細菌性バイオフィルムの除去、低減または予防方法であって、a膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含む融合タンパク質を提供しb前記融合タンパク質と物質、液体、表面または生体物質とを接触させることを含む前記方法。エンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンに融合される前記ペプチドが、長さ6~39アミノ酸残基を有する合成または天然に存在するペプチドである、請求項1に記載の方法。エンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンに融合される前記ペプチドが、合成カチオン性、合成ポリカチオン性、合成疎水性、合成両親媒性または天然に存在する抗菌ペプチドである、請求項1または2に記載の方法。前記ペプチドが、エンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンのN末端およびまたはC末端に融合され、特にエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンのN末端に融合される、請求項1~3のいずれか1つに記載の方法。前記エンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンが、グラム陰性菌およびまたはグラム陽性菌の細胞壁の分解活性、特に腸内細菌科、シュードモナス科、ナイセリア属、モラクセラ属、ビブリオ属、アエロモナス属、ブルセラ属、フランシセラ属、ボルデテラ属、レジオネラ属、バルトネラ属、コクシエラ属、ヘモフィルス属、パスツレラ属、マンヘミア属、アクチノバチルス属、ガードネレラ属、スピロヘータ科、レプトスピラ科、カンピロバクター属、ヘリコバクター属、スピリルム属、ストレプトバチルス属、バクテロイデス科、アシネトバクター属、特にAバウマニからなる群から選択されるグラム陰性菌の細胞壁の分解活性を有し、ここでグラム陽性菌が、リステリアモノサイトゲネス、スタフィロコッカスアウレウス、エンテロコッカスフェカリス、エンテロコッカスフェシウム、ストレプトコッカスニューモニエ、ストレプトコッカスピオゲネス、ストレプトコッカスミュータンス、ストレプトコッカスエクイ、クロストリジウムディフィシル、クロストリジウムボツリヌム、クロストリジウムテタニ、クロストリジウムパーフリンジェンス、バチルスアンスラシス、バチルスセレウス、プロピオニバクテリウムアクネス、マイコバクテリウムアビウム、マイコバクテリウムツベルクローシス、コリネバクテリウムジフテリエ、マイコプラズマニューモニエ、アクチノミセス属からなる群から選択される、請求項1~4のいずれか1つに記載の方法。前記エンドリシンが、配列番号1のphiKZgp144、配列番号2のELgp188、配列番号3のサルモネラエンドリシン、配列番号4の腸内細菌ファージT4エンドリシン、配列番号5のアシネトバクターバウマニーエンドリシン、配列番号6のEコリファージK1Fエンドリシン、配列番号7のOBPgpLys、配列番号8のPSP3サルモネラエンドリシン、配列番号9のEコリファージP2エンドリシン、配列番号85のPly511、配列番号92のPly2638からなる群から選択されるかまたは、前記バクテリオシンが配列番号87である、請求項1~5のいずれか1つに記載の方法。カチオン性ポリカチオン性ペプチドが配列番号10~30および32~34のアミノ酸配列を示すか、または抗菌ペプチドが配列番号93~133のアミノ酸配列を示すか、または疎水性ペプチドが配列番号134および135のアミノ酸配列を示すか、または両親媒性ペプチドが配列番号136~138のアミノ酸配列を示す、請求項1~6のいずれか1つに記載の方法。前記エンドリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントが、配列番号35~49、53、57、62~64、66~78および139~142からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。融合タンパク質に接触する物質が、石、岩、土壌、堆積物、食物、飼料または化粧品である、請求項1~8のいずれか1つに記載の方法。融合タンパク質に接触する液体が、水、特に飲料水、地下水もしくは廃水、熱水泉、海、湖、川、任意の種類の水性系、コンタクトレンズ、義歯、インプラント、補装具またはブレースの洗浄液および保存液である、請求項1~9のいずれか1つに記載の方法。融合タンパク質に接触する液体が、生体、特に植物および哺乳動物、好ましくはヒトに由来するかまたはそれから得られる任意の物質である、請求項1~10のいずれか1つに記載の方法。融合タンパク質に接触する液体が、医療機器、工業用水システムまたは飲料水システムの配管および天然水系の表面である、請求項1~11のいずれか1つに記載の方法。融合タンパク質と組み合わせて、またはそれに添加して抗生物質を添加することができる、請求項1~12のいずれか1つに記載の方法。細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌およびまたはグラム陽性菌感染症の治療薬として使用するための、膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含むエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアント。抗生物質と組み合わせて、またはそれに添加してエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントが用いられる、請求項14記載の使用のためのエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアント。食品、食品加工装置、食品加工工場、食品と接触する面、医療機器、病院または手術室における表面の細菌性バイオフィルムと関連するグラム陰性菌およびまたはグラム陽性菌汚染の除去、低減およびまたは予防のための、膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含むエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントの使用。細菌性バイオフィルムと関連する医薬、食品もしくは飼料の診断法または環境診断法における診断手段、消毒薬または化粧用物質としての、膜破壊活性またはLPS破壊活性を有するペプチドが融合されたエンドリシン、オートリシンまたはバクテリオシンを含むエンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントの使用。エンドリシンバリアント、オートリシンバリアントまたはバクテリオシンバリアントが、抗生物質と組み合わせて、またはそれに添加して用いられる、請求項16および17に記載の使用。以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものと考えてはならない。特記しない限り、例えば、Sambrocketal1989MolecularCloningALaboratoryManual2ndeditionColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYorkに記載されているような分子生物学の標準法を用いた。修飾phiKZgp144およびELgpgp188エンドリシンバリアントのクローニング、発現および精製配列番号1に示したphiKZgp144および配列番号2に示したELgp188は、N末端ペプチドグリカン結合ドメインおよびC末端触媒ドメインを有するシュードモナスエルギノーサファージφKZおよびEL由来のモジュラーエンドリシンである。phiKZgp144およびELgp188のオープンリーディングフレームのPCR増幅のために、標準5プライマーELgp188のために5’ATGAACTTCCGGACGAAG3’ならびに配列番号81の82の標準3プライマーELgp188のためにATACGAAATAACGTGACGAを用いた。phiKZgp144またはELgp188をコードするオープンリーディングフレームの5’末端を、正に荷電した9つの残基をコードする遺伝子フラグメントで伸長するために、伸長した5プライマーELgp188のために5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAACTTCCGGACGAAG3’ならびに配列番号81および82の標準3プライマーを用いるテールPCRを利用した。製造業者のプロトコルに従って、PCR産物をpEXP5CTTOPO発現ベクターにクローニングした。tRNAの枯渇を避け、フレームシフトのリスクを抑えるために、リジントリプレットに加えてアルギニントリプレットを組み込んだ。設計されたBamHI制限部位への追加のポリカチオン性カセットの挿入により、余分のカチオン性残基でテールが長くなる。この挿入により、各連結部位にアルギニンおよびセリンのトリプレットが生じる。最大4つまでのポリカチオン性ペプチドをphiKZgp144およびELgp188の両方に融合させ、ngp144またはngp188と呼んだ。それぞれは、N末端に9、19、29および39の正に荷電したアミノ酸残基を含む。かくして、EコリBL21pLysS細胞内で以下の構築物を発現させた修飾エンドリシンバリアントPOLYgp144、2gp144、POLYgp188および2gp188をさらなる研究に用いた。C末端6xHisタグを用いるNi2アフィニティークロマトグラフィーによって前記タンパク質を精製した。Eコリ発現培養物1リットル当たりの全収量を、タンパク質濃度の分光光度測定および精製原液の全量によって測定した。高純度を確実にするために、gpl44誘導体と比較してよりストリンジェントな条件下でgp188誘導体の精製を行った。Eコリ発現培養物1リットル当たりの全収量を表5に示す。表5Ecoli発現培養物1リットル当たりのエンドリシン誘導体の組換え体精製収量精製原液は~90の純度であった。POLY誘導体の精製溶液の質量スペクトル分析により、微量のEコリ50Sリボソームサブユニットタンパク質L2および16SrRNAウリジン516シュードウリジル酸合成酵素の存在が明らかとなった。すべてのphiKZgp144誘導体は多量体形成を示したが、これはβメルカプトエタノールの添加によって単量体に変換することができた。このことは、分子間ジスルフィド結合が多量体化を引き起こすことを示している。