"ポリペプチド二量体に結合することができる二価結合剤であって、該二価結合剤がリンカーを介して互いに連結されている2個の一価結合剤からなり、aここで該第1一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第1標的ポリペプチドのエピトープに結合し、bここで該第2一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第2標的ポリペプチドのエピトープに結合し、cここでそれぞれの一価結合剤は5×10-3/秒~10-4/秒の範囲のKdissを有し、そしてdここで該二価結合剤は3×10-5/秒以下のKdissを有する;前記二価結合剤。一価結合剤の少なくとも一方が単鎖抗体、またはモノクローナル抗体のFab断片もしくはFab’断片である、請求項1に記載の二価結合剤。一価結合剤の両方がモノクローナル抗体に由来し、Fab断片、またはFab’断片、またはFab断片およびFab’断片である、請求項1に記載の二価結合剤。前記の二価結合剤が10-5/秒以下のKdissを有する、請求項1~3のいずれかに記載の二価結合剤。リンカーが6~100nmの長さを有する、請求項1~4のいずれかに記載の二価結合剤。リンカーがL-DNAリンカーである、請求項1~5のいずれかに記載の二価結合剤。ポリペプチド二量体に特異的に結合する二価結合剤を得るための方法であって、以下の工程:a前記の二量体中に含まれる第1標的ポリペプチドのエピトープに5×10-3/秒~10-4/秒のKdissで結合する第1一価結合剤を選択し、b前記の二量体中に含まれる第2標的ポリペプチドのエピトープに5×10-3/秒~10-4/秒のKdissで結合する第2一価結合剤を選択し、c両方の一価結合剤をリンカーにより連結し、そしてd3×10-5/秒以下のKdiss値を有する二価結合剤を選択する;を含む、前記方法。前記のリンカーがL-DNAである、請求項7に記載の方法。さらに二価結合剤を単離する工程eを含む、請求項7または8に記載の方法。ポリペプチド二量体がホモ二量体である、請求項1~6のいずれかに記載の二価結合剤または請求項7~9のいずれかに記載の方法。両方の一価結合剤が重複するエピトープに結合する、請求項10に記載の二価結合剤。両方の一価結合剤が同じエピトープに結合する、請求項10に記載の二価結合剤。ポリペプチド二量体がヘテロ二量体である、請求項1~6のいずれかに記載の二価結合剤または請求項7~9のいずれかに記載の方法。ポリペプチド二量体に関する組織染色法であって、以下の工程:a細胞または組織試料を提供し、b前記の試料をポリペプチド二量体に結合することができる二価結合剤と共に保温し、該結合剤はリンカーを介して互いに連結されている2個の一価結合剤からなり、ここで第1一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第1標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここで第2一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第2標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでそれぞれの一価結合剤は5×10-3/秒~10-4/秒の範囲のKdissを有し、ここで該二価結合剤は3×10-5/秒以下のKdissを有し、そしてc該二価結合剤を検出し、それにより前記の試料をポリペプチド二量体に関して染色する;を含む、前記方法。細胞または組織試料の染色における、請求項1~6のいずれかに記載の二価結合剤の使用。1態様において、本発明はポリペプチド二量体に結合することができる二価結合剤に関し、その結合剤はリンカーを介して互いに連結されている2個の一価結合剤からなり、aここでその第1一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第1標的ポリペプチドのエピトープに結合し、bここでその第2一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第2標的ポリペプチドのエピトープに結合し、cここでそれぞれの一価結合剤は5×10-3/秒~10-4/秒の範囲のKdissを有し、dここでその二価結合剤は3×10-5/秒以下のKdissを有する。時々、単独のポリペプチドはそのタンパク質が活性であるのに十分である。しかし、上記で示したように、タンパク質がその特定の機能を果たすことを可能にするために、しばしば2個以上のポリペプチドが相互作用することが必要である。この場合、例えば2個のポリペプチド鎖が互いに会合している場合のタンパク質またはポリペプチドについて言及している。その二量体形成は2個のポリペプチド鎖の間の相互作用に由来し、および/またはそれはリガンドの結合により誘発され得る。二量体は、水素結合、イオン結合、ならびにより一般的でないが疎水性界面および鎖間ジスルフィド結合により一緒の状態を保たれている。受容体のホモおよび/またはへテロ二量体化は、細胞活性および生理的および/または病理的プロセスの制御において極めて重要な機構である。本発明の意味における二量体は、2個のポリペプチド鎖が会合しており、生物学的に関連する複合体を形成する場合に存在する。その二量体は膜結合型二量体であってよく、またはそれは循環中に存在する二量体、すなわち生理的条件下で安定である2個のポリペプチドの複合体であってよい。1態様において、それらが天然に存在するような二量体中の2個のポリペプチド鎖は共有結合的に連結されているのではなく、タンパク質間相互作用により、例えばイオン架橋ionbridgesまたはファンデルワールスvanderWals力に基づいて一緒の状態を保たれている。本発明に従う二価結合剤は、正確に2個の一価結合剤を含む結合剤である。好ましい態様において、それぞれの一価結合剤の、および二価結合剤の動態学的速度特性は、実施例において詳細に記述されるようなBiacore商標SPR技術により特性付けられる。当業者は理解するであろうように、本発明において記述される二価結合剤は、望まれるように単離および精製することができる。1態様において、本発明は本明細書において開示されるような単離された二価結合剤に関する。単離された二価結合剤は、同定され、例えばそのような二価結合剤の合成において用いられる試薬混合物から分離および/または回収された二価結合剤である。そのような反応混合物の望まれない構成要素は、例えば最終的にその望まれる二価結合剤にならなかった一価結合剤である。1態様において、その二価結合剤は80より大きい純度まで精製される。一部の態様において、その二価結合剤はそれぞれ90重量、95重量、98重量または99重量より大きい純度まで精製される。両方の一価結合剤がポリペプチドである場合、純度は例えば還元または非還元条件下でのSDS-PAGEにより、タンパク質検出において例えばクーマシーブルーまたは銀染色を用いて容易に決定される。純度を核酸レベルで評価する場合、サイズ排除クロマトグラフィーを適用して二価結合剤を副産物から分離し、260nmにおけるDOを監視してその純度を評価する。冠詞aおよびanは、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の1個を、または1個より多くをすなわち少なくとも1個を指して用いられる。例として、抗体anantibodyは1個の抗体または1個より多くの抗体を意味する。用語オリゴヌクレオチドまたは核酸配列は、本明細書で用いられる際、一般に短い、一般に一本鎖の、少なくとも8ヌクレオチドを、最大で約1000ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも9、10、11、12、15、18、21、24、27または30ヌクレオチドの長さを有するであろう。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35または30ヌクレオチドより長くない長さを有するであろう。下記でポリヌクレオチドに関して示す記述は、オリゴヌクレオチドに等しく、かつ完全に適用可能である。オリゴヌクレオチドという用語は広く理解されるべきであり、DNAおよびRNAならびにそれらの類似体および修飾を含む。オリゴヌクレオチドは、例えば標準的な塩基であるデオキシアデノシンdA、デオキシグアノシンdG、デオキシシトシンdC、デオキシチミジンdT、デオキシウラシルdUにおいて置換基を有する置換されたヌクレオチドを含有していてよい。そのような置換された核酸塩基の例は次のものである:5-置換ピリミジン類、例えば5メチルdC、アミノアリルdUまたはdC、5-アミノエチル-3-アクリルイミド-dU、5-プロピニル-dUまたはdC、5ハロゲン化-dUまたはdC;N置換ピリミジン類、例えばN4-エチル-dC;N置換プリン類、例えばN6-エチル-dA、N2-エチル-dG;8置換プリン類、例えば8-[6-アミノ-ヘキサ-1-イル]-8-アミノ-dGまたはdA、8ハロゲン化dAまたはdG、8-アルキルdGまたはdA;および2置換dA、例えば2アミノdA。オリゴヌクレオチドはヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体を含有していてよい。すなわち、天然存在核酸塩基を以下のような核酸塩基類似体を用いることにより交換することができる:5-ニトロインドールdリボシド;3ニトロピロールdリボシド、デオキシイノシンdI、デオキシキサントシンdeoyxanthosinedX;7デアザ-dG、-dA、-dIまたは-dX;7-デアザ-8-アザ-dG、-dA、-dIまたは-dX;8-アザ-dA、-dG、-dIまたは-dX;dホルマイシン;プソイドdU;プソイドイソdC;4チオdT;6チオdG;2チオdT;イソdG;5-メチル-イソ-dC;N8-結合型8-アザ-7-デアザ-dA;5,6-ジヒドロ-5-アザ-dC;およびエテノ-dAまたはピロロ-dCpyrollo-dC。当業者には明らかであるように、相補鎖中の核酸塩基は二本鎖形成が特異的であるような様式で選択されなければならない。例えば、5-メチル-イソ-dCが一方の鎖例えばaにおいて用いられるならば、イソdGがその相補鎖例えばa’中になければならない。そのオリゴヌクレオチド主鎖は、置換された糖残基、糖類似体、ヌクレオシド間ホスフェート部分における改変を含有するように改変されてよく、および/またはPNAであってよい。オリゴヌクレオチドは、例えば2’-メトキシ、2’-フルオロ、2’-メチルセレノ、2’-アリルオキシ、4’-メチルdNここでNは核酸塩基、例えばA、G、C、TまたはUであるのような置換されたデオキシリボースを有するヌクレオチドを含有していてよい。糖類似体は、例えばキシロース;2’-O,4’-Cメチレン-LNAとして知られるオリゴマーまたは2’-O,4’-Cエチレン-ENAとして知られるオリゴマーのような2’,4’架橋リボース;L-リボース、L-d-リボース、ヘキシトールHNAとして知られるオリゴマー;シクロヘキセニルCeNAとして知られるオリゴマー;アルトリトールANAとして知られるオリゴマー;C3’およびC5’原子がエチレン架橋により連結されており、それが縮合してシクロプロパン環になっている三環式リボース類似体トリシクロDNAとして知られるオリゴマー;グリセリンGNAとして知られるオリゴマー;グルコピラノースホモDNAHomoDNAとして知られるオリゴマー;カルバリボースcarbariboseテトラヒドロフラン小単位の代わりにシクロペンタンを有する;ヒドロキシメチル-モルホリンモルホリノDNAとして知られるオリゴマーである。多数のヌクレオシド間ホスフェート部分の改変もハイブリダイゼーション特性に干渉しないことが分かっており、そのような主鎖の改変は置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と組み合わせることもできる。例はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートおよびメチルホスホネートオリゴヌクレオチドである。PNAホスフェートおよびd-リボースなしの主鎖を有するもDNA類似体として用いることができる。上記で言及した修飾されたヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ならびにオリゴヌクレオチド主鎖の改変は、本発明の意味でのオリゴヌクレオチド中で望まれるように組み合わせることができる。用語ポリペプチドおよびタンパク質は互換的に用いられる。本発明の意味でのポリペプチドは、アルファアミノペプチド結合により連結された少なくとも5個のアミノ酸からなる。標的ポリペプチドは、それに関して決定または測定のための方法が求められている対象のポリペプチドである。本発明の標的ポリペプチドは、ホモまたはヘテロ二量体型ポリペプチド複合体を形成することが既知である、または疑われるポリペプチドである。本発明に従う一価結合剤は、標的ポリペプチドと単一の結合部位において5×10-3/秒~10-4/秒のKdissで相互作用する分子である。動態学的結合速度特性の生物物理学的特性付け、それぞれラングミュアモデルに従う解離速度定数kd1/sの決定は、好ましくはバイオセンサーに基づく表面プラズモン共鳴分光法により分析される。好ましくは、実施例の節において詳細に記述されるようなBiacore商標技術が用いられる。一価結合剤の例は、ペプチド、ペプチド模倣物、アプタマー、spiegelmer、darpin、レクチン、アンキリンリピートタンパク質、Kunitz型ドメイン、単一ドメイン抗体HeyTetalTrendsBiotechnol23514522参照および抗体の一価断片である。当業者には明らかであるように、本発明に従うそれぞれの一価結合剤は標的ポリペプチド上の単一のエピトープにのみ結合する。特定の好ましい態様において、その一価結合剤は一価抗体断片、好ましくはモノクローナル抗体に由来する一価断片である。一価抗体断片には下記で提供するようなFab、Fab’-SHFab’、単一ドメイン抗体、Fv、およびscFv断片が含まれるが、それらに限定されない。好ましい態様において、その一価結合剤のすくなくとも一方は、単一ドメイン抗体、モノクローナル抗体のFab断片またはFab’断片である。本明細書で開示される二価結合剤においてその一価結合剤の両方がモノクローナル抗体に由来し、Fab断片である、またはFab’断片である、またはFab断片およびFab’断片であることも、好ましい態様である。モノクローナル抗体の技法は、特異的なモノクローナル抗体またはその断片の形態の極めて特異的な結合剤の製造を可能にする。当技術で特に周知であるのは、マウス、ウサギ、ハムスター、またはあらゆる他の哺乳類を目的のポリペプチドで免疫することによりモノクローナル抗体またはその断片を作り出すための技法である。モノクローナル抗体またはその断片を作り出す別の方法は、sFv単鎖可変領域、特にヒトのsFvのファージライブラリーの使用である例えば、Griffithsetal,米国特許第5885793号;McCaffertyetal,国際公開第9201047号;Limingetal,国際公開第9906587号を参照。抗体断片は伝統的な手段、例えば酵素消化により、または組み換え技法により生成されてよい。特定の抗体断片の総説に関して、HudsonPJetalNatMed9129134を参照。Fvは完全な抗原結合部位を含有する最小限の抗体断片であり、定常領域を欠いている。1態様において、2鎖Fv種は堅固に非共有結合的に会合した1個の重鎖可変ドメインおよび1個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖FvscFv種の1態様において、1個の重鎖可変ドメインおよび1個の軽鎖可変ドメインが、その軽鎖および重鎖が2鎖Fv種における二量体構造に類似した二量体構造で会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーにより共有結合的に連結されていることができる。scFvの総説に関して、例えばPlueckthunInThePharmacologyofMonoclonalAntibodiesVol113RosenburgandMooreSpringerVerlagニューヨークpp269315を参照;国際公開第9316185号ならびに米国特許第5571894号および第5587458号も参照。一般に、6個の超可変領域HVRが抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変領域または抗原に特異的な3個のHVRのみを含むFvの半分でさえも抗原を認識して結合する能力を有する。Fab断片は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1定常ドメインCH1も含有する。Fab’断片は、抗体ヒンジ領域からの1個以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端における少数の残基の追加によりFab断片と異なる。Fab’-SHは、その定常ドメインのシステイン残基単数または複数が遊離のチオール基を有するFab’に関する本明細書における名称である。抗体断片の生成のために様々な技法が開発されてきた。伝統的に、抗体断片は完全な抗体のタンパク質分解による消化により得られた107117およびBrennanetalScience2298183を参照。例えば、抗体のパパイン消化は、Fab断片と呼ばれそれぞれが単一の抗原結合部位を有する2個の同一の抗原結合断片および残りのFc断片を生成し、その名前は容易に結晶化するその能力を反映している。抗体断片は組み換え宿主細胞により直接生成することもできる。Fab、FvおよびscFv抗体断片は全て大腸菌中で発現させてそれから分泌させることができ、従ってこれらの断片の容易な大量生産が可能である。抗体断片は、標準的な手順に従って抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab’-SH断片は大腸菌から直接回収することができる163167。哺乳類細胞系も、抗体断片を発現させる、そして望まれるならば分泌させるために用いることができる。特定の態様において、本発明の一価結合剤は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒトの単一ドメイン抗体であるDomantisIncWalthamMA;例えば米国特許第6248516B1号を参照。1態様において、単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部からなる。2個の一価結合剤の1つである第1一価結合剤は、第1標的ポリペプチド上のエピトープに結合する。本発明に従うエピトープ-対応する一価結合剤により結合される標的ポリペプチド上の結合部位-は、アミノ酸からなる。そのアミノ酸は天然存在アミノ酸であり、または1個以上の二次修飾を有してcaryいてよい。1態様において、そのアミノ酸は二次修飾されていない。1態様において、その一価結合剤は線状エピトープ、すなわち一続きの5~12個の連続したアミノ酸からなるエピトープに結合するか、またはその一価結合剤はその標的ポリペプチドの空間的配置により形成される三次構造に結合するかのどちらかである。結合剤により、例えば抗体の抗原認識部位またはパラトープにより認識される三次エピトープは、抗原分子の三次元表面特徴であると考えることができ;これらの特徴はその結合剤の対応する結合部位中に正確に納まり、それにより結合剤および標的ポリペプチドの間の結合が促進される。本明細書で開示されるような二価結合剤において、第1一価結合剤は第1ポリペプチド上のエピトープに結合し、第2一価結合剤は第2ポリペプチド上のエピトープに結合する。ポリペプチド二量体中の第1および第2ポリペプチドは同一の配列を有することができ、すなわちこの二量体はホモ二量体であり、または第1および第2ポリペプチドは異なっていることができ、すなわちこの二量体はヘテロ二量体である。上記で言及したように、多くの受容体分子に関して、ポリペプチドホモまたはヘテロ二量体それぞれの形成は細胞シグナル伝達およびタンパク質活性の制御への鍵である。これは膜結合型受容体、特にいわゆる受容体型チロシンキナーゼRTKに関して特に知られており、当てはまる。名称が既に示唆しているように、そのRTKの細胞内シグナル伝達の少なくとも一部はそのようなRTKの細胞内ドメインの特定のチロシンのリン酸化状態により媒介される。従って、1つの好ましい態様において、本発明は受容体ポリペプチド二量体に結合する二価結合剤に関する。明らかに、そのような二価結合剤は活性なホモまたはヘテロ二量体型受容体ポリペプチドの検出において非常に有用である。1つの好ましい態様において、本発明は本明細書において上記で開示したような二価結合剤に関し、ここでその標的ポリペプチド二量体は、膜結合型受容体分子からなる群から、好ましくは2個の受容体型チロシンキナーゼポリペプチドの会合により形成されるホモまたはヘテロ二量体から選択される。一部の態様において、ホモまたはヘテロ二量体の一部であるRTKポリペプチドは以下のものからなる群から選択される:ALK、接着関連キナーゼ受容体例えばAxl、ERBB受容体例えばEGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、エリスロポエチン産生肝細胞性EPH受容体例えばEphA1;EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB5、EphB6、線維芽細胞成長因子FGF受容体例えばFGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5、Fgr、IGFIR、インスリンR、LTK、M-CSFR、MUSK、血小板由来成長因子PDGF受容体例えばPDGFR-A、PDGFR-B、RET、ROR1、ROR2、ROS、RYK、血管内皮成長因子VEGF受容体例えばVEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLK1、VEGF3、免疫グロブリン様およびEGF様ドメインを有するチロシンキナーゼTIEの受容体例えばTIE-1、TIE-2/TEK、Tec、TYRO10、インスリン様成長因子IGF受容体例えばINS-R、IGF-IR、IR-R、ジスコイジンドメインDD受容体例えばDDR1、DDR2、c-Metに関する受容体MET、マクロファージ刺激1受容体macrophagestimulating1receptorとしても知られているrecepteurd’originenantaisRON、Flt3fins関連チロシンキナーゼ3Flt3、コロニー刺激因子1CSF1受容体、c-kitに関する受容体KIT、SCFRおよびインスリン受容体関連IRR受容体。1態様において、ホモまたはヘテロ二量体の一部であるRTKは以下のものからなる群から選択される:ERBB受容体例えばEGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、血小板由来成長因子PDGF受容体例えばPDGFR-A、PDGFR-Bならびに血管内皮成長因子VEGF受容体および補助受容体例えばVEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLK1、VEGF3、ニューロピリン-1、ニューロピリン-2、インスリン様成長因子IGF受容体例えばINS-R、IGF-IR、IR-R、ならびにインスリン受容体関連IRR受容体。