"下記プライマーセットのいずれか又は複数を含む口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって,プライマーセット1は,5ACAAGTCCTCCTCAAGCGACGATTCGCCTAGTTTTGCCCGT3配列番号10又は5GTCCCATTTCTCCTGAAAACGGGATGAACCTTCACCCGGAAG3配列番号11のいずれか又は両方と,5CAACCACAAGAATTGCCTTC3配列番号6と,5GACTTGTACAAACACGATCTACTCAGGCACCCCTCTAGACCTGGAA3配列番号12と,5GTGGAGTCAAGCACAGTACA3配列番号9とからなり,プライマーセット2は,5GCCACGGAGATCAACTTCTCCTCTTGAGGCTATCCTCTCCTT3配列番号24と,5GTGATGGCCTCAAAGACC3配列番号20と,5GACGAGTACCGGCGTCTCTTCGCAGGTAAAGTGATCTGT3配列番号25と,5ATTATGCGTCACCACACAC3配列番号23とからなり,プライマーセット3は,5GTCACGTGCTTTGAGTTGTTTCTCCGCCTCGAGTTTCTTCCG3配列番号36と,5ATTCTGTTGGCCGGGTTG3配列番号32と,5TCAAGAACGGCGAGTGGCTTCTCTTCTGAGGCGATCCA3配列番号37と,5GGTCTGTCATGGTGACAAAC3配列番号35とからなり,プライマーセット4は,5ACAGGTTTGTAAAACCCAGTTCCACACTCCATTGCCGATGTCAC3配列番号47と,5TGACAAAAGCGACAAAGGTT3配列番号43と,5ATGGCTTCGAAGACCCTCGAACGGAGATCAACTTCTCCTGTA3配列番号48と,5TGGACTGCGAGTCCTGC3配列番号46とからなる,ことを特徴とするプライマーセット。下記プライマーセットのいずれか又は複数を含む口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって,プライマーセット1は,5ACAAGTCCTCCTCAAGCGACGATTCGCCTAGTTTTGCCCGT3配列番号10又は5GTCCCATTTCTCCTGAAAACGGGATGAACCTTCACCCGGAAG3配列番号11のいずれか又は両方と,5CAACCACAAGAATTGCCTTC3配列番号6と,5GACTTGTACAAACACGATCTACTCAGGCACCCCTCTAGACCTGGAA3配列番号12と,5GTGGAGTCAAGCACAGTACA3配列番号9とを含み,さらに,5TTTCGTGCGCAGACGTCCC3配列番号13,5ACTAGGCGAATTTGCCGTTTTA3配列番号14,5GCAACTTGAAACTCCGCCT3配列番号15,5CCGACACAAACCGTGCAA3配列番号16のいずれか又は複数を含み,プライマーセット2は,5GCCACGGAGATCAACTTCTCCTCTTGAGGCTATCCTCTCCTT3配列番号24と,5GTGATGGCCTCAAAGACC3配列番号20と,5GACGAGTACCGGCGTCTCTTCGCAGGTAAAGTGATCTGT3配列番号25と,5ATTATGCGTCACCACACAC3配列番号23とからなり,さらに,5CCACGGCGTGCAAAGGA3配列番号26,5GAGCCCTTCCAGGGCCTCTT3配列番号27,5GCCTCTTTGAGATCCCAAGCT3配列番号28のいずれか又は複数を含み,プライマーセット3は,5GTCACGTGCTTTGAGTTGTTTCTCCGCCTCGAGTTTCTTCCG3配列番号36と,5ATTCTGTTGGCCGGGTTG3配列番号32と,5TCAAGAACGGCGAGTGGCTTCTCTTCTGAGGCGATCCA3配列番号37と,5GGTCTGTCATGGTGACAAAC3配列番号35とからなり,さらに,5GCTCTCTCAAGGTCTTCGGG3配列番号38,5CTTGCCATCCGCGACTGGA3配列番号39のいずれか又はすべてを含み,プライマーセット4は,5ACAGGTTTGTAAAACCCAGTTCCACACTCCATTGCCGATGTCAC3配列番号47と,5TGACAAAAGCGACAAAGGTT3配列番号43と,5ATGGCTTCGAAGACCCTCGAACGGAGATCAACTTCTCCTGTA3配列番号48と,5TGGACTGCGAGTCCTGC3配列番号46とからなり,さらに,5GGAAGTGTCTTTTGAGGAA3配列番号49,5TTTGCACGCCGTGGGAC3配列番号50のいずれか又はすべてを含むことを特徴とするプライマーセット。配列番号1で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列の,121番~351番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列,又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号2~12で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた,少なくとも連続する15塩基を含む請求項3に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。口蹄疫ウィルスの標的核酸上の3末端側からF3c,F2c,F1cという塩基配列領域を,5末端側からB3,B2,B1という塩基配列領域を選択し,それぞれの相補的塩基配列をF3,F2,F1,そしてB3c,B2c,B1cとしたときに,以下のa~dから選ばれた少なくとも1種の塩基配列からなることを特徴とする請求項3又は4に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。a標的核酸のF2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。b標的核酸のF3領域を有する塩基配列。c標的核酸のB2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。d標的核酸のB3領域を有する塩基配列。口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき,5末端から3末端に向かい以下のe~gから選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項3ないし5に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。e5配列番号2の塩基配列に相補的な塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号3の塩基配列3f5配列番号4の塩基配列に相補的な塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号5の塩基配列3g5配列番号7の塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号8の塩基配列に相補的な塩基配列3配列番号17で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列の,7883番~8092番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列,又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号18~25で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた,少なくとも連続する15塩基を含む請求項7に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。口蹄疫ウィルスの標的核酸上の3末端側からF3c,F2c,F1cという塩基配列領域を,5末端側からB3,B2,B1という塩基配列領域を選択し,それぞれの相補的塩基配列をF3,F2,F1,そしてB3c,B2c,B1cとしたときに,以下のa~dから選ばれた少なくとも1種の塩基配列からなることを特徴とする請求項7又は8に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。a標的核酸のF2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。b標的核酸のF3領域を有する塩基配列。