"NP、P/C、M、F、HNおよびLの各遺伝子からなるセンダイウイルス遺伝子のうち、M遺伝子、F遺伝子及びHN遺伝子の各機能をすべて欠損し、かつ、L遺伝子が持続的遺伝子発現を可能とする変異を有するセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子とが同一のゲノム上に存在することを特徴とする初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを、末梢血由来単核細胞に感染させ、該細胞の初期化を行い、次いで該細胞から初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを人為的に除去することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、上記末梢血由来単核細胞が単球であることを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、上記初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターが発現するLタンパク質の1618番目のアミノ酸残基がバリンであることを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、上記初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターをsiRNAにより除去することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、上記初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの遺伝子が多能性幹細胞で発現しているマイクロRNAの標的配列を有することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。請求項1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、末梢血由来単核細胞がヒト由来である、誘導多能性幹細胞の製造方法。請求項1~6のいずれかに記載の方法により製造された誘導多能性幹細胞。従って、本発明が解決しようとする課題は、患者のゲノム情報と同一のゲノム情報を持ち、かつES細胞と近似した性質を有する誘導多能性幹細胞以下、iPS細胞という場合がある。を、iPS細胞の作製に用いた遺伝子を細胞内に残すことなく、ヒト末梢血単球から作製することである。この課題が達成されれば、最小限の侵襲により実施できる一般的な医療行為である採血により採取した細胞材料から、移植細胞の免疫拒絶や、染色体への外来遺伝子の挿入遺伝子損傷による腫瘍化の可能性を回避できる多能性幹細胞を作製することができる。該課題は、組換え挿入修復等の相互作用によりヒトゲノムを改変する活性を持たず、かつ単球に適用可能な遺伝子発現系を用いることで、解決できる。本発明者らは、持続発現型センダイウイルスベクター特許第4478788号、及びPCTJP2008057212に初期化遺伝子である、Oct34、Sox2、Klf4、cMycの各ヒト遺伝子産物をコードする遺伝子を搭載して、ヒト末梢血から高度に精製した単球に導入することにより、効率的にESiPS細胞のマーカーが発現することを見いだした。上記初期化遺伝子搭載ベクターは、外来遺伝子を染色体に組み込むことなく、しかも、該ベクターは初期化後siRNAにより容易かつ速やかに除去でき、これを精製した単球に適用することによって、安全性の高い、該単球の提供個体と同一のゲノム情報を持つ誘導多能性幹細胞iPS細胞を作製できることを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。1NP、P/C、M、F、HNおよびLの各遺伝子からなるセンダイウイルス遺伝子のうち、M遺伝子、F遺伝子及びHN遺伝子の各機能をすべて欠損し、かつ、L遺伝子が持続的遺伝子発現を可能とする変異を有するセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子とが同一のゲノム上に存在することを特徴とする初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを、末梢血由来単核細胞に感染させ、該細胞の初期化を行い、次いで該細胞から初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを人為的に除去することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。2上記1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、上記末梢血由来単核細胞が単球であることを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。3上記1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、上記初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターが発現するLタンパク質の1618番目のアミノ酸残基がバリンであることを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。4上記1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、上記初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターをsiRNAにより除去することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。5上記1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、上記初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの遺伝子が多能性幹細胞で発現しているマイクロRNAの標的配列を有することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。6上記1に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法であって、末梢血由来単核細胞がヒト由来である、誘導多能性幹細胞の製造方法。7上記1~6のいずれかに記載の方法により製造された誘導多能性幹細胞。本発明で用いるセンダイウイルスベクターは、複数の初期化遺伝子を一つのベクターに搭載して同一細胞で一度に発現できるため、分化細胞を初期化するための操作が極めて簡便、かつ効率的であり、再現性が高い。これは複数の初期化遺伝子を別々に搭載したベクターを混合して使用する方法には見られない大きな特徴である。また、本発明で用いる初期化遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクターは、細胞質に持続安定的に保持されて初期化遺伝子を発現するため、染色体に外来遺伝子を挿入する恐れがなく、このため細胞をガン化することなく極めて安全である。上記のベクターを使用すれば、患者のゲノム情報と同一のゲノム情報を持ちかつES細胞と近似した多能性を有する誘導多能性幹細胞以下、iPS細胞という場合がある。を、最小限の侵襲で採取できる104個以下のヒト単球から作製可能である。また、初期化遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクターは、細胞質において持続的に初期化遺伝子を発現して組織細胞を多能性幹細胞に変化させた後、siRNAを使用することにより極めて容易に細胞から除去することができる。また、除去をより容易にするために内在性のマイクロRNAの機能を利用して細胞から除去することができる。その結果、安全性がさらに高まるとともに、分化細胞提供個体と全く同一のゲノム情報を有するiPS細胞が得られる。これらの点からヒトに対しても適用が大いに期待できる。また、センダイウイルスの幅広い種特異性細胞特異性を活かして、ヒト以外の動物由来の細胞や、線維芽細胞単球以外のヒト組織細胞から多能性幹細胞を作製することができる。その結果、ヒト以外の動物を使って多能性幹細胞の機能を検証することが可能である。したがって、本発明によれば、完全なゲノム情報を持ちかつ外来の初期化遺伝子を含まないため安全性の高いヒトiPS細胞を、微生物による汚染の可能性が低くかつ侵襲の少ない採血によって得られたヒト末梢血単球から、極めて効率的かつ簡便に再現性良く作製することができる。これは、従来、iPS細胞作成に用いられているアデノウイルスベクターEBVベクターその他のDNAベクターや従来型センダイウイルスベクターを使用する方法では実現できなかった大きな進歩である。これにより、ヒトiPS細胞は一般の医療機関でも末梢血から容易に作製することができるようになり、再生医療特に細胞補充療法や遺伝子治療、さまざまな遺伝的背景を持った患者由来のiPS細胞を使った創薬研究、ヒト細胞を使ったバイオ医薬品製造、ガンや難治疾患の原因の解明や治療法の開発など、幅広い技術分野の発展に大いに貢献するものである。本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2010‐250993の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。本発明における、誘導多能性幹細胞を製造するために使用する初期化遺伝子を搭載するベクターは、センダイウイルス由来のNP遺伝子、PC遺伝子およびL遺伝子を有し、同ウイルスのF、M、HN遺伝子機能をすべて欠損させたセンダイウイルス粒子以下、センダイウイルスベクターという。である。なお、本願明細書において、遺伝子あるいは遺伝子材料というとき、マイナス鎖RNAまたはcDNA、及びこれと相補のプラス鎖RNAまたはcDNAを含む。すなわち転写あるいは逆転写により、上記いずれかの遺伝子あるいは遺伝子材料を合成しうるものは本発明に含まれる。また、本明細書において誘導多能性幹細胞というとき、胚性幹細胞ES細胞と類似した形態と胚性幹細胞特異的なマーカーを発現していて、試験管内での自己複製能を有する細胞を意味する。該細胞は、動物生体内あるいは試験管内での三胚葉への分化能を有することが知られている。また、マーカーとしてはNanog、SSEA4、TRA160、TRA181、Oct4等が知られている。