"iE153及びD174を含む配列番号43のエピトープに結合し、任意で以下の特徴の一以上を有する抗体:aメソテリンのグリコシル化形態に対する結合の減少を示さない;bメソテリンのMUC16に対する結合を遮断しない;及びc≦5nMの親和性でメソテリンに結合する;iiE211を含む配列番号43のエピトープに結合し、任意で以下の特徴の一以上を有する抗体:aメソテリンのMUC16に対する結合を遮断しない;及びb≦5nMの親和性でメソテリンに結合する;及びiii配列番号43のアミノ酸配列1-131内のエピトープに結合し、≦5nMの親和性でメソテリンに結合する抗体から選択されるメソテリンに結合する単離された抗体。モノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、請求項1に記載の抗体。メソテリンに結合する抗体断片である、請求項1に記載の抗体。メソテリンが配列番号43のヒトメソテリンである、請求項1に記載の抗体。抗体が、ai配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR-H3、ii配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR-L3、及びiii配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR-H2;bi配列番号39のアミノ酸配列を含むHVR-H3、ii配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR-L3、及びiii配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR-H2;又はcATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体のHVR-H3、HVR-L3及びHVR-H2を含む、請求項1に記載の抗体。抗体が、ai配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR-H1、ii配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR-H2、及びiii配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR-H3;bi配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR-H1、ii配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR-H2、及びiii配列番号39のアミノ酸配列を含むHVR-H3;又はcATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体のHVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含む、請求項1に記載の抗体。ai配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR-H1;ii配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR-H2;iii配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR-H3;iv配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR-L1;v配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及びvi配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR-L3;bi配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR-H1;ii配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR-H2;iii配列番号39のアミノ酸配列を含むHVR-H3;iv配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR-L1;v配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及びvi配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR-L3;又はcATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体のHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及びHVR-L3を含む、請求項7に記載の抗体。抗体が、ai配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR-L1、ii配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及びiii配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR-L3;bi配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR-L1、ii配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及びiii配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR-L3;又はcATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体のHVR-L1、HVR-L2及びHVR-L3を含む、請求項1に記載の抗体。配列番号25のフレームワークFR2配列と配列番号27のFR3配列を含む軽鎖可変ドメインを更に含む、請求項8a又は9aに記載の抗体。抗体が、a配列番号8のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有するVH配列;b配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有するVL配列;caのVH配列及びbのVL配列;d配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有するVH配列;e配列番号12のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有するVL配列;fdのVH配列及びeのVL配列;gATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体のVH配列のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有するVH配列;hATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体のVL配列のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有するVL配列;igのVH配列及びhのVL配列;を含む、請求項1に記載の抗体。配列番号8のVH配列、配列番号16のVH配列、又はATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体のVH配列を含む、請求項11に記載の抗体。配列番号4のVL配列、配列番号12のVL配列、又はATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体のVL配列を含む、請求項11に記載の抗体。a配列番号8のVH配列及び配列番号4のVL配列;b配列番号16のVH配列及び配列番号12のVL配列;cATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体のVH配列及びVL配列;又はdATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体を含む抗体。IgG1、IgG2a又はIgG2b抗体である、請求項1に記載の抗体。請求項1から15の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。