"不活化または欠失されたL-乳酸脱水素酵素遺伝子と、不活化または欠失されたアセト乳酸合成酵素遺伝子とを含む単離された遺伝子組換え細菌細胞。請求項1に記載の細菌細胞であって、さらにピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素をコードする遺伝子、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からなる群から選択された、不活化または欠失された1つ以上の遺伝子を含む細菌細胞。請求項1に記載の細菌細胞であって、外因性遺伝子を導入する遺伝子組換えを行った細菌細胞。請求項1に記載の細菌細胞であって、前記遺伝子組換えは乳酸脱水素酵素ldh、ピルビン酸ギ酸リアーゼpflB、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflA、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼalsD、およびアセト乳酸合成酵素alsSのうちの少なくとも1つをコードする遺伝子に突然変異を生じさせること、あるいは乳酸脱水素酵素ldh、ピルビン酸ギ酸リアーゼpflB、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflA、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼalsD、およびアセト乳酸合成酵素alsSのうちの少なくとも1つをコードする遺伝子の一部または全部を欠失させることを含む細菌細胞。請求項4に記載の細菌細胞であって、前記遺伝子の突然変異は、前記遺伝子のオープンリーディングフレームに1つまたは複数の点突然変異を導入すること、または1つまたは複数の終止コドンを導入することを含む細菌細胞。請求項3に記載の細菌細胞であって、前記遺伝子組換えは乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つのコード配列に点突然変異を導入すること、若しくは前記コード配列を欠失させること、または乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つのコード領域に外因性配列を挿入することを含む細菌細胞。請求項1に記載の細菌細胞であって、外因性遺伝子の全部または一部を含まない細菌細胞。請求項1に記載の細菌細胞であって、前記細菌細胞が有する乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つの酵素活性は、温度感受性プラスミドを任意に利用した相同組換えによって不活化される細菌細胞。請求項8に記載の細菌細胞であって、前記遺伝子組換えは、アセト乳酸合成酵素をコードする遺伝子の全部または一部を欠失させることを含む細菌細胞。請求項1に記載の細菌細胞であって、前記細菌はBacillusspp、あるいはBacilluscoagulans、Bacilluslicheniformis、Bacillussubtilis、Bacillusamyloliquifaciens、Bacilluspumilus、Bacilluscirculans、またはBacillusthiaminolyticusからなる群から選択された細菌である細菌細胞。請求項1に記載の細菌細胞であって、QZ4、QZ5、QZ13、QZ14、QZ15、またはQZ19である細菌細胞。D--乳酸を生成する方法であって、D--乳酸の生成を可能にする条件下で炭素源を含む培地において遺伝子組換え細菌細胞を培養し、前記細菌細胞は、不活化または欠失されたL-乳酸脱水素酵素遺伝子、および不活化または欠失されたアセト乳酸合成酵素遺伝子を含む遺伝子組換え細菌細胞、またはQZ4、QZ5、QZ13、QZ14、QZ15、若しくはQZ19から選択されるD--乳酸生成方法。請求項12に記載のD--乳酸生成方法であって、さらにD--乳酸を単離または精製するD--乳酸生成方法。請求項13に記載のD--乳酸生成方法であって、前記細菌細胞は嫌気性条件下で培養されるD--乳酸生成方法。請求項12に記載のD--乳酸生成方法であって、前記培地は2から20w/vの間の濃度の炭素源を含むD--乳酸生成方法。請求項12に記載のD--乳酸生成方法であって、前記炭素源はグルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、スクロース、セロビオース、ヘミセルロース、セルロース、グリセロール、またはその組み合わせであるD--乳酸生成方法。請求項12に記載のD--乳酸生成方法であって、前記培養は、嫌気性条件下においてpHを約5.0から約7.5、または約7.0、または約5.0に維持して行われるD--乳酸生成方法。請求項12に記載のD--乳酸生成方法であって、前記細菌細胞は、発酵開始から48時間以内に発酵培地1リットルにつき少なくとも60gの乳酸を生成するD--乳酸生成方法。請求項12に記載のD--乳酸生成方法であって、前記細菌細胞を培養するために使用する前記培地のpHは、酸または塩基を自動添加することにより維持されるD--乳酸生成方法。請求項12に記載のD--乳酸生成方法であって、約30°Cから約65°Cの間、約37°Cから約65°Cの間、約37°Cから約55°Cの間、約45°Cから約60°Cの間、または約45°Cから約50°Cの間の温度範囲、あるいは約30°C、約37°C、または約55°Cの温度で前記細菌細胞を培養するD--乳酸生成方法。30°Cから55°Cの間の温度範囲でD--乳酸を生成する能力を有する遺伝子組換え微生物を提供する。本発明の様々な実施形態において、この微生物は不活化染色体乳酸脱水素酵素ldh遺伝子および/または不活化染色体アセト乳酸合成酵素alsS遺伝子を有してもよい。本開示の方法において利用される微生物の例としては、BacilluscoagulansなどのBacillussppが挙げられる。本開示に従って生産される微生物は、少なくとも60g/L例えば、少なくとも70g/L、80g/L、90g/L、または100g/Lの培地でD--乳酸を生成する。本開示の遺伝子組換え微生物の生産方法および利用方法を提供する。本発明の一側面によれば、D--乳酸を生成する能力を有する遺伝子組換え微生物が提供される。本発明の様々な実施形態において、この微生物は、不活化染色体乳酸脱水素酵素ldh遺伝子、不活化染色体ピルビン酸ギ酸リアーゼpflB遺伝子、不活化ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflA、不活化α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼalsD、および/または不活化アセト乳酸合成酵素alsS染色体遺伝子を有してもよい。また、この微生物は、BacilluscoagulansなどのBacillussppである。本開示に従って生産された微生物は、少なくとも60g/L例えば、少なくとも70g/L、80g/L、90g/L、または100g/Lの培地でD--乳酸を生成する。本発明の一側面によれば、不活化染色体乳酸脱水素酵素ldh遺伝子、不活化染色体ピルビン酸ギ酸リアーゼpflB遺伝子、および不活化染色体アセト乳酸合成酵素alsS遺伝子を有する微生物が提供される。本発明の他の側面によれば、不活化染色体乳酸脱水素酵素ldh遺伝子および不活化染色体アセト乳酸合成酵素alsS遺伝子を有する微生物が提供される。本発明のさらに他の側面によれば、不活化酵素活性の様々な組み合わせを有する微生物が提供される下記考察参照。遺伝子という用語は、プロモーターおよびオペレーターなどの特定の制御機能を有する領域、ならびに構造遺伝子を含む。遺伝子という用語は、上流制御配列および下流制御配列だけでなく、遺伝子のオープンリーディングフレームも含む。上流制御領域は、遺伝子のプロモーター領域とも呼ばれる。下流制御領域は、ターミネーター配列領域とも呼ばれる。ldhおよびalsSは、1ldh、pflA、pflB、alsD、およびalsS遺伝子のうちの少なくとも1つのプロモーターやオペレーターなどの転写制御に関わる、染色体DNAにおけるヌクレオチド配列を欠失させること2乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つが活性タンパク質として発現しないようにフレームシフトを導入すること、あるいは3乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つをコードする構造遺伝子の全部またはその一部を欠失させることにより不活化してもよい。本発明の好ましい実施形態において、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つをコードする遺伝子の全部が欠失した微生物が提供される。Bcoagulans株P4-102Bにおける乳酸脱水素酵素遺伝子およびアセト乳酸合成酵素遺伝子、ならびにα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ遺伝子の例示的な配列を、それぞれSEQIDNO1およびSEQIDNO2に示す。Bcoagulans株P4-102Bにおけるピルビン酸ギ酸リアーゼおよびピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素のコード配列をSEQIDNO3に示す。