"明細書中に記載の発明。発明の要旨本発明は、非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液を用いて、これが、凍結乾燥の間および後、すなわち、凍結乾燥の際uponの凝集および分解に対して生物学的分子を安定化させ得るという驚くべき発見に起因する。1つの局面によれば、本発明は、少なくとも1つの非晶質賦形剤、少なくとも1つの非晶質緩衝剤、および少なくとも1つのMenC免疫原を含む溶解緩衝液を提供する。別の局面によれば、本発明は、凍結乾燥の際、1つ以上のMenC免疫原を安定化させる方法を提供する。この方法は、少なくとも1つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液中にMenC免疫原を溶解して混合物を形成する工程、次いでこの混合物を凍結乾燥する工程を包含する。なお別の局面において、本発明は、1つ以上のMenC免疫原を保管貯蔵する方法を提供する。この方法は、少なくとも1つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液中にMenC免疫原を溶解して混合物を形成する工程、次いでこの混合物を凍結乾燥する工程を包含する。なお別の局面において、本発明は、MenC免疫原を凍結乾燥する方法を提供する。この方法は、少なくとも1つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液中にMenC免疫原を溶解して混合物を形成する工程、この混合物を、約1000Pa~約2000Paの圧力下で約10°C~約20°Cで負荷する工程、この混合物を約1000Pa~約2000Paの圧力下で約-70°C~約-50°Cの温度で約1時間~約4時間凍結させる工程、この混合物を約5Pa~約10Paの圧力下で約-50°C~約-35°Cの温度で約18時間~約30時間乾燥させる工程、およびこの混合物を約5Pa~約10Paの圧力下で約10°C~約20°Cの温度で約2時間~約12時間乾燥させる工程、を包含する。別の局面において、本発明は、MenC免疫原の凍結乾燥のための方法を提供する。この方法は、少なくとも1つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液中でMenC免疫原を溶解して混合物を形成する工程、この混合物を、約1000Paの圧力下で約10°Cで負荷する工程、この混合物を約1000Paの圧力下で約-50°Cの温度で約2時間凍結させる工程、この混合物を約5Paの圧力下で約-35°Cの温度で約24時間乾燥させる工程、およびこの混合物を約5Paの圧力下で約20°Cの温度で約8時間乾燥させる工程、を包含する。別の局面において、本発明は、凍結乾燥の際、MenCワクチンを安定化させる方法を提供する。この方法は、少なくとも1つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液中でMenCワクチンを溶解して混合物を形成する工程、およびこの混合物を凍結乾燥する工程、を包含する。例えば、本発明は以下を提供する。項目1少なくとも1つの非晶質賦形剤、少なくとも1つの非晶質緩衝剤、および少なくとも1つのMenC免疫原を含有する、溶解緩衝液。項目2前記非晶質緩衝剤が有機緩衝剤である、項目1に記載の溶解緩衝液。項目3前記有機緩衝剤が、イミダゾール緩衝剤およびヒスチジン緩衝剤からなる群より選択される、項目2に記載の溶解緩衝液。項目4前記非晶質賦形剤が糖である、項目1に記載の溶解緩衝液。項目5前記糖がスクロースである、項目4に記載の溶解緩衝液。項目6前記MenC免疫原がMenC-CRM197である、項目1に記載の溶解緩衝液。項目7凍結乾燥の際に1つ以上のMenC免疫原を安定化するための方法であって、以下:a該MenC免疫原を、少なくとも1つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含有する溶解緩衝液に溶解して、混合物を形成する工程、ならびにb該混合物を凍結乾燥する工程、を包含する、方法。項目8前記MenC免疫原がMenC-CRM197である、項目7に記載の方法。項目9項目7に記載の方法に従って安定化された、凍結乾燥組成物であって、少なくとも1つの非晶質賦形剤、少なくとも1つの非晶質緩衝剤、および少なくとも1つのMenC免疫原を含有する、組成物。