顆粒デンプンスラリーからグルコースシロップを生産するための一段階プロセスであって、顆粒デンプンのゼラチン化温度以下の温度でアルファアミラーゼと顆粒デンプン加水分解活性を有するグルコアミラーゼとを顆粒デンプン基質から得られた顆粒デンプンスラリーに同時に接触させる工程と、グルコースシロップを含む組成物を得るために顆粒デンプンを加水分解するのに十分な時間アルファアミラーゼとGSHEとを作用させる工程とを含むことを特徴とする方法。前記顆粒デンプン基質がトウモロコシ、コムギ、オオムギ、又はコメから得られることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記顆粒デンプン基質が全穀物から得られたトウモロコシデンプンであることを特徴とする請求項2に記載の方法。前記顆粒デンプン基質が乾燥粉砕又は湿式粉砕されていることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記顆粒デンプンスラリーが15乃至55の乾燥固形含量を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。前記顆粒デンプンスラリーが15乃至45の乾燥固形含量を有することを特徴とする請求項5に記載の方法。前記温度が50°Cより高く65°Cより低いことを特徴とする請求項1に記載の方法。前記温度が55°Cより高く65°Cより低いことを特徴とする請求項1に記載の方法。顆粒デンプンの加水分解に十分な時間が2乃至100時間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記接触工程がpH50乃至pH60で行われることを特徴とする請求項1に記載の方法。アルファアミラーゼがバチルス由来である請求項1に記載の方法。デンプン1メートルトン当たりのアルファアミラーゼの量が005kg乃至50kgであることを特徴とする請求項1に記載の方法。デンプン1メートルトン当たりのアルファアミラーゼの量が005kg乃至20kgであることを特徴とする請求項12に記載の方法。配列番号3又は配列番号6の配列と少なくとも90の配列相同性を有す前記GSHEをコードするポリヌクレオチドの異種発現によりGSHEを得ることを特徴とする請求項1に記載の方法。GSHE量が001乃至100GSHEUg乾燥固形デンプンであることを特徴とする請求項1に記載の方法。GSHE量が01乃至50GSHEUg乾燥固形デンプンであることを特徴とする請求項15に記載の方法。GSHEの量が025乃至25GSHEUg乾燥固形デンプンであることを特徴とする請求項16に記載の方法。少なくとも90の顆粒デンプンを24時間以内に加水分解することを特徴とする請求項1に記載の方法。前記グルコースシロップを回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。前記グルコースシロップをろ過分離により回収することを特徴とする請求項19に記載の方法。前記グルコースシロップを所望の最終生成物に転換する工程を更に含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。前記所望の最終生成物がフルクトースシロップであることを特徴とする請求項21に記載の方法。前記所望の最終生成物がエタノールであることを特徴とする請求項21に記載の方法。前記所望の最終生成物が結晶グルコースであることを特徴とする請求項21に記載の方法。グルコースシロップ分離の副生成物として残余デンプンを得ることを特徴とする請求項20に記載の方法。顆粒デンプンのゼラチン化温度以下の温度で、GSHEとアルファアミラーゼとを前記残余デンプンに接触させることにより前記残余デンプンを再利用する工程を更に含むことを特徴とする請求項25の方法。請求項1の方法で得られたグルコースシロップをフルクトースシロップへ酵素的転換工程を含むことを特徴とする高フルクトースデンプンベースシロップを生産する方法。前記転換工程がグルコースイソメラーゼの使用を含むことを特徴とする請求項27の方法。グルコースシロップを含む組成物を生産するために請求項1に記載の方法に従って顆粒デンプン基質を接触させる工程と、残余デンプンを含む混合物を得るために前記組成物からグルコースシロップを分離する工程とを含む残余デンプン組成物を生産する方法。請求項29に記載の方法により得られた残余デンプンをデンプン糖化工程に用いる方法。請求項1に記載の方法により生産されたグルコースシロップをエタノール生成微生物を用いて発酵させる工程を含むことを特徴とするエタノールを生産する方法。前記発酵が接触工程と別に又は連続して行われることを特徴とする請求項31に記載の方法。