一般式、5’[N1]x[N7]r{N3[N4]pCG[N5]qN6}n[N8]s[N2]z3’[式中、各々のN1は独立してCまたはGであり;各々のN2は独立してCまたはGであり;N3およびN4が双方Cである組合せは除外するという条件でN3=T、CまたはGであり;各々のN4およびN5は独立してCまたはTであり;N6=A、T、GまたはCであり;N7=A、T、CまたはGであり;N8=A、T、CまたはGであり;x=3~10であり;z=0~10であり;n=2~100であり;p=1~6またはN4=Tであれば1~25であり;q=1~6またはN5=Tであれば1~25であり;r=0~8またはN7=Tであれば1~25であり;s=0~8またはN8=Tであれば1~25である、]を有する免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩。N6=A、TまたはCである請求項1のオリゴデオキシヌクレオチド。N3がTまたはG、およびN6がYである請求項1または2のオリゴデオキシヌクレオチド。N3、N4、N5およびN6=Tである請求項3のオリゴデオキシヌクレオチド。N3、N4およびN5=TならびにN6=Cである請求項1または2のオリゴデオキシヌクレオチド。N3がGでありおよびN6=Tである請求項1または2のオリゴデオキシヌクレオチド。N5=TおよびN6=Cである請求項1または2のオリゴデオキシヌクレオチド。N5=C、N6=Cおよびq=1である請求項1または2のオリゴデオキシヌクレオチド。N4=TおよびN5=Yである請求項1または2のオリゴデオキシヌクレオチド。N4=TおよびN5=Tである請求項9のオリゴデオキシヌクレオチド。xが4~7であり、およびr=0またはN7がAまたはTである請求項1~10のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。x=6である請求項11のオリゴデオキシヌクレオチド。zが0~6、およびs=0またはN8がAまたはTである請求項1~12のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。zが0~3である請求項13のオリゴデオキシヌクレオチド。N1がGである請求項1~14のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。N2がGである請求項1~14のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。nが3~18である請求項1~16のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。nが4~18である請求項1~16のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。nが5~18である請求項1~16のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。nが5~18でありおよびxが4~7でありおよびzが0~3でありおよびr=0またはN7がAまたはTであり、およびs=0またはN8がAまたはTである請求項1~11のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。N1およびN2がホスホロチオエート結合を有しならびに他のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を有する請求項1~20のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。N7=TおよびN8=Tである請求項1~21のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。{N3[N4]pCG[N5]qN6}nがホモポリマーである請求項1~22のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。当該オリゴデオキシヌクレオチドが担体またはハプテンに結合している請求項1~23のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチド。請求項1~23のいずれか一項のオリゴデオキシヌクレオチドを含むベクター。当該ワクチンが免疫賦活性量の請求項1~24のいずれか一項の免疫賦活性量のオリゴデオキシヌクレオチドおよび/または請求項25のベクター、免疫学性量の抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報、ならびに薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする、感染症の予防または防止用ワクチン。前記抗原成分がその野生型形態において家禽に対し病原性であるウイルスまたは微生物であるかまたはそれに由来することを特徴とする請求項26のワクチン。前記ウイルスまたは微生物が、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ガンボロ病、ニワトリ貧血ウイルス、トリレオウイルス、トリ呼吸器感染症病原菌、七面鳥鼻気管炎ウイルス、トリ伝染性コリザ病原菌鼻感冒、水痘ウイルス、ニワトリ脳脊髄炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス、Eimeria種、トリ感染症病原菌オルニソバクテリウムライノトラキア、出血性敗血症菌パスツレラムルトシダ、トリ病原菌マイコプラズマシノビエ、Salmonella種および大腸菌から成る群より選択されることを特徴とする請求項27のワクチン。薬剤としての使用のための請求項1~24のいずれか一項の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド。家禽の感染予防における使用のための請求項1~24のいずれか一項の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド。TLR21受容体およびNF‐κBレポーター遺伝子をコードし、細胞中で安定して保持されるプラスミドを含む細胞。前記レポーター遺伝子が分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項31の細胞。前記細胞がニワトリ細胞株HD11またはその中にニワトリTLR21受容体遺伝子がクローンされたHEK293細胞株の細胞であることを特徴とする請求項31または32の細胞。当該方法が、aオリゴデオキシヌクレオチドを請求項31~33のいずれか一項の細胞と接触させ、およびbレポーター遺伝の産物のレベルを検出する段階を含むことを特徴とする、請求項1~24のいずれか一項の免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチドの検出方法。レポーター遺伝子の産物が分泌型アルカリホスファターゼである請求項34の方法。細胞がニワトリ細胞株HD11、またはその中にニワトリTLR21受容体遺伝子がクローンされたHEK293細胞株の細胞であることを特徴とする請求項34または35の免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチドの検出方法。免疫調節剤としての特異的CpGを含むODVの設計はこれまで極めて行き当たりばったりだった。これは非哺乳動物のCpGを含むODVに関しては特にあてはまっている。これに対する理由には複数の要因があるが、まず第一に、ヒトTLRに対する免疫調節性CpGモチーフと、非哺乳動物種は言うまでもなく非ヒトにおけるTLRに対するそれとの間の相関性について知識が存在しない。第二に、極めて低濃度のCpGを含むODVの効果を選択的に試験するために、ノイズレベルに対し十分に低いバックグラウンドを具備する利用可能な細胞系が存在しない。さらに、利用可能な高処理のスクリーニング法が存在せず、存在したとしても、非哺乳動物種における免疫調節剤としてのCpGを含むODVのインビボとインビトロでの効果の間の明確な相関性が存在しない。従って、高い免疫調節効果を有しそれ故に低用量で効果的な新規のCpGを含むODVの必要性がある。しかも、CpG‐活性のインビトロとインビボ活性の間の相関性を示す、獣医学上の目的のための選択的で鋭敏なCpGを含むODV選択系の必要性がある。それが当該新規CpGを含むODVを提供する本発明の目的の一つである。