"a目的の異種の核酸を含むアデノ随伴ウイルスAAVベクターであって、AAVベクターのゲノムが、野生型AAVゲノムに比して過大であるベクターと、bプロテアソーム阻害剤とを含む組成物。前記AAVベクターのゲノムのサイズが、約5.0kb超である、請求項1に記載の組成物。前記AAVベクターが、二本鎖AAVベクターのゲノムを含む、請求項1または2に記載の組成物。前記AAVベクターが、分断された導入遺伝子のAAVベクター含む、請求項1または2に記載の組成物。前記プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブベルケイド登録商標である、請求項1から4のいずれか1項に記載の組成物。前記目的の異種の核酸が、凝固因子をコードする、請求項1から5のいずれか1項に記載の組成物。前記凝固因子が、第VIII因子FVIIIである、請求項6に記載の組成物。前記目的の異種の核酸が、ジストロフィンをコードする、請求項1から5のいずれか1項に記載の組成物。前記異種の核酸が、野生型ヌクレオチド配列に比して最適化されたコード配列を含む、請求項1から8のいずれか1項に記載の組成物。前記異種の核酸が、野生型非コード配列に比して最適化された非コード配列を含む、請求項1から9のいずれか1項に記載の組成物。前記AAVベクターのゲノムが、野生型AAVゲノムに比して最適化された、請求項1から10のいずれか1項に記載の組成物。薬学的に許容される担体中に、請求項1から11のいずれかに記載の組成物を含む医薬製剤。目的の核酸を細胞に送達する方法であって、請求項1から11のいずれか1項に記載の組成物または請求項12に記載の医薬製剤を細胞内に導入するステップを含む方法。目的の核酸を対象に送達する方法であって、請求項1から11のいずれか1項に記載の組成物または請求項12に記載の医薬製剤を対象に投与するステップを含む方法。目的の核酸を細胞に送達する方法であって、細胞に、a目的の異種の核酸を含むアデノ随伴ウイルスAAVベクターであって、AAVベクターのゲノムが、野生型AAVゲノムと比較した場合、過大であるベクターと、bプロテアソーム阻害剤とを接触させるステップを含む方法。目的の核酸を対象に送達する方法であって、a目的の異種の核酸を含むアデノ随伴ウイルスAAVベクターであって、前記AAVベクターのゲノムが、野生型AAVゲノムと比較した場合、過大であるベクターと、bプロテアソーム阻害剤とを対象に投与するステップを含む方法。前記細胞が、筋肉細胞、または肝臓細胞、または関節もしくは骨軟骨の部位の細胞である、請求項13または15に記載の方法。前記AAVベクターを、プロテアソーム阻害剤の投与の前に、その後に、および/またはそれと同時に、いずれかの組合せで投与する、請求項14または15に記載の方法。前記プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブベルケイド登録商標である、請求項13から18のいずれか1項に記載の方法。前記目的の異種の核酸が、FVIIIをコードする、請求項13から19のいずれか1項に記載の方法。前記目的の異種の核酸が、ジストロフィンをコードする、請求項13から19のいずれか1項に記載の方法。前記異種の核酸が、野生型ヌクレオチド配列に比して最適化されたコード配列を含む、請求項13から21のいずれか1項に記載の方法前記異種の核酸が、野生型非コード配列に比して最適化された非コード配列を含む、請求項13から22のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターのゲノムが、野生型AAVゲノムに比して最適化された、請求項13から23のいずれか1項に記載の方法。a目的の異種の核酸を含むアデノ随伴ウイルスAAVベクターであって、AAVベクターのゲノムが、野生型AAVゲノムと比較した場合、過大であるベクターと、bプロテアソーム阻害剤とを含むキット。前記目的の異種の核酸が、FVIIIをコードする、請求項25に記載のキット。前記目的の異種の核酸が、ジストロフィンをコードする、請求項25に記載のキット。前記プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブベルケイド登録商標である、請求項25から27のいずれか1項に記載のキット。対象において血友病Aを治療する方法であって、aFVIIIをコードする異種のヌクレオチド配列を含むAAVベクターと、bボルテゾミブベルケイド登録商標とを対象に投与するステップを含む方法。前記対象がヒトである、請求項29に記載の方法。前記FVIIIをコードする異種のヌクレオチド配列が、FVIIIをコードする野生型配列に比して最適化されている、請求項29または30に記載の方法。前記FVIIIをコードする異種のヌクレオチド配列が、野生型非コード配列に比して最適化されている非コード配列を含む、請求項29から31のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターのゲノムが、野生型AAVベクターのゲノムに比して最適化されている、請求項29から32のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターを、ボルテゾミブベルケイド登録商標の投与の前に、その後に、および/またはそれと同時に、いずれかの組合せで投与する、請求項29から33のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターを、ボルテゾミブベルケイド登録商標の投与の前に投与する、請求項29から33のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターがAAV8型である、請求項29から35のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターがAAV2型である、請求項29から35のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターがAAV5型である、請求項29から35のいずれか1項に記載の方法。対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、aジストロフィンをコードする異種のヌクレオチド配列を含むAAVベクターと、bボルテゾミブベルケイド登録商標とを対象に投与するステップを含む方法。前記対象がヒトである、請求項39に記載の方法。前記ジストロフィンをコードする異種のヌクレオチド配列が、ジストロフィンをコードする野生型配列に比して最適化されている、請求項39または40に記載の方法。前記ジストロフィンをコードする異種のヌクレオチド配列が、野生型非コード配列に比して最適化されている非コード配列を含む、請求項39から41のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターのゲノムが、野生型AAVベクターのゲノムに比して最適化されている、請求項39から42のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターを、ボルテゾミブベルケイド登録商標の投与の前に、その後に、および/またはそれと同時に、いずれかの組合せで投与する、請求項39から43のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターを、ボルテゾミブベルケイド登録商標の投与の前に投与する、請求項39から43のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターがAAV8型である、請求項39から45のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターがAAV2型である、請求項39から45のいずれか1項に記載の方法。前記AAVベクターがAAV2型である、請求項39から45のいずれか1項に記載の方法。ここに、本発明を、添付する図面を参照して、より詳細に記載し、本発明の好ましい実施形態を示す。しかし、本発明は、異なる形態で具体化することができ、本発明が本明細書に記載する実施形態に限定されると解釈してはならない。むしろ、本開示を徹底的かつ完全となし、本開示により本発明の範囲が当業者に十分に伝わるように、これらの実施形態を提供する。別段に定義しない限り、本明細書において使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書の本発明の記載において使用する用語法は、特定の実施形態を記載する目的に限られ、本発明を制限するものではない。本明細書に引用する刊行物、特許出願、特許、特許公開およびその他の参考文献は全て、参照される文および/または段落と関連性がある教示のために、それらの全体が参照により組み込まれている。そうでないことを具体的に示さない限り、ヌクレオチド配列を、本明細書においては、左から右へ5’から3’の方向の一本鎖のみによって提示する。