請求項16に記載の核酸を含む宿主細胞。請求項17に記載の宿主細胞を抗体が産生されるように培養することを含む、抗体を産生する方法。式Ab-L-Dpを有するイムノコンジュゲートであって、aAbは請求項1から15の何れかの抗体であり;bLはリンカーであり;cDは式DEの薬物でありかつ、R2及びR6の各々はメチルであり、R3及びR4の各々はイソプロピルであり、R5はH、R7はsec-ブチルであり、各R8はCH3,O-CH3,OH,及びHから独立に選択され;R9はHであり;かつR18は-CR82-CR82-アリールであり;及びdpは1~8の範囲であるイムノコンジュゲート。薬物がアウリスタチンである、請求項19に記載のイムノコンジュゲート。薬物がMMAEである、請求項20に記載のイムノコンジュゲート。リンカーがプロテアーゼにより切断可能である、請求項19に記載のイムノコンジュゲート。リンカーがval-citジペプチドを含む、請求項22に記載のイムノコンジュゲート。Sが硫黄原子である式を有する、請求項19に記載のイムノコンジュゲート。pが2~5の範囲である、請求項24に記載のイムノコンジュゲート。請求項8aの抗体を含む、請求項24に記載のイムノコンジュゲート。請求項8bの抗体を含む、請求項24に記載のイムノコンジュゲート。請求項14aの抗体を含む、請求項24に記載のイムノコンジュゲート。請求項14bの抗体を含む、請求項24に記載のイムノコンジュゲート。請求項19から29の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。付加的治療薬を更に含む請求項30に記載の薬学的製剤。付加的治療薬がゲムシタビンである、請求項31に記載の薬学的製剤。付加的治療薬は、細胞傷害性薬物に結合した抗MUC16抗体である、請求項31に記載の薬学的製剤。医薬として使用のための、請求項19から29の何れかに記載のイムノコンジュゲート。メソテリン陽性癌の治療において使用のための、請求項19から29の何れかに記載のイムノコンジュゲート。メソテリン陽性癌が、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮内膜癌、及び中皮腫から選択される、請求項35における使用のためのイムノコンジュゲート。メソテリン陽性癌が二重陽性癌である、請求項35における使用のためのイムノコンジュゲート。医薬の製造のための、請求項19から29の何れかに記載のイムノコンジュゲートの使用。医薬が二重陽性癌の治療用である、請求項38に記載の使用。メソテリン陽性癌が、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮内膜癌、及び中皮腫から選択される、請求項39に記載の使用。メソテリン陽性癌が二重陽性癌である、請求項39における使用。メソテリン陽性癌を有する個体を治療する方法であって、該方法が請求項19から29の何れかに記載のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む方法。メソテリン陽性癌が、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮内膜癌、及び中皮腫から選択される、請求項42に記載の方法。メソテリン陽性癌が二重陽性癌である、請求項42に記載の方法。付加的治療薬を個体へ投与することを更に含む、請求項42に記載の方法。付加的治療薬がゲムシタビンである、請求項45に記載の方法。付加的治療薬は、細胞傷害性薬物に結合した抗MUC16抗体である、請求項45に記載の方法。メソテリン陽性細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法が、細胞の表面上のメソテリンに対するイムノコンジュゲートの結合を許容する条件下で、請求項19から29の何れかに記載のイムノコンジュゲートに細胞を曝露することを含み、それにより細胞の増殖を阻害することを含む方法。細胞が、膵臓、卵巣、肺、又は子宮内膜癌細胞又は中皮腫細胞である、請求項48に記載の方法。細胞が二重陽性癌である、請求項48に記載の方法。標識にコンジュゲートした、請求項1から15の何れかに記載の抗体。標識が陽電子放出体である、請求項51に記載の抗体。陽電子放出体が89Zrである、請求項52に記載の抗体。生物学的サンプル中のヒトメソテリンを検出する方法であって、該方法が、天然に生じるヒトメソテリンに対する抗メソテリン抗体の結合を許容する条件下で、生物学的サンプルを請求項1から15の何れかに記載の抗メソテリン抗体と接触させることを含み、生物学的サンプル中で抗メソテリン抗体と天然に生じるヒトメソテリンの間に複合体が形成されるかを決定することを含む方法。抗メソテリン抗体が請求項8c、14c及び14dの何れかに記載の抗体である、請求項54に記載の方法。生物学的サンプルが、膵臓癌サンプル、卵巣癌サンプル、肺癌サンプル、子宮内膜癌サンプル、又は中皮腫サンプルである、請求項54に記載の方法。方法が、組織切片における免疫組織化学法を実施することを含む、請求項54に記載の方法。生物学的サンプルが血清である、請求項54に記載の方法。i標識された抗メソテリン抗体が請求項1から15の何れかに記載の抗メソテリン抗体を含む、標識された抗メソテリン抗体をメソテリン陽性癌を有する又は有すると疑われる被検体に投与し、及びii標識された抗メソテリン抗体が被検体におけるメソテリン陽性癌を示す、標識された抗メソテリン抗体を被検体において検出することを含む、メソテリン陽性癌を検出するための方法。標識された抗メソテリン抗体が請求項8a又は14aに記載の標識された抗体である、請求項59に記載の方法。標識された抗メソテリン抗体が、陽電子放出体にコンジュゲートした抗メソテリン抗体を含む、請求項59又は請求項60に記載の方法。陽電子放出体が89Zrである、請求項61に記載の方法。i配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR-H1;ii配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR-H2;iii配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR-H3;iv配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR-L1;v配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及びvi配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項8に記載の抗体。配列番号25のフレームワークFR2配列と配列番号27のFR3配列を含む軽鎖可変ドメインを更に含む、請求項63記載の抗体。i配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR-H1;ii配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR-H2;iii配列番号39のアミノ酸配列を含むHVR-H3;iv配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR-L1;v配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及びvi配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項8に記載の抗体。ATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体のHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む、請求項8に記載の抗体。配列番号8のVH配列、及び配列番号4のVL配列を含む、請求項14に記載の抗体。配列番号16のVH配列、及び配列番号12のVL配列を含む、請求項14に記載の抗体。ATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される抗体のVH配列及びVL配列を含む、請求項14に記載の抗体。ATCC受託番号PTA-11464を有するバイブリドーマ19C3により産生される、請求項14に記載の抗体。III.実施例以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。A.