"オリゴヌクレオチドの製造方法であって、エクソンから転写したRNAについて、RNAの一部分が該RNA中の他の部分にハイブリダイズしている領域からなるクローズド構造と、ハイブリダイズしていない領域からなるオープン構造とを該RNAの二次構造から決定し、そして少なくとも一部が該RNAのクローズド構造に相補的であり、且つ他の少なくとも一部が該RNAのオープン構造に相補的であることを特徴とするオリゴヌクレオチドを製造することを包含する方法。該オリゴヌクレオチドが相補的なオープン構造とクローズド構造が、該RNAにおいて互いに隣接していることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。該オリゴヌクレオチドが、該RNAの連続した14~50ヌクレオチドからなる部分に相補的であることを特徴とする、請求項1または2に記載の製造方法。該オリゴヌクレオチドがRNAを含むことを特徴とする、請求項1~3のいずれかに記載の製造方法。該オリゴヌクレオチドに含まれるRNAが修飾、好ましくは2’-O-メチル修飾リボースまたは2’-O-メチル修飾デオキシリボースによる修飾を有することを特徴とする、請求項4に記載の製造方法。該エクソンを含むmRNA前駆体が、対象生物において望ましくないスプライシングを示すことを特徴とする、請求項1~5のいずれかに記載の製造方法。該mRNA前駆体から生じるmRNA中に該エクソンが存在しない場合に、タンパク質のコード領域が生じることを特徴とする、請求項6に記載の製造方法。該エクソンを含む該RNAが転写された遺伝子は、異常型のデュシェンヌ型筋ジストロフィー遺伝子DMD、コラーゲンVIα1遺伝子COL6A1、筋細管ミオパシー1遺伝子MTM1、ジスフェリン遺伝子DYSF、ラミニン-α2遺伝子LAMA2、エメリー-ドレイファス型筋ジストロフィー遺伝子EMDおよびカルパイン3遺伝子CAPN3からなる群より選ばれる少なくとも1種をコードすることを特徴とする、請求項6または7に記載の製造方法。該遺伝子が、異常型のデュシェンヌ型筋ジストロフィーをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項8に記載の製造方法。該エクソンが、エクソン2,8,9,17,19,29,40~46,48~53,55または59を含むことを特徴とする、請求項9に記載の製造方法。製造するオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの同等物であり、該同等物は該オリゴヌクレオチドと同種であるが、その強度は必ずしも同等ではないハイブリダイゼーション特性を有することを特徴とする、請求項1~9のいずれかに記載の製造方法。該同等物が、ペプチド核酸、構造的にロックされた核酸およびモルフォリノ-ホスホロジアミデートからなる群より選ばれる少なくとも1種を含むことを特徴とする、請求項11に記載の製造方法。該同等物が、構造的にロックされた核酸を含むことを特徴とする、請求項12に記載の製造方法。オリゴヌクレオチドまたはその同等物が、該エクソンのスプライス供与部位配列およびスプライス受容部位配列の少なくとも1種と重複しないことを特徴とする、請求項1~13のいずれかに記載の製造方法。請求項1~14のいずれかの製造方法によって得られるオリゴヌクレオチドまたはその同等物。遺伝子にコードされているmRNA前駆体内の少なくとも2個のエクソンにハイブリダイズし得る化合物であって、該化合物は少なくとも2つの部分を含み、該少なくとも2つの部分には、該少なくとも2個のエクソンの内の第1のエクソンに相補的な配列中の連続した少なくとも8個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む第1の部分、および該mRNA前駆体内の第2のエクソンに相補的な配列中の連続した少なくとも8個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む第2の部分が含まれる。16~80ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項16に記載の化合物。該mRNA前駆体内の第1と第2のエクソンは、該化合物に含まれるオリゴヌクレオチドが相補性を示さない少なくとも1個のエクソンによって隔てられていることを特徴とする、請求項16または17に記載の化合物。該エクソンに相補的なヌクレオチド伸長鎖を含む少なくとも2つの部分は、それぞれ連結成分によって隔てられていることを特徴とする、請求項16~18のいずれかに記載の化合物。該連結成分が4~40ヌクレオチド、好ましくは少なくとも4個のウラシルヌクレオチドを含む4~40ヌクレオチドを包含することを特徴とする、請求項19に記載の化合物。請求項16~20のいずれかの化合物の同等物であって、好ましくは請求項12の製造方法で得られる同等物。請求項15~21のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、mRNA前駆体内の1つまたは複数のエクソンに対する認識を少なくとも部分的に改変する方法。請求項15~21のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、医薬の製造方法。請求項15~21のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を包含する医薬用製剤。請求項15~21のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、伝達性遺伝疾患の治療用医薬の製造方法。請求項15~21のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、mRNA前駆体におけるエクソンスキッピングを誘導する方法。請求項15~21のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、mRNA前駆体内のエクソンの認識を改変する方法。請求項15~21のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、スプライシング機構によるスプライス供与部位配列またはスプライス受容部位配列の利用効率を改変する方法。請求項15~21のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、mRNA前駆体内の2個以上のエクソンのエクソンスキッピングを誘導する方法。請求項15~21のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、mRNA前駆体内の3個以上のエクソンのエクソンスキッピングを誘導する方法。請求項15~21のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、mRNA前駆体内の少なくとも2個のエクソンと、該少なくとも2個のエクソンの間に位置する配列である介在配列のスキッピングを誘導する方法。該介在配列が、少なくとも1個のエクソンを含むことを特徴とする、請求項31に記載の方法。スプライシング機構によるmRNA前駆体内のエクソンの認識効率を改変する方法であって、mRNA前駆体は少なくとも2個のエクソンと少なくとも1個のイントロンを含む遺伝子によってコードされるものであり、該改変方法は以下の工程を包含する。スプライシング機構と該遺伝子を包含する転写系に、請求項15~21のいずれかのオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を第1成分として提供し、但し、該第1成分として用いるオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物は、該少なくとも2個のエクソンの内の少なくとも1個にハイブリダイズし得るものであり、そして該転写系において転写とスプライシングを実施せしめる。該遺伝子が、少なくとも3個のエクソンを含むことを特徴とする、請求項33に記載の改変方法。請求項15~21のオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物であって、該少なくとも2個のエクソンの他の1個にハイブリダイズし得るものを第2成分として該転写系に提供することを特徴とする、請求項33または34に記載の改変方法。該第1成分として用いるオリゴヌクレオチドまたはその同等物と、該第二成分として用いるオリゴヌクレオチドまたはその同等物とが、互いに物理的に結合していることを特徴とする、請求項35に記載の改変方法。結果この研究には、異なる変異表1に冒された6人のDMD患者が含まれる。患者DL512.2はエクソン45~50の欠失を有し、エクソン51のスキッピングはフレームを補正すると考えられた。患者DL363.2はエクソン45~54の欠失を有し、この患者のリーディングフレームはエクソン44をスキップすることで補正されると考えられた。エクソン48~50の欠失に冒された患者50685.1においては、リーディングフレームの補正にエクソン51のスキッピングが必要である。患者DL589.2はエクソン51~55の欠失を有し、エクソン50をスキップすることでリーディングフレームは補正されると考えられた。患者53914.1はエクソン52単一の欠失を有する。注目すべきことに、この患者の場合、エクソン51とエクソン53のいずれのスキッピングもフレームを補正すると考えられた。最後に、患者50423.1は、エクソン49内の1個の塩基対、具体的にはcDNAレベルで7389番の塩基対の欠失を有し、その結果、エクソン49にフレームシフトと未成熟なストップコドンが存在する。エクソン49はインフレームエクソンなので、このエクソンのスキッピングはこの患者のリーディングフレームを補正すると考えられた。本発明者らは、上記の標的エクソン44、49、50、51および53のスキッピングを1μMの濃度で誘導可能なAONをすでに同定している文献23。しかしながら、続いて行った用量-応答実験では、大部分のAONに関して、500nMや200nM、さらには100nMといったより低濃度で実質的なスキッピング効率が得られたデータは示さない。これはトランスフェクションに必要なPEIの用量を低下させるというさらなる有利な効果をもたらし、その結果、本発明者らの過去のトランスフェクション実験で見られた細胞毒性レベルを著しく低下させた。上記の6人のDMD患者由来の培養筋管に適切なAONをトランスフェクトした。平均70~90の細胞が、蛍光標識AONの核への特異的な取り込みを示した。RNAはトランスフェクションの24時間後に単離し、RT-PCRで分析した図1。すべての患者について、新規な短い転写産物の配列を解析することで確認されたように、標的エクソンのスキッピングが高い効率をもって、エクソンの境界で正確に行われた図1。患者50685.1では、さらなる転写フラグメントが検出された図1のC。配列の解析によって、このフラグメントがエクソン51内の潜在的スプライス部位の活性化により産生されたものであることがわかった。このフラグメントは、既に同じAONで処理したヒト対照細胞にも見られたものである文献23。驚くべきことに、低レベルの自発的エクソンスキッピングが以下の患者に由来する非処理細胞で観察された:DL363.2エクソン44をスキップする、DL589.2エクソン50をスキップするおよび53914.1エクソン53をスキップする。DMD遺伝子転写産物のいくつかの大きな領域についてRT-PCR分析を行ったところ、AON処理により誘導されるさらなる予想外の異常なスプライシングパターンは発見されなかった。得られたインフレーム転写産物はジストロフィン合成を修復すると考えられる。実際のところ、トランスフェクトした培養筋管を免疫組織化学的に分析したところ、各患者の筋管の大部分でジストロフィンが検出された図2。治療効果は、十分に分化した筋管を同定するための抗ミオシン抗体と抗ジストロフィン抗体を用いた二重染色により測定した。ミオシン陽性筋管の平均で75~80がジストロフィンの発現を示した。本発明者らは、トランスフェクションの2日後に、患者DL363.2、患者DL589.2および患者53914.1ではっきりとした膜結合ジストロフィンを観察した図2のB、D、E。各患者について、ジストロフィンの存在をウェスタンブロット分析により確認した図3。患者50685.1と患者DL363.2について経時実験を行ったところ、ジストロフィンが早くもトランスフェクション後16時間で検出され図3のD、タンパク質の量はトランスフェクションの7日後まで増加する図3のBことがわかった。患者DL515.2、患者DL363.2と患者DL589.2より得たジストロフィンタンパク質はヒト対照のものよりも著しく短く、これは欠失の大きさによるものである。1人の患者DL363.2については、ジスロトフィン合成の誘導がDGCの修復をもたらすかどうかについても調べた図4。AON処理の前には、低下した量の、主として細胞質に存在するα-、β-およびγ-サルコグリカンならびにβ-ジストログリカンのシグナルをそれぞれ30、30、40および80の培養筋管で確認した図4のA。続くAONトランスフェクションにより、主として膜結合型のα-、β-およびγ-サルコグリカンならびにβ-ジストログリカンの増量が、それぞれ70、90、90および80の処理培養筋管で検出された図4のB。考察DMD患者のためのリーディングフレーム補正戦略の目的は、アンチセンス誘導性の標的エクソンスキッピングである。このようなスキッピングによって、重症のDMD表現型を大部分が軽症であるBMD表現型に変換することができると考えられる。6人の患者、即ち、5種の欠失とエクソン49内の点変異をそれぞれ有する患者について、上記戦略の幅広い適用性を調べた表1。AON処理に続いて、各患者について、RNAレベルで標的エクソンが正確にスキップされていること、および75~80の処理筋管にジストロフィンタンパク質が存在することを示した。特にこの研究では、いくつかの異なる欠失によって崩れたリーディングフレームを補正するための単一AON処理即ち、エクソン51の誘導性スキッピングの適用について、初めて報告する。興味深いことに、DMD患者細胞で観察されたエクソンスキッピングのレベルは、ヒト対照細胞でこれまでに観察されたレベルよりも著しく高い文献23。概して、新規なスキップ転写産物が主要産物である。これは、ナンセンス仲介減衰nonsensemediateddecayNMDというプロセスの作用によって説明することができる文献25、32。対照細胞では、アウトオブフレームエクソンのスキッピングは、NMDの影響を受けやすいアウトオブフレーム転写産物をもたらす。一方、患者細胞では、標的エクソンのスキッピングは、NMDに耐性であり、従って本来存在するアウトオブフレーム転写産物よりも安定なインフレーム転写産物をもたらす。3人の患者DL363.2、DL589.2および53914.1については、エクソン44、50および53の低レベルの自発的スキッピングを非処理細胞で検出した。この現象は、いわゆる復帰筋繊維revertantmusclefibersについて過去にも報告されている文献33~35。このようなジストロフィン陽性繊維はDMD筋肉に少量2~10存在しており、リーディングフレームを修復する二次体性変異および/または選択的スプライシングの結果であると考えられる。復帰筋繊維の存在は、疾患の重症度と相関することが示唆されている文献36、37。ジストロフィン合成の修復を早くもトランスフェクションの16時間後に検出することができた。トランスフェクションの2日後にはジストロフィンが膜で検出され、この新規なBMD様タンパク質が部分的に機能性を有すると考えられることが示された。さらに、ジストロフィン合成の修復がジストロフィン-糖タンパク質複合体の形成を再度確立させると見られることを示す。患者DL363.2および患者DL589.2では、それぞれ標的エクソンのスキッピングによる欠失がエクソン44~54およびエクソン50~55に広がっていた。これまでにこのような欠失は、DMD患者やBMD患者で報告されていない。つまり、これらの欠失がいずれも存在しないか、BMDであると診断されない非常に軽症の表現型を生じることを意味する。BMD変異の多様性および観察したBMD発病率が著しく低いことを考慮すると、後者の説明が前者よりも妥当であると考えられる。患者DL515.1、患者50685.1および患者50423.1のアウトオブフレーム欠失は、エクソン45~51、エクソン48~51またはエクソン49の欠失を有するBMD患者に見られるインフレーム欠失に変換された文献30、38~40。注目すべきことには、エクソン48~51の欠失は無症候性のヒトでも報告されている文献40。しかしながら、一方では、このような欠失を有するDMD患者も存在する文献38、41~43。このような理論上のインフレーム欠失の大部分がDNAレベルでのみ検出されたものなので、これらDMD患者におけるジストロフィン欠乏は、アウトオブフレーム転写産物をもたらすRNAレベルのさらなる異常なスプライシングパターンによって発生したものと仮定した。ライデンDMD変異データベースに報告されている変異の75超を補正することが可能である文献30。本発明者らの結果は、アンチセンス誘導性のリーディングフレーム補正が、種々の欠失や点変異を有する多くのDMD患者のための見込みある治療アプローチになることを示している。臨床試験の確立のために、invivoのマウス筋組織における送達法の研究と最適化を現在行っている。材料と方法AONとプライマー使用したAON表1はすでに公知のものである文献23。AONは、5’フルオレセイン基6-FAM、全長ホスホロチオエート主鎖および2’-O-メチル修飾リボース分子ベルギー国、Eurogentec社製を含有する。二次抗体の蛍光シグナルとの干渉を回避するために、免疫組織化学的分析には非標識のAONを用いた。RT-PCR分析のためのプライマー配列は要求に応じて公表するは、Eurogentec社ベルギー国またはIsogenBioscienceBVオランダ国によって合成された。筋原細胞の培養とAONによるトランスフェクション患者DL515.2エクソン45~50を欠失、患者DL363.2エクソン45~54を欠失、患者50685.1エクソン48~50を欠失、患者DL589.2エクソン51~55を欠失および患者53914.1エクソン52を欠失について、筋生検材料から原始ヒト筋芽細胞を単離し、公知の方法文献44で培養した。コラーゲンVitrogen100;Cohesion社製をあらかじめコートしたフラスコとプレートに培養物を植えつけた。血清欠乏条件で7~14日間培養した後に、コンフルエントに達した培養筋芽細胞から筋管を取り出した。