植物においてミュラー管抑制因子を産生する方法であって、植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導する、融合タンパク質パートナーを含むミュラー管抑制因子融合タンパク質をコードする核酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる核酸構築物を含む植物をインキュベートするかまたは生育する工程を含む前記方法において、好ましくは、インキュベートするかまたは生育する工程の前に、植物に核酸構築物が導入またはインフィルトレーションされる前記方法。ミュラー管抑制因子が、ミュラー管抑制因子のC末端フラグメントである、請求項1に記載の方法。核酸構築物が、植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導する融合タンパク質パートナーをコードする第1核酸配列であって、場合により、1以上の天然に存在しない反復配列モチーフをコードする核酸配列をさらに含む前記配列ミュラー管抑制因子をコードする第2核酸配列および場合により、アミノ酸リンカーをコードする第3核酸配列であって、配列中のペプチド結合が特異的に切断されることができる前記第3核酸配列を含み、ここで前記第1、第2および第3核酸配列が互いに作動可能に連結されている、請求項1または請求項2に記載の方法。植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導する前記融合タンパク質パートナーがγゼインまたはその断片である、請求項1~3のいずれかに記載の方法。植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導する融合タンパク質パートナーをコードする核酸配列が、植物細胞の小胞体にミュラー管抑制因子融合タンパク質を先導するペプチド、好ましくはシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1~4のいずれかに記載の方法。植物からミュラー管抑制因子融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収するさらなる工程を含み、前記工程が、好ましくは、植物材料をホモジナイズする工程ホモジナイズした植物材料を、低速、好ましくは約200xgで遠心分離する工程ホモジナイズした植物材料を、工程よりも高速、好ましくは約6000xgで遠心分離する工程ミュラー管抑制因子融合タンパク質を含むタンパク質顆粒をペレット分画に回収する工程を含む、請求項1~5のいずれかに記載の方法。融合タンパク質を可溶化するさらなる工程を含み、前記可溶化工程が、好ましくは、尿素、ジチオスレイトールおよびホスフィンを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる混合物の使用を含む、請求項1~6のいずれかに記載の方法。前記ミュラー管抑制因子融合タンパク質からミュラー管抑制因子を放出させるさらなる工程であって、好ましくは、前記融合タンパク質からミュラー管抑制因子を放出させるために、プロテアーゼ、好ましくはTEVプロテアーゼ、またはタンパク質スプライシング手段、好ましくはインテインが用いられる前記工程を含む、請求項1~7のいずれかに記載の方法。前記プロテアーゼまたは前記タンパク質スプライシング手段が、ミュラー管抑制因子の切断末端に余分なアミノ酸を残すことなく、ミュラー管抑制因子融合タンパク質からミュラー管抑制因子を切断する、請求項8に記載の方法。植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導する融合タンパク質パートナーをコードする第1核酸配列であって、場合により、天然に存在しない反復配列モチーフをコードする核酸配列を含む前記配列ミュラー管抑制因子、好ましくはミュラー管抑制因子のC末端フラグメントをコードする第2核酸配列および場合により、アミノ酸リンカーをコードする第3核酸配列であって、配列中のペプチド結合が特異的に切断されることができる前記第3核酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる核酸構築物であって、前記第1、第2および第3核酸配列が互いに作動可能に連結されている前記核酸構築物。前記核酸配列の転写を制御する制御ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項10に記載の核酸構築物。請求項10または請求項11に記載の核酸構築物を含むベクター。植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導する融合タンパク質パートナーをコードするアミノ酸配列であって、場合により、1以上の天然に存在しない反復配列モチーフをコードするアミノ酸配列をさらに含む前記アミノ酸配列場合により、リンカーをコードするアミノ酸配列であって、配列中のペプチド結合が特異的に切断されることができる前記アミノ酸配列ミュラー管抑制因子、好ましくはミュラー管抑制因子のC末端フラグメントをコードするアミノ酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるミュラー管抑制因子融合タンパク質。請求項10もしくは請求項11に記載の核酸構築物または請求項12に記載のベクターまたは請求項13に記載のミュラー管抑制因子融合タンパク質を含む、それに由来するトランスジェニック植物または植物材料。請求項14に記載のミュラー管抑制因子融合タンパク質を含む植物タンパク質顆粒。定義本願の範囲内で用いられる専門用語および表現は、植物および分子生物学の関連技術においてそれらに一般に用いられている意味を一般に有するものとする。以下の用語の定義は、すべて、本願の全内容に適用される。語含んでいるは、他の要素または工程を排除せず、不定冠詞あるまたはあるは、複数であることを排除しない。個々の工程は、請求項に記載のいくつかの特徴の機能を満たすことができる。属性または属性値と関連する用語本質的に、約、おおよそなどはまた、特に、それぞれ、属性を正確に定義するか、または属性値を正確に定義する。所定の数値または数値範囲との関係において、用語約とは、所定の数値または範囲の20以内、10以内または5以内の数値または範囲のことを言う。相同性、同一性または類似性は、配列のアラインメントによって比較された、2つのポリペプチド間または2つのポリヌクレオチド分子間の配列類似度を指す。比較される2つの別々のポリヌクレオチド配列間の類似度は、相当する位置における一致するまたはマッチングするヌクレオチド数の関数である。同一性パーセントで表される類似度は、目視検査または数学的計算によって決定することができる。あるいは、2つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントは、Devereuxらによって記載されたGAPコンピュータプログラム、バージョン60を用い、配列情報を比較することによって決定することができ、UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroupから入手できる。GAPプログラムの典型的なデフォルトパラメータは、SchwartzandDayhoffedsAtlasofProteinSequenceandStructureNationalBiomedicalResearchFoundationpp3533581979に記載されているように、単項比較マトリックスおよびGribskovandBurgessNuclAcidsRes1467451986の加重比較マトリックス各ギャップに対して30のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対して010の追加ペナルティならびにエンドギャップに対するペナルティなしを含む。配列比較に関する当業者に公知の種々のプログラムを用いることができる。用語上流とは、直鎖状ポリヌクレオチド配列に沿った参照エレメントに対する相対方向相対位置のことを言い、ポリヌクレオチド配列の5’末端の方の方向位置を示す。上流は、参照エレメントの5’末端と同義で使用することができる。用語下流とは、直鎖状ポリヌクレオチド配列に沿った参照エレメントに対する相対方向相対位置のことを言い、ポリヌクレオチド配列の3末端の方の方向位置を示す。下流は、参照エレメントの3末端と同義で使用することができる。断片または短縮体は、翻訳後の対象酵素またはポリペプチドの構造的または機能的特徴の少なくとも1つを保持するポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質からのペプチド配列が、1以上のペプチド結合によって共有結合したタンパク質を含む。融合タンパク質パートナーとは、植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導する融合タンパク質の部分のことを言う。用語作動可能に連結されたとは、異なるDNAエレメント、断片または配列を結合させて機能的転写ユニットを生じさせることを言う。従って、適切には、前記DNAエレメント、断片または配列の転写を制御する調節配列は、それらの上流に配置される。用語精製するおよび単離するならびにそれらの文法的変異形は、混合物からの少なくとも1つの不純物の完全なまたは部分的な分離または除去であって、それによって組成物中のMISの純度のレベルが改善されることを意味するために用いられる。形質転換とは、細胞への外因性遺伝物質の導入によって生じる細胞の遺伝物質の改変のことを言う。植物細胞を形質転換するために、粒子銃、遺伝子銃技術、アグロバクテリウムによる形質転換、ウイルスベクターを用いた形質転換およびエレクトロポレーションを含む多くの方法が利用でき、それらはすべて本明細書に組み込まれる。遺伝的に形質転換された植物細胞を再生することによってトランスジェニック植物を作成することができる。アグロインフィルトレーションまたはインフィルトレーションは、植物において遺伝子の一過性発現を誘導するかまたは所望のタンパク質を産生させる方法である。一側面において、本技術は、植物葉の裏面にアグロバクテリウム細胞の懸濁液を注入し、それによって所望の遺伝子を植物細胞に導入することを含む。バキュームインフィルトレーションは、植物組織に多数のアグロバクテリウム細胞を導入するためのもう1つの方法である。本手順において、リーフディスク、葉または全植物が該懸濁液の入った容器中に沈められ、その容器が真空チャンバー中に置かれる。次いで、気孔から空気が出ていくように真空がかけられる。真空が解除されるとき、その圧力差によって気孔を介して植物組織に懸濁液が押し込まれる。用語植物とは、その生活環または発生の任意のステージにおける任意の植物およびその子孫のことを言う。該植物は、天然に存在する植物、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物であることもできるし、それらに由来することもできる。用語植物細胞とは、植物の構造的および生理学的単位のことを言う。該植物細胞は、細胞壁のないプロトプラスト、単離された単一細胞、培養された細胞、2以上の細胞の凝集塊であることもできるし、限定するものではないが、植物組織、植物器官または全植物などの高度に組織化された単位の一部であることもできる。用語植物材料とは、葉、茎、根、花もしくは花の部分、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、挿し木、分泌物、抽出物、細胞もしくは組織培養物または植物の任意の他の部分もしくは産物を含む、植物から入手されるかまたは入手可能な任意の固体もしくは液体組成物またはそれらの組み合わせのことを言う。一実施形態において、植物材料は、緑葉などの葉であるか、またはそれに由来する。発明の詳細な説明一側面において、植物においてMISを産生する方法は、植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導するタンパク質をコードする核酸配列およびMISをコードする核酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる核酸構築物であって、前記核酸配列が互いに作動可能に連結されている前記核酸構築物が導入された植物をインキュベートする工程を含む。