修飾phiKZgp144およびELgp188バリアントの抗菌活性対数的に増殖しているPエルギノーサPAO1p細胞JClinMicrobiol4111921202を100倍希釈し、緩衝液中、100μgmlの最終濃度で、各10μgの未透析タンパク質およびELpg188ならびに修飾エンドリシンバリアント、POLYgp144、2gp144、POLYgp188および2gp188と共に室温でインキュベートした。1時間後、細胞浮遊液をPBS緩衝液で希釈し、プレーティングした。さらに、PBS緩衝液中に細胞を含む陰性対照をプレーティングした。終夜インキュベーション後に、残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、相対的不活化l00N0未処理細胞数Ni処理細胞数として対数単位で抗菌活性を算出した。すべての試料を6連で行った。平均値標準偏差を示す。スチューデントt検定を用いて統計解析を行った。未修飾エンドリシン、phiKZgp144およびELgp188は、陰性対照と比較して細胞数を有意には減少させない。この観察は、グラム陰性菌の細胞壁を分解するエンドリシンのバリアとしての外膜の有効性を明らかにしている。対照的に、表6に示すように、修飾エンドリシン、POLYgp144、2gp144、POLYgp188および2gp188とのインキュベーションは、細菌細胞数の有意な減少を引き起こす。ポリカチオン性ペプチドの長さの増加は、特にphiKZgp144の場合において、さらに抗菌活性を増強させる傾向がある2gp144では、1時間以内に9998±002または37±03対数単位までの減少が達成される。さらに、phiKZgp144の修飾エンドリシンは、ELgp188の修飾エンドリシンよりも高い抗菌活性を有することが実験により明らかとなった。表6未修飾ならびに修飾phiKZgp144およびELgp188エンドリシンバリアントの抗菌効果従って、本実施例により、phiKZgp144のN末端に9つのカチオン性残基の短いペプチドの添加によって、すでに、1時間以内に細胞のほぼ999を殺すのに十分であることが明らかとなった。ポリLリジンは固有の抗菌活性を有しているが、これまでは、この特性は少なくとも20残基のポリマーでやっともたらされていたに過ぎない。しかしながら、ポリカチオン性ペプチドとエンドリシンの協調作用は細胞を殺す。さらなる実験において、修飾エンドリシンPOLYgp144を、50mMKH2P04K2HP04に対して透析し、前述の未透析タンパク質溶液の代わりに用いた。それによって、不活化レベルは、さらに、29±03対数単位から39±02対数単位まで上昇した。非毒性の組換え産生のための宿主としてのピキアパストリスにおける修飾phiKZgp144およびELgp188バリアントの発現POLYgp144をコードするオープンリーディングフレームをpPICZαAシャトルベクターにクローニングし、続いてこれを相同組換えによってPパストリスのゲノムに組み込んだ。BMMY培地中でメタノールによって遺伝子発現を誘導し、1、3および4日後に酵素活性の存在に関して上清を分析した。そのために、Pパストリス発現培養物30μl量の上清を、クロロホルムで透過化させたPエルギノーサPAO1p細胞JClinMicrobiol4111921202270μlに、1、3および4日後に加えた。続いて、分光光度学的に吸光度を記録した。吸光度の低下は、Pパストリスによる溶菌酵素の分泌を示す。陰性対照として、発現プラスミドを含まないPパストリスX33を含めた。このように、上清試料の添加による基質の溶解は、PパストリスによるPOLYgp144の組換え産生および分泌の成功の尺度である。1日後、わずかな酵素活性を検出できた。最大活性は3日後に観察された。なぜなら、4日後に上清における活性の有意な増加が観察されなかったからである。Pパストリスの細胞密度に対する毒作用は認められなかった。Pパストリスによる発現中、ベクターのα分泌シグナルは、周囲の媒質への組換えタンパク質の分泌を引き起こすが、限られた数の他のタンパク質が分泌されるだけなので、これにより精製が容易になる。オープンリーディングフレームの5’末端におけるBamHI制限部位により、追加のポリカチオン性ペプチドをコードするさらなるカセットの付加が可能になる。異なるポリカチオン性ペプチドを有するさらなる修飾エンドリシンphiKZgp144バリアントポリカチオン性ペプチドの潜在能を試験および比較するために、タンパク質のN末端に異なるポリカチオン性ペプチドを有するphiKZgp144および他のエンドリシンのバリアントをコードする遺伝子を合成した。ペプチドの変化は、リンカー配列の長さ、組成および挿入に関する。一方では、N末端KRKモチーフ複数体を有するさらなるポリカチオン性ペプチドを産生させた。他方では、アルギニンまたはリジンのみからなるポリカチオン性ペプチドを産生させた。さらに、長いポリカチオン性ペプチドの翻訳を促進するために、リンカー配列を含むポリカチオン性ペプチドを産生させた。異なる産物をpET32b発現ベクターにクローニングした。Eコリ宿主に対するポリカチオン性ペプチドの潜在的毒性を抑えるために、pET32bを用いた。ベクターにコードされる融合タンパク質は、ポリカチオン性ペプチドをマスクし、精製プロセス中に除去されることができる。従って、EコリBL21細胞において、37°CでOD600nmの吸光度が06に達するまで、以下の修飾エンドリシンバリアントを発現させた。