"標的CD40ポリペプチド配列番号28に対する抗体の抗原結合部分を含む単離された抗体またはタンパク質であって、a.10nM以下のKDでCD40ポリペプチドに結合し、b.サイレントIgGFc領域を含むことを特徴とする抗体またはタンパク質。CD40L誘導性シグナル伝達を50ng/ml以下のIC50で阻害する、請求項1に記載の単離された抗体またはタンパク質。CD40シグナル伝達に関してアゴニスト活性を有さないか、またはアゴニスト活性が低い、請求項1または2のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。配列番号17、配列番号18または配列番号19のアミノ酸配列からなる群から選択されるサイレントIgGFc領域を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。配列番号9の重鎖VHおよび配列番号10の軽鎖VLそれぞれと少なくとも60、70、80、90、95、96、97、98、99または100パーセントの配列同一性を有するVHおよびVL可変領域を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。a.配列番号11の重鎖アミノ酸配列および配列番号12の軽鎖アミノ酸配列を含むmAb1抗体、b.配列番号13の重鎖アミノ酸配列および配列番号14の軽鎖アミノ酸配列を含むmAb2抗体、ならびにc.配列番号15の重鎖アミノ酸配列および配列番号16の軽鎖アミノ酸配列を含むmAb3抗体からなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。医薬品として使用するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。自己免疫障害および/または炎症性障害の処置に使用するための、請求項1から7のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。移植における移植片拒絶の危険性の防止または軽減において使用するための、請求項1から8のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、移植拒絶および移植片対宿主病の処置において使用するための、請求項7に記載の単離された抗体またはタンパク質。少なくとも薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせた、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体またはタンパク質を含む医薬組成物。その他の活性成分をさらに含む、請求項11に記載の医薬組成物。少なくとも緩衝液と共に請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体またはタンパク質を含む液体医薬製剤。請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体またはタンパク質をコードする単離された核酸。請求項14に記載の1種または複数の核酸を含むクローニングまたは発現ベクター。適切なプロモーター配列に作動可能に連結した、以下のコーディング配列a~c:a配列番号22および配列番号23、b配列番号24および配列番号25、またはc配列番号26および配列番号27の少なくとも1つを含む、請求項15に記載のクローニングまたは発現ベクター。請求項15から16に記載の1種または複数のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞。請求項17の宿主細胞を培養することと、前記抗体またはタンパク質を精製し回収することとを含む、請求項1から6のいずれか一項の抗体またはタンパク質の生産方法。材料1.モノクローナル抗体Chir12.121.9mg/ml、mAb10.88mg/ml、mAb21.9mg/mlおよびmAb31.9mg/mlは、クエン酸塩50mM、pH7.0、NaCl140mM中に用意した。選択実験のためにIgGアイソタイプ対照も使用したSigma、St.Louis、USA。2.B細胞活性化刺激AfiniPureFab’2断片ウサギ抗ヒトIgMは、JacksonImmunoResearchSuffolk、UKから入手し、CpG2006はMicrosynthBalgach、Switzerlandから入手した。組換えヒトCD40Lは、当業者に公知の標準的手順を使用して作製した。ヒトIL-4を含有する上清は、当業者に公知の標準的手順を使用して作製した。3.インビトロ組織培養試薬PBMC培養培地:RPMI-1640、FBS10、ペニシリン/ストレプトマイシン1、非必須アミノ酸1、ピルビン酸ナトリウム1、β-メルカプトエタノール5mMいずれもInvitrogen製、SanDiego、USA。方法1.CD40L媒介PBMC増殖アッセイ1.1ヒト末梢血単核細胞PBMCの精製初代PBMCは、健康なボランティアから得られた全血バフィーコートから精製したBlutspendezentrum、Basel。EDTA5mMを含有しCa2およびMg2を含まないPBSでバフィーコートを14に希釈し、25mlずつ50mlのFalconチューブに分注した。希釈したバフィーコートをFalconチューブ1本当たりFicoll-PlaquePlusGEHealthcare14mlと共に重層し、室温において2250rpmで20分間遠心したブレーキをかけない。遠心後、中間層を1本の50mlのFalconチューブに移した。複数のチューブ1ドナーからの中間層を一緒にして容量を30mlにした。EDTA5mMを補給したPBSを添加し、細胞を室温において2250rpmで5分間回転した。上清を廃棄してから赤血球RBC溶解緩衝液15mlを添加し、室温で5分間インキュベートした。その後、PBS/EDTA5mMを20ml添加し、細胞を再度回転した2250rpmでRT/5分。細胞をPBS/EDTA5mMで2回洗浄し遠心工程を介在させる、PBMC培地35mlに再懸濁してからトリパンブルー色素排除法を使用して生細胞数を測定した。インビトロ刺激にすぐに使用しない細胞は凍結保存した。1.2インビトロPBMC刺激アッセイCostar96ウェルプレートにおいて、抗-IgMFab’25μg/ml、CpG20061μM、ヒトIL-475ng/mlを含有する上清または組換えhuCD40L40μg/ml最終濃度を示したの一定用量存在下または非存在下で、各抗CD40またはアイソタイプ対照mAbの2倍希釈系列7点を3連で作った。各抗CD40mAbの開始濃度は、実験に応じて20μg/mlから100μg/mlの範囲であった。CD40Lは、全実験について陽性対照として用量応答において使用した。抗IgM、CpG2006、IL-4およびCD40Lの用量は、これらの試薬単独または組み合わせがPBMCまたはB細胞増殖を誘導する能力を用量応答において評価した以前の実験データは示さずに基づいて選択した。PBMC最終密度はウェル当たり8×104個をその後各ウェルに添加し、37°C/CO25で3日間インキュベートした。3H-チミジン1μCi/50μl/ウェルを各ウェルに添加し、最後に6時間培養してから収集し、MicroBetaTriluxシンチレーションカウンターを使用してチミジン取り込みを測定した。細胞および培地ならびに細胞および培地および抗IgM、IL-4、CpG2006またはCD40L対照培養物抗CD40mAbの非存在下は各実験に含めたことに注意されたい。シンチレーションデータは、ExcelおよびGraphPadPrismソフトウェアを使用して解析した。結果は、1分当たりの平均計数率cpm/-平均の標準誤差対抗CD40mAb濃度の対数変換として表す。