"生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンFc領域および非ペプチド性重合体からなり、該生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンFc領域が前記非ペプチド性重合体を介して共有的に連結された、蛋白質結合体ただし、該蛋白質結合体は、単一宿主を使用して製造された融合蛋白質でない。。非ペプチド性重合体が、その両末端で反応基を介して生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンFc領域とそれぞれ共有結合によって連結されるものである、請求項1に記載の蛋白質結合体。免疫グロブリンFc領域が非糖鎖化されたものである、請求項1に記載の蛋白質結合体。免疫グロブリンFc領域が、CH1、CH2、CH3およびCH4ドメインよりなる群から選択される1~4個のドメインから構成されるものである、請求項1に記載の蛋白質結合体。免疫グロブリンFc領域がヒンジ領域をさらに含む請求項4に記載の蛋白質結合体。免疫グロブリンFc領域が、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドのFc領域よりなる群から選択される請求項1に記載の蛋白質結合体。免疫グロブリンFc領域が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドのFc領域よりなる群より選択される請求項6に記載の蛋白質結合体。免疫グロブリンFc領域がIgG4Fc領域である請求項7に記載の蛋白質結合体。免疫グロブリンFc領域が、ヒト非糖鎖化IgG4Fc領域である請求項8に記載の蛋白質結合体。非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体よりなる群から選択される請求項2に記載の蛋白質結合体。スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートである請求項10に記載の蛋白質結合体。非ペプチド性重合体がその両末端に反応基として反応性アルデヒド基を持つ請求項11に記載の蛋白質結合体。非ペプチド性重合体のその各末端で免疫グロブリンFc領域と生理活性ポリペプチドのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基の遊離反応基に連結される請求項1記載の蛋白質結合体。非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される請求項1に記載の蛋白質結合体。非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである請求項14に記載の蛋白質結合体。生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造蛋白質、リガンド蛋白質および受容体よりなる群から選択される請求項1に記載の蛋白質結合体。生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカゴン様ペプチド類、Gプロテイン関連受容体、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合蛋白質類、サイトカイン結合蛋白質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、B細胞因子、T細胞因子、プロテインA、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ-1アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポ蛋白質-E、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子VII、VIIa、VIII、IX、XIII、プラズミノゲン活性因子、フィブリン-結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、プロテインC、C-反応性蛋白質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体よび抗体領域類よりなる群から選択される請求項16に記載の蛋白質結合体。生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、インターフェロン-アルファ、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子およびFab’抗体領域である請求項17に記載の蛋白質結合体。請求項1に記載の蛋白質結合体を製造する方法であって、aa1活性化された非ペプチド性重合体の一方の末端に免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドを共有結合によって連結する段階と、a2反応混合物から非ペプチド性重合体と連結された免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドを含む連結体を分離する段階と、a3分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドを共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域および生理活性ポリペプチドと結合した蛋白質結合体を生成する段階と、b上記蛋白質結合体を分離する段階と、を含み、上記段階a1において、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の反応モル比が1:2.5~1:5であるか、または、免疫グロブリンFc領域と非ペプチド性重合体の反応モル比が1:5~1:10であり、上記段階a3において、段階a2で収得された連結体:免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応モル比が1:0.5~1:20である製造方法。段階a1および段階a3の反応が還元剤の存在下で行われる請求項19に記載の製造方法。前記還元剤が、NaCNBH3、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミン硼酸塩またはピリジン硼酸塩よりなる群から選択される請求項20に記載の製造方法。段階a1および段階a2で免疫グロブリンFc領域が原核細胞宿主を使用して製造した組換え型免疫グロブリンFc領域であり、生理活性ポリペプチドが真核細胞宿主を使用して製造した組換え型生理活性ポリペプチドである請求項19に記載の製造方法。段階a1および段階a2で免疫グロブリンFc領域が非糖鎖化されたものであり、生理活性ポリペプチドが糖鎖化されたものである請求項19に記載の製造方法。このように生理活性蛋白質に高分子を結合させる様々な方法が試みられてきたが、既存の方法は、ポリペプチドの安定性を高めると、活性が著しく減少し、あるいは安定性とは関係なく活性のみを増加させる方法であって、修飾による蛋白質薬物の活性減少を最小化し且つ安定性の向上を達成する方法の開発が依然として要求されている。そこで、本発明者は、従来では同時に達成し難いものと思われてきた活性減少の最小化と安定性の増加を同時に成し遂げる持続性蛋白質薬物製剤を開発するために研究を行い続けた結果、免疫グロブリンFc領域、非ペプチド性重合体および生理活性ポリペプチドを互いに共有結合によって連結させて製造した蛋白質結合体が、生理活性蛋白質の血中半減期を画期的に増加させ、公知の蛋白質薬物に比べて高い力価を維持することを確認することにより、本発明を完成した。したがって、本発明の目的は、免疫反応を誘発することなく、生理活性ポリペプチドの活性減少を最小化し且つ血中半減期を延長させる蛋白質結合体およびその製造方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は、血中半減期が延長された前記蛋白質結合体を有効成分とする持続性蛋白質薬物製剤を提供することにある。また、本発明の別の目的は、生理活性ポリペプチドの活性減少を最小化し且つ血中半減期を増加させ、安全性および生理活性の持続性を増進させる方法を提供することにある。実施例1インターフェロンアルファIFNα-PEG-免疫グロブリンFc領域Fc結合体の製造I段階1免疫グロブリンを用いた免疫グロブリンFc領域の製造免疫グロブリンFc領域を製造するために、10mMのリン酸塩緩衝液に溶解された分子量150kDaの免疫グロブリンGImmunoglobulinG;IgG、緑十字200mgに蛋白質加水分解酵素パパインPapain、Sigma社を2mg処理して37°Cで2時間徐々に攪拌しながら反応させた。酵素反応後、生成された免疫グロブリンFc領域を精製するために、Superdexカラム、プロテインAカラムおよび陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィを順次行った。具体的に、反応液を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液PBS、pH7.3で平衡化させたSuperdex200カラムSuperdex200、Pharmacia社に滴下し、同一の緩衝液を用いて流速1mL/分で溶出させた。免疫グロブリンFc領域より分子量が相対的に大きい未反応免疫グロブリンIgGとFab’2などは早く溶出するので、これを先に除去した。免疫グロブリンFc領域と類似の分子量を持つFabは、次のようにプロテインAカラムクロマトグラフィを行って除去した図1。20mMのリン酸塩緩衝液pH7.0で平衡化させたプロテインAカラムPharmacia社にSuperdex200カラムから溶出した免疫グロブリンFc領域含有分画を5mL/分の流速で負荷した後、カラムに結合していない蛋白質を除去するために同一の緩衝液で十分洗浄した。ここに100mMのクエン酸ナトリウムNacitrate、pH3.0緩衝液を流して高純度の免疫グロブリンFc領域を溶出させた。プロテインAカラムで精製されたFc分画を最後に陽イオン交換樹脂カラムpolyCA、PolyLC社を用いて精製したが、10mMの酢酸塩緩衝液pH4.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.4M法によって溶出して高純度のFc分画を得、これを12SDS-PAGE上で確認した図2のレーン2。段階2IFNα-PEG連結体の製造両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量3.4kDaのポリエチレングリコールALD-PEG-ALDShearwater社を、ヒトインターフェロンアルファ-2bhIFNα-2b、分子量20kDaが5mg/mLの濃度で溶解された100mMのリン酸塩緩衝液にIFNα:PEGのモル比が1:1、1:2.5、1:5、1:10および1:20となるように添加した。