自然免疫応答を促進するのに使用するための細菌ゴースト。細菌ゴーストの表面が、フラジェリンモノマーを含まない、請求項1に記載の細菌ゴースト。細菌ゴーストの表面が、フラジェリンを含まない、請求項1又は2に記載の細菌ゴースト。自然免疫応答が、少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び又は放出の誘導により促進される、請求項1から3のいずれかに記載の細菌ゴースト。少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び又は放出が、上皮細胞において誘導される、請求項4に記載の細菌ゴースト。上皮細胞がケラチノサイトである、請求項5に記載の細菌ゴースト。少なくとも1種の自然免疫調節物質が、抗菌防御分子、炎症性サイトカイン、活性窒素種及び活性酸素種からなる群から選択される、請求項4から6のいずれかに記載の細菌ゴースト。少なくとも1種の抗菌防御分子の発現が増強される、請求項4から7のいずれかに記載の細菌ゴースト。少なくとも1種の抗菌防御分子が、ソリアシン及びヒトβデフェンシン2からなる群から選択される、請求項8に記載の細菌ゴースト。少なくとも1種の炎症性サイトカインの発現及び又は放出が増強される、請求項4から9のいずれかに記載の細菌ゴースト。少なくとも1種の炎症性サイトカインが、インターロイキン6及びインターロイキン8からなる群から選択される、請求項10に記載の細菌ゴースト。少なくとも1種の活性窒素種の放出が増強される、請求項4から11のいずれかに記載の細菌ゴースト。活性窒素種がNOである、請求項12に記載の細菌ゴースト。自然免疫応答が、哺乳類、好ましくはヒトにおいて促進される、請求項1から13のいずれかに記載の細菌ゴースト。更なる活性剤と組み合わせて投与される、請求項1から14のいずれかに記載の細菌ゴースト。薬物がレスベラトロールである、請求項15に記載の細菌ゴースト。非病原性グラム陰性細菌に由来する、好ましくは大腸菌株に由来する、請求項1から16のいずれかに記載の細菌ゴースト。大腸菌株が、大腸菌Nissle1917である、請求項17に記載の細菌ゴースト。皮膚及び又は粘膜に投与される、請求項1から18のいずれかに記載の細菌ゴースト。経口、局所、粘膜、肺及び又は経鼻投与される、請求項1から19のいずれかに記載の細菌ゴースト。免疫系が不全の個体に投与される、請求項1から20のいずれかに記載の細菌ゴースト。自然免疫応答を促進する方法であって、有効量の細菌ゴーストを、それを必要とする患者、特にヒト患者に投与する方法。自然免疫応答を促進するための細菌ゴーストの使用。本発明の目的は、自然免疫防御系、特に皮膚の自然免疫防御系を増強することである。従って、自然免疫調節物質の発現を刺激するべきである。従って、一態様において、本発明は、自然免疫応答を促進するための細菌ゴーストの使用に関する。本発明によれば、驚くべきことに、KCによって細菌ゴーストの外被構造が認識され、自然免疫応答を促進することが判明した。特に、自然免疫応答が、天然又はほぼ天然の外被構造を有する細菌ゴーストにより促進され得ることが判明した。BGは、細胞質内容物を欠く、細菌、特にグラム陰性細菌由来の非生細胞外被標本である。BGは、例えば、細菌におけるプラスミドにコードされた溶菌遺伝子の制御された発現により、例えば、グラム陰性細菌におけるプラスミドにコードされたバクテリオファージψΧ174の溶菌遺伝子Eの発現により産生することができる。遺伝子Eは、内膜及び外膜を融合してE特異的溶解トンネルを形成することができる膜タンパク質をコードし、全細胞質内容物はE特異的溶解トンネルを通して排出される。生存していない細菌外被であるBGは、天然の細菌の完全な細胞形態を維持する。外膜タンパク質、アドヘシン、リポ多糖及びペプチドグリカンを含むあらゆる細胞表面構造は、BGに保存されている。BGが獲得免疫系を刺激できることが以前に示された。特に、BGは、それ自体の外被構造に対する免疫化のために用いても、外来標的抗原の抗原送達系として用いてもよい。コレラ菌ゴーストによる免疫化は、ウサギ動物モデルにおいて、完全に病原性のあるコレラ菌に曝露した後の下痢及び死亡から保護する、或いは、大腸菌BG表面におけるB型肝炎ウイルスのコア抗原の取り込みは、マウスにおける該コア抗原に対する有意な免疫応答を生じる。BGは、ドキソルビシン等の活性物質の送達媒体として又はDNAや酵素の担体として用いてもよい。本発明において、細菌ゴーストは、自然免疫防御系、特に皮膚の自然免疫防御系を増強することも判明した。従って、細菌ゴーストを、自然免疫応答を促進するのに使用した。本発明の好ましい実施形態において、細菌ゴーストの表面は、フラジェリンモノマーを含まない。別の好ましい実施形態において、細菌ゴーストの表面は、フラジェリンを含まない。フラジェリンは、重合して細菌鞭毛のフィラメントを形成する約30000~60000ダルトンのタンパク質である。タンパク質フラジェリンは、細菌鞭毛の主要置換成分であり、殆ど全ての鞭毛細菌に大量に存在する。哺乳類において、獲得免疫応答、即ちT細胞応答及び抗体応答は、鞭毛抗原に対して、従って鞭毛細菌に対してよく産生される。これは恐らく、フラジェリンが鞭毛細菌において非常に豊富なタンパク質であり、更には、フラジェリンを認識する特異的自然免疫受容体、TLR5が存在するという事実によるものであろう。表面にフラジェリンを含まない細菌ゴーストは、フラジェリンを発現することができない細菌株、例えばフラジェリン欠失変異体に由来し得る。或いは、前記細菌ゴーストは、フラジェリンを細胞表面に輸送することのできない細菌株に由来し得る。表面にフラジェリンを含まない細菌ゴーストを得るため、本技術分野において公知の任意の適切な遺伝子工学的方法を用いてよい。例えば、フラジェリンタンパク質をコードする遺伝子の欠失は、フラジェリン欠失変異体を生じる。或いは、フラジェリンの発現は、本技術分野において公知の任意の適切な方法により、例えば、RNAiを用いて抑制することができる。更に、フラジェリンタンパク質をコードする遺伝子に突然変異、例えば、未成熟終止コドンを導入して切断型タンパク質を発現させてもよい。フラジェリン遺伝子の発現制御配列の欠失及び又は突然変異も機能喪失型遺伝子を生じ、よって、フラジェリンを発現できない細菌株を生じることができる。フラジェリンを細胞表面に輸送できない変異体細菌株は、例えば、個々のフラジェリン遺伝子配列の欠失及び又は突然変異によって得ることもできる。前記技法は、当業者によく知られている。フラジェリンが、自然免疫応答及び獲得免疫応答両方の刺激に重要な細菌成分であることを理解すると、フラジェリンを欠くBGも自然免疫応答の促進に効果的であることは、より一層驚くべきことであった。自然免疫応答は、好ましくは、少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び又は放出の誘導により促進される。