"部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよびまたはギ酸デヒドロゲナーゼ酵素PDH/FDH濃縮物を製造する方法であって、以下の工程:a.フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよびまたはギ酸デヒドロゲナーゼを製造し得る微生物の発酵ブロスを製造し;b.該ブロスをミクロ流動化させて、得られた細胞から活性を放出させ、PDHおよびまたはFDH酵素を含むミクロ流動化ブロスを得;c.該ブロスを凝集剤で処理することにより細胞破砕物を凝集させてDNAおよび不要なタンパク質を除去して、該ブロスを清浄化し;d.清浄化ブロスを濾過し;そしてe.該ブロスを濃縮して、PDHについて少なくとも約400IU/ml、FDHについて少なくとも約20IU/mlのPDH/FDH活性を有する部分精製された酵素濃縮物を得ることを含む方法。ブロスを、約12000~約20000psiの範囲内の圧力下でミクロ流動化する、請求項1に記載の方法。ブロスの温度を約25°C以下に保ちながら該ブロスをミクロ流動化する、請求項1に記載の方法。ブロスの温度を約25°C以下に保つ、請求項3に記載の方法。フェニルアラニンデヒドロゲナーゼをSporosarchina、Thermoactinomyces属から得る、請求項1に記載の方法。フェニルアラニンデヒドロゲナーゼをThermoactinomycesintermediusから得る、請求項1に記載の方法。フェニルアラニンデヒドロゲナーゼが、Thermoactinomycesintermedius、ATCC33205から得られ、EscherichiacoliまたはPichiapastorisにおいて発現される、請求項1に記載の方法。微生物がEsherichiacoliJM110である、請求項1に記載の方法。清浄化ブロスを限外濾過する、請求項1に記載の方法。以下の構造:を有するアミン体を製造する方法であって、以下の工程:a.以下の構造:を有するケト酸の水溶液をギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ/ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素PDH/FDHで処理し;そしてb.反応混合物のpHを水酸化ナトリウムで調整し、望ましくない過剰なアンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン体を得ることを含む方法。部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ/ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を請求項1に記載の方法により製造する、請求項10に記載の方法。3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸、ギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ/ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素の水溶液を約35~約40°Cの範囲内の温度に温めて約24~約48時間の範囲内の時間、約7.8~約8.2の範囲内のpHで維持してアミン体を製造する、請求項10に記載の方法。以下の構造:を有するBOC保護されたアミン体を製造するための方法であって、以下の工程:a.以下の構造を有するアミノ酸αS-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸:部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ/ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を用いて、請求項12に記載のケト酸:の還元的アミノ化において製造されるの水溶液を提供し;そしてb.上記水溶液をジ-tert-ブチルジカルボネートと処理してBOC保護アミン体を得ることをを含む方法。αS-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸の水溶液およびジ-tert-ブチルジカルボネートの混合物のpHを約8.5~約12.5の範囲内に維持する、請求項13に記載の方法。BOC保護アミン体を反応混合物から単離して、BOC保護アミン体を結晶化させる工程をさらに含む、請求項13に記載の方法。請求項1に記載の方法により製造された部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ/ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素。PDHおよびFDH活性を有することを特徴とする部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ/ギ酸デヒドロゲナーゼ。以下の構造:を有するBOC保護アミン体を製造するために提供される方法であって、以下の工程:a.部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ/ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素濃縮物を製造し;b.以下の構造:を有するケト酸の水溶液を、ギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ/ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素濃縮物PDH/FDHと処理し;c.