表面を持つ支持体、およびその表面に取付けられた複数のポリマー分子を含むポリマー分子のアレイであって、各ポリマー分子はランダムコイル状態を持ち、かつ一つ以上の線状ポリマーユニットの複数コピーの分岐構造または線状構造を含んでいて、ポリマー分子が、表面上のランダムコイルの投影像と実質的に等価な領域内で、表面に取付けられ、かつポリマー分子の少なくとも30パーセントを別々に検出することができるような密度で、ランダムに配置されるようなアレイ。前記一つ以上の線状ポリマーユニットがそれぞれ一本鎖ポリヌクレオチドであり、前記表面が、そこに取付けられた反応性官能基または捕捉オリゴヌクレオチドを持ち、前記ポリマー分子がそれぞれ、前記ポリマー分子の相補的官能基と反応する一つ以上の反応性官能基によって形成される一つ以上の結合によって、または捕捉オリゴヌクレオチドとポリマー分子の相補的配列との間に形成される一つ以上の複合体によって、前記表面に取付けられる、請求項1に記載のポリマー分子のアレイ。前記表面が、不連続な相隔たる領域のアレイを持つ平面状の表面であり、各不連続な相隔たる領域が、前記ポリマー分子の前記ランダムコイルの前記投影像と実質的に等価なサイズを持ち、かつ、そこに取付けられた前記反応性官能基または前記捕捉オリゴヌクレオチドを含有する、請求項2に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が1μm2未満の面積を持つ、請求項3に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が、01~20μmの範囲の最近接距離を持つ規則的アレイを形成し、前記不連続な相隔たる領域の過半数が、一つを超える前記ポリマー分子を含有しない、請求項4に記載のアレイ。前記ポリマー分子が前記不連続な相隔たる領域にランダムに分布し、前記最近接距離が03~3μmの範囲にある、請求項5に記載のアレイ。前記ポリマー分子のそれぞれが、ターゲット配列およびアダプターオリゴヌクレオチドの複数コピーのコンカテマーを含むポリヌクレオチド分子である、請求項6に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が前記支持体中のウェルであり、そのウェルがそれぞれ、前記不連続な相隔たる領域の面積に等しいかそれより小さい面積を持つ開口部を有する、請求項4に記載のアレイ。表面を持つ支持体;およびその表面に取付けられた複数のポリヌクレオチド分子を含むポリヌクレオチド分子のアレイであって、各ポリヌクレオチド分子はランダムコイル状態を持ち、かつターゲット配列の複数コピーのコンカテマーを含み、ポリヌクレオチド分子が、表面上のランダムコイルの投影像に実質的に等価な領域内で、表面に取付けられ、かつポリヌクレオチド分子の少なくとも30パーセントが少なくとも50nmという最近接距離を持つような密度で、ランダムに配置されるようなアレイ。前記表面がそこに取付けられた反応性官能基を持ち、前記ポリヌクレオチド分子がそれぞれ、前記ポリヌクレオチド分子の相補的官能基と反応する一つ以上の反応性官能基によって形成される一つ以上の結合によって、前記表面に取付けられる、請求項9に記載のアレイ。前記表面が、不連続な相隔たる領域のアレイを持つ平面状の表面であり、各不連続な相隔たる領域が、前記ポリヌクレオチド分子の前記ランダムコイルの前記投影像と実質的に等価なサイズを持ち、かつ、そこに取付けられた前記反応性官能基を含有し、そのような領域に前記ポリヌクレオチドが多くとも一つだけ取付けられている、請求項10に記載のアレイ。前記反応性官能基が疎水性官能基である、請求項11に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が1μm2未満の面積を持つ、請求項11に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が前記支持体中のウェルであり、そのウェルがそれぞれ、前記不連続な相隔たる領域の面積に等しいかそれより小さい面積を持つ開口部を有する、請求項13に記載のアレイ。前記ポリヌクレオチドが前記不連続な相隔たる領域にランダムに分布し、前記最近接距離が03~3μmの範囲にある、請求項13に記載のアレイ。実質上全ての前記不連続な相隔たる領域にポリヌクレオチドが取付けられている、請求項15に記載のアレイ。前記コンカテマーが、前記ターゲット配列と前記アダプターオリゴヌクレオチドのコピーを交互に含む、請求項15に記載のアレイ。前記コンカテマーのそれぞれが、各々のターゲット配列を少なくとも10コピーは含有する、請求項17に記載のアレイ。前記ターゲット配列がそれぞれ50~500ヌクレオチドの範囲の長さを持ち、前記アダプターオリゴヌクレオチドが6~60ヌクレオチドの範囲の長さを持つ、請求項17に記載のアレイ。前記反応性官能基が全て同じである、請求項15に記載のアレイ。前記コンカテマーのそれぞれが、各々のターゲット配列を同定するためのデコーダーオリゴヌクレオチドを少なくとも一つは含む、請求項15に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が、前記平面状の表面に、直線的パターンで配置され、各不連続な相隔たる領域が、01~10μmの直径を持つ円によって囲まれる面積を持つ、請求項15に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が、01~20μmの範囲の最近接距離を持つ規則的アレイを形成する、請求項11に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域のそれぞれが、前記ポリヌクレオチドを実質的に含まない領域間間隙で取り囲まれる、請求項23に記載のアレイ。前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの少なくとも過半数が光学的に解像可能であるように、前記平面状の表面にランダムに配置される、請求項10に記載のアレイ。前記ポリヌクレオチドの少なくとも70パーセントが光学的に解像可能である、請求項25に記載のアレイ。不連続な相隔たる領域各不連続な相隔たる領域は、1μm2未満の面積を持ち、かつそこに取付けられた反応性官能基を含有するの規則的アレイを有する表面を持つ支持体;およびその表面に取付けられた複数の単分子各単分子は、高分子構造と、取付け部分を持つ少なくとも一つの分析物とを含み、各高分子構造が、ユニークな官能基と、不連続な相隔たる領域の反応性官能基との結合を形成する能力を持つ複数の取付け官能基とを含み、分析物が、ユニークな官能基と分析物の取付け部分との間の結合によって高分子構造に取付けられるようになっているを含む単分子のアレイであって、複数の単分子が、不連続な相隔たる領域上に、その不連続な相隔たる領域の少なくとも過半数が単分子を一つだけ含有するように、ランダムに配置されるアレイ。前記高分子構造が分岐ポリマーまたは線状ポリマーである、請求項27に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が前記支持体中のウェルであり、そのウェルがそれぞれ、前記不連続な相隔たる領域の面積に等しいかそれより小さい面積を持つ開口部を有する、請求項28に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域がそれぞれ01~20μmの範囲の最近接距離を持ち、前記高分子構造が分岐ポリヌクレオチドまたは線状ポリヌクレオチドである、請求項28に記載のアレイ。前記最近接距離が03~3μmの範囲にある、請求項30に記載のアレイ。実質上全ての前記不連続な相隔たる領域に単分子が取付けられている、請求項31に記載のアレイ。前記高分子構造が線状ポリヌクレオチドである、請求項31に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が、前記平面状の表面に、直線的パターンで配置され、各不連続な相隔たる領域が、01~10mμmの直径を持つ円によって囲まれる面積を持つ、請求項31に記載のアレイ。前記分析物がポリヌクレオチドまたはタンパク質である、請求項31に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域のそれぞれが、前記高分子構造を実質上含まない領域間間隙によって取り囲まれる、請求項31に記載のアレイ。前記ユニークな官能基が第1オリゴヌクレオチドであり、前記取付け部分が、第1オリゴヌクレオチドに相補的な配列を持つ第2オリゴヌクレオチドである、請求項31に記載のアレイ。前記分析物がポリヌクレオチドである、請求項37に記載のアレイ。捕捉オリゴヌクレオチドが取付けられている表面を持つ支持体;およびその表面に取付けられた複数のポリヌクレオチド分子を含むポリヌクレオチド分子のアレイであって、各ポリヌクレオチド分子は、ターゲット配列およびアダプターオリゴヌクレオチドの複数コピーのコンカテマーを含み、ポリヌクレオチド分子が、捕捉オリゴヌクレオチドとアダプターオリゴヌクレオチドとの間に形成される一つ以上の複合体によって、表面に取付けられるようになっており、ポリヌクレオチド分子の少なくとも過半数が少なくとも50nmという最近接距離を持つような密度で、ポリヌクレオチド分子が表面にランダムに配置されるアレイ。前記表面が、不連続な相隔たる領域のアレイを持つ平面状の表面であり、各不連続な相隔たる領域が1μm2未満の面積を持ち、かつそこに取付けられた前記捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、実質上全てのそのような領域に前記ポリヌクレオチド分子が多くとも一つだけ取付けられている、請求項39に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が前記支持体中のウェルであり、そのウェルがそれぞれ、前記不連続な相隔たる領域の面積に等しいかそれより小さい面積を持つ開口部を有する、請求項40に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が、01~20μmの範囲の最近接距離を持つ規則的アレイを形成する、請求項40に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域上の前記ポリヌクレオチド分子が、それらが光学的に解像可能であるような最近接距離を持つ、請求項42に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域のそれぞれが、前記ポリヌクレオチド分子を実質上含まない領域間間隙で取り囲まれる、請求項42に記載のアレイ。前記ポリヌクレオチド分子が前記不連続な相隔たる領域上にランダムに分布し、前記最近接距離が03~3μmの範囲にある、請求項42に記載のアレイ。実質上全ての前記不連続な相隔たる領域にポリヌクレオチド分子が取付けられている、請求項45に記載のアレイ。前記コンカテマーが、前記ターゲット配列および前記アダプターオリゴヌクレオチドのコピーを交互に含む、請求項45に記載のアレイ。前記コンカテマーのそれぞれが、各々のターゲット配列を少なくとも10コピーは含有する、請求項47に記載のアレイ。前記ターゲット配列がそれぞれ50~500ヌクレオチドの範囲の長さを持ち、前記アダプターオリゴヌクレオチドが6~60ヌクレオチドの範囲の長さを持つ、請求項47に記載のアレイ。前記捕捉オリゴヌクレオチドの全てが同じヌクレオチド配列を持つ、請求項45に記載のアレイ。前記コンカテマーのそれぞれが、各々のターゲット配列を同定するためのデコーダーオリゴヌクレオチドを少なくとも一つは含む、請求項45に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が、前記平面状の表面に、直線的パターンで配置され、各不連続な相隔たる領域が、01~10μmの直径を持つ円によって囲まれる面積を持つ、請求項45に記載のアレイ。前記捕捉オリゴヌクレオチドと前記アダプターオリゴヌクレオチドとの間の前記一つ以上の複合体が二重鎖である、請求項45に記載のアレイ。同じサブアレイ内の前記不連続な相隔たる領域が、同じヌクレオチド配列を持つ捕捉オリゴヌクレオチドを有し、異なるサブアレイ内の前記不連続な相隔たる領域が、異なるヌクレオチド配列を持つ捕捉オリゴヌクレオチドを有するような形で、前記不連続な相隔たる領域が複数の規則的サブアレイを形成し、複数あるどのサブアレイ内でも、前記不連続な相隔たる領域のそれぞれが1~20μmの範囲の最近接距離を持つ、請求項40に記載のアレイ。前記規則的サブアレイがそれぞれ直線的アレイであり、前記不連続な相隔たる領域間の前記最近接距離がそれぞれについて同じである、請求項54に記載のアレイ。前記ポリヌクレオチド分子が、前記ポリヌクレオチド分子の少なくとも過半数が光学的に解像可能であるように、前記平面状の表面にランダムに配置される、請求項39に記載のアレイ。前記ポリヌクレオチド分子の少なくとも70パーセントが光学的に解像可能である、請求項56に記載のアレイ。ポリヌクレオチド分子のアレイを作製する方法であって、ソースDNAからのDNAフラグメントおよびアダプターオリゴヌクレオチドのコンカテマーをそれぞれが含む、複数のポリヌクレオチド分子を生成させるステップ;捕捉オリゴヌクレオチドが取付けられている表面を持つ支持体上に、ポリヌクレオチド分子が、捕捉オリゴヌクレオチドとアダプターオリゴヌクレオチドとの間に形成される一つ以上の複合体によって表面に固定されるように、かつポリヌクレオチド分子が、ポリヌクレオチド分子の過半数が少なくとも50nmという最近接距離を持つような密度で、表面上にランダムに分布するように、複数のポリヌクレオチド分子を配置し、それによってポリヌクレオチド分子のアレイを形成させるステップを含む方法。前記表面が、不連続な相隔たる領域のアレイを持つ平面状の表面であり、各不連続な相隔たる領域が1μm2未満の面積を持ち、かつそこに取付けられた前記捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、実質上全てのそのような領域に前記ポリヌクレオチド分子が多くとも一つだけ取付けられている、請求項58に記載の方法。前記ポリヌクレオチド分子を、それらを前記支持体上に配置した後に、増幅するステップをさらに含む、請求項59に記載の方法。前記増幅ステップが、前記コンカテマーのそれぞれの前記不連続な相隔たる領域内で、前記コンカテマーを切断して第2フラグメントを形成させ、第2フラグメントを環状化し、第2フラグメントをRCR反応によって増幅することを含む、請求項60に記載の方法。前記不連続な相隔たる領域が前記支持体中のウェルであり、そのウェルがそれぞれ、前記不連続な相隔たる領域の面積に等しいかそれより小さい面積を持つ開口部を有する、請求項61に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域が、01~20μmの範囲の最近接距離を持つ規則的アレイを形成する、請求項59に記載の方法。前記ポリヌクレオチド分子が前記不連続な相隔たる領域にランダムに分布し、前記最近接距離が03~3μmの範囲にある、請求項63に記載の方法。前記生成ステップが、前記ソースDNAを断片化して前記DNAフラグメントを作成するステップ、前記DNAフラグメントを環状化するステップ、およびローリングサークル複製によって前記DNAフラグメントのコンカテマーを形成させるステップをさらに含む、請求項64に記載の方法。前記不連続な相隔たる領域上の前記ポリヌクレオチド分子が、それらが光学的に解像可能であるような最近接距離を持つ、請求項65に記載の方法。ポリヌクレオチド分子のアレイを作製する方法であって、ソースDNAからのDNAフラグメントのコンカテマーをそれぞれが含む、複数のポリヌクレオチド分子を生成させるステップ;反応性官能基が取付けられている表面を持つ支持体上に、ポリヌクレオチド分子が、反応性官能基とポリヌクレオチド分子上の相補的官能基との間に形成される一つ以上の結合によって表面に固定されるように、かつポリヌクレオチド分子が、ポリヌクレオチド分子の少なくとも過半数が少なくとも50nmという最近接距離を持つような密度で、表面上にランダムに分布するように、複数のポリヌクレオチド分子を配置し、それによってポリヌクレオチド分子のアレイを形成させるステップを含む方法。前記表面が、不連続な相隔たる領域のアレイを持つ平面状の表面であり、各不連続な相隔たる領域が1μm2未満の面積を持ち、かつそこに取付けられた前記反応性官能基を含有し、実質上全てのそのような領域に前記ポリヌクレオチド分子が多くとも一つだけ取付けられている、請求項67に記載の方法。前記生成ステップが、前記ソースDNAを断片化して前記DNAフラグメントを作成するステップ、前記DNAフラグメントを環状化するステップ、およびローリングサークル複製によって前記DNAフラグメントのコンカテマーを形成させるステップをさらに含む、請求項68に記載の方法。ターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、aターゲットポリヌクレオチドから複数のターゲットコンカテマーを生成させるステップ各ターゲットコンカテマーは、ターゲットポリヌクレオチドのフラグメントのコピーを複数含み、上記複数のターゲットコンカテマーには、ターゲットポリヌクレオチドを実質的にカバーする数のフラグメントが含まれる;bターゲットコンカテマーの少なくとも過半数が光学的に解像可能であるような密度で表面に固定されたターゲットコンカテマーのランダムアレイを形成させるステップ;c第1のプローブセットからの一つ以上のプローブを、その一つ以上のプローブとターゲットコンカテマー上の相補的配列との間の完全にマッチした二重鎖の形成を許す条件下で、ランダムアレイにハイブリダイズさせるステップ;d第2のプローブセットからの一つ以上のプローブを、その一つ以上のプローブとターゲットコンカテマー上の相補的配列との間の完全にマッチした二重鎖の形成を許す条件下で、ランダムアレイにハイブリダイズさせるステップ;eターゲットコンカテマーに対して、隣接した部位でハイブリダイズした、第1セットおよび第2セットからのプローブを、連結するステップ;f連結した第1プローブおよび第2プローブの配列を同定するステップ;ならびにgターゲットポリヌクレオチドの配列を、連結したプローブの配列のアイデンティティから決定することができるまで、ステップc~fを繰り返すステップを含む方法。前記表面が、不連続な相隔たる領域のアレイを持つ平面状の表面であり、各不連続な相隔たる領域が1μm2未満の面積を持ち、実質上全てのそのような領域に前記ターゲットコンカテマーが多くとも一つだけ取付けられている、請求項70に記載の方法。ターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、a光学的に解像可能な不連続な相隔たる領域のアレイを持つ平面状の表面に固定されたターゲットコンカテマーのランダムアレイを用意するステップ各不連続な相隔たる領域は1μm2未満の面積を持ち、実質上全てのそのような領域に前記ターゲットコンカテマーが多くとも一つだけ取付けられており、各ターゲットコンカテマーはターゲットポリヌクレオチドのフラグメントのコピーを複数含み、いくつかの異なるターゲットコンカテマーが存在して、各々のフラグメントがターゲットポリペプチドを実質的にカバーするようになっている;b第1プローブセットからの一つ以上のプローブを、その一つ以上のプローブとターゲットコンカテマー上の相補的配列との間の完全にマッチした二重鎖の形成を許す条件下で、ランダムアレイにハイブリダイズさせるステップ;c第2のプローブセットからの一つ以上のプローブを、その一つ以上のプローブとターゲットコンカテマー上の相補的配列との間の完全にマッチした二重鎖の形成を許す条件下で、ランダムアレイにハイブリダイズさせるステップ;dターゲットコンカテマーに対して、隣接した部位でハイブリダイズした、第1セットおよび第2セットからのプローブを、連結するステップ;e連結した第1プローブおよび第2プローブの配列を同定するステップ;ならびにfターゲットポリヌクレオチドの配列を、連結したプローブの配列のアイデンティティから決定することができるまで、ステップb~eを繰り返すステップを含む方法。ターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、aターゲットポリヌクレオチドから複数のターゲットコンカテマーを生成させるステップ各ターゲットコンカテマーは、ターゲットポリヌクレオチドのフラグメントのコピーを複数含み、上記複数のターゲットコンカテマーには、ターゲットポリヌクレオチドを実質的にカバーする数のフラグメントが含まれる;bターゲットコンカテマーの少なくとも過半数が光学的に解像可能であるような密度で表面に固定されたターゲットコンカテマーのランダムアレイを形成させるステップ;c各ターゲットコンカテマー中の各フラグメントの少なくとも一部の配列を同定するステップ;およびdコンカテマーのフラグメントの各部分の配列のアイデンティティからターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を再構築するステップを含む方法。ソース核酸からDNAフラグメントのコンカテマーのランダムアレイを作製するためのキットであって、表面を持つ支持体;各DNAフラグメントに連結して、それと共にDNAサークル各DNAサークルは、ローリングサークル複製反応によって複製されて、表面上にランダムに配置することができるコンカテマーを形成する能力を持つを形成させるための少なくとも一つのアダプターオリゴヌクレオチドを含むキット。前記表面が、不連続な相隔たる領域のアレイを持つ平面状の表面であり、各不連続な相隔たる領域が前記コンカテマーのサイズと等価なサイズを持つ、請求項74に記載のキット。前記不連続な相隔たる領域が、01~20μmの範囲の最近接距離を持つ規則的アレイを形成する、請求項75に記載のキット。前記不連続な相隔たる領域上の前記コンカテマーが、それらが光学的に解像可能であるような最近接距離を持つ、請求項76に記載のアレイ。前記不連続な相隔たる領域に捕捉オリゴヌクレオチドが取付けられており、前記アダプターオリゴヌクレオチドがそれぞれに捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な領域を持っていて、捕捉オリゴヌクレオチドと前記アダプターオリゴヌクレオチドの相補的領域との間の複合体の形成によって、前記コンカテマーを前記不連続な相隔たる領域に取付けることができるようになっている、請求項76に記載のキット。前記コンカテマーが前記不連続な相隔たる領域上にランダムに分布し、前記最近接距離が03~3μmの範囲にある、請求項78に記載のキット。a前記DNAフラグメントにホモポリマーテールを取付けて、前記アダプターオリゴヌクレオチドの第1末端に結合部位を提供するためのターミナルトランスフェラーゼ、b前記アダプターオリゴヌクレオチドの鎖を前記DNAフラグメントの末端に連結して前記DNAサークルを形成させるためのリガーゼ、c前記アダプターオリゴヌクレオチドの鎖の一領域にアニールさせるためのプライマー、およびd鎖にアニールさせたプライマーをローリングサークル複製反応で伸長するためのDNAポリメラーゼをさらに含む、請求項79に記載のキット。前記アダプターオリゴヌクレオチドが、4~12の範囲の縮重塩基数を持つ第2の末端を有する、請求項80に記載のキット。ターゲットポリヌクレオチドを配列決定するためのキットであって、光学的に解像可能な不連続な相隔たる領域のアレイを有する平面状の表面を持つ支持体各不連続な相隔たる領域は1μm2未満の面積を持つ;不連続な相隔たる領域上にランダムに配置された複数のコンカテマーにハイブリダイズさせるための第1のプローブセットコンカテマーはそれぞれにターゲットポリヌクレオチドのDNAフラグメントのコピーを複数含有する;複数のコンカテマーにハイブリダイズさせるための第2のプローブセット第1セットからのプローブが第2セットからのプローブと隣接してハイブリダイズする場合はいつでも、それらのプローブが連結されるようになっているを含むキット。リガーゼ、リガーゼバッファー、およびハイブリダイゼーションバッファーをさらに含む、請求項82に記載のキット。前記不連続な相隔たる領域に捕捉オリゴヌクレオチドが取付けられており、前記コンカテマーがそれぞれに捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な領域を持っていて、捕捉オリゴヌクレオチドと前記コンカテマーの相補的領域との間の複合体の形成によって、前記コンカテマーを前記不連続な相隔たる領域に取付けることができるようになっている、請求項83に記載のキット。単分子アレイを構築するためのキットであって、反応性官能基を持つ表面を有する支持体;およびそれぞれがユニークな官能基と複数の相補的官能基とを持つ複数の高分子構造高分子構造は、表面上にランダムに取付けることができ、その取付けは、一つ以上の反応性官能基と一つ以上の相補的官能基との反応によって形成される一つ以上の結合によって形成され、ユニークな官能基は、分析物分子上の官能基と選択的に反応して、単分子アレイを形成させる能力を持つを含むキット。前記表面が、前記反応性官能基を含有する不連続な相隔たる領域のアレイを持つ平面状の表面であり、各不連続な相隔たる領域が1μm2未満の面積を持つ、請求項85に記載のキット。前記不連続な相隔たる領域が、01~20μmの範囲の最近接距離を持つ規則的アレイを形成する、請求項86に記載のキット。前記不連続な相隔たる領域上の前記コンカテマーが、それらが光学的に解像可能であるような最近接距離を持つ、請求項87に記載のキット。前記高分子構造が、一つ以上のDNAフラグメントのコンカテマーであり、前記ユニークな官能基がコンカテマーの3末端または5末端にある、請求項88に記載のキット。