"治療方針を決定するための方法であって、前記方法が、a乳がんを有する対象から得た試料中で、循環腫瘍細胞CTCのレベルを検出すること;およびb前記試料中の前記CTCのレベルに基づいて、治療方針を決定すること、を含む方法。前記治療方針が、抗エストロゲン療法を含む、請求項1に記載の方法。前記抗エストロゲン療法が、タモキシフェンを含む、請求項2に記載の方法。前記抗エストロゲン療法が、レトロゾール、アナストロゾール、およびエキセメスタンから成る群から選択される、請求項2に記載の方法。前記治療方針が、化学療法を含む、請求項1に記載の方法。前記CTC上で、1つまたは複数の腫瘍マーカーを特徴付けるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。前記腫瘍マーカーが、エストロゲン受容体、HER-2、bcl-2、アポトーシスマーカー、およびki67から成る群から選択される、請求項6に記載の方法。前記アポトーシスマーカーが、モノクローナル抗体M30を使用して検出される、請求項7に記載の方法。前記腫瘍マーカーのうちの1つまたは複数が、マルチプレックスPCR法を使用して検出される、請求項7に記載の方法。前記腫瘍マーカーが、免疫磁気アッセイを使用して検出される、請求項7に記載の方法。CTC-内分泌療法指数EndocrineTherapyIndexCTC-ETIを決定するステップをさらに含む、請求項6に記載の方法。前記CTC-ETIが、前記腫瘍マーカーの前記発現およびCTCの総数に基づく、請求項11に記載の方法。前記乳がんが、転移性である、請求項1に記載の方法。前記乳がんが、エストロゲン受容体陽性である、請求項1に記載の方法。発明を実施するための形態本発明は、限定されるものではないが、がんマーカーを含む、がんの診断、研究、および治療のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、がん治療に対する対象の反応を予測するための組成物および方法に関する。西欧諸国における乳がんの死亡率は過去30年間で減少したが、その理由の1つは、アジュバント全身療法の適用が普及したためである。しかしながら、米国では、2008年に40,000人が転移性乳がんで死亡したと推定される。転移性乳がんを有する患者は、ときには治癒したと見られることもあるが、大部分は、最終的には自身の疾病で死亡する運命にある。それでも、いくつかの治療法がこのような状況の患者に導入され、その結果、生存期間が中程度に延長し、寛解が実質的に改善されている。したがって、大部分の転移性乳がん患者に対する治療の目標は、反応の可能性が最も高く、かつ毒性の最も低い治療法を選択し、それにより、がんの症候と治療の副作用とのバランスを取ることである。実際、現在では、こうした患者を治療するための多様な方策および薬剤が利用可能になっている。こうした方策薬剤には、化学療法現在、転移性乳がんの治療用として10種類を超える薬剤が承認済みのほか、抗HER2療法トラスツズマブ、ラパチニブなどがある。また、FDAに承認されていないが、抗血管新生療法も非常に有望と見られる。しかしながら、転移性乳がん患者の主力の治療法の1つは、抗エストロゲン療法である。乳がんは、様々な抗エストロゲン方法で治療でき、これらの方法は基本的に、相加的方法と切除的方法に分類できる。最もよく使われている相加的治療法は、選択的エストロゲン受容体調節物質SERMであるタモキシフェンの使用であるが、フルオキシメステロンなどのアンドロゲン治療、および酢酸メゲストロールなどのプロゲステロン作用薬も効果がある。切除療法は、過去においては主として外科的であったが、最近では、閉経前女性には、ゴセレリン、ロイプロリドなどの黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニストおよびアンタゴニスト、閉経後女性には、前駆物質であるジヒドロエピアンドロステンジオンDHEAおよびテストステロンからエストラジオールおよびエストロンへのアロマターゼ誘導性変換を阻害する薬剤を用いた切除療法が行われている。米国では、3種類のアロマターゼ阻害AI剤:レトロゾール、アナストロゾール、およびエキセメスタンを利用できる。転移性乳がん患者の適切な治療法の選択は、2つの要因、すなわち予後と予測に基づいて行われる。この点で、抗エストロゲン療法は、最古の標的療法とみなすことができる。その後の試験により、ER陰性の乳がん患者では、タモキシフェンが不活性であることが実証された。しかしながら、抗エストロゲン治療が有効であるのは、転移性、初期状況のいずれも、ER陽性のすなわちERが豊富な腫瘍を有する女性のわずか30~50である。ER陽性であるが内分泌療法に抵抗性の転移性乳がん患者に関しては、毒性は低いが効力のない内分泌療法を数ヶ月間試して化学療法を遅らせるより、毒性プロファイルの上昇にもかかわらず直ちに化学療法を施した方が役立つと考えられている。転移性乳がん患者に対してひとたび対症療法レジメンが選択されると、その療法を停止して新しい療法を開始する理由は、次の2つのうちどちらかとなる。1選択した治療法の毒性があまりに高く、たとえ作用していても寛解を誘発できる見込みがない、または2その治療法は作用しておらず、腫瘍が進行している。このような現象、特に後者の現象を確定するために現在使われている方法には、問診、理学的検査、血清検査、およびX線検査評価が含まれる。問診と理学的検査は、主観性の問題があり、また、患者の50超は、内部器官骨、肝臓、肺などの転移性病変のみを有するという事実があることから、信頼性がないものとして広く認識されている。非特異的血清検査、例えば、骨由来の酵素アルカリホスファターゼ、肝臓由来の酵素アルカリホスファターゼ、血清グルタミン酸シュウ酸トランスフェラーゼSerumglutamateoxalatetransferaseなどは、進行を確定するに足る十分な感受性および特異性の両方に欠ける。このような患者のモニタリングにおいては、腫瘍関連の少なくとも3種類の腫瘍マーカーが使われている。これらには、MUC-1タンパク質CA15-3、CA27.29、がん胎児性抗原CEA、およびHER2細胞外ドメインのアッセイが含まれる。米国臨床腫瘍学会の腫瘍マーカーガイドライン委員会は、転移性乳がんを有する特定の患者のモニタリングにおいて、少なくともCA15-3とCEAを使用することを勧告した。しかしながら、3つのいずれの場合も、治療の反応または失敗の初期判定では、腫瘍マーカースパイクという現象による混乱が生じる。腫瘍マーカースパイクとは、最終的に治療に反応したと感じられる患者の25にも上る数において、腫瘍マーカー値がベースライン以下に低下するまでの2~3週間から数ヶ月の間、マーカー値が実際に上昇する現象である。