反応混合物のpHを水酸化ナトリウムで調節して、望ましくない過剰アンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン体:を得;そしてd.アミノ酸中間体を単離せずに、上記水溶液をジ-tert-ブチルジカルボネートと処理して以下の構造:を有するBOC保護アミン体を得ることを含む方法。部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ/ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素が、以下の工程:a.フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび/またはギ酸デヒドロゲナーゼを製造し得る微生物の発酵ブロスを製造し;b.該ブロスをミクロ流動化させて得られた細胞から活性を放出させ、PDHおよびまたはFDH活性を有するミクロ流動化ブロスを得;c.該ブロスを凝集剤と処理することにより細胞破砕物を凝集させて、該ブロスを清浄化し;d.清浄化ブロスを濾過し;そしてe.該ブロスを濃縮して、PDHについて少なくとも約400IU/ml、FDHについて少なくとも約20IU/mlのPDH/FDH活性を有する精製された酵素濃縮物を得ることにより製造される、請求項18に記載の方法。以下の構造:を有する遊離塩基化合物を生成するための方法であって、請求項13に記載の方法により製造した以下の構造:を有するBOC保護化合物を提供し、BOC保護化合物を塩化メシルおよびヒューニッヒ塩基および以下の構造:を有する化合物Jおよび1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBTと処理し、構造K:を有するBOC保護中間体化合物を生成し、ピリジンおよびトリフルオロ酢酸無水物の存在下で中間体Kを脱水し、次いで強塩基の存在下で反応生成物を加水分解して以下の化合物L:を生成し、そして化合物Lを塩酸と処理して対応する以下の塩酸塩L:を生成し、化合物Lを塩酸および水酸化ナトリウムと処理して遊離塩基化合物Mを生成する方法。以下の実施例は本発明の好ましい態様を表す。実施例1プラスミドpBMS2000PPFDHPDHmodの構築発現ベクターpBMS2000PPFDHPDHmodの2工程構築を用いた。適合性の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位とともにPpastorisのFDH遺伝子の5’末端および3’末端を含むオリゴヌクレオチドプライマー:を用い、PpastorisのFDH遺伝子を発現ベクターpBMS2000に開示されているにサブクローニングした。それぞれ1×TaqPlus反応緩衝液、0.2mMの各デオキシヌクレオチド三リン酸dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、0.4nMの各オリゴヌクレオチド、2.5UのTaqPlusDNAポリメラーゼ、およびクローン化されたPpastorisのFDH遺伝子を含む10pgのプラスミドDNAを含有する100μLずつの反応液4つにおいてPpastorisのFDH遺伝子の高忠実度PCR増幅を行った。増幅条件は、自動伸長パーキンエルマーモデル480サーモサイクラーを用い、94°Cで4分間インキュベート後、94°Cで1分間;50°Cで1分間;および72°Cで1.5分間の25サイクルを含むものであった。このPCR反応混合物を等容量のフェノール:クロロホルム1:1を用いて精製した。単離したフラグメントの濃度を低分子量ラダーに対する電気泳動により推定し、5:1挿入物:ベクターのモル比にて全量10μLにおいて22°Cで2時間、ライゲートした。15μLのdH2Oおよび250μLの1-ブタノールを加えてDNAを沈殿させ、マイクロ遠心管中、13000×gで5分間ペレット化した。液体を吸引除去し、DNAをSpeedVacで5分間、低加熱下で乾燥させた。ペレットを5μLのdH2Oに再懸濁した。再懸濁したDNAを、エレクトロポレーションにより0.04mLのEcoliDH10Bコンピテント細胞に25μFおよび250Ωで形質転換した。SOC培地を直ちに加え0.96mL;SOC=1リットル当たり0.5酵母抽出物、2トリプトン、10mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4および20mMグルコース、細胞をシェーカー中で1時間、37°Cおよび225rpmでインキュベートした。プラスミドDNAを含むコロニーを、50μg/mlの硫酸カナマイシンを含むLB寒天プレートで選択した。所望の挿入物を有するプラスミドは、RapidCyclerを用いたキャピラリー管でのコロニーPCRにより同定した。各反応混合物は、50mMTris-HClpH8.3、4mMMgCl2、0.25mg/mLのウシ血清アルブミン、2スクロース400、0.1mMクレゾールレッド、0.4nMの各プライマー配列番号1および配列番号2、および2.5UのTaqDNAポリメラーゼを含んでいた。反応混合物を10μLずつに分け、丸底マイクロタイタープレートのウェルにピペッティングした。カナマイシン耐性コロニーを使い捨てプラスチック接種針を用いて拾い、反応混合物にかき混ぜて入れ、LBカナマイシン寒天に移した。各反応混合物の一部を30μL容キャピラリー管に入れ、管の両端をフレームシールした。細胞を溶解し、94°Cで30秒インキュベートしてDNAを変性し、RapidCyclerThermocyclerを用いて94°Cで0秒間、40°Cで0秒間、および72°Cで60秒間の30サイクルを用いて増幅を行った。試料を1.0TAEアガロースゲル上で2時間、100vにて電気泳動した。