"K11リジン結合を含む第一のポリユビキチンに特異的に結合する単離された抗体であって、該抗体は第二のリジン結合を含む第二のポリユビキチンには特異的に結合せず、該第二のリジン結合はK11リジン結合とは異なる抗体。K11リジン結合を含む第一のポリユビキチン及び第二のリジン結合を含む第二のポリユビキチンの両方に特異的に結合する単離された抗体であって、該第二のリジン結合は該K11リジン結合とは異なり、該抗体はモノユビキチンに特異的に結合せず、かつ該抗体は、第二のポリユビキチンに対して、第一のポリユビキチンに対する抗体の結合親和性と比べて実質的に減少した結合親和性で結合する抗体。リジン11結合型ポリユビキチンに特異的に結合する単離された抗体であって、該抗体はモノユビキチンに特異的には結合しない抗体。配列番号2及び配列番号57-60;配列番号3及び配列番号61;配列番号4、配列番号6-11;配列番号12-17及び配列番号67;及び配列番号18-23、配列番号68及び配列番号69のそれぞれ何れかのHVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3から選択される少なくとも一つの超可変HVR配列を含む、請求項3に記載の抗体。HVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3から選択される少なくとも一つの配列を含み、HVR-H1は、アミノ酸配列X1X2X3X4IleX5配列番号24を含み、ここでアミノ酸X1はセリン及びスレオニンから選択され、X2はアスパラギン、アスパラギン酸、セリン、グリシンから選択され、アミノ酸X3はチロシン、セリン、スレオニンから選択され、アミノ酸X4はトリプトファン、アスパラギン酸、グリシン、チロシンから選択され、アミノ酸X5はセリン及びヒスチジンから選択され;HVR-H2はアミノ酸配列X6X7IleX8ProX9GlyX10TyrX11配列番号25を含み、アミノ酸X6は、グリシン及びアラニンから選択され、アミノ酸X7は、アスパラギン酸、トリプトファン、グリシン、グルタミン酸及びバリンから選択され、アミノ酸X8はセリン、チロシン及びアスパラギンから選択され、アミノ酸X9はアスパラギン酸、アラニン、ヒスチジン及びアスパラギンから選択され、アミノ酸X10は、チロシン及びセリンから選択され、アミノ酸X11はチロシン、アスパラギン酸及びアスパラギンから選択され;及びHVR-H3はアミノ酸配列X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21Asp配列番号26を含み、ここでアミノ酸X12はアルギニン及びリジンから選択され、アミノ酸X13はグルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸及びプロリンから選択され、アミノ酸X14はセリン、イソロイシン、バリン、及びトリプトファンから選択され、アミノ酸X15は、トリプトファン、グリシン、チロシン、及びフェニルアラニンから選択され、アミノ酸X16はトリプトファン、チロシン、ロイシン、グリシン、及びフェニルアラニンから選択され、アミノ酸X17は、セリン、チロシン、フェニルアラニン、及びグリシンから選択され、アミノ酸X18は、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、及びグリシンから選択されるか又は存在せず、アミノ酸X19は、トリプトファン、グリシン、アラニン、及びチロシンから選択されるか又は存在せず、アミノ酸X20はバリンか又は存在せず、かつアミノ酸X21はメチオニン及びフェニルアラニンから選択される、請求項3に記載の抗体。HVR-L1、HVR-L2から選択される少なくとも一つの配列を含み、HVR-L1はアミノ酸配列X22X23SerX24X25X26X27X28X29X30X31配列番号73を含み、アミノ酸X22はアルギニン及びグリシンから選択され、アミノ酸X23はアラニン及びバリンから選択され、アミノ酸X24はグルタミン及びヒスチジンから選択され、アミノ酸X25はアスパラギン酸、アスパラギン、及びイソロイシンから選択され、アミノ酸X26はロイシン及びバリンから選択され、アミノ酸X27はセリン、アスパラギン酸、グリシン、及びグルタミン酸から選択され、アミノ酸X28はスレオニン及びセリンから選択され、アミノ酸X29はアラニン、バリン、及びフェニルアラニンから選択され、アミノ酸X30はバリン及びイソロイシンから選択され、アミノ酸X31はセリンから選択され、かつHVR-L2はアミノ酸配列X32X33X34PheX35TyrSer配列番号74を含み、アミノ酸X32はセリン及びアスパラギンから選択され、アミノ酸X33はグルタミン及びアラニンから選択され、アミノ酸X34はグルタミン酸及びセリンから選択され、アミノ酸X35はロイシン及びバリンから選択される、請求項3に記載の抗体。HVR-H2及びHVR-H3から選択される少なくとも一つの配列を含み、HVR-H2はアミノ酸配列X36IleAsnProX37GlyGlyTyrThrTyrTyrAlaAspSerValLysGly配列番号75を含み、アミノ酸X36はアラニン及びグリシンから選択され、アミノ酸X37はアラニン及びアスパラギンから選択され、かつHVR-H3はアミノ酸配列GluTrpTyrX38X39GlyTyrValMetAspTyr配列番号76を含み、アミノ酸X38はフェニルアラニン及びチロシンから選択され、アミノ酸X39はグリシン及びアスパラギン酸から選択される、請求項3に記載の抗体。配列番号2のHVR-L1配列、配列番号3のHVR-L2配列、及び配列番号4のHVR-L3配列をそれぞれ含む、請求項3に記載の抗体。図1BのクローンのA3、A6、A9、B5、F5又はG3について記載されたものに対応するHVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3配列を含む、請求項3に記載の抗体。図4Aのクローンの1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6又は2G4について記載されたものに対応するHVR-L1、HVR-L2及びHVR-L3配列を含む、請求項3に記載の抗体。図4Bのクローンの1A11、1C12、1F12、2A3、2A6、2D7、2E6又は2G4について記載されたものに対応するHVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3配列を含む、請求項3に記載の抗体。図6Aのクローンの1C1/2E6又は2A3/2E6について記載されたものに対応するHVR-L1、HVR-L2及びHVR-L3配列を含む、請求項3に記載の抗体。図6Bのクローンの1C1/2E6又は2A3/2E6について記載されたものに対応するHVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3配列を含む、請求項3に記載の抗体。配列番号2のHVR-L1配列、配列番号3のHVR-L2配列、配列番号4のHVR-L3配列、配列番号11のHVR-H1配列、配列番号17のHVR-H2配列、及び配列番号23のHVR-H3配列を含む、請求項3に記載の抗体。配列番号2のHVR-L1配列、配列番号3のHVR-L2配列、配列番号4のHVR-L3配列、配列番号11のHVR-H1配列、配列番号17又は配列番号67のHVR-H2配列、及び配列番号23、配列番号68、及び配列番号69から選択されるHVR-H3配列を含む、請求項3に記載の抗体。配列番号2、配列番号57、配列番号58、及び配列番号59から選択されるHVR-L1配列、配列番号3又は配列番号61のHVR-L2配列、配列番号4のHVR-L3配列、配列番号11のHVR-H1配列、配列番号17のHVR-H2配列、及び配列番号23のHVR-H3配列を含む、請求項3に記載の抗体。配列番号58のHVR-L1配列、配列番号3のHVR-L2配列、配列番号4のHVR-L3配列、配列番号11のHVR-H1配列、配列番号17のHVR-H2配列、及び配列番号23のHVR-H3配列を含む、請求項3に記載の抗体。配列番号60のHVR-L1配列、配列番号3のHVR-L2配列、配列番号4のHVR-L3配列、配列番号11のHVR-H1配列、配列番号17のHVR-H2配列、及び配列番号23のHVR-H3配列を含む、請求項3に記載の抗体。配列番号5及び配列番号62-66から選択される軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項3に記載の抗体。配列番号27-32、及び配列番号70-72から選択される軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項3に記載の抗体。配列番号5及び配列番号32;配列番号63及び配列番号32;配列番号65及び配列番号32;配列番号5及び配列番号72;配列番号63及び配列番号72;及び配列番号65及び配列番号72の配列の組合わせの一つのアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を持つ軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含む、請求項3に記載の抗体。請求項1から21の何れかに記載の抗体と同じK11結合型ポリユビキチン上の抗原決定基に結合する単離された抗体であって、抗体がモノユビキチンに特異的に結合しない抗体。請求項1から21の何れかに記載の抗体と、ポリユビキチンへの結合について競合する単離された抗体であって、該抗体がモノユビキチンに特異的に結合しない抗体。抗体がK11結合型ポリユビキチン化タンパク質へ特異的に結合する、請求項1から21の何れかに記載の単離された抗体。抗体が少なくとも一つのポリユビキチン媒介性シグナル伝達経路を調節する、請求項1から21の何れかに記載の単離された抗体。抗体が、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及びK11結合型ポリユビキチンに結合する抗体断片である請求項1から21の何れかに記載の単離された抗体。請求項1から21の何れかに記載の抗体をコードする単離された核酸。請求項27に記載の核酸を含むベクター。請求項27に記載の核酸を含む宿主細胞。抗体が産生される条件下で、請求項29の宿主細胞を培養することを含む、K11リジン結合を含む第一のポリユビキチンに特異的に結合する抗体を産生する方法。宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、請求項30に記載の方法。請求項1に記載の抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。請求項1に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。追加の治療剤を更に含む請求項33に記載の薬学的製剤。医薬としての使用のための、請求項1に記載の抗体。細胞周期関連疾患又は障害の治療に使用するための、請求項1に記載の抗体。細胞周期関連疾患又は障害は、細胞周期進行の異常な亢進に関連する疾患又は障害、又は細胞周期進行の異常な低下に関連する疾患又は障害から選択される、請求項36に記載の抗体。細胞周期進行の異常な増加に関連する疾患又は障害が癌である、請求項37に記載の抗体。疾患又は障害が、変性筋障害及び変性神経障害から選択される、請求項37に記載の細胞周期進行の異常な増加に関連した疾患又は障害。医薬の製造における、請求項1に記載の抗体の使用。医薬が、癌、変性筋障害、及び変性神経障害から選択される疾患又は障害のためである、請求項40に記載の使用。