"配列番号41の塩基配列、またはその塩基配列に対して1~3個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、を含む1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。前記1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドが、miRNA作用を有する、請求項1に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドが、smallRNAである、請求項1に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドが、1本鎖または2本鎖のRNA鎖である、請求項1に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドが、15以上のヌクレオチドからなる、請求項1に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドが、100以下のヌクレオチドからなる、請求項5に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記1本鎖のポリヌクレオチドがshRNAまたはpre-miRNAであり、前記2本鎖のポリヌクレオチドがsiRNAまたはmiRNAである、請求項1に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記shRNAまたはpre-miRNAが35~100ヌクレオチドからなり、前記siRNAまたはmiRNAのガイド鎖が15~40ヌクレオチドからなる、請求項7に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記shRNA、前記pre-miRNA、前記siRNA、および前記miRNAが、1~5ヌクレオチドからなるオーバーハングを含む、請求項7に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドが、さらに、配列番号42の塩基配列、またはその塩基配列に対して1~5個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含む、請求項1に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドが、さらに、配列番号41の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖を含む、請求項1に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドが、1本鎖のポリヌクレオチドであり、且つpre-miRNAである、請求項1に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記1本鎖のポリヌクレオチドが、配列番号43の塩基配列、またはその塩基配列に対して1~4個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含む、請求項12に記載の多能性幹細胞誘導剤。配列番号41の塩基配列、またはその塩基配列に対して1~3個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、を含むsmallRNAを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。a配列番号43の塩基配列、b配列番号43の塩基配列に対して、80以上の相同性を有する塩基配列、c配列番号43の塩基配列において1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、d配列番号43の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列、からなる群から選ばれる1種以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。体細胞を多能性幹細胞へ誘導する、請求項1に記載の多能性幹細胞誘導剤。悪性腫瘍細胞を多能性幹細胞へ誘導する、請求項1に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記悪性腫瘍が、肝臓癌、膵臓癌、線維肉腫、多形性膠芽腫、メラノーマからなる群から選ばれる1種以上の悪性腫瘍である、請求項17に記載の多能性幹細胞誘導剤。前記多能性幹細胞が、内在性のp53を発現している、請求項1に記載の多能性幹細胞誘導剤。配列番号41の塩基配列、またはその塩基配列に対して1~3個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、を含む1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有し、未分化細胞マーカーの発現を調節する、未分化細胞マーカー発現調節剤。請求項20に記載の未分化細胞マーカー発現調節剤であって、前記未分化細胞マーカーが、Klf4、c-Myc、Oct4、Sox2、PROM1からなる群から選ばれる1種以上の未分化細胞マーカーである、未分化細胞マーカー発現調節剤。配列番号41の塩基配列、またはその塩基配列に対して1~3個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、を含む1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有し、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進する、多能性幹細胞のp53発現促進剤。配列番号41の塩基配列、またはその塩基配列に対して1~3個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、を含む1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法。請求項23に記載の生産方法で得られる、多能性幹細胞。HPS0002:253G1株に比べて内在性のp53の発現量が増大している、請求項24に記載の多能性幹細胞。フィーダー細胞の非存在下で培養可能である、請求項25に記載の多能性幹細胞。配列番号41の塩基配列、またはその塩基配列に対して1~3個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、を含む1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有する、悪性腫瘍の治療薬。請求項27に記載の悪性腫瘍の治療薬であって、前記悪性腫瘍が、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、線維肉腫、多形性膠芽腫、メラノーマからなる群から選ばれる1種以上の悪性腫瘍である、悪性腫瘍の治療薬。前記悪性腫瘍が肉腫である、請求項27に記載の悪性腫瘍の治療薬。配列番号41の塩基配列に相補的な塩基配列、またはその塩基配列に対して1~3個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。請求項30に記載のベクターを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。請求項30に記載のベクターを含む、悪性腫瘍の治療薬。配列番号41の塩基配列、またはその塩基配列に対して1~3個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、多能性幹細胞誘導用、未分化細胞マーカー発現調節用、多能性幹細胞のp53発現促進用、または悪性腫瘍の治療用のキット。しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。上記文献においてiPS細胞の作成方法が徐々に明らかになってきているが、より効率的に、より高品質のiPS細胞を開発するには、新しい作成方法を明らかにし、iPS細胞に関する情報を蓄積していく必要があった。個々の文献について見てみると、特許文献1では癌原遺伝子であるc-Mycを使用しているため、iPS細胞が癌化するリスクを秘めていた。特許文献2ではc-Mycを使用していないが、遺伝子3つとmiRNA1つを細胞に導入させる工程は、複雑であり効率的な作成方法とはいえなかった。非特許文献1ではc-Mycを使用していないが、癌抑制遺伝子であるp53遺伝子を欠損させているので、細胞の癌化や不安定化等のリスクを負っていた。非特許文献2は、miR-302のクラスターを使用しているが、miR-302は腫瘍抑制因子であるPTENphosphataseandtensinhomologdeletedonchromosome10を標的とするmiRNAであることが報告されているPolisenoetalSciSignal2010Apr133ra29。そのため細胞の癌化のリスクを負っていた。一方で、上記文献において悪性腫瘍のメカニズムが徐々に明らかになってきているが、それだけでは十分とはいえず、新規の医薬品または治療戦略立案のためには、新しい抗悪性腫瘍物質を明らかにし、悪性腫瘍に関する情報を蓄積していく必要があった。非特許文献3および4では、hTERTmRNAが癌形成に関連していることと、RGM249mRNAに対するshRNAまたはsiRNAによってhTERTmRNAが減少することが記載されているが、癌に治療効果のある物質は何ら明らかにされていない。本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、多能性幹細胞を誘導する新規の化合物を提供することを目的とする。または、未分化細胞マーカー発現調節剤を提供することを目的とする。また別の目的は、多能性幹細胞のp53発現促進剤を提供することである。また他の目的は、新規の悪性腫瘍治療薬を提供することである。また他の目的は、新規の多能性幹細胞を提供することである。本発明によれば、配列番号41の塩基配列を含む1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤が提供される。この多能性幹細胞誘導剤は、後述する実施例で、細胞を多能性幹細胞へ誘導することが実証されている1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有する。そのため、この多能性幹細胞誘導剤を用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導することができる。また本発明によれば、配列番号41の塩基配列を含む、smallRNAを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤が提供される。この多能性幹細胞誘導剤は、後述する実施例で細胞を多能性幹細胞へ誘導することが実証されているsmallRNAを含有する。そのため、この多能性幹細胞誘導剤を用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導することができる。また本発明によれば、配列番号43の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤が提供される。この多能性幹細胞誘導剤は、後述する実施例で細胞を多能性幹細胞へ誘導することが実証されているポリヌクレオチドを含有する。そのため、この多能性幹細胞誘導剤を用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導することができる。また本発明によれば、配列番号41の塩基配列を含む、1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有し、未分化細胞マーカーの発現を調節する、未分化細胞マーカー発現調節剤が提供される。この未分化細胞マーカー発現調節剤は、後述する実施例で細胞内の未分化細胞マーカーを促進または抑制することが実証されている1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有する。そのため、この未分化細胞マーカー発現調節剤を用いれば、細胞内の未分化細胞マーカーの発現量を調節することができる。また本発明によれば、配列番号41の塩基配列を含む、1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有し、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進する、多能性幹細胞のp53発現促進剤が提供される。このp53発現促進剤は、後述する実施例で多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進することが実証されている1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有する。そのため、このp53発現促進剤を用いれば、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進することができる。また本発明によれば、配列番号41の塩基配列を含む、1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法が提供される。この生産方法は、後述する実施例で多能性幹細胞を作成するために利用できることが実証されている。そのため、この生産方法を用いれば、多能性幹細胞を生産することができる。また本発明によれば、配列番41の塩基配列を含む、1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有する、悪性腫瘍の治療薬が提供される。この悪性腫瘍の治療薬は、後述する実施例で悪性腫瘍を抑制することが実証されている1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有する。そのため、この悪性腫瘍の治療薬を用いれば、悪性腫瘍の治療をすることができる。また本発明によれば、配列番号41の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。このベクターを利用すれば、配列番号41を含む、1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを発現させることができる。そのため、このベクターを用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導、未分化細胞マーカーの発現量の調節、多能性幹細胞のp53の発現量を促進、または癌悪性腫瘍の治療をするための物質を生産することができる。また本発明によれば、配列番号41の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、多能性幹細胞誘導用、未分化細胞マーカー発現調節用、多能性幹細胞のp53発現促進用、または悪性腫瘍の治療用のキットが提供される。このキットを利用すれば、後述する実施例において、細胞を多能性幹細胞へ誘導すること、未分化細胞マーカーの発現量を調節すること、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進すること、または悪性腫瘍を抑制することが実証されている1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを簡易に使用することができる。そのため、このキットを用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導、未分化細胞マーカーの発現量の調節、多能性幹細胞のp53の発現量を促進、または悪性腫瘍の治療をすることができる。なお、上記のいずれかの多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、p53発現促進剤、多能性幹細胞の生産方法、悪性腫瘍の治療薬、ベクター、およびキットにおいて、配列番号41の塩基配列の1~3個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていたとしてもよい。または、配列番号42の塩基配列の1~5個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていたとしてもよい。または、配列番号43の塩基配列の1~4個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていたとしてもよい。本発明によれば、多能性幹細胞を誘導する新規の化合物が得られる。または、未分化細胞マーカーの発現を調節する新規の化合物が得られる。