本発明の実施には、別段の表示がない限り、当業者の技量の範囲を超えない有機化学、ポリマー技術、分子生物学組換え技法を含む、細胞生物学、生化学、および免疫学の通常の技法および記述を使用する。そのような通常の技法には、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、およびラベルを用いるハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適切な技法の具体例は後述の実施例に見ることができる。ただし、他の等価な通常の技法も、もちろん使用することができる。そのような通常の技法および記述は、標準的実験マニュアル、例えばGenomeAnalysisALaboratoryManualSeries、UsingAntibodiesALaboratoryManual、CellsALaboratoryManual、PCRPrimerALaboratoryManualおよびMolecularCloningALaboratoryManualいずれもColdSpringHarborLaboratoryPress刊、StryerLBiochemistry第4版、Freeman、ニューヨーク、GaitOligonucleotideSynthesisAPracticalApproach1984、IRLPress、ロンドン、NelsonおよびCoxLehningerPrinciplesofBiochemistry第3版、WHFreemanPub、ニューヨーク州ニューヨーク、ならびにBergらBiochemistry第5版、WHFreemanPub、ニューヨーク州ニューヨークなどに見出すことができ、これらは全て、あらゆる目的で、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。本発明は、分子特にDNAフラグメント、例えばゲノムDNAフラグメントの集団を大規模パラレル解析するためのランダム単分子アレイを提供する。一般に、本発明の単分子は、取付け部分および分析物部分を含む。取付け部分は、表面特に、その表面または取付けられた分析物から生成するシグナルが濃縮されるように、表面上のコンパクトな面積または限られた面積への多価取付けに対応する、高分子構造を含む。すなわち、高分子構造は表面のコンパクトかつ限定された領域を占有する。本発明の高分子構造はさまざまな方法で表面に結合させることができる。多価結合は共有結合でも非共有結合でもよい。非共有結合には、表面上の捕捉オリゴヌクレオチドと高分子構造中の相補的配列との間の二重鎖の形成、および引力的非共有結合相互作用、例えばファンデルワールス力、水素結合、イオン相互作用および疎水相互作用などによる表面への吸着が含まれる。多価共有結合は、後に詳述するように、高分子構造中の複数の相補的官能基と反応することができる反応性官能基を表面上に用意することによって、達成することができる。分析物部分は、ユニークな結合を使って高分子構造に取付けることができるか、または高分子構造と一体化して高分子構造の一部分を形成することができる。本発明の単分子は、通常は溶液から、支持材料の表面上にランダムに配置される。したがって、ある態様では、単分子が、ポアソン分布に非常に近い形で、表面上に均一に分布する。もう一つの態様では、単分子は、不連続な相隔たる領域を含有する表面上に配置され、単分子はそれらの領域に取付けられる。好ましくは、高分子構造、製造方法、およびそのような不連続な相隔たる領域の面積は、実質上全てのそのような領域が単分子を多くとも一つだけ含有するように選択される。好ましくは、本発明の単分子、特にコンカテマーは、表面上でほぼランダムコイルコンフィギュレーションをとり、不連続な相隔たる領域の面積に閉じこめられる。ある態様では、不連続な相隔たる領域が、規則的アレイ中に、直線的rectilinearパターン、六角形パターンなどに対応しうる所定の位置を持つ。そのような領域の規則的アレイは、解析中にアレイから収集されるシグナルの検出およびデータ解析にとって好都合である。また、不連続な相隔たる領域の限られた面積に閉じこめられた単分子は、解析作業に蛍光プローブを使用する場合は特により濃縮されたシグナルまたはより強いシグナルを与え、その結果、シグナル/ノイズ値を高める。本発明の単分子は、不連続な相隔たる領域上に、ある与えられた領域が通常は同様の確からしさで異なる単分子のいずれかを受け取るように、ランダムに分布する。言い換えると、結果として生じるアレイは、製作直後は、空間的にアドレス可能spatiallyaddressableではないが、同定またはデコーディング作業を行うことによって、空間的にアドレス可能にすることができる。すなわち、単分子のアイデンティティは識別可能であるが、わかっているわけではない。後に詳述するように、いくつかの実施形態では、不連続な相隔たる領域のサブセットであって、例えば捕捉オリゴヌクレチドおよびアダプターオリゴヌクレオチドの相補的配列によって規定されるような、対応するサブセットからの単分子しか受け取らないものが存在する。本発明の高分子構造は、ポリマー分岐ポリマーまたは線状ポリマーを含み、合成物例えば分岐DNAでもよいし、天然源に由来するもの例えば患者のゲノムDNAから得られる線状DNAフラグメントであってもよい。通例、高分子構造は、合成物であっても、天然源に由来するものであって、両者の組み合わせであってもよい線状一本鎖DNAフラグメントのコンカテマーを含む。本明細書で使用するターゲット配列という用語は、合成核酸または天然源例えば患者標本など由来の核酸を指す。通例、ターゲット配列は、本発明の方法によって例えばRCRによって生成させたコンカテマーの一部分であるが、他の構造、例えばデンドリマー、および他の分岐構造などの一部であってもよい。ターゲット配列が合成物であるか天然源に由来する場合、それらは通例、本発明の高分子構造または単分子を形成させる過程において、さまざまな方法によって複製される。そのような方法はコピー中にエラーを導入する場合があるが、それでもなお、それらはターゲット配列という用語に包含されると理解される。高分子構造の個々の特徴または構成要素は、個々の実施形態におけるさまざまな設計目標を満たすように選択することができる。例えば、いくつかの実施形態では、例えばユニークな結合の一部として非可撓性分子スペーサーを設けることなどによって、分析物分子を表面からできる限り遠くに保っておくことが有利になりうる。もう一つの例として、一つの不連続な相隔たる領域に複数の高分子構造が取付けられるのを効果的に防ぐサイズを持つように、反応性官能基を選択することもできる。さらにもう一つの例として、例えば溶解度を高めること、水素結合による二次構造の形成を促進することなどとといった他のさまざまな目的で、高分子構造に他の官能基を設けることもできる。ある態様では、高分子構造が十分に大きく、そのサイズ、例えば通常の生理食塩溶液中で占める体積の長さ寸法直径などは、不連続な相隔たる領域のサイズとほぼ等価である。線状ポリヌクレオチドである高分子構造の場合、一態様として、サイズは数千ヌクレオチド例えば10000から数十万ヌクレオチド例えば10万~20万の範囲に及びうる。後に詳述するように、いくつかの実施形態では、環状DNAを生成させてから、それらをローリングサークル複製反応で複製して、環状DNAの相補鎖のコンカテマーを形成させることによって、そのような高分子構造が作製される。図1A~1Gに模式的に示す実施形態で、上述の概念を、より詳しく説明する。これらの図面を説明した後、本発明の諸要素をさらに詳しく開示し、実施例を挙げる。上述のように、ある態様では、本発明の高分子構造が、ターゲット配列またはターゲットフラグメントのコンカテマーを含む一本鎖ポリヌクレオチドである。特に、そのようなポリヌクレオチドは、ターゲット配列およびアダプターオリゴヌクレオチドのコンカテマーであることができる。例えば、ソース核酸1000を処理1001して、好ましくは50~600ヌクレオチド、より好ましくは300~600ヌクレオチドの範囲の一本鎖フラグメント1006を形成させ、次にそれらをアダプターオリゴヌクレオチド1004に連結して、アダプターフラグメントコンジュゲートの集団1002を形成させる。ソース核酸1000は、通常の技法を使って試料から抽出されたゲノムDNA、または通常の技法によって作成されたcDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリー、または合成DNAなどであることができる。処置1001は普通、例えば化学的断片化、酵素的断片化、または機械的断片化などといった通常の技法による断片化と、それに続く変性による、一本鎖DNAフラグメントの作成を伴う。この例では、アダプターオリゴヌクレオチド1004を使って、図2Aに図解する方法により、DNAサークルの集団1010を形成させる1008。ある態様では、集団1010の各メンバーが、同一のプライマー結合部位を持つアダプターと、ソース核酸1000に由来するDNAフラグメントとを有する。アダプターは、他の機能的要素、例えば限定するわけではないが、タグ付け配列、取付け配列、パリンドローム配列、制限部位、官能化配列などを持っていてもよい。別の実施形態として、異なるプライマー結合部位を持つアダプターを用意することにより、DNAサークルのクラスを作り出してもよい。DNAサークル1010を形成させた後、プライマーおよびローリングサークル複製RCR試薬を加えることにより、通常のRCR反応で、アダプターオリゴヌクレオチドおよびDNAフラグメントの相補鎖のコンカテマー1015の集団1012を生成させる1011ことができ、次に、その集団を、通常の分離技法で単離することができる。あるいは、考えうる配列を全て含有する混合物から、またはサークルが合成物である場合には、サークル複製用の選択された配列を持つオリゴヌクレオチドの限られた混合物から、短いオリゴヌクレオチド例えば6マーの逐次ライゲーションによって、RCRを実行してもよい。また、ターゲット分子の始まりと終わりの両方に相補的なブリッジングテンプレートDNAの存在下でターゲットDNAのライゲーションを行うことによって、コンカテマーを生成させることもできる。異なるターゲットDNAの集団を、対応するブリッジングテンプレートの混合物によって、コンカテマーに変換することができる。次に、単離されたコンカテマー1014を、支持体表面1018上に配置して1016、単分子のランダムアレイを形成させる。取付けが不完全な単分子または先の製造ステップからくる他の試薬類であってその存在が望ましくないものまたは表面1018に非特異的に結合するものを除去するために、取付けには、さまざまなストリンジェンシーの洗浄ステップも含まれうる。コンカテマー1020は、共有結合および非共有結合を含むさまざまな技法によって、表面1018に固定することができる。一実施形態として、アダプターオリゴヌクレオチドのセグメント例えばプライマー結合部位または他の要素との複合体例えば二本鎖二重鎖を形成する捕捉オリゴヌクレオチドを、表面1018に取付けておくことができる。別の実施形態として、アダプターオリゴヌクレオチドとの三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドクランプなどの構造を、捕捉オリゴヌクレチドが含んでもよいGryaznovらの米国特許第5473060号。もう一つの実施形態として、例えばマイクロアレイにcDNAを取付けるために用いられる技法と同じ技法により、コンカテマー上の相補的官能基と反応して共有結合を形成する反応性官能基を、表面1018が持っていてもよい例えばSmirnovらGenesChromosomesCancer407277;BeaucageCurrentMedicinalChemistry812131244;これらは参照により本明細書に組み入れられる。疎水表面、例えば低濃度のさまざまな反応性官能基例えばOH基を持つ清浄なガラス表面に、長いDNA分子例えば数百ヌクレオチド以上を効率よく取付けることもできる。DNAフラグメントのコンカテマーは、表面への配置後に、insituで、さらに増幅することができる。例えば配置後に、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによってアダプター配列中の制限部位を再構成させることにより、コンカテマーを切断し、次に、そのフラグメントを後述のように環状化し、RCR反応によって、insituで増幅させる。図1Bに、単分子例えば一本鎖ポリヌクレオチドのランダムアレイの表面の一片1102を図解する。そのような分子は、通常の条件例えばTE、SSC、SSPEなどの通常のDNAバッファー、室温下で、約100~300nmの直径を持つ溶液中の球状容積をほぼ満たすランダムコイルを形成し、その直径は、当業者には周知の形で、DNAのサイズおよびバッファー条件に依存する例えばEdvinssonOnthesizeandshapeofpolymersandpolymercomplexesDissertation696。ランダムコイルポリマー例えば一本鎖DNAのサイズの一尺度は、末端間距離の二乗平均平方根であり、これは大雑把に言ってランダムコイル状構造の直径の尺度である。本明細書においてランダムコイル直径というそのような直径は、例えばZetasizerNanoSystemMalvernInstruments、英国などの装置を使って、光散乱法で測定することができる。本発明の高分子構造の他のサイズ尺度には、分子量例えばダルトンで表したもの、および総ポリマー長分岐ポリマーの場合、これはその分枝の全ての長さの和であるが含まれる。表面に取付けると、取付けケミストリー、結合の密度、表面の性質などに依存して、一本鎖ポリヌクレオチドは、平均して、ランダムコイルコンフィギュレーションのコンカテマーの直径にほぼ等しい直径1110を持つ破線の円1108によって規定される領域1107によって区切られる扁平なスフェロイド状容積を満たす。言い方を変えると、一態様として、高分子構造例えばコンカテマーなどは、表面1102上へのそのランダムコイル状態の投影像に実施的に等価な領域例えば破線の円1108で図示される領域内で、表面1102に取付けられる。高分子構造が占める面積は変動しうるので、いくつかの実施形態では、予想面積が、投影像1108の面積の2~3倍から、そのような面積の小部分例えば25~50パーセントまでの範囲内に含まれうる。どこか他の項で言及するように、表面上にコンパクトな形態の高分子構造を保つことにより、高分子構造またはコンカテマーの構成要素に特異的なプローブ例えば蛍光標識オリゴヌクレオチドに、より強いシグナルを生じさせることが可能になる。領域1107の直径1110および単分子を含有する最近接領域までの距離1106は、アレイの製作において重要な二つの量である。表面上の単分子の近接性を測定するには、領域1107の中心間距離、領域1007のエッジ間距離など、さまざまな距離測定基準を使用することができる。ここでは、通例、中心間距離を使用する。本発明のアレイを製作する場合、これらのパラメータの選択は、一つには、解析工程で使用するシグナル生成系およびシグナル検出系に依存する。一般的には、分子の少なくとも20パーセント、または少なくとも30パーセント、または少なくとも40パーセント、または少なくとも過半数を、使用するシグナル生成系およびシグナル検出系で個別に解像することが可能になるような単分子の密度を選択する。ある態様では、単分子の少なくとも70パーセントを個別に解像することが可能になるような密度が選択される。ある態様では、走査型電子顕微鏡を、例えば金ナノ粒子ラベルを持つ分子特異的プローブと共に使用する場合例えばNieらAnalChem7815281534;これは参照により本明細書に組み入れられるはいつでも、単分子の少なくとも過半数が50nm以上の最近接距離を持つように、密度が選択され;またもう一つの態様では、単分子の少なくとも70パーセントは100nm以上の最近接距離を持つことが保証されるように、そのような密度が選択される。もう一つの態様では、光学顕微鏡を、例えば蛍光ラベルを持つ分子特異的プローブと共に使用する場合はいつでも、単分子の少なくとも過半数が200nm以上の最近接距離を持つように、密度が選択され;またもう一つの態様では、単分子の少なくとも70パーセントは200nm以上の最近接距離を持つことが保証されるように、そのような密度が選択される。さらにもう一つの態様では、光学顕微鏡を、例えば蛍光ラベルを持つ分子特異的プローブと共に使用する場合はいつでも、単分子の少なくとも過半数が300nm以上の最近接距離を持つように、密度が選択され;またもう一つの態様では、単分子の少なくとも70パーセントは300nm以上、または400nm以上、または500nm以上、または600nm以上、または700nm以上、または800nm以上の最近接距離を持つことが保証されるように、そのような密度が選択される。さらにもう一つの実施形態では、光学顕微鏡を使用する場合はいつでも、単分子の少なくとも過半数が、その顕微鏡の最小特徴解像力minimalfeatureresolutionpowerの少なくとも2倍の最近接距離を持つように、密度が選択される。もう一つの態様では、別々に検出することができるポリマー分子の密度が、1μm2あたり少なくとも1000、または1μm2あたり少なくとも10000、または1μm2あたり少なくとも100000になるように、本発明のポリマー分子が表面上に配置される。図1Cの特定実施形態を例示する本発明のもう一つの態様では、ランダムに配置される単分子の密度を、望ましい最近接距離が確保されるように選択する要件が、単分子を取付けるための実質上唯一の部位である不連続な相隔たる領域を表面上に設けることによって、取り除かれる。すなわち、そのような実施形態では、不連続な相隔たる領域の間にある表面上の領域本明細書ではこれを領域間部分というが、コンカテマーまたは他の高分子構造がそのような領域には結合しないという意味で、不活性である。いくつかの実施形態では、そのような領域間部分をブロッキング剤例えばコンカテマーDNAとは無関係なDNA、他のポリマーなどで処理することができる。図1Aの場合と同様に、ソース核酸1000を断片化し、環状化1010のためにアダプターを付加1002し、次に、RCRによってコンカテマーを形成させる1012。次に、表面1120の設計および製作によって決定される最近接距離1124をそれぞれに持つ不連続な相隔たる領域1122の規則的アレイを有する表面1120に、単離されたコンカテマー1014を適用する。後に詳述するように、捕捉オリゴヌクレオチドまたは反応性官能基で誘導体化するためのミクロン寸法およびサブミクロン寸法を持つ不連続な相隔たる領域1122のアレイは、電子線リソグラフィー、ナノインプリント技術、フォトリソグラフィーなどの、通常の半導体製作技法を使って製作することができる。一般に、単分子を表面1120に適用した時に実質上全ての領域1122が一つを超える単分子によって占有されないように、不連続な相隔たる領域1122の面積は、取付けケミストリー、使用する高分子構造などと共に、本発明の単分子のサイズに一致するように選択される。不連続な相隔たる領域一つにつき一つだけの単分子を持つ可能性は、反応性官能基または捕捉オリゴヌクレオチドの密度を、そのような部分が単分子上の各々の相補鎖よりも少なくなるように選択することによって、増加させることができる。そうすることで、単分子は、ある特定の不連続な相隔たる領域における表面への結合を全て占有することになり、その結果として、第2の単分子が同様に同じ領域に結合する機会を減少させる。特に、ある実施形態では、不連続な相隔たる領域中の捕捉オリゴヌクレオチドの実質上全てが、単一の高分子構造上のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。ある態様では、不連続な相隔たる領域が、単分子の相補的官能基またはアダプターオリゴヌクレオチドの数の約10パーセント~約50パーセントであるような数の反応性官能基または捕捉オリゴヌクレオチドを含有する。捕捉オリゴヌクレオチドの長さおよび配列は、幅広く変動することができ、周知の原理に従って選択することができる例えばWetmurCriticalReviewsinBiochemistryandMolecularBiology26227259;Hamesら編NucleicAcidHybridizationAPracticalApproachIRLPress、オックスフォード、1985の第1章BrittenおよびDavidson。ある態様では、捕捉オリゴヌクレオチドの長さが6~30ヌクレオチドの範囲にあり、もう一つの態様では、8~30ヌクレオチド、または10~24ヌクレオチドの範囲にある。捕捉オリゴヌクレオチドの長さは、NucleicAcidsResearch2154035407;RubinらNucleicAcidsResearch2335473553など;これらは参照により本明細書に組み入れられる。プライマー結合部位1301を含む合成DNAサークル1300を、PCR反応1306でプライマー1302と組み合わせることにより、コンカテマー1308を作成する。通例、この実施形態では、すべてのサークルが同じ配列を持つが、例えばコンカテマーのサブセットを、アレイの予め選択した領域に、相補的な取付け部分例えばアダプター配列と捕捉オリゴヌクレオチドを使って誘導するために、異なる配列を使用することもできる。分析物上の相補的官能基と反応して共有結合を形成する能力を持つ官能基1304;Rと呼ぶをその5末端に持つプライマー1302を合成する。代表的官能基には、市販の化学薬品例えばGlenResearchを使って取付けることができるアミノ基、スルフヒドリル基などがある。コンカテマー1308を表面1310に適用してアレイ1314を形成させた後、取付け部分を持つ分析物1312をアレイ1310に適用すると、ユニークな官能基R1311と取付け部分1312との反応により、コンカテマーとの結合が形成される。あるいは、アレイ1310への適用に先だって、取付け部分とユニークな官能基とが反応して結合を形成できるようにコンカテマー1308を分析物1312と混合した後、得られたコンジュゲートをアレイ1310に適用してもよい。コンカテマー1308と多くの分析物クラスとを連結するための適当な取付け部分およびユニークな官能基の選択については、文献に豊富な手引きがある。一態様として、タンパク質またはペプチド分析物をコンカテマーに連結するために、多くのホモ二官能性およびヘテロ二官能性試薬が市販され例えばPierce、参照により本明細書に組み入れられるHermansonBioconjugateTechniquesAcademicPress、ニューヨーク、1996などの文献に開示されている。例えば、ユニークな官能基がアミノ基である場合はいつでも、Nスクシンイミジル3プロピオネートSPDP、スクシンイミジルオキシカルボニルαメチルαトルエンSMPT、スクシンイミジル4シクロヘキサン1カルボキシレートSMCC、mマレイミドベンゾイルNヒドロキシスクシンイミドエステルMBS、NスクシンイミジルアミノベンゾエートSIAB、スクシンイミジル6アミノヘキサノエートSIAXなどの試薬を使って、コンカテマー1308を分析物上のスルフヒドリル基に連結することができる。分析物上の適切な相補的官能基には、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボニル基などがあり、これらは分析物上に天然に存在する場合もあるし、適切なホモ二官能性またはヘテロ二官能性試薬との反応によって付加することもできる。分析物分子は、非共有結合、例えばビオチンストレプトアビジン結合、複合体例えばコンカテマーに取付けられた第1オリゴヌクレオチドと分析物に取付けられたまたは分析物の一部を形成している相補的オリゴヌクレオチドとの二重鎖の形成などの結合を使って、高分子構造に取付けることもできる。分析物には、核酸例えばDNAまたはRNAフラグメント、多糖、タンパク質などの生体分子が含まれる。上述のように、本発明の高分子構造は、線状ポリマー、例えばDNAフラグメントのコンカテマーに加えて、分岐ポリマーも含みうる。代表的な分岐ポリマー構造を図1Fおよび1Gに図解する。図1Fには、主鎖ポリヌクレオチド1400と複数の分枝ポリヌクレオチド1402とを含む分岐DNA構造が図解されている。この分岐DNA構造において、前記複数の分枝ポリヌクレオチドは、それぞれがその5末端によって主鎖ポリヌクレオチド1400に接続されて、主鎖ポリヌクレオチド1400上の単一の5末端1404以外は全て3である末端を持つ櫛状の構造を形成しており、その単一の5末端はユニークな官能基を持つように誘導体化される。後述するように、そのようなユニークな官能基は反応性化学基例えば保護されたまたは保護されていないアミン、スルフヒドリルなどであってもよいし、それに相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを有する分析物を捕捉するためのユニーク配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。また、そのようなユニークな官能基は、例えばビオチンなどの捕捉部分であってもよい。そのような分岐DNA構造は、公知の技法を使って合成される例えばGryaznovの米国特許第5571677号;Urdeaらの米国特許第5124246号;Seemanらの米国特許第6255469号など;これらは参照により本明細書に組み入れられる。そのような高分子構造がポリヌクレオチドである場合はいつでも、その構成要素の配列を自己集合が容易になるように選択するか、あるいはそれらを専用の連結ケミストリー例えば以下に開示するものを使って連結することができ、その場合は、他の因子例えば、いくつかの実施形態では、自己アニーリングの回避、表面上の捕捉オリゴヌクレオチドへの容易な結合などに基づいて、配列が選択される。図1Gには、デンドリマー構造が図解されている。