"軟骨表層から軟骨下骨までをくりぬいてできる動物軟骨小片。軟骨表層に微小な穴があることを特徴とする請求項1に記載の動物軟骨小片。動物がブタ乃至ウシであることを特徴とする請求項1乃至2に記載の動物軟骨小片。軟骨が関節軟骨であることを特徴とする請求項1乃至3に記載の動物軟骨小片。下骨部分が除去されていることを特徴とする請求項1乃至4に記載の動物軟骨小片。軟骨表層面の形状が円で、直径5~10mmの円柱状であること特徴とする請求項1乃至5に記載の動物軟骨小片。微小な穴の体積が1~10μLであること特徴とする請求項2乃至6に記載の動物軟骨小片。請求項2乃至7の動物軟骨小片を培養し、穴の修復への培養条件の影響を調べることによる、軟骨欠損修復評価系。穴に化合物を入れて培養し、穴の修復への該化合物の影響を調べることを特徴とする請求項8に記載の軟骨欠損修復評価系。穴に細胞を入れて培養し、穴の修復への該細胞の影響を調べることを特徴とする請求項8に記載の軟骨欠損修復評価系。以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。ブタ大腿骨顆部の軟骨組織から骨軟骨片骨軟骨ディスク,直径:6.5mm,高さ:1cmを骨軟骨移植法に用いられる管状ノミSMITHNEPHEW,Tubularchisel-8.5mmを用いて採取し、球形のカッター半径:0.8mmを装着したグラインダー東洋アソシエイツ,ペンタイプツールPT-αを用いて図1骨軟骨ディスクの軟骨表面に約2μlの体積の欠損を作製した。この時、同じブタの大腿骨顆部の軟骨組織から軟骨小片をメスを用いて採取し、0.25コラゲナーゼ溶液DMEM10FBSに溶かすに懸濁し、37°Cで4時間インキュベートして、軟骨細胞懸濁液を得た。また、ブタ大腿骨を覆う筋肉組織から注射針を用いて末梢血を採取した。一方で、ヒト腸骨から注射針を用いて吸引採取した骨髄液をDMEM10FBSの入った55cm2ディッシュに播種し、37°Cで3週間培養して、ディッシュに接着した細胞を間葉系幹細胞MSCとして得た。500μlのDMEM10FBSが入った15ml容遠心管に骨軟骨ディスクを、200μlのDMEM10FBSが入った24穴マルチウェルに骨部分をメスで分離した軟骨ディスクを入れ、それぞれの欠損内に1.0×108cells/mlの軟骨細胞またはMSCの懸濁液PBS-を2μl注入し37°C、5CO2下で6時間静置培養した。6時間後、全量が1.5mlになるようにDMEM10FBSを加え37°C、5CO2下で3週間培養した。いずれも3日ごとに半量の培地を交換した。また、それぞれの培養液を培養開始後1、2、3、4日目に50μlずつ採取し血球計算盤を用いて細胞数を計数した後、これをギムザ染色することで培養液中の浮遊細胞の同定を行った。培養終了後、骨軟骨ディスクと軟骨ディスクを固定ホルムアルデヒド、パラフィン包埋後、欠損部の中心を通る切片厚さ4μmを作製し、軟骨マトリクス染色アルシアンブルー染色や分解核染色TUNEL染色し欠損内に形成した組織を分析した図2その結果、軟骨細胞を播種した場合、骨軟骨ディスクと軟骨ディスクの両方の欠損内でアルシアンブルー陽性の軟骨様組織が認められたが、MSC播種の場合には骨軟骨ディスク欠損内ではTUNEL陽性のアポトーシスしたMSCが認められ、軟骨様組織は軟骨ディスク欠損内でのみ見られた図2。この結果から、骨を分離した軟骨ディスクを用いることで欠損内でMSCを良好に培養できることが分かった。ここで、培養液中に漏れ出した浮遊細胞を分析すると、軟骨ディスクの培養液中にはブタ末梢血に見られる赤血球やリンパ球はほとんど認められなかったが、骨軟骨ディスクの培養液中には赤血球やリンパ球を含む2.0×106cells以上の浮遊細胞の拡散が認められたことから図3A,B、ブタ骨軟骨ディスクの欠損内に播種したヒトMSCは、骨軟骨ディスクから漏れ出てくる浮遊性細胞の異種細胞に対する免疫反応によって分解されたと推測された。ブタ大腿骨顆部の軟骨組織から骨軟骨片骨軟骨ディスク,直径:6.5mm,高さ:1cmを骨軟骨移植法に用いられる管状ノミSMITHNEPHEW,Tubularchisel-8.5mmを用いて採取し、球形のカッター半径:0.8mmを装着したグラインダー東洋アソシエイツ,ペンタイプツールPT-αを用いて骨軟骨ディスクの軟骨表面に約2μlの体積の欠損を作製した後、骨部分をメスで分離し軟骨ディスクを得た。