"ヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を産生するための方法であって、a培養容器中の細胞培養培地にヒト単球を播種するステップと;bインターロイキン3IL-3及びアデノシンを含む細胞培養培地中で前記単球を培養するステップと;cステップbと同時に又はステップbの後で、線維芽細胞増殖因子4FGF-4を含む細胞培養培地中で前記細胞を培養するステップと、を含む方法。ステップbの前記細胞培養培地が、マクロファージコロニー刺激因子M-CSFを更に含む、請求項1に記載の方法。前記アデノシンが、10~300nMの濃度でステップbの前記細胞培養培地培地に存在する、請求項1または2に記載の方法。ステップcの前記細胞培養培地が、上皮増殖因子EGF、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンからなる群から選択される少なくとも1つの化合物を更に含む請求項1乃至3のいずれか一項に記載の方法。ステップcの前記細胞培養培地が、EGF、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンを含む、請求項4に記載の方法。ステップa、b及びcのうちの少なくとも一つの前記細胞培養培地が、無血清である、請求項1乃至5のいずれか一項に記載の方法。ステップa、b及びcのうちの少なくとも一つの前記細胞培養培地が、アルブミンを含む、請求項6に記載の方法。前記ヒト単球を播種した後1時間未満の時点で、前記細胞培養培地を変更するステップを更に含む、請求項1乃至7のいずれか一項に記載の方法。ステップb及びcのうちの少なくとも一方において、前記細胞培養培地の容積が、前記培養容器の40~90μl/cm2である、請求項1乃至8のいずれか一項に記載の方法。ステップbにおいて、前記細胞が、少なくとも4日間培養される、請求項1乃至9のいずれか一項に記載の方法。ステップcにおいて、前記細胞が、少なくとも7日間培養される、請求項1乃至10のいずれか一項に記載の方法。前記細胞を少なくとも15日間培養中で維持することができる、請求項1乃至11のいずれか一項に記載の方法により取得可能な、ヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞。前記細胞が、CD95結合抗体と共に24時間インキュベートされるとアポトーシスを起こすことが可能である、請求項12に記載の細胞。invitro毒性試験における、請求項12又は13に記載の細胞の使用。細胞療法における、請求項12又は13に記載の細胞の使用。したがって、本発明の目的は、非常に再現性が高く、高収量で細胞を産生する、ヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を産生するための方法を提供することである。本発明の更なる目的は、細胞移植及びinvitro薬物試験に好適である、ヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を提供することである。本発明のこれらの及び更なる目的は、本記載から明白になるように、独立クレームの主題により達成される。本発明の好ましい実施形態の幾つかは、従属クレームの主題を形成する。本発明の発明者らは、ヒト末梢単球をIL-3及びアデノシンで処理し、その後FGF-4で処理すると、ヒト肝細胞の特徴を有する細胞が高い細胞収量で再現性よく産生されることを見出した。これら細胞は、CD95リガンド等のアポトーシス誘導物質で処理されると、アポトーシスを起こすことが可能である。更に、これら細胞は、シトクローム酵素の長期発現を示し、したがってinvitro試験での物質の急性毒性の決定だけでなく長期毒性の決定を可能にする。更に、本発明者らは、本発明の方法により産生された細胞が、末梢単球のドナーの性別に応じてシトクローム発現の差異を示し、したがって薬物代謝の性依存的差異の研究も容易にすることを示すことができた。したがって、1つの実施形態では、本発明は、ヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を産生するための方法であって、以下のステップを含む方法を提供する:a培養容器中の細胞培養培地にヒト単球を播種するステップ;bインターロイキン3IL-3及びアデノシンを含む細胞培養培地中でその単球を培養するステップ;及びcその細胞を、ステップbと同時に又はステップbの後で、線維芽細胞増殖因子4FGF-4を含む細胞培養培地中で培養するステップ。本発明の好ましい実施形態では、ステップbの細胞培養培地は、マクロファージコロニー刺激因子M-CSFを更に含む。本発明の更なる好ましい実施形態では、アデノシンは、10~300nMの濃度でステップbの細胞培養培地に存在する。本発明の更に別の好ましい実施形態では、ステップcの細胞培養培地は、上皮増殖因子EGF、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンからなる群から選択される少なくとも1つの化合物を更に含み、本発明の更により好ましい実施形態では、ステップcの細胞培養培地は、EGF、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンを含む。本発明の更なる好ましい実施形態では、ステップa、b、及び/又はcの細胞培養培地は無血清であり、更により好ましい実施形態では、細胞培養培地はアルブミンを含む。本発明の更なる実施形態では、本方法は、ヒト単球の播種後1時間未満の時点で細胞培養培地を変更するステップを更に含む。本発明の更に別の実施形態では、ステップb及び/又はcの細胞培養培地容積は、培養容器の40~90μl/cm2である。本発明の1つの実施形態では、細胞は、本発明の方法のステップbにおいて、少なくとも4日間培養される。本発明の更に別の実施形態では、細胞は、本発明の方法のステップcにおいて、少なくとも7日間培養される。本発明は、本発明の方法により取得可能であり、少なくとも15日間培養中で維持することができる、ヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を更に提供する。好ましくは、ヒト肝臓から単離された肝細胞は、除外される。より好ましくは、細胞は、CD95結合抗体と共に24時間インキュベートされると、アポトーシスを起こすことが可能である。更に、本発明は、invitro毒性試験又は細胞療法のための、本発明の細胞の使用に関する。本発明の例示的な実施形態を詳細に説明する前に、以下の一般的定義を提供する。下記で例示的に説明されている本発明は、任意の要素複数可の非存在下で、本明細書で具体的に開示されていない制限複数可下で、好適に実施することができる。本発明は、特定の実施形態に関して説明されることになるが、本発明はそれらに限定されず、請求項によってのみ限定される。用語含むは、本明細書及び請求項で使用される場合、他の要素を除外しない。本発明の目的では、用語からなるは、用語含むの好ましい実施形態であるとみなされる。これ以降、ある群が、少なくともある数の実施形態を含むと定義される場合は、これも、好ましくはこれら実施形態のみからなる群を開示すると理解されるべきである。本発明の目的では、用語得られたは、用語取得可能なの好ましい実施形態であるとみなされる。以降、例えば細胞が、特定の方法により取得可能であると定義される場合、これも、この方法により得られた細胞を開示すると理解されるべきである。単数名詞を参照する際に、不定冠詞又は定冠詞、例えばa、an、又はtheが使用される場合、これは、特に別様の記載がない限り、その名詞の複数を含む。本発明の状況では、用語約又はおよそは、目的とする特徴の技術的効果が依然として保証されると当業者が理解するであろう正確性の間隔を示す。この用語は、典型的には、表示数値から±10、好ましくは±5の偏差を指す。用語ヒト肝細胞は、タンパク質合成及び貯蔵、糖質の変換、コレステロール、胆汁酸塩、及びリン脂質の合成、並びに外因性及び内因性物質の解毒作用に関与するヒト肝臓の主要組織の細胞を意味する。培養中の初代ヒト肝細胞は通常、六角形の形態を示し、ギャップ結合によりできる細胞間接触、並びにサイトケラチン18及び汎アクチンpan-actin等の上皮マーカータンパク質の発現により決定される上皮表現型を含むコンフルエント細胞層を確立する。初代ヒト肝細胞、つまりいかなる形質転換ステップも行わずに肝臓組織から単離された細胞は、非常に限られた期間、つまり8~14日間しか、それらの特性及び生存能を失わずに培養中で維持することができない。