"増強された免疫調節活性を有する抗体集団を生産する方法であって、以下:a.抗体調製物を、セイヨウニワトコ凝集素又はその等価物上のアフィニティークロマトグラフィーにかける工程;b.場合により、非結合抗体集団-SNAフラクションを集める工程;c.場合により、アフィニティーマトリックスを洗浄する工程;d.結合している抗体集団を、炭水化物を用いて中性pHで溶離する工程E1フラクション;e.残りの結合した抗体集団を、炭水化物を用いて酸性pHで溶離する工程E2フラクション:を含み、ここでE2フラクションは、SNAマトリックスの総溶出物SNAフラクションと比較した場合に増強された免疫調節活性を有する、上記方法。炭水化物が糖である、請求項1に記載の方法。糖がラクトースである、請求項2に記載の方法。中性pHが6~8の範囲のpHである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。酸性pHが5未満のpHである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。抗体調製物がヒト血漿から単離されたIgG調製物である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。抗体調製物が、少なくとも1000人のドナーからプールされたヒト血漿から単離されたIgG調製物である、請求項6に記載の方法。抗体調製物がIVIG又はSCIG調製物である、請求項7に記載の方法。免疫調節活性が、抗炎症活性を測定するためのインビトロアッセイにより決定される、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。工程eにおいて得られ得る抗体集団E2フラクションの免疫調節活性が、総結合及び溶離フラクションSNAフラクション又は工程dにおいて得られ得る抗体集団E1フラクションの免疫調節活性より少なくとも10高い、請求項9に記載の方法。請求項1~10のいずれか1項に記載の方法により得られ得る抗体集団。工程dにおける炭水化物を用いた中性pHでの溶離により得られ得るフラクションE1フラクションが、a.アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物とほぼ等しい、Fc領域におけるシアル酸付加;及び/又はb.アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物よりも少なくとも50高い、Fab領域における総グリカンのシアル酸付加を有する、請求項11に記載の抗体集団。工程eにおいて酸性pHで炭水化物を用いた溶離により得られ得るフラクションE2フラクションが、a.アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物若しくは工程dのフラクションより少なくとも20高い、Fc領域におけるシアル酸付加;及び/又はb.アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物より少なくとも50高い、Fab領域における総グリカンのシアル酸付加;及び/又はc.工程dの抗体集団より少なくとも5高い、Fab領域における総グリカンのシアル酸付加を有する、請求項11に記載の抗体集団。請求項11~13のいずれか1項に記載の抗体集団、及び薬学的に許容しうる担体又は添加物を含む医薬組成物。医薬としての使用のための、請求項11~13のいずれか1項に記載の抗体集団。炎症状態の処置又は予防における使用のための、請求項11~13のいずれか1項に記載の抗体集団。炎症状態が自己免疫疾患又は神経変性疾患である、請求項16に記載の抗体集団。自己免疫疾患又は神経変性疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスSLE、抗リン脂質抗体症候群、免疫性血小板減少症ITP、川崎病、ギランバレー症候群GBS、多発性硬化症MS、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーCIDP、皮膚水疱疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症候群に関連するアルツハイマー病、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症及び血管性認知症から選択される、請求項17に記載の抗体集団。しかし、多数の抗体製品が現在治療のために使用されているが、臨床適用においてより有益な有効性を有する代替の及び/又は改善された抗体調製物を提供する必要性がまだ存在する。この技術課題に対する解決策は、特許請求の範囲において特徴付けられた実施態様を提供することにより達成される。本明細書において、我々は、最初は中性pHで炭水化物を用いて溶離し、続いて酸性pHで炭水化物を用いて溶離する、セイヨウニワトコアフィニティーカラムに結合した物質のさらなる分離を開示する。我々は、中性炭水化物を用いた前溶離pre-elution後に酸性炭水化物を用いて溶離された抗体が、驚くほど増強された免疫調節活性を有するということを示す。発明の要旨本発明の一局面は、増強された免疫調節活性を有する抗体集団を生産するための方法であり、以下:a.抗体調製物をセイヨウニワトコ凝集素又はその等価物上のアフィニティークロマトグラフィーにかける工程;b.場合により、非結合抗体集団-SNAフラクションを集める工程;c.場合により、アフィニティーマトリックスを洗浄する工程;d.結合している抗体集団を、炭水化物を用いて中性pHで溶離する工程E1フラクション;e.残りの結合した抗体集団を、炭水化物を用いて酸性pHで溶離する工程E2フラクション、を含み、ここでE2フラクションは、SNAマトリックスの総溶出物SNAフラクションと比較した場合に増強された免疫調節活性を有する。好ましくは、炭水化物は糖であり、より好ましくは糖はラクトースである。好ましくは、中性pHは、6~8の範囲、より好ましくは6.5~7.5の範囲のpHであり、なおより好ましくはpHは約7.5である。好ましくは、酸性pHは5未満のpHであり、より好ましくは4未満のpH、なおより好ましくは3.5未満のpH、最も好ましくは約3のpHである。抗体調製物は、好ましくはヒト血漿から単離されたIgG調製物であり、より好ましくは少なくとも1000人のドナーからプールされたヒト血漿から単離されたIgG調製物であり、なおより好ましくは抗体調製物はIVIG又はSCIG調製物である。免疫調節活性は、抗炎症活性を測定するためのインビトロアッセイを使用して決定され得る。好ましくは、このアッセイは血液細胞又は細胞株に対する炎症刺激の効果、例えば末梢血単核細胞PBMC又はU937のような細胞株若しくは類似した細胞株に対する植物性血球凝集素、インターフェロン-ガンマ、リポ多糖LPS、TLRアゴニスト又は他の因子による刺激の効果の阻害を測定する。炎症効果は、例えば細胞表面マーカー又はサイトカインの産生を測定することにより決定され得る。好ましくは、免疫調節活性は、単球による植物性血球凝集素誘導若しくはLPS誘導CD54発現の阻害又は血液細胞のサイトカイン分泌の阻害を測定することにより決定される。好ましくは、工程eにおいて得られ得る抗体集団E2フラクションの免疫調節活性は、総結合及び溶離フラクションSNAフラクション又は工程dにおいて得られ得る抗体集団E1フラクションの免疫調節活性より少なくとも10高い。本発明の別の局面は、上記の方法により得られ得る抗体集団である。好ましくは、上で概説した方法の工程dにおいて中性pHで炭水化物を用いた溶離により得られ得る抗体集団E1フラクションは、a.アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物とほぼ等しい、Fc領域におけるシアル酸付加;かつ/又はb.アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物よりも少なくとも50高い、好ましくは少なくとも60高い、なおより好ましくは少なくとも70高い、なおより好ましくは少なくとも80高い、最も好ましくは90よりも高い、Fab領域における総グリカンのシアル酸付加を有する。好ましくは、上で概説した方法の工程eにおいて酸性pHで炭水化物を用いた溶離により得られ得る抗体集団E2フラクションは、a.アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物若しくは工程dのフラクションより少なくとも15、好ましくは少なくとも20、なおより好ましくは少なくとも22、24、25、26、27、28、29、30高い、Fc領域におけるシアル酸付加;及び/又はb.アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物より少なくとも50高い、好ましくは少なくとも60高い、なおより好ましくは少なくとも70高い、なおより好ましくは少なくとも80高い、最も好ましくは90より高い、Fab領域における総グリカンのシアル酸付加;及び/又はc.工程dの抗体集団より少なくとも4、好ましくは少なくとも5、なおより好ましくは少なくとも6高い、Fab領域における総グリカンのシアル酸付加を有する。本発明のさらなる局面は、本発明の抗体集団、及び薬学的に許容しうる担体又は添加剤を含む医薬組成物である。本発明のさらなる局面は、医薬としての使用のための本発明の抗体集団である。本発明のなおさらなる局面は、炎症状態の処置又は予防における使用のための本発明の抗体集団である。好ましくは、炎症状態は自己免疫疾患又は神経変性疾患である。より好ましくは、自己免疫疾患又は神経変性疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスSLE、抗リン脂質抗体症候群、免疫性血小板減少症ITP、川崎病、ギランバレー症候群GBS、多発性硬化症MS、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーCIDP、皮膚水疱疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症候群に関連するアルツハイマー病、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症及び血管性認知症から選択される。発明の詳細な説明本発明は、抗体集団を生産する方法、さらには増強された免疫調節活性を有する得られた抗体集団に関する。本方法は、セイヨウニワトコSambucusnigra凝集素SNAアフィニティーマトリックス又はその等価物上のアフィニティークロマトグラフィーによる分画に基づく。抗体集団は、分画前の抗体調製物と比較した場合、又はアフィニティーマトリックスから溶離された全抗体フラクションSNAと比較した場合でも、増強された免疫調節活性を有する。免疫調節活性は、例えば抗炎症活性を測定するためのインビトロアッセイを使用して決定され得る。当業者はこのようなアッセイを十分に知っている。好ましくは、このアッセイは血液細胞又は細胞株に対する炎症刺激の効果、例えば末梢血単核細胞PBMC又はU937のような細胞株若しくは類似した細胞株に対する植物性血球凝集素、LPS;インターフェロン-ガンマ、TLRアゴニスト又は他の因子による刺激の効果の阻害を測定する。炎症効果は、例えば細胞表面マーカー又はサイトカインの産生を測定することにより決定され得る。好ましくは、免疫調節活性は、単球による植物性血球凝集素誘導若しくはLPS誘導CD54発現の阻害を測定することにより決定される。抗体集団の免疫調節活性は、総SNAIVIGと比較した場合に少なくとも10、好ましくは少なくとも12、13、14、又は15、より好ましくは少なくとも18、なおより好ましくは少なくとも20、なおより好ましくは21、22、23、24、25、26、27、28、29、30だけ増強され、最も好ましくは30より多く増強される。本発明の別の実施態様は、以下の工程:a.抗体調製物を、セイヨウニワトコ凝集素マトリックス又はその等価物上のアフィニティークロマトグラフィーにかける工程、b.場合により、非結合集団-SNAフラクションを集める工程、c.場合により、洗浄工程を含む工程、及びd.中性pHで炭水化物を用いて結合している集団を溶離する工程E1フラクション、及びe.酸性pHで炭水化物を用いて未だ結合している集団を溶離する工程E2フラクションにより抗体調製物から得られ得る抗体集団であり、ここで該E2フラクションは、SNAカラムの総溶出物SNAフラクションと比較した場合に、増強された免疫調節活性を有する。本発明のさらなる実施態様は、増強された免疫調節活性を有する抗体集団を生産するための方法であり、以下:a.抗体調製物を、セイヨウニワトコ凝集素又はその等価物上のアフィニティークロマトグラフィーにかける工程、b.場合により、非結合集団-SNAフラクションを集める工程、c.場合により、洗浄工程を含む工程、d.中性pHで炭水化物を用いて結合している集団を溶離する工程E1フラクション、e.酸性pHで炭水化物を用いて残りの結合している集団を溶離する工程E2フラクションを含み、ここで該E2フラクションは、SNAカラムの総溶出物SNAフラクションと比較した場合に、増強された免疫調節活性を有する。溶離に使用される炭水化物は、好ましくは糖であり、より好ましくはラクトース又はシアロラクトースであり、最も好ましくはラクトースである。抗体調製物は、好ましくはヒト血漿、好ましくは少なくとも1000のドナーからプールされたヒト血漿から単離され、より好ましくは抗体調製物はIgGを濃縮されており、なおより好ましくはそれは精製されたIgGである。最も好ましくは、それは患者への静脈内又は皮下投与のために製剤化されたヒトIgG調製物、例えばIVIg又はSCIg、特にSandoglobulin、Privigen、又はHizentraのような治療用製品である。典型的には、抗体調製物のIgA及びIgM含有量は2未満、好ましくは1.5未満、より好ましくは1未満である。本発明はまた、本発明の抗体集団を含む組成物に関する。用語組成物は、本発明に従って、本発明の抗体集団を含む組成物に関する。本発明の抗体集団は、シアル酸残基に結合するアフィニティーマトリックス上での分画により得られるので、これは抗体調製物から濃縮された抗体集団でもあり、ここで濃縮された抗体集団は、濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のFab領域において変更されたシアル酸付加パターンを有するか、又は濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のFab領域において変更されたシアル酸付加パターンを有する抗体集団を少なくとも含む。組成物は、それにより例えば抗体の機能を減少、安定化、遅延、調節及び/又は活性化する、本発明の抗体集団の特徴を変更することができるさらなる分子を場合により含み得る。組成物は固形であっても液状であってもよく、とりわけ、散剤単数又は複数、錠剤単数又は複数、液剤単数ま又は複数、又はエアロゾル単数又は複数の形態であり得る。好ましい実施態様において、本発明の組成物は、薬学的に許容しうる担体、添加物及び/又は希釈剤を場合によりさらに含む医薬組成物である。本発明に従って、用語医薬組成物は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。本発明の医薬組成物は、上記の抗体集団を含む。本発明の医薬組成物は、場合により、そしてさらに、薬学的に許容しうる担体を含み得る。薬学的に許容しうる担体により、任意の型の非毒性の固形、半固形、又は液体のフィラー、希釈剤、封入材料又は製剤化補助剤を意味する。適切な製薬用担体の例は当該分野で周知であり、これには塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液、水、油/水エマルションのようなエマルション、種々の型の湿潤剤、滅菌溶液、有機溶媒などが含まれる。好ましくは、担体は非経口担体であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張性の溶液である。担体は、等張性及び化学的安定性を増強する物質のような少量の添加剤を適切に含む。このような物質は使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そしてこれらとしては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸及び他の有機酸若しくはそれらの塩のような緩衝剤;アスコルビン酸のような抗酸化剤;低分子量約10未満の残基のポリペプチド、例えばポリアルギニン若しくはトリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、若しくはさらなる免疫グロブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;アミノ酸、例えばグリシン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸若しくはアルギニン;単糖類、二糖類及びセルロース若しくはその誘導体を含む他の炭水化物、グルコース、マンノース、若しくはデキストリン;EDTAのようなキレート剤;マンニトール若しくはソルビトールのような糖アルコール;ナトリウムのような対イオン;並びに/又はポリソルベート、ポロキサマー、若しくはPEGのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法により製剤化され得る。