"移植レシピエント中の形質導入された細胞による再構成の増強方法であって、前記方法は、前記移植レシピエント中への移植前に形質導入された細胞を選択する工程を含み、前記形質導入された細胞が、以下:i幹細胞を含む多分化能細胞を含む第1の細胞集団と、プロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターとをinvitroで接触させ、それにより、幹細胞を含む形質導入された多分化能細胞を含む第2の細胞集団を生成する工程;およびii前記第2の細胞集団と、濃度1~25μg/mlのピューロマイシンとを4日間以下invitroで接触させ、それにより、幹細胞を含む形質導入された多分化能細胞を含む第3の細胞集団を生成する工程であって、前記第3の細胞集団が、前記第2の細胞集団より高い百分率の形質導入された多分化能細胞を含み、前記第3の細胞集団が、前記移入ベクターを含む少なくとも2つの異なる細胞系統の産生を前記第3の細胞集団の移植レシピエントへの移植後invivoで少なくとも4ヶ月間維持することができる、工程を含む方法によって選択される、方法。複数の前記第3の細胞集団を前記移植レシピエントに移植する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記第1の細胞集団を前記移植レシピエントから得た、請求項1または2に記載の方法。前記第1の細胞集団を骨髄、動員末梢血、臍帯血、および/または胚性幹細胞から得た、請求項1または2に記載の方法。前記少なくとも4ヶ月間が、前記移植から2年以内に始まる任意の時点においても起こり得る、請求項1に記載の方法。前記第2の細胞集団を約5μg/mlのピューロマイシンと約24時間接触させる、請求項1に記載の方法。前記第1の細胞集団が造血幹細胞を含む、請求項1に記載の方法。前記移入ベクターが、プロモーター配列に作動可能に連結された治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記移入ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項1に記載の方法。前記移入ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項1に記載の方法。前記レンチウイルスベクターがヒト免疫不全ウイルスHIVベクターである、請求項10に記載の方法。前記レンチウイルスベクターがサル免疫不全ウイルスSIVベクターである、請求項10に記載の方法。前記レンチウイルスベクターがウマ伝染性貧血ウイルスEIAVベクターである、請求項10に記載の方法。前記移入ベクターがトランスポゾンである、請求項1に記載の方法。前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび前記治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが同一のプロモーター配列に作動可能に連結される、請求項8に記載の方法。前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび前記治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが異なるプロモーター配列に作動可能に連結される、請求項8に記載の方法。前記プロモーターが構成性プロモーターである、請求項15または16に記載の方法。前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記プロモーター配列が、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。前記プロモーターが、幹細胞中の活性が前記幹細胞から分化した細胞中のその活性と比較して高い組織特異的プロモーターである、請求項18に記載の方法。前記幹細胞が造血幹細胞である、請求項19に記載の方法。前記治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記プロモーター配列が、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される、請求項8に記載の方法。前記プロモーターが、多分化能細胞中の活性が前記多分化能細胞から分化した細胞中のその活性と比較して低い組織特異的プロモーターである、請求項21に記載の方法。前記組織特異的プロモーターが赤血球中で活性である、請求項22に記載の方法。前記移入ベクターが自殺遺伝子またはcDNAを含むポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記自殺遺伝子または前記cDNAが自殺ポリペプチドをコードする、請求項1または8に記載の方法。前記自殺遺伝子または前記cDNAがチミジンキナーゼ誘導体をコードする、請求項24に記載の方法。前記自殺遺伝子または前記cDNAがチミジル酸キナーゼTmpK誘導体をコードする、請求項24に記載の方法。前記自殺遺伝子または前記cDNAがカスパーゼ誘導体をコードする、請求項24に記載の方法。前記自殺遺伝子または前記cDNAを含むポリヌクレオチド配列が、前記移入ベクター中に存在するプロモーター配列に作動可能に連結されない、請求項24に記載の方法。前記自殺遺伝子または前記cDNAを含むポリヌクレオチド配列が、前記移入ベクター中に存在するプロモーター配列に作動可能に連結される、請求項24に記載の方法。前記移入ベクター中に存在し、且つ前記自殺遺伝子または前記cDNAを含むポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記プロモーター配列が、誘導性プロモーターである、請求項29に記載の方法。前記自殺遺伝子または前記cDNAを含むポリヌクレオチド配列および前記治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が前記移入ベクター中に逆方向で存在する、請求項24に記載の方法。前記移入ベクターが、前記自殺遺伝子または前記cDNAの上流にスプライス受容配列を含む、請求項24に記載の方法。前記自殺遺伝子または前記cDNAを含むポリヌクレオチド配列が、前記自殺遺伝子または前記cDNAの5’末端にコザックコンセンサス配列を含み、前記自殺遺伝子または前記cDNAの3’側に転写終結配列を含む、請求項24または31に記載の方法。前記移入ベクターが、前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび前記自殺ポリペプチドをインフレーム融合ポリペプチドとして発現する、請求項24に記載の方法。前記融合ポリペプチドが前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドと前記自殺ポリペプチドとの直接的な融合物である、請求項34に記載の方法。前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドまたは前記自殺ポリペプチドが、前記移入ベクター中の前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と前記自殺遺伝子または前記cDNAを含むポリヌクレオチド配列との間に存在する配列内リボソーム進入部位IRESの使用によって発現する、請求項24に記載の方法。前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび前記自殺ポリペプチドが、前記移入ベクター中の前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と前記自殺遺伝子または前記cDNAを含むポリヌクレオチド配列との間に存在する翻訳2Aシグナル配列の使用によって発現する、請求項24に記載の方法。前記移入ベクターが、前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と前記自殺遺伝子または前記cDNAを含むポリヌクレオチド配列との間に配列内リボソーム進入部位IRESを含む、請求項24に記載の方法。前記融合ポリペプチドが、前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドと前記自殺ポリペプチドとの間にリンカー配列を含む、請求項24に記載の方法。前記リンカー配列がGly3リンカー配列を含む、請求項39に記載の方法。前記リンカー配列が自己触媒性ペプチド切断部位を含む、請求項40に記載の方法。前記自己触媒性ペプチド切断部位が翻訳2Aシグナル配列を含む、請求項41に記載の方法。前記移入ベクターが、前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と前記自殺遺伝子または前記cDNAを含むポリヌクレオチド配列との間のジャンク配列をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記ジャンク配列をコードするポリヌクレオチド配列が、その5’末端で終止コドンに隣接し、その3’末端で開始コドンに隣接する、請求項39に記載の方法。前記第3の細胞集団を第4の細胞集団と組み合わせて被験体に提供する工程をさらに含み、前記第4の細胞集団が前駆細胞を含み、前記第4の細胞集団が前記第4の細胞集団の移植レシピエント中への移植後に造血を短期間支持することができる、請求項2に記載の方法。前記第4の細胞集団を、多分化能細胞の拡大および/または少なくとも部分的な分化を誘導する条件に予め暴露した、請求項44に記載の方法。前記第4の細胞集団が形質導入されていない、請求項44または45に記載の方法。前記第4の細胞集団が、以下:i前記第4の細胞集団と、プロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターとを接触させる工程、およびii前記第4の細胞集団と、1~25μg/mlの濃度のピューロマイシンとを、4日間以下接触させ、それにより、前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドを含む形質導入された細胞を選択する工程を含む方法によって形質導入および選択した細胞を含む、請求項44または45に記載の方法。前記第4の細胞集団が造血細胞を含む、請求項44~47のいずれか1項に記載の方法。前記第1の細胞集団および前記第4の細胞集団を、同一の被験体から得た、請求項44~47のいずれか1項に記載の方法。前記第1の細胞集団および前記第4の細胞集団を、骨髄、動員末梢血、臍帯血、および/または胚性幹細胞から得た、請求項49に記載の方法。前記第1の細胞集団、前記第2の細胞集団、または前記第3の細胞集団のうちの少なくとも1つと、接触させた前記細胞集団中に存在する幹細胞の数を増加させることができる1つ以上の薬剤とを接触させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記1つ以上の薬剤がアリール水素受容体アンタゴニストを含む、請求項51に記載の方法。前記アリール水素受容体アンタゴニストがSR1を含む、請求項52に記載の方法。前記1つ以上の薬剤が成長因子の組み合わせを含む、請求項52に記載の方法。前記多分化能細胞の数が4日間と21日間との間の培養期間後に増加する、請求項51に記載の方法。少なくとも75の前記第3の細胞集団が形質導入される、請求項1に記載の方法。高レベルの形質導入された多分化能細胞HSCが含まれるを達成する新規の方法および形質導入されたHSCの移植後に骨髄抑制を阻害する方法が当該分野で明らかに必要である。本発明は、かかる方法ならびにこれらの方法の実施で有用な移入ベクターの提供によりこのニーズに取り組む。概要本発明は、移植レシピエント中の形質導入された細胞による再構成を増強する新規な方法を含む。特定の実施形態では、これらの方法は、レトロウイルス/レンチウイルスによって形質導入された多分化能細胞のピューロマイシンベースの選択を含み、この方法により、十分に短期間の暴露でexvivoにて脆弱な細胞を効率的に選択することができ、それにより、有効性および多分化能細胞の限定された喪失の両方が得られる。さらに、本発明の実施形態は、骨髄破壊およびその後の移植後の一過性の骨髄抑制を軽減または阻害する移植法の開発に基づく。この方法は、長期再増殖可能な形質導入された多分化能細胞幹細胞などを一過性または短期再増殖可能な細胞と組み合わせて移植する工程を含む。特定の実施形態では、一過性または短期再増殖を提供するために導入される細胞集団には、長期再増殖を提供するために導入される細胞集団と比較して、長期再増殖を達成する能力が低いか無視できる細胞の割合がより高く、前駆細胞および/または少なくとも部分的に分化した造血細胞が含まれ得る。1つの実施形態では、本発明は、移植レシピエント中の形質導入された細胞による再構成の増強方法であって、移植レシピエント中への移植前に形質導入された細胞を選択する工程を含み、形質導入された細胞が、以下:i多分化能細胞幹細胞が含まれるを含む第1の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターとinvitroで接触させ、それにより、形質導入された多分化能細胞幹細胞が含まれるを含む第2の細胞集団を生成する工程;およびii第2の細胞集団を濃度1~25μg/mlのピューロマイシンと4日間以下invitroで接触させ、それにより、形質導入された多分化能細胞幹細胞が含まれるを含む第3の細胞集団を生成する工程であって、第3の細胞集団が、第2の細胞集団より高い百分率の形質導入された多分化能細胞を含み、第3の細胞集団が、移入ベクターを含む少なくとも2つの異なる細胞系統の産生を第3の細胞集団の移植レシピエントへの移植後invivoで少なくとも4ヶ月間維持することができる、工程を含む方法によって選択される、方法を提供する。一定の実施形態では、第3の細胞集団は、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、または少なくとも90の形質導入された細胞を含む。特定の実施形態では、本方法は、複数の第3の細胞集団を移植レシピエントに移植する工程をさらに含む。一定の実施形態では、第1の細胞集団を移植レシピエントから得た。一定の実施形態では、第1の細胞集団を骨髄、動員末梢血peripheralmobilizedblood、臍帯血、および/または胚性幹細胞から得た。特定の実施形態では、少なくとも4ヶ月間が、移植から2年以内に始まる任意の時点においても起こり得る。したがって、移植と、体内移植され、形質導入された細胞が少なくとも2つの異なる細胞系統の持続的な産生を開始するときとの間に遅滞期が存在し得る。1つの実施形態では、第2の細胞集団を、約5μg/mlのピューロマイシンと約24時間接触させる。一定の実施形態では、第1の細胞集団は造血幹細胞を含む。特定の実施形態では、移入ベクターは、プロモーター配列に作動可能に連結された治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、移入ベクターはレトロウイルスベクターである。種々の実施形態では、移入ベクターはレンチウイルスベクターである。種々の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスHIVベクター、サル免疫不全ウイルスSIVベクター、またはウマ伝染性貧血ウイルスEIAVベクターである。特定の実施形態では、移入ベクターはトランスポゾンである。本発明の方法の特定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは同一のプロモーター配列に作動可能に連結される。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは異なるプロモーター配列に作動可能に連結される。一定の実施形態では、プロモーターは構成性プロモーターである。関連する実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列は、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される。一定の実施形態では、プロモーターは、幹細胞中の活性が幹細胞から分化した細胞中のその活性と比較して高い組織特異的プロモーターである。特定の実施形態では、幹細胞は造血幹細胞である。一定の実施形態では、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列は、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される。一定の実施形態では、プロモーターは、多分化能細胞中の活性が多分化能細胞から分化した細胞中のその活性と比較して低い組織特異的プロモーターである。特定の実施形態では、組織特異的プロモーターは赤血球中で活性である。本発明の方法の一定の実施形態では、移入ベクターはプロモーター配列に作動可能に連結された自殺遺伝子またはcDNAを含むポリヌクレオチドをさらに含み、自殺遺伝子またはcDNAは自殺ポリペプチドsuicidepolypeptideをコードする。一定の実施形態では、自殺遺伝子またはcDNAはチミジンキナーゼ誘導体をコードする。特定の実施形態では、自殺遺伝子またはcDNAは、チミジル酸キナーゼTmpKまたはその誘導体をコードする。一定の実施形態では、自殺遺伝子またはcDNAは、カスパーゼまたはその誘導体をコードする。特定の実施形態では、自殺遺伝子またはcDNAを含むポリヌクレオチド配列は、移入ベクター中に存在するプロモーター配列に作動可能に連結されない。他の実施形態では、自殺遺伝子またはcDNAを含むポリヌクレオチド配列は、移入ベクター中に存在するプロモーター配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、移入ベクター中に存在し、且つ自殺遺伝子またはcDNAを含むポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列は誘導性プロモーターである。一定の実施形態では、自殺遺伝子またはcDNAを含むポリヌクレオチド配列および治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は移入ベクター中に逆方向で存在する。特定の実施形態では、移入ベクターは、自殺遺伝子またはcDNAの上流にスプライス受容配列を含む。特定の実施形態では、自殺遺伝子またはcDNAを含むポリヌクレオチド配列は、自殺遺伝子またはcDNAの5’末端にコザックコンセンサス配列を含み、自殺遺伝子またはcDNAの3’側に転写終結配列を含む。特定の実施形態では、移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび自殺ポリペプチドをインフレーム融合ポリペプチドとして発現する。特定の実施形態では、融合ポリペプチドはピューロマイシン耐性ポリペプチドと自殺ポリペプチドとの直接的な融合物である。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび自殺ポリペプチドは、移入ベクター中に存在する配列内リボソーム進入部位IRESの使用によって発現し、IRESは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と自殺遺伝子またはcDNAを含むポリヌクレオチド配列との間に位置し得る。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび自殺ポリペプチドは、移入ベクター中に存在する翻訳2Aシグナル配列translational2Asignalsequenceの使用によって発現する。一定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドと自殺ポリペプチドとの間にリンカー配列を含む。特定の実施形態では、リンカー配列はGly3リンカー配列を含む。特定の実施形態では、リンカー配列は自己触媒性ペプチド切断部位を含む。特定の実施形態では、自己触媒性ペプチド切断部位は翻訳2Aシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と自殺遺伝子またはcDNAを含むポリヌクレオチド配列との間にジャンク配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ジャンク配列をコードするポリヌクレオチド配列は、その5’末端で終止コドンに隣接し、その3’末端で開始コドンに隣接する。