ヒト肝細胞の典型的な特徴には、これらに限定されないが、以下が含まれる:-以下のもの等の酵素活性:例えば、発色基質Gly-Pro-p-ニトロアニリドで測定される、ジペプチジルペプチダーゼ-IVDPP-IVBauvois1990年Eur.J.Immunol20巻3号:459~68頁;例えば、Randox-Laboratories社から購入されたALTキットを用いて製造業者の説明書に従って測定される、アラニンアミノトランスフェラーゼALT;例えば、L-ガンマ-グルタミル-p-ニトロアニリドとグリシルグリシンが反応してガンマ-グルタミル-グリシルグリシド及びp-ニトロアニリンが生じるγ-GT触媒反応に起因するp-ニトロアニリンの量を決定することによるガンマグルタミルトランスペプチダーゼγ-GTを決定してもよいSzaszG:Gamma-glutamyl-transpeptidase、in:MethodenderEnzymatischenAnalyse、第3版1巻、BergmeyerHU編、Weinheim/Bergstr.,VerlagChemie、1974年、757~762頁;例えば、Promega社から得られる細胞毒性キットを製造業者の説明書に従って使用して測定される乳酸脱水素酵素LDH;-ヘキソキナーゼ/グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ法Bondarら1974年ClinChem20巻/5号:586~590頁を使用してNADPHの光度測定法により測定される、グルカゴン刺激後のグルコース分泌-例えば、選択された薬理学的物質での処理時に細胞質酵素LDHが培地に放出されることにより測定される、アセトアミノフェンAPAP及びジクロフェナク等の薬理学的物質を代謝する能力;-例えば、ウエスタンブロット又はRT-PCR分析により測定される、アルブミン、α-フェトプロテイン、アシアロ糖タンパク質受容体1及び2、カルバモイルリン酸シンテターゼ1、並びに凝固因子I及びIIの発現;-例えば、ウエスタンブロット又はRT-PCR分析により測定される、CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、CYP2P8~9、CYP2E1、CYP3A3~5、CYP2C9、CYP3A4等のCYP450酵素の発現;-発光により例えば、P450-Glo商標-アッセイPromega社製を製造業者の説明書に従って使用して又は蛍光3-シアノ-クマリン;Donatoら2004年DrugMetabolismandDisposition32巻7号:699~706頁により測定される、CYP1A2、CYP2C9、及びCYP3A4等のCYP450酵素の活性;-例えば、酵素による尿素検査例えば、製造業者の説明書に従って、Clonagen社ブリュッセル、ベルギーのQuantiChrome商標尿素アッセイキットにより測定される、アンモニウムイオンと共にインキュベーションした後の尿素合成能力;-例えば、細胞培養培地中の第VII因子が直接ELISAで測定される、ビタミンKと共にインキュベーションした後の第VII因子産生能力;-例えば、細胞培養培地中の第VIII因子がサンドイッチELISAで測定されるEspositoら2000年KidneyInt.58巻:123~130頁;Ziyadehら1990年Am.J.Physiol.259巻:F704~F714頁、第VIII因子産生能力;-例えば、細胞培養培地のELISAにより測定される、アルブミンの分泌;-例えば、蛍光染料ローダミン123又はHOECHST33342の輸出により測定されるBrownCD2008年、Toxicol.Appl.Pharmacol.233巻3号:428~38頁、ABC輸送体ファミリーのタンパク質等の生体異物輸送体の発現;及び-例えば、様々なCYPP450遺伝子及びE2F等の転写因子の遺伝子発現パターン、並びにRAR、RXR及びPPARファミリーの遺伝子発現パターン。上記の特徴を決定するのに好適な試験方法の詳細は、下記の実施例部分に記載されている。本発明の方法により産生される細胞は、上記に列挙した特徴の少なくとも1つ、好ましくは2つ又は3つ、より好ましくは4つ又は5つ、更により好ましくは6つ、7つ、又は8つ、最も好ましくは全てを示す。本発明のプロセスでは、上記の特徴は、好ましくは、FGF-4を含む細胞培養培地中で細胞を少なくとも4日間及び最長で42日間培養した後で測定される。より好ましくは、特徴は、FGF-4を含む細胞培養培地中で細胞を7~14日間培養した後で測定され、最も好ましくは、特徴は、FGF-4を含む細胞培養培地中で細胞を14日間培養した後で測定される。用語単球は、細胞表面抗原CD14の高レベル発現を特徴とする白血球タイプを指す。これら単球は、通常、ヘパリン、EDTA、又はクエン酸塩等の抗血液凝固剤で処理された全血から得られる。全血は、単球を単離するまで、4°Cで最長24時間保管することができる。全血は、好ましくは密度勾配遠心分離により血漿並びに白血球及び赤血球に分離することができ、血漿は、遠心分離後、バフィーコートとも呼ばれる、白血球全体を含有する層がその下に存在する上清に見出される。このバフィーコートの下に、赤血球を含有する相が存在する。その後、例えば、公知のプロセスを使用して遠心分離により、バフィーコート層を単離及び分離して、単球が得られる。例えば、バフィーコート層を、フィコールハイパック等のリンパ球分離媒体にコーティングし、遠心分離してもよい。バフィーコートが赤く染まることで明らかなように、バフィーコートが赤血球で汚染されている場合、細胞を、NH4Cl、KHCO3、及びEDTAを含有する赤血球溶解緩衝液と共にインキュベートする。或いは、単球は、それらがCD14等の細胞表面マーカーを発現することに基づき、FACS、免疫磁気ビーズ選別、及び磁気活性化細胞選別等の方法により、全血から得ることができる。本発明の方法で使用される単球は、任意の単離されたヒト血液から得ることができ、また、血液は、由来が脾臓、リンパ節、又は骨髄等の器官であってもよい。本発明の別の実施形態では、単球は、腹水から単離される。本発明の細胞、つまりヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を細胞療法に使用することが目的である場合、本発明の方法の出発物質として使用される単球は、好ましくは自己由来の単球、つまりその後本発明の細胞で治療しようとする患者の血液に由来する単球である。用語細胞を播種するは、本件のヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞等の細胞混合物内の導入細胞又は少なくともある集団の生存及び/又は増殖を促進することが可能なinvitro環境に細胞混合物を導入することを指す。本発明の方法で接種される細胞は、末梢血又は腹水等の好適な供給源から得られる単球である。好ましい実施形態では、細胞は、それらの単離直後に播種される。しかしながら、単離と播種との間に、細胞の凍結又は遠心分離等の1つ又は複数の追加ステップを導入することも可能である。細胞は、培養容器の100,000~400,000細胞/cm2の密度で、好ましくは培養容器の150,000~350,000細胞/cm2の密度で、より好ましくは培養容器の200,000~300,000細胞/cm2の密度で、最も好ましくは培養容器の250,000細胞/cm2の密度で播種される。細胞は、IL-3及びアデノシン及び随意にM-CSFを含む細胞培養培地に播種してもよい。しかしながら、細胞の播種後1時間以内、好ましくは20分以内に培地が変更されることになっている場合、また、細胞が播種される細胞培養培地は、IL-3、アデノシン、及びM-CSFを欠如していてもよい。培養容器は、液相中又は容器の内面に付着しているかのいずれかである培養培地又は寒天で細胞を増殖させるのに好適なあらゆる容器をいう。そのような専用容器のタイプには、ロールボトル、撹拌フラスコ、ペトリ皿、及び組織フラスコが含まれる。培養容器は、温度、湿度、及び気体が制御された環境中でインキュベートして、最大の細胞又は組織増殖を促進するように設計されている。一般的に、細胞培養培地又は寒天の層は、増殖表面を覆っている。増殖表面として使用されない容器の部分は、細胞培養を取り囲む内部気体環境を囲い込んでいる。細胞、組織、及び微生物等は、典型的には、容器の開口部から細胞培養容器の内部に導入される。細胞の導入後、開口部は、細胞の培養中に細胞が環境と接触しないように閉鎖される。本発明の好ましい実施形態では、培養容器は、組織培養のために処理されており、それは、培養容器の表面が、ヒト肝細胞等の通常は接着状態で増殖する細胞は接着して増殖するが、懸濁中で増殖する細胞は、接着しないか又はわずかしか接着しないように処理されることを意味する。組織培養用のそのような処理には、容器の照射、或いは例えば特殊なプラスチック、ポリマー、若しくはナノ構造物による、又は細胞外マトリックスのタンパク質による容器のコーティングが含まれていてもよい。