド、定量化するは、WO97/27317に記載の通りであり、その特許は参照により本明細書に組み込まれる。用語ヌクレオチド三リン酸、ヌクレオチド、プライマー配列は欧州特許出願EP1096024に記載されているものであり、参照により本明細書に組み込まれる。用語遺伝子は、遺伝の基本的な物理的および機能的単位を意味し、世代から世代へと情報を伝える特異的な機能産物をコードしている染色体上の特異部位に位置するDNA断片である。DNA断片は、転写される領域コードDNAの前後領域およびエクソン間のイントロンおよび転写を可能にする調節配列から構成される。用語座位は、遺伝子配列上の単一ヌクレオチド多型SNPの位置を意味する。相同配列は、対応する位置で、純粋にランダムな整列より高い同一ヌクレオチドのパーセンテージを有するヌクレオチド配列を意味する。比較しようとする2つの配列の一方における付加または欠失ギャップなどを考慮して配列が最適に整列された後に、全ヌクレオチドと比較して位置毎に見つかる同一ヌクレオチドのパーセンテージとして定義される相同性または配列同一性を2つの配列がその間で最低限示すとき、2つの配列は相同であると見なされる。相同配列はその配列の1箇所だけ、数か所または部分もしくは全長に渡って相同である可能性があるので、相同性または配列同一性の程度は大きく変化し得る。1塩基だけが異なるヌクレオチド配列は、相同性の高い配列であり、単一ヌクレオチド多型SNPと称される。両方の配列において同一である配列の箇所または部分は、保存されていると言われる。保存された三次元構造を示すタンパク質ドメインは、通常相同配列によっておよびさらに多くの場合固有のエクソンによってコードされている。それらの配列において高い不変性を示す配列は、高度に保存されていると言われ、それらは高い相同性を示す。配列の整列方法は、コンピュータ化された局所的相同性アルゴリズムに基づいており、例えばこれらに限定されないがClustal登録商標Intelligenetics、MountainViews、California、またはGAP登録商標、BESTFIT登録商標、FASTA登録商標およびTFASTA登録商標WisconsinGeneticsSoftwarePackage、GeneticsComputerGroupMadison、Wisconsin、USAまたはBoxshade登録商標として利用可能である。用語共通配列は、検討しようとするいくつかの相同配列を整列した後に決定される配列である比較され、整列された、相同配列において位置毎に最も共通に見出される塩基として算出される。共通配列は、比較された全配列からできるだけ近い一種の平均配列を表す。高い相同配列の場合、または共通配列が十分に長く反応条件が厳しすぎない場合、共通配列は全ての相同配列に結合することができる。これは、共通プライマーと呼ばれる同じプライマーを用いる相同配列の増幅に特に有用である。実験的に、上記のプログラムから算出される共通配列は、そのような特性を得るために適合され得る。マイクロアレイおよびアレイは、単一の捕捉プローブまたは捕捉プローブ種が固定化されて、所与の特異的標的、好ましくはタンパク質または核酸を結合できる固体支持体を意味する。マイクロアレイは、これらに限定されないが、ピンもしくはピンとリングなどを表面に接触させる物理的手段によって、または圧電性もしくはナノディスペンサーなどの方法で溶液の微小液滴を放出することによってなされる基体上での捕捉分子の堆積で優先的に得られる。別法として、基体上での捕捉分子のインサイチュ合成は、所定の位置でオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを合成する光空間的分解能を持つ本発明の実施形態の1つであり、例えば、US-P-5,744,305およびUS-P-6,346,413によって提供されている。マイクロアレイは、固体支持体の表面上もしくは内部または固体支持体を覆っている基体上の所与の位置に堆積された捕捉プローブのスポットで選択的に構成されている。しかし、捕捉プローブは様々な形態で固体支持体上に存在でき、スポットに限定されない。好ましくは、捕捉プローブが付着されている固体表面上のスポットの空間分布は、これに限定されないが例えば正方形、長方形またはさらに単列のスポットのような幾何学的な整列である。マイクロアレイの適用のある特定の形態は、1ウェルに1つまたはいくつかの異なる捕捉プローブを有し、同じ支持体の部分であるウェル内の捕捉プローブの存在である。都合の良いことに、異なる支持体が特異的捕捉プローブを含有し互いに区別される限り、マイクロアレイの捕捉プローブも異なる支持体上に形成されて、特異的標的配列の定量化が可能になる。特定の特徴を有し互いに認識され得るビーズの混合物を使用することによってこれが達成されて、結合した分子が定量化される。用語捕捉分子は、所与のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはタンパク質もしくはそれらのファミリーに特異的に結合可能な分子に関する。好ましくは、ポリヌクレオチド結合は、一方が固定化された捕捉プローブまたは捕捉配列であり、他方が検出されようとする標的分子配列である2つのポリヌクレオチドの、塩基対合によって得られる。用語入射角は、表面上の入射方向と表面に対して垂直な線、法線と呼ばれる、との入射位置での角度を表す。本発明において、放射光が支持体を通過して検出されるので、入射角は支持体の中内部と見なされる。本発明において用語臨界角は、支持体において固体支持体表面に対する法線と対比する度で与えられ、θc=sin-1n2/n1によって定義される角度であり、n1は固体支持体の屈折率でありn2は外側の屈折率である。本発明において、好ましくは、n2は水溶液n2約1.33である。臨界角は、支持体において全内部反射が起こる入射角の値である。臨界角は同じ方法で算出され、ラジアンで表示され得る。用語観察角θobinは、支持体内の放射光の観察に使用される角度であり、標的分子を有する固体支持体表面に対する支持体内の法線と対比して表現される。用語θoboutは、透明な光学ブロックの側面の法線と対比して支持体の外側に位置する検出デバイスに対する観察角である。本発明の禁制角度は、臨界角と所与の溶液が呈する放射光に相当する波長の光線に対して90°の角度の間にあり、所与の支持体を通して検出される角度である。用語エバネセント波結合またはエバネセント結合は、エバネセントまたは減衰電磁場を用いて、電磁波がある媒体から別の媒体に伝達される工程である。一般的な意味において、用語エバネセント場またはエバネセント波は、入射光源によって照射される全内部反射界面の向こう側または遠位側に発生され指数的に減衰する電磁場のことを指す。エバネセント波は、全内部反射される入射光の波長のエネルギーと同じ励起エネルギーを与える。このエネルギーは、全内部反射が起こる表面上で固定された分子を励起させる誘導されたエバネセント。エバネセント場は、界面の遠位表面から比較的短い距離にしか有意なエネルギーを伝播しない例えば、ほぼその波長の長さ程度。用語放射されたエバネセントまたは逆エバネセントは、誘導されたエバネセントの逆、すなわち全反射している表面の向こう側支持体の外側に非常に近い1波長または数波長以内物体から放射される光が手前側支持体内部に伝達される工程である。用語光学的に透明な支持体は、非常に低い吸収で、光線の均一性に欠陥を起こすこと無く導光する特徴を有する支持体を意味している。好ましくは、光学的に透明な支持体は、少なくとも90、好ましくは少なくとも95、さらにより好ましくは少なくとも99の光を透過させる支持体を意味している。典型的な光学上透明な支持体は、高品質ガラスまたはZeonexもしくはTopasなどの材料で作られている。蛍光標識には、増幅産物に組み込まれている蛍光標識されたヌクレオチドが含まれる。これは、蛍光標識された核酸プライマーまたは標識されたデオキシリボヌクレオチドのいずれかを使用して達成される。蛍光標識には、SYBRグリーンのようなインターカレート蛍光色素も含まれる。用語リアルタイムPCRは、PCRサイクルの間にアンプリコンの存在を検出および/または定量化できる方法を意味している。リアルタイムPCRにおいて、アンプリコンの存在は増幅サイクルの少なくとも1つにおいて検出および/または定量される。PCRサイクルの間に形成されるアンプリコンまたはアンプリコンの量と相関したシグナルの増加は、PCR溶液中の所与のヌクレオチド配列の検出および/または定量化に使用される。本発明において用語アンプリコンは、酵素的な核酸増幅の産物である標的ポリヌクレオチド分子のコピーに関する。生物学的標的分子は、生物学的工程に関わる分子を意味している。標的分子は核酸に限定される。本発明は、完全にオートメーション化されている完結したデバイスにおける複数のポリヌクレオチドの迅速なリアルタイム増幅ならびに直結した検出および/または定量化の完全な解決策を提案している。本発明は、一緒に動作するシステムの異なる部分に規格を与えることによっておよび固定化された捕捉分子を有する検出チャンバーの特異的な特徴によって問題を解決した。本発明は、異なる特徴および制御を含むデバイスに適合された機器において、そのようなデバイスでアッセイを実施するための特定のパラメータを用いて最良に実施される。そのような機器は、アッセイに必要な測定およびデータ分析および/または溶液中に存在する標的の定量化を組み込んでいる適切なソフトウェアによって制御されている。本方法およびデバイスは、可能性がある複数の標的の検出用である。可能性があるとは、複数の標的がサンプル中に存在するときに、アッセイがそれらを検出できることを意味している。しかし、最も一般的な状況において、所与のサンプル中にはこれら標的の1つだけまたは限られた数しか存在しない。本方法およびデバイスは、標的が所与のサンプル中に存在する場合、1個、より良くは少なくとも4個、さらにより良くは10個超の異なる標的を検出する。典型的な35サイクルの増幅/検出実験が105分以内、さらには70分以内、さらに良くは35分以内に実施されるように、増幅の1サイクルが3分未満、好ましくは2分未満、さらには1分未満に実施される非常に迅速な方法で全体のアッセイが実施される。増幅された標的を検出するためのハイブリダイゼーションの時間はきわめて短く、好ましくは1サイクルにつき1分未満、またはさらには30秒未満、またはより良くは20秒未満なので、そのような複合アッセイにおけるアッセイの速度は予想外であった。通常、その時間は約2秒以上、好ましくは5秒以上である。実施例4に例証されているように、約240μLの容量を有するフローデバイスの場合、マイクロアレイ検出チャンバー内を50μLの溶液が通過する時間は、1サイクルにつき約16秒間である。マイクロアレイの典型的なハイブリダイゼーション時間は、静的マイクロアレイにおいて標準的なプロトコールで14-16時間のように、通常数時間より長い。Idekerら、2002年、Hybridizationandpost-hybridizationwashing、DNAMicroarrays、D.BowtellおよびJ.Sambrook、coldspringHarborLaboratoryPress、ColdspringHarbor,NewYork、228-239頁。マイクロアレイのハイブリダイゼーション速度とシグナル強度の両方を、静的ハイブリダイゼーションと比較して改善するカオス的混合器に基づく動的なハイブリダイゼーションによって、反応は増強されるMcQuainら、2004、AnalyticalBiochemistry、325、215-226頁。しかし動的ハイブリダイゼーションを用いても、必要な時間は1時間以上であり、フロースルーアッセイにおいてはほぼ5-20分程度であるMocanuら、2008、Anal.Biochem.、380、84-90頁。この特徴は、複数の捕捉プローブを持つマイクロアレイを使用することによって複数の標的がリアルタイムに増幅/検出される利点を持ち、溶液中で検出しながら実施される迅速なPCRに対する本アッセイの競争力を高める。これは、本発明の完全な解決策の一部として提案されてきた全体的な特徴によるものである。短い反応時間に関する1つの特徴は、マイクロアレイがフローシステムの一部なので、溶液の全てがサイクル毎に同じマイクロアレイ上を通過するという事実である。また好ましくは検出チャンバーの体積は限定されており、好ましくは、1μLから1mL、好ましくは1から20μL、さらに良くは1から10μLからなる体積の溶液を含有するように構成されている。好ましくは、反応チャンバーの高さは1mm未満、好ましくは250μm未満である。検出チャンバーの検出部分の液体の高さは、好ましくは、10から250μm、好ましくは50から150μmからなる。また、フローデバイスの異なる固体部分は所与の温度に保たれている。限られた体積の溶液だけがサイクルを通じて加熱および冷却され、迅速な増幅サイクルがもたらされる。短いハイブリダイゼーション時間は、小さな溶液体積で動作することになる予想外の利点を有する。小さな体積は熱容量が低いので、異なる増幅ステップに必要な要求温度にしたがってある領域から他へ移動する際に、容易に加熱または冷却される。また、小さな体積によりサンプルから取り出される標的を濃縮溶液にすることができ、したがって本方法の感度が高まる。大量にサンプルを希釈すると、ハイブリダイゼーション時間が増加することになるが、本明細書で上述した通りこれは必要とされていない。本発明の別の利点は、検出が連続工程へと完全に集積化されているという事実である。先行技術に記載されている段階的PCR/マイクロアレイに関しては、デバイスの取り扱いおよび時間を必要とするハイブリダイゼーションの特別な別個のステップは存在しない。本方法により、溶液と捕捉分子とが接触するサイクル毎にマイクロアレイにハイブリダイズされる標的を蓄積できる。予想外なことに、ハイブリダイズした標的は、かなり高いハイブリダイゼーション温度でも、液相を取り除き捕捉プローブを気相中にしてもまた、その捕捉分子に対して安定である。捕捉分子はまた、溶液無しでかなり高い温度の状態を保った後でも、依然として次のサイクルで非常に効率的な方法で標的を固定できる。本発明の1つの特徴は、複数の増幅サイクルが共通のマイクロアレイ表面を共有するので、増幅サイクルを通じて特異的なスポットにハイブリダイズしたアンプリコンが蓄積することである。マイクロアレイの所与の別々の領域スポットに存在する特異的な捕捉分子に対する所与の標的アンプリコンの特異的なハイブリダイゼーションに有利に働くような方法で、温度および溶液組成が選択される。所与のポリヌクレオチド配列が別のポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイゼーションするのに有利に働くまたは不利に働く溶液組成の効果には、溶液の厳しさまたは尿素もしくは界面活性剤など特異的な化合物の存在が含まれる。連続したサイクルの間にハイブリダイゼーションさせるがハイブリダイズしたアンプリコンを除去させないように条件が最良に選択されて、特異的なスポットにハイブリダイズしたアンプリコンが蓄積され、それにより本方法の検出感度が高まる。この特徴は、溶液と捕捉分子との接触が非常に短くても本方法を特に高感度にする。解決されるPCRに関連する別の問題点は、変性ステップにおいて高温で加熱している間の泡の形成および流体工程の異なる相の温度の変動による圧力変化である。好ましくは、本発明において全体システムは2つの相、好ましくは液相および気相で存在する。泡は、形成された場合、ほとんど気相に入り、液相に干渉せず、その結果全スポットを均質にハイブリダイゼーションできる。また、高温での液体膨張による圧力の増加は、気相の存在により打ち消される。この好ましい実施形態において、溶液の位置もしくは存在またはその流れもしくは液相/気相の移行相を検出するためのチップセンサーを備え、それによって溶液の存在下または気相のいずれかでアレイを検出するためのタイミングを制御できることにより、本発明は経時的に位置が変化する2つの相を有する流体の不均一性の問題も解決する。センサーシグナルが分析されて、液体の存在もしくは運動または流れと関連した変化が検出され、好ましくは溶液の前部または終端部の流れおよび/または通過の間の移行相が検出される。好ましくは、検出チャンバー内に液体が存在するタイミングは、フローチップ上のセンサーの位置、シグナルが変化するタイミングおよび液体の流速を含めた異なるパラメータの分析から導き出される。