ヌクレオチドおよびアミノ酸を、本明細書においては、IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommissionにより推奨されている様式、またはアミノ酸については1文字コードもしくは3文字コードのいずれかにより示す。1文字コードまたは3文字コードの両方は、米国特許法施行規則1.822条37C.F.R.§1.822に従う、確立された使用法である。別段の記載がある場合を除き、遺伝子のクローニング、核酸の増幅および検出等のための、当業者に公知の標準的な方法を使用することができる。そのような技法は、当業者に公知である。例えば、Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual、2版ColdSpringHarbor、NY、1989;Ausubelら、CurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenPublishingAssociates,Inc.およびJohnWileySons,Inc.、NewYorkを参照されたい。<定義>本明細書で使用する場合、あるa、あるanおよびそのtheは、使用されている文脈に応じて、1つまたは2つ以上を意味することができる。例えば、あるa細胞は、1つの細胞または複数の細胞を意味することができる。また、本明細書で使用する場合、および/またはは、1つまたは複数の関連の列挙された項目のあらゆる可能な組合せを、ならびに選択肢またはとして解釈する場合には、組合せの欠如を指し、これらを網羅する。さらに、用語約は、本明細書で使用する場合、測定可能な値、例として、本発明の化合物または薬剤の量、用量、時間、温度等を指す場合には、特定の量の±20、±10、±5、±1、±0.5、またはさらに±0.1の変動を包含することを意味する。用語から本質的になるconsistessentiallyofおよび文法上の変型は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列に適用する場合、言及する配列例えば、配列番号と、言及する配列の5’および/もしくは3’の終点またはN末端および/もしくはC末端の終点上の総数10個以下例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸との両方からなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであって、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的に変化していないようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。総数10個以下の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸は、両方の末端上の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を一緒にして足した総数を包含する。用語実質的に変化しているmateriallyalteredは、本発明のポリヌクレオチドに適用する場合、言及する配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較した場合の、少なくとも約50以上の、コードするポリペプチドを発現する能力の増加または減少を指す。用語実質的に変化しているは、本発明のポリペプチドに適用する場合、言及する配列からなるポリペプチドの活性と比較した場合の、少なくとも約50以上の活性の増加または減少を指す。用語パルボウイルスは、本明細書で使用する場合、自律複製性パルボウイルスおよびディペンドウイルスを含めて、パルボウイルス科を網羅する。自律的なパルボウイルスは、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属およびコントラウイルス属のメンバーを包含する。例示的な自律的なパルボウイルスとして、これらに限定されないが、マウスの微小ウイルス、ウシのパルボウイルス、イヌのパルボウイルス、ニワトリのパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコのパルボウイルス、ガチョウのパルボウイルス、H1パルボウイルス、ノバリケンmuscovyduckのパルボウイルス、B19ウイルス、および現在公知のまたは後に発見される、任意のその他の自律的なパルボウイルスが挙げられる。その他の自律的なパルボウイルスが、当業者に公知である。例えば、BERNARDN.FIELDSら、VIROLOGY、volume2、chapter694版、Lippincott-RavenPublishersを参照されたい。本明細書で使用する場合、用語アデノ随伴ウイルスAAVとして、これらに限定されないが、AAV1型、AAV2型、3A型および3B型を含めたAAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型、AAV10型、AAV11型、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、ヒツジAAV、および現在公知のまたは後に発見される、任意のその他のAAVが挙げられる。例えば、BERNARDN.FIELDSら、VIROLOGY、volume2、chapter694版、Lippincott-RavenPublishersを参照されたい。最近になって、推定上の新しいAAVの血清型およびクレードがいくつか同定されている例えば、Gaoら、2004J.Virology78:6381~6388;Morisら、2004Virology33-:375~383;および表5を参照されたい。AAVおよび自律的なパルボウイルスの種々の血清型のゲノム配列、ならびに末端反復TR、Repタンパク質およびキャプシドサブユニットの配列が、当技術分野で公知である。そのような配列を、文献または公共のデータベース、例として、GenBank中に見出すことができる。例えば、GenBank受託番号:NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579を参照されたい。これらの開示が、パルボウイルスおよびAAVの核酸およびアミノ酸の配列を教示するために、参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、Srivistavaら1983J.Virology45:555;Chioriniら1998J.Virology71:6823;Chioriniら、1999J.Virology73:1309;Bantel-Schaalら、1999J.Virology73:939;Xiaoら、1999J.Virology73:3994;Muramatsuら、1996Virology221:208;Shadeら、1986J.Virol.58:921;Gaoら、2002Proc.Nat.Acad.Sci.USA99:11854;Morisら、2004Virology33-:375~383;国際特許公開第WO00/28061号、第WO99/61601号、第WO98/11244号;および米国特許第6,156,303号も参照されたい;これらの開示が、パルボウイルスおよびAAVの核酸およびアミノ酸の配列を教示するために、参照により本明細書に組み込まれる。用語指向性tropismは、本明細書で使用する場合、ウイルスの、特定の細胞または組織への優先的な進入、および場合により、それに続く、細胞中での、ウイルスゲノムが運ぶ1つまたは複数の配列の発現例えば、転写、および場合により、翻訳、例えば、組換えウイルスについては、1つまたは複数の異種のヌクレオチド配列の発現を指す。当業者であれば、ウイルスゲノムからの異種の核酸配列の転写は、トランス作用因子、例えば、誘導性プロモーターのためまたはそれ以外により制御される核酸配列のためのトランス作用因子の非存在下では開始することができないことを理解するであろう。rAAVゲノムの場合、ウイルスゲノムからの遺伝子の発現は、安定に組み込まれたプロウイルスからの発現、非組込み型non-integratedエピソームからの発現、およびウイルスが細胞内部でとることができる任意のその他の形態であり得る。本明細書で使用する場合、用語ポリペプチドは、別段の記載がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を網羅する。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の配列であり、天然に存在するヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチドの両方を含めたRNA配列、DNA配列、またはDNA-RNAのハイブリッド配列であり得るが、代表的な実施形態では、一本鎖または二本鎖のいずれかのDNA配列である。