または、多能性幹細胞のp53発現促進剤が得られる。または、新規の悪性腫瘍治療薬が得られる。以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については、繰り返しの煩雑を避けるために適宜説明を省略する。1特定の塩基配列を含むポリヌクレオチド本発明の一実施形態は、配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドである。この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、後述する実施例で細胞を多能性幹細胞に誘導することが示唆されている。そのため、この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。また、この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、後述する実施例で未分化細胞マーカーの発現の促進または抑制をすること、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進すること、または悪性腫瘍の抑制に効果があることが示唆されている。そのため、この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。または、この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、多能性幹細胞のp53の発現量を促進するために好適に使用できる。または、この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。他の実施形態は、配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤である。ここで、配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果は、上述したとおりである。そのため、この多能性幹細胞誘導剤は、細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。または、この多能性幹細胞誘導剤は、未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。または、この多能性幹細胞誘導剤は、多能性幹細胞のp53の発現量を促進するために好適に使用できる。または、この多能性幹細胞誘導剤は、悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。他の実施形態は、配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有する、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のp53発現促進剤、または悪性腫瘍の治療薬である。ここで、配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果は、上述したとおりである。そのため、この未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のp53発現促進剤、または悪性腫瘍の治療薬は、未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。または、それらは細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。または、それらは多能性幹細胞のp53の発現量を促進するために好適に使用できる。または、それらは悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。他の実施形態は、配列番号41の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有する、shRNAまたはpre-miRNAである。ここで、配列番号41の塩基配列を含むポリヌクレオチドの有する効果は、上記の配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果と同様である。そのため、このshRNAまたはpre-miRNAは、細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。または、このshRNAまたはpre-miRNAは、未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。または、このshRNAまたはpre-miRNAは、多能性幹細胞のp53の発現量を促進するために好適に使用できる。または、このshRNAまたはpre-miRNAは、悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。他の実施形態は、配列番号41の塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有する、ベクターである。このベクターは、上記の配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドを発現、又は生産するために好適に使用できる。そのため、このベクターは上記の配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の用途多能性幹細胞誘導剤、治療薬等に使用できる。またこのベクターは、さらに、配列番号42の塩基配列に相補的な塩基配列を含んでいてもよい。この場合、配列番号41の塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、塩基対を形成可能なポリヌクレオチドを発現、又は生産するために好適に使用できる。また、配列番号41の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有するsiRNA、miRNA、pre-miRNAまたはshRNAを発現、又は生産するために好適に使用できる。上記の配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、さらに、配列番号42の塩基配列を含んでいてもよい。この場合、上記の配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドが発揮する、RNAiまたはmiRNAの作用効率が上昇すると考えられる。なぜならば、配列番号41の塩基配列と配列番号42の塩基配列とが塩基対を形成することで、RISCに取り込まれやすくなると考えられるためである。また、上記の、1または複数本鎖が1本鎖である場合には、shRNAまたはpre-miRNAの構造をとることができる。また、配列番号42の塩基配列を含む場合、上記の配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドがより安定化されると考えられる。また、上記の配列番号41の塩基配列を含む、1または複数本鎖のポリヌクレオチドが、配列番号41の塩基配列からなるRNA鎖の相補鎖を含んでいても同様の効果が得られると考えられる。さらには、配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、配列番号43の塩基配列を含む1本鎖のポリヌクレオチドであってもよい。この場合、shRNAまたはpre-miRNAとして好適に使用できる。他の実施形態は、配列番号43の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、後述する実施例で細胞を多能性幹細胞に誘導すること、未分化細胞マーカーの発現の促進または抑制をすること、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進すること、または悪性腫瘍の抑制に効果があることが示唆されている。そのため、このポリヌクレオチドは、多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のp53発現促進剤、悪性腫瘍の治療薬の用途に使用できる。また、shRNA、pre-miRNAまたはベクターとしても使用可能である。また、配列番号1、2、3、8、または44~47の1つ以上の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、上述したような配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果と、同様の効果を発揮しうることが、後述する実施例で示唆されている。そのため、多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のp53発現促進剤、悪性腫瘍の治療薬、siRNAまたはmiRNAもしくはshRNAまたはpre-miRNA、またはベクターの用途に使用できる。なお、配列番号1、2、3、8、または44~47の1つ以上の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、それらの相補鎖、またはそれぞれ配列番号4、5、6、9、または48~51の1つ以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドをさらに含んでいても良い。また、配列番号8の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、配列番号10の塩基配列を含む1本鎖のポリヌクレオチドであってもよい。また、配列番号44~47の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号52~55もしくはそれぞれ56~59の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドであってもよい。これと同様のことは、配列番号7の塩基配列を含むRNA鎖を、ダイサーで処理して得られるRNA鎖に対して相補的な塩基配列以下、ダイサー処理後の相補的な塩基配列と称することもあるを含む、1または複数本鎖のポリヌクレオチドでもいえる。即ち、ダイサー処理後の相補的な塩基配列を含む、1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のp53発現促進剤、悪性腫瘍の治療薬、siRNAまたはmiRNAもしくはshRNAまたはpre-miRNA、またはベクターの用途に使用できる。この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、ダイサー処理後の相補的な塩基配列に相補的な配列をさらに含んでいても良い。また、ダイサー処理後の相補的な塩基配列は、配列番号11、12、および13からなる群から選ばれる1種以上の塩基配列を含むRNA鎖に対して、RNAi作用を有する1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドであっても良い。これと同様のことは、配列番号7の塩基配列を含むRNA鎖に対してRNAi作用を有する1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドでもいえる。即ち、配列番号7の塩基配列を含むRNA鎖に対してRNAi作用を有する1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドは、多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のp53発現促進剤、悪性腫瘍の治療薬、siRNAまたはmiRNAもしくはshRNAまたはpre-miRNA、またはベクターの用途に使用できる。2実施形態に係るポリヌクレオチドが導入された細胞他の実施形態は、上記のいずれかの1または複数本鎖のポリヌクレオチド、または上記のいずれかのベクターが導入された細胞である。この細胞は多能性が誘導されているため、再生医療等の医療材料や研究材料として好適に使用できる。またこの細胞は、外来性のc-Mycが無く、内在性のp53が発現しているため、悪性腫瘍化のリスクが低い。このp53の発現量は、例えば、hiPSCのHPS0002:253G1株のp53発現量に対して、1、12、14、16、18、20、30、40、50、10、100、または1000倍であるが、それらに限定されない。またこの発現量は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また、p53の発現量の測定方法は、測定精度および簡便性の面からリアルタイムPCRが好ましい。詳しい測定条件については、後述する実施例におけるリアルタイムPCRの測定条件を用いることができる。3多能性幹細胞及びその生産方法他の実施形態は、上記のいずれかの1または複数本鎖のポリヌクレオチドを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法である。又は、上記のいずれかのベクターを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法である。この方法を適切に用いれば、多能性幹細胞を生産することができる。なおポリヌクレオチドまたはベクターの細胞への導入、および培養方法は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルスアデノウイルス、レトロウイルス、HIV等を用いた方法、またはマイクロインジェクションなどを使用できる[改訂第4版新遺伝子工学ハンドブック,羊土社2003:152-179.]。また薬剤耐性やセルソーター等を利用して、導入された細胞のみを選択することができる。培地は、例えば、霊長類ES細胞用培地コスモバイオ社や通常のヒト細胞用の培地例えば、DMEMやRPMIベースの培地等を使用できる。一般的にES細胞を樹立する際にはフィーダー細胞と共培養することが多いが、本実施形態の多能性幹細胞はフィーダー細胞の非存在下でも樹立可能である。フィーダー細胞は、例えばEuropeanCollectionofCellCulturesより入手できる。さらに、本実施形態の多能性幹細胞は、いずれもF12HAMDMEMRPMI1640LglutamineDMEMhighglucoseLglutamine01mMNEAAおよびREPROSTEM:bFGF310ngmlからなる群から選ばれる1種以上の培地で37°C、5CO2、10FBSの条件で培養可能である。そのため、いわゆるiPS細胞の有する培養上の困難性を克服することにも成功している。他の実施形態は、上記生産方法で得られる多能性幹細胞である。または、HPS0002:253G1株に比べて内在性のp53の発現量が増大している、多能性幹細胞である。または、上記のいずれかの1または複数本鎖のポリヌクレオチドの発現量が増大している、多能性幹細胞である。これらの細胞は、内在性のp53が発現しているため、悪性腫瘍化のリスクが低い。4実施形態に係るポリヌクレオチドに関連する配列ここで、上記の配列番号1~10、および41~59の塩基配列は、ある程度であれば変異を受けていてもよい。そのような変異を有している塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。変異型の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、人工的に作成することが可能であり、その場合には改変型の塩基配列を含むポリヌクレオチドと呼ぶこともできる。なお、RNAiやmiRNA等の用途で用いる場合には、配列番号4~6、9、42、48~51、および56~59の塩基配列の変異は、配列番号1~3、8、41、44~47、および52~55の塩基配列の変異より大きくても、その機能に変動が生じにくい。なぜならば、配列番号1~3、8、41、44~47、および52~55の塩基配列は、RNAiやmiRNA等の機能を特徴付ける重要な配列であるが、一方で、配列番号4~6、9、42、48~51、および56~59の塩基配列は補助的な配列なためである。また、上記の配列番号1~10、および41~59の塩基配列は、それぞれの塩基配列の1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であっても良い。そのような塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。ここで上記1もしくは数個は好ましくは10個以下であり、より好ましくは5個以下であり、より好ましくは4個以下であり、より好ましくは3個以下であり、より好ましくは2個以下であり、さらに好ましくは1個である。なぜならば、上記1もしくは数個が少ないほど、野生型に近い特性を有していることになるからである。