細胞における標的化組換えの方法であって、TALIII型エフェクター結合ドメインおよび切断ドメインを含んで成る融合タンパク質を前記細胞に導入し、その結果、細胞クロマチンがTALエフェクター結合ドメインにより標的化された領域で切断され、その結果、相同組換えが起こりうるステップを含むものである前記方法。前記TALIII型エフェクター結合ドメインが非改変のTALIII型エフェクター結合ドメインとは異なる部位と結合するように改変されている、請求項1に記載の方法。前記TALIII型エフェクターがXanthomonasoryzaepvoryzae由来である、請求項1に記載の方法。前記TALIII型エフェクターがAvrXa7である、請求項1に記載の方法。前記TALIII型エフェクターがイネ遺伝子Os11N3を活性化する、請求項1に記載の方法。前記切断ドメインがFokI由来である、請求項1に記載の方法。細胞クロマチンが染色体にある、請求項1に記載の方法。融合タンパク質において、切断ドメインがN末端に近くかつTALエフェクター結合ドメインがC末端に近い、請求項1に記載の方法。Xanthomonasoryzaepvoryzae由来のTALIII型エフェクター配列とFokI切断ドメインを含む融合タンパク質。前記TALIII型エフェクター配列がAvrXa7である、請求項9に記載の融合タンパク質。前記AvrXa7配列が標的部位を変えるように改変されている、請求項10に記載の融合タンパク質。前記融合タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列を有する、請求項10に記載の融合タンパク質。請求項9に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。請求項9に記載の融合タンパク質を含む改変された細胞。請求項13に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。イネ遺伝子Os11N3にてまたは近くにおける細胞における標的化組換えの方法であって、前記細胞にTALII型エフェクター結合ドメインAvrXa7および切断ドメインFokIを含む融合タンパク質を導入し;その結果、細胞クロマチンがAvrXa7により標的化された領域で切断され、その結果、相同組換えが起こりうるステップを含む前記方法。前記TALIII型エフェクターがXanthomonasoryzaepvoryzae由来である、請求項1に記載の方法。前記TALIII型エフェクターがAvrXa7である、請求項1に記載の方法。前記TALIII型エフェクターがイネ遺伝子Os11N3を活性化する、請求項1に記載の方法。前記切断ドメインがFokIである、請求項1に記載の方法。細胞クロマチンが染色体にある、請求項1に記載の方法。融合タンパク質において、切断ドメインがN末端に近くかつTALエフェクター結合ドメインがC末端に近い、請求項1に記載の方法。TALIII型エフェクターにより標的化された領域において細胞クロマチンを切断する方法であって、目的の領域を選択するステップ;TALIII型を遺伝子操作するステップを含むものである前記方法。細胞において標的化組換えを行う方法であって、前記細胞へAvrXa7TALIII型エフェクター結合ドメイン標的配列および切断ドメインを含む融合タンパク質を導入し;その結果、細胞クロマチンがTALエフェクター結合ドメインにより標的化された領域において切断され、その結果、相同組換えが起こりうるステップを含むものである前記方法。前記AvrXa7TALIII型エフェクター結合ドメインが配列ATAAACCCCCTCCAACCAGGTGCTAAを標的化する、請求項24に記載の方法。前記AvrXa7TALIII型エフェクターがXanthomonasoryzaepvoryzae由来である、請求項24に記載の方法。前記結合ドメイン標的配列が、AvrXa7TALIII型エフェクター結合ドメインの第12および第13アミノ酸の次のコード:HDCGまたはATNIATまたはGCまたはCGNGTANSATまたはTAまたはCGNNCGまたはATまたはGCNCGまたはTAまたはATHGTAによって決定される、請求項24に記載の方法。前記TALIII型エフェクターがイネ遺伝子Os11N3を活性化する、請求項24に記載の方法。前記切断ドメインがFokI由来である、請求項24に記載の方法。細胞クロマチンが染色体にある、請求項24に記載の方法。融合タンパク質において、切断ドメインがN末端に近くかつTALエフェクター結合ドメインがC末端に近い、請求項24に記載の方法。Xanthomonasoryzae由来のTALIII型エフェクター配列およびFokI切断ドメインを含む融合タンパク質。前記TALIII型エフェクター配列がAvrXa7である、請求項32に記載の融合タンパク質。前記AvrXa7配列が標的部位を変えるように改変されている、請求項33に記載の融合タンパク質。前記融合タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列を有する、請求項33に記載の融合タンパク質。請求項32に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。請求項32に記載の融合タンパク質を含む改変された細胞。請求項36に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。イネ遺伝子Os11N3にてまたは近くにおける細胞における標的化組換えの方法であって、前記細胞にTALIII型エフェクター結合ドメインAvrXa7標的化配列および切断ドメインFokIを含む融合タンパク質を導入し;その結果、細胞クロマチンがAvrXa7により標的化された領域で切断され、その結果、相同組換えが起こりうるステップを含む前記方法。前記標的配列が、AvrXa7TAL標的配列の第12および第13アミノ酸の次のコード:HDCGまたはATNIATまたはGCまたはCGNGTANSATまたはTAまたはCGNNCGまたはATまたはGCNCGまたはTAまたはATHGTAに従って決定される、請求項39に記載の方法。前記AvrXa7TALIII型エフェクター結合ドメインが配列ATAAACCCCCTCCAACCAGGTGCTAAを標的化する、請求項39に記載の方法。前記TALIII型エフェクターがイネ遺伝子Os11N3を活性化する、請求項39に記載の方法。前記切断ドメインがFokI由来である、請求項39に記載の方法。細胞クロマチンが染色体にある、請求項39に記載の方法。融合タンパク質において、切断ドメインがN末端に近くかつTALエフェクター結合ドメインがC末端に近い、請求項39に記載の方法。AvrXa7TALIII型エフェクターにより標的化された領域において細胞クロマチンを切断する方法であって、目的の領域を選択するステップ;AvrXa7TALIII型エフェクター結合ドメインを遺伝子操作して目的の領域において第1のヌクレオチド配列と結合するステップ;細胞において、AvrXa7TALIII型エフェクター結合ドメインおよび切断ドメインを含んで成る第1の融合タンパク質を発現するステップ;を含み、ここで、融合タンパク質は第1のヌクレオチド配列と結合し、その結果、細胞クロマチンは目的の領域で切断され、その結果、相同組換えが起こりうる前記方法。本発明者らはTALヌクレアーゼ、すなわち、FokIおよびAvrXa7から誘導したハイブリッドタンパク質を作製して特徴付けたここで、AvrXa7は植物病原性細菌由来の転写活性化因子様TALエフェクターファミリーのメンバーである。TALNと呼ぶこのハイブリッドタンパク質は、標的AvrXa7の26ヌクレオチドに対する認識特異性およびFokIの二本鎖DNA切断活性の両方を保持する。TALNは最適条件下でAvrXa7結合部位に隣接するDNAをinvitroにて切断し、そして発現されると、酵母において対合した標的配列を含有するLacZ遺伝子のDNA相同組換えを促進する。標的DNA配列に対するTAL反復のモジュールの性質は、特注設計の新規TALタンパク質がより長い同族DNA配列を認識することを可能にするので、TALヌクレアーゼは、標的化ゲノムまたはクロマチン改変に対する可能性をもつ新規酵素のさらなるツールボックスを示す。本発明は、目的の領域における細胞クロマチンの標的化切断および/または細胞における目的の所定の領域における相同組換えのための組成物および方法を提供する。細胞には、培養細胞、生体中の細胞、および、治療のために生体から取り出され、治療後にその細胞および/またはその子孫は前記生体に戻される細胞が含まれる。細胞クロマチン中の目的の領域は、例えば、ゲノム配列またはその部分であってもよい。組成物には、TALエフェクター結合ドメインと切断ドメインを含むポリペプチドが含まれる。切断ドメインはエンドヌクレアーゼ由来であってもよい。ある特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼはIIS型制限エンドヌクレアーゼである。さらなる実施形態において、IIS型制限エンドヌクレアーゼはFokIである。細胞クロマチンは、任意の型の細胞中に存在してもよく、それには、限定されるものでないが、原核および真核生物細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞およびヒト細胞が含まれる。細胞クロマチンは、例えば、感染性細菌またはウイルスの染色体中にまたは細胞内ゲノム中に存在してもよい。従って、本発明は細胞の遺伝材料を改変する方法を含む。その方法は、相同組換えが起こることを所望する染色体標的DNA配列を含有する初代細胞を提供するステップ;二本鎖DNAを切断できるエンドヌクレアーゼドメインおよび細胞中の標的DNA内の特定のヌクレオチド配列と、組み合わせて、結合する複数のTALエフェクター反復配列を含むTALエフェクタードメインを含んで成るTALエフェクターエンドヌクレアーゼを提供するステップ;ならびに、標的DNA配列を細胞中のTALエフェクターエンドヌクレアーゼと接触させ、その結果、TALエフェクターエンドヌクレアーゼが細胞中の標的DNA配列内のまたは隣接するヌクレオチド配列の両方の鎖を切断するステップを含むものである。その方法はさらに、標的DNAの少なくとも一部分と配列相同性を含む核酸を提供し、その結果、標的DNA配列と前記核酸の間で相同組換えが起こるステップを含んでもよい。標的DNA配列は細胞にとって内因性であってもよい。細胞は植物細胞または哺乳動物細胞であってもよい。接触するステップは、細胞をTALエフェクターエンドヌクレアーゼコード配列を含むベクターでトランスフェクトするステップ、細胞中でTALエフェクターエンドヌクレアーゼタンパク質を発現するステップ、TALエフェクターエンドヌクレアーゼタンパク質を機械的に細胞中に注射するステップ、TALエフェクターエンドヌクレアーゼタンパク質を細菌III型分泌系を用いて細胞中に送達するステップ、またはTALエフェクターエンドヌクレアーゼタンパク質をエレクトロポレーションにより細胞中に導入するステップを含みうる。エンドヌクレアーゼドメインはIII型制限エンドヌクレアーゼ例えば、FokI由来であってもよい。標的DNA内の特定のヌクレオチド配列と結合するTALエフェクタードメインは15個以上のDNA結合反復を含みうる。細胞は、植物、動物、哺乳動物、ヒト、硬骨魚、真菌、細菌または原生動物からなる群より選択される生物由来であってもよい。他の実施形態において、本発明はDNAを特定の位置にて切断できる配列特異的TALエフェクターエンドヌクレアーゼを設計する方法を含む。その方法は、二本鎖切断の導入を所望する第2のヌクレオチドに隣接した第1のユニークな内因性染色体のヌクレオチド配列を特定するステップ;ならびに第1のユニークな内因性染色体のヌクレオチド配列と、組み合わせて、結合する複数のDNA結合反復ドメイン、および第2のヌクレオチド配列にて二本鎖切断部を作製するエンドヌクレアーゼを含む配列特異的TALエフェクターエンドヌクレアーゼを設計するステップを含む方法である。融合タンパク質の極性は、TALエフェクター結合ドメインが切断ドメインのN末端であってもよく;代わりに、切断ドメインがTALエフェクター結合ドメインのN末端であってもよい。同じ極性の2つの融合タンパク質を用いる場合、それらの結合部位は目的の領域においてDNAの反対鎖上にある。さらなる実施形態においては、反対の極性の2つの融合タンパク質を用いる。この場合、2つのタンパク質の結合部位は同じDNA鎖上にある。本発明の好ましい実施形態において、切断ドメインはTAL配列のN末端である。それぞれの融合体FNTAL、TALFNの配向は、両方とも、本明細書に実証した通り機能性である一方、FNTALの極性が好ましい、何故なら、C末端の転写活性化ドメインが無傷であり、ヌクレアーゼ融合に用いる天然TALまたは新しく遺伝子操作で作ったTALのDNA結合特異性の測定を可能にするからである。また、この配向は、TALNを設計するときに、2つの標的部位間のスペーサー長さおよびそれら自体による標的部位の配向の柔軟性を与える。例えば、FNTALは2つの部位間の30ntについて作用する一方、本発明者らの実験ではTALFNは19ntについて作用する。この事はTALを設計する場合、標的部位、スペーサー長さなどを考慮する上で重要である。本発明によって、例えば、融合タンパク質を細胞に送達することにより、または、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達し、もしDNAであればポリヌクレオチドを転写し、そして細胞に送達されたRNA分子もしくは細胞に送達されたDNA分子の転写物を翻訳し、融合タンパク質を作製することにより、融合タンパク質を細胞で発現させることができる。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達する方法は当技術分野で公知であり、本開示の随所に記載されている。上記方法からもたらされる標的化突然変異には、限定されるものでないが、点突然変異すなわち、単一塩基対の異なる塩基対への変換、置換すなわち、複数の塩基対の同一長さの異なる配列への変換、1以上の塩基対の挿入、1以上の塩基対の欠失、および上記配列変化の組み合わせが含まれる。標的化組換え例えば、染色体中の配列または細胞クロマチン中の目的の領域の改変または置換のためのも提供される。例えば、遺伝性疾患または遺伝した障害を治療するために、突然変異体ゲノム配列を、野生型配列により置き換えることができる。さらに、例えば、癌遺伝子産物または不適当な炎症応答に関わる遺伝子産物の機能を防止するために、野生型ゲノム配列を突然変異体配列により置き換えることができる。さらに、一遺伝子の1つの対立遺伝子を異なる対立遺伝子により置き換えることができる。本発明にはまた、特定のDNA配列に特異的なエンドヌクレアーゼドメインとTALエフェクターDNA結合ドメインを含むTALエフェクターエンドヌクレアーゼが含まれる。TALエフェクターエンドヌクレアーゼはさらに精製タグを含んでもよい。エンドヌクレアーゼドメインはIII型制限エンドヌクレアーゼ例えば、FokI由来であってもよい。特許または出願ファイルは少なくとも1つのカラー図面を含む。カラー図面を伴う本特許または本特許出願公報のコピーは、請求および必要な費用の支払いをすると役所により提供されるであろう。AvrXa7は、XanthomonasoryzaepvoryzaeXooイネの細菌性胴枯れ病の偶発性病原体由来のIII型TALエフェクターである。これは26個の反復のRVDのユニークな組み合わせを有する図1B。いくつかのXoo菌株にとって、AvrXa7は感受性イネにおける重要な病原性因子であるが、同族耐性遺伝子Xa7を含有する他の耐性植物における非病原性決定因子でもある。本質的な病原性因子として、AvrXa7はイネ遺伝子Os11N3を活性化して疾患感受性の状態を誘導する。AvrXa7による遺伝子誘導は、Os11N3のプロモーター領域内のDNAエレメント本明細書ではエフェクター結合エレメントEBEと呼ぶエレメントであり、配列は図1Bに示されているの認識を介して行われる。原理の証明として、本発明者らは、AvrXa7の配列特異性とエンドヌクレアーゼFokIのヌクレアーゼ触媒活性とを利用することにより、新しい型のエンドヌクレアーゼ作製の実現可能性を試験した。本出願人は、全長AvrXa7のFNとの融合、および、融合体のヌクレアーゼ活性のinvitroおよび酵母アッセイにおける特徴付けにより、TALNを創製した。総論本明細書に開示した方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、特に断らない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えDNA、ならびに当技術分野の技術の範囲内にある関係分野の通常の技法を利用する。これらの技法は文献に全て説明されている。例えば、SambrooketalMOLECULARCLONINGALABORATORYMANUALSecondeditionColdSpringHarborLaboratoryPress1989andThirdedition2001;AusubeletalCURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYJohnWileySonsNewYork1987およびその定期最新版;シリーズ版のMETHODSINENZYMOLOGYAcademicPressSanDiegoWolffeCHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTIONThirdeditionAcademicPressSanDiego1998;METHODSINENZYMOLOGYVol304ChromatinAcademicPressSanDiego1999;およびMETHODSINMOLECULARBIOLOGYVol119ChromatinProtocolsHumanaPressTotowa1999を参照されたい。定義用語核酸、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは互換的に使用され、直鎖または環状高次構造の、および一本鎖または二本鎖のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味する。本開示に目的に対して、これらの用語はポリマーの長さを限定すると解釈してはならない。用語は天然ヌクレオチド、ならびに塩基、糖および/またはリン酸部分例えば、ホスホロチオアート主鎖が修飾されたヌクレオチドの公知の類似体を包含しうる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対合特異性を有する;すなわち、Aの類似体はTと塩基対合しうる。用語ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語はまた、1以上のアミノ酸が対応する天然のアミノ酸の化学類似体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。結合bindingは高分子間の例えば、タンパク質および核酸間の配列特異的、非共有結合相互作用を意味する。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全成分が配列特異的であることを必要としない例えば、DNA主鎖のリン酸残基との接触。かかる相互作用は一般に、106M1以下の解離定数Kdにより特徴付けられる。親和力は結合の強さを意味する:結合親和力の増加はKdの低下と相関がある。結合タンパク質は非共有結合で他の分子と結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、DNA分子DNA結合タンパク質、RNA分子RNA結合タンパク質および/またはタンパク質分子タンパク質結合タンパク質と結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自体と結合しうるホモ二量体、ホモ三量体などを形成するおよび/または異なるタンパク質の1以上の分子と結合しうる。