このデンドリマー構造はオリゴヌクレオチド1406を含み、それが、それぞれに二つの官能基1410;Rで示すを持つ複数の三価連結基1408で誘導体化される。さらに、それらの官能基により、追加ポリマー1407例えばポリヌクレオチドを取付けて、オリゴヌクレオチド1406への結合を形成させ、その結果として高分子構造1409を形成させることができる。そしてまた、それを多価リンカーで同様に誘導体化すれば、核酸デンドリマーを形成することができる。オリゴヌクレオチド用の三価リンカー1408は、Iyerらの米国特許第5916750号に開示されており、この特許は参照により本明細書に組み入れられる。図1Hに図解するように、そのようなデンドリマー構造または分岐構造1411が構築されたら、それらは、線状ポリヌクレオチドについて上述したように、アレイ1420に取付けることができ、その後、分析物1430を、ユニークな官能基1410によって取付けることができる。場合によっては、未反応のユニークな官能基1422を、通常の技法でキャッピングしてもよい。あるいは、デンドリマー構造または分岐構造1411を、まず分析物1430と、例えば溶解した状態で混合して、コンジュゲートを形成させ、次にそのコンジュゲートをアレイ1420上に配置する。図1Iに示すように、分析物が遊離の3末端を持つポリヌクレオチド1440である場合は、その末端をinsituRCR反応で伸長させて、ターゲット配列またはさらなる付加のための他の配列のコンカテマーを形成させることができる。同様に、ポリヌクレオチド分析物は、通常の技法を使ったライゲーションによって伸長させることもできる。ソース核酸およびターゲット配列の環状化本発明の一態様では、高分子構造が、試料例えば患者、経済的に重要な生物などから得られるゲノムDNAまたはcDNAから抽出または誘導されるポリヌクレオチド分析物すなわちターゲット配列のコンカテマーを含む。そのような単分子を含む本発明のランダムアレイは、配列決定、SNP測定、アレルの定量、コピー数測定などを含むゲノムワイドな解析を行うのに役立つ。哺乳類サイズのゲノムの場合、好ましくは断片化を少なくとも二段階で行い、第1段階では、約100キロ塩基Kb~約250キロ塩基のサイズ範囲にあるフラグメントの集団を生成させ、各100~250Kbフラグメントに個別に適用される第2段階では、約50~600ヌクレオチド、より好ましくは約300~600ヌクレオチドのサイズ範囲にある、ランダムアレイ用のコンカテマーを生成させるためのフラグメントを生成させる。本発明のいくつかの態様では、断片化の第1段階を、そのようなフラグメントの予め決定されたサブセット例えばシグナル伝達系路のタンパク質をコードする遺伝子を含有するフラグメントなどを選択するために使用することもできる。本発明のアレイを構築するのに必要なゲノムDNAの量は広く変動しうる。ある態様では、哺乳類サイズのゲノムに関して、少なくとも10ゲノム相当のDNAからフラグメントを生成させ;もう一つの態様では、少なくとも30ゲノム相当のDNAからフラグメントを生成させ;もう一つの態様では、少なくとも60ゲノム相当のDNAからフラグメントを生成させる。ゲノムDNAは、例えばSambrookら前掲1999;CurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelら編JohnWileyandSonsInc、ニューヨーク、1999などに開示されているような通常の技法を使って取得される。ゲノムDNAの単離にとって重要な因子には、以下に挙げるものが含まれる:1DNAがDNAプロセシング酵素を含まず、塩類の混入がないこと;2ゲノム全体を等しく表していること;および3DNAフラグメントの長さが約5000~100000bpであること。多くの場合、抽出されたDNAは消化する必要がない。なぜなら、溶解および抽出中に生じる剪断力が望ましい範囲のフラグメントを生成させるからである。もう一つの実施形態として、制限エンドヌクレアーゼを使った酵素的断片化によって、さらに短いフラグメント1~5kbを生成させることができる。ある実施形態では、10~100ゲノム相当のDNAにより、フラグメントの集団がゲノム全体をカバーすることを保証する。少量のDNAしか利用できず、例えば容器の壁などへの非特異的結合による損失の危険がある場合はいつでも、担体DNA例えば無関係な環状合成二本鎖DNAを用意し、それを試料DNAと混合して使用することが有利なこともある。フラグメントを生成させる場合、どちらの段階においても、フラグメントはゲノム全体に由来してもよいし、ゲノムの選ばれたサブセットに由来してもよい。ゲノムのサブセットからのフラグメントの単離または濃縮には、参照により本明細書に組み入れられる以下の文献によって例示されるように、多くの技法を利用することができる:KandpalらNucleicAcidsResearch1817891795;Callowらの米国特許出願公開第20050019776号;Zabeauらの米国特許第6045994号;Deugauらの米国特許第5508169号;Sibsonの米国特許第5728524号;Guilfoyleらの米国特許第5994068号;Jonesらの米国特許出願公開第20050142577号;Gullbergらの米国特許出願公開第20050037356号;Matsuzakiらの米国特許出願公開第20040067493号など。哺乳類サイズのゲノムの場合、ゲノムDNAの最初の断片化は、一つ以上の稀な切断制限エンドヌクレアーゼ例えばNotI、AscI、BaeI、CspCI、PacI、FseI、SapI、SfiI、PsrIなどを使った消化によって達成することができる。その結果生じたフラグメントは、直接使用することもできるし、あるいは既に配列決定されているゲノムの場合には、特異的フラグメントをそのような消化DNAから単離した後、図2Bに図解するような加工に使用してもよい。ゲノムDNA230を稀な切断制限エンドヌクレアーゼで消化232してフラグメント234を生成させた後、そのフラグメント234をさらに、5一本鎖エキソヌクレアーゼ例えばλエキソヌクレアーゼで短時間すなわち反応を完了させない消化して、フラグメントの末端にある制限部位配列に隣接する配列237を露出させる。そのような露出させた配列は、各フラグメントにユニークであるだろう。したがって、所望のフラグメントの末端に特異的なビオチン化プライマー241を、単離用の捕捉オリゴヌクレオチドにアニールさせるか、あるいは、そのようなフラグメントを、捕捉部分例えばビオチンを持つプライマーにアニールさせ、鎖置換活性を持たないDNAポリメラーゼ例えばTaqポリメラーゼStoffelフラグメントで伸長させることができる。そのような伸長後は、プライマー241の3末端がフラグメントの上側の鎖topstrand242に接し、それらを連結することで、連続した鎖を形成させることができるようになる。鎖置換活性を持ち、上側の鎖を合成によって置き換えるDNAポリメラーゼを使って、後者のアプローチを実行することもできる。どちらのアプローチでも、次に、ビオチン化されたフラグメントを、ストレプトアビジンで誘導体化された固形支持体239を使って単離240することができる。もう一つの態様では、ゲノムDNAテンプレートからのプライマー伸長を使って、ゲノムの関心領域を取り囲む10キロ塩基を超える選ばれた配列の線形増幅物を生成させる。例えば、所定サイズのターゲットの集団を作り出すために、フォワードプライマーを使って20サイクルの線形増幅を行った後、リバースプライマーを使った20サイクルを行う。2番目のプライマーを適用する前に、長いDNAを精製するための標準的カラムを使って最初のプライマーを除去するか、数個のウラシル塩基が組み込まれている場合には、最初のプライマーを分解する。フォワード鎖よりも多数のリバース鎖が生成して、二本鎖分子と一本鎖のリバース鎖の集団が得られる。リバースプライマーをビオチン化すれば、ストレプトアビジンビーズに捕捉することができ、これを加熱すると、捕捉されたホモ二重鎖を融解することができる。取付けられた分子は全て一本鎖で、元のゲノムDNAの一方の鎖を表すことになる。生成した産物は、02~2kbのサイズ、より好ましくは03~06kbのサイズ固形支持体からそれらを効果的に放出させるに断片化し、RCR反応のために環状化することができる。図2Aに図解する環状化の一方法では、ゲノムDNA200を断片化し、変性した202後に、一本鎖DNAフラグメント204を、まずターミナルトランスフェラーゼで処理206することによって、3末端にポリdAテール;BiracらJMolGraphModel;Seemanらの米国特許第6255469号などこれらは参照により本明細書に組み入れられるなどによって開示されているように、構成要素線状ポリヌクレオチドから自己集合させうる。ある態様では、本発明の線状ポリマーユニットが、nの形式を持つ式中、Lはリンカー部分であり、Mは、不活性非立体障害スペーサー部分として役立つことから、他の構成要素を取付けるための分岐点として、あるいはラベルを取付けるための部位;例えばUrdeaらの米国特許第5124246号またはWangらの米国特許第4925785号に記述されているようにアンプリファイヤamplifier鎖またはアンプリファイヤ構造にハイブリダイズまたは結合させるオリゴヌクレオチドまたは他の結合ポリマーを取付けるための部位;例えばWhiteleyらの米国特許第4883750号に記述されているようにフックhookを取付けるための部位;あるいは溶解度に影響を与え、二重鎖およびまたは三重鎖形成を促進するための他の基例えばインターカレーター、アルキル化剤などを取付けるための部位として役立ちうる反応性官能基を提供することまで、さまざまな機能を提供するために、広範囲にわたるさまざまな化学構造から選択されうるモノマーである。以下の参考文献には、本発明における使用に適したいくつかのホスホロアミダイトおよびまたはハイドロゲンホスホネートモノマーが開示されており、それらの合成およびオリゴヌクレオチドへの組み込みに関する手引きが記載されている:NewtonらNucleicAcidsResearch2111551162;GriffinらJAmChemSoc11479767982;JaschkeらTetrahedronLetters34301304;Maらの国際出願PCTCA9200423;Zonらの国際出願PCTUS9006630;DurandらNucleicAcidsResearch1863536359;SalunkheらJAmChemSoc11487688772;Urdeaらの米国特許第5093232号;Ruthの米国特許第4948882号;Cruickshankの米国特許第5091519号;HaralambidisらNucleicAcidsResearch1548574876など。より具体的には、Mは、1~20個の炭素原子と酸素、窒素、および硫黄からなる群より選択される0~10個のヘテロ原子とを含有する直鎖状、環状、または分岐状の有機分子構造である。好ましくは、Mは、1~16個の炭素原子を含有するアルキル、アルコキシ、アルケニル、またはアリール;3~8個の炭素原子と、酸素、窒素、および硫黄からなる群より選択される1~3個のヘテロ原子とを持つ複素環;グリコシル;またはヌクレオシジルである。より好ましくは、Mは、1~8個の炭素原子を含有するアルキル、アルコキシ、アルケニル、またはアリール;グリコシル;またはヌクレオシジルである。好ましくは、Lは、リンV連結基であり、これは、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルまたはエチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなどであることができる。一般に、ホスホロアミダイトまたはハイドロゲンホスホネート前駆体から誘導される結合は好ましいので、本発明の線状ポリマーユニットは、例えばAppliedBiosystemsIncカリフォルニア州フォスターシティーモデル394などの市販自動DNA合成装置を使って、簡便に合成することができる。nは、MおよびLの性質に依存してかなり変化しうる。通例、nは約3から約100まで変化する。Mがヌクレオシドもしくはその類似体またはヌクレオシドサイズのモノマーであり、LがリンV結合である場合、nは約12から約100まで変化する。好ましくは、Mがヌクレオシドもしくはその類似体またはヌクレオシドサイズのモノマーであり、LがリンV結合である場合、nは約12~約40まで変化する。ポリマーユニットは、それらの間に一つ以上の共有結合架橋を形成させることによって、アセンブルすることができる。ある態様では、一つ以上の構成要素上にあるチオール、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート基を、一つ以上の他の構成要素上にあるハロアシルまたはハロアルキルアミノ基と反応させて、一つ以上のチオもしくはジチオホスホリルアシルまたはチオもしくはジチオホスホリルアルキル架橋を形成させることにより、架橋が形成される。一般に、そのような架橋は、以下に挙げる形式の一つを持つ:NHRSPまたはNHRS式中、Rはアルキルまたはアシルであり、Zは硫黄または酸素である。アセンブリ反応には、その実施形態に依存して2~20個の構成要素が関与しうるが、好ましくは2~8個の構成要素が関与し、より好ましくは2~4個の構成要素が関与する。好ましくは、上記ハロアシルアミノまたはハロアルキルアミノ基はハロアセチルアミノ基であり、より好ましくはハロアセチルアミノ基がブロモアセチルアミノ基である。ハロアシルまたはハロアルキルアミノ基のアシル部分またはアルキル部分は、1~12個の炭素原子を含有し、より好ましくは、そのような部分が1~8個の炭素原子を含有する。反応は広範囲にわたるさまざまな溶媒系で行うことができるが、一般的には、アセンブリ反応は液体水性条件下で行われるか、例えば液体水性反応混合物の温度を低下させることによって得られる氷中に凍結した状態で行われる。もう一つの選択肢として、DMSOH2Oにおけるチオホスホリルアセチルアミノ架橋の形成が、ThuongらTetrahedronLetters2841574160およびFrancoisらProcNatlAcadSci8697029706によって報告されている。典型的な水性条件には、25mMNaClおよび15mMリン酸緩衝液pH70中、4μMの反応物が含まれる。チオもしくはジチオホスホリルアシルまたはチオもしくはジチオホスホリルアルキルアミノ架橋は好ましい。なぜなら、それらは、硝酸銀、ヨウ化カリウムなどの酸化剤によって、容易にかつ選択的に切断することができるからである。好ましくは、架橋のおよそ百倍モル過剰に相当する濃度のヨウ化カリウムKI3を使って、架橋を切断する。通例、KI3は約01Mの濃度で使用される。これらの架橋の切断が容易であることは、複雑な高分子構造の合成において、著しい利点である。というのも、それは、最終産物を解析して最終産物の構造が正しいことを確認するための簡便な方法になるからである。3ハロアシルまたはハロアルキルアミノこの例ではハロアセチルアミノ誘導体化オリゴヌクレオチド1を、5ホスホロチオエート誘導体化オリゴヌクレオチド2と、以下のスキームに従って反応させる:5BBBBNHCCH2X1SPBBBB3→25BBBBNHCCH2SPOBBBB3[式中、Xはハロであり、Bはヌクレオチドである]。ヌクレオチドが、より一般的な上述のポリマーユニットMLnの代表例に過ぎないことは、言うまでもない。化合物1は、NNジメチルホルムアミドDMF中のNスクシンイミジルハロアセテートを、ホウ酸ナトリウムバッファー中の3アミノデオキシリボヌクレオチド前駆体と、室温で反応させることによって製造することができる。約35分後に、その混合物を例えばH2Oで希釈し、脱塩し、例えば逆相HPLCによって精製する。Yアミノデオキシリボヌクレオチド前駆体は、GryaznovおよびLetsingerNucleicAcidsResearch2034033409に記述されているように製造することができる。簡単に述べると、脱保護後に、標準的なスクシニル結合によって支持体に連結されているデオキシチミジンの5ヒドロキシルを、ジクロロメタンジイソプロピルエチルアミンなどの適当な溶媒中で、クロロメトキシホスフィンとの反応により、ホスフィチル化する。テトラゾールで活性化した後、その5ホスフィチル化チミジンを5トリチルO3アミノ3デオキシヌクレオシドと反応させて、ヌクレオシド部分がホスホロアミデート結合によって共有結合的に接合されているヌクレオシドチミジン二量体を形成させる。オリゴヌクレオチドの残りの部分は、標準的なホスホロアミダイトケミストリーによって合成される。スクシニル結合を切断した後、酸処理例えば80酢酸水溶液、室温で18~20時間によってホスホロアミデート結合を切断することにより、3末端アミノ基を持つオリゴヌクレチドを生成させる。5モノホスホロチオエートオリゴヌクレオチド2は、以下のように形成される:5モノホスフェートを、オリゴヌクレチドの5末端に、化学的にまたはキナーゼを使って酵素的に取付ける例えばSambrookらMolecularCloningALaboratoryManual第2版ColdSpringHarborLaboratory、ニューヨーク、1989。好ましくは、オリゴヌクレオチド合成の最終ステップとして、Eckstein編OligonucleotidesandAnaloguesIRLPress、オックスフォード、1991の第12章にThuongおよびAssclineが記載している、またはTetrahedronLett274705にHornおよびUrdeaが記載している、化学的リン酸化により例えばClontechLabortoriesカリフォルニア州パロアルトの5PhosphateON商標などといった市販の試薬を使ってモノホスフェートを付加する。次に、その5モノホスフェートを、通常の硫化剤、例えばS8の5ピフィジンpyfidineCS2溶液による処理1:1、vv、室温で45分間、または米国特許第5003097号、同第5151510号、もしくは同第5166387号に記載されている硫化剤による処理を使って硫化する。モノホスホロジチオエートも類似の手法で製造される例えばFroehlerらの欧州特許公開0360609A2;Caruthersらの国際出願PCTUS8902293など。上記と同様に、5ハロアセチルアミノ誘導体化オリゴヌクレオチド3を、以下のスキームに従って、3モノホスホロチオエートオリゴヌクレオチド4と反応させる:3BBBBNHCCH2X3SPOBBBB5→43BBBBNHCCH2SPBBBB5[式中、jマーおよびkマーのヌクレオチドモノマーが反対向きである点以外、記号は上記と同意義である]。この場合、化合物3は、3アミノオリゴヌクレオチドについて上述したように、NNジメチルホルムアミドDMF中のNスクシンイミジルハロアセテートを、ホウ酸ナトリウムバッファー中の5アミノデオキシリボヌクレオチド前駆体と室温で反応させることによって、製造することができる。5アミノデオキシヌクレオシドは、GlinskiらJChemSocChemComm915916;MillerらJOrgChem291772;OzolsらSynthesis7557559;およびAzhayevらNucleicAcidsResearch6625643これらは参照により本明細書に組み入れられるに従って製造される。3モノホスホロチオエートオリゴヌクレオチド4は、ThuongおよびAsscline前掲が記述しているように、製造することができる。オリゴヌクレオチド1と4および2と3を反応させて、それぞれ二つの5末端または二つの3末端を持つポリマーユニットを形成させてもよい。分枝を取付けるための反応性官能基は、さまざまな部位に導入することができる。好ましくは、ポリマーユニットまたはループ上の選ばれたモノマーまたは連結部分に、アミノ官能基を導入し、次にそれを、上述のようにハロアセチルアミノ基に変換する。ヌクレオシドモノマーのアミノ誘導体化塩基は、Urdeaらの米国特許第5093232号;Ruthの米国特許第4948882号;HaralambidisらNucleicAcidsResearch1548574876などに教示されているように、導入することができる。ClontechLaboratoriesカリフォルニア州パロアルトからAminomodifierII商標として市販されている保護ヒドロキシアミンホスホロアミダイトによって、アミノ官能基を導入することもできる。好ましくは、例えばAgrawalらNucleicAcidsResearch1854195423;およびJagerらBiochemistry2772377246に教示されているように、I2およびアルキルジアミンを使ったホスファイト結合の酸化によって、誘導体化されたホスホロアミデート結合を生成させることにより、アミノ官能基を導入する。一般に、上記の手法については、ハロアシルまたはハロアルキルアミノ誘導体化ポリマーユニットを、ホスホロチオエート誘導体化ポリマーユニットとは別個に製造することが好ましく、そうしない場合は、ホスホロチオエート部分に保護基が必要である。ランダムアレイを構築するための固相表面本発明では広範囲にわたるさまざまな支持体を使用することができる。ある態様では、支持体が、表面好ましくは、調査対象の単分子を同じ平面に置くことができるように、実質的に平面状である表面を持つ堅い固体である。平面状という特徴は、検出光学機器による効率の良いシグナル収集を可能にする。もう一つの態様では、本発明の固形支持体が無孔性である特に、単分子のランダムアレイが、所要体積の小さいハイブリダイゼーション反応によって解析される場合。適切な固形支持体材料として、例えばガラス、ポリアクリルアミド被覆ガラス、セラミックス、シリカ、シリコン、石英、種々のプラスチックなどの材料が挙げられる。一態様として、平面状の表面の面積は05~4cm2の範囲にあることができる。ある態様では、固形支持体が、均一にシラン処理された表面を持つ顕微鏡スライドなどのガラスまたは石英である。これは、例えば酸処理後に、3グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、NNジイソプロピルエチルアミン、および無水キシレン8:1:24vvの溶液に、80°Cで浸漬することなど、通常のプロトコールを使って達成することができる例えばBeattieらMolecularBiotechnology4213。そのような表面は、例えば表面への適用に先だって捕捉オリゴヌクレオチドに3または5トリエチレングリコールホスホリルスペーサーを設けることこれにより、エポキシシラン化された表面が形成されるなどによってBeattieら前掲参照、捕捉オリゴヌクレオチドの末端取付けが可能になるように、たやすく処理される。Beaucage前掲の開示からもわかるように、ガラスおよび他の表面に反応性官能基を付加するには、他にも多くのプロトコールを使用することができる。酵素処理が必要でない場合はいつでも、捕捉オリゴヌクレオチドは、好ましい性質例えば増加した二重鎖安定性を付与する非天然ヌクレオシド単位およびまたは結合を含むことができる。そのような化合物として、ペプチド核酸PNA、ロックト核酸LNA、オリゴヌクレオチドN3→P5ホスホロアミデート、オリゴ2Oアルキルリボヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限るわけではない。不連続な相隔たる領域のパターンが要求される本発明の実施形態では、フォトリソグラフィー、電子線リソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィー、およびナノプリンティングを使って、そのようなパターンを広範囲にわたるさまざまな表面上に生成させることができる例えばPirrungらの米国特許第5143854号;Fodorらの米国特許第5774305号;GuoJournalofPhysicsDAppliedPhysics37R123141;これらは参照により本明細書に組み入れられる。ある態様では、複数の不連続な相隔たる領域を含有する表面を、フォトリソグラフィーによって製作する。市販の光学的に平坦な石英基板に、厚さ100~500nmのフォトレジスト層をスピンコーティングする。次にそのフォトレジストを石英基板上に焼き締める。活性化すべき領域のパターンを持つレチクルの像を、フォトレジストの表面に、ステッパーを使って投影する。露光後に、フォトレジストを現像して、UV光源に曝された投影パターン部分を除去する。これは、プラズマエッチング極めて微細な細部を生じることができる乾式現像技法によって達成される。次に、残っているフォトレジストを強化するために、基板を焼き締める。焼き締め後、石英ウエハは官能化できる状態になっている。次に、そのウエハを、3アミノプロピルジメチルエトキシシランの蒸着に付す。アミノ官能化モノマーの密度は、モノマーの濃度および基板のばく露時間を変えることにより、緻密に制御することができる。プラズマエッチング工程によって露出された石英の部分だけが、モノマーと反応し、モノマーを捕捉しうる。次に、アミノ官能化モノマーの単層を露出した石英にキュアするために、基板を再び焼き締める。焼き締め後は、残留フォトレジストをアセトンで除去することができる。レジストとシランとでは結合ケミストリーが異なるので、基板上のアミノシラン官能化部分は、アセトン洗浄でも、無傷のままであることができる。これらの部分は、それらをピリジンおよびNNジメチルホルムアミドの溶液中、pフェニレンジイソチオシアネートと反応させることによって、さらに官能化することができる。この場合、基板はアミノ修飾オリゴヌクレチドと反応する能力を持つ。あるいは、5カルボキシ修飾剤c10リンカーGlenResearchを持つオリゴヌクレオチドを製造することもできる。この技法では、オリゴヌクレオチドをアミン修飾支持体に直接取付けることができるので、追加の官能化ステップを回避することができる。