次いで、低血清培地中で筋管をポリエチレンイミンPEIを用いたトランスフェクションに3時間付した。トランスフェクションは製造者の説明書ExGen500MBIFermentas社製に添付のものに従って行い、トランスフェクトするAON1μgあたり3.5μlのPEIを用いた。RT-PCR分析には、濃度が500nMのAONを用いた。この濃度だと、細胞死が穏やかなレベルであるにもかかわらず、スキッピングレベルが最大となった。免疫組織化学的分析とウェスタンブロット分析にはより多くの生存筋管が必要なので、使用するAON濃度を200nMにした。エクソン49に点変異を有する患者50423.1については、繊維芽細胞のみが提供されていた。MyoD遺伝子を含有するアデノウイルスベクターAd50MyoDによる感染MOI50~100に続いて、公知のプロトコール文献45~47に従って繊維芽細胞の筋発生を強制的に行った。トランスフェクションの2時間後に培地を低血清培地に交換し、そして筋管が形成されるまで細胞を8~10日間インキュベートした。トランスフェクション条件は上記のものと同じであった。RNAの単離とRT-PCR分析トランスフェクションの24時間後に総RNAを培養筋管から単離したRNABeeRNAisolationsolvent;オランダ国、CamproScientific社製。300ngの総RNAをCthermポリメラーゼオランダ国、RocheDiagnostics社製を用いたRT-PCR分析に付し、20μlの反応系、60°Cで30分、種々のDMD遺伝子特異的リバースプライマー表1をプライマーとして会合させた。初期PCRとしては、94°C40秒、60°C40秒そして72°C60秒からなるサイクルを20サイクル行った。次いで、得られた反応液1μlをネステッドPCRに付し、94°C40秒、60°C40秒そして72°C60秒からなるサイクルを32サイクル行って再増幅した。PCR産物は1.5または2のアガロースゲル上で分析した。注目すべきことに、既知量の標準転写フラグメントと短い転写フラグメントとの混合物の規定の系列についてPCR分析を行ったところ、短いフラグメントの増幅に対する顕著な選択性を示す証拠は得られなかったデータは示さない。配列の解析RT-PCR産物は、QIAquickGelExtractionKitQiagen社製を用いてアガロースゲルから単離した。ダイレクトDNAシークエンシングは、ライデンゲノムテクノロジーセンターLeidenGenomeTechnologyCenterLGTCがBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionkitPEAppliedBiosystems社製を用いて実施し、ABI3700SequencerPEAppliedBiosystems社製で解析した。タンパク質の単離とウェスタンブロット分析タンパク質抽出物は、筋管の生存率に応じて、トランスフェクションの2~4日後の処理培養筋管25cm2のフラスコから、150μlの処理用緩衝液75mMのTris-HClpH6.8、15のSDS、5のβ-メルカプトエタノール、2のグリセロールおよび0.001のブロモフェノールブルーを用いて単離した。経時実験では、トランスフェクション後4時間、8時間、16時間、24時間および48時間にタンパク質抽出物を単離する患者50685.1の場合か、トランスフェクション後2日、4日および7日に単離した患者DL363.2の場合。ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロッティングは、Andersonetalの報告文献48にわずかな修正を加えた方法で行った。簡単に記すと、サンプル75μlを、4~7のポリアクリルアミドグラジエントゲルに4°Cで一晩流した。得られたゲルをニトロセルロースに対して4°Cで5~6時間ブロットした。5脱脂粉乳を含むTBST緩衝液10mMのTris-HCl、0.15MのNaClおよび0.5のTween20pH8でニトロセルロース上のブロットを1時間ブロッキングし、1:50に希釈したジストロフィンを認識するNCL-DYS2と共に一晩インキュベートした。1:10,000に希釈したHRP-結合抗マウス抗体SantaCruz社製を二次抗体として用いた。免疫反応バンドは、LumiLightplusWesternBlottingSubstrateで視覚化し、LumiImagerオランダ国、RocheDiagnostics社製でスキャンした。免疫組織化学的分析処理した培養筋管を、筋管の生存率に応じてトランスフェクションの1~4日後に-20°Cのメタノールで固定した。種々の抗体と反応させる前に、5のウマ血清GibcoBRL社製と0.05のTween-20Sigma社製とを含有するPBSGibcoBRL社製であるブロッキング溶液中で1時間インキュベートした。使用したすべての抗体をこのブロッキング溶液で希釈した。以下の抗体を処理した筋管にアプライした。1:100に希釈したデスミンポリクローナル抗体ICNBiomedicals社製;1100に希釈したミオシンモノクローナル抗体MF20;アイオワ大学、発生研究ハイブリドーマバンクDevelopmentalStudiesHybridomaBankより入手;1:100に希釈したミオシンポリクローナル抗体L53オランダ国、AMC、MvandenHoff博士より寄贈;ジストロフィンを検出するための、1:10に希釈したMANDYS1英国、ノースイーストウェールズインスティチュートNorthEastWalesInstitute、GMorris博士より寄贈と110に希釈したNCL-DYS2NovacastraLaboratoriesLtd社製;およびα-サルコグリカン、β-サルコグリカン、γ-サルコグリカンとβ-ジストログリカンをそれぞれ検出するための、1:75に希釈したNCL-a-SARCNovacastraLaboratoriesLtd社製、1:50に希釈したNCL-b-SARCNovacastraLaboratoriesLtd社製、1:50に希釈したNCL-g-SARCNovacastraLaboratoriesLtd社製、と1:50に希釈したNCL-b-DGNovacastraLaboratoriesLtd社製。抗体と共に1時間インキュベートした後、筋管を含むスライドをすすぎ、二次抗体として1:1000に希釈したAlexaFluor594標識ヤギ抗ウサギ抗体または1:250に希釈したAlexaFluor488標識ヤギ抗マウス抗体共にMolecularProbesInc社製と共に1時間インキュベートした。このスライドは落射蛍光光学部品を備えたLeica社製の共焦点顕微鏡で観察した。デジタル画像はCCDカメラPhotometrics社製で撮影した。材料と方法AONとプライマーAONの系列各エクソンにつき2種、表2参照は、比較的プリン含量の高いエクソン内部標的配列に結合し、好ましくは、RNAmfoldversion31サーバーで推定した37°CにおけるmRNA前駆体二次構造のオープン構造にも結合するように設計した文献[22]。AONの長さは15~24bpであり、G/C含量は26~67であった。これらAONは以下の化学修飾を有するように合成した:5’-フルオロセイン基6-FAM、全長ホスホロチオエート主鎖および2-O-メチル修飾リボース分子ベルギー国、Eurogentec社製。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR分析に用いたプライマー表3は、Eurogentec社ベルギー国またはIsogenBioscienceBVオランダ国により合成された。Invitro実験原始ヒト筋芽細胞は、非罹患個体KM108の筋生検材料から酵素的解離により単離した。簡単に記すと、組織を5mg/mlのコラゲナーゼVIIISigma社製、5mg/mlのウシアルブミン画分VSigma社製および1のトリプシンGibcoBRL社製を含有するPBSGibcoBRL社製中でホモジナイズした。37°Cで15分間の一連の培養工程を数回行った後、20のウシ胎児血清GibcoBRL社製と1のペニシリン/ストレプトマイシン溶液GibcoBRL社製とを添加した増殖培地GlutaMax1添加NutMixF10、GibcoBRL社製に解離細胞を含む懸濁液を等量加え、そこでプールした。遠心分離を行った後、精製ウシ表皮コラーゲンVitrogen100;Cohesion社製であらかじめコートしたフラスコを用い、細胞を増殖培地に植え付けてさらに培養した。免疫組織化学的アッセイでデスミン陽性細胞の百分率として求めた培養物中の筋原細胞含量は、培養を繰り返すことにより58まで上昇した文献[23]。筋管は、低血清培地2のGlutaMax1、1のグルコース、2のウシ胎児血清および1のペニシリン/ストレプトマイシン溶液を添加したDMEMGibcoBRL社製で7~14日間インキュベートしてコンフルエントに達した培養筋原細胞から得た。培養筋管のトランスフェクションには、ポリエチレンイミンPEI;ExGen500を製造者MBIFermentas社の説明書に従って用いた。AONに3.5等量のPEIを結合したもの1mMを、低血清培地中で培養筋管に3時間トランスフェクトした。RNAの単離とRT-PCR分析トランスフェクションの24時間後に、RNAzolBオランダ国、CamproScientific社製を製造者の説明書に従って用い、総RNAを培養筋管から単離した。1μgのRNAをCthermポリメラーゼRocheDiagnostics社製を用いたRT-PCR分析に付し、20μlの反応系、60°Cで30分、種々のDMD遺伝子特異的リバースRTプライマー表3をプライマーとして会合させた。初期PCRにはアウタープライマーのセット表3参照を用い、94°C40秒、60°C40秒そして72°C90秒からなるサイクルを20サイクル行った。次いで、得られた反応液1μlを適当なプライマーの組み合わせ表3を用いてネステッドPCRに付し、94°C40秒、60°C40秒そして72°C60秒からなるサイクルを32サイクル行って再増幅した。PCR産物は1.5または2のアガロースゲル上で分析した。配列の解析RT-PCR産物は、QIAquickGelExtractionKitQiagen社製を用いてアガロースゲルから単離した。ダイレクトDNAシークエンシングは、ライデンゲノムテクノロジーセンターLGTCがBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionkitPEAppliedBiosystems社製を用いて実施し、ABI3700SequencerPEAppliedBiosystems社製で解析した。結果Invitroエクソンスキッピングカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンPEIを用いたヒト対照培養筋管へのトランスフェクションに続く、AONによるエクソンスキッピングの誘導について、実験的に分析した。蛍光標識AONの核への取り込み量から求めた平均トランスフェクション効率は、60~80であった。トランスフェクションの24時間後に、標的エクソンを包囲する種々のプライマーの組み合わせ表3を用いたRT-PCRによって、転写産物を分析した。試験した30個のAONのうちの合計21個70について、標的エクソンの特異的スキッピングに対応する大きさの、短い転写フラグメントが再現性をもって産生された図5および表2。実際に、短い転写産物の配列の解析によって確認されたようにデータは示さない、標的とした15個のエクソンのうち13個即ち、7個のインフレームエクソンのうちの5個と8個のアウトオブフレームエクソンのうちの8個で特異的なスキッピングを誘導することができた。エクソン47とエクソン48のスキッピングは検出されなかった図5のe、g。この実験で調べた特定の転写領域では、トランスフェクトしていない対照筋管において、エクソン2とエクソン29の近傍で選択的スプライシングパターンが観察された図5のb、c。このような選択的スプライシング産物のシークエンシングを行ったところ、これらはエクソン2~7インフレーム、エクソン3~7アウトオブフレーム、エクソン28~29インフレームおよびエクソン27~29インフレームのスキッピングによるものであることがわかった。これらの天然genuinelyのエクソンスキッピングは、これまでにヒト骨格筋でも検出されている文献[24]、[25]。驚くべきことに、選択的スプライシングのレベルは、トランスフェクトした培養筋管におけるAON処理により著しく増加した。注目すべきことに、h2AON1が正常転写産物だけでなく、エクソン1と2がエクソン8にスプライシングしている選択的転写産物のいずれかにおいても、エクソン2のスキッピングを誘導することも確認した図5のb。大部分のAONが、隣接するエクソンの本来のスプライス部位を用いて標的エクソンの正確なスキッピングを誘導した。しかしながらh51AON2に対する応答では、エクソン51内のインフレーム潜在的スプライス部位が用いられた図5のh。このような選択的スプライス産物のレベルは、一連のトランスフェクション実験で変動した。最後に、トランスフェクション実験のいくつかでは、隣接するエクソンの共スキッピングcoskippingによるさらなる異常なスプライシングフラグメントが検出された。しかしながら、このような共スキッピングの発生は一貫しておらず、しかも非常に低いレベルであった。実施例2の参考文献以下の文献番号は、実施例2に記載した番号にのみ対応する1HoffmanEPBrownJrRHKunkelLMDystrophintheproteinproductoftheDuchennemusculardystrophylocusCell1987519199282MonacoAPBertelsonCJLiechtiGallatiSMoserHKunkelLMAnexplanationforthephenotypicdifferencesbetweenpatientsbearingpartialdeletionsoftheDMDlocusGenomics1988290953KoenigMBeggsAHMoyerMetalThemolecularbasisforDuchenneversusBeckermusculardystrophycorrelationofseveritywithtypeofdeletionAmJHumGenet1989454985064ZubrzyckaGaarnEEBulmanDEKarpatiGetalTheDuchennemusculardystrophygeneproductislocalizedinsarcolemmaofhumanskeletalmuscleNature19883334664695YoshidaMOzawaEGlycoproteincomplexanchoringdystrophintosarcolemmaJBiochem19901087487526ErvastiJMCampbellKPMembraneorganizationofthedystrophinglycoproteincomplexCell199166112111317KoenigMMonacoAPKunkelLMThecompletesequenceofdystrophinpredictsarodshapedcytoskeletalproteinCell1988532192268vanDeutekomJCFloydSSBoothDKetalImplicationsofmaturationforviralgenedeliverytoskeletalmuscleNeuromusculDisord199881351489MayedaAHayaseYInoueHOhtsukaEOhshimaYSurveyingcisactingsequencesofpremRNAbyaddingantisense20OmethyloligoribonucleotidestoasplicingreactionJBiochem199010839940510GalderisiUCascinoAGiordanoAAntisenseoligonucleotidesastherapeuticagentsJCellPhysiol199918125125711BakerBFMoniaBPNovelmechanismsforantisensemediatedregulationofgeneexpressionBiochimBiophysActa1999148931812KoleRSazaniPAntisenseeffectsinthecellnucleusmodificationofsplicingCurrOpinMolTher2001322923413SicinskiPGengYRyderCookASBarnardEADarlisonMGBarnardPJThemolecularbasisofmusculardystrophyinthemdxmouseapointmutationScience19892441578158014DunckleyMGManoharanMVillietPEperonICDicksonGModificationofsplicinginthedystrophingeneinculturedMdxmusclecellsbyantisenseoligoribonucleotidesHumMolGenet199871083109015MannCJHoneymanKChengAJetalAntisenseinducedexonskippingandsynthesisofdystrophininthemdxmouseProcNatlAcadSciUSA200198424716WiltonSDLloydFCarvilleKetalSpecificremovalofthenonsensemutationfromthemdxdystrophinmRNAusingantisenseoligonucleotidesNeuromusculDisord1999933033817TakeshimaYWadaHYagiMetalOligonucleotidesagainstasplicingenhancersequenceledtodystrophinproductioninmusclecellsfromaDuchennemusculardystrophypatientBrainDev20012378879018PramonoZATakeshimaYAlimsardjonoHIshiiATakedaSMatsuoMInductionofexonskippingofthedystrophintranscriptinlymphoblastoidcellsbytransfectinganantisenseoligodeoxynucleotidecomplementarytoanexonrecognitionsequenceBiochemBiophysResCommun199622644544919WatakabeATanakaKShimuraYTheroleofexonsequencesinsplicesiteselectionGenesDev1993740741820TanakaKWatakabeAShimuraYPolypurinesequenceswithinadownstreamexonfunctionasasplicingenhancerMolCellBiol1994141347135421vanDeutekomJCBremmerBoutMJansonAAetalAntisenseinducedexonskippingrestoresdystrophinexpressioninDMDpatientderivedmusclecellsHumMolGenet2001101547155422MathewsDHSabinaJZukerMTurnerDHExpandedsequencedependenceofthermodynamicparametersimprovespredictionofRNAsecondarystructureJMolBiol199928891194023RichlerCYaffeDTheinvitrocultivationanddifferentiationcapacitiesofmyogeniccelllinesDevBiol19702312224SuronoATakeshimaYWibawaTPramonoZAMatsuoMSixnoveltranscriptsthatremoveahugeintronrangingfrom250to800kbareproducedbyalternativesplicingofthe50regionofthedystrophingeneinhumanskeletalmuscleBiochemBiophysResCommun199723989589925ShigaNTakeshimaYSakamotoHetalDisruptionofthesplicingenhancersequencewithinexon27ofthedystrophingenebyanonsensemutationinducespartialskippingoftheexonandisresponsibleforBeckermusculardystrophyJClinInvest19971002204221026WellsDJWellsKEAsanteEAetalExpressionofhumanfulllengthandminidystrophinintransgenicmdxmiceimplicationsforgenetherapyofDuchennemusculardystrophyHumMolGenet199541245125027SironiMPozzoliUCaglianiRComiGPBardoniABresolinNAnalysisofsplicingparametersinthedystrophingenerelevanceforphysiologicalandpathogeneticsplicingmechanismsHumGenet20011097384AAartsmaRusetalNeuromuscularDisorders12S71S77結果2人のDMD患者におけるダブルエクソンスキッピングこの研究には、リーディングフレームの補正に2個のエクソンのスキッピングを必要とする、DMD遺伝子の異なるフレーム崩壊変異表5に冒された2人のDMD患者が含まれる。患者DL90.3はエクソン43にナンセンス変異を有する。この単一エクソンがアウトオブフレームであることを考慮すると、エクソン43のスキッピングはナンセンス変異を取り除くが、リーディングフレームを修復しないと考えられた。エクソン44との組み合わせはインフレームなので、この患者では、これら両方のエクソンを標的としたダブルエクソンスキッピングを目的とした。患者DL470.2は、エクソン46~50の欠失に冒されている。フレームの修復にはこの欠失に隣接する両方のエクソンのダブルエクソンスキッピングが必要であると考えられた。両方の患者のそれぞれから得た培養筋管に、エクソン43特異的AONとエクソン44特異的AONとの混合物DL90.3の場合またはエクソン45特異的AONとエクソン51特異的AONとの混合物DL470.2の場合をトランスフェクトした。個々のAON表5は、既に単一エクソンスキッピングで高い効果を示している。蛍光標識AONの核への特異的な取り込みのあった細胞数から明かなように、トランスフェクション効率は概ね80を超えた。トランスフェクションの24~48時間後のRT-PCR分析は、実際に両方のサンプルで特異的なダブルエクソンスキッピングが行われたことを示した図6および図7。この結果は配列の解析により確認したデータは示さない。さらに、短い転写フラグメントが以下の単一エクソンスキッピングにより得られた:患者DL90.3におけるエクソン44のスキッピング図6、および患者DL470.2におけるエクソン51のスキッピング図7。マルチエクソンスキッピングDL470.2で誘導されたようにエクソン44が直接エクソン52にスプライシングされることにより、インフレーム転写産物が産生された。これらエクソンの間に介在するエクソン全てからなる伸長鎖のスキッピング即ち、マルチエクソンスキッピングを誘導することにより、いくつかの既知の小さいDMD変異をカバーしてそれらを修復するBMD様欠失45~51が誘導されると仮定した。これは一種類のフレーム補正の恩恵に与るDMD患者群をさらに拡大すると考えられた。マルチエクソンスキッピングの可能性は、エクソン45特異的AONとエクソン51特異的AONとの混合物で処理したヒト対照筋管で最初に示された図7;KM109。その後、上記AON混合物をエクソン48~50の欠失を有する第3のDMD患者50685.1から得た筋管に投与した。エクソン45とエクソン51と共に、それらの間の残っているエクソンを含む伸長鎖のAON誘導性スキッピングにより、エクソン44がエクソン52にスプライシングしてなる、予想された小さいインフレーム転写産物が得られた図7。Uで連結したAONの組み合わせを用いた、ダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピング1個のmRNA前駆体分子から1個よりも多くのエクソンをスキップするには、使用するAONがすべて同じ核内に存在し、同一の分子を標的とする必要がある。このような機会を増やすために、エクソン45特異的AONとエクソン51特異的AONh45AON5とh51AON2とを10個のウラシルヌクレオチドで連結したものを含有する結合型AONの可能性について調べた表5。このU-リンカーAONをヒト対照およびDMD患者であるDL470.2と50685.1のそれぞれから得た筋管へトランスフェクトし、次いでRT-PCR分析を行ったところ、エクソン52にエクソン44がスプライシングされた予想通りのインフレーム転写産物を産生するというAONの効力が明らかになった図7。配列の解析により確認したところ、このマルチエクソンスキッピングはエクソンの境界で特異的且つ正確に生じたデータは示さない。患者DL470.2とは対照的に、ヒト対照および患者50685.1では、U-リンカーAONはAONの混合物よりもわずかに効率的だった。材料と方法AONとプライマーエクソン43、44と51のそれぞれを標的とするAONは公知のものであるAartsmaRus2002。エクソン45を標的とするAONは新たに設計した配列は要求に応じて公表する。すべてのAONは、5’フルオレセイン基6-FAM、全長ホスホロチオエート主鎖および2’-O-メチル修飾リボース分子ベルギー国、Eurogentec社製を含有する。二次抗体の蛍光シグナルとの干渉を回避するために、免疫組織化学的分析には非標識のAONを用いた。RT-PCR分析のためのプライマー表5、配列は要求に応じて公表するは、Eurogentec社ベルギー国によって合成された。RNAの単離とRT-PCR分析トランスフェクションの24~48時間後に総RNAを培養筋管から単離したRNABeeRNAisolationsolvent;オランダ国、CamproScientific社製。300ngの総RNAをCthermポリメラーゼオランダ国、RocheDiagnostics社製を用いたRT-PCR分析に付し、20μlの反応系、60°Cで30分、種々のDMD遺伝子特異的リバースプライマー表5をプライマーとして会合させた。初期PCRとしては、94°C40秒、60°C40秒そして72°C60秒からなるサイクルを20サイクル行った。次いで、得られた反応液1μlをネステッドPCRに付し、94°C40秒、60°C40秒そして72°C60秒からなるサイクルを32サイクル行って再増幅した。PCR産物は1.5または2のアガロースゲル上で分析した。転写産物の定量のためには、ネステッドPCRを24サイクル行った。PCR産物は、DNA7500LabChipRKitとAgilent2100bioanalyzerオランダ国、AgilentTechnologies社製を用いて分析した。配列の解析RT-PCR産物は、QIAquickGelExtractionKitQiagen社製を用いてアガロースゲルから単離した。ダイレクトDNAシークエンシングは、ライデンゲノムテクノロジーセンターLGTCがBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionkitPEAppliedBiosystems社製を用いて実施し、ABI3700SequencerPEAppliedBiosystems社製で解析した。本発明のオリゴヌクレオチドを含む転写産物をコードする発現ベクタージストロフィンmRNA前駆体およびAONは共に代謝回転率が決まっているので、本発明のDMDフレーム補正治療は、AONの反復投与を必要とする。しかも、ジストロフィンmRNA前駆体の転写およびスプライシングが起こる核内で、比較的高濃度のアンチセンスRNAが必要とされる。そこで本発明者らは、特定のAON配列が修飾遺伝子に組み込まれたベクター系を構築した。この実施例では、このような態様をU7核内低分子RNAU7snRNAに関連して説明する。U7snRNAは、ヒストンmRNA前駆体の3’末端のプロセシングに関与するU7リボ核タンパク質粒子U7snRNPのRNA成分である。その機能に固有の現象として、U7snRNAは細胞質から効率的に輸送されて核に戻り、核では非常に安定なU7snRNP複合体に組み込まれる。β-サラセミアに対するAONに基づく遺伝子治療の研究において、類似のアプローチの適用に成功した文献53、54。これらの研究では、修飾U7snRNA遺伝子を含む種々のプラスミドを遺伝子工学的に作製しており、修飾U7snRNA遺伝子は、ヒストンmRNA前駆体に対するU7snRNA遺伝子内の天然のアンチセンス配列を、β-グロブリン遺伝子内のβ-サラセミア関連異常スプライシング部位を標的としたアンチセンス配列で置換したものである。このプラスミドのトランスフェクションの後には、正しいスプライシングおよび全長β-グロブリンタンパク質の発現を修復することができ、その効率は、種々の変異β-グロブリン遺伝子を発現する培養細胞で65にまで達することができた。種々のU7snRNA遺伝子構築物を文献53の記載に従って遺伝子工学的に作製したが、但し、β-グロブリン配列を、種々のAONから誘導したアンチセンス配列で正確に置換するという変更を加えた。この実施例では、マウスのエクソン46のスキッピングを誘導する際に有効だったm46AON4、6、9または11を、β-グロブリン配列を置換するアンチセンス配列として用いた。センス構築物も負の対照として含めたm46SON6。シークエンシングで構築物を確認した後に、プラスミドを培養C2C12マウス筋芽細胞にトランスフェクトすることによりinvitroで試験した。U7snRNA-m46AON6構築物が最も効率的だった。AON-U7snRNA遺伝子構築物の送達性を向上するために、組換えアデノ随伴ウイルスrAAVのベクターにクローニングした。AAVは、非病原性で、ヘルパー依存性の生活環を示す一本鎖DNAパルボウイルスである。他のウイルスアデノウイルス、レトロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスとは対照的に、rAAVベクターは成熟骨格筋の形質導入に非常に効率的である。古典的なDMD遺伝子添加研究にrAAV用いることは、そのパッケージングの限度に限りがある<5kbが故に妨げられていたが、ここではずっと小さなU7snRNAアンチセンス構築物<600bpの成熟マウス骨格筋への効率的な送達にrAAVを用いる。マウスC2C12筋管へのトランスフェクションに続くエクソン46のスキッピングの誘導は、U7-m46AON6構築物が最も効率的であり、これをNotI断片としてrAAVベクターStratagene社製にクローニングした。このベクターは、AAV-由来ITR配列間にクローニングされた緑色蛍光タンパク質の遺伝子GFP-cDNAを含有する。感染後、GFPタンパク質は、筋肉における形質導入効率の決定を可能とする。U7-AON構築物を単独、またはGFP遺伝子に隣接してかその遠位に含む種々のベクターを遺伝子工学的に作製した。ベクターの挿入物は、配列の解析により確認した。rAAVウイルスを産生するために、293細胞にU7-AON-rAAVプラスミドと共に、パッケージング/ヘルパープラスミドとなるpDP-5をコトランスフェクトした。このパッケージング/ヘルパープラスミドは、AAVベクターの増幅とパッケージングに必要な全てのAAV配列とアデノウイルス配列を含む改良ヘルパープラスミドである。JKleinschmidt博士ドイツ国、ハイデルベルグ、dkfzより寄贈されたpDP-5プラスミドは、感染性rAAV1mlあたり1012個のウイルス粒子に達する高い力価での産生を容易にし、野生型のAAVまたはアデノウイルスによる汚染はない。精製および濃縮に続いて、二種の構築物、即ち、rAAV-U7m46AON6とrAAV-GFP-U7m46AON6について、C2C12マウス筋管に二種のMOI感染多重度で感染させることにより試験した。感染の7日後にRNAを単離し、RT-PCR分析を材料と方法の欄の記載に従って行った。rAAV-m46AON6構築物は最も効率的であり、エクソン46のスキッピングを20に達するレベルで誘導した図17参照。表題:ダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピングAONの組み合わせを用いてエクソン43とエクソン44のダブルエクソンスキッピングを誘導し、エクソン43のナンセンス変異に冒された一人の患者から得た筋管でジストロフィン合成を修復した。エクソン46~50の欠失を有する別の一人の患者では、治療効果のある、エクソン45とエクソン51のダブルエクソンスキッピングが達成された。注目すべきことに、対照筋管では、AONの後者の組み合わせにより、エクソン45~51の全伸長鎖のスキッピングが生じた。このようなインフレームマルチエクソンスキッピングは、種々のDMD発症性変異を有する一連の患者の治療に役立つと考えられた。実際に、エクソン48~50の欠失を有する患者から得た筋管でその可能性を証明する。マルチエクソンスキッピングの適用は、より大きなDMD患者群のためのより不変的な方法を提供する。AONは近年、ヒト疾患の研究や治療において魅力的な手段となった。最初のうちAONは、発生過程を明らかにしたり、悪性または異常な遺伝子の発現を抑制したりするための、遺伝子の配列特異的阻害に用いられていたDennisetal1998Stevensonetal1999NaseviciusandEkker2000CoreyandAbrams2001Dove2002。これらの研究では、AONはdsRNAのRNAaseHによる分解を仲介したり、転写や翻訳の開始を妨げたりした。しかしながら、AONはmRNA前駆体のスプライシングを調節することも可能であるSierakowskaetal1996。疾病発症性点変異の少なくとも15がRNAスプライシングの欠陥をもたらすと推定されていることからKrawczaketal1992Cartegnietal2002Burattietal2003、後者の適用法は、将来的な遺伝子治療と密接に関連すると考えられる。例えば、RNAaseH耐性AONは、潜在的スプライス部位のブロッキングによる擬似エクソンpseudoexonsのスキッピングをβ-グロブリン遺伝子Sierakowskaetal1996と嚢包性線維症膜貫通調節遺伝子Friedmanetal1999で誘導することに成功した。また、通常はスキップされる変異BRCA1エクソンおよび変異SMN2エクソンの包含を誘導するために、スプライシングエンハンサー因子を人為的に導入するための10個のアルギニン-セリンジペプチドリピート配列で連結したAONをinvitroで用いたCartegniandKrainer2003。悪性のイソフォームを非悪性のイソフォームに変換するために、癌関連遺伝子に対してAONを用いた場合に、AONは選択的スプライシング比率の改変にも有効であることが示されたMercatanteetal20012002。最後になるが、軽んじるべきではない用途としては、変異転写産物のリーディングフレームを補正するために特異的なエクソンスキッピングを誘導し、部分的に機能性を有するタンパク質を翻訳できるようにするという、最近開発された見込みあるAONの用途が挙げられる。ジストロフィンをコードしているDMD遺伝子は、この最後の用途に適している。このタンパク質は、アクチンフィラメントに結合するN-末端ドメイン、中央のロッドドメイン、およびジストロフィン-糖タンパク質複合体に結合するC-末端システインリッチドメインからなるHoffmanetal1987Koenigetal1988YoshidaandOzawa1990。リーディングフレームを中断させるDMD遺伝子の変異は、ジストロフィン機能の完全な喪失をもたらし、重症のデュシェンヌ型筋ジストロフィーDMDMIM310200を発症させるHoffmanetal1988Koenigetal1989Ervastietal1990。一方、軽症のベッカー型筋ジストロフィーBMDMIM300376は、上記と同じ遺伝子内のフレームシフトを伴わない変異の結果であり、この変異は、内部領域を欠失しているが、N-末端とC-末端を保持する部分的に機能性を有するジストロフィンをもたらすKoenigetal1989DiBlasietal1996。