1態様において、ホモまたはヘテロ二量体の一部であるRTKは以下のものからなる群から選択される:ERBB受容体例えばEGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、血小板由来成長因子PDGF受容体例えばPDGFR-A、PDGFR-Bならびに血管内皮成長因子VEGF受容体および補助受容体例えばVEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLK1、VEGF3、ニューロピリン-1、ニューロピリン-2、インスリン様成長因子IGF受容体例えばINS-R、IGF-IR、IR-R、ならびにインスリン受容体関連IRR受容体。1態様において、本発明は、ポリペプチド二量体に結合することができる二価結合剤に関し、その結合剤はリンカーを介して互いに連結されている2個の一価結合剤からなり、ここでその第1一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第1標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでその第2一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第2標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでそれぞれの一価結合剤は5×10-3/秒~10-4/秒の範囲のKdissを有し、ここでその二価結合剤は3×10-5/秒以下のKdissを有し、ここで前記の二量体はERBB受容体例えばEGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4および血管内皮成長因子VEGF受容体および補助受容体例えばVEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLK1、VEGF3、ニューロピリン-1、ニューロピリン-2からなる群から選択される。1態様において、受容体のホモおよび/またはヘテロ二量体化はVEGFシグナル伝達に関わるポリペプチドに関する。それには血管内皮成長因子およびそれらの対応する受容体が1つの具体例として含まれる完全な詳細に関して、OtrockZetalBloodCellsMoleculesandDiseases38258268を参照。VEGFシグナル伝達は、しばしば生理的血管新生における重要な律速段階である。血管新生は既存の血管からの新しい血管の出芽sproutingである。このプロセスは、胎児発生および組織修復の間の新しい血管の成長に関して重要である;しかし、制御されない血管新生は新生物疾患および他の障害を促進する。このプロセスの実行の成功は、成長促進因子および成長抑制因子の釣り合いに依存する。血管新生の最も特異的かつ重要な制御因子の1つがVEGFである。VEGFファミリーは、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盤成長因子PIGFおよびVEGF-Fと呼ばれる7種類の分泌糖タンパク質を含む。そのVEGFファミリーのメンバーはそれらの同族の受容体に結合する。今までに同定された受容体は、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3およびニューロピリン類NP-1およびNP-2と呼ばれている。VEGF-Aはその生物学的作用を細胞表面受容体との相互作用を通して及ぼす。これらの受容体は膜貫通型チロシンキナーゼ受容体であり、それらには血管内皮細胞上で選択的に発現しているVEGF受容体-1VEGFR-1;Flt-1およびVEGFR-2キナーゼ挿入ドメイン含有受容体/Flk-1、ならびに血管内皮およびニューロン上で発現しているニューロピリン受容体NP-1およびNP-2が含まれる。VEGF-Aのその受容体の細胞外ドメインへの結合の際、その細胞内受容体型チロシンキナーゼの二量体化および自己リン酸化の後、下流のタンパク質のカスケードが活性化される。VEGFR-2はVEGF-Aの血管新生促進作用の媒介に寄与する主な受容体であるようである。VEGFR-1fms様チロシンキナーゼ;Flt-1は7個の細胞外免疫グロブリンIg相同ドメイン、単一の膜貫通領域および細胞内チロシンキナーゼドメインからなる。VEGFR-1はVEGF-A、VEGF-BおよびPIGFに高い親和性で結合する。VEGFR-2KDR、ヒト;Flk-1、マウスは1991年に最初に単離され、キナーゼ挿入ドメイン含有受容体KDRと名付けられた。VEGFR-1のように、VEGFR-2は7個の免疫グロブリンIg様ドメインを有する細胞外領域、膜貫通ドメインおよび約70アミノ酸の挿入を有するチロシンキナーゼドメインを有する。VEGFR-2はVEGF-A、VEGF-C、VEGF-DおよびVEGF-Eに結合する。内皮細胞受容体型チロシンキナーゼのメンバーであるVEGFR-3fms様チロシンキナーゼ4、Flt4は6個のみのIg相同ドメインを有する[121]。VEGFR-3はVEGF-CおよびVEGF-Dに優先的に結合する。VEGF受容体1、2および3はリガンド結合の際にホモ二量体を形成することができ、それは活性であり、細胞内チロシンキナーゼドメインを介してそれらの作用を及ぼす。しかし、ホモ二量体の形成は作用の唯一の方式ではなく、いわゆるso-aclledニューロピリン類が補助受容体として重要な役割を果たす。ニューロピリンNP-1は最初に、軸索およびニューロンの発生における反発性誘導シグナルの役目を果たす分泌型および膜貫通タンパク質の大きなファミリーであるセマフォリン/コラプシン類に関する受容体の役目を果たす130~140kDaの細胞表面糖タンパク質として同定された。NP-1はVEGF-A、VEGF-BおよびPIGFに結合し、一方でNP-2はVEGF-A、VEGF-CおよびPIGFに結合する。NP-1はVEGF-A-VEGFR-2の相互作用を増進する補助受容体として作用し、VEGFR-1と複合体を形成し、生体内で腫瘍の血管新生を増強する。この経路を調べるため、VEGFR-2/NP-1ヘテロ二量体の特異的な検出が必要である。最近の研究は、NP-2をリンパ管の発生に結びつけた。上記で指摘したように、VEGFファミリーの受容体のメンバーはそれらが単量体である限り活性でないが、リガンドが結合してホモおよび/またはヘテロ二量体化すると、異なる作用様式につながる一連の異なる生化学経路が誘導される。不活性な単量体および様々なホモおよび/またはヘテロ二量体を区別する能力は、VEGF/VEGF受容体系の生理学的作用様式およびこの系の1個以上のメンバーを標的とする薬物の作用の解明において極めて重要である。1態様において、本発明は、ポリペプチド二量体に結合することができる二価結合剤に関し、その結合剤はリンカーを介して互いに連結されている2個の一価結合剤からなり、ここでその第1一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第1標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでその第2一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第2標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでそれぞれの一価結合剤は5×10-3/秒~10-4/秒の範囲のKdissを有し、ここでその二価結合剤は3×10-5/秒以下のKdissを有し、ここでホモおよび/またはヘテロ二量体はVEGF/VEGF受容体系の一部である。そのような結合剤において、1態様において、一方の一価結合剤はVEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盤成長因子PIGFおよびVEGF-Fからなる群から選択されるVEGFに結合し、他方の一価結合剤はVEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3およびニューロピリン類NP-1およびNP-2からなる群から選択される受容体に結合する。または、そのような受容体は、1態様において、VEGFR-1、VEGFR-2およびVEGFR-3からなる群から選択される受容体ポリペプチドに結合する一方の一価結合剤およびニューロピリンNP-1またはNP-2に結合する他方の一価結合剤を有する。論じられたように、本明細書で開示されるような二価結合剤の構築における使用のための一価結合剤は、5×10-3/秒から10-4/秒までのKdissを有していなければならない。好ましくは、その第1一価結合剤は第1ポリペプチド上のエピトープに特異的に結合している。すなわち、この結合剤はヘテロ二量体二価結合剤に関する場合のように第2標的ポリペプチド上に存在しないエピトープに結合するか、またはそれはホモ二量体二価結合剤に関する場合のように第2標的ポリペプチド上に存在するpersntエピトープと重複する、もしくは同一であるエピトープに結合するかのどちらかである。ポリペプチドエピトープへの特異的な結合は、前記の結合剤がその標的ポリペプチド上のエピトープに関してあらゆる他のペプチド上の例えば第1および第2標的ポリペプチドが異なる場合に第2標的ポリペプチド上のあらゆる類似の、または完全に無関係のエピトープと比較して少なくとも20倍低いKdissを有する場合に認められる。ヘテロ二量体中のポリペプチドは、一価結合剤がそのポリペプチドの一方のみに特異的に結合する場合に、異なると認められる。第1一価結合剤の第1標的ポリペプチド上のエピトープに対するKdissがあらゆる他のポリペプチド上のあらゆるエピトープと比較して少なくとも30、40、50、80、90、95または少なくとも100倍低いことも好ましい。1つの好ましい態様において、本明細書で開示する二価結合剤は、2個の異なるポリペプチドを含むヘテロ二量体に結合する。この場合、第2一価結合剤は好ましくはその第1ポリペプチドに関してそれの第2標的ポリペプチドへの結合に関するKdissと比較して少なくとも20倍低いKdissを有するように選択される。第2一価結合剤の第2標的ポリペプチドに対するKdissが第1標的ポリペプチド上のあらゆるエピトープに関するKdissと比較して少なくとも30、40、50、80、90、95または少なくとも100倍低いことも好ましい。上記で言及したように、本発明に従う二価結合剤は最大で3×10-5/秒の、またはより低い、すなわちより良いKdissを有するであろう。この発明に従う二価結合剤における1態様において、それぞれの一価結合剤は2×10-3/秒から10-4/秒までのKdissを有する。この発明に従う二価結合剤における1態様において、それぞれの一価結合剤は10-3/秒から10-4/秒までのKdissを有する。VentanaMedicalSystemsInc.ツーソンが流通させている自動免疫組織化学染色機械は、かなりストリンジェントな洗浄条件を用いる。BenchMark登録商標分析器シリーズにおいて用いられる抗体は、適当な染色強度を与えるために最大で5×10-5/秒のKdissを有するべきである。Kdissがより低いほど、染色強度もより良いであろう。本明細書で開示するような二価結合剤は、最大で3×10-5/秒のKdissを有する。さらなる態様において、本明細書で開示するような二価結合剤は2×10-5/秒以下のKdissを有し、または10-5/秒以下のKdissも好ましい。1態様において、それぞれの一価結合剤の、およびその二価結合剤の動態学的速度特性は、実施例において詳細に記述されるようなBiacore商標SPR技術により特性付けられる。本発明に従う二価結合剤はリンカーを含有する。そのリンカーがその2個の一価結合剤を共有結合的に連結することもでき、またはそのリンカーおよびその一価結合剤が2個の異なる特異的な結合対a:a’およびb:b’により結合していることもできる。そのリンカーは、例えば一緒に、およびその2個の一価結合剤に共有結合により連結された適切な単量体で構成されていてよい。好ましくは、そのリンカーは糖部分、ヌクレオチド部分、ヌクレオシド部分および/またはアミノ酸を含有するであろう。特定の好ましい態様において、そのリンカーは本質的にヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはアミノ酸からなるであろう。好ましくは、その2個の一価結合剤を結合対により共有結合的に連結している、または結合させているリンカーは、6~100nmの長さを有する。そのリンカーが6~50nmの、または6~40nmの長さを有することも好ましい。やはり好ましい態様において、そのリンカーは10nm以上の、または15nm以上の長さを有するであろう。1態様において、本発明に従う二価結合剤中に含まれるリンカーは10nm~50nmの長さを有する。理論上の、および複合的な方法による、所与のリンカーa-S-bの非ヌクレオシド構成要素の長さは、その非ヌクレオシド構成要素に化学的に類似した化合物の既知の結合距離および結合角を用いることにより計算することができる。そのような結合距離は、標準的な教本:CRCHandbookofChemistryandPhysics第91版20102011第9節においていくつかの分子に関して要約されている。しかし、正確な結合距離はそれぞれの化合物に関して異なる。その結合角においても変動性が存在する。従って、そのような計算において平均のパラメーター分かりやすい近似値を用いることがより実際的である。スペーサーまたはリンカーの長さの計算において、以下の近似値が適用される:a非ヌクレオシド構成要素の長さの計算に関して、連結された原子の性質とは無関係に、180°の結合角を伴う130pmの平均結合長が用いられ;b一本鎖中の1個のヌクレオチドは500pmで計算され、そしてc二本鎖中の1個のヌクレオチドは330pmで計算される。130pmの値は、2個のCsp3の間の結合角が109°28’および距離が153pmであるCsp3-Csp3-Csp3鎖の2個の末端の炭素原子の距離がおおよそ250pmであり、それは180°の仮定された結合角および125pmの2個のCSp3の間の結合距離に換算されるという計算に基づく。PおよびSのような複素原子ならびにsp2およびsp1のC原子もそのスペーサーの一部であり得ることを考慮して、130pmの値が採用される。スペーサーがシクロアルキルまたはアリールのような環構造を含む場合、その距離は類似の方法で、その距離を定めている原子鎖全体の一部である前記の環構造の結合の数を数えることにより計算される。上記で言及したように、そのリンカーがその2個の一価結合剤を共有結合的に連結することもでき、またはそのリンカーおよびその一価結合剤が2個の異なる特異的な結合対a:a’およびb:b’により結合していることもできる。従って、ポリペプチド二量体に結合する本発明に従う二価結合剤は、下記の式Iにより表すこともでき:A-a’:a-S-b:b’-B、ここでAは前記の第1標的ポリペプチドのエピトープに結合する第1一価結合剤であり、ここでBは前記の第2標的ポリペプチドのエピトープに結合する第2一価結合剤であり、ここでそれぞれの一価結合剤AおよびBは5×10-3/秒~10-4/秒の範囲のKdissを有し、ここでa’:aならびにb:b’は独立して結合対であり、またはa’:aおよび/またはb:b’は共有結合しており、ここでa’:aおよびb:b’は異なり、ここでSはスペーサーであり、ここで-は共有結合を表し、ここでそのリンカーa-S-bは6~100nmの長さを有し、ここでその二価結合剤は3×10-5/秒以下のKdissを有する。a-S-bからなるリンカーLは、6~100nmの長さを有する。好ましくは、a-S-bからなるリンカーLは6~80nmの長さを有する。そのリンカーが6~50nmの、または6~40nmの長さを有することも好ましい。やはり好ましい態様において、そのリンカーは10nm以上の長さを、または15nm以上の長さを有するであろう。1態様において、そのリンカーは10nm~50nmの長さを有する。1態様において、aおよびbはそれぞれ結合対のメンバーであり、それぞれ少なくとも2.5nmの長さを有する。スペーサーSは、例えば望まれる長さを、ならびに他の望まれる特性を提供するために必要であると解釈することができる。そのスペーサーは、例えば完全または部分的に天然存在または非天然存在アミノ酸で、ホスフェート-糖単位、例えば核酸塩基なしのDNA様主鎖で、グリコペプチド性glyco-peptidic構造で、または少なくとも部分的に糖単位で、または少なくとも部分的にグリコール類もしくはアクリルアミドのような重合可能な小単位で構成されていることができる。本発明に従う化合物中のスペーサーSの長さは、望まれるように異なっていてよい。多様な長さの利用可能なスペーサーライブラリーを容易に作製するために、そのようなライブラリーのスペーサーへの簡単な合成経路accessを有することが好ましい。スペーサーの組み合わせ固相合成が好ましい。スペーサーは約100nmの長さまで合成されなければならないため、その合成戦略は、その単量体合成構築ブロックが固相合成の間に高い効率で組み立てられるような方法で選択される。単量体構築ブロックとしてのホスホラミダイトの組み立てに基づくデオキシオリゴヌクレオチドの合成は、完全にこの要求を満たす。そのようなスペーサー中で、スペーサー内の単量体単位は、それぞれの場合においてホスフェートまたはホスフェート類似体部分により連結されている。そのスペーサーSは、多官能性アミノカルボン酸の遊離の正または/および負に荷電した基、例えばアミノ、カルボキシレートまたはホスフェートを含有することができる。例えば、その電荷担体は、a1個のアミノ基および2個のカルボキシレート基またはb2個のアミノ基および1個のカルボキシレート基を含有する三官能性アミノカルボン酸に由来することができる。そのような三官能性アミノカルボン酸の例は、リシン、オルニチン、ヒドロキシリシン、α,β-ジアミノプロピオン酸、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸、カルボキシグルタミン酸ならびにEPA0618192またはUSA5519142において記述されている合成三官能性カルボン酸のような合成三官能性カルボン酸である。あるいは、その三官能性アミノカルボン酸a中のカルボキシレート基の1つをホスフェート、スルホネートまたはサルフェート基により置き換えることができる。そのような三官能性アミノ酸の例はホスホセリンである。そのスペーサーSは、無電荷の親水基も含有することができる。無電荷の親水基の好ましい例は、エチレンオキシドまたは好ましくは少なくとも3個のエチレンオキシド単位を有するポリエチレンオキシド基、スルホキシド、スルホン、カルボン酸アミド、カルボン酸エステル、ホスホン酸アミド、ホスホン酸エステル、リン酸アミド、リン酸エステル、スルホン酸アミド、スルホン酸エステル、硫酸アミドおよび硫酸エステル基である。そのアミド基は、好ましくは第1級アミド基、特に好ましくはアミノ酸例えばアミノ酸アスパラギンおよびグルタミン側鎖基中のカルボン酸アミド残基である。そのエステルは好ましくは親水性アルコール類、特にC1~C3アルコール類またはジオール類またはトリオール類に由来する。1態様において、そのスペーサーSは1タイプの単量体からなる。例えば、そのスペーサーは排他的にアミノ酸、糖残基、ジオール類、リン糖酸phospho-sugar単位からなり、またはそれはそれぞれ核酸であることができる。1態様において、そのスペーサーはDNAである。1つの好ましい態様において、そのスペーサーは、ベータ-L-DNA、L-DNAまたは鏡像DNAとしても知られているDNAのL-立体異性体である。L-DNAは、2本のL-DNAの相補的な一本鎖の間でのみ二本鎖が形成され、L-DNAの一本鎖および相補的なDNA鎖の間では二本鎖が形成されないことを意味する直交orthogonalハイブリダイゼーション挙動、ヌクレアーゼ耐性、ならびに長いスペーサーでさえも合成が容易であることのような利点を特徴とする。指摘したように、合成の容易さおよびスペーサーの長さにおける変動可能性は、スペーサーライブラリーに関して重要である。変動可能な長さのスペーサーは、最適な長さのスペーサーを有する本発明に従う二価二重結合剤の同定、従って2個の一価結合剤の間の最適な距離の提供において極めて有用である。スペーサー構築ブロックは、その名の通り、間隔を空ける部分をスペーサーSの中に導入するために、またはリンカーa-S-bのスペーサーSを構築するために用いることができる。異なる数および種類の非ヌクレオチド性ならびにヌクレオチド性スペーサー構築ブロックが、間隔を空ける部分を導入するためにすぐに利用できる。多くの異なる非ヌクレオチド性二官能性スペーサー構築ブロックが文献において既知であり、多種多様なものが商業的に入手可能である。非ヌクレオチド性二官能性スペーサー構築の選択は、そのスペーサー分子の電荷および柔軟性に影響を及ぼす。二官能性スペーサー構築ブロックにおいて、酸不安定性保護基で保護されたヒドロキシル基がホスホラミダイト基に連結されている。1態様における二官能性スペーサー構築ブロックは、非ヌクレオシド性化合物である。例えば、そのようなスペーサーはC2~C18アルキル、アルケニル、アルキニルalkinyl炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニルalkinyl鎖はそのリンカーの親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび/またはアミド部分または四級化されたquarternized陽イオン性アミン部分により遮られていてよい。場合により1または2個のC1~C6アルキル基で置換されているC5~C6-シクロアルキル、C4N、C5N、C4O、C5O-ヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状部分も、非ヌクレオシド性二官能性スペーサー部分として用いることができる。好ましい二官能性構築ブロックは、C3~C6アルキル部分およびトリ-~ヘキサ-エチレングリコール鎖を含む。表Iは、異なる親水性、異なる剛性および異なる電荷を有するヌクレオチド性二官能性スペーサー構築ブロックのいくつかの例を示す。一方の酸素原子は酸不安定性保護基、好ましくはジメトキシトリチルに連結されており、他方はホスホラミダイトの一部である。スペーサーSを構築する、またはスペーサーS中に間隔を空ける部分を導入するための簡単な方法は、標準的なDまたはLヌクレオシドホスホラミダイト構築ブロックを用いることである。1態様において、一本鎖の一続きのdTが用いられる。dTは塩基保護基を有しないため、これは好都合である。二本鎖の長さは一本鎖と比較して低減し、二本鎖は一本鎖よりも堅いため、スペーサーの長さ結合対のメンバーaおよびbの間の距離およびスペーサーの柔軟性を変化させるためにハイブリダイゼーションを用いることができる。ハイブリダイゼーションに関して、1態様において、官能性部分Xで修飾されたオリゴヌクレオチドが用いられる。ハイブリダイゼーションのために用いられるオリゴヌクレオチドは、そのスペーサーとハイブリダイズしない1または2個の末端の延長部分を有することができ、および/またはそれは内部で分枝している。そのようなスペーサーとハイブリダイズしないかつ結合対a:a’およびb:b’に干渉しない末端の延長部分は、さらなるハイブリダイゼーション事象のために用いることができる。1態様において、末端の延長部分とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは標識されたオリゴヌクレオチドである。