ヒトメソテリン遺伝子発現ヒトメソテリン遺伝子発現は遺伝子発現情報を含む専有データベースを使用して分析したGeneExpress登録商標,GeneLogicInc.,Gaithersburg,MD。GeneExpress登録商標データベースのグラフィカル解析をマイクロアレイプロファイルビューアを使用して行った。図2は、左に一覧される様々な組織におけるヒトメソテリン遺伝子発現のグラフィック表示である。グラフの上部のスケールは、ハイブリダイゼーションシグナル強度に基づく遺伝子発現レベルを示す。点が、各々のリストされた組織に隣接する線の上下両方に表示される。線の上に現れる点は正常組織における遺伝子発現を示し、線の下に現れる点は腫瘍及び疾患組織における遺伝子発現を示す。図2は、所定の腫瘍又は疾患組織において、それらの正常カウンターパートと比較したメソテリン遺伝子発現の増加を示す。特に、メソテリンは、腺癌と中皮腫を含む卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜、肺腫瘍において実質的な過剰発現を示している。ヒトメソテリンの発現は、正常中皮腹膜、心膜、及び胸膜を除いて、正常組織に本質的に存在しない。B.抗体生成ヒトメソテリンに対するモノクローナル抗体は、以下の手順を使用して生成された。各々N末端ユニザイムHisHQタグに融合している、ヒトMPFメソテリン配列番号42のアミノ酸34-580又はヒトメソテリン配列番号42のアミノ酸296-580の何れかが大腸菌58F3で発現され、NiーNTAカラムQiagenで精製され、その後以前に記載の通りKirchhoferetal200320mMのMES、pH6.06MのGdnHCl中でセファデックス200カラムでゲル濾過し、1mMのHCl中でー80°Cでの貯蔵用に透析した。5匹のBalb/cマウスCharlesRiverLaboratories,Hollister,CAが、Ribiアジュバント中で2μgの2つの抗原混合物で6回過免疫したRibiImmunochemResearch,Inc.,Hamilton,MO。2匹の最良のマウスが直接ELISAにより高い抗体力価に基づいて選択され、それらのB細胞はプールされ、以前に記載されたものと類似した改変プロトコールを使用して、マウスミエローマ細胞X63.Ag8.653;AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VAにより融合された。KoehlerandMilstein1975Hongoetal1995。10~12日後に、上清をハイブリドーマから回収し、直接ELISAにより両方の抗原に対する結合について別個にスクリーングした。適切にフォールドし、グリコシル化された、細胞表面に発現したメソテリンの認識を確かめるために、ELISA陽性上清がgDメソテリントランスフェクトSVT2細胞上で更にFACSによりスクリーニングされたgDは、抗gD抗体とともに陽性コントロールとして使用されるN-末端エピトープタグである。陽性ハイブリドーマが限定希釈により2回サブクローニングされ、11がスケールアップされ、抗体がプロテインAクロマトグラフィーにより精製された。図3は、以下に更に詳述される特性と共に、単離されたモノクローナル抗体を示す。C.7D9と22A10のヒト化モノクローナル抗体7D9と22A10は以下に記載されるようにヒト化された。残基番号はKabatetalSequencesofproteinsofimmunologicalinterest5thEdPublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthBethesdaMDに従う。1.7D9のヒト化aマウス7D9可変ドメインのクローニング全RNAを、標準的な方法を用いてマウス7D9を産生するハイブリドーマ細胞から抽出した。可変軽鎖VL及び可変重鎖VHドメインが、重鎖および軽鎖に対する縮重プライマーによりRT-PCRを用いて増幅された。順方向プライマーは、VLおよびVH領域のN末端アミノ酸配列に特異的であった。それぞれ、LCおよびHC逆方向プライマーは、種を超えて高度に保存されている定常軽鎖CL及び定常重鎖ドメイン1CH1の領域にアニーリングするように設計された。挿入物のポリヌクレオチド配列は通常の配列決定法を使用して決定された。7D9のVLとVHアミノ酸配列は図4と5にそれぞれ示される。bアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク上への直接的超可変領域の移植7D9のヒト化の最中に構築された変異体はIgGの形態で評価された。マウス7D9由来のVL及びVHドメインはヒトVLカッパIVLKI及びヒトVHサブグループIIIVHIIIコンセンサス配列に整列された。マウス7D9mu7D9抗体からの超可変領域は7D9.v1を生成するためにVLKI及びVHATAアクセプターフレームワーク中へ設計された。アクセプターVHフレームワークVHATAは、3つの位置:R71A,N73T,及びL78AでVHIIIと異なる。7D9のVLドメインから、位置24-34L1,50-56L2及び89-97L3がVLKIへ移植された。7D9のVHドメインから、位置26-35H1,49-65H2及び95-102H3がVLATAへ移植された図1及び2。CDRの定義は、それらの配列の超可変性WuTTKabatEA、それらの構造上の位置ChothiaCLeskAM及び抗原-抗体接触におけるそれらの関与MacCallumetalJMolBiol262732745により定義される位置を含む。直接移植片、7D9.v1は各超可変領域に対して別個のオリゴヌクレオチドを使用して、クンケル変異誘発により生成された。重鎖あるいは軽鎖のどちらかに対して3つのリン酸化オリゴヌクレオチドが、最終容積が40μlで、50mMTrispH7.5,10mMMgCl2中の571ngのクンケルテンプレートに加えられた。混合物は90°Cで2分間、50°Cで5分間アニールされ、次いで氷上で冷却された。10μlのアニールされたテンプレートは、室温で2時間、0.5μlの100mMのATP,0.5μlの25mMのdNTPsdATP,dCTP,dGTP及びdTTPの各々25mM,1μlの100mMのDTT,1μlの10XTMバッファー0.5MのTrispH7.5,0.1MのMgCl2,80UT4リガーゼ及び4UT7ポリメラーゼを加えることにより総容積が13.6μlに充填された。10μlの充填され連結された生成物は次いでXL1-ブルー細胞中へ形質転換されたStratagene。正しいクローンがDNA配列決定により同定され、IgGとして発現された。c変異体の評価7D9変異体はCHO一過性導入によりIgGとして発現された。IgGをプロテインGアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ヒトメソテリンの各7D9IgG変異体の親和性は、BIAcoreTM-2000を使用して表面プラズモン共鳴によって決定された。Biacoreの研究品質等級CM5チップが、Biacoreからのアミンカップリングキットを使用して組換えヒトメソテリン由来の大腸菌のおよそ110RUで固定された。各7D9変異体の段階的2倍希釈物0.05のTween20を含有するPBS中に0.488から1000nMが30μl/分の流速で注入された。各サンプルは5分間の会合と3~5分間の解離により解析された。各注入の後、チップは10mMのグリシンpH1.7を使用して再生された。結合応答は、同様の密度で固定化された無関係のIgGとともにフローセルからRUを差し引くことにより補正された。konとkoffの同時フィッティングの1:1Languirモデルが動力学的解析に用いられた。d結果7D9のヒト化に使用されたヒトアクセプターフレームワークは、ヒトVLカッパIコンセンサスVLKI及びアクセプターVHフレームワークVHATAに基づいており、それは3箇所:R71A,N73T,及びL78AでヒトVHサブグループIIIコンセンサスVHIIIとは異なる。マウス7D9のVLおよびVHドメインがヒトVLKI及びVHIIIドメインと整列され;超可変領域が同定されてヒトアクセプターフレームワークへ移植され、7D9.v1を生成した図4及び5。IgGとして、7D9.v1の親和性は、Biacoreにより評価されると、mu7D9キメラ7D9としてフォーマットされるに比べて~2倍減少する図6。7D9.v1の結合親和性を改善するために、軽鎖の位置36と87及び重鎖の位置48、67、69、71、73、75、76、78及び80がmu7D9におけるこれらの位置で見いだされる残基へ変更された。