"2つの転写カセットを縦列で含む発現ベクターであって、それぞれのカセットは、aOmpA、pelB、OmpC、OmpF、OmpT、β-la、PhoA、PhoS、及びStaphAから選択されるシグナルペプチドをコードしている核酸の読み枠3’に結合したペプチド生産物をコードしている核酸を持ったコード化領域;及びbtacプロモーターがlacプロモーターの上流に存在する2つのプロモーターを縦列で有し、且つ少なくとも1のリボソーム結合サイトを含む、該コード化領域と操作可能に結合した制御領域;を含み、前記発現ベクターは、SecE、SecY、及びprlA-4から選択される少なくとも1の分泌促進ペプチドをコードする核酸を更に含む、発現ベクター。上記ペプチド生産物のC末端アミノ酸がグリシンである、請求項1記載の発現ベクター。請求項1または2記載のベクターにより形質転換した又は形質移入した宿主細胞。上記宿主細胞が大腸菌である、請求項3記載の宿主細胞。上記ペプチド生産物がサケカルシトニン前駆体であって、且つ上記宿主が大腸菌BLR株である、請求項4記載の宿主細胞。培地中で請求項3から5のいずれか一項記載の宿主細胞を培養すること、次いで該宿主細胞が培養されている培地からペプチド生産物を回収することを含む、ペプチド生産物の製造方法。a炭素源の存在する培地中で請求項3から5のいずれか一項記載の宿主細胞を培養すること、及びペプチド生産物の発現を誘導すること、同時に時間当たり0.05と0.20倍化の間の増殖率で上記宿主細胞の増殖を制御すること;及びbその後培地からペプチド生産物を回収すること;の工程を含む、ペプチド生産物の製造方法。膜透過量のグリシンを、上記制御した増殖の少なくとも一部の期間、培地に存在させる、請求項7記載の方法。上記ペプチド生産物を回収することが:a培地から宿主細胞を分離すること;及びbその培地を逆相液体クロマトグラフィーにかけること及びペプチド生産物を含んでいるフラクションを回収すること;及びc工程bの上記フラクションをカチオン交換クロマトグラフィーにかけること;及びdその後にペプチド生産物を含んでいるフラクションを回収すること;を含む、請求項6から8のいずれか一項記載の方法。a上記宿主細胞がC末端グリシンを有するペプチド生産物を発現し;且つb上記ペプチド生産物がC末端グリシンをアミノ基に換えることによってアミド化ペプチドに変換される;請求項7記載の方法。上記ペプチド生産物が、aペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼ、又はペプチジルグリシンα-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの存在中で酸素及び還元剤と上記ペプチド生産物とを接触することによって反応混合物を形成すること;bもし工程aでペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼを使用しないなら、及びもしその反応混合物がそれまでに塩基性でないなら、それのpHが塩基性となるまで該反応混合物のpHを増加すること;及びc上記反応混合物から上記アミド化ペプチドを回収すること;によってアミド化ペプチドに変換される、請求項10記載の方法。本発明は、有効な発現ベクターによって高い収量でペプチドを生産すること、及び高収率培養技術及び細胞膜の無欠性を過度に損なうことなしに、培地から排出された重要なペプチドの高収率回収を与える他の改善を提供することを求める。従って、ペプチド生産宿主細胞を培養している培地中に良好な収量でペプチド生産物蓄積を有することが本発明の目的である。これは、その培地が多くの細胞のペプチド夾雑物を相対的に含んでいないことから有効である。遺伝的に処理した宿主細胞によって発現したペプチド生産物の収量を増加するための改善された発酵方法を提供することが本発明の別の目的である。本発明の新規発現ベクターを発現するために特に有用である遺伝的に操作した宿主細胞を提供することが本発明の別の目的である。サケカルシトニンの発現のために利用した発現ベクターに関わりなく、サケカルシトニン前駆体の生産のために特に適した宿主細胞を提供することが本発明の別の目的である。C末端グリシンを有する前駆体ペプチド、前駆体は本発明に従い培地中での直接発現に続いてアミド化される、を利用するアミド化ペプチドの生産のための改善された方法を提供することが本発明の更に別の目的である。一つの実施態様において、本発明は、aシグナルペプチドをコードしている核酸の読枠3’に結合したペプチド生産物をコードしている核酸を持つたコード化領域;及びb該コード化領域と操作可能に結合した制御領域、上記制御領域は、複数のプロモーターと少なくとも1のリボソーム結合サイトを含み、少なくとも1の上記プロモーターはtacである、を含む発現ベクターを提供する。該ベクターによって形質転換され又は形質移入された宿主細胞は、その宿主細胞を培養することによってペプチド生産物の直接発現の方法として提供される。別な実施態様において、本発明は、サケカルシトニン前駆体、又はカルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体を発現するための遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換した宿主細胞を、上記宿主細胞は大腸菌BLR株とされる;及び培地中で上記前駆体を得るために同じく培養する方法を提供する。別な実施態様において、本発明は、ここで報告した何れかのベクター、宿主、又は発酵方法を用いてC末端グリシンを有する前駆体を生産すること;及びその後に、ペプチドアミドを精製するため上記グリシンをアミノ基に変換することによってアミド化ペプチド生産物を製造する方法を提供する。別な実施態様において、本発明は、a上記培地中で、時間当たり0.05と0.20倍化の範囲内にとどめるように上記宿主細胞の増殖が制御される条件下でシグナルペプチドと一緒に上記ペプチド生産物を発現する、遺伝的に操作した宿主細胞を上記培地中で培養すること;ここでインデューサーを上記制御した培養の期間のいずれかの間存在させる;及びbシグナルペプチドの細胞内切断後に培地から上記ペプチド生産物を回収すること、の工程を含む培地へのペプチド生産物の直接発現のための方法を提供する。別の実施態様において、外層膜の透過性を増加する及びペプチド生産物の排出を増すために、直接発現発酵の過程を通してグリシンが加えられる。本発明は、培地のリットル当たり100mgを超えるペプチド生産物収量を与える。それは新規の発現ベクター、新規め宿主、新規発酵方法、又は上記の2又はそれ以上の組合せによりなされる。好ましい発現ベクターの概観一つの実施態様において、本発明はコード化領域と制御領域を含む発現ベクターを提供する。そのコード化領域は、シグナルペプチドをコードしている核酸から下流の読み枠に結合した重要なペプチド生産物のための核酸を含む。制御領域は、該コード化領域に操作可能に結合し、且つ複数のプロモーターと少なくとも1のリボソーム結合サイトを含み、ここで少なくとも1のプロモーターはtac及びlacからなる群から選択される。好ましくは、該ベクターは、縦列で配された複数の転写カセットを含み、それぞれのカセットは本発明の制御領域とコード化領域を有する。そのようなジジェニックベクター又はマルチジェニックベクターは、ジシストロニック又はマルチシストロニック発現ベクターよりも良好な発現を提供するものと確信する。これは、従来技術により示唆されると確信することができないジシストロニック又はマルチシストロニック発現を越える驚くべき改善である。該ベクターは、プレッサーオペレーターが制御領域中のプロモーターの1又はそれ以上と結合したリプレッサーペプチドをコードしている配列、転写ターミネーター領域、選択可能なマーカー領域及び/又は少なくとも1の分泌促進ペプチドをコードしている領域を任意に更に含むことができる。