もう一つの態様では、複数の不連続な相隔たる領域を含有する表面が、ナノインプリントリソグラフィーNILによって製作される。DNAアレイを作成するために、一般に転写層と呼ばれるレジストの層を、石英基板にスピンコーティングする。次に、一般にインプリント層と呼ばれるもう一つのタイプのレジストを、転写層の上に塗布する。次に、マスターインプリントツールにより、インプリント層に陥凹を作る。インプリント層の総厚を、インプリントの低部が転写層に達するまで、プラズマエッチングで減少させる。転写層はインプリント層より除去しにくいので、大半が手つかずのまま残る。次にインプリント層および転写層を、加熱によって硬化させる。次に、インプリントの低部が石英に達するまで、基板をプラズマエッチャーに入れる。次に、上述のように蒸着によって基板を誘導体化する。もう一つの態様では、複数の不連続な相隔たる領域を含有する表面を、ナノプリンティングによって製作する。この工程では、フォトリソグラフィー、インプリントリソグラフィー、または電子線リソグラフィーを使って、プリントヘッド上に要求されるフィーチャーのネガ像であるマスターモールドを作る。プリントヘッドは、通例、ポリジメチルシロキサンPDMSなどの柔らかい可撓性ポリマーで作られている。この材料、または異なる性質を持つ材料の層を、石英基板上にスピンコーティングする。次に、モールドを使って、レジスト材料のトップ層に、制御された温度および圧力条件下で、フィーチャーを型押しする。次に、そのプリントヘッドをプラズマベースのエッチング工程に付して、プリントヘッドのアスペクト比を改善し、型押しされた材料の経時的弛緩によるプリントヘッドの歪みを除去する。均一に誘導体化された表面上にアミン修飾オリゴヌクレオチドのパターンを沈着させることにより、ナノプリンティングを使って、ランダムアレイ基板を作製する。これらのオリゴヌクレオチドは、RCR産物用の捕捉プローブとして役立つだろう。ナノプリンティングの潜在的利点の一つは、交互配置された異なる捕捉プローブのパターンをランダムアレイ支持体上にプリントできることである。これは、それぞれのヘッドが異なるパターンを持ち、全てのパターンが組み合わされて最終構造の支持体パターンを形成する、複数のプリントヘッドを使った逐次プリントによって達成されるだろう。そのような方法により、ランダムアレイ内でのDNA要素の位置符号化positionalencodingが、いくらか可能になる。例えば、特定の配列を含有する対照コンカテマーを、ランダムアレイの全体にわたって規則的な間隔で結合させることができる。さらにもう一つの態様では、コアおよび被覆材料を持つ約100億~1億本の光ファイバーの束または束の束から製造されたプリンティングヘッドまたはインプリントマスターを使って、サブミクロンサイズの捕捉オリゴヌクレオチドスポットの高密度アレイを製造する。ファイバーを牽引し融合させることにより、類似するサイズまたは2~5分の1もしくは2~5倍のサイズを持つ被覆材料によって隔てられた約50~1000nmのコアを持つユニークな材料が作成される。被覆材料のディファレンシャルエッチング溶解により、非常に数多くのナノサイズのポストを持つナノプリンティグヘッドが得られる。このプリンティングヘッドは、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的タンパク質、オリゴペプチド、DNA、アプタマーもしくは化学的化合物例えばさまざまな活性基を持つシランを沈着させるために使用することができる。ある実施形態では、グラスファイバーツールを、パターニングされる支持体として使用して、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的もしくは化学的化合物を沈着させる。この場合は、エッチングで作り出されたポストだけが、沈着させる材料と接触するだろう。また、コアを通る光を導き、光誘発性化学反応がコアの先端表面だけで起こって、その結果として、エッチングの必要を排除することが可能になるように、溶融ファイバー束の平坦な切り口を使用することもできる。どちらの場合も、次に、同じ支持体を、オリゴヌクレオチドまたは他の反応物をタグ付けするために使用した蛍光ラベルをイメージングするための導光集光装置として、使用することができる。この装置は、大きな視野を大きな開口数潜在的に>1と共に与える。活性材料またはオリゴヌクレオチドの沈着を行うスタンピングツールまたはプリンティングツールを使って、2~100種類のオリゴヌクレオチドを、交互的パターンでプリントすることができる。この工程には、約50~500nmへのプリントヘッドの正確な位置決めが要求される。このタイプのオリゴヌクレオチドアレイは、2~100種類のDNA集団例えば異なるソースDNAを取付けるために使用することができる。また、DNA特異的アンカーまたはタグを使用することにより、サブ光分解能sublightresolutionスポットからのパラレル読出しにも、使用することができる。情報は、DNA特異的タグ例えば16個のDNAに対する16個の特異的アンカーによってアクセスすることができ、5~6色の組み合わせにより、16回のライゲーションサイクルまたは1回のライゲーションサイクルと16回のデコーディングサイクルを使って、2塩基を読み取ることができる。このアレイ作製方法は、1フラグメントあたりに要求される情報が限られている例えばサイクル数が少ない場合には効率がよく、したがって、1サイクルあたりの情報量または1表面あたりのサイクル数が増加する。ある実施形態では、不活性コンカテマーを使って、試験コンカテマーを取付けるための表面を準備する。表面をまず、2タイプの合成コンカテマー一方は捕捉コンカテマーであり、他方はスペーサーコンカテマーである上に存在する結合部位に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドで覆う。スペーサーコンカテマーは、試験コンカテマーの製造に使用するアダプターに相補的なDNAセグメントを持たず、捕捉コンカテマーに対して約5~50好ましくは10倍過剰に使用される。捕捉オリゴヌクレオチドを持つ表面を、スペーサーコンカテマーが捕捉コンカテマーに対して約10倍または5~50倍過剰に使用されている合成コンカテマー連鎖ライゲーションchainligationまたはRCRによって製造の混合物で、飽和させる。スペーサーコンカテマーと捕捉コンカテマーの比が約10:1であるため、捕捉コンカテマーは大部分がスペーサーコンカテマーの海に浮かぶ個別の島になる。10:1という比により、二つの捕捉コンカテマーは平均すると二つのスペーサーコンカテマーで隔てられることになる。コンカテマーが約200nmの直径を持つとすると、二つの捕捉コンカテマーは約600nmの中心間間隔を持つことになる。次に、この表面を使って、捕捉コンカテマーの一領域ただしスペーサーコンカテマー上には存在しない領域に相補的な結合部位を持つ試験コンカテマーまたは他の分子構造を取付ける。一つの捕捉コンカテマースポットにつき試験コンカテマーが一つだけ取付けられることを保証するために、捕捉コンカテマーは、試験コンカテマー中の結合部位の数より少ないコピー数を持つように製造することができる。試験DNAは捕捉コンカテマーだけに結合することができるので、集塊を作らずに高い部位占有率を持つ試験コンカテマーのアレイを製造することができる。ランダムな取付けであるため、表面上のいくつかの部分にはコンカテマーが何も取付けられていないということもありうるが、遊離の捕捉オリゴヌクレオチドを持つこれらの部分は、試験コンカテマーを結合することができないだろう。というのも、試験コンカテマーは捕捉オリゴヌクレオチドに対する結合部位を持たないように設計されるからである。ここに記載する個々の試験コンカテマーのアレイは、格子パターンには整列されないだろう。秩序正しい格子パターンはデータ収集を単純化するはずである。なぜなら、必要なピクセル数が少なくなり、画像解析システムもそれほど精巧でなくてよいからである。一態様として、複数の本発明のアレイを単一の表面上に置くことができる。例えば、標準的な96または384ウェルプレート形式に合致するように、パターニングされたアレイ基板を作成することができる。作成フォーマットは、一片のガラスまたはプラスチックおよび他の光学適合材料上、9mmピッチの6mm×6mmアレイの8×12パターンまたは45mmピッチの333mm×333mmの16×24パターンであることができる。ある例では、各6mm×6mmアレイが、1マイクロメートルピッチの250~500nm角の領域3600万個からなる。ユニットアレイ間で異なる反応が混合しないように、疎水性もしくは他の表面または物理的障壁を使用することができる。一例として、シリコン、石英、またはガラス表面上の二酸化ケイ素にリソグラフィーで規定した部位を、3アミノプロピルジメチルエトキシシランなどのシラン処理剤でシラン処理した後、pフェニレンジイソチオシアネートなどの誘導体化剤で誘導体化することにより、DNA試料用の結合部位すなわち不連続な相隔たる領域を調製する。例えば、結合部位は、フォトリソグラフィー、電子線直接描画、またはナノインプリントリソグラフィーによって作成された四角形、円形または規則的不規則的多角形であることができる。結合部位間の領域における非特異的結合の最小化。結合部位を取り囲む区域の湿潤性疎水性対親水性および反応性を制御して、その区域すなわち結合部位以外の場所におけるDNA試料の結合を防ぐことができる。例えば、この区域は、表面に共有結合するヘキサメチルジシラザンHMDSなどの薬剤を使って、疎水性になるように、したがってDNA試料の親水性結合には適さなくなるように、製造することができる。同様に、この区域をDNA試料に対して非反応性にするフッ素系炭素化合物などの化学薬剤で、この区域をコーティングしてもよい。先の段落に挙げた三つの表面製作工程では、以下の代表的ステップに従う。フォトリソグラフィーの場合:1ガラスウエハを洗浄する2HMDSで表面をプライミングする3フォトレジストに結合部位をパターニングする4HMDSを除去するために酸素で結合部位表面を反応性イオンエッチングする5033アミノプロピルジメチルエトキシシランでシラン処理する6裁断中のウエハを保護するためにフォトレジストでコーティングする7ウエハをチップに裁断する8フォトレジストを剥がす910ピリジンおよび90NNジメチルホルムアミドDMFの溶液で、溶液1mlにつき225mgのpフェニレンジイソチオシアネートPDCを使って、結合部位を2時間誘導体化した後、メタノール、アセトン、および水ですすぐ。電子線直接描画による表面製作の場合:1ガラスウエハを洗浄する2HMDSで表面をプライミングする3電子線でPMMAに結合部位をパターニングする4HMDSを除去するために酸素で結合部位表面を反応性イオンエッチングする5033アミノプロピルジメチルエトキシシランでシラン処理する6裁断中のウエハを保護するためにフォトレジストでコーティングする7ウエハをチップに裁断する8フォトレジストを剥がす910ピリジンおよび90NNジメチルホルムアミドDMFの溶液で、溶液1mlにつき225mgのpフェニレンジイソチオシアネートPDCを使って、結合部位を2時間誘導体化した後、メタノール、アセトン、および水ですすぐ。ナノインプリントリソグラフィーによる表面製作の場合:1ガラスウエハを洗浄する2HMDSの表面をプライミングする3転写層でウエハをコーティングする4ナノインプリントテンプレートおよび転写層の上にあるフォトポリマーを使って、コンタクトプリントパターニングする5パターンを転写層まで乾式エッチングする6HMDSを除去するために酸素で結合部位表面を反応性イオンエッチングする7033アミノプロピルジメチルエトキシシランでシラン処理する8裁断中のウエハを保護するためにフォトレジストでコーティングする9ウエハをチップに裁断する10フォトレジストを剥がす1110ピリジンおよび90NNジメチルホルムアミドDMFの溶液で、溶液1mlにつき225mgのpフェニレンジイソチオシアネートPDCを使って、結合部位を2時間誘導体化した後、メタノール、アセトン、および水ですすぐ。上述のように、ガラス表面も、本発明のランダムアレイを構築するために使用することができる。例えば、適切なガラス表面を、顕微鏡カバースリップから構築することができる。顕微鏡カバースリップ22mm角、厚さ約170μmをテフロン登録商標製ラックに入れる。それらを95エタノール水中の3MKOHに、2分間浸漬する。次に、それらを水中ですすいだ後、アセトンですすぐ。これにより、表面汚染が取り除かれ、シラン処理の準備がガラスに施される。プラズマ洗浄はKOH洗浄に代わる一方法である。ガラスの代りに溶融シリカまたは溶融石英を使用することもできる。清浄な乾燥したカバースリップを、アセトン中の033アミノプロピルジメチルエトキシシラン、03水に浸漬する。それらを45分間反応させておく。次にそれらをアセトン中ですすぎ、100°Cで1時間、キュアする。3アミノプロピルジメチルエトキシシランはガラス表面上に単層を形成するので、3アミノプロピルトリエトキシシランの代用品として使用することができる。単層表面の方が低いバックグラウンドをもたらす。シラン処理剤は蒸着法を使って適用することもできる。3アミノプロピルトリエトキシシランは、液相で沈着させると、より多くのポリマー表面を形成する傾向がある。次に、アミノ修飾シランをチオシアネート基で終端させる。これは、10ピリジンおよび90NNジメチルホルムアミドDMFの溶液中、溶液1mlにつき225mgのpフェニレンジイソチオシアネートPDCを使って行われる。反応を2時間行った後、スライドをメタノール中で洗浄し、次にアセトン、および水ですすぐ。次に、カバースリップを乾燥すると、プローブを結合する準備が整う。シラン処理剤の末端にあるアミノ基を修飾するために使用することができる化学薬品は他にもある。例えば、グルタルアルデヒドを使って、シラン処理剤の末端にあるアミノ基を、アミノ修飾オリゴヌクレオチドにカップリングすることができるアルデヒド基に修飾することができる。100mM重炭酸ナトリウム水溶液中の10~50μM捕捉オリゴヌクレオチド溶液を表面に適用することによって、捕捉オリゴヌクレオチドをカバースライドの表面に結合させる。溶液を乾燥させた後、水中で洗浄する。3アミノ基をPDCで終端させることを避け、5末端がカルボキシル基またはアルデヒド基で修飾されている捕捉オリゴヌクレオチドへの3アミノ末端の直接コンジュゲーションを行うことが有益であるかもしれない。カルボキシル基の場合は、EDC1エチル3カルボジイミドを含有する溶液に、オリゴヌクレオチドを適用する。アルデヒド基の場合は、オリゴを5~10分間濡れた状態に保ってから、表面を1水素化ホウ素ナトリウムで処理する。本発明のもう一つの態様では、ナノメートルサイズのビーズを使って、ランダムアレイを製造する。コンカテマーを生成させるために使用するサークル中のアダプターオリゴヌクレオチドに相補的な短いオリゴヌクレオチド例えば6~30ヌクレオチドで誘導体化されたサブミクロン例えば20~50nm範囲のガラスタイプまたは他のタイプのビーズを使用する。ビーズ上のオリゴヌクレオチドの数および配列の長さは、溶解した状態でコンカテマーを弱く結合するように、制御することができる。ビーズの反応速度は、固相支持体のみの場合より、はるかに速いはずである。コンカテマーを結合した後、ビーズをアレイ基板の表面に沈降させる。アレイ基板は、表面への優先的結合と、それによる間隔の空いたコンカテマーのアレイの形成を可能する条件を選択することができるように、より長く、より安定で、より多くのオリゴヌクレオチドを持つ。ビーズが磁気ビーズである場合は、磁場を使ってそれらを表面に引張ることができ、それらを表面付近で移動させるために使用することもできる。あるいは、遠心分離を使ってビーズを表面上に濃縮することもできる。代表的なプロトコールは以下のとおりである:1.1μlにつき100万個のコンカテマーを含むコンカテマー溶液20μlの調製物を、約8塩基長異なる条件下で6~16塩基を使用しうるの捕捉ヌクレオチド約500個を持つ2000万個のナノビーズと混合する。100nmナノビーズは約40000nm2あり、4000個までの短いオリゴヌクレオチドを保持することができる。捕捉プローブの密度を制御するための一方法は、この場合であれば、同じ取付けケミストリーを持つ2~4塩基長オリゴヌクレオチドを約8倍多く、捕捉プローブと混合することである。また、もっと小さいナノビーズ20~50nmを使用することもできる。2.300を超えるコピーを持つコンカテマーが、有意な個数でナノビーズに付着するように、反応条件温度、pH、塩濃度を調節する。3.その反応を、同じストリンジェント条件下で、サイズが約200nmの活性部位1600万個を持つ4×4mmのパターニングされた表面を有する支持体に適用し、ナノビーズを基板表面上に自然にまたは強制的に沈降させて、大きいコンカテマーをナノビーズと共に連れてくる。ナノビーズコンカテマーが移動する必要がある最大距離は約1mmである。ビーズの垂直移動は、潜在的コンカテマーコンカテマー遭遇の数を最小化する。反応溶液は、少しずつ例えば5μlずつ4回適用することができる。この場合、適用される溶液の厚さ例えばナノビーズ最大移動距離は、わずかに約250ミクロンである。4.反応のストリンジェンシーをさらに増加させることにより、コンカテマーをナノビーズから放出させ、それらを、長さ20~50塩基の捕捉オリゴヌクレオチド約300個を持つ支持体上の活性部位に取付ける。5.ナノビーズに取付けたコンカテマーは、最初は主として、支持体上の活性部位の間に沈降するだろう。なぜなら、不活性表面は活性表面よりも25倍多いからである。ナノビーズコンカテマーを約1~数ミクロン移動させるために、わずかな水平移動力例えば基板傾斜などの力をかけてもよい。検出機器上述のように、本発明に従って作製されたランダムアレイ上の単分子からはシグナルが生成し、そのシグナルは、走査電子顕微鏡、近接場走査型光学顕微鏡NSOM、全反射照明蛍光顕微鏡TIRFMなど、いくつかの検出システムによって検出される。表面上のナノスケール構造を解析し検出することを目的とするそのような技法の応用については、以下に挙げる文献これらは参照により本明細書に組み入れられるからもわかるように、豊富な手引きが文献に見出される:Reimerら編ScanningElectronMicroscopyPhysicsofImageFormationandMicroanalysis第2版Springer1998;NieらAnalChem7815281534;HechtらJournalChemicalPhysics11277617774;Zhuら編NearFieldOpticsPrinciplesandApplicationsWorldScientificPublishing、シンガポール、1999;Drmanacの国際特許公開WO2004076683;LehrらAnalChem7524142420;NeuschaferらBiosensorsBioelectronics18489497;Neuschaferらの米国特許第6289144号など。特に興味深いのは、例えばNeuschaferらの米国特許第6289144号;Lehrら前掲;およびDrmanacの国際特許公開WO2004076683などに開示されているTIRFMである。一態様として、本発明のアレイと共に使用される機器は、三つの基本構成要素を含む:iプローブ、洗浄液などの試薬類を貯蔵し、アレイに移動させ、加工するためのフルイディクスシステム;Science270484487;およびBrennerらNatureBiotechnology18630634。そのようなゲノムワイドな測定には、限定するわけではないが、例えば、当業者に知られる広範囲にわたるさまざまなアッセイによって行うことができるような、多形ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入、逆位などの決定、メチル化パターン、コピー数パターンなどの決定が含まれる例えばSyvanenNatureGeneticsSupplement37S5S10;GundersonらNatureGenetics37549554;FanらColdSpringHarborSymposiaonQuantitativeBiologyLXVIII6978;および米国特許第4883750号;同第6858412号;同第5871921号;同第6355431号など;これらは参照により本明細書に組み入れられる。本発明のランダムアレイでは、例えば、限定するわけではないが、ハイブリダイゼーションに基づく方法、例えばDrmanacの米国特許第6864052号;同第6309824号;および同第6401267号;ならびにDrmanacらの米国特許出願公開第20050191656号これらは参照により本明細書に組み入れられるに開示されているもの、SBS法、例えばNyrenらの米国特許第6210891号;Ronaghiの米国特許第6828100号;RonaghiらScience281363365;Balasubramanianの米国特許第6833246号;Quakeの米国特許第6911345号;LiらProcNatlAcadSci100414419これらは参照により本明細書に組み入れられる、ならびにライゲーションに基づく方法、例えばShendureらScience30917281739これは参照により本明細書に組み入れられるなど、さまざまなシークエンシング方法を使用することができる。一態様として、本発明に従ってターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法は、以下に挙げるステップを含む:aターゲットポリヌクレオチドから複数のターゲットコンカテマーを生成させるステップ各ターゲットコンカテマーはターゲットポリヌクレオチドのフラグメントのコピーを複数含み、複数のターゲットコンカテマーには、ターゲットポリヌクレオチドを実質的にカバーする数のフラグメントが含まれる;bターゲットコンカテマーの少なくとも過半数が光学的に解像可能であるような密度で表面に固定されたターゲットコンカテマーのランダムアレイを形成させるステップ;c各ターゲットコンカテマー中の各フラグメントの少なくとも一部の配列を同定するステップ;およびdコンカテマーのフラグメントの各部分の配列のアイデンティティからターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を再構築するステップ。通例、実質的ににカバーするとは、解析されるDNAの量が、ターゲットポリヌクレオチドの少なくとも2コピーに相当するものを含有すること、もう一つの態様では少なくとも10コピー、もう一つの態様では少なくとも20コピー、もう一つの態様では少なくとも100コピーに相当するものを含有することを意味する。ターゲットポリヌクレオチドには、ゲノムDNAフラグメントおよびcDNAフラグメントなどのDNAフラグメント、ならびにRNAフラグメトを含めることができる。一態様として、複数のDNAまたはRNAフラグメント中の配列を決定するために本発明と共に使用されるシークエンシング方法は、以下のステップを含む:aそれぞれがDNAまたはRNAフラグメントのコンカテマーを含む複数のポリヌクレオチド分子を生成させるステップ;bターゲットコンカテマーの少なくとも過半数が光学的に解像可能であるような密度で表面に固定されたポリヌクレオチド分子のランダムアレイを形成させるステップ;およびc解像可能なポリヌクレオチド中の各DNAまたはRNAフラグメントの少なくとも一部の配列を、光学的に検出可能な反応物の少なくとも一つの化学反応を使って同定するステップ。ある実施形態では、そのような光学的に検出可能な反応物がオリゴヌクレオチドである。もう一つの実施形態では、そのような光学的に検出可能な反応物がヌクレオシド三リン酸、例えばコンカテマーにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させるために使用することができる蛍光標識ヌクレオシド三リン酸である。もう一つの実施形態では、そのような光学的に検出可能な試薬が、コンカテマー上で隣接した二重鎖を形成する第1オリゴヌクレオチドと第2オリゴヌクレオチドとを連結することによって形成されるオリゴヌクレオチドである。もう一つの実施形態では、そのような化学反応が、例えばコンカテマーにハイブリダイズしたプライマーを伸長させることなどによる、DNAまたはRNAの合成である。さらにもう一つの実施形態では、上記の光学的に検出可能な反応物が、核酸結合性オリゴペプチドまたはポリペプチドまたはタンパク質である。ある態様では、ランダムアレイ上のコンカテマーのポリヌクレオチド分析物のパラレルシークエンシングが、Drmanacが前掲の特許に開示したコンビナトリアルSBHcSBHによって達成される。ある態様では、第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブセット各セットは、そのセット内の所定のプローブ長について考えうる全ての配列を持つオリゴヌクレオチドを含むメンバープローブを有するを用意する。例えば、あるセットが長さ6のプローブを含有するとすると、そのセットは4096=46個のプローブを含有する。もう一つの態様では、第1および第2のオリゴヌクレドプローブセットが、選ばれたターゲットポリヌクレオチドセットを検出するために設計された選ばれたヌクレオチド配列を持つプローブを含む。配列は、一つのプローブまたはプローブプールをハイブリダイズさせ、第2のプローブまたは第2のプローブプールをハイブリダイズさせ、それぞれのターゲット配列上で完全にマッチした二重鎖を形成するプローブを連結し、連結されるプローブを同定して、ターゲット配列に関する配列情報を取得し、全てのプローブまたはプローブプールがハイブリダイズされるまでこれらのステップを繰返し、そのハイブリダイゼーションおよび同定ステップ中に蓄積される配列情報からターゲットのヌクレオチド配列を決定することによって決定される。