これらの変更された軽鎖と重鎖と7D9.v1からの鎖との組み合わせがCHO中へトランスフェクトされ、IgGとして発現され、Biacoreによりヒトメソテリンに対する結合について評価された図6。変異体7D9.v2と7D9.v3は、その両方が変更された軽鎖を含み、キメラ7D9に匹敵する親和性を有していた。変異体7D9.v3は軽鎖の2つの位置で7D9.v1と異なっている。どちらの変化もmu7D9のそれに匹敵する結合を改善するには十分でなかった図6。ヒト化7D9.v3についての変更の概要6匹のマウス7D9のCDR位置24-34L1,50-56L2及び89-97L3,26-35H1,49-65H2及び93-102H3として定義されるがヒトコンセンサスVLKI及びVHATAアクセプタードメイン中へ移植された。2つの付加的なフレームワーク残基の、軽鎖の36と87が元のマウスの残基へ変えられ、mu7D9に対して匹敵する親和性を持つ7D9.v3をもたらした。2.22A10のヒト化aマウス22A10可変ドメインのクローニング全RNAを、標準的な方法を用いてマウス22A10を産生するハイブリドーマ細胞から抽出した。可変軽鎖VL及び可変重鎖VHドメインが、重鎖HCおよび軽鎖LCに対する縮重プライマーによりRT-PCRを用いて増幅された。順方向プライマーは、VLおよびVH領域のN末端アミノ酸配列に特異的であった。それぞれ、LCおよびHC逆方向プライマーは、種を超えて高度に保存されている定常軽鎖CL及び定常重鎖ドメイン1CH1の領域にアニーリングするように設計された。挿入物のポリヌクレオチド配列は通常の配列決定法を使用して決定された。22A10のVLとVHアミノ酸配列は図7と8にそれぞれ示される。bアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク上への直接的超可変領域の移植22A10のヒト化の最中に構築された変異体は、IgGの形態で評価され、又はファージ上にFabとして一価で提示された。この作業に使用されたファージミドは一価のFab-g3提示ベクターであり、単一のphoAプロモーターの制御下で2つのオープンリーディングフレームからなる。第一のオープンリーディングフレームは、アクセプター軽鎖のVLとCH1ドメインに融合したstIIシグナル配列からなり、第二はアクセプター重鎖のVHとCH1ドメインに融合したstIIシグナル配列からなり、マイナーファージコートタンパク質P3が続く。マウス22A10由来のVL及びVHドメインがヒトVLカッパIVLKI及びヒトVHサブグループIIIVHIIIコンセンサス配列に整列された。マウス22A10mu22A10抗体からの超可変領域は22A10移植片を生成するためにVLKI及びVHIIIアクセプターフレームワーク中へ設計された。22A10のVLドメインから、位置24-34L1,50-56L2及び89-97L3がVLKIへ移植された。22A10のVHドメインから、位置26-35H1,49-65H2及び95-102H3がVLIIIへ移植された図7及び8。CDRの定義は、それらの配列の超可変性WuTTKabatEA、それらの構造上の位置ChothiaCLeskAM及び抗原-抗体接触におけるそれらの関与MacCallumetalJMolBiol262732745により定義される位置を含む。22A10移植片は各超可変領域に対して別個のオリゴヌクレオチドを使用して、クンケル変異誘発により生成された。重鎖あるいは軽鎖のどちらかに対して3つのリン酸化オリゴヌクレオチドが、最終容積が40μlで、50mMのTrispH7.5,10mMのMgCl2中の571ngのクンケルテンプレートに加えられた。混合物は90°Cで2分間、50°Cで5分間アニールされ、次いで氷上で冷却された。10μlのアニールされたテンプレートは、室温で2時間、0.5μlの100mMのATP,0.5μlの25mMのdNTPsdATP,dCTP,dGTP及びdTTPの各々25mM,1μlの100mMのDTT,1μlの10XTMバッファー0.5MのTrispH7.5,0.1MのMgCl2,80UT4リガーゼ及び4UT7ポリメラーゼを加えることにより総容積が13.6μlに充填された。10μlの充填され連結された生成物は次いでXL1-ブルー細胞中へ形質転換されたStratagene。正しいクローンがDNA配列決定により同定され、IgGとして発現された。c超可変領域のソフトランダム化22A10移植片はソフトランダム化の戦略を使用して親和性成熟された。配列の多様性は、毒性オリゴヌクレオチド合成戦略を用いて、マウス可変領域配列に向かうバイアスが維持されるように、各超可変領域に別々に導入した。多様化した各位置において、野生型アミノ酸をコードするコドンは各位置における平均50突然変異率をもたらすヌクレオチドの70-10-10-10混合物で毒されている。配列の多様性は、クンケル突然変異誘発を使用して22A10移植片の超可変領域に導入され、別々にソートされた6つのソフト無作為化ファージライブラリーを生成した。6つのライブラリーが作成され、各々は単一のソフト無作為超可変領域から成る。dファージライブラリーの生成各超可変領域に多様性を導入するように設計されたオリゴヌクレオチドは、37°Cで1時間、660ngのオリゴヌクレオチド、50mMのTrispH7.5,10mMのMgCl2,1mMのATP,20mMのDTT、及び5Uポリヌクレオチドキナーゼを含有する20μlの反応物中に別々にリン酸化された。各ライブラリーに対して、2μlのリン酸化オリゴヌクレオチドが、最終容積が10μlで、50mMのTrispH7.5,10mMのMgCl2中の300ngのクンケルテンプレートに加えられた。混合物は90°Cで2分間、50°Cで5分間アニールされ、次いで氷上で冷却された。アニールされたテンプレートは、室温で2時間、0.5μlの10mMのATP,0.5μlの10mMのdNTPsdATP,dCTP,dGTP及びdTTPの各々10mM,1μlの100mMのDTT,1μlの10XTMバッファー0.5MのTrispH7.5,0.1MのMgCl2,80UT4リガーゼ及び4UT7ポリメラーゼを加えることにより総容積が20μlに充填された。次いで、これらの充填され連結された生成物は、各々XL1-ブルー細胞中に形質転換され、37°Cで2時間、5μgの/mlのテトラサイクリンとM13/KO7ヘルパーファージMOI10を含む0.5mlの2YT中で増殖され、次いでプールされ50μg/mlのカルベニシリンを含有する500mlの2YTへ移され、37°Cで16時間増殖された。eファージ選択固体ファージセレクションにおいて、293由来のヒト又はカニクイザルメソテリンが、マキシソープマイクロタイタープレートNunc,Rochester,NY上の50mMの炭酸水素ナトリウムpH9.6中において4°Cで一晩固定化された。プレートをカゼインブロッカーを使用して少なくとも1時間ブロックしたPierce,Rockford,IL。ファージを培養上清から回収し、5の粉ミルクと0.05のTween20PBSBTを含有するPBSに懸濁した。ファージライブラリーを添加し、1時間インキュベートした後、マイクロタイターウェルを0.05のトゥイーン20PBSTを含むPBSで十分に洗浄し、結合したファージを、20mMのHCl、500mMのKClで30分間ウェルをインキュベートすることにより溶出した。溶出したファージは、1MのTris、pH8を用いて中和し、XL1-ブルー細胞とM13/KO7ヘルパーファージを使用して増幅し、2YT,50μg/mlのカルベニシリン中、37°Cで一晩増殖させた。標的を含有するウェルから溶出されたファージの力価を、濃縮度を評価するために、非標的物を含有するウェルから回収されたファージの力価と比較した。溶液相ファージの選択については、293由来のヒト又はビオチン化カニクイザルのメソテリンが、5粉ミルクおよび0.05のTween20PBSBTを含むPBS中に懸濁させたファージに追加された。インキュベーション後に、ビオチン化メソテリンに結合したファージが、ストレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレート上にて5分間捕捉された。マイクロタイターウェルを0.05のトゥイーン20PBSTを含むPBSで十分に洗浄し、結合したファージを、20mMのHCl、500mMのKClで30分間ウェルをインキュベートすることにより溶出した。