"aそのC末端でbに連結されたシグナルペプチドをコードする第1の核酸配列bそのC末端でcに連結された、ビオチン模倣ペプチドBMPまたはビオチンアクセプタペプチドBAPをコードする第2の核酸配列c細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチをコードする第3の核酸配列を含む核酸分子。第1および第2の核酸配列および/または第2および第3の核酸配列が、リンカーペプチドをコードする核酸配列により連結されている請求項1記載の核酸分子。細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチが、配列番号9のCD59aである請求項1または2記載の核酸分子。細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチが、CD48-GPIに直接連結された配列番号1のアミノ酸配列の合成キャリアペプチドである請求項1または2記載の核酸分子。細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチが、膜貫通ペプチドに連結された配列番号1の合成キャリアペプチドである請求項1または2記載の核酸分子。膜貫通ペプチドが配列番号2のIGF-1R-TMである請求項5記載の核酸分子。シグナルペプチドが、ヒト成長ホルモンのシグナルペプチドまたはCD59のシグナルペプチドである請求項1~6のいずれか1項に記載の核酸分子。細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチが、選択耐性を付与するポリペプチドにそのC末端で連結される請求項1~6のいずれか1項に記載の核酸分子。選択耐性を付与するポリペプチドが、抗生物質加水分解酵素、抗生物質捕捉タンパク質、代謝酵素および抗生物質修飾酵素からなる群より選択される請求項8記載の核酸分子。細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチが、リンカーペプチドを介して選択耐性を付与するポリペプチドに連結している請求項8記載の核酸分子。抗生物質加水分解酵素が、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼPACなどのピューロマイシン加水分解酵素、およびアミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼなどのアミノグリコシド加水分解酵素からなる群より選択され、抗生物質捕捉タンパク質がShble遺伝子産物であり、抗生物質修飾酵素がハイグロマイシンキナーゼである請求項9記載の核酸分子。リンカーペプチドが、イソロイシンおよびプロリンのアミノ酸配列からなる、または配列番号4のアミノ酸配列からなる請求項2記載の核酸分子。核酸分子の転写を駆動することのできるプロモーターに作動可能に連結され、かつ任意にはEMCVIRES配列の上流に作動可能に連結されている請求項1記載の核酸分子。プロモーターがhCMVである請求項13記載の核酸分子。第2の核酸配列がBMPをコードする請求項1~14のいずれか1項に記載の核酸分子。BMPが配列番号5のアミノ酸配列を含む請求項15記載の核酸分子。核酸分子がさらに、配列番号2のアミノ酸配列の膜貫通ペプチドに直接連結された配列番号1のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、配列番号6のアミノ酸配列のCD59aのシグナルペプチド、および配列番号7のアミノ酸配列のPACをコードする核酸配列を含む請求項15記載の核酸分子。配列番号8の核酸配列を含む請求項17記載の核酸分子。核酸分子がさらに、配列番号9のアミノ酸配列のマウスCD59a、および配列番号6のアミノ酸配列のCD59aのシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む請求項15記載の核酸分子。核酸配列が配列番号10のものである請求項18記載の核酸分子。核酸分子がさらに、配列番号2のアミノ酸配列の膜貫通ペプチドに直接連結された配列番号1のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、および配列番号6のアミノ酸配列のCD59aのシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む請求項14記載の核酸分子。核酸分子が配列番号11のものである請求項20記載の核酸分子。核酸分子がさらに、配列番号3のアミノ酸配列のCD48-GPIアンカーペプチドに直接連結された配列番号1のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、および配列番号6のアミノ酸配列のCD59aのシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む請求項14記載の核酸分子。核酸配列が配列番号12のものである請求項22記載の核酸分子。さらにPOIコード核酸配列を含む請求項1記載の核酸分子。POIコード核酸配列が、EMCVIRES配列の上流に作動可能に連結されているか、または核酸分子の転写を駆動することのできるプロモーターの下流に作動可能に連結されているか、またはその両方である請求項25記載の核酸分子。POIコード核酸配列が、シグナルポリペプチドをコードするPOIコード核酸配列である請求項25記載の核酸分子。POIコード核酸配列が、POIの異なるサブユニットをコードする2つのPOIコード核酸配列を含む請求項25記載の核酸分子。サブユニットが、抗体の軽鎖および重鎖である請求項28記載の核酸分子。目的のタンパク質が、そのアミノ末端でシグナルペプチドに、任意にはリンカーペプチドを介して、連結されている請求項25記載の核酸分子。POIが、Fc-融合産物、抗体、サイトカイン、ホルモン、成長因子、神経伝達物質、酵素、受容体リガンド、シアロムチン、核タンパク質、調節タンパク質および毒素、またはそれらの機能的画分からなる群より選択される請求項26記載の核酸分子。請求項1~7のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。細胞表面にBMPを提示する細胞を同定することを含む、目的のタンパク質POIを分泌する真核細胞の選択方法であって、細胞表面におけるBMP提示のレベルが分泌されたPOIの量と相関し、d第2の核酸配列がBMPをコードし、第2のベクターがPOIコード核酸配列を含む請求項32記載のベクターで細胞をトランスフェクトするか、または第2の核酸配列がBMPをコードする請求項25記載の核酸分子を含むベクターで細胞をトランスフェクトし、それによりBMPトランスフェクト細胞の安定なプールを確立する工程;eBMPトランスフェクト細胞を検出可能なビオチン結合部分で標識する工程;およびf検出可能なビオチン結合部分で標識化されたトランスフェクト細胞を同定および単離する工程を含む方法。細胞表面にビオチンを提示する細胞を同定することを含む、目的のタンパク質POIを分泌する真核細胞の選択方法であって、細胞表面におけるビオチン提示のレベルが分泌されたPOIの量と相関し、a第2の核酸配列がBAPをコードし、第2のベクターがPOIコード核酸配列を含む請求項32記載のベクターで細胞をトランスフェクトするか、または第2の核酸配列がBAPをコードする請求項25記載の核酸分子を含むベクターで細胞をトランスフェクトし、それによりBAPトランスフェクト細胞の安定なプールを確立する工程;bBirAおよびビオチンを追加する工程;cBAPトランスフェクト細胞を検出可能なビオチン結合部分で標識する工程;およびd検出可能なビオチン結合部分で標識化されたトランスフェクト細胞を同定および単離する工程を含む方法。さらに、単離された細胞を増殖させ、かつb~d工程を繰り返す請求項33または34記載の方法。さらに、検出可能なビオチン結合部分で標識化された単一細胞を単離し、かつその細胞を増殖させてクローンを形成することを含む請求項35記載の方法。さらに、分泌された目的のタンパク質を検出および定量し、それにより目的のタンパク質を分泌する真核細胞を選択することを含む請求項36記載の方法。前記細胞がBMPをその細胞表面に提示する請求項33記載の方法。前記細胞が哺乳類、植物、昆虫および酵母細胞から選択される真核細胞である請求項33~38のいずれか1項に記載の方法。哺乳類の細胞が、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、ベビーマウス骨肉腫NS0細胞、ハムスター腎臓BHK細胞、ヒト胎児腎臓HEK細胞、ヒト網膜細胞、COS細胞、SP2/0細胞、WI38細胞、MRCS細胞およびPer.C6細胞から選択される請求項39記載の方法。細胞が、蛍光アビジンおよび蛍光ストレプトアビジンからなる群より選択される検出可能なビオチン結合部分に接触させることによって標識化される請求項33または34記載の方法。