"本願明細書に記載された発明。配列決定を必要とすることなくサブタイプ内遺伝的分岐をまた与え得る、HCV遺伝子型分類およびサブタイプ分類のための正確な信頼できるアッセイを開発すること。本発明は、例えば、上記課題を解決するために、以下の手段を提供する。項目1配列番号1に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。項目2配列番号2に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。項目3配列番号3に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。項目4配列番号4に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。項目5配列番号5に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。項目6配列番号6に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。項目7配列番号7に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。項目8配列番号8に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。項目9配列番号9に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。項目10センスプライマーが配列番号1からなり、そしてアンチセンスプライマーが、配列番号2、配列番号3、配列番号4、および配列番号5からなる群より選択される、PCRプライマー対。項目11アンチセンスプライマーが配列番号6からなり、そしてセンスプライマーが、配列番号7、配列番号8、および配列番号9からなる群より選択される、PCRプライマー対。項目12HCV株のHCV遺伝子型を決定する方法であって、以下の工程:a該HCV株を、1段階以上のPCRに供する工程であって、ここで該1段階以上のPCRが、HCVゲノムのコアまたはE1領域由来のセンスプローブおよびHCVゲノムのコアまたはE1領域由来のアンチセンスプローブを利用する、工程;b工程aで得られた増幅産物の混合物と、既知のHCV遺伝子型のDNAまたはRNAフラグメントとを変性および再アニールすることにより、ヘテロ二本鎖を形成する工程;cサイズにより分離する系において該ヘテロ二本鎖の移動度と、既知遺伝子型のDNAまたはRNAフラグメントのホモ二本鎖の移動度とを比較して、該HCV株の遺伝子型を決定する工程を包含する、方法。項目13項目12に記載の方法であって、ここで前記HCV株が、2段階のPCRに供され、第1のセットのプライマーが、前記HCVゲノムのコアまたはE1領域由来のユニバーサルセンスプローブおよび前記HCVゲノムのコアまたはE1領域由来の型特異的アンチセンスプローブを含み、そして第2のセットのPCRプライマーが、前記HCVゲノムのコアまたはE1領域由来のユニバーサルアンチセンスプローブおよび前記HCVゲノムのコアまたはE1領域由来の型特異的センスプローブを含む、方法。項目14項目12に記載の方法であって、ここで前記第1のセットのPCRプライマーが項目10に記載のプライマーであり、そして前記第2のセットのPCRプライマーが項目11に記載のプライマーである、方法。項目15前記既知の遺伝子型のDNAまたはRNAフラグメントがDNAプローブを含む、項目12に記載の方法。項目16前記プローブが一本鎖である、項目15に記載の方法。項目17前記DNAプローブが放射標識される、項目16に記載の方法。項目18前記一本鎖DNAプローブがPCR増幅により得られる、項目16に記載の方法。項目19項目18に記載の方法であって、ここで前記DNAプローブが、前記第1の段階に項目10に記載のプライマーおよび前記第2の段階に項目11に記載のプライマーを利用する2段階PCR増幅により得られる、方法。項目20前記HCV株が前記ヘテロ二本鎖を形成する混合物中に過剰に存在する、項目12に記載の方法。項目21HCV株の薬物治療に対する応答を、該HCV株に感染した患者から予測する方法であって、既知のHCV遺伝子型の該薬物治療に対する感受性を決定する工程、項目12に記載の方法により該HCV株の該HCV遺伝子型を決定する工程、および該薬物治療前の該株の該HCV遺伝子型と、該薬物治療に対する既知のHCV遺伝子型の該感受性とを比較する工程を包含する、方法。項目22HCV株の治療ワクチンに対する応答を、該HCV株に感染した患者から予測する方法であって、既知のHCV遺伝子型の該治療ワクチンに対する感受性を決定する工程、項目12に記載の方法により該HCV株の該HCV遺伝子型を決定する工程、および該治療ワクチンの投与前の該株の該HCV遺伝子型と、該治療ワクチンに対する既知のHCV遺伝子型の該感受性とを比較する工程を包含する、方法。