"分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を製造する方法であって、逆転写酵素を構成する複数のサブユニットが、特定のサブユニットおよびその断片であり、当該特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを導入して宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養することで、逆転写酵素を製造する方法。逆転写酵素がトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素である、請求項1に記載の方法。特定のサブユニットが配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項2に記載の方法。特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドが配列番号2に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、請求項2に記載の方法。請求項1から4のいずれかに記載の方法で製造した逆転写酵素と、RNAポリメラーゼとを含む、RNA増幅試薬。本発明は、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素AMV-RTといった分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を、煩雑な操作なく製造する方法を提供することにある。本願発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本願発明を完成させるに至った。すなわち本発明の第一の態様は、分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を製造する方法であって、逆転写酵素を構成する複数のサブユニットが、特定のサブユニットおよびその断片からなり、当該特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを導入して宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養することで、逆転写酵素を製造する方法である。また本発明の第二の態様は、逆転写酵素がトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素である、前記第一の態様に記載の方法である。また本発明の第三の態様は、特定のサブユニットが配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、前記第二の態様に記載の方法である。また本発明の第四の態様は、特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドが配列番号2に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、前記第二の態様に記載の方法である。さらに本発明の第五の態様は、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の方法で製造した逆転写酵素と、RNAポリメラーゼとを含む、RNA増幅試薬である。以下、本発明を詳細に説明する。本発明で製造する逆転写酵素は、分子量の異なる複数のサブユニットから構成され、かつ当該複数のサブユニットが、特定のサブユニットおよびその断片からなるのであれば特に限定はなく、前述したAMV-RTβ鎖分子量95kDaおよびα鎖分子量63kDaの他にも、HIVHumanImmunodeficiencyVirus逆転写酵素分子量66kDaおよび分子量51kDaのサブユニットや、トリ肉腫-白血病ウイルスASLV逆転写酵素として知られる一群の逆転写酵素が例示できる。すなわち、ラウス肉腫ウイルスRSV逆転写酵素、トリ赤芽球症ウイルスAEVヘルパーウイルスMCAV逆転写酵素、トリ骨髄細胞腫症ウイルスMC29ヘルパーウイルスMCAV逆転写酵素、トリ網内症ウイルスREV-TヘルパーウイルスREV-A逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスUR2ヘルパーウイルスUR2AV逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスY73ヘルパーウイルスYAV逆転写酵素、ラウス関連ウイルスRAV逆転写酵素、および骨髄芽球症関連ウイルスMAV逆転写酵素を含むが、それらに限定されない。各サブユニット間の分子量差は特に限定はなく、100から10万、好ましくは1000から数万である。なお本発明においてサブユニットとは、機能を有する1つの単位であり、本発明では逆転写酵素を構成するポリペプチドに相当する。また本発明において特定のサブユニットとは、逆転写酵素を構成する複数のサブユニットのうち、最も分子量の大きいサブユニットのことをいう。