構造遺伝子の一部、構造遺伝子の全部またはその一部という語句は、その構造遺伝子部分における単一ヌクレオチド欠失を指してもよい。この欠失は、好ましくは、構造遺伝子における5個から10個のヌクレオチドの欠失であり、より好ましくは、10個から50個のヌクレオチドの欠失、さらに好ましくは50個から100個のヌクレオチドの欠失である。本発明の一側面においては、構造遺伝子の全部が欠失していてもよい。本発明の他の側面によれば、欠失乳酸脱水素酵素ldh、欠失ピルビン酸ギ酸リアーゼpflB、欠失ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflA、欠失α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼalsD、および欠失アセト乳酸合成酵素alsSのうちの少なくとも1つが提供される。上述の酵素をコードする各遺伝子のオープンリーディングフレームを配列一覧に示す。以下に説明するように、pflA、pflB、alsS、およびalsDのあらゆる組み合わせとldhとを欠失させることができる。本発明の一側面においては、外因性遺伝子の全部またはその一部を導入することなく、微生物の染色体の遺伝子を突然変異させることができる。本発明の他の側面によれば、1つまたは複数の点突然変異を生じさせること、あるいは組換えられている内因性遺伝子のオープンリーディングフレームに1つまたは複数の終止コドンを導入することによって、突然変異を起こした内因性遺伝子が提供される。本発明のさらに他の側面においては、内因性遺伝子のオープンリーディングフレームを染色体DNAから欠失させることができる。本発明の一側面においては、所望の表現型の突然変異遺伝子を有する菌株を選択するために、外因性ヌクレオチド配列を導入して標的遺伝子を不活化してもよい。微生物ゲノムに導入された外因性ヌクレオチド配列は、その後、残すことなく完全に除去することができる。本発明の一実施形態においては、高い力価、収率、および容積生産性でD--乳酸生成を生成する能力により生体触媒を選択する。本発明の一実施形態によれば、1モルの炭素源例えばグルコースを消費するごとに少なくとも0.5モルのD--乳酸を生産可能な生体触媒が提供される。このような生体触媒を、増殖に基づく選択を利用して任意に選択してもよい。力価という用語は、発酵ブロスにおける特定の化合物のモル濃度を意味する。したがって、D--乳酸を生成するための発酵プロセスにおいて、100mMの力価であれば、測定時の発酵ブロス1リットルにつき100mMの乳酸が含まれていることになる。収率という用語は、発酵プロセスにおいて消費された原料1モル当たり生成される特定の化合物のモル数を指す。したがって、グルコースを原料としたD--乳酸を生成するための発酵プロセスにおいて、収率という用語は、消費されたグルコース1モル当たり生成されるD--乳酸のモル数を指す。容積生産性という用語は、単位体積および単位時間当たり生成される特定の化合物の量をグラム数で表したものである。したがって、0.9gL-1h-1のD--乳酸の容積生産性値であれば、1時間の増殖で、発酵ブロス1リットルにつき0.9gのD--乳酸が蓄積したことになる。本開示の遺伝子組換え微生物が有する容積生産性の範囲は、例えば4gL-1h-1までとすることができる。例えば、QZ19は3gL-1h-1よりも高い容積生産性を有することができる。本開示において使用する力価、収率、および容積生産性という用語には、基準化された力価、基準化された収率、および基準化された容積生産性も含まれる。基準化された力価、基準化された収率、および基準化された容積生産性を決定する際には、増殖培地のpHを維持するために発酵槽に添加された中和試薬の体積も考慮される。w/vという用語は、1リットル当たりの物質の量グラム数g/Lを指す。本明細書で使用する遺伝子操作または遺伝子組換えという用語は、微生物のゲノムDNAを操作することによりその微生物中の1つまたは複数の酵素の発現を調節することを指す。遺伝子組換え微生物、遺伝子組換え菌株GMBS、および生体触媒という用語は、本開示においては区別せずに使用してもよい。本発明の一実施形態においては、Bacilluscoagulans株、Bacilluslicheniformis株、Bacillussubtilis株、Bacillusamyloliquifaciens株、Bacillusmegaterium株、Bacillusmacerans株などの様々なBacillusspp、Paenibacillusspp、またはGeobacillusstearothermophilus株などのGeobacillussppに対して遺伝子組換えを行うことができる。他のBacillus株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関ATCCなどのカルチャーコレクションから得ることができる。また、本明細書に記載の遺伝子組換えを行うことにより、そのBacillus株はD--乳酸を生成することができるようになる。本発明の一実施形態では、特に、Bcoagulans株SUY27-13およびSUY27-13のうちの少なくとも一方の中で発見された点突然変異を含むBcoagulans株を特許請求の範囲から除外してもよい。したがって、本発明の一側面によれば、遺伝子組換え菌株によって炭素化合物から商業的に重要な量の乳酸を生成する方法が提供される。本明細書に記載されているように、D--乳酸の生成に適した微生物は、1段階または2段階の方法で培養することができる。この方法のいずれのステップにおいても、約30°Cから約65°Cの間の温度範囲で遺伝子組換え微生物を培養してもよい。本発明の様々な実施形態においては、約30°C、37°C、または55°Cの温度で微生物を培養することが期待される。本発明の他の実施形態においては、約37°Cから約65°Cの間、約37°Cから約55°Cの間、約45°Cから約60°Cの間、または約45°Cから50°Cの間の温度範囲で微生物を培養することが期待される。突然変異、または不活化は、オープンリーディングフレームならびに上流制御領域および下流制御領域を含む遺伝子に対して実施された遺伝子組換えのことを指す。遺伝子に突然変異が起こると、その遺伝子のオープンリーディングフレームORFの転写がダウンレギュレーションまたは完全阻害される。遺伝子の突然変異は、その遺伝子ORFのコード領域全体、またはコードヌクレオチド配列ORFのの一部を欠失させること、コード領域にフレームシフト突然変異を導入すること、ミスセンス突然変異を導入すること、すなわち遺伝子がコードするタンパク質の活性を阻害する配列を挿入すること、終止コドンを導入すること、あるいは、上述の遺伝子突然変異のあらゆる組み合わせにより実現される。本明細書で使用する外因性という用語は、細胞外由来の分子または活性を宿主微生物に導入することを指す。微生物細胞に導入された外因性核酸分子の場合、導入された核酸は、独立したプラスミドとして存在するか、または宿主染色体DNAに組み込まれてもよい。本発明の一実施形態に係る生体触媒においては、タンパク質をコードする外因性核酸が発見されない。他の実施形態においては、外因性遺伝子を含む生体触媒を考慮する。外因性遺伝子核酸配列が存在する場合、プロモーターやターミネーター配列などの微生物独自の制御配列に発現可能な形態で導入してもよい。あるいは、外因性核酸分子は、宿主染色体DNAに組み込んでもよく、また宿主制御配列の制御化にあってもよい。内因性という用語は、宿主細胞内に自然に生まれつき存在する分子および活性を指す。生合成活性に関連して使用する場合、外因性という用語は、宿主指標生物に導入された活性を指す。その起源は、例えば、宿主微生物への導入後にその活性を発現する同種または異種のコード核酸とすることができる。タンパク質をコードする核酸が同種の微生物から得られた場合、それを同種DNAと呼ぶ。核酸が異種の微生物から得られた場合、それを異種DNAと呼ぶ。DNAが宿主細胞に導入された場合、同種DNAであろうと異種DNAであろうとDNAの種類に関係なく、導入されたDNA由来のDNAおよび活性は外因性のものとする。したがって、コード核酸の外因性発現においては、同種または異種、あるいは同種および異種のコード核酸を利用することができる。本発明の一側面によれば、優れた力価、高い収率、および高い容積生産性でD--乳酸を生成するGMBSが提供される。様々な糖類を利用してD--乳酸を生産する生産方法において、本開示の微生物を利用することができる。本発明の一実施形態において、遺伝子組換えには、微生物が生まれつき有するゲノム内の遺伝子を操作することのみが含まれる。本実施形態においては、抗生物質耐性遺伝子、またはある酵素タンパク質をコードする他のあらゆる外因性ヌクレオチド配列を有するプラスミドなどの外因性遺伝物質が、D--乳酸生成菌株内に存在しない。本発明においては、特定の遺伝子組換え技術と、増殖に基づく選択プロセスとを組み合わせて、高い収率、力価、および容積生産性でD--乳酸を生成する菌株を得る。続いて、本開示の方法で生産された遺伝子組換え菌株を、低pHなどの様々な条件下で数世代にわたって増殖させ、親株よりもD--乳酸の生成量が多いクローン、および親株と比較して細胞収率の高いクローンのうちの少なくとも一方を選択してもよい。この点に関して、例示的な図を図7に示す。