ここに還元剤のナトリウムシアノボロハイドライドNaCNBH3、Sigma社を最終濃度が20mMとなるように添加し、4°Cで徐々に攪拌しながら3時間反応させた。インターフェロンアルファのアミノ末端部位に選択的にPEGが連結され、PEGとインターフェロンアルファが1:1で結合した連結体を得るために、前記反応混合物をSuperdexSuperdexR、Pharmacia社サイズ排除クロマトグラフィにかけた。溶出液として10mMのリン酸カリウム緩衝液pH60を用いてIFNα-PEG連結体を精製し、PEGと結合していないインターフェロンアルファ、未反応PEGおよび2つのインターフェロンアルファがPEGと連結された二量体副産物を除去した。精製されたIFNα-PEG連結体を5mg/mLの濃度に濃縮した。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないIFNα:PEGの最適反応モル比は1:2.5~1:5であることを確認した。段階3IFNα-PEG-Fc結合体の形成前記段階2で精製されたIFNα-PEG連結体に免疫グロブリンFc領域のN末端に結合させるために、段階1で準備された免疫グロブリンFc領域約53kDaを10mMのリン酸塩緩衝液に溶解させた後、IFNα-PEG連結体:Fcのモル比がそれぞれ1:1、1:2、1:4および1:8となるように、IFNα-PEG連結体と混合して反応させた。反応液を100mMのリン酸塩緩衝液状態に作り、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで20時間徐々に攪拌しながら反応させた。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないIFNα-PEG連結体:Fcの最適反応モル比は1:2であることを確認した。段階4IFNα-PEG-Fc結合体の分離および精製前記段階3の結合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体を精製するためにSuperdexサイズ排除クロマトグラフィを行った。反応混合物を濃縮した後、10mMのリン酸塩緩衝液pH7.3を用いて流速2.5mL/分でカラムに通過させ、結合していないFcおよび未反応物質を除去し、IFNα-PEG-Fc蛋白質結合体分画を得た。得られたIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体分画には不純物として少量の未反応Fcおよびインターフェロンアルファ二量体が混在しているから、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。IFNα-PEG-Fc蛋白質結合体分画を10mMの酢酸ナトリウムpH4.5で平衡化させたPolyCATLPカラムPolyLC社に仕込み、1Mの塩化ナトリウムNaClを含む10mMの酢酸ナトリウムpH4.5緩衝液を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.5M法で溶出してさらに精製した。最後に、陰イオン交換カラムを用いてIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体を純粋に獲得した。PolyWAXLPカラムPolyLC社を10mMのTris-HClpH7.5緩衝液で平衡化させた後、精製されたIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体分画を負荷し、1Mの塩化ナトリウムを含む10mMのTris-HClpH7.5緩衝液を直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.3M方法で流して純粋なIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体を精製した。実施例2IFNα-PEG-Fc結合体の製造II段階1Fc-PEG連結体の製造両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量3.4kDaのポリエチレングリコールALD-PEG-ALDShearwater社を、前記実施例1の段階1で準備された免疫グロブリンFc領域が15mg/mLの濃度で溶解された100mMのリン酸塩緩衝液に免疫グロブリンFc:PEGのモル比がそれぞれ1:1、1:2.5、1:5、1:10および1:20となるように添加した。還元剤のNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで徐々に攪拌しながら3時間反応させた。免疫グロブリンFc領域のアミノ末端部位に選択的にPEG:Fcが1:1で結合した連結体を得るために、前記反応混合物を持ってSuperdexSuperdexR、Pharmacia社サイズ排除クロマトグラフィを行った。溶出液として10mMのリン酸カリウム緩衝液pH60を用いてFc-PEG連結体を精製し、PEGと結合していない免疫グロブリンFc領域、未反応PEGおよび2つの免疫グロブリンFc領域がPEGに連結された二量体副産物を除去した。精製されたFc-PEG連結体を約15mg/mLの濃度で濃縮した。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないFc:PEGの最適反応モル比は1:3~1:10であることを確認した。段階2Fc-PEG連結体とインターフェロンアルファの結合体の形成および精製前記段階1で精製されたFc-PEG連結体をIFNαのN末端に結合させるために、10mMのリン酸塩緩衝液に溶解されたインターフェロンアルファを使用し、Fc-PEG連結体:IFNαのモル比がそれぞれ1:1、1:1.5、1:3および1:6となるように添加して反応させた。反応液を100mMのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで20時間徐々に攪拌しながら反応させた。反応後、実施例1の段階4と同一の方法で精製して未反応物質および副産物を除去し、これから生成されたFc-PEG-IFNα蛋白質結合体を純粋に分離した。実施例3ヒト成長ホルモンhGH-PEG-Fc結合体の製造インターフェロンアルファの代わりにヒト成長ホルモンhGH、分子量22kDaを使用し、hGH:PEGのモル比を1:5とする以外は、実施例1と同一の方法でhGH-PEG-Fc蛋白質結合体を製造および精製した。実施例4ヒト顆粒球コロニー刺激因子G-CSF-PEG-Fc結合体の製造インターフェロンアルファの代わりにヒト顆粒球コロニー刺激因子G-CSFを使用し、G-CSF:PEGのモル比を1:5とする以外は、実施例1と同一の方法でG-CSF-PEG-Fc蛋白質結合体を製造および精製した。一方、天然型G-CSFの17番目のアミノ酸がセリンで置換された誘導体17S-G-CSFを用いて前記と同一の方法で17S-G-CSF-PEG-Fc蛋白質結合体を製造および精製した。実施例5ヒト赤血球生成因子EPO-PEG-Fc結合体の製造インターフェロンアルファの代わりにヒト赤血球生成因子Erythropoietin;EPOを使用し、EPO:PEGのモル比を1:5とする以外は、実施例1と同一の方法でEPO-PEG-Fc蛋白質結合体を製造および精製した。実施例6反応基の種類を異にするPEGを用いた蛋白質結合体の製造両末端の反応基が全てスクシンイミジルプロピオネートSuccinimidylpropionate;SPAであるPEGを用いてIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体を次のように製造した。インターフェロンアルファ10mgが溶解された100mMのリン酸塩緩衝液に、両末端にSPA反応基を持つ分子量3.4kDaのポリエチレングリコールSPA-PEG-SPAShearwater社をIFNα:PEGのモル比がそれぞれ1:1、1:2.5、1:5、1:10および1:20となるように添加し、常温で徐々に攪拌しながら2時間反応させた。インターフェロンアルファのリジン残基のアミノ基部位に選択的にPEGが1:1で結合したPEG-IFNα連結体を得るために、反応混合物をもってSuperdexサイズ排除クロマトグラフィを行った。溶出液として10mMのリン酸カリウム緩衝液pH60を用いてIFNα-PEG連結体を精製し、PEGと結合していないインターフェロンアルファ、未反応PEG、およびPEGの両末端に2つのインターフェロンアルファが連結された二量体副産物を除去した。IFNα-PEG連結体を免疫グロブリンFcのリジン残基のアミノ基部位に融合させるために精製されたIFNα-PEG連結体を約5mg/mLの濃度で濃縮した後、実施例1の段階3および4と同一の方法でIFNα-PEG-Fc結合体を製造および精製した。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないインターフェロンアルファ:PEGの最適反応モル比は1:2.5~1:5であることを確認した。一方、前記と同一の方法を行うが、両末端の反応基が全てN-ヒドロキシスクシンイミジルNhydroxysuccinimidyl;NHSであるPEGNHS-PEG-NHS;Shearwater社、または両末端の反応基が全てブチルアルデヒドであるPEGBUA-PEG-BUA;Shearwater社を用いてIFNα-PEG-Fc結合体の生成を確認した。実施例7分子量の異なるPEGを用いた蛋白質結合体の製造両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量10kDaのポリエチレングリコールALD-PEG-ALDShearwater社を用いて実施例1の段階2と同一の方法でIFNα-10KPEG連結体を製造および精製した。この際、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないインターフェロンアルファ:10KPEGの最適モル比は、1:2.5~1:5であることが確認された。精製されたIFNα-PEG連結体を約5mg/mLとなるように濃縮した後、これを用いて実施例1の段階3および4と同一の方法でIFNα-10KPEG-Fc蛋白質結合体を製造および精製した。実施例8Fab’-S-PEG-N-Fc結合体の製造-SH基段階1Fab’の発現および精製抗腫瘍壊死因子-アルファFab’を発現する大腸菌形質転換体BL21/poDLHF寄託番号:KCCM-10511をLB培地100mLに接種して一晩中振盪培養した後、5Lの発酵器Marubishiに接種して温度30°C、空気投入量20vvm、攪拌速度500rpmの条件下で培養した。