項目101つ以上のMenC免疫原を貯蔵するための方法であって、以下:aMenC免疫原を溶解緩衝液に溶解して混合物を形成する工程であって、該溶解緩衝液が、少なくとも1つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含有する、工程、ならびにb該混合物を凍結乾燥する工程、を包含する、方法。項目11前記MenC免疫原がMenC-CRM197である、項目10に記載の方法。項目12MenC免疫原の凍結乾燥のための方法であって、以下:MenC免疫原を溶解緩衝液に溶解して混合物を形成する工程であって、該溶解緩衝液が、少なくとも1つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含有する、工程;該混合物を、約10°C~約20°Cで、約1000Pa~約2000Paの圧力下で負荷する工程;該混合物を、約1時間~約4時間、約-70°C~約-50°Cの温度で、約1000Pa~約2000Paの圧力下で凍結させる工程;該混合物を、約18時間~約30時間、約-50°C~約-35°Cの温度で、約5Pa~約10Paの圧力下で乾燥する工程;および該混合物を、2時間~約12時間、約10°C~約20°Cの温度で、約5Pa~約10Paの圧力下で乾燥する工程、を包含する、方法。項目13前記MenC免疫原がMenC-CRM197である、項目12に記載の方法。項目14MenC免疫原の凍結乾燥のための方法であって、以下:MenC免疫原を溶解緩衝液に溶解して混合物を形成する工程であって、該溶解緩衝液が、少なくとも1つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含有する、工程;該混合物を、約10°Cで、1000Paの圧力下で負荷する工程;該混合物を、約2時間、約-50°Cの温度で、1000Paの圧力下で凍結させる工程;該混合物を、約24時間、約-35°Cの温度で、約5Paの圧力下で乾燥する工程;および該混合物を、約8時間、約20°Cの温度で、約5Paの圧力下で乾燥する工程、を包含する、方法。項目15前記免疫原がMenC-CRM197である、項目14に記載の方法。項目16凍結乾燥の際にMenCワクチンを安定化するための方法であって、以下:a該MenCワクチンを溶解緩衝液に溶解して混合物を形成する工程であって、該溶解緩衝液が、少なくとも1つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含有する、工程、ならびにb該混合物を凍結乾燥する工程、を包含する、方法。項目17前記MenCワクチンがMenC-CRM197である、項目16に記載の方法。項目18項目16に記載の方法に従って安定化された、MenCワクチンであって、少なくとも1つの非晶質賦形剤および少なくとも1つの非晶質緩衝剤を含有する、MenCワクチン。発明の詳細な説明本発明は、緩衝液組成物、生物学的分子組成物、ならびに凍結乾燥時の生物学的分子の凝集および分解を減少させることによる生物学的分子の調製および安定化のための方法を提供する。この組成物および方法は、結晶化し得る非晶質性のない緩衝剤および賦形剤と完全に非晶質かまたは部分的に非晶質な緩衝剤および賦形剤との交換に関する。本明細書中で用いられる場合、用語溶解緩衝液は、あるタンパク質または複数のタンパク質を凍結乾燥のために溶解するための溶液をいう。この溶解緩衝液は、少なくとも1つの非晶質賦形剤および少なくとも1つの非晶質緩衝剤を含む。好ましい実施形態において、溶解緩衝液は、MenC免疫原をさらに含む。さらに好ましい実施形態において、溶解緩衝液は、MenC-CRM197をさらに含む。本明細書中で用いられる場合、用語生物学的分子は、タンパク質、核酸、および糖を含むがこれらに限定されない。生物学的分子は、個々にまたは他の生物学的分子と組み合わせて使用され得る。本発明の好ましい実施形態において、生物学的分子は免疫原である。さらに好ましい実施形態において、生物学的分子はMenC免疫原である。なおさらに好ましい実施形態において、生物学的分子はMenC-CRM197である。本明細書中で用いられる場合、用語タンパク質は、ポリペプチド、ペプチド、およびこれらのアナログをいう。