なお、上記付加には挿入の概念を含む。また、上記の配列番号1~10、および41~59の塩基配列は、それぞれの塩基配列に対して、80以上の相同性を有する塩基配列であっても良い。そのような塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。ここで上記80以上は好ましくは85以上であり、より好ましくは90以上であり、より好ましくは95以上であり、より好ましくは96以上であり、より好ましくは97以上であり、さらに好ましくは98以上であり、最も好ましくは99以上である。なぜならば、上記80以上が大きいほど、野生型に近い特性を有していることになるからである。また、上記の配列番号1~10、および41~59の塩基配列は、それぞれの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであっても良い。そのような塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。本明細書において相同性とは、2つもしくは複数間の塩基配列の同一の塩基数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定したものである。割合を算定する前には、比較する塩基配列群の塩基配列を整列させ、同一の割合を最大にするために必要である場合は塩基配列の一部に間隙を導入する。また、最適に整列した状態において、オーバーラップする塩基を含めた全塩基に対する、同一の塩基数の割合を意味する。整列のための方法、割合の算定方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られており、一般的な配列分析プログラム例えば、GENETYX、GeneChipSequenceAnalysisなどを使用して測定することができる。本明細書においてストリンジェントな条件とは、例えば1洗浄のための低イオン強度と高温度、例えば、50°Cにおいて0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1のドデシル硫酸ナトリウムを用いる、2ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42°Cにおいて50volvolホルムアミドと0.1ウシ血清アルブミン/0.1フィコール/0.1ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウムバッファーpH6.5、および750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いる、または342°Cにおいて50ホルムアミド、5×SSC0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム、50mMのリン酸ナトリウムpH6.8、0.1のピロリン酸ナトリウム、5×デンハート液、超音波処理サケ精子DNA50μg/ml、0.1SDS、および10のデキストラン硫酸と、42°Cにおいて0.2×SSC塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム中での洗浄および55°Cのホルムアミド、次いで55°CにおけるEDTAを含む0.1×SSCにてストリンジェントな洗浄を含む条件であっても良い。また中程度にストリンジェントな条件の例は、20ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウムpH7.6、5×デンハート液、10デキストラン硫酸、および20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中において、37°Cで一晩インキュベーション、次いで1×SSC中37~50°Cでのフィルターの洗浄のような条件である。なお、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者によって容易に決定でき、一般的にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存する。一般に、長いプローブは適当なアニーリングのために高温を必要とし、短いプローブは低温を必要とする。また一般に、ストリンジェンシーは塩濃度に逆比例する。通常、遺伝子工学や生命工学の分野では、ポリヌクレオチド中の塩基がある程度の変異や欠失等をしていても、野生型と同様の機能が保たれることが知られている。また、2つのポリヌクレオチド間での塩基のミスマッチについてもある程度許容されることが知られている。後述する実施例においても、実際にポリヌクレオチド中の塩基の欠失や、ミスマッチが存在する。例えば、RGM249shRNAに1塩基の欠失があっても、悪性腫瘍抑制効果がみられている図1B、図1D。このことは、ある程度の欠失等が生じても、野生型と同様の機能が保たれることを示唆している。miR-47siRNAの配列をみると、ガイド鎖とパッセンジャー鎖の間に3つのミスマッチが存在している図3B。miR-101siRNAの配列をみると、ガイド鎖とパッセンジャー鎖間に1つのミスマッチが存在している図3B。miR-47とmiR-47siRNAのガイド鎖の間に3つのミスマッチが存在している図3C。これらのことは、RNAiまたはmiRNAの機能は、2本鎖がある程度ミスマッチを有していても生じることを示唆している。5実施形態に係るポリヌクレオチドに関連するその他の特徴本明細書において多能性幹細胞とは、多能性を有しており、様々な細胞へ分化することができる細胞である。例えば、国際公開第2007/069666号や、文献[HongetalNature2009Aug2746011325Epub2009Aug9]に生産方法や特性の例が記載されている。また、多能性幹細胞は当業者であれば認識できるが、例えば、ヒト人工多能性幹細胞であるhiPSCHPS0002253G1に比べて、いずれかの未分化マーカーを同程度かそれ以上発現している細胞を含む。本明細書において未分化細胞マーカーとは、未分化の細胞で特異的に発現しているDNA鎖、RNA鎖、または蛋白質等の化合物の総称である。例えば、Klf4、c-Myc、Oct4、Sox2、PROM1、Nanog、SSEA-1、ALP、eRas、Esg1、Ecat1、Fgf4、Gdf3、REX-1などが挙げられる。多能性幹細胞マーカーということもある。本明細書においてRNAiとは、siRNAshortinterferingRNAやshRNAshorthairpinRNA、短鎖または長鎖の1または複数本鎖RNA等によって、標的遺伝子やmRNA等の機能が抑制される現象である。一般的に、この抑制は配列特異的であり、様々な生物種に存在する。siRNAを用いた場合の、典型的な哺乳類におけるRNAiのメカニズムは以下の通りである。まず、siRNAを細胞内に導入すると、siRNAの一本鎖化が起こり、その後RISCRNAinducedSilencingComplexを形成する。RISCは取り込まれた1本鎖RNAをガイド分子として、この1本鎖RNAと相補性の高い配列を持つ標的RNA鎖を認識する。標的RNA鎖はRISC内のAGO2によって、siRNAの中心部分で切断される。その後、切断された標的RNA鎖は分解される。以上が典型的なメカニズムであるが、その他に、生体内のmiRNAを標的として抑制した例が文献[KrutzfeldtetalNucleicAcidsRes200735288592Epub2007Apr16]に記載されている。なお、本明細書においてRNAi作用を有する分子は、RNAi作用を引き起こすことができる分子であり、例えば、siRNA、shRNA等を含む。本明細書においてsiRNAとは、RNAiを引き起こす2本鎖のポリヌクレオチドである。一般的にsiRNAの2本鎖はガイド鎖とパッセンジャー鎖に分けることができ、ガイド鎖がRISCに取り込まれる。RISCに取り込まれたガイド鎖は、標的RNAを認識するために使われる。RNAi研究では主に人工的に作成したものが使用されるが、生体内において内在的に存在するものも知られている。本明細書においてmiRNAmicroRNAとは、siRNAと類似の機能を有しているポリヌクレオチドであり、標的RNA鎖の翻訳抑制や分解をすることが知られている。pre-miRNAは、miRNAの前駆体である。miRNAとsiRNAとの違いは、一般的に生成経路と、詳細なメカニズムにある。生体内におけるmiRNAの典型的な生成経路は以下の通りである。まず、miRNA遺伝子から長いpri-RNAprimarymiRNAとして転写される。このpri-miRNAの中には、後にmiRNAになる配列が含まれており、その部分はヘアピン構造をとっている。このヘアピン構造の根本をDroshaが切断する。切り出されたヘアピンはpre-miRNAと呼ばれる。このpre-miRNAはExportin-5によって細胞質に運ばれる。次に細胞質においてDicerがpre-miRNAを切断することで2本鎖のmiRNAができ、さらにこれが1本鎖化してRISCを形成する。この1本鎖RNAがガイド分子として働いて、標的RNA鎖を認識し、切断または翻訳抑制する。以上が典型的なmiRNAの生成経路である。なお、本明細書においてmiRNA作用を有する分子は、miRNA作用を引き起こすことができる分子であり、例えば、miRNA、pre-miRNA、pri-miRNA等を含む。本明細書においてshRNAとは、ヘアピン状に折りたたまれた構造ヘアピン様構造を形成可能な1本鎖のポリヌクレオチドであり、RNAiを誘導する機能を有する。pre-miRNAと類似の構造をしており、通常細胞内ではDicerによって切断され、siRNAが切り出される。このsiRNAによって標的RNAの切断が生じることが知られている。本明細書においてsmallRNAとは、比較的小さいRNAをいい、例えば、siRNA、miRNA、shRNA、pre-miRNA、1または複数本鎖の低分子RNAなどを挙げることができるが、それらに限定されない。塩基数は、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、または100塩基であるが、それらに限定されない。またこの塩基数は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。本明細書においてダイサーDicerは、siRNAやmiRNA等の前駆体を切断して、siRNAやmiRNA等を切りだす機能を有している酵素を含む。例えば、dsRNAをsiRNAへ、pre-miRNAをmiRNAへ、shRNAをsiRNAへと導くことができる。また、ダイサーは上記以外のいくつかの機能を有していることが知られている。上記の1または複数本鎖は、1本鎖または2本鎖であってもよい。この場合、siRNA、miRNA、shRNA、またはアンチセンスRNAのメカニズムを利用することができる。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、いずれかを個々で使用してもよいが、2つ以上を併用してもよい。そのような場合でも、多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のp53発現促進剤、または悪性腫瘍の治療薬として好適に使用できる。なお2つ以上を併用する場合の併用割合は特に限定しない。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、RNAi作用を有していてもよい。この場合、標的とするRNA鎖をRNAi作用によって分解することが可能である。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、smallRNAであってもよい。この場合、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低い。インターフェロン応答とは、一般的に細胞が2重鎖RNAdsRNAを感知することによって抗ウイルス状態になる現象として知られている。長鎖のdsRNAを細胞に導入した場合に、dsRNA応答性プロテインキナーゼPKRが活性化し、インターフェロン反応が誘導されることが報告されているGiletalApoptosis2000Apr510714。その結果、非特異的な遺伝子発現の抑制やアポトーシスが誘導されるといわれている。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、または500ヌクレオチドであるが、それらに限定されない。この数は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。この数が15以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、この数が100以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。この現象は、ヌクレオチド数が少ないほど生じにくいと考えられる。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、1本鎖の場合にはshRNAであってもよく、2本鎖の場合にはsiRNAであってもよい。この場合、標的とするRNA鎖をRNAi作用によって分解することが可能である。また、塩基対を形成しているため、RISCに取り込まれやすくなり効率的にRNAiが生じるMartinezetalCell2002Sep611056374。また、2本鎖の場合には、miRNAであっても良い。この場合、標的とするRNA鎖をmiRNA作用によってサイレンシングすることが可能である。また、1本鎖でshRNAのようなへアピン構造を有していない場合であってもよい。そのような構造でも、標的RNA鎖の発現抑制を奏することが文献[HohjohetalFEBSLett2002Jun195211959]に記載されている。また、上記shRNAは35以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。35以上であれば、shRNAに特有のへアピン様構造を精度よく形成できる可能性が高まる。また、上記shRNAは100以下のヌクレオチドから構成されていてもよい。100以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。但し、一般的にshRNAと構造および機能が類似しているpre-miRNAの多くが、100ヌクレオチド程度またはそれ以上の長さを有していることから、shRNAの長さは必ずしも100ヌクレオチド以下でなくても、shRNAとして機能できると考えられる。また、文献[LinetalRNA2008Oct14211524Epub2008Aug28]には、人工的にpre-miRNAを4つ結合させた大きな分子でも機能できることが示唆されている。そのため、この数はshRNAとして機能できれば限定されず、例えば、35、36、37、38、39、40、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、または500ヌクレオチドである。またこの数は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また、pre-miRNAも同様の理由から、shRNAと同程度の数のヌクレオチドを有していても良い。また、上記siRNAまたはmiRNAのガイド鎖は15以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。15以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、それらガイド鎖は40以下のヌクレオチドから構成されていてもよい。40以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。この数は、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または40ヌクレオチドであるが、それらに限定されない。またこの数は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチド、shRNA、siRNA、miRNA、およびpre-miRNAは、1~5ヌクレオチドからなるオーバーハングを含んでいてもよい。この場合、RNAiの効率が上昇すると考えられる。この数は、例えば5、4、3、2、または1ヌクレオチドであるが、それらに限定されない。またこの数は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。