発酵が進むにつれて、微生物の成長のために足りないエネルギー源を補うために、葡萄糖と酵母抽出液とを微生物の発酵状態に応じて投与し、吸光度600nmでのOD値が80となる時期にIPTGを投与して蛋白質の発現を誘導した。これを40~45時間高濃度で培養して吸光度600nmでのOD値が120~140となるようにした。得られた発酵液を遠心分離20,000g、30分して沈殿物は捨て、上澄み液のみを取った。得られた上澄み液から次の3段階のカラムクロマトグラフィを経て抗腫瘍壊死因子-アルファFab’を純粋に精製した。20mMのリン酸塩緩衝液pH7.0で平衡化させたHiTrapプロテインGカラム5mL、Pharmacia社に前記上澄み液を滴下した後、100mMのグリシンGlycine、pH3.0緩衝液で溶出させた。溶出したFab’分画を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.3で平衡化させたSuperdex200カラムSuperdex200Pharmacia社に滴下し、同一の緩衝液で溶出させた。溶出したFab’分画をpolyCAT21×250カラムPolyLC社を用いて最終精製したが、10mMの酢酸塩緩衝液pH4.5を直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.4M方法で流して純粋な抗腫瘍壊死因子-アルファFab’分画を得た。段階2Fc-PEG連結体の製造および精製免疫グロブリンFcのN末端のアミノ基にリンカーPEGを結合させるために、前記実施例1の段階1と同一の方法で製造された免疫グロブリンFcを100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0に5mg/mLの濃度で溶解させ、ここにNHS-PEG-MAL3.4kDa、Shearwater社をFc:PEGのモル比が1:10となるように添加した後、4°Cで徐々に攪拌しながら12時間反応させた。反応終了後、反応緩衝液を20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0で交換しながら、反応していないNHS-PEG-MALを除去した。緩衝液の交換後、反応物をpolyCATカラムPolyLC社に負荷し、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0を直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.5M方法で流して免疫グロブリンFc-PEG連結体を先に溶出させて得た後、反応していない免疫グロブリンFcを溶出させて除去した。段階3Fab’-S-PEG-N-Fc結合体-SH基の製造および精製Fab’の遊離システイン基に免疫グロブリンFc-PEG連結体を結合させるために、段階1で精製されたFab’を100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.3に2mg/mLで溶解させた後、同一の緩衝液に段階2で準備された免疫グロブリンFc-PEG連結体をFab’:連結体のモル比が1:5となるように入れた。最終蛋白質の濃度が50mg/mLとなるように濃縮し、4°Cで徐々に攪拌しながら24時間反応させた。カップリング反応の終了後、反応液を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.3で平衡化させたSuperdex200カラムSuperdex200、Pharmacia社に滴下し、同一の緩衝液を1mL/分の流速で流して溶出させた。カップリングされたFab’-S-PEG-N-Fc結合体は、分子量が大きくて先に溶出し、反応していない免疫グロブリンFc-PEG連結体およびFab’は後で溶出するため除去することができた。残存する未反応免疫グロブリンFcを完全に除去するために、溶出したFab’-S-PEG-N-Fc結合体分画をさらにpolyCAT21×250カラムPolyLC社に滴下し、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.5M法で溶出し、Fc-PEG連結体がFab’のC末端付近の-SH基に連結されたFab’-S-PEG-N-Fc結合体を純粋に得た。実施例9Fab’-N-PEG-N-Fc結合体の製造N末端段階1Fab’-PEG連結体N末端の製造および精製前記実施例8の段階1で得た、精製されたFab’40mgを100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0に5mg/mLの濃度で溶解させた後、ブチルALD-PEG-ブチルALD3.4kDa、Nektar社をFab’:PEGのモル比が1:5となるように添加した。還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで徐々に攪拌しがら2時間反応させた。反応終了後、反応緩衝液を20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0で交換した。緩衝液の交換後、反応物をpolyCATカラムPolyLC社に負荷し、20mMの酢酸塩緩衝液pH4.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.4M法で溶出し、Fab’のN末端にリンカーPEGが結合したFab’-PEG連結体分画を先に溶出させて得た後、反応していないFab’を溶出させて除去した。段階2Fab’-N-PEG-N-Fc結合体の製造および精製段階1で精製されたFab’-PEG連結体を免疫グロブリンFcのN末端に結合させるために、100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0に10mg/mLで溶解させた後、同一の緩衝液に溶解された免疫グロブリンFcをFab’-PEG連結体:Fcのモル比が1:5となるように入れた。最終蛋白質の濃度が50mg/mLとなるように濃縮し、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで徐々に攪拌しながら24時間反応させた。カップリング反応の終了後、反応液を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.3で平衡化させたSuperdex200カラムSuperdex200、Pharmacia社に滴下し、同一の緩衝液を1mL/分の流速で流して溶出させた。カップリングされたFab’-N-PEG-N-Fc結合体は、分子量が大きくて先に溶出し、反応していない免疫グロブリンFcおよびFab’-PEG連結体は後で溶出するため除去することができた。残存する未反応免疫グロブリンFcを完全に除去するために、溶出したFab’-N-PEG-N-Fc結合体分画をさらにpolyCAT21×250カラムPolyLC社に負荷し、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.5M法で溶出し、免疫グロブリンFc-PEG連結体がFab’のN末端に連結されたFab’-N-PEG-N-Fc結合体を純粋に得た。実施例10脱糖鎖化免疫グロブリンFcの製造および精製前記実施例1と同一の方法で製造した免疫グロブリンFc200mgを100mMのリン酸塩緩衝液pH7.5に2mg/mLの濃度となるように調製した後、脱糖鎖化酵素PNGaseFNEB社を300U/mgとなるように添加した。反応混合物を37°Cで24時間徐々に攪拌しながら反応させた。反応終了後、脱糖鎖化免疫グロブリンFcを精製するために、反応物をSPセファロースFFカラムPharmacia社に負荷し、10mMの酢酸塩緩衝液pH4.5条件で1MのNaClを使用した直線濃度勾配0.1M→0.6M法で溶出させ、天然型免疫グロブリンFc分画を先に溶出させた後、脱糖鎖化免疫グロブリンFcdeglycosylatedFC:DGFcを溶出させて得た。実施例11IFNα-PEG-DGFc結合体の製造前記実施例1の段階2で精製されたIFNα-PEG連結体に、前記実施例10で製造された脱糖鎖化免疫グロブリンFcを結合させるために、IFNα-PEG連結体を10mMのリン酸塩緩衝液に溶解されたDGFcにIFNα-PEG連結体:DGFcのモル比がそれぞれ1:1、1:2、1:4および1:8となるように添加して反応させた。反応液を100mMのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで20時間徐々に攪拌しながら反応させた。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないIFNα-PEG連結体:DGFcの最適反応モル比は1:2であることを確認した。結合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたIFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体を精製するために、反応混合物を用いてSuperdexSuperdexR、Pharmacia社サイズ排除クロマトグラフィを行った。リン酸塩緩衝液pH7.3を用いて流速2.5mL/分でカラムに通過させ、結合していないDGFcおよび未反応物質を除去し、IFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体分画を精製した。これから得られたIFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体分画には、不純物として少量の未反応DGFcおよびIFNα-PEG連結体が混在しているから、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。IFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体分画を10mMの酢酸ナトリウムpH4.5で平衡化させたPolyCATLPカラムPolyLC社に仕込み、1MのNaClを含んだ10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.6M法で溶出してさらに精製し、最後に陰イオン交換カラムを用いてIFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体を純粋に獲得した。PolyWAXLPカラムPolyLC社を10mMのTris-HCl緩衝液pH7.5で平衡化させた後、精製されたIFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体分画を負荷し、1Mの塩化ナトリウムを含んだ10mMのTris-HCl緩衝液pH7.