陽性対照ならびに細胞および培地のバックグラウンドレベルは、各グラフについて示す。IC50またはEC50値を算出し、Prismによってデータの曲線フィッティングをうまく行った。PBMCは、上記で示したように、試験する抗CD40mAbの用量応答性の存在下または非存在下で、CD40L20μg/mlで3日間刺激した。増殖は、培養して72時間後の3H-チミジン取り込みによって評価した。結果は、3回の培養の平均およびSEMとして表し、4ドナー独立した実験を代表する。抗CD40mAb媒介阻害のIC50値は、μg/mlで集計する。2.インビトロPBMCアゴニストアッセイヒトPBMCは、同時刺激非存在下で、または抗IgMFab’25μg/mlもしくはCpG20061μMのいずれかの存在下で、上記の項1.2で示したようにChir12.12、mAb1、mAb2またはmAb3の用量応答を用いて3日間刺激した。増殖は、培養して72時間後の3H-チミジン取り込みによって評価した。結果は、3回の培養の平均およびSEMとして表し、4ドナー独立した実験を代表している。3.ADCCアッセイPBMC懸濁液10×106細胞/mL50μlを丸底ウェルCorningIncorporated-Costar3790に添加し、カルセイン染色したラージ細胞2×105細胞/mL50μlおよび抗体希釈液または対照100μlを添加した。最大の溶解は、2Triton100中で測定された。細胞をプレートの底に収集し250gで3分、37°Cにおいて湿潤なCO2雰囲気5中で1時間インキュベートした。細胞を遠心750gで3分によって培地から分離し、測定のために上清100μlを透明底の黒いプレートCorningIncorporated-Costar3904に移した。蛍光は、SpectraMaxGemini分光計MolecularDevicesで485nmで励起した後535nmで測定した。特異的溶解は、以下の式を使用して計算した:実験的放出-自然放出/最大放出-自然放出×100。4.抗ヒトCD40抗体変異体のヒトBJAB細胞系に対する結合ヒトBJAB細胞への結合における様々な抗CD40抗体Fc変異体の結合を比較するために、フローサイトメトリーを使用した。したがって、96ウェルV底プレートにおいてウェル当たり2×105細胞を接種した。プレートはFACS緩衝液PBS、FCS5、EDTA2mM200μLで4°Cにおいて1350×gで2分間で2回洗浄した。上清を廃棄し、ヒト血清8を含有するFACS緩衝液InVitromex、カタログ番号S4190100mLに細胞を再懸濁し、10分間インキュベートした。2回洗浄した後で、抗ヒトCD40Fc変異体を、ヒト血清1を含むFACS緩衝液50μLに10μg/mLの濃度で開始して1:2の希釈で添加した。細胞は、氷上で30分間インキュベートし、その後2回洗浄工程を行った。ポリクローナルウサギ抗ヒトIgGFITCFab’2DAKO、カタログ番号F031550μlを各ウェルに添加し、氷上で30分間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を2回洗浄し、FACS緩衝液100μLに再懸濁し、FACSCantoIIで取得した。取得後、FITCチャネルの平均蛍光強度をFloJoで取得した。グラフ作成および曲線フィッティングは、GraphPadPrism5.0で実施した。個々の実験の強度には変化があるため、値は正規化した。したがって、各抗体試験系列の最高値は、100に相当した。非線形曲線フィッティングは、パーセント値で実施した。5.単核球由来の樹状細胞MoDCにおけるCD40L媒介サイトカイン産生アッセイ5.1ヒト単核球由来の樹状細胞の調製ヒトPBMCは、スイス赤十字によって提供されたヒトバフィーコートから調製した。バフィーコートはPBSで1:5に希釈しInvitrogen、カタログ番号20012019、50mLFalconチューブに35mLずつ分注した。その後、FicollGEHealthcare、カタログ番号171440-0213mLを各チューブに重層した。細胞をRTにおいて1680×gで20分間、ブレーキをかけずに遠心した。PBMCを含有する層を収集し、大量のPBSで1000×gで5分間、2回洗浄した。最終的に、細胞をPBS10mLに再懸濁し、計数した。ヒト単核球は、AutoMACS機器でMiltenyiMiltenyi、Germany、カタログ番号130-091-153製のヒト単核球単離キットIIを使用して、製造者の指示に従って、PBMC100×107から逆に単離された。単離後、細胞は4°Cにおいて培養培地RPMI1640Invitrogen、カタログ番号61870010、FCSInvitrogen、カタログ番号16000044、US由来10、ピルビン酸ナトリウムInvitrogen、カタログ番号113600391mM、1×NEAAInvitrogen、カタログ番号111400351×ペニシリン/ストレプトマイシンInvitrogen、カタログ番号15140122で1000×gで5分間、2回洗浄した。単離された単核球を計数し、6ウェルプレートに0.4×106/mLの密度で播種し、37°C、5CO2で7日間培養した。単核球を樹状細胞組換え体に分化させるために、培養開始時にヒトIL-4[80ng/mL]およびヒトGM-CSF[100ng/mL]いずれも自家製を培養培地に添加した。5.2サイトカイン放出のための樹状細胞DCの刺激培養7日後に6ウェルプレートを濯ぐことによって未熟なDCを収集し、細胞をプールし、培養培地で1400×gで5分間、2回洗浄した。その後、iDC2×105個を96ウェル平底プレートBectonDickinson、カタログ番号353072中の100μLに接種した。陽性対照として、細胞を1μg/mLの濃度のMegaCD40LAlexis、カタログ番号ALX-522-110-C010で刺激し、陰性対照は、培地のみに入れたiDCからなった。アンタゴニズムアッセイでは、用量応答のため、抗ヒトCD40抗体Fc変異体を10μg/mLで1:2希釈で、MegaCD40L1μg/mLと一緒に添加した。刺激した細胞の上清をTNFα測定のために24時間後に収集した。アゴニズムアッセイでは、抗ヒトCD40抗体Fc変異体を10μg/mLで、1:2希釈のみで添加し、上清をTNFα測定のために48h後に収集した。細胞を接種し、全アッセイについて3連で刺激した。5.3ELISAによるTNFアルファの測定上清中のTNFαの量を測定するため、ELISAを以下のように実施した。抗TNFα捕捉抗体BDPharmingen、カタログ番号551220をELISAプレートGreiner、NuncF96Maxisorp、カタログ番号442404に5μg/mLでウェル当たり50μLで4°Cにおいて一晩コーティングした。洗浄工程毎に、プレートはBioTekELx405プレート洗浄器で250μLで3回洗浄した。1回目の洗浄後、SuperblockTBSThermoScientific、Pierce、カタログ番号37535200μLを37°Cで1時間インキュベートした。次に、TNFα標準物組換えヒトTNFα、RDSystems、カタログ番号210-TAまたは試料を25μl添加した。標準物は、最終濃度20ng/mLで開始し、1:2で連続希釈した。さらに、検出抗体抗ヒトTNFαビオチン、BDPharmingen、カタログ番号55451125μLを1:500希釈で添加した。プレートを4°Cで一晩インキュベートした。洗浄後、アビジン-PODコンジュゲートExtrAVアルカリホスファターゼ、Sigma、カタログ番号E-2636をSuperblockTBSで15000に希釈し、50μLで添加し、RTで1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、基質p-ニトロフェニルホスフェートSigma、カタログ番号C-304150μLを添加し、15分間発色させた。