標識化された細胞が、FACSまたは電磁ビーズの手段により同定および単離される請求項33~41のいずれか1項に記載の方法。選択された真核細胞が、安定なプールのトランスフェクトされた細胞よりも、より高い量のBMPをその表面に提示し、かつより多い量の目的のタンパク質を分泌する請求項39記載の方法。選択された真核細胞の表面上のBMPの量および選択された真核細胞により分泌される目的のタンパク質の量が、安定なプールのトランスフェクトされた細胞よりも少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15倍大きく、最高30倍まで大きい請求項43記載の方法。FACSなどのフローサイトメトリーによる細胞ソーティングは、蛍光シグナルを必要とする。目的のタンパク質POIは、通常蛍光性ではないため、その発現が目的の遺伝子GOIの発現に関連付けられる蛍光性レポーター遺伝子産物が必要とされる。標識化細胞表面マーカーのビオチン-ストレプトアビジンシステムは、いくつかの理由、すなわち1システムが低いバックグラウンドで多くの細胞種に適用可能である;2ストレプトアビジンへのビオチンの結合の親和性と特異性が非常に高い;および3システムが動物成分不含条件に適合するという理由により有益であり、規制当局に個別のファイルが必要とされる抗体の使用が要求されない。ビオチンはタンパク質やペプチドではなく、特定のDNA配列によりコードさせることができないので、1ビオチンをそのストレプトアビジンへの結合能力の点において模倣するペプチドBMPの利用[22、23]、および2細菌起源由来のBirAなどのビオチンタンパク質リガーゼBPLにより特異的にビオチン化できる[25、26]合成ビオチンアクセプタペプチドBAP[24]を、コーディングDNA[27~29]として細胞中にトランスフェクトするか、酵素混合物[24、30、31]にタンパク質として添加するかのいずれかによる採用、という2つの戦略がとられる。合成BAP配列[24]は、酵素BPL[26]により、長い天然配列[26]と同様に特異的にビオチン化される。細胞表面上のF-SAによるレポーターの検出を可能にするためには、POIのプロセッシングおよび分泌のために細胞により使用されるのと同じ分泌機構により処理された後、レポーターが細胞膜タンパク質に結合し、ERおよびゴルジ系において分泌経路により処理されるように設計された。BMPおよびBAPは、膜固定配列をもたないため、本発明によれば、相対的に短く、容易に発現でき、通常CHO細胞上には発現されない、細胞毒性であると知られておらず、かつ細胞に対する悪影響が知られていない膜結合配列が用いられる。膜貫通ドメイン配列の予測は、当技術分野において良く知られている。たとえば、TMHMMサーバーv.2.0[32]を用いて実行することができる。またはGPI修飾部位予測[33~36]を用いることによってGPI固定配列についても行うことができる。例示のみの目的で、2つの膜アンカーが選択された。1つは、マウス膜タンパク質CD59aであり、グリコシルホスファチジルイノシトールGPIを含み、CHO細胞において良好に発現すること、およびFACSにより検出される[38]ことが報告されている124アミノ酸の小さなタンパク質である[37]。補体溶解効果から細胞を保護するその生物活性についての文献における追加的な報告[39]では、細胞毒性のリスクは指摘されていない。GPIにより細胞膜の外側に固定され[40]、シグナル伝達プロセスを誘発する可能性のある内部細胞質ドメインは有していない。さらなる膜固定タンパク質は、60アミノ酸の合成ペプチド配列およびそのC末端に近接した2つの潜在的N-グルコシル化部位、およびGPI固定配列または膜貫通TM配列のいずれかにもとづくものである。前述のように、ある態様においては、本発明は、aそのC末端でbに連結されたシグナルペプチドをコードする第1の核酸配列、bそのC末端でc連結された、ビオチン模倣ペプチドBMPまたはビオチンアクセプタペプチドBAPをコードする第2の核酸配列、c細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチをコードする第3の核酸配列を含む核酸分子を提供する。ある実施態様においては、aおよびbおよび/またはbおよびcの核酸配列は、それぞれペプチドリンカーをコードする核酸配列により連結されている。別の実施態様においては、細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチは、そのGPIを含むCD59aである。また別の実施態様においては、細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチは、CD48-GPIに直接連結された配列番号1のアミノ酸の合成キャリアペプチドである。また別の実施態様においては、細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチは、膜貫通ペプチドに直接連結された配列番号1の合成キャリアペプチドである。好ましい実施態様においては、膜貫通ペプチドが配列番号2のアミノ酸配列のIGF-1Rの膜貫通ペプチドである。前述したように、BMPまたはBAPは、そのN-末端で、任意にはペプチドリンカーを介して、シグナルペプチドに連結される。シグナルペプチドは、レポーターを細胞膜、細胞小器官膜、または細胞の外側に指向させる任意のアミノ酸配列であればよい。その配列は、たとえば文献に教示されているアルゴリズム[41、42]を用いて容易に予測可能である。したがって、ある実施態様においては、BMPまたはBAPは、そのN-末端でリンカーペプチドを介してシグナルペプチドに連結され、シグナルペプチドは、抗体、サイトカイン、ホルモン、成長因子、神経伝達物質、酵素、受容体リガンド、毒素またはそれらの機能的画分からなる群より選択されるタンパク質のシグナルペプチドである。シグナルペプチドは、目的のタンパク質の、またはヒト成長ホルモンのもしくはCD59の、天然または内因性のシグナルペプチドであってもよい。トランスフェクトされた細胞に対する生物学的選択の能力、レポーター遺伝子の最も高いレベルの発現細胞をソートする能力、およびそれにより目的のタンパク質の最も高いレベルの産生細胞を選択する能力は、選択された選択試薬に対する細胞の耐性と、レポーターの発現および目的のタンパク質の発現との間の相関が増加するような方法で、選択耐性を付与するポリペプチドをレポーターに融合させることにより改善することができる。さらに、生物学的選択は、トランスフェクション後でソーティング前の短時間に適用され、そして耐性集団の大部分が選択耐性遺伝子、レポーター遺伝子およびGOIを発現することを確実にする。したがって、さらなる実施態様においては、細胞膜にBMPを固定させるポリペプチドストレッチは、そのカルボキシ末端で選択耐性を付与するポリペプチドに連結される。このポリペプチドは、抗生物質加水分解酵素、抗生物質捕捉タンパク質、たとえばゼオシンに結合してその活性を阻害するShble遺伝子産物、およびキナーゼなどの抗生物質修飾酵素からなる群より選択される。あるいは、選択は、細胞に存在しないか、または非常に低レベルで存在する代謝酵素の導入と、増殖培地からのこれらの代謝物または代謝物の源の除去とによりなすこともできる。2つの既知の例は、ジヒドロ葉酸還元酵素DHFR[43]およびグルタミン合成酵素GS[44]系である。選択圧力の増加と過剰生産をもたらす増幅は、上述の例では、DHFR系に関してはメトトレキサート[45]またはGS系についてはメチオニンスルホキシミン[46]の増殖培地中への添加により得られる。ある実施態様においては、細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチは、リンカーペプチドを介して抗生物質加水分解酵素に連結される。もう1つの実施態様においては、抗生物質加水分解酵素は、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼPACなどのピューロマイシン不活性化酵素、アミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼなどのアミノグリコシドたとえばジェネティシン加水分解酵素からなる群より選択され、抗生物質捕捉タンパク質はShble遺伝子産物であり、そして抗生物質修飾酵素はハイグロマイシンキナーゼである。BMPまたはBAPと細胞膜にそれらを固定させるポリペプチドストレッチとの連結、MBPまたはMAPとそれらのシグナル配列との連結およびポリペプチドストレッチと選択耐性を付与するポリペプチドとの連結は、直接的であっても、リンカーペプチドを介したものであってもよい。好ましい実施態様においては、リンカーペプチドが、イソロイシンおよびプロリンのアミノ酸配列からなる、または配列番号4のアミノ酸配列G4SnG4m式中、nは1、2、3、4または5から選択される整数、特に2または4であり、そしてmはゼロまたは1から選択される整数であるからなる。