シークエンシング作業のために、いくつかの実施形態では、米国特許第6864052号に開示されているように、上記のセットをサブセットに分割し、それらをプールして一緒に使用することができる。第1セットおよび第2セットからのプローブを、ターゲット配列に、一緒にまたは順番に、セット全体として、またはサブセットもしくはプールとして、ハイブリダイズさせることができる。第1セットまたは第2セット中のプローブの長さは、ある態様では5~10ヌクレオチドの範囲、もう一つの態様では5~7ヌクレオチドの範囲にあって、連結された時に、それらがそれぞれ10~20および10~14の範囲の長さを持つライゲーション産物を形成するようになっている。もう一つの態様として、そのような技法を使って、取付けられたDNAコンカテマーのそれぞれの配列アイデンティティを、シグネチャーアプローチで決定することもできる。取付けられたコンカテマーの約25~50いくつかの応用例では10~30が各プローブに対して完全マッチ配列を持つことになるように、約50~100個あるいは200個のプローブを使用する。このタイプのデータにより、コンカテマー内の各増幅DNAフラグメントを、基準配列にマッピングすることが可能になる。例えば、そのような工程により、4色のラベリングスキームで16回のハイブリダイゼーションストリップオフサイクルを使って、64個の4マーすなわちが考えうる全256個の4マーの25をスコアリングすることができる。コンカテマー中に増幅された60~70塩基フラグメントでは、64プローブのうち約16プローブが陽性になるだろう。というのも、64塩基長の配列には64の考えうる4マーすなわち全ての考えうる4マーの4分の1が存在するからである。無関係な60~70塩基フラグメントは、著しく異なる約16の陽性デコーディングプローブセットを持つことになる。64プローブのうちの16プローブの組み合わせが偶然に存在する確率は10億フラグメントごとに1であり、これは実際上、そのコンカテマーのユニークなシグネチャーになる。20サイクルで80プローブをスコアリングし、20の陽性プローブを生成させると、より一層ユニークであると思われるシグネチャーを生成し、偶然による出現率は10億の10億倍回に1回である。シグネチャーアプローチはcDNAライブラリーから新規遺伝子を選択するために使用されたことがある。シグネチャーアプローチの実行は、試験した全てのプローブについて、得られた強度を選別し、陽性プローブ閾値を満たすプローブを所定の予想される数まで選択することである。これらのプローブは、そのアレイ中に存在すると予想される全DNAフラグメントの配列にマッピングされるだろうより長い基準配列のスライディングウィンドウを使用することができる。選ばれた陽性プローブを全てまたは統計的に十分な数だけ持つ配列が、与えられたコンカテマー中のDNAフラグメントの配列として割り当てられる。もう一つのアプローチでは、前もって測定しておいた完全マッチおよびミスマッチハイブリダイゼーションライゲーション効率を使って、予想されるシグナルを、使用したプローブの全てについて定義することができる。この場合は、相関係数に似た尺度を算出することができる。4マーをスコアリングする好ましい方法は、プローブのペア、例えば:NBBBをBNと、連結することであるここに、Bは所定の塩基であり、Nは縮重塩基である。より長いDNAコンカテマープローブ上でシグネチャーを生成させるには、より多くのユニーク塩基が使用されるだろう。例えば、1000塩基長のフラグメントにおける25の陽性率は、NBBBBおよびBBNによって達成されるだろう。より長いフラグメントが、約60~80プローブという同じ数4色を使って15~20のライゲーションサイクルを必要とすることに注意されたい。ある実施形態では、与えられた長さの全てのプローブ例えば4096個のN24BBBBBBN24または全てのライゲーションペアを使って、コンカテマー中のDNAの全配列を決定することができる。例えば、NB3とBBNの1024の組み合わせをスコアリングして4色を使用すると256サイクル、約250塩基好ましくは約100塩基までのDNAフラグメントの配列を決定することができる。多数のNを持つシークエンシングプローブのデコーディングは、効率の差を最小限に抑えるために、縮重塩基における配列のサブセットを複数合成することによって準備することができる。各サブセットを適正な濃度で混合物に加える。また、一部のサブセットは、他のサブセットよりも多くの縮重位置を持ちうる。例えば、セットNBBBの64プローブのそれぞれは、4つの異なる合成で製造することができる。一つは、完全に縮重した通常の5~7塩基であり;2番目はN035BBBであり;3番目はN02BBBであり、4番目はN02BBBである。三つの特異的合成で得たオリゴヌクレオチド調製物を、実験的に決定した量で通常合成に加えて、BBB配列の前にATリッチ例えばAATATまたはAもしくはTおよびGもしくはC交互配列例えばACAGTもしくはGAGACを持つターゲット配列とのハイブリッド生成を増加させる。これらの配列はハイブリッド形成の効率が低いと予想される。1024のターゲット配列全てを、N03NNNNNBBBプローブとのハイブリッドを形成する効率について調べることができ、最も弱い結合を与えるタイプを、約1~10の追加合成で製造し、基本プローブ調製物に加えることができる。シグネチャーによるデコーディング:小数の異なる試料に対する小数のプローブ:20プローブ中5~7陽性4色を使って5サイクルは、約1万~10万の異なるフラグメントを識別する能力を持つ。8~20マーRCR産物のデコーディング:この応用例では、DNAコンカテマーの形をしたユニークな8~20塩基認識配列のランダムな分布として、アレイを形成させる。8~20塩基プローブ領域の配列を決定するために、プローブをデコードする必要がある。これを行うために少なくとも二つの選択肢を利用することができ、以下の例では、12マーについて、その工程を説明する。まず最初に、短いプローブのハイブリダイゼーション特異性および完全にマッチしたハイブリッドのライゲーション特異性を利用して、配列の半分を決定する。12マーに隣接する6~10塩基は予め定義され、6マー~10マーオリゴヌクレオチドのサポートsupportとして機能する。この短い6マーは、その3末端で4つの標識6マー~10マーの一つに連結する。これらのデコーディングプローブは、4つのオリゴヌクレオチドプールからなり、各オリゴヌクレオチドは、4~9個の縮重塩基と1個の所定塩基とからなる。また、このオリゴヌクレオチドは4つの蛍光ラベルの一つで標識されるだろう。したがって、4つの考えうる塩基A、C、G、またはTのそれぞれは、蛍光色素によって表されるだろう。例えば、これら5群の4つのオリゴヌクレオチドと1つのユニバーサルオリゴヌクレオチドUsを、ライゲーションアッセイで使用することにより、12マーの最初の5塩基を配列決定することができる:B=末端の特定色素またはタグと関連づけられた4塩基のそれぞれ:UUUUUUUUBNNNNNNNUUUUUUUUNBNNNNNNUUUUUUUUNNBNNNNNUUUUUUUUNNNBNNNNUUUUUUUUNNNNBNNN。6個以上の塩基は、追加のプローブプールを使って配列決定することができる。12マーの中央近くの位置における識別を改善するために、6マーオリゴヌクレオチドをさらに12マー配列中に置くことができる。これには、そのシフトに対応するために、非標識オリゴヌクレオチドの3末端に縮重塩基を組み込む必要があるだろう。これは、12マーの6位および7位に関するデコーディングプローブの一例である。UUUUUUNNNNNBNNNNUUUUUUNNNNNNBNNN。同様にして、12マーの右側から6塩基を、固定されたオリゴヌクレオチドおよび5標識プローブを使って、デコードすることができる。上述のシステムでは、12マーの片側の6塩基を定義するのに6サイクルが必要である。ライゲーション部位から離れた塩基の冗長サイクル解析により、これは7または8サイクルは増加しうる。したがって合計すると、12マーの完全な配列決定は、12~16サイクルのライゲーションで達成できるだろう。タイプの異なる二つの検出プローブライブラリーを組み合わせることによる、アレイ化DNAの部分的なまたは完全な配列決定。このアプローチでは、一つのセットが一般タイプN38B46のプローブアンカーを持ち、これがセットBN68、NBN57、N2BN46、およびN3BN35からの第1の2または3または4プローブプローブプールと連結される。主な要件は、第1セットからのプローブを第2セットからの2~4またはそれ以上のプローブと共に数サイクルで試験して、より長い連続した配列、例えば5~63~4=8~10を、ほんの3~4サイクルで読み取ることである。一例として、この工程は以下のとおりである:11~4個の4マーまたはより多くの5マーアンカーをハイブリダイズして、1DNAあたり70~80の1または2アンカーを得る。プールからどのアンカーが陽性であるかを識別するための一方法は、異なるハイブリッド安定性を持つおそらくNの数も異なる特異的プローブを混合することである。プールからどのアンカーがスポットにハイブリダイズされるかを決定するために、アンカーにタグ付けしてもよい。追加DNAセグメントとしてのタグは、検出方法としてのアジャスタブルディスプレイスメントadjustabledisplacementに、使用することができる。例えば、EEEEEEEENNNAAAAAおよびFFFFFFFFNNNCCCCCプローブは、ハイブリダイゼーションまたはハイブリダイゼーションおよびライゲーション後に、対応する二つのディスプレーサーdisplacer:EEEEEEEENNNNNおよびFFFFFFFFNNNNNNNNによって、差別的に除去することができ、この場合は、2番目の方が効率的である。どのアンカーが陽性であるかを決定するためだけに、別個のサイクルを使用することができる。この目的には、複数の色で標識またはタグ付けされたアンカーを、非標識N7~N10サポーターオリゴヌクレオチドに連結することができる。24つの塩基に対応する4色を持つBNNNNNNNNプローブをハイブリダイズさせる;二つのアンカーが一つのDNA中で陽性である場合には、弁別的に洗浄してまたはタグに対する相補鎖で置換して、スコアリングされた二つの塩基のどちらがどちらのアンカーに関連するかを読み取る。このようにして、二つの7~10塩基配列を同時にスコアリングすることができる。24サイクルにおいてさらなる24塩基について46塩基のアンカーに伸長して、各アレイにつき16の異なるアンカー4色を使用する場合、32~64回の物理的サイクルを実行して1フラグメントにつき約16の考えうる8マー合計約100塩基を決定するそれを基準配列にマッピングするには十分である100マーが10個の8マーからなるセットを持つ確率は、1兆の1兆倍回に1回未満1028である。もう一つのアレイ中の同じフラグメント上で並列してスコアリングされた異なるアンカーからのデータを組み合わせることにより、そのフラグメントの配列、ひいてはゲノム全体の配列を、オーバーラップする7~10マーから生成させることができる。デコーディングプローブまたは配列決定プローブのより大きなマルチプレックスのための、DNAタグによるプローブのタグ付け。プローブを直接標識する代わりに、それらを、天然塩基または新しい合成塩基isoGおよびisoCなどで構成される異なるオリゴヌクオチド配列でタグ付けすることができる。タグは、異なるオリゴヌクレオチド長約6~24塩基およびまたは配列GC含量を含むを使って、それらのアンチタグと極めて正確な結合効率を持つように設計することができる。例えば、4回の連続的サイクルまたは1回のハイブリダイゼーションサイクルとそれに続く弁別的洗浄で、特異的アンチタグを使って認識することができる、4つの異なるタグを設計することができる。弁別的洗浄では、初期シグナルが、各タグにつき、それぞれ95~99、30~40、10~20および0~5に低下する。この場合、異なるタグを持つプローブは同じドットにはまれにしかハイブリダイズしないと仮定すると、二つの画像を取得することにより、4つの測定が得られる。それらが連続的にまたは2~16の異なる色で標識して1回に2~16がデコードされるとしても、多くの異なるタグを持つことのもう一つの利点は、1回のアッセイ反応に多数の個別に認識できるプローブを使用できることである。このように、プローブが短いインキュベーションおよび除去反応でデコードされるのであれば、4~64倍長いアッセイ時間これは、より特異的なまたはより強いシグナルをもたらしうるが可能だろう。デコーディング工程には48~96以上のデコーディングプローブが必要である。これらのプールは、それぞれが異なる蛍光スペクトルを持つ4つの蛍光体でそれらをエンコードすることにより、さらに12~24以上のプールに組み合わされる。20倍対物レンズを使うと、各6mm×6mmアレイは、10メガピクセルカメラを使って完全にカバーするのに、約30画像を必要としうる。1マイクロメートルアレイ部分のそれぞれは、約8ピクセルによって読まれる。各画像は250ミリ秒で取得される露光に150ミリ秒およびステージを移動させるのに100ミリ秒。この速い取得を使うと、各アレイをイメージングするのに約75秒あるいは各基板上の96アレイの全セットをイメージングするのに12分を要するだろう。イメージングシステムの一実施形態において、この高い画像取得速度は、それぞれが異なる蛍光体の蛍光スペクトルをイメージングする4つの10メガピクセルカメラによって達成される。カメラは一連の二色性ビームスプリッターを通して顕微鏡に結合される。余分な時間を要する自動焦点ルーチンは、取得した画像の焦点が合っていない場合にのみ動作する。その場合は、次のイメージングサイクル時に、そのアレイのそのセクションに戻ったときに使用するために、Z軸位置情報が保存されるだろう。基板上の各位置について自動焦点位置をマッピングすることにより、画像取得に要する時間が劇的に短縮されるだろう。各アレイはデコードするのに約12~24サイクルを要する。各サイクルは、ハイブリダイゼーション、洗浄、アレイイメージング、およびストリップオフステップからなる。これらのステップは、この順に、上記の例の場合、それぞれ5、2、12、および5分を要し、各サイクルにつき合計24分、あるいは作業がリニアに行われたとして、各アレイにつきほぼ5~10時間を要しうる。各アレイをデコードする時間は、システムが絶えずイメージングできるようにすることによって、2分の1に短縮することができる。これを達成するために、各顕微鏡で二つの別個の基板のイメージングを互い違いに配置する。一つの基板を反応させている間に、他方の基板をイメージングする。cSBHを使った代表的デコーディングサイクルには、以下のステップが含まれる:iアレイの温度をハイブリダイゼーション温度通常は5~25°Cの範囲に設定する;ii次に、ロボットピペッターを使って、少量のデコーディングプローブを適当な量のハイブリダイゼーションバッファーと予備混合する;iii混合した試薬をハイブリダイゼーションチャンバにピペッティングする;iv予定の時間、ハイブリダイズさせる;vポンプシリンジなどを使ってチャンバから試薬を排出する;vi非ハイブリッドのミスマッチを洗浄するためにバッファーを加える;viiチャンバ温度を適当な洗浄温度約10~40°Cに調節する;viiiチャンバを排液する;顕微鏡対物レンズを使って、イメージングする;プレートステージがチャンバあるいは投入ロートを含むフローセルをオブジェクトobjectの上で動かすか、対物光学アセンブリがチャンバの下で動く;二色性ミラービームスプリッターを使用する一定の光学的配置を使って、マルチスペクトル画像を同時に収集することにより、画像取得時間を短縮することができる;アレイは、アレイ画像サイズピクセル密度に応じて、セクションごとにイメージイングするか、全体的にイメージングすることができる;セクションは活性部位作製時に基板上に予めコードしておいた統計的に有意な空領域を使って画像を整列することによりアセンブルするか、マルチステップナノプリンティング技法を使って作製することができ、例えば特定の捕捉プローブを使って、部位活性部位のグリッドを、そのグリッド中に空領域を残してプリントし、次に、別個のプリントヘッドを使って、その領域に異なるパターンまたは捕捉プローブをプリントすることができる;xiチャンバを排液してプローブストリップバッファーで置き換えまたは既に充填されているバッファーを使用、チャンバをプローブストリップオフ温度60~90°Cに加熱する;ストリップオフステップでは、ストリップオフ温度を下げるために、高pHバッファーを使用することができる;指定した時間、待つ;xiiバッファーを除去する;xiii次のデコーディングプローブプールをセットで使って、次のサイクルを開始する。ラベルおよび本発明のアレイ上のポリヌクレオチドに対するプローブによるシグナル生成本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、放射性部分、蛍光部分、比色部分、化学発光部分などの直接的または間接的取付けなど、さまざまな方法で標識することができる。DNAを標識する方法およびDNAアダプターを構築する方法に関する包括的な総説は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブの構築に応用できる手引きになる。そのような総説には、KrickaAnnClinBiochem39114129;SchaferlingらAnalBioanalChem;MatthewsらAnalBiochemVol169125;HauglandHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals第10版InvitrogenMolecularProbesInc、ユージーン、2006;KellerおよびManakDNAProbes第2版StocktonPress、ニューヨーク、1993;ならびにEckstein編OligonucleotidesandAnaloguesAPracticalApproachIRLPress、オックスフォード、1991;WetmurCriticalReviewsinBiochemistryandMolecularBiology26227259;HermansonBioconjugateTechniquesAcademicPress、ニューヨーク、1996など。本発明に応用できる多くのより具体的な方法が、以下の参考文献例に開示されている:Fungらの米国特許第4757141号;HobbsJrら米国特許第5151507号;Cruickshankの米国特許第5091519号;レポーター基を取付けるための官能化オリゴヌクレオチドの合成;JablonskiらNucleicAcidsResearch1461156128酵素オリゴヌクレオチドコンジュゲート;JuらNatureMedicine2246249;Bawendiらの米国特許第6326144号誘導体化蛍光ナノ結晶;Bruchezらの米国特許第6274323号誘導体化蛍光ナノ結晶など。ある態様では、一つ以上の蛍光色素、例えばMenchenらの米国特許第5188934号47ジクロロフルオレセイン色素;Begotらの米国特許第5366860号スペクトル的に分割可能なローダミン色素;Leeらの米国特許第5847162号47ジクロロローダミン色素;Khannaらの米国特許第4318846号エーテル置換フルオレセイン色素;Leeらの米国特許第5800996号エネルギー移動色素;Leeらの米国特許第5066580号キサンテン色素;Mathiesらの米国特許第5688648号エネルギー移動色素などを、オリゴヌクレオチドプローブのラベルとして使用する。標識は、以下に挙げる特許および特許出願これらは参照により本明細書に組み入れられるに開示されているように、量子ドットを使って行うこともできる:6322901;6576291;6423551;6251303;6319426;6426513;6444143;5990479;6207392;20020045045;20030017264など。本明細書で使用する蛍光シグナル生成部分という用語は、一つ以上の分子の蛍光吸収およびまたは蛍光放出特性によって情報を伝達するシグナリング手段を意味する。そのような蛍光特性には、蛍光強度、蛍光寿命、蛍光スペクトル特徴、エネルギー移動などが含まれる。標識オリゴヌクレオチドに容易に組み込まれる市販の蛍光ヌクレオチド類似体には、例えばCy3dCTP、Cy3dUTP、Cy5dCTP、Cy5dUTPAmershamBiosciences、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ、フルオレセイン12dUTP、テトラメチルローダミン6dUTP、TexasRed5dUTP、CascadeBlue7dUTP、BODIPYFL14dUTP、BODIPYR14dUTP、BODIPYTR14dUTP、RhodamineGreen5dUTP、OregonGreen4885dUTP、TexasRed12dUTP、BODIPY63065014dUTP、BODIPY65066514dUTP、AlexaFluor4885dUTP、AlexaFluor5325dUTP、AlexaFluor5685dUTP、AlexaFluor5945dUTP、AlexaFluor54614dUTP、フルオレセイン12UTP、テトラメチルローダミン6UTP、TexasRed5UTP、CascadeBlue7UTP、BODIPYFL14UTP、BODIPYTMR14UTP、BODIPYTR14UTP、RhodamineGreen5UTP、AlexaFluor4885UTP、AlexaFluor54614UTPMolecularProbesInc、米国オレゴン州ユージーンなどがある。合成後の取付けに利用することができる他の蛍光体として、なかんずくAlexaFluor350、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor647、BODIPY493503、BODIPYFL、BODIPYR6G、BODIPY530550、BODIPYTMR、BODIPY558568、BODIPY558568、BODIPY564570、BODIPY576589、BODIPY581591、BODIPY630650、BODIPY650665、CascadeBlue、CascadeYellow、ダンシル、リサミンlissamineローダミンB、MarinaBlue、OregonGreen488、OregonGreen514、PacificBlue、ローダミン6G、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、TexasRedMolecularProbesInc米国オレゴン州ユージーンから入手することができる、ならびにCy2、Cy35、Cy55、およびCy7AmershamBiosciencesニュージャージー州ピスカタウェイなどが挙げられる。PerCPCy55、PECy5、PECy55、PECy7、PETexasRed、およびAPCCy7などのFRETタンデム蛍光体も使用することができ、PEAlexa色素610、647、680およびAPCAlexa色素も使用することができる。ビオチンまたはその誘導体を、検出オリゴヌクレオチド上のラベルとして使用し、続いて、検出可能に標識されたアビジンストレプトアビジン誘導体例えばフィコエリトリンコンジュゲートストレプトアビジンまたは検出可能に標識された抗ビオチン抗体で結合することもできる。ジゴキシゲニンをラベルとして組み込み、続いて検出可能に標識された抗ジゴキシゲニン抗体例えばフルオレセイン化抗ジゴキシゲニンで結合することができる。アミノアリルdUTP残基を検出オリゴヌクレオチドに組み込み、続いてNヒドロキシスクシンイミドNHS誘導体化蛍光色素例えば上に列挙したものにカップリングすることもできる。一般に、検出可能に標識されたコンジュゲートパートナーを、検出が可能なように結合することができる限り、コンジュゲートペアのどのメンバーでも、検出オリゴヌクレオチドに組み込むことができる。本明細書で使用する抗体という用語は、任意のクラスの抗体分子、またはそのサブフラグメント例えばFabを指す。他の適切な検出オリゴヌクレオチド用ラベルとして、フルオレセインFAM、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノールDNP、ダンシル、ビオチン、ブロモデオキシウリジンBrdU、ヘキサヒスチジン6×His、リンアミノ酸例えばPtyr、Pser、Pthr、または他の任意の適切なラベルを挙げることができる。ある実施形態では、以下に挙げるハプテン抗体ペアを検出に使用するこの場合、抗体のそれぞれは検出可能なラベルで誘導体化される:ビオチンαビオチン、ジゴキシゲニンαジゴキシゲニン、ジニトロフェノールDNPαDNP、5カルボキシフルオレセインFAMαFAM。以下のスキームで説明するように、プローブを、とりわけハプテンで間接的に標識した後、そのハプテンを、例えばHoltkeらの米国特許第5344757号;同第5702888号;および同第5354657号;Huberらの米国特許第5198537号;Miyoshiの米国特許第4849336号;MisiuraおよびGaitのPCT公開WO9117160等に開示されているように、捕捉剤によって結合することができる。本発明と共に使用するために、多くの異なるハプテン捕捉剤ペアを利用することができる。代表的なハプテンには、ビオチン、デスビオチンおよび他の誘導体、ジニトロフェノール、ダンシル、フルオレセイン、CY5、および他の色素、ジゴキシゲニンなどがある。ビオチンの場合、捕捉剤はアビジン、ストレプトアビジン、または抗体であることができる。抗体は、他のハプテンの捕捉剤として使用することができる多くの色素抗体ペアが市販されている;例えばMolecularProbes。