17の試験した試料のうち7試料が1100塩基対で強いバンドを示した。このプラスミド本明細書中でpBMS2000PPFDHと称するを含む1つのコロニーをプラスミド構築における次の工程のために選択した。PDHmodは、3-ヒドロキシアダマンタン-1-イルオキソ酢酸のS-アミノ3-ヒドロキシアダマンタン-1-イル酢酸への完全な変換に必要なカルボキシル末端の最後の2つのアミノ酸および別の12アミノ酸の変化により、開示されたDNA配列とは異なっている改変したThermoactinomycetesintermediusフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをいう。この変化をプラスミドpPDH9K10に詳細が記載されているに導入し、次いでこのプラスミドをPpastorisSMD1168に形質転換した。天然PDH遺伝子の3’末端および対応するアミノ酸を以下に示す:PDHmod遺伝子の3’末端および対応するアミノ酸を以下に示す変化したまたは新規なアミノ酸は太字:適合性の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位とともにPDHmod遺伝子の5末端および3末端を含むオリゴヌクレオチドプライマー:を調製した。PCRによるPDHmodの増幅および精製のための反応条件は、ATCC74408から調製した染色体DNAを反応のための鋳型として含めた以外はPpastorisのFDH遺伝子に用いたものと同じであった。得られたフラグメントを各20単位のNdeIおよびSmaIを用い、25°Cで1時間、次いで37°Cで2時間、全容量50μLで消化した。これと平行して、開始コドンにNdeI部位を有するpBMS2000ベクターのバージョン2μgを同一条件を用いてNdeIおよびSmaIで消化した。消化した試料を別々に1.0TAEアガロースゲル上で2時間、100vで電気泳動した。PDHmod遺伝子1200塩基対フラグメントおよび線状化ベクター4700塩基対フラグメントに対応するバンドをゲルから切り出し、QIAquickGelExtractionKitを用いて精製した。これら2つのフラグメントのライゲーション、Ecoliの形質転換、およびPDHmod遺伝子を有する挿入物を含むコロニーのスクリーニングを上記のように行った。pBMS2000PPFDHPDHmodの構築のため、pBMS2000PDHmod2μgを50μLの反応物中、各10UのHindIIIおよびSmaIを用いて25°Cで1時間、次いで37°Cで1時間開裂させた。10単位のT4DNAポリメラーゼおよび4つの全てのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の2.5mMの混合物2μLを加え、試料を11°Cで20分間インキュベートした。反応液を1.0TAEアガロースゲル上で2時間、100vで電気泳動した。1800塩基対フラグメントを切り出し、QIAquickGelExtractionKitを用いて単離した。このフラグメントは、順にtacプロモーター、groES遺伝子、およびPDHmod遺伝子転写融合物としてを含んでいる。次に、pBMS2000PPFDH2μgを10単位の制限エンドヌクレアーゼSmaIを用い、50μL容量で2時間、25°Cで消化し、次いで0.4Uのエビアルカリホスファターゼで1時間、37°Cで処理した。プラスミドDNAを1.0TAEアガロースゲル上で2時間、100vで電気泳動し、単離し、QIAquickキットを用いて抽出した。これら2つのフラグメントを6.5:1挿入物:ベクターのモル比で16°Cにて4時間、10μLの最終容量でライゲートした。1-ブタノール抽出および遠心分離後、DNAをエレクトロコンピテントなDH10B細胞に形質転換した。カナマイシン耐性コロニーを、FDHについて既に記載したように2つのPDHmod特異的プライマーを用いてPDHmod遺伝子の存在についてスクリーニングした。第二ラウンドのPCRスクリーニングは、それぞれPPFDHの5’末端およびPDHmod遺伝子の3’末端に相同なDNAプライマーを用いて行った。1400塩基対フラグメントの増幅を支持することができる構築物のみが2つの遺伝子を同じ方向で有していた。そのようなプラスミドの1つが見出され、方向性がKpnIを用いた診断的制限消化によって確認され、これにより5422塩基対および1826塩基対の予想されたフラグメントが得られた。このプラスミドをpBMS2000PPFDHPDHmodと表した。実施例2FDHおよびPDHmodの発現pBMS2000PPFDHPDHmodをエシェリキアコリEscherichiacoliJM110に形質転換した。振盪フラスコでの検討においてJM110をMT5培地2.0Yeastamine、4.0グリセロール、0.6リン酸ナトリウム[二塩基性]、0.3リン酸カリウム[一塩基性]、0.125硫酸アンモニウム、0.0256硫酸マグネシウム[七水和物;滅菌1M溶液からオートクレーブ後に添加]、および50μg/mLの硫酸カナマイシン[濾過滅菌した50mg/mL溶液からオートクレーブ後に添加]中、28°C、250rpmで18時間増殖させた。600nmでの光学密度OD600を記録し、0.35の開始OD600を与えるに十分な細胞を新鮮なMT5/カナマイシン培地に加えた。OD600が0.8~1.0となるまで、フラスコを250rpm、28°Cで振盪した。滅菌濾過した1Mイソプロピルチオ-β-D-ガラクトピラノシドIPTGを最終濃度35μMで加えることにより両遺伝子の発現を誘導し、発酵を24~48時間続けた。細胞を6500×gで5分間遠心分離することによってペレット化し、等容量の50mMギ酸アンモニウムpH7.0で1回洗浄し、再度ペレット化した。細胞を-20°Cで凍結保存するか、または直ちに用いた。