この標識されたオリゴヌクレオチドも、さらなるハイブリダイゼーションを可能にするための末端の延長部分を含んでいてよく、または分枝していてよく、それによりポリヌクレオチドの凝集体またはデンドリマーを得ることができる。多数の標識polylabelをもたらすために、またはXの高い局所的濃度を得るために、好ましくはポリオリゴ核酸デンドリマーが用いられる。1態様において、スペーサーSは1~100nmの主鎖の長さを有する。言い換えると、ここで式Iの基aおよびbは1~100nm離れている。1態様において、aおよびbはそれぞれ結合対のメンバーであり、そのスペーサーSは1~95nmの主鎖の長さを有する。a’:aならびにb:b’はそれぞれ独立して結合対を表し、またはそれぞれ共有結合したa’:aおよび/またはb:b’を表す。a’:aならびにb:b’は異なる。異なるという用語は、a対a’の結合結合対内結合または共有結合性カップリングが他方の対b対b’の結合対内結合または共有結合性カップリングに干渉せず、逆もまた同じであることを示す。1態様において、a’:aまたはb:b’のどちらかは共有結合しており、他方、すなわちそれぞれb:b’またはa’:aは結合対を表す。1態様において、a’:aおよびb:b’の両方が共有結合している。a’:aおよびb:b’の間のカップリング化学は互いに異なっており、標準的なプロトコルから選択される。結合パートナーの、およびスペーサーの性質に応じて、適切なコンジュゲーション化学が選択される。a’のaへのカップリングにおいて、すなわちA-a’のaを含むリンカーへのカップリングにおいて用いられる化学は、bのb’へのカップリングにおいて、すなわちb’-Bのbを含むリンカーへのカップリングにおいて用いられる化学に干渉しない。当業者は理解しているであろうように、それぞれ共有結合a’:aならびにb:b’をもたらす反応部位a、a’、bおよびb’は、それぞれ好ましくは一価結合剤式IのAおよび/またはB上に存在する可能性のあるあらゆる官能基にも干渉しない。その一価結合剤の少なくとも一方がタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物である場合、それはおそらく1個以上のOH、COOH、NH2および/またはSH基を有し、それは潜在的に特定のカップリング試薬と反応する可能性がある。そのような副反応は、例えば表IIにおいて示したカップリング化学の1つを選択することにより回避することができる。表IIは、A-a’およびb’-Bそれぞれを両方ともリンカーに共有結合しているa-S-baおよびbそれぞれに結合させるためのルーチン的に用いられる反応基に関する概要を提供する。上記の双直交bi-orthogonalカップリング化学は、例えばその一価結合剤の少なくとも一方がポリペプチドである場合に適切である。その2個の結合パートナーが一価結合剤AおよびBとしてそれぞれ特定の反応性官能基を有していない場合、例えば2種類のアプタマーの組み合わせの場合、その反応部位a’、a、bおよびb’それぞれの選択にはより大きな自由度が存在する。従って、上記の表において示した対応する反応部位の対に加えて、またはそれとの組み合わせで、アミノ/活性エステル例えばNHSエステル、およびSH/SHまたはSH/マレインイミドを直交カップリングのために用いることができる。上記の例から明らかであるように、a’:a間およびb:b’間それぞれの共有結合の少なくとも一方はアルファアミノペプチド結合ではない。両方の共有結合がアルファアミノペプチド結合ではないことも好ましい。1態様において、a’:aおよびb:b’の両方が結合対である。結果的に、1態様において、本発明は式I:A-a’:a-S-b:b’-Bの少なくとも二重特異性の結合剤に関し;ここでAは第1標的ポリペプチドのエピトープに結合する第1一価結合剤であり、ここでBは第2標的ポリペプチド上のエピトープに結合する第2一価結合剤であり、ここでそれぞれの一価結合剤AおよびBは5×10-3/秒~10-4/秒の範囲のKdissを有し、ここでa’:aならびにb:b’は独立して結合対であり、かつ異なっており、ここでSはスペーサーであり、ここで-は共有結合を表し、ここでそのリンカーa-S-bは6~100nmの長さを有し、ここでその二価結合剤は3×10-5/秒以下のKdissを有する。この態様において、それぞれaおよびa’は結合対a’:aのメンバーであり、bおよびb’は結合対b:b’のメンバーである。好ましくは、結合対のそれぞれのメンバーは10kD以下の分子量である。さらなるやはり好ましい態様において、そのような結合対のそれぞれの結合剤の分子量は8、7、6、5または4kD以下である。1態様において、a’:aおよびb:b’は結合対であり、結合対a’:aおよびb:b’のメンバーはロイシンジッパードメイン二量体およびハイブリダイズする核酸配列からなる群から選択される。1態様において、両方の結合対はロイシンジッパードメイン二量体を表す。1態様において、両方の結合対はハイブリダイズする核酸配列である。a:a’またはb’:bが結合対を表す場合、そのような結合対に関するそのような結合対内の結合親和性は少なくとも108l/molである。両方の結合対は異なる。ある結合対に関して、違いは例えば相互結合reciprocalbinding、例えばaならびにa’のbまたはb’に対する結合に関する親和性が対a:a’内の親和性の10以下である場合に認められる。その相互結合、すなわちaならびにa’のbまたはb’それぞれに対する結合が対a:a’内の親和性の5以下である、またはそれが対a:a’内の親和性の2以下である場合も好ましい。1態様において、その違いは、その相互交差反応性結合が結合対内の特異的結合親和性と比較して1以下であるほど顕著である。用語ロイシンジッパードメインは、一続きのおおよそ35残基中に7残基ごとにロイシン残基が存在することを特徴とする一般的に認識されている二量体化ドメインを示すために用いられている。ロイシンジッパードメインは、それらがあるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーはいくつかのDNA結合タンパク質中で最初に同定され17591764、それ以来様々な異なるタンパク質中で見付かってきた。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または3量体化する天然存在ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性多量体タンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの例がPCT出願国際公開第9410308号において記述されており、そのロイシンジッパーはHoppeHJetalFEBSLett344191195において記述されている肺サーファクタントタンパク質DSPDに由来する。ロイシンジッパードメインは、アルファらせんのコイルドコイルにより一緒の状態を保たれた二量体結合対を形成する。コイルドコイルは一周につき3.5残基を有し、それは7残基ごとにそのらせんの軸に関して同等の位置を占めることを意味する。そのコイルドコイルの内側のロイシンの規則的な配列は、疎水性およびファンデルワールス相互作用によりその構造を安定化する。ロイシンジッパードメインが第1結合対a’:aおよび第2結合対b:b’を形成する場合、両方のロイシンジッパー配列は異なり、すなわち、配列aおよびa’はbおよびb’に結合しない。ロイシンジッパードメインは、そのようなドメインを含有することが既知である天然タンパク質、例えば転写因子から単離することができる。1つのロイシンジッパードメインが例えば転写因子fosに由来し、第2のロイシンジッパードメインが転写因子junに由来することができる。ロイシンジッパードメインは合成および設計のための当技術で既知の標準的な技法を用いて人工的に設計および合成することもできる。1つの好ましい態様において、結合対a’:aおよびb:b’の両方のメンバー、すなわちa、a’、bおよびb’はロイシンジッパードメインを表し、スペーサーSはアミノ酸からなる。この態様において、コンストラクトa-S-bの生成は容易に可能である。そのようなスペーサーSの長さを望まれるように変えることは、当業者にとって簡単である。そのようなポリペプチドは合成することができ、または組み換えにより生成することができる。例えば、N末端においてロイシンジッパーペプチドに、そしてC末端においてロイシンジッパーペプチドに融合したスペーサーポリペプチドを含む組み換え融合タンパク質を、標準的な技法に従って適切な宿主細胞中で発現させることができる。望まれるペプチドスペーサーをコードするDNA配列を、第1ロイシンジッパードメインaのメンバーをコードする配列および同じ読み枠中で第2ロイシンジッパードメインbのメンバーをコードするDNA配列の間に挿入することができる。そのスペーサーSは、そのリンカーa-S-bがポリペプチドである場合、1態様において、GGGGSアミノ酸配列モチーフを1回または数回含む。そのスペーサーSはタグ配列も含んでいてよい。そのタグ配列は、一般的に用いられるタンパク質認識タグ、例えばYPYDVPDYAまたはGLNDIFEAQKIEWHEから選択されてよい。1つの好ましい態様において、結合対a’:aおよびb:b’の両方がハイブリダイズする核酸配列である。名称により既に示されているように、aおよびa’ならびにbおよびb’はそれぞれ互いにハイブリダイズする。一方でaおよびa’中に含まれる核酸配列と他方でbおよびb’中に含まれる核酸配列は異なる。言い換えると、結合対a’:a中の配列はそれぞれ結合対b:b’の配列に結合せず、逆もまた同じである。1態様において、本発明は式Iの少なくとも二重の結合剤に関し、ここでその結合対a:a’およびb:b’それぞれは両方ともハイブリダイズする核酸配列であり、ここでその異なる結合対a’:aおよびb:b’のハイブリダイズする核酸配列は互いとハイブリダイズしない。言い換えると、aおよびa’は互いにハイブリダイズするが、bまたはb’のいずれにも結合せず、それらのハイブリダイゼーションにも干渉せず、逆もまた同じである。ハイブリダイゼーションの速度論およびハイブリダイゼーションの特異性は、融点分析により容易に監視することができる。結合対例えばa:a’の特異的なハイブリダイゼーションおよび例えばbまたはb’への不干渉は、対a:a’に関する融解温度がbまたはb’とのあらゆる可能性のある組み合わせそれぞれすなわちa:b;a:b’;a’:bおよびa’:b’と比較して少なくとも20°C高い場合に認められる。結合対、例えばa:a’またはあらゆる他の核酸配列に基づく結合対を形成する核酸配列は、あらゆる天然存在核酸塩基またはそれらに対する類似体を弱めてcompromiseよく、上記で記述したような改変された、もしくは改変されていない主鎖を、それが多数の塩基対合により安定な二本鎖を形成することができる限り、有していてよい。安定は、その二本鎖の融解温度が37°Cより高いことを意味する。好ましくは、その二本鎖は2本の完全に相補的な一本鎖からなる。しかし、37°Cにおける安定性が与えられる限り、ミスマッチまたは挿入が可能である。当業者は理解しているであろうように、核酸二本鎖は鎖間架橋によりさらに安定化され得る。いくつかの適切な架橋法、例えばソラレンを用いる、またはチオヌクレオシドに基づく方法が当業者に既知である。結合対のメンバーである核酸配列は、好ましくは12~50ヌクレオチドからなる。そのような核酸配列が15~35ヌクレオチドからなるであろうことも好ましい。RNアーゼは至る所にあり、RNAに基づく結合対および/またはスペーサー配列の望まれない消化を避けるために特別な注意を払わなければならない。例えばRNAに基づく結合対および/またはスペーサーを用いることは確かに可能であるが、DNAに基づく結合対および/またはスペーサーが好ましい態様である。直交相補性オリゴヌクレオチドの2つより多くの対を提供するために、適切なハイブリダイズする核酸配列を容易に設計することができ、2つより多くの結合対の容易な生成および使用が可能になる。本発明の二重結合剤においてハイブリダイズする核酸配列を用いることの別の利点は、核酸配列中に容易に修飾を導入することができることである。修飾された構築ブロックは商業的に入手可能であり、それは例えば官能性部分を含むリンカーの容易な合成を可能にする。そのような官能性部分は、あらゆる望まれる位置において、構造aおよびa’ならびにbおよびb’および/またはSのいずれの中にも、それらがオリゴヌクレオチドを表す限り、容易に導入することができる。1つの好ましい態様において、式Iに従う結合剤中に含まれるスペーサーSは核酸である。1つの好ましい態様において、両方の結合対がハイブリダイズする核酸配列であり、スペーサーSも核酸である。この態様において、a-S-bからなるリンカーLはオリゴヌクレオチドである。そのスペーサーSならびに配列a、a’、bおよびb’が全てオリゴヌクレオチド配列である場合、Sならびに結合対a’:aおよびb:b’それぞれのメンバーaおよびbを含むリンカーLに相当する単一のオリゴヌクレオチドを提供および合成することは、容易に可能である。その一価結合剤AおよびBがそれぞれポリペプチドである場合、それらはそれぞれそのハイブリダイズする核酸配列a’およびb’それぞれに容易に連結することができる。そのようなコンストラクト中に含まれるスペーサーSの長さは、あらゆる望まれる方法で容易に変えることができる。3つのコンストラクトa-S-b、A-a’およびb’-Bを元にして、式Iの結合剤を、標準的な手順に従って、a’:aおよびb:b’それぞれの間のハイブリダイゼーションにより最も用意に得ることができる。異なる長さのスペーサーが用いられる場合、結果として得られるコンストラクトは他の点では同一の二重結合剤を提供するが、一価結合剤AおよびBの間において異なる距離を有する。これは最適な距離および/または柔軟性を可能にする。1つの好ましい態様において、そのスペーサSならびに配列a、a’、bおよびb’はDNAである。鏡像異性のL-DNAは、その直交ハイブリダイゼーション挙動、そのヌクレアーゼ耐性に関して、および変動可能な長さのオリゴヌクレオチドの合成の容易さに関して知られている。この適切なスペーサーを設計することによるリンカーの長さの変動の容易さは、本明細書で開示されるような結合剤のその抗原単数または複数への結合を最適化するために重要である。1つの好ましい態様において、そのリンカーL=a-S-bは鏡像異性のL-DNAまたはL-RNAである。1つの好ましい態様において、リンカーa-S-bは鏡像異性のL-DNAである。1つの好ましい態様において、a、a’、bおよびb’ならびにそのスペーサーSは鏡像異性のL-DNAまたはL-RNAである。1つの好ましい態様において、a、a’、bおよびb’ならびにそのスペーサーSは鏡像異性のL-DNAである。1態様において、そのスペーサーSはオリゴヌクレオチドであり、互いにハイブリダイズすることができる末端を含む2つの部分で合成される。この場合、そのスペーサーSはこれらのハイブリダイズすることができる末端の互いとのハイブリダイゼーションにより簡単に構築することができる。結果として得られたスペーサーコンストラクトは、オリゴヌクレオチド二本鎖部分を含む。明らかであるように、そのスペーサーをその方法で解釈したconstrued場合、前記の二本鎖を形成するそのハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド構成要素の配列は、結合対a:a’およびb:b’とのハイブリダイゼーションまたはそれらへの干渉が起こり得ないような様式で選択される。上記で示したように、本発明に従う二価結合剤は、1態様において、ポリペプチドホモ二量体に結合する。その2個の標的ポリペプチドがホモ二量体を形成する場合、同じ一価結合剤を2回用いることが好ましい。1態様において、本発明は式Iに従うタンパク質ホモ二量体に結合することができる二価結合剤に関し、ここでSはポリヌクレオチドスペーサーであり、ここでその一価結合剤Aは第1標的ポリペプチドに結合し、ここでその第2一価結合剤通常はBもAであり、第2標的ポリペプチドに結合し、ここでa’:aおよびb:b’は両方ともポリヌクレオチド結合対を表す。当業者には明らかであるように、その一価結合剤Aにより結合されるエピトープはその標的ポリペプチド上に1回だけ存在していなければならず、または2個の異なる一価結合剤AおよびBそれぞれにより認識されるエピトープは1回だけ存在していなければならず、かつその2個の一価結合剤が単一の単量体の標的ポリペプチド上に結合することを避けるために重複していなければならない。1態様において、その二価結合剤はホモ二量体に結合し、両方の一価結合剤は重複するエピトープに結合する。1態様において、その二価結合剤はホモ二量体に結合し、両方の一価結合剤が同じエピトープに結合する。本発明に従う二価結合剤がポリペプチドホモ二量体に結合する場合、単純化された方法を用いてそのような二価結合剤を構築することもできる。この態様において、その一価結合剤Aを単一の種のハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドa’のみに連結することができ、そのリンカーをそれぞれがそのコンストラクトA-a’にハイブリダイズ可能な2個の末端を提供するように解釈するconstruedことができる。この態様において、そのリンカーはa-S-aの形態であってよい。本明細書で示す実施例において、そのような特別なリンカーはアプタマーと呼ばれている。言及したように、1態様において、そのスペーサーSはオリゴヌクレオチドであり、互いにハイブリダイズ可能な末端を含む2つの部分で合成される。この場合、そのスペーサーSはこれらのハイブリダイズ可能な末端の互いとのハイブリダイゼーションにより簡単に構築することができ、その結果として得られるスペーサーコンストラクトはオリゴヌクレオチド二本鎖部分を含む。上記で示したように、本発明に従う二価結合剤は、1態様において、ポリペプチドヘテロ二量体に結合する。その2個の標的ポリペプチドがヘテロ二量体を形成する場合、2種類の異なる結合対a’:aおよびb:b’をそれぞれ用いることが好ましい。1態様において、本発明は式Iに従う二価結合剤に関し、ここでSはポリヌクレオチドスペーサーであり、ここでその一価結合剤Aは第1標的ポリペプチドに結合し、ここでその第2一価結合剤Bは第2標的ポリペプチドに結合し、ここでAおよびBはその第1および第2標的ポリペプチドそれぞれに特異的に結合し、ここでa’:aおよびb:b’は両方ともポリヌクレオチド結合対を表し、ここでa’:aおよびb:b’は互いに結合も干渉もしない。上記で既に記述したように、式Iの一価特異的結合剤AおよびBは核酸であってよい。本発明の1態様において、a’、a、b、b’、A、BおよびSは全てオリゴヌクレオチド配列である。この態様において、式IのサブユニットA-a’、a-S-bおよびb’-Bは標準的な手順に従って容易に、かつ独立して合成することができ、一般に用いられる標準的な手順に従ってハイブリダイゼーションにより組み合わせることができる。上記で詳細に論じたように、そのカップリングは共有結合性であることもでき、またはそれは特異的な結合対によることもできる。当業者は容易に理解するであろうように、本発明に従う二価結合剤は1個以上の官能性部分を有するようにさらに修飾されてよい。そのような官能性部分Xは、好ましくは結合基、標識基、エフェクター基および反応基からなる群から選択される。1個より多くの官能性部分Xが存在する場合、それぞれのそのような官能性部分はそれぞれの場合において独立して結合基、標識基、エフェクター基または反応基であることができる。1態様において、その官能性部分Xは好ましくは結合基、標識基およびエフェクター基からなる群から選択される。1態様において、その基Xは結合基である。当業者には明らかであるように、その結合基Xは対a’:aおよびb:b’に干渉しないように選択されるであろう。結合基の例はバイオアフィンbioaffine結合対のパートナーであり、それはそのバイオアフィン結合対の他方のパートナーと特異的に相互作用することができる。適切なバイオアフィン結合対は、ハプテンまたは抗原および抗体;ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン;糖およびレクチン、オリゴヌクレオチドおよび相補性オリゴヌクレオチド、受容体およびリガンド、例えばステロイドホルモン受容体およびステロイドホルモンである。1態様において、Xは結合基であり、式Iの化合物のa’、a、b、b’またはSの少なくとも1つに共有結合している。好ましくは、バイオアフィン結合対のより小さいパートナー、例えばビオチンもしくはそれに対する類似体、受容体リガンド、ハプテンまたはオリゴヌクレオチドは、上記で定義されたようなa’、a、S、bまたはb’の少なくともatlest1個に共有結合している。1態様において、官能性部分Xは、ハプテン;ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン;オリゴヌクレオチドおよびステロイドホルモンから選択される結合基である。1態様において、その官能性部分Xは反応基である。その反応基は、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシレート、ヒドロキシル、アジド、アルキニルAlkinylまたはアルケニルのようなあらゆる既知の反応基から選択することができる。1態様において、その反応基はマレインイミド、スクシンイミジル、ジチオピリジル、ニトロフェニルエステル、ヘキサフルオロフェニルエステルから選択される。1態様において、その官能性部分Xは標識基である。その標識基はあらゆる既知の検出可能な基から選択することができる。当業者は、最少の消光での最高の感度のために適切であるように標識の数を選択するであろう。その標識基はあらゆる既知の検出可能な基から選択することができる。1態様において、その標識基は、色素、例えば発光標識基、例えば化学発光基、例えばアクリジニウムエステル類もしくはジオキセタン類、または蛍光色素、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびそれらの誘導体、発光性金属錯体、例えばルテニウムもしくはユーロピウム錯体、CEDIAクローン化酵素供与体免疫アッセイClonedEnzymeDonorImmunoassay、例えば欧州特許第0061888号に関して用いられるような酵素、微粒子もしくはナノ粒子、例えばラテックス粒子または金属ゾル、ならびに放射性同位体から選択される。1態様において、その標識基は発光性金属錯体であり、その化合物は一般式IIの構造を有し:[ML1L2L3]n-Y-XmAII式中、Mは希土類または遷移金属イオンから選択される二価または三価金属陽イオンであり、L1、L2およびL3は同じまたは異なっており、少なくとも2個の窒素含有複素環を有するリガンドを示し、ここでL1、L2およびL3はその金属陽イオンに窒素原子を介して結合しており、XはリンカーYを介してそのリガンドL1、L2およびL3の少なくとも1個に共有結合している反応性官能基であり、nは1から10まで、好ましくは1から4までの整数であり、mは1または2、好ましくは1であり、Aは電荷を等しくするために必要である可能性のある対イオンを示す。その金属錯体は好ましくは発光性金属錯体、すなわち適切な励起後に検出可能な発光反応を経る金属錯体である。その発光反応は、例えば蛍光または電気化学発光測定により検出することができる。この錯体中の金属陽イオンは、例えば遷移金属または希土類金属である。その金属は好ましくはルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムまたはタングステンである。ルテニウム、イリジウム、レニウム、クロムおよびオスミウムが特に好ましい。ルテニウムが最も好ましい。リガンドL1、L2およびL3は、少なくとも2個の窒素含有複素環を有するリガンドである。芳香族複素環、例えばビピリジル、ビピラジル、ターピリジルおよびフェナントロリルが好ましい。そのリガンドL1、L2およびL3は、特に好ましくはビピリジンおよびフェナントロリン環系から選択される。その錯体はさらに電荷を等しくするための1個または数個の対イオンAを含有することができる。適切な負に荷電した対イオンの例は、ハロゲン化物、OH-、カーボネート、アルキルカルボキシレート、例えばトリフルオロアセテート、サルフェート、ヘキサフルオロホスフェートおよびテトラフルオロボレート基である。ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロアセテートおよびテトラフルオロボレート基が特に好ましい。適切な正に荷電した対イオンの例は、一価陽イオン、例えばアルカリ金属およびアンモニウムイオンである。さらに好ましい態様において、その官能性部分Xはエフェクター基である。好ましいエフェクター基は療法上有効物質である。療法上有効物質は、例えば癌の抑制においてそれらが有効である方式が異なる。それらはアルキル化により、架橋により、またはDNAの二本鎖の切断によりDNA鋳型を損傷することができる。他の療法上有効物質はインターカレーションによりRNA合成を遮断することができる。一部の薬剤は紡錘体毒、例えばビンカアルカロイド類、または酵素活性を阻害する抗代謝剤、またはホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤である。エフェクター基Xは、アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍性抗生物質、ビンカアルカロイド類、エピポドフィロトキシン類、ニトロソ尿素類、ホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤、ならびに毒素から選択されてよい。現在より好ましいアルキル化剤は、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、チオテパ、イホスファミド、ナイトロジェンマスタードにより例示することができる。現在より好ましい抗代謝剤は、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、6-チオグアニン、6-メルカプトプリンにより例示することができる。現在より好ましい抗腫瘍性抗生物質は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イドルビシンidorubicin、ニミトキサントロンnimitoxantron、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、およびプリカマイシンにより例示することができる。現在より好ましい紡錘体毒はメイタンシンおよびメイタンシノイド類により例示することができ、ビンカアルカロイド類およびエピポドフィロトキシン類はビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデスチンvindestin、エトポシド、テニポシドにより例示することができる。現在より好ましいニトロソ尿素類は、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンにより例示することができる。現在より好ましいホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤は、アドレノコルチコルチコイド類adrenocorticorticoids、エストロゲン類、抗エストロゲン剤、プロゲスチン類、アロマターゼ阻害剤、アンドロゲン類、抗アンドロゲン剤により例示することができる。追加の好ましい無作為な合成薬剤は、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、プロカルバジドprocarbazide、シスプラチン、カルボプラチンにより例示することができる。官能性部分Xは、共有結合的に、または追加の結合対を介してのどちらかで、例えばa’、a、b、b’またはSの少なくとも1つに結合している。その官能性部分Xは1回または数n回存在することができる。nは整数であり、1または1より大きい。好ましくは、nは1~100である。nが1~50であることも好ましい。特定の態様において、nは1~10、または1~5である。さらなる態様において、nは1または2である。官能性部分Xのa’、a、b、b’またはSの少なくとも1つへの共有結合に関して、あらゆる適切なカップリング化学を用いることができる。当業者はそのようなカップリング化学を標準的なプロトコルから容易に選択することができる。a’、a、b、b’またはSを合成する際に適切な構築ブロックの使用により官能性部分を組み込むことも可能である。1つの好ましい態様において、官能性部分Xは式Iにより定義されるような結合剤のa、b、またはSに結合している。1つの好ましい態様において、官能性部分Xは式Iにより定義されるような結合剤のスペーサーSに結合している。1つの好ましい態様において、官能性部分Xは式Iにより定義されるような結合剤のa、b、またはSに共有結合している。官能性部分Xがa、a’、bまたはb’それぞれに相当するハイブリダイズするオリゴヌクレオチド内に位置する場合、好ましくはそのような官能性部分は修飾されたヌクレオチドに結合しており、またはヌクレオシド間のP原子に結合している国際公開第2007059816号。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに干渉しない修飾されたヌクレオチドがそれらのオリゴヌクレオチド中に組み込まれる。そのような修飾されたヌクレオチドは、好ましくはC5置換ピリミジン類またはC7置換7デアザプリン類である。オリゴヌクレオチドは、内部で、または5’もしくは3’末端において、官能性部分の導入のために用いられる非ヌクレオチド性構成要素で修飾することができる。好ましくは、そのような非ヌクレオチド性構成要素はスペーサーSの内部、すなわち2個の結合対メンバーaおよびbの間に位置している。スペーサーの構築のための多くの異なる非ヌクレオチド性修飾剤modifier構築ブロックが文献において既知であり、多種多様なものが商業的に入手可能である。官能性部分の導入に関して、非ヌクレオシド性二官能性修飾剤構築ブロックまたは非ヌクレオシド性の三官能性修飾された構築ブロックのどちらも、末端標識のためのCPGとして、または内部標識のためのホスホラミダイトとしてのどちらでも用いられるWojczewskiCetalSynlett1016671678参照。二官能性修飾剤構築ブロック二官能性修飾剤構築ブロックは、官能性部分または必要であれば保護された官能性部分をホスホラミダイト基に、その構築ブロックを成長しているオリゴヌクレオチド鎖の末端のヒドロキシル基に5’末端において通常の合成または3’末端において逆向きの合成取り付けるために連結する。二官能性修飾剤構築ブロックは、好ましくは非ヌクレオシド性化合物である。例えば、そのような修飾された構築ブロックはC2~C18アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニル鎖はそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび/またはアミド部分により遮られていてよい。場合により1または2個のC1~C6アルキル基で置換されているC5~C6-シクロアルキル、C4N、C5N、C4O、C5O-ヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状部分も、非ヌクレオシド性の二官能性修飾された構築ブロックとして用いることができる。好ましい修飾された二官能性構築ブロックは、C3~C6アルキル部分およびトリ-~ヘキサ-エチレングリコール鎖を含む。二官能性修飾剤構築ブロックの限定的でないが好ましい例を、下記の表IIIにおいて示す。三官能性修飾剤構築ブロック三官能性構築ブロックは、i官能性部分または必要であれば保護された官能性部分、iiレポーターまたは官能性部分または必要であれば保護された官能性部分をオリゴヌクレオチド合成の間に成長しているオリゴヌクレオチド鎖のヒドロキシル基に連結するためのホスホラミダイト基、およびiii酸不安定性保護基で、好ましくはジメトキシトリチル保護基で保護されているヒドロキシル基を連結する。この酸不安定性保護基を除去した後、ヒドロキシル基が解放され、それはさらなるホスホラミダイトと反応することができる。従って、三官能性構築ブロックは官能性部分をオリゴヌクレオチド内のあらゆる位置に配置することを可能にする。三官能性構築ブロックは、固体支持体、例えば制御細孔ガラスcontrolledporeglassCPGを用いる合成にも必須であり、それはオリゴヌクレオチドの3’末端標識のために用いられる。この場合、その三官能性構築ブロックは官能性部分または必要であれば保護された官能性部分にC2~C18アルキル、アルケニル、アルキニルalkinyl炭素鎖を介して連結されるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニルalkyinyl鎖はそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび/またはアミド部分により遮られていてよく、切断可能なスペーサーを介して固体支持体に結合したヒドロキシル基および酸不安定性保護基で保護されたヒドロキシル基を含む。この保護基の除去の後、ヒドロキシル基が解放され、次いでそれはホスホラミダイトと反応することができるであろう。三官能性構築ブロックは非ヌクレオシド性またはヌクレオシド性であってよい。非ヌクレオシド性三官能性構築ブロックはC2~C18アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニルはそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび/またはアミド部分により遮られている。他の三官能性構築ブロックは、場合により1または2個のC1~C6アルキル基で置換されているC5~C6-シクロアルキル、C4N、C5N、C4O、C5Oヘテロシクロアルキル、フェニルのような環式基である。環式および非環式基は1個の-C1~C18アルキル-O-PG基により置換されていてよいが、前記のC1~C18アルキルはエチレンオキシn、アミドm部分を含み、nおよびmは互いに独立して0~6であり、PGは酸不安定性保護基である。好ましい三官能性構築ブロックは、場合により1個のアミド結合を含みC1~C6アルキルO-PG基で置換されたC3~C6アルキル、シクロアルキル、C5Oヘテロシクロアルキル部分であり、ここでPGは酸不安定性保護基、好ましくはモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、最も好ましくはジメトキシトリチルである。非ヌクレオシド性三官能性構築ブロックに関する限定的でないが好ましい例が、例えば表IVにおいて要約されている。ヌクレオシド性修飾剤構築ブロック:ヌクレオシド性修飾剤構築ブロックは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比較してそのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性に影響を及ぼさない必要がある場合に内部標識のために用いられる。従って、ヌクレオシド性構築ブロックは、なお相補的塩基とハイブリダイズすることができる塩基または塩基類似体を含む。本発明の式Iに従う結合剤中に含まれるa、a’、b、b’またはSの1個以上の核酸配列を標識するための標識化合物の一般式は、式IIにおいて与えられる。式中、PGは酸不安定性保護基、好ましくはモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、最も好ましくはジメトキシトリチルであり、ここでYはC2~C18アルキル、アルケニル、アルキニルalkinylであり、ここで前記のアルキル、アルケニル、アルキニルalkinylはエチレンオキシおよび/またはアミド部分を含んでいてよく、ここでYは好ましくはC4~C18アルキル、アルケニルまたはアルキニルalkinylであり、1個のアミド部分を含有し、ここでXは官能性部分であり、それに標識を結合させることができる。その塩基の具体的な位置は、そのような置換に関してハイブリダイゼーション特性への影響が最小限になるように選択されてよい。従って、以下の位置が置換に関して好ましい:a天然塩基に関して:C5で置換されたウラシル;C5で、またはN4で置換されたシトシン;C8で、またはN6で置換されたアデニン、およびC8で、またはN2で置換されたグアニン、ならびにb塩基類似体に関して:C7で置換された7デアザAおよび7デアザG;C7で置換された7デアザ8アザAおよび7デアザ8アザG;C7で置換された7デアザアザ2アミノA;N1で置換されたプソイドウリジンおよびN2で置換されたホルマイシン。ヌクレオシド性三官能性構築ブロックに関する限定的でないが好ましい例を表Vにおいて示す。表III、IVおよびVにおいて、二官能性部分の末端の酸素原子の1個または三官能性部分の末端の酸素原子の1個はホスホラミダイトの一部であり、それは完全に詳細には示されていないが当業者には明らかである。三官能性構築ブロックの第2の末端の酸素原子は、上記で式IIに関して定義されたように、酸不安定性保護基PGで保護されている。合成後修飾は、共有結合した官能性部分をリンカーまたはスペーサー分子中に導入するための別の戦略である。このアプローチにおいて、固相合成の間に二官能性または三官能性構築ブロックを用いることによりアミノ基が導入される。そのアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドの支持体からの切断および精製の後、官能性部分の活性化されたエステルと、またはその中の1個の官能基が活性エステルである二官能性試薬と反応させる。好ましい活性エステルはNHSエステルまたはペンタフルオロpentafluorフェニルエステル類である。合成後修飾は、固相合成および脱保護の間に安定でない官能性部分を導入するために特に有用である。例は、シュタウディンガーライゲーションのためのトリフェニルホスフィンカルボキシメチルエステルによる修飾697701、ジゴキシゲニンによる、または商業的に入手できるスルホSMCCを用いてマレインイミド基を導入するための修飾である。官能性部分Xは、1態様において、a’、a、b、b’またはSの少なくとも1個に追加の結合対を介して結合している。官能性部分Xを結合させることができる追加の結合対は、好ましくはロイシンジッパードメインまたはハイブリダイズする核酸である。その官能性部分Xがa’、a、b、b’またはSの少なくとも1個に追加の結合対のメンバーを介して結合している場合、Xが結合している結合対のメンバーならびに結合対a’:aおよびb:b’それぞれは全て異なる特異性を有するように選択される。その結合対a:a’、b:b’およびXが結合している結合対はそれぞれ、その他の結合対のいずれの結合にも干渉せずに、それらのそれぞれのパートナーに結合する例えばハイブリダイズする。結合対のメンバーの一価結合剤への共有結合性カップリングその結合剤の生化学的性質に応じて、異なるコンジュゲーション戦略がすぐに利用できる。その結合剤が50~500アミノ酸の天然存在タンパク質または組み換えポリペプチドである場合、タンパク質コンジュゲートの合成に関する化学を記述する教本中に標準的な手順があり、当業者は容易にそれに従うことができる1003010074。1態様において、マレインイミド部分のそのタンパク質内のシステイン残基との反応が用いられる。これは、例えば抗体のFabまたはFab’断片が一価結合剤として用いられる場合に好ましいカップリング化学である。あるいは、1態様において、結合対のメンバー式Iのa’またはb’それぞれのその結合剤ポリペプチドのC末端へのカップリングが実施される。タンパク質の、例えばFab断片のC末端修飾は、例えばSunbulMetalOrganicBiomolecularChemistry733613371により記述されたように実施することができる。一般に、結合対のメンバーの一価ポリペプチド性結合剤への部位特異的反応および共有結合性カップリングは、天然アミノ酸をタンパク質中に存在する他の官能基の反応性に対して直交性である反応性を有するアミノ酸に変換することに基づく。例えば、稀な配列前後関係sequencecontext内の特定のシステインをアルデヒド中で酵素的に変換することができるホルミルグリシンアルデヒドタグ-新規の翻訳後修飾によるタンパク質工学425427を参照。特定の酵素の所与の配列前後関係中の天然アミノ酸との特異的な酵素反応性を利用することにより望まれるアミノ酸修飾を得ることも可能である例えば以下の参考文献を参照:TakiMetalProteinEngineeringDesignSelection17119126GautierAetalChemistryBiology15128136プロテアーゼに触媒されるC-N結合の形成がBordusaFHighlightsによりBioorganicChemistry389403において用いられており、ソルターゼSortaseに媒介されるタンパク質ライゲーションがMaoHらによりJAmChemSoc12626702671において用いられており、ProftTによりBiotechnolLett32110において総説されている。結合対のメンバーの一価ポリペプチド性結合剤への部位特異的反応および共有結合性カップリングは、末端のアミノ酸の適切な修飾試薬との選択的反応によっても達成することができる。N末端システインのベンゾニトリル類との反応性96589662を、部位特異的共有結合性カップリングを達成するために用いることができる。天然型Native化学的ライゲーションはC末端システイン残基に頼ることもできる6596。欧州特許第1074563号は、一続きの負に荷電したアミノ酸内のシステインの一続きの正に荷電したアミノ酸中に位置するシステインとのより速い反応に基づくコンジュゲーション法を記述している。その一価結合剤は、合成ペプチドまたはペプチド模倣物であってもよい。ポリペプチドが化学的に合成される場合、直交性化学反応性を有するアミノ酸をそのような合成の間に組み込むことができる12811295。多種多様な直交性官能基が賭かっておりatstake、合成ペプチド中に導入することができるため、そのようなペプチドのリンカー中へのコンジュゲーションは標準的な化学である。単一標識されたmono-labeledタンパク質を得るため、1:1の化学量論を有するコンジュゲートをクロマトグラフィーにより他のコンジュゲーション産物から分離することができる。この手順は色素標識された結合対のメンバーおよび荷電したスペーサーを用いることにより促進される。この種類の標識された、および高度に負に荷電した結合対のメンバーを用いることにより、電荷および分子量の違いを分離のために用いることができるため、1コンジュゲート化タンパク質が未標識のタンパク質および1個より多くのリンカーを有するタンパク質から容易に分離される。その蛍光色素は、二価結合剤bindigagentを標識された一価結合剤のような未結合の構成要素から精製するために役立つ。従って、1態様において、本発明の二価結合剤を形成するために、例えば合成の間に二官能性または三官能性修飾剤構築ブロックを二官能性スペーサー構築ブロックとの組み合わせで用いて合成された蛍光色素で標識されている結合対のメンバー式Iのa’および/またはb’それぞれを用いることが好ましい。1つの好ましい態様において、そのスペーサーSならびにその配列a、a’、bおよびb’はDNAであり、a’またはb’それぞれの少なくとも一方は蛍光色素で標識されている。1つの好ましい態様において、そのスペーサーSならびにその配列a、a’、bおよびb’はDNAであり、a’およびb’それぞれは両方ともそれぞれ異なる蛍光色素で標識されている。1態様において、ポリペプチド二量体に特異的に結合する二価結合剤を製造するための方法を開示する。その方法は、以下の工程を含む:a第1標的ポリペプチドに5×10-3/秒~10-4/秒のKdissで結合する第1一価結合剤を選択し、b第2標的ポリペプチドに5×10-3/秒~10-4/秒のKdissで結合する第2一価結合剤を選択し、c両方の一価結合剤をリンカーにより連結し、そしてd3×10-5/秒以下のKdiss値を有する二価結合剤を選択する。本発明において開示されるような方法を用いて、それぞれが異なる長さのリンカーを含む様々な二価結合剤を製造すること、および望まれる結合特性、すなわち3×10-5/秒以下のKdiss値を有するそれらの二価結合剤を選択することは、今ではかなり容易である。望まれるKdissを有する二価結合剤の選択は、1態様において、実施例2.8において開示されるようなBiacore商標分析により実施される。1態様において、本発明は本発明に従う二価結合剤を形成する方法に関し、ここで、第1標的ポリペプチドに10-3/秒~10-4/秒のKdissで結合し、第1結合対のメンバーに連結された第1一価結合剤、第2標的ポリペプチドに10-3/秒~10-4/秒のKdissで結合し、第2結合対のメンバーに連結された第2一価結合剤、ならびにスペーサーならびにその第1および第2結合対のメンバーに対する相補的な結合対のメンバーを含むリンカーそれぞれを一緒に保温し、それにより3×10-5/秒以下のKdiss値を有する二価結合剤が形成され、ここでその第1および第2結合対は互いに干渉しない。当業者は理解しているであろうように、そのKdissは温度依存性の値である。理論上、両方の一価結合剤の、ならびに本発明に従う二価結合剤のKdiss値は同じ温度で決定される。理解されるであろうように、好ましくはKdiss値はその二価結合剤が用いられることになる、例えばアッセイが実施されることになる温度と同じ温度で決定される。1態様において、そのKdiss値は室温で、すなわち20°C、21°C、22°C、23°C、24°Cまたは25°Cそれぞれで確立される。1態様において、そのKdiss値は4または8°Cそれぞれで確立される。1態様において、そのKdiss値は25°Cで確立される。1態様において、そのKdiss値は37°Cで確立される。1態様において、そのKdiss値は40°Cで確立される。1つの好ましい態様において、Kdissの決定、すなわちそれぞれの一価結合剤に関するKdissの決定および二重結合剤に関するKdissの決定は37°Cにおいてなされる。1態様において、上記の方法はさらにその二価結合剤を単離する工程を含む。本発明に従う二価結合剤の形成または組み立てに関する好ましい化学量論比は1:1:1である。1つの好ましい態様において、本発明に従う二価結合試薬を製造する方法はL-DNAリンカーを利用する。1つの好ましい態様において、本発明に従う二価結合試薬を製造する方法はDNA、好ましくはL-DNAからなる2個の特異的な結合対およびL-DNAリンカーを利用する。二価結合剤の形成および形成された二価結合剤の化学量論は、現状技術の手順に従うサイズ排除クロマトグラフィーにより分析することができる。望まれるならば、その形成された複合体をSDS-PAGEにより分析することもできる。