この点で本発明の1実施態様は、一般式5’[N1]x[N7]r{N3[N4]pCG[N5]qN6}n[N8]s[N2]z3’を有し、ここで各々のN1は独立してCまたはGであり;各々のN2は独立してCまたはGであり;N3およびN4が双方Cである組合せは除外するという条件でN3はT、CまたはGであり;各々のN4およびN5は独立してCまたはTであり;N6=A、T、GまたはCであり;N7=A、T、CまたはGであり;N8=A、T、CまたはGであり;x=3~10であり;z=0~10であり;n=2~100であり;p=1~6、またはN4=Tであれば1~25であり;q=1~6、またはN5=Tであれば1~25であり;r=0~8、またはN7=Tおよびs=0~8であれば1~25であり、またはN8=Tであれば1~25である、免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドまたは前記オリゴデオキシヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩に関する。免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドとは、NF‐κBまたはインターフェロン制御因子3IRF3等の転写因子の活性化をもたらしてシグナル伝達カスケードの開始を刺激する、非メチル化シチジン‐リン酸グアノシンジヌクレオチド配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドを言う。炎症性サイトカインおよび他の細胞活性化事象の発現において次々に生じるのはこの活性化である。NF‐κB結合部位およびNF‐κBによって影響を受ける遺伝子発現は、SchindlerおよびBaichwal1994年によって記載されている。用語オリゴデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドの短い核酸ポリマー、換言すればリン酸基および交換可能な有機塩基に結合する多数のデオキシリボースを含む分子を意味する。当該有機塩基とは置換ピリミジンまたは置換プリンである。例は、それぞれシトシンおよびチミン、アデニンおよびグアニンである。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは修飾を含んでもよい。当該修飾の例は、例えばヌクレオシドの3’および/または5’末端に位置するリン酸ジエステルのヌクレオチド間架橋中の修飾である。当該修飾は、例えばホスホロチオエートまたはジチオリン酸によるリン酸ジエステルの置換に関連する。他の修飾は、例えばデホスホ架橋によるリン酸ジエステル架橋の置換である。デホスホ架橋の例は、メチルヒドロキシルアミン、ギ酸アセタールおよびジメチレンスルホン基である。さらなる他の修飾は、非天然ヌクレオシド塩基、例えば5‐フルオロシトシン、7‐デアザ‐7‐置換グアニン、7‐デアザ‐8‐置換グアニン、2‐チオウラシル、ジヒドロウラシル、5‐ブロモ‐シトシン、6‐置換シトシン、N4‐置換シトシン等による天然ヌクレオシド塩基の置換に関係する修飾である。また他の例としては、糖単位の置換、例えばL‐2’‐デオキシリボースまたは2’‐L‐アラビノース等の修飾糖単位によるβ‐リボース糖単位またはβ‐D‐2’‐リボース糖単位の置換に関係する修飾である。オリゴデオキシヌクレオチドのより以上の識見を与えてくれる教科書は、例えばPCRPrimer:ALaboratoryManualPCRプライマー:実験マニュアル第2版、2003年、CarlW.Dieffenbachアメリカ国立アレルギー感染症研究所;GabrielaS.Dreksler軍人保健科学大学編、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ISBN978‐087969654‐2である。CpGモチーフを保有する構造{N3[N4]pCG[N5]qN6}nは、本発明のODNの活性な免疫賦活性部を表す。それ故に本発明は、このいわゆる骨格backboneを含む免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの骨格、構造{N3[N4]pCG[N5]qN6}nは少なくとも2回、好ましくは3回存在しなければならないことが見出された。それ故に、nは少なくとも2であるべきである。またnが増加すると、オリゴデオキシヌクレオチドの活性が増大することも見出された。この効果はnが増加するにつれ横ばいとなる。基本的に、骨格構造の数字nは、それ故に少なくとも2であるべきである。好ましくはnの範囲は3≦n≦100であるが、といって合成配列が長くなればなるほど合成するのがますます困難となるという事実がある。実際に好ましいのは、2≦n≦18の範囲である。より好ましいのは3≦n≦18の範囲であり、より一層好ましいのは4≦n≦18の範囲であり、さらなるより一層好ましいnの範囲は5≦n≦18の範囲である。本発明のCpGを含むODVの検出確認は、NF‐κB活性化の検出用に現在使用されている系よりもより選択的な検出系を使用することによって可能となった。Brownlieら2009年はNF‐κBルシフェラーゼを含むレポーター系を記載している。他の系は、例えばIL‐8転写産物の測定またはサイトカイン分泌またはNO分泌の検出に基づいている。これに反して本発明においては、分泌型アルカリホスファターゼに基づく検出系SEAPを使用した。SEAPは哺乳動物系におけるレポーター酵素であるYangら、1997年。この系は、驚くほど鋭敏でありしかも加えて驚くべきことに、試験したCpGを含むODVのインビトロ活性およびインビボ活性の間の緊密な相関性を提供することが分かった。SEAP系は基質としてパラニトロフェニルリン酸pNPPと共に使用した。現行系に関するもう一つの改善は、SEAP遺伝子を保有するプラスミドの細胞への導入と安定した保持だった。今まで、すべての検出系はレポーター遺伝子による細胞の一過性形質移入を使用した。今度初めて用量反応曲線を作成することができたのは、レポーター遺伝子の細胞への導入と安定した保持のためである。当該曲線は、種々のCpGを含むODV活性間で信頼できる比較をするために必須である。それ故に、実施例の欄において詳細に記載する本発明の方法および細胞株が、種々のCpGを含むODV間の信頼できる並行比較を行うことを初めて可能とする。使用した系のそれ以上の詳細は、実施例の欄に提示する。今や本発明の方法および細胞株により種々のCpGを含むODV間の信頼できる当該並行比較が可能であるので、N6=A、TまたはCである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、N6=Gよりも高い活性を有することが証明され得た。それ故に、この実施態様の好ましい形態においてN6=A、TまたはCである。同じ理由で、他の好ましい形態においてN3はTまたはG;およびN6=YY=CまたはTである。この実施態様のより好ましい形態において、N3、N4、N5およびN6=Tである。この実施態様の他の好ましい形態は、N3、N4およびN5=TおよびN6=Cである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この実施態様のさらなる他の好ましい形態は、N3がGでありN6=Tである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この実施態様のさらなる他の好ましい形態は、N5=TおよびN6=Cである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。またこの実施態様の好ましい形態は、N5=C、N6=Cおよびq=1である本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この実施態様の他の好ましい形態は、N4=YおよびN5=Yである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この最後の実施態様のより好ましい形態は、N4=TおよびN5=Yである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この最後の実施態様のより一層好ましい形態は、N4=TおよびN5=Tである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この実施態様の他の形態は、xが4~7およびr=0またはN7がAまたはTである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この実施態様の好ましい形態は、xが6およびr=0またはN7がAまたはTである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この実施態様の他の形態は、zが0~6およびs=0またはN8がAまたはTである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この実施態様の好ましい形態は、zが0~3およびs=0またはN8がAまたはTである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この実施態様のさらなる他の形態は、N1がGである。この実施態様の好ましい形態は、N2がGである。