別の実施態様においては、本発明の核酸分子は、hCMVなどの核酸分子の転写を駆動することのできるプロモーターに作動可能に連結され、かつ任意にはEMCVIRES配列の下流に作動可能に連結されている。本明細書の以下、実施例において示されるように、いくつかのプラスミドが種々の目的の遺伝子GOIsと構築され、BMPまたはBAPレポーターの遺伝子のいずれかは、膜固定キャリアに融合された。GOIsおよびレポーター遺伝子は、内部リボソーム侵入部位IRESにより連結された。これらのプラスミドにおいて、GOI発現は、強力なヒトCMVhCMVプロモーターにより駆動され、レポーター遺伝子は、IRESの下流に配置される。GOI発現は、hCMVとは別の任意の強いプロモーター、たとえば、非限定的に、IgG抗体の軽鎖および重鎖の発現を駆動するために本明細書の下記で使用されたマウスCMVIE1またはマウスCMVIE2によっても駆動されることができる。この2シストロン性構造は、同じmRNA上の両方の遺伝子の転写を決定づける[47]。BAP配列をビオチニル化するためには、細胞を、細菌性BirA発現ベクター[27]で同時トランスフェクトしてトランスフェクト細胞自身によるビオチニル化を得るか[27~29、31、48]、または特異的反応バッファーにおけるビオチンとBirAとの添加により外部でBAPをビオチニル化するかのいずれかである[30、49]。CHO-S細胞などの真核細胞は、プラスミドでトランスフェクトされ、そして安定なプールが選択された。蛍光ストレプトアビジンF-SAで検出されたトランスフェクトされた細胞におけるBAPおよびBMPの特異的な発現は、有意なバックグラウンドなしで証明された。さらに、レポーターとしてBMPで、高発現に関するFACSによる3回の連続したソートがなされ、GOIsの発現レベルにおける有意な改善が得られた。好ましい実施態様においては、プラスミド、すなわち本発明の核酸分子は、BMPをコードする核酸配列、特に配列番号5のアミノ酸配列を含むBMP、および特に配列番号5のBMPをコードする核酸配列を含む。ある実施態様においては、核酸分子はさらに、配列番号2のアミノ酸配列の膜貫通ペプチドに直接連結された配列番号1のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、配列番号6のアミノ酸配列のCD59aのシグナルペプチド、および配列番号7のアミノ酸配列のPACをコードする核酸配列プラスミドMB-098を含む。特に、この核酸分子は、配列番号8の核酸配列を含み、これは、そのカルボキシ末端で合成キャリアペプチドに直接連結されたBMPをコードし、この合成キャリアペプチドはそのカルボキシ末端で膜貫通ペプチドに直接連結され、この膜貫通ペプチドは、そのカルボキシ末端でPACにG4S4配列を介して連結されており、該BMPは、マウスCD59aシグナルペプチドにイソロイシン-プロリンリンカーペプチドを介してそのアミノ末端で連結されている。もう1つの実施態様においては、核酸分子はさらに、配列番号9のアミノ酸配列のマウスCD59a、および配列番号6のアミノ酸配列のCD59aのシグナルペプチドを、配列番号5のアミノ酸配列のBMPに加えてコードする核酸配列プラスミドMB-070-MB-072を含む。特に、この核酸分子は、配列番号10の核酸配列を含み、これは、そのカルボキシ末端でG4S2G4配列配列番号4を介してマウスCD59aに連結され、そのアミノ末端で同族のCD59aシグナルペプチドにイソロイシン-プロリンリンカーペプチドを介して連結されているBMPをコードする。また別の実施態様においては、核酸分子はさらに、配列番号2のアミノ酸配列の膜貫通ペプチドに直接連結された配列番号1のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、および配列番号6のアミノ酸配列のCD59aのシグナルペプチドを、配列番号5のアミノ酸配列のBMPに加えて、コードする核酸配列プラスミドMB-073およびMB-075を含む。特に、この核酸分子は、配列番号11の核酸配列を含み、これは、そのカルボキシ末端で合成キャリアペプチドに直接連結され、この合成キャリアペプチドはそのカルボキシ末端で膜貫通ペプチドに直接連結されているBMPをコードし、該BMPは、マウスCD59aシグナルペプチドにイソロイシン-プロリンリンカーペプチドを介してそのアミノ末端で連結されている。さらに別の実施態様においては、核酸分子はさらに、配列番号5のアミノ酸配列のBMPに加えて配列番号3のアミノ酸配列のCD48-GPIアンカーペプチドに直接連結された配列番号1のアミノ酸配列の合成キャリアペプチド、および配列番号6のアミノ酸配列のCD59aのシグナルペプチドをコードする核酸配列プラスミドMB-074および076を含む。特に、この核酸分子は、配列番号12の核酸配列を含み、この核酸配列は、そのカルボキシ末端で合成キャリアペプチドに直接連結されているBMPをコードし、この合成キャリアペプチドはそのカルボキシ末端でCD48-GPIアンカーペプチドに直接連結されている。そして該BMPは、そのアミノ末端でマウスCD59aシグナルペプチドにイソロイシン-プロリンリンカーペプチドを介して連結されている。本発明によれば、レポーター遺伝子産物および目的のタンパク質は、別個のプラスミド上の核酸によってコードされていてもよく、またはそれらが同じプラスミド上の核酸によってコードされていてもよい。レポーター遺伝子産物およびPOIは、別個のプラスミド上の核酸によりコードされる場合、細胞は、レポーター遺伝子を含むプラスミドおよびPOIをコードする遺伝子を含む第2のプラスミドの両方で同時トランスフェクトされる。1つのプラスミドが用いられる場合、本発明は、aシグナルペプチドをコードする第1の核酸配列;bビオチン模倣ペプチドBMPまたはビオチンアクセプタペプチドBAPをコードする第2の核酸;c細胞膜にBMPまたはBAPを固定させるポリペプチドストレッチをコードする第3の核酸;およびdPOI-コード核酸配列を含む核酸分子を提供する。ある実施態様においては、POI-コード核酸配列は、EMCVIRES配列の上流に作動可能に連結されているか、または核酸分子の転写を駆動することのできるプロモーターの下流に作動可能に連結されているか、またはその両方である。もう1つの実施態様においては、いくつかのPOI-コード核酸配列が、マルチサブユニットタンパク質のいくつかの異なるサブユニットをコードするように存在してもよい。したがって、たとえば目的のサイトカインが、単一のPOI-コード核酸配列によりコードされ、一方、IgGまたはIgMは、2つまたは3つのPOI-コード核酸配列にそれぞれコードされ得る。1つの実施態様においては、POI-コード核酸配列は、単一のポリペプチドをコードする1つのPOI-コード核酸配列であり、一方、別の実施態様においては、POI-コード核酸配列は、抗体の異なるサブユニットをコードする2つの核酸配列を含む。多くの場合、目的のタンパク質は、培地へ分泌され、したがって、その場合、そのアミノ末端で、任意にはリンカーペプチドを介して、シグナルペプチドに連結され得る。目的のタンパク質は、真核細胞において発現されるものであればいかなるタンパク質であってもよい。非限定的な例として、また単にどのようなタンパク質が目的のタンパク質として考えられるかについて明らかにするために、目的のタンパク質は、Fc-融合産物、抗体、サイトカイン、ホルモン、成長因子、神経伝達物質、酵素、受容体リガンド、シアロムチン、核タンパク質、調節タンパク質および毒素からなる群、またはそれらの機能的画分、すなわちそれ自体が抗体たとえばFab、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質、酵素、受容体リガンド、シアロムチンもしくは毒素であるタンパク質の画分より選択される。Fc-融合産物は、シグナルペプチドとN-末端またはC末端融合パートナーとしてのイムノグロブリンのFc断片との融合物として発現されるタンパク質であり、上述のように、多種多様なPOIsの高レベルでの発現および分泌を促進する。Fcドメインは、疎水性タンパク質の溶解性の改善に役立ち、融合タンパク質の容易な検出および精製に関する情報を提供し、そして所望の場合、プロテアーゼによる処理により切断できる。Fc-融合産物sCD164-Fc、抗体抗-IL22RAmAb、成長ホルモン顆粒球コロニー刺激因子GCSFまたはサイトカインIL6などの様々な目的のタンパク質を発現し、これらのタンパク質を高レベルで発現する高産生細胞が、それらの表面上のBMPを高レベルで発現する細胞を選択することにより効率的に単離できることが、本発明により見いだされた。