センダイウイルスベクターの構成材料センダイウイルスベクターは、センダイウイルスのゲノムに任意の遺伝子を挿入するか、センダイウイルスの遺伝子を任意の遺伝子と置き換えることによって、該遺伝子を発現させることができる遺伝子導入発現ベクターである。センダイウイルスはNP、PC、F、M、HN及びLの各遺伝子を有し、同ウイルスのNP、PCおよびL遺伝子はセンダイウイルスの転写、複製に関与する遺伝子であり、一方、F、M、NH遺伝子は、ウイルス粒子形成に関与する遺伝子である。したがって、F、M、NH遺伝子の機能をすべて欠損させたセンダイウイルスベクターは、細胞に感染した後に単独では新規のウイルス粒子を形成できず、非伝播性となる。本発明で用いるベクターを構成するL遺伝子としては、L遺伝子がコードするLタンパク質の1618番目がバリンである遺伝子が用いられる。この変異は、センダイウイルスCl.151株由来のLタンパク質のアミノ酸配列から見いだされたものである。センダイウイルスCl.151株は温度感受性の増殖をすることが知られており、38°Cでウイルス粒子をほとんど産生せず、32°Cでは複製サイクルが働き、ウイルス粒子を産生する。このようなセンダイウイルスCl.151株は、吉田哲也博士らによって1979年に報告されているものであるYoshidaetalVirology92139154。上記Lタンパク質の1618番目がバリンである遺伝子を有するセンダイウイルスCl.151株は、インターフェロン誘導能が低下するため、細胞傷害性がなく、持続感染能を有し、外来遺伝子を担持させれば、細胞内で長期間該遺伝子の発現が維持される。このL遺伝子としては、例えば非持続感染株であるセンダイウイルス名古屋株のLタンパク質の1618番目のロイシンをバリンになるように変異させた変異L遺伝子を用いてもよい。以下、Lタンパク質の1618番目がバリンであるLタンパク質を変異Lタンパク質、変異Lタンパク質をコードする遺伝子を変異L遺伝子という場合がある。したがって、本発明で用いるセンダイウイルスベクターの構成遺伝子であるNP、CPおよびL遺伝子は、L遺伝子が上記変異を有する限り、センダイウイルスCl.151株の塩基配列に限らず、例えば、センダイウイルス名古屋株あるいはZ株等の細胞傷害性を有し持続感染能を有しない株の塩基配列を有していてもよい。また、leaderRNAの3’末端に、人工的にセンダイウイルスの転写終結配列を挿入させれば、アンチゲノムRNAのコピー数を低下させ、インターフェロン誘導能をさらに、減弱させることもできる。さらに、センダイウイルスが動物細胞で持続感染するためには、上記変異L遺伝子を持つことに加えて、F、M、HN遺伝子がすべてCl.151株由来でなければならない。そのため、上記変異L遺伝子とCl.151株由来のF、M、NH遺伝子を同時に持つセンダイウイルスベクターは細胞傷害性がなく、持続感染能を有し、外来遺伝子を担持させれば、細胞内で長期間該遺伝子の発現が維持される。またこのCl.151株を基に作成したセンダイウイルスベクターでは、ベクターに搭載した遺伝子を長期持続発現する能力を損なうこと無く、Cl.151株由来のF、M、NH遺伝子の機能をすべて欠損させることが可能である。また、これら遺伝子の機能はその一つの欠損でもベクターの伝播性を顕著に抑制することが可能ではあるが、完全に抑制するためにはF、M、NH遺伝子の各機能の全てを欠損させることが好ましい。F、M、NH遺伝子機能をすべて欠損させる方法としては、単純にこれら各遺伝子を欠失させても良いし、任意の外来遺伝子の挿入あるいは置換によってもよい。上記センダイウイルスCl.151株の全長遺伝子cDNAは、GenBankに登録済みであるAccessionNumberAB275416。初期化遺伝子一方、初期化遺伝子は、本願発明のセンダイウイルスベクターに挿入するが、初期化遺伝子としては、ヒトマウスあるいは任意の哺乳動物のOct34、Sox2、Klf4の各遺伝子の組み合わせ、及びさらにcMyc遺伝子を加えた組み合わせ、あるいはNanog、Lin28、Esrrb、UTF1、TERTテロメラーゼ触媒サブユニット、SV40のT抗原の各遺伝子を加えた組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター作成用鋳型ベクター本発明においては、センダイウイルスベクターの構成材料である上記NP、PC、変異Lの各遺伝子を、上記初期化遺伝子とともにファージ等のクローニングベクターに挿入する。このとき初期化遺伝子は、必要とする複数の遺伝子の全てを挿入することが可能である。これにより、後述する初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターは、初期化に必要な遺伝子を全て含み、従来のように各初期化遺伝子をそれぞれ別のベクターに導入する必要がなく、極めて効率的に初期化が行える。このようにして得られた組み換えベクターは、本発明で用いる初期化遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクター、すなわち初期化遺伝子を担持したセンダイウイルス粒子を作成するための鋳型となる。以下この組み換えベクターを鋳型ベクターという。この鋳型ベクターにおいて、NP、PC、変異Lの各遺伝子及び初期化遺伝子は、NP-PC―初期化遺伝子あるいは、さらに、マーカー遺伝子を導入してもよい。―変異L遺伝子の順でファージ等のベクターに組み込まれる。この初期化遺伝子あるいはマーカー遺伝子は、センダイウイルスベクターにおけるF、M、NHの各遺伝子に挿入あるいは該遺伝子の配列と置換させて、これらF、M、NHの各遺伝子の機能を欠損させることに用いることもできる。また、この鋳型ベクターにおいては、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子も挿入することができ、これにより鋳型ベクターあるいはセンダイウイルスベクターが挿入された標的細胞のスクリーニングが容易に行える。具体的には、センダイウイルスベクターの上記各遺伝子からなる構成材料及び上記初期化遺伝子cDNAあるいはさらにマーカー遺伝子cDNAを、上記順序で、細胞内で鎖のゲノムRNAが形成されるように結合して、鋳型ベクターを作成する。例えば、上記構成材料cDNAをλDASHII等のクローニングベクターに組み込むとともに、組み込まれた全長cDNAの上流ゲノムRNAにおける3’末端側にT7プロモーター配列、3個のグアニジン残基をこの順で配置し、同全長cDNAの下流ゲノムRNAにおける5’末端側にタバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列、T7RNApolymerase終止配列をこの順で配置する。なお、T7プロモーター配列はT7RNApolymeraseによってゲノムRNAにおける3’末端側から鎖ゲノムRNAが生合成されるように、3個のグアニジン残基はT7RNApolymeraseによるRNA転写効率を上昇させるようにSLeyreretalJVirolMethods754758、タバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列は転写された鎖ゲノムRNAが末端で正確に切断されるように、T7RNApolymerase終止配列はT7RNApolymeraseによるRNA転写を正確に終結させるために付加するものである。初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの作成このように作成された初期化遺伝子を有する鋳型ベクターは、ウイルスベクター産生用細胞に導入して、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを作成することができる。ウイルスベクター産生用細胞には、鋳型ベクターから鎖のアンチゲノムRNAを転写するためにT7RNApolymeraseを供給する必要があり、ウイルスベクター産生用細胞として、例えば、T7RNApolymerase発現ワクシニアウイルスを感染させた細胞を用いることもできるし、T7RNApolymeraseを恒常的に発現するようにクローニングした細胞株を用いることもできる。ヒト型T7RNApolymeraseを恒常的に発現する細胞株BHKT7細胞では従来のバクテリア型のT7RNApolymeraseを発現する細胞株BSRT75細胞と比較して、顕著にT7RNApolymerase発現量が増加しており、この細胞を用いて組換えウイルスの産生を行った結果、効率良く組換えウイルスが回収された。すなわち、効率良く組換えウイルスを産生するためにT7RNApolymerase発現量を増強させた細胞株を用いることが有効である。上記鋳型ベクターが導入されたウイルスベクター産生細胞においては、鋳型ベクターDNAはT7RNApolymeraseによってT7プロモーター以降がRNAに転写されるが、その際、産生するRNA分子はヘアピンリボザイム配列によって、それ以降の配列が切断されて削除され、鋳型ベクター中のNP遺伝子-PC遺伝子-初期化遺伝子―変異L遺伝子をこの順で含むDNA部分、あるいはさらにマーカー遺伝子を含むDNA部分に対応する鎖のアンチゲノムRNA分子ができる。また、T7RNApolymeraseにより鋳型ベクターから転写された鎖のアンチゲノムRNAを持つウイルスベクター産生用細胞に、さらにNP、P及びL遺伝子産物を産生するための発現ベクターを導入すると、上記鎖アンチゲノムRNAにNP、P、L遺伝子産物が結合してRNP複合体ヌクレオカプシドが形成される。次にこのRNP複合体を鋳型として、ウイルス産生細胞中のRNAポリメラーゼにより鎖アンチゲノムRNAから-鎖ゲノムRNAが転写される。-鎖ゲノムRNAは、ウイルスベクター産生用細胞内のNP、P及び変異L遺伝子産物と結合して-鎖ゲノムRNAを含むRNP複合体を形成する。上記使用した鋳型ベクターにおいては、非伝播性にするために、Cl.151株由来のM,F及びHN遺伝子機能をすべて欠損させているため、これに基づき形成された上記RNP複合体は、組織細胞に感染させるために必要なウイルス粒子の形成が抑制されている。そこで、このようにして形成された-鎖ゲノムRNAを含むRNP複合体ヌクレオカプシドを持つウイルスベクター産生用細胞に、F、M、及びHNタンパク質を発現することができる発現ベクターを導入し、ウイルス粒子産生温度である32°Cで培養する。これにより、-鎖ゲノムRNAを含むRNP複合体がウイルスベクター粒子に取り込まれ、初期化遺伝子を搭載したセンダイウイルス粒子が再構成される。上記したように、本発明においては、ウイルス粒子形成のために不足するF、M、NH遺伝子を搭載した発現ベクターを別途ウイルス産生用細胞に導入しているため、ベクター産生細胞の培養上清からウイルス粒子を回収することが可能になる。