請求項1から26の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌、変性筋障害、及び変性神経障害から選択される疾患又は障害を有する個体を治療する方法。ポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質を含むことが疑われるサンプル中におけるポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質の存在を決定する方法であって、サンプルを請求項1から26の何れか一項に記載の抗体の少なくとも一つに曝露し、サンプル中のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質に対する少なくとも一の抗体の結合を測定することを含む方法。サンプルを請求項1から26の何れかに記載の少なくとも一つの抗体と接触させることを含む、サンプル中の非K11結合型ポリユビキチン化タンパク質からK11結合型ポリユビキチン化タンパク質を分離する方法。細胞又はサンプルを請求項1から26の何れか一項に記載の少なくとも一つの抗体と接触させ、細胞又はサンプル上で該接触工程の影響を評価することを含む、細胞又はサンプル中でのK11結合型ポリユビキチンの機能及び/又は活性を決定する方法。III.実施例以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。実施例1:抗K11結合型ポリユビキチン抗体の単離と特性評価抗K11結合型ポリユビキチン抗体のファージディスプレイに基づいた単離は、標準的な技術を使用して、いくつかの異なるライブラリを用いて行った。簡単に言えば、合成完全長K11結合型ジユビキチンMichaelRape’slab,UCBerkeleyが96ウェルマキシソープイムノプレートMaxisorbimmunoplateNUNC上に固定化された。プレートは、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中の5μg/mLのK11ジユビキチンで4°Cで一晩コーティングされた。コーティングされたプレートは、その後、0.05Tween20PBSTを含むPBS中の2.5のミルクの200μL/ウェルでブロックされた。ナイーブなファージライブラリーを、20PEG/2,5MのNaClの1/5の容積で、グリセロールストックから沈殿させ、2.5のミルク/PBST中に再懸濁し、25°Cで1時間インキュベートした。再懸濁されたファージがブロックされたプレートに添加され100μL/ウェル、震盪させて4時間25°Cでインキュベートした。結合後、プレートはPBSTで10回洗浄し、ファージは50mMのHCl/500mMのKClが150μL/ウェルで30分間25°Cで震とうさせて溶出した。溶出は1Mのトリス、pH7,5を150μL/ウェルで中和され、その後、M13K07ヘルパーファージを添加したXL1-Blue大腸菌ストラタジーンで増殖された。増幅されたファージは、上記のK11結合ジユビキチンに対する選択の更なるラウンドで使用された。ラウンド2から4において、さまざまな結合型の可溶性モノユビキチン又はポリユビキチンが、対抗選択のためファージに追加された。第二ラウンドにおいて、10μg/mLの可溶性モノユビキチンBostonBiochemが用いられた。3番目と4番目のラウンドでは、10μg/mLの各々の可溶性モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、K48結合型ポリユビキチン2-7鎖,及びK63結合型ポリユビキチン2-7鎖全てBostonBiochemが用いられた。各ライブラリーから選別の第三及び第四ラウンドの両方からの96個のクローンは、96ウェル形式に、50μg/mLのカルベニシリン、及び1010ファージ/mLのM13K07ヘルパーファージを含む1mLの2YTブロス中で、37°Cで一晩震とうさせて増殖させた。細胞をペレット化し、上清は、K11結合型ジユビキチン、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、K48結合ポリユビキチン2-7、K63結合ポリユビキチン2-7,抗gD抗体ジェネンテック又は未コーティングウェルへの結合に対するハイスループットファージスポットELISAに使用した。Fabファージディスプレイライブラリーの全てが、軽鎖にカルボキシ末端のgDタグを含んでおり、これは、抗gD抗体の結合を観察することにより、表示レベルの評価を可能にする。ユビキチンタンパク質のパネルは、上記のように384ウェルのマキシソープイムノプレートNUNCに固定化した。プレートは、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中において、2μg/mLの各ユビキチンタンパク質で4°Cで一晩コーティングされた。コーティングされたプレートは、その後、PBST中の2.5のミルクを60μL/ウェルで、1時間、25°Cで震とうさせてブロックされた。1時間後、ブロッキングバッファーが除かれ、20μL/ウェルのPBST及び10μL/ウェルのファージ上清が添加された。プレートは振とうしながら1時間25°Cでインキュベートした。プレートをPBSTで6回洗浄した。PBST中で抗M13西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体GEHealthcareを5000倍希釈した30マイクロリットルが、ファージ結合の検出のために使用された。洗浄後、結合した二次抗体をTMB基質KPLを用いて検出し、等量の1Mリン酸と450nmの分光光度測定値でクエンチングした。ナイーブ抗ペプチドのFabファージディスプレイライブラリーは、上記のように、上記で参照した精製されたK11結合型ジユビキチンUCBerkeleyに対して4ラウンドの選別を施された。用いた抗ペプチドのFabファージディスプレイライブラリーは、全ての3つの重鎖CDR及び軽鎖CDRL3における無作為のアミノ酸が含まれており、長いCDRL1を持ち、かつCDRL2の配列多様性を許容している、改変されたヒト化抗体4D5フレームワークに基づいていた。特異的な抗K11結合型ジユビキチンバインダーの濃縮は、4ラウンドの選別後に観察されなかった。次に、ナイーブYSGXFabファージディスプレイライブラリーは、上記のように、上記で参照した精製されたK11結合型ジユビキチンUCBerkeleyに対して4ラウンドの選別を施された。YSGXFabファージディスプレイライブラリーは3つ全ての重鎖CDR及び軽鎖CDRL3において無作為化アミノ酸を含んでおり米国特許出願公開第2005-0106667号及びFellouseetal2007JMolBiol37392440を参照、ヒト化抗体4D5に基づいている。K11結合型ジユビキチンに対するバインダーにおいて適度な3倍濃縮のみが、4ラウンドの選別後に観察された。これらのバインダーに関して、全てがK11結合型ジユビキチンへの結合に対して弱いシグナルを示し、他のユビキチン型及びポリユビキチン型に対して付加的な弱い結合を持っていた。最後に、ナイーブVHFabファージディスプレイライブラリーは、上記で参照したK11結合型ジユビキチンに対して4ラウンドの選別を施された。VHFabファージディスプレイライブラリーは3つ全ての重鎖CDR及び軽鎖CDRL3において無作為化アミノ酸を含んでおり米国特許出願公開第20050119455号及びLeeCWetal2004JMB340107393を参照、ヒト化抗体4D5に基づいている。24倍濃縮が選別の4ラウンド後に観察された。強いK11結合型ジユビキチン特異的バインダーがライブラリー選別から同定された。第三及び第四ラウンドの選別からのVHライブラリークローンの重鎖が配列決定された。VHライブラリーの設計に基づいて、HVRH1配列、HVRH2配列、及びHVRH3配列はクローン特異的であると予想されていたが、重鎖フレームワーク配列及び全軽鎖配列HVR及びフレームワーク領域は不変であることが予想された。HVRL1配列はRASQDVSTAVA配列番号2であって、CDRL2配列はSASFLYS配列番号3,であって、HVRL3配列はQQSYTTPPT配列番号4図1Aであった。6つの固有の重鎖配列が同定され図1B、識別子のA3、A6、A9、B5、F5及びG3が与えられた。クローンG3はK11結合型ジユビキチンに対して最強のバインダーで、上記のファージスポットELISAアッセイにおいて最も特異的であって、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、K48結合型ポリユビキチン2-7、又はK63結合型ポリユビキチン1-7への結合を示さなかった図2。これらの6つのFabの重鎖のHVR領域のコンセンサスアミノ酸配列は、HVR-H1:X1X2X3X4IleX5配列番号24、X1はセリン及びスレオニンから選択され、X2はアスパラギン、アスパラギン酸、セリン、グリシンから選択され、X3はチロシン、セリン、スレオニンから選択され、X4はトリプトファン、アスパラギン酸、グリシン、チロシンから選択され、X5はセリン及びヒスチジンから選択される;HVR-H2:X6X7IleX8PX9GX10TX11配列番号25、X6は、グリシン及びアラニンから選択され、X7は、アスパラギン酸、トリプトファン、グリシン、グルタミン酸、バリンから選択され、X8はセリン、チロシン及びアスパラギンから選択され、X9はアスパラギン酸、アラニン、ヒスチジン及びアスパラギンから選択され、X10は、チロシン及びセリンから選択され、X11はチロシン、アスパラギン酸及びアスパラギンから選択される;及びHVR-H3:X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21D配列番号26、X12はアルギニン及びリジンから選択され、X13はグルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸及びプロリンから選択され、X14はセリン、イソロイシン、バリン、及びトリプトファンから選択され、X15は、トリプトファン、グリシン、チロシン、及びフェニルアラニンから選択され、X16はトリプトファン、チロシン、ロイシン、グリシン、及びフェニルアラニンから選択され、X17は、セリン、チロシン、フェニルアラニン、及びグリシンから選択され、X18は、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、及びグリシンから選択されるか又は存在せず、X19は、トリプトファン、グリシン、アラニン、及びチロシンから選択されるか又は存在せず、X20はバリンか又は存在せず、かつアミノ酸X21はメチオニン及びフェニルアラニンから選択される。A.G3Fabの産生VHFabファージディスプレイライブラリーからnoクローンを,大腸菌アルカリホスファターゼPhoAプロモーターの制御下で発現させた。軽鎖及び重鎖の両方が大腸菌内で分泌させるために、アミノ末端細菌STIIシグナル配列を含み、単一のファージミドベクターから発現された。重鎖カルボキシル末端は、M13バクテリオファージの遺伝子産物IIIgpIIIが続くロイシンジッパーにインフレームで融合させ、ファージ上の二価のFab-zip断片の表示を可能にした。可溶性Fabを発現させるために、終止コドンが、FabのCH1定常ドメインの終わりとロイシンジッパーの開始までの間のG3ファージミドに導入された。