aiSEQIDNO1に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO2に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、iiSEQIDNO3に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO4に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、iiiSEQIDNO5に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO6に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにivSEQIDNO7に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO8に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーからなる群より選択される、少なくとも1種の緑膿菌Pseudomonasaeruginosa血清型特異的プライマー対を、試料中の標的核酸へアニールさせる工程、b標的核酸を増幅する工程、ならびにc増幅されたシュードモナス標的核酸を検出する工程を含む、試料中の緑膿菌の血清型特異的な検出のためのアッセイ法。検出工程が、請求項1において選択された少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的プライマー対がアニールする配列の内部にある配列へ、少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的ハイブリダイゼーションプローブ対をハイブリダイズさせる工程を含む、請求項1記載のアッセイ法。少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的ハイブリダイゼーションプローブ対が、iSEQIDNO9に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO10に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、iiSEQIDNO11に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO12に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、iiiSEQIDNO13に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO14に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにivSEQIDNO15に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO16に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブからなる群より選択される、請求項2記載のアッセイ法。緑膿菌血清型特異的ハイブリダイゼーションプローブが、検出可能なマーカーにより標識される、請求項2または3記載のアッセイ法。検出可能なマーカーが、発光マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカー、および酵素マーカーからなる群より選択される、請求項4記載のアッセイ法。緑膿菌血清型が、定量化分析、増幅曲線分析、または融解曲線分析により検出される、請求項2~5のいずれか一項記載のアッセイ法。二つ以上の緑膿菌血清型が同時に検出される、請求項1~6のいずれか一項記載のアッセイ法。検出される血清型が、緑膿菌血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、ならびに血清型IATSO2、IATSO5、およびIATSO16を含有している血清群2である、請求項7記載のアッセイ法。試料が、痰、気管支肺胞洗浄液、気管吸引液、血液、尿のような体液、組織、および細菌培養物から単離されたDNAの群より選択される、請求項1~8のいずれか一項記載のアッセイ法。試料が、食物、土壌、および水の群より選択される、請求項1~8のいずれか一項記載のアッセイ法。試料中の細菌量が、10cfuml~109cfumlの範囲で検出可能である、請求項1~10のいずれか一項記載のアッセイ法。種特異的である、請求項1~11のいずれか一項記載のアッセイ法。aSEQIDNO1に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO2に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、bSEQIDNO3に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO4に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、cSEQIDNO5に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO6に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、dSEQIDNO7に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO8に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド;eSEQIDNO9に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO10に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、fSEQIDNO11に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO12に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、gSEQIDNO13に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO14に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、ならびにhSEQIDNO15に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO16に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるオリゴヌクレオチド対。aSEQIDNO1に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO2に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、bSEQIDNO3に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO4に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、cSEQIDNO5に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO6に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにdSEQIDNO7に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO8に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーからなる群より選択される少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的プライマー対と、アニーリングに必要とされる試薬と、任意で増幅のための試薬および緑膿菌の血清型特異的な検出のための説明書とを含む、緑膿菌の血清型特異的な検出のためのキット。請求項14において選択される少なくとも1種の血清型特異的プライマー対がアニールする配列の内部にある配列にハイブリダイズする少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的ハイブリダイゼーションプローブ対をさらに含む、請求項14記載のキット。