本発明の方法の特定の実施形態では、方法は、第3の細胞集団を第4の細胞集団と組み合わせて被験体に提供する工程をさらに含み、第4の細胞集団は前駆細胞を含み、第4の細胞集団は第4の細胞集団の移植レシピエント中への移植後に造血を一過性にまたは短期間支持することができる。一定の実施形態では、第4の細胞集団を、多分化能細胞の拡大および/または少なくとも部分的な分化を誘導する条件に以前に暴露した。特定の実施形態では、第4の細胞集団は形質導入されていない。他の実施形態では、第4の細胞集団は、以下:i第4の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと接触させる工程;およびii第4の細胞集団をピューロマイシンと濃度1~25μg/mlで4日間以下接触させ、それにより、ピューロマイシン耐性ポリペプチドを含む形質導入された細胞を選択する工程を含む方法によって形質導入および選択した細胞を含む。一定の実施形態では、第4の細胞集団は造血細胞を含む。一定の実施形態では、第1および第4の細胞集団を、同一の被験体から得た。関連する実施形態では、第1および第4の細胞集団を、骨髄、動員末梢血、臍帯血、および/または胚性幹細胞から得た。本発明の方法の特定の実施形態では、方法は、第1の細胞集団、第2の細胞集団、または第3の細胞集団のうちの少なくとも1つと、接触した細胞集団中に存在する幹細胞の数を増加させることができる1つ以上の薬剤とを接触させる工程をさらに含む。特定の実施形態では、1つ以上の薬剤はアリール水素受容体arylhydrogenreceptorアンタゴニストを含む。1つの実施形態では、アリール水素受容体アンタゴニストはSR1を含む。一定の実施形態では、1つ以上の薬剤は成長因子の組み合わせを含む。特定の実施形態では、多分化能細胞は、4日間と21日間との間の培養期間後にその数が増加する。一定の実施形態では、少なくとも75の第3の細胞集団が形質導入される。詳細な説明本発明は、レトロウイルス/レンチウイルスによって形質導入された造血細胞のピューロマイシンベースの選択が十分に短期間の暴露でexvivoにて脆弱な細胞幹細胞などを効率的に選択することができ、それにより、有効性および多分化能細胞の限定された喪失の両方が得られるという予想外の発見に一部基づく。これを、本明細書中では造血幹細胞への遺伝子移入によって例示する。しかし、このアプローチは、脆弱な細胞のexvivo選択が治療効力を増大させるのに望ましい他の細胞型に適用可能である。さらに、本発明の態様は、骨髄破壊およびその後の移植後の一過性の骨髄抑制を軽減または阻害する移植法の開発に基づく。この方法は、再増殖可能な形質導入された多分化能細胞幹細胞などを再増殖を達成する能力が比較的低いか無視できる非形質導入細胞前駆細胞または少なくとも部分的に分化した造血細胞などと組み合わせて移植する工程を含む。前駆細胞または少なくとも部分的に分化した造血細胞は、移植レシピエントに一過性に再増殖し、したがって、骨髄抑制を阻害する一方で、形質導入された幹細胞はより長い長期再増殖プロセスを受ける。この方法は、形質導入された細胞が選択を受けた場合に特に有効である。なぜなら、形質導入された細胞が選択されない場合と比較して典型的には移植されている細胞の数は減少し、それにより、移植レシピエントの骨髄抑制リスクが増大するからである。したがって、本発明は、遺伝病の処置における遺伝子治療の有効性を改善し、それにより、一部の細胞のみしか移入ベクターによって治療効果の付与に不十分なレベルで効率的にターゲティングされないという満たされていない臨床的ニーズに取り組む。本発明は、具体的には、非形質導入例えば、未修正の細胞が除去されることが望ましい結果である、細胞の混合集団からの遺伝子操作された細胞の富化および選択に関する。定義本明細書中で使用する場合、本発明を説明するために使用される以下の用語および句は、以下に示す意味を有するものとする。用語レトロウイルスは、任意の公知のレトロウイルス例えば、c型レトロウイルスモロニーマウス肉腫ウイルスMoMSV、ハーベイマウス肉腫ウイルスHaMuSV、マウス乳腺癌ウイルスMuMTV、テナガザル白血病ウイルスGaLV、ネコ白血病ウイルスFLV、スプーマウイルス、フレンド、マウス幹細胞ウイルスMSCV、およびラウス肉腫ウイルスRSVなどをいう。本発明のレトロウイルスには、ヒトT細胞白血病ウイルスHTLV-1およびHTLV-2、およびレトロウイルスのレンチウイルスファミリーヒト免疫不全ウイルスHIV-1、HIV-2、サル免疫不全ウイルスSIV、ネコ免疫不全ウイルスFIV、ウマ免疫不全ウイルスEIVなど、およびレトロウイルスの他のクラスも含まれる。レトロウイルスは、その複製周期中に逆転写酵素を利用するRNAウイルスである。レトロウイルスゲノムRNAは、逆転写酵素によって二本鎖DNAに変換される。このウイルスの二本鎖DNA形態は、感染細胞の染色体内に組み入れることができ、一旦組み入れられると、プロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、RNAポリメラーゼIIのテンプレートとしての機能を果たし、必要とされる構造タンパク質および酵素をコードするRNA分子の発現を指示して新規のウイルス粒子を産生する。プロウイルスの各末端は長末端反復またはLTRと呼ばれる構造である。用語長末端反復LTRは、その天然の配列構成で直接反復であり、且つU3、R、およびU5領域を含むレトロウイルスDNAの末端に位置する塩基対のドメインをいう。LTRは、一般に、レトロウイルス遺伝子の発現例えば、遺伝子転写物の促進、開始、およびポリアデニル化およびウイルス複製の基礎となる機能を提供する。LTRは、多数の調節シグナル転写調節エレメント、ポリアデニル化シグナル、ならびにウイルスゲノムの複製および組み込みに必要な配列が含まれるを含む。ウイルスLTRは、U3、R、およびU5と呼ばれる3つの領域に分類される。U3領域は、エンハンサーエレメントおよびプロモーターエレメントを含む。U5領域は、プライマー結合部位とR領域との間の配列であり、ポリアデニル化配列を含む。R反復領域は、U3領域およびU5領域に隣接する。U3、R、およびU5領域から構成されるLTRは、ウイルスゲノムの5’末端および3’末端の両方に出現する。本発明の1つの実施形態では、LTR5’LTRが含まれる内のプロモーターは、異種プロモーターに置換される。使用することができる異種プロモーターの例には、例えば、サイトメガロウイルスCMVプロモーターが含まれる。用語レンチウイルスは、徐々に進行する疾患を発症するレトロウイルスの群または属をいう。この群内に含まれるウイルスには、HIVヒト免疫不全ウイルス;HIV1型およびHIV2型が含まれる、ヒト後天性免疫不全症候群AIDSの病原体;ビスナマエディヒツジにおいて脳炎ビスナまたは肺炎マエディを引き起こす、ヤギ関節炎脳炎ウイルスヤギにおいて免疫欠損、関節炎、および脳症を引き起こす;ウマ伝染性貧血ウイルスウマにおいて自己免疫性溶血性貧血および脳症を引き起こす;ネコ免疫不全ウイルスFIVネコにおいて免疫欠損を引き起こす;ウシ免疫不全ウイルスBIVウシにおいてリンパ節症、リンパ球増加症、およびおそらく中枢神経系感染を引き起こす;およびサル免疫不全ウイルスSIVヒトより下等な霊長類において免疫欠損および脳症を引き起こすが含まれる。これらのウイルスによって引き起こされる疾患は、長期潜伏期間および遅延性の経過によって特徴づけられる。通常、ウイルスは潜在的に単球およびマクロファージに感染し、これらから他の細胞に伝播する。HIV、FIV、およびSIVもまた、Tリンパ球すなわち、T細胞に容易に感染する。用語ハイブリッドは、レンチウイルス配列および非レンチウイルスレトロウイルス配列の両方を含むベクター、LTR、または他の核酸をいう。用語ベクターまたは移入ベクターは、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。用語発現ベクターには、細胞による発現に適切な例えば、プロモーターに連結した形態の遺伝子構築物を含む任意のベクター例えば、プラスミド、コスミド、またはファージの染色体が含まれる。プラスミドを一般にベクターの形態で使用するので、本明細書中で、プラスミドおよびベクターを交換可能に使用する。さらに、本発明は、等価な機能を果たす他のベクターが含まれることが意図される。用語ウイルスベクターは、主にウイルスに由来する構造的および機能的な遺伝エレメントを含むベクターをいう。用語レトロウイルスベクターは、主にレトロウイルスに由来する構造的および機能的な遺伝エレメントを含むベクターをいう。用語レンチウイルスベクターは、主にレンチウイルスに由来するLTRの外側に構造的および機能的な遺伝エレメントを含むベクターをいう。用語自己不活化ベクターSINベクターは、右側の3’LTRエンハンサー-プロモーター領域U3領域として公知が第1ラウンドのウイルス複製を超えたウイルス転写を防止するために改変された例えば、欠失または置換によるベクター例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターをいう。したがって、ベクターは、感染し、次いで、宿主ゲノムに1回だけ組み込むことができ、さらに継代することはできない。これは、右側の3’LTRU3領域がウイルス複製中に左側の5’LTRU3領域のテンプレートとして使用され、したがって、U3エンハンサー-プロモーターを使用しないでウイルス転写物を作製することができないからである。ウイルス転写物が作製されない場合、プロセシングやビリオンへのパッケージングが不可能であり、それ故、ウイルスの生活環が終焉する。したがって、SINベクターは、望ましくない複製可能ウイルスが作製されるリスクが大幅に軽減される。何故なら、右側の3’LTRU3領域が第1ラウンドの複製を超えたウイルス転写を防止するように改変され、それ故、ウイルスが継代する能力が排除されるからである。用語TARは、レンチウイルス例えば、HIVLTRのR領域中に存在するトランス活性化応答遺伝エレメントをいう。このエレメントは、レンチウイルストランス活性化因子tat遺伝エレメントと相互作用してウイルス複製を増強する。用語R領域は、キャッピング基すなわち、転写開始の始点から始まり、ポリAトラクトの開始直前で終了するレトロウイルスLTR内の領域をいう。R領域を、U3およびU5領域に隣接するとも定義する。R領域は、一方のゲノム末端から他方への新生DNAの移行において逆転写中で重要な役割を果たす。用語トランスフェクションは、真核細胞内への外来DNAの導入をいう。トランスフェクションを、当分野で公知の種々の手段リン酸カルシウム-DNA共沈、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および遺伝子銃が含まれるが、これらに限定されないによって行うことができる。用語形質導入は、トランスフェクションによるよりもむしろウイルス感染によるウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いたある遺伝子または他のポリヌクレオチド配列の送達をいう。好ましい実施形態では、レトロウイルスベクターを、細胞との接触前のビリオン内へのベクターのパッケージングによって形質導入する。例えば、レトロウイルスベクターによって保持された抗HIV遺伝子を、感染およびプロウイルス組み込みによって細胞に形質導入することができる。一定の実施形態では、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用した感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を細胞が含む場合、細胞は形質導入されている。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、その細胞ゲノム中にウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターによって送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む。用語プロモーター/エンハンサーは、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含むDNAのセグメントをいう。例えば、レトロウイルスの長末端反復は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を含む。エンハンサー/プロモーターは、内因性または外因性または異種性であり得る。内因性エンハンサー/プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に連結されるエンハンサー/プロモーターである。外因性または異種性エンハンサー/プロモーターは、その遺伝子の転写が連結したエンハンサー/プロモーターによって指示されるように遺伝子操作すなわち、分子生物学的技術によって遺伝子の近位に配置されたエンハンサー/プロモーターである。真核細胞中での組み換えDNA配列の効率的な発現には、得られた転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指示するシグナルの発現が必要である。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。用語ポリA部位またはポリA配列は、本明細書中で使用する場合、新生RNA転写物の終結およびポリアデニル化の両方を指示するDNA配列を示す。ポリAテールを欠く転写物が不安定であり、且つ急速に分解されるので、組み換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクター中で利用されるポリAシグナルは、異種性または内因性であり得る。内因性ポリAシグナルは、ゲノム内の所与の遺伝子のコード領域の3’末端に天然に見出されるポリAシグナルである。異種ポリAシグナルは、ある遺伝子から単離され、別の遺伝子の3’に配置されるポリAシグナルである。用語移行エレメントは、細胞の核から細胞質へのRNA転写物の輸送を調節するシス作用転写後調節エレメントをいう。RNA移行エレメントの例には、ヒト免疫不全ウイルスHIVrev応答エレメントRRE例えば、Cullenら1991J.Virol.65:1053;およびCullenら1991Cell58:423を参照のことおよびB型肝炎ウイルス転写後調節エレメントPRE例えば、Huangら1995Molec.andCell.Biol.157:3864;Huangら1994J.Virol.685:3193;Huangら1993Molec.andCell.Biol.312:7476、および米国特許第5,744,326号を参照のことが含まれるが、これらに限定されない。一般に、RNA移行エレメントを遺伝子の3’UTR内に配置し、1つまたは複数のコピーとして挿入することができる。RNA移行エレメントを、任意のまたは全ての個別のベクターに挿入して本発明のパッケージング細胞株を生成することができる。本明細書中で使用する場合、用語パッケージング細胞株を、パッケージングシグナルを含まないが、ウイルス粒子の正確なパッケージングに必要なウイルス構造タンパク質および複製酵素例えば、gag、pol、およびenvを安定してか一過性に発現する細胞株に関して使用する。句レトロウイルスパッケージング細胞株は、RNAをパッケージングして複製可能なヘルパーウイルスを産生する能力を欠くウイルス粒子を産生するために必要なコード配列を含む細胞株典型的には、哺乳動物細胞株をいう。パッケージング機能が細胞株内に提供される場合例えば、プラスミドベクターによってトランスに、パッケージング細胞株は組み換えレトロウイルスを産生し、それにより、レトロウイルス産生細胞株になる。用語核酸カセットは、本明細書中で使用する場合、RNAを発現し、その後にタンパク質を発現することができるベクター内の遺伝子配列をいう。核酸カセットは、目的の遺伝子を含む。核酸カセットは、カセット内の核酸をRNAに転写し、必要に応じてタンパク質またはポリペプチドに翻訳し、形質転換された細胞中の活性に必要な適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画へのターゲティングまたは細胞外区画内への分泌によって生物学的活性に適切な区画にトランスロケーションすることができるようにベクター内に位置的および順序的に配向する。好ましくは、カセットは、ベクターへの容易な挿入に適したその3’末端および5’末端を有する例えば、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。本発明の1つの好ましい実施形態では、核酸カセットは、異常血色素状態を処置するために使用される治療遺伝子の配列を含む。カセットを除去し、単一の単位としてベクターまたはプラスミドに挿入することができる。本明細書中で使用する場合、用語目的の遺伝子は、発現ベクターのポリリンカーに挿入される遺伝子をいう。一定の実施形態では、目的の遺伝子は、疾患または障害の処置または予防において治療効果を発揮するポリペプチドをコードし、このポリペプチドを、治療ポリペプチドということができる。1つの実施形態では、目的の遺伝子は、異常血色素症の処置のための治療機能を提供する遺伝子をコードする。目的の遺伝子および目的の遺伝子からコードされるポリペプチドには、野生型の遺伝子およびポリペプチドならびにその機能的バリアントおよびフラグメントの両方が含まれる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、対応する野生型の基準ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対して少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、または少なくとも99の同一性を有する。一定の実施形態では、機能的バリアントまたはフラグメントは、対応する野生型ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、または少なくとも90を有する。記述配列同一性または、例えば、~と50同一の配列を含むは、本明細書中で使用する場合、比較ウィンドウにわたってヌクレオチド対ヌクレオチドを基本とするかアミノ酸対アミノ酸を基本として配列が同一な程度をいう。したがって、配列同一性のパーセンテージを、比較ウィンドウにわたる2つの最適に整列させた配列の比較、同一の核酸塩基例えば、A、T、C、G、Iまたは同一のアミノ酸残基例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、およびMetが両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の全位置数すなわち、ウィンドウサイズで割ること、および結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算することができる。典型的にはポリペプチドバリアントが基準ポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を保持する場合、本明細書中に記載の任意の基準配列例えば、配列表を参照のことに対して少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、または100の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。2つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列関係を説明するために使用される用語には、基準配列、比較ウィンドウ、配列同一性、配列同一性のパーセンテージ、および実質的同一性が含まれる。基準配列は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて少なくとも12単量体単位であるが、頻繁には15~18単量体単位、しばしば少なくとも25単量体単位の長さである。