以下の工程を含む、複合ワクチンを調製する方法:少なくとも1個のカルボニル基を含む第一部分を、少なくとも1種のアミノオキシ試薬と反応させ、第一部分上に少なくとも1個のペンダント官能基を形成する工程であり、ここで第一部分は、多糖、オリゴ糖、糖質、および糖質含有分子より選択される、工程;少なくとも1個のペンダント官能基を含む第一部分を、第二部分と反応させ、複合体を含有する組成物を形成する工程であり、ここで第二部分は、タンパク質、ペプチド、およびハプテンより選択される工程;ならびに複合体を、薬学的に許容できる送達ビヒクルと混合し、複合ワクチンを形成する工程。少なくとも1個のカルボニル基が、アルデヒド基およびケトン基より選択される、請求項1記載の方法。アミノオキシ試薬が、ホモ官能性試薬およびヘテロ官能性試薬より選択される、請求項1記載の方法。少なくとも1個のペンダント官能基を含む第一部分が、第二部分と直接的に反応し、複合体を形成する、請求項1記載の方法。少なくとも1個のペンダント官能基を含む第一部分が、第二部分と間接的に反応し、複合体を形成する、請求項1記載の方法。第二部分が、第一部分とのその反応の前に、官能基化される、請求項1記載の方法。タンパク質が、ハプテン化されたタンパク質である、請求項1記載の方法。糖質含有分子が、リポ多糖、リポオリゴ多糖、リポテイコ酸、および脱アシル化されたリポテイコ酸より選択される、請求項1記載の方法。以下の工程を含む、複合ワクチンを調製する方法:少なくとも1個のペンダントアミノオキシ基を含む第一部分を第二部分と反応させ、複合体を含有する組成物を形成する工程;ここで第一の部分は、多糖、オリゴ糖、糖質、および糖質含有分子より選択され、ならびに第二部分は、タンパク質、ペプチド、およびハプテンより選択され;ならびに複合体を薬学的に許容できる送達ビヒクルと混合し、複合ワクチンを形成する工程。少なくとも1個のペンダントアミノオキシ基を含む第一部分が、第二部分と直接的に反応し、複合体を形成する、請求項9記載の方法。少なくとも1個のペンダントアミノオキシ基を含む第一部分が、第二部分と間接的に反応し、複合体を形成する、請求項9記載の方法。第二部分が、第一部分とのその反応の前に、官能基化される、請求項9記載の方法。タンパク質が、ハプテン化されたタンパク質である、請求項9記載の方法。糖質含有分子が、リポ多糖、リポオリゴ多糖、リポテイコ酸、および脱アシル化されたリポテイコ酸より選択される、請求項9記載の方法。以下の工程を含む、複合ワクチンを調製する方法:多糖、オリゴ糖、糖質、および糖質含有分子より選択された第一部分が;少なくとも1種のアミノオキシ試薬と反応した第二部分と反応し、ここで第二部分は、タンパク質、ペプチド、およびハプテンより選択され、複合体を含有する組成物を形成する工程;ならびに複合体を薬学的に許容できる送達ビヒクルと混合し、複合ワクチンを形成する工程。アミノオキシ試薬が、ホモ官能性試薬およびヘテロ官能性試薬より選択される、請求項15記載の方法。第一部分が、第二部分と直接的に反応し、複合体を形成する、請求項15記載の方法。第一部分が、第二部分と間接的に反応し、複合体を形成する、請求項15記載の方法。第一部分が、第一部分とのその反応の前に、官能基化される、請求項15記載の方法。タンパク質が、ハプテン化されたタンパク質である、請求項15記載の方法。糖質含有分子が、リポ多糖、リポオリゴ多糖、リポテイコ酸、および脱アシル化されたリポテイコ酸より選択される、請求項15記載の方法。以下の工程を含む、複合ワクチンを調製する方法:第一部分を、少なくとも1種のペンダントアミノオキシ基を含む第二部分と反応させ、複合体を含有する組成物を形成する工程であり、ここで第一部分は、多糖、オリゴ糖、糖質、および糖質含有分子より選択され、ならびに第二部分は、タンパク質、ペプチド、およびハプテンより選択される工程;ならびに複合体を薬学的に許容できる送達ビヒクルと混合し、複合ワクチンを形成する工程。第一部分が、第二部分と直接的に反応し、複合体を形成する、請求項22記載の方法。第一部分が、第二部分と間接的に反応し、複合体を形成する、請求項22記載の方法。第一部分が、第二部分とのその反応の前に、官能基化される、請求項22記載の方法。タンパク質が、ハプテン化されたタンパク質である、請求項22記載の方法。糖質含有分子が、リポ多糖、リポオリゴ多糖、リポテイコ酸、および脱アシル化されたリポテイコ酸より選択される、請求項22記載の方法。官能基化された第二部分が、第一部分との反応の前に、少なくとも1個のペンダントアミノオキシ基を含む、請求項22記載の方法。以下の工程を含む、複合ワクチンを調製する方法:多糖、オリゴ糖、糖質、および糖質含有分子より選択された第一部分を提供する工程;少なくとも1個のアルデヒド基を含むN末端12アミノアルコールより選択された第二部分を提供する工程;該第二部分を少なくとも1種のアミノオキシ試薬と反応させる工程;該第一部分を、官能基化された第二部分と反応させ、複合体を含有する組成物を形成する工程;ならびに複合体を薬学的に許容できる送達ビヒクルと混合し、複合ワクチンを形成する工程。少なくとも1個のアルデヒド基が、選択的酸化により第二部分上に作製される、請求項29記載の方法。アミノオキシ試薬が、ホモ官能性試薬およびヘテロ官能性試薬より選択される、請求項29記載の方法。第一部分が、第二部分と直接的に反応し、複合体を形成する、請求項29記載の方法。第一部分が、第二部分と間接的に反応し、複合体を形成する、請求項29記載の方法。第一部分が、第二部分とのその反応の前に、官能基化される、請求項29記載の方法。糖質含有分子が、リポ多糖、リポオリゴ多糖、リポテイコ酸、および脱アシル化されたリポテイコ酸より選択される、請求項29記載の方法。以下の工程を含む、複合ワクチンを調製する方法:少なくとも1個のペンダントアミノオキシ基を含有する第一部分を反応する工程であり、ここで第一部分が、多糖、オリゴ糖、糖質、および糖質含有分子より選択される工程;第一部分を第二部分と反応させ、複合体を含有する組成物を形成する工程であり、ここで第二部分が、少なくとも1個のカルボニル基を含む糖タンパク質より選択される工程;ならびに複合体を薬学的に許容できる送達ビヒクルと混合し、複合ワクチンを含有する組成物を形成する工程。少なくとも1個のカルボニル基が、アルデヒド基およびケトン基より選択される、請求項36記載の方法。少なくとも1個のペンダントアミノオキシ基を含む第一部分が、第二部分と直接的に反応し、複合体を形成する、請求項36記載の方法。少なくとも1個のペンダントアミノオキシ基を含む第一部分が、第二部分と間接的に反応し、複合体を形成する、請求項36記載の方法。第二部分が、第一部分とのその反応前に、官能基化される、請求項36記載の方法。糖タンパク質が、ハプテン化された糖タンパク質である、請求項36記載の方法。糖質含有分子が、リポ多糖、リポオリゴ多糖、リポテイコ酸、および脱アシル化されたリポテイコ酸より選択される、請求項36記載の方法。以下の工程を含む、複合ワクチンを調製する方法:多糖、オリゴ糖、糖質、および糖質含有分子より選択される第一部分が、アミノオキシ試薬と反応する工程であり、ここでこの反応は、第一部分の還元末端で生じ、官能基化された第一部分を生成する工程;官能基化された第一部分を、タンパク質、ペプチド、およびハプテンより選択された第二部分と反応させ、複合体を含有する組成物を形成する工程;ならびに複合体を薬学的に許容できる送達ビヒクルと混合し、複合ワクチンを形成する工程。アミノオキシ試薬が、ホモ官能性試薬およびヘテロ官能性試薬より選択される、請求項43記載の方法。第一部分が、第二部分と直接的に反応し、複合体を形成する、請求項43記載の方法。第一部分が、第二部分と間接的に反応し、複合体を形成する、請求項43記載の方法。第二部分が、第一部分とのその反応の前に、官能基化される、請求項43記載の方法。タンパク質が、ハプテン化されたタンパク質である、請求項43記載の方法。糖質含有分子が、リポ多糖、リポオリゴ多糖、リポテイコ酸、および脱アシル化されたリポテイコ酸より選択される、請求項43記載の方法。請求項1記載の方法により調製された複合体を含有するワクチン。薬剤を調製するための、請求項1記載のワクチンの使用。患者へ、請求項1に従い調製された複合体を含有するワクチンを投与する工程を含む、患者における免疫応答を誘導する方法。発明の詳細な説明A複合に関する戦略本発明は、複合ワクチンを調製するための先行技術の方法の変更を提供する。特に本発明は、第一部分が、多糖、オリゴ糖、糖質、および糖質含有分子より選択され、ならびに第二部分が、タンパク質、ペプチド、およびハプテンより選択され、ならびに複合は、少なくとも1個のアミノオキシ官能基を使用し進行するような、第一部分を第二部分へ複合する新規方法を提供する。本発明の範囲内の第一部分および第二部分を反応する多くの方法が存在し、これらの方法の各々は、この方法における少なくとも1個のアミノオキシ基の使用に頼っている。1個のアミノオキシ基を伴う少なくとも1種のアミノオキシ試薬は、第一部分と反応し、少なくとも1個の非アミノオキシペンダント官能基を伴う組成物を形成することができる。複数のアミノオキシ基を伴う少なくとも1種のアミノオキシ試薬は、第一部分と反応し、少なくとも1個のアミノオキシペンダント官能基を伴う組成物を形成することができる。この態様において、少なくとも1個の非アミノオキシペンダント官能基が任意に追加的に存在してもよい。1個のアミノオキシ基を伴う少なくとも1種のアミノオキシ試薬は、第二部分と反応し、少なくとも1個の非アミノオキシペンダント官能基を伴う組成物を形成することができる。複数のアミノオキシ基を伴う少なくとも1種のアミノオキシ試薬は、第二部分と反応し、少なくとも1個のアミノオキシペンダント官能基を伴う組成物を形成することができる。この態様において、少なくとも1個の非アミノオキシペンダント官能基が任意に追加的に存在してもよい。従って本発明において、少なくとも1種の第一部分および第二部分は、アミノオキシ試薬と反応し、少なくとも1個のペンダント官能基を伴う組成物を生じるであろう。