少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的ハイブリダイゼーションプローブ対が、aSEQIDNO9に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO10に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、bSEQIDNO11に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO12に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、cSEQIDNO13に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO14に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにdSEQIDNO15に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO16に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブからなる群より選択される、請求項15記載のキット。緑膿菌血清型特異的プローブが、検出可能なマーカーにより標識される、請求項15または16記載のキット。検出可能なマーカーが、発光マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカー、および酵素マーカーからなる群より選択される、請求項17記載のキット。請求項14において定義される項目a~dの血清型特異的プライマー対を含む、緑膿菌血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、ならびに血清型IATSO2、IATSO5、およびIATSO16を含有している血清群2の同時検出のためのキット。緑膿菌の血清型特異的な検出のための、請求項1または3において定義されるオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブの使用。緑膿菌血清型という用語は、本明細書において使用されるように、血清型特異性を担う緑膿菌の外側糖質のリポ多糖LPSの特異的なO抗原成分の存在を意味する。緑膿菌の外側糖質層、特に、O抗原は、これらの細菌の異なる単離物において著しく多様である。O抗原の違いに基づく、少なくとも20の異なる血清型が記載されているRiveraetal1992。最も優勢な緑膿菌血清型は、血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、および血清群2IATSO2、IATSO5、IATSO16である。血清型特異的な検出という用語は、本明細書において使用されるように、前記定義の最も優勢な緑膿菌血清型のうちの一つまたは複数の検出および同定を意味する。本発明によると、検出は、増幅技術によって関心対象の試料を分析することにより実施される。ポリメラーゼ連鎖反応PCRまたはリガーゼ連鎖反応LCRに基づくテクノロジーを含む、多数のそのような増幅技術が、先行技術において記載されている。そのような増幅技術の使用は、当業者にとってルーチンの作業であり、それらは、本明細書において関連のある増幅技術の適当な例を表す。好ましい遺伝子増幅技術は、PCR、より好ましくは、リアルタイムPCRであり、最も好ましいのは、多重リアルタイムPCRまたはLightCyclerに基づくリアルタイム多重PCRである。プライマー、オリゴヌクレオチドプライマー、またはプライマー対という用語は、本明細書において使用されるように、DNA標的配列を増幅するために、前述の増幅技術において使用される短いオリゴヌクレオチド典型的には、10~50bp、好ましくは、15~35bpをさす。本発明に係るプライマーは、SEQIDNO1~8に示されるヌクレオチド配列のいずれかの少なくとも10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、または35個の連続するヌクレオチドを含有している分子である。本明細書において定義されるプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマーは、当技術分野において公知の技術、例えば、ホスホトリエステル法およびホスホジエステル法Gaitetal1980、または自動化された技術Conolly1987を使用して合成的に作製される。緑膿菌血清型特異的プライマーという用語は、本明細書において使用されるように、血清型特異的な標的、例えば、O抗原遺伝子座をコードするDNAに相当するかまたは相補的である、核酸配列の増幅を可能にする条件の下に置かれた時に合成の開始点として機能することができるプライマーを意味する。プライマー伸張産物の合成を可能にする条件には、ヌクレオチド基質の存在、DNAポリメラーゼのような重合のための薬剤、ならびに適当な温度およびpHが含まれる。好ましくは、プライマーは、プライマーの他のコピーと塩基対を形成せず、ヘアピン構造を形成しない核酸配列である。プライマー長は、約10~50ヌクレオチド、好ましくは、約15~35ヌクレオチドである。本発明は、検出工程が、本明細書中の前記定義のアッセイのアニーリング工程aの実施のために選択された少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的プライマー対がアニールする配列の内部にある配列へ、少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的ハイブリダイゼーションプローブ対をハイブリダイズさせる工程をさらに含む、本明細書中の前記定義のアッセイを提供する。ハイブリダイゼーション技術は、当技術分野において公知であり、例えば、SambrookJFritschEFManiatisTinMolecularCloningALaboratoryManual1989ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYに記載されている。好ましい態様によると、前記定義のアッセイのアニーリング工程aの実施のために選択された少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的プライマー対がアニールする配列の内部にハイブリダイズする少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的ハイブリダイゼーションプローブ対は、iSEQIDNO9に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO10に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、iiSEQIDNO11に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO12に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、iiiSEQIDNO13に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO14に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにivSEQIDNO15に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO16に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブからなる群より選択される。プローブ、オリゴヌクレオチドプローブ、またはハイブリダイゼーションプローブという用語は、本明細書において使用されるように、増幅された標的ヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションによって検出するために使用される任意のヌクレオチド配列を意味する。本発明に係るプローブとは、短いオリゴヌクレオチド典型的には、10~50bp、好ましくは、15~35bpをさす。プローブとは、本明細書において使用されるように、SEQIDNO9~16のいずれかに示されるヌクレオチド配列の少なくとも10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、または35個の連続するヌクレオチドを含む分子である。プローブまたはオリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野において公知の技術を使用して合成的に作製可能である。プローブは、増幅産物の検出を可能にする、少なくとも1種の検出可能な標識に連結されていてもよく、好ましくは、共有結合により連結されていてもよい。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、ある血清型に特異的でありかつ第1のプライマーセットがアニールする配列の内部にある配列にハイブリダイズする場合、適したハイブリダイゼーションプローブを意味する。検出可能な標識という用語は、本明細書において使用されるように、具体的な限定を示さない。検出可能な標識は、放射標識、発光標識、蛍光色素、酵素活性を有する化合物、磁性標識、抗原、および検出可能な標識に対する高い結合親和性を有する化合物からなる群より選択され得る。例えば、プローブに連結された蛍光色素は、例えば、リアルタイムPCRにおいて、検出標識として機能することができる。適当な放射性マーカーは、P32、S35、I125、およびH3であり、適当な発光マーカーは、化学発光化合物、好ましくは、ルミノールであり、適当な蛍光マーカーは、好ましくは、ダンシルクロリド、フルオレセイン5イソチオシアネート、および4フルオロ7ニトロベンズ2アザ13ジアゾールであり、適当な酵素マーカーは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、αガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、またはビオチンである。リアルタイムPCRは、自動化されたセットアップおよびデータ分析を受け入れる一工程閉管法に関する。本発明の好ましい態様によると、LightCyclerに基づくリアルタイムPCRが使用される。リアルタイムPCRに基づく手法は、一次診断および標的定量化を組み入れる可能性を有する。好ましい態様において、増幅工程において使用される特定のオリゴヌクレオチド配列オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、さらに特異性を増加させるため、特定のオリゴヌクレオチド配列オリゴヌクレオチドプローブのセットと組み合わせられる。最も好ましい態様において、プライマー対およびプローブ対は、以下のオリゴヌクレオチドプライマー配列およびオリゴヌクレオチドプローブ配列の対のうちの1種または複数種より選択される:iSEQIDNO1および2に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQIDNO9および10に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ;iiSEQIDNO3および4に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQIDNO11および12に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ;iiiSEQIDNO5および6に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQIDNO13および14に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ;ならびにiVSEQIDNO7および8に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQIDNO15および16に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ。本発明の好ましい態様において、緑膿菌血清型を検出する工程は、既知の細菌濃度の標準曲線との比較によって細菌量を決定することができる定量化分析;シグナル強度の増加によってPCR産物の増幅の成功を観察することができる増幅曲線のモニタリング;および/またはPCR増幅が個々の融解温度を有する産物の合成をもたらす融解曲線分析によって実施される。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、最高レベルの特異性を提供し、a標準曲線との比較による細菌量の定量化、bオンラインでの血清型特異的な増幅の観察、またはc融解曲線分析による血清型の同定を可能にする。本発明のアッセイは、多くの実際の適用を有する。例えば、広範囲のコピー数の緑膿菌を含有していると推測される医学的試料、獣医学的試料、または環境試料において、最も優勢な緑膿菌血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、および血清群2IATSO2、IATSO5、IATSO16を個々にまたは同時に検出するため、アッセイを使用することができる。関心対象の試料における一つの血清型の特異的な検出のため、2セットのオリゴヌクレオチド配列:2個のプライマー順方向=fwdおよび逆方向=revならびに2個のプローブが使用される。本発明の好ましい態様において、多価アッセイまたは多重アッセイとも呼ばれる、二つ以上の緑膿菌血清型が同時に検出されるアッセイが提供される。例えば、前述の四つの最も優勢な緑膿菌血清型の特異的な検出のためには、4×2個のプライマーおよび4×2個のプローブが、一つのアッセイにおいて使用される4価アッセイ。好ましくは、検出すべき緑膿菌血清型は、最も優勢な血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、ならびに血清型IATSO2、IATSO5、およびIATSO16を含有している血清群2である。プライマー順方向=fwdおよび逆方向=revならびにプローブは、1工程で同時に使用されてもよいし、または別々の2工程で連続的に使用されてもよい。最も好ましいのは、本明細書において定義されるオリゴヌクレオチド配列の、4価LightCyclerアッセイにおける使用である。4価LightCyclerアッセイという用語は、四つの緑膿菌血清型の同時検出を可能にするアッセイを意味し、特に、4価LightCyclerアッセイは、緑膿菌の四つの最も優勢な血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、および血清群2の平行検出を可能にする。アッセイは、さらに、単一の反応において極めて高い特異性および感度を示す。しかしながら、4価アッセイによって、型決定不能な株の量を低下させることができ、4価LightCyclerアッセイは、臨床的な気管支肺胞洗浄液BAL試料からの直接測定について成功裡に実証されている。LightCyclerに基づくリアルタイムPCRにおいては、増幅および検出が、閉鎖されたガラスキャピラリーの中で起こり、従って、アンプリコン相互汚染が防止される。LightCyclerは、ヒートブロック伝導ではなくファンにより駆動される空気によって、高速のサーマルサイクリングを達成する。従って、4価緑膿菌血清型決定試験の結果は、およそ1時間以内に入手可能である。本発明による緑膿菌の検出、特に、上記の4価血清型決定試験による検出は、単離された細菌DNAに対して実施されてもよいし、または痰、気管支肺胞洗浄液、もしくは気管吸引液のような臨床試料から直接実施されてもよく、一般的には、超高純度H2Oによる希釈の後に実施される。好ましいのは、肺障害を有するヒト患者のようなヒトの肺洗浄液から直接入手された試料である。臨床試料には、血液、尿、組織等のような生体材料も含まれ得る。典型的には、試料は、ヒトまたは哺乳動物の創傷、熱傷、肺、および尿路の感染から採取され得る。緑膿菌の血清型は、食物試料、土壌試料、または水試料からも検出され得る。緑膿菌感染肺炎患者においては、10cfuml~109cfumlの範囲の細菌量をルーチンに見出すことができる。呼吸器分泌物例えば、気管支肺胞洗浄液、気管内標本等を入手する方法に依って、シュードモナスのコロニー形成または急性感染についての異なる解釈カットオフ点が、臨床的な日常のルーチンにおいて定義されている。これらのカットオフ点は、細菌コロニー形成についての≦103~6cfuml、感染、例えば、肺炎についての>106cfumlの範囲にわたっている。従って、少なくとも6桁の範囲にわたって細菌量を決定する必要がある。