ペレットを50mMリン酸アンモニウムpH7.0中、10mL/g湿細胞重量で再懸濁し、FisherScientificModel50SonicDismembratorを用いて3×15秒間超音波処理した。細胞破砕物は、13000×gにて室温で5分間遠心分離することによりペレット化した。試料を70°Cで10分間加熱した。1mLの1Mジチオスレイトール溶液を混合物に加え、10μLを10NuPAGEBisTrisポリアクリルアミドミニゲルに適用した。電気泳動を200vで50~60分間行い、ゲルを0.1w/vクマシーブルー、40v/vエタノールおよび10v/v酢酸からなる溶液で染色した。染色液に浸漬したゲルを沸騰が明らかとなるまで電子レンジで加熱し、次いでオービタルシェーカーで40rpmにて15分間振盪した。ゲルを脱イオン水で十分に洗浄し、脱色溶液;Invitrogenで覆った。この溶液を再び沸点ちょうどまで加熱し、少なくとも2時間穏やかに振盪した。誘導によりMr43000および40000に2つの顕著なバンドが認められ、これらはFDHおよびPDHmodのサブユニットの予想された分子量に対応していた。また試料は、実施例4、6および7に記載するようにして試験したときにFDHおよびPDHの両活性を有していることがわかった。この組換えEcoli株にSC16496の内部表示を与えた。SC16496を引き続き15リットルおよび250リットル容量で発酵させた。15リットル発酵のために、1mLの凍結SC16496を入れた一つのバイアルを室温で解凍し、4リットルフラスコ中の50μg/mLのカナマイシンを含む1リットルのMT5培地に加えた。このフラスコを28°C、250rpmで24時間インキュベートし、Braun発酵装置中の13リットルのMT5培地15Lの最終容量に基づいて成分を1回分としたに移した。それぞれ50μg/mLおよび0.0246の最終濃度を与えるのに十分な硫酸カナマイシンおよび硫酸マグネシウム七水和物を500mLの蒸留水に溶解し、0.2ミクロン酢酸セルロース濾過ユニットにより濾過滅菌した。この溶液をタンクに加え、直ちに接種した。最初のOD600は約0.35であった。発酵作業パラメーターは以下の通りであった:作業容量:16リットル温度:28°C換気:1.0vvm圧力:690mbar攪拌:500rpm必要に応じてNH4OHを用いてpHを6.8に調節発泡は必要に応じてUCONを添加して調節した。OD6000.8~1.0接種後約2時間で濾過滅菌したIPTG500mLのdH2Oに溶解を無菌的に加えて最終濃度を35μMとした。発酵をさらに48時間続けた時点でタンクの内容物を10°Cに過冷した。細胞を遠心分離により回収し、0.1用量の50mMギ酸アンモニウム、pH7.0で1回すすいだ。細胞ペーストをプラスチック容器に入れ、必要とされるまで-70°Cで保存した。250Lタンクについては、接種物は以下のようにして調製した:1mLの凍結SC16496を解凍し、50μg/mLのカナマイシンを有する300mLのMT5培地に加えた。フラスコを28°C、250rpmで24時間増殖させた。OD600を決定し、80OD単位を与える適当な容量の細胞を取り、250mLの新鮮なMT5培地に加えた。細胞をBraun発酵装置中の10LのMT5/カナマイシン培地に無菌的に加え最初のOD600~0.008、上で開示した発酵作業パラメーター下で16時間増殖させた。次いで、培養液を適当な濃度のカナマイシンおよび硫酸マグネシウムを含む250LのMT5に移した。これら条件下でのSC16496の倍加時間が90分であることに基づき、250L中の10Lの接種物は0.30~0.35の開始OD600を与えるはずである。誘発、増殖、回収および保存は、15L発酵について記載したものと同様に行った。実施例3単離したPDH/FDH酵素濃縮物を用いた、3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸式1からのαS-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸式2を介したαS-α-[[1,1-ジメチルエトキシカルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸式3の短縮製造工程1:PDH/FDH酵素濃縮物の単離エシェリキアコリEscherichiacoliJM110の発酵ブロス30リットルを4000Lタンク発酵実施例2と類似した方法を用いて製造から得、マイクロフルイダイザーに通し1回、ブロスの温度を40°C以下に保ちながら細胞から活性を放出させた。ミクロ流動化ブロスのPDH/FDH活性は、PDHについては32IU/ML、FDHについては8IU/mlであった。ブロス全体を清澄化するため、十分に攪拌したブロスに4.5kgのセライトを加えた。次いで、0.201Lの30ポリエチレンイミン水溶液を加え、30分間混合した。次いで、混合物をフィルタープレスを用いて濾過し、18Lの濾液を得た。濾過ケークを12Lの水で洗浄して容量を30Lに戻した。この工程の収率は、活性が31IU/mlとなったPDHでは97の活性の回収がなされ、FDHの活性は8IU/mlであった。清澄化したブロスを100000MWCOフィルターカセットδ3857229818241793168216291529ppm13CNMRδ165929942816893254150444784452944020357503475930149ppmLabHPLCYMCODSAS3120Åλ200nm25ml分溶媒:A水中の02H3PO4B水中の90CH3CN勾配:10分間で20Aから100Bへ2.3-ヒドロキシ-α-オキソトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸の製造圧を均等にする滴下漏斗およびアルゴン導入口を備えた250mL容三頸フラスコに、上記工程1に記載の方法により製造したジクロロ3-ヒドロキシアダマンタン-1-イル酢酸メチルエステル式VIII15g,51.16mmolを入れ、次いでテトラヒドロフラン30mL,不安定化を加えた。