タンパク質はまた、複数のポリペプチドおよび他の生物学的分子と複合体化しているペプチドも含む。本発明の好ましい実施形態において、タンパク質は免疫原である。本明細書中で用いられる場合、用語免疫原は、細胞に接触した場合に細胞および/または体液の免疫応答を誘発し得る任意の化合物をいい、ワクチンおよび免疫原を含む組成物が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、抗体の応答およびT細胞の応答が誘発される。このような免疫原は、予防目的の適用および治療目的の適用、ならびに抗体の生成に関する研究目的の適用において有用であると考えられる。本明細書中で用いられる場合、用語核酸は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドをいい、DNAおよびRNAを含む。本明細書中で用いられる場合、用語糖は、オリゴ糖および多糖を含む。本発明中で用いられる場合、用語非晶質賦形剤は、凍結乾燥時に非晶質性を維持する賦形剤をいう。特定の条件下では非晶質性を維持するが、他の条件下では結晶化し得る賦形剤が含まれる。賦形剤の非晶質の性質を維持する条件は、本発明に含まれる。非晶質賦形剤は当業者に周知であり、スクロース、ラクトース、および本明細書中に記載される条件下ではマンニトールを含む糖類が挙げられるがこれらに限定されない。非晶質賦形剤としてはまた、当業者に周知の条件下ではセルロース、特にソルビトールが挙げられ得るが、これらに限定されない。非晶質賦形剤は、個々にかまたは2つ以上の異なる非晶質賦形剤を含む混合物としてかのいずれかで使用され得る。好ましい実施形態において、この非晶質賦形剤はスクロースである。より好ましい実施形態において、溶解緩衝液中のスクロースの終濃度は約1.5~約5である。本明細書中で用いられる場合、用語MenCワクチンは、少なくとも1つのMenC免疫原を含むワクチンをいう。好ましい実施形態において、MenCワクチンはMenC-CRM197を含む。本明細書中で用いられる場合、用語非晶質緩衝剤は、凍結乾燥時に非晶質性を維持する緩衝剤例えば、有機緩衝剤をいう。特定の条件下では非晶質性を維持するが、他の条件下では結晶化し得る緩衝剤が含まれる。緩衝剤の非晶質の性質を維持する条件もまた含まれる。非晶質緩衝剤は、当業者に周知であり、イミダゾール緩衝剤およびヒスチジン緩衝剤、ピペリジン、ならびにジイソプロピルエチルアミンが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態において、この非晶質緩衝剤は、イミダゾール緩衝剤である。さらに好ましい実施形態において、この非晶質緩衝剤はイミダゾール緩衝剤であり、かつ約10mMの濃度を有する。本明細書中で用いられる場合、用語安定化は、凝集ならびに分解の阻害、減少reducing、抑制、減少decreasing、減少diminishing、および低下と同義で用いられる。本発明は、生物学的分子の凝集および/または分解を実質的に阻害する方法を含む。実質的な凝集の阻害または分解は、結晶化し得る緩衝剤および/または賦形剤を用いたコントロールと比較して、約25から約100の凝集および分解の減少をいう。好ましくは、凝集または分解は、約50、より好ましくは約75、そしてなおより好ましくは約100阻害される。本明細書中で用いられる場合、用語凍結乾燥時とは、生物学的分子の凍結乾燥の期間および凍結乾燥された生物学的分子のその後の保存の期間をいう。本明細書および添付の特許請求の範囲中で用いられる場合、単数形a、an、およびtheは、その内容がそうではないことをはっきりと示さない限り複数の参照を含む。従って、例えば、免疫原animmunogenに対する参照は、2つ以上のこのような免疫原の混合物を含む。本発明に基いて、生物学的分子を凍結乾燥する方法もまた提供される。この方法は、少なくとも1つの非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤を含む溶解緩衝液に生物学的分子を溶解し、混合物を形成する工程、次いでこの混合物を凍結乾燥する工程を包含する。本発明の1つの実施形態において、凍結乾燥は、20°Cでサンプルを負荷する工程、約25ミクロンの真空圧および約25°C/時間の傾斜率の下でサンプルを約2時間、凍結させて約-50°Cにする工程、および約24時間、約-35°Cで乾燥する工程を包含する。