変異原性オリゴヌクレオチドRF6471-1TCTTGTGACAAAACTCACTAATAACGCATGAAACAGCTAGAGG配列番号33及びRF6471-2CCTCTAGCTGTTTCATGCGTTATTAGTGAGTTTTGTCACAAGA配列番号34がQuikChange登録商標LightningSite-DirectedMutagenesisキットストラタジーンを使用して停止コドンを挿入するために使用された。得られた可溶性G3Fab発現プラスミドは大腸菌株62A7ジェネンテックに形質転換され、カルベニシリンを含有する固形寒天上に蒔かれた。単一コロニーが、50μg/mLのカルベニシリンを含む2YTブロス25mLを植菌するために使用された。培養物を37°Cで一晩増殖させ、5mLが、完全C.R.A.P.培地3.57gNH42SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム2H2O、1.07gのKCl、5.36gの酵母エキス認定、5.36gのHycaseSFSheffield、pHはKOHの添加で7.3に調整され、容積は超純水で872mLに調整され、オートクレーブ滅菌し、55°Cへ冷却され、それにリッターあたり1MのMOPSpH7.3を110mL、50グルコースを11mL及び1MのMgSO4を7mLが添加されたに50μg/mLのカルベニシリンを接種するために使用された。培養物を振とうしながら24時間30°Cで増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、ペレットはー20°Cで保存した。Fabは、10μg/mLのDNaseIインビトロジェン、0.2mg/mLのリゾチームUSB、及び1mMのフッ化フェニルメチルスルホニルカルビオケムを含む、冷やした洗浄緩衝液リン酸緩衝生理食塩水PBS150mMのNaClの35mLに細胞ペレットを再懸濁することにより精製した。ペレットを25°Cで45分間急速にボルテックスすることにより再懸濁した。細胞の破片を遠心分離によりペレット化し、溶解液を、冷洗浄緩衝液で事前に平衡化した1mLのタンパク質A-セファロースGEHealthcareカラム上にロードした。カラムは、冷洗浄緩衝液50mLで洗浄し、0.1M酢酸3mLで溶出し、2Mのトリス、pH11.0を150μL加えて中和した。Fabは、アミコンウルトラ-15遠心式フィルターユニット10kDaのカットオフ、ミリポアを用いて濃縮した。得られたFabの濃度を分光光度計で測定した1OD280=1.5mg/mL。B.G3Fabの解析G3のFabの親和性は、BIACORE3000GEHealthcareを使用する表面プラズモン共鳴SPRによって決定された。およそ60共鳴単位RUのK11結合型ジユビキチンジェネンテック、K48結合型ジユビキチンBostonBiochem、及びK63結合型ジユビキチンBostonBiochemが、製造者により提供されたアミン結合プロトコールを使用してCM5チップの別々のフローセル上に固定化された。G3Fabの10mMのHepes、pH7.2、150mMのNaCl、及び0.01のTween20HBSTによる2倍連続希釈0.5-500nMが、HBSTをランニング緩衝液として使用して各フローセルへ注入された。各フローセルにおいて信号が記録され、非共役及びブロックされたフローセルからの基準信号を減算した。8分間の解離時間の後、チップ表面を20μLの10mMのHClで再生した。データは、変動ベースラインで1:1結合モデルに適合させた。速度定数と結合定数は、製造業者によって提供されたソフトウェアを使用して、非線形回帰分析により同時に算出し、表2の一番上の行に示されている。G3のFabの速度定数ka及びkd及び結合定数KDの3つの測定値からの平均値Avg.と標準偏差Std.dev.が示されている。G3はK63結合型ジユビキチンに結合定数が105nMで結合する。K48結合型ジユビキチン又はK63結合型ジユビキチンへの結合は検出できなかったことを実証している。精製されたG3Fabが、ELISAによるユビキチンタンパク質のパネルへの結合について試験された。K63結合型ジユビキチンUCBerkeley、モノユビキチンBostonBiochem、直鎖状ジユビキチンBostonBiochem、K48結合型ジユビキチンBostonBiochem,、及びK63結合型ジユビキチンBostonBiochemが96ウェルMaxisorbイムノプレート上へ固定化された。プレートは、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中において、5μg/mLの各ユビキチンタンパク質で25°Cで2時間コーティングされた。コーティングされたプレートは、その後、PBST中の2.5のミルクを200μL/ウェルで、1時間、25°Cで震とうさせてブロックされた。G3Fabの12回の2倍連続希釈が、PBST中の2.5のミルク中で1.0μMから0.5nMまでなされた。1時間後、ブロッキング緩衝液が除去され、各G3Fab希釈の100μL/ウェルが添加され、25°Cで1時間、震とうしてインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してPBSTで12回洗浄した。抗ヒトカッパ軽鎖特異的HRP結合2次抗体シグマアルドリッチのPBSTによる1:5000の希釈がFab結合の検出用に用いられた。100μL/ウェルの2次希釈が添加され、プレートを振とうしながら、30分間25°Cでインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してPBSTで12回、手動でPBSで2回洗浄した。結合した二次抗体をTMB基質KPLを用いて検出し、続いて等量の1Mリン酸でクエンチングした。吸光度を450nmで読み取った。G3Fabは濃度依存性結合を、K11結合型ジユビキチンのみに対して示したが、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、K48結合型ジユビキチン、又はK63結合型ジユビキチンに対しては示さなかった。したがって、G3はELISAフォーマットにおいてK11結合型ジユビキチンに対して非常に特異的である。G3Fabは,親和性の別の推定値を得るためにIC50競合ELISAで更に試験された。初回のタイタ-ELISAが、OD450=0.5のシグナルが達成されるであろうFabの濃度を決定するために行われた。K11結合型ジユビキチンジェネンテックが96ウェルのMaxisorbイムノプレート上に、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中に1μg/mLの濃度で、4°Cで一晩コーティングすることにより固定化された。コーティングされたプレートは、その後、PBST中の2.5のミルクを200μL/ウェルで、1時間、25°Cで震とうさせてブロックされた。G3Fabの12回の2倍連続希釈が、PBST中の2.5のミルク中で1μMから0.5nMまでなされた。1時間後、ブロッキング緩衝液が除去され、各G3Fab希釈の100μL/ウェルが添加され、25°Cで15分間、震とうしてインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してPBSTで6回洗浄した。ヤギ抗ヒトFab断片特異的HRP結合2次抗体シグマアルドリッチのPBSTによる1:5000の希釈がFab結合の検出用に用いられた。100μL/ウェルの2次希釈が添加され、プレートを振とうしながら、30分間25°Cでインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してPBSTで12回、手動でPBSで2回洗浄した。結合した二次抗体をTMB基質KPLを用いて検出し、続いて等量の1Mリン酸でクエンチングした。吸光度を450nmで読み取った。OD450=0.5のFabの濃度は94nMであった。可溶性K11結合型ジユビキチン2.5ミルク中94nMのG3FabのPBSTによる2倍連続希釈を25°Cで1時間震とうさせてインキュベートした。次に、各K11結合型ジユビキチン濃度での非結合Fabの量が、1μg/mLのK11結合型ジユビキチンでコーティングされてかつPBST中2.5のミルクでブロックされた96ウェルのMaxisorbイムノプレートにより、その混合物をインキュベートすることにより測定された。Fab/K11の混合物は、振とうしながら25°Cで15分間プレート上でインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してPBSTで6回洗浄した。ヤギ抗ヒトFab断片特異的HRP結合2次抗体シグマアルドリッチのPBSTによる1:5000の希釈がFab結合の検出用に用いられた。100μL/ウェルの2次希釈が添加され、プレートを振とうしながら、30分間25°Cでインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してPBSTで12回、手動でPBSで2回洗浄した。結合した二次抗体をTMB基質KPLを用いて検出し、続いて等量の1Mリン酸でクエンチングした。吸光度を450nmで読み取った。吸光度をK11結合型ジユビキチン濃度に対してプロットしたところ、IC50が75nMであることとを示した図3B。これは、上記SPRによって決定された105nMのKDと一致している。G3Fabはまた、K11結合型ジユビキチンUCBerkeley、モノユビキチンBostonBiochem、直鎖状ジユビキチンBostonBiochem、K48結合型ジユビキチンBostonBiochem、及びK63結合型ジユビキチンBostonBiochemへ特異的に結合するその能力についてウエスタンブロット法で試験された。還元剤入り1×LDS緩衝液中の1μgの各タンパク質が70°Cで10分間加熱され、MES緩衝液中、4-12のNuPAGEビストリス1.0mmゲルインビトロジェン上で二通りに泳動された。一つのゲルを全てのタンパク質を検出するために、クマシーブルーで染色した。他のゲルは、10メタノール及び1×NuPage転写緩衝液インビトロジェン中で、一定の30Vで1時間湿式転写により、0.2μmのニトロルロースインビトロジェンに転写された。膜上の非特異的結合部位は、振とうしながら25°Cで1時間、PBST中の5ミルクでのインキュベーションによってブロックした。次いで、膜を振とうしながら25°Cで1.5時間PBST中の5ミルク中の5μg/mLのG3Fab溶液中でインキュベートした。膜を振とうしながら、PBSTで3回洗浄した。G3Fabは、振とうしながら25°Cで1時間、PBST中の5ミルク中のヤギ抗ヒトFab断片特異的HRP結合二次抗体シグマアルドリッチの1:10,000希釈液中で膜をインキュベートすることにより検出された。次いで、膜をPBSTで3回洗浄し、続いてPBS中で1回洗浄した。二次抗体は、SuperSignalWestPico化学発光基質PierceBiotechnologyを用いて検出し、続いてフィルムへブロットを露光した。G3Fabは、K11結合型ジユビキチンのみ検出したが、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、K48結合型ジユビキチン、又はK63結合型ジユビキチンは検出しなかった図3Cを参照。従って、それはウェスタンブロット形式でもまたK11結合型ジユビキチンに対して非常に特異的である。実施例2:K63結合型特異的Fabの親和性成熟A.G3ファージミドの一価Fabディスプレイへの変換及びテンプレート生成の停止VHライブラリからのG3ファージミドクローンは、親和性成熟を目的として、二価のFab-zip形式から一価のFabディスプレイへ変換された。CH1定常ドメインおよびgpIIIの端部との間のロイシンジッパーはクンケル突然変異誘発を用いて除去したKunkelProcNatlAcadSciUSA82488を参照。