数分攪拌した後、式VIIIのメチルエステルの大部分は溶解して濁った溶液を生成した。この溶液に蒸留水30mLを加えると、ゆるい懸濁液が生成した。滴下漏斗に1NNaOH69mL、69mmol、式VIIIの化合物の投入量に対して~1.35当量を入れた。NaOHを70分かけて滴下により加えてほぼ無色の溶液を得、これを周囲温度で攪拌した。~16時間でのHPLC分析は、式VIII化合物の加水分解が完了したことを示した。この反応混合物はpHが13.24の透明な無色溶液であり、これに~6NHCl2.8mLを加えてpH7.40に調節した。固体のNaHCO311.2g,0.133mol、2.60当量を加えて懸濁液を生成した。4時間15分加熱した後のHPLC分析は、反応が完了したことを示す。5時間加熱後、熱源を除き、反応混合物透明で無色な溶液を冷却した。室温に冷却した後、反応混合物を冷蔵庫4°Cで4日間保存した。冷所で4日間保存した後、反応混合物は依然として透明で無色な溶液であり、HPLC分析は保存による変化を殆ど示さない。室温に温めた後、混合物pH7.77に濃HCl11mL必要、CO2発生;pH~1.40にて無色の固体が沈殿し始めたを注意深く加えてpH0.20の酸性にした。その結果得られた懸濁液をEtOAc×4、全量~500mL;各EtOAc抽出後に水性画分についてHPLC分析を行ったで抽出した。1回目のEtOAc抽出後の水層pH0.38に濃HCl~1.6mL必要を加えてpH0.18に調節した。2回目のEtOAc抽出後の水層pH0.37に濃HCl~0.8mL必要を加えてpH0.17に調節した。水層は、残りのEtOAc抽出;HPLC,100面積。元素分析値:C12H16Cl2O35546502315、TR46905計算値:C6427H719実測値:C6442H704F.L-ピログルタミン酸式Eのエステル化によるL-ピログルタミン酸エチルエステル式Fの生成反応容器にエタノール49.0Lを入れ、-5°Cに冷却した。次いで、混合物の温度が0°Cを超えない方法で反応容器に塩化チオニル4.97kgを入れた。塩化チオニルの添加完了後、混合物を再び-5°Cに冷却し、添加の間に温度が0°Cと-5°Cとの間に維持されるようにL-ピログルタミン酸式Eを少しずつ加えた。酸添加後、反応混合物を20~25°Cに加熱し、5時間攪拌した。次いで、反応混合物を最初の容量の約15まで真空下Tmax45°Cで蒸発させた。次いで、残存する油状物をトルエン49Lに溶解した。次いで、トルエン溶液を約10°Cに冷却し、最大温度が20~25°Cとなるようにトリエチルアミン8.45kgをゆっくり加えた。得られた懸濁液を30分間攪拌し、次いで濾過した。濾過ケークをトルエン約5Lで洗浄した。濾液を50°C、真空下で全量約10Lまで減らした。シクロヘキサン8Lを50°Cでゆっくり加え、その後に約30°Cに冷却することにより結晶化を開始した。種晶生成後、混合物を20~25°Cに冷却し、シクロヘキサンの2回目の8L分を入れた。次いで、混合物を6~8°Cに冷却し、1時間攪拌し、得られた結晶を濾去した。この結晶をシクロヘキサン各4Lで2回洗浄した。収量は、無色針状物としてのL-ピログルタミン酸エチルエステル式Fが4.89kg82であった。G.L-ピログルタミン酸エチルエステル式GのBOC保護L-ピログルタミン酸エチルエステル式F5.00kgを室温でトルエン24.97Lに溶解した。次いで、この溶液に4-ジメチルアミノピリジン0.19kgを加えた。次いで、反応混合物の温度が25°Cを超えないような方法でトルエン24.97Lに溶解した無水BOC7.29kgの溶液を反応混合物に入れた。完全に添加した後、反応混合物を25°Cで3時間攪拌した。次いで、反応混合物に半飽和NaHCO3溶液49.94Lを入れ、10分間激しく攪拌し、その後に有機層と水層を分離した。分離した有機層を水24.97Lで2回洗浄した。次いで、有機層を真空下、最高50°Cで溶媒から蒸発させた。残存する無色からわずかに黄色がかった油状物は静置すると結晶化した。理論的収量は、5S-2-オキソピロリジン-1,5-ジカルボン酸,1-1,1-ジメチルエチル,5-エチルエステル式G8.18kg31.81molであった。H.SuperHydride還元および脱離5S-2-オキソピロリジン-1,5-ジカルボン酸,1-1,1-ジメチルエチル,5-エチルエステル式G4.80kgをトルエン30.97L;Kfmax0.01水に溶解し、-50°Cに冷却した。この溶液に反応温度が-45°Cを超えないような方法で、SuperHydrideLiEt3BH:THF中に1M;19.96Lを入れた。添加完了後、混合物を-45~-50°Cで30分間攪拌した。次いで、温度が-45°Cを超えないような方法で反応混合物にN-エチルジイソプロピルアミンDIPEA;14.47Lを加えた。ジメチルアミノピリジン0.030kgを固体として混合物に加えた。次いで、反応温度が-45°Cを超えないような方法で反応混合物に無水トリフルオロ酢酸TFAA4.70kgを加えた。添加完了後、反応混合物を20~25°Cに1時間内温め、この温度でさらに2時間維持した。次いで、反応混合物を0°Cに冷却し、反応温度が5°Cを超えないような方法でゆっくりと水48.00Lを入れた。次いで、水層と有機層を分離し、有機層を再び48Lの水0~5°Cで洗浄した。次いで、有機層を蒸発させ、40°Cで脱気した。