不足するM、F及びHN遺伝子産物の発現系として、不足する遺伝子をそれぞれ導入した複数のベクターを使用してもよいし、またこれら不足する遺伝子を複数導入したベクターを使用しても良い。また、このウイルス粒子の産生プロセスにおいては、ウイルスタンパク質の形成を補い、ウイルス粒子を効率的に産生させるために、上記欠損遺伝子に加え、さらに、NP遺伝子、P/C遺伝子、L遺伝子を有する発現ベクターを上記細胞に導入するのが好ましい。なお、目的のウイルス産生細胞は、上記のように例えば薬剤耐性遺伝子を挿入することによって、薬剤導入培地で培養することにより選択が可能となるし、それ以外にも、EGFP遺伝子などのマーカー遺伝子を指標にして分取することも可能である。以上のようにして得られた初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターはウイルス粒子の形態であり、分化細胞に持続感染可能である。しかし、該ベクターはF、M、NHの各遺伝子機能をすべて欠損しており、感染後において、感染のために必要なウイルス粒子の形成が抑制されているため、非伝播性である。また、該ベクターのL遺伝子はLタンパク質の1618番目のロイシンがバリンになるよう変異させた遺伝子であり、インターフェロン誘導能を有しておらず、持続感染可能であり、長期間該、細胞に保持され、初期化遺伝子の持続発現が可能となる。分化細胞の初期化上記で得られたウイルス粒子形態の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを、初期化の対象となる分化細胞に感染させる。この初期化の対象となる分化細胞としては、後述の実施例ではヒト末梢血由来単球を使用したが、特にヒト細胞に限定されるものではなく、センダイウイルスが感染できることが知られているマウスラットハムスターモルモットウサギイヌネコサルウシブタヒツジヤギニワトリ等の動物の単球であっても良い。これは、センダイウイルスが非常に幅広い動物種に由来するさまざまな細胞に感染できる能力を持っているためで、センダイウイルスが感染できない細胞としては、ウマ由来の細胞及びさまざまな動物種のBリンパ球が知られているにすぎないNakanishietalJContRel5461681998。この特徴は、現在までに誘導多能性幹細胞iPS細胞の作成に使われているレトロウイルスベクターレンチウイルスベクターアデノウイルスベクターのように宿主域が狭いウイルスベクターや、EBVベクターのようにヒト細胞でしか使えない遺伝子発現系、さらに物理的な遺伝子導入法と組み合わせる必要があるため導入できる細胞種が限られるプラスミドベクターやトランスポゾンEBVベクターとは大きく異なる利点である。本発明で用いる初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターは、インターフェロン誘導活性を持たない変異L遺伝子を持ち、かつ野生型センダイウイルスのM、F、HN遺伝子を欠損しているため、細胞傷害性を持たず持続感染性を示し、分化細胞に感染後、該細胞の細胞質において、染色体と独立して安定的に存在し、細胞分裂後も維持される。これは変異L遺伝子を持たない、あるいは野生型センダイウイルスのM、F、HN遺伝子のいずれかを持つ他のセンダイウイルスベクターには見られない特徴である。したがって、本発明で用いるセンダイウイルスベクターを使えば、10日から20日とされている初期化に必要な期間にわたって初期化遺伝子の発現を維持できるため、一度の遺伝子導入で初期化を行うことができる。これは一過性の遺伝子発現しかできないアデノウイルスベクターやプラスミドベクターでは得られない利点である。例えば、本発明で用いる初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターにOct34、Sox2、Klf4及びcMycを搭載した場合、ベクターを一度細胞に感染させるだけで、7日目~14日目にかけて、胚性多能性細胞ES細胞のマーカーであるSSEA4やTRA160を持続的に発現する細胞が出現する。さらに、本発明で用いるセンダイウイルスベクターを使えば、導入した遺伝子あるいはその一部が染色体の不特定部位に挿入されることは無い。このため、得られたiPS細胞はガン化を引き起こす恐れがなく、極めて安全である。これはレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクタートランスポゾンのように染色体の不特定部位に遺伝子を挿入する系に比べて大きな利点である。さらに、染色体への遺伝子挿入を否定することが難しいアデノウイルスベクターやプラスミドベクターEBVベクターを含むを使用する場合に比べても大きな利点である。例えば、初期化遺伝子の中にはcMyc、Oct4、Lin28は単独で細胞ガン化や異形性を引き起こすことが知られているが、本発明で用いるセンダイウイルスベクターを使用すれば、これら遺伝子も安全に使用できる。また、細胞の初期化に使うベクター系に求められる性質として、均一な性質を持った多能性幹細胞が再現性良く作製できることが挙げられる。そのためには、複数例えば4個の初期化遺伝子を同一の細胞に一度に導入できるだけでなく、これらが常に一定の割合で発現することが求められる。複数の遺伝子をセンダイウイルスベクターで細胞に導入する場合、本発明の実施例で示したようにすべてを同一のベクターに搭載する方法と、非特許文献12、非特許文献21及び特許文献1に例示されているように個々の遺伝子を別々のベクターに搭載し、混合した上で細胞に感染させる方法の2つが考えられる。この2つの方法における遺伝子発現の違いを、EnhancedGreenFluorescentProtein遺伝子とKusabiraOrange遺伝子を、同一のベクターに搭載した場合と、別々のベクターに搭載して混合した場合を比較して検証した。その結果、一定の比で再現性良く外来遺伝子を発現させるためには、複数の遺伝子を同一のベクター上に搭載する必要があることが明らかになった実施例7。さらに線維芽細胞から高い効率でiPSマーカー発現細胞を誘導するためには、初期化遺伝子がすべて同一のベクター上に搭載されている必要があることも確認できた実施例11。以上のことから、4個の初期化遺伝子を同一のベクター上に搭載している本発明で用いる初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを使えば、常に再現性良く、また非常に高い効率で、性質が均一な多能性幹細胞を作製できることが明らかになった。初期化遺伝子の除去本発明で用いる初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターは、分化細胞に感染導入され、該細胞の細胞質内において初期化遺伝子は持続発現して該細胞を初期化する。初期化された後の細胞の遺伝情報を初期化前の細胞の遺伝情報と同一にするためには、不要となった初期化遺伝子を除去する必要があるが、本発明においてはsiRNAを使用して初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター全体を除去する。使用するsiRNAとしては、センダイウイルスベクターのL遺伝子を標的にして行う。本発明者の実験によれば、NP遺伝子やP遺伝子を標的にしてもある程度の除去は可能であるが、L遺伝子を標的にすれば完全に初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを除去できる。L遺伝子中のターゲット部位としては、例えば、Lタンパク質の527番目あるいは1913番目のヌクレオチド残基をコードする部分を含む領域が挙げられるが、特にこれらに限定されるわけではなく他の領域であっても良い。siRNAは、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを分化細胞に感染させた後、5日間から20日間後に該細胞に導入する。また、siRNAのかわりに細胞内に存在するmicroRNAmiRNAを利用することも考えられる。miRNAは動物細胞のゲノムから転写される小さなRNAであって、DNA、mRNA、タンパク質と相互作用してその機能を調節している。mRNAとの相互作用では、mRNA上の標的配列に結合して、その分解を誘導もしくは翻訳を抑制することで遺伝子の発現を抑制する機構が存在している。この機構を利用して、ある遺伝子から転写されるmRNAのタンパク質非コード領域に特定のmiRNAの標的配列を人工的に挿入することにより、そのmiRNAが発現している細胞中で該遺伝子の発現を抑制できることが知られている。この機構を利用すれば、初期化された細胞でのみ出現するmiRNAの標的配列をセンダイウイルスベクターのL遺伝子、NP遺伝子あるいはP遺伝子の非コード領域に付加することにより、siRNAの場合と同様にL遺伝子、NP遺伝子あるいはP遺伝子の発現を抑制することによって初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを除去することができる。この目的で使用するmiRNAとしては、例えばヒトやマウスのES細胞で特異的に発現しているmir302aが挙げられるが、このmiRNAに限定されるわけではない。miRNAを利用した初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの除去法の利点としては、外部からsiRNAを導入する必要が無く、センダイウイルスベクターの除去が自動化できることが挙げられる。このようにL遺伝子をターゲットにしたsiRNAや、miRNA標的配列をL遺伝子、NP遺伝子あるいはP遺伝子の非コード領域に付加したセンダイウイルスベクターを使用して、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを除去することにより、得られるiPS細胞は染色体に挿入された外来遺伝子を有せず、分化細胞の提供個体と全く同一のゲノム情報を有し。試験管内で長期の自己複製能を有する。以下に、本発明の実施例を示す。但し本発明はこれら実施例により限定されるものではない。実施例1.持続発現型センダイウイルスベクター再構成用細胞の作製動物細胞での発現効率を向上させるためにコドンを最適化したT7RNApolymeraseをコードするcDNA配列表配列番号1をレトロウイルスベクター作成用プラスミドpCX4SRalphaneoベクターAkagietalPNAS10013567135722003にクローニングした。またセンダイウイルスCl151株Mタンパク質をコードするcDNANishimuraetalJBC28227383273912007をレトロウイルスベクター作成用プラスミドpCX4SRalphapuroベクターAkagietalPNAS10013567135722003にクローニングした。