多能性幹細胞からエピブラスト様細胞EpiLCを製造する方法であって、前記多能性幹細胞をアクチビンAの存在下で培養する、方法。EpiLCが、分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つの遺伝子発現の上昇を示す、請求項1記載の方法。EpiLCが、分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの遺伝子発現の低下を示す、請求項1又は2記載の方法。さらに塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF及び/又はKnockOut商標SerumReplacementKSRの存在下で培養を実施する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。無血清及び無フィーダー条件下で培養を実施する、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。培養を3日未満実施する、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。培養を約2日間実施する、請求項6記載の方法。多能性幹細胞から始原生殖細胞様PGC様細胞を製造する方法であって、以下の工程I及びIIを含む、方法:I請求項1~7のいずれか1項に記載の方法でEpiLCを製造する工程、II工程Iで得られたEpiLCをBMP4及びLIFの存在下で培養する工程。PGC様細胞が、分化誘導前のEpiLCに比して、Blimp1及び/又はStellaDppa3遺伝子発現の上昇を示す、請求項8記載の方法。PGC様細胞が、正常な精子形成に貢献できる、請求項8又は9記載の方法。前記工程IIの培養をさらにSCF及び/又はBMP8b及び/又はEGFの存在下で実施する、請求項8~10のいずれか1項に記載の方法。前記工程IIの培養を無血清条件下で実施する、請求項8~11のいずれか1項に記載の方法。前記工程Iの培養をアクチビンA、bFGF及びKSRの存在下で実施し、前記工程IIの培養をBMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFの存在下で実施する、請求項8記載の方法。さらに、III前記工程IIで得られた細胞からBlimp1陽性細胞を選択する工程を含む、請求項8~13のいずれか1項に記載の方法。さらに、III前記工程IIで得られた細胞からSSEA1-及びインテグリン-β3-二重陽性細胞を選択する工程を含む、請求項8~13のいずれか1項に記載の方法。多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞iPSC又は胚性幹細胞ESCである、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。アクチビンA、bFGF及びKSRを含む、多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導用試薬キット。以下の1及び2を含む、多能性幹細胞からPGC様細胞への分化誘導用試薬キット:1アクチビンA、bFGF及びKSRを含む、多能性幹細胞からEpiLCへの1以上の誘導用試薬、2BMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFを含む、EpiLCからPGC様細胞への1以上の誘導用試薬。多能性幹細胞がiPSC又はESCである、請求項17又は18記載の試薬キット。請求項1~7のいずれか1項に記載の方法により製造される、EpiLCを含む細胞集団。EpiLCが、以下の1及び2の特徴を有する、請求項20記載の細胞集団:1分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つの遺伝子発現が上昇している、2分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの遺伝子発現が低下している。1つ以上の初期化遺伝子が、細胞集団を構成する細胞のゲノム中に組み込まれた、請求項20又は21記載の細胞集団。初期化遺伝子が、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycからなる4種の遺伝子、又はOct3/4、Sox2及びKlf4からなる3種の遺伝子である、請求項22記載の細胞集団。請求項20~23のいずれか1項に記載の細胞集団を細胞源として用いる、エピブラストに由来する種々の細胞種の製造方法。発明の概要従って、本発明の目的は、高効率で高い再現性を有する、多能性幹細胞からEpiLCを誘導する方法を提供し、それによりinvitroにおいて、ESC及びiPSCを含む多能性幹細胞からの生殖細胞分化決定経路の機能的再構成を達成することである。本発明の別の目的は、無血清及び無フィーダー条件下で多能性幹細胞から生殖細胞を誘導する方法を提供することである。エピブラスト幹細胞EpiSCは、培養液中のアクチビンA及び塩基性線維芽細胞増殖因子bFGFの連続的な存在下、E55~E65エピブラストに由来する多能性幹細胞でありNature448191-1952007;Nature448196-1992007、そこからinvitroでPGC様細胞を誘導するための潜在的候補である。しかし、本発明者らは、複数の条件下で培養されたEpiSCが、BMP4を含有するSFMにおいて、Blimp1-及びstella-陽性細胞に効率的に誘導されないことを発見した。EpiSCは、Gata6、Sox17、Cer1などの内胚葉マーカーの高レベルな発現に反映されるように、PGCの運命付けfateに完全に適したものではないため、原腸陥入前のエピブラストとは異なる特性を有し得る。従って、本発明者らは、上記目的を達成するために、多能性幹細胞をE55~E60エピブラスト様状態に誘導し得る条件を決定しようと試みた。第一に、本発明者らは、Blimp1-mVenusandstella-ECFPレポーターBVSC;Reproduction136503-5142008を有するマウスESCを作製した。PGCは、Blimp1Prdm1及びstellaDppa3を特異的に発現するので、マウスESCは、そこからのPGC分化を可視化できる。レポーターESCを、約E35~E45ICM/初期エピブラスト様状態でESCを保つ条件下で維持し、次いでアクチビンAを添加したSFM任意選択でbFGF及びKnockOut商標SerumReplacementKSRを添加してもよい中で3日間培養した。培養の間、ESCはエピブラスト様の扁平な細胞、すなわちEpiLCに一様に分化した。次いで、得られたEpiLCを、BMP4、BMP4及びLIF、又はBMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFを添加したSFM中で培養した。その結果、EpiLCは、基本的にはBMP4の存在下、Blimp1-及びstella-陽性PGC様細胞に誘導され、PGC様細胞の維持/生存/増殖は、LIFにより高められ、LIF、SCF、BMP8b及びEGFによってより確実にrobustly高められた。EpiLCを介したESCからのPGC様細胞の誘導と関連する遺伝子発現ダイナミクスは、エピブラストを介した内部細胞塊ICMからのPGC分化決定のものと酷似した。