対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させることを含み、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性である、対象のウイルスを細胞培養において生産するための方法であって、対象のウイルスを含む溶液と感受性の細胞間の接触時間が120分未満である又は120分に等しいことを特徴とする方法。a約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であるステップ、b対象のウイルスを含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、及びc前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップを含む、対象のウイルスを生産するための方法。a約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であるステップ、b対象のウイルスを含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、c前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、及び任意選択でd前記生産されたウイルスを適切な医薬担体と一緒に製剤化するステップを含む、医療において使用するための対象のウイルスを生産するための方法。対象のウイルスを含む溶液が一つ又は複数の外来性媒介体を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。細胞が一つ又は複数の外来性媒介体の感染に感受性である、請求項4に記載の方法。a対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であり、接触期間が、細胞の集団の少なくとも部分集団に、対象のウイルスを感染させるのに十分であるステップ、b対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、c前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップを含み、前記少なくとも一つの外来性媒介体のDNA含有量レベルが、対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に存在するレベルに比べて、複製された対象のウイルスの集団において少なくとも90減少している、対象のウイルスを生産するための方法。a対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であり、接触期間が、細胞の集団の少なくとも部分集団に、対象のウイルスを感染させるのに十分であるステップ、b対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を前記細胞の集団から取り除くステップ、c前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、を含み、前記少なくとも一つの外来性媒介体が、対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に比べて、複製された対象のウイルスの集団から取り除かれる又は実質的に取り除かれる、対象のウイルスを細胞培養で生産する間に外来性媒介体を取り除くための方法。接触期間が120分未満である又は120分に等しい、請求項6又は7に記載の方法。a約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であるステップ、b対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を細胞から取り除くステップ、c前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、を含む、対象のウイルスを細胞培養で生産する間に外来性媒介体を取り除くための方法。ステップaにおける接触時間が、細胞の集団の少なくとも部分集団に、対象のウイルスを吸着させるのに十分である、請求項6~9のいずれか一項に記載の方法。少なくとも一つの外来性媒介体のDNA含有量レベルが、対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液に存在するレベルに比べて、複製された対象のウイルスの集団において少なくとも90減少している、請求項7又は請求項9に記載の方法。細胞が一つ又は複数の外来性媒介体の感染に感受性である、請求項6~11のいずれか一項に記載の方法。追加のステップaにおいて細胞の集団を接触させるための対象のウイルスを含む溶液としてステップcで得られた複製された対象のウイルスの集団を使用して、aからcの一連のステップが少なくとも一回繰り返される、請求項2~12のいずれか一項に記載の方法。接触期間が、10秒から120分まで、1分から30分まで、5分から15分までの範囲であり、10分である、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。細胞が、哺乳動物、トリ又は昆虫細胞である、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。細胞が群MRC5、Vero、CHO、FRHL2、MDCK、PERC6、EBx細胞及びニワトリ胚線維芽細胞CEFから選択される、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。細胞がVero細胞である、請求項16に記載の方法。対象のウイルスが、弱毒化されたウイルスである、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。対象のウイルスが群麻疹、ムンプス、風疹、ヒトパピローマウイルス、バキュロウイルス、インフルエンザ、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、B型肝炎、C型肝炎、E型肝炎、デングウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器多核体ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトロタウイルス、アデノウイルス又はA型肝炎から選択される、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。対象のウイルスがヒトロタウイルス、HRVである、請求項19に記載の方法。対象のウイルスに、約1、約05、約01、約001、約0001、約00001又は約000001の感染多重度で細胞を接触させる、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。外来性媒介体が、ウイルス、PCV、PCV1及び又はPCV2である、請求項4~21のいずれか一項に記載の方法。ステップcにおける細胞が、約1から30日間、約2から20日間、約3から9日間、約4から8日間、約5から7日間、又は約5から6日間インキュベートされる、請求項2~22のいずれか一項に記載の方法。ステップcにおける細胞が、約25°Cから約41°Cまで、約34°Cから40°Cまで、35°Cから39°Cまで、36°Cから38°Cまで、たとえば、約37°C±1°Cの温度でインキュベートされる、請求項2~23のいずれか一項に記載の方法。複製された対象のウイルスの集団を収集するステップをさらに含む、請求項2~24のいずれか一項に記載の方法。複製された対象のウイルスの集団を清澄化して、細胞片を取り除くステップをさらに含む、請求項2~25のいずれか一項に記載の方法。複製された対象のウイルスの集団において対象のウイルスを不活化するステップをさらに含む、請求項2~26のいずれか一項に記載の方法。複製された対象のウイルスの集団を、滅菌等級フィルター膜を通して滅菌濾過するステップをさらに含む、請求項2~27のいずれか一項に記載の方法。請求項1~28のいずれか一項に記載の方法により入手可能なウイルス。請求項29に従って得られるウイルスから生産される免疫原性組成物又はワクチン。医療において使用するための、請求項30に記載の免疫原性組成物又はワクチン。疾患又は状態に対するヒトの予防及び又は処置において使用するための、請求項31に記載の免疫原性組成物又はワクチン。ワクチン組成物に外来性媒介体がない又は実質的にない、ウイルスを含む免疫原性組成物又はワクチン組成物。ウイルスがHRVである、請求項33に記載の免疫原性組成物又はワクチン。PCV1及び又はPCV2が実質的にない、請求項33又は34に記載の免疫原性組成物又はワクチン。医療において使用するための、請求項33~35のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。疾患の処置又は予防において使用するための、請求項33~36のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。第一の態様では、本発明は、対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させることを含み、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性である、対象のウイルスを細胞培養において生産するための方法であって、対象のウイルスを含む溶液と感受性の細胞間の接触時間が120分未満である又は120分に等しいことを特徴とする方法を提供する。第二の態様では、本発明は、a約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であるステップ、b対象のウイルスを含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、及びc前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップを含む、対象のウイルスを生産するための方法を提供する。第三の態様では、本発明は、a約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルスを含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であるステップ、b対象のウイルスを含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、c前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、及び任意選択でd前記生産されたウイルスを適切な医薬担体と一緒に製剤化するステップを含む、医療において使用するための対象のウイルスを生産するための方法を提供する。