ライブラリー合成のために、TAA停止コドンが、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH3、又はCDRのL3及びH3の両方の何れかに別個に同時に導入されたそれぞれ、L1、L2、L3、H3の停止テンプレート、及びL3/H3の停止テンプレートを生じる。停止コドンは、完全長Fabの発現を得て、ファージ上に表示するためにその停止の修復を必要とすることにより、特定のCDRループ内に多様性を余儀なくする。変異原性オリゴヌクレオチドのF220-delzipTCTTGTGACAAAACTCACAGTGGCGGTGGCTCTGGT配列番号35は、下記に列挙された停止コドン変異原性オリゴヌクレオチドのそれぞれと1μgのG3ファージミドクンケルDNAとに別々に組み合わされた。軽鎖のCDRL1内の位置24カバット番号付けでのTAA停止コドンの挿入に使用されたCDRL1停止変異原性オリゴヌクレオチドは、4D5LC1.stopGTCACCATCACCTGCTAAGCCAGTCAGGATGTG配列番号36であった。軽鎖のCDRL2内の位置50カバット番号付けでのTAA停止コドンの挿入に使用されたCDRL2停止変異原性オリゴヌクレオチドは、4D5LC2.stopGAAGCTTCTGATTTACTAAGCATCCTTCCTCTAC配列番号37であった。軽鎖のCDRL3内の位置89カバット番号付けでのTAA停止コドンの挿入に使用されたCDRL3停止変異原性オリゴヌクレオチドは、4D5LC3.stopGCAACTTATTACTGTTAACAATCTTATACTACTC配列番号38であった。重鎖のCDRH3内の位置98カバット番号付けでのTAA停止コドンの挿入に使用されたCDRH3停止変異原性オリゴヌクレオチドは、VH5CDRH3:413Vh5SRo6GAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTGAGGCCTCGTAACTGCCCCCCTACGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTC配列番号39であった。得られた一価Fabファージミド停止テンプレートは親和性成熟ライブラリ生成のために使用された。B.親和性成熟ライブラリの生成二つの親和性成熟のアプローチが取られた。最初のアプローチでは、ライブラリは軽鎖においてのみアミノ酸の多様性を含んで生成された。後述するように、これらの軽鎖ライブラリは、それぞれの軽鎖CDR位置のソフトランダム化softrandomizationを許容した。第ニのアプローチでは、ライブラリは、重鎖CDRおよび軽鎖CDRの両方において様々な組み合わせでアミノ酸の多様性を含んで生成された。これらの重鎖ライブラリーは、以下に説明するように、天然に生じるヒト抗体に見いだされるアミノ酸の多様性、又は主に表面に露出する残基のソフトランダム化のいずれかを含んでいた。全てのライブラリは、クンケル突然変異誘発によって生成されたKunkelProcNatlAcadSciUSA82488を参照。ソフトランダム化の場合には、野生型残基が50の時間を保持されれ、かつ50の時間は残りの19アミノ酸の一つがコード化されるであろうように、縮重オリゴヌクレオチドが合成された。ソフトランダム化を達成するために、あるヌクレオチド位置が指定の塩基でその時間の70を占め、時間の10が三つの他の塩基の一つで占められるように、オリゴヌクレオチドが設計された。そのようなソフトランダム化が、特定の塩基で含まれていたオリゴヌクレオチドについて、ソフトランダム化の存在はその塩基位置の番号の存在で示される。番号5は、塩基のアデニンが時間の70その位置に存在し、一方、塩基のグアニン、シトシン、チミンはぞれぞれ時間の10である。同様に、番号6は、グアニン、7はシトシン、8はチミンを指し、各場合において、他の三つの塩基の各々は時間の10だけ存在する。ハードランダム化の場合、縮重オリゴヌクレオチドは、天然型ヒト抗体内の特定の位置で見つかるアミノ酸の多様性が許容されるであろうように合成された。この場合、縮重コドンが用いられ、文字Rは、グアニン又はアデニンをコード化し、Yは、チミン又はシトシンをコードし、Mは、アデニン又はシトシンをコードし、Kは、グアニン又はチミンをコードし、Sは、グアニン又はシトシンをコードし、Wは、アデニン又はチミンをコードし、Hは、アデニン、シトシン、又はチミンをコードし、Bは、グアニン、チミン、又はシトシンをコードし、Vは、グアニン、シトシン、又はアデニンをコードし、Dは、グアニン、アデニン、又はチミンをコードし、Nは、グアニン、アデニン、シトシン又はチミンをコードしている。軽鎖ライブラリが作成され、L1、L2、L3、及びL1/L2/L3と命名された。L1ライブラリは、軽鎖の位置24-34カバット番号付けをソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドL1GATAGGGTCACCATCACCTGC768676567756658686567577676686676TGGTATCAACAGAAACCAGGA配列番号40及び20μgのL1停止テンプレートのクンケルDNA実施例2Aに記載が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。L2ライブラリは、軽鎖の位置50-56カバット番号付けをソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドL2AAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTAC567676567887786857567GGAGTCCCTTCTCGCTTCTCT配列番号41及び20μgのL2停止テンプレートのクンケルDNA実施例2Aに記載が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。L3ライブラリは、軽鎖の位置89-97カバット番号付けをソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドL3GACTTCGCAACTTATTACTGT756756567857577577776776577TTCGGACAGGGTACCAAGGTG配列番号42及び20μgのL3停止テンプレートのクンケルDNA実施例2Aに記載が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。L1/L2/L3ライブラリは、軽鎖の位置24-34、50-56、及び89-97カバット番号付けをソフトランダム化した。上述された変異原性オリゴヌクレオチドのL1配列番号40、L2配列番号41,及びL3配列番号42及び20μgのL3停止テンプレートのクンケルDNA実施例2Aに記載が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。6つの重鎖ライブラリもまた作成され、L1/L2/L3ハード、L3/H1/H2、L3/H3、L1/H3、H2/H3、及びH3と命名された。L1/L2/L3ハードライブラリは、ハードランダム化された軽鎖の位置28-33、50、53、55、91-94、及び96カバット番号付けを、天然型抗体内でこれらの位置で見出されるアミノ酸の多様性を可能とするために、有していた。L1変異原性オリグヌクレオチドのF111-L1ACCTGCCGTGCCAGTCAGRDTRKTRVWANWTHTGTAGCCTGGTATCAACAGAAAC配列番号43及びF202-L1ACCTGCCGTGCCAGTCAGRDTRKTRVWANWTHTCTGGCCTGGTATCAACAGAAAC配列番号44が1:2の比率で混合され、L2変異原性オリグヌクレオチドのF201-L2CCGAAGCTTCTGATTTACKBGGCATCCAVCCTCTACTCTGGAGTCCCT配列番号45及びF203-L2CCGAAGCTTCTGATTTACKBGGCATCCAVCCTCGMATCTGGAGTCCCTTCTCGC配列番号46が1:1の比率で混合され、かつL3変異原性オリグヌクレオチドのF133aGCAACTTATTACTGTCAGCAATMTDMCRVTNHTCCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC配列番号47、F133bGCAACTTATTACTGTCAGCAATMTDMCRVTNHTCCTTWTACGTTCGGACAGGGTACC配列番号48、F133cGCAACTTATTACTGTCAGCAASRTDMCRVTNHTCCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC配列番号49、F133dGCAACTTATTACTGTCAGCAASRTDMCRVTNHTCCTTWTACGTTCGGACAGGGTACC配列番号50が1:1:1:1の比率で混合された。これらの混合物の各々の等量及び20μgのL3停止テンプレートのクンケルDNA実施例2Aに記載が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。L3/H1/H2ライブラリは、軽鎖の位置91-94、96カバット番号付け及び重鎖の位置30-32、50、5252aではなく、53、及び54カバット番号付けをソフトランダム化した。L3変異原性オリグヌクレオチドのF563-L3ソフト1ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCT777ACGTTCGGACAGGGTACC配列番号51、F564-L3ソフト2ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCTTWTACGTTCGGACAGGGTACC配列番号52、及びF565-L3ソフト3ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC配列番号53が、1:0.5:1の比率で混合された。L3オリゴ混合物及び変異原性オリグヌクレオチドのG3CDRH1ソフトGCAGCTTCTGGCTTCACCTTC878558878TATATTAGCTGGGTGCGTCAG配列番号54及びG3CDRH2ソフトGGCCTGGAATGGGTTGCT668ATT558CCT558668GGTTATACTTACTATGCCG配列番号55の等量、及び20μgのL3停止テンプレートのクンケルDNA実施例2Aに記載が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。L3/H3ライブラリは、軽鎖の位置91-94、96カバット番号付け及び重鎖の位置98-100及び100bカバット番号付けをソフトランダム化した。上述されたL3変異原性オリグヌクレオチドのF563-L3ソフト1配列番号51、F564-L3ソフト2配列番号52,及びF565-L3ソフト3配列番号53が、1:0.5:1の比率で混合された。L3オリゴ混合物及び変異原性オリグヌクレオチドのG3CDRH3ソフトGTCTATTATTGTGCTCGTGAGTGGTAC888668668TAC688ATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC配列番号56の等量、及び20μgのL3/H3停止テンプレートのクンケルDNA実施例2Aに記載が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。