驚くべきことに、PGC様細胞は、精子形成及び健常な子孫の創出に確実に貢献した。本発明者らは、これらの発見に基づきさらに研究を進め、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下に関する:[1]多能性幹細胞からエピブラスト様細胞EpiLCを製造する方法であって、前記多能性幹細胞をアクチビンAの存在下で培養する、方法。[2]EpiLCが、分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つの遺伝子発現の上昇を示す、上記[1]記載の方法。[3]EpiLCが、分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの遺伝子発現の低下を示す、上記[1]又は[2]記載の方法。[4]さらに塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF及び/又はKnockOut商標SerumReplacementKSRの存在下で培養を実施する、上記[1]~[3]のいずれかに記載の方法。[5]無血清及び無フィーダー条件下で培養を実施する、上記[1]~[4]のいずれかに記載の方法。[6]培養を3日未満実施する、上記[1]~[5]のいずれかに記載の方法。[7]培養を約2日間実施する、上記[6]記載の方法。[8]多能性幹細胞から始原生殖細胞様PGC様細胞を製造する方法であって、以下の工程I及びIIを含む、方法:I上記[1]~[7]のいずれかに記載の方法でEpiLCを製造する工程、II工程Iで得られたEpiLCをBMP4及びLIFの存在下で培養する工程。[9]PGC様細胞が、分化誘導前のEpiLCに比して、Blimp1及び/又はStellaDppa3遺伝子発現の上昇を示す、上記[8]記載の方法。[10]PGC様細胞が、正常な精子形成に貢献できる、上記[8]又は[9]記載の方法。[11]前記工程IIの培養をさらにSCF及び/又はBMP8b及び/又はEGFの存在下で実施する、上記[8]~[10]のいずれかに記載の方法。[12]前記工程IIの培養を無血清条件下で実施する、上記[8]~[11]のいずれかに記載の方法。[13]前記工程Iの培養をアクチビンA、bFGF及びKSRの存在下で実施し、前記工程IIの培養をBMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFの存在下で実施する、上記[8]記載の方法。[14]さらに、III前記工程IIで得られた細胞からBlimp1陽性細胞を選択する工程を含む、上記[8]~[13]のいずれかに記載の方法。[15]さらに、III前記工程IIで得られた細胞からSSEA1-及びインテグリン-β3-二重陽性細胞を選択する工程を含む、上記[8]~[13]のいずれかに記載の方法。[16]多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞iPSC又は胚性幹細胞ESCである、上記[1]~[15]のいずれかに記載の方法。[17]アクチビンA、bFGF及びKSRを含む、多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導用試薬キット。[18]以下の1及び2を含む、多能性幹細胞からPGC様細胞への分化誘導用試薬キット:1アクチビンA、bFGF及びKSRを含む、多能性幹細胞からEpiLCへの1以上の誘導用試薬、2BMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFを含む、EpiLCからPGC様細胞への1以上の誘導用試薬。[19]多能性幹細胞がiPSC又はESCである、上記[17]又は[18]記載の試薬キット。[20]上記[1]~[7]のいずれかに記載の方法により製造された、EpiLCを含む細胞集団。[21]EpiLCが、以下の1及び2の特徴を有する、上記[20]記載の細胞集団:1分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つの遺伝子発現が上昇している、2分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの遺伝子発現が低下している。[22]1つ以上の初期化遺伝子が、細胞集団を構成する細胞のゲノム中に組み込まれた、上記[20]又は[21]記載の細胞集団。[23]初期化遺伝子が、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycからなる4種の遺伝子、又はOct3/4、Sox2及びKlf4からなる3種の遺伝子である、上記[22]記載の細胞集団。[24]上記[20]~[23]のいずれかに記載の細胞集団を細胞源として用いる、エピブラストに由来する種々の細胞種の製造方法。本発明の多能性幹細胞からPGC様細胞への誘導は、中間体としてEpiLCの誘導を伴う。EpiLCは、E55~E60エピブラストの培養等価物であり、PGCの直前の前駆細胞である。従って、本発明の誘導系は、invivoにおけるICM/初期エピブラストからのPGC分化決定経路を、培養下で正確且つ段階的に再現するものであると考えられる。この考えは、PGC様細胞誘導経路と関連する遺伝子発現ダイナミクスが、invivoにおけるPGC分化決定経路に関連するものと酷似したことから、強く裏付けられる。中でも注目すべきは、誘導されたPGC様細胞は、比較的高い効率移植された精巣の3/6で精子形成陽性で精子形成に貢献し、健常な子孫の創出に貢献する。これは、invitroにおいてESC又はiPSCから誘導された生殖系列細胞から健常な動物を作出することを初めて実証するものである。PGC分化決定及びその後の発生に関与するメカニズムは、PGCの数がinvivoにおいて極端に少ないこと及びinvitroにおいて増殖し難いことに主に起因して、探索が非常に困難であった。本発明の培養系は、比較的多数約105~106のPGC様細胞を容易に作製でき、それ故、物理的制限によりこれまで探索されていなかった生殖細胞生物学領域を解明するための基礎として役立つ例えば、PGC分化決定及び増殖/生存に関与する主要なタンパク質の生化学的特性の分析、PGCにおけるエピジェネティックリプログラミングの正確なメカニズムの分析など。さらに、無血清及び無フィーダー条件下で多能性幹細胞から適切な特性を有するPGC様細胞を得ることは、生殖細胞発生をinvitroで再構成するための必須の最初のステップである。生殖細胞発生をinvitroで再構成することは、一般に、生殖細胞生物学のより包括的な理解、並びに生殖技術及び医薬の進歩に不可欠であるだろう。さらに、精子や卵子などの生殖細胞系列は、遺伝情報を次世代に継承し、個体を再構成する唯一の細胞系譜である。発生の異常は、不妊又は遺伝性疾患の伝播/発症をもたらし得る。従って、発生過程をinvitroで再構成することは、生殖細胞の詳細な発生メカニズムの解明のみならず、不妊及び遺伝性疾患発症のメカニズムの解明も促進するだろう。方法の概要BVSC及びP14Vトランスジェニックマウスは既に報告されており、主にC57BL/6バックグラウンドで維持されたNatGenet401016-10222008Reproduction136503-5142008。全ての動物実験は、京都大学の倫理指針下で実施した。