免疫調節物質は、例えば免疫強化において、免疫抑制において又は免疫寛容誘導において、免疫応答を所望のレベルへ調整するのに関与する。本発明によれば、免疫強化、即ち、免疫応答の増強が望ましい。免疫応答は、その発生のスピード及び程度を増加させること並びにその持続期間を延長させることにより増強され得る。自然免疫調節物質は、自然免疫応答に関与する、上に定義する免疫調節物質である。自然免疫調節物質の例として、炎症性サイトカイン、活性窒素種及び活性酸素種が挙げられる。本発明によれば、抗菌防御分子、炎症性サイトカイン、活性窒素種及び活性酸素種からなる群から選択される少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び又は放出が誘導されることが好ましい。抗菌ペプチド又は宿主防御ペプチドとしても知られる抗菌防御分子は、強力な広域抗生物質である。前記分子は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌、マイコバクテリア、外被を有するウイルス、真菌並びに更にはトランスフォーム細胞又は癌性細胞を死滅させることが立証された。従来の抗生物質の大多数とは異なり、抗菌ペプチドは、免疫調節物質として機能することにより免疫を増強させる能力をも有し得る。抗菌防御分子の例として、ソリアシン及びヒトβデフェンシン2が挙げられる。本発明によれば、ソリアシン及びヒトβデフェンシン2からなる群から選択される少なくとも1種の抗菌防御分子の発現が増強される。炎症性サイトカインは、全身性炎症を促進するサイトカインである。炎症性サイトカインの例として、TNFアルファ、インターロイキン1、インターロイキン6及びインターロイキン8が挙げられる。本発明によれば、インターロイキン6及びインターロイキン8からなる群から選択される少なくとも1種の炎症性サイトカインの発現及び又は放出が増強される。活性窒素種は、それぞれ誘導型一酸化窒素合成酵素及びNADPHオキシダーゼの酵素活性により産生された一酸化窒素及びスーパーオキシドに由来する抗菌分子のファミリーである。iNOSは、サイトカイン及び微生物生成物、特にインターフェロンガンマ及びリポ多糖による誘導後に、主にマクロファージにおいて発現される。しかし、一酸化窒素の生成は、貪食細胞だけの特色という訳ではない。免疫反応に関与する他の細胞、例えば上皮細胞又はケラチノサイトも、これらのラジカルを産生することができる907~16頁Bogdan、C、2000ImmunolRev17317~26頁Bogdanら、2000CurrOpinImmunol1264~76頁。NOは、およそ6秒の急速な半減期を有する多義的な内在性の役割を示す多用途分子であることが示された252~9頁。これは一方では、様々な細胞機能の重大なメディエーター分子を表すが、酸化的バースト条件下等、過剰量が産生されると、細胞傷害性及び変異原性作用を生じ得る252~9頁。NOは抗菌剤として作用するため、これは、サルモネラ菌、トリパノソーマムスクリ、結核菌、レジオネラニューモフィラ又は森林型熱帯リーシュマニア等、細胞内病原体と戦うために絶対に必要である621~7頁Summersgillら、1992JLeukocBiol52625~9頁。高反応性NOは、多くの疾患の病態生理に関与する。しかし、様々なエフェクター及び免疫調節機能、例えば、抗菌、抗腫瘍及びアポトーシス活性、或いはそのサイトカイン及びT細胞分化の調節特性のため、NOは、免疫系において重要な役割を果たす。低濃度のNOは、特定の細菌病原体に対する抗菌活性に寄与するが、高濃度では、炎症及び発癌における役割を果たすことが判明した。実際には、構成的に発現される神経細胞NOS及び内皮NOS、並びに誘導型アイソフォームとして知られる、3種の主要な一酸化窒素合成酵素アイソフォームが存在する。後者は、マクロファージ及びケラチノサイトにおけるNO産生に関与する。3種のNOSは全て、1分子のLアルギニンのグアニジン窒素を酸化して酸化型中間体とし、1分子のNO及びLシトルリンを生じる907~16頁Bogdan、C、2000ImmunolRev17317~26頁Bogdanら、2000CurrOpinImmunol1264~76頁Sharmaら、2007Inflammopharmacology15252~9頁。細菌のリポ多糖は、iNOS誘導に最も重要な刺激の一つである。保存された細菌成分のマクロファージセンサーは、その主要アゴニストLPSの結合により自然免疫系を誘発することができるTLR4によって表される352~63頁。NFカッパーb等の転写因子の結合部位は、iNOS遺伝子のプロモーター領域に存在する。マクロファージをLPSに曝露してそれを活性化すると、発現が増強される64~76頁。本発明によれば、少なくとも1種の活性窒素種、例えばNOの放出が増強される。活性酸素種は、酸素原子を含有するフリーラジカルである。これは、不対原子価殻電子が存在するため高反応性である。ROSは、正常な酸素代謝の天然副産物として発生し、細胞シグナル伝達において重要な役割を有する。しかし、環境ストレスを受けるとROSレベルは劇的に増加して、細胞構造に有意な損傷を生じ得る。これが積み重なり、酸化ストレスとして知られる状況となる。本発明によれば、少なくとも1種の活性酸素種の放出が増強される。活性窒素種は、活性酸素種と共働して細胞に損傷を与え、ニトロソ化ストレスを生じる。従って、これら2種はしばしばROSRNSと総称される。本発明の別の好ましい実施形態において、更なる活性剤、例えば、薬物及び又は他の生物学的物質を、細菌ゴーストと組み合わせて投与することができる。活性剤が細菌ゴーストに実質的に取り込まれるよう、前記活性剤を細菌ゴーストに添加することができる。或いは、活性剤は、単に細菌ゴーストの近傍に存在する。活性剤は、免疫調節物質、即ち、免疫系の増強に適した薬物及び又は物質、特に、自然免疫系、獲得免疫系又はその両方における効果を呈する薬物及び又は物質となり得る。或いは、前記活性剤は、その他のプロドラッグ又は薬物となり得る。当業者であれば、種々の適切なプロドラッグ及び薬物を理解している。細菌ゴーストと共に用いるための特定の活性剤は、患者の自然免疫系を刺激するため、細菌ゴーストを投与される患者の特異的な状況を考慮しつつ決定されるであろう。活性剤は、ポリフェノール、例えばレスベラトロール等の抗酸化剤であってもよい。レスベラトロールは、広範囲の免疫調節活性を示す、様々な植物種、特にブドウ、ピーナッツ及び液果類の皮に存在するトランス又はシス異性体型のいずれかで自然発生するポリフェノール化合物である。多くの研究が、レスベラトロールに様々な生物における抗癌、抗酸化及び心臓保護特性並びに寿命延長を割り振った2783~840頁Gaoら、2003BiochemPharmacol662427~35頁Falchettiら、2001LifeSci7081~96頁Saikoら、2008MutatRes65868~94頁。