L1/H3ライブラリは、軽鎖の位置28-33カバット番号付けをハードランダム化させ、天然型ヒト抗体内のこれらの位置に見いだされるアミノ酸の多様性を可能としており、重鎖の位置98-100及び100bカバット番号付けをソフトランダム化させた。L1変異原性オリグヌクレオチドのF111-L1配列番号43及びF202-L1配列番号44が、1:2の比率で混合された。L1オリゴ混合物と変異原性オリグヌクレオチドのG3CDRH3ソフト配列番号56の等量、及び20μgのL1停止テンプレートのクンケルDNA実施例2Aに記載が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。H2/H3ライブラリは、重鎖の位置50、5252aでなく、53、54、98-100、及び100bカバット番号付けをソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドのG3CDRH2ソフト及びG3CDRH3ソフト配列番号55及び56及び20μgのH3停止テンプレートのクンケルDNA実施例2Aに記載が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。H3ライブラリは、重鎖の位置98-100及び100bカバット番号付けをソフトランダム化した。変異原性オリゴヌクレオチドのG3CDRH3ソフト配列番号56及び20μgのH3停止テンプレートのクンケルDNA実施例2Aに記載が、クンケル突然変異生成によるライブラリの作成に用いられた。変異誘発反応は電気的形質転換受容性のXL1-Blueストラタジーン大腸菌中へ電気穿孔され、37°Cで45分間震とうさせて、25mLのSOC培地に回収された。20マイクロリットルが除去され、10倍希釈がカルベニシリンを含有する固形寒天プレート上に蒔かれ、ライブラリのサイズを決定するために、37°Cで一晩増殖させた。残った培養物は、50μg/mLのカルベニシリンと1010ファージ/mLのM13K07ヘルパーファージを含有する500mLの2YTブロスへ移された。細胞は、37°Cで1時間、震とうして感染させた。50μg/mLのカナマイシンが添加され、培養物は更に7時間37°Cで震とうして増殖させた。温度をその後30°Cへシフトさせ、培養物を更に22時間増殖させた。ライブラリは、各々少なくとも~3.5×1010コロニー形成単位CFUを含有した。ファージを、20ポリエチレングリコールPEG/2.5MのNaClの1/5量により2ラウンドの沈降により培養上清から精製した。C.親和性成熟ライブラリの選別軽鎖ライブラリーは4ラウンドの選別を受けた。4つのライブラリの各々は、以下のプロトコールを用いる全4ラウンドを通して平行して別々に選別された。第一ラウンドは、96ウェルMaxisorbイムノプレートNUNC上に固定化されたK11結合型ジユビキチンによるプレートベースでの選別であった。プレートは、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中の5μg/mLのK11結合型ジユビキチンで4°Cで一晩コーティングされた。コーティングされたプレートは、0.05のTween20PBSTを含むPBST中の2.5のミルクを200μL/ウェルで、1時間、25°Cで震とうさせてブロックされた。ファージライブラリはPBST中の2.5のミルクでOD=2.0まで希釈され、30μg/mLのモノユビキチンが対抗選択のために添加された。1時間後、ブロッキング緩衝液が除去され、100μL/ウェルのファージが添加され、25°Cで1時間、震とうしてインキュベートした。結合後、プレートは、PBSTにより、手作業でウェルを満たし、洗浄の間に緩衝液を取り除くことにより、20回洗浄された。ファージは50mMのHCl/500mMのKClが150μL/ウェルで30分間25°Cで震とうさせて溶出した。溶出は1Mのトリス、pH7,5を150μL/ウェルで中和され、その後、M13K07ヘルパーファージを添加したXL1-Blue大腸菌ストラタジーンで増殖された。増幅されたファージは、溶液ベースの選別において、K11結合型ジユビキチンに対する選択の更なるラウンドで使用された。K11結合型ジユビキチンUCBerkeleyは、EZ-Linkスルホ-NHS-ビオチンPierceBiotechnologyの3倍モル過剰でビオチン化された。第二の選別において、ニュートラアビジンPierceBiotechnologyが、96ウェルMaxisorbイムノプレートNUNCに固定化された。プレートは、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中の5μg/mLのニュートラアビジンで4°Cで一晩コーティングされた。コーティングされたプレートは、その後、PBST中の2.5のミルクを200μL/ウェルで、1時間、25°Cで震とうさせてブロックされた。第一ラウンドの選別からのファージは、250nMのビオチン化K11結合型ジユビキチンUCBerkeley及びモノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、K48結合ポリユビキチン2-7、及びK63結合ポリユビキチン2-7全てBostonBiochemからの各々を10μg/mLを対抗選択のために含む、PBST中の2.5ミルクで、OD=1.0まで希釈した。ファージは、溶液中で2時間25°Cで回転により、ビオチン化K11結合型ジユビキチンに結合させた。結合後、ファージはPBST中の2.5のミルクで5倍に希釈され、ビオチン化K11結合型ジユビキチンに結合したファージは、25°Cで10分間の震とうにより、ニュートラアビジンプレート上へ捕獲された。捕獲後、プレートは、PBSTにより、手作業でウェルを満たし、洗浄の間に緩衝液を取り除くことにより、30回洗浄された。ファージは50mMのHCl/500mMのKClが100μL/ウェルで30分間25°Cで震とうさせて溶出した。溶出は1Mのトリス、pH7,5を100μL/ウェルで中和され、その後、M13K07ヘルパーファージを添加したXL1-Blue大腸菌ストラタジーンで増殖された。後者の選別のストリンジェンシーは、3つの方法で、即ち、選別に使用されたビオチン化K11結合型ジユビキチンの量を減少させることにより、プレート洗浄の回数と時間を増加することにより、及びファージ結合の時間を減少させることにより増大した。第三の選別は、プレート洗浄回数を40回に増やしたことを除いて、上述の第二の選別と同様に実施された。第四の選別は、ビオチン化K11結合型ジユビキチンの量を100nMに減らし、結合時間を1時間に減らし、かつ4回の更なるプレート洗浄が追加されたことを除き、第三の選別と同様に実施された。これらの洗浄液は、25°Cで15分間震とうしてインキュベートした。濃縮は、各ラウンドについて、K63結合型ジユビキチンで回収されたファージの数を、プレート選別においてコーティングされていないウェル又は溶液選別においてニュートラアビジンコーティングされたウェルに対して、比較することで計算された。濃縮は、4つのライブラリの全てにおいて全4ラウンドで観察された表3を参照。4ラウンドの選別後に、48の個々のクローンが4つのライブラリの各々から選ばれ合計192、96ウェル形式で、50μg/mLのカルベニシリン及び1010ファージ/mLのM13K07ヘルパーファージを含有する2YTブロスの1mLで増殖させた。それらの培養物からの上清が、K11結合型ジユビキチンUCBerkeley、モノユビキチンBostonBiochem、直鎖状ジユビキチンBostonBiochem、K48結合ポリユビキチン2-7BostonBiochem、K63結合ポリユビキチン2-7BostonBiochem、抗gD抗体ジェネンテック、又は非コーティングウェルに対する結合に対して、ハイスループットファージスポットELISAで使用された。32のクローンが、K11結合型ジユビキチンに対する特異的結合を示すとして同定された。重鎖ライブラリーは4ラウンドの選別を受けた。4つのライブラリの各々は、第一ラウンドで平行して選別され、次いで、2から4までの選別のために貯えられた。プレートベースの選別が、軽鎖ライブラリについて上述された通りに、第一ラウンドで使用された。増幅したファージが、選別の後のラウンドで使用された。後者の選別のストリンジェンシーは、4つの方法、即ち、選別に使用されたビオチン化K11結合型ジユビキチンの量を減少させることにより、プレート洗浄の回数と時間を増加することにより、ファージ結合の時間を減少させることにより、及び、ニュートラアビジンで捕獲する前にファージ結合を競合するために、過剰の非ビオチン化K11結合型ジユビキチンを添加することにより、増大した。第二の選別は溶液ベースであって、100nMのビオチン化K11結合型ジユビキチンが使用され、全6つのライブラリが貯蔵され一緒に選別されることを除き、軽鎖ライブラリについて上述したとおりに実施された。第三の選別は、10nMのビオチン化K11結合型ジユビキチンが使用され、結合時間が1時間に減少されることを除き、軽鎖ライブラリについて記述したとおりに実施された。第四の選別は、三つの平行した選別が、5nM、1nM、及び0.5nMのビオチン化K11結合型ジユビキチンにより行われたことを除き、軽鎖ライブラリについて上述したとおりに実施された。更に、ファージ結合の1時間後、及びニュートラアビジンで捕獲前に、30μg/mLの非ビオチン化K11結合型ジユビキチンUCBerkeleyが添加され、25°Cで30分回転させてファージ結合を競合させ、遅いオフレートoff-rateを持つクローンを選択した。濃縮は上記のように各ラウンドごとに算出した。濃縮は、全4ラウンドで観察された表3を参照。4ラウンドの選別後に、192のクローンが選ばれ、96ウェル形式で、50μg/mLのカルベニシリン及び1010ファージ/mLのM13K07ヘルパーファージを含有する2YTブロスの1mLで増殖させた。それらの培養物からの上清が、K11結合型ジユビキチン、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、K48結合ポリユビキチン2-7、K63結合ポリユビキチン2-7、抗gD抗体、又は非コーティングウェルに対する結合に対して、ハイスループットファージスポットELISAで使用された。23のクローンが、K11結合型ジユビキチンに対する特異的結合を示すとして同定された。単一スポット競合ファージELISAが、どのクローンが親のG3クローンよりも親和性の最大の改善があったかを決定するために行われた。ファージスポットELISA実施例2Cからのファージ上清を用いた。競合ELISAが、ファージ上清が、精製Fabの代わりに使用され、可溶性K11結合型ジユビキチンジェネンテックの単一濃度50nMのみ使用された点を除いて、IC50ELISAについて記載のように行われた実施例1B。競合はまた、各クローンについても、任意の競合する抗原の非存在下でファージ結合シグナルを決定するために、任意の可溶性K11結合型ジユビキチンを添加すること無しで行われた。50nMのK11結合型ジユビキチンの存在下における結合の阻害率は、[1-50nMのK11におけるOD450/K11無しにおけるOD450]×100として計算された。G3親クローンは、50nMのK11結合型ジユビキチンの存在下で、平均で33の阻害を示した。60又はそれ以上の阻害を示すクローンが、更なる解析のために選択された。D.親和性成熟クローンの配列決定単一スポット競争ファージELISA実施例2Cで同定された最高の親和性クローンの軽鎖と重鎖の両方が配列決定された。合計8の固有の親和性成熟クローンが、複数の同一同胞とともに、同定された図4A及び4B表4参照。クローンG3L1.1A11、G3L1.1C12、G3HC.2A3、及びG3HC.2G4は、CDRL1内にのみ変異を含んでいた。