一方で、ヒト腸骨から注射針を用いて吸引採取した骨髄液をDMEM10FBSの入った55cm2ディッシュにに播種し、37°Cで3週間培養して、ディッシュに接着した細胞を間葉系幹細胞MSCとして得た。200μlのDMEM10FBSが入った24穴マルチウェルに軟骨ディスクを入れ、欠損内に1.0×108cells/mlのMSCの懸濁液PBS-を2μl注入し37°C、5CO2下で6時間静置培養した。6時間後、培地を1.5mlの軟骨分化用培地DMEMdexamethasone39ng/ml、ITSTM-Premix1、IGF-I100ng/ml、TGF-β310ng/mlに交換し37°C、5CO2下で3週間培養した。いずれも3日ごとに半量の培地を交換した。培養終了後、軟骨ディスクを固定ホルムアルデヒド、パラフィン包埋後、欠損部の中心を通る切片厚さ4μmを作製し、ヘマトキシリンエオシン染色し欠損内の細胞の形態を分析した図4。その結果、欠損の表層で繊維芽状、欠損の深部で球状の2種類の細胞形態が欠損内に播種したMSCに観察され、この2種類の細胞形態は天然の軟骨組織の表層繊維芽状と中間層球状に見られる軟骨細胞の形態それぞれ類似していた。すなわち、本軟骨欠損モデルはinvivoの軟骨欠損内の微小環境を良く反映する優れたexvivoモデルであると考えられた。ブタ大腿骨顆部の軟骨組織から骨軟骨片骨軟骨ディスク,直径:6.5mm,高さ:1cmを骨軟骨移植法に用いられる管状ノミSMITHNEPHEW,Tubularchisel-8.5mmを用いて採取し、球形のカッター半径:0.8mmを装着したグラインダー東洋アソシエイツ,ペンタイプツールPT-αを用いて骨軟骨ディスクの軟骨表面に約2μlの体積の欠損を作製した後、骨部分をメスで分離し軟骨ディスクを得た。一方で、ヒト腸骨から注射針を用いて吸引採取した骨髄液をDMEM10FBSの入った55cm2ディッシュに播種し、37°Cで3週間培養して、ディッシュに接着した細胞を間葉系幹細胞MSCとして得た。200μlの増殖培地DMEM10FBSが入った24穴マルチウェルに軟骨ディスクを入れ、欠損内に1.0×108cells/mlのMSCの懸濁液PBS-を2μl注入し37°C、5CO2下で6時間静置培養した。6時間後、培地を1.5mlの増殖培地、軟骨分化用培地DMEMdexamethasone39ng/ml、ITSTM-Premix1、IGF-I100ng/ml、TGF-β310ng/mlまたは、軟骨分化培地に10ng/mlのFGF-2を添加したFGF-2培地に交換し37°C、5CO2下で3週間培養した。3日ごとに半量の培地を交換した。培養終了後、軟骨ディスクを固定ホルムアルデヒド、パラフィン包埋後、欠損部の中心を通る切片厚さ4μmを作製し、アルシアンブルー染色、I型コラーゲン免疫染色、II型コラーゲン免疫染色、および核染色PI染色し欠損内に形成した組織の分析を行った図5。その結果、10のFBSを含む増殖培地で軟骨ディスクを培養した場合、欠損内のMSCはアルシアンブルー染色とI型コラーゲン染色が弱陽性でII型コラーゲン染色が陰性の組織を形成した図5A,D,G。一方、TGF-β310ng/mlやIGF-I100ng/mlを含む軟骨分化培地を用いて軟骨ディスクを培養すると、欠損内のMSCはアルシアンブルー染色とII型コラーゲン染色が陽性でI型コラーゲン染色が弱陽性の軟骨様組織を形成した図5-1B,E,H。この結果から、増殖培地で培養したMSCは欠損内で軟骨マトリクスの乏しい繊維性の組織しか形成できないが、TGF-β3やIGF-Iを含む軟骨分化培地を用いることで豊富な軟骨マトリクスを有する軟骨様組織が形成されることが分かった。また、FGF-2培地で軟骨ディスクを培養すると、欠損内のMSCは弱陽性のアルシアンブルー染色やII型コラーゲン染色に対して強陽性のI型コラーゲン染色を認める繊維性軟骨様組織を形成した図5C,F,I。さらに、PIによる細胞核の染色画像から赤色蛍光に染まった細胞核の数を計数し細胞核の密度を求めた結果、FGF-2培地で培養すると欠損内における細胞核の密度が、増殖培地や軟骨分化培地で培養したときや天然の軟骨組織よりも2倍以上高いことが分かった。すなわち、MSCをFGF-2とともに移植すると本来の軟骨組織が再生できない可能性が示唆された。図5J-M,図6。