前記発酵が接触工程と同時に行われることを特徴とする請求項31に記載の方法。発酵からエタノールを回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項31に記載の方法。トリコデルマレーシにおけるフミコーラグリセアvarセルモイデアGSHE遺伝子の発現AフミコーラグリセアvarセルモイデアGSHE遺伝子のクローニング凍結スキタリジウムセルモフィリラム、フミコーラグリセアvarセルモイデアの菌糸からゲノムDNAを抽出した。この凍結菌糸をコーヒーミルの中でドライアイスと一緒に粉砕し、EasyDNAプロトコルによりDNAを抽出した。クロロホルムフェノールイソアミルアルコール抽出工程をこの標準的な手順に追加した。NCBIデータベース登録番号M89475配列にもとづいてPCRプライマーを消化した。以下のプライマーはpENTRDベクター内でクローニングするためのモチーフを含んでいる。このRSH003fプライマーは、CAACATGCATACCTTCTCCAAGCTCCTC及びRSH004rプライマーの配列はTTAACGCCACGAATCATTCACCGTCである。インビトロジェンゲートウェイシステムプロトコルに従ってPCR生成物をpENTRD内へクローンした。このベクターは、その後化学的に有用なTop10大腸菌の中で形質転換され、カナマイシン選択された。幾つかのクローンからのプラスミドDNAが正確なサイズの消化を確認するために制限消化された。いくつかのクローンからのgla1挿入が配列決定された。一のクローンからのプラスミドDNA、pENTRDN13pをTrex3glamdS消化ベクターDNAと共にLRクロナーゼ反応に添加した。LPクロナーゼ反応における組換えは、消化ベクターのCmR及びccdB遺伝子と、pENTRDベクターからのフミコーラグリセアgal1とを置換した。組換えは、gal1をcbh1プロモーターとターミネータとの間に挿入した。48及び50bpの組換え部位配列はそれぞれgal1の上流及び下流に残っていた。LRクロナーゼ反応のアリコートは化学的に適したTop10大腸菌内へ形質転換され、一晩、カルベニシリンで選択条件で育成した。いくつかのクローンからのプラスミドDNAが正しい挿入サイズを確認するために適切な消化酵素で消化された。cbh1プロモーター:gla1:cbh1ターミネーター:amdSを含む発現カセットを切り離すためにクローンからのプラスミドDNA、pTrex3gN13をXbal1で消化した。66kbのカセットを標準技術を用いたアガロースゲル抽出法により精製し、上で述べたように公知の入手可能なQM6のトリコデルマレーシ株内で形質転換した。このカセットをSequetechMountainViewCAを用いて配列決定し、GSHEに対するDNAを図1に、アミノ酸配列を図2に示した。Bトリコデルマレーシの形質転換菌糸の胞子を有する約2cm2のプレートを250mlの4バッフルの振とうフラスコ内の50mlのYEGブロスに接種し37°Cで16乃至20時間200rpmでインキュベーションした。インキュベーションしたものを50mlのコニカルチューブ内に移し2500rpmで10分間遠心して菌糸を回収した。上清を別容器に移した。菌糸のペレットは40mlのフィルターろ過したβDグルカナーゼ溶液を含む250mlの022ミクロンCAコーニングフィルターボトルへ移し、形質転換のためのプロトプラストを育成するために30°Cで200rpmで2時間インキュベーションした。プロトプラストを滅菌ミラクロスから50mlのコニカルチューブにろ過することにより回収した。それらは、2000rpmで5分間遠心分離することによりペレット形成し、アスピレータで乾燥させた。このプロトプラストペレットを、12Mソルビトール50mLで一度洗浄し、遠沈し、アスピレータで乾燥した。25mlのソルビトールCaCl2で洗浄した。このプロトプラストをカウントし、その後、2000rpm、5分間でペレット形成した。上清を別容器に移し、プロトプラストペレットを1mlあたり125×108のプロトプラスト濃度を調製するのに十分量のソルビトールCaCl2の量の中に懸濁して、プロトプラスト溶液を調製した。20μLまでの発現ベクターDANのアリコートを15mlのコニカルチューブに入れ、氷上に置いた。その後に200μLのプロトプラスト懸濁液を50μLのPEG溶液とともに各形質転換アリコートに添加した。チューブをおだやかに撹拌し、氷上で20分間インキュベートした。2mlのPEG溶液をアリコートチューブに添加し、それらを室温で5分間インキュベートした。ソルビトールCaCl2溶液、4mlをこのチューブに添加した。