代替的に、幾つかの実施態様において、リプレッサーペプチドと分泌促進ペプチドをコードしている核酸は、ペプチド生産物を発現しているベクターと同じ宿主細胞中に共発現した離れたベクター上に存在させ得る。構築した発現ベクター、及びそのような発現ベクターを構築するための方法の特有の実施例が、この中に記載される。多くの商業的に利用可能なベクターは、本発明の好ましいベクターのための出発ベクターとして利用され得る。本発明のベクターの好適な領域の幾つかは、本発明のベクターを得るために要求される多数の変更が相対的に控えめとなるように開始ベクター中に既に包含され得る。好ましい出発ベクターは、しかしそれに制限されないが、pSP72とpKK2332を含む。本発明の新規のベクターは、そのベクターに固有である効果を授けること、及び、たとえ、ここにおいて特に有用であるとして同定した特有の宿主以外の宿主細胞においてそのベクターが利用される場合でも、及び個々に記載した改善された発酵方法が利用されるかどうかに関わらず、それの予期されない効果が提供されるであろうことを確信する。同様に、ある実施態様においては、特有の宿主細胞が、サケカルシトニン前駆体及びカルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体のようなペプチドの発現において特に有用であるとして同定される。ここで同定した特有な宿主細胞を特に利用することによって与えられた効果は、その発現ベクターがここに記載した新規ベクターの一つであるかどうか、又はここに記載した新規の発酵方法が利用されるかどうかに関わりなく存在するものと確信される。換言すれば、これらの宿主細胞が、従来技術の発酵又は従来技術のベクターを利用することでも顕著な予測されない効果を与えるであろうと確信される。新規発酵方法は、該発酵方法によって授けられた固有の効果のために増加した重量を提供すると確信する。これらの効果は、好ましい宿主細胞及び/又はここに記載した新規ベクターが利用されるかどうかに関わりなく供与されるであろうと確信される。前述に関わらず、本発明の一つの好適な実施態様は、本発明の特に同定した及びここに記載した好ましい発酵発明を利用して発現した宿主細胞に形質転換した本発明の改善された発現ベクターを同時に利用する。これら3つの発明の全てが組合せにおいて使用される場合、生産物の収量と回収の顕著な増加が、従来技術に対して達成できると確信される。制御領域制御領域は、コード化領域に操作可能に結合され、複数のプロモーターと少なくとも1のリボソーム結合サイトとを含み、少なくとも1のプロモーターはlacとtacからなる群から選択される。単一の制御領域中のプロモーターの上記組合せが、コード化領域によって生産されたペプチド生産物の収量を顕著に増加することが、驚くべきことに見出されている。2つのそのようなプロモーターが重複機能を大部分は提供し、且つ何れかの付加的な又は相乗的な効果を提供しないであろうことが予期されている。出願人により実施された実験は、驚くべきことに、プロモーターの請求した組合せを用いることにおいて相乗作用を示している。他のプロモーターは当該分野で周知であり、且つ本発明に従うtac又はlacプロモーターとの組合せにおいて使用され得る。そのようなプロモーターは、制限されることなく、lpp,araB,trpE,galKを含む。好ましくは、該制御領域は、厳密に2つのプロモーターを含む。プロモーターの一方がtacである場合、そのtacプロモーターが制御領域中の別なプロモーターの5’にあることが好適である。プロモーターの一方がlacである場合、そのlacプロモーターは制御領域中の別なプロモーターの3’が好適である。一つの実施態様において、制御領域はtacプロモーターとlacプロモーターの両方を、好ましくはlacプロモーターがtacプロモーターの3’とされている、を含む。コード化領域コード化領域は、シグナルペプチドをコードしている核酸から下流の読み枠に結合した重要なペプチド生産物をコードしている核酸を含み、それによって該コード化領域は、シグナル及びペプチド生産物のN末端からC末端までに、それぞれ含んでいるペプチドをコードする。理論に結び付けるべき意図無しに、そのシグナルは、ペリプラズムへのそれの分泌に酸化することに加え、蛋白分解的な分解からペプチド生産物のいずれかの保護を提供し得ると確信する。多くのペプチドシグナル配列が知られ、且つ本発明に従い使用され得る。これらは、良く特徴付けされた宿主細胞の外層膜タンパク質のシグナル配列、及びペリプラズムへのペプチド生産物の転移が、及びその転移の結果として該宿主によって後転写的に切断されることが可能な何れかの配列を含む。有用なシグナルペプチドは、制限されること無しに、OmpApelBOmpCOmpFOmpTβlaPhoAPhoS及びStaphAを含む。該ペプチド生産物は、本発明にない、それが従来技術を用いる融合パートナーを通例要求するであろうように十分小さいことが好適である。典型的に、そのペプチド生産物は、10kDaよりも小さい分子量を有する。とりわけ、そのペプチド生産物はC末端グリシンを有し、且つそのC末端グリシンをアミノ基に変換する、その結果アミド化ペプチドを生じる酵素的アミド化反応の前駆体として使用される。そのような変換は、この中により詳細に記載される。多数の生物学的に重要なペプチドホルモン及び神経伝達物質が、このタイプのアミド化ペプチドである。例えば、コード化領域によってコードしたペプチド生産物は、サケカルシトニン前駆体又はカルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、C末端グリシンを有する両者及び成熟サケカルシトニン又は成熟カルシトニン遺伝子関連ペプチドに酵素学的にアミド化され得る両者とされ得る。本発明に従い生産され得る他のアミド化ペプチドは、制限されること無しに、成長ホルモン放出因子、血管作用性腸ポリペプチド及びガラニンを含む。他のアミド化ペプチドは、当該分野で周知である。副甲状腺ホルモンの類似物もまた、本発明に従い生産することができる。例えば、副甲状腺ホルモンの最初の34アミノ酸を有するペプチドは、34アミノ酸類似物のアミド化版として、副甲状腺ホルモンそれ自身のものと類似した機能を提供できる。その後者は、ここに記載した1又はそれ以上の発現系及び方法に従い、副甲状腺ホルモンの最初の34アミノ酸、それに続くグリシン35を発現することにより生産され得る。ここに記載したような酵素的アミド化は、グリシンをアミノ基に変換することができた。ここに記載した直接発現系の好適な実施態様でC末端グリシンを有するペプチドを生産する限りにおいて、何れかのペプチドが、ここに記載したベクター、宿主及び/又は発酵技術を利用することで良好な収量及び容易な回収を享受するであろう。本発明の好適なベクターの又は本発明のベクターと同じ宿主中で発現されるべき他のベクターの他の任意の態様リプレッサー任意の、本発明の好適なベクターは、少なくとも1のプロモーターにより制御した発現を抑制することができるリプレッサーペプチドをコードしている核酸を含み得る。代替的に、しかしながら、リプレッサーペプチドをコードしている核酸は、本発明のベクターと宿主細胞中の分離ベクター上に存在され得る。適当なリプレッサーは、多数のオペレーターとして当該技術において周知である。好ましくは、そのリプレッサーをコードしている核酸は、少なくとも1つのプロモーターが本発明の好適なベクターに常時存在する、tacとlacプロモーターの両方に含まれるlacオペレーターを抑制するために、本発明の好適な実施態様におけるlacリプレッサーをコードする。選択可能なマーカー非常に多数の選択可能マーカー遺伝子のいずれかが本発明のベクター中に存在することが好ましい。これは、本発明の新規ベクターによって効果的に形質転換され又は形質移入される宿主細胞の適切な特異的選択を与えるであろう。分泌促進ペプチド少なくとも1の分泌促進ペプチドをコードしている核酸は、本発明のベクター中に任意に存在する。代替的に、該分泌促進ペプチドをコードしているペプチドは、ペプチド生産物をコードしているベクターとして同じ宿主細胞中で発現した分離ベクター上に存在し得る。