免疫組織化学染色手順において用いられる場合、この発明で開示される二価結合剤のみが著しく結合し、それが3×10-5/秒またはより優れたKdissを有する場合、そのような手順の様々な保温工程の間に洗い落とされない。このKdissは、両方の一価結合剤がそれらの対応する結合部位に結合する場合にのみ達成され得る。その2個の標的ポリペプチドの1個の上の1つのエピトープのみが存在する場合、すなわちそのポリペプチドが単量体であり二量体ではない場合、著しい染色は見られないであろう。従って、そしてこれは非常に好都合なことだが、免疫組織化学染色はポリペプチド二量体がその試料中に存在する場合にのみ観察されるであろう。従って、好ましい態様において、本発明は組織染色法に関し、その方法は以下の工程を含む:a細胞または組織試料を提供し、b前記の試料をリンカーを介して互いに連結された2個の一価結合剤からなる二価結合剤と共に保温し、ここで第1一価結合剤は第1ポリペプチドに結合し、第2一価結合剤は第2ポリペプチドに結合し、それぞれの一価結合剤は5×10-3/秒~10-4/秒の範囲のKdissを有し、ここでその二価結合剤は3×10-5/秒以下のKdissを有し、そしてcその二価結合剤を検出し、それにより前記の試料を目的のポリペプチド二量体に関して染色する。本発明に従う二価結合剤の免疫組織化学的方法による細胞または組織試料の染色における使用は、さらなる好ましい態様である。より一般的に言うと、本発明はリンカーを介して互いに連結された2個の一価結合剤からなる二価結合剤に関し、その結合剤は標的ポリペプチド二量体に自動化されたアッセイ系の要求を満たすKdissまたはよりよいKdissで結合し、ここでa第1一価結合剤は第1標的ポリペプチドにその自動化されたアッセイ系の要求より少なくとも10倍上のより悪いKdissで結合し、b第2一価結合剤は第2標的ポリペプチドにその自動化されたアッセイ系の要求より少なくとも10倍上のKdissで結合し、そしてcここでその2種類の一価結合剤aおよびbのKdiss値の積は少なくともその自動化された系により要求されるKdiss以下である。一般的に言うと、2個の標的ポリペプチドを含むポリペプチド二量体に少なくとも自動化されたアッセイ系の最小限のアッセイ要求を満たすKdissまたはよりよいKdissで特異的に結合する二価結合剤を得るための方法が記述され、その方法は以下の工程を含む:a第1標的ポリペプチドにその自動化されたアッセイ系の最小限のアッセイ要求より少なくとも10倍上のKdissで結合する第1一価結合剤を選択し、b第2標的ポリペプチドにその自動化されたアッセイ系の最小限のアッセイ要求より少なくとも10倍上のKdissで結合する第2一価結合剤を選択し、ここで工程aおよびbにおけるその2種類の一価結合剤のKdiss値の積は少なくともその自動化された系により要求されるKdiss以下であり、そしてc両方の一価結合剤をリンカーにより連結する。1態様において、その自動化された系はVentanaMedicalSystemsInc.ツーソンが流通させているようなBenchmark登録商標分析器である。以下の実施例、配列リストおよび図は本発明の理解を助けるために提供されており、その正確な範囲は添付された特許請求の範囲において述べられている。述べられた手順において本発明の精神から逸脱することなく修正を行うことができることは理解されている。配列リストの記述1.抗体断片2.ssDNAの配列a19塩基長ssDNA3’末端により抗トロポニンTMABbのFab’またはリン酸化されたIGF-1Rに対するFab’8.1.2それぞれに共有結合している5’AGTCTATTAATGCTTCTGC3’b17塩基長ssDNA5’末端により抗トロポニンTMABaのFab’またはIGF-1Rに対するFab’1.4.168それぞれに共有結合している5’AGTTCTATCGTCGTCCA3’c相補性19塩基長ssDNAリンカーの一部として用いられる5’GCAGAAGCATTAATAGACT3’d相補性17塩基長ssDNAリンカーの一部として用いられる5’TGGACGACGATAGAACT3’3.トロポニンTエピトープの配列SEQIDNO9ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAEアミド、ここでUはβアラニンを表す。抗トロポニン抗体aに関するエピトープASEQIDNO10SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKEアミド、ここでOはアミノ-トリオキサ-オクタン酸を表す。抗トロポニン抗体bに関するエピトープB4.IGF-1R/IRエピトープの配列:SEQIDNO11FDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSSTIGF1RSEQIDNO12YEEHIPYTHMNGGKKNGRILTLPRSNPShIR5.タンパク質リンカーおよびタグ配列:SEQIDNO13GGGGSモチーフ例えばポリペプチドリンカーの一部prtとしてSEQIDNO14YPYDVPDYAHA-タグSEQIDNO15GLNDIFEAQKIEWHEAvi-タグ6.ポリペプチドホモ二量体に対する二価結合剤を編集するcompilingために用いられた配列SEQIDNO16ACCTGCTGCTATCTTGAこのオリゴヌクレオチドは5’末端においてFAM標識され、カップリングのために3’末端においてマレイミドを有するように修飾された。SEQIDNO17GCAGAAGCATTAATAGACTTGGACGACGATAGAACTリンカーオリゴヌクレオチドSEQIDNO18GTCTATTAATGCTTCTGCC3TGGACGACGATAGAACTアダプターオリゴヌクレオチド7.免疫組織化学における使用のためのHER2/HER3ヘテロ二量体に対する二重結合剤において用いられた配列HC二重結合剤、x=1、2、3または4であり、アミノ酸配列モチーフmotiveGlyGlyGlyGlySerが1、2、3または4回存在することを示す。SEQIDNO25WDQDPPERGAPPSTヒトHER2SEQIDNO26PLHPVPIMPTAGTTPDEDYEYMNRQRヒトHER3SEQIDNO275’4アミノリンカー3AGTTCTATCGTCGTCCAフルオレセイン3’17塩基長オリゴSEQIDNO285’フルオレセインAGTCTATTAATGCTTCTGC3アミノリンカー’43’19塩基長オリゴ図の説明図1抗pIGF1-R二重結合剤の組み立ての効率を評価する分析的ゲル濾過実験。線図a、bおよびcは、個々の二重結合剤構成要素フルオレセイン-ssFab’1.4.168、Cy5-ssFab’8.1.2およびリンカーDNAT=0;ssFab’は一本鎖オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたFab’断片を意味するの溶離プロフィールを示す。線図dは、二価結合剤を形成するのに必要な3種類の構成要素を1:1:1のモル比で混合した後の溶離プロフィールを示す。より太い一番下の曲線は、ssFab’タンパク質またはリンカーDNAそれぞれの存在を示す280nmにおいて測定された吸光度を表す。bおよびdにおけるより細い一番上の曲線495nmにおける吸光度はフルオレセインの存在を示し、aにおけるより細い一番上の曲線およびdにおける中央の曲線635nmにおける吸光度は、Cy5の存在を示す。単一の二重結合剤の構成要素の溶離体積VEssFab’1.4.168約15ml;VEssFab’8.1.2約15ml;VEリンカー約16mlの反応混合物の溶離体積VE混合物約12mlとの比較は、二重結合剤組み立て反応が成功であったことを示す収率:約90。溶離された二重結合剤に相当する主な280nmのピークは、495nmおよび635nmのチャンネルにおける主なピークとうまく重なっており、二価結合剤に相当するピーク中にssFab’8.1.2およびssFab’1.4.168の両方が存在することを証明している。図2Biacore商標実験のスキーム。模式的および例示的に、溶液中の2種類の結合分子を示す:T0-T-Digリンカー16、二価結合剤およびT40-T-Digリンカー15、二価結合剤。これら両方の二価結合剤はそれらのリンカーの長さにおいてのみ異なる2個のハイブリダイズする核酸配列の間に追加のTを有しない中心のジゴキシゲニン化されたdigoxigenylatedT対40個の追加のT中心のT-Digのそれぞれの側に20個を有する中心のジゴキシゲニン化されたT。さらに、ssFab’断片8.1.2および1.4.168を用いた。図3100nM二価結合剤T40-T-DigssDNAリンカー、すなわちリンカー15上にハイブリダイズしたssFab’8.1.2およびssFab’1.4.168からなるの固定されたペプチドpIGF-1Rとの相互作用を、100nMssFab’1.4.168または100nMssFab’8.1.2の同じペプチドに対する結合特性と比較して示す、3つの速度論を重ねてプロットしたBiacore商標センサーグラムsensorgram。最も高い結合性能は二重結合剤コンストラクトを用いて得られ、これはその二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドpIGF-1Rに対する親和性を増大させることを明確に示している。図4T40-T-DigssDNAリンカー、すなわちリンカー15上にハイブリダイズしたssFab’8.1.2およびssFab’1.4.168からなる二価結合剤の固定されたペプチドpIGF-1Rリン酸化されたIGF-1R、IGF-1RまたはpIRリン酸化されたインスリン受容体との相互作用を示す3つの速度論を重ねてプロットしたBiacore商標センサーグラム。最も高い結合性能はpIGF-1Rペプチドで得られ、これは二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドpIGF-1Rに対する特異性を例えばリン酸化されたインスリン受容体ペプチドpIRと比較して増大させることを明確に示している。図5T40-T-DigssDNAリンカー、すなわちリンカー15上にハイブリダイズしたssFab’8.1.2およびssFab’1.4.168からなる100nM二価結合剤ならびにリンカーDNAを有しない100nMssFab’8.1.2およびssFab’1.4.168の混合物の相互作用を示す2つの速度論を重ねてプロットしたBiacore商標センサーグラム。最高の結合性能は二価結合剤を用いてのみ得られ、一方でリンカーを有しないssFab’の混合物は、これらのssFab’の合計濃度が200nMであったという事実にも関わらず、観察可能な協同的結合作用を示さない。図6Biacore商標サンドイッチアッセイの概略図。このアッセイは、両方の抗体のリン酸化されたIGF-1Rペプチドへのエピトープ接近可能性を調べるために用いられた。<MIgGFcy>Rはマウス抗体M-1.4.168を捕捉するために用いられたウサギ抗マウス抗体を示す。次いでM-1.4.168を用いてpIGF-1Rペプチドを捕捉する。M-8.1.2が最終的にM-1.4.168、ペプチドおよびM-8.1.2からなるサンドイッチを形成する。図7二次抗体8.1.2のpIGF-1Rペプチドに対する、これがBiacore商標チップ上で抗体1.4.168により捕捉された後の結合シグナル太線を示すBiacore商標センサーグラム。その他のシグナル細い線は対照シグナルである:一番上から一番下に向かって、それぞれ500nMの8.1.2、500nMの1.4.168;500nMの標的と無関係の抗体<CKMM>M-33-IgG;および500nMの標的と無関係の対照抗体<TSH>M-1.20-IgGの線を示す。これらの対照にいずれにおいても結合事象を検出することはできなかった。図8センサー表面上のビオチン化二重結合剤を示す、Biacore商標アッセイの概略図。フローセル1=FC1示していない上で、アミノ-PEO-ビオチンを捕捉させた。FC2、FC3およびFC4上で、増大するリンカーの長さを有する二価結合剤を固定したFC2上の二重結合剤T0-bi=1個の中央のT-BiのみおよびFC4上の二重結合剤T40-bi=1個の中央のT-Biならびに上流および下流それぞれの20個のTをそれぞれ示す。分析物1:そのペプチドの右側の末端においてM-1.4.168ssFab’エピトープを含有するIGF-1Rペプチド一番上の線-このペプチドはリン酸化されていないため、M-8.1.2ssFab’ホスホ-エピトープは存在しない;分析物2:M-8.1.2ssFab’ホスホ-エピトープPおよびM-1.4.168ssFab’エピトープを含有するpIGF-1Rペプチド2番目の線;分析物3:交差反応するM-8.1.2ssFab’ホスホ-エピトープを含有するがM-1.4.168ssFab’に関するエピトープは含有しない、pIRペプチド3番目の線。図9二重結合剤実験の速度論データ。ssFab’8.1.2およびssFab’1.4.168を有するT40-T-Biリンカー二重結合剤=図中のT40は、pIGF-1Rに対して、pIRkd=3.70E-02/sと比較した場合に1300倍低い解離速度kd=2.79E-05/sを示す。図10T40-T-Bi二重結合剤のpIGF-1Rペプチドリン酸化されたIGF-1Rペプチドに対する濃度依存的測定を示すBiacore商標センサーグラム。そのアッセイの構成は図8において示されている通りである。pIGF-1Rペプチドの濃度系列は、30nM、10nM、2×3.3nM、1.1nM、0.4nM、0nMで注入された。対応するデータが図9の表において示されている。図11T40-T-Bi二重結合剤のIGF-1Rペプチドリン酸化されていないIGF-1Rペプチドに対する濃度依存的測定を示すBiacore商標センサーグラム。そのアッセイの構成は図8において示されている通りである。IGF-1Rペプチドの濃度系列は、300nM、100nM、2×33nM、11nM、4nM、0nMで注入された。対応するデータが図9の表において示されている。図12T40-T-Bi二重結合剤のpIRペプチドリン酸化されたインスリン受容体ペプチドに対する濃度依存的測定を示すBiacore商標センサーグラム。そのアッセイの構成は図8において示されている通りである。pIRペプチドの濃度系列は、100nM、2×33nM、11nM、4nM、0nMで注入された。対応するデータが図9として示した表中に示されている。図13IGF-1受容体に結合する二重結合剤。2個のmAb1.4.168のFab’断片を一本鎖DNAとコンジュゲートし、アダプターDNAおよびリンカーDNAとハイブリダイズさせる。示したように、そのリンカーDNAはビオチン標識を有し、それは免疫組織化学染色において検出することができる。図14その二重結合剤によるIGF1受容体のIHC検出。その二重結合剤1μg/mLはIGF1受容体を発現している安定導入したNIH3T3細胞を染色するA。アダプターDNAなしの陰性一価対照Fab’-ssDNAは洗い流され、その細胞を染色しないB。図15HER2/HER3ヘテロ二量体検出のための二重結合剤。その二重結合剤は2個のFab断片からなり、1個はHER2を認識し=図中の<Her2>、1個はHER3を認識する=図中の<Her3>。そのFab断片はヘマグルチニンタグHAおよび複数単位のGlyGlyGlyGlySerアミノ酸残基モチーフからなるペプチドリンカーにより連結されている。二量体検出のためにFab断片の間の距離を最適化するため、そのリンカーの長さをいくつかのG4S単位x=1、2、3、4の導入により容易に変更することができる。実施例4において用いられた二重結合剤は、2個のG4S単位を有するx=1。実施例1トロポニンTに対する二価結合剤1.1モノクローナル抗体およびFab’断片ヒト心臓トロポニンTに異なる重複しないエピトープそれぞれエピトープA’およびエピトープB’で結合する2種類のモノクローナル抗体を用いた。これらの抗体は両方とも最新のRocheElecsys商標トロポニンTアッセイにおいて用いられ、ここでトロポニンTはサンドイッチ免疫アッセイの形式で検出される。モノクローナル抗体の培養上清からの精製は、タンパク質化学の現状技術の方法を用いて実施された。その精製されたモノクローナル抗体を、予め活性化したpre-activatedパパイン抗エピトープA’MAbまたはペプシン抗エピトープB’MAbのどちらかを用いてプロテアーゼ消化するとFab’2断片が得られ、続いてそれを低濃度のシステアミンを用いて37°Cで還元すると、Fab’断片、すなわち式IA-a’:a-S-b:b’-BにおけるAおよびBそれぞれになる。その反応を、SephadexG-25カラムGEHealthcare上でシステアミンをその試料のポリペプチド含有部分から分離することにより停止する。1.2Fab’断片のssDNA-オリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションそのFab’断片を、下記で記述する活性化されたssDNAaおよびssDNAbオリゴヌクレオチドとそれぞれコンジュゲートさせる。Fab’-断片-ssDNAコンジュゲートAおよびBそれぞれの調製:aFab’-抗トロポニンT<エピトープA’>-ssDNA-コンジュゲート=AFab’-抗トロポニンT<エピトープA’>-ssDNAa-コンジュゲートAの調製のために、SEDIDNO5の誘導体、すなわち5’AGTCTATTAATGCTTCTGCXXXYZ3’が用いられ、ここでX=ホスホラミダイトC3プロピル1ホスホラミダイトにより導入されたプロピレン-ホスフェートであり、ここでY=3’アミノ修飾剤TFAアミノC6lcaaCPGにより導入された3’アミノ修飾剤C6であり、ここでZ=スルホスクシンイミジル4Nマレイミドメチルシクロヘキサン1カルボキシレートにより導入された4Nマレインイミドメチルシクロヘキサン1カルボキシである。bFab’-抗トロポニンT<エピトープB’>-ssDNAb-コンジュゲート=BFab’-抗トロポニンT<エピトープB’>-ssDNA-コンジュゲートBの調製のために、SEDIDNO6の誘導体、すなわち5’YZXXXAGTTCTATCGTCGTCCA3’が用いられ、ここでX=ホスホラミダイトC3プロピル1ホスホラミダイトにより導入されたプロピレン-ホスフェートであり、ここでY=ヘキシルホスホラミダイトにより導入された5アミノ修飾剤C6であり、Z=スルホスクシンイミジル4Nマレイミドメチルシクロヘキサン1カルボキシレートにより導入された4Nマレインイミドメチルシクロヘキサン1カルボキシである。SEQIDNO5または6のオリゴヌクレオチドはそれぞれ現状技術のオリゴヌクレオチド合成法により合成された。そのマレインイミド基の導入は、Yのアミノ基のZのスクシンイミジル基との反応により行われ、それは固相オリゴヌクレオチド合成プロセスの間に組み込まれた。上記で示した一本鎖DNAコンストラクトはチオール反応性マレイミド基を有し、それはシステアミン処理により生成されたFab’のヒンジ領域のシステインと反応する。高い百分率の単一標識されたFab’断片を得るため、ssDNAのFab’断片に対する相対的なモル比は低く保たれる。単一標識されたFab’断片ssDNA:Fab’=1:1の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム:MonoQ,GEHealthcareにより行われる。効率的な標識および精製の検証は、分析的ゲル濾過クロマトグラフィーおよびSDS-PAGEにより達成される。1.3ビオチン化されたリンカー分子ssDNAリンカーL1、L2およびL3それぞれにおいて用いられるオリゴヌクレオチドは、現状技術のオリゴヌクレオチド合成法により、ビオチン化に関してビオチン化ホスホラミダイト試薬を用いて合成された。リンカー1=L1スペーサーを有しないビオチン化ssDNAリンカー1は、以下の組成を有する:5’GCAGAAGCATTAATAGACTTGGACGACGATAGAACT3’。それはそれぞれSEQIDNO7および8のssDNAオリゴヌクレオチドを含み、そのスペーサーの中央においてビオチンdTビオチニルアミノヘキシル3アクリルイミド2デオキシウリジン3’ホスホラミダイトの使用によりビオチン化された。リンカー2=L211塩基長のチミジンに基づくスペーサーを有するビオチン化ssDNAリンカー2は、以下の組成を有する:5’GCAGAAGCATTAATAGACTT5T5TGGACGACGATAGAACT3’。それはそれぞれSEQIDNO7および8のssDNAオリゴヌクレオチド、それぞれ5個のチミジンからなる2回のオリゴヌクレオチドの一続きを含み、そのスペーサーの中央においてビオチンdTビオチニルアミノヘキシル3アクリルイミド2デオキシウリジン3’ホスホラミダイトの使用によりビオチン化された。リンカー3=L331塩基長のチミジンに基づくスペーサーを有するビオチン化ssDNAリンカー3は、以下の組成を有する:5’GCAGAAGCATTAATAGACTT15T15TGGACGACGATAGAACT3’。それはそれぞれSEQIDNO7および8のssDNAオリゴヌクレオチド、それぞれ15個のチミジンからなる2回のオリゴヌクレオチドの一続きを含み、ビオチンdTビオチニルアミノヘキシル3アクリルイミド2デオキシウリジン3’ホスホラミダイトの使用によりビオチン化された。1.4一価トロポニンT結合剤AおよびBそれぞれに関するエピトープ抗トロポニンT抗体aおよびbそれぞれに由来する対応するFab’断片に対してそれぞれ中程度の親和性しか有しない合成ペプチドが考えられたconstrued。a抗体aに関するエピトープA’は次の配列中に含まれ:SEQIDNO9ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAEアミドここでUはβアラニンを表す。b抗体bに関するエピトープB’は次の配列中に含まれ:SEQIDNO10SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKEアミドここでOはアミノトリオキサオクタン酸を表す。当業者は理解するであろうように、これら2種類のエピトープを含有するペプチドを2通りで組み合わせることが可能であり、両方の変種はエピトープA’およびB’を線状に組み合わせることにより設計および調製された。両方の変種の配列:エピトープの線状配列A’-B’=TnT-1およびB’-A’=TnT-2はそれぞれ現状技術のペプチド合成法により調製された。エピトープA’およびB’に関する配列はそれぞれ、ヒトの心臓トロポニンTの配列P45379/UniProtKB上の本来のエピトープと比較してそれらに対するFabのそれぞれに関する結合親和性を低減するために修正されていた。これらの状況下で、例えばBiacore商標技術により結合親和性を分析することにより、ヘテロ二価結合の作用の動態をよりよく観察することができる。1.5生体分子相互作用分析この実験に関して、Biacore商標3000機器GEHealthcareを、系の中に取り付けられたBiacore商標SAセンサーと共にT=25°Cで用いた。前条件付けPreconditioningは100μl/分で50mMNaOH中の1MNaClの3×1分間の注入および1分間の10mMHClの注入で行われた。HBS-ET10mMHEPESpH7.4、150mMNaCl、1mMEDTA、0.05Tween登録商標20をシステム緩衝液として用いた。試料緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。Biacore商標3000システムは制御ソフトウェアV1.1.1の下で運転された。フローセル1を7RUのD-ビオチンで飽和させた。フローセル2上に1063RUのビオチン化ssDNAリンカーL1を固定した。