第四の態様では、本発明は、a対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であり、接触期間が、細胞の集団の少なくとも部分集団に、対象のウイルスを感染させるのに十分であるステップ、b対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、c前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップを含み、前記少なくとも一つの外来性媒介体のDNA含有量レベルが、対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に存在するレベルに比べて、複製された対象のウイルスの集団において少なくとも90減少している、対象のウイルスを生産するための方法を提供する。第五の態様では、本発明は、i対象のウイルス及び一つ又は複数の外来性媒介体を含むウイルス接種材料を感受性細胞に接種するステップ、ii前記接種された細胞をインキュベートするステップ、並びにiii接種後120分未満の後に前記接種された細胞培養物を洗浄するステップ、を含む、対象のウイルスの複製中に外来性媒介体の発生を取り除く及び又は減少させるための方法を提供する。追加の態様では、本発明は、a約120分未満である又は約120分に等しい期間、対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスによる感染に感受性であるステップ、b対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を前記細胞から取り除くステップ、c前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、を含む、対象のウイルスを細胞培養で生産する間に外来性媒介体を取り除くための方法を提供する。さらに追加の態様では、本発明は、a対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に細胞の集団を接触させるステップであって、前記細胞が対象のウイルスの感染に感受性であり、接触期間が、細胞の集団の少なくとも部分集団に、対象のウイルスを感染させるのに十分であるステップ、b対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液を前記細胞の集団から取り除くステップ、c前記細胞を培養培地中でインキュベートして、複製された対象のウイルスの集団を生産するステップ、を含み、前記少なくとも一つの外来性媒介体が、対象のウイルス及び前記少なくとも一つの外来性媒介体を含む最初の溶液に比べて、複製された対象のウイルスの集団から取り除かれる又は実質的に取り除かれる、対象のウイルスを細胞培養で生産する間に外来性媒介体を取り除くための方法を提供する。本発明は、本発明の方法によって入手可能なリサーチウイルス種子、マスターウイルス種子及び又はワーキングウイルス種子並びに本発明のウイルス種子から生産される免疫原性組成物又はワクチンも提供する。本発明は、本明細書に記載される方法のいずれによっても入手可能なウイルス懸濁液又はウイルス調製物、前記懸濁液又は調製物を含むワクチン免疫原性組成物、並びに医療、特に疾患の予防及び又は処置におけるその使用も提供する。ウイルスは様々な物理化学的な特性を示し、したがって、物理的又は化学的処置に対するその感受性は異なる。典型的には、エンベロープウイルスは非エンベロープウイルスほど抵抗力がなく、溶剤がオルトミクソウイルス科又はパラミクソウイルス科などのエンベロープウイルスを破壊することができることは周知である。医療において使用するのに適切なウイルス培養物から、汚染する外来性媒介体、特に外来性ウイルスを除去する方法は、特に外来性ウイルスが対象のウイルスよりも物理化学的処置に対して抵抗力が大きい場合には、明確にするのが困難であることが多くあり得る。対象のウイルス及び外来性ウイルスが同一細胞培養で複製することができる場合は、外来性ウイルスの発生を取り除く及び又は減少させるための方法はさらに限定される。どんな外来性媒介体でも取り除く古典的方法は、エンドポイント希釈により対象のウイルスをクローン化することである。外来性ウイルスのアンチウイルス又は阻害剤は、既知である場合には使用することが可能であるが、対象のウイルスへの影響は一般的に未知である。対象のウイルスの複製へのいかなる干渉をも回避する及び若しくは減少させるために、対象のウイルスを生産するのに使用される細胞から、存在する場合には、外来性媒介体を取り除くこと、又は対象のウイルスの増殖及び生産から生じるウイルス懸濁液から外来性媒介体を取り除くことが極めて望ましい。ワクチンなどの免疫原性組成物及び又は遺伝子治療における使用に適しているウイルスは、ウイルスを複製させる、すなわち、細胞がウイルスに感受性である細胞培養物において増殖される。外来性媒介体は、細胞培養物、前記細胞に接種するのに使用される対象のウイルス接種材料並びにウイルス複製及び生産の間に使用される試薬のいずれをも汚染することが可能である。一部の汚染物質は無害なこともあるが、外来性媒介体は、ワクチン及び又は遺伝子治療において使用される対象のウイルスの増殖を妨げることがあるために、その発生又は存在を取り除く又は実質的に減少させることが特に望ましい。同様に、安全上の理由及び健康規制事項のために、ウイルスを含むワクチンなどの最終産物をどんな外来性媒介体汚染もない、又は実質的にないようにすることが好ましい。したがって、細胞培養でウイルスを生産する際に外来性媒介体を取り除くための方法を提供することが本発明の目的である。本発明者は、感受性細胞培養物における対象のウイルスの複製増幅及び生産中に外来性媒介体の発生又は存在を取り除く及び又は減少させるための手段を実証した。驚くべきことに、本発明者らは、感受性細胞と、対象のウイルスを含む溶液との間の接触時間を減らすと、外来性媒介体がない又は実質的にない対象のウイルスが生産されることを観察した。用語接触時間は当技術分野では周知であり、本明細書で使用されるように、接種後にウイルス接種材料を細胞に接触したままにしておく期間、すなわち、洗浄することによりウイルス接種材料が取り除かれる又は実質的に取り除かれる前の期間を意味する。接触時間の減少は、生産される対象のウイルスの種類に応じて変化することがある。たとえば、接触の持続時間は、感受性細胞の少なくとも部分集団にウイルスを吸着させる又は付着させるのに必要な時間と同じ程度に短くてもよい。当業者であれば、所与のウイルスの所与の細胞への付着動態をモニターし、したがって、最適なウイルス接触時間を決定することができる。ウイルス接触時間の最大持続時間は、外来性媒介体の量を、対象のウイルス接種材料中で検出可能な場合には、本発明の方法に従って得られる対象のウイルス調製物において少なくとも50、適切には90、さらに適切には95及び99又は999さえも減少させるように決定してもよい。したがって、一部の実施形態では、本発明の方法において、対象のウイルス及び少なくとも一つの外来性媒介体を含む溶液に感受性細胞を接触させ、接触期間は、細胞の集団の少なくとも部分集団に対象のウイルスを感染させる、特に少なくとも吸着させるのに十分であり、前記外来性媒介体のDNA含有量レベルが、対象のウイルスを含む溶液中に最初に存在するレベルに比べて、生産された対象のウイルスの調製物において少なくとも90、適切には少なくとも99、さらに適切には999減少している。本発明の方法における適切な接触時間は、120分未満である又は120分に等しく、たとえば、約90分、約60分、約45分、約30分、25分、約20分、約15分、約10分、約5分、約1分未満、又は45秒未満、特に約5秒から約1時間まで、約10秒から約55分まで、約15秒から約50分まで、約20秒から約45分まで、約30秒から約40分まで、約45秒から約35分まで、又は約1分から約30分まで、たとえば、10から30秒まで、20秒から1分まで、10秒から約30分までである。本発明の特定の実施形態では、接触時間は少なくとも10秒である。追加の実施形態では、接触時間は約45分未満、特に約35分未満、たとえば、約5秒から約1時間まで、約10秒から約55分まで、約15秒から約50分まで、約20秒から約45分まで、約30秒から約40分まで、約45秒から約35分まで又は約1分から約30分まで、たとえば、10から30秒まで、20秒から1分まで、10秒から約30分までである。したがって、本発明の特定の実施形態では、ウイルス接触材料又はウイルス溶液は、本明細書に記載される方法において、10秒から120分まで、1分から30分まで、5分から15分までの範囲、特に10分間の期間感受性細胞に接触させる。本明細書で使用される用語発生を減少させるは、生産されるウイルス懸濁液、ウイルス種子及び又は調製物が、接種材料が取り除かれ洗い流されることがない若しくは接触時間が本発明の方法の接触時間よりも多い、特に120分よりも長い方法を用いて調製される場合よりも少ない外来性媒介体、すなわち、DNA、RNA及び若しくは感染性外来性粒子、又は細胞に接種する及び感染するのに使用されるウイルス種子若しくはウイルス調製物に最初に存在するよりも少ない外来性媒介体、すなわち、DNA、RNA及び若しくは感染性外来性粒子を含むことを意味する。本明細書で使用される用語外来性媒介体を取り除くは、本発明の方法に従って生産されるウイルス懸濁液、ウイルス種子及び又は調製物に、ウイルス接種材料に存在していた一つ又は複数の外来性媒介体がない、又は実質的にないことを意味する。本明細書で使用される用語実質的にないは、ミリリットルあたり検出可能な外来性媒介体が106、105、104、103、102、101未満である又はまったくないことを意味する。特に、本発明の方法に従って入手可能である対象のウイルス、たとえば、ロタウイルスの調製物は、104未満、適切には103未満、さらに適切には102未満、又は101未満のPCV1などの外来性媒介体のDNAコピーmlを含む。用語外来性媒介体を取り除くは、本発明の方法に従って生産されるウイルス懸濁液が、細胞に接種する及び感染するのに使用される対象のウイルス種子又はウイルスの調製物に最初に存在する量よりも少なくとも90少ない、適切には少なくとも95少ない、さらに適切には少なくとも99少ない、及び少なくとも999さえ少ない外来性媒介体を含むことを意味してもよい。