また別の態様においては、本発明は細胞表面にBMPを提示する細胞を同定することを含む、目的のタンパク質POIを分泌する真核細胞の選択方法であって、細胞表面におけるBMP提示のレベルが分泌されたPOIの量と相関し、ai前述の第1、第2および第3の核酸配列を含む核酸分子およびPOIコード核酸配列を含む第2の核酸分子;またはii上記iに規定する両方の核酸分子を含む核酸分子のいずれかを含むベクターで細胞をトランスフェクトし、それによりBMPトランスフェクト細胞の安定なプールを確立する工程;bBMPトランスフェクト細胞を検出可能なビオチン結合部分で標識する工程;およびc検出可能なビオチン結合部分で標識化されたトランスフェクト細胞を同定および単離する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施態様においては、それぞれ前記少なくとも1つのPOI-コード核酸配列が、EMCVIRES配列の上流に作動可能に連結され、核酸分子の転写を駆動することのできるプロモーターの下流に作動可能に連結されているか、またはその両方である。目的のタンパク質の産生に使用される細胞は、哺乳類、植物、昆虫または酵母細胞などの遺伝子操作に適している任意の真核細胞であればよい。哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、ベビーマウス骨肉腫NS0細胞、ハムスター腎臓BHK細胞、ヒト胎児腎臓HEK細胞、ヒト網膜細胞、COS細胞、SP2/0細胞、WI38細胞、MRCS細胞、Per.C6細胞であってよい。植物細胞は、タバコ、ニンジンおよびコメ細胞が使用できる。ある実施態様においては、細胞はCHO細胞である。いくつかの実施態様においては、細胞は、蛍光アビジンおよび蛍光ストレプトアビジンからなる群より選択される検出可能なビオチン結合タンパク質または部分に接触させることによって標識化され、標識化された細胞は、その後FACSの手段により同定および単離される。しかしながら、標識化された細胞を同定および単離するためには、任意の方法、例えば非限定的に、ビオチン結合部分で被覆されたビーズを用いる方法などが使用できる。本発明の方法は、細胞の表面上に発現されたリポーター遺伝子産物の量と、発現および分泌された目的のタンパク質の量との間の高い相関を提供し、したがって、高レベルのレポーター遺伝子産物を提示する細胞を単離することにより高産生細胞の選択を可能とする。特に、選択された真核細胞は、より高い量のBMPをそれらの表面に提示し、安定なプールのトランスフェクトされた細胞よりもより多くの量の目的のタンパク質を分泌する。いくつかの実施態様においては、選択された真核細胞の表面上のBMPの量および選択された真核細胞により分泌される目的のタンパク質の量は、安定なプールのトランスフェクトされた細胞よりも2倍と30倍の間の範囲で多く、すなわち少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15倍多く、そして30倍まで多い。本発明の膜結合レポーター分子は、本明細書中に後述されるように、FACSにより高産生細胞をソーティングするために効率的なものであることが見いだされた。その結果からいくつかの重要な結論が導かれる。BMPおよびBAPレポータータンパク質は、トランスフェクトされた細胞において特異的に検出できる;標識された非トランスフェクト細胞のバックグラウンド染色は、無視できるものとわかり、それによりこれらのレポーターは、求められる細胞の選択に適している実施例3。本発明は、最も高いレベルのレポーター遺伝子を発現する細胞をソートし、それにより最も高いレベルのPOIを産生する細胞を選択する能力を提供する。その方法は、いくつかの膜固定スキャフォールドおよびいくつかのGOIsで実証された。生産性は、プールステージからソーティングサイクルの3回り後のプールまでで、種々のタンパク質および種々のレポーター構造物で1.7~13.5倍表1参照増加した。同じレポーター発現レベルによるFACSによってなされるクローニング工程を伴う追加のソーティングサイクルは、さらに、選択されたクローンのPOI生産性レベルを増加させ得る。これらの結果は、システムの有効性を高めるものである。レポーター構造は、蛍光-ストレプトアビジンによる便利な染色を容易にする。これらの実験において使用される蛍光-ストレプトアビジンは、非動物由来起源のものであることが確認されているため、クローン開発プロセスにおいてこの試薬は円滑に使用される。基本的な基盤の重要な開発は、膜結合レポーター分子のPAC選択遺伝子への融合であり、この構築物は、FACSによる高産生細胞の生物学的選択とソーティングに非常に効率的であることが見いだされた。以下の点を指摘することが重要である。天然ではその酵素は細胞質に局在化しているにもかかわらず、PAC選択耐性遺伝子は、膜結合タンパク質として活性であることが見いだされたこと。生産性は、ソーティングサイクルの開始時と比較してプール~11PCDで~3倍までソーティングサイクルのあいだに増加すること。さらなる増加が、ProCHO5培地26PCDでは、6倍までの値でクローンにおいて得られた。これらの結果は、レポーターの発現がPOIの発現と緊密に関連付けられていることを示す。本発明は、ここで以下の非限定的な実施例により説明される。材料および方法細胞:CHO-SギブコBRL、カタログ番号11619細胞CHODHFR培地粉末、SAFCバイオサイエンス、カタログ番号C6614に適応試薬AccuPrimePfxインビトロジェンDNAポリメラーゼカタログ番号12344-024氷酢酸メルクカタログ番号K28351556独国アクリルアミドゲル-NuPAGE;10トリスゲル、カタログ番号NP0301BOX、インビトロジェン米国アガロースIBIカタログ番号IB70042アンピシリン-シグマカタログ番号A9518ELISA用抗体:捕捉:ヤギ抗-ヒトIgGHL、カタログ番号109-005-088ジャクソンイムノリサーチ米国。検出:ヤギ抗-ヒトIgGFabHRP、カタログ番号109-036-098ジャクソンイムノリサーチ米国。ウェスタンブロット用抗体:染色:Aヤギ抗-ヒトIgGFcHRP、ジャクソン、カタログ番号109-036-098;Bヤギ抗-ヒトκ軽鎖、サザンバイオテック、カタログ番号2060-01、続いてロバ抗-ヤギHRP、ジャクソン、カタログ番号705-015-147。ブロッティング紙GB002カタログ番号426677、シュライヒャーアンドシュエルSchleicherandSchuell米国ウシ血清アルブミンBSA、Bovostar、ボボジェンBovogen、カタログ番号BSAS.01ウシ血清アルブミンBSA、シグマ、カタログ番号A-4503ブロモフェノールブルー、メルク、カタログ番号2126169デキストラン硫酸塩シグマ、カタログ番号D4911DH5αコンピテントバクテリア、ライフ-テクノロジーズ、カタログ番号18263-012DMSO、メルク、カタログ番号K31630931DNAラダー:DNA用1kbラダー、バイオラボ、カタログ番号3232LDNAラダー:DNA用100bpラダー、バイオラボ、カタログ番号3231L電気泳動サンプルバッファーLDS、インビトロジェン、カタログ番号NP0007、米国エタノール、メルク、カタログ番号00983.1000FACSAccudropBeads、BD、カタログ番号MAB345249グルコース、シグマ、カタログ番号G7021グルタミン、シグマ、カタログ番号G5972HispeedplasmidMaxiKit、キアゲン社、独国、カタログ番号12663HTバイオロジカルインダストリー、カタログ番号03-085-1C37塩酸、メルク、カタログ番号1.00314塩酸、メルク、カタログ番号UN-17891.00314.2500LBアンピシリンプレート-Hy-Labs、カタログ番号PD178細菌生育用LB培地-Hy-Labs、カタログ番号BP302/400SLipofectAmine試薬、ギブコBRL、カタログ番号18324-020L-メチオニンスルホキシミンMSX、シグマ、カタログ番号M5379発光性基質:ECLアマシャムキット、カタログ番号RPN2109メタノール、メルク、カタログ番号1.06009.2500Mgcl2-1M、シグマ、カタログ番号M1028NuPAGEMOPSランニングバッファー、X20、インビトロジェン、カタログ番号NP0001NuPageトランスファーバッファー、インビトロジェン、カタログ番号NP0006-1NuPAGETrisグリシンランニングバッファー、X10、インビトロジェン、カタログ番号LC2675フェノールレッド、シグマ、カタログ番号P0290PluronicF-68、シグマ、カタログ番号P5556ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートTween20、シグマ、カタログ番号P-1379事前染色マーカータンパク質標準品、カタログ番号、LC5925、インビトロジェンプロテアーゼ阻害剤カクテル、シグマ、カタログ番号P8340純粋ニトロセルロースメンブレンBA-85、シュライヒャーアンドシュエル、78×90mm、カタログ番号401184ピューロマイシン、インビボジェン、カタログ番号ant-pr-1参照試料抗-IL22RAMSB0010074/C12を、PBS、pH6.0中のEMDGVA5.9mg/mlから得た。