例えば逆転写酵素がAMV-RTの場合、特定のサブユニットはAMV-RTβ鎖となる。本発明の方法により、分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を製造する場合は、前記複数のサブユニットのうち、特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを導入して宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養して製造すればよい。逆転写酵素を構成する特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを作製するにあたっては、宿主にウイルス例えばAMVを感染させ、当該宿主により大量に増殖させたウイルスから直接抽出し精製してもよく、当該抽出物を鋳型としたPCRにより前記特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを増幅させてもよく、公知の逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの配列情報を基に人工的に合成してもよい。逆転写酵素のアミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、NCBITheNationalCenterforBiotechnologyInformation等の公知のデータベースを利用することで入手可能である。本発明の製造方法で使用する宿主は、逆転写酵素を構成する特定のサブユニットの発現が可能で、かつ前記特定のサブユニットの一部を断片化可能な宿主であればよく、一例として、大腸菌Escherichiacoli、バチルスBacillus属に属する菌、ロドコッカスRhodococcus属に属する菌、ストレプトマイセスStreptomyces属に属する菌、スタフィロコッカスStaphyrococcus属に属する菌といった原核細胞、酵母のサッカロマイセスSaccharomycesに属する菌、カンジダCandida属に属する菌、ポンベPombe属に属する菌、糸状菌のアスペルギルスAspergillus属に属する菌といった真核細胞、昆虫細胞、動物細胞があげられる。その中でも、培養が容易で、遺伝子組み換えタンパク質製造用宿主としての実績も多い、大腸菌が、本発明の製造方法で使用する宿主として好ましい。なおここで、特定のサブユニットの一部を断片化可能とは、特定のサブユニットのポリペプチドを特定の箇所で切断可能であることを意味し、当該ポリペプチド中の特定のペプチド間を認識して切断可能なプロテアーゼ活性を有していると好ましい。プロテアーゼ等により特定のサブユニットのポリペプチドを切断する箇所としては、断片化したポリペプチドに所定の酵素活性が残存していればよい。逆転写酵素が配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるAMV-RTの場合、配列番号1に記載のアミノ酸配列中、500番目から600番目までの任意の箇所で切断すればよい。なお宿主自身では特定のサブユニットの断片化が不可能な場合でも、逆転写酵素を構成する特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを当該宿主に導入する際に、プロテアーゼ等特定のサブユニットを断片化可能な酵素をコードするポリヌクレオチドも当該宿主に導入することで、前記断片化可能な酵素を発現させ、それにより特定のサブユニットの一部を断片化させればよい。逆転写酵素を構成する特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入するには、当該ポリヌクレオチドを宿主に直接導入してもよいが、当該ポリヌクレオチドをベクターに挿入し、それを用いて宿主に導入した方が、当該ポリヌクレオチドが安定して複製される点で好ましい。当該ポリヌクレオチドを挿入するベクターは、AMV-RTを発現させる宿主を基づき適宜選択すればよく、宿主が大腸菌の場合、pUC、pET、pTrc99a、pBluescript、pBBR、pBR322が例示できる。逆転写酵素を構成する特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを用いて宿主を形質転換させるには、塩化カルシウム法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等、遺伝子組換え技術において汎用されている方法に準じて実施すればよい。前述の形質転換により得られた形質転換体は、宿主の培養に適した培地を用いて培養することによって増殖させることができる。形質転換体が大腸菌の場合は、好ましい培地として、必要な栄養源を補ったLBLuria-Bertani培地が例示できる。また、培地には炭素源、窒素源および無機塩類の他に、形質転換体が効率良く増殖するように適宜栄養源を加えてもよい。