ミュラー管抑制因子をコードする核酸配列は、MIS、好ましくはヒトMISの核酸配列に対して実質的相同性または実質的同一性を有する核酸配列を含む。MISは、ヒトにおいては、AMH遺伝子4568598によってコードされる。ヒトにおいては、MISの遺伝子は、染色体19p133に位置し、Genbankアクセッション番号NG012190を有する。用語MISは、プレプロMIS、プロMISおよびMISの断片などまたはそれらに対して実質的相同性または実質的同一性を有するポリペプチドもまた含む。好ましい実施形態において、MISはC末端フラグメントまたはそれに対して実質的相同性または実質的同一性を有するポリペプチドである。本明細書に記載されるように、MISポリヌクレオチドのバリアントは、Genbankアクセッション番号NG012190に報告された配列に対して、少なくとも60、65、70、71、72、73、74、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100の配列同一性を有することができる。MISバリアントは、MISタンパク質の生物活性およびまたは免疫学的活性を示すMISバリアントであることができる。本明細書において、語句MISタンパク質の生物活性は、そのMIS様ポリペプチドが、ミュラー管の退縮を促すかまたは1種類以上の卵巣腫瘍細胞、例えば細胞株HOC21に対して細胞傷害性である能力などの、少なくとも1つの天然に存在するMISタンパク質と実質的に同じであるかまたは同等である少なくとも1つの生物活性を有し、好ましくは、そのペプチドがミュラー管の退縮を促し、かつ1種類以上の卵巣腫瘍細胞に対して細胞傷害性であることを意味する。本明細書において、語句MISタンパク質の免疫学的活性は、天然に存在するMISタンパク質に特異的な抗体と交差反応するMIS様ポリペプチドの能力のことを言う。このような抗体の例は、US4487833に開示されている。MISのバリアントは、天然のMISタンパク質のアミノ酸に加えてアミノ酸を含む場合もあり、天然のMISタンパク質のアミノ酸のすべてを含むとは限らない場合もある。該バリアントは、サイレント変異を生じ、機能的に同等なタンパク質をもたらす、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有することができる。その物質の二次結合活性が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性およびまたは両親媒性における類似性に基づいて人工的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み、非荷電極性頭部基を有し類似した親水性値を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。例えば以下の表に従って保存的置換を行うことができる。第2列における同じブロックのアミノ酸、好ましくは第3列における同じラインにおけるアミノ酸を、互いに置換することができる。また、このポリペプチドは、成熟タンパク質または未成熟タンパク質または未成熟タンパク質由来のタンパク質であることができる。ポリペプチドは、MISアミノ酸配列の改変によって調製されて、特性の改善、例えばより優れた貯蔵安定性またはinvivoでの半減期の増加が達成されたMISポリペプチドの誘導体であることができる。前記方法はまた、無傷の535アミノ酸ヒトMISモノマーの残基427におけるタンパク質切断によって生じる約125kDaのMISのC末端フラグメントに対応するかまたはそれに構造的に類似するタンパク質を含むMISのC末端フラグメントを産生するために用いることができる。タンパク質切断認識部位は、551アミノ酸ウシMIS分子の残基443である。特に、この断片は、MISの約25kDaのホモ二量体C末端フラグメントを含む。ミュラー管退縮活性および抗増殖活性はMISのC末端ドメインに存在するので、用途によっては、MISのこの部位のみが必要な可能性がある。本方法はまた、無傷の535アミノ酸ヒトMISモノマーの残基427における切断によって生じる約57kDaの断片を含むMISのN末端断片を発現するために用いることもできる。前記核酸配列は、それがMISまたはMISのバリアントをコードする限り、天然に存在するMISと同一でないことができる。従って、前記核酸配列は、天然に存在するMISのコード配列に対して、少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99または100の配列同一性を有することができる。好ましい実施形態において、本発明に用いられるMISをコードする核酸配列は、植物におけるコドン使用頻度に従って、特定のコドンを代替コドンに置換することによって、植物における発現に最適化される。一実施形態において、MISの核酸配列は、植物における発現に最適化されたコード配列であり、配列番号1に示す配列またはそのバリアント、断片もしくはホモログを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。一実施形態において、MISのアミノ酸配列は、配列番号2に示す配列またはそのバリアント、断片もしくはホモログを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導するタンパク質をコードする核酸配列もまた含まれる。タンパク質顆粒は、正確な折りたたみおよび生物活性を保持したまま真核細胞の細胞内に貯蔵タンパク質を濃縮するように進化した、特定の植物の種子における天然に存在する構造体である。タンパク質顆粒は、細菌からの封入体の特徴の一部を共有する。タンパク質顆粒は高密度であり、疎水性相互作用によってきつく詰まった多量の凝集タンパク質を含む。貯蔵タンパク質は、シグナルペプチドによって小胞体内腔に挿入されることができ、小胞体由来タンパク質顆粒と呼ばれる特異的細胞小器官を発達させている小胞体またはタンパク質貯蔵空胞のいずれかに集積される。植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導するタンパク質の例は、貯蔵タンパク質または改変貯蔵タンパク質を含む。γゼインはトウモロコシ貯蔵タンパク質であり、4つのトウモロコシプロラミンの1つである。他の穀類プロラミンと同様に、αおよびγゼインは、粗面小胞体の細胞質側の膜結合型ポリソームにおいて生合成され、内腔に集積され、次いで小胞体由来タンパク質顆粒に隔離される。適切なプロラミンは、限定するものではないが、γゼイン、αグリアジン、コメrP13タンパク質およびトウモロコシαゼイン22kDaN末端断片を含む。好ましい実施形態において、植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導するタンパク質は、4つの特徴的ドメインi19アミノ酸からなるペプチドシグナルiiヘキサペプチドPPPVHLを8単位含むリピートドメイン、iiiプロリン残基が他のアミノ酸と交互に来るProXドメインおよびiv疎水性システインリッチC末端ドメイン、で構成されるγゼインである。植物細胞においてMISの発現レベルを改善することができる1以上の天然に存在しない反復配列モチーフがγゼインに組み込まれるか置換されることができる。天然に存在しない反復配列モチーフの例は、PPPVHL以外の反復配列モチーフである。天然に存在しない反復配列モチーフが置換される場合、これらのドメインのリピートドメインもしくはProXドメインまたはその両方は変異されて天然に存在しない配列モチーフを生じる。反復配列は天然に存在しない配列モチーフなので、それは天然γゼイン配列には存在しない。一実施形態において、天然に存在しない反復配列モチーフが、γゼインのリピートドメインに組み込まれるか置換される。他の実施形態において、天然に存在しない反復配列モチーフが、γゼインのProXドメインに組み込まれる。他の実施形態において、天然に存在しない反復配列モチーフが、γゼインのリピートドメインおよびProXドメインに組み込まれる。好ましい実施形態において、天然に存在しない反復配列モチーフが、本質的にγゼインリピートドメインおよびProXドメインからなる断片に置換される。このような断片の例は、γゼインの少なくともアミノ酸残基22~109、22~110、22~111、22~112、22~113、22~114または22~115を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。すなわち、融合タンパク質パートナーのN末端は、γゼインのシグナルペプチドならびに、前述の記載に従った種々の置換を有するγゼインの最初の105~115アミノ酸を含む。天然に存在しない反復配列モチーフの限定するものではない例は、nもしくはnnもしくはnnもしくはnおよびnもしくはnまたはそれらの2以上の組み合わせからなる群から選択される。好ましい実施形態において、n7または8である。アラニンおよびグルタミン酸に加えて、他のアミノ酸もまたプロリンリッチ非天然反復配列に用いることができる。他の実施形態において、リピートドメイン、ProXドメインまたはその両方において、2以上の異なる天然に存在しない反復配列モチーフの組み合わせ、例えばnおよびnまたはnおよびnまたはnおよびnおよびnまたはnおよびnおよびnまたはnおよびnおよびnおよびnを用いることができる。一実施形態において、γゼインのリピートドメインにおけるn配列は、配列番号6に示す配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。一実施形態において、γゼインのリピートドメインにおけるn配列は、配列番号7に示す配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。一実施形態において、γゼインのリピートドメインにおけるn配列は、配列番号8に示す配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。一実施形態において、γゼインのリピートドメインにおけるn配列は、配列番号9に示す配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。一実施形態において、γゼインのリピートドメインにおけるn配列は、配列番号10に示す配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。一実施形態において、γゼインのProXドメインにおけるn配列は、配列番号11に示す配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。一実施形態において、γゼインのProXドメインにおけるn配列は、配列番号12に示す配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。天然に存在しない反復配列モチーフは、γゼインのリピートドメインおよびまたはProXドメインの5末端または3末端に位置することができる。天然に存在しない反復配列モチーフは、γゼインのリピートドメインおよびまたはProXドメインの5末端または3末端に位置することができる。適切な実施形態において、天然に存在しない反復配列モチーフは、γゼインのリピートドメインおよびまたはProXドメイン内に位置する。適切には、前記植物細胞は、融合タンパク質をコードする核酸の非存在下でタンパク質顆粒を産生しない。適切には、タンパク質顆粒誘導配列は、さらに、植物細胞の小胞体に融合タンパク質を先導するペプチドをコードする配列を含む。該ペプチドは、多くの場合、リーダー配列またはシグナルペプチドと呼ばれ、融合タンパク質が発現される植物と同じ植物由来であることもできるし、異なる植物由来であることもできる。シグナルペプチドの例は、19残基γゼインシグナルペプチド配列αグリアジンの19残基シグナルペプチド配列または21残基γグリアジンシグナルペプチド配列5443450andEMBOJ3140911415参照である。同様に、他の植物からのシグナルペプチドの官能基化もまた前記文献に報告されている。シグナルペプチドは、γゼインおよびまたはMISに対して天然であるシグナルペプチドであることができる。シグナルペプチドをコードする核酸は、それがタンパク質のN末端またはC末端で発現されるように、核酸構築物中に位置することができる。一実施形態において、シグナルペプチドはN末端で発現される。本明細書において、γゼインに対して実質的相同性または実質的同一性を有するバリアントもまた含まれる。