直前に記したように、戦略1または2および3または4の任意の組合せに従い、第一部分および第二部分の両方が官能基化されることは可能である。別の態様において、第一部分または第二部分のいずれかが、官能基化されてよい。次いで第一部分および第二部分は、共に複合体化されてよい。この複合は、第一部分上のペンダント官能基を、第二部分へ直接連結することにより、直接的に進行することができる。あるいはこの複合は、第一部分上のペンダント官能基がスペーサーと称される追加の試薬に連結し、これが次に第二部分に連結されることにより、間接的に進行することができる。当然、第一および第二部分の位置を単に逆にすることにより、同様の戦略を、第二部分上のペンダント官能基で辿ることができる。B第一部分:多糖、オリゴ糖、糖質、および糖質含有分子本明細書において使用される糖質は、可溶性の単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖を意味する。本発明の方法での使用に適した多糖の例は、細菌、真菌およびウイルスの多糖を含む。例えば水溶性多糖などの、可溶性多糖は、本発明での使用に適している。適当な多糖の具体例は、チフス菌Vi抗原;髄膜炎菌多糖C;および、肺炎球菌多糖、例えば肺炎球菌多糖14型がある。本発明のある態様に従い、糖質は、天然、半合成、または全合成の高分子量分子である。ひとつの態様に従い、少なくとも1種の糖質含有部分は、大腸菌多糖、黄色ブドウ球菌多糖、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、アガロース、肺炎球菌多糖、フィコール、クリプトコッカスネオフォルマンス、インフルエンザ菌PRP、緑膿菌、肺炎レンサ球菌、AおよびB群レンサ球菌、髄膜炎菌、およびそれらの組合せより選択される。ひとつの態様に従い、糖質含有部分はデキストランである。本明細書において使用されるデキストランは、多くの供給業者から得ることができる単独の糖で構成された多糖を意味する。別の好ましい糖質含有部分は、フィコールであり、これは不活性で半合成のイオン化されない高分子量ポリマーである。本発明に従い使用することができる部分の追加の限定的でない例は、リポ多糖、リポオリゴ多糖、リポテイコ酸、脱アセチル化されたLPS、脱アセチル化されたLTA、脱脂質されたLPS、脱脂質されたLTA、および関連分子を含む。一般に還元的アミノ化を使用しカップリングされている糖質含有分子は、アルデヒド部分の形成が必要である。場合によっては、例えばこれらのアルデヒドは、本明細書に開示されたアミノオキシ化学を用いカップリングすることもできる。還元的アミノ化を使用し、LPSおよびLOSはカップリングされており、これらは両方とも、アミノオキシ化学を用いてカップリングすることができる。還元的アミノ化化学を使用するLPSおよびLOSのカップリングの例は、MieszalaetalCarbohydrateResearch338167;JenningsetalInfImmun43407;および米国特許第4663160号に開示されている。C第二部分:タンパク質、ペプチドおよびハプテン本発明に従い、様々な異なるタンパク質を、様々な異なる多糖にカップリングすることができる。下記リストは、本発明に従い使用するのに適したタンパク質の例を含む:ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、寄生虫タンパク質、動物タンパク質。前記給源のいずれかに由来する糖タンパク質も、第一部分との複合体の形成に使用することができる。脂質、糖脂質、ペプチド、およびハプテンも、本発明の第二部分としての使用に適している。ハプテン化されたタンパク質、すなわちハプテンにより誘導体化されたタンパク質も、本発明の第二部分としての使用に適している。具体的タンパク質は、破傷風毒素、百日咳毒素、ウシ血清アルブミン、リポタンパク質、ジフテリア毒素、ヒートショックタンパク質、T細胞スーパー抗原、プロテインD、CRM197、および細菌の外膜タンパク質を含む。これらのタンパク質出発材料は全て、生化学品または薬品の供給業者、もしくはBernaLaboratoriesから商業的に入手することができるか、またはJMCruseandRELewisConjugateVaccinesinContributionstoMicrobiologyandImmunology、Vol10に説明されたような標準の方法により調製することができる。D第一または第二部分のアミノオキシ基による官能基化法アミノオキシ官能基NH2ORは、タンパク質上に認められるアミンよりもより低いpKaを有し、およびはるかに低いpHで求核性である。アミノオキシ基は、カルボニル含有基、例えばアルデヒドおよびケトンと非常に反応性であり、高度に安定したオキシムを形成する。この反応の最適pHは、4~8の範囲、例えば5~7である。本発明のひとつの局面に従い、最適pHは約5である。オキシムは安定しているので、前述の還元的アミノ化法における還元工程は、最良である。この反応の高い効率性は、より短い反応時間を生じる。更に相補的試薬の間の反応部位に若干の制御を発揮することが可能である。対照的に、ヒドラジドおよびアミンのケトンのような基との反応は、比較的遅くはるかに効率が悪い。タンパク質および多糖は、相補的オキシム形成基により官能基化され、反応し、オキシム連結したタンパク質多糖複合ワクチンを形成する。本発明のひとつの局面に従い、タンパク質は多糖へ直接連結される。ひとつの態様に従い、アミノオキシホモ官能性またはヘテロ官能性試薬を、少なくとも1個のカルボニル基を含む多糖、オリゴ糖、糖質、および糖質含有分子より選択された実体と混合し、少なくとも1個のオキシム連結により官能基化された多糖、オリゴ糖、糖質、または糖質含有分子を形成する工程を含む方法が提供される。官能基化は、例えば、チオール、カルボキシ、アミノオキシ、ハロゲン、アルデヒドなどの、更なる反応を促進する基を付加することを意味する。この態様は、下記の非限定的例により例示されるに説明されている。例えばPRPが過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化される場合、多糖鎖は切断され、各末端にアルデヒドを持つオリゴ糖を生成する。アルデヒドを生成する多くの他の方法が、当業者に公知である。例えば、Jenningsらの米国特許第4356170号、ImmunogenicPolysaccharideProteinConjugates;Taiら、米国特許第5425946号、VaccinesagainstGroupCNeisseriaMeningitidis;Porro、米国特許第5306492号、OligosaccharideConjugateVaccines;Yangら、米国特許第5681570号、Immunogenicconjugatemolecules;Constantinoら、Developmentandphase1clinicaltestingofaconjugatevaccineagainstmeningococcusAandC、Vaccine10691;Laferriereら、ThesynthesisofStreptococcuspneumoniaepolysaccharidetetanustoxoidconjugatesandtheeffectofchainlengthonimmunogenicity、Vaccine15179がある。本発明に従い、アルデヒド部分をタンパク質およびまたは多糖へ付加することは望ましいことがある。当業者は、それを実行する多くの許容できる方法が存在することを理解するであろう。アルデヒドをタンパク質および多糖へ付加する方法の適当な非限定的例は、以下を含む:1ヒドロキシル基が、塩基中で、クロロヘキサノールジメチルアセタールと反応し、引き続き遮蔽されたアルデヒドは、穏やかな酸加水分解により露出する。Dickら、ConjugateVaccinespp9193。2グルクロノラクトンおよび水素化シアノホウ素ナトリウムを使用し、タンパク質アミンを還元的にアミノ化する。けん化を使用し、ラクトンを開環する。次いで、糖を過ヨウ素酸ナトリウムを用いてアルデヒドへ酸化する。3カルボキシル化された糖質、例えばグルクロン酸、ガラクタル酸、グリセリン酸、または酒石酸が、カルボジイミド試薬を用い、タンパク質アミンに付加される。このグリコシル化されたタンパク質は次に酸化され、過ヨウ素酸ナトリウムを用い、アルデヒド部分を生成する。4アルデヒドは、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびノイロミニダーゼなどの適当な酸化酵素を使用する、酵素的酸化によっても生成することができる。例えばノイラミニダーゼを使用し、末端シアル酸を除去し、次いでガラクトースオキシダーゼが使用される。5アルデヒドのタンパク質または多糖上のアミンへの化学付加は、スクシンイミジルpホルミル安息香酸またはスクシンイミジルpホルミルフェノキシ酢酸を使用し実行することができる。これらのアルデヒドのNHSエステルは、アミンと反応し、アルデヒドの付加を生じる。6更に別の方法は、ビスアルデヒドのアミンとの反応を使用する。7別の適当な方法は、還元的アミノ化を使用し、グリセルアルデヒドをタンパク質アミンへ付加し、次いで過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化し、アルデヒドを生成する。任意で、この複合体が残留する遊離のアミノオキシ基またはアルデヒドを含む場合、ならびにこれらの基を反応停止することが望ましい場合、追加工程が採用される。アルデヒドを有する複合体を反応停止する方法のひとつは、還元、例えば水素化ホウ素ナトリウムの使用である。あるいは残留カルボニルは、モノアミノオキシ試薬、例えばアミノオキシ酢酸により停止することができる。残留アミノオキシ基は、一官能性カルボニル、例えばグリセルアルデヒド、アセトンまたはコハク酸セミアルデヒドにより停止することができる。