以上の結果から、本軟骨欠損モデルは添加するサイトカイン種の作用を反映した組織を欠損内に形成できる優れたexvivoモデルであること考えられた。ブタ大腿骨顆部の軟骨組織から骨軟骨片骨軟骨ディスク,直径:6.5mm,高さ:1cmを骨軟骨移植法に用いられる管状ノミSMITHNEPHEW,Tubularchisel-8.5mmを用いて採取し、球形のカッター半径:0.8mmを装着したグラインダー東洋アソシエイツ,ペンタイプツールPT-αを用いて骨軟骨ディスクの軟骨表面に約2μlの体積の欠損を作製した後、骨部分をメスで分離し軟骨ディスクを得た。一方で、ヒト腸骨から注射針を用いて吸引採取した骨髄液をDMEM10FBSの入った55cm2ディッシュに播種し、37°Cで3週間培養して、ディッシュに接着した細胞を間葉系幹細胞MSCとして得た。TGF-β3の遺伝子を高発現するpCMVE-Col1A2p/TGF-β3プラスミドベクター1.0pmolJournalofBioscienceandBioengineering,1105,593-5962010をNucleofector装置LONZA,TGF-β3の遺伝子を発現しないネガティブコントロールとして、pcDNA3.1ベクターINVITROGEN、430018を同様の方法でMSCに導入した。遺伝子導入24時間後、MSCの6穴マルチウェルから剥離し、PBS-で1.0×105cells/μlの濃度に再懸濁した後、軟骨欠損内への播種に用いた。200μlの増殖培地DMEM10FBSが入った24穴マルチウェルSUMILON,MS-80240に軟骨ディスクを入れ、欠損内に1.0×108cells/mlの遺伝子導入したMSCの懸濁液PBS-を2μl注入し37°C、5CO2下で6時間静置培養した。6時間後、pCMVE-Col1A2p/TGF-β3ベクターを導入したMSCはTGF-β3を含まない軟骨分化培地-DMEMdexamethasone39ng/ml、ITSTM-Premix1、IGF-I100ng/mlを、pcDNA3.1ベクターを導入したMSCは軟骨分化培地-と軟骨分化培地-に10ng/mlのTGF-β3を添加した軟骨分化培地をそれぞれ用いて、5CO2、37°Cのインキュベーター内で3週間静置培養した。いずれも3日ごとに半量の培地を交換した。培養開始後、3、7、14、21日目に培養液の一部を採取し、TGF-β3濃度をELISA法を用いて測定した図7。培養終了後、軟骨ディスクを固定ホルムアルデヒド、パラフィン包埋後、欠損部の中心を通る切片厚さ4μmを作製し、ヘマトキシリンエオシン染色、アルシアンブルー染色、I型コラーゲン免疫染色、およびII型コラーゲン免疫染色し欠損内に形成した組織の分析を行った図8。培養液中のTGF-β3濃度を測定した結果、pCMVE-Col1A2p/TGF-β3ベクターを導入したMSCを軟骨欠損内で軟骨分化培地-を用いて3日間培養した培養液中には、10ng/ml以上のTGF-β3が検出され、その後、6日目に培地交換を行った後も7日目まで10ng/ml以上のTGF-β3が維持された図-7丸印。一方で、pcDNA3.1ベクターを導入したMSCを軟骨分化培地-で培養した培養液中には、21日間の培養期間を通してTGF-β3は検出されなかった図7四角印。したがって、pCMVE-Col1A2p/TGF-β3ベクターを導入したMSCは軟骨欠損内においてTGF-β3遺伝子を発現していることが確かめられた。また、pcDNA3.1ベクターを導入したMSCを10ng/mlのTGF-β3タンパクを含む軟骨分化培地を用いて軟骨欠損内で培養した場合は、21日間の培養期間を通して約5ng/ml程度のTGF-β3が培養液中に検出された図7三角印。欠損内に形成された組織を分析した結果、pCMVE-Col1A2p/TGF-β3ベクターを導入したMSC図8C,F,I,Lは、pcDNA3.1を導入し軟骨分化培地-で培養したMSC図8B,E,H,Kや、軟骨分化培地で培養したMSC図8A,D,G,Jよりも顕著に濃いアルシアンブルー染色、I型コラーゲン染色、およびII型コラーゲン染色を呈する軟骨様組織を欠損内で形成した。すなわち本結果は、pCMVE-Col1A2p/TGF-β3ベクターを導入したMSCを軟骨欠損に移植することで、豊富な軟骨マトリクスを蓄積伴う良好な軟骨再生が得られる可能性を示唆した。"