形質転換混合物を3のアリコートに約2mlずつ添加した。各3のアリコートに3の溶解したトップアガーを添加することによりオーバーレイ混合物を作成し、このオーバーレイ混合物を形質転換プレート上に注いだ。形質転換プレートは30°Cで7日間インキュベートした。形質転換体のamdS選択を行った。アセトアミドソルビトールプレート及びトップアガーを形質転換に用いた。トップアガーは、ノーブルアガーの代わりに低融点アガロースを用いた以外は、プレートであるスルビトールアセトアミドアガーレシピと同様に調製した。形質転換体は、アセトアミドを含む新しい選択培地に移すために単離されコロニーを移すことにより精製された。本実施例に用いた溶液を以下のように調製した。140mlのβDグルカナーゼは、600mgのβDグルカナーゼ及び400mgのMgSO47H2Oを含む12Mのソルビトールから調製した。250gのPEG4000及び147gのCaCl22H2Oを含む200mlPEGはdH2Oを用いて調製した。3ソルビトールCaCl2は、12Mのソルビトールと50mMのCaCl2を含む。4アセトアミドソルビトールアガー;パート106gのアセトアミド、168gのCsCl、20gのグルコース、20gのKH2PO4の06gのMgSO7H2O、06gのCaCl22H201mlの1000x塩をpH55に調製しdH2Oで300mlにメスアップし、滅菌フィルター処理をした。パートII20gのノブルアガー1000x塩5gのFeS047H2O16gのMnS04H20、14gのZnS047H2O1gのCaCl26H2Oを混合し、dH2Oを用いて容量を1Lに調整し、フィルター滅菌をした。CフミコーラグリセアvarセルモイデアGSHE遺伝子により形質転換されたトリコデルマレーシの発酵一般的に、ForemanetalJBiolChem2783198831997に説明されている発酵手順は以下のようである。より具体的には、図5に示した各株に対して2回の発酵を行った。15ml凍結スポア懸濁液を5のグルコースを含む08Lのボゲルズ最小培地MethodsinEnzymology17Apg79143andDavisRowlandNEUROSPORACONTRIBUTIONSOFAMODELORGANISMOxfordUnivarSityPressに接種した。48時間後、各培地を、14Lのバイオラフィット発酵槽中にある62Lの同じ培地に移した。発酵は25°C、750RPM及び1分間あたり8リットルの空気速度で行った。1時間後、最初に添加されたグルコースが全て消費された。25ラクトースの供給をラクトースの蓄積による炭素制限が生じないように供給した。グルコース及びラクトースの濃度は、グルコースオキシダーゼキット又はラクトースを切断するβガラクトシダーゼを用いたグルコースヘキソキナーゼアッセイキットにより、それぞれモニターされた。発酵の進行具合をモニターするため定期的にサンプルを採取した。収集されたサンプルを、50mlの遠心管に移し、InternationalEquipmentCompanyclinicalcentrifugeにおいて34スピードで遠心分離した。サンプルの上清を、MOPSSDS緩衝液及びLDSサンプル緩衝液を用いた条件下で4乃至12のBISTRISSDSPAGEゲルを用いて電気泳動を行った。結果を図5に示す。レーン3、4及び5は、異なる時間におけるrGSHEの68kDのバンドが見られた。D形質転換されたトリコデルマレーシクローンのGSHE活性のアッセイ酵素活性GSHE活性は、酵素調製液のアリコートを用いて、50°C、pH45、5mlの10顆粒コーンスターチを含む01M酢酸バッファー中で、インキュベーションしたときに、1分間あたりに放出される還元糖のミリグラムを用いて決定される。GSHEの1の単位は、この条件下で10mgの還元糖を1分間放出する。フミコーラグリセアvarセルモイデア由来の天然のGSHE及びトリコデルマレーシ由来の組換えGSHEを、フェニルセファロースを用いた疎水相互クロマトグラフィーで処理し、その後にSPセファロースを用いたイオン交換クロマトグラフィーを用いた標準技術により精製した。最初にトリコデルマレーシクローンにより発現された組換えGSHEは、ほぼ同じ濃度のタンパク質分画を含んでいた。これらのピークをrGSHE1及びrGSHE2とした。これらのピークは、1500Dによる、及び、輸送マススペクトロメーターにおけるマトリックス支援レーザーイオン化により測定される03pH単位によるマスにおいて、及び製造会社の説明書に従った等電点フォーカシングゲルにおいて違いが見られた。