液体の体積を使用して、液体が検出チャンバー内に存在する継続時間を決定する。紫外線光による流路の照射下にDNAの吸光度を使用して流れの速度を決定する例が、GB2433259に表示されている。また、センサー位置での液体の通過と関連付けて時間と共に記録しているセンサー内の変動数を決定することによって、センサーはサイクル数を計数できる。好ましくは、液相から気相への移行相の数がサイクル数に対応する。必要に応じて、まず標準化されるデータ処理によって算出に補正が導入される。サイクルを計数することにより、リアルタイム増幅および/または定量化の1要件である、スポット値と増幅サイクルとの関係を得ることができる。好ましくは、標的検出に対応するスポットの値を増幅サイクルの関数として表現することによって、標的の定量化が実施される。好ましい実施形態において、溶液に由来するバックグラウンドシグナルを下げることができるので、ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子の蛍光シグナルの測定は気相で実施される。代替的な実施形態において、ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子の蛍光シグナルの測定は、標識された標的ポリヌクレオチド分子を含有する増幅溶液の存在下で実施される。均質な相を有する溶液の存在下でのハイブリダイズした標的のアッセイは、限局部位に対する比較シグナルを与える。好ましくは、検出は均質な溶液相の存在下で実施される。増幅の間に標的に組み込まれるまたはそれに結合する多量の蛍光色素標識を含有する溶液の存在下でも、サイクル中に増幅された標的を検出できることは別の予想外の結果であった。本発明の予想外の結果の1つは、非常に高いプローブ安定性である。この安定性は図1に例証されており、かなりの退色をもたらす様々な連続照射に供された場合でも、検出対照スポットのシグナルは、サイクルを通じて非常に安定である。本方法は、この特徴に基づいている先行技術RAP技術と明らかに区別した。検出対照の安定性は、工程を通じた捕捉分子の安定性の明らかな指標であり、異なる捕捉分子上で得られたシグナルの定量的な比較分析の正当性を示している。マイクロアレイの特異的な問題の1つは、捕捉分子が固定化された全スポットまたは限局部位が工程の全ステップにおいて同じ方法で処理されて、その結果がマイクロアレイの異なる位置に存在している異なる捕捉分子と関連しなければならないという事実である。本発明は、マイクロアレイ上の液体の連続的な通過に関連する問題を解決する。好ましくは増幅サイクル毎に、全スポットおよび各サイクルに対して同じハイブリダイゼーション時間になるように、液体が同じ時間で異なる限局部位と接触された。好ましくは、マイクロアレイ表面の異なる位置に位置している複製スポットから得られるシグナルの標準偏差は、試験値の20未満、さらには10未満である。マイクロアレイの最良の表面分解能を得るために、好ましくは、検出器に対する光学ブロックの位置が一旦作られるその位置は、毎月のように時々;またはより多くの変動が予想される場合、フローチップ毎に一度またはその間にいつでも点検されてよい。好ましくは、捕捉分子を有する光学ブロックの厚さは、少なくとも0.5mm、好ましくは1mm、より好ましくは3mm以上、さらには約5mm以上である。本発明は、光学ブロックを厚いものにでき、それにより禁制角度での検出を薄いブロックより容易にできるという予測外の優位性を有する。これにより、検出チャンバーの固定温度を得ることができる。一般に、厚さは20mm未満、好ましくは10mm未満になる。想定されなかった別の特徴は、異なる捕捉分子を有する限局部位で覆われている検出される表面と比較した検出システムの位置安定性である。この物理的安定性によって、サイクルを通じて同じ幾何学的形状を有する互いに完全に重ね合わされるマイクロアレイ表面の画像がもたらされ、その結果スポットは同じ位置に存在し、異なる画像が容易に比較および分析される。好ましい実施形態の1つにおいて、マイクロアレイ画像のグリッド化が最初に撮影された画像上で一旦実施され、次いで完全に比較されるように、同じグリッドが以後の画像に使用される。これにより、同じ実験の異なる画像に対する異なるグリッド化およびデータ比較における難点を避けることができる。また、画像は画素位置の複雑な補正なしに、容易に重ね合わされるまたは減算される。本発明の副次的特徴は、液体が閉鎖系である流路およびマイクロアレイを通って循環することである。閉鎖系は、周辺環境における増幅産物の汚染を防ぎ、さらなるアッセイに対する汚染を避ける利点を有する。一旦アッセイが行われると、全デバイスが機器から取り外され、したがって開けずに廃棄される。しかし、必要に応じて、対照またはアッセイの確認のためのように、捕捉分子にハイブリダイズした標的の存在のさらなる読み取りが実施される。チャンバーおよび流束デバイスおよび方法の具体的な実施形態において、検出チャンバーは、楕円形、卵形、菱形、六角形、八角形、ダイヤモンド形から選択される形状を有する。チャンバーは、マイクロアレイ上に液体フローの均質な配分を生み出すために、構成されている。チャンバーの設計に際して、液体の流入がマイクロアレイ表面上に均一に分配され、気相が検出チャンバーを通過する間にいかなる液体もチャンバー内に残らないように液体の流出もチャンバーから均一に取り除かれるために、特にチャンバーの幾何学的形状は液体の流束、チャンバーの高さおよびその幅/長さ比を考慮する。チャンバーは、チャンバーの主な方向と比較するマイクロ水路内の液体の角度、液体の流速、チャンバーの高さおよびチャンバー表面の親水性/疎水性を考慮して構成されている。チャンバー表面が高親水性であるとき、溶液は気泡を発生すること無く円滑および迅速にチャンバー内へと流入する。親水性/疎水性は、固体表面上の溶液-気体界面の接触角によって最も良く測定される。マイクロアレイを担持している検出チャンバーの表面は、好ましくは100°未満、より良くは80°未満、さらに良くは60°未満の接触角を有する。チャンバーの好ましい幾何学的形状は、図7aに表示されている。好ましくは図7bに例示されているように、所与のチャンバー、特定の疎水性を有するマイクロアレイ表面および所与の流速の場合、チャンバーの幅および液体の高さが調整されて、チャンバーの幅に沿って均一に分配された液体/気体正面が得られる。好ましい実施形態において、チャンバー内部の流入方向は、チャンバー縱軸と対比して0°が最良であり、チャンバーの両側は液体流束と比較して対称である。なお好ましい実施形態において、図7cに概説した通りチャンバーの注入部分が調整された高さを有して、チャンバー内部の断面と同じ断面を有する。いくつかの実施形態において、検出チャンバーは、コイル形状または直鎖状のいずれかの水路様形態を有する。この具体的な実施形態において、マイクロアレイは水路内部にスポットされている直鎖状アレイである。好ましくは、溶液がチャンバーに入るとき、全ての限局部位が同じ時間溶液によって覆われている。また好ましくは、各限局部位上の液体のフローは、ある限局部位と他の部位とで同一であるまたは20超まで、より良くは10までしか変わらない。複製スポット値の再現性は、フローチャンバー内の液体の均質な分配を制御するための最良の方法である。好ましくは、複製スポット値は、増幅のサイクルを通じて20超変化しない、より良くは10しか変化しない。具体的な実施形態において、検出チャンバー内のフローは層流であり、フローのレイノルズ数は層流と乱流とを区別する固定値より低い。より正確には、レイノルズ数は約2300未満である。さらに別の実施形態において、フローチップデバイスは20μLから2mLからなる体積の溶液を含有するように構成されている。流路を通して溶液を繰り返し輸送することによって、溶液の循環が得られる。増幅溶液は、フローチップデバイスの温度領域の間を一方向性または双方向性で輸送される。いくつかの実施形態において、増幅溶液は、循環方式一方向性図4または往復方式双方向性で温度領域の間を転送される。水路を通して溶液を輸送するための様々な手段が存在する。輸送は、例えば加圧による能動輸送もしくは例えば拡散による受動輸送のいずれかまたは毛管力によって駆動される輸送である。したがって、増幅溶液が温度領域を通過するとき、これは領域を通しての能動的ならびに受動的な輸送を含意している。例えば輸送が対流または拡散などの物理的な効果だけに基づく場合、この文脈における輸送システムとは、例えばフローチップデバイスに本質的に備わっている受動システムである。マイクロ流体デバイスにおける能動輸送は、流体輸送の2つの方式、圧力駆動フローまたは動電学的駆動フローの一方を利用している。動電学的輸送とは、電気浸透と電気泳動的輸送の組合せのことを指す。電気浸透とは、外部から印加された電界によって静止固体表面を通り過ぎる水溶液のバルク運動のことを指す。電気浸透は、固液界面に荷電二重層が存在する必要がある。電気泳動とは、印加電界の作用下で流体中に浸っている荷電表面の運動を表す。好ましくは、ポンプの動作、圧縮素子、磁気ビーズなどの使用またはその組合せを含むがこれらに限定されない、圧力駆動フローを使用して流路を通して溶液を繰り返し輸送することによって、フローチップデバイス内に溶液の循環が得られる。好ましくは、ポンプは1から500rpmからなる回転数を有する蠕動ポンプである。好ましくは、流路内の液体フローの速度は、6μL/分から3000μL/分、好ましくは50から500μL/分である。なお具体的な実施形態において、液体フローの速度は、実験のタイミングおよびフローデバイス内の液体の位置にしたがって変化する。液体フローを調整して液体と領域との所与の接触時間を得て、PCRのための変性、アニーリングおよび伸長温度ステップである増幅工程に最適な所与の温度タイミングを調整する。具体的な実施形態において、液体フローは増幅の特定のサイクルで所与の時間、フローデバイスの特定の領域内に停止する。PCRにおいて、液体は最初のサイクルにおいて変性領域内に所与の時間停止して、最初のアニーリングステップを開始するのに必要なゲノムDNAの適切な変性を得る。なお具体的な実施形態において、検出チャンバーはアニーリング領域と同じ温度であり、そしてPCRサイクルのアニーリングステップの一部と見なされる。好ましくは、増幅溶液と接触しているフローチップの表面はブロッキング試薬でコートされて、標的DNAおよびPCR試薬プライマー、dNTP、DNAポリメラーゼに対する表面の親和性が減少される。好ましくは、ブロッキング試薬は、Tween系表面活性物質ポリソルベート、ソルビタンエステル、ポリオキシ-1,2エタンジイル誘導体、Tween、TritonX-100ポリエチレングリコールp-1,1,3,3-テトラメチルブチル-フェニルエーテル、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、4-オクチルフェノールポリエトキシレート、Mono30、TX-100、t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、オクトキシノール-9、ポリエチレングリコールPEGおよび血清アルブミンヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンまたはBSAからなる群から選択される。Tween系表面活性物質ポリソルベート、ソルビタンエステル、ポリオキシ-1,2エタンジイル誘導体、Tweenは、ソルビトールのヒドロキシルおよびソルビトールから得られるヘキシトロール無水物ヘキシタンおよびヘキシドにポリオキシエチレン鎖を付加し、次いでラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸などの一般的な脂肪酸を用いて部分的にエステル化することによって、六価のアルコール類、アルキレンオキサイドおよび脂肪酸から得られる複合エステルおよびエステル-エーテルからなる水溶性非イオン性ポリマー界面活性剤である。一実施形態において、Tween系表面活性物質は、1つまたは複数のTween20、Tween40、Tween60またはTween80から選択され、またポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60およびポリソルベート80として製薬業界に公知である。ポリソルベート20モノラウリン酸ポリオキシエチレン化ソルビタンはラウリン酸エステルであり、ポリソルベート60モノステアリン酸ポリオキシエチレン化ソルビタンはステアリン酸エステルおよびパルミチン酸エステルの混合物であり、ポリソルベート80モノオレイン酸ポリオキシエチレン化ソルビタンはオレイン酸エステルである。そのようなTween系表面活性物質は市販されており、および/または当該技術分野において公知の技術によって調製される。好ましい実施形態において、Tween系表面活性物質は、モノラウリン酸ポリオキシエチレン化ソルビタンポリソルベート20、Tween20である。好ましくは、ブロッキング試薬の濃度は0.01から2からなる。好ましくは、コーティングはこれに制限されないが、コーティング剤としてBSAウシ血清アルブミンなどのタンパク質が0.01から0.05の範囲の濃度で使用される。PEGポリエチレングリコールのような高分子量分子も、コーティング剤として0.05から2の範囲の濃度で使用される。約0.1の濃度で使用されるとき、Tween20またはTritonX100のような界面活性剤がコーティング効果を有する。好ましい実施形態において、ブロッキング試薬はポリヌクレオチド分子増幅用試薬の一部であり、前記ブロッキング試薬は好ましくはTween系表面活性物質、TritonX-100、PEGおよび血清アルブミンからなる群から選択される。別法として、ブロッキング試薬を用いるプレコーティングが増幅前に実施される。ブロッキング溶液は、フローチップデバイスの流路および反応チャンバーを通して循環される。一実施形態において、溶液と接触しているフローチップの表面は、増幅前にTween系表面活性物質、TritonX-100、PEGおよび血清アルブミンからなる群から選択されるブロッキング試薬を用いて1から90分間プレコートされる。さらに他の実施形態において、流路およびフローチップはフローチップ製造業者によって前処理されてよく、フローチップは既製品で供給されることができる。具体的な実施形態において、本発明は追跡リアルタイムPCRサイクル用マイクロ流体デバイス内の相変化のアッセイ方法であって、a-0.01から10mm2からなる断面および体積V1を有する流路であって、流路に導入された溶液が流路を通って循環されるように構成されている流路、-流路と流体連通している検出チャンバーであって、光学的に透明な固体支持体の表面の限局部位に固定化された少なくとも1つの捕捉分子を含む前記透明な固体支持体を有し、高さ1mm未満および体積V2を有する検出チャンバー、-温度が調節されている少なくとも2つ、好ましくは3つの異なる温度領域であって、各温度領域が流路の異なる位置に位置しており、1つの温度領域が検出チャンバーを含み、標的ポリヌクレオチド分子が捕捉分子にハイブリダイゼーションできる温度を有する温度領域を含むフローチップデバイスを用意するステップ、b液体/空気および/または空気/液体の相変化を検出するためのフローチップセンサー、c体積がV3であり標的ポリヌクレオチド分子を含有する溶液およびポリヌクレオチド分子増幅用の試薬を流路に導入するステップであって、デバイス内に溶液に加えて空気が存在するように比率V3/V1V2が0.02より大きく1未満であるステップ、d溶液を少なくとも5回の増幅サイクルに供して標識された標的ポリヌクレオチド分子を得るステップであって、1回の増幅サイクルは流路および異なる温度領域の間にある同じ検出チャンバーを通して溶液を循環させることによって得られ、増幅サイクルが3分未満で実施されるステップ、eフローチップセンサーのデータを分析することによって増幅サイクルを決定するステップ、f光線によって蛍光色素を励起した後に測定される標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光を検出することによって、少なくとも3回、好ましくは少なくとも5回の異なる増幅サイクルにおいて、増幅の異なるサイクルにハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルを測定するステップ、g増幅サイクルを通じて限局部位から得たシグナル値を分析して、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子を検出および/または定量するステップを含む方法を包含する。