更に、レスベラトロールは、動物及びヒトの種々の感染症の治療において高い治療可能性を保有する。その活性は、皮膚糸状菌99~104頁及びウイルス様単純ヘルペス242~51頁に対し立証された。レスベラトロールの増殖阻害効果は、急性気道感染の原因となる細胞内肺炎クラミジア等、広範な細菌種に対し実証された99~104頁Schrieverら、2003Atherosclerosis171379~80頁。更に、レスベラトロールにより、魚類の疾患の原因となる原生動物種の感染力減少が達成され171~4頁Leiroら、2004AntimicrobAgentsChemother482497~501頁、ごく最近では、皮膚リーシュマニア症の原因である細胞内皮膚病原体森林型熱帯リーシュマニアの排除が立証された91~7頁Kedzierskiら、2009CurrMedChem16599~614頁。本発明に従って用いられる細菌ゴーストは、種々の細菌に由来し得る。好ましくは、細菌ゴーストは、非病原性グラム陰性細菌、より好ましくは大腸菌株に由来する。いかなる大腸菌株を用いてもよい。適切な大腸菌株の一例は、大腸菌Nissle1917である。上に概略する通り、皮膚等の表面障壁は、感染に対する第一の防御ラインである機械的障壁の例である。更に、皮膚及び気道は、抗菌ペプチド、例えばβデフェンシンを分泌し、これにより感染から保護する化学的障壁として機能する。従って、自然免疫応答は、好ましくは、皮膚及び又は粘液性膜とも命名される粘膜において促進される。粘膜の例として、口腔、頬側、食道、胃、腸、呼吸器、気管支、鼻、嗅覚器、子宮、陰茎粘膜及び子宮内膜が挙げられる。皮膚及び粘膜は、上皮細胞からなる。上皮細胞は、身体中の構造の腔及び表面を裏打ちする細胞で構成された組織を表す上皮を形成する。ケラチノサイトは、表皮、即ち皮膚外層の主成分である。ケラチノサイトは、休止状態ではIL4及びTGFβ等、阻害性サイトカインを分泌することにより免疫応答の統合性を維持する必須免疫調節物質であるが、ケラチノサイトは、誘発されるとTNFα及び1L1β分泌により皮膚炎症及びランゲルハンス細胞活性化を刺激する。本発明によれば、少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び又は放出は、好ましくは上皮細胞において誘導される。好ましくは、上皮細胞はケラチノサイトである。自然免疫応答の刺激は、他の生物による感染に対する宿主防御を非特異的様式で増強すると考えられる。従って、本発明によれば、自然免疫応答が、哺乳類、好ましくはヒト、より好ましくは感染に対して感受性が高い個体又は免疫系が不全の個体において促進されることが好ましい。本発明の更なる態様において、細菌ゴーストは、哺乳類、好ましくはヒトに投与される。細菌ゴーストは、皮膚及び又は粘膜に投与されることが好ましい。細菌ゴーストの適切な投与様式として、経口、局所、粘膜、経鼻及び又は肺投与が挙げられる。適切な医薬製剤は、例えば、ガム、吸入器、経鼻スプレー、皮膚パッチ、軟膏、ローション、エアロゾル、坐剤、灌注、ゲル状液体、懸濁液、練り歯磨きの形態である。本発明によれば、細菌ゴーストは任意の個体に投与することができる。好ましくは、細菌ゴーストは、乳児、幼児、高齢者、慢性疾患個体、免疫系が不全の個体、例えばAIDS患者、被移植者に投与される。更なる態様において、本発明は、自然免疫応答を促進する方法であって、細菌ゴーストを患者に投与する方法に関する。細菌ゴーストの適切な投与様式及び適切な医薬形態剤形製剤は、上述の通りである。次に、非限定的な実施例により本発明を更に説明する。細菌ゴーストはヒトケラチノサイトにおける自然免疫応答を促進する上皮細胞、特にヒトKCによる自然免疫調節物質の発現を誘導するBGの能力について、殆ど知られていない。本研究において、ヒト初代KCにおける抗菌ペプチド及び炎症性サイトカイン発現を誘導する大腸菌BGの能力が調査された。得られた結果は、BG表面におけるフラジェリンの存在が、ヒトKCによる抗菌ソリアシン及びhBD2の発現並びにインターロイキン6及びIL8の放出を増強することを立証する。材料と方法細胞培養新生児包皮から調製されたヒト初代KCをCloneticsから入手し、以前に記載された通りに無血清ケラチノサイト増殖培地において培養した。刺激のため、3回継代KCを12ウェル組織培養プレートにおいて培養し、60~70コンフルエンスで用いた。ケラチノサイト基本培地において刺激を行った。RNA単離及びqRTPCR刺激後に、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、TRIzol試薬を用いてメーカーの説明書に従ってRNAを単離した。cDNA合成のために、GeneAmpRNAPCRキット及びオリゴdTプライマーを用いてMuLV逆転写酵素によりRNAを逆転写した。研究対象の遺伝子のcDNA配列をGenBankから得た。WhiteheadInstituteforBiomedicalResearchのPRIMER3ソフトウェアを用いてプライマーを設計した。次の遺伝子に次のフォワード及びリバースイントロンスパニングプライマーを用いた。β2ミクログロブリンF5GATGAGTATGCCTGCCGTGTG3R5’CAATCCAAATGCGGCATCT3ソリアシンF5’GGAGAACTTCCCCAACTTCCTT3R5GGAGAAGACATTTTATTGTTCCT3増幅及び検出のためのFastStartSYBRGreenIキットを用いてLightCycler技術によりqRTPCRを行った。全アッセイにおいて、標準化プログラムを用いてcDNAを増幅した。各LightCyclerキャピラリーに、15μlのDNAマスターミックス18μlのMgCl2102μlのH20及び05μlの各プライマーを添加した。Pfafflの数理モデルを用いて標的遺伝子発現の相対的定量化及び増幅効率の決定を行った。標的遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子β2ミクログロブリンの発現に対し正規化した。全リアルタイムPCRは、三回複製して行った。PCR反応の特異性は、PCR産物の配列決定により確認した。BG産生及びKC刺激大腸菌NK9373及びfliC遺伝子内にインフレーム欠失を有するフラジェリン欠損株である大腸菌NK9375は、DavidBates博士、テキサス州ヒューストンのご厚意により分譲して頂いた。溶解プラスミドpGLysivbを有する大腸菌株を、ゲンタマイシンを含有する動物質不含LennoxBroth、5gl酵母エキス、5glNaClにおいて35°Cで増殖させた。単一の形質転換体コロニーに由来する4mlのグリセリンストックを2リットルの培地に接種し、一晩インキュベーションした後、発酵前培養物として用いた。