γゼインポリヌクレオチドのバリアントは、Genbankアクセッション番号NM001111884に報告されている配列に対して少なくとも60、65、70、71、72、73、74、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100の配列同一性を有することができる。本用語はまた、γゼインに対する実質的相同性または実質的同一性を有するγゼインの断片を含む。γゼインバリアントは、γゼインの生物活性およびまたは免疫学的活性を示すバリアントであることができる。本明細書において、語句γゼインの生物活性は、γゼインバリアントが、天然に存在するγゼインと実質的に同じであるかまたは同等である少なくとも1つの生物活性を有することを意味する。本明細書において、語句γゼインの免疫学的活性は、天然に存在するγゼインに特異的な抗体と交差反応するγゼインバリアントの能力のことを言う。γゼインのバリアントは、天然のγゼインタンパク質のアミノ酸に加えてアミノ酸を含む場合もあり、天然のγゼインタンパク質のアミノ酸のすべてを含むとは限らない場合もある。該バリアントは、サイレント変異を生じ、機能的に同等なタンパク質をもたらす、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有することができる。その物質の二次結合活性が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性およびまたは両親媒性における類似性に基づいて人工的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み、非荷電極性頭部基を有し類似した親水性値を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。例えば以下の表に従って保存的置換を行うことができる。第2列における同じブロックのアミノ酸、好ましくは第3列における同じラインにおけるアミノ酸を、互いに置換することができる。γゼインは、γゼインタンパク質の断片であって、植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む前記断片であることができる。従って、例として、γゼインは、タンパク質γゼインの反復ドメインの全部または一部をコードすることもできるし、ProXドメインの全部または一部をコードすることもできる。一実施形態において、γゼインの核酸配列は、配列番号3に示す配列を含むか、またはそのバリアント、断片もしくはホモログである。一実施形態において、γゼインのアミノ酸配列は、配列番号4に示す配列を含むか、またはそのバリアント、断片もしくはホモログである。他の実施形態において、γゼインの断片のアミノ酸配列は、配列番号5に示す配列を含むか、またはそのバリアント、断片もしくはホモログである。適切には、核酸配列は、MISおよびγゼインを含む融合タンパク質が植物細胞内で互いに作動可能に連結されている。一実施形態において、核酸分子は5’末端にMISを含み、3末端にγゼインを含む。他の実施形態において、核酸分子は3末端にMISを含み、5’末端にγゼインを含む。適切には、核酸分子は、植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導する核酸配列とMISをコードする核酸配列との間にリンカー配列を含む。前記リンカー配列は、それらに作動可能に連結されることができる。一実施形態において、リンカー配列は、その配列中の1以上のペプチド結合が特異的に切断されることができるアミノ酸リンカーをコードする。従って、それは、2つのタンパク質を互いに分離できるように、酵素またはインテインなどの認識部位として機能できる。リンカーは、1以上のペプチド結合を特異的に切断することができる任意の実体によって切断されることができる。好都合には、リンカーは、融合タンパク質からMISの分離を可能にし、それによって、続いて、必要に応じてMISが精製され、それによって実質的に均一な組換えMISタンパク質を得ることを可能にする。適切には、MISは内部で切断されず、従ってMISの断片は生成されない。適切には、MISは、MISのN末端またはC末端で3未満、2または1の余分なアミノ酸が残るように切断される。適切には、MISは、MISのN末端またはC末端に余分なアミノ酸を残すことなく切断される。一実施形態において、融合タンパク質は、エンテロキナーゼを用いて切断されない。なぜなら、エンテロキナーゼはMISを内部で切断するからである。融合タンパク質を切断してMISを放出させる好ましい方法は、融合パートナーのN末端がアミノ酸リンカーを介してMISのC末端に結合され、ここで配列中のペプチド結合が特異的に切断されることができ、このアミノ酸リンカーが融合タンパク質中の他の部位には存在しないように融合タンパク質を設計することである。このアプローチの利点は、特異的認識配列などの特異的アミノ酸配列を参照することにより切断手段を選択することができることである。このリンカーは、1以上のペプチド結合の特異的切断を指示するのに必要な絶対最少配列を超えて含むことができる。このリンカーは、2つの核酸配列間の結合の結果として生成されることができる。この実施形態において、各配列は、切断可能なリンカーを形成するために連結されることができるいくつかのヌクレオチドを含む。リンカーにおける1以上のペプチド結合を特異的に切断するために、プロテアーゼを用いることができる。このプロテアーゼはAlaCエンドプロテアーゼであることができる。他の実施形態において、このプロテアーゼはGluCエンドプロテアーゼであり、これはスタフィロコッカスアウレウスプロテアーゼV8とも呼ばれる。このプロテアーゼは、グルタミン酸残基のC末端のペプチド結合を特異的に切断するセリンプロテアーゼである。このプロテアーゼはまた、グルタミン酸残基よりも100~300倍低い速度でアスパラギン酸残基を切断する。他の実施形態において、プロテアーゼはTEVプロテアーゼである。TEVプロテアーゼはタバコエッチウイルスにおいて見られる高度に部位特異的なシステインプロテアーゼである。このプロテアーゼの最適切断認識部位は、配列GluAsnLeuTyrPheGlnであり、GlnとGlySer残基の間で切断が行われる。従って、限定するものではない適切なリンカーの例は、GluAsnLeuTyrPheGln、xyであり、ここでyは2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10またはそれ以上であるを含む。一実施形態において、リンカーは4である。他の実施形態において、リンカーは3である。他の実施形態において、MISをコードする配列は、前記リンカーの3末端に位置する。他の実施形態によれば、2つのタンパク質を分離するために、非蛋白分解性手段を用いることができる。従って、例えば、インテインを用いることができる。定義された条件下、例えば還元条件下で切断を誘導することができる種々様々なインテインが当該技術分野で公知である。従って、一実施形態によれば、アミノ酸リンカーはインテインをコードすることができる。インテインは、種々の細菌種由来であることができ、例えばシネコシスティス種またはマイコバクテリウム種であることができる。インテインは、サッカロミセス種、例えばサッカロミセスセレビシエ由来であることができ、例えば、サッカロミセスセレビシエの液胞膜ATPアーゼインテインであることができる。一実施形態において、インテインはマイコバクテリウムゼノピのジャイレースAインテインである。融合タンパク質からMISを分離するために化学物質を用いることもでき、その場合はアミノ酸リンカーを必要としないこともできる。さらなる実施形態によれば、本発明の方法に使用するための核酸構築物は、植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導するタンパク質をコードする第1核酸配列であって、場合により天然に存在しない反復配列モチーフをコードする核酸配列をさらに含む前記第1核酸配列MISをコードする第2核酸配列および場合により、配列中のペプチド結合が特異的に切断されることができるアミノ酸リンカーをコードする第3核酸配列を含み、ここで前記第1、第2および第3核酸配列は互いに作動可能に連結されている。従って、前記核酸配列の転写を制御する種々の制御ヌクレオチド配列もまた含むことができる。これらには、植物の発生における特定の時期における特定の細胞または組織、例えば栄養組織または生殖組織においてのみ活性な転写調節エレメントが含まれる。このような例の1つはプロモーターであり、これは、一般的には上流に位置し、二本鎖DNA断片に作動可能に連結されたポリヌクレオチドエレメント配列のことを言う。適切なプロモーターは、RNA合成を開始するために、RNAポリメラーゼおよび種々の因子を含む転写複合体を動員することによって核酸配列の転写活性化を可能にする。プロモーターは、もっぱらネイティブ遺伝子に隣接する領域に由来することもできるし、異なる天然プロモーターまたは合成DNAセグメント由来の異なるエレメントから構成されることもできる。一実施形態によれば、組織特異的発現を用いることができ、これは、特定の組織における1以上のポリヌクレオチドの発現が好ましい場合に好都合であるであることができる。発生制御下での組織特異的プロモーターの例は、特定の組織、例えば栄養組織、または生殖組織、例えば果実、卵子、種子、花粉、雌しべ、花もしくは任意の胚組織のみにおいて転写を開始することができるプロモーターを含む。生殖組織特異的プロモーターは、例えば、葯特異的、卵子特異的、胚特異的、胚乳特異的、珠皮特異的、種子および種皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、萼片特異的またはそれらの組み合わせであることができる。適切な葉特異的プロモーターは、C4植物からのピルビン酸正リン酸ジキナーゼプロモーター、トウモロコシからのcabm1Ca2プロモーター、アラビドプシスタリアナmyb関連遺伝子プロモーター、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターを含む。適切な老化特異的プロモーターは、果実成熟、葉の老化および離脱に際して活性なトマトプロモーター、システインプロテアーゼをコードする遺伝子のトウモロコシプロモーターを含む。適切な葯特異的プロモーターを用いることができる。当業者に公知の適切な根優先的プロモーターを選択することができる。適切な種子選択的プロモーターは、種子特異的プロモーターおよび種子発芽プロモーターの両方を含む。このような種子優先的プロモーターは、限定するものではないが、Cim1milpsmZE402nuclcおよびcelAを含む。Glob1は胚特異的プロモーターである。双子葉植物に関しては、種子特異的プロモーターは、限定するものではないが、マメβファセオリン、ナピン、βコングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどを含む。単子葉植物に関しては、種子特異的プロモーターは、限定するものではないが、トウモロコシ15kDaゼインプロモーター、22kDaゼインプロモーター、27kDaゼインプロモーター、gゼインプロモーター、27kDaγゼインプロモーター、waxyプロモーター、shrunken1プロモーター、shrunken2プロモーター、グロブリン1プロモーター、Itp2プロモーター、cim1プロモーター、トウモロコシend1およびend2プロモーター、nuc1プロモーター、Zm40プロモーター、eep1およびeep2lec1、チオレドキシンHプロモーターmlip15プロモーター、PCNA2プロモーターならびにshrunken2プロモーターを含む。誘導性プロモーターの例は、病原菌攻撃、嫌気性条件、高温、光、干ばつ、冷温または高塩濃度に感受性のあるプロモーターを含む。病原体誘導性プロモーターは、病原体による感染後に誘導される病因関連タンパク質に由来するものを含む。植物プロモーターに加えて、他の適切なプロモーターは、細菌起源、例えばオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターおよびTiプラスミド由来の他のプロモーター由来であることもできるし、ウイルスプロモーターの35Sおよび19SRNAプロモーター、タバコモザイクウイルスの構成的プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス19Sおよび35Sプロモーターまたはゴマノハグサモザイクウイルス35Sプロモーター由来であることもできる。