rGSHE1及びrGSHE2の、生デンプン加水分解アッセイにより測定された比重、及びMicroBCAタンパク質アッセイキットを用いて測定したタンパク質及び溶液中の消散係数のパーセンテージは同じであった。初期のrGSHE発現の後約72時間、1のみのrGSHEが存在していた。GSHEの総炭水化物量は、4Nのトリフルオロ酢酸を用いて、100°Cで5時間、酸加水分解をすることにより決定された。測定値は、パラヒドロキシ安息香酸複合体を用いて、放出された還元糖を測定することにより決定された。初期の発現のときに、rGSHE1及びrGSHE2は総炭水化物含量の270を占めていた。しかしながら、72時間後、培地中のrGSHE3の糖化レベルは総炭水化物のうちの057であった。天然GSHEの糖化レベルは112であった。Eフミコーラグリセアvarセルモイデア由来の天然GSHE及びトリコデルマレーシ中で発現した組換えフミコーラグリセアvarセルモイデアGSHEの比較1pH3乃至7のpH安定性上で説明したように組換え的に生産されたGSHEの収集サンプル及び天然GSHEの収集サンプルをpH45の20mM酢酸緩衝液を用いて、タンパク質濃度が同じになるように希釈した。その後、pH3乃至7の各pHレベルにおいて、100mMクエン酸NaOH緩衝液で50°C、30分間反応を行った。サンプルチューブ中にある10mlの反応物に、100mM酢酸pH45中に10のトウモロコシデンプンを含む溶液、5mlを添加した。このチューブを50°Cで20分間振とうした。05mlの20のNaOHを添加した。チューブを、遠心し、05mlの上清を、ジニトロサリチル酸アッセイ上記を用いて還元糖の放出についてアッセイした。アッセイの結果を図8Aに示す。組換え的に生産されたGSHEはpH35において約80の活性を有していた。対照的に対応する天然GSHEは約20の残存活性を有していた。pH40におい組換えGSHE及び天然GSHEは約82の残存活性を有しており、pH55において両酵素は約90乃至100の残存活性を有していた。上で説明した方法を用いてpH75乃至105における安定性も測定された。しかしながら、この試験においては、緩衝液は100mMホウ酸NaOH緩衝液であって。図8に示すように、pH75において、両酵素は約100の活性を保持していた。pH85において、組換えGSHEは約82の残存活性を示したのに対し、天然のGSHEは約90の残存活性を有していた。pH95において、組換えGSHEの残存活性は天然GSHEよりも低かった。2所定の温度における活性プロファイル温度安定性はpH55で測定した。pH安定性試験と同じ手順を用いた。酵素サンプルを100mM酢酸緩衝液に同じ濃度になるように希釈し、10mlの希釈酵素を、40°C、50°C、60°C、及び70°Cの温度のウォーターバス内で、10分間インキュベートし、活性をpH安定性の試験で述べたのと同様に測定した。結果を表5に示す。組換えGSHEの各温度における活性プロファイルは、天然GSHEと同様であった。3nGSHE及びrGSHEによる顆粒トウモロコシデンプンの加水分解フミコーラグリセアvarセルモイデア由来の天然GSHE及びトリコデルマレーシにおいて組換え的に発現されたフミコーラグリセアvarセルモイデアをpH45の酢酸緩衝液を用いて同じ濃度になるように希釈した。1mlの希釈物を20mMのpH45の酢酸緩衝液中に10のトウモロコシデンプンを含むスラリーの中に添加し、50°Cにおいて350rpmで振とうした。所定の時間間隔で、100μLのスラリーを採取し、10μLの2NaOHを添加した。このサンプルを遠沈し、上清をMonarchclinicalanalyzerにおいて、グルコースオキシダーゼ反応を用いてグルコースをアッセイした。図9に示すように、トウモロコシデンプンの加水分解はnGSHEと比較してrGSHEがわずかに低かった。トリコデルマレーシにおけるアスペルギウスアワモリvarカワチGSHEの発現Aアスペルギウスアワモリvarカワチ遺伝子のクローニング実施例1で説明した方法に従って、アスペルギウスアワモリvarカワチ株の凍結菌糸からゲノムDNAを抽出した。PCRプライマー配列はアスペルギウスアワモリvarカワチグルコアミラーゼGAIAgricBiolChem53923929に基づいて設計された。このGAIはGSHEである。GatewayディレクショナルモチーフCACCを含、CACCATGTCGTTCCGATCTCTTCTCを有するRSH10fプライマー、及び、CTACCGCCAGGTGTCGGTCACを有するRSH10rプライマーを用いた。DNA配列を図6に示す。シグナルペプチドを含むコードされるGSHEポリペプチド配列を図7Aに示す。成熟タンパク質配列は図7Bに示す。