組織培養用に処理された培養容器は、組織培養皿及び組織培養フラスコを含んでいてもよく、BectonDickinson社、Greiner社、Sigma社、及びTPP社等の様々な供給業者から入手可能である。用語細胞培養及び細胞の培養は、細胞、好ましくはヒト細胞を、invitroで維持及び増殖することを指す。理想的には、培養された細胞は、自発的には分化しないが、本発明の方法で使用されるFGF-4等の好適な刺激で処理される場合にのみ分化する。別様の指定がない限り、本開示が、本発明の細胞を培養するための期間を提供している場合、この期間は、本発明の方法のステップaおよびステップbの両方を含む。細胞培養培地は、invitroでの培養で細胞を維持するために使用される。幾つかの細胞タイプの場合、培地は、培養中の細胞の増殖を支援するのに十分な場合もある。本発明による培地は、エネルギー源、アミノ酸、及び無機イオン等の栄養素を提供する。加えて、本発明による培地は、フェノールレッドのような色素、ピルビン酸ナトリウム、幾つかのビタミン、遊離脂肪酸、抗生物質、酸化防止剤、及び微量元素を含有していてもよい。本発明の細胞を培養する場合、イスコフ改変ダルベッコ培地IMDM、アルファ-MEM、ダルベッコ変法イーグル培地DMEM、RPMI培地、及びマッコイ培地等の任意の標準的培地が好適である。これら培地は、当業者に周知であり、Cambrex社イーストラザフォード、USA、Invitrogen社サンディエゴ、USA、及びSigma-Aldrich社ダイセンホーヘン、ドイツ等の企業から購入することができる。好ましくは、培地は、DMEM/Ham’sF121:1である。好ましくは、培地は、2-メルカプト-エタノール又はジメチルスルホキシドDMSO等の硫黄化合物を含有していない。しかしながら、本発明のプロセスで使用される培地は、L-グルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシン等の他の従来の細胞培養培地補完物を含有していてもよい。本発明の方法では、単球は、インターロイキン3IL-3及びアデノシンを含有する培地中でまず培養される本発明の方法のステップbに対応する。IL-3は、多能性造血幹細胞の骨髄前駆細胞への分化を刺激し、単球を含む骨髄系統の全ての細胞の増殖を刺激するサイトカインである。好ましくは、ヒトIL-3が使用され、最も好ましくは、組換えヒトIL-3が使用される。野生型ヒトIL-3は、例えば、RDSystems社ミネアポリス、USA、GenWay社サンディエゴ、USA、又はMiltenyiBiotech社ベルギッシュグラートバッハ、ドイツから得ることができる。用語IL-3は、IL-3類似体、つまり、野生型IL-3の受容体結合特性及び骨髄細胞の増殖を刺激する等の生物活性を実質的に維持し、IL-3ポリペプチドのアミノ酸配列内に1つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は付加を有する変異体も含むことが意図されている。好適なIL-3類似体は、例えば、Lopezら1992年Proc.Natl.Acad.Sci.USA89巻:11842~11846頁に記載されており、ポリペプチドの101位にアラニンを有するIL-3、116位にバリンを有するIL-3、及び101位にアラニンを有するIL-3、及び116位にバリンを有するIL-3が含まれる。IL-3は、本発明の方法のステップb及び随意にステップcの細胞培養培地中に、0.2ng/ml~2.5ng/ml又は0.3ng/ml~2ng/ml、好ましくは0.4ng/ml~1.8ng/ml又は0.5ng/ml~1.7ng/ml、より好ましくは0.6ng/ml~1.6ng/ml又は0.7ng/ml~1.5ng/ml、更により好ましくは0.8ng/ml~1.4ng/ml又は0.9ng/ml~1.1ng/ml、最も好ましくは1ng/mlの濃度で存在する。アデノシンは、リボース糖分子部分に結合したアデニンの分子で構成されるヌクレオシドである。アデノシンは、エネルギー移動及びシグナル伝達等の生化学的プロセスに重要な役割を果たす。用語アデノシンは、アデノシンA3受容体に結合し、IL-3の刺激効果を高める、N6-3-ヨードベンジルアデノシン-5’-N-メチルウロンアミドIB-MECAHoferら2009年Physiol.Res.58巻:247~252頁等のアデノシンの類似体も含むことが意図されている。アデノシンは、Sigma-Aldrich社、ダイセンホーヘン、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。アデノシンは、本発明の方法のステップb及び随意にステップcの細胞培養培地中に、10~300nM又は20~280nM、好ましくは30~250nM又は40~220nM、より好ましくは50~200nM又は60~180nM、更により好ましくは80~150nM又は90~120nM、最も好ましくは100nMの濃度で存在する。本発明の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、0.2~2.5ng/mlのIL-3及び10~300nMのアデノシン、より好ましくは0.6~1.6ng/mlのIL-3及び50~200nMのアデノシン、更により好ましくは0.8~1.4ng/mlのIL-3及び80~150nMのアデノシン、最も好ましくは1ng/mlのIL-3及び100nMのアデノシンを含む。好ましい実施形態では、本発明の方法のステップb及び随意にステップcで使用される培地は、マクロファージコロニー刺激因子M-CSFを更に含む。M-CSFCSF-1とも呼ばれるは、単球、繊維芽細胞、及び内皮細胞により産生される、その特異的c-Fms受容体CSF-1Rとも呼ばれるに結合すると単球の分裂を誘導するサイトカインである。好ましくは、ヒトM-CSFが使用され、最も好ましくは、組換えヒトM-CSFが使用される。細胞培養培地に使用されるM-CSFは、RDSystems社ミネアポリス、USA又はSigmaAldrich社ダイセンホーヘン、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。用語M-CSFは、本発明の意味内では、野生型M-CSFアミノ酸配列に対して1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び/又は付加を含み、M-CSFの受容体結合及び生物活性を保持するM-CSFの類似体も含むことが意図されている。好適なM-CSF類似体には、例えば、Taylorら1994年J.Biol.Chem.269巻49号:31171~31177頁に記載のQ17A、R21AM-CSF及びE115A、N119AM-CSFが含まれる。M-CSFは、本発明の方法のステップb及び随意にステップcの細胞培養培地中に、0.1ng/ml~7ng/ml又は0.2ng/ml~5ng/ml、好ましくは0.25ng/ml~3ng/ml又は0.3ng/ml~2.5ng/ml、より好ましくは0.35ng/ml~1.0ng/ml又は0.4ng/ml~0.8ng/ml、及び最も好ましくは0.5ng/mlの濃度で存在する。本発明の好ましい実施形態では、ステップbの細胞培養培地は、0.2~2.5ng/mlのIL-3、10~300nMのアデノシン、及び0.1ng/ml~7ng/mlのM-CSF、より好ましくは0.6~1.6ng/mlのIL3、50~200nMのアデノシン、及び0.3ng/ml~2.5ng/mlのM-CSF、更により好ましくは0.8~1.4ng/mlのIL-3、80~150nMのアデノシン、及び0.4ng/ml~0.8ng/mlのM-CSF、最も好ましくは1ng/mlのIL-3、100nMのアデノシン、及び0.5ng/mlのM-CSFを含む。細胞は、IL-3及びアデノシン及び随意にM-CSFを含むが、FGF-4を含まない細胞培養培地で、少なくとも4日間、好ましくは少なくとも5日間、より好ましくは少なくとも6日間、最も好ましくは7日間培養される。細胞は、IL-3及びアデノシン及び随意にM-CSFを含むが、FGF-4を含まない細胞培養培地で、最長で10日間、好ましくは最長で9日間、より好ましくは最長で8日間、最も好ましくは7日間培養される。好ましくは、細胞は、IL-3及びアデノシン及び随意にM-CSFを含むが、FGF-4を含まない細胞培養培地で、少なくとも4日間及び最長で10日間培養される。本発明の方法の第2の培養ステップでは本発明の方法のステップcに対応する、細胞は、線維芽細胞増殖因子4FGF-4を含む細胞培養培地で培養される。好ましい実施形態では、第1の培養ステップで使用される細胞培養培地は、除去され、FGF-4を含む細胞培養培地が添加される。つまり、細胞は、IL-3及びアデノシン及び随意にM-CSFを含む細胞培養培地で細胞を培養した後、FGF-4を含む細胞培養培地で培養される。