c標的核酸のB2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。d標的核酸のB3領域を有する塩基配列。口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき,5末端から3末端に向かい以下のe~fから選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項7ないし9に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。e5配列番号18の塩基配列に相補的な塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号19の塩基配列3f5配列番号21の塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号22の塩基配列に相補的な塩基配列3配列番号29で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列の,4326番~4542番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列,又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号30~37で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた,少なくとも連続する15塩基を含む請求項11に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。口蹄疫ウィルスの標的核酸上の3末端側からF3c,F2c,F1cという塩基配列領域を,5末端側からB3,B2,B1という塩基配列領域を選択し,それぞれの相補的塩基配列をF3,F2,F1,そしてB3c,B2c,B1cとしたときに,以下のa~dから選ばれた少なくとも1種の塩基配列からなることを特徴とする請求項11又は12に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。a標的核酸のF2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。b標的核酸のF3領域を有する塩基配列。c標的核酸のB2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。d標的核酸のB3領域を有する塩基配列。口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき,5末端から3末端に向かい以下のe~fから選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項11ないし13に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。e5配列番号30の塩基配列に相補的な塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号31の塩基配列3f5配列番号33の塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号34の塩基配列に相補的な塩基配列3配列番号40で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列の,7767番~7964番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列,又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号41~48で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた,少なくとも連続する15塩基を含む請求項15に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。口蹄疫ウィルスの標的核酸上の3末端側からF3c,F2c,F1cという塩基配列領域を,5末端側からB3,B2,B1という塩基配列領域を選択し,それぞれの相補的塩基配列をF3,F2,F1,そしてB3c,B2c,B1cとしたときに,以下のa~dから選ばれた少なくとも1種の塩基配列からなることを特徴とする請求項15又は16に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。a標的核酸のF2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。b標的核酸のF3領域を有する塩基配列。c標的核酸のB2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。d標的核酸のB3領域を有する塩基配列。口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき,5末端から3末端に向かい以下のe~hから選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項15ないし17に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。e5配列番号41の塩基配列に相補的な塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号42の塩基配列3f5配列番号44の塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号45の塩基配列に相補的な塩基配列3請求項1又は2に記載のプライマーセットを用いて,口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする口蹄疫ウィルスの検出方法。請求項3ないし18に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて,口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする口蹄疫ウィルスの検出方法。請求項3ないし18に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて1本,2本あるいは3本の反応チューブ内で用いて,4タイプの口蹄疫ウィルス遺伝子の標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする包括的な口蹄疫ウィルスの検出方法。口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法であることを特徴とする請求項19ないし21に記載の口蹄疫ウィルスの検出方法。請求項1ないし2に記載のプライマーセットを用いて,口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより,口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。請求項3ないし18に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより,口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。請求項3ないし18に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて1本,2本あるいは3本の反応チューブ内で用いて,4タイプの口蹄疫ウィルス遺伝子の標的核酸領域の増幅を検出することにより,口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。口蹄疫ウィルス検出もしくは口蹄疫診断のためのキットであって,請求項1又は2のプライマーセットを含むことを特徴とするキット。口蹄疫ウィルス検出もしくは口蹄疫診断のためのキットであって,請求項3ないし18に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。非特許文献8から10では,LAMP法を用いた口蹄疫の診断方法が開示されている。しかしながら非特許文献8では,中国国内で限定された期間に収集された59検体のうち,2にあたる1検体は検出が出来ず,偽陰性を示している。また,非特許文献9では,世界各国で分離された口蹄疫ウィルス93株のうち,18にあたる17株は検出が出来ず偽陰性を示している。発明者らは,これら非特許文献8から10に開示された技術の検証実験を行った。