項目23所定のサンプル集団に対する予防ワクチン組成物の適性を予測する方法であって、該予防ワクチンの遺伝子型を決定する工程、項目12に記載の方法により該サンプル集団における既知のHCV遺伝子型の優勢を決定する工程、および該予防ワクチンの該集団サンプルへの投与前に、該予防ワクチン株の該HCV遺伝子型と決定された優勢遺伝子型とを比較する工程を包含する、方法。発明の要旨本発明は、ヘテロ二本鎖トラッキングアッセイHTAに基づいた、HCV遺伝子型分類およびサブタイプ内変異の特徴付けのためのプライマーおよび方法を含む。好ましいプローブプライマーは、HCVのコアのカルボキシ末端およびE1領域の一部由来の一本鎖である。HTAは、2つ以上のウイルスゲノム間の遺伝的関係を決定する方法に基づいたハイブリダイゼーションである。この方法の基礎は、分岐テンプレートから同時増幅された関連DNA産物が、ランダムに再アニールして、中性ポリアクリルアミドゲルのようなサイズに基づいて分子を分離するように設計された系において、減少した移動度で移動するヘテロ二本鎖を形成することであり、HTAは、HIV1を遺伝子型分類するために、そして患者および集団におけるHIV1のインビボ進化を追随するために最初に使用された。例えば、Delwartら1993Science262:17571261およびDelwartら1994J.Virol.68:67226883を参照のこと。本発明の1つの局面は、HCVを遺伝子型分類するための方法であり、この方法は、部分的に相補的なDNA鎖またはRNA鎖を変性および再アニールする工程、ならびにサイズに基づいて分子を分離するように設計された系において例えば、ポリアクリルアミドまたはMDEゲルを介する電気泳動に従うことによりDNAヘテロ二本鎖の電気泳動移動度を書き留めることにより配列変異を検出する工程を含む。本発明の別の局面は、HCVゲノムのコアおよびE1領域から選択された、遺伝子型分類において使用されるプローブに関する。本発明の別の局面は、異なる既知の遺伝子型の薬物治療に対する感受性を決定すること、患者を感染させるHCV株の遺伝子型を決定すること、およびその遺伝子型とその薬物治療感受性とを比較して、患者の薬物治療に対する応答を予測することにより、HCV株に感染した患者の薬物治療に対する応答を予測する方法に関する。本発明の別の局面は、治療ワクチンに関し、そしてHCV株に感染した患者の遺伝子型を決定すること、および同じ遺伝子型の治療ワクチンを投与することにより、どの治療ワクチンが利用されるべきかを予測することに関する。本発明の別の局面は、予防ワクチンに関し、そして同様のサンプルにおいて優勢な遺伝子型を決定すること、および集団サンプルに対して優勢な遺伝子型であると思われる遺伝子型の予防ワクチンを投与することにより、どのワクチンが特定の集団サンプルに投与されるべきか予測することに関する。本発明の別の局面は、本発明の方法を用いて新規のHCV遺伝子型を発見する能力に関する。発明の説明本発明の実施は、他に示されない限り、当該技術の範囲内の分子生物学、微生物学、組換えDNA、ポリペプチド合成および核酸合成、ならびに免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、文献中で十分に説明される。例えば、Sambrookら,MOLECULARCLONING;ALABORATORYMANUAL,第2版1989;DNACLONING,第IおよびII巻D.NGlover編、1985;OLIGONUCLEOTIDESYNTHESISM.J.Gait編,1984;NUCLEICACIDHYBRIDIZATIONB.D.HamesおよびS.J.Higgins編,1984;TRANSCRIPTIONANDTRANSLATIONB.D.HamesおよびS.J.Higgins編,1984;ANIMALCELLCULTURER.I.Freshney編,1986;IMMOBILIZEDCELLSANDENZYMESIRLPress,1986;B.Perbal、APRACTICALGUIDETOMOLECULARCLONING1984;シリーズMETHODSINENZYMOLOGYAcademicPress,Inc.;GENETRANSFERVECTORSFORMAMMALIANCELLSJ.H.MillerおよびM.P.Calos編,1987,ColdSpringHarborLaboratory、MethodsinEnzymology第154巻および第155巻それぞれ、WuおよびGrossman、ならびにWu編、MayerおよびWalker編1987,IMMUNOCHEMICALMETHODSINCELLANDMOLECULARBIOLOGYAcademicPress,London、Scopes,1987,PROTEINPURIFICATION:PRINCIPLESANDPRACTICE,第2版SpringerVerlag,N.Y.、ならびにHANDBOOKOFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY,第IIV巻D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編1986を参照のこと。ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な略語が本明細書中で使用される。本明細書中に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願が参考として援用される。本明細書中で使用する用語組換えポリヌクレオチドは、その起源または操作により、1天然に関連するポリヌクレオチドの全てもしくは一部に関連しないか、2天然に連結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結するか、または3天然に生じない、ゲノム、cDNA、半合成、もしくは合成起源のポリヌクレオチドを意図する。本明細書中に使用する用語ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいう。この用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、この用語は、二本鎖および一本鎖DNAおよびRNAを含む。これは、既知の型の修飾例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、キャップ、1つ以上の天然に生じるヌクレオチドのアナログによる置換、ヌクレオチド内修飾例えば、非荷電結合例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等による修飾および荷電結合例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等による修飾、ペンダント部分例えば、タンパク質例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリLリジン等を含むを含む修飾、インターカレーター例えば、アクリジン、ソラレン等による修飾、キレーター例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等を含む修飾、アルキル化剤を含む修飾、修飾結合例えば、αアノマー核酸等による修飾、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態をも含む。PCRは、本明細書中でポリメラーゼ連鎖反応PCR技術を意味し、これはMullis米国特許第4,683,195号Mullisらおよび同第4,683,202号、本明細書中に参考として援用されるにより開示される。PCR技術において、所望の配列の反対の末端に適合する短いオリゴヌクレオチドプライマーが調製される。プライマー間の配列は既知である必要はない。DNAまたはRNAサンプルは抽出され、そして変性される好ましくは、熱により。次いで、オリゴヌクレオチドプライマーを、dNTPおよびポリメラーゼ好ましくは、熱安定性のTaqポリメラーゼと共にモル過剰で添加する。DNAは複製され、次いで再度変性される。これは、それぞれのプライマーで始まる2つの長い産物および2つの最初の鎖二本鎖DNA分子あたりを生じる。次いで、反応混合物は、重合条件に戻され例えば、温度を低下させるか、変性剤を不活化するか、またはより多くのポリメラーゼを添加することにより、そして第2のサイクルが開始される。第2のサイクルは、2つの最初の鎖、サイクル1由来の2つの長い産物、2つの新たな長い産物最初の鎖から複製された、および長い産物から複製された2つの短い産物を提供する。短い産物は、各末端でプライマーを有する標的配列センスまたはアンチセンスの配列を有する。さらなる各サイクルで、さらなる2つの長い産物が生成され、そして短い産物の数は、前のサイクルの終わりに残った長い産物および短い産物の数に等しい。従って、短い産物の数は、各サイクルで指数的に増殖する。特定の分析配列のこの増殖は、極端に少ない量のDNA検出を可能にする。本明細書中で使用する用語3SRは、欧州特許公開第373,960号1990年6月20日に公開に記載されたような自立selfsustained配列複製としても知られる標的核酸増幅法をいう。本明細書中で使用する用語LCRは、Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.USA199188:189193により記載されるようなリガーゼ連鎖反応としても知られる標的核酸増幅法をいう。オープンリーディングフレームORFは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり;この領域は、コード配列の一部または総コード配列を示し得る。コード配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、通常mRNAを介してポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、5末端での翻訳開始コドンおよび3末端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、cDNAおよび組換えポリヌクレオチド配列を含み得るが、これらに限定されない。