第2の培養ステップで使用される細胞培養培地は、第1の培養ステップで使用される細胞培養培地と同じであってもよく、又は異なっていてもよい。したがって、培地は、IL-3、アデノシン、随意にM-CSF、及びFGF-4を一緒に含んでいてもよく、又は培地は、FGF-4のみを含んでいてもよい。好ましくは、本発明の第2の培養ステップで使用される細胞培養培地は、IL-3、M-CSF、及びアデノシンを含んでいない。しかしながら、微量の、つまり最大で50又は40、好ましくは最大で30又は20、より好ましくは最大で15又は10、最も好ましくは最大で5又は2の濃度の、第1の培養ステップのIL-3、アデノシン、及び随意にM-CSFが、第2の培養ステップに存在していてもよい。更なる実施形態では、細胞は、細胞を播種した直後に、IL-3、アデノシン、随意にM-CSF、及びFGF-4を含む培地でインキュベートしてもよい。更に、第2の培養ステップで使用される基本培地は、第1のステップで使用される基本培地と同じあってもよく、又は異なっていてもよい。例えば、DMEM/Ham’sF12l:1が第1のステップで使用される場合、第2のステップで使用される培地も、DMEM/Ham’sF121:1であってもよく、又は第2のステップで使用される培地は、例えばRPMIであってもよい。好ましくは、第1及び第2の培養ステップで使用される培地は同じであり、最も好ましくは、第1及び第2の培養ステップで使用される培地は、DMEM/Ham’sF121:1である。繊維芽細胞増殖因子は、血管新生、創傷治癒、及び胚発生に関与する増殖因子のファミリーである。繊維芽細胞増殖因子は、ヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面に結合しているヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用は、FGFシグナル伝達に不可欠であることが示されている。好ましくは、ヒトFGF-4が使用され、最も好ましくは、組換えヒトFGF-4が使用される。組換えヒトFGF-4は、RDSystems社ミネアポリス、USA等の好適な供給業者から得ることができる。本発明の方法のステップcの細胞培養培地中のFGF-4の濃度は、0.5~7ng/ml、好ましくは1~5ng/ml、より好ましくは2~4ng/ml、最も好ましくは3ng/mlである。本発明の好ましい実施形態では、本発明の第2の培養ステップで使用される細胞培養培地は、上皮増殖因子EGF、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンからなる群から選択される少なくとも1つの化合物を更に含み、より好ましくは、本発明の第2の培養ステップで使用される細胞培養培地は、EGF、グルカゴン、及びインスリンを更に含み、最も好ましくは、本発明の第2の培養ステップで使用される細胞培養培地は、EGF、グルカゴン、ヘパリン、及びインスリンを更に含む。EGFは、細胞成長、増殖、分化、及び生存の調節に重要な役割を果たす増殖因子である。存在する場合、第2の培養ステップの細胞培養培地中のEGFの濃度は、5~20ng/ml、好ましくは7~15ng/ml、より好ましくは8~12ng/ml、最も好ましくは10ng/mlである。好ましくは、ヒトEGFが使用され、最も好ましくは、組換えヒトEGFが使用される。細胞培養培地に使用されるEGFは、BiochromAG社、ベルリン、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。グルカゴンは、膵臓により分泌され、肝臓が貯蔵グリコーゲンを、その後血流に放出されるグルコースに変換することを促すホルモンである。存在する場合、本発明の方法の第2の培養ステップの細胞培養培地中のグルカゴンの濃度は、2~10nM、好ましくは3~8nM、より好ましくは4~7nM、最も好ましくは5nMである。好ましくは、ヒトグルカゴンが使用され、最も好ましくは、組換えヒトグルカゴンが使用される。細胞培養培地に使用されるグルカゴンは、Sigma-Aldrich社、ダイセンホーヘン、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。インスリンは、膵臓のランゲルハンス島により産生され、体内のエネルギー及びグルコース代謝を調節するペプチドホルモンである。存在する場合、本発明の方法の第2の培養ステップの細胞培養培地中のインスリンの濃度は、0.10~0.50IU、好ましくは0.15~0.40IU、より好ましくは0.17~0.35IU、更により好ましくは0.20~0.30IU、最も好ましくは0.28IUである。好ましくは、ヒトインスリンが使用され、最も好ましくは、組換えヒトインスリンが使用される。細胞培養培地に使用されるインスリンは、BiochromAG社、ベルリン、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。ヘパリンは、注射可能な抗血液凝固剤として広く使用されている高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンである。存在する場合、本発明の方法の第2の培養ステップの細胞培養培地中のヘパリンの濃度は、2~10IU/ml、好ましくは3~8IU/ml、より好ましくは4~7IU/ml、最も好ましくは5IU/mlである。細胞培養培地に使用されるヘパリンは、BiochromAG社、ベルリン、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。好ましくは、第2の培養ステップの細胞培養培地は、5~20ng/mlのEGF、2~10nMのグルカゴン、0.10~0.50IUのインスリン、及び2~10IU/mlのヘパリンを含む。より好ましくは、第2の培養ステップの細胞培養培地は、8~12ng/mlのEGF、3~8nMのグルカゴン、0.17~0.35IUのインスリン、及び3~8IU/mlのヘパリンを含み、最も好ましくは、第2の培養ステップの細胞培養培地は、10ng/mlのEGF、5nMのグルカゴン、0.28IUのインスリン、及び5IU/mlのヘパリンを含む。本発明の更により好ましい実施形態では、第2の培養ステップの細胞培養培地は、0.5~7ng/mlのFGF-4、5~20ng/mlのEGF、2~10nMのグルカゴン、0.10~0.50IUのインスリン、及び2~10IU/mlのヘパリンを含み、更により好ましくは、1~5ng/mlのFGF-4、8~12ng/mlのEGF、3~8nMのグルカゴン、0.17~0.35IUのインスリン、及び3~8IU/mlのヘパリンを含む。本発明の最も好ましい実施形態では、第2の培養ステップの細胞培養培地は、3ng/mlのFGF-4、10ng/mlのEGF、5nMのグルカゴン、0.28IUのインスリン、及び5IU/mlのヘパリンを含む。好ましい実施形態では、本発明の方法の第2の培養ステップで使用される細胞培養培地は、肝細胞増殖因子HGFを含有していない。第1及び第2の培養ステップで使用される細胞培養培地は、胆汁酸又は胆汁酸塩、例えばタウロコール酸、グリココール酸、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコラート、及びリトコール酸;カフェイン;及び/又はヒドロコルチゾン及びデキサメタゾン等のグルココルチコイド等の更なる化合物を含んでいてもよい。デオキシコラートが培地中に存在する場合、デオキシコラートは、1~30μM、好ましくは2~25μM又は3~20μM、より好ましくは4~18μM又は5~15μM、最も好ましくは10μMの濃度で存在する。カフェインが培地中に存在する場合、カフェインは、5~100μM、好ましくは10~80μM又は20~70μM、より好ましくは30~65μM又は40~60μM、最も好ましくは50μMの濃度で存在する。細胞は、FGF-4、並びに随意にEGF、グルカゴン、インスリン、及びヘパリンの1つ若しくは複数又は全てを含む細胞培養培地で、少なくとも7日間、及び好ましくは最長で50日間、より好ましくは最長で40日間、更により好ましくは最長で35日間培養され、最も好ましくは、細胞は、7~35日間培養される。少なくともFGF-4、並びに随意にEGF、インスリン、グルカゴン、及びヘパリンの1つ又は複数を含有する細胞培養培地で、少なくとも4日間、好ましくは少なくとも7日間、より好ましくは少なくとも14日間培養した後、細胞は、上述のようなヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴を獲得する。用語培地変更は、細胞と接触している培地を、例え吸引により取り除き、新しい培地、つまりそれまで細胞と接触していない培地を添加するステップを意味することが意図されている。