2つのポリヌクレオチドは、それぞれ、12つのポリヌクレオチド間で類似の配列すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみおよび22つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含むことができるので、2つまたはそれを超えるポリヌクレオチドの間の配列比較を、典型的には、配列が類似する局所的領域を同定および比較するための比較ウィンドウにわたる2つのポリヌクレオチド配列の比較によって行う。比較ウィンドウは、2つの配列を最適に整列させた後に配列を同数の連続する位置の基準配列と比較する少なくとも6、通常約50~約100、より通常には約100~約150の連続する位置の概念的セグメントをいう。比較ウィンドウは、2つの配列の最適なアラインメントのために基準配列付加や欠失を含まないと比較して約20以下の付加または欠失すなわち、ギャップを含むことができる。比較ウィンドウの整列のための配列の最適なアラインメントを、アルゴリズムWisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0,GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,WI,USAのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTAのコンピュータ化された実行または選択された任意の種々の方法によって得られる目視および最良のアラインメントすなわち、比較ウィンドウにわたって最高の相同性パーセンテージが得られるによって行うことができる。例えば、Altschulら,1997,Nucl.AcidsRes.25:3389によって開示のプログラムのBLASTファミリーを参照することもできる。配列分析の詳細な考察を、Unit19.3ofAusubelら,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySonsInc,1994-1998,Chapter15に見出すことができる。用語プロモーターは、本明細書中で使用する場合、RNAポリメラーゼが結合するDNA鎖の認識部位をいう。プロモーターは、転写活性を開始および駆動するためにRNAポリメラーゼと開始複合体を形成する。複合体を、エンハンサーと呼ばれる活性化配列またはサイレンサーと呼ばれる阻害配列によって改変することができる。本明細書中で使用する場合、用語シスを、同一染色体上の遺伝子の存在に関して使用する。用語シス作用性を、同一染色体上に存在する遺伝子に及ぼす調節遺伝子の調節効果に関して使用する。例えば、下流mRNAの合成に影響をおよぼすプロモーターはシス作用性調節エレメントである。用語自殺遺伝子を、本明細書中で、自殺遺伝子を発現する細胞に致命的な産物を発現する任意の遺伝子を定義するために使用する。1つの実施形態では、自殺遺伝子は、本発明のベクター上の目的の遺伝子に関してシス作用性である。自殺遺伝子の例は当分野で公知であり、HSVチミジンキナーゼHSV-Tkが含まれる。用語作動可能に連結されたは、記載の成分がその意図する様式で機能を果たす関係にあるような近位をいう。1つの実施形態では、この用語は、発現調節配列が第2の配列に対応する核酸の転写を指示する、核酸発現調節配列プロモーターまたは一連の転写因子結合部位などと第2の核酸配列の間の機能的連結をいう。用語偽型またはシュードタイピングは、本明細書中で使用する場合、そのウイルスエンベロープタンパク質が好ましい特徴を保有する別のウイルスのエンベロープタンパク質と置換されたウイルスをいう。HIVエンベロープタンパク質env遺伝子によってコードされるは通常はウイルスをCD4提示細胞にターゲティングさせるので、例えば、HIVを水疱性口内炎ウイルスGタンパク質VSV-Gエンベロープタンパク質でシュードタイピングすることができ、それにより、HIVを広範な細胞に感染させることが可能である。本発明の1つの好ましい実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質をVSV-Gでシュードタイピングする。本明細書中で使用する場合、用語パッケージングは、タンパク質キャプシドの内側にウイルスゲノムを隔離またはパッケージングする過程をいい、それにより、ビリオン粒子が形成される。この過程は、キャプシド形成としても公知である。本明細書中で使用する場合、用語パッケージングシグナルまたはパッケージング配列は、ウイルスRNAのウイルスキャプシドまたは粒子への挿入に必要なレトロウイルスゲノム内に位置する配列をいう。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのキャプシド形成に必要な最小のパッケージングシグナルプサイ[ψ]配列ともいうを使用する。したがって、本明細書中で使用する場合、用語パッケージング配列、パッケージングシグナル、プサイ、および記号ψを、ウイルス粒子形成中のレトロウイルスRNA鎖のキャプシド形成に必要な非コード配列に関して使用する。本明細書中で使用する場合、用語複製欠損は、感染性ビリオンが産生されないように完全で有効な複製が不可能なウイルス例えば、複製欠損性のレンチウイルスの子孫をいう。用語複製可能なは、ウイルスのウイルス複製によって感染性ビリオンを産生することができるように複製することができる野生型ウイルスまたは変異体ウイルス例えば、複製可能なレンチウイルスの子孫をいう。本明細書中で使用する場合、用語組み込むは、ベクターが治療遺伝子産物を細胞内に発現することができるような細胞内へのベクター例えば、DNAまたはRNAの取り込みまたは移入をいう。組み込みは、DNA発現ベクターの組み入れまたはDNA発現ベクターのエピソーム複製を含むことができるが、必要ではない。本明細書中で使用する場合、用語赤血球系細胞特異的発現または赤血球特異的発現は、エリスロサイトまたは赤血球RBC本明細書中で交換可能に使用される中のみで生じる遺伝子発現をいう。用語遺伝子送達または遺伝子移入は、外来DNAの標的細胞筋肉細胞など中への確かな挿入のための方法および系をいう。かかる方法により、遺伝子を一過性または長期間発現することができる。遺伝子移入により、後天性疾患および遺伝性疾患の処置のための固有のアプローチが得られる。哺乳動物細胞への遺伝子移入のための多数の系が開発されている。例えば、米国特許第5,399,346号を参照のこと。本発明のレンチウイルスベクターを、実質的に全ての循環RBC中にて治療レベルで抗鎌状赤血球化タンパク質を発現するように最適化することができる。用語幹細胞は、前駆細胞の由来となる多分化能細胞をいう。幹細胞を、その自己再生能力によって定義する。幹細胞には、例えば、胚性幹細胞および体性幹細胞が含まれる。造血幹細胞は、任意の造血系統の娘細胞を生成することができる。長期造血再構成能を有する幹細胞を、多数の物理的性質および生物学的性質によって分化細胞および前駆細胞と区別することができる例えば、Hodgson,G.S.Bradley,T.R.,Nature,Vol.281,pp381-382;Visserら,J.Exp.Med.,Vol.59,pp.1576-1590,1984;Spangrudeら,Science,Vol.241,pp.58-62,1988;Szilvassyら,Blood,Vol.74,pp.930-939,1989;Ploemacher,R.E.Brons,R.H.C.,Exp.Hematol.,Vol.17,pp.263-266,1989を参照のこと。一定の造血幹細胞は、移植レシピエント中で造血細胞集団を長期再構成する能力を有する。多分化能細胞は、2つ以上の異なる細胞に分化する能力を有する。本明細書中で使用する場合、用語前駆体または前駆細胞は、分化細胞の前駆体である細胞をいう。多数の前駆細胞は単一の系統にそって分化するが、非常に広範な増殖能力を有することができる。前駆細胞の例には、造血前駆細胞、骨髄系前駆細胞、およびリンパ球前駆細胞が含まれるが、これらに限定されない。造血前駆細胞は、自己再生しないが、移植レシピエント中で造血細胞集団を一過性または短期間再構成する能力を有する。用語グロビンを、本明細書中で、ヘム部分に共有結合または非共有結合することができ、したがって、酸素を輸送または貯蔵することができる全タンパク質またはタンパク質サブユニットを意味するために使用する。脊椎動物および無脊椎動物のヘモグロビン、脊椎動物および無脊椎動物のミオグロビンのサブユニットまたはその変異体は、用語グロビンに含まれる。グロビンの例には、β-グロビンまたはそのバリアント、β-グロビンまたはそのバリアント、β-グロビンまたはそのバリアント、およびβ-グロビンが含まれる。本明細書中で使用する場合、造血は、前駆細胞からの血球の形成および発生ならびに幹細胞からの前駆細胞の形成をいう。血球には、エリスロサイトまたは赤血球RBC、網状赤血球、単球、好中球、巨核球megakaryote、好酸球、好塩基球、B細胞、マクロファージ、顆粒球、肥満細胞、栓球、および白血球が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する場合、用語異常血色素症または異常血色素状態には、血中の異常なヘモグロビン分子の存在を含む任意の障害が含まれる。異常血色素症の例には、ヘモグロビンC症、ヘモグロビン鎌状赤血球症SCD、鎌状赤血球貧血、およびサラセミアが含まれるが、これらに限定されない。異常ヘモグロビンの組み合わせが血中に存在する異常血色素症例えば、鎌状赤血球/Hb-C病も含まれる。用語鎌状赤血球貧血または鎌状赤血球症を、本明細書中で、赤血球の鎌状赤血球化に起因する任意の症候性貧血状態が含まれると定義する。鎌状赤血球症の症状発現には、以下が含まれる:貧血;疼痛;および/または臓器機能不全腎不全など、網膜症、急性胸部症候群、虚血、持続勃起症、および卒中。本明細書中で使用する場合、用語鎌状赤血球症は、特にHbSにおける鎌状赤血球置換についてホモ接合体である被験体における鎌状赤血球貧血に伴う種々の臨床上の問題をいう。これらのうち、鎌状赤血球症という用語の使用によって本明細書中で言及される体質上の発現は、成長および発達の遅延、特に肺炎球菌に起因する重症感染症の発症傾向の増大、顕著な脾臓機能障害、循環細菌の有効な排除の阻止であり、再発性梗塞を伴い、最終的に脾組織の破壊が起こる。主に腰椎、腹部、および大腿骨幹に影響を及ぼし、減圧痛と機構および重症度が類似する急性筋骨格痛も用語鎌状赤血球症に含まれる。成人では、かかる発作は、一般に、数週間または数ヶ月毎の軽度または中等度の短期間の発作として発現し、この発作は1年間に約1回引き起こされる5~7日間継続する発作が散見される。その内で、かかる急性発症を引き起こすことが公知の事象はアシドーシス、低酸素症、および脱水症であり、その全てがHbSの細胞内重合を増強するJ.H.Jandl,Blood:TextbookofHematology,2ndEd.,Little,BrownandCompany,Boston,1996,pages544-545。本明細書中で使用する場合、用語サラセミアは、ヘモグロビン合成に影響を及ぼす変異に起因して生じる遺伝性貧血を含む。したがって、本用語には、サラセミア状態重症またはβサラセミア、重症型サラセミア、中等症サラセミア、αサラセミアヘモグロビンH症などなどに起因する任意の症候性貧血が含まれる。本明細書中で使用する場合、サラセミアは、ヘモグロビン産生の欠損によって特徴づけられる遺伝性障害を示す。サラセミアの例には、βおよびαサラセミアが含まれる。βサラセミアは、βグロビン鎖の変異によって生じ、重症型および軽症型で生じ得る。重症型のβサラセミアでは、小児は正常に出生するが、生後1年間に貧血を発症する。軽症型のβサラセミアは小型の赤血球を産生し、サラセミアはグロビン鎖由来の遺伝子の欠失によって生じる。本明細書中で使用する場合、抗鎌状赤血球化タンパク質には、鎌状赤血球状態においてエリスロサイトの鎌状赤血球化を導く病理学的事象を防止または逆行するタンパク質が含まれる。本発明の1つの実施形態では、本発明の形質導入された細胞を使用して、異常血色素状態を有する被験体に抗鎌状赤血球化タンパク質を送達させる。抗鎌状赤血球化タンパク質には、抗鎌状赤血球化アミノ酸残基を含む変異β-グロビン遺伝子も含まれる。本明細書中で使用する場合、本明細書中で交換可能に使用される用語インスレーターまたはインスレーターエレメントは、ゲノム配列付近の宿主ゲノムへのベクターの組み込みの際に組み入れられた導入遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止するために本発明のベクターに付加することができる外因性DNA配列をいう。逆に、インスレーターエレメントは、組み入れられたベクターが近くのゲノム配列の発現に影響を及ぼすのを防止する。一般に、インスレーターが組み入れられたベクターに隣接し例えば、LTR領域内、組み入れられたDNA配列を遮断するように作用するようにインスレーターがベクターのゲノム内への組み入れの際に複製される場合にこれが達成される。本発明での使用に適切なインスレーターには、ニワトリβ-グロビンインスレーターChungらCell199374:505;Chungら,PNAS199794:575;およびBellらCell199998:387本明細書中で参考として援用されるを参照のことが含まれるが、これに限定されない。インスレーターエレメントの例には、β-グロビン遺伝子座由来のインスレーターニワトリHS4などが含まれるが、これに限定されない。本明細書中で使用する場合、文脈上そうでないと明記しない限り、処置treatmentおよび類似の用語処置された、処置treatingなどは、有利または所望の結果好ましい臨床結果が含まれるを得るためのアプローチを示す。処置は、任意選択的に、疾患もしくは状態の症状の軽減もしくは改善または疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを含むことができる。本明細書中で使用する場合、文脈上そうでないと明記しない限り、予防するおよび類似の用語予防された、予防などは、疾患または状態の発生または再発の可能性を予防、阻害、または減少させるためのアプローチを示す。これは、疾患もしくは状態の発症もしくは再発の遅延または疾患もしくは状態の症状の発生もしくは再発の遅延もいう。本明細書中で使用する場合、予防および類似の用語には、疾患または状態の発症または再発前の疾患または状態の強度、影響、症状、および/または負荷の軽減も含まれる。本明細書中で使用する場合、薬剤または物質の有効量または治療有効量は、所望の生物学的効果有利な結果臨床結果が含まれるなどに影響を及ぼすのに十分な量である。本明細書中で使用する場合、薬学的に許容され得るキャリアには、生理学的に適合可能な任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、ならびに等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。1つの実施形態では、キャリアは非経口投与に適切である。好ましくは、キャリアは、罹患関節への直接投与に適切である。キャリアは、静脈内投与、腹腔内投与、または筋肉内投与に適切であり得る。薬学的に許容され得るキャリアには、滅菌注射液または注射用分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのかかる媒質および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または薬剤が形質導入された細胞と適合しない場合を除き、本発明の薬学的組成物中でのその使用が意図される。以下の説明では、本発明の種々の実施形態の完全な理解のために一定の詳細な説明を記載する。しかし、当業者は、これらの詳細な説明を利用せずに本発明を実施することができると理解するであろう。文脈上他の意味に解すべき必要がある場合を除き、明細書および特許請求の範囲を通して、用語含むcompriseおよびそのバリアント含むcomprisesおよび含むcomprisingなどを、オープンな他の要素を包含することを意味するすなわち、~が含まれるが、これらに限定されないと解釈すべきである。本明細書中で使用する場合、用語含むincludeおよび含むcompriseを同義語として使用する。本明細書を通して1つの実施形態oneembodimentまたは1つの実施形態anembodimentについての言及は、実施形態と併せて記載される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも1つの本発明の実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書中の種々の場所の句1つの実施形態ではinoneembodimentまたはinanembodimentの出現は、必ずしも全てが同一の実施形態について言及していない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を、1つ以上の実施形態中に任意の適切な様式で組み合わせることができる。本説明では、他で示さない限り、任意の濃度範囲、百分率の範囲、比の範囲、または整数範囲が、引用した範囲内の任意の整数の値および必要に応じたその分数整数の1/10および1/100などが含まれると理解すべきである。また、他で示さない限り、任意の物理的特徴ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの長さなどに関する本明細書中に引用した任意の数字の範囲は、引用した範囲内の任意の整数が含まれると理解すべきである。本明細書中で使用する場合、他で示さない限り、約は、示した範囲、値、または構造の±20を意味する。用語aおよびanが、本明細書中で使用する場合、1つ以上の列挙した成分をいうと理解すべきである。代替物例えば、またはの使用は、代替物の一方、両方、またはその任意の組み合わせを意味すると理解すべきである。本明細書中で使用する場合、用語含むincludeおよび含むcompriseを同義語として使用する。さらに、本明細書中に記載の構造および置換物の種々の組み合わせに由来する各ベクターまたはベクター群が、各ベクターまたはベクター群が個別に記載されるのと同一の範囲で本出願によって開示されると理解すべきである。したがって、特定のベクター構造または特定の置換物の選択は、本開示の範囲内である。形質導入された細胞を産生および選択する方法、それに関連する形質導入された細胞による移植レシピエント中の細胞集団の再構築の増強方法、ならびに治療ポリペプチドの必要とする被験体への送達方法本発明の一定の態様は、ピューロマイシンベースの選択系が十分な程度の多分化能細胞の質および生着能力を保持しながら形質導入された多分化能細胞形質導入された幹細胞が含まれるの選択で有効であり得るという予想外の発見に起因する。この知見の重要な態様は、形質導入された多分化能細胞がその多分化能および生着能力を保持する一方で非形質導入細胞が枯渇するような適切なピューロマイシン濃度およびピューロマイシンへの細胞の適切な曝露時間の同定である。例えば、一定の例では、本発明の方法によって選択されたピューロマイシン選択された形質導入された造血幹細胞は、かかる細胞が移植された移植レシピエントの造血細胞を再構成することができる。この再構成は長期再構成であり得る。したがって、本発明は、形質導入された多分化能細胞幹細胞が含まれるの新規の選択方法、ならびに関連する形質導入された多分化能細胞および形質導入された多分化能細胞中で富化された細胞集団の産生におけるピューロマイシン選択の使用方法を提供する。本明細書中に提供した説明および例が多分化能細胞特に、造血幹細胞が含まれるの形質導入および選択に注目する一方で、本発明の方法および移入ベクターを使用して、他の細胞型多分化能細胞または幹細胞の他の型が含まれるおよび治療用途のために形質導入された細胞の選択が以前は不可能であった脆弱な細胞を形質導入して選択することもできる。かかる細胞には、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および体性幹細胞造血幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、および臍帯基質幹細胞が含まれるが含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の方法にしたがって使用される細胞を、任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトから得ることができ、細胞を、任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに移植することができる。