PLATEパッケージング細胞MoritaetalGeneTherapy7106310662000にLipofectamine2000LifeTechnologiesを用いてそれぞれ上記プラスミドDNAを導入し、培養上清にレトロウイルスT7RNApolymerase組み換えレトロウイルス、151M組み換えレトロウイルスを得た。BHK21細胞にT7RNApolymerase組み換えレトロウイルスを感染させ、G418800μgmlと10ウシ胎児血清FCSを含むDulbecco’sModifiedMinimalEssentialMediumに移しT7RNApolymeraseを安定に発現するG418耐性細胞を単離した。続いてBHKT7細胞に151M組み換えレトロウイルスを感染させ、G418800μgml、puromycin15μgml、10FCSを含むDMEM培地に移し、T7RNApolymeraseとMタンパク質を安定に発現するG418puromycin耐性細胞を単離した。実施例2.hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1の作製ベクターcDNAの作製AvrII認識配列ヒトOct4ORFセンダイウイルスSeVゲノムcDNA66176666塩基ヒトSox2ORFAgeI認識配列をこの順序で含む二本鎖DNA配列表配列番号2を合成し、プラスミドベクターpUC57にクローニングしたGenScript社に委託pUC57OctSox。pUC57OctSoxからAvrII、AgeIで切断したDNA配列をプラスミドpMO078pBluescriptIISKAgilentTechnologiesIncにClaI認識配列SeVCl151株ゲノムcDNA28713650塩基NotI認識配列ブラストサイジンS耐性遺伝子MluI認識配列SeVCl151株ゲノムcDNA47284828塩基AvrII認識配列ヒト化クサビラオレンジ遺伝子SeVCl151株ゲノムcDNA66176666塩基gp91phox遺伝子AgeI認識配列SeVCl151株ゲノムcDNA844210479塩基をこの順序で挿入したプラスミドベクター:配列表配列番号3のAvrIIAgeI間に挿入することによってプラスミドpMO084を得た図1。NheI認識配列ヒトKlf4ORFセンダイウイルス転写終結配列センダイウイルス転写開始配列NotI認識配列をこの順序で含む二本鎖DNA配列表配列番号4を合成し、プラスミドベクターpUC57にクローニングしたGenScript社に委託pUC57KLF4。hKlf4遺伝子増幅用プライマーとして、5’ACTAGCTAGCAGTCTGACATGGCTGTCAGCGACGCGCT3’配列表配列番号5N末端側、5’GGTCCACGCGTTTAAAAATGCCTCTTCATGTG3’配列表配列番号6C末端側の2本のプライマーを用いてpUC57KLF4上からヒトKlf4遺伝子をPCR法によって増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNheI、MluIで切断し、pMO026pBluescriptIISKにClaI認識配列SeVCl151株ゲノムcDNA28713650塩基NotI認識配列NheI認識配列ブラストサイジンS耐性遺伝子MluI認識配列SeVCl151株ゲノムcDNA47285335塩基をこの順番で挿入したプラスミドベクター配列表配列番号7のNheIMluI間に挿入することによって、pMO097を得た。さらにpMO097のClaIMluI断片とpMO084のClaIMluIを結合することによりpMO099を得た図1。pUC57KLF4からNheI、NotIで切断したDNA配列をpNK214pBluescriptIISKAgilentTechnologiesIncにSeVNagoya株ゲノムcDNA143塩基センダイウイルス転写終結配列SeVNagoya株ゲノムcDNA562870塩基SeVCl151株ゲノムcDNA28713656塩基NheI認識配列NotI認識配列をこの順序で挿入したプラスミドベクター配列表配列番号8のNheINotI間に挿入することによってプラスミドpMO094配列表配列番号9を得た図1。hcMyc遺伝子増幅用プライマーとして、5’ACTAGCTAGCTTAGACGCTGGATTTTTTTCGGGTAGTGG3’配列表配列番号10N末端側、5’GTCCGACGTCCTTACGCACAAGAGTTCCGT3’配列表配列番号11C末端側の2本のプライマーを用いてヒトcMyccDNA全長を含むプラスミドpJL1上からヒトcMyc遺伝子をPCR法で増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNheI、AatIIで切断し、pMO094のNheIAatII間に挿入することによって、pMO103を得た図1。以上によって得られた各プラスミドのうち、pMO103からT7プロモーター配列~SeV13655を、pMO099からSeV365510480を切り出し、λ151NishimuraetalJBC28227383273912007をEcoRI切断することによって得た、SeV104801538λDASHIIrightarmのDNA断片と合わせてクローニングし、λSeVpを作製した図1hcMychOct4hSox2hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターVersion1ゲノム全長に相補的なcDNAは配列表配列番号12。2hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1の調製BHKT7151M細胞を5×105cellswellで6wellプレートに播種し、24時間培養した後に洗浄した。λSeVpファージDNA、NPタンパク質発現プラスミドpGEMNP、Pタンパク質発現プラスミドpGEMP、Lタンパク質発現プラスミドpGEMLpGEMNP、pGEMP、pGEMLは、GarcinetalEMBOJ14608760941995、Fタンパク質発現プラスミドpSRDFZmut、HNタンパク質発現プラスミドpMKITNaHNpSRDFZmut、pMKITNaHNはTairaetalArchVirol1401871941995をそれぞれ2μg、1μg、1μg、1μg、1μg、1μgの量比でOptiMEM300μLに懸濁し、10μLのLipofectamine2000を含む300μLのOptiMEMLifeTechnologiesと混合して20分間室温放置した培地を、細胞に添加して4時間培養した。細胞を再度洗浄後、10FCS含有DMEM培地を加えてさらに32°Cで3日間培養した。さらに37°Cで3日間培養後、センダイウイルスNPタンパク質に対する抗体、及び、hOct4hSox2hKlf4遺伝子産物に対する抗体を用いて蛍光抗体法で染色することにより、トランスフェクションした細胞中でベクターゲノムの再構成が起こったことを確認し、この細胞集団をこれ以上のクローニングせずにhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1産生細胞として用いた。50x105個のhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1産生細胞に、欠損遺伝子発現プラスミドであるpMKIT151MTairaetalArchVirol1401871941995、pSRDZFmut、pMKITNaHN各2μgをLipofectamine2000を用いて導入し、4時間後に細胞を洗浄した後、10FCS含有DMEM培地を加えてさらに32°Cで49日間培養した。その後、hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターを含む培養上清を回収し、045μmのフィルターで濾過後、必要ならば超遠心法によりベクターを濃縮した。ベクター懸濁液は液体窒素にて急速冷凍し、80°Cにて保存した。実施例3.hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion2の作製1ベクターcDNAの作製hcMyc遺伝子増幅用プライマーとして、5’ACTAGCTAGCTTAGACGCTGGATTTTTTTCGGGTAGTGG3’配列表配列番号13N末端側、5’GTCCACCGGTCTTACGCACAAGAGTTCCGT3’配列表配列番号14C末端側の2本のプライマーを用いてヒトcMyccDNA全長を含むプラスミドpJL1上からヒトcMyc遺伝子をPCR法で増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNheI、AgeIで切断し、実施例2で作製したpMO084のNheIAgeI間に挿入することによってプラスミドpMO118を得た図2。hSox2遺伝子増幅用プライマーとして、5’AGTACCTAGGCGCATGTACAACATGATGGAGACGG3’配列表配列番号15N末端側、5’GTCCGACGTCCTCACATGTGTGAGAGGGGCAGT3’配列表配列番号16C末端側の2本のプライマーを用いてpUC57Sox2上からヒトSox2遺伝子をPCR法によって増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をAvrII、AatIIで切断し、pMO118のAvrIIAatII間に挿入することによって、pMO119を得た図2。hOct4遺伝子増幅用プライマーとして、5’ACTAGCTAGCGGTTCCCCATGGCGGGACACCTGGCTTCGG3’配列表配列番17N末端側、5’GGTCCACGCGTTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCC3’配列表配列番号18C末端側の2本のプライマーを用いてpUC57Oct4上からヒトOct4遺伝子をPCR法によって増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNheI、MluIで切断し、pMO097のNheIMluI間に挿入することによって、pMO116を得た。次に、pMO116のClaIClaIフラグメントの向きを入れ替えてpMO120を得た。さらにpMO119のSalIMluI断片とpMO120のSalIMluIを結合することによりpMO122を得た図2。