Eアミノオキシ試薬複合ワクチンの調製は、様々なアミノオキシ試薬を使用し実現することができる。様々な有用なホモ官能性およびヘテロ官能性アミノオキシ試薬は、当業者により調製され、同じくSolulinkIncにより入手することもでき、更に他のものは文献に説明されている。更に多くが想像でき、かつ容易に合成することができる。ToyokuniらSynthesisofanewheterofunctionallinkerN4butylmaleimideforfacileaccesstoathiolreactive18Flabelingagent、BioconjugateChem141253。本発明に従い使用することができる試薬の適当な非限定例は、Solulinkにより調製されたものを含む。例えばビスシステアミンは、ヘテロ官能性チオールアミノオキシ試薬へ転換することができる、ホモ官能性アミノオキシ試薬である。Bocは、tブトキシカルボニル保護基について、当技術分野において認められる頭字語である。Bocアミノオキシ酢酸を使用し、例えば下記スキームに従い、多くの適当なアミノオキシ試薬を合成することができる。Rにより指定されたリガンドは、本発明に従い使用することができる求核リガンドの適当な非限定的例である。前記試薬は、Bachemから入手可能な、2酢酸を基にしている。アミノオキシ試薬の生成のための他の有用な出発試薬は、NBocヒドロキシルアミンおよびNFmocヒドロキシルアミンである。これらの試薬は、AldrichChemicalから入手可能である。NBocヒドロキシルアミンは、以下のように有用なアミノオキシ試薬の調製に使用することができる。ホモ官能性アミノオキシ試薬は、本発明に従い使用することができる。使用することができる適当なホモ官能性アミノオキシ試薬は、例えばビスエチレンジアミン、ビスブタン、およびビステトラヒドログリコールを含み、これらは全て公知でありかつ当技術分野において認められた方法により調製することができる。例えばビスブタンは、以下のように調製することができる。様々な有用なヘテロ官能性アミノオキシ試薬の合成は、例えばMikolajczyketalBioconjugateChem5636;MikolaHanninenBioconjugateChem3182;WebbKanekoBioconjugateChem196などの文献に説明されている。Jonesらは、有用なアミノオキシ試薬への別の経路を提供する、NBocヒドロキシルアミンおよびヨウ化アルキルおよび臭化アルキルからのアミノオキシエーテルの合成を説明している。DixonおよびWeissは、本発明で使用することができるビスアミノオキシ試薬を説明している。ケトンを、例えばNHSレブレートよりなどの試薬を使用し、アミンへ付加することができる。糖タンパク質などのタンパク質上の糖基は、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムにより、カルボニルへ酸化することができる。加えてRoseらの論文に説明されたように、逆タンパク質分解を使用し、カルボニルまたはアミノオキシ基を付加することができる。タンパク質上のN末端トレオニンまたはセリンは、アルデヒドへ選択的に酸化することができる。小型のリンカー分子も、タンパク質および多糖をアミノオキシ基により官能基化するために使用することができる。例えば、VilasecaetalProteinconjugatesofdefinedstructuresynthesisanduseofanewcarriermolecule、BioconjChem4515;および、JonesetalSynthesisofLJP993amultivalentconjugateoftheNterminaldomainofb2GPIandsuppressionofanantib2GPIimmuneresponseBioconjChem121012を参照されたい。当業者に公知であるように、アミノオキシ、アミノオキシ、アミノキシ、およびオキシアミンは全て、同義語である。F間接的複合前述のように、第一部分と第二部分の間の複合は、直接的または間接的のいずれかで進行し得る。ある場合には、タンパク質および多糖を混合する方法は、望ましくない副作用につながることがある。場合によっては、直接カップリングを、互いに非常に近接しているタンパク質および多糖に行い、タンパク質と多糖の間の過剰な架橋の形成を促進することができる。このような極端な条件下で得られる物質は、非常に濃厚となり始める。過剰架橋は、タンパク質成分および多糖成分の免疫原性の低下も生じることができる。加えて架橋法は、複合体への外来エピトープの導入を生じることができ、かつそうでなければ有用なワクチンの製造にとって弊害をもたらし得る。過剰な架橋の導入は、この問題点を悪化する。タンパク質と多糖の間の架橋の制御は、各々の上の活性基の数、濃度、pH、緩衝液の組成、温度、スペーサーおよびまたは電荷の使用、ならびに当業者に周知の他の手段により制御することができる。例えば架橋度を制御するために、タンパク質と多糖の間にスペーサーを提供することができる。スペーサーは、タンパク質分子と多糖分子の間の物理的分離を維持することを補助し、これはタンパク質と多糖の間の架橋の数を制限するために使用することができる。追加の利点として、スペーサーは、得られる複合体の構造を制御するために使用することもできる。複合体が正確な構造を有さない場合、複合体物質の免疫原性に有害に作用し得る問題が生じる。非常に速いかまたは非常に遅いかのいずれかである、カップリング速度も、得られる複合体生成物の全体の収量、構造、および免疫原性に影響を及ぼす。SchneersonetalJournalofExperimentalMedicine152361。Gワクチン組成物本発明は更に、本発明の方法で生成された複合体から調製することができるワクチンおよび他の免疫学的試薬に関する。例えば、ワクチンまたは他の免疫学的試薬を作製するために、本発明の方法で生成された複合体は、当業者に公知の常法により、薬学的に許容できる媒体または送達ビヒクルと混合することができる。このようなワクチンまたは免疫学的試薬は、患者への投与に適した形を提供するために、本発明の複合体の治療的有効量を、適量のビヒクルと共に含有するであろう。これらのワクチンは、ミョウバンまたは他のアジュバントを含有してよい。薬学的に許容できる媒体またはビヒクルの例は、例えば、水、または石油、動物、植物もしくは合成起源のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む油などの滅菌液を含む。生理食塩水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に好ましいビヒクルである。水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、液体ビヒクルとして、特に注射用液剤において使用することができる。適当な薬学的ビヒクルは、当技術分野において周知であり、例えばEWMartinRemingtonsPharmaceuticalSciencesに記載されている。本発明に従い調製されるワクチンは、ジフテリアワクチン;百日咳ワクチン;破傷風ワクチン;b型インフルエンザ;肺炎レンサ球菌、全ての血清型;大腸菌、内毒素またはJ5抗原;大腸菌、O多糖;クレブシエラ、多糖;黄色ブドウ球菌5および8型;表皮ブドウ球菌、血清型多糖I、II、およびIII;髄膜炎菌、血清型特異的またはタンパク質抗原;ポリオワクチン;おたふくかぜ、はしか、風疹ワクチン;RSウイルス;狂犬病;A、B、C型肝炎および他の肝炎;IおよびII型ヒト免疫不全ウイルス;1および2型単純ヘルペスウイルス;CMV;EBV;水痘帯状疱疹ウイルス;マラリア;結核菌;カンジダアルビカンス、他のカンジダ;ニューモシスティスカリニ;マイコプラズマ;AおよびB型インフルエンザウイルス;アデノウイルス;A群レンサ球菌、B群レンサ球菌、血清型Ia、Ib、II、およびIII;緑膿菌;鼻炎ウイルス;パラインフルエンザ;コロナウイルス;サルモネラ;シゲラ;ロタウイルス;エンテロウイルス;トラコーマクラミジアおよびクラミジア肺炎病原体;ならびに、クリプトコックスネオフォルマンスを含むが、これらに限定されるものではない。本発明は、免疫賦活量のワクチンを投与することによる、患者の治療にも関連している。用語患者は、治療が有益である任意の対象を意味し、哺乳動物、特にヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、イヌ、およびネコ、更にはニワトリなどの他の動物を含む。免疫賦活量とは、疾患の予防、改善または治療のために、患者の免疫応答を刺激することができるワクチンの量を意味する。本発明のワクチンは、任意の適当な経路により投与することができるが、好ましくは、静脈内、筋肉内、鼻腔内、または皮下注射により投与される。例えば、糖質ベースのワクチンを、癌療法に使用することができる。加えて、本発明のワクチンおよび免疫学的試薬は、治療、予防、または診断の目的のような、任意の適当な目的のために投与することができる。本発明は、先に説明されたワクチンを患者に免疫し、その結果ドナーがそのワクチンに対する抗体を産生することによる、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、または化学物質により引き起こされた感染症に対する免疫療法物質の調製法にも関連している。抗体が単離されるか、またはB細胞が得られ、後に骨髄腫細胞と融合され、モノクローナル抗体を作出することができる。モノクローナル抗体の作出は一般に、当技術分野において公知であるを参照されたい。本明細書において使用される免疫療法剤は、患者の受動的治療において使用するために、特異的免疫原に対する抗体の組成物を意味する。血漿ドナーは、ワクチン中に含まれる免疫原に対する抗体を産生するためにワクチンが注射される任意の対象である。