結合タンパク質は1以上の型の結合活性を有しうる。例えば、ジンクフィンガータンパク質はDNA結合、RNA結合およびタンパク質結合活性を有する。TALエフェクターDNA結合タンパク質または結合ドメインまたはTALエフェクターDNA認識配列は、より大きいタンパク質内に、DNAと配列特異的な方式で結合する一連の反復可変二残基RVDを包含するタンパク質である。TALエフェクターのRVD領域はTAL内で、典型的には、34アミノ酸の反復の、典型的には、位置12および13において多型であり;前記反復は特定のヌクレオチドと結合して複数の反復するユニット区間が一緒に特異的なTALエフェクターDNA結合ドメインを作り上げる。TALエフェクターDNA結合タンパク質ドメインそれらのRVDを予め決めたヌクレオチド配列と結合するように遺伝子操作することができる。前記を遺伝子操作する方法は、限定されるものでないが、設計および選択である。設計されるTALエフェクターDNA結合タンパク質は自然に存在せず、その設計/組成は主に合理的な判定基準から得られるものである。設計の合理的な判定基準は、現存するRVD設計および結合データの情報を保存するデータベース中の情報を処理するための、置換規則および計算機アルゴリズムの応用を含む。用語配列は、DNAまたはRNAであってもよく、直鎖、環状または分子鎖であってもよく、そして一本鎖もしくは二本鎖であってもよい、任意の長さのヌクレオチド配列を意味する。用語ドナー配列はゲノム中に挿入されたヌクレオチド配列を意味する。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、2~10000ヌクレオチドの長さまたはそれらの間もしくはそれら以上の任意の整数値、好ましくは約10~1000ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約200~500ヌクレオチドの長さであってもよい。相同性の非同一配列は、第2配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列は第2配列の配列と同一ではない第1配列を意味する。例えば、突然変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは突然変異体遺伝子の配列と相同性であって同一でない。ある特定の実施形態において、2つの配列間の相同性の程度は、正常の細胞機構を利用してその間の相同組換えを可能にするのに十分である。非同一配列の2つの相同性は任意の長さであってよく、それらの非相同性の程度は単一ヌクレオチドのように小さくてもよく例えば、標的化相同組換えによるゲノムの点突然変異の修正に対するまたは10000塩基以上のように大きくてもよい例えば、染色体中の予定した異所部位における遺伝子挿入に対する。相同性非同一配列を含む2つのポリヌクレオチドは同じ長さである必要はない。例えば、20~10000ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチドすなわち、ドナーポリヌクレオチドを用いることができる。核酸およびアミノ酸配列同一性を決定する技法は当技術分野で公知である。典型的には、かかる技法は、ある遺伝子に対するmRNAのヌクレオチド配列を決定するステップおよび/またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定するステップ、およびこれらの配列を第2のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較するステップを含む。ゲノム配列もこの方式で決定しかつ比較することができる。一般に、同一性は2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を意味する。2以上の配列ポリヌクレオチドまたはアミノ酸をそれらの同一性を決定することにより比較することができる。2つの配列の同一性は、核酸またはアミノ酸配列のいずれでも、2つのアラインメントした配列間の正確な整合数を短い方の配列の長さで除して100を乗じたものである。核酸配列に対する近似的なアラインメントは、SmithandWatermanAdvancesinAppliedMathematics2482489の局所相同性アルゴリズムにより与えられる。このアルゴリズムは、DayhoffAtlasofProteinSequencesandStructureMODayhoffed5suppl3353358NationalBiomedicalResearchFoundationWashingtonDCUSAが開発し、GribskovNuclAcidsRes1467456763が規準化したスコアリングマトリックスを用いることにより、アミノ酸配列に応用することができる。配列の同一性を決定するための、このアルゴリズムの実行の例示は、GeneticsComputerGroupMadisonWisによりBestFitユーティリティアプリケーションに与えられている。この方法のデフォールトパラメーターは、theWisconsinSequenceAnalysisPackageProgramManualVersion8GeneticsComputerGroupMadisonWisから入手可能に記載されている。本発明の開示の文脈における同一性を設定する好ましい方法は、UniversityofEdinburghが著作権を有するMPSRCHパッケージのプログラムJohnFCollinsおよびShaneSSturrokが開発し、IntelliGeneticsIncが配給するを用いることである。この一揃いのパッケージ、SmithWatermanアルゴリズムを使うことができ、ここでスコアリング表にはデフォールトパラメーター例えば、ギャップオープンペナルティ=12、ギャップエキステンションペナルティ=1、およびギャップ=6を用いる。作製されたデータからの整合値は配列同一性を反映する。配列間の同一性または類似性を計算するための他の好適なプログラムは、一般に、当技術分野で公知であり、例えば、他のアラインメントプログラムはデフォールトパラメーターを用いるBLASTである。例えば、BLASTNおよびBLASTPは次のデフォールトパラメーターを用いて使うことができる:遺伝コード標準;フィルター=なし;鎖=両方;カットオフ=60;期待値=10;マトリックス=BLOSUM62;Descriptions記述=50配列;ソート方法=高スコア;データベース=nonredundant非冗長GenBankEMBLDDBJPDBGenBankCDStranslationsSwissproteinSpupdatePIR。これらのプログラムの詳細は次のインターネットアドレスにて見出すことができる:httpwwwncbinlmgovcgibinBLAST。本明細書に記載の配列について、所望される配列同一性の程度の範囲はおよそ80~100およびそれらの間の任意の整数値である。典型的には、配列間の同一性は少なくとも70~75、好ましくは80~82、より好ましくは85~90、さらにより好ましくは92、さらにより好ましくは95、そして最も好ましくは98配列同一性である。あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間の安定な二本鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、次いで一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化した断片のサイズ決定により決定することができる。2つの核酸または2つのポリペプチド配列は、それらの配列が、その分子の規定した長さにわたり、上記方法を用いて決定して、少なくとも約70~75、好ましくは80~82、より好ましくは85~90、さらに、より好ましくは92、さらにより好ましくは95、および最も好ましくは98配列同一性を示すと、お互いに実質的に相同である。本明細書で使用する、実質的な相同性はまた、ある特定したDNAまたはポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列も意味する。実質的に相同性であるDNA配列は、例えば、その特別な系について規定されたストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション実験で特定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の規定は当技術分野の技術に含まれる。例えば、前掲のSambrooketalNucleicAcidHybridizationAPracticalApproacheditorsBDHamesandSJHigginsOxfordWashingtonDCIRLPressを参照されたい。2つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは次の通り決定することができる。2つの核酸分子間の配列同一性の程度は、かかる分子間のハイブリダイゼーションの効率と強度に影響を与える。部分的に同一の核酸配列は、完全に同一配列の標的分子とのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害しうる。完全に同一配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当技術分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価することができる例えば、サザンDNAブロット、ノーザンRNAブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど:SambrooketalsupraNucleicAcidHybridizationAPracticalApproacheditorsBDHamesandSJHigginsOxfordWashingtonDCIRLPressを参照されたい。かかるアッセイは、選択性の程度を変える技法を用いて、例えば、低から高ハイブリダイゼーションまで条件を変える技法を用いて、実施することができる。もし低ストリンジェンシーの条件を使えば、非特異的結合の非存在は、部分的な程度の配列同一性すら欠く二次プローブ例えば、標的分子と約30未満の配列同一性しか有しないプローブを用いて、非特異的結合事象が存在しなければ、二次プローブは標的とハイブリダイズし得ないというようにして評価することができる。ハイブリダイゼーションに基づく検出系を利用する場合、参照核酸配列と相補性のある核酸プローブを選び、次いでプローブと参照配列がお互いに選択的にハイブリダイズ、または結合して二重分子を形成する適当な条件を選択する。中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列と選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、典型的には、選択した核酸プローブの配列と少なくともおよそ70配列同一性を有する少なくとも約10~14ヌクレオチドの長さの標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択した核酸プローブの配列と少なくともおよそ90~95より大きい配列同一性を有する少なくとも約10~14ヌクレオチドの長さの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと参照配列が特異的な程度の配列同一性を有する場合のプローブ/参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で公知のように決定することができる例えば、NucleicAcidHybridizationAPracticalApproacheditorsBDHamesandSJHigginsOxfordWashingtonDCIRLPressを参照。ハイブリダイゼーションの条件は当業者には周知である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ミスマッチしたヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を少なくする程度を意味し、高いストリンジェンシーはミスマッチしたハイブリッドの低い許容度と相関がある。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える因子は当業者に周知であり、限定されるものでないが、有機溶媒、例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどの温度、pH、イオン強度、および濃度が含まれる。当業者に公知であるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは温度が高いほど、イオン強度が低いほど、および溶媒濃度が低いほど、増加する。ハイブリダイゼーションに対するストリンジェンシーについて当技術分野で周知であることは、例えば、次の因子を変えることにより、多数の等価な条件を使って特別なストリンジェンシーを設定できるということである:配列の長さと性質、様々な配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液組成物の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断剤例えば、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコールの存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメーター、ならびに、様々な洗浄条件。ハイブリダイゼーション条件の特別なセットの選択は、当技術分野の標準的方法に従って行われる例えば、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionColdSpringHarborNYを参照。組換えは2つのポリヌクレオチド間の遺伝情報交換のプロセスを意味する。本開示の目的にとって、相同組換えHRは、例えば、細胞中の二本鎖切断の修復中に起こるかかる交換の特別な型を意味する。このプロセスはヌクレオチド配列相同性を必要とし、ドナー分子を標的分子すなわち、二本鎖切断を受けた分子のテンプレート修復に使用し、ドナーから標的分子への遺伝情報の伝達を生じるので、非交叉型遺伝子変換または短路遺伝子変換として様々な呼び方で知られている。いずれの理論にも拘束されることなく、かかる伝達は、切断標的とドナーとの間に生じるヘテロ二本鎖DNAのミスマッチ修正、および/またはドナーを用いて標的の部分になる遺伝情報を再合成する合成依存鎖アニーリングおよび/または関連するプロセスに関わりうる。かかる特殊化HRはしばしば標的分子の配列の改変をもたらし、その結果、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に組み込まれる。切断はDNA分子の共有結合主鎖の切断を意味する。切断は様々な方法により開始することができ、それには、限定されるものでないが、リン酸ジエステル結合の酵素または化学加水分解が含まれる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は2つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こりうる。DNA切断は平滑末端、または、スタッガー型末端を生成しうる。ある特定の実施形態においては、融合ポリペプチドを用いて標的化した二本鎖DNAを切断する。切断ドメインはDNA切断の触媒活性を持つ1以上のポリペプチド配列を含む。切断ドメインは単一ポリペプチド鎖中に含有されてもよく、または切断活性は2つまたはそれ以上のポリペプチドの会合から得てもよい。クロマチンは細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは核酸、主にDNA、ならびに、タンパク質ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質が含まれるを含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ここで、ヌクレオソームコアは、ヒストンH2A、H2B、H3およびH4をそれぞれ2つ含む八量体と会合したおよそ150塩基対のDNAを含み;生物に応じて可変の長さであるリンカーDNAがヌクレオソームコア間に伸長する。ヒストンH1の1分子が一般にリンカーDNAと会合する。本発明の目的に対して、用語クロマチンは、原核生物および真核生物両方の全ての型の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンは染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。染色体は細胞ゲノムの全てまたは一部分を含むクロマチン複合体である。細胞ゲノムは、その核型細胞ゲノムを含む全染色体のコレクションにより特徴付けられることが多い。細胞ゲノムは1以上の染色体を含みうる。アクセス可能な領域は、核酸に存在する標的部位がその標的部位を認識する外因性分子により結合されうる細胞クロマチンの部位である。いずれの理論にも拘束されることなく、アクセス可能な領域はヌクレオソーム構造中に詰め込まれていない領域であると考えられる。アクセス可能な領域の明確な構造は化学および酵素プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対する感受性により検知しうることが多い。標的部位または標的配列は、結合のために十分な条件が与えられれば、結合分子が結合しうる核酸の部分を規定する核酸配列である。例えば、配列5GAATTC3は、EcoRI制限エンドヌクレアーゼに対する標的部位である。外因性分子は通常、細胞中に存在しないが、1以上の遺伝的、生化学的または他の方法により細胞中に導入することができる分子である。細胞中の通常の存在は、細胞の特別な発生段階および環境条件について決定される。従って、例えば、筋肉の胚発生中にだけ存在する分子は成人筋肉細胞については外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は熱ショックを受けてない細胞については外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子または通常に機能する内因性分子の機能不全バージョンを含みうる。外因性分子は、とりわけ、例えば、コンビナトリアル化学プロセスにより作製される小分子、または、高分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の修飾された誘導体、または1以上の上記分子を含む複合体であってもよい。核酸は、DNAおよびRNAを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく;直鎖、分枝鎖または環状鎖であってもよく;いずれの長さであってもよい。核酸は二本鎖、ならびに三本鎖を形成する核酸を形成できるものを含む。例えば、米国特許第5176996号および第5422251号を参照されたい。タンパク質は、限定されるものでないが、DNA結合タンパク質、転写因子、クロマチン再造形因子、メチル化DNA結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼおよびヘリカーゼを含む。外因性分子は内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドまたはエピソーム、または細胞に通常存在しない染色体であってもよい。