すなわち,発明者らは,特に東アジアおよび東南アジアで発生があり日本への侵入も危惧される,O型,A型,C型,Asia1型の4タイプの口蹄疫ウィルスに着目し,非特許文献8から10の技術が,これら4タイプの口蹄疫ウィルスを十分に検出が可能かどうかについて検討を行った。これら4タイプの口蹄疫ウィルスは,サブタイプを含めて217検体が既存の塩基配列情報として知られている。これら217検体に対する非特許文献8から10記載のLAMP法プライマーの特異性を検証したところ,LAMP法において発明者らが重要な領域と考える核酸増幅反応で用いられる各プライマーの反応拠点側から5塩基の領域以下,反応重要領域というならびにそれ以外の領域に極めて多くのミスマッチを有することを発明者らは見出した。加えて,発明者らは,非特許文献8および10記載のLAMP法プライマーは,中国国内の限定された期間に入手可能であった検体を使用して設計されたものであり,それを用いて口蹄疫の特異性を検証しているにすぎず,そのため,非特許文献8および10記載のLAMP法プライマーは,口蹄疫ウィルスの極めて多様な塩基配列に対応しきれていないことにも着目した。検証実験の結果,これら非特許文献8から10に見られるLAMP法プライマーでは,多様な口蹄疫ウィルスを十分に検出が可能とはいえないことを発明者らは確認した。上記事情を背景として,本発明では,多様な口蹄疫ウィルスを迅速かつ高感度に検出することが可能な口蹄疫ウィルスの検出方法の開発を課題とする。特に,東アジアおよび東南アジアで発生があり日本への侵入が危惧される,O型,A型,C型,Asia1型の少なくとも4タイプの検出を目的とした口蹄疫ウィルスの検出方法の開発を課題とする。発明者らは,鋭意研究の結果,O型,A型,C型,Asia1型の4タイプの口蹄疫ウィルスを迅速かつ高感度で検出しうるオリゴヌクレオチドプライマーを見出した。すなわち,それらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて口蹄疫ウィルスの遺伝子を増幅させることにより,口蹄疫ウィルスの検出が可能となる。加えて,発明者らは,オリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせたプライマーセットをも見出し,それらプライマーセットを単独もしくは組み合わせてLAMP法に用いることにより,口蹄疫ウィルスを迅速かつ高感度で検出することが可能となり,本発明を完成させた。本発明は以下の構成からなる。1下記プライマーセットのいずれか又は複数を含む口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって,プライマーセット1は,OIPF1:5ACAAGTCCTCCTCAAGCGACGATTCGCCTAGTTTTGCCCGT3配列番号10又はOIPF2:5GTCCCATTTCTCCTGAAAACGGGATGAACCTTCACCCGGAAG3配列番号11のいずれか又は両方と,OOPF:5CAACCACAAGAATTGCCTTC3配列番号6と,OIPB:5GACTTGTACAAACACGATCTACTCAGGCACCCCTCTAGACCTGGAA3配列番号12と,OOPB:5GTGGAGTCAAGCACAGTACA3配列番号9とからなり,プライマーセット2は,AIPF:5GCCACGGAGATCAACTTCTCCTCTTGAGGCTATCCTCTCCTT3配列番号24と,AOPF:5GTGATGGCCTCAAAGACC3配列番号20と,AIPB:5GACGAGTACCGGCGTCTCTTCGCAGGTAAAGTGATCTGT3配列番号25と,AOPB:5ATTATGCGTCACCACACAC3配列番号23とからなり,プライマーセット3は,CIPF:5GTCACGTGCTTTGAGTTGTTTCTCCGCCTCGAGTTTCTTCCG3配列番号36と,COPF:5ATTCTGTTGGCCGGGTTG3配列番号32と,CIPB:5TCAAGAACGGCGAGTGGCTTCTCTTCTGAGGCGATCCA3配列番号37と,COPB:5GGTCTGTCATGGTGACAAAC3配列番号35とからなり,プライマーセット4は,Asia1IPF:5ACAGGTTTGTAAAACCCAGTTCCACACTCCATTGCCGATGTCAC3配列番号47と,Asia1OPF:5TGACAAAAGCGACAAAGGTT3配列番号43と,Asia1IPB:5ATGGCTTCGAAGACCCTCGAACGGAGATCAACTTCTCCTGTA3配列番号48と,Asia1OPB:5TGGACTGCGAGTCCTGC3配列番号46とからなる,ことを特徴とするプライマーセット。2下記プライマーセットのいずれか又は複数を含む口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって,プライマーセット1は,OIPF1:5ACAAGTCCTCCTCAAGCGACGATTCGCCTAGTTTTGCCCGT3配列番号10又はOIPF2:5GTCCCATTTCTCCTGAAAACGGGATGAACCTTCACCCGGAAG3配列番号11のいずれか又は両方と,OOPF:5CAACCACAAGAATTGCCTTC3配列番号6と,OIPB:5GACTTGTACAAACACGATCTACTCAGGCACCCCTCTAGACCTGGAA3配列番号12と,OOPB:5GTGGAGTCAAGCACAGTACA3配列番号9とを含み,さらに,OLPF1:5TTTCGTGCGCAGACGTCCC3配列番号13,OLPF2:5ACTAGGCGAATTTGCCGTTTTA3配列番号14,OLPB1:5GCAACTTGAAACTCCGCCT3配列番号15,OLPB2:5CCGACACAAACCGTGCAA3配列番号16のいずれか又は複数を含み,プライマーセット2は,AIPF:5GCCACGGAGATCAACTTCTCCTCTTGAGGCTATCCTCTCCTT3配列番号24と,AOPF:5GTGATGGCCTCAAAGACC3配列番号20と,AIPB:5GACGAGTACCGGCGTCTCTTCGCAGGTAAAGTGATCTGT3配列番号25と,AOPB:5ATTATGCGTCACCACACAC3配列番号23とからなり,さらに,ALPF:5CCACGGCGTGCAAAGGA3配列番号26,ALPB1:5GAGCCCTTCCAGGGCCTCTT3配列番号27,ALPB2:5GCCTCTTTGAGATCCCAAGCT3配列番号28のいずれか又は複数を含み,プライマーセット3は,CIPF:5GTCACGTGCTTTGAGTTGTTTCTCCGCCTCGAGTTTCTTCCG3配列番号36と,COPF:5ATTCTGTTGGCCGGGTTG3配列番号32と,CIPB:5TCAAGAACGGCGAGTGGCTTCTCTTCTGAGGCGATCCA3配列番号37と,COPB:5GGTCTGTCATGGTGACAAAC3配列番号35とからなり,さらに,CLPF:5GCTCTCTCAAGGTCTTCGGG3配列番号38,CLPB:5CTTGCCATCCGCGACTGGA3配列番号39のいずれか又はすべてを含み,プライマーセット4は,Asia1IPF:5ACAGGTTTGTAAAACCCAGTTCCACACTCCATTGCCGATGTCAC3配列番号47と,Asia1OPF:5TGACAAAAGCGACAAAGGTT3配列番号43と,Asia1IPB:5ATGGCTTCGAAGACCCTCGAACGGAGATCAACTTCTCCTGTA3配列番号48と,Asia1OPB:5TGGACTGCGAGTCCTGC3配列番号46とからなり,さらに,Asia1LPF:5GGAAGTGTCTTTTGAGGAA3配列番号49,Asia1LPB:5TTTGCACGCCGTGGGAC3配列番号50のいずれか又はすべてを含む,ことを特徴とするプライマーセット。3配列番号1で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列GenBankaccessionNoAB079061の,121番~351番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列,又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。4口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号2~12で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた,少なくとも連続する15塩基を含む3に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。