"その細菌の通常の増殖に必要な量より過剰の鉄を含む培地で、その細菌細胞を培養したことを特徴とする、Photobacteriumdamselaeの培養物から誘導した生物材料を含む組成物。生物材料が、宿主細胞への侵入に関与する外膜蛋白、またはinvasinまたはadhesinを含み、かつワクチンの調製に使用する通常の培地中より多量に発現する請求項1に記載の組成物。invasinと血清学的に関連する細胞外蛋白が、通常の培養より多量に発現する請求項1または2に記載の組成物。培地からの鉄の直線的取込みがもはや起こらなくなるまで細胞に鉄を担持させるように、十分な鉄を含んだ培地中でPhotobacteriumdamselaeの細菌細胞を培養する段階を含むワクチンの生産方法。細胞が鉄で飽和される請求項4に記載の方法。鉄が第二鉄塩の形態で培地に供給される請求項4または5に記載の方法。培養後、細菌が不活性化される請求項4から6のいずれか一項に記載の方法。不活性化がホルムアルデヒド組成物を用いて行われる請求項7に記載の方法。その方法の生産物が抗体の生産に使用される請求項4から8のいずれか一項に記載の方法。細菌による感染に対して、魚類を予防または治療処理するワクチンの調製における、請求項4から8のいずれか一項に記載の方法により生産される細胞、細胞膜または細胞外生成物の使用。細菌による感染に対して、魚類を予防または治療処理するワクチンの調製における、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物の使用。ワクチンが生理的に許容し得る担体を含む請求項10または11に記載の使用。ワクチンが免疫反応を増強するのに適したアジュバントを含む請求項10から12のいずれか一項に記載の使用。細菌、とりわけ微生物Photobacteriumdamelaesubsp.piscicidaによる感染に対して、魚類を予防および/または治療処理するワクチン組成物であって、英国、アバディーンのN.C.I.M.B.に2000年8月4日に登録番号41062で寄託された微生物の培養により生産される成分を含む組成物。ワクチンの調製における、英国、アバディーンのN.C.I.M.B.に2000年8月4日に登録番号41062で寄託された細菌の使用。請求項9に記載の方法によって生産される抗体。実施例1:invasin発現P.damselaeワクチンの製造トリプトン大豆ブロスオキソイドを30g/lで蒸留水中で調製し、塩化ナトリウムを三角フラスコ中で20g/lで添加したが、その際、フラスコの容量は十分なエアレーションが可能であるように媒体容量の5倍であった。121°Cで15分間のオートクレーブ処理による滅菌の後に、塩化第二鉄を、蒸留水中100ミリモルの無菌ストックからの100マイクロモルの最終濃度に添加した。ブロスを25°Cに予備加温し、これに、フォトバクテリウムdamselaeMT1415株、アバディーン英国のN.C.I.M.Bに2000年8月4日に受入番号41062番で寄託されているようなカプセルポジティブビルレント分離菌の、塩2を含有する一晩トリプトン大豆ブロス培養1/10000容量を播種した。インキュベーションを140rpmでの振盪下に25°Cで40時間継続した。インキュベーションの後に、ホルマリン0.5v/v遊離ホルムアルデヒド0.2の添加により培養を不活化し、ブロスを25°Cで24時間放置して、完全に不活化した。最終ワクチン製剤の光学濃度を求め、ワクチンを必要になるまで4°Cで貯蔵した。投与のために、この細胞懸濁液をいくつの方法のうちの1つで投与した。25°Cの真水に入れたニジマス10~15gにMS222sigmaで麻酔をかけた。麻酔をかけられた魚に適切なワクチン製剤100μlまたは対照製剤または対照としての無菌リン酸緩衝生理食塩水を腹腔内注射により播種した。免疫化後少なくとも500度日後に魚にビルレントP.damselae108cfuの腹腔内注射でチャレンジした。死亡率を毎日記録し、対照魚に比較してのRPS相対生存百分率を求めた。結果を下記の図1に示したが、この際、本発明で使用したRPSをいくつかの対照ワクチンと比較している;1対照ワクチン、2対照ワクチン、3鉄制限ワクチン、4鉄補足ワクチン本発明のワクチン、5標準トリプトン大豆ブロスTSBワクチン、6~12対照ワクチン。もしくは、アメリカチヌ0.3gを本発明または対照ワクチンの10倍希釈液中で一回60秒浸漬することにより免疫化した。ワクチン接種後500日の後の魚をビルレントP.damselae約105cfu/mlを含有する懸濁液に25°Cで1時間浸漬することによりチャレンジした。死亡率を上記と同様に記録した。結果を図2に示した;1鉄制限ワクチン、2TSBワクチン、3鉄補足ワクチン本発明。防御抗原の同定腹腔内注射によりスズキDicentrarchuslabraxを免疫化するために、上記と同様に調製されたワクチンを使用した。フロインド不完全アジュバントを1:1の比率で同時に投与した。魚を25°Cの海水に20日間保持し、その後、これらに2回目の同じ用量を与えた。