3’‐および5’‐末端ヌクレオチドの双方の数に関し広い範囲が存在するとはいえ、双方の値に関して最適範囲が存在することが見出された。s=0またはN8がAまたはTであるならば、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド骨格の3’‐フランキング領域を形成する[N2]ヌクレオチドの数は、好ましくは0と5ヌクレオチドの間、より好ましくは0と3ヌクレオチドの間の範囲である。またr=0またはN7がAまたはTであるならば、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド骨格の5’‐フランキング領域を形成する[N1]ヌクレオチドの数は、4と7ヌクレオチドの間の範囲において最適であることも見出された。この実施態様の最も好ましい形態は、r=0またはN7がAまたはTであり、ならびにs=0またはN8がAまたはTであり、ならびにn=5~18およびx=4~7およびz=0~3である。上述の通り、ヌクレオシドの3’および/または5’末端に位置するリン酸ジエステルのヌクレオチド間架橋における数種の修飾が実行可能である。しかし基本的に、2のヌクレオチド間の一般的な通常の結合型は、合成の方法に依存してリン酸ジエステル結合PDEおよびホスホロチオエートPTO結合である。CpGを含むODVの安定性および免疫賦活効果を改善するために、合成オリゴデオキシヌクレオチドの構成要素にはホスホロチオエートが提供され、その結果PTO結合を形成する。しかし驚いたことには、[N1]ヌクレオチドおよび[N2]ヌクレオチドだけがPTO結合で結合し、ならびに他のヌクレオチドがPDE結合で結合しているときに、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの効力が強く増強されることが見出された。その場合、N1ないしN7結合GTはPTOであり、一方でN8ないしN2TG結合はPDEである。これは[N1]および[N2]ヌクレオチドがGであるときの特別な場合である。それ故にこの実施態様の他の好ましい形態は、N1および/またはN2がホスホロチオエート結合を有して、他のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を有する本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関してN7=TおよびN8=Tであるとき、より一層効果的なオリゴデオキシヌクレオチドが得られることが見出された。従って、この実施態様のさらなる他の好ましい形態は、N7=TおよびN8=Tである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この場合、rおよびsは独立して1~25の間である。本発明のオリゴデオキシヌクレオチド骨格、構造{N3[N4]pCG[N5]qN6}nはあらゆるnに対して同一である必要はない。これは本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが、{TTCGTT}{CTCGTG}{GTCGTA}のようであり得ることを意味する。3の異なる連続する異なる骨格のこのような系列は、ヘテロポリマーと表される。3の同一の複製物の一続きはホモポリマーと呼ばれる。好ましくは本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ホモポリマー{N3[N4]pCG[N5]qN6}を含む。本発明のCpGを含むオリゴデオキシヌクレオチドは、インビトロおよびインビボでの双方の試験系においてほとんどの場合ナノモル量で活性である。しかし本発明のCpGを含むオリゴデオキシヌクレオチドの幾つかは、ピコモルナノモル以下量でさえ活性であり、そのEC5050有効濃度は1nM未満である。オリゴデオキシヌクレオチドの最大半量効果濃度EC50とは、レポーター細胞HEK293‐pNifty2‐ニワトリTLR21またはHD11‐pNifTy2Hyg中の、最大半量吸収を与えるレポーター酵素SEAP405nmに吸収をもつ着色産物を産生するの量を誘導するのに必要であるオリゴデオキシヌクレオチドの量である。オリゴデオキシヌクレオチドのEC50がこれらの細胞中で1nM未満であれば、ピコモルナノモル以下量で活性であると考えられる。以下に列挙する4の一般式の一と一致するほとんどのCpGを含むODNは、インビトロでナノモル量での効果の引き金を引くことが明らかとなった。15’[G]x{TTCGTN6}n[G]z3’ここでN6=AまたはT、n=5~100、x=3~10、z=0~1025’[G]x{N3TCGTC}n[G]z3’ここでN3=GまたはT、n=5~100、x=3~10、z=0~1035’[G]x{TTCGCC}n[G]z3’ここでn=5~100、x=3~10、z=0~1045’[G]x{T[T]pCG[T]qT}n[G]z3’ここでp=1~10、q=1~10、n=5~100、x=3~10、z=0~10これら4の全ての式にとって、費用対効果の理由からnは好ましくは5~18の範囲である。Xは4~9、5~8、6または7の範囲がその優先順位で好ましく、zは8、7、6、5、4、3、2、1または0がその優先順位で好ましい。該当する場合は、pは好ましくは1~5ならびにqは好ましくは1~5である。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドを、反応性の化学基によって担体またはハプテンに結合することも可能である。当該結合は結合分子の免疫賦活作用を亢進する。当該成分の例にすぎないが、ジゴキシゲニン、アミノヘキシル、Texasredおよびビオチンがある。好ましい担体またはハプテンは、3’‐および5’‐標識Texasredおよび5’‐標識ジゴキシゲニンである。ハプテン/担体へのオリゴデオキシヌクレオチドの結合は当該分野において周知である。本発明の他の実施態様は、本発明の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターに関する。当該ベクターは、例えばプラスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは分子生物学において使用される任意の他のベクター等の核酸分子であり得る。単に例に過ぎないが、免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターはDNA分子、例えば、本発明の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドがクローンされた、細菌中で増殖でき得るプラスミド等であり得る。当該プラスミドは好ましくは、多数のプラスミドが宿主中に存在することを招来する活性な複製起点を有する。その後プラスミドの単離へと続く大規模な当該細菌の増殖は、本発明の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドの合成による生産の代替法を提供する。本発明の目的の一つは、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報、ならびに薬学的に許容可能な担体と共に感染症を予防または防止するワクチン中の奏功する免疫賦活性成分として使用し得る、新規CpGを含むODVを提供することである。一般的に用語抗原成分とは、ヒトまたは動物に投与されたときに免疫応答を誘導、刺激または亢進し得る少なくとも1のエピトープを含む物質の組成物を言う。抗原成分は任意の種類の抗原成分であってもよいが、好ましくは、その野生型の形態においてヒトまたは動物に対し病原性である微生物またはウイルス由来である。抗原成分は病原体の全体であり得るが、好ましくは不活化または弱毒化形態、病原体の抽出物または病原体の免疫原性タンパク質であり得る。抗原成分が病原体の免疫原性タンパク質であるならば、当該免疫原性タンパク質は好ましくはインビトロでの培養細胞において発現し同細胞から回収する。それ故に他の実施態様は、感染症を予防または防止するためのワクチンに関し、前記ワクチンは免疫賦活性量の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドおよび/または本発明のベクター、免疫原性量の抗原成分または免疫成分をコードする遺伝情報、ならびに薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする。もちろん、免疫賦活性量のオリゴデオキシヌクレオチドおよび免疫原性量の抗原成分は強く相互に関係している。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの存在が、感染症を予防または防止するために必要である抗原成分量を低下させ得ることは、本発明の利点の一つである。感染症を予防または防止するために必要である抗原成分量は、抗原成分の免疫原性量とも呼ばれる。