外因性分子を細胞中に導入する方法は当業者に公知であり、限定されるものでないが、脂質が介在する伝達すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、リン酸カルシウム共沈降、DEAEデキストランが介在する伝達およびウイルスベクターが介在する伝達を含む。対照的に、内因性分子は、特別な細胞中に特別な発生段階において特別な環境条件下に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の小器官のゲノム、または天然エピソームの核酸を含みうる。さらなる内因性分子はタンパク質、例えば、転写因子および酵素を含みうる。融合分子は、2以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結されている。サブユニット分子は同じ化学型の分子であってもよく、または異なる化学型の分子であってもよい。第1の型の融合分子の例は、限定されるものでないが、融合タンパク質例えば、TALエフェクター配列DNA結合ドメインと切断ドメインの間の融合体および融合核酸例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸を含む。第2の型の融合分子の例は、限定されるものでないが、三本鎖を形成する核酸とポリペプチドの間の融合体、ならびに副溝バインダーと核酸の間の融合体を含む。細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達からまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達から生じうるのであって、後者の場合、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳され、そして融合タンパク質が作製される。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションも細胞中のタンパク質の発現に関わりうる。細胞へポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達する方法は本開示の随所に記載されている。本開示の目的にとって、遺伝子は、遺伝子産物下記参照をコードするDNA領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全DNA領域を含むものであって、かかる調節配列がコード配列および/または転写される配列に隣接するかどうかに関わらない。従って、遺伝子は、必ずしも限定されるものでないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域を含む。遺伝子発現は遺伝子に含有される情報の遺伝子産物への変換を意味する。遺伝子産物は遺伝子の直接転写産物例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造RNAまたはRNAの他の型またはmRNAの翻訳により産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物はまた、プロセス、例えば、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集により修飾されたRNA、および例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化により修飾されたタンパク質も含む。遺伝子発現のモジュレーションは遺伝子の活性の変化を意味する。発現のモジュレーションは、限定されるものでないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含みうる。真核細胞は、限定されるものでないが、真菌細胞例えば、酵母、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む。目的の領域は、例えば、外因性分子との結合が所望される遺伝子内のもしくは隣接する遺伝子または非コード配列など細胞クロマチンのいずれかの領域である。結合は標的化DNA切断および/または標的化組換えを目的とするものであってもよい。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、小器官ゲノム例えば、ミトコンドリア、葉緑体、または感染性ウイルスのゲノムに存在しうる。目的の領域は、遺伝子のコード領域内に、転写される非コード領域、例えば、リーダー配列、トレイラー配列またはイントロン内に、またはコード領域の上流または下流の非転写領域内に存在しうる。目的の領域は単一ヌクレオチド対のように小さくても、または長さで2000ヌクレオチド対まで、いずれの内在値のヌクレオチド対であってもよい。用語操作的連結および操作的に連結されたまたは操作可能に連結されたは、2つ以上の成分例えば、配列エレメントの並置への言及と互換的に用いられ、ここで、前記並置においては、両方の成分が通常に機能しかつ少なくとも1つの成分が少なくとも1つの他の成分に作用する機能に介在しうる可能性を許容するように、これらの成分は配置される。例示として、プロモーターなどの転写調節配列は、もし転写調節配列が、1以上の転写調節因子の存在または非存在に応答して、コード配列の転写レベルを制御すれば、コード配列と操作的に連結されている。転写調節配列は一般にコード配列とincisで操作的に連結されるが、直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは隣接していないが、コード配列と操作的に連結された転写調節配列である。融合ポリペプチドについて、用語操作的に連結されたは、成分のそれぞれが他の成分と連結して、もし連結されていなくてもそれが果たすのと同じ機能を実行する事実を意味しうる。例えば、TALエフェクターDNA結合ドメインが切断ドメインと融合している融合ポリペプチドについて、もし融合ポリペプチドにおいて、TALエフェクターDNA結合ドメイン部分がその標的部位および/またはその結合部位と結合できる一方、切断ドメインが標的部位の近くでDNAを切断できれば、TALエフェクターDNA結合ドメインと切断ドメインは操作的に連結されている。タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の機能性断片は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一でないが、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能性断片は、対応する未変性分子より多く、より少なく、または同じ数の塩基を保有してもよく、および/または1以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有してもよい。核酸の機能例えば、コーディング機能、他の核酸とハイブリダイズする能力を確認する方法は当技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定する方法も周知である。例えば、ポリペプチドのDNA結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイにより決定することができる。DNA切断はゲル電気泳動により試験することができる。Ausubeletal前掲を参照されたい。他のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは相補性、遺伝および生化学の両方により決定することができる。例えば、FieldsetalNature340245246;米国特許第5585245号およびPCTWO9844350を参照されたい。標的部位開示した方法および組成物は切断ドメインとTALエフェクターDNA結合ドメインを含んで成る融合タンパク質を含むものであって、ここで、RVDは細胞クロマチン中の配列例えば、標的部位または結合部位との結合により、その配列の近郊に対する切断ドメインまたは切断ハーフドメインの活動を指示し、この故に、標的配列の近郊における切断を誘導する。本開示の随所に説明したように、TAL結合ドメイン内の特別なRVDは所望の配列と実質的に結合するように遺伝子操作で作ることができる。従って、切断または組換えが所望される配列を含有する目的の領域を特定した後に、1以上のTALエフェクターDNA結合ドメインを目的の領域における1以上の配列と結合するように遺伝子操作で作ることができる。細胞中にTALエフェクターDNA結合ドメインと切断ドメインを含んで成る融合タンパク質が発現すると、目的の領域において切断が行われる。TALエフェクターDNA結合ドメインによる結合のための細胞クロマチン中の配列例えば、標的部位の選択は、当業者に公知の方法により達成することができる。例えば、単純なヌクレオチド配列の視覚検査を標的部位の選択に利用することができる。従って、標的部位選択のためのいずれの手法でも請求項に記載の方法で用いることができる。配列特異的エンドヌクレアーゼ配列特異的エンドヌクレアーゼおよび配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする組換え核酸を本明細書で提供する。配列特異的エンドヌクレアーゼはTALエフェクターDNA結合ドメインとエンドヌクレアーゼドメインを含みうる。従って、配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ヌクレアーゼ由来のヌクレオチド配列と連結した配列特異的TALエフェクター由来のヌクレオチド配列を含みうる。TALエフェクターは、病原体により植物細胞中に注入された植物病原性細菌のタンパク質であり、これらは核へ移動して転写因子として機能し、特定の植物遺伝子を活性化する。TALエフェクターの一次アミノ酸配列は、それが結合するヌクレオチド配列を指令する。TALアミノ酸配列と標的結合部位の間の関係は単純であるので、TALエフェクターの標的部位を予測することができ、そしてまた、特別なヌクレオチド配列との結合を目的とするTALエフェクターを遺伝子操作で作製することができる。TALエフェクターをコードする核酸配列に融合されるのは、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの一部分をコードする配列であって、典型的には、III型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、FokI由来の非特異的切断ドメインであるKimetalProcNatlAcadSciUSA9311561160。他の有用なエンドヌクレアーゼには、例えば、HhaI、HindlII、NotI、BbvC1、EcoRI、BglI、およびAlwIを含まれうる。いくつかのエンドヌクレアーゼ例えば、FokIが二量体としてだけ機能する事実は、TALエフェクターの標的特異性を向上するのに利用することができる。例えば、いくつかの事例では、各FokIモノマーを色々なDNA標的配列を認識するTALエフェクター配列と融合して、2つの認識部位が密接したときだけ不活性モノマーが一緒になって機能性酵素を作製する。ヌクレアーゼを活性化するためにDNA結合を必要とすることにより、高度に部位特異的な制限酵素酵素を作製することができる。本明細書に記載した配列特異的TALエフェクターエンドヌクレアーゼは、細胞中に存在する予め選択した標的ヌクレオチド配列内の特別な配列を認識することができる。従って、いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列をヌクレアーゼ認識部位について走査し、特別なヌクレアーゼをこの標的配列に基づいて選択することができる。他の事例では、TALエフェクターエンドヌクレアーゼが特別な細胞配列を標的化するように遺伝子操作で作ることができる。所望のTALエフェクターエンドヌクレアーゼを任意の好適な発現ベクター中に挿入することおよび1以上の発現制御配列と連結することができる。例えば、ヌクレアーゼコード配列を、形質転換する植物の種におけるエンドヌクレアーゼの構成的発現を起こしうるプロモーター配列と操作可能に連結することができる。あるいは、エンドヌクレアーゼコード配列を、条件付き発現例えば、ある特定の栄養条件下での発現をもたらしうるプロモーター配列と操作可能に連結することができる。切断ドメイン本明細書に開示した融合タンパク質の切断ドメインはいずれかのエンドまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを導入することができる例示のエンドヌクレアーゼは、限定されるものでないが、制限酵素エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含む。例えば、20022003CatalogueNewEnglandBiolabsBeverlyMassandBelfortetalNucleicAcidsRes2533793388を参照されたい。DNAを切断するさらなる酵素は公知である例えば、S1ヌクレアーゼ;緑豆ヌクレアーゼ;膵臓DNaseI;小球菌ヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ;LinnetalNucleasesColdSpringHarborLaboratoryPress1993も参照のこと。1以上のこれらの酵素またはその機能性断片を切断ドメインの供給源として用いることができる。制限エンドヌクレアーゼ制限酵素は多くの種に存在し、DNAと認識部位において配列特異的に結合し、DNAを結合部位もしくはその近くにて切断することができる。ある特定の制限酵素例えば、IIS型はDNAを認識部位から離れた部位で切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、IIS型酵素FokIは1つの鎖上のその認識部位から9ヌクレオチド、および他の鎖上のその認識部位から13ヌクレオチドにおいて、DNAの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第5356802号;第5436150号および第5487994号;ならびにLietalProcNatlAcadSciUSA8942754279;LietalProcNatlAcadSciUSA9027642768;KimetalProcNatlAcadSciUSA91883887;KimetalJBiolChem2693197831982を参照されたい。従って、一実施形態において、融合タンパク質は少なくとも1つのIIS型制限酵素由来の切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。切断ドメインが結合ドメインから分離可能なIIS型制限酵素の例はFokIである。この特別な酵素は二量体として活性がある。BitinaiteetalProcNatlAcadSciUSA951057010575。従って、本開示の目的にとって、開示したタンパク質に用いられるFokI酵素の部分は1つの切断ハーフドメインと考えられる。従って、TALFokI融合体を用いる細胞配列の標的化二本鎖切断および/または標的化置換のために、それぞれFokI切断ハーフドメインを含む2つの融合タンパク質を用いて触媒活性のある切断ドメインを再構築することができる。TALFokI融合体を用いる標的化切断および標的化配列改変に対するパラメーターは本開示の随所に提供される。切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化例えば、二量体化して機能性切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質のいずれかの部分でありうる。さらなる制限酵素も分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらも本開示により期待される。例えば、RobertsetalNucleicAcidsRes31418420を参照されたい。IIS型制限酵素の例には、AarI、BsrBI、SspD5I、AceIII、BsrDI、Sth132I、AciI、BstF5I、StsI、AloI、BtrI、TspDTI、BaeI、BtsI、TspGWI、Bbr7I、CdiI、Tth111II、BbvI、CjePI、UbaPI、BbvII、DrdII、BsaI、BbvCI、EciI、BsmBI、BccI、Eco31I、Bce83I、Eco57I、BceAI、Eco57MI、BcefI、Esp3I、BcgI、FauI、BciVI、FinI、BfiI、FokI、BinI、GdiII、BmgI、GsuI、Bpu10I、HgaI、BsaXI、Hin4II、BsbI、HphI、BscAI、Ksp632I、BscGI、MboII、BseRI、MlyI、BseYI、MmeI、BsiI、MnlI、BsmI、Pfl1108I、BsmAI、PleI、BsmFI、PpiI、Bsp24I、PsrI、BspGI、RleAI、BspMI、SapI、BspNCI、SfaNI、BsrI、およびSimIが含まれる。TALエフェクターDNAドメイン切断ドメイン融合体融合タンパク質および同タンパク質をコードするポリヌクレオチドを設計および構築する方法は当業者に公知である。例えば、TALタンパク質および同タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む融合タンパク質を設計および構築する方法は米国特許第6453242号および第6534261号に記載されている。ある特定の実施形態においては、かかる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを構築する。これらのポリヌクレオチドをベクター中に挿入してもよく、またそのベクターを細胞中に導入してもよいポリヌクレオチドを細胞中に導入するベクターおよび方法に関するさらなる開示は以下を参照されたい。本明細書に記載した方法の特定の実施形態においては、融合タンパク質はAvrXa7由来のTALエフェクター結合ドメインとFokI制限酵素由来の切断ハーフドメインを含み、2つのかかる融合タンパク質は一細胞において発現させる。2つの融合タンパク質の一細胞中の発現は、2つのタンパク質の細胞への送達;1つのタンパク質とタンパク質の1つをコードする1つの核酸の細胞への送達;タンパク質の1つをそれぞれコードする2つの核酸の細胞への送達;または両方のタンパク質をコードする単一核酸の細胞への送達によりもたらされる。さらなる実施形態において、融合タンパク質は2つの切断ハーフドメインと1つのTALAvrXa7結合ドメインを含む単一のポリペプチド鎖を含むものである。この事例では、単一融合タンパク質が1つの細胞に発現され、そして理論に拘束されることなく、切断ハーフドメインの分子内二量体の形成の結果としてDNAを切断すると思われる。特定の実施形態においては、融合タンパク質例えば、TALFokI融合体の成分が切断ドメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、そしてTALドメインがカルボキシ末端に最も近くなるように配置する。この配置によって、ヌクレアーゼ融合に用いられる天然TALまたは新しく遺伝子操作で作ったTALのDNA結合特異性を測定することができる転写活性化因子活性の保持という確かな利点が得られ、かつこの配向はスペーサー長さの柔軟性を与えうる。標的化切断の方法開示した方法および組成物を用いて、DNAを細胞クロマチンの目的の領域にて例えば、ゲノムにおける、例えば、突然変異体または野生型の遺伝子における所望のまたは予定部位にて切断することができる。かかる標的化DNA切断のためには、TAL結合ドメインを予定切断部位にてまたは近くで標的結合部位と結合するように遺伝子操作で作り、そしてその遺伝子操作で作ったTAL結合ドメインと切断ドメインを含む融合タンパク質を細胞に発現させる。