好ましい実施形態において、この生物学的分子はMenC免疫原である。より好ましい実施形態においてこの生物学的分子は、MenC-CRM197である。本発明の実施を通じて、生物学的分子は、凝集および分解に対して安定化される。本発明は、凍結乾燥時に凝集が減少されそして分解が最小化された生物学的分子を調製するための組成物および方法に対する長年の必要性を満足させる。溶解緩衝液中の非晶質のない賦形剤および非晶質性のない緩衝剤を、非晶質賦形剤および非晶質緩衝剤と交換することにより、凍結乾燥時およびその後の保存時の凝集および分解の減少が達成される。材料および方法別に注意書きがない限り、以下の材料および方法が用いられる。meningococcalC群多糖MenCは、2~9個が連結したシアル酸N-アセチルノイラミン酸のホモポリマーであり、C7および/またはC8位で部分的にO-アセチル化している。CRM197は、野生型ジフテリア毒素の変異体であるConstantinoら、Vaccine、1992、Vol.10、No.10、691-8。アミノ酸52位に存在するグリシンをグルタミン酸で置換することにより、酵素活性を完全に喪失させられる。複合体を調製するために、NeisseriameningitidisC群の内包性多糖を加水分解し、そして得られたオリゴ糖OSをCRM197にカップリングした。内包性多糖へのCRM197のカップリングは、オリゴ糖の選択的な末端還元基の活性およびその後の特別なスペーサーを通じたタンパク質のカップリングに基づいたConstantinoら、Vaccine、1992、10、691-698。この複合体中のCRM197に対するシアル酸の割合は約0.6である。オリゴ糖の長さの平均を、イオン交換クロマトグラフィーMono-Q分析、SepharoseFFTMでの溶出により14.2と概算した。オリゴ糖のKdは0.33と0.41の間であり、そして遊離の糖濃度は約2.5であった。MenC-CRM197バルクロット1MenCBulkは、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH=7.2中の約1.045mg/mLCRM197、および約0.636mg/mLMenC抗原シアル酸含有量で測定したからなり、4°Cで保存される。本明細書で開示されるすべてのMenC-CRM197溶液を、試験前に0.22μm滅菌MilliporeTMフィルターを通して濾過した。このバルク溶液は凍結乾燥の前に希釈される。Sienaから得た抗原MenC-CRM197を凍結乾燥したMenC複合ワクチンは、以下の組成物を有する:19.7μgのCRM197と複合体化した12μgシアル酸含有量で測定したのmeningococcalCオリゴ糖抗原Siena、イタリア、9mgのマンニトール、および10mMのリン酸緩衝液pH7.2。投与前に、凍結乾燥された抗原を、0.6mLの水酸化アンモニウムアジュバンドに溶解する。この溶液の0.5mLを注入する。DSC示差走査熱量分析:DifferentialScanningCalorimetry:Hewlett-Packardのオペレーティングシステムを備えたSIISeiko機器を用いて、付加的な結晶性を分析することによりDSCを算出した。賦形剤溶液のサンプル溶液を、10°C/分の傾斜率で凍結し、約-50°Cの温度にした。媒介ガスとして乾燥窒素を用い、種々の傾斜率0.625°C/分~10°C/分でサンプルを暖める間の温度変化をモニターした。温度変化に対する賦形剤組成物の効果を評価した。MenCBulkの透析法を、Spectra/PorMembrane登録商標SpectrumLaboratories,LagunaHills,CAを使用して、リン酸ナトリウム緩衝液を本明細書中で試験した種々の緩衝液で置換するために10,000MWのカットオフで実施した。透析後に、MenCBulk溶液を、種々の容積の緩衝液および適切な量の賦形剤で希釈することによって、1.045mg/mLの所望のタンパク質濃度を得た。リン酸ナトリウム、ヒスチジンヒドロクロリド、およびイミダゾールヒドロクロリド緩衝液全てのpHは、7.2を、処方において使用した。緩衝液の濃度を、5~10mMへと変えた。