実施例1:アミノオキシ官能基化されたタンパク質の調製下記実施例は、多糖と複合することができるアミノオキシ官能基化されたタンパク質の調製を例示している。ウシ血清アルブミンを、モデルタンパク質として使用した。ビステトラエチレングリコールを、カルボジイミドにより、ウシ血清アルブミン上のカルボキシ基に連結した。BSA単量体を、論文に説明されたように調製した。ビステトラエチレングリコールにより調製、MW361は、05MHCl850μl中に作製した。5NNaOHを添加し、pHを~45に調節した。BSA単量体1mlを添加した。25μlの新たに調製したEDCプロピル3エチルカルボジイミド塩酸塩、水中100mgmlを添加することにより、反応を開始した。約3時間後、この溶液を、生理食塩水に対して4°Cで一晩透析した。次いでこの溶液を、生理食塩水で4mlとし、AmiconUltra4遠心装置で、~05mlに濃縮し、更に生理食塩水で平衡化した1x15cmG10カラム上で脱塩した。次に排除容量画分を、AmiconUltra4装置を用い、~1mlに濃縮した。BCAアッセイを用い、タンパク質濃度は、34mgmlBSAであると概算した。トリニトロベンゼンスルホン酸アッセイは、強い赤色オレンジ色を生じ、このことはアミノオキシ基の存在を示している。実施例2:アミノオキシ誘導体化された多糖の調製下記実施例は、タンパク質、ペプチド、またはハプテンに複合することができる任意のアミノオキシ官能基化された多糖の調製を例示する。Pn14を、CDAP40mg、引き続きトリエチルアミンをpHが94に上昇するまで添加することにより、活性化した。約25分後、05Mヘキサンジアミン4mlを添加した。この反応を、約2時間進行させた。次いで過剰な試薬を、生理食塩水に対する透析により除去し、アミノPn14を得た。次にアミノPn14は、過剰なNHSブロモ酢酸とpH8で反応させ、生理食塩水に対し暗所で4°Cで透析した。ブロモ酢酸化されたPn14を、加圧濾過により濃縮し、次いで水に対して透析した。アミノオキシシステアミンを、ビスアミノオキシシステアミンから、以下のような、TCEP還元、それに続くDowex1X8カラム上でのイオン交換により調製した:ビスシステアミンを、最大50NMP水中に作製し、01Mとした。TCEPは、水中に05Mで作製し、1M炭酸水素ナトリウムの3xモル等量を添加した。15モル過剰なTCEPを、ビスシステアミンと混合し、炭酸ナトリウムでpH~7に調節した。10分後、この混合物を、pH5の10mMビストリス中に5倍希釈した。この反応混合液を、1MNaClで洗浄し、および10mMビストリスで平衡化した1x3cmDowex1x8カラムに負荷した。還元したアミノオキシシステアミンを、カラムを通る流動中に認めた。アミノオキシシステアミンを、ブロモアセチル化されたPn14に添加し、暗所でpH8で反応させた。次いで反応混合物を濃縮し、ダイアフィルトレーションし、次いで水に対して透析した。Pn14濃度を、レゾルシノール硫酸法により、91mgmlであると決定した。TNBSアッセイおよびアミノオキシ酢酸を標準として用い、アミノオキシ濃度を、074mMと概算し、多糖100kDa当たりに約8個のアミノオキシ基を得た。実施例3:BSAデキストラン複合体の調製下記実施例は、アミノオキシ官能基化されたタンパク質および酸化された多糖を使用する複合ワクチンの調製を例示している。特に実施例2において調製されたアミノオキシ官能基化されたBSAを、酸化されたデキストランに連結した。デキストランを、以下のように、過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化した:T2000デキストラン10mgml溶液を、酢酸ナトリウム中10mMとし、次いで10mM過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、室温暗所でインキュベーションした。1、5、10、および15分後に、アリコートを採取し、グリセロールの添加により反応停止し、暗所で水に対して透析した。デキストランの最終濃度は、約45mgmlと決定した。タンパク質を、以下のように多糖へ複合した:酸化されたデキストラン調製物の各々110μlを、15μlのBSAアミノオキシと混合した。室温暗所で一晩反応させた後、試料をSDSPAGEにより分析した。図1に関して、レーンは、1分間酸化されたデキストラン;dexox5分間;dexox10分間;dexox15分間で調製された複合体;BSAアミノオキシのみである。各複合反応は、ゲルに進入しない高分子量物質を生じたことは明らかである。本質的に複合していないタンパク質は明白ではなく、これは高度の複合を示している。これら4種の複合体をプールし、生理食塩水により平衡化した、S400HRゲル濾過カラム上で分画した。排除容量画分をプールし、タンパク質および多糖についてアッセイした。このプールは、021mgmlBSAおよび027mgmlデキストランを含有することを決定した。当初のタンパク質および多糖の少なくとも50を回収した。従って酸化された多糖を伴うアミノオキシタンパク質は、優れた収量で可溶性複合体を生じた。実施例4:AO官能基化されたTTの調製下記の仮説に基づいた実施例は、二工程法を使用する、アミノオキシ基を伴う破傷風毒素誘導体の調製を例示している。2MNaCl中の破傷風毒素1mlを、1MHEPES50μlの添加により、pH8とした。このタンパク質を、01MNHSブロモ酢酸7μlの添加により、ブロモアセチル化した。1時間インキュベーションした後、アミノシステインアミン2μモルを添加した。一晩反応させた後、過剰な試薬を、2MNaClに対する透析により除去した。タンパク質濃度を、BCAアッセイを用いて決定し、アミノオキシ基の存在を、TNBSを用い確認した。実施例5:二工程法を使用するアミノオキシ誘導体化されたBSAの調製BSAのブロモアセチル化:BSA単量体41mlを、1MHEPES400μlおよび水55mlの添加により、pH8とした。NMP中の02MNHSブロモ酢酸1mlを、激しく攪拌しながら、ゆっくり添加した。一晩室温暗所で反応させた後、この溶液を、生理食塩水に対し2日間透析し、遠心し、濾過した。153mgmlのBSA106mlを得た。アミノオキシシステアミンの調製:ビスアミノキソシステアミン515mgを、1M炭酸ナトリウム11ml、DMSO586μl、および水586μl中に作製したTCEP56mgの溶液に添加した。15分後、TCEPを、10mMビストリスで平衡化した、1x5cmDowex1x8カラムで除去した。DTNB陽性の流れをプールし、226mMチオールであることを認めた。6mlを、ブロモアセチル化されたBSAに添加し、pHを8に調節した。反応を、暗所で一晩進行させ、次いで生理食塩水に対し4°Cで2日間、複数回交換しながら透析した。アミノオキシBSAを、約86mgmlであると決定した。pH8でのTNBSによるアリコートの反応は、オレンジ色がかった色を生じ、これはアミノオキシ基の存在を示している。実施例6:アミノオキシ誘導体化された多糖およびアミノオキシ複合体の調製のためのCDAPの使用本実験は、アミノオキシ誘導体化された多糖およびアミノオキシ複合体を調製するためのCDAPの使用を例示している。これは、どのように酸化以外の化学を使用し、多糖をアミノオキシ基により官能基化するかを例示している。ICDAP化学を使用するアミノオキシ誘導体化された多糖の調製二官能性アミノオキシ試薬の溶液を、1MNaAc200μl中にビスアミノオキシ酢酸により調製29mgを可溶化することにより調製した。デキストランを、以下のようにCDAP化学を用いて活性化した。水中のT2000デキストラン10mgmlの溶液05mlに、CDAP25μlを添加し、30秒後、02Mトリエチルアミン25μlおよび無希釈のTEA5μlの3回の添加により、pHを上昇した。25分後、pHを、1MNaAc100μlの添加により、低下させた。次いでビスAO溶液200μlを添加した。~30分間反応させた後、この溶液を、NaAc緩衝液で平衡化した1x15cmP6DGカラム上で脱塩した。脱塩した多糖は、レゾルシノールアッセイを用い、デキストランが17mgml、およびTNBSアッセイを用い、約11個アミノオキシ基100kDaデキストランと概算した。II酸化されたオボアルブミンの調製オボアルブミンの溶液04mlへ、1M酢酸ナトリウム10μlを添加し、引き続き05M過ヨウ素酸ナトリウム10μlを添加した。室温暗所で15分間インキュベーションした後、50グリセロールを数滴添加することにより、反応を停止した。次いで反応混合物を、再度暗所でNaAc緩衝液に対して透析した。280nmでの吸光度により、酸化されたオボアルブミンの濃度は、66mgmlであった。III複合体および対照の調製以下の溶液を調製し、各々室温暗所で一晩インキュベーションした:A500μlDexAO75μlOVA100μl1MNaAcpH5B250μlDexAO375μlNaAc緩衝液50μl1MNaAcC250μlNaAc緩衝液375μlOVA50μl1MNaAc。次に各々を、SDSPAGEおよびSECHPLCによりアッセイした。SECHPLCにより概算すると、試料Aのみ、高分子量物質を含有し、~20のタンパク質が複合した。BもCも、SECHPLCまたはSDSPAGEにより、HMW物質を示さなかった。実施例7:ビスアミノオキシ試薬による多糖の標識のための臭化シアンの使用この予言的な実施例は、臭化シアンを使用する、アミノオキシ試薬による多糖の誘導体化を明らかにしている。多糖は、水中に10mgmlで作製し、pHstat内で多糖1mgにつき1mgのCNBrにより、pH105で6分間処理した。次いで反応混合物を、05Mビスアミノオキシ試薬の添加により、~pH7に低下した。一晩反応させた後、この溶液を、水に対して透析し、アミノオキシ基についてTNBSにより、および糖質についてレゾルシノールアッセイによりアッセイした。このアミノオキシ誘導体化された多糖は、カルボニル含有タンパク質との複合に使用した。