好ましくは、分泌促進ペプチドは、SecY又はprlA4からなる群から選択される。SecYとprlAは同一であり、その2つの用語は当該分野において別称として使用されていることが指摘される。prlA4は、prlAの周知の変形であり且つ同様の機能を有する。別の好適な分泌促進ペプチドは、prlGとしても知られるSecEである。最も好ましくは、複数の分泌促進ペプチドは、SecEと、SecY及びprlA4からなる群から選択されるその他の少なくとも1つとがコードされる。その2つは、細胞質からペリプラズムまでのペプチド生産物のトランスロケーションを助力するように相互作用すると確信される。理論による結び付けを意図しないで、これらの分泌促進ペプチドは、それの分泌促進機能に加えて細胞質プロテアーゼからペプチド生産物を保護することに助力し得る。宿主細胞本発明はまた、本発明の何れかのベクターによって形質転換され又は形質移入された宿主細胞をも提供する。好ましくは、宿主細胞は細菌の細胞である。より好ましくは、該宿主細胞はグラム陰性細菌である。更により好ましくは、該宿主細胞は大腸菌である。より好ましくは、その大腸菌は、BLR,BL21又はWA837株である。また最も好ましくは、該宿主細胞は、少なくとも1の分泌促進ペプチドを発現する。本発明は、サケカルシトニン前駆体またはカルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体を含む発現ベクターによって形質転換した宿主、該宿主は大腸菌BLR株とされる、を更に提供する。これら2つのペプチドのBLR発現は、従来技術のベクターがその発現のために使用されても特に有効となるであろう。換言すれば、ここに報告した新規の発現ベクターは、BLR宿主中のこれら2つのペプチドの良好な発現のために要求されると確信されない。異種ペプチドの生産方法新規の発酵条件が、高い収率で培地中にペプチド生産物の放散又は排出を与える培養条件下に非常に高い細胞密度で宿主細胞を増殖するために提供される。該新規発酵法において有用な宿主細胞は、制限されること無しに、上述した宿主細胞、及び/又は上述した1又はそれ以上の新規発現ベクターによって形質転換した又は形質移入した宿主細胞を含む。シグナル領域と一緒にペプチド生産物を発現するように遺伝的に操作した他の宿主細胞が使用され得る。その細胞は、空気又は他のガス、炭素源、及び培地への他の成分を供給する適当な手段及びプロモーターの導入のための手段を好ましくは含む発酵槽中に配される。酸素濃度、細胞密度、pHなどをモニターするための適当な手段も好適である。出願人は、培地への直接発現したペプチド生産物の有意に改善された収量が、時間当たり0.05と0.20倍化の間の臨界範囲内に平均細胞増殖速度を注意深く制御することによって得られることを見出している。この制御された増殖は、培養の遅滞期のより早期に始めることが好適である。発酵期間を通して、時間当たり0.10と0.15倍化の間、より好ましくは時間当たり0.13倍化の平均細胞増殖速度に維持することがより好ましい。増殖速度は、この中のsCTglyの生産と題したセクション中に記載した何れかのパラメーター、特に多数の他のパラメーターに対する供給率Qの等式、を調整することによって制御され得る。出願人は、発酵細胞に供給している炭素源の割合を変化することが、該臨界範囲内に該増殖速度を維持するための有効な方法であることを見出している。相対的に定常の増殖速度を維持するために、発酵槽の中に供給する炭素源の量は、細胞の数における上昇に比例して増加する傾向にある。出願人はまた、有意に改善された収量が制御した増殖の上記発酵期間を通してインデューサーを供給することで得ることができることを発見している。炭素源と同様に、適切な量のインデューサーの供給は、細胞の数の増殖に関して供給の割合に比例して増加することを含む。炭素源とインデューサーの両方の供給が細胞増殖に結び付く手法において好んで増加することから、出願人は、供給及びインデューサーと共にミックスすること及び細胞増殖を制御するための適当な割合でその2つの混合物を供給すること、かくして、炭素源の量に対して一定の割合にとどめるインデューサーの継続供給を同時に維持することが有効であることを見出している。しかしながら、それは勿論、炭素源とインデューサーを別々に供給することも可能である。しかしながら、大量で細胞に毒となり得る化学インデューサーが使用されるなら、そのインデューサーと炭素源は、インデューサーの重量比が、該発酵方法の全体を通して加えた炭素源の量に対して該発酵方法の全体を通して加えたインデューサーの量の比率から、同じ時間投薬量が50より大きく変化しないで加える炭素源に対して何れか与えられた時間で加えられるような量で、培養の各時間を通して添加される。その50変数は、比較される2つの比のより低い割合から測定される。例えば、全体の発酵のためのインデューサーに対する炭素源の比率が2から1である場合、いずれか与えられた時間での比率は、3から1より高くなく、1.333から1より低くはないことが好ましい。培養の温度のシフト又は特有な化合物又は栄養源の濃度の変更のような他の手段によって増殖を通しての1又はそれ以上のプロモーターを誘導することもまた可能である。外因的な炭素源の供給が細胞増殖の制御方法として使用される場合、培地中に最初からあるいずれかの炭素源が細胞増殖は最初に外因性の炭素供給なしに、もはや支持することができないその時点まで消耗されるまで待つことが有効とされる。これは外因的な供給は、最初の炭素源からの顕著な妨害なしに細胞増殖を直接制御している。酸素源は、測定されている溶存酸素によって発酵培地中に継続的に好ましくは供給される。酸素レベルにおける上方への急増は、最初の炭素源の消耗をその結果示すことができる細胞増殖の顕著な落下及び外部供給を始める時であることを示す。ペプチド生産物収量が、増加する発酵培地の酸素飽和度と同じく増加することが予期せずに見出されている。これは、たとえ低い酸素飽和レベルが細胞増殖を維持するために十分であるとしても真実である。かくして、全体の発酵方法を通して、酸素又は酸素に富むソースが発酵培地に供給され、且つ少なくとも20、好ましくは少なくとも50酸素飽和度が達成される。ここで用いたような酸素飽和度は、その培地が通常は空気によって完全に飽和された場合の発酵培地中の酸素のパーセンテージを意味する。換言すれば、発酵培地は100の酸素飽和度を有する空気によって飽和した。100より高い顕著な、即ち空気の酸素含量より以上の発酵培地の酸素飽和度を維持することが困難とされる場合、これは可能であり、且つより高い酸素含量がより高い収量を提供することに鑑みて一様に望ましい。これは、空気より高い酸素含量を有するガスによってその培地をスプレーすることによって達成される。顕著な収量の改善が70より低くない、特に80より低くない、発酵培地中の酸素飽和度を維持することにより達成され得る。それらのレベルは、相対的に容易に維持される。早い撹拌は酸素飽和を増加するのを促進できる。その発酵培地が一度濃密化を始めると、酸素飽和度を維持することがより困難となり、且つそれは少なくともこの状態で空気よりもより高い酸素含量を持つガスを供給することが推奨される。出願人は、普通の空気が、発酵期間において相対的に後期まで良好な酸素飽和度を十分に維持することができることを見出している。出願人は、発酵期間中の最後部で50酸素供給又は100酸素供給を伴う空気供給で増強している。好ましくは、その宿主細胞は、20と32時間の間、好ましくは22と29時間の間、最も好ましくは約24-27時間の期間、培養される。宿主細胞は、20と35°Cの間、より好ましくは28と32°Cの間、より好ましくは29.5と30.5°Cの間の温度でインキュベーションされる。30°Cの温度が、出願人により実施された幾つかの発酵において至適であることが見出されている。好ましくは、培地のpHは、6.0と7.5、より好ましくは6.6と7.0、特に好ましくは6.78-6.83とされる。