発酵は、TechforsS発酵槽を用いて20lの培地で行った。次のパラメータ、温度、流動、撹拌機、pH、p02、起泡性並びに酸、塩基及び消泡剤のためのポンプを記す。細菌の増殖及び溶解に続き、スパイラルプレーターを用いたコロニー形成単位の決定及び定期的に採取した試料の顕微鏡観察により光学密度の測定を行った。pH72に調整したLBv培地においてエアレーション及び撹拌しつつ、細菌を対数増殖中期まで増殖させた。42°Cへと温度上昇させることにより、溶解タンパク質Eの発現を誘導した。溶解プロセスが完了した後、ベータプロピオラクトンを添加して残存する無傷細菌を死滅させた。30分間の時間間隔を置きつつ、等しい2用量で合計0075のBPLを添加した。BPLとのインキュベーションのため、撹拌速度を600rpmに設定した。分離器による収集のため、温度を16°Cに設定し、約200ml分の流速を用いた。BGペレットを再懸濁する前に、5Lの滅菌蒸留水でシステムをリンスし、その後、HermleZK401遠心分離機を用いた8000分1、4°C、15分間の再懸濁遠心分離サイクル5回により、総容量75Lの蒸留水でBGを洗浄した。最終ペレットを200mlの蒸留水に再懸濁し、凍結乾燥ボトルに分注して80°Cで保存した。LyolabB凍結乾燥機を用いて、試料を約60時間凍結乾燥した。KCに適用する前に、大腸菌NM522、大腸菌NK9373及び大腸菌NK9375の凍結乾燥BGをKBM培地に再懸濁した。invitroアッセイのため、組換えIL1α及びネズミチフス菌由来の精製フラジェリンを用いた。Abtinら、2168~2176に記載されている通り、野生型及びΔFliC大腸菌の培養上清を調製した。KC刺激前に、培養上清をKBMに1100希釈した。サイトカイン測定刺激したKCの培養上清は、遠心分離により脱離細胞又は細胞破片を枯渇させ、解析まで20°Cで保存した。酵素結合免疫吸着測定法によりメーカーの説明書に従ってIL6及びIL8の濃度を決定した。イムノブロット解析タンパク質発現解析のため、SDSPAGEローディングバッファーにKCを溶解した。超音波処理の後、遠心分離により不溶性細胞デブリを除去し、BCA法によりタンパク質濃度を測定した。以前に記載された通りにウエスタンブロット解析を行った。タンパク質ライセートの添加量が等しいことをメンブレンのポンソーS染色により確認した。次の一次抗体、マウスモノクローナルIgG1抗ソリアシンクローン47C1068を用いた。Chemiglow試薬を用いてメーカーの説明書に従ってメンブレンを現像した。ImageJソフトウェアに基づく解析を適用して、イムノブロット解析により得られたバンドの密度を定量化した。様々な粒子濃度の野生型及びΔFliC大腸菌BGによるKCの刺激後に得られたソリアシン発現の値を、組換えIL1αによるKC刺激後に得られたソリアシン発現の値に対し正規化した。フルオレセインイソチオシアネート標識BGの取り込み以前に記載された通りにヒト初代KCのエンドサイトーシス活性の効率を測定した。即ち、24ウェルプレートにおいて培養したヒト初代KCをFITCBGと共に2時間37°Cでインキュベートした。インキュベーションの後、細胞をPBSで3回洗浄して過剰なBGを除去した。最後に、TrypLEExpressを用いて細胞を脱離させ、PBSで2回洗浄し、PBSに溶解した冷15パラホルムアルデヒドにおいて固定し、BDFACSCantoフローサイトメーターにおいて解析した。統計解析GraphPadPrismバージョン5により得られた結果を解析した。2群間の差の統計的有意性をスチューデントt検定により評価し、3群以上の間の差は一元配置ANOVAにより評価した。p005の差が有意であると考慮された。結果BGによるヒト初代KCにおける抗菌ペプチドの発現大腸菌培養上清が、上皮KCにおける抗菌ペプチドソリアシン及びhBD2の発現を誘導すると報告された。上皮細胞による自然免疫応答を誘発するBGの能力を調査するため、野生型大腸菌から作製された様々な粒子濃度のBGでヒト初代KCを24時間刺激した。フラジェリン及びIL1αによるKCの刺激は、解析する抗菌ペプチドの上方制御の陽性対照とし、未処理細胞は陰性対照とした。定量的リアルタイムPCRにより抗菌ソリアシンの相対mRNA上方制御を決定した。図1に示し得るように、KCにおけるソリアシンのmRNA発現は、BGとインキュベーションした後に上方制御された。刺激されたソリアシンmRNA産生は、BG粒子依存的であり、2×108BG粒子mlで最も強い上方制御が観察され、2×108粒子mlを下回るBG濃度に効果はなかった。本発明者らは、KCにおけるソリアシンの誘導が、大腸菌によるフラジェリン発現に依存的であると以前に報告した。BGのフラジェリンが同様の効果を有するか調査するため、本発明者らは、野生型NK9373及び同質遺伝子的フラジェリン欠損NK9375大腸菌株からBGを作製した。陽性対照として、フラジェリン、IL1α及び野生型大腸菌の培養上清でKCを刺激した。非馴化細菌培養用培地、ΔFliC大腸菌の培養上清の存在下及び刺激なしでインキュベートしたKCは陰性対照とした。KCを48時間刺激し、後にイムノブロットによりソリアシンタンパク質産生を解析した。mRNAデータとは対照的に、ソリアシンはタンパク質レベルでは2×107BG粒子mlでかすかなバンドが検出された。野生型大腸菌BGにより、2×108粒子mlでソリアシンの強い誘導が観察され、これは2×109粒子mlで更に強くなった。同質遺伝子的ΔfliC株に関し、ソリアシンは2×108BG粒子mlからかすかなバンドが検出され、2×109BG粒子mlで顕著な発現レベルが観察された。BG処理後のヒト初代KCにおけるサイトカインの発現BGと48時間インキュベーションした後のKCによる炎症性サイトカインIL6及びIL8の分泌をELISAにより調査した。野生型及びΔfliC大腸菌BGとインキュベーションした後のKCによるIL6及びIL8の放出は、BG源及び用いた粒子数に依存的であった。得られた結果は、IL6及びIL8放出における野生型大腸菌BGの効果が、濃度2×107粒子mlから検出できることを示した。2×107粒子mlを下回る濃度はほぼ無効であったが、2×109粒子mlは、それぞれIL6の分泌を2pgmlから600pgmlに、IL8の分泌を60pgmlから1350pgmlに強力に増強した。しかし、ΔfliC大腸菌BGは、2×109粒子mlを用いた場合のみ、両サイトカインの分泌をそれぞれ134pgml及び750pgmlのIL6及びIL8へと増加させ、一方、これを下回るBG濃度は、両サイトカインの放出において有意な効果がなかった。更に、野生型大腸菌の培養上清と比較して、ΔFliC大腸菌の培養上清の存在下でKCをインキュベーションした後にサイトカイン産生がほぼ1桁低くなる場合、フラジェリンの存在に関するIL6及びIL8両方の分泌における有意差は、KCと野生型大腸菌及びΔFliC大腸菌の培養上清とのインキュベーション後に検出された。