本発明のキット本明細書に記載する方法の商業化においては、本発明のランダムアレイを構築し、それをさまざまな応用例に使用するための一定のキットが、とりわけ有用である。本発明のランダムアレイを応用するためのキットには、例えば、ターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのキット、基準DNA配列と試験DNA配列の間の相違の大規模同定を行うためのキット、エクソンをプロファイリングするためのキットなどがあるが、これらに限るわけではない。キットは、典型的には、表面を持つ少なくとも一つの支持体、および本発明のランダムアレイを構築するのに、またはそれを使った応用を行うのに、必要または有用な一つ以上の試薬を含む。そのような試薬には、限定するわけではないが、核酸プライマー、プローブ、アダプター、酵素などがあり、それぞれ、流通に適したパッケージ例えば、限定するわけではないが、箱、封をした小袋、ブリスター包装およびカートンなど中の容器例えば、限定するわけではないが、バイアル、チューブまたはボトルなどに入れられる。パッケージは典型的には、梱包されている材料の使用法を示すラベルまたは添付文書を含む。本明細書にいう梱包材料には、キット中の試薬を配布するための梱包に用いられる任意の物品例えば、限定するわけではないが、容器、バイアル、チューブ、ボトル、小袋、ブリスター包装、ラベル、タグ、指示シートおよび添付文書などを包含する。一態様として、本発明は、ソース核酸から得られるDNAフラグメントのコンカテマーのランダムアレイを作製するためのキットであって、以下の構成要素を含むものを提供する:i表面を持つ支持体;および;MashalらNatureGenetics9177183;BabonらMolecularBiotechnology237381;EllisらNucleicAcidsResearch2227102711など;これらは参照により本明細書に組み入れられる。Cleavaseは、ThirdWaveTechnologiesから商品化されている切断フラグメント長多形cleavagefragmentslengthpolymorphism:CFLP技法で使用される。一本鎖DNAをフォールドさせて二次構造をとらせると、DNAは、その鎖の塩基配列に依存する位置に、内部ヘアピンループを形成するだろう。Cleavaseは一本鎖DNAをそのループの5側で切断するので、そのフラグメントをPAGEまたは同様のサイズ分割技法によって分離することができる。MutSおよびMutYなどのミスマッチ結合タンパク質も、その突然変異部位同定能力を、ヘテロ二重鎖の形成に依拠している。ミスマッチは通常、修復されるが、ゲル電気泳動における移動度シフトまたはエキソヌクレアーゼからの保護によってフラグメントを選択するために、これらの酵素の結合作用を使用することができる例えばEllisら前掲。ヘテロ二重鎖形成のためのテンプレートは、ゲノムDNAからのプライマー伸長によって調製される。基準DNAの同じゲノム領域について、試験DNAの場合と同じ方法で、ただし別個の反応として、過剰の反対鎖を調製する。生成した試験DNA鎖をビオチン化し、ストレプトアビジン支持体に取付ける。加熱と相補鎖の除去によってホモ二重鎖の形成を防止する。ここで、基準調製物を一本鎖試験調製物と混合して、アニールさせることにより、ヘテロ二重鎖を生じさせる。このヘテロ二重鎖はいくつかのミスマッチを含有すると思われる。残存DNAを洗い流してから、ミスマッチエンドヌクレアーゼを加える。仮に1kbごとにミスマッチがあるとすると、10kbプライマー伸長物の場合は、これにより、約10個のフラグメントが生成すると予想される。切断後に、各フラグメントは各末端でアダプターを結合して、ミスマッチフラグメントサークル選択工程に移行することができる。大きいゲノムフラグメントから得られるミスマッチ切断されたDNAの捕捉。大きいゲノムフラグメントから上述のように調製された5~10kbのゲノムフラグメントを、ターミナルトランスフェラーゼでビオチン化ジデオキシヌクレオチドを3末端に付加することによってビオチン化し、過剰のビオチン化ヌクレオチドを濾過によって除去する。同じ配列領域をカバーする基準BACクローンを、同じ6塩基切断因子で消化して、試験DNAから生成するフラグメントと一致させる。ビオチン化ゲノムフラグメントを、BAC基準DNAの存在下で熱変性し、ゆっくりとアニールさせて、ビオチン化ヘテロ二重鎖を生成させる。基準BACDNAは、ゲノムDNAに対して大過剰であるから、ビオチン化産物の大半がヘテロ二重鎖になる。次に、基準DNAを除去するために、ビオチン化DNAを表面に取付けることができる。残存DNAを洗い流してから、ミスマッチエンドヌクレアーゼを加える。切断後に、各フラグメントは各末端でアダプターを結合して、以下に述べるミスマッチサークル選択工程に移行することができる。aDNAをミスマッチの両側で切断する。b連結することができる5オーバーハングを生成させる4塩基認識部位を持つ適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化で3オーバーハングも生成させる。c一端に活性オーバーハングを持っているアダプターを導入する。dアダプターを、生成した二つのフラグメントのそれぞれに連結する上側の鎖の3末端への配列の付加後、5リン酸基から右側へのライゲーションのみ。eその分子をリン酸化し、ブリッジングオリゴヌクレオチドを使って、一本鎖分子の二つの末端を連結する。。しかし、スプライス部位配列を改変する突然変異またはスプライソソームとスプライス部位の相互作用に影響を及ぼす外部因子のせいで、選択的スプライス部位または潜在的スプライス部位が選択されて、異なるエクソンセットを持つmRNAによってコードされるタンパク質変異体の発現をもたらすということが起こりうる。大規模ESTシークエンシングプロジェクトで得られたcDNA配列の調査により、50を超える遺伝子が既知のスプライス変異体を持つことが示された。マイクロアレイに基づくアプローチを使った最近の研究では、75もの遺伝子が選択的スプライシングを受ると見積られた例えばJohnsonらScience30221412144。選択的スプライシングによって生じるタンパク質の多様性は、高等真核生物における生物学的過程の複雑さの一因になっている可能性がある。また、このことから、変異型タンパク質の異常発現が疾患の病理発生の原因になりうることも考えられる。実際、選択的スプライシングは、成長ホルモン欠乏症、パーキンソン病、嚢胞性線維症および筋緊張性ジストロフィーのようなさまざまな疾患に関連することがわかっている例えばGarciaBlancoらNatureBiotechnology22535546。新規なスプライス変異体を単離し、特徴づけるのは困難であるため、がんにおけるスプライス変異体の役割を暗示する証拠は、氷山の一角に過ぎないのかもしれない。mRNAのスプライシングパターンを迅速かつ確実に特徴づけることができるツールを入手することができれば、がんおよび疾患発生全般における選択的スプライシングの役割を解明するのに役立つだろう。一態様として、本発明の方法は、以下に挙げるステップによるスプライス変異体の大規模測定を可能にする。aターゲットmRNAまたは全mRNAから完全長第1鎖cDNAを調製する。b生成した完全長または全第1鎖cDNA分子を、アダプター配列の組み込みによって環状化する。cアダプター配列に相補的なプライマーを使って、cDNAサークルのローリングサークル複製RCRを行うことにより、最初のcDNAを100コピー以上含むコンカテマーを形成させる。dアダプター配列の一部に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドで被覆されたガラス表面に、RCRで作製したcDNAボールを取付けることにより、ランダムアレイを調製する。高度なサブミクロンパターニングが施された表面の場合、1mm2に100万~1000万のcDNAスポットを設けることができる。この取付けは分子過程であり、個々のcDNAボールまたはコンカテマーをロボットでスポッティングする必要はないことに注意されたい。e試料生物組織中の1000以上のターゲット遺伝子~全ての既知遺伝子に含まれる10000以上のエクソンを全て試験するために、4096の6マーおよび1024の標識5マーの既製ユニバーサルライブラリーから出発して、高度なコンピュータプログラムと簡単なロボットピペッターとを使って、約200の6マーおよび20の5マーの40~80プールを作成する。f各サイクルのアレイ画像を生成させるための高感度10メガピクセルCCD検出器を持つ自動化された顕微鏡様の機器を使って、4~8時間の工程において、40~80サイクルで全てのプローブプールを、同じランダムアレイにハイブリダイズ連結させる。gコンピュータプログラムを使って、スポットシグナル強度解析を行うことにより、どのcDNAがどのスポット上にあるかを同定すると共に、予想されるエクソンのいずれかが、解析した遺伝子のいずれかに、欠けているかどうかを同定する。アレイにおける出現数を計数することにより、各スプライス変異体について正確な発現レベルを得る。標識mRNAcDNAとハイブリダイズさせた現行の発現アレイを使って、ただ単に、転写された遺伝子の集団全体にわたる、エクソン使用の比率に関する情報、またはスプライシング事象の定量を得る代りに、このシステムでは、一つの転写物についてエクソンパターンの完全な解析が得られる。その感度の上限では、何百という他の細胞のうちの1細胞にしか存在しないmRNAタイプの単分子まで、詳細に解析することができる。これは、癌細胞の早期診断にユニークな可能性をもたらす。選択的cDNA調製物と、標準的な384ウェルフォーマットのランダムアレイのアレイと、ユニバーサルな短いプローブのスマートプールとの組み合わせは、例えば選択した試料中の少数遺伝子の深い解析、または多数の試料における、より全般的な解析、または小数試料中の多数の遺伝子の解析など、アッセイの設計に著しい自由度を与える。解析は、1各特異的スプライス変異体の検出、2野生型mRNAおよび選択的スプライシングを受けたmRNAの発現の定量を、同時にもたらす。ヘテロ接合性の喪失およびランダムアレイ上の単スポット上の同じ転写物における二つの遺伝子からのエクソンの二つのサブセットの存在により、遺伝子欠失および遺伝子転座の検出に基づいて、総体的な染色体変化をモニターするために使用することもできる。このアッセイの例外的な容量と情報量は、極めて少量のmRNAからの簡単な試料調製、全て既製の実証された試薬類ユニバーサル標識および非標識プローブのライブラリーならびに最終的には全てのヒトおよびモデル生物遺伝子について開発されるであろうプライマーアダプターを含むに基づく完全に自動化されたアッセイと結びつけて考えられる。ここに提案するスプライス変異体プロファイリング工程は、個々の完全長cDNAクローンのハイスループットシークエンシングと等価であり、rSBHスループットは、4~8時間のアッセイで100万cDNA分子のプロファイリングに達することができる。このシステムは、疾患の出現および進行中に起こるさまざまなスプライス変異体の発現レベルの変化をモニターするための強力なツールになるだろう。新規スプライス変異体の発見を可能にすること、または既知のスプライス変異体ががんの進行をモニターするための生体マーカーとして役立つことを実証することもできる。選択的スプライス変異体の役割および治療ターゲットとしてのそれらの考えうる用途をさらに理解するための手段を提供することもできる。この低コストなハイスループットアッセイの万能性および柔軟性は、がん研究および診断薬ならびに他の全ての生物医学分野において、大きな商業的機会をもたらす。この高容量システムはサービス提供ラボまたはサービス提供会社にとって理想的である。インビトロ転写用テンプレートの調製.エクソン配列を、プラスミドpBluescriptなどのベクターのマルチクローニング部位MCSにクローニングする。プローブプールの有用性を実証する目的には、連続した完全長配列をクローニングする必要はなく、適正なタンパク質コーディングフレームを維持する必要もない。1kbより短い遺伝子の場合は、完全長配列用の遺伝子特異的オリゴを使って、PCR産物をcDNAから生成させる。それより長い遺伝子の場合は、エクソンの連続するブロックに対応する約500bpを含むPCR産物を生成させ、pBluescriptのMCS中の適当なクローニング部位にクローニングすることによって、それらのフラグメントを順序づける。これは、選択的スプライス変異体をクローニングするためのアプローチでもある。というのも、望ましい変異体は、PCRに使用されるcDNAソース中に存在しないかもしれないからである。MCSの最後の部位を使って、細胞mRNAのポリAテールを真似るために、40個のAからなるストリングを挿入する。これは、ポリAテールが後述する試料調製ステップと干渉するかもしれないという可能性を考慮に入れるためだが、ポリdAテールは、上述のゲノムフラグメントの試料調製物に組み込まれるので、これが問題になるとは思われない。T7RNAポリメラーゼを使って、ランオフ転写物を生成させ、生成したRNAを標準的な方法で精製する。アレーイング用試料の調製。プローブプールは特定遺伝子用に設計されるので、それら特定遺伝子だけについて、cDNAを調製する。逆転写酵素反応をプライミングするために、遺伝子特異的プライマーを使用する。したがって1000の遺伝子には、1000のプライマーを使用する。逆転写のためのプラミング部位の位置は、注意深く選択する。というのも、>2kbのcDNAの合成が高い効率で起こると期待することは、合理的でないからである。最後のエクソンがコーディング配列の末端と長い3非翻訳領域とからなることは、非常によくあることである。例えばCD44の場合、完全長mRNAは約57kbであるが、3UTRは3kbから構成され、コーディング領域は22kbしかない。したがって、逆転写プライマー部位の論理的な位置は、通常は、コーディング配列の末端のすぐ下流である。一部のスプライス変異体では、選択的エクソンがしばしばブロックとして一つにクラスター化して、変動領域を生じる。テネイシンC変異体85kbの場合、最も一般的なアイソフォームは、8追加エクソンのブロックを持ち、この領域におけるエクソン使用には変動があることを示唆する証拠がある。したがって、テネイシンCの場合、プライマーはこの領域のすぐ下流に置かれるだろう。>2kbの長さを持つcDNAの合成に関わる問題ゆえに、長い遺伝子については、複数のプライマーを使ってエクソンを2kbのブロックに分割する必要があるかもしれない。逆転写反応は、市販のシステム、例えばInvitrogenカリフォルニア州カールズバッドのSuperScriptIIIシステムや、Stratageneカリフォルニア州ラホーヤのStrataScriptシステムを使って行うことができる。一本鎖cDNA分子を作製したら、残りの手順には、上述のように、アダプター配列の付加、分子の環状化およびRCRが含まれる。cDNAの5末端は、基本的に、逆転写を開始させるために使用した遺伝子特異的プライマーが組み込まれたものである。逆転写プライミングオリゴの5末端上に7塩基ユニバーサルタグを組み込むことにより、生成するcDNAは全て、同じ7塩基配列を5末端に持つことになる。従って、縮重塩基を持つテンプレートオリゴヌクレオチドを使わなくても、アダプター配列とユニバーサルタグの両方に相補的な単一のテンプレートオリゴヌクレオチドを使って、ターゲット分子の全てにアダプターを連結することができる。通常は不明確なcDNAの3末端mRNAの5末端については、ゲノムフラグメントのランダム配列末端のように処理することができる。ポリAテールを付加する同様の方法が適用されるだろう。したがって、サークル閉環反応も、同じものを使用することができる。逆転写酵素は、時期尚早に終結して、切断型cDNAを生成しやすい。著しく切断されたcDNAは、おそらく、遺伝子割当てに結びつくほど十分なプローブ結合部位を持たず、したがって解析されないだろう。完全長に近いが完全長ではないcDNA分子は、5エクソンを欠くスプライス変異体として現われうる。そのような変異体を裏付ける補強証拠が配列データベースから得られないのであれば、それらは無視されうる。そのような問題を避ける方法は、完全長cDNAまたは望ましい3末端を持つものだけを、サークル閉環反応に適合するものとして選択することである。そうすれば、切断型分子は環状化されず、複製もされないだろう。まず、ライゲーションをブロックするために、ジデオキシシトシン残基を全てのcDNAの3末端に付加することができ、次に所望の配列をターゲットとするミスマッチオリゴを使って、新しい3末端を、T4エンドヌクレアーゼVIIを使って酵素ミスマッチ切断によって生成させることができる。新しい3末端を持つcDNAは、続いてポリdAテールを付加し、環状化および複製の標準的プロトコールに付すことができる。エクソンフラグメントのコンカテマーの複製およびアッセイは、上述のように、コンビナトリアルSBHを使って行うことができる。この技法で用いる5マーおよび6マープローブを選択するために、以下のステップのアルゴリズムを使用することができる。ステップ1:1000~2000の最も短いエクソン全部で約20~50kbを選択し、1024個の利用可能な標識5マーのそれぞれについて、マッチする配列を見つける。平均すると、各5マーは、20kbに20回出現するだろうが、一部は50回以上または100回以上出現しうる。最も頻度の高い5マーを選択することにより、最も多数の短いエクソンが、単一の標識プローブで検出されるだろう。目標は、1サイクルあたり約50~100個の短いエクソン500エクソンの10~20を検出することである。したがって、10個未満の標識プローブおよび50~100個の非標識6マーで十分だろう。少数の標識プローブが好ましい。なぜなら、それにより、総蛍光バックグラウンドが最小限になるからである。ステップ2.選択した10個の5マーに相補的な1000個の遺伝子全てにおける全ての部位に隣接する全ての6マーを見つける。平均して、各2kb遺伝子にそのような部位が20存在するだろう。部位の総数は約20000になり、例えば各6マーは平均して5回出現するだろう。6マーをヒット頻度で分類する。最も頻繁なものは20ヒット以上を持ちうる。例えばそのような6マーは、10個の標識プローブと組み合わせることにより、20遺伝子を検出するだろう。したがって、500遺伝子のそれぞれについて一つのプローブペアを得るには、最低25個の6マープローブが必要だろう。現実的には、100~200個の6マーが必要になりうる。6マーおよび5マープローブの既製のライブライーを使用するコンビナトリアルSBHの利点ゆえに、確立されたピペッティングロボティクスを使って、1プールにつき約200プローブを含む40のプローブプールが容易に調製される。生成する情報は、1エクソンあたり3つを上回るプローブを持つことに等しいので、1セットの1000遺伝子に要求される30000の長いエクソン特異的プローブが、8000の5マーおよび6マーの使用で効果的に置き換えられる。エクソンプロファイリング.エクソンのプロファイリングは、遺伝子同定段階およびエクソン同定段階という二段階で行うことができる。遺伝子同定段階では、アレイ上の各コンカテマーを、ある特定遺伝子とユニークに結びつけることができる。理論的には、以下のスキームを使えば、1000個の遺伝子を同定するのに、10のプローブプールまたはハイブリダイゼーションサイクルで十分だろう。各遺伝子にユニークな二進コードを割り当てる。したがって、二進数字の数は、8遺伝子の場合は3数字、1024遺伝子の場合は10数字というように、遺伝子の総数に依存する。各プローブプールは、二進コードの数字に対応するように設計され、1遺伝子につき1ヒットだけで、それらの遺伝子の半分のユニークな組み合わせをヒットするようなプローブを含有するだろう。したがって、各ハイブリダイゼーションサイクルにつき、遺伝子のユニークな半分は、その数字に関して1を記録し、残りの半分は0を記録するだろう。10個のプローブプールを使った10回のハイブリダイゼーションサイクルにより、アレイ上のコンカテマーの全てに1000のユニークな遺伝子を割り当てるのに十分な、1024のユニークな二進コードが生成する。同定データに冗長性を与えるために、15~20サイクルが使用されるだろう。20サイクルを使用した場合、100万のユニークな二進コードが得られ、失われたエクソンまたは遺伝子欠失によるシグナルの喪失を説明するのに十分な情報が存在するはずである。またこれは、平均で、各遺伝子につき10データポイントそれぞれ500データポイントの20サイクルは、合計10000データポイントをあたえるまたは1エクソンにつき1陽性プローブペアを持つことに等しくなるだろう。20サイクル後のこの時点で、このシステムは、アンプリオットampliotに100万のユニークな遺伝子アイデンティティを割り当てる能力を持つ。したがって、アンプリオットの遺伝子アイデンティティを数えることにより、与えられた任意の試料中の全ての遺伝子の発現レベルを定量的に決定することただしスプライス変異体のサブタイピングではないができる。各アンプリオットを遺伝子割当てと結びつけた後、エクソン同定段階では、そのエクソンパターンがプロファイリングされる。エクソン同定段階では、遺伝子の全てまたは大半において、1遺伝子につき1つのエクソンが、1回のハイブリダイゼーションサイクルで試験される。ほとんどの場合、10~20回のエクソン同定サイクルで十分なはずである。したがって、20回のエクソン同定サイクルの場合、各遺伝子中の10エクソンのそれぞれについて2プローブの情報が得られるだろう。20を超えるエクソンを持つ遺伝子の場合、1遺伝子につき2エクソンを同じサイクルでプローブすることができるような方法を開発することができる。一つの可能性は、色の異なる複数の蛍光体を使用することであり、もう一つの可能性は、異なるライゲーションプローブペアの差別的なハイブリッド安定性を利用することである。結論として、合計約40回のアッセイサイクルにより、各スポットにおける遺伝子アイデンティテイを取得し、10000エクソンのそれぞれについて、選択的スプライシングまたは染色体欠失による失われたエクソンの正確な同定をもたらすのに十分な情報冗長性で、3つのマッチングプローブペアを提供するのに十分な情報が与えられるだろう。ランダムアレイ支持体としてのガラスカバースリップ:誘導体化プロトコールこの実施例では、DNAコンカテマーを配置するための支持体として使用されるガラスカバースリップを製造する。以下の材料を使用する:MilliporeDI水25mLの3アミノプロピルジメチルエトキシシランGelest16グラムのpフェニレンジイソチオシアネートAcrosOrganicsfisher210グラムのKOHVWRエタノールVWRメタノールVWRピリジンVWRNNジメチルホルムアミドVWRアセトンVWR装置100c乾燥器磁気撹拌プレート2インチ×05インチ磁気撹拌子14リットルNuncビーカー24インチ×8インチ×4インチ硝子容器71リットルメスシリンダー100mLメスシリンダー1実験用天秤1Metzlerはかり1大秤量皿1小秤量皿1厚手ニトリル手袋1対大ロート1対1mLピペットマンフィルターチップ付きNalgene撹拌子1気密容器タッパーウェア1大メスシリンダーを使ってエタノール950mlを計量し、4リットルNuncビーカーに加える。小メスシリンダーでDI水50mlを計量し、同じnuncビーカーに入れる。KOHペレット210グラムを実験用天秤の秤量皿に秤取る。ビーカーに撹拌子およびKOHペレットを加える。ビーカーを撹拌プレートに置き、KOHが完全に溶解するまで低速で撹拌する。KOHを溶解している間に、予洗したガラス容器6個を配置する。容器2~5を上端から12インチまでDI水で満たす約800ml。容器6を上端から12インチまでアセトンで満たす。溶解したKOH溶液を容器1に上端から12インチまで注意深く注ぎ込む。ラックに収納したカバースリップを容器1に入れて3分間待ち、容器1からラックを取り出し、容器2~5で、それぞれの容器にラックを最低15秒間は放置することによって洗浄する。ラックを容器6に短時間沈める。ラックを取りのけておき、容器1および2の溶液を、塩基性廃液容器に、大ロートと厚手ニトリル手袋を使って捨て、実験器具を清掃し、乾燥する。清浄な乾燥ガラス容器7個を配置する。容器1にアセトン775mlを加える。容器1にDI水25mlを加える。容器1をピペットチップで20秒間撹拌する。新しいピペットチップを使って、3アミノプロピルジメチルエトキシシラン25mlを容器1に加える。ピペットチップを使って10秒間撹拌する。カバースリップのラック5個を全て、容器に浸漬する。容器1をポリプロピレン製のフタで覆う。45分間待つ。反応完了の15分前に、容器2~4をアセトンで上端から12インチまで満たし、容器5を水で上端から12インチまで満たす。容器6をアセトンで上端から12インチまで満たす。反応が完了45分間したら、カバースリップラック1~5を容器1から容器2に移し、15秒間待つ。これを容器6まで繰り返す。ラックを空の容器7に入れ、100c乾燥器に入れる。1時間待つ。ガラス容器7個を配置する。ラックを乾燥器から取り出した後、Meltzerはかりを使って、pフェニレンジイソチオシアネートPDC16グラムを小秤量皿に秤取る。洗浄した1リットルメスシリンダーにジメチルホルムアミド720mlを注ぎ込み、ピリジンで800mlまで満たす。この溶液を、清浄な硝子容器に50注ぎ込んだ後、それをシリンダーに戻すことによって混合する1回繰返す。この溶液で容器1を上端から12インチまで満たす。PDCを秤量皿から容器1に加える。撹拌子を使って容器を混合する。溶解しようとしないPDC塊を押し砕き、再び撹拌する。この時点でカバースリップラックはもう冷めているはずである。5つのラックすべてを容器1に入れる。ポリプロピレン製のフタで覆う。2時間待つ。