菌株を増殖させて、最も好ましい表現型を有するクローンを選択するプロセスを、増殖に基づく選択と呼ぶ。図7は、D--乳酸生成菌株を生産するための例示的な概略図である。一般的に、標的菌株/細菌細胞に対して遺伝子組換えを行うことで、ピルビン酸分岐点における競争反応であるL-乳酸脱水素酵素活性およびアセト乳酸合成酵素活性を不活化する。そして、pH4.5から5.5の間の酸素制限条件下で細胞を培養する。親株と比較して細胞収率の高い細胞および/または乳酸生産量の多い細胞を選択し、さらに成長させる。その後、選択した細胞をpH6.5から7.5の間の酸素制限下/嫌気性条件下で培養する。選択した細胞と比較して細胞収率の高い細胞および/または乳酸生産量の多い細胞を選択し、さらに成長させ、あるいは、D--乳酸の生成に利用した。本発明の好ましい側面において、D--乳酸の生成に利用される細胞は、好ましくは48時間以内に培地1リットル当たり少なくとも60gの乳酸を生成する。増殖に基づく選択を行っている間、遺伝子組換え菌株を新しい培地に一定期間繰り返し植菌することで、細胞増殖が速く、様々な炭素源を急速に消費し、複数の糖類を同時に利用する能力を有し、炭素源に含まれる有害化学物質に対して耐性があり、所望の有機酸の生産収率および生産性が高く、他の有機酸の生産量が少ないクローンを得る。増殖に基づく選択を行っている間、上述の望ましい表現型を有するクローンを選択するように注意する。この選択プロセスにより、とても高い増殖率を示すが所望の有機酸の収率が高くないクローンが得られたとしても、それは望ましいものではない。本開示の方法を実施する際、遺伝子組換え菌株の培養を好気的条件下で開始し、培養系例えば発酵槽内において酸素制限条件下でその菌株を連続継代することにより、菌株を選択する。酸素制限条件下で増殖できる遺伝子組換え微生物を選択して、微好気的条件または嫌気性条件に達するまで継代を続ける。それから、pHを上げて微生物を嫌気的に培養し、この培養条件におけるD--乳酸の生産量を基に微生物を選択する。この方法のいずれのステップにおいても、遺伝子組換え微生物を約30°Cから約65°Cの間の温度範囲で培養する。本発明の様々な実施形態においては、微生物を30°C、37°C、または55°Cの温度で培養することが期待される。本発明の他の実施形態においては、微生物を約37°Cから約65°Cの間、約37°Cから約55°Cの間、約45°Cから約60°Cの間、または約45°Cから約50°Cの間の温度範囲で培養することが期待される。遺伝子操作はいくつかの異なる段階に分けて実施することができ、この段階の間に、増殖に基づく選択を行う。遺伝子操作には、内因性DNA配列を操作すること、または特定のDNA配列をゲノムDNAから完全に除去することが含まれる。遺伝子操作は、微生物のゲノムDNA配列に外因性DNA配列を挿入することを含んでもよい。本発明の一実施形態においては、微生物のゲノムDNAから特定のDNA配列を除去することによって、外因性DNAを導入せずに遺伝子操作を実施することができる。特定のタンパク質生成物をコードする遺伝子の発現を抑えるのに必要な遺伝子操作では、外因性DNA配列を微生物のゲノムに挿入して、所望の遺伝子組換えクローンを選択する必要がある。例えば、外因性抗生物質マーカー遺伝子を利用して、内因性遺伝子を挿入的に不活化し、所望の遺伝子型を有するクローンを選択することができる。本発明の一実施形態において、導入された外因性DNA配列は、遺伝子操作プロセスの最後に、微生物がゲノムDNA内に外因性DNAをほとんど有しないように、または有しないように、特に外因性DNA遺伝子の全部またはその一部を有しないように、微生物のゲノムDNAから最終的に除去される。本発明の好ましい実施形態の目的を達成するのに必要な様々な遺伝子操作技術は、当該技術分野において周知であり、また、高温度で不安定性を示すプラスミドを利用することを含む例えば、本願の実施例に記載の物質および方法を参照。引用科学出版物および引用特許文献はいずれも、本発明に有用な遺伝子操作技術を実施するために必要なあらゆる詳細情報を提供することを目的として、その全体が参照として組み込まれる。本発明の一実施形態において、発酵経路で機能することが周知であるタンパク質をコードする1つまたは複数の遺伝子は、上述のように1つまたは複数の遺伝子操作または遺伝子操作技術により不活化される。不活化してもよい遺伝子および酵素には、乳酸脱水素酵素ldh、およびアセト乳酸合成酵素alsSが含まれる。これにより、以下の非限定的な実施形態が提供される。1a乳酸脱水素酵素ならびに任意にアセト乳酸合成酵素およびピルビン酸ギ酸リアーゼのうちの少なくとも1つb乳酸脱水素酵素およびアセト乳酸合成酵素c乳酸脱水素酵素、アセト乳酸合成酵素、およびピルビン酸ギ酸リアーゼ、またはd乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素アセト乳酸合成酵素α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼアセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼアセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼアセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼアセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼアセト乳酸合成酵素のあらゆる組み合わせの酵素活性を不活化させる遺伝子組換えを行った細菌細胞。2前記1に記載の細菌細胞であって、さらに所望の酵素活性を不活化させる遺伝子組換えを行った細菌細胞。3前記1または2に記載の細菌細胞であって、さらに外因性遺伝子を導入する遺伝子組換えを行った細菌細胞。4前記1または2に記載の細菌細胞であって前記遺伝子組換えは、乳酸脱水素酵素ldh、ピルビン酸ギ酸リアーゼpflB、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflA、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼalsD、およびアセト乳酸合成酵素alsSのうちの少なくとも1つをコードする遺伝子に突然変異を生じさせること、または乳酸脱水素酵素ldh、ピルビン酸ギ酸リアーゼpflB、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflA、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼalsD、およびアセト乳酸合成酵素alsSのうちの少なくとも1つをコードする遺伝子の一部または全部を欠失させることを含む細菌細胞。5前記4に記載の細菌細胞であって前記遺伝子の突然変異は前記遺伝子のオープンリーディングフレームに1つまたは複数の点突然変異を導入すること、または1つ若しくは複数の終止コドンを導入することを含む細菌細胞。6前記1~3に記載の細菌細胞であって前記遺伝子組換えは乳酸脱水素酵素ldh、ピルビン酸ギ酸リアーゼpflB、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflA、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼalsD、およびアセト乳酸合成酵素alsSのうちの少なくとも1つのコード配列/オープンリーディングフレームに点突然変異を導入すること、または前記コード配列/オープンリーディングフレームを欠失させること、または乳酸脱水素酵素ldh、ピルビン酸ギ酸リアーゼpflB、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflA、α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼalsD、およびアセト乳酸合成酵素alsSのうちの少なくとも1つのコード領域/オープンリーディングフレームに外因性配列を挿入することを含む細菌細胞。7前記1、2,4,5、または6のいずれか1つに記載の細菌細胞であって外因性遺伝子の全部またはその一部を含まない細菌細胞。8前記1、2、4、5、または6のいずれか1つに記載の細菌細胞であって前記細菌細胞が有するL-乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、およびアセト乳酸合成酵素のうちの少なくとも1つの酵素活性は、温度感受性プラスミドを任意に利用した相同組換えによって不活化される細菌細胞。9前記8に記載の細菌細胞であって前記遺伝子組換えはアセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素、およびピルビン酸ギ酸リアーゼのうちの少なくとも1つをコードするヌクレオチドの全部または一部を欠失させることを含む細菌細胞。10前記1~9のいずれか1つに記載の細菌細胞であって前記細菌はBacilluscoagulans、Bacilluslicheniformis、Bacillussubtilis、Bacillusamyloliquifaciens、Bacilluspumilus、Bacilluscirculans、またはBacillusthiaminolyticusなどのBacillussppでありBacilluscoagulansSuy27-13は、特許請求の範囲から任意に除外してもよい細菌細胞。