好ましくは、培地は、単球を播種した後の1時間未満の、より好ましくは45分未満、更により好ましくは30分未満、最も好ましくは20分又は10分の時点で変更される。培地変更の更なるステップは、単球を播種した18~30時間後、好ましくは20~28時間後、より好ましくは22~26時間後、最も好ましくは24時間後に行ってもよい。本発明の別の好ましい実施形態では、第1及び/又は第2の培養ステップで使用される細胞培養培地は、無血清であり、つまり培地は、ウマ血清、ヒト血清、又は子ウシ血清FCS等の血清成分を含有していない。しかしながら、無血清培地は、個別のタンパク質又はバルクタンパク質画分を含有していてもよい。無血清培地を使用することにより、できるだけ少数の変数を有するように設計された一連の条件で細胞を培養することが可能になる。更に、本発明の方法により産生される細胞が、細胞療法に使用することを目的とする場合、培地に血清を使用することは、汚染リスクもあるため、不利である。更により好ましい実施形態では、無血清培地は、ヒト血清アルブミン又はウシ血清アルブミン等のアルブミンを含む。好ましくは、ヒト血清アルブミンが、培地中に存在する。ヒト血清アルブミンは、Sigma社ダイセンホーヘン、ドイツ又はBaxter社ウンターシュライス-ハイム、ドイツ等の好適な供給業者から得ることができる。存在する場合、アルブミンは、0.5~10、好ましくは1~8、より好ましくは1.5~5、最も好ましくは2の濃度で細胞培養培地の中に存在する。好ましくは、アルブミンは、本発明の方法の第1及び第2の培養ステップの無血清培地中に存在する。本発明の更なる好ましい実施形態では、第1及び/又は第2の培養ステップでの細胞培養培地の容積は、低いままに維持されており、好ましくは、培地容積は、培養期間全体、つまり第1及び第2の両培養ステップにおいて低いままに維持される。好ましくは、細胞培養培地の容積は、培養容器の40~90μl/cm2又は50~85μl/cm2であり、より好ましくは60~80μl/cm2又は65~75μl/cm2であり、最も好ましくは70μl/cm2である。培地の容積、及びしたがって細胞の上にある培地カラムの高さは、細胞周囲の酸素分圧に影響を及ぼすことが既に示されているGstraunthalerら1999年CellPhysiol.Biochem.9巻3号:150~172頁;Wolffら1993年Am.J.Physiol.265巻5号:C1266~1270頁。したがって、培地容積がより低いと、細胞が低酸素になるのが防止されると考えられる。第2の培養ステップの後、ヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を、更なる使用、例えば細胞療法用に回収することができる。用語細胞を回収するは、細胞が細胞培養から取り出され、随意に更なる使用のために加工されることを意味することが意図されている。細胞は、例えば、接着細胞を培養容器から剥離するトリプシン処理により回収することができる。その後、細胞を遠心分離して、細胞培養培地を除去してもよい。更に、細胞を、例えばPBSリン酸緩衝生理食塩水又は他の緩衝生理食塩溶液で1回又は複数回洗浄してもよい。或いは、回収した後、同じ又は新しい培養容器中の好適な培地に、細胞を再び播種してもよい。更に、invitro毒性試験等の幾つかの応用の場合、細胞を回収する必要がないが、第2の培養ステップ中又は第2の培養ステップ後に直接使用することもできる。回収された細胞は、細胞療法又はinvitro毒性試験に直接使用してもよく、又は約-196°C~約-20°C、好ましくは約-196°C~-80°Cの温度で細胞を凍結することにより凍結保存してもよい。本発明の細胞は、凍結保存後でもそれらの特徴を維持することが、実験により示されている。本発明の方法により、少なくとも15~50×106個、好ましくは少なくとも20~45×106個、より好ましくは30~40×106個の、ヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を、細胞を播種した後10~14日以内に100mlの末梢血から得ることができる。本発明の方法により得られる細胞は、本発明の細胞又はMetahepsとも呼ばれ、より長期間、つまり少なくとも15日間、好ましくは少なくとも17日間又は20日間、より好ましくは少なくとも23日間又は25日間、更により好ましくは少なくとも28日間又は32日間、最も好ましくは少なくとも35日間、それらの代謝特性及び生存能を失わずに培養される能力により、初代ヒト肝細胞phHと区別することができる。本発明の細胞は、最長で56日間、好ましくは最長で52日間又は49日間、より好ましくは最長で45日間又は42日間、最も好ましくは最長で38日間培養される。この場合、培養期間は、FGF-4による処理が開始される時点から計算される。用語代謝特性は、上述のようなヒト肝細胞の少なくとも1つの特徴、つまりジペプチジルペプチダーゼIVDPP-IV、アラニンアミノトランスフェラーゼALT、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼγ-GT、及び乳酸脱水素酵素LDH等の酵素活性;グルカゴン刺激後のグルコース分泌;アセトアミノフェンAPAP及びジクロフェナク等の薬理学物質を代謝する能力;アルブミン、α-フェトプロテイン、アシアロ糖タンパク質受容体1及び2、カルバモイルリン酸シンテターゼ1、及び凝固因子I及びIIの発現;CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、CYP2P8~9、CYP2E1、CYP3A3~5、CYP2C9、CYP3A4等のCYP450酵素の発現;CYP1A2、CYP2C9、及びCYP3A4等のCYP450酵素の誘導可能な活性;アンモニウムイオンと共にインキュベーションした後で尿素を合成する能力;ビタミンKと共にインキュベーションした後で第VII因子を産生する能力;第VIII因子を産生する能力;アルブミンの分泌;及びABC輸送体ファミリーに由来するタンパク質等の生体異物輸送体の発現を意味することが意図されている。本発明の意味内では、上記の特性のいずれかが、FGF-4を含有する培地で7日間培養された本発明の細胞の特性の少なくとも80、好ましくは少なくとも82又は85、より好ましくは少なくとも87又は90、最も好ましくは92又は95である場合、代謝特性は失われていない。本発明の細胞の生存能は、当技術分野で公知の方法により、例えば、死細胞は色素を取り込んで青色に染色され、生細胞は色素を取り込まないトリパンブルー染色により決定することができる。本発明の意味内では、特定の時点で、細胞の20未満、好ましくは18又は15未満、より好ましくは12又は10未満、最も好ましくは8又は5未満が死細胞である場合、細胞は、生存能を保持している。対照的に、初代ヒト肝細胞は、最長で14日間のみ、及び無血清コラーゲンサンドイッチ等の特殊条件下で培養された場合のみ、肝細胞特徴を維持するTuschlら2009年ChemBiolInteract.181巻1号:124~37頁;G.Elautら2006年Curr.DrugMetab.7巻6号:629~660頁。したがって、初代ヒト肝細胞とは対照的に、本発明の細胞は、物質の長期毒性に関する研究に好適である。用語長期毒性は、ラパマイシン又はAPAP等の薬理学物質での処理に応答して、少なくとも7日後、好ましくは少なくとも10又は14日後、より好ましくは少なくとも20又は25日後、更により好ましくは少なくとも28又は30日後、最も好ましくは少なくとも35日後に、培地中のシトクロームP450酵素発現若しくは活性を誘導するか又はLDHを放出する本発明の細胞の能力を指す。更に、本発明の細胞は、例えば、CD95を活性化する抗体で24時間処理した後でアポトーシスを起こす能力により、HepG2等の不死化細胞系と区別することができる。したがって、本発明の細胞がヒトに移植された後で腫瘍に成長するというリスクは低い。アポトーシスを起こす能力は、下記の実施例に記載のように、処理細胞をHOECHST染色で染色することにより、又は処理細胞におけるカスパーゼ活性を測定することにより測定することができる。本発明の細胞とHepG2細胞との別の相違点は、本発明の細胞が、アンモニアによる処理後に尿素を合成することができること、及びシトクロームP450系の酵素を誘導することができること、である。最後に、例えば、Ruhnkeら2005年Gastroenterology128巻7号:1774~1786頁、Ruhnkeら2005年Transplantation79巻9号:1097~1103頁、及びRiquelmeら2009年Differentiation77巻3号:263~276頁に記載のネオ肝細胞と呼ばれる細胞とは対照的に、本発明の細胞は、500ng/mlのCD95活性化抗体APOで24時間処理すると、アポトーシスを起こすことが可能である。