使用した賦形剤は、マンニトール、マンニトール-スクロース混合物、またはスクロースであった。賦形剤の濃度は、1.5、3、または5であった。いくつかの処方物Tween-80登録商標もまた、添加した。調製後、全ての処方されたMenCBulk溶液を、0.22μmの滅菌Milliporeフィルターで濾過し、そして4°Cで保存した。凍結乾燥:最終生成物を、MenCBulkの凍結乾燥によって調製した。フリーズドライサイクルは、異なる段階を誘導し、そしてマンニトールA、マンニトール-スクロースB、およびスクロースC処方物とで異なった表1を参照のこと。HPSEC高速サイズ排除クロマトグラフィーHighPerformanceSizeExclusionChromatography分析:TSKGELRG4000SWXLカラム30cm×7.8mm内径TosoHaas,Montgomeryville,PA、液体移動相中でのSECサイズ排除クロマトグラフィーSizeExclusionChromatography分離のための小粒子親水性ゲルのカラムを、凍結乾燥および可溶化の後に、MenC-CRM197ワクチンの分析のために使用した。製造業者によって提供された指針書に従って、理論段数は、16,000より大きく、そして非対称性因子は、0.7~1.6であった。HPSEC分析は、MenC-CRM197SienaおよびMenCBulkそれぞれに対して、18.3分および22.8分の反応時間を示した。蛍光検出器で測定されるように、MenCの回収率は、約9510μLの注射容積に対して5回の測定から計算された値であった。注射容積の増加は、主なピークの領域での比例的な増加に導いた。注射の再現性は、1未満の標準誤差標準偏差×100/平均ピーク領域で高かった。異なるバイアルからの10回の注射各20μLの精度もまた、高かった平均値=19.83μL、標準偏差=0.085μL。最小注入容積標準偏差=0.1μL~20μLは、0.35μLであると見出された。MenC-CRM197の代表的なクロマトグラム凍結乾燥は、図1に示され、そして19~24分メインピークに、幅広い非対称的なピークを示す。サンプルに圧力を加えた後に、2つのさらなるピークが出現した:一方は、15~17分の保持時間を有する高分子量の生成物凝集生成物に関し、そして他方は、保持時間が24分を越える低分子量の生成物断片生成物であった。カラムクロマトグラフィーに関して、流速が、0.5mL/分であり、圧力が350~400psi.であり、移動相が、室温で、200mMのNH42SO4HPLC等級、Bio-Radの100mMリン酸緩衝液pH=7.2であった。サンプルの放出は、UV検出器214nmおよび蛍光検出器280nmEx.および340nmEm.で検出された。γ-グロブリン、オボアルブミン、ミオグロビン、およびビタミンB-12Bio-Radを含むゲル濾過標準が、標準として使用された。分析は、2個のポンプWaters510HPLCシステムWatersAutomatedGradientControllerおよびModl510ポンプ、Waters486TuneableAbsorbanceDetector、Waters712WISP注入システム、およびXeポンプを備えたHitachiF1DetectorL-7480からなるシステムを使用して実施された。以下の実施例は、本発明を例示することを意味し、そして任意の方法で、本発明を限定するように構築されない。当業者は、本発明の意図および範囲内である改変を認識する。実施例実施例1:pH指示薬を用いた凍結実験18個の異なる処方物を、凍結の間に、pHの変化における、溶液組成の影響を研究するために調製した。表2は、リン酸緩衝液の濃度、賦形剤の濃度、およびこれらの処方物中でのマンニトール-スクロースの割合の変動を示す。全処方物の開始のpH値は、pH7.2であった。凍結実験を、凍結乾燥チャンバ中で実施し、そして数回の工程を含んだ。サンプルを、凍結乾燥チャンバ中に充填し、そして0.2時間20°Cで保持した。次いで、サンプルを、60°C/分のランプ速度ramprateで-50°Cまで冷却し、次いで、-50°Cで0.5時間保持した。次に、サンプルを60°C/分のランプ速度で-20°Cまで昇温させ、そして-20°Cで0.5時間保持した。