融合タンパク質のTALRVD部分が標的部位と結合すると、DNAは標的部位近くで切断ドメインにより切断される。TAL結合ドメイン切断ドメイン融合ポリペプチドを用いる標的化切断のために、結合部位は切断部位、または切断部位から1、2、3、4、5、6、10、25、50またはそれ以上のヌクレオチドまたは1~50の任意の内在値のヌクレオチドの近端を包含しうる。切断部位に対する結合部位の正確な位置は特別な切断ドメインおよびいずれかのリンカーの長さに依存しうる。従って、本明細書に記載した方法は、遺伝子操作で作った切断ドメインと融合したTALエフェクターDNA結合ドメインを使用することができる。これらの事例においては、切断が所望されるところかまたは近くで標的配列と結合するように結合ドメインを遺伝子操作で作製する。融合タンパク質または上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入する。いったん細胞に導入されるか、または発現されると、融合タンパク質は標的配列と結合し、標的配列にてまたは近くで切断する。正確な切断部位は、切断ドメインの性質および/または結合と切断ドメインの間のリンカー配列の存在および/または性質に依存する。最適な切断のレベルはまた、2つの融合タンパク質の結合部位間の距離SmithetalNucleicAcidsRes2833613369;BibikovaetalMolCellBiol21289297と各融合タンパク質におけるZCリンカーの長さの両方に依存しうる。特定の実施形態においては、切断ドメインは2つの切断ハーフドメインを含み、両方とも、結合ドメイン、第1切断ハーフドメインおよび第2切断ハーフドメインを含んで成る単一ポリペプチドの一部分である。切断ハーフドメインは、DNAを切断する機能を有する限り、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有してもよい。切断ハーフドメインはまた、別々の分子で提供してもよい。例えば、それぞれのポリペプチドが結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む2つの融合ポリペプチドを1つの細胞中に導入することができる。切断ハーフドメインは、DNAを切断する機能を有する限り、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有してもよい。さらに、結合ドメインは標的配列と結合するが、典型的には、前記結合ドメインは融合ポリペプチドと結合すると、2つの切断ハーフドメインがお互いに対して例えば、ハーフドメインの二量体化により切断ドメインの再構築を可能にする空間配位を提示し、それによりハーフドメインが機能性切断ドメインを形成するようにお互いに位置し、目的の領域における細胞クロマチンの切断をもたらすやり方で配置される。一般に、再構築された切断ドメインによる切断は2つの標的配列間に置かれた部位にて起こる。タンパク質の1つまたは両方を標的部位と結合するように遺伝子操作で作ることができる。2つの融合タンパク質は目的の領域において、同じかまたは反対の極性で結合することができ、それらの結合部位すなわち、標的部位は任意の数のヌクレオチド、例えば、0~200ヌクレオチドまたは任意のそれらの内在値だけ離れていてもよい。ある特定の実施形態において、2つの融合タンパク質との結合部位は、それぞれ、TALエフェクター結合ドメインと切断ハーフドメインを含み、他の結合部位に最も近い結合部位の端から測定して、5~18ヌクレオチド離れて、例えば、5~8ヌクレオチド離れて、または15~18ヌクレオチド離れて、または6ヌクレオチド離れて、または16ヌクレオチド離れて位置してもよく、切断は結合部位の間で起こる。DNAが切断される部位は、一般に2つの融合タンパク質との結合部位の間に存在する。DNAの二本鎖切断はしばしば2つの一本鎖切断、またはニック、1、2、3、4、5、6またはそれ以上のヌクレオチドによるオフセットoffsetから生じる例えば、未変性のFokIによる二本鎖DNAの切断は4ヌクレオチドの一本鎖切断オフセットから生じる。従って、切断は必ずしも各DNA鎖上の正確に反対の部位にて起こらない。さらに、融合タンパク質の構造と標的部位間の距離が、切断が単一ヌクレオチド対に隣接して起こるかどうか、または切断がいくつかの部位で起こるかどうかに影響をあたえうる。しかし、標的化組換えおよび標的化突然変異誘発下記参照を含む多くの応用にとって、一般に、ヌクレオチドのある範囲内の切断で十分であり、特別な塩基対間の切断を必要としない。上記のように、融合タンパク質はポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドとして導入することができる。例えば、上記ポリペプチドの1つをコードする配列をそれぞれ含む2つのポリヌクレオチドを細胞中に導入してもよく、ポリペプチドが発現されてそれぞれがその標的配列と結合すると、切断が標的配列またはその近くで起こる。あるいは、両方の融合ポリペプチドをコードする配列を含む単一ポリヌクレオチドを細胞中に導入する。ポリヌクレオチドはDNA、RNAまたはいずれかの修飾された型または類似体またはDNAおよび/もしくはRNAであってもよい。切断特異性を増強するために、本明細書に記載の方法にさらなる組成物を使ってもよい。例えば、単一の切断ハーフドメインは限られた二本鎖切断活性を表しうる。2つの融合タンパク質を細胞中に導入する方法において、どちらのタンパク質もおよそ9ヌクレオチド標的部位を規定する。18ヌクレオチドの集合標的配列はおそらく哺乳動物のゲノムにおいてユニークであるが、いずれの所与の9ヌクレオチド標的部位もヒトゲノムにおいては平均でおよそ23000回存在する。従って、単一のハーフドメインの部位特異的結合による非特異的切断が起こりうる。従って、本明細書に記載の方法は、2つの融合タンパク質と共に細胞において発現される切断ハーフドメイン、例えば、FokIまたはそれをコードする核酸のドミナントネガティブな突然変異体の使用を意図している。ドミナントネガティブな突然変異体は二量体化は可能であるが、切断はできない、そしてまた、二量体化されるハーフドメインの切断活性もブロックする。融合タンパク質に対してモル過剰のドミナントネガティブな突然変異体を与えることにより、両方の融合タンパク質が結合した領域だけが、二量体化および切断が起こるのに十分な高い機能性の切断ハーフドメインの局所濃度を有しうる。2つの融合タンパク質のうちの1つだけ結合した部位では、その切断ハーフドメインはドミナントネガティブな突然変異体ハーフドメインと二量体を形成し、望ましくない、非特異的切断は起こらない。FokI切断ハーフドメイン中の3つの触媒アミノ酸残基は特定されている:Asp450、Asp467およびLys469BitinaiteetalProcNatlAcadSciUSA951057010575。従って、これらの残基の1つにおける1以上の突然変異を用いて、ドミナントネガティブ突然変異を作製することができる。さらに、他のIIS型エンドヌクレアーゼの多数の触媒活性アミノ酸残基が公知であり、および/または、例えば、FokI配列とのアラインメントによりおよび/または触媒活性に対する突然変異体の作製と試験により確認することができる。本明細書に記載した融合分子だけでなく、選択したゲノム配列の標的化置換はまた、置換またはドナー配列の導入を必要とする。融合タンパク質の発現の前に、と同時に、またはその後に、ドナー配列を細胞中に導入することができる。ドナーポリヌクレオチドはゲノム配列と十分な相同性を有し、それと相同性を有するゲノム配列との相同組換えを支援する。ドナーとゲノム配列の間のおよそ25、50、100または200ヌクレオチドまたはそれ以上または10~200ヌクレオチドの内在値、またはそれ以上の配列相同性はそれらの間の相同組換えを支援しうる。ドナー配列は10~5000ヌクレオチドまたはそれらの間のヌクレオチドの内在値またはそれ以上の長さの範囲であってもよい。ドナー配列は、典型的には、それが置き換わるゲノム配列と同一でないことは容易にわかるであろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドの配列は、相同組換えを支援するために十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に対して1以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位または再配置を含有しうる。あるいは、ドナー配列は2つの相同性領域に隣接した非相同性配列を含有しうる。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン中の目的の領域と相同性でない配列を含有するベクター分子を含んでもよい。一般に、ドナー配列の相同性領域は、組換えを所望するゲノム配列と少なくとも50配列同一性を有しうる。ある特定の実施形態においては、60、70、80、90、95、98、99、または999配列同一性が存在する。1~100のいずれかの値の配列同一性が、ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて存在しうる。ドナー分子は、細胞クロマチンに相同な非連続領域をいくつか含有しうる。例えば、目的の領域に通常存在しない配列の標的化挿入については、前記配列がドナー核酸分子中にかつ目的の領域における配列に対する相同性の領域に隣接して存在してもよい。ドナー配列の挿入の首尾を確認するアッセイ例えば、ハイブリダイゼーション、PCR、制限酵素消化を単純化するために、ドナー配列中にゲノム配列と比較してある特定の配列差異が存在してもよい。好ましくは、もしコード領域に位置しても、かかるヌクレオチド配列差異はアミノ酸配列を変化しないか、またはサイレントなアミノ酸変化すなわち、そのタンパク質の構造または機能に影響を与えない変化を生じるであろう。ドナーポリヌクレオチドは、場合によっては、相同組換えにより細胞中に導入されるドナー配列の切断を防止するために、目的の領域中にTALエフェクタードメイン結合または認識部位に対応する配列の変化を有してもよい。ドナーポリヌクレオチドはDNAまたはRNA、一本鎖または二本鎖であってもよく、細胞中に直鎖または環状で導入してもよい。もし直鎖で導入すれば、ドナー配列の末端を、当業者に公知の方法により例えば、末端核酸加水分解から保護してもよい。例えば、1以上のジデオキシヌクレオチド塩基を直鎖分子の3末端に加える、および/または自己相補性オリゴヌクレオチドを1つのまたは両方の末端に連結してもよい。例えば、ChangetalProcNatlAcadSciUSA8449594963NehlsetalScience272886889を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するさらなる方法には、限定されるものでないが、末端アミノ基の付加、および修飾ヌクレオチド間連鎖、例えば、ホスホロチオアート、ホスホロアミダイト、およびOメチルリボースまたはデオキシリボース残基などの使用が含まれる。ポリヌクレオチドは、さらなる配列、例えば、複製起点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子などを有するベクター分子の一部分として細胞中に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドを、裸の核酸として、リボソームまたはポロキサマーなどの薬剤と複合化した核酸として導入することができるし、またはウイルス例えば、アデノウイルス、AAVにより送達することができる。1つの理論に拘束されることなく、細胞配列中の二本鎖切断の存在は、前記切断に隣接するもしくは取り囲む領域と相同性を有する外因性DNA分子の存在と一体にして、ドナー分子から細胞例えば、ゲノムまたは染色体の配列中への配列情報の伝達により、すなわち、相同組換えのプロセスにより前記切断を修復する細胞機構を活性化すると思われる。本出願者の方法は、有利なことに、遺伝子操作で作られたTALの強力な標的化能力を切断ドメインまたは切断ハーフドメインと組み合わせて、組換えが所望されるゲノムの領域に、二本鎖切断を特異的に標的化する。染色体配列の改変については、所望の配列改変を行うのに十分なドナー配列がコピーされる限り、ドナーの全配列を染色体中にコピーする必要はない。特定の実施形態においては、相同染色体がドナーポリヌクレオチドの役割を果たす。従って、例えば、ヘテロ接合体における突然変異の修正は、一染色体上の突然変異配列と結合しかつ切断するが、相同染色体上の野生型配列を切断しない融合タンパク質を遺伝子操作で作製することにより達成することができる。突然変異を有する染色体上の二本鎖切断は相同性に基づく遺伝子変換プロセス、すなわち、相同染色体からの野生型配列を切断された染色体中にコピーして野生型配列の2コピーを修復するプロセスを刺激する。融合分子とドナーDNA分子を含む細胞における標的化組換えの効率のさらなる増加は、相同性駆動修復プロセスが最大限に活性である細胞周期のG2期における細胞の遮断により達成される。かかる停止はいくつかの方法で達成することができる。例えば、細胞を、例えば、細胞周期進行に影響を与えて細胞をG2期に停止させる薬物、化合物および/または小分子で処理してもよい。この型の分子の例には、限定されるものでないが、微小管重合に影響する化合物例えば、ビンブラスチン、ノコダゾール、タキソール、DNAと相互作用する化合物例えば、cis白金IIジアミンジクロリド、シスプラチン、ドキソルビシンおよび/またはDNA合成に影響する化合物例えば、チミジン、ヒドロキシウレア、Lミモシン、エトポシド、5フルオロウラシルが含まれる。組換え効率のさらなる増加は、クロマチン構造を改変してゲノムDNAを細胞の組換え機構にさらにアクセスし易くする、ヒストンデアセチラーゼHDACインヒビター例えば、酪酸ナトリウム、トリオスタチンAの使用により達成される。さらなる細胞周期停止の方法には、例えば、前記タンパク質をコードするcDNAの細胞中への導入による、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現を活性化する遺伝子操作で作られたZFPを細胞中に導入することによる、CDK細胞周期キナーゼの活性を阻害するタンパク質の過剰発現が含まれる。細胞周期停止はまた、例えば、RNAi方法例えば、米国特許第6506559号を用いることによりサイクリンおよびCDKの活性を阻害することにより、または細胞周期進行に関わる1以上の遺伝子、例えば、サイクリンおよび/またはCDK遺伝子の発現を抑制する遺伝子操作で作られたZFPを細胞中へ導入することにより達成される。例えば、米国特許第6534261号methodsforthesynthesisofengineeredTALproteinsforregulationofgeneexpression遺伝子発現の調節用の遺伝子操作したTALを合成する方法を参照されたい。相同組換えを促進する細胞因子をスクリーニングする方法相同組換えは、DNA末端の改変およびいくつかの細胞因子のタンパク質複合体への補充を必要とする多段プロセスであるので、ドナーDNAおよびTAL切断ドメイン融合体をコードするベクターと共に、1以上の外因性因子を加えることにより標的化相同組換えを促進することができる。かかる1以上の因子を特定する方法の例は、マイクロアレイ例えば、AffymetrixGeneChipRTMアレイを用いて色々な細胞のmRNA発現パターンを比較する遺伝子発現の分析を使用する。例えば、ドナーDNAおよびTAL切断ドメイン融合体の存在のもとで、助けを受けないでまたは遺伝子修正のレベルを増加することが公知の条件下で、二本鎖切断で駆動される相同組換えを刺激するより高い能力を示す細胞をかかる能力を欠く細胞と比較して、それらの遺伝子発現パターンを分析することができる。それにより、相同組換えのレベルの増加と直接相関する方式でアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる遺伝子を特定して、いくつもの発現ベクターのいずれかにクローニングすることができる。これらの発現構築物をTAL切断ドメイン融合体およびドナー構築物と共に同時トランスフェクトして、高効率の相同組換えを達成する方法を改善することができる。発現ベクター1以上の融合タンパク質をコードする核酸をベクターにクローニングし、原核生物または真核細胞を形質転換して複製および/または発現させることができる。ベクターは原核生物ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクター、昆虫ベクター、または真核生物ベクターであってもよい。TALエフェクター結合ドメインをコードする核酸はまた、発現ベクターにクローニングし、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞に投与することができる。クローンした遺伝子または核酸の発現を得るために、融合タンパク質をコードする配列を、典型的には、転写を指令するプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングする。プロモーターは、転写を開始しかつモジュレートするRNAポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識と結合に関わる。コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、典型的には、ポリペプチドの翻訳読み枠の翻訳開始部位を、プロモーターの下流1~約50ヌクレオチドの間に配置する必要がある。しかし、プロモーターを、翻訳開始部位の上流約5000ヌクレオチド、または転写開始部位の上流約2000ヌクレオチドに配置してもよい。プロモーターは、典型的には、少なくともコア基礎プロモーターを含む。プロモーターはまた、少なくとも1つの制御エレメント、例えば、上流エレメントを含んでもよい。かかるエレメントには、上流活性化領域UARおよび、任意に、ポリヌクレオチドの転写に影響する他のDNA配列、例えば、合成上流エレメントが含まれる。含むべきプロモーターの選択は、限定されるものでないが、効率、選択可能性、誘導可能性、所望の発現レベル、および細胞または組織特異性を含むいくつかの因子に依存する。例えば、わずかにまたは主に特別な組織、器官、および細胞型に、それぞれ転写を与える組織、器官および細胞に特異的プロモーターを用いることができる。いくつかの実施形態において、植物組織、例えば、幹、実質、基本分裂組織、維管束、形成層、師部、皮質、茎頂分裂組織、側枝分裂組織、根頂成長組織、側根成長組織、葉原基、葉肉、または葉表皮に特異的なプロモーターは好適な調節領域でありうる。いくつかの実施形態において、種子に本質的に特異的であるプロモーター種子選好性プロモーターが有用でありうる。種子特異的プロモーターは、種子発生過程で胚乳および子葉組織中の操作可能に連結された核酸の転写を促進する。あるいは、構成的プロモーターは植物のほとんどまたは全組織において、植物発生の間、操作可能に連結された核酸の転写を促進することができる。他のクラスのプロモーターには、限定されるものでないが、誘導プロモーター、例えば、化学薬品、発生刺激、または環境刺激などの外界刺激に応答して転写を与えるプロモーターが含まれる。基本プロモーターは転写開始に必要な転写複合体の構築に必要な最小限の配列である。基本プロモーターはしばしば、転写開始部位から上流の約15~約35ヌクレオチドの間に位置しうるTATAボックスエレメントを含む。基本プロモーターはまた、転写開始部位から上流の約40~約200ヌクレオチド、典型的には、約60~約120ヌクレオチドの間に位置しうるCCAATボックスエレメント典型的には配列CCAATおよび/またはGGGCG配列を含みうる。