DMD患者およびBMD患者の3分の2超が、1個以上のエクソンの欠失を有するdenDunnenetal1989。驚くべきことに、非常に軽症のBMDを発症しているが、中央のロッドドメインの67までを欠く患者が報告されているEnglandetal1990Winnardetal1993Mirabellaetal1998。このような報告は、大きな欠失であっても転写産物がインフレームである限り、部分的に機能性を有するジストロフィンの産生が可能であることを示唆する。スプライシングを改変するためのAONは、オープンリーディングフレームを修復し、重症のDMD表現型を軽症のBMD表現型に変換する。いくつかの研究によって、治療を目的としたAON誘導性の単一エクソンスキッピングが、mdxマウスモデルから得た細胞Dunckleyetal1998Wiltonetal1999Mannetal20012002Luetal2003および種々のDMD患者から得た細胞Takeshimaetal2001vanDeutekometal2001AartsmaRusetal20022003DeAngelisetal2002について報告されている。現在までに、本発明者らは20種のエクソンエクソン2、8、17、19、29、40~46、48~53、55および59のスキッピングの誘導に用いることのできる一連のAONを同定したAartsmaRusetal2002。すべてのDMD患者のうち、75超がこれらのエクソンのスキッピングの恩恵に与ると考えられた。これまでに、異なるDMDを患う患者8人から得た細胞で単一エクソンスキッピングの適用に成功しているvanDeutekometal2001AartsmaRusetal2003。これらの研究では、アウトオブフレーム欠失に隣接するエクソンまたはナンセンス変異を含むインフレームエクソンのスキッピングはリーディングフレームを修復し、処置細胞の約75~80でBMD様ジストロフィンの合成を誘導した。このような新規なジストロフィンは早くもトランスフェクションの16時間後に検出することができ、ジストロフィンはそれから4日間のうちに顕著なレベルまで増加し、少なくとも7日間は維持されたAartsmaRusetal2003。本発明では、ダブルエクソンスキッピングおよびマルチエクソンスキッピングを実施することにより図8、この手法の治療への適用性を著しく拡大する。アウトオブフレームエクソンにナンセンス変異を有する一人の患者と、1個のエクソンのみのスキッピングでは回避できない欠失を有する別の一人の患者においては、2個のエクソンの同時スキッピングダブルエクソンスキッピングに続いてリーディングフレームが修復された。さらに、連続したエクソン全てからなる伸長鎖のスキッピングマルチエクソンスキッピングによって、既知のDMD変異のうちの14までを修復する可能性のあるBMD様欠失が生じた。材料と方法AONとプライマーエクソン44を標的とするエクソン内部AONh44AON1およびエクソン51を標的とするエクソン内部AONh51AON2は公知のものであるAartsmaRusetal2002。エクソン43標的AONおよびエクソン45標的AONはこの研究のために特別に設計したh43AON5:CUGUAGCUUCACCCUUUCC;h45AON5:GCCCAAUGCCAUCCUGG。AONのBLAST分析では、ヒトゲノム内の他の配列との完全なホモロジーは発見されなかった最大ホモロジー:94、最小E値:0.3。すべてのAONは、5’フルオレセイン基6-FAM、全長ホスホロチオエート主鎖および2’-O-メチル修飾リボース分子Eurogentec社製を含有する。二次抗体の蛍光シグナルとの干渉を回避するために、免疫組織化学的分析には非標識のAONを用いた。RT-PCR分析のためのプライマー図8は、Eurogentec社によって合成された配列は要求に応じて公表する。筋原細胞の培養とAONによるトランスフェクションヒト対照と2人のDMD患者DL470.2エクソン46~50の欠失および50685.1エクソン48~50の欠失について、筋生検材料から原始筋芽細胞を単離し、公知の方法AartsmaRusetal2002で培養した。血清欠乏条件で7~14日間培養した後に、コンフルエントに達した培養筋芽細胞から筋管を取り出した。筋管に各AON200nMを含む混合物をトランスフェクトした。ポリエチレンイミンPEIをトランスフェクション試薬とし、製造者の説明書ExGen500Fermentas社製に添付のものに従って使用した。各AONにつき別々のAON-PEI希釈物を調製し、トランスフェクトするAON1μgあたり3.5μlのPEIを用いた。エクソン43に点変異を有する患者DL90.3については、繊維芽細胞のみが提供されていた。MyoD遺伝子を含有するアデノウイルスベクターAd50MyoDによる感染感染多重度MOIは50~100に続いて、公知のプロトコールMurryetal1996Roestetal1996AartsmaRusetal2002Havengaetal2002に従って繊維芽細胞の筋発生を強制的に行った。トランスフェクション条件は上記のものと同じであった。RNAの単離とスキップ産物のRT-PCR分析RNAの単離、RT-PCRおよび配列の解析を公知の方法AartsmaRusetal2002に従って行った。プライマーの位置については、図8を参照されたい。スキップ産物の定量ためには、ネステッドPCRを24サイクル行った。PCR産物は、DNA1000LabChipKitと2100BioanalyzerAgilentTechnologies社製を用いて分析した。全長DMD遺伝子のスプライシングを分析するために、1μgのRNA、ランダムヘキサマープライマーおよびSuperScriptIIIInvitrogen社製を用いてRT反応を行った。PCR分析は、公知の短縮タンパク質アッセイproteintruncationtest、PTT用プライマーRoestetal1993を用いて行った。PCRプライマーのいくつかは患者DL470.2では欠失しているエクソンに位置しているので、エクソン41、42、45、53と54のそれぞれに対するさらなるプライマーを特別に設計した配列は要求に応じて公表する。ジストロフィンタンパク質の分析免疫組織化学的分析およびウェスタンブロット分析は公知の方法AartsmaRusetal2002に従って行った。ミオシンポリクローナル抗体L53オランダ国、アムステルダムメディカルセンターAmsterdamMedicalCenter、MvandenHoff博士より寄贈はミオシンを検出するために用いた。MANDYS1英国、ノースイーストウェールズインスティチュート、GMorris博士より寄贈、NCL-DYS2NovacastraLaboratories社製およびNCL-DYS1NovacastraLaboratories社製はジストロフィンを検出するために用いた。ウェスタンブロット分析では、ジストロフィンレベルをLumiAnalyst30Roche社製を用いて定量した。結果2人のDMD患者におけるダブルエクソンスキッピング単一エクソンのみのスキッピングは、すべての変異のリーディングフレームの修復に十分ではない。かなりの数の変異においては、2個のエクソンを同時にスキップする必要がある図8のA。例えば、患者DL90.3はエクソン43にナンセンス変異を有する。この単一エクソンがアウトオブフレームであることを考慮すると、エクソン43のスキッピングはナンセンス変異を取り除くが、リーディングフレームを修復しない。エクソン43とエクソン44との組み合わせはインフレームなので、これら両方のエクソンの同時スキッピングを目的とした。患者DL470.2は、エクソン46~50の欠失に冒されている。フレームの修復にはこの欠失に隣接する2個のエクソンの共スキッピングが必要である図8のA。両方の患者のそれぞれから得た培養筋管に、エクソン43特異的AONとエクソン44特異的AONとの混合物DL90.3の場合またはエクソン45特異的AONとエクソン51特異的AONとの混合物DL470.2の場合をトランスフェクトした。蛍光標識AONの核への特異的な取り込みのあった細胞数から明かなように、トランスフェクション効率は概ね80を超えた。トランスフェクションの24時間後または48時間後のRT-PCR分析は、実際に両方の患者で特異的なダブルエクソンスキッピングが行われたことを示し患者DL90.3および患者DL470.2について、それぞれ総転写フラグメントの30および75、この結果は配列の解析により確認した図9のAおよび図10のA。予想した通り、ダブルエクソンスキッピングに加えて、単一エクソンスキッピングを患者DL90.3エクソン44、総転写産物の27と患者DL470.2エクソン51、総転写産物の12で検出した。DMD転写産物よりも大きな領域やその他の領域がAON処理の影響を受けていないことを確認するために、全長DMD遺伝子について、一連のエクソンの組み合わせを用いたRT-PCR分析を行った。処理筋管と非処理筋管の両方で、DMD遺伝子にさらなる異常なスプライシングパターンは検出されなかった図11。ジストロフィンの内部領域に対する抗体MANDYS1およびC末端部分に対する抗体Dys2の2種を用いた免疫組織化学的分析は、ダブルエクソンスキッピングにより得られたインフレーム転写産物がBMD様ジストロフィンを産生したことを示した。ミオシン陽性筋管の平均で70が、AONトランスフェクションに応答してジストロフィン発現を示した図9のBおよび図10のB。ウェスタンブロット分析により、トランスフェクションの4日後の患者DL90.3およびトランスフェクションの2日後の患者DL470.2においてジストロフィンの存在を確認したところ、その量は対照筋管と比べてそれぞれ3.3および1.8であった図9のCおよび図10のC。マルチエクソンスキッピング患者DL470.2で誘導されたようにエクソン44が直接エクソン52にスプライシングされることにより、インフレーム転写産物が産生された。これらエクソンの間に介在するエクソン全てからなる伸長鎖のスキッピング即ち、マルチエクソンスキッピングを誘導することにより、種々のより小さな内部DMD変異にまたがるBMD様欠失エクソン45~51が産生されると考えた図8のB。マルチエクソンスキッピングは、エクソン45特異的AONとエクソン51特異的AONとをそれぞれ200nM含む混合物で処理したヒト対照筋管個体:KM109で初めに試験した図12のA。標的としたエクソン45~51のスキッピングによって生じると考えられる産物に対応する大きさの、新規な短い転写産物が観察された。実際に、配列の解析により、エクソン44が直接エクソン52にスプライシングされたことが明らかになったデータは示さない。その後、上記AON混合物をエクソン48~50の欠失を有するDMD患者50685.1から得た筋管に投与した図8のB。エクソン45~51のすべてのエクソンのAON誘導性スキッピングにより、目的としたインフレーム転写産物が得られた図12のA。Uで連結したAONの組み合わせを用いた、ダブルエクソンスキッピングとマルチエクソンスキッピング1個のmRNA前駆体分子から1個よりも多くのエクソンをスキップするには、使用するAONがすべて同じ核内に存在し、同一の分子を標的とする必要がある。このような確率を特異的に増やすために、エクソン45AONとエクソン51AONh45AON5とh51AON2とを10個のウラシルヌクレオチドで連結したものを含有する結合型AONを設計した図12のB。このU連結AONをヒト対照個体:KM109および2人のDMD患者DL470.2と50685.1のそれぞれから得た筋管へトランスフェクトし、次いでRT-PCR分析を行ったところ、エクソン52にエクソン44がスプライシングされたインフレーム転写産物を産生するというAONの効力が明らかになった図12のA。配列の解析により確認したところ、このマルチエクソンスキッピングはエクソンの境界で特異的且つ正確に生じたデータは示さない。患者50685.1とヒト対照の筋管では、U連結AONはAONの混合物よりも効率的であることが定量により明かとなったが、患者DL470.2の筋管では異なっていた図12のC。考察実際に誘導した単一エクソンの誘導性スキッピングは、DMD患者から得た培養筋細胞において、リーディングフレームを補正してBMD様ジストロフィンの合成を誘導する治療可能性を示したTakeshimaetal2001vanDeutekometal2001DeAngelisetal2002AartsmaRusetal2003。この実施例では、治療を目的とする標的アンチセンス誘導性マルチエクソンスキッピングの可能性を示す。複数のエクソンの自発的スキッピングは、低レベルであるが天然でしばしば生じる。このようなスキッピングはDMD患者と非罹患個体の両方で検出されているSironietal2002。さらに、この現象はmdxマウスモデルとDMD患者におけるジストロフィン陽性復帰繊維の発生の根底にあるメカニズムであると示唆されているSherrattetal1993Thanhetal1995Luetal2000。マルチエクソンスキッピングは、mdxマウスの筋細胞における変異エクソン23の標的スキッピングを目的としたDMD遺伝子治療研究でも観察されたDunckleyetal1998Wiltonetal1999Bertonietal2003。このエクソンの3’-スプライス部位に対するAONとDNA-RNAキメラオリゴヌクレオチドの両方が、エクソン23に隣接しているエクソンもスキップした、短いインフレーム転写産物またはアウトオブフレーム転写産物を産生した。この実施例では、マルチエクソンスキッピングの誘導に特に焦点を当てた。AONの組み合わせを用いることにより、エクソン43~44やエクソン45~51におけるダブルエクソンスキッピングを患者から得た培養筋管で誘導した。個々の筋管の免疫組織化学的分析は、このスキッピングにより70に達する筋管でジストロフィンの合成を可能にしたことを示す。この百分率は、単一エクソンスキッピングの研究でこれまでに得られた値75~80AartsmaRusetal2003よりも著しく低いものではなかった。この結果は、2種のAONを同時にトランスフェクトすることとその場合のスキッピング能は、単一AONに比べて著しく効率が悪いわけではないことを示唆する。しかしながら、多くの残存するジストロフィン陰性筋管では、単一エクソンスキッピングのみが生じた。患者から得た総筋管の培養物から調製したタンパク質抽出物のウェスタンブロット分析は、ジストロフィン濃度が比較的低い3未満ことを示した。免疫組織化学的分析で高いレベル70が観察されたことを考慮すると、矛盾があるようだ。しかしながらこの矛盾は、免疫組織化学的分析では1つのミオシン陽性筋管に焦点を当てているのに対し、ウェスタンブロット分析のサンプルには非常に多くのジストロフィン陰性細胞も含まれるという事実によって説明することができる。さらに、対照タンパク質サンプルを得た培養細胞は、2倍も高い筋原性即ち、培養患者細胞では40であるのに対し、対照サンプルでは90を示したので、より多くのジストロフィン産生細胞が含まれていた。最後に、ウェスタンブロット分析の対照タンパク質サンプルは、分化の全期間2週間にわたりジストロフィンを発現していた筋管から得たものであるのに対し、患者から得た筋管では、ジストロフィン合成は分析時にのみ最大でも4日間だけ誘導した。筋管はトランスフェクションから数日間のみ生存可能であることから、これより長い発現期間を達成することはできない。エクソン45特異的AONとエクソン51特異的AONを種々の割合で用いて評価したところ、最も高いダブルエクソンスキッピング率が1:1の割合のときに得られたデータは示さない。両方のAONが同じ効率で核に進入した。ダブルエクソンスキッピングに加えて単一エクソンスキッピングが、特にエクソン44患者DL90.3の場合とエクソン51患者DL470.2の場合について観察された。これは、mRNA前駆体の局部二次構造はこれらのエクソンを標的としているAONの影響をより強く受け、その結果、エクソン43とエクソン45のそれぞれにAONが接近しづらくなっているためと考えられる。2つのAONが共に同じ核に取り込まれるだけでなく、同じRNA分子にハイブリダイズする確率を向上するために、10個のウラシルヌクレオチドで連結した2つのAONからなるAONを設計した。2種のAONの混合物と比べると、Uで連結したAONは、実際にヒト対照とエクソン48~50の欠失を有する患者のそれぞれの筋管において、高いレベルのマルチエクソンスキッピングを誘導した。対照的に、未だその理由は不明であるが、エクソン46~50の欠失を有する患者の筋管では、ダブルエクソンスキッピングの誘導効率が低かった。追跡実験によって、U-リンカーの長さの影響について評価したところ、顕著な差は見られなかったデータは示さない。マルチエクソンスキッピングのメカニズムについては、2つの説が考えられる。第一は、mRNA前駆体の二次構造における、AON誘導性の全体的な改変によってエクソン45とエクソン51の間に存在するエクソンとイントロンの両方からなる全領域がスプライシングにより除かれるという説である。第二は、エクソン45~51の個々のエクソンのスプライシングが、エクソン44がエクソン45にスプライシングされるよりも早く生じるとする説であるイントロン44の長さが270kbであることを考慮すると、ありえないわけではない。この場合、エクソン45とエクソン51のそれぞれにハイブリダイズしたAONが存在するので、スプライシング機構はエクソン45~51を1個の大きなエクソンとみなしてそれを削除する。後者の説は、上流のイントロンよりも前に下流のイントロンがスプライシングを受けるDMD遺伝子内領域でのみマルチエクソンスキッピングが有効であることを示唆する。本発明者らは、現在、DMD遺伝子の他の領域でUで連結したAONの種々の組み合わせを用いて、この説の立証に取り組んでいる。単一エクソンスキッピングのみを考慮すると、アンチセンスに基づくリーディングフレーム補正治療は、理論的にはDMD患者の75超に利益をもたらすと考えられた。マルチエクソンスキッピングは、この百分率をDMD変異の大部分にまで著しく拡大すると考えられるが、N-末端の機能的に重要なドメインやシステインリッチC-末端ドメインに影響を与える変異あるいはプロモーター領域、第一エクソンまたは転移に関与する変異を除くものとする。しかしながら、後者の変異は、本発明者らのデータベースに報告されているDMDを有する全患者の8未満にしか見られないdenDunnen1996。