"哺乳動物の免疫細胞、又はT細胞及び/若しくはB細胞、又は活性化T細胞を同定する方法であって、遺伝子ccr6及び/若しくはblr1又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含む、哺乳動物の免疫細胞、又はT細胞及び/若しくはB細胞、又は活性化T細胞を同定する方法。非活性化T細胞と比較した場合の脱メチル化が、安定に活性化されたT細胞、NK細胞、記憶T細胞、又はCD4記憶T細胞若しくはCD8記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞及び記憶B細胞から選択される細胞の指標となる、請求項1に記載の方法。遺伝子ccr6における脱メチル化が、CCR6CD4T細胞若しくはCCR6CD8T細胞、又は安定に活性化されたCCR6CD4T細胞若しくはCCR6CD8T細胞から選択される細胞の指標となり、前記方法が任意でCD3細胞を単離する工程を更に含む、請求項2に記載の方法。前記遺伝子CCR6及び/若しくはBLR1又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態が、記憶T細胞、ナイーブB細胞及び/又は記憶B細胞におけるそれぞれのCpG位置と比較した場合の顆粒球、単球、NK細胞、ナイーブT細胞、ナイーブ細胞傷害性T細胞及び記憶細胞傷害性T細胞における遺伝子BLR1又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子のメチル化の増大、並びにNK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞及び/又は記憶B細胞におけるそれぞれのCpG位置と比較した場合の顆粒球、単球、ナイーブT細胞及びナイーブ細胞傷害性T細胞における遺伝子CCR6又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子のメチル化の増大から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記メチル化状態の分析が、遺伝子CCR6及び/若しくはBLR1又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子の転写開始領域、プロモーター領域、イントロン及び/若しくはエクソン/イントロン境界より上流の5’領域内、又は配列番号13による遺伝子CCR6のプロモーター領域又はそのオーソロガス領域若しくはパラロガス領域と重複する領域内の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。前記メチル化状態の分析が、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシング、MSP、HeavyMethyl、MethyLight、Ms-SNuPE、又は増幅DNAの検出に基づく他の方法から選択される方法を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。サンプルのプールを、少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態について分析する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。前記遺伝子CCR6のメチル化状態の分析が、配列番号1及び配列番号2、配列番号3及び配列番号4、配列番号5及び配列番号6、配列番号7及び配列番号8、並びに配列番号11及び配列番号12、並びにそのオーソロガスプライマー対若しくはパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも1つを用いた増幅を含むか、又は前記メチル化状態の分析が、配列番号5及び配列番号6、配列番号7及び配列番号8、配列番号11及び配列番号12、並びにそのオーソロガスプライマー対若しくはパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも1つを用いた増幅を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。前記メチル化状態の分析が、配列番号1及び配列番号2のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの71位、98位、106位、135位、178位、193位、277位、316位及び339位、配列番号3及び配列番号4のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの23位、36位、38位、53位及び114位、配列番号5及び配列番号6のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの23位、109位、161位、193位、217位及び245位、配列番号7及び配列番号8のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの62位、101位、124位、202位、246位及び251位、配列番号11及び配列番号12のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの71位、98位、106位、135位、178位、193位、277位及び316位、並びにそのオーソロガスCpG位置又はパラロガスCpG位置からなる群から選択される少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含む、請求項8に記載の方法。前記遺伝子BLR1のメチル化状態の分析が、配列番号9及び配列番号10、並びにそのオーソロガスプライマー対又はパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも1つを用いた増幅を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。前記メチル化状態の分析が、配列番号9及び配列番号10のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの23位、25位、46位、51位、109位、157位、177位、183位、199位、229位、244位、247位、287位及び360位、並びにそのオーソロガスCpG位置又はパラロガスCpG位置からなる群から選択される少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含む、請求項10に記載の方法。前記哺乳動物がマウス、ラット、サル又はヒトである、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。哺乳動物の免疫状態を診断する方法であって、a免疫細胞を含有するサンプルを診断対象の前記哺乳動物から得る工程と、b請求項1~12のいずれか一項に記載の方法により、前記免疫細胞における遺伝子CCR6及び/若しくはBLR1又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析する工程と、c前記サンプル中に存在する免疫細胞の量を前記メチル化状態に基づいて特定する工程と、d特定された前記量に基づいて前記哺乳動物の免疫状態について結論付ける工程と、を含む、哺乳動物の免疫状態を診断する方法。前記サンプルが血液サンプル、血中リンパ球のサンプル若しくはその画分、又はCD3細胞の画分から選択される、請求項13に記載の方法。前記哺乳動物が自己免疫疾患、同種移植レシピエントにおける有害作用、腫瘍性疾患、卵巣がん、慢性移植片対宿主病、アレルギー性喘息、多発性硬化症、炎症、炎症関節、関節リウマチ、乾癬性疾患、炎症性腸疾患、脳症、及びX連鎖免疫調整異常多発性内分泌障害腸症候群IPEXから選択される疾患を患う患者である、請求項13又は14に記載の方法。前記免疫細胞がナイーブT細胞、記憶T細胞、及びCCR6CD4T細胞若しくはCCR6CD8T細胞、又は安定に活性化されたCCR6CD4T細胞若しくはCCR6CD8T細胞から選択される活性化T細胞である、請求項13~15のいずれか一項に記載の方法。前記T細胞における遺伝子CCR6及び/又はBLR1の発現を調整する化学物質及び/又は生体物質に応じた前記T細胞の量を測定及び/又はモニタリングすることを更に含む、請求項13~16のいずれか一項に記載の方法。患者への移植に対するinvitroで生成した又は展開させた免疫細胞の適合性を決定するinvitro方法であって、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法と、分析されるCpG位置が少なくとも80、又は90、又は95までメチル化されているか否かを検出することとを含む、患者への移植に対するinvitroで生成した又は展開させた免疫細胞の適合性を決定するinvitro方法。免疫細胞におけるCCR6及び/又はBLR1の発現を調整する化学物質及び/又は生体物質を同定するinvitro方法であって、前記化学物質及び/又は生体物質の1つ又は複数を免疫細胞と接触させることと、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法を行うことと、前記化学物質及び/又は生体物質が、分析されるCpG位置のメチル化を調整するか否かを検出することとを含む、免疫細胞におけるCCR6及び/又はBLR1の発現を調整する化学物質及び/又は生体物質を同定するinvitro方法。前記物質が、分析されるCpG位置の少なくとも80、又は90、又は95までの脱メチル化をもたらす、請求項19に記載の化学物質及び/又は生体物質を同定する方法。配列番号1~配列番号12のいずれか1つによるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号1及び配列番号2、配列番号3及び配列番号4、配列番号5及び配列番号6、並びに配列番号7及び配列番号8、並びに配列番号9及び配列番号10、並びに配列番号11及び配列番号12から選択されるプライマー対によって増幅されるアンプリコン、又は配列番号13によるアンプリコン、又はオーソロガス若しくはパラロガスなオリゴマー若しくはアンプリコン。活性化T細胞若しくはB細胞、又はナイーブT細胞若しくは記憶T細胞を、遺伝子CCR6及び/又はBLR1内のCpG位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するためのキットであって、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法を行うための材料を含む、活性化T細胞若しくはB細胞、又はナイーブT細胞若しくは記憶T細胞を、遺伝子CCR6及び/又はBLR1内のCpG位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するためのキット。免疫細胞、又は安定した活性化T細胞若しくはB細胞を検出及び/又は同定するための請求項21に記載のオリゴマー若しくはアンプリコン、又は請求項22に記載のキットの使用。本発明の目的の1つは、哺乳動物の及び/又は哺乳動物における或る特定の免疫細胞、好ましくはT細胞及び/又はB細胞を確実に同定するために、脊椎動物における細胞型及び細胞状態の指標として従来の方法論を補完するか、又はそれに取って代わることのできる優れたツールとして、特にその検出並びに品質保証及び品質管理のために、タンパク質CCR6及び/又はBLR1の遺伝子の発現分析、特にDNAメチル化分析に基づく発現分析の改良された方法を提供することである。その第1の態様によると、本発明は、BLR1及び/又はCCR6に陽性の哺乳動物の免疫細胞、好ましくはNK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞又は記憶B細胞、最も好ましくは安定した活性化T細胞を同定する方法であって、上記哺乳動物における遺伝子CCR6及び/若しくはBLR1又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含む、BLR1及び/又はCCR6に陽性の哺乳動物の免疫細胞、好ましくはNK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞又は記憶B細胞、最も好ましくは安定した活性化T細胞を同定する方法を提供することによって上記の目的を解決するものである。驚くべきことに、CCR6及び/又はBLR1の脱メチル化がTリンパ球の安定した活性化の指標となることが見出された。当該技術分野で既知のように、T細胞又はTリンパ球は細胞性免疫において中心的役割を果たし、T細胞受容体TCRと呼ばれるそれらの細胞表面上の特有の受容体の存在によって、B細胞及びナチュラルキラー細胞等の他のリンパ球型と識別することができる。活性化という用語も当業者に既知であり、CD4T細胞の活性化は、それぞれAPC抗原提示細胞上の主要組織適合性複合体ペプチド及びB7ファミリーメンバーによる、T細胞上のT細胞受容体及びCD28の両方の連結によって起こる。細胞傷害性T細胞はウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応にも関与する。これらの細胞はCD8糖タンパク質をそれらの表面に発現するため、CD8T細胞としても知られる。細胞傷害性T細胞の活性化は、T細胞の表面上に発現された分子とAPCの表面上に発現された分子との間の幾つかの同時相互作用に依存する。一時的な活性化とは対照的な安定した活性化は、近年本発明者らによってTreg特異的転写因子FOXP3について実証されたように非特許文献19、免疫細胞がそれらの表現型、特にCCR6及び/又はBLR1の発現を長時間にわたって維持することを意味する。本発明による方法はinvitro及び/又はinvivoで行うことができる。非活性化T細胞と比較した場合の脱メチル化が、安定に活性化されたT細胞、NK細胞、記憶T細胞、特にCD4記憶T細胞若しくはCD8記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞及び記憶B細胞から選択される細胞の指標となる、本発明による方法が好ましい。上記BLR1及び/又はCCR6に陽性の免疫細胞、好ましくはNK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞又は記憶B細胞が、安定したBLR1及び/又はCCR6に陽性の免疫細胞、好ましくは安定したNK細胞、記憶T細胞、特にCD4記憶T細胞又はCD8記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞及び記憶B細胞、並びにCD25highCD4調節性T細胞である、本発明による方法が更に好ましい。BLR1遺伝子座及び/又はCCR6遺伝子座の接近可能性の分析は、単なるBLR1及び/又はCCR6の発現以外にも、どの程度まで例えば記憶T細胞系統への変換が起こるかという更なる情報を提供する。遺伝子ccr6における脱メチル化が、CCR6CD4T細胞若しくはCCR6CD8T細胞、特に安定に活性化されたCCR6CD4T細胞若しくはCCR6CD8T細胞から選択される細胞の指標となり、上記方法が任意でCD3細胞を単離する工程を更に含む、本発明による方法が更に好ましい。ヒトT細胞上の安定したCCR6又はBLR1の発現が後成的機構によって制御されるか否かについては、これまでに研究されていない。概して、CCR6の転写調節は十分に理解されていない。プロモーター活性を有する領域がマウスCCR6遺伝子において同定されておりKucharzikTHudsonJT3rdWaikelRLMartinWDWilliamsIRCCR6expressiondistinguishesmousemyeloidandlymphoiddendriticcellsubsetsdemonstrationusingaCCR6EGFPknockinmouseEurJImmunol200232104112、Th17細胞のマスター調節因子である転写因子RORγtの過剰発現が、ヒト及びマウスのT細胞上でのCCR6発現をもたらすHirotaKYoshitomiHHashimotoMetalPreferentialrecruitmentofCCR6expressingTh17cellstoinflamedjointsviaCCL20inrheumatoidarthritisanditsanimalmodelJExpMed200720428032812、ManelNUnutmazDLittmanDRThedifferentiationofhumanT17cellsrequirestransforminggrowthfactorbetaandinductionofthenuclearreceptorRORgammatNatImmunol20089641649。本発明者らはしたがって、CCR6遺伝子座のDNAメチル化を含む後成的機構が、ヒトT細胞における安定したCCR6発現の調節に寄与するか否かを調査した。本発明者らは、一次T細胞において転写活性を有し、ヒトのCCR6-T細胞及びCCR6T細胞において差次的にメチル化される、CCR6遺伝子内の非コード領域を同定することができた。これらの観察結果及びDNAメチル化阻害剤5’-アザシチジンの誘導効果から、後成的機構がヒト免疫細胞、特にCCR6陽性記憶T細胞における安定したCCR6発現の調節、及び異なるホーミング特性のインプリンティングに関与することが示唆される。関節リウマチに関与することが報告されている細胞集団であるIL17陽性画分がCCR6陽性であることが示されたため、このマーカーは特に診断的価値がある下記を参照されたい。このマーカーの脱メチル化を測定する完全に定量的なメチル化アッセイを行う用途が好ましい。好ましくは、上記メチル化状態の分析は、遺伝子CCR6及び/若しくはBLR1又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子の転写開始領域、プロモーター領域、イントロン及び/若しくはエクソン/イントロン境界より上流の5’領域内、特に配列番号13による遺伝子CCR6のプロモーター領域又はそのオーソロガス領域若しくはパラロガス領域と重複する領域内の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含む。本発明者らは、免疫細胞におけるCCR6及び/又はBLR1の発現の調節に機能的に関与する遺伝子CCR6及び/又はBLR1内の特定のparticular領域を同定した。この領域は、例えばバイサルファイトシークエンシング方法を用いて、BLR1を発現する細胞、好ましくは記憶T細胞、ナイーブB細胞若しくは記憶B細胞、及び/又はCCR6を発現する細胞、好ましくはNK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞若しくは記憶B細胞を、CCR6及び/又はBLR1を発現しない細胞と比較した場合に、差次的メチル化状態を示す多くのCpGモチーフを含有する。本発明者らは、CCR6-細胞及びBLR1-細胞では遺伝子CCR6及び/又はBLR1のCpGモチーフがそれぞれ、ほぼ完全にすなわち70超、好ましくは80超、好ましくは90超、最も好ましくは95超までメチル化されているが、同じモチーフが例えばCCR6T細胞では完全に脱メチル化されていることを実証することができた。上述の領域内のCpGモチーフの差次的メチル化は、CCR6及び/又はBLR1の発現と強く相関する。このため、CCR6遺伝子座及び/又はBLR1遺伝子座のメチル化状態の決定は、関節リウマチ、自己免疫疾患、移植片拒絶又はアレルギーの治療における臨床用途に必要とされる、選択的な免疫細胞の安定した集団を同定するのに有益なツールである。CCR6は、mRNA転写産物を用いて分析を行った場合及びタンパク質に対する抗体を用いて分析を行った場合の両方で、その遺伝子発現が活性化免疫細胞において観察されるため、上記細胞のマーカーとして記載されている。しかしながら、これらの同定手段は、単にその時点でまたそのため一時的に活性化された細胞を認識するものである。このアッセイシステムは、安定に活性化されたT細胞と、刺激を受けたのみであり、これが誘発された後間もなく機能的表現型を失うloseT細胞とを識別することは可能ではない。第1の群は、CCR6を永久的に発現するこれらのリンパ球を構成し、したがって活性化コンパートメントを構成する。安定したCCR6を発現する中期/長期の活性化リンパ球のみが脱メチル化されるため、リンパ球のメチル化パターンの分析によってのみ2つの種類/サブグループ間の識別が可能となる。したがって、実際には、メチル化分析によってのみ、CCR6活性化リンパ球によって示される真の免疫応答及び機能を構成する安定したCCR6細胞が同定される。活性化Tリンパ球の陽性同定については、この状況では全てのB細胞が永久的にCCR6であり、したがってバックグラウンドノイズを構成するため、CD3陽性細胞の事前単離例えば、例えば細胞選別を用いた精製が必要とされ得る。しかしながら、Tリンパ球コンパートメント内では、脱メチル化されたCCR6細胞のみを完全かつ安定に活性化されているとみなすことができる。細胞培養物中では永久的に活性化されたCCR6細胞をFACS、MACS及びmRNAを用いて単離培養形態で同定することができるが、この測定では単一の時点でのCCR6陽性及びBLR1細胞、したがって安定に活性化された細胞及び一時的に活性化された細胞の両方が同定されるため、血液サンプル又はそのT細胞含有画分ではこれを達成することはできない。血液中での識別のためのマーカーは現在知られていない。驚くべきことに、一時的なCCR6/BLR1タンパク質産生細胞がメチル化されたままである一方で、永久的に安定したCCR6陽性/BLR1陽性の対応物は脱メチル化されるため、本発明のメチル化マーカーは識別を達成することができる。上記遺伝子CCR6及び/若しくはBLR1又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態が、記憶T細胞、ナイーブB細胞及び/又は記憶B細胞におけるそれぞれのCpG位置と比較した場合の顆粒球、単球、NK細胞、ナイーブT細胞、ナイーブ細胞傷害性T細胞及び記憶細胞傷害性T細胞における遺伝子BLR1又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子のメチル化の増大、並びにNK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞及び/又は記憶B細胞におけるそれぞれのCpG位置と比較した場合の顆粒球、単球、ナイーブT細胞及びナイーブ細胞傷害性T細胞における遺伝子CCR6又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子のメチル化の増大から選択される、本発明による方法が好ましい。本発明との関連で、遺伝子という用語は、CCR6及びBLR1等の或る特定のタンパク質をコードし、上記遺伝子の調節に関与する他の遺伝要素を含有する染色体DNAの領域、例えば配列番号13による遺伝子CCR6のプロモーター領域又はそのオーソロガス領域若しくはパラロガス領域と重複する領域を意味するものとする。このため、遺伝子はイントロン、エンハンサー、プロモーター配列、及び遺伝子の5’非翻訳領域も含む。本発明の場合では、遺伝子は、本明細書中に示されるアクセッション番号で与えられる配列だけでなく、その上流及び下流の非翻訳領域も含む。本発明について行われる一部の分析は、マウス系において行われた。しかし、BLR1-細胞及びBLR1細胞並びに/又はCCR6-細胞及びCCR6細胞の間でCpGモチーフの差次的メチル化を示す領域は、哺乳動物間、特にマウスとヒトとの間で高度に保存されている。加えて、実験から、ヒト系においてもマウスのBLR1細胞及び/又はCCR6-細胞と同じ及び/又は相同なCpGモチーフが脱メチル化されることが示されている。本発明との関連で、この事実はオーソロガス遺伝子又はパラロガス遺伝子という用語によって説明される。オーソログは共通祖先から進化した2つ以上の種における遺伝子であり、オーソロガス遺伝子とも呼ばれる。本発明との関連で、ヒトHomosapiensCCR6はしたがって、ハツカネズミMusmusculusCCR6遺伝子及び/又はタンパク質のオーソログである。パラログはゲノム内の重複によって関連する遺伝子であり、パラロガス遺伝子とも呼ばれる。オーソログは進化の過程で同じ機能を保持するが、パラログは元の遺伝子と関連していても新たな機能を進化させている。パラログという用語には、正常遺伝子に類似するが、機能的な最終産物を産生しないヌクレオチド配列である偽遺伝子が含まれる。偽遺伝子には2つの変形がある。第1の変形では最終産物がタンパク質である必要がある。第2の変形では最終産物はRNAとなる。本明細書中で与えられる情報に基づいて、当業者は容易にオーソロガス遺伝子又はパラロガス遺伝子を例えば、ClustalWプログラム等の配列をアラインメントするためのコンピュータプログラムを用いて比較し、両方の遺伝子において同じ領域内に及び/又は更には同じ等価位置に見ることができる領域及び/又はCpG位置を同定することが可能である。本発明によると、これらの領域及び/又はCpG位置はオーソロガス又はパラロガスとみなされる。通常、アラインメントは、分析される2つ以上のDNA断片間の配列同一性のレベルに基づく。配列同一性のレベルは、所与の断片の好ましくは約75、より好ましくは約80、最も好ましくは約90である。CpG位置のメチル化状態を分析するために、DNAメチル化を分析する任意の既知の方法を用いることができる。本発明による方法の好ましい実施の形態では、メチル化状態の分析は、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、CpG島メチル化、MSP、HeavyMethyl、MethyLight、Ms-SNuPEから選択される分析、又は増幅DNAの検出に基づく他の方法を含む。これらの方法は当業者に十分に知られており、それぞれの文献中に見ることができる。さらに、例えば5サンプル以上のプールされたサンプルを用いることもでき、通常は、サンプルのプールを少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態について分析する。本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記遺伝子CCR6のメチル化状態の分析は、配列番号1及び配列番号2アンプリコン888、配列番号3及び配列番号4アンプリコン1201、配列番号5及び配列番号6アンプリコン1202、配列番号7及び配列番号8アンプリコン1203、並びに配列番号11及び配列番号12DMR、並びにそのオーソロガスプライマー対若しくはパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも1つを用いた増幅を含み、好ましくは上記メチル化状態の分析が、配列番号5及び配列番号6、配列番号7及び配列番号8、配列番号11及び配列番号12、並びにそのオーソロガスプライマー対若しくはパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも1つを用いた増幅を含む。本発明による方法の別の好ましい実施の形態では、上記遺伝子BLR1のメチル化状態の分析が、配列番号9及び配列番号10アンプリコン1037すなわち配列番号29、並びにそのオーソロガスプライマー対又はパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも1つを用いた増幅を含む。好ましくは、増幅はポリメラーゼ酵素、PCR若しくは化学増幅反応、又は当業者に既知であり、例えばMSP、HeavyMethyl若しくはMethyLightとの関連で下記に記載されるような他の増幅方法を含む。本発明の別の態様では、配列番号1~配列番号12のいずれかによるオリゴマー、若しくは配列番号1及び配列番号2、配列番号3及び配列番号4、配列番号5及び配列番号6、並びに配列番号7及び配列番号8、並びに配列番号9及び配列番号10、並びに配列番号11及び配列番号12から選択されるプライマー対によって増幅される例えば配列番号13によるアンプリコン、又はオーソロガス若しくはパラロガスなオリゴマー若しくはアンプリコンが、本発明の好ましい実施の形態を構成する。当業者は、上記の情報及びマウス系から得られるデータに基づいて、上記のプライマーと好ましくは約75、より好ましくは約80、最も好ましくは約90の配列同一性を有するオーソロガスプライマー対又はパラロガスプライマー対を設計することができる。上記メチル化状態の分析が配列番号5及び配列番号6、配列番号7及び配列番号8、配列番号11及び配列番号12、並びにそのオーソロガスプライマー対又はパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも1つを用いた増幅を含む、本発明による方法が特に好ましい。上記メチル化状態の分析が、配列番号1及び配列番号2のプライマー対によって増幅されるアンプリコンのヌクレオチド位置71、98、106、135、178、193、277、316及び339、配列番号3及び配列番号4のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの23位、36位、38位、53位及び114位、配列番号5及び配列番号6のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの23位、109位、161位、193位、217位及び245位、配列番号7及び配列番号8のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの62位、101位、124位、202位、246位及び251位、配列番号11及び配列番号12のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの71位、98位、106位、135位、178位、193位、277位及び316位、並びにそのオーソロガスCpG位置又はパラロガスCpG位置からなる群から選択される少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含む、本発明による方法が更に好ましい。メチル化状態の分析が、配列番号9及び配列番号10のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの23位、25位、46位、51位、109位、157位、177位、183位、199位、229位、244位、247位、287位及び360位、並びにそのオーソロガスCpG位置又はパラロガスCpG位置からなる群から選択される少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含む、本発明による方法が更に好ましい。これらの位置の大部分が活性化T細胞において脱メチル化されていることを実験で示すことができた。当業者はさらに、分析対象の部位、例えばアンプリコン888上に存在する全ての部位、及び/又はアンプリコン1037上に存在する全ての部位、又はDMR、又はそのオーソロガスCpG位置若しくはパラロガスCpG位置の量を最小限に抑えるために、CpG位置の特定のサブセットを選択することが可能である。本発明による方法は、遺伝子BLR1及び/若しくはCCR6又はそのオーソログ若しくはパラログを有する任意の哺乳動物を用いて行うことができ、上記哺乳動物がマウス、ラット、サル又はヒトである本発明による方法が好ましい。本発明の別の態様では、本発明は、哺乳動物の免疫状態を診断する方法であって、a免疫細胞を含有するサンプルを診断対象の上記哺乳動物から得る工程と、b本発明による方法により、上記免疫細胞における遺伝子CCR6及び/若しくはBLR1又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析する工程と、c上記サンプル中に存在する免疫細胞の量及び/又はタイプを上記メチル化状態に基づいて特定する工程と、d特定された上記量及び/又はタイプに基づいて上記哺乳動物の免疫状態について結論付ける工程とを含む、哺乳動物の免疫状態を診断する方法を提供する。本方法の一態様では、種々のタイプの免疫細胞を含有するサンプル中のT細胞の全集団を、CCR6遺伝子及び/又はBLR1遺伝子におけるそれらのメチル化状態について分析する。部位の全メチル化頻度の結果に基づいて、例えば分析した集団内の記憶T細胞の比率及び/又は量を決定することができる。上記結果から、診断対象の哺乳動物の免疫状態及び/又はT細胞状態について結論付けることができる。方法はinvitro及び/又はinvivoで行うことができる。概して、好適なT細胞を含有する限り、全ての生体サンプルを使用することができる。上記サンプルが血液サンプル、血中リンパ球のサンプル又はその画分から選択される方法が好ましい。最も好ましくは、サンプルはCD3によって、好ましくは細胞選別又は磁性ビーズMACSを用いて精製されたT細胞を含む。本方法を用いて、分析用のB細胞含有サンプルを生成することもできる。本発明による方法は、遺伝子ccr6及び/若しくはblr1又はそのオーソログ若しくはパラログを有する任意の哺乳動物を用いて行うことができ、上記哺乳動物がマウス、ラット、サル又はヒトである本発明による方法が好ましい。上記哺乳動物が自己免疫疾患、自己免疫疾患における有害作用、同種移植レシピエントにおける有害作用、腫瘍性疾患、卵巣がん、慢性移植片対宿主病、アレルギー性喘息、多発性硬化症、炎症、炎症関節、関節リウマチ、乾癬性疾患、炎症性腸疾患、脳症、及びX連鎖免疫調整異常多発性内分泌障害腸症候群IPEXから選択される疾患を患う患者である、方法が好ましい。好ましくは、上記疾患は関節リウマチである。これらの疾患及び免疫細胞とのそれらの関係は、それぞれの文献に記載されている。BLR1免疫細胞及び/又はBLR6免疫細胞、好ましくは活性化T細胞、NK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞又は記憶B細胞の量が、少なくとも80、好ましくは90、より好ましくは95までの分析対象のCpG位置の脱メチル化に相当する方法が更に好ましい。免疫細胞におけるCCR6及び/又はBLR1の発現を調整する化学物質及び/又は生体物質に応じた上記免疫細胞の量及び/又は比率を測定及び/又はモニタリングすることを更に含む方法がまた更に好ましい。すなわち、例えば疾患例えば本明細書中に記載されるの治療、並びに免疫細胞に対する効果の点での上記治療の成功及び/又は進行によって生じる免疫細胞の量又は比率における変化は、本方法を用いて追跡することができる。本明細書中のマーカーに基づく免疫細胞のメチル化パターンの追跡調査は、上記化学物質及び/又は生体物質に対する応答による細胞における変化を指摘するものであり、場合によっては表現型変化の前であっても観察することができる。次いで、この情報を、基礎疾患又は関連疾患例えば本明細書中で言及されるに対する治療法の調整に使用し、それにより副作用を回避及び/又は低減することを含む、改良されたより効果的な治療及び/又は予防を可能にすることができる。本発明の更に別の態様では、本発明は、患者への移植に対するinvitroで生成した又は展開させた免疫細胞の適合性を決定する方法であって、本発明による方法と、分析されるCpG位置が少なくとも80、好ましくは90、より好ましくは95までメチル化されているか否かを検出することとを含む、患者への移植に対するinvitroで生成した又は展開させた免疫細胞の適合性を決定する方法を提供する。方法はinvitro及び/又はinvivoで行うことができる。例えば、CCR6及び/又はBLR1の発現の変調、特に低下を示すと思われる免疫細胞は、通常は安定であるとはみなされず、更に使用されることはない。本発明の更に別の態様では、本発明は、免疫細胞におけるCCR6及び/又はBLR1の発現を調整する化学物質及び/又は生体物質を同定する方法であって、上記化学物質及び/又は生体物質の1つ又は複数を免疫細胞と接触させることと、本明細書中に記載される本発明による方法を行うことと、上記化学物質及び/又は生体物質が、分析されるCpG位置のメチル化を調整するか否かを検出することとを含む、免疫細胞におけるCCR6及び/又はBLR1の発現を調整する化学物質及び/又は生体物質を同定する方法を提供する。方法はinvitro及び/又はinvivoで行うことができる。この態様では、本発明は、調節性T細胞に特異的な薬物療法及びそれぞれの医薬組成物の開発の出発点として用いることのできる、CCR6及び/又はBLR1の発現を変調する化学物質及び/又は生体物質を同定することを目的とする、スクリーニング方法と呼ばれる場合もある方法を包含する。本方法は、CCR6遺伝子及び/又はBLR1遺伝子が、NK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞又は記憶B細胞等の本明細書中に記載されるような免疫細胞の発生に中心的役割を果たすことが広く認められているという事実に基づく。したがって、CCR6及び/又はBLR1の発現を変調する因子は、自己免疫疾患又は同種移植レシピエントを治療するための興味深いツールでもある。CCR6及び/又はBLR1の発現を防止する因子であっても、BLR1免疫細胞及び/又はCCR6免疫細胞、好ましくはNK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性T細胞、ナイーブB細胞又は記憶B細胞が、強い抗腫瘍応答を防止することが示されている腫瘍患者の治療にとっては興味深い。CCR6及び/又はBLR1の発現の安定した修飾をもたらすかかる因子は、本発明において記載される方法を用いて検出することができる。さらに、免疫細胞の分化を促進し、自己免疫障害及びアレルギー障害の緩和をもたらすことのできる因子を本発明の方法を用いて同定することができる。スクリーニング化合物として好適な化学物質及び/又は生体物質は当業者に既知であり、例えば小分子、ペプチド及びタンパク質、並びに抗体又はその断片が挙げられる。さらに、スクリーニングは商用のcommercial化合物ライブラリーを、最も有利にはロボット等の好適な自動装置とともに用いて行うことができる。化学物質及び/又は生体物質を同定する方法の好ましい1つの実施の形態では、上記物質は、分析されるCpG位置の少なくとも80、好ましくは90、より好ましくは95までの脱メチル化をもたらす。本発明による別の好ましい方法は、遺伝子CCR6及び/又はBLR1の異常発現と関連する疾患を診断する方法であって、本明細書中に記載される本発明による方法と、分析されるCpG位置が少なくとも80、好ましくは90、より好ましくは95まで脱メチル化されているか否かを検出することとを含み、疾患が自己免疫疾患、同種移植レシピエントにおける有害作用、腫瘍性疾患、卵巣がん、慢性移植片対宿主病、アレルギー性喘息及びIPEX症候群から選択される、遺伝子CCR6及び/又はBLR1の異常発現と関連する疾患を診断する方法である。本方法はinvitro及び/又はinvivoで行うことができる。本発明の別の好ましい態様は、免疫細胞、例えば活性化T細胞、好ましくはナイーブT細胞又は記憶T細胞を、遺伝子CCR6及び/又はBLR1内のCpG位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するためのキットであって、本発明による方法を行うための材料を含む、免疫細胞、例えば活性化T細胞、好ましくはナイーブT細胞又は記憶T細胞を、遺伝子CCR6及び/又はBLR1内のCpG位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するためのキットに関する。本発明による好ましい1つの実施の形態では、キットは、aバイサルファイト試薬と、b上述したCpG位置のメチル化分析のための材料とを含む。当業者はさらに、分析対象の部位、例えばアンプリコン888上に存在する全ての部位、及び/又はアンプリコン1037上に存在する全ての部位、及び/又は配列番号13によるアンプリコンDMR上に存在する全ての部位、又はそのオーソロガスCpG位置若しくはパラロガスCpG位置の量を最小限に抑えるために、CpG位置の特定のサブセットの材料を選択することが可能である。キットは診断キットであってもよい。本発明によるキットは好ましくは、以下のものを含有してもよい:1.細胞サンプルを処理するための化学物質バイサルファイト等;2.手順プロトコル;3.特定の細胞型と関連するマーカーを検出する本発明によるオリゴヌクレオチドプローブ、アンプリコン、遮断剤又は伸長プライマー。オリゴヌクレオチドは、リアルタイムPCRRT-PCR又は一塩基伸長法SBE等の一般に利用可能な検出プラットフォーム上でシグナルを生成するように構成され得る。各々のシグナルは、サンプル中の特定の標的部位でのメチル化のレベルを示す。代案として、記載の核酸によるプローブをチップ上で使用するために作製することができる;4.結果を処理するための生物情報学ツール。これ、例えばソフトウェアは、生データからシグナルを正規化するか、読み出し値の解釈のための結果の行列を含有するか、又は例えば細胞型の割合若しくは有効性予測を計算する様々なアルゴリズムを実行するものであり得る。本発明の更に別の好ましい態様は、免疫細胞、好ましくはナイーブT細胞又は記憶T細胞を検出及び/又は同定するための、上記に記載したものと同様の本発明によるオリゴマー若しくはアンプリコン又は本発明によるキットの使用に関する。本発明の更に別の好ましい態様は、CCR6及び/又はBLR1の発現に関連する疾患、自己免疫疾患、同種移植レシピエントにおける有害作用、腫瘍性疾患、卵巣がん、慢性移植片対宿主病、アレルギー性喘息、多発性硬化症、炎症、炎症関節、関節リウマチ、乾癬性疾患、炎症性腸疾患、脳症、及びX連鎖免疫調整異常多発性内分泌障害腸症候群IPEX、好ましくは関節リウマチ、乾癬性疾患、炎症性腸疾患、最も好ましくは関節リウマチを治療する方法に関する。該方法は、CCR6及び/又はBLR1の発現を用いて本発明によって特徴付けられる有効量の免疫細胞を、それを必要とする上記患者に投与することを含む。有効量の免疫細胞を投与する方法は文献に記載されており例えば、BharatAFieldsRCMohanakumarTRegulatoryTcellmediatedtransplantationtoleranceImmunolRes200633195212、JuneCHBlazarBRClinicalapplicationofexpandedCD425cellsSeminImmunol2006Jan31、KhazaieKvonBoehmerHTheimpactofCD4CD25TregontumorspecificCD8TcellcytotoxicityandcancerSeminCancerBiol2006Apr16124136Epub2006Jan26、及びそれらにおいて引用される参考文献、当業者は本発明との関連でこれらの方法を適用することが可能である。治療という用語は、上記CCR6及び/又はBLR1の発現に関連した疾患の予防も含む。CCR6遺伝子座及び/又はBLR1遺伝子座内の領域のメチル化状態の分析は、細胞集団がCCR6遺伝子及び/又はBLR1遺伝子を安定に発現するか否かについての予測の改善を可能にする。したがって、本方法は、自己免疫疾患を患うか、又は同種移植を受けている患者への養子移入前に、invitroで生成した又は展開させた免疫細胞の品質管理として用いることができる。CpGモチーフが或る程度まで脱メチル化されている場合に限り、これらの細胞がCCR6遺伝子及び/又はBLR1遺伝子を安定に発現し、しばらくした後でCCR6及び/又はBLR1の発現を失うことはないことが確信される。養子移入した細胞の調節性表現型の安定性に関するかかる品質管理は不可欠であり、CCR6遺伝子座及び/又はBLR1遺伝子座の上述の領域複数も可のメチル化状態の分析によってのみ達成することができる。本発明の1つの実施の形態では、本明細書中に記載されるように、CCR6遺伝子座及び/又はBLR1遺伝子座のメチル化状態をバイサルファイトシークエンシングによって分析し、顆粒球、単球、ナイーブT細胞又はナイーブ細胞傷害性T細胞と、NK細胞、記憶T細胞、記憶細胞傷害性細胞、ナイーブB細胞又は記憶B細胞との著しい違いが明らかになった。CCR6については、アンプリコン888及びアンプリコン1203実施例を参照されたいは通常のconventional顆粒球、単球、ナイーブT細胞又はナイーブ細胞傷害性T細胞内で高度のメチル化ほぼ100を示した図8A、図8B及び図9。アンプリコン1204配列番号26;実施例を参照されたいは、通常のナイーブT細胞及びナイーブ細胞傷害性T細胞内で高度のメチル化ほぼ100を示した。アンプリコン1201及びアンプリコン1202実施例を参照されたいにおいては、脱メチル化プロセスはナイーブB細胞及び記憶B細胞のみで起こり、脱メチル化が無作為事象ではなく、規定の領域に限定されることが示される。特に、CCR6CD4記憶T細胞及びCD8記憶T細胞内で高度の脱メチル化ほぼ100を示す領域がCCR6遺伝子座において同定された配列番号13を参照されたい。BLR1遺伝子座と同様に、アンプリコン1037実施例を参照されたいは、通常の顆粒球、単球、NK細胞、ナイーブT細胞、記憶細胞傷害性T細胞又はナイーブ細胞傷害性T細胞内で高度のメチル化ほぼ100を示した図8。免疫細胞上の異なるケモカイン受容体の差次的発現により、リンパ系組織及び非リンパ系組織への及びそれらの内部での様々な機能的サブセット及び分化段階のエフェクター細胞及び調節性細胞の組織的な時空的分布が確実になる。移行性の表現型、とりわけT細胞及びB細胞の一部は、分化時に見かけ上永久的にインプリンティングされ、身体の特定のコンパートメントへの記憶集団の選択的な送達ホーミングが可能となる。T細胞及びB細胞の子孫において安定したホーミング表現型がどのように獲得され、維持されるかについては十分に理解されていない。後成的機構、とりわけ本明細書中に記載されるようなDNA領域のメチル化/脱メチル化は転写調節に関与し、遺伝性メチル化シグネチャーのインプリンティングによる表現型変化の長期記憶をもたらすのに理想的に適している。本発明との関連では、本発明者らはこのため、差次的DNAメチル化が一次ヒトT細胞における安定したCCR6発現の獲得に関与し得るか否かを調査した。本発明との関連では、驚くべきことに、白血球の亜集団間で差次的にメチル化されるCCR6遺伝子座内の領域配列番号13、DMRが、DMH手法によって初めに同定され非特許文献20、選別されたヒト血球サブセットのメチル化状態をバイサルファイト変換を用いて分析することによって検証された。観察されたメチル化パターンは、様々なリンパ球サブセットにおけるCCR6の発現に概ね一致し、CD56NK細胞及びNKT細胞、一部のCD4T細胞及びCD8T細胞、成熟B細胞及びCD4Treg等のCCR6発現細胞が、部分的に又は更には完全に脱メチル化されたCCR6領域を示したが、この遺伝子座はCCR6発現を欠く休止期のCD14単球及びCD15顆粒球では完全にメチル化された。しかし、CD4記憶T細胞及びCD8記憶T細胞では、CCR6領域の脱メチル化は、表面上にCCR6タンパク質を発現するこれらのサブセットに限定され、CCR6調節におけるこの遺伝要素及びそのメチル化状態に対する役割が示唆される。本発明者らがTreg特異的転写因子FOXP3について近年実証することができたように非特許文献19、DNAの脱メチル化は通常、安定した遺伝性の発現パターンのシグネチャーとして見られる。他の多くの炎症性ケモカインの受容体と同様、CCR6は循環記憶T細胞の大部分で発現されるが、ナイーブT細胞には見られずLiaoFRabinRLSmithCSSharmaGNutmanTBFarberJMCCchemokinereceptor6isexpressedondiversememorysubsetsofTcellsanddeterminesresponsivenesstomacrophageinflammatoryprotein3alphaJImmunol1999162186194、SatoKKawasakiHNagayamaHetalChemokinereceptorexpressionsandresponsivenessofcordbloodTcellsJImmunol200116616591666、CCR6発現がT細胞プライミング時に獲得されることが示唆される。CCR6発現は、IL-1、IL-6、TGF-β及びTNF-αを含有するサイトカインカクテルを用いてナイーブCCR6-CD4T細胞から新たに誘導することができる非特許文献14、SatoKKawasakiHNagayamaHetalChemokinereceptorexpressionsandresponsivenessofcordbloodTcellsJImmunol200116616591666。CCR6細胞の割合が誘導条件下での反復刺激によって増大するにもかかわらず、達成されるCCR6発現は、exvivoで選別されたCCR6記憶T細胞とは対照的に長期の培養時に安定であることが見出されず、CCR6領域の脱メチル化と関連もしていなかったため、これらはCCR6記憶集団に特徴的であることが判明した。本発明者らがIL-17分泌CCR6細胞及びIL-17非分泌CCR6細胞におけるCCR6領域の脱メチル化について考えるところでは、記憶細胞におけるメチル化状態は機能的表現型から独立したものであり得る。まとめると、本発明によって提供されるデータから、CD4T細胞において安定したCCR6発現プロファイルをインプリンティングするには、特異的なこれまでに知られていないシグナルが必要とされることが示唆される。最後に、DNAメチル化とCCR6の実際の発現との間の相関関係の欠如が、TCR刺激後のCD4記憶T細胞上のCCR6の下方調節について見出された。CCR6発現の一時的な喪失は、メチル化パターンの変化を伴わなかった。ここでも、CCR6がTCR刺激の除去及びIL-2の添加の後に急速に再発現されたことから、発現の変化は安定していなかった。しかしながら、この場合、CCR6下方調節がCCR6発現の転写調節ではなくratherthan受容体の変調によるものであることを排除することはできない。これらのデータから、CCR6遺伝子座の重要な領域におけるDNAメチル化が、記憶T細胞における永久的にCCR6を発現する表現型の獲得に関与することが示される。CCR6遺伝子座における調節性遺伝子要素のメチル化状態がCCR6発現の長期安定性を決定付けるという結果を、人工DNA低メチル化を用いる実験によって更に裏付けた。T細胞刺激時のDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤5’-アザシチジンの適用は、外因性CCR6誘導サイトカインの非存在下であってもCCR6発現を増大させただけでなく、invitro展開時に安定したCCR6発現を示すCCR6細胞を生じ、これは以前にinvitroで誘導されたTregにおけるFoxp3発現についても観察された所見であるPolanskyJKKretschmerKFreyerJetalDNAmethylationcontrolsFoxp3geneexpressionEurJImmunol20083816541663。本明細書で、本発明者らは、CCR6を発現する記憶CD4T細胞及び記憶CD8T細胞、並びにCD25highFOXP3Tregにおいて非メチル化CpGモチーフを示すヒトCCR6遺伝子座の非コード領域を同定し、特徴付けた。CCR6記憶CD4T細胞でのCCR6発現は、サイトカイン誘導増殖時に安定であり、TCR刺激後に僅かに下方調節された。しかしながら、かかるCCR6下方調節は単に一時的なものであり、CCR6遺伝子座内の調節性領域の再メチル化を伴わなかった。一方で、炎症性サイトカインの存在下でのTCR刺激によるナイーブCD4T細胞におけるCCR6発現のinvitro誘導は不安定なCCR6発現をもたらし、CCR6遺伝子座のメチル化状態における変化を示さなかった。特に、DNAメチル化阻害剤5’-アザシチジンによる処理は、CCR6発現の増大及び部分的な安定をもたらした。レポーター遺伝子プラスミドにクローニングすると、この差次的にメチル化される領域は、exvivoで単離したCCR6一次T細胞へのトランスフェクション後に構成的転写活性を示し、これがCCR6発現を調節するエンハンサー要素として働き得ることが実証された。要するに、本発明者らは、後成的機構によって安定したCCR6発現を媒介する、CCR6T細胞において構成的転写活性を示すヒトCCR6遺伝子の非コード領域を同定した。本発明は、後成的機構がケモカイン受容体の転写活性を調節するだけでなく、さらに永久的な発現パターンのインプリンティングにおいて重要な役割を果たし、それにより分化した記憶T細胞に組織分布的記憶を与え、それらの長期にわたる移行挙動を形作るものであり得るという実験的証拠を初めて提供する。ここで、本発明を以下の実施例において添付の図面及び配列表を参照して更に説明するが、本発明はこれらに限定されない。以下の実施例は主に、遺伝子CCR6の好ましい脱メチル化領域の分析との関連で行ったが、これらの実験をCCR6及びBLR1に関して本明細書中に記載される遺伝子の他の関連領域のメチル化分析に容易に適合させることができることは、当業者には理解される。材料及び方法細胞、抗体及びフローサイトメトリーバフィーコートDRKBlutspendedienst,Berlin,Germany及び末梢血サンプルを、地方倫理委員会の承認に従ってインフォームドコンセント後に健常ドナーから得た。フィコールハイパック勾配SigmaAldrichを用いてPBMCを分離した。細胞表面抗原を、以下のモノクローナル抗体を用いて、単一パラメーター又は多重パラメーターの蛍光活性化細胞選別装置FACS分析によって分析した:PE-抗CCR611A9及びAlexa700-抗CD4RPA-T4どちらもBDBiosciences製。APC-抗CD25BC96はebioscienceから購入した。BeckmanCoulter製のPE-Cy5-抗CD8B9.11、PE-Cy5-抗CD56N901及びFITC-抗CD25B1.49.9。社内DRFZ,Berlinで生成された抗体:FITC-抗CD45RA4G11、Alexa405-抗CD4TT1及びAlexa405-抗CD3OKT3。一部の実験では、CCR6発現をビオチン化CCR611A9、BDBiosciencesを用いた間接免疫蛍光法によって検出し、続いてAPC結合ストレプトアビジンSouthernBiotechを用いて染色した。染色は非特異的な結合を遮断するために、0.5ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝生理食塩水中で行った。FACSCantoIIBDBiosciencesをデータ取得に用い、FlowJoソフトウェアTreestarを使用して分析を行った。T細胞の単離及びFACS商標選別抗CD4磁性ビーズ又は抗CD8磁性ビーズのそれぞれ及び自動MACS分離システムMiltenyiBiotec,BergischGladbach,Germanyをメーカーの使用説明書に従って用いて、全CD4T細胞及びCD8T細胞をPBMCから富化した。抗CD4、抗CD8、抗CD25、抗CD45RA及び抗CCR6を用いた続く染色の後、以下の細胞集団をFACSAria商標又はFACSDiva商標細胞選別装置BDBiosciencesで選別した:ナイーブCD4T細胞CD4CD25-CD45RA、CD4TregCD4CD25high、CCR6-ナイーブCD4T細胞、CCR6-記憶CD4T細胞CD4CD25-CD45RA-、CCR6記憶CD4T細胞、CCR6-ナイーブCD8T細胞CD8CD25-CD45RA、CCR6-記憶CD8T細胞CD8CD25-CD45RA-及びCCR8記憶CD8T細胞。再分析の際に、選別した細胞は常に98を超える純度を示した。exvivoで単離した細胞を、メチル化分析又はinvitro細胞培養下記を参照されたいのいずれかに使用した。ナイーブCD4T細胞及び記憶CD4T細胞のT細胞培養invitro培養アッセイについては、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、非必須刺激nonessentialstimulation、β-メルカプトエタノール及び5ヒト血清を含有するRPMI1640Glutamax培地Invitrogen完全培地CM中で細胞を培養した。ナイーブCD4T細胞の刺激については、1×105個の細胞を平底マイクロタイタープレート内で、抗CD3及び抗CD28でコーティングされた1×105個の磁性ビーズDynabeads、Invitrogenとともに、20ng/mlのIL-2RDSystems並びにIL-4、IL-12及びIFN-γに対する2μg/mlの中和抗体を添加したCM中性条件、抗体はBDBiosciences製中で4日間培養し、続いて1000U/mlのIL-2Proleukin、Chironを含有するCMに移した。ナイーブCD4細胞でのCCR6の誘導については、以下のサイトカインを培養の初めに添加した:10ng/mlのTGF-β、10ng/mlのIL-6、10ng/mlのIL-1、10ng/mlのTNF-αRD。一部の実験では、細胞の刺激を同じ条件下で最大3回繰り返した。メチル化阻害薬5’-アザシチジンAza、SigmaAldrichによるナイーブCD4細胞でのCCR6の誘導については、48時間の培養後に5μMのAzaを添加した。記憶CD4CCR6細胞及び記憶CD4CCR6-細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルCFSEを用いて染色し、上記に記載されるような磁性ビーズ、又は10ng/mlのIL-7及び10ng/mlのIL-15RDSystemsを含有するCM中で培養した。4日後、Dynabeadsを含有する培養物のみを、1000U/mlのIL-2Proleukin、Chironを含有するCMに移した。培養の終了時に、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、メチル化分析下記を参照されたいに使用した。ルシフェラーゼレポーターアッセイヒトCCR6遺伝子座の差次的にメチル化される領域を、鋳型としてヒトcDNA、及び以下のプライマーを用いたPCRによって増幅した:A5’-GACTACGCGTCAGTAAGGGGGAGCCACTG-3’配列番号11、B5’-GACTAGATCTCAAGGAAAGCAGCTGACGA-3’配列番号12。増幅された501bpの要素を、MluI及びBglIIによってpGL3プロモーターベクターPromegaに、最小SV40プロモーターの前にクローニングし、pGL3-CCR6を生成した。クローニングした領域のシークエンシングから、Ensemblに保管されたヒトゲノムのCCR6領域配列との100の同一性が明らかになった。MACSによって選別された全CD4T細胞を、2.5μgのpGL3プロモーターベクター又はpGL3-CCR6ベクターを用いてトランスフェクトした。合成ウミシイタケルシフェラーゼレポーターベクターpRL-TK、Promega1.5μgを、トランスフェクション効率の内部対照として使用した。ヌクレオフェクションLonzaによるトランスフェクションの4時間後に、細胞をIL-2を含有するRPMI1640培地中で培養するか、又はPMA10ng/ml、Sigma及びイオノマイシン500ng/ml、Sigmaで4時間刺激した。48時間の培養後に細胞を採取し、デュアルルシフェラーゼアッセイシステムPromegaを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。データをウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化した。プライマー、DNA調製、バイサルファイト変換、PCR及びシークエンシングプライマーをバイサルファイト特異的PCR及びシークエンシング反応に使用した。ゲノムDNAを、選別されたT細胞サブセットからDNeasy組織キットQiagenを用いて、培養動物細胞用のプロトコルに従って単離した。ゲノムDNAのバイサルファイト処理を、これまでに記載されているように行ったOlekAOswaldJWalterJAmodifiedandimprovedmethodforbisulphitebasedcytosinemethylationanalysisNucleicAcidsRes19962450645066。PCRを、1×PCRバッファー、1UのTaqDNAポリメラーゼQiagen、200μMdNTP、各12.5pmolのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに7ngのバイサルファイト処理したゲノムDNAを含有する25μLの最終容量で、95°Cで15分間、並びに95°Cで1分間、55°Cで45秒間及び72°Cで1分間の40サイクル、及び72°Cで10分間の最終伸長工程で行った。PCR産物をEx-oSAP-ITUSBCorpを用いて精製し、PCRプライマー及びABIBigDyeTerminatorv1.1ケミストリAppliedBiosystemsを適用してシークエンシングし、続いてABI3100遺伝子分析装置でキャピラリー電気泳動を行った。ESMEを用いてAB1ファイルを解釈したLewinJSchmittAOAdorjanPHildmannTPiepenbrockCQuantitativeDNAmethylationanalysisbasedonfourdyetracedatafromdirectsequencingofPCRamplificatesBioinformatics20042030053012。好ましいプライマー及びプローブの例は以下の通りである:アンプリコン888の増幅プライマーバイサルファイトシークエンシング用:フォワード:888pGTTAGTGGGGTTGAGTAGGATA配列番号1リバース:888oAAAACCCTAAAATCACAAAACTA配列番号2アンプリコン1201の増幅プライマーバイサルファイトシークエンシング用:1201qTTGGTAATGTTTGTTTGGAAAG配列番号31201rCTCCTAAATCCCTCAACATCTA配列番号4アンプリコン1202の増幅プライマーバイサルファイトシークエンシング用:1202oAAACTCACAACTTCCTTCACTC配列番号51202pAAGGGTAGTGTTAGAGGGTATTT配列番号6アンプリコン1203の増幅プライマーバイサルファイトシークエンシング用:1203oCACCTAATCTTCATATAACACAAAA配列番号71203pGGTATAGTGTATTGGGAAGTGG配列番号8アンプリコン1204の増幅プライマーバイサルファイトシークエンシング用:1204rTCTCTTTTTCTTATCACTTTACCA配列番号271204qTGTTTTTAGGAAAGGAAGTTTG配列番号28アンプリコン1037の増幅プライマー配列番号29;バイサルファイトシークエンシング用:1037oCCTTATCTACTTCTTCCACAAAAT配列番号91037pAGTGATGAGTTGTGAGGTAGGT配列番号10DMRの増幅プライマーバイサルファイトシークエンシング用:CpGメチル化特異的PCRシステムフォワードプライマーGAGATGATAAGGGGTGC配列番号14リバースプライマーACACCTCACCTAAATCG配列番号15プローブHEX-TTTAGGCGTGAGGACGTGGAGTT-BHQ1配列番号16TpG脱メチル化特異的PCRシステムフォワードプライマーGAGATGATAAGGGGTGT配列番号17リバースプライマーACCACACCTCACCTAAATCA配列番号18プローブFAM-ATTTAGGTGTGAGGATGTGGAGTTTAGGG-BHQ1配列番号19CCR6DMRアッセイのゲノム標的領域は太字で示し、CpGには下線を引いている:GCCAGTGGGGTTGAGCAGGACACAGGTCCTGCTGTGTCTAGCTGGTTCCCCAGAGAGATGATAAGGGGTGCGCTCCAGCTTCTCAGGCTCACTCAGGCGTGAGGACGTGGAGCTCAGGGCTCTGCAGGAAGGAGCGACCCAGGTGAGGTGTGGTCAAGATAGAGCAGAGCTGGGCAGCGGGCAGTGGAGCCTCGTGGGCAGCCTGGGGGTGGGGAGGCACAGTGCACTGGGAAGTGGAGAAAGTGTGAGTCCATCAGGCTGGCTGAGAATTGATCACGAACCTATTGTCTGTAAAACTTTTGTTATTTCCTGAGACGTGGTTCACAGCAACCCAGGTGCGAACAGCCTTGTGATTCTAGGGTTCT配列番号13コンピュータによる分析推定転写因子結合部位の予測については、MatInspectorツールGenomatixを用いた。統計データは平均±SDとして表す。群間差を、指定のマンホイットニー検定又はウィルコクソン順位検定を用いて評価した。0.05未満のP値は有意であるとみなした。実施例1CCR6遺伝子座内の非コード領域は、CCR6発現と相関して差次的メチル化を示す本発明者らは以前に、差次的メチル化ハイブリダイゼーションDMH技法を用いて通常のナイーブCD4T細胞とCD25highCD4Tregとを比較することによって、ヒトTregにおける後成的に調節される遺伝子のスクリーニングを行った非特許文献20。このDMHスクリーニングでは、CCR6が差次的にメチル化される遺伝子の一つであることが分かった。好ましい差次的にメチル化される領域は、報告された2つのCCR6転写産物の上流に位置し、推定CCR6プロモーターと重複する図1A。DMHのデータを確認するために、本発明者らは、ヒト末梢血から単離された通常のナイーブCD45RACD4T細胞及びCD25highCD4Tregに由来するゲノムDNAを用いてバイサルファイトシークエンシングを行った。CD25highCD4Tregは、大部分が脱メチル化されたCCR6領域を示したが平均メチル化率23.8、通常のナイーブT細胞はほぼ完全にメチル化されていた平均メチル化率81図1B。TregKleinewietfeldMPuentesFBorsellinoGBattistiniLRotzschkeOFalkKCCR6expressiondefinesregulatoryeffectormemorylikecellswithintheCD25CD4TcellsubsetBlood200510528772886に加えて、CCR6の発現はCD4記憶T細胞及びCD8記憶T細胞の両方について報告されている。CCR6遺伝子座の観察された脱メチル化が、exvivoでCCR6を発現する細胞の画分に限定されるか否かを理解するために、CD4T細胞及びCD8T細胞のサブセットを、CCR6及びCD45RAの発現に従って選別し図2A、CCR6遺伝子座のバイサルファイトシークエンシングによって分析した。CCR6発現を欠くナイーブCD45RACD4T細胞、及びCCR6-CD45RA-CD4記憶T細胞の両方が強くメチル化されたが、CCR6を発現するCD4記憶T細胞は、分析したCCR6領域のほぼ完全な脱メチル化を示した図2B。CD8T細胞は全体的に低いDNAメチル化レベルを示したが、CCR6CD8記憶T細胞は明らかにCCR6-CD8記憶T細胞と比較して低いメチル化CCR6領域を示した図2B。これらのデータに一致して、休止期のCD14単球及びCD15顆粒球等のCCR6発現を欠く末梢血白血球サブセットは、ほぼ完全にメチル化されたCCR6領域を示したが平均メチル化率84超、CCR6を発現するCD56NK細胞及びNKT細胞並びに成熟B細胞は、この部位で完全に脱メチル化されていた。まとめると、本発明者らのデータは、CCR6発現がヒト白血球においてCCR6領域の脱メチル化と相関することを示している。CCR6T細胞は、invitro展開時にCCR6を安定に発現し、脱メチル化されたCCR6領域を維持するCD4記憶T細胞上のCCR6発現及び分析したCCR6領域の対応するメチル化パターンの両方が、細胞分裂時に安定しているかを調べるために、選別されたCCR6CD25-CD45RA-CD4T細胞をCFSEで標識し、記憶細胞の恒常的代謝回転を媒介するサイトカインを用いて、又はTCRによって誘発することによって刺激した。以前の報告GeginatJSallustoFLanzavecchiaACytokinedrivenproliferationanddifferentiationofhumannaivecentralmemoryandeffectormemoryCD4TcellsJExpMed200119417111719と一致して、記憶T細胞がIL-7及びIL-15等の恒常性サイトカインの存在下で増殖し、多数の細胞分裂の後であっても全ての増殖細胞が高レベルのCCR6発現を維持していた図3A。TCR刺激はCCR6発現の下方調節をもたらしSallustoFKremmerEPalermoBetalSwitchinchemokinereceptorexpressionuponTCRstimulationrevealsnovelhomingpotentialforrecentlyactivatedTcellsEurJImmunol19992920372045、これはTGF-βによって阻害され、IL-4によって促進された図3A及び図3B。しかしながら、試験した全ての刺激条件下で、CCR6領域のメチル化状態は変化しないままであり、同等の低レベルのメチル化を示した図3C。重要なことには、TCR刺激の際にCCR6発現を失ったCCR6-/low細胞が、TCR刺激の非存在下での培養後にCCR6を急速に再発現したため、TCRによって誘導されるCCR6発現の下方調節は一時的でしかなかった図3D。このため、CCR6領域の脱メチル化はCCR6発現の長期安定性に関連する。CCR6発現のinvitro誘導は不安定であり、CCR6領域の脱メチル化をもたらさないCCR6発現は、炎症性サイトカインTNF-α、IL-6、IL-1TGF-βのカクテルの存在下での活性化によって、ナイーブCD4T細胞の画分に対してinvitroで誘導することができる。本発明者らは、この新たなCCR6発現の誘導が、CCR6領域の脱メチル化と関連しているか否かについて分析した。ナイーブCD4T細胞を、炎症性サイトカイン及びTGF-βの存在下で抗CD3/抗CD28Dynabeads商標で刺激した。invitro培養の6日目に、サイトカインの非存在下で刺激したT細胞と比較して有意に高いT細胞の画分がCCR6を発現した図4A。しかしながら、両方の細胞集団がCCR6領域内でほぼ完全にメチル化され、未刺激ナイーブT細胞に対して違いを示さなかった図1B及び図2B。CCR6-細胞及びCCR6細胞への選別後も、新たに誘導されたCCR6細胞においてCCR6領域の選択的な脱メチル化は観察することができなかった図4B。サイトカインカクテルの存在下での反復刺激はCCR6細胞の頻度を更に増大したが、CCR6領域の脱メチル化は依然として検出可能ではなく図4C及び図4D、炎症性サイトカインのカクテルがCCR6発現の誘導には十分であるが、CCR6遺伝子座の脱メチル化には十分でないことが示された。exvivoで単離したCD4記憶T細胞とは対照的に、炎症性サイトカインの存在下でのTCR刺激によるナイーブT細胞におけるCCR6の新たな誘導は、一時的なCCR6発現しかもたらさず、ほぼ全ての細胞が誘導性サイトカインの非存在下での長期のinvitro培養の際にCCR6発現を失った図4D。DNAメチル化の阻害は培養ナイーブT細胞において部分的に安定したCCR6発現をもたらすDNAメチル化状態は、5’-アザシチジンAza等のDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤の存在下でのDNA複製の誘導によって薬理学的に操作することができる。分析されるCCR6領域の脱メチル化が、CCR6発現の安定化に関与するか否かを更に調べるために、本発明者らは、ナイーブCD4T細胞をAzaの存在下で抗CD3及び抗CD28Dynabeads商標を用いて活性化した。驚くべきことに、Aza処理は、外因性サイトカインの非存在下であっても相当な割合の細胞においてCCR6発現を誘導し、これらのAza処理細胞においてCCR6領域の明らかな脱メチル化を検出することができた図5A。興味深いことに、Azaによって誘導されたCCR6細胞を選別し、Azaの非存在下で中性条件下にて再刺激すると、CCR6発現の顕著な安定性がこれらの細胞において観察され、CCR6遺伝子座の脱メチル化がT細胞において安定したケモカイン受容体の発現を制御することが更に示された。CCR6遺伝子座の差次的にメチル化される要素は転写活性を有するCCR6遺伝子座の好ましい差次的にメチル化される領域は、2つの予測CCR6転写産物の444/446塩基上流に位置する図1A。CCR6領域は、コンピュータにより予測されたプロモーター領域と部分的に重複する。転写開始部位のようなプロモーターに典型的な要素はCCR6領域においては検出されなかったが、転写調節因子PPAR、GATA、AHR、ETS1又はRXRそれらの一部、例えばETS1はメチル化依存的にそれらの標的配列に結合するの推定結合部位が検出されたMaierHColbertJFitzsimmonsDClarkDRHagmanJActivationoftheearlyBcellspecificmb1genebyPax5isdependentonanunmethylatedEtsbindingsiteMolCellBiol20032319461960andownunpublishedobservations。CCR6発現の転写調節に対するCCR6領域の役割を分析するために、本発明者らはこの要素を、転写活性を有するエンハンサー要素の検出を可能にするSV40最小プロモーターを含有するルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングした。末梢血から単離された全D4T細胞へのトランスフェクション後、ルシフェラーゼレポーター構築物を含有するCCR6領域の転写活性は、空の対照ベクターと比較して約2.4倍増大した図6。興味深いことに、PMAイオノマイシンによるトランスフェクトしたCD4T細胞の刺激が同等の結果をもたらしたため、CCR6領域の転写活性は細胞の活性化状態に依存しなかった。これらの発見から、CCR6遺伝子座の差次的にメチル化される領域が、TCR媒介シグナルとは独立してエンハンサー活性を示すことが実証され、この要素が記憶T細胞における安定したCCR6発現の維持に機能的に関与することが示唆される。実施例2種々のT細胞種を2人の独立したドナーから精製し、FACS選別した。細胞傷害性T細胞及びヘルパーT細胞の分別のためのマーカーとしてCD4及びCD8を用いて、細胞を分離した。次いで、CD45RAを用いてこれらの集団をナイーブ細胞集団及び記憶細胞集団に更に分離した。記憶集団をCCR6陽性集団及びCCR6陰性集団に更に分離した。結果を以下の表1にまとめる。表1:本発明による遺伝子のメチル化パターン図8を参照されたい図11に示されるバイサルファイトシークエンシングデータを確認するために、アンプリコン888におけるCCR6のCpG位置71、98、106及び135を対象にするqPCR分析にサンプルを更に供した。使用したメチル化特異的なCpG特異的プライマー対を配列番号14/配列番号15に示し、対応するプローブを配列番号16に示す。脱メチル化された配列TpG特異的を検出するために、配列番号17/配列番号18に示すプライマー対を、配列番号19のプローブとともに使用した。結果を表2にまとめる。図11に示されるバイサルファイトシークエンシング結果を、qPCRアッセイにおいて確認することができた。表2:2人のドナーで分析し、CD4CD45RA及びCD4CD45RA-に選別したCCR6のDNAメチル化パターンアンプリコン888を示す"