したがって、治療法を新規に開始してから最初の1~2ヶ月間の進行を確定するには、循環腫瘍マーカーの結果は、今のところ基本的に無価値である。X線画像法は、転移性乳がん患者の臨床経過を判断する手段として最も高く評価されている。単純X線写真、コンピューター断層撮影、および磁気共鳴画像法について、反応、安定性、および進行を明確化するための厳格な基準が策定されている。しかし、X線画像法にはいくつか欠点がある。治療の最初の1または2サイクルの間は、大部分の患者にとって、これらのすべての診断法は進行に対する感度が低く、特に後者の2診断法は不便であり、費用を要し、患者の不快感を伴う。こうしたことから、これらの検査は通常、新しい治療法の開始から数ヶ月して、患者の経過を観察する時点になるまで行われない。おそらくより重要なことは、転移性乳がん患者のうち、測定可能な疾患を有するのは、わずか50程度であり、転移性乳がん患者はむしろ、骨および/または胸膜の測定不能の病変や、皮膚および肺における小さすぎて正確に定量化できない粟粒病変を有することである。骨のみの疾患を有する患者をモニタリングしようとする努力は、特にフラストレーションを起こしがちである。これらの患者をモニターする画像診断法として、ピロリン酸テクネチウムを用いた骨シンチグラフィーが最も広く使われているが、この診断法は、進行検出に対しては比較的感度が低く、かつ、いわゆるシンチグラフィックフレアscintigraphicflareがある点で限界がある。シンチグラフィックフレアにおいては、治療、特に内分泌療法に反応している患者は、既知の病変部に放射性トレーサーの取り込みの増加が見られ、さらに、骨芽細胞治癒活性の増加に応じて、新規の取り込み部位の出現が見られる場合もある。臨床、血清、および/またはX線による手段により、急速な進行が容易に確定される特定の患者が存在する。しかし、新規に開始した治療法が数ヶ月間に渡って奏功する見込みであるか、あるいは無益なレジメンであるかを判断する上で、転移性乳がんを有する多くの患者は臨床上の難題を呈する。無益なレジメンである場合、そのような患者は、現在の治療と比べてたとえ毒性が高くても潜在的に効果の高い、化学療法などの治療の方がより適切に治療できることになる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ER陽性であり、抗エストロゲン療法に反応する可能性の低い転移性乳がん患者を特定する方法を提供する。このような患者においては、直ちに、または抗エストロゲン療法を短期間試行した後に、従来の化学療法を開始することができる。いくつかの実施形態では、本発明の本方法は、現在の治療の効果をより早期にモニタリングすることを可能にする。そのような状況においては、現在の治療に反応していない対象の別の治療法を選択することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、循環腫瘍細胞CTCの分析を利用した方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、CTCのレベルを定量化することにより抗エストロゲン療法の効果を確定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、CTCレベルを使用して、予後を判定し治療方針を導く。いくつかの実施形態では、CTCレベルを、がんを有していない対象のCTCレベル、またはがんと診断されていない対象群の母集団平均のCTCレベルと比較する。いくつかの実施形態では、CTCを、転移性乳がんと診断された対象群抗エストロゲン療法に反応した対象群および反応しなかった対象群を含むの母集団平均と比較する。他の実施形態では、転移性乳がんまたは非転移性乳がんと診断された対象のCTCのレベルを経時的にモニタリングする。他の実施形態では、抗エストロゲン療法が奏功する女性と、ホルモン抵抗性と見られる女性とを区別し、それにより予後または治療方針を決定する目的で、CTCに関連する1つ以上の腫瘍マーカーを特徴付けする。いくつかの実施形態では、これらの腫瘍マーカーにはER、HER2、bcl-2、アポトーシスモノクローナルM30で染色、IGRFR1、ビメンチン、およびKi67が含まれるが、これらに限定されない。当業者に対して公知の、さらなる腫瘍マーカーを利用してもよい。本発明は、既知、未知例えば未発見の両方の腫瘍マーカーを企図している。好ましい腫瘍マーカーは、CTC表面に存在し、抗エストロゲン療法に対する反応を単独または組み合わせにより示すマーカーである。いくつかの実施形態では、CTC表面の腫瘍マーカーの状態と、同一患者から収集した原発組織内および/または転移性組織内の同一腫瘍マーカーの状態とを相関させる。I.循環腫瘍細胞ヒトの血行路に初めて腫瘍細胞が認められたのは、死後のものではあるが、150年以上前のことである。近年の技術進歩により、免疫磁気的方法を用いて全血から循環腫瘍細胞CTCを分離するための、高度に自動化され標準化されたシステムの開発が可能になった。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、CellSearch商標システムイミュニコン社、ペンシルベニア州ハンチンドンバレーを利用してCTCを定量化するAllardetalClinCancerRes2004106897904CristofanillietalNEnglJMed200435178191これらの各文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。CELLSEARCHシステムは、抗サイトケラチン抗体を用いた免疫蛍光染色により元は上皮性であることが測定時に特徴付けられ、DAPIを用いた染色により細胞性であると判定された事象を特定する。抗CD45モノクローナル抗体を用いた免疫蛍光染色により、混入した白血球を特定し、結果をデジタル形式で画像表示する。本発明は、CELLSEARCHシステムの使用に限定されない。CTCを単離および/または定量化する任意の方法を利用してよい。II.腫瘍マーカーいくつかの実施形態では、本発明は、CTCに関連する腫瘍マーカーを特定する方法を提供する。代表的な腫瘍マーカーについて、以下でより詳細に説明する。エストロゲン受容体ER。数あるマーカーの中でも、エストロゲン療法からの独立性を示す特定のマーカーには、ER、HER2、bcl-2、およびアポトーシス測定値の相対レベルが含まれる。いくつかの試験により、ER発現および内分泌療法の利点の間の関連性は二分法的ではなく、ERタンパク質の定量的レベルに関連することが示唆されている。したがって、ERの様々なアッセイに対して、様々なカットオフ値を使用して陽性と陰性の二分類が行われている。いくつかの実施形態では、CTCで測定できるERの相対レベルを用いて、内分泌療法に反応する可能性の判定に役立てる。