好適な実施態様において、発酵は、tacとlacプロモーターの両方を含む制御領域及びサケカルシトニン前駆体をコードしているヌクレオチドの上流にシグナルペプチドをコードしているヌクレオチドを含むコード化領域を有する発現ベクターによって形質転換した宿主を用いて実行される。そのような発現ベクターは、複数の、特に2つの転写カセットを縦列で好ましくは含む。ここで用いたような、用語縦列で転写カセットは、制御又はコード化領域が、少なくとも1の補足の制御領域と、第1のコード化領域と同じペプチド生産物をコードしている少なくとも1の補足のコード化領域に続いていることを意味する。これは、単一の制御領域が、コード化領域中の2つのコピーの発現を制御するジシストロニックな発現と区別すべきである。その定義は、ペプチド生産物に関係していないコード化領域の変更、例えば、第2の転写カセット中の、第1の転写カセット中にコードされる以外の異なるシグナルペプチドをコードしているヌクレオチドの挿入、を与えるであろう。非常にたくさんの炭素源が当該分野で知られる。グリセリンは有効であることが見出されている。本発明の好適な方法は、IPTG及び/又はラクトースのような化学インデューサーの添加を含む。温度シフト又は栄養物のレベルにおける変更のような他の方法が使用され得る。その制御領域中のオペレータ又はプロモーターに適切な他の誘導技術もまた使用され得る。ペプチド生産物の生産は、発酵培地中の細胞の増殖が上述した好ましい増殖速度の範囲内を容認できなくなるとほぼ同時に顕著に落下する。その時点で、発酵は中止され、炭素源とインデューサ一供給および酸素フローが止められる。好ましくは、その培養物はプロテアーゼの活性化を防ぐため、そしてペプチド生産物の分解を減じるために急速に冷却される。それはまた、蛋白分解活性を実質的に減じるレベルにまでpHを修正することも望ましい。サケカルシトニン前駆体が、本発明の好ましいベクターと宿主細胞を用いて生産される場合、蛋白分解活性はpHが低下されるようにして減じられる。この酸性化は、培地の冷却と同時に好ましくは成される。1好ましいpH範囲は、以下により詳細に記載される。発酵生産物を測定するために使用されると同じアッセイは、異なるpHレベルで分解を測定するために使用すること、かくして得られたペプチド及びその不純物のために至適なpHを確立することが可能である。[1又は細菌細胞の除去後に実行され得る]異質なペプチドの回収本発明は、培地から宿主細胞を除去すること、及びその後に、ゲル濾過、イオン交換、逆相、アフィニティー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択されるクロマトグラフィーの少なくとも1のタイプに該培地をかけることを含むペプチド生産物を回収するための方法を更に提供する。システイン残基を含むペプチドにおいて、Sスルホン化は、ペプチドの集団化を防ぎ且つモノメリックペプチドの収量を増加するために精製工程の前にまたはその間に実行され得る。好ましくは、3つのクロマトグラフィー工程が以下の順序において使用される:イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び他のイオン交換クロマトグラフィー。発酵が完成した後、培地のpHは、蛋白分解活性を減じるために任意に変えられる。生産物の生産を測定するために便用したアッセイはまた、生産物の分解を測定するため及び安定化のための最良のpHを決定するために使用可能である。サケカルシトニン前駆体が本発明に従い生産される場合、2.4と4.0の間、特に3.0と3.5の間のpHが好適である。これらのpH範囲はまた、カチオン交換カラム上にサケカルシトニン前駆体を保持を促進するため、かくして個々に記載した好ましい精製技術の間の良好な精製を提供すると確信する。また、任意に、発酵か完了した後の培地の温度は、10°Cより下の温度にまで、好ましくは3°Cと5°Cの間、最も好ましくは4°Cに低下される。これはまた、望ましくない蛋白分解活性を減じるものと確信する。本発明は、次の工程:C末端グリシンを有するペプチド生産物を発現する本発明のいずれかの宿主細胞を、培地中で培養すること;上記培地から上記ペプチド生産物を回収すること;ペプチジルグリシンαアミド化モノオキシゲナーゼ、又はペプチジルグリシンαヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの存在中で酸素と還元剤とを上記ペプチド生産物と接触することにより上記ペプチド生産物をアミド化すること、を含むアミド化ペプチド生産物を生産するための方法を更に提供する。もしペプチジルグリシンαアミド化モノオキシゲナーゼを上記において使用しないなら、及びもしその反応混合物がそれまでに塩基性でないなら、そのpHが塩基性となるまで該反応混合物のpHを増加する。アミド化ペプチドはその後に、後述の実施例6中に記載した精製技術を好ましくは利用してその反応混合物から回収され得る。好ましくは、その宿主細胞は、インデューサーの存在において、同時に時間当たり0.05と0.20倍化の間の培養を通しての平均細胞培養速度を維持しつつ培地中で培養される。実験の詳細pSCT037とpSCT038クローン化方法pSCT037とpSCT038の構築は、最終的に望む発現プラスミドを構築するのに必要な中間のベクターを創製するために収束した8つのパートよりなる。このプロジェクト用の記載テキストの外に使用した又は構築した全ての遺伝子とフラグメントを表1中にリスト化した。パートIpSCT018Dの構築TACプロモーターカートリッジは、pGEM11ZFTACを創製するHindIIIBamHIフラグメントとしてpGEM11ZF内にサブクローンした。pelBsCTglycas2遺伝子は、発現ベクターpSCT013Bを創製するためのBamHIサイト内のtacプロモーターの下流に結紮した。そのtacpelBsCTglyオペロンは、HindIIIとEcoRIを用いてpSCT013Bから切断した。このフラグメントは、pSCT015Bを創製するpSP72内に、HindIIIPstIアダプターと一緒に結紮した。そのカナマイシン耐性遺伝子は、pSCT016Bを創製する、pSCT015BのPstIサイト内に結紮した。βラクタマーゼ遺伝子の5’コード化及び制御領域は、pSCT017Bを創製する再結紮に続いてPvuIIとFspIにより該ベクターを切断することにより削除した。pSP72T1T2からのT1T2転写ターミネーターは、pSCT018Bを創製するSalIとBglIIサイトを用いて切断し且つPSCT017B内に結紮した。BamHIとEcoRIサイトを含むLACIQ遺伝子は、pSCT018Dを創製するためPSCT018BのBglIIEcoRIサイト内に結紮した。パートIIpSCT019の構築pSCT013BからのサイトPstIとHindIIIとHindIIIEcoRIフラグメントを持ったlacPOは、pSCT015Aを創製するpSP72のPstIとEcoRIサイトの中に、3つの結紮手法で挿入した。pSCT017Bの構築において記載した通り、KanR遺伝子を挿入し且つβラクタマーゼ遺伝子を、pSCT016AとpSCT017Aを創製するためにpSCT015Aから取り外した。lpplacompAsCTglyPstIAccIフラグメントは、pSP72OMPAから切断し、pSCT019を創製するためにpSCT017A中の両立性サイト内に結紮した。パートIIIpSCT025の構築PCR増幅したオペロンlacompAsCTglyのBamHIフラグメントは、pSCT023を創製するpelBsCTgly遺伝子を置換している、pSCT018DのBamHIサイト内に結紮した。そのは、挿入物がtacプロモーターとの関係において逆方向に挿入されたことを表す。lacompAsCTglyオペロンは、pSCT023からBamHIとSalIを用いて切断し、pSCT017DELTAを創製するpSCT017Bの両立サイト内に結紮した。