上記のベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド例えば、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、枯草菌由来のプラスミド例、pUB110、pTP5、pC194、酵母由来プラスミド例、pSH19、pSH15、λファージなどのバクテリオファージ、HIV、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどのウイルス由来のベクター、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo、pSUPEROligoEngine社、BLOCKitInducibleH1RNAiEntryVectorインビトロジェン社、pRNATinH14Lentiなどを用いることができる。上記の多能性幹細胞誘導剤は、体細胞を多能性幹細胞へ誘導する機能を有していてもよい。この場合、体細胞から多能性幹細胞を作成することができる。本明細書において体細胞とは、生殖細胞を除いた他の細胞のことで、皮膚由来の細胞、線維芽細胞等が含まれる。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において多能性幹細胞誘導剤とは、細胞を多能性幹細のような多能性を有している細胞に近づける作用を持った物質のことである。本明細書においてリプログラミングとは細胞を多能性幹細のような多能性を有している細胞に近づける作用のことである。上記の多能性幹細胞誘導剤は、悪性腫瘍細胞を多能性幹細胞へ誘導する誘導剤であってもよい。この場合、悪性腫瘍細胞から多能性幹細胞を作成することができる。本明細書において悪性腫瘍とは、正常な細胞が突然変異を起こして増殖を続けることで起こる疾患を含む。また、癌腫、肉腫を含む。悪性腫瘍は全身のあらゆる臓器や組織から生じ、悪性腫瘍細胞が増殖すると、かたまりとなって周囲の正常な組織に侵入し破壊することが知られている。癌は、例えば、肺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、胆道癌、乳癌、大腸癌、小腸癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、尿管癌、腎盂癌、尿管癌、陰茎癌、精巣癌、脳腫瘍、中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、頭頸部癌口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、鼻腔副鼻腔癌、唾液腺癌、甲状腺癌等、グリオーマ、多形性膠芽腫、皮膚癌、メラノーマ、甲状腺癌、唾液腺癌、血液の癌、または悪性リンパ腫などを含む。上記の多能性幹細胞誘導剤は、肝臓癌、膵臓癌、線維肉腫、多形性膠芽腫、メラノーマからなる群から選ばれる1種以上の悪性腫瘍の細胞を多能性幹細胞へ誘導する誘導剤であってもよい。この場合、それらの悪性腫瘍細胞から多能性幹細胞を作成することができる。悪性腫瘍細胞を多能性幹細胞へ誘導することはこれまでにほとんど報告されておらず、新しい革新的な悪性腫瘍の治療方法として期待できる。上記の多能性幹細胞は、内在性のp53を発現していてもよい。この場合、悪性腫瘍化が生じにくいと考えられる。なお、p53の発現量は、コントロール試料例えば、p53ノックアウト細胞、正常細胞、またはそれらに由来する試料等に比べて有意に高発現していることが好ましい。明細書において有意にとは、例えばコントロール群と被検査群との間の統計学的有意差をスチューデントStudentのt検定を使用して評価し、p<0.05であるときを含む。本明細書においてコントロール群とは、被検査群と異なる条件下に置かれた試料のことであり、当該技術分野において通常使用される範囲内の概念で表すことができる。p53は一般的に悪性腫瘍抑制遺伝子に分類される遺伝子であり、DNAが損傷したときに活性化されて、細胞分裂の停止と損傷の修復を誘導する機能が知られている。一方で、p53をノックアウトやノックダウンさせると、iPS細胞の作成効率が上昇することが報告されているZhaoetalCellStemCell2008Nov634759、HongetalNature2009Aug2746011325Epub2009Aug9。これらことは、p53による悪性腫瘍抑制とiPS細胞作成の効率化は、トレードオフの関係にあることを示している。また、p53を欠損したES細胞は染色体が不安定であることや、分化誘導に対して抵抗性を持つことが報告されているLinetalNatCellBiol2005Feb716571Epub2004Dec26。これは分化誘導後に未分化細胞が残存する可能性が高いことを意味している。そのため、再生医療においてp53を欠損させた細胞を移植した場合に、悪性腫瘍形成のリスクが高まると考えられる。従って、この面からもp53は細胞にとって重要な分子であることがわかる。本明細書において内在性とは、被検物質が細胞の内部のメカニズムに由来して存在していることを表している。例えば、細胞内で恒常的に発現している蛋白質は、その発現した蛋白質に限っては内在性に含まれる。上記の未分化細胞マーカー発現調節剤において、未分化細胞マーカーはKlf4、c-Myc、Oct4、Sox2、PROM1からなる群から選ばれる1種以上の未分化細胞マーカーであってもよい。未分化細胞マーカーや各種蛋白質は、RT-PCRReverseTranscriptionPolymeraseChainReactionなどの公知の方法を用いて検出することができる。RT-PCRは、RNA鎖を鋳型に逆転写を行い、生成されたcDNAに対してPCRを行う方法である。なお、トータルRNAは細胞からグアニジンチオシアネート法、市販の試薬またはキットを使用して抽出できる。細胞は、インビトロジェン株式会社、三光純薬株式会社、タカラバイオ株式会社等から購入できる。また未分化細胞マーカーや各種蛋白質は、さらにリアルタイムPCRと組み合わせて検出することもできる。そのような方法は、リアルタイムRT-PCRと呼ばれる。リアルタイムPCRは、PCRによって増幅する核酸をリアルタイムでモニタリングする方法である。例えば、文献[原理からよくわかるリアルタイムPCR実験ガイド、羊土社、2007/12]に記載の手順によって行うことができる。上記モニタリングの方法としては、インターカレーション法、ハイブリダイゼーション法、LUXLightUponeXtensyon法などが挙げられる。インターカレーション法の典型的な方法は、SYBRGreenIなどの蛍光物質が二本鎖の核酸に入り込み、励起光の照射によって発光を発する特性を利用して核酸量を測定する方法である。蛍光の強さは核酸の量に比例して強くなるため、蛍光強度を測定することによって核酸の増幅量を知る事ができる。また、リアルタイムPCRを使用した定量方法では、大きく分けて絶対定量法と相対定量法の2つの定量方法がありそれらを適宜使用できる。本明細書において発現調節剤とは、標的蛋白質またはmRNAの発現量を増加または減少させることが可能な物質を含む。ここで、増加または減少する量は、コントロール細胞に比べて有意差があることが好ましい。上記の悪性腫瘍の治療薬は、さらに、DDSDrugDeliverySystemを含んでいてもよい。この場合、ポリヌクレオチドを細胞内に効率的に導入できる。DDSとしては、ゼラチンハイドロゲルまたはアテロコラーゲンを含む。本明細書においてゼラチンハイドロゲルとは、ゼラチンを原料としたハイドロゲルでDDSとして使用できる。ゼラチンハイドロゲルは生体適合性、生体吸収性に優れている。本明細書においてアテロコラーゲンとは、アテロコラーゲンを原料としたDDSである。細胞への導入効率や安全性に優れている。アテロコラーゲンとは、一般的にコラーゲンに含まれるテロペプチドを酵素的に分解したもので、免疫反応を誘発し難い。上記の悪性腫瘍の治療薬において、悪性腫瘍は肝臓癌、肺癌、膵臓癌、線維肉腫、多形性膠芽腫、メラノーマからなる群から選ばれる1種以上の悪性腫瘍であってもよい。この場合、それらの悪性腫瘍の治療が可能になる。特にこれらの悪性腫瘍はいずれも革新的な治療方法が無いために、上記の悪性腫瘍の治療薬は有望な治療薬である。本明細書において肝臓癌とは、肝臓の細胞が増殖を続けることで起こる疾患を含む。肝臓癌を生起させることができる肝細胞は胆管、門静脈のような血管の細胞、樹状細胞または肝細胞を含む。また、原発性肝癌と転移性肝癌を含む。原発性肝癌の多くは肝細胞癌hepatocellularcarcinomaであることが知られている。本明細書において肺癌とは、気管、気管支、肺胞の上皮細胞等に発生する悪性腫瘍を含み、病理学的には、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、小細胞癌に分類できる。進展形式や治療反応性などが小細胞癌とその他の癌とでは異なるため、腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌はまとめて非小細胞癌とも呼ばれる。カルチノイドや円柱種など、小細胞癌および非小細胞癌に含まれない少数の腫瘍もある。本明細書において膵臓癌とは、膵臓から発生した悪性腫瘍を含む。膵臓は、膵液を産生する腺房、膵液を運ぶ膵管、および内分泌腺であるランゲルハンス島などからなる。癌はいずれの組織からも発生しうる。例えば、浸潤性膵管癌、膵内分泌腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、腺房細胞癌、漿液性嚢胞腺癌等が挙げられる。本明細書において肉腫とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する悪性腫瘍を含む。例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、皮膚線維肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、胞巣状軟部肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、顆粒球肉腫、ユーイング肉腫、骨原発の線維肉腫、悪性骨巨細胞腫、骨原発の脂肪肉腫、骨原発の血管肉腫等が挙げられる。本明細書においてグリオーマとは、神経膠細胞から発生する悪性腫瘍を含む。例えば、星状膠細胞系腫瘍、稀突起膠細胞系腫瘍、上衣系腫瘍、脈絡叢腫瘍、多形性膠芽腫等が挙げられる。本明細書においてメラノーマとは、皮膚、眼窩内組織、口腔粘膜上皮などに発生するメラノサイト由来の悪性腫瘍を含む。例えば、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、末端黒子型黒色腫等が挙げられる。本明細書においてポリヌクレオチドとは、ヌクレオチドもしくは塩基、またはそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ヌクレオチドおよび塩基は、DNA塩基またはRNA塩基を含む。上記の等価物は、例えばDNA塩基またはRNA塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、またはヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。DNA鎖とは、DNA塩基またはそれらの等価物が2個以上連結した形態のことを表す。RNA鎖とは、RNA塩基またはそれらの等価物が2個以上連結した形態のことを表す。塩基配列とは、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドまたはその等価物の配列である。一般的に塩基配列は、Aアデニン、Gグアニン、Cシトシン、Tチミンによって表すことができる。また、TとUウラシルは、用途に合わせて互いに読み替えることが可能である。例えば、代表的なデータベースであるNCBIReferenceSequenceにおいて、DNA鎖およびRNA鎖の塩基配列を表すときにA、G、C、Tが用いられている。なお、ポリヌクレオチドはDNA/RNA合成装置を用いて合成可能である。その他、DNA塩基またはRNA塩基合成の受託会社例えば、インビトロジェン社やタカラバイオ社等から購入することもできる。また、siRNA、miRNA、shRNA、pre-miRNA、またはそれらをコードするベクターの合成も各メーカーに委託することができる。そのようなsiRNA等のデザインには、StealthRNAidesignerInvitrogenやsiDirect20NaitoetalBMCBioinformatics2009Nov3010392等を使用できる。RNAi作用またはmiRNA作用の確認は、リアルタイムRT-PCRによるRNA鎖発現量の定量によって行なうことができる。または、ノザンブロットによるRNA鎖発現量の解析や、ウェスタンブロットによる蛋白量の解析表現型の観察等の方法でも行うことができる。特にリアルタイムRT-PCRによる方法が効率的である。本明細書において相補鎖とは、一つのポルヌクレオチドに対して、ハイブリダイズすることが可能な相補性の高い他のポリヌクレオチドである。本明細書においてハイブリダイズとは、複数のポリヌクレオチド間において、塩基間の水素結合等によって塩基対ができる性質のことを表す。塩基対はワトソンクリック型塩基対、フーグスティーン型塩基対、または任意の他の配列特異的な形で生じうる。2つの1本鎖がハイブリダイズした状態は2本鎖と呼ばれる。また相補的とは、例えば一つのポリヌクレオチドに対して、AにはT、GにはCが対応する形で、他のポリヌクレオチドがハイブリダイズすることが可能な形態を含む。本明細書において治療とは、被験者の疾患または疾患に伴う1つ以上の症状の、予防または症状改善効果を発揮しうることをいう。本明細書において被験者とは、ヒトもしくはその他哺乳動物例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、サル、チンパンジー、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなどを含む。好ましくは、マウス、ラット、サル、チンパンジー、またはヒトであり、特に好ましくはヒトである。なぜならば、ヒトであればヒトの疾患の治療や、ヒト用の治療薬または診断薬の開発等に、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを利用できるためである。また、マウス、ラット、サル、およびチンパンジーは、世界中で研究用のモデル動物として汎用され多くの特性が明らかになっているため、これらの生物に対して、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドの薬効薬理を調査することで、より優れた治療薬等の開発のために特に有用な情報が得られる。また、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを治療薬または予防薬として使用する場合、単独で投与することも可能ではあるが、通常はDDSまたは薬理学的に許容される1つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。また、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを直接使用せずに、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドの前駆体を投与することも可能である。また、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを生体に投与する際の投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、腹腔内、眼内または静脈内などの非経口投与をあげることができ、全身または局部的に投与することができる。投与経路は、好ましくは非経口投与あげることができる。後述する実施例のように、皮下または静脈内投与であっても良い。この場合、1または複数本鎖のポリヌクレオチドが患部へ到達する効率が高い。その他の投与形態としては、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、注射剤、座剤、噴霧剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。さらに、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80TM、HCO-50と併用してもよい。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製することができる。また、噴霧剤は上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体、などを用いて調製することができる。この担体としては具体的には乳糖、グリセリンなどが例示できる。