一般に、製剤は医薬組成物の成分を均一かつ徹底的に液体担体又は微粉化された固形担体又はその両方と接触させることにより製造される。次いで、必要な場合、生成物を所望の製剤へと成形する。これらの医薬組成物は適切な用量で被験体に投与され得る。投与計画は主治医及び臨床因子により決定されるだろう。医学技術分野において周知であるように、いずれか1患者についての投薬量は多くの因子に依存し、これには患者の大きさ、体表面面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、時間及び投与経路、全体的な健康、並びに同時に投与される他の薬物が含まれる。所定の状況についての治療有効量は、慣用の実験により容易に決定され、通常の臨床医又は医師の技術及び判断の範囲内である。医薬組成物は、1回の投与用でも、長期間にわたる規則的な投与用でもよい。一般に、医薬組成物の投与は、単回投与について例えば10μg/体重kgから2g/体重kgの範囲であるべきである。しかし、より好ましい投薬量は、単回投与について100μg/体重kg~1.5g/体重kg、なおより好ましくは1mg/体重kg~1g/体重kg、そしてなおより好ましくは10mg/体重kg~500mg/体重kgの範囲であり得る。本発明の医薬組成物の投与は、様々な方法で、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋内、皮内、経口、鼻腔内又は気管支内投与により達成され得る。治療投与に使用しようとする医薬組成物の成分は無菌でなくてはならない。無菌性は、滅菌ろ過膜例えば0.2ミクロンの膜を通してろ過することにより容易に達成される。医薬組成物の成分は、通常、単回又は複数回用量の容器、例えば密封されたアンプル又はバイアルで、水溶液として、又は再構成用の凍結乾燥された製剤として保存される。凍結乾燥された製剤の例として、10-mlバイアルを滅菌ろ過された1w/v水溶液5mlで満たし、そして得られた混合物を凍結乾燥する。注入液剤は、凍結乾燥された化合物を静菌性の注射用蒸留水を使用して再構成することにより製造される。保存料及び他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどが存在していてもよい。医薬組成物は、その医薬組成物の意図される用途に依存してさらなる薬剤を含んでいてもよい。別の実施態様は、本発明の抗体集団、又は組成物、好ましくは本発明の抗体集団を含む医薬組成物の医学的使用である。炎症状態、例えば自己免疫疾患及び/又は神経変性疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデスSLE、抗リン脂質抗体症候群、免疫性血小板減少症ITP、川崎病、ギランバレー症候群GBS、多発性硬化症MS、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーCIDP、皮膚水疱疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症候群に関連するアルツハイマー病、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症及び血管性認知症の処置又は予防における使用のための、本発明の抗体集団も本発明に含まれる。好ましくは、これらの状態における使用のための抗体集団は、増加したシアル酸含有量、好ましくは抗体のFab領域又はFc領域、より好ましくはFab領域において増加したシアル酸含有量を有する。本発明はまた、アテローム性動脈硬化症、癌及び細菌感染症、ウイルス感染症又は真菌感染症のような感染症の予防及び/又は処置における使用のための本発明の抗体集団に関する。本発明の抗体集団が、例えば抗生物質に対する耐性の発生に起因してdue、従来の処置計画に影響を受けない感染症の予防及び/又は処置において使用され得ることは特に好ましい。本明細書において記載される疾患は全て当業者に周知であり、そして従来技術及び当業者の周知の一般的な知識に従って定義される。上記のように、本発明の抗体集団は、セイヨウニワトコアフィニティーマトリックス上での抗体調製物の分画により得られる。セイヨウニワトコ凝集素は、末端アルファ2,6-連結シアル酸残基に特異的なレクチンである。従って、アフィニティーカラムへの抗体集団の結合が、アフィニティーカラムのフロースルーで見られる抗体集団と比較して、そして中性pHで炭水化物を用いて溶離された抗体集団と比較しても増強された、本発明の抗体集団のシアル酸付加と関連付けられるということはあり得ることである。増強されたシアル酸付加はFab領域において見られそうであるが、増強されたシアル酸付加はFc領域においても見られ得る。用語シアル酸付加の量及びシアル酸の量は本明細書において交換可能に使用される。以下で定義されるように、シアル酸付加の変更された量は、抗体のFab領域又はFc領域におけるシアル酸付加の量の増加でも減少でもよい。好ましくは、本発明の抗体集団は、アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物中のFab領域におけるシアル酸付加の量と比較して少なくとも1.25倍多いか若しくは少ない、より好ましくは少なくとも1.5倍多いか若しくは少ない、より好ましくは少なくとも2倍多いか若しくは少ない、例えば少なくとも3倍又は少なくとも4倍多いか若しくは少ない量のシアル酸付加を有することによりアフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物と異なる。より好ましくは、シアル酸付加の量は、アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物中のFab領域におけるシアル酸付加の量と比較して少なくとも5倍多いか又は少ない。用語倍多いか又は少ないは、全グリカンのうちシアル酸付加されたグリカンのを測定した場合に出発物質と比較した相対的な増加又は減少を指す。例えば、アフィニティークロマトグラフィー前の抗体集団がグリカンの15のシアル酸の量を有する場合、3倍多いか又は少ない量のシアル酸を有する濃縮された抗体集団は、それぞれ45又は5のシアリル酸を有するグリカンの量を有する。IgGの場合、Fcフラグメントのシアル酸付加は、トリプシンのようなプロテアーゼを用いた消化、続いて得られたFc特異的糖ペプチドの分析例えば実施例2,方法aに記載されるようににより決定され、そして本明細書で引用される濃縮についての数量は、全Fc特異的糖ペプチドのうち、1つ又はそれ以上のシアル酸残基を有するFc特異的糖ペプチドの濃縮倍数又はパーセントを指す。IgG分子のシアル酸付加の総量Fabシアル酸付加及びFcシアル酸付加を含むは、トリプシンペプチドをN-グリコシダーゼFを用いて消化し、続いて放出されたグリカンを例えば実施例2、方法bにおいて記載されるように分析することにより決定され得る。この場合、数量は、全グリカンのうち1つ又はそれ以上のシアル酸残基を有するグリカンの数量又はパーセントを指す。本発明の抗体集団は、アフィニティークロマトグラフィーに使用される出発物質としての抗体調製物の選択に依存して、単離及び/又は精製された抗体集団であってもよい。本発明の全ての実施態様によれば、抗体は血漿から抽出することができるか、又は例えばHarlow及びLane1988及び1999前出に記載されるような、当該分野で公知の種々の手順のいずれか1つにより製造することができる。従って、抗体は、例えば合成により製造され得、そしてペプチド模倣剤も含み得る。さらに、単鎖抗体の製造に関して記載される技術とりわけ米国特許第4,946,778号を参照のことが適用され得る。また、トランスジェニック動物又は植物例えば米国特許第6,080,560号を参照のことが、ヒト化抗体を発現するために使用され得る。モノクローナル抗体の製造には、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供するいずれかの技術を使用することができる。例えばHarlow及びLane1988及び1999前出に記載されるような、当該分野で公知のこのような技術の例としては、ハイブリドーマ技術KoehlerandMilsteinNature2561975,495-497、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術Kozbor,ImmunologyToday41983,72及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.1985,77-96が挙げられる。用語抗体が、細胞において発現され得る抗体構築物、例えばとりわけウイルス又はプラスミドベクターを介してトランスフェクト及び/又は形質導入され得る抗体構築物を含むことも、本発明の文脈において考慮される。