マルチエクソンスキッピングは、このアプローチの恩恵に与る患者の数を増加させるばかりでなく、もっと重要なことには、このアプローチの変異特異性を低減させる。この研究で示したエクソン45~51のマルチエクソンスキッピングは、DMD変異データベースに報告されている全欠失変異の14および小さな変異の全量のうちの6について、フレームを修復すると考えられたdenDunnen1996。さらに、軽症BMD表現型と関連することが知られる比較的大きなインフレーム欠失を生じるといった治療可能性を提供するEnglandetal1990Winnardetal1993Mirabellaetal1998。この手法の最終的な治療への適用は、invivoでの効率に大きく依存する。Luおよびその共同研究者ら2003は、最近、プルロニック共重合体F127を送達試薬として用いた、mdx筋肉におけるAON誘導性エクソン23スキッピングについて報告した。正常に近いレベルのほぼ全長といえるジストロフィンが多くの筋繊維で観察され、筋肉の機能を向上させた。このような効果は2~4週間で最適となったが、AON注射の3ヶ月後でもジストロフィンは検出可能であったLuetal2003。本発明者らの経験では、筋細胞におけるAONのinvitroの効果とinvivoの効果は非常によく相関するので、この結果は、現在行っているマウスのマルチエクソンスキッピングに関する研究が有望であることの根拠となる。本実施例に記載したデータに関するURLを次に示す:オンラインヒトメンデル遺伝OnlineMendelianInheritanceinManOMIM、httpwwwncbinlmnihgovOmimDMDおよびBMDに関するデータ。実施例5の参考文献AartsmaRusABremmerBoutMJansonAdenDunnenJvanOmmenGvanDeutekomJTargetedexonskippingasapotentialgenecorrectiontherapyforDuchenneMusculardystrophyNeuromusculDisord12S71AartsmaRusAJansonAAKamanWEBremmerBoutMdenDunnenJTBaasFVanOmmenGJetalTherapeuticantisenseinducedexonskippinginculturedmusclecellsfromsixdifferentDMDpatientsHumMolGenet12907914BertoniCLauCRandoTARestorationofdystrophinexpressioninmdxmusclecellsbychimeraplastmediatedexonskippingHumMolGenet1210871099BurattiEBaralleFEPaganiFCanapatchinaskippedexonmakethepremRNAsplicingmachinerunbetterTrendsMolMed9229232CartegniLChewSLKrainerARListeningtosilenceandunderstandingnonsenseexonicmutationsthataffectsplicingNatRevGenet3285298CartegniLKrainerARCorrectionofdiseaseassociatedexonskippingbysyntheticexonspecificactivatorsNatStructBiol10120125CoreyDRAbramsJMMorpholinoantisenseoligonucleotidestoolsforinvestigatingvertebratedevelopmentGenomeBiol2reviews10151reviews10153DeAngelisFGSthandierOBerarducciBTosoSGalluzziGRicciECossuGBozziniIChimericsnRNAmoleculescarryingantisensesequencesagainstthesplicejunctionsofexon51ofthedystrophinpremRNAinduceexonskippingandrestorationofadystrophinsynthesisinDelta4850DMDcellsProcNatlAcadSciUSA9994569461denDunnenJライデン筋ジストロフィーページTheLeidenMuscularDystrophypageshttpwwwdmdnl2003年12月10日付でアクセスdenDunnenJTGrootscholtenPMBakkerEBlondenLAGinjaarHBWapenaarMCvanPaassenHMvanBroeckhovenCPearsonPLvanOmmenGJTopographyoftheDuchennemusculardystrophygeneFIGEandcDNAanalysisof194casesreveals115deletionsand13duplicationsAmJHumGenet45835847DennisJUDeanNMBennettCFGriffithJWLangCMWelchDRHumanmelanomametastasisisinhibitedfollowingexvivotreatmentwithanantisenseoligonucleotidetoproteinkinaseCalphaCancerLett1286570DiBlasiCMorandiLBarresiRBlasevichFCornelioFMoraMDystrophinassociatedproteinabnormalitiesindystrophindeficientmusclefibersfromsymptomaticandasymptomaticDuchenneBeckermusculardystrophycarriersActaNeuropathol92369377DoveAAntisenseandsensibilityNatBiotechnol20121124DunckleyMGManoharanMVillietPEperonICDicksonGModificationofsplicinginthedystrophingeneinculturedMdxmusclecellsbyantisenseoligoribonucleotidesHumMolGenet710831090EnglandSBNicholsonLVJohnsonMAForrestSMLoveDRZubrzyckaGaarnEEBulmanDEHarrisJBDaviesKEVerymildmusculardystrophyassociatedwiththedeletionof46ofdystrophinNature343180182ErvastiJMOhlendieckKKahlSDGaverMGCampbellKPDeficiencyofaglycoproteincomponentofthedystrophincomplexindystrophicmuscleNature345315319FriedmanKJKoleJCohnJAKnowlesMRSilvermanLMKoleRCorrectionofaberrantsplicingofthecysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorgenebyantisenseoligonucleotidesJBiolChem2743619336199HavengaMJLemckertAAOphorstOJvanMeijerMGermeraadWTGrimbergenJvanDenDoelMAVogelsRvanDeutekomJCTJansonAAMdeBruijnJDUytdehaagFQuaxPHLogtenbergTMehtaliMBoutAExploitingthenaturaldiversityinadenovirustropismfortherapyandpreventionofdiseaseJVirol7646124620HoffmanEPBrownRHJrKunkelLMDystrophintheproteinproductoftheDuchennemusculardystrophynlocusCell51919928HoffmanEPFischbeckKHBrownRHJohnsonMMedoriRLoikeJDHarrisJBetalCharacterizationofdystrophininmusclebiopsyspecimensfrompatientswithDuchennesorBeckersmusculardystrophyNEnglJMed31813631368KoenigMBeggsAHMoyerMScherpfSHeindrichKBetteckenTMengGetalThemolecularbasisforDuchenneversusBeckermusculardystrophycorrelationofseveritywithtypeofdeletionAmJHumGenet45498506KoenigMMonacoAPKunkelLMThecompletesequenceofdystrophinpredictsarodshapedcytoskeletalproteinCell53219226KrawczakMReissJCooperDNThemutationalspectrumofsinglebasepairsubstitutionsinmRNAsplicejunctionsofhumangenescausesandconsequencesHumGenet904154LuQLMannCJLouFBouGhariosGMorrisGEXueSAFletcherSPartridgeTAWiltonSDFunctionalamountsofdystrophinproducedbyskippingthemutatedexoninthemdxdystrophicmouseNatMed910091014LuQLMorrisGEWiltonSDLyTArtemyevaOVStrongPPartridgeTAMassiveidiosyncraticexonskippingcorrectsthenonsensemutationindystrophicmousemuscleandproducesfunctionalrevertantfibersbyclonalexpansionJCellBiol148985996MannCJHoneymanKChengAJLyTLloydFFletcherSMorganJEPartridgeTAWiltonSDAntisenseinducedexonskippingandsynthesisofdystrophininthemdxmouseProcNatlAcadSciUSA984247MannCJHoneymanKMcCloreyGFletcherSWiltonSDImprovedantisenseoligonucleotideinducedexonskippinginthemdxmousemodelofmusculardystrophyJGeneMed4644654MercatanteDRMohlerJLKoleRCellularresponsetoanantisensemediatedshiftofBclxpremRNAsplicingandantineoplasticagentsJBiolChem2774937449382MercatanteDRSazaniPKoleRModificationofalternativesplicingbyantisenseoligonucleotidesasapotentialchemotherapyforcancerandotherdiseasesCurrCancerDrugTargets1211230MirabellaMGalluzziGManfrediGBertiniERicciEDeLeoRTonaliPServideiSGiantdystrophindeletionassociatedwithcongenitalcataractandmildmusculardystrophyNeurology51592595MurryCEKayMABartosekTHauschkaSDSchwartzSMMuscledifferentiationduringrepairofmyocardialnecrosisinratsviagenetransferwithMyoDJClinInvest9822092217NaseviciusAEkkerSCEffectivetargetedgeneknockdowninzebrafishNatGenet26216220RoestPARobertsRGvanderTuijnACHeikoopJCvanOmmenGJdenDunnenJTProteintruncationtesttorapidlyscreentheDMDgenefortranslationterminatingmutationsNeuromusculDisord3391394RoestPAvanderTuijnACGinjaarHBHoebenRCHogerVorstFBBakkerEdenDunnenJTvanOmmenGJApplicationofinvitroMyodifferentiationofnonmusclecellstoenhancegeneexpressionandfacilitateanalysisofmuscleproteinsNeuromusculDisord6195202SherrattTGVulliamyTDubowitzVSewryCAStrongPNExonskippingandtranslationinpatientswithframeshiftdeletionsinthedystrophingeneAmJHumGenet5310071015SierakowskaHSambadeMJAgrawalSKoleRRepairofthalassemichumanbetaglobinmRNAinmammaliancellsbyantisenseoligonucleotidesProcNatlAcadSciUSA931284012844SironiMCaglianiRPozzoliUBardoniAComiGPGiordaRBresolinNThedystrophingeneisalternativelysplicedthroughoutitscodingsequenceFEBSLett517163166StevensonJPYaoKSGallagherMFriedlandDMitchellEPCassellaAMoniaBKwohTJYuRHolmlundJDorrFAODwyerPJPhaseIclinicalpharmacokineticandpharmacodynamictrialofthecraf1antisenseoligonucleotideISIS5132JClinOncol1722272236TakeshimaYWadaHYagiMIshikawaYMinamiRNakamuraHMatsuoMOligonucleotidesagainstasplicingenhancersequenceledtodystrophinproductioninmusclecellsfromaDuchennemusculardystrophypatientBrainDev23788790ThanhLTNguyenThiMHoriSSewryCADubowitzVMorrisGECharacterizationofgeneticdeletionsinBeckermusculardystrophyusingmonoclonalantibodiesagainstadeletionproneregionofdystrophinAmJMedGenet58177186vanDeutekomJCBremmerBoutMJansonAAGinjaarIBBaasFdenDunnenJTvanOmmenGJAntisenseinducedexonskippingrestoresdystrophinexpressioninDMDpatientderivedmusclecellsHumMolGenet1015471554WiltonSDLloydFCarvilleKFletcherSHoneymanKAgrawalSKoleRSpecificremovalofthenonsensemutationfromthemdxdystrophinmRNAusingantisenseoligonucleotidesNeuromusculDisord9330338WinnardAVKleinCJCoovertDDPriorTPappASnyderPBulmanDEetalCharacterizationoftranslationalframeexceptionpatientsinDuchenneBeckermusculardystrophyHumMolGenet2737744YoshidaMOzawaEGlycoproteincomplexanchoringdystrophintosarcolemmaJBiochem108748752アンチセンスオリゴヌクレオチドAONは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーDMDのための小分子薬物として、特定のエクソンスキッピングを誘導し、DMD転写産物の崩壊したリーディングフレームを修復することが報告されている。これにより、機能の大部分を有するBMD様ジストロフィンの合成と、重症DMD表現型の軽症BMD表現型への潜在的な変換が可能となる。これまで、本発明者らは2’-O-メチルホスホロチオエート2OMePSAONを用いてきた。この研究では、モルフォリノ-ホスホロジアミデート、構造的にロックされた核酸LNAまたはペプチド核酸PNAからなる主鎖を含む種々のAON類似体のスキッピング効率について調べた。PNAとモルフォリノ化合物とは対照的に、LNAはスプライス調節物質としては未だ試験されていない。最も効果的なAONであるエクソン46に対する2OMePSAONと比べて、LNAはより高いスキッピングレベルの誘導をヒト対照から得た筋管85対20とエクソン45欠失DMD患者から得た筋管98対75で示した。モルフォリノ誘導性スキッピングのレベルはたった5~6であり、PNAは効果がないと考えられた。さらに、3つ以下のミスマッチを有するLNAAONと2OMePSAONとの比較分析によって、LNAはより高いスキッピング効率を誘導するものの、配列特異性は低いことが明らかになった。