本明細書に提供される核酸構築物に含まれうるプロモーターの例は、限定されるものでないが、カリフラワーモザイクウイルスCaMV35S転写開始領域、AgrobacteriumtumefaciensのTDNA由来の1または2プロモーター、BuskPlantJ1112851295に記載のトウモロコシ葉特異的遺伝子由来のプロモーター、トウモロコシおよび他の種由来のknlに関係する遺伝子、ならびに、様々な植物遺伝子、例えば、トウモロコシユビキチン1プロモーター由来の転写開始領域を含む。5非翻訳領域UTRは転写されるが翻訳されず、転写物の出発部位と翻訳開始コドンとの間に存在し、1ヌクレオチドを含んでもよい。3UTRは翻訳終結コドンと転写物末端の間に位置しうる。UTRは特別な機能、例えば、mRNAメッセージ安定性の増強または翻訳減衰を有しうる。3UTRの例には、限定されるものでないが、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が含まれる。コード領域の3末端のポリアデニル化領域はまた、コード配列と操作可能に連結されうる。ポリアデニル化領域は、様々な他の植物遺伝子から、またはアグロバクテリアTDNA由来の天然遺伝子から誘導することができる。本明細書に記載のベクターはまた、例えば、複製起点および/またはスカフォールド付着領域SARを含んでもよい。さらに、発現ベクターは発現したポリペプチドの操作または検出例えば、精製または局在化を促進するように設計したタグ配列を含んでもよい。タグ配列、例えば、緑色蛍光タンパク質GFP、グルタチオンSトランスフェラーゼGST、ポリヒスチジン、cmyc、赤血球凝集素、またはFlagタグKodakNewHavenCT配列は、典型的には、コードされたポリペプチドとの融合体として発現される。かかるタグは、カルボキシルまたはアミノ末端を含むポリペプチド内の随所に挿入することができる。1以上の調節領域、例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、および誘導性エレメントが組換えポリヌクレオチド中に存在しうることは理解されよう。組換え核酸構築物は、細胞例えば、植物細胞または動物細胞の形質転換に好適なベクターに挿入されたポリヌクレオチド配列を含みうる。組換えベクターは、例えば、標準組換えDNA技法を用いて作ることができる例えば、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual2ndedColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNYを参照。好適な細菌および真核生物のプロモーターは当技術分野で周知であり、例えば、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual;KrieglerGeneTransferandExpressionALaboratoryManual;およびCurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubeletal前掲に記載されている。ZFPを発現する細菌発現系は、例えば、大腸菌、バシラス菌種、およびサルモネラ菌Palvaら、Gene22:2292351983で利用することができる。かかる発現系は市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞に対する真核生物の発現系は、当業者に公知であり、市販もされている。TAL切断ドメイン融合タンパク質をコードする核酸の発現を指令するために用いるプロモーターは特別な応用に応じて決定される。例えば、TAL切断ドメイン融合タンパク質を発現および精製するためには、典型的には、強い構成的プロモーターを用いる。対照的に、TAL切断ドメイン融合タンパク質をinvivoで遺伝子調節のために投与する場合には、TAL切断ドメイン融合タンパク質の特別な使用に応じて、構成的または誘導プロモーターを用いる。さらに、TAL切断ドメイン融合タンパク質を投与するための好ましいプロモーターは弱いプロモーター、例えば、HSVTKまたは類似の活性を有するプロモーターであってもよい。プロモーターは典型的には、また、トランス活性化に関わるエレメント、例えば、応答エレメント、Gal4応答エレメント、lacリプレッサー応答エレメント、および小分子制御系、例えば、tet調節系およびRU486系を含んでもよい例えば、GossenBujardPNAS895547OliginoetalGeneTher5491496WangetalGeneTher4432441;NeeringetalBlood8811471155;およびRendahletalNatBiotechnol16757761を参照されたい。MNDU3プロモーターも用いてもよく、CD34造血性幹細胞において選好的に活性がある。発現ベクターは、プロモーターに加えて、典型的には、原核生物または真核生物の宿主細胞における核酸の発現に必要なさらなる全てのエレメントを含有する転写ユニットまたは発現カセットを含む。典型的な発現カセットは、従って、TAL切断ドメイン融合タンパク質および、例えば、転写物のポリアデニル化、転写の終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結のために必要なシグナルをコードする核酸配列と操作可能に連結されたプロモーターを含有する。前記カセットのさらなるエレメントは、例えば、エンハンサーおよび異種スプライシングシグナルを含みうる。細胞中への遺伝情報を輸送するために用いられる特別な発現ベクターは、TAL切断ドメイン融合タンパク質の意図する使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現について選択される下記の発現ベクターを参照されたい。標準の細菌発現ベクターは、プラスミド、例えば、pBR322basedプラスミド、pSKF、pET23D、および市販される融合発現系、例えば、GSTとLacZを含む。融合タンパク質の例はマルトース結合タンパク質MBPである。かかる融合タンパク質はTAL切断ドメイン融合タンパク質の精製に用いられる。エピトープタグ、例えば、cmycまたはFLAGを組換えタンパク質に加えて単離の好都合な方法を提供し、発現のモニタリングならびに細胞および細胞下の局所化のモニタリングをすることができる。真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクター、例えば、SV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびベクターエプスタインバーウイルス由来のベクターがしばしば、真核生物の発現ベクターに用いられる。他の真核生物のベクターの例には、pMSG、pAV009A、pMTO10A、pMAMneo5、バキュロウイルスpDSVE、ならびに、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが示された他のプロモーターの指令下でタンパク質の発現を可能にする他のベクターが含まれる。いくつかの発現系は安定してトランスフェクトされた細胞株を選択するためのマーカー、例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。例えば、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスベクターの指令下の、TAL切断ドメイン融合タンパク質をコードする配列を伴う昆虫細胞中のバキュロウイルスベクターを用いる、高収率発現系も好適である。発現ベクター中に典型的に含まれるエレメントはまた、大腸菌で機能するレプリコン、抗生物質耐性をコードして組換えプラスミドを保持する細菌の選択を可能にする遺伝子、および、組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非本質的領域中のユニークな制限部位を含む。標準のトランスフェクション方法を用いて、大量のタンパク質を発現する植物、細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞株が産生され、これらのタンパク質は標準技法を用いて精製される例えば、ColleyetalJBiolChem2641761917622GuidetoProteinPurificationinMethodsinEnzymologyvol182を参照。真核生物および原核生物の細胞の形質転換は、標準技法によって行われる例えば、MorrisonJBact132349351;ClarkCurtissCurtissMethodsinEnzymology101347362を参照。外来のヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入する周知の手順のいずれかを用いることができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波方法例えば、ソノポーレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび組込みの両方、ならびに、クローニングしたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝材料を宿主細胞中に導入する他の周知の方法のいずれか例えば、Sambrookら、前掲を参照の使用が含まれる。ただ、使用する特別な遺伝子工学の手順が、選択したタンパク質を発現することができる宿主細胞に少なくとも1つの遺伝子を首尾よく導入できることを必要とする。融合タンパク質をコードする核酸および細胞への送達通常のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を用いて、遺伝子操作で作ったTAL切断ドメイン融合タンパク質をコードする核酸を、動物細胞例えば、哺乳動物細胞および標的組織に導入することができる。かかる方法を用いて、TAL切断ドメイン融合タンパク質をコードする核酸を細胞にinvitroで投与することもできる。ある特定の実施形態においては、TAL切断ドメイン融合タンパク質をコードする核酸を、invivoまたはexvivoの遺伝子治療用に投与する。非ウイルスベクター送達系は、DNAプラスミド、裸の核酸、および送達ビヒクル、例えば、リポソームまたはポロキサマーと複合化した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、エピソームまたは細胞への送達後に組み込まれたゲノムを含む。遺伝子治療手順の総括については、AndersonScience256808813;NabelFelgnerTIBTECH11211217;MitaniCaskeyTIBTECH11162166;DillonTIBTECH11167175;MillerNature357455460;VanBruntBiotechnology611491154;VigneRestorativeNeurologyandNeuroscience83536;KremerPerricaudetBritishMedicalBulletin513144;HaddadaetalinCurrentTopicsinMicrobiologyandImmunologyDoerflerandBohm;およびYuetalGeneTherapy11326を参照されたい。遺伝子操作で作ったTAL切断ドメイン融合タンパク質をコードする核酸を非ウイルス送達する方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、裸のDNA、人工ビリオン、およびDNA摂取の薬物強化を含む。例えば、Sonitron2000系RichMarを用いるソノポレーションも核酸の送達に用いることができる。さらなる核酸送達系の例には、AmaxaBiosystemsCologneGermany、MaxcyteIncRockvilleMdが提供する系およびBTX分子送達系Holliston、Massが含まれる。遺伝子操作で作ったTAL切断ドメイン融合タンパク質をコードする核酸を送達する、RNAまたはDNAウイルスに基づく系の使用は、ウイルスを身体の特定の細胞に標的化しかつウイルス本体を核へ輸送する高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターを直接、患者に投与してもよくinvivo、またはそれらを用いて細胞を処置してinvitro、改変された細胞を患者に投与してもよいexvivo。TAL切断ドメイン融合タンパク質をコードする核酸を送達する通常のウイルスに基づく系には、限定されるものでないが、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが含まれる。宿主ゲノムにおける組込みはレトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法で可能であり、挿入したトランスジーンの長期発現をもたらすことが多い。さらに高い形質導入効率が多数の異なる細胞型および標的組織において観察されている。TAL切断ドメイン融合タンパク質の一過性発現が好ましい応用においては、アデノウイルスに基づく系を用いることができる。アデノウイルスに基づくベクターは多数の細胞型において非常に高い効率の形質導入が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは比較的簡単な系で大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルスAAVベクターを用いて細胞に標的核酸を、例えば、核酸およびペプチドのinvitro産生において、およびinvivoおよびexvivo遺伝子治療手順のために形質導入することができる例えば、WestetalVirology1603847;米国特許第4797368号;WO9324641;KotinHumanGeneTherapy5793801;MuzyczkaJClinInvest941351を参照されたい。組換えAAVベクターの構築は、米国特許第5173414号;TratschinetalMolCellBiol532513260;TratschinetalMolCellBiol420722081;HermonatMuzyczkaPNAS8164666470andSamulskietalJVirol63038223828を含むいくつもの刊行物に記載されている。組換え複製欠損アデノウイルスベクターAdは高力価にて産生していくつもの異なる細胞型に容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターを、トランスジーンがAdE1a、E1b、および/またはE3遺伝子と置き換わるように遺伝子操作し;引き続いて複製欠損ベクターをヒト293細胞に伝播し、欠失した遺伝子機能をintransで供給する。Adベクターはinvivoで非分裂性の分化した細胞、例えば、肝臓、腎臓および筋肉において見られるものを含む、複数タイプの組織に形質導入することができる。通常のAdベクターは大きい運搬能力を有する。臨床試験におけるAdベクターの使用例は、筋肉内注入による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法に関わったStermanetalHumGeneTher710839。臨床試験における遺伝子導入に対するアデノウイルスベクターのさらなる使用例は、RoseneckeretalInfection241510;StermanetalHumGeneTher9710831089;WelshetalHumGeneTher220518;AlvarezetalHumGeneTher5597613;TopfetalGeneTher5507513;StermanetalHumGeneTher710831089を含む。パッケージング細胞を用いて宿主細胞に感染できるウイルス粒子を形成する。かかる細胞はアデノウイルスをパッケージする293細胞、およびレトロウイルスをパッケージするpsi2細胞またはPA317細胞を含む。遺伝子治療に用いるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージするプロデューサー細胞株により作製される。ベクターは典型的には、パッケージングおよびもし応用可能であれば引き続いての宿主細胞中への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は発現すべきタンパク質をコードする発現カセットにより置き換えられる。欠けているウイルス機能はintransでパッケージング細胞により補給される。例えば、遺伝子治療に用いるAAVベクターは、典型的には、パッケージングと宿主ゲノム中への組込みに必要であるAAVゲノム由来の逆位の末端反復ITR配列だけを持つ。ウイルスDNAを、他のAAV遺伝子、すなわち、repおよびcapをコードするが、ITR配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージする。その細胞株もヘルパーとしてのアデノウイルスに感染させる。ヘルパーウイルスはAAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはITR配列を欠くので、有意な量はパッケージされない。アデノウイルによる汚染は、例えば、熱処理により低減することができるアデノウイルスはAAVより熱処理に対する感受性が高い。多くの遺伝子治療応用において、遺伝子治療ベクターは特別な組織型に対して高度の特異性で送達することが所望される。従って、リガンドをウイルス外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質として発現することにより、ウイルスベクターを所与の細胞型に対して特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和力を有するように選ばれる。例えば、HanetalProcNatlAcadSciUSA9297479751は、Moloneyマウス白血病ウイルスを、gp70と融合したヒトヘレグリンheregulinを発現するように改変して、この組換えウイルスをヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳癌細胞に感染させることができると報じている。この原理を、標的細胞が受容体を発現しかつウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞のペアーに拡張することができる。例えば、糸状ファージを遺伝子操作して、実質的にいずれかの選んだ細胞受容体と特異的な結合親和力を有する抗体断片例えば、FABまたはFvを提示させることができる。以上の記載は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。かかるベクターを、特定の標的細胞による摂取に好都合な特定の摂取配列を含有するように遺伝子操作で作製することができる。遺伝子治療ベクターを、個々の患者への投与により、典型的には、全身投与例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入、または、以下に記載の局所適用によりinvivo送達することができる。あるいは、ベクターを細胞exvivo、例えば、個々の患者または一般的なドナーの造血性幹細胞から外植した細胞例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織バイオプシーへ送達し、その後、通常、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞を患者中に再移植することができる。診断、研究のため、または遺伝子治療のためのexvivo細胞トランスフェクション例えば、トランスフェクトした細胞の宿主細胞中への再注入を介するは当業者に周知である。好ましい実施形態においては、細胞を主題の生物から単離し、ZFP核酸遺伝子またはcDNAを用いてトランスフェクトし、そして主題の生物例えば、患者中に再注入して戻す。