以上によって得られた各プラスミドのうち、pMO094実施例2,図1からT7プロモーター配列~SeV13655を、pMO122からSeV365510480を切り出し、λ151をEcoRI切断することによって得たSeV104801538λDASHIIrightarmのDNA断片と合わせてクローニングし、λSeVpを作製した図2hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion2ゲノム全長に相補的なcDNAは配列表配列番号19。2hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion2の調製上記hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion2ゲノム全長に相補的なcDNAから、実施例22に記載の方法に従って、hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion2を調製した。実施例4.iPS細胞から自動除去されるhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion3の作製1ベクターcDNAの作製ES細胞特異的miRNAであるmir302aの標的配列を4つつなげた配列をクローニングするために、5’CCGGTTATCACCAAAACATGGAAGCACTTACGATTCACCAAAACATGGAAGCACTTAGGTACC3’配列表配列番号20と5’TAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATAA3’配列表配列番号21、5’TCACCAAAACATGGAAGCACTTACGATTCACCAAAACATGGAAGCACTTAA3’配列表配列番号22と5’CCGGTTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAGGTACC3’配列表配列番号23、の2組のオリゴDNAをアニーリングさせた後にライゲーションし、AgeIで切断したpGL412PromegaCorpにクローニングしてpNK300を得た図3。pNK15AgilentTechnologiesIncにSeVCl151株ゲノムcDNA901415384塩基タバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列T7RNApolymerase終止配列をこの順序で挿入したプラスミドベクター:配列表配列番号24に対してXmaI認識配列挿入部位作製用プライマーとして、5’GACAGCTCGTAATCCCGGGTCCCTATCGTGC3’配列表配列番号25センス鎖5’GCACGATAGGGACCCGGGATTACGAGCTGTC3’配列表配列番号26アンチセンス鎖を用いて、QuikchangeSitedirectedMutagenesisIIkitによってXmaI認識配列をSeV15244の後ろに挿入してpNK287を得た。pNK300をAgeIで切断した断片を、pNK287のXmaI部位に挿入することによってプラスミドpNK309を得た図3。実施例2で作製したpMO103からT7プロモーター配列~SeV13655を、pMO099からSeV365510480を切り出し、pNK309からSeV901415384ヘアピンリボザイム配列T7RNApolymerase終止配列を切り出し、λDASHIIrightarm、leftarmのDNA断片と合わせてクローニングし、λSeVpを作製した図3hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion3ゲノム全長に相補的なcDNAは配列表配列番号27。2hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion3の調製上記hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion3ゲノム全長に相補的なcDNAから、実施例22に記載の方法でhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion3を調製した。実施例5.iPS細胞から自動除去されるhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion4の作製1ベクターcDNAの作製実施例3で作製したpMO094からT7プロモーター配列~SeV13655を、pMO122からSeV365510480を切り出し、実施例4で作製したpNK309からSeV901415384ヘアピンリボザイム配列T7RNApolymerase終止配列を切り出し、λDASHIIrightarm、leftarmのDNA断片と合わせてクローニングし、λSeVpを作製した図4hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion4ゲノム全長に相補的なcDNAは配列表配列番号28。2hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion4の調製上記hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion4ゲノム全長に相補的なcDNAから、実施例22に記載の方法でhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion4を調製した。実施例6持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムの、siRNAを用いた細胞からの除去についての経時的検討実施例2から実施例5で示した持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムは、細胞内で安定に維持され、発現した初期化遺伝子産物によって細胞の初期化が起こることが期待される。一方、最終的にiPS細胞を完成するためには、外来の初期化遺伝子を搭載した持続発現型センダイウイルスベクターを細胞から除去する必要がある。そこで、持続発現型センダイウイルスベクターを安定に保持している細胞からsiRNAを用いてベクターゲノムを除去する方法について、マーカー遺伝子を搭載した持続発現型センダイウイルスベクターを使って除去の経時変化を定量的に解析すると共に、siRNA処理を行った細胞にベクターゲノムが存在しないことを確認した。持続発現型センダイウイルスベクターによる遺伝子発現のマーカーとして、不安定型ホタルルシフェラーゼ遺伝子Luc2CPPromegaCorpと大腸菌ハイグロマイシンB耐性遺伝子HygBpapertrouを使用した。ルシフェラーゼ活性はゲノムRNAのコピー数を反映し、ハイグロマイシンB耐性細胞の数は持続発現型センダイウイルスベクターを保持している細胞の数を反映する。Luc2CP遺伝子とHygB遺伝子を搭載したKOHygBEGFPLuc2CP搭載持続発現型センダイウイルスベクターは、実施例2で示したhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1の作製と同じ手法を用い、hcMyc遺伝子をKusabiraOrangeKO遺伝子MedicalBiologicalLaboratoriesCoLtdで、hKlf4遺伝子をHygB遺伝子で、hOct4遺伝子をEnhancedGreenFluorescentProteinEGFP遺伝子で、hSox2遺伝子をLuc2CP遺伝子でそれぞれ置換して作製した。L遺伝子の発現は、shortinterferingRNAsiRNA1:センス鎖5’GGUUCAGCAUCAAAUAUGAAG3’配列表配列番号29、アンチセンス鎖5’UCAUAUUUGAUGCUGAACCAU3’配列表配列番号30を使って抑制した。陰性対照siRNAは使用したセンダイウイルスベクターゲノムの塩基配列と相同性が無いウミボタルルシフェラーゼ遺伝子PromegaCorpRlucと相補性を持つsiRNAを用いた。該siRNAによるベクターゲノム除去効果を調べるため、Luc2CP遺伝子とHygB遺伝子を搭載した持続発現型センダイウイルスベクターのゲノムを安定に保持しているHeLa細胞を、3x104個/04mL培地MEM10ウシ胎児血清/wellの濃度で24wellプレートに播種した。siRNAは最終濃度40nMになるようにOptiMEMで希釈してLipofectamineRNAiMAXLifeTechnologiesInc1μLを加えて室温20分反応後、上記細胞に加えた。以後、細胞を経時的に回収し、3日目と6日目に細胞を上記の条件で継代すると同時に、siRNAを上記の条件で細胞に導入した。その結果、細胞内のベクターの量の指標となるルシフェラーゼの活性は経時的に低下し、8日目以降はルシフェラーゼ活性が検出限界となった図5A。さらにsiRNAを3回導入した細胞を、siRNA非存在下で4週間培養し、次に104個の細胞を200μgmLのハイグロマイシンBを含む選択培地中に移してさらに1週間培養した。その結果、ハイグロマイシンB耐性クローンは出現せず、HygB遺伝子を搭載した持続発現型センダイウイルスベクターのゲノムを持つ細胞が存在しないことが示された図5B。実施例7持続発現型センダイウイルスベクターに搭載した2つの外来遺伝子の遺伝子発現様式の検討iPS細胞の作製には4つの初期化遺伝子が同時に一つの細胞で発現する必要がある。また、4つの初期化遺伝子の発現の強さのバランスを変えることにより初期化効率が変化する参考文献:PapapetrouetalProcNatlAcadSciUSA10612759127642009だけでなく、iPS細胞に形態が似ていても多分化能を持たない質の低い細胞株が出現する可能性が指摘されている参考文献:ChanetalNatBiotech27103410372009。そのため、iPS細胞を高効率でかつ再現性良く作製する方法は、14つの初期化遺伝子が同時に1個の細胞に導入されること、2これら4つの遺伝子がすべての細胞で同じバランスで発現すること、の2点を満たす必要がある。センダイウイルスベクターを使って4個の初期化遺伝子を細胞に導入する場合、本発明で例示しているようにすべての初期化遺伝子を1つのベクターに搭載して遺伝子導入する方法と、特許文献1非特許文献12非特許文献21で示されているように1~3種類の初期化遺伝子を搭載したベクターを別々に作製してから混合して遺伝子導入する方法が考えられる。そこで、KusabiraOrangeKO遺伝子とEnhancedGreenFluorescentProteinEGFP遺伝子の2つの遺伝子の発現を指標にして、上記の2つの方法における外来遺伝子の発現様式に違いがあるかどうかを検討した。KO遺伝子とEGFP遺伝子を同時に搭載したベクターとしては、実施例6に記載されたKOHygBEGFPLuc2CP搭載持続発現型センダイウイルスベクターを用いた。