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤と、用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤化が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。また、上記の治療薬または予防薬は、緩衝剤例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど、安定剤例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど、保存剤例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどに対して投与することができる。また、投与方法は被験者の年齢、症状、対象臓器等により適宜選択することができる。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤を含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、被験者あたり0.001~100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。体重1kgあたりの投与量は、例えば00001、001、1、50、100、250、500、または1000mgである。この投与量は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。投与量は目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なる。投与量、投与方法は、被験者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。また、適切な化学療法薬と併用で投与してもよい。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、悪性細胞の抑制等の効果を通して、畜産において動物の成育を補助するための添加剤などにも使用できる。また本発明の他の実施形態は、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含む、試薬またはキットである。この試薬またはキットは、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果を通して、研究用の試薬もしくはキット、または医療用のキットとして使用できる。たとえば、iPS細胞作成用、人工臓器作成用、悪性腫瘍細胞抑制用、未分化マーカー発現調節用、またはp53発現細胞作成用の添加物、補助物質として使用できる。また、キットには上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを用いる際の使用方法もしくは使用例を記載した指示書、その指示書の所在を記載した文面、または種々のバッファーを含んでいてもよい。以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。<実施例1:RGM249shRNAのマウスへの投与と、抗癌作用の評価>1-1RGM249shRNAの作成StealthRNAidesignerによってRGM249shRNAの配列をデザインし、BLOCKitInducibleH1RNAiEntryVectorを用いてRGM249shRNAを生成するベクターRGM249shRNAプラスミドを作成した。このRGM249shRNAは、生体内においてRGM249mRNAに対するRNAiを誘導するように設計されたsmallRNAである。ここで、RGM249mRNAの塩基配列は、5GGAAAACUAAAAUGAGAGAAUGGGUGUCCAAGAGGACAAGUUCAUGCUCACCCGGUGAUGAGAGUUUGAUUGCAGAAUAAGGCUAGACAAAGGGAAGCUGAACAUGACCAAAGCCAUGUGACAUCGUAUGAUCCUCGAAUCUCACAGUAUCUAUGUAUCUAUAAUCAGAUACAUCCCUAGACUUUCCAGGAAUUCUGGUACUUCACGAGGAUGUGAGAAGACUCUGAACAAAAUAAUACACUGCUCGUG3配列番号7である。RGM249shRNAプラスミド内のトップストランドにおいて、RGM249shRNAをコードする配列は、5CACCGCAGAATAAGGCTAGACAAAGCGAACTTTGTCTAGCCTTATTCTGC3配列番号11である。ボトムストランドにおいて、上記トップストランドと2重鎖を形成している配列は、5AAAAGCAGAATAAGGCTAGACAAAGTTCGCTTTGTCTAGCCTTATTCTGC3配列番号12である。図1AにRGM249mRNAの2次構造と、RGM249shRNAのターゲット部位を示す。RGM249shRNAの塩基配列は、5GCAGAAUAAGGCUAGACAAAGUUCGCUUUGUCUAGCCUUAUUCUGCGGUG3配列番号10である。プラスミドから転写後はヘアピン様構造を形成すると考えられる図1B。図中の下線部は、水素結合を形成可能な部分である。RGM249shRNAの塩基配列において、RGM249mRNAの一部に相補的な配列は、5CUUUGUCUAGCCUUAUUCUGC3配列番号8である。この配列番号8に相当する部分は、RGM249shRNAの塩基配列中の5GCAGAAUAAGGCUAGACAAAG3配列番号9と水素結合を形成し、へアピン様構造を形成すると考えられる。RGM249shRNAによってRNAiを誘導する際には、この配列番号8に相当する部分がRGM249mRNAに対してハイブリダイズすると考えられる。UUCGはループ部分に相当する。GGUGはオーバーハングしていると考えられる。また、RGM249shRNAのチミンの一つが欠損したRGM249m-1shRNAを発現するベクターRGM249m-1shRNAプラスミドを作成した。RGM249m-1shRNAプラスミド内のトップストランドにおいて、RGM249m-1shRNAをコードする配列は、5CACCGCAGAATAAGGCTAGACAAAGCGAACTTTGTCAGCCTTATTCTGC3配列番号13である。ボトムストランドにおいて、上記トップストランドと2重鎖を形成している配列は、5AAAAGCAGAATAAGGCTGACAAAGTTCGCTTTGTCTAGCCTTATTCTGC3配列番号14である。コントロールにはLacZshRNAを使用した。RGM249m-1shRNAの塩基配列は、5GCAGAAUAAGGCUGACAAAGUUCGCUUUGUCUAGCCUUAUUCUGCGGUG3配列番号15である。配列番号15の塩基配列が配列番号10の塩基配列と異なるのは、配列番号10の5末端から14番目のAが欠失している点である。RGM249mRNAに一部に相補的な配列は、上記RGM249shRNAの場合と同じである。1-2RGM249shRNAの腫瘍抑制効果胸腺欠損マウスの右側腹に、HLF細胞を皮下注射によって播種した。またそのマウスの右側腹に、5日毎にRGM249shRNAプラスミドDDS、RGM249m-1shRNAプラスミドDDS、またはLacZshRNAプラスミドDDSを皮下注射した。この皮下注射は、DDS1mg当たり数μg~数十μgの生理活性物質を混ぜ、マウス20~30gに対して行った。このときの腫瘍ボリュームの変化を調査した図1C。その結果、投与から21日後、LacZshRNAグループと比較してRGM249shRNAグループによる有意な腫瘍抑制効果が見られた。なお、DDSDrugDeliverySystemとしてはカチオン化ゼラチンハイドロゲルMedGel社製を使用した。プラスミドとDDSは、メーカーのプロトコールに従い各100nMで混合した。グラフには標準誤差を示してある。データn=5はマンホイットニーテストによって分析したP<0.01。また、最初の投与から4週間後、RGM249shRNAグループは、RGM249-m1shRNAグループとLacZshRNAグループに比較して、有意に腫瘍抑制効果を示したP=0.034、P=0.021。図1Dの3つの写真は、上記それぞれのプラスミドを皮下注射した際の、腫瘍ボリュームの目視的な観察結果である。皮下注射から約28日後に、RGM249shRNAグループは平均で80の抑制効果を示していた。また、RGM249m-1shRNAグループは平均で50未満に腫瘍ボリュームを抑制していた。1-3RGM249shRNA投与によるmRNA発現の抑制効果1-3-1皮下投与また皮下注射から35日後に、腫瘍で発現している遺伝子の発現抑制効果を調査した図2A。細胞からmirVanamiRNAIsolationkitを用いてmiRNAを抽出した後、MirXTMmiRNAqRTPCRSYBRKitを用いてmiRNAの発現量を調べた。その結果、RGM249shRNAプラスミドDDS、またはRGM249m-1shRNAプラスミドDDSを投与した場合において、RGM249mRNAおよびhTERTmRNAの発現レベルが、LacZshRNAと比較して有意に低下していたRGM249mRNAとhTERTmRNAのP値は、それぞれP=0.036、P=0.025。これらのデータはマンホイットニーテストによって分析した。クローズドの四角はRGM249の発現を示し、オープンの四角はhTERTmRNAの発現を示す。1-3-2尾静脈投与一方で、上記のそれぞれのプラスミドを尾静脈へ静脈注射した場合において、28日後に腫瘍で発現している遺伝子の発現抑制効果を調査した図2B。DDSには、アテロコラーゲンAteloGeneTMJoJYamamotoetalJNanosciNanotechnol628532859、TakeshitaetalMolTher18181187を用いた。プラスミドとDDSは、メーカーのプロトコールに従い各100μMで混合した。その結果、RGM249shRNAプラスミドDDSを投与した場合において、RGM249mRNAおよびhTERTmRNAの発現レベルが、LacZshRNAと比較して有意に低下していた。これらのデータはマンホイットニーテストによって分析したP<0.05。クローズドの四角はRGM249の発現を示し、オープンの四角はhTERTmRNAの発現を示す。以上のように、RGM249shRNAグループにおけるRGM249mRNAとhTERTmRNAの発現は、LacZshRNAグループと比較して、両方とも有意に抑制されたそれぞれP=0.049、0.046。1-4RGM249shRNA投与による癌転移抑制効果また静脈注射から28日後に、肝臓の内外の結節を目視的に観察した。HLF細胞のみのグループdatanotshownと、LacZshRNAグループにおいて癌結節が目視的に見られた。また、顕微鏡でみた場合、全てのマウスの肝臓または肺に転移性の病巣が、1匹のマウスで左腎への転移が見られた。目視的に観察した結果、RGM249shRNAグループでは、1匹のマウスでのみ肝臓に結節の存在が確認された表1。また、1匹のマウスでのみ腎臓に結節を有していることが確認された。この結果は、RGM249shRNAグループが他のグループと比較して腫瘍形成と転移を抑制したことを表す。即ち、RGM249shRNAグループは静脈注射で与えたときに腹腔内の発癌を抑制した。また、注入されたヒト由来の腫瘍を、ヒト特異的なRGM249mRNAを標的として治療したことを意味する。以上の結果より、RGM249mRNAをRNAi作用によって分解すると、癌抑制と腫瘍減少、hTERTmRNAの減少、および癌の転移抑制に効果があることが示された。このことから、RGM249mRNAが、癌になんらかのメカニズムを経て影響していると考えられた。またRGM249m-1shRNAは、RGM249shRNAに比べて若干効果は劣るが、癌の抑制効果を奏する等、RGM249shRNAと類似の効果を有していた。次に、RGM249mRNAから生成されるmiRNAと、そのmiRNAに対するsiRNAによる癌への影響を調べた。<実施例2:3つのsiRNAによる癌細胞増殖抑制と、未分化マーカーへの影響の評価>2-1miR-47siRNA、miR-101siRNA、miR-197siRNAのコンストラクトRGM249を、pRNATU61neoベクターに連結した。T7RNAポリメラーゼにより生成されたRGM249mRNAを、Dicer酵素を使用して消化した。miRNAを、mirVANAmiRNA単離キットにより分画し、ヒト抗Ago2ビーズを用いたmiRNA単離キットを用いて精製した。また、小RNAがAgo2に結合しない可能性があるため抗Ago2を用いずにも精製した。消化したsmallRNAsを、miRCATmicroRNAクローニングキットを使用してクローニングし、TOPOベクターを使用してシークエンシングした。そして、二次構造を予測した。smallRNAsの配列相同性を、miRBasを使用して検討した。以上の結果、miR-47、miR-101、miR-197の3つのmiRNAが得られた。miRNA前駆遺伝子であるRGM249mRNAと、内部の3つのmiRNAに相当する部位を図3Aに示す。miR-47の塩基配列は5CUCACCCGGUGAUGAGAGUUUGAUU3配列番号16、miR-101の塩基配列は5AACAUGACCAAAGCCAUGUG3配列番号17、miR-197の塩基配列は5GUACUUCACGAGGAUGUG3配列番号18である。上記3つのmiRNAに対するsiRNAを生成するコンストラクトshRNAを作成する場合、pRNATinH14Lentiを使用した。また、3つのsiRNAmiR-47siRNA、miR-101siRNA、miR-197siRNAをInvitrogen社のsiRNAdesignerを用いて合成した。各siRNAの推定2次構造を図3Bに示す。miR-47siRNAの塩基配列はセンス鎖が5CUCACCCGGUGAUGAGAGUUUGA3配列番号4、アンチセンス鎖が5AAUCAAACUCUCACCGGGUGAG3配列番号1である。miR-101siRNAの塩基配列はセンス鎖が5AACAUGACCAAAGCCCAUGUGUU3配列番号19、アンチセンス鎖が5CACAUGGCUUUGGUCAUGUU3配列番号2である。miR-101siRNAのセンス鎖は、3末端においてチミンが2塩基突出している。この2塩基を除いた配列は、5AACAUGACCAAAGCCCAUGUG3配列番号5である。miR-197siRNAの塩基配列はセンス鎖が5GUACUUCACGAGGAUGUGUU3配列番号20、アンチセンス鎖が5CACAUCCUCGUGAAGUAC3配列番号3である。miR-197siRNAのセンス鎖は、3末端においてチミンが2塩基突出している。この2塩基を除いた配列は、5-GUACUUCACGAGGAUGUG-3配列番号6である。また、3つのmiRNAと、3つのsiRNAのアンチセンス鎖との配列比較を図3Cに示す。2-2細胞増殖の抑制効果miR-47siRNA、miR-101siRNA、miR-197siRNA、またはそれらの混合物3siRNA混合物各50nMを高レベルのRGM249を発現するHMV-Iへトランスフェクションした。トランスフェクションにはFuGeneキットRoche社製を使用した。トランスフェクションから24時間経過後の形質転換体を収集した。細胞数を測定した結果、DDSで処理したコントロール細胞と比較して、それぞれのsiRNAを単独で使用した場合に、若干の癌細胞増殖の抑制効果がみられた図3D。さらには、3siRNA混合物をトランスフェクションした場合、癌細胞増殖の顕著な抑制効果がみられた。これは、3つのsiRNAが相乗的に働いたためと考えられる。一方で、siRNAを2つ組み合わせて使用した場合には、同等の効果は見られなかった。このことは、2つでは相乗効果が生じにくく、むしろ1つ当たりの濃度が低くなったことが癌細胞増殖の抑制効果を弱めたと考えられる。この結果から、3つのmiRNAを阻害すると、癌細胞の増殖抑制効果があることが強く示唆された。この結果は実施例1とも矛盾なく、RGM249mRNAが3つのmiRNAに分解され、その3つのmiRNAが癌に関与するメカニズムが、生体内で働いていると考えられる。上記の3つのsiRNAはこのメカニズムを遮断することで、癌細胞の増殖抑制効果を発揮したと考えられる。2-3siRNAによるmiRNA発現レベルの変化上記2-2において3siRNA混合物を同時にトランスフェクションしたHMV-IからRNA抽出を行い、miR-47、miR-101、miR-197の発現レベルを調査した図3E。2-4siRNAによる未分化マーカー量の変化形質転換体の転写発現プロファイリングを、癌hTERT、c-Myc、p53、多分化能Oct4、Sox2、Klf4、幹細胞性PROM1に関連する遺伝子について評価した図3F。3siRNA混合物を使用した場合、Oct4、Sox2、hTERT、p53遺伝子は3siRNA混合物による処理に伴いアップレギュレイトし、c-MycとKlf4遺伝子はダウンレギュレイトした。