次いで、1mMIPTGを用いてタンパク質発現を誘導し、発現を4時間行った。次いで、6000gで20分間の遠心分離によってEコリ細胞を採取し、Stag精製キットに従って細胞破壊およびタンパク質精製を行った。すべてのタンパク質は、STAG1rEK精製キットを用いて精製した。pET32bベクターを用いて発現されたタンパク質は宿主に対して毒性ではなく、産生タンパク質が高収量で得られた。精製原液は高純度を示した。対数増殖期のPエルギノーサPAO1p細胞JClinMicrobiol4111921202を100倍希釈し、緩衝液中、100μgmlの最終濃度で上記のように各10μgの未透析タンパク質と共に室温でインキュベートした。1時間後、細胞浮遊液を1100に希釈し、LB上にプレーティングした。さらに、緩衝液を用いて陰性対照をプレーティングした。37°Cでの終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、相対的不活化l00N0未処理細胞数Ni処理細胞数として抗菌活性を算出した。すべての試料を少なくとも4連で行った。表7未修飾ならびに修飾phiKZgp144およびELgp188エンドリシンの抗菌効果未修飾phiKZgp144は、陰性対照と比較して細胞数を有意には減少させない。それ以上に、N末端KRKモチーフ複数体のポリカチオン性ペプチドを有する修飾phiKZgp144バリアントは、抗菌効果を著しく増強する。しかしながら、リジンまたはアルギニンのホモマーペプチドを有するバリアントもまた、測定されるように、未修飾phiKZgp144と比較して細胞の有意な減少を示す。さらに、38アミノ酸残基のポリカチオン性ペプチドを有し、リンカー配列を含むバリアントもまた、抗菌効果を著しく増強する。サルモネラティフィムリウムファージPSP3の修飾エンドリシンバリアント配列番号8のPSP3gp10は、サルモネラティフィムリウムファージPSP3に由来する165アミノ酸残基の球状エンドリシンであり、λ様ムラミダーゼ触媒ドメインを有する。BLASTpおよびPfam分析によって予測されるように、PSP3gp10エンドリシンは、アミノ酸残基約34~アミノ酸残基約152の範囲にその触媒ドメインを含む。鋳型としてファージPSP3の精製ゲノムDNAを用い、以下のPCRパラメータを用いて、ホットスタートTaqポリメラーゼPCR反応でPSP3gp10のオープンリーディングフレームを増幅した。前記PCRのために、標準5プライマーおよび標準3プライマーを用いた。ポリカチオン性9マーペプチドLysArgLysLysArgLysLysArgLysをコードする遺伝子フラグメントで、PSP3gp10をコードするORFの5’末端を伸長するために、伸長した5プライマーおよび配列番号51の標準3プライマーを用いるテールPCRを利用した。元の未修飾PSP3gp10PCRフラグメントおよびPK伸長フラグメントの両方を、製造業者のTAクローニングプロトコルに従って、pEXP5CTTOPO発現ベクターに連結した。対数的に増殖しているEコリBL21pLysS細胞において、1mMIPTGを用いての誘導後に、37°Cで4時間、配列番号8のPSP3gp10および配列番号53のPKPSP3gp10の組換え発現を行う。pEXP5CTTOPO発現ベクターによってコードされるC末端6xHisタグを用いて、Ni2アフィニティークロマトグラフィーによって両方のタンパク質を精製した。その後の4段階において、すべて室温で、Ni2アフィニティークロマトグラフィーを行う1流速05ml分での、洗浄緩衝液10カラム体積を用いるHistrapHP1mlカラムの平衡化。2流速05ml分での、HistrapHP1mlカラムへの全溶解物のローディング。3流速1ml分での、洗浄緩衝液15カラム体積を用いるカラムの洗浄。4流速05ml分での、溶出緩衝液10カラム体積を用いる、カラムからの結合エンドリシンの溶離。Eコリ発現培養物1リットル当たりの、両方の精製組換えタンパク質の全収量を表8に示す。波長280nmにおける精製原液のタンパク質濃度および全量の分光光度測定によって数値を測定した。溶出緩衝液中の、それぞれPSP3gp10およびPKPSP3gp10からなる精製原液は、SDSPAGEゲルにおいて視覚的に測定するとき、少なくとも純度90であった。表8Ecoli発現培養物1リットル当たりの精製組換えPSP3gp10エンドリシンおよびその修飾バリアントPKPSP3gp10の収量配列番号53のPKPSP3gp10エンドリシンの抗グラム陰性菌スペクトルを測定するために、臨床分離株Pエルギノーサ株PAO1pおよびBr667、エシェリキアコリWK6ならびにサルモネラティフィムリウムに対して1315μMPKPSP3gp10エンドリシンおよび05mMEDTAの組み合わせを試験した。対数的に増殖している細菌細胞を100倍希釈して最終密度約106mlにし、各株を、未修飾エンドリシンPSP2gp10および修飾エンドリシンPKPSP3gp10と共に、それぞれ05mMEDTAの有り無しの組み合わせで、30分間室温で振盪なしでインキュベートした。インキュベーションのために、各エンドリシンを緩衝液中で用い、エンドリシン最終濃度1315μMでインキュベーションを行った。対照として、05mMEDTAを含むがエンドリシンを含まない各株もまた30分間インキュベートした。