本明細書で使用する場合、単離されたポリヌクレオチド例えば、単離されたDNAまたは単離されたRNAは、天然に存在する生物もしくはウイルスのその他の構成成分、例えば、細胞もしくはウイルスの構造上の構成成分のうちの少なくともいくつかからか、または当該ポリヌクレオチドに付随して一般に見出される、その他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。同様に、単離されたポリペプチドは、天然に存在する生物もしくはウイルスのその他の構成成分、例えば、細胞もしくはウイルスの構造上の構成成分のうちの少なくともいくつかからか、または当該ポリペプチドに付随して一般に見出される、その他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されているポリペプチドを意味する。本明細書で使用する場合、ウイルスベクターを単離するまたは精製するまたは文法上の相当語句により、ウイルスベクターが、出発材料中のその他の構成成分のうちの少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されることを意味する。治療用ポリペプチドは、細胞または対象におけるタンパク質の不在または欠損の結果生じる症状を軽減するまたは低下させることができるポリペプチドである。あるいは、治療用ポリペプチドは、別の場合には、利益、例えば、抗がん作用または移植生存率の改善を対象に付与するポリペプチドである。用語治療するtreat、治療するtreatingまたはの治療treatmentofまたは文法上の同等の用語により、対象の状態の重症度を、低下させるか、または少なくとも部分的に改善するか、または寛解させること、ならびに/あるいは少なくとも1つの臨床症状の何らかの軽減、緩和または減少を達成すること、ならびに/あるいは疾患または障害について、状態の進行の遅延および/または発症の予防もしくは遅延があることを意味する。したがって、用語治療する、治療するまたはの治療または文法上の同等の用語は、予防的投与計画および治療的投与計画の両方を指す。能動免疫応答または能動免疫は、免疫原と遭遇した後の、宿主の組織および細胞の関与により特徴付けられる。能動免疫には、リンパ細網組織中の免疫担当細胞の分化および増殖が関与し、それにより、抗体の合成もしくは細胞媒介型反応性の発生または両方が生じる.HerbertB.Herscowitz、Immunophysiology:CellFunctionandCellularInteractionsinAntibodyFormation、IMMUNOLOGY:BASICPROCESSES117JosephA.Bellanti編、1985。それに代わって、感染またはワクチン接種による免疫原に対する暴露の後に、能動免疫応答が、宿主により開始されるとも記述される。能動免疫は、能動的に免疫化した宿主から、あらかじめ形成された物質抗体、トランスファー因子、胸腺移植片、インターロイキン-2を非免疫宿主へ導入することを通して獲得される受動免疫と対比することができる同文献。防御免疫応答または防御免疫は、本明細書で使用する場合、免疫応答が、疾患の発生を予防または低下させるという点で、何らかの利益を対象に付与することを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特に、がんまたは腫瘍を例えば、がんもしくは腫瘍の退縮を引き起こすこと、および/または転移を予防すること、および/または転移性の小結節の増殖を予防することによって治療するのに有用で有り得る。防御効果は、治療の利益がそのいずれの欠点にも勝る限り、完全であってもまたは部分的であってもよい。対象において免疫応答を誘発する前述の方法によれば、下記の記載に従って、異種のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを、免疫原性有効量で投与することができる。異種のヌクレオチド配列または異種の核酸は、ウイルスにおいて、天然には存在しない配列である。一般に、異種の核酸は、目的のポリペプチドまたは非翻訳RNAをコードするオープンリーディングフレームを例えば、細胞または対象に送達するために含む。また、異種のヌクレオチド配列または異種の核酸は、ヌクレオチド配列または核酸であって、その中に、当該ヌクレオチド配列または核酸が導入される細胞中で、天然には存在しないヌクレオチド配列または核酸であってもよい。あるいは、異種のヌクレオチド配列または異種の核酸は、天然に存在するヌクレオチド配列または核酸分子と同じであるが、当該異種のヌクレオチド配列または核酸分子が、その天然に存在する対応物が典型的に見出される場所もしくは位置には存在せず、かつ/または天然に存在する対応物の発現を制御する調節エレメントとは異なる調節エレメントの制御下にあるヌクレオチド配列または核酸分子であってもよい。本明細書で使用する場合、用語ウイルスベクター、ベクターまたは遺伝子送達ベクターは、核酸送達ビヒクルとして機能し、AAVのキャプシド内部にパッケージした、ベクターのゲノム例えば、ウイルスDNA[vDNA]を含むウイルス例えば、AAV粒子を指す。あるいは、一部の文脈では、用語ベクターを使用して、ベクターのゲノム/vDNA単独を指すこともできる。rAAVベクターのゲノムまたはrAAVゲノムは、1つまたは複数の異種のヌクレオチド配列を含むAAVゲノムすなわち、vDNAである。rAAVベクターは一般に、ウイルスを生成するのに、シスの145塩基の末端反復複数可TR複数可のみを必要とする。その他のウイルスの配列は全て、欠失可能であり、トランスに供給することができるMuzyczka1992Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.158:97。典型的には、rAAVベクターのゲノムは、最低限のTR配列複数可のみを保持し、その結果、ベクターにより、効率的にパッケージされ得る導入遺伝子のサイズが最大化される。構造タンパク質および非構造タンパク質のコード配列を、例えば、ベクター、例として、プラスミドからか、または配列をパッケージング細胞中に安定に組み込むことによってトランスに供給することができる。rAAVベクターのゲノムは、少なくとも1つのTR配列例えば、AAVのTR配列、場合により、2つのTR例えば、2つのAAVのTRを含み、これらのTRは典型的には、異種のヌクレオチド配列の5’末端および3’末端にあるが、それらに隣接している必要はない。TRは、同じであってもまたは相互に異なっていてもよい。AAVの末端反復またはAAVのTRは、任意のAAVに由来してよく、血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくは11、または現在公知のもしくは今後に発見される、任意のその他のAAVが挙げられるが、これらに限定されない。AAVの末端反復は、末端反復が、所望の機能、例えば、複製、ウイルスのパッケージング、組込みおよび/またはプロウイルスのレスキュー等を媒介する限り、野生型末端反復配列を有する必要はない例えば、野生型配列を、挿入、欠失、切断またはミスセンス突然変異により変化させることができる。用語末端反復またはTRは、任意のウイルスの末端反復、およびヘアピン構造を形成し、逆位末端配列として機能する合成配列、例として、Samulskiらに対する米国特許第5,478,745号に記載されている二重D配列double-Dsequenceを包含する。自律的なパルボウイルスおよびAAVのキャプシド構造が、BERNARDN.FIELDSら、VIROLOGY、volume2、chapters69および704版、Lippincott-RavenPublishersにより詳細に記載されている。また、AAV2Xieら、2002Proc.Nat.Acad.Sci.99:10405~10、AAV4Padronら、2005J.Virol.79:5047~58、AAV5Waltersら、2004J.Virol.78:3361~71、ならびにCPVXieら、1996J.Mol.Biol.6:497~520、およびTsaoら、1991Science251:1456~64の結晶構造の記載も参照されたい。本発明のウイルスベクターはさらに、標的化ウイルスベクター例えば、方向付けられた指向性を有するベクター、および/または国際特許公開第WO00/28004号およびChaoら、2000MolecularTherapy2:619に記載されているハイブリッドパルボウイルスすなわち、rAAVゲノムおよびウイルスのキャプシドが、異なるパルボウイルスに由来するであってもよいこれらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。本発明のウイルスベクターはさらに、国際特許公開第WO01/92551号その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるに記載されている二重鎖のパルボウイルス粒子であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、二本鎖二重鎖のゲノムを、本発明のウイルスのキャプシド内にパッケージすることができる。