11前記1~10のいずれか1つに記載の遺伝子組換え細菌細胞であってQZ15またはQZ19である細菌細胞。12D--乳酸を生成する方法であってD--乳酸の生成を可能にする条件下で、炭素源を含む培地において前記1~11のいずれか1つに記載の遺伝子組換え細菌細胞を培養するD--乳酸を生成する方法。13前記12に記載のD--乳酸生成方法であって、さらにD--乳酸を単離または精製するD--乳酸生産方法。14前記13に記載のD--乳酸生成方法であって、前記細菌細胞は嫌気性条件下で培養されるD--乳酸生産方法。15前記12~14に記載のD--乳酸生成方法であって、前記培地は2から20w/vの間の濃度の炭素源を含むD--乳酸生成方法。16D--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞を生産する方法であって、a前記細菌細胞における乳酸脱水素酵素活性およびアセト乳酸合成酵素活性を不活化しbpHを3.0から6.0の間の範囲に維持した炭素源を含む培地において、前記細菌細胞を好気性条件下および酸素制限条件下の少なくとも一方で培養し、c親株と比較して細胞収率および/またはD--乳酸生成量が増加した細菌細胞を選択し、dpHを6.5から8.0の間の範囲に維持した炭素源を含む培地において、前記選択された細菌細胞を嫌気性条件下で培養し、e親株、すなわちステップdで選択された細菌細胞と比較して細胞収率および/またはD--乳酸生成量のうちの少なくとも一方が増加した細菌細胞を選択するD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。17前記16に記載のD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、ステップbは、約4.5若しくは5.5、または約5.0のpHで実施されるD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。18前記16に記載のD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、ステップdは、約6.5若しくは7.5、または約7.0のpHで実施されるD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞生産方法。19前記16~18に記載のD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、炭素源の量を増やした培地において、ステップdおよびステップeを繰り返すD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。20前記16~18に記載のD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、炭素源の量を増やした培地において、ステップbおよびステップcを繰り返すD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。21前記16~18に記載のD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、炭素源の量を増やした培地においてステップb~ステップeを繰り返すD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。22前記12~21に記載のD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、前記炭素源はグルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、スクロース、セロビオース、ヘミセルロース、セルロース、グリセロール、またはその組み合わせであるD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。23前記12~15に記載のD--乳酸生成方法であって、前記発酵は、嫌気性条件下においてpHを約6.5から7.5、または約7.0に維持して行われるD--乳酸生成方法。24前記12~22に記載のD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、前記細菌細胞は、発酵開始から48時間以内に発酵培地1リットルにつき少なくとも60gの乳酸を生成し、発酵培地1リットルにつき少なくとも80gの乳酸を生成し、または発酵培地1リットルにつき少なくとも90gの乳酸を生成するD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。25前記12~24に記載のD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、前記細菌細胞を培養するために使用する培地のpHは、酸または塩基を自動添加することにより維持されるD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。26前記16~23に記載のD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、前記細菌細胞は、最初に好気性条件下で培養され、微好気的条件または嫌気性条件に達するまで、培養系内に存在する酸素の量を低減させた条件下で連続継代されるD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。27前記16~23、または26に記載のD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、前記細菌細胞は、Bacilluscoagulans、Bacilluslicheniformis、Bacillussubtilis、Bacillusamyloliquifaciens、Bacilluspumilus、Bacilluscirculans、またはBacillusthiaminolyticusなどのBacillussppであり、BacilluscoagulansSuy27-13は任意に除外されるD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。28前記1~10および12~27のいずれか1つに記載の細菌細胞、D--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、前記細菌細胞は、ldhpflB、ldhpflA、ldhpflApflB、ldhalsS、ldhalsD、ldhalsSalsD、ldhpflBalsS、ldhpflBalsD、ldhpflAalsS、ldhpflAalsD、ldhpflApflBalsS、ldhpflApflBalsD、ldhpflAalsDalsS、ldhpflBalsDalsS、およびldhpflApflBalsDalsSの遺伝子の組み合わせのうちいずれか1つが不活化された、または乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸脱水素酵素アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素アセト乳酸合成酵素α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼアセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素アセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼアセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素α‐アセト乳酸デカルボキシラーゼアセト乳酸合成酵素、乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼアセト乳酸合成酵素、および乳酸脱水素酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼアセト乳酸合成酵素の酵素活性の組み合わせのうちいずれか1つが不活化された細菌細胞、D--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。29前記1~11または28のいずれか1つに記載の細菌細胞であって、約30°Cから約65°Cの間、約37°Cから約65°Cの間、約37°Cから約55°Cの間、約45°Cから約60°Cの間、若しくは約45°Cから約50°Cの間の温度範囲、または、約30°C、約37°C、若しくは約55°Cの温度でD--乳酸を生成する細菌細胞。30前記12~28のいずれか1つに記載のD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法であって、約30°Cから約65°Cの間、約37°Cから約65°Cの間、約37°Cから約55°Cの間、約45°Cから約60°Cの間、若しくは約45°Cから約50°Cの間の温度範囲、または、約30°C、約37°C、若しくは約55°Cの温度で前記細菌細胞を培養することを含むD--乳酸生成方法またはD--乳酸生成遺伝子組換え細菌細胞の生産方法。