5口蹄疫ウィルスの標的核酸上の3末端側からF3c,F2c,F1cという塩基配列領域を,5末端側からB3,B2,B1という塩基配列領域を選択し,それぞれの相補的塩基配列をF3,F2,F1,そしてB3c,B2c,B1cとしたときに,以下のa~dから選ばれた少なくとも1種の塩基配列からなることを特徴とする3又は4に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。a標的核酸のF2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。b標的核酸のF3領域を有する塩基配列。c標的核酸のB2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。d標的核酸のB3領域を有する塩基配列。6口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき,5末端から3末端に向かい以下のe~gから選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする3~5に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。e5配列番号2の塩基配列に相補的な塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号3の塩基配列3f5配列番号4の塩基配列に相補的な塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号5の塩基配列3g5配列番号7の塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号8の塩基配列に相補的な塩基配列37配列番号17で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列GenBankaccessionNoAY593802の,7883番~8092番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列,又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。8口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号18~25で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた,少なくとも連続する15塩基を含む7に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。9口蹄疫ウィルスの標的核酸上の3末端側からF3c,F2c,F1cという塩基配列領域を,5末端側からB3,B2,B1という塩基配列領域を選択し,それぞれの相補的塩基配列をF3,F2,F1,そしてB3c,B2c,B1cとしたときに,以下のa~dから選ばれた少なくとも1種の塩基配列からなることを特徴とする7又は8に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。a標的核酸のF2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。b標的核酸のF3領域を有する塩基配列。c標的核酸のB2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。d標的核酸のB3領域を有する塩基配列。10口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき,5末端から3末端に向かい以下のe~fから選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする7~9に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。e5配列番号18の塩基配列に相補的な塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号19の塩基配列3f5配列番号21の塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号22の塩基配列に相補的な塩基配列311配列番号29で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列GenBankaccessionNoAY593809の,4326番~4542番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列,又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。12口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号30~37で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた,少なくとも連続する15塩基を含む11に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。13口蹄疫ウィルスの標的核酸上の3末端側からF3c,F2c,F1cという塩基配列領域を,5末端側からB3,B2,B1という塩基配列領域を選択し,それぞれの相補的塩基配列をF3,F2,F1,そしてB3c,B2c,B1cとしたときに,以下のa~dから選ばれた少なくとも1種の塩基配列からなることを特徴とする11又は12に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。a標的核酸のF2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。b標的核酸のF3領域を有する塩基配列。c標的核酸のB2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。d標的核酸のB3領域を有する塩基配列。14口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき,5末端から3末端に向かい以下のe~fから選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする11~13に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。e5配列番号30の塩基配列に相補的な塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号31の塩基配列3f5配列番号33の塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号34の塩基配列に相補的な塩基配列315配列番号40で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列GenBankaccessionNoAY593795の,7767番~7964番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列,又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。16口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号41~48で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた,少なくとも連続する15塩基を含む15に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。17口蹄疫ウィルスの標的核酸上の3末端側からF3c,F2c,F1cという塩基配列領域を,5末端側からB3,B2,B1という塩基配列領域を選択し,それぞれの相補的塩基配列をF3,F2,F1,そしてB3c,B2c,B1cとしたときに,以下のa~dから選ばれた少なくとも1種の塩基配列からなることを特徴とする15又は16に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。a標的核酸のF2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。b標的核酸のF3領域を有する塩基配列。c標的核酸のB2領域を3末端側に有し,5末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。d標的核酸のB3領域を有する塩基配列。