制限酵素は、ニューイングランドバイオラボから購入した。R-フィコエリトリン-共役ストレプトアビジンSA-PE、0.2mg/ml、バイオレジェンドBioLegend、カタログ番号4052039.3のCoOおよび9.4のCoA参照スキムミルクパウダー、フルカ、カタログ番号70166重炭酸ナトリウム、メルク、カタログ番号6329炭酸ナトリウム、メルク、カタログ番号6392リン酸ナトリウム、シグマ、カタログ番号S-3264SYBRSafeDNAゲル染色、インビトロジェン、カタログ番号S33102、3Dl/ゲルTMBSavionDiagnostics、カタログ番号1928Tween20ポリオキシエチレン-ソルビタンモノラウレート-シグマ、カタログ番号P-1379水、R.O.ITLワットマン3mm、ワットマン、カタログ番号3030917溶液1漂白剤-FACSClean、ベクトンデッキンソン、カタログ番号340345PBSITL製造、BRR0450V010.1プロニック酸含有PBS培地CHODHFR-クローニング培地、SAFCバイオサイエンス、カタログ番号C6366、4mML-グルタミンおよび15mg/Lフェノールレッド、シグマ、カタログ番号P0290を補足ProCHO5培地、ロンザLonza、カタログ番号BE12-766Q、4mML-グルタミンおよび15mg/Lフェノールレッド、シグマ、カタログ番号P0290を補足イーグル最小必須培地、シグマ、カタログ番号M2279方法DNA発現ベクターの構築全てのベクターは、たとえばF.M.Ausubelら[FMAusbel2009132]に教示されているような標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。プラスミドDNAの調製プラスミドDNAは、QIAGENHispeedplasmidMaxiKitを用いて製造業者により説明された手順にしたがって単離した。DNA配列決定契約企業ジーンアートGeneArt、独国により製造され、標準的な手法によりベクターにクローン化されたDNAフラグメントは、Hy-Labs、イスラエル国で配列決定された。DNA配列決定は、完全に自動化された16CapillaryABIPrism3100GeneticAnalyzerにより行われた。配列は、Sci-EdGeneralソフトウェアClonemanagersoftware、バージョン7.01およびAlignplus5、バージョン5.01を用いて社内で分析した。CHO-S細胞のトランスフェクションCHO-S細胞を溶かし、ProCHO5血清不含培地ロンザ、カタログ番号BE12-766Qにヒポキサンチン13.61mg/Lおよびチミジン3.88mg/LHTx1、バイオロジカルインダストリー、カタログ番号03-085-1Bを補足した培地で培養した。細胞を、フィルターチューブ50mlバイオリアクターTPP、カタログ番号87050において、37°C、加湿、および320RPMで振とうして浮遊状態で増殖させた。トランスフェクションの2日前、細胞を、500mlの蓋付き三角フラスココーニング、カタログ番号431145に0.2×106細胞/mlの濃度で播いた。細胞を、LipofectAmineギブコBRL、カタログ番号18324-020によりトランスフェクトした。トランスフェクションの日に、細胞を洗浄して再懸濁し、10×106細胞を、125mlのフィルターキャップ付き三角フラスココーニング、カタログ番号431143の4mlMEMシグマ、カタログ番号M2279中に播いた。各単一のプラスミドによるトランスフェクションに対し、20μg線状化ベクターMB-098を使用した。最終DNA容量は、MEM中で100μlに調整した。その後、100μlのLipofectAmineを添加し、45分間室温でインキュベートした。次に、DNA-LipofectAmine混合物を、細胞に添加し、4時間、37°C、5CO2で45RPMで振とうするインキュベーターにおいてインキュベートした。このインキュベーション期間の終了時に、細胞を遠沈し、培地を、125mlのフィルターキャップ付き三角フラスココーニング、カタログ番号431143において、20mlの新しいProCHO5ロンザ、カタログ番号BE12-766Qにヒポキサンチン27.22mg/Lおよびチミジン7.76mg/LHTx2、バイオロジカルインダストリー、カタログ番号03-085-1Bを補足した培地に置換した。フラスコを37°Cで振とうインキュベーターにおいて125RPMで72時間インキュベートした。トランスフェクションから72時間後、細胞を回収し、遠心分離にかけ、そして20mlのProCHO5培地にピューロマイシン20μg/mlインビボジェン、カタログ番号ant-pr-1、MSX25μMシグマ、カタログ番号M5379およびデキストラン硫酸塩100μg/mlシグマ、カタログ番号D4911を補足した培地に再懸濁した。これらの選択条件下では、PAC遺伝子を発現する細胞のみが生き残ることができた。インビトロビオチン化動物成分不含培地ACFMで培養された細胞を、プルロニック酸F-680.1シグマ、カタログ番号P5556およびMgCl25mMシグマ、カタログ番号M1028を含むPBSリン酸バッファー食塩水中で洗浄し、その後2×106細胞を、プルロニック酸F-680.1シグマ、カタログ番号P5556、MgCl25mMシグマ、カタログ番号M1028、BirA0.06mMアビディティーAvidity、カタログ番号BirA500、ATP1mMシグマ、カタログ番号A6419およびビオチン10mMシグマ、カタログ番号B4639を含むPBSで、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、プルロニック酸F-680.1シグマ、カタログ番号P5556およびMgCl25mMシグマ、カタログ番号M1028を含むPBSで洗浄した。蛍光ストレプトアビジンF-SAによる標識化インビボもしくはインビトロのいずれかにおいてビオチン化されたBAPを発現する細胞2×106、またはBMPを発現する細胞を、プルロニック酸F-680.1シグマ、カタログ番号P5556を含むPBSで洗浄し、その後、プルロニック酸F-680.1および1:100に希釈したR-フィコエリトリン共役ストレプトアビジンSA-PEジャクソン、カタログ番号016-110-084F-SAを含むPBSでインキュベートし、37°Cで30分間、80RPMで振とうしながらインキュベートした。その後、細胞を、0.1プルロニック酸F-68を含むPBSで洗浄し、解析のためにFACSAriaにかけた。FACSによる分析BMPを発現する細胞2×106を、0.1プルロニック酸F-68シグマ、カタログ番号P5556を含むPBSで洗浄し、その後、0.1プルロニック酸F-68および1:100に希釈したR-フィコエリトリン共役ストレプトアビジンSA-PEBioLegend、カタログ番号405203F-SAを含むPBSでインキュベートし、37°Cで30分間、80RPMで振とうしながらインキュベートした。その後、細胞を、0.1プルロニック酸F-68を含むPBSで洗浄し、解析のためにFACSAriaにかけた。細胞増殖細胞培養物を、つぎのようにACFMに維持した。細胞を、50mlチューブに、25mlの容量で0.2×106細胞/mlの濃度で播き、φ25mmのオービタルシェーカー上で、320rpm、37°Cでインキュベートした。週に2回、細胞数と生存率を測定した。培養物を、4°Cで5分間、100gで遠心分離することにより継代させ、その後、細胞ペレットを新鮮な事前に温めたACFMに再懸濁した。細胞増殖およびACFMにおける生産性細胞培養物の維持細胞培養物をつぎのようにACFMにおいて維持した。細胞を、T-80フラスコに、0.2×106細胞/mlの濃度で播き、45rpmでオービタルシェーカー上で37°Cでインキュベートした。週に2回、細胞数と生存率とを測定した。培養物を、4°Cで5分間、100gで遠心分離することにより継代させ、その後、細胞ペレットを新鮮な事前に温めたACFMに再懸濁した。組織培養フラスコ25cm2を8~10mlの培地で播種し、f25mmのオービタルシェーカー上、55rpmでインキュベートした。組織培養フラスコ80cm2を20~30ml培地で播種し、f25mmのオービタルシェーカー上、45rpmでインキュベートした。ACFMにおける細胞の生産性ACFMにおける比生産性PCDについて、細胞を、50mlチューブに入れた特定のACFMに0.5×106細胞/mlの濃度で播き、オービタルシェーカー320rpm上、37°Cで24時間インキュベートした。その後、培地を試料に取り、生成物濃度をELISAにより測定した。計算は、24時間力価を播種時の細胞の平均濃度と、24時間実験後での細胞の平均濃度により割ることで行った。