黄味を帯びた油状物が、4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸,1-1-ジメチルエチル,5-エチルエステルBOC-DHPEE式G’の収量4.5kg18.66mol、100で得られた。I.BOC-DHPEE式G’の加水分解4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1,5-ジカルボン酸,1-1,1-ジメチルエチル,5-エチルエステルBOC-DHPEE式G’6.00kgおよびエタノール24.00Lから製造した溶液を0~5°Cに冷却し、この温度で水20.87L中の水酸化リチウム水和物2.09kgの溶液でゆっくりと処理して濁った溶液を生成した。次いで、この濁った溶液を20~25°Cに温め、この温度で2時間攪拌した。次いで、反応混合物を最高温度40°C、真空下で約10.5Lの容量まで蒸発させ、水24.00Lおよびt-ブチルメチルエーテルTBMEまたはMTBE、24Lを入れ、10分間混合した。得られた有機層と水層を分離し、水層に再び24LのTMBEを入れた。次いで、この混合物を5~10°Cに冷却し、激しく攪拌しながらH3PO485-水1:4を用いてpHを2.3~2.3に調節した。この工程の間、安定性のために温度を5~10°Cに維持した。得られた有機層と水層を分離した。有機層を保存し、水層を、予め5~10°Cに冷却した24LのTBMEで再び抽出した。得られた有機層を保存していた有機層と合わせ、ジイソプロピルエチルアミンDIPEA4.82kgを入れた。次いで、溶液を蒸発させ、最高温度30°C、真空下で脱気した。収量は7.84kg22.88mol,92[N-BOCデヒドロプロリンDIPEABOC-DHP]であった。J.BOC-DHPのアミド生成実施例Iに記載の鹸化によって合成したBOC-DHPは、水を含んでいるかもしれない。従って、反応を行う前にトルエンとの共沸蒸留を適用した。しかし、試薬が過剰なため、原料は水を除去する前のBOC-DHPの量に基づいて計算した。共沸蒸留では、BOC-DHPをトルエンを用いて約30溶液まで希釈した。トルエンを真空下、40°Cで除いた。次いで、処理したBOC-DHP6.00kgをTHF48.0Lに溶解した。この溶液にDIPEA2.26kgを入れ、反応混合物を-20~-25°Cに冷却した。次いで、塩化メシル3.01kgをゆっくり加えた。この添加の間に塩酸DIPEAが沈殿した。次いで、得られた懸濁液を-20°Cで2時間攪拌し、次いで表面下の気体導入口によりアンモニアで飽和させた。アンモニアを添加する間、反応物を0°Cに加熱した。飽和後、反応混合物を20°Cに加熱し、3時間攪拌した。攪拌後、反応混合物を濾過して塩酸塩を除去した。濾過ケークをTHF12Lで数回洗浄した。濾液を真空下、最高温度40°Cで濃縮し、次いで塩化メチレン33.33Lに溶解した。この溶液を水26.66Lで洗浄した。得られた有機層と水層を分離し、水層を塩化メチレン各20Lで2回抽出した。得られた有機層を合わせ、真空濃縮および脱気して過剰のヒューニッヒ塩基を除去した。収量は5S-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-1,1-ジメチルエチルエステルBOC-DHPA式Gについて、3.35kg15.77mol,90であった。K.5S-5-アミノカルボニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸1-1,1-ジメチルエチルエステル式Gのシクロプロパン化第一の反応器である反応器Aに、塩化メチレン18.0Lに溶解したBOC-DHPA式IV4kgを入れ、20°Cに維持した。第二の反応器である反応器Bには塩化メチレン18.00Lを入れ、-30°Cに冷却した。次いで、反応器BにジメトキシエタンDME3.36kg、次いでトルエン中のジエチル亜鉛15.36kgの30溶液を-30~-25°Cの温度に維持しながら入れた。次いで、反応温度を-30~-25°Cに維持しながら、ジヨードメタン19.99kgを反応器Bに入れた。ジヨードメタンの添加完了後、混合物を-30~-25°Cで45分間攪拌した。次いで、この混合物を冷却パイプ-20~-25°Cにより反応器Aに入れた。反応が完了するまで反応器Aの反応温度が22~24°Cに維持されるように、約5の部分にて添加をゆっくりと行った。反応完了後、反応器Aの混合物を5~10°Cに冷却した。次いで、この反応混合物に、反応温度が15°Cを超えない方法で飽和重炭酸塩溶液21.6Lをゆっくりと入れた。この添加後、反応混合物を少なくとも1時間攪拌すると、その間に沈殿が生成した。懸濁液を濾過した。得られた濾過ケークを容器に戻し、塩化メチレン14.4Lで30分間再度スラリー化し、再度濾過した。この第二の濾過後、濾過ケークをさらに塩化メチレン7.2Lで洗浄した。次いで、濾液を水層と有機層に分離し、有機層を半飽和食塩水21.6Lで洗浄した。次いで、溶媒を最高温度30°Cで真空除去し、ヘプタンと交換した。ヘプタン中の粗生成物のスラリーが得られた。溶媒交換後のこの懸濁液の最終容量は14.4Lであった。粗生成物を濾過により単離した。濾過ケークをヘプタン2.9Lで洗浄し、次いで真空乾燥して一定の重量とした。粗生成物の収量は2.76kg12.2mol,72[1S-1α,3β,5α]-3-アミノカルボニル-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル式Hであった。精製するため、この粗物質を8倍量の酢酸ブチル/ヘプタンの1:1混合物中に20~22°Cで4時間スラリー化した。この物質を濾過し、濾過ケークを約1倍量のヘプタンで洗浄した。収量は2.11kg9.33mol,55[1S-1α,3β,5α]-3-アミノカルボニル-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル式Hであった。