このようなLNAの限界は、ヒトゲノムの他の場所における副作用の危険性を増大する。従ってオリゴ化学oligochemistryのさらなる発展を待っている現状では、標的DMDエクソンスキッピングのための最も好ましい化合物は2OMePSAONであると考える。アンチセンスオリゴヌクレオチドAONがmRNA前駆体のスプライシングを調節することは、いくつかの研究によって報告されている文献1。例えば、AONは、潜在的スプライス部位のブロッキングにより正常なスプライシングに修復し文献2、3、悪性のイソフォームを非悪性のイソフォームに変換する選択的スプライシングの発生率を改変し文献4、そして通常はスキップされる変異エクソンの包含を誘導する文献5。これらの研究では、AON処理は野生型mRNAの再構築を目的とした。一方、近年のデュシェンヌ型筋ジストロフィーDMD遺伝子治療研究においては、AONをジストロフィンmRNAの崩壊したリーディングフレームの修復に用いている。DMD患者は重症の筋変性に苦しむが、これはジストロフィンタンパク質の合成を未成熟の状態で中断させる、DMD遺伝子内のフレーム崩壊性変異によるものである文献6~9。対照的に、リーディングフレームに影響しないDMD遺伝子内変異は、内部領域を欠失しているが、部分的に機能性を有するジストロフィンを産生し、重症度の低いベッカー型筋ジストロフィーBMDをもたらす文献10、11。DMDリーディングフレームのAON誘導性修復は、特定のエクソンのスキッピングの誘導に基づいている。この手法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者とmdxマウスモデルのそれぞれから得た培養筋細胞に対する適用に成功している文献12~19。90に達する高いエクソンスキッピングレベルが達成され、顕著なレベルのBMD様ジストロフィンの合成が処置細胞の75超で可能となった文献17。合成されたジストロフィンは筋鞘の近傍に位置し、そして機能修復の確固たる指標であるジストロフィン糖タンパク質複合体を修復した。これらの研究で用いたAONは、RNaseH独立性にするための2’-O-メチル修飾リボース分子と、全長ホスホロチオエート主鎖を含んでいた2OMePSAON表6。2OMePSAONは、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性や、ホスホジエステルAONと比べて増加した取り込み量といった利点を有するものの、ホスホロチオエート主鎖が多少の細胞毒性を有することや、免疫原性応答を誘発する可能性があるという問題点も有する文献20、21。オリゴ化学の近年の発展は、ヌクレオチドの糖や主鎖への種々の修飾によって、種々の生物物理学的、生化学的そして生物学的な特性を有するAONを提供した。修飾AON類似体には、モルフォリノ-ホスホロジアミデートモルフォリノ化合物、構造的にロックされた核酸LNAおよびペプチド核酸PNSが含まれる文献21で検討している。モルフォリノ化合物では、DNAの糖リン酸主鎖がモルフォリノ-ホスホロジアミデートオリゴヌクレオチドで置換されている表6文献22、23。モルフォリノ化合物は非毒性であり、ヌクレアーゼ耐性であり文献23、そしてRNAへの親和性が増加していることから、RNAの二次構造を崩壊することが示唆されている文献1、22。一方、モルフォリノ化合物は電荷を帯びていないので、トランスフェクトするのが難しい。それにもかかわらず、スクレープローディング法scrapeloadingtechniqueやエトキシル化ポリエチレンイミンEPEIを用いた手法で妥当~良好なトランスフェクション効率が達成されている。モルフォリノ化合物はとりわけ、遺伝子のノックダウンによるゼブラフィッシュの発生過程の研究文献26や、invitroとinvivoでのβ-グロブリン遺伝子のスプライシングの調節文献25、27に使用されている。最近では、mdxマウスモデルで変異エクソン23のスキッピングを誘導するためにモルフォリノ化合物を用いている文献28。モルフォリノ化合物は、カチオン性リポプレックスを形成するために、センスオリゴ鎖連結鎖leashと組み合わせて細胞にトランスフェクトした。このようなモルフォリノ処理は、invitroとinvivoの両方でmdx筋細胞におけるジストロフィン合成を修復した。LNAは、リボースの2’-酸素を4’-炭素につなぐメチレンブリッジを有するDNA類似体である表6。このブリッジは3’内部構造の固定をもたらすので、リボース構造の可とう性を低減する文献1。LNAはヌクレアーゼ耐性であり、非毒性であり、そしてこれまでにいかなるDNA類似体について報告されているよりも高い親和性を、相補的なDNAとRNAに対して示す文献29、30。このような高い親和性故に、次のような利点と問題点が発生する。LNAは非常に効率的にその標的にハイブリダイズするが、15塩基対を超えるLNAは熱安定性の自己構造化selfstructuringを示す。さらに全長LNAは、PNAAONおよび2OMePSAONよりも低い配列特異性でハイブリダイズすると考えられる文献29、31。LNAは負の電荷を帯びているので、細胞への送達にはカチオン性脂質ポリマーを用いる。LNAは癌関連遺伝子の発現に対する強力な阻害剤であることが報告されている文献31が、スプライシング調節物質としてはこれまで研究されていない。PNAでは、DNAの糖リン酸主鎖がアキラルなポリアミド主鎖で置換されている表6文献32。PNAは2OMePS主鎖に比べてDNAとRNAに対する親和性が非常に増加しているので、より配列特異的であり、プロテアーゼ耐性およびヌクレアーゼ耐性であり、高濃度でも非毒性であることが示唆されている文献1、33。PNAが非イオン性であることの欠点は水溶性が不十分なことであり、この性質によりPNAのトランスフェクションが煩雑になる文献27、34。Sazaniおよびその共同研究者らは近年、4個のリシン残基をPNAのC末端にカップリングすることでこの問題を回避した文献27、35。リシンのカチオン性は水溶性を非常に向上させたので、トランスフェクション試薬を使用することなく、PNAが細胞と核へ進入するのを可能とした。PNAは、invitroでのマウスインターロイキン5レセプターのα鎖のスプライシング、およびinvitroとinvivoでのβ-グロブリ遺伝子のスプライシングの調節に有効であった文献27、35、36。今後の臨床研究のために好ましいAON類似体は、低い細胞毒性レベルで最も高いレベルのエクソンスキッピングを誘導するものである。この実施例では、対照生物と患者のそれぞれから得た筋管の両方においてDMDエクソン46に特異的な、公知の2OMePSAON文献16、37と、その類似体であるモルフォリノ類似体、LNA類似体とPNA類似体の効力、効率および適用性を比較した。結果ヒト対照筋管におけるAON類似体の比較分析種々のAON類似体表6の標的mRNA前駆体への結合親和性を測定するために、ゲル移動度シフトアッセイを行った。DNAAON、2OMePSAON、モルフォリノAON、LNAAONおよびPNAAONを32P標識エクソン46RNAフラグメントにハイブリダイズさせた図13のa。DNAAON、2OMePSAONおよびLNAAONはそれぞれはっきりとした移動度シフトを誘導し、これら類似体が標的RNAに結合できることを示した。モルフォリノAONおよびPNAAONについては、シフトは検出されなかった。この結果は、これら類似体は標的RNAに対する親和性が低いことを示唆した。しかしながら、これまでに行った実験において、顕著な移動度シフトを誘導しないにもかかわらず、実際にエクソンスキッピングを誘導するものがAONの中には存在することを観察している未発表結果。このような理由から、モルフォリノAONとPNAAONも、さらなる分析の対象とすることに決定した。いずれも5’-フルオロセイン基を有する種々のAON類似体のトランスフェクション条件は、ヒト対照筋管で最適化した図13のb。核蛍光シグナルの存在に基づいてトランスフェクション効率を測定したところ、2OMePSAON、モルフォリノAONおよびLNAAONは概ね80を超えた。PNAのトランスフェクション効率は一般的にこれよりも低かった~60-70。注目すべきことに、2OMePSAON、LNAAONおよびPNAAONについては蛍光発光の大部分が核内で見られたのに対し、モルフォリノ化合物の蛍光発光は明かに細胞質にも存在していた。これまでの実験によると、最も効率的なRT-PCRによって検出したスキッピングレベルは、500nMの2OMePSAONを用いた際に得られた文献17。以下の実験では、2OMePSAONの他に、LNAAONと、驚くべきことにモルフォリノAONがエクソン46のスキッピングの誘導に有効であることを示す図13のc。モルフォリノAONとLNAAONの濃度系列実験は、それぞれ用量が1μMと500nMのときに最も高いスキッピング効率が達成されることを示した。両方の類似体において、より高い濃度がさらに高いレベルのエクソン46スキッピングをもたらすことはなくデータは示さない、その代わりにモルフォリノAONでは、重度の細胞毒性作用が誘導された。500nMのLNAをトランスフェクトした培養筋管においては、トランスフェクションの6日後でも最小レベルの細胞毒性しか存在しなかったのに対し、200nMの2OMePSAONの場合には、同じ時点で重度の細胞死が観察されたデータは示さない。LNAのトランスフェクションにはより多くの単位のPEIを用いたので、上記の差はPEI誘導性細胞毒性によるものとは考えられない。高用量の2OMePSAONとLNAAONのそれぞれに応じて生じる、エクソン45とエクソン46の両方のスキッピングも低レベルであるが時折観察した図13のc。PNAは、20μMでもエクソン46のスキッピングを一貫して誘導しなかったデータは示さない。種々のAON類似体によるエクソン46のスキッピング効率は、RT-PCRフラグメントの定量により求めた図13のd。2OMePS20と比べると、LNAAONはより効率的85であったのに対し、モルフォリノAONのスキッピングレベルは6以下だった。患者から得た筋管におけるAON類似体の比較分析これまでに、2OMePSAONは対照サンプルと比べて高いレベルのエクソンスキッピングを患者から得た筋管で誘導することを観察した文献16、17。以下の実験では、この効果をエクソン45の欠失に冒されたDMD患者DL279.1から得た筋管で確認した。この患者では、エクソン46のスキッピングによりインフレーム転写産物が産生される。2OMePSAONについては、患者DL279.1で観察したエクソン46のスキッピングは75であったのに対し、対照筋管では20だった図13のc、d。LNAAONとモルフォリノAONもエクソンスキッピングを誘導可能であったがそれぞれ98および5、PNAは誘導できなかった図13のc、d。2OMePSAONと同様に、LNAは、対照筋管と比べて高いスキッピングレベルをDL279.1で示した98対85。しかしながら、この効果は、モルフォリノAONやPNAAONでは著しいものではなかった。用量効果と配列特異性に関する、LNAAONと2OMePSAONの比較LNAが最も高いスキッピングレベルを誘導したことから、最小有効用量を測定するために濃度系列実験を行った。RT-PCR分析図14のaおよび定量分析図14のbの結果は、ヒト対照筋管では、用量が500nM未満になると効率が97から30に著しく下落し、100nMで検出されるエクソン46のスキッピングは非常に低いレベル<1であることを示した。しかしながら、患者から得た筋管では、低用量によるエクソンスキッピングのレベルはより緩やかに下降し、用量が300nMの時に検出されるエクソン46のスキッピングのレベルは86であり、100nMでも顕著なレベル10であった図14のa、b。次いで、対照筋管よりも高いスキッピングレベルを示すという理由から患者筋管で、LNAAONと2OMePSAONの配列特異性を分析した。5’末端、3’末端または中央部分に1つまたは2つのミスマッチを有する5種のLNALNAmm1~LNAmm5、図15のaおよびエクソン46の3’方向にシフトした1つのLNALNA9、図15のaについて検討した。ゲル移動度シフトアッセイは、すべてのLNAが標的mRNA前駆体に結合し得ることを明らかにしたデータは示さない。その後、500nMのLNAを患者筋管にトランスフェクトした。RT-PCR分析図15のbおよび定量図15のcの結果は、3’末端に1つまたは2つのミスマッチを有するLNALNAmm1およびLNAmm4は、本来の100相補的なLNA8に匹敵する高いレベル71~94対100でエクソン46のスキッピングが誘導可能なことを示し、これはLNAの配列特異性が低いことを示唆した。中央に1つのミスマッチを有するLNALNAmm2は低レベル8のエクソンスキッピングを誘導したのに対し、中央に2つのミスマッチを有するLNALNAmm5と5’末端にミスマッチを有するLNALNAmm3は検出可能なスキッピングを誘導しなかった。LNA9はエクソン46に完全に相同であるにもかかわらず、エクソン46のスキッピングを誘導しなかった。3’ミスマッチ含有LNAの低濃度における効果についても調べたところ、LNA8と同等の低用量でエクソンスキッピングが観察されたデータは示さない。本来の配列を有する2OMePSオリゴ鎖と比べて最大で3つのミスマッチを有する5種の2OMePSオリゴ鎖類似体について、同様に患者筋管で試験した2OMePSmm1~2OMePSmm5、図15のd。LNAとは対照的に、3末端に1つまたは2つのミスマッチを有する2OMePSAON2OMePSmm1~2OMePSmm2は、本来のオリゴ鎖に比べて低いレベルのエクソン46スキッピングを誘導した7~17対48図15のe、f。3’末端に3つのミスマッチを有するオリゴ鎖2OMePSmm3や5’末端に1つのミスマッチを有するオリゴ鎖2OMePSmm4は、かろうじて検出可能なレベル1~2のエクソンスキッピングを誘導し、3つのミスマッチがオリゴ鎖全体に分散した2OMePS2OMePSmm5はエクソンスキッピングを誘導することはできなかった。ミスマッチを有する2OMePSAONおよびLNAについてトランスフェクション実験およびRT-PCR分析を数回繰り返したところ、得られる効率には再現性があった。本発明者らの結果は、2OMePSAONはLNAよりも配列特異性が高いことを示す。考察アンチセンス誘導性エクソンスキッピングに関するこれまでの研究には、2OMePSAONを用いた文献16、17、37。この実験では、さらなるAON類似体について、対照培養筋管とDMD患者から得た培養筋管のそれぞれにおいてDMDのエクソン46のスキッピングを誘導する効力、効率そして適用可能性を試験した。臨床試験を将来行うにあたって最も適したAON類似体は、高いレベルのエクソンスキッピングを誘導するのはもちろん、非毒性で、送達が容易であり、好ましくは比較的安価なものである。この実験で試験した、AONに代わる4種の類似体のうち、LNAのみが2OMePSAONよりも高いレベルのエクソンスキッピングを誘導した。モルフォリノ化合物は患者筋管と対照筋管の両方で、2OMePSよりも効率が低いながらもスキッピングを示したのに対し、PNAは全く効果がなかった。LNAAONと2OMePSAONの両方のエクソンスキッピングレベルが、対照細胞よりも患者から得た細胞で高かった。本発明者らは、これまでにこのような効果を他のDMD患者から得た細胞で観察しており文献17、これは、ナンセンス仲介RNA減衰NMDによるものであると仮定する。対照筋管においてNMDはアウトオブフレームスキップ産物を選択的に標的とし、スキップ産物の相対量に負の影響を与える。患者から得た細胞では、本来のアウトオブフレームmRNAはNMDに付されるのに対し、インフレームスキッピング産物はNMDに付されない。他の説明としては、患者では、局所的なスプライシングをすでに混乱させている欠失が存在するために、AON仲介エクソンスキッピングが実際に増幅されているというものがある。モルフォリノ誘導性エクソンスキッピングのレベルは、患者サンプルと対照サンプルで同等であった6対5。ゲル移動度シフトアッセイでは、モルフォリノAONとPNAAONについてシフトは見られず、標的mRNA前駆体に対するこのような明かに低い親和性にもかかわらず、モルフォリノ化合物はエクソン46のスキッピングを低レベルで誘導することができた。これは、標的RNAフラグメントへの正しいハイブリダイゼーションを妨げ得るセンスDNAオリゴ鎖EPEIカップリングトランスフェクションのための連結鎖にモルフォリノ化合物がハイブリダイズしていたという事実によって説明できる。細胞にトランスフェクトした後にモルフォリノ化合物は連結鎖からはずれるので、標的RNAにハイブリダイズすることが可能となる。Schmajukおよびその共同研究者らは、モルフォリノ化合物は2OMePSAONよりもβ-グロブリン遺伝子の野生型スプライシングの修復に効果的であることを見出した文献25。しかしながら、モルフォリノ化合物のトランスフェクション後には細胞質と核の両方に蛍光発光が見られることから、エクソンスキッピングが低レベルであることは、モルフォリノ化合物の効率が低いというよりはむしろ核への取り込みが不十分なためと考えられる。したがって、モルフォリノ化合物そのものとEPEIトランスフェクションに必要な連結鎖のさらなる最適化によって、エクソン46のスキッピングのレベルが向上すると考えられる。実際に、Gebskiおよびその共同研究者らは、mdxマウスにおけるエクソン23のスキッピングのレベルは、異なる連結鎖を用いると変化することを近年報告した文献28。PNA類似体とLNA類似体の配列は完全に同じであるものの、LNAは高レベルのエクソン46スキッピングを誘導するのに対し、PNAは検出可能なスキッピングを誘導しない。PNAオリゴ鎖は、モルフォリノ類似体や2OMePS類似体よりも高いレベルの正しくスプライシングされたβ-グロブリンmRNAを誘導することが報告されている文献27、35。この知見は、実際のところPNAはスプライシングを調節することができることを示し、この実験でエクソン46のスキッピングが見られないのは特定の標的RNA配列に本発明者らのPNAが結合できないか、PNA-RNA複合体の安定性が不十分なためであることを示唆した。さらなる実験によって、エクソン46標的配列に対する高い結合親和性を有するPNAを同定することができるであろう。LNAは比較的新しいAON類似体であり、これまで標的遺伝子の発現の阻害にのみ用いられていた文献29、31。この実験では、LNAがmRNA前駆体の強力な調節物質でもあることを示す。一連の実験では、LNAは対照転写産物の85で、そしてエクソン45の欠失を有するDMD患者から得た転写産物の98で、エクソン46のスキッピングを誘導した。