exvivoトランスフェクションに好適な様々な細胞は当業者に周知であり例えば、FreshneyetalCultureofAnimalCellsAManualofBasicTechnique、ならびに、患者からの細胞の単離および培養方法の考察に対する前記文献に引用された言及を参照されたい。一実施形態においては、幹細胞を細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのexvivo手順に用いる。幹細胞を用いることの利点は、これらはinvitroで他の細胞型に分化できること、または、それらが骨髄において生着しうる哺乳動物例えば、細胞のドナー中に導入できることにある。サイトカイン、例えば、GMCSF、IFNγおよびTNFαを用いて、CD34細胞をinvitroで臨床的に重要な免疫細胞型に分化させる方法は公知であるInabaetalJExpMed17616931702を参照。幹細胞を形質導入および分化するために公知の方法を用いて単離する。例えば、欲しない細胞と結合する抗体、例えば、CD4およびCD8T細胞、CD45panB細胞、GR1顆粒球、およびlad分化した抗原提示細胞を用いて骨髄細胞をパニングすることにより、幹細胞を骨髄細胞から単離するInabaetalJExpMed17616931702を参照。治療用TAL切断ドメイン融合タンパク質核酸を含有するベクター例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム、なども、細胞のinvivo形質導入のために、生物に直接投与することができる。あるいは、裸のDNAを投与することができる。投与は分子を血液または組織細胞と究極的に接触させるために通常使われる経路のいずれかにより、これには、限定されるものでないが、注射、輸液、局所適用およびエレクトロポレーションが含まれる。かかる核酸を投与する好適な方法を当業者は利用しうるしかつ周知しており、特別な組成物を投与するために1以上の経路を用いることはできるが、特別な経路がしばしば他の経路より直接的でかつ効果的な反応を提供しうる。製薬上許容される担体は、ある程度、投与する特別な組成物により、ならびに組成物を投与するために用いる特別な方法により決定される。従って、以下に記載の通り、広範な様々な好適な医薬組成物の製剤を利用しうる例えば、RemingtonsPharmaceuticalSciences17thed1989を参照。さらに植物に関しては、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよびベクターを用いていくつもの単子葉および双子葉の植物および植物細胞系を形質転換することができ、これらには双子葉類、例えば、ベニバナ、アルファルファ、ダイズ、コーヒー、アマランス、アブラナ高エルカ酸およびキャノーラ、ピーナッツまたはヒマワリ、ならびに単子葉類、例えば、油ヤシ、サトウキビ、バナナ、スーダングラス、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、キビ、またはソルグムが含まれる。また、裸子植物、例えば、モミおよびマツにも好適である。従って、本明細書に記載の方法は、双子葉植物、例えば、Magniolales、Illiciales、Laurales、Piperales、Aristochiales、Nymphaeales、Ranunculales、Papeverales、Sarraceniaceae、Trochodendrales、Hamamelidales、Eucomiales、Leitneriales、Myricales、Fagales、Casuarinales、Caryophyllales、Batales、Polygonales、Plumbaginales、Dilleniales、Theales、Malvales、Urticales、Lecythidales、Violales、Salicales、Capparales、Ericales、Diapensales、Ebenales、Primulales、Rosales、Fabales、Podostemales、Haloragales、Myrtales、Cornales、Proteales、Santales、Rafflesiales、Celastrales、Euphorbiales、Rhamnales、Sapindales、Juglandales、Geraniales、Polygalales、Umbellales、Gentianales、Polemoniales、Lamiales、Plantaginales、Scrophulariales、Campanulales、Rubiales、Dipsacales、およびAsterales目に属する植物に利用することができる。本明細書に記載の方法はまた、単子葉植物、例えば、Alismatales、Hydrocharitales、Najadales、Triuridales、Commelinales、Eriocaulales、Restionales、Poales、Juncales、Cyperales、Typhales、Bromeliales、Zingiberales、Arecales、Cyclanthales、Pandanales、Arales、Lilliales、およびOrchidales目に属する植物、または裸子植物、例えば、Pinales、Ginkgoales、CycadalesおよびGnetalesに属する植物に利用することができる。本方法は、広範囲の植物種にわたって用いることができ、それには、双子葉類のAtropa、Alseodaphne、Anacardium、Arachis、Beilschmiedia、Brassica、Carthamus、Cocculus、Croton、Cucumis、Citrus、Citrullus、Capsicum、Catharanthus、Cocos、Coffea、Cucurbita、Daucus、Duguetia、Eschscholzia、Ficus、Fragaria、Glaucium、Glycine、Gossypium、Helianthus、Hevea、Hyoscyamus、Lactuca、Landolphia、Linum、Litsea、Lycopersicon、Lupinus、Manihot、Majorana、Malus、Medicago、Nicotiana、Olea、Parthenium、Papaver、Persea、Phaseolus、Pistacia、Pisum、Pyrus、Prunus、Raphanus、Ricinus、Senecio、Sinomenium、Stephania、Sinapis、Solanum、Theobroma、Trifolium、Trigonella、Vicia、Vinca、Vilis、およびVigna属;単子葉類のAllium、Andropogon、Aragrostis、Asparagus、Avena、Cynodon、Elaeis、Festuca、Festulolium、Heterocallis、Hordeum、Lemna、Lolium、Musa、Oryza、Panicum、Pannesetum、Phleum、Poa、Secale、Sorghum、Triticum、およびZea属;または裸子植物のAbies、Cunninghamia、Picea、Pinus、およびPseudotsuga属が含まれる。遺伝子操作した細胞を特別な形質または活性、例えば、マーカー遺伝子もしくは抗生物質耐性遺伝子によりコードされた形質または活性について選択またはスクリーニングすることにより、形質転換した細胞、カルス、組織、または植物を特定して単離することができる。かかるスクリーニングおよび選択技法は当業者に周知である。さらに、物理的および生化学的方法を用いて形質転換体を特定することができる。これらの技法には、ポリヌクレオチドを検出するサザン分析またはPCR増幅;RNA転写物を検出するノーザンブロット、S1RNase保護、プライマー伸長、またはRTPCR増幅;ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素もしくはリボザイム活性を検出する酵素アッセイ;およびポリペプチドを検出するタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈降、および酵素結合イムノアッセイが含まれる。他の技法、例えば、insituハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色もポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出するために用いることができる。全ての言及した技法の実施方法は公知である。安定して植物細胞中に組み込まれたポリヌクレオチドは、例えば、標準の育種技法を用いて他の植物中に導入することができる。DNA構築物は、様々な通常の技法により所望の植物宿主のゲノム中に導入することができる。かかる技法の総括については、例えば、WeissbachWeissbachMethodsforPlantMolecularBiologySectionVIIIpp421463andGriersonCoreyPlantMolecularBiologyBlackieLondonCh79を参照されたい。例えば、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの技法を用いてDNA構築物を植物細胞ゲノムDNA中に直接導入してもよいし、またはDNA粒子ボンバードメントなどの微粒子銃を用いて植物組織に直接導入することができる例えば、KleinetalNature3277073を参照。あるいは、DNA構築物を好適なTDNA隣接領域と組み合わせ、通常のAgrobacteriumtumefaciens宿主ベクター中に導入することができる。ディスアーミングdisarmingと二成分ベクターの使用を含む、Agrobacteriumtumefaciensが介在する形質転換技法は科学文献に記載されている。例えば、HorschetalScience233496498andFraleyetalProcNatlAcadSciUSA804803を参照されたい。細胞を、二成分TDNAベクターBevanNucAcidRes1287118721または共培養手順HorschetalScience22712291231を用いて細菌に感染させると、Agrobacteriumtumefaciens宿主の病原性機能は構築物および隣接マーカーの植物細胞DNA中への挿入を指令しうる。一般に、アグロバクテリウム形質転換系を用いて双子葉植物の遺伝子操作が行われるBevanetalAnnRevGenet16357384RogersetalMethodsEnzymol118627641。アグロバクテリウム形質転換系を用いて、DNAを単子葉植物および植物細胞を形質転換、ならびに導入することもできる。HernalsteenetalEMBOJ330393041;HooykassVanSlogterenetalNature311763764;GrimsleyetalNature3251677179;BoultonetalPlantMolBiol123140;およびGouldetalPlantPhysiol95426434を参照されたい。代わりの遺伝子導入および形質転換方法には、限定されるものでないが、カルシウム、ポリエチレングリコールPEGまたはエレクトロポレーションが介在する裸のDNAの摂取を通してのプロトプラスト形質転換PaszkowskietalEMBOJ327172722PotrykusetalMolecGenGenet199169177;FrommetalProcNatAcadSciUSA8258245828;およびShimamotoNature338274276を参照ならびに植物組織のエレクトロポレーションDHalluinetalPlantCell414951505が含まれる。植物細胞を形質転換するためのさらなる方法には、マイクロインジェクション、シリコンカーバイドが介在するDNA摂取KaeppleretalPlantCellReporter9415418、および微粒子銃seeKleinetalProcNatAcadSciUSA8543054309;およびGordonKammetalPlantCell2603618が含まれる。開示した方法および組成物を用いて外因性配列を植物細胞ゲノムの予定位置中に挿入することができる。これは、導入されるトランスジーンの植物ゲノム中の発現がその組込み部位に厳密に依存するので有用である。従って、例えば、栄養分、抗生物質または治療分子をコードする遺伝子を、標的化組換えにより、その発現が好都合な植物ゲノムの領域中に挿入することができる。以上の形質転換技法のいずれかにより産生した形質転換植物細胞を培養し、その形質転換した遺伝形質、従って、その所望の表現型を持つ全植物を再生することができる。かかる再生技法は、組織培養成長培地中のある特定の植物ホルモンの操作に依存し、典型的には、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入されている殺生物剤および/または除草剤マーカーに依存する。培養プロトプラストからの植物再生は、EvansetalProtoplastsIsolationandCultureinHandbookofPlantCellCulturepp124176MacmillianPublishingCompanyNewYork1983;およびBindingRegenerationofPlantsPlantProtoplastspp2173CRCPressBocaRaton1985に記載されている。再生はまた、植物カルス、外植体、器官、花粉、胚またはそれらの一部分から行うことができる。かかる再生技法は一般に、KleeetalAnnRevofPlantPhys38467486に記載されている。植物細胞中に導入される核酸を用いて本質的にいずれの植物にも所望の形質を与えることができる。本開示の核酸構築物および上記の様々な形質転換法を用いて、広範囲の様々な植物および植物細胞系を本明細書に記載の所望の生理学的および農学的特徴について遺伝子操作することができる。好ましい実施形態においては、遺伝子操作のための標的植物および植物細胞には、限定されるものでないが、これらの単子葉および双子葉植物、例えば、穀物を含む作物例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、キビ、オオムギ、果実作物例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ、試料作物例えば、アルファルファ、根菜例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤム、葉野菜作物例えば、レタス、ホウレンソウ;花植物例えば、ペチュニア、バラ、キク、針葉樹およびマツ例えば、マツ、モミ、エゾマツ;植物治療に用いる植物例えば、重金属蓄積植物;油作物例えば、ヒマワリ、アブラナおよび実験目的で使用される植物例えば、Arabidopsisが含まれる。従って、開示した方法と組成物は広範囲の植物にわたる用途を有し、かかる植物には、限定されるものでないが、Asparagus、Avena、Brassica、Citrus、Citrullus、Capsicum、Cucurbita、Daucus、Glysine、Hordeum、Lactuca、Lycopersicon、Malus、Manihot、Nicotiana、Oryza、Persea、Pisum、Pyrus、Prunus、Raphanus、Secale、Solanum、Sorghum、Triticum、Vitis、Vigna、およびZea属からの種が含まれる。当業者は、発現カセットはトランスジェニック植物に安定して組み込まれかつ操作可能であることが確認された後、生殖交雑により他の植物中に導入できることを認識するであろう。交雑する種に応じて、いくつかの標準育種技法を用いることができる。形質転換するDNA上に存在するマーカー遺伝子がコードする形質について遺伝子操作で作られた植物材料を選択またはスクリーニングすることにより、形質転換した植物細胞、カルス、組織または植物を特定しかつ単離することができる。例えば、形質転換遺伝子構築物が耐性を与える抗生物質または除草剤の阻害量を含有する培地で、遺伝子操作で作られた植物材料を育てることにより、選択を実施することができる。さらに、形質転換植物および植物細胞はまた、組換え核酸構築物に存在しうるいずれかの可視マーカー遺伝子例えば、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、BまたはC1遺伝子の活性をスクリーニングすることによって特定することができる。かかる選択およびスクリーニング手法は当業者に周知である。物理的および生化学的方法を用いて挿入した遺伝子構築物を含有する植物または植物細胞を特定することもできる。これらの方法には、限定されるものでないが、1組換えDNAインサートの構造を検出および確認するためのサザン分析またはPCR増幅;2遺伝子構築物のRNA転写物を検出および試験するためのノーザンブロット、S1RNase保護、プライマー伸長または逆転写酵素PCR増幅;3かかる遺伝子産物が遺伝子構築物によりコードされる酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ;4遺伝子構築産物がタンパク質である、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット技法、免疫沈降、または酵素結合イムノアッセイが含まれる。さらなる技法、例えば、insituハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色を、特定の植物器官および組織における組換え構築物の存在または発現を検出するために用いることができる。全てのこれらのアッセイを行う方法は当業者に周知である。本明細書に開示した方法を用いる遺伝子操作の効果は、例えば、目的の組織から単離したRNA例えば、mRNAのノーザンブロットにより観察することができる。典型的には、もしmRNAの量が増加していれば、対応する内因性遺伝子が前より大きい比率で発現されていると想定することができる。遺伝子および/またはCYP74B活性を測定する他の方法を用いてもよい。用いる基質および反応産物または副産物の増加または減少を検出する方法に応じて、色々な型の酵素アッセイを用いることができる。さらに、発現されるCYP74Bタンパク質のレベルを免疫化学的に、すなわち、当業者に周知のELISA、RIA、EIAおよび他の抗体に基づくアッセイ、例えば、電気泳動検出アッセイ染色またはウェスタンブロットを伴うで測定することができる。トランスジーンを植物のいくつかの組織においてまたはいくつかの発生段階において選択的に発現させてもよく、またはトランスジーンを実質的に全植物組織に、実質的にその全生活環にわたって発現させてもよい。しかし、いずれかのコンビナトリアル発現様式も応用可能である。本開示はまた、本開示のトランスジーンまたは遺伝子構築物を有する、上記トランスジェニック植物の種子を包含する。本開示はさらに、本開示のトランスジーンまたは遺伝子構築物を有する、上記トランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株または細胞を包含する。送達ビヒクルポリペプチド化合物、例えば、TAL切断ドメイン融合タンパク質の投与における重要な因子は、そのポリペプチドが細胞の原形質膜、または核などの細胞内コンパートメントの膜を横切る能力を有することの保証である。細胞膜は、小さい、非イオン親油性化合物に対して自由に透過性であるが、極性化合物、高分子、および治療もしくは診断薬に対して本来、不透過性である脂質タンパク質二重層から構成されている。