フローセル3上に879RUのビオチン化ssDNAリンカーL2を固定した。フローセル4上に674RUのビオチン化ssDNAリンカーL3を捕捉させた。その後、Fab’断片DNAコンジュゲートAを600nMで注入した。Fab’断片DNAコンジュゲートBをシステム中に900nMで注入した。そのコンジュゲートを2μl/分の流速で3分間注入した。そのコンジュゲートを連続的に注入して、それぞれのFab’断片DNAコンジュゲートのそのそれぞれのリンカー上でのそれぞれの飽和シグナルを監視した。Fab’の組み合わせは、それぞれのリンカー上に存在する単一のFab’断片DNAコンジュゲートA、単一のFab’断片DNAコンジュゲートBならびに両方のFab’断片DNAコンジュゲートAおよびBを用いて駆動されたdriven。安定なベースラインはそのリンカーがFab’断片DNAコンジュゲートにより飽和された後に生成され、それはさらなる速度論的測定のための必要条件であった。人工のペプチド分析物TnT-1およびTnT-2を、溶液中の分析物として、表面に提示されたFab’断片と相互作用させるためにそのシステム中に注入した。TnT-1を500nMの分析物濃度で注入し、TnT-2を900nMの分析物濃度で注入した。両方のペプチドを50μl/分で4分間の会合時間で注入した。解離を5分間監視した。全てのフローセルに関して、50mMNaOHの50μl/分での1分間の注入により再生を行った。速度論データをBiaevaluationソフトウェアV.4.1を用いて決定した。TnT-1およびTnT-2ペプチドのそれぞれの表面に提示されたFab’断片の組み合わせからの解離速度kd1/sを、線形ラングミュア1:1当てはめfittingモデルに従って決定した。その複合体の分での半減時間を一次速度方程式:ln2/60kdの解法に従って計算した。結果:表1および2それぞれにおいて示した実験データは、分析物TnT-1またはTnT-2それぞれおよび様々なヘテロ二価Fab’-Fab’二量体A-Bの間の複合体の安定性における一価dsDNAFab’AまたはBコンジュゲートそれぞれと比較した場合の増大を実証している。この作用はそれぞれの表において2および3行目lineと比較した1行目において見られる。その結合活性作用はさらにそのリンカーの長さに依存している。表1の下に示した副表sub-tablesにおいて、すなわち人工分析物TnT-1に関して、31塩基長のスペーサーを含むリンカーL3は最低の解離速度または最高の複合体安定性を示す。表2の下に示した副表において、11塩基長のスペーサーを含むリンカーL2は人工分析物TnT-2に関して最低の解離速度または最高の複合体安定性を示す。これらのデータをまとめると、本発明において与えられるアプローチに本来備わっているようなリンカーの長さにおける柔軟性は非常に有用かつ好都合であることを実証している。実施例2リン酸化されたIGF-1Rに対する二価結合剤2.1モノクローナル抗体の開発mAb8.1.2およびmAb1.4.168aマウスの免疫処置BALB/Cマウスを0、3、6および9週目においてそれぞれ免疫する。免疫処置あたり100μgのリン酸化されたペプチドpIGF-1R1340~1366を含むコンジュゲートを用いる。このペプチドは、チロシン1346においてリン酸化され=1346-pTyr、C末端のシステインを介してKLHに連結されて=Aoc-Cys-MP-KLH-1340、免疫処置のために用いられるコンジュゲートがもたらされた。0および6週目それぞれにおいて腹腔内に、3および9週目それぞれにおいてマウスの体の様々な部分において皮下にsubcutanuosly免疫処置を実施する。b融合およびクローニング免疫したマウスの脾臓細胞を、GalfreGandMilsteinCMethodsinEnzymology73346に従って骨髄腫細胞と融合させる。このプロセスにおいて、免疫したマウスの約1×108個の脾臓細胞を2×107個の骨髄腫細胞aP3X63-Ag8653、ATCCCRL1580と混合し、遠心分離する250gおよび37°Cにおいて10分間。次いでその細胞をウシ胎児血清FCSを含まないRPMI1640培地で1回洗浄し、50mlコニカルチューブ中で250gで再度遠心分離する。上清を廃棄し、細胞沈降物をタッピングにより穏やかにほぐし、1mlのPEG分子量4000、Merck、ダルムシュタットを添加し、ピペット操作により混合する。37°Cの水浴中で1分間保温した後、5mlのFCSを含まないRPMI1640を室温で4~5分の期間内に滴加する。この工程をさらに10mlのFCSを含まないRPMI1640を用いて繰り返す。その後、25mlの10FCSを含有するRPMI1640を添加し、続いて37°C、5CO2において30分間の保温工程を行う。250gおよび4°Cにおいて10分間の遠心分離の後、その沈降した細胞を10FCSを含有するRPMI1640中に回収し、ヒポキサンチン-アザセリン選択培地RPMI164010FCS中100mmol/lヒポキサンチン、1μg/mlアザセリン中で蒔く。100U/mlのインターロイキン6をその培地に増殖因子として添加する。7日後、その培地を新しい培地と交換する。10日目に、その初代培養物を特異的な抗体に関して試験する。陽性の初代培養物を、蛍光活性化セルソーターにより、96ウェル細胞培養プレートにおいてクローニングする。c細胞培養上清からの免疫グロブリンの単離得られたハイブリドーマ細胞をCELLine1000CLフラスコIntegra中で1×107細胞の密度で蒔く。IgGを含有するハイブリドーマ細胞上清を週2回収集する。収量は典型的には1mlの上清あたり400μg~2000μgのモノクローナル抗体の範囲である。抗体の培養上清からの精製は、タンパク質化学の一般的に用いられる方法を用いて例えばBruckCMethodsinEnzymology121587695に従って実施した。2.2ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの合成それぞれSEQIDNO5および6において示した配列を含む、以下のアミノ修飾された前駆体を、標準的な方法に従って合成した。下記で示したオリゴヌクレオチドは、いわゆるアミノリンカーだけでなく蛍光色素も含む。当業者はすぐに理解するであろうように、この蛍光色素はオリゴヌクレオチド自体の、ならびにそれらを含む構成要素の精製を促進するために非常に好都合である。a5’フルオレセインAGTCTATTAATGCTTCTGC3C7アミノリンカーb5’Cy5AGTCTATTAATGCTTCTGC3C7アミノリンカーc5’アミノリンカー3AGTTCTATCGTCGTCCAフルオレセイン3’d5’フルオレセイン3C7アミノリンカーベータLはこれがL-DNAオリゴヌクレオチドであることを示すおよびe5’アミノリンカー3フルオレセイン3’ベータLはこれがL-DNAオリゴヌクレオチドであることを示す。合成はABI394合成装置上で10μmolスケールで、5’アミノ修飾に関してトリチルオンまたは3’アミノ修飾に関してトリチルオフモードで、固体支持体として商業的に入手可能なCPGを、ならびに標準的なdAbz、dT、dGiBuおよびdCBzホスホラミダイトSigmaAldrichを用いて実施された。オリゴヌクレオチド合成の間に以下のアミダイト類、アミノ修飾剤およびCPG支持体を用いてC3スペーサー、色素およびアミノ部分をそれぞれ導入した:スペーサーホスホラミダイトC3プロピル1ホスホラミダイト5’アミノ修飾剤は、5’アミノ修飾剤C6ヘキシルホスホラミダイトを用いることにより導入した5’フルオレセインホスホラミダイト6ヘキシル1OホスホラミダイトCy5商標ホスホラミダイト13プロピル13propyl13LightCyclerフルオレセインCPG500Aおよび3’アミノ修飾剤TFAアミノC6lcaaCPG500A。Cy5標識されたオリゴヌクレオチドに関して、dA、dT、dG、dCホスホラミダイトを用いて、33アンモニアによる脱保護を室温で2時間実施した。L-DNAオリゴヌクレオチドは、ベータLdA、dT、dGおよびdCホスホラミダイトを用いることにより合成された。フルオレセイン修飾されたハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの精製は、2工程の手順により実施された:まず、そのオリゴヌクレオチドを逆相HPLCOAcMeCN955BMeCN3分間のA中20B、12分間のA中20~50Bおよび25分間のA中20B、10ml分の流速、260nmにおいて検出上で精製した。望まれる生成物を含有する画分分析的RPHPLCにより監視したを合わせ、蒸発させて乾燥させた5’末端においてモノメトキシトリチル保護されたアルキルアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドは、20酢酸と共に20分間保温することにより脱トリチル化する。フルオレセインを標識として含有するオリゴマーは、HPLC上でのIEXクロマトグラフィーMonoQカラム:緩衝液A:水酸化ナトリウム;緩衝液B:水酸化ナトリウム中で溶解させた1M塩化ナトリウム;勾配:30分間で100緩衝液Aから100緩衝液Bまで、流速1ml分、260nmにおいて検出により再度精製した。その生成物を透析により脱塩した。Cy5標識されたオリゴマーは、逆相HPLC上での最初の精製OAcMeCN955BMeCN3分間のA中20B、12分間のA中20~50Bおよび25分間のA中20B、10ml分の流速、260nmにおいて検出の後に用いられた。そのオリゴマーを透析により脱塩し、SpeedVacエバポレーター上で凍結乾燥させると固体が得られ、それを24°Cで凍結させた。2.3ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの活性化実施例2からのアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドを01Mホウ酸ナトリウム緩衝液中で溶解させ、DMF中で溶解させた18倍モル過剰量のThermoScientificからのスルホSMCCと反応させた。その反応生成物を、スルホSMCCの加水分解分解産物である4Nマレイミドメチルシクロヘキサン1カルボキシレートを除去するために、水に対して完全に透析した。その透析物を蒸発により濃縮し、チオール基を含む一価結合剤とのコンジュゲーションのために直接用いた。2.4両端においてハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むリンカーオリゴヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドは、標準的な方法により、ABI394合成装置上で10μmolスケールで、トリチルオンモードで、固体支持体として商業的に入手可能なdT-CPGを用いて、標準的なdAbz、dT、dGiBuおよびdCBzホスホラミダイトSigmaAldrichを用いて合成された。L-DNAオリゴヌクレオチドは、固体支持体として商業的に入手可能なベータL-dT-CPGを、ならびにベータ-L-dAbz、dT、dGiBuおよびdCBzホスホラミダイトChemgenesを用いることにより合成された。オリゴヌクレオチドの精製を、実施例2.3の下で記述したように逆相HPLC上で実施した。望まれる生成物を含有する画分分析的RPHPLCにより分析/監視したを合わせ、蒸発させて乾燥させた。脱トリチル化を、80酢酸と共に15分間保温することにより実施した。酢酸を蒸発により除去した。残留物reminderを水中で溶解させ、凍結乾燥した。オリゴヌクレオチド合成の間に以下のアミダイト類およびCPG支持体を用いてC18スペーサー、ジゴキシゲニンおよびビオチン基を導入した:スペーサーホスホラミダイト18ホスホラミダイトビオチンdTビオチニルアミノヘキシル3アクリルイミド2デオキシウリジン3ホスホラミダイトビオチンホスホラミダイト1ジメトキシトリチルオキシ2プロピル3OホスホラミダイトならびにジゴキシゲニンNヒドロキシルスクシンイミジルエステルによるアミノ修飾および後標識に関して、5ジメトキシトリチル5N3アクリルイミド2デオキシウリジン、3ホスホラミダイト。以下の架橋コンストラクトまたはリンカーを合成した:リンカー15’GCAGAAGCATTAATAGACTTGGACGACGATAGAACT3’リンカー25’GCAGAAGCATTAATAGACTTGGACGACGATAGAACT3’リンカー35’BLGCAGAAGCATTAATAGACTTGGACGACGATAGAACT3’リンカー45’BLGCAGAAGCATTAATAGACTT5T5TGGACGACGATAGAACT3’リンカー55’BLGCAGAAGCATTAATAGACTT20T20TGGACGACGATAGAACT3’リンカー65’BLGCAGAAGCATTAATAGACTT30T30TGGACGACGATAGAACT3’リンカー75’GCAGAAGCATTAATAGACTT5T5TGGACGACGATAGAACT3’リンカー85’GCAGAAGCATTAATAGACTT10T10TGGACGACGATAGAACT3’リンカー95’GCAGAAGCATTAATAGACTT15T15TGGACGACGATAGAACT3’リンカー105’GCAGAAGCATTAATAGACTT20T20TGGACGACGATAGAACT3’リンカー115’GCAGAAGCATTAATAGACTスペーサーC18スペーサーC18TGGACGACGATAGAACT3’リンカー125’GCAGAAGCATTAATAGACT22TGGACGACGATAGAACT3’リンカー135’GCAGAAGCATTAATAGACT33TGGACGACGATAGAACT3’リンカー145’GCAGAAGCATTAATAGACT44TGGACGACGATAGAACT3’リンカー155’GCAGAAGCATTAATAGACTT20T20TGGACGACGATAGAACT3’リンカー165’GCAGAAGCATTAATAGACTTGGACGACGATAGAACT3’リンカー175’GCAGAAGCATTAATAGACTTGGACGACGATAGAACT3’上記の架橋コンストラクトの実施例は、少なくとも第1のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドおよび第2のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含む。リンカー3~17は、そのハイブリダイズ可能な核酸の一続きに加えて、中央のそれぞれビオチン化もしくはジゴキシゲニン化されたチミジンまたは上記で示した長さのチミジン単位からなるスペーサーを含む。その5’ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQIDNO7に、その3’ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQIDNO8にそれぞれ対応する。SEQIDNO7のオリゴヌクレオチドは、SEQIDNO5のオリゴヌクレオチドに容易にハイブリダイズするであろう。SEQIDNO8のオリゴヌクレオチドは、SEQIDNO6のオリゴヌクレオチドに容易にハイブリダイズするであろう。上記の架橋コンストラクトの実施例において、BLはL-DNAオリゴヌクレオチド配列が示されていることを示し;スペーサーC18、ビオチンおよびビオチンdTはそれぞれ上記で示した構築ブロックに由来するようなC18スペーサー、ビオチンおよびビオチン-dTを指し;そして数を伴うTは示した位置においてそのリンカー中に組み込まれたチミジン残基の数を示す。2.5二重結合剤コンストラクトの組み立てAIgGの切断およびFab’断片のssDNAによる標識精製したモノクローナル抗体をペプシンプロテアーゼの助けにより切断するとFab’2断片が得られ、続いてそれを37°Cでの低濃度のシステアミンでの処理により還元するとFab’断片になる。その反応を、PD10カラム上でのシステアミンの分離により停止する。そのFab’断片を、実施例3に従って生成されるような活性化されたオリゴヌクレオチドにより標識する。この一本鎖DNA=ssDNAはチオール反応性マレイミド基を有し、それはFab’のヒンジ領域のシステインと反応する。高い百分率の単一標識されたFab’断片を得るため、ssDNAのFab’断片に対する相対的なモル比は低く保たれる。単一標識されたFab’断片ssDNA:Fab’=1:1の精製は、イオン交換クロマトグラフィーカラム:Source15QPE4.6/100、Pharmacia/GEにより行われる。効率的な精製の検証は、分析的ゲル濾過およびSDS-PAGEにより達成される。B抗pIGF-1R二重結合剤の組み立て抗pIGF-1R二重結合剤は、IGF-1Rの細胞内ドメインの異なるエピトープを標的とする2種類のFab’断片に基づいている:Fab’8.1.2は前記の標的タンパク質のリン酸化部位pTyr1346を検出し、Fab’1.4.168は前記の標的タンパク質の非ホスホ部位を検出する。そのFab’断片は一本鎖DNAssDNAに共有結合的に連結されている:Fab’1.4.168はSEQIDNO6を含みフルオレセインを蛍光マーカーとして含有する17塩基長のssDNAに、そしてFab’8.1.2はSEQIDNO5を含みCy5を蛍光マーカーとして含有する19塩基長のssDNAに共有結合的に連結されている。以下、共有結合した17塩基長または19塩基長のssDNAを有するこれらのFab’をそれぞれssFab’1.4.168およびssFab’8.1.2と呼ぶ。二重結合剤の組み立ては、そのssFab’断片の対応するssDNAにハイブリダイズする2種類の相補性ssDNAオリゴヌクレオチドそれぞれSEQIDNO7および8を含むリンカーすなわち架橋コンストラクトにより媒介される。その二重結合剤の2個のssFab’断片の間の距離は、スペーサー、例えばC18スペーサーまたは異なる長さのDNAをそれぞれ用いることにより修正することができる。組み立て評価のために、その二重結合剤構成要素ssFab’8.1.2、ssFab’1.4.168ならびにリンカーコンストラクトI=実施例2.4のリンカー175’GCAGAAGCATTAATAGACTTTGGACGACGATAGAACT3’およびII=実施例2.4のリンカー105’GCAGAAGCATTAATAGACTTTGGACGACGATAGAACT3’を室温で等モル量で混合した。1分間の保温工程の後、その反応混合物を分析的ゲル濾過カラム上で分析した。単一の二重結合剤構成要素の溶離体積VEのその反応混合物のVEとの比較は、その二重結合剤がうまく形成されたことを実証している図1。そのリンカーの両方の中央にあるビオチン化チミジンは、これらの実験において機能を有しない。2.6抗pIGF-1R二重結合剤の固定されたIGF-1RおよびIRペプチドへの結合を評価するBiacore商標実験この実験に関して、Biacore商標2000機器GEHealthcareを、系の中に取り付けられたBiacore商標SAセンサーと共にT=25°Cで用いた。前条件付けは100μl/分で50mMNaOH中の1MNaClの3×1分間の注入および1分間の10mMHClの注入で行われた。HBS-ET10mMHEPESpH7.4、150mMNaCl、1mMEDTA、0.05Tween登録商標20をシステム緩衝液として用いた。試料緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。Biacore商標2000システムは制御ソフトウェアV1.1.1の下で運転された。続いてビオチン化されたペプチドをそれぞれのフローセル中のSA表面上に捕捉させた。16RUのIGF-1R1340~1366[1346-pTyr;GluBi-PEG-1340]アミドすなわち、1346位のチロシンがリン酸化されており、位置1340に対応するグルタミン酸を介して結合したPEGリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQIDNO11のペプチドをフローセル2上に捕捉させた。18RUのIGF-1R1340~1366;GluBi-PEG-1340]アミドすなわち、1346位のチロシンがリン酸化されておらず、位置1340に対応するグルタミン酸を介して結合したPEGリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQIDNO11のペプチドをフローセル3上に捕捉させた。20RUのhIR1355~1382[1361-pTyr;GluBi-PEG-1355]アミドすなわち、1361位のチロシンがリン酸化されており、ヒトインスリン受容体の位置1355に対応するグルタミン酸を介して結合したPEGリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQIDNO12のペプチドをフローセル4上に捕捉させた。最後に、全てのフローセルをd-ビオチンで飽和させた。二重結合剤の形成に関して、実施例2.5において記述したような組み立てプロトコルを用いた。2種類のssFab’の一方のみを用いて個々の運転を実施した際、リンカーDNAの非存在または存在は会合または解離曲線に影響を及ぼさなかったデータは示していない。100nMの溶液中の分析物これらの実験では二価二重結合剤を50μl/分で240秒の会合時間の間に注入し、解離を500秒間監視した。80mMNaOHを用いた50μl/分での1分間の注入工程を用いることにより、効率的な再生が達成された。フローセル1は基準の役目を果たした。抗原の注入の代わりにブランク緩衝液の注入を用いて、緩衝液のシグナルを引くことによりそのデータを二重に参照した。それぞれの測定サイクルにおいて、溶液中の以下の分析物の1つを4つのフローセル全てにわたってそれぞれ注入した:100nMのssFab’8.1.2、100nMのssFab’1.4.168、100nMのssFab’8.1.2および100nMのssFab’の混合物、リンカーIII5’GCAGAAGCATTAATAGACTTTTGGACGACGATAGAACT3’=実施例2.4のリンカー15上にハイブリダイズしたssFab’8.1.2およびssFab’1.4.168からなる100nMの二価結合剤、ならびにリンカーIV5’GCAGAAGCATTAATAGACTTTGGACGACGATAGAACT3’=実施例2.4のリンカー16上にハイブリダイズしたssFab’8.1.2およびssFab’1.4.168からなる100nMの二価結合剤。上記のリンカー中の中央のチミジンのジゴキシゲニン化は、これらの実験に関連しない。そのシグナルは、時間依存性Biacore商標センサーグラムとして監視された。報告の時点は、それぞれの相互作用の応答単位シグナルの高さを監視するため、分析物の会合段階の終了時結合末期BindingLate、BLに、および分析物の解離段階の終了時安定性末期StabilityLate、SLに設定された。解離速度kd1/sをBiacore商標評価ソフトウェア4.1を用いて線形1:1ラングミュア当てはめに従って計算した。その複合体の分での半減時間を式ln2/60kdに基づいて計算した。そのセンサーグラム図2-5は、ssFab’1.4.168およびssFab’1.4.168が二重結合剤=二価結合剤の形態で用いられた際の、おそらく基礎になっている協同的結合作用による、pIGF-1R結合における特異性および複合体の安定性の両方における増大を示している。Fab’1.4.168単独ではpIRペプチドに関する交差反応性を示さないが、IGF-1Rのリン酸化型および非リン酸化型を識別しない両方の場合においてT1/2dis=3分。