調節配列は、植物において機能しうる転写終結配列を含むこともできる。調節配列は、植物において機能しうる翻訳エンハンサーを含むこともできる。エンハンサーは、転写活性化因子などの転写制御タンパク質を動員してプロモーター活性を増強することによって転写活性化を増強することができる核酸配列である。適切なエンハンサーは、目的とする天然プロモーターに隣接する領域に由来することもできるし、非天然構造に由来し、プロモーターの活性または組織特異性を増強するために、目的とする任意のプロモーターに作動可能に連結されることもできる。転写ユニットの配向に対して任意の配向で作動するエンハンサーもある。例えば、エンハンサーは、プロモーターおよび核酸構築物を含む転写ユニットの上流または下流に位置することができる。他の実施形態において、核酸配列、核酸構築物またはベクターなどは、例えばウイルス起源の遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、遺伝子サイレンシングサプレッサーは、ハーフェル川ウイルス、セイヨウナシ潜伏ウイルス、トルコギキョウネクローシスウイルス、ブドウアルジェリア潜在ウイルス、ぺラルゴニウムネクローシス斑点ウイルス、シンビジウムリングスポットウイルス、アーチチョークモトルドクリンクルウイルス、カーネーションイタリアンリングスポットウイルス、レタスネクローシススタントウイルス、イネ黄色まだらウイルス、ジャガイモウイルスX、アフリカカッサバモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、キュウリネクローシスウイルス、ジャガイモウイルスY、タバコエッチウイルスおよびトマトブッシースタントウイルスまたはそれらの2以上の組み合わせからなる群から選択されるウイルスの遺伝子サイレンシングサプレッサーである。本発明に用いることができる遺伝子サイレンシングサプレッサーの例は、限定するものではないが、イネ黄色まだらウイルスのp1タンパク質、ジャガイモウイルスXのp25タンパク質、アフリカカッサバモザイクウイルスのAC2タンパク質、キュウリモザイクウイルスの2bタンパク質、キュウリネクローシスウイルスの19kDap19タンパク質、ジャガイモウイルスY、タバコエッチウイルスおよびトマトブッシースタントウイルスのヘルパー成分プロテアーゼを含む。一実施形態において、遺伝子サイレンシングサプレッサーはタバコエッチウイルスのHcProである。他の実施形態において、遺伝子サイレンシングサプレッサーはトマトブッシースタントウイルスのp19タンパク質である。従って、他の実施形態において、植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導するタンパク質をコードする第1核酸配列であって、場合により、天然に存在しない反復配列モチーフをコードする核酸配列をさらに含む前記第1核酸配列MISをコードする第2核酸配列および場合により、アミノ酸リンカーをコードする第3核酸配列であって、配列中のペプチド結合が特異的に切断されることができる前記第3核酸配列を含む核酸構築物であって、前記第1、第2および第3核酸配列が互いに作動可能に連結され、場合により、前記核酸配列の転写を制御する制御ヌクレオチド配列および場合により遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードする発現可能な核酸が、適切にはウイルス起源である前記核酸構築物が提供される。別の実施形態において、遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードする発現可能な核酸は、該植物または植物細胞に導入され、MISもまた産生する該植物または植物細胞において同時発現される異なる第2核酸分子または第2核酸の一部であることができる。組換えMISの発現に用いられる植物宿主細胞は、植物由来であることも植物から誘導可能であることもでき、また植物以外に培養された培養植物細胞であることもできる。従って、一実施形態において、植物は、invitroで栽培された植物細胞または凝集細胞塊などの、培養でまたは植物以外に栽培された植物細胞などの植物細胞である。限定するものではない植物の例は、単子葉植物および双子葉植物の植物、例えば作物、観賞用植物および非栽培植物または野生植物を含む。さらなる例は、商業利益または農業利益に関する植物、例えば、作物、木材またはパルプ製造用樹木、野菜植物、果実植物および観賞用植物を含む。植物、例えば単子葉植物および双子葉植物の植物に1以上の核酸分子を導入する技術は当該技術分野で公知である。核酸分子、ベクター、構築物などを植物に導入するために任意の方法を用いることができる。例として、それらは、構築物でコーティングされたミクロ粒子を用いる粒子銃または遺伝子銃技術、アグロバクテリウムによる形質転換、A.リゾゲネス、A.ルビまたはAツメファシエンスを用いる、ウイルスベクターを用いた形質転換エレクトロポレーションおよびアグロバクテリウム細胞によるインフィルトレーションによって植物に導入されることができる。一実施形態において、植物細胞のアグロバクテリウムによる形質転換が用いられる。他の実施形態において、全植物、無傷の植物、またはその一部に核酸を導入するためにアグロインフィルトレーションが用いられる。アグロインフィルトレーションは、当該技術分野で公知の技術および装置によって、低空気圧下または真空下で行うことができる。植物への核酸の導入によって、核酸によってコードされるタンパク質の安定発現をもたらすことができる。一般的には、宿主ゲノムへの核酸の組み込みが行われ、それによってトランスジェニック植物が作成されることによって安定発現がもたらされ、該核酸は次世代に伝えられる。植物への核酸の導入によって、核酸によってコードされるタンパク質の一過性発現をもたらすことができる。一過性発現は、必ずしも、宿主ゲノムへの核酸への組み込みに依存しない。一般的には、アグロバクテリウム細胞によってインフィルトレーションされたタバコ植物が、5、10、15もしくは20日間またはそれ以上インキュベートされ、次いで植物部分が採取され、組換えにより製造されたタンパク質が回収される。発現の両方の形態が本発明によって考えられる。核酸が導入された植物は、選択マーカー遺伝子が用いられる場合は、場合により選択下で、インキュベートし、子孫を得ることができる。これらの子孫は、トランスジェニック種子を製造するために用いることもできるし、あるいは他の植物によって育種することもできる。このような子孫によって得られた種子は、発芽させ、培養し、最初に導入された核酸を含む子孫のその後の世代の製造に用いることができる。植物からの未成熟胚または胚発生カルスを出発材料として用いることができる。これらの技術は、ルーチンであり、当業者に公知である。植物が成熟したら、該ヌクレオチド配列が発現される組織が採取され、本明細書に記載の方法を用いそれらから回収される。例えば、安定な植物形質転換は、以下のように行うことができる。ベクターをアグロバクテリウムツメファキエンスに導入する。DraperetalInPlantGeneticTransformationandGeneExpressionALaboratoryManualBlackwellScientificPublicationsの方法に従って、タバコまたはNタバカムのリーフディスクが形質転換される。再生される植物は、200mgLカナマイシンを含む培地で選択され、温室に移される。最も高い導入遺伝子産物レベルを有する形質転換タバコ植物を培養し、T1世代を得る。生育している葉を採取し、直ちに液体窒素で凍結し、さらなる実験のために80°Cで保存する。植物宿主細胞は、穀類作物植物飼料作物植物油種作物植物ツリーナッツサトウキビ、ココヤシ、ナツメヤシ、オリーブ、テンサイ、チャノキおよびコーヒーノキ木材またはパルプ製造用樹木野菜作物植物、例えばマメ科植物、レタス、アスパラガス、アーティチョーク、セロリ、ニンジン、ハツカダイコン、ブラシカ属の各種、ウリ科、アリウム属の各種、ナス科のメンバーおよびアカザ科のメンバー果実作物植物、例えばリンゴ、西洋ナシ、柑橘類の果物、核果類、バナナ、パイナップル、ブドウ、キーウィ、パパイヤ、アボカドおよびベリーならびに観賞用顕花植物、観賞用樹木、観賞用グランドカバーおよび観賞用草を含む観賞用植物であることができる。さらなる双子葉植物の例は、限定するものではないが、カノーラ、綿、ジャガイモ、キノア、アマランサス、ソバ、ベニバナ、ダイズ、テンサイおよびヒマワリを含み、より適切にはダイズ、カノーラおよび綿を含む。さらなる単子葉植物の例は、限定するものではないが、小麦、オートムギ、大麦、トウモロコシ、ライ麦、ライコムギ、米、観賞用および飼料草、ソルガム、ミレットおよびサトウキビを含む。植物宿主細胞は、以下の科の1つからの種を含む、単子葉植物または双子葉植物の植物または植物細胞系であることもできるし、それに由来することもできるキツネノマゴ科、ネギ科、ユリズイセン科、ヒガンバナ科、キョウチクトウ科、ヤシ科、キク科、メギ科、ベニノキ科、アブラナ科、パイナップル科、アサ科、ナデシコ科、イヌガヤ科、アカザ科、イヌサフラン科、Cucurbitaceae、ヤマノイモ科、マオウ科、コカノキ科、トウダイグサ科、マメ科、シソ科、アマ科、ヒカゲノカズラ科、アオイ科、メランチウム科、バショウ科、フトモモ科、ヌマミズキ科、ケシ科、マツ科、オオバコ科、イネ科、バラ科、アカネ科、ヤナギ科、ムクロジ科、ナス科、イチイ科、ツバキ科またはブドウ科。適切な種は、アベルモスクス属、アビエス属、アセル属、アグロスチス属、アリウム属、アルストロメリア属、アナナス属、アンドログラフィス属、アンドロポゴン属、アルテミシア属、アルンド属、アトローパ属、ベルベリス属、ベタ属、ビクサ属、ブラシカ属、カレンデュラ属、カメリア属、カンプトテカ属、カンナビス属、カプシクム属、カルタムス属、カタランサス属、ケファロタクスス属、クリサンセマム属、シンコナ属、キトルルス属、コフィア属、コルチカム属、コリウス属、ククミス属、ククルビタ属、キノドン属、ダツラ属、ダイアンサス属、ジギタリス属、ディオスコレア属、エラエイス属、エフェドラ属、エリアンサス属、エリスロキシルム属、ユーカリプタス属、フェスツカ属、フラガリア属、ガランツス属、グリシン属、ゴシピウム属、ヘリアンサス属、ヘベア属、ホルデウム属、ヒヨスチアムス属、ジャトロファ属、ラクツカ属、リナム属、ロリウム属、ルピナス属、リコペルシコン属、リコポディウム属、マニホット属、メディカゴ属、メンタ属、ミスカンツス属、ムサ属、ニコチアナ属、オリザ属、パニクム属、パパベル属、パルテニウム属、ペンニセツム属、ペチュニア属、ファラリス属、フレウム属、ピヌス属、ポア属、ポインセチア属、ポプルス属、ラウオルフィア属、リシヌス属、ロサ属、サッカルム属、サリクス属、サンギナリア属、スコポリア属、セカレ属、ソラヌム属、ソルガム属、スパルティナ属、スピナキア属、タナセタム属、タクサス属、テオブロマ属、トリチコセカレ属、トリチクム属、ウニオラ属、ベラトルム属、ビンカ属、ヴィティス属およびゼア属のメンバーを含むことができる。他の適切な種は、パニクム種、ソルガム種、ミスカンサス種、サッカルム種、エリアンサス種、ポプルス種、アンドロポゴンゲラルディイ、ペンニセツムプルプレウム、ファラリスアルンディナケア、キノドンダクティロン、フェスツカアルンディナケア、スパルティナペクティナタ、メディカゴサティウァ、アルンドドナックス、セカレケレアレ、サリクス種、ユーカリプタス種、トリチコセカレ小麦タイムライ麦、タケ、ヘリアンサスアンヌス、カルタムスティンクトリウス、ジャトロファクルカス、リキヌスコムムニス、エラエイスギネエンシス、リヌムウシタティッシムム亜麻仁油、ブラッシカユンケア、ベタブルガリス、マニホットエスクレンタ、リコペルシコンエクスレンタム、ラクツカサティバ、ムサパラディシアカ、ソラヌムツベロスム、ブラシカオレラシア、カメリアシネンシス、フラガリアアナナッサ、テオブロマカカオ、コフィアアラビカ、ヴィティスヴィニフェラ、アナナスコモサス、カプシクムアンヌウム、アリウムセパ、ククミスメロ、ククミスサティウス、ククルビタマクシマ、ククルビタモスカータ、スピナキアオレラケア、シトルルスラナタス、アベルモスクスエスクレンツス、Solanummelongena、ロサ種、ディアンツスカリオフィルス、ペチュニア種、ポインセチアプルケリマ、ルピナスアルブス、ウニオラパニクラータ、ベントグラス、ポプルストレムロイデス、ピヌス種、アビエス種、アセル種、ホルデウムウルガレ、ポアプラテンシス、ロリウム種およびフレウムプラテンセ、パニクムウィルガツム、ソルガムビカラー、ミスカンサスギガンテウス、サッカルム種、ポプルスバルサミフェラ、ゼアマイス、グリシンマックス、ブラッシカナプス、トリチクムアエスチウム、ゴシピウムヒルスツム、オリザサティバ、ヘリアンサスアンヌス、メディカゴサティウァ、ベタブルガリスまたはペンニセツムグラウクムを含むことができる。