一方でPROM1への影響は見られなかった。またmiR-47siRNAは、Oct3/4およびhTERT遺伝子をアップレギュレイトし、c-MycおよびKlf4遺伝子をダウンレギュレイトした。図3D中のは、mRNAの発現をβ-actinmRNAと比較した時に有意差があることを示す。以上の結果、miR-47siRNAの使用によって未分化マーカーOct3/4の発現がアップレギュレイトしたことから、HMV-Iは未分化状態に変換したか、少なくとも未分化状態に誘導されたと考えられる。また、癌遺伝子であるc-Mycがダウンレギュレイトしたことから、未分化状態に誘導された細胞は癌化が抑制された状態にあると考えられる。さらには、3siRNA混合物を使用した場合には、2つの未分化マーカーOct3/4、Sox2の発現がアップレギュレイトした。c-MycはmiR-47siRNAを使用した場合と同様に、ダウンレギュレイトした。また、癌抑制遺伝子であるp53がアップレギュレイトした。即ち、未分化状態に誘導された細胞は、c-Mycおよびp53の両面から癌化が抑制された状態にあると考えられる。以上の結果から、3つのmiRNAは、癌と、分化のメカニズムに関与していることが示唆された。また、3つのsiRNAは癌抑制と、癌細胞のリプログラミングの機能を有していることが示唆された。次に、siRNAをマウスに投与することで、癌抑制と癌細胞のリプログラミングについてさらに詳しく調査した。<実施例3:3siRNA混合物のマウスへの投与と、抗癌作用の評価>3-1siRNAの皮下投与3siRNA混合物DDSの皮下投与は、DDSのみのコントロール投与に比べて、HMV-I細胞の増殖性の抑制を示したKruskalWallisテストにおいてP<0.01、n=5図4。この試験には胸腺欠損マウスを用いた。DDSはアテロコラーゲンAteloGeneTMを用いた。3siRNA混合物とDDSは、メーカーのプロトコールに従い各100μMで混合した。図4中の上部に示した写真は、RNAを含まないアテロコラーゲンmockを皮下注射したときの写真である。下部に示した写真は、3siRNA混合物DDSを皮下注射したときの写真である。はRNAを含まないものとsiRNAを含むものの間に有意差P<0.01があることを示す。また、コントロールマウスは肺15.8±1.9結節と腹腔内0.8±0.6結節に複数の結節を示した表2。いくつかの転移性の病巣が腹腔内および腹腔外で観察され、皮下浸潤も観察された。3-2siRNAの静脈投与胸腺欠損マウスにHLF細胞を投与した後1週間後から、3siRNA混合物DDSを毎週静脈注射した。マウス当たりに1×107細胞を含む200μlをインジェクションした。DDSはアテロコラーゲンAteloGeneTMを使用した。3siRNA混合物とDDSは、メーカーのプロトコールに従い各100μMで混合した。28日後にその動物を屠殺し、肝内腫瘍と腹腔内転移の試験を行なった表3。この結果、3siRNA混合物DDSの静脈投与は、HMV-1細胞の抗転移能を有意に誘導したP<0.05、肺と肝臓それぞれ。肝臓と肺では転移がほとんど見られず、1匹のマウスのみで腹腔内への転移が見られた。以上の結果、3siRNA混合物をマウスに投与することで、癌の増殖と、転移を有意に抑制できることが示された。<実施例4:3siRNA混合物のマウスへの投与と、未分化マーカーの発現レベルの評価>4-1腫瘍におけるmiRNAとmRNAの発現レベルの評価方法siRNAで処理した腫瘍を用いてmiR-47、miR-101、miR-197の発現レベルの評価を以下の通り行った。miRNAの発現量は、細胞または組織からmirVanamiRNAIsolationkitを用いてmiRNAを抽出した後、MirXTMmiRNAqRTPCRSYBRKitを用いて調べた。これにより、siRNAによるmiRNAの発現抑制効果、およびmiRNAの発現量の変化を確認した。mRNAを定量化するために用いたプライマーセットの配列を表4に示す。ウエスタンブロット法はi-Blotゲル転写システムを用いて行った。抗体抗hTERT抗体、抗p53抗体、抗c-Myc抗体、抗Oct4抗体、抗PROM1抗体は1:500倍に希釈し、抗βアクチン抗体は1:1000倍に希釈した。LAS4000を使用して、化学発光シグナルを1分以内に検出した。4-1-1皮下投与皮下による異種移植によって、3つのmiRNAの抑制効果を実証した。前記異種移植は、1×107個のHMVI細胞を右側腹へ接種することにより確立した。触知できる腫瘍は播種から7日後に確認できた。10匹のマウスをランダムに2グループに分け、3siRNA混合物100μMn=5、または等量のDDSn=5を投与した。3siRNA混合物をトランスフェクションした細胞は、invitroで増殖が抑制された。5週間後、腫瘍を分析するためにマウスを屠殺した。腫瘍ボリュームはボリューム=π/6×横幅×縦幅×高さの式によって評価した。4-1-2尾静脈投与siRNA混合物400μMまたはDDSで処理する1週間前に、HMV-I細胞1×107細胞を胸腺欠損マウスの尾静脈にインジェクションした。siRNA混合物またはDDSは毎週投与し、腫瘍ボリュームまたは転移を5週間後に調査した。全てのマウスはJapaneseAssociationforAccreditationforLaboratoryAnimalCareapprovedfacilitiesで保管および飼育した。動物実験および取り扱いはfederalInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeguidelinesを厳格に遵守した。図5Aに示すように腫瘍のあるパーツ毎に分けて評価した。1は表面、2は内部、3は中央部分である。なお腫瘍はもろいため、わけ方はおおよそのものである。4-2腫瘍におけるmiRNAの発現レベルの評価結果腫瘍内のRNAの定量化、および高い再現性のシークエンシングを行ない、3siRNA混合物による、miR-47、miR-101、miR-197それぞれの発現抑制効果を評価した結果を図5Bに示す。データはクラスカルワーリステストn=5を用いて分析した。はDDS処理した腫瘍に対してmiRNA発現レベルに有意差P<0.01があることを示す。3つのmiRNAはの量は、3siRNA混合物を投与することによって減少する傾向が見られた。4-3ヘマトキシリンエオシン染色上記4-1-2で得られた腫瘍について、顕微鏡による調査結果HEヘマトキシリンエオシン染色;×400を図5Cに示す。上部はコントロールを、下部はsiRNAで処理した腫瘍を示す。siRNAで処理した腫瘍はHMV-I細胞で減少し、フィブロシスによる置き換わりに伴って腫瘍は壊死し、新血管新生は抑制された。4-4腫瘍における未分化マーカーの発現レベルの評価結果上記4-1-2で得られた腫瘍について、腫瘍、分化、多能性の関連遺伝子の転写レベルを試験した結果を図5Dに示す:P<0.05,:P<0.01。Oct4、Klf4、p53、hTERT、PROM1、Sox2は多能性、腫瘍形成、または癌幹細胞性に関与すると考えられる。2-△△法を用いてβ-actinmRNAの発現を比較した。図5D中においてCntlはコントロールDDSのみを表し、3mixは3siRNA混合物DDSを表す。この結果、3siRNA混合物はp53およびSox2のmRNAの上昇を誘導した。一方で、hTERT、PROM1、Oct3/4、Klf4は減少した。以上の結果、3siRNA混合物をマウスに投与することで、3つのmiRNAはダウンレギュレイトし、未分化マーカーであるSox2と、癌抑制遺伝子であるp53はアップレギュレイトすることが示された。次に、免疫組織科学的試験を利用して、癌細胞のリプログラミングについてさらに詳細に調査した。<実施例5:癌細胞のリプログラミングと、iPS細胞の評価>5-1miRNA-197の抑制と、hsa-mir-520dのアップレギュレーションの評価FuGeneキットRoche社製を用いて、miR-197siRNAを293FT細胞にトランスフェクションした後、顕微鏡で観察した図6A。また、ウイルスベクターpMIRNA1、SystemBioscienceSBI社製を用いて、hsa-mir-520dAccession:MI0003164をヒトの線維芽細胞細胞TIG-1-20に感染させた後、顕微鏡で観察した。このhsa-mir-520dは、RGM249shRNAをトランスフェクションすることによってアップレギュレイトされるmiRNAであるAnoncodingRNAgeneonchromosome10p153mayfunctionupstreamofhTERTMiuraetalBMCMolBiol2009Feb2105。上記ウイルスベクターから発現するhsa-mir-520dの塩基配列は5UCUCAAGCUGUGAGUCUACAAAGGGAAGCCCUUUCUGUUGUCUAAAAGAAAAGAAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGUUACGGUUUGAGA3配列番号43である。その推定2次構造を図6Bに示す。この配列において、ガイド鎖に相当する配列は5UCUACAAAGGGAAGCCCUUUCUG3配列番号41、パッセンジャー鎖に相当する配列は5AAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGU3配列番号42である。miR-197siRNAとhsa-mir-520dの発現量は、各RNA鎖とともに発現しているGFPプロテインを検出することで評価した。図6Aの上部はmiR-197siRNAで処理した細胞の写真である拡大率:×40。円形細胞が培地に出現した後、ES細胞のための培地ReproCELL社に移して観察した。下部は、hsa-mir-520dで処理した細胞の写真である拡大率:×100。以上により、miR-197siRNAとhsa-mir-520dの発現が確認された。こうして、miRNA-197の抑制またはhsa-mir-520dのアップレギュレーションを行った。5-2miR-197siRNA投与後の未分化マーカーの発現量の評価miR-197siRNAをトランスフェクションした293FT細胞ヒト胎児腎臓由来細胞株を、顕微鏡で免疫組織化学的に観察した結果を図6Cに示す。図6Cは未分化マーカーであるOct4とNANOGを検出している。上部0hrの3つは、トランスフェクションしていない293FT細胞を顕微鏡拡大率:×40で観察した写真である。左の列は身染色、真ん中の列は抗Oct4抗体によるローダミン染色、右の列は抗NANOG抗体によるローダミン染色を施した結果である。細胞の染色は各1週間行った。真ん中24hrの3つは、未分化状態の細胞をmiR-197siRNAで誘導してから24時間後に、顕微鏡で免疫組織化学的に観察した写真である。下部48hrの3つは、48時間後に、同様に顕微鏡で免疫組織化学的に観察した写真である。その結果、Oct4真ん中の列、拡大率:×100とNANOG右の列、拡大率:×200が強く発現していた。以上の結果、miR-197siRNAで処理した293FT細胞は、Oct4またはNANOGを発現したことから、リプログラミングされ、iPS細胞化したと考えられる。またその効率も良く、106細胞から20~100程度のiPS細胞が作成できた。この293FT細胞は、一般的にES細胞やiPS細胞にみられる細胞形状を有していた。また、培地中で7日後も未分化状態を維持していた。iPS細胞化した293FT細胞は、ES細胞用培養液で培養できるが、一般培養用の培養液でも十分培養可能であった。フィーダー細胞は不要であり、培養面のコーティングはコラーゲンでもマトリゲルでもよかった。5-3hsa-mir-520d投与後の未分化マーカーの発現量の評価hsa-mir-520dを各種癌細胞にウイルスベクターpMIRNA1、SystemBioscienceSBI社製で感染させ、強制発現させた。その後、上述の免疫組織科学的試験と同様の方法で未分化マーカーの発現量を観察した。その結果を図6D、図6E、図6Fに示す。使用した癌細胞は、HT1080細胞ヒト線維肉腫細胞株、T98G細胞ヒトグリオーマ細胞株、PK-45p細胞ヒト膵臓癌由来細胞株、HMV-I細胞ヒト悪性黒色腫由来細胞株、HLF細胞ヒト肝癌由来細胞株である。またHMV-I細胞、およびHLF細胞においては、未分化マーカーであるOct4またはNANOGを発現していた。以上の結果、hsa-mir-520dで処理した癌細胞は、リプログラミングされ、iPS細胞化したと考えられる。なおこのhsa-mir-520dを強制発現させた癌細胞は、一般的にES細胞やiPS細胞にみられる細胞形状を有していた。5-4生成したiPS細胞の各種遺伝子発現量の評価、およびhiPSCとの比較上記ようにして生成したiPS細胞における各種遺伝子の転写量を図7Aに示す。miR-197siRNAで処理した293FT細胞、およびhsa-mir-520dが過剰発現した293FT細胞における各種遺伝子の転写量は同じであった。図7Aは、その2つの細胞の転写量を、hiPSCHPS0002253G1GenerationofmouseinducedpluripotentstemcellswithplasmidvectorsOkitaetalNatProtoc5418428の発現量に対して比較した結果である。転写レベルはワンステップリアルタイムRT-qPCRで調査した。図中、hiPSCの発現量を0として表している。上部は、293FT細胞用の培地において293FT細胞にトランスフェクションまたは感染させてから48時間後の転写量である。下部は、その後2週間、ES細胞のための培地で維持したときの転写量である。トランスフェクションまたは感染させてから48時間後、Oct4、p53、RGM249mRNAは、hiPSCに比べてハイレベルで発現していた。その後2週間、ES細胞のための培地で維持後は、RGM249mRNAのみハイレベルで発現していた。他の遺伝子は、2週間後hiPSCとほとんど同レベルの発現量であった。hiPSCと293FT細胞におけるmiRNA-197とhsa-mir-520dの、miRNA発現レベルの関連性をツーステップリアルタイムRT-qPCRn=5で評価した結果を図7Bに示す。左のパネルはhsa-mir-520dの発現量を示す。左から、hiPSC、hsa-mir-520dを過剰発現している293FT細胞、miR-197siRNAで処理した293FT細胞、293FT細胞である。また右のパネルはmiRNA-197の発現量を示す。これにより形質転換体におけるmiRNA-197サイレンシングとmir-520d過剰発現を確認した。左のパネルから、生成したiPS細胞のhsa-mir-520dの発現量はhiPSCと類似していることがわかる。一方で、293FT細胞においてはhsa-mir-520dの発現量は有意にダウンレギュレイトしていることがわかる。右のパネルからは、生成したiPS細胞はmiRNA-197をhiPSCと同じくらい弱く発現していることがわかる。一方で、293FT細胞においてはmiRNA-197を他の細胞と比較して10倍多く発現していた。<実施例6:>hsamir520dに関する実験方法と結果6-1細胞invitroとinvivoにおけるhsamir520d発現の効果を評価するために、複数種類の細胞株とレンチウイルスベクターとを使用した。ヒトメサンギウム細胞株である293FTは、日本Invitrogen社から提供され、10FBS、01mMMEM非必須アミノ酸溶液、2mMLグルタミン、および1ペニシリンストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。強力なRGM249発現を有するヒト未成熟または未分化肝細胞株とRGM249の弱い発現を有する高分化肝癌細胞株を、アメリカ培養細胞系統保存機関から購入し、10FBSおよび1ペニシリンストレプトマイシンを添加したRPMI培地中で培養した。ウイルス処理により形質転換した細胞の未分化状態を維持するため、5ngmlのbFGF2を有するReproStem培地中で、細胞を培養した。ヒト誘導多能性幹細胞は、理研バイオリソースセンターの細胞バンクから提供された。6-2レンチウイルスベクター作製、及びトランスフェクションpMIRNA1mir520dGFPとモックベクターとしてのpCDHとを各々、293FT細胞へトランスフェクトした。上清中のウイルス粒子を回収するために、4°C、120分間、170000×gで遠心後、ウイルスペレットを回収し、LentiXTMqRTPCR滴定キットを使用して力価測定を行った。293FTまたはHLF細胞へのレンチウイルス感染のために、10cm培養プレート当たり100万個のウイルスを使用した。ポジティブコントロールとして使用したRGM249miRNA197siRNAを、ステルスRNAiデザイナーを用いて設計し、FuGENEHDトランスフェクション試薬を用いて、50nMの合成オリゴヌクレオチドを、293FT細胞へトランスフェクトした。