ELISAプレートをSpectraMaxM5でソフトウェアSoftMaxProMolecularDevicesを用いて450nmで読み取った。6.毒性試験毒性試験の最初の主要な目的は、Chir12.12と比較して高用量100mg/kgmAb1の潜在的毒性を調べることであった。モーリシャス産のカニクイザル30匹をこの試験に使用した。投与開始時、動物の年齢は約4から5歳で、体重は雄4.5から6.6kg、雌3.1から4.3kgであった。mAb150mg/mLをカニクイザルの一群雄5匹/雌5匹;群2に100mg/kgの用量レベルで、2mL/kgの投与量で、1週1回5週間静脈内投与した1、8、15、22、29および36日目に試験物質を適用。カニクイザルの他の群雄5匹/雌5匹;群3には、親抗体Chir12.12を低速ボーラス注入によって100mg/kgの用量レベルおよび5mL/kgの投与量で静脈内投与した。mAb1プラセボは2mL/kgの投与量で、対照として使用したカニクイザルの別の群雄5匹/雌5匹;群1に与えた。動物は全て、最後の投与の1または2日後に剖検した。両抗CD40Abの有効性を評価するために、キーホールリンペットヘモシアニンKLH免疫を組み込むことに決定した。2日目に、動物をAlumに溶かしたKLH1mgで免疫し、その後、23日目にAlumに溶かしたKLH0.5mgで追加免疫注射を行った。血清を免疫前/追加免疫ならびに免疫および追加免疫後7日目および14日目それぞれから採取した。KLH特異的IgM/IgG力価は、標準物としてカニクイザル抗KLHIgM/IgG参考血清を使用してELISAによって測定した。血液は、未処理B細胞の免疫表現型検査CD20CD21CD27-のために、投与前に3回および15、29日目および剖検時37/38日目に採取した。未処理CD20B細胞の絶対数は、血液試料当たりの全リンパ球数から計算し、未処理CD20B細胞の相対数はフローサイトメトリーによって計算した。表4毒性試験の概要直近の個体の体重に基づく毒性の評価は、死亡率、臨床的所見投与後の所見、便検査、毛並みの検査および食物摂取を含む臨床徴候、体重、眼科検査、心血管所見、臨床病理学検査凝固、外部血小板活性化検査、血液学的検査、臨床化学検査および尿検査を含む、器官重量、ならびに肉眼的および顕微鏡的剖検所見に基づいた。血液免疫表現型検査は、投与前3回、投与相の15日目および29日目ならびに剖検日に実施した。さらに、脾臓組織およびキーホールリンペットヘモシアニンKLH注射部位の流入領域リンパ節の免疫表現型検査は剖検時に実施した。さらに、完全なADCCを引き起こすことができるChir12.12の影響をmAb1と直接比較するために、KLHに対するT細胞依存抗体応答TDARを調べた。毒物動態学評価および有望な抗薬物抗体ADA評価のために全動物から血液を収集した。7.mAb1のさらなるインビトロプロファイル7.1PBMC精製ヒト末梢血単核細胞は、既に項1.1に記載したように調製した。7.2ヒト扁桃腺B細胞の精製扁桃被膜および結合組織を取り出し、扁桃物質は扁桃腺を約5mmの大きさの切片に切断した後、金属製のセルストレーナーですりつぶし、B細胞培地で通常通り洗浄した。次に、細胞残渣を取り除くため、扁桃腺細胞を70μMセルストレーナーで2回濾過した。B細胞は、EasySepネガティブ選択ヒトB細胞濃縮キットStemcellTechnologies、Vancouver、BC、Canadaを使用して新鮮なPBMCから単離した。B細胞は、EasySepネガティブ選択ヒトB細胞濃縮キットを使用して、製造元StemcellTechnologies、Vancouver、BC、Canadaの指示の通りに精製した。7.3ヒトおよび非ヒト霊長類PBMCまたはB細胞を使用したCD40結合EC50値の評価PBMCアカゲザル、カニクイザルまたはヒトまたは扁桃腺B細胞ヒトのみを、用量応答における精製した標識mAb1またはアイソタイプ対照抗体最終濃度範囲2.5μg/ml~0.00125μg/mlと共に4°Cで30分間インキュベートした。その後細胞を洗浄し、続いて抗ヒト非ヒト霊長類交差反応性およびNHPとの交差反応性が最小限のビオチン化抗ヒトIgG抗体とインキュベートしたR10、抗IgM染色を含めるか、またはFACS染色の強度差のいずれかによって、膜IgG発現ヒトB細胞を区別することが可能なことに注意。細胞を再度4°Cで30分間インキュベートしてから洗浄し、ストレプトアビジン-FITCを用いて4°Cで20分間、最後の染色を行った。その後細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによってCD20細胞上のCD40発現の評価を実施した。7.4ヒトおよび非ヒト霊長類PBMCまたはB細胞のCD154誘導性増殖の阻害の評価96ウェルプレートにおいて、ヒト組換えCD154およびIL-4のEC80濃度の存在下で、各抗CD40またはアイソタイプ対照mAbの2倍希釈系列7点を3連で作った。各抗CD40mAbの開始濃度は、実験に応じて20μg/mlから100μg/mlの範囲であった。細胞および培地対照は、全実験について陰性対照として使用した。PBMCアカゲザル、カニクイザルまたはヒトまたは扁桃腺B細胞ヒトのみをその後各ウェルに添加し、37°C/CO25で3日間インキュベートした。3H-チミジン1μCi/50μl/ウェルを各ウェルに添加し、最後に6時間培養してから収集し、シンチレーションカウンターを使用してチミジン取り込みを測定した。8.カニクイザルの腎臓同種異系移植モデルにおけるシクロスポリンAと併用したmAb1の有効性8.1動物使用したカニクイザルMacacafascicularisは全て、7.5~9歳の雄5529/5533、5523/5524および5536/5538で、捕捉飼育され、7.7±0.9kgで、フィリピン産であったSiconbrec、MakatiCity、Philippines。移植時に、動物は正常な血液学的検査、血清/尿化学検査を示し、結核、サルモネラ/シゲラ、ウイルス因子ヘルペスB、サルT細胞白血病ウイルス、サル免疫不全ウイルス、サルD型レトロウイルス、B型肝炎に対する抗体および関連のある内外寄生虫は陰性だった。しかし、動物は全て、サイトメガロウイルスおよびA型肝炎ウイルスHAVに対する抗体を示した2010に試験した;動物5536はHAVについて陰性だった。動物5523の糞便試験は、2010年12月にバランチジウムコリBalantidiumcoliについて陽性であった。手術後の最初の1週間、動物は遠隔測定個室ケージに収容し、他の動物とは視覚的に接触可能にさせた。残りの時間、動物5536/5538は一緒に収容して、残りの4頭の動物は全実験中隔離を維持した性格が合わない動物。動物は全て維持された温度下で20~24°C、湿度は少なくとも40で、天然の光周期の下で収容した。全動物に、毎日少なくとも2回果物および野菜の混合物を給餌した。水およびKlibaNafag3446ペレットKaiseraugst、Germanyは自由に与えた。実験は全て、スイスにおける動物福祉規制に従い、BS1555の認可の元で実施された。表5動物の特徴8.2実験条件8.2.1腎臓移植および術後のモニタリングドナー/レシピエントの組み合わせは、ABO一致、DRBエキソン2ミスマッチImmunogenetics5826982および一方向混合リンパ球反応MLRにおける応答に従って選択し、MLR刺激指標MLR-SIは>7および<47であったJPharmacolToxicolMethods501539。この選択の結果は表6に示し、2重移植2匹のドナー間の交換移植が存在した。各レシピエントには、動脈血圧、心拍数および運動活性をモニターするため、遠隔測定プローブDataSciencesInc、USAを埋め込んだ。