216kbのPCR産物をゲル精製し、ゲートウェイシステムプロトコルに従いpENTRD内へクローンした。このベクターを化学的に適したTop10大腸菌内へ形質転換しカナマイシン選択をした。幾つかのクローンからのプラスミドDNAを正しいサイズの挿入を確認するために制限消化した。幾つかのクローンからのGAI遺伝子挿入を配列決定した。一のクローンからのプラスミドDNA、pENTRDAk33xx1、をpTrex3gandS消化ベクターDNAと共にLRクロナーゼ反応に添加した。LRクロナーゼ反応における組換えは、消化ベクターのCmR及びccdB遺伝子とpENTRDベクターからのアスペルギウスカワチGAIとを置き換えた。この組換えは、GAIを消化ベクターのcbh1プロモーター及びターミネータの間に方向付けて挿入する。48及び50bpのAttB組換え部位配列は、それぞれグルコアミラーゼの上流及び下流にそれぞれ残っていた。図3を参照していただきたい。この実施例において、フミコーラグリセアgla1は、アスペルギウスカワチGAIに置き換えられる。2μLのLRクロナーゼ反応物を化学的に適合なTop10大腸菌内へ形質転換し、一晩カルベニシリン選択条件下でインキュベートした。クローンからのプラスミドDNA、pTrex3gAkxx3をcbh1プロモーター:GAI:cbh1ターミネーター:amdSを含む発現カセットを切り離すためにXbalで消化した。この67kbカセットは標準技術を用いたアガロース抽出により精製され、公知の入手可能なQM6a株由来のトリコデルマレーシの株内へ形質転換された。Bアスペルギウスアワモリvarカワチ遺伝子を有するトリコデルマレーシの形質転換トリコデルマレーシの胞子懸濁液を、MABA形質転換プレートの中心から6cmのところに広げた。このプレートをその後、チャンバー内で風乾した。ストッピングスクリーン及びマクロキャリアホルダーを70のエタノールに浸し、風乾した。ドリライトデシキャントを小さなペトリ皿の上に置き、ワットマンフィルターペーパーを用いて積み重ねた。マクロキャリアーを含むマクロキャリアホルダーをフィルターペーパーの上に水平に置き、ぺトリ皿の蓋を置き換えた。タングステン粒子の懸濁液を60mgのタングステンM10粒子をエッペンドルフチューブ内で調製した。1mlのエタノールを添加した。このタングステンをエタノール溶液中で攪拌し、15分間浸した。このエッペンドルフチューブをタングステンペレットを作るために最大速度で短時間、遠心分離した。このエタノールを移し、脱イオン水で3回洗浄した。3回目の洗浄水を移した後、タングステンを1mlの滅菌グリセロールに懸濁した。このタングステンを、2週間おきに新しく調製した。形質転換反応は25μLの懸濁されたタングステンを各形質転換のための15mlのタングステン懸濁液に添加することによって調製した。添加に続いて、05乃至5μLのDNA、25μlの25MCaCl2、10μLの01Mのスペルミジンを順番に添加した。反応物はタングステンを懸濁状態に維持するために、5乃至10分間ボルテックスで激しく攪拌した。このエッペンドルフチューブを短時間遠心し、上清を別容器に移した。このタングステンペレットを200μLの70エタノールで洗浄し、短時間遠心し、上清を別容器に移した。次いで、このタングステンペレットを、24μLの100エタノールの中でピペットを用いて懸濁した。このエッペンドルフチューブを超音波水槽に15秒間静置し、8μLのアリコートを乾燥したマクロキャリアーの真ん中に移した。マクロキャリアーを乾燥したペトリ皿の中で乾燥させた。Heタンクを1500psiに調製した。1100psiの大気放出板をModelPDS1000HeBiolisticParticleDelivarySystemに用いた。タングステン溶液が乾燥したときに、停止スクリーン及びマクロファージホルダーをPDS1000に挿入した。標的トリコデルマレーシ胞子を含むMABAプレートを停止スクリーンの下6cmに置いた。29インチのHgのバキュームをチャンバー上に設置し固定した。HeBiolisticParticleDelivarySystemを照射した。チャンバー内を通気し、MABAプレートを28°C、5乃至7日間のインキュベートのために取り出した。実施例2で用いた溶液は以下の様に調製した。変更amdSBiolisticアガーLパートIdH2O500ml中1000×塩1mlノベルアガー20gpHを60に調製してオートクレーブパートIIdH2O500ml中アセトアミド06gCaCl168gグルコース20gKH2PO15gMgSO47H2O06gCaCl22H2O06gpHを45に調製し、02ミクロンのフィルター滅菌をし、50°Cのオーブン内で加熱し、パートI混合物と混合し、プレートに注いだ。