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.3M法で溶出して純粋なIFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体を精製した。実施例12組み換え非糖鎖化免疫グロブリンFc誘導体の製造および精製IgG4Fc誘導体1発現ベクターの製造ヒト免疫グロブリンIgG4重鎖不変領域を製造するために、天然型ヒンジ領域でアミノ末端から9個のアミノ酸が除去された誘導体1IgG4delta-Cysと、12個のアミノ酸が全て除去されてヒンジ領域が欠失された誘導体2IgG4単量体を製造した。大腸菌分泌配列を含んだ発現ベクターは、本発明者によって開発されたpT14S1SH-4T20V22Q大韓民国特許第38061号を使用した。ヒト免疫グロブリンIgG4の重鎖不変領域を製作するために、ヒトの血液から収得した血球細胞のRNAを鋳型として次のようなRT-PCRを行った。QiampRNAbloodキットQiagen社を用いて約6mLの血液から全体RNAを収得した後、このRNAを鋳型として配列番号1および2、配列番号2と3のプライマー対を合成した後、OneStepRT-PCRキットQiagen社を用いて遺伝子を増幅した。配列番号1は、下記IgG4ヒンジ領域の12個のアミノ酸配列のうち10番目のアミノ酸配列であるセリンから始まる配列であり、配列番号3は、CH2ドメインの一番目のアミノ酸であるアラニンから始まるように設計されている。配列番号2は、終結コドンを含んだBamHI制限酵素認識部位を挿入した。123456789101112gagtccaaatatggtcccccatgcccatcatgcccactcaggtttataccagggggtacgggtagtacgggtGluSerLysTyrGlyProProCysProSerCysProそれぞれ増幅されたIgG4不変領域断片を、大腸菌分泌配列誘導体を用いた発現ベクターにクローニングするために、本発明者によって開発された発現ベクターpT14S1SH-4T20V22Q大韓民国特許第38061号を使用した。前記発現ベクターは、配列番号4で表わされる塩基配列を有する熱安定性エンテロトキシン分泌配列誘導体を含む。クローニングを容易にするために、pT14S1SH-4T20V22Qプラスミドの熱安定性エンテロトキシン分泌配列誘導体に配列番号5および6のプライマー対を使用した部位特異的突然変異誘発を行い、分泌配列の最後の遺伝子配列にStuI制限酵素認識部位を挿入し、塩基配列分析法によって正確にStuI制限酵素認識部位が生成されたことを確認した。pT14S1SH-4T20V22QプラスミドにStuI制限酵素認識部位が生成されたプラスミドをpmSTIIと命名した。前記のように製作されたプラスミドpmSTIIにStuI/BamII制限酵素を処理した後、アガロースゲルに電気泳動を行い、大腸菌熱安定性エンテロトキシ分泌配列誘導体を含む大きい断片4.7kbを回収した。前記増幅された遺伝子をBamHI制限酵素で処理した後発現ベクターに挿入してプラスミドpSTIIdCG4FcおよびpSTIIG4Moを製作した。前記製作された発現ベクターを発現宿主の大腸菌BL21DE3に形質転換させて大腸菌形質転換体BL21/pSTIIdCG4FcHM10932とBL21/pSTIIG4MoHM10933を得、これらを韓国微生物保存センターKCCMに2004年9月15日付で寄託した寄託番号:KCCM-10597、KCCM-10598。以後、吸光度600nmでのOD値が80となる時期に誘導物質IPTGを投与して発現を誘導した。これを40~45時間高濃度で培養して吸光度600nmでのOD値が100~120となるようにした。発酵液から回収された大腸菌細胞を破砕して細胞溶血液を得、細胞質内に存在する組み換え免疫グロブリン不変領域誘導体を2段階カラムクロマトグラフィによって精製した。プロテインA親和性カラムproteinAaffinitycolumn、Pharmacia社5mLをPBSで平衡化した後、前記細胞溶血液を5mL/分の流速で負荷した。結合していない分画をPBSで洗浄した後、100mMのクエン酸溶液pH3.0で溶出させた。溶出した分画を脱塩カラムdesaltingcolumn、HiPrep26/10、Pharmacia社を用いて10mMのTris緩衝液pH8.0で交換した。その後、QHP26/10カラムPharmacia社50mLを用いて2次陰イオン交換カラムクロマトグラフィを行い、1次精製された組み換えAGFc誘導体分画を結合させた後、10mMのTris条件pH8.0で直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.2M法によって溶出し、組み換え非糖鎖化免疫グロブリンFcaglycosylatedFc:AGFc誘導体であるIgG4delta-CysおよびIgG4単量体分画を高純度で得た。実施例13IFNα-PEG連結体と組み換えAGFc誘導体の結合体の製造前記実施例1および11と同一の方法により、実施例12で製造されたAGFc誘導体であるIgG4delta-CysのN末端にIFNα-PEG連結体を結合させた。融合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたIFNα-PEG-AGFc蛋白質結合体Iを精製するために、QHP26/10カラムPharmacia社50mLを用いて1次精製した後、高圧カラムのpolyCAT21.5×250カラムPolyLC社で高純度の結合体を精製した。カップリング反応液を脱塩カラムHiPrep26/10Pharmacia社を用いて10mMのTris緩衝液pH8.0で交換した後、QHP26/1050mLカラムに8mL/分の流速で負荷して結合させた後、直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.2M法で所望の分画を得た。溶出した分画を10mMの酢酸塩緩衝液pH5.2で平衡化されたpolyCAT21.5×250カラムに15mL/分の流速でさらに結合させた後、直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.1M→0.3M法で溶出させて高純度の分画を得ることができた。同一の方法により、実施例12で製造された別のAGFc誘導体であるIgG4単量体を用いてIFNα-PEG-AGFc蛋白質結合体IIを製造した。実施例14ヒト赤血球生成因子EPO-PEG-組み換えAGFc誘導体の結合体の製造前記実施例13と同一の方法により、EPO-PEG連結体とAGFc誘導体であるIgG4delta-Cysとが連結された結合体を製造した。比較例1IFNα-40KPEG連結体の製造100mMのリン酸カリウム緩衝液pH6.0にインターフェロンアルファ5mgを溶解して最終体積が5mLとなるように調製した後、PEGの分子量40kDaの活性化メトキシ-PEG-アルデヒドShearwater社をインターフェロンアルファ:40KPEGのモル比が1:4となるように前記溶液に添加した。前記反応溶液に還元剤NaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで18時間徐々に攪拌させながら反応させた。インターフェロンアルファに反応していないPEGを不活性化させるために、エタノールアミンを最終濃度が50mMとなるように添加した。未反応PEGの分離および緩衝液の交替のためにSephadexG-25カラムPharmacia社を用いた。まず、2カラム体積columnvolume;CVの10mMTris-HCl緩衝液pH7.5でカラムを平衡化させた後、反応混合物を滴下し、波長260nmで紫外部吸光計によって吸光度を検出した。前記カラムを同一の緩衝液で溶出させると、大きさが更に大きいPEGでによってN末端に挿入KYM修飾されたインターフェロンアルファが先に溶出し、未反応PEGは時差をおいて後で溶出するため、IFNα-40KPEGのみを分離することができる。前記で得た溶出液からIFNα-40KPEG連結体をさらに純粋に分離、精製するために、次のようにクロマトグラフィを行った。3mLのPolyWAXLPカラムPolywax社を10mMのTris-HCl緩衝液pH7.5で平衡化させた。PEG-IFNα連結体を含有する溶出液を1mL/分の流速でカラムに付加した後、15mLの平衡緩衝液で洗浄した。30mLの1MNaCl緩衝液で30分間0~100の塩濃度勾配方法を用いてトリ-、ジ-およびモノ-PEGが結合したインターフェロンアルファを順序とおりに溶出させた。さらに純粋なモノ-PEG結合インターフェロンアルファを分離するために、前記で収得したモノ-PEGとインターフェロンアルファの連結体溶出分画をもってサイズ排除クロマトグラフィを行った。10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0で平衡化させたSuperdex200Superdex200、Pharmacia社に前記溶出液を濃縮して滴下した後、同一の緩衝液で溶出させた。この際、1mL/分の流速で緩衝液を流した。トリ-およびジ-PEGが結合したインターフェロンアルファは、モノ-PEGが結合したインターフェロンアルファより溶出時間が相対的に早いので、これを除去して、モノ-PEGが結合したインターフェロンアルファのみを純粋に分離した。同一の方法により、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子およびその誘導体のアミノ末端に40KPEGが結合したhGH-40KPEG、G-CSF-40KPEGおよび40KPEG-17S-G-CSF誘導体の連結体を製造した。比較例2IFNα-PEG-アルブミン結合体の製造実施例1の段階2で精製されたIFNαF-PEG連結体をアルブミンのアミノ末端に結合させるために、10mMのリン酸塩緩衝液に溶解されたヒトアルブミンhumanserumalbumin、HSA、約67kDa、緑十字をIFNα-PEG連結体:アルブミンのモル比が1:1、1:2、1:4および1:8となるように添加した後、反応させた。反応液を100mMのリン酸塩緩衝液状態に作り、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで20時間徐々に攪拌しながら反応させた。これより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないIFNα-PEG連結体:アルブミンの最適反応モル比は1:2であることを確認した。結合反応の後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたIFNα-PEG-アルブミン蛋白質結合体を精製するために、Superdexサイズ排除クロマトグラフィを行った。