本明細書で使用される用語洗浄するは、たとえば、細胞に感染する前などの培養培地であれ、細胞に感染するのに使用される対象のウイルス接種材料などのウイルス含有溶液であれ、溶液又はその溶液の実質的にすべてを取り除き、前記溶液を培養培地などのウイルスがない培地で置き換えることを意味し、ウイルスのない培地は実質的に取り除かれ、必要に応じて、一、二、三、四、五又はそれよりも多い回数新鮮なウイルスのない培地で置き換えられてもよい。したがって、本発明の一部の実施形態では、ウイルス溶液を取り除いた後、細胞はさらにインキュベートして複製された対象のウイルスの集団を生産する前に、少なくとも一回、適切には二回洗浄される。そのもっとも広い意味でのウイルス種子は、細胞上でウイルスを複製させ増殖させるために、接種することにより細胞に感染させるのに使用される任意のウイルス溶液又はウイルス懸濁液又はウイルス調製物として理解されるべきである。ウイルス種子は、その接種材料が細胞に接種するために使用されるウイルス接種材料と呼ぶことも可能である。たとえば、ワクチン製造を考慮する場合、用語ウイルス種子は、そこからワクチン及び又は遺伝子治療において使用するためのそれに続くすべてのウイルスが生産されるウイルス調製物として理解し得る。ウイルス種子の起源は公知であり、ウイルスが受けた継代数は明確にされている。本発明の目的のために、用語ウイルス種子は、リサーチ種子、マスター種子及びワーキング種子を包含し、したがって本発明はいかなるウイルス種子でも生産するのに適している。マスター種子は、起源種子に由来する既知の継代数の同種ウイルス調製物である。リサーチ種子は、起源種子由来であって、マスター種子の一、二、三、四、五、六又はそれよりも多い回数継代が少ない任意のウイルス調製物である。ワーキング種子は、マスター種子に由来し、典型的には一継代差であるが、マスター種子よりも二、三、四、五又はそれよりも多い回数継代されていてもよいウイルス調製物である。ウイルス種子は一般的には、使用されるまで滅菌ポリエチレンバイアル中に、たとえば、約40°Cから約70°C及び196°Cまでで凍結保存される。本発明に従った方法は、いかなる種類のウイルス種子をも含むいかなる種類のウイルス調製物の生産にも適用可能である。用語感染は当技術分野では周知である。しかし、明確にするために、感染は、少なくとも、細胞上へのウイルスの吸着又は付着、細胞内へのウイルスの侵入若しくは浸透、及びおそらくウイルスの複製、及びさらに細胞に感染することができる新たに形成されたウイルス粒子の放出のステップを包含する。本明細書で使用される用語外来性媒介体は、たとえば、ワクチンに封入するためのウイルスなどの目的の産物にとって外来性である任意の病原体を意味する。本明細書に記載される外来性媒介体は当業者には公知のいかなる手段によっても検出することが可能である。当業者に利用できる方法には、免疫学的アッセイ、核酸法並びに又は力価測定及び若しくは感染性アッセイが含まれるが、これらに限定されない。多くの外来性媒介体を検出する方法は、WO2006027698に開示されている。ブタサーコウイルス、サルレトロウイルス、トリ白血病ウイルス及び内在性トリウイルスを含むワクチンに見出される外来性ウイルスを検出する方法は、VictoriaJGetal、20106033~6040に開示されている。PCVを検出するための方法はOuardaniMetal20001707にも開示されている。外来性媒介体の発生を取り除く及び又は減少させるための方法は、ウイルスウイルス種子の生産に特に有用である。さらに、本発明の方法theprocessesandmethodsoftheinventionは、任意の未知の外来性媒介体によるいかなる汚染に対しても防御手段として日常的に用い得る。したがって、本発明の方法は、検出可能な外来性媒介体がない又は既知の外来性媒介体がない場合でも用い得ることが想定されている。したがって、感受性細胞をウイルス懸濁液に接触させることにより感受性細胞に接種することを含み、ウイルス懸濁液と感受性細胞間の接触時間が120分未満である、たとえば、約90分、約60分、約45分、約30分、25分、約20分、約15分、約10分未満、又は約5分、約1分未満、又は45秒未満、特に約5秒から約1時間まで、約10秒から約55分まで、約15秒から約50分まで、約20秒から約45分まで、約30秒から約40分まで、約45秒から約35分まで、又は約1分から約30分まで、たとえば、10から30秒まで、20秒から1分まで、10秒から約30分までであることを特徴とする、ウイルスを生産するための方法が提供される。本発明の追加の実施形態では、iウイルスを含むウイルス接種材料を感受性細胞に接種し、前記接種された細胞をインキュベートするステップ、ii接種後120分未満、たとえば、約90分、約60分、約45分、約30分、25分、約20分、約15分、約10分、約5分、約1分未満、又は接種後45秒未満、特に約5秒から約1時間まで、約10秒から約55分まで、約15秒から約50分まで、約20秒から約45分まで、約30秒から約40分まで、約45秒から約35分まで、又は約1分から約30分まで、たとえば、10から30秒まで、20秒から1分まで、10秒から約30分までの前記接種された細胞を洗浄するステップを含む、ウイルス種子を生産するための方法が提供される。本発明は、たとえば、ワクチン免疫原性組成物及び又は遺伝子治療において使用するためのウイルスの生産において、一つ又は複数の外来性媒介体を減少させる及び又は取り除くことが望ましい場合に、ウイルスの生産においても有用である。したがって、本発明の追加の実施形態では、ウイルス接種材料又はウイルス調製物に感受性細胞を接触させることにより感受性細胞に接種することを含み、ウイルス接種材料又はウイルス調製物と感受性細胞間の接触時間が120分未満である、たとえば、約90分、約60分、約45分、約30分、25分、約20分、約15分、約10分、約5分未満、又は約1分未満、たとえば、約1から約120分まで、約1分から90分まで、約1から約90分まで、約1から約60分まで、約1から約45分まで、約1から約30分まで、約1から約25分まで、約1から約20分まで、約1から約15分まで、約1から約10分まで、約1から約5分まで、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20分であることを特徴とする、医療において使用するためのウイルスを生産するための方法が提供される。本発明の別の実施形態では、ウイルスを含むウイルス接種材料を感受性細胞に接種し、前記接種された細胞をインキュベートするステップ、接種後120分未満、たとえば、約90分、約60分、約45分、約30分、25分、約20分、約15分、約10分未満、又は約5分、約1分未満、又は接種後45秒未満、特に約5秒から約1時間まで、約10秒から約55分まで、約15秒から約50分まで、約20秒から約45分まで、約30秒から約40分まで、約45秒から約35分まで又は約1分から約30分まで、たとえば、10から30秒まで、20秒から1分まで、10秒から約30分までの前記接種された細胞を洗浄するステップを含む、医療において使用するためのウイルスを複製するための方法が提供される。外来性媒介体汚染は、種々の源から、たとえば、ウイルスが複製し生産される細胞から、細胞に感染させるのに使用されるウイルス接種材料から又は細胞培養及び若しくはウイルス複製中に使用される培地試薬から生じ得る。一実施形態では、ウイルス接種材料又は対象のウイルス溶液が一つ又は複数の外来性媒介体を含む本発明の方法が提供される。本発明の方法の一目的は、外来性媒介体の発生存在を減少させる及び又は取り除くことである。用語外来性媒介体は当技術分野では周知であり、本明細書で使用されるように、たとえば、ワクチン及び又は遺伝子治療において使用するために生産されることを意図している対象のウイルス以外のウイルスなどの任意の外来性の汚染する感染性作用物質を意味する。したがって、本発明の目的のために、その中に開示されている方法により生産されることを意図しているウイルスは対象のウイルスと呼ばれ、本発明の方法により取り除かれる又は減少されることを意図している望ましくない汚染する外来性ウイルスは外来性ウイルスと呼ばれる。たとえば、一実施形態では、インフルエンザウイルスは複製されることを意図している対象のウイルスであるが、別の実施形態ではインフルエンザウイルスは、生産されることを意図している対象のウイルスが異なるウイルス、たとえば、麻疹ウイルスである場合には外来性ウイルスとなり得る。したがって、本発明は、外来性媒介体が外来性ウイルスである、本明細書に定義される方法を提供する。外来性ウイルスは本明細書に記載されるいかなるウイルスでもあり得る。本発明の特定の実施形態では、外来性ウイルスは、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、パルボウイルス科、サーコウイルス科、アデノウイルス科などのアデノウイルス又はポリオーマウイルス科などの非エンベロープウイルスである。他の外来性ウイルスには、ヘルペスウイルス科及び単純ヘルペス2、パラインフルエンザウイルスたとえば、PIV1、PIV2及びPIV3、SARSコロナウイルスなどのコロナウイルス科、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス又はエコーウイルス、ライノウイルス、ニューモウイルス亜科、モルビリウイルス又はパラミクソウイルス科が含まれる。本発明の一実施形態では、外来性ウイルスは、霊長類、たとえばヒトにおいて複製し及び又は疾患を引き起こすことがないウイルスである。本発明の特定の実施形態では、外来性媒介体は、ブタサーコウイルスであり、本発明の追加の実施形態では、外来性媒介体はブタサーコウイルス1型及び又はPCV2型である。ブタサーコウイルスは、非分割型環状ゲノムを有する非エンベロープの一本鎖DNAウイルスであり、ウイルス科サーコウイルス科のメンバーである。PCV2は若い子ブタに、下痢及び体重が増えないことを特徴とする離乳後多臓器発育不良症候群を引き起こすと考えられている。PCV1はPCV2と関係しているが、ブタで疾患を引き起こすとは思われない。PCV1はヒトでは増殖せず、ヒトで疾病を引き起こすことは知られていない。PCV1及び又はPCV2はHRVワクチンにおける外来性媒介体として知られている。したがって、特定の実施形態では、特にワクチンにおける使用のために本発明の方法により生産される対象のウイルスはHRVであり、その外来性媒介体はPCV、特にPCV1及び又はPCV2である。外来性媒介体は細胞中で又は培養培地において複製することができる場合がある。