手術のために、一般的麻酔は、アトロピン0.05mg/kgi.m.と共にケタミン10mg/kgの筋肉注射i.m.によって導入し、N2O/O25050で人工呼吸を維持し、プロポフォールを静脈注射i.v.した4~10mg/kg/h;必要ならいつでも5~10mgのボーラスを補給した。ドナーの腎臓を取り出し、冷4°Cウィスコンシン大学液で洗浄し低温保存時間≦4時間、移植片腎静脈とレシピエントの大静脈との間および移植片腎動脈とレシピエント遠位大動脈との間に端側吻合を生成するため標準的微小血管技術を使用して吻合時間≦40分異所性移植した。移植片から尿が出現したら、尿管膀胱瘻造設術を実施した。元の腎臓は摘出した。術後の鎮痛は、ブプレノルフィン0.01~0.02mg/kg、i.m.、1日3回抗生物質セファタキシム、25mg/kg、i.m.、1日2回またはセフトリアキソン、50mg/kg、i.m.リドカイン1溶液、1日4回によって行った。鎮痛剤および抗生物質は、5日間与えた。血小板数が著しく増加または減少したらいつでも、アスピリンを5mg/kgの用量で毎日i.m.で投与したAspegic、Sanofi-Aventis、Meyrin、Switzerland。レシピエントの臨床的および心血管状態の変化、体重、食物および水の摂取最大100~150ml/kg/日を補給、尿量、血液学的検査BeckmannCoulterACT5Diffを使用、血清および尿化学検査毎日のSCrea/Surea/SAmylase測定にはVetscan分析器を使用し、血清および尿試料の最終的な確認にはBeckmannSynchronCX5分析器を使用をモニターした。血清クレアチニンSCreaおよび尿素Sureaレベルは移植片機能のマーカーとして使用した。経皮的超音波ガイド下生検は、30日目に一般的麻酔下で以前に記載されたようにVetRadiolUltrasound422596416G針で実施した動物5529および5533のみ。さらに、血液凝固能および血小板凝集の特別なモニタリングはまた、移植前後に動物5529/5533および5523/5524で実施した。レシピエントは、i超音波スコアの増加が伴っても伴わなくても重篤な移植不全例えば、SCrea>500μmol/lまたはSurea>20mmol/lの場合、あるいはii全般的な健康問題および/または苦痛の明白な臨床徴候がある場合、最終的に安楽死させた。剖検では、その他の主要な器官全てと一緒に腎臓同種異系移植を収集し尿管および吻合部を含む、その後の組織学的解析のために処理した。表6ドナーレシピエントの組み合わせおよび使用した処置計画についての一般的情報8.2.2mAb1およびシクロスポリンACsA処置mAb1は、注入の日に-80°Cから新たに解凍して液体形態で用意した。-1、0および1日目移植前および移植後の最初の3回の投与以外は、週に1回30mg/kg/i.v.の適用を行った。経口投与p.o.用のCsAは、マイクロエマルジョンプレコンセントレートmicroemulsionpreconcentrateSandimmunNeoral登録商標飲用液、100mg/ml、NovartisPharmaAGであった。CsAは、20mg/kg/p.o.の1日用量で-1日目に開始、mAb1と組み合わせて適用した表6参照。8.2.3mAb1薬物動態PK、免疫原性霊長類抗ヒト抗体および薬物動力学PDのモニタリングmAb1曝露を測定するために、-1、3、7ベースラインおよび15分、14、28、42、56、70、84および100日目の血液試料血清500μlを採取したi.v.投与前。CsA測定のために、血液試料をCsAの経口投与前C0/C24および適用の2時間後C2に採取した。C2は、CsA吸収のピークレベルに対応する。さらに処理するまでCsA検出キット、HotStarTaqMasterMix、QiagenMinnesota、US、材料は全て-80°Cで保存した。mAb1免疫原性のための試料は、-1、7、14、28、42、56、70、84および100日目に採取し血清50μl、-80°Cで凍結を維持した。簡単に説明すると、96ウェルマイクロタイタープレートを組換えヒトCD40でコーティングした。これらを名目上4°Cで一晩保存した。ブロッキング後、較正標準物質Cs、品質管理QC試料およびmAb1を含有する試料標本をプレートに添加した。プレートを名目上25°Cで撹拌しながら120分間インキュベートした。プレートを洗浄後、マウス抗ヒトカッパ軽鎖抗体、続いてHRPヤギ抗マウスHLコンジュゲートをプレートに添加し、組換えCD40に結合したいかなるmAb1も検出した。これは、色素原基質TMBを添加することによって視覚化され、生じた色吸収の強度は存在するmAb1の濃度に正比例した。次に、試料中のmAb1の濃度を較正曲線から逆算した。PD試料は、ベースラインとして移植の2~3日前に得たヘパリン中0.5ml。その後、収集物はPK試料と同じ計画に従った。CD20およびCD3細胞は、使用したTruCountチューブBectonDickinson、カタログ番号340334によって、製造者の指示に従って、抗ヒトCD40-APCmAbクローン5C3、BectonDickinson、カタログ番号555591、抗ヒトCD3-PerCPクローンSP34-2、BectonDickinson、カタログ番号552851および抗ヒトCD20-FITCmAbクローンLT20、Immunotools、カタログ番号21279203X2を用いて計数した。データは、LSRIIフローサイトメトリーBectonDickinsonBiosciencesによって、DIVAバージョン6.1.1ソフトウェアを使用して取得した。リンパ球およびビーズは、サイズおよび粒度に従ってFSC/SSCドットブロットでゲーティングして、CD20およびCD3の発現についてさらに分析した。8.2.4組織学的検査採取した組織移植片生検または剖検時は全て、肉眼によって調べ、4緩衝化ホルマリンで固定した。脱水後、パラフィンワックスに包埋した。厚さ3μmの切片をパラフィンブロックから切断し、ヘマトキシリンおよびエオジンHEで染色した。腎臓の切片ではさらに3種類の染色過ヨウ素酸シッフ染色、トリクローム染色およびVerhoeff染色を実施した。生検および剖検試料は、経験のある病理学者が調べ、Banff07の同種異系移植腎病理の診断基準に従って記録したSolezKColvinRBRacusenLCetalAmJTransplant875360。ピアレビューはまた、外部の専門家が実施した。さらに、補体タンパク質C4dの免疫組織化学検査は、パラフィン切片の染色に適した多価抗C4d抗体を使用して実施した。C4bは、急性体液性拒絶AHRの安定した信頼性のあるマーカーと考えられる。固定し、パラフィンワックスに包埋した後、厚さ3μmの切片を有するガラススライドSuperFrostPlus、登録商標、Menzel-Glaeser、Germanyを用意し、スライドへの接着を最適にするために、37°Cでオーブンで一晩乾燥させた。ヒト拒絶腎臓切片を陽性対照として追加した。使用前に、スライドをキシレンで脱パラフィンし10分、エタノールで段階的に再水和し、蒸留水に入れた。抗原の取り出しは、以前に記載されたようにSegererSMackMRegeleHKerjaschkiDSchloendorffDKidneyInt1999565264クエン酸緩衝液pH6.0中で1バールで10分間加圧処理することによって実施した。免疫染色のため、以下の手順を使用した:iH2O20.5無水メタノール溶液で室温で20分間、内在性ペルオキシダーゼを不活性化し、ii0.01MPBS、pH7.4でスライドを洗浄しSigma-AldrichChemieGmbH、Germany、iiiスライドをPBSに溶かした無脂肪粉乳Rapilait4MigrosGenossenschaftsbund,Switzerlandで室温で60分間インキュベートし、はたいて、洗浄はせず、ivNGtS1を含有するPBSに溶かしたpAbウサギ抗ヒトC4dBiomedicaMedizinprodukte、Vienna、Austria1:40で1枚のスライドを4°Cで一晩インキュベートした。