各反応混合物を濃縮した後、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液を2.5mL/分の流速でカラムに通過させ、結合していないアルブミンおよび未反応物質を除去し、IFNα-PEG-アルブミン蛋白質結合体のみを精製した。得られたIFNα-PEG-アルブミン蛋白質結合体分画には、不純物として少量の未反応アルブミンおよびインターフェロンアルファ二量体が混ぜられているので、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。IFNα-PEG-アルブミン蛋白質結合体分画を10mMの酢酸ナトリウム溶液pH4.5で平衡化させたカラムSP5PW、Waters社に仕込み、1Mの塩化ナトリウムNaClを含んだ10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.5M法で溶出してさらに精製し、IFNα-PEG-アルブミン蛋白質結合体を純粋に獲得した。同一の方法により、ヒト成長ホルモン、G-CSFおよびその誘導体にそれぞれアルブミンが結合したhGH-PEG-アルブミン、G-CSF-PEG-アルブミンおよび17S-G-CSF-PEG-アルブミン結合体を製造した。比較例3Fab’-S-40KPEG連結体の製造実施例8の段階1で精製されたFab’に存在する遊離システイン基を活性化させるために、活性化緩衝液20mMの酢酸ナトリウムpH4.0、0.2mMのDTTに1時間放置した。PEG修飾緩衝液である50Mのリン酸カリウムpH6.5で緩衝液を交換した後、マレイミド-PEG分子量40kDa、Shearwater社をFab’:40KPEGのモル比が1:10となるように添加した後、4°Cで徐々に攪拌しながら24時間反応させた。反応終了後、反応液を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.3で平衡化させたSuperdex200カラムSuperdex200、Pharmacia社に滴下し、同一の緩衝液を1mL/分の流速で流して溶出させた。40KPEGが修飾されたFab’-40KPEG連結体は、分子量が大きくて、反応していないFab’より早く溶出し、Fab’は後で溶出するため除去することができた。完全に除去されていないFab’を除去するために、溶出したFab’-40KPEG連結体分画をpolyCAT21×250カラムPolyLC社を用いて最終精製した。20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH4.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.5M法で溶出し、Fab’の-SH基に40KPEGが連結されたFab’-S-40KPEG連結体を純粋に得た。実験例1蛋白質結合体の確認および定量1-1蛋白質結合体の確認前記実施例で製造した蛋白質結合体は、4~20の濃度勾配ゲルおよび12のゲルを用いた非還元性SDS-PAGEおよびELISARDsystem社法で確認した。SDS-PAGE結果、図3に示すように、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体であるPEGおよび免疫グロブリンFc領域のカップリング反応によってIFNα-PEG-Fc結合体A、17Ser-G-CSF-PEG-Fc結合体BおよびEPO-PEG-Fc結合体Cが生成されたことを確認した。また、前記実施例10で製造したDGFcを確認するために非還元性12SDS-PAGEを行った結果、図6bに示すように、天然型Fcに比べて除去された糖鎖分子量だけ減少した位置でDGFcバンドが検出された。1-2蛋白質結合体の定量前記実施例で製造したそれぞれの蛋白質結合体の量は、SuperdexカラムSuperdex7526/60、Pharmacia社と10mMのリン酸カリウム緩衝液pH6.0を溶出液として用いるサイズ排除クロマトグラフィ上でピーク面積を対照区と比較して換算する方法によって計算した。既に定量されているIFNα、hGH、G-CSF、17S-G-CSF、EPOおよびFcでそれぞれサイズ排除クロマトグラフィを行った後、濃度とピーク面積間の換算係数を測定した。各蛋白質結合体の一定量を使用して同一のサイズ排除クロマトグラフィを行い、ここから得られたピーク面積から免疫グロブリンFc領域に該当するピーク面積を差し引いた値を、各蛋白質結合体に存在する生理活性蛋白質の定量値として決定した。図4は精製されたIFNα-PEG-Fc結合体のサイズ排除クロマトグラフィカラム分析結果を示すもので、二量体以上の多量体不純物がない単一ピークを確認した。Fcが生理活性ポリペプチドに結合すると、生理活性ポリペプチドの抗体でその量を定量するとき、抗体と前記ポリペプチドとの結合が阻害され、クロマトグラフィによって計算される実際値より少なく定量される。ELISA分析結果、IFNα-PEG-Fcの場合には、ELISAによって測定された値が大略実際値の約30程度であると確認された。1-3蛋白質結合体の純度および質量確認それぞれの実施例で得た蛋白質結合体に対してサイズ排除クロマトグラフィを行った後、280nmの吸光度を測定した。IFNα-PEG-Fc、hGH-PEG-Fc、G-CSF-PEG-Fcおよび17Ser-G-CSF-PEG-Fcは、分子量70~80kDaの物質の滞留時間帯で単一ピークを示した。一方、実施例1、11および13で獲得した蛋白質結合体IFNα-PEG-Fc、IFNα-PEG-DGFcおよびIFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体試料の純度を分析するために、逆相HPLCを行った。逆相カラムVydac社、259VHP54カラムを用いて分析し、0.5TFAの存在下のアセトニトリル溶媒を用いた濃度勾配40~100法によって溶出した。純度は、280nmの吸収を測定することによって解析された。その結果、図8から分かるように、結合していないインターフェロンまたは免疫グロブリンFcは存在しておらず、IFNα-PEG-Fc結合体A、IFNα-PEG-DGFc結合体BおよびIFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体Cのいずれも96以上の純度で純粋に精製された。各精製された試料の正確な分子量を確認するために、各試料の質量をMALDI-TOFVoyagerDE-STR、AppliedBiosystems社超高速質量分析器を用いて分析した。マトリックスとしてはシナピン酸を使用し、それぞれの試験用試料0.5μLを試料スライドに塗布して自然乾燥させた後、同量のマトリックス溶液を添加し、その後さらに自然乾燥させてイオン源に導入した。検出はポジティブ方式でリニアモードTOF方式の装置を用いて行った。イオンは、遅延したイオン抽出DEを用いる分割抽出供給源で、遅延した抽出時間を750nsec/1500nsecとして、約2.5kVの全体電位差によって加速化した。下記表1は前記実施例で得たそれぞれのFc蛋白質結合体のMLADI-TOF質量分析結果を数値化して示したもので、図5はEPO-PEG-Fc結合体、図7はIFNα-PEG-FcおよびIFNα-PEG-DGFc結合体のMALDI-TOF質量分析結果を示したものである。その結果、収得されたEPO-PEG-Fc蛋白質結合体の純度は95以上であり、理論値と非常に近い分子量を示した。また、免疫グロブリンFc領域に赤血球生成因子EPOが1:1で結合した形態であると確認された。また、MALDI-TOF質量分析法により、実施例10で製造されたFcおよびDGFcの分子量を測定した結果、DGFcの分子量は天然型Fcより3kDa程度小さい50kDaと確認された図6a。減少した3kDaは理論的糖鎖サイズに該当する分子量であって、糖鎖が完全に除去されたことを確認することができた。下記表2は、前記実施例11で製造されたIFNα-PEG-DGFc結合体と、実施例13で製造されたIFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体IおよびIIのMALDI-TOF質量分析結果を示したものである。IFNα-PEG-Fc結合体の分子量75.9kDaと比較したとき、IFNα-PEG-DGFc結合体は約3kDa程度小さい分子量を示し、IFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体Iは約3~4kDa程度小さい分子量を示した。Fc単量体に連結されたIFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体IIは、Fc単量体分子量に該当する24.5kDaが減少した分子量を示した。実験例2薬物動態学的な調査I各群当たり5匹のSDラットにおいて、天然型生理活性蛋白質対照群と前記実施例および比較例で製造した-40KPEG連結体、-PEG-アルブミン結合体、-PEG-Fc結合体、-PEG-DGFc結合体、および-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体の血液内安定性および薬物動態学的係数を比較した。対照群および-40KPEG連結体、-PEG-アルブミン結合体、-PEG-Fc結合体、-PEG-DGFc結合体、および-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体試験群を各100μg/kgずつ皮下注射した後、対照群は注射してから0.5.1、2、4、6、12、24、30、48、72および96時間後に採血し、試験群は注射してから1、6、12、24、30、48、72、96、120、240および288時間後に採血した。ヘパリンを含有するチューブに血液試料を集めて凝固を防止し、エッペンドルフ高速マイクロ遠心分離機で5分間遠心分離して細胞を除去した。血漿内の蛋白質量は、各生理活性蛋白質に対する抗体を用いてELISA方法によって測定した。IFNα、hGH、G-CSFまたはEPOの天然型蛋白質、これらの-40KPEG連結体、-PEG-アルブミン結合体、-PEG-Fc結合体、および-PEG-DGFc結合体の薬物動態の分析結果を下記表3~表7に示した。下記表において、Tmaxは最高薬物濃度に到達する時間を、T1/2は薬物の血中半減期を、MRTは薬物分子の平均的な体内滞留時間をそれぞれ意味する。前記表3および図9の薬物動態グラフから分かるように、IFNα-PEG-Fc蛋白質結合体の場合、血中半減期は90.4時間であって天然型に比べて約50倍増加した。これは比較例1で製造したIFNα-40KPEGの半減期である35.8時間より約2.5倍増加したものである。