本明細書中で使用する用語ポリペプチドは、アミノ酸のポリマーをいい、そして特定の長さの産物をいわず;従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質がポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などをいわないか、または除外する。例えば、1つ以上のアミノ酸アナログ例えば、非天然アミノ酸等を含むを含むポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、ならびに天然および非天然の両方の当該分野で公知の他の修飾が、定義内に含まれる。示された核酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列にコードされるポリペプチドまたはその一部ここで、その一部は、少なくとも3~5アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも8~10アミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも11~15アミノ酸からなるか、またはその配列にコードされるポリペプチドと免疫学的に同定可能であるのアミノ酸配列と同一の、アミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。この用語はまた、示された核酸配列から発現されるポリペプチドを含む。タンパク質は、そのタンパク質に特異的な抗体モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかを生成するために使用され得る。これらの抗体を生成するための方法は、当該分野で公知である。組換え宿主細胞、宿主細胞、細胞、細胞培養物、および他のこのような用語は、組換えベクターまたは他の転移DNAのレシピエントとして使用され得るかもしくは使用されてきた、そして形質転換された最初の細胞の子孫を含む、例えば、微生物、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を意味する。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発的、または計画的変異により、形態またはゲノムもしくは総DNA相補物において最初の親細胞と必ずしも完全に同一ではあり得ないことが理解される。哺乳動物宿主細胞の例として、チャイニーズハムスター卵巣CHOおよびサル腎臓COS細胞が挙げられる。cDNAは、mRNAの相補鎖にハイブリダイズする相補的mRNA配列を意味する。精製および単離は、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列をいう場合に、示された分子が、同じ型の他の生物学的巨大分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。本明細書中で使用する用語精製は、存在する同じ型の生物学的巨大分子の、好ましくは少なくとも75重量、より好ましくは少なくとも85重量、なおより好ましくは少なくとも95重量、そして最も好ましくは少なくとも98重量を意味するしかし、水、緩衝液、および他の低分子特に、1000未満の分子量を有する分子は存在し得る。薬学的に受容可能なキャリアは、それ自体が組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導しない、任意の薬学的キャリアを意味する。適切なキャリアは、代表的には、大きな緩徐に代謝される巨大分子例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー;および不活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。治療組成物は、代表的には、薬学的に受容可能なビヒクル例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール等を含む。さらに、補助物質例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝化物質等がこのようなビヒクルに存在し得る。代表的には、治療組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかのような注射可能物質として調製される;注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適した固体形態もまた調製され得る。調製物はまた、増強したアジュバント効果のために乳化され得るか、またはリポソーム内にカプセル化され得る。異なるHCV遺伝子型が、異なる病原性ならびに別々の地理的分布を有し得、そして感染した患者において異なる血清学的プロフィールを部分的に誘発し得ることが、証拠によって示される。Cammarotaら、J.Clin.Microb.199533:27812784を参照のこと。