さらに20日の後に魚から採血し、血液を血餅にし、赤血球を遠心分離により除去して、血清を集めた。血清をリン酸緩衝生理食塩水に対して透析し、-80°Cで凍結貯蔵した。外膜タンパク質OMPおよび細胞外生成物ECPを鉄制限下に、標準TSM中で、または鉄補足下に培養したP.damselaeから調製した。鉄制限のために2,2-ジピリジル100マイクロモルをトリプトン大豆ブロスに添加して、P.damselaeの接種前に鉄をキレート化した。次いでインキュベーションを前記と同様に実施した。沈殿、続いて内膜のサルコシル可溶化により、OMPを調製したHancockPoxton1988BacterialCellSurfaceTechniques,JohnWileySons,Chichester英国。細胞外生成物をブロス培養上澄み液から回収した。非還元条件下にECPおよびOMP同じタンパク質濃度をSDS-PAGEゲル上に泳動させ、PVDF膜上にブロッティングした。膜を抗鉄補足P.damselaeバス血清で、続いて、抗バス免疫グロブリンマウスモノクローナル抗体でSantos他1997Fish.ShellfishImmunol.7:175-191、続いて抗マウスヤギ血清アルカリフォスファターゼ複合体で調べた。バンドを視覚化するために膜を、ニトロブルーテトラゾリウムおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルフォスフェートからなる基質中でインキュベートした。結果を図3および図7に示している。鉄含有培養からのOMP調製物では澄明なバンドが97Kdaマーカー付近で視認されたが、これは鉄制限下では存在しない図3および7。デンシトメトリーを走査することにより、標準TSM培養に対して鉄補足培養からのOMPでは少なくともその2.6倍以上濃縮されていて、鉄制限培養では検出されなかったことがこのバンドで決定された。鉄含有媒体中で培養した細胞からのECPでは、2つのバンドが明らかであり、それらのうち、移動度がおよそ97Kda付近のバンドは、OMP調製物で認められたバンドと同一であると確認された。もう一方のバンドはより低分子量で、55KDaマーカー付近ではあるが、それよりも下に存在した。これらのバンドのどちらも鉄不足培地中で培養された細胞からのOMPSまたはECP中では検出されなかった。鉄補足P.damselaeに対する抗血清による魚類上皮細胞の浸潤の抑制Bandin他1995DisAquat.Org.23:221~227によって記載された蛍光標識直接カウント法によって、魚類上皮細胞EPCに浸潤するP.damselaeの能力を決定した。フルオレセインイソチオシアネートFITC0.1mg/mlを使用してP.damselae細胞を1時間標識した。次いでP.damselaeをPBS中で十分に洗い、109細胞/mlの密度に再懸濁した。細胞懸濁液を分け、1つのアリコットを前記の抗鉄補足P.damselaeスズキ抗血清を加熱することにより調製された熱不活化免疫血清と共に45°Cで15分間、インキュベーションし、第2のアリコットは熱不活化正常スズキ血清と共にインキュベーションした。血清処理されたP.damselae細胞のアリコット10μlをG-MEM1ml中の6×105EPC細胞に添加し、25°Cで2時間、接触および浸潤させた。PBS中で洗うことにより外部細菌を除去し、EPCを臭化エチジウムで対比染色した。アリコット10μlをガラススライドに置き、ガラスカバーで覆い、その後、蛍光顕微鏡検査法により分析した。少なくとも100場での直接カウントにより、内在化したバクテリアの割合を決定した。実験を4回、反復した。結果を図4に示す:1対照血清を伴わないP.damselae、2熱不活化正常スズキ血清と共にインキュベートしたP.damselae、3熱不活化抗血清と共にインキュベートしたP.damselaeスズキvsP.damselae。レクチンを使用しての、スズキ細胞中へのP.damselae内在化に随伴するタンパク質の同定以前の研究により、魚類細胞中へのP.damselaeの内在化に伴う実体は糖蛋白質でありうるということが提示されているMagari-os他1996FEMSMicrobiolLett.138:29~34。糖蛋白質の炭水化物側鎖は特異的に特定のレクチンに結合しうる。レクチンは特定の糖の配置に対して高い特異的な親和性を有する植物抽出物である。異なる種類のレクチンと共にP.damselaeをインキュベーションし、次いでスズキ幼生線維芽細胞SBLに浸潤するその能力を決定し、浸潤を抑制しうるレクチンおよび抑制しえないレクチンを同定した。次いで、浸潤に伴う糖蛋白質をビオチン化レクチンを用いてのウエスタンブロットでプローブすることにより同定することができた。FITCで標識し、洗浄し、前記と同様に109cfu/mlの密度に再懸濁したP.damselaeを100μg/mlの濃度の様々なレクチンVectorLaboratoriesと共に1時間インキュベーションした。インキュベーションの後に、細胞を十分に洗い、浸潤アッセイを前記と同様に実施した。