特定の適用は、検出チャンバー内のマイクロアレイも含み、前記マイクロアレイは固体支持体の表面の限局部位に固定化されている捕捉分子を4個超、好ましくは20個超含む。好ましくは、増幅溶液は、流路内に気相および液相の2つの相を備えている。具体的な実施形態において、フローシステムの2つの相は、増幅の水性溶液および油相によって構成されている。好ましくは、比率V2/V1は0.001から0.5、より良くは0.01から0.1からなる。予想外なことに、図11に提示されている通りフローチップデバイスが増幅溶液V3でほぼ完全に満たされたとき、小さい体積を使用したときと比較して、標的アンプリコンはより初期のサイクルで検出された。好ましくは、たとえ非常に小さくても、密閉デバイス内に気相は残した。気相が存在することにより、あるサイクルとその他とで液体を物理的に分離することができ、サイクル毎に移行相を検出するセンサーを用いて増幅サイクルを容易に計数できる。好ましい実施形態において、比率V3/V1V2は0.5超、好ましくは0.75超、さらには0.9超であり1未満である。好ましくは、1未満の比率V3/V1V2とは0.999未満、好ましくは0.99未満、例えば0.95以下などを意味している。好ましい実施形態において、液体フローは始めから終わりまで一定であり、流路および/または検出チャンバー内の増幅溶液液相の位置は流路内の液相位置を時間制御することによってわかる。好ましくは、液相の位置は、流路の少なくとも1つの位置において気相/液相変化から得られるシグナルの測定からわかり、前記測定は温度シフト、蛍光シグナル変化、電気シグナル、発光または光吸収変化によって得られる。増幅本方法およびデバイスの具体的な実施形態において、溶液が温度領域を通って輸送されるとき、試薬が標的ポリヌクレオチド分子と接触するように、ポリヌクレオチドの分子増幅に必要な試薬の少なくとも1つが、流路および/または検出チャンバー内に固定化されている。本発明による方法において使用される増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リガーゼ連鎖反応LCR、サイクリングプローブ技術CPT、核酸配列ベース増幅NASBA、鎖置換増幅SDA、ループ媒介等温増幅loop-mediatedisothermalamplificationLAMP、自家持続配列複製3SR、ヘリカーゼ依存性増幅HDAを含むがこれに限定されない周知の増幅プロトコールによって有利に得られる。増幅方法は、2つの種類、熱サイクル法PCR、LCRと等温法CPT、NASBA、SDA、LAMP、3SR、HDAにさらに分けられる。また、これら増幅法の変形の適用、例えば逆転写PCR、リアルタイムPCR、非対称PCRまたはホットスタートPCRも、本発明の方法によってまたは本発明によるデバイス/装置において実施される。好ましくは、増幅はPCRによって実施され、増幅溶液はDNAポリメラーゼおよび標的ポリヌクレオチド分子に実質的に相補的なプライマーを含む。好ましい実施形態において、増幅は変性、アニーリングおよび伸長ステップを含むPCRによって得られる。好ましくは、増幅サイクルに溶液を付するステップの前に、溶液は1分超、好ましくは2分超、さらには4分超の変性ステップに付される。好ましくは、増幅サイクルは4つの異なる温度ステップ、変性、アニーリング、ハイブリダイゼーションおよび伸長を必要とする。他の実施形態において、増幅サイクルは3つの温度ステップ、変性、アニーリング/ハイブリダイゼーションおよび伸長を含む。この実施形態において、アニーリングステップはハイブリダイゼーションステップと同じ温度で実施される。好ましくは、アニーリングステップは検出チャンバー内で実施され、アニーリングおよびハイブリダイゼーションステップは同じ温度領域で実施される。さらに具体的な実施形態において、増幅サイクルは2つの温度ステップ、変性およびアニーリング/ハイブリダイゼーション/伸長を含む。この具体的な実施形態において、アニーリングおよび伸長ステップは、ハイブリダイゼーションステップと同じ温度で実施される。好ましくは、アニーリングおよび伸長ステップは検出チャンバー内で実施され、アニーリング、伸長およびハイブリダイゼーションステップは、同じ温度領域で実施される。好ましくは、ポリヌクレオチド分子増幅用の試薬は、プライマー、dNTP、熱安定性DNAポリメラーゼおよび緩衝液を含む。好ましくは、標識された標的を形成するために、プライマーおよび/またはdNTPは、蛍光色素標識された増幅前駆体を含む。好ましくは、蛍光色素標識された増幅前駆体を組み込むことにより、増幅された標識された標的ポリヌクレオチド分子が蛍光標識される。好ましくは、増幅前駆体の蛍光色素には、Alexa誘導体、アミノクマリン、CY3、CY5、CY7、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ、フィコエリトリン誘導体、シアニン誘導体、アクリジン誘導体またはクマリン誘導体が含まれる。他の実施形態において、二重らせんの中にインターカレート色素を組み込むことによって、増幅される標識される標的ポリヌクレオチド分子が蛍光標識され、蛍光の増加がもたらされる。この具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド分子増幅用の試薬は、好ましくはSYBRグリーン、臭化エチジウム、アクリジンオレンジ、SYTOXブルーからなる群から選択されるインターカレート蛍光色素を含む。好ましい実施形態において、標的ポリヌクレオチド分子生物または生物の一部に特異的なヌクレオチド配列はDNAヌクレオチド配列である。代替的な実施形態において、標的ポリヌクレオチド分子は、PCRの前にcDNAに逆転写されるmRNAである。特定の実施形態において、本発明の方法は生物学的生物または生物の一部からその生物に特異的なヌクレオチド配列を抽出するステップを含む。緩衝液は、好ましくは陽イオンおよび陰イオンから構成される塩を含み、前記陰イオンは2つのカルボキシル基および1つのアミン基を有し、組成物の塩濃度は、10mMから400mMからなり、除外薬剤の重量で1から20からなる。陰イオンは、好ましくはグルタミン酸である。好ましくは、ポリヌクレオチド分子増幅用の試薬はホットスタートシステムを含む。ホットスタートシステムを得るための1つの具体的な方法は、フローチップデバイス内での少なくとも1つのPCR試薬の物理的な分離による。別法として、ホットスタートシステムが、ホットスタートTaqポリメラーゼを使用して得られる。別の実施形態において、25から300mMからなる塩濃度で、少なくとも1回のPCRサイクルが、活性がある熱安定性DNAポリメラーゼ酵素を使用することを含む。好ましい塩類は、グルタミン酸カリウム、塩化カリウムおよび塩化ナトリウムである。好ましくは、ポリメラーゼ酵素は、サーマスアクアチクスThermusaquaticusDNAポリメラーゼ酵素である。熱安定性とは、1回のPCRサイクル後にまだ初期活性の少なくとも50を保持していることを意味する。塩の中で活性がある25から300mMからなる塩濃度では、25mM未満の塩を含む溶液中での活性と比較して、好ましくは少なくとも5およびより良くは少なくとも20、さらにより良くは少なくとも50の活性を示す酵素を意味する。本発明の好ましい実施形態において、増幅はテイルドプライマーtailedprimersおよび第2プライマーを用いて実施され、両方とも増幅の最初から存在し、テイルドプライマーのどんな滅失も無い。本方法はテイルドプライマーと第2プライマーを適切な割合で使用する必要があり、前者は後者より多くとも1/5未満、好ましくは1/10未満である。本発明の方法は、マイクロアレイ上で実施される多重化リアルタイムPCR反応の自動化に完全に適合されている。マイクロアレイ上に存在している固定化された捕捉分子の数により、検出される標的の数は非常に多い。一実施形態において、マイクロアレイは1つまたは複数のポリヌクレオチド標的分子の増幅を実施するための試薬と接触している。好ましい実施形態において、溶液中に存在する1から4個の標的ポリヌクレオチド分子、好ましくは1から10個の標的ポリヌクレオチド分子およびより好ましくは1から20個の標的ポリヌクレオチド分子が、同じアッセイにおいて増幅、検出および/または定量化される。さらなる実施形態において、好ましくは、溶液中に存在する少なくとも2つ以上、より好ましくは3つ以上、さらにより好ましくは4つ以上の標的ポリヌクレオチドが同じアッセイにおいて増幅および/または定量化される。別の実施形態において、溶液中に存在する20から1000個の標的ポリヌクレオチド分子が同じアッセイにおいて増幅、検出および/または定量化される。本発明は、Cp-Gジヌクレオチド中に見られるDNAメチル化、特にシトシン-5DNAメチル化のアッセイにも良く適合している。具体的なアッセイにおいて、DNAはまず亜硫酸水素塩で処理されて、非メチル化シトシンがウラシルに転換される。配列の判別は、PCR増幅のレベルで完全にマッチしたプライマーとミスマッチプライマーとのアニーリングの差に基づいて進められるEadsら、2000、NucleicAcidsRes28、e33、参照により組み込まれる、を参照のこと。別の具体的方法において、シトシンにマッチしているプローブおよびウラシルにマッチしている別のプローブを使用して、アレイ上に固定化されたプローブレベルで判別が得られる。この場合、プライマーは両方の配列を増幅し、マッチしたまたはマッチしないアンプリコンの存在によって、2つのプローブそれぞれに対して異なるシグナル強度を得て判別する。本発明は、DNAまたはRNA配列中のSNPの判別にも特によく適合されている。具体的な実施形態において、アンプリコン中の変異または欠失の存在の決定は、完全にマッチしたプローブまたはマッチしないプローブのいずれかに固定されているアンプリコンの解離の温度の差に対するアッセイに基づいている。好ましくは、解離温度の差はハイブリダイゼーションチャンバー領域を漸次加熱し、マッチするおよびマッチしないプローブ両方のシグナルを記録することによって得られる。その温度にしたがった解離速度および/またはシグナル値の差は、ミスマッチ配列と比較して完全にマッチした配列の溶液中での存在を指し示すことになる。所与の温度において、完全なマッチとミスマッチシグナルとの間に少なくとも4、より良くは10、より良くは20の差異が得られる場合、結論が最も良く得られる。マイクロアレイ好ましくは、本方法およびデバイスによるマイクロアレイは、1cm2につき4個超の捕捉分子、好ましくは10個超、20個超、さらには50個超を含むマイクロアレイの形態で、固体支持体の限局部位に特異的に固定化された捕捉分子を有する低または中密度マイクロアレイである。好ましくは、限局部位の表面は10μm2から1mm2、好ましくは1μm2から100μm2からなる。好ましくは、マイクロアレイは4から100000個の捕捉分子、好ましくは10個超の捕捉分子、さらにより好ましくは20個超の捕捉分子を含む。好ましくは、マイクロアレイは、例えば12、25、40、80または160個のように約1000個以下の捕捉プローブ、より好ましくは200個以下の捕捉プローブを含有する。好ましくは、マイクロアレイの密度は1cm2につき4から100000スポット、好ましくは1cm2につき10から1000スポットからなり、各スポットは1種類の捕捉分子に対する限局部位である。好ましくは、支持体に固定化される捕捉分子の量は、1cm2につき20から2000フェムトモルからなる。好ましくは、マイクロアレイの表面は、0.1から10cm2、より良くは0.2から4cm2、さらにより好ましくは0.5から2cm2の間にある。好ましい実施形態において、マイクロアレイは2D-アレイまたは線形アレイである。好ましくは、捕捉分子はスペーサー部分と捕捉部分を有する。捕捉分子の捕捉部分だけがアンプリコンに特異的である。スペーサー部分が固体支持体と捕捉部分との間に位置するように、捕捉分子は固体支持体に固定化されている。好ましくは、捕捉分子の捕捉部分は、好ましくは少なくとも20ヌクレオチド、および好ましくは40ヌクレオチド超の長さ、より好ましくは少なくとも90ヌクレオチドの配列である少なくとも6.8nmの長さのスペーサー部分によって固体支持体の表面から分離されており、約20から約120塩基からなる。スペーサー部分はヌクレオチド配列がより良く、スペーサー部分の遠位端のヌクレオチドを使用して固体支持体に捕捉分子を結合する。この目的のために、スペーサー部分の遠位端のヌクレオチドはアミノ基を持って提供され、そのアミノ基は、例えば前処理された固体支持体の表面に存在するエポキシ基またはアルデヒド基と共有結合を形成する。支持体の表面に捕捉分子を固定化する化学反応は、増幅に必要な温度応力に耐えるように十分安定でなければならない。増幅工程の間または後に支持体上に捕捉分子を保持する割合を制御する手段は、蛍光標識された捕捉分子である陽性検出対照をマイクロアレイに組み込むことになる。具体的な実施形態において、マイクロアレイはサイクル1と比較して増幅サイクル35においてその蛍光を50超、好ましくは80超、さらに良くは90超保っている蛍光標識された捕捉分子陽性検出対照を含む。好ましくは、捕捉分子の捕捉部分はPCRの間に生み出されるアンプリコンに特異的な10から100ヌクレオチド、好ましくは15から40ヌクレオチド、より好ましくは20から30ヌクレオチドを含有する。好ましくは、捕捉分子の捕捉部分は10から600塩基、好ましくは20から50塩基、より好ましくは15から40塩基からなっている。特定の実施形態において、捕捉分子はアンプリコンの特異的配列に相補的な10から100ヌクレオチドの捕捉部分を含み、その結果前記捕捉部分はアンプリコンの2つの非相補的な末端および少なくとも20ヌクレオチドを有するスペーサー部分を定義し、アンプリコンの2つの非相補的な末端はスペーサー末端および非スペーサー末端をそれぞれ含み、その結果スペーサー末端は捕捉分子のスペーサー部分に非相補的であり、前記スペーサー末端は前記非スペーサー末端を少なくとも50塩基上回っている。好ましい実施形態において、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の同定および/または定量化は、少なくとも2サイクルの増幅工程において1つの位置につき少なくとも2回の測定を用いて、マイクロアレイの異なる位置のシグナルをモニタリングすることによって実施される。その後、データが処理される。別の実施形態において、生物に特異的なアンプリコンの捕捉分子に対するハイブリダイゼーションは、予め定められた位置に単一スポットのシグナルを形成し、前記単一スポットのシグナルを検出することにより他の生物由来の他の相同なアンプリコンと特異的アンプリコンとを判別できる。標識および検出ハイブリダイズした標的は、PCRによる制約に適合する限り、本明細書で以下に表示した方法に限定されないが記載されている一連の方法によって、マイクロアレイで検出される。非標識法がマイクロアレイに適用できると提案されてきており、マイクロアレイに適合された質量分析による標的の同定に基づいている米国特許第5,821,060号、その全体を本明細書において参照により本明細書に組み込む。標識に関連した検出方法は数多くある。異なる標識分子の総説がWO97/27317に示されており、その全体を本明細書において参照により本明細書に組み込む。すでに標識されたプライマーを使用して、またはコピーもしくは増幅ステップの間に標識されたヌクレオチドを酵素的に組み込むことによって、または薬剤をインターカレートしその後蛍光検出することによってそれらは得られるWO97/27329、その全体を本明細書において参照により本明細書に組み込む。最も多用される標識は、マイクロアレイスキャナGeneralScanning、GeneticMicrosystemを使用してマイクロアレイを分析するのに適しているCy3、Cy5およびCy7のような蛍光色素である。