Fab領域において低レベルのシアル酸付加を有するかシアル酸付加を有していない抗体は本発明に従うアフィニティークロマトグラフィーにより結合されないので、工程aにおいて結合しておらず工程bにおいて収集される抗体集団は、アフィニティークロマトグラフィー前の調製物と比較して抗体のFab領域において減少した量のシアル酸付加を有する集団である。換言すると、この抗体集団は、シアル酸が減少した集団である。工程aで結合し、アフィニティーマトリックスから炭水化物を用いて溶離される抗体集団は、Fab領域において高レベルのシアル酸付加を有する抗体のアフィニティークロマトグラフィーに対する結合に起因して、アフィニティークロマトグラフィー前の調製物と比較して抗体のFab領域において増加した量のシアル酸付加を有する集団である。従って、出発抗体集団の抗体は、抗体のFab領域において増加した量又は減少した量のいずれかのシアル酸付加を有する濃縮された集団に分離される。本発明の方法の好ましい実施態様において、少なくとも1つの洗浄工程が、カラムへのローディングと溶離の開始との間に行われる請求項1における工程c。適切な洗浄液は当業者に周知であり、例えばtris緩衝化食塩水TBS又はリン酸緩衝化食塩水PBSが使用され得る。本発明の方法のより好ましい実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、抗体のシアル酸付加されたFab領域に対するよりも、抗体のシアル酸付加されたFc領域に対して低い親和性を有し、すなわち、親和性はFcシアル酸付加よりもFabシアル酸付加に対して選択的である。従って、本発明の方法において使用されるアフィニティーマトリックスは、抗体のFab領域に含まれるシアル酸に優先的に結合するが、抗体のFc領域に含まれるシアル酸には結合しないか又は小さい程度で結合するのみだろう。結果として、分離はFabシアル酸付加に基づくので、溶離請求項1における工程d及びeにより得られ得る抗体集団は、Fcシアル酸付加を有する抗体よりも、Fabシアル酸付加を有する抗体についてより多く濃縮されており、そして同様に、工程bにおいて得られ得る抗体集団は、それらのFcシアル酸付加に関係なく、Fabシアル酸付加を有していないか又はほとんど有していない抗体についてより多く濃縮されている。好ましくは、Fcシアル酸付加は、糖ペプチドの総量のうちシアル酸付加された糖ペプチドのとして測定した場合に、100未満、より好ましくは50未満、なおより好ましくは30未満、最も好ましくは20未満だけ異なるだろう。本発明はさらに、アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物と比較して、抗体のFab領域において変更された量のシアル酸付加を有する抗体集団に関する。抗体集団が濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のFab領域において変更された量のシアル酸付加を有するか否かの決定は、上記のように行うことができる。変更された量のシアル酸付加は、現在利用可能な多数の方法の検出限界内でのIVIGのシアル酸付加の量と同じでないシアル酸付加の量と見なされる。好ましくは、抗体集団のシアル酸付加の量は、濃縮前の抗体調製物中の抗体のFab領域におけるシアル酸付加の量と比較して、少なくとも1.25倍多いか又は少なく、より好ましくは少なくとも1.5倍多いか又は少なく、より好ましくは少なくとも2倍多いか又は少なく、例えば少なくとも3倍又は少なくとも4倍多いか又は少ない。より好ましくは、シアル酸付加の量は、濃縮前の抗体調製物中の抗体のFab領域におけるシアル酸付加の量と比較して、少なくとも5倍多いか又は少ない。上記のような、用語倍多いか又は少ないは、濃縮前の抗体調製物中のシアル酸の量と比較した相対的な増加又は減少を指す。本発明の抗体のFab領域のシアル酸付加の量がさらに変更され得るということも想定される。例えば、シアル酸付加の量は、抗体のFab領域におけるシアル酸付加のさらなる増加又は減少が得られ、そしてそれぞれの抗体集団の全体的なシアル酸付加の量のさらなる変更がもたらされるように変更され得る。抗体のFab領域におけるシアル酸の量の増加と減少の両方が想定される。本発明の抗体集団が抗体のFab領域において増加した量のシアル酸を有する場合、さらなる変更は抗体のFab領域におけるシアル酸の量のさらなる増加であることが好ましい。本発明の抗体集団が抗体のFab領域において減少した量のシアル酸を有する場合、さらなる変更は抗体のFab領域におけるシアル酸の量のさらなる減少であることも好ましい。シアル酸付加のパターン、すなわちシアル酸の型及び/又は抗体のFab領域におけるそれらの位置がさらに変更されることも想定される。シアル酸付加パターンの変更は酵素的に達成される。酵素による変更は、例えば、抗体のFab領域におけるシアル酸の量を増加させるためにシアリルトランスフェラーゼ及びシアル酸ドナーを使用することにより行われ得る。あるいは、抗体のFab領域におけるシアル酸の量の減少は、例えばシアリダーゼ酵素を使用して、それによりシアル酸を除去することにより達成され得る。シアリルトランスフェラーゼの非限定的な例は、ST3GalIIIα-2,3シアリルトランスフェラーゼとも呼ばれるEC2.4.99.6、及びα-2,6シアリルトランスフェラーゼEC2.4.99.1である。α-2,3シアリルトランスフェラーゼは、Gal-β-1,3GlcNAc又はGal-β-1,4GlcNAcグリコシドのGalへのシアル酸の転移を触媒しWenetal.,J.Biol.Chem.267:210111992;VandenEijndenetal.,J.BioI.Chem.256:31591991、そして糖ペプチドにおけるアスパラギン連結オリゴ糖のシアル酸付加に関与する。α-2,6シアリルトランスフェラーゼの活性は、6-シアル酸付加オリゴ糖6-シアル酸付加ガラクトースを含むを生じる。α-2,6シアリルトランスフェラーゼの異なる形態が存在し、これは異なる組織から単離され得るか、又は組み換え技術を使用して産生され得る。シアリダーゼノイラミニダーゼ、N-アセチルノイラミネートグリコヒドロラーゼとも呼ばれるの非限定的な例は、シアリダーゼAu、アルファ-2-3,6,8,9EC3.2.1.18;シアリダーゼCp、アルファ-2-3,6EC3.5.1.18及びシアリダーゼSpアルファ-2-3EC3.5.1.18である。抗体のFab領域におけるシアル酸付加の量の選択的変更を達成するために、抗体のFc領域を当該分野で公知の種々の方法のいずれかにより酵素活性から保護してもよい。例えば、特異的Fc結合リガンドは、Fc領域をマスクするために使用され得る。このようなFc特異的リガンドの非限定的な例としては、上に記載されるような化学的に合成されたリガンド、又は可溶性Fc受容体、Fc特異的抗体若しくはプロテインA/Gのような生物学的リガンドが挙げられる。さらに、細胞培養条件は、細胞培養において産生される抗体のシアル酸付加の量を変化させるために変更され得る。例えば、増加した量のシアル酸は、産生速度が減少して浸透圧が一般的に約250mOsm~約450mOsmの範囲に維持される場合に得られる。この及び他の適切な細胞培養条件は、例えば米国特許第6,656,466号に記載される。さらに、PatelらPateletal.,BiochemJ,285,839-8451992により、抗体連結糖側鎖中のシアル酸の含有量は、抗体が腹水として又は無血清若しくは血清含有培地中で産生された場合に有意に異なるということを報告した。さらに、細胞増殖に異なるバイオリアクターを使用すること、及び培地中の溶解酸素の量が抗体連結糖部分におけるガラクトース及びシアル酸の量に影響を与えることも示されているKunkeletal.,Biotechnol.Prog.,1.6,462-4702000。変更された量のシアル酸付加は、上記のように、Fab領域におけるシアル酸付加の量の減少であり得る。あるいは変更された量のシアル酸付加は、上記のように、Fab領域におけるシアル酸付加の量の増加であり得る。抗体のFab領域において変更された量のシアル酸付加を有する抗体集団は、例えば炎症状態及び自己免疫状態のような疾患、例えばアテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、SLE及び上で列挙した他の疾患の処置において使用され得る。定義本発明全体を通して使用される用語抗体は、例えばポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を包含する。用語抗体はまた、抗原結合特異性をまだ保持しているその誘導体又はフラグメントも含む。従って、キメラヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン、単鎖及びヒト化非ヒトCDR以外はヒト抗体抗体、さらにはとりわけFab又はFabフラグメントのような抗体フラグメントも含む。