これらの結果全体として、BGの無傷外被表面構造の重要性及び自然免疫系の刺激におけるフラジェリンの役割を強調する。ヒト初代KCによる野生型及びΔfliC大腸菌BGのエンドサイトーシス上に述べた通り、KCによる抗菌ソリアシンの上方制御及び炎症性サイトカイン放出の増強は、BG表面におけるフラジェリンの存在に依存的である。KCによるBG取り込みにおけるフラジェリンの役割を更に調査するため、野生型及びΔfliC大腸菌BGのエンドサイトーシスを比較、解析した。BG表面にフラジェリンを欠くと、KCがBGと結合しエンドサイトー―シスを行う能力を有意に低下させる。FACS解析は、FITC標識野生型大腸菌BG及びΔFliC大腸菌BGの内部移行の間の差を明示した。図4Cに示す通り、無傷フラジェリンの存在により、KCが野生型大腸菌BGと結合し内部移行させる能力は、ΔFliC大腸菌BGと比較しておよそ6倍増加することが観察された。考察BGは、その細胞形態及び天然の表面抗原構造は保存されているが、細胞質内容物を欠くグラム陰性細菌由来の非生細胞外被標本である40。本研究において、ヒト初代KCを用いて自然免疫調節物質の制御におけるBGの効果を決定した。非病原性大腸菌から作製されたBGとヒトKCとのインキュベーションは、抗菌ソリアシンの発現を上方制御した。この結果は、大腸菌株の培養上清又は破砕細胞が、抗菌ペプチドの発現を増強したという以前の報告と一致した2。従って、本研究は、フラジェリンを含むBGの外被構造が完全に機能的且つ無傷であり、KCによって認識されて、以前の研究で用いられた細菌化合物と同様に自然免疫応答を促進することを確認した2。以前に報告された通り、KCによる大腸菌に対する応答性は、TLR5及びそのリガンド、フラジェリンに媒介される2。野生型大腸菌は、ソリアシン産生のBG濃度依存性誘導を呈示したが、一方、ΔFliC大腸菌は、野生型株よりも1桁高いBG濃度におけるソリアシンの発現を示した。従って、ΔFliC変異体株と比較すると、炎症性サイトカインIL6及びIL8の放出から得られたデータは、BG標本におけるフラジェリンの存在の意義を強調した。シャドフラジェリン及び又は精製フラジェリンの供給源としての大腸菌上清による以前の研究から、フラジェリンが、ヒトKCにおけるソリアシンの主要な誘導因子であることは明らかである2。しかし、ΔFliCBGもソリアシン誘導できるため、追加のFliC非依存的経路が存在すると思われる。更に、KCによる野生型大腸菌及びΔFliC大腸菌に由来するBG取り込みの調査は、有鞭毛株のBGが、ΔFliCBGよりも概して1桁優れて吸収されることを示した。この観察は、BG表面におけるフラジェリンの存在が、KCによるBGの結合及び内部移行に寄与することを示唆する。更に、ソリアシン産生並びにIL6及びIL8分泌の誘導におけるフラジェリンの重要な役割は、ΔFliC大腸菌BGとのインキュベーション又はΔFliC大腸菌培養上清とのインキュベーション後のこれらタンパク質の産生におけるKCの応答減少によって反映される。表面における他の成分、例えば、ΔFliC大腸菌BGのLPSが、抗菌ペプチド及び又は炎症性サイトカインの産生のためのシグナル伝達活性を有するか疑問が残る。しかし、BG粒子数との直接相関は検出できなかったため、KCによるIL6及びIL8の放出は、フラジェリンの存在に対する感受性が高かった。ΔFliCBGとインキュベーションした後のKCによる、IL6と比較してより高度なIL8の分泌及びΔFliC大腸菌のBGの部分的内部移行は、BGの殻におけるLPSの存在と関連し得る。培養上清に出現する破砕細菌細胞由来のLPSの存在は、ΔFliC大腸菌の培養上清とのインキュベーション後のKCによる低分泌IL8の検出を説明することができる。LPSによる皮膚メラノーマ細胞の活性化が、IL8の産生増強及び細胞接着をもたらすことが以前に示された、75~83。TLR4は、内皮細胞による細胞LPS取り込みに関与しないことが報告されているが、LPSによるTLR4媒介性上皮KC活性化と、その食作用活性との間の連絡を定義する必要がある、1166~1170。KC表面におけるTLR4の機能的発現は、一部の研究者により観察された以外に報告がないという事実にもかかわらず2、BGの外被における無傷LPSは、KC等のヒト皮膚細胞による細菌成分の認識における複雑なプロセスに寄与し得る。従って、LPSシグナル伝達を介した上皮KCの活性化に関与する正確な役割及び機序を決定する必要がある。KCのリソソーム区画における野生型大腸菌BGに存在する鞭毛の酸分解がモノマー型フラジェリンを生じ、これがTLR5と結合してサイトカインIL6及びIL8の発現並びにソリアシンの産生を刺激する可能性もある。TLR5と結合するフラジェリン2はΔFliCBGによって生成されず、その結果この結合によるシグナル伝達が誘導されないため、NFカッパーB誘導性ソリアシン発現をもたらす内部シグナル伝達の他の経路が、KCにおいてBGにより誘導される必要がある。フラジェリン発現に関係なくBG又はBG構成成分の存在を感知し得る細胞内受容体候補は、NOD1又はNOD2等、NLRである。近年の研究は、KCにおけるペプチドグリカン断片によるNOD122及びNOD22の機能的発現を報告した。特に、NOD1は、アミノ酸、メソジアミノピメリン酸を含有するペプチドグリカン断片の感知を媒介し、NOD2は、ムラミルジペプチド2の感知を媒介し、これら断片は両者共に大腸菌BGの未だ無傷のペプチドグリカンの分解産物である60。初代KCにおけるムラミルジペプチドによるNOD2の活性化と、抗菌ペプチド産生の増加との間の連絡が報告されており2、本発明者らの研究において、ソリアシンを誘導するためのBGの使用が立証された。従って、得られた結果は、皮膚の自然免疫防御系を増強するための治療アプローチにおける生存していない安全なBGの理想的な使用を立証する。BGの潜在的な治療効果は、薬物又は他の生物活性物質をBGにパッケージングすることにより組み合わせ、これを更なる有益な健康効果の刺激のために細胞内に送達することができる2。レスベラトロール負荷細菌ゴーストによるRAW2647におけるNO産生の調節作用以前の研究において立証された通り、BGは、サイトカイン分泌及び抗菌ペプチド発現等、自然免疫系のパラメータにおいてかなりの影響を有する。自然免疫における重要な役割を有する分子であるNOのiNOS誘導性産生が、LPSによって刺激されることを考慮して、本発明者らは、BG刺激によるラジカル放出の程度を試験した。更に、化学薬品が原因の抗炎症性及び抗増殖性活性の調節に関して、RV負荷ゴーストの影響を調査した。材料方法化学薬品他に断りがなければ、あらゆる化学薬品はSigmaAldrichから入手した。