さらに、ウイルスのキャプシドまたはゲノムは、挿入、欠失および/または置換を含めた、その他の改変形態も含有することができる。したがって、本明細書で使用する場合、用語ウイルスベクターは、パルボウイルスおよびAAVのハイブリッドウイルス粒子、標的化ウイルス粒子および二重鎖ウイルス粒子、ならびにその他の改変した形態を網羅する。用語制御するregulate、制御するregulatesまたは制御regulationは、特定のレベルまたは活性の増強例えば、増加または阻害例えば、減少を指す。用語増強するenhanceまたは増加させるincreaseは、少なくとも約1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、またはさらに15倍の特定のパラメータの増加を指す。用語阻害するinhibitもしくは低下させるreduceまたはそれらの文法上の変形したものは、本明細書で使用する場合、少なくとも約15、25、35、40、50、60、75、80、90または95以上の特定のレベルまたは活性の減少または縮小を指す。特定の実施形態では、阻害または低下の結果、検出可能な活性がほとんどまたは本質的になくなるせいぜい、とるに足らない量、例えば、約10未満またはさらに5未満。本明細書で使用する場合、形質導入は、ウイルスの細胞内への進入、ならびにゲノムが送達する配列の発現例えば、転写および/または翻訳を指す。組換えベクターの場合、形質導入は一般に、組換えウイルスの細胞内への進入、およびベクターのゲノムが送達する目的の核酸の発現を指す。また、本明細書で使用する場合、導入遺伝子は、細胞のトランスフェクションまたは形質導入すなわち、形質転換において使用する任意の核酸配列を指し、この細胞は、invitroにおける細胞であっても、または生物中の細胞であってもよい。したがって、導入遺伝子は、コード配列、非コード配列、cDNA、遺伝子またはその断片もしくは部分、ゲノム配列、調節エレメント等であり得る。トランスジェニック生物、例として、トランスジェニック植物またはトランスジェニック動物は、導入遺伝子が、送達または導入されている生物であり、導入遺伝子を、トランスジェニック生物中で発現させて、産物を産生することができ、産物の存在は、生物中で、作用例えば、治療的もしくは有益な作用および/または表現型例えば、所望のもしくは変化した表現型をもたらすことができる。さらに、本明細書で使用する場合、野生型AAVゲノムに比して過大である、AAVベクターのゲノムは、4680ヌクレオチド4.68kbよりも大きいAAVゲノムであり、4.68kbは、野生型AAVゲノムのサイズである。そのような過大なAAVベクターのゲノムは、例えば、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5.0kb、5.1kb、5.2kb、5.3kb、5.4kb、5.5kb、5.6kb、5.7kb、5.8kb、5.9kb、6.0kb、6.1kb、6.2kbまたは6.3kb等であり得る。増強されたまたは増加した形質導入および同類の用語は、例えば、研究室および/または臨床の目的に有用である、任意の、形質導入の増加を指す。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、パルボウイルスベクターの形質導入を、少なくとも約10、15、20、25、30、40、50、60、75、90、100、150、200、250、300等、および少なくとも約2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、25倍、50倍、75倍、100倍、500倍、1000倍、2000倍または5000倍以上増強するまたは増加させる。本発明のパルボウイルスの形質導入の増強または増加は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載する対照または標準と比べることができる。増強されたまたは増加した発現および同類の用語は、例えば、研究室および/または臨床の目的に有用である、本発明の異種の核酸分子の任意の、発現の増加を指す。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、本発明のパルボウイルスベクター中に存在する異種の核酸の発現を、少なくとも約10、15、20、25、30、40、50、60、75、90、100、150、200、250、300等、および少なくとも約2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、25倍、50倍、75倍、100倍、500倍、1000倍、2000倍または5000倍以上増強するまたは増加させる。本発明の異種の核酸分子の発現の増強または増加は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載する対照または標準と比べることができる。治療有効量は、本明細書で使用する場合、何らかの改善または利益を対象にもたらすのに十分である量である。それに代わって、治療有効量は、対象において、少なくとも1つの臨床症状の何らかの軽減、緩和または減少をもたらす量であるとも記述される。当業者であれば、治療効果は、何らかの利益が対象にもたらされる限り、完全である必要も根治的である必要もないことを理解するであろう。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが形質導入されている細胞を投与して、送達した例えば、導入遺伝子として発現させるか、またはキャプシド中のポリペプチドに対して免疫原性応答を惹起することができる。典型的には、免疫原性有効量のポリペプチドを発現する細胞の分量を、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与する。免疫原性有効量は、医薬製剤を投与した対象において、能動免疫応答を誘起するのに十分である発現したポリペプチドの量である。特定の実施形態では、投与量は、本明細書に定義する防御免疫応答を発生させるのに十分である。付与される防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利益がそのいずれの欠点にも勝る限り、完全である必要も、永久的である必要もない。本発明は、サイズが野生型とは実質的に異なる、組換えパルボウイルスベクターのゲノムを、ウイルス粒子中にパッケージし、標的細胞に感染させることができるが、これらのウイルス粒子による形質導入が、標的細胞内への進入後の点において低下するという発見に一部基づいている。本発明は、任意の特定の理論により拘束されないが、そのようなベクターによる形質導入は、細胞内移動の機構および/または第二鎖の合成により、少なくとも部分的に阻害されることが考えられる。本発明者らは、プロテアソーム阻害剤が、サイズが野生型ゲノムとは実質的に異なる、ベクターのゲノムを送達する場合を含めて、パルボウイルスベクターによる形質導入を増強することができることを見出すに至った。例えば、Hirschら、Littlevector,biggenetransduction:fragmentedgenomereassemblyofadeno-associatedvirus、MolecularTherapy181:6~82010;JohnsonおよびSamulski、Enhancementofadeno-associatedvirusinfectionbymobilizingcapsidsintoandoutofthenucleolus、J.Virol.836:2632~26442009;ならびにGriegerおよびSamulski、Packagingcapacityofadeno-associatedvirusserotypes:impactoflargergenomesoninfectivityandpostentrysteps、J.Virol.7915:9933~99442005を参照されたい。それらのそれぞれの全内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、一態様として、本発明は、a目的の異種の核酸を含むパルボウイルスベクターと、bプロテアソーム阻害剤とを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、パルボウイルスベクターは、ハイブリッドのAAV/自律的なパルボウイルスのベクター、例えば、AAVベクターのゲノムと、自律的なパルボウイルスのキャプシドとを、または逆を含むベクターである。パルボウイルスベクターはさらに、キメラのパルボウイルスベクターであってもまたは標的化パルボウイルスベクターであってもよい例えば、WO00/28004、およびChaoら、2000MolecularTherapy2:619を参照されたい。特定の実施形態では、パルボウイルスは、野生型ゲノムのサイズとはサイズが実質的に異ならないゲノムを含む。その他の実施形態では、ゲノムのサイズは、野生型のサイズとは実質的に異なる例えば、野生型のサイズの約80~85未満および約105~107超。