また、IFNα-PEG-アルブミンの半減期である17.1時間に比べても、本発明のIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体が著しく優れた血中半減期を示すことを確認した。一方、表3および図11に示すように、IFNα-PEG-DGFc結合体の場合には、血中半減期が71.0時間であって、IFNα-PEG-Fc結合体とほぼ同等なので、糖鎖がなくても生体内安定性には大きい影響がなく、組み換え方法で生産された組み換えAGFc誘導体を用いた結合体も天然型由来のDGFcと同一の効果を示すことを確認した。ところが、Fc単量体を使用した結合体の場合には、正常的なFc二量体の結合体と比較したとき、約半分に減少した血中半減期を示した。ヒト成長ホルモンの場合も、表4に示すように、本発明の蛋白質結合体が示す血中半減期の増加効果を確認することができる。すなわち、天然型1.1時間に比べてhGH-40KPEG連結体およびhGH-PEG-アルブミン結合体の半減期が7.7時間および5.9時間と多少増加した反面、本発明のhGH-PEG-Fc蛋白質結合体の場合には血中半減期が11.8時間と画期的に増加した。表5および表6における顆粒球コロニー刺激因子とその誘導体に対する薬物動態の分析結果においても、天然型、-40KPEG連結体および-PEG-アルブミン結合体に比べて本発明のG-CSF-PEG-Fcおよび17S-G-CSF-PEG-Fc結合体が一層長い血中半減期を示した。蛋白質の血中持続性を増加させる免疫グロブリンFc領域の効果は、天然型生理活性蛋白質だけでなく、一部のアミノ酸を変形させた誘導体においても天然型とほぼ同一の程度であることを確認することができ、このような結果より、本発明の方法が他の蛋白質の誘導体においても類似の効果を示すことを容易に予想することができる。表7および図10に示すように、糖鎖化されている天然型蛋白質としての赤血球生成因子に対しても本発明の蛋白質結合体の血中半減期増加効果が確認された。すなわち、天然型赤血球生成因子の血中半減期が9.4時間であり、EPOを高糖鎖化させて血中安定性を高めたダーベポエチン-αDarbepoetinα、Aranesp、Amgen社の場合は半減期が18.4時間と増加することが分かる。赤血球生成因子に免疫グロブリンFc領域を結合させた本発明のEPO-PEG-Fc結合体の場合には、血中半減期がおおよそ61.5時間と画期的に増加し、糖鎖が除去された大腸菌由来の組み換えAGFc誘導体を使用した結合体の場合には87.9時間まで半減期の増加を示し、糖鎖が除去されても、血中安定性には影響を及ぼすことなく、抗体機能がない結合体を製造することができることを確認した。前記結果から分かるように、本発明によって免疫グロブリンFc領域および非ペプチド性重合体と共有結合した蛋白質結合体は、天然型蛋白質に比べて数倍~数十倍以上増加した血中半減期を示した。また、免疫グロブリンFcを遺伝子組み換え法によって大腸菌で生産し、あるいは酵素処理によって糖鎖を除去しても、これを用いて製造された蛋白質結合体における血中半減期の増加効果はほぼ同様に維持された。特に、既存の蛋白質血中持続性を増加させるためのPEG剤形のうち持続性が最も高い40kDaPEGを修飾した蛋白質との比較においても、免疫グロブリンFc蛋白質結合体が著しく高い血中安定性を示した。また、免疫グロブリンFcの代わりにアルブミンを結合させた蛋白質結合体との比較試験においても、本発明の蛋白質結合体が、卓越した血中安定性を示すことから、本発明の蛋白質結合体が持続型蛋白質薬物製剤の開発に効果的であることを確認することができた。点突然変異によるコロニー刺激因子誘導体まで広範囲な範囲の蛋白質において従来のPEG結合蛋白質またはアルブミン蛋白質結合体より卓越した血中安定性と平均滞留時間MRTを示す結果からみて、本発明の蛋白質結合体による安定性および持続性増加効果は他の生理活性ポリペプチドにも適用可能であることが分かる。一方、非ペプチド性重合体として10kDaPEGを使用したIFNα-10KPEG-Fc蛋白質結合体実施例7を用いて前記と同一の方法で血中半減期を測定したとき、血中半減期は48.8時間であって、分子量3.4kDaのPEGを使用した蛋白質結合体の血中半減期である79.7時間より多少減少した。また、非ペプチド性重合体PEGの分子量の増加に伴って血中半減期はむしろ多少減少したが、このような結果から、蛋白質結合体の血中安定性および持続性の増加の主な要因が非ペプチド性重合体の分子量よりは結合した免疫グロブリンFc領域による効果であることが確認できる。PEGの反応基をアルデヒド反応基以外の反応基に変化させた場合でも、見掛け分子量と血中半減期が、アルデヒド反応基を持つPEGを使用した場合と類似の様相を示した。実験例3薬物動態学的な調査II実施例8および9で製造されたFab’-S-PEG-N-Fc、Fab’-N-PEG-N-Fc結合体および比較例3で製造されたFab’-S-40KPEG連結体の血中半減期を測定するために、Fab’を対照群として前記結合体または連結体を用いて実験例2と同一の方法で薬物動態学的な調査を行い、その結果を図12に示した。図12より、Fab’-S-PEG-N-FcおよびFab’-N-PEG-N-Fc結合体が、Fab’またはFab’-S-40KPEG連結体に比べて2~3倍延長された血中半減期を示すことが分かる。実験例4細胞内活性の測定4-1インターフェロンアルファ蛋白質結合体の細胞内活性比較インターフェロンアルファ蛋白質結合体の細胞内活性比較のために、IFNα-PEG-Fc実施例1、IFNα-PEG-DGFc実施例11、IFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体実施例13、IFNα-40KPEG比較例1およびIFNα-PEG-アルブミン比較例2の抗ウイルス活性を水泡性口内炎ウイルスで飽和させたMDBKMadinDarbyBovineKidney、ATCCCCL-22を使用する細胞培養生検で測定した。この際、PEGが結合していないインターフェロンアルファ-2bNIBSC国際標準品を標準物質として使用した。MDBK細胞を、MEMminimumessentialmedium:JBI社に10FBSおよび1ペニシリン/ストレプトマイシンが添加された培地で37°C、5CO2の条件で培養した。測定しようとする試料および標準物質を一定の濃度で細胞培養培地に希釈して96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ分注した。前記で培養された細胞を回収し、試料が分注されているプレートに100μLずつ加えた後、37°C、5CO2の条件で約1時間程度培養した。1時間後、ウイルスの濃度が5~7×103PFUとなるように調節されたVSVを50μLずつプレートに添加し、37°C、5CO2の条件で約16~20時間さらに培養した。試料および標準物質を入れないで細胞とウイルスのみを入れたウェルを陰性対照群として使用し、ウイルス希釈溶液を入れないで細胞のみを入れたウェルを陽性対照群として使用した。培養液を除去し、生きている細胞を染色するために、ニュートラルレッド溶液を100μLずつ添加した後、37°C、5CO2の条件で2時間培養した。上澄み液を除去した後、100のエタノールと1の酢酸を1:1と混ぜて100μLずつ入れた。染色された細胞をよく振って溶解させた後、540nmで吸光度を測定した。陰性対照群をブランクとし、陽性対照群を細胞成長100と見なして50細胞成長時の濃度ED50を計算した。その結果、表8に示すように、IFNα-40KPEGは、その活性度が天然型の4.8水準に低下することが確認できる。特に、修飾されたPEGの大きさが大きいほど、血中安定性は増加し、相対的に活性度は徐々に減少したが、インターフェロンアルファの場合、12kDaPEGが修飾された場合には25、40kDaPEGが修飾された場合には約7程度の試験管内活性を持つと報告されたことがあるPBailonetalBioconjugateChem121952022001。すなわち、PEGの分子量が増加すると、血中半減期は長くなるが、相対的に活性は急激に減少するので、血中半減期が長いながら活性も優れた蛋白質結合体の開発が要求されている。また、IFNα-PEG-アルブミン結合体も天然型に比べて約5.2程度と低い活性を示したが、本発明のIFNα-PEG-Fc結合体およびIFNα-PEG-DGFc結合体は、天然型に比べて相対的活性度が28.1および25.7と画期的に高くなることを確認することができ、組み換えAGFc誘導体を使用した結合体においても類似の活性増加効果を示した。このような結果から、血中半減期の画期的増加に伴ってインターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域の結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待される。4-2ヒト成長ホルモン蛋白質結合体の細胞内活性比較ヒト成長ホルモン蛋白質結合体の細胞内活性を比較するために、hGH-PEG-Fc、hGH-40KPEGおよびhGH-PEG-アルブミンの細胞内活性を比較試験した。ヒト成長ホルモン依存的に分裂を行う細胞としてのラット結節リンパ腫細胞株であるNb2細胞EuropeanCollectionofCellCultures97041101を用いて細胞内活性度を試験管内の分析によって確認した。Nb2細胞を、培養液Fisher’smediumに10の牛胎児血清FBS、fetalbovineserum、0.075のNaCO3、0.05mMの2-メルカプトエタノールおよび2mMのグルタミンを添加した培地で培養した後、10の牛胎児血清を除いた同一の培地で24時間さらに培養した。培養液で培養された細胞の数を数えて約2×104個の細胞を96ウェルプレートの各ウェルに入れた後、hGH-PEG-Fc、hGH-40KPEG、hGH-PEG-アルブミン、対照群である国際標準品NationalInstituteforBiologicalStandardsandControls、NIBSCおよび天然型ヒト成長ホルモンHM-hGHをそれぞれ希釈して濃度別に添加した。その後、37°C、CO2の培養器で48時間培養した。その後、細胞の成長程度各ウェルの細胞数を測定するために、細胞染色薬CellTiter96AqueousOneSolution、Promega社を各ウェルに25μLずつ入れた後、4時間培養した。その後、490nmで吸光度を測定して各試料の力価を計算し、その結果を下記表9に示した。表9から分かるように、ヒト成長ホルモンの場合も、hGH-40KPEGの活性度は天然型の約7.6と低下し、hGH-PEG-アルブミン結合体の試験管内活性は天然型に比べて約5.2程度と低い活性を示した。ところが、本発明のhGH-PEG-Fc結合体は、相対的活性度が天然型に比べて28以上画期的に増加した。