細胞培養アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から得られたRAW2647細胞を、2mMLグルタミン及び10熱失活ウシ胎仔血清を補充した45gLグルコース含有ダルベッコ変法基本培地において培養した。更に、100UPenStrepを培養培地に添加した。生存率評価のために別の培地を用いた。そこで、10熱失活ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、200mMLグルタミン、HEPESバッファー、10非必須アミノ酸及びプラスモシンを補充したロズウェルパーク記念研究所培地1640において細胞を培養した。コンフルエント状態に達するまで細胞を45~48時間培養した。様々な実験の解析に用いた培地は、抗生物質のみを含有した。細菌ゴースト産生他に記載されている381~8頁Mayrら、2005InfectImmun734810~7頁ファージ由来の溶解タンパク質Eの制御された発現により、大腸菌NM522由来のBGを産生した。抗生物質を添加することにより、溶解されていない細菌の不活化を行った。凍結乾燥BGを室温にて保存した。処理実験前にBGを試験培地に再懸濁した。BGのレスベラトロール負荷12~24mg量の凍結乾燥BGを様々なレスベラトロール濃度に懸濁し、激しく振盪しつつ30分間28°Cでインキュベートした。13000rpmで15分間遠心分離することにより負荷されたBGを収集し、ペレットを水で3回洗浄した。1mgのBGのアリコートを20°Cで使用まで保存した。亜硝酸塩アッセイRAW2647細胞を96ウェルプレートに播種し、2日間培養した。続いて、ウェル当たりおよそ3105マクロファージを、200μlの規定濃度の空BGで、レスベラトロール負荷ゴーストで、或いは空の細菌ゴースト外部に投与された規定のレスベラトロール濃度で20分間刺激した。その後、PBSで2回洗浄することにより細菌ゴースト懸濁液を除去し、更に20時間、暗所で37°C、5CO2にて細胞をインキュベートした。純粋LPS刺激の影響を調査するため、様々なLPS濃度による長期インキュベーション実験を20時間行った。NO産生の指標として、グリース反応の使用によりマクロファージの上清における亜硝酸塩濃度を測定した131~8頁。要約すると、100μlの各上清を、5H3P04に溶解した1スルファニルアミド及び水に溶解したNエチレンジアミン二塩酸塩と混合した。ELISA読み取り装置で550nmの吸光度を決定した。取り込み試験FITC標識BGのRAW2647への適用及び検出エンドサイトーシス性レスベラトロール送達の指標として、解析された細胞系においてFITC標識BGの取り込みを決定した。このため、凍結乾燥細菌ゴーストを15mlの01MNa2CO3pHほぼ90に再懸濁した。その後、25μlのFITC原液をBG懸濁液に添加し、2時間暗所にて16°Cで振盪した。PBSによる5回の洗浄工程及び陽性標識のチェックの後、再度炭酸ナトリウムバッファー中にゴーストペレットを再懸濁し、20°Cで使用まで保存した。RAW2647の培養及び処理は、一部変更した以外は亜硝酸塩アッセイと同じである。規定量の空BGと20分間インキュベーションした後、マクロファージをPBSで2回洗浄し、洗浄溶液を隣接する空ウェルに収集した。続いて、TecanGeniospro蛍光光度計により励起及び発光波長485535で蛍光を記録した。総蛍光値は適用したゴースト量の100とし、取り込みはマクロファージ当たりの得られた蛍光から算出した。細胞傷害性アッセイニュートラルレッドアッセイを用いて、RAW2647細胞の生存率における空BG又はRV負荷BGと共に化学薬品それ自体の影響を試験した。ニュートラルレッドは、生細胞のリソソームにおいて選択的に蓄積し1125~31頁、従って、生存率の定量的な評価を可能にする。96ウェルプレートの個々のウェルに125×105細胞を接種して、一晩付着させた。異なるBG対細胞比のRV負荷及び非負荷BGを含有する200μlの培地で、或いはRV単独でマクロファージを20分間処理し、続いて20時間の回復期間又は24時間置いた。2種のRV濃度に同一条件を適用した。TritonX100を陽性対照とし、試験培地で処理した細胞は陰性対照を表す。処理後に、細胞をPBSで2回洗浄し、培養用培地と20時間インキュベート、或いは直接的に100μlのNRと更に2時間インキュベートした。その後、色素を廃棄し、ウェルをPBSで2回洗浄した。100μlの酸性脱染溶液を添加することにより色素の抽出を行った。プレートを10分間振盪し、プレートリーダーにより570nmにて発色を測定した。統計GraphPadPrismを用いて全結果を解析した。データは平均SDとして表す。スチューデントt検定を用いて統計解析を行った。P値005を統計的に有意であると考慮した。結果BGのRV負荷単にBGを所望のRV溶液に再懸濁することにより、凍結乾燥大腸菌NM522のBGにRVを負荷した。BGにおけるRVの量を決定するため、エタノール抽出を行ってHPLCにより解析した。結果を図5Aに示す。RV負荷濃度と回収されたRVとの間に明確な依存性が観察できた。凍結乾燥BGを35mgmlRV溶液に懸濁した後に最高負荷効率を得た。1×1010BGの抽出後に平均して46μgのRVを検出することができた。当初の凍結乾燥ゴースト量から計算しておよそ4の原液を回収した。マウスマクロファージによるFITC標識BGの付着及び取り込み短時間の同時インキュベーション後に細胞と会合又はマウスマクロファージにより取り込まれたBG量を調査するため、蛍光定量による定量化実験を行った。図5Bは、20分間の同時インキュベーション及び2回の洗浄工程後にRAW2647及び大腸菌NM522BGの蛍光定量的測定により得られた結果を示す。適用したゴーストと、細胞と会合したゴーストに明確な用量依存性が見られ、殆ど完全な直線回帰を生じる。更に、96又は24ウェルプレートにおいて実験を行った場合で、差は観察されなかった。適用したゴーストの平均して25は、この短いインキュベーション時間の後に、マクロファージと会合した。この期間内にBGが既にマウスマクロファージにより取り込まれているかも明らかにするため、内部移行を視覚的に検査する共焦点レーザー走査顕微鏡試験を行った。このため、20及び40分後のFITC標識大腸菌NM522ゴーストとRAW2647細胞とのインキュベーション後にzstacksを行った。細胞のFアクチン骨格と選択的に結合するテキサスレッドファロイジンでマクロファージを染色した。様々な光学切片の代表的な単一のzstacksを表示する画像を図6A及び図6Bに示す。細胞により既に内部移行しているFITC標識BGが黄色に見えることが認められる。緑色のBGは、取り込まれておらず、細胞外部に付着したBGを表す。更に、BG対細胞比1000において、本発明者らは、各マクロファージにおいて、摂取されたBGと共に内部移行したBGクラスターを観察した。