カナマイシン耐性遺伝子、taclacプロモーター及びompAsCTglyを含む、より大きなBglIBglIIフラグメントを、pSCT017DELTAから切断し、pSCT025を創製するためpSCT018DのBglIBamHIサイト内に結紮した。パートIVpSCT029Aの構築XhoIとEcoRIサイトを含むRRNBT1T202のPCR生産物は、pSCT025Aを創製するpSCT025のSalIEcoRIサイト内に結紮した。taclacompAsCTglyRRNBT1T2ターミネーター遺伝子カートリッジを含んでいるpSCT025から切り出したHindIIISacIフラグメントは、pCPM01を創製するpSP72の両立サイト内に結紮した。pCPM01Aベクターは、pSCT025Aについて記載したと同じ方法を用いて構築した。pSCT025AとpCPM01Aプラスミドは、RRNBT1T2転写ターミネーターの上流と下流にある制限サイトのタイプにおいてpSCT025とpCPM01プラスミドと異なる。taclacompAsCTglyRRNBT1T2ターミネーター遺伝子カートリッジを含んでいるXhoIEcoRIフラグメントは、pCPM01Aから切断し且つジジェニック発現ベクターpSCT029Aを創製するためpSCT025AのSalIEcoRIのサイト内に結紮した。pSCT029Aを創製するために用いた方法は、pSCT034の構築のために以下に示した通り、補足のポリジェニック発現ベクターを創製するために繰り返すことができる。パートVpSECEの構築ベクターpCPM01は、次いでpSP72の両立サイト内に結紮される、lacPOを削るためにPstIとXbaIによって消化した。XbaIとBamHIクローン化サイトを含んでいるPCR増幅したsecE遺伝子は、pCMSECEを創製するompAsCTglyT1T2シストロンクローン化ベクターの両立サイト内に結紮した。secE及びT1T2ターミネーターは、XhoIEcoRIフラグメントのようにpCMSECEから切断し、pSECEを創製するためpSP72のSalIEcoRIサイト内に、lacPOを含むXbaISalIフラグメントと一緒に結紮した。パートVIpPRLA4の構築ompAsCTglyT1T2シストロンベクターのT1T2ターミネーター領域は、BamHIとSmaIを用いて削り、PRLA4INT中間体クローン化ベクターを創製するpSP72のPvuIIとBamHIサイト内に結紮された。そのlacPOは、XbaIとSacIによりpSP72LACから切断し、pPRLA4を創製するためPRLA4INTのSacIBamHIサイト内に、XbaIとBamHI制限サイトを含む、pr1A4PCRフラグメントと一緒に結紮した。パートVIIpSECEYの構築trpEPO配列を含む合成オリゴヌクレオチドは、pCPM08を創製するためpCPM01AのXhoIXbaIサイト内にサブクローンした。prlA4とT1T2配列は、XbaIとXhoIによりpPRLA4から切断し、pSECEYを創製するためpCPM08のXbaIとEcoRIサイト内に、lacsecET1T2オペロンを含むpSECEからのSalIEcoRIフラグメントと結紮した。パートVIIIpSCT037とpSCT038の構築secEとprlA4コード化領域は、XhoIとBglIIによってpSECEYから切断した。その残りのフラグメントは、それぞれpSCT037とpSCT038を創製するため、pSCT025AとpSCT029AのSalIBglIIサイトに結紮した。pSCT034の構築pSCT034は、TacLacompAsCTglyRRNBT1T2転写カセットの3つのコピーを含むトリジェニック発現プラスミドである。このベクターは、その発現カートリッジの第3のコピーに加えpSCT029AのSalIとEcoRIサイト内にpCM01Aからの記載したカートリッジを挿入することによって構築した。構築の方法は、pCM01AとpSCT025AからのpSCT029Aの構築のための方法と同じである。その3’SalIとEcoRIサイトは、該カートリッジのより多いコピーを加えるために必要なサイトを提供するよう再創製される。★pelB-ErwiniacarotovoraからのペクタートリアーゼBのシグナル配列。該pRLA41ベクターは、プリンストン大学でTomSilhavyにより提供された。prlA4変異対立遺伝子は異種ペプチドとタンパク質のより容易なトランスロケーションを与える特性を有し得る。しかしながら、自然prlA遺伝子は、同様に機能化されるだろう。pSCT029A又はpSCT038による大腸菌の形質転換pSCT029A又はpSCT038プラスミドの構築後、即ち各種のDNAフラグメントの結紮後、それはプラスミドの増殖のため及び将来のタンパク質発現作業のために大腸菌宿主株を形質転換するための最終結紮混合物を使用することが必要である。この形質転換を実行するために、DNAを受容するための能力のある大腸菌細胞を作製する必要がある。その受容可能細胞の調製は、CaCl2処理及び電気穿孔法のような各種の方法によって成すことができる。好ましい細胞系、UGL165とUGL703の最終調製のために、我々は以下のプロトコールに連続して従う両方の方法を用いる。I.大腸菌K12宿主、BB4への第1の形質転換この第1の形質転換は、必須ではないが、しかし大腸菌BB4K12宿主が望ましい各種のクローンと同一の非常に多数の形質転換体及び高い蓋然性の結果を生じる高い形質転換能力を有するために好適である。A.CaCl2処理による受容体BB4細胞の調製BB4遺伝子型LE39232FlacIQZΔMI5proABTn101.宿主細胞の一晩飽和した培養物を調製する。2.05までの培地の100mlに接種することによる新鮮宿主細胞培養物の調製及び002003のA600nmまでの増殖。3.01503のA600nm、ほぼ3倍化までの該培養物の増殖。4.10分間該細胞を氷上で保管する。5.5krpmx10分、遠心分離によって培地から細胞を取り除く。6.氷冷01MCaCl2の05x容量での細胞の再懸濁と塊状化、30分間氷上保存、次いで上記の細胞の塊状化。7.01MCaCl2の0lx容量で塊状化した細胞の再懸濁;使用の前の1時間氷上で保管する。B.形質転換プロトコール1.記載の通り調製した受容細胞の100μlにプラスミドベクターDNAの210ngを理想的に含むであろう結紮混合物の12μlを加える。2.30分間氷上で該混合物を保存する。3.37°Cで加熱ブロック又は水浴中に配することで該混合物を熱ショックする。4.予備加熱した培地1mlに該混合物を加え、37°Cで3060分間該混合物をインキュベートする。5.必要な選択抗生物質を含む適当な固体培地上に形質転換混合物を適量散布し、且つコロニー出現まで1824時間その平板をインキュベートする。II.第2形質転換形質転換体は各種の方法により同定される。幾つかのクローンは第2宿主、大腸菌B宿主BLR株への転移のために選択される。BLRは、選択又は発酵とタンパク質発現の宿主株である。BLRの遺伝子型は、FomoThsdSBgaldcmΔ306Tn10である。大腸菌細胞は、制御した且つ指定した条件下で電場にさらされた後DNAを受け入れるであろう。大腸菌B宿主株は、結紮混合物でなくて完全なプラスミドによってより容易に形質転換され、且つCaCl2処理によるよりも電気穿孔法により受容させる場合に外来DNAをより受け入れる。A.次の電気穿孔法のための受容大腸菌BLR細胞の調製1.宿主細胞の一晩飽和培養物を調製する。2.10に培地の100mlを接種することによって新鮮な宿主細胞培養物を調製し、0305のA600nmまで培養する。3.15分間氷上で培養物を冷却した後に遠心分離によって細胞を収穫する。4.可能な限り多くの培地を除去するよう上清をデキャンタする。氷冷10グリセリン水溶液、wvの100mlsの全量中に該細胞を再懸濁する。再懸濁した細胞を直ちに再遠心分離する。5.氷冷10グリセリンの50mls中に細胞を再懸濁する。