溶出したファージは、1MのTris、pH8を用いて中和し、XL1-ブルー細胞とM13/KO7ヘルパーファージを使用して増幅し、2YT,50μg/mlのカルベニシリン中、37°Cで一晩増殖させた。標的を含有するウェルから溶出されたファージの力価を、濃縮度を評価するために、非標的物を含有するウェルから回収されたファージの力価と比較した。溶液相ファージの選択については、選択ストリンジェンシーを、溶液中で低下するビオチン化メソテリンの濃度に結合したファージを捕捉しその後10分間ニュ-トラビジン上で捕捉すること速度選択オン、及び弱く結合したファージを洗い流すことができるように洗浄時間と温度を上昇させること速度選択オフの両方により、徐々に増加させた。fIgG産生スクリーニング目的のために、IgG変異体は最初に293細胞で産生された。VL及びVH25μgをコードするベクターをFUGENEシステムを使用して293細胞にトランスフェクトしたRoche,Basel,Switzerland。500μlのFuGeneは、FBSを含有しない4.5mlのDMEM培地と混合され、室温で5分間インキュベートした。各鎖25μgがこの混合物に対して添加され、室温で20分間インキュベートし、次いで、5のCO2中37°Cで一晩のトランスフェクションのために、5本のT-150フラスコに移された。翌日、トランスフェクション混合物を含有する培地は除去され、0.1ml/Lの微量元素A0934および10mg/LのインスリンA0940を含む23mlのPS04培地で置換された。細胞を更に5日間インキュベートした後、培地を5分間の1000rpmで回収し、0.22μmの低タンパク質結合フィルターを使用して滅菌濾過した。サンプルは、全ての125ml培地について2.5mlの0.1PMSFを添加後に4°Cで貯蔵することができた。IgGをプロテインGアフィニティークロマトグラフィーで精製した。g親和性決定ヒト又はカニクイザルのメソテリンの22A10IgG変異体の親和性を、BIAcoreTM-2000を使用して表面プラズモン共鳴によって決定した。Biacoreの研究品質等級CM5チップが、Biacoreからのアミンカップリングキットを使用して組換えヒト又はカニクイザルのメソテリン由来の大腸菌のおよそ110RUで固定された。各22A10変異体の段階的2倍希釈物0.05のTween20を含有するPBS中に0.488から1000nMが30μl/分の流速で注入された。各サンプルは5分間の会合と3~5分間の解離により解析された。各注入の後、チップは10mMのグリシンpH1.7を使用して再生された。結合応答は、同様の密度で固定化された無関係のIgGとともにフローセルからRUを差し引くことにより補正された。konとkoffの同時フィッティングの1:1Languirモデルが動力学的解析に用いられた。h結果22A10のヒト化のために使用したヒトアクセプターフレームワークはコンセンサスヒトカッパIのVLドメイン及びコンセンサスヒトサブグループIIIのVHドメインに基づいていた。mu22A10のVL及びVHドメインはヒトカッパI及びサブグループIIIと整列され;各相補性決定領域CDRが同定されてヒトアクセプターフレームワークへ移植され、IgGとして発現され得る又はファージ上にFabとして呈示され得るCDRグラフトを生成した図7及び8。6つのソフトランダム化ライブラリが生成され、そこでは多様性が22A10CDR移植片の各CDRに別々に導入された。ライブラリーが、ヒト及びカニクイザルのメソテリンに対して293細胞由来、カニクイザル又はヒトメソテリンのグリコシル化形態への結合を改善する目的で、固相及び溶液選別戦略の両方を使用してパンされた。非標識化標的の追加はより速い解離速度offratesを持つクローンを除去するために使用することができる一方で、溶液選別法はビオチン化標的濃度及びファージ捕捉時間の操作を通じて、高親和性クローンが選択されることを可能にする。各ライブラリーの最後のラウンドからのクローンがDNA配列解析のために採取され、CDR-L2及びCDR-H2を除いて各CDRで標的された配列の変化が明らかにされ、抗原結合を改善するための多くの可能なバ変形を示唆している。ヒト又はカニクイザルのどちらかのメソテリンで選択された幾つかのクローンは、CDR-H2に変化があり、最も豊富なものは位置99でチロシンからイソロイシンへの変化を有していた。この変異体は、幾つか他のと一緒に、IgGとして発現され、ビアコア及びキャッチャー解析によりメソテリンへの結合について特徴づけられた図9A。いくつかのクローンは22A10の移植片の親和性を超えていた。ヒト化22A10変異体が、安定的にメソテリンを発現する細胞株からメソテリンを免疫沈降するために使用された。異なる種のgDタグ付きメソテリンを安定的に発現するBJAB細胞が、図9Bに示されるように、ヒト化22A10変異体Gr,移植片;v11,v1717及びv8383、又は比較のためにh7D9.v3、h5B6抗-gD又はhIgG陰性コントロールと共に免疫沈降された。免疫沈降物が洗浄され、gD-メソテリンを検出するために、マウス抗-gD抗体でウエスタンブロットした。h2210.v83は、3種のメソテリン全てを免疫沈降するその性能において最良のh22A10変異体であったカニクイザル、上;ヒト、中央;及びラット、下のブロット。一番右のレーンは、全発現レベルの比較のために20の入力溶解物免疫沈降せずを示している。分子量マーカーkDaは左側に示されている。ヒト化22A10.v83についての変更の概要ヒトコンセンサスカッパIのVL及びサブグループIIIのVHへの6つのマウス22A10CDR位置24-34L1,50-56L2,89-97L3,26-35H1,49-65H2及び95-102H3として定義されるの移植片から開始して、CDRソフト無作為化が、ヒト及びカニクイザルのメソテリンへの結合を改善するCDRH3Y99Iの変化を同定するために使用された。22A10.v83は高親和性結合を示し、かつまた、他のヒト化変異体に比してより多くの結合部位を認識する能力を示した。この出願を通じて、マウスモノクローナル抗体の7D9と22A10は、別の方法では7D9、m7D9又はmu7D9;及び22A10、m22A10又はmu22A10として言及される。ヒト化モノクローナル抗体の7D9.v3及び22A10.v83は、別の方法では、他に指定されない限り、7D9.v3,h7D9.v3又はhu7D9.v3;及び22A10.v83,h22A10.v83又はhu22A10.v83としてそれぞれ言及される。D.種の交差反応性モノクローナル抗体は、それらが、ヒト以外の種由来のメソテリンと交差反応するかどうかを決定するために試験した。図11は、ヒト配列番号43、カニクイザル配列番号46、ラット配列番号47及びマウス配列番号48のメソテリンの間の配列相同性を示す。網掛けshaded残基は、少なくとも二つの種の間で同一である。網掛けの無い残基は、4種の少なくとも二つの間で異なる。図12は、gDエピトープタグ付きメソテリンヒト、カニクイザル、ラットまたはマウスメソテリンで安定的にトランスフェクトされ;10μg/mlのh7D9.v3,h22A10.v83又は抗gDh5B6で染色され;Alexa647抗ヒト抗体で検出された;293細胞のFACS解析の結果を示す。トランスフェクトされていない293細胞は、通常はメソテリンを発現しないWT。h7D9.v3はヒトメソテリンに特異的であるが、h22A10.v83は、ヒト、カニクイザルおよびラットメソテリンに結合するが、マウスメソテリンに結合しない。抗-gD染色はマウスメソテリンが実際に発現していることを検証した。E.抗体親和性h7D9.v3及びh22A10.v83の相対的結合親和性を決定するために、スキャッチャード分析を標準的手順に従って、簡単には、非標識化抗体濃度を増加させつつ、離脱細胞を[I125]で標識したh7D9.v3又はh22A10.v83とともに2時間室温でインキュベートし、洗浄し、シンチレーションカウンティングによって細胞に結合した放射能を定量することにより行った、データは、新しいリガンドNewLigandプログラムで非線形回帰曲線フィッティングにより分析しGenentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA、Kd値を見積もった。図13に示されるように、h7D9.v3は、安定的にトランスフェクトされた293細胞株、BJAB細胞株及びHT1080細胞株で発現されるgDタグ付きヒトメソテリンに対してそれぞれ0.2,0.25及び0.97nMの親和性で結合した。