抗体フラグメント又は誘導体は、Fd、Fab2、Fv又はscFvフラグメントをさらに含む;例えばHarlowandLaneAntibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988及びHarlowandLaneUsingAntibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,1999を参照のこと。本発明の全ての実施態様に従って用語抗体集団は、均質であるすなわち、1つの特定の抗体のみのいくつかの分子を含むか、又は不均質複数の異なる抗体を含むのいずれかである抗体の群を指す。いずれの場合も、抗体集団はIgGクラスの抗体から優先的になるかIgGクラスの抗体を含む以下も参照のこと。しかし、これはIgM若しくはIgAクラスの抗体、又はIgG、IgM及び/若しくはIgAクラスの免疫グロブリンの混合物も含むかこれらからなり得る。本明細書全体を通して使用される用語Fab領域は、抗体の各重鎖及び軽鎖からの1つの定常ドメイン及び1つの可変ドメインで構成される抗体の領域を指し、そしてこれは抗原結合に関与する部位を含む。それぞれのインタクトな天然IgG抗体は2つのFab領域を含む。本発明によれば、用語Fabフラグメントは、抗体がパパインで消化される場合に一般的に得られる抗体のフラグメントに対して使用される。パパイン消化により、2つの重鎖を連結しているジスルフィド架橋の上側の抗体の切断が生じ、従って、2つの個々のFabフラグメントが放出される。他方では、ペプシンを用いた消化により、抗体のヒンジ領域により一緒に連結される2つのFabフラグメントいわゆるFab2フラグメントが放出される。これらの酵素消化により消化されない抗体に関して、用語Fab領域は、パパイン又はペプシンでの消化が行われた場合にFab及び/又はFab2フラグメントを形成するであろう抗体の部分を指す。パパイン又はペプシン消化により得られる抗体フラグメントに関して、Fab領域はFabフラグメントに相当する。Fabフラグメントの場合、対応する分子はFab領域と同一である。しかし、Fab領域におけるグリコシル化は抗体の可変領域に位置するので、本発明の文脈において、Fv領域、単鎖Fvフラグメント又は抗体の可変領域を含む他のフラグメントは等価と見なされる。本発明にしたがって使用される用語変更された量のシアル酸付加は、抗体集団におけるシアル酸の量の変化を指し、ここでシアル酸は上記集団の抗体のFab領域及び/又はFc領域に位置している。従って、濃縮された抗体集団の抗体のFab領域及び/又はFc領域におけるシアル酸の全体の量が、濃縮前の抗体調製物の抗体のFab領域及び/又はFc領域におけるシアル酸の全体の量と異なる場合、濃縮された抗体集団のシアル酸付加の量は変更されている。シアル酸の量の変化は、増加した量のシアル酸であっても減少した量のシアル酸であってもよい。濃縮前の抗体調製物と比較して抗体集団が抗体のFab領域において変更された量のシアル酸付加を有するか否かの決定は、当該分野で公知の種々の方法のいずれかを使用して行うことができる。例えば、シアル酸付加の量は、濃縮前の抗体調製物及び目的の抗体集団の両方に対して決定することができ、そしてそのようにして得られた結果を直接比較することができる。シアル酸付加の量を決定する方法は当該分野で周知である。非限定的な例としては、実施例の項に詳述される方法、又は例えばCurrentProtocolsinProteinScience:Unit12.4Hudsonetal,12.6Royleetal及び12.7Harveyetal,JohnWileyandSons2006に記載されるような、目的の抗体のペプシン消化と、それに続くFcフラグメントからの得られたFab’2及びペプシンフラグメントの分離例えばcentriconを使用する、そしてこれらのフラクションにおけるシアル酸の定量例えばHPLC若しくはMSを用いるか又は酵素ベースの測光アッセイ、QA-bioLLC,PalmDesert,Ca:qa-bio.comで利用可能が挙げられる。これらの方法は、本明細書に記載される全ての実施態様のシアル酸付加の変更された量の決定のために使用することができる。シアル酸付加の増加量又は減少量は、一般的に全グリカンのうちシアル酸付加されたグリカンのとして表されるか、又はFcシアル酸付加については糖ペプチドの総量のうちシアル酸付加された糖ペプチドのとして表される。本発明によれば、用語シアル酸は、ノイラミン酸9つの炭素の骨格を有する単糖のN-置換又はO-置換誘導体を指す。このノイラミン酸誘導体のファミリーの最もよく知られたメンバーは、N-アセチルノイラミン酸Neu5Ac又はNANAである。このファミリーのさらなるメンバーはN-グリコリルノイラミン酸NGNA又はNeu5Gcであり、ここでNeu5AcのN-アセチル基はヒドロキシル化されている。用語シアル酸には、2-ケト-3-デオキシノヌロソン酸KDNNadanoetaI.1986J.BioI.Chem.261:11550-11557;KanamorietaI.,J.BioI.Chem.265:21811-218191990、さらには9-置換シアル酸、例えば9-O-ラクチル-Neu5Ac又は9-O-アセチル-Neu5Acのような9-O-C-C6アシルNeu5Ac、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Ac及び9アジド-9-デオキシ-Neu5AcVarki,Glycobiology2:25-401992;SialicAcids:Chemistry,MetabolismandFunction,R.Schauer,Ed.SpringerVerlag,NewYork1992も包含される。本発明によれば、用語免疫調節特性は、抗体集団が免疫系に及ぼす作用を指す。免疫調節作用は免疫抑制でも免疫賦活でもよい。種々のインビトロ又はインビボでの方法が、抗体集団のような物質の免疫調節特性を測定するために当業者に利用可能である。例えば、単球由来細胞株、例えばU937細胞は、レチノイン酸又はビタミンDを用いて増殖及び分化され得る。次いでこれらを試験物質の存在下及び不在下で、例えばインターフェロン-γ又は植物性血球凝集素を用いて刺激し得る。適切なインキュベーションの後、IL-8のような炎症マーカーの量を細胞の上清において測定することができ、そしてU937細胞上の細胞表面マーカー、例えばCD54、CD14又はCD45を、例えば蛍光活性化細胞分析FACS分析により決定することができる。免疫抑制、例えば抗炎症特性を有する物質は、コントロールサンプルと比較してより少ない量の炎症マーカーを生じるだろう。物質はこのようなアッセイを用いて抗炎症作用についてランク付けされ得る;生じた炎症マーカーが少ない量であるほど、抗炎症作用が高い。別の例は、ヒト血液から単離され、ロキソリビン又はCpGのような特定の物質で刺激された末梢血単核細胞PBMCを試験物質の不在下又は存在下にて使用する方法である。試験物質によるインターフェロン-α産生の阻害は、免疫抑制、例えば抗炎症作用の指標になるだろう。免疫賦活を測定する同様のアッセイもまた利用可能である。例えば、例えばインターフェロン又は植物性血球凝集素又は類似の賦活薬による刺激を使用しないこと以外は上記と同じ方法を使用することができる。本発明に従う用語血漿bloodplasma免疫グロブリンG調製物は、血漿から単離された免疫グロブリンG調製物を指す。血漿から単離される免疫グロブリンGは、循環B細胞抗体を分泌する形質細胞により分泌されたものであってよい。血漿免疫グロブリンG調製物は、例えばヒトのような哺乳動物から得ることができるが、非限定的な例として、ヒト免疫グロブリンG調製物レパートリーを発現するトランスジェニック動物、例えばブタ、ヤギ、ヒツジまたはウシからも得ることができるEchelardYandMeadeH.,Towardanewcashcow.NatBiotechnol.2002Sep;209:881-2で概説される。疑念を避けるために、血漿bloodplasmaは、しばしば単に血漿plasmaと言及され、両方とも交換可能に使用される。本発明に従う静注用免疫グロブリンGIVIGは当業者に周知であり、1千を超える血液ドナーの血漿から抽出されプールされたIgG免疫グロブリンを含有する血漿調製物を指す。IVIGは、免疫不全、炎症性疾患及び自己免疫疾患、さらには急性感染症のような疾患の処置のために静脈投与される製品としての薬剤において使用される。IVIGの好ましい例はPrivigenTMである。本発明に従う皮下注用免疫グロブリンGSCIGは当業者に周知であり、IVIGに類似であるが皮下投与される製品としての薬剤においてのみ使用される血漿調製物を指す。SCIGの好ましい例はHizentraTMである。