本発明は、HCVを検出し、そして異なる型のHCVによる感染を同定する方法を含む。本発明は、HCVを遺伝子型分類すること、HCVの新規の遺伝子型を発見する能力、および薬物治療に対する応答を予測する能力についてウイルス集団を評価することを含む。本発明はまた、HCVの遺伝子型分類における使用のためのプローブを含む。HCVを遺伝子型分類する方法として、HCVゲノムのコアE1領域由来のプローブプライマーを利用する、ヘテロ二本鎖トラッキングまたは移動度アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。HCV遺伝子型間の証明された抗原的差異は、血液ドナースクリーニングおよびIFN処置に対する応答の予測においてのみならず、異なる国におけるHCVに対する候補ワクチンの示された組成物、治療ワクチンの選択、ならびに新規の遺伝子型の同定においてもまた有用性を有する。ゲノムの異なる領域の分析例えば、RFLPに基づいた、集団を感染させる主要な遺伝子型を同定するための他の方法が提案されている。5非コード領域NCRから同時増幅された配列のRFCPを用いてHCVを遺伝子型分類する議論については、Davidsonら、J.GenVirol.199576:11971204を参照のこと。既知の核酸に基づく遺伝子型分類法は、サブタイプ特異的RTPCR逆転写酵素PCRプライマーOkamoto1992J.GenVirol73:673679を参照のこと米国特許第5,427,909号;2特異的プローブG.Marteenら、Lineプローブアッセイ;3制限部位多型性ヌクレオチド配列ntの機能、または4遺伝子型を決定するための直接的配列を必要とする。5NC配列のRFLPによる分析は、実施しやすいが、全てのHCV遺伝子型を正確に予測せず、そしていくつかのサブタイプは誤分類され得る。例えば、制限酵素により認識される1aと1bとの間の配列における変化は絶対的でなく、そして1aおよび1b、ならびに2aおよび2b以外の配列は誤分類される。例えば、1c型は1a型と思われ、2c型は2a型または2b型のいずれかであると思われる。Cammarotaら、J.Clin.Microb.,199533:27812784を参照のこと。この理由のため、RFLPは、エスケープ種、新規の分岐種、または疫学的傾向を検出し得ない。RFLPのような分類方法は、HCV配列不均一性に関して回収される急速に増大する情報に適応するために、恐らく連続的に改変されなければならない。上記のように、核酸に基づく遺伝子型分類法を使用する場合、型もしくはサブタイプのいずれかの結果、または分類不可能な結果である陰性が得られる。例えば、遺伝子型特異的PCRにより分類されないままであった単離物が、コアおよびNS5遺伝子から得られたPCR増幅物の配列分析に基づいてサブタイプ2cに分類された、Cammarotaら、J.Clin.Microb.199533:27812784を参照のこと。この問題は、コアのC末端E1の中央23におけるRTPCRプライマーを選択することによりHCV遺伝子型を決定する、目下請求される本発明を用いることによって避けられる。さらに、単離物のサブタイプは、本発明のHCV遺伝子型分類を用いて正確に決定され得、そして単離物は、約30分岐未満のものでさえも検出され得、これは配列決定なしで新規のサブタイプの特徴付けを可能にする。ヘテロ二本鎖トラッキングまたは移動度アッセイ本発明におけるHCV遺伝子型を決定する方法は、複雑な準種における少数の変異体を利用する。1つのこのような技術は、二本鎖トラッキングアッセイHTAである。HIVを用いた使用について当該分野で周知のHTA例えば、Delwartら、J.Virol.199468:66726683;Delwartら、Science1993262:12571261;Delwartら、PCRMethodsandApplications4:S202S2161995ColdSpringsHarbor;およびDelwartら、HeteroduprexMobilityAnalysisHIV1envSubtypingKitProtocolVersion3これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用されるを参照のことは、配列が感染個体の末梢血単核細胞からネスティッドPCRにより増幅された場合、分岐テンプレートから同時増幅された関連DNA産物が、ランダムに再アニールして、中性ポリアクリルアミドゲルにおいて減少した移動度で移動するヘテロ二本鎖を形成し得たという観察に起因する。これらの技術を用いて、複数のウイルスDNAテンプレート分子間の遺伝的関係が確立され得る。HTAは、特に、標識プローブとして第1のPCR産物を利用する。これは放射性であり得、異なる供給源すなわち、分類が所望される供給源由来の過剰量ドライバーdriverの非標識PCR産物と混合される。次いで、プローブ配列は、ドライバーと完全にヘテロ二本鎖にさせられ、そしてサイズに基づいて分離される。