アメリカ合衆国61604イリノイ州ピオリア、ノースユニバーシティストリート1815にあるアグリカルチュラルリサーチサービスカルチャーコレクションAgriculturalResearchServiceCultureCollectionに微生物を寄託した表5。本寄託物は、本特許出願の係属中、37CFR1.14および35USC122の下で特許商標庁長官により資格を有すると決定された者は、本寄託物を利用できるよう保証されるという条件下で寄託されている。本願の写し、またはその所産が提出されている国における外国特許法の定めるところにより、本寄託物を利用することができる。しかし、本寄託物を利用できたとしても、行政措置により付与された特許権に関し、特例として本発明の実施権が与えられるわけではないことが理解されよう。さらに、本寄託物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約BudapestTreatyfortheDepositofMicroorganismsの条項に従って保存され、一般に利用可能となる。すなわち、本寄託物は、寄託試料の最近の分譲請求から少なくとも5年間、またいずれの場合でも、寄託日から少なくとも30年間、または、培養物を開示している発行可能性のある特許の権利行使可能期間、生存可能かつ汚染されていない状態を保つために必要なあらゆる配慮をもって保存される。寄託者は、寄託物の分譲請求を受けた際に寄託物の状態により寄託機関が試料を分譲できない場合、寄託物を交換する義務があることを認めている。本寄託物の一般の利用可能性に関するすべての制限は、本寄託物を開示する特許が付与された際に、取消不能に取り除かれる。以下の実施例は、本発明を説明するために提供される。これら発明は、本発明の範囲を限定するものではない。いくつかの異なる実施形態において、工業微生物学分野の経験者であれば、本発明の精神を逸脱することなく、本発明を実施することができるであろう。本明細書において参照または引用されるすべての特許、特許出願、仮特許出願、および刊行物は、本明細書の明確な教示と矛盾しない程度に、すべての図および表を含むその全体が参照として組み込まれる。以下は、本発明を実施するための手順を示す実施例である。これら実施例は、本発明を限定するものと解釈してはならない。特に断りのない限り、百分率はすべて重量百分率であり、溶媒混合比はすべて体積比である。<実施例1:D--乳酸生成耐熱性Bacilluscoagulansの構造>[材料および方法]菌株およびプラスミドBcoagulans野生株P4-102Bについては非特許文献27に既に記載されている。本研究で使用する様々なプラスミドを構築する際に、Escherichiacoli株Top10インビトロジェン社およびBacillussubtilis株HB1000非特許文献11参照を宿主として利用した。プラスミドpGK12は、クロラムフェニコール耐性遺伝子およびエリスロマイシン耐性遺伝子を有し、いくつかのグラム陽性菌およびEcoli内において複製を行う非特許文献17,21参照。このプラスミドは広宿主域を有するが、複製を行うための温度は必然的に42°C以下に限られる。温度感受性を有するプラスミドpGK12が50°Cの温度で複製を行うことにより、50°C~55°Cの温度範囲で増殖できるBcoagulansの染色体DNA成分を選択する機会が与えられる。プラスミドpGK12およびその誘導体を、Bsubtilis株HB1000内に37°Cの温度で維持した。Bcoagulansに形質転換する際に、この形質転換体を選択し、37°Cの温度で維持する。Bcoagulans変異株、および変異株の構築の際に利用したプラスミドの一覧を表1に示す。培地および増殖条件富栄養培地としてLB培地非特許文献19参照を使用し、必要に応じてpHを5.0または7.0に維持して細菌を培養した。グルコースを個別に滅菌して、所望の濃度で培地に添加し、その後、植菌した。必要に応じてクロラムフェニコール、エリスロマイシン、およびアンピシリンをそれぞれ7.5mg/L、5mg/L、100mg/LずつLB培地に添加した。既に非特許文献30に記載されているように、グルコース添加2、w/vLB寒天培地に2.5mlの炭酸カルシウム寒天1.5の寒天を添加した水に懸濁した固体の炭酸カルシウム1w/vを重ね合わせることで、炭酸カルシウム培地を調製した。振とう機内において、200rpmの攪拌速度で好気性培養物を増殖させた。小さな特注の発酵槽非特許文献2参照、または2.5Lの発酵槽NewBrunswickScientificBioflo110内で発酵を行った。2Nまたは6NのKOHを自動添加することにより、培養pHを設定値に維持した。別に指定しない限り、発酵の初期に、固体の炭酸カルシウムフィッシャーサイエンティフィックFisherScientific社ペンシルベニア州ピッツバーグを必要に応じて2.0w/vの濃度で添加した。これら培養物の接種菌を、50°Cの温度で一晩、同じ培地において好気的に増殖させた。1w/vの接種菌を用いて、発酵を開始した。発酵産物を決定するため、および残糖濃度を求めるために、定期的に試料を取り出した。Bcoagulansの欠失変異株の構築既に非特許文献13に記載された、標的遺伝子の両端を含むプラスミドDNAを適切なDNA配列相同性を利用して単一の組換え事象により染色体の標的部位に組み込む方法を基に、Bcoagulansの欠失変異株を単離した。適切な抗生物質耐性を有するこのような組換え体は、細胞質から完全なプラスミドが細胞質から取り除かれる制限温度において複製条件付きプラスミドを利用することで容易に特定することができる。続いて、導入されたプラスミドDNAおよび適切な染色体DNAの異なる部位において単一の相同組換えが起こることにより、このプラスミドDNAおよび関連する抗生物質耐性遺伝子が染色体から除去される。これにより、標的遺伝子を欠失させることができる。ldh遺伝子を欠失させたBcoagulansを構築する際、Bcoagulans内で複製できないプラスミドベクターを最初に用いた。しかし、このようなプラスミドを利用しても、導入されたプラスミドDNAの染色体への挿入は検出されなかった。これは、Bcoagulans株P4-102Bのプラスミド形質転換頻度が、取り込まれたプラスミドの染色体への潜在的な組換え頻度よりも低い非特許文献29参照ことによるものと考えられる。この形質転換頻度が低いという問題を解決するために、DNAをBcoagulansへ移動させる主要な媒体としてプラスミドpGK12を利用して欠失変異株を構築した。プラスミドpGK12は、Bcoagulans内において、37°Cの温度では安定であるが、50°Cの温度では安定でない。37°Cの温度において、母集団109CFU/mlの各細胞内にプラスミドが存在することにより、プラスミドDNAの細菌への形質転換頻度が低いという問題の解決に役立つ。プラスミドDNAを有する細胞の母集団が大きいことにより、プラスミドDNAと染色体との相同領域間における稀な組換え事象を選択することができる。抗生物質耐性遺伝子とともに染色体に組み込まれたプラスミドDNAを有する細胞の母集団における稀な組換えは、50°C~55°Cの温度範囲で増殖した後、そのプラスミドDNAが細胞から取り除かれることで容易に特定することができる。ldh遺伝子欠失変異株の単離ldh欠失誘導体を構築するために、2組のプライマープライマー9BsaAI、10EcoRI、11EcoRI、12StuIを利用して、Bcoagulans株P4-102Bから得たゲノムDNAを鋳型として用いて、ldh遺伝子の5’末端および3’末端を個別に増幅した。RT-PCRで用いたプライマーの一覧を表2に示す。これらプライマーは、5’末端に固有のエンドヌクレアーゼ認識配列を有する。この2つの増幅断片をEcoRIにより切断し、結合した。結合生成物を鋳型として用いプライマー9および12、ldh遺伝子のATGのうちのAから数えて431番目の塩基対から始まるldh遺伝子中央の100塩基対領域を欠く、プロモーターを有しないldh遺伝子断片を生成した。この断片をBsaAIおよびStuIで切断し、同様に切断されたプラスミドpGK12プラスミドpQZ44に結合した。プラスミドへの挿入は、シークエンシングにより確認した。プラスミドpQZ44をBcoagulans株P4-102Bに形質転換し、エリスロマイシン耐性コロニーを37°Cの温度にて選択した。形質転換体の1つを50°Cの温度で培養し、L-LDH要求性約1であるエリスロマイシン耐性誘導体を選択した株QZ3。株QZ3の染色体のldh遺伝子にプラスミドDNAが存在することは、適切なプライマーを用いてゲノムDNAをPCR増幅し、増幅生成物の配列を決定するにより確認した。エリスロマイシン無添加培地での継代培養中、株QZ3のldh要求性は不安定であることが発見され、ldh非要求性復帰突然変異株が容易に単離された。株QZ3をエリスロマイシン無添加の新しい培地に、55°Cの温度において、連続的に毎日、10日間植菌した1w/vの接種濃度。最終培養物を希釈し、LB寒天培地にプレーティングした。50°Cの温度にて一晩増殖させた後、レプリカ平板法にてコロニーをLB寒天培地、LB寒天エリスロマイシン培地、および炭酸カルシウム培地グルコースおよび炭酸カルシウム添加LB寒天培地非特許文献30参照に植菌した。LB寒天培地で増殖したが、LB寒天エリスロマイシン培地では増殖せず、炭酸カルシウム培地が透明化した範囲を基に乳酸を生成しなかったコロニーを採取し、このコロニーを液体培養することにより乳酸の生成を試験した。