図3は、レシピエントへの移植前に形質導入された細胞を選択するための本発明の1つのプロセスを示す概略図を提供する。これらの形質導入された細胞をレシピエントに移植し、形質導入された多分化能細胞が非形質導入細胞と競合することなく成長し、最終的にレシピエント内に細胞集団を再構成する1つの実施形態では、本発明は、形質導入された多分化能細胞幹細胞が含まれ得るの選択方法であって、多分化能細胞幹細胞が含まれ得るを含む第1の細胞集団を1~25μg/mlのピューロマイシンと4日間以下接触させる工程であって、第1の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと事前に接触させ、それにより、形質導入された多分化能細胞形質導入された幹細胞が含まれ得るを含む第2の細胞集団を産生する工程を含む、方法を提供する。特定の実施形態では、第1の細胞集団を、移入ベクターによる細胞の形質導入または細胞のゲノムへのポリヌクレオチド配列の組み入れに十分な条件下および時間で移入ベクターと接触させる。上記の形質導入された細胞の選択方法を、形質導入された多分化能細胞形質導入された幹細胞が含まれ得るの産生の文脈で使用することができる。したがって、関連する実施形態では、本発明は、形質導入された多分化能細胞を産生する方法であって、i多分化能細胞幹細胞が含まれ得るを含む第1の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと接触させ、それにより、移入ベクターを含む多分化能細胞幹細胞が含まれ得るを含む第2の細胞集団を産生する工程;およびii第2の細胞集団を1~25μg/mlピューロマイシンと4日間以下接触させ、それにより、第3の細胞集団を産生する工程であって、第3の細胞集団が第2の細胞集団より高い百分率の形質導入された多分化能細胞を含む、工程を含む、方法を提供する。特定の実施形態では、第1の細胞集団を、移入ベクターによる細胞の形質導入または細胞のゲノムへのポリヌクレオチド配列の組み入れに十分な条件下および時間で移入ベクターと接触させる。本発明の任意のピューロマイシン選択方法の特定の実施形態では、ピューロマイシン選択後に残存する細胞例えば、第3の集団の少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、または少なくとも90が形質導入される。一定の実施形態では、第3の集団中の細胞の少なくとも75が形質導入される。上記の方法は、移植レシピエント内の細胞集団を再構成するために使用することができる形質導入された多分化能細胞形質導入された幹細胞が含まれるを含む細胞集団を提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、被験体内の細胞集団の形質導入された幹細胞による再構成の増強方法であって、上記形質導入された幹細胞を産生する工程および複数の第3の細胞集団を被験体に移植する工程を含む、方法を含む。特定の実施形態では、第3の細胞集団内の形質導入された多分化能細胞は、必ずしも被験体への細胞の導入直後でなくて良いが、被験体への第3の細胞集団の導入後少なくとも4ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、または少なくとも12ヶ月間移入ベクターを含む少なくとも2つの異なる細胞系統を産生することができる。少なくとも2つの異なる細胞系統の産生は即時でなくて良いがすなわち、遅滞期が存在し得る、特定の実施形態では、生きている被験体への第3の細胞集団の導入直後から24ヶ月、28ヶ月、36ヶ月、または48ヶ月以内に、上記の少なくとも4ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、または少なくとも12ヶ月間の期間が始まると認識される。本発明の方法にしたがって産生された形質導入された細胞を治療的に使用することができる。例えば、これらの細胞を、必要とする被験体に体内移植することができる。例えば、治療ポリペプチドを発現する形質導入された細胞を、減少した量の治療ポリペプチドを発現するか、治療ポリペプチドの変異体形態を発現するレシピエント被験体に移植することができる。したがって、一定の例では、形質導入すべき細胞を、形質導入された幹細胞による移植自系移植を必要とする被験体から得る。他の例では、形質導入すべき細胞を、別のドナー形質導入された幹細胞による移植同種異系移植を必要とする被験体に組織適合し得るから得る。細胞を、当該分野で公知であり且つ利用可能な方法を使用してドナー中の種々の異なる供給源から得ることができる。例えば、造血細胞造血幹細胞HSCが含まれるを針を使用して骨髄から得ることができ、末梢血球をアフェレーシスによって得ることができ、細胞を出産後の臍帯血から濾過することができる。細胞を、従来の技術を使用して他の組織成分脂肪および細胞外基質などから精製して、細胞集団幹細胞を含み得るを産生することができる。多分化能細胞幹細胞が含まれるを、形質導入前に細胞集団から選択するか細胞集団内で富化することができる。例えば、幹細胞を、幹細胞と会合した少なくとも1つのマーカーのその発現に基づくか、物理的な分離手段によって選択することができる。幹細胞に会合したマーカーの例には、CD34、Thy-1、およびrhoが含まれる。これらのマーカーを発現する細胞を、種々の手段1つ以上のマーカーに特異的な抗体を使用した蛍光標示式細胞分取FACSが含まれるによって細胞集団から精製するか、細胞内で富化することができる。特定の実施形態では、ドナーから得た細胞集団をCD34細胞について富化するか、CD34細胞を形質導入前に他の細胞から精製する。細胞の形質導入を、ピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現することができる移入ベクター下記の任意の移入ベクターが含まれるを使用して行う。したがって、移入ベクターは、それを発現する細胞中でピューロマイシン耐性を付与する任意のポリペプチドであり得るピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ピューロマイシンN-アセチル-トランスフェラーゼPACをコードするpac遺伝子は、ストレプトマイセス産生株から単離されているdelaLuna,S.Ortin,J.1992.MethodsEnzymol.216:376-385;delaLuna,S.,ら1988.Gene62:121-126。この遺伝子は、ピューロマイシン生合成経路を決定する他の遺伝子に連結されたpurクラスター領域中に存在する。pac遺伝子の発現により、この遺伝子を発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞にピューロマイシン耐性が付与される。しかし、外因性DNA細菌起源のピューロマイシン耐性遺伝子などは、哺乳動物細胞中での発現にあまり適切ではないかもしれない。第1に、細菌におけるコドン使用頻度は、哺乳動物のコドン使用頻度と非常に異なる。さらに、CpGジヌクレオチドにおける外来細菌DNAの組成は、哺乳動物DNAにおけるCpG分布と非常に異なる。この相違により、遺伝子発現に負の影響を及ぼす以下の2つの現象を引き起こす:哺乳動物免疫系による異物としての細菌DNAの認識および遺伝子サイレンシングを引き起こすCpGのシトシン残基のメチル化。したがって、移入ベクター中でのpac遺伝子サイレンシングを回避するために、改変pac遺伝子を、本発明の移入ベクター中で使用することができる。一定の実施形態では、改変pac遺伝子を哺乳動物発現のためにコドン最適化し、そして/またはいくつかまたは全てのCpGモチーフが除去されている。特定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、pac遺伝子または改変pac遺伝子のコード領域のみを含む。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号1に記載の核酸配列を有する。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドは、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する。本発明はまた、任意のこれらのピューロマイシン耐性ポリペプチドの機能的フラグメントまたはバリアントの使用を意図する。特定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現する移入ベクターは、レトロウイルスベクター例えば、レンチウイルスベクターHIVベクターなどである。レンチウイルス感染は、他の形質導入法を超えるいくつかの利点を有する分裂している細胞および分裂していない細胞の高効率感染、トランスジェニックの長期安定発現、および低免疫原性が含まれる。本発明にしたがって使用することができる種々の移入ベクターを、上に記載している。感染性ウイルス粒子およびウイルスストック溶液の産生を、従来技術を使用して行うことができる。ウイルスストック溶液の調製方法は、当該分野で公知であり、例えば、Y.Soneokaら1995Nucl.AcidsRes.23:628-633およびN.R.Landauら1992J.Virol.66:5110-5113に例示されている。例えば、ウイルス粒子を、パッケージング細胞株または感染性ウイルス粒子のパッケージングおよび産生で使用されるウイルスタンパク質を産生するプラスミドと組み合わせた移入ベクターの一過性トランスフェクションのいずれかを使用して産生することができる。適切なパッケージング細胞株の例は、例えば、米国特許第6,958,226号、同第6,620,595号、同第5,739,018号、同第5,686,279号、および同第5,591,624号に記載されている。特定の実施形態では、HIV1型HIV-1ベースのウイルス粒子を、産生細胞中でのビリオンパッケージングエレメントおよび移入ベクターの同時発現によって生成することができる。これらの細胞を、多数のプラスミドで一過性にトランスフェクトすることができる。典型的には、3つ~4つのプラスミドを使用するが、レンチウイルス成分が個別の単位に分けられる程度に応じてより多数であり得る。例えば、1つのプラスミドは、HIV-1由来のビリオンのコア成分および酵素成分をコードすることができる。このプラスミドを、パッケージングプラスミドと呼ぶ。別のプラスミドは、典型的には、エンベロープタンパク質、最も一般的には水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質VSVGその高い安定性および広い親和性のためをコードする。このプラスミドを、エンベロープ発現プラスミドということができる。さらに別のプラスミドは、標的細胞に移入すべきゲノムをコードしすなわち、ベクター自体、移入ベクターと呼ばれる。パッケージングプラスミドを、公知の技術リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれるによって、一般に、優性の選択可能なマーカーネオマイシン、DHFR、グルタミンシンターゼ、またはADAなどと共にヒト細胞株に導入し、その後に適切な薬物の存在下で選択し、クローンを単離することができる。選択可能なマーカー遺伝子を、構築物中のパッケージング遺伝子に物理的に連結することができる。数百万形質導入単位/ミリリットルTU/mlの力価の組み換えウイルスを、この技術およびその異形によって生成することができる。超遠心後、およそ109TU/mlの濃縮ストックを得ることができる。本発明のレンチウイルスのストック溶液の1つの例示的な生成方法では、レンチウイルス許容性細胞本明細書中で産生細胞というを、ウイルス粒子産生に必要なウイルスタンパク質またはその誘導体を発現する移入ベクターおよび他のベクターでトランスフェクトする。次いで、細胞を、適切な細胞培養条件下で成長させ、レンチウイルス粒子を上記のように細胞自体または細胞培養液のいずれかから回収する。適切な産生細胞株には、ヒト胚性腎臓細胞株293および293T、ウマ真皮細胞株NBL-6、ならびにイヌ胎児胸腺細胞株Cf2THが含まれるが、これらに限定されない。かかるマルチプラスミドウイルスパッケージング系の例は、米国特許第5,994,136号、同第6,924,144号、同第7,250,299号、同第6,790,641号、および同第6,013,516号に記載されている。感染性ウイルス粒子を、従来技術を使用してパッケージング細胞から回収することができる。例えば、感染性粒子を、当該分野で公知のように、細胞溶解または細胞培養物上清の回収によって回収することができる。任意選択的に、回収されたウイルス粒子を、必要に応じて精製することができる。適切な精製技術は、当業者に周知である。本発明の一定の実施形態にしたがって利用することができる遺伝子治療におけるウイルスベクターの使用に関する他の方法を、例えば、Kay,M.A.1997Chest1116Supp.:138S-142S;Ferry,N.andHeard,J.M.1998Hum.GeneTher.9:1975-81;Shiratory,Y.ら1999Liver19:265-74;Oka,K.ら2000Curr.Opin.Lipidol.11:179-86;Thule,P.M.andLiu,J.M.2000GeneTher.7:1744-52;Yang,N.S.1992Crit.Rev.Biotechnol.12:335-56;Alt,M.1995J.Hepatol.23:746-58;Brody,S.L.andCrystal,R.G.1994Ann.N.Y.Acad.Sci.716:90-101;Strayer,D.S.1999ExpertOpin.Investig.Drugs8:2159-2172;Smith-Arica,J.R.andBartlett,J.S.2001Curr.Cardiol.Rep.3:43-49;およびLee,H.C.ら2000Nature408:483-8中に見出すことができる。ウイルスを使用して、当該分野で周知の標準的なトランスフェクション技術を使用してexvivoまたはinvitroで細胞に感染させることができる。例えば、細胞例えば、CD34細胞、樹状細胞、末梢血球、または腫瘍細胞をexvivoで形質導入する場合、ベクター粒子を、一般にほぼ1~50感染多重度MOI程度1×105~50×105形質導入単位/105細胞のウイルスベクターにも対応するの用量を使用して細胞と共にインキュベートすることができる。これは、勿論、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、および50MOIに対応するベクター量を含む。典型的には、ベクター量を、HEK293、HEK293T、NIH3T3、またはHeLa形質導入単位TUで示すことができる。一旦細胞がウイルスに感染すると、移入ベクターによって形質導入され、且つピューロマイシン耐性遺伝子を発現する細胞を、ピューロマイシンまたはその機能的フラグメントもしくは誘導体との細胞の接触によって選択する。ピューロマイシンは、例えば、ClontechMountainView,CAから販売されている。特定の実施形態では、細胞を、ピューロマイシンと5日間以下、4日間以下、3日間以下、2日間以下、または1日間以下接触させる。特定の実施形態では、細胞を、ピューロマイシンと12~24時間、12~36時間、12~48時間、または24~48時間接触させる。典型的には、これは、ピューロマイシンへの細胞の数時間または数日間の連続した曝露を示す。特定の実施形態では、細胞を、ピューロマイシンと1~25μg/ml、1~20μg/ml、1~10μg/mlの濃度範囲またはピューロマイシン濃度約2μg/ml、約3μg/ml、約4μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約7μg/ml、約8μg/ml、約9μg/ml、または約10μg/mlで接触させる。添付の実施例で実証されるように、5μg/mlという少量のピューロマイシンでの24時間という短期間の処理により、形質導入された細胞が有意に選択および富化された。ピューロマイシン選択前、選択中、および/または選択後、細胞を、細胞の維持、成長、または増殖に適切な培地中で培養することができる。適切な培養培地および条件は当該分野で周知である。ピューロマイシン選択後、選択された細胞を、その維持、成長、または増殖に適切な条件下で培養することができる。特定の実施形態では、選択された細胞を、移植前に約7~約14日間培養する。ピューロマイシン選択細胞をアッセイして、移入ベクターで首尾よく形質導入されたかどうか決定することができる。一定の実施形態では、移入ベクターの存在を、非形質導入細胞中に存在しない移入ベクター領域を特異的に増幅するプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応PCRによって決定する。例えば、PCR分析を、個別のコロニーまたはクローン細胞集団に対して行うことができる。特定の実施形態では、ピューロマイシン選択により、得られた選択細胞集団内の形質導入された細胞が富化される。一定の実施形態では、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または100の細胞が、移入ベクターで形質導入される。特定の実施形態では、これは、形質導入された細胞の少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍の富化を示す。形質導入された細胞のピューロマイシン選択中またはピューロマイシン選択後に、選択された細胞を、幹細胞または多分化能細胞の拡大を促進する条件下で培養することができる。当該分野で公知の任意の方法を使用することができる。一定の実施形態では、選択中または選択後、細胞を、幹細胞または多分化能細胞の拡大を促進する1つ以上の小分子の存在下で培養する。かかる分子の例には、SR1アリール炭化水素受容体をアンタゴナイズするおよびバルプロ酸が含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、選択中または選択後、細胞を、幹細胞または多分化能細胞の拡大を促進する1つ以上の成長因子の存在下で培養する。幹細胞または多分化能細胞の拡大を促進する成長因子の例には、マウス造血幹細胞の自己再生を促進することが実証されている胎児肝臓チロシンキナーゼFlt3リガンド、幹細胞因子、ならびにインターロイキン6および11が含まれるが、これらに限定されない。他には、骨形成タンパク質4の活性化によって始原造血前駆体の増殖を誘導するソニックヘッジホッグ、HSCの自己再生を刺激するWnt3a、脳由来神経栄養因子BDNF、上皮成長因子EGF、線維芽細胞成長因子FGF、毛様体神経栄養因子CNF、トランスフォーミング成長因子-βTGF-β、線維芽細胞成長因子FGF、例えば、塩基性FGF、酸性FGF、FGF-17、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-8b、FGF-8c、FGF-9、顆粒球コロニー刺激因子GCSF、血小板由来成長因子PDGF、例えば、PDGFAA、PDGFAB、PDGFBB、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF、幹細胞因子SCF、間質細胞由来因子SCDF、インスリン様成長因子IGF、トロンボポエチンTPO、またはインターロイキン-3IL-3が含まれる。特定の実施形態では、選択中または選択後、細胞を、幹細胞または多分化能細胞の拡大を促進する1つ以上の小分子および1つ以上の成長因子の両方の存在下で培養する。一定の状況では、限られた期間中例えば、ピューロマイシン選択過程中のみでピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現することが望ましいかもしれない。