ESCは、マウス胚性フィーダー細胞上Nature453519-523doinature06968[pii]101038/nature069682008、2i及びLIFを有するN2B27培地N2を添加したDMEM/F12とB27を添加したNeurobasalとの1:1混合物NatBiotechnol21183-186doi101038/nbt780で得た。4継代後、ポリ-L-オルニチン001;Sigma及びラミニン10ng/mlBDBiosciencesでコートされたディッシュ上、無フィーダーで雄のESCを維持した。ヒト血漿フィブロネクチン167μg/ml;Milliporeでコートされたディッシュ上、N2B27培地中、アクチビンA20ng/ml;Peprotech、bFGF12ng/ml;Invitrogen及びKSR1;InvitrogenによりESCからEpiLCを誘導した。PGC様細胞は、低細胞結合性U底96ウェルプレートNUNC中、浮遊条件で1ウェル当たり1000細胞集合体、SFM[15KSR、01mMNEAA、1mMピルビン酸ナトリウム、01mM2-メルカプトエタノール、100U/mlペニシリン、01mg/mlストレプトマイシン及び2mML-グルタミンを有するGMEMInvitrogen]Cell137571-5842009中、BMP4500ng/ml;RDSystems、LIF1000U/ml;Invitrogen、SCF100ng/ml;RDSystems、BMP8b500ng/ml;RDSystems及びEGF50ng/ml;RDSystemsによりEpiLCから誘導した。DP72カメラを備えたSZX16蛍光解剖顕微鏡Olympus又はAxioCamMRmカメラを備えたAxiovert200倒立蛍光顕微鏡Zeissにより画像を得た。定量Q-PCRGenesDev221617-16352008;BiolReprod75705-7162006用プライマー配列Q-PCR、バイサルファイト分析AnalBiochem226161-166doiS0003-26978571204-3[pii]101006/abio199512041995;Genomics79530-5382002;Nature450908-9122007用プライマー配列Bisulfite、及びBVSC導入遺伝子のジェノタイピングReproduction136503-5142008用プライマー配列Genotypingを表1に列記する。免疫組織化学のために使用した一次抗体Reproduction139381-393doiREP-09-0373[pii]101530/REP-09-03732010は以下のとおりであった:抗-Oct3/4マウスモノクローナル;BDBiosciences、抗-Sox2ウサギポリクローナル;SantaCruz、抗-Nanogラットモノクローナル;eBioscience、抗-H3K9me2ウサギポリクローナル;Upstate、抗-H3H27me3ウサギポリクローナル;Upstate及び抗-Dnmt3bマウスモノクローナル;Abcam。二次抗体は以下のとおりであった:AlexaFluor488抗-ウサギIgG、AlexaFluor568抗-ウサギ又はラット又はマウスIgG、AlexaFluor633抗-マウスIgGこれらは全てヤギポリクローナル;Invitrogen。免疫蛍光画像は、共焦点顕微鏡OlympusFV1000により得た。蛍光活性化セルソーティングFACSは、ARIAIIセルソーターBDBiosciencesを用いて実施した。新生児W/WvマウスSLC精細管へのPGC様細胞の移植、及び卵細胞質内精子注入ICSIは、以前に記載されたように実施したIntJDevBiol41111-1221997;BiolReprod52709-7201995。方法1.動物全ての動物実験は、京都大学の倫理指針下で実施した。BVSC及びP14Vトランスジェニックマウスは既に報告されておりNatGenet401016-10222008;Reproduction136503-5142008、主にC57BL/6バックグラウンドで維持された。ROSAマウス[B6129S-GtROSA26Sor/Jストック番号002073]GenesDev51513-15231991はJacksonLaboratoryから購入した。W/WvマウスWB×C57BL/6はSLCShizuokaJapanから購入した。交尾プラグを確認した日の正午を胎生期E05とした。2.ESC/EpiSCの派生及び培養BVSC及びROSA導入遺伝子を有する胚盤胞をE35で子宮から流し、マウス胚性フィーダー上Nature453519-523doinature06968[pii]101038/nature069682008、2iPD0325901、04μM;Stemgent;CHIR99021、3μM;Stemgent及びLIF1000U/mlを有するN2B27培地N2を添加したDMEM/F12とB27を添加したNeurobasalとの1:1混合物NatBiotechnol21183-186doi101038/nbt780nbt780[pii]2003中、96ウェルプレートのウェル中で培養した。広がったESCコロニーをTrypLEInvitrogenで解離することにより継代した。4継代までESCをフィーダー上で維持した。4継代時に、ESCをCellBanker3ZENOAQによりストックした。その後、雄のESCを融解し、培養し、ポリ-L-オルニチン001;Sigma及びラミニン10ng/ml;BDBiosciencesでコートされたディッシュ上、無フィーダーで維持した。Acro/Act-EGFPAAG導入遺伝子を有するESC129Sv×C57BL/6を標準的なESC派生手順により得て、2iLIF、無フィーダー培養条件に適合させた。EpiSCは、アクチビンA20ng/ml;Peprotech、bFGF12ng/ml;Invitrogen及びKSR20;Invitrogenを含むN2B27培地中、MEF上でE575エピブラストから得た。細胞は、細胞集塊cellclumpとしてコラゲナーゼIV1mg/ml;Invitrogenで解離することにより3日毎に継代し、約10継代後に典型的なEpiSCの形態を有する細胞を樹立した。3.EpiLC及びPGC様細胞の誘導アクチビンA20ng/ml;Peprotech、bFGF12ng/ml;Invitrogen及びKSR1;Invitrogenを含むN2B27培地中、ヒト血漿フィブロネクチン167μg/ml;Milliporeでコートされた12ウェルプレートのウェル上に10×105ESCを播くことにより、EpiLCを誘導した。培地は毎日交換した。サイトカインBMP4500ng/ml;RDSystems、LIF1000U/ml;Invitrogen、SCF100ng/ml;RDSystems、BMP8b500ng/ml;RDSystems及びEGF50ng/ml;RDSystemsの存在下、無血清培地[SFM;15KSR、01mMNEAA、1mMピルビン酸ナトリウム、01mM2-メルカプトエタノール、100U/mlペニシリン、01mg/mlストレプトマイシン及び2mML-グルタミンを有するGMEMInvitrogen]中、低細胞結合性U底96ウェルプレートNUNCのウェルに10×103EpiLCを播くことにより、浮遊条件でPGC様細胞を誘導した。4.