得られたポリアクリルアミドゲルの例のためのオートラジオグラムは、これらのヘテロ二本鎖のみを明らかにし、そして研究下での2つのウイルス集団間の関係の視覚的な表示を提供する。ヘテロ二本鎖が異なる移動度で移動するという事実は、非適合mismatchedおよび非対合unpairedヌクレオチドの鎖特異的組成物がそれらの移動度に影響することを示す。次いで、Delwartらに記載される指数方程式を使用して、既知の配列の遺伝子の対様pairwise分析からの実験データに適合する曲線を記載する。本発明において、この方程式を使用して、プローブの既知の遺伝子型と患者サンプルの未知の遺伝子型との間の遺伝的距離を評価する。HTAにおける使用のためのプライマーE1またはコア領域がHCV不均一性を研究するための最良の領域であり得ることが決定され、従って、E1領域は、本発明におけるプライマーのための選択となった。本発明のゲノムの最も不均一な領域である部分的E1配列、ならびにより長いフラグメントすなわち、400nt1000ntほどの長さであり得るがの使用は、サブタイプ型間で交差ハイブリダイズしないプローブの設計を可能にし、従って正確な遺伝子型分類を可能にする。不均一な領域を隣接させることにより、センスおよびアンチセンスプライマーの保存nt配列が同定された。好ましくは、第1回のPCRのためのユニバーサルセンスプライマーと型特異的アンチセンスプライマーとの組合せ、ならびに第2回のためのユニバーサルアンチセンスプライマーと型特異的センスプライマーとの組合せが利用された。PCRは2回である必要はなく、そしてプライマーは、上記の組合せに限定されない。しかし、好ましい組合せは、一本鎖プローブの調製を可能にし、そしてPCRプライマー組合せの数を最小にする。好ましいプローブは、コアおよびE1領域における配列である。この広範な遺伝子型のついての配列は公開され、そして少なくとも12個の異なる遺伝子型およびサブタイプ:I1a、II1b、III2a、IV2b、2c、3a、4a、4b、4c、4d、5a、6aに分類されている。同じ遺伝子型のHCV単離物間のE1遺伝子のヌクレオチド配列同一性は、88.0~99.1の範囲であるが、異なる遺伝子型のHCV単離物のものは、53.5~78.6の範囲である。中性ポリアクリルアミドゲルにおけるヘテロ二本鎖の良好な区別のための変異の程度は、快適には、分岐テンプレートが恐らく再アニールして、それらが同じサブタイプである場合にヘテロ二本鎖を形成するような、3~20の範囲内である。この理由のために、一本鎖32p標識DNAプローブが、ヘテロ二本鎖の形成が不可能な場合、ssDNAプローブが再アニールし、そしてホモ二本鎖バンドを恐らく形成し得ないように使用された。直接的配列決定をすることなく、本発明は、サブタイプの確実な同定だけでなく、同じサブタイプ内の遺伝的関係もまた迅速に与え得る。例えば、分析された遺伝子型すなわち、1a、1b、2a、2b、3aは、異なるサブタイプ間で重複を示さなかった。さらに、単離物の約30分岐がゲル上で視覚化され得るので、新規のサブタイプは視覚化され得、そして集団中の単離物の分布は特徴付けられ得、そして集団または個々の単離物の後に、疫学的研究における集団または個体が続き得る。HCV遺伝子型分類キットHCVの遺伝子型を決定するためのキットは、本発明の範囲内にある。Delwartら、HeteroduprexMobilityAnalysisHIV1envSubtypingKitProtocolVersion3においてHIVについて記載されるように、このようなキットは、特異的なプライマーを含む。好ましいプライマーは、HCVゲノムのコアおよびE1領域由来である。2段階のPCRが所望される場合、第1回のプライマーは、例えば、ユニバーサルセンスプローブ好ましくは、HCVゲノムのコアE1領域に位置するを含み得る。1つのこのようなユニバーサルプライマーは、HCV1のヌクレオチド508~529に位置し、そして表1に示される。ユニバーサルプライマーと対となるのは、好ましくはまたHCVゲノムのコアE1領域に位置し得る、型特異的アンチセンスプライマーであり得る。これらのプライマーの例は、HCVゲノムの1型、2a型、2b型、および3a型についてはヌクレオチド1032~1012由来であり、そしてまた表1に示される。第2回のPCRが所望される場合、第2回のプライマーは、同様に、HCVゲノムのコアE1領域由来である。好ましい第2回のプライマーは、HCV1ゲノムのヌクレオチド978~958に由来するユニバーサルアンチセンスプライマーを含み得、このプライマーは表1に示される。さらに、第2回のプライマーは、コアE1領域由来の型特異的センスプライマーを含み得る。好ましい第2回の型特異的センスプライマーは、HCVゲノム1型、2型、または3型のヌクレオチド536~557由来であり、表1に示される。第1回または第2回のプライマーは、ウイルス濃度が十分に高い場合、第2回のPCRを使用することなくウイルスRNAを増幅するのに十分であり得る。すなわちネスティッドPCRは必ずしも必要とされず、必要とされるものは100倍過剰量のプローブ中のPCR産物である。