オリゴデオキシヌクレオチドの免疫賦活性量とは、抗原成分の免疫原性量、即ち感染症を予防または防止するために必要である抗原成分量を減少させることのできる量である。それゆえ基本的に、オリゴデオキシヌクレオチドの免疫賦活性量および免疫原性量という表現は、互い同士の関係において検討されなくてはならない。言うまでもないが、ワクチンが抗原成分をコードする遺伝情報を含むならば、この遺伝情報によって発現される抗原成分量は、感染症を予防または防止するために十分であるべきであり、即ち免疫原性量でなければならない。本発明の非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドが免疫賦活性であるという事実は、それらがワクチン中の抗原成分の免疫学的効果を亢進することを意味する。その理由から本発明のワクチンは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが存在しないとすればそうであろう場合よりも、多くの場合より少ない抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報を含むであろう。いくつかの場合には抗原成分それ自体が、免疫賦活性オリゴヌクレオチドの添加なしでは、非常に低い免疫原性の性質しか有さないために、望む免疫原性に達しないにもかかわらず大量に与えられなければならない。しかしながら今やこのような場合に、抗原成分は望むレベルの免疫原性を得るために本発明のオリゴデオキシヌクレオチドと共に、通常の高濃度で与えることができる。従って本発明のオリゴヌクレオチドと共に投与される抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報の量は、大ざっぱに言うとオリゴヌクレオチド非存在下で与えられる量と同等かまたは低いであろう。特定のワクチンの製造に関与する当業者は、その特定のワクチンに対するその量を知っているであろう。また実施例には、例えば異なる3の不活化ウイルスワクチン:ニューカッスル病ウイルスワクチン、伝染性気管支炎ウイルスワクチンおよび七面鳥鼻気管炎ワクチンにおいて使用される抗原成分量に関する豊富なガイダンスを提供する。抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報と共に投与される必要のある本発明のオリゴデオキシヌクレオチド量は、選択されたオリゴデオキシヌクレオチドおよび抗原成分の双方に依存する。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの非常に適した量は、通常1および100ナノモルの間で変動するであろう。例えば、平均長30デオキシヌクレオチドを有する1~10μgの本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関し非常に良いインビボでの結果が得られ、それはインビトロ試験においてナノモル範囲で活性であることが明らかにされた。オリゴデオキシヌクレオチドがピコモル範囲で活性であるオリゴデオキシヌクレオチド群から選択されるならば、当業者はナノモル量で試験する前に1ナノモル未満の、おそらく1ナノモルに到底達しない量、即ちピコモル量を試験する価値があるであろうことを了解するであろう。本発明のワクチンは薬学的に許容可能な担体を含む。この担体の性質は投与経路に依存する。投与経路が経口または鼻腔内経路であるならば、担体は滅菌水、生理食塩水または緩衝液のように単純であり得るであろう。注射が好ましい経路であるならば、担体は好ましくは等張であり、しかもそれを注射に適化するpH制限を有するべきであろう。しかしながら当該担体は当該分野において広く知られている。本発明のワクチンは、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報、および本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに加えて、アジュバントを含んでもよい。アジュバントは一般的に、宿主の免疫応答を非特異的に追加免疫する物質である。多くのアジュバント、例えば完全および不完全フロイントアジュバント、ビタミンE、硫酸デキストラン等の非イオン性ブロックポリマーおよびポリアミン、カーボポールおよびピラン、水酸化アルミニウム等が適していることが当該分野で知られている。また、しばしばリン酸アルミニウム、サポニン、トコフェロール等の植物油および鉱物油が使用される。非常に効果的なアジュバントは、水中油型エマルジョンおよび特に油中水型エマルジョンであり、また水中油型アジュバントおよび油中水型アジュバントとも言う。好ましくは抗原成分は、その野生型の形態において家禽に対し病原性であるウイルスまたは微生物であるかまたはそれらに由来する。より好ましくは、前記のウイルスまたは微生物は、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ガンボロ病、ニワトリ貧血ウイルス、トリレオウイルス、トリ呼吸器感染症病原菌、七面鳥鼻気管炎ウイルス、トリ伝染性コリザ病原菌鼻感冒、水痘ウイルス、ニワトリ脳脊髄炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス、Eimeria種、トリ感染症病原菌オルニソバクテリウムライノトラキア、出血性敗血症菌パスツレラムルトシダ、トリ病原菌マイコプラズマシノビエ、Salmonella種および大腸菌から成る群より選択される。本発明のさらなる他の実施態様は、薬剤としての使用のための本発明の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドに関する。本発明のさらなる他の実施態様は、家禽における感染症の予防または防止における使用のための本発明の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドに関する。今まですべての検出系は、レポーター遺伝子による細胞の一過性の形質移入を使用していた。当該一過性の系は、CpGを含むODVの効果の信頼できる並行比較を可能としない。上述の通り、現行系にまさった主な改善は、レポーター遺伝子を保有するプラスミドの細胞中への導入および安定した保持だった。安定したとは、プラスミドが数回の細胞分裂周期後にも細胞中に依然として存在することを意味する。しばしばプラスミドの安定した保持は、プラスミド上にそれに対する耐性遺伝子が存在する抗生物質等の1または複数の選択剤の圧力下で細胞を増殖することによって得られる。プラスミドの消失は次にプラスミドを消失した細胞を死滅させるであろう。残った生細胞は、プラスミドをまだ内部に保持するであろう。従って本発明のさらなる他の実施態様は、TLR21‐受容体およびNF‐κBレポーター遺伝子をコードするプラスミドを含む細胞に関し、そのプラスミドは細胞中で安定して保持される。当該細胞はCpG分子のスクリーニング、より具体的には本発明のCpG分子のスクリーニングにおける使用に非常に適している。実施例は、細胞中に安定して保持され得るレポーター遺伝子をコードするプラスミドを含む当該細胞をいかにして得るかについて、豊富なガイダンスを提供する。また上述の通り、分泌型アルカリホスファターゼSEAPに基づく検出系は、使用する検出系に非常に適していることも示された。従って好ましくは、レポーター遺伝子は分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子である。基本的に、NF‐κBレポーター遺伝子、上述の通り好ましくはSEAP遺伝子を保有するプラスミドの導入および好ましくは安定した保持を可能とし、TLR21を保有する任意の細胞または細胞株は、TLR21に特異的なCpGを含むODVの試験に適している。TLR21に特異的なCpGを含むODVを試験するための当該適した細胞株の好ましい例は、ニワトリ細胞株HD11である。それ故に好ましくは、検出系における使用のための細胞株は、レポーター遺伝子をコードする安定したプラスミド含むHD11細胞株である。HD11細胞株等のニワトリの細胞株は、ニワトリのTLRの全パネルを示す。このことが一定の条件下で一定のバックグラウンドアクティビティを引き起こすのかもしれない。それ故に、哺乳動物の細胞株等の非家禽細胞株がより好ましい細胞株である。当該哺乳動物の細胞株の例は、TLR21がクローン化されたHEK293細胞である。当該細胞株はTLR21の活性化シグナルに対しより特異的で選択的である。それ故により好ましくは、検出系における使用のための細胞株は、安定して保持されるレポーター遺伝子を含み、その中にTLR21が既にクローンされている哺乳動物の細胞株HEK293である。本発明のさらなる他の実施態様は、本発明の免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチドの検出法に関し、ここで当該方法は、a本発明のオリゴデオキシヌクレオチドを細胞と接触させ、bレポーター遺伝子の産物レベルを検出する段階を含む。