特に適切な実施形態において、植物宿主細胞は、天然に存在するタバコ植物、変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物であることもできるし、それらに由来することもできる。タバコ植物は、ニコチアナ属の植物であって、NルスチカおよびまたはNタバカムを含むニコチアナ属の種々の種を含む。他の種は、Nアカウリス、Nアクミナタ、Nアクミナタ変種マルチフロラ、Nアフリカナ、Nアラタ、Nアムプレキシカウリス、Nアレントシ、Nアテヌアタ、Nベナビデシ、Nベンサミアナ、Nビゲロビ、Nボナリエンシス、Nカビコラ、Nクレベランジ、Nコルジフォリア、Nコリンボサ、Nデブネイ、Nエクセルシオル、Nフォルゲチア、Nフラグランス、Nグラウカ、Nグルチノサ、Nグッドスピーディ、Nゴセイ、Nハイブリッド、Nイングルバ、Nカワカミ、Nナイチアナ、Nラングスドルフィ、Nリネアリス、Nロンギフロラ、Nマリチマ、Nメガロシホン、Nミエルシ、Nノクチフロラ、Nヌジカウリス、Nオブツシフォリア、Nオシデンタリス、Nオシデンタリス亜種ヘスペリス、Nオトホラ、Nパニクラータ、Nパウシフロラ、Nペツニオイデス、Nプルムバギニフォリア、Nクアドリバルビス、Nライモンジ、Nレパンダ、Nロスラタ、Nロスラタ亜種イングルバ、Nロツンジホリア、Nセトケリ、Nシムランス、Nソラニフォリア、Nスペガジニ、Nストクトニ、Nスアベオレンス、Nシルベストリス、Nタバカム、Nチルシフロラ、Nトメントサ、Nトメントシホルミス、Nトリゴノフィラ、Nアンブラチカ、Nアンドゥラタ、Nベルチナ、NウィガンジオイデスおよびNxサンデラエを含む。栽培品種もしくは優良栽培品種であるかまたはそれら由来である植物宿主細胞の使用も考えられる。限定するものではない変種または栽培品種の例は、BD64、CC101、CC200、CC27、CC301、CC400、CC500、CC600、CC700、CC800、CC900、Coker176、Coker319、Coker371Gold、Coker48、CD263、Denzizli、DF911、Galpaoタバコ、GL26H、GL350、GL600、GL737、GL939、GL973、HB04P、K149、K326、K346、K358、K394、K399、K730、KDH959、KT200、KT204LC、KY10、KY14、KY160、KY17、KY171、KY907、KY907LC、KTY14xL8LC、Karabaglar、LittleCrittenden、McNair373、McNair944、msKY14xL8、NarrowLeafMadole、NC100、NC102、NC2000、NC291、NC297、NC299、NC3、NC4、NC5、NC6、NC7、NC606、NC71、NC72、NC810、NCBH129、NC2002、NealSmithMadole、OXFORD207、Periqueタバコ、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R630、R711、R712、RG17、RG81、RGH51、RGH4、RGH51、RS1410、Speight168、Speight172、Speight179、Speight210、Speight220、Speight225、Speight227、Speight234、SpeightG28、SpeightG70、SpeightH6、SpeightH20、SpeightNF3、TI1406、TI1269、TN86、TN86LC、TN90、TN97、TN97LC、TND94、TND950、TRMadole、TurkishSamson、VA309、VA359、DAC、Mata、Fina、PO2、BY64、AS44、RG17、RG8、HB04P、BasmaXanthiBX2A、Coker319、Hicks、McNair944、Burley21、K149、YakaJB1253、KasturiMawar、NC297、Coker371Gold、PO2、Wislica、Simmaba、TurkishSamsun、AA371、B13P、交配種BU21xHojaParado97株からのF4、Samsun、PO1、LAB21、LNKY171、TI1406、Basma、Galpao、Beinhart10001またはPeticoである。Nタバカム栽培品種の限定するものではない例は、AA371、B13P、Xanthi、KTRD3ハイブリッド107、BelW3、79615、SamsunHolmesNN、KTRDC2ハイブリッド49、KTRDC4Hybrid110、Burley21、BY64、KTRDC5KY160SI、KTRDC7FCA、KTRDC6TN86SI、Coker371Gold、K149、K326、K346、K358、K394、K399、K730、KY10、KY14、KY160、KY17、KY8959、KY9、KY907、MD609、McNair373、NC2000、PG01、PG04、M066、PO1、PO2、PO3、RG11、RG17、RG8、SpeightG28、TN86、TN90、VA509、AS44、BanketA1、BasmaDramaB8431、BasmaIZichnaZP4B、BasmaXanthiBX2A、Batek、BesukiJember、C104、Coker319、Coker347、CriolloMisionero、DACMataFina、Delcrest、Djebel81、DVH405、GalpaoComum、HB04P、HicksBroadleaf、KabakulakElassona、KasturiMawar、KutsageE1、KY14xL8、KY171、LABU21、McNair944、NC2326、NC71、NC297、NC3、PVH03、PVH09、PVH19、PVH2110、RedRussian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar28、TurkishSamsun、Wislica、Yayaldag、NC4、TRMadole、PrilepHC72、PrilepP23、PrilepPB1561、PrilepP1221、YakaJK48、YakaJB1253、TI1068、KDH960、TI1070、TW136、SamsunNN、Izmir、Basma、TKF4028、L8、TKF2002、TN90、GR141、Basmaxanthi、GR149、GR153、PetitHavanaまたはXanthiNNである。植物宿主細胞は、組換えMISタンパク質の発現およびまたは活性を改善するように改変されることができる。宿主細胞は、例えば、MISの生成をさらに促進させるためにシャペロンタンパク質を含むように改変されることができる。宿主細胞は、MISの発現をより効率的に制御するためにリプレッサータンパク質をまたはさらには発現レベルを改善するためにエンハンサータンパク質を含むように改変されることができる。植物においてMISを産生する方法は、前記植物において、融合タンパク質としてのMISの発現を可能にする条件下で前記植物を生育させる第2工程を含む。従って、MISポリペプチドは、融合タンパク質として該ポリペプチドを発現させるのに適切な培養条件下で植物細胞をインキュベートすることによって製造される。得られたポリペプチドは、タンパク質顆粒の形態で植物細胞の小胞体内に発現される。MISの発現は、細胞内のMISポリペプチドをコードするmRNAの量を検出することによって測定でき、これは、例えば、PCRまたはノーザンブロットによって定量することができる。試料中のMISポリペプチドの量の変化を測定しようとする場合は、公知の技術を用い、抗MIS抗体の使用によるMISの検出を用いて、細胞内のMISポリペプチドの量を定量することができる。あるいは、MISの生物活性は、本明細書に記載されるように測定することができる。融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収するために、種々の方法を用いることができる。組換えタンパク質顆粒様集積体は、特定の融合タンパク質に関する所定の密度を有する。所定の密度は、一般的には、ホモジネート中に存在する内因性宿主細胞タンパク質の全部の密度を実質的に超え、一般的には約11~約135gmlである。このタンパク質顆粒の高密度は、多量体として集積し、蓄積する組換え融合タンパク質の一般的能力によるものであることができる。植物内で発現される場合、該タンパク質顆粒は、一般的には約1ミクロンの直径を有する球形の形状であり、周囲の膜を有する。密度によるタンパク質顆粒の回収は、一般的には、遠心機を用いて行われる。遠心分離は、密度勾配を与える溶質または糖の存在下で行うことができる。ホモジネート中に異なる密度の領域を形成して、比較的高い濃度のタンパク質顆粒を含む領域と、比較的低い濃度のタンパク質顆粒を含む領域とを得ることができる。タンパク質顆粒の少ない領域から比較的高い濃度のタンパク質顆粒を含む領域を分離して、前記融合タンパク質を回収することができる。本明細書に記載されるように、融合タンパク質を含むタンパク質顆粒の単離の前に、タンパク質顆粒を採取するか、または1以上の試薬で処理するか、または1以上の手順に供することができる。いくつかの実施形態において、採取したタンパク質顆粒は、融合タンパクの単離を必要とすることなく、そのまま用いられる。いくつかの実施形態において、1回の低速遠心分離工程で、ペレットの形態でタンパク質顆粒を十分に回収することができる。従って、例として、4°C、200xgで10分間の遠心分離で十分であることができる。他の実施形態において、低速遠心分離工程を1以上の高速遠心分離工程と組み合わせた2以上の遠心分離工程を行うことができる。従って、例として、固形物および細胞の破片を除去するための4°C、約200xgで10分間の遠心分離工程と、融合タンパク質をペレットに回収するための、例えば4°C、約6000xgで10分間の高速遠心分離工程とを組み合わせることができる。この遠心分離工程は、場合により、次に、タンパク質顆粒の可溶化の前に、融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を濃縮および富化するために、さらなる任意の遠心分離工程と共に、界面活性剤を含む溶液での1以上の洗浄工程を行うことができる、さらなる任意の遠心分離工程は、洗浄の合間に行うことができる。一実施形態において、用いられる界面活性剤はトリトンX100であり、適切には1トリトンX100である。他の実施形態において、さらなる遠心分離工程が4°C、約6000xgで10分間行われ、これは洗浄の合間に行うことができる。従って、本発明の一実施形態によれば、本方法は、植物または植物材料から融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収するさらなる工程であって、前記工程は、好ましくは、植物材料をホモジナイズする工程ホモジナイズした植物材料を、低速、好ましくは約200xgで遠心分離する工程ホモジナイズした植物材料を工程よりも高速、好ましくは、約6000xgで遠心分離する工程融合タンパク質を含むタンパク質顆粒をペレット分画に回収する工程を含む。融合タンパク質を可溶化するために、種々の緩衝液および試薬を用いることができる。例として、洗剤およびまたは還元剤を含む水性緩衝液に周囲の膜を溶出することによって、採取したタンパク質顆粒からMISを含む融合タンパク質を得ることができる。還元剤の例は、2メルカプトエタノール、チオグリコール酸、チオグリコール酸塩、ジチオスレイトール、亜硫酸塩または亜硫酸水素イオンを含む。洗剤の例は、ドデシル硫酸ナトリウム、イオン性洗剤、非イオン性洗剤ならびに双性イオン洗剤を含む。結合したMISタンパク質を破壊しアンフォールドしないように条件が選択される。適切な可溶化条件を見出すために試験することができる変数は、pH、塩、洗剤、還元剤ならびに他の変数例えば、成分比、時間および温度を含む。