再遠心分離。6.氷冷10グリセリンの25mls中に細胞を再懸濁する。再遠心分離。7.工程6を繰り返す。8.氷冷10グリセリンの2mlsの最終容量中に細胞を再懸濁する。最終細胞濃度は13x1010細胞mlとなるであろう。細胞は-80°Cで1年まで保存できる。B.電気穿孔法による形質転換1.滅菌キュベットと白色チャンバースライドを氷上で10分間インキュベートする。また数本のポリプロピレン管もインキュベートする。2.100pgμlの適当な濃度でTrisEDTA中にプラスミドDNAを含む溶液の12μl溶液と細胞懸濁液の40μlを混合する。を防ぐために可能な限り塩分フリーとする必要がある。溶液を良く混合し0510分氷上でインキュベートする。3.25μFでGenePulser装置にセットする。200オームでパルス制御器抵抗をセットする。02cmキュベットで25Kv又は10cmキュベットを用いる場合、1518KvにGenePulser装置をセットする。冷やした電気穿孔キュベットに細胞とDNAの混合物を移し、全ての気泡を除去するためキュベットの底までの懸濁物を振る。冷やした安全チャンバースライド中にキュベットを配置し、キュベットがチャンバーの基部中の接触部の間に固定されるまで、チャンバーにスライドを押す。4.上記セッティングでキュベットを一度パルスする。5.キュベットにSOC緩衝化培地1mlを直ちに加え、細胞を再懸濁する。6.滅菌17x100mmポリプロピレン管に懸濁物を移し、37°Cで1時間インキュベートする。7.選択培地平板上で電気穿孔した混合物を平板培養する。sCTglyの生産発酵バッチ培地は表2中に載せた成分を用いて調製される。発酵は接種培地中で増殖した対数期後期培養物により接種される。接種容量は、0015と024の間に発酵槽内のイニシャルA600nmが達するまでに要した接種物の量により決定される。発酵作動のためのpH、DO2、及び温度パラメータは、表3中にリスト化される。発酵の供給バッチ段階は、バッチ培地中のグリセリンが消耗した時に開始した。[グリセリン消耗は溶存酸素の急増及び/又はグリセリン測定により測定され得る。]供給率は、グリセリン消耗の時点で細胞量に基づく一定の細胞分裂速度を維持するようにセットした。供給率は以下の式に基づいている:式中:Mu=増殖速度dcw=個々の大腸菌株のための経験的に決定した供給開始での培地のリットル当たり乾物細胞重量グラムt=時間での経時Yxs=宿主用のグリセリン利用定数v=リットルでの培養容量feed=供給培地のリットル当たりのグラムグリセリン。Q=グリセリン供給率、リットル/時間該誘導方法はセットした増殖速度に適合するよう経時でインデューサーを増加する供給率と結びつけた濃度勾配導入を用いて達成される。発酵の進行は600nmでの吸光度、glでの細胞湿重量、加えてmglでのsCTglyの存在と濃度のために培地サンプルのCEXクロマトグラフィー分析を測定することによりモニターされる。グリシンは、外層膜透過性を増加するために発酵に加えることができる。グリシンはバッチ培地に又は供給物に加えネことができる。好ましくは、グリシンは、発酵培地中のグリシン濃度が細胞増殖速度に伴って増加するような供給量で加えられる。グリシンの至適濃度は、発酵の最終段階で100ml当たり011グラムの範囲内とすべきである。実施において、供給物に加えられるグリシンの量は、発酵の終わりでの望まれるグリシン濃度が達成されるように計算される。グリシンの実際の量は、発酵の時間の長さ、誘導後、及び望まれる最終グリシン濃度に基づいている。我々が使用している方法は:グリシンの24glを、誘導後26時間で5glの最終グリシン濃度の結果になるように発酵供給物に加えた。我々は、供給物へのグリシンの添加が、バッチ培地にグリシンを加えるよりもより有効であることを見出している。sCTglyの分離条件付けた培地は、タンジェンシャルフロー濾過又は培地から採集するための遠心分離と該細胞の廃棄のいずれかを用いて培地から細胞を分離することで収穫される。排出されたsCTglyは、30の最終pHまで20NHClを加えることによって培地中で安定化される。グリシン延長化サケカルシトニンは、pH30時点で延長した期間、安定である。細胞除去とpH安定化の後、該ペプチドはカチオン交換及び逆相クロマトグラフィー法を用いて精製される。カチオン交換クロマトグラフィーに続く逆相クロマトグラフィーは、良好な精製を提供でき、最初のカチオン交換工程もまた逆相液体クロマトグラフィーの前に含めることも好適である。大型の精製のために、これは逆相クロマトグラフィーのかける容量を減じ、かくしてアセトニトリルのような有機溶媒の高い容量を用いる必要性に起因する環境及び安全性の心配を減じる。別の好ましい変形例は、モノメリックペプチドの収量を改善するために精製前に又はその間を通してのサケカルシトニンペプチドのシステイン残基のSスルホン化である。クローンの記載モノジェニックUGL172クローンは、C末端グリシンを持ったサケカルシトニンをコードしている一つの転写カセットを含むベクターpSCT025Aを含む大腸菌BLR宿主株である。2ジジェニックUGL165クローンは、C末端グリシンを持ったサケカルシトニンをそれぞれコードしている縦列で2つのカセットを有するベクターpSCT029Aを含む大腸菌BLR宿主株である。トリジェニックUGL168クローンは、C末端グリシンを持ったサケカルシトニンをそれぞれコードしている縦列で3つのカセットを有するベクターpSCT034を含む大腸菌BLR株である。モノジェニックUGL702クローンは、1つのカセットと分泌因子遺伝子を含むベクターpSCT037を含む大腸菌BLR株である。ジジェニックUGL703クローンは、縦列に2つのカセットと、分泌因子遺伝子を含むベクターpSCT038を含む大腸菌BLR株である。2好ましい転写カセットは、転写ターミネーター配列rmBT1T2に続くsCTglyの配列に続くOmpAシグナル配列の配列に続くリボソーム結合サイトに続く2重taclacプロモーターを含む。実施例1-1LスケールでのUGL165発酵UGL165クローンの発酵は、実験の詳細に記載した通り実行した。表4は、発酵パラメーターと結果を要約した。概略は、UGL165クローン細胞を、接種用培地中で培養し、006のイニシャルA600nmを与えるようにバッチ培地の1リットルを含む発酵槽を播種するために使用した。細胞は、該培地中のグリセリンが消耗されるまで625時間培養した。次いで、発酵の供給バッチ段階を開始し、255時間、供給培地を連続して補充した。ゼロ時点での条件は、以下の通り:酸素飽和度、94;温度30°C;及びpH68。発酵の終了での条件は、以下の通り:酸素飽和度40;温度31°C;及びpH68。また、発酵の終了時に、600nmでの吸光度は、1133に等しく、1リットル当たりのgでの細胞湿重量は168gであった。発酵終了時のsCTgly生産物もまた、222mg培地のリットルとして測定された。実施例4に記載した通りCEXHPLCを用いて測定したsCTgly撹拌は1450rpm一晩2時間供給開始後とした実施例2-1LスケールでのUGL703発酵組換え大腸菌UGL703は、特許手続の目的のために微生物の寄託に関するブダペスト条約の規定に従い、ATCC98395としてAmericanTypeCultureCollectionに寄託されている。UGL703クローンの発酵は、実験の詳細に記載した通り実行した。表5は、この発酵の条件を要約した。概略は、UGL703クローン細胞を、接種用培地中で培養し、006のイニシャルA600nmを与えるようにバッチ培地の1リットルを含む発酵槽を播種するために使用した。細胞は、該培地中のグロセリンが消耗されるまで625時間増殖した。次いで、発酵の供給バッチ段階を開始し、26時間、供給培地を連続して補充した。ゼロ時点での条件は、以下の通り:酸素飽和度、95;温度30°C;及びpH68。発酵の終了での条件は、以下の通り:酸素飽和度80;温度31°C;及びpH68。