第2のスライドは、1次抗体の代わりにウサギアイソタイプ対照を適用することによって陰性対照として用いZymedLaboratoriesInc、USA、v0.01MPBS、pH7.4でスライドを洗浄し、vi全スライドをNGtS1を含有するPBSで1:200に溶かしたビオチン化ヤギ抗ウサギIgGVectorLaboratories,Inc.USAで室温で30分間インキュベートし、vii0.01MPBS、pH7.4でスライドを洗浄し、viiiPBSに溶かしたストレプトアビジン/HRPVectorLaboratories,Inc.USAで室温で30分間インキュベートし、ixAECDakoCytomationCorp.、Carpenteria、USAで8~10分間HRP活性を発色させ、顕微鏡によって染色強度を制御し、蒸留水で洗浄し、xDako登録商標自動ヘマトキシリンDakoCytomationCorp.、Carpenteria、USAで2分間対比染色し、水道水を5分間流して青色にして、xi水性封入剤MediteMedizintechnikAG、Switzerlandで封入した。実施例1:mAb1、mAb2およびmAb3のアゴニスト活性の評価実験データは、単離した未分画の初代ヒトPBMCの使用に基づく。全PBMC調製物単離されたB細胞または単核球の代わりは、抗CD40mAbが様々な種類の白血球に対して複数の直接的および間接的影響を有し得るインビボの状況に極めて似ている。このPBMC増殖アッセイを使用して、親Chir12.12抗体から変化していない抗原結合部分のアミノ酸配列を保持している未グリコシル化抗CD40mAbであるmAb1N297AおよびmAb2D265Aは、親Chir12.12mAbの非アゴニスト性CD40Lブロッキング特性を保持していることが測定された。抗体mAb3LALA突然変異体は、IL-4の存在下で弱アゴニスト性であった。特に、実験結果は、どのFcサイレント抗CD40mAbもヒトPBMCn=4ドナーによる細胞分裂を刺激することはできないことを示しており、親Chir12.12mAbで認められた結果と類似した結果である図1参照。PBMCは、CD40Lに応じて増殖した。mAb1もmAb2もPBMCのCpG2006または抗IgMFab’2誘導性増殖を増強することはできなかった図2。さらに、Chir12.12はPBMCの抗IgMFab’2誘導性増殖を増強することはできなかったが、mAb1およびmAb2とは異なり、CpG誘導性PBMC増殖を完全に阻害した。IL-4の存在下では、mAb3LALA突然変異は、IL-4単独によって誘導されるチミジン取り込みレベルを上回る、低いが再現性のよいチミジン取り込みレベルを誘導することが認められたn=4ドナーが、一方、mAb1、mAb2およびChir12.12では認められなかった図3。総合的に、これらの結果は、mAb3IL-4の存在下を除いてどの抗CD40mAbもアゴニスト活性を有さないことを示唆した。上記の結果はまた、mAb1およびmAb2が共刺激シグナルの存在下ではアゴニスト活性を有さないことを明らかに示した。慢性自己免疫疾患の患者の白血球は活性化された、または部分的に活性化された表現型を有する可能性があり、したがって、CD40またはその他の刺激物を介したシグナル伝達に敏感な可能性があるようなので、このことは重要な発見である。Chir12.12はCpG2006誘導性PBMC増殖を完全に阻害するが、FcサイレントmAbまたはCD40Lは阻害しないことが示された。CpG2006はToll様受容体9TLR9の合成リガントで、この受容体は病原体および宿主由来のssDNAに結合することが示された。ヒトにおいて、TLR9は末梢血中のB細胞およびより少ない程度で単核球によって発現する。CpG含有ODNは以前にADCCを増強することが示されたのでMogaetal2008、CpG2006は、親Chir12.12mAbの生殖系列IgG1Fc部分によって媒介されるADCCを増強することができると推測することができる。実施例2:Fcサイレント抗CD40mAbがCD40L媒介PBMC増殖を遮断する能力の評価以前のデータは、Chir12.12が初代ヒトB細胞およびヒトB細胞リンパ腫細胞系のCD40L媒介増殖を遮断できることを示した。Chir12.12および本発明による3種類の抗体、mAb1、mAb2、mAb3によるCD40L媒介PBMC増殖の阻害を測定した。以下の表7は、mg/mlで表に示したそのような阻害のIC50値を表している結果は、3連の培養の平均およびSEMとして示され、4ドナーの独立した実験の代表である。結果によって、Chir12.12はまた、CD40L媒介PBMC増殖を阻害できることが示される。さらに、mAb1、mAb2およびmAb3はまた、Chir12.12と類似の能力でCD40L媒介PBMC分裂を完全に遮断した。抗CD40mAbのいずれも、抗IgMIL-2誘導性PBMC増殖を遮断せずデータは示さず、抗CD40mAbのブロッキング活性は、標的依存であることおよびFc機能に関係がないことが示唆された。表7PBMCのCD40L媒介増殖の抗CD40mAbによる阻害のIC50値実施例3:抗ヒトCD40抗体変異体のヒトBJAB細胞系に対する結合CD40への特異的結合の変化の可能性を排除するために、3種類の変異体、mAb1、mAb2およびmAb3の、構成的にCD40を発現するB細胞系BJABへの結合を、親Chir12.12と比較して試験した。結合は、10μg/mLで開始し1:2希釈によって用量漸増法で試験した。異なる実験の曲線を比較するために、個々の用量漸増法それぞれの最高の蛍光強度中央値を100結合に設定して、非線形曲線フィッティングを適用した。2つの別々の実験において、4種類の抗体変異体、Chir12.12、mAb1、mAb2およびmAb3全てがBJAB細胞に対して同等の結合曲線を示した図5。Chir12.12のFc結合領域の様々な突然変異では、変異体の結合能力に変化を認めることはできなかった。したがって、上記の結果は、Fc結合部位の突然変異は親Chir12.12の可変領域のCD40結合部位に影響を及ぼさないことを示した。mAb1、mAb2およびmAb3は、BJAB細胞上のCD40に同等の結合を保持していた。実施例4:抗CD40Fc変異体によるヒト単核球由来の樹状細胞からのTNFアルファ放出の刺激/阻害抗CD40Fc変異体によるヒトMoDCからのTNFアルファ放出の刺激いくつかの抗ヒトCD40抗体は、様々な細胞集団に対してアゴニスト効果を有することが示されているGruber1989。Fc変異体、mAb1、mAb2、mAb3およびChir12.12がMoDCの活性化を引き起こすのを排除するため、細胞と48時間インキュベートしたとき、抗体がそれら自体TNFα放出を誘導するかどうかを調べた。アンタゴニストのアッセイとは対照的に、7日齢のヒトMoDCを4種類の抗CD40変異体全ての存在下のみで48時間培養し、用量反応曲線を10μg/mLから開始した。その後、上清のTNFαの量をELISAによって試験した。抗CD40変異体mAb1、mAb2、mAb3およびChir12.12は全て、陽性対照であるCD40L刺激と比較してMoDCからのTNFαの放出を誘導しなかったデータは示さず。4種類の抗体変異体いずれによっても用量依存性を認めることはできなかった。TNFαの量は、未刺激MoDCのレベルを超えて有意には上昇しなかったデータは示さず。したがって、これら4種類の抗体のアゴニスト活性は排除することができた。