一実施形態において、尿素、ジチオスレイトールおよびトリスホスフィンを含む緩衝液を用い、適切には110のタンパク質顆粒緩衝液比で可溶化を行うことができる。タンパク質顆粒は、終夜室温で緩衝液と共にインキュベートすることもできるし、かつまたは細胞破砕機と共にインキュベートすることもできる。緩衝液の所望のpHに応じて、種々の緩衝液を用いることができる。pH範囲を調節するために用いることができる緩衝液成分の限定するものではない例は、アセタート、シトラート、ヒスチジン、ホスファート、アンモニウム緩衝液、例えば酢酸アンモニウム、スクシナート、MES、CHAPS、MOPS、MOPSO、HEPES、トリスなど、ならびにこれらのトリスリンゴ酸NaOHの組み合わせ、マレアート、クロロアセタート、ホルマート、ベンゾアート、プロピオナート、ピリジン、ピペラジン、ADA、PIPES、ACES、BES、TES、トリシン、ビシン、TAPS、エタノールアミン、CHES、CAPS、メチルアミン、ピペリジン、ホウ酸、炭酸、乳酸、ブタネアン二酸、ジエチルマロン酸、グリシルグリシン、HEPPS、HEPPSO、イミダゾール、フェノール、POPSO、コハク酸、TAPS、アミンベースのベンジルアミン、トリメチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、フェニルアミン、エチレンジアミンまたはモホリンを含む。一実施形態において、緩衝液はpH約9を含む。他の実施形態において、緩衝液は、TCEP、DTTおよび尿素を含む50mMトリスpH9である。他の実施形態において、緩衝液は、約5mMTCEP、約50mMDTTおよび約4M尿素を含む50mMトリスpH9である。従って、本発明の方法は、融合タンパク質を可溶化するさらなる工程であって、前記可溶化工程は、好ましくは、尿素、ジチオスレイトールおよびホスフィンを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる混合物の使用を含むを含むことができる。場合により、調製物は、次の方法工程の前に、例えば20000xgで10分間遠心分離されることができる。MISタンパク質を含む、分離され、可溶化された融合タンパク質が採取される。この工程で、MISタンパク質は、そのまま用いることができる。好ましくは、MISタンパク質は、さらに処理される。従って、一実施形態において、本方法は、前記融合タンパク質からMISを放出するさらなる工程を含む。融合タンパク質からのMISの分離は、本明細書に記載されている。他の実施形態において、融合タンパク質からのMISの分離に続いて、本方法は、切断放出されたMISタンパク質を精製するさらなる工程を含む。従って、一実施形態において、このように精製された組換えMISは、例えばSDSPAGEまたはELISAによって測定される他のポリペプチドを実質的に含まない。他の実施形態において、精製されたMISは、例えばSDSPAGEまたはELISAによって測定された100ppm未満の宿主タンパク質、適切には90ppm未満、80ppm未満、70ppm未満、60ppm未満、50ppm未満、40ppm未満、30ppm未満、20ppm未満、10ppm未満または5ppm未満の宿主タンパク質を含むMIS組成物であるとみなされる。本発明によって得られた、または得られるMISタンパク質は、その配列が由来する天然タンパク質の比活性の少なくとも50、60または70、そして最も適切には少なくとも80、90、95または100の比活性を有することができる。タンパク質精製は、負に荷電し、吸着剤または固相を横切るまたは通過する水溶液中のカチオンとの交換のための遊離カチオンを有する陽イオン交換樹脂を用いることができる。下記のように、陽イオン交換樹脂を形成するのに適切な任意の負に荷電したリガンド、例えばカルボキシラート、スルホナートなどを用いることができる。市販陽イオン交換樹脂は、限定するものではないが、例えば、スルホナートベースの基を有する樹脂、SPSepharoseHighPerformance、Tosoh社製のToyopearlSP650SおよびSP650M、BioRad社製のMacroPrepHighS、PallTechnologies社製のCeramicHyperDS、TrisacrylMおよびLSSPおよびSpherodexLSSPスルホエチルベースの基を有する樹脂スルホプロピルベースの基を有する樹脂スルホキシエチルベースの基を有する樹脂、カルボキシメチルベースの基を有する樹脂スルホン酸およびカルボン酸ベースの基を有する樹脂カルボン酸ベースの基を有する樹脂スルホン酸ベースの基を有する樹脂ならびにオルトリン酸塩ベースの基を有する樹脂を含む。タンパク質精製には、正に荷電し、従ってそれに結合した1以上の正に荷電したリガンドを有する陰イオン交換樹脂を用いることができる。吸着剤または固相に結合した、陰イオン交換樹脂を形成するのに適切な任意の正に荷電したリガンド、例えば第四級アミノ基を用いることができる。市販の陰イオン交換樹脂は、AppliedBiosystems社製のDEAEセルロース、PorosPI20、PI50、HQ10、HQ20、HQ50、D50、Sartorius社製のSartobindQ、のMonoQ、MiniQ、Source15Qおよび3OQ、Q、DEAEおよびANXSepharoseFastFlow、QSepharosehighPerformance、QAEHADEXおよびFASTQSepharose、JTBaker社製のWPPEI、WPDEAM、WPQUAT、BiochromLabs社製のHydrocellDEAEandHydrocell、Biorad社製のUNOsphereQ、MacroPrepDEAEおよびMacroPrepHighQ、PallTechnologies社製のCeramicHyperDQ、ceramicHyperDDEAE、TrisacrylMandLSDEAE、SpherodexLSDEAE、QMASpherosilLS、QMASpherosilMおよびMustangQ、DowLiquidSeparations製のDOWEXFineMeshStrongBaseTypeIおよびTypeIIAnionResinsおよびDOWEXMONOSPHERE77、ミリポア社製のInterceptQ膜、MatrexCellufmeA200、A500、Q500およびQ800、EMD社製のFractogelEMDTMAE、FractogelEMDDEAEおよびFractogelEMDDMAE、SigmaAldrich社製のAmberiiteweakstronganionexchangerstypeIandII、DOWEXweakandstronganionexchangerstypeIandII、DiaionweakandstronganionexchangerstypeIandII、Duolite、Tosoh社製のTSKゲルQおよびDEAE5PWおよび5PWHR、ToyopearlSuperQ650S、650Mおよび650C、QAE550Cおよび650S、DEAE650Mおよび650C、Whatman社製のQA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、ExpressIonDおよびExpressIonQを含む。アフィニティークロマトグラフィーは、通例、空間的相補性および結合部位における1以上のタイプの化学的相互作用、例えば、静電力、水素結合、疎水性力およびファンデルワールス力の組み合わせでタンパク質が生物学的に特異的なリガンドに可逆的かつ特異的に結合する分離技術のことを言う、タンパク質精製のもう1つの方法である。これらの相互作用は、例えば等電点、疎水性またはサイズなどの分子の一般的特性によるものではなく、タンパク質とリガンドとの間の特異的相互作用、例えばエピトープに対する免疫グロブリン結合、免疫グロブリンに対するプロテインA結合、生物学的反応修飾剤とその細胞表面受容体との間の相互作用の結果によるものである。多くの場合、生物学的に特異的なリガンドはまた、タンパク質またはポリペプチドであり、固相、例えばビーズに固定されることができる。混合モードイオン交換樹脂は、タンパク質精製のもう1つの方法であり、陽イオン部分、陰イオン部分または疎水性部分で共有結合的に改変された固相のことを言う。混合モードイオン交換樹脂の例は、BAKERBONDABX、セラミックヒドロキシアパタイトタイプIおよびIIならびにフルオリドヒドロキシアパタイトならびにMEPおよびMBIHyperCelを含む。疎水性電荷誘導クロマトグラフィーは、混合物中のタンパク質が、添加塩の非存在下で弱い疎水性相互作用によって、イオン化可能なリガンドに結合する混合モードクロマトグラフィープロセスの1つのタイプである。混合モードは、結合のためのあるモードおよび溶離のためのもう1つのモードのことをいう。例えば、HCICに有用な固相は、その分離能力のために、チオフィリック作用の特性を組み合わせたリガンドである疎水性基およびイオン化可能基を含む。従って、本発明の方法に用いる吸着剤は、中性または弱酸性のpH、例えばpH約5~10、好ましくはpH約6~95でイオン化可能であり、弱い疎水性のリガンドを含む。このpHでは、リガンドは主に非荷電性であり、弱い非特異的疎水性相互作用によってタンパク質に結合する。pHが低下すると、そのpHシフトによる溶質に対する帯電反発によって、リガンドは電荷を獲得し、疎水性結合は破壊される。HCICに使用するための適切なリガンドの例は、任意のイオン化可能な芳香族または複素環構造抗体クロマトグラフィーマトリックスに組換えMISを結合させる工程であって、ここで前記抗体はMISに特異的である前記工程アルカリ金属ハリド溶液であって、キレート剤の有効量を含む前記溶液の有効量を前記マトリックスに加えることによって、混在するMISタンパク質分解活性を有する酵素またはMIS抗増殖活性の阻害薬を実質的に除去する工程、約25~40のpHを有する酸溶液で溶出することによって組換えMISを回収する工程を含むMISの精製法を記載している。一実施形態において、植物においてMISを産生する方法は、植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導するタンパク質をコードする第1核酸配列であって、場合により、天然に存在しない反復配列モチーフをコードする核酸配列をさらに含む前記核酸配列、第2核酸配列をコードするMISおよび場合により、アミノ酸リンカーをコードする第3核酸配列であって、配列中のペプチド結合が特異的に切断されることができる前記第3核酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる核酸構築物であって、前記第1、第2および第3核酸配列が互いに作動可能に連結されている前記核酸構築物が導入された植物をインキュベートする工程、前記植物において、融合タンパク質としてのMISの発現を可能にする条件下で前記植物をインキュベートする工程植物から融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収する工程融合タンパク質を含むペレット分画を可溶化する工程前記融合タンパク質からMISを放出させる工程放出されたMISタンパク質を精製する工程を含む。さらなる側面は、本明細書に記載されるように、前記核酸配列および、前記核酸配列の転写を制御する制御ヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関する。該構築物は、1以上のMIS核酸を含む、二本鎖の組換えDNA断片であることができる。さらなる側面は、核酸配列、核酸分子または核酸構築物を含むベクターに関する。適切なベクターは、限定するものではないが、染色体外複製が可能なエピゾーム、例えば環状二本鎖DNAプラスミド線状化二本鎖DNAプラスミドおよび任意の起源の他のベクターを含む。該ベクターは、細菌の形質転換およびまたは植物への導入に適したベクターを含む。本明細書に記載の核酸配列、核酸分子または構築物を含むベクターは、細胞に導入されたとき、前記細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体に加えて複製されるプラスミド、コスミドまたは植物ベクターであることができる。基本的な細菌または植物ベクターは、適切には、広宿主域複製起点選択マーカーおよび、アグロバクテリウムによる形質転換のために、アグロバクテリウムによる植物染色体への導入のためのTDNA配列を含む。