したがって、一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドの発現を形質導入後例えば、ピューロマイシンでの細胞の接触前および/または接触の間にオンにし、その後にピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現する細胞の選択後にオフにすることができるように、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを一過性誘導性プロモーターに作動可能に連結させる。したがって、ピューロマイシン耐性ポリペプチドは、移植レシピエント中で発現されないであろう。このことは、細胞内での内因性癌遺伝子の活性化または免疫寛容の確立前の移植レシピエントによるピューロマイシン耐性ポリペプチドに対する免疫反応および関連する拒絶などのその発現による可能性のある望ましくない影響を減少または軽減するはずである。種々の一過性誘導性プロモーター系は当該分野で公知であり、且つ利用可能である例えば、Cre/loxP系、2種のテトラサイクリン応答Tet系Tet-On、Tet-Off、糖質コルチコイド応答マウス乳腺癌ウイルスプロモーターMMTVprom、エクジソン-誘導性プロモーターEcP、およびT7プロモーター/T7RNAポリメラーゼ系T7Pが含まれる。これらのいずれかを使用して、本発明の一定の実施形態にしたがってピューロマイシン耐性遺伝子の誘導性発現を駆動することができる。別の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドの発現が形質導入された幹細胞および多分化能細胞で起こり、したがってピューロマイシン選択が容易になるが、形質導入された細胞のレシピエントへの移植後、ピューロマイシン耐性ポリペプチドの発現が体内移植された形質導入された幹細胞および多分化能細胞から生成された分化細胞中で減少するように、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、幹細胞または多分化能細胞中の活性が分化細胞中でのその活性と比較して高いプロモーターに作動可能に連結される。特定の実施形態では、プロモーターは、赤血球中よりも造血幹細胞中で活性が高い。分化細胞と比較して多分化能細胞例えば、幹細胞で高い活性を有する種々のプロモーターが当該分野で公知であり、且つ利用可能である。上記のように、本発明の方法にしたがって産生された形質導入された細胞を使用して、治療ポリペプチドを必要とする被験体に送達させることができる。したがって、移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の両方を含むことができる。1つの実施形態では、これらのポリヌクレオチド配列のそれぞれは同一のプロモーターに作動可能に連結されるが、他の実施形態では、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現および治療ポリペプチドの発現が独立して調節されるようにこれらのポリヌクレオチド配列のそれぞれは異なるプロモーターに作動可能に連結される。特定の実施形態では、一方または両方のプロモーターが構成性プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターである。一定の実施形態では、上記で考察されるように、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現を駆動するプロモーターは誘導性プロモーターである。一定の実施形態では、治療ポリペプチドの発現を駆動するプロモーターは、幹細胞または多分化能細胞中において、かかる幹細胞または多分化能細胞から分化した少なくとも1つの細胞型の活性と比較して低い活性を有する。したがって、治療ポリペプチドの発現を、1つ以上の分化細胞型中で増強され得るか、または1つ以上の分化細胞型に限定され得る。特定の実施形態では、治療ポリペプチドの発現を駆動するプロモーターは、1つ以上の分化した造血細胞例えば、赤血球などで活性である。1つ以上の分化した組織中で発現を優先的に駆動する組織特異的プロモーターは、当該分野で公知であり、且つ利用可能である例えば、ヒトβ-グロビンプロモーターが含まれる。組織特異性を、組織特異的エンハンサーエレメントを含めることによってさらに増強することができる。例えば、マウスGata1IE第1エクソン赤血球系プロモーターmHS-3.5上流のエンハンサーエレメントは、赤血球系細胞および巨核球の発現の両方を指示することができる。本発明は、さらに、必要に応じて形質導入された細胞をネガティブ選択することができるような移入ベクター中の自殺遺伝子の含有を意図する。特定の実施形態では、自殺遺伝子は誘導性プロモーターに作動可能に連結される。種々の実施形態では、自殺遺伝子は構成性プロモーターに作動可能に連結される。例えば、自殺遺伝子は構成性に活性であり得、その発現は、必要に応じて作動可能に連結された誘導性プロモーターを使用して誘導される。さらなる例として、自殺遺伝子は誘導性に活性であり得、作動可能に連結された構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターをそれぞれ使用して構成性に発現されたか誘導性に発現される。特定の実施形態では、本発明の方法は、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび条件的自殺遺伝子単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼなどの両方の発現を利用する。したがって、移植レシピエントにおけるベクター媒介挿入変異誘発の際に生成され得る腫瘍性細胞を、化学的に誘導された細胞自殺例えば、ガンシクロビルによって処置可能にされ得る。他の条件的自殺遺伝子を、単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼコード遺伝子の代わりに使用することができる。特定の実施形態では、ピューロマイシン耐性および条件的細胞自殺タンパク質は、iポリシストロニックベクター内の内部リボゾーム侵入部位IRESによるか、ii前駆体タンパク質の切断によるか、またはiii融合タンパク質として同時発現することができる。哺乳動物細胞での発現のための構成性プロモーターも当該分野で公知且つ利用可能であり、例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼPGKプロモーターおよびその誘導体例えば、マウスPGKプロモーター、サルウイルス40初期プロモーターSV40、サイトメガロウイルス最初期プロモーターCMV、ヒトユビキチンCプロモーターUBC、ヒト伸長因子1aプロモーターEF1A、およびCMV初期エンハンサーと結合したニワトリβアクチンプロモーターCAGGが含まれる。上記で考察されるように、本発明の方法を使用して、必要とする被験体への治療ポリペプチドの送達のための形質導入された細胞を産生することができる。特定の実施形態では、これらの方法を実施して、形質導入された幹細胞または多分化能細胞から分化することができる1つ以上の細胞型に対する治療ポリペプチドを得る。一定の実施形態では、1つ以上の細胞型は造血細胞型であり、骨髄系列単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、エリスロサイト、巨核球/血小板、樹状細胞およびリンパ系T細胞、B細胞、NK細胞が含まれる。特定の実施形態では、本発明の方法にしたがって産生された形質導入された細胞を使用して、造血系の疾患または障害異常血色素症、貧血、またはサラセミアなどを処置する。本明細書中で使用する場合、用語異常血色素症または異常血色素状態には、血中の異常なヘモグロビン分子の存在を含む任意の障害が含まれる。異常血色素症の例には、ヘモグロビンC症、ヘモグロビン鎌状赤血球症SCD、鎌状赤血球貧血、およびサラセミアが含まれるが、これらに限定されない。異常ヘモグロビンの組み合わせが血中に存在する異常血色素症例えば、鎌状赤血球/Hb-C病も含まれる。用語鎌状赤血球貧血または鎌状赤血球症を、本明細書中で、赤血球の鎌状赤血球化に起因する任意の症候性貧血状態が含まれると定義する。鎌状赤血球症の症状発現には、以下が含まれる:貧血;疼痛;および/または臓器機能不全腎不全など、網膜症、急性胸部症候群、虚血、持続勃起症、および卒中。本明細書中で使用する場合、用語鎌状赤血球症は、特にHbSにおける鎌状赤血球置換についてホモ接合体である被験体における鎌状赤血球貧血に伴う種々の臨床上の問題をいう。これらのうち、鎌状赤血球症という用語の使用によって本明細書中で言及される体質上の発現は、成長および発達の遅延、特に肺炎球菌に起因する重症感染症の発症傾向の増大、顕著な脾臓機能障害、循環細菌の有効な排除の阻止であり、再発性梗塞を伴い、最終的に脾組織の破壊が起こる。主に腰椎、腹部、および大腿骨幹に影響を及ぼし、減圧痛bendと機構および重症度が類似する筋骨格痛の急性エピソードも用語鎌状赤血球症に含まれる。成人では、かかる発作は、一般に、数週間または数ヶ月毎の軽度または中等度の短期間の発作として発現し、この発作は、平均で1年間に約1回引き起こされる5~7日間継続する苦痛のある発作が散見される。その内で、かかる急性発症を引き起こすことが公知の事象はアシドーシス、低酸素症、および脱水症であり、その全てがHbSの細胞内重合を増強するJ.H.Jandl,Blood:TextbookofHematology,2ndEd.,Little,BrownandCompany,Boston,1996,pages544-545。本明細書中で使用する場合、サラセミアは、ヘモグロビン産生の欠損によって特徴づけられる遺伝性障害を示す。サラセミアの例には、βおよびαサラセミアが含まれる。βサラセミアは、βグロビン鎖の変異によって生じ、重症型および軽症型で生じ得る。重症型のβサラセミアでは、小児は正常に出生するが、生後1年間に貧血を発症する。軽症型のβサラセミアは小型の赤血球を産生し、サラセミアはグロビン鎖由来の遺伝子の欠損によって生じる。したがって、本用語には、サラセミア状態重症またはβ-サラセミア、重症型サラセミア、中等症サラセミア、α-サラセミアヘモグロビンH症などなどに起因する任意の症候性貧血が含まれる。特定の実施形態では、治療ポリペプチドは抗鎌状赤血球化タンパク質である。本明細書中で使用する場合、抗鎌状赤血球化タンパク質には、鎌状赤血球状態においてエリスロサイトの鎌状赤血球化を導く病理学的事象を防止または逆行するタンパク質が含まれる。本発明の1つの実施形態では、本発明の形質導入された細胞を使用して、異常血色素状態を有する被験体に抗鎌状赤血球化タンパク質を送達させる。抗鎌状赤血球化タンパク質には、抗鎌状赤血球化アミノ酸残基を含む変異β-グロビン遺伝子例えば、87位でのトレオニンのグルタミンとの置換を有する変異β-グロビンから発現されるポリペプチドも含まれる。治療ポリペプチドをコードする遺伝子またはcDNA配列を、当業者に公知の種々の技術による移入ベクターへの挿入のために得ることができる。本発明は、さらに、本明細書中に記載の方法にしたがって産生された形質導入された細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物を含む。1つの実施形態では、キャリアは非経口投与に適切である。キャリアは、静脈内投与、腹腔内投与、または筋肉内投与に適切であり得る。薬学的に許容され得るキャリアには、滅菌注射液または注射用分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのかかる媒質および薬剤の使用は、当該分野で周知である。移植レシピエントにおける骨髄抑制の軽減方法本発明の別の態様は、移植レシピエント、特に、形質導入された幹細胞または多分化能細胞例えば、形質導入された造血幹細胞または多分化能細胞の移植前に骨髄破壊処置を受けた患者で起こり得る一過性骨髄抑制の阻害、予防、または改善に関する。本発明のこの態様は、特に、形質導入された細胞が移植前に本発明の方法にしたがって選択された場合事前のex-vivoピューロマイシン処理に由来する非形質導入細胞例えば、造血細胞の喪失に起因するに関連する。移植細胞数が少ないほど骨髄抑制リスクが高くなる。さらに、幹細胞が実質的に再増殖する前に実質的な時間の遅延が存在し得る。したがって、本発明は、ピューロマイシン選択された形質導入された細胞多分化能細胞が含まれるの集団を、骨髄抑制を罹患している被験体で枯渇する造血細胞赤血球、白血球、および/または血小板などを産生することができる個別の細胞集団と共に被験体に同時移植することによって一過性骨髄抑制を阻害する方法を提供する。特定の実施形態では、この個別の細胞集団は、被験体の自己再生または長期再増殖が可能な幹細胞を含まないか、少量のかかる細胞例えば、10未満、5未満、1未満、0.1未満、または0.01未満しか含まない。したがって、個別の細胞集団は造血細胞を一過性または短期で再増殖させ、それにより、骨髄抑制を阻害または軽減する一方で、ピューロマイシン選択された形質導入された細胞中に存在する形質導入された多分化能細胞形質導入された幹細胞が含まれるは、被験体中の造血細胞を長期再増殖させる。一定の実施形態では、短期再増殖のために含めた細胞集団は、幹細胞長期再増殖のために使用される形質導入された幹細胞を含む細胞集団の比率が低いであろう。しかし、これらの異なる細胞集団の一方または両方が、幹細胞、多分化能細胞、前駆細胞、および分化細胞から選択される1つ以上の細胞型を含むことができると理解される。しかし、短期再増殖のために使用される細胞集団本明細書中に記載の細胞集団が含まれる中に存在する幹細胞数を減少させるための工程を使用することができる。本発明の方法の種々の実施形態によれば、短期再増殖のために使用される細胞は、形質導入された細胞または非形質導入細胞のいずれかであり得る。例えば、一定の実施形態では、短期再増殖のために使用される細胞を、上記のように形質導入および選択するが、次いで、本明細書中に記載のように拡大および/または分化する。特定の実施形態では、移植患者内の細胞系統の短期再増殖または一過性再増殖は、少なくとも1ヶ月間、少なくとも2ヶ月間、少なくとも3ヶ月間、または少なくとも4ヶ月間の再増殖の持続期間を示す。特定の実施形態では、移植患者内の細胞系統の短期再増殖または一過性再増殖は、1年未満、6ヶ月未満、または4ヶ月未満の再増殖の持続期間を示す。特定の実施形態では、移植患者内の細胞系統の短期再増殖または一過性再増殖は、1ヶ月間と1年間の間、1ヶ月間と6ヶ月間との間、または1ヶ月間と4ヶ月間との間の再増殖の持続期間を示す。特定の実施形態では、移植患者内の細胞系統の長期再増殖は、少なくとも4ヶ月間の再増殖の持続時間を示し、この持続時間は移植後のどの時点でも起こり得る。特定の実施形態では、移植患者内の細胞系統の長期再増殖は、1年超、6ヶ月超、または4ヶ月超の再増殖の持続時間を示す。再増殖が起こる期間は、移植後任意の時点であり得る。一定の実施形態では、再増殖は、移植後1年以内、18ヶ月以内、または2年以内に開始される。したがって、1つの実施形態では、本発明は、形質導入された幹細胞の移植レシピエントへの移植後に骨髄抑制を阻害する方法であって、形質導入された幹細胞を含む第1の細胞集団を第1の細胞集団と比較して幹細胞の百分率が低い第2の細胞集団と組み合わせて移植レシピエントに移植する工程を含む、方法を含む。特定の実施形態では、移植レシピエントは移植前に骨髄破壊レジメンを受けており、特定の実施形態では、移植レシピエントは、種々の分化された造血細胞赤血球などに分化することができる造血前駆細胞数が減少している。一定の実施形態では、第1の細胞集団は、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む移入ベクターで形質導入された幹細胞を含む。特定の実施形態では、第1の細胞集団は移植レシピエント内の造血細胞を長期間再増殖することができ、第2の細胞集団は移植レシピエント内の造血細胞を短期間再増殖することができる。特定の実施形態では、第1の細胞集団は形質導入された幹細胞を含む。種々の実施形態では、第2の細胞集団は、形質導入された前駆細胞および/または非形質導入前駆細胞を含む。種々の実施形態では、第2の細胞集団を、任意のその後の培養または改変前に移植レシピエントまたは別のドナーから得る。したがって、第1の細胞集団を、第2の細胞集団と同一または異なる最初の供給源から得ることができる。例えば、第1の細胞集団を移植レシピエントから得た細胞を使用して産生することができるのに対して、第2の細胞集団を同種異系ドナーから得た細胞から調製する。別の例では、第1の細胞集団および第2の細胞集団の両方を、移植レシピエントから得た細胞から産生させる同時または異なる時期に。第2の細胞集団中に存在する細胞をレシピエントに移植して細胞区画造血系などの一過性再増殖を得ることを考慮して、本発明の一定の実施形態は、第2の細胞集団が第1の細胞集団より低い百分率の幹細胞を有することを意図する。したがって、長期の生着および再増殖を、第1の細胞集団中に存在するピューロマイシン選択された形質導入された幹細胞によって行うであろう。したがって、特定の実施形態では、例えば、一定の成長因子の組み合わせによって一過性に再増殖する造血前駆体集団を維持または拡大しながら、第2の細胞集団を、長期再増殖する幹細胞集団が枯渇する条件下で培養する。したがって、特定の実施形態では、本発明のこの態様の方法は、第2の細胞集団を、集団から幹細胞を枯渇または除去する薬剤、幹細胞の成長または増殖を阻害する薬剤、または幹細胞の前駆細胞への分化を誘導または促進する薬剤と接触させる工程を含む。特定の実施形態では、幹細胞は造血幹細胞である。集団からの幹細胞の枯渇または除去のために使用することができる薬剤には、幹細胞上に発現する細胞表面マーカー例えば、CD34、Sca1、Lin、c-kitに特異的な抗体が含まれるが、これらに限定されず、これらの薬剤を使用して、幹細胞を結合し、細胞集団から幹細胞を除去するか富化することができる。幹細胞の成長または増殖を阻害するために使用することができる薬剤には、当該分野で公知の任意の薬剤が含まれる。多分化能幹細胞例えば、幹細胞の前駆細胞への分化を誘導または促進するために使用することができる薬剤には、例えば、種々のサイトカインおよび成長因子ならびにその組み合わせが含まれる。かかるexvivoでの拡大または分化のために使用することができるサイトカインの例には、IL-1すなわち、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-11、G-CSF、GM-CSF、およびそのアナログが含まれるが、これらに限定されない。exvivo拡大に適切な成長因子を、c-kitリガンドSCFまたはSF、FLT-3リガンドFL、トロンボポエチンTPO、エリスロポエチンEPO、およびそのアナログから選択することができる。本明細書中で使用する場合、アナログには、天然に存在する形態の特徴的な生物学的活性を有する種々のサイトカインおよび成長因子のバリアントが含まれる。1つの実施形態では、その基剤組成物中のサイトカインおよび成長因子の混合物は、幹細胞因子SCF、FLT-3リガンドFL、およびトロンボポエチンthromobopoietinTPOを有する。他の実施形態では、サイトカインおよび成長因子の混合物は、IL-3、IL-6、IL-11、G-CSF、GM-CSF、およびその組み合わせ、特に、IL-3、IL-6、IL-11、およびその組み合わせから選択されるさらなるサイトカインを有する。したがって、1つの実施形態では、サイトカインおよび成長因子の混合物が組成物SCF、FL、TPO、およびIL-3を有する一方で、別の実施形態では、混合物は、組成物SCF、FL、TPO、およびIL-6を有する。さらなるサイトカインの1つの組み合わせは、サイトカインおよび成長因子の混合物が組成物SCF、FL、TPO、IL-6、およびIL-11を有するようなIL-6およびIL-11である。骨髄系前駆細胞を拡大するためのサイトカインおよび成長因子の混合物を含む培養培地中での造血幹細胞の培養方法はまた、米国特許出願公開第2006/0134783号に記載されている。この出願は、出発集団としてCD34、CD90HSCを使用した骨髄系前駆細胞集団の拡大を記載している。細胞を、任意選択的に骨髄系拡大に相乗効果を及ぼすと考えられるIL-6と組み合わせたKITL、FLT3L、TPO、およびIL-3の組み合わせで処理する。特定の組み合わせには、任意選択的にIL-3、さらに任意選択的にIL3、IL-6、およびIL-11の組み合わせを有するKITL、FLT3L、TPOが含まれる。