a哺乳動物細胞培養の粗培養上清を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、bエチレングリコールと無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用することにより、抗IGF1R抗体を回収し、よって、抗IGF1R抗体を生成させる工程を含む抗IGF1R抗体の製造方法。工程aの前に、次の付加工程a1:a1無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。工程aの後で工程bの前に、次の付加工程ab:ab緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、よって、抗IGF1R抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない工程を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。工程abが、2つの工程ab1及び工程ab2:ab1無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、及びab2変性剤を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程を含み、よって、抗IGF1R抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されないことを特徴とする請求項3に記載の方法。変性剤が塩酸グアニジン及び尿素から選択されることを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。無機塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化アンモニウムから選択されることを特徴とする請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。工程bの緩衝液が、20mM~30mMのトリス、1050mM~1350mMの塩化ナトリウム、及び約20のエチレングリコールを、pH7.1~pH7.3のpH値で含有することを特徴とする請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。工程a1の緩衝液が、20mM~30mMのトリス、80mM~120mMの塩化ナトリウムを、pH7.1~pH7.3のpH値で含有することを特徴とする請求項2から7のいずれか一項に記載の方法。工程ab1の緩衝液が、20mM~30mMのトリス、80mM~120mMの塩化ナトリウムを、pH7.1~pH7.3のpH値で含有することを特徴とする請求項4から8のいずれか一項に記載の方法。工程ab2の緩衝液が、110mM~140mMのトリス、80mM~120mMの塩化ナトリウム、及び30mM~40mMのアルギニンを、pH7.1~pH7.3のpH値で含有することを特徴とする請求項4から9のいずれか一項に記載の方法。多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料が、カルボン酸、エーテル、チオエーテル及び芳香族官能基を含む多様式弱カチオン交換リガンドが共有結合している架橋アガロースを含有することを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。ここでは、溶離及び洗浄の最適条件を含む、StreamlineCST及び/又はCaptoMMCを使用して、清澄化された細胞培養上清から捕捉された抗体を精製する方法が報告される。特に、生成物関連及びプロセス関連不純物を効率的に除去することができ、古典的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーに匹敵する純度の調製物が生じる。よって、古典的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを、ここで報告される方法に置き換えることができる。一実施態様では、本方法は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー工程を含まない。一般的なクロマトグラフィー方法及びその用途は当業者に知られている。例えば、Chromatography第5版PartAFundamentalsandTechniquesHeftmannEElsevierSciencePublishingCompanyNewYorkAdvancedChromatographicandElectromigrationMethodsinBiosciencesDeylZElsevierScienceBVAmsterdamTheNetherlandsChromatographyTodayPooleCF及びPooleSKElsevierSciencePublishingCompanyNewYorkScopesProteinPurificationPrinciplesandPracticeSambrookJらMolecularCloningALaboratoryManual第2版ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY1989又はCurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelFMらJohnWileySonsIncNewYorkを参照。に適用するなる用語は、溶液がクロマトグラフィー材料と接触させられる精製方法の一部の工程を示す。これは、a溶液が、クロマトグラフィー材料を収容するクロマトグラフィー装置に添加されるか、又はbクロマトグラフィー材料が溶液に添加されることを意味する。ケースaでは、溶液は、溶液に含有される物質とクロマトグラフィー材料との間の相互作用を可能にする装置を通過する。条件、例えばpH、伝導率、塩分濃度、温度、及び/又は流量に応じて、溶液のいくつかの物質がクロマトグラフィー材料に結合し、他の物質がクロマトグラフィー材料から回収されうる。溶液に残存するか又はクロマトグラフィー材料から回収される物質は、フロースルーに見出すことができる。フロースルーは、適用された溶液又は緩衝液のいずれかであり、カラムの洗浄、又はクロマトグラフィー材料に結合した物質の溶離に使用される、装置を通過した後に得られる溶液を示す。