この方法の好ましい形態において、レポーター遺伝子の産物はSEAPである。この実施態様のより好ましい形態は、本発明の免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチドの検出法に関し、ここで細胞はニワトリの細胞株HD11、またはその中にニワトリTLR21が既にクローンされたHEK293細胞株の細胞である。ニワトリTLR21の遺伝子クローニングおよび異種発現最近のニワトリTLR研究の進歩は、TLR21は鳥類における哺乳動物のTLR9の機能的ホモログであることを示唆するKeestra2008年、Brownlieら、2009年。TLR21遺伝子クローニングの概要Genbankデータベースの配列NM_001030558に基づいて、ニワトリTLR21遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応PCR増幅用にプライマー対を合成した:プライマーは、開始コドンおよび終止コドンボールド体にフランキング制限クローニングサイト下線およびコザック配列イタリック体を提供するように設計した。これらのプライマーおよび鋳型としてニワトリ脾臓全RNAを使用して逆転写PCRRT‐PCRを実施した。所期サイズ~3000bpのPCR産物をpCR2.1‐Topoにクローンし、それから5の独立したプラスミドクローンP1、P2、P12、P13、P14を配列決定した。使用したニワトリTLR21のDNA塩基配列pcDNA3.1‐Neo‐chiTLR21によるHEK293‐pNifTy2‐Zeoクローン細胞株の形質移入ヒト胎児腎HEK細胞293は1970年代にウイルスによる形質転換によって樹立されGrahamら、1977年、今ではATCC等の細胞株寄託機関経由で研究者たちに入手可能である。pNifty2は、多くの免疫賦活性作用、その中のToll様受容体活性化の特徴である、転写因子NF‐κBの活性化の検出を可能とするプラスミドである。その転写/翻訳においてNFκB活性化に依存するpNifTy2中のレポーター遺伝子は分泌型アルカリホスファターゼであるSEAP。詳細はこのプラスミドの販売会社Invivogenのデータシートに記載されている。pNifty2による形質転換/形質移入の現象は、増殖培地へのzeocin添加によって細菌細胞および哺乳動物細胞の双方において選択される。HEK293細胞を標準法リポフェクションによってpNifTy2を用いて形質移入して、安定した細胞株を選択し、ヒト腫瘍壊死因子αSigmaを用いた刺激によってNF‐κB/SEAP軸の機能性を確立した。刺激された細胞の培養上清中の分泌SEAPは、アルカリ性緩衝液NaHCO350mM、pH9.6、MgCl22mM中で発色基質p‐ニトロフェニルリン酸pNPP、5mMを使用してマイクロタイタープレート比色分析法によって測定した。発色λ=405nmをマイクロタイタープレートリーダーによって測定した。またこの読み出し値は、高信号雑音比を有するクローン細胞株を限界希釈法によって選択するためにも使用した。この選択クローンの一クローン11と呼ぶをその後ニワトリTLR21に関する研究にさらに使用した。pcDNA3.1‐neoは、Invitrogenから購入した標準的な哺乳動物発現ベクターである。このベクターへのニワトリTLR21遺伝子のサブクローニングは、PCRによって導入されたフランキングHindIII開始コドンおよびNotI終止コドンサイトにより行った図1を参照。このプラスミドは次にクローン細胞株NEK293‐pNifty2‐zeoに形質移入しリポフェクション、それから増殖培地へのzeocinおよびG418の双方の添加によって組換え細胞を選択した。生じたポリクローナル組換え細胞株の機能性は、ODN‐X4およびODN‐HEK1‐PTOを用いた培地の刺激およびSEAPの検出によって評価した。次に優れたクローン細胞株はその後に刺激およびSEAP検出を伴う限界希釈法によって同定した。SEAPは哺乳動物系におけるレポーター酵素であるYangら、1997年。SEAPは、ヒト胚性アルカリホスファターゼの分泌型である。その主な利点は、高い安定性および極めて高い比活性であり、それらは検出の感度および堅牢性を保証する。数個の基質がSEAPの検出用に記載されてきたが、その反応産物p‐ニトロフェノラートが高感度で検出されるのでε405=18500M-1cm-1、経済的でかつ堅牢なpNPPが選択された。発明者らの試験設定において、それらが定量のより広い動作範囲ダイナミックレンジを提供するので、発明者らは動力学的アッセイを実施する。HEK293‐pNifTy2‐Zeo細胞は、pcDNA3.1‐Neo‐chiTLR21PvuIで直線化したを用いて形質移入し、それから培地に350μg/mlのzeocinおよび600μg/mlのG418を補給することによってポリクローナル細胞株を選択した。機能試験は、ODN‐X4PDEおよびODN‐HEK1PTOを用いて細胞を刺激することによって実施した。分泌型アルカリホスファターゼSEAPは選択細胞によって産生されたが、親細胞株HEK293‐pNifTy2‐Zeoによっては産生されなかった。シングルセルクローニングを実施し、それから個々のクローンは、ODN‐X4PDEGGGGGGTTCGTTTTCGTTTTCGTTGGGGGおよびODN‐HEK1PTOTCGTCGTTTTGTCGTTTGTCGTTに対するそれらの応答性に関し分析した。zeo/G418の双方に耐性であるクローン細胞株46株の中3株だけが明確にODN刺激に対し応答性であったが、一方で細胞株の3ないし4株は弱いシグナルを示した。それ故に選択されたクローンの85は機能的でなかった。それ以降の全ての研究のためには、ODN‐X4PDEおよびODN‐HEK1PTOの刺激に対する応答の最高のSEAPの読み出しシグナルを産生した、クローン細胞株38を使用した。図2~5は、種々のzeo/G418‐二重耐性クローン細胞株のSEAP活性の概要を示す。N3~N6の性質の活性に関する影響の分析以下のPDE型CpG‐ODVを試験した:さらに対照として、そのPTO型カウンターパートがヒト腫瘍治療における薬剤/ワクチン候補であるODN‐2006CpG7909のPDE型バージョンを正の対照として使用し、一方ではそのGpC型カウンターパートを負の対照として使用したODN2006‐対照。HD11‐pNifTyhygクローン細胞株に関して、2000nMから始まる滴定試験において得られた結果を図6に示す。この試験に基づく活性順位は、ODN‐X4>ODN‐X2>ODN‐X1>>ODN‐2006PDE型である。ODN‐X3、ODN‐X5、ODN‐X6、ODN‐X7、ODN‐2006‐対照PDE型は不活性である。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、100nMから始まる滴定試験において得られた結果を図7に示す。この試験に基づく活性順位は、ODN‐X4>>ODN‐X2である。ODN‐X1、ODN‐X3、ODN‐X5、ODN‐X6、ODN‐X7は不活性である。まとめるとこれらの試験より、典型的なマウスODN‐X1およびヒトODN‐X2ではなくPDE型CpGを含むODV‐X4が、ニワトリ細胞株HD11および異種ニワトリTLR21試験系の双方において最も効果的な試薬であることが証明された。CpGモチーフに直に隣接するヌクレオチドの役割ニワトリHD11細胞および異種的に発現されたニワトリTLR21に対する異型の6塩基配列モチーフの活性を同定するために、CpGエレメントに直に隣接する位置が並び替えられた誘導体を作成した。TNCGNT3モチーフを基礎とする。配列の並べ替えは一度ODN‐X4モチーフ→ODN‐Y11に戻りつくことを指摘しておくべきであろう。HD11‐pNifTyhygクローン細胞株に関して、2000nMから始まる滴定試験において得られた結果を図8に示す。HD11‐pNiftyhygにおけるこの試験に基づく活性順位は、ODN‐Y11=ODN‐X4>ODN‐Y15>ODN‐Y12>ODN‐Y9>ODN‐Y3>ODN‐Y16>ODN‐Y7~ODN‐Y6~ODN‐Y10~ODN‐Y14>ODN‐Y8~ODN‐Y5である。ODN‐Y1、ODN‐Y2、ODN‐Y4、ODN‐Y13は不活性である。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、100nMから始まる滴定試験において得られた結果を図9に示す。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21におけるこの試験に基づく活性順位は、ODN‐Y11=ODN‐X4>>ODN‐Y15>ODN‐Y9>ODN‐Y12>ODN‐Y14~ODN‐Y6>ODN‐Y7~ODN‐Y8~ODN‐Y10~ODN‐Y16>ODN‐Y3~ODN‐Y5である。ODN‐Y1、ODN‐Y2、ODN‐Y4、ODN‐Y13は不活性である。まとめると双方の試験系より、同様の結論が引き出され得る。