HER2。ER陽性の乳がんにおいて、HER2の過剰発現および/または増幅がエストロゲン治療に対する感受性を低下させることを、種々の前臨床試験および臨床試験が示している。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、本発明を実行する上で、機序の理解は必要とされない。とはいえ、ER陽性かつHER2陽性の乳がんを有する患者は、抗エストロゲン治療の利点を得る可能性が比較的低いことが予期されている。BCL-2。BCL-2は、細胞がプログラム細胞死経路に進入するのを防止する抗アポトーシス性タンパク質である。BCL-2は、一般に乳がんに発現し、予後悪化と関連性がある。BCL-2は、ER陰性の乳がんよりもER陽性の乳がんで多く発現する。前臨床試験およびいくつかの臨床試験では、BCL-2の発現は、抗エストロゲン療法に対する相対的耐性に関連すると見られることを示している。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、本発明を実行する上で、機序の理解は必要とされない。とはいえ、ER陽性かつBCL-2陽性の乳がんは、内分泌療法に抵抗性である可能性が比較的高いことが予期されている。アポトーシス。抗エストロゲン療法の一作用機序は、アポトーシスによるプログラム細胞死が介在する。したがって、アポトーシスを連続的にモニタリングすることにより、乳がん細胞死のエビデンスが得られる。化学療法、ホルモン療法の両方の術前試験では、アポトーシスの早期誘導がその後の臨床反応と関連していることが実証されている。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、本発明を実行する上で、機序の理解は必要とされない。とはいえ、アポトーシスの連続的評価が、抗エストロゲン療法の効果を示すことが予期されている。KI-67。Ki67は、細胞の代謝回転を表す増殖抗原である。原発組織におけるKi67の免疫組織化学染色は、早期乳がんの予後と関連している。ネオアジュバント試験では、Ki67レベルの低下が、抗エストロゲン療法タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤の両方を含むの明らかな利点と関連していた。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、本発明を実行する上で、機序の理解は必要とされない。とはいえ、内分泌治療前および内分泌治療時のCTCに関連するKi67の連続的評価が、利点の可能性を示すものと予期されている。いくつかの実施形態では、上に挙げたマーカーの1つ以上が多重形式またはパネル形式で検出される。例えば、いくつかの実施形態では、OncotypeDX商標ジェノミックヘルス社、カリフォルニア州などの多パラメータrt-PCRベースのアッセイを利用する。ER、BCL-2、HER2、およびKi67の発現の相対値がアルゴリズムを駆動し、このアルゴリズムを使ってOncotypeDxの再発スコアRSが導き出される。高度に妥当性確認された相関試験では、リンパ節転移陰性、リンパ節転移陽性の両方の患者のうち、高ER、低HER2、低BCL-2、および低Ki67を示す再発スコアの低い患者は、タモキシフェン単独で治療した場合に何らかの予後を有するのに対し、低ER、高HER2、高BCL-2、および高Ki67を示す再発スコアの高い患者は、タモキシフェン単独で治療した場合は予後が非常に悪化するが、化学療法の利点を得る可能性が非常に高いことが実証されているPaiketalNEnglJMed2004351281726PaiketalJClinOncol200624372634。III.検出方法CTCに関連するマーカーの代表的な検出方法を以下に述べる。ただし、腫瘍マーカー核酸またはタンパク質を検出する任意の適切な方法を利用してよい。A.DNAおよびRNAの検出いくつかの実施形態では、当業者に対して公知の種々の核酸手法を使用して、腫瘍マーカーをmRNAとして検出する。このような核酸技術には、核酸シークエンシング配列決定、核酸ハイブリダイゼーション、および核酸増幅が含まれるが、これらに限定されない。1.シークエンシング配列決定核酸シークエンシング手法の例示的で非限定的な例として、チェーンターミネーターサンガーシークエンシングおよびダイターミネーターシークエンシングが挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、RNAは細胞内で比較的不安定であり、ヌクレアーゼ攻撃を受けやすいことを経験から得ているため、通常は、RNAをDNAに逆転写してからシークエンシングすることを認識するであろう。チェーンターミネーターシークエンシングでは、修飾ヌクレオチド基質を用いて、DNA合成反応を配列特異的に停止させる。鋳型DNA上の特定の部位で、伸長を開始する。このとき、その部位の鋳型に対して相補的な、放射性標識または他の標識がされた短いオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。オリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、DNAポリメラーゼ、標準の4つのデオキシヌクレオチド塩基、および低濃度の一本鎖停止ヌクレオチド最もよく使われるのはジデオキシヌクレオチドを使って行う。この反応を、4つの個別のチューブにおいて、塩基の各々をジデオキシヌクレオチドとして使用して順に繰り返す。DNAポリメラーゼにより鎖停止ヌクレオチドが限定的に取り込まれる結果、該当する特定のジデオキシヌクレオチドが使われた位置でのみ停止した一連の関連DNA断片が得られる。個々の反応チューブごとに、平板ポリアクリルアミドゲルまたは粘性ポリマー充填毛細管での電気泳動により、断片をサイズ別に分離する。ゲルの上から下の方向へ、標識プライマーの視覚化マークが生じた列を読み取ることにより、配列を決定する。ダイターミネーターシークエンシングでは、代わりにターミネーターを標識する。ジデオキシヌクレオチドのチェーンターミネーターの各々を、異なる波長で蛍光発光する個別の蛍光色素で標識することにより、1回の反応で完全なシークエンシングを実施できる。2.ハイブリダイゼーション核酸ハイブリダイゼーション手法の例示的で非限定的な例として、insituハイブリダイゼーションISH、マイクロアレイ、およびサザンまたはノーザンブロットが挙げられるが、これらに限定されない。insituハイブリダイゼーションISHは、組織の一部もしくは切片insitu、または組織が十分に小さい場合は組織全体ホールマウントISHにおいて、特定のDNA配列またはRNA配列の位置を特定するプローブとして、標識された相補的なDNA鎖またはRNA鎖を使用するハイブリダイゼーションの一種である。