2回目の組換えにより、ldh遺伝子内の100塩基対が欠失しているためにL-LDH活性を欠くエリスロマイシン感受性誘導体が生産されることが期待された。本実験において、ldh遺伝子欠失の頻度は、5000個のエリスロマイシン感受性コロニーのうち1個であった。これらldh遺伝子欠失変異株の1つである株QZ4を選択してさらに研究を行った。同様の方法により、クロラムフェニコール耐性遺伝子を選択マーカーとして利用しても、ldh遺伝子欠失変異株を単離することはできなかった。プラスミドの骨格に関係なく、クロラムフェニコール耐性遺伝子は、プラスミドのBcoagulans染色体DNAとは無関係の染色体における固有の位置にプラスミドDNAを挿入することを目的として存在していることが発見されたSuおよびRhee、未発表データ。これら結果は、クロラムフェニコール耐性遺伝子がこのBcoagulans株における変異株の構築に適していないことを示している。als遺伝子欠失変異株の構築アセト乳酸合成酵素活性を欠く株QZ4の変異誘導体は、Bcoagulansのldh変異株が生成する発酵産物であるアセトインおよび23ブタンジオールを生成しないものと考えられている非特許文献30参照。この二重変異株ldh遺伝子欠失変異株およびals遺伝子欠失変異株を構築するための最初のステップとして、alsDα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ配列およびalsSアセト乳酸合成酵素配列を、プライマー17および21を用いて、株P4-102BのゲノムDNAからPCRにより増幅した。このPCR断片をT4ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、HincII切断プラスミドベクターpUC19に結合することにより、プラスミドpQZ45を構築した。このalsSDDNAがプラスミドpQZ45へ挿入されたことを、適切なプライマーを用いたシークエンシングにより検証した。プライマー18および22を用いて、alsSDコード領域のみを含むプロモーターを含まないプラスミドpQZ45から得た2380塩基対のDNAをPCRにより増幅した。増幅したDNAは、プラスミドpUC19のHincII部位に移植し、プラスミドpQZ45-1を生成した。alsSの596塩基対領域を、AfeIおよびHincIIにより切断した後、プラスミドpQZ45-1から除去し、エリスロマイシン耐性遺伝子カセットをその位置に挿入した。この新しいプラスミドpQZ54は、鋳型プライマー18および22としての役割を果たし、alsSにおいて596塩基対の欠失がありalsSD遺伝子を有する断片、およびエリスロマイシン耐性をコードする遺伝子を増幅させた。このPCR生成物をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、BsaAIおよびAfeIで切断されたプラスミドpGK12に結合した。こうして得られたプラスミドpQZ64をエレクトロポレーションによりBcoagulans株QZ4ldh遺伝子欠失株に形質転換し、エリスロマイシン耐性コロニーを37°Cの温度にて選択した。ldh遺伝子欠失株を構築するための上述の手順を用いて、alsS遺伝子が欠失した突然変異を株QZ4に導入した。この方法により、好気性条件および嫌気性条件において増殖率が異なるいくつかのalsS変異株が生産された。最も高い増殖率を示した変異株株QZ5を選択し、さらに研究を行った。Ecoli、Bsubtilis、およびBcoagulansの形質転換Ecoliについては、既に記載されている標準的な技術に基づいて形質転換を行った。Bacillussubtilis株HB1000については、Boylanらによる手順非特許文献4参照に従って、いくつか変更を加えながら形質転換を行った。LB培地にて一晩培養した増殖静止期の細胞を、125mlの三角フラスコ内で新たに調整した10mlのMCmodifiedcompetence培地非特許文献29参照に植菌し10w/v、37°Cの温度で3時間振とうさせながら培養した。MC培地には、100mMのリン酸緩衝液pH7.0、3mMのクエン酸三ナトリウム、3mMの硫酸マグネシウム、2のグルコース、22μg/mlのクエン酸第二鉄アンモニウム、0.1のカゼイン加水分解物、および0.2のグルタミン酸カリウムが含まれる。OD600nmがおよそ0.6に達したとき、0.6mlの培養物を13×100mmの試験管に移植し、DNAを細胞に添加した。このDNAを含む培養物を、37°Cの温度で2.5時間、遠心分離機にて培養した。細胞を室温にて遠心分離により回収し、0.1mlのLB培地に再懸濁し、適切な抗生物質を含むLB寒天培地にプレーティングした。プレートは37°Cの温度で培養し、翌日、形質転換体を選択した。野生型BcoagulansP4-102Bを形質転換させるために、125mlのフラスコに入れた10mlのLB培地において50°Cの温度で増殖した細胞OD420nm、0.3を、1リットルのフラスコに入れた100mlのLB培地に植菌した10w/v。OD420nmが約0.3~0.5に達するまで、約3~4時間振とうしながら200RPM、50°Cの温度にて細胞を培養した。細胞を遠心分離により回収し4°C、4300xg、10分、30、25、15mlの十分に冷えたSG培地スクロース、0.5M、グリセロール、10で3回洗浄した。このようにして得られたエレクトロコンピテント細胞をすぐに利用した。75μlの細胞懸濁液を0.1μgのプラスミドDNAと混合し、冷却したエレクトロポレーションキュベットに移した1mmギャップ。エレクトロポレーション条件Bio-Radエレクトロポレーターは、1.75kV、5msの矩形波に設定した。エレクトロポレーション後、細胞を予め温められた37°Cまたは50°C2mlのRG培地0.5Mのスクロース、55.6mMのグルコース、および20mMの塩化マグネシウムを添加したMLB培地に植菌した。この細胞を13×100mmのスクリューキャップチューブに植菌し、チューブローテーターにて3時間、50°Cの温度で培養し、その後、選択抗生物質培地にプレーティングした。温度感受性プラスミドを形質転換させるため、再生温度を37°Cとし、培養物を一晩培養した。変異株QZ4を形質転換させるため、DNA濃度を1μgプラスミドDNAまで増加させ、エレクトロポレーション条件を1.5kV、25μF、600Ω、10msの時定数に変更した。所望の表現型を有する自然突然変異株の増殖に基づく選択微生物培養を行うと必ず一定数の自然突然変異が発生するので、特定の変異株の増殖を選択的に促進すると考えられる増殖条件を与えることで、所望の表現型を有する変異株をその母集団から容易に単離することができる。ldh遺伝子欠失およびalsS遺伝子欠失変異株であるQZ5は、培養pH5.0において嫌気性増殖不全である。したがって、新しい発酵経路例えば、D-乳酸生成を開始することで嫌気性増殖の割合を増加させると考えられる突然変異体は、他の母集団に対して増殖優位性を有することが予想される。嫌気性増殖の割合をさらに増加させるためには、複数の突然変異が必要である例えば、新しい発酵経路を開始するため、酵素濃度を増加させることでその発酵経路への代謝フラックスを増加させるため。単一の細胞内で所望の数の突然変異が起こり、その結果、特定可能な表現型を示すまで連続して培養物を植菌することにより、増殖率および生成物のうちの少なくとも一方の生成量を徐々に増加させる有利な突然変異を蓄積させることができる。株QZ5は嫌気性増殖不全であるため、空気を気相としてpHを制御した小さな発酵槽内で培養を開始した500mlの容器に250mlの発酵培養物。培養物が増殖し始めると、厳しい酸素制限により、増殖および細胞収率が制限されるであろう。さらに細胞密度が増加するかどうかは、培地に存在する糖類を発酵する細胞の能力に左右されるであろう。嫌気的に増殖できる株QZ5の変異誘導体を単離するために、pHを制御した小さな発酵槽を使用して、所望の条件下で連続的に発酵培養物を継代培養した。植菌条件は、異なる時間および異なる接種量となるように調整した。2の接種濃度で培養物を増殖させ、糖濃度の増加に適応している間、平均して2日ごと、または3日ごとに植菌を実施した。mRNAレベルの決定BcoagulansのmRNAレベルを求めるために、異なる条件下で増殖した細胞を遠心分離16000×g、30秒、室温により回収した。既に非特許文献30に記載されているフェノール酸抽出法を用いて、RNAを単離した。全RNA濃度を260nmの吸光度から求めたNanoVue、GE社。選択される遺伝子に特異的なプライマーを用いて、SuperscriptIII逆転写酵素インビトロジェン社によりcDNAコピーを作製した。遺伝子特異的プライマー、およびPCRリアクションミックスPCRreactionmixを含むサイバーグリーンSYBRgreenバイオラッドラボラトリーズBioRadLaboratories社、アメリカ合衆国カリフォルニア州ハーキュリーズを用いて、PCRによりcDNAmRNA濃度を求めた。異なる濃度のcDNAを用いたPCRごとのCtthresholdcycle値を求め、同時に流した標準DNA鋳型と比較した非特許文献16参照。この結果から、試料中に存在する遺伝子特異的mRNAの濃度比を算出した。報告する結果は、少なくとも3回行った実験から得られた平均値である。