別の態様に従い、CNBr活性化された多糖は、アミノオキシ酢酸と反応することができる。これは、カルボキシ基で官能基化された多糖を生じるであろう。カルボキシ基は次いで更に官能基化され、間接的または直接的にタンパク質へ連結される。実施例8:アミノオキシ誘導体化されたタンパク質の酸化された多糖による複合この実施例は、アミン上に生じる官能基化による、アミノオキシ誘導体化されたタンパク質の調製を例示している。このアミノオキシ誘導体化されたタンパク質は次いで、臨床的に関連のある多糖である髄膜炎菌AおよびCへ共有的に連結される。Iタンパク質のそのアミンのアミノオキシ基を伴うタンパク質への官能基化性タンパク質上のアミンは、ブロモアセチル化され、次いでチオールアミノオキシ試薬と反応し、ペンダントアミノオキシ基を伴うタンパク質を生成する。ビスシステアミン2HClは、Solulinkにより調製した。BSA単量体は、422mgmlであった。NHSブロモ酢酸は、Prochemから入手し、NMP中に01Mとした。アミノオキシタンパク質を、以下のように調製した。2本の各チューブ内で、BSAおよびH2O250μl1MHEPES100μlの溶液05mlを調製した。1本のチューブはNHSブロモ酢酸の30倍モル過剰量と、および他方は10倍モル過剰量と反応させた。約1時間後、各々を、酢酸ナトリウム緩衝液で15mlとし、AmiconUltra15装置を用い、約200μlに濃縮した。アミノオキシ酢酸システアミンを以下のように調製した:1M酢酸ナトリウム114μlNMP114μlを溶媒とするビスシステアミンにより調製98mgの溶液に、1MHEPES中の025MTCEP228μlを還元剤として添加した。1時間後、部分的に還元されたアミノオキシチオール試薬を、ブロモアセチル化されたBSA調製物の各々に添加し、pHを約pH8に調節し、その反応を暗所で、4°Cで一晩進行させた。各々は、AmiconUltra15装置を用いて脱塩し、NaAc緩衝液により容量を15mlとし、遠心した。この脱塩工程を、4回繰り返した。最終容量は、約200μlであり、次いでNaAc緩衝液で約1mlとした。この生成物を、BSASAOと称した。280nmでの吸光度により、30x調製物は298mgml、および10x調製物は248mgmlと決定した。II酸化された髄膜炎菌多糖AおよびCの調製NeissPsAおよびPsCは、水中に10mgmlで、室温で一晩可溶化し、次いで4°Cで貯蔵した。1M酢酸ナトリウム50μlを、各多糖溶液1mlに添加し、引き続き05M過ヨウ素酸ナトリウム25μlを添加した。室温で暗所に10分放置後、各々を水4Lに対して4時間透析した。次いで各々を水で4mlとし、更にAmiconUltra4装置を用い脱塩した。レゾルシノールアッセイを用い、酸化されたNeissPsAは121mgml、および酸化されたNeissPsCは178mgmlと決定した。III酸化されたNeissPsAおよびPsCによるBSASAOの複合BSASAOならびに酸化されたPsAおよびPsCの下記混合物を調製した。室温暗所において一晩反応させた後、複合体を、Phastゲルを還元条件下で用い、SDSPAGEによりアッセイした。図2に関して、レーンは左から右へ、BSA30xPsA、BSA30xPsC、BSA30x、BSA10xPsA、BSA10xPsC、BSA10xであった。ゲルに進入しなかった著しい量の高分子量材料が認められ、このことはタンパク質の多糖への複合が生じたことを示している。PsA複合体をプールし、生理食塩水により平衡化した、S400HRカラム上でゲル濾過により分画した。同様にPsC複合体をプールし、分画した。約1ml画分を収集し、タンパク質またはレゾルシノールアッセイを用い糖質についてアッセイした。結果を、図3に示した。PsC複合体に関して、チューブ1822をプールし、PsA複合体に関して、チューブ1923をプールし、および還元条件を用いSDSPAGEにより試験した。図4に関して、BSANeissPsC複合体は左側に、およびPsA複合体をその隣に配置した。右側は、分子量標準である。各々に少量の遊離のBSAが認められ、このことは複合されたタンパク質と遊離のタンパク質の間の不完全な分離を示している。各々、ゲルへ進入した著しい量の複合された高分子量の物質を含んでいる。実施例9:アミノオキシPn14複合体の調製この実施例は、アミノオキシ基のケトンとの反応を例示し、これは、複合体の形成、より詳細にはアミノオキシPn14の調製に使用することができることを示している。NHSレブリン酸塩は、Solulinkから入手し、100μlNMP中51mgに可溶化することにより作製した。これは、485mgmlのBSA200μl、水200μl、および1MHEPES100μlの激しく攪拌している溶液に緩徐に添加した。一晩反応させた後、混合物を、AmiconUltra15装置を用い、ダイフィルトレーションした。最終容積は、05mlであった。この生成物は、BSALEVであった。BSALEV100μlを、アミノオキシPn14300μlと一緒にし、数日間暗所でインキュベーションした。複合体および個別の成分を、Superose6カラムを用い、SECHPLCによりアッセイした。次いで複合体を、S400HRカラム上で分画した。タンパク質はBradford色素法を、および多糖はレゾルシノール法を用いてアッセイした。高分子量画分は、BSAmgPn14を06mg含有することが見出された。実施例10:アミノオキシBSAナイセリアPsC複合体の調製一般にJenningsLugowskiJImm1271011に説明されるように、NeissPsCを酸化し、末端アルデヒドを生成した。SECHPLCは、PsCの分子量が有意に低下したことを示した。PsCおよびBSAAOを一晩複合した後、SECHPLCSuperose6上で05ml分で、分析を行った。複合体を、10mM酢酸ナトリウム、150mMNaCl、2mMEDTAで平衡化した、1x60cmS200HRカラム上で分画した。SEC分析およびゲル濾過の両方により、ほとんどのBSAは複合されたことを決定した。高分子量ピークを、タンパク質および糖質について分析し、濃度02mgBSAmgPsCを決定した。実施例11:アミノオキシBSAナイセリアPsA複合体の調製この実施例は、タンパク質のアミノオキシ基による官能基化による、ナイセリアPsABSA複合体の調製について例示している。NeissPsAは、一般にJenningsLugowskiJImm1271011に説明されるように、NaBH4によりアルジトールへ末端が還元され、次いで酸化され、末端アルデヒドを生成している。ナイセリアPsAは、水中に、20mgmlで15分間可溶化した。可溶化された多糖1mlへ、水素化ホウ素ナトリウム10mgを添加した。このpHを約8~9に維持した。1時間後、1MNaAc100μlを添加し、pHを5に調節した。還元されたPsAを、生理食塩水で平衡化した、1x15cmG10カラム上で脱塩し、この排除容量画分を、AmiconUltra4により約1mlに濃縮した。固形過ヨウ素酸ナトリウム20mgを、1M酢酸ナトリウム100μlと共に添加した。室温暗所で15分間酸化した後、グリセロール液滴の添加により、反応を停止し、次いで10mMNaAC、150mMNaClおよび2mMEDTAで平衡化した1x15cmG10カラム上で脱塩した。排除容量をプールし、BCAアッセイにおいて陽性であることを認め、これは還元糖の存在を示している。この物質をダイアフィルトレーションし、Ultra4装置により酢酸緩衝液へ濃縮した。アミノオキシBSAおよびPsAの両方を、SECHPLCにより試験した。PsAの分子量は、還元酸化法により顕著に低下した。複合:複合工程において、6mgmlのアミノオキシBSA150μlを、PsA50μlおよび1MNaAc25μlとpH5で混合した。暗所で4°Cで一晩インキュベーションした後、複合体を、SECHPLCにより分析した。PsAは、ごくわずかな吸光度に寄与し、およびAOBSAは複合時に分子量が増大したことが認められた。この複合体を、1x60cmS200HRゲル濾過カラム上で分画し、高分子量画分を、タンパク質およびPsAについてアッセイし、04mgBSAmgPsAを含有することを認めた。結論:還元酸化法は、アミノオキシタンパク質に連結することができるアルデヒドを生成するのに、良く作用した。PsAは恐らく、NaBH4工程時に加水分解され、これはpHを上昇する。実施例12:PRPBSAAO複合体の調製1PRPHibの酸化227mgPRPHibを、水中に10mgmlとし、1MNaAc100μlおよび05M過ヨウ素酸ナトリウム46μlと混合した。暗所および氷上で反応を15分間進行させ、次いで50グリセロールで停止した。反応混合物を、AmiconUltra4装置4x4mlで水へダイアフィルトレーションし、最終容積を、約1mlとした。レゾルシノールアッセイを、10mgmlで行った。この試料は、BCAアッセイにおいて陽性であり、このことはアルデヒドの存在を示している。2アミノオキシBSAの複合AOSBSAを、15mgmlで提供した。BSASAO10mgの667μlを、1M酢酸ナトリウム100μlおよび約1mlPRPと一緒にし、暗所で一晩反応を進行させた。次いでこれは、025Mアミノオキシ酢酸50μlの添加により反応停止した。3PBS05ml分で平衡化したSECSuperose6調製等級HR1030によるアッセイ、OD220ここで、複合体05mlを、1x60cmS200HR上で分画し、PBSで平衡化した。全ての画分が、BSAの前に溶離し、より高いMWを示した。実施例13:グリシド酸の酸化によるBSAPn14複合体の調製この実施例は、グリシド酸が、カルボジイミドを使用し、BSA上のアミンに付加されるプロトコールを例示している。次いでタンパク質上のグリシド酸は酸化され、アミノオキシPn14と反応した。IBSAグリシド酸BSA単量体およびグリシド酸を、各々、水中の最終濃度125mgmlおよび28mgmlに混合した。このpHを約5に調節し、水中の100mgmlEDCの220μlを添加した。