また、KO遺伝子を搭載したベクターとしては、実施例2で記述したhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1からhcMyc遺伝子を除去し、Klf4遺伝子をゼオシン耐性Zeo遺伝子で、Oct4遺伝子をKO遺伝子で、Sox2遺伝子を分泌型ルシフェラーゼCLuc遺伝子で置換したZeoKOCLuc搭載持続発現型センダイウイルスベクターを用いた。またEGFP遺伝子を搭載したベクターとしては、実施例2で記述したhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1からhcMyc遺伝子を除去し、Klf4遺伝子をBsr遺伝子で、Oct4遺伝子をEGFP遺伝子で、Sox2遺伝子を慢性肉芽種症原因遺伝子gp91phoxで置換したBsrEGFPgp91phox搭載持続発現型センダイウイルスベクターを用いた。サルLLCMK2細胞に、KOHygBEGFPLuc2CP搭載ベクターを細胞あたり5ベクター粒子の条件で感染させ、ハイグロマイシンBで選択して、KOHygBEGFPLuc2CP搭載ベクターを保持する細胞プールLLCMK2を樹立した。また、同様にZeoKOCLuc搭載ベクターとBsrEGFPgp91phox搭載ベクターをベクター粒子比1:1で混合し、それぞれ細胞当たり5ベクター粒子の条件でLLCMK2細胞に感染させた後、ブラストサイジンSとゼオシンで同時に選択して、この2つのベクターゲノムを同一の細胞中に持つ細胞プールLLCMK2を樹立した。この2つの細胞株を蛍光顕微鏡Zeissで観察し、KOが発する蛍光に赤色の疑似カラーを、EGFPが発する蛍光に緑色の疑似カラーを割り当てて画像を重ねたところ、LLCMK2はすべてKOとEGFPが同時に発現していることを示す黄色の画像となったのに対し、LLCMK2は赤色黄色緑色の細胞が混在しており、KOとEGFPの発現のバランスが細胞によって非常に異なっていることが示された図6AさらにKOとEGFPの発現のバランスを定量的に解析するため、これらの細胞を蛍光細胞解析装置FluorescentactivatedCellAnalyzerBDFACSCalibur、BectonDickinsonandCompanyで解析した。104個のLLCMK2およびLLCMK2をそれぞれ2mLの生理的緩衝液に懸濁し、EGFPの蛍光強度FL1とKOの蛍光強度FL2を測定した。その結果、LLCMK2ではEGFPの蛍光強度とKOの蛍光強度の比が常に一定であるのに対し、LLCMK2ではその比が非常に分散していることが示された図6B。またFL1とFL2の比を解析すると、LLCMK2では50以上の細胞が単一の比を示すのに対し、LLCMK2では0から100の間に広く分布していた図6C。以上の結果から、2つ以上の遺伝子を細胞に同時に導入して同じ比率で発現させることは、本発明で実施する4つの初期化遺伝子を同一のセンダイウイルスベクター上に搭載する方法では可能であるが、特許文献1非特許文献12非特許文献21で示されているような4つの初期化遺伝子を2つ以上のセンダイウイルスベクターに分けて別々に搭載する方法では不可能であることが示された。実施例8ヒト胎児由来線維芽細胞からのヒトiPSマーカー発現細胞の誘導1ヒトiPSマーカー発現細胞の誘導ヒト胎児由来線維芽細胞であるTIG3細胞を12wellplateに10x105cellswellで播種し、翌日に実施例2で作製したhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1、及び実施例3で作製したhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion2をそれぞれ培地中に加え、室温で2時間放置した後に37°Cで一晩培養することによって感染させた。マイトマイシンC処理をしたMEFをフィーダー細胞として、ゼラチンコートしたディッシュ上に準備し、上記ベクター感染細胞をその上に蒔いて、hESmediumDMEMF1220KnockOutSerumReplacement01mMnonessentialaminoacids055mM2ME10ngmlbFGFもしくは霊長類ES細胞用培地ReproCELL中で培養する。hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1感染10日後ほどからヒトES細胞様のコロニーの形成が確認され、アルカリフォスファターゼ活性後記bが確認された図7。また、RTPCR法後記cにより、ヒトiPS細胞のマーカーであるヒトNanogが、これらのコロニーを形成する細胞において誘導されていることを確認した。図8。また、蛍光抗体法後記aにより、ヒトiPS細胞のマーカーであるSSEA4が、これらのコロニーを形成する細胞において誘導されていることを確認した図9。また、hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion2を用いても同様の結果が得られた。2ヒトiPSマーカー発現細胞の誘導効率の検定持続発現型センダイウイルスベクターで遺伝子導入した細胞のベクターゲノムRNA保持率を感染2日目にNPタンパク質に対する蛍光抗体法によって定量し、アルカリフォスファターゼ活性陽性コロニー数をベクター保持率で補正することによって、ヒトiPSマーカー発現細胞の誘導効率を算出した。結果を表1に示す。表1に示される結果から、これまで報告されているレトロウイルスベクターによってhOct4hSox2hKlf4hcMycの4遺伝子を導入したiPS細胞作製の報告よりも有意に高い効率でヒトiPSマーカー発現細胞が誘導できることが明らかになった。また、hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion2を用いても同様の結果が得られた。実施例9持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムの除去によるヒトiPS細胞の作製実施例8で得たヒトiPSマーカー発現細胞を実施例6で示したようにL遺伝子に対するsiRNAで処理し、その後継続して培養することによって、ベクター感染約1ヶ月後には、センダイウイルスNPタンパク質に対する蛍光抗体染色後記aでベクターのRNAゲノムが細胞中に残存していないコロニーの存在が確認された。さらにそのコロニーをクローニングし、NP遺伝子由来メッセンジャーRNAmRNAを検出するRTPCR法後記cによって確認し、ベクターゲノムが残存していないヒトiPS細胞クローンを得た図10A。また、ベクターRNAを除去した後もiPS細胞マーカーであるヒトNanogの発現が持続的に維持されていることをRTPCR法後記cにより確認した図10B。また、蛍光抗体法後記aにより、ベクターRNAを除去した後もiPS細胞マーカーであるヒトSSEA4とOct4の発現が持続的に維持されていることを確認した図11。実施例10ヒトiPS細胞からのテラトーマ形成実施例9で得られたヒトiPS細胞を10x106cells40μLHepesBuffered生理食塩水HBSS匹になるように調製する。ネンブタール、イソフルラン麻酔下でマウスCB17IcrscidJclの精巣を露出させ、調製したiPS細胞を注入した後に縫合した。接種後約8週間で、肉眼で確認可能な奇形種が形成され、移植60日後に奇形種を摘出した。ブアン固定液75飽和ピクリン酸、12ホルマリン、3酢酸によって固定した後、70エタノール1時間、90エタノール1時間、100エタノール1時間、2回、50エタノール:502ブタノール1時間、1002ブタノール30分を2回の処理で脱水した。サンプルをパラフィン固定後、ミクロトームで厚さ6μmの切片を作製した。切片を脱パラフィン後、HE染色により観察した結果、三胚葉すべてへの分化が確認された図12。実施例11初期化遺伝子を別々に搭載した持続発現型センダイウイルスベクターを用いたiPS細胞誘導本発明で実施している4つの初期化遺伝子を同一のベクター上に搭載してiPS細胞を作製する方法と、特許文献1非特許文献12非特許文献21で示されているような4つの初期化遺伝子を2つ以上のベクター上に分けて搭載してiPS細胞を作製する方法について、iPS細胞の作製効率の比較を行った。4つの初期化遺伝子を同一のベクター上に搭載したベクターとして、実施例2で示したhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1を用いた。また、4つの初期化遺伝子を2つ以上のベクター上に分けて搭載したベクターとして、実施例2で示したhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1からhcMyc遺伝子を除いたhOct4hSox2hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターと、初期化遺伝子としてcMycだけを搭載したZeoKOhcMyc持続発現型センダイウイルスベクターを用いた。ZeoKOhcMyc持続発現型センダイウイルスベクターは、実施例3で作製したhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion2からKlf4遺伝子を除き、Oct4遺伝子をZeo遺伝子で、Sox2遺伝子をKO遺伝子でそれぞれ置換して作製した。マウス胎児由来線維芽細胞に、hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクター単独、もしくはhOct4hSox2hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターとZeoKOhcMyc持続発現型センダイウイルスベクターをベクター粒子比1:1で混合したものを実施例8に従って感染させ、iPS細胞コロニーの出現をアルカリフォスファターゼ陽性の細胞コロニーの出現を指標に検定した。その結果、本発明で実施している4つの初期化遺伝子を同一のベクター上に搭載してiPS細胞を作製する方法は、特許文献1非特許文献12非特許文献21で示されているような4つの初期化遺伝子を2つのベクター上に分けて搭載してiPS細胞を作製する方法に比較してはるかにiPS細胞作製効率が高いことが示された図13実施例12hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion3を用いたiPS細胞誘導TIG3細胞を12wellplateに10x105cellswellで播種し、翌日に実施例3で作製したhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターもしくは実施例4で作製したhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion3を培地中に加え、実施例8に従ってヒトiPS細胞を誘導した。