即ちODN‐X4と同一であるODN‐Y11は、HD11マクロファージおよびニワトリTLR21を異種的に発現するHEK293細胞の最強の刺激物質として確認される。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株の識別力はHD11‐pNiftyhygのそれよりも高いように思われる。ODN‐X4中のTpCpGpTエレメントの3’側隣接位置の役割。ニワトリD11細胞および異種的に発現されたニワトリTLR21に対する好ましい6塩基配列モチーフをさらに同定するために、ODN‐X4中のTpCpGpTエレメントの3’側の隣接位置を並び替えた。TTCGTN3モチーフを基礎とする。HD11‐pNifTyhygクローン細胞株に関して、2000nMから始まる滴定試験において得られた結果を図10に示す。HD11‐pNifTyhygにおけるこの試験に基づく活性順位は、ODN‐X4~ODN‐X43>ODN‐X42~ODN‐X41である。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、100nMから始まる滴定試験において得られた結果を図11に示す。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21におけるこの試験に基づく活性順位は、ODN‐X43>>ODN‐X4~ODN‐X42>DN‐X41である。ODN‐X4中のTpCpGpTエレメントの5’側隣接位置の役割ニワトリ細胞HD11に対するさらなる6塩基配列モチーフをさらに同定するために、ODN‐X4中のTpCpGpTエレメントの5’側の隣接位置を並び替えた。NTCGTT3モチーフを基礎とする。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、100nMから始まる滴定試験において得られた結果を図12に示す。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21におけるこの英検に基づく活性順位は、ODN‐X4>>ODN‐X25>ODN‐X2>ODN‐X24である。5’‐dG6デオキシグアノシンの短縮または削除の効果ニワトリ細胞HD11および異種的に発現されたニワトリTLR21におけるPDE型ODNX4に対する構造活性相関SARをさらに特性化するために、5’‐dG6の短縮または削除の効果を研究した。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、100nMから始まる滴定試験において得られた結果を図13に示す。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21におけるこの試験に基づく活性順位は、ODN‐X4>ODN‐X4‐5’‐1>ODN‐X4‐5’‐2>ODN‐X4‐5’‐3>>ODN‐X4‐5’‐4>ODN‐X4‐5’‐6≒ODN‐X4‐5’‐5である。ODN‐X4‐5’‐4~‐6はこの濃度範囲では不活性である。3’‐dG6の短縮または削除の効果ニワトリHD11細胞および異種的に発現されたニワトリTLR21におけるPDE型ODNX4に対する構造活性相関SARをさらに特性化するために、3’‐dG6の短縮または削除の効果を研究した。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、100nMから始まる滴定試験において得られた結果を図14に示す。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21におけるこの試験に基づく活性順位は、ODN‐X4‐5’‐5≒ODN‐X4‐5’‐4≒ODN‐X4‐5’‐3≒ODN‐X4‐5’‐2>ODN‐X4‐5’‐1>ODN‐X4である。3’dG6および3’dG5を欠くODNX4‐minusGは双方とも、この濃度範囲では不活性である。さらに、5’‐dG6および3’dG5でのGの付加が効力を有するかどうか研究した。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、100nMから始まる滴定試験において得られた結果を図15に示す。ODN‐X4の両側への1個のGの付加は、HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21における刺激活性に有益な効果も有害な効果も有さない一方で、2個のGの付加は低効力の分子を生じるように思われる。ホスホロチオエート型PTOアナログによるリン酸ジエステルPDE結合の置換CpG‐ODNの安定性および免疫賦活性の効力を改善するために、ホスホロチオエート型PTOアナログによるリン酸ジエステルPDE結合の置換を研究した。HD11‐pNifTyhygニワトリマクロファージおよび異種的に発現されたニワトリTLR21におけるPDE‐ODNX4に対する構造活性相関SARという観点をさらに特性づけるために、PTOによるすべてのPDE結合の置換ODN‐X4‐PTOの効果および5’‐dG6および3’‐dG5の連続配列だけにおけるPTOによるPDE結合の置換ODN‐X4‐PTO‐Gonlyの効果を研究した。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、50nMから始まる滴定試験において得られた結果を図16に示す。この読み出し系において、X4‐PDEに比較してX4‐PTOの効力がより低いことが見出された。X4‐PTO‐Gonlyは、HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21において親のX4‐PDEよりも高い効力であることが証明された。インビトロでの効力順位は、ODN‐X4‐PTO‐Gonly>ODN‐X4PDE>OODN‐X4‐PTOである。ODN‐X4PDEの種特異性の研究ODN‐X4PDEの種特異性を研究するために、HEK293‐XL‐pUNO‐ヒトTLR9細胞を購入し、その後pNifTy2を用いて形質移入し、文献のPTO‐CpGに対するそれらの応答性を確立し、機能細胞株を樹立し、それからその中の一つをHEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21に関する比較試験に使用した。この比較試験においてODN‐X4PDEに加えて、ヒトTLR9に対し確立した高い効力を有するPTO‐ODN2006=CpG7909および2007およびそれらのGpC対照カウンターパートを使用した。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、50nMから始まる滴定試験において得られた結果を図17に示す。次の活性順位、ODN‐X4PDE~PTO‐2006>PTO‐2007が得られた。GpC対照のPTO‐ODN2006および2007はここで考慮した濃度範囲において不活性だった。HEK293‐XL‐pUNO‐huTLR9‐pNifTy2クローン細胞株に関して、50nMから始まる滴定試験において得られた結果を図18に示す。次の活性順位、PTO‐2006>PTO‐2007が得られた。GpC対照のPTO‐ODN2006および2007ならびにODN‐X4PDEはここで考慮した濃度範囲において不活性だった。この結果は、ODN‐X4PDEのニワトリ種特異性を確立した。TTCGTT繰り返しの最適回数に関する研究TTCGTT繰り返しの最適回数を研究するために以下のコンストラクトを作成した。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、20nMから始まる滴定試験において得られた結果を図19に示す。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21に対して、以下の刺激効力順位、X4‐hex~X4‐pent>X4‐quad>X4‐tip=元のclassicalX4が確認された。X4‐doubおよびX4‐singはここで適用された試験濃度では不活性だった。分離するT数の効果CpGモチーフを分離するTの数の効果を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、25nMから始まる滴定試験において得られた結果を図20に示す。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21に対して、以下の賦活性の効力順位、X4‐Li6~X4‐Li5~X4‐Li4=元のclassicalX4>X4‐Li3>X4‐Li2~X4‐Li1が確認された。dG連続配列の境界にあるT残基の最適数に関する研究dG連続配列の境界にあるT残基の最適数を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、20nMから始まる滴定試験において得られた結果を図21に示す。