本発明の特定の実施形態では、対象のウイルスを感染させる細胞は、外来性媒介体が前記細胞由来であれ、ウイルス懸濁液由来であれ、試薬由来であれ、一つ又は複数の外来性媒介体に感受性である。本発明は、細胞が外来性媒介体に感受性である、すなわち前記外来性媒介体が細胞内で複製することができる場合には特に有用である。したがって、細胞が一つ又は複数の前記外来性媒介体の感染に感受性である方法が提供される。本明細書で使用される用語細胞は、ワクチン及び又は遺伝子治療において使用するための対象のウイルスの生産のために使用される任意の細胞、すなわち人工的条件下、特にインビトロで維持される細胞を意味する。使用される細胞の種類は生産される対象のウイルスに依存することになる。なぜならば、前記細胞は、生産されるウイルスに感受性でなければならない、すなわち対象のウイルスは前記細胞内で複製することができなければならないからである。当業者であればどの細胞型が特定のウイルスに感受性であるかを知っている。いくつかの細胞型がワクチンに使用するのに適切なウイルスを生産するために使用されており、これらの細胞には、MRC5、Vero、CHO、FRHL2、MDCK、PERC6などの哺乳動物細胞、又はニワトリ胚線維芽細胞CEF若しくはEBx細胞などのトリ細胞が含まれる。本発明の一実施形態では、細胞がウイルスワクチンを生産するのに使用される任意の細胞型から選択される本発明の方法が提供される。追加の実施形態では、本発明の方法は、群MRC5、Vero、CHO、FRHL2、MDCK、PERC6、EBx細胞及びニワトリ胚線維芽細胞CEFから選択される細胞を使用する。本発明の特定の実施形態では、細胞はVero細胞である。Vero細胞は、特にHRV及びポリオウイルスに感受性である。一実施形態では、本発明の方法はVero細胞を使用してHRVを生産する。代わりに、Vero細胞を使用してポリオウイルスを生産する。本発明の別の特定の実施形態では、細胞は、WO2008129058又はWO2003076601において製造される又は他の方法で開示される、ニワトリ細胞若しくは細胞株EB14又はアヒル細胞若しくは細胞株EB24若しくはEB66である。MDCK細胞、PERC6及びEB66は、特にインフルエンザウイルスの感染に感受性であることが知られている。CEF細胞は、特に麻疹及びムンプスウイルスの感染に感受性である。本発明の細胞は典型的にはインビトロで増殖される。細胞は単層の形態で、すなわち容器の表面に付着している又はマイクロキャリアに付着しているなどの培養培地における懸濁液中の支持体に付着しているなどの接着細胞でもよい。好ましいマイクロキャリアは、好ましいCytodexIなどの架橋されたデキストランを含む合成材料から製造されている。別の実施形態では、細胞は培養培地における懸濁液中に存在していてもよい。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法において使用される細胞は哺乳動物、トリ又は昆虫細胞である。特定の実施形態では、本発明の方法において使用される細胞は哺乳動物由来である。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される細胞は、アフリカミドリザルなどの霊長類由来である。本発明の方法は、特にワクチンの製造において使用されるウイルスを生産するのに使用される。したがって、一実施形態では、対象のウイルスが霊長類、特にヒトに感染する及び又は霊長類、特にヒトにおいて疾患を引き起こすウイルスである本発明の方法が提供される。本発明の方法により生産され、したがって本発明の方法において使用されるウイルスは弱毒化され得る、すなわちウイルスは生存可能であるが、野生型株と比べて毒性が弱い又は無毒性である。一実施形態では、対象のウイルスが、弱毒化されたウイルスである本発明の方法が提供される。別の実施形態では、ウイルスは弱毒化されていない。これらの状況では、感染された細胞のインキュベーションに続いて、非弱毒化ウイルスは、ワクチンが投与される宿主に前記ウイルスが疾患を引き起こす、たとえば、ポリオウイルスの場合にはその後不活化される。いくつかの状況では、生きたウイルスはヒトに疾患を引き起こさず、別の生物に対して免疫応答を誘発するので不活化される必要はない。たとえば、前記免疫応答は関連するウイルス及び病原体に対して防御を生じたか、又は別の実施形態では、前記ウイルスは、前記病原体に対して防御的免疫応答を誘発する異なる病原体由来の一つ又は複数の抗原をコードし得る。一実施形態では、対象のウイルスが群麻疹、ムンプス、風疹、ヒトパピローマウイルス、バキュロウイルス、インフルエンザ、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、B型肝炎、C型肝炎、E型肝炎ウイルス、デングウイルス、サイトメガロウイルス、呼吸器多核体ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトロタウイルス、アデノウイルス又はA型肝炎から選択される、本発明の方法が提供される。本発明の特定の実施形態では、ウイルスはヒトロタウイルスである。ヒトロタウイルスは幼児及び小児に重度の下痢を引き起こし、レオウイルス科由来の二本鎖RNAウイルスである。5種類のロタウイルス、A、B、C、D及びEがあり、そのうちのAがもっとも一般的にヒトに感染する。HRV種Aは血清型により特徴付けることが可能である。糖タンパク質VP7はG型を定義し、プロテアーゼ感受性タンパク質VP4はP型を定義する。株は一般にそのG血清型特異性によって示され、P型はP血清型を表す数と文字により及び対応するP遺伝子型を表す角括弧内の数字により示される。本発明の特定の実施形態では、選択されるロタウイルスはHRVAである。追加の実施形態では、HRVは血清型G1、G2、G3、G4、G9、P1又はP8を含む群から選択される。追加の実施形態では、本発明の方法により生産される対象のウイルスはG1P8型のヒトロタウイルスである。本発明の方法は、たとえば、ヒト、ウシ、及びヒトウシリアソータントを含むリアソータントロタウイルスの生産にも適用可能である。したがって、本発明は、その中に開示されている方法に従って細胞に感染するいかなる種類のリアソータントロタウイルスも含む溶液を使用することを企図している。感染多重度は対象のウイルス、並びにウイルス接種材料又はウイルス溶液中のいずれの外来性媒介体にも依存することになる。当業者であれば用語MOIを完全に理解しているが、明確にするために、MOIは感染時の細胞に対するウイルスの比である。感受性細胞に感染する際に対象のウイルスのMOIの数を増やすと、対象のウイルスの収率が改善される場合がある。しかし、この数を増やすと汚染する外来性媒介体の生産が同時に増加する場合もある。汚染する外来性媒介体のレベルを許容可能なレベルに維持しながら、MOIの数を変化させ、どれだけの数が適切な収率の対象のウイルスを与えるのかを決定するのは当業者の能力の範囲内である。本発明の方法に従って生産される対象のウイルスを目的とする適用に応じて、汚染する外来性媒介体の最小及び最大閾値は変化し得る。したがって、MOI数は対象のウイルスの目的の収率に及び汚染する外来性媒介体の望ましいレベルに適応されることになる。一実施形態では、対象のウイルスに約10、約05、約01、約001、約0001、約00001又は約000001の感染多重度で細胞を接触させることにより細胞が適切に感染される本発明の方法が提供される。特定の実施形態では、細胞、特にVero細胞には、おそらくPCV1で汚染されている、たとえばHRVなどのウイルスを01のMOIで接触させる。ウイルス感染のための温度条件は変化し得る。温度はウイルス型に応じて32°Cから39°Cまで及び得る。インフルエンザウイルス生産では、細胞培養感染は、生産される株に応じて変化し得る。インフルエンザウイルス感染は適切には、32°Cから35°Cまでの範囲の温度で、適切には33°Cで実施される。代わりに、ロタウイルス感染は適切には、37°Cで実施される。プロテアーゼ、典型的にはトリプシンを、ウイルス株に応じて細胞培養物に添加し、ウイルス複製及び増殖を最適化してもよい。たとえば、インフルエンザウイルス及びロタウイルス生産は、細胞培養においてトリプシンを使用することにより改善することが可能である。プロテアーゼは培養中の適切であればどの段階でも添加することが可能である。プロテアーゼは、感受性細胞に接触させる対象のウイルスを含む溶液中に及び又はウイルスに接触させた後に細胞をインキュベートするのに使用される培養培地に添加することが可能である。トリプシンは非動物起源である、すなわち、プロテアーゼが動物源から精製されていないことが適切である。トリプシンは、細菌などの微生物、酵母又は植物において組換え的に生産されるのが適切である。組換えトリプシンの適切な例は、トウモロコシにおいて生産される組換えトリプシンであるTrypzean、又は真菌において発現されるトリプシン様酵素であるTrpLEである。代わりに、トリプシンは動物起源である、適切にはブタ起源であることが可能である。非限定的例として、上記に従って添加されるトリプシンの適切な濃度は5μgmlから25μgmlまでの範囲であり、適切には75μgml又は15μgmlである。本発明の追加の実施形態では、ウイルスに接触させた細胞をインキュベートして複製された対象のウイルスの集団を生産させるステップをさらに含む、本明細書で定義される方法が提供される。接触させた細胞は、ウイルス複製及び生産に適している条件下でインキュベートされる。温度は生産されるウイルスに従って変化し得る。したがって、本発明の一実施形態では、対象のウイルスを含む溶液に接触させた細胞が、たとえば、25°Cから41°Cまでなどの25°Cよりは高く、適切には41°Cよりも低い、たとえば、34°Cから40°Cまでの、35°Cから39°Cまでの、36°Cから38°Cまでの、たとえば、約37°C±1°Cの温度でインキュベートされる、本発明の方法が提供される。本発明のさらに追加の実施形態では、複製された対象のウイルスの集団を収集するステップをさらに含む、本明細書で定義される方法が提供される。細胞は、感染されると、受動的溶解とも呼ばれる宿主細胞の自然溶解のせいで、又は出芽現象のせいで、新たに複製し形成されるウイルス粒子を培養培地中に放出し得る。したがって、生産された対象のウイルスを収集する考えうる一つの方法は、ウイルス含有培養培地を収集することである。代わりに、ウイルス感染後、生産された対象のウイルスは、能動的溶解とも呼ばれる、細胞を溶解する外部因子を用いることにより収穫し得る。能動的細胞溶解のために使用することができる方法は公知である。この点に関して有用な方法は、たとえば、凍結融解、固体剪断、高張性及び若しくは低張性溶解、液体剪断、高圧押出し、界面活性剤溶解、又はその任意の組合せである。