出現したコロニーをsiRNAの非存在下で2回植え継いだ後の感染24日後に、コロニーに対してNPタンパクに対する抗体を用いて蛍光染色したところ、hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion3を用いた場合、多くのコロニーでベクターの除去が確認された図14。それに対し、hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1を用いた場合はベクターがまだ残存していた。以上の結果から、hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion3を用いてヒトiPS細胞を誘導した場合、誘導されたiPS細胞で発現するmir302aの働きによって自動的にベクターが除去されることが明らかになった。また、hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion4でも同様の効果があった。実施例13ヒト末梢血単核細胞からのiPS細胞の樹立成人の末梢血20mLをPBS20mLで希釈し、Lymphoprep6mLに重層して1800回転30分の遠心で、血小板を含む上層、単核細胞を含む中間層、赤血球を含む下層に分離した。中間層をPBSで洗浄してヒト末梢血単核細胞とした。この細胞を使い、実施例8の方法に従ってhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターを感染させ培養したところ、アルカリフォスファターゼ陽性でヒトES細胞と同様の形態を持ったiPS細胞が出現した図15。ベクターを感染させなかった陰性対照からは、このような細胞コロニーは出現しなかった。実施例14ヒト末梢血からの単球の精製成人54歳、男性の末梢血38mLをPBS42mLで希釈し、全体量を80mLとした。希釈した末梢血8mLを、7mLのFicoliPaquePREMIUM1073に重層し、1800回転30分の遠心分離を行った。Ficoll層と上層の中間層から単球を含む単核細胞を回収した。この分画25mLに12mLのPBS2ウシ胎児血清、1mMEDTAを加え、1000回転10分の遠心分離を行い、血小板を除いて単核細胞を沈渣として回収した。この単核細胞からさらに、抗CD14抗体結合磁気ビーズMiltenyiBiotecを使って磁力により単球特異的抗原であるCD14陽性の細胞を精製した。精製した細胞は、抗CD14FITCDAKOで染色し、フローサイトメーターで純度を検定した。FicoliPaqueによる精製後の純度は31図16A、さらに抗CD14抗体結合磁気ビーズによる精製を行うと純度は98以上となった図16B。最終精製細胞をライト染色で観察したところ、ほぼすべてが典型的な単球の形状を保持していた図16C。以上の試験を経て、計6x106個の純度98以上の単球が回収された。実施例15ヒト末梢血由来単球からのiPSマーカー発現細胞の誘導1ヒトiPSマーカー発現細胞の誘導実施例14で単離したヒト単球3x105個に、実施例2から5で作製したhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1、2、3及び4を加えて200μLとし、室温で2時間感染させた。比較対照としては、初期化遺伝子を搭載していない持続発現型センダイウイルスベクターを使用した。感染後、培地RPMI164010ウシ血清500μLを加えて低速遠心し、ベクターを除去した。感染した単球はヒトES細胞用培地ReproCELLに懸濁し、フィーダー細胞マイトマイシンCで前処理したマウス胎児由来線維芽細胞を18x105個細胞/wellの密度で培養した12wellプレートに、1x105細胞/well/500μLで播種した後、37°C、5炭酸ガス存在下で培養した。培養液は隔日で交換した。hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターを感染させたヒト単球では、培養5日目から8日目に、細胞が凝集して増殖するコロニーが観察された図17A。比較対照とした初期化遺伝子を搭載していない持続発現型センダイウイルスベクターを感染させた単球からはこのような細胞塊は出現しなかった。これらの細胞塊を構成する細胞は、ヒトiPS細胞のマーカーであるSSEA4抗原及びTRA160抗原を発現していた図17B、図17C。2ヒト末梢血由来単球からのコロニー誘導効率の検定hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターVersion1、2、3及び4感染後8日目において、0091図17Aで示した形状を持つコロニーの数を測定し、播種した細胞数1x105細胞で割って、コロニー誘導効率を算出した。結果を表2に示す。表2に示された結果から、使用したベクターによって若干の差はあるが、およそ01から06の細胞が将来iPS細胞になる可能性を持つコロニーを形成していると考えられた。実施例16持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムの除去によるヒトiPS細胞の作製実施例15で出現したヒトiPSマーカー発現細胞をトリプシンで解離し、同じ培養条件で継代した。同時に、実施例6で示した方法により、培地に抗L遺伝子siRNAを合計で3回加え、センダイウイルスベクターを除去した。感染15日目に、ヒトES細胞用解離液を使って継代し、さらに2回siRNAで処理した。感染31日目には、典型的なヒトESiPS細胞と同様に平板な形状を持つ細胞のコロニーが出現した図18A、B。出現したコロニーは、ヒトiPS細胞のマーカーであるNanog図19A、BOct4図19C、D、SSEA4抗原図19E、F、TRA160抗原図19G、H、TRA181抗原図19I、Jを発現していたが、センダイウイルスのNP抗原は発現しておらず図19K、L、センダイウイルスベクターを含まないヒトiPS細胞であることが確認された。実施例17ヒト単球由来iPS細胞におけるT細胞レセプター遺伝子のリアレンジメント解析実施例14から16で示したヒト末梢血単球由来のiPS細胞の作製において、作製に使った単球の純度は98以上であるため、実施例16で示したiPS細胞は単球由来である可能性が極めて高い。しかし、抗CD14抗体結合磁気ビーズによる精製前の単核細胞にはリンパ球T細胞及びB細胞が含まれている。特に、T細胞からはiPS細胞が作製できることが既に知られている非特許文献1012ため、実施例16で示したiPS細胞が、使用した細胞材料に2以下の確率で含まれるT細胞あるいはB細胞に由来する可能性を検討した。まず、ヒト末梢血B細胞はセンダイウイルスに感染できないことが知られているNakanishietalJContRel5461681998ので、実施例16で示したiPS細胞がB細胞由来である可能性は否定される。一方、実施例16で示したiPS細胞がT細胞由来であるかどうかを検討するため、T細胞レセプター遺伝子のリアレンジメントを検討した。この手法は、白血病細胞がT細胞由来であるかどうかを診断する方法として臨床分野で確立している。ヒトiPS細胞のゲノムDNAは、DNeasyBloodTissuekitQIAGEN社を使って精製し、40ng図20Aまたは20ng図20Bを解析に使用した。T細胞レセプターベータ鎖遺伝子のリアレンジメントは、vanDongenetalLeukemia17225723172003に記された方法によりPCR法で解析した。また、T細胞レセプターガンマ鎖遺伝子のリアレンジメントは、BenhattaretalDiagnMolPathol41081121995に記された方法によりPCR法で解析した。その結果を図20に示す。T細胞レセプターベータ鎖遺伝子にリアレンジメントが起こっている場合は、約300bpまたは約180bpのところに明確なDNAのバンドが検出される。比較対照として用いたT細胞由来iPS細胞のゲノムDNAではリアレンジメントが起こっており、明瞭なバンドが検出されるが、実施例16で示したiPS細胞2検体のゲノムDNAでは相当するバンドは検出されなかった図20A。同様に、T細胞レセプターガンマ鎖遺伝子にリアレンジメントが起こっている場合は、約200bpのところに明確なDNAのバンドが検出される。比較対照として用いたT細胞由来iPS細胞のゲノムDNAではリアレンジメントが起こっており、明瞭なバンドが検出されるが、実施例16で示したiPS細胞2検体のゲノムDNAでは相当するバンドは検出されなかった図20B。以上により、実施例16で示したiPS細胞はT細胞あるいはB細胞に由来するものではなく、単球に由来することが示された。上記実施例8~16で用いた確認手段は以下のとおりである。a間接蛍光抗体法による遺伝子発現の確認各細胞におけるヒトOct4ヒトSSEA4センダイウイルスNP遺伝子の発現を、それぞれの遺伝子産物に対する抗体を用いて蛍光抗体法で確認した。用いた一次抗体と希釈率は以下の通りである。ヒトOct4rabbitantiOct4polyclonalantibodyx400;SSEA4マウスantiSSEA4monoclonalantibodyx200;TRA160マウスantiTRA160monoclonalantibodyx200;TRA181マウスantiTRA181monoclonalantibodyx200;ヒトNanogウサギantiNanogpolyclonalantibodyx1000;センダイウイルスNPmouseantiNPmonoclonalantibodyx1000もしくはrabbitantiNPpolyclonalantibodyx1000bアルカリフォスファターゼ染色培地を除去し、PBSで一回洗浄後、VectorRedAlkalinePhosphataseSubstrateKitIを加えて室温で20~30分反応させた。アルカリフォスファターゼ活性を有する細胞は赤色に染色された。c逆転写PolymeraseChainReaction法RTPCR法によるヒトNanogセンダイウイルスNP遺伝子発現の確認細胞からISOGENNipponGeneを用いてtotalRNAを抽出した。抽出したRNAを鋳型に用い、ランダムプライマーとSuperScriptIIIFirststrandsynthesissystemLifeTechnologiesを用いてcDNAを合成した後、以下に示したプライマーを用いて標的となるcDNAをPCR法で増幅し、発現の確認を行った。