表9用いられたグラム陰性株のリストPirnayJPetalMolecularepidemiologyofPseudomonasaeruginosacolonizationinaburnunitpersistenceofamultidrugresistantcloneandasilversulfadiazineresistantcloneJClinMicrobiol4111921202インキュベーション後、細胞浮遊液を3回希釈し、各希釈液100μlをLB培地上にプレーティングした。37°Cでの終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、対数単位での相対的不活化として抗菌活性を算出した。表10異なる対数的に増殖しているグラム陰性種に対する、EDTANa2の有無による未修飾エンドリシンおよびその修飾エンドリシンバリアントの抗菌活性すべての試料を3連で行った。平均値標準偏差を示す。観察される最大減少は、10細胞mlの検出レベルおよび最初の細胞密度に依存する。PAO1pに関しては、未修飾PSP3gp10エンドリシンおよびその修飾バリアントPKPSP3gp10の両方に対してEDTAは相乗的に作用する。エシェリキアコリファージP2の修飾エンドリシンバリアント配列番号9のP2gp09は、エシェリキアコリファージP2に由来する165アミノ酸残基の球状エンドリシンであり、λ様ムラミダーゼ触媒ドメインを有する。BLASTpおよびPfam分析によって予測されるように、P2gp09エンドリシンは、アミノ酸残基約34~アミノ酸残基約152の範囲にその触媒ドメインを含む。鋳型としてファージP2の精製ゲノムDNAを用い、以下のPCRパラメータを用いて、Pfuポリメラーゼを用いる標準PCR反応でP2gp09のオープンリーディングフレームを増幅した。前記PCRのために、標準5プライマーおよび標準3プライマーを用いた。ポリカチオン性9マーペプチドLysArgLysLysArgLysLysArgLysをコードする遺伝子フラグメントで、P2gp09をコードするORFの5’末端を伸長するために、伸長した5プライマーおよび配列番号55の標準3プライマーを用いるテールPCRを利用した。元の未修飾P2gp09PCRフラグメントおよびPK伸長フラグメントの両方を、製造業者のTAクローニングプロトコルに従って、pEXP5CTTOPO発現ベクターに連結した。対数的に増殖しているEコリBL21pLysS細胞において、1mMIPTGを用いての誘導後に、37°Cで4時間、配列番号9のP2gp09および配列番号57のPKP2gp09の組換え発現を行う。pEXP5CTTOPO発現ベクターによってコードされるC末端6xHisタグを用いて、Ni2アフィニティークロマトグラフィーによって両方のタンパク質を精製した。その後の4段階において、すべて室温で、Ni2アフィニティークロマトグラフィーを行う1流速05ml分での、洗浄緩衝液10カラム体積を用いるHistrapHP1mlカラムの平衡化。2流速05ml分での、HistrapHP1mlカラムへの全溶解物のローディング。3流速1ml分での、洗浄緩衝液15カラム体積を用いるカラムの洗浄。4流速05ml分での、溶出緩衝液10カラム体積を用いる、カラムからの結合エンドリシンの溶離。Eコリ発現培養物1リットル当たりの、両方の精製組換えタンパク質の全収量を表11に示す。波長280nmにおける精製原液のタンパク質濃度および全量の分光光度測定によって数値を測定した。溶出緩衝液中の、それぞれP2gp09およびPKP2gp09からなる精製原液は、SDSPAGEゲルにおいて視覚的に測定するとき、少なくとも純度95であった。表11Ecoli発現培養物1リットル当たりの精製組換えP2gp09エンドリシンおよびそのPK修飾誘導体PKP2gp09の収量配列番号57のPK2gp09エンドリシンの抗グラム陰性菌スペクトルを測定するために、臨床分離株Pエルギノーサ株PAO1pおよびBr667、バークホルデリアシュードマレイ、シュードモナスプチダG1ならびにエシェリキアコリWK6に対して、1315μMPK2gp09エンドリシンおよび05mMEDTAの組み合わせを試験した。対数的に増殖している細菌細胞を100倍希釈して最終密度約106mlにし、各株を、未修飾エンドリシンP2gp09および修飾エンドリシンPKP2gp09と共に、それぞれ05mMEDTAの有り無しの組み合わせで、30分間室温で振盪なしでインキュベートした。インキュベーションのために、各エンドリシンを緩衝液中で用い、エンドリシン最終濃度1315μMでインキュベーションを行った。対照として、05mMEDTAを含むがエンドリシンを含まない各株もまた30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞浮遊液を3回希釈し、各希釈液100μlをLB培地上にプレーティングした。37°Cでの終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、対数単位での相対的不活化として抗菌活性を算出した。表12対数的に増殖している異なるグラム陰性種に対する、EDTANa2の有無による未修飾エンドリシンおよびその修飾エンドリシンバリアントの抗菌活性すべての試料を3連で行った。平均値標準偏差を示す。観察される最大減少は、10細胞mlの検出レベルおよび最初の細胞密度に依存する。