ウイルス含有培養培地の収集と細胞の溶解を組み合わせて、本発明の方法に従って生産される対象のウイルスを収穫してもよい。ウイルスを収集する前のインキュベーションの持続時間は、生産される対象のウイルスに依存する。たとえば、インキュベーションの持続時間は約1日から約30日まででもよい。特定の実施形態では、対象のウイルスに接触させた細胞が約2日から10日、たとえば、3日から9日、4日から8日、5日から7日、又は5日から6日間インキュベートされる本発明の方法が提供される。生産されたウイルスを収穫する最適時間は通常、感染ピークの決定に基づいている。たとえば、対象のウイルスが細胞変性である、すなわち感染後に細胞の自然溶解を誘発する場合、CPEは、細胞円形化、方向性の喪失、膨化若しくは収縮、死、表面からの脱離を含む、ウイルス接種後の細胞において起きる形態学的変化をモニターすることにより測定することが可能である。特定のウイルス抗原の検出は、ウェスタンブロット解析などのタンパク質検出の標準技法によってもモニターし得る。次に、収穫物は目的の検出レベルに到達した時に収集することが可能である。抗原の含有量も、当業者にはよく知られている技法であるSRDアッセイJBiolStandard5、237~247により、ウイルスによる細胞接種後いつでもモニターし得る。この技法は、インフルエンザウイルスのHA含有量を決定するのに特に適している。代わりに、対象のウイルスの生産又は収率は、細胞の50に感染することができるウイルスの量を表す細胞培養感染量を測定することにより解析することが可能である。試験される感染性ウイルス試料の一連の連続希釈を実施し、各希釈物の一部が感受性細胞に接種するのに使用される。ウイルスが複製することができるように数日間細胞をインキュベートした後、ウイルスの存在は、当業者には公知である二つの読取り方法、すなわち、細胞における細胞変性効果の解析及び又は培養液上清で実施されるニワトリ赤血球を用いた血液凝集アッセイにより検出し得る。次に、ウイルス力価はリードミュンヒ法に従って計算される。一実施形態では、対象のウイルスに接触させた細胞は6日間又は7日間インキュベートされ、その後ウイルスは細胞培養培地を収集することによりおそらく収穫される本発明の方法が提供される。方法に応じて、インキュベーションに続いて、ウイルス懸濁液はウイルス種子として使用してもよいし、又はワクチンを生産するのに直接使用してもよい。ウイルス懸濁液をもっと後の日付で使用するつもりであれば、ウイルスは、ウイルスの生存率を維持するいかなる条件下でも凍結してよい。特に、ウイルスは約40°Cから約70°Cまでの温度、たとえば約45°C、約60°C、約70°Cで又は約196°Cで保存し得る。したがって、一実施形態では、ウイルス懸濁液を凍結するステップをさらに含む本発明の方法が提供される。細胞培養でのその生産に加えて、対象のウイルスは任意選択で精製することが可能である。一つ又は複数の精製ステップは、当技術分野で公知であるが、本発明の方法中に実行することが可能である。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、そこに記載される方法は、清澄化、限外濾過ダイアフィルトレーション、密度、特にショ糖密度勾配超遠心分離などの超遠心分離及びクロマトグラフィー、又はその任意の組合せから選択される少なくとも一つのステップを含む。望まれる純度レベルに応じて、上記ステップはいかなる形でも組合せ得る。特定の実施形態では、複製された対象のウイルスの集団又は細胞培養で生産されるウイルス懸濁液を清澄化して細胞片を取り除くステップをさらに含む本発明の方法が提供される。本明細書で使用される用語清澄化するは、無傷の浮遊する細胞及び又は細胞片などの細胞性物質からウイルスを分離することを意味する。ウイルス懸濁液は、濾過又はマイクロフィルター法を含むがこれらに限定されない当業者には公知のいかなる手段によっても清澄化することができる。適切な代わりの清澄化手段は遠心分離である。特に、本発明の方法に従って得られるウイルス懸濁液は、約1000rpmで、たとえば10分間などの数分間遠心分離される。本発明のウイルス懸濁液は、清澄化する前に凍結してもよく、したがって、一実施形態では、ウイルス懸濁液が凍結される本明細書で定義される方法が提供される。ウイルスは、ウイルスの生存率を維持するいかなる条件下でも凍結し得る。特に、ウイルスは約40°Cから約70°Cまでの温度で、たとえば約45°C、約60°C又は約70°Cで保存し得る。ウイルスが清澄化に先立って凍結される場合、ウイルス懸濁液は清澄化に先立って解凍除霜する必要がある。一実施形態では、凍結されたウイルス懸濁液を解凍し次にウイルス懸濁液を清澄化して細胞片を取り除くステップをさらに含む本発明の方法が提供される。細胞に由来するDNAを取り除くためには、ウイルス懸濁液は、Benzonaseを含むが、これに限定されない当業者には公知のヌクレアーゼで処理し得る。したがって、たとえばBenzonaseを使用して、ウイルス懸濁液を処理し細胞由来のDNAを取り除く本発明の方法が提供される。本発明の方法により生産されるウイルス懸濁液又は複製された対象のウイルスの集団は、たとえば、ワクチン接種に適した容量に製剤化するために又は細胞を接種に適した容量に再懸濁することができるように、濃縮を必要とする場合がある、すなわち、ウイルスを懸濁させる液体の容量を減らす必要がある場合がある。したがって、追加の実施形態では、本発明の方法により生産されるウイルス懸濁液は、限外濾過を含むがこれに限定されない当業者には公知の手段により濃縮し得る。ウイルスが弱毒化されず宿主において疾患を引き起こす本発明の実施形態では、ウイルスが防御的免疫応答を誘発するが、前記ウイルスが投与された宿主において疾患を引き起こさないように、ウイルスを不活化する必要がある。したがって、本発明は、ウイルスを不活化するステップを含む本発明の方法を提供する。不活化の方法は当業者には公知である。本発明の特定の実施形態では、ウイルスは、スプリッティング、すなわち、界面活性剤を使用してウイルスを破壊しウイルス断片を作り出すことにより不活化される。代わりに、又はさらに、本発明の方法に従って得られる対象のウイルスは、ベータプロピオラクトン若しくはホルムアルデヒドを使用するなどの化学的処理、及び紫外線照射などの物理的処理、又はその両方の組合せにより不活化することが可能である。細菌などのより大きな外来性媒介体を本明細書で定義されるウイルス懸濁液から取り除くために、ウイルス懸濁液は滅菌濾過され得る。したがって、追加の実施形態では、滅菌等級フィルター膜を通してウイルス懸濁液を滅菌濾過するステップをさらに含む本明細書で定義される方法が提供される。滅菌濾過するのに適切な手段は当業者には周知である。滅菌濾過は滅菌等級フィルター膜を使用して実施される。滅菌等級フィルター膜は、有効濾過面積の1×107cm2よりも大きな又は1×107cm2に等しいチャレンジレベルで微生物により攻撃された後に滅菌流出液を作り出すフィルター膜である。滅菌等級フィルターは当業者には周知であり、約02μmの孔径を有し、したがって約022μmの孔径のフィルターを含む。本発明の追加の実施形態では、本明細書で定義される方法により生産されるウイルス懸濁液は、一つ又は複数のフィルターを通してウイルス懸濁液を濾過するステップをさらに含む。本発明の特定の実施形態では、ウイルス懸濁液が約05μmの孔径のフィルターを通して、続いて滅菌等級フィルターを通して濾過される本明細書で定義される方法が提供される。本発明の方法のステップのいずれも、たとえば一、二、三、四、五、六又はそれよりも多い回数繰り返してよい。本発明の意味で、本発明の方法のaからcの一連の連続するステップは、ウイルス継代とも呼ばれる。たとえば、特定の実施形態では、ウイルスが一、二、三、四、五又はそれよりも多い回数継代される本発明の方法が提供される。本発明の特定の実施形態では、ウイルスは、aからcの最初の一連のステップに加えて一回又は二回さらに継代される。したがって、特定の実施形態では、aからcの一連のステップが、追加のステップaにおいて細胞の集団を接触させるための対象のウイルスを含む溶液として、ステップcで得られる複製された対象のウイルスの集団を使用して、少なくとも一回繰り返される本発明の方法が提供される。適切には、aからcの一連のステップは一回よりも多い、たとえば、一、二、三、四、五、六又はそれよりも多い回数繰り返される。本発明の方法のaからcのステップを繰り返すことによって、ウイルスを二回又は三回などの一回よりも多く継代すると、特に汚染する外来性媒介体の存在をさらに減少させることが可能である。本発明の方法により生産される又は一回継代された複製された対象のウイルスの集団は、追加のウイルス継代を受ける前に、任意選択で保存することが可能である。特定の実施形態では、第一の継代に続いて生産されるウイルス懸濁液が新たな細胞に感染させるのに使用される前に任意選択で保存される、二回目の継代をウイルスは受ける。本発明の方法により、一つ又は複数の外来性媒介体の発生が減少している又は、存在が減少している及び若しくは非存在である、ウイルス種子などのウイルス懸濁液又はウイルス調製物が得られる。したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明に従ってウイルスを生産するための方法のいずれによっても入手可能なウイルス種子などのウイルス調製物が提供される。追加の実施形態では、本発明の方法のいずれによっても入手可能なウイルス種子などのウイルス調製物から生産される及び又は由来するワクチンなどの免疫原性組成物が提供される。本発明の方法により生産されるウイルス種子などのウイルス調製物により作られる又は由来するワクチン又は免疫原性組成物は、一つ又は複数のウイルスを含み得る。本発明の特定の実施形態では、ウイルスがHRVである、ウイルスを生産するための方法のいずれによっても入手可能なウイルス懸濁液から生産される及び又は由来するワクチンが提供される。本発明の特定の実施形態では、組成物又はワクチンに外来性媒介体が実質的にない、ウイルスを含むワクチンなどの免疫原性組成物が提供される。特定の実施形態では、外来性媒介体が実質的にない組成物又はワクチンはHRVを含む。さらに具体的な実施形態では、組成物又はワクチンにPCV1及び又はPCV2が実質的にない、HRVを含む免疫原性組成物又はワクチンが提供される。同様に、本発明の方法は、ワクチン接種及び又は遺伝子治療において使用するためのウイルスを生産するために使用することができ、したがってそれにより、本発明は、本明細書で定義される方法のいずれによっても入手可能なウイルス及び又はウイルス懸濁液も提供する。