これらのKd値は、4つ膵臓と2つの卵巣細胞株において内因性メソテリンで見られる範囲を包含する0.41-1nM。同じ安定な細胞株で発現されるヒトメソテリンに対するh22A10.v83の親和性は、内因性ヒトメソテリンに対するその親和性~9-10nMに従って、それぞれ2.7,1.8及び6.2nMであった。h22A10.v83は安定的にトランスフェクトされた293細胞とBJAB細胞に発現されたラットメソテリンに、それぞれ7.3nM及び2.7nMの親和性で結合し、これは正常な胸膜細胞株4/4-RM4で内因性のラットメソテリンに対して観察された6.2nMでのKdに一致する。F.エピトープ群7D9と22A10が図3に記載されている他の抗メソテリン抗体と同じエピトープを共有するかどうかを決定するために、モノクローナル抗体のエピトープマッピングが、標準的なクロスブロッキングELISAにより実施された。96穴のNuncImmunosorpプレートNalgeNunc,USAが、コーティングバッファー50mMの炭酸ナトリウム、pH9.5中の1μg/mLのヒトメソテリン細胞外ドメインの100μLと共に4°Cで一晩コーティングされた。続く全ての工程は室温で実施された。200μLの洗浄バッファー0.05のTween20、pH7.4を含有するPBSで3回洗浄後、プレートをELISAバッファー0.5ウシ血清アルブミンBSAと0.05Tween20、pH7.4を含有するPBSで60分間ブロックした。次いでマウスモノクローナル抗体7D9又は22A10がELISAバッファーに20μg/mLで2時間添加されたウェルあたり100μL。洗浄無しで、全試験抗メソテリン抗体のビオチン化バージョンが最終濃度が1μg/mlまで30分間添加された。200μLの洗浄バッファーで3回洗浄後、任意のビオチン化抗体の結合が、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼHRPZymed;Carlsbad,CAを30分間1:5000の希釈度で添加することによって検出された。上記のように3回の洗浄後、100μLの発色性3,3’、5,5’-テトラメチルベンジジンTMB基質を5分間添加したBioFXLaboratories;OwingsMills,MD。発色反応は100μLの停止試薬の添加により停止されBioFXLaboratories、吸光度をウルトラマイクロプレートリーダーで620nmで読み取ったBiotekInstruments;Winooski,VT。ビオチン化抗体のそれぞれの可能な結合の最大の程度を、非ビオチン化抗体7D9と22A10の欠損下でそれらをメソテリンとともにインキュベートすることにより並行して測定した。結果を図14に示す。9つのビオチン化抗メソテリン抗体のいずれかによるシグナルは、一次抗体をめぐる競合の欠如を示している比較のために一次抗体の欠損下での各ビオチン化抗体による最大結合はまた、右の群に表示されている。7D9図14で7D9.5.2として言及は、7D9が存在するときには結合できない唯一の抗体であるが、一方、22A10は通常は結合する左の群における黒いバー。逆に、22A10が事前に結合されている場合、22A10は結合できない中央の群の最後のバーが一方7D9および他の抗体は可能である。従って、7D9と22A10は互いに競合しないだけでなく、各々は他の7つの抗体とは区別されるエピトープに結合する。7D9はそれ自身によって競合されるが、任意の別の抗体によってはされないELISAコート抗体7D9又は22A10の欠損下でプレート上のメソテリンに対する各々の抗体結合についての最大シグナルに対して各バーを比較せよ。同様に、22A10のみがそれ自身と競合するが、7D9を含む別の抗体とは競合しない。従って、7D9と22A10はお互いに対して及び他の単離されたモノクローナル抗体に対して異なるエピトープを有する。G.ヒト:マウス及びカニクイザル:ヒトメソテリンキメラを使用するエピトープマッピング及び変異解析h7D9.v3を固定化ヒトメソテリンに結合させ、次いでこれらをトリプシンとインキュベートし、抗体で保護された残りのペプチドを溶出して質量分析により同定するトリプシンペプチドマッピング実験を実施した。それらの実験は、配列番号43のアミノ酸133-183をh7D9.v3結合部位として結びつけた。この領域を確認するために、我々は、マウスメソテリンコンストラクト385又はカニクイザルメソテリンコンストラクト383でなく、ヒトメソテリン図15に示されるコンストラクト387のと7D9の反応をキメラを生成するために利用し、我々はそれを切断変異体よりも良好にフォールドするはずであると予測した。我々は、マウスのコンストラクトにヒトの配列を導入するために、アミノ酸131でのサイレントMfeI部位QLをコードする及びアミノ酸213でのサイレントBglII部位DLをコードするを用いて、ヒト:マウスメソテリンキメラ398及び399を構築した。更に、カニクイザルのコンストラクト400が作成され、そこではアミノ酸131-178がMfeI部位を介してヒトメソテリンのそれらと置換された。各コンストラクトは発現を確認するためのN-末端のgDタグ図示せずを有していた。図15に示されるgDタグ付きのGPI固着されたメソテリンコンストラクトは一過性に293細胞で発現され、0.02μg/mlのマウス7D9、1μg/mlのマウス22A10,又は1μg/mlの抗gDタグにより染色された発現差異レベルを標準化するため。Alexa488抗マウス抗体による検出後、サンプルが洗浄され、FACSにより解析され、蛍光強度データは、野生型293陰性コントロール細胞上の任意のバックグラウンド染色を差し引いた後で、抗-gDシグナルに標準化した。図16に示されるように、7D9はヒト:マウスキメラ399ヒトアミノ酸1~213を有するに結合するが、全長マウスメソテリン385又は398ヒトアミノ酸の1~131からのみを有するの何れにも結合せず、7D9がアミノ酸131と213の間のエピトープに結合することを示唆している。カニクイザル:ヒトのキメラ400ヒトアミノ酸131-178を有するに結合するその能力、しかし全長カニクイザル383でなく、はアミノ酸131と178の間にエピトープを制限した。22A10よりも7D9で見られる比較的低い結合のは50倍低い7D9の抗体濃度によるものである。同じキメラが、ラット、カニクイザル及びヒトただし、マウスでなく反応性22A10エピトープをマッピングするために使用された。結合はキメラ399、しかし398でなく、を発現する細胞で観察された。従って、22A10はアミノ酸131-213の間の決定的残基を持つエピトープに結合する。図16。7D9と22A10はお互いに競合しないゆえ図13、それらはおそらく、アミノ酸131から213内の異なるエピトープに結合する。それらの異なるエピトープを同定するために、ヒトのメソテリンの2-4アミノ酸伸張が、399キメラグラウンドにおいて対応するマウスのアミノ酸に変異された。4種の間でアミノ酸132-212のアラインメントが、15の変異体の位置を示す番号付きボックスを付して図17に示されている。図17の下に表に一覧された15の変異体の各々において、マウスの配列下に変異されたヒトの配列上が示されている。記:変異11は成功裏には生成されなかった。図17から変異体11を除く全変異体が293細胞に発現され、図16にあるように、各抗体のヒト化バージョンl即ち、h7D9.v3,h22A10.v83及びh5B6抗gDタグ陽性コントロールの5μg/mが使用されたことを除き、検出のために使用されるAlexa488抗マウス抗体によりFACS解析を受けた。結果は発現レベルに対して正規化するために抗gDシグナルの割合として示される蛍光データとともに図18Aに示される。記:変異体13は293細胞中で発現しなかったのでデータセットから削除されている。h7D9.v3は6と9を除いて全変異体に結合したが、一方h22A10.v83は15を除いて全変異体に結合した矢印。異なる種のメソテリンのアラインメントにより、h7D9.v3エピトープにおいて鍵となる残基が、ヒト配列と非交差反応性カニクイザル配列の間で異なる2つのアミノ酸に特定された:変異体6のE153及び変異体9のD174。抗体結合のためのそれらの残基の重要性は、対応するヒト残基に対してカニクイザルのメソテリンで同等の残基を変異させることにより確認した即ち、R153をE及びG174をD。h7D9.v3、これは、それ以外の場合カニクイザルのメソテリンに結合しない、はカニクイザルのメソテリン変異体に結合することができた図18B。