DNAISHを使用すると、染色体の構造を特定できる。RNAISHは、組織切片またはホールマウント内のmRNAおよび他の転写物を測定し位置を特定するのに使用する。通常は、試料の細胞および組織を処置して標的転写物を適所に固定し、プローブを接近しやすくする。温度を上げた状態で、プローブが標的配列とハイブリダイズし、次いで余分なプローブが洗い流される。放射性物質、蛍光、または抗原で標識されたプローブについて、それぞれ、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法、または免疫組織化学的検査を使用して、組織内のプローブの位置を特定し、プローブを定量化する。また、ISHでは、放射性標識または他の非放射性標識で標識された2つ以上のプローブを使用して、2つ以上の転写物を同時に検出することもできる。2.1FISHいくつかの実施形態では、蛍光insituハイブリダイゼーションFISHを使って腫瘍マーカー配列を検出する。本発明のための好ましいFISHアッセイは、細菌人工染色体BACを利用する。BACは、ヒトゲノム配列決定プロジェクトにおいて広範に使用されNature409953958を参照、現在では、多くのソース例えばNCBIを通じて検索可能な頒布者から、個々のBACを含むクローンを入手できる。ヒトゲノム由来の各BACクローンには、明確に識別できる参照名が与えられている。この参照名を使って、対応するGenBank配列を検索し、頒布者にクローンのコピーを注文することができる。FISHを実施するための具体的プロトコルは、当技術分野でよく知られており、本発明に容易に適応できる。方法に関する指針は、以下の文献を含む多くの文献から取得できる:InsituHybridizationMedicalApplicationsKluwerAcademicPublishersBostonInsituHybridizationInNeurobiologyAdvancesinMethodologyOxfordUniversityPressIncEnglandInsituHybridizationAPracticalApproachOxfordUniversityPressIncEnglandKuoetalAmJHumGenet49112119KlingeretalAmJHumGenet515565およびWardetalAmJHumGenet52854865。FISHアッセイを実施するためのプロトコルを示した市販のキットも存在する例えば、メリーランド州ゲイサーズバーグのオンコール社から入手できる。方法に関する指針を示している特許には、米国特許第5,225,326号、第5,545,524号、第6,121,489号、第6,573,043号が含まれる。これらの参考文献すべての全文は、参照により本明細書に組み込まれ、当技術分野における類似の参考文献および本明細書の実施例の部分で提供する情報と共に使用することにより、個々の研究室にとって簡便な手順を確立することができる。2.2マイクロアレイ様々な種類の生物学的アッセイがマイクロアレイと呼ばれており、具体的には、DNAマイクロアレイ例えばcDNAマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ;タンパク質マイクロアレイ;組織マイクロアレイ;トランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ;化合物マイクロアレイ;および抗体マイクロアレイなどがあるが、これらに限定されない。DNAマイクロアレイは、一般に遺伝子チップ、DNAチップ、またはバイオチップと呼ばれ、数千の遺伝子の発現プロファイリングまたは発現レベルのモニタリングを同時に行う目的で、微視的なDNAスポットの集団を固体表面例えばガラス、プラスチック、またはシリコンチップに付着させアレイ状に配置したものである。付着したDNA断片はプローブと呼ばれ、単一のDNAマイクロアレイに数千のプローブを使用できる。マイクロアレイを使用して、疾患細胞と正常細胞の遺伝子発現を比較することにより、疾患遺伝子を特定することができる。マイクロアレイは、様々な技術を使用して作製できる。こうした技術には、先端の細いピンによるガラススライドへのプリント;既製マスクを使用したフォトリソグラフィー;動的マイクロミラーデバイスを使用したフォトリソグラフィー;インクジェットプリンティング;または微小電極アレイ上の電気化学反応が含まれるが、これらに限定されない。サザンブロット法とノーザンブロット法は、それぞれ、特定のDNA配列またはRNA配列を検出するために用いられる。試料から抽出したDNAまたはRNAを断片化し、マトリックスゲル上で電気泳動により分離し、メンブレンフィルターに移す。フィルターに結合したDNAまたはRNAを、目的の配列と相補的な標識プローブとハイブリダイズさせる。フィルターに結合しハイブリダイズされたプローブを検出する。この手順の異型が逆ノーザンブロットであり、この場合、膜に付着する基質核酸が、単離されたDNA断片の集団であり、プローブは、組織から抽出され標識されたRNAである。3.増幅ゲノムDNAおよびmRNAは、検出前または検出と同時に増幅することができる。核酸増幅手法の例示的で非限定的な例として、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR、転写介在増幅TMA、リガーゼ連鎖反応LCR、鎖置換増幅SDA、および核酸配列に基づく増幅NASBAが挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、ある特定の増幅手法例えば、PCRでは、増幅の前にRNAをDNAに逆転写する必要がある例えば、RT-PCRのに対し、他の増幅手法では、RNAを直接増幅する例えば、TMAおよびNASBAことを認識するであろう。ポリメラーゼ連鎖反応米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号、および第4,965,188号。これらの各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられるは、一般にPCRと呼ばれ、変性、プライマーペアの逆鎖へのアニーリング、およびプライマー伸長というサイクルを繰り返すことにより、標的核酸配列のコピー数を指数関数的に増加させる。RT-PCRと呼ばれるバリエーションでは、逆転写酵素RTを使用してmRNAから相補的DNAcDNAを作製してから、cDNAをPCRで増幅してDNAの複数のコピーを作製する。