また、発酵の終了時に、600nmでの吸光度は、809に等しく、1リットル当たりのgでの細胞湿重量は1291gであった。発酵終了時のsCTgly生産物もまた、284mg培地のリットルとして測定された。sCTglyは、実施例4中に記載したCEXHPLCアッセイを用いて測定した。結論他の実験は、UGL172、UGL168及びUGL702クローンを用い、全体的に類似の条件下で実行した。図12と13は、ジジェニックUGL165クローンが、sCTglyの生産のために最適であることを、トリジェニックUGL165クローンがモノジェニックUGL173クローンを越えて二番目に良好であることと併せて示す。しかしながら、UGL165によるsCTglyの生産は、共-発現分泌因子の存在において更に改善され得る。発酵を通しての酸素飽和度に関して、図14Aと14Bは、発酵培地中に加えた酸素は、細胞増殖においては重要でないが、sCTglyの生産を増加することにおいて非常に重要であるとの結論を裏付ける。図15A、15B、及び16は、大腸菌BLR株がsCTglyの生産のために最良であることを示す。sCTglyの生産は、供給成分の添加としてグリシンの添加によって更に一層増加できる。実施例3-UGL165培地からのsCTglyの精製:カチオン交換クロマトグラフィー1:タンジエンシャルフロー濾過又は遠心分離のいずれか一方で収穫されている培地のほぼ1000Lは、pHを30に減少するために2N塩酸の十分な量で酸性化した。該培地は、≦75mSにまで導電率を減じるよう十分な量の水で連続希釈した。希釈した培地は、25L分の流速で、10mMクエン酸pH30で平衡させているカチオン交換カラムにロードした。ローディングが完結した後、そのカラムは10mMクエン酸pH30によりほぼ40分間8L分で、又は安定したUVベースラインが達成されるまで洗浄した。その生産物は、8L分の流速で10mMクエン酸、350mM塩化ナトリウムpH30によって溶出した。そのカラムは洗浄し且つ05M水酸化ナトリウムで衛生化した。8L分で60分10M塩化ナトリウム。結果として得られたCEX1溶出液を含む撹拌タンクは、トロメタミンの6057グラムが加えられる。その溶液は全ての固体が溶解するまで撹拌される。その溶液のpHは2MNaOHを用いて825範囲:80から85に調節されるトリス塩酸の2364グラムが加えられ、全ての固体が溶解するまで撹拌される。トリス塩酸中に溶解した硫酸ナトリウムの10kgの溶液とトリス塩酸中に溶解したテトラチオン酸ナトリウムの200g溶液か撹拌しつつそのタンクに加えられる。その反応は15分間撹拌することで成される。もし必要であれば、そのpHを2MNaOHによって825範囲:80から85に調節される。その反応混合物は、室温で一晩撹拌される。その反応混合物のpHは、2MHClにより225範囲:20から25に調節される。逆相クロマトグラフィー1:得られたSスルホン化反応混合物は、20L分で、01トリフルオロ酢酸によって平衡化されている逆相カラムに直接ロードした。ローディングが完結した後、そのカラムは01トリフルオロ酢酸により750ml分で安定したUVベースラインが達成されるまで洗浄した。そのカラムは、01トリフルオロ酢酸、20アセトニトリルによって750ml分で、主要な不純物ピークが完全に無くなるまで洗浄した。その生産物は、01トリフルオロ酢酸、40アセトニトリルによって750ml/分で溶出した。そのカラムは750ml分で30分間、01トリフルオロ酢酸、80アセトニトリルによって洗浄した。カチオン交換クロマトグラフィー2:得られたRP1溶出液を、25mMMESpH58で平衡化されているカチオン交換カラムに500ml分で直接ロードした。ローディングが完結した後、そのカラムは25mMMESpH58によって750ml分で、カラム溶出液がpH58に復帰するまで洗浄した。そのカラムは25mMMESpH58によって750ml分で主要なペプチド干純物を除去するために補足の30分間洗浄した。その生産物は、25mMMES、100mM塩化ナトリウムpH58により、750ml分で溶出した。その生産物フラクションは直後のアミド化までに10MHClでpH3050に調整される。そのカラムは01M水酸化ナトリウム、01M塩化ナトリウムによって750ml分で60分間洗浄し且つ衛生化した。アミド化反応得られたpH調節したCEX2溶出液は、sCTglyの真性のサケカルシトニンへのインビトロでの変換において使用するための適当な基質溶液である精製したsCTglyを含み、その反応は以下の実施例5中に示した通り、ペプチジルグリシンαアミド化酵素により促進される。実施例4sCTglyの定量化のための分析用カチオン交換HPLC:採集したクロマトグラフィーフラクション中のsCTglyは、分析用CEXHPLCによって同定し且つ定量分析した。各フラクションのアリコートは、10mMリン酸ナトリウムpH50で平衡化したカチオン交換カラムに、12ml分の流速でロードした。分離は、10mMリン酸ナトリウムpH50から10mMリン酸ナトリウム250mM塩化ナトリウムpH50までの直線的濃度勾配を12ml分で15分間にわたり実行することによって達成した。そのカラム溶出液は、220nmでUV吸収によりモニターした。sCTglyは、精製したsCTgly参照標準品のそれに対してその保持時間の比較により同定した。sCTglyは、sCTgly参照標準品との比較としてピーク面積により定量した。この分析方法はまた、発酵培地からのSCTglyを定量するためにも使用した。実施例5-αアミド化酵素を用いるグリシン延長化サケカルシトニンの真性サケカルシトニンへの変換アミド化サケカルシトニンの至適収量を得るために、以下の臨界パラメーターが観測される:1そのアミド化反応は、反応容器に対するペプチドの非特異的な吸収を防止するためにシラン化したガラス容器中で実行される。2溶解した酸素の高いレベルは、拡散及び/又は振混ぜにより反応混合物中に維持される。好ましくは溶解した酸素のレベルは≧75である。3アミド化を通してインキュベーション温度は35°C-39°Cに維持される。4アミド化反応のpHは60と65の間に維持される。5アミド化反応中のグリシン延長化サケカルシトニンの開始濃度は35-105mgmlの間とすべきである。6実質的にプロテアーゼ無しのαアミド化酵素の1200024000単位mlが反応混合物に加えられ且つ基質の濃度が上記5中に示された通りである場合、その反応は46時間実行される。しかしながら、その反応時間は、生産物への有害な作用無しに24時間まで更に増加できる。7アスコルビン酸塩制限化の精製からアミド化反応を防止するため、アスコルビン酸塩の補足の同等物が該反応のほぼ中間点で加えられる。アミド化反応混合物の成分は以下のものである:Sスルホン化、グリシン延長サケカルシトニンの35105mgml30mMMES緩衝液、pH606505から10μMCuSO4415mMKI15エタノール10100μgmlカタラーゼ1530mMアスコルビン酸塩ペプチジルグリシンαアミド化モノオキシゲナーゼ。PAM酵素は、Millerら,ABB298380388米国特許第4708934号、欧州公開0308067と0382403、及びBiotechnologyVolII1993pp6470中に記載された通り得ることができ、その開示は参考によりここに加えられる。グリシン延長化サケカルシトニンは、実施例1と実施例2中に記載した通りの発酵法により生産し、アミド化の前に実施例3に記載したように精製できる。アミド化に用いた酵素がペプチジルグリシンαヒドロキシル化モノオキシゲナーゼである場合には、PAMをPHM上述したそれと同じ反応混合物が使用される。加えて4から6時間のインキュベーション期間の終わりで、反応混合物のpHは塩基の添加により8と9の間にまで増加される。その反応混合物は、反応を終結するまでの補足の4から8時間の期間撹拌される。ペプチジルグリシンαヒドロキシル化モノオキシゲナーゼは、PAMのN末端部分のみを発現することにより得ることができる。