pHは約5におよそ15時間維持し、1M酢酸ナトリウム0025mlの添加により、反応を停止した。次いで反応混合物を、生理食塩水に対し、4°Cで一晩透析した。IIBSAグリシド酸の酸化1M酢酸ナトリウム100μlを、BSAグリシド酸1mlに、次いで水中の05M過ヨウ素酸ナトリウム25μlを添加した。暗所で10分間放置後、グリセロールを添加し、反応を停止し、カットオフ値30kDaのAmicon超遠心装置を用い過剰な試薬を除去した。最終容積は、約400μlであった。酸化されたBSAグリシド酸100μlを、93mgmlのアミノオキシPn14250μlと、1M酢酸ナトリウム50μlと共に混合した。アリコートを、SECHPLCにより評価した。一晩反応させた後、別のアリコートを、同じ方法でアッセイした。吸光度の有意な部分は、排除容量で溶離されたことが認められ、このことはこのタンパク質は高分子量Pn14に連結されたことを示している。S400HRカラムでのゲル濾過後、高分子量画分は、03mgBSAmgPn14を含有することを決定した。この比は、先のクロマトグラムにおいて複合された高分子量タンパク質の割合から決定されたものに類似している。従って、カルボジイミドを用いグリシド酸をタンパク質へ連結する方法は、タンパク質上にアルデヒドを形成し、これが引き続きアミノオキシ基に連結されることを提供する。実施例14:BSAをデキストランへ連結するためのアミノオキシ化学の使用この実施例は、アミノオキシ誘導体化されたタンパク質へその還元末端を介した、オリゴ糖の結合を例示している。T40デキストランを、水中に100mgmlとした。還元末端の数は、標準としてグルコースを用いるBCAアッセイを用いて概算した。35mM還元末端100mgmlT40デキストランが存在し、その平均分子量は、約28000kDaであることが見出された。BSA1個につき~8個のアミノオキシを有するアミノオキシBSA5mgを、pH5でT40デキストランと2つの比で混合した:BSAAO153mgml830μlを、T40デキストラン100mgmlの620μlおよび1MNaAc100μlと混合した。BSAAO153mgml830μlを、T40デキストラン100mgmlの31mlおよび1MNaAc500μlと混合した。溶液は、室温暗所で1週間反応させ、次いでSECHPLCでアッセイした。両方の複合体は、BSAAOよりもはるかに早く溶離し、このことはそれらの分子量が増加したことを示している。次いで複合体を、アニオンイオン交換により分画した。SECプロファイルと同じく、より高い分子量は、より低いイオン強度で、複合体を溶離した。IEX溶離画分を、糖質のタンパク質に対する比について分析し、質量比およびモル比の両方でプロットした。各IEX溶離液からのピーク画分を、SECHPLCで分析した。T40dexBSA複合体について、BSA単量体は存在せず、MWの高対低の比は増加した。SDSPAGEは、高分子量の性質の複合体IEXが溶離することを確認した。実施例15:オリゴ糖およびタンパク質を連結するためのアミノオキシ化学の使用この実施例は、オリゴ糖を、その還元末端を介してタンパク質へ間接的に連結するためのアミノオキシ化学の使用を明らかにしている。このプロトコールの全般的説明は以下である。T40デキストランの還元末端を、アミノオキシ酢酸のアミノオキシ基と反応させ、ひとつの末端に単独のカルボキシ基を有するデキストランを生成した。このカルボキシ基を次に、エチレンジアミンおよびカルボジイミドとの反応により、アミンへ転換した。次いでアミン先端のデキストランを、チオール化し、マレイミド誘導体化されたBSAと反応させ、そこから伸びる糖質の糸を伴うタンパク質からなる複合体を生成した。Iデキストランの還元末端へのアミノオキシ酢酸の付加T40デキストラン850mgを、水850μl中に室温で一晩可溶化した。アミノオキシ酢酸235mgを、DMSO850μlおよび1M酢酸ナトリウム500μlの混合液中に可溶化し、T40デキストラン溶液と混合した。追加のDMSO500μlを添加し、約50DMSO溶液を形成した。約68°Cで約6時間インキュベーションした後、この溶液を水に対し十分に透析した。この生成物は、その還元末端に単独のカルボキシ基を有するデキストランであった。この溶液に、エチレンジアミン2HCl18gを添加し、pHを1NNaOHで約5に調節した。EDCプロピル3エチルカルボジイミド塩酸塩220mgを添加し、pHを約5で3時間維持した。次いで1M酢酸ナトリウムを添加することにより、反応を停止し、生理食塩水に対して透析し、およびAmiconUltra15を用い濃縮した。次いでこれを更に、生理食塩水に対し、次に水に対し透析した。この生成物を、TNBSを用いアミンについて、およびレゾルシノールアッセイを用い糖質についてアッセイした。デキストラン40000kDaにつき約045個のアミンが存在することが決定された。この生成物は、その還元末端に単独のアミン基を有するデキストランであり、およびNH2AOAcT40デキストランと称された。レゾルシノールアッセイを用い、この溶液は、濃度約119mgmlデキストランであることが決定された。T40デキストランは、このポリマー内の還元末端の置換の実際の度合いを決定することが困難であるような、分子量分布からなる。IIチオール化されたデキストランおよびマレイミドBSAマレイミド誘導体化されたBSAを、以下のように調製した:GMBSを、BSA単量体200μl、075MHEPES50μl、5mMEDTA、および水100μlの溶液へ添加した。2時間反応させた後、1M酢酸ナトリウム100μlの添加により、pHを低下させた。この溶液を、AmiconUltra4限外濾過装置および10mMNaAc、015MNaCl、5mMEDTAを用い脱塩した。NH2AOAcT40デキストランは、SPDPを用い以下のようにチオール化した:NH2AOAcT40デキストラン05mlを、1MHEPES100μlと混合し、および01MSPDP100μlを添加した。約2時間後、01MEDTA50μlを添加し、引き続き水を溶媒とする1M酢酸ナトリウム100μlおよび05Mジチオスレイトール50μlを添加した。1時間インキュベーションした後、この溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液に対して4°Cで一晩透析した。チオール先端のT40デキストランおよびマレイミド誘導体化されたBSAを混合した。一晩反応させた後、混合液の半分を、生理食塩水で平衡化した1x60cmS400HRカラムを用いるゲル濾過により分画した。比較のために、BSA単量体100μl、T40デキストランAOAc300μl、および生理食塩水05mlの混合物を、同じゲル濾過カラム上で同様に分画した。画分を、280nmの吸光度によりタンパク質について、およびレゾルシノールアッセイを用いデキストランについて分析した。図5ADに関して、タンパク質およびデキストランは、T40デキストランAOAcチオールマレイミドBSA複合体である場合、これらの成分が混合された場合よりも、カラムからより早く溶離することは明らかである。このことは、より高分子量の複合体が生成されたことを示している。更にデキストランのタンパク質に対する比は増加した。これらのカラム画分を更に、SDSPAGEにより分析し、結果を図6に示した。左から右へ、MWマーカー、複合体画分18、20、22、24、26、混合物画分24、26、28、30、未分画複合体、出発BSAマレイミドであった。分画されない複合体は、小さい割合の遊離のタンパク質のみを含むことは明らかであり、これはこの複合体が高収量で生成されたことを示している。この混合画分においては、高分子量タンパク質は明らかではなかった。複合体画分においては、複合体のみが明らかであり、および本質的に遊離のタンパク質は明らかではなかった。このことは、複合体が高収量で生成されたことを確認している。実施例16:グリシド酸およびアミノオキシ誘導体化されたPn14を介したBSAPn14複合体の調製下記の実施例は、アルデヒド置換されたタンパク質を使用する、複合体の調製を例示している。ITSTUおよびBSAへの付加を使用するグリシド酸のNHSエステルのインサイチュー合成この工程において、グリシド酸ヘミカルシウム塩一水和物79mgを、NMP110μl中に可溶化した。これは、NMP中の05MTSTU200μl、およびトリエチルアミン100μlと混合し、24mgmlBSAの1mlに添加した。このpHをpH8に調節した。約2時間後、この混合物を、2x1L生理食塩水に対して透析した。BSA上の遊離アミンの数を、TNBSを用いて決定した。対照について、この数は332NH2BSAであった。グリシド酸TSTUBSAについて、この数は25NH2BSAであった。これらの結果は、BSAは、約8個のグリシド酸単位BSAで標識されたという結論につながる。II官能基化されたBSAの酸化アリコート5mgを、25mMNaAc、および25mM過ヨウ素酸ナトリウムで作製した。この反応液を、室温暗所で15分間進行させ、次いでグリセロール液滴を添加し、この反応を停止した。混合物は、S200HRで分画し、主要ピークをプールし、濃縮した。IIIBSAAOPn14複合体の調製この工程において、アミノオキシ官能基化されたPn14444μlを、101mgmlとしたBSA04ml、1MNaAc100μlと混合し、室温で一晩反応させた。ゲル濾過S400HR1x60cm、生理食塩水002アジドSECHPLCによる分画は、グリシド酸TSTUBSAの酸化は、BSAの重合を引き起こしたことを示した。同じく、高分子量ピークの連続的増加が認められ、このことは複合は経時的に増加したことを示している。AOPn14単独は、最低の吸光度を有した。実施例17:メルカプトグリセロールブロモ酢酸BSAの調製この実施例は、BSAAOデキストラン複合体を調製する方法を例示している。ブロモアセチル化されたBSAの調製BSA単量体500μlを、NMP中の1MHEPES500μl、および01MNHSブロモ酢酸25μlと混合した。