本明細書において使用される精製された抗体集団は、1つのクラスの抗体例えばIgGのみを含む抗体集団を指す。抗体集団はまた、IgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4のような特定のサブクラスの抗体のみを含むか若しくは本質的にそれのみすなわち90より多くを含むか、又はある抗原に対して確定された特異性の抗体のみを含むか若しくは本質的にそれのみを含むという趣旨で、精製され得る。用語単離された抗体集団は、抗体以外の分子を含まない抗体集団を指す。用語炎症性状態は、炎症に関連する異常を指し、これは多数のヒトの疾患の根底にある。炎症は有害な刺激に対する複雑な生物学的応答であり、有害な刺激を除去して治癒を開始しようとする身体の試みである。しかし、異常が生じて慢性炎症又は自己免疫疾患のような炎症性状態をもたらし得る。用語自己免疫疾患は、免疫系が自己抗原を攻撃する状態を指す。例としては、関節リウマチ、多発性硬化症、狼瘡、重症筋無力症、乾癬が挙げられる。用語神経変性疾患は、ニューロンの死を含むニューロンの構造又は機能の進行性の喪失が見られる状態を指す。神経変性疾患の例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ハンティングトン病が挙げられる。本発明に従って、アテローム性動脈硬化症は、動脈血管に影響を及ぼす慢性疾患を指す。これは主にマクロファージ白血球の蓄積に起因する動脈壁における慢性炎症性応答であり機能的高密度リポタンパク質HDLによりマクロファージから脂肪及びコレステロールが適切に除去されることなく低密度リポタンパク質により促進される。これは動脈内で多発性プラークが形成されることにより引き起こされる。炎症はアテローム性動脈硬化症の全ての段階において中心的であり、先天性及び適応性の両方の免疫-炎症機構が関与する。疾患の進行は酸化されたリポタンパク質に対する自己抗体の形成、並びに循環するサイトカイン及び炎症マーカーの増加を伴う。本発明に従って、がんは、制御されない細胞分裂、及び浸潤により隣接する組織中に直接増殖するか、又は転移により離れた部位への移入この場合、がん細胞は血流又はリンパ系を通って輸送されるのいずれかにより広がるこれらの能力を特徴とする疾患又は障害のクラスを指す。本発明に従って、感染は、外来種による宿主生物の有害な集落形成である。感染において、感染した生物は、通常宿主を犠牲にして増殖するために宿主の資源を利用しようとする。感染に対する宿主の応答は炎症である。本発明に従って、細菌感染症としては、細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、リステリア症、百日咳Pertussis百日咳WhoopingCough、肺炎球菌性肺炎、サルモネラ症、破傷風、チフス、結核、黄色ブドウ球菌又は尿路感染症が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に従って、ウイルス感染症としては、単核球症、AIDS、水痘、感冒、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、肝炎、インフルエンザ、耳下腺炎、灰白髄炎、狂犬病、痘瘡、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性脳炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎又は黄熱が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に従って、真菌感染としては、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクイシジオイデス真菌症、クリプトコックス症、ヒストプラスマ症、又は足部白癬症が挙げられるがこれらに限定されない。図面は以下を示す:以下の実施例は説明を意図されるが、本発明を限定することは意図されない。実施例1:2,6シアル酸特異的セイヨウニワトコ凝集素SNAを使用したIVIGの分画100mltris緩衝化食塩水TBS0.1mMCaCl2、pH7.5中の1gIVIGを100mlセイヨウニワトコ凝集素SNAカラムにロードした。フロースルーを集めた。0.1mMCaCl2を含有するTBS300mlで洗浄した後、SNAカラムに結合したフラクションSNAIVIGをTBS中0.5Mラクトース200mlを用いて溶離しE1、続いて0.2M酢酸中0.5Mラクトース50mlを用いて溶離したE2。2回目のフロースルーフラクションをカラムに流して-SNAIVIGを得た図1。IgG中の総シアル酸含有量を、SDSPAGE非還元条件及びレクチンブロットでモニタリングした図1。得られたIVIGフラクションを、Nupage10BisTrisゲルを使用するSDSPAGEで分離した。ゲルをクーマシーで染色してニトロセルロースにブロットした。ブロットをビオチン-SNA及びAP-ストレプトアビジンを用いてプローブしprobed、そして発色基質で可視化した。図1Dにおいて、重鎖及び軽鎖を還元条件下でのSDSPAGEで分離した。SNA-ビオチンでプローブしたレクチンブロットにおいて、両方の鎖は明確に現れ、軽鎖シアル酸付加を示していた。それ故、有意なFabシアル酸付加はSNAIVIGで検出することができた。シアル酸の定量シアル酸を酸性加水分解により放出させて、1,2-ジアミノ-4,5-メチレンジオキシベンゼン二塩酸塩DMBを用いて誘導体化を行った。定量はN-アセチルノイラミン酸Neu5Acを標準として使用する逆相高速液体クロマトグラフィーRP-HPLCで行い、そしてIgGあたりのシアル酸質量/質量又はMol/Molで表した。実施例2:グリカン分析分離前後のIVIGのグリコシル化プロフィールを調べるために、典型的なIVIG調製物のFc領域由来のトリプシン糖ペプチドを同定してプロファイリングし、そしてIVIGの総N-グリカン集団をグリカン放出及び分析によりプロファイリングした。方法aペプチドマッピングによるIgG1及びIgG2/3Fcグリカンプロフィールの決定IVIGサンプルを、トリプシン消化後に液体クロマトグラフィー-質量分析LC-MSにより分析して、IgG1及びIgG2/3Fc領域に特異的なグリカンプロフィールを決定した。IgG2Fc領域についてモニタリングした糖ペプチドはIgG3Fc領域にも見出され得、そのためこれらをIgG2/3と呼ぶ。血清中のIgGサブクラスの既知の相対的存在量に基づいて、IgG2/3ペプチドについて見られるシグナルの大部分はIgG2分子起源であると予想される。変性、還元グアニジン-HCl及びDTTと共に加熱及びアルキル化ヨードアセトアミドを用いるの後に、1:50の酵素対基質比を使用してトリプシン消化した。トリプシンペプチドを単離し、そしてC18固相抽出SPEスピンカラムで精製し、そして真空下でチューブ中にて乾燥した。LC-MS分析を、ペプチド分離にAgilentProshell300SB-C18カラムを使用するAgilentQ-TOFシステムで行った。クロマトグラムを抽出し、そして[M2H]2及び[M3H]3シグナルを合計し、そして推定構造の計算されたモノアイソトピック質量を使用して各IgG1及びIgG2/3糖ペプチドについて統合した。データを分析し、そしてAgilentMassHunterソフトウェア、バージョンB.02.00Huddlestonetal.AnalChem65,877,1993を使用して処理した。IgG糖ペプチドの同定トリプシン消化物のLC-MS分析は複雑なクロマトグラムを生じた。有効な糖ペプチドを同定するために、IgGサブクラス1~4について重鎖定常領域の配列をEntrezタンパク質データベースから得たそれぞれ受入番号12054072、12054074、12054076及び12054078。配列をインシリコで消化した。表1に列挙されるペプチドを、N-連結グリコシル化コンセンサス配列の存在により有効な糖ペプチドと同定した。これらのペプチドの理論的質量を共通のIgGグリカンG0Fと結びつけて、予測[M3H]3イオンも計算した。表1.4つのIgGサブクラスからの予測糖ペプチドのリスト。N-連結グリコシル化コンセンサス配列を太字で強調している。裸のbareペプチド、G0Fグリカンに接続されたペプチド、及び[M3H]3イオンの計算されたモノアイソトピック質量を示す。b全体的なグリカンプロフィールの決定サンプルを以下のように分析して全体的なグリカンプロフィールを決定した。各サンプル250μgから誘導された乾燥トリプシンペプチドを50μL100mMNH4HCO3で再構成し、そして250UN-グリコシダーゼFPNGaseFと共に37°Cで終夜インキュベートした。二回目のC18SPE精製を行い、脱グリコシルしたトリプシンペプチドを放出されたグリカンから分離した。