NO産生の誘導iNOSはLPSにより誘導されるため、様々な濃度のLPSによるRAW2647細胞の20時間の刺激後にNO産生を調査した。図7Aに示す通り、1~1000ngmlのLPSによる処理は、1ngmlから有意な感度のNO産生をもたらした。BGが、外被において結合しているそのLPS分子を完全に維持するという事実から、BGがどの程度までNO産生を刺激できるか決定するための実験を行った。ゴースト対細胞比10は、遊離LPS1ngmlと同様のレベルのNO産生の有意な誘導に優に十分であることが判明した。MOI100~1000の空BGで細胞を処理した場合、NO産生の明確な粒子依存性刺激が達成された。しかし、より高濃度のBGは、更なる影響を全く示さなかった。外部に配置されたRVとは対照的な、BG自体及びRV負荷BGによるNO刺激の調節能力図7Bに既に示した通り、BGは、100~1000の間のBG対細胞比でマクロファージに適用されると、用量依存的様式でNO産生を刺激することができる。多くの研究が、RVがLPS誘導性NO産生を低下できることを示したため68~94頁Tsaiら、1999BrJPharmacol126673~80頁、RVがBG誘導性NO産生を調節する可能性を調べるための実験を行った。このため、空の大腸菌NM522BGを比率500で細胞に適用した。同時に、3種の異なる濃度のRVを細胞培養物に添加した。20分間の同時インキュベーション及び2回の洗浄工程の後、NO産生を20時間後に測定した。結果を図8Aに示す。03μM及び03μMRVと空の大腸菌NM522ゴーストとの同時処理が、BG誘導性NO産生に影響を及ぼさないことが認められる。30μMRVによる処理後に統計的有意差が観察できた。BGに封入されているRV量及び20分間の処理後にマクロファージと会合しているBG数に基づき、BGにより送達されたレスベラトロール粒子を決定することができた。RAW2647細胞におけるNO誘導の刺激は、MOI100及び1000における最高のRV収率を有するBGにより行ったため、算出されたBGによるRV送達値は、048025μM及び886221μMレスベラトロールに相当するであろう。BGにおいて結合しているRVが、NO産生における調節様式を持ち得るか調査するため、同一量の空ゴースト対RV負荷ゴーストの影響を解析した。更に、空BG及び3μMRVの同時適用によるラジカル放出を評価した。外部適用されたRVと空の大腸菌NM522BGが、RV負荷ゴーストと同程度に効果的にラジカル放出を減少できなかったことが認められる。本発明者らの知見から、有意な亜硝酸塩低下がBG対細胞比100におけるRV負荷ゴーストにより見出されたが、3μMRVには効果がなかったことが示される。他方で、MOI1000におけるマクロファージの処理後に得られた結果は、両方の変種による低下をもたらした。それにもかかわらず、BG単独による処理と比較した場合、RVゴーストをRAW2647細胞に適用すると、空BGと同時に投与した3μMRVよりも有意に低い量のNOが産生された。細胞生存率の決定RAW2647マクロファージの細胞生存率における空及びRV負荷BGの影響を調査するため、3種の異なるBG対細胞比による2種の異なる処理条件を試験した。NO測定に記載されているのと同じ仕方で第一の試験を行った、即ち、20分間の処理及び続く20時間後の測定。第二の解析は、24時間の長期インキュベーションの効果に関係した。図9Aに示す通り、大腸菌NM522ゴーストそれ自体は、この期間内に細胞傷害性影響を及ぼさなかった。それにもかかわらず、MOI10におけるマクロファージとBGとの24時間インキュベーションは、有意な増殖刺激効果をもたらしたが、より高いBG濃度は、無血清培地処理対照と変わらなかった。RV負荷ゴーストとの又は化学薬品それ自体との短期同時インキュベーション後に効果は見られなかったが、24時間後のMOIが10及び100のRVBGとの処理後に代謝活性の増強が見られた。本発明者らは、24時間インキュベーション後のBGの細胞会合量を決定しなかったため、BGにより送達されたRV濃度に関する適切な記述は為されない。理論的には、MOI1000で適用された全BGがマクロファージによって取り込まれる場合、30μMのレベルが達成される。しかし、本発明者らは、顕微鏡検査からこれが正しくないことを知っている。この期間でBG量の半量が取り込まれると仮定すると、算出された濃度15μMレスベラトロールが得られる。従って、ゴースト対細胞比1000で適用されたBGにおいて結合しているRVと対比して、細胞生存率における15μM及び30μMRVの影響が調査される比較実験を行った。最低化学薬品濃度は全く影響がなかったが、30μMRVによる処理後に細胞生存率は大幅に減少した。RVBGによる細胞生存率の有意な減少も観察された。平均として、送達された化学薬品により10の細胞が死滅した。考察本研究において、本発明者らは、BGがマクロファージによるNO生成を誘導しており、この活性がRV負荷BGにより調節できることを立証した。病原体による疾患、例えば、リーシュマニア症又は結核を治癒するためのiNOS活性及びNO放出における依存性が数例の研究において立証された252~9頁ChakravorttyandHensel、2003MicrobesInfect5621~7頁。病原体は、自然免疫系の細胞により貪食されることが一般に知られている。他の研究の結果は、BGがこれらの細胞により優先的に取り込まれることを立証し、様々なマクロファージ細胞系及び樹状細胞に関する取り込みが報告された57~66頁Kudelaら、2005JImmunother28136~43頁Pauknerら、2003JDrugTarget11151~61頁。以前の知見によると、取り込みは、BGの短期同時インキュベーション後にRAW2647マクロファージ細胞系において確認することができた。興味深いことに、CLSMによる顕微鏡観察は、マクロファージが、単一のゴーストと共にゴーストクラスターを取り込み得ることを示した。BGは、その天然状態の細菌と同様にその病原体関連分子パターンを全て保有するため、BGは、その対応する宿主自然免疫受容体、例えば、Toll様受容体によって認識される。従って、細菌LPSはTLR4と、フラジェリンはTLR5と相互作用する352~63頁。マウスRAW2647マクロファージ細胞系におけるBGの取り込みは、この細胞系はTLR5を殆ど発現しないため、主としてTLR4に関係する1065~74頁。一方、実施例1において、大腸菌BGは、フラジェリン依存性TLR5経路及び他の取り込み機序により初代ケラチノサイトに進入することが示される。ヒトマクロファージを用いたPanaroらの研究は、LPS誘導性NO産生と間の直接相関を立証する。iNOSの競合的阻害剤であるLNMMAが存在すると、両方のパラメータにおいて有効性が有意に低下した122~7頁。