PCRの他の様々な置換については、例えば、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号;MullisetalMethEnzymol155335;およびMurakawaetalDNA7287それぞれ、参照により全体が本明細書に組み入れられるを参照。一般にTMAと呼ばれる転写介在増幅米国特許第5,480,784号および第5,399,491号。これらの各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられるでは、温度、イオン強度、およびpHが実質的に同一であり、標的配列の複数のRNAコピーが自己触媒的に追加のコピーを生成する条件下で、自己触媒的に標的核酸配列の複数コピーを合成する。例えば、米国特許第5,399,491号および第5,824,518号これらの各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられるを参照。米国特許出願公開第20060046265号この全体が参照により本明細書に組み入れられるに記載されているバリエーションでは、TMAは、任意で遮断部分、停止部分、および他の変更部分の使用を取り入れて、TMAプロセスの感度と精度を向上させる。一般にLCRと呼ばれるリガーゼ連鎖反応WeissRScience2541292。この全体が参照により本明細書に組み入れられるでは、標的核酸の隣接領域とハイブリダイズする2セットの相補的DNAオリゴヌクレオチドを使用する。DNAオリゴヌクレオチドは、熱変性、ハイブリダイゼーション、および連結という反復サイクルにおいて、DNAリガーゼによる共有結合を受け、検出可能な二本鎖連結オリゴヌクレオチド産物を生成する。一般にSDAと呼ばれる鎖置換増幅WalkerGetalProcNatlAcadSciUSA89392396;米国特許第5,270,184号および第5,455,166号。これらの各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられるでは、プライマー配列ペアを標的配列の逆鎖へアニーリングし、dNTPαSの存在下でのプライマーの伸長により、二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を生成し、エンドヌクレアーゼの介在により半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位にニックを入れ、ポリメラーゼの介在によりニックの3’末端からプライマーを伸長させることにより既存の鎖を置換し、次回のプライマーアニーリング、ニッキング、鎖置換のための鎖を生成するというサイクルを用いて、産物を幾何級数的に増幅させる。好熱性SDAtSDAは、本質的に同じ方法で、ただしより高い温度で、好熱性のエンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用する欧州特許第0684315号。他の増幅方法の例として、一般にNASBAと呼ばれる、核酸配列に基づく増幅米国特許第5,130,238号。この全体が参照により本明細書に組み入れられる;一般にQβレプリカーゼと呼ばれ、RNAレプリカーゼを使用してプローブ分子自身を増幅させる方法LizardietalBioTechnol61197。この全体が参照により本明細書に組み入れられる;転写に基づく増幅方法KwohetalProcNatlAcadSciUSA861173;および自律的配列複製GuatellietalProcNatlAcadSciUSA871874。各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられるが挙げられる。公知の増幅方法のさらなる考察については、PersingDavidHInVitroNucleicAcidAmplificationTechniquesDiagnosticMedicalMicrobiologyPrinciplesandApplicationspp5187を参照。4.検出方法増幅を受けない、または増幅された腫瘍マーカー核酸は、従来の任意の手段により検出できる。例えば、いくつかの実施形態では、検出可能に標識されたプローブとのハイブリダイゼーションおよびその結果生じるハイブリッドの測定により、腫瘍マーカー核酸を検出する。検出方法の例示的で非限定的な例を以下に記載する。1つの例示的な検出方法であるハイブリダイゼーション保護アッセイHPAは、化学発光性オリゴヌクレオチドプローブ例えば、アクリジニウムエステル標識AEプローブを標的配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズされていないプローブ上に存在する化学発光標識を選択的に加水分解し、残りのプローブから生じる化学発光を照度計で測定することを伴う。例えば、米国特許第5,283,174号およびNormanCNelsonetalNonisotopicProbingBlottingandSequencingch17LarryJKrickaed2ded1995各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられるを参照。別の例示的な検出方法では、増幅プロセスの定量的評価をリアルタイムで行うことができる。増幅プロセスのリアルタイムの評価は、増幅反応中、連続的または定期的に、反応混合物中の単位複製配列の量を測定し、その測定値を使用して、試料中に最初に存在していた標的配列の量を算出することを伴う。リアルタイム増幅に基づき、試料に最初に存在していた標的配列の量を決定する様々な方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許第6,303,305号および6,541,205号で開示されている方法などがあるこれらの各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられる。試料中に最初に存在していた標的配列の量を決定するための別の方法として、リアルタイム増幅に基づかない方法が米国特許第5,710,029号この全体が参照により本明細書に組み入れられるに開示されている。増幅産物は、様々な自己ハイブリダイズプローブを使用してリアルタイムに検出でき、そうしたプローブの大部分はステムループ構造を有する。このような自己ハイブリダイズプローブは、プローブが自己ハイブリダイズした状態か、それとも標的配列とのハイブリダイゼーションを通じて変化した状態であるかによって、異なる検出可能シグナルを発するように標識される。非限定的な例として、分子トーチは、自己相補性の特定領域標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインと呼ばれるを含む自己ハイブリダイズプローブの一種である。