放出されたグリカンを、塩基性水素化ホウ素ナトリウム溶液を使用して、終夜45°Cでインキュベートしてアルジトールに変換した。残りのボロハイドライドの分解後、グリカンアルジトールをDowex50WX4-400イオン交換樹脂スピンカラムで脱塩して乾燥した。残りのホウ酸を除去するためにメタノール中1酢酸の添加及びエバポレーションを繰り返した。グリカンアルジトールを出発移動相10mMNH4HCO3で再構成し、そしてネガティブモードでLC-MSで繰り返して分析した。10mMNH4HCO3/アセトニトリル移動相系を使用する黒鉛化カーボン高速highHPLCカラムでグリカン分離を行った。クロマトグラムを抽出して、各グリカンについて統合し、グリカンアルジトールの[M-1H]1-、[M-2H]2-、及び[M-3H]3-シグナルからのシグナルを合計した。グリカンアルジトールの製造及び分析は、以前に報告された研究と同様であるKarlssonetal.RapidCommunMassSpectrom18,2282,2004。結果図2に示されるように、Fcにおけるシアル酸付加レベルは、IVIG、-SNAIVIG、及びE1フラクションと比較してSNAIVIGにおいてそれほど高くなかった。しかし、E2フラクションは、他の抗体集団よりも約2~3高い、Fc領域におけるIgG1糖ペプチドのシアル酸付加を示し、これは約30の増加である図2A。他方で、Fab領域及びFc領域におけるシアル酸付加を含む総N-グリカンシアル酸付加レベルはSNAIVIGフラクションE1及びE2において有意に高かった図2B。図2Cにおいて見られるように、Fab領域におけるシアル酸付加は約100増加しており、すなわち総グリカンが37から74E1、そして80E2であった。これらの結果に基づいて、SNAアフィニティークロマトグラフィーによる分画が、IVIGのFab領域におけるグリカンの異なるシアル酸付加に主に基づくと結論づけることができる。要約すれば、実施例1に記載される分画方法は、元のIgG調製物IVIGと比較してより高いシアル酸付加E1及びE2SNAIVIG又はより低いシアル酸付加-SNAIVIGのIgG集団を生じる。観察されたより高いシアル酸付加レベルは、IgGのFab領域におけるより高いシアル酸付加含有量に主に起因する。これらの結果は、中性ラクトースを用いたE1フラクションの溶離後に酸性ラクトースを用いて溶離されたE2フラクションが、E1フラクションと比較してFc及びFab領域の両方においてわずかに高いシアル酸付加を有し得るということを示唆する。IVIG、-SNAIVIG、E1SNAIVIG及びE2SNAIVIGからのFab’2のグリカン分析Fab2はIVIG及び実施例1に記載されるように製造されたIVIGのフラクションのペプシン消化により製造した。酢酸緩衝液中pH4.0で2時間37°Cにてペプシン0.5mg/gIVIGを用いてIVIGを消化した。pH8に達するまで2MTris塩基を加えることにより反応を停止させた。濃縮及び低分子消化生成物からの精製、そしてPBSへの緩衝液交換をCentricon30’000Mwカットオフを使用して例えばCurrentprotocolsinImmunology:Unit2.7及び2.8AndrewetalJohnWileyandSons1997に記載されるように行った。トリプシン消化の後、サンプルをLC-MSにより分析した。材料の変性、還元、そしてアルキル化の後、上記のようにトリプシン消化を行った。サンプルを上記のように分析して全体的なグリカンプロフィールを決定した図2C。実施例3:全血刺激アッセイ健常ドナーからの全血を、1mg/l植物性血球凝集素-MPHAを用いて刺激した。シアル酸が増強されたSNA;E1;E2及び減少したIVIG-SNA及びそれらのフラクションを刺激の間又は刺激剤の添加前に細胞に加えた。コントロールサンプルにおいて、未刺激全血及びIgG添加したものをインキュベートした。37°Cで20/-2時間のインキュベーション後に、市販のELISAキット又はビーズアレイサイトカイン定量キットにより上清中の炎症マーカーを測定することにより刺激をモニタリングした。血液細胞をPBSで洗浄し、そしてPBSに入れた。炎症細胞表面マーカーを、蛍光標識抗体BDPharmingenを使用したCantoIIBDBioscienceでのフローサイトメトリーFACS分析により定量した。E2IVIGフラクションによる単球上の刺激マーカーCD54の、ネガティブコントロール血液のみのCD54レベルまで低下した用量依存性減少が観察された。SNAフラクションは、炎症マーカーの中間の阻害を示したが、-SNA非SNA結合及び元のIVIGは阻害作用を示さなかった図3。上述のIgG調製物に加えてシアリダーゼ処理IVIgフラクションNAaseIVIg及びシアリダーゼ処理E2フラクションNAaseE2を含めて実験を繰り返した。IgGを24時間37°Cにて7U/mgのノイラミニダーゼとともに製造者の指示にしたがってウェルシュ菌Clostridiumperfringensからクローンされた、NewEnglandBiolabsインキュベートすることによりIgGの脱シアル酸化を行った。FACSによる単球上のCD54の測定とは別に、上清中のMCP-1濃度も、ELISAキットRDSystemsを使用して製造者の指示にしたがって決定した。結果を図4に示す。この場合もやはり、用量依存性阻害作用が上記のように得られ、E2は全ての調製物のうちで最も高い阻害を示した。E2の阻害作用はシアリダーゼ処理により完全に消滅し、シアル酸残基がこの作用に重要であることを示した。我々の実験のいくつかにおいて、未分画の元のIVIgもいくらかの阻害作用を示したが、高濃度例えば50mg/mlでのみ時々示すだけであった。刺激をLPSを用いて0.1~1ng/mlの濃度で行った場合に同様の結果が得られた。実施例4:インビトロ細胞刺激アッセイにおいて試験された抗炎症活性に対するFabシアル酸付加の効果種々の自己免疫疾患及び神経変性疾患において、炎症状態はこれらの疾患と関連がある。インビトロ細胞培養アッセイにおいて、インビボで観察される炎症状態は、様々なシアル酸が濃縮されたIVIG及び減少したIVIG及びFabフラクションの抗炎症活性について試験するために作られたものである。多くの全身性エリテマトーデスSLE患者は、疾患の活性及び重症度に関連するI型IFNサインを有するBengtssonetal,2000Lupus99664-671。RNA又はDNA核タンパク質を含有する免疫複合体ICは、取り込まれてToll様受容体をTLR7,9を刺激し得、IFN-α産生をもたらすVollmeretal2005J.Exp.Med.200211,1575-1585。この実験において、目的は、シアル酸付加SAIgGがIFN-α産生をヒト細胞のTLR7/TLR9刺激後に調節するか否か、及びどのように調節するかを決定することである。末梢血単核細胞PBMCを、健常ボランティアのヘパリン化静脈血からFicoll-PaqueAmershamBiosciencesでの密度勾配遠心分離により単離した。PBMC培養物96ウェル丸底組織培養プレートにおいて5x105/ウェル、Nunc、総体積150μLをロキソリビン200μM、Invivogen又はCpG2216200nM、Invivogenで刺激し、そしてIVIG及びシアル酸が濃縮されたすなわちE1及びE2フラクション若しくは減少したすなわち-SNAIVIG実施例1に記載されるように又は対応するFab’2若しくはFc部分で500μg/mlのIgG又は等モル量Fab’2フラグメント及びFcフラグメントそれぞれ333μg/mlFab’2、167μg/mlFcの濃度で処理した。20±2時間後に上清を集めてIFN-αを社内のELISAで市販の抗体を記載されるように使用して定量したSanteretal.,2009J.Immunol182,1192-1201。結果をIVIG処理を受けなかった細胞と比較したIFN-αの阻害パーセントとして表す。E2は、-SNAIVIG、IVIG及びE1、さらには溶離された全SNAフラクションと比較して炎症マーカーの増強された減少を示した。等モル濃度でFab’2調製物がそれらの全IgG対応物とほぼ等しいレベルの阻害を生じるということが考えられ得、より高度のIFN-アルファ阻害の原因であるのは増加したシアル酸付加を有するFab部分であるということを示す。実施例5:ヒト単球細胞株U937を使用する、インビトロ抗炎症活性に対するFabシアル酸付加の効果U937細胞ATCCをATCCにより提供される指示にしたがって培養で増殖させた。細胞をレチノイン酸0.5μM及び/又はビタミンDを用いて実験の1日前に分化させた。分化させたU937細胞を400xgでの遠心分離により採取し、そして1ヒトアルブミンを含有するPBSを用いて再懸濁させた。次いで細胞をインターフェロン-ガンマIFNγ50~500単位又は植物性血球凝集素PHA0.1~2マイクログラムを用いて刺激した。