形質転換体の培養温度、培地のpHは、形質転換に用いた宿主に基づき適宜設定すればよく、形質転換体が大腸菌の場合、培養温度は10°Cから50°Cの範囲が好ましく、より好ましくは25°Cから37°Cである。また培地のpHはpH6.5からpH7.5が好ましく、より好ましくはpH6.8から7.2の範囲である。形質転換体培養液からの逆転写酵素の分離抽出は、宿主の発現形態により適宜選択すればよい。逆転写酵素が宿主細胞外に分泌発現する場合には、培養液を遠心分離等することで細胞を除去後、細胞を除去した培養上清より逆転写酵素を抽出すればよい。一方、逆転写酵素が宿主細胞内に発現する場合には、遠心分離等によって細胞を回収後、回収細胞を中性付近で緩衝能を有する緩衝液に懸濁し、超音波等で細胞を破砕する、または界面活性剤を添加することにより、逆転写酵素を抽出すればよい。抽出した逆転写酵素をさらに高純度化するには、カラムクロマトグラフィー等、当業者が通常用いる精製手段を用いて行なえばよい。カラムクロマトグラフィーの例として、アフィニティークロマトグラフィー、群特異性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズイクスクルージョンクロマトグラフィーがあげられる。なお当該クロマトグラフィーで使用する、カラムのサイズ、使用する緩衝液、流速、温度等の条件は、当該クロマトグラフィーにより溶出したフラクションの分析結果に基づき適宜決定すればよい。本発明は、AMV-RTといった、特定のサブユニットおよびその断片からなる、分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を製造する際、当該特定のサブユニットAMV-RTの場合はAMV-RTβ鎖をコードするポリヌクレオチドを導入して宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養して製造することを特徴としている。本発明により、従来煩雑な操作を必要とした前記逆転写酵素の製造を、簡便に実施できる。また本発明の方法で製造した逆転写酵素は、複数のサブユニットから構成された状態AMV-RTの場合はAMV-RTαβ複合体で発現するため、逆転写酵素が本来有する、複数の酵素活性は保持されている。よって、本発明の方法で製造した逆転写酵素は、NASBANucleicAcidSequence-BasedAmplification法、TMATranscriptionMediatedAmplification法、TRC法TranscriptionReversetranscriptionConcertedreaction等のRNA増幅法を利用したRNA増幅試薬の構成試薬として好ましいといえる。以下、AMV-RTαβ複合体の製造を実施例として、本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明の一部を示すものであり、本発明を限定するものではない。実施例1逆転写酵素遺伝子の作製および配列解析1配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素AMV-RTβ鎖をコードするポリヌクレオチド配列番号2を作製するためのオリゴヌクレオチドをDNAWorks法NucleicAcidRes.,30,e432002により設計し、合成した。合成したオリゴヌクレオチドの配列を配列番号3から122に示す。2以下の2段階からなるPCRにより、配列番号2に記載のヌクレオチド配列からなるAMV-RTβ鎖をコードするポリヌクレオチドを作製した。2-1表1に記載の組成からなるPCR溶液を調製し、1段階目のPCRを実施した。なお表1のうち、DNAミックスは、1で合成した、配列番号3から122に記載のヌクレオチド配列からなる120種類のオリゴヌクレオチドを、それぞれ50pmol/μLとなるようTE緩衝液10mMTris-HClpH8.0、1mMEDTApH8.0に溶解し、その溶解液を1μLずつ採取して混合したものである。またPCRは、94°Cで5分間の熱処理後、94°Cで30秒間の第1ステップ-62°Cで30秒間の第2ステップ-72°Cで1分間の第3ステップからなる反応を25サイクル行ない、最後に72°Cで4分間反応を行なった。2-2表2に記載の組成からなるPCR溶液を調製し、2段階目のPCRを実施した。なおPCRプライマーとして、配列番号1235’―ATGC[GAATTC]ATGACTGTTGCGCTACATCTGGC―3’、角かっこ内は制限酵素EcoRIの認識部位に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号1245’―GACT[GGTACC]TTACGCAAATAACGGGCTGGCC―3’、角かっこ内は制限酵素KpnIの認識部位に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。またPCR条件は、前述の1段階目のPCR2-1と同じである。32段階PCR終了後、PCR産物を制限酵素EcoRIおよび制限酵素KpnIで消化し、0.9のアガロース電気泳動でPCR産物を確認した。