一実施態様では、装置はカラム又はカセットである。ケースbでは、クロマトグラフィー材料は、溶液中の物質とクロマトグラフィー材料との間の相互作用を可能にさせるように、例えば固体として、例えば精製される関心ある物質を含有する溶液に添加されうる。相互作用の後、クロマトグラフィー材料は、例えば濾過により除去され、クロマトグラフィー材料に結合した物質は、それとともに溶液から除去されるが、クロマトグラフィー材料に結合していない物質は、溶液に残ったままである。結合溶離bindandeluteモードなる用語は、精製されるべき関心ある物質を含む溶液がクロマトグラフィー材料に適用され、それによって関心ある物質がクロマトグラフィー材料に結合するクロマトグラフィー工程の操作モードを示す。よって、関心ある物質は、クロマトグラフィー材料に保持されているが、関心のない物質は、フロースルー又は上清と共に除去される。その後、関心ある物質は、溶離液を用いる第2工程において、クロマトグラフィー材料から回収される。一実施態様では、ここで報告されている方法は、結合溶離モードで操作される。緩衝液なる用語は、酸性又はアルカリ性物質の添加又は放出によるpHの変化が、溶解した緩衝物質により一様にされた溶液を示す。このような性質を有する任意の緩衝液を使用することができる。一般的に、薬学的に許容可能な緩衝物質が使用される。一実施態様では、緩衝液は、リン酸及びその塩からなるリン酸緩衝液、又は酢酸及びその塩からなる酢酸緩衝液、又はモルホリン緩衝液、又は2エタンスルホン酸緩衝液、又はヒスチジン緩衝液、又はグリシン緩衝液、又はトリスアミノメタン緩衝液から選択される。他の実施態様では、緩衝液は、トリス緩衝液、又はクエン酸緩衝液、又はヒスチジン緩衝液から選択される。緩衝液は、無機塩、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化アンモニウム、又は硫酸アンモニウムを含有しうる。この出願内で交換可能に使用される連続溶離及び連続溶離法なる用語は、溶離を生じさせる溶液の伝導率、すなわちクロマトグラフィー材料からの結合化合物の回収が変化する、すなわち連続的に上昇又は低下される、つまり、溶離を生じさせる物質の濃度のそれぞれ2又は1の変化以下の小さな一連の段階で、濃度が変化させられる方法を示す。この連続溶離において、一又は複数の条件、例えばpH、イオン強度、塩分濃度、及び/又はクロマトグラフィーの流量は、線形的又は指数関数的又は漸近的に変化しうる。一実施態様では、変化は直線的である。段階溶離なる用語は、例えば、溶離を引き起こす物質の濃度、すなわちクロマトグラフィー材料からの結合物質の回収が、一度に、すなわち、直接ある値/レベルから次の値/レベルまで上昇又は低下される方法を示す。この段階溶離では、一又は複数の条件、例えばpH、イオン強度、塩分濃度、及び/又はクロマトグラフィーの流量は、最初の、例えば出発時の値から、第2の、例えば最終的な値まで、一度に全て変化することが可能である。よって、条件は、線形変化とは異なり、増加的に、すなわち段階的に変化する。多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料なる用語は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーの固定相として使用される、共有結合した荷電置換基を担持する、化学的に架橋したアガロースのような固定された高分子量マトリックスを示す。全体の電荷的中性のため、共有的に結合していない対イオンがそこに結合している。多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料は、その共有的に結合していないカチオン性対イオンを、周囲の溶液の類似した荷電イオンに交換する能力を有している。多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料は、イオン性相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、並び周囲溶液に含まれる分子との水素結合の形成に働きかけることが可能な、共有的に結合したリガンドを含む。当業者には、例えばポリペプチドの、アミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応の核酸配列に転換させるための手順及び方法はよく知られている。よって、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列により、またそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列により、特徴付けられる。この出願で使用される結合に適した条件下なる用語及びその文法的同義語は、関心ある物質、例えば抗IGF1R抗体が、それに接触した場合に固定相、例えばイオン交換材料に結合することを示す。これは、関心ある物質の100が結合することを必ずしも示すものではないが、関心ある物質の本質的に100、すなわち関心ある物質の少なくとも50が結合する、好ましくは関心ある物質の少なくとも75が結合する、好ましくは関心ある物質の少なくとも85が結合する、さらに好ましくは関心ある物質の95以上が固定相に結合する。ここでの抗体なる用語は最も広義に使用され、限定するものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体例えば二重特異性抗体、及びそれらが所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を包含する種々の抗体構造を含む。自然に生じる抗体は、様々な構造を有する分子である。例えば、天然IgG抗体は、ジスルフィド結合した2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖からなる約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。NからC末端へ、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも称される可変ドメインを有し、3又は4の定常ドメインが続く。同様に、NからC末端へ、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインと称される可変ドメインを有し、定常軽鎖ドメインが続く。