ヒトメソテリンの配列の残基E152がQに変異されたさらなる研究は、h7D9.v3結合の阻害をもたらし、残基E152が抗体結合において役割を果たしていることを示唆している。最近予測されたメソテリンのアルマジロ様リピート構造に基づいて、7D9抗体は、おそらくメソテリンの内側ヘリックス4と外側ヘリックス5を架橋する可能性がある。同様に、h22A10.v83は、マウスではなく、ラットと交差反応するため、変異体15の残基E211上掲Sathyanarayanaらの外側ヘリックス6にあるはそのエピトープの重要な決定因子である可能性がある。図19は、h7D9.v3とh22A10.v83によって結合される残基を示している。H.h7D9.v3の結合はグリコシル化により阻害されない。h7D9.v3がグリコシル化メソテリンに結合するかを決定するために、C末端にHisタグを付けたヒトメソテリンがCHO細胞で発現され、精製され、SDS-PAGEゲル上のクーマシーブルー染色により示されるように、MonoSカラムの電荷に従って、高画分A11、中間A12、低B1及び低から無B5に更に分離された。図20、上段左。各画分を事前に結合したh7D9.v3でチップ上に流動させ、オンとオフの割合が測定され、各画分図20左下に対しての同一の親和性1.5nMが明らかにされ、h7D9.v3の結合は、グリコシル化によって阻害されないことを示唆している。これらのデータは、h7D9.v3は、安定的にgD-ヒトメソテリンを発現するそのgDエピトープタグはグリコシル化部位を欠いているHT1080細胞由来のヒト化抗-gDh5B6抗体と同じバンドの全てを免疫沈降させることができることをを示すことによって確認され、h7D9.v3は、グリコシル化状態に関係なくヒトのメソテリンを免疫沈降することができることを示唆している。対照的に、ヒト化22A10は優先的に低分子量少なくともグリコシル化の種を免疫沈降させ、22A10の結合はグリコシル化により影響され得ないことを示唆している。図20、右。h7D9.v3と比較して、試験抗体のグリコシル化メソテリンへ結合する能力を評価するためにFACSアッセイが実施され、そこではOVCAR3細胞への試験抗体の結合がOVCAR3細胞へのh7D9.v3の結合と比較される。適切な2次抗体がOVCAR3細胞へのh7D9.v3及び試験抗体の結合を検出するために使用された例えば、Alexa647抗ヒト抗体がh7D9.v3の結合の検出に使用される。I.モノクローナル抗体19C3はメソテリンに対するMUC16の相互作用を遮断するモノクローナル抗体は、それらがメソテリンに対するMUC16の結合を遮断することができるかどうかを決定するために試験された。MUC16の精製ビオチン化断片Muc16-Bt、3回のムチン繰り返しを持つの、A431細胞通常はメソテリンを発現しない上で安定的に発現されるメソテリンへの結合が図21抗体無しnoAb、左パネルに示される。19C3しかし7D9ではないの5倍モル比を用いた細胞のプレインキュベーションは、図21、左パネルに示されているようにように、ストレプトアビジン-PEによるFACSによって検出されるように、メソテリンに対するMUC16-Btの結合を阻害した。逆に、組換えC末端his8タグ付きメソテリン293細胞から精製の安定的にMUC16を発現するPC3細胞への結合が、指定された抗メソテリン抗体の5倍モル過剰の非存在下又は存在下で評価され図21右パネル、これらはAlexa647抗his6を抗体でFACSにより検出した。19C37D9または22A10でなくとメソテリンのプレインキュベーションは、MUC16発現細胞に対するにメソテリンの結合を阻害する図21、右パネル。実際には、7D9と22A10は、このアッセイにおいてMUC16に対するメソテリンの結合を強化するように見える。J.様々な癌のタイプにおけるヒトメソテリンの罹患率種々の癌におけるヒトメソテリンの発現は、免疫組織化学法を用いて解析した。膵管腺癌図22、卵巣漿液腺図23及び非小細胞肺腺癌図24のホルマリン固定パラフィン包埋FFPE腫瘍マイクロアレイ腫瘍ごとに1mmのコアが、顕微鏡スライド上に切片化され、脱パラフィン処理され、希釈アルコール系を通して再水和された。スライドは、標的回復溶液Dako,Glostrup,Denmarkを使用して抗原回復のために前処理され、反応停止し、ブロックされ、そしてダコの自動染色液上で60分間、10μgの/mlのマウス抗ヒトメソテリンモノクローナル抗体19C3で染色された。洗浄後、193Cはビオチン化抗マウス抗体で、続いてABC複合体VECTASTAINABCEliteKit,VectorLaboratories,Burlingame,CAで検出され、そしてDABPierceLaboratoriesを色素原として視覚化した。次いで、スライドをマイヤーズヘマトキシリンで対比染色し、アルコール及びキシレンの系列で脱水し、有機封入剤を使用してカバーガラスを装着したPermaMount,FisherScientific,Pittsburgh,PA。メソテリンの染色茶色は、強度茶色染色の暗さ並びに染色の幅を考慮して、以下の方式に従って訓練された病理学者によってスコア化された。各メソテリンスコアの代表例は、それぞれの腫瘍タイプに対して図22-24に示されている。0陰性:腫瘍細胞の>90で非常に弱いか又は全く染色無し1軽度:優勢な染色パターンは弱い2中等度:優勢な染色パターンは、腫瘍細胞の大部分>50で適度に強い3強:優勢な染色パターンは、腫瘍細胞の大部分>50で強い図22は、膵管腺癌の70が、1、2又は3レベルでの染色を示し、メソテリン陽性であることを示しており、33は2又は3の染色を示している。図23は、卵巣漿液腺癌98が、メソテリン陽性であり、74が2又は3のレベルでの染色を示している。また、卵巣漿液性腺癌からの8つの試験された転移の全てがメソテリン陽性であり、原発性卵巣腫瘍は転移後にメソテリンの発現を失わないことを示唆している。図24は、44の非小細胞肺癌NSCLC、腺癌のサブタイプが、メソテリン陽性であり、26が2又は3のレベルでの染色を示している。更に、メソテリン陽性原発性NSCLC患者の腫瘍に由来する試験され適合した転移の8つのうち3つ38が、メソテリン陽性染色を保持していた。メソテリンはまた、19C3抗体を用いてIHCにより決定されるように、中皮腫や子宮内膜癌で発現している。カニクイザルにおけるメソテリンの発現も調べた。ヒトホルマリン固定パラフィン包埋切片及びカニクイザル凍結切片からの肺胸膜と心臓心膜中皮の切片が切片化され、それぞれ、19C3モノクローナル抗体又は22A10モノクローナル抗体で染色された。ヒト中皮は、19C3で特異的に染色し図25、左、カニクイザル中皮は22A10で特異的に染色した図25、右。これらの結果は、22A10は、ヒトと同様の分布を有する、内因性カニクイザルメソテリンを認識できることを示している。K.抗メソテリン抗体薬物コンジュゲートの製造抗メソテリン抗体薬物コンジュゲートADCは、h7D9.v3とh22A10.v83を薬物リンカー部分MC-vc-PAB-MMAEにコンジュゲートすることにより生成され、それは上のセクションII.Dに図示されている。便宜上、薬物リンカー部分MC-vc-PAB-MMAEは、実施例及び図中において、vcMMAE又はVCEとして別に言及される。例えば、h7D9.v3-MC-vc-PAB-MMAEはこれらの実施例において、及び図において、h7D9.v3-vcMMAE又はh7D9.v3-VCEと言及される。コンジュゲーションに先立って、抗体は、国際公開第2004/010957A2号に記載された方法に従う標準的な方法を用いて、部分的にTCEPで還元した。部分的に還元された抗体は、DoroninaetalNatBiotechnol21778784及び米国特許出願公開第2005/0238649A1号に記載の方法に従い、標準的な方法を用いて薬物リンカー部分にコンジュゲートされた。簡単には、部分的に還元された抗体は、システイン残基への該部分のコンジュゲーションを可能にするために、薬物リンカー成分と結合された。コンジュゲーション反応を急冷し、ADCを精製した各ADCに対する薬物負荷抗体当たりの薬物部分の平均数を決定し、全ての場合において3.33と4.0の間であった。L.インビボHPACモデルにおけるh7D9.v3-vcMMAEの有効性h7D9.v3-vcMMAEの有効性を膵臓腺癌異種移植モデルを用いて調べた。HBSS中の500万個のHPAC細胞19C3によるIHCによりメソテリン陽性2をSCIDベージュマウスに皮下注射し、腫瘍に.1.1,2.7,5.5,11,及び16.4mg/kgでh7D9.v3-vcMMAEを3.5MMAE/抗体で,又は5,10及び15mg/kgでh5B6抗gD-vcMMAEを抗体あたり3.3MMAEとともに,又は15mg/kgのネイキッドh7D9.v3をMMAE無し投与した。