L.[1S-1α,3β,5α]-3-アミノカルボニル-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル式Hの脱保護による1S,3S,5S-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド式Jの生成メカニカルスターラーおよび熱電対を備えた100mLの二頸フラスコに[1S-1α,3β,5α]-3-アミノカルボニル-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル式H5.0g,22.1mmolおよびTHF20mLを入れた。次いで、HClEtOAc中2.5M,25mL,62.5mmolを懸濁液に加えた。得られた溶液を室温で18時間攪拌すると、その間に沈殿が観察された。反応の完了をHPLCによりモニターした。メチルt-ブチルエーテルMTBE30mLを懸濁液に加え、攪拌をさらに30分間続けた。次いで、懸濁液をN2保護下に濾過して白色固体を得、これをMTBE20mLで洗浄した。該固体をオーブン中、減圧下で48時間乾燥させて、1S,3S,5S-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミドの塩酸塩式J;3.6g,100を得た。M.αS-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸式2のBOC保護によるαS-α[[1,1-ジメチルエトキシカルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸、式3の酸の生成遊離酸式3を製造するための好ましい方法を実施例3に記載する。別法として、以下の方法を用いて遊離酸を製造することができる:αS-α-アミノ-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸式2469g,2.08molを、温度プローブおよびpHプローブを備えた相分離器中、氷冷1NNaOH5L,5mol,2.4当量に溶解した。THF2.5Lを溶液に加えた。次いで、固体のBoc2Oを加え、反応混合物を周囲温度で約1時間攪拌した。次いで、EtOAc4Lを攪拌しながら加え、得られた有機層と水層を分離した。水層のpHを濃HClで7に調節した。次いで、EtOAc4Lを加え、さらにHClを加えてpHを約1に下げた。添加した濃HClの全量は510mLであった。有機層と水層を再び分離し、水層をEtOAc3×3Lで抽出した。次いで、有機層を合わせ、水3Lおよび食塩水3Lで洗浄した。次いで、洗浄した有機層をNa2SO4で乾燥し、エバポレーターにおいて室温で濃縮して乾燥させた。収量はαS-α[[1,1-ジメチルエトキシカルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸式3について542gであった。N.3-シアノ-αS-α-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]-1-デシル-β-オキソ-1S,3S,5S-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル式Kを生成するカップリング反応温度計、メカニカルスターラーおよび気体導入口を備えた2L容の三頸フラスコに、αS-α[[1,1-ジメチルエトキシカルボニル]アミノ]-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]デカン-1-酢酸式350g,153.8mmolを入れた。THF200mLを加え、攪拌して透明な溶液を得た。この溶液をアセトン-ドライアイス-水浴で-6°Cに冷却した。次いで、塩化メタンスルホニルMes-Cl13.1mL,169mmol、1.1当量を一度に加え、次いでジイソプロピルエチルアミン94mL,539mmol,1.1当量を加えた。このジイソプロピルエチルアミンは約4分かけてゆっくり加えて内部温度を8°C以下に保った。全ての酸が混合無水物に変換されるまで、反応混合物を0°Cで攪拌した。次いで、1S,3S,5S-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボキサミド塩酸塩32.5g、200mmol,1.1当量およびヒドロキシベンゾトリアゾールHOBT1.04g,7.6mmol,0.05当量を一度に加え、フラスコを冷浴から取り出した。反応混合物を室温で2時間攪拌し、次いで室温で終夜放置した。O.3-シアノ-αS-α-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]-1-デシル-β-オキソ-1S,3S,5S-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル式Lを生成する脱水および加水分解実施例Nの反応混合物にピリジン6当量,922mmol,74.6mLを加え、反応混合物を冷浴で-8°Cに冷却した。次いで、温度を10°C以下に維持しながら、無水トリフルオロ酢酸TFAA4当量,616mmol,87mLを6分かけてゆっくり加えた。反応液を24°Cで0.5時間攪拌し、HPLC30mL,0.5mLAcN,0.5mLH2Oで実施例Nの化合物Kの消失についてチェックした。次いで、反応液を冷浴で約-3°Cに冷却した。反応温度を10°C以下に維持しながら、NaOH5N,6当量,0.925mol,185mLを反応液に10分かけて加えた水性pH=9.9。K2CO3水溶液319g,15当量,510mLのH2Oに溶解を5分かけて加えた温度=8°C、水性pH11.1。反応を7時間40分かけて行った。