細胞ソーティングFACSソーティングについては、20μg/mlピューロマイシンおよびMSX25μMを補足したProCHO5培地の統一プールから、トランスフェクトされた細胞が使用された。各ソートについて、約60×106細胞を培養し、F-SAで標識化した。ソートされるべき細胞を、0.1プルロニック酸F-68および1:100に希釈したF-SAを含むPBS中で、T80フラスコの4×106細胞/mlの濃度で標識化し、80rpmで振とうインキュベーターにおいて37°Cで1時間インキュベートした。標識化後、細胞を回収し、PBS0.1プルロニック酸F-68で2回洗浄し、バルクソーティングのためにPBS0.1プルロニック酸F-68に、最終濃度10×106で再懸濁した。最も高い蛍光細胞4を単一細胞精密モードにおけるFACDAriaフローサイトメーターによるソーティングのために、FSC/PEドットプロット上でゲーティングした。ソートされた細胞を、20μg/mlピューロマイシンおよびMSX25μMを補足したProCHO5培地に播き、細胞生存率が>=90で生存細胞数が≧70×106まで増殖させた。この段階で、蛍光が解析およびつぎのソーティングサイクルがなされた。全部で、3回の連続したソートがなされた。FACSACDUによるクローニングクローニングは、FACSAria細胞ソーターの自動細胞捕集装置ACDUデバイスにより、20μg/mlピューロマイシンおよびMSX25μMを含むProCHO5において増殖する細胞になされた。2×106細胞を回収し、PBS0.1プルロニック酸F-68で2回洗浄し、2μg/ml希釈1:100濃度のSA-PEBioLegend0.5mlで標識化した。細胞を24ウェルプレートで30分間、80rpm、37°Cでインキュベートした。標識化後、細胞を回収し、PBS0.1プルロニックで2回洗浄し、4mlのPBS0.1プルロニック酸に再懸濁した細胞濃度、約0.1~0.2細胞/ml。最も高い蛍光細胞2.5を、単一細胞精密モードにおいて、ACDUにより、ProCHO5において培養された細胞用の80シグマC6366および20ProCHO5ACFM混合物180μl/ウェルを含む96ウェルプレート中にクローン化した。プレートをCellavistaにより、0日目、その後2~3日周期で、単一コロニーを有するウェルの検出のために解析した。クローニングの2週間後、コロニー増殖が検出されたウェルからの上清をサンプリングし、ELISAにより分析した。ウェルにつき1より多いコロニーを含むウェルは、除外した。細胞を、最も高い力価を有するウェルから採取し、まず、4mlの50シグマC6366および50ProCHO5培地混合物を含む振とうなしのT25フラスコに移した。3~5日後、2~4mlの100ProCHO5培地をT25フラスコに添加し、細胞を、振とうしながらインキュベートした。1~3日後、8mlのProCHO5を添加し、懸濁液をT80フラスコに移した全体で、87.5のProCHO5と12.5のC6366。1~2日後、10mlの新鮮な培地を細胞に添加した。その後、細胞を25mlの新鮮な培地に0.2×106細胞/mlで別の増殖サイクルのために播種した。比生産性を決定するために、細胞を0.5×106細胞/mlの濃度で、24時間、37°C、320rpmで50フィルターチューブに播いた。sCD164-Fcに対するELISA以下の手法を用いた。1.マイクロタイタープレートを0.5mg/mlのPBS中CD164に対するモノクローナル抗体で被覆し、~4°Cで一晩インキュベートした。2.プレートを洗浄バッファー0.05Tween20を含むPBSで3回洗浄した。3.プレートをブロッキングバッファー0.5I-Blockを含むPBS200μl/ウェルで、37°C、振とう下で1時間ブロッキングした。4.ブロッキング後、プレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、アッセイバッファー0.25I-Blockおよび0.05Tween20を含むPBS中の試験試料、検量線0.78~50ng/mlおよびチェック試料の100mlアリコートをプレートに添加し、振とう下、37°Cで60分インキュベートした。5.プレートを再び洗浄バッファーで3回洗浄し、そして100mlのFc部分への二次抗体アッセイバッファー中に1:40,000に希釈されたHRP共役Fab’2フラグメントヤギ抗ヒトを各ウェルに添加した。6.プレートを振とう下、37°Cで60分インキュベートした。7.プレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、基質溶液TMB100mlを各ウェルに添加し、プレートを室温で振とうなしで20分間インキュベートした。8.反応を停止溶液4NHCl50μl/ウェルを添加することにより止めた。9.吸光度をELISAリーダーにおいてA492nmで測定した。10.検量溶液を、293HEK細胞由来のStd.SCD164-Fcの段階希釈により調製し、アッセイバッファーにおける0.78~50ng/mlの範囲線形範囲は0.78~12.5ng/mlの間であった。で検量線を得た。SCD164-Fcプールからの粗収穫物の試料を、アッセイバッファーで希釈し、~10ng/mlを得て、チェック試料として用いた。11.光学密度データ結果を処理し、結果をMagelanソフトウェアにより計算した。12.試料の希釈、検量線希釈シリーズの調製およびプレート上の試料の分配は、ロボットサンプルプロセッサーにより行われた。GCSFに対するELISA以下の手順を用いた。1.マイクロタイタープレートを1μg/mlのPBS中GCSFに対するモノクローナル抗体で被覆し、~4°Cで一晩インキュベートした。2.プレートを洗浄バッファー0.05Tween20を含むPBSで3回洗浄した。3.プレートをブロッキングバッファー1BSAを含むPBS、200μl/ウェルで、37°C、振とう下で1時間ブロッキングした。4.ブロッキング後、プレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、試験試料、検量線試料およびチェック試料の100mlアリコートをプレートに添加し、振とう下、37°Cで60分インキュベートした。5.プレートを再び洗浄バッファーで3回洗浄し、そして100mlの検出ビオチニル化抗体抗-ヒトGCSF溶液を各ウェルに添加した。6.プレートを振とう下、37°Cで60分インキュベートした。7.プレートを、二次抗体、ストレプトアビジンHRPでインキュベートし、上記工程5~6に記載されたのと同じ手順を行った。8.プレートを洗浄バッファーで3回洗浄した。9.基質溶液TMB100mlを各ウェルに添加し、プレートを室温で振とうなしで20分間インキュベートした。10.反応を停止溶液3NHCl50μl/ウェルを添加することにより止めた。11.吸光度をELISAリーダーにおいて492nmで測定した。12.検量溶液を、標準組換えヒトGCSFの段階希釈により調製し、1.56~100ng/ml線形範囲は3~50ng/mlの間であった。の検量線を得た。13.光学密度データ結果を処理し、結果をMagelanソフトウェアにより計算した。14.試料の希釈、検量線希釈シリーズの調製およびプレート上の試料の分配は、ロボットサンプルプロセッサーにより行われた。IL-6に対するELISA以下の手順を用いた。1.マイクロタイタープレートを1mg/mlのPBS中IL6に対するモノクローナル抗体で被覆し、~4°Cで一晩インキュベートした。2.プレートを洗浄バッファー0.05Tween20を含むPBSで3回洗浄した。3.プレートをブロッキングバッファー1BSAを含むPBS、200μl/ウェルで、37°C、振とう下で1時間ブロッキングした。4.ブロッキング後、プレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、試験試料、検量線試料およびチェック試料の100mlアリコートをプレートに添加し、振とう下、37°Cで60分インキュベートした。5.プレートを再び洗浄バッファーで3回洗浄し、そして100mlの検出抗体:ビオチニル化抗-IL6を各ウェルに添加した。6.プレートを振とう下、37°Cで60分間インキュベートした。7.プレートを、二次抗体、アビジン-HRPでインキュベートし、続いて上記工程5~6に記載されたのと同じ手順を行った。8.プレートを洗浄バッファーで3回洗浄した。9.基質溶液TMB100mlを各ウェルに添加し、プレートを室温で振とうなしで20分間インキュベートした。10.反応を停止溶液3NHCl50μl/ウェルを添加することにより止めた。11.吸光度をELISAリーダーにおいて450nmで測定した。12.検量溶液を、IL6参照標準の段階希釈により調製し、31.75~2000pg/ml線形範囲は31.75~500pg/mlの間であった。の検量線を得た。13.光学密度データ結果を処理し、結果をMagelanソフトウェアにより計算した。試料の希釈、検量線希釈シリーズの調製およびプレート上の試料の分配は、ロボットサンプルプロセッサーにより行われた。