以下の段階を含む、神経幹細胞NSCを産生する方法:a体細胞を提供する段階、bBmi1、Sox2、Mash1、Sox11、Emx2、Foxg1、およびPax6の群より選択される少なくとも2種の遺伝子を導入することにより、該体細胞をNSCへリプログラミングする段階;ならびにc増殖因子および低分子を用いてリプログラミングのために誘導する段階。dNSCの増殖に適する条件下で、段階bおよびcの産物をインキュベーションする段階をさらに含む、請求項1記載の方法。段階aの体細胞が、ヒト細胞である、請求項1または2のいずれか一項記載の方法。段階aの体細胞が、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、および脂肪細胞の群より選択される、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。段階cの増殖因子および低分子が、化学的に定義された培地の補給物である、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。化学的に定義された培地が、インスリン、トランスフェリン、およびプロゲステロンを補給した無血清培地である、請求項5記載の方法。段階bの少なくとも2種の遺伝子が、Bmi1およびSox2を含む、請求項1~6のいずれか一項記載の方法。段階bの少なくとも2種の遺伝子が、Mash1、Sox11、Emx2、Foxg1、およびPax6の群より選択される少なくとも1種の遺伝子をさらに含む、請求項7記載の方法。段階bの少なくとも2種の遺伝子が、Bmi、Sox2、およびMash1を含む、請求項7または8記載の方法。段階cの増殖因子が、FGF2、EGF、およびBDNFの群より選択される、請求項1~9のいずれか一項記載の方法。段階cの低分子が、ROCK阻害剤を含む、請求項1~10のいずれか一項記載の方法。ROCK阻害剤が、1ホモピペラジン、Nベンジル2チアゾール4カルボキサミド、トランス4Nシクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、およびN44ベンゾイルアミノアゼパン3イル4ヒドロキシ35ジメチルベンズアミドの群より選択される、請求項11記載の方法。体細胞が、ヒストンデアセチラーゼHDAC阻害剤で前処理される、請求項1~12のいずれか一項記載の方法。体細胞のリプログラミングが、レンチウイルスによる少なくとも2種の遺伝子の組み合わせの送達を通して達成される、請求項1~13のいずれか一項記載の方法。請求項1~14のいずれか一項記載の方法により取得された、神経幹細胞。CNS疾患用のインビトロのモデルとしての、請求項15記載の神経幹細胞の使用。請求項15記載の神経幹細胞を含む、治療用組成物。神経幹細胞が、ニューロンまたはグリア細胞に分化する、請求項17記載の治療用組成物。請求項1~14のいずれか一項記載の方法により取得されたNSCの、バイオバンク。本質的に本明細書において記載されるような、方法および使用。ヒト繊維芽細胞を神経幹細胞NSCへ変換するために使用される本発明による方法を図示する、本明細書における図1を参照することにより、本方法を例証することができる。本方法において、ヒト繊維芽細胞を、0日目にトリプシン処理し、計数し、かつその生存度を判定した。10×105~30×105個のトリプシン処理した繊維芽細胞を、その後、誘導培地に再懸濁し、遺伝子の組み合わせをレンチウイルスとして送達した。レンチウイルス導入の効率を増大させるために、誘導培地にポリブレンヘキサジメトリンブロミドを添加した。感染を、15分間エッペンドルフチューブ中で行った。遺伝子との組み合わせで、ヒトネスチンGFPレポーターを使用した。ネスチンは、NSCに特異的に発現される周知のマーカーである。ネスチンレポーターにおいて、蛍光タンパク質GFPはヒトネスチンプロモーターの発現下であり図2、従って、人工リプログラミング神経幹細胞irNSCGFPの容易なスクリーニングが可能になる。感染させた細胞を、適切な容量の誘導培地において10000~30000細胞cm2の濃度を用いて、組織培養プレート中にプレーティングした。