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21に対して、以下の刺激効力順位、X4‐Bo4~X4‐Bo3>X4‐Bo2=元のclassicalX4>X4‐Bo1が確認された。dG連続配列の境界にあるT残基の最適数をさらに研究するために、以下の同一のおよびより長いコンストラクトを作成しそれから再試験した。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21クローン細胞株に関して、20nMから始まる滴定試験において得られた結果を図22に示す。HEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21に対して、以下の刺激効力順位、X4‐Bo6>X4‐Bo5>X4‐Bo4>X4‐Bo3>X4‐Bo2=元のclassicalX4>X4‐Bo1が確認された。骨格の三量体と隣接するT数の効果のさらなる研究骨格の三量体と隣接するTの最適数を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。最大刺激作用に関してもおよび50効果濃度=EC50に関しても、X4‐Bo5からのTのさらなる付加によって引き起こされる増加はわずかであるか存在しない。それにもかかわらず、X4‐Bo10は未だに高活性である。従って、より以上のTの付加による効果は横ばいになると仮定して差し支えない。X4‐Bo20、X4‐Bo25またはX4‐Bo30へのコンストラクトでさえなお非常に適しているということが容易に予想し得る。図23を参照。CGエレメントを分離するT数の効果のさらなる研究CGエレメントを分離するTの最適数を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。既に検討した通り、X4‐Li1およびX4‐Li2は考慮した濃度範囲<20nMにおいて不活性である。EC50はX4‐Li3からX4‐Li7ではそれほど変化しない一方で、達成可能な最大刺激作用はその順で増加するように思われる。驚くべきことは、X4‐Li7からX4‐Li8でのEC50におけるジャンプであり、それはまた最大刺激作用における増加も伴う。X4‐Li8、X4‐Li9およびX4‐Li10は、EC50および最大刺激作用に関しておよそ同等の効力である。にもかかわらず、X4‐Li10はなお極めて有効である。従って、より以上のTの付加による効果は横ばいすると予想して差し支えない。X4‐Li20、X4‐Li25またはX4‐Li30へのコンストラクトでさえなお非常に適しているということが容易に予想し得る。図24を参照。TTCGTT繰り返し数の効果のさらなる研究TTCGTT繰り返しの最適数を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。既に検討した通り、X4‐singおよびX4‐doubは考慮した濃度範囲<20nMにおいて不活性である。達成可能な最大刺激作用はX4‐tripからX4‐heptまで強く増加し、またその順でEC50も強く減少するように思われる。特にX4‐quadからX4‐pentへのジャンプは顕著である。X‐heptからX4‐decまでは、中程度にしかし連続的に、最大刺激作用は増加しEC50は減少する。従って、より以上の三量体の付加による効果は横ばいすると予想して差し支えない。X4‐X、X4‐XVまたはX4‐XVIIIへのコンストラクトでさえなお非常に適しているということが容易に予想し得る。しかしながら当該コンストラクトは、合成することがますます困難となるであろう。図25および26を参照。繰り返し三量体の型の効果のさらなる研究繰り返し三量体の最適型を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。刺激作用レベルがX4‐tipないしX4‐Iで、ないしX4‐II/X4‐IIIで強く増加する。そのうえEC50は、X4からX4‐Iで強く減少し、それからX4‐IIIで徐々に小さくなる。X4‐IIIはなお高活性である。図27を参照。TTTCGTTT繰り返しの効果のさらなる研究TTCGTTT繰り返しの境界でのT残基の最適数を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。X4系列におけると同様に、X4‐I‐singおよびX4‐I‐doubは考慮した濃度範囲では不活性である<20nM。最初の効力のあるODNはX4‐Iであり、それから達成可能な最大刺激作用がX4‐quadおよびX4‐I‐pent/X4‐I‐hexに関して増加する。EC50はX4‐I‐trip~X4‐I‐hexに関して同じ桁低nMである。X4‐I‐hexはなお高活性である。図28を参照。3量体性の6量体CGモチーフの3’隣接位置の研究3量体性の6量体CGモチーフの最適の3’隣接位置を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。EC50算出:X4:61.6nMX41:未検、>>100nMX42:62.1nMX43:3.3nMこれらおよび以前の結果に基づくと、最大刺激作用およびEC50値の双方に関してODN‐X43はODN‐X4より優れている。ODN‐X42は最大刺激作用に関してはやや低いが、EC50はODN‐X4のそれと同等である。3量体性の6量体CGモチーフのさらなる研究―GTCGTCの同定PDE‐ODNの効力をODN‐X2に基づき探索するために、以下のODNを6量体の5’末端および3’末端の修飾体として合成した。X2、X24、X25およびX26/X4の結果は上述した。X21およびX22と同様に、X2、X24、X25はX26/X4と比べて活性が単に不十分かまたは不活性である。しかしながらX23は、X26/X4のそれより優れた予期しない高い活性を示した。EC50算出:X23:3.1nMX4:61.6nMこれらのおよび以前の結果に基づくと、ODN‐X23は最大刺激作用およびEC50値の双方に関してODN‐X4より優れている。ODN‐X42モチーフ数の効果ODN‐X42はTTCGTAモチーフの三量体に基づいている。モチーフ数の効果を試験するために、1から6までモチーフ数を研究した。EC50ODN‐X4‐trip40.6nMODN‐X42‐trip33nMODN‐X42‐quad3.1nMODN‐X42‐pent0.84nMODN‐X42‐hex0.37nMODN‐X4‐trip‐PTO‐Gonly6.8nM先の試験で検討した通り、X4‐tripおよびX42‐tripの効力は同等である。X42系列におけるヘキサヌクレオチド繰り返し数を減少させることは、活性の損失をもたらすがX42‐sing、X42‐doub、一方で4、5および6までの数の増加は、最大シグナルおよびEC50におけるその順での増加をもたらし、X42‐pentではピコモルの効力に達する。また驚くべきは、X42‐quad以降のODNがODN‐X4‐trip‐PTO‐Gonlyよりも優れているという事実である。n=10、n=15またはn=18へのコンストラクトでさえなお非常に適していることは容易に想像し得る。しかしながら当該コンストラクトは、合成することがますます困難となるであろう。図29を参照。ODN‐X43モチーフ数の効果ODN‐43はTTCGTCモチーフの三量体に基づいている。モチーフ数の効果を試験するために、1から6までモチーフ数を研究した。さらに、X43‐trip~X43‐hexのPTOG-only変異型を合成し試験した。以前の試験で検討した通り、X43‐tripの効力はX4‐tripのそれより優れている。X43系列におけるヘキサヌクレオチド繰り返し数を減少させることは、活性の損失をもたらすがX43‐sing、X43‐doub、一方で数の4、5および6への増加はその順で最大シグナルおよびEC50の増加をもたらし、X43‐quadで既にピコモルの効力に達する。また驚くべきことは、X43‐trip以降のすべてのX43‐ODNがODN‐X4‐trip‐PTO‐Gonlyよりも優れているという事実である。X43‐trip~X43‐hexのPTOG‐onlyバージョンは、少なくとも純粋にリン酸ジエステル結合したODNバージョンと同程度に有効である。X43‐hexおよびX43‐hex‐PTOG‐onlyはなお高度に有効であり、換言すれば限界および/または最適になお到達していなかった。さらにn=10、n=15またはn=18へのコンストラクトさえなお非常に適していることは容易に予想され得る。しかしながら、当該コンストラクトは、合成することがますます困難となるであろう。図30および図31を参照。ODN‐X4のさらなる変異型PDE‐ODNの効力をODN‐X4に基づきさらに探索することを目的として、CpGエレメントの5’‐側および3’‐側のTTジヌクレオチドをGG、AAおよびCCそれぞれで置換してODNを合成した。HEK293‐pNifTy2‐chiTLR21刺激試験において、X4‐GG、X4‐AA、X4‐CC、GG‐XおよびAA‐Xは考慮した濃度範囲にわたり不活性であることが証明された。