特定の実施形態では、第2の細胞集団は、同一の組織型の完全な分化細胞の前駆体である比較的未熟な細胞である前駆体または前駆細胞を含む。前駆体または前駆細胞例えば、造血前駆細胞は増殖することができるが、1つを超える細胞型への分化能力は制限されている。さらに、前駆体または前駆細胞は、長期自己再生能力を欠く。特定の実施形態では、造血前駆細胞は、レシピエントへの移植後約3~4ヶ月間または3~6ヶ月間造血を回復することができる。特定の実施形態では、造血前駆細胞は、少なくとも2つの異なる造血細胞への分化能力を有する。第2の細胞集団は、形質導入されていても形質導入されていなくても良い。一定の実施形態では、第2の細胞集団を、治療ポリペプチドを発現する移入ベクターで形質導入する。なぜなら、第2の細胞集団が移植レシピエントにおいて再増殖する期間中にこれらの細胞の少なくとも一部が治療ポリペプチドを発現することが有利であり得るからである。特定の実施形態では、形質導入された第2の細胞集団をピューロマイシンに供さない。したがって、一定の実施形態では、同一の治療ポリペプチドが第1および第2の細胞集団中の形質導入された細胞によって発現されない一方で、同一または異なる移入ベクターを使用して、第1および第2の細胞集団のそれぞれを形質導入することができる。特定の実施形態では、第1の細胞集団を形質導入するために使用される移入ベクターがピューロマイシン耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む一方で、第2の細胞集団を形質導入するために使用される移入ベクターは、かかるポリヌクレオチドを含んでいても含んでいなくても良い。したがって、一定の実施形態では、本発明は、以下:1上記のように産生され、且つピューロマイシン選択された形質導入された幹細胞または多分化能細胞を含む細胞集団、および2特定の実施形態では、本明細書中に記載されているように調製される可能性がある第3の細胞集団と比較して幹細胞の比率が低い別の細胞集団の両方を必要とする被験体に提供する工程を含む骨髄抑制を軽減または阻害する方法を提供する。例えば、この他の細胞集団は、幹細胞の少なくとも部分的な分化を誘導する条件下に暴露している可能性がある。この他の細胞集団は形質導入されていても形質導入されていなくてもよく、ピューロマイシンと接触していても接触していなくても良い。この他の細胞集団は造血前駆細胞を含むことができる。細胞集団のいずれかまたは両方を、骨髄、動員末梢血、臍帯血、または胚性幹細胞から得た細胞から産生することができる。同様に、一定の実施形態では、本発明は、移植レシピエントへの形質導入された幹細胞の移植後に骨髄抑制を軽減または阻害する高度に関連した方法であって、形質導入された幹細胞を含む第1の細胞集団を、第1の細胞集団と比較して幹細胞の百分率が低い第2の細胞集団と組み合わせて移植レシピエントに移植する工程を含む方法を提供し、第1の細胞集団を形質導入された細胞について選択することを含む手順によって産生し、選択が第1の細胞集団を1~25μg/mlのピューロマイシンと4日間以下接触させることを含み、第1の細胞集団を、プロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと第1の細胞集団内の複数の細胞のゲノム内にポリヌクレオチドを組み入れるのに十分な条件下および期間予め接触させた。特定の実施形態では、第1の細胞集団は、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む移入ベクターで形質導入された幹細胞を含む。したがって、これらの方法を、種々の疾患および障害下記の任意の疾患および障害ならびに特定の実施形態では、造血系の疾患が含まれるの処置で使用することができ、処置には、移植レシピエントの内因性の骨髄または造血細胞の骨髄破壊myeloblationが含まれる。特定の実施形態では、第1および第2の細胞集団は、1つ以上の造血細胞例えば、赤血球などに分化することができる細胞を含む。特定の実施形態では、第1の細胞集団は、移植レシピエント中に生着し、細胞区画例えば、造血細胞を長期再増殖する能力を有するのに対して、第2の細胞集団は、移植レシピエント中に生着し、細胞区画例えば、造血細胞を短期または一過性に再増殖する能力を有する。1つの実施形態では、本発明は、形質導入された多分化能細胞の移植レシピエントへの移植後に骨髄抑制を阻害する方法であって、形質導入された多分化能細胞を含む第1の細胞集団を第1の細胞集団と比較して多分化能細胞の百分率が低い第2の細胞集団と組み合わせて移植レシピエントに移植する工程であって、第2の細胞集団は移植レシピエントを一過性に再増殖することができる、工程を含む、方法を含む。特定の実施形態では、第1の細胞集団は、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む移入ベクターで形質導入された多分化能細胞を含む。種々の実施形態では、第2の細胞集団は形質導入されているか、形質導入されていない。一定の実施形態では、第1の細胞集団は、移植レシピエントへの第1の細胞集団の移植後invivoで少なくとも4ヶ月間にわたり少なくとも2つの異なる細胞系統を産生することができる。一定の実施形態では、第2の細胞集団は、移植レシピエントの造血系を一過性に再増殖することができる。特定の実施形態では、移植レシピエントは、移植前に骨髄破壊治療を受けていた。一定の実施形態では、第1および第2の細胞集団は造血細胞を含む。特定の実施形態では、第2の細胞集団は、第1の細胞集団と比較して多分化能細胞の百分率が減少している。特定の実施形態では、第2の細胞集団を、移植前に多分化能細胞の拡大および/または少なくとも部分的な分化を誘導する条件に暴露した。一定の実施形態では、第2の細胞集団を、移植前に培養物中で拡大した。種々の実施形態では、第1および第2の細胞集団を、移植レシピエントから得た。一定の実施形態では、第1および/または第2の細胞集団を、骨髄、動員末梢血、臍帯血、および/または胚性幹細胞から得た。一定の実施形態では、第1の細胞集団を、形質導入された細胞を選択することを含む手順によって産生した。この手順は第1の細胞集団を1~25μg/mlのピューロマイシンと4日間以下接触させることを含み、第1の細胞集団は、プロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと第1の細胞集団内の複数の細胞のゲノム内にポリヌクレオチドを組み入れるのに十分な条件下および期間予め接触させていた。本発明の特定の実施形態では、上記の形質導入された細胞を産生および選択する方法、それに関連する形質導入された細胞による移植レシピエント中の細胞集団の再構築の増強方法、ならびに治療ポリペプチドの必要とする被験体への送達方法という表題の任意の方法を、移植レシピエントにおける骨髄抑制の軽減方法という表題の任意の本明細書中に記載の方法と組み合わせ、それにより、骨髄抑制を軽減しながら移植され、形質導入された幹細胞の再構成を増強するための特定の実施形態を得ることができる。したがって、1つの実施形態では、本発明は、形質導入された幹細胞を移植レシピエント中に移植する方法であって、方法が、i多分化能細胞幹細胞が含まれるを含む第1の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターとinvitroで接触させ、それにより、形質導入された多分化能細胞幹細胞が含まれるを含む第2の細胞集団を生成する工程;ii第2の細胞集団を濃度1~25μg/mlのピューロマイシンと4日間以下invitroで接触させ、それにより、形質導入された多分化能細胞幹細胞が含まれるを含む第3の細胞集団を生成する工程であって、第3の細胞集団が、第2の細胞集団より高い百分率の形質導入された多分化能細胞を含み、第3の細胞集団が、移入ベクターを含む少なくとも2つの異なる細胞系統の産生を第3の細胞集団の移植レシピエントへの移植後invivoで少なくとも4ヶ月間維持することができる、工程;iii移植レシピエント中に複数の第3の細胞集団を第4の細胞集団と組み合わせて移植する工程であって、第4の細胞集団は前駆細胞を含み、第4の細胞集団が第4の細胞集団の移植レシピエント中への移植後に造血を短期間支持することができる、工程を含む、方法を提供する。第3および第4の細胞集団を組み合わせて移植する場合、これは第3および第4の細胞集団を同時に移植することを必ずしも意味せず、その代わりに、2つの集団のうちの1つを他の集団による移植の前、同時、または後に移植することができると理解される。しかし、両集団は、ある期間中に移植レシピエント中に存在するであろう。一定の実施形態では、両集団を、同時、互いに1時間以内、2時間以内、または24時間以内に移植することができる。一過性または短期で再増殖させるために移植された第4の細胞集団が一過性または短期で再増殖させることを意図する細胞集団について上記の任意の特徴を有することができると理解される。したがって、特定の実施形態では、第4の細胞集団を、多分化能細胞の拡大および/または少なくとも部分的な分化を誘導する条件に予め暴露した。種々の実施形態では、第4の細胞集団は形質導入されていないか、形質導入されている。したがって、第4の細胞集団は、形質導入された細胞を含んでも含んでいなくても良い。1つの実施形態では、第4の細胞集団は、i第4の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと接触させる工程;およびii第4の細胞集団を濃度1~25μg/mlのピューロマイシンと4日間以下接触させ、それにより、ピューロマイシン耐性ポリペプチドを含む形質導入された細胞について選択する工程を含む方法によって形質導入および選択された細胞を含む。特定の実施形態では、第4の細胞集団は造血細胞を含む。一定の実施形態では、第1および第4の細胞集団を同一の被験体から得た。特定の実施形態では、第1および第4の細胞集団を、骨髄、動員末梢血、臍帯血、および/または胚性幹細胞から得た。図4Aは、本発明の生着の改善方法を示す概略図を提供する。この方法は、以下の両方を含む:1ピューロマイシン耐性を付与する移入ベクターで形質導入された細胞多分化能細胞造血幹細胞HSCなどが含まれるの選択;および2選択された形質導入された細胞多分化能細胞HSCなどが含まれるの拡大された非形質導入前駆細胞と組み合わせた移植。移植後、拡大された非形質導入前駆細胞は短期再増殖する一方で、選択された形質導入されたHSCは非形質導入HSCと競合することなく成長し、最終的にレシピエント内で細胞集団が再構成される。図の下のグラフは、骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な骨髄抑制レベル左のグラフおよび骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な移植細胞からの再増殖右のグラフを示す。示すように、移植レシピエントは拡大された前駆細胞と組み合わせて形質導入されたHSCを移植した場合に非形質導入細胞の除去後の形質導入された細胞のみの移植後のより遅い回復と比較して迅速な回復を示すと予想される。さらに、移植レシピエントは拡大された前駆細胞から一過性に再増殖し、形質導入されたHSCから持続的に再増殖すると予想される。図4Bは、本発明の生着の改善方法を示す概略図を提供する。この方法は、以下の両方を含む:1ピューロマイシン耐性を付与する移入ベクターで形質導入された細胞多分化能細胞造血幹細胞HSCなどが含まれるの選択;および2HSCの拡大を促進する薬剤アリール水素受容体アンタゴニストSR1などの存在下での培養による選択された形質導入された細胞の拡大。これらの拡大して形質導入された細胞をレシピエントに移植し、形質導入された多分化能細胞が非形質導入細胞と競合することなく成長し、最終的にレシピエント内で細胞集団が再構成される。図の下のグラフは、骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な骨髄抑制レベル左のグラフおよび骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な移植細胞からの再増殖右のグラフを示す。示すように、移植レシピエントは拡大されたHSCを移植された場合に非形質導入細胞の除去後の非拡大細胞の移植後のより遅い回復と比較して迅速に回復し、より早期の疾患の是正も付随すると予想される。さらに、移植レシピエントは拡大された形質導入されたHSCを移植した場合に形質導入された細胞の選択後の非拡大細胞の移植後の低い再増殖と比較して高いレベルの生着および持続的再構成を示すと予想される。移入ベクター本発明は、さらに、本発明の方法を実施するために使用することができる移入ベクターを提供する。これらのベクターを、ピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現し、それにより、形質導入された細胞の選択が容易になるようにデザインする。好ましい実施形態では、移入ベクターを、治療ポリペプチドを発現するようにさらにデザインする。当業者は、かかる移入ベクターを種々の異なるウイルスベクターを使用して産生することができると認識する一方で、特定の実施形態では、移入ベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。これは、その一部の理由として、レンチウイルスベクターがinvitroおよびinvivoの両方で導入遺伝子を非分裂細胞に効率的に送達させ、組み入れ、長期発現することができるからである。種々のレンチウイルスベクターが当該分野で公知であり、Naldiniら,1996a,1996b,および1998;Zuffereyら,1997;Dullら,1998,米国特許第6,013,516号;および同第5,994,136号これらのいずれかを本発明の移入ベクターを産生させるために適合させることができるを参照のこと。一般に、これらのベクターはプラスミドベースまたはウイルスベースであり、治療ポリペプチドをコードする核酸の宿主細胞への移入に不可欠な配列を保有するように構成する。レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスDNAには、レトロウイルス中で見出される3つの遺伝子gag、pol、およびenvが含まれ、これらは2つの長末端反復LTR配列に隣接している。gag遺伝子は内部構造マトリックス、キャプシド、およびヌクレオカプシドタンパク質をコードし、pol遺伝子はRNA指向性DNAポリメラーゼ逆転写酵素、プロテアーゼ、およびインテグラーゼをコードし、env遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。5’および3’LTR’は、ビリオンRNAの転写およびポリアデニル化をそれぞれ促進する機能を果たす。レンチウイルスは、さらなる遺伝子vif、vpr、tat、rev、vpu、nef、およびvpxが含まれるを有する。5’LTRに隣接する配列は、ゲノムの逆転写tRNAプライマー結合部位およびウイルスRNAの粒子への効率的なキャプシド形成Psi部位に必要な配列である。さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターはHIVベクターである。したがって、ベクターは、ヒト免疫不全-1HIV-1、ヒト免疫不全-2HIV-2、サル免疫不全ウイルスSIV、ネコ免疫不全ウイルスFIV、ウシ免疫不全ウイルスBIV、ジュンブラナ病ウイルスJembranaDiseaseVirusJDV、ウマ伝染性貧血ウイルスEIAV、およびヤギ関節炎脳炎ウイルスCAEVなどに由来し得る。HIVベースの構築物がヒト細胞の形質導入で最も効率的であるという点で、HIVベースのベクター骨格すなわち、HIVシス作用性配列エレメントならびにHIVのgag、pol、およびrev遺伝子を、一般に、本発明のほとんどの態様と併せることが好ましい。特定の実施形態では、本発明の移入ベクターは、左側の5’レトロウイルスLTR;レトロウイルス移行エレメント、任意選択的にレンチウイルスRev応答エレメントRRE;目的の遺伝子例えば、治療ポリペプチドをコードするに作動可能に連結されたプロモーターまたはその活性部分および任意選択的に遺伝子座調節領域LCR、またはその活性部分;プロモーターに作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列;および右側の3’レトロウイルスLTRを含む。本発明の移入ベクターは、他のエレメント1つ以上のセントラルポリプリントラクトcentralpolypurinetract/DNAフラップcPPT/FLAP例えばψパッケージングシグナルおよび/またはHIV-1由来のcPPT/FLAPが含まれるなどをさらに含むことができる。一定の実施形態では、5’LTRのプロモーターを、異種プロモーター例えば、サイトメガロウイルスCMVプロモーターが含まれると置換する。本発明の1つの実施形態では、ベクターのLTR領域3’LTRなどをU3および/またはU5領域で改変し、自己不活性化SINベクターが作製される。かかる改変は、遺伝子送達用のベクターの安全性の増大に寄与する。1つの実施形態では、本発明のSINベクターは、U3領域の一部がインスレーターエレメントに置換された3’LTRの欠失を含む。例示的なSINベクターは、例えば、米国特許出願公開第2006/0057725号ならびに米国特許第7,250号および同第6,165,782号に記載されている。インスレーターは、ベクター内のエンハンサー/プロモーター配列がゲノム付近の遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止し、その逆もまた同様であり、付近のゲノム配列がベクター内の遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止する。例示的なインスレーター配列は、例えば、米国特許出願第2006/0057725号および米国特許第5,610,053号に記載されている。本発明のさらなる実施形態では、U5領域を、例えば、理想的なポリA配列と置換するように3’LTRを改変する。LTRの改変3’LTR、5’LTR、または3’LTRと5’LTRとの両方の改変なども本発明に含まれることに留意すべきである。特定の実施形態では、本発明の移入ベクターは、左側の5’レトロウイルスLTR;レトロウイルス移行エレメント、任意選択的にレンチウイルスRev応答エレメントRRE;目的の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターまたはその活性部分および遺伝子座調節領域LCRまたはその活性部分;プロモーターに作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列;および右側の3’レトロウイルスLTRを含む。本発明のレトロウイルスベクターは、セントラルポリプリントラクト/DNAフラップcPPT/FLAP例えば、HIV-1由来のcPPT/FLAPが含まれるをさらに含むことができる。別の実施形態では、5’LTRのプロモーターを、異種プロモーター例えば、サイトメガロウイルスCMVプロモーターが含まれると置換する。特定の実施形態では、左側の5’LTR、右側の3’LTR、または左側および右側のLTRの両方のU5領域の全部または一部を理想的なポリA配列と置換するように改変し、左側の5’長末端反復LTR、右側の3’LTR、または左側および右側のLTRの両方のU3領域を、1つ以上のインスレーターエレメントを含むように改変する。1つの実施形態では、U3領域を、U3領域のフラグメントの欠失およびこのフラグメントのインスレーターエレメントとの置換によって改変する。特定の実施形態では、右側の3’LTRのU5領域を、U5領域の欠失およびこの領域のDNA配列例えば、理想的なポリA配列との置換によって改変する。さらに別の実施形態では、ベクターは、β-グロビン遺伝子座由来のインスレーター例えば、ニワトリHS4が含まれるを含むインスレーターエレメントを含む。本発明の移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくはフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。