サンプルを、60°C/分のランプ速度で-50°Cまで冷却し、次いで60°C/分のランプ速度で-20°Cまで昇温させた。凍結乾燥後に、種々の時間点および温度でpH測定した。この賦形剤を、汎用pH指示薬この指示薬は、pHの変化で色が変わるを用いて実施した。各色は、適切なpHと関連した。20°Cで0時間点1、-20°Cで3時間後点2、-50°Cで4時間後点3、および-20°Cで5時間後点4に、pH測定を行った。サンプルを、-20°Cで一晩保持し、そして-20°Cで34.5時間後点5に次の測定を行った。種々の処方物を含む144個のバイアル各処方物に対して8個のバイアル;18種の処方物の統計的な研究を、-20°Cで34.5時間後に実施した。20°C2~-20°C4の温度での乾燥の間に、リン酸緩衝液が、pHを変化させることは、既知である。マンニトールまたはマンニトール-スクロース混合物のいずれかを含む処方物は、pHの変化をほとんど示さなかった表2を参照のこと。-50°Cで、pHは、約5と5.5との間であり、そして-20°Cで、pHは、約6と6.5との間であった。種々の処方物のpHの有意な変化は、開始5時間の間に観測されなかった。しかし、特定の色の変化いわゆる、黄色および橙色固体の界面での橙色および赤色スポットの出現は、34.5時間後に生じた。この観測は、リン酸塩の結晶化が緩慢なプロセスおよびランダムなプロセスであることを実証した。さらに、2種の塩リン酸一ナトリウムおよびリン酸二ナトリウムは、異なる結晶点それぞれ、-9.7°Cおよび-0.5°Cを有した。凍結乾燥の間のpH変化の統計学的研究によると、この観測が3つの群に分けられ得ることを示した。群1pH6.0黄色pH6.0およびpH5.5のスポット群2pH5.5橙色pH5.5およびpH5.0の5個以上のスポット群3pH5.5赤色pH5.0~5.5およびpH5.0の5個以上のスポット。各群に属する、サンプルの割合は、以下の式:=n×100/Nを使用して計算されるnは、各群のサンプルの数であり、そしてNは、分析したサンプルの総数であったこの場合N=8表2を参照のこと。表2に示される統計学的分析は、広い範囲で、マンニトールを含む処方物は、群2および3に属する一方で、高いスクロース含有量を有する処方物は、群1に属することを示す。従って、マンニトールの一部をスクロースに置換することで、わずかにpHが変化する。処方物中により多くスクロースが存在すると、より小さなpH変化が得られる。ほとんどの顕著な結果が、10mMのリン酸緩衝液中の1.5の賦形剤80、90または100のマンニトールのいずれかを含む、および5mMのリン酸緩衝液中のスクロースを含む5の賦形剤80または90のマンニトールのいずれかを含むのいずれかから得られるこれらの各々は、黄色の群に入るサンプルの100に導く。マンニトールおよびスクロースのような不活性な有機化合物の添加は、リン酸緩衝液のpHの変化を減少させる。これらの添加物の効果は、結晶の成長およびリン酸塩の沈殿を阻害する処方物の増加した粘度に関連する。この溶液の粘弾特性は、結晶化の温度5に影響を与えるので、この特性は、冷却の際に、塩の結晶化を妨げ、氷晶網目構造内に分散された過冷却された液体を提供する。実施例2:再結晶における、緩衝液選択の効果水中のマンニトールは、マンニトールの結晶化に起因して、約-25°Cで発熱ピークを示すことが示されているGathlinら、J.Parent.Drug.Assoc.,1980,344:398-408。リン酸ナトリウム緩衝液の存在下で、この発熱ピーク温度は、水溶液中においてのものと異なるWilliamsら、J.ParentSci.Tech.,1991,45:94-100;Seguroら、Cryobiology,1990,27:70-79。観測された熱挙動差thermalbehaviordifferenceは、結晶化度の変化に関連し得るIzutsuら、Pharm.Res.,1993,10,No.8,1232-1237。図2A-C中のDSC図は、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液中の3マンニトール溶液pH7.2が-23.5°CΔH=-7735.2mJ/mgで発熱性再結晶、ならびに-32°CΔCp=351mJ/des。mgおよび-30.1°CΔCp=442mJ/deg.mgで発熱性ガラス転移を生じる。