クローンG3HC.2A6及びG3HC.2D7は、CDRH3内に変異を含んでいた。G3L2.1F12は、このファージ選別に使用されたXL1-Blue大腸菌などのアンバーサプレッサー株で発現された場合、グルタミンで置換可能であるアンバー停止コドンを含む、CDRL2内に変異を含んでいた。クローンのG3HC.2E6は、CDRH2内においてのみ変異を含んでいた。上記クローンにおいて変異性を示した軽鎖HVR領域のコンセンサスアミノ酸配列は:HVR-L1:X22X23SerX24X25X26X27X28X29X30X31配列番号73を含み、X22はアルギニン及びグリシンから選択され、X23はアラニン及びバリンから選択され、X24はグルタミン及びヒスチジンから選択され、X25はアスパラギン酸、アスパラギン、及びイソロイシンから選択され、X26はロイシン及びバリンから選択され、X27はセリン、アスパラギン酸、グリシン、及びグルタミン酸から選択され、X28はスレオニン及びセリンから選択され、X29はアラニン、バリン、及びフェニルアラニンから選択され、X30はバリン及びイソロイシンから選択され、X31はセリンから選択され、かつHVR-L2:X32X33X34PheX35TyrSer配列番号74を含み、X32はセリン及びアスパラギンから選択され、X33はグルタミン及びアラニンから選択され、X34はグルタミン酸及びセリンから選択され、X35はロイシン及びバリン7から選択される、であった。上記クローンにおいて変異性を示した重鎖HVR領域のコンセンサスアミノ酸配列は:HVR-H2:X36IleAsnProX37GlyGlyTyrThrTyrTyrAlaAspSerValLysGly配列番号75、X36はアラニン及びグリシンから選択され、X37はアラニン及びアスパラギンから選択され、かつHVR-H3:GluTrpTyrX38X39GlyTyrValMetAspTyr配列番号76、X38はフェニルアラニン及びチロシンから選択され、X39はグリシン及びアスパラギン酸から選択される、であった。E.ファージ特異性ELISA異なる結合のポリユビキチンに対する8つの親和性成熟クローンの特異性が、ファージELISAでアッセイされた。ファージELISAは、ファージ上清の代わりに、OD268=1.0で始まる6回の5倍連続希釈が使用された点を除いて、実施例1で記載のように実行された。全ての親和性成熟クローンは、ファージ濃度依存的にK11結合型ジユビキチンに結合した図5。K48結合ポリユビキチンへの非常に弱い結合のみ、試験された最高のファージ濃度で見られた。F.Fabの産生、親和性解析、及びハイブリッド生成G3の親のFab可変ドメイン及び8つの親和性成熟Fab可変ドメインが、軽鎖定常ドメインにgDタグを欠くFab発現プラスミド中にクローニングされた。更に、クローンG3L2.1F12のCDRL2内のアンバーstopTAGが、グルタミンをコードするCAGに変異された。変異原性オリグヌクレオチド5’-G3LC1F12stopQCCGAAGCTTCTGATTTACAACCAGGAATTCGTGTACAGCGGAGTC配列番号77及び3’-G2LCF12stopQGACTCCGCTGTACACGAATTCCTGGTTGTAAATCAGAAGCTTCGG配列番号78が、QuikChange登録商標LightningSite-DirectedMutagenesisキットストラタジーンを使用してTAGコドンをCAGコドンで置換するために使用された。得られたプラスミドは、大腸菌株64B4ジェネンテックに形質転換され。可溶性Fabとして発現され、実施例1に記載のようにプロテインA-セファロースを使用して精製された。精製されたFabは、実施例1に記載のように、それらの親和性を決定するために、同一のチップを用いて、SPR実験に使用された。全ての8つのクローンは、親分子に対する、K11結合型ジユビキチンの解離定数KDの改善を示し、K48結合型ジユビキチン又はK63結合型ジユビキチンの何れにも検出可能な結合は見られなかった表2を参照。軽鎖中で変異を持つ高親和性クローンは、G3L1.1C12及びG3HC.2A3であり、解離定数はそれぞれ35nMと25nMであった。双方ともCDRL1の変化のみ含有しており図4A及び4Bを参照、親のG3クローンに対して、会合定数kaと解離定数kdの両方で改善が見られた表2。重鎖に変異を持つ最高親和性クローンは、47nMの解離定数を持つ、G3HC.2E6であった。このクローンはCDRH2の変化のみ含有しており、解離定数の改善のみが観察された。実施例2Bに記載の親和性成熟ライブラリ設計に起因し、CDRL1及びCDRH2の両方の変化を許容するであろうCDR変異の組合わせは無かった。従って、ハイブリッドのFabファージミドは、軽鎖のG3L1.1C12と重鎖のG3HC.2E6を組合わせたか得られたクローンは1C12/2E6、又は軽鎖のG3HC.2A3と重鎖のG3HC.2E6を組合わせた得られたクローンは2A3/2E6、標準的な制限消化クローニング方法を使用して生産された図6A及び6Bを参照。これらのハイブリッドはまた、可溶性Fabとして発現され、精製され、実施例1Cと1Dに記載されているように、SPRによって分析した。これらの重鎖と軽鎖の組み合わせは、添加剤の親和性の改善をもたらした表2を参照。1C12/2E6と2A3/2E6の両方とも、G3親Fabに比べ親和性のほぼ9倍の改善に相当する、K11結合型ジユビキチンに対する12nMの解離定数を有し、そのことは両方のハイブリッドに対する会合定数と解離定数の両方の改善に起因していた。更に、1C12/2E6又は2A3/2E6のどちらとも、K48結合型又はK63結合型ジユビキチンに検出可能な結合を示さなかった。G.IgGフォーマットへの変換及び親和性解析親のFabG3及び2つの親和性成熟ハイブリッドFab1C12/2E6及び2A3/2E6は、ヒト免疫グロブリンIgGとして293細胞で発現させた。発現コンストラクトは、ヒトカッパIgG1の重鎖及び軽鎖をコードするpRK哺乳動物発現コンストラクト中にFab可変ドメインをクローニングすることにより作成された。IgGは、実施例1におけるFabの精製について記載されたように標準的な方法論により、プロテインAセファロースカラム上で、親和性クロマトグラフィーで精製され、PD10脱塩カラムGEHealthcareを使用してPBSにバッファー交換された。ハイブリッドFabの親和性は、CM5チップ上に直接抗原をアミン結合させるSPR実験にSPRにより決定された実施例2F。これは、抗原上で利用可能なリジン側鎖の1級アミンを含有した。2つのユビキチンモノマーを一緒に連結してジユビキチンを形成するイソペプチド結合に関与するリジンは、カップリングには利用できないであろう。K11、K48、及びK63結合型ジユビキチンは、イソペプチド結合に関与する異なるリジン残基を有するため、チップへのカップリングに利用可能なリジンもまた異なり、従って、異なるエピトープが、結果として抗体結合に利用可能か又は利用できない場合がある。チップに結合したリジンの交絡作用を潜在的に避けるために、この実施例で生成されたIgGの親和性を、BIACORETM3000GEHealthcare上でIgG捕獲を使用するSPRで試験した抗ヒトFc捕捉抗体GEHealthcareのおよそ11500の共鳴ユニットRUが、製造者により供給されたアミン結合プロトコルを用いて、CM5チップのフローセルの1又は2に固定された。10mMのHepes、pH7.2、150mMのNaCl、及び0.01のTween20HBST中の60μLの0.5μg/mLのIgGが、フローセル2上で流量30μL/分で注入され、結果として約800RUのIgGが捕捉された。フローセル1は、基準の減算として働く捕捉抗体のみを有していた。K11結合型ジユビキチンジェネンテック、K48結合型ジユビキチンBostonBiochem、又はK63結合型ジユビキチンBostonBiochemのHBSTによる2倍連続希釈が、フローセル1及び2に注入された流量30μL/分で全60μL。各フローセルにおいて信号が記録され、基準信号を減算した。4分間の解離時間の後、チップ表面を15μLの3MのMgCl2で再生した。データは、G3IgGの物質移動による1:1の結合モデルにフィットさせたか、又は1C12/2E6IgG及び2A3/2E6IgGに対する変動ベースラインによる1:1の結合モデルにフィットさせた。速度定数と結合定数は、製造業者によって提供されたソフトウェアを使用して、非線形回帰分析により同時に算出し、表5に示されている。G3IgGはK11ジユビキチン結合に対するKDが129nMであり、1C12/2E6IgG及び2A3/2E6IgGの両方ともKDが20nMで結合した。これらの親和性は矛盾が無く、抗原法の直接結合を使用して、同じFabについて測定された結合定数の許容可能な誤差の2倍の範囲内であった表2を参照。更に、K48結合型ジユビキチン又はK63結合型ジユビキチンへの検出可能な結合は見られなかった。実施例3:親和性成熟ハイブリッド抗K11抗体の特性評価A.IgG特異性ELISAG3の親IgG、1C12/2E6IgG及び2A3/2E6IgGがELISAによりユビキチンタンパク質のパネルへの結合について試験された。K11結合型ジユビキチンジェネンテック、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、K48結合型ジユビキチン、K63結合型ジユビキチン、K48結合ポリユビキチン、K63結合ポリユビキチン全てBostonBiochemからが、96ウェルMaxisorbイムノプレート上に固定された。プレートは、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中において、1μg/mLの各タンパク質で25°Cで2時間コーティングされた。コーティングされたプレートは、その後、PBST中の2.5のミルクを200μL/ウェルで、1時間、25°Cで震とうさせてブロックされた。G3親IgG、1C12/2E6IgG及び2A3/2E6IgGのPBST中2.5ミルクによる11回の2倍連続希釈が20μg/mLから0.02μg/mLまで行われた。1時間後、ブロッキング緩衝液が除去され、各IgG希釈の100μL/ウェルが添加され、25°Cで1時間、震とうしてインキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してPBSTで6回洗浄した。ヤギ抗ヒトFcγ特異的HRP結合Fab’22次抗体JacksonImmunoresearchのPBSTによる1:5000の希釈がIgG結合の検出用に用いられた。100μL/ウェルの2次希釈が添加され、プレートを振とうしながら、25°Cで30分間インキュベートした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用してPBSTで12回、手動でPBSで2回洗浄した。結合した二次抗体をTMB基質KPLを用いて検出し、続いて等量の1Mリン酸でクエンチングした。吸光度を450nmで読み取った。3つ全てのIgGが、非常に低濃度のIgGでさえも、K11結合型ジユビキチンを認識した。K11結合型ジユビキチン結合についてほぼ同じシグナルが、各IgG濃度でG3、1C12/2E6、及び2A3/2E6について、それらの間に7倍から9倍の親和性の相違があるという事実にもかかわらず、観察された。従って、このELISAフォーマットは、親のIgGの親和性と親和性成熟変異体の親和性を区別することが出来なかった。更に、低IgG濃度において、三つ全てのIgGは高度に特異的であったが、しかし、IgG濃度を20μg/mLへ上げると、K48結合型ポリユビキチン、K63結合型ジユビキチン、及びK63結合ポリユビキチンに対する若干の非特異的な結合が、このアッセイ形式において1C12/2E6及び2A3/2E6の両方において見られた。