典型的には、機能的バリアントは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドに対して少なくとも90、少なくとも95、または少なくとも99のアミノ酸同一性を含み、機能的フラグメントはピューロマイシン耐性を付与するのに十分なピューロマイシン耐性ポリペプチドの一部を含む。かかる機能的バリアントおよびフラグメントは、これらが発現される細胞中でこれらが由来する野生型ピューロマイシン耐性ポリペプチドの少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、または少なくとも90のピューロマイシン耐性活性を付与することができる。当業者は、ピューロマイシン耐性活性を容易に決定することができる。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性遺伝子は、ピューロマイシンN-アセチル-トランスフェラーゼPAC、またはその機能的バリアントもしくはフラグメントをコードするpac遺伝子またはそのコドン至適化バリアントである。本発明の移入ベクターレンチウイルスベクターが含まれるは、目的の遺伝子例えば、目的のポリペプチドまたは治療ポリペプチドを発現するポリヌクレオチド配列が含まれるを含むことができる。特定の実施形態では、治療ポリペプチドを、ポリペプチドが低減されたレベルで、または変異し、機能性がより低い形態で発現される患者に提供する。目的の遺伝子およびその発現されたポリペプチドの例には、副腎脳白質ジストロフィALD遺伝子またはそのコード領域、およびALDタンパク質米国特許第5,644,045号に記載;グロビン遺伝子または抗鎌状赤血球化タンパク質をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。1つの実施形態では、本発明のレトロウイルスベクター中で発現されるグロビン遺伝子は、β-グロビン、δ-グロビン、またはγ-グロビンである。別の実施形態では、ヒトβ-グロビン遺伝子は、野生型ヒトβ-グロビン遺伝子またはヒトβA-グロビン遺伝子である。別の実施形態では、ヒトβ-グロビン遺伝子は、1つ以上のイントロン配列の欠失を含むか、少なくとも1つの抗鎌状赤血球化アミノ酸残基をコードする変異ヒトβ-グロビン遺伝子である。抗鎌状赤血球化アミノ酸は、ヒトδ-グロビンまたはヒトγ-グロビンに由来し得る。別の実施形態では、変異ヒトβ-グロビン遺伝子は、コドン87でのトレオニン-グルタミン変異をコードするβA-T87Q。本発明にしたがって使用することができるグロビン配列の例は、米国特許第5,861,488号に提供されており、グロビン配列を含む例示的移入ベクターは、米国特許第5,631,162号にも記載されている。移入ベクターのプロモーターは、特定の遺伝子の5’隣接領域と天然にすなわち、invivoで細胞と共に生じるのでまたは非天然に会合されたプロモーターであり得る。プロモーターは、真核生物ゲノム、ウイルスゲノム、または合成配列に由来し得る。プロモーターを、非特異的全組織中で活性であるか、組織特異的であるか、天然の調節過程によって調節されるか、外因的に適用された薬物によって調節されるか、特異的な生理学的状態によって調節される急性期反応中に活性化するプロモーターまたは複製細胞中のみで活性化するプロモーターなどように選択することができる。本発明におけるプロモーターの非限定的な例には、レトロウイルスLTRプロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、およびサイトメガロウイルスCMVが含まれる。プロモーターを、状態異常血色素症が含まれるが、これに限定されないに関連することが見出され得る選択された細胞型で特異的に発現することが示されたプロモーターから選択することもできる。本発明の1つの実施形態では、プロモーターは、遺伝子発現が赤血球に制限されるように細胞特異的である。エリスロサイト特異的発現を、ヒトβ-グロビンプロモーター領域および遺伝子座調節領域LCRの使用によって達成することができる。ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、同一または異なるプロモーター配列に作動可能に連結することができる。ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび/または治療ポリペプチドを、1つ以上の構成性プロモーターから発現することができる。しかし、本発明の移入ベクターは、1つまたは両方の治療ポリペプチドおよび/またはピューロマイシン耐性遺伝子の一時性発現または組織特異的発現が可能な1つ以上のプロモーターまたはエンハンサーエレメントを含むことができる。特定の実施形態では、哺乳動物中で天然に発現される細胞中のみで治療ポリペプチドを発現することが望ましいかもしれない。したがって、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、細胞中での治療ポリペプチドの発現を選択的に駆動する組織特異的プロモーターおよび/またはエンハンサーに作動可能に連結させることができる。赤血球中での発現を駆動するために使用することができる組織特異的プロモーターの一例は、β-グロビンプロモーターおよびLCRである。一定の実施形態では、誘導性プロモーターを使用してピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現することが望ましいかもしれない。その結果、このポリペプチドは、被験体内へ移入ベクターを使用して形質導入された細胞の導入後に発現されないか、無視出来るほどしか発現されないであろう。例えば、形質導入後およびピューロマイシン選択過程前またはその間にピューロマイシン耐性ポリペプチドの発現を誘導することが望ましいかもしれない。他の実施形態では、体内移植および再構成に有利であり得る形質導入された幹細胞の選択を増強するために前駆体または分化細胞と比較して幹細胞中でピューロマイシン耐性遺伝子を優先的に発現することが望ましいかもしれない。したがって、移入ベクター中で、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、前駆体または分化細胞よりも幹細胞中で活性な誘導性プロモーターおよび/またはエンハンサーまたはプロモーターおよび/またはエンハンサーに作動可能に連結することができる。使用することができる種々の誘導性プロモーターおよび/またはエンハンサーは当該分野で公知であり、例えば、Cre/loxP系、2種のテトラサイクリン応答Tet系Tet-On、Tet-Off、糖質コルチコイド応答マウス乳腺癌ウイルスプロモーターMMTVprom、エクジソン-誘導性プロモーターEcP、およびT7プロモーター/T7RNAポリメラーゼ系T7Pが含まれるが、これらに限定されない。1つの特定の実施形態では、HIVベースの組み換え移入ベクターは、5’→3’方向に、5’隣接HIVLTR、パッケージングシグナルまたはψ、HIV-1のセントラルポリプリントラクトまたはDNAフラップcPPT/FLAP、Rev応答エレメントRRE、ヒトβ-グロビン遺伝子3’エンハンサー、目的の遺伝子βA87Thr:Gln変異を含むヒトβ-グロビン遺伝子バリアントなど、266bpのヒトβ-グロビンプロモーター、2.7kbのヒトβ-グロビンLCR、PGKプロモーターまたは誘導性プロモーター、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリプリントラクトPPT、および3’隣接HIVLTRを含む。LTR領域は、U3領域およびU5領域ならびにR領域をさらに含む。U3領域およびU5領域を、自己不活化し、それにより遺伝子送達で用いるベクターの安全性が増大する移入ベクターを作製するために共にまたは独立して改変することができる。U3領域およびU5領域を、インスレーターエレメントを含むようにさらに改変することができる。本発明の1つの実施形態では、インスレーターエレメントはニワトリHS4である。他の実施形態では、本発明の移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび自殺遺伝子産物例えば、条件的自殺遺伝子単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼを使用の両方を発現する。さらに、移入ベクターは、治療ポリペプチドまたは目的の遺伝子を発現することができる。したがって、移植レシピエントにおけるベクター媒介挿入変異誘発の際に生成され得る腫瘍性細胞を、化学的に誘導された細胞自殺例えば、ガンシクロビル;NaujokO.らStemCellRev.2010Sep;63:450-61によって処置可能にされる。他の条件的自殺遺伝子を、単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼコード遺伝子の代わりに使用することができる。特定の実施形態では、ピューロマイシン耐性および条件的細胞自殺タンパク質は、iポリシストロニックベクター内の内部リボゾーム侵入部位IRESによるか、ii前駆体タンパク質の切断によるか、iii融合タンパク質として同時発現される。したがって、本発明の別の実施形態では、移入ベクターは、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、自殺遺伝子はHSVチミジンキナーゼHSV-Tkである。移入ベクターはまた、細胞のinvivo選択のための遺伝子invivo選択のための遺伝子例えば、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼMGMT遺伝子などを含むポリヌクレオチドを含むことができる。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、構成性または誘導性プロモーター本明細書中に記載の任意のプロモーターが含まれるに作動可能に連結される。1つの実施形態では、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列は、ベクター中の5’LTRの下流および治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に存在する。一定の実施形態では、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列は、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターの5’末端が治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの5’末端に向かって存在し治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列と比較して逆方向に存在し、したがって、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの5’末端は5’LTRよりも3’LTRに近い、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列の3’末端がpptおよび/または3’LTRの5’末端に向かって存在するように配向する。一定の実施形態では、自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、その発現がベクター中のプロモーターによって駆動されないようにベクター中に方向づける。したがって、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター内のプロモーターに作動可能に連結されない。むしろ、細胞プロモーターの影響下で細胞の染色体DNAの領域にベクターを挿入する場合に自殺遺伝子が発現する。特定の実施形態では、自殺タンパク質は、条件的または構成性であり得る。1つの実施形態では、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター中の5’LTRの下流および治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に存在する。一定の実施形態では、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの5’末端が5’LTRに向かって存在し、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの3’末端が治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの3’末端に向かって存在するように方向づける。したがって、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、逆方向で存在し得る。これらのエレメントが存在するベクターの特定の実施位形態では、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター中のcPPT/FLAPおよび/またはRREエレメントの上流に存在し得る。自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドが5’LTRの下流およびcPPT/FLAPおよび/またはRREエレメントの上流に存在する特定の実施形態では、スプライス受容配列を、自殺タンパク質の5’側例えば、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドのすぐ隣りに含めることができる。一定の実施形態では、スプライス受容配列は、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの20塩基、10塩基、5塩基、またはそれ未満の塩基の上流に存在する。1つの実施形態では、移入ベクターは、ベクター内のプロモーターに作動可能に連結されない自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドは5’LTRの下流およびcPPT/FLAPおよび/またはRREエレメントの上流に存在し、スプライス受容部位は自殺タンパク質の5’側例えば、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドのすぐ隣りまたは、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの20塩基、10塩基、5塩基、またはそれ未満の塩基の上流の範囲内に含まれる。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性タンパク質および自殺タンパク質は、インフレーム融合タンパク質またはポリペプチドとして発現される。特定の実施形態では、これらのタンパク質は、ピューロマイシン耐性ポリペプチドと自殺ポリペプチドとの直接的な融合物として発現される。一定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドと自殺ポリペプチドとの間にリンカー配列を含む。ペプチドリンカー配列を使用して、確実にポリペプチドドメインがその所望の機能を果たすことが可能なように各ポリペプチドがその適切な二次構造および三次構造に折りたたまれるのに十分な距離で任意の2つ以上のポリペプチド成分を分離することができる。かかるペプチドリンカー配列を、当該分野で標準的な技術を使用して融合ポリペプチドに組み込む。適切なペプチドリンカー配列を、以下の要因に基づいて選択することができる:1可撓性の伸長されたコンフォメーションを採用する能力;2第1および第2のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用することができる二次構想を採用することができないこと;および3ポリペプチド機能的エピトープと反応することができる疎水性残基または荷電残基を欠くこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly残基、Asn残基、およびSer残基を含む。他の中性付近のアミノ酸ThrおよびAlaなどもリンカー配列中で使用することができる。リンカーとして有用に使用することができるアミノ酸配列には、Marateaら,Gene40:39-46,1985;Murphyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:8258-8262,1986;米国特許第4,935,233号、および米国特許第4,751,180号に開示のアミノ酸配列が含まれる。特定の融合ポリペプチドセグメントが機能的ドメインを分離して立体干渉を防止するために使用することができる非必須N末端アミノ酸領域を含む場合にリンカー配列は必要ない。好ましいリンカーは、典型的には、組み換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸サブシーケンスである。リンカーポリペプチドは、1アミノ酸長と200アミノ酸長との間、1アミノ酸長と100アミノ酸長との間、または1アミノ酸長と50アミノ酸長との間その間の全ての整数値が含まれるであり得る。例示的なリンカーには、以下のアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない:GGG;DGGGS配列番号16;TGEKP配列番号17例えば、Liuら,PNAS5525-55301997を参照のこと;GGRR配列番号18Pomerantzら1995,supra;GGGGSn配列番号19Kimら,PNAS93,1156-11601996.;EGKSSGSGSESKVD配列番号20Chaudharyら,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070;KESGSVSSEQLAQFRSLD配列番号21Birdら,1988,Science242:423-426、GGRRGGGS配列番号22;LRQRDGERP配列番号23;LRQKDGGGSERP配列番号24;LRQKdGGGS2ERP配列番号25。あるいは、可撓性リンカーを、DNA結合部位およびペプチド自体の両方をモデリングすることができるコンピュータプログラムDesjarlaisBerg,PNAS90:2256-22601993,PNAS91:11099-111031994を使用するかファージディスプレイ法によって合理的にデザインすることができる。一定の実施形態では、リンカー配列は、3つのグリシン残基を含むGly3リンカー配列を含む。特定の実施形態では、リンカー配列が切断可能である。特定の実施形態では、リンカー配列は自己触媒性ペプチド切断部位を含む。例示的なポリペプチド切断シグナルには、ポリペプチド切断認識部位プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位、および自己切断型ウイルスオリゴペプチドdeFelipeandRyan,2004.Traffic,58;616-26を参照のことなどが含まれる。適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは、当業者に公知である例えば、Ryanら,1997.J.Gener.Virol.78,699-722;Scymczakら2004NatureBiotech.5,589-594を参照のこと。例示的なプロテアーゼ切断部位には、ポティウイルスNIaプロテアーゼ例えば、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ、ポティウイルスHCプロテアーゼ、ポティウイルスP1P35プロテアーゼ、ビモウイルスbyovirusNIaプロテアーゼ、ビモウイルスbyovirusRNA-2コードプロテアーゼ、アフトウイルスLプロテアーゼ、エンテロウイルス2Aプロテアーゼ、ライノウイルス2Aプロテアーゼ、ピコルナ3Cプロテアーゼ、コモウイルス24Kプロテアーゼ、ネポウイルス24Kプロテアーゼ、RTSVライスツングロスフェリカルウイルスricetungrosphericalvirus3C様プロテアーゼ、PYVFパースニップイエローフレックウイルスparsnipyellowfleckvirus3C様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Xa因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が含まれるが、これらに限定されない。