例えば、ミズノ等BBRCVol148No2pp54652を参照、それがミズノのAE1に関係するその開示は参考によってここに合併される。カエル皮膚は自然にPHMを発現することが知られる。アミド化反応が終止されている後、その反応物は十分な量の水で30mgml以下となる最終ペプチド濃度になるように希釈する。十分な1MTRISpH90がほぼ100mMにTRISの最終濃度になるように混合物に加えられる。もし必要なら、pHが2MNaOHで80から90に調整される。SO3sCTの最終濃度を超える、Lシステインの30倍過量がその反応混合物に撹拌しつつゆっくりと加えられる。もし必要なら、pHが2MNaOHで80から90に調整される。その再生反応物は室温で1時間、撹拌される。その反応は、pH2019から23に10リン酸で酸性化することにより終止させる。実施例6アミド化後の精製カチオン交換クロマトグラフィー3:このカラムはαアミド化と再生化に続きsCTを精製するために使用した。αアミド化/再生化の後の主要な不純物はsCTGである。CEX3クロマトグラフィーは、ToyopearlSP650S樹脂を充填したAmiconVantageAカラムを用いる。単位操作は注入用の水と150mMリン酸ナトリウムpH55と一緒に05M,50mM及び175mM塩化ナトリウムを用いて達成される。その方法の工程の概略に記載は以下の通り:1操作流速は750ml分にセットする。2クロマトグラフィーをモニターするために用いた以下のパラメーターがLC系制御装置を用いてセットされる:UV波長230nm範囲064AUFS導電率x10003そのカラムは750ml分の流速で少なくとも5分間、WFIによって最初に洗浄される。4希釈ポンプは、50ml分にセットし、且つそのカラムは安定なpHベースラインが観測されるまで750ml分の流速で10mMリン酸ナトリウムで平衡化される。5そのカラムは、60以下の安定なpHベースラインが達成されるまで750ml分の流速で10mMリン酸ナトリウムで再平衡化される。注:もしカラムのpHが60以下でないなら、150mMリン酸ナトリウム洗浄が要求される。もし150mMリン酸ナトリウム洗浄が実行されるなら、そのカラムは次の工程の操作の前に10mMリン酸ナトリウムpH55を用い再平衡化する必要がある。6再平衡化に続き、そのカラムは175mM塩化ナトリウム;10mMリン酸ナトリウムpH55により750ml分の流速で4分間、ブランク溶出にかけられる。7そのカラムは安定なpHベースラインが達成されるまで750ml分の流速で10mMリン酸ナトリウムで再平衡化される。8一度平衡化が達成された1025グラムのsCTを含むアミド化/再生化処理液は、2N水酸化ナトリウムを用い35にpH調整され、且つ400ml分でCEX3カラムにロードされる。そのサンプルのロードはWFIの500mlによってロードコンテナーを濯ぐことによって続行される。9そのロードに続き、カラムは750ml分の流速で10mMリン酸ナトリウムで30分間、又はそのカラムのpHが50以上で安定化されるまで洗浄される。10カラムのpHが50以上で安定化しているそのカラムは、750ml分の流速で50mm塩化ナトリウム;10mMリン酸ナトリウムpH55で100分間又はsCTglyピークが出現するまで洗浄される。11100分間が満了し175mm塩化ナトリウムがその系に続けられる。そのカラムは、750ml分の流速で175mM塩化ナトリウム;10mMリン酸ナトリウムpH55で洗浄し、次いで生産物が溶出される。全体の生産物ピークが一つの容器に採集される。CEX3溶出液材料の重量が測定され、次いで1N酢酸がそのフラクションに加えられる。12そのカラムは750ml分の流速で15分間、05M塩化ナトリウム;10mMリン酸ナトリウムpH55で脱着化した。13脱着されているそのカラムに10M塩化ナトリウム/025N水酸化ナトリウムが該系に接続される。希釈ポンプは0000ml分にセットされ、該カラムは10M塩化ナトリウム/025N水酸化ナトリウムにより600ml分の流速で少なくとも30分洗浄される。14そのカラムは750ml分の流速で5分間WFIにより洗浄される。15そのカラムは500ml分の流速で10mM水酸化ナトリウムにより30分間洗浄される。そのカラムはこれらの条件下で保存される。逆相クロマトグラフィー:この工程はCEX3に続き、凍結乾燥の前の塩と緩衝液交換工程として用いられる。該工程の主要な目的は、酢酸塩と塩とを交換することである。RP2クロマトグラフィーは、AmberchromCG300md樹脂を充填したAmiconVantageAカラムを用いる。単位操作は、注入用尾水、エチルアルコール、250mM酢酸ナトリウムと05酢酸を用いて達成される。操作工程の概略記載は以下の通り:1CEX3溶出液は、リン酸によりpH20に酸性化し、333mM酢酸ナトリウム溶液の3等量により希釈し、少なくとも1時間放置させる。2流速は320ml分にセットされ、一方希釈ポンプは400ml分の全般的な操作流速のために80ml分にセットされる。3クロマトグラフィーをモニターするために用いた以下のパラメーターがLC系制御装置を用いてセットされる:UV波長230nm範囲254AUFS導電率x10004そのカラムは400ml分の流速で安定な導電率が観測されるまで01酢酸によって最初に洗浄される。5そのカラムは、安定したpHベースラインが観測されるまで400ml分の流速で80エチルアルコール、01酢酸によって脱着される。6そのカラムは、安定したpHベースラインが観測されるまで01酢酸によって洗浄される。7その洗浄の後、カラム試験が樹脂洗浄をたどるために実行される。該カラムは40エチルアルコール;01酢酸によって400ml分の流速で6分間、ブランク溶出にかけられる。そのカラム試験から採集された溶出液は分析試験のQCに従う。8そのカラムは400ml分の流速で、安定した導電率ベースラインが観測されるまで01酢酸によって洗浄される。9その洗浄の完了したなら、WFIがその入り口から外され、250mM酢酸ナトリウムが接続される。希釈ポンプは0000ml分にセットされる。そのカラムは、安定したpHベースラインか観測されるまで、400ml分の流速で250mM酢酸ナトリウムにより平衡化される。10平衡が達成されたなら、CEX3溶出液が、400ml分で該RP2カラムにロードされる。そのサンプルロードは、250mM酢酸ナトリウムの10リットルによってロードコンテナーを濯ぐことによって追出される。11そのカラムは、400ml分の流速で60分間、250mM酢酸ナトリウムを用いて洗浄される。12酢酸ナトリウム洗浄に続き、その酢酸ナトリウムは入口から取り外され、WFIが接続される。希釈ポンプは80ml分の流速に戻され、そのカラムは01酢酸によって400ml分の流速で25分間、洗浄される。1301酢酸洗浄に続き、その生産物は、400ml分の流速で40エチルアルコール;01酢酸によって溶出される。生産物ピークの全体を採集し、精製されたsCT粉末を得るために凍結乾燥にかけられる。14そのカラムは、少なくとも20分間、400ml分の流速で80エチルアルコール;01酢酸によって脱着される。15脱着に続き、希釈ポンプは0000ml分にセットされ、そのカラムは少なくとも5分間、400ml分の流速でWFIにより洗浄される。16WFI洗浄の後、WFIが入口から取り外され、05N水酸化ナトリウムが接続される。そのカラムは、少なくとも20分間、400ml分の流速で05N水酸化ナトリウムによって洗浄される。1705N水酸化ナトリウムが該系から分離され且つWFIが接続される。そのカラムは400ml分の流速で少なくとも20分間、50エチルアルコールで洗浄される。そのカラムはこれらの条件下で保存される。18そのRP3溶出液は、2から8°Cで保存される。本発明がそれの特有の実施態様に関して記載されているとしても、多くの他の変形及び修正及び他の使用は当業者に明らかとなるであろう。本発明はそれ故に、ここでの特異的な開示に限定されること無しに、添付したクレームにのみある。"