結果、設計サイズである約2.5kbaseに相当する位置にPCR産物のバンドを確認することができた。4約2.5kbaseに相当する位置のバンドをQiaquickGelExtractionkitキアゲン社製を用いて抽出し、抽出DNAをTAKARABKLkitタカラバイオ社製を用いてリン酸化処理を行なった。5リン酸化されたDNAを、DNALigationkitVer.1タカラバイオ社製を用いて、あらかじめ制限酵素EcoRIおよび制限酵素KpnIで消化したpTrc99aベクターにライゲーションした。6ライゲーション後、ライゲーション液と大腸菌E.coliJM109CompetentCellsタカラバイオ社製とを氷上で混合後、ヒートショック法により大腸菌E.coliJM109を形質転換した。形質転換後の溶液を100μg/mLのカルベニシリンタカラバイオ社製を含むLBLuria-Bertani寒天培地プレートに塗布し培養した。7得られたコロニーを、100μg/mLのカルベニシリンを含むLB液体培地に接種し、37°Cで18時間培養した。8培養液を遠心分離操作することにより得られた培養菌体から、QIAprepSpinMiniprepkitキアゲン社製を用いてプラスミドを抽出した。9pTrc99aベクターに挿入したDNAの塩基配列を、チェーンターミネーター法に基づくBigDyeTerminatorCyclesequencingFSreactionkitPEアプライドバイオシステム社製を用いるサイクルシークエンス反応に供し、全自動DNAシークエンサーABIprism3700analyzerPEアプライドバイオシステム社製により解析した。なおシークエンス用プライマーとして、1で合成したオリゴヌクレオチドを適宜使用した。配列解析の結果、pTrc99aベクターに挿入したDNAの塩基配列は設計通りの配列であることを確認した。本実施例で作製した、AMV-RTβ鎖を発現可能なベクターをpAMVβと命名した。pAMVβの構造概略図を図2に示す。実施例2逆転写酵素遺伝子の培養1実施例1で作製した発現ベクターpAMVβを用いて、ヒートショック法により、大腸菌E.coliW3110株を形質転換した。形質転換後の溶液を100μg/mLのカルベニシリンを含むLB寒天培地プレートに塗布し培養した。2得られたコロニーを、100μg/mLのカルベニシリンを含む20mLの2×YT培地1.6Tryptone、1YeastExtract、0.5NaClに接種し、37°Cで18時間振とう培養した120rpm。310mLの培養液を2000mLの2×YT培地に接種し、引き続き37°Cで振とう培養した120rpm。4培養液の600nmにおける吸光度OD600を測定し、OD600の値が約0.5になったところで、培養温度を25°Cに変更した。変更約1時間後、IPTGIsopropylβ-D-1-thiogalactopyranosideタカラバイオ社製を培養液に添加終濃度5mMし、25°Cで48時間振とう培養した120rpm。実施例3逆転写酵素の精製1実施例2で作製した培養液を遠心分離10000×g、20分、4°Cし、培養菌体を回収した。2回収菌体を冷却したPhosphate-BufferedSalinePBSで洗浄後、湿菌体9gあたり45mLの緩衝液A10w/vグリセロール、1mMDTT、0.2TritonX-100商品名を含む20mMリン酸カリウム緩衝液pH7.4を添加し、ソニケーターInsonator201M、久保田製作所社製を使用して菌体を破砕した。3菌体破砕後、破砕液を遠心分離10000×g、20分、4°Cし、破砕物を除去した。4破砕物除去後の遠心上清に0.83w/vとなるようにストレプトマイシン和光純薬社製を添加し、4°Cで30分間撹拌後、遠心分離10000×g、30分、4°Cした。5沈殿物に45mLの緩衝液Aを添加し、沈殿物を再溶解させることで、粗精製溶液を調製した。6粗精製溶液を、緩衝液Aで平衡化したホスホセルロースゲルPhosphocelluloseP11、Whatman社製を充填したカラム26mmI.D.×9cmに添加した。7カラムに十分量の緩衝液Aを通液し、ゲルに結合した非特異結合成分を洗浄後、1MKClを含む緩衝液A緩衝液Bを用いたリニアグラジエント溶出法により、AMV-RTを溶出させた。具体的には、緩衝液Aによる洗浄後、10カラムボリュームCVで緩衝液Bが100となるよう、流速5mL/分で通液した。8溶出した溶液は10mL毎に試験管に回収し、後述の活性測定法実施例6を用いてAMV-RT活性フラクションを決定した。9決定したAMV-RT活性フラクションを緩衝液Aで透析後、緩衝液Aで平衡化したバイオゲルバイオゲルHTP、Bio-Rad社製を充填したカラム10mmI.D.×2cmに添加した。10カラムに十分量の緩衝液Aを通液し、ゲルに結合した非特異結合成分を洗浄後、緩衝液Bを用いたリニアグラジエント溶出法により、AMV-RTを溶出させた。具体的には、緩衝液Aによる洗浄後、15CVで緩衝液Bが100となるよう、流速0.5mL/分で通液した。