抗CD40Fc変異体によるヒトMoDCからのTNFアルファ放出の阻害親Chir12.12抗体は、CD40-CD40Lの相互作用を遮断するので、細胞活性化も遮断するはずである。ヒト単核球由来樹状細胞上のCD40のCD40Lトリマーによる刺激は、例えばTNFαのような炎症誘発サイトカインの放出を導くMa2009。また、Fc領域の変化は、Chir12.12と比較して、変異体のブロッキング機能に影響は及ぼさないはずである。4種類の抗体は全て、ヒトMoDCからのCD40L媒介TNFαの放出を同等のIC50で阻害するはずである。したがって、7日齢ヒトMoDCを、4種類のブロッキング抗CD40変異体全ての存在下で、MegaCD40L、2重3量体doubletrimeric組換えコンストラクトで24時間刺激した。その後、上清のTNFαの量をELISAによって試験した。Fc突然変異による変異体mAb1、mAb2およびmAb3は全て、3つの異なる実験においてChir12.12と同じ用量応答阻害を示したデータは示さず。予備段階の結果はまた、ヒトMoDCからのIL-23放出の類似の阻害を示しているデータは示さず。4種類の抗体全てのIC50を推定するために非線形曲線フィッティングを適用し、実験から平均IC50を計算した。ヒトMoDCからのTNFα放出についての4種類の変異体の平均IC50は、32ng/mLと40ng/mLの間の範囲である表8。要約すると、Fc領域の突然変異は、抗体変異体のアンタゴニスト効果に影響を及ぼさなかった。表8TNFアルファの阻害についての様々なFc変異体のIC503つの独立した実験の様々な抗ヒトCD40Fc変異体のngmLで表したIC50。Chir1212の1では、非線形曲線フィッティングによって、IC50の有効な推定を行うことは不可能であった。したがって、上記の結果によって、4種類の変異体は全てMoDCからのTNFα放出の誘導には不活性であることが示された。より重要なことに、変異体mAb1、mAb2およびmAb3は全て、Chir12.12と比較してインビトロにおいて類似の有効性でヒトMoDCによるCD40L媒介サイトカイン産生を阻害した。実施例5:データの概要以下の表9は、親Chir12.12抗体と比較して本発明の抗体mAb1、mAb2およびmAb3の重要な特性のいくつかをまとめて示す。表9比較データ実施例6:本発明の実施に有用なアミノ酸およびヌクレオチド配列の簡単な説明実施例7:本発明の実施に有用なアミノ酸およびヌクレオチド配列実施例8:毒性試験の結果毒性試験の第1の目的は、カニクイザルに週1回5週間静脈内投与した後、mAb1の毒性を測定することであった6つの試験項目を適用。この抗体Chir12.12の非サイレントADCC型も、ADCC活性型抗体の効果をADCC-サイレント型mAb1と比較するために使用した。さらに、両抗CD40Abの有効性を評価するために、動物をKLHで免疫した。mAb1またはChir12.12による処置に起因する死亡率または体重の変化、臨床徴候および推定食物消費の変化はなかった。KLH注射部位の局所的な反応は、全群で同程度であった。また、眼科および心血管の検査において試験項目に関連した所見はなかった。血液学的検査では、好塩基球の割合および絶対数にわずかではあるが統計学的に有意な減少がmAb1およびChir12.12で処置した動物において認められ、試験項目-処置の関連は排除することができなかった。尿検査によって、mAb1で処置した雌の1/5およびChir12.12で処置した雌の2/5の尿において、投与との関連が不確かなケトンが明らかになった。臨床化学検査では、Chir12.12で処置した雄ならびにChir12.12で処置した雌1頭にリパーゼ濃度のわずかな増加傾向が認められたが、これは限定的に毒性が関連していると見なされた。血液凝固は、プロトロンビン時間、活性化部分プロトロンビン時間およびフィブリノーゲンによって評価すると、mAb1またはChir12.12による処置によって影響を受けなかった。血小板数は、正常範囲内で現れた。血漿中のPセレクチンまたはsCD40L濃度は、血小板の活性化を示さなかった。Chir12.12で処置した動物では、血液の免疫表現型検査によって、CD20B細胞の顕著な減少が示され、これはこの抗体の予測された薬理学的作用であった。特に、CD20lowCD21B細胞CD40highであると考えられるは、Chir12.12によって除去された。しかし、CD20highCD21-B細胞も特に試験終了時に向かって実質的に減少した。優先的に、CD20CD21CD27-未処理B細胞は、ADCC活性抗体Chir12.12によって除去され、一方、CD20CD21CD27記憶B細胞はほとんど影響を受けなかった。Chir12.12で処置した動物では、CD16NK細胞の絶対数も約50減少した。予測通り、mAb1ADCCサイレントであるによる処置の後、CD20B細胞の顕著な減少は認められず、CD16NK細胞の絶対数のいかなる減少も認められなかった。投与中、中程度の減少を示した唯一のB細胞は、CD20highCD21-B細胞であった。これらの細胞は、マカクサル特異的で、胚中心由来であることが知られており、したがって、この所見は、ヒトへの移行に関係があるとは見なされない。剖検時の脾臓およびKLH流入領域リンパ節の免疫表現型検査によって類似の臨床像が明らかになった。Chir12.12で処置した動物では、CD20B細胞の相対数の減少があったが、mAb1で処置した動物ではCD20B細胞の関連のある減少は認められず、CD21-B細胞の軽度から中程度の減少が伴ったリンパ節では両性別で、脾臓では雄のみ。KLH注射部位から流入する左右リンパ節の免疫表現型検査の結果には差はなかった。T細胞依存性抗体反応TDARによって、対照群と比較して、KLHに対するIgGおよびIgM応答は、mAb1またはChir12.12で処置した動物では認められないことが示された。CD40-CD40リガンド相互作用の阻害によるB細胞活性化の遮断はmAb1の意図した薬理学的作用であり、Chir12.12はB細胞の除去を意図するので、この所見は、毒物学的に関連があるとは見なされない。毒物動態学的評価によって、トラフ濃度は試験経過中に増加することが明らかになり、mAb1およびChir12.12の蓄積が示唆された。4回目および5回目の投与後の平均トラフ濃度は類似しており、mAb1およびChir12.12では、5回目の投与後は定常状態に近い状態であることを示している。4回目および5回目の投与後の投与間隔の平均曝露両性別AUCTはそれぞれ、mAb1では906および990h.mg/Lで、Chir12.12では757および751h.mg/mLであった。AUCT値はまた、5回目の投与後の定常状態に近い状態を示していた。肉眼的検査では、標的器官毒性のいかなる証拠も示されず、器官の重量はまた、この種の正常範囲内であった。顕微鏡的には、両抗体の試験項目関連の所見は、全リンパ性器官[脾臓およびリンパ節腸間膜、下顎、腋窩および鼠径部]で認められ、mAb1およびChir12.12は皮質のB細胞領域における胚中心の発達の完全な抑制を引き起こした。脾臓ならびにKLH流入領域および反対側リンパ節組織のCD20免疫染色によって、脾臓のリンパ濾胞の大きさの減少ならびに脾臓およびリンパ節のB細胞除去が示され、この効果は、mAb1による処置と比較して、Chir12.12で処置した動物ではるかに顕著であった。mAb1で処置した動物の胚中心の所見は、免疫表現型検査時に認められたCD21-B細胞の減少に対応した。CD40免疫染色によって、mAb1またはChir12.12のいずれかによる処置後のリンパ節および脾臓におけるCD40の染色の著しい減少が示された。結論として、この研究の結果に基づいて、雌雄のカニクイザルにmAb1またはChir12.12を100mg/kgの濃度で週に1回5週間静脈内投与すると6回投与、耐容性が良好であった。