1000×塩LFeSO47H2O5gMnSO4H2O16gZnSO47H2O14gCaCl26H2O1g02ミクロンのフィルター滅菌rGSHEの発現において発現したアスペルギウスアワモリvarカワチGSHEは実施例1のフミコーラグリセアvarセルモイデアの発現について説明したのと同様に決定された。発現のレベルは1gL以上であった。図10は、トリコデルマレーシ宿主内におけるアスペルギウスアワモリvarカワチGSHEの発現を示すSDSPAGEの結果である。アルファアミラーゼによる異なる顆粒デンプン基質の可溶化及び加水分解典型的な試験において、150グラムの顆粒デンプンを350グラムの脱イオン水に懸濁した。混合の後、6NのNaOHを用いてpHを55に調整した。アルファアミラーゼをデンプンスラリーに添加し、60°Cに維持されているウォーターバス内で攪拌しながらインキュベートした。このサンプルを異なる時間間隔で回収し、ブリックスを測定した。インキュベートから24時間の時点で回収されたサンプルをHPLCを用いた糖組成の決定に用いた。表6に示す結果は、顆粒デンプン基質の可溶化に有意な違いを示す。コムギが最も可溶化固形分率が多く、トウモロコシが最も低いパーセンテージであった。有意な違いは24時間における糖組成についても見られた。アルファアミラーゼ及びrGSHEによる顆粒デンプン基質の可溶化及び加水分解通常の実験において、350gの水を150gの顆粒トウモロコシデンプン、顆粒コムギデンプン及び顆粒タピオカデンプンに添加し、6NのNaOHを用いてpHを55に調整した。このスラリーを、混合物を均一に保つために攪拌しながら、60°C維持した水槽内に静置した。温度が安定した後、アルファアミラーゼ及びrHGSHEを各デンプンスラリーに添加し、インキュベーションを続けた。サンプルを異なる時間間隔において回収し、遠心し、ブリックスを測定した。24時間のサンプルは糖組成を解析した。顆粒デンプンの相対的な可溶化はジェットクッキングプロセス処理されたブリックスの比較により計算した。GZymeG997及びrHGSHEを組み合わせると、穏やかな条件で近年用いられている高温に置けるジェットクッキングと比較に匹敵する、完全な顆粒デンプンの加水分解が実現した。24時間のサンプルの解析は、965以上のグルコース生産を示した。顆粒デンプン加水分解活性を有するグルコアミラーゼによる顆粒デンプンの可溶化及び加水分解アスペルギウスニガー及びリゾプスニベウス由来の顆粒デンプン加水分解活性を有する市販グルコアミラーゼを、実施例1のrHGSHEと比較した。これらの酵素の顆粒デンプン基質加水分解活活性は上で説明した方法で測定した。30の顆粒トウモロコシデンプンスラリーを調製し、pHを6NのNaOHで55に調整した。GZymeG997を01KgMTデンプンdsに添加し、デンプンスラリーを60°Cに維持したウォーターバス内に静置した。GZymeG997を含む各デンプンスラリーにグルコアミラーゼを同じ投与量、すなわち、15GSHE単位gデンプンds添加し、60°Cでインキュベートした。アリコートを異なる時間で回収し、遠心分離した。透明な上清をブリックス測定に用いた。2、6、225、及び49時間インキュベーションしたサンプルをHPLCによる糖組成の解析に用いた。結果を表9に示す。アルファアミラーゼ及びrHGSHEと共にインキュベーションした間の顆粒トウモロコシデンプンの可溶化おけるpHの影響372gの水を178gのトウモロコシデンプンに添加した。このスラリーの混合を均一にするためにスターラーでよく攪拌し、6NのNaOHを用いてpHを40、50、55、60、及び70に調整した。このサンプルを60°Cに維持したウォーターバスの中に静置した。温度が平衡になったあと、GZymeG997及びrHGSHEをスラリーに添加した。このスラリーをインキュベーションの間攪拌し、1時間インキュベーションした後のサンプルをブリックスの測定に用いた。最大可溶化は、pH50乃至56の間で起こった。顆粒トウモロコシデンプンの可溶化における有意な減少は、pH50乃至55以下のpHで起こった。このことは、活性が低くなったか、酵素が失活したかのいずれかを示唆する結果である。アルファアミラーゼ及びrHGSHEでインキュベーションした間の顆粒トウモロコシデンプンの可溶化における温度の影響372gの水を178gのトウモロコシデンプンに添加した。このスラリーを均一にするためによく混合し、pHを6NのNaOHを用いて55に調整した。このサンプルを55°C、60°C、及び65°Cに維持したウォーターバス内に静置した。