反応完了の10分前に、容器2および3をメタノールで上端から12インチまで満たす。容器4および5をアセトンで上端から12インチまで満たす。容器6を65アセトン35水で上端から12インチまで満たす。容器7をアセトンで満たす。ラックを順次、全ての容器に移し、それぞれの移動の間、15秒間待つ。ラックを容器7から取り出し、容器1~7の内容物を、有機廃液槽に捨てる。ラックを容器7に移し、乾燥器で15分間乾燥する。乾燥したラックを気密容器に入れる。この時点で取付けの準備ができている。大腸菌ゲノムDNAからのRCR産物の調製およびガラスカバースリップへの配置大腸菌ゲノムDNA32μgSigmaChemicalCoをDnaseIEpicentre016Uを使って37°Cで10分間断片化した後、95°Cで10分間熱失活させた。アガロースゲル電気泳動で確認したところ、反応産物は平均サイズ200bpで分布していた。反応産物が所要のサイズ分布を満たさない場合は、新しい酵素を加えて、それらをさらに消化した。ゲノムDNAの最終濃度は200ngμlだった。Dnase消化したDNA26ngμlを、NewEnglandBiolabsNEBのターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ066Uμlと、NEBが供給する反応バッファー中で反応させた。この反応はdATP2mMを含有し、37°Cで30分間行った後、70°Cで10分間熱失活させた。次に、DNA試料を95°Cに5分間加熱してから、氷で急冷した。次に、まず、65塩基オリゴヌクレオチドTATCATCTACTGCACTGACCGGATGTTAGGAAGACAAAAGGAAGCTGAGGGTCACATTAACGGAC配列番号8と第2のオリゴヌクレオチドNNNNNNNGTCCGTTAATGTGAC323ddC配列番号9とのハイブリッドを65マーの3末端で形成させることこの際、7つのNはオーバーハングを形成するにより、ゲノムDNAの5末端に、合成DNAアダプターを連結した。短い方のオリゴは、ゲノムフラグメントの5末端に65マーを連結するためのスプリントとして役立つだろう。このスプリント分子は、その5末端が、ゲノムDNAの5末端にあるさまざまな塩基にハイブリダイズする7つの縮重塩基からなっている。1200pmolのアダプターを1200pmolのスプリントとを、52μl中、95°Cから室温まで1時間かけて、ゆっくりハイブリダイズさせることにより、アダプターハイブリッドを形成させた。T4DNAリガーゼ03Uμlを、ゲノムDNA17ngμlおよびアダプタースプリント05μMと、NEBが供給する1×リガーゼ反応バッファー中で混合した。ライゲーションを15°Cで30分間、20°Cで30分間進行させた後、70°Cで10分間失活させた。次に、第2のスプリント分子AGATGATATTTTTTTT323ddC配列番号1006μMを反応に加え、その混合物にリガーゼバッファーおよびT4DNAリガーゼ03Uμlを追加した。反応を15°Cで30分間、次に20°Cで30分間進行させてから、70°Cで10分間失活させた。次に、ライゲーション混合物を、エキソヌクレアーゼINEB1Uμlで、37°Cで60分間処理した後、80°Cで20分間失活させた。ローリングサークル複製は、NEBが供給する反応バッファー中、BSA01μgμl、02mM各dNTP、開始プライマーTCAGCTTCCTTTTGTCTTCCTAAC配列番号112fmolμl、エキソヌクレアーゼで処理したゲノムDNAのライゲーション24pgμl、およびφ29ポリメラーゼ02Uμlを使って行った。反応を30°Cで1時間行った後、70°Cで10分間熱失活させた。カバースリップの表面にまずアミン修飾オリゴヌクレオチドを取付けることにより、カバースリップの表面にRCR反応産物を取付けた。01μMNaHCO3中で捕捉プローブAMINOC6SPC18SPC18GGATGTTAGGAAGACAAAAGGAAGCTGAGG配列番号1250μMをDITC誘導体化カバースリップに加え、40°Cで約30分間乾燥させた。カバースリップをDDI水で15分間すすぎ、乾燥した。次に、RCR反応産物45μlを05μlの20×SSPEと混合し、スライドの中心に加えた。試料を風乾し、取付けられていない物質を3×SSPE中で10分間洗い落とした後、DDI水で短時間洗浄した。次に、スライドを乾燥してから、顕微鏡で組み立てた。取付けられたRCR産物を、アダプターの一領域に相補的な11マーTAMRA標識プローブをハイブリダイズさせることにより、可視化した。RCR反応産物を、一本鎖80マー合成DNAターゲットNNNNNNNNGCATANCACGANGTCATNATCGTNCAAACGTCAGTCCANGAATCNAGATCCACTTAGANTAAAAAAAAAAAA配列番号13から、上述のように、ただしTDTによるポリA付加を行わずに形成させた。このRCR反応は推定126fmolμlのターゲット分子を含有した。反応産物5μlを、20μlの総反応体積で、SSPE2×およびSDS03と混合した。01μMNaHCO3を使って50μMの溶液中で沈着させた捕捉プローブAMINOC6SPC18SPC18GGATGTTAGGAAGACAAAAGGAAGCTGAGGの列を表面上に乾燥させたカバースリップに、試料を適用して、湿潤チャンバ中に30分間放置した。次に、その溶液を3×SSPE中で10分間洗い落としてから、水中で短時間洗浄した。さまざまな反応構成要素を、それらがRCR産物形成に及ぼす影響について調べた。RCR反応にはφ29を02Uμlの最終濃度で加えるよりも、01Uμlの最終濃度で加えた方が、検出プローブハイブリダイゼーション後の強度が大きいRCR産物をより高い比率で生成することがわかった。開始プライマーは推定ターゲット濃度に対して10~100倍のモル比で添加することが最適であることもわかった。伸長時間を長くすると、より強い蛍光シグナルが得られるが、より発散したコンカテマーを生じる傾向があった。現在の取付けプロトコールでは、2時間の伸長時間により、RCR産物の形態への有害な影響を最小限に抑えつつ、1時間のインキュベーションと比較して強化されたシグナルが得られた。合成およびゲノムターゲットの推定濃度を、RCR反応中、01から025fmolμlに下げることによって、RCR産物のさらなる最適化が達成された。これは、典型的には、取付けに方法1を使用することにより、明確でユニークなPCR産物を、顕微鏡スライドの表面にもたらす。より高濃度のターゲット例えば>5fmolμlがRCR反応中に存在しうる合成ターゲットの場合は、RCR産物を方法2で取付けることができる。取付け方法1.RCR反応産物45μlを05μlの20×SSPEと混合し、スライドの中央に加えた。試料を風乾し、取付けられていない材料を3×SSPE中で10分間洗い落としてから、DDI水中で短時間洗浄した。次に、スライドを乾燥してから、顕微鏡上で組み立てた。取付けられたRCR産物を、アダプターの一領域に相補的な11マーTAMRA標識プローブをハイブリダイズさせることにより、可視化した。取付け方法2.RCR反応産物1μlを50μlの3×SSPEと混合し、捕捉プローブが取付けられているカバースリップの中央に加えた。SDS03を添加すると、誘導体化された表面にではなく、捕捉プローブへの特異的な取付けが促進されることがわかった。試料を室温で30分間インキュベートし、取付けられていない材料を、3×SSPE中で10分間洗い落とした後、DDI水中で短時間洗い落とした。次に、スライドを乾燥してから、顕微鏡上で組み立てた。取付けられたRCR産物を、アダプターの一領域に相補的な11マーTAMRA標識プローブをハイブリダイズさせることにより、可視化した。上記のプロトコールにより、2~4平方ミクロンあたり約1RCR産物というRCR産物密度が得られる。得られたカバースリップの代表的な画像を図3に示す。蛍光標識プローブを使ったRCR産物の識別炭疽菌Bacillusanthracisおよびペスト菌Yersiniapestisの診断領域に由来するPCR産物を一本鎖DNAに変換し、ユニバーサルアダプターに取付けた。次に、それら二つの試料を混合し、RCRを使って一緒に複製し、ガラス表面上にランダムアレイとして沈着させた。図4に図解するように、アンプリコン特異的プローブによる逐次的ハイブリダイゼーションにより、アレイ上の各スポットが上記二つの配列のどちらか一方にユニークに対応すること、およびそれらをそのプローブと特異的に結びつけうることが示された。この結果は、RCR反応によって生成する約100~1000コピーのDNAフラグメントを持つサブミクロンサイズのDNAコンカテマー中に存在するDNAを同定する際の感受性および特異性を示している。炭疽菌由来の155bpアンプリコン配列およびペスト菌由来の275bpアンプリコン配列を、プライマーペアのうち一方のプライマーをリン酸化したPCRプライマーを使って、標準的なPCR技術で増幅した。リン酸化された鎖をラムダエキソヌクレアーゼで分解することにより、一本鎖型のPCR産物を生成させた。次に、一本鎖産物をユニバーサルプアダプターに連結することができるように、T4DNAポリヌクレオチドキナーゼを使って、残った鎖の5末端をリン酸化した。ターゲットの5末端とユニバーサルアダプターの3末端とに相補的なテンプレートオリゴヌクレオチドの助けを借りて、ユニバーサルアダプターをターゲット分子の5末端に、T4DNAリガーゼを使って連結した。次に、アダプターを連結したターゲットを、アダプターとターゲットの3末端とに相補的な塩基を持つブリッジングオリゴヌクレオチドを使って環状化した。エキソヌクレアーゼIを使った処理により、線状DNA分子を除去した。一本鎖試料を混合し、ブリッジングオリゴヌクレオチドを開始プライマーとして、環状化したアダプターターゲット分子をφ29ポリマーゼで複製することにより、RCR産物DNAコンカテマーを生成させた。アミン修飾オリゴヌクレオチドの取付けに備えてカバースリップを準備するために、カバースリップをまずカリウムエタノール溶液中で洗浄した後、すすいで、乾燥した。次に、それらを3アミノプロピルジメチルエトキシシラン、アセトン、および水の溶液で45分間処理し、100°Cの乾燥器で1時間キュアした。最終ステップとして、カバースリップをpフェニレンジイソチオシアネートPDC、ピリジン、およびジメチルホルムアミドの溶液で、2時間処理した。捕捉オリゴヌクレオチド配列5GGATGTTAGGAAGACAAAAGGAAGCTGAGG3配列番号14はユニバーサルアダプター配列に相補的であり、5末端がアミン基および2つのC18リンカーで修飾される。取付けのために、01MNaHCO3中10μMの捕捉オリゴ10μlを、誘導体化したカバースリップの中央にスポットし、70°Cで10分間乾燥し、水ですすいだ。DNAコンカテマーのアレイを作るために、DNAコンカテマーを含有するRCR反応液を3×SSPEで10倍に希釈し、次に、そのうちの20μlを、カバースリープ表面上の固定化捕捉オリゴヌクレオチド全体に、水分飽和チャンバ中で30分間、沈着させた。次に、DNAコンカテマーを含むカバースリップを反応チャンバに組み入れ、2mLの3×SSPEですすいだ。炭疽菌およびペスト菌に由来するアレイ化ターゲットコンカテマー分子を、TAMRA標識オリゴマー:プローブBrPrb3配列:5CATTAACGGAC3配列番号15、ユニバーサルアダプター配列に特異的に相補的、プローブBa3配列:5TGAGCGATTCG3配列番号16、Ba3アンプリコン配列に特異的に相補的、プローブYp3配列:5GGTGTCATGGA3、Yp3アンプリコン配列に特異的に相補的で、順次プローブした。プローブは、室温の3×SSPE中、01μMの濃度で20分間、アレイにハイブリダイズさせた。過剰なプローブを2mlの3×SSPEで洗い落とした。画像をTIRF顕微鏡で撮影した。次に、1mlの3×SSPEを使って80°Cで5分間、プローブを剥がすことにより、次のハイブリダイゼーションに備えて、アレイ化ターゲット分子を準備した。図4に示すように、3つのプローブの逐次ハイブリダイゼーションから得えられる画像をオーバーレイすることにより、アダプタープローブとハイブリダイズしたアレイ化分子の大半は、アンプリコン1プローブ例えば図4のAまたはアンプリコン2プローブ例えば図4のBのどちらか一方にだけハイブリダイズし、両方にハイブリダイズするものは極めて少ないことがわかる。この特異的ハイブリダイゼーションパターンは、アレイ上の各スポットが1タイプの配列炭疽菌アンプリコンまたはペスト菌アンプリコンのどちらかだけを含有することを実証している。縮重塩基を含有する合成80マーオリゴヌクレオチドから作製されたアレイ化コンカテマーにおける塩基位置のデコーディング縮重塩基を含有する合成オリゴヌクレオチドの個々の分子は4つの部分集団に分割することができ、それぞれは、その特定位置に、A、C、GまたはT塩基を持ちうる。この合成DNAから作製されるコンカテマーのアレイは、スポットの約25が、それぞれの塩基を持ちうる。図5に示すように、それら4つの塩基に特異的なプローブペアの、4回にわたる連続的ハイブリダイゼーションおよびライゲーションにより、これらのコンカテマーの部分集団をうまく同定できるということを実証した。5リン酸化3TAMRA標識ペンタマーオリゴヌクレオチドを、4つのヘキサマーオリゴヌクレオチドの一つとペアにした。これら4つのライゲーションプローブペアのそれぞれは、A、C、GまたはT含有型ターゲットのいずれか一つにハイブリダイズするはずである。大半のターゲットについて3より高い識別スコアが得られたことから、ナノボールターゲット間の一塩基の相違を同定できることが実証された。識別スコアは、最も高いスポットスコアを、同じスポットの他の3つの塩基特異的シグナルの平均で割ったものである。アッセイ条件バッファー組成、全ての構成要素の濃度、サイクル中の各ステップの時間および温度を調節することにより、シグナル対バックグラウンドおよび完全マッチ対ミスマッチ比が高くなると期待される。これは、6マープローブのスポット型アレイで行った類似のライゲーションアッセイによって実証された。この場合、完全マッチバックグラウンド比は約50、平均完全マッ対ミスマッチ比は30だった。これらの結果はさらに、連続的プローブサイクルの数を増やすか、1サイクルにつき異なる色素で標識された4つ以上のプローブを使用することによって、コンカテマー中に存在するDNAの部分配列または完全配列を決定できることも実証している。合成オリゴヌクレオチドT1A:5NNNNNNNNGCATANCACGANGTCATNATCGTNCAAACGTCAGTCCANGAATCNAGATCCACTTAGANTAAAAAAAAAAAA3配列番号13は、位置32に縮重塩基を含有している。ユニバーサルアダプターをこのオリゴヌクレオチドに連結し、そのアダプターT1ADNAを、上述のように環状化した。このターゲットでのローリングサークル複製RCR反応を使って作製したDNAコンカテマーを、ランダムアレイ上にアレイした。このランダムアレイ上の各スポットは、一分子のT1Aに由来するタンデムに複製されたコピーに相当するので、アレイされた特定スポット中のDNAは、T1Aの位置32に対応する位置にA、またはC、またはG、またはTのいずれか一つを含有するだろう。これらの部分集団を同定するために、4つの塩基のそれぞれに特異的な4つのライゲーションプローブセットを使用した。CAAACという配列を持つ、T1Aの位置33~37に対応する5リン酸化3TAMRA標識ペンタマーオリゴヌクレオチドプローブT1A9bを、位置27~32に対応する以下のヘキサマーオリゴヌクレオチドの一つとペアにした:ACTGTAプローブT1A9a、ACTGTCプローブT1A10a、ACTGTGプローブT1A11a、ACTGTTプローブT1A12a。これら4つのライゲーションプローブペアのそれぞれは、A、C、GまたはT含有型T1Aのいずれか一つにハイブリダイズするはずである。各ハイブリダイゼーションサイクルについて、T4DNAリガーゼを含有するライゲーションハイブリダイゼーションバッファー中、20°Cで5分間、プローブをアレイと共にインキュベートした。過剰のプローブを20°Cで洗い落とし、TIRF顕微鏡で画像を撮影した。次のハイブリダイゼーションの準備をするために、結合しているプローブを剥がした。全てのスポットの位置を確定するためにアダプター特異的なプローブBrPrb3をアレイにハイブリダイズさせた。次に、上記4つのライゲーションプローブペアを、04μMで、アレイに順次ハイブリダイズさせることにより、図5に4つのスポットについて図示するように、塩基を同定した。スポットの大半が4つのライゲーションプローブペアの一つだけと関連づけられること、したがってT1Aの位置32にある塩基の性質を特異的に決定できることは、明らかである。合成80マーオリゴヌクレオチドの末端にある二つの縮重塩基のデコーディング上記の合成オリゴヌクレオチドは、ランダムなゲノムDNA末端を真似て、5末端に8個の縮重塩基を含有している。このオリゴヌクレオチドから作製されるコンカテマーは、アダプター配列のすぐ隣に置かれたこれら8つの縮重塩基を持ちうる。既知のアダプター配列に隣接する未知の2塩基を配列決定することが実行可能であることを実証するために、アダプターの3末端にハイブリダイズさせるための特異的配列を持つ12マーオリゴヌクレオチドUK012配列5ACATTAACGGAC3配列番号17をアンカーとして使用し、BBNNNNNNの形をした16個のTAMRA標識オリゴヌクレオチドを、配列読み取りプローブとして使用した。各ハイブリダイゼーションサイクルにつき、02μMのUK012アンカープローブおよび04μMのBBNNNNNNプローブを、T4DNAリガーゼを含有するライゲーションハイブリダイゼーションバッファー中、20°Cで10分間、アレイと共にインキュベートした。過剰のプローブを20°Cで洗い落とし、TIRF顕微鏡で画像を撮影した。次のハイブリダイゼーションの準備をするために、結合しているプローブを剥がした。BBNNNNNNプローブセットのサブセットすなわちBBの代りにGA、GC、GGおよびGTを使って、図6に示すように、これら4つのプローブの一つに特異的に結合するターゲットから作製されたコンカテマーアレイ上のスポットを、20を超える平均完全マッチミスマッチ比で、同定することができた。定義本明細書で使用する核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語は、その分野の標準的な専門書および教科書例えばKornbergおよびBakerDNAReplication第2版WHFreeman、ニューヨーク、1992;LehningerBiochemistry第2版WorthPublishers、ニューヨーク、1975;StrachanおよびReadHumanMolecularGenetics第2版WileyLiss、ニューヨーク、1999;Eckstein編OligonucleotidesandAnalogsAPracticalApproachOxfordUniversityPress、ニューヨーク、1991;Gait編OligonucleotideSynthesisAPracticalApproachIRLPress、オックスフォード、1984などのものに従う。アンプリコンは、ポリヌクレオチド増幅反応の産物を意味する。すなわち、これは、一つ以上の出発配列から複製されるポリヌクレオチド通常は二本鎖の集団である。一つ以上の出発配列は、同じ配列の一つ以上のコピーであってもよいし、異なる配列の混合物であってもよい。アンプリコンは、その産物が一つ以上のターゲット核酸の多数の複製物であるような種々の増幅反応によって生成されうる。一般に、アンプリコンを生成する増幅反応は、反応物ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの塩基対形成が、反応産物の生成に必要な相補鎖をテンプレートポリヌクレオチド中に持つという点で、テンプレート駆動型templatedrivenである。一態様として、テンプレート駆動型反応は、核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長、または核酸リガーゼによるオリゴヌクレオチドライゲーションである。そのような反応には、参照により本明細書に組み入れられる以下の文献に開示されているポリメラーゼ連鎖反応PCR、線形ポリメラーゼ反応、NASBANucleicAcidSequenceBasedAmplification、ローリングサークル増幅などがあるが、これらに限るわけではない:Mullisらの米国特許第4683195号;同第4965188号;同第4683202号;同第4800159号PCR;Gelfandらの米国特許第5210015号taqmanプローブを使ったリアルタイムPCR;Wittwerらの米国特許第6174670号;Kacianらの米国特許第5399491号NASBA;Lizardiの米国特許第5854033号;青野らの特開平4262799ローリングサークル増幅など。一態様として、本発明のアンプリコンは、PCRによって生成される。増幅反応の進行と同時に反応産物を検出することができるような検出ケミストリーを利用できるのであれば、増幅反応はリアルタイム増幅例えばLeoneらNucleicAcidsResearch2621502155などの参考文献に記述されている後述のリアルタイムPCRまたはリアルタイムNASBAであってもよい。本明細書において増幅するという用語は、増幅反応を行うことを意味する。反応混合物は、反応を実行するのに必要な反応物これには、例えば反応中にpHを選択したレベルに維持するための緩衝剤、塩類、補因子、補集剤などが含まれうるが、それらに限るわけではないを全て含有する溶液を意味する。相補的または実質上相補的とは、ヌクレオチド間または核酸間例えば、二本鎖DNA分子の二つの鎖の間、またはオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間などで起こるハイブリダイゼーションもしくは塩基対形成または二重鎖の形成を指す。相補的ヌクレオチドは、一般に、AとTもしくはAとUまたはCとGである。二つの一本鎖RNAまたはDNA分子は、適当なヌクレオチド挿入またはヌクレオチド欠失を加えて最適に整列して比較した時に、一方の鎖のヌクレオチドが他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約80、通常は少なくとも90~95、より好ましくは約98~100と対を形成するのであれば、実質上相補的であるという。あるいは、RNAまたはDNA鎖が選択的ハイブリダイゼーション条件下でその相補鎖にハイブリダイズする場合には、実質的相補性が存在する。典型的には、少なくとも14~25ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約65の相補性、好ましくは少なくとも約75、より好ましくは少なくとも約90の相補性がある場合に、選択的ハイブリダイゼーションが起こるだろう。参照により本明細書に組み入れられるMKanehisaNucleicAcidsRes12203を参照されたい。二重鎖は、完全にまたは部分的に相補的であって、WatsonCrick型の塩基対形成を起こして安定な複合体を形成する、少なくとも二つのオリゴヌクレオチドおよびまたはポリヌクレオチドを意味する。アニーリングおよびハイブリダイゼーションという用語は、安定な二重鎖の形成を表すために、可換的に使用される。二重鎖に関して完全にマッチしたとは、二重鎖を構成しているポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、各鎖中のすべてのヌクレオチドが他方の鎖中のヌクレオチドとWatsonCrick塩基対形成を起こすような形で、互いに二本鎖構造を形成することを意味する。二重鎖という用語は、使用しうるヌクレオシド類似体、例えばデオキシイノシン、2アミノプリン塩基を持つヌクレオシド、PNAなどの対形成を包含する。2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド間の二重鎖中のミスマッチとは、その二重鎖中の一対のヌクレオチドがWatsonCrick結合を起こせないことを意味する。ゲノムまたはターゲットポリヌクレクレオチドに関して遺伝子座または座とは、ゲノムまたはターゲットポリヌクレオチドの連続した小領域またはセグメントを意味する。本明細書にいう遺伝子座または座は、ミトコンドリアDNAを含むゲノムにおけるヌクレオチド、遺伝子、もしくは遺伝子の一部の位置を指すか、またはそれがある遺伝子内にあるかどうか、もしくはある遺伝子と関連するかどうかとはかかわりなく、ゲノム配列の任意の連続部分を指しうる。一態様として、遺伝子座は、ミトコンドリアDNAを含むゲノム配列の任意の部分単一のヌクレオチドから数百例えば100~300ヌクレオチド長のセグメントまでを指す。遺伝子変異体は、遺伝子座における一つ以上のヌクレオチドの置換、逆位、挿入、もしくは欠失、またはある遺伝子座から別の遺伝子座へのDNAの転座を意味する。一態様として、遺伝子変異体は、ある個体集団中に存在しうる、ある遺伝子座における選択的ヌクレオチド配列であって、その集団の他のメンバーと比較してヌクレオチド置換、挿入、および欠失を含むものを意味する。もう一つの態様として、ある遺伝子座における挿入または欠失は、もう一つの個体集団における同じ座と比較して、そのような座における1~10ヌクレオチドの付加または不在を含む。ハイブリダイゼーションは、二つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合的に結合して安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成する過程を指す。ハイブリダイゼーションという用語は、三本鎖ハイブリダイゼーションも指しうる。