ワクチン又は免疫原性組成物は、本発明の方法によって生産されるワクチンにおいて使用するための一つ又は複数のウイルスを含み得る。本発明の特定の実施形態では、ウイルスがHRVである本発明の方法により生産される対象のウイルスを含むワクチンが提供される。本発明のHRVワクチンはHRVの一つよりも多い血清型を含み得、本発明の特定の実施形態では、HRVワクチンは五つ又はそれよりも多いHRV血清型を含む。ロタウイルス又はその抗原は、ヒト、ウシ又はヒトウシリアソータントなどのリアソータントであることが可能である。代わりに、本発明のロタウイルスワクチンは、任意選択で弱毒化されているG1P8株を含む。本発明の追加の実施形態では、外来性媒介体がない又は実質的にないウイルスを含む免疫原性組成物又はワクチンが提供される。別の実施形態では、外来性媒介体がない又は実質的にない本明細書で定義されるHRVワクチンが提供される。本発明の特定の実施形態では、PCV1及び又はPCV2が実質的にない本明細書で定義されるHRVワクチンが提供される。本発明の追加の実施形態では、本明細書で定義される一つ又は複数のウイルスを含むワクチンが提供される。本発明の特定の実施形態では、ワクチンは麻疹、ムンプス、風疹、水痘帯状疱疹ウイルス又はその任意の組合せを含む。別の特定の実施形態では、ワクチンはインフルエンザウイルスを含む。一つ又は複数のウイルスを含む本発明の免疫原性組成物又はワクチンでは、前記ウイルスのうちの一つ、いくつか又はすべては本発明の方法により生産され得、一部のウイルスは他の方法により生産され得る。各ウイルスは別々に生産され最終ワクチン製剤に組み合わされることが想定されている。追加の実施形態では、一つ又は複数の対象のウイルス及び一つ若しくは複数の細菌由来の一つ若しくは複数の抗原、たとえば、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、インフルエンザ菌多糖類、又はナイセリア由来の抗原又はそれらの組合せを含むワクチンが提供される。特定の実施形態では、本発明のワクチン又は免疫原性組成物は水銀物質及び又は動物由来産物を含まない。本明細書に記載される本発明のワクチン及び又は免疫原性組成物は、ミョウバンなどの一つ又は複数のアジュバント、Toll様受容体リガンド、サポニン、リポソーム、水中油型乳剤、又はそれらの組合せをさらに含み得る。本発明のワクチン及び免疫原性組成物は、医療において使用するのに、特に哺乳動物における疾患の予防及び又は処置で使用するのに適している。したがって、一実施形態では、医療において使用するための本明細書に記載される本発明のワクチン及び免疫原性組成物が提供される。追加の実施形態では、疾患又は状態に対する予防及び又は処置において使用するための本明細書に記載される本発明のワクチン及び免疫原性組成物が提供される。特に、ワクチンがロタウイルスを含む場合には、前記ワクチンはロタウイルス関連胃腸炎を予防する及び又は処置するために使用される。追加の実施形態では、疾患又は状態に対する予防及び又は処置のための医薬の製造における本明細書に記載される本発明のワクチン及び免疫原性組成物の使用が提供される。別の実施形態では、本明細書に記載される本発明のワクチン及び免疫原性組成物を投与するステップを含む処置方法が提供される。本発明のワクチン組成物又はワクチンに関する本明細書の実施形態は、本発明の免疫原性組成物に関する実施形態にも適用可能であり、逆もまた同じである。本明細書の用語含むは、いかなる場合も、任意選択でそれぞれ用語からなると代用可能であることが発明者らにより意図されている。数値xに関係する用語約はx±5又は10を意味する。用語実質的には完全にを排除せず、本発明の定義から省いてもよい。本発明は、この時点で以下の非限定的実施例を参照することによりさらに説明される。プロトコールの要旨ロタウイルスの大量生産は、さまざまな前培養段階を通じてVero細胞バンクを増殖させることにより実施された。外来性媒介体PCV1は、DNA、RNA、及び感染性粒子を含むウイルス粒子として、細胞に感染するのに使用されるロタウイルス種子中に存在していた。必要な細胞培養支持体の調製後、細胞をロタウイルス懸濁液に接触させることによりウイルスは増殖及び生産のために接種され、細胞は5日から7日間ウイルスと一緒にインキュベートさせておいた。生産されたウイルスは、上清を収集することにより望ましいインキュベーション時間後に収穫された。収穫されたウイルスは凍結され70°Cで保存された。11細胞培養物調製Vero細胞培養物は、増殖培地としてVPSFM培養培地を使用して無血清条件下で調製された。T175フラスコ又はT25フラスコに50000から100000細胞cm2を播種し3日から7日間増殖させた。12ウイルス調製必要量のロタウイルス接種材料は、攪拌下水浴中37°Cで解凍された。次に、ウイルスは、室温で30分間、ブタトリプシンを最終濃度75から20μgmlで補充されたDMEMの溶液中で活性化された。活性化後、ウイルス溶液は、101、103、104又は105のMOIを目標とするのに必要なウイルス濃度を得るために、最終濃度75μgmlでトリプシンを補充された新鮮なDMEMを添加することにより希釈された。13ウイルス感染増殖培地はTフラスコから廃棄され、細胞層は50mlのDMEMで洗浄された。次に、細胞に以下の通りにロタウイルスを感染させた細胞は、洗浄培地を45mlの上記希釈され活性化されたウイルス溶液で置き換えることにより目的のMOI数のウイルスと接触させた。次に、細胞は、1分未満若しくは1分に等しい時間又は30分間37°Cでウイルス溶液に接触したままにされた。14ウイルス生産指示された接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞層はDMEMで二回洗浄された。次に、Tフラスコは、15μgmlのトリプシンを補充されたDMEM中で5から7日間37°Cでさらにインキュベートされた。対照として、いくつかのフラスコは、細胞をウイルス溶液に接触させた後洗浄されず、5から7日間37°Cでウイルス溶液と一緒にインキュベートされたままにした。ウイルス含有上清は感染後の5から7日目に収集された。前記物質は70°Cで保存された。15ロタウイルス力価を測定するための方法ffumlでのウイルス力価測定MA104細胞は、10ウシ胎児血清を補充されたDMEM中で培養された。96ウェルプレートにウェルあたり20000細胞を播種した。細胞は37°Cで4日間インキュベートされたままであった。力価測定されるウイルス含有上清の試料を細胞に添加する前に、細胞はDMEMで三回穏やかに洗浄された。次に、120μlの力価測定培地、すなわち8μgmlのトリプシンを補充されたDMEMが細胞に添加された。ウイルス含有上清の最初の二倍希釈試料が調製され、希釈されたウイルスは室温で30分間活性化された。活性化された希釈ウイルスを使用して、上で調製されたMA104細胞を含む96ウェルプレートに直接実施される追加の連続二倍希釈を調製した。120μlの活性化された希釈ウイルスは最初の一連のウェルに添加され、それぞれのウェルは120μlの力価測定培地を含有していた。次に、120μlのそのさらに希釈されたウイルスは次の一連のウェルに添加され、それぞれのウェルは120μlの力価測定培地を含有していた、等。プレートは、2000rpm、30°Cで1時間30分間遠心分離された。次に、96ウェルプレートはウイルス含有試料の希釈物と一緒に16時間インキュベートされた。次に、細胞はDMEMで一回洗浄され、20°Cで15分から25分間冷アセトン80中で前記細胞をインキュベートすることにより固定された。次に、アセトン溶液は取り除かれ、プレートは乾燥させた。次に、試料中のロタウイルスの存在を検出し定量化するために、VP6タンパク質に対するモノクローナル抗体を含む溶液が細胞に添加され、37°Cで1時間インキュベートされた。前記存在は、37°Cで1時間、細胞上でインキュベートされたFITCに結合された二次抗マウス抗体を使用する免疫蛍光によって明らかにされた。蛍光に陽性の一細胞は、前記細胞が感染されていることを示している。ウイルスの集団と一緒の細胞の16時間インキュベーションにより、細胞には一つのウイルスのみが感染することが可能であると推定される。したがって、ffumlで示されるウイルス溶液の力価は、希釈係数により補正されるウェル中で検出されるフォーカスの数に一致する。ffuとはフォーカス形成単位を表す。16ロタウイルス力価を測定するための方法logCCID50mlでのウイルス力価測定ウイルス不活化は、TCID50アッセイを通じてウイルス力価を測定することにより評価された。一晩のインキュベーションの終了時に、各実験内のすべてのBPL条件由来の試料が収集されて、BPL不活化の有効性を評価するために、その感染性を試験した。試験される試料の一連の連続希釈が実施される。50μlの各希釈物は、MDCK細胞を含有する96ウェルマイクロプレーに10複製物で接種され、8希釈物が試験される試料ごとに接種される。次に、プレートは、ウイルスが感染性の場合には細胞内で複製することができるように、35°Cで5~7日間インキュベートされる。細胞中の感染性ウイルスの存在は、顕微鏡によって細胞に対する細胞変性効果をモニターすることにより検出される。感染性ウイルスの懸濁液は、細胞感受性を実証するために陽性対照として使用され、非接種培養物は陰性対照として使用される。CPEが検出されるウェルの数は感染した細胞として希釈物ごとに点数化され、ウイルス力価はリードミュンヒ法に従って計算される。17PCV1DNA含有量を測定するための方法QPCRアッセイリアルタイム増幅アッセイとしても知られている定量的PCRは、各PCRサイクル後に増幅された産物の蓄積を検出する蛍光プローブの使用に基づいている。PCR産物増幅は、増幅された産物に特異的に結合する蛍光発生プローブを介してリアルタイムでモニターされる。プローブが結合しない限り、蛍光を発することはない。QPCRアッセイは、以下の通りに実施された。試験試料一本鎖DNAは、市販のシステムを製造業者の使用説明書に従って使用して抽出された。抽出されたPCV1DNAは、特定のプライマー及びプローブを使用するQPCRにより増幅された。QPCRアッセイに使用されるサイクリング条件は表2に詳述されている。前記アッセイは、AppliedBiosystem社製のABIPRISM7900HT装置を使用して96ウェルマイクロプレートにおいて実行された。試料の汚染を回避するために、専用の部屋及び材料が各ステップに割り当てられた。多数の陽性及び陰性対照を使用してアッセイを検証した。DNAが存在していない抽出DNAが存在していないPCR反応PCR反応の陽性対照として使用される、及び試験される試料の定量化を可能にする標準曲線を描くために使用される既知の濃度のPCV1DNA各試料は二通りに実行された。