表13用いられたグラム陰性株のリストPirnayJPetalMolecularepidemiologyofPseudomonasaeruginosacolonizationinaburnunitpersistenceofamultidrugresistantcloneandasilversulfadiazineresistantcloneJClinMicrobiol4111921202シュードモナスプチダファージOBPの修飾エンドリシンバリアント配列番号7のOBPgpLYSは、推定上のN末端ペプチドグリカン結合ドメインおよびC末端触媒キチナーゼドメインを有するシュードモナスプチダファージOBPに由来する328アミノ酸残基のモジュラーエンドリシンである。BLASTpおよびPfam分析によって予測されるように、OBPgpLYSエンドリシンは、アミノ酸残基約126~アミノ酸残基約292の範囲にその触媒ドメインを含み、アミノ酸残基約7~96の範囲にN末端ペプチドグリカン結合ドメインを含む。鋳型としてファージOBPの精製ゲノムDNAを用い、以下のPCRパラメータを用いて、Pfuポリメラーゼを用いる標準PCR反応でOBPgpLYSのオープンリーディングフレームを増幅した従って、標準5プライマーおよび標準3プライマーを用いた。ポリカチオン性9マーペプチドLysArgLysLysArgLysLysArgLysをコードする遺伝子フラグメントで、OBPgpLYSをコードするORFの5’末端を伸長するために、伸長した5プライマーおよび配列番号59の標準3プライマーを用いるテールPCRを利用した。元の未修飾OBPgpLYSPCRフラグメントおよび伸長したフラグメントの両方を、製造業者のTAクローニングプロトコルに従って、pEXP5CTTOPO発現ベクターに連結した。対数的に増殖しているEコリBL21pLysS細胞において、1mMIPTGを用いての誘導後に、37°Cで4時間、配列番号7のOBPgpLYSおよび配列番号61のPKOBPgpLYSの組換え発現を行う。pEXP5CTTOPO発現ベクターによってコードされるC末端6xHisタグを用いて、Ni2アフィニティークロマトグラフィーによって両方のタンパク質を精製した。その後の4段階において、すべて室温で、Ni2アフィニティークロマトグラフィーを行う1流速05ml分での、洗浄緩衝液10カラム体積を用いるHistrapHP1mlカラムの平衡化。2流速05ml分での、HistrapHP1mlカラムへの全溶解物のローディング。3流速1ml分での、洗浄緩衝液15カラム体積を用いるカラムの洗浄。4流速05ml分での、溶出緩衝液10カラム体積を用いる、カラムからの結合エンドリシンの溶離。Eコリ発現培養物1リットル当たりの、両方の精製組換えタンパク質の全収量を表14に示す。波長280nmにおける精製原液のタンパク質濃度および全量の分光光度測定によって数値を測定した。溶出緩衝液中の、それぞれOBPgpLYSおよびPKOBPgpLYSからなる精製原液は、SDSPAGEゲルにおいて視覚的に測定するとき、少なくとも純度90であった。表14Ecoli発現培養物1リットル当たりの精製組換えOBPgpLYSエンドリシンおよびそのPK修飾誘導体PKOBPgpLYSの収量配列番号61のPKOBPgpLYSエンドリシンの抗グラム陰性菌スペクトルを測定するために、臨床多剤耐性株PエルギノーサBr667、シュードモナスプチダG1および一連の他のグラム陰性病原体に対して1315μMOBPgpLYSエンドリシンおよび05mMEDTAの組み合わせを試験した。対数的に増殖している細菌細胞を100倍希釈して最終密度約106mlにし、各株を、未修飾エンドリシンOBPgpLYSおよび修飾エンドリシンPKOBPgpLYSと共に、それぞれ05mMEDTAの有り無しの組み合わせで、30分間室温で振盪なしでインキュベートした。インキュベーションのために、各エンドリシンを緩衝液中で用い、エンドリシン最終濃度1313μMでインキュベーションを行った。対照として、05mMEDTAを含むがエンドリシンを含まない各株もまた30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞浮遊液を3回希釈し、各希釈液100μlをLB培地上にプレーティングした。37°Cでの終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、対数単位での相対的不活化として抗菌活性を算出した。すべての試料を3連で行った。平均値標準偏差を示す。観察される最大減少は、10細胞mlの検出レベルおよび最初の細胞密度に依存する。表15対数的に増殖している異なるグラム陰性種に対する、EDTANa2の有無による未修飾エンドリシンおよびその修飾エンドリシンバリアントの抗菌活性表16用いられたグラム陰性株のリストPirnayJPDeVosDCochezCBilocqFPirsonJStruelensMDuinslaegerLCornelisPZiziMVanderkelenAMolecularepidemiologyofPseudomonasaeruginosacolonizationinaburnunitpersistenceofamultidrugresistantcloneandasilversulfadiazineresistantcloneJClinMicrobiol4111921202OBPgpLYS処理の全般的有効性は種に依存するが、表16の結果は、05mMEDTAの非存在下および存在下の両方において、試験したすべての細菌種に対して、未修飾OBPgpLYSと比較して、PKOBPgpLYSの追加効果を示す。