この特定領域は連結領域例えば、非ヌクレオチドリンカーにより連結され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする。好ましい実施形態では、分子トーチは、標的結合ドメイン中に1~約20塩基長さの一本鎖塩基領域を含み、鎖置換条件下において、増幅反応物に存在する標的配列とハイブリダイズしやすくなっている。鎖置換条件下では、標的配列が存在する場合以外は、分子トーチ中の2つの相補的領域完全に相補的でも部分的に相補的でもよいがハイブリダイズしていることが好ましく、標的配列が存在する場合、標的配列は、標的結合ドメインに存在する一本鎖領域に結合し、標的閉鎖領域の全部または一部を置換する。分子トーチの標的結合ドメインと標的閉鎖ドメインは、検出可能標識または相互作用する標識ペア例えば、発光/消光剤を含み、この標識は、分子トーチが自己ハイブリダイズしているときと、分子トーチが標的配列とハイブリダイズしているときとで異なるシグナルを発するように配置されているため、ハイブリダイズしていない分子トーチの存在下で、試験試料中のプローブ:標的の二重鎖を検出することができる。分子トーチおよび種々の相互作用標識ペアは、米国特許第6,534,274号で開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。自己相補性を有する検出プローブの別の例として、分子ビーコンがある。分子ビーコンは、標的に相補的な配列を有する核酸分子のほか、増幅反応物中に存在する標的配列がないときはプローブを閉鎖立体構造に保持する親和性ペアまたは核酸アーム、およびプローブが閉鎖立体構造にあるときに相互作用する標識ペアを含む。標的配列および標的に相補的な配列がハイブリダイズすると、親和性ペアのメンバーが分離し、それによりプローブが開放立体構造に移行する。標識ペアは、例えば蛍光体と消光剤例えばDABCYLとEDANSであってよく、開放立体構造の移行は、この標識ペアの相互作用の低下により検出できる。分子ビーコンは米国特許第5,925,517号および6,150,097号で開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。他の自己ハイブリダイズプローブは当業者によく知られている。非限定的な例として、例えば米国特許第5,928,862号この全体が参照により本明細書に組み入れられているに開示されているような相互作用標識を有するプローブ結合ペアは、本発明での使用に適応しうる。さらなる検出方式として、米国特許出願公開第20050042638号この全体が参照により本明細書に組み入れられるに開示されている分子スイッチが挙げられる。インターカレート性色素および/または蛍光色素を含むプローブなどの他のプローブも、本発明における増幅産物の検出に有用である。例えば、米国特許第5,814,447号この全体が参照により本明細書に組み入れられるを参照。B.タンパク質の検出いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍マーカータンパク質および/または腫瘍マーカータンパク質のレベルを検出する方法を提供する。当業者に対して公知の様々なタンパク質手法を用いてタンパク質を検出できる。これらの手法には、タンパク質シークエンシング配列決定およびイムノアッセイが含まれるが、これらに限定されない。1.シークエンシング配列決定タンパク質シークエンシング手法の例示的で非限定的な例として、質量分析およびエドマン分解が挙げられるが、これらに限定されない。質量分析は、原理上は、任意のサイズのタンパク質を配列決定できるが、計算的には、サイズが大きくなるほど困難になる。タンパク質をエンドプロテアーゼで消化させ、得られた溶液を高圧液体クロマトグラフィーカラムに通す。カラムの末端で、高い正電位をかけた細いノズルから、溶液を質量分析計に噴射する。小滴にかかった電荷により、単一のイオンのみが残るまでタンパク質が断片化される。次に、ペプチドを断片化し、断片の質量電荷比を測定する。質量スペクトルをコンピューターで解析し、また多くの場合、以前に配列決定されているタンパク質のデータベースと比較して、断片の配列を決定する。次いで、このプロセスを別の消化酵素で繰り返し、配列の重複部分を用いてタンパク質の配列を構成する。エドマン分解反応では、配列決定するペプチドを固体表面例えば、ポリブレンを塗布したガラス繊維に吸収させる。エドマン試薬であるフェニルイソチオシアネートPTCを、12トリメチルアミンの弱塩基性緩衝液と共に、吸収されたペプチドに加え、N末端アミノ酸のアミン基と反応させる。次に、無水酸を追加することにより、末端アミノ酸誘導体を選択的に分離できる。誘導体が異性化して置換フェニルチオヒダントインが生成されるので、これを洗い流してクロマトグラフィーで同定でき、このサイクルを繰り返すことができる。各段階の効率は約98であり、約50のアミノ酸を高い信頼性で決定できる。2.イムノアッセイイムノアッセイの例示的で非限定的な例として、免疫沈降;ウェスタンブロット;ELISA;免疫組織化学法;免疫細胞化学法;フローサイトメトリー;および免疫PCRが挙げられるが、これらに限定されない。当業者に対して公知の様々な手法を使用して検出可能に標識された例えば、比色、蛍光、化学発光、放射性物質ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、イムノアッセイでの使用に適している。免疫沈降は、抗原を、その抗原に特異的な抗体を用いて溶液から沈降させる手法である。このプロセスを用いて、細胞抽出物中に存在するタンパク質複合体に含まれると考えられるタンパク質を標的にすることにより、タンパク質複合体を同定することができる。最初に細菌から単離された、プロテインAやプロテインGなどの不溶性の抗体結合性タンパク質により、溶液から複合体を取り出す。また、抗体をセファロースビーズに結合させると、溶液から容易に単離することができる。洗浄後、質量分析、ウェスタンブロット法、その他の任意の数の方法を用いて沈降物を解析し、複合体の成分を同定できる。ウェスタンブロットまたはイムノブロットは、組織ホモジネートまたは抽出物の所与の試料中のタンパク質を検出する方法である。この方法では、ゲル電気泳動を使用して、変性したタンパク質を質量別に分離する。次に、タンパク質をゲルからメンブレン通常はポリビニルジフルオリドまたはニトロセルロースに移し、目的のタンパク質に特異的な抗体を用いてタンパク質を探索する。その結果、研究者は、所与の試料中のタンパク質の量を調べ、いくつかのグループ間でレベルを比較することができる。