その他の代表的な実施形態では、パルボウイルス例えば、AAVは、サイズが、約5.0、5.2、5.3、5.4もしくは5.5kb超、および/または約6、6.1、6.2、6.3、6.4または6.5kb未満であるAAVベクターのゲノムを含む。特定の実施形態では、AAVベクターのゲノムは、約5.2kb超および約6.1kb未満である。その上さらなる実施形態では、パルボウイルス例えば、AAVは、サイズが、約4.0、3.9、3.8、3.7または3.6kb未満であるAAVベクターのゲノムを含む。本発明によれば、パルボウイルスベクターは、単鎖のベクターのゲノムを含むことができる。あるいは、パルボウイルスベクターは、二本鎖のベクターのゲノムを含むこともできる。二本鎖のAAVベクターが記載されている。例えば、国際特許公開第WO01/92551号を参照されたい。また、本発明は、当技術分野で公知である、分断された導入遺伝子のAAVベクターも網羅する。例えば、Chaoら、ExpressionofhumanfactorVIIIbysplicingbetweendimerizedAAVvectors、MolTher56:716~7222002;Sarkarら、TotalcorrectionofhemophiliaAmicewithcanineFVIIIusinganAAV8serotype、Blood1034:1253~602003;Chenら、TheenhancingeffectsofthelightchainonheavychainsecretioninsplitdeliveryoffactorVIIIgene、MolTher1510:1856~622007;Lostalら、Efficientrecoveryofdysferlindeficiencybydualadeno-associatedvector-mediatedgenetransfer、HumMolGenet1910:1897~19072010;Halbertら、EfficientmouseairwaytransductionfollowingrecombinationbetweenAAVvectorscarryingpartsofalargergene、NatBiotechnol207:697~7012002を参照されたい。プロテアソーム阻害剤は、ペプチド類似体および小型分子の阻害剤を含めた、現在公知のまたは後に発見される、任意のプロテアソーム阻害剤であってよい。多数のプロテアソーム阻害剤が、当技術分野で公知であり、いくつかは、がん療法において使用されている。特定の実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、1疎水性側鎖の後を切断するキモトリプシン様、2酸性側鎖の後を切断するポストグルタミルペプチダーゼpostglutamylpeptidase、3塩基性側鎖の後を切断するトリプシン様、4分枝鎖アミノ酸の後を切断するBrAAP活性、または5小型の中性アミノ酸の後を切断するSNAAP活性プロテアソームを阻害する。代表的な実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、1C末端ペプチドアルデヒド、2ペプチドビニルスルホン例えば、C末端において、ビニルスルホン部分により改変されているペプチド、3ラクタシスチン、4ジ-またはトリ-ペプチドアルデヒド、5ペプチドホウ素エステルpeptideboronester、6α-ケト-カルボニルペプチドpeptideα-keto-carbonyl、7α,β-エポキシケトン、または8アントラサイクリン誘導体である。その他の特定の実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、以下のうちの1つまたは複数、すなわち、N-アセチル-L-ロイシル-L-ロイシル-L-ノルロイシンLLnL、MG-132、PS-341ボルテゾミブまたはベルケイド商標、ドキソルビシン、アクラルビシン、アクラシノマイシンA、AdaAhx3L3VS、AdaLysBioAhx3L3VS、ALLM、ALLN、エポキソミシン、α-メチルオムラリド、MG-115、NLVS、NP-LLL-VS、プロテアソーム阻害剤I、プロテアソーム阻害剤II、プロテアソーム阻害剤III、プロテアソーム阻害剤IV、プロテアソーム阻害剤VII、チロペプチンtyropeptinAまたはYU101を包含する。多数のプロテアソーム阻害剤が、商業的供給元、例として、CalbiochemおよびMilleniumPharmaceuticals,Incから入手可能である。いくつかの実施形態では、本発明のプロテアソーム阻害剤を、デキサメタゾンと共に投与することができ、いくつかの実施形態では、プロテアソーム阻害剤を、デキサメタゾンの投与の不在下で投与することができる。プロテアソーム阻害剤は、当技術分野で公知であり、例えば、Bogyoら、1997Biopoly43:269~280に記載されている。パルボウイルスベクターは、いずれの、目的の異種の核酸配列複数可も含むことができる。目的の核酸配列は、治療用ポリペプチド例えば、医学的もしくは獣医学的に使用するため、または免疫原性ポリペプチド例えば、ワクチンのためを含めた、ポリペプチドをコードする核酸配列を包含する。本明細書で使用する場合、野生型コード配列例えば、FVIIIまたはジストロフィンについてのコード配列に比して最適化されているコード配列を含む異種の核酸またはヌクレオチド配列により、例えば、稀なコドン例えば、ヒトコドンの使用を最小限に留めるため、代替のリーディングフレームを除去するため等の当技術分野で周知のプロトコールに従って最適化されているコード配列を記載する。それらのプロトコールは、当技術分野で公知であろう例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるPCT/US2007/071553に記載されている。また、本明細書で使用する場合、野生型非コード配列に比して最適化されている非コード配列を含む異種の核酸またはヌクレオチド配列により、例えば、プロモーター、ポリAシグナル、末端反復および/またはその他の非コードエレメントの活性を増強するため、ならびに遺伝子の発現、制御および/または産生に関与するシスエレメントおよびトランスエレメントの活性および/または機能を調節するため等の当技術分野で周知のプロトコールに従って最適化されている非コード配列を含む異種の核酸またはヌクレオチド配列も記載する。それらのプロトコールは、当技術分野で周知であろう。さらに、本明細書で使用する場合、野生型AAVベクターのゲノムに比して最適化されているAAVベクターのゲノムにより、ゲノムが、複製、パッケージングおよび/または送達に必要なウイルスのシスエレメントの活性を増強するため等に最適化されているAAVベクターも記載する。それらの最適化は、当技術分野で周知であろう。そのような最適化AAVベクターは、最適化された転写カセット、最適化された末端反復等を含むことができ、これらは、当技術分野で周知であろう。治療用ポリペプチドとして、これらに限定されないが、嚢胞性線維症の膜貫通制御因子タンパク質CFTR、ジストロフィンジストロフィンのミニ遺伝子のタンパク質産物を包含する。例えば、Vincentら1993NatureGenetics5:130;米国特許公開第2003/017131号、ユートロフィンTinsleyら、1996Nature384:349を参照されたい、凝固因子および凝固因子の制御タンパク質例えば、第VIII因子、第IX因子、第X因子、フォン-ヴィルブランド因子、ADAMTS13等、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、LDL受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β-グロビン、α-グロビン、スペクトリン、α1-アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β-グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームのヘキソサミニダーゼA、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、RP65タンパク質、サイトカイン例えば、α-インターフェロン、β-インターフェロン、インターフェロン-γ、インターロイキン-2、インターロイキン-4、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等、ペプチド増殖因子、神経栄養因子、ならびにホルモン例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子1および2、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、神経栄養因子-3および-4、脳由来神経栄養因子、骨形態形成タンパク質[RANKLおよびVEGFを包含する]、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子-αおよび-β等、リソソームの酸性α-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼA、受容体例えば、腫瘍壊死増殖因子可溶性受容体、抗炎症因子、例として、IRAP、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体単鎖モノクローナル抗体を包含する。