LPSは、TLR4との相互作用を介したiNOSの誘導に関して著名なため907~16頁、本発明者らは、RAW2647細胞における遊離LPSとの長期インキュベーションと、様々な量のBGとの短期インキュベーションとの間の比較実験を行った。MOI10の大腸菌ゴーストによるマクロファージの処理が、Panaroら122~7頁によって寄生虫の排除に効能があることが分かった100ngmlLPSと同じ効果を示すことが判明した。更に、本発明者らは、NO放出の程度と関連して観察された粒子依存性BG細胞との間の関係を解析し、有意な正の相関を見出した。NO産生以外に、サイトカイン等の他の因子が、細胞内病原体に対する自然免疫応答を誘発する。IFNγ等、I型インターフェロンは種々の細胞によって産生され、強力な抗菌活性を発揮する。以前の研究において、BGがサイトカイン産生を刺激する特色を保有することが立証された。例えば、Ebensenらは、マンヘミアヘモリチカBGの適用が、免疫化マウスにおける脾臓IFNγ産生細胞の量の増大を生じることを立証した6858~65頁。別の動物実験において、脾臓IFNγレベルは、大腸菌0157H7BGによる免疫化の後に有意に増加した4810~7頁。IL12がIFNγ産生を増強し、Th1細胞発達において中心的な役割を果たすことが知られているため、Haslbergerら57~66頁によってBGを用いた研究が行われ、抗原提示細胞におけるIL12産生の効果的な刺激が報告された。NO産生に話題を戻すと、レスベラトロールによる研究の結果は、iNOS誘導に対する抑制的な特性を立証した68~94頁Tsaiら、1999BrJPharmacol126673~80頁。従って、本研究において、空BGとコインキュベートされた、或いはBGにおいて細胞内で結合しているレスベラトロールの、RAW2647マクロファージによるBG誘導性NO産生に対する効果を決定した。BGにおいて結合しているRVの適用により、その空バージョンと比較して高度に有意なラジカル放出の減少が得られた。更に、外部に添加された濃度レベル3μMの純粋化合物は、ラジカル放出を約15低下させたBG負荷適用と比較してNO産生に影響がなかった。本発明者らの知る限りにおいて、レスベラトロールの細胞取り込み機序は依然として不明である。現在のところ、この薬物に対する特異的受容体は発見されていない。その構造から、レスベラトロールは、エストロゲン受容体又はインテグリン等の細胞表面受容体と相互作用することができる68~94頁Linら、2006FasebJ201742~4頁。しかし、本発明者らの知見や、マクロファージによる取り込み後のRV負荷BGによるレスベラトロールの細胞内送達の事実によると、内部レスベラトロール受容体が存在する可能性は非常に高い。本発明者らは、このような仮説上の受容体に対する用語として、BGRVを提唱する。細菌LPSが、多種多様な哺乳類細胞における数多くの病態生理学的効果の原因であることが知られている。最悪の事態において、その結果、内毒素ショック及び多臓器不全に続き死亡する可能性もある。この内毒素性は、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン1、IL6及び一酸化窒素等、多数の生理活性メディエーターを産生する宿主免疫及び炎症性細胞、特に単核貪食細胞の活性化により媒介される1011~5頁。グラム陰性細菌の内毒素性内容物もBGに存在するため、BGの安全性及び毒性試験が過去10年間行われてきた。病原性大腸菌O26B6及びネズミチフス菌C5に由来する細菌ゴースト標本は、標準アメリカカブトガニ属アメボサイトライセートアッセイ及び2ケト3デオキシオクタン酸アッセイの使用により、その内毒素活性に関して調査される実験が為された57~66頁Maderら、1997Vaccine15195~202頁。平均として、どちらのゴースト種も、ウマ流産菌の遊離LPSと比較して2~5の内毒素活性しか呈示しなかった。RAW2647細胞による細胞培養実験は、腫瘍壊死因子アルファ分泌及びプロスタグランジンE2合成に、遊離LPSと比較して100倍多いBGが必要とされることを明らかにした。著者らは、ウサギにおける測定可能な免疫応答の誘導に十分な用量250ngkg1のBGをiv投与した場合、ウサギにおいて有意により少ない応答が記録されていないことについても脚光を当てた195~202頁。本研究において細胞傷害性研究も行った。インキュベーションが最大24時間行われた場合であっても、大腸菌BGそれ自体の殺傷効果は観察されなかった。よって、iNOS発現及び大量のNO産生のためのBG関連の連続的刺激が、invitroで細胞死をもたらさないことが明示された。しかし、細胞を低BG、MOI10でインキュベートした場合、増殖刺激効果が観察された。同一処理条件下において、RVを粒子内部に負荷した場合、このプラスの影響は更に増強された。それにもかかわらず、細胞当たり1000BG比の24時間適用後に、BG送達されたRVによる細胞傷害性効果が更に立証され得る。これは、細胞生存率のおよそ10減少をもたらし、BGによる効果的なRV送達の別の証拠を示す。抗炎症性効果、即ちiNOS抑制に加えて、RVは、invitroにおける抗菌99~104頁Faithら、2006AntiviralRes72242~51頁Schrieverら、2003Atherosclerosis171379~80頁Kedzierskiら、2007ParasitolRes10291~7頁活性をもたらすことを示し、様々な研究においてその癌化学療法効力が見いだされた68~94頁を参照。食事由来のレスベラトロール含有量に関する短い概要は、Udenigweらに記載されている。赤ワインにおいて、23~463μMの範囲に亘る最高濃度が見出された445~54頁。このような値は、本研究におけるBGにおいて結合し、マクロファージに送達されるRV含有量に相当する。しかし、言及されている濃度は、この飲料の1リットル消費を必要とする。更に、RVは、invivoでは8~14分間以内に腸及び肝臓において急速に代謝されることが知られている68~94頁。効果は、RAW2647細胞との20分間の短時間同時インキュベーション後のRVBGにより観察できるため、本発明者らは、この代謝が恐らくゴースト外被による該物質の保護により回避でき、細胞特異的送達の遅延がinvivoで誘発され得ると考える。本研究において立証された通り、BGは、マクロファージにおけるinvitroでのNO産生の刺激において非常に有意な影響を有し、これは、RVがBG内部と結合している場合に改変されることが示された。NO放出と共に、RVが抗菌及び抗癌性効果に寄与すること、BGが細胞のサイトカイン分泌及び抗菌ペプチドを増強するという事実を考慮することは、細胞内病原体又は癌の治療的処置における使用のための該システムに脚光を当てる。参考文献