ELISAは、Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay酵素結合免疫吸着検定法の略語であり、試料中の抗体または抗原の存在を検出する生化学手法である。この方法では、少なくとも2つの抗体を利用する。その一方は抗原に対して特異的であり、他方は酵素と結合している。第2の抗体が、発色基質または蛍光発生基質を通じてシグナルを出す。ELISAのバリエーションとして、サンドイッチELISA、競合ELISA、ELISPOTなどがある。ELISAは、試料中の抗原の存在と抗体の存在のどちらの評価にも実施できるので、血清抗体濃度の測定と抗原の存在の検出の両方に利用できる、有用なツールである。免疫組織化学法と免疫細胞化学法は、それぞれ、組織切片中または細胞中のタンパク質の位置を特定するプロセスを指し、組織中または細胞中の抗原がそれぞれの抗体と結合するという原理に基づく。抗体に発色タグまたは蛍光タグを付けることにより、可視化が可能になる。発色タグの代表例として、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光体タグの代表例として、フルオレセインイソチオシアネートFITCやフィコエリトリンPEが挙げられるが、これらに限定されない。フローサイトメトリーは、流体の流れの中に懸濁した微細粒子を計数、調査、および選別する手法である。この方法では、光学/電子検出装置内を流れる単一細胞の物理的および/または化学的特性の同時の多パラメータ解析が可能である。単一の周波数または色の光線例えば、レーザーを、流体力学的に集中した流体の流れに向ける。流れが光線を通過する点に、数台の検出器で狙いを定める。ここで、1台は光線と方向を揃え前方散乱FSC、数台は光線と垂直の方向に向ける側方散乱SSCおよび1台以上の蛍光検出器。光線を通過する各懸濁粒子が何らかの方法で光を散乱して、粒子中の蛍光化学物質が励起され、光源より低い周波数で光を放射し得る。散乱光と蛍光の組み合わせを検出器で測定し、また、蛍光放射ピークごとに各検出器における輝度の変動を解析することにより、個別の各粒子の物理的および化学的構造に関する様々な事実を推定することができる。FSCは細胞容積と相関し、SSCは粒子の密度または内部の複雑さ例えば、核の形状、細胞質顆粒の量とタイプ、膜の粗さなどと相関する。免疫ポリメラーゼ連鎖反応IPCRでは、核酸増幅手法を利用して、抗体に基づくイムノアッセイにおけるシグナル生成を増加させる。PCRにはタンパク質の同等物が存在しないため、つまり、PCR中の核酸増幅と同じ方法でタンパク質を複製することはできないため、検出感度を上げる唯一の方法は、シグナルの増幅である。標的タンパク質は、オリゴヌクレオチドに直接的または間接的にコンジュゲートしている抗体に結合する。結合していない抗体は洗い流され、残りの結合した抗体のオリゴヌクレオチドが増幅される。増幅されたオリゴヌクレオチドを標準の核酸検出方法リアルタイムの方法を含むで検出することにより、タンパク質が検出される。いくつかの実施形態では、免疫磁気による検出を利用する。いくつかの実施形態では、検出は自動化される。代表的な免疫磁気検出方法として、ベリデックスニュージャージー州ラリタンが市販している検出方法が挙げられるが、これに限定されない。C.データ解析いくつかの実施形態では、コンピューターベースの解析プログラムを使用して、検出アッセイで生成された生データ例えば、腫瘍マーカー発現の有無もしくは量および/またはCTCレベルを臨床医向けの予測値データに変換する例えば、がん治療法の選択。臨床医は、任意の適切な手段を使用して予測データにアクセスできる。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、遺伝学や分子生物学の教育を受けない可能性のない臨床医でも生データの理解は不要であるという、さらなる利点を提供する。データは、その最も有用な形態で臨床医に直接提示される。次いで、臨床医は、対象の治療を最適化するために、この情報を直ちに利用することができる。本発明は、アッセイを実施している研究室、情報提供者、医療従事者、および対象との間で情報の受信、処理、および送信ができる任意の方法を企図している。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、対象から試料例えば、生検試料または血液もしくは血清試料を取得し、世界の任意の場所例えば、対象が居住する国や情報が最終的に使われる国とは異なる国に位置するプロファイリングサービス例えば、医療施設の臨床検査室、ゲノムプロファイリング業者などに提出して、生データを作成する。試料が組織または他の生体試料を含む場合は、対象が医療センターを訪れ、試料を採取させてプロファイリングセンターに送付させるか、または対象が試料例えば、尿試料を自身で採取して、直接プロファイリングセンターに送付することができる。試料が以前に測定された生体情報を含む場合は、対象からプロファイリングサービスに直接情報を送信してもよい例えば、情報を含む情報カードをコンピューターでスキャンし、電子通信システムを使用してプロファイリングセンターのコンピューターに伝送してもよい。プロファイリングサービスが試料を受領した後、試料が処理され、その対象に望まれる診断情報または予後情報に特化したプロファイルが作成されるすなわち発現データ。次いで、治療担当医による解釈に適した形式でプロファイルデータが作成される。例えば、生のデータを提供するのでなく、対象の診断またはリスク評価例えば、がん治療が奏功する見込みを、特定の治療選択肢に関する推奨事項と共に提示する形式で作成できる。データは、任意の適切な方法で臨床医に表示することができる。例えば、いくつかの実施形態では、プロファイリングサービスは、臨床医向けに例えば、治療の現場で印刷できる報告書、または臨床医に対してコンピューターモニターに表示できる報告書を作成する。いくつかの実施形態では、最初に治療現場または地域の施設で情報を解析する。次に、生データを中央処理施設を送付してさらなる解析を行い、かつ/または、生データを臨床医もしくは患者にとって有用な情報に変換する。中央処理施設は、プライバシー統一したセキュリティプロトコルの下で全データを中央施設に保存、スピード、およびデータ解析の一様性という利点を提供する。次に、中央処理施設は、対象の治療後のデータの扱いを管理できる。例えば、中央施設は、電子通信システムを用いて臨床医、対象、または研究者にデータを提供することができる。いくつかの実施形態では、対象は、電子通信システムを使用してデータに直接アクセスすることができる。対象は、結果に基づいて、さらなる介入またはカウンセリングを選択してもよい。いくつかの実施形態では、データは研究用途で使用される。例えば、データを使用して、特定の症状または病期の有用な指標としてのマーカーの採用または除外を、さらに最適化することができる。