ldhプライマーはプライマー23および24、pflプライマーはプライマー25および26、pdhAE1αプライマーはプライマー27および28、dldhプライマーはプライマー29および30、alsプライマーはプライマー31および32、内部制御に用いたpolAプライマーはプライマー33および34である。酵素分析PDH活性レベルおよびLDH活性レベルを求めるために、指数増殖中期~後期に達するまで細胞をLB培地にて培養した。細胞を遠心分離10000×g、10分、室温により採取し、10mlのリン酸緩衝液50mM、pH7.0にて一度洗浄し、5.0mlの同じリン酸緩衝液で再懸濁した。フレンチプレッシャーセルFrenchpressurecell20000PSIで処理することにより、細胞を破砕した。このステップ後の操作は、すべて4°Cの温度にて行った。細胞抽出物を12000×gで30分間遠心分離することで細胞残屑を取り除き、上清を100000×gベックマンBeckmanで1時間、再び遠心分離することで大きな粒子および膜小胞を取り除いた。この上清を用いて酵素測定を行った。PDH活性測定は、既に非特許文献33に記載されているように、340nmε=6220Μ1cm1でのNADのピルビン酸依存還元を基にして行った。各1mlの反応混合物には、リン酸カリウム緩衝液50mM、pH7.5、チアミンピロリン酸0.4mM、CoA0.13mM、塩化マグネシウム六水和物2mM、ジチオスレイトール2.6mM、NAD0.75mM、および粗抽出液が含まれる。ピルビン酸5mMを添加することにより、反応を開始した。既に非特許文献35に記載されているように、ピルビン酸の存在下でNADHの酸化を基にLDH活性を測定した。各1mlの反応混合物には、リン酸カリウム緩衝液50mM、pH7.5、NADH0.1mM、および粗抽出液が含まれる。ピルビン酸25mMを添加することにより、反応を開始した。ウシ血清アルブミンを標準としてブラッドフォード法によりタンパク質濃度を求めた非特許文献5参照。分析方法既に非特許文献32に記載されているように、AminexHPX87Hイオン排除カラム300mm×7.8mmを用いたHPLCにより、グルコースおよび発酵産物を測定した。2mMの硫酸銅IIを溶離液としてChirex3126Dペニシラミンカラム150×4.6mm、5μmPhenomenexを用いたHPLCにより、D--乳酸およびL-乳酸の光学異性体を測定した。D--乳酸はまた、D-乳酸脱水素酵素シグマケミカル社、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイスを用いた酵素に基づく方法により分析した。材料生化学材料は、シグマケミカル社アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイスから入手し、有機化学材料および無機化学材料はフィッシャーサイエンティフィックFisherScientific社ペンシルベニア州ピッツバーグから入手した。分子生物学試薬および分子生物学用品はニューイングランドバイオラボNewEnglandBiolabs社マサチューセッツ州イプスウィッチ、インビトロジェン社、またはバイオラッドラボラトリーズ社から入手した。[結果および考察]Bcoagulansなどの有胞子性乳酸菌は、炭素源グルコース、キシロース、セロビオースなどに関係なく、主要発酵産物としてL-乳酸を生成する非特許文献10,27,28参照。その証拠に、ピルビン酸分岐点でタンパク質をコードする複数の遺伝子間において、増殖pHまたは増殖期に関係なく、ldh遺伝子をコードするmRNAのレベルが最も高かった。表3非特許文献30参照。D--乳酸脱水素酵素ldhAをコードする遺伝子がBcoagulans内において特定され、この遺伝子をEscherichiacoli内に移植することで活性型の遺伝子として発現した。しかし、Bcoagulansの発酵ブロスにおけるD--乳酸のレベルは生成された全乳酸の5を超えることはなく、実際には、発酵ブロスのほとんどにおいて、検出可能なD--乳酸が不足していた非特許文献27参照。細胞内のldhAmRNAレベルは、ldhmRNAレベルの0.5未満であった表3。糖発酵、特にピルビン酸ギ酸リアーゼ活性の存在を示すキシロースなどのペントース類の発酵において、Bcoagulansは少量の酢酸、エタノール、およびギ酸も生成していた非特許文献27参照。23ブタンジオール経路においてこれら酵素をコードする遺伝子はBcoagulansが有する配列決定されたゲノムに存在するが、増殖pHに関係なく、野生型Bcoagulansの発酵ブロスにおいて23ブタンジオールは検出されなかった。これは、野生型BcoagulansにおけるalsSDオペロンの発現が弱いこと表3、またはピルビン酸のプールを枯渇させるほど乳酸へのフラックスが高いことによると考えられる。D--乳酸を主要発酵産物として生成するBcoagulans誘導体を構築するためには、L-LDHldhに触媒されるL-乳酸への主要発酵経路を除去し、D-LDHをコードするldhAの発現レベルを増加させる必要がある。ldh遺伝子欠失変異株の構築既に非特許文献30に記載されているL-LDH活性を欠くBcoagulans変異株は、発酵産物として酢酸、エタノール、ギ酸、および23ブタンジオールを生成したが、D--乳酸は生成しなかった。このldh変異株Suy27-13は単一の塩基置換が生じたldh遺伝子を有し、嫌気性増殖、特にpH5.0での増殖の間に復帰突然変異が生じる。株Suy27-13においてldh突然変異の復帰率が高いという問題を解決するために、ldh遺伝子を欠失させた。細菌において遺伝子を欠失させるいくつかの方法が利用でき、これら方法の多くは、標的遺伝子に対応する短いDNA配列の側に抗生物質耐性遺伝子などの正の選択遺伝子を有する適切な直鎖状DNAを利用する非特許文献7,20,24参照。しかし、直鎖状DNAを利用してldh遺伝子欠失変異株を構築する試みは、Bcoagulansにおいては失敗に終わっている。これは、Bcoagulansの形質転換効率が低いことに加え、取り込まれたDNAを組換えて選択可能な形質転換体を生産する必要があることが原因と考えられる。このような欠点を克服するために、遺伝子欠失に有効であることが証明されている代替方法を用いた非特許文献13参照。適切な標的ldh遺伝子配列およびエリスロマイシン耐性遺伝子を有する温度感受性プラスミドを構築したプラスミドpQZ44。Bcoagulans株P4-102Bをエレクトロポレーションにより形質転換させた後、プラスミドpQZ44含有形質転換体を、このプラスミドを安定に維持できる37°Cの温度で選択した。このプラスミド含有誘導体を継代培養することで、ldh遺伝子の単一組換えにより、母集団のごく一部においてプラスミドが染色体へ移動することが期待される。このプラスミドは50°Cの温度では複製不能なため、50°Cの温度でこの誘導体を増殖させるとプラスミドが細胞から取り除かれる。50°Cの温度で現れるエリスロマイシン耐性コロニーにおいては、染色体ldh遺伝子にこのプラスミドDNAが組み込まれていることが予想される。これら誘導体をさらに培養することでDNAが再編成され、これにより、標的遺伝子ldhを欠失させることができる。このようなldh変異株の1つであるQZ4は、エリスロマイシン耐性が喪失していることおよび、発酵産物としての乳酸が欠乏していることにより特定された表3および4。ldh変異株における以前の報告非特許文献30参照と一致して、株QZ4の嫌気性増殖の割合は、pH5.0のグルコース添加富栄養培地においてもとても少なかった。ldh遺伝子欠失変異株QZ4の特性図1は、pH5.0図1AおよびpH7.0図1BにおけるBcoagulans株QZ4ldh遺伝子欠失株の発酵プロファイルを示す。ここでは、pHを制御した小さな発酵槽において、LBグルコース培地を用いて発酵を行った。初期グルコース濃度は、pH5.0で30g/L、pH7.0で50g/Lとした。ldh変異株QZ4は、pH7.0で培養すると主要な発酵産物としてエタノールを生成し、pH5.0で増殖発酵を行った場合は、主要産物として23ブタンジオールを生成した表4、図1。PFLおよびPDHの両方がpH7.0でのエタノール生成過程におけるアセチル-CoAの生成に関与し、PDHが関与して生成されたエタノールは、ブロスにおけるギ酸の量を基に約80であると算出された。PDHに基づいてエタノールが生成されたことの証拠に、pH7.0の発酵で増殖させた変異株の指数増殖前期~中期におけるPDH活性が指数増殖後期におけるPDH活性の約2倍の高さであった表4。しかし、培養物が静止期に入ると、静止期の親株における活性の増加とは対照的に、PDH活性は減少した。pH5.0において、変異株の嫌気性増殖は検出されず、気相として空気を用いて酸素制限条件pHを制御した発酵を開始することにより、変異株を増殖させることができた。しかし、細胞密度の増加により酸素が制限されると、増殖が停止し、pH5.0で発酵培養した際の最終的な細胞収率は親株のわずか2分の1程度であった。このような酸素制限発酵において、ldh変異株は、pH7.0での発酵と比較してかなり低いレベルのエタノールを生成した。pH5.0で培養した際に得られる生成物のほとんどは、23ブタンジオールであった表4、図1。