対照について、BSA250μlを、HEPES250μlおよびNMP12μlと混合した。約1時間後、各々を、AmicanUltra4装置を用い、生理食塩水へ脱塩した。最終容積は、BSAbromoAc450μl、およびBSA対照300μlであった。次に50mMメルカプトエタノールおよび50mMメルカプトグリセロールを、水中で調製した。調製物E:BSABromoAc225μlを、1MHEPES100μlおよび50mMメルカプトグリセロール50μlと混合した。調製物F:BSA対照を、1MHEPES100μlおよび50mMメルカプトグリセロール50μlと混合した。調製物G:BSABromoAc225μlを、1MHEPES100μlおよび50mMメルカプトエタノール50μlと混合した。30分後、各々を、NaAc緩衝液を用い、AmiconUltraで脱塩した。最終容積は05mlであった。次に各々を、新たに調製した05Mストック液から作製した10mM過ヨウ素酸ナトリウム中に入れ、暗所で4°Cで10分間インキュベーションし、次いでグリセロールを添加し反応停止し、AmiconUltra装置で脱塩し、NaAc緩衝液で洗浄した。OD280により、各々は約20mgmlBSAであると決定した。調製物Eは、BSAアルデヒドを含有し;調製物Fは、ブロモ酢酸で標識されず、そのためこれはメルカプトグリセロールと反応しなかった。従ってこれはアルデヒドを含まない。調製物Gは、ペンダントメルカプトエタノールを有し、これは酸化されず、そのためこれはアルデヒドを含まない。159mgmlのアミノオキシデキストラン315μlを、各BSA調製物250μlと一緒にし、室温暗所で一晩インキュベーションした。次いで各々を、生理食塩水で平衡化したS400HR1x60cm上でゲル濾過により分画した。高分子量画分は、タンパク質およびデキストランについて分析した。結果は、酸化されたメルカプトグリセロールを含有するBSAのみが、複合体を形成したことを示し、これは高分子量画分のタンパク質デキストラン比により確認された。EBSAメルカプトグリセロールAOdex097mgBSAmgdexFBSA対照AOdex01mgBSAmgdexGBSAメルカプトエタノールAOdex01mgBSAmgdex。実施例18:オキシム形成によるタンパク質の多糖への連結下記実施例は、オキシム形成による、タンパク質のそのN末端基を介した多糖への連結を例示している。リソスタフィンのN末端トレオニンが酸化され、ビスアミノオキシ試薬により誘導体化された。このタンパク質の酸化は、一般にGaertnerおよびOffordのSitespecificattachmentoffunctionalizedpolytotheaminoterminusofproteins、BioconjugateChem738に説明されているように実行した。リソスタフィン27kDaタンパク質は、乳酸球菌において産生された。試験番号1使用したリソスタフィンは、約30の遊離のN末端トレオニンを含んだ。GaertnerおよびOffordの条件を、N末端トレオニンの酸化に使用した。より詳細には、50モル過剰なメチオニンを、リソスタフィンの10mgml溶液1mlに添加した。炭酸水素ナトリウムを添加し、pHを83に調節した。酸化は、過ヨウ素酸ナトリウムの添加により開始した。反応混合液を、室温暗所で10分間維持し、この時点でDMSO中の50mgml溶液として調製したビステトラエチレングリコールにより入手71mgを、添加した。暗所に1時間放置後、この溶液を、生理食塩水に対して、室温暗所で透析した。生成物を、リソスタフィンAOと称した。このリソスタフィン濃度は、OD280で、049mgml吸光度単位を用い決定した。アリコートを、TNBSで試験した。これまでに、アミノオキシは、これらの条件下でTNBSと反応するが、アミンは反応しないことはわかっている。アッセイは、以下のように行った:リソスタフィンまたはリソスタフィンAO50μlを、01MNaAc440μlに添加し、次いで水中の10mgmlTNBS10μlを添加した。1mMアミノオキシ酢酸5μlを、前記溶液中の標準として使用した。暗所で6時間インキュベーションした後、試料を500nmで読みとった。試料溶液はオレンジ色であり、このことは、アミノオキシ基の存在を示している。標準を用い、約30のリソスタフィンが、AO基に誘導体化されたと概算した。このリソスタフィンAOは次いで、過剰に酸化されたT2000デキストランと、室温暗所で反応させ、オキシム形成を介して複合させた。この反応液は、SECHPLCによりアッセイし、低分子量から高分子量への質量のシフトを決定した。PhenomenexBiosepSEC2000は、PBSで平衡化し、05ml分で流し、280nmでモニタリングし、これをSECHPLCに使用した。図6に関して、上側クロマトグラムは、約1分の反応混合物であり、中間のクロマトグラムは、一晩反応後であり、下側図は、リソスタフィンAO単独であった。反応を一晩進行した後の、高分子量物質へのシフトに留意されたい。この図は、リソスタフィン上のAO基は、高分子量の酸化されたデキストランに連結されていることを示唆している。高分子量ピークの面積の割合を基に、約27がカップリングした。TNBSアッセイにより示されるように、リソスタフィンの約13が、遊離のトレオニンを含み、かつAOで誘導体化されたので、これは予想された割合内である。実施例19:DTAOPn14複合体の調製この実施例は、DTAOPn14複合体の調製を例示し、同じく試薬が、一容器反応として調製される方法を明らかにしている。Iメルカプトグリセロールジフテリア毒素ジフテリア毒素05mlを、NMP中の1MHEPES100μl、および01MNHSブロモ酢酸10μlと混合した。これを暗所で約30分間インキュベーションし、次いで123μlのメルカプトグリセロール10μlを添加した。一晩反応後、この溶液を、AmiconUltra4を用い、最終容積約400μlへ脱塩した。次に1M酢酸ナトリウム50μlを添加し、引き続き05M過ヨウ素酸ナトリウム9μlを添加した。酸化は、室温暗所で10分間進行させた。次いで50グリセロールの添加により、反応を停止した。低分子量成分を、同じAmiconUltra4装置上で除去し、生理食塩水中でダイアフィルトレーションした。最終容積は約200μlであった。前記プロトコールは、ブロモアセチル化されたDTおよびブロモ酢酸を含有する溶液への、過剰なメルカプトグリセロールの添加による、脱塩工程のひとつを省略した。II複合アミノオキシPn141mlを、酸化されたDTへ添加し、および1M酢酸ナトリウム100μlを添加した。反応を、室温暗所で一晩進行させ、次いでS400HRカラム上で分画した。高分子量画分をプールした。タンパク質は、1mgml1ODを用いて概算し、ならびにPn14濃度は、レゾルシノールアッセイを用いて決定した。この画分は、約13mgDTmgPn14を含有することが見出された。実施例20:gp350AOSPn14複合体の調製gp350は、ヒト補体受容体に結合する、エプスタインバーウイルスの糖タンパク質である。これは、DrGoutamSenにより酵母細胞において組換え的に作出され、疎水性相互クロマトグラフィーにより精製された。PBS中8mgmlのgp350の05mlのpHは、1M酢酸ナトリウム50μlの添加により低下し、および05M過ヨウ素酸ナトリウム11μlを添加した。暗所で8分間氷上でインキュベーションした後、反応を50グリセロール100μlの添加により停止した。過剰な試薬を、AmiconUltra4装置を使用するダイアアフィルトレーションにより除去した。合計4回、4mlのPBSで交換したものを使用した。最終容積は約300μlであった。この溶液へ、1MNaAc100μlを添加し、引き続きAOSPn14400μlを添加した。一晩暗所で4°Cで反応させた後、025Mアミノオキシ酢酸100μlの添加により、反応を停止した。得られた複合体は、生理食塩水で平衡化した、1x60cmS400HRカラム上でゲル濾過により分画した。排除容量画分をプールした。Pn14濃度を、レゾルシノール硫酸法で決定し、タンパク質は、1mgml1吸光度単位の吸光係数を使用し、280nmの吸光度から決定した。この複合体は、09mggp350mgPn14を含んだ。対照gp350は、アミノオキシ酢酸をアミノオキシPn14の代わりに添加した以外は、前述のように、酸化しかつ調製した。蛍光標識したgp350との競合アッセイにおいて、対照および複合化されたgp350の両方が、ヒトB細胞の補体受容体に結合することが可能であった。マウスを、gp350Pn14複合体で、0日目および10日目に免疫し、10日目および23日目に採血した。ブースト時の抗Pn14IgGの増加は、タンパク質および多糖が共有的に連結されかつT細胞依存性抗原として作用することの指標である。T細胞非依存性抗原として、Pn14単独は、力価の増加を示さなかった。実施例21:DeAcLTAAOSHGMBSBSA複合体の調製LTAは、pH10の炭酸水素ナトリウム中、約75°Cで1時間のインキュベーションにより、脱アシル化した。試料を次に、水に対して透析した。これは、脱アシル化されたLTAであった。試料を次に、10mM過ヨウ素酸ナトリウム中で、暗所室温で一晩酸化し、再度水に対して透析し、凍結乾燥した。この試料を、少量の水に溶解し、還元したアミノオキシシステアミンと共に一晩インキュベーションし、凍結乾燥した。試料は、水約1mlに溶解し、かつ10mM酢酸ナトリウム、150mMNaCl、および5mMEDTAで平衡化した、S200HRカラム上で分画した。Piおよびチオールの両方を含有する低分子量画分をプールし、凍結乾燥し、水約075mlに溶解した。この画分は、約1mMチオールおよび350μモルリン酸を含むことが見出された。この物質は、チオール標識したDeAcLTAであった。BSAは、50倍モル過剰なGMBSで標識し、酢酸ナトリウム緩衝液中で脱塩し、AmiconUltra4装置を用い、最終濃度約55mgmlに濃縮した。