蛍光活性化セルソーティングFACS分析誘導されたPGC様細胞をTrypLE10分、37°Cで解離し、01BSAを添加したDMEM/F12で洗浄し、遠心分離により集めた。大きな細胞集塊はセルストレーナーBDBiosciencesを用いて除去した。フローサイトメーターARIAII;BDBiosciencesで細胞をソーティングし分析した。BV又はEGFP及びSCの蛍光活性は、それぞれFITC及びPacificbluechannelにより検出した。AAGESC及びiPSCに由来するPGC様細胞の精製のために、PE及びAlexaFluor647とそれぞれ結合させた抗-インテグリンβ3抗体BioLegend及び抗-SSEA1抗体eBioscienceとともに解離細胞をインキュベートした。01BSAを添加したPBSで洗浄した後、フローサイトメーターで細胞をソーティングし分析した。5.Q-PCR、マイクロアレイ分析、バイサルファイト配列決定、ジェノタイピング、AP染色、免疫組織化学及びBrdU取込み1Q-PCR単離したE575エピブラスト、ESC、EpiLC並びにFACSでソーティングされたPGC様細胞及び非PGC様細胞のtotalRNAをRNeasymicroKitQIAGENを用いて抽出し精製した。totalRNAをSuperscriptIIIInvitrogenにより逆転写し、一本鎖cDNAをPowerSYBRGreenABIを用いたQ-PCR分析に使用した。用いたプライマー配列を表1に列記する。2マイクロアレイ分析GeneChipMouseGenome43020ArrayAffymetrixを用いて網羅的遺伝子発現を分析した。ESC、d1、d2及びd3EpiLC、EpiSC並びにPGC様細胞のtotalRNA10μgを製造者の説明書に従って処理した。マイクロアレイデータはプログラムdChipProcNatlAcadSciUSA9831-362001を用いて分析した。以下の基準を使用して13183のプローブを選択した:1生物学的複製の間の再現性を保証する発現レベル<2倍、及び2発現差異サンプルのいずれかのペア間で少なくとも2倍の差。およそ500のESC、d2EpiLC、EpiSC、E575エピブラスト、PGC様細胞及びE95PGCのtotalRNAを、最初のPCRで12サイクル使用した以外は、以前に記載されたように増幅したNucleicAcidsRes34e422006;NatProtoc2739-7522007。再現性及び発現差異についての基準として4倍の差を使用して、増幅サンプルについて9711のプローブを選択した。UHC、PCA及び機能的カテゴリー分析は、それぞれ、プログラムTMEV4Biotechniques34374-3782003、RR:AlanguageandenvironmentforstatisticalcomputingViennaAustriaRFoundationforStatisticalComputing2005及びEASEGenomeBiol4R702003を用いて実施した。3バイサルファイト配列決定及びジェノタイピングESC、FACSでソーティングされたPGC様細胞、PGC様細胞に由来する子孫の尾、及び野生型マウスの尾からゲノムDNAを単離し、EpiTectBisulfiteKitQIAGENを用いてバイサルファイト反応を実施した。Igf2r、Snrpn、H19及びKcnq1ot1のメチル化可変領域のPCR増幅は、以前に記載されたプライマーセット及び条件Genomics79530-5382002;Nature450908-9122007表1を用いて実施した。PCR産物をpGEM-TEasyvectorPromegaにサブクローニングし、配列決定した。BVSC導入遺伝子のジェノタイピングは以前に記載されたように実施したReproduction136503-5142008;Nature448313-3172007;Cell126663-6762006表1。4AP染色及び免疫組織化学AP染色及び免疫組織化学は以前に記載されたように実施したReproduction136503-5142008;Reproduction139381-393doiREP-09-0373[pii]101530/REP-09-03732010;JHistochemCytochem471443-14561999。使用した一次抗体は以下のとおりであった:抗-Oct3/4マウスモノクローナル;BDBioscience、抗-Sox2ウサギポリクローナル;SantaCruz、抗-Nanogラットモノクローナル;eBioscience、抗-H3K9me2ウサギポリクローナル;Upstate、抗-H3H27me3ウサギポリクローナル;Upstate及び抗-Dnmt3bマウスモノクローナル;Abcam。使用した二次抗体は以下のとおりであった:AlexaFluor488抗-ウサギIgG、AlexaFluor568抗-ウサギ又はラット又はマウスIgG、AlexaFluor633抗-マウスIgGこれらは全てヤギポリクローナルである;Invitrogen。免疫蛍光画像は、共焦点顕微鏡OlympusFV1000により得た。5BrdU取込みBrdU取込みの分析のために、BrdU標識及び検出キットRocheを使用した。PGC様細胞のために4日間誘導された集合体を10μMのBrdUで6時間インキュベートした。インキュベート後、集合体をTrypLE処理により解離し、Cytospin4ThermoScientificによりスライドガラス上に広げ、50mMグリシン中70EtOHで固定し、PBSで洗浄した。次いで、細胞を抗-BrdU及び抗-GFP、それに続いてAlexaFluor568抗-マウスIgG及びAlexa488抗-ラットIgGでインキュベートした。免疫蛍光画像は、共焦点顕微鏡OlympusFV1000により得た。6.新生児W/Wvマウス精細管へのPGC様細胞の移植及び卵細胞質内精子注入ICSIBVSCESCC57BL/6バックグラウンドからのPGC様細胞誘導の全集合体[実験当たり約1922つの96ウェルプレート集合体]をTripLEInvitrogenにより単一の細胞に解離した。レシピエント動物[WB×C57BL/6F1バックグラウンドSLCからの、内因性精子形成を欠損した新生児7~9日齢W/WvマウスJExpZool134207-2371957]に氷上で低体温麻酔を導入し、ドナー細胞懸濁液[全細胞解離物dissociates、又はFACSでソーティングされたBV陽性細胞約2μl表3]を各精巣の輸出管に注入したIntJDevBiol41111-1221997。術後、レシピエント動物を同腹子に戻し、10週間後に分析した。移植してから10週間後、レシピエント精巣の精細管から、誘導されたPGC様細胞由来の精子を調製した。簡単に述べると、レシピエントの精巣から精細管を単離し、排精に相当する暗い中心領域を有するもの、又はAcro/Act-EGFP導入遺伝子のGFP蛍光を有するものを解剖顕微鏡下に置いた。これらの精細管をはさみで優しく細切し、解離して、精原細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液はICSIまで4°Cに保った。本質的には以前に記載されたようにICSIを実施したBiolReprod52709-7201995。