しかし、Fab’8.1.2はIGF1-Rペプチドのリン酸化版にのみ結合するが、リン酸化されたインスリン受容体とのいくらかの望まれない交差反応性を示す。その二重結合剤はpIGF-1Rペプチドおよび両方の他のペプチドを十分に識別し図4参照、従って非特異的結合の問題の克服を助ける。その特異性における増大は、両方のFab’がリンカーDNAなしで適用された場合には失われることを特筆する図5。その二重結合剤のpIGF-1Rペプチドに対する親和性における増大は、個々のFab’およびそのリンカーDNAを抜かしたFab’混合物と比較して増大した解離半減時間において示される図3および図5。試験した2種類の異なるDNAリンカーの長さを有する二重結合剤は標的結合特異性および親和性への全体的なプラスの作用を共有しているが、より長いリンカーT40-T-Digをスペーサーとして有するIIIすなわち実施例2.4のリンカー15が両方の基準に関して好都合であるように思われる。2.7M-1.4.168-IgGおよびM-8.1.2-IgGのBiacore商標アッセイサンドイッチBiacore商標T100機器GEHealthcareをシステム中に取り付けられたBiacore商標CM5センサーと共に用いた。そのセンサーは、0.1SDS、50mMNaOH、10mMHClおよび100mMH3PO4の100μl/分での1分間の注入により前条件付けされた。システム緩衝液はHBS-ET10mMHEPESpH7.4、150mMNaCl、1mMEDTA、0.05Tween登録商標20であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。Biacore商標T100システムは制御ソフトウェアV1.1.1の下で運転された。10mM酢酸NapH4.5中で30μg/mlのポリクローナルウサギIgG抗体<IgGFCγM>RJacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.を、10000RUでフローセル1、2、3、および4それぞれの上に、EDC/NHS化学により、製造業者の説明書に従って固定した。最後に、そのセンサー表面を1Mエタノールアミンでブロッキングした。全部の実験を13°Cで運転した。500nMの一次mAbM-1.004.168-IgGを<IgGFCγM>R表面上に10μl/分で1分間捕捉させた。ブロッキング溶液を含有する3μMのIgGクラスIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3のIgG断片混合物を30μl/分で5分間注入した。ペプチドIGF-1R1340~1366[1346-pTyr;GluBi-PEG-1340]アミドを300nMで30μl/分において3分間注入した。300nMの二次抗体M-8.1.2-IgGを30μl/分で注入した。10mMグリシン-HClpH1.7を50μl/分で3分間用いてセンサーを再生させた。図6はそのアッセイの構成を説明している。図7において、その測定の結果を示す。その測定は、両方のモノクローナル抗体がそれらのそれぞれの標的ペプチド上の2つの別個の無関係なエピトープに同時に結合することができることを明確に示している。これは、協同的結合事象を生じさせる目的を有するあらゆる後の実験のための必要条件である。2.8センサー表面上の二重結合剤のBiacore商標アッセイBiacore商標3000機器GEHealthcareをシステム中に取り付けられたBiacore商標SAセンサーと共にT=25°Cで用いた。そのシステムは、100μl/分での50mMNaOH中1MNaClの3×1分間の注入および1分間の10mMHClの注入により前条件付けされた。システム緩衝液はHBS-ET10mMHEPESpH7.4、150mMNaCl、1mMEDTA、0.05Tween登録商標20であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。Biacore商標3000システムは制御ソフトウェアV4.1の下で運転された。124RUのアミノ-PEO-ビオチンを基準フローセル1上に捕捉させた。1595RUのビオチン化された14.6kDaのT0-Bi37塩基長ssDNA-リンカーI5’GCAGAAGCATTAATAGACTTTGGACGACGATAGAACT3’=実施例2.4のリンカー17および1042RUのビオチン化された23.7kDaのT40-Bi77塩基長ssDNA-リンカーII5’GCAGAAGCATTAATAGACTTTGGACGACGATAGAACT3’=実施例2.4のリンカー10を、異なるフローセル上に捕捉させた。300nMのssFab’8.1.2および300nMのssFab’1.004.168をそのシステムの中に50μl/分で3分間注入した。それぞれのssFabの速度論的寄与を試験するため、対照として300nMのssFab’8.1.2または300nMのssFab’1.004.168のみを注入した。対照として、緩衝液をssFabの代わりに注入した。ペプチドpIR1355~1382[1361-pTyr]アミドおよびIGF-1R1340~1366アミドそれぞれ溶液中で遊離しているfreeinsolutionをシステム中に0nM、4nM、11nM、33nM2回、100nMおよび300nMの濃度段階で50μl/分で4分間注入した。ペプチドpIGF-1R1340~1366[1346-pTyr]アミドに対する親和性を測定するための実験の別のセットにおいて、0nM、0.4nM、1.1nM、3.3nM2回、10nMおよび30nMの濃度段階を用いた。解離を50μl/分で5.3分間監視した。それぞれの濃度工程の後、250mMのNaOHの12秒間のパルスによりシステムを再生し、ssFab’リガンドを再装填したreloaded。図8はBiacore商標機器上のアッセイ構成を模式的に説明している。図9で示した表は、このアプローチからの定量の結果を示す。図10、11および12はT40二重結合剤を用いたこのアッセイ構成からの典型的なBiacore商標の結果を示す。図9における表は、二重結合剤の概念の利益を実証している。T40二重結合剤実施例2.4のリンカー10、すなわちT20-ビオチン-dT-T20のスペーサーを有するリンカーを有する二重結合剤は結果として、それぞれ192分および30pMであるT0二重結合剤すなわち実施例2.4のリンカー16を有する二重結合剤と比較した場合に、2倍向上した抗原複合体の半減時間414分および3倍向上した親和性10pMをもたらす。これは最適な協同的結合作用をもたらすためにリンカーの長さを最適化する必要性を強調する。T40二重結合剤すなわちT40-T-Biリンカー実施例2.4のリンカー10を含む二重結合剤は、リン酸化されたIGF-1Rペプチドに対する10pMの親和性を示す図9、図10における表。これはリン酸化されたインスリン受容体ペプチド24nMに対する2400倍の親和性の向上であり、リン酸化されていないIGF-1Rペプチドに対する100倍の向上である。従って、2種類の別個の分離された結合事象の組み合わせにより特異性および親和性を増大させる目的は達成されている。協同的結合作用は特にリン酸化されたIGF-1Rペプチドに対する解離速度から明らかになり、ここで二重結合剤は、一価結合剤8.1.2単独による0.5分および一価結合剤1.4.168単独による3分それぞれに対して414分の抗原複合体半減時間を示す。さらに、完全に組み立てられたコンストラクトは、単独でFab’がハイブリダイズしたコンストラクトと比較した場合に、その解離速度kd1/sをおおよそ掛け合わせる図10、11、12および図9中の表。興味深いことに、会合速度ka1/Msも単独のFab’の相互作用事象と比較した場合にわずかに増大し、これはそのコンストラクトの分子の柔軟性の増大によるものである可能性がある。強い洗浄手順を用いる診断系は、個々の一価のFab’分子とは対照的に、そのT40二重結合剤の高い性能を確実に促進するはずである。そのハイブリダイズしたコンストラクト、すなわち本発明に従う二価結合剤は特異的かつ極めて安定な結合事象をもたらすが、一価結合剤はより急速に解離し、例えばそれらはより急速に洗い流される。実施例3:インスリン様成長因子1のホモ二量体型に結合する二価結合剤インスリン様成長因子1受容体IGF1-Rはチロシンキナーゼ受容体のファミリーに属し、それはIGF1により活性化される。その受容体はホモ二量体である。IGF1-R単量体は、膜貫通βサブユニットにジスルフィド架橋を介して共有結合的に連結された1個の細胞外αサブユニットからなる。2個の単量体が2個の単量体のαサブユニット間のジスルフィド架橋により共有結合的に連結される。IGF1受容体は癌、加齢およびインスリンシグナル伝達において重要な役割を果たしている。我々が開発した二量体結合剤は、2個の同一のFab’断片を含む。これらのFab’断片は両方とも個々に用いられた場合それらの標的ペプチドIGF1-Rに低い複合体安定性でしか結合しない。二価結合剤を生成するため、そのFab’断片をハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにコンジュゲートする。リンカーDNAならびにこのオリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイズすることができるアダプターDNAを、そのFab’-DNAおよびリンカーDNAとハイブリダイズするための架橋として用いて、用いた2個のto一価結合剤に関する適切な距離も特徴とする安定な二価結合剤を提供する模式図を図13において示す。この抗IGF1-R二重結合剤を、自動化された免疫組織化学染色システムBenchMark登録商標XTにおいて試験した。3.1IGF1受容体に対する低親和性モノクローナル抗体の開発aマウスの免疫処置Balb/cマウスをIGF1R1340~1366[1346-pTyr;Aoc-Dys-MP-KLH-1340]アミドのペプチドで免疫した。そのリン酸化されていないアミノ酸aminocid配列をSEQIDNO11として示す。最初の免疫用量は100μgであった。4、8および12週間後にそのマウスを100μgの免疫原でさらに免疫した。b融合およびクローニング前記のマウスの脾臓細胞を、GalfreGandMilsteinCMethodsinEnzymology73346に従って骨髄腫細胞と融合させた。このプロセスにおいて、免疫したマウスの1×108個の脾臓細胞を2×107個の骨髄腫細胞P3x63-Ag8-653、ATCCCRL1580と混合し、250gおよび37°Cにおいて10分間遠心分離した。その上清を廃棄し、細胞のペレットをタッピングによりほぐした。1mLのPEG分子量4000、Merck、ダルムシュタットを一滴ずつ、37°Cにおいて水浴中で1分以内に添加した。その後、5mlのFCSを含まないRPMI1640を5分以内に一滴ずつ添加し、続いてさらに10mLのFCSを含まないRPMI1640を10分以内に一滴ずつ添加した。次の工程として、10FCS、100mmol/lヒポキサンチン、1μg/mlアザセリンおよび50uのIL-6を含む25mLのRPMI1640を添加し、その細胞を37°C、5CO2において60分間保温し、次いで250gで10分間遠心分離した。その細胞のペレットを10FCS、100mmol/lヒポキサンチン、1μg/mlアザセリンおよび50uのIL-6を含む30mLのRPMI1640中で再懸濁し、37°C、5CO2で培養した。c細胞培養上清からの免疫グロブリンの単離約10日後、その初代培養物を抗原特異性に関して試験した。陽性初代培養物を蛍光活性化セルソーターにより96ウェル細胞培養プレートにおいてクローニングした。それに続く24ウェルプレート、6ウェルプレートおよびT75フラスコCorningにおけるNutridoma栄養補助剤Rocheを含むHyclone培地TheromoScientific中での増殖の後、望まれる低親和性抗体を発現するハイブリドーマ細胞を最終的にCELLineバイオリアクターIntegrabiosciences中で製造業者の説明書に従って培養した。最も有望な抗体をmAb1.4.168と名付けた。dmAb1.4.168の生物物理学的特性付けmAb1.4.168およびIGF1受容体の間の相互作用の速度論的特性を、Biacore商標技術を用いた表面プラズモン共鳴により調べた。Biacore商標T100機器GEHealthcareをシステム中に取り付けられたBiacore商標CM5センサーと共にT=25°Cで用いて、それを0.1SDS、50mMNaOH、10mMHClおよび100mMH3PO4の100μl/分での1分間の注入により前条件付けした。システム緩衝液はHBS-ET10mMHEPESpH7.4、150mMNaCl、1mMEDTA、0.05Tween登録商標20であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。Biacore商標T100システムは制御ソフトウェアV1.1.1の下で運転された。10mM酢酸NapH4.5中で30μg/mlのポリクローナルウサギIgG抗体<IgGFCγM>RJacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.を、8000RUでフローセル1、2、3、4上に、EDC/NHS化学により、製造業者の説明書に従って固定した。最後に、そのセンサー表面を1Mエタノールアミンでブロッキングした。250nMmAbM-1.004.168-IgGをその<IgGFCγM>R表面上に10μl/分で1分間捕捉させた。900nM、300nM、150nM、50nM、17nM、6nM、および0nMのペプチドIGF-1R1340~1366[1346-pTyr;GluBi-PEG-1340]アミドの濃度系列を溶液中の分析物として用いて、それを100μl/分で3分間の会合時間の間注入した。解離を100μl/分で10分間監視した。そのアッセイの再現性を確実にするため、対照として1つの濃度段階を2回分析した。フローセル1は参照セルの役目を果たした。抗原の注入の代わりにブランク緩衝液の注入を用いて、緩衝液のシグナルを引くことによりそのデータを二重に参照した。その捕捉系を、10mMグリシンpH1.7の10μl/分での3分間の注入を用いて再生させた。そのデータを、会合速度定数ka[1/Ms]、解離速度定数kd[1/s]および結果として得られる親和性定数KD[M]を計算するため、Biacore商標T100評価ソフトウェアV1.1.1を用いて1:1二成分ラングミュア相互作用モデルに従って評価した。mAb1.4.168に関する解離速度定数は3.6×10-31/sであり、従って我々の二重結合剤アプローチに必要な低い複合体安定性を有する抗体の範囲内であった。さらに、表面プラズモン共鳴を用いて抗原特異性を決定した。Biacore商標2000機器GEHealthcareを、系の中に取り付けられたBiacore商標SAセンサーと共にT=25°Cで用いて、それを100μl/分で50mMNaOH中の1MNaClの3×1分間の注入および1分間の10mMHClの注入により前条件付けした。システム緩衝液はHBS-ET10mMHEPESpH7.4、150mMNaCl、1mMEDTA、0.05Tween登録商標20であった。試料緩衝液はシステム緩衝液1mg/mlCMDカルボキシメチルデキストラン,Sigmaであった。続いて、ビオチン化されたペプチドをそれぞれのフローセル中のSA表面上に捕捉させた。フローセルを最終的に2μMのd-ビオチンで飽和させた。ハイブリドーマクローンの培養上清を1:2希釈し、それを50μl/分で2分間注入し、解離を5分間監視した。10mMGly/HClpH1.7の30μl/分での1.5分間の注入で再生させた。フローセル1は基準の役目を果たした。抗原の注入の代わりにブランク緩衝液の注入を用いて、緩衝液のシグナルを引くことによりそのデータを二重に参照した。そのデータを、Biacore商標評価ソフトウェア1.1.1に従って評価した。シグナルの高さを注入時間の終了時結合末期RUに測定した。下記の表3は、mAb1.4.168はリン酸化された、およびリン酸化されていないIGF-1RペプチドSEQIDNO11を同等に十分に認識したが、それはリン酸化されたインスリン受容体ペプチドSEQIDNO12とは相互作用しなかったことを明確に示している。FC=フローセル、リガンド=それぞれSAコートされたチップ上に捕捉されたビオチンおよびビオチン化されたペプチド、RU=共鳴resonace単位リガンドとしてSA表面上に捕捉されたbi-ペプチドの質量に相関する、分析物=溶液中のmAb1.4.168、結合末期RU=分析物注入期の終了時におけるシグナルの高さ。3.2抗体の精製、Igの切断およびFab’断片の生成a精製mAb1.4.168をまず最終pH4.75への2N酢酸による酸沈殿により精製した。15分の保温時間ならびに4°Cおよび13,000rpmでの遠心分離の後、その上清を1MK3PO4によりpH7.0に緩衝した。その後、その抗体を硫酸アンモニウム沈殿30.5g/100mLによりさらに精製した。9000rpmで4°Cにおいて30分間の遠心分離の後、上清を廃棄し、ペレットを10mMクエン酸Na、20mMNaClpH5.5中で再懸濁した。次いでその抗体を10mMクエン酸Na、20mMNaClpH5.5に対して透析し、4°C、13,000rpmで30分間遠心分離し、細胞のペレットを廃棄した。その抗体を、10mMクエン酸Na、20mMNaClpH5.5中で平衡化したSPセファロースカラムGEHealthcare上でのイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。その抗体を、6カラム体積にわたる20mMから250mMまでのNaClの勾配で溶離した。その溶離液をフラクションコレクターで集め、タンパク質を含有する画分をHPLCおよびSDS-PAGEにより分析してその抗体を確実にpositively同定した。その抗体を含有する画分をプールし、製造業者の説明書に従って限外濾過AmiconUltra10kDaMWCOにより濃縮し、50mMリン酸カリウム、150mMNaClpH7.5に対して透析した。bFab’2分子を生成するためのパパイン消化その精製された抗体を、25mUパパイン/mgIgGで37°Cにおいて80分間切断した。その反応を、反応体積の0.1倍の270mMヨウ素アセトアミドiodineacetamide、75mMリン酸カリウム、150mMNaClおよび2mMEDTAの添加により停止した。その後、その反応混合物を10mMリン酸カリウム、20mMNaClpH7.0に対して透析した。次いでそのFab’2をDEAEイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。そのDEAEカラムGEHealthcareを10mMリン酸カリウム、20mMNaClpH7.0で平衡化し、その透析された反応混合物を装填loadingした後、そのFab’2を10mMリン酸カリウム、1MNaClpH7.0で溶離した。さらに、そのFab’2を免疫親和性クロマトグラフィーにより、ポリクローナル抗パパイン抗体を装填したカラム、続いてM-Fcγに対するポリクローナル抗体を装填したカラムの素通り画分として精製した。PBSを運転緩衝液として用いた。その最終的な素通り画分をAmiconUltra10kDaMWCO遠心式フィルターを用いて濃縮し、その純度をSDS-PAGEにより決定した。Fab’2の還元およびFab’断片の生成そのFab’2を37°CにおいてthermomixerEppendorf中で15mMシステアミン、25mMリン酸カリウム、5mMEDTApH6.5中で60分間還元した。その反応を、100mMリン酸カリウム、2mMEDTApH6.3中で平衡化したSephadexG25P10カラムGEHealthcare上でのサイズ排除クロマトグラフィーゲル濾過におけるFab’のシステアミンからの分離により停止した。そのFab’を、25mMKPO4、2mMEDTApH6.5で溶離した。3.3Fab’断片のDNA標識実施例3.2で得られたFab’断片を、ssDNA-マレイミド誘導体と1;1のモル比で20分間コンジュゲートした。このssDNA配列は、リンカーおよびアダプターオリゴヌクレオチドそれぞれの上にある相補配列にハイブリダイズすることができる。その反応を過剰量のシステイン-HClの添加コンジュゲートしていないDNA-マレイミドの停止quenchingのため、続いて過剰量のN-メチルマレイミドの添加遊離のシステイン-SH基の停止により停止した。その後、そのFab’を20mMトリスpH7.6に対して透析した。次いで単一標識されたFab’を多標識されたFab’から、SourceQカラムGEHealthcareを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで分離した。そのカラムを20mMトリスpH7.6中で平衡化し、そのFab’-DNAコンジュゲートをNaCl勾配で溶離した。流速は2ml/分であり、そのFab’-DNAコンジュゲートは400~700mMNaClの塩濃度で溶離された。単一標識されたFab’-DNAコンジュゲートをフラクションコレクターで集め、限外濾過AmiconUltra10kDaMWCOにより濃縮し、10mMHEPES、150mMNaCl、1mMEDTA、0.05Tween20pH7.4に対して透析した。3.42個の抗IGF1-RFab’断片を含む二価結合剤の形成実施例3.3からのssDNAリンカーで標識されたFab’断片、リンカーDNAおよびアダプターDNAを等モル量で室温において混合し、二価ホモ二量体結合剤を形成させた図13参照。1分間の保温工程の後、その反応混合物を分析的ゲル濾過カラムSuperdex商標200,10/300GL,GEHealthcare上で分析した。そのFab’-DNAコンジュゲートの濃度は2.5μMであり、そのDNA-リンカーおよびDNAアダプターの濃度はそれぞれ1.25μMであった。3.5二重結合剤の形成を調べるための分析的サイズ排除クロマトグラフィー分析的サイズ排除クロマトグラフィーを、GEHealthcareSuperdex20010/300GL分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて、0.5ml/分の流速で実施した。PBSを運転緩衝液として用いて、100μLの試料をそれぞれの運転において注入した。DNAハイブリダイゼーションによる二重結合剤の形成は、Fab’-DNAコンジュゲートならびにFab’-DNA、リンカー-DNAおよびアダプターDNAの三元複合体の間の保持時間の違いにより確証された表4。最も効率的な二重結合剤の形成は、2:1:1のFab’-DNA、リンカーDNAおよびアダプターDNAの比率で観察された。保持時間は280nm芳香族の吸光度および495nmフルオレセインの吸光度における吸光度の変化により監視された。保持時間はそれぞれの運転の溶離プロフィールにおける結果としてもたらされたピークの最大吸光度280nmとして測定された。Fab’-DNAコンジュゲート、リンカーDNAおよびアダプターDNAの三元複合体は、個々の構成要素単独ならびにFab’-DNAおよびリンカー-DNAの複合体よりも短い保持時間で溶離され、これはより高い分子量を示しており、従って三元複合体の形成を示している。3.6免疫組織化学染色NIH3T3細胞を、ヒトIGF1受容体を過剰発現するように安定形質移入した。その形質移入された細胞を固定し、標準的な手順に従ってパラフィンブロック中に包理した。ミクロトームHM355S,ThermoScientificを用いてそのブロックの3μmの切片を生成し、VentanaBenchMark登録商標XTシステムにおける自動化されたIHC染色のためにスライドガラス上に移した。