本発明のHCV遺伝子型分類キットはまた、新規のサブタイプがこのキットにおける使用のために発見および評価されるにつれて変化し得る、サブタイプ参照を含む。単一の参照に対する比較が明確な結果をいつも提供するとは限らないので、所定のサブタイプ由来の1つより多い参照の使用は推奨される。前述の議論および以下の実施例は、本発明を例示するのみであり、当業者は、本発明が他の方法で実行され得、そして本発明が請求の範囲の参照によってのみ定義されることを理解する。実施例1患者サンプル規則的な血液透析を受けている35人の血液透析患者を研究した:平均年齢64.8±13歳の20人男性57および15人女性43。血清サンプルを、1995年8月に回収し、アリコートに分け、そして80°Cで保存した。26人の患者が抗HCVELISA陽性であり、そして9人が抗HCVELISA陰性であった。26人のELISA陽性のうち25人はまたRIBAIII陽性であったが、1人は不確定であった。9人のELISA陰性は、全てRIBAIII陰性であった。15人の患者がHCVRNA5UTRおよびE1PCR陽性であった。15個の5NCR産物の直接的配列決定により、5人の患者が1型;3人が2型;そして7人の患者が3型に帰された。実施例2cDNAおよびPCRHCVRNAを、StratageneRNAIsolationKitからのStratagene試薬を用いて、少なくとも2つの異なる回数で抽出したChomezynskyおよびSacchi法。RNAを20μlの血漿から抽出し、これを100pmolのPCRプライマーを用いて25μlのcDNA混合物BRLcDNA合成キット、8085SB中で逆転写させた。cDNA混合物を5分間煮沸し、氷上ですばやく冷却し、そしてPerkinPCRキットN8010055説明書に従って最終濃度でPCRcDNA試薬に添加した。40回のPCRサイクル94°C10秒、55°C30秒、および72°C30秒を行った。10μlの第1のPCR反応混合物を、ネスティッドPCRプライマーを含む第2のPCR反応混合物に添加し、そして上記のように40サイクル増幅した。最初の抽出物を、Shimizuら、PNAS199254775481に以前に記載された5NCRに特異的なプライマーを用いたネスティッドPCR反応に使用し、そしてこの産物を直接配列決定し、そしてRFLPに使用した。同じ抽出物由来のRNAを、コアE1プライマーを用いたHTAに使用した。第2のRNA抽出を、RFLPおよびまたはHTAのために行って、結果を確認した。HTAに使用したプライマーを表1に示す。これらのE1産物を得るために使用したPCRプライマーのネスティッド対は、1、2a、2b、および3a型で異なった。第1回の増幅のためのユニバーサルセンスプローブは、Chooら、PNAS、1991の5~3nt508~529、アミノ酸170~176に対応するが、第2回の増幅のためのユニバーサルアンチセンスプライマーは、Chooら、PNAS、1991のnt978~958、アミノ酸320~326に対応する。ssDNADNAプローブをHTAにおける使用のために調製した場合、ネスティッドPCRのためのプライマーの1つをビオチン化した。例えば、表1における配列番号6を参照のこと。実施例3HTA一本鎖プローブを、プライマー320Aの1つをビオチン化した以外は、上記のような同じPCRプライマーを用いた既知の遺伝子型のHCVELISAおよびRIBA陽性血清のRTPCRにより調製した。ssDNAプローブを、HengPanおよびEricDelwartのプロトコルに従って、DynabeadsM280Streptavidinを用いて作製した。非ビオチン化一本鎖を、磁気ビーズストレプトアビジンカラムから溶出した。プローブを、異なる遺伝子型の20ngのssDNAから作製し、そしてT4ポリヌクレオチドキナーゼGibcoBRLおよび100μCiの32PATPを用いて末端標識し、次いでカラム精製した。キナーゼプローブを、PharmaciaBioSepharoseカラムを用いて32PATPから分離した。32P標識一本鎖プローブを、100倍過剰量のドライバーと混合し、そしてPCR産物を、患者サンプルまたはコントロール血清血漿から生成した。ハイブリダイゼーションは2×SSCであった。混合物を、94°Cのヒートブロックに3分間置いた。次いで、それらを55°Cのヒートブロックに少なくとも2時間移した。全反応容量を、1mm厚の6ポリアクリルアミドMDEゲルBakerにロードし、そして500Vで16時間電気泳動した。ゲルを80°Cで濾紙上で真空乾燥し、そしてX線フィルムに暴露した。各サンプルの遺伝子型を、Delwart法に基づいて決定した。表2は、HTAを用いることにより決定した遺伝子型結果を示す。図1A~1Eは、表1における一本鎖プローブの各々を示すオートラジオグラムであり、すなわち遺伝子型1a、1b、2a、2b、3aについて既知の特異的なプローブは、それぞれ図1A~E中であるMDEゲルの左端のレーンを参照のこと。ホモ二本鎖h由来した二本鎖RTPCR産物形態に対するssプローブを、プローブに隣接して示す。