また、520dHLF細胞が骨芽細胞へと分化誘導することを確認するために、通常のRPMI1640培地中に2Mのpurmorphamineを添加して、その細胞を一週間処理した。6-3免疫不全マウスとinvivo試験方法レンチウイルス感染後のHLFを回収し、1マウス当たり5×107個のHLF細胞を、各々のマウスの腹腔内および皮下へ接種した。注入体積は、200μlであった。6週齢の免疫不全マウスを、4週間通常給餌した。KSNSlcマウスを、100mgkgのネンブタールを腹腔内注射することにより麻酔し、解剖および組織学的検査のために屠殺した。皮下への異種移植を使用して、hsamir520dの抑制効果を実証した。体積評価は、以下の式を使用して決定した体積π6×幅×長さ×高さ。全ての動物は、日本実験動物管理公認協会承認施設で保管および飼育した。動物の研究と取り扱いについては国際動物実験委員会のガイドラインを厳格に遵守した。6-4RTPCRsmallRNA分画を含んだトータルRNAを、培養細胞またはホモジェナイズしたマウス組織から、mirVanamiRNA分離キットを使用して抽出した。MirXmiRNAqRTPCRSYBRキットを製造元のマニュアルに従って使用することにより、成熟型miRNAsの定量を実施した。U6smallnuclearRNAをインターナルコントロールとして使用した。トータルRNAを、OneStepRTPCRキットを用いて逆転写および増幅した。PCR解析とデータ収集解析とは、LineGeneを使用して実施した。サンプルの発現レベルを、検量線方法2ΔΔ法を使用して決定した。全てのデータを、インターナルコントロールであるβアクチンに対して標準化した。hTERTの推定は、本発明者が以前開発した定量方法に従って、コピー数により行った。そのRNA定量を、シークエンシングによって、高い再現性をもって確認した。miRNAを、MirXmiRNAqRTPCRSYBRキット、東京、日本を使用して定量した。siRNAによる抑制を確認するために、miRNA発現変化を評価した。mRNAまたはmiRNA定量用のプライマー配列を、表4に示す。有意差を、P005、P001として示した。6-5ウエスタンブロット20μgμlのタンパク質とiBlotゲル転写システムとを用いてウエスタンブロット解析した。製造元のマニュアルに従って、抗βアクチン抗体以外の抗体を1500倍に希釈し、抗βアクチン抗体を11000倍に希釈した。LAS4000を使用して、化学発光シグナルを1分以内に検出した。6-6免疫細胞化学製造元のマニュアルに従って、多能性幹細胞マーカーならびに胚性幹細胞マーカー抗体パネルを用いて、免疫組織化学的検査を実施した。293FT細胞およびHLF細胞に、miRNA197に対するsiRNAもしくはhasmir520dを含むレンチウイルス粒子をトランスフェクトまたは感染させた。浮遊するトランスフェクタントを回収し、顕微鏡観察用の新しい培養プレートまたは免疫染色用スライドチャンバーに移した。Huh7においても、293FTとHLFと同一の処理を、免疫細胞化学検査のために行った。6-7免疫組織化学免疫組織化学解析のために、4パラフォルムアルデヒド中で固定された肝臓組織標本を、常法により処理した。この試験で用いられたモノクローナル抗体は、以下のものである抗アルブミン抗体、抗AFP抗体、および抗GFAP抗体。ネガティブコントロールとしては、一次抗体を省略して染色工程を実行した。発現の程度は、病理専門家が評価した。6-8細胞周期解析細胞周期解析を実行するために、単一細胞懸濁物を、冷却したPBSで一度洗浄した。細胞ペレットを、その後、穏やかにチューブを振とうすることによりほぐして、ddH2O中の37ホルマリンを滴下して固定した。細胞を、少なくとも一晩、20°Cでインキュベートした。固定後、細胞を冷却したPBSを用いて二回洗浄してEtOHを除去した。その後、細胞を、100UmlのRNaseA含有PBS中に、1×106細胞mlにて再懸濁し、37°Cで50分間インキュベートした。50μgmlのヨウ化プロピジウムを直接加えて、光を遮蔽して氷上において40分間インキュベートした。DNA含量を、EXPO32ADC解析ソフトウエアを搭載したフローサイトメーターにより解析した。DNA含量は、pMIRNA1mir520dGFPクローンをトランスフェクト後に、約20000イベントで評価した。GFP陽性細胞を、MofloXDPセルソーターにより分取した。6-9組織学的検査腫瘍体積、ならびに肺、肝臓、腹腔内、および後腹膜腔への転移がんを、明視野イメージング機能を備えた解剖顕微鏡下または肉眼で検査および計測した。組織サンプルは、10緩衝ホルマリン溶液中で一晩固定し、PBSで洗浄し、70エタノールへ移した。その後、パラフィンに包埋し、薄切し、ヘマトキシリンエオシンを用いて染色した。6-10細胞における蛍光検出レンチウイルスmir520d発現ベクターによる感染効率を評価するために、緑色蛍光発現を検出した。6-11統計解析一観察変数を有し、P005を有意なものと見なすMannWhitneyUテストを用いて、3つの群群、およびmir520d群間で比較した。P005、P001である。6-12結果6-12-1293FT細胞へのhasmir520dのウイルス感染によるinvitro試験表現系の変化を、顕微鏡的に評価した。図8Aは、293FT細胞へのhasmir520dのウイルス導入後に出現した浮遊細胞集団を示す。GFP陽性浮遊細胞を、ES細胞用のフィーダー細胞不含有培地中で培養し、GFP発現を有するトランスフェクタントの増殖過程をタイムラプスモードで観察した。hasmir520dがウイルス感染した293FT細胞は、24時間以内にシート状の層を形成した。幹性化転換を、免疫細胞化学に基づき確認した。GFP陽性細胞は、抗Oct4抗体により強く染色された。3日から1週間後、細胞はより大きなコロニーに生育し、NANOG陽性状態を維持していた。トランスフェクタントの遺伝子発現を、RTPCR、Westernblot、および定量的miRNARTPCRにより評価した。ヒト誘導多能性幹細胞またはRGM249miRNA197siRNAによるトランスフェクタントと比較すると、hasmir520dが過剰発現した293FTは、p53とRGM249とを強力に転写的にアップレギュレートし、Oct4とhTERTとをより弱く発現した。293FTと比較すると、p53、RGM249、およびOct4は、より強くアップレギュレートされるが、hTERTは、同じレベルで発現されていた。ヒト誘導多能性幹細胞と比較すると、浮遊状態にある520d293FTでは、p53とOct4とがより強く転写的にアップレギュレートされていた。hTERTは、同等に発現されていた。293FTと比較すると、p53とOct4とは、より強くアップレギュレートされていたが、hTERTは同じレベルで発現されていた。Dicer1はアップレギュレートされていて、そのことは、520dが成熟する過程にDicer1が必要なことを示唆した。さらに、520d293FTにてhasmir520dの過剰発現と、およびRGM249miRNA197siRNAによるトランスフェクタント中におけるRGM249miRNA197の抑制とを確認後では、RGM249miRNA197発現はhiPSC中でのものと同等であった。2種類のオリゴヌクレオチドを用いて処理することにより、hiPSCレベルのmiRNA発現を有する細胞へと、293FT細胞を有意に誘導した。hasmir520dの過剰発現は、RGM249miRNA197のダウンレギュレーションを生じた。このことは、これらが、invivo用に適応できる材料であることも示唆している。細胞周期解析によると、293FTおよびモックウイルス感染293FTと比較して、520d293FTは、G0期が増加し、S期が減少していた。520d293FT細胞中のエピジェネティックマーカーは、mock293FTと比較した場合、高レベルで有意に維持されていた。しかし、DNMT1メチルトランスフェラーゼは、293FTまたはmock293FT中でのものと同程度であった。6-12-2HLF細胞へのhasmir520dウイルス感染によるinvitro試験hasmir520d発現ベクターを受容したHLF細胞以下520dHLFと称することもあるを、10cmプレート当たり20~50個の新規細胞集団へと転換した。図11Aに形態学的変化を示す。これらの細胞は、GFPおよび多能性マーカーを発現していた。その中で、Oct4およびNANOGは、転写的にアップレギュレートされていた。対照的に、RGM249、CD44、Alb、およびp53は、有意にダウンレギュレートされていた。浸潤アッセイにおいては、多能性マーカー陽性細胞のほとんどは、フィブロネクチン膜を通過して移動することはできなかった。対照的に、mockHLF細胞は、容易に移動することができた。ウエスタンブロットは、Oct4およびp53のアップレギュレーションを示した。hasmir520d発現HLF細胞中で、DICER1が抑制されていた。mockHLF細胞と比較した場合、520dHLF細胞では、メチル化マーカーが有意に低いレベルで維持されていた。細胞周期解析によると、mockHLFと比較して、520dHLF細胞はS期が増加し、G0期が減少していたことを示した。mir520dを安定的に発現する10クローンのHLF細胞を、ES用培地で一ヶ月間に渡り培養した後には、HLFのものと比べて、520dHLF細胞中でのhTERTおよびアルブミンはダウンレギュレートされていた。520dHLF細胞中での、Oct4およびp53はアップレギュレートされていた。がん幹細胞マーカーは、HLF、hiPSC、520dHLF細胞間では有意差はなかった。CD44発現は有意に減少していた。さらにまた、mir520dによるHuh7細胞における多能性誘導を検証した。小さく丸い細胞集団におけるOct4およびNANOG発現は、モックベクターによる誘導と比較して、より上昇していた。また、2μMのpurmorphamine添加により、ALP、SPP1、およびIBSPのアップレギュレーションを有する骨芽細胞へと、520dHLF細胞を誘導した。図13はHLF細胞の場合の初期化レベルを検討するためのグラフである。293FT細胞と共通しているのは、AIDDNMT1の発現レベルのみであり、293FTではHDACSin3AMBD3が有意に発現を高めるのに対し、HLFではそれらの発現が有意に低下した。6-12-3hasmir520dウイルスが感染したHLF細胞によるinvivo試験hasmir520dのレンチウイルス発現ベクターまたはモックベクターにより、HLF細胞を感染したのち、その細胞を、免疫不全マウスの腹腔内間隙へ注射した。hasmir520dを発現したHLF細胞を注入したマウス群の75は、腹腔内または注射針の刺入部分に沿って腫瘍を形成した。対照的に、100のモック感染群は、白色結節にて組織学的に未分化肝癌細胞を、腹腔内または肝臓に形成した。125のマウス群中の520dHLF細胞は、を有し、部分的に腺腫様過形成を内部に有する正常肝組織へと転換した。375のHLF細胞は、表皮を有する類皮嚢胞と、汗腺とおよび皮脂腺とからなる奇形腫に形質転換した。生成した奇形腫と肝組織は、GFPタンパク質を発現していた。肝組織中のほとんど全ての肝細胞がヒトアルブミンを強く発現しているのを免疫組織化学染色により確認した。肝星細胞筋線維芽細胞のマーカーである、グリア線維性酸性タンパク質およびアルファフェトプロテインは、弱く発現していた。このことは、一ヶ月間に、520dHLF細胞が未成熟肝組織へと分化したことを示唆する。50は、全く腫瘍および特定組織を形成しなかった。6-12-4hasmir520dウイルスが感染したHLF細胞の分化また、免疫組織化学的分析により、未分化な肝臓組織のマーカーを用いて肝組織を構成する肝細胞、胆管、静脈、星細胞などの存在を確認できた図15。骨分化誘導によりOsteopontinsialoprotein陽性の骨芽細胞を得たことから、内中外胚葉へ分化できる間葉系幹細胞MSCに形質転換できた。図16。6-12-5hasmir520dウイルスが感染した各種悪性腫瘍細胞の評価図17は高分化型肝癌Huh7細胞について評価した結果である。肝癌細胞においては分化度に関わらず、同等に多能性マーカー強陽性に変化させることができた。図18は多形性膠芽腫T98G細胞について評価した結果である。未分化脳腫瘍においても幹性誘導し、invivoで腫瘍を形成せずに正常組織に生着した。図19は膵癌PK-9細胞について評価した結果である。膵癌においても幹性誘導が見られた。図20は線維肉腫HT1080細胞について評価した結果である。非上皮性悪性腫瘍である肉腫細胞をも幹性誘導し、脂肪細胞へ分化させることができた。<実施例7:hsamir192siRNA等に関する実験方法と結果>7-1細胞HMVIT98Gヒト神経膠芽腫HT1080ヒト線維芽肉腫Pk45ヒト肝臓癌7-2検討したmiRNA7-3shRNA表5のmiRNAに対するshRNAhsamir192shRNA、hsamir196a1shRNA、hsamir4233pshRNA、hasmir222shRNAをコードするベクターは、GenScriptcorpNJUSAから購入した。このベクターは、pRNATinH14Lentiに上記shRNAをコードする塩基配列が組込まれたものである以下、siRNA生成ウイルスと証することもある。細胞に導入後、shRNAを発現し、さらにsiRNAを生成することができる。7-4siRNA表5のmiRNAに対するsiRNAhsamir192siRNA、hsamir196a1siRNA、hsamir4233psiRNA、hasmir222siRNAは、StealthRNAidesignerInvitrogen社によって入手した。配列を表6に示す。これらsiRNAが細胞増殖抑制等の効果を有していることを確認した後、上記7-3のshRNAでさらに細胞増殖抑制等の効果がみられるかどうかを検証するという流れで実験を行った。なお、hsamir192siRNA、hsamir196a1siRNA、hsamir4233psiRNA、hasmir222siRNAhsamir192siRNA等のアンチセンス鎖において、表5のmiRNAの配列に対して、相補的な関係にある部分の配列を表7に示す。この相補的な部分が、RNAi又はmiRNAの作用において特に重要な部分と考えられる。また、さらにその部分に相補的なセンス鎖の配列を併せて示す。7-5細胞へのレンチウイルスのinfection細胞へのinfectionは、まず、293FTまたは293H細胞へレンチウイルスベクターをtransfectionし、上清を回収し、遺伝子実験施設にある超遠心機で、27000rpm、2時間遠心してウイルスを回収し、ペレットをPBSに溶解し、力価を検討後、-80度で保存した。そのウイルスを用いて、力価に基づき、各50μlずつ細胞に感染させた。また、3種類のsiRNA共感染または4種類のsiRNA共感染では、1種類のウイルス粒子が有効に作用する力価で感染させた。7-6RNAの抽出mirVanamiRNAIsolationKitを使用してmiRNAtotalRNAを抽出した。washした細胞にTorizolReagentLifeTechnologiesCarlabadCAUSAを添加し、3分間インキュベート後TorizolReagentの15量のchloroformニッポンジーンTokyoJapanを添加した。15秒間振盪後、14000rpmで15分間遠心を行った。得られた上清の110量の100エタノールを加え、数回転倒混和しspincolumnに入れ、10000gで15秒遠心した。カラムをwashするためmiRNAWashSolution1を700μl加え、10000gで15秒遠心した。更にWashSolution23を500μl加え、同様に遠心した。この作業を2回繰り返し、あらかじめ、95度に温めておいたRNaseDNaseFreeWaterを100μl加え、同様に遠心、そして、この過程を2回繰り返した。その後、真空濃縮を40分間し、そのうち2μlを使用し、NanoDropバイオメディカルサイエンスTokyoJapanを用いて濃度を測定した。7-7realtimeRTPCRRGM249hTERTSox2p53cMycOct4PROM1の7種類の発現を調べるためにQIAGENOneStepRTPCRKitを使用した。GAPDHβactinをコントロールとした。検討した遺伝子は多能性関連マーカー、未分化マーカー及び分化マーカー、テロメレース関連遺伝子を使用した。7-8蛋白質抽出PBSでwashした細胞をtrypsin処理した後、エッペンドルフチューブに回収し、蛋白分解酵素阻害剤CompleteMiniを含むCellLysisBuffer22μlを加え、たんぱく質抽出液を得た。そのうちの2μlをNanoDropを用いて濃度測定に使用した。7-9WesternBlot解析iBlottmドライブロッティングシステムInvitorogenTokyoJapanを使用し、電気泳動したゲルをセミドライ状態でメンブレンに転写した。