従って、広範囲の鋳型濃度で信頼性が高い緑膿菌血清型同定を可能にする診断法を提供することが望ましいと考えられる。驚くべきことに、本発明によると、緑膿菌血清型の検出は、広範囲の試料中の鋳型濃度で実施可能である。本発明の一つの態様において、試料中の細菌量は、10cfuml~109cfumlの範囲、または102cfuml~108cfuml、または103cfuml~108cfuml、または104cfuml~108cfumlの範囲で検出可能である。本発明のさらなる態様によると、アッセイは種特異的である。特記しない限り、種特異的という用語は、緑膿菌種についての特異性を示すために本明細書において使用される。特に、種特異的な検出とは、アシネトバクターバウマンニAcinetobacterbaumannii、クラミドフィラニューモニエChlamydophilapneumoniae、エンテロバクターエロゲネスEnterobacteraerogenes、エンテロバクタークロアカcloacae、大腸菌Escherichiacoli、クレブシエラオキシトカKlebsiellaoxytoca、クレブシエラニューモニエ、プロテウスミラビリスProteusmirabilis、セラチアマルセセンスSerratiamarcescens、ステノトロホモナスマルトフィリアStenotrophomonasmaltophilia、アクチノバチルスアクチノミセテムコミタンスActinobacillusactinomycetemcomitans、エロモナスハイドロフィラAeromonashydrophilia、バクテロイデスフラジリスBacterioidesfragilis、バルトネラヘンセラBartonellahenselae、百日咳菌Bordetellapertussis、ボレリアブルグドルフェリBorreliaburgdorferi、バークホルデリアセパシアBurkholderiacepacia、カンピロバクタージェジュニCampylobacterjejuni、カルジオバクテリウムホミニスCardiobacteriumhominis、インフルエンザ菌Haemophilusinfluenza、レジオネラニューモフィラLegionellapneumophila、リステリアモノサイトゲネスListeriamonocytogenes、モラクセラカタラーリスMoraxellacatarrhalis、モルガネラモルガニーMorganellamorganii、髄膜炎菌Neisseriameningitidis、パンテアアグロメランスPantoeaagglomerans、ポルフィロモナスジンジバリスPorphyromonasgingivalis、プレボテラデンチコラPrevotelladenticola、プロテウスブルガリスProteusvulgaris、エルシニアエンテロコリチカYersiniaenterocolitica、エンテロコッカスフェカリスEnterococcusfaecalis、エンテロコッカスフェシウムfaecium、スタフィロコッカスアウレウスStaphylococcusaureus、スタフィロコッカスエピデルミデスepidermidis、スタフィロコッカスヘモリチカスhaemolyticus、ストレプトコッカスニューモニエStreptococcuspneumoniae、ストレプトコッカスアガラクチアagalactiae、ストレプトコッカスピオゲネスpyogenes、ストレプトコッカスミティスmitis、バチルスセレウスBacilluscereus、クロストリジウムパーフリンジェンスClostridiumperfringens、コリネバクテリウムジェイケイウムCorynebacteriumjeikeium、ゲメラヘモリサンスGemellahaemolysans、ヒストプラズマカプスラーツムHistoplasmacapsulatum、マイコバクテリウムフォーチュイタムMycobacteriumfortuitum、結核菌Mycobacteriumtuberculosis、マイコプラズマニューモニエMycoplasmapneumoniae、ペプトストレプトコッカスマグナスPeptostreptococcusmagnus、プロピオニバクテリウムアクネスPropionibacteriumacnes、アスペルギルスフミガーツスAspergillusfumigatus、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、カンジダグラブラタglabrata、カンジダクルゼイkrusei、カンジダパラプローシスparapsilosis、カンジダトロピカリスtropicalis、クリプトコッカスネオフォルマンスCryptococcusneoformans、アデノウイルスAdenoviruses、ヘルペスウイルスHerpesviruses、オルソミクソウイルスOrthomyxoviruses、パラミクソウイルスParamycxoviruses、およびピコルナウイルスPicornavirusesのような、緑膿菌以外の高頻度に存在する微生物細菌、真菌、またはウイルスが、本発明のアッセイ、キット、またはオリゴヌクレオチドによって検出されないことを意味する。前記定義のIATSO1、S2IATSO2、IATSO5、IATSO16を含む血清群2、IATSO6、およびIATSO11の群より選択される一つまたは複数の緑膿菌血清型を特異的に決定することができるオリゴヌクレオチド対がさらに提供される。ここで、第1および第2のオリゴヌクレオチド対は、SEQIDNO1および2、3および4、5および6、7および8、9および10、11および12、13および14、または15および16に示されるヌクレオチド配列の少なくとも10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、または35個の連続するヌクレオチドを含む。特に、本発明は、aSEQIDNO1に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO2に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、bSEQIDNO3に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO4に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、cSEQIDNO5に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO6に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、dSEQIDNO7に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO8に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド;eSEQIDNO9に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO10に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、fSEQIDNO11に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO12に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、gSEQIDNO13に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO14に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチド、ならびにhSEQIDNO15に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチド、およびSEQIDNO16に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるオリゴヌクレオチド対を提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の表1に示される技術的特徴を有する。表1124規則による融点計算ATヌクレオチド=2°C、GCヌクレオチド=4°C本発明に係るオリゴヌクレオチド配列は、シュードモナス血清型IATSO1、S2IATSO2、IATSO5、IATSO16を含む血清群2、IATSO6、IATSO11を特異的に決定することができる。