18口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき,5末端から3末端に向かい以下のe~hから選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする15~17に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。e5配列番号41の塩基配列に相補的な塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号42の塩基配列3f5配列番号44の塩基配列塩基数0~50の任意の塩基配列配列番号45の塩基配列に相補的な塩基配列3191又は2に記載のプライマーセットを用いて,口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする口蹄疫ウィルスの検出方法。203~18に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて,口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする口蹄疫ウィルスの検出方法。213~18に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて1本,2本あるいは3本の反応チューブ内で用いて,4タイプの口蹄疫ウィルス遺伝子の標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする包括的な口蹄疫ウィルスの検出方法。22口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法であることを特徴とする19~21に記載の口蹄疫ウィルスの検出方法。231又は2に記載のプライマーセットを用いて,口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより,口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。243~18記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより,口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。253~18記載のオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて1本,2本あるいは3本の反応チューブ内で用いて,4タイプの口蹄疫ウィルス遺伝子の標的核酸領域の増幅を検出することにより,口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。26口蹄疫ウィルス検出もしくは口蹄疫診断のためのキットであって,1又は2のプライマーセットを含むことを特徴とするキット。27口蹄疫ウィルス検出もしくは口蹄疫診断のためのキットであって,3~18に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。本明細書において,プライマーとは,特に限定しない限り,複数の塩基配列を有する核酸断片をいい,DNAポリメラーゼによるDNA合成の際用いることができるものをいう。また,プライマーセットとは,複数個のプライマーの組合せのみならず,そのようなプライマーの組合せを複数個含むものも合わせてプライマーセットというものとする。さらに,LAMP法LoopMediatedIsothermalAmplificationとは,鋳型となるヌクレオチドに自身の3末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに,このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより,等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法として定義される。本発明により,従来法よりも高感度で迅速かつ簡易に口蹄疫ウィルスを検出することが可能となった。特に,日本への侵入が危惧される4タイプの口蹄疫ウィルスを,特異的,高感度かつ迅速に検出することが可能となり,日本を含めたアジア地域での口蹄疫ウィルスに対する防疫に貢献することが期待できる。以下,下記のプライマーセットを用いたLAMP法による口蹄疫ウィルス検出法を一例として説明する。これら1から4に例示するプライマーセットは,プライマーセット1がO型,プライマーセット2がA型,プライマーセット3がC型,プライマーセット4がAsia1型の口蹄疫ウィルスを主な検出対象とするプライマーのセットである。これらプライマーセットは,主な検出対象である口蹄疫ウィルスのタイプを高率で検出することが可能であるが,主な検出対象の型の口蹄疫ウィルスのみの検出に限定する意図ではなく,その他の型の口蹄疫ウィルスの検出に用いてもかまわない。例えば,プライマーセット1を用いて,A型やC型の口蹄疫ウィルスを検出するなどである。通常,口蹄疫ウィルスを検出する場合,対象となる型が分からないことも多い。その場合などには種々のプライマーセットを複合的に用いることにより,より正確な口蹄疫ウィルス検出や診断が可能となることが期待できるからである。なお,詳細は後述するが,IPFはインナープライマーF,OPFはアウタープライマーF,IPBがインナープライマーB,OPBがアウタープライマーB,LPFがループプライマーF,LPBがループプライマーBの略である。1.プライマーセット1OIPF1:5ACAAGTCCTCCTCAAGCGACGATTCGCCTAGTTTTGCCCGT3配列番号10OIPF2:5GTCCCATTTCTCCTGAAAACGGGATGAACCTTCACCCGGAAG3配列番号11OOPF:5CAACCACAAGAATTGCCTTC3配列番号6OIPB:5GACTTGTACAAACACGATCTACTCAGGCACCCCTCTAGACCTGGAA3配列番号12OOPB:5GTGGAGTCAAGCACAGTACA3配列番号9OLPF1:5TTTCGTGCGCAGACGTCCC3配列番号13OLPF2:5ACTAGGCGAATTTGCCGTTTTA3配列番号14OLPB1:5GCAACTTGAAACTCCGCCT3配列番号15OLPB2:5CCGACACAAACCGTGCAA3配列番号162.プライマーセット2AIPF:5GCCACGGAGATCAACTTCTCCTCTTGAGGCTATCCTCTCCTT3配列番号24AOPF:5GTGATGGCCTCAAAGACC3配列番号20AIPB:5GACGAGTACCGGCGTCTCTTCGCAGGTAAAGTGATCTGT3配列番号25AOPB:5ATTATGCGTCACCACACAC3配列番号23ALPF:5CCACGGCGTGCAAAGGA3配列番号26ALPB1:5GAGCCCTTCCAGGGCCTCTT3配列番号27ALPB2:5GCCTCTTTGAGATCCCAAGCT3配列番号283.プライマーセット3CIPF:5GTCACGTGCTTTGAGTTGTTTCTCCGCCTCGAGTTTCTTCCG3配列番号36COPF:5ATTCTGTTGGCCGGGTTG3配列番号32CIPB:5TCAAGAACGGCGAGTGGCTTCTCTTCTGAGGCGATCCA3配列番号37COPB:5GGTCTGTCATGGTGACAAAC3配列番号35CLPF:5GCTCTCTCAAGGTCTTCGGG3配列番号38CLPB:5CTTGCCATCCGCGACTGGA3配列番号394.プライマーセット4Asia1IPF:5ACAGGTTTGTAAAACCCAGTTCCACACTCCATTGCCGATGTCAC3配列番号47Asia1OPF:5TGACAAAAGCGACAAAGGTT3配列番号43Asia1IPB:5ATGGCTTCGAAGACCCTCGAACGGAGATCAACTTCTCCTGTA3配列番号48Asia1OPB:5TGGACTGCGAGTCCTGC3配列番号46Asia1LPF:5GGAAGTGTCTTTTGAGGAA3配列番号49Asia1LPB:5TTTGCACGCCGTGGGAC3配列番号50まず,本明細書におけるLAMP法LoopMediatedIsothermalAmplificationについて説明する。本明細書においてLAMP法とは,鋳型となるヌクレオチドに自身の3末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに,このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより,等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法として定義される。