これに比べて今まで使用していた2OMePSAONが対照細胞で誘導したエクソン46のスキッピングは20であり、エクソン45欠失転写産物におけるスキッピングは75だった。注目すべきことに、LNAは2OMePSAONよりも細胞毒性が低いようである。これらの結果に基づくと、LNAは、原則としてアンチセンス誘導性エクソンスキッピング研究のための有望な代替物であると考えられる。しかしながら残念なことに、短い配列14量体であるためにヒトゲノム内のいくつかの他の配列に完全に相同である。これらの大部分は遺伝子内またはその近傍の非コード領域に位置する。LNAを長くすると特異性が向上する文献29。ミスマッチを有するLNAを用いた本発明者らの実験の結果は、AONの3’部分に1つまたは2つのミスマッチを有するLNAが特異的LNAと同じくらい強力であることを示す。これは、たった12個の塩基対による結合がエクソン46のスキッピングの誘導に十分であることを示唆するが、LNAの融解温度が非常に高い本発明者らの14量体LNAの予想融解温度は131°Cである;表6ことを考慮すると、これは驚くべきことではない。しかしながら、この結果は、本発明者らのエクソン46特異的LNAは、このような12塩基対を含有するヒトゲノム内の他の配列にも望ましくない結合を示すことを意味する。例えば、7量体でも予想される融解温度は60°Cを超えるので、LNAは短い配列にも結合し得る。最近、本発明者らはヒトLNAをマウス筋肉に注射した。マウス配列と比べて1つのミスマッチを有するこのヒトLNAは、マウスエクソン46のスキッピングを低濃度でも誘導することができた。RNAに対する親和性を低下するために、キメラ状のLNA/2’-O-メチルRNAオリゴ鎖を製造した文献38。このようなキメラは全長LNAよりも融解温度は低いが、RNAに対する親和性は2OMePSAONよりも高い。実際に、キメラLNAは、HIV-1トランス活性化応答エレメントHIV1transactivatingresponsiveelementの転写をinvitroで阻害することが報告されている文献38。ミスマッチを有する2OMePSAONを用いた本発明者らの結果は、この類似体がLNAよりも配列特異性が高いことを示す。3’末端に存在する1つのミスマッチによってエクソン46のスキッピングレベルはほぼ3分の1に減少し、3つの3ミスマッチを有する2OMePSAONではエクソンスキッピングは起こらなかった。短い14量体であるLNAにおける1つのミスマッチの効果のほうが、それよりも長い20量体である2OMePSAONにおける効果よりも大きいと考えがちである。しかしながら、3’末端のミスマッチについては、この逆こそが真実であった。さらに、LNA類似体および2OMePS類似体の両方において、3’末端のミスマッチは、AONの5’末端や中央のミスマッチよりも高いレベルのエクソン46スキッピングを誘導した。これは、蛍光標識の存在のためか否か、5’末端のミスマッチは標的RNAに対する親和性を大きく減少させることを示唆する。材料と方法AONとプライマーこの実験のAON類似体の特徴は表6に概説した。2OMePSAON配列は図15のdに示した;ベルギー国、Eurogentec社製は全長ホスホロチオエート主鎖および2’-O-メチル修飾リボース分子を有する公知のAON文献16、37である。モルフォリノ化合物米国、GeneTools社製はモルフォリノ-ホスホロアミデート主鎖を有し、EPEIトランスフェクションのためのセンスDNAオリゴ鎖に連結している。LNA配列は図15のaに示した;仏国、Proligo社製は、その全長主鎖がロックされた核酸からなるものである。PNAベルギー国、Eurogentec社製はペプチド核酸主鎖、および水溶性の向上と細胞へのトランスフェクションの促進のための4個のリシン残基をC末端に有する。すべてのAONは5’フルオレセイン基6-FAMを含有する。ゲル移動度シフトアッセイヒトジストロフィンエクソン46RNAは、公知の方法文献16に従ってinvitroで転写した。個々のAON0.5pmolの結合親和性は、ハイブリダイゼーション緩衝液1mMのTris-HClpH7.4、50nMのNaClおよび5mMのMgCl2中、37°Cで一晩インキュベートし、次いで8PAGEおよびPhosphoImagerMolecularDynamics社製で分析することにより求めた。筋原細胞の培養とトランスフェクション非罹患対照およびDMD患者DL279.1;エクソン45の欠失を有する患者について、筋生検材料から原始ヒト筋芽細胞を単離し、公知の方法文献37で培養した。血清欠乏条件で7~14日間培養した後に、コンフルエントに達した培養筋芽細胞から筋管を取り出した。2OMePSAONとLNAAONのトランスフェクションには、製造者の説明書ExGen500MBIFermentas社製に添付のものに従ってPEIを用いた。具体的には、トランスフェクトするAON1μgあたり3.5μlのPEI即ち、2OMePSAONには12.9μl70μM、LNAオリゴ鎖には9.2μl50μMを用いた。モルフォリノAONのトランスフェクションには、製造者の説明書に従ってEPEIを用いた。具体的には、各200nmolのモルフォリノ化合物に1μlの200μMEPEI米国、GeneTools社製用いた。PNAは、いかなるトランスフェクション試薬も用いずに1mlの培地にアプライした。トランスフェクションの3時間後に2mlの培地を添加した。RNAの単離、RT-PCRと配列の解析RNAの単離、RT-PCR分析と直接シークエンシングは公知の方法文献17で行った。初期PCRにはエクソン43に対するプライマーCCTGTGGAAAGGGTGAAGCとエクソン48に対するプライマーCTGAACGTCAAATGGTCCTTCが含まれ、ネステッドPCRにはエクソン44に対するプライマーCGATTTGACAGATCTGTTGAGとエクソン47に対するプライマーGAGCACTTACAAGCACGGGが含まれていた。すべてのプライマーがEurogentec社ベルギー国によって合成された。定量のために、スキップ産物はDNA1000LabChipRKitを用い、Agilent2100bioanalyzer米国、AgilentTechnologies社製で分析した。実施例6の参考文献1BraaschDACoreyDRNovelantisenseandpeptidenucleicacidstrategiesforcontrollinggeneexpressionBiochemistry200241450345102SuwanmaneeTetalRepairofaSplicingDefectinErythroidCellsfromPatientswithbetaThalassemiaHbEDisorderMolTher200267187263FriedmanKJetalCorrectionofaberrantsplicingofthecysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorgenebyantisenseoligonucleotidesJBiolChem199927436193361994MercatanteDRSazaniPKoleRModificationofalternativesplicingbyantisenseoligonucleotidesasapotentialchemotherapyforcancerandotherdiseasesCurrCancerDrugTargets200112112305CartegniLKrainerARCorrectionofdiseaseassociatedexonskippingbysyntheticexonspecificactivatorsNatStructBiol2003101201256HoffmanEPBrownRHJrKunkelLMDystrophintheproteinproductoftheDuchennemusculardystrophylocusCell1987519199287HoffmanEPetalCharacterizationofdystrophininmusclebiopsyspecimensfrompatientswithDuchennesorBeckersmusculardystrophyNEnglJMed1988318136313688KoenigMetalThemolecularbasisforDuchenneversusBeckermusculardystrophycorrelationofseveritywithtypeofdeletionAmJHumGenet1989454985069ErvastiJMetalDeficiencyofaglycoproteincomponentofthedystrophincomplexindystrophicmuscleNature199034531531910DiBlasiCetalDystrophinassociatedproteinabnormalitiesindystrophindeficientmusclefibersfromsymptomaticandasymptomaticDuchenneBeckermusculardystrophycarriersActaNeuropathol19969236937711KoenigMMonacoAPKunkelLMThecompletesequenceofdystrophinpredictsarodshapedcytoskeletalproteinCell19885321922612DunckleyMGetalModificationofsplicinginthedystrophingeneinculturedMdxmusclecellsbyantisenseoligoribonucleotidesHumMolGenet199871083109013WiltonSDetalSpecificremovalofthenonsensemutationfromthemdxdystrophinmRNAusingantisenseoligonucleotidesNeuromusculDisord1999933033814DeAngelisFGetalChimericsnRNAmoleculescarryingantisensesequencesagainstthesplicejunctionsofexon51ofthedystrophinpremRNAinduceexonskippingandrestorationofadystrophinsynthesisinDelta4850DMDcellsProcNatlAcadSciUSA2002999456946115TakeshimaYetalOligonucleotidesagainstasplicingenhancersequenceledtodystrophinproductioninmusclecellsfromaDuchennemusculardystrophypatientBrainDev20012378879016vanDeutekomJCetalAntisenseinducedexonskippingrestoresdystrophinexpressioninDMDpatientderivedmusclecellsHumMolGenet2001101547155417AartsmaRusAetalTherapeuticantisenseinducedexonskippinginculturedmusclecellsfromsixdifferentDMDpatientsHumMolGenet20031290791418AartsmaRusAetalAntisenseinducedmultiexonskippingforDuchennemusculardystrophymakesmoresenseAmJHumGenet2004748392Epub2003Dec201619LuQLetalFunctionalamountsofdystrophinproducedbyskippingthemutatedexoninthemdxdystrophicmouseNatMed20036620AgrawalSImportanceofnucleotidesequenceandchemicalmodificationsofantisenseoligonucleotidesBiochimBiophysActa19991489536821ManoharanMOligonucleotideconjugatesaspotentialantisensedrugswithimproveduptakebiodistributiontargeteddeliveryandmechanismofactionAntisenseNucleicAcidDrugDev20021210312822EkkerSCLarsonJDMorphanttechnologyinmodeldevelopmentalsystemsGenesis200130899323SummertonJMorpholinoantisenseoligomersthecaseforanRNaseHindependentstructuraltypeBiochimBiophysActa1999148914115824MorcosPAAchievingefficientdeliveryofmorpholinooligosinculturedcellsGenesis2001309410225SchmajukGSierakowskaHKoleRAntisenseoligonucleotideswithdifferentbackbonesModificationofsplicingpathwaysandefficacyofuptakeJBiolChem1999274217832178926NaseviciusAEkkerSCEffectivetargetedgeneknockdowninzebrafishNatGenet20002621622027SazaniPetalSystemicallydeliveredantisenseoligomersupregulategeneexpressioninmousetissuesNatBiotechnol2002201228123328GebskiBLetalMorpholinoantisenseoligonucleotideinduceddystrophinexon23skippinginmdxmousemuscleHumMolGenet2003121801181129BraaschDALiuYCoreyDRAntisenseinhibitionofgeneexpressionincellsbyoligonucleotidesincorporatinglockednucleicacidseffectofmRNAtargetsequenceandchimeradesignNucleicAcidsRes2002305160516730LeumannCJDNAanaloguesfromsupramolecularprinciplestobiologicalpropertiesBioorgMedChem20021084185431FluiterKetalInvivotumorgrowthinhibitionandbiodistributionstudiesoflockednucleicacidantisenseoligonucleotidesNucleicAcidsRes20033195396232LarsenHJBentinTNielsenPEAntisensepropertiesofpeptidenucleicacidBiochimBiophysActa1999148915916633MologniLetalAdditiveantisenseeffectsofdifferentPNAsontheinvitrotranslationofthePMLRARalphageneNucleicAcidsRes1998261934193834RayANordenBPeptidenucleicaciditsmedicalandbiotechnicalapplicationsandpromiseforthefutureFasebJ2000141041106035SazaniPetalNuclearantisenseeffectsofneutralanionicandcationicoligonucleotideanalogsNucleicAcidsRes2001293965397436KarrasJGetalDeletionofindividualexonsandinductionofsolublemurineinterleukin5receptoralphachainexpressionthroughantisenseoligonucleotidemediatedredirectionofpremRNAsplicingMolPharmacol20005838038737AartsmaRusAetalTargetedexonskippingasapotentialgenecorrectiontherapyforDuchennemusculardystrophyNeuromusculDisord200212S7138ArzumanovAetalInhibitionofHIV1Tatdependenttransactivationbystericblockchimeric2OmethylLNAoligoribonucleotidesBiochemistry2001401464514654マルチエクソンスキッピングフレーム修復性マルチエクソンスキッピングの他の例としては、DMD変異の最大20を治療可能なエクソン17と48の間の伸長鎖エクソン17~48の欠失は、軽症BMD様表現型と関連することが知られる非常に大きな変異である、エクソン19~5135に適用可能、エクソン48~5918に適用可能およびエクソン42~5565に適用可能が挙げられる。特に最後の組み合わせは、本願で他の1つの例図8として挙げたように、大きな患者群への適用が考えられる。エクソン42~55のマルチエクソンスキッピングの可能性を、h42AON1とh55AON1との混合物表2参照、またはこれらAONを10個のウラシルヌクレオチドで連結したものを含有する結合型AONで処理したヒト対照筋管で証明した。この混合物またはU連結AONの筋管へのトランスフェクションに続いてRT-PCR分析を行ったところ、エクソン42がエクソン55にスプライシングされた予想通りのインフレーム転写産物の誘導において、いずれも類似した効率を示すことが明らかになった図16。