1日目に、全誘導培地を更新した。ヒト繊維芽細胞と比較して形態に明らかな変化を有するいくつかのirNSCGFP図3を同定することが可能であった。irNSCGFPは、NSCに典型的である、より凝縮された細胞質を有する双極性かつ伸長した形態を獲得した。さらに、irNSCは、Notch経路の増殖促進性proproliferativeシグナルを活性化するために伝統的なNSC培養において獲得される典型的な細胞間相互作用に類似している、ぎっしり詰まった単層培養において増殖している。2日目、irNSCGFPは、より成熟した状態にあり、非常にぎっしり詰まった細胞のクラスターを形成し始めた。これらのirNSCのクラスターは、irNSCGFPを含有する緻密なコアを有する球状構造を形成し始めた図4。3日目、球状構造が完全に形成され、組織培養プレートから持ち上がって離れ、培地中にニューロスフェアとして浮遊し始めた。ニューロスフェアは、明白な境界を有するおよそ20~100μmの寸法を有し、かつ、irNSCGFPを同定することが可能である高密度の細胞を含むコアを有する図5。本発明の飛躍的進歩を達成するために、特定の遺伝子の組み合わせを使用することが必要であった。インビボおよびインビトロでNSC特性の維持に関与する遺伝子の以下のリストを、文献の知見から検索した:Sox2Sox転写因子で、かつNSCの重要なマーカー、Brn2Soxタンパク質に結合することが公知であるPOUドメインタンパク質。ネスチンプロモーター上のSox2およびBrn2の結合が報告されている。Brn2KOマウスはCNS発生の障害を有する、Bmi1細胞周期の調節に関与するタンパク質であり、サイクリンEcdk2複合体のp21およびp27阻害因子の発現を増加させることが報告されている。サイクリンEcdk2の阻害は、細胞周期に対する網膜芽細胞腫タンパク質制御の欠失を決定し、NSCの自己複製状態の間の高速細胞周期を結果としてもたらす、Mash1インビボで神経前駆体の増殖のための重要な調節因子であることが記載されている、Sox11インビボでSGZに発現していることが報告されているSoxタンパク質、NCamフローサイトメトリーにおけるNSCマーカーであり、CNSの様々な領域に発現している、Kpna1外胚葉由来組織においてタンパク質の核移行をインポーチンβと共に担うインポーチンα5としてよりよく知られている。すべての遺伝子を、cDNAとしてレンチウイルスプラスミド中にクローニングし、続いてレンチウイルス中にパッケージングした。Sox2、Bmi1、Mash1、Sox11、NCam、Kpna1、ネスチンGFPレポーターについてのレンチウイルスのパッケージングされた粒子を、ヒト繊維芽細胞中に直接導入した。様々な遺伝子の組み合わせを、上述の方法において検定した。3日目に、生成したニューロスフェアを計数することにより、irNSCの産生の成功を評定することが可能であった。50μmより大きいニューロスフェアのみを、考慮に入れた。図6に表わされるように、誘導培地へのファスジルの添加を伴わないネスチンレポーターレンチウイルスの導入は、ヒト繊維芽細胞をirNSCへリプログラミングしなかった。誘導培地へのファスジルの添加で、ニューロスフェア約50μmおよびいくつかのより小さいもの約20μm、計数していないの生成が報告された。遺伝子の組み合わせ:Sox2Bmi1を用いた本発明者らの革新的な方法で生成したニューロスフェアを3日目に収集し、さらに14日間拡大した。irNSCニューロスフェアの拡大は、重大な段階であった。特別な極めて低い非接着性プレートCorningにおいて、FGF、EGF、BDNFを補給したN2B27培地を用いて、ニューロスフェアを培養した。irNSCGFPニューロスフェアの同質の集団を達成するため、2~3日毎に清掃手順を適用した。拡大の14日間に、低密度のirNSCGFPを有するいくつかのニューロスフェアは、変換されていない繊維芽細胞の混入にほぼ確実に起因して、適切に増殖することができなかった。そのような種類の混入を有するニューロスフェアは、除去される必要がある単一の細胞に分解された。