免疫表現型検査によって、B細胞の除去はChir12.12で処置した動物では示されたが、CD21-B細胞を除いてmAb1で処置した動物では示されず、しかしながら、TDARでは、mAb1およびChir12.12で処置した動物の両方においてKLH免疫後にIgGおよびIgM反応がないことが示された。組織病理学検査によって、mAb1およびChir12.12で処置した動物では脾臓およびリンパ節には胚中心が欠如していることが明らかになった。B細胞に対する効果は望ましい薬理学的作用であり、したがって、有害とは見なされない。無有害作用量NOAELは、この研究の条件下では、mAb1およびChir12.12の両方について100mg/kgの用量であると考えられる。実施例9:mAb1のさらなるインビトロプロファイルmAb1の結合および機能的交差反応性をヒト、アカゲザルおよびカニクイザル白血球の間で測定した。表10は、3種全てにおけるmAb1の結合EC50を直接比較して示している。表10mAb1のヒトおよびNHP交差反応性mAb1は、3種全てのCD20細胞B細胞に同程度のEC50で結合する。さらに、mAb1はヒト扁桃腺B細胞のならびにカニクイザルおよびアカゲザルのPBMCのCD154IL-4誘導性増殖を阻害することができた。総合すると、これらの結果は、mAb1がCD40に結合し、ヒトB細胞または非ヒト霊長類PBMCのCD154誘導性増殖を阻害する能力は非常に類似していることを示唆した。インビトロにおける受容体占有ROデータの利用および機能阻害によって、これら2つの変数の間の関係をそれぞれの種について測定することが可能になった表11。表11mAb1ROと機能阻害との間の関係aアカゲザルのPBMCおよびヒト扁桃腺B細胞における可溶性CD154IL4誘導性増殖bアカゲザルおよびヒトにおけるインビボKDは、カニクイザルにおけるPKPD試験で算出されたものと同じであると仮定する。cmAb1が標的よりも十分に高いと仮定すると、ヒルラングミュアの式が適用可能である。この結果は、ヒトB細胞と比較してアカゲザルPBMCでは、PBMC増殖を50阻害するのにmAb1によって必要とされるROは約2倍少ないことを示している。ヒトでは、完全な阻害は、約75インビボにおいて予想のROで得ることができた。実施例10:移植試験移植片の生着腎臓同種異系移植中にmAb130mg/kgi.v.および経口的シクロスポリンA、20mg/kgで併用処置することによって、試験に関与した動物6頭の生着の著しい延長が引き起こされた。移植片は、動物5529において>91日、5533において31日、5523において>92日、5524において>92日、5536において>98日および5538において>98日平均:>83.6日機能したプロトコル終了時。未処理動物または治療IS以下の用量で処置された動物における生着は、7~10日の範囲であった病歴データ。動物5533は、移植後31日目に、急性腎不全および無尿のため安楽死させた。この病変は、高血圧の期間が継続し、生検を採取するために麻酔した後で出現した。移植後のモニタリングaクレアチニンSCreaおよび尿素Surea血清濃度SCreaは、腎臓機能を評価するために使用した主なパラメータであった。6頭の動物全てにおいて、SCreaレベルは、移植1日後にベースラインレベルを上回って増加した81.8±14.6から221.5±37.1μmol/l。SCreaのそのような上昇は、移植後第1週の間の通常の特徴である表12。表12mAb130mgkgおよびCsA20mgkgによる併用療法で処置したNHP腎臓同種異系移植レシピエントにおいて認められたSCreaの変化第1週の間、SUrea濃度は、0日目に測定したベースライン4.5±1.3mmol/lを上回って急激な上昇を示した表13。動物5529/5533および5536/5538では、SUreaレベルは16~20mmol/l3~5日目で、一方、動物5523および5524ではそれぞれ9または8mmol/l7日目であった。表13mAb130mgkgおよびCsA20mgkgによる併用療法で処置したNHP腎臓同種異系移植レシピエントにおいて認められたSUreaの変化移植1週間後、腎臓機能は正常化する傾向にあり、SCrea/Sureaはベースラインレベルに近づくようになる。しかし、動物5533、5523および5524は、移植後7日と19~25日との間にSCrea/Sureaのさらなる増加を示ししかし、5529、5536および5538は示さなかった、腎臓の機能不全を示唆した。この期間中、多飲症/多尿5523および5524のような徴候、高血清カルシウムSCaの維持5533または移植片容量の増加5523および5524を認めることができた。20~25日後、動物5529、5523、5524、5536および5538は、試験が終了するまで改善し、すぐれた腎臓機能を示した。しかし、31日目に、動物5533はSCrea/SUreaレベルの顕著な増加を示し、急性腎不全が確認されたSCrea;629μmol/lおよびSUrea;18mmol/l。この病変は、高血圧の期間が継続し、麻酔1日前の生検手順後に出現した。この期間中、高血圧ピーク収縮期約170mmgHgおよび低血圧エピソード収縮期約40mmgHgが記録された。b血清アミラーゼ、リパーゼ濃度、体重および血小板数血清アミラーゼ濃度は、全動物で移植後1~7日目に約1.3倍に少し増加した移植後0日目311±53U/Lおよび8日目418±66.8U/L表14。動物5533は、移植後1日目の試験で観察された最高のアミラーゼ濃度を示した1050U/L。移植前では、1回目のmAb1投与前および24時間後-1日目および0日目に観察されたアミラーゼレベルの間には差はなかった。表14mAb130mgkgivおよびCsA20mgkgpoを併用して処置した腎臓移植動物における血清アミラーゼ濃度リパーゼ血清濃度は、平均して、移植前後にわずかな変化を示した表15。実験プロトコルの終了時のみ、わずかな増加が認められた84日目;2.18倍。動物5533は、1日目に測定された最高のリパーゼ濃度を示した284.4U/L。動物5536および5538のリパーゼデータは使用できなかった。アミラーゼおよびリパーゼ濃度の変化は、異なる抗体または低分子量化合物を使用したその他の移植実験で見出されたレベルと類似していたデータは示さず。表15mAb130mgkgivおよびCsA20mgkgpoの濃度で処置した腎臓移植動物4頭における血清リパーゼ濃度迅速で著しい体重の減少は、主に動物5529、5533および5536で認めることができた。移植された動物6頭全てにおいて、移植後の最初の21日の間、体重は-4から-18の範囲であった。しかし、体重減少は、その時点以降および試験終了に向かって回復傾向にあった。血小板数は、移植後の期間中に正常300~400細胞×103/μlであるかまたは増加した600~800細胞×103/μl。動物5529は、血小板数が急速に増加したため、3日間7~9日目アスピリン処置を受けた。動物5533は長期間血小板増加症>1000細胞×103/μlを示し、7~26日の間、アスピリン処置を受けた。cmAb1血液レベルおよびB細胞数参考のPK/PD試験および分析は以前に実施され、カニクイザルは抗体10mg/kgの静脈内単回投与を受けたデータは示さず。この試験において、濃度対時間プロファイルは、明らかな標的介在性の動態TMDを示し、1動物は、おそらくより高い標的発現レベルの結果として、別の動物と比較してより迅速な排泄を示し、PKの管理における標的発現レベルの役割が強調された。この試験から、mAb1血清濃度が約5マイクロg/mLを上回ったとき、これはCD40受容体占有率がほぼ100であると解釈することも確認された。移植試験の設計毎週高レベルのmAb1、30mg/kgを投与および回復/休薬期間なしでは、以前実施されたPK/PD試験と同じ分析レベルおよびモデリングは可能ではなかった。