シュードモナスおよびバークホルデリア種に関しては、PKOBPgpLYS活性に対するEDTAとの明確な相乗効果が観察される。OBPgpLYSおよびPKOBPgpLYSの抗菌活性に対する異なるEDTA濃度の効果未修飾および修飾エンドリシンの抗菌活性に対するEDTAの影響を測定するために、異なる濃度のEDTAおよびエンドリシンを用いて、シュードモナスエルギノーサPAO1p細胞11921202に対して未修飾OBPgpLYSエンドリシンおよびPKOBPgpLYSエンドリシンの抗菌活性を試験した。対数的に増殖している細菌細胞を100倍希釈して最終密度約106mlにし、未修飾エンドリシンOBPgpLYSおよび修飾エンドリシンPKOBPgpLYSと共に30分間室温で振盪なしでインキュベートした。インキュベーションのために、各エンドリシンを、緩衝液中、エンドリシンの最終濃度0013μM、0131μMおよび1315μMで用いた。それに関して、以下の異なるEDTA濃度0mM、005mM、05mMおよび10mMを用いた。対照として、エンドリシンを加えないで、代わりに緩衝液を加えた試料1つもまた30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞浮遊液を3回希釈し、各希釈液100μlをLB培地上にプレーティングした。37°Cでの終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、対数単位での相対的不活化として抗菌活性を算出した。すべての試料を3連で行った。平均値標準偏差を示す。観察される最大減少は、10細胞mlの検出レベルおよび最初の細胞密度に依存する。Δは、OBPgpLYSおよびPKOBPgpLYS試料それぞれの間の活性の差異を示す。表17対数的に増殖しているPseudomonasaeruginosaPAO1p細胞に対する、異なるEDTA濃度と組み合わせての、未修飾エンドリシンおよびその修飾エンドリシンバリアントの抗菌活性表17に示すように、未修飾エンドリシンOBPgpLYSは、陰性対照と比較して、1315μMでは25対数単位を超えて、0013μMでは1対数単位で細胞数を有意に減少させる。修飾エンドリシンPKOBPgpLYSは、対数的に増殖しているPAO1p細胞に対して、さらなる05対数単位の減少をもたらす。PKOBPgpLYSと、05および10mMEDTAの濃度での外膜を透過化させるEDTANa2とを組み合わせることによって、観察される抗菌効果を569対数単位の減少にまで増強することができる。未修飾OBPgpLYSとPK修飾OBPgpLYSとの間の活性の差異は、添加するエンドリシン量を増加させることによって大きくなる。異なるグラム陰性菌に対する修飾phiKZgp144バリアントの抗菌活性ポリカチオン性ペプチドphiKZgp144および他のエンドリシンのバリアントの潜在能を試験し、比較するために、タンパク質のN末端にポリカチオン性ペプチドを有するコード遺伝子を合成した。pET32b発現ベクターに異なる産物をクローニングした。Eコリ宿主に対するポリカチオン性ペプチドに対する潜在的毒性を抑えるためにpET32bを用いた。ベクターにコードされる融合タンパク質は、ポリカチオン性ペプチドをマスクし、精製プロセス中に除去することができる。smi01およびKRK9smi01をコードする遺伝子を全合成し、pET32bにクローニングした。従って、吸光度OD600nmが06に達するまで、37°CでEコリBL21細胞において、以下の修飾エンドリシンバリアントを発現させたsmi01、KRK9smi01、phiKZgp144、pKKZ144pET32bおよびPOLYKZ144。1mMIPTGでタンパク質発現を誘導し、発現を4時間行った。次いで、6000g、20分間の遠心分離によってEコリ細胞を採取し、STAGrEK精製キットを用いて細胞破壊およびタンパク質精製を行った。pET32bベクターを使用して発現されたタンパク質は宿主に対して毒性ではなく、高収量の産生タンパク質が得られた。精製原液は高純度を示した。試験のために、かつ比較のための参照として、実施例1の記載に従ってphiKZgp144およびPOLYgp144を合成し、精製した。PエルギノーサPAO1pJClinMicrobiol4111921202、アシネトバクターバウマニーまたはバークホルデリアソラナセラムの対数増殖期の増殖細胞を100倍希釈し、緩衝液中100μgmlの最終濃度で、上記の未透析タンパク質各10μgと共に室温でインキュベートした。1時間後、細胞浮遊液を1100に希釈し、LB上にプレーティングした。さらに、緩衝液を用いて陰性対照をプレーティングした。37°Cでの終夜インキュベーション後に残存コロニーを計測した。計測細胞数に基づいて、相対的不活化l00N0未処理細胞数Ni処理細胞数として抗菌活性を算出した。すべての試料を少なくとも4連で行った。表18異なる細菌種に対する異なる修飾エンドリシンバリアントの抗菌効果未修飾エンドリシン、phiKZgp144およびsmi01は、陰性対照と比較して有意に細胞数を減少させない。この観察は、さらに、グラム陰性菌の細胞壁を分解するエンドリシンのバリアとしての外膜の有効性を示している。対照的に、表18に示すように、修飾エンドリシンKRK9smi01、pKKZ144pET32bおよびPOLYgp144とのインキュベーションは、アシネトバクターバウマニー、シュードモナスエルギノーサおよびバークホルデリアソラナセラムに対して細菌細胞数の有意な減少を引き起こす。これらの実験は、他のエンドリシンに対するカチオン性ポリカチオン性融合アプローチの適用性を明らかにしている。さらに、本実験は、修飾エンドリシンが種々の細菌に対して活性であることを明らかにした。シュードモナスエルギノーサバイオフィルムの低減本実験において、シュードモナスエルギノーサ2572株および2573株のバイオフィルムに対する修飾エンドリシンバリアントSMAP29KZ144およびPKOBPならびにエンドリシンOBPおよびKZ144ならびにペプチドPKの抗菌活性を試験した。バイオフィルムの低減は、クリスタルバイオレットアッセイを用いて定量した。バイオフィルム形成シュードモナスエルギノーサ2572のムコイド株、シュードモナスエルギノーサ2573ならびに非ムコイドEコリBL21の終夜液体培養物をOD60001まで希釈した。ポリスチレン96ウェルプレートに培養物100μlウェルで接種した。37°Cでのインキュベーション4時間後、上清を捨て、付着細菌を生理食塩水100μlを用いて洗浄した。接種したウェルに液体LB培地100μlを充填し、さらに24時間インキュベートした。上清を捨てた後、発達したバイオフィルムをPS100μlで再度洗浄した。バイオフィルム処理50μgウェルのPKKZ144または20uウェルのアルギン酸リアーゼまたは50μgウェルのSMAP29KZ144およびKZ144または25μgウェルのPKOBPおよびOBPまたは125μgのPKペプチド1部に対して2xLB培地1部で希釈して用いてバイオフィルムを処理し、12時間インキュベートした。未処理のシリーズを陰性対照として行った1部。上清を捨てた後、発達したバイオフィルムをPS100μlで再度洗浄した。バイオフィルム定量洗浄したバイオフィルムをメタノール300μlで固定し、風乾した。03クリスタルバイオレット100μlを用いて染色を行った。20分後、ウェルを水道水ですすぎ、33酢酸300μlを用いて、バイオフィルムの細胞外マトリックスから結合クリスタルバイオレットを溶解した。20分後、110希釈を行って、吸収を測定した。アルギン酸リアーゼで処理した接種物または未処理の接種物と比較して、PKKZ144を用いた場合にバイオフィルムの著しい低減が検出されたことが統計解析により示された。PKKZ144を用いた場合、非ムコイドEコリ実験室株のレベルまでバイオフィルムを低減させることが可能であった。修飾エンドリシンバリアントSMAP29KZ144およびPKOBPもまた、エンドリシンOBPおよびKZ144と比較して、シュードモナスエルギノーサバイオフィルムの著しい低減を示した。これに反して、PKペプチドは、シュードモナスエルギノーサバイオフィルムの形成を促進すると思われる。アシネトバクターバウマニーバイオフィルムの低減本実験において、アシネトバクターバウマニーDSMZ30007株のバイオフィルムに対して、修飾エンドリシンバリアントPKOBP、エンドリシンOBPおよびペプチドPKの抗菌活性を試験した。クリスタルバイオレットアッセイを用いてバイオフィルムの低減を定量した。実施例10の記載に従って、バイオフィルムの形成、処理および定量を行った。修飾エンドリシンバリアントPKOBPは、エンドリシンOBPと比較して、アシネトバクターバウマニーバイオフィルムの著しい低減を示した。これに反して、PKペプチドは、アシネトバクターバウマニーバイオフィルムの形成を促進すると思われる。スタフィロコッカスアウレウスバイオフィルムの低減本実験において、スタフィロコッカスアウレウスKS13株のバイオフィルムに対するPly2638PKおよびPKリゾスタフィンの融合タンパク質、酵素リゾスタフィンおよびPly2638ならびにペプチドPKの抗菌活性を試験した。クリスタルバイオレットアッセイを用いてバイオフィルムの低減を定量した。実施例10の記載に従って、バイオフィルムの形成、処理および定量を行った。ただし、バイオフィルムの処理には、25μgウェルのPly2638APKおよびPly2638Aまたは18μgウェルのPKリゾスタフィンおよびリゾスタフィンまたは125μgのPKペプチドを用いた。融合タンパク質PKリゾスタフィンおよびPKPly2638は、酵素リゾスタフィンおよびPly2638と比較して、スタフィロコッカスアウレウスバイオフィルムの著しい低減を示した。これに反して、PKペプチドは、スタフィロコッカスアウレウスバイオフィルムの形成を促進すると思われる。リステリアモノサイトゲネスバイオフィルムの低減本実験において、リステリアモノサイトゲネスScottA株のバイオフィルムに対して、修飾エンドリシンバリアントペンタペプチドPly511の抗菌活性を試験した。クリスタルバイオレットアッセイを用いてバイオフィルムの低減を定量した。実施例10の記載に従ってバイオフィルムの形成、処理および定量を行った。ただし、バイオフィルムの処理には、25μgウェルのペンタペプチドPly511を用いた。修飾エンドリシンバリアントPKPly511は、リステリアモノサイトゲネスバイオフィルムの著しい低減を示した。