しかしながら、CC‐XEC50=6.94nMはX4EC50=52.3nMのそれに対し7倍優れたEC50活性を示し、しかもまたより高い最大刺激シグナルも示した。図32を参照。本発明のCpGモチーフの動物試験1諸言1.1目的W/O型エマルジョンと組み合わせた、最小限量の不活化NDVクローン30抗原と併用するTLRToll様受容体が、生NDVHedrts33/56の攻撃感染に対し保護を与えるかどうかを評価すること。1.22材料と方法2.1試験の簡単な概略隔離飼育器に収容した、3週齢のSPFホワイトレグホンニワトリの18群に、表1群分けおよび投薬に示す製剤の一つにより、右胸筋の筋肉内に1回だけワクチン接種した筋肉内注射。12羽の動物からなる各々の群から、10羽だけにワクチン接種し、残りの2羽は対照として役立てた。血液試料は、ワクチン接種一日前T=0に無作為に選びとった18羽の動物各々の群から1羽から、およびワクチン接種後のT=3週間目に全群の全動物から採取した。ワクチン接種後のT=3週間目の血液採取後に、全ニワトリは、ニワトリ当たり0.2mlの短潜伏期性のNDV株Herts33/56106.0EID50を用いて右下肢筋に筋肉内i.m.経路により攻撃感染した。攻撃感染後の14日の期間、ニワトリはNDV感染の臨床エビデンスまたは致死率の発生に関し毎日点数化した。攻撃感染後の2週間目に、血液を全動物から採取し、その後動物を安息死させた。局所反応は肉眼的にしらべて点数化した。反応または病変が観察可能であるときは型通りの組織学用試料を採取した。2.2試験材料2.2.12.2.1.1ワクチン:0.25w/wの不活化NDVクローン30W/O型エマルジョン中2.2.1.2TLRリガンド:X4‐PDEY11―Biolegio社製―オランダX4‐PTOY11‐TibMolBiol社製―ベルリン‐ドイツX4‐PTO‐G‐onlyY11―TibMolBiol社製2007‐PTO文献公知―TibMolBiol社製2.2.1.3CpG配列:2.2.2ワクチン調製各々のTLRリガンドについて一定の希釈液を新たに作成し、0.5ml当たり1μgまたは10μgの用量となるように、終濃度2.5v/vになるまでそれを[0.25w/wNDVのW/O型エマルジョン]‐ワクチンに添加した。ここで使用する試験ワクチンのワクチン総投与量は、8.06w/vNDV感染卵尿膜腔液/W/O型エマルジョンを含む。ワクチンへTLRリガンドを添加した後、ミニ‐ボルテックスを使用して激しく混合した。不活化ニューカッスル病ウイルスの1/4用量とは、オリゴデオキシヌクレオチドがない場合に、DNV感染から家禽を保護することのできる抗体力価を与えると知られた不活化NDVの最小限量の1/4を意味する。2.3ワクチン接種各々の群の動物10羽に、3週齢で0.5mlのワクチンを用いて筋肉内注射で右胸筋に接種した。各々の群の残りの動物2羽は接種せずに対照として役立てた。2.4攻撃感染ワクチン接種後3週間目に、全18群の全12動物を、0.2mlの生NDVHerts33/65ニワトリ当たり106.0EID50を用いて筋肉内注射経路により右下肢筋に攻撃感染した。2.5血液試料血清学用の血液は、ワクチン接種一日前にT=0無作為に選びとった18羽の動物各々の群から1羽から、および一次接種後T=3週間目に全動物から採取した。攻撃感染後2週間目の血液を、NDV攻撃感染に生き残った全ての残っている動物から採取した。2.6HIアッセイNDV特異抗体の血清レベルは、赤血球凝集抑制HIアッセイによって測定した。血清の2段階希釈液をマイクロタイタープレート中で調製し、それからNDV抗原50μl中に8赤血球凝集単位を含む等容量と混合した。力価は、ニワトリの赤血球緩衝食塩水中1v/vの血球凝集を完全に抑制する最高希釈倍数の逆数で表した。試料は、1:2以上の希釈倍数における赤血球凝集抑制に対して陽性とみなした。3結果NDVのHI力価:結果から、またNDVのHI力価は保護と正確に相関することも明らかである。保護を誘導した各々のTLRリガンドに対し、最高のHI力価が、換言すれば用量当たり10μgで、最高の保護と相関することが見出された。対照的に、TLRリガンドの最も高い用量でHI力価は最も低かった。組織学および病理学注射部位の肉眼観察による研究において、異なる群由来のトリの注射部位の間に肉眼観察による差異は認められなかった。これらの観察は、使用したTLRリガンドが安全であり、しかもそれらが例えば局所反応等の追加の副作用を誘発しなかったことを示している。保護/生存:結果から、NDVのW/O型エマルジョンだけを用いては保護が得られなかったことが明らかであり群1、一方いくつかの他の群においては20ないし90のトリが、0.25w/wNDVクローン30W/O型エマルジョンへのTLRリガンドの付加により保護された。非ワクチン接種の対照ニワトリn=36において保護は観察されなかった。本発明のCpGモチーフのさらなる動物試験。1諸言1.1目的W/O型エマルジョン鉱物油に基づいた油中水型エマルジョンと組み合わせたX4‐Pent‐PDEのニワトリにおける抗NDV、抗IBVおよび抗TRT抗体力価に及ぼす影響を評価すること。1.2動機付け本試験において発明者らは、W/O型エマルジョンと組み合わせた総用量の1/4の不活化NDV、IBVまたはTRT抗原へのX4‐Pent‐PDEの付加が、NDVおよびTRTの総用量、またはIBVの半分の用量と比べたときに同等かより高い抗体力価を惹起することができるか否かを研究した。2材料と方法2.1試験の簡単な概要4週令のSPFホワイトレグホンニワトリの群群当たりn=10に、表2に示す製剤の一つにより右下肢筋に1回、筋肉内注射でワクチン接種した。血液試料は、ワクチン接種一日前T=0に無作為に選びとった20羽の動物から、およびワクチン接種後のT=4およびT=6週間目に全群の全動物から採取した。血清は、抗NDV、抗IBVおよび抗TRT抗体力価を測定するために使用した。2.2試験材料2.2.1試験物質2.2.1.1抗原不活化:NDVクローン30:ワクチン総用量は、NDV‐感染卵/W/O型エマルジョンの8.06w/v尿膜腔液を含む。IBV‐249G:ワクチン総用量は、IB‐感染卵/W/O型エマルジョンの30w/v尿膜腔液を含む。TRT:原生産単位。ワクチン総用量は100E.U./用量を含む。2.2.1.2ワクチン:表2を参照。2.2.1.3免疫賦活剤:2.2.2ワクチン調製X4‐Pent‐PDE型TLRリガンドの予備希釈液を新たに作成し、ワクチン0.5ml当たり1μgまたは10μgの用量となるように、終濃度2.5v/vまでワクチンに添加した。TLRリガンドの添加後にワクチンをミニ‐ボルテックスを使用して激しく混合した。2.3ワクチン接種各々の群由来の動物は、4周齢のときにワクチン0.5mlを用いて右下肢筋に筋肉内注射で接種した。2.4血液試料血清学用の血液試料は、ワクチン接種前T=0に無作為に選びとられた動物20羽からおよび一次接種後T=4週間目に全動物から採取した。2.5抗体力価2.5.1NDVのHI‐アッセイNDV特異抗体の血清レベルは、赤血球凝集抑制HIアッセイによって測定した。血清の2段階希釈液をマイクロタイタープレート中で調製し、それからNDV抗原50μl中に8赤血球凝集素単位を含む等容量と混合した。力価は、ニワトリの赤血球緩衝食塩水中1v/vの血球凝集を完全に抑制する最高希釈倍数の逆数で表した。試料は、1:4以上の希釈倍数における赤血球凝集抑制に対して陽性とみなしたが、2の対数で示す。2.5.2IBVのHI‐アッセイIB特異抗体力価の血清レベルは、赤血球凝集抑制HIアッセイによって測定した。血清の2段階希釈液をマイクロタイタープレート中で調製し、それからIBV‐D274抗原50μl中に8~16赤血球凝集素単位を含む等容量と混合した。力価は、ニワトリの赤血球緩衝食塩水中1v/vの血球凝集を完全に阻害する最高希釈倍数の逆数で表した。試料は、1:16以上の希釈倍数における赤血球凝集抑制に対して陽性とみなしたが、2の対数で示す。2.5.3TRTのELISATRT特異抗体の血清レベルは、標準ELISAによって測定した。手短に言えば、1:200希釈TRT抗原材料の100μlをマイクロタイタープレートに被覆した。血清は1:100および1:800に予備希釈し、それからマイクロタイタープレートに添加した。血清力価は、5以上の力価で陽性とみなしたが、2の対数で示す。2.5.4結論表2の結果より以下のことが直ちに結論し得る。11/4用量のNDVワクチンは、X4‐Pent10μgと共に投与されるとき、X4‐Pent無添加の総用量のNDVに匹敵する力価を与える。21/4用量のNDV/IBV併用ワクチンは、X4‐Pent10μgと共に投与されるとき、X4‐Pent無添加の総用量のNDV/IBV併用ワクチンに匹敵するNDV力価およびIBV力価を与える。31/4用量のTRTワクチンは、X4‐Pent10μgと共に投与されるとき、X4‐Pent無添加の総用量のTRTワクチンに匹敵する力価を与える。3結果