用語アポトーシスを起こすことが可能であるは、本発明の細胞培養14日目をCD95活性化抗体APOで24時間インキュベーションした後、死細胞の数例えば、ヨウ化プロピジウムで細胞を染色し、その後FACS分析をすることにより測定されるが、抗体と共にインキュベートされていない対照細胞と比較して、少なくとも1.5倍、より好ましくは少なくとも1.8倍、更により好ましくは少なくとも2倍、最も好ましくは少なくとも2.5倍増加することを意味する。また、ネオ肝細胞は、対応する受容体を発現するが、細胞死誘導性サイトカインTNF-α及びCD95Lによる致死的刺激に反応しないことが他者により見出されているMs.IsabellePochic、UniversityofKonstanzの博士論文:TheUseofNeoHepatocytesforAssessmentofMetabolism-DependentHumanAcuteToxicity、http://kops.ub.uni-konstanz.de/handle/urn:nbn:de:bsz:352-opus-57745で入手可能。したがって、ネオ肝細胞は、細胞療法に有用ではない可能性があると結論付けられた。また、本発明の細胞は、ネオ肝細胞よりも高いレベルの第VII因子及び第VIII因子合成を示す。本発明の細胞における第VII因子の合成は、ネオ肝細胞よりも、少なくとも5倍、好ましくは少なくとも10倍、より好ましくは少なくとも15倍、最も好ましくは少なくとも20倍高い。本発明の細胞における第VIII因子の合成は、ネオ肝細胞よりも、少なくとも3倍、好ましくは少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも7倍、最も好ましくは少なくとも10倍高い。本発明の細胞及びネオ肝細胞が無血清培地で産生される場合、本発明の細胞における第VII因子の合成は、ネオ肝細胞よりも、少なくとも20倍、好ましくは少なくとも30倍、より好ましくは少なくとも40倍、最も好ましくは少なくとも50倍高い。本発明の細胞及びネオ肝細胞が無血清培地で産生される場合、本発明の細胞における第VIII因子の合成は、ネオ肝細胞よりも、少なくとも5倍、好ましくは少なくとも7倍、より好ましくは少なくとも10倍、最も好ましくは少なくとも12倍高い。更に、ネオ肝細胞とは対照的に、本発明の細胞は、500μMのカフェインで細胞を処理することによって阻害することができないシトクローム活性を示す。本発明の細胞は、例えば薬物スクリーニングで物質の毒性を研究するためにinvitroで使用することができる。例えば、細胞は、基本培地中で8~24時間饑餓状態にし、その後様々な量の試験物質又は対照用の対応する媒体を含有する基本培地でインキュベートすることができる。最長72時間のインキュベーションの場合、培地は変更されず、より長いインキュベーションの場合は、培地試料を取得し、培地を週3回変更する。インキュベーション期間の終わりに、培地試料を取り出し、対応する溶解緩衝液例えば、TritonX100/MOPSで細胞を溶解する。溶解した後、溶解物中のタンパク質含有量及び酵素活性DPP-IV、GGT、LDH、ALTを決定することができる。上記で既に概説されているように、本発明の細胞は、例えば、試験化合物と共に、少なくとも14日間、より好ましくは少なくとも21日間、更により好ましくは少なくとも28日間インキュベートすると、試験化合物の急性毒性だけでなく、試験化合物の長期毒性を研究するために使用することができる。また、本発明の細胞は、標的メタボロミクスと呼ばれる手法に使用して、特に新たに開発された物質の作用機構及び代謝を研究することができる。この方法では、代謝物質は、自動質量分析ハイスループット法により定性的及び定量的に検査され、機能的に注釈がつけられる。既存の代謝プロファイルに基づき、関与する代謝経路に関する結論を導き出すことができ、標的構造を同定することができる例えば、Dudleyら2010年Adv.ProteinChem.Struct.Biol.80巻:45~83頁;Koal及びDeigner2010年Curr.Mol.Med.10巻2号:216~226頁を参照。更に、本発明の細胞は、CYP依存性代謝を個々に特徴づける代謝表現型決定に使用して、患者特異的な治療投薬計画を開発することができる例えば、Kleinら2010年Front.Pharmacol.1巻:1~20頁を参照。更に、本発明の細胞は、急性又は慢性肝不全を罹患している、例えば、薬剤誘導性又は毒性肝不全等の疾病、アルコール乱用、ウイルス性肝炎、例えばB、B/D、又はC型、鉄又は銅過負荷又は非アルコール性脂肪肝疾病、胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝臓病、遺伝学的に遺伝する肝臓病、及び小児の肝臓病の経過中のヒトに細胞を移植することによる細胞療法に使用することができる。また、細胞は、フェニルケトン尿症等の原因が1つである疾病の、例えばRNAを移植することによる遺伝子治療用に自己由来ベクターとして使用することができる例えば、Kormannら2011年Nat.Biotech.29巻:154~157頁を参照。好ましくは、細胞療法では、自己由来細胞、つまり本発明の細胞を用いて治療しようとする患者から単離された単球から産生された細胞が使用される。細胞療法の場合、細胞は、脾臓内、門脈内、肝臓内、又は末梢静脈内注射、又はそれらの組み合わせのいずれかにより、無菌PBS、0.9NaCl、又はリンゲル液中の懸濁物として投与される。本発明のより完全な理解は、以下の具体的な例を参照することにより得られるが、それらの例は、例示の目的で本明細書に提供されており、本発明の範囲を限定するためのものではない。1.本発明の方法による、ヒト肝細胞の特徴を有する細胞の産生健常ドナーに由来する全血をヘパリンで処理し、血液対フィコールの比率が2:1のフィコールを使用して勾配遠心分離400g;室温;30分間で分離した。中間層を、1:3~1:4の細胞懸濁物対PBSの比率で氷冷無菌PBSに再懸濁し、その後400gで5分間4°Cにて遠心分離した。最初の洗浄後、上清を廃棄し、細胞ペレットを、氷冷無菌PBSに再懸濁した50ml全血からのPBMCの場合、20~30mlの氷冷無菌PBSを使用する。可視的な赤血球の混入が存在した場合、この洗浄ステップは、無菌溶血緩衝液8.29g/lのNH4Cl、1g/lのKHCO3、0.037g/lのEDTAで10分間、暗所で室温にてインキュベーションした後で行う。再びPBSに再懸濁した後、細胞を300gで5分間遠心分離した4°C。もう一度上清を廃棄し、細胞をPBSに再懸濁し、その後250gで5分間4°Cにて最後の遠心分離を行った。この最終洗浄ステップの後、PBSを廃棄し、細胞を、以下の組成を有する培地に37°Cにて再懸濁した:DMEM/Ham’sF121:110FCS標準条件又は2ヒトアルブミン無血清条件2mMグルタミン100μg/mlストレプトマイシン1000IEペニシリン1ng/ml組換えヒトIL-3RDSystems社100nMアデノシンSigma社、ダイセンホーヘン、ドイツ0.5ng/ml組換えヒトM-CSFRDSystems社細胞を、250,000細胞/cm2の密度で、細胞播種の30~120分前に培地と共に予めインキュベートしたペトリ皿に播種した。細胞を96ウエルプレートに播種した場合、外側ウエルは、空のままにしておき、細胞培養培地のみで満たし、温度並びにO2及びCO2分圧の違いをなくした。播種した後、細胞を10~30分間付着させた。付着した後、培地を、培養容器の1cm2当たり70μlの新しい培地に取り替えた。細胞培養培地を、培養の最初の24時間以内に再び交換した。培養の最初の24時間後、豆状の核を有する小さな円形細胞であることを特徴とする単球の接着集団が存在した。この段階では、細胞は、DPP-IV、GGT、及びALTの特異的活性をほとんど示さなかったが、単球マーカーCD14及び汎白血球マーカーpan-leukocyte-markerCD45が高度に発現された。最初の24時間後、培地を週3回変更した。培養の最初の4~10日間、細胞を上記の培地で培養した。細胞を、IL-3、M-CSF、及びアデノシンを含む培地でインキュベートした後、培地を、以下の組成を有する同じ容積の培地と取り換えた:DMEM/Ham’sF121:110FCS標準条件又は2ヒトアルブミン無血清条件2mMグルタミン100μg/mlストレプトマイシン1000IEペニシリン3ng/ml組換えヒトFGF-410ng/ml組換えヒトEGF5nM組換えヒトグルカゴン0.28IE組換えヒトインスリン5IE/mlヘパリン細胞を、少なくとも7日間、又は図及び図の凡例に示されている期間、この培地でインキュベートした。