25のマンニトールをスクロースで置換することによって、再結晶化ピークΔH=-2572mJ/mgの減少、ならびに-41.4°CΔCp=6.7mJ/deg.mgおよび-31.0°CΔCp=93mJ/dec.mgへのガラス転移温度のシフトを生じる。リン酸ナトリウム緩衝液中でのスクロース溶液の熱分析図2Cにより、-29.2°CΔCp=289.8mJ/deg.mgでガラス転移のみを示した。従って、スクロースを結晶化マンニトール溶液に添加することで、冷却の間に非結晶マンニトールの形成を生じ、そして結晶化を予防する。実施例3:スクロースでのMenCBulkの安定化MenCBulkのスクロースでの安定化を、凍結実験において示した図3。MenCBulkの14の処方物を、種々の組成の非晶質賦形剤および種々の濃度のリン酸緩衝液で、上記のように調製した図3。これらの処方物を、方法Bに従って凍結乾燥した表1を参照のこと。この凍結乾燥は、Siena,ItalyCarpenterら、1988、25:244-255によって以前に開発されたように、アニーリングを伴う凍結を包含した。サイズ排除クロマトグラフィーによって決定される、凍結乾燥の間の凝集の抑制を使用して、安定化を測定した。図4に示すように、凝集の抑制は、スクロースの含有量に直接関係することが見出された。実施例4:非晶質緩衝剤でのリン酸ナトリウム緩衝剤の置換が、MenCBulk処方物の安定性を増加させるヒスチジン-ヒスチジン塩酸塩およびイミダゾール-イミダゾール塩酸塩の溶液両方pH7.2を、緩衝液として使用した。マンニトールを含まない純粋なスクロースを使用して、タンパク質を安定化した。種々の処方物を、MenCBulkを安定化する試みにおいて試験した。これらの処方物を、方法Cに従って凍結乾燥した表1を参照のこと。この凍結乾燥サイクルは、アニーリングなしでの1回の凍結、および-35°Cスクロースのガラス転移温度より低温での一次乾燥を包含した。凍結乾燥の間の賦形剤の非晶質の状態に起因して、凍結サイクルの時間の合計は、減圧が増加するにつれて増加した。表3に示す結果は、凍結乾燥の間の凝集が完全に防止されたことを実証する。コントロール実験すなわち、非晶質ではない緩衝剤および/または賦形剤において、凝集は、試験溶液に対して観察された凝集より高かった。例えば、凝集は、スクロースを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液中で3.3であり、そしてマンニトールを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液中で9.5であった。凝集は、1.5スクロースを含む10mMイミダゾール緩衝液中で0であり、そして1.5スクロースを含む10mMヒスチジン緩衝液中で0.78であった。実施例5:安定性研究MenC-CRM197固体サンプルを、インキュベーターで3ヶ月間にわたって、4°C、25°C、または37°Cでの凍結乾燥後に、ストレスを加えた。選択した時点において、サンプルをインキュベーターから取り出し、0.6mLの蒸留水で再構成し、そしてHPSECによって分析した。全ての処方物は、4°Cにおいて安定であった。すなわち、貯蔵の際に凝集の増加を示さなかった。MenC-CRM197のサンプルSiennaは、イミダゾールまたはヒスチジンの緩衝剤のいずれかを含有する処方物が示したより高い凝集を、ストレス試験の間に示した図5。MenC-CRM197処方物におけるヒスチジンまたはイミダゾールの緩衝剤の使用は、ワクチンの安定性を増加させた。本発明は、この機構に束縛されることを望まないが、安定化は、CRM197のトリプトファンの、構造的に類似のイミダゾール環との相互作用に起因し得ると考えられる。本明細書中において引用した全ての参考文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。ABiocineによって以前に開発された凍結ランプ-60°C/h、乾燥ランプ-25°C/h特別の工程は、予備通気N2/空気、圧力0.85bar、封止、通気N2/空気、および4°Cでの貯蔵である。A=マンニトールに対する凍結乾燥サイクルB=マンニトール-スクロースに対する凍結乾燥サイクルC=スクロースに対する凍結乾燥サイクル。固体サンプルの表面上のスポットに対するpH値"