異種配列の植物ゲノムへの組み込みを可能にするのに適した配列もまた用いることができる。これらには、トランスポゾン配列など、Crelox配列および相同組換えのための宿主ゲノム断片ならびに植物ゲノムへのランダム挿入を可能にするTi配列を含むことができる。本明細書に記載の融合タンパク質を発現するのに特に有用であることができる発現ベクターを作成するために、プロモーターをベクターに組み込むことができる。適切な発現ベクターは、染色体外複製が可能なエピゾーム、例えば環状二本鎖DNAプラスミド線状化二本鎖DNAプラスミドおよび他の機能的に同等な任意の起源の発現ベクターを含む。発現ベクターは、MIS核酸またはMIS核酸構築物などに作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む。プロモーターは、MIS核酸に直接に結合されることもできるし、中間にある介在核酸、例えば融合タンパク質の1以上の成分をコードする核酸であることもできる。核酸配列、核酸構築物、核酸ベクターなどの製造において、それらの種々の断片を、種々の処理条件、例えばライゲーション、制限酵素消化、PCR、invitro変異誘発、リンカーおよびアダプター付加などに供することができる。従って、MISの発現のための構築物に用いられるDNAに、ヌクレオチド移行、塩基転換、挿入、欠失などを行うことができる。制限酵素消化、クレノウ平滑末端処理、ライゲーションなどのための方法は、当業者に公知であり、例えばManiatisらColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYに記載されている。他の側面において、植物においてタンパク質顆粒の生成を誘導するタンパク質をコードするアミノ酸配列であって、場合により、天然に存在しない反復配列モチーフをコードするアミノ酸配列をさらに含む前記アミノ酸配列場合により、リンカーをコードするアミノ酸配列であって、配列中のペプチド結合が特異的に切断されることができる前記アミノ酸配列およびMISをコードするアミノ酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる融合タンパク質が記載される。融合タンパク質は、植物細胞における、本明細書に記載の核酸配列または核酸分子の発現産物である。融合タンパク質は、植物細胞内の安定な小胞体由来タンパク質顆粒に蓄積される。他の側面において、本明細書に記載の核酸配列、核酸構築物、ベクターまたは融合タンパク質を含む植物または植物材料が記載される。他の側面において、本発明の方法によって入手されるかまたは入手可能なMISが記載される。本発明によって入手されるかもしくは入手可能な組換えMISまたはMISを含み、所望の純度を有するタンパク質顆粒の凍結乾燥製剤または水溶液の形態の製剤は、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を参照のことと混合することによって、貯蔵のために調製することができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる用量および濃度でレシピエントに毒性がなく、緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤防腐薬低分子量ポリペプチドタンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン親水性ポリマー、例えばオリビニルピロリドンアミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジングルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物キレート剤、例えばEDTA糖、例えばショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール塩形成性対イオン例えばナトリウム金属錯体または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコールを含む。組換えMISタンパク質はまた、公知の方法を用いてPEG化することもできるし、ポリエチレングリコールに結合させることもできる。PEG化MISタンパク質は、invivoでより安定であることができ、治療を必要とする哺乳動物に投与されるとき、体内でより長い半減期をもたらす。一般に、他の薬学的に重要なポリペプチドに用いる方法と同様な方法を用いて医薬組成物を処方し、投与することができる。組換えMISタンパク質は、凍結乾燥形で保存され、投与の直前に滅菌水で再構成され、静脈内に投与されることができる。好ましくは、医薬製剤は、治療される特定の状態のためのルーチン用量滴定実験によって決定される用量で投与される。以下の実施例は例として提供されるものであり、限定のために提供されるものではない。特記しない限り、本発明は、分子生物学、植物生物学および植物育種の慣用法および方法を用いる。材料および方法クローニングおよびインフィルトレーションγゼイン野生型遺伝子、その断片およびバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、それぞれ成熟MISをコードする合成配列に連結される。γゼインの断片またはバリアントが用いられる場合、その断片またはバリアントに天然γゼインシグナルペプチドが存在するとき、該核酸構築物は、さらに、その5’末端に天然γゼインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実験に関して、その構築物中にγゼインとMISコード配列の間に位置する、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーをコードする合成核酸配列もまた含まれる。成熟MISのコード配列は、植物における発現のために最適化された。核酸構築物は、タバコ植物細胞における核酸構築物の発現をmin35Sプロモーターが促進する部位で、ベクターにクローニングされる。クローニングされる核酸構築物を含むベクターは、アグロバクテリウムツマファキエンスAgl1株に導入される。アグロバクテリウム細胞は、ロータリーシェーカー上でOD600が16を超えるまで、28°C、250rpmで増殖される。増殖後、細菌を、4°C、8’000gで15分間遠心分離することによって採取し、10mMMgCl2および5mMエタンスルホン酸、MESを含むインフィルトレーション溶液に再懸濁し、最終的にpHを56、OD600を2にする。植物は、通常条件下で生育され、個々の葉は、シリンジを用い、標準法によってインフィルトレーションされる。木の葉を注意深く逆さにし、背軸面を暴露し、細菌懸濁液を含む1mL無針シリンジを用いて、その葉の細胞内スペースに圧力でインフィルトレーションする。インフィルトレーション後6日から10日で、熱シールポーチ中にリーフディスクを採取し、シールし、ドライアイス層の間に少なくとも10分間置く。組換えタンパク質の抽出タバコ葉を液体窒素中で粉砕し、抽出緩衝液および任意のプロテアーゼインヒビターLロイシルアグマチンを用いてホモジナイズする。ホモジネートを4°Cで20分間撹拌し、次いで遠心分離する。この材料を、Miraclothで重力によって濾過し、次いで遠心分離し、続いてさらに遠心分離する。ペレット分画を1トリトンX100で洗浄し、20分間撹拌する。ウェスタンブロット分析15SDSポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分離し、セミドライ装置を用いてニトロセルロース膜に移行させる。膜をγゼイン特異的抗体PlantSci414148と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗体と共にインキュベートする。免疫反応性バンドを増強化学発光によって検出する。ELISAアッセイ可溶性葉タンパク質抽出物についてのMISの定量のためにELISAアッセイを行い、融合タンパク質を部分精製する。マイクロタイタープレートに、リン酸緩衝化生理食塩水pH75で希釈した可溶性タンパク質を負荷し、終夜4°Cでインキュベートする。ウェルを3回洗浄後、PBSTによる3ウシ血清アルブミンを用い、室温で1時間特異的結合をブロックする。このプレートをMIS抗血清と共に2時間インキュベートし、PBSTで4回洗浄した後、ペルオキシダーゼ共役二次抗体と共に2時間インキュベートする。一次抗体および二次抗体を1BSAを含むPBSTで希釈する。PBSTでよく洗浄した後、過酸化水素を含む基質緩衝液を用い、37°Cで酵素反応を行う。10分後に2N硫酸を用いてこの反応を停止させ、MultiskanEX分光光度計を用いて450nmで吸光度を測定する。MIS抗血清を用いて得た検量線から、植物抽出物中の抗原濃度を外挿する。融合タンパク質の可溶化可溶化のために選択された緩衝液中、終夜室温で融合タンパク質をインキュベートする。融合タンパク質の切断切断のために、消化用緩衝液30マイクロリットル中で切断剤と共に融合タンパク質を30°Cで3時間インキュベートする。18トリストリシンポリアクリルアミドゲル電気泳動で消化産物を分析し、放出されたMISをイムノブロットによって検出する。放出されたMISの精製MISタンパク質を20mMトリスHClpH86に再懸濁し、PD10カラムで脱塩する。RESOURCERPC3mlカラムを備えたAKTAExplorerを用いて、高速逆相タンパク質液体クロマトグラフィーによって脱塩したタンパク質抽出物を分画する。2アセトニトリル、01TCAおよび20mMβメルカプトエタノールを含む第1緩衝液ならびに80アセトニトリル、01TCAおよび20mMβメルカプトエタノールを含む第2緩衝液を用いる。流速を2ml分に調整し、0~60の緩衝液10CVならびに60~100の緩衝液20mCVの勾配を用いた。1ml05mlの容量で分画を溶出する。溶離分画におけるMISの存在は、15SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動および、MIS抗血清を用いるイムノブロット検出によって評価する。陽性分画を脱塩し、5KNMWL遠心濾過機で濃縮する。MISγゼイン融合タンパク質の発現レベルアグロバクテリウムによるアグロインフィルトレーションを用いてタバコ植物にγゼインエンテロキナーゼMIS融合タンパク質構築物を導入する。総タンパク質を抽出し、γゼイン特異的抗体を用いるウェスタンブロットによって定量する。γゼインを含まない同一条件下で発現したMISを用いる対照実験もまた実施する。4つのアグロインフィルトレーション事象の平均からの発現レベルは次のとおりである。γゼインMISに関しては、発現レベルは約02~06gγゼインMISkg新鮮重である。γゼインを含まないMISに関しては、発現レベルは、約01~03gγゼインMISkg新鮮重である。これらの平均結果に基づけば、γゼインを含まない発現レベルよりは、γゼインMISの発現が約30高いということが結論される。γゼインにおいて天然に存在しない種々のリピートモチーフの分析γゼインにおいて天然に存在しない種々のリピートモチーフを用いてγゼインMIS融合構築物を製造する。以下の構築物試験するγゼインペプチドのみnリピートモチーフを含むγゼインnリピートモチーフを含むγゼインnリピートモチーフを含むγゼインおよびnリピートモチーフを含むγゼイン。アグロバクテリウムによるアグロインフィルトレーションを用いて、種々のタバコ植物に構築物を別々にインフィルトレーションする。総タンパク質を抽出し、γゼイン特異的抗体を用いるウェスタンブロットによって定量する。γゼインwtに対する2つのアグロインフィルトレーション事象の平均からの発現レベルは次のとおりである。試験した5つの構築物のうち3つnおよびγゼインnは、γゼインwt単独と比較して、発現レベルが顕著に増加している。C末端MISを用いる種々のγゼインリピートモチーフの分析構築物のC末端にMISを有するγゼインにおいて、種々の天然に存在しないリピートモチーフを用いてγゼインMIS融合構築物を製造する。以下の構築物を用いるγゼインペプチドのみnリピートモチーフを含むγゼインnリピートモチーフを含むγゼインnリピートモチーフを含むγゼインおよびnリピートモチーフを含むγゼイン。アグロバクテリウムによるアグロインフィルトレーションを用い、種々のタバコ植物に構築物を別々にインフィルトレーションする。総タンパク質を抽出し、γゼイン特異的抗体を用いるウェスタンブロットによって定量する。