第2の培養ステップ中に、形態が再び変化し、細胞器官が豊富な細胞質を有する、大型で単核又は多核の多角形細胞、metahepsのコンフルエント又はサブコンフルエント層がもたらされる。この形態は、培養培地中の血清の存在又は非存在とは無関係に観察される。実験を実施する前に、L-グルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシンのみを含有するDMEM/Ham’sF121:1基本培地と呼ぶでインキュベーションすることにより、細胞を飢餓状態にした。基本培地をインキュベーションにも使用して、培地成分が、実施されるアッセイと干渉するのを回避した。溶解する前に、細胞を、氷冷PBSで3回洗浄した。2.タンパク質含有量の決定タンパク質含有量は、ビシンコニン酸BCAアッセイSigma社、ダイセンホーヘン、ドイツで決定した。細胞を、培養容器で増殖させ、基本培地で24時間饑餓状態にし、表示されている実験用化学薬品と共にインキュベートした。培養培地を除去した後、細胞を、TritonX-100登録商標/MOPSで溶解し、10μl等量の溶解物を、200μlのBCA試薬と共に37°Cにて30分間インキュベートした50部の試薬1部の4CuSO4。560nmの吸光度をマルチラベルカウンターDynatech社製MR7000で測定した。タンパク質含有量は、ウシ血清アルブミンを基準として使用して計算した。3.酵素活性の決定aLDH活性LDH活性は、ピルビン酸塩及びβ-NADHを乳酸塩及びβ-NDAにするLDH触媒反応から生じるβ-NADを、標準的プロトコールBergmeyerH.U.Hrsg.MethodenderenzymatischenAnalyse3.Aufl.1974、Band1、VerlagChemieWeinheim/Bergstrを使用して、又は製造業者の説明書に従いCytoTox96登録商標キットPromega社を使用して測定することにより分光光度的に決定した。bALT活性ALTの活性は、ALTによるL-アラニン及びα-ケトグルタル酸塩からピルビン酸塩及びL-グルタミン酸塩の生成、及びLDH依存性のβ-NAD形成によるピルビン酸塩生成のその後の定量化からなる2段階反応により測定したSchumannGら2002年ClinChemLabMed40巻7号:718~724頁。試料13,000U/分で4°Cにて遠心分離した後の、TritonX-100登録商標/MOPS中の細胞溶解物を、α-ケトグルタル酸塩の非存在下で、反応混合物100mmolTRIS、500mmolL-アラニン、0.18mmolβ-NADH、0.1mmolピリトキサル-5’-ホスフェート、1700U/lL-乳酸デヒドロゲナーゼ、pH7.15と共に37°Cにて300秒間インキュベートした。15mmolα-ケトグルタル酸塩を添加することにより反応を開始し、90秒間インキュベーションした後、β-NADH吸光度の減少を180秒間モニターした。或いは、RandoxChemicals社製のALTキットを製造業者の説明書に従って使用した。cガンマ-グルタミル-トランスペプチターゼ活性ガンマ-グルタミル-トランスペプチターゼ活性は、L-γ-グルタミル-p-ニトロアニリン及びグリシルグリシンからγ-グルタミル-グリシルグリシド及びp-ニトロアニリンへのγ-GT触媒反応から生じるp-ニトロアニリンの光度決定を使用して測定したSzaszG:Gamma-glutamyl-transpeptidase、inMethodenderEnzymatischenAnalyse、第3版1巻BergmeyerHU編、Weinheim/Bergstr.、VerlagChemie、1974年、757~762頁。細胞を、PBSで3回すすぎ、TritonX-100登録商標で溶解し、遠心分離し13,000U/分、10分間、細胞溶解物を100mMTRIS、4mML-γ-グルタミル-p-ニトロアニリド、及び50mMグリシルグリシンと共にインキュベートすることにより、総γ-GT活性を測定した。p-ニトロアニリンの吸光度を405nmで測定した。ΔE/分を、5、10、15、30、及び45分時点の測定から計算した。dDPP-IV活性DPP-IV活性は、発色基質Gly-L-Pro-p-ニトロアニリドのDPP-IV触媒切断から生じるp-ニトロアニリンの光度決定を使用して測定した。細胞をTritonX-100登録商標/MOPSで溶解した。溶解物を遠心分離13,000U/分;4°Cした後、溶解物を、37°Cにて0.1MTRISpH8.0中の0.2mMGly-L-Pro-pNAでインキュベートし、405nmの吸光度を、0、5、10、15、30、及び45分後に測定してΔE/分を決定した。p-ニトロアニリンを用いた標準曲線からDPP-IV活性を決定し、BCA法により測定されたタンパク質含有量に対して正規化した。4.P450シトクローム活性の決定CYPP450活性を測定するために、P450Glo商標アッセイPromega社を製造業者の説明書に従って使用した。手短に言えば、細胞を基本培地中で饑餓状態にし、様々な誘導因子と共にインキュベートしたCYP1A2の場合は、0.1~10μM、典型的には1μMの濃度の3-メチルコラントレン;10μMのデキサメタゾン;10~100μM、典型的には50μMのリファンピシン;CYP3A4の場合は、5~10μM、典型的には10μMのフェニトイン;及び2C9の場合は、50μMリファンピシン及び10μMフェニトインで24時間~72時間。典型的には、誘導は、48時間のインキュベーション時間を使用して実施した。誘導した後、細胞を氷冷PBSで3回すすぎ、製造業者の説明書に従って、対応するルシフェリン基質を含有する基本培地でインキュベートし、30分間インキュベーションした後、製造業者の説明書に従いルシフェリン検出試薬を用いて上清の発光を測定した。発光測定値は、BCA法により決定された細胞溶解物中のタンパク質含有量に正規化した。蛍光染料3-シアノ-7-エトキシクマリンethoxycoumarineを使用してCYP1A2活性を決定するためにDonatoら2004年DrugMetabolismandDisposition32巻7号:699~706頁、細胞を、3-メチルコラントレンで48時間処理し、その後、HEPES緩衝生理食塩水中の3-シアノ-7-エトキシクマリン30μMで120分間37°Cにてインキュベーションした後、氷冷PBSで3回すすいだ。75μlの上清をピペットでアッセイプレートに移し、25μlのβ-グルクロニダーゼ/アリールスルファターゼ酢酸ナトリウムNatriumacetat中1.5μl/1mlと共に37°Cにて2時間インキュベートした。0.1mMリン酸カリウム緩衝液を反応停止溶液として添加した後、励起/発光408/455nmの蛍光をプレート蛍光光度計で測定した。蛍光測定値は、BCAアッセイにより決定されたタンパク質含有量に対して正規化した。5.APAP毒性の決定毒性アッセイは、細胞を基本培地で24時間飢餓状態にした後、様々な濃度のAPAPを基本培地に溶解させて24時間インキュベーションすることにより実施した。培地及び溶解物中のLDH活性を、Promega社製のCytoTox96登録商標キットを使用して上述のように決定し、LDH放出を、100×培地中のLDH活性/培地中のLDH活性溶解物中のLDH活性で計算した。6.アポトーシスの決定aHOECHST33342染色によるアポトーシス細胞を、様々な濃度の抗APOAlexisAXXORABiochemicals社、レラッハ、ドイツ/プロテインABioVisionResearchProducts社、マウンテンビュー、USAと共に24~48時間インキュベートした。インキュベーション期間後、細胞をHOECHST3334210μMで15分間染色し、PBSで3回洗浄した後、蛍光顕微鏡を使用して分析した。bカスパーゼ-3測定によるアポトーシス細胞溶解物中のカスパーゼ-3活性は、Benesicら2006年KidneyBloodPressRes.29巻5号:280~293頁に記載のように発色カスパーゼ-3基質Ac-DEVD-pNA終濃度40μMを使用して決定した。p-ニトロアニリンを用いた標準曲線を使用して活性を評価し、BCA法により測定されたタンパク質含有量に対して正規化した。cFACS分析によるアポトーシス細胞の評価DNA断片化によりアポトーシスを評価するために、ヨウ化プロピジウムで染色した細胞のFACS分析を実施した。細胞を基本培地で24時間饑餓状態にし、基本培地又は表示濃度の抗APOAlexisAXXORABiochemicals社、レラッハ、ドイツを含有する基本培地でインキュベートした。24時間インキュベーションした後、Accutase登録商標を使用して細胞を剥離し、250gで5分間4°C遠心分離し、0.2ウシ血清アルブミンを含有する氷冷PBSに再懸濁した。