その染色手順は、商業的に入手できるVentanaからの試薬を用いて実施された。その細胞を脱パラフィン処理し、抗原の回復のために標準的なCC1緩衝液Ventanaを用いて処理した。100μLの抗体希釈緩衝液Ventana中1μg/mlの二重結合剤またはアダプターDNAなしの二重結合剤をそのスライドガラスの上に手作業で滴定しtitrated、32分間保温した。その細胞を100μLのヘマトキシリンIIVentanaで4分間および100μLの青色染色試薬bluingreagentVentanaで8分間対比染色した。その二重結合剤の検出は、キットのiviewDABビオチン化二次抗体の代わりに反応緩衝液Ventanaを用いたことを除き、XTiviewDAB検出キットVentanaに基づいており、従ってそのキットのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートはビオチン化されたリンカー-DNAのみを認識した。その染色を光学顕微鏡により分析した。二重結合剤のみが細胞を染色し、一方でアダプターDNAなしのFab’-DNA/DNAリンカー複合体ハイブリダイズして二重結合剤になることができないは洗い流され、IGF1受容体陽性細胞を染色しなかった図14。論考:マウスを抗体発現のためにIGF1受容体抗原で免疫した。最も有望な抗体mAb1.4.168を、速度論的特性および特異性に関して表面プラズモン共鳴により特性付けした。次いでその抗体を精製し、切断し、17塩基長のDNA配列で標識した。Fab’-DNA、リンカー-DNAおよびアダプターDNAの間のハイブリダイゼーションを分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより確かめ、次いでその二重結合剤を、安定導入された細胞に対する自動化されたIHC染色VentanaBenchMark登録商標XTにおいて用いた。二重結合剤のみがその細胞を陽性に染色し、一方でアダプターDNAなしのFab’-DNA/リンカーDNA複合体単独は洗い流され、従って染色しなかった。そのホモ二量体性受容体に対する二重結合剤の両方の結合要素の協同的結合が結果としてそのIHC機器におけるストリンジェントな洗浄に耐えるための十分に高い複合体安定性をもたらした可能性が最も高く、それは単一の結合要素のみではそうではなかった図14参照。実施例4:免疫組織化学における二重結合剤によるHER2/HER3ヘテロ二量体の検出Her受容体の受容体型チロシンキナーゼファミリーは4つのメンバー:HER1、HER2、HER3およびHER4からなる。リガンド結合の際、その受容体は様々な方法でホモまたはヘテロ二量体として二量体化し、そのリガンドおよびその4つのファミリーのメンバーのそれぞれの発現レベルに依存して異なるシグナル伝達経路の引き金を引く。例えば、HER3はそれがそのリガンドであるニューレグリン1NRG1またはニューレグリン2NRG2それぞれに結合した際に立体構造変化を経て、HER3二量体化ドメインが露出し、それは他のHer受容体と相互作用することができる。その二量体化ドメインはHER2HER2において構成的に露出しており、従ってそれはそれの二量体化を誘導するために特定のリガンドにより活性化される必要はない。従って、HER3のNRG1またはNRG2による刺激はそれのHER2HER2とのオリゴマー化を誘発することができる。二量体化の際、HER2の構成的に活性なチロシンキナーゼドメインは、機能するチロシンキナーゼドメインを欠くHER3をリン酸化する。HER2/HER3のヘテロ二量体を検出するための二重結合剤を提供することができる。添付された特許請求の範囲において定義された範囲内の解離速度定数を有する、HER3およびHER2に対するモノクローナル抗体を開発する。さらに、その抗体を免疫組織化学において癌細胞株、異種移植片および腫瘍組織における標的認識に関して検証する。選択された抗体を標準的な分子生物学の方法を用いて配列決定し、組み換えタンパク質発現を用いて二重結合剤のライブラリーを生成する。次いで異なる長さのリンカーを有する二重結合剤をホルマリン固定されパラフィン包理された癌細胞においてスクリーニングする。包理の前に、その細胞を飢餓状態にしておくか、またはHER2/HER3ヘテロ二量体化を誘導するためにヒトNRG1で刺激しておくかのどちらかで処理する。ヘテロ二量体化の検出を、自動化された免疫組織化学染色システムVentanaBenchMark登録商標XTにおいて評価する。そのスクリーニングにおける陽性のヒットは、刺激された細胞HER2/HER3二量体が存在するを染色するが飢餓状態の細胞ヘテロ二量体なしは染色しない二重結合剤として定義される。定められた解離速度定数の範囲内のHER3およびHER2に対するモノクローナル抗体の開発aマウスの免疫処置SJL、Balb/cおよびNMRIマウスをHER31242~1267[KLH-MP-Cys-UZU-1243]アミドおよびHER21223~1236[KLH-MP-Cys-UZU]アミドで免疫する。最初の免疫用量は100μgである。そのマウスを6および10週間後に100μgのその免疫原でさらに免疫する。b融合およびクローニング前記のマウスの脾臓細胞を、GalfreGandMilsteinCMethodsinEnzymology73346に従って骨髄腫細胞と融合させる。このプロセスにおいて、免疫したマウスの1×108個の脾臓細胞を2×107個の骨髄腫細胞P3x63-Ag8-653、ATCCCRL1580と混合し、250gおよび37°Cにおいて10分間遠心分離する。その上清を廃棄し、細胞のペレットをタッピングによりほぐす。1mLのPEG分子量4000、Merck、ダルムシュタットを一滴ずつ、37°Cにおいて水浴中で1分以内に添加する。その後、5mLのFCSを含まないRPMI1640を5分以内に一滴ずつ添加し、続いてさらに10mLのFCSを含まないRPMI1640を10分以内に一滴ずつ添加する。次の工程として、10FCS、100mmol/lヒポキサンチン、1μg/mlアザセリンおよび50uのIL-6を含む25mLのRPMI1640を添加し、その細胞を37°C、5CO2において60分間保温し、次いで250gで10分間遠心分離する。その細胞のペレットを10FCS、100mmol/lヒポキサンチン、1μg/mlアザセリンおよび50uのIL-6を含む30mLのRPMI1640中で再懸濁し、37°C、5CO2で培養する。次いでその細胞懸濁液を96ウェルプレートに移し、37°C、5CO2で培養する。c細胞培養上清からの免疫グロブリンの単離約10日後、その初代培養物を抗原特異性に関して試験する。陽性初代培養物を蛍光活性化セルソーターにより96ウェル細胞培養プレートにおいてクローニングする。それに続く24ウェルプレート、6ウェルプレートおよびT75フラスコCorningにおけるNutridoma栄養補助剤Rocheを含むHyclone培地TheromoScientific中での増殖の後、望まれる低親和性抗体を発現するハイブリドーマ細胞を最終的にCELLineバイオリアクターIntegrabiosciences中で製造業者の説明書に従って培養する。dモノクローナル抗体の生物物理学的特性付けそのモノクローナル抗体およびHER2またはHER3の間の相互作用の速度論的特性を、Biacore商標技術を用いた表面プラズモン共鳴での速度論的スクリーニングにより調べる。ソフトウェアバージョンV1.1の制御下にあるBiacore商標A100機器を用いる。Biacore商標CM5チップがその機器の中に取り付けられており、それは製造業者の説明書に従って水力学的に処理されaddressed、条件付けされる。運転緩衝液として、HBS-EP緩衝液を用いる10mMHEPESpH7.4、150mMNaCl、1mMEDTA、0.05w/vP20。ポリクローナルウサギ抗マウスIgGFc捕捉抗体を、10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5中30μg/mlでフローセル1、2、3および4中のスポット1、2、4および5に10,000RUで固定する。その抗体はNHS/EDC化学により共有結合的に固定される。その後、そのセンサーを1Mエタノールアミン溶液で不活性化する。スポット1および5は決定のために用いられ、スポット2および4は基準として用いられる。センサーチップへの適用の前に、mAbを含有するハイブリドーマ上清をHBS-EP緩衝液中で1:2希釈する。その希釈された溶液を30μl/分の流速で1分間適用する。その後すぐに分析物である個々にストレプトアビジン上に移植されたgraftedヒト_HER31242~1267-Bi-PEG-アミドまたはヒト_HER21223~1236-Bi-PEG-アミドを30μl/分の流速で2分間注入する。その後、シグナルを5分間の解離時間の間記録する。そのセンサーを、10mMグリシン-HCl溶液pH1.7を30μl/分の流速で2分間注入することにより再生させる。解離速度定数kd1/sを、ラングミュアモデルに従って、評価ソフトウェアを用いて製造業者の説明書に従って計算する。選択されたモノクローナル抗体は、HER2、HER3それぞれと、特許請求の境界内にある解離速度定数で相互作用する。その抗体はそれらのエピトープに特異的に結合しなければならず、すなわち、抗HER2抗体はHER3と相互作用せず、逆もまた同じである。選択されたHER3に対して向けられた抗体を7.2.32と名付けそれぞれSEQIDNO19において示されている可変領域重鎖およびSEQIDNO20において示されている可変領域軽鎖、その解離速度定数は2.3×10-31/sであると決定され、それは結果的に二重結合剤アプローチに関して要求される範囲内である。選択されたHER2に対して向けられた抗体は4.1.43と呼ばれそれぞれSEQIDNO21において示されている可変領域重鎖およびSEQIDNO22において示されている可変領域軽鎖、その解離速度定数は9.63×10-41/sであり、従ってそれも二重結合剤アプローチに関して要求される範囲内であった。選択されたモノクローナル抗体の免疫組織化学における特性付けその選択されたHER2およびHER3に対するモノクローナル抗体は、特定の解離速度定数の範囲内でそれらの標的に結合しなければならないだけでなく、それらはその二重結合剤の基礎として適していることを免疫組織化学において十分に特性付けられなければならない。まず、両方のモノクローナル抗体が免疫組織化学においてなおそれらの抗原を認識することを確実にしなければならない。これは、一過性導入後に組み換えHER1、HER2、HER3またはHER4を過剰発現するホルマリン固定されパラフィン包理されたHEK293を染色することにより達成することができる。その染色は、VentanaBenchMark登録商標自動免疫組織化学プラットフォームにより、抗HER2および抗HER3抗体に関するプロトコルと同じプロトコルを用いて実施される必要がある。例えば、その染色は、ultraviewDABキットにより、CC1Standardを用いて、37°Cにおいて32分間の抗体保温時間で、ultraWashオプションならびにヘマトキシリンIIで4分間および青色染色試薬で8分間の対比染色を用いて実施することができるであろう。さらに、その抗体は既知のHER2およびHER3発現レベルを有する異種移植片および腫瘍組織において同じ染色プロトコルを用いて検証されるべきである。加えて、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、標準的な分子生物学の手順を用いてそのハイブリドーマクローンから得る。HER2およびHER3を認識する二重結合剤の開発aペプチドリンカーを用いた二重結合剤の開発我々は、グリシン-グリシン-グリシン-グリシン-セリンG4S単位およびヘマグルチニンタグYPYDVPDYAのリンカーにより連結されている2個のFab断片からなる二重結合剤を開発する図15。そのリンカーの長さは、異なる数のG4S単位をリンカー中に組み込むことにより容易に変更することができる。そのリンカーは2~8個のG4S単位を含有することができる。その二重結合剤は、Fab_7.2.32-リンカー-Fab_4.1.43重鎖の融合タンパク質SEQIDNO24において示されているをコードするプラスミドHC二重結合剤およびそのFabの軽鎖をコードする2種類のプラスミドを用いたHEK293細胞中での一過性発現の後に発現される。全てのプラスミドは、抗体をコードする配列の上流に細胞外輸送のためのシグナル伝達配列もコードしている。コドン使用頻度は組み換え真核細胞発現のために最適化されており、次いで対応するDNAが合成されGeneart、pUCベクター中にBamHI/XbaI制限部位を用いてクローニングされる。そのリンカー配列には、そのプラスミドのリンカー配列を標準的な分子生物学の方法を用いて容易に交換することを可能にするために、HindIII/KpnI制限部位が隣接している。懸濁状態のHEK293-F細胞を、その組み換え二重結合剤の一過性発現のためのプラスミドを用いて形質移入する。合計で、90より大きい生存度を有する50mLの1×106細胞/mlを、1:1:1の比率のHC-二重結合剤SEQIDNO24において示したタンパク質配列をコードしている、LC_7.2.32SEQIDNO20において示したタンパク質配列をコードしているおよびLC_4.1.43SEQIDNO22において示したタンパク質配列をコードしているのプラスミドにより、293-Free商標形質移入試薬Novagenを製造業者の説明書に従って用いて形質移入する。形質移入の後、そのHEK293-F細胞を130rpm、37°Cおよび8CO2で7日間培養する。次いでその細胞を4°C、8000rpmで20分間遠心分離する。二重結合剤を含有する上清を0.22μmsteriflipMillipore真空濾過システムを用いてさらに濾過し、分割量に分けaliquoted、液体窒素中で急速冷凍し、20°Cで保管する。bDNAに基づくリンカーを用いた二重結合剤の開発DNAリンカーを介したハイブリダイゼーションに基づく二重結合剤を生成するため、組み換えFab断片をソルターゼ切断認識配列をコードする融合タンパク質として発現させる。次に、その組み換えタンパク質を部位特異的に17塩基長のオリゴ分子SEQIDNO27で示した4.1.43標識のためのオリゴおよび19塩基長のオリゴ分子SEQIDNO28で示した7.2.32標識のためのオリゴで標識し、次いでそれを利用可能なリンカーDNAのライブラリーとハイブリダイズさせることができる。酵素ソルターゼをトランスペプチダーゼ反応において用いるDNA-オリゴコンジュゲーション酵素ソルターゼはトランスペプチダーゼ活性も有する原核生物のタンパク質分解酵素である。ここで、その酵素はLPXTGモチーフおよびDNA-オリゴに結合したグリシン残基の間のトランスペプチダーゼ反応を触媒する。7.2.32および4.1.43の組み換えFab断片をHEK293細胞中で発現させる。90より大きい生存度を有する400mLの1×106HEK293細胞/mlを、7.2.32または4.1.43の重鎖および軽鎖をコードするプラスミドで1:1の比率で、293-Free商標形質移入試薬Novagenを製造業者の説明書に従って用いて形質移入した。そのタンパク質は融合タンパク質として発現され、そのFab断片の軽鎖においてC末端の6×HISタグおよび重鎖においてC末端のソルターゼ切断配列を有する。さらに、7.2.32はそのソルターゼ切断タグの上流にHAタグを有する。形質移入の後、そのHEK293-F細胞を130rpm、37°Cおよび8CO2で7日間培養する。次いでその細胞を4°C、8000rpmで20分間遠心分離する。その組み換えタンパク質を含有する上清を、0.22μmsteriflipMillipore真空濾過システムを用いてさらに濾過する。そのFab断片を、AKTAエクスプローラーFPLCシステムを用いるニッケル親和性カラムクロマトグラフィーおよび分取ゲル濾過により、標準的な精製法を用いて精製する。純度をSDS-PAGEおよび分析的ゲル濾過により評価した。その標識は、50mMトリスpH7.5、150mMNaCl、5mMCaCl2の緩衝液中で、10μM組み換えソルターゼ、50μMFab断片および200μMオリゴを用いて37°Cで一夜実施された。次に、その標識反応物を20mMトリスpH8.0中で10倍希釈し、20mMトリスpH8.0中で平衡化したResourceQイオン交換カラムGEHealthcareに適用する。その強く負に荷電したオリゴおよびオリゴ-Fab断片を20mMトリスpH8.0および1MNaClの高い塩勾配で溶離し、そうして低い塩濃度で溶離するソルターゼおよび未標識のFab断片から分離する。溶離を495nmにおける吸光度を追跡して監視し、オリゴの蛍光標識を検出する。オリゴおよびFab-オリゴを含有する溶離された画分をプールし、20mMトリス8.0、200mMNaClを平衡化および運転緩衝液として用いるHiLoad16/60カラムSuperdex200カラムGEHealthcare上での分取ゲル濾過により、Fab-オリゴをコンジュゲートしていないオリゴから分離する。最終生成物の純度を分析的ゲル濾過およびSDS-PAGEを用いて評価し、純度が90より大きい最終生成物のみが二重結合剤の組み立てにおいて用いられるであろう。二重結合剤の組み立てを、分析的ゲル濾過により調べる。等モル比での7.2.32-Fab-19塩基長および4.1.43-Fab-17塩基長コンジュゲートを、個々の実験において、リンカー分子実施例2.4において示されているリンカー3~14のそれぞれの1種類と混合する。次いでその二重結合剤の組み立てを、分析的ゲル濾過を用いて調べる。分析的サイズ排除クロマトグラフィーを、GEHealthcareSuperdex20010/300GL分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて、0.5ml/分の流速で実施する。20mMトリスpH8.0、200mMNaClを運転緩衝液として用いて、100μLの試料をそれぞれの運転において注入する。Fab-オリゴコンジュゲートおよびリンカーの濃度は2.5μMである。保持時間を280nm芳香族の吸光度および495nmフルオレセインの吸光度における吸光度の変化により監視する。DNAハイブリダイゼーションによる二重結合剤の形成は、Fab-オリゴコンジュゲート、Fab-オリゴおよびリンカーの複合体、ならびに2個のFab断片およびリンカーの三元複合体の間の保持時間の違いにより確証される。ホルマリン固定されパラフィン包理されたMCF-7細胞の生成MCF-7癌細胞株は、中間的なレベルのHER2およびHER3を発現するがHER1は発現しないことが知られており、従ってそれはHER2/HER3ヘテロ二量体化の誘導を検出するための好ましい研究モデルである。さらに、HER2/HER3ヘテロ二量体は刺激されたMCF-7細胞において他の方法を用いて既に検出されている2011。MCF-7細胞を、2mML-グルタミンGibcoおよび10FCSを含むRPMI1640Gibcoを用いて培養し、それらをT175cm2フラスコ中で最適な培養密度まで増殖させる。そのコンフルエントな細胞をFCSを含まないRPMI1640、2mML-グルタミン中でおおよそ18時間飢餓状態にする。次いでその細胞を20nMのNRG1-β1Peprotechで37°Cにおいて15分間刺激する。陰性対照として、細胞をFCSを含まない新しい細胞培養培地中で37°Cにおいて15分間刺激なしのままにする。その細胞を、記述されたようにホルマリンで固定し、パラフィン中に包理するR44。HER3のリン酸化はリガンド結合の後にのみ起こるため、リン酸化されたHER3の染色は処理されたMCF-7細胞および未処理のMCF-7細胞の間のHER3の活性化状態の違いを示すはずであり、それはHER2/HER3ヘテロ二量体化の異なるレベルも示す可能性がある。NRG1-β1によるHER3の刺激を、ホルマリン固定されパラフィン包理されたMCF-7細胞において、リン酸化されたHER3に特異的な21D3CellSignaling抗体を用いる免疫組織化学染色により検証する。その手作業での免疫組織化学染色は、抗原回復のためにEDTA緩衝液ThermoScientificを、DAB色素原Dakoによる抗原検出のためにUltraVisionLPLargeVolumeDetectionSystemThermoScientificを用いて、標準的なプロトコルに従って実施される。NRG1-β1により刺激されたMCF-7細胞のみがリン酸化されたHER3に関して陽性に染色され、未刺激の細胞は陰性に染色される。MCF-7細胞におけるHER2/HER3ヘテロ二量体の検出免疫組織化学染色をVentanaBenchMark登録商標XTシステム上で実施する。ペプチドリンカーを有する二重結合剤の検出は、架橋抗体bridgingantibody抗HAタグ抗体C29F4CellSignalingにより行われる。その抗HAタグ抗体のFc部分を、OptiviewDAB検出キットVentanaを用いて検出する。その検出シグナルはOptiview増幅キットVentanaを用いて増幅することができる。DNAに基づくリンカーを有する二重結合剤の検出は、記述された架橋抗体抗HAタグ抗体C29F47.2.32重鎖のC末端におけるHAタグを標的とするによるか、またはストレプトアビジンに基づくiVIEWDAB検出キットVentanaに関する検出タグの役目を果たすことができるそのリンカー分子のビオチン標識によるかのどちらかで行われる。二重結合剤のライブラリーは、個々の実験において、その7.2.32-Fab-19塩基長および4.1.43-Fab-17塩基長を等モル比で実施例2.4で示されているリンカーリンカー3~14のそれぞれと混合することにより調製される。ミクロトームHM355S,ThermoScientificを用いてMCF-7細胞のブロックの3.5μmの切片を生成し、スライドガラス上に移す。自動化されたBenchMark登録商標XT染色システムにおいて、その細胞を脱パラフィン処理し、抗原の回復のためにCC1緩衝液を用いて32分間処理する。スクリーニングのため、それぞれの二重結合剤をVentana抗体希釈液中で1:1~1:1000の異なる希釈率で希釈し、100μLを手作業でスライドガラスに適用し、37°Cで16分間保温する。抗HAタグ抗体C29F4CellSignalingをVentana抗体希釈液中で1:400希釈し、ディスペンサー中に移す。その抗HA抗体は、それがその二重結合剤のHAタグに結合し、同時にそのFc部分をVentanaOptiviewDAB検出キットの抗ウサギ検出系を用いて検出することができるため、架橋抗体の機能を有する。後固定剤postfixativeとして、100μLのその架橋抗体を適用し、32分間保温する。次に、Optiview検出および増幅試薬を製造業者の推奨に従って適用する。その染色を明視野顕微鏡法で分析する。そのスクリーニングの陽性のヒットは、NRG1-β1で処理され、HER2/HER3ヘテロ二量体化が誘導されたMCF-7細胞のみを染色し、未処理のMCF-7細胞HER2およびHER3の単量体のみの陰性対照を染色しない二重結合剤である。さらに、その染色は、HER2/HER3ヘテロ二量体はその二重結合剤の両方の腕が自由に接近可能である場合にのみ検出可能であるはずであるため、その二重結合剤の2個の結合部位の1個を阻害するためのエピトープのペプチド:25μg/mlのSEQIDNO25で示したHER21223~1236、または25μg/mlのSEQIDNO26で示したHER31242~1267の添加により阻害される。"