本発明に従って使用される好ましいオリゴヌクレオチドは、表2に示されるプライマーおよびプローブである。表2本明細書において定義されるプライマーの作用の組み合わせは、対応するハイブリダイゼーションプローブによるその後のまたは同時の血清型特異的な検出のため、適当な標的遺伝子を血清型特異的に増幅することができる。緑膿菌のLPSO抗原遺伝子クラスタに属する血清型特異的プライマー/プローブ対の設計のため、本発明により使用された標的遺伝子は、wzzおよびGtGr4と命名された遺伝子である。シュードモナス血清型IATSO1、S2IATSO2、IATSO5、IATSO16を含む血清群2、IATSO6、IATSO11についての標的遺伝子wzzおよびGtGr4の配列は、配列表のSEQIDNO18~21に示される。緑膿菌血清型IATSO1についての標的遺伝子は、SEQIDNO18に示され:NCBIアクセッションAF498400バージョンAF4984001;ORF4;領域:12842321ORF4;wzz;鎖長決定タンパク質chainlengthdeterminantproteinに類似に見出され得る。血清群2についての標的遺伝子緑膿菌血清型IATSO2、IATSO5、およびIATSO16;三つの血清型全てについて同一の配列は、SEQIDNO19に示され、NCBIアクセッションAF498412バージョンAF4984121;ORF19;領域:1876919788ORF19;GtGr4;第4グループ糖転移酵素Glycosyltransferasegroup4に類似;可能性のある複数の膜貫通ドメインに見出され得る。緑膿菌血清型IATSO6についての標的遺伝子は、SEQIDNO20に示され、NCBIアクセッションAF498417バージョンAF4984171;ORF14;領域:1265413694ORF14;GtGr4;第4グループ糖転移酵素に類似;可能性のある複数の膜貫通ドメインに見出され得る。緑膿菌血清型IATSO11についての標的遺伝子は、SEQIDNO21に示され、NCBIアクセッションAF498402バージョンAF4984021;ORF13;領域:1107312098ORF13;GtGr4;第4グループ糖転移酵素に類似;可能性のある複数の膜貫通ドメインに見出され得る。LPSO抗原クラスタは高い遺伝的多様性を有する領域として同定されており、同定され決定された配列は、緑膿菌血清型を識別するための、DNA配列に基づくPCR法を開発する機会を提供すると推測されているRaymondetal2002。O抗原遺伝子クラスタの全部で11のグループが、20の緑膿菌血清型から、Raymondらによって定義されている。著者らは、各遺伝子クラスタがDNA配列レベルで相互に高度に相違することが示されたと主張したが、本発明者らは、可能性のある標的遺伝子の大多数のDNAの違いが、血清型特異的なオリゴヌクレオチド設計を可能にするには小さすぎることを経験した。さらに、高い遺伝的多様性を保有する数少ない遺伝子においてすら、血清型特異性の欠如、不十分な感度、低いシグナル強度、または適用される鋳型濃度に依存する強度のシグナル変動のため、設計されたオリゴヌクレオチドの大部分が使用可能でないことが判明した。本発明のアッセイを適用するための適当な試薬は、適当な容器にパッケージ化される、必要な材料を提供する便利なキットへとパッケージ化され得る。そのようなキットは、本明細書に記載された方法によって、試料中の緑膿菌血清型、好ましくは、IATSO1、IATSO6、IATSO11、および血清群2IATSO2、IATSO5、IATSO16を検出するのに必要とされる全ての試薬を含むことができ、任意で、本発明の方法の実施において有用な適当な支持体を含むこともできる。好ましくは、本発明に係るキットは、適切な陽性対照および/または内部対照の標的核酸配列、ならびに陰性対照として使用される核酸配列またはH2Oも含む。本発明のアッセイおよびキットは、多くの実際の適用を有する。例えば、本発明の方法およびキットは、緑膿菌を含有していると推測される医学的試料、獣医学的試料、または環境試料において、緑膿菌血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、および血清群2IATSO2、IATSO5、IATSO16を同時に検出するために使用され得る。キットは、さらに、病原性マーカーおよび耐性マーカーについての試薬および対照を提供してもよい。さらに好ましい態様によると、本発明は、定義された緑膿菌の血清型特異的な検出のためのアッセイを実施するためのキットを提供する。キットは、iSEQIDNO1に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO2に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、iiSEQIDNO3に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO4に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、iiiSEQIDNO5に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO6に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにivSEQIDNO7に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO8に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーからなる群より選択される少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的プライマー対と、アニーリングに必要とされる試薬とを含み、任意で、増幅のための試薬および/または緑膿菌の血清型特異的な検出のための説明書を含む。そのようなキットにおいて有用な試薬は、DNA増幅酵素またはRNA増幅酵素を含有している酵素溶液、除染酵素を含有している酵素溶液、Mg2を含有している緩衝溶液、dNTPミックス、ならびに/またはプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブの混合物、適切な陽性対照および/または内部対照、ならびに陰性対照として使用される核酸配列またはH2Oである。本発明の好ましい態様において、キットは、少なくとも1種の血清型特異的プライマー対がアニールする配列の内部にある配列にハイブリダイズする少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的ハイブリダイゼーションプローブ対をさらに含む。好ましくは、少なくとも1種の緑膿菌血清型特異的ハイブリダイゼーションプローブ対は、iSEQIDNO9に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO10に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、iiSEQIDNO11に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO12に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、iiiSEQIDNO13に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO14に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにivSEQIDNO15に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、およびSEQIDNO16に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブからなる群より選択される。