7.iPSCの派生及び培養、EpiLC及びPGC様細胞の誘導、並びにその分析雄のiPSCMEF-Ng-20D-17:Nature448313-3172007;MEF-Ng-178B-5:NatBiotechnol26101-1062008;MEF-Ng-492B-4:Science322949-9532008はRIKENBRCから得た。iPSCは、ポリ-L-オルニチン001;Sigma及びラミニン10ng/ml;BDBiosciencesでコートされたディッシュ上、2iPD0325901、04μM;Stemgent;CHIR99021、3μM;Stemgent及びLIF1000U/mlを有するN2B27培地N2を添加したDMEM/F12とB27を添加したNeurobasalとの1:1混合物中で維持した。iPSCからのEpiLC及びPGC様細胞の誘導は、上記3.と同じ方法で実施した。誘導されたEpiLC及びPGC様細胞は、上記5.と同じ方法で分析した。実施例1:ESCからの原腸陥入前エピブラスト様細胞EpiLCC57BL/6バックグラウンドで、Blimp1-mVenusandstella-ECFPレポーターBVSCReproduction136503-5142008を有する雄のESCを得、MAPKシグナリング阻害剤PD0325901、04μM、GSK3阻害剤CHIR99021、3μM及びLIF1000U/ml[2iLIF]を有するN2B27培地中約E35~E45ICM/初期エピブラスト様状態基底状態にESCを保つ条件Nature453519-523doinature06968[pii]101038/nature069682008;Development1363215-3222doidev038893[pii]101242/dev0388932009で維持した。検証した種々の条件のうち、フィブロネクチンでコートされたディッシュ上、アクチビンA20ng/ml、bFGF12ng/ml及びKnockout商標SerumReplacementKSR1で刺激することにより、非常にコンパクトなESCコロニーが、エピブラストに類似したより扁平な上皮性構造に、3日にわたって均一に誘導されることを発見した図1A、B。刺激すると、細胞は、最初の2日間は比較的急速に増殖したが、その後、かなりの程度の細胞死を起こし、3日目の生存細胞数は2日目のものと類似した図1D。3日目の細胞は、より伸長し突起のある形態を示した図1B。3日の分化期間において、基底状態のESC又は誘導されたエピブラスト様細胞以下、EpiLCと称するにおいてBVSC発現は観察されなかった図1B。Prdm14レポーターPrdm14-mVenus;P14VNatGenet401016-10222008を有する独立したESC株は、アクチビンA、bFGF及びKSRによる刺激時に類似した分化を示した:Prdm14はESCにで発現したが、EpiLCの誘導とともに急速に減少した図1B。キーとなる多能性タンパク質Oct3/4、Sox2及びNanog発現概説についてはDevelopment1362311-2322doi136/14/2311[pii]101242/dev0243982009を参照されたいの免疫蛍光分析により、EpiLC誘導の間に、Oct3/4は持続して発現したが、Sox2及びNanogは、それぞれ2日目及び1日目に減少したことが示された図1C。EpiLCの特性をより正確に検証するために、EpiLCと単離したE575エピブラストとの間で、多数のマーカーの発現を定量Q-PCRにより比較した。レポーター遺伝子発現及び免疫蛍光分析と十分一致して、EpiLC分化の過程で、Oct3/4は比較的一定のレベルで発現したが、ICM状態とより緊密に関連する遺伝子、例えば、Sox2、Nanog及びPrdm14、並びにZfp42Rex1、Tbx3、Tcl1、Esrrb、Klf2、Klf4及びKlf5などは、エピブラストのものと類似のレベルまで下方制御された図1E。対照的に、エピブラストで上方制御される遺伝子、例えば、Wnt3、Fgf5及びDnmt3bなどの発現はNatGenet22361-3651999DevDyn2331064-10752005Development112397-4061991Development112407-4151991Cell99247-2571999GeneExprPatterns927-30doiS1567-133X0800108-7[pii]101016/jgep2008090022009、実際に上昇した図1E。特に、EpiSCとは相違して、Gata4、Gata6、Sox17などの内胚葉マーカーは下方制御されるか、非常に低く維持された図1E。PGC以外では近位内胚葉及び胚体内胚葉で発現を示すBlimp1が、EpiLCでさらに下方制御されたことにも留意しなくてはならない図1E。これらの発見は、基底状態で培養されたESCが、アクチビンA、bFGF及びKSRでの刺激により、一過性であるとはいえ、原腸陥入前エピブラスト様細胞に誘導されたことを示す。特に、2日目のEpiLCday-2EpiLCは、その形態及び遺伝子発現に関して、原腸陥入前エピブラストと酷似する。実施例2:EpiLCを介した、ESCからのPGC様細胞の誘導次に我々は、EpiLCが、invivoにおける原腸陥入前エピブラストの場合と同様に、PGC様細胞に誘導されるかを検証した。このような誘導は、EpiLCが原腸陥入前エピブラストの機能的特性を有するか否かの重要な指標であると考えられた。我々は、BVSCESC並びに1日目day-1、2日目day-2及び3日目day-3のEpiLCを、浮遊条件下低細胞結合性U底96ウェルプレートのウェル当たり1000細胞、SFM単独、又はLIF1000U/mlを有するSFM中、又はBMP4500ng/mlを有するSFM中、又はBMP4及びLIFを有するSFM中で2日間培養した。図2Aに示すように、SFM単独又はLIFを有するSFM中で培養した集合体のいずれも、有意なBV誘導は観察されなかった。対照的に、BMP4を有するSFM、又はBMP4及びLIFを有するSFM中で培養した場合には、顕著且つ比較的均一なBV誘導が、day-2EpiLC由来の集合体において明確に見られたが、ESC又はday-1EpiSC由来の集合体では見られなかった図2A。day-3EpiLC由来の集合体もBV誘導を呈したが、他の起源のものと比較して、非常に小さく、あまり組み込まれていないようであった図2A。SCは、2日の培養の間、いずれの条件下でも誘導されていないようであった。これらの発見は、E55~E60エピブラストと同様に、EpiLC、特にday-2EpiLCが、BMP4に応答して特異的にBlimp4を発現する能力を有することを示す。EpiLCから誘導されたBV陽性細胞がさらにPGC様細胞となるかどうかを調べるために、SFM単独、又はBMP4を有するSFM、又はBMP4及びLIFを有するSFM、又はBMP4、LIF、SCF100ng/ml、BMP8b500ng/ml及びEGF50ng/mlを有するSFM[完全誘導条件Cell137571-5842009]中、6日間、day-2EpiLCの浮遊培養を実施した。day-2EpiLCをSFM単独で培養した場合、6日の間に有意なBVSC誘導は観察されなかった図2B。BMP4を有するSFM中で培養した場合には、2日目にBVが強く誘導された。4日目には、集合体は非常に増殖し、BV陽性細胞は複数の緊密なクラスターを形成し、そのうちのいくつかはSCに対してわずかに陽性であった。6日目では、集合体はさらに発達したが、BV陽性巣fociは、その大部分がSC陽性であるとはいえ、さらに小さくなった図2B。