このような結果より、血中半減期の画期的増加に伴ってヒト成長ホルモンと免疫グロブリンFc領域の蛋白質結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待することができる。また、本発明の免疫グロブリンFc蛋白質結合体の活性増加は、免疫グロブリンFcによる血中安定性の増加および受容体との結合力保存、または非ペプチド性重合体によって形成された空間的余裕によるものと把握される。このような作用は、他の生理活性蛋白質の免疫グロブリンFc蛋白質結合体においても類似であるものと期待される。4-3顆粒球コロニー刺激因子蛋白質結合体の細胞内活性比較顆粒球コロニー刺激因子誘導体の蛋白質結合体の細胞内活性を比較するために、天然型G-CSFFilgrastim、第一薬品株、17Ser-G-CSF誘導体、20KPEG-G-CSFNeulasta社、40KPEG-17S-G-CSF、17Ser-G-CSF-PEG-アルブミンおよび17S-G-CSF-PEG-Fcの細胞内活性を測定した。まず、ヒト骨髄由来の細胞株であるHL-60ATCCCCL-240、Promyelocyticleukemiapatient36yroldCaucasianfemaleを10の牛胎児血清を含むRPMI1640倍地で培養してから、細胞の数を約2.2×105細胞/mLとなるように調整した後、DMSOdimethylsulfoxide、culturegrade、Sigma社を最終1.25v/vとなるように添加した。前記の細胞株を96ウェルプレートに90μLずつ入れてウェル当たり細胞が約2×104個となるようにした後、5のCO2が供給される37°Cの培養器で約72時間培養した。G-CSFELISAキットRDsystems社を用いて、濃度が決定された各試料を同一の濃度となるようにRPMI1640で希釈し、最終濃度が10μg/mLとなるようにし、これをさらにRPMI1640で1/2に希釈することを19回繰り返し行った。こうして作られた試料を培養中のHL-60細胞株の各ウェルに10μLずつ加え、最終濃度が1μg/mLから連続的に半減するようにした。前記で製造した蛋白質試料を処理した細胞株は、37°Cの培養器で72時間をさらに培養した。培養後、細胞株の増加程度を調べるために、CellTiter96TMCat.No.G4100、Promega社を用いて分析し、増加した細胞株の数は、670nm波長における吸光度を測定することによって決定した。その結果、表10から分かるように、G-CSFのアミノ酸を置換させた17Ser-G-CSF誘導体の免疫グロブリンFc蛋白質結合体も天然型蛋白質の蛋白質結合体と類似の効果を示した。17Ser-G-CSF-PEGの場合には、PEGで修飾されていないものに比べて、血中半減期は増加するが活性度は低下すると既に報告されたことがある大韓民国特許公開第2004-83268号。特に、修飾されたPEGの大きさが大きいほど、血中安定性は増加するが、相対的に活性度は徐々に低下することが分かり、17Ser-G-CSF-40KPEGは天然型に比べて約10以下の非常に低い活性度を示した。すなわち、PEGの分子量が増加すると、血中半減期は長くなるが相対的に活性は急激に減少するので、血中半減期が長くて活性も優れた蛋白質結合体の開発が要求されている。17Ser-G-CSF-PEG-アルブミンも天然型に比べて約23程度と低い活性を示したが、17Ser-G-CSF-PEG-Fcは天然型に比べて相対的活性度が51以上と高くなることを確認することができた。これにより、血中半減期の画期的増加に伴って免疫グロブリンFc領域と17Ser-G-CSF誘導体の結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待することができる。4-4Fab’結合体の細胞毒性中和試験実施例8および9で製造されたFab’-S-PEG-N-Fc、Fab’-N-PEG-N-Fc結合体、および比較例3で製造されたFab’-S-40KPEG連結体の試験管内活性実験を行った。マウス繊維亜細胞株L929ATCCCRL-2148を用いてTNFαの細胞毒性を測定する実験を基本骨格として、Fab’がTNFαの細胞壊死活性をどれくらい中和させるかを測定した。Fab’-S-PEG-N-Fc、Fab’-N-PEG-N-Fc結合体およびFab’-S-40KPEG連結体をそれぞれ2倍ずつ順次希釈して96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ分注した後、rhTNF-αRDsystems社およびRNA合成の阻害剤として用いられるアクチノマイシンDactinomycinD、Sigma社をそれぞれ最終濃度が10ng/mLおよび1μg/mLとなるように添加し、37°C、5CO2で30分間反応させた後、分析用マイクロプレートに移した。プレートの各ウェルにL929細胞株を5×104個/50μL培地となるように添加し、37°C、5CO2の培養器で24時間培養した。マイクロプレート内の培養液を除去した後、PBSに5mg/mLの濃度で溶けているMTTSigma社を50μLずつ入れた。約4時間37°C、5CO2の培養器で培養した。150μLのDMSOを添加して溶かした後、540nmで吸光度を測定して細胞毒性中和の度合いを確認した。対照群としては、実施例8の段階1で精製したFab’を使用した。その結果、図13に示すように、実験に使用した全ての蛋白質結合体は、Fab’と類似の力価を示しており、このような結果から、Fab’のN末端またはC末端近くの遊離システイン残基にPEGを介して免疫グロブリンFcを結合させた蛋白質結合体は、Fab’の血中半減期を画期的に増加させることは勿論のこと、生体内活性度も高く維持させることが分かる。4-5CDC活性の測定前記実施例で製造した誘導体と大腸菌形質転換体から発現されて精製された免疫グロブリン不変領域蛋白質とがヒトClqに結合するか否かを確認するために、下記のように固相酵素免疫検定法ELISAを行った。実験群として、韓国微生物保存センターKCCMに2004年9月15日付で寄託した形質転換体HM10932寄託番号:KCCM-10597およびHM10927寄託番号:KCCM-10588から生産された免疫グロブリン不変領域試料と前記実施例で製造した誘導体を使用し、比較群として、糖が結合している免疫グロブリンIVIG-グロブリンS、緑十字PBMを始めとして、商業化されて治療用抗体として使われているいろいろの抗体を使用した。前記実験群と比較群の試料を10mMのカーボネート緩衝液pH9.6に1μg/mLの濃度で調製した。準備された試料を96ウェルプレートNuncにウェル当たり200ngの量で分注した後、4°Cで一晩中コートし、その後ウェルプレートをPBS-T溶液137mMのNaCl、2mMのKCl、10mMのNa2HPO4、2mMのKH2PO4、0.05のツイン20で3回洗浄した。牛血清アルブミンを1の濃度でPBS-T溶液に溶解させて準備したブロッキング緩衝液250μLを各ウェルに添加した後、常温で1時間放置し、同一のPBS-T溶液で3回洗浄した。標準液と試料を適切な濃度でPBS-T溶液によって希釈した後、抗体がコートされたウェルに加えて常温で1時間放置させて反応させ、その後さらにPBS-T溶液で3回洗浄した。遮断反応が完了したプレートに2μg/mLのClqRDsystems社、米国を添加した後、2時間常温で反応させ、反応済みのプレートを前記PBS-T溶液で6回洗浄した。ヒトの抗ヒトClq抗体とペルオキシダーゼとの結合体Biogenesis社、米国を遮断緩衝溶液に1000:1で希釈して各ウェルに200μLずつ加えた後、1時間常温で反応させた。反応が完了した後、各ウェルをPBS-T溶液で3回洗浄した後、発色溶液AとBカラーA-安定化ペルオキシダーゼColorAStabilizedperoxide溶液およびカラーB-安定化クロモゲンColorBstabilizedchromogen溶液、DY999、RDsystems社を同量で混合し、当該混合液を各ウェルに200μLずつ添加し、30分間放置した。その後、反応停止溶液である2Mの硫酸を50μLずつ添加して反応を停止させた。反応済みのウェルプレートは、マイクロプレートリーダーMolecularDevice社を用い、標準液と検液の450nmの波長の吸光度を測定し、その結果を図14、図15にそれぞれ示した。免疫グロブリンのFc領域における補体活性をサブクラスによって比較した結果、ヒト免疫グロブリンIgG1Fitzgerald、IgG2Fitzgerald、IgG4Fitzgeraldの順にClqに対する高い結合力を持っていることが確認でき、これにより補体活性もサブクラス間に差異があることが分かった。前記実験に使用したIVIGの場合、IgGサブクラスの集合体であるが、IgG1がほぼ大部分を占めているので、分離精製されたIgG1とほぼ類似の親和度を示した。このような対照群と比較するとき、非糖鎖化によるClqの親和度変異は補体活性が最も強いIgG1Fcで著しく減少することが分かり、既に補体反応がないものと知られているIgG4FcではClqに対する結合力が殆どないので、補体活性のない優れた組み換えキャリアであることが分かった図14。Clq親和度が除去されたキャリアの特性が生理活性ペプチドと結合体を作った後にも依然として維持されるかを調べるために、IFNαをモデルとして、糖鎖化Fc、酵素を用いた脱糖鎖Fcおよび非糖鎖化組み換えFcをキャリアとして用いて各結合体を作った後、Clqに対する結合力を検討した。糖鎖化FcとIFNα結合体IFNα-PEG-Fc:GlycosylatedIgG1Fcは、Clqに対して依然として高い親和度を維持するが、ここにPNGaseFなどを用いて脱糖鎖化させたインターフェロン結合体IFNα-PEG-DGFc:DeglycosylatedIgG1Fcは、結合力が著しく低くなることを確認し、その程度は大腸菌由来の非糖鎖化Fc結合体と同様の水準のClqに対する結合力を示した。それだけでなく、IgG1の非糖鎖化Fcを用いたインターフェロン結合体IFNα-PEG-AGFcG1:AglycosylatedIgG1FcをIgG1からIgG4に変えたインターフェロン結合体IFNα-PEG-FcG4誘導体1:AglycosylatedIgG4Fcの場合、Clqに対する親和度が完全に除去されることを確認することができ、結合体を非糖鎖化IgG4Fc単量体に変えた結合体IFNα-PEG-FcG4誘導体2:AglycosylatedIgG4Fcの場合にも、やはりClqに対する結合能力は完全に除去されることからみて、抗体断片のエフェクター機能がない良いキャリアであることを確認することができた図15。本発明は、以下の態様でも提供され得る:[1]生理活性ポリペプチド、免疫グロブリンFc領域および非ペプチド性重合体からなり、該生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンFc領域とが非ペプチド性重合体を介して共有結合によって連結され、生理活性ポリペプチド-非ペプチド性重合体-免疫グロブリンFc領域の構造を有する蛋白質結合体。