抗体の軽鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ及びラムダと称される2つのタイプの一方があてがわれている。ヒトインスリン様成長因子Iレセプターは、膜貫通タンパク質チロシンキナーゼのファミリーに属している143163AdamsTEらCellMolLifeSci5710501063。IGFIRは、高親和力でIGFIに結合し、インビボでこのリガンドに対する生理学的応答を開始する。しかしながら、IGFIRはIGFIIに、わずかに低い親和力で結合する。IGFIRの過剰発現は細胞の腫瘍化を促進させ、IGFIRが細胞の癌化に関与し、よって癌の治療の治療剤を開発するための有用な標的である証拠が存在する10501063。例示的な抗IGF1R抗体、それらのコード化配列及び生産方法は、国際公開第2004/087756号、国際公開第2007/045456号、及び国際公開第2007/115814号に報告されている。例えば、細胞培養法により産生された免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片の精製では、一般的には、異なったクロマトグラフィー工程の組合せが用いられる。通常、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーには、一又は二の付加的な分離工程が続く。一実施態様では、前記付加的なクロマトグラフィー工程は、カチオン及びアニオン交換クロマトグラフィー工程又はその逆である。最終精製工程は、微量不純物及び汚染物質、例えば凝集した免疫グロブリン、残留HCP、DNA、ウイルス、又は内毒素を除去するための、いわゆるポリッシュ工程である。一実施態様では、最終精製工程は、フロースルー式のアニオン交換クロマトグラフィーである。多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料を、よく使用されているプロテインAアフィニティークロマトグラフィーの代わりに、細胞培養の粗培養上清を直接用いるカラムクロマトグラフィー精製法での第1工程として使用することができることが見出された。ここで報告される一態様は、次の工程:a哺乳動物細胞培養の粗培養上清を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、b無機塩とエチレングリコールを含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用することにより、抗IGF1R抗体を回収し、よって、抗IGF1R抗体を生成させる工程、を含む抗IGF1R抗体の生産方法である。ここで報告されている方法では、粗培養上清のプレコンディショニングは必要ない。これは、種々の抗体が産生される培養から得られる培養上清では、培養上清から直接抗体の捕捉を可能にするためには、少なくとも伝導率の低下が必要であるので、驚くべきことであった。さらに、粗細胞培養上清からの抗IGF1R抗体の捕捉は、ほぼ定量的である。カチオン交換クロマトグラフィー材料からのポリペプチドの回収のための一般的に適用可能な条件と多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に対しての疎水性相互作用による結合の条件は反対方向に向いているので、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料からの抗体の回収のための新規な条件が必要であった。一実施態様では、本方法は、工程aの前に、次の付加工程a1a1無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程を含む。一実施態様では、本方法は、工程aの後で工程bの前に、次の付加工程abab緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、よって、抗IGF1R抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない工程を含む。さらなる実施態様では、工程abは、2つの工程ab1及び工程ab2:ab1無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、及びab2変性剤を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程を含み、よって、抗IGF1R抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない。一実施態様では、変性剤は塩酸グアニジン、尿素、及びアルギニンから選択される。一実施態様では、無機塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化アンモニウムから選択される。また一実施態様では、工程bの緩衝液は、20mM~30mMのトリス、1050mM~1350mMの塩化ナトリウム、及び約20のエチレングリコールを、pH7.1~pH7.3のpH値で含有する。一実施態様では、工程a1の緩衝液は、20mM~30mMのトリス、80mM~120mMの塩化ナトリウムを、pH7.1~pH7.3のpH値で含有する。さらなる実施態様では、工程ab1の緩衝液は、20mM~30mMのトリス、80mM~120mMの塩化ナトリウムを、pH7.1~pH7.3のpH値で含有する。他の実施態様では、工程ab2の緩衝液は、110mM~140mMのトリス、80mM~120mMの塩化ナトリウム、及び30mM~40mMのアルギニンを、pH7.1~pH7.3のpH値で含有する。さらなる他の実施態様では、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料は、カルボン酸、エーテル、チオエーテル及び芳香族官能基を含む多様式弱カチオン交換リガンドが共有結合している架橋アガロースを含有する。一実施態様では、工程a1の緩衝液の5カラム容量の全容量が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用される。他の実施態様では、工程ab1の緩衝液の5カラム容量の全容量が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用される。また一実施態様では、工程ab2の緩衝液の10カラム容量の全容量が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用される。