マイクロアレイ上で得られた標的固定のシグナルは、蛍光、比色、拡散、電子発光、生物-もしくは化学発光、磁気、インピーダンスもしくはボルタンメトリのような電気、例えば米国特許第5,312,527号を参照のこと、その全体を本明細書において参照により本明細書に組み込むまたは放射性検出を使用して検出される。好ましい標識は、蛍光検出器を用いて高感度で検出される蛍光色素である。蛍光色素には、市販のマイクロアレイスキャナ例えば、GeneralScanning、GeneticMicrosystemから入手可能を使用するマイクロアレイの分析に適しているシアニン色素Cy3、Cy5およびCy7が含まれるが、これに限定されるものではない。好ましくは、Cy3の励起波長は550nmにピークを持つ約540から558nmであり、発光波長は570nmにピークを持つ約562から580nmである。好ましくは、Cy5の励起波長は649nmにピークを持つ約639から659nmであり、発光波長は670nmにピークを持つ約665から685nmである。好ましくは、Cy7の励起波長は743nmにピークを持つ約733から753nmであり、発光波長は767nmにピークを持つ約757から777nmである。蛍光色素は、標的のアミン基とN-ヒドロキシスクシンイミドNHS基を有する蛍光色素との反応など化学反応によって標的に組み込まれる可能性もある。本発明における他の有用な蛍光色素には、シアニン色素、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質が含まれる。そのような標識の使用を教示している特許には、米国特許第3,817,837号;第3,850,752号;第3,939,350号;第3,996,345号;第4,277,437号;第4,275,149号;および第4,366,241号が含まれる。本発明の好ましい実施形態において、捕捉分子に対するアンプリコンの存在に関連した蛍光シグナルの検出から、溶液中の蛍光と比較してマイクロアレイ上でシグナルの増加が得られる。具体的な実施形態において、溶液中で自由に運動する分子と比較して、マイクロアレイ上に存在する蛍光色素の検出の差は、DNA二重らせんとして捕捉分子にハイブリダイズした結合分子に関連する蛍光色素の異方性の差に基づいている。異方性は、検出される蛍光色素の可動性および寿命によって決まる。マイクロアレイ上での異方性のアッセイ方法は現在、BlueshiftBiotechnologiesInc.、238EastCaribbeanDrive、Sunnyvale、Calif.94089http://www.blueshiftbiotech.com/dynamicfl.htmlから入手可能である。好ましい検出方法は、表面から放射される蛍光結合した標的と溶液中に存在する蛍光遊離標的とを判別するための禁制角度の使用に基づいている。好ましくは、標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズした表面の限局部位から放射される蛍光の検出が、固定化された捕捉分子を有する光学的に透明な固体支持体を通して禁制角度内にある観察角でアッセイされる。好ましい実施形態において、シグナルは、禁制角度内の観察角、前記表面に対する法線と対比して90°>θobin>sin-1n2/n1のようなθobinで検出され、この際、光学的に透明な固体支持体は屈折率n1を有し、屈折率n2を有する溶液と接触しており、その際n1>n2である。好ましくは、観察角は臨界角プラス10°、好ましくはプラス5°、より好ましくはプラス3°の範囲である。表面から放射される蛍光結合した標的と溶液中に存在する蛍光遊離標的とを判別するための別の具体的検出方法は、エバネセント場である。そのような具体的な実施形態において、限局部位から放射される蛍光の検出は、ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドを有する表面のエバネセント誘起照射の後にアッセイされる。エバネセント場を使用する検出は、例えば米国特許出願公開第11/526,159号に記載されている。エバネセント場またはエバネセント波は、一般的に理解される意味で本明細書において使用され、すなわち入射光源によって照射される全内部反射界面の向こう側または遠位側に発生され指数的に減衰する電磁場のことを指す。一般に、エバネセント波の励起エネルギーは、全内部反射される入射光の波長のエネルギーと同じである。通常、エバネセント場は、界面の遠位表面から比較的短い距離にしか有意なエネルギーを伝播しない例えば、ほぼその波長の長さ程度。好ましくは、例えば照射は固定化された捕捉分子を有する固体支持体の表面で全内部反射蛍光TIRFおよび均質なエバネセント場が得られなければならない。好ましくは、励起光源1はエバネセント場を生み出す。好ましくは、エバネセント場は、約60°から90°からなる入射角で固体支持体の表面を照射する入射光源によって発生される。エバネセント場は標識されたアンプリコンの標識を励起し、放射されたシグナルは検出器によって検出される。表面から放射される蛍光結合した標的と溶液中に存在する蛍光遊離標的とを判別するための別の代わりの検出方法は、表面上に合焦させた照射および/または検出に基づいている。そのような実施形態において、限局部位から放射される蛍光の検出は、ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドを有する表面の焦点を合わせた照射の後にアッセイされる。好ましくは、励起はマイクロアレイの表面に合焦させたレーザー光によって得られる。レーザー光の合焦を伴うスキャナ法は、ピンホールを含めた共焦点スキャン法を使用した。そのようなスキャナの多くは、PROSCANARRAY登録商標PerkinElmer登録商標Lifeのスキャナ品目、Affymetrix428スキャナ、VirtekVisionChipreader品目、などから市販されている。蛍光レーザーに基づくいくつかの検出が、現在マルチウエル形式用として使用可能である、例えばTecanのSafirTecanTradingAG、Mannedorf、Switzerland;www.tecan.com。それらは、本発明に適合され得る。具体的な実施形態において、蛍光色素分子の検出は、時間分解法で好ましくは得られる。蛍光分子は、発光工程と関連した蛍光寿命を有する。通常は、フルオレセインおよびローダミンなどの小さい蛍光色素の寿命は、2-10ナノ秒の範囲にある。時間分解蛍光TRFアッセイは、長寿命>1000ナノ秒の蛍光色素を使用して、ほとんどの場合10ナノ秒よりかなり短い寿命を有するマトリックスの自己蛍光または蛍光サンプルの自己蛍光など、短命な干渉とアッセイシグナルとを判別する。1つの特定の実施形態において、蛍光色素の検出はPLEXOR商標TechnologyPromegaを使用して実施される。好ましくは、蛍光発光の波長の差は、蛍光共鳴エネルギー移動FRETによって得られる。1つの特定の実施形態において、プライマーは所与の最適な蛍光発光波長を有し、溶液中で、その励起波長で励起されたときに蛍光ドナーとして機能する蛍光色素F1で標識されている。好ましい実施形態において、シグナルを検出するためのデバイスは、不溶性固体支持体の側を照射する光源を含む。AuroraPhotonicsInc.26791WestLakeview、LakeBarrington、USA;infoauroraphotonics.comによって提案されるように、好ましくは、光源は1対の光ファイバーバンドルによる平行でないレーザー光源または発光ダイオードである。蛍光特性を有するナノ結晶の粒子などいくつかの蛍光標識は、特に興味深いものである。最も一般的なものは量子ドットHanら、NatureBiotechnology、19巻、631頁、2001である。それらは、蛍光性であり、時間と共にまたは照射で退色しない。それらの安定性は、本発明で提案される連続的観察における使用に特に適している。また、蛍光以外の方法も使用して捕捉分子への付着をモニタリングするように、これらの粒子に特異的な特性を与える金属をそれらは含有する。これら粒子の熱加熱は、時間と共に最も良くモニタリングされるパラメータの1つである。金属が光線、好ましくはレーザー光のエネルギーを吸収し、粒子の加熱を誘導するという事実は支持体上の低密度金粒子を検出する基礎として使用されており、単一粒子ですら検出されるBoyerら、Science、297巻、1160頁、2002。本方法は、光熱干渉コントラストと呼ばれている。マイクロアレイの捕捉分子に対する標的分子の結合を検出するための直接的な方法は、非線形周波発生分光法GFSの光学的工程に基づく化学的地図製作であるL.Dreesenら、ChemPhysChem、5巻、1719頁、2004。この技術により、ミクロン以下の空間的分解能で表面および界面の振動特性をリアルタイムに撮影できる。測定は基体表面で2色のレーザー光を混合することによって得られ、一方は可視光緑色の固定周波数を有し、他方は赤外線の可変周波数を有する。サンプルによって放射される光を測定することによって、界面での振動の特徴が赤外線レーザー光の周波数の関数の形で得られる。この方法は検出される標的の標識を回避し、したがって具体的な実施形態を表している。ナノ粒子を直接的に測定する別の技術はレイリー散乱である。本方法は、検出される電磁放射が粒子から得られるように適合された光線を使用して、金属粒子に電子の振動を得ることに基づいているStimpsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、100巻、11350頁、2003光導波路を使用する、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上でのDNAハイブリダイゼーションおよび融解のリアルタイム検出。しかしこれまで、本方法は生体試料に適用するには必要な感度を欠いている。別法として、ラマン散乱および表面プラズモン共鳴は本発明に特に適用される方法であり、これらの技術は抗体/抗原結合の検出に広範に使用されてきたが、マイクロアレイの多パラメータ測定および生体試料に必要な感度にもよく適しているThielら、AnalyticalChemistry、69巻、4948頁、1997。別の実施形態において、水晶振動子マイクロバランスが適用され、現在1ナノグラム未満の質量変化を測定するのに十分に高感度であるCarusoら、AnalyticalChemistry、69巻、2043頁、1997を参照のこと。これは、リアルタイムにマイクロアレイを検出するための1つの提案である。カンチレバーは、マイクロアレイ上のDNAを検出するための別の選択肢である。McKendryら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、99巻、9783頁、2002。また、別の技術はナノ粒子の電気的検出であり、この技術はそれらの金属特性を考慮している。電気化学的検出がまず適用されたが、低感度であった。より高度でありより高感度な方法は、微分パルスボルタンメトリによる検出であるOzsozら、AnalyticalChemistry、75巻、2181頁、2003。金属の抵抗度および静電容量特性は、電子チップ上で検出される最良の特性の1つである。金属の抵抗度および静電容量特性も、電子チップ上で検出される最良の特性の1つである。2本の電極間の金属の存在は、抵抗度および静電容量の変化を誘発することになる。捕捉分子が一方の電極に存在するとき、DNAまたはタンパク質の検出が次いで観察されるMoreno-Hagelsiebら、SensorsandActuatorsB-Chemical、98、269-274頁、2004。金標識されたDNAの静電容量アッセイが、Guiducciら、ESSDERC2002によって記載されている。電子チップはいくつかの区割で作られ得るので、異なる標的が異なる区割上で検出され、抵抗度または静電容量の変化が記録される。この方法がまだ、生体試料に必要とされる高い信頼性および高感度な検出を生み出せないにせよ、それらの一部はリアルタイム検出の要件を満たすことに成功すると予測されている。マイクロアレイの捕捉分子に対する標的分子の結合を測定するための別の有望な技術は、非線形周波発生分光法GFSの光学的工程に基づく化学的地図製作であるL.Dreesenら、ChemPhysChem、5、1719-1725頁、2004。この技術により、ミクロン以下の空間的分解能で表面および界面の振動特性をリアルタイムに撮影できる。測定は基体表面で2色のレーザー光を混合することによって得られ、一方は可視光緑色の固定周波数を有し、他方は赤外線の可変周波数を有する。サンプルによって放射される光を測定することによって、界面での振動の特徴が赤外線レーザー光の周波数の関数の形で得られる。この方法により、標的の標識を回避して検出できる。好ましい実施形態において、マイクロアレイの異なる位置上でモニタリングされるシグナルは、比色分析、蛍光、時間分解蛍光、光熱干渉コントラスト、レイリー散乱、ラマン散乱、表面プラズモン共鳴、質量変化、水晶振動子マイクロバランス、カンチレバー、微分パルスボルタンメトリ、非線形周波発生分光法による化学的地図製作、光学的変化、抵抗度、静電容量、異方性、屈折率および/またはナノ粒子計数からなる群から選択される。一実施形態において、いくつかの捕捉分子はポリメラーゼによって伸長され、それと同時に他のいくつかの捕捉分子は熱サイクルの間に溶液中に蓄積する増幅産物とハイブリダイズされる。一実施形態において、伸長した捕捉分子は変性の温度ステップの間に検出される。別の実施形態において、伸長した捕捉分子およびその捕捉分子に結合している標識ヌクレオチド分子の両方が、アニーリングおよび/または伸長の温度ステップの間に検出される。さらに別の実施形態において、捕捉分子は蛍光消光物質または蛍光アクセプター、および蛍光ドナーの両方を有する。捕捉分子への干渉により消光物質または蛍光アクセプターが放出され、支持体上で蛍光ドナーが検出およびまたは定量化される。好ましくは、消光物質のそのような放出は酵素活性の結果として起こる。好ましくは、酵素は二本鎖DNAまたはDNA-RNAに特異的であり、ウラシルDNAグリコシラーゼUNG、制限酵素、3’,5’エキソヌクレアーゼ、5’,3’エキソヌクレアーゼ、RNAseHの活性を有する酵素を含むが、これらに限定されない。好ましくは、酵素は60°Cで、より良くは80°Cで、さらにより良くは94°Cで安定である。特定の実施形態において、捕捉分子に対する消光効果は消光物質と蛍光ドナーとの間の短い距離によって得られる。消光物質と蛍光剤が近位で維持されるなら別だが、好ましくは捕捉分子はヘアピンを含む。好ましい実施形態において、消光物質は直径1.4nmの金ナノ粒子であり、蛍光色素はフルオレセイン、ローダミン6G、テキサスレッドまたはCy5である。好ましくは、消光物質は捕捉プローブの自由末端に位置し、蛍光色素は支持体に固定化された捕捉分子の末端または末端の近くに位置している。本発明により、異なる一本鎖捕捉ポリヌクレオチド配列が結合しているマイクロアレイを使用して、捕捉配列と標的配列とが結合した結果得られる単一のシグナルを決定することによって多形性の存在を同定でき、標的配列は鋳型として標的配列を使用して3’5’の方向にその3’末端ヌクレオチドの向こうに少なくとも1つ捕捉配列のヌクレオチドを延長し、前記延長は重合剤およびヌクレオチド前駆体の存在下で実施され、延長された捕捉配列に組み込まれた少なくとも1つのヌクレオチドは検出可能に修飾されたヌクレオチドである。1つの好ましい支持体は、化学的および熱的な安定性、低い蛍光ならびに光学的安定性を有するポリマー、好ましくはZeonex登録商標もしくはZeonor登録商標ZeonChemicals、Louisville、USAなどのシクロ-オレフィンポリマー、またはこれらに限定されないが、Topas、Udel、RadelもしくはTHVを含む。データ分析および定量化分析好ましい実施形態において、本方法は、増幅の異なるタイミングにマイクロアレイの異なる限局部位において限局部位当たり少なくとも5回測定されるシグナルを、少なくとも5サイクル、好ましくは少なくとも10サイクルの異なる増幅サイクル、より好ましくは少なくとも20サイクルの異なる増幅サイクルにおいてモニタリングすることによって実施される。その後データは処理される。特定の実施形態において、工程は20サイクル超の異なる増幅サイクルを含み、および/または測定は最初の20増幅サイクルの間は実施されない。好ましい実施形態において、蛍光シグナルを測定するための増幅の異なるタイミングは増幅サイクルに対応している。好ましくは、増幅サイクルは、フローチップセンサーのデータ分析によって決定される。センサーシグナルが分析されて、液体の存在もしくは運動または流れと関連した変化が検出され、好ましくは溶液の前部または終端部の流れおよび/または通過の間の移行相が検出される。センサー位置での液体の通過と関連付けて時間と共にセンサーによって記録される変動数を決定することによって、センサーはサイクル数を計数できる。好ましくは、液相から気相への移行相の数がサイクル数に対応する。サイクルを計数することにより、リアルタイム増幅および/または定量化の1要件である、スポット値と増幅サイクルとの関係を得ることができる。別法として、フローチップデバイス内に気相が無い場合、増幅サイクルはフローチップデバイスの特徴であるV1V2および流速から算出される。サイクル継続時間は、溶液が流路および検出チャンバーを通って循環を完了するための時間である。増幅サイクルの継続時間は、デバイスV1V2V1は流路の体積、V2は検出チャンバーの体積の特徴にしたがって決定または算出され、その特徴は流路断面およびカートリッジの異なる温度領域内部の流路長ならびに検出チャンバーV2の体積によって主に決まっている。フローデバイス内の流速はポンプ速度またはデバイス内に液体の流れを作るために使用される他のシステムに依存している。好ましくは、標準化工程の一部として所与の作業条件における流速および/または1サイクルを実施するための時間を決定し、その後実験する。代わりの実施形態において、シグナルは増幅サイクル当たり少なくとも2回の測定を実施することによって経時的にモニタリングされる。別の実施形態において、増幅は、少なくとも5、より良くは10、さらに良くは20増幅サイクルを使用して得られ、各サイクルは変性、アニーリングおよび伸長からなる3つのステップを含み、各サイクルは、3分以内、好ましくは2分以内、さらには1分以内に実施される。別の実施形態において、ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド分子からの蛍光シグナルの測定は、各限局部位に対するバックグラウンドシグナルの測定および各限局部位に対する蛍光シグナルからのバックグラウンドシグナルの減算をさらに含む。好ましくは、バックグラウンドシグナルは、捕捉分子が結合している限局部位の周りの局所的バックグラウンドである。好ましくは、deLonguevilleら、2002、Biochem.Pharmacol.、64、137-149頁によって記載の通り、スポットの定量化および/またはデータ分析が実施される。好ましい実施形態において、シグナル値の分析は、増幅前または最初の10増幅サイクルのうちの1サイクルで撮影された画像参照画像の画素値によって補正された画素値を有するマイクロアレイ画像で実施される。好ましくは、画像補正後のシグナル/バックグラウンド比は、2、好ましくは5、さらには10倍に高められる。好都合なことに、画像補正後のバックグラウンドシグナルは、65000階調のグレースケールで500未満、さらには200未満である。また利点として、スポットの局所的バックグラウンド内の画素値の標準偏差は、画像補正後には多くとも1/2未満、さらには1/5未満である。参照画像は、所与のデバイスのマイクロアレイ画像であり、その画像は検出対照またはハイブリダイゼーション対照のような全ての参照スポットを含むが、標的に関連するスポットは陰性であり、ブランクと見なされている。標的スポットは、実験の開始前または増幅標的の濃度がまだ低くすぎてスポットのシグナルを得られない数サイクルにおいて陰性である。好ましくは、最初のサイクルはサイクル1であり、サイクル5まではまだサイクルの1つであり、サイクル10まではまだサイクルの1つである。具体的な実施形態において、参照とはいくつかの画像の合計または平均のような、最初の数サイクルに由来するデータの結果である。試験画像に対して参照画像を減算することにより、具体的な実験においてデバイスから生じた欠損およびほとんどの非特異的シグナルを補正できる。好ましくは、グリッド化は初期のサイクルの画像によって画像を補正した後に実施される。好ましくは、検出器と比較したマイクロアレイ表面の位置は、所与の実験に必要な各画像の間一定に保たれている。また好ましくは、画像のグリッド化調整は一度だけ実施され、1回の実験の間、特定のデバイスで撮影される各画像に対して同じグリッド化パラメータが使用される。次いでデバイスの位置が検出器の位置と比較して固定される。さらに好ましい実施形態において、シグナル値の分析がマイクロアレイ上で実施され、増幅サイクルnのマイクロアレイ画像の画素値が増幅サイクルn-1のマイクロアレイ画像の画素値に加算される。好ましくは、分析は連続したサイクルの画像から生じるデータで実施される。好ましい実施形態において、異なる画像の画素値が加算され、得られた累積スポット値は溶液中の所与の標的の状況に対する測定と見なされる。好ましい実施形態において、累積スポット値が増幅サイクルと共にプロットされて、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子が検出および/または定量化される。好ましくは、累積スポット値は増幅サイクルと共にプロットされ、ならびに/またはカットオフCt値の決定および標的の定量化に使用される。標的の定量化定量化は、マイクロアレイのハイブリダイゼーション収量および検出尺度標的および参照配列に対して同一であるだけでなく、抽出、増幅またはコピーおよび標識ステップも考慮に入れなければならない。好ましい実施形態において、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の定量化は、異なる位置のシグナル値を固定値と比較することによって得られる。別の実施形態において、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の定量化は、固定値CTに到達するのに必要な増幅サイクル数を参照ポリヌクレオチド分子のCTと比較することによって得られ、好ましくは参照ポリヌクレオチド分子は同じ溶液中で増幅され、標的ポリヌクレオチド分子と同じマイクロアレイ上で検出されるポリヌクレオチド分子である。別法として、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の定量化は、固定値CTに到達するのに必要な増幅サイクル数を標準曲線と比較することによって得られ、CT値が標準濃度に対してプロットされている。別の他の実施形態において、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の定量化は、少なくとも2サイクルの増幅サイクルのシグナルの速度定数を比較することによって得られる。別の実施形態において、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子のコピー数の定量化は、標的ポリヌクレオチド分子のシグナル値を、既知のコピー数で予め定められた数の標準ポリヌクレオチド分子を増幅溶液に添加して得られるシグナル値と比較することによって得られる。好都合なことに、標準ポリヌクレオチド分子は、初発生体試料にまたは抽出ステップの後に添加され、同じプライマーを用いて増幅またはコピーされ、ならびに/または標的ポリヌクレオチド分子と同一の長さおよびGC含有量もしくは20以下しか異ならない長さおよびGC含有量を有する。好ましくは、標準ポリヌクレオチド分子のハイブリダイゼーション収量その特異的捕捉分子に対するは、標的ポリヌクレオチド分子のハイブリダイゼーション収量と同一、または20以下異ならない。具体的には、標準ポリヌクレオチド分子は、文書WO98/11253その全体を本明細書において参照により本明細書に組み込むに見られる内部標準の特性を有する競合内部標準として設計されている。そのような標準の使用に基づく定量化は、WO98/11253にも記載されている。前記標準ポリヌクレオチド分子、外部および/または内部標準はおそらく、本発明による異なるステップを実施するために必要な全ての媒体および手段ハイブリダイゼーションおよび培地、ポリメラーゼおよび他の酵素、標準配列、標識分子などと一緒に本発明によるキットに含まれても有利である。デバイスおよびキット好ましくは、本発明による工程は、本発明の方法を実施するための手段および媒体を含む、生物学的生物または生物の一部を特異的に同定する診断および/または定量化キットを使用して実施される。具体的には、好ましいキットは、本発明の方法によるフローチップデバイス、プライマー、dNTP、DNAポリメラーゼおよび緩衝液を含めた増幅用試薬を含む。プライマーおよび/またはdNTPは、増幅された産物を標識するために、蛍光色素で標識された増幅前駆体を含む。特に好ましい実施形態において、デバイスは独立して加熱される分離された4つの領域を含む。1つの領域は85から100°C、好ましくは95°Cから99°Cの温度でPCRの変性ステップに専用であり、第2領域は37°Cから70°C、好ましくは50°Cから65°Cの温度でアニーリングステップに専用であり、第3領域は60°Cから80°C、好ましくは68°Cから75°Cの温度で伸長ステップに使用されている。第4領域は、他の3領域のうちの1つのサイズを変えるためにどんな温度でも加熱される領域である。薄い流路はデバイスの4つの領域を通過し、この水路は1mm2、好ましくは0.25mm2の断面および各領域に特異的な長さを有する。流路の全体積は、2mLから20μL、好ましくは300μLから100μLである。好ましくは、水路のサイズは、第1領域において全流路サイズの約5-40、好ましくは10-30など例えば約25であり、第2領域において約10-60、好ましくは20-50など例えば約35であり、第3領域において約10-50、好ましくは約15-40など例えば約25であり、第4領域において0から約40、好ましくは0から30など例えば約15である。第2領域も水路に接続されている検出チャンバーを含有する。この検出チャンバーはスポットされているマイクロアレイを含有する。好ましくは、流路が配置されている基体は、不透明なポリマーを含む。好ましくは、照射および発光光によって交差される表面を除く検出チャンバーの全ての側面は黒色である、または黒色に色付けされている。具体的な実施形態において、溶液と接触しているフローチップデバイスの表面は、シクロオレフィンまたはエラストメリックポリマーにある。好ましくは、シクロオレフィンポリマーは、Zeonex登録商標もしくはZeonor登録商標ZeonChemicals、Louisville、USA、Topas、Udel、RadelまたはTHVから選択される。さらに別の具体的な実施形態において、検出チャンバーを含む温度領域の表面は温度領域の全表面の少なくとも40である。キットの好ましい実施形態において、捕捉部分の特異的な配列の長さは、約10から600塩基、好ましくは15から50塩基、より好ましくは15から40塩基からなる。キットの好ましい実施形態において、捕捉分子の特異的な配列捕捉部分は、その対応する標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ、少なくとも6.8nmのスペーサー部分によって固体支持体の表面から分離されている15から50塩基の配列を有する。キットの別の実施形態において、スペーサー部分は20塩基超、好ましくは40塩基超、より好ましくは90塩基超のヌクレオチド配列である。スポッティング溶液中に約600から約3,000nMの捕捉分子濃度が好ましい。しかし、好ましい状況共有結合固定の収量が高いときまたは検出される標的が一本鎖であり高濃度で存在するときでは、約100nMの低濃度でもまだ陽性結果が得られる。そのような低いスポッティング濃度は、1cm2につき20フェムトモルの低い捕捉分子密度に相当する。一方、より高密度は、捕捉溶液の濃度によってアッセイが制限されるだけだった。3,000nMより高い濃度は、優れた結果を与える。本発明によるキットにおいて、捕捉分子は、不溶性固体支持体上の1μm2から75mm2、好ましくは0.005から0.2mm2の表面部位を有する限局部位内に存在する。好ましい実施形態において、マイクロアレイは1cm2につき少なくとも20、好ましくは50、さらには100個超の限局部位を含有する。好ましくは、マイクロアレイは約1000個の限局部位またはより少ない限局部位を含有することになる。マイクロアレイは固体支持体の少なくとも0.1、より良くは1、さらに良くは少なくとも4cm2の表面を覆っている。一般に、マイクロアレイは約10cm2の表面領域またはより少ない表面領域を覆っている。具体的な実施形態において、支持体および/またはチャンバー材料はガラス、電子デバイス、シリコン支持体、プラスチック製支持体、シリカ、金属およびその混合物からなる群から選択され、前記支持体は準備されたスライド、ディスク、ゲル層およびマイクロビーズからなる群から選択される形式で準備される。なお特定の実施形態において、支持体および/またはチャンバー材料は、シクロオレフィンポリマー、好ましくはZeonex登録商標もしくはZeonor登録商標ZeonChemicals、Louisville、USA、Topas、Udel、RadelまたはTHVを含む。好ましくは、フローチップデバイスは使い捨てデバイスである。好ましくは、温度制御装置および調整装置、例えば加熱器および/または冷却器は、そのようなデバイス、特に使い捨てデバイスの一部でない。他の実施形態において、加熱器または冷却器はデバイスの一部である。具体的な実施形態において、デバイスは、例えば増幅溶液を調製するすなわちサンプルを調製するための追加的な区画を含む。また好ましくは、液体輸送システムまたは輸送システムの一部例えばポンプは、使い捨てデバイスの一部でない。いくつかの実施形態において、液体輸送システムはデバイス内に含まれる。好ましくは、検出チャンバーの温度領域の構造または様式は、温度制御および調整システムの加熱器および/または冷却器の構造または様式に反映されている。また好ましくは、デバイスは熱伝導および/または断熱表面の様式を有する。装置好ましい実施形態において、本発明の方法を実施するための装置は、流路を通して液体を輸送し、デバイス内部に溶液の循環を作るために作動的に配置されたシステムを含む。好ましくは、このシステムは、ポンプ、圧縮素子、磁気ビーズなどまたはその組合せを含む。なお好ましい実施形態において、流路内の液体フローの速度は6μL/分から3000μL/分、好ましくは50から500μL/分からなる。好ましい実施形態において、装置は、好ましくは熱検出器、蛍光検出器または光吸収検出器であるフローチップセンサーを含む。好ましくは、フローチップセンサーはフローデバイス上に固定され、温度、光学密度、光散乱、蛍光、屈折率および電気抵抗を含むがこれらに限らない物理的なパラメータを記録できるセンサーである。センサーシグナルが装置によって分析されて、液体の存在または運動と関連した変化が検出され、好ましくは溶液の頭部の流れおよび/または通過の間の移行相が検出される。好ましくは、検出チャンバー内に液体が存在するタイミングは、フローチップ上のセンサーの位置、シグナルが変化するタイミングおよび液体の流速を含めた異なるパラメータの分析から導き出される。液体の体積を使用して、液体が検出チャンバー内に存在する継続時間を決定する。紫外線光による流路の照射下にDNAの吸光度を使用して流れの速度を決定する例が、GB2433259に表示されている。好ましくは、サイクル数は、センサー位置での液体の通過と関連付けて時間と共に記録しているセンサー内の変動数を計数することから得られる。なお具体的な実施形態において、フローデバイス内の液体の位置は、アッセイのタイミングおよびデバイス内の液体フローの速度から算出される。流束の速度は、デバイス内のフロー位置を算出するために領域の温度に対して時間および距離に照らして補正される。好ましい実施形態において、フローチップデバイスの異なる温度領域は、好ましくは空気層を含む二重分離によって互いに分離されている。好ましくは、加熱システムはペルティエデバイス、抵抗加熱器、熱交換器および酸化薄インジウム素子からなる群から選択される。好ましくは、増幅ステップの異なる領域は、領域の両側、一方はフローチップ領域の下側に他方は上側に位置する加熱工程によって囲まれている。検出チャンバーは、チャンバーの一方の側によって最も良く加熱され、他方の側はマイクロアレイの照射のために開けられている。具体的な実施形態において、アニーリング領域は検出チャンバーと同じであり、検出用として光照射ビームをマイクロアレイに到達させるという方法でアニーリング領域を覆っている加熱器素子の一方が切り取られている。具体的な実施形態において、単一の温度制御装置が全ての温度領域の温度を調節している。代替的な実施形態において、温度制御装置が複数個の温度制御装置の1つであり、各温度制御装置が1つの温度領域の温度を別々に調節している。温度制御装置は、変性、アニーリングおよび伸長ステップを含むPCRを得るために少なくとも2つの異なる温度領域に温度を調節できる。好ましくは、加熱システムは、以下の妥当な構成部分の最も単純な変形で構成されている:熱電対、伝達物質、変換器および加熱器。加熱システムは、デバイスの各温度領域で実質的に一定の温度を発生して、正確に増幅および/またはハイブリダイゼーションできることを目指している。各温度領域において発生した温度は、増幅工程の間実質的に一定に保たれている。熱電対は、加熱される領域のできるだけ近くに定着し、伝達物質を考えた温度を測定する。この温度情報は、変換器を経てコンピュータに出力される。ソフトウェアは、毎秒など通常の間隔で測定された実際の温度を、最終利用者によって要求された設定温度と比較する。測定された温度が要求された温度より高い場合、単に加熱器が止められる。測定された温度が設定点より低い場合、システムは加熱工程を続ける。好ましくは、加熱冷却システムにより、1°C未満、より好ましくは0.25°C未満の温度変動にできる。好ましくは、検出チャンバーの表面上の熱の均一性は、少なくとも1°C好ましくは少なくとも0.1°Cである。好ましくは、温度の精度は0.5°Cより良く、好ましくは0.1°Cより良い。加熱システムに加えて、検出は、結合している標識された標的ポリヌクレオチド分子からのシグナルを測定するための照射光源および検出器を必要とする。好ましくは、光源は光線を発生して、反応チャンバーの平面に結合された結合している標識された標的を励起する。検出は、分析されるマイクロアレイによって覆われている全表面上で同じ検出効率を得るような方法で安定させなければならない。この文脈において使用される典型的な検出器は、マイクロアレイ全体の写真を撮影できるCCDカメラである。好ましい別の実施形態において、光学的システムの分解能は、0.1ミクロンから500ミクロン、より好ましくは10から100ミクロンである。好ましい実施形態において、励起光は好ましくは635nm±5nmの波長を有する赤色レーザーダイオードである。レーザーダイオードは、例えば10から35°Cからなる温度で作動し、10から2000mWの出力を有するPearl商標2W639nmである。歪を減らすために、好ましくは、レーザーは低温発光成分を有する。好ましくは、照射はマイクロアレイの下側から来る。好ましくはまた、レーザー光は固定されている捕捉分子を有する平面に対して垂直/-10°である。好ましくは、レーザー光と平面との間に鏡が設置されて、直線ビーム長が減じられる。好ましくは、非特異的な励起と発光との重なりを避けるために、スペクトル線幅は最大5nm、さらには3nmである。好ましくは、光線はマイクロアレイの全表面、好ましくは例えば20×10mmの表面を均一に照射する。照射の均一性は、全表面の少なくとも95に渡り、さらには少なくとも98に渡るべきである。さらに別の実施形態において、レーザーがマイクロアレイ表面をスキャンする。近似ガウスプロファイルは、空間フィルタもしくは単一モード光ファイバーとのカップリングによって、または別法としてDPSSなどの固体レーザーを使用して得られる。好ましくは、光源によって発生されたレーザー光は、ほとんど平行であり近似ガウスである。好ましい実施形態において、光屈折素子または光拡散素子などの光学素子が使用されて、全マイクロアレイ表面に渡って照度が均質化されている。交換可能な励起フィルタを使用して対象の波長だけを集光している。好ましくは、追加的なフィルタホイールが設置され、減衰フィルタとして使用されて、レーザー強度が正確に調整されている。このフィルタホイールは、可変的な既知の吸収レベルとは異なって遮られている。反射防止コーティングされているレンズを使用して、反応チャンバーの平面上にレーザー光を合焦させる。好ましい実施形態において、検出器は光学レンズを含む。放射光が光学レンズを通して検出器に合焦されて、その中に存在する光子の数が検出される。好ましくは、検出器は冷却CCDカメラである。好ましくは、カメラは単色CCDである。好ましくは670nmである発光波長で最大量子効率を得るために、カメラが選択される。好ましくは、670nmでのCCD量子効率は少なくとも20、好ましくは少なくとも50である。好ましくは、画素サイズは8から24μmの間にある。CCDセンサー領域は1:1の比率および最高の画像視野を得るために、少なくとも20×10mmである。好ましくは、CCDカメラは、フルフレームカメラである。好ましくは、十分な定量化レベルを得るために、画像のデジタル化は少なくとも12ビット、より良くは少なくとも14ビットである。リアルタイム定量化を可能にするには、好ましくは、露出時間は少なくとも1秒間であり、好ましくは10秒未満、なお好ましくは5秒未満およびより良くは3秒未満である。好ましくは、鏡が避けられて、塵の蓄積および写真の悪化を防いでいる。好ましくは、レンズは大きなイメージサークルすなわち直径43.2mm、大きな開口部:f/2.8からf/16、短い焦点距離すなわち40mm、10cm未満の接写能力といった特徴を有しており、1:1のサイズ比に適している。特定の実施形態において、約665nmより長い波長を有する光を透過する発光フィルタが追加される。好ましくは、発光フィルタはレンズ上またはレンズ近くに設置されている。好ましくは、発光フィルタは低域通過を備える帯域通過、カットオン周波数665nm、カットオフ700nm、帯域幅内の透過率0.8T超、帯域幅外の透過率0.001T未満、500から665nmの透過率0.0001T未満、帯域幅精度±3nmといった特徴を有する。好ましい実施形態において、照射光源は反応チャンバーの平面に直接合焦されている励起光を生み出し、励起光は45から135°に含まれる角度の範囲でマイクロアレイ表面に到達する。好ましくは、励起光は約90°の角度で、したがって垂直に支持体の表面に到達する。法線に照らして算出した場合、この角度は約0°になる。したがって、励起光は、エバネセント波によって得られるような光の内面反射を誘導しない角度の範囲で反応チャンバーの平面に到達する。好ましい実施形態において、検出はWO2009/013220に記載の禁制角度法を使用して実施される。フローチップデバイス装置に設置されているは、屈折率1.30超、厚さ少なくとも0.5mm、好ましくは少なくとも3mmを有する光学的に透明な固体支持体の表面上に固定化されている捕捉分子を含み、前記固体支持体は、上に捕捉分子が固定化されている支持体の表面S1に対して傾斜している2つの表面S2およびS3を有しており、一方の表面S2は光学的に透明であり捕捉分子の限局部位から放射される光を禁制角度θobinで集光するために使用され、固体支持体表面と対比して90から60°の間の角度まで傾斜しており、向かい合っている他方の表面S3は黒色であるまたは黒色になる色で覆われているまたは放射光の波長に対応する吸収を有する色で覆われており、デバイスが装置上に置かれて、禁制角度θobinで放射される光が傾斜表面S2を通して検出器に達している。好ましくは、観察角は臨界角プラス10°、好ましくはプラス5°、より好ましくはプラス3°の範囲内である。好ましくは、カメラは、支持体の側面に対する法線と対比して0°>θobout>θcoutでありθcout=Arcsinn1/n3cosθcとなるような固定観察角θoboutで装着されている。n1が光学ブロックの屈折率の場合、n2は溶液の屈折率、好ましくは水溶液n2約1.33であり、n3は空気の屈折率である。別の実施形態において、シグナルは結合している標識された標的ポリヌクレオチド分子からの、照射に応答した散乱光である。他の実施形態において、シグナルは結合している標識された標的ポリヌクレオチド分子からの、照射に応答した光回折の結果である。好ましい実施形態において、入射光源、固体支持体および検出器は、検出の間互いに相対的に動かない。これは、最も単純なシステムである。CCDカメラは、固体支持体表面から放射される光を一回の取得で集光する。増幅および検出の加熱工程は、集積化されたシステムにおいて実施される。実施例5に記載される具体的な機器において、光源は、熱安定化されたヒーターと接触している表面と向かい合う支持体の表面に向けられる。本発明はまた、サンプル中に存在する可能性がある微生物もしくは生物の一部を、主に診断および/または定量化するための工程の様々なステップを実施するのに必要な機械および装置であって、aマイクロアレイによる特異的な位置で不溶性固体支持体表面に結合している捕捉分子、b熱調節のためのデバイス、cアンプリコンと捕捉分子との結合位置で形成されるシグナルを検出するためのデバイス、およびdシグナルをデジタルデータに変換するためのコンピュータプログラムを含む機械および装置を包含する。好ましい実施形態において、装置は、-異なる測定のデータを格納するための記憶装置、-照射、検出および記憶のステップを繰り返す制御装置、-フローチップデバイス内の液体の位置を決定するフローチップセンサーのデータ分析、-データを処理して、増幅の前に溶液中に存在しているポリヌクレオチド分子の量を検出および/または定量化するためのプログラムも含む。別の実施形態において、さらにコンピュータプログラムは、シグナルが形成されるマイクロアレイの位置を認識する。装置において、好ましくは、捕捉分子はマイクロアレイの位置で不溶性固体支持体に共有結合している一本鎖の捕捉分子であり、前記捕捉分子は10から600塩基の捕捉部分を含み、前記捕捉部分は前記アンプリコンに特異的に結合できる。装置は、好ましくは、比色分析、蛍光、時間分解蛍光、光熱干渉コントラスト、レイリー散乱、ラマン散乱、表面プラズモン共鳴、質量変化、水晶振動子マイクロバランス、カンチレバー、微分パルスボルタンメトリ、非線形周波発生分光法による化学的地図製作、光学的変化、抵抗度、静電容量、異方性、屈折率および/またはナノ粒子計数からなる方法群から選択される検出器を有する。具体的な実施形態において、蛍光スキャナは共焦点スキャン法、さらに好ましくはピンホールを含めたレーザー光を使用する。具体的な実施形態において、装置は、熱サイクルの定義済みのタイミングに支持体の少なくとも5つの異なる位置に対する異なる測定からのデータを格納するための記憶システム、マイクロアレイの各位置に対する少なくとも1回の熱サイクルにおいて少なくとも1回の検出および記憶ステップを繰り返す制御装置、および/または少なくとも1回の熱サイクルにおいて得たデータを処理して、増幅の前にサンプル中に存在しているヌクレオチド分子の量を検出および/または定量化するためのコンピュータプログラムをさらに含む。具体的な実施形態において、装置は、レーザー光源、前記レーザー光源によって生み出されるレーザー光用の合焦デバイス;光電子増倍管およびピンホールをさらに含む。別の実施形態において、装置は、ある位置で形成されたシグナルを特定の標的の存在と関連付けられるデータに変換するためのコンピュータプログラムをさらに含む。特定の実施形態において、装置は、遺伝子、DNAおよびポリヌクレオチド配列を増幅および検出するための多機能装置であり、その装置はPCR増幅、ポリヌクレオチド検出、リアルタイムPCR、定量化リアルタイムPCR、マイクロアレイ検出および/または定量化ならびにSNP検出を実施する。図9のフローチャートは、リアルタイムPCR装置がプログラム可能なコンピュータによって制御されている実施形態について記載している。検出器は、レーザーによって照射されている間にマイクロアレイの写真を撮影するための高感度CCDカメラであり得る。対照は実施例7および図10に作られている。ステップ1において、利用者は、-CCDカメラの露出時間、-光源のレーザー強度、-変性温度、-アニーリング/ハイブリダイゼーション温度、-伸長温度、-ポンプの速度、-液相または気相における検出または画像取得、-増幅サイクルの継続時間またはセンサーによって計数される増幅サイクルの決定、-検出器によってマイクロアレイの画像が取得される時点などの必要なパラメータを記入するよう指示される。異なるパラメータの説明:CCDカメラの露出時間は、検出チャンバー内のマイクロアレイの写真を撮影する時間に対応する。5秒の露出時間が、実施例7において使用されている。レーザー強度は、検出チャンバー内のマイクロアレイを照射するための光源の強度を定義する。実施例7において、2Wの高輝度レーザーが使用されている。PCR増幅の3つの温度は、以下の方式で設定される。1.変性温度機器において、第1加熱ブロック上部および下部の温度は、PCRの変性ステップに対応する固定値に設定されている。その結果、カートリッジの変性の温度領域は変性温度へと加熱される。変性温度は、85から100°C、好ましくは95°Cから99°Cからなる。実施例7において、95°Cが変性温度として使用されている。2.アニーリング/ハイブリダイゼーション温度機器において、第2加熱ブロック上部および下部の温度は、PCRのアニーリング/ハイブリダイゼーションステップに対応する固定値に設定されている。その結果、カートリッジのアニーリング/ハイブリダイゼーションの温度領域はアニーリング/ハイブリダイゼーション温度へと加熱される。アニーリング/ハイブリダイゼーション温度は、37°Cから70°C、好ましくは50°Cから65°Cからなる。実施例7において、58°Cがアニーリング/ハイブリダイゼーション温度として使用されている。3.伸長温度機器において、第3加熱ブロック上部および下部の温度は、PCRの伸長ステップに対応する固定値に設定されている。その結果、カートリッジの伸長の温度領域は伸長温度へと加熱される。伸長温度は、60°Cから80°C、好ましくは68°Cから75°Cからなる。実施例7において、72°Cが伸長温度として使用されている。各加熱ブロックは、アルミニウム素子の内側に設置された熱電対によって熱的に調節されている。電子デバイスを調節している外部PIDOMRONは、一定間隔で加熱抵抗に電力を送って所望の温度を維持した。各加熱アルミニウムブロックに空気パルスラジエータが接続されて、必要なときに妥当な時間で温度を下げられるようにした。場合によっては、他の3領域のうちの1つのサイズを変えるために所与の温度で加熱される追加の温度領域がデバイスに組み込まれる。ポンプの速度は、カートリッジ内の流速を定義する主要なパラメータの1つである。実施例7において、ポンプ速度は13rpmに設定されている。水路断面、カートリッジの異なる温度領域温度が調節されている内部の水路長および検出チャンバーV2の体積によりデバイス体積V1V2の算出が可能になる。ポンプの速度は流速、したがって各増幅ステップ変性、アニーリング/ハイブリダイゼーションおよび伸長の継続時間を定義している。例えば、クレジットカードの寸法80mm×50mm×2mmを有する図4に規定されている集積化フローチップデバイスは、4つの異なる温度領域領域1:20cmの長さの水路、領域2:40cmの長さの水路、領域3:15cmの長さの水路および領域4:20cmの長さの水路の内部に流路水路断面:500μm×500μmおよび領域2に相互接続された検出チャンバーを含む。13rpmのポンプ速度の場合、4つの温度領域を通って循環を完了する継続時間は約90秒かかる。好ましくは、1サイクルの継続時間は、所与の動作パラメータを使用するシステムの標準化または較正によって予め決められている。デバイスの全体積V1V2と比較してカートリッジに導入される溶液の体積V3に応じて、カートリッジ内に2つの相気相/液相または1つの相液相だけが存在することになる。気相の存在は、フローチップデバイスに導入された溶液の体積V3がデバイスの全容積V1V2より少ないことを意味している。検出は、液相または気相で実施される。デバイス内の気相の存在は、増幅サイクルの数変性、アニーリング/ハイブリダイゼーションおよび伸長を含むの決定を実験的に可能にする。サイクルの計数は、例えば流路の特定の位置で気相から液相への変遷を検出する熱電対プローブによって実施される。ポンプの速度、およびプローブによって制御される水路の断面に溶液が到達するタイミングを知ることによって、液相または気相のいずれかにおいてマイクロアレイの画像の取得を実施できる。プローブでサイクルを計数する代わりに、流路断面、カートリッジの異なる温度領域温度が調節されている内部の流路長およびポンプ速度などのフローチップデバイスの特徴によって、サイクルの継続時間を算出することもできる。CCDカメラによってマイクロアレイが検出される時点は、利用者がアレイの画像を取得したい時点を定義している。それは、毎サイクル1回もしくは数回またはセンサーによって計数される予め決められたサイクル数のいずれかまたはサイクル継続時間に対応して予め決められた間隔である。実施例7において、検出チャンバーが気相であったとき、画像取得はセンサーによって決定される2、5、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39および40サイクルで実施される。このパラメータは、増幅の間に検出器によって取得される画像の数を定義している。ステップ2において、システムは初期化される:機器の重要なパラメータが確認される:加熱ブロックの温度、照射光源のレーザー強度、CCDカメラの温度、センサーおよびポンプ速度。ステップ3において、機器内の第1加熱ブロックの所定の変性温度への加熱が起こる。フローチップデバイスにおいて、変性の温度領域は変性温度に加熱される。同じことがアニーリング/ハイブリダイゼーションおよび伸長温度に対して起こる。ステップ4において、フローチップデバイスの変性領域を通して液体が流され、変性が起こる。場合によっては、ポンプ速度を下げて、最初の増幅サイクルの変性時間を最大化する。ステップ5aにおいて、アニーリング/ハイブリダイゼーション領域を通して液体が流される。プライマーのアニーリングおよびマイクロアレイ上への標的アンプリコンのハイブリダイゼーションが起こる。ステップ5bにおいて、場合によってはプログラムにしたがって、マイクロアレイの画像が所与の増幅サイクルに検出器によって取得され、取得した画像が収集されて、支持体上に存在している各標的に対するシグナルおよびバックグラウンド値が定量化および抽出され、サイクルワイズのデータ分析が実施される。ステップ6において、伸長領域を通して液体が流されて伸長ステップが実施される。ステップ7において、増幅サイクルが決定される。センサー例えばプローブ熱電対を用いてサイクルを計数することによって、増幅サイクルも実験的に決定される。センサーデータが記録され、データが分析されてサイクル数が決定される。別法として、検出チャンバーを含むフローデバイスの体積およびポンプ速度により、増幅サイクルの継続時間が理論的に決定される。サイクル継続時間は、溶液が流路および検出チャンバーを通って循環を完了するための時間である。さらに別の算出モードにおいて、増幅サイクル時間は公知であり、システムパラメータの一部である。取得されるべき数の画像取得が達成されない場合、続いてプログラムサイクルはステップ4に戻る。取得されるべき数の画像取得が達成された場合、ステップ8が起こる:結果の全体的検査によってデータ分析が完了され、データ分析は結果の報告を含む。データ分析はスポット位置を決定し、所与の標的に対するスポットと関連した値を決定するためのアレイ表面画像の処理を含む。好ましくは、定量化は様々な補正、Ct値の決定および出発溶液中に存在する標的の定量化も含む。アレイ分析のための異なる方法は、標的の定量化のためにリアルタイムPCRのデータを処理する方法と同様に公知であるdeLonguevilleら、2002、Biochem.Pharmacol.64、137-149;Meneses-Lorenteら、2003、Chem.Res.Toxicol.16、1070-1077;Hamelsら、2001、Biotechniques、31、1364-1372;WO02/097135およびUS2004/0161767を参照のこと、参照として本明細書に導入した。本発明は、以下の非限定的な実施例でさらに例示される。[実施例1]:フローチップデバイスのマイクロアレイ上で検出される単一リアルタイムPCR使い捨てプラスチック製カートリッジ、可撓性チューブ参照:C-flex06422-2;Cole-Palmer、Vernonhills、IL、USA、ポンプチューブ参照:049ef0a-051、Watson-Marlow、Stockholm、Sweden、および検出チャンバーの組合せによって第1のフローチップデバイスが準備されて、密閉水路ループが作製された。使い捨てプラスチック製カートリッジは、成形および溶接されて1mm2の断面を持つ水路が作製された2片のTopasプラスチックでできていた。3つの異なる水路長:30cm長い、20cm中間および10cm短いを持つ3つのそれぞれ異なる使い捨てプラスチック製カートリッジ長い、中間、短いがあった。使い捨てプラスチック製カートリッジは、可撓性チューブに接続できる内側開口部および外側開口部を有した。検出チャンバーは楕円形を有し、7mm幅×20mm長さ×100μm高さであった。検出チャンバーは、上側を厚さ1.5mmの黒色のプラスチック製囲いによって、底側を厚さ3.5mmの光学ブロックによって密閉された。検出チャンバーは約10μLの溶液を保持するように設計された。光学ブロックは、光学的品質のZeonexであった。表面は、かき傷および塵を回避して完全に平滑で平坦であった。光学ブロックは、表面上にエポキシ基を生成するためにプラズマ処理によって活性化されたP2i、Abingdon、UK。捕捉ヌクレオチド配列は、自家製ロボットデバイスを用いて直径250μmのピンを使用して光学ブロック表面上に印刷された。スポットは直径400μmを有し、分配された体積は約0.3nLであった。光学ブロックは室温で乾燥され、検出チャンバー上にレーザー溶接され、使用されるまで20°Cで保管された。光学ブロックの観察側とは向かい側の側部は、黒い塗装で覆われた。フローチップデバイスは、以下の通り準備された。デバイスは4つの領域を含有した:領域Aは、1つの中間プラスチック製カートリッジの内側開口部に付着した15cmの可撓性チューブで作られた。領域Bは、一方の末端が領域Aプラスチック製カートリッジの外側開口部に、他方の末端が検出チャンバーの内側開口部に固定された10cmの可撓性チューブで作られた。検出チャンバーの外側開口部は5cmの可撓性チューブで固定され、次いで1つの長いプラスチック製カートリッジに5cmの可撓性チューブが続いた。領域Cは、22cmの可撓性チューブで作られた。領域Dは、領域Cの可撓性チューブの末端および領域Aの可撓性チューブの起端に接続されて閉鎖ループを作っているポンプチューブ049.EF0A.051、Watson-Marlow、Stockholm、Swedenで作られた。フローチップデバイスは領域Dおよび領域Aの接合部で開口でき、フローデバイスへの溶液の導入が可能になる。一旦、液体がフローチップデバイス内になると、このデバイスは密閉され、ポンプチューブが蠕動ポンプSerie100、Watson-Marlow、Stockholm、Swedenに導入され、液体はフローチップデバイスの閉鎖ループ内を流れることができた。流路および検出チャンバーを含めたフローチップデバイスの全容積量は2mLであった。フローチップデバイスは、フロー機器の内側に設置された。この機器は、異なる温度99°C、58°Cおよび72°Cで独立に加熱される3つのアルミニウム区域で作られた。フローチップデバイスの領域Aは、99°Cに加熱されたアルミニウム区域に設置され、領域Bは58°Cの区域および領域Cは72°Cの区域に設置された。フローチップデバイスとアルミニウムブロックとの熱的接触は、アルミニウム表面とフローチップデバイス底面との間に吸熱化合物DowCorning340、DowCorningGMBH、Wiesbaden、Germanyの層を使用して作られた。禁制角度を使用して検出チャンバー内のマイクロアレイの写真を作るために、検出チャンバーはレーザーの上、カメラの前に正確に設置された。フローチップデバイスの周りの熱を保つために、3つの加熱区域の上に、3つのアルミニウムカバーが設置された。検出チャンバーの光学ブロック上にスポットされたマイクロアレイは、400μmが9X19スポットであり、Cy5標識されている検出対照、5’末端アミノ-ポリヌクレオチドのスポットを含有した:検出対照:配列番号15’NH2-TACCTACTACGCTACACGAACCTACAAGACAAGATAAAGACAGACTCATG-3’Cy5。この標識された捕捉プローブは、500nMの濃度でスポットされた。マイクロアレイは異なる配列に特異的な未標識の捕捉分子も含有し、これら捕捉分子の1つは捕捉部分およびスペーサー部分下線を引いたを含む標的GUTに特異的である:GUT捕捉プローブ:配列番号25’NH2-TTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAA-3’未標識の捕捉プローブは、12μMの濃度でスポットされた。スポッティングした後、プラスチック製光学ブロックをオーブンの中で湿度下に20°Cで30分間、次いで湿度下に60°Cで30分間設置した。次いでプラスチック製光学ブロックを、SSC2XpH71BSA0.1SDSで1×5分間、H2Oで2×1分間および最終的に熱湯で1×3分間洗浄した。洗浄ステップの後、プラスチック製光学ブロックは室温で乾燥され、検出チャンバーの底部に溶接されてマイクロアレイを含有する密閉された検出チャンバーを作製した。5’末端がOysterで標識されている1対のプライマーを用いて標的GUTを特異的に増幅するために、PCR混合物が調製された。PCR緩衝液1X50mMTaps、95mMTris-HCL、2mMMgCl2、0.05BSA、各々1μMの1対のプライマー5’Oyster-GGGACCCTCGCCCAGAAAC-3’配列番号3および5’-CCACCTGCTGACCCCGTC-3’配列番号4、1U/50μLSupersaltTaqポリメラーゼ、200μMdATP、200μMdCTP、200μMdGTP、100μMdTTPおよび300μMdUTPならびに100コピーのGUT標的DNAを含有するPCR混合物500μLが調製された。WO2009/086608に提示されているように、1XPCR緩衝液はグルタミン酸塩およびデキストランも含有した。このPCR混合物400μLが99°Cで5分間インキュベートされ、その後フロー機器内側のフローチップデバイスに入れられ、以下のプログラムを用いて処理された:99°Cの変性ステップ、58°Cのアニーリングステップおよび72°Cの伸長ステップを含む1分20秒を40サイクル。検出チャンバーが液体を含まないときに、0、10、15、20、25、30、35および40サイクルに禁制角度内で光学ブロックの側面を通して5秒間の写真が撮影されて、検出チャンバー内のマイクロアレイを検出した。これらの生写真の分析は、MaximDLソフトウェアDiffractionLimited、Ottawa、Canadaを用いて得られ、3スポットGUT捕捉プローブスポット1つ、このスポットの局所的バックグラウンドスポットおよび検出対照スポット1つの生シグナル強度の定量化が実施された。生シグナル強度が、サイクル数に対してプロットされ、結果は図1に提示された。対照として、このPCR混合物100μLがPCRチューブでMastercyclerEppendorf、Hamburg、Germanyで以下のプログラムを用いて処理された:95°Cで5分間それに続いて95°Cで30秒間の変性ステップ、58°Cで90秒間のアニーリングステップおよび72°Cで30秒間の伸長ステップを含む40サイクル、それに続いて72°Cで10分間、その後4°Cの温度に下げる。40PCRサイクルの後、チューブ内で実施されたPCR溶液1μLおよびフローチップデバイス内で作られたPCR溶液1μLが、BioanalyserDNA2000ゲルカートリッジAgilent、SantaClara、Ca、USAにロードされた。GUTアンプリコンに対応しているバンドの強度が測定され、アンプリコン濃度に変換された。データはフローチップデバイスの場合34nMおよびPCRチューブの場合32nMの値を与え、PCR収量が同程度であることを示した。[実施例2]:フローチップデバイス内のマイクロアレイ上で検出されるリアルタイム多重化PCR実施例1に提示されている通りフローチップデバイスが準備された。実施例1の緩衝液中に、S.アウレウスの増幅用プライマー対5’Oyster-TCAGTCTTACCTGCTCGATTC-3’配列番号5および5’-TGCACGTCTAATACCACTCT-3’配列番号6を含有する50nM/75nM標識されたプライマーの場合の16対のプライマー混合物プライマー混合物3.4、1U/50μLSupersaltTaqポリメラーゼ、200μMdNTP混合物dATP、dCTP、dGTP、100μMdTTPおよび300μMdUTPならびに1,000,000コピーのS.アウレウス標的ゲノムDNAを含むPCR混合物500μLが調製された。このPCR混合物400μLが99°Cで5分間インキュベートされ、その後フロー機器内側のフローチップデバイスに入れられ、以下のプログラムを用いて処理された:99°Cの変性ステップ、58°Cのアニーリングステップおよび72°Cの伸長ステップを含む1分10秒を48サイクル。フローデバイスは、2mLの全体積を有し、アニーリング区域に検出チャンバーを含有した。この検出チャンバーは、捕捉部分およびスペーサー部分下線を引いたを含む標的S.アウレウスアンプリコンに特異的な捕捉プローブを含む捕捉プローブの実施例1のようなマイクロアレイを保持している。S.アウレウス捕捉プローブ配列番号7:5’NH2-TTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTATGTTAAGTTATGTGGTGGAATATTCGTTGCCATACCTACCGC-3’検出チャンバー内に液体無しで、サイクル0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45および48サイクルに禁制角度内で、この検出チャンバーの5秒間の写真が撮影された。これらの生写真の分析は、MaximDLソフトウェアを用いて得られ、S.アウレウス捕捉プローブの1スポットに対する生シグナル強度マイナスこのスポットの局所的な生バックグラウンドの定量化がサイクル数に対してプロットされた。結果は図2に提示された。対照として、PCR溶液100μLがPCRチューブでMastercyclerEppendorf、Hamburg、Germanyで以下のプログラムを用いて処理された:95°Cで5分間それに続いて95°Cで30秒間の変性ステップ、58°Cで90秒間のアニーリングステップおよび72°Cで30秒間の伸長ステップを含む48サイクル、それに続いて72°Cで10分間、その後4°Cの温度に下げる。48PCRサイクルの後、チューブ内で作られたPCR1μLおよびフローチップデバイス内で作られたPCR1μLが、BioanalyserDNA2000ゲルカートリッジにロードされた。S.アウレウスアンプリコンに対応しているバンドの強度が測定され、アンプリコン濃度に変換されたnM。データはフローチップデバイスの場合10nMおよびチューブの場合41nMの値を与えた。[実施例3]:フローチップデバイス内のマイクロアレイ上でのシグナル発生およびリアルタイムPCRシグナルの処理P35増幅用の異なるプライマー対を使用して単一PCRが実施されたという違いはあるが、アッセイは実施例1と同様に実施された:-5’Cy5-CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG-3’配列番号8および-5’-TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT-3’配列番号9。この検出チャンバーは、捕捉部分およびスペーサー部分下線を引いたを含む標的P35アンプリコンに特異的な捕捉プローブを含む捕捉プローブの実施例1のようなマイクロアレイを保持している:P35捕捉プローブ配列番号10:5’NH2-ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTAGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATAT-3’PCRは、P35標的DNA1,000,000コピーで実施され、検出チャンバー内に存在する蛍光液体無しで、0、3、6、9、12、18、21、24、27、30、33、36、39および40サイクルに禁制角度内で、マイクロアレイ上の特異的捕捉分子にハイブリダイズしたPCR産物の検出が実施された。異なるPCRサイクルで得られた結合している標的P35のシグナルを示すグラフが図3aに示された。グラフは、1スポットn°2の生値および標準偏差ならびにその局所的バックグラウンドに対する生値および標準偏差を示している。図3bは、MaximDL5ソフトウェアのピクセルマスpixelmath機能を使用してサイクル毎に異なる画像がサイクル3の画像を減算してオフセット1500を加算することによって補正される場合、同じスポットのシグナル値および局所的バックグラウンド値ならびにスポットのシグナルおよび局所的バックグラウンドの標準偏差を示している。減算は画素毎に行われた。[実施例4]:集積化フローチップデバイスの設計フローチップデバイスは、図4に表示される使い捨てのプラスチック製カートリッジであった。そのフローチップデバイスはクレジットカードの寸法80mm×50mm×2mmを有し、4つの異なる温度領域領域1:20cmの長さの水路、領域2:40cmの長さの水路、領域3:15cmの長さ、および領域4:20cmの長さの水路の内部に流路水路断面:500μm×500μmおよび領域2に相互接続された検出チャンバーを含んだ。フロー機器の一部である外部ポンプに、領域1の水路のポンプ開口部および領域4の水路のポンプ開口部を、可撓性ポンプチューブを介して接続した後、液体運動は閉鎖回路であった049.EF0A.051、Watson-Marlow、Stockholm、Sweden。検出チャンバーは六角形の形状を有し、10mm幅×20mm長さ×100μm高さであった。検出チャンバーは、上側を厚さ1.5mmの黒色のプラスチック製囲いによって、底側を厚さ3.5mmの光学ブロックによって密閉された。検出チャンバーは約15μLの溶液を保持するように設計された。光学ブロックは、光学的品質のZeonexであった。表面は、かき傷および塵を回避して完全に平滑で平坦であった。フローデバイスへの溶液の導入は、領域1または領域4のポンプ開口部の一方を通して実施された。一旦、液体がフローチップデバイス内になると、このデバイスは密閉され、ポンプチューブが蠕動ポンプSerie100、Watson-Marlow、Stockholm、Swedenに導入され、液体はフローチップデバイスの閉鎖ループ内を流れることができた。流路および検出チャンバーを含めたフローチップデバイスの全容積量は約240μLであった。フローチップデバイスは、実施例5に記載され、図5および図6に図式的に提示されているフローPCR機器の内側に合うように設計された。[実施例5]:集積化フローPCR機器の設計機器F-RAP機器により、実施例4に記載され、図5および図6に示されている増幅のための熱循環とフローチップデバイス内の液体フローとの両方が可能になった。合計8つの物理的に分離された加熱素子が機器内に存在するように、機器はカートリッジの上下両方に位置する4つの加熱ブロックで構成された。カートリッジの4つの温度領域は各々、表面に熱パッド素子を有する1対の加熱アルミニウムブロックの間に挟まれて、アルミニウムブロックとプラスチック製カートリッジの間の伝導性を改善した。熱源は、アルミニウムブロック内側に設置され電源に接続された加熱抵抗であった。過度の熱勾配を避けるために、各加熱素子はプラスチック構造および薄い空気層によって互いに分離された。アルミニウムブロックはそのブロックが設置されるポリオキシメチレンPOMポケットより意図的に少し小さく作られて、加熱ブロックとその周囲のホルダの間の伝導性を減少させた。各加熱ブロックは、アルミニウム素子の内側に設置された熱電対によって熱的に調節されていた。電子デバイスを調節している外部PIDOMRONは、一定間隔で加熱抵抗に電力を送って所望の温度を維持した。各加熱アルミニウムブロックに空気パルスラジエータが接続されて、必要なときに妥当な時間で温度を下げられるようにした。弱い圧力を使用して加熱素子間のカートリッジを圧迫し、優れた熱的接触を得た。機器は、レンズ付き高輝度レーザー光源nLightPearl商標2W、発光フィルタおよびレーザーによって照射されている間にマイクロアレイの写真を撮影するための高感度CCDカメラKodakKAF6303から構成される光学的検出システムを含有した。レーザー光源がマイクロアレイに到達するように、下からの照射用として1つの開口が下側のカートリッジホルダに作られた。別の開口が照射軸から76°で作られて、マイクロアレイから発せられる放射光をいわゆる禁制角度内でCCDカメラによって検出可能にした。プラスチック製カートリッジ内で流体を移動させるために、チューブの短い断片がカートリッジに接続され加熱システムから突き出した。このチューブは、1から500rpmに制御されているFaulhaberelectricservoDCmotor小さな蠕動ポンプMarlowの内側に設置された。熱電対プローブセンサーがチューブ外面に接続されて、通過している流体が検出された。液体は気相より高い熱エネルギーを伝える、それゆえプローブのレベルを通過するときに、その温度プロファイルにスパイクを示した。この温度変化が記録され、検出チャンバー内の液体のタイミングが算出された。センサーによってサイクル数を計数することもできた。[実施例6]:サイクルに伴う集積化フローチップデバイス内の捕捉プローブ上でのアンプリコンの蓄積この実施例において、フローチップデバイスは、図4および実施例4に提示されている使い捨てのプラスチック製カートリッジであった。そのフローチップデバイスはクレジットカードの寸法80mm×50mm×2mmを有し、4つの異なる温度領域の内側に流路水路断面:500μm×500μmを含む。フローチップデバイスは、図5および図6ならびに実施例5に提示される、F-RAP機器に合うように設計された。機器F-RAPにより、増幅のための熱循環とフローデバイス内の液体フローとの両方が可能になる。この実験の場合、光学ブロックは異なる捕捉プローブでスポットされていた:これらの捕捉プローブの3つは、-検出対照:配列番号1:5’NH2-TACCTACTACGCTACACGAACCTACAAGACAAGATAAAGACAGACTCATG-3’Cy5。この標識された捕捉プローブは、500nMの濃度でスポットされた。-GUT捕捉プローブ:配列番号11:5’NH2-ATTCTTATATCTTTACCTTTTCATCTTAACTACTCTACCTCTCATTTATTGTGCGCCCCAGCCCTCACGGCATGATG-3’-A.バウマニ捕捉プローブ:配列番号12:5’NH2-TTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTATTAATTAACGGTGCTGCTGGTATTGCTGTAGGTATGGC-3’GUTおよびA.バウマニ捕捉プローブは、12μMの濃度でスポットされ、スペーサー部分下線を引いたを含んだ。HybridizationMastermix2.0Eppendorf、Hamburg、Germany、20nMのOysterで標識されたGUT検出プローブ5’Oyster-CATCATGCCGTGAGGGCTGGGGCGCACAGTCAAATTA-3’配列番号13、1nMの精製A.バウマニアンプリコンプライマー:5’Oyster-GCATTCACAACTTCTGTCATG-3’、配列番号14およびプライマー:5’-TACCGAAGTCCGTATGACTAAG-3’、配列番号15を用いて作製されたを含有するハイブリダイゼーション混合物が調製された。このハイブリダイゼーション混合物50μLがフローカートリッジに導入され、次いでそのカートリッジは2つのポンプ開口部をポンプチューブに接続することによって密閉され、F-RAP機器に導入された。4つの下部加熱ブロックカートリッジの温度領域1、2、3および4がそれぞれ95°C、58°C、58°Cおよび72°Cに設定され、上部加熱ブロックカートリッジの温度領域1、2、3および4がそれぞれ95°C、58°C、58°Cおよび72°Cに設定された。熱電対プローブはポンプチューブ72°Cに設定された温度領域の直後に固定され、液体の流れが記録されてハイブリダイゼーションのサイクル数が計数された。ポンプ速度は、13rpmv200に調整された。検出チャンバーが気相のとき、0、1、2、3、4、5、6、10および15サイクルに5秒間の写真が撮影された。これらの生写真の分析は、MaximDLソフトウェアDiffractionLimited、Ottawa、Canadaを用いて得られ、GUT捕捉プローブの1スポットに対する生シグナル強度マイナスこのスポットの局所的な生バックグラウンドの定量化がサイクル数に対してプロットされ、A.バウマニ捕捉プローブの1スポットの生シグナル強度マイナスこのスポットの局所的な生バックグラウンドシグナルの定量化がサイクル数に対してプロットされた。結果は図8に提示された。[実施例7]:集積化フローチップデバイス内のマイクロアレイ上で検出されるリアルタイム多重化PCRこの実施例において、フローチップデバイスは、図4および実施例4に提示されている使い捨てプラスチック製カートリッジであった。そのフローチップデバイスはクレジットカードの寸法80mm×50mm×2mmを有し、4つの異なる温度領域の内側に流路水路断面:500μm×500μmを含む。フローチップデバイスは、図5-図6および実施例5に提示される、F-RAP機器に合うように設計された。機器F-RAPにより、増幅のための熱循環とフローデバイス内の液体フローとの両方が可能になる。フローデバイスは、約240μLの全体積を有し、アニーリング区域に検出チャンバーを含有した。この検出チャンバーは、捕捉部分およびスペーサー部分下線を引いたを含む標的H.インフルエンザエアンプリコンに特異的な捕捉プローブを含む捕捉プローブの実施例1のようなマイクロアレイを保持している:-H.インフルエンザエ捕捉プローブ:配列番号16:5’NH2-TTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTACTCAATGAGAAATATTGCTGATGGGTTTTGGATATCCTGAAGA-3’1XPCR緩衝液50mMTaps、95mMTris-HCL、2mMMgCl2、0.1Tween-20、H.インフルエンザエの増幅用プライマー対5’Oyster-CGTGGCATTGCGAATTTCT-3’配列番号17および5’-TACGGCGTTAAACGTCCTAAAG-3’配列番号18を含有する50nM/75nM標識されたプライマーの場合の29対のプライマー混合物プライマー混合物4.0、1U/50μLSupersaltTaqポリメラーゼ、200μMdNTP混合物dATP、dCTP、dGTP、100μMdTTPおよび300μMdUTPならびに5105コピーのH.インフルエンザエ標的ゲノムDNAを含むPCR混合物100μLが調製された。WO2009/086608に提示されているように、1XPCR緩衝液はグルタミン酸塩およびデキストランも含有した。このPCR混合物100μLが99°Cで5分間インキュベートされ、その後フローカートリッジに導入され、次いでそのカートリッジは2つのポンプ開口部をポンプチューブに接続することによって密閉され、F-RAP機器に導入された。4つの下部加熱ブロックカートリッジの温度領域1、2、3および4がそれぞれ95°C、58°C、58°Cおよび72°Cに設定され、上部加熱ブロックカートリッジの温度領域1、2、3および4がそれぞれ95°C、58°C、58°Cおよび72°Cに設定された。熱電対プローブはポンプチューブ72°Cに設定された温度領域の直後に固定され、液体の流れが記録されて増幅のサイクル数が計数された。ポンプ速度は、13rpmv200に調整された。検出チャンバーが気相のとき、2、5、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39および40サイクルに5秒間の写真が撮影された。溶液が熱電対プローブレベルにあるときに、温度プロファイルの中のスパイク数を決定することによって、サイクル数は得られた。これらの生写真の分析は、MaximDLソフトウェアDiffractionLimited、Ottawa、Canadaを用いて得られ、H.インフルエンザエ捕捉プローブの1スポットの生シグナル強度マイナスこのスポットの局所的な生バックグラウンドシグナルの定量化。結果は図10aに提示された。H.インフルエンザエのアンプリコンはサイクル26で検出される。熱電対プローブによって計数されたサイクル数は図10bに提示された。[実施例8]:異なる体積のPCR溶液を使用する集積化フローチップデバイス内のマイクロアレイ上で検出されるリアルタイム多重化PCR実験は、標的DNAとして5105コピーのH.インフルエンザエゲノムを用いて実施例7に記載の通り実施された。異なる体積のPCR溶液、50μL、150μLまたは200μLのいずれかで満たされた3つのフローチップデバイス内でPCRが実施された。PCR混合物は99°Cで5分間インキュベートされ、その後フローカートリッジに導入され、次いでそのカートリッジは2つのポンプ開口部をポンプチューブに接続することによって密閉され、F-RAP機器に導入された。4つの下部加熱ブロックカートリッジの温度領域1、2、3および4がそれぞれ95°C、58°C、58°Cおよび72°Cに設定され、上部加熱ブロックカートリッジの温度領域1、2、3および4がそれぞれ95°C、58°C、58°Cおよび72°Cに設定された。熱電対プローブはポンプチューブ72°Cに設定された温度領域の直後に固定され、液体の流れが記録されて増幅のサイクル数が計数された。ポンプ速度は、13rpmv200に調整された。溶液が50μlのデバイスの場合、検出チャンバーが気相のとき、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39および40サイクルに5秒間の写真が撮影された。溶液が150μlのデバイスの場合、検出チャンバーが気相のとき、1、2、3、4、5、7、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39および40サイクルに5秒間の写真が撮影された。溶液が200μlのデバイスの場合、検出チャンバーが液相のとき、3、4、5、6、7、10、13、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39および40サイクルに5秒間の写真が撮影された。体積が50μLおよび150μLの場合、溶液が熱電対プローブレベルにあるときに、温度プロファイルの中のスパイク数を決定することによって、サイクル数は得られた。スパイクは、溶液の前方がセンサー位置を通過することによって得られ、1つのスパイクは1回の増幅サイクルに対応する。体積が200μLの場合、サイクル継続時間はシステムのパラメータ流路断面、カートリッジの異なる温度領域内部の流路長、検出チャンバーの体積および溶液の流速によって、100秒になるように算出された。これらの生写真の分析は、MaximDLソフトウェアDiffractionLimited、Ottawa、Canadaを用いて得られ、H.インフルエンザエ捕捉プローブの1スポットの生シグナル強度マイナスこのスポットの局所的な生バックグラウンドシグナルの定量化。結果は図11に提示された。PCR溶液の体積は、検出サイクルに強い影響があった。予想外なことに、PCR溶液の体積が大きいほど、より初期にアンプリコンが検出された。最も大きい200μLの体積では最少の検出サイクル21サイクル、次いで150μLの体積では22サイクルおよび50μlでは34サイクルを得た。"