プローブにハイブリダイズした15人の透析患者番号1、2、3、4、7、18、20、22、23、24、26、28、30、33、35由来のRTPCR産物もまた、各図の適切なレーンとして示される。図1A~1Eにおいて示され得るように、1型ssサブタイププローブは各1型サブタイプに特異的であり、そして他のサブタイプ1b、2a、2b、3aに交差ハイブリダイズしなかった2a、2bは示さず。3a型ssサブタイプ特異的プローブもまたサブタイプ3aに特異的であり、そして1a、2c、または2a、2s単離物に交差ハイブリダイズしなかったデータは示さず。ssサブタイプ2プローブは、互いに交差ハイブリダイズしないがデータは示さず、サブタイプ2c単離物に交差ハイブリダイズした;しかし、ホモ二本鎖と2c単離物との間の距離は高度の分岐を示し、これは患者23、30、および33が異なるサブタイプを有することを示唆した。血清23、30、および33中のウイルスは、部分的E1の配列決定によりサブタイプ2cに最も密接に関連することが確認されたが図2bを参照のこと、51UTR配列決定によっては不明瞭であった。図2Dを参照のこと。単離物23、30、および33は、2aプローブとハイブリダイズするが、30および33のみが2bプローブにハイブリダイズする。ゲルはまた、単離物30が2bより2aに密接に関連することを示す。従って、3つの全ての血清は明らかに2型非a非bサブタイプであるが、それらは、全てが等しく2aおよび2b型と分岐しているとは限らない。図1Bおよび1Dにおいて示されるように、患者4は、1b型および非a非b型サブタイプに同時感染しているらしい。1bプローブは患者JK16に由来し、そしてホモ二本鎖レーンhに反映される2つのウイルスゲノムを有するらしく、従って各1b患者は2つのバンドを有する。ssプローブ3aは、3a型個体JK3aからの1つのRTPCR産物のプラスミドクローンに由来した図1E、レーンhを参照のこと。従って、レーン22における複数のバンドは、最も恐らくは、この患者における2つの密接に関連したウイルスを反映する。非常にしばしば、患者が独特のウイルス単離物を有すると思われた。患者3および18が、同一のまたは高度に関連したウイルス単離物を有することは可能である。同様に、MDEゲルでのバンドの同時移動に基づいて、患者20および26は、同じ3a型ウイルス単離物を有し、そして患者2および4は、同じ1b型単離物を有した。図2a~2cは、部分的E1ヌクレオチド配列の各々の遺伝的関係を示す系統発生樹系統樹を示す。これらの系統樹を、Weinerら、J.Virol.67:43654368頁1993により記載されたように、計算手段を有するコンピューターソフトウェアプログラムGeneWorksUnweightedPairGroupMethodsを使用することによる、互いに対するヌクレオチド配列の対様連続的アラインメントにより構築した。図2a~2cにおける系統樹を、ゲノムの同じ領域上での1a型HCV1Chooら、PNAS1991;1bHCVJKatoら;2aHCJ6Okamotoら1992;2bHCJ8Okamotoら、1992;2cBukhら、PNAS、1993、および3aNZL1Sakamotoら、1994について公開された遺伝子型配列に対する配列分析により決定されたように、透析患者由来の推定1型nt625~93、2型nt583~915、または3型nt558~834単離物の部分的E1配列を比較することにより形成した。図2Dは、ゲノムの同じ領域について、単離物23、30、および33の部分的5UTR配列のいずれかと、公開された1、2、および3型nt274~81遺伝子型配列とを比較することにより、上記のように形成した系統樹である。RFLPおよびHTAの結果を比較し、そして表2に示す。図3a~3dにおける部分的E1配列は、表2において与えられたHTAサブタイプ指定を確証し、そして患者23、30、および33が2cと最も密接に関連し、33が2cと最も離れて18.6分岐関連することを決定的に示す。ScrFIDavidsonら、J.Gen.Virol.199576:11971204を参照のことを用いたRFLP結果は、23、30、および33を2a型と誤って指定した。この誤った指定は図2Dにおいて反映され、これはコンピューターが、5UTRnt配列に基づいても、ゲノムのこの領域における不十分なnt分岐に起因して正確にHCV2cをサブタイプ分類しなかったことを示す。コアおよびエンベロープ領域に対するプライマーを利用する本発明のHTAは、HCVゲノムの3レベルの特徴付けを可能にした。第1は、RTPCRプライマーの選択における型特異性であった。第2は、コアE1領域における、400ntを超える領域由来のプライマーの選択に基づくサブタイプ特異性であり、これは、サブタイププローブ例えば、1および3、2a、2b間の交差ハイブリダイゼーションの欠如、ならびに遺伝子型間の差異を最大にする高度の不均一性交差ハイブリダイゼーションの欠如をもたらした。最後に、単離物特異性を、図1.E~1.Eにおいて例示されるようなホモ二本鎖からの距離により決定した。他の遺伝子型分類方法は、単離物差異を分析する能力を有さない。"