D.組成物およびキット本発明の診断方法で使用する組成物には、プローブ、増幅オリゴヌクレオチド、および抗体が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい組成物は、CTC試料中の腫瘍マーカーの発現レベルの存在を検出する。これらの組成物のいずれも、単独で、または本発明の他の組成物と組み合わせて、キットの形で提供することができる。例えば、腫瘍マーカーの増幅と検出のために、単一の標識プローブおよび1対の増幅オリゴヌクレオチドをキットとして提供できる。キットには、適切な対照および/または検出試薬をさらに含めてもよい。本発明のプローブおよび抗体組成物を、アレイまたはパネルアレイの形で提供することもできる。IV.治療方針の決定いくつかの実施形態では、本発明は、治療方針を決定するためのシステム、キット、および方法を提供する。いくつかの実施形態では、CTC-内分泌療法指数EndocrineTherapyIndexCTC-ETIを決定する。いくつかの実施形態では、CTCおよび腫瘍マーカーのレベルにポイントを割り当てることにより、CTC-ETIを算出する例えば、実施例1を参照。いくつかの実施形態では、低いCTC-ETIは、内分泌例えば抗エストロゲン療法に反応する見込みがある対象を示す。いくつかの実施形態では、高いCTC-ETIスコアは、内分泌療法に反応する可能性が低く、化学療法の方が良好に治療される対象を示す。実施例以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態を実証しさらに例証するために提供され、その範囲を限定するものとは解釈されない。実施例1CTC-内分泌療法指数EndocrineTherapyIndexCTC-ETIの開発CTCは、市販の、自動化された免疫磁気システム例えば、CellSearch登録商標システム;ベリデックスエルエルシーVeridexLLCを使用して、再現性よく、および確実に、数えることが出来る。高レベルのCTCは、転移性乳がんMBCを有する患者における急速な進行を予測するCristofanillietalNEJM2004。内分泌療法ETの恩恵を受けるのは、エストロゲン受容体ER陽性MBCを有する患者の~50のみである。内分泌性-難治性MBCは、化学療法によって、より良好に緩和される。本実施例は、ETによる恩恵を受ける可能性が低く、化学療法によってより良好に治療される、ER陽性MBCを有する患者を特定する、CellSearch登録商標を使用した多パラメータアッセイを説明する。方法。CellSearch登録商標システムは、4つの蛍光チャネルを有する。これらのうち3つを使用して、CTCをWBCDAPI、抗サイトケラチン、抗CD45と識別する。4番目の空のチャネルは抗原特異的な蛍光標識された抗体を用いて、ER、Bcl-2、HER2、およびKi67の発現を測定するために使用された。これらの4つのマーカーは、ETに対する感受性ER、Bcl-2または抵抗性HER2、Ki-67との関連により正当に選択された。培養されたヒト乳がん細胞MCF-7:ER、BCL-2、HER2-、Ki67;MDA-MB-231:ER-、Bcl-2-、HER2-、Ki67;BT-474:ER、Bcl-2、HER2、Ki67を、正常な提供者から得た7.5mlのヒト全血中に混入し、CXCCellSearch登録商標キットを使用して分離し、特徴付けした。表1は種々のマーカーとETに対する応答の関連を示す。表2は抗体および実験パラメータを示す。結果。各細胞株を、それぞれのマーカーに対して、適切な陰性対象で、適切に染色したが、単一の細胞株内であっても、染色は不均一であった図1~3。これらのデータを使用して、細胞数と各マーカーの細胞陽性度の相対的な割合および程度との組み合わせから成る個々のカテゴリーにスコアを割り当て、より低いスコア低いCTCまたはCTC無し、またはERおよびBcl-2の高および強度を伴うCTC;低いHER2およびKi-67においてETに対する良好な応答が予測される、CTC-ETIが開発された表3および4。上述の方法を使用して、転移性乳がんを有する3人の患者についてのCTC-ETIを決定した。結果を図4に示す。さらなる試験において、21人の患者を試験した。試験デザインおよび結果を図7~8に示す。一人の患者が不適格であった。20人の患者のうち5人が低CTC数<5CTC/7.5mlの全血を有し、比較的良好な予後を有すると期待される。CTC-ETIは10人50の患者において決定された:2人の患者は低数値、3人は中数値、および5人は高数値のCTC-ETIを有した。技術的な問題により、残りの4人の患者において、正確なCTC-ETIが得られなかった。追記として、一人の患者におけるCTCの中でバイオマーカーの発現は不均一であった。より低いCTC-ETIスコア低いCTCまたはCTC無し、または高いCTCERおよびBCL-2ならびに低いCTCHER2およびKi-67を伴うCTCが、ETに対する良好な応答に関連していると考えられる。高CTC-ETIが、ETにおける抵抗性および迅速な進行を予測するかどうかを判断するために、MBCを有する患者において、CTC-ETIを算出した。上述の明細書に記載される、全ての刊行物、特許、特許出願および受託番号は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明は特定の実施形態との関連において記載されているが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に、不当に限定されるべきではないことを理解するべきである。実際には、記載される本発明の組成物および方法の種々の改変および変更が、当業者には明らかであり、以下の請求の範囲に含まれることが意図される。図1は、がん細胞株における、エストロゲン受容体の発現を示す図である。図2は、がん細胞株における、aBcl-2、bKi-67、およびcHER-2の発現を示す図である。図3は、がん細胞株についてのCTC-ETIスコアの算出法を示す図である。図4は、3人の患者についてのCTC-ETIスコアの算出法を示す図である。図5は、乳がんにおける、CTC-ETIスコアの例示的な臨床試験および臨床結果を示す模式図である。図6は、乳がんにおける、CTC-ETIスコアの例示的な臨床試験および臨床結果を示す模式図である。図7は、乳がんにおける、CTC-ETIスコアの例示的な臨床試験および臨床結果を示す模式図である。図8Aは、CTC-ETIスコアをモニターした8人の患者の臨床試験の結果を示す図である。図8Bは、CTC-ETIスコアをモニターした8人の患者の臨床試験の結果を示す図である。図8Cは、CTC-ETIスコアをモニターした8人の患者の臨床試験の結果を示す図である。"