図26に示されるように、実質的な腫瘍増殖阻害は5.5mg/kgのh7D9.v3-vcMMAEで達成され、退縮は11-16mg/kgのh7D9.v3-vcMMAEで達成されたが、有意な効果は15mg/kgのgD-vcMMAE又はネイキッド抗体では観察されなかった。全体的な増殖率に基づいてモデル化されたカーブのフィットが示されている。図26の右下のパネルは、FACS解析、HPAC細胞におけるh7D9.v3の内在化、IHCを示す。M.原発性膵臓腺癌モデルにおけるh7D9.v3-vcMMAEの有効性h7D9.v3-vcMMAEの有効性が原発性膵臓腺癌モデルにおいて調査されたOncotest,GMBH,Germany。原発性ヒトメソテリン陽性膵腫瘍のかたまりIHCによりメソテリンを1-2で発現するを、5、10及び20mg/kgのh7D9.v3-vcMMAE3.5MMAE/抗体を投与された雌のNMRIヌードマウスに皮下移植した。平均腫瘍体積±標準偏差が図27にプロットされている。有意な腫瘍増殖阻害はh7D9.v3-vcMMAEのすべての用量で見いだされた。原発性膵臓腫瘍のIHCが右側に示される。N.卵巣癌モデルにおけるh7D9.v3-vcMMAEの有効性h7D9.v3-vcMMAEの有効性を膵臓腺癌異種移植モデルを用いて調べた。1000万個のOvCar3x2.1細胞19C3によるIHCによりメソテリン陽性2-3がCB17SCIDベージュマウスの乳腺脂肪体に注入され、続いて1,2.5,5,10及び15mg/kgのh7D9.v3-vcMMAE3.5MMAE/抗体又はh5B6抗gD-vcMMAE3.3MMAE/抗体が投与された。図28に示されるように、中程度の活性が2.5mg/kgのh7D9.v3-vcMMAEで見られ、退縮は5mg/kg以上で見られたが、抗gD-vcMMAEは5mg/kg未満で活性を示さなかった10mg/kgで中程度の活性を示すだけで15mg/kgでは腫瘍は静止した。全体的な増殖率に基づいてモデル化されたカーブのフィットが示されている。図28の右のパネルは、FACS解析、OvCar3x2.1細胞におけるh7D9.v3の内在化、IHCを示す。O.肺癌モデルにおけるh7D9.v30-vcMMAEの有効性h7D9.v3-vcMMAEの有効性を肺癌扁平上皮癌異種移植モデルを用いて調べた。500万個のH226x2細胞IHCによりメソテリン陽性3が、CB17SCIDマウスの脇腹にHBSS:マトリゲルの50:50ミックスで注入された。平均腫瘍体積±標準偏差が図29にプロットされる。h7D9v3-vcMMAE3.5MMAE/抗体は5mg/kgで中程度の活性を示し、10mg/kgで腫瘍は静止したが、抗gD-vcMMAEコンジュゲート:3.97MMAE/抗体は両方の用量において有意な活性が無かった。図29の右のパネルは、FACS解析、H226x2細胞におけるh7D9.v3の内在化、IHCを示す。P.h7D9.v3-vcMMAEとh22A10.v83-vcMMAEは類似の有効性を有する。h22A10.v83-vcMMAEに比べたh7D9.v3-vcMMAEの有効性が調べられた。gDヒトメソテリン左又はgDカニクイザルメソテリン右のどちらかを安定的に発現する2000万個のBJAB細胞を、HBSSバッファー中でCB17SCIDマウスに皮下接種した。マウスは、BJAB-gDヒトメソテリンを接種されたマウスにh7D9.v3-vcMMAE又はBJAB-gDカニクイザルメソテリンを接種されたマウスにh22A10.v83-vcMMAEを0.5又は2mg/kgで投与され、又は陽性コントロールとして及び2種類の細胞株の間での発現の任意の相違に対する正規化群として使用される抗gD-vcMMAEを2mg/kgで投与された。平均腫瘍体積±標準偏差が図30にプロットされている。h7D9.v3-vcMMAEとh22A10.v83-vcMMAEの両方が、BJAB-gDヒトメソテリン腫瘍及びBJAB-gDカニクイザルメソテリン腫瘍のそれぞれに対して、2mg/kgで、gD-vcMMAEコントロールよりも良好な活性を示した。この実験における陰性コントロールは、vcMMAEにコンジュゲートした無関係であった抗体であり、それは有意な活性を示さなかった。h22A10.v83-vcMMAEの活性を更に評価するために、図29のH226x2腫瘍と図28に説明されるように増殖したOvCar3x2.1腫瘍に指定された濃度のh7D9.v3-vcMMAE及びh22A10.v83-vcMMAE3.53MMAE/抗体、又は陰性コントロールとして抗gD-vcMMAEが投与された。平均腫瘍体積±標準偏差が図31にプロットされている。h7D9.v3と比較して、FACSによるこれらの細胞株の両方に対するネイキッドh22A10.v83の著しく弱い結合にも関わらず、h22A10.v83-vcMMAEは、H226x2モデルにおいてh7D9.v3-vcMMAEと同様に効果的であり左上パネル、6mg/kgを投与後の腫瘍の速い退縮によって示されるように、OvCar3x2.1モデルにおいてごくわずかに活性が小さかった右上パネル。Q.MUC16とメソテリンは二重陽性細胞株で複合体を形成する。細胞株でのMUC16とメソテリンとのの相互作用を調べた。メソテリンおよびMUC16の両方を発現するOvCar3細胞を、1のNP40緩衝液中で溶解した。図32の左パネルに示されるように、溶解物をm7D9またはアイソタイプコントロールIgGで免疫沈降させ、抗MUC16抗体上ブロットまたはh7D9下のブロットでウエスタンブロットを行い、メソテリン:MUC16複合体又は全メソテリンをそれぞれ検出した。20の非免疫沈降インプットが左レーンに示される。m7D9はOvCar3細胞溶解物からメソテリンとMUC16を共免疫沈降することができた。その結果は、MUC16は、メソテリンおよびMUC16の両方を発現する細胞株すなわち、二重陽性細胞株においてメソテリンと複合体を形成することを示している。図32、右パネルに示されるように、メソテリン又はMUC16の何れかに対する抗体が、指定された細胞株が増殖する条件培地からそれらのタンパク質を免疫沈降させるために使用された。その細胞株は、メソテリンのみHPACS、MUC16のみA431発現する、何れも発現しないH520、又は両方を発現するOvCar3,CAPAN-2,EKVX及びOvCar429細胞。抗メソテリンキメラ抗体ch7D9上と下のパネル又は抗MUC16のみ16抗体中央パネルが免疫沈降に使用された。洗浄した免疫沈降物はマウス抗メソテリン抗体2E5上又はマウス抗MUC16BドメインM11様抗体1.B.823でウエスタンブロットWBしたUSBiological,Swampscott,MA;中央と下のパネル。従って、上のパネルはメソテリンを発現する細胞株からの免疫沈降したメソテリンを示し、中央パネルはMUC16を発現する細胞株からの免疫沈降したMUC16を示し、下のパネルは、両方のタンパク質を発現する細胞株二重陽性細胞株に特異的である、共免疫沈降したメソテリン:MUC16複合体を示す。これらの結果は、メソテリンはMUC16に結合しつつ培地中に離脱することが可能であることを示唆している。従って、本発明の抗体および免疫複合体は、二重陽性の癌を含む、メソテリン陽性癌を治療するために有用である。R.7D9でなく、19C3はメソテリンから事前に結合したMUC16を外す。MUC16の存在下でメソテリンに対する19C3の結合を調べた。MUC16ビオチン1ug/ml又は9.2nMを、メソテリンを発現するHT1080細胞に事前に結合させた。19C35ug/mlが、事前に結合したMUC16と置換するかどうかを決定するために添加された。MUC16-ビオチンをSAPE検出試薬を用いて検出し、結合した抗体をAlexa488抗マウス抗体を用いて検出した。図33は、19C3が実際にMUC16と置換し、メソテリンに結合することができたことを示している。MUC16結合部位の外側のメソテリンの領域に結合する抗体7D933nMが、陰性コントロールとして使用され、期待通りに、事前に結合したMUC16を置換することができなかった。追加実験では、19C3はまた、0.1ug/mlでMUC16を置換するが、一方抗体2E5は≧5ug/mlでのみでMUC16を置換することができるデータ非表示ことを実証した。前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。"