それにも関わらず、以下の所見が認められた表16にまとめて示した;imAb1は1回目の投与前に採取した試料では検出されなかった、iimAb1は投与期間全体を通じて検出された、およびiii採取された試料全てにおいて、個体間のトラフ濃度は変動したカニクイザル5524では1200~2500マイクロg/mL、カニクイザル5523では1000~2000マイクロg/mLおよびカニクイザル5529では850~2400マイクロg/mL。曝露値は全て、カニクイザルにおける完全な受容体占有率を得るために必要な濃度を十分上回っていた170~500倍。表16カニクイザル5533、5529、5523および5524のmAb1血清濃度免疫原性試験サル抗mAb1抗体もこの試験において評価した。試料結果は全て陰性であったが、この試料ではmAb1レベルが高く、薬剤の干渉のため検出が妨害された可能性があった。CD20細胞の部分的な除去が、処置した動物全てにおいて時間と共に認められた。類似の所見が、以前実施されたPK/PD試験で認められたデータは示さず。組織学的検査結果腎臓同種異系移植の組織病理学的評価によって、移植片5523、5524、5529および5538における急性および慢性拒絶はなく、実験終了に到達した移植片5536における境界変化が明らかになった、すなわち、結果は表17にまとめて示した。動物5523、5524および5538における最小限の血管周囲または間質浸潤ならびに動物5529における最小限の腎糸球体細胞過形成が認められた。表17組織学的検査の結果移植後31日目に安楽死させた動物5533は、尿細管拡張、間質浸潤および線維症を示したが、尿細管炎は最小限のみであった。さらに、尿管近傍の顕著な好酸球浸潤および吻合部に近接した膿瘍が見出された。これらの所見は全て、腎機能の長期に亘る不良を示すが、拒絶を確認することはできなかった。C4d免疫染色は全例において陰性であった。濾包性萎縮を有する、または有さない胚中心の発達欠如が全動物のリンパ器官において認められた。バランチジウムコリ感染に起因する盲腸炎が動物5529および5533で診断された。その他の処置に関連した変化には直面しなかった。移植試験-考察移植試験の目的は、腎臓同種異系移植片拒絶の非ヒト霊長類モデルにおいて、治療量以下のシクロスポリンAとの併用療法として投与した場合のmAb1の有益な効果を評価することであった。さらに、全身炎症が誘導されたモデルにおいて副作用がないことを評価することに関連した。治療量以下のCsA20mg/kgp.o.との併用療法として適用したとき、mAb1はNHPにおける腎臓同種異系移植の生着期間延長において有効性を示した。平均移植片生着期間は>83.6日であり、6頭中5頭の動物が実験プロトコルの終了まで到達した91~98日と確認された。非アゴニスト性ブロッキング抗CD40抗体mAb1を使用したCD40の標的化によって、腎臓または膵島移植NHPにおける移植片生着期間の延長がもたらされた。さらに、mAb1Fcサイレントであるを使用することによって、以前に報告されたChir12.12B細胞除去および共刺激ブロッキング特性を備えたIgG1/カッパアイソタイプの完全なヒトモノクローナル抗CD40抗体と比較してより良好な有効性および安全性を評価することができた。移植後の全期間中、いかなる関連性のある臨床上の病変イベント例えば、移植後の一般的な腎機能障害に起因するアミラーゼ/リパーゼレベルのわずかな増加もなかった。しかし、動物5333、5523および5524は7~19日の間に腎機能の低下を表した。この期間は通常、移植後の動物のSCrea/Sureaレベル、血圧および移植片容量の回復によって特徴付けられる。これらの動物では、SCrea/SUreaの増加3動物全て、移植片容量の一時的な増加5523、5524または多飲症/多尿5523、5524などの腎機能障害の徴候が見られた。1つの仮説は、これらの動物は早期に拒絶過程を発症し、mAb1処置の3週間後に制御されるようになったことである。移植後早期におけるこの異常は、CD40経路を標的とする分子Fcサイレントの作用の免疫様式によって誘導される差によるものであり得る。1頭の動物5533は、急性腎不全拒絶なしのため31日目に安楽死させた。この結果は、移植手順後の腎機能の不完全な回復によって引き起こされた。腎機能不良を示す徴候は、高レベルのSUrea11~19mmol/lまたは高いSCa濃度の維持>2.8mmol/lであった。最終的な移植片喪失は、高血圧の継続収縮期>140mmHgに相俟って生検採取手順中に適用された麻酔中に低血圧が認められたこと、および安楽死前夜に高血圧ピーク収縮期約170mmHgが記録されたことによって加速したPalmerBFNEnglJMed34712561261。このようなイベントは全て、mAb1処置に起因するのではなく、移植後における個体差にのみ起因する。併用療法の高い有効性はまた、組織学的に示すことができた。6つの移植片のうち5つが、実験終了時にすぐれた移植片の質を示した。Chir12.12による移植実験においても、胚中心発達の欠如は認められた。その他の処置に関連した組織変化には認められなかった。長期間生着の1頭5529がバランチジウムコリによる盲腸炎を発症した。しかし、この感染はマカクでは一般的で、無症状のことが多く、免疫抑制が急性疾患の発病を引き起こす可能性があるClinMicrobiolRev2162638。この動物では、下痢または体重減少などの臨床徴候は認められなかった。B細胞数モニタリングに関して、部分的な除去が処置した動物全てにおいて時間と共に認めることができた。mAb1がサイレントされた抗体であり、FcRに結合せず、インビトロADCCも媒介しないので、この部分的な除去はおそらく活性Fc受容体が媒介する除去によるものではない。部分的な除去は、胚中心の欠如を反映することができ、実験終了時の組織学的検査において認められる。この部分的な除去は、生着シグナルの欠如によるものである可能性がある。結論として、移植試験の結果によって、すぐれた安全性特性を備えた併用療法における腎臓拒絶の処置の妥当な標的としてmAb1また拡大すれば、本発明のその他の抗体およびタンパク質を使用することが支持される。すぐれた安全性特性および有効性によってさらに、自己免疫障害および/または炎症性障害の処置ならびにCD40抗原を発現する細胞上のCD40L媒介CD40シグナル伝達によって媒介される移植拒絶の予防において本発明の抗体を使用することが支持される。概要抗CD40抗体が、患者における止血イベントを誘導することは報告されたことはないが、抗CD40AbChir12.12を投与されたB細胞リンパ腫患者における膵臓酵素の上昇は報告されており、膵炎の危険性があり得るので、安全性のため慢性自己免疫疾患および移植においてFcコンピテント抗CD40抗体を使用することは避けられている。したがって、インビトロおよびインビボの両方において抗体依存性細胞傷害ADCCまたは補体依存性細胞障害CDCを媒介することができないFcサイレントIgG1抗CD40抗体mAb1、mAb2およびmAb3を作製した。mAb1は、治療量以下のシクロスポリンと併用して、非ヒト霊長類の腎臓同種異系移植生着期間を延長することができた。さらに、mAb1はT細胞依存性抗原による免疫に対する1次および2次抗体応答を完全に抑制することができた。移植または免疫試験のいずれにおいても、止血イベントまたは膵臓の組織学的異常の証拠はなかったことは重大である。総合的に、これらの結果は、mAb1が安全で治療上有効であり、Bリンパ球および抗原提示細胞由来の自己免疫疾患を罹患している患者またはCD40-CD154相互作用が病理の一因として寄与している同種異系移植を受けている患者の処置に使用することができることを示唆している。"