さらなる実施態様では、工程bの緩衝液の10カラム容量の全容量が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用される。緩衝液の個々の成分は、次の効果を有していることが見出されている:次の実施例及び図は、その真の範囲は添付の請求の範囲に記載されている本発明の理解を補助するために提供されている。本発明の精神から逸脱しないで、記載された手順に修正をなすことができることが理解される。材料及び方法特に別の記載がなければ、種々の方法は、材料製造者のマニュアルに従い実施した。組換えDNA技術SambrookJらMolecularcloningAlaboratorymanualColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYork1989に記載されたように、標準的な方法を使用して、DNAを操作した。製造者の使用説明書に従い、分子生物学用試薬を使用した。タンパク質定量:タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用し、320nmの参照波長で、280nmでの光学密度を測定することにより決定した。サイズ排除HPLC:ASI100HPLCシステムにおいて、TosohHaasTSK3000SWXLカラムを用い、クロマトグラフィーを実施した。UVダイオードアレイ検出器により、溶離ピークを280nmでモニターした。1mg/mlまで濃縮したサンプルを溶解させた後、安定したベースラインが達成されるまで、200mMのリン酸二水素カリウムと250mMの塩化カリウムからなるpH7のバッファーを用い、カラムを洗浄した。分析実験を、0.5ml/分の流量を使用し、室温で30分、均一濃度条件下で実施した。Chromeleonを用い、クロマトグラムをマニュアルで積分した。逆相HPLC:純度はRPHPLCにより分析される。アセトニトリル/TFA水溶液勾配を使用し、Poroshellカラムでアッセイは実施される。溶離プロファイルが、215nmでのUV吸光度としてモニターされる。溶離物質の割合が、溶離タンパク質の全ピーク面積に基づき算出される。DNA閾値システム例えば、MerrickH及びHawlitschekGBiotechForumEurope9398403を参照。宿主細胞タンパク質定量:マイクロタイタープレートのウェルの壁面に血清アルブミン及びストレプトアビジンをコートする。HCPに対するヤギ由来ポリクローナル抗体を、マイクロタイタープレートのウェルの壁面に結合させる。洗浄工程の後、マイクロタイタープレートの種々のウェルを、種々の濃度のHCP較正列及びサンプル溶液と共にインキュベートする。インキュベート後、結合していないサンプル物質を、緩衝液で洗浄することにより除去する。検出では、ウェルを抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートと共にインキュベートし、結合した宿主細胞タンパク質を検出する。固定ペルオキシダーゼの活性を、ABTSと共にインキュベートし、405nmで検出することで検出する。実施例1多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料CaptoTMMMCにおけるここで報告された方法を用いた抗IGF1R抗体のクロマトグラフィークロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した:樹脂:CaptoTMMMCカラム直径:1cmベッド高:14.6cm適用液:粗細胞培養上清添加:材料1ml当たり30mgの抗体工程a125mMのトリスHCl、100mMのNaCl、pH7.1工程ab125mMのトリスHCl、100mMのNaCl、pH7.1工程b25mMのトリスHCl、1200mMのNaCl、20のエチレングリコール、pH7.2溶離方法:段階溶離流速:250cm/h得られた抗体の分析用サイズ排除クロマトグラムを図1に示す。実施例2多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料CaptoTMMMCにおけるここで報告された方法とは異なる条件を用いる、抗IGF1R抗体の実施例1に対する比較クロマトグラフィークロマトグラフィーを次のパラメーターを用いて実施した:樹脂:CaptoTMMMCカラム直径:1cmベッド高:14.6cm適用液:粗細胞培養上清添加:材料1ml当たり30mgの抗体工程a125mMのトリスHCl、100mMのNaCl、pH7.1工程ab125mMのトリスHCl、100mMのNaCl、pH7.1工程b可変-以下の表を参照溶離方法:段階溶離流速:250cm/h以下にまとめた表から、工程bのわずかに異なる条件を用いると、精製はあまり効果的ではない形で実施されうることが分かる。実施例3多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料CaptoTMMMCにおける、ここで報告された方法を用いた抗IGF1R抗体のクロマトグラフィークロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した:樹脂:CaptoTMMMCカラム直径:1cmベッド高:14.6cm適用液:粗細胞培養上清添加:材料1ml当たり30mgの抗体工程a125mMのトリスHCl、100mMのNaCl、pH7.1工程ab125mMのトリスHCl、100mMのNaCl、pH7.1工程ab2125mMのトリスHCl、100mMのNaCl、38mMのアルギニン、pH8.1工程b25mMのトリスHCl、1200mMのNaCl、20。実施例6粗培養上清のプレコンディショニングした、抗IL13R抗体の比較例クロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した:樹脂:CaptoTMMMCカラム直径:1cmベッド高:11cm適用液:1.4mS/cmに調節された粗細胞培養上清添加:材料1ml当たり20mgの抗体工程a110mMのリン酸カリウム、pH6.5、1.4mS/cm工程ab10mMのリン酸カリウム、pH6.5、1.4mS/cm工程b100mMのリン酸カリウム、pH7.5、14.9mS/cm溶離方法:線形溶離流速:150cm/hクロマトグラムにおいて、鋭いピークが見られる。得られた抗体は96.6の純度を有し、68の収率であった。