BSAGMBS60μlを、チオール標識したDeAcLTAへ添加した。反応が進行するにつれ、DTNBアッセイで決定したチオール濃度が、少なくとも110に減少した。複合化は、Superose6カラム上で、SECHPLCによりモニタリングした。下側トレースは、GMBS標識したBSA単独のクロマトグラムを示し、上側トレースは、増大した分子量を示すより早く溶離した複合体を示している。SDSPAGEにより、複合体のMWは、SECクロマトグラムと一致した様式で、明らかに増加した。BSA単量体は、この複合体において明らかではなかった。ウェスタンブロットを行い、高分子量タンパク質上のLTAの存在を明らかにした。この複合体はLTAに反応性であることが認められる。BSAもLTAも単独でまたは混合では、高分子量LTAを示さない。更にLTAとBSAの間の共有的連結を明らかにするために、二重ELISAを行った。ELISAプレートを、抗BSAで被覆し、引き続き複合体またはLTA、BSAもしくは混合物で被覆した。次いで抗LTAを塗布し、結合した量を決定した。従ってBSAおよびLTAの両方を含有する物質のみが検出される。このアッセイにおいては、複合体のみが陽性であった。従って反応のモニタリング、分子量、ウェスタンブロットおよび二重ELISAにより、これらは全て、タンパク質とLTAの間の共有的連結の形成を示した。実施例22:LTATT複合体の調製試薬を、Aldrichから入手した。アミノオキシアセチルシステアミンは、SolulinkIncのDrDavidSchwartzにより調製された。TCEPは、Pierceより購入した。黄色ブドウ球菌血清型5実験株は、100Lの発酵槽においてKempBiotechが増殖した。細胞を遠心し、再懸濁し、遠心し、細胞10Lのアリコートとした。この細胞ペーストを、70°Cで貯蔵した。アリコートを解凍し、01Mクエン酸ナトリウム中に再懸濁し、01mジルコニウムビーズを用いるBeadBeaterにより、破壊した。この装置は氷冷し、1分間のオンおよび1分間のオフの4サイクルで試行した。液体を除去し、ビーズをクエン酸緩衝液で洗浄した。あるいは、細胞を、1mgmlリソスタフィンで一晩4°Cで処理し、次いでMicrofluidizerModel110Yを用い、23000psiで3回通過させて破壊した。ILTA抽出LTAは、小さい変更を伴うFischerらのフェノール抽出法p52330、またはMorathらのブタノール法p3937のいずれかを用い、細胞ペレットから抽出しかつ精製した。簡単に述べると、破壊された細胞懸濁液を、等量のnブタノールと共に30分間激しく混合した。次いでこの溶液を、13000xgで20分間遠心した。上相を除去し、下側水相を凍結乾燥した。最初に、ブタノール相を再抽出し、新たな水相を、ELISAによりLTAについて試験したが、有意でない量のLTAが回収された。ペレットは、クエン酸緩衝液25ml中に再懸濁し、凍結した。数回の抽出を行い得られたペレットは一緒にし、破壊抽出法を繰り返した。可溶化した抽出物を、Whatman045μmシリンジフィルターを用いて濾過し、流量5ml分で、15nプロパノール中の01M酢酸アンモニウムで平衡化した、26x20cmOctylSepharoseカラム上に負荷した。このカラムを次に、280nmの吸光度がベースラインに戻るまで、15nプロパノール中の01M酢酸ナトリウムで洗浄した。次いでカラムを、40nプロパノール中の25mM酢酸ナトリウムで、4ml分で溶離し、8ml画分を収集した。リン酸含有する画分をプールし、同じ緩衝液で平衡化した、5mlSepharoseQFFカラムに負荷した。吸光度がベースラインに戻ったとき、このカラムは、緩衝液05MKClで溶離した。リン酸を含有するチューブをプールし、部分的に凍結乾燥し、容積を減少し、水に対して透析し、塩を除去し、再度凍結乾燥した。IILTAの破傷風毒素への複合LTA1mlは、01M炭酸ナトリウム01Mヒドロキシルアミン中での75°C2時間のインキュベーション、引き続きの35kDaカットオフメンブレンを使用する水に対する透析により、脱アシル化した。次いでこの溶液を、凍結乾燥し、水05mlに溶解した。脱アシル化されたLTAを、1M酢酸ナトリウム100μlおよび05Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム125μlの添加により酸化した。2時間後、50グリセロール100μlの添加により、反応を停止し、水に対し暗所で一晩透析した。この物質を、プルパルドアッセイp7382において、アルデヒドについて陽性であることを試験した。システアミンを、25NMP水溶液中への11mgビスシステアミンの可溶化により調製した。1M炭酸ナトリウム中のTCEPを添加し、この溶液を10分間インキュベーションし、次いで10mMビストリスで平衡化した、Dowex1x8カラムを通過させた。フロースルー中のDTNB陽性画分を、プールした。プールしたシステアミンを、チオールについてアッセイし、52μモルSHを含むことを測定した。この試薬を、酸化され脱アシル化されたLTAと混合し、暗所で4°Cで一晩インキュベーションし、次いで10mM酢酸ナトリウム、015M塩化ナトリウム、5mMEDTAに対し透析し、過剰な試薬を除去した。最終溶液は、25mMチオールおよび25mMリン酸2mlであった。15MHEPES、5mMEDTA中に緩衝した破傷風毒素の146mgml溶液へ、50倍モル過剰なGMBSを添加することにより、TTをマレイミドで標識した。1時間反応させた後、この溶液を、AmiconUltra4装置を使用する2MNaClへのダイアフィルトレーションにより脱塩し、遠心し最終容積04mlとした。維持された物質は、DTNB陽性であった。チオール化され、脱アシル化されたLTAを、窒素流れ下で、マレイミドTTと混合し、075MHEPESの添加により、pHを65に調節した。密封し、かつ一晩4°Cでインキュベーションした後、この溶液をアッセイし、依然2mMチオールであることを決定した。追加のTT7mgを、前述のようにマレイミドで標識し、ダイアフィルトレーションし、05mlに濃縮し、先の反応混合物に添加した。30分間かけて、チオール含量は次第に減少し、その時点で反応を、05Mヨウ化アセトアミド100μl1M炭酸ナトリウム100μlの添加により、停止した。この複合体を、生理食塩水で平衡化した、Superose6カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。IIIマウスの免疫20匹のBalbcマウス群を、先に説明されたように、TTとの混合またはTTとの複合のいずれか、およびRibiMPLアジュバントと共に、LTAの5μlで、0、14、および28日目に免疫し、14日後に採血した。個々の血清は、抗IgGについてELISAによりアッセイした。結果は図7に示した。M110を、標準として用いた。血清中の抗LTAレベルをアッセイした。結果を、図8に示した。この複合体は、高レベルの抗体を誘導し、かつ混合物は、わずかに非常に低レベルの抗体のみを誘導した。抗血清の生物学的活性を評価するために、オプソニン食作用を行った。血清は、125に希釈した。IVリン酸分析リン酸は、ChenPS、TYToribaraおよびHWarnerの論文28p17561758に説明されたものに若干の変更を加え決定した。簡単に述べると、13x100mmホウケイ酸製のチューブ中で、試料100μl硝酸マグネシウム30μlの溶液を、激しく攪拌し、ヒートブロック内で乾燥し、褐色の気体が放出されるまで、プロパントーチで火炎処理した。05MHClの300μlを添加し、チューブにガラス玉で蓋をし、沸騰水浴中で15分間加熱した。これらのチューブを冷却し、アスコルビン酸モリブデン酸アンモニウムの混合液700μlを添加し、45°Cで20分間インキュベーションし、試料を820nmで読みとった。この混合液は、モリブデン酸アンモニウムの溶液6部および水中10アスコルビン酸1部を混合することにより調製した。リン酸標準は、Sigmaから入手した。本発明の別の態様は、本明細書の考察およびここに明らかにされた本発明の実践から、当業者には明らかであろう。本明細書および実施例は、単なる例とみなされ、本発明の真の範囲および精神は、特許請求の範囲により示されることが意図される。本明細書は、本明細書に引用された参考文献の内容を考慮し、最も完全に理解される。本明細書内の態様は、本発明の態様の例示を提供し、本発明の範囲を制限するために構築されたものではない。当業者は、多くの他の態様が本発明に包含されることを、容易に認めるであろう。前記方法のいずれかは、本発明に従い適している。前記は、例示する例としてのみ利用され、限定しない。引用された刊行物および特許は全て、それらの全体が本明細書に参照として組入れられている。参照により組込まれた資料が本明細書と矛盾するか、または一致しない範囲では、本明細書が、そのような資料に優先するであろう。本明細書の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に先行することを認めるものではない。特に記さない限りは、特許請求の範囲を含む本明細書において使用される成分の量、反応条件などを表す全ての数値は、用語約により修飾されるものとして理解されなければならない。従って相容れないことが特に記さない限りは、数値パラメータは、概数であり、本発明により得られると考えられる望ましい特性に応じて変動し得る。控えめに見ても、特許請求の範囲への均等論の適用が制限されることを企図するものではないので、各数値パラメータは、有効桁の数値および通常の数字まるめ法を考慮し構築されるべきである。特に記さない限りは、一連の要素に先行する用語少なくともは、その系列の中の各要素を意味すると理解されるべきである。当業者は、本明細書に説明された本発明の具体的態様の多くの同等物を認めるか、またはこれを慣習的なものを超えない実験を用い確定することができるであろう。このような同等物は、特許請求の範囲に包含されることが意図されている。