ヒトNanog5’AGCATCCGACTGTAAAGAAT3’配列表配列番号31センス鎖、5’CCTCTCCACAGTTATAGAAG3’配列表配列番号32アンチセンス鎖SeVNP5’AGACCCTAAGAGGACGAAGA3’配列表配列番号33センス鎖、5’ACTCCCATGGCGTAACTCCATAGTG3’配列表配列番号34アンチセンス鎖。実施例18ヒト末梢血単球由来iPS細胞からのテラトーマ形成実施例16で得られたヒト末梢血単球由来iPS細胞を10x106cells40μLHepesBuffered生理食塩水HBSS匹になるように調製する。ネンブタール、イソフルラン麻酔下でマウスCB17IcrscidJclの精巣を露出させ、調製したiPS細胞を注入した後に縫合した。接種後約8週間で、肉眼で確認可能な奇形種が形成され、移植60日後に奇形種を摘出した。ブアン固定液75飽和ピクリン酸、12ホルマリン、3酢酸によって固定した後、70エタノール1時間、90エタノール1時間、100エタノール1時間、2回、50エタノール:502ブタノール1時間、1002ブタノール30分を2回の処理で脱水した。サンプルをパラフィン固定後、ミクロトームで厚さ6μmの切片を作製した。切片を脱パラフィン後、HE染色により観察した結果、三胚葉すべてへの分化が確認され、ヒト末梢血単球由来iPS細胞が多能性を持っていることが確認された図21。実施例19ヒト末梢血単球由来iPS細胞の血球細胞への再分化能の検討ヒトiPS細胞は、しばしば作製に使った体細胞のエピジェネティックな性質を残しているため、元の体細胞と同じ組織の細胞に再分化しやすい傾向があることが知られている。もし、ヒト末梢血単球由来iPS細胞が完全なゲノムを持った造血前駆細胞に再分化しやすい傾向を持っていれば、再生医療や試験管内での血小板の製造などに極めて有用である。そこでES細胞を試験管内で血液細胞に分化させる系TakayamaetalBlood11152985306を用いて、ヒト末梢血単球由来iPS細胞とヒト線維芽細胞由来iPS細胞の血液細胞への分化傾向を比較した。実施例16で得られたヒト末梢血単球由来iPS細胞および実施例9で得られたヒト線維芽細胞由来iPS細胞を、高山中内らの方法TakayamaetalBlood11152985306に従い、血球細胞へ再分化させた。使用直前に50Gyのガンマ線を照射して増殖能を失わせたマウス間葉系幹細胞株C3H10T12理化学研究所バイオリソースセンターより入手100mmディッシュ1枚の上に、100細胞程度の小塊にしたiPS細胞を重層して、分化培地IscovemodifiedDMEM10μgmLhumaninsulin55μgmLhumantransferring5ngmLsodiumselenite2mMLglutamine045mMmonothioglycerol50μgmLascorbicacid15FCSVEGF20ngmLにて2週間培養する。2週間後に、iPSsacと呼ばれる袋状の構造を単離し、その中に含まれるCD34CD43陽性の造血前駆細胞マーカー陽性の細胞数をフローサイトメーターで計測した図22A。結果は、ヒトiPS細胞105個あたりに出現するCD34CD43陽性細胞の数で表した。ヒト末梢血単球由来iPS細胞4株のうち3株は、ヒト線維芽細胞由来iPS細胞に比べて造血前駆細胞への分化能が有意に高く、1株は同程度であった。このことから、同じようにhOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターを使って作製しても、ヒト末梢血単球由来iPS細胞はヒト線維芽細胞由来iPS細胞に比べてヒト造血前駆細胞に再分化しやすいことが示された。また、iPSsac内に含まれる細胞2x104個を、ガンマ線照射済みC3H10T12細胞6wellplateの上にまき直し、サイトカインカクテルhumanIL6IL11SCFを含む。PharmaciaUpjohn社製を含む分化培地で3種間培養した。培地は3日に一回交換し、3週間後に出現した血液細胞のコロニーをその形状で判定して数を定量した図22B。結果は、ヒトiPS細胞105個あたりに出現する顆粒球マクロファージコロニー形成ユニットCFUGM、赤芽球コロニー形成ユニットCFUE、赤芽球バースト形成ユニットBFUE、混合コロニー形成ユニットCFUMixの数とその総和で表した。ヒト末梢血単球由来iPS細胞4株のうち3株は、ヒト線維芽細胞由来iPS細胞に比べて、分化した血液細胞コロニーを作る活性が高く、1株は同程度であった。このことから、ヒト末梢血単球由来iPS細胞に由来するヒト造血前駆細胞は、マクロファージ顆粒球赤芽球への正常な分化能を持っていることが確認された。実施例20hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターを使って樹立したヒト末梢血単球由来iPS細胞と、ヒト線維芽細胞由来iPS細胞やヒトES細胞との遺伝子発現の比較1解析用RNAサンプルの用意実施例16で得られたヒト末梢血単球由来iPS細胞、及び実施例9で得られたヒト線維芽細胞由来iPS細胞を、フィーダー細胞を使わずに、MEFconditionedmedium中でマトリゲルBectonDickinsonandCompany上に培養し、10x106細胞ずつ回収した。回収した細胞から、ISOGENNipponGeneCoLtdを用いて全細胞RNAを抽出した。比較対象としては、ヒト正常線維芽細胞、ヒトES細胞およびレトロウイルスベクターでhOct4hSox2hKlf4hcMyc遺伝子を導入して作製した標準ヒトiPS細胞株201B7京都大学山中伸弥博士より供与されたを、同様に培養してRNAを抽出した。2遺伝子発現の解析05μgの全細胞RNAをQuickAmpLabelngKitAgilentTechnologiesIncを用いてCy3で標識する。標識したRNAはGeneExpressionHybridizationKitAgilentTechnologiesIncを用いて、WholeHumanGenomeDNAarrayAgilentTechnologiesIncにハイブリダイゼーションさせ、AgilentDNAマイクロアレイスキャナを用いてシグナルを取得する。取得したシグナルはGeneSpringGX10ソフトウェアAgilentTechnologiesIncを用いて解析し、各細胞クローン間の遺伝子発現を、発現の強度を赤から緑へのグラジエントで示すHeatMapという表示方法で解析した図23。その結果、hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターを使って樹立したヒト末梢血単球由来iPS細胞は、同じ方法を用いて作製したヒト線維芽細胞由来iPS細胞や、標準ヒトiPS細胞株201B7、ヒトES細胞とほぼ同等の遺伝子発現パターンを示した。実施例21hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターを使って樹立したヒト末梢血単球由来iPS細胞のゲノムDNAにおけるT細胞レセプター遺伝子の再構成の解析実施例16で得られたヒト末梢血単球由来iPS細胞が、使用した単球分画に少量混入しているTリンパ球由来ではないことを確認するために、T細胞レセプター遺伝子の再構成を検討した。分化したT細胞では必ずT細胞レセプター遺伝子の再構成が起こっており、αβ鎖からなるT細胞レセプターか、γδ鎖からなるT細胞レセプターのいずれかを持っている。このうちαβ鎖からなるT細胞レセプター持つ細胞では必ずβ鎖遺伝子の再構成が先に起こるため、この遺伝子を解析した。γδ鎖からなるT細胞レセプターを持つ細胞ではγ鎖とδ鎖の遺伝子が再構成しているので、両方の遺伝子を解析した。ヒトiPS細胞のゲノムDNAは、DNeasyBloodTissuekitQIAGEN社を使って精製し、05μgを解析に使用した。陽性対象としては解析キットに付属している末梢血全T細胞由来のゲノムDNAと、各T細胞レセプター遺伝子に再構成が起こっていることが確認されているT細胞由来細胞株由来のゲノムDNAを使用した。また、陰性対照としては、線維芽細胞由来ヒトiPS細胞のゲノムDNAとマウスフィーダー細胞のゲノムDNAを使用した。β鎖遺伝子とγ鎖遺伝子の再構成はTCRBTCRGTCellClonalityAssayforABIFluorescenceDetectionを、δ鎖遺伝子の再構成はTCRDClonalityAssayforABIFluorescenceDetectionをそれぞれ用いて検出し、PCR産物のサイズを3130GeneticAnalyzerで解析した。いずれの場合も、ゲノムDNAに含まれるT細胞レセプター遺伝子に再構成が起こっていれば特異的なPCR産物が検出できる。β鎖遺伝子の再構成の結果を図24に、γ鎖遺伝子の再構成の結果を図25に、δ鎖遺伝子の再構成の結果を図26に、それぞれ示す。いずれの場合も、ヒト末梢血単球由来iPS細胞のゲノムDNAではT細胞レセプター遺伝子の再構成に特異的なPCR産物は認められず、これらのiPS細胞が、その作製に使用した単球分画に少量混入しているTリンパ球由来ではないことが確認された。実施例22hOct4hSox2hKlf4hcMyc持続発現用センダイウイルスベクターを使って樹立したヒト末梢血単球由来iPS細胞のゲノムDNAにおける免疫グロブリンH鎖遺伝子の再構成の解析実施例16で得られたヒト末梢血単球由来iPS細胞が、使用した単球分画に少量混入しているBリンパ球由来ではないことを確認するために、分化しているB細胞では必ず起こっている免疫グロブリンH鎖遺伝子の再構成があるかどうかを検討した。ヒトiPS細胞のゲノムDNAは、DNeasyBloodTissuekitQIAGEN社を使って精製し、05μgを解析に使用した。陽性対象としては解析キットに付属している末梢血全B細胞由来のゲノムDNAと、再構成が起こっていることが確認されているB細胞由来細胞株由来のゲノムDNAを使用した。また、陰性対照としては、線維芽細胞由来ヒトiPS細胞のゲノムDNAとマウスフィーダー細胞のゲノムDNAを使用した。免疫グロブリンH鎖遺伝子の再構成はIGHGeneRearrangementAssayforABIFluorescenceDetectionを用いて検出し、PCR産物のサイズを3130GeneticAnalyzerで解析した。いずれの場合も、ゲノムDNAに含まれる免疫グロブリンH鎖遺伝子に再構成が起こっていれば特異的なPCR産物が検出できる。解析結果を図27に示す。ヒト末梢血単球由来iPS細胞のゲノムDNAではいずれも免疫グロブリンH鎖遺伝子の再構成に特異的なPCR産物は認められず、これらのiPS細胞が、その作製に使用した単球分画に少量混入しているBリンパ球由来ではないことが確認された。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。"