例示的なMabが、ハーセプチンMabであるが挙げられる。その他の例示的な異種の核酸配列は、自殺遺伝子の産物例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素および腫瘍壊死因子、がん療法において使用する薬物に対する耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制因子遺伝子の産物例えば、p53、Rb、Wt-1、TRAIL、FAS-リガンド、ならびに治療効果を、それを必要とする対象において示す任意のその他のポリペプチドをコードする。一般に、遺伝子の発現に関連する任意の障害に伴う症状を治療するまたは寛解させるために、パルボウイルスベクターを利用して、生物学的作用を示す任意の異種の核酸を送達することができる。あるいは、本発明を使用して、治療用ポリペプチドを送達するのが有益である任意の疾患状況を治療することもできる。例示的な疾患状況として、これらに限定されないが、嚢胞性線維症嚢胞性線維症の膜貫通制御因子タンパク質およびその他の肺疾患、血友病A第VIII因子、血友病B第IX因子、サラセミアβ-グロビン、貧血エリスロポエチンおよびその他の血液障害、アルツハイマー病GDF;ネプリライシン、多発性硬化症β-インターフェロン、パーキンソン病グリア細胞由来神経栄養因子[GDNF]、ハンチントン病反復を除去するためのRNAi、筋萎縮性側索硬化症、てんかんガラニン、神経栄養因子およびその他の神経学的障害、がんエンドスタチン、アンジオスタチン、TRAIL、FAS-リガンド、インターフェロンを含めたサイトカイン;VEGFまたは多剤耐性遺伝子の産物に対するRNAiを含めた、RNAi、糖尿病インスリン、デュシェンヌ型ジストロフィン、ミニ-ジストロフィン、インスリン様増殖因子I、サルコグリカン[例えば、α、β、γ]、ミオスタチンに対するRNAiおよびベッカー型を含めた、筋ジストロフィー、ゴーシェ病グルコセレブロシダーゼ、ハーラー病α-L-イズロニダーゼ、アデノシンデアミナーゼ欠損症アデノシンデアミナーゼ、糖原病例えば、ファブリー病[α-ガラクトシダーゼ]やポンペ病[リソソームの酸性α-グルコシダーゼ]およびその他の代謝の欠陥、先天性肺気腫α1-アンチトリプシン、レッシュ-ナイハン症候群ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニーマン-ピック病スフィンゴミエリナーゼ、テイ-サックス病リソソームのヘキソサミニダーゼA、メープルシロップ尿症分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、網膜変性疾患および眼や網膜のその他の疾患;例えば、黄斑変性についてのPDGF、実質臓器、例として、脳パーキンソン病[GDNF]、星状細胞腫[エンドスタチン、アンジオスタチン、および/またはVEGFに対するRNAi]、神経膠芽腫[エンドスタチン、アンジオスタチン、および/またはVEGFに対するRNAi]を包含する、肝臓、腎臓、うっ血性心不全または末梢動脈疾患PADを含めて、心臓例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤II-1、ホスホランバン、serca2a、ホスホランバン遺伝子を制御するジンクフィンガータンパク質、Barkct、β2-アドレナリン作動性受容体、β2-アドレナリン作動性受容体キナーゼBARK、ホスホイノシチド-3キナーゼPI3キナーゼ、カルサルシンcalsarcin等を送達することによるの疾患、関節炎インスリン様増殖因子、関節障害インスリン様増殖因子、内膜過形成例えば、enos、inosを送達することによる、心臓移植の生存期間の改善スーパーオキシドジスムターゼ、AIDS可溶性CD4、筋消耗インスリン様増殖因子I、腎臓欠損エリスロポエチン、貧血エリスロポエチン、関節炎抗炎症因子、例として、IRAPおよびTNFα可溶性受容体、肝炎α-インターフェロン、LDL受容体の欠損LDL受容体、高アンモニア血症オルニチントランスカルバミラーゼ、クラッベ病ガラクトセレブロシダーゼ、バッテン病、SCA1、SCA2およびSCA3を含めた、脊髄脳運動失調、フェニルケトン尿症フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、自己免疫疾患等が挙げられる。本発明はさらに、臓器移植の後に使用して、移植の成功を増加させること、および/あるいは臓器移植または例えば、免疫抑制剤もしくはサイトカイン産生を遮断するための阻害性の核酸を投与することによる補助療法の負の副作用を低下させることもできる。別の例として、例えば、骨折またはがん患者における外科的除去の後に、RANKLおよび/またはVEGFを含めた骨形態形成タンパク質を、骨の同種移植片と共に投与することができる。ポリペプチドをコードする異種のヌクレオチド配列は、レポーターポリペプチド例えば、酵素をコードする配列を包含する。レポーターポリペプチドは、当技術分野で公知であり、それらとして、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの遺伝子が挙げられる。あるいは、核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム例えば、米国特許第5,877,022号に記載されているもの、スプライソゾーム媒介性のトランス-スプライシングをもたらすRNAPuttarajuら、1999NatureBiotech.17:246;米国特許第6,013,487号;米国特許第6,083,702号を参照されたい、遺伝子の発現抑制を媒介するsiRNAを含めた、干渉RNARNAiSharpら、2000Science287:2431を参照されたい、またはその他の非翻訳RNA、例として、ガイドRNAGormanら、1998Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:4929;Yuanらに対する米国特許第5,869,248号等をコードすることもできる。例示的な非翻訳RNAとして、多剤耐性MDR遺伝子の産物に対するRNAi例えば、腫瘍を治療するため、および/もしくは心臓に投与して、化学療法による損傷を予防するため、ミオスタチンに対するRNAiデュシェンヌ型筋ジストロフィー、またはVEGFに対するRNAi例えば、腫瘍を治療するためが挙げられる。また、ウイルスベクターは、宿主の染色体上の遺伝子座と相同性を共有し、それと組み換わる核酸も含むことができる。このアプローチを活用して、宿主細胞中の遺伝的欠損を修正することができる。異種の核酸はさらに、例えば、ワクチン接種のための免疫原性ポリペプチドをコードすることもできる。核酸は、当技術分野で公知の、目的の免疫原のいずれかをコードすることができ、それらとして、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルスHIV、サル免疫不全ウイルスSIV、インフルエンザウイルス、HIVまたはSIVのgagタンパク質由来の免疫原、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原等が挙げられる。パルボウイルスのワクチンとしての使用は、当技術分野で公知である例えば、Miyamuraら1994Proc.Nat.Acad.SciUSA91:8507;Youngらに対する米国特許第5,916,563号、Mazzaraらに対する米国特許第5,905,040号、米国特許第5,882,652号、Samulskiらに対する米国特許第5,863,541号を参照されたい。これらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。抗原を、パルボウイルスのキャプシド中に提示することができる。あるいは、抗原を、組換えベクターのゲノム中に導入した異種の核酸から発現させることもできる。免疫原性ポリペプチドまたは免疫原は、これらに限定されないが、微生物、細菌、原虫、寄生虫、真菌および/またはウイルスによる疾患を含めた疾患から、対象を防御するのに適した任意のポリペプチドであってよい。例えば、免疫原は、オルソミクソウイルス免疫原例えば、インフルエンザウイルス免疫原、例として、インフルエンザウイルス赤血球凝集素HA表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原、あるいはレンチウイルス免疫原例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルスSIV免疫原またはヒト免疫不全ウイルスHIV免疫原、例として、HIVまたはSIVのエンベロープGP160タンパク質、HIVまたはSIVのマトリックス/キャプシドのタンパク質、ならびにHIVまたはSIVのgag、polおよびenvの遺伝子産物であり得る。