LAMP法では,プライマーの3末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために,塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。この結果として,LAMP法は,高感度かつ特異性の高い核酸増幅反応が可能であるという特徴を有する。LAMP法の核酸増幅で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは,鋳型核酸の塩基配列の計6領域,すなわち3’末端側からF3c,F2c,F1cという領域と,5’末端側からB3,B2,B1という領域の塩基配列を認識する少なくとも4種類のプライマーであって,各々インナープライマーF及びB,アウタープライマーF及びBと呼ばれる。また,F1c,F2c,F3cの相補的な塩基配列はF1,F2,F3と,B1,B2,B3の相補的な塩基配列はB1c,B2c,B3cとそれぞれ呼ばれる。本明細書においてインナープライマーとは,標的塩基配列上のある特定のヌクレオチド配列領域を認識し,かつ合成起点を与える塩基配列を3’末端に有し,同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5’末端に有するオリゴヌクレオチドとして定義される。ここで,F2より選ばれた塩基配列及びF1cより選ばれた塩基配列を含むプライマーをインナープライマーFIPF,そしてB2より選ばれた塩基配列とB1cより選ばれた塩基配列を含むプライマーをインナープライマーBIPBと呼ぶ。インナープライマーは,F2より選ばれた塩基配列とF1cより選ばれた塩基配列の間,あるいはB2より選ばれた塩基配列とB1cより選ばれた塩基配列の間に,塩基数0~50の任意の塩基配列を持っても良い。一方,本明細書においてアウタープライマーとは,標的塩基配列上のある特定のヌクレオチド配列領域の3’末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとして定義される。ここで,F3より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーF以下OPF,B3より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーB以下OPBと呼ぶ。ここで,各プライマーにおけるFとは,標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し,合成起点を提供するプライマー表示であり,一方Bとは,標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し,合成起点を提供するプライマー表示である。ここで,プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは,10塩基以上,好ましくは15塩基以上で,化学合成あるいは天然のどちらでも良く,各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく,複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。また,各プライマーは1種類でも2種類でも良い。このようにLAMP法の核酸増幅においては,それぞれFとBに対応するインナープライマーとアウタープライマーの少なくとも4種類が必須の構成プライマーとなる。前述のプライマーセットでいうと,プライマーセット1では,IPFとして配列番号10ないし11,IPBとして配列番号12,OPFとして配列番号6,OPBとして配列番号9のプライマーが役割を果たすこととなる。同様に,プライマーセット2では,IPFとして配列番号24,IPBとして配列番号25,OPFとして配列番号20,OPBとして配列番号23,プライマーセット3では,IPFとして配列番号36,IPBとして配列番号37,OPFとして配列番号32,OPBとして配列番号35,プライマーセット4では,IPFとして配列番号47,IPBとして配列番号48,OPFとして配列番号43,OPBとして配列番号46のプライマーがそれぞれ役割を果たすこととなる。続いてLAMP法の一連の流れについて説明を行う。LAMP法による口蹄疫ウィルス検出のためには,検体試料が必要である。この検体試料としては,通常用いられるあらゆる検体試料を用いることが可能であり,例えば,ウィルス,ウィルスを含む培養細胞ならびに培養液,牛などの家畜由来の検体などが挙げられる。この場合,家畜由来の検体を検体試料として用いることがより好ましく,例えば血液,血清,体液,組織抽出液,あるいは組織拭い液ならびに組織拭き取り検体を検体試料として用いることができる。これにより,迅速な口蹄疫ウィルス検出が可能となるという効果を有する。口蹄疫ウィルス検出のための検体試料については,通常用いられる前処理を行い後述するLAMP法に用いる際の試料とすることができる。例えば,タンパク質分解酵素等による組織細胞由来タンパク質を分解後,フェノール及びクロロホルムを用いて核酸抽出や精製を行ったり,市販されている抽出キット例えばキアゲン社のRNeasyMiniKitを用いて得られた核酸を抽出したりするなどである。検体試料の準備ができたら,前述のプライマーセットを用いて,核酸増幅のための操作を行う。この核酸増幅の際の操作として,例えば,反応Buffer中,少なくとも4種類のプライマーIPF,IPB,OPF,OPB,鋳型依存性核酸合成酵素,デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を,60から65°Cで15分から1時間程度インキュベートすればよい。この場合,口蹄疫ウィルスはRNAウィルスであるため,鋳型がDNAの場合の反応液に逆転写酵素を添加する事で,同様に核酸増幅反応を進めることができるRTLAMP法。また,上述の通り,ループプライマーをさらに用いることもできる。鋳型依存性核酸合成酵素は,通常用いられるあらゆる鋳型依存性核酸合成酵素を用いることができる。このような酵素として,例えば,BstDNAポリメラーゼラージフラグメント,BcaDNAポリメラーゼ,大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント等が挙げられ,好ましくはBstDNAポリメラーゼラージフラグメントが挙げられる。RTLAMP法に用いる逆転写酵素としては,通常用いられるあらゆる逆転写酵素を用いることができる。このような酵素として,例えばAMVやMMLVの逆転写酵素,SuperscriptII,ReverTraAce,Thermoscriptなどが挙げられ,より好ましくは,AMV逆転写酵素が挙げられる。またBcaDNAポリメラーゼのように,逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素があり,このような酵素を用いると,RTLAMP反応を1つの酵素で行う事ができるという利点を有する。プライマーセットは,単独のプライマーセットを用いて核酸増幅操作を行うこともできるし,複数を組み合わせて核酸増幅操作を行うこともできる。複数のプライマーセットを組み合わせて核酸増幅操作を行うことにより,少ないサンプルで同時に複数のタイプの口蹄疫ウィルス検出が可能となるため,簡便性と迅速性の観点から有用である。加えてプライマーセットは,口蹄疫ウィルスの多様性に対応するため,1種類のプライマーに対して複数用いることも可能である。1つのプライマーセットでIPFを複数用いるなどがこれに該当し,例えば,前述のプライマーセット1で,配列番号10と11の二つのIPFを用いていることがこれに該当する。さらに,プライマーセットでは,感度を向上させるために,ループプライマーを用いることができ,このループプライマーについても同種のものを複数用いることが可能である。例えば,前述のプライマーセット1で,配列番号13と14のLBFを用いていることがこれに該当する。これらプライマーセットは,少なくとも4種類のプライマーから構成される。O型を検出するプライマーセットの場合,配列番号1GenBankaccessionNoAB079061で示される,121番から351番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列,もしくはそれらと相補的な塩基配列を基に設計することができる。同様に,A型を検出するプライマーセットの場合は配列番号17GenBankaccessionNoAY593802で示される7883番~8092番,C型を検出するプライマーセットの場合は配列番号29GenBankaccessionNoAY593809で示される4326番~4542番,Asia1型を検出するプライマーセットの場合は配列番号40GenBankaccessionNoAY593795で示される7767番~7964番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列,もしくはそれらと相補的な塩基配列を基に設計することができる。