その高い切断ストリンジェンシーのために、TEVタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ切断部位が好ましい1つの実施形態では、例えば、EXXYXQG/S配列番号3、例えば、ENLYFQG配列番号4およびENLYFQS配列番号5式中、Xは任意のアミノ酸を示すTEVによってQとGとの間またはQとSとの間が切断される。特定の実施形態では、自己切断ペプチドには、ポティウイルスおよびカルジオウイルス2Aペプチド、FMDV口蹄疫ウイルス、ウマ鼻炎Aウイルス、Thoseaasignaウイルス、およびブタテッショウウイルスから得たポリペプチド配列が含まれる。一定の実施形態では、自己切断ポリペプチド部位は、2Aまたは2A様部位、配列、またはドメインを含むDonnellyら,2001.J.Gen.Virol.82:1027-1041。例示的な2A部位には、以下の配列が含まれる。1つの実施形態では、自己触媒性ペプチド切断部位は、翻訳2Aシグナル配列例えば、18アミノ酸配列であるアフトウイルス口蹄疫ウイルスFMDVポリタンパク質の2A領域などを含む。使用することができる2A様配列のさらなる例には、昆虫ウイルスポリタンパク質、C型ロタウイルスのNS34タンパク質、およびTrypanosomaspp.中の反復配列例えば、Donnellyら,JournalofGeneralVirology2001,82,1027-1041に記載が含まれる。さらなる実施形態では、移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と自殺遺伝子またはcDNAを含むポリヌクレオチド配列との間に存在するジャンク配列を含む。本明細書中で使用する場合、用語ジャンク配列は、公知の機能を有さないDNA配列をいう。一定の実施形態では、ジャンク配列は、哺乳動物細胞中で有意または検出可能なプロモーター活性またはエンハンサー活性を持たず、任意のまたは任意の公知の機能活性を有する任意のポリペプチドや任意のポリペプチドをコードしない。一定の実施形態では、ジャンク配列をコードするポリヌクレオチド配列は、その5’末端で終止コドンに隣接し、そして/またはその3’末端で開始コドンに隣接する。種々の実施形態では、移入ベクターは自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に存在するか、その逆のいずれかである。1つの実施形態では、移入ベクターは、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、構成性または誘導性プロモーター本明細書中に記載の任意のプロモーターが含まれるに作動可能に連結される。1つの実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列は、ベクター中の5’LTRの下流および治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に存在する。一定の実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列を、プロモーターの5’末端が治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの5’末端に向かって存在し治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列と比較して逆方向に存在し、したがって、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの5’末端は5’LTRよりも3’LTRに近い、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列の3’末端がpptおよび/または3’LTRの5’末端に向かって存在するように方向づける。1つの実施形態では、移入ベクターは、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの5’側例えば、プロモーターのすぐ隣りにスプライス受容配列を含む。一定の実施形態では、スプライス受容配列は、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの20塩基、10塩基、5塩基、またはそれ未満の塩基の上流に存在する。さらなる実施形態では、スプライス受容配列は、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの5’側および/または自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の5’側および/またはピューロマイシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の5’側にその任意の適切な組み合わせで含まれる。スプライス受容配列は、これらのポリヌクレオチド配列のそれぞれまたは全ての20塩基、10塩基、5塩基、またはそれ未満の塩基の上流に存在し得る。一定の実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、その発現がベクター中のプロモーターによって駆動されないようにベクター中に方向づける。したがって、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター内のプロモーターに作動可能に連結されない。むしろ、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現は、細胞プロモーターの影響下で細胞の染色体DNA領域にベクターが挿入される場合に起こる。1つの実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター中の5’LTRの下流および治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に存在する。一定の実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、自殺タンパク質またはピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの5’末端が5’LTRに向かって存在し、自殺タンパク質またはピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの3’末端が治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの3’末端に向かって存在するように方向づける。したがって、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドと逆方向で存在し得る。これらのエレメントが存在するベクターの特定の実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター中のcPPT/FLAPおよび/またはRREエレメントの上流に存在し得る。自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドが5’LTRの下流およびcPPT/FLAPおよび/またはRREエレメントの上流に存在する特定の実施形態では、スプライス受容配列は、自殺タンパク質および/またはピューロマイシン耐性タンパク質の5’側例えば、自殺タンパク質および/またはピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのすぐ隣りまたは20塩基、10塩基、5塩基、またはそれ未満の塩基の上流の範囲内に含まれ得る。1つの実施形態では、移入ベクターは、ベクター内のプロモーターに作動可能に連結されない自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは5’LTRの下流およびcPPT/FLAPおよび/またはRREエレメントの上流に存在し、スプライス受容部位は、自殺タンパク質および/またはピューロマイシン耐性タンパク質の5’側例えば、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのすぐ隣りまたは20塩基、10塩基、5塩基、またはそれ未満の塩基の上流の範囲内に含まれる。移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび/または自殺タンパク質の発現を駆動するプロモーターの上流にスプライス受容配列を含むことができる。一定の実施形態では、ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の発現を駆動するプロモーター配列のすぐ上流にスプライス受容配列を含む。種々の実施形態では、移入ベクターは、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はピューロマイシン耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドの上流に存在し、その逆もまた同様であり、その発現を駆動するプロモーターの上流にスプライス受容配列をさらに含む。一定の実施形態では、ベクターは、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流にピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの開始コドンの上流またはピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の開始コドンの上流にスプライス受容配列をさらに含む。一定の実施形態では、ベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドの上流に自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの開始コドンの上流またはピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の開始コドンの上流にスプライス受容配列をさらに含む。一定の実施形態では、自殺遺伝子またはcDNAを含むポリヌクレオチドは、自殺遺伝子の5’末端にコザックコンセンサス配列を含み、自殺遺伝子またはcDNAの3’側に転写終結配列を含む。使用することができる例示的な強力なコザック配列は、コンセンサス配列、GCCRCCATGG配列番号26式中、RはプリンAまたはGであるであるKozak,1986.Cell.442:283-92およびKozak,1987.NucleicAcidsRes.1520:8125-48。特定の実施形態では、移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドとの間に配列内リボソーム進入部位IRESを含む。IRESは、mRNAの中央で翻訳を開始させるヌクレオチド配列である。したがって、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドとの間のIRESの存在により、ピューロマイシン耐性タンパク質および自殺タンパク質を個別に翻訳可能である。ウイルスゲノムおよび哺乳動物RNA由来の種々のIRESは公知であり、本発明にしたがって使用することができる例えば、脳心筋炎ウイルスEMCV由来のIRESが含まれる。移入ベクターを、当該分野で公知の日常的な分子生物学技術を使用して作製することができる。例えば、目的の治療遺伝子例えば、ヒトβ-グロビンなどのcDNAを、PCRによって適切なライブラリーから増幅する。遺伝子を、所望のプロモーターまたは遺伝子発現調節配列ヒトβ-グロビンプロモーターおよびLCRエレメントなどを含むプラスミドpBluescriptIIKSStratageneなどにクローン化する。制限酵素消化または所望のDNA配列を得るための当業者に公知の他の方法の後、次いで、図1に示すように、プロモーターおよびLCRエレメントならびに目的の治療遺伝子を含む核酸カセットを、レンチウイルスベクターの適切なクローニング部位に挿入する。本発明の移入ベクターレンチウイルスベクターが含まれるを、遺伝子治療異常血色素症の処置が含まれるで使用することができる。本発明はまた、例えば、本発明のベクターを含む例えば、トランスフェクトされた宿主細胞を含む。1つの実施形態では、宿主細胞は、胚性幹細胞、体性幹細胞、または前駆細胞である。他の実施形態では、本発明は、赤血球系細胞中で安定した高レベルの遺伝子発現を達成するための例えば、赤血球系特異的疾患を処置するため前述の至適化ベクターの使用方法を提供する。実施例1ピューロマイシン選択による形質導入されたCD34細胞の富化この実施例は、ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを使用した首尾の良い形質導入および形質導入されたCD34細胞の選択、それにより形質導入された細胞中で富化した細胞集団の産生を実証する。これらの実験で使用したレンチウイルスベクターHPV654を、hPGKプロモーターに作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を改変ヒトβ-グロビンポリペプチドを発現する以前に記載のベクター米国特許出願公開第2006/0057725号に記載のβA-T87Q-グロビンレンチウイルスに挿入することによって構築した。この改変したヒトβA-グロビン遺伝子バリアントは、コドン87でβ-グロビンのほとんどの抗鎌状赤血球化活性を担うと考えられているグルタミンをコードするように変異している[βA87Thr:GlnβA-T87Q]Nagelら1979PNASUSA767:670。HPV654ベクターの概略図を、図1に提供する。図1中に示すように、ベクターは、HIVLTRHIV1型長末端反復;ψpsiパッケージングシグナル;cPPTセントラルポリプリントラクト/DNAフラップ;RRERev応答エレメント;I、II、III、ヒトβ-グロビン遺伝子エクソン;介在配列;βグロビンプロモーターSnaBI部位からCap部位まで;3’βグロビンエンハンサーAvrII部位下流まで、およびDNアーゼI高感受性部位LCRのHS2SmaIからXbaI、HS3SacIからPvuII、およびHS4StuIからSpeI、PGKヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター;puroピューロマイシン耐性遺伝子、pptポリプリントラクト;U3delHIVLTR;およびウサギグロビンポリAを含む。水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質-GVSV-Gでシュードタイピングした組み換えウイルスのストックを、HIV-1Gag-Pol、Rev、Tat、およびVSV-Gを発現する個別のプラスミドと共にHPV654ベクターを使用した293T細胞の一過性トランスフェクションによって生成した。ウイルスを4°Cでの超遠心によって濃縮し、ウイルスペレットをStemPro-34無血清培地LifeTechnologies,Frederick,Md.に懸濁した。ウイルス力価を、プロウイルスコピー数を調節した形質導入されたNIH3T3細胞のqPCR分析によって決定した。正常なヒトドナー由来の新鮮な骨髄BM、Lonza,Walkersville,MDまたは低温保存したG-CSF動員末梢血mPB、AllCells,Emeryville,CACD34精製細胞のいずれかを使用した。1×106/mlの細胞濃度で、CD34細胞を、L-グルタミン、100ng/mlhSCF、100ng/mlhTPO、100ng/mlhFLT3-L、および20ng/mlhIL-3BM用または60ng/mlhIL-3mPB用を補足したStemPro-34SFM中にて24時間BMまたは18時間mPB予め刺激した。次いで、細胞を、8μg/ml硫酸プロタミンおよびHPV654上清10最終曝露力価3×107IU/mlMOI7.5BM用および1×107IU/mlMOI3.3mPB用または50最終曝露力価1.5×108IU/mlMOI37.5BM用および5×107IU/mlMOI16.7mPB用のいずれかをさらに補足したサイトカインを含む同一の培地中で濃度4×106BMまたは3×106mPB細胞/mlに懸濁した。HPV654上清添加の24時間後、新鮮なサイトカイン含有培地を添加して細胞を2.0×106/mlBM用または1.5×106/mlmPB用に希釈し、さらに24時間培養した。次いで、2つの各感染細胞集団を以下の2つのサンプルに分けた:図2に示すように、各細胞集団由来の一方のサンプルを5μg/mlピューロマイシンで24時間処理し、他のサンプルをピューロマイシンで処理しなかった。次いで、細胞をピューロマイシン除去のために洗浄し、MethoCult登録商標H4434StemCellTechnologiesInc.,Vancouver,BC,Canadaに3ml中で1×103および4×103細胞ピューロマイシン未処理ならびに4×103および4×104ピューロマイシン処理の用量でプレートした。次いで、コロニー形成単位-顆粒球/マクロファージCFU-GMを、14日間培養して成長させた。次いで、各コロニーを、エリスロポエチン遺伝子BM用およびヒトアクチン遺伝子mPB用のプライマーならびにレンチウイルスベクターに特異的なプライマーGAGBM用およびLTRmPB用を使用した各コロニーのPCR分析によってレンチウイルスベクターの存在について分析した。図2Aに示すように、10HPV654上清で形質導入した骨髄CD34細胞について、ピューロマイシン選択を使用しないで生成した4/1723コロニーがレンチウイルスベクターに陽性であったのに対して、ピューロマイシン選択を使用して生成した20/20100コロニーはレンチウイルスベクターに陽性であった。50HPV654上清で形質導入した細胞について、ピューロマイシン選択を使用しないで生成した3/1916コロニーがレンチウイルスベクターに陽性であったのに対して、ピューロマイシン選択を使用して生成した15/1979コロニーはレンチウイルスベクターに陽性であった。10HPV654上清で形質導入したG-CSF動員CD34細胞についての図2Bに示す第2の実験では、ピューロマイシン選択を使用しないで生成した10/1855コロニーがレンチウイルスベクターに陽性であったのに対して、ピューロマイシン選択を使用して生成した15/1788コロニーはレンチウイルスベクターに陽性であった。50HPV654上清で形質導入した細胞について、ピューロマイシン選択を使用しないで生成した6/1637コロニーがレンチウイルスベクターに陽性であったのに対して、ピューロマイシン選択を使用して生成した18/18100コロニーはレンチウイルスベクターに陽性であった。これらの実験は、形質導入されたCD34細胞の富化を、細胞をピューロマイシンと24時間という短い期間にわたり接触させるピューロマイシン選択によって行うことができることを実証する。かかる選択を有利に使用して、高比率で形質導入された細胞を含む細胞集団を産生し、それにより、その後の移植レシピエント中の形質導入された細胞の生着および再増殖を増強することができる。上記の種々の実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書中で言及され、そして/または出願データシート中に列挙された全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される。おさらなる実施形態を得るために種々の特許、出願、および刊行物の概念を使用することが必要な場合、実施形態の態様を修正することができる。上記の詳細な説明を考慮して、実施形態のこれらの変更および他の変更を行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用した用語によって特許請求の範囲が明細書および特許請求の範囲に開示の特定の実施形態に制限されると解釈すべきではないが、権利化されるかかる特許請求の範囲の全範囲の等価物と共に全ての可能な実施形態が含まれると解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示に制限されない。"