day-2EpiLCをBMP4及びLIFを有するSFM中で培養した場合、2日目に集合体は強いBV誘導を示し、4日目にはBV陽性細胞が緊密且つ大きなクラスターを形成し、とりわけ、その大部分はSC誘導を示した。6日目には、BVSC陽性巣は小さくなり、より分散されたように見えたが、依然として存続しており、集合体の周囲に移動した図2B。4日目から6日目に、BVSC陰性集団が、より急速な拡大を呈した。完全誘導条件下で培養した場合には、2日目に集合体は均一なBVを呈し、4日目にBV陽性細胞は周辺に移動し、明確なSC発現を開始した。6日目には、集合体全体が広がり、BVSC陽性細胞は増殖して、集合体を覆った図2B。完全誘導条件下、day-2EpiLCに由来する集合体の構造的な発達及びBVSC陽性PGC様細胞の出現は、エピブラストのものと酷似するCell137571-5842009。これらの発見は、day-2EpiLCは、基本的にはBMP4によりBVSC陽性PGC様細胞に誘導され、BVSC陽性細胞の維持/生存/増殖は、LIFにより高められ、より確実にはLIF、SCF、BMP8b及びEGFの組合せ効果により高められることを実証する。我々は、蛍光活性化セルソーティングFACSにより、完全誘導条件下、day-2EpiLCからBVSC陽性細胞への進行を分析し、それにより、BVが早ければ2日目にも実際に強く誘導され約407、4日目頃にはBV陽性細胞からSCが生じるBV:約387;BVSC:約135ことが示された図2C。倒立蛍光顕微鏡下で定量されるように、1000細胞集合体当たりのSC陽性細胞数は、4日目及び6日目でそれぞれおよそ480及びおよそ900であった図2D。我々は、BVSC陽性領域が、アルカリフォスファターゼAP陽性であることを確認した図5。BVSC陽性細胞は、完全誘導条件下、10日目まで保たれた図6。さらに、我々は、基底状態で培養した複数の独立したESC株から、EpiLCを介して、BVSC又はP14V陽性PGC様細胞への誘導を再現できた図7及びデータ示さず。集約すると、これらの発見は、day-2EpiLCは、おそらく完全ではないものの、E55~E60エピブラストの培養等価物であり、EpiLCを介した、基底状態ESCからPGC様細胞への誘導は、高い再現性を有する確固としたプロセスである、との考えを裏付ける。我々は、d2EpiLCからのBVSC細胞誘導と、エピブラストからのものとを比較した。完全誘導条件下、d2EpiLCに由来する集合体の構造的発達、並びにBVSC細胞誘導の効率及びダイナミクスは、エピブラスト由来のものと類似した図10A:2日目にはエピブラスト細胞の約458がd2EpiLCの約415と比較強いBV陽性を示し、細胞数/BV陽性プロットは、d2EpiLC及びエピブラスト細胞の両方についてその大部分が、BV陽性状態へシフトしたことを明らかにした図10B。これは、d2EpiLC及びエピブラストが、BMP4に応答してBlimp1を発現できる、類似した能力を有することを示す。4/6日目では、エピブラスト細胞の反応はいくらかまとまりがあるように見えたが、d2EpiLC及びエピブラストに由来するBVSC細胞の出現効率及び様式は、やはり類似していた図10C。これらの発見は、d2EpiLCが、原腸陥入前エピブラスト細胞と同一でないにせよ類似した特性を有することを確認する。実施例3:PGC様細胞誘導と関連する遺伝子発現ダイナミクスPGC様細胞誘導プロセスについて、より重要な見解を得るために、我々は、day-2EpiLCからのPGC様細胞誘導と関連する遺伝子発現ダイナミクスをQ-PCRにより評価した図2E。Oct3/4は、BV陽性細胞及びBVSC陽性細胞それぞれ、2日目、及び4/6日目でわずかに上方制御された一方、day-2EpiLCで下方制御されたSox2及びNanog図1Eは、これらPGC様細胞において有意に回復した。PGC分化決定時に特異的に上方制御される遺伝子Blimp1、Prdm14、Tcfap2c、Nanos3、stellaDppa3、Tdrd5及びDnd1を含むは、BV陽性及びBVSC陽性細胞において、すべて高度に上昇した。対照的に、Hoxa1、Hoxb1、Snai1などの壁側中胚葉のプログラムと関連する遺伝子は、2日目のBV陽性細胞では一時的な上方制御を示したが、その後、4日目及び6日目のBVSC陽性細胞では、大幅な抑制を呈した。他方、Dnmt3a及び3b、Dnmt1の重要な補助因子co-factorをコードするNp95、並びにc-mycは、単調に下方制御された。Mvh、Dazlなどの生殖細胞発生後期と関連する遺伝子は、BVSC陽性細胞において、わずかな上方制御を示した。従って、invitroにおけるPGC様細胞誘導と関連する遺伝子発現ダイナミクスは、invivoにおけるPGC分化決定のものと酷似するGenesDev221617-16352008Nature418293-3002002BiolReprod75705-7162006。我々は、6日目において、BVSC-細胞での内因性stellamRNAレベルが、BVSC細胞のものと類似したことに注目した図2F。SC発現は、stella発現が現れてから25日後、E95になって初めて高くなるのでReproduction136503-5142008Nature418293-3002002、この発見は、BVSC-細胞の多く、特に誘導後期にあるものが、高いレベルで内因性stellaを発現しており、従って、樹立されたPGC様細胞と考えるべきであることを示す。特に、BV-又はBVSC-陰性細胞は、比較的高いレベルのOct3/4、Sox2及びNanogを保持/回復し、生殖細胞特異的遺伝子をある程度上方制御した図2E。これは、本質的に全てのday-2EpiLCは、サイトカイン、最も重要なものとしてはBMP4により生殖細胞の運命へと方向付けられており、十分なレベルでBlimp1を獲得したものは、首尾よくPGC様細胞へとさらに進むことができるが、十分なBlimp1を得ることが出来なかったものは、いくつかの確率的パラメーター又はわずかな本質的相違により非生殖細胞の形質となる、との考えと一致する。次いで、PGCLC誘導の網羅的転写ダイナミクスを測定するために、我々は、ESC、d1/2/3EpiLC、EpiSC、E575エピブラスト、誘導6日目のBVSC陽性PGC様細胞、及びE95でのstella-EGFPPGCGenesis4475-832006からtotalRNAを単離した。我々は、2セットのマイクロアレイハイブリダイゼーションを実施した;1つは、ESC、d1/2/3EpiLC、EpiSC及びPGC様細胞由来の非増幅RNAであり、もう1つは、ESC、d2EpiLC、EpiSC、E575エピブラスト、PGC様細胞及びE95PGC由来の増幅RNAであった。非増幅サンプルの教師なし階層的クラスタリングUnsupervisedhierarchicalclustering:UHCにより、ESC、d1/2/3EpiLC、EpiSC及びPGC様細胞の2つの独立したサンプルが、共に緊密にクラスター化されたことが示された図11Aa。これは、PGC様細胞誘導の再現性を反映するものである。主成分分析により、漸増値のPC2スコアを有するESC、d1、d2及びd3EpiLCが示され、ESCからのEpiLC誘導が、指向性且つ進行性のプロセスであることが示唆された図11Ab。