14日目に、ニューロスフェアを、ポリオルニチン/ラミニンコーティングされたプレートへの付着、およびニューロン様細胞の生成について検定した。付着については、細胞付着および伸展を改善するために、最初の日のみにファスジル10μMを補給した拡大培地において、ポリオルニチン/ラミニンコーティングしたプレート上に、20~40ニューロスフェア/cm2をプレーティングした。培養の1日目に、ニューロスフェアの付着および伸展を示すことが可能であった図7。伸展するニューロスフェアの中心に、本発明者らは、典型的なNSC形態を有するirNSCGFPを同定した。ニューロスフェアをさらに3日間増殖させ、かつその後、BDNFのみをN2B27に添加した。EGFおよびFGFを中止すると、irNSCは形態を変化させた。それらはより伸長し、かつ神経突起様の細胞突出を形成し始めた。分化条件の7日目に、細胞を固定し、ニューロンマーカーtuj1について染色した図8。ファスジルと共に拡大したニューロスフェアは、より良好な形態、および明白かつ鮮明な境界を有し良好に形成されたニューロスフェアの証明、図9、パネルB;ファスジルが無いと、ニューロスフェアは、ぼやけた境界を有する図9、パネルA。irNSCは、典型的なNSC形態を有し、かつSox2およびネスチン陽性であった図10。図11は、Rockキナーゼ阻害剤であるバラノール様324化合物が、GFPニューロスフェアの収率を増大させることを示す。これらの証拠は、本方法が、遺伝子導入最良の組み合わせ:Sox2Bmi1、Sox2Bmi1Mash1、Sox2Bmi1Sox11、Sox2Bmi1Emx2、Sox2Bmi1Foxg1、およびSox2Bmi1Pax6、図13も参照されたいならびに化学的に定義された培地誘導の連結された段階に基づいて、ヒト繊維芽細胞をirNSCへ変換できたことを示す。irNSCの収率を増大させるために、ヒト繊維芽細胞を、HDAC阻害剤であるバルプロ酸VPA、2プロピルペンタン酸、一ナトリウム塩を伴うかまたは伴わずに前処理した。この目的に向けて、ヒト繊維芽細胞を、感染の前に、1mMVPAを補給し、FBS10およびLグルタミンを補給したDMEMF12中でインキュベーションした図12。図14は、成体ヒト皮膚繊維芽細胞HDFaからのirNSCニューロスフェアの生成を示す。図15は、アスコルビン酸、ソニックヘッジホッグShh、Jagged1、DLL4、およびFGF8の組み合わせを用いたirNSCニューロスフェアの拡大を示す。図16は、NSCマーカーであるネスチンおよび初期ニューロンマーカーであるTuj1の発現についての、irNSCニューロスフェアの免疫細胞化学特徴決定を示す。材料および方法細胞培養:誘導培地:ヒトEGFPeprotech30ngml、ヒトFGF230ngmlPeprotech、ヒトBDNFRoche20ngml、およびファスジルCalbiochem10μMまたはバラノール様324化合物N44ベンゾイルアミノアゼパン3イル4ヒドロキシ35ジメチルベンズアミド2μMを補給したN2B27N2B27は、N2およびB27両方ともGibco由来を補給したDMEMF12GibcoPaisleyUKの11混合物である。拡大培地:ヒトEGFPeprotech30ngml、ヒトFGF230ngmlPeprotech、ヒトBDNFRoche20ngmlを補給したN2B27、またはFGF、EGF、BDNF20ngml;ヘパリン2μgml;バラノール様3242μM;アスコルビン酸02mM、SHH組み換えヒトソニックヘッジホッグ、カタログ番号:1845SH500ngml、FGF8組み換えヒトFGF8aアイソフォーム、カタログ番号:4745F8100ngml、DLL4組み換えヒトDLL4、カタログ番号:1506D4500ngml、Jagged1組み換えヒトJagged1Fcキメラ、カタログ番号:1277JG500ngmlを含むNeuroCult登録商標NSAProliferationKitヒト、StemCellsTechnologies。分化培地:ヒトBDNFRoche20ngml、ラミニン2μgmlInvitrogenを補給したN2B27。