また、免疫原は、アレナウイルス免疫原例えば、ラッサ熱ウイルス免疫原、例として、ラッサ熱ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質、ポックスウイルス免疫原例えば、ワクシニア、例として、ワクシニアのL1遺伝子もしくはL8遺伝子の産物、フラビウイルス免疫原例えば、黄熱病ウイルス免疫原もしくは日本脳炎ウイルス免疫原、フィロウイルス免疫原例えば、エボラウイルス免疫原もしくはマールブルグウイルス免疫原、例として、NP遺伝子およびGP遺伝子の産物、ブニヤウイルス免疫原例えば、RVFVウイルス、CCHFウイルスおよびSFSウイルス、またはコロナウイルス免疫原例えば、感染性ヒトコロナウイルス免疫原、例として、ヒトコロナウイルスのエンベロープ糖タンパク質、もしくはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、もしくはトリ伝染性気管支炎ウイルス免疫原であってもよい。免疫原はさらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原例えば、CMV免疫原、EBV免疫原、HSV免疫原、流行性耳下腺炎免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素もしくはその他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎例えば、A型肝炎、B型肝炎もしくはC型肝炎の免疫原、または当技術分野で公知の任意のその他のワクチン免疫原であってもよい。あるいは、免疫原は、任意の腫瘍細胞抗原またはがん細胞抗原であってもよい。好ましくは、腫瘍抗原またはがん抗原は、がん細胞の表面上に発現する。例示的ながん細胞抗原および腫瘍細胞抗原が、S.A.Rosenberg、1999Immunity10:281に記載されている。その他の例示的ながん抗原および腫瘍抗原として、これらに限定されないが、BRCA1遺伝子産物、BRCA2遺伝子産物、gp100、チロシナーゼ、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-カテニン、MUM-1、カスパーゼ-8、KIAA0205、HPVE、SART-1、PRAME、p15、MART-1Coulieら、1991J.Exp.Med.180:35を含めた、メラノーマ腫瘍抗原Kawakamiら、1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3515;Kawakamiら、1994J.Exp.Med.、180:347;Kawakamiら、1994CancerRes.54:3124、gp100Wickら、1988J.Cutan.Pathol.4:201、ならびにMAGE抗原、すなわち、MAGE-1、MAGE-2およびMAGE-3VanderBruggenら、1991Science、254:1643;CEA、TRP-1、TRP-2、P-15およびチロシナーゼBrichardら、1993J.Exp.Med.178:489;HER-2/neu遺伝子産物米国特許第4,968,603号、CA125、LK26、FB5エンドシアリンendosialin、TAG72、AFP、CA19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、SPan-1、CA72-4、HCG、STNシアリルTn抗原、c-erbB-2タンパク質、PSA、L-CanAg、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、p53腫瘍抑制因子タンパク質Levine、1993Ann.Rev.Biochem.62:623;ムチン抗原国際特許公開第WO90/05142号;テロメラーゼ;核マトリックスタンパク質;前立腺の酸性ホスファターゼ;パピローマウイルス抗原;ならびに以下のがん、すなわち、メラノーマ、腺がん、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚部がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がんおよびその他に関連する抗原例えば、Rosenberg、1996Ann.Rev.Med.47:481~91を参照されたいが挙げられる。あるいは、異種のヌクレオチド配列は、望ましくは、invitro、exvivoまたはinvivoにおいて細胞中で産生される任意のポリペプチドをコードすることもできる。例えば、パルボウイルスベクターを、培養細胞中に導入し、発現した遺伝子産物を、そこから単離することができる。当業者であれば、目的の異種の核酸複数可を、適切な制御配列と作動可能に結合させることができることを理解するであろう。例えば、異種の核酸を、発現調節エレメント、例として、転写/翻訳の制御シグナル、複製開始点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位IRES、プロモーター、エンハンサー等と作動可能に結合させることができる。当業者であれば、多様なプロモーター/エンハンサーエレメントを、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて使用することができることを理解するであろう。プロモーター/エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的であってもまたは制御可能であってもよい。プロモーター/エンハンサーは、未変性または外来性であってよく、天然または合成の配列であってよい。外来性により、転写開始領域が、当該転写開始領域を導入する野生型宿主中では見出されないことを意図する。プロモーター/エンハンサーエレメントは、標的細胞もしくは治療しようとする対象にとって未変性であってもよく、かつ/または異種の核酸にとって未変性であってもよい。プロモーター/エンハンサーエレメントは一般に、目的の標的細胞中で機能するように選ばれる。プロモーター/エンハンサーエレメントは、場合により、哺乳動物のプロモーター/エンハンサーエレメントであってもよい。さらに、プロモーター/エンハンサーエレメントは、構成的であってもまたは制御可能であってもよい。本発明は、これまではサイズの限界のために制限されていたパルボウイルスベクター中に、制御可能な発現調節エレメントを含むことを促進する。核酸の送達のための制御可能なプロモーター/エンハンサーエレメントは、組織特異的なプロモーター/エンハンサーエレメントであり得、それらとして、心筋、骨格筋および/または平滑筋を含めた筋肉に特異的な、脳に特異的なものを含めて神経組織に特異的な、網膜に特異的なものおよび角膜に特異的なものを含めて眼の、肝臓に特異的な、骨髄に特異的な、膵臓に特異的な、脾臓に特異的な、ならびに肺に特異的なプロモーター/エンハンサーエレメントが挙げられる。その他の誘導性のプロモーター/エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性エレメントおよび金属誘導性エレメントを包含する。例示的な誘導性のプロモーター/エンハンサーエレメントとして、これらに限定されないが、Teton/offエレメント、RU486誘導性プロモーター、エクダイソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられる。異種の核酸配列複数可が、標的細胞内で、転写され、次いで、翻訳される実施形態では、特異的な開始シグナルが、挿入したタンパク質コード配列の効率的な翻訳に必要となり得る。これらの外来の翻訳制御配列は、ATG開始コドンおよび隣接配列を包含することができ、天然および合成の両方の多様な起源の配列であり得る。異種の核酸のサイズに対する特定の限定はない。特定の実施形態では、異種の核酸は、少なくとも約15、18、24、50、100、250、500または1000ヌクレオチド長以上である。また、本発明は、薬学的に許容される担体中に、本発明の組成物を含む医薬製剤も提供する。薬学的に許容されるにより、生物学的にも別の点でも望ましい材料を意味する。すなわち、材料を、実質的に有害な生物学的作用を引き起こすことも、当該材料を含有する組成物のその他の構成成分のうちのいずれとも有害な様式で相互作用することもなく、選択された粒子および/またはそれらの集団と併せて対象に投与することができる。薬学的に許容される担体は、ヒトおよび本発明のその他の対象への投与または送達に適している。当業者には周知であろうが、担体は当然ながら、活性成分のいかなる分解も最小限に留め、対象におけるいかなる有害な副作用も最小限に留めるように選択されるであろう例えば、Remington’sPharmaceuticalScience;最新版を参照されたい。