シアル酸が増強されたすなわちE1及びE2フラクションか及び減少したすなわち-SNAIVIGならびにそれらのフラグメントを刺激の間又は刺激薬剤の添加前に細胞に加えた。37°Cでの20/-2時間のインキュベーションの後、上清中の炎症マーカーを市販のELISAキット又はBectonDickinsonBDBiosciencesからのヒト炎症サイトカイン用ビーズアレイにより測定することにより刺激をモニタリングした。IL-8及びネオプテリンをELISAキットBiosource/Demeditecdiagnosticsを使用して測定した。表面マーカーCD54、CD14、CD45をFACS分析により蛍光標識抗体BDPharmingenを使用してBDFACSCantoIIBDBioscienceで定量した。IVIGのSNAフラクションによる、特にE2フラクションによる炎症マーカーの減少が、分画していないIVIG及び-SNAフラクションと比較して観察された。実施例6:単球誘導樹状細胞moDC刺激アッセイヒト単球の単離及び未熟単球誘導樹状細胞iMoDCの分化末梢血単核細胞PBMCを1ドナーの提供全血の細胞部分を含有するバフィーコートBlutspendedienstSRK,Bern,CHから密度遠心分離により単離した。バフィーコートをPBSで1/1希釈した。希釈したバフィーコート25mlをFicollPlaqueGEHealthcareEuropeGmbH,Otelfingen,CH15mlにロードし、そして35分間遠心分離した室温、400g、停止用ブレーキなし。PBMCを含有する細胞層を集めてプールした。洗浄50mlPBSで2回した後、単球をCD14-MACSビーズMiltenyiBiotechGmbH,BergischGladbach,GERを使用して磁気細胞分離MACSにより単離した。PBMCの正確な数10x必要な単球の数をMACS緩衝液PBS、0.5BSA、2mMEDTA中に取り、そして抗CD14mAb被覆MACSビーズ80μl/107PBMCs;MiltenyiBiotechGmbHと共に20分間氷上で暗所インキュベートした。MACS緩衝液で洗浄200gで10分間遠心分離した後、ビーズで標識した細胞を予備洗浄した3mlMACS緩衝液LSMACSカラムMiltenyiBiotechGmbHにロードし、洗浄し3mlMACS緩衝液を用いて3回、そしてカラムを磁場から外した後5mlMACS緩衝液で洗い流した。PBSで洗浄した後、新しく単離した単球を、10iFCSBiochromAG、Berlin、DE、10000U/mlペニシリン及びストレプトマイシンAmimed、BioConcept、Allschwil、CH及び10mMHEPESを含有するRPMI-1640に入れて24ウェル0.5x106単球/ウェルml又は48ウェルプレート0.25x106単球/ウェル0.5mlBDBiosciencesに0.5x106単球/mlの濃度で分配した。単離された単球の純度をCD14染色によりFACS分析で評価した。FACS分析の詳細を以下に記載する。その後6日間の間、単球を50ng/mlGM-CSFRDSystemsEuropeLtd.,Abingdon,UK及び20ng/ml組み換えヒトIL-4PeproTechECLtd.,LondonUKの存在下で未成熟単球誘導樹状細胞iMoDCへと分化させた。分化の間、1日おきに培地の半分を除去して十分に補充された上記を参照のこと新鮮な培地と置き換えた。6日後、細胞をDC-表現型について光学顕微鏡法及びFACS分析により分析した。CD14、DC-SIGNCD209、CD11c及びCD1a全てBDBiosciencesからのモノクローナル抗体の細胞表面発現を評価した。FACS分析の詳細を以下に記載する。新しく単離された単球、分化したiMoDC及び成熟MoDCのFACS分析FACS緩衝液PBS、2iFCS50μl中の約60,000~100,000個の細胞を、すぐに使えるready-to-usemAb抗-CD14、CD11c、CD1a、DC-SIGN、HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD64、CD32及びCD16;全ての抗体はBDBiosciencesの直接標識されたモノクローナル抗体である1~2μlを用いて染色し、そして30分間4°C暗所でインキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、そしてPBS50μlに入れて350μl1xBDCellFixBDBiosciencesで固定し、そして暗所にて4°Cで採取するまで貯蔵した。サンプルあたり10,000個の細胞をFACSCaliburを用いて取得し、そしてBDCellQuestソフトウェア両方ともBDBiosciencesにより分析した。免疫複合体によるiMoDCの刺激未成熟iMoDCを、様々な量のIVIGフラクション実施例1に従って製造された及びそれらのフラグメントと共に3時間プレインキュベートした。iMoDCを、0.1~100μg/mlLPSを用いて刺激した。十分に補充されたRPMI50ng/mlGM-CSF及び20ng/mlIL-4を含む中で24ウェルプレートにおいて分化させた0.5x106iMoDCを、LPSと共に24時間の間37°C、5CO2でインキュベートした。IC-媒介刺激成熟化の分析のために、FACS分析及びサイトカイン測定を行った。それらの細胞をウェルの底からピペット操作により洗い出すことにより採取した。細胞懸濁液を集めて直ぐに氷上で保存した。遠心分離300g、10分、4°C後に、上清を集めて後のサイトカイン測定のために-20°Cで保存した。細胞をFACS緩衝液PBS、2iFCS50μl中に入れてFACS分析を上記のように行った。2つの共起刺激分子CD80B7-1及びCD86B7-2の細胞表面発現を測定し、DC特異的成熟マーカーCD83全て直接標識されたmAb、BDBiosciencesも同様に測定した。細胞培養上清におけるサイトカイン測定iMoDC刺激実験の細胞培養上清を集めてサイトカイン測定まで-20°Cで保存した。IL-12p70、IL-10、IL-6、IL-8、TNF-α及びIL-1βを製造者の指示にしたがってBectonDickinsonBDBiosciencesからのヒト炎症性サイトカイン用の細胞数測定ビーズアレイCytometircBeadArrayCBAにより測定した。炎症マーカーの、IVIGのSNAフラクションE1及びE1による減少が観察され、これは増加したシアル酸付加について濃縮された免疫グロブリンの抗炎症特性を示している。この効果はE2フラクションにおいてより顕著であった。等モル濃度でFab’2調製物がそれらの全IgG対応物とほぼ等しいレベルの阻害を生じるということが考えられ得、より高度のIFN-アルファ阻害の原因であるのは増加したシアル酸付加を有するFab部分であるということを示す。実施例7:EAEマウスモデルにおける従来のIVIgと比較した、シアル酸付加されたIVIgの有利な効果の評価IVIGSNAフラクションの抗炎症効果の評価は、自己免疫モデルで観察することができ、そして原因となる機序を調べることができる。このモデルにおいて、IVIGが調節性T細胞の増殖によりその抗炎症効果を及ぼすということが示された。EAEを使用して、SNAE1及びE2Fc、SNAE1及びE2Fab’2、SNAE1及びE2インタクトIVIg及び未分画IVIgの間での比較を行った。様々な用量のこれらの調製物を0日目から疾患のピークまで、又は5日目まで投与した。臨床スコア及び生存を測定した。EAEの誘導:マウスのC57BL/6J系統を使用してEAEを誘導した。実験動物に関する倫理的規則にしたがって実験を行った。10~12週齢の雌性マウスを、無成育性の乾燥結核菌MycobacteriumtuberculosisH37RA800μgを含有するCFA1v/1v中に乳化させたMOG3555ペプチド純度>95200μgで免疫した。最終体積200μlを側腹部上の4箇所に皮下s.c.注射した。さらに、百日咳毒素300ngを同じ日及び2日後に静脈内投与した。EAEの臨床徴候を毎日以下のスコア付けシステムを用いて評価した:0-無徴候;1-尾部麻痺;2-後肢脱力及び尾部麻痺;3-後肢及び尾部の麻痺;4-後肢及び尾部の麻痺並びに前肢脱力;5-病的状態morbidum;6-死亡。EAEの症状は10日目以後から観察されて免疫21~25日後あたりでピークとなり、平均臨床スコアは3であった。臨床症状の、IVIGのSNAフラクションによる減少が、未分画IVIGと比較して観察され、これは増加したシアル酸付加について濃縮された免疫グロブリンの抗炎症特性を示している。E2フラクションの効果は、E1フラクション又は総溶離フラクションSNAの対応する試薬を用いて観察された効果よりも顕著であった。"