分析用抗-IL22RA細胞培養収穫物の回収産生細胞0.5×106を、フィルターチューブ50の20mlのProCHO5培地に播き、320rpmのシェーカー上で、37°Cで、24時間培養した。収穫物を遠心分離し、0.22μmフィルターを通してろ過した。透明な上清をELISAアッセイ、ついでウェスタンブロットアッセイにて解析した。抗-IL22に対するELISA以下の手順を用いた。1.マイクロタイタープレートを、コーティングバッファー中、2.0μg/mlのヤギ抗-ヒトIgGHLで1ウェルにつき100μlでコートし、湿潤箱において~4°Cで一晩インキュベートした。プレートは、O/Nインキュベーションの後、3ヵ月間-20°Cで保管できる。2.プレートを洗浄バッファー0.05Tween20を含むPBSで4回洗浄した。3.プレートをブロッキングバッファー1BSAを含むPBS-T0.05200μl/ウェルで、室温で1時間ブロッキングした。4.ブロッキング後、プレートを洗浄バッファーで4回洗浄し、アッセイバッファーPBS×1中ミルク1中の試験試料、検量線試料1.56~100ng/mlおよびチェック試料の100mlアリコート。プレートを、プレートシーラーで覆い、振とうなしで、37°Cで60分間インキュベートした。5.プレートを再び洗浄バッファーで4回洗浄し、そしてアッセイバッファーに1:100,000で希釈した二次抗体、ヤギ抗ヒトIgGFabHRP100μlを各ウェルに添加した。6.プレートを、37°Cで60分間インキュベートした。7.プレートを洗浄バッファーで4回洗浄し、基質溶液TMB100mlを各ウェルに添加し、プレートを室温で振とうなしで15~20分間インキュベートした。8.反応を停止溶液1NHCl100μl/ウェルを添加することにより止めた。9.吸光度をELISAリーダーにおいてA450nmで測定した。10.検量溶液を、標準抗IL22RAMSB0010074/C12のPBSでの段階希釈により調製し、pH6.0、アッセイバッファーにおける1.56~100ng/ml線形範囲は1.56~50ng/mlの間であった。の検量線を得た。関連するプールからの粗収穫物のサンプルを、アッセイバッファーで希釈して、~25ng/mlを得て、チェック試料として使用した。11.光学密度データ結果を処理し、結果をMagelanソフトウェアにより計算した。12.試料の希釈、検量線希釈シリーズの調製およびプレート上の試料の分配は、ロボットサンプルプロセッサーにより行われた。SDS-PAGE/ウェスタンブロット解析ProCHO5培地中の抗-IL22RAクローンの透明な上清試料をSDSPAGE試料バッファーに希釈した。抗-IL22RAクローンの試料ELISAによりレーンにつき0.1μgを、非還元条件下、SDS-PAGE10ビストリスゲル上で分離した。事前に染色したMWタンパク質標準15mclを、同様にゲル上に載せた。電気泳動を定電圧100Vで、~2時間、NovexXcellSureLockMini-Cell電気泳動システムにより行った。SDSPAGE実行の終わりに、1時間で35ボルトに調整された電源を用いる移行バッファーを備えたブロッティングモジュールにおいて、タンパク質をゲルからニトロセルロース膜に移した。膜をPBS-0.05Tween20で5分間洗浄し、ブロッキングバッファーで4°Cで一晩インキュベートした。膜をワーキングバッファーに希釈した以下の抗体と共に、振とう下、2時間室温でインキュベートした。aヤギ抗-ヒトIgGFcHRP、bヤギ抗-ヒトκ軽鎖、そしてロバ抗-ヤギHRPに続く。その後、膜をPBS-0.05Tween20で3回、各回5分間洗浄した。バンドをECL試薬中で1分間インキュベーションし、フィルムをAFPX-線フィルムプロセッサーMini-Medical現像液に曝すことにより可視化した。現像後、フィルムを詳細に調べた。実施例1:仕様設計細胞表面上のBMPおよびBAP発現レベルの評価のための仕様設計は、当初、充分な発現を保証し、発現評価を可能とするために個々の発現カセット上に位置するレポータータンパク質により作製された図1;ベクターMB-065、MB-066およびMB-067。レポータータンパク質発現の検証とFACSによる細胞表面上の検出の後、新規なBMP含有ベクターを、BMPに基づくレポーター遺伝子と2シストロン性mRNAにおけるGOIsとの間の固い結合により構築した。プラスミドは、強力なヒトCMVhCMVプロモーターにより駆動されるGOIsからなり、レポーター遺伝子は、EMCVIRESの下流に配置した。この構造は、同じmRNA上での両遺伝子の転写を決定している[47]図1;ベクターMB-070-MB-076。レポーター分子は、膜結合タンパク質またはペプチドとレポーター部分を含有したBMPまたはBAP。最初の膜結合タンパク質は、101アミノ酸[37]の小さなタンパク質で、そのC末端を介してグリコシルホスファチジルイノシトールGPI[40]により細胞膜の外側に固定されたマウス由来のCD59aからなっていた図1のベクターMB065、MB066、MB-070-MB-072。BMP-CD59a構築物の核酸配列は、配列番号10に規定されているものである。あるいは、60アミノ酸の合成ペプチドが作製され配列番号1、これは2つの潜在的N-グリコシル化部位を有し、マウスIGF-Iレセプター由来のTMドメイン配列番号2;ベクターMB-073およびMB-075;図1か、またはCD48のGPI固定ドメインCys残基がSerにより置き換えられていた;配列番号3;ベクターMB-074およびMB-076;図1のいずれかを介して細胞膜に固定された。TMドメイン配列の予測は、TMHMMserverv.2.0によりなされ[32]、そしてGPI固定配列は、GPI修飾部位推定によりなされた[33~36]。膜タンパク質またはペプチドのN末端またはGPI固定シグナルは、リンカーを介して、CHPQGPPC[22、23]配列番号5のアミノ酸配列に対するBMPコーディング配列、またはGLNDIFEAQKIEWHE[24]配列番号13のアミノ酸配列に対するBAPコーディング配列のいずれかに結合される。BMP含有ベクターによりトランスフェクトされた細胞は、蛍光標識ストレプトアビジンにより直接染色されたF-SA、図2A。BAP発現細胞の染色は、このレポーターペプチドのビオチニル化よりも前に必要とされる。これは、細胞自身によるインビボビオチニル化を得るためのCHO最適化BirA配列[27]による同時トランスフェクションによるかデータは示さず[27~29、31、48]、または細菌性酵素BirAを外から加えることによる細胞表面でのBAPのインビトロビオチニル化によるか[30、49]図2Bのいずれかで達成された。仕様は、BMPをPAC耐性遺伝子と融合させることにより目的の遺伝子を高レベルに産生する細胞をストリンジェントに選択するために拡張された。BMP-PACは、トランスフェクション後のピューロマイシン選択と、それに続くBMPレベルによるFACS選択を可能とする。2つの発現カセット、重鎖に対するものと軽鎖に対するものからなるモデル抗体の発現のためにプラスミドを構築した。重鎖発現は強力なマウスCMVIE2mCMVIE2プロモーターにより駆動され、レポーター遺伝子はEMCVIRESの下流に配置される。軽鎖発現は、マウスCMVIE1mCMVIE1プロモーターにより駆動され、QSyグルタミンシンセターゼ選択マーカーは、別のEMCVIRESの下流に配置される。この構造は、単一mRNA上での重鎖およびBMP-PAC遺伝子の転写と、別のmRNA上での軽鎖およびQSyの転写を決定している[47]図3;ベクターMB98。レポーター選択分子は、マウスCD59a分子由来のシグナルペプチドの前に置かれたBMPを含む。BMPは、そのC末端で60アミノ酸の合成ペプチドに融合し、この合成ペプチドは2つの潜在的なN-グルコシル化部位を有する。この合成キャリアは、マウスIGF-Iレセプター由来のTMドメインに連結される。TMドメインは、PAC選択耐性遺伝子に、短いリンカーを介して連結される図2C、図3;ベクターMB-098。TMドメイン配列の予測は、TMHMMserverv.2.0によりなされた。BMPは、配列番号5のアミノ酸配列によりコードされる。この特定の構築物におけるPACは、細胞膜に付着される。したがって、PACは、膜結合タンパク質として有効なNアセチル化活性を含まなければならず、その天然の細胞質状態とは異なる。実施例2:発現ベクターの構築この研究課題のため、3つのセットのベクターが研究課題の種々のステージで構築された。第1のセットでは、ビオチン模倣ペプチドBMP、ビオチンアクセプタペプチドBAPおよびBirA遺伝子を、hCMVプロモーターの直接下流でベクターにクローン化した。これらのベクターは、当初は、細胞表面上のBMPおよびBAP発現レベルおよびFACSによる蛍光ストレプトアビジンF-SAでのこれらのマーカーの検出能力のテストのために使用され、実験の後期には対照ベクターとして使用された。