18PCV1感染力アッセイ細胞培養物ベースのアッセイは、ロタウイルスバルクにおけるPCV1複製能力のある粒子、すなわち、PCV1感染性粒子の存在を評価するために実施された。前記アッセイはPCV1無しVero細胞上で実行された。下の実施例に記載される通りに、クリアランス試験から生じるロタウイルス含有上清試料由来のロタウイルスは、ロタウイルス特異的モノクローナル抗体を添加することにより中和された。前日にフラスコに播種されたサブコンフルエントVero細胞に上記中和された試料を接触させた。37°Cで2時間の接触時間後、培養上清は取り除かれ、細胞は洗浄されて新鮮な培養培地が添加された。陰性対照として、Vero細胞にはロタウイルス含有試料を接触させず培養培地で満たされた。陽性対照は、ロタウイルス特異的モノクローナル抗体有り又は無しの培養培地中でPCV1ウイルスストックから1×103CCID50でVero細胞に感染させることにより作製された。フラスコは通常の細胞継代で、37°Cでインキュベートされた。ウイルス試料での接種14日後、細胞は収集され、PCV1転写物の存在は、下に記載される通りに逆転写酵素repRTQPCRアッセイにより試験され、この転写物は、存在すれば、PCV1の複製能力、したがって感染性PCV1粒子の存在を反映する。2×106Vero細胞はPBSで洗浄され、細胞ペレットは製造業者の使用説明書に従ってDNAse処理と共にHighpureRNAキットを使用してRNA抽出を受けた。RNAは50μlの溶出バッファーに溶出されTurboDNAseで処理された。RT反応はQスクリプトcDNA合成を使用することにより試料ごとに実施された。手短に言えば、5μlのRNAは20μlの容積中で逆転写され22°Cで5分間、続いて42°Cで30分間さらに85°Cで5分間インキュベートされた。Rep転写物に対して向けられるTaqmanQPCRが使用され、111bpの断片を増幅させた。使用されたプライマー及びプローブは、MankertzHillenbrand、2001に開示されているものであった。QPCRは、25μlのcDNAを含有する最終容積25μlで、Geneexpressionmastermixを使用することにより実施された。50°Cで2分及び95°Cで10分間後、95°Cで15秒及び60°Cで1分間からなる40サイクルが実施された。細胞とのウイルス接触時間を減らす効果21三つの独立した実験は、ウイルス溶液が取り除かれずウイルス収穫時まで維持される対照に比べた、減少させた接触時間後にウイルス溶液を取り除く効果を評価するために開始された。ウイルスMOIは101であり、細胞培養及びウイルス感染の条件は同一であり実施例1に記載される通りであった。ウイルス含有上清は6又は7日後に収穫された。実行1では、PCV1無しVero細胞培養物は、セクション11に記載される通りに、T175フラスコ内のVPSFMにおいて増殖された。前記細胞培養物はDMEMで洗浄され、次に前記細胞培養物をMOI101のロタウイルス溶液に接触させることにより感染させた。37°Cで10から30秒後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞層はDMEMで二度洗浄された。その後、75μgmlのトリプシンを補充されたDMEMが細胞に添加され、細胞は37°Cで6日又は7日間さらにインキュベートされた。接触に先立って、ウイルスは15μgmlのトリプシンを補充されたDMEM中でセクション12に記載される通りに特異的に活性化された。対照として、ウイルス溶液はいくつかのフラスコからは取り除かれず、ウイルス溶液との接触はインキュベーション期間中ずっと維持された。ウイルス含有上清は感染の6日又は7日後に収穫され、70°Cで凍結された。同一方法に基づいて、第二のウイルス継代は、実行1に類似する形で調製されるVero細胞において行われた。実行1の上記収穫された上清由来のウイルス試料は解凍され、15μgmlのトリプシンを補充されたDMEM中でセクション12に記載される通りに特異的に活性化された。細胞はDMEMで洗浄され、101のMOIの活性化されたウイルス溶液に接触させることにより感染させた。10から30秒の接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれ、細胞はDMEMで二度洗浄され、37°Cで6日間75μgmlのトリプシンを補充されたDMEM中でさらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清は収集され、70°Cで保存された。第三のウイルス継代は同一方法でT25フラスコにおいて実施された。実行1の第二のウイルス継代の上記収集された上清由来のウイルス試料は解凍され、15μgmlのトリプシンを補充されたDMEM中でセクション12に記載される通りに特異的に活性化された。細胞はDMEMで洗浄され、101のMOIの活性化されたウイルス溶液に接触させることにより感染させた。10から30秒の接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれ、細胞はDMEMで二度洗浄され、37°Cで7日間75μgmlのトリプシンを補充されたDMEM中でさらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清は収穫され、70°Cで保存された。実行2では、ウイルス継代は上記方法に従ってT175フラスコ又はT25フラスコのいずれかで行われた。PCV1無しVero細胞培養物は、セクション11に記載される通りに、VPSFMにおいて増殖させた。細胞はDMEMで洗浄され、次に101のロタウイルス溶液に接触させることにより感染させた。37°Cで10から30秒の接触又は30分の接触後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞層はDMEMで二度洗浄された。その後、75μgmlのトリプシンを補充されたDMEMが細胞に添加され、細胞は37°Cで6日間さらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清は収穫され、70°Cで保存された。第二のウイルス継代は、上記に類似する形で調製されるVero細胞において行われた。実行2bの上記収穫された上清由来のウイルス試料は解凍され、上に記載される通りに特異的に活性化された。細胞はDMEMで洗浄され、101のMOIの活性化されたウイルス溶液に接触させることにより感染させた。10から30秒の接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれ、細胞はDMEMで二度洗浄され、37°Cで7日間75μgmlのトリプシンを補充されたDMEM中でさらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清は収集され、70°Cで保存された。実行3では、一ウイルス継代は上記方法に従って細胞ファクトリーにおいて実施された。細胞をロタウイルス溶液に接触させることに先立って、ウイルスは20μgmlのトリプシンを補充されたDMEM中でセクション12に記載される通りに特異的に活性化された。細胞はDMEMで洗浄され、101のMOIの活性化されたウイルス溶液に接触させることにより感染させた。接触時間は1分近くであった。その後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞はDMEMで二度洗浄され、37°Cで6日間75μgmlのトリプシンを補充されたDMEM中でさらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清が収穫された。上記のロタウイルス含有上清はすべて、それぞれ上記のセクション15及び17に記載される通りに、ロタウイルス力価の測定を可能にする力価測定アッセイ及びPCV1DNA含有量の決定を可能にするQPCRアッセイを受けた。結果は表3に示されている。結果は、それぞれlogffuml及びDNAコピーmlで表されている。結果101のMOIで10から30秒のウイルス接触時間が使用された実行1では、ウイルス溶液は取り除かれずロタウイルスを収穫する前に6又は7日間維持される対照に比べて、一ウイルス継代後のPCV1DNA含有量の2から3logの減少が観察された。さらに、第一のウイルス継代後に収集されたウイルス収穫物を使用する第二のウイルス継代で検出可能なPCV1の非存在が観察された。注目に値することであるが、ウイルス溶液は取り除かれずロタウイルスを収穫する前に6又は7日間維持される対照に比べて、ロタウイルス力価はほとんど同一のままであった。実行1の第二のウイルス継代後に収集されたウイルス収穫物を使用する第三のウイルス継代後PCV1DNAレベルは検出不可能なままであったが、ロタウイルス力価は、第二のウイルス継代後に得られた力価に比べてさらに増加していた。実行2では、10から30秒のウイルス接触時間を使用すると、ロタウイルス種子中に存在するPCV1DNAのレベルに比べて、PCV1DNA含有量が7log減少することが観察された。30分のウイルス接触時間を使用すると、ロタウイルス種子中に存在するPCV1DNAのレベルに比べて、6log減少が観察されるので、それでも良好な減少結果が得られた。さらに、30分などのより長いウイルス接触時間は、ロタウイルスにさらに高い力価を与えると思われる。221分、10分及び30分などの短いウイルス接触時間を使用する効果を評価するために二つの追加の独立した実験が行われた。実行4実験には、所与の30分ウイルス接触時間について、101のMOI対05のMOIを比較する所与の30分接触時間及び所与の101のMOIについて、ウイルス生産培地中に75μgmlのトリプシン対15μgmlのトリプシンの使用を比較するという二つの追加の一連の条件の評価も含まれる。Vero細胞は50000細胞cm2の密度で播種され、ウイルス感染前に6日間又は7日間増殖させた。ロタウイルス溶液は室温で30分間20μgmlのトリプシンを補充されたDMEM中で特異的に活性化された。感染前、細胞はDMEMで洗浄された。次に、細胞は1分間、10分間又は30分間、15μgmlのトリプシンを補充したDMEMに希釈された101の上記の活性化されたロタウイルス溶液に細胞を接触させることにより感染させた。指示された接触時間後、ロタウイルス溶液は取り除かれ、細胞はDMEMで二度洗浄され、75μgmlのトリプシンを又は15μgmlのトリプシンを補充したDMEM中で7日間さらにインキュベートされ、この時点でウイルス含有上清は収穫された。その後、ウイルス含有上清は、室温で10分間、180gの遠心分離により清澄化した。