pH5.0での培養におけるpflB遺伝子の発現が比較的低いレベルであること、および酸素制限発酵におけるギ酸のレベルが低いこと表3,4、図1は、pH5.0において、ldh変異株が表現型の上でLDH要求性およびPFL要求性であることを示す。Ecoliのldh、pfl二重変異株は嫌気要求性であり非特許文献15参照、同様の特徴をBcoagulansも有することが既に報告されている。ldh変異株は、pH5.0において主要発酵産物として23ブタンジオールを生成したが、この発酵経路を用いて嫌気的に増殖することはできなかった。これは、pH5.0での発酵に少量の酸素を導入すると23ブタンジオールの生成レベルが高くなり、それに関連して増殖が促進されることから、酸化還元のバランスが崩れたことによるものと考えられる。ブタンジオールはpH7.0での増殖においてもldh変異株の重要な発酵産物であるので、L-LDHおよびALSの両方を欠く二重変異株QZ5を構築した。BcoagulansldhalsS二重変異株図2は、pH5.0図2AおよびpH7.0図2BにおけるBcoagulans株QZ5ldh、alsS遺伝子欠失株の発酵プロファイルを示す。ここでは、KOHを自動添加することによりpHを制御した小さな発酵槽において、LBグルコース培地30g/Lを用いて発酵を行った。ldhalsS二重変異株QZ5をpH5.0およびpH7.0の両方で好気的に増殖させた。pHを制御して好気的に発酵を行わせたところ、この二重変異株の嫌気性増殖はpH7.0の場合のみ検出可能であった。これは、この二重変異株が親株QZ4と共有する特性である図2。pH7.0での発酵における主要生成物は、エタノール、ギ酸、ピルビン酸、および酢酸であった。pH7.0で培養した二重変異株の発酵ブロスに多くのピルビン酸が含まれていたことは、PDHとPFLによるピルビン酸の分解率が、解糖によるグルコースからピルビン酸への変換率に匹敵しなかったことを示す。単一変異株QZ4および二重変異株QZ5のどちらも、検出可能なレベルのL-乳酸を生成しなかった。この二重変異株は多量のギ酸およびPFL活性を示す他の生成物を生成したので、PFL活性を欠く三重変異株を構築した。しかし、L-LDH活性、ALS活性、およびPFL活性を欠くこの三重変異株は、試験したすべての条件において嫌気的に増殖することはできず、それ以上は利用しなかった。D--乳酸を生成するための増殖に基づく選択二重変異株QZ5が生成した少量の乳酸は、D--乳酸であった表4。D--乳酸生成レベルを増加させることで、L-乳酸を主要発酵産物として嫌気的に増殖できる野生株と同様に、二重変異株の嫌気性増殖を促進することが期待される。ldh変異株は、培養pHに関係なく、野生型と比較して高いレベルのldhAmRNAを生成した表3。pH5.0での変異株の増殖においてギ酸生成に基づくPFL活性のレベルがとても低いこと表4、およびpflBの発現レベルが低いこと表3は、PFLの制御に培養pHが関与していることを示す。pH5.0での発酵において、D-LDH活性をPFL活性よりも高くなるようにすること、およびldhAの発現を増加させることの少なくとも一方で嫌気性増殖率および細胞収率を増加させるために、増殖に基づく選択を実施した。対照的に、pH7.0において、PFL活性のレベルが高いldh、alsS二重変異株に対して同様の増殖に基づく選択を行うと、D-LDH活性レベルは増加せずPFL活性レベルが増加した誘導体が得られる。図3は、pH5.0の小さな発酵槽において実施した、LBグルコース培地30g/Lを用いたBcoagulans株QZ5の増殖に基づく選択を示す。pHを5.0に維持したLBグルコース培地において発酵を行った株QZ5に対して嫌気的条件下で増殖に基づく選択を行うことにより、約120日後に誘導体Bcoagulans株QZ13が生産された図3。生産された株QZ13は、pH5.0での発酵において初期の株QZ5よりも高い細胞収率を示した。pH7.0での発酵において、株QZ13とその出発親株であるQZ5の細胞収率およびグルコース消費量はほぼ同じであったが、pH7.0での発酵における株QZ13のD-乳酸の収率は、株QZ5のD-乳酸の収率の約11倍であった表4。PDH/PFLが関与した発酵産物の量もまた、株QZ5におけるグルコース消費量の0.85から約0.4へと減少した。図4は、pH7.0の小さな発酵槽において実施した、LBグルコース培地50g/Lを用いたBcoagulans株QZ13の増殖に基づく選択を示す。株QZ13によるpH7.0での発酵におけるPFL/PDH由来の生成物を同時還元することによりD-乳酸の収率を増加させる必要があるため、pHを7.0に維持したLBグルコース培地での発酵において高い増殖率および細胞収率を示す菌株をさらに選択した。40日間の連続選択およびpH7.0での増菌の後、Bcoagulans株QZ14を得た図4。株QZ14の乳酸収率は発酵グルコースの約0.8で、PFL/PDHが関与した生成物はグルコース由来生成物の約7に減少した表4。株QZ14の発酵ブロスには、依然として検出可能なレベルのピルビン酸が含まれ、細胞内のD-LDH活性レベルが解糖によるグルコースフラックスに匹敵しないことが示された。LDH活性とグルコースの解糖系フラックスとのバランスをとることができる変異誘導体を単離するために、乳酸の力価を増加することに焦点を置いて次の選択を行った。図5は、pH7.0の小さな発酵槽においてグルコース濃度を増加させながら実施した、LBグルコース培地を用いたBcoagulans株QZ14の増殖に基づく選択を示す。培地は20g/Lの炭酸カルシウムも含有する。初期グルコース濃度は50g/Lとした。3回目の植菌の後、グルコース濃度を60g/Lに増加させた。5回目の植菌の後、培地のグルコース濃度は100g/Lとした。グルコース濃度を増加させながら、連続植菌および選択をさらに60日間行った後、Bcoagulans株QZ15を単離した。pH7.0でグルコース発酵を行った株QZ15のD--乳酸力価は、80g/Lを超えていた。図6は、LBグルコース培地に20g/Lの炭酸カルシウムを添加して得られた培地における、pH7.0でのBcoagulans株QZ19の発酵プロファイルを示す。株QZ15の継続的進化により、乳酸へのグルコースフラックスがさらに増加し、pH7.0での発酵開始から48時間以内に90g/Lに達した株QZ19、表4、図6。この高い乳酸力価を有する誘導体を含む発酵ブロスにおいてギ酸は検出されなかった。これら培養物から生成された少量のエタノールおよび酢酸は、PDHによって生成されたアセチルCoAに由来するものと考えられる非特許文献15参照。この結果により、ldh遺伝子及びalsS遺伝子の欠失と、ピルビン酸分岐点における微生物の生理学的な理解に基づく適切な突然変異のための嫌気的条件下での増殖に基づく選択とを組み合わせることで、Bcoagulansの主要発酵産物をL-乳酸からD--乳酸に変更できることが示された。pflAB遺伝子は最終的な誘導体において欠失がない状態を維持しているが、D-LDHによるD-乳酸への代謝フラックスを増加させると、原則的には、PFLによるアセチルCoAへのピルビン酸フラックスが相殺された。QZ19におけるD-LDH活性を増加させた突然変異を特定するために、さらに研究を行ったその結果は、2011年11月7日にオンライン発行された米国科学アカデミー紀要に掲載のWangらによるEvolutionofDlactatedehydrogenaseactivityfromglyceroldehydrogenaseanditsutilityforDlactateproductionfromlignocellulosedoi101073pnas1111085108という題名の論文に公開され、その全体が参照として組み込まれる。[結論]遺伝子操作が困難なBcoagulansにおいて特定の遺伝子を欠失させるために開発された方法を用いて、L-LDHをコードするldh遺伝子を欠失させた。ldh遺伝子欠失変異株はpH5.0において嫌気的に増殖できなかったが、pH7.0においては増殖に著しく影響があるわけではなかった。PFL、PDH、および23ブタンジオール経路により、pH7.0での発酵性増殖が促進された。ldh、alsS、およびpflBを欠失させることにより、D-LDHをコードする遺伝子ldhAが染色体に存在しても、変異株の嫌気性増殖が抑えられた。様々な増殖pHにおけるBacilluscoagulansの生理的特性、およびこの細菌が嫌気性増殖を行う際のピルビン酸分岐点における炭素の流れを理解した上で、増殖に基づく選択をldh、alsS二重変異株から開始することより、野生型におけるL-乳酸収率およびL-乳酸力価と同等なレベルのD-乳酸生成能力を有する変異株を生産することができた。発酵ブロスに存在する副産物である少量のエタノールおよび酢酸を除去するために、乳酸生成率をさらに増加させることが期待される。本明細書は細菌固有の遺伝子のみを用いて外因性遺伝子を用いずに主要発酵産物をL-乳酸からD--乳酸に変化させた好熱性乳酸菌に関する最初の報告である。これはさらなる適切な戦略をもたらした選択的突然変異および細菌の生理の評価を基にしている。50°C~55°Cの温度範囲において光学的に純粋なD--乳酸またはL-乳酸を生成する耐熱性Bcoagulans株を利用できることは、乳酸の光学純度を低減する可能性のある潜在的な汚染物質を最小限にすることにより、様々な熱化学的特性を有するバイオポリラクチドプラスチック類を生成するための原料としての乳酸のコストを低減させるのに役立つと期待されている。"