結果を図5に示す:P.damselaeを次と共にインキュベーションした;1Sophorajaponicaグルチニン、2コンカナバリンAアグルチニン、3Lensculinarisアグルチニン、4Griffoniasimplicifoliaアグルチニン、5スクシニル化小麦胚芽アグルチニン、6ドリコスアグルチニン、7ピーナッツアグルチニン、8大豆アグルチニン、9Ulexeuropaeusアグルチニン、10小麦胚芽アグルチニン。P.damselaeによる浸潤を強力に抑制しうる2種のレクチン、SophorajaponicaグルチニンSJAおよびConAアグルチニンConAを選択した。浸潤を抑制しなかった1種のレクチン、ドリコスアグルチニンDBAも選択した。これらのレクチンVectorLaboratoriesのビオチン化製剤をP.damselaeからのSDS-PAGE分離OMPのウエスタンブロットを染色するために使用した。結果を図6に示した。全てのレクチンがいくつかの炭水化物/糖蛋白質を染色した。しかしながら、1つの領域のみがConAによって染色され、DBAによっては染色されなかった。この領域は2つの蛋白質バンドのコンプレックスからなり、非限定的条件下に近似的分子量55Kdaを有し、鉄飽和条件下に培養されたP.damselaeからのOMP製剤中でのみ検出され、鉄制限条件下に培養されたP.damselaeからの製剤では検出されなかった。さらに、P.damselaeからのOMPのウエスタンブロットを切り出し、ConAレクチンおよび抗鉄補足P.damselaeスズキ抗血清で染色すると、通常のバンド、55Kdaコンプレックスが両方の方法で染色された。レーン1は抗55KDaコンプレックスウサギでプローブされたOMPを示し、レーン2は浸潤抑制研究で使用された抗フォトバクテリウムdamsealeMT1415スズキ抗血清でプローブされたOMPを示す。レーン3はドリコアグルチニンでプローブされたOMPを示し、レーン4はコンカナバリンAレクチンでプローブされたOMPを示し、レーン5はSigmaビオチン化分子量マーカーSDS-6Bを示す。97KDaOMPと55KDaECPとの間の血清学的関連性97KDaOMPおよび55KDaECPを慎重にポリアクリルアミドゲルから切除し、ホモジナイズし、スズキに注入した。30日後、血清を集め、OMPおよびECPのウエスタンブロットをプローブするために使用した。97KDaOMPに対してスズキで生じた抗血清を55KDaと交叉反応させた。同様に、55KDaECPに対してスズキで生じた抗体も、KDaOMPと交叉反応させた。本発明者は55KDaECPは97KDaOMPの分泌バージョンの1つであると提案する。精製およびN末端配列55KDa蛋白質の後続精製および配列決定はこの領域の3個の蛋白質を明らかにした。主要な抗原蛋白質はN-末端ブロックされていて、転写後のグリコシレーションと矛盾せず、したがって配列を求めることはできないが、このフラクションは強い赤血球凝集活性を有し、内在化での概然的波及を示す。第2のたんぱく質はβ-1,4N-アセチルムラミダーゼ、他のバクテリアに対する防御に対して100相同性を有するN-末端アミノ酸配列を与えた:AMKRHGLDNYRGYSLGNWVC。第3のたんぱく質はデアミナーゼまたは異化作用性デヒドラターゼのフラグメントでありうる:NVVLHGDNFDSTXVXVKAV。スズキDicentrarchuslabraxでの攻撃研究での、55KDaコンプレックスを発現するワクチンと発現しないワクチンとの防護効力の比較次の研究を独立して、CEFASWeymouthLaboratoryで研究プロトコルP0075、参照99008で行った。55KDaたんぱく質コンプレックスを発現するワクチンを次のように調製した:2.5lエルレンマイヤーフラスコ中塩化第二鉄200マイクロモルを含有するトリプトン大豆ブロス500mlNaCl2TSB2にフォトバクテリウムdamsealesubsp.piscicidaMT1415の18時間TSB2培養の接種物0.01v/vを接種した。この培養を後期指数成長段階まで約40時間140rpmの振盪下に24°Cで成長させた。生じた培養をホルマリン最終濃度0.2で不活化し、フェニルメチルスルホニルフルオリドPMSFを添加して、イソプロパノール中の100ミリモル原液から100マイクロモルの最終濃度にして、プロテアーゼを不活化した。55KDaコンプレックスの発現が完全に抑制されるワクチンを製造するために、フォトバクテリウムdamselaesubsp.piscicida分離菌MT1415を、2,2ジピリジル、鉄キレート化剤100マイクロモルを含有するTSB2中で2回、18時間継代培養した。生じた完全に鉄を消尽した培養をワクチン培養のための接種材料0.5v/vとして使用したが、これを、2.5lエルレンマイヤーフラスコ中の2,2ジピリジル100マイクロモルを含有するTSB2500ml中、140rpmでの振盪下に、遅い指数成長段階まで約48時間、24°Cで成長させた。この製剤からの55Daコンプレックスの不在が、重複培養から調製された外膜たんぱく質のウエスタンブロットにより確認された図7参照。"