ベクターの第2のセットは、EMCVIRESの下流にBMP-CD59-GPIカセットを含有し、したがって、前に使用されたベクターにおいてよりも強固に直接的な方法でGOIにFACS選択マーカーを連結した。第3のセットは、マウスCD59aの代りに合成ペプチドキャリアGPIを含むを含み、GPIまたはTMドメインを介して細胞膜に固定された図1。選択マーカーとして、PAC遺伝子をSV40プロモーターの下流でベクターに挿入し、トランスフェクトされた細胞で細胞質PACを生じた。すべてのベクターは、既知の手法、たとえばF.M.Ausubelらに教示されているような手法にしたがって構築された[50]。実施例3:高POI産生細胞のソーティングに対するレポーター分子の評価3.1細胞表面上のレポーター分子の発現と検出GOIおよびBMP、またはGOIおよびBAP、またはGOIおよびBAPおよびBirAを発現する細胞の作製は、CHO-S細胞へのプラスミドのLipofectAmineトランスフェクションによりなされ、その後、ピューロマイシンにより、またはBirA含有プラスミドで同時トランスフェクトされた細胞においてピューロマイシンおよびゼオシンにより選択された。安定なプールをレポーター遺伝子の発現レベルについて解析した。BAPレベルは、外から添加されたBirAによるビオチニル化、その後F-SAでの標識化後に解析された図4、またはBirAにより同時トランスフェクトされたそれらの細胞における細胞内でのビオチニル化、その後F-SAで標識化後に解析されたデータは示さず。BMPレベルは、F-SAの結合により直接的に解析された。結果は、非トランスフェクト細胞および非標識化細胞に関する有意なバックグラウンドなしでトランスフェクトされた細胞上のレポーター分子の特定の蛍光シグナルを示す図5A。図5において、非トランスフェクトCHO-S細胞、およびBMP-CD59aをhCMVプロモーターの下流に直接A、またはEMCVIRESの下流に直接B含むプラスミドでトランスフェクトされたCHO-S細胞を、F-SAで染色するかまたは染色せず、FACSによるそれらの蛍光標識レベルを解析した。ストレプトアビジン-染色BMPの蛍光レベル図5は、ストレプトアビジン-染色BAPの蛍光レベル図4よりも低かった。BMPとBAPで染色した細胞の蛍光標識強度における違いについての理由は、BAPの場合には天然のビオチンであるのに対して、ストレプトアビジンに対するビオチン模倣ペプチドの有意に低い親和性にあると考えられる数桁分。この違いにもかかわらず、FACSにより標識された細胞のソーティングを可能とするバックグラウンドよりも有意にBMP発現細胞の高い染色強度が得られた。低い蛍光と高い蛍光の2つのピークが、トランスフェクトされ標識化された細胞に見られる図5A-B;曲線--。これらの2つのピークは、おそらく低いBMP発現細胞と高いBMP発現細胞を示す。低い発現細胞は、また、PACが標準的な発現カセットに配置されていてもなおPACの発現も低いことが推測される。PACレベルは、それでも細胞がピューロマイシン選択圧力下で生存するのに充分であった。3.2高産生細胞のソーティングと作製細胞を、3つの異なるGOIssCD164-Fc、GCDF、IL-6および、BMP-CD59aベクターMB-070、MB-071、MB-072、BMP-ペプチドキャリア-GPIベクターMB-074およびMB-076またはBMP-ペプチドキャリア-TMベクターMB-073およびMB-075のキメラを含み、GOIおよびBMPが、EMCVIRESにより分けられた同じ2シストロン発現カセット上に配置されているベクター図6~12でトランスフェクトした。異なるカセット上で発現されるピューロマイシンでの生物学的な選択により作製された安定なプールについて、FACSによりレポーター分子の発現レベルを、そして特異的ELISAによりGOIsの発現レベルを解析した。低い蛍光と高い蛍光を有する2つのピークが、トランスフェクトされ標識化された細胞に見られた図6~12;曲線--。それらの2つのピークは、低いBMP発現細胞と高いBMP発現細胞とを示す。低い発現細胞はPACの発現も低いことが推測される。PACレベルは、細胞がピューロマイシン選択圧力下で生存するのに充分であるが、それらの細胞のBMP発現および、もしかするとPOIレベルも低いと思われる。全てのケースにおいて図6~12有意なレベルのBMPならびにGOIsが検出された。細胞をF-SAで標識化し、最も高い蛍光細胞4をソートした。その後、ソートした細胞を増殖させ、BMPおよびGOIsレベルを解析した。ソーティング手順と分析は、連続的に3回繰り返した。各ソーティングにおいて、最も高いBMP発現集団を富化し、結果として、GOIの生産性レベルを高めた。GOIおよびBMP発現レベルの間の正相関が見られた図6~12。実施例4:レポーターPAC融合産物をコードする発現ベクターの構築4.1ベクターMB-098図3の構築-ベクターMB-098は、たとえばF.M.Ausubelら[50]に教示されているように既知の手法にしたがって構築した。4.2BMP-PACレポーターを含む安定なプールの作製、PAC活性の評価および生産性の解析ProCHO5においてBMP-PAC含有ベクターでトランスフェクトされたCHO-S細胞は、20μg/mlピューロマイシンインビトロジェン、カタログ番号ant-pr-1およびMSX25μMシグマ、カタログ番号M5379による選択に付された。これらの条件下、浮上した安定な細胞は、PACが膜結合型で活性であることを示す。安定なプールは、抗-IL22RAmAbを、比生産性8.5~9.4PCDで発現する図13。4.3BMP-PACレポーターを含有する高産生プールのソーティングおよび作製安定な細胞を、ProCHO5培地においてFACSにより分析、およびソートした図14。分析は、BMPがトランスフェクトされたプールで検出されることを示す。2つの亜集団がソートの前に見られ、高いBMPレベルと低いBMPレベルとを発現する。最も高いBMP発現細胞4の選択により行われた連続的なソートは、BMPレベルと相関するPCD上昇との結果を示した。結果のまとめを表1に示す。ProCHO5において、抗-IL22RAmAbおよびBMP-PACを含むベクターでトランスフェクトされた安定な細胞3反復実験図14を、20μg/mlピューロマイシンおよびMSX25μMで選択し、統一のプールに一緒にした。細胞をBMPレベル赤線について解析した。プールを、それらのF-SAで標識されたBMPレベルにより連続的に3回ソートした。各ソーティングサイクル後、細胞を回収し、蛍光ならびに生産性を測定した。蛍光レベルと生産性の値は、図14の簡単な説明に示す。3.5FACSACDU装置によるソートされたプールのクローニング-クローンの単離3回の連続的なソーティングサイクルの後、ProCHO5中の抗-IL22RAmAb産生プール2418UN-Hx3の上から4の蛍光細胞を、96ウェルプレートへの単細胞クローニングを可能とする、FACSAriaの自動細胞捕集装置ACDUによりクローン化した。ProCHO520mg/mlピューロマイシンおよび25μM/mlMSX中で培養されている細胞のクローニングを、80培地C6366および20C6614を含む96ウェルプレートにおいて行った。コロニーを、播種日とその後2~3日毎にCellavistaにより検出した。1つより多くのコロニーを有するウェルを廃棄した。クローニング以降、培地にはピューロマイシンは含まれていなかった。358ウェルからの上清を試料とし、ELISAにより生産性力価についてアッセイした図15。プールから誘導した最も高い力価を有する40個のクローンをまずT25フラスコに移し、その後、比生産率を評価するために50ml試験管に移した図16。両プール由来の最も優秀な15個のクローンを、50ml試験管において生産性の評価のために、25μMMSXと培養した図17。3.6SDSPAGEおよびウェスタンブロットによる粗細胞培養培地におけるタンパク質生成物の同定候補のクローンをProCHO-5培地において培養した。これらのクローンにより粗細胞培養培地中に産生された生成物は、SDS-PAGE/ウェスタンブロッティングにより解析した図18。生成物の検出は、ヒトFcおよび抗-IL22RAmAbのκ軽鎖サブユニットに対する抗体により行ったそれぞれAおよびB。結果は、見掛けの分子量~150kDaを有するインタクトな生成物ヘテロダイマーが、両抗体により同定されたことを示す。さらに、全ての候補クローンにより分泌された自由な軽鎖見掛けのMWによるとモノマーおよびダイマーが、抗-LCで染色されたウェスタンブロットにおいて認められた図18Bおよび19B。全てのクローン由来の粗細胞培養培地におけるヘテロダイマーの分子量は、抗-IL22RAmAb参照サンプル由来の精製された生成物のものと一致する。異なるクローンの生成物の見掛けのMWにおいて有意差は見られなかった。多重バンドは、グリコシル化の微小不均一性microheterogeneityを表す。"