医薬製剤、例として、本発明のワクチンまたはその他の免疫原性組成物は、免疫原性量の本発明のPIV粒子を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含むことができる。例示的な薬学的に許容される担体として、これらに限定されないが、無菌の発熱性物質を含有しない水および無菌の発熱性物質を含有しない生理学的食塩水が挙げられる。また、本発明は、目的の核酸を細胞に送達する方法も提供し、これらの方法は、細胞を、目的の核酸およびプロテアソーム阻害剤を含むパルボウイルスベクターと接触させるステップを含む。さらなる態様として、本発明は、目的の核酸を対象に送達する方法を提供し、これらの方法は、目的の核酸およびプロテアソーム阻害剤を含むパルボウイルスベクターを、対象に投与するステップを含む。パルボウイルスベクターとプロテアソーム阻害剤は、別個に、または同じ組成物として、場合により、医薬製剤として投与され得る。別個に投与する場合、パルボウイルスベクターとプロテアソーム阻害剤は、場合により、同時に例えば、相互に数分または数時間以内に投与されてもよい。本発明の方法は、獣医学的および医学的の両方の適用例において有用である。適切な対象は、トリおよび哺乳動物の両方を包含する。用語トリとして、本明細書で使用する場合、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコが挙げられるが、これらに限定されない。用語哺乳動物として、本明細書で使用する場合、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ等が挙げられる。ヒト対象は、新生児、乳児、青少年および成人を包含するが、これらに限定されない。対象に投与すべきパルボウイルスベクターの投与量は、投与様式、標的の組織または臓器、治療しようとする疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター、および送達しようとする核酸によって異なり、日常的に決定することができる。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約105、106、107、108、109、1010、1011、1012、103、1014または1015形質導入単位transcudingunit以上の、好ましくは、約106、107、または108~1012もしくは1013形質導入単位のウイルス力価である。同様に、プロテアソーム阻害剤の投与量も、日常的に決定することができ、投与経路、標的の組織または臓器、特定のプロテアソーム阻害剤、対象、および通常の技能をもつ作業者の範囲に属するその他のパラメータと共に変化させる。一般に、プロテアソーム阻害剤は、パルボウイルスベクターによる形質導入を増強するのに有効な量で投与する。特定の実施形態では、ベクターもしくはプロテアソーム阻害剤のいずれか、または両方の2回以上の投与例えば、2、3または4回以上の投与を利用して、所望のレベルの核酸の発現を、種々の間隔、例えば、1日1回、週1回、月1回、年1回等の一定期間にわたり達成することができる。例示的な投与様式として、経口、直腸、経粘膜、外用、鼻腔内、くも膜下腔内、眼内、経皮、吸入、非経口例えば、静脈内、皮下、皮内、[心筋、骨格筋および/または横隔膜筋への投与を含めた]筋肉内ならびに関節腔内投与等、さらに、直接的な組織または臓器への注入が挙げられる。特定の実施形態では、本発明を実行して、これらに限定されないが、筋ジストロフィー[デュシェンヌ型筋ジストロフィーもしくはベッカー型筋ジストロフィーを包含する]、血友病A、血友病B、多発性硬化症、糖尿病、ゴーシェ病、ファブリー病、ポンペ病、がん、関節炎、筋消耗、心臓疾患[先天性心不全もしくは末梢動脈疾患を包含する]、内膜過形成、神経学的障害[てんかんを包含する]、ハンチントン病、パーキンソン病、またはアルツハイマー病、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー病、クラッベ病、フェニルケトン尿症、バッテン病、脊髄脳運動失調、LDL受容体の欠損、高アンモニア血症、貧血、関節炎、黄斑変性を含めた、網膜変性障害、アデノシンデアミナーゼ欠損症、またはがん[腫瘍形成がんを包含する]を包含する状態を有するかまたはそれらについてのリスクがある対象を治療する。本発明を、記載してきたが、以下の実施例で、より詳細に説明する。これらの実施例は、例証する目的に限って本明細書に包含するに過ぎず、本発明を制限するものではない。<AAV2ベクターおよびAAV8ベクターを用いた研究>AAVベクターを使用する、野生型アデノ随伴ウイルスAAVの4680ヌクレオチド長のゲノムよりも大きい遺伝子の送達は、効率が悪い。この研究では、AAV中にパッケージした5.6kbの第VIII因子の発現カセットを使用して、FDAの承認を得ているプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブをベクター送達と併用した場合の治療の効果を、invivoにおいて試験した。血友病マウスにおいて、肝臓内へのベクター送達の結果、1年超の経過観察にわたり持続した第VIII因子の発現が生じた。AAV2の第VIII因子ベクターまたはAAV8の第VIII因子ベクターと共に与えた、単回用量のボルテゾミブはそれぞれ、発現を、平均して約600および約300増強した。さらに、血友病Aイヌn=4における、AAV8.イヌFVIII1×1013vg/kgとボルテゾミブとの同時投与の結果、未治療の血友病Aイヌn=3またはベクター単独を投与したイヌn=3と比較して、全血凝固時間WBCTの完全な正常化および出血頻度の90の低下も、最長32カ月にわたり生じた。FDAの承認を得ている薬物ボルテゾミブと、過大な導入遺伝子を運ぶAAVベクターとの組合せ療法による、血友病Aイヌの表現型の2年超にわたる矯正の妥当性が確認されたことによって、ヒト遺伝子療法における治療対象の顕著な拡大が促進される。<invivoにおける、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブの用量>これらの研究の主要な目標は、小型および大型の動物において、FDAの承認を得ている薬物ボルテゾミブと、AAV導入遺伝子用ベクターとを使用する組合せ療法の妥当性を確認することであった。提示する研究は、プロテアソーム阻害剤のボルテゾミブベルケイド登録商標としてもまた公知であるの使用を記載する。これは、この薬物が、臨床における使用について現時点でFDAの承認を得ている唯一のプロテアソーム阻害剤であるからである。ボルテゾミブは、ほとんどの化学療法と同様、体表面積に基づいて投与される。大型動物の研究については全て、FDAの承認を得ている用量1.3mg/m2を使用した。しかし、マウスについては、前臨床毒性データから、0.5mg/キログラム体重のボルテゾミブの安全な用量が確立されている23。AAVベクターがない状態で、0.5mg/kgの用量を与えたマウスは、プロテアソーム阻害剤を忍容し、副作用も血液学的パラメータの変化も明らかに生じないことが確立された。追加のマウスを、より高い用量1.0mg/kgのボルテゾミブを用いて試験したが、時折、この用量を与えたマウスは、活動および摂食の減少を示した。したがって、以前の前臨床における毒性の研究および解析に基づいて、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブを、マウスの研究全てにおいて、0.5mg/kgで、単回の門脈注射により、AAVベクターと同時投与して与えた。マウスにおける投与量は、臨床的に推奨されている体表面積ではなく、キログラム体重当たりに基づいて計算したにもかかわらず、マウスにおいて使用した総用量は、本明細書に記載するイヌの研究において使用した総用量とおおよそ同等である。<AAVベクターおよび追加の薬物>これらの研究で使用した第VIII因子発現ベクターは、これまでに記載されている6。このベクターは、合成的に誘導した短い肝臓特異的プロモーター/エンハンサーにより推進される、イヌのBドメイン欠失BDDFVIIIcFVIIIcDNA、およびそれに続く、キメラのイントロンIGBP/enh/イントロンを含有する。第IX因子ベクターは、これまでに記載されており、CMVエンハンサー/ニワトリβ-アクチンプロモーターの転写制御下にあるhFIXcDNA1.4kbを包含する4.2kbの発現カセットを含有するrAAV-CBA-hFIX22。全てのベクターを、以前の記載に従って39、UNCVirusVectorCoreFacilityにおいて生成し、力価を測定した。これらのベクターは、緑色蛍光タンパク質GFPをコードし、CMVプロモーターにより推進される、一本鎖のかつ自己相補的なAAV2総サイズ:約1.5kb;CBAプロモーターにより推進される、AAV8のキャプシドを用いてキャプシド形成したホタルルシフェラーゼ;ならびにヒト第IX因子