異なるIgGの親和性を区別することができ、かつ本アッセイ形式でK11結合型ジユビキチンのより特異的な認識を与えるであろうよりストリンジェントな条件を同定するために、4Mの尿素を含む緩衝液4M尿素、20mMのトリスpH7.5、135mMのNaCl、1のトリトンX-100、10のグリセロール、1mMのEDTA、1.5mMのMgCl2中で、再びELISAが行われた。これらのストリンジェントな条件下で、試験されたIgGの最高濃度20μg/mLを除いて、K11結合型ジユビキチンへのごくわずかな結合がG3親IgGについて観察された図7A。これに対して、親和性成熟変異体の1C12/2E6及び2A3/2E6について、最低のIgG濃度の0.02μg/mLを含み、強い結合が全ての濃度で見られた。更に、4Mの尿素緩衝液の使用は、維持されるべきK11結合型ジユビキチンについて高度な特異性を与える。1C12/2E6のみ、試験されたIgGの最高濃度でK48結合ポリユビキチンへの非常に弱い結合を示した。2A3/2E6は、試験されたIgGの最高濃度においてさえも20μg/mL、K11結合型ジユビキチン以外のユビキチン型のどれに対しても結合を示さなかった。従って、これらのストリンジェントな条件下で、ELISAにおいて、親和性の増大は抗体の機能の増大につながる。B.IgGのウエスタンブロット分析G3親IgG、1C12/2E6IgG及び2A3/2E6IgGが、ウェスタンブロットで純粋なジユビキチン鎖を検出するその能力について最初に試験された。K11結合型ジユビキチンジェネンテックの1XLDS緩衝液インビトロジェンによる1μgから15ngへの7回の2倍連続希釈、及び1XLDS緩衝液インビトロジェン中のモノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、K48結合型ジユビキチン、及びK63結合型ジユビキチン全てBostonBiochemからの各1μgを、70°Cで10分間加熱っし、MES緩衝液インビトロジェン中で非還元状態下で、4-12のビストリスNuPAGE1.0mmゲルインビトロジェン上で4通りに泳動された。一つのゲルを、全タンパク質を検出するためにクマシーブルーで染色した。他の3つのゲルは、10メタノール及び1×NuPage転写緩衝液インビトロジェン中で、一定の30Vで1時間湿式転写により、0.2μmのニトロルロースインビトロジェンに転写された。膜上の非特異的結合部位は、振とうしながら25°Cで1時間、PBST中の5ミルクでのインキュベーションによってブロックした。次いで、膜を振とうしながら25°Cで1時間PBST中の5ミルク中の1μg/mLのG3IgG、1C12/2E6IgG又は2A3/2E6IgG中でインキュベートした。膜を振とうしながら、PBSTで3回洗浄した。IgGは、振とうしながら25°Cで1時間、PBST中の5ミルク中のヤギ抗ヒトFcγ特異的HRP結合Fab’2二次抗体JacksonImmunoresearchの1:10,000希釈液中で膜をインキュベートすることにより検出された。次いで、膜をPBSTで3回洗浄し、続いてPBS中で1回洗浄した。二次抗体は、SuperSignalWestPico化学発光基質PierceBiotechnologyを用いて検出し、続いてフィルムへブロットを露光した。三つ全てのIgGはK11結合型ジユビキチンのみを検出したが、モノユビキチン、直鎖状ジユビキチン、K48結合型ジユビキチン、又はK63結合型ジユビキチンは検出せず、ウェスタンブロットの文脈においてはK11結合型ジユビキチンに非常に特異的であることを示している図7B参照。更に、親和性成熟変異体は、わずか15ngのK11結合型ジユビキチンを検出可能であるという点でG3親IgGより遙かに感受性が高かったが、G3IgGの検出限界はこの特定のブロット暴露で125ngであった。従って、親抗体に対する本ハイブリッドの7倍から9倍の親和性の改善は、K11結合型ジユビキチンの認識においてウェスタンブロットにおける機能の改善につながった。所望の抗原に対する親和性の増大にも関わらず、特異性は維持され、かつ1C12/2E6IgG又は2A3/2E6IgGの何れも、試験された他のユビキチン型の何れかに対する結合を検出することができなかった。1C12/2E6親和性成熟変異体及び2A3/2E6親和性成熟変異体はSPR解析、特にIgGELISA及び上述のジユビキチンに対するウェスタンブロットで同様に振る舞ったため、2A3/2E6のみが更なる試験に使用された。K11結合特異的抗体がK11結合型ジユビキチン抗原に対して産生され、そのためそれらは恐らくは結合そのものを認識したか、又はより可能性があるのは、K11結合から生じたジユビキチンの構造のため接近して配置されたドナーユビキチンとアクセプターユビキチンの周辺表面残基を認識した。ジユビキチンは抗原の最小認識単位であり、K11結合ポリユビキチンは、モノマー単位の反復としてジユビキチンを持つポリマーであり、抗体はまたK11結合により連結したより長いポリユビキチン鎖にも結合するはずである。これを検証するために、2A3/2E6IgGがウエスタンブロットにおいて純粋なポリユビキチン鎖を検出するその能力について試験された。還元剤入りの1XLDS緩衝液インビトロジェン中のモノユビキチンBostonBiochem、K48結合ポリユビキチン2-7BostonBiochem、K63結合ポリユビキチン2-7BostonBiochem及びK11結合ポリユビキチンジェネンテックの各々1μgを、MES緩衝液インビトロジェン中で還元条件下、70°Cで10分間加熱し、4-12のビストリスNuPAGE1.0mmゲル上で3通りに泳動された。一つのゲルを全てのタンパク質を検出するために、クマシーブルーで染色した。ウエスタンブロットの残りの部分は、0.45μmのニトロセルロースインビトロジェンへの転写が30Vで2時間行われた点を除き、上記のように行われた。コントロールのパンユビキチン抗体、P4D1は、モノユビキチン、K48結合型ポリユビキチン2-7、K63結合ポリユビキチン2-7、K11結合型ポリユビキチンを認識したが、2A3/2E6IgGはK11結合型ポリユビキチンのみを認識した図7C。従って、K11結合型ジユビキチンと同じく、2A3/2E6抗体はK11結合を含むポリユビキチン鎖を検出できるが、他の結合のポリユビキチン鎖を認識しない。2A3/2E6抗体は純粋なK11結合型ポリユビキチン鎖に特異的に結合できたたため、次に、2A3/2E6IgGが、哺乳動の全細胞溶解物物及び酵母の全細胞溶解物の両方に由来するK11結合型ポリユビキチンを検出する能力について試験された。293T細胞を、10のウシ胎児血清FBSと2mMのL-グルタミンを補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地DMEMで増殖した。細胞をプレートから掻き取り、4°Cで10分間、2000rpmでスピンダウンし、冷PBSを20mLで洗浄し、再度ペレット化した。細胞を、8Mの尿素、50mMのトリス、pH7.5、及び25mMのNaCl、10μL/mLの100XHaltプロテアーゼ阻害剤及びフォスファターゼ阻害剤PierceBiotechnology、5mMのEDTAPierceBiotechnology、及び2mMのN-エチルマレイミドNEM,PierceBiotechnologyを含む緩衝液中に溶解し、次に、粘度を低下させるために簡潔に超音波処理した。溶解物は、免疫沈降IP緩衝液20mMトリス,pH7.5,135mMのNaCl,1トリトンX-100,10グリセロール、1mMのEDTA、1.5mMのMgCl2で4Mの尿素へと2倍希釈された。Saccharomycescerevisiae株のYRG-2ストラタジーンを30°Cで一晩YEPD培地で増殖した。細胞18mLを5分間3000rpmでペレット化し、水で洗浄し、再ペレット化し、400mgの細胞ペレットが得られた。細胞は、製造元の指示に従って、25μMのMG132CaymanChemical,2mMのNEMPierceBiotechnology,1mMのPMSFCalbiochem、及び5mMジチオスレイトールDTTを補充した1mLのY-PERPierceBiotechnologyに溶解した。還元剤入りの1×LDS緩衝液インビトロジェン中で、50ナノグラムのK11結合型ジユビキチンジェネンテック、1μgのK48結合型ジユビキチンBostonBiochem、1μgのK63結合型ジユビキチンBostonBiochem、293T細胞溶解物からの全タンパク質を100μg、及びS.cerevisiae細胞溶解物の22μLを、70°Cで10分間加熱し、MES緩衝液インビトロジェン中、還元条件下、4-12ビストリスNuPAGE1.0mmゲル上で、2通り、泳動した。ゲルの転写及びウエスタンブロットは、0.45μmのニトロセルロースインビトロジェンへの転写が30Vで2時間行われた点を除き、上記のように行われた。2A3/2E6IgGは陽性コントロールのK11結合型ジユビキチンを検出したが、陰性コントロールのK48結合型ジユビキチン又はK63結合型ジユビキチンの何れも検出しなかった図7D。更に、2A3/2E6は、293T細胞溶解物からのユビキチン化の特徴である高分子量スメア、並びに、酵母細胞溶解物からのいくつかの高分子量のバンドを認識することができた。従って、このIgGはまた全細胞溶解物からのK11結合型ポリユビキチン鎖を検出することができた。C.自己ユビキチン化MuRF1の免疫沈降さらに、抗体の特異性を特徴づけ、それが免疫沈降IPに使用することができるかどうかを判断するために、MuRF1自己ユビキチン化反応が、複数結合のポリユビキチン鎖で修飾された純粋な基質を生成するために使用された。MuRF1は、E1ユビキチン活性化酵素のUbe1及びE2ユビキチン結合酵素のUbcH5cと組み合わされた場合、K11結合型ポリユビキチン鎖、K48結合型ポリユビキチン鎖、及びK63結合型ポリユビキチン鎖を持つ基質の欠損下で自分自身で自己ユビキチン化することが知られているE3ユビキチンリガーゼであるKimHTetal2007JBC2821737586。自己ユビキチン化反応は、総体積40μL中、100nMの組み換え型ヒトHis6-Ube1BostonBiochem、5μMの組み換え型ヒトUbcH5cBostonBiochem、1μMの組み換え型ヒトHis6-MuRF1BostonBiochem、100μMの組み換え型ヒトユビキチンBostonBiochem、20mMのトリスpH7.5、20mMのKCl、5mMのMgCl2、2mMのアデノシン三リン酸ATP、及び1mMのDTTにより、37°Cで1.5時間行った。抗体の特異性を調べるために、反応は、野生型ユビキチン並びにK11結合鎖の形成を阻止するK11R変異体ユビキチンの両方で行われた。各反応物の6マイクロリッターが、4M、2M、1M、0.5M、又は0Mの尿素を含有する免疫沈降緩衝液20mMのトリスpH7.5、135mMのNaCl、1のトリトンX-100、10のグリセロール、1mMのEDTA、1.5mMのMgCl2により100倍に希釈された。各免疫沈降反応物は、50μLのプロテインAダイナビーズDynabeadインビトロジェンで、25°Cで1時間回転させて、前もって除去された。ビーズは磁石で捕捉され、上清を新しいチューブに移した。2A3/2E6IgGの20マイクログラムを、各免疫沈降に追加し、回転しながら25°Cで一晩インキュベートした。翌日、IgGを、免疫沈降あたりプロテインAダイナビーズDynabeadsを100μLで、回転しながら15分間25°Cでインキュベートすることにより捕捉した。