配列の解析により、この特定のマルチエクソンスキッピングがエクソンの境界で特異的に且つ正確に生じたことが確認されたデータは示さない。これらの実験は、上述したエクソン45~51のマルチエクソンスキッピング実施例5の材料と方法の欄を参照と同様に行った。参考文献1HoffmanEPBrownRHJrKunkelLMDystrophintheproteinproductoftheDuchennemusculardystrophylocusCell519199282HoffmanEPFischbeckKHBrownRHJohnsonMMedoriRLoikeJDHarrisJBWaterstonRBrookeMSpechtLetalCharacterizationofdystrophininmusclebiopsyspecimensfrompatientswithDuchennesorBeckersmusculardystrophyNEnglJMed318136313683DenDunnenJTGrootscholtenPMBakkerEBlondenLAGinjaarHBWapenaarMCvanPaassenHMvanBroeckhovenCPearsonPLvanOmmenGJTopographyoftheDuchennemusculardystrophygeneFIGEandcDNAanalysisof194casesreveals115deletionsand13duplicationsAmJHumGenet458358474KoenigMBeggsAHMoyerMScherpfSHeindrichKBetteckenTMengGMullerCRLindlofMKaariainenHetalThemolecularbasisforDuchenneversusBeckermusculardystrophycorrelationofseveritywithtypeofdeletionAmJHumGenet454985065TufferyGiraudSChambertSDemailleJClaustresMPointmutationsinthedystrophingeneevidenceforfrequentuseofcrypticsplicesitesasaresultofsplicingdefectsHumMutat143593686PriorTWBartoloCPearlDKPappACSnyderPJSedraMSBurghesAHMendellJRSpectrumofsmallmutationsinthedystrophincodingregionAmJHumGenet5722337MoserHDuchennemusculardystrophypathogeneticaspectsandgeneticpreventionHumGenet6617408EmeryAEThemusculardystrophiesLancet3596876959YoshidaMOzawaEGlycoproteincomplexanchoringdystrophintosarcolemmaJBiochem10874875210ErvastiJMCampbellKPMembraneorganizationofthedystrophinglycoproteincomplexCell661121113111DiBlasiCMorandiLBarresiRBlasevichFCornelioFMoraMDystrophinassociatedproteinabnormalitiesindystrophindeficientmusclefibersfromsymptomaticandasymptomaticDuchenneBeckermusculardystrophycarriersActaNeuropathol9236937712ErvastiJMOhlendieckKKahlSDGaverMGCampbellKPDeficiencyofaglycoproteincomponentofthedystrophincomplexindystrophicmuscleNature34531531913MatsumuraKBurghesAHMoraMTomeFMMorandiLCornelloFLeturcqFJeanpierreMKaplanJCReinertPetalImmunohistochemicalanalysisofdystrophinassociatedproteinsinBeckerDuchennemusculardystrophywithhugeinframedeletionsintheNH2terminalandroddomainsofdystrophinJClinInvest939910514MonacoAPBertelsonCJLiechtiGallatiSMoserHKunkelLMAnexplanationforthephenotypicdifferencesbetweenpatientsbearingpartialdeletionsoftheDMDlocusGenomics2909515ClemensPRDuncanFJProgressingenetherapyforDuchennemusculardystrophyCurrNeurolNeurosciRep1899616KhanMACorticosteroidtherapyinDuchennemusculardystrophyJNeurolSci12081417DeAngelisFGSthandierOBerarducciBTosoSGalluzziGRicciECossuGBozzoniIChimericsnRNAmoleculescarryingantisensesequencesagainstthesplicejunctionsofexon51ofthedystrophinpremRNAinduceexonskippingandrestorationofadystrophinsynthesisinDelta4850DMDcellsProcNatlAcadSciUSA999456946118MannCJHoneymanKChengAJLyTLloydFFletcherSMorganJEPartridgeTAWiltonSDAntisenseinducedexonskippingandsynthesisofdystrophininthemdxmouseProcNatlAcadSciUSA98424719vanDeutekomJCBremmerBoutMJansonAAGinjaarIBBaasFdenDunnenJTvanOmmenGJAntisenseinducedexonskippingrestoresdystrophinexpressioninDMDpatientderivedmusclecellsHumMolGenet101547155420WiltonSDLloydFCarvilleKFletcherSHoneymanKAgrawalSKoleRSpecificremovalofthenonsensemutationfromthemdxdystrophinmRNAusingantisenseoligonucleotidesNeuromusculDisord933033821DunckleyMGManoharanMVillietPEperonICDicksonGModificationofsplicinginthedystrophingeneinculturedMdxmusclecellsbyantisenseoligoribonucleotidesHumMolGenet71083109022TakeshimaYWadaHYagiMIshikawaYMinamiRNakamuraHMatsuoMOligonucleotidesagainstasplicingenhancersequenceledtodystrophinproductioninmusclecellsfromaDuchennemusculardystrophypatientBrainDev2378879023AartsmaRusABremmerBoutMJansonAdenDunnenJvanOmmenGvanDeutekomJTargetedexonskippingasapotentialgenecorrectiontherapyforDuchennemusculardystrophyNeuromusculDisord12S7124ShigaNTakeshimaYSakamotoHInoueKYokotaYYokoyamaMMatsuoMDisruptionofthesplicingenhancersequencewithinexon27ofthedystrophingenebyanonsensemutationinducespartialskippingoftheexonandisresponsibleforBeckermusculardystrophyJClinInvest1002204221025CartegniLChewSLKrainerARListeningtosilenceandunderstandingnonsenseexonicmutationsthataffectsplicingNatRevGenet328529826SchaalTDManiatisTMultipledistinctsplicingenhancersintheproteincodingsequencesofaconstitutivelysplicedpremRNAMolCellBiol1926127327TakeshimaYNishioHSakamotoHNakamuraHMatsuoMModulationofinvitrosplicingoftheupstreamintronbymodifyinganintraexonsequencewhichisdeletedfromthedystrophingeneindystrophinKobeJClinInvest9551552028PramonoZATakeshimaYAlimsardjonoHIshiiATakedaSMatsuoMInductionofexonskippingofthedystrophintranscriptinlymphoblastoidcellsbytransfectinganantisenseoligodeoxynucleotidecomplementarytoanexonrecognitionsequenceBiochemBiophysResCommun22644544929KoenigMMonacoAPKunkelLMThecompletesequenceofdystrophinpredictsarodshapedcytoskeletalproteinCell5321922630DenDunnenJライデン筋ジストロフィーページTheLeidenMuscularDystrophypageshttpwwwdmdnl31MannCJHoneymanKMcCloreyGFletcherSWiltonSDImprovedantisenseoligonucleotideinducedexonskippinginthemdxmousemodelofmusculardystrophyJGeneMed464465432KerrTPSewryCARobbSARobertsRGLongmutantdystrophinsandvariablephenotypesevasionofnonsensemediateddecayHumGenet10940240733KleinCJCoovertDDBulmanDERayPNMendellJRBurghesAHSomaticreversionsuppressioninDuchennemusculardystrophyevidencesupportingaframerestoringmechanisminraredystrophinpositivefibersAmJHumGenet5095095934SherrattTGVulliamyTDubowitzVSewryCAStrongPNExonskippingandtranslationinpatientswithframeshiftdeletionsinthedystrophingeneAmJHumGenet531007101535LuQLMorrisGEWiltonSDLyTArtemyevaOVStrongPPartridgeTAMassiveidiosyncraticexonskippingcorrectsthenonsensemutationindystrophicmousemuscleandproducesfunctionalrevertantfibersbyclonalexpansionJCellBiol14898599636NicholsonLVJohnsonMABushbyKMGardnerMedwinDFunctionalsignificanceofdystrophinpositivefibresinDuchennemusculardystrophyArchDisChild6863263637VainzofMPassosBuenoMRTakataRIPavanelloRdeCZatzMIntrafamilialvariabilityindystrophinabundancecorrelatedwithdifferenceintheseverityofthephenotypeJNeurolSci119384238SinghVSinhaSMishraSChaturvediLSPradhanSMittalRDMittalBProportionandpatternofdystrophingenedeletionsinnorthIndianDuchenneandBeckermusculardystrophypatientsHumGenet9920620839MelaciniPFaninMDanieliGAFasoliGVillanovaCAngeliniCVitielloLMiorelliMBujaGFMostacciuoloMLetalCardiacinvolvementinBeckermusculardystrophyJAmCollCardiol221927193440MelisMACauMMuntoniFMatedduAGalanelloRBocconeLDeiddaFLoiDCaoAElevationofserumcreatinekinaseastheonlymanifestationofanintragenicdeletionofthedystrophingeneinthreeunrelatedfamiliesEuropJPaediatrNeurol225526141OnengutSKavaslarGNBattalogluESerdarogluPDeymeerFOzdemirCCalafellFTolunADeletionpatterninthedystrophingeneinTurksandacomparisonwithEuropeansandIndiansAnnHumGenet64334042RosenbergCNavajasLVagenasDFBakkerEVainzofMPassosBuenoMRTakataRIVanOmmenGJZatzMDenDunnenJTClinicaldiagnosisofheterozygousdystrophingenedeletionsbyfluorescenceinsituhybridizationNeuromusculDisord844745243SerticJBarisicNSostarkoMBrzovicZStavljenicRukavinaADeletionscreeningoftheDuchenneBeckermusculardystrophygeneinCroatianpopulationCollAntropol2115115644RandoTABlauHMPrimarymousemyoblastpurificationcharacterizationandtransplantationforcellmediatedgenetherapyJCellBiol1251275128745MurryCEKayMABartosekTHauschkaSDSchwartzSMMuscledifferentiationduringrepairofmyocardialnecrosisinratsviagenetransferwithMyoDJClinInvest982209221746RoestPAvanderTuijnACGinjaarHBHoebenRCHogerVorstFBBakkerEdenDunnenJTvanOmmenGJApplicationofinvitroMyodifferentiationofnonmusclecellstoenhancegeneexpressionandfacilitateanalysisofmuscleproteinsNeuromusculDisord619520247HavengaMJLemckertAAOphorstOJvanMeijerMGermeraadWTGrimbergenJvanDenDoelMAVogelsRvanDeutekomJJansonAAetalExploitingthenaturaldiversityinadenovirustropismfortherapyandpreventionofdiseaseJVirol764612462048AndersonLVDavisonKMultiplexWesternblottingsystemfortheanalysisofmusculardystrophyproteinsAmJPathol1541017102249NeugebauerKMetalJCellBiol12989990850TackeRandManleyJLProcSocExpBiolMed220596351GraveleyBRetalCurrBiol9R6752MisteliTetalNature38752352753GormanLSuterDEmerickVetalStablealterationofpremRNAsplicingpatternsbymodifiedU7smallnuclearRNAsProcNatlAcadSciUSA1998954929493454SuterDTomasiniRReberUetalDoubletargetantisenseU7snRNAspromoteefficientskippingofanaberrantexoninthreehumanbetathalassemicmutationsHumMolGenet1999824152423"