[2]非ペプチド性重合体が、両末端の反応基を介して生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンFc領域とそれぞれ共有結合によって連結される1に記載の蛋白質結合体。[3]免疫グロブリンFc領域が非糖鎖化されることを特徴とする1に記載の蛋白質結合体。[4]免疫グロブリンFc領域が、CH1、CH2、CH3およびCH4ドメインよりなる群から選択される1~4個のドメインから構成される1に記載の蛋白質結合体。[5]免疫グロブリンFc領域がヒンジ領域をさらに含む4に記載の蛋白質結合体。[6]免疫グロブリンFc領域が、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドのFc領域よりなる群から選択される1に記載の蛋白質結合体。[7]免疫グロブリンFc領域が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドのFc領域よりなる群より選択される6に記載の蛋白質結合体。[8]免疫グロブリンFc領域がIgG4Fc領域である7に記載の蛋白質結合体。[9]免疫グロブリンFc領域が、ヒト非糖鎖化IgG4Fc領域である8に記載の蛋白質結合体。[10]非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体よりなる群から選択される2に記載の蛋白質結合体。[11]スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートである10に記載の蛋白質結合体。[12]非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基の反応基を持つ11に記載の蛋白質結合体。[13]非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域と生理活性ポリペプチドのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基の遊離反応基に結合している1記載の蛋白質結合体。[14]非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする1に記載の蛋白質結合体。[15]非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである14に記載の蛋白質結合体。[16]生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造蛋白質、リガンド蛋白質および受容体よりなる群から選択される1に記載の蛋白質結合体。[17]生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカゴン様ペプチド類、Gプロテイン関連受容体、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合蛋白質類、サイトカイン結合蛋白質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、B細胞因子、T細胞因子、プロテインA、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ-1アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポ蛋白質-E、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子VII、VIIa、VIII、IX、XIII、プラズミノゲン活性因子、フィブリン-結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、プロテインC、C-反応性蛋白質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体よび抗体断片類よりなる群から選択される16に記載の蛋白質結合体。[18]生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、インターフェロン-アルファ、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子およびFab’抗体断片である17に記載の蛋白質結合体。[19]1に記載の蛋白質結合体を製造する方法であって、aa1活性化された非ペプチド性重合体の一方の末端に免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドを共有結合によって連結する段階と、a2反応混合物から非ペプチド性重合体と連結された免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドを含む連結体を分離する段階と、a3分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドを共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域および生理活性ポリペプチドと結合した蛋白質結合体を生成する段階と、b上記蛋白質結合体を分離する段階と、を含み、上記段階a1において、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の反応モル比が1:2.5~1:5であるか、または、免疫グロブリンFc領域と非ペプチド性重合体の反応モル比が1:5~1:10であり、上記段階a3において、段階a2で収得された連結体:免疫グロブリンFc領域または生理活性ポリペプチドの反応モル比が1:0.5~1:20である製造方法。[20]段階a1および段階a3の反応が還元剤の存在下で行われる19に記載の製造方法。[21]前記還元剤が、NaCNBH3、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミン硼酸塩またはピリジン硼酸塩よりなる群から選択される20に記載の製造方法。[22]1の蛋白質結合体およびこの薬剤学的に許容可能な担体を含む、生理活性ポリペプチドの生体内持続性および安定性増加用薬剤学的組成物。[23]非ペプチド性重合体が、両末端の反応基を介して生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンFc領域とそれぞれ共有結合によって連結される22に記載の薬剤学的組成物。[24]免疫グロブリンFc領域が非糖鎖化されることを特徴とする22に記載の薬剤学的組成物。[25]免疫グロブリンFc領域が、CH1、CH2、CH3およびCH4ドメインよりなる群から選択される1~4個のドメインから構成される22に記載の薬剤学的組成物。[26]免疫グロブリンFc領域がヒンジ領域をさらに含む25に記載の薬剤学的組成物。[27]免疫グロブリンFc領域が、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドのFc領域よりなる群から選択される22に記載の薬剤学的組成物。[28]免疫グロブリンFc領域が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドのFc領域よりなる群より選択される27に記載の薬剤学的組成物。[29]免疫グロブリンFc領域がIgG4Fc領域である28に記載の薬剤学的組成物。[30]免疫グロブリンFc領域がヒト非糖鎖化IgG4Fc領域である29に記載の薬剤学的組成物。[31]非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体よりなる群から選択される23に記載の薬剤学的組成物。[32]スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカーボネートである31に記載の薬剤学的組成物。[33]非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基の反応基を持つ32に記載の薬剤学的組成物。[34]非ペプチド性重合体の両末端が、それぞれ免疫グロブリンFc領域と生理活性ポリペプチドのアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基の遊離反応基に結合している22に記載の薬剤学的組成物。[35]非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする22に記載の薬剤学的組成物。[36]非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである35に記載の薬剤学的組成物。[37]生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造蛋白質、リガンド蛋白質および受容体よりなる群から選択される22に記載の薬剤学的組成物。[38]生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカゴン様ペプチド類、Gプロテイン関連受容体、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合蛋白質類、サイトカイン結合蛋白質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、B細胞因子、T細胞因子、プロテインA、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ-1アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポ蛋白質-E、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子VII、VIIa、VIII、IX、XIII、プラズミノゲン活性因子、フィブリン-結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、プロテインC、C-反応性蛋白質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体よび抗体断片類よりなる群から選択される37に記載の薬剤学的組成物。[39]生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、インターフェロン-アルファ、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子およびFab’抗体断片である38に記載の薬剤学的組成物。"