その結果生じる通常は二本鎖のポリヌクレオチドがハイブリッドまたは二重鎖である。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約1M未満の塩濃度、より一般的には約500mM未満、約200mM未満の塩濃度を含むだろう。ハイブリダイゼーションバッファーは、5×SSPEなどの緩衝塩溶液である。ハイブリダイゼーション温度は、5°Cという低温であってもよいが、典型的には22°Cより高く、さらに典型的には約30°Cより高く、好ましくは約37°Cを超える。ハイブリダイゼーションは、通常はストリンジェントな条件、すなわちプローブがそのターゲットサブ配列にハイブリダイズするような条件で行われる。ストリンジェントな条件は配列に依存し、状況が異なればストリンジェントな条件も異なる。長いフラグメントほど、特異的ハイブリダイゼーションには、高いハイブリダイゼーション温度を必要とする。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、ならびに塩基ミスマッチの程度などといった他の因子もハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼしうるので、いずれか一つのみの絶対値よりもパラメータの組み合わせの方が重要である。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびpHにおけるその具体的配列についてのTmを約5°C下回るように選択される。代表的なストリンジェント条件には、少なくとも001M~1M以下のNaイオン濃度または他の塩、pH70~83、および少なくとも25°Cの温度が含まれる。例えば、5×SSPE750mMNaCl、50mMリン酸Na、5mMEDTA、pH74および25~30°Cの温度という条件は、アレル特異的プローブハイブリダイゼーションに適している。ストリンジェントな条件については、例えばSambrookFritscheおよびManiatisMolecularCloningAlaboratoryManual第2版、ColdSpringHarborPressおよびAndersonNucleicAcidHybridization第1版、BIOSScientificPublishersLimitedを参照されたいこれらの参考文献は、上述のあらゆる目的に関して、その全てが、参照により本明細書に組み入れられる。特異的に~にハイブリダイズするまたは~に特異的にハイブリダイズするなどの表現は、あるヌクレオチド配列または配列群が複雑な例えば全細胞DNAまたはRNA混合物中に存在する場合に、ある分子が、ストリンジェントな条件下で、その特定ヌクレオチド配列または配列群に、実質的に、またはもっぱらそれだけに、結合、二重鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。ライゲーションは、テンプレート駆動型の反応において、二つ以上の核酸例えばオリゴヌクレオチドおよびまたはポリヌクレオチドの末端間に、共有結合を形成することを意味する。結合の性質は多種多様であることができ、ライゲーションは酵素的または化学的に行うことができる。本明細書にいうライゲーションは、通常は、酵素的に行われて、あるオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの5炭素と、もう一つのオリゴヌクレオチドの3炭素との間に、リン酸ジエステル結合を形成する。さまざまなテンプレート駆動型ライゲーション反応が、以下の参考文献に記述されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる:Whitelyらの米国特許第4883750号;Letsingerらの米国特許第5476930号;Fungらの米国特許第5593826号;Koolの米国特許第5426180号;Landegrenらの米国特許第5871921号;XuおよびKoolNucleicAcidsResearch27875881;HigginsらMethodsinEnzymology685071;EnglerらTheEnzymes15329;ならびにNamsaraevの米国特許出願公開第20040110213号。酵素的ライゲーションは、通常は、使用するそのリガーゼに必要な二価カチオン、補酵素などを全て含有する緩衝塩類溶液であるリガーゼバッファー中で行われる。マイクロアレイまたはアレイとは、核酸を含有する部位のアレイを保持する表面通常は平面状または実質的に平面状の表面を持つ固相支持体であって、アレイの各メンバー部位が、固定化されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの同一コピーを含み、空間的に明確であり、アレイの他のメンバー部位とはオーバーラップしないようになっているもの、すなわち、部位が空間的に不連続であるものを指す。場合によっては、マイクロアレイの部位は、不連続であるだけでなく、相隔てられていてもよい。すなわち、異なる部位は境界を共有するのではなく、通常は核酸が結合していない部位間領域によって、隔てられる。空間的に明確なハイブリダイゼーション部位はさらに、その位置およびその固定化オリゴヌクレオチドのアイデンティティが既知であるか、または例えばその使用前に、予め決定されるという点で、アドレス可能であってもよい。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが一本鎖であり、固相支持体に、通常は5末端または3末端によって共有結合される。別の態様では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、固相支持体に、例えばビオチンストレプトアビジン結合、共有結合された捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションなどによって、非共有結合的に取付けられる。従来のマイクロアレイ技術は、以下の参考文献に概説されている:Schena編MicroarraysAPracticalApproachIRLPress、オックスフォード、2000;SouthernCurrentOpinChemBiol2404410;NatureGeneticsSupplement21160。本明細書にいうランダムアレイまたはランダムマイクロアレイは、空間的にアドレスされない空間的に不連続なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの領域を持つマイクロアレイを指す。すなわち、取付けられたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのアイデンティティは、少なくとも最初はその位置から識別することができないが、アレイ上で特定の作業例えば配列決定、デコーディングプローブのハイブリダイゼーションなどを行うことによって決定することができる。ランダムマイクロアレイは、しばしば、マイクロビーズの平面的アレイから形成される例えばBrennerらNatureBiotechnology18630634;Tulleyらの米国特許第6133043号;Stuelpnagelらの米国特許第6396995号;Cheeらの米国特許第6544732号など。ミスマッチは、WatsonCrick塩基対GCおよびAT以外の、塩基A、TまたはRNAの場合はU、G、およびCの任意の二つの間の塩基対を意味する。考えうる8つのミスマッチは、AA、TT、GG、CC、TG、CA、TC、およびAGである。突然変異および多形は、ヌクレオチド配列が基準DNA配列または野生型配列または正常組織配列とは一つ以上の塩基の挿入およびまたは欠失によって異なっているDNA分子例えば遺伝子を表すために、通常はある程度可換的に用いられる。文脈によっては、突然変異が、ある生物にとって病的であるかどうかとはかかわりなく、任意の塩基変化であると理解されるのに対して、多形は、通常、直接的な病理学的帰結を伴わない塩基変化であると理解されるという点で、CottonMutationDetectionOxfordUniversityPress、オックスフォード、1997の用法に従う。本明細書にいうヌクレオシドには、2デオキシ型および2ヒドロキシル型を含む天然ヌクレオシド、例えばKornbergおよびBakerDNAReplication第2版Freeman、サンフランシスコ、1992に記述されているものが包含される。ヌクレオシドに関して、類似体には、例えばScheitNucleotideAnalogsJohnWiley、ニューヨーク、1980;UhlmanおよびPeymanChemicalReviews90543584などに記述されている修飾塩基部分およびまたは修飾糖部分を持つ合成ヌクレオシドが含まれる。ただし、それらは、特異的ハイブリダイゼーションが可能であるものとする。そのような類似体には、結合特性を強化する、複雑度を下げる、特異性を増加させるなどの目的で設計された合成ヌクレオシドが含まれる。強化されたハイブリダイゼーション特性またはヌクレアーゼ耐性を持つ類似体を含むポリヌクレオチドは、UhlmanおよびPeyman前掲;CrookeらExpOpinTherPatents6855870;MesmaekerらCurrentOpinioninStructualBiology5343355などに記述されている。二重鎖安定性を強化する能力を持つポリヌクレオチドの代表的タイプには、オリゴヌクレオチドN3→P5ホスホロアミデート本明細書ではアミデートという、ペプチド核酸本明細書ではPNAという、オリゴ2Oアルキルリボヌクレオチド、C5プロピニルピリミジンを含有するポリヌクレオチド、ロックト核酸LNAなどの化合物が含まれる。そのようなオリゴヌクレオチドは市販されているか、あるいは文献記載の方法を使って合成することができる。ポリメラーゼ連鎖反応またはPCRは、DNAの相補鎖の同時プライマー伸長によって特定のDNA配列をインビトロ増幅するための反応を意味する。言い換えると、PCRは、プライマー結合部位に挟まれたターゲット核酸のコピーまたは複製物を数多く作製するための反応であって、以下に挙げるステップの一回以上の繰返しを含む:iターゲット核酸を変性するステップ、iiプライマー結合部位にプライマーをアニールさせるステップ、およびiiiヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによってプライマーを伸長するステップ。通例、反応は、サーマルサイクラー装置中で、各ステップに最適化された異なる温度を循環する。具体的温度、各ステップにおける継続時間、ステップ間の変化速度は、例えば次に挙げる文献からもわかるように、当業者によく知られる多くの因子に依存する:McPhersonら編PCRAPracticalApproachおよびPCR2APracticalApproachIRLPress、オックスフォード、それぞれ1991および1995。例えば、TaqDNAポリメラーゼを使用する通常のPCRでは、二本鎖ターゲット核酸を>90°Cの温度で変性し、50~75°Cの範囲の温度でプライマーをアニールさせ、72~78°Cの範囲の温度でプライマーを伸長することができる。PCRという用語は、例えば、限定するわけではないが、RTPCR、リアルタイムPCR、ネステッドPCR、定量PCR、マルチプレックスPCRなどといった、派生形の反応も包含する。反応液量は数百ナノリットル例えば200nLから数百μL例えば200μLまでの範囲にわたる。逆転写PCRまたはRTPCRは、ターゲットRNAを相補一本鎖DNAに変換する逆転写反応が先行して行われた後、増幅が行われるPCRである例えばTecottらの米国特許第5168038号、この特許は参照により本明細書に組み入れられる。リアルタイムPCRは、反応の進行と同時に反応産物すなわちアンプリコンの量がモニターされるPCRである。リアルタイムPCRには多くの形態があり、それらは主として、反応産物のモニタリングに使用される検出ケミストリーが異なる例えばGelfandらの米国特許第5210015号taqman;Wittwerらの米国特許第6174670号および同第6569627号インターカレーティング色素;Tyagiらの米国特許第5925517号分子ビーコン;これらの特許は参照により本明細書に組み入れられる。リアルタイムPCR用の検出ケミストリーは、MackayらNucleicAcidsResearch3012921305に概説されており、この参考文献も参照により本明細書に組み入れられる。ネステッドPCRは、第1PCRのアンプリコンが、新しいプライマーセットそのうち少なくとも一方は最初のアンプリコンの内部位置に結合するものを用いる第2PCR用の試料になるという、二段階PCRを意味する。ネステッド増幅反応に関して本明細書にいう初期プライマーとは、第1アンプリコンを生成させるために使用するプライマーを意味し、二次プライマーとは、第2またはネステッドアンプリコンを生成させるために使用する一つ以上のプライマーを意味する。マルチプレックスPCRは、複数のターゲット配列または単一のターゲット配列と一つ以上の基準配列が同じ反応混合物中で同時に行われるPCRを意味する例えばBernardらAnalBiochem273221228二色リアルタイムPCR。通常は、増幅される各配列ごとに、異なるプライマーセットを使用する。定量PCRは、試料または標本における一つ以上の特定ターゲット配列の存在量を測定するために設計されたPCRを意味する。定量PCRには、そのようなターゲット配列の絶対的定量と相対的定量の両方が含まれる。定量的測定は、一つ以上の基準配列を使ってなされ、その基準配列はターゲット配列とは別個に、またはターゲット配列と一緒に、アッセイされうる。基準配列は、試料または標本にとって内在性または外因性であることができ、後者の場合は一つ以上の競合的テンプレートを含みうる。典型的な内在性基準配列には、以下に挙げる遺伝子の転写物のセグメントがある:βアクチン、GAPDH、β2ミクログロブリン、リボソームRNAなど。定量PCRの技法は、以下に挙げる参考文献これらは参照により本明細書に組み入れられるに例示されるように、当業者には周知である:FreemanらBiotechniques26112126;BeckerAndreらNucleicAcidsResearch1794379447;ZimmermanらBiotechniques21268279;DiviaccoらGene12230133020;BeckerAndreらNucleicAcidsResearch1794379446など。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは可換的に用いられ、それぞれに、ヌクレオチドモノマーの線状ポリマーを意味する。本明細書で使用するこれらの用語は二本鎖型も指しうる。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、モノマー間相互作用の規則的パターン例えばWatsonCrick型の塩基対形成、塩基スタッキング、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の塩基対形成などを介して天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することにより、二重鎖型または三重鎖型を形成する能力を持つ。そのようなモノマーおよびそれらのヌクレオシド間結合は天然の結合であってよいし、その類似体例えば天然類似体または非天然類似体であってもよい。非天然類似体として、例えばPNA、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、蛍光体またはハプテンなどのラベルの取付けを可能にする連結基を含有する塩基を挙げることができる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が、酵素的処理、例えばポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーションなどを必要とする場合はいつでも、そのような場合のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、どの位置にも、または一部の位置には、ヌクレオシド間結合、糖部分、または塩基の一定の類似体を、そのような類似体が酵素反応に適合しない場合に、含有しないことは、当業者には理解されるだろう。ポリヌクレオチドは典型的には、数モノマー単位例えば5~40、この場合、それらは通常、オリゴヌクレオチドと呼ばれるから、数千モノマー単位までのサイズを持つ。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが文字大文字または小文字の配列例えばATGCCTGなどによって表される場合はいつでも、別段の表示がない限り、または文脈から明らかでない限り、ヌクレオチドは左から右に向かって5→3の順であること、そしてまた、Aがデオキシアデノシンを表し、Cがデオキシシチジンを表し、Gがデオキシグアノシンを表し、Tがチミジンを表し、Iがデオキシイノシンを表し、Uがウリジンを表すことは言うまでもない。別段の注記がない限り、用語法および原子番号付け規約は、StrachanおよびReadHumanMolecularGenetics2WileyLiss、ニューヨーク、1999に開示されているものに従う。通常、ポリヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合によって連結された4つの天然ヌクレオシド例えば、DNAの場合はデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、RNAの場合はそのリボース相当物を含む。しかしそれらは、非天然ヌクレオチド類似体例えば修飾された塩基、糖、またはヌクレオシド間結合を含むものを含んでもよい。酵素が、その活性にとって、例えば一本鎖DNA、RNADNA二重鎖など、特定のオリゴヌクレオチド基質またはポリヌクレオチド基質要求性を持つことは、当業者には明白であるので、オリゴヌクレオチド基質またはポリヌクレオチド基質に関して適当な組成を選択することは、とりわけ専門書、例えばSambrookらMolecularCloning第2版ColdSpringHarborLaboratory、ニューヨーク、1989などの参考文献の手引きがあれば、当業者の知識で十分に対応することができる。プライマーは、ポリヌクレオチドテンプレートとの二重鎖を形成したときに、核酸合成の開始点としての役割を果たし、伸長された二重鎖が形成されるようにその3末端からテンプレートに沿って伸長される能力を持つ、天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。伸長過程で付加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはDNAポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、9~40ヌクレオチドの範囲、または場合によって14~36ヌクレオチドの範囲の長さを持つ。リードアウトreadoutは、測定およびまたは検出される一つまたは複数のパラメータであって、数字または値に変換することができるものを意味する。文脈により、リードアウトは、収集または記録されたそのようなデータの実際の数値表現を指しうる。例えば、マイクロアレイからの蛍光強度シグナルのリードアウトは、マイクロアレイの各ハイブリダイゼーション部位で生じるシグナルの位置および蛍光強度である。したがってそのようなリードアウトは、さまざまな方法で、例えばマイクロアレイの画像、数表などとして、記録または保存することができる。固形支持体支持体および固相支持体は可換的に使用され、剛体または半剛体表面を一つまたは複数持つ材料または材料群を指す。多くの実施形態では、固形支持体の少なくとも一つの表面が実質的に平坦であるだろうが、一部の実施形態では、異なる化合物のための合成領域を、例えばウェル、隆起領域、ピン、エッチングされたトレンチなどによって、物理的に分離することが望ましいこともあるだろう。他の実施形態によれば、固形支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェア、または他の幾何学的構成をとるだろう。マイクロアレイは通常、少なくとも一つの平面的固相支持体、例えばガラス製顕微鏡スライドなどを含む。DNAの基準配列または基準集団とは、基準DNA集団と試験DNA集団の相補鎖間で起こるヘテロ二重鎖の形成によって、DNAまたはRNAの試験集団または試験DNA配列もしくは試験DNA集団と比較される、個々のDNA配列またはDNAまたはそこから誘導されるRNAの収集物を指す。完全にマッチしたヘテロ二重鎖が形成される場合は、基準集団と試験集団の各メンバーは同一であり、そうでない場合、それらは互いの変異体である。典型的には、基準集団のメンバーのヌクレオチド配列は既知であり、その配列は、典型的には、Genbank、Emblなどの配列データベースに記載されている。一態様として、DNAの基準集団は、既知細胞タイプまたは組織ソース由来のcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを含みうる。例えば、DNAの基準集団は、健常個体の組織に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを含み、DNAの試験集団は、罹患個体の同じ組織に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを含みうる。DNAの基準集団は、個々のポリヌクレオチド、cDNA、遺伝子またはそのエクソンを組み合わせた収集物、例えば既知p53変異体の全てまたはサブセットをコードする遺伝子またはエクソン、シグナル伝達経路の遺伝子を含んでもよい。ある分子の、もう一つの分子への結合例えばプローブに対する標識ターゲット配列の結合に関して特異的または特異性とは、それら二分子の間の認識、接触、および安定な複合体の形成と、それに加えて、その分子の他の分子との認識、接触、または複合体形成が実質的に少ないこととを意味する。一態様として、第2分子に対する第1分子の結合に関して特異的とは、第1分子が、ある反応または試料中の別の分子を認識し、その分子と複合体を形成する限りにおいて、それが第2分子との複合体を最も多数形成することを意味する。好ましくは、この最も多数とは、少なくとも50パーセントである。一般に、特異的結合事象に関与する分子は、その表面上または空洞中に、互いに結合する分子間の特異的認識をもたらす部分を持つ。特異的結合の例には、抗体抗原相互作用、酵素基質相互作用、ポリヌクレオチドおよびまたはオリゴヌクレオチド間の二重鎖または三重鎖の形成、受容体リガンド相互作用などがある。特異性または特異的結合に関して本明細書にいう接触とは、例えばファンデルワールス力、水素結合、塩基スタッキング相互作用、イオン相互作用および疎水相互作用などの弱い非共有結合的化学相互作用がそれらの分子の相互作用を支配するのに十分なほど二つの分子が近くにあることを意味する。本明細書で使用するTmという用語は融解温度に関して用いられる。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離した状態になる温度である。当技術分野では核酸のTmを算出するための等式がいくつかよく知られている。標準的な参考文献に示されているように、核酸が1MNaClの水性溶液中にある場合、Tm値の簡単な推定値は、式:Tm=815041GCによって算出されうる例えばAndersonおよびYoungQuantitativeFilterHybridizationinNucelicAcidHybridizationを参照されたい。他の参考文献例えばAllawiHTおよびSantaLuciaJJrBiochemistry361058194には、配列特徴だけでなく構造特徴および環境特徴を考慮してTmを算出する代替計算方法が記載されている。試料は、通常、生物学的ソース、環境ソース、医学的ソース、または患者ソースから得られたある量の材料であって、ターゲット核酸の検出、測定、または標識が求められるものを意味する。一方において、これは、標本または培養物例えば微生物学的培養物を包含するものとする。他方において、これは、生物学的試料および環境試料をどちらも包含するものとする。試料は、合成起源の標本を含みうる。生物学的試料は、動物ヒトを含むの体液、固形物例えば糞便または組織、ならびに液状および固形の食品および飼料製品および成分、例えば乳製品、野菜、肉および肉副産物、および廃棄物でありうる。生物学的試料は、患者から採取された材料、例えば限定するわけではないが、培養物、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、乳汁、リンパ液、喀痰、精液、針吸引物などを含みうる。生物学的試料は、さまざまな科の家畜、ならびに野生動物、例えば限定するわけではないが、有蹄類、熊、魚、齧歯類などの動物の全てから得ることができる。環境試料は、表層物質、土壌、水および産業試料などの環境材料、ならびに食品および乳製品を加工するための設備、器具、装置、用具、使い捨て品および非使い捨て品を含みうる。これらの例が本発明に適用可能な試料タイプを限定するとみなしてはならない。上記の教示内容は、本発明を例示するためのものであって、本発明の請求項の範囲がそれらの詳細によって限定されることはない。本発明の好ましい例示的実施形態を記述したが、そこに本発明から逸脱することなくさまざまな改変および変更を加えうることは当業者には明白であり、本発明の真の趣旨および範囲に含まれるそのような改変および変更は全て、本願請求項に包含されるものとする。