温度を平衡化した後、GZymeG997、01kgMTデンプン及び実施例1のrHGSHEを添加した。このスラリーをインキュベーションの間、連続的に攪拌し1時間後にブリックスを測定した。顆粒コーンスターチの可溶化温度はGZymeG997及びrHGSHEの存在下で、温度が上昇すると高くなった。しかしながら、65°C以上の温度での炭水化物の可溶化のHPLC測定によると、rHGSHE単独ではグルコース濃度低くなることからrHGSHEの失活が示唆される。上の表のように、65°C以上の温度において、高い可溶化が起こるのは、主に、GZymeG997の高温における顆粒デンプンの液化に対する影響である。顆粒トウモロコシデンプンの可溶化及び加水分解におけるGZymeG997及びrHGSHEの濃度の影響別々のフラスコ内で372gの水に178gの顆粒トウモロコシデンプンを含むスラリーを均一にするためによく混合した。このスラリーのpHを55に調整した。異なるレベルのGZymeG99701kgMTデンプン及び05kgMTデンプンを、025、05、及び01GSHE単位gdsデンプンと共にインキュベートした。サンプルを異なる時間間隔で回収し、ブリックス及び総糖組成の測定に用いた。表12Aにおける結果は、GZymeG99701kgMTのデンプン乃至05kgMTデンプンの投与は顆粒デンプンのより早い可溶化になった。しかし、両レベルにおいて、可溶化がrHGSHEの10GSHE単位の存在下で24時間において95以上の顆粒デンプンが可溶化されていた。GZymeG997の存在下における顆粒デンプンの可溶化におけるrHGSHEの影響は酵素の濃度が高くなるに従って高くなった。上の結果は明らかにGZymeG997又はrHGSHEのいずれか一方が顆粒デンプンを完全に可溶化したのではなく、これらの酵素を共に添加したときに完全な可溶化が起こることを示している。60°C、pH55において、12、24、30時間、顆粒トウモロコシデンプンをGZymeG997及びrHGSHEと共にインキュベーションする間に精製する可溶化された顆粒トウモロコシデンプンの炭水化物組成をHPLCで解析し、結果を表12Bに示した。表12Bの結果は、バシルスステアロセレモフィリスアルファアミラーゼ及びrHGSHEの適切なブレンドは、従来の高温調理プロセスを適用することなく、顆粒デンプンから直接、糖甘味料及び他の生化学的生産物の工業的生産における様々な必要性を満たすことを示している。高いレベルのアルファアミラーゼは、顆粒デンプンの可溶化の比を促進するが、rHGSHEの高いレベルは、高度に重合した糖のレベルを有意に低くする逆反応生成物のレベルが高くなる。グルコアミラーゼ調製物による酵素液化トウモロコシデンプン及び顆粒デンプン基質の加水分解の比較32dsのトウモロコシデンプンをpH56において、低温ジェットクッキング工程を04kgsMTデンプンdsで添加した。液化工程において、SPEZYMEFERD液化デンプン基質のpHを42に調整し、グルコアミラーゼを022GSHEgds添加した。加水分解を60°Cで行った。サンプルを異なる時間間隔で回収し、最大グルコース生産にいたるまでの時間を決定するためにHPLCで解析した。蒸留水中22dsの顆粒トウモロコシデンプンが調整され、スラリーのpHを1NのNaOHを用いて55に調整した。振とうフラスコを60°Cに維持したウォーターバス内に置き、GZymeG997を01KgsMtdsの濃度で添加し及びrHGSHEを10GSHE単位gdsの濃度で添加し、サンプルを60°Cで攪拌しながらインキュベートした。ブリックス及びグルコース生産を測定するために、サンプルを異なる時間間隔で回収した。グルコアミラーゼによる液化固形デンプンの加水分解は最大グルコース産性にいたる時間が不溶性顆粒デンプンの加水分解と比較してより長かった。最大グルコース生産のピーク時間において、液化された可溶性デンプンと比較したときの顆粒デンプンによるグルコースレベルは、高く。本発明のアルファアミラーゼ及びGSHEブレンドの混合物は、短い時間に高いグルコース産性をする能力及び高温ジェットクッキング工程が排除できるという点において、従来技術に対して差別化されている。GZymeG997及びrHGSHEを用いたインキュベーションの間のデンプンの可溶化及び加水分解における顆粒トウモロコシデンプン濃度の影響蒸留水中に異なる顆粒トウモロコシデンプンの濃度のスラリーを調整した。このスラリーのpHをpH55に調整した。このサンプルを60°Cに維持したウォーターバス内に置き、スラリーを均一にするために攪拌を続けた。GZymeG997及び実施例1のrHGSHEをスラリーに添加した。ブリックス及び糖組成のために、サンプルの一部をインキュベーションの間の異なる時間間隔で回収した。