連続撹拌下で純粋エタノールをPBS/BSAにゆっくりと添加して、エタノールの終濃度を75にした。細胞を-20°Cで凍結して、一晩固定させた。その後、細胞を400gで5分間4°C遠心分離した。上清を廃棄し、PBS中の50μlヨウ化プロピジウムで少なくとも30分間暗所にて細胞を染色し、その後FACS分析した。アポトーシスは、サブG1事象を評価することにより評価した。7.尿素合成の決定尿素合成は、細胞を基本培地で24時間飢餓状態にし、その後、様々な濃度の塩化アンモニウム0~100mMで24時間インキュベーションした後で測定した。上清を収集し、製造業者の説明書に従いQuantiChrome商標尿素アッセイキットClonagen社を使用して尿素含有量を決定した。培地の尿素含有量は、BCA法により測定された細胞溶解物中のタンパク質含有量に対して正規化した。8.第VII因子分泌の決定第VII因子分泌は、Espositoら2000年KidneyInt.58巻:123~130頁;Ziyadehら1990年Am.J.Physiol.259巻:F704~F714頁と同様に、直接ELISAにより測定した。飢餓状態にした後に、細胞を、表示されている様々なメナジオン濃度で48時間インキュベートした。培地を収集し、100μ等量を、免疫吸着プレートNunc社にて200μlVoller緩衝液1.59gNa2CO32.93gNaHCO3を100mlの再蒸留水aquabidestに添加で一晩4°Cにてインキュベートした。プレートを、200μlのPBS/0.05Tween登録商標-20で3回すすぎ、PBS/0.05Tween登録商標-20中200μlの2BSAで2時間ブロッキングした。その後、プレートを空にし、2-BSA-PBS/0.05Tween登録商標-20中で50μlのウサギ抗第VII因子抗体Abeam社、ケンブリッジ、英国1:1000と共に1~2時間4°Cにてインキュベートした。200μlのPBS/0.05Tween登録商標-20で3回洗浄した後、プレートを、2-BSA-PBS/0.05Tween登録商標-20中で50μlの抗ウサギペルオキシダーゼ-Ak1:5000Santacruz社、ハイデルベルグ、ドイツと共に暗所で室温にて1時間インキュベートした。200μlのPBS/0.05Tween登録商標-20で3回すすいだ後、その後、100μlのHRP基質再蒸留水中の0.5mg/mlのo-フェニレンジアミン、11.8mg/mlのNa2HPO42H2O、7.3mg/mlのクエン酸、0.015のH2O2と共に、暗所にて15及び45分間インキュベーションを行った。マルチウエルリーダで490nmの吸光度を測定し、その後波長補正した630nm。吸光度を、BCA法により決定された細胞溶解物タンパク質含有量で正規化した。9.第VIII因子分泌の決定第VIII因子は、Espositoら2000年KidneyInt.58巻:123~130頁;Ziyadehら1990年Am.J.Physiol.259巻:F704~F714頁と同様に、サンドイッチELISAで測定した。飢餓状態にした後、細胞を24時間基本培地でインキュベートした。培地を収集し、100μl等量を、1μg/mlヤギ抗ヒト第VIII因子Santacruz社、ハイデルベルグ、ドイツが事前にコーティンされている免疫吸着プレートNunc社中で2時間室温にてインキュベートした。プレートを、200μlのPBS/0.05Tween登録商標-20で3回すすいだ。その後、プレートを空にして、1-BSA-PBS/0.05中で50μlウサギ抗第VIII因子Santacruz社、ハイデルベルグ、ドイツ1:1000と共に室温にて1時間インキュベートした。200μlのPBS/0.05Tween登録商標-20で3回洗浄した後、プレートを、1-BSA-PBS/0.05Tween登録商標-20中で50μl抗ウサギペルオキシダーゼ-Ak1:5000Santacruz社と共に暗所で室温にて1時間インキュベートした。200μlのPBS/0.05-Tween登録商標-20で3回すすいだ後、その後、100μlのHRP基質再蒸留水中の0.5mg/mlのo-フェニレンジアミン、11.8mg/mlのNa2HPO42H2O、7.3mg/mlのクエン酸、0.015のH2O2で、暗所にて15及び45分間インキュベーションを行った。マルチウエルリーダで490nmの吸光度を測定し、その後波長補正した630nm。吸光度を、BCA法により決定された細胞溶解物タンパク質含有量で正規化した。10初代ヒト肝細胞と比較した遺伝子発現解析同じドナーのMetaheps及び初代ヒト肝細胞pHHの遺伝子発現を、cRNA-マイクロアレイKat.Nr.OHS401、HumanToxicologyandDrugResistanceSABiosciences社で解析した。このアレイで解析される遺伝子は、下記の表1に示されている。単球及び肝細胞は、肝細胞供与及び採血のインフォームドコンセントに署名した、肝部分切除を受けた患者から獲得した。患者は、HumanTissueandCellResearchFoundationHTCR、c/oBioPark、Josef-Engert-Str.9,93053レーゲンスブルクと協力して選択した。肝細胞は、Weissら2003年JHepatol.38巻4号:476~482頁に記載のように単離及び培養した。培養の4日後、製造業者の説明書に従ってSABiosciences社製のアレイ等級全RNA単離キットを使用して、mRNAをpHHから単離した。FGF-4中で培養した3、7、及び14日目のMetahepsについても同じことを実施した。製造業者の説明書に従って、mRNA試料を、ビオチン化cRNAに転写し、アレイ膜上でハイブリダイズした。その後、SABiosciences社製の化学発光検出キットを使用して化学発光検出を実施した。TIGRSpotfinderソフトウェアでアレイを解析し、SPSSソフトウェアを使用してデータを分析した。更に、クラスター解析を実施した。11本発明の細胞の長期毒性本発明の細胞が長期毒性研究に適合することを示すために、細胞を上述のように産生し、低濃度のアセトアミノフェンAPAP及びジクロフェナクdicloと共に15日間インキュベートした。インキュベーションの1、3、6、8、10、13、及び15日目に、培地試料を取り出し、培地中のLDH活性を、Promega社製の細胞毒性キットを使用して決定した。LDH放出を、100×培地中のLDH/LDH培地LDH溶解物としてで計算した。低濃度のジクロフェナクは、Metahepsにおいて長期毒性を示す一方で、アセトアミノフェンは、Metahepsにおいて急性毒性を起こした。12結果の考察提示されたデータは、本発明の細胞の肝細胞様特徴を示す。重要な知見は、1A2、2C9、及び3A4等のCYPP450酵素の発現及び活性により要約され、また、これらは、典型的物質例えば、アリール炭化水素受容体AHR、プレグナン-X-受容体PXR、構成的アンドロスタン受容体CAR、及びグルココルチコイド受容体GRのリガンドを使用して誘導可能である。肝臓で最も豊富なCYPP450酵素であるCYP2E1は、APAP毒性により、及びタンパク質レベルで間接的に示すことができた。更に、アンモニア依存性尿素合成並びに凝固因子VII及びVIIIの合成は、ELISAにより示すことができた。DPP-IV、γ-GT、及びLDHの特異的酵素活性が存在し、初代肝細胞又は肝細胞由来細胞Huh-7又はHepG2等と類似している。したがって、本発明の細胞は、肝細胞様の代謝、遺伝子発現、合成機能、同様に酵素活性を示す。更に、本発明の細胞は、カスパーゼ-3活性、HOECHST染色、及びFACS分析により示されるように、CD95結合により誘導されるアポトーシスを起こすことが可能である。これは、治療介入に潜在的に使用することができる細胞の重要な特徴である。観察された酵素活性、代謝、及び合成特性を、培養中の初代ヒト肝細胞と比較し、本発明の細胞は、少なくとも20の肝細胞第VIII因子合成、30の肝細胞CYP3A活性、並びに70の肝細胞特異的酵素活性を示した。更に、本発明の細胞は、長期毒性試験に有用であることが示された。Ruhnkeら2005年Gastroenterology128巻7号:1774~1786頁の方法により培養された細胞ネオ肝細胞と比較すると、本発明の細胞は、10~20倍より高い第VIII因子放出、並びに3CEC蛍光により測定された、より高いCYP1A2活性を示した。更に、ほとんどCYP2C9により媒介される3-CECのカフェイン非感受性代謝は、Ruhnkeらの方法により培養された細胞にはほとんど存在しない。加えて、後者の細胞は、24時間のCD95結合後に、測定可能なアポトーシスを一切示さなかった。これは、本発明の細胞との別の顕著な違いである。"