11溶出した溶液は2mL毎に試験管に回収し、後述の活性測定法実施例6を用いてAMV-RT活性フラクションを決定した。12決定したAMV-RT活性フラクションを緩衝液Aで透析後、緩衝液Aで平衡化したCM-セファロースゲルGEヘルスケア社製を充填したカラム1.6mmI.D.×2.5cmに添加した。13カラムに十分量の緩衝液Aを通液し、ゲルに結合した非特異結合成分を洗浄後、緩衝液Bを用いたリニアグラジエント溶出法により、AMV-RTを溶出させた。具体的には、緩衝液Aによる洗浄後、10CVで緩衝液Bが100となるよう、流速0.5mL/分で通液した。14溶出した溶液は1mL毎に試験管に回収し、後述の活性測定法実施例6を用いてAMV-RT活性フラクションを決定した。実施例4逆転写酵素の分析その1実施例3の各精製工程における溶出フラクション、および最終精製物の純度検定をSDS-PAGESDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行なった。1メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液を溶出フラクションに添加し、98°Cで5分間熱処理後、5から20濃度勾配のポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。なお、AMV-RTの標準品としてLifeTechnology社製のAMV-RTを使用した。2電気泳動後、CBBCoomassieBrilliantBlueG-250による染色を行ない、常法によりゲルを脱色した。バイオゲルカラムより溶出した各フラクションのSDS-PAGE結果を図3に、CM-セファロースカラムから溶出した各フラクションのSDS-PAGE結果を図4にそれぞれ示す。バイオゲルカラムより溶出したフラクションの一部フラクション15から22およびCM-セファロースカラムから溶出したフラクションの一部フラクション8から10において、AMV-RTβ鎖分子量95kDaに相当するバンドの他に、AMV-RTα鎖分子量63kDaに相当するバンドも確認できた。実施例5逆転写酵素の分析その2AMV-RTα鎖に相当するバンドのタンパク質のアミノ酸配列を解析するために、電気泳動後のポリアクリルアミドゲル実施例4から当該バンドを切り出し、エドマン法によりN末端側のアミノ酸配列を決定した。結果、当該バンドのタンパク質のN末端側アミノ酸配列はThr-Val-Ala-Leu-Hisであり、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち1番目から5番目までのアミノ酸配列と同一であることを確認した。すなわち、当該バンドのタンパク質は確かにAMV-RTα鎖であることが判明した。実施例6活性測定AMV-RTが有する酵素活性を、下記に示すTRC法TranscriprtionReverse-transcriptionConcertedreactionを利用した方法特開2003-334095号公報により評価した。1TRCRtestNoroW東ソー社製に添付の陽性標準液を、TRCRtestNoroW東ソー社製に添付の陰性標準液で5倍希釈することにより、RNA試料を調製した。2TRCRtestNoroW東ソー社製に添付の基質試薬10μLおよびTRCRtestNoroW東ソー社製に添付のプライマー試薬10μLを0.5mL容量PCR用チューブIndividualDomeCapPCRTube、SSI社に分注し、これに1で調製したRNA試料5μLを添加した。32の混合液を42°Cで5分間保温後、あらかじめ42°Cで2分間保温した、以下の組成からなる酵素液5μLを添加した。酵素液の組成:0.12mg/mL牛血清アルブミン2.0w/vソルビトール28.4U/μLT7RNAポリメラーゼ1μL溶出フラクション実施例3または6.4UAMV-RT対照品LifeTechnology社製4引き続きPCRチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、42°Cで反応させると同時に反応溶液の蛍光強度励起波長470nm、蛍光波長520nmを経時的に20分間測定した。CM-セファロースカラムから溶出した各フラクションを用いて、前記TRC反応を行なった結果を図5に示す。フラクション7から9を用いたときに核酸増幅反応が確認された。さらにフラクション8および9を用いたときは、AMV-RT対照品を用いたときとと同等の核酸増幅反応が確認された。TRC法によるRNA増幅は、AMV-RTαβ鎖複合体が存在することにより進行する特開2003-334095号公報ことから、このことからも、フラクション8および9にはAMV-RTαβ複合体が含まれていることがわかる。以上をまとめると、実施例1で作製したAMV-RTβ鎖発現ベクターpAMVβを用いて大腸菌を形質転換して得られる組換え体により、AMV-RTβ鎖を発現させると、その一部が大腸菌により分解されAMV-RTα鎖となり、さらに生成したAMV-RTα鎖がAMV-RTβ鎖と複合体を形成することが明らかとなった。"