HPLC30μL,0.5mLAcN,0.5mLH2Oによって測定されるように全ての中間体が最後から2番目まで加水分解されたときに反応は完了した。次いでEtOAc500mLを反応混合物に加え、得られた水層と有機層とを分離した。有機層を500mLの緩衝溶液2MH3PO4,1MNaH2PO4で洗浄した。温度は15°Cから23°Cに上昇した;添加時間:5分、水性V=560mL、pH=4.5、HPLCにより32mgの生成物;有機性V=1080mL。有機層を第二の500mL緩衝溶液で洗浄した;水性V=780mL、pH=2.5、HPLCにより415mgの生成物;有機性V=800mL、1.02v/vピリジン。有機層を300mLの食塩水で洗浄した;水性V=350mL、pH=1.8,HPLCにより20mgの生成物。有機層を130mLの飽和NaHCO3溶液で洗浄した;水性V=176mL、pH=6.0、780mgの生成物。有機層を300mLの半飽和食塩水で洗浄した;水性V=330mL、pH=5.2、25mgの生成物;有機性V=650mL、ピリジン0.045v/v。5gのDarcoを有機層に加え、5分間攪拌し、50gのシリカで濾過し、4×25mLのEtOAcで洗浄、有機性V=750mL、ピリジン0.04v/v。次いで、有機層を約133mLまで蒸留した。溶液が曇るまで有機層を1時間攪拌した。133mLのヘプタンを15分かけて加え、スラリーを終夜攪拌した。133mLのヘプタンを一晩かけて加えた。混合物を機械的攪拌により20分間激しく攪拌した。固形分を濾去し、濾過ケークを50mLの5EtOAc/ヘプタンで洗浄した;母液からの溶媒除去後に3.4gの生成物が8.86gの粗生成物において見出された。乾燥生成物の結晶を真空下、50°Cで終夜加熱した。467gの生成物が得られた、~73、96.6AP。P.1S,3S,5S-2-[2S-2-アミノ-2-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]-1-デシル-1-オキソエチル]-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-カルボニトリル安息香酸塩1:1式Mを生成する脱保護3-シアノ-αS-α-3-ヒドロキシトリシクロ[3.3.1.137]-1-デシル-β-オキソ-1S,3S,5S-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-エタンカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル式L5.0g,12.04mmolを、温度計、メカニカルスターラー、および気体導入口を備えた三頸フラスコに入れた。EtOAc約45~50mLを加えて透明な溶液とした。濃HCl3.00mL,37w/w,36.14mmol,3当量を室温で加え、固体が生成するまで反応混合物を攪拌した。次いで、水30mLを加え、混合物を1~2分間攪拌した。この反応混合物を分液漏斗に移し、反応混合物の層を、明確に相が分割するまで分離させた。温度を25°C以下に維持しながら、水層を25NaOHで約6より低いpHに調節した。次いで、水層にイソプロピルアルコールIPA;2~3mLを加え、次いで安息香酸ナトリウム6.5mLの水に2.6gの安息香酸ナトリウムを溶解することにより調製した安息香酸ナトリウム溶液を0.65mLを加えることによって塩交換した。次いで、残りの安息香酸ナトリウム溶液を滴下漏斗で滴下して加えた。得られた反応混合物を室温で16~24時間攪拌した。次いで、反応混合物中の固形分をブフナー漏斗で濾過し、AgNO3を用いたClテストで固体が陰性を示すまで水で洗浄した。次いで、固体をヘプタン10mLで洗浄して水を除去し、漏斗上で風乾し、真空オーブンにおいて35°Cで、KF≦5まで乾燥させた。収率は79、4.1gであった。Q.化合物L:の脱保護による遊離塩基M’:の製造実施例Oの化合物L300g,0.723mol、効力90.6、塩化メチレン3L、メタノール288mL,7.23molおよび濃塩酸36288mL、7.23molを、メカニカルスターラー、温度プローブおよびN2ガス導入口を備えた三頸の12Lフラスコに入れた。反応温度を約20~約25°Cの範囲に維持しながら反応を行った。反応混合物を18時間攪拌し、2層に分離し、上部の水層を回収した。水層に塩化メチレン6Lおよび水720mLを加え、5NNaOH~600mLを滴下して加えてpHを9.0~10.5に調節した。式:の塩酸塩HPLCにより同定式L’を含む有機相を塩化メチレン6Lおよび水720mLで処理し、反応温度を20~25°Cに維持しながら5N水酸化ナトリウム溶液~600mLを滴下して加えて、pHを9~10.5に調節した。NaCl120gを加え、混合物を20分間攪拌して層を分離させた。有機層6.2Lを回収し~174gの化合物M’を含有、水層1.75Lは廃棄した6.5gの化合物M’を含有。有機層を1NH4Cl食塩水溶液450mLで洗浄した1NH4Cl食塩水溶液は1gのNH4Cl、25gのNaClおよび74gのH2Oを含んでいた。得られた相分離から6.0Lの有機層を回収し溶液中に~176gの化合物M’を含んでいた、1.4gの化合物M’~0.4を含む水層0.45Lは廃棄した。25°C/50mmHgでCH2Cl2を留去しながら酢酸エチル~4Lを有機層に加えた。最終容量が2.5Lに達したら蒸留を停止した。有機層をポリッシュ濾過して固体のNaClを除去し、~1Kg1Lの酢酸エチル中に化合物M’が~170gGC分析:DCM<0.1まで濃縮した。水17mLを滴下して加え、10分後に結晶化が始まった。17mLの水を加え、得られたスラリーを30分間攪拌し、濾過し、濾過ケークを酢酸エチルで洗浄し、室温で乾燥させて186gの化合物M’を収率81で得た。"