ビーズが捕捉され、尿素の適切な量を含む溶解緩衝液1mLで3回洗浄し、その後PBSの1mLで2回洗浄し、各洗浄の間に捕捉した。最後の洗浄中にビーズを新しいチューブに移した。免疫沈降物質は、ビーズを還元剤を含む1×LDSサンプル緩衝液インビトロジェンの20μLに再懸濁し、70°Cで10分間インキュベートすることにより溶出した。各インプット反応の10と免疫沈降物質の100が、MES緩衝液中インビトロジェン還元条件下、4-12のビストリスNuPAGE1.0mmゲルインビトロジェン上で泳動した。ウェスタンブロットをパンユビキチンP4D1抗体により上記のように行った。結果は、尿素の全試験濃度において、野生型ユビキチンが自己ユビキチン化反応に使用された場合に、2A3/2E6抗体は自己ユビキチン化MuRF1を免疫沈降することが可能であることを示していた図8A及び8B。更に、インプットレーンに存在する残りのモノユビキチンの免疫沈降は見られなかった。K11R変異体ユビキチンが用いられる場合、それはK11結合型ポリユビキチン鎖を生成するMuRF1の能力をブロックするが、自己ユビキチン化はなおK48結合鎖及びK63結合鎖を生成する。従って、2A3/2E6IgGがK11結合鎖に特異的である場合、K11R変異体ユビキチンが用いられると自己ユビキチン化MuRF1の免疫沈降は観察されるべきではないことが期待されよう。実際に、4Mの尿素の存在下で免疫沈降が行われた場合にはそうであり、2A3/2E6IgGはそうした条件下でK11結合鎖に高度に特異的であることを示している図8C。この特異性は尿素濃度を2Mに減らすと失われた。これは実施例3Aに示されたELISAにおいて4Mの尿素で見られた特異性の増大、並びにK48結合及びK63結合に対して生成された他のユビキチン結合特異的抗体による免疫沈降における4M尿素下で見られた特異性に一致している例えば、米国特許出願公開第20070218069号に記載の抗体を参照。免疫沈降におけるIgGの特異性を更に探索するために、四つのMuRF1自己ユビキチン化反応が、上記の組換えヒト野生型ユビキチン、K11R変異体ユビキチン、K48R変異体ユビキチン、及びK63R変異体ユビキチンBostonBiochemを用いて行われた。アルギニン変異体へのリジンの使用は、ポリユビキチン結合がそれらの特定のリジンを介して形成されるのを防ぐ。4つの反応が、その後分割され、同等部分が2A3/2E6IgG、及びユビキチンのいかなる型にも特異的に結合しないヒトカッパIgG1アイソタイプコントロール抗体ジェネンテックにより免疫沈降に供された。各自己ユビキチン化反応からのインプット物質、並びに各免疫沈降サンプルが、上記のように、クーマシー染色での並列SDS-PAGEゲル及びパンユビキチンP4D1抗体によるウエスタンブロット解析により分離された。図8Dに示されるように、2A3/2E6IgGはK11結合鎖が存在するときのみ野生型ユビキチン、K48Rユビキチン、又は変異体K63Rユビキチンを使用した場合、自己ユビキチン化MuRF1を免疫沈降することができた。K11R変異体ユビキチンを用いた場合、MuRF1はK11結合鎖を構築することができず下の質量分析の確認を参照、2A3/2E6IgGは、これらの条件下で自己ユビキチン化MuRF1の何れも免疫沈降することができなかった。これに対して、アイソタイプコントロール抗体は、4つの自己ユビキチン化反応の何れかに由来する自己ユビキチン化MuRF1の何れをも免疫沈降することができなかった。パンユビキチンウェスタンブロットシグナルによって導かれ、質量分析が高分子量のゲル領域上>188kDaで行われた。簡単に説明すると、この領域に対応するゲルの部分を切り出し、ゲル内トリプシン消化を行った。ゲル片を50mMアンモニウム重炭酸塩/50メタノールを用いて脱色され、その後アセトニトリルACNで乾燥した。トリプシンの効果的な取り込みを可能にするために、ゲル片を50mM重炭酸アンモニウム/10のACNで希釈した20ng/μLの修飾化シクエンスグレードトリプシンPromegaを用いて氷上で2時間インキュベートした。消化は、37°Cで一晩行い、50ACN/5ギ酸FAの添加により停止した。同位体標識内部標準ペプチド1pmolを、抽出の2ラウンド前に各試料に添加した。抽出されたペプチドは完全に乾燥させ、質量分析の少なくとも30分前に10ACN/5FA/0.01過酸化水素水に再懸濁した。サンプルはサーモAQUASILC18カラム2.1×150mm上に直接ロードされ、5から90緩衝液B98ACN/0.1のFAの26分間の勾配に対して200μL/分の流量で、Agilent1200キャピラリLCを用いて分離した。質量分析検出は、ユビキチンの配列を網羅する標識ペプチド及び非標識ペプチドの両方を検出するため、セグメント化されたマルチプルリアクションモニタリングMRM法を用いてABI4000QTRAP上で行った。定量は、ABIMultiquant1.1ソフトウェアを使用して、各ペプチドの標識版及び非標識版の間のピーク面積を比較することによって行った。野生型ユビキチンの反応からのインプットサンプルはK11結合型ポリユビキチン鎖、K48結合型ポリユビキチン鎖、およびK63結合型ポリユビキチン鎖の混合物を示したが、一方、ユビキチン変異体K11R、K48R、K63Rとの反応は、K11結合、K48結合、及びK63結合が欠損していた図8E。野生型ユビキチンを用いた反応からの2A3/2E6IgG抗体によって免疫沈降したサンプルでは、ポリユビキチンリン結合プロファイルは、インプット物質と同様に推移し図8E参照、基質分子の大半は3つの主要な結合K11、K48及びK63のそれぞれを運ぶことを示唆している。同様の結果は、抗K48及び抗K63結合特異的抗体の特性評価の間に得られたNewtonKetal2008Cell134668678。K48R及びK63R変異体ユビキチン反応からの2A3/2E6IgG抗体を用いた免疫沈降は、対応するインプットに類似したポリユビキチン結合プロファイルにより自己ユビキチン化MuRF1をプルダウンした。これとは対照的に、2A3/2E6IgGは標的結合の欠如のため、K11R変異体ユビキチン反応からのユビキチンを免疫沈降できなかった。これは2A3/2E6IgGが免疫沈降においてK11結合鎖に高度に特異的であることを示している。予想されたように、アイソタイプコントロール抗体は、4つの反応のいずれかからもユビキチンをプルダウンすることができなかった。D.細胞溶解液からの免疫沈降2A3/2E6IgGはまた、全細胞溶解物からのK11結合型ポリユビキチン鎖を免疫沈降する能力について試験された。293T細胞を、10のウシ胎児血清FBSと2mMのL-グルタミンを補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地DMEMで増殖した。細胞は、ヒト野生型ユビキチン、K0変異体ユビキチン全7つのリジンはアルギニンに変異させたを過剰発現するプラスミドでトランスフェクトしたか、又は模擬トランスフェクトした図9A。トランスフェクションは、25μgのDNA、5つの10cmプレート当たりリポフェクタミン2000Invitrogenを75μL用いて、製造者の指示に従って行った。トランスフェクション後四十八時間で細胞を回収し、上記のように溶解した。各溶解物の総タンパク質濃度は、8M尿素中に10mg/mlに調整した。次に溶解物は、免疫沈降IP緩衝液20mMトリス、pH7.5、135mMのNaCl、1トリトンX-100、10グリセロール、1mMのEDTA、1.5mMのMgCl2で4Mの尿素へ希釈され、5mg/mLの全タンパク質濃度を得た。体積1mLの全タンパク質の5mgが、免疫沈降反応ごとに使用された。2A3/2E6IgGで行われた免疫沈降に加えて、ユビキチンの何れの型ジェネンテックにも結合しない、ヒトカッパIgG1アイソタイプコントロール抗体も使用した。各免疫沈降反応物は、プロテインAダイナビーズインビトロジェンの100μLにより、2時間25°Cで回転しながら前もって除去され、その後沈殿した物質を除去するために2分間14,000rpmで遠心分離した。ビーズは磁石で捕捉され、上清を新しいチューブに移した。2A3/2E6又はコントロールIgGの40μgを、各免疫沈降に追加し、回転しながら25°Cで一晩インキュベートした。翌日、IgGを、免疫沈降あたりプロテインAダイナビーズDynabeadsを200μLで、回転しながら15分間25°Cでインキュベートすることにより捕捉した。ビーズが捕捉され4M尿素免疫沈降緩衝液4M尿素、20mMトリス、pH7.5,135mMのNaCl,1TritonX-100,10グリセロール、1mMのEDTA,1.5mMのMgCl2の1mLで5回洗浄され、その後PBSを1mLで5回洗浄され、各洗浄の間に捕捉された。最後の洗浄中にビーズを新しいチューブに移した。免疫沈降物質は、ビーズを還元剤を含む1×LDSサンプル緩衝液インビトロジェンの15μLに再懸濁し、70°Cで10分間インキュベートすることにより溶出した。ウエスタンブロット解析のため、5mg/mLの全細胞溶解物インプットの0.1、及び免疫沈降物質の10が、MES緩衝液中インビトロジェン還元条件下、4-12のビストリスNuPAGE1.0mmゲルインビトロジェン上で泳動した。ウェスタンブロットをパンユビキチンP4D1抗体を用いて上記のように行った。質量分析のため、5mg/mLの全細胞溶解物インプットの10、及び免疫沈降物質の90が、MES緩衝液中インビトロジェン還元条件下、4-12のビストリスNuPAGE1.0mmゲルインビトロジェン上で泳動した。ゲルはSimplyBlue染色Invitrogenを用いて染色した。疑似トランスフェクトされた溶解物において、比較的少量のポリユビキチンが存在しており、2A3/2E6により免疫沈降した図9A。野生型ユビキチンを過剰発現させた場合、全細胞溶解液中のポリユビキチン鎖が、2A3/2E6によってプルダウンされたポリユビキチン鎖と共に大幅に増加しており、K11結合型ポリユビキチン鎖が、ユビキチンの過剰発現によって上方制御されることが示唆された。驚くべきことに、K0変異体ユビキチン全てのリジン残基をアルギニンに変異させており、従って、イソペプチド結合を含むポリユビキチン鎖を形成することが出来ないが過剰発現しているときは、ポリユビキチン鎖はまた、高度に上方制御される。これはK0の過剰発現が、内因性ユビキチンを含むユビキチン鎖の合成を増加へと導くことを示唆している。2A3/2E6がそれらを免疫沈降することができたので、これらの鎖の大部分はK11にリンクされていたに違いない。確かにその通りであったかどうかを判断するため、ゲル片を50mM重炭酸アンモニウム/10のACNで希釈した20ng/μLの修飾化シークエンスグレードトリプシンPromegaで45分間氷上でインキュベートし、その後トリプシン溶液が除去され、37°Cでの一晩の消化に先立って50mM重炭酸アンモニウム/5ACNで置換されたことを除いて、上記のように、質量分光光度法的分析を行った。>188kDaに対応するクーマシー染色されたポリアクリルアミドゲルからの二つの分子量領域を分析した図9B及び9C。これらのサンプルの定量分析は、インプット溶解物に存在するK11結合の割合に比べて免疫沈降におけるK11結合の濃縮を示していた図9C及び9D。K48結合及びK63結合の有意なレベルの検出は、個々の基質は、異種混在結合鎖として、又は恐らくは別の基質のリジン上の均質鎖としての何れかで、異なる結合のユビキチン鎖を一般的に運ぶことが示唆された。アイソタイプコントロールAbを用いて行った免疫沈降は、全ての場合で無視できる量の鎖のユビキチンを明らかにしデータ非表示、図9Aのウェスタンブロットの結果と一致する。前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。"