その後WesternBreezeイムノディテクションキットInvitorogenTokyoJapanを使用し、ブロッキング30分、リンス5分×2、一次抗体60分、wash5分×4、二次抗体30分、wash5分×4、リンス2分×2を行った。そして、ケミルミネッセンス25mlをメンブレンに添加し5分後、遺伝子実験施設のLas1000plusで検出した。7-10cellcycle解析1×106個の細胞をwashした後、trypsin処理し15mlチューブに回収した。その後、95エタノールを5ml加え、オーバーナイトで固定した。翌日1μgmlのRNaseを1ml加え、1時間37度でインキュベートした後、PIを5μl加え、30分以上4度、遮光で遺伝子実験施設のEPICSALTRAで解析を行った。7-11MTTassayPBSでwashした細胞をtrypsin処理した後、96wallプレートに1×106個の細胞を100μlずつ蒔いた。Promega社のCellTiter96RNonRadioactiveCellProliferationAssaykitを使用して細胞増殖能を検討した。7-12colonyformationassaysoftagerを使用して、形質転換を起こした細胞の足場依存性及び腫瘍形成能を検討した。60mmディッシュにボトムアガロースを23ml入れ、ある固形化した後、トップアガロースで重層した。そして、そのディッシュに細胞を播き、12週間培養し、その後、細胞をカウントした。7-13miRNAの定量Takara社のmirxmiRNA定量kitを用いて定量した。指定されたプロトコールに準じて施行した。7-14ゲノムへのウイルスベクターの取り込み検討感染効率はレンチウイルスベクターの情報に準じて評価した。感染をGFP発現に関して蛍光顕微鏡で可視化して判定し、neomycinの導入、miRNAの導入を感染細胞の一部よりDNAまたはRNAを抽出し、PCRで増幅後、電気泳動で可視化して評価した。ゲノムへの取り込み部位の検討は施行しなかった。7-15実験結果7-15-1siRNA生成Lentivirus感染後のHMV1におけるMTTassay各siRNA生成ウイルスを感染させたHMV1でのMTTassayを3日間施行した図21。3種類のsiRNA共感染または4種類のsiRNA共感染細胞で有意に増殖抑制を確認した。統計学的有意差をで示した。7-15-2siRNA生成Lentivirus感染2週間後でのHMV1の蛍光顕微鏡写真と増殖曲線各siRNA生成ウイルス感染による導入はmiRNA発現を阻害した。また、細胞の増殖抑制を示す経時的変化を示した図22。図中のトップパネルは、1週間後のmockとhsamir196a1hsamir4233phsamir222でのGFP検出のための蛍光顕微鏡写真である。図中のボトムパネルは、ウイルス感染後のHMV1の増殖曲線である。コントロール、mock、hsamir192、hsamir196a1siRNA、hsamir222siRNAと比較して、3種類のsiRNA共感染または4種類のsiRNA共感染で顕著な増殖抑制を観察し、感染細胞は3週間以内にアポトーシスに至った。7-15-3HMV1のsiRNA生成レンチウイルス感染におけるcolonyformationassaymiRNAに対するsiRNAを生成するウイルスベクターに感染させ、siRNAが導入されたHMV1において、腫瘍形成能を評価するためにsoftagerを用いて、colonyformationassayを行った図23。コントロールではコロニーを多数形成しているのに対し、hsamir192単独導入、4種類のmiRNAの共発現で、顕著にコロニー形成能が抑制された。hsamir192に対するsiRNAでは途中までコロニー形成を認めたが、その後、増殖は止まり、そのまま細胞の断片化を起こしてアポトーシスに至った。また、4種類の共感染ではコロニーを形成することはなかった。以上の実施例における各種材料および操作方法は、特に記載のない限り、以下の通り行なった。アンタゴマーの合成アンタゴマーmiRNAを標的としたsmallRNAのデザインと合成はInvitrogen社StealthRNAidesignerとGenScript社へ委託したpRNATinH14LentipRNATT61neo。shRNA-generatingベクターはBLOCKitInducibleH1RNAiEntryVectorInvitrogenCAUSAを用いて、プロトコールに沿って作成した。セルラインHLF細胞ラインとHMV-I細胞ラインはAmericanTypeCultureCollectionとTohokuUniversityからそれぞれ購入し、10FBSと1ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI培地で培養した。アンタゴマー処理の場合、HMV-1細胞を50nMのantagomirとともにインキュベーションした。RNAiFuGeneHDtransfectionReagentRocheDiagnosticGmbHを使用して、HLFまたはHMV-I細胞に、50nMsiRNA、コントロールのオリゴヌクレオチド、または空のベクターをトランスフェクションした。ダイサーDicerenzymeはGenlantisから購入し、プロトコールに沿って使用した。3つのmiRNAは、ダイサーで消化したものをmiRCATmicroRNAcloningkitIntegratedDNATechnologiesでクローニングすることによって得た。免疫不全マウスは、CharlesriverからCAnNCgFoxn1BALBcnuを、SHIMIZULaboratorySuppliesCoLtd.からKSNSlcを購入した。RNAの単離とmiRNAの定量トータルRNA、smallRNAフラクションは、培養細胞またはホモジナイズしたマウス組織から、mirVanamiRNAIsolationKitAmbionを用いて抽出した。miRNAの成熟化の定量は、MirXTMmiRNAqRTPCRSYBRkitTakaraBioCompanyを用いて説明書に従って行った。U6smallnuclearRNAをインターナルコントロールとして使用した。mRNAのリアルタイムPCRトータルRNAは、OneStepRTPCRkitQIAGENを用いて逆転写及び増幅させた。PCRとデータ収集分析はLineGeneTOYOBOを用いて行った。サンプルの発現レベルは、検量線方法2ΔΔ法を使用して決定した。全てのデータを、インターナルコントロールであるβアクチンに対して標準化した。hTERTおよびRGM249の推定は、本発明者が以前開発した定量方法に従って、コピー数により行った。mRNAに関しては50ngμlで、smallRNAに関しては100ngμlで試験した。免疫ブロッティングウエスタンブロット解析をiBlotゲル転写システムを使用して実行した。目的バイオマーカー遺伝子に対するそれぞれの抗体を、製造元のマニュアルに従った希釈率を用いて使用した。20μgの細胞抽出物を試験した。腫瘍形成および転移に関する実験取大学動物実験委員会で承認されたプロトコルに基づいて、動物実験を実施した。腫瘍細胞接種、検死、および組織学的解析を、実験方法セクションに記載したように実施した。播種から7日後、ショートサイレンスオリゴヌクレオチドによる処理を、マウスの尾静脈または右側腹の皮下に、siRNAまたはshRNA100μMを週一回のペースで4~5週にわたって行なった。腫瘍を摘出して計量した。腫瘍体積、ならびに肺、肝臓、腹腔内、および腹腔外転移がんを、明視野イメージング機能を備えた解剖顕微鏡下または肉眼で検査および計測した。組織サンプルは、10緩衝ホルマリン溶液中で一晩固定し、PBSで洗浄し、70エタノールへ移した。その後、パラフィンに包埋し、薄切し、ヘマトキシリンエオシンを用いて染色した。転移プロセスの後期ステージにおけるantagomirの効果を評価するために、胸腺欠損マウスの尾静脈を介するかまたは皮下に腫瘍細胞を移植した。次に、腫瘍細胞移植7日後に、同所性の実験に使用したと同一の用量と頻度でantagomir治療を開始した。静脈内投与の場合は全身性転移によって、または、皮下接種の場合は肝臓転移もしくは腹腔内転移によって、マウスは30日目には瀕死の状態になり、安楽死させた。毒性の評価胸腺欠損マウスを、1グループにつき5匹に分けて、PBSDDSまたは50μMのアンタゴマーを、週一回のペースで4~5週間にわたって6回、静脈投与した。体重は2週に1回のペースで測定した。マウスは最後の投与後6日で安楽死させ、組織を収集した。全血の一定分量をEDTAで処理したチューブに集めた。遠心分離により血球細胞を除去して、血漿を得た。サンプルを、オリンパス社製Bioanalyzerを使用して解析し、血液の生化学的値を測定した。全ての可能な病理状態に関して、肺または肝臓の切片を検査した。ヒト正常細胞への誘導miRNA-47、-101、-197に対するsiRNAをトランスフェクションすることにより、293FT細胞はヒト正常細胞へと誘導された。その後、RT-PCRとウエスタンブロット法を用いて関連遺伝子の発現の変化を評価した。免疫組織化学試験製造元のマニュアルに従って、未分化マーカーならびに胚性幹細胞マーカー抗体パネルを用いて、免疫組織化学検査を実施した。細胞に、miRNA197に対するsiRNAをトランスフェクトまたは感染した。浮遊するトランスフェクタントを回収し、顕微鏡観察用の新しい培養プレートまたは免疫染色用スライドチャンバーに移した。hiPSCHumaninducedpluripotentstemcellsヒト人工多能性幹細胞であるhiPSCHPS0002253G1はRikenBioresourceCenterCellBankGenerationofinducedpluripotentstemcellswithoutMycfrommouseandhumanfibroblastsNakagawaMetalNatBiotechnol26101106から提供された。培養条件miR-197siRNAまたはhsa-mir-520dを導入して作成した多能性幹細胞は、ES細胞用培養液で培養できるが、F12HAMDMEMRPMI1640LglutamineDMEMhighglucoseLglutamine01mMNEAAおよびREPROSTEM:bFGF310ngmlからなる群から選ばれる1種以上の培地で37°C、5CO2、10FBSの条件で培養可能であった。フローサイトメトリーmiRNA197に対応するsiRNAをトランスフェクトした293FT細胞を使用して、トリプシンにより分離脱着した細胞上で、フローサイトメトリーを実行した。単一細胞懸濁物を、冷却したPBSで一度洗浄した。細胞ペレットを、その後、穏やかにチューブを振とうすることによりほぐして、ddH2O中の冷却70EtOHを滴下して固定した。細胞を、少なくとも一晩、20°Cでインキュベートした。固定後、細胞を冷却したPBSを用いて二回洗浄してEtOHを除去した。その後、細胞を、100UmlのRNAaseA含有PBS中に、1×106細胞mlにて再懸濁し、37°Cで50分間インキュベートした。50μgmlのヨウ化プロピジウムを直接加えて、光を遮蔽して氷上において40分間インキュベートした。DNA含量を、フローサイトメーターにより解析した。リプログラムされた細胞の発現を評価するために、EXPO32ADC解析ソフトウエアを搭載したフローサイトメーターにより、siRNA197をトランスフェクション後、約20000イベントで、iPS細胞を評価した。GFP発現細胞もしくはPE陽性細胞のフローサイトメトリーを用いた精製に関しては、ウイルストランスダクション過程の完了24時間後に、293FT細胞またはHLF細胞を、5FCSを添加したリン酸緩衝液中に再懸濁した。PE抱合抗アルカリホスファターゼ抗体で、細胞を染色後、GFP陽性細胞またはPE陽性細胞を、MofloXDPを使用して分取および解析した。1×108細胞を、アルゴンレーザーを用いて、フォワードスキャッター、サイドスキャッター、ならびにPEおよびGFP蛍光に関して解析した。検出器としては、各々、GFPに関してはFL1を、PEに関してはFL2を使用した。頭蓋内注入方法免疫不全マウスをペントバルビタールナトリウムを用いて麻酔し、定位固定装置中に配置した。外科手術中、動物の体温を、加熱パッドを使用して、37°Cに維持した。頭蓋を露出し、左線条体の上に、小規模な開頭を作製した。ポリエチレンの管を介して10μlのハミルトンシリンジに連結された30Gの注射針を、細胞移植用に使用した。注射針を、左線条体に定位的に挿入05mm、L20mm、D25mmし、5μlの細胞懸濁物を圧力注射した。注射後、その注射針をゆっくりと引き抜いて、頭蓋の孔を、歯科用セメントを用いて被覆した。切開部を、60プロレンを用いて縫合した。外科手術から回復後、動物を元の飼育ケージへと戻した。<結果の考察>以上の結果を踏まえて考察する。実施例の結果、RGM249shRNAは悪性腫瘍の増殖抑制、悪性腫瘍の転移抑制、細胞内RGM249mRNA量の抑制、または細胞内hTERTmRNA量の抑制の効果を有していることが示された。また、3つのsiRNAは、悪性腫瘍の増殖抑制、悪性腫瘍の転移抑制、細胞内の3つのmiRNA量の抑制、未分化マーカーのアップレギュレイト、p53のアップレギュレイト、または正常細胞もしくは悪性腫瘍細胞のリプログラミングの効果を有していることが示された。hsa-mir-520dは、未分化マーカーのアップレギュレイト、p53のアップレギュレイト、または正常細胞もしくは悪性腫瘍細胞のリプログラミング、悪性腫瘍の増殖抑制等の効果を有していることが示された。また、hsamir192siRNA等についても類似の効果が見られた。マウスで見られた悪性腫瘍の抑制は、悪性腫瘍細胞のリプログラミングが要因のひとつであると考えられる。また、未分化型だけでなく高分化型肝癌細胞でもOct4陽性かつNANOG陽性細胞になり、分化型によらない幹性化効果が見られた。なお、RGM249shRNAと3つのsiRNAは、RGM249mRNAから始まるカスケードを遮断する点で機能が共通しており、この機能が上記の悪性腫瘍の抑制や悪性腫瘍細胞のリプログラミング等の効果に関与していると考えられる。hsa-mir-520dはこのときアップレギュレイトしていると考えられる。以上から、RGM249shRNA、3つのsiRNA、hsa-mir-520d、hsamir192siRNA等はいずれも悪性腫瘍治療に好適に使用できると考えられる。さらには、これらsmallRNAは体内外で細胞を多能性幹細胞へと誘導する誘導剤、または多能性幹細胞を生産するための試薬として好適に使用できると考えられる。特に、癌遺伝子を使用しない点、悪性腫瘍細胞をリプログラミングできる点、単剤でリプログラミングできる点、p53のアップレギュレイトが生じる点、または培養時にフィーダー細胞が不要である点において従来の多能性幹細胞を生産するために研究されてきた化合物よりも優れた特性を有していると考えられる。特に悪性腫瘍細胞のリプログラミングについては世界的にほとんど研究成果がでていない領域であり、今後の悪性腫瘍治療の新たな可能性を秘めている。また、p53については、そのノックアウトやノックダウンがiPS細胞の作成効率を上昇させることが報告されているZhaoetalCellStemCell2008Nov634759、HongetalNature2009Aug2746011325Epub2009Aug9ため、上記smallRNAを用いて得られた多能性幹細胞が、p53をアップレギュレイトしていたことは驚くべき結果であった。そしてこの多能性幹細胞は、p53が発現しているため悪性腫瘍化しにくいと考えられる。なお、上記smallRNAを導入した細胞の腫瘍化は、導入後未分化維持環境を持続させる場合に生じ、生体内では腫瘍は発生しにくかった。そのため、細胞にsmallRNA導入後は1週間以内に治療に用いることが好ましい。またRGM249shRNA、3つのsiRNA、hsa-mir-520dは、それぞれへアピン様構造の1本鎖、2本鎖、pre-miRNA様構造の1本鎖からなっている。このことは、siRNAまたはmiRNAが機能するときの2次構造は必ずしも固定されたものではなく、ある程度の範囲を許容できることを示唆している。なお上記実施例において3つのsiRNA、hsa-mir-520d、またはhsa-mir-192siRNA等は、標的RNA鎖をRNAiまたはmiRNAの作用でサイレンシングしていると考えられる。しかし仮に他のメカニズムが働いていたとしても、3つのsiRNAのセンス鎖配列番号4、配列番号5、または配列番号6およびアンチセンス鎖配列番号1、配列番号2、または配列番号3、hsa-mir-520d配列番号43、またはhsa-mir-192siRNA等配列番号44等を使用すれば、上記のような効果が得られることは明らかである。または、ここで示されない標的RNA鎖と反応していても同様である。以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。"