ウイルス含有上清の試料は、それぞれセクション16及び17に記載されている通りに、ロタウイルス力価の測定を可能にする力価測定アッセイ及びPCV1DNA含有量の決定を可能にするQPCRアッセイを受けた。結果は表4に示されている。結果は、それぞれlogCCID50ml及びDNAコピーmlで表されている。同じロタウイルス種子を使用して、実行4及び実行5では細胞に感染させたが、この種子はlogCCID50mlで測定された場合、75の力価を有する。その上、このロタウイルス種子の試料で実施されたPCV1DNA含有量を測定するためのQPCRアッセイによれば、PCV1DNAはこの種子内に4×107DNAコピーmlのレベルで存在していることが示された。この値は、本セクションにおいて例示される本発明の方法を使用した場合、DNAPCV1減少を評価するための対照値としての役割を果たす。結果実行4で得られるデータを検討すると、達成されたPCV1DNA減少は、1分、10分又は30分のウイルス接触時間を使おうとも、約5log以上であり、それらの短い接触時間のいずれでも良好なPCV1DNA減少を与えることを示している。実行5において得られたデータを検討すると、1分及び10分のウイルス接触時間を使用した場合は類似の5log減少が観察され、30分のウイルス接触時間ではより低い減少が得られた。なぜならば、この接触時間では4log減少が観察されたからであった。実行4でも実行5でもロタウイルス力価測定では、ウイルス接触時間を増加させるとロタウイルス力価が増加する傾向にあることが示された。変化するロタウイルスMOIの効果31別々の実験で、PCV1DNA含有量に対する減少したMOI、すなわち、103、104及び105などの101未満の影響を評価した。PCV1無しのVero細胞培養物は、T175フラスコ又はT25フラスコのいずれかにおいてVPSFMで増殖させた。細胞はDMEMで洗浄され、10から30秒間又は30分間、101又は103のMOIでロタウイルス溶液に接触させた。別々の実験で、104又は105のMOIのロタウイルス溶液を10から30秒間又は30分間、洗浄された細胞に接触させた。MOI101及び103を用いた感染はそれぞれ、一つのT175フラスコにおいて試験され、MOI104及び105はT25フラスコにおいて五つの培養複製物で試験された。細胞をウイルスに接触させることに先立って、ウイルスはセクション12に記載される通りに、15μgmlのトリプシンを補充されたDMEMにおいて特異的に活性化された。37°Cでの10から30秒又は30分のウイルス接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞層はDMEMで二度洗浄された。次に、75μgmlのトリプシンを補充されたDMEMが添加され、細胞は37°Cで5又は6日間さらにインキュベートされた。したがって、ウイルス含有上清は5又は6日後に収穫され、70°Cで保存された。同一方法に基づいて、第二のウイルス継代は、上記の第一の継代に類似する形で調製されたVero細胞上で行われた。上記の第一のウイルス継代から生じる上記収穫された上清由来のウイルス試料は解凍され、セクション12に記載される通りに、15μgmlのトリプシンを補充されたDMEMにおいて特異的に活性化された。細胞をDMEMで洗浄後、細胞は、101のMOIの活性化されたウイルス溶液に接触させることにより感染させた。10から30秒の接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれ、細胞はDMEMで二度洗浄され、37°Cで7日間、75μgmlのトリプシンを補充されたDMEM中でさらにインキュベートされた。その後、ウイルス含有上清は収穫され、70°Cで保存された。上記のウイルス含有上清はすべて、それぞれセクション15に及びセクション17に記載されている通りに、ロタウイルス力価の測定を可能にする力価測定アッセイ及びPCV1DNA含有量の決定を可能にするQPCRアッセイを受けた。結果は表5に示されている。結果は、それぞれlogffuml及びDNAコピーmlで表されている。101及び103のMOIのウイルスが試験される実験においてVero細胞に感染させるのに使用されるロタウイルス種子は、62×1010DNAコピーのPCV1mlを含んでいた。この値は、本セクションにおいて例示される本発明の方法を使用した場合、DNAPCV1減少を評価するための対照値としての役割を果たす。結果ウイルス接触時間30分で、103などの101未満のMOIを使用すると、一ウイルス継代後PCV1DNA含有量に関する限りネガティブ結果及び58logのロタウイルス力価が得られる。30分の又は10~30秒のウイルス接触時間で、より低いMOI、すなわち104及び105が試験される実験では、得られたロタウイルス力価は著しく低く、104のMOIでは≦4log及び105のMOIでは≦33であった。その低いMOIでの第一のウイルス継代に続くQPCRによりPCV1DNAは検出されなかった。PCV1ネガティブデータは、第一ウイルス継代中に生産されたMOI101のウイルス及び10から30秒の接触時間を使用する第二のウイルス継代後に確認され、ロタウイルス力価は67logまで増加していた。それらの結果は、103、104及び105などのより低いウイルスMOIを使用すれば、101MOIを使用した場合に得られる結果に比べて、PCV1DNA含有量を大いに減少させることも可能であったことを示している。ロタウイルス力価に関する限り、それらのより低いウイルスMOIにより、101MOIを使用した場合に得られる力価よりも著しく低い力価が得られた。しかし、得られたウイルスをさらに継代すれば、PCV1DNA含有量をネガティブに維持したままロタウイルス力価をさらに増加させることが可能であった。32セクション22に示されるように、実行4実験は、評価される条件に基づいて三つの部分に分けられ、第一の部分はセクション22にすでに記載されている。第二の部分は、PCV1DNA含有量に対するMOI数を増加させる影響を試験することを目標とした101対05。第三の部分は、以前の実験のように、ウイルス生産培地において15μgmlのトリプシンを使用すること対75μgmlのトリプシンを使用することの影響を試験することを目標とした。PCV1無しVero細胞培養物は、セクション11に記載される通りに細胞ファクトリー中のVPSFMにおいて増殖させた。実験条件はセクション22に記載される条件と同じであった。すべてのウイルス含有上清の試料は、それぞれセクション16に及び17に記載されている通りに、ロタウイルス力価の測定を可能にする力価測定アッセイ及びPCV1DNA含有量の決定を可能にするQPCRアッセイを受けた。結果は表6に示されている。結果は、それぞれlogCCIDml及びDNAコピーmlで表されている。細胞に感染させるのに使用されるロタウイルス種子は、logCCID50mlで測定された場合、75の力価を有している。このロタウイルス種子の試料で実施されたPCV1DNA含有量を測定するためのQPCRアッセイにより、PCV1DNAは4×107DNAコピーmlのレベルでこの種子内に存在していることが示された。結果ウイルス生産培地において15μgmlのトリプシン濃度を用いる30分のウイルス接触時間を使用すれば、MOI101でもMOI05でもPCV1DNA含有量の良好な減少が得られた。しかし、MOI101を使用すると、MOI05と比べて、より良好な減少が得られた。ロタウイルス収率に関しては、力価測定データは、より大きなMOIを使用するとより高いロタウイルス力価を与える傾向があることを示している。ウイルス生産培地におけるトリプシン濃度に関しては、表6に示されているデータによれば、生産中トリプシンが多いほど、力価はほぼ1log増加することが可能であることが示された。条件の最適化ロタウイルスプレマスター種子の調製41PCV1無しVero細胞培養物は、250000細胞cm2の細胞密度に到達するように細胞ファクトリーのVPSFMにおいて増殖させた。次に、細胞はDMEMで洗浄された。ロタウイルス溶液は、トリプシンを20μgmlの濃度で補充されたDMEMにおいて室温で30分間特異的に活性化された。次に、細胞はDMEMで洗浄した後、101MOIの活性化されたロタウイルス溶液に37°Cで10分間接触させることにより感染させた。10分の接触時間後、ウイルス溶液は取り除かれた。細胞層はDMEMで二度洗浄された。その後、15μgmlのトリプシンを補充されたDMEMが細胞に添加され、細胞は37°Cで7日間さらにインキュベートされ、その時点でウイルス含有上清は収穫された。次に、ウイルス収穫物は、室温で1000rpmでの遠心分離により清澄化した。ウイルス上清は収集され、70°Cで保存された。上記のウイルス含有上清は、それぞれセクション16に及び17に記載されている通りに、ロタウイルス力価の測定を可能にする力価測定アッセイ及びPCV1DNA含有量の決定を可能にするQPCRアッセイを受けた。結果は表7に示されている。結果は、それぞれlogffuml及びDNAコピーmlで表されている。結果6×107PCV1DNAコピーmlで汚染されたロタウイルス種子から開始して、本実施例4において例示される本発明の方法、すなわち、101のウイルスMOIと、10分の細胞とのウイルスの減少された接触時間とを組み合わせる本発明の方法により、5logよりも大きなPCV1DNA含有量の減少を達成することが可能になり、ウイルス損失はわずか06logであるためにロタウイルス力価は著しい影響を受けない。本発明の方法に従った一ウイルス継代後、本実施例4において例示されるように、PCV1のDNA含有量は、ロタウイルス種子に存在する最初のレベルに比べて、9999よりも多く減少した。42上記に従って得られるロタウイルスプレマスター種子も、PCV1感染力アッセイにかけられた。上記プレマスター種子の試料は、セクション18に記載される通りに、先ず抗ロタウイルス抗体で中和され、次にVero細胞上に接種された。接種の14日後、接種されたVero細胞は収集され、PCV1から特定のmRNAを増幅させることを目的とするRTQPCRをセクション18に記載される通りに実施できるように、セクション18に記載される通りにRNAが抽出された。このRTQPCRの結果は表8に示されている。陰性対照として、特にこのアッセイにおいて使用されたVero細胞がPCV1無しであることを確認するために、Vero細胞にプレマスター種子を接種する前にRTQPCRはVero細胞でも実施された。結果D14で得られた表8のネガティブ結果は、本実施例において例示される本発明の方法に従って得られるロタウイルスプレマスター種子がいかなる感染性PCV1粒子も含有していなかったことを示している。