ヒト繊維芽細胞:IMR90胎児肺繊維芽細胞ATCCロット番号580229699または成体ヒト皮膚繊維芽細胞GIBCO、カタログ番号:C0135C。レンチウイルス:あらかじめパッケージングされ、そのまま使用できるレンチウイルス粒子を、SigmaStemgentReprogrammingLentivirusヒトSox2、カタログ番号ST070012、GenecopeiaヒトBmi1LentifectLentiviralParticles、カタログ番号LPB0015Lv105;Sox11LentifectLentiviralParticles、カタログ番号LPMO425LV105;Mash1LentifectLentiviralParticles、カタログ番号LPZ0740LV105;ヒトKpna1LentifectLentiviralParticles、カタログ番号LPU1286Lv105;NCam1LentifectLentiviralParticles、カタログ番号LPZ2645Lv105、およびSBISystemsBiosciencesネスチンGFPレポーター:pGreenZeo商標hNestinTranscriptionalReporterVirus、SR10035VA1から取得した。タイター:ネスチンGFP145105μl、BMI143105μl、Sox2107104μl、Sox1132106μl、Mash147106μl、NCam33104μl、Kpna118105μl。プロトコール:1.irNSCの生成:200000個のIMR90ヒト繊維芽細胞に、ポリブレンヘキサジメトリンブロミド、Sigma4μgmlを含む300μl誘導培地を有するエッペンドルフにおいて、様々な遺伝子の組み合わせについてのレンチウイルス各単一のレンチウイルスについて30の感染多重度MOIを使用するおよびレポーターネスチンGFPレンチウイルス10のMOIを使用するを感染させる。室温で15分間インキュベーションする。組織用処理された6ウェルプレートのウェル中の17ml誘導培地に、300μlをプレーティングする。1日目、2mlの誘導培地/各ウェルを更新する。3日目、浮遊性スフェアと共に2mlを注意深く回収し、ニューロスフェアを収集する。ニューロスフェアを拡大する。2.ニューロスフェアの拡大:6ウェルプレートの3ウェルから15mlチューブに、浮遊性ニューロスフェアと共に培地を回収する。スフェアを10分間沈降させる。上清を非常に注意深く除去する単一の細胞は沈降しないはずであり、上清と共に吸引する。スフェアを4ml最終容積の拡大培地に再懸濁する。超低接着性プレートのB6プレートCorningにプレーティングする。2~3日インキュベーションする。irNSCの生成から14日目まで、2~3日毎に拡大手順を反復する。3.ニューロスフェアの分化:irNSCの生成および拡大手順後の14日目に、明白な境界を有しかつirNSCGFPに富む丸いニューロスフェアを、実体顕微鏡の下で選択する。ファスジル10μMまたはバラノール様324化合物2μMを添加した拡大培地を用いて、ポリオルニチン/ラミニンであらかじめコーティングした24ウェルプレートのウェルに40個のスフェアをプレーティングする。翌日、ファスジル/バラノール様324化合物2μMを含まない拡大培地に更新する。3日間インキュベーションする。拡大培地を除去し、分化培地を添加する。3~4日後に分化培地を更新する。3~4日間インキュベーションする。細胞をPFA4で固定し、免疫染色を行う。irNSCニューロスフェアを染色するプロトコール:15日目のニューロスフェアを、以下の抗体で特徴決定のために染色した:マウスネスチンおよびウサギSox2でON、ならびにその後、二次抗体である抗マウス488および抗ウサギ555で1時間。一次抗体:ネスチンマウス、モノクローナル、1500希釈MAB5326MilliporeSox2ウサギ、ポリクローナル、1500希釈AB5603MIMillipore二次抗体:Alexafluor488、IgG、11000希釈、ヤギ抗マウスA11029InvitrogenAlexafluor555、IgG、11000希釈、ヤギ抗ウサギA21429Invitrogen