最も好ましくは、本発明のキットは、以下のオリゴヌクレオチド配列の対より選択される1種または複数種のプライマー対およびプローブ対を含有している:iSEQIDNO1および2に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQIDNO9および10に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ;iiSEQIDNO3および4に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQIDNO11および12に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ;iiiSEQIDNO5および6に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQIDNO13および14に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ;ならびにivSEQIDNO7および8に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQIDNO15および16に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ。本発明のキットは、ポリメラーゼ連鎖反応において、増幅された核酸分子または予定されたその断片を生成するのに必要とされる試薬、および増幅された配列をアッセイするための手段をさらに含有していてもよい。本発明のキットに含有される血清型特異的なプローブは、検出可能なマーカーにより標識される。好ましくは、検出可能なマーカーは、発光マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカー、および酵素マーカーからなる群より選択される。好ましい態様において、本発明は、本明細書中の前記定義の血清型特異的プライマー対を含む、緑膿菌血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、ならびにIATSO2、IATSO5、およびIATSO16を含有している血清型2の同時検出のためキットを提供し、好ましくは、プライマー対は、aSEQIDNO1に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO2に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、bSEQIDNO3に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO4に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、cSEQIDNO5に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO6に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにdSEQIDNO7に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびSEQIDNO8に示される配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーからなる群より選択される。好ましい態様において、本発明に係るキットは、緑膿菌血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、ならびに血清型IATSO2、IATSO5、およびIATSO16を含有している血清群2を同時に特異的に検出することができる。本発明は、さらに、特定の緑膿菌血清型について診断された患者群における、緑膿菌感染のより有効な処置のための、血清型特異的抗体の使用に関する。本発明は、緑膿菌感染の処置のための医薬の調製のための、緑膿菌血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、ならびに血清型IATSO2、IATSO5、およびIATSO16を含有している血清群2のうちの一つまたは複数に特異的な抗体の使用を提供する。従って、好ましい態様において、本発明は、特定の緑膿菌血清型が本発明のアッセイによって検出された患者における、緑膿菌の処置のための医薬の調製のための、緑膿菌血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、ならびに血清型IATSO2、IATSO5、およびIATSO16を含有している血清群2のうちの一つまたは複数に特異的な抗体の使用を提供する。さらなる態様において、本発明は、緑膿菌感染の処置において使用するための、緑膿菌血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、ならびに血清型IATSO2、IATSO5、およびIATSO16を含有している血清群2のうちの一つまたは複数に特異的な抗体を提供する。好ましい態様において、本発明は、特定の緑膿菌血清型が本発明のアッセイによって検出された患者における、緑膿菌感染の処置において使用するための、緑膿菌血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、ならびに血清型IATSO2、IATSO5、およびIATSO16を含有している血清群2のうちの一つまたは複数に特異的な抗体を提供する。本発明は、さらに、緑膿菌の血清型特異的な検出のための、本明細書中の前記定義のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブの使用を提供する。以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明の範囲を制限するためのものではない。本明細書を参照し、一般知識を考慮すれば、さらなる態様が、当業者には明らかになるであろう。材料および方法LightCyclerに基づく4価緑膿菌血清型決定試験4価緑膿菌血清型決定試験は、融解曲線分析と呼ばれる機能を通して、増幅産物の血清型特異的な配列の確認を提供することができる。各PCRランの完了後、サーマルチャンバー内の温度を徐々に高める。この過程の間に、各キャピラリー内の蛍光を頻繁な間隔で測定する。これは、増幅されたDNAの融解挙動を極めて精密にモニタリングすることを可能にする。温度が高まるや否や、プローブの一つが放出された時のFRET蛍光共鳴エネルギー転写中止の結果として、蛍光が減少するであろう。融解曲線分析の解釈のため、試料蛍光の一次微分の負の値を温度に対してプロットし、各試料の融解温度ピークとして示す。プローブが置換される温度は、配列、長さ、およびGC含量に依って大きく変動し、単一のヌクレオチドの違いですら、融解温度を変化させることができる。従って、特定のDNA産物を同定するため、融解温度プロファイルを使用することができる。本発明に係るプライマーおよびプローブを使用した4価緑膿菌血清型決定試験の実施の後、融解曲線分析を実施することにより、融解温度Tmを、陽性対照の増幅に起因する産物のTmと比較することによって、未知の臨床試料からのPCR産物のシュードモナス血清型を決定することができる。図1に示された例において、緑膿菌血清型IATSO1、IATSO6、IATSO11、および血清群2についての血清型特異的なTm値が、例示的な検出チャンネルにおいて示されている。本質的に、PCRは広範な多重化を受け入れず、複数の遺伝子標的の調査には、複数の反応を必要とする。LightCyclerに基づくリアルタイムPCRにおいては、別々のチャンネルにおいて同時に蛍光を測定することができ、従って、単一の試料からの複数の標的配列の分析を可能にする光学ユニットにより、この障壁が解決される。単一の反応からのいくつかの緑膿菌血清型好ましくは、IATSO1、IATSO6、IATSO11、および血清群2の同時検出を可能にするため、個別の色によって各々標識された複数のプローブおよび複数のプライマーが、4価緑膿菌血清型決定試験において使用され得る。そのような反応はより高い複雑度を提供し、従って、特異的かつ信頼性が高い結果をもたらす適当な反応条件を決定することが重要となる。しかしながら、そのような多重分析は、反応パラメーターが注意深く選ばれた場合にのみ、特異的かつ高感度である。アッセイ設計のための基準は、例えば、プライマーの設計ハイブリダイゼーションプローブの設計標的濃度分析される試料の中の非特異的な残余DNA汚染異なる生物学的マトリックスからの例えば、気管支肺胞洗浄液からの試料調製である。標的遺伝子同定標的遺伝子同定のため、異なる緑膿菌血清型のO抗原遺伝子座を構成するオープンリーディングフレームORFを遺伝子バンクからダウンロードし、Clustal様アラインメントによって比較したChennaetal2003。第1選択過程において、問題の血清型のO抗原遺伝子座に存在しないか、または複数回存在するORFを棄却した。