この結果は、30と同じ高さの溶解された固形物における糖化の24時間以内に96以上のグルコースを生産することができることを示した。35以上の固形レベルにおけるこの96以上のグルコース生産は、糖化工程に不溶性の顆粒デンプンを用いたときに達成された。当該技術分野で知られているように、グルコース高含有シロップを得るための酵素酵素デンプン添加工程は、熱安定性アルファアミラーゼを用いて不溶性デンプン基質を高温液化工程に適用することにより可溶性液化デンプンを生産する工程を含む。活性を有するアルファアミラーゼの存在により、糖化工程においてグルコアミラーゼによるグルコース生産が減少することを防ぐために、糖化工程に先立ち、液化工程で残ったアルファアミラーゼを不活性化することは商業的生産における常套手段である。残余アルファアミラーゼ活性の不活性化は通常95°CにおいてpH42で液化物を処理することにより行われる。高温及びpH45において、アルファアミラーゼは完全に失活する。従って、我々は、pH55において液化デンプンの糖化における活性又は不活性アルファアミラーゼの影響を検討した。典型的な実験において、トウモロコシデンプンから調整された可溶性液化は、ジェットクッキング条件において、液化酵素としてZymeG997を用いて製造される。更に残余アルファアミラーゼを失活させるために液化デンプンの一部を加熱する。残余アルファアミラーゼ活性を有する又は有さない、液化デンプンの糖化物を、実施例1のrHGSHE、05GSHE単位gを用いて60°C、pH55の条件で、更に糖化させる。サンプルを異なる時間間隔で回収し、グルコース生産をHPLCを用いて解析した。表15の結果は、グルコアミラーゼによる可溶化デンプン基質の糖化の間のGZymeG997のアルファアミラーゼ活性の存在はグルコース生産を低めることを示している。一方、グルコアミラーゼが実質的に高いグルコースレベルにすることにより、不溶性デンプン基質の加水分解をアルファアミラーゼが高める。トウモロコシデンプンの加水分解物からのグルコースシロップ及び残余デンプンの生産反応管中に、水1200gに顆粒トウモロコシデンプンを懸濁したスラリーを得るため均一に混合した。4NのNaOHを用いてこのスラリーのpHを55に調整した。60°Cにおいて、GZymeG997及びトリコデルマレーシの中で発現したフミコーラグリセアvarセルモイデア10GSHEUgデンプンを添加した。サンプルを異なる時間間隔で回収し、ブリックス及び総糖含量の測定に用いた。10時間の反応時間において、顆粒デンプンの90以上が可溶化した後、HPLCにより測定される可溶化顆粒デンプンの糖組成は表17に示すようになった。10時間反応させた後、4NのH2SO4を用いてpHを35に調整することにより加水分解を停止させた。シロップ混合物は、30以上の固形含量において、96のデキストロースを含んでいた。この混合物を500000分子量カットオフ精密ろ過膜カートリッジを用いて60°Cでフィルターろ過した。残余デンプンのサンプルを乾燥させ、電子顕微鏡のスキャニングによりその構造を解析し、本発明の方法に従って酵素に曝す前の典型的なデンプン顆粒と比較した。乾燥サンプルは、両面接着性のカーボンテープを用いてSEMサンプルスタッズの上に乗せた。あらゆる余分なサンプルを圧縮空気を用いて取り除いた。このサンプルはその後、BalTecMed020ModularHighVacuumCoatingSystemの中に約30°の角度でおかれ、60rpmの回転数で10nmのプラチナでスパッタコートした。これらのセッティングによりデンプン顆粒の前面に均一にコートされた。コーティングの厚さは、デンプン顆粒の酵素作用からの結果となる特徴的なサイズと比較すると無視できる程度である。加速電圧は2乃至5Kvの間で変化し、倍率は500ないし1500Xであった。図12aの電子顕微鏡写真は、本発明の酵素組成物及び方法に曝す前の典型的な顆粒デンプンを示す。表面は滑らかで均質であり、プラチナ金属コーティングのために生じた小さな亀裂のみが特徴である。一旦、本発明の酵素ブレンド及び方法に曝されると顆粒表面の形態が変化した。図12の電子顕微鏡写真bdに示すように、デンプン顆粒基質の酵素消化により大きな丸い穴が顆粒の穴に開いていた。この穴の直径の幅は、穴の深さにより変動する。酵素反応の異なる動態段階におけるデンプン顆粒の集団を反映した。幾つかの顆粒は数個の穴しか有しなかったけれども、幾つかの顆粒は穴が密集していた。幾つかの顆粒は、消化された内部の切断面が示すように半分に切れていた。顕微鏡写真dは酵素消化の完了を示す。酵素により刳り抜かれた断片が観察された。