しかし、タンパク質、リポソーム、およびポリペプチドなどの他の化合物、例えば、TAL切断ドメイン融合タンパク質は細胞膜を横切って移行する能力を有することが記載されている。例えば、膜移行ポリペプチドは、膜移行担体として作用する能力を有する両親媒性または疎水性アミノ酸サブ配列を有する。一実施形態においては、ホメオドメインタンパク質が細胞膜を横切って移行する能力を有する。ホメオドメインタンパク質の最短の内部化可能なペプチド、Antennapediaはアミノ酸位置43~58のタンパク質の第3ヘリックスであることが見出された例えば、ProchiantzCurrentOpinioninNeurobiology6629634を参照。他のサブ配列、シグナルペプチドのh疎水性ドメインは類似の細胞膜移行特性を有することが見出された例えば、LinetalJBiolChem2701425514258を参照。タンパク質の細胞中への摂取を促進するためにタンパク質と連結しうるペプチド配列の例には、限定されるものでないが、HIVのtatタンパク質の11アミノ酸ペプチド;p16タンパク質のアミノ酸84~103に対応する20残基ペプチドFahraeusetalCurrentBiology684;アンテナペディアAntennapediaの60アミノ酸長さのホメオドメインの第3ヘリックスDerossietalJBiolChem26910444;カポジ繊維芽細胞成長因子KFGFh領域などのシグナルペプチドのh領域Linetal、前掲;またはHSVからのVP22移行ドメインElliotOHareCell88223233が含まれる。細胞の摂取の増強を与える他の好適な化学部分はまた、ZFPとの化学的連結であってもよい。膜移行ドメインすなわち、内部移行ドメインはまた、無作為化ペプチド配列のライブラリーから選択することもできる。例えば、YehetalMolecularTherapy7S461Abstract1191を参照されたい。毒素分子も細胞膜を横切ってポリペプチドを輸送する能力を有する。しばしば、かかる分子二成分毒素と呼ばれるは少なくとも2つの部分:移行/結合ドメインまたはポリペプチドおよび分離可能な毒素ドメインまたはポリペプチドから構成される。典型的には、移行ドメインまたはポリペプチドは細胞の受容体と結合し、次いで毒素が細胞中に輸送される。ガス壊疽菌ιClostridiumperfringensiota毒素、ジフテリア毒素DT、シュードモナスエキソトキシンAPE、百日咳毒素PT、炭疽菌Bacillusanthracis毒素、および百日咳アデニル酸シクラーゼCYAを含むいくつかの毒素を用いて、ペプチドが細胞サイトゾルへ内部またはアミノ末端融合体として送達されるAroraetalJBiolChem26833343341PerelleetalInfectImmun6151475156StennarketalJCellBiol11310251032DonnellyetalPNAS9035303534CarbonettietalAbstrAnnuMeetAmSocMicrobiol95295SeboetalInfectImmun6338513857KlimpeletalPNASUSA891027710281andNovaketalJBiolChem26717186171931992。TAL切断ドメイン融合タンパク質を、かかるペプチド配列を用いて細胞膜を横切って移行させることができる。TAL切断ドメイン融合タンパク質をかかる配列と好都合に融合するかまたは誘導体化してもよい。典型的には、移行配列は融合タンパク質の一部分として提供される。場合によっては、リンカーを用いてTAL切断ドメイン融合タンパク質と移行配列を連結してもよい。いずれかの好適なリンカー、例えば、ペプチドリンカーを用いることができる。TAL切断ドメイン融合タンパク質はまた、リポソームおよびリポソーム誘導体、例えば免疫リポソームを介して、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞中に導入することができる。用語リポソームは、水相を封入する1以上の同心円状に配置された脂質二重層で構成される小胞を意味する。水相は典型的には細胞へ送達される化合物を含有する。リポソームは原形質膜と融合し、それにより、薬物を細胞質ゾル中に放出する。あるいは、リポソームは輸送小胞において細胞により食作用を受けるかまたは摂取される。いったんエンドソームまたはファゴソーム中に取り込まれると、リポソームは分解するかまたは油相小胞の膜と融合してその内容物を放出する。リポソームを介して薬物送達する現在の方法において、リポソームは究極的に透過性となり封入された化合物本事例ではTAL切断ドメイン融合タンパク質を標的組織または細胞において放出する。全身または組織特異的送達については、これが、例えば、受け身のやり方で行われ、その場合、リポソーム二重層は体内において様々な作用薬の作用を介して時間をかけて分解する。あるいは、活性薬放出はリポソーム小胞における透過性変化を誘導する薬剤を用いることに関わる。リポソーム膜は、環境がリポソーム膜近くで酸性になると不安定化するように構築してもよい例えば、PNAS847851Biochemistry28908を参照。リポソームが標的細胞による飲食作用を受けると、例えば、不安定化しかつその内容を放出する。この不安定化はフゾゲネシスと呼ばれる。多くのフゾゲネシス系はジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPEに基づく。開示した標的化組換えの方法を用いて、いずれのゲノム配列を相同性で非同一の配列と置き換えてもよい。例えば、突然変異体ゲノム配列を、その野生型対応体により置き換えて、それにより、例えば、遺伝病、遺伝性障害、癌、および自己免疫疾患を治療する方法を提供することができる。似たやり方で、ある遺伝子の1つの対立遺伝子を、本明細書に開示した標的化組換えの方法を用いて異なる対立遺伝子により置き換えることができる。遺伝病の例には、限定されるものでないが、軟骨形成不全、色盲、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症OMIMNo102700、副腎白質萎縮症、アイカルディ症候群、α1抗トリプシン欠乏症、α地中海貧血症、アンドロゲン不応症候群、アペール症候群、催不整脈性右室異形成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候、β地中海貧血症、青色ゴムまり様母斑症候群、カナヴァン病、慢性肉芽腫性疾患CGD、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成、ファンコニ貧血症、進行性骨化性線維形成異常症、脆弱X染色体症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシド蓄積症例えば、GM1、血色素症、βグロビンの第6コドンにおけるヘモグロビンC突然変異HbC、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガーギーディオン症候群、白血球接着欠損症LAD、OMIMNo116920、白質委縮症、QT延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症MPS、爪膝蓋骨症候群、腎原発性尿崩症、神経線維腫症、ニーマンピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダーウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンスタインテイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症の複合免疫不全SCID、シュバックマン症候群、鎌状赤血球病鎌形赤血球貧血、スミスマゲニス症候群、スティックラー症候群、テイサックス病、血小板減少とう骨欠損症候群、トリーチャーコリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル障害、フォンヒッペルリンダウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウイスコットアルドリッチ症候、連鎖リンパ増殖症候群XLP、OMIMNo308240が含まれる。標的化DNA切断および/または相同組換えにより治療できるさらなる疾患の例には、後天性の免疫不全症、リソソーム沈着症例えば、ゴーシェ病、GM1、ファブリー病およびテイサックス病、ムコ多糖症例えばハンター病、ハーラー病、異常血色素症例えば、鎌形赤血球病、HbC、α地中海貧血症、β地中海貧血症および血友病が含まれる。特定の事例においては、多能性細胞例えば、造血性幹細胞中のゲノム配列の改変が所望される。造血性幹細胞を動態化、濃縮および培養する方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5061620号;第5681559号;第6335195号;第6645489号;および第6667064号を参照されたい。処置した幹細胞を患者に戻し、限定されるものでないが、SCIDおよび鎌形赤血球貧血を含む様々な疾患を治療することができる。多くのこれらの事例において、目的の領域は突然変異を含み、そしてドナーポリヌクレオチドは対応する野生型配列を含む。同様に、野生型ゲノム配列を、所望であれば、突然変異体配列により置き換えることができる。例えば、癌遺伝子の過発現は、その遺伝子を変異させることによりまたはその制御配列を発現のより低い、非病理レベルを支持する配列で置き換えることにより逆転させることができる。他の例として、ApoAI遺伝子の野生型対立遺伝子をApoAIMilano対立遺伝子により置き換えてアテローム性動脈硬化症を治療することができる。実際、特別なゲノム配列に依存するいずれかの病理を、いずれかのやり方で、本明細書に開示した方法と組成物を用いて修正するかまたは軽減することができる。標的化切断および標的化組換えを用いて非コード配列例えば、プロモーター、エンハンサー、イニシエーター、ターミネーター、スプライス部位などの調節配列を改変して遺伝子産物の発現のレベルを改変することができる。かかる方法は、例えば、治療の目的、機能性ゲノムおよび/または標的確証の研究に用いることができる。実施例1:キメラ遺伝子構築N末端FokIドメインおよびC末端AvrXa7の配置を有するFNAvrXa7に対する遺伝子を、標準の大腸菌株sおよびDNA技法を用いて構築した31。全長AvrXa7を最初にPCRプライマーTalFおよびTalRで改変し、プラスミドpZWavrXa7に基づいて、5末端の開始コドンの上流に制限部位KpnIおよびBglIIならびに3末端にHindIII、XbaIおよび終止コドンSpeIを含有するを組み込んだ29。反復中心領域を有しないAvrXa7を、プライマーTalFおよびTalRを用いてPCR増幅し、KpnIおよびSpeIによりpBluescriptKS中にクローニングした。次いで中心反復領域をSphIによりクローニングして戻し、pSKavrXa7を得た。切断ドメインをコードするFokINCBI受託番号J04623のDNA断片アミノ酸388~583をプライマーFoknFおよびFoknRならびにテンプレートとしてFokI遺伝子を含有するプラスミドを用いてPCR増幅した。FoknFは制限部位KpnIおよびBglIIを含有する一方、FoknRはBamHI制限部位を含有した。その産物をATクローニングベクターpGEMTPromega、Madison中にクローニングした。FokIヌクレアーゼドメインに対するKpnIおよびBamHIで消化したDNA断片をKpnIおよびBglIIで処理したpSKavrXa7中にクローニングし、5末端にFNおよび3末端にAvrXa7を持つキメラ遺伝子を含有するpSKFNAvrXa7を得た。全てのPCR産物の精度は配列決定により確認した。プライマー配列を補充データ表S1に掲げた。FNAvrXa7のDNA結合活性に対する一過性発現アッセイAvrXa7のEBEを含有するOS11N3プロモーター下の緑色蛍光タンパク質GFPに対するレポーター遺伝子の構築物を次の通り作った。GFPに対する領域をプラスミドpEGFPClontechLaboratories、MountainView、CA94043から、プライマーGFPFおよびGFPRを用いてPCR増幅し、配列確認用のpGEMT中にクローニングした。付加した制限部位をもつGFPを、AvrXa7EBEを含有するプロモーター領域の下流とOs11N3のターミネーターの上流との間にクローニングしてpEBEOs11N3GFPを得た。このGFP発現カセットを次いでpCAMBIA1300CAMBIA中のKpnIおよびHindIII制限部位にクローニングした。構築物をレポーター菌株としてのAgrobacteriumtumefaciens菌株EHA105中に形質転換した。FNAvrXa7に対するDNAを、改変されたpCAMBIA1300ベクター中のカリフラワーモザイクウイルスCaMV35Sプロモーター下にクローニングし、エフェクター菌株としてのEHA105中に動態化した。AvrXa7を含有するエフェクター菌株を同様にポジティブ対照として作った。レポーターおよびエフェクター菌株をNicotianabenthamiana葉に同時浸潤した。接種した葉を、蛍光立体顕微鏡LeicaM205FAのもとでGFPの発現についてチェックした。FNAvrXa7の産生と精製BglIIおよびSpeI消化したFNAvrXa7断片を連結することにより、キメラ遺伝子FNAvrXa7をpPROEXHTbInvitrogen中にクローニングした。製造業者InvitrogenCarlsbadCA92008のマニュアルに従って、発現構築物を大腸菌株BL21ED3中に形質転換し、イソプロピル1チオβDガラクトピラノシドIPTGの誘導で組換えタンパク質を過発現した。6Xヒスチジンタグ付きFNAvrXa7を、NiNTAアガロースQiagenを用いて精製し、そしてタンパク質濃度をBioRad’sBradfordキットを用いて決定した。タンパク質を10SDSポリアクリルアミドゲル上に供給し、タンパク質ゲルブロット分析を、1;20000希釈の抗FLAGモノクローナル抗体M2Sigmaで実施し、AvrXa7タンパク質の同一性を確認した。電気泳動易動度シフトアッセイによるDNA結合AvrXa7EBEを含有するOs11N3FとOs11N3Rの相補オリゴヌクレオチド、ならびに、変異AvrXa7EBEを含有するOs11N3MFとOs11N3MRの相補オリゴヌクレオチドをそれぞれアニーリングし、そして5末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼ触媒によりγ32PATPで標識した。標識したオリゴヌクレオチド二本鎖DNAを、TrisHCl15mM、pH75、KCl60mM、DTT1mM、グリセロール20、ポリ50ngul、EDTA02mM、標識したDNA50fmol、FNAvrXa7350fmolおよび、競合体プローブとして、無標識DNA0~25pmolを含有する反応溶液中でFNAvrXa7と混合した。結合反応液を室温にて30分間保った後、6TBEポリアクリルアミドゲル上に供給し、このゲルを電気泳動後の写真用のX線フィルムに曝した。InvitroDNA切断AvrXa7EBEを包含するイネOs11N3の406bpゲノム領域を、フォワードプライマーOs11N3PFおよびおよびリバースプライマーOs11N3PRを用いてPCR増幅し、ATクローニングベクターpTOPOInvitrogenCarlsbadCA92008中にクローニングした。そのクローンを配列決定し、そして、プラスミドの主鎖上に位置するユニークな制限部位EcoNIにて直鎖化した後、FNAvrXa7を用いてinvitro消化アッセイを実施した。EMSAと同じであるが、25mMMgCl2の存在するバッファー条件で、DNAXugをFokIAvrXa7とインキュベートした。酵母組換えアッセイ酵母菌株YPH499およびYPH500および発現プラスミドpCP5およびpCP3はDrDanVoytas32により記載されたもので、好意で提供された。単一AvrXa7EBEを含有するpC5由来のレポーター構築物を、アニーリングしたオリゴヌクレオチドEBESFおよびEBESRをBglIIおよびSpeI消化したpCP5中に挿入することにより作った。頭部対頭部の配向で14bpのスペーサーにより分離された2つのAvrXa7EBEを含有する二本鎖のオリゴヌクレオチドEBEDH14FおよびEBEDH14Rを、BglIIおよびSpeI消化したpCP5中に挿入した。2つのAvrXa7EBEを持つが様々な長さ19、24、30、35bpのスペーサーにより分離された類似の構築物を、第1EBEをEBEDH19FとEBEDH19R、EBEDH24FとEBEDH24R、およびEBEDH30FとEBEDH30Rのオリゴヌクレオチド二本鎖と、それぞれ、BglIIおよびKpnIにより交換することによって作った。これらの置換体は同一のEBE配列を有するが、異なる長さのスペーサーヌクレオチドを有する。発現ベクターpCP3を最初に翻訳伸長因子1αプロモーターの下流にマルチクローニングサイトを含有するリンカー配列で改変し、pCP3Mを得た。リンカーは2つのオリゴヌクレオチドリンカーFおよびリンカーRをアニーリングすることにより作り、XbaIおよびXhoI消化したpCP3中にライゲートした。キメラ遺伝子FNAvrXa7をBglIIおよびSpeIで消化し、BamHIおよびSpeI消化したpCP3Mベクター中にライゲートした。レポータープラスミドを酵母接合菌株YPH500MATα中に、そしてエフェクタープラスミドFNAvrXa7および空をYPH499MATa中に形質転換した。2つの接合菌株の形質転換体を混合し、酵母栄養分培地YPDで一晩成長させ、次いでヒスチジンおよびトリプトファンを欠く合成完全培地にプレーティングした。記載のように、コロニーを膜にリフトし、βガラクトシダーゼ活性用のXgalを含有するZバッファーで染色した33。プライマーとそれらの配列はデータ表S1に提供する。結果FNAvrXa7に対するキメラ遺伝子の構築AvrXa7は26反復の中心領域を含有する天然TALタンパク質であるが、その関係タンパク質と同様に、最後の反復は他の反復に類似した最初の20アミノ酸残基だけを含有する。26個のRVDの連続配列それ自体が、他のTALタンパク質と比較してユニークな構造を作る図1B。AvrXa7は特異的にOs11N3中の26塩基対の予想される配列とそのDNA結合反復を介してプロモーターエレメントと直接結合する[図1b;34および本発明者らの添付原稿]。本発明者らは、AvrXa7とエンドヌクレアーゼDNA切断ドメインのハイブリッドタンパク質は、その標的配列を認識しかつ認識部位に隣接するDNAを切断する機能を有すると考える。エンドヌクレアーゼFokIのDNA切断ドメインは、他のDNA結合ドメイン、例えばジンクフィンガータンパク質と連結した時の周知の非特異的触媒活性によって選ばれた。本発明者らはFNAvrXa7の立体配置を選んで、全長AvrXa7のDNA配列をFokIの切断ドメインをコードするDNA配列と融合することによりキメラ遺伝子を作った。キメラ遺伝子はN末端にFokIドメインをもつハイブリッドタンパク質をコードすると予想される。得られるキメラ遺伝子は1628アミノ酸残基のタンパク質をコードすると予想される。196アミノ酸のFNはそれ自体1459アミノ酸を含有するAvrXa7と4アミノ酸残基により連結される。図2A、またFNAvrXa7の完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対する添付図S1も参照のことFNAvrXa7のinvivo転写活性本発明者らがタンパク質融合においてFNをN末端に置きかつTALC末端活性化ドメインを無傷に保った1つの理由は、ハイブリッドタンパク質FNAvrXa7またはいずれかの新しく合成したTAL由来のハイブリッドタンパク質のDNA結合能力を測定する間接的手段として一般に転写活性を利用できるかを研究するためであった。