EpiSCは、他のサンプルとは離れてクラスター化され図11Aa、他の細胞タイプとは相違することが示された。増幅サンプルのUHCにより、第一に、全ての細胞タイプの2つの独立したサンプルは、やはり共にクラスター化されたことが示され、第二に、d2EpiLC及びPGC様細胞は、それぞれ、E575エピブラスト及びE95PGCと最も近接してクラスター化された一方、EpiSCは、他の細胞タイプとは離れてクラスター化されたことが示された図11Ac。散布図分析により、d2EpiLCとE575エピブラスト、及びPGCLCとE95PGCとが極めて類似することが実証され、EpiSCとE575エピブラストとは相対的に大きく異なることが実証された図11B。我々は、PCAにより得られた3つの主要なパラメーターにより定義される3次元空間に全ての細胞タイプをプロットした図11D。とりわけ、d2EpiLCからPGC様細胞への誘導経路は、E575エピブラストからのE95PGC形成のものと平行であった図11D。さらに、エピブラストからのEpiSCの派生は、別の経路を伴い図11D、これは、異なるPC1総分散の61を表すスコアにより反映された。これらの発見は、EpiLCを介したESCからのPGC様細胞の形成は、エピブラストからのPGC形成を再現することを強調する。我々は、ESCのレベルと比して、E575エピブラスト、d2EpiLC及びEpiSCで上方制御される遺伝子を列挙し分類した。この分析により、EpiSCは、E575エピブラスト及びd2EpiLCよりも種々の臓器系心臓、血管、腎臓、筋肉及び骨の発生と関連する遺伝子を上方制御したことが明らかとなり図11C、これにより、その派生の間、EpiSCは、E575エピブラスト及びd2EpiLCよりも、より発生的に進んだ特徴を獲得することが実証された。実施例4:PGC様細胞のエピジェネティックプロファイル及び細胞ダイナミクス次に、我々は、完全誘導条件下、6日目における、day-2EpiLCから誘導されたBVSC陽性細胞のエピジェネティックな特性を決定した。我々は、BVSC陽性細胞が、有意に減少したH3K9me2と、その代わり高く上昇したH3K27me3を有するようであることを発見した図3Aa、b。Q-PCR分析と一致して、BVSC陽性細胞は、Dnmt3bに対して陰性であった図3Ac。次いで、我々は、母方で発現したSnrpn、Kcnq1ot1インプリンティング遺伝子及び父方で発現したIgf2r、H19インプリンティング遺伝子のインプリンティング状態を、これら遺伝子のメチル化可変領域についてのバイサルファイト配列決定分析により測定した。図3Bに示すように、BVSC陽性PGC様細胞は、Igf2r及びSnrpnのメチル化インプリントは保持していたが、H19及びKcnqlot1のメチル化インプリントレベルは減少しているようであり、これは、day-6BVSC陽性細胞が、インプリント消去プロセスを開始することを示唆するMechDev11715-232002。集約すると、これらの結果は、day-2EpiLCからのPGC様細胞の発生は、遺伝子発現及びエピジェネティックなリプログラミングに関してPGC分化決定及び発生を正確に再現しており、day-6BVSC陽性細胞は、およそ約E95頃の移動PGCmigratingPGCと、同一でないまでも、酷似した特性を有することを明確に実証するDevelopment1342627-26382007。我々は、PGC様細胞誘導及び増殖のダイナミクスを検証した図3Ca及び表2。約1000EpiLC集合体からのPGC様細胞誘導2日目では、強いBV細胞の平均数は783約39であった一方、BV-細胞の平均数は1225約61であった。4日目には、BV細胞の平均数は1415約26であり、そのうち482細胞は、SC約9であった一方、BV-細胞の平均数は3967約74であった。6日目には、BV細胞の平均数は2222約12であり、そのうち848細胞はSC約5であった一方、BV-細胞の平均数は15811約88であった。細胞周期分析により、BV細胞、特に4/6日目のBVSC細胞がG2期に豊富に存在する一方、BV-細胞は、特に4/6日目において、体細胞周期のものと類似したプロファイルを示すことが明らかとなった図3Cb。一貫して、PGC様細胞は、誘導4日目、6時間の培養の間に、BrdUを効率的に取り込まず、一方、非PGC様細胞は、活発に取り込んだ図3Cc。集約すると、これらのデータは、EpiLCからのBV誘導は効率的なプロセスであり、恐らく全てのBV細胞は、その後stella発現を開始するがSC陽性を問わない;上記参照、誘導されたBVSC細胞の増殖は緩慢である一方2日~6日で1~2分裂、BV-細胞は、より急速に増殖する3~4分裂ことを示す。緩慢な増殖及び細胞周期G2期での停止は、移動PGCのキーとなる特徴でありDevelopment1342627-26382007、PGC様細胞が同等の特性を有するとの発見は、PGC様細胞形成が、PGC形成の再構成であるとの更なる証拠を提供するものである。実施例5:PGC様細胞の精子形成及び正常な子孫次に我々は、PGC様細胞の機能を評価するために、内因性生殖細胞を欠損した新生児W/Wvマウス精細管にPGC様細胞を移植することにより、PGC様細胞が適切な精子形成を起こすかどうかを検証したDevelopment132117-1222005。精子形成に貢献する細胞の能力は、当該細胞が雄性生殖細胞となるかどうかの最も厳密な指標であるColdSpringHarbSympQuantBiol7317-23doisqb200873033[pii]101101/sqb2008730332008。我々は、BVSCESC株からPGC様細胞を6日間誘導し、集合体全体又はFACSによりソーティングしたBV陽性細胞から解離した単一細胞をレシピエントの精巣に移植し、10週間後にこれを評価した。集合体全体の細胞を移植した精巣は全て8/8及び6/6三胚葉の細胞を含む明らかなテラトーマを生じた図8及び表3。際立って対照的に、FACSソーティングされたBV陽性細胞を移植した精巣は、テラトーマ形成を示さなかった。その代わり、驚くべきことに、6つの精巣のうち3つが、見かけ上適切な精子形成を有する精細管を有した;移植された精細管は、外見上排精に相当する暗い中心のセクションを含み、これら精細管は、精子形成していないものよりも、かなり厚いものであった図4Aa及び表3。厚い精細管内を調べることにより、正常な形態を有する豊富な精子の存在が実際に明らかとなった図4Ab。厚い精細管の組織学的検査により、確固たる断続的な精子形成が明確に示され、一方、薄い精細管にはセルトリ細胞しか含まれていなかった図4Ac、d。PGC様細胞のコロニー形成効率は、我々が実施したinvivoでのPGCのものと類似したCell137571-5842009。これらの発見は、ESCから誘導されたPGC様細胞は、invivoにおけるPGCと機能的に類似した特性を有することを示す。我々は、卵細胞質内精子注入ICSIにより、ESCに由来する精子を野生型卵母細胞に受精した。得られた受精卵は正常に発達し、胚盤胞期までに、ドナーESCゲノム由来の強いSCを呈した図4Ba~d及び表4。移植された胚は、正常な胚盤及び正常なインプリンティングパターンを有する極めて健常な子孫を生じた図4Be~g、図4C。BV及びSC導入遺伝子は、21子孫のうち、それぞれ13及び7子孫で陽性であり図4Bh、半数体ドナー精子を介した導入遺伝子の遺伝と一致した。