γゼインwtに対して、4つのアグロインフィルトレーション事象の平均からの相対的発現は次のとおりであるトランスジェニックタバコ植物の葉からMIS融合タンパク質の可溶性抽出物を得、次いで低速で遠心分離する。沈殿したタンパク質を緩衝液に再懸濁し、可溶化する。γゼインwtに対する可溶化後の収量は次のとおりであるγゼインn、γゼインn、γゼインnおよびγゼインnはMISの発現レベルを顕著に増加させる。低速遠心分離後のペレットにおけるタンパク質の回収によってみられるように、上清においてタンパク質の明らかな損失が見られないことから、すべての構築物は、密な構造での融合タンパク質の蓄積を可能にする。本実験において、γゼインnMISは、最も良い収量をもたらす。融合タンパク質を含むタンパク質顆粒の回収γゼインnMISおよびγゼインnMIS融合タンパク質顆粒を回収するために、以下の方法を用いる。タバコ葉を液体窒素中で粉砕し、抽出緩衝液および任意のプロテアーゼインヒビターLロイシルアグマチンを用いてホモジナイズする。ホモジネートを20分間撹拌し、20分間遠心分離し、20分間撹拌する。この混合物を、Miraclothの1層を介し、重力によって濾過する。さらなる遠心分離工程で固形物および細胞の破片を除去し、次いで第2遠心分離工程によってペレットに融合タンパク質を回収する。これに続いて、1トリトンX100で2回洗浄し、20分間撹拌し、次いで、さらなる遠心分離工程を行う。この方法もまた、タンパク質顆粒の濃縮および富化を可能にする。融合タンパク質の可溶化融合タンパク質を可溶化するために、種々のセットの緩衝液を試験する。試験される変数は、pH、塩、洗剤、尿素、還元剤、比率、時間および温度を含む。γゼインGluMISおよびγゼインPAPAMISタンパク質顆粒を可溶化するために本実験で見出される条件セットは、タンパク質顆粒緩衝液の比率が110での50mMトリスpH9、約5mMTCEP、約50mMDTTおよび約4M尿素を含む緩衝液である。タンパク質顆粒は、終夜室温で、緩衝液と共にインキュベートされる。融合タンパク質の切断MISのN末端で余分なアミノ酸を残すことなくMISを切断するために、種々様々な切断剤を分析する。30°C、50mMトリスpH80、05mMEDTA、1mMDTTおよび02切断剤中で3時間、切断が行われる。試験される切断剤は、エンテロキナーゼ、プラスミン、TEVプロテアーゼおよびインテインを含む。本実験において、TEVプロテアーゼは、MISタンパク質上に余分なアミノ酸を残すことなく、5リンカーを用いる試験される構築物中の正しい位置で切断することが見出される。構築物はまた、天然に存在しない配列モチーフであるPAPAまたはGluを含む。融合タンパク質からのMISの首尾よい分離のために、マイコバクテリウムゼノピジャイレースAインテインもまた用いられる。切断MISタンパク質の精製MISに関して所望のレベルの純度をもたらす方法を見出すために、種々のクロマトグラフ法を試験する。以下の条件下で、高速逆相タンパク質液体クロマトグラフィーを用いてMISを精製する。CVカラム体積。図1に示すように、溶離分画をSDSPAGEで分析する。精製されたMISの分画が得られる。MISアッセイ例えば、すべての植物生成試料の生物活性に関してスクリーニングするために、MISに関する標準的器官培養バイオアッセイ131291296を用いて、生物活性に関してMISをアッセイし、その結果を、CHO細胞45685698から分泌される精製されたMISと比較することができる。簡潔に言えば、10雌ウシ胎児血清および試験される試料を含むMISを含む強化CMRL1066培地上の寒天コーティングされたステンレススチールグリッドに雌胎児ラット泌尿生殖器隆腺を置く。インキュベーション3日後、試料を15ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、8mm連続切片を作り、染色し、グレード0からグレード5までスコアを付ける。本明細書に引用または記載したすべての文献は、本願の出願日以前に開示された関連情報を提供する。ここでの記載は、本発明者が、そのような開示に先行しないものと認めるものとして解釈してはならない。上記の明細書に記載のすべての公報は、参照により本願に組み込まれる。本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく、種々の改変および本発明の変形が可能であることは当業者に明らかであろう。特定の好ましい実施形態と関連して本発明を詳細に説明してきたが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、本発明を実施するための記載されたモードの種々の改変は、細胞、分子および植物生物学または関連分野の当業者には明らかであり、以下の請求項の範囲内であるものとする。配列の概要配列番号1植物における発現に最適化されたヒト成熟MISのヌクレオチド配列tcagctggtgctaccgctgctgatgggccttgcgccttgagggagttatctgtggacctgcgagcagaaaggtcagttctaatacctgagacttatcaagcaaacaattgtcaaggtgtctgcggttggccccaaagtgataggaatccacgttatggtaaccatgtagttcttctcttgaaaatgcaagctcgtggtgctgccctagctcgaccaccctgttgtgttcctacagcctacgccggaaagttacttatcagtttatcagaagaaagaatcagtgctcaccacgttcctaatatggtcgctacagagtgtggatgcagataa配列番号2植物における発現に最適化されたヒト成熟MISのタンパク質配列SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR配列番号3ゼアマイスγゼインのDNA配列1gcaccagtttcaacgatcgtcccgcgtcaatattattaaaaaactcttacatttctttat61aatcaacccgcactcttataatctcttctctactactataataagagagtttatgtacaa121aataaggtgaaattatgtataagtgttctggatattggttgttggctccatattcacaca181acctaatcaatagaaaacatatgttttattaaaacaaaatttatcatatatcatatatat241atatatacatatatatatatatatataaaccgtagcaatgcacgggcatataactagtgc301aacttaatacatgtgtgtattaagatgaataagagggtatccaaataaaaaacttgttcg361cttacgtctggatcgaaaggggttggaaacgattaaatctcttcctagtcaaaattgaat421agaaggagatttaatctctcccaatccccttcgatcatccaggtgcaaccgtataagtcc481taaagtggtgaggaacacgaaacaaccatgcattggcatgtaaagctccaagaatttgtt541gtatccttaacaactcacagaacatcaaccaaaattgcacgtcaagggtattgggtaaga601aacaatcaaacaaatcctctctgtgtgcaaagaaacacggtgagtcatgccgagatcata661ctcatctgatatacatgcttacagctcacaagacattacaaacaactcatattgcattac721aaagatcgtttcatgaaaaataaaataggccggacaggacaaaaatccttgacgtgtaaa781gtaaatttacaacaaaaaaaaagccatatgtcaagctaaatctaattcgttttacgtaga841tcaacaacctgtagaaggcaacaaaactgagccacgcagaagtacagaatgattccagat901gaaccatcgacgtgctacgtaaagagagtgacgagtcatatacatttggcaagaaaccat961gaagctgcctacagccgtctcggtggcataagaacacaagaaattgtgttaattaatcaa1021agctataaataacgctcgcatgcctgtgcacttctccatcaccaccactgggtcttcaga1081ccattagctttatctactccagagcgcagaagaacccgatcgacaccatgagggtgttgc1141tcgttgccctcgctctcctggctctcgctgcgagcgccacctccacgcatacaagcggcg1201gctgcggctgccagccaccgccgccggttcatctaccgccgccggtgcatctgccacctc1261cggttcacctgccacctccggtgcatctcccaccgccggtccacctgccgccgccggtcc1321acctgccaccgccggtccatgtgccgccgccggttcatctgccgccgccaccatgccact1381accctactcaaccgccccggcctcagcctcatccccagccacacccatgcccgtgccaac1441agccgcatccaagcccgtgccagctgcagggaacctgcggcgttggcagcaccccgatcc1501tgggccagtgcgtcgagttcctgaggcatcagtgcagcccgacggcgacgccctactgct1561cgcctcagtgccagtcgttgcggcagcagtgttgccagcagctcaggcaggtggagccgc1621agcaccggtaccaggcgatcttcggcttggtcctccagtccatcctgcagcagcagccgc1681aaagcggccaggtcgcggggctgttggcggcgcagatagcgcagcaactgacggcgatgt1741gcggcctgcagcagccgactccatgcccctacgctgctgccggcggtgtcccccactgaa1801gaaactatgtgctgtagtatagccgctggctagctagctagttgagtcatttagcggcga1861tgattgagtaataatgtgtcacgcatcac配列番号4配列番号3の翻訳されたアミノ酸配列MRVLLVALALLALAASATSTHTSGGCGCQPPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHVPPPVHLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQLQGTCGVGSTPILGQCVEFLRHQCSPTATPYCSPQCQSLRQQCCQQLRQVEPQHRYQAIFGLVLQSILQQQPQSGQVAGLLAAQIAQQLTAMCGLQQPTPCPYAAAGGVPH配列番号5γゼインの断片のアミノ酸配列MRVLLVALALLALAASATSTHTSGGCGCQPPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHVPPPVHLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ配列番号6nのアミノ酸配列APAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPA配列番号7nのアミノ酸配列EPAPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPE配列番号8nのアミノ酸配列VELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVEVPPPVE配列番号9nのアミノ酸配列VALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVAVPPPVA配列番号10nのアミノ酸配列VTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTVPPPVT配列番号11nのアミノ酸配列PPPAPAPPPAPAPPPAPCPCPAPAPPPCP配列番号12nのアミノ酸配列PPPEPEPPPEPEPPPEPCPCPEPEPPPCP