全長avrXa7遺伝子をキメラ遺伝子の合成に用いるので、ハイブリッドタンパク質はinvivoで発現するとさらに転写活性化因子として機能することを期待した。本発明者らは、TALタンパク質のそれらの標的宿主遺伝子との相互作用を研究するために首尾よく用いられた改変Agrobacteriumtumefaciensが介在する植物一過性発現アッセイに適応させた25、28。我々の場合、レポーター構築物はAvrXa7EBEを含有するOs11N3のプロモーター下の緑色蛍光タンパク質GFPに対する遺伝子を含有した;このエフェクター構築物は、それぞれ、強力でかつ保存性のCaMV35Sプロモーター下のAvrXa7およびFNAvrXa7から作られた。レポーターおよびエフェクター遺伝子は両方ともAgrobacteriumtumefaciensにより送達され、Nicotinanabenthamiana葉に発現された。AvrXa7と同様に、FNAvrXa7はGFPの発現を誘導する一方、avrXa7またはFNavrXa7を欠く構築物は前記発現を誘導しなかった図2B。この結果は、ハイブリッドFNAvrXa7がAvrXa7のDNA結合能力を保持すること、および一過性発現アッセイは細胞におけるTAL由来のハイブリッドタンパク質のDNA結合能力を試験する方法を提供しうることを示す。FNAvrXa7タンパク質の発現と精製キメラ遺伝子FNavrXa7をN末端の6ヒスチジンタグとインフレームで過剰発現ベクター中にクローニングして大腸菌から発現させ、アフィニティクロマトグラフィで精製した。タンパク質はIPTGの誘導下で大腸菌から首尾よく発現され、Niビーズを用いて比較的純粋なタンパク質に精製された図3A。FNAvrXa7の同一性をさらにウェスタンブロット分析により、AvrXa7のC末端に組み込んだFLAGエピトープに対する抗体を用いて確認したYangetal2000図3B。タンパク質の予想サイズは約175KDである。IPTGを培養に加えても、FNAvrXa7を発現する大腸菌細胞は明らかな増殖欠陥を示さなかったデータは示してない。FokIAvrXa7のDNA結合および切断活性大腸菌から精製したFNAvrXa7を用いてそのDNA結合特異性および触媒活性をinvitroで試験した。精製FNAvrXa7のinvitroでDNA基質と結合する能力を、Os11N3のAvrXa7EBEおよびその変異バージョンを含有するオリゴヌクレオチド二本鎖を用いて試験した図4A。電気泳動易動度シフトアッセイEMSAはFNAvrXa7が、標的配列を含有する標識した二本鎖DNAと選好的に結合するが、変異標的配列を含有するプローブとは結合しないことを実証した図4B、左パネルの3つのレーン。さらに、FNAvrXa7のAvrXa7EBE結合はその無標識DNAプローブと競合しうるが、結合は過剰の変異体オリゴヌクレオチドOs11N3Mと競合しなかった図4B、中央および右パネル。本発明者らはまた基質DNAをinvitroで切断するFNAvrXa7の能力も試験した。最初にイネ由来のOs11N3プロモーターのクローニングしたDNA断片を含有するプラスミドを選んだ。プラスミドpTOPOs11N3を最初にユニークな制限部位EcoN1にて直鎖化し、消化後に精製した。変異したAvrXa7EBE部位および無関係のDNA断片を含有するプラスミドを対照として用いた図5A。DNAを次いでFNAvrXa7と37°Cにて1時間、記載したバッファー条件下でインキュベートした。明らかに、FNAvrXa7は直鎖DNAを2つの断片に切断して1つの主な切断部位を示した図5B、レーン1が、AvrXa7の変異結合部位を含有するプラスミドは示さず図5B、レーン2、AvrXa7標的配列と無関係であるGFPを含有するプラスミドも示さなかった図5B、レーン3。この切断をまた、増加量のFNAvrXa7タンパク質を用いて実施した。XngのFNAvrXa7の濃度下で、Xngの基質DNAの切断は完全であり得たが、FNAvrXa7の増加と共に、切断はアガロースゲルに示したスメアバンドのように非特異的に見えた図5C。これらの実験は、FNAvrXa7が二本鎖DNAを切断する酵素活性を有しかつその切断活性がある特定の反応条件下で基質配列に対して特異的であることを実証する。センスおよびアンチセンス鎖の主な切断部位を特定するために、pTOPOs11N3から誘導された切断されたDNA断片ほぼ890bpおよびほぼ2000bpの予想サイズを精製し、04kbOs11N3プロモーター断片の片側にそれぞれ相補的な2つのプライマーを用いることにより配列決定を行った。右側プライマーM13RonpTOPを用いて、プライムのテンプレートであるセンス鎖を配列決定した。逆相補配列トレースはAvrXa7結合部位の近位にあるセンス鎖の元来の配列とほとんど整合し、前記AvrXa7結合部位のトレースは元来の配列との整合が乏しかった図6A。左側プライマーM13Fについては、アンチセンス鎖がテンプレートであった。配列トレースは結合配列を含むセンス鎖の元来の配列と完全に整合した。アンチセンス鎖上の2つの主要切断部位はクロマトグラフから解釈することができて、1つは結合部位の6塩基対にて開始しそして他の1つは結合部位の最後のヌクレオチドに位置した図6B。酵母におけるFNAvrXa7刺激による相同組換え本発明者らは、従来確立された酵母一本鎖アニーリングアッセイSSA32、35を用いることにより、invivoでの標的配列との結合および切断におけるハイブリッドタンパク質の能力を試験することを追及した。このアッセイにおいては、酵母細胞においてレポーター構築物をエフェクター構築物と共発現させる。レポーター構築物は、URA3遺伝子およびAvrXa7EBEを挿入するためのマルチクローニングサイトを包含する12kb配列により分離された、2つの125bplacZコード配列の直接反復を含有する図7A。エフェクター構築物はTEF1プロモーター下のFNAvrXa7を含有する。反復の間で切断が発生すると、直接DNA反復は高能率で相同組換えを起こすことが予想され、前記組換えは機能性lacZ遺伝子の再構築をもたらし、標的配列の存在におけるTALエフェクタータンパク質の機能性を反映する高い組換え頻度の定量を可能にする36、37、38。レポータープラスミドのコレクションを、頭部対頭部の配向でかつ可変長のスペーサーにより分離された1つまたは2つのAvrXa7EBE部位を用いて構築した。わずか1つのAvrXa7EBE部位を含有する構築物をもつ酵母細胞は、FNAvrXa7と共発現したとき、FNAvrXa7を欠くエフェクター構築物で形質転換した対照と比較して、βガラクトシダーゼ活性の増加を示さなかった図7B、構築物pS。2つのAvrXa7EBE部位の間に14および19スペーサーを含有するプラスミドで形質転換した酵母細胞はいずれもβガラクトシダーゼ活性の増加を示さなかった。しかし、24および30bp分離されたAvrXa7EBE部位を含有する構築物は対照より有意な量のβガラクトシダーゼ活性を有した図7B。SSAアッセイはFNAvrXa7が酵母細胞の対合部位において二本鎖DNAを効率的に切断することを実証する。考察TALエフェクターとそのモジュレートされた宿主遺伝子の間の相互作用を理解することを試みる数年の努力がTALエフェクターのDNA認識コードを解読する最近のブレークスルーに導いた27、28。DNA結合特異性に対するTAL中央ドメインの予想可能性と操作可能性は、TALを潜在的なバイオテクノロジーへの応用を開拓する優れた系にしている。本研究において、本発明者らは他のタンパク質の機能性ドメインとの融合におけるTALDNA結合活性の適応性を試験した。AvrXa7公知の標的配列特異性を持つ典型的なTALを選んで、FokIヌクレアーゼドメインのC末端と連結することによりキメラタンパク質を創製した。組換えタンパク質が大腸菌から首尾よく産生されかつ精製され、最適化反応条件において予想部位において切断活性を示した。ハイブリッドタンパク質は、発現されると、酵母一本鎖アニーリングアッセイにおいて対合した認識部位を含有したレポーター遺伝子LacZのHRを刺激した。FokIは広範に研究されている13、14、15。それ自体によるエンドヌクレアーゼドメインは切断に対する特異性を有しないが、一緒に連結すると、DNA結合ドメインにより特定された部位においてDNAを切開する。この意味で、いくつかの型のFokInに基づく融合タンパク質が首尾よく創製され、これらは新しい配列特異性と切断活性を保持し、ZFNが最も評判がよい6、7、39。本発明者らはFokI切断ドメインを選んでTALエフェクターファミリーの1つのメンバーと融合し、原理の証明として、TALエフェクターに帰属しうる配列特異性を持つヌクレアーゼの一種を創製することの実行可能性を実証した。DNA結合に対するTALエフェクターの特性は、ゲノム編集を含むいくつかの応用のために非特異的DNA切断ドメインと融合させると、このグループのタンパク質またはそれらの反復ドメインを、エンドヌクレアーゼの重要な成分として所望されるものにした。例えば、大部分の天然TALタンパク質は多数の反復を含有し、数事例でしか示されないが、希切断性メガヌクレアーゼまたはホーミングヌクレアーゼの標的の長さ14~40bpならびに複数の単一フィンガーから組み立てた人工ZFPほぼ18bpの標的部位の長さと比較しうる長い配列を対応して認識する5、40。今まで研究されてきたTALタンパク質はそれらの標的遺伝子のEBEと高い配列特性を示す34、41。さらに、反復の数およびRVD特性に基づいてTALタンパク質の標的部位を予想するモデルを逆に用いて、目的のDNA配列、操作に受け入れられるモジュール特性に基づいてTALタンパク質を設計することができる。次のステップは、高い特異性と親和力を持つ広範囲のDNA部位を認識できる新規のTALタンパク質を特注設計することの実行可能性を試験することである。従来、TALエフェクターは転写活性化因子として機能することおよび、多くの他の転写因子のように、おそらく標的DNAと結合する二量体として作用することが見出されている。AvrBs3は、invitroおよび細胞質において二量体化し、その後に宿主細胞の核中に進入することが示された唯一のTALエフェクターである43。公知のTALの配列特異性は標的部位の1つの鎖だけとアラインすることができ、その配列は一般に不斉である27、28。TALエフェクタータンパク質は標的DNAの存在またはその欠如のもとで、一般に二量体または多量体を形成するかは明らかでない。TALエフェクターの構造研究は分子内反応が存在するかというような疑問に答える助けとなろう。しかし、AvrXa7FokInは単一を認識しうる。2つの認識部位間の距離は、試験したZFNについては柔軟性があると思われ、>4および<40の範囲内である44。標的DNAの効率的な二本鎖切断にはFokIn二量体化が必要であることは確立されている17。それ故に、DNAの効率的な切開のためにFokInAvrXa7を二量体化する必要があることは考えられる。これは以下に示す2つのモデルを介して達成される。最初に、未だ特徴付けされてないTALエフェクターの二量体化ドメインを介して、1つのEBEに結合したFokInAvrXa7が他のフリーなまたは既に結合したFokInAvrXa7と二量体を形成し、そしてAvrXa7が介在する二量体化が2つのFokIヌクレアーゼドメインを結合部位のごく近くに運び、我々のinvitro切断条件下で切断が行われる。あるいは、ZFNと未変性のFokIに対する場合と同様に、2つのEBEに結合されたFokIAvrXa7はFokInを介して二量体を形成して効果的な二本鎖切断が行われる。未変性のFokI機能はDNAと二価金属結合を介してアロステリックに調節される。ハイブリッドヌクレアーゼがかかる調節を欠いて、FokIヌクレアーゼドメインの切断機能の実行をより緩和することがありうる。二価金属の結合なしにおよび非存在のもとで、FokInはDNA認識モチーフとの相互作用を介して隔絶され、従って、FokIモノマーはアイドル状態を維持する。認識部位との結合後におよび金属の存在のもとで、2つの既に結合したFokI個々の分子が切断ドメインの相互作用を介して二量体を形成する。二量体化は2つのDNA/タンパク質複合体を二本鎖切開のごく近位に運ぶ14、16、17。連結されたFokInはZFNの場合のように、DNA結合パートナーの配列特異性を改変しない5。FokInAvrXa7はAvrXa7EBE部位回りの両方の鎖に複数の切断部位を示した。結合機能に対する反復領域とFokinの間の領域ほぼ300アミノ酸残基であるは切断に対して緩和したドメインを作る。類似した複数切断の知見はまた、ZFNおよびさらに未変性のIIS型酵素についても観察された7、12、44。参考文献表S1本研究で用いたプライマー実施例2:未変性のTALエフェクター由来のTALNは酵母染色体の環境のEBEを標的化するさらに最近、本発明者らの結果は、遺伝子のATG開始コドンの直ぐ下流にPthXo1AvrXa7EBE部位を含有するURA3を構築し、染色体5上の野生型URA3遺伝子をこの改変されたが全機能性のURA3遺伝子で置き換えることにより、酵母染色体上の遺伝子先に示した酵母プラスミドDNAに対してを標的化した場合、TALNにより引き起される遺伝子切断の可能性を実証した。同様に、一対の公知のZFNに対する二重標的配列も、比較のために、URA3遺伝子中に組み込んだ図10A。URA3遺伝子を不活化した酵母細胞を、5フルオロオロト酸機能性URA3遺伝子を含有する細胞で毒素に変換されるを含有する培地で選択した。図10Bおよび10Cに示した結果は、形質転換した酵母細胞中の両方の型のヌクレアーゼの発現は標的化部位における特異的切断およびDSBに対して誤りがちなNHEJによる変異原性DNA挿入/欠失をもたらすことを示した。図10URA3遺伝子のORFとインフレームに組み込まれた標的化配列を伴う染色体5ChrV中の酵母URA3遺伝子の模式図。小文字のスペーサー配列を伴う標的部位に下線が引かれている。ZFNおよびTALNは標的部位と結合し、FokIヌクレアーゼドメインFNは二量体化して標的部位間の二本鎖DNAを切断する。ZFNにより誘導された突然変異の部位におけるゲノムDNA配列。親菌株PTおよび挿入赤色の小文字および欠失赤色の破線のある5つの代表的な突然変異体Mが示されている。TALNにより引き起された突然変異部位におけるゲノム配列。親菌株PTと比較した突然変異体Mにおける、赤色の小文字は挿入を示し、破線はDNA配列の欠失を示す。酵母における、4モジュールを組み立てることによる特注作製TALNの使い易さおよび標的化DSBと内因性遺伝子に対するその後の遺伝的修飾を作製する人工TALNの能力。他の最近の、未公開の実験は、遺伝子はその自然の染色体の環境において、中央の34AA反復が合成されかつinvitroで組み立てられた遺伝子によりコードされた人工TALNを用いて、ノックアウトを首尾よく標的化できることを本発明者らが実証することを可能にした。図11Aは、DNA中の4つのヌクレオチドA、T、G、およびCのそれぞれを認識するように設計された34AA反復をコードする4つのモジュールを示す。各末端のユニークな4つの塩基対オーバーハングを生成するように設計されたプライマーを用いるこれらのモジュールのPCR増幅と引き続いての制限酵素、BsmBIの消化は、特定のDNA配列を認識する能力のあるTALエフェクターをコードする遺伝子中にユニークに組み込むことができる反復モジュールのコレクションをもたらす。図11に記した実験において、野生型URA3遺伝子位置16および597における中の2つの部位を選択して、それぞれの標的化配列を認識するように設計したTALNの2つの異なるセットのTALNにより別々に標的化した図11C。TALN遺伝子のいずれかのセットを含有するプラスミドによる野生型酵母細胞の形質転換は5FOAの存在のもとで増殖できるコロニーの産生をもたらした。TALN遺伝子を欠くプラスミドのセットで形質転換した細胞は5FOA耐性コロニーを産生しなかったデータは示されてない。DNA配列決定分析は、2セットのTALNにより引き起される様々な欠失/挿入を表した代表的なデータを図11D、11Eに記載した。図114つのヌクレオチドの1つを特異的に認識する第12番と第13番目の残基RVDすなわち、NIはAを、NGはTを、NNはGを、そしてHDはCをそれぞれ認識するを伴うそれぞれ34個のAAをコードする4つのモジュール。各モジュールは隣接する反復の2つのハーフから成る第2ハーフを太字で示した。各末端の4つの塩基対オーバーハングXXXXは、認識部位がGAGACG下線を引いたであるBsmBIにより作製される。この4つのオーバーハングは両側の隣接反復のオーバーハングと共存しうるので、102個のbp反復の配列アセンブリを可能にし、得られるTALエフェクターが標的遺伝子中の特異的ヌクレオチドのアレイと整合する。ドットは示されてないヌクレオチドまたはアミノ酸を記す。TALNを遺伝子操作で作るための標的部位ボックスで囲んだ下線を引いた配列として選んだ染色体5ChrV上の酵母URA3遺伝子赤色の活字書体ATGおよびTTAで範囲を定めた領域の位置16および597ATG開始コドンのAと相対的ににおける2つのEBE部位TalU1LとTalU1Rを16に始まるEBE部位におよびTalU2LおよびTalU2Rを597の位置にを示す。4つのTALNTalU1L、R、およびTalU2L、Rとそれらの対応する認識DNA配列を、に図解した個々のモジュールを用いて特注合成した反復の配列と共に示した。および親菌株WTから検索したURA3対立遺伝子と2セットのTALNTalU1L、RおよびTalU2L、Rに関連する挿入赤色文字/欠失赤色破線をもつその誘導体の突然変異体ura31、2、3、4、5、10、11および12のDNAアラインメント。二重TALN標的部位TalU1EBEおよびTalU2EBEに下線を引いた。実施例3:哺乳動物細胞における標的化遺伝子切断本発明者らはレポーター遺伝子緑色蛍光タンパク質egfpを標的化するTALEエンドヌクレアーゼを設計した。これは、eGFPdTALENを哺乳動物発現ベクター中にクローニングし、増加する量のeGFPdTALENSの存在のもとで、EGFP発現プラスミドを用いてヒトHEK293T細胞にトランスフェクトすることにより実施した。次に、GFPトランスフェクトした細胞をFACSにより定量した。次いで、処置した細胞からのGFP遺伝子を増幅しかつ配列決定して、標的部位における突然変異/挿入を特徴付けた。図12はTALNによるeGFP遺伝子の標的部位を示す。ヒトHEK293T細胞をEGFP発現プラスミドによって増加量のeGFPdTALENの存在のもとでトランスフェクションするために、HEK293T細胞を6ウエルプレートにプレーティングした。細胞をDNAでpEGFPc2:100ngウエルにておよびTALGFPLTALGFPR:0、05、1ugウエルにて二通りで共トランスフェクトした。次いで細胞を3日間インキュベートし、そして蛍光顕微鏡で調べた。図13はGFP検出を示す。次にGFPトランスフェクトした細胞をFACSにより定量するために、細胞を6ウエルプレートから剥がし、パラフォルムアルデヒドで固定した。各処置グループからの50000細胞をFACSによりGFP発現について分析した。結果を図14に示す。処置した細胞からGFP遺伝子を増幅し、配列決定した。EGFP増幅、PCR反応、およびPCR産物のTAクローニング用のプライマーを設計した。ポジティブクローンをスクリーニングし、配列決定をした。図15は設計プライマーに対する代表的配列を示す。これらの結果に従って、GFP遺伝子の標的化切断を観察した。GFPTAL14クローン;0mgTALEN形質転換;挿入/欠失なし。GFPTAL210クローンs;05mgウエルTALEN05ugウエル;5/10クローンが標的部位に欠失を含有する。配列結果を図16に記した。本明細書全体で引用した特許、特許出願、および参照の内容は、本明細書に参照によりその全てが組み込まれる。当業者は日常程度の実験を用いて、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認できるであろう。かかる等価物は次の請求項により包含されることを意図する。