第2工程において、不十分な配列多様性を保有するORF、およびプライマー/プローブに基づくアッセイの設計にとって小さすぎるORFを排除した。これらの選択基準を適用すると、28個のORFのうちの4個のみがプライマー/プローブ設計のために適当であるようであった。シュードモナスO抗原遺伝子クラスタの遺伝子バンクデータに基づき、4個の残ったORFのうちの2個アスパラギン合成酵素および酸化還元酵素ファミリーNAD結合ロスマンフォールドOxidoreductasefamilyNADbindingRossmannfoldは、限られた数の血清型にのみ存在すると考えられた。しかしながら、プライマー/プローブ設計の後、両遺伝子から血清型非依存性のPCR増幅が観察されることが判明した。結果として、それぞれの血清型のO抗原遺伝子座の外部に、これらの遺伝子の複製物を見出すことができ、従って、これらの遺伝子は血清型識別のために適していない、と結論付けることができる。プライマー/プローブ設計緑膿菌単離物の血清型特異的な検出のためには、特異的なプライマー/プローブオリゴヌクレオチドが必要である。そのような配列の設計のため、LightCyclerProbeDesignSoftware20RocheAppliedScienceを使用した。第1に、2種の残った標的遺伝子鎖長決定タンパク質に類似しているwzz、および第4グループ糖転移酵素に類似しているGtGr4の配列データを、ソフトウェアにインポートし、続いて、得られたプライマー/プローブ配列の、選ばれた設計パラメーターによる、自動化された分析およびスコアリングを行った。本発明において記載されたプライマー/プローブ対について、いくつかの設計設定を適用した:定量的PCRのためのプライマー/プローブセット、融解曲線分析のためのプライマー/プローブセット、および多重PCR検出のためのプライマー/プローブセット。次の工程において、示唆されたプライマー/プローブ対を、NCBIウェブサイトへの直接サブミッションにより、可能性のある交差相補性について試験した。設計過程の完了後、得られたヌクレオチド配列を、まず、極めて限定された数の細菌単離物で試験した。異なる希釈率での特定の緑膿菌参照株の測定は、選ばれたプライマー/プローブ対の最初の評価のための最も有意義な実験であることが判明した。これらの条件の下で、設計されたアッセイの大部分が、信頼性が高い血清型検出シグナルも生成しないし、十分な感度での検出も可能にしなかった。しかしながら、広範囲の鋳型濃度での信頼性が高い安定した血清型検出は、臨床的に極めて重要であり、従って、診断アッセイの設計の成功にとって不可欠の必要条件である。従って、これらの要件を満たさなかったプライマー/プローブ対を直ちに棄却した。ソフトウェアに基づくプライマー/プローブ設計過程を要約すると、良好なプライマーおよびプローブの設計の一般的な要件例えば、分子内の配列相同性の欠如、鋳型上の単一のアニーリング部位、アンプリコンサイズ、所望の融解温度等を満たす多くのオリゴヌクレオチド配列が示唆された。にも関わらず、示唆されたプライマー/プローブ対の多くが、検出シグナルの過剰の変動のため、血清型特異性を欠いているため、または不十分な感度のため、信頼性が高い血清型同定のためには使用可能でなかった。同一反応条件、血清型特異性および種特異性、ならびに分析感度に関する全ての要件を満たす四つの別々の血清型決定試験IATSO1、IATSO6、IATSO11、および血清群2の検出のプライマー/プローブ対を、四つの緑膿菌血清型の同時検出を可能にする多重アッセイを提供することを目標として、一つの反応において組み合わせた。この段階で、ソフトウェアに基づく設計を越えて、いくつかの試験のプライマー/プローブ対を改良しなければならなかった例えば、シグナル強度を増加させるため、プローブパートナー間の間隔について血清群2特異的プローブを最適化し、異なる検出チャンネル間のシグナルクロストークを防止するため、一方のプローブの短縮および不安定化により、IATSO11特異的プローブを改良した。最終的な改良の後、緑膿菌血清型決定アッセイの4価フォーマットは、1反応当たり10~107の特異的な遺伝子コピー102~109遺伝子コピーmlに相当の再現性のある検出を可能にする。そのような特異的な血清型同定は、両方に無関係の緑膿菌血清型、または他の種例えば、細菌、真菌、およびウイルスに由来するDNAが、1反応当たり106遺伝子コピー108遺伝子コピーmlに相当まで存在していても、観察可能である。十分な量のプライマー/プローブが、分析される試料中の増幅すべき核酸分子またはそのオリゴヌクレオチド断片に相補的な配列を含有していることを条件として、プライマー/プローブが非相補配列を含有していてもよいことが認識されるであろう。増幅産物のクローニングおよび配列決定を容易にする、適切な制限酵素による増幅産物の消化を可能にする制限部位リンカーが、プライマーに組み込まれてもよい。リアルタイムPCRのための反応条件は、プライマーの長さおよび組成、鋳型濃度、増幅すべきDNAセグメントの長さ、熱安定性DNAポリメラーゼの特性、ならびにマグネシウムMg2濃度に一般に依存する。これらのパラメーターの各々は、従来の実務に従って、当業者によって容易に決定可能である。大部分の場合において、増幅されたDNAは、アガロースゲル電気泳動またはアクリルアミドゲル電気泳動、臭化エチジウム染色、およびUV照射によって検出される。PCRの感度を増加させるため、またはより迅速な結果を提供するため、オリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブの一方もしくは両方を上記のように標識してもよいし、または重合中に増幅されるDNAに標識を組み込んでもよい。標識されたDNA産物を増幅中にオンラインで分析し、それにより、ゲル電気泳動による結果解釈の必要性を排除することも可能である。実施例1:微生物学的試料4価緑膿菌血清型決定試験の開発のため、16の参照株および94の臨床単離物を使用した。参照株は、InstitutePasteurParisFranceまたはBelgiumbacteriacollectionBCCMGentBelgiumのいずれかから入手された。臨床単離物は、UniversityHospitalBasle、UniversityHospitalBerne、UniversityHospitalZurichSwitzerlandまたはUniversityHospitalJenaGermany、および嚢胞性線維症に関する多国籍臨床研究から入手された。開発された4価緑膿菌血清型決定試験を、市販の凝集反応試験BioRadと比較するため、米国、ドイツ、ギリシア、およびベルギーのおよそ20の病院で収集されたほぼ500の呼吸器緑膿菌単離物を使用した。実施例2:試料調製21精製された細菌DNAの測定参照株および臨床単離物の各々を、37°Cで、5mlのBHI培地BDBioscienceにおいて一夜oN増殖させた。高純度PCR鋳型調製キットRocheDiagnosticsを使用して、細菌細胞ペレットから細菌のDNAを単離した。PCRへの適用の前に、全てのDNA試料のDNAストック溶液を20ngμlに規準化した。DNAストック溶液から、超高純度H2ORocheDiagnosticsによる1:10希釈工程によって、段階希釈ワーキング溶液を調製した。各5μlのDNAワーキング溶液を鋳型溶液として適用した。22細菌培養物からの測定参照株および臨床単離物を、BHI寒天プレートBDBioscience上に播種した。37°CでのoNインキュベーションの後、1白金耳の細菌を、500μlの超高純度H2ORocheDiagnosticsに溶解させた。各8μlの細菌希釈物を鋳型溶液として適用した。23気管支肺胞洗浄液BAL試料からの測定精製された細菌DNAを、103および106遺伝子コピー/反応の濃度で、加工されたBAL試料に添加した。BAL試料はUniversityHospitalBerneから入手された。PCRへの適用の前に、添加されたBAL試料を、SputasolOxoidで希釈し1:3、36°Cで30分間インキュベートすることにより可溶化した。添加され可溶化されたBAL試料を、超高純度H2ORocheDiagnosticsで最終希釈した1:100。各8μlの加工されたBAL試料を鋳型溶液として適用した。実施例3:プライマーおよびアッセイの設計31標的遺伝子の選択表3血清型特異的プライマー/プローブ対の設計のために使用された標的遺伝子32プライマーおよびプローブの配列の設計プライマー/プローブオリゴヌクレオチドを、LightCyclerProbeDesignSoftware20RocheAppliedScienceを使用して設計した。