これにより,反応重要領域においてミスマッチの少ないプライマーの設計が可能となり,LAMP法における感度,特異度を高めることが可能となる。この場合の塩基配列の長さとしては,核酸増幅効率の観点から,少なくとも10,好ましくは15以上の塩基配列を有することが好ましい。加えて,IPFとしてのプライマーを選択する場合は40塩基程度,IPBとしてのプライマーを選択する場合は40塩基程度,OPFとしてのプライマーを選択する場合は20塩基程度,OPBとしてのプライマーを選択する場合は20塩基程度を有することが好ましい。このようにプライマー設計に必要とされる反応重要領域でのミスマッチを少なくすることによりLAMP法における感度,特異度を高めるという観点に加え,一定のGC含量を有しプライマーとしての安定性を高め,かつ,口蹄疫ウィルスの多様な塩基配列に対応できるインナープライマー部分として,配列番号1の塩基配列を基に配列番号2から5,7と8を用いることができる。これらのプライマー部分は,主にO型の口蹄疫ウィルスを検出する目的で,配列番号2がIPFのプライマーの一部,配列番号3がIPFのプライマーの一部,配列番号4がIPFのプライマーの一部,配列番号5がIPFのプライマーの一部,配列番号7がIPBのプライマーの一部,配列番号8がIPBのプライマーの一部として用いることができる。これらのプライマー部分もしくはプライマー部分と相補的な塩基配列を組み合わせて用いることにより,適切なインナープライマー設計を行うことができる。例えば,配列番号2は,5cgtcgcttgaggaggacttgt3,配列番号3は5attcgcctagttttgcccgt3の塩基配列を有するが,配列番号2と相補的な塩基配列5acaagtcctcctcaagcgacg3と配列番号3を組み合わせることにより,5acaagtcctcctcaagcgacgattcgcctagttttgcccgt3配列番号10とすることができる。この場合,核酸増幅機能を損なわないことから,配列番号2に相補的な塩基配列と配列番号3の間に0から50の塩基配列を挿入しても構わない。同様に,配列番号4と相補的な塩基配列と配列番号5により配列番号11の塩基配列,配列番号7と配列番号8と相補的な塩基配列で配列番号12の塩基配列とすることができ,それぞれの塩基配列の間に0から50の塩基配列を挿入しても構わない。また,同様のプライマー設計コンセプトにより,アウタープライマーとして配列番号6OPF,配列番号9OPBの塩基配列とすることができる。その他,A型やC型,Asia1型の口蹄疫ウィルスに関するプライマーについても,O型と同様のプライマー設計コンセプトを用いることができる。この場合,主にA型の口蹄疫ウィルスを検出する目的で,配列番号18がIPFのプライマーの一部,配列番号19がIPFのプライマーの一部,配列番号20がOPF,配列番号21がIPBのプライマーの一部,配列番号22がIPBのプライマーの一部,配列番号23がOPB,配列番号24がIPF配列番号18に相補的な塩基配列と,配列番号19の組合せ,配列番号25がIPB配列番号21と,配列番号22に相補的な塩基配列の組合せのプライマーとして用いることができる。加えて,主にC型の口蹄疫ウィルスを検出する目的で,配列番号30がIPFのプライマーの一部,配列番号31がIPFのプライマーの一部,配列番号32がOPF,配列番号33がIPBのプライマーの一部,配列番号34がIPBのプライマーの一部,配列番号35がOPB,配列番号36がIPF配列番号30に相補的な塩基配列と,配列番号31の組合せ,配列番号37がIPB配列番号33と,配列番号34に相補的な塩基配列の組合せのプライマーとして用いることができる。さらに,主にAsia1型の口蹄疫ウィルスを検出する目的で,配列番号41がIPFのプライマーの一部,配列番号42がIPFのプライマーの一部,配列番号43がOPF,配列番号44がIPBのプライマーの一部,配列番号45がIPBのプライマーの一部,配列番号46がOPB,配列番号47がIPF配列番号41に相補的な塩基配列と配列番号42の組合せ,配列番号48がIPB配列番号44と,配列番号45に相補的な塩基配列の組合せのプライマーとして用いることができる。核酸増幅反応操作が終了したら,核酸増幅産物の検出を行う。核酸増幅産物の検出には,通常用いられるあらゆる検出方法を用いることができる。例えば,増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いた検出や蛍光性インターカレーター法,アガロースゲル電気泳動法による検出などである。アガロースゲル電気泳動法においてLAMP増幅産物は,塩基長の異なる多数のバンドがラダーはしご状に検出される。加えて,LAMP法では目視による検出ができる場合があり,迅速な口蹄疫ウィルス検出が必要な場合に好ましい。すなわち,LAMP法では,核酸の合成により基質が大量に消費され,副産物であるピロリン酸が,共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり,反応液が肉眼で確認できる程度に白濁することから口蹄疫ウィルスの検出が可能である。この場合,反応中の濁度上昇経過や反応終了後の濁度を光学的に観察できる分光光度計等の測定機器を用いて,口蹄疫ウィルスの検出を確認することも可能である。本発明のプライマーやプライマーセットを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は,あらかじめパッケージングしてキット化することができる。例えば,本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド,核酸合成の基質となる4種類のdNTP,鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素,逆転写活性を持つ酵素,酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類,酵素や鋳型を安定化する保護剤,さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが,本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。<<実験1,検出感度の確認>>本発明におけるプライマーを用いた場合のLAMP法による検出感度について,PCR法と比較として実験を行った。<陽性コントロール試料の調製>ファスマック社製の人工塩基配列配列番号51~54をTE緩衝液で溶解し,10倍ずつTE緩衝液で段階的に希釈を行い,コピー数を算出した上で,鋳型DNAとして用いた。なお,配列番号51が口蹄疫ウィルスO型,配列番号52が口蹄疫ウィルスA型,配列番号53が口蹄疫ウィルスC型,配列番号54が口蹄疫ウィルスAsia1型の陽性コントロールとして用いた。<実施例,LAMP法に使用したプライマー>下記のプライマーセットを用いた。実施例1プライマーセット1OIPF1:5ACAAGTCCTCCTCAAGCGACGATTCGCCTAGTTTTGCCCGT3配列番号10OIPF2:5GTCCCATTTCTCCTGAAAACGGGATGAACCTTCACCCGGAAG3配列番号11OOPF:5CAACCACAAGAATTGCCTTC3配列番号6OIPB:5GACTTGTACAAACACGATCTACTCAGGCACCCCTCTAGACCTGGAA3配列番号12OOPB:5GTGGAGTCAAGCACAGTACA3配列番号9OLPF1:5TTTCGTGCGCAGACGTCCC3配列番号13OLPF2:5ACTAGGCGAATTTGCCGTTTTA3配列番号14OLPB1:5GCAACTTGAAACTCCGCCT3配列番号15OLPB2:5CCGACACAAACCGTGCAA3配列番号16実施例2プライマーセット2AIPF:5GCCACGGAGATCAACTTCTCCTCTTGAGGCTATCCTCTCCTT3配列番号24AOPF:5GTGATGGCCTCAAAGACC3配列番号20AIPB:5GACGAGTACCGGCGTCTCTTCGCAGGTAAAGTGATCTGT3配列番号25AOPB:5ATTATGCGTCACCACACAC3配列番号23ALPF:5CCACGGCGTGCAAAGGA3配列番号26ALPB1:5GAGCCCTTCCAGGGCCTCTT3配列番号27ALPB2:5GCCTCTTTGAGATCCCAAGCT3配列番号28実施例3プライマーセット3CIPF:5GTCACGTGCTTTGAGTTGTTTCTCCGCCTCGAGTTTCTTCCG3配列番号36COPF:5ATTCTGTTGGCCGGGTTG3配列番号32CIPB:5TCAAGAACGGCGAGTGGCTTCTCTTCTGAGGCGATCCA3配列番号37COPB:5GGTCTGTCATGGTGACAAAC3配列番号35CLPF:5GCTCTCTCAAGGTCTTCGGG3配列番号38CLPB:5CTTGCCATCCGCGACTGGA3配列番号39実施例4プライマーセット4Asia1IPF:5ACAGGTTTGTAAAACCCAGTTCCACACTCCATTGCCGATGTCAC3配列番号47Asia1OPF:5TGACAAAAGCGACAAAGGTT3配列番号43Asia1IPB:5ATGGCTTCGAAGACCCTCGAACGGAGATCAACTTCTCCTGTA3配列番号48Asia1OPB:5TGGACTGCGAGTCCTGC3配列番号46Asia1LPF:5GGAAGTGTCTTTTGAGGAA3配列番号49Asia1LPB:5TTTGCACGCCGTGGGAC3配列番号50<比較法,PCR法に使用したプライマー>PCR法で使用するプライマーとして,Reidらの報告ReidSMFerrisNPHutchingsGHSamuelARandKnowlesNJ2000PrimarydiagnosisoffootandmouthdiseasebyreversetranscriptionpolymerasechainreactionJVirolMethods89167176に記載の5‘UTR流域を認識するプライマー1FGCCTGGTCTTTCCAGGTCTとプライマー1RCCAGTCCCCTTCTCAGATCの組み合わせ,AOPF配列番号20とAOPB配列番号23の組み合わせ,COPF配列番号32とCOPB配列番号35の組み合わせならびにAsia1OPF配列番号43とAsia1OPB配列番号46の組み合わせをそれぞれ用いた。<核酸増幅法による反応>1.LAMP法による反応LAMP法による増幅のため,最終反応溶液25μL中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。なお,プライマーの合成は北海道システムサイエンス社に依頼し,簡易カラム精製したものを使用した。反応溶液組成20mMTrisHClpH8810mMKCl8mMMgSO414mMdNTPsGEHealthcare社製10mM2SO408MBetaine和光純薬社製01Tween2016μMIPF16μMIPB04μMOPF04μMOPB08μMLPF08μMLPB8UBstDNApolymeraseNewEnglandBiolabs社製方法LAMP反応は上記試薬24μLに,各濃度の試料溶液1μLを加え,最終反応溶液25μLとして,0.2mLの専用チューブ内で63°C60分間,リアルタイム濁度測定装置LA-200栄研化学を用いて,リアルタイムに反応を検出した。4組のプライマーセットを組み合わせて1本のチューブ内で反応させた場合の反応条件のみ63°C90分間とした。リアルタイム濁度測定装置LA-200に接続したパーソナルコンピュータ画面上のグラフで反応結果をリアルタイムに視認した。所定時間内に濁度が0.1を超えた検体を陽性と判定した。2.PCR法による反応PCR反応は,以下の方法により行った。鋳型DNAは人工合成塩基配列ファスマック社製を使用した。PCRの反応溶液組成及び反応条件1反応あたり各試薬が下記になるよう調製した。PCRbuffer×10Qiagen社製25μL2mMdNTPsQiagen社製2μLdDW滅菌超純水2098μL100pmolμLOPF前述のReidらの報告によるプライマー1F,配列番号20,配列番号32もしくは配列番号430.16μL100pmolμLOPB前述のReidらの報告によるプライマー1R,配列番号23,配列番号35,もしくは配列番号460.16μL5UμLTaqPolymeraseQiagen社製01μL方法反応溶液に各希釈段階の鋳型DNA1.0μLを加え,最終反応液量25.0μLとして各PCR反応を行った。PCR反応の温度サイクル条件は,94°C5分静置後,熱変性94°C1分,アニーリング55°C1分,ポリメラーゼ伸長反応72°C2分を1サイクルとして計30サイクル行い,最後に72°C7分間静置後,反応を終了した。所要時間は約3時間であった。反応終了後の反応溶液3μLを2アガロースゲルで電気泳動を行い,エチジウムブロマイド染色した。3.実験結果実験結果のまとめを下記の表1に示す。図1から図13にそれぞれの実験結果を示す。図中,横軸は核酸増幅反応を行った時間分を示し,縦軸は濁度Absを示す。核酸が増幅されればされるほど反応溶液中の濁度が上昇することとなり,結果,対象となるウィルスの存在を検出することが可能となる。また,図中グレーで示した枠内は,単位チューブあたりの人工塩基配列のコピー数を示す。すなわち,コピー数が多いほど,核酸増幅反応数が容易に進むとともに濁度の上昇が早く検出できる。逆にコピー数が少ないほど,核酸増幅反応は進みにくくなるため濁度の上昇が遅くなり,検出に時間がかかることとなる。図1から図4においてそれぞれのプライマーセット単独で行った場合,プライマーセット1が20コピー,プライマーセット2が20コピー,プライマーセット3が50コピー,プライマーセット4が700コピーまでの検出が可能であった。それぞれPCR法の検出感度と比較すると,プライマーセット1が10倍,プライマーセット2が10倍,プライマーセット3が100倍,プライマーセット4が10倍の感度であった。図5から図8において2組のプライマーセットを組み合わせて用いた場合,プライマーセット単独での検出感度と比較して変化はなかった。また,濁度の上昇時間を比較しても,大きな変化はなく,2組のプライマーセットの組合せは,検出感度および検出時間の点で大きな影響を与えないことが分かった。図9から図12において4組のプライマーセットを組み合わせて用いた場合,プライマーセット単独での検出感度と比較して,配列番号51を除き,約10倍の検出感度の低下にとどまった。この場合であっても,PCRと同等以上の検出感度を有していることが確認された。図13に示すように,PCR法では,LAMP反応チューブあたり7,000~200copyまで希釈したものまで検出可能であった。以上をまとめると,4組のプライマーセットをそれぞれ単独で使用した場合と2組のプライマーセットを組み合わせて1本のチューブ内で反応を実施した場合の検出感度は,いずれもLAMP法がPCR法よりも10倍優れていた。4組のプライマーセットを組み合わせて1本のチューブ内で反応を実施した際の検出感度は,LAMP法がPCR法よりも10倍優れているか,あるいは同等であった。反応所要時間はPCR法では約3時間の増幅反応と約30分の電気泳動分析を必要としたのに対し,LAMP法では60分から90分であり,LAMP法のほうが迅速であった。<<実験2,プライマーセットの定性確認>>実験1で用いた人工塩基配列とは異なる塩基配列配列番号55から58を用いて,各プライマーセットがこれらの塩基配列を検出できるかについて定性的に調べた。なお,各配列番号については口蹄疫ウィルスの一部を抜き出した形で陽性コントロールとして用いており,配列番号55が口蹄疫ウィルスO型GenBankaccessionNoAY593812,配列番号56が口蹄疫ウィルスO型GenBankaccessionNoAY593821,配列番号57が口蹄疫ウィルスO型GenBankaccessionNoAY593830,配列番号58が口蹄疫ウィルスA型GenBankaccessionNoAY593782の陽性コントロールである。1.使用したプライマーセットプライマーセット1,プライマーセット2,プライマーセット1と2の混合したものを用いた。2.実験方法実験1のLAMP法の手法により行った。なお,各人工塩基配列のコピー数は,1チューブあたり約10000000コピーで行った。3.結果結果を表2に示す。検出が可能だった場合を陽性と,検出ができなかった場合を陰性として示す。検出が可能であった場合は,検出にかかった時間も合わせて表に示す。プライマーセット1は,O型の陽性コントロール配列である配列番号55,56,57のいずれも検出が可能であった。プライマーセット2は,A型の陽性コントロール配列である配列番号58の検出が可能であった。プライマーセット1と2を組み合わせた場合であっても,いずれの配列番号についても検出が可能であった。また,検出までの時間についても大きな変化はなかった。以上のことから,プライマーセット1がO型の口蹄疫ウィルスについて,プライマーセット2がA型の口蹄疫ウィルスについて検出が可能であることが確認された。加えて,プライマーセットを組み合わせて検出を行った場合であっても,検出が可能であり,検出時間についても大きな影響を及ぼさないことが確認できた。"