PGC様細胞由来の子孫は、正常に発達し、妊孕性の成体に成長した図12及び表4。全ての証拠に基づいて、我々のシステムは、invivoにおけるICMからの生殖細胞分化決定経路をinvitroで初めて機能的に再現するものである、と結論づけ、提案する。実施例6:PGC様細胞を単離するための表面マーカーの同定PGC様細胞の純粋な集団を区別する表面マーカーの同定は、ヒトを含む種々の哺乳動物種由来のiPSCやESCなどの、適切なトランスジェニックレポーターを有さないPSCからPGC様細胞を単離するために必須であるReproduction139931-9422010。我々は、BV集団を定義するものを同定するために、表面マーカーSSEA1、PECAM1、EPCAM、N-カドヘリン、インテグリン-β3、インテグリン-αV、CXCR4及びKIT及びそれらの組合せをスクリーニングした。6日間誘導されたBVSCd2EpiLCの集合体を、SSEA1及びインテグリン-β3によりFACSソーティングした場合に、それらは、3つの主要な亜集団に分類された[P1SSEA1高、インテグリン-β3高、P2SSEA1高、インテグリン-β3低及びP3SSEA1低、インテグリン-β3高/低]。特に、P1では、99超の細胞がBVであったが、P2及びP3では、それぞれ、わずか12及び17の細胞しかBV細胞を含まず図13A、P1が、BV集団とほぼ同一であることが示された。我々は、Acro/Act-EGFPAAG導入遺伝子を有するESCDevGrowthDiffer42105-1122000をPGC様細胞に誘導し、6日目の集合体をSSEA1及びインテグリン-β3によりFACSソーティングした。これら集合体のソーティングパターンは、BVSCESC由来の集合体のものとはいくらか相違したが、我々は、3つの類似する亜集団を同定した図13B。我々は、これら亜集団における、図2Eで分析した20遺伝子の発現レベルと、BVPGC様細胞におけるものとを比較した。P1における20遺伝子の発現レベルは、BVPGCLCのものとよく相関したがR2=080、他の2つの亜集団におけるものは、弱い相関しか示さなかった図13B。AAGESC由来のP1亜集団が精子形成に貢献するかどうかを調べるために、我々は、W/Wvマウスの精細管にそれらと集団全体とを移植し、8週間後にレシピエントを評価した。集団全体を移植した精巣では全てテラトーマが見られたが、P1亜集団を用いた精巣ではテラトーマは検出されず、その代わりに、6の精巣のうち5つでAAG導入遺伝子によるGFP蛍光を有する適切な精子形成が実証された図13Ca~e、表3。得られた精子は、12ICSIとそれに続く胚移植手順を用いて、健常で妊孕性の子孫に貢献した図13Cf及び表4。これらの発見は、SSEA1及びインテグリン-β3によるソーティングにより、催奇形性の未分化細胞が基本的には混入することなく、PGC様細胞が精製され、関連するトランスジェニックマーカーを有さないESCからのPGC様細胞の形成及び精製を確立することを実証する。実施例7:EpiLCを介したiPSCからのPGC様細胞の誘導、PGC様細胞の精子形成及び子孫実施例1及び2と同様の方法でiPSCからEpiLC及びPGC様細胞を誘導し、免疫蛍光法及びQ-PCRにより特徴付けた。マウスiPSCとして、3遺伝子Oct3/4、Sox2、Klf4の導入により作製されたiPS178B-5NatBiotechnol26101-1062008、並びに4遺伝子Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの導入により作製されたiPS492B-4Science322949-9532008及び20D17Nature448313-3172007を使用したこれらは全てNanog-EGFPNG導入遺伝子を有している。分析結果を図9に示す。iPSCをEpiLCに2日間分化誘導すると、ESCの場合と同様に、エピブラスト様の構造に形態的に変化した。免疫蛍光法により、EpiLC誘導の間、Nanog発現が急激に消失することが明らかとなった図9A~9C、a。次に、Q-PCRを実施して、実施例1と同様の方法で得られたEpiLCを特徴付けた。その結果、iPSCを2日間分化誘導して得られたEpiLCは、ESC由来のEpiLCと類似して、ICM状態と密接に関連する遺伝子の下方制御を示し、エピブラストで上方制御される遺伝子の発現上昇を示した。さらに、内胚葉マーカーも、ESC由来EpiLCと同様に下方制御された図9D。次に、我々は、iPSC由来のEpiLCが、ESC由来のものと同様に、PGC様細胞に誘導されるかを調べた。EpiLCを完全誘導条件BMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFを含有するSFM下で6日間培養した。細胞集合体は、ESC由来EpiLCの場合と同様に、PGC様細胞誘導とともに広がった。Nanog陽性細胞は、ESC由来EpiLCをPGC様細胞に分化誘導した場合のBVSC陽性細胞と同様に、培養6日目の細胞集合体の周辺部で検出された図9A~9C、b。我々は、6日目の誘導された集合体をSSEA1及びインテグリン-β3によりFACSソーティングした。3つの株のソーティングパターンはお互いにいくらか異なっており、20D17株のものは、ESC株のものとより類似した図9A~9C、c及び図9E。20D17株の集合体において、NG陽性細胞は、約57を示した図9Ac。移動PGCの特徴と一致して、P1亜集団は、NG高細胞及びNG低細胞の両方を含んだ図9AcGeneExprPatterns5639-6462005。他方、P2亜集団は、NG高細胞を豊富に含み、これはおそらく未分化集団を表している図9Ac。20D17株由来のP1亜集団における、図2Eで分析した20遺伝子の発現レベルは、BVPGC様細胞におけるものと顕著な相関を示したがR2=096、他の2つの亜集団におけるものは、弱い相関しか示さなかった図9E。我々は、3つの株由来のP1細胞をW/Wvマウス精細管に移植し、10週間後にレシピエントを評価した。178B-5又は492B-4株由来の細胞を有する精巣はいずれも精子形成を示さず、178B-5細胞を有する2つはテラトーマを形成した表3。驚くべきことに、20D17株由来の細胞を有する18の精巣のうち3つは、適切な精子形成を呈し、この株のレシピエントにおいてテラトーマは観察されなかった図9Fa及び表3。得られた精子は、ICSI及びその後の胚移植手順により、妊孕性子孫に貢献した図9Fb、表4。特に、子孫の一部は、外見から判断して首領域周辺の腫瘍により、早期に死亡しデータ示さず、これは、20D17キメラのF1子孫の一部で観察された結果と類似したNature448313-3172007。これらの発見は、iPSCは、株によって異なる誘導特性を呈するものの、それでもなお、invitroにおいて適切な機能を有するPGC様細胞を形成できることを実証する。本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。従って、本発明は添付の請求の範囲の精神及び範囲に包含されるすべての変更を含むものである。ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。本願は、米国仮特許出願第61/373563号を基礎としており、その内容は、ここで参照したことにより本明細書に組み込まれる。