ソフトウェアに基づく設計を越えて、プローブパートナー間の間隔について、血清群2特異的プローブを最適化し、センサープローブの短縮および不安定化により、血清型O11特異的プローブを改良した。表44価緑膿菌血清型決定試験-プライマーおよびプローブの配列関心対象の試料における一つの血清型の特異的な検出のため、2セットのオリゴヌクレオチド配列:2個のプライマーおよび2個のプローブが使用される。例えば、前述の四つの最も優勢な緑膿菌血清型の特異的な検出のためには、複数のプライマーおよびプローブが一つのアッセイにおいて使用される。実施例4:PCR条件、試験成分、および試験対照表5a4価緑膿菌血清型決定試験-PCR条件表5b4価緑膿菌血清型決定試験-試験成分本発明において記載されたアッセイを使用した、緑膿菌の血清型特異的な検出のため、プライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチド、ならびに内部対照および陽性対照を、一般的なLightCyclerFastStartDNAMasterHybProbeKitRocheDiagnostics;カタログ番号03003248001および除染酵素LightCyclerUracilDNAGlycosylaseRocheDiagnostics;カタログ番号03539806001と組み合わせて使用することができる。表64価緑膿菌血清型決定試験-PCRの陽性対照および内部対照内部対照プラスミドおよび陽性対照プラスミドの両方の構築のため、4価LightCyclerアッセイによって検出される全てのアンプリコンを、参照株または臨床単離物のいずれかからPCR増幅した。PCR増幅の後、得られたDNA断片を精製し、制限部位BamHISacIを使用して、プラスミドpT3T7BMRocheDiagnosticsへクローニングした。対照プラスミドのクローニングの成功を、DNA配列決定により最終的に確証した。実施例5:本発明に係るプライマーおよびプローブは、臨床的に優勢な緑膿菌血清型IATSO1、血清群2IATSO2、IATSO5、IATSO16、IATSO6、およびIATSO11の特異的な検出のために適している表7緑膿菌血清型決定試験四つの指定された緑膿菌血清型IATSO1、血清群2IATSO2、IATSO5、IATSO16、IATSO6、およびIATSO11の各々を表す6つの参照株および72の臨床単離物を、100の感度および精度を有する4価緑膿菌血清型決定試験により検出した。4価緑膿菌血清型決定試験の設計に基づき、検出可能な血清型のいずれか一つに属する株の決定は、常に一つの特異的な陽性血清型検出シグナルをもたらし、多重4価アッセイに含まれている他の血清型試験については三つの陰性シグナルをもたらした。陰性血清型決定試験について、内部対照は陽性に検出され、従って、PCR法の失敗は排除することができる。78全てのDNA試料をおよそ106コピー/反応で試験した。1:感度:検出された単離物の数/試験された単離物の数2:精度:正確に検出された単離物の数/試験された単離物の数実施例6:本発明のプライマー/プローブは、他の血清型の緑膿菌株との交差反応性を示さない表8緑膿菌血清型決定試験緑膿菌血清型決定試験は、10の付加的な緑膿菌血清型IATSO3、IATSO4、IATSO7、IATSO8、IATSO9、IATSO10、IATSO12、IATSO13、IATSO14、およびIATSO15の参照株および臨床単離物との交差反応性を示さない。全てのDNA試料をおよそ106コピー/反応で試験した。試料中に存在する可能性のあるPCR阻害剤のために陰性血清型決定結果が入手される可能性を排除するため、実施された反応の各々に内部対照溶液を添加した。内部対照は32全ての調査された血清型試料から成功裡に検出されたため、PCR阻害は排除することができる。実施例7:本発明に係るプライマーは種特異的である表9緑膿菌血清型決定試験緑膿菌血清型決定試験の種特異性を、58の細菌性、真菌性、およびウイルス性の微生物の測定により立証した。微生物学的試料は、AmericanTypeCultureCollectionATCC、DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenDSMZ、およびBelgianCoordinatedcollectionsofMicroorganismsBCCMから入手された。評価された全てのDNA試料が、4価緑膿菌血清型決定試験により交差反応性を示さなかった。全てのDNA試料をおよそ106のコピー/反応で試験した。試料中に存在する可能性のあるPCR阻害剤のために陰性血清型決定結果が入手される可能性を排除するため、実施された反応の各々に内部対照溶液を添加した。内部対照は58全ての調査された種試料から成功裡に検出されたため、PCR阻害は排除することができる。実施例8:方法の再現性/頑健性異なる実験セットアップにおける血清型検出の高い再現性を、血清型IATSO6について例示的に示す。図2に示されるように、A参照株および19の臨床単離物の測定から、B適用された鋳型濃度102~107ゲノム/反応に依存せず、またはC30の臨床試料気管支肺胞洗浄液の測定の後同一のTm値が入手される。実施例9:分析感度7つの標的陽性試料の8倍レプリケートにおいて、精製されたDNAを使用して、緑膿菌IATSO1、血清群2IATSO2、IATSO5、およびIATSO16、IATSO6、ならびにIATSO11の参照株のヒット率分析により、緑膿菌血清型決定試験の分析感度を決定した。試験された各微生物DNAについて、Probit分析を使用して、検出下限値LODを決定するため、95カットオフ値を計算した。4価血清型決定試験の多重フォーマットは、四つの試験の各々のLODに影響を及ぼす可能性がある。四つのアッセイの各々は、別々に試験された時、より低いLODを有すると仮定することができる。表104価緑膿菌血清型決定試験-分析感度実施例10:比較:4価緑膿菌血清型決定試験およびスライド凝集反応による臨床単離物の血清型決定呼吸器緑膿菌単離物を、米国、ドイツ、ギリシア、およびベルギーのおよそ20の病院で収集した。測定を、37°Cで、BHI寒天プレートBDBioscience上での細菌株のoNインキュベーションの後に実施した。各1白金耳の株を、凝集反応のために使用し、超高純度H2Oによる希釈、それに続く、LightCycler分析にも使用した。両血清型決定法から入手された結果を比較すると、高い信頼性で同定される臨床単離物の数が、4価緑膿菌血清型決定試験の適用によって劇的に増加し得ることが明白である。絶対数で、観察された改善は、500の調査された細菌株の15パーセントに相当する543から692への血清型決定の改善。この特定の実施例において、15パーセントの違いは、血清型特異的抗体による処置の資格を有するであろう可能性のある患者75人に相当する。表11実施例11:4価緑膿菌血清型決定試験-非機能性プライマー/プローブ対緑膿菌単離物の血清型特異的な検出のためには、特異的なプライマー/プローブオリゴヌクレオチドが必要である。そのような配列の設計のため、LightCyclerProbeDesignSoftware20RocheAppliedScienceを使用した。ソフトウェアは、良好なプライマーおよびプローブの設計の一般的な要件例えば、分子内の配列相同性の欠如、鋳型上の単一のアニーリング部位、アンプリコンサイズ、所望の融解温度等を満たす多くのオリゴヌクレオチド配列を示唆したが、示唆されたプライマー/プローブ対の多くが、列挙された排除基準のため、信頼性が高い血清型同定のためには使用可能でなかった。表12LightCyclerProbeDesignSoftware20RocheAppliedScienceを使用して設計された25のプライマー/プローブオリゴヌクレオチドを示した。いずれのプライマー/プローブ対も、広範囲の鋳型濃度で信頼性が高い血清型特異的な検出シグナルを生成するためには使用可能でなかった。図3は、LightCyclerProbeDesignSoftwareを使用することにより生成された3種の非機能性プライマー/プローブ組み合わせを示す。増幅特異的なTm値の偏差が強い場合、対応するプライマー/プローブ対は信頼性が高い血清型同定のために使用可能でない。図3は、適用された鋳型濃度に依存する強度のTm変動を有する三つの例を示す。IATSO11A、IATSO2B、およびIATSO1Cの参照株を使用して、三つ全ての実験において、10e6~10e2ゲノム/反応を測定した。示された試料は、表12のプライマー/プローブ組み合わせ19A、9B、および1Cに相当する。参照: