"脂肪酸エステル基及び任意選択で1つ以上のアニオン基で完全に置換されている、置換された三糖コアを含む三糖誘導体の、アジュバントとしての使用。前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリウロース又はケストース、好ましくはラフィノース、メレジトース又はマルトトリオース、最も好ましくはラフィノース又はマルトトリオースに由来する、請求項1に記載の使用。前記置換された三糖コアが、アニオン基として、1つ又は2つの硫酸エステル基又はリン酸エステル基を含む、請求項1又は2に記載の使用。前記アニオン基が硫酸エステルである、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用。前記脂肪酸エステル基が、鎖長が炭素原子数4~20、好ましくは6~18、より好ましくは炭素原子数8~16、最も好ましくは炭素原子数10~14、きわめて好ましくは炭素原子数12の、直鎖、分枝、飽和又は不飽和の脂肪酸のエステルである、請求項1~4のいずれか一項に記載の使用。前記脂肪酸エステルが、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸又はアラキジン酸、好ましくはラウリン酸のエステルである、請求項1~5のいずれか一項に記載の使用。前記置換された三糖コアの脂肪酸エステル基が全て同一である、請求項1~6のいずれか一項に記載の使用。前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースに由来し、前記三糖誘導体が、置換された各三糖につき、同一の脂肪酸エステル基で完全に置換されている、請求項1~7のいずれか一項に記載の使用。前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースに由来し、前記三糖コアが、置換された各三糖につき、1個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び10個の同一の脂肪酸エステル基を、又は、置換された各三糖につき、2個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び9個の同一の脂肪酸エステル基を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の使用。前記脂肪酸エステル基がラウリン酸のエステルである、請求項1~9のいずれか一項に記載の使用。脂肪酸エステル基及び任意選択で1つ以上のアニオン基で完全に置換されている、置換された三糖コアを含む、アジュバントとしての三糖誘導体。前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリウロース又はケストース、好ましくはラフィノース、メレジトース又はマルトトリオース、最も好ましくはラフィノース又はマルトトリオースに由来する、請求項11に記載の三糖誘導体。前記置換された三糖コアが、アニオン基として、1つ又は2つの硫酸エステル基又はリン酸エステル基を含む、請求項11又は12に記載の三糖誘導体。前記アニオン基が硫酸エステルである、請求項11~13のいずれか一項に記載の三糖誘導体。前記脂肪酸エステル基が、鎖長が炭素原子数4~20、好ましくは6~18、より好ましくは炭素原子数8~16、最も好ましくは炭素原子数10~14、きわめて好ましくは炭素原子数12の、直鎖、分枝、飽和又は不飽和の脂肪酸のエステルである、請求項11~14のいずれか一項に記載の三糖誘導体。前記脂肪酸エステルが、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸又はアラキジン酸、好ましくはラウリン酸のエステルである、請求項11~15のいずれか一項に記載の三糖誘導体。前記置換された三糖コアの脂肪酸エステル基が全て同一である、請求項11~16のいずれか一項に記載の三糖誘導体。前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースに由来し、前記三糖誘導体が、置換された各三糖につき、同一の脂肪酸エステル基で完全に置換されている、請求項11~17のいずれか一項に記載の三糖誘導体。前記置換された三糖コアが、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースに由来し、前記三糖コアが、各置換された三糖につき、1個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び10個の同一の脂肪酸エステル基を、又は、各置換された三糖につき、2個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び9個の同一の脂肪酸エステル基を含む、請求項11~17のいずれか一項に記載の三糖誘導体。前記脂肪酸エステル基がラウリン酸のエステルである、請求項11~19のいずれか一項に記載の三糖誘導体。i三糖を用意し、これを溶媒中に溶解させるステップと、ii前記三糖の全てのOH-基を脂肪酸又は該脂肪酸の供給源によってエステル化するステップとを含む、三糖誘導体の調製方法。前記三糖のOH-基のうち少なくとも1つをアニオン作用剤と反応させる、請求項21に記載の方法。前記アニオン作用剤が、ピリジン.SO3若しくはTEA.SO3などの硫酸化剤、又は、リン酸化剤である、請求項22に記載の方法。使用する前記溶媒が、ジメチルホルムアミド、ピリジン又はこれらの混合物である、請求項21~23のいずれか一項に記載の方法。三糖:アニオン作用剤:脂肪酸の当量比が、それぞれ、1:0~3:8~l1、好ましくは1:0~1:10~11である、請求項21~24のいずれか一項に記載の方法。前記三糖が、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、マルトトリウロース又はケストースである、請求項21~25のいずれか一項に記載の方法。前記三糖が、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースである、請求項21~26のいずれか一項に記載の方法。前記脂肪酸が、鎖長が炭素原子数4~20の間、好ましくは6~18の間、より好ましくは炭素原子数8~16の間、最も好ましくは炭素原子数10~14、きわめて好ましくは炭素原子数12の、直鎖、分枝、飽和又は不飽和の脂肪酸である、請求項21~27のいずれか一項に記載の方法。前記脂肪酸が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸又はアラキジン酸である、請求項21~28のいずれか一項に記載の方法。前記三糖が、ラフィノース、メレジトース又はマルトトリオースであり、前記三糖が、同一の脂肪酸で、又は、各三糖につき、平均で1個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び10個の同一の脂肪酸エステル基で、又は、各三糖につき、2個の硫酸エステル基若しくはリン酸エステル基及び9個の同一の脂肪酸エステル基で完全にエステル化されており、好ましくは前記脂肪酸エステルがラウリン酸のエステルである、請求項21~29のいずれか一項に記載の方法。請求項21~30のいずれか一項に記載の方法によって得られる三糖誘導体。請求項31に記載の三糖誘導体の、アジュバントとしての使用。アジュバントとして使用するための、請求項11~20又は31のいずれか一項に記載の三糖。請求項11~20又は31のいずれか一項に記載の三糖誘導体又はその混合物並びに薬学的に許容されるレシピエントrecipient及び/又は賦形剤を含むアジュバント組成物。水中油型乳剤として製剤化された、請求項34に記載のアジュバント組成物。前記乳剤の油相がスクアラン及び/又はポリソルベートを含む、請求項35に記載のアジュバント組成物。請求項34~36のいずれか一項に記載のアジュバント組成物を含むワクチン製剤。抗原組成物及び請求項34~37のいずれか一項に記載のアジュバント組成物を含むキット。本発明による三糖誘導体の調製実施例1本発明によるスルホ-リポ-三糖の一般的な合成三糖を真空オーブン中で乾燥し、結晶水を除去する。続いて三糖5gを、還流冷却器を備えた100mL三口丸底フラスコ中で、30mLのDMF及び14mLのピリジン中に窒素流下で溶解させる。1.05当量のピリジン.SO3を、強力に攪拌しながら添加する。1時間後、フラスコを氷水中で冷却し、反応混合物が温まるのを防止するために強力に攪拌しながら塩化ラウロイルを滴加する。15分後、氷浴をゆっくりと40°Cまで加熱する。反応の進行はHPLCでモニターする。反応完了後、混合物を、ロータリーエバポレーター60°Cまで加熱に入れて真空内で濃縮する。粗生成物を300mLヘプタン及び150mL塩水中に取り込む。有機層を500mL分液漏斗中で分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過する。ヘプタン溶液を真空内で濃縮する。得られた油を200mLヘプタン中に溶解させ、トリエチルアミン2.37mLを滴加する。得られた溶液を濾過し、真空内で濃縮する。油を100mLヘプタン中に再び溶解させ、濾過し、溶液を真空内で濃縮する。実施例2ピリジン.SO3ルートによるスルホ-リポ-マルトトリオースS1L10-Maの合成表題生成物を、実施例1に記載した一般的な方法に従って、以下の詳細にて合成した。即ち、マルトトリオース5.1g、10mmolを真空炉vacuumstove中で、<10mbarにて、40°Cで19時間及び70°Cで48時間乾燥し、収量は4.9gであった。乾燥したマルトトリオースを30mLのDMF及び14mLのピリジン中に溶解させ、1.6g1.05当量のピリジン.SO3で硫酸化し、2mLのDMF中に懸濁した。1時間後、スルホ-三糖を、氷浴中で11当量25.5mLの塩化ラウロイルでエステル化した。混合物をゆっくりと40°Cまで加熱し、3時間反応させた。反応ステップに続いて、HPLC-ELSD分析を行った。抽出及びトリエチルアミン交換をしてから生成物を単離した。濃厚な黄褐色のシロップの収量は15.5g5.5g50°Cまで加熱した後の蒸発フラスコからの二次収穫物。HPLC-ELSDクロマトグラムについては図1Aを参照。実施例3ピリジン.SO3ルートによるスルホ-リポ-マルトトリオースS1L10-Maの代替合成表題生成物を、実施例1に記載した一般的な方法に従って、以下の詳細にて合成した。即ち、マルトトリオース5.0g、10mmolを真空炉中で、<10mbarにて、40°Cで20時間及び70°Cで90時間乾燥し、収量は4.9gであった。乾燥したマルトトリオースを30mLのDMF中に溶解させ、1.6g1.05当量のピリジン.SO3を14mLのピリジン中の懸濁液として添加した。1時間後、スルホ-三糖を、氷浴中で11当量25.2mLの塩化ラウロイルでエステル化し、ゆっくりと40°Cまで加熱した。HPLC-ELSD分析用試料を、処理中の一定時間毎に取り出した。塩化ラウロイルとの反応を周囲温度で終夜放置した。後処理を、実施例1に記載の通りに行った。濃厚な黄褐色のシロップの収量は24.7g。HPLC-ELSDクロマトグラムについては図1Bを参照。実施例4ピリジン.SO3ルートによるスルホ-リポ-ラフィノースS1L10-Raの合成表題生成物を、実施例1に記載の通りに、以下の詳細にて合成した。即ち、ラフィノース五水和物5.0g、10mmolを、真空炉中で、<10mbarにて、30°Cで24時間及び60°Cで90時間乾燥し、収量は4.3gであった。乾燥したラフィノースを30mLのDMF及び14mLのピリジン中に溶解させた。ピリジン.SO31.6g、1.05当量を一度に添加した。1時間後、スルホ-三糖を氷浴中で12当量23.5mLの塩化ラウロイルでエステル化し、40°Cまでゆっくりと加熱した。4時間後、実施例1に記載の通りに、混合物を真空内で濃縮し、抽出し、TEAで処理した。濃厚な黄褐色のシロップの収量は18.0g。HPLC-ELSDクロマトグラムについては図2を参照。実施例5リポ-マルトトリオースL11-Maの合成表題生成物を、実施例1に記載した一般的な方法に従って、以下の詳細にて合成した。即ち、マルトトリオース水和物0.50gを真空オーブン中で乾燥した。乾燥した三糖0.49g、0.97mmolをピリジン1.4mL及びDMF3mL中に溶解させ、氷浴中で冷却し、塩化ラウロイル3.36mL、15当量と、0°Cで1時間、続いて室温で16時間反応させた。反応混合物はゲルになり、3mLのヘプタンを添加し、音波処理をすると、生成物は溶解した。ヘプタンの添加を2回繰り返した。有機相75mLを水で洗浄し、3層系を形成した。有機層のみを単離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、濃厚な黄褐色のシロップ1.39gを得た。HPLC-ELSDクロマトグラムについては図3Aを参照。実施例6リポ-ラフィノースL11-Raの合成ラフィノース五水和物0.50gを真空オーブン中で乾燥した。乾燥したラフィノース0.41g、0.86mmolをピリジン1.4mL及びDMF3mL中に入れ、氷浴中で冷却し、塩化ラウロイル2.97ml、15当量と、0°Cで1時間、続いて室温で18時間反応させた。反応混合物をヘプタン50mlで希釈し、水25mlで洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、濃厚な黄褐色のシロップ2.33gを得た。HPLC-ELSDクロマトグラムについては図3Bを参照。本発明による三糖誘導体を含むアジュバントの、抗GnRH価、血清テストステロン値及び有害作用の発生に対する影響。動物実験を実施して、本発明による三糖のアジュバントとしての使用に関連する有効性及び考えられる有害作用を評価した。ラットにおける当試験では、3種のスルホ-リポ-三糖系のアジュバントを試験した。即ち、実施例3に従って調製したスルホ-リポ-マルトトリオース1つの硫酸-エステル基及び10のラウロイルエステル基、S1L10-Ma、実施例4に従って調製したスルホ-リポ-ラフィノース1つの硫酸-エステル基及び10のラウロイルエステル基、S1L10-Ra、及び実施例6に従って調製したリポ-ラフィノースラウロイルエステル基で完全に置換されたラフィノース、L11-Raである。スルホ-リポ-マルトトリオースを含むアジュバントには、リポ-マルトトリオースラウロイルエステル基で完全に置換されたもので、L11-Maも含めた。スルホ-リポ-ラフィノースを含むアジュバントには、リポ-ラフィノースラウロイルエステル基で完全に置換されたもので、L11-Raも含めた。スルホ-リポ系のアジュバントを、1用量につき0.008~8mgの種々な用量にて試験した。アジュバントを、1用量につき、0.7μgのコンジュゲートしたGnRHを伴うGnRH-KLHコンジュゲートと組み合わせて試験した。アジュバントのアジュバント活性を、陽性対照アジュバントのスルホ-リポ-スクロース1つの硫酸エステル基及び7つのラウロイル酸エステル基を伴う二糖、S1L7-Su、及び糖類化合物を含まず水中スクアラン乳剤からなる陰性対照アジュバント、並びにPBSのみを受ける1グループと比較した。有効性を、抗体価と、テストステロン値に対する誘発された抗体の生物学的影響とによって判定した。アジュバントを伴う免疫処置の有害作用を判定するために、毎日の臨床観察を行い、体温及び注射部位反応を判定した。アジュバント乳剤の調製糖類:スルホ-リポ-マルトトリオースS1L10-Maスルホ-リポ-ラフィノースS1L10-Raリポ-ラフィノースL11-RaスクアランAEConnockポリソルベート-80Fagron滅菌PBS-witpH7.4MediabereidingASG、LelystadMilliQ水Millexシリンジ式フィルターユニット0.22μmPES、33mm、4.5cm2Millipore相互作用チャンバー、型F20Yを備えたマイクロフルイダイザーMicrofluidizerM-110SマイクロトラックナノトラックアナライザーシステムMicrotracNanotracAnalyzerSystemNPA-253実験用アジュバントを以下の通り調製した。注:グループ5及び10については、糖類をスクアラン中に溶解させた。これらの溶液のうち、4.0056g5及び4.0006g10を、さらなる乳剤の調製に使用した。最終的な乳剤中のSLS含有量は1mg/25mlであった。油相成分糖、スクアラン、ポリソルベート-80及びMilliQ水、量は表1に示した通りを、50mlファルコンFalconチューブ中で重量測定した。ボルテックスを使用して成分を混合し、50°Cの湯浴中で糖類が溶解するまで加熱した。温まった油相を水相PBSに添加し、2つの相を、ボルテックス及びウルトラタラックスultra-turraxによって、24000min-1で約30秒間、間隔を置いて混合した。続いて、乳剤を、マイクロフルイダイザー処理によって形成した。操作圧力を500kPa5barに設定し、各混合物を、氷浴に浸した相互作用チャンバーの冷却下に3回通過させた。各乳剤に手作業で滅菌濾過を施した。乳剤の粒径を、ナノトラック粒子測定器を使用して測定した。ワクチン1~13を、同等体積のアジュバント表2に示した糖類化合物を含むを水相0.7μgのコンジュゲートしたGnRHを含有するに添加することによって製剤した。ワクチン14はPBSのみからなる。以下のワクチンを調製した。動物及び免疫処置雄の10週齢のウィスターラットを、1ケージにつき3匹ずつ収容した。ラットに餌及び水を自由に摂取させた。実験デザイン表2に従って、0日目、14日目及び28日目に、ラットに200μl水相及び200μlアジュバントを含む400μlワクチンで免疫処置した。2本の筋肉内注射各100μlを左右大腿部内側に注射し、2×100μlを頸部に皮下注射した。各グループは5匹のラットからなるものとする。免疫処置前並びに41日目及び56日目に、血清用の血液試料を全ての動物から採取した。ワクチンの有効性アッセイGnRHに特異的な抗体をELISAで測定した。リン酸緩衝液pH5に溶解した0.2グルタルジアルデヒドでプレート96ウェルをプレコートし、室温で3時間置き、0.1Mリン酸緩衝液pH8で洗浄し、各ウェルにリン酸緩衝液pH81mlにつき10μgのGnRHPepscanPresto、Lelystad、オランダを含有する溶液100μlをコートし、37°Cで3時間インキュベートした。コートしたプレートを0.05Tween-80で洗浄した。血清試料をPEM4ウマ血清を伴う1Tween-80中に希釈した1/10。この希釈液を96ウェルプレート各ウェルに100μl、8ステップ中でさらに希釈し、37°Cで1時間インキュベートした。0.05Tween-80で洗浄してから、PEMに入れた、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗ラット抗血清100μlをウェルに添加した。プレートを37°Cで1時間インキュベートし、0.05Tween-80で12回洗浄した。続いて、2,2-アジノ-ビス-3-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸ABTSにH2O2を加えたものを含有する150μlの基質溶液を、プレートの各ウェルに加えた。プレートを周囲の室温で45分間インキュベートし、吸光度を405nmで測定した。抗体価を希釈因子の10logとして表した。これはバックグラウンドの4倍の光学密度約100を示している。血清テストステロン値を、市販のテストステロンEIABeckmanCoulter、Woerden、オランダを使用して、製造元の使用説明書に従って測定した。GnRH抗体価スルホ-リポ-マルトトリオースS1L10-Ma及びスルホ-リポ-ラフィノースS1L10-Raで処置したグループのGnRH抗体価を、図4A及び4Bに示す。両スルホ-リポ-三糖とも、GnRHに対して用量依存的な抗体価を誘発した。抗体価は、0.08~8mgのスルホ-リポ-三糖で処置したラットの方が、糖類を含まないアジュバントで処置したラットNS、グループ11よりも大幅に高かった。これは、免疫応答に対してスルホ-リポ-三糖が大いに貢献していることを示している。図4Cは、本発明による8mgの糖類化合物、即ちS1L10-Ma-8、S1L10-Ra-8及びL11-Ra-8を受けたラットのGnRH抗体価が、スクアラン乳剤のみで処置したラットNSよりも大幅に高かったことを明白に示す。これによって、S1L10-三糖とL11-三糖の両方の強力なアジュバント活性が際立つ。血清テストステロン本発明によるスルホ-リポ-三糖、即ちS1L10-Ma及びS1L10-Raを含むアジュバントとともに乳化したGnRH-KLHコンジュゲートで免疫処置をした結果、スルホ-リポ-三糖0.08mgからそれ以上で、血清テストステロン値の劇的な減少をもたらした図5A~Bが、一方、最も低用量のスルホ-リポ-三糖0.008mgの、血清テストステロンに対する影響は糖類化合物を含まない水中油型乳剤と類似していた。脂質化三糖L11-Ra-8での免疫処置もテストステロン値の減少を誘発した図5C。有害作用平均体温の上昇全ての動物において少なくとも1日1回の臨床観察を行った。全ての動物に対し、各免疫処置の前後に、直腸温にて平均体温MBTを測定した。各グループの平均体温MBTを、免疫処置前の値について図6に示す。各ワクチン接種の3時間後、0.8、0.08及び0.008mg用量のスルホ-リポ-三糖で処置したラットには、MBTに対する影響は認められなかった一方で、8及び2mg用量でのみ、MBTにおけるわずかな上昇が観察された。しかしその翌日、ワクチン接種の21時間後、MBTは降下して再びほぼ正常値になった図6A及び6B。これとは対照的に、二糖化合物S1L7-Su-8での免疫処置では、ワクチン接種の3時間後に、三糖化合物よりもMBTの上昇がわずかに高く、免疫処置の1日後にMBTの降下は示されず、MBTはワクチン接種の21時間後も依然として上昇していた図6C。脂質化三糖L11-Ra-8はMBTの上昇を何ら誘発しなかった。したがって、図6から明らかであるのは、従来技術において既知の二糖誘導体と比較したとき、本発明による化合物S1L10-三糖をアジュバントとして含むワクチンが誘発する体温への影響は驚くほど顕著に短く、一方、脂質化三糖L11-三糖は、糖類化合物を含まない水中油型乳剤NSと類似して、体温への影響を全く誘発しなかったということである。注射部位反応ワクチン接種前に、異常の存在又は存在する局所反応について注射部位を評価した。かかる異常も局所反応もなければ、動物のその部位に注射した。各免疫処置の後、注射部位の組織腫脹について検査した。皮下注射部位のサイズを測定した直径mmにて。後肢の筋肉内注射部位反応は判定が困難であるため、筋肉内注射部位組織腫脹の存在のみを判定し、任意の値有り=10mm、無し=0mmで表した。各検査でラット1匹につき4つの注射部位について、注射部位反応のスコアを合計し、グループ毎の平均値を計算した。その結果を図7に示す。免疫処置後、軽度の用量依存的注射部位反応が、スルホ-リポ-三糖で処置したラット、主に8及び/又は2mgで処置したラットにおいて観察された図7A及び7B。注射部位反応のサイズは、免疫処置後3日目に漸減し、次の免疫処置の5日後にはほとんど検知不能であった。スルホ-リポ-二糖S1L7-Su-8での免疫処置によって生じた注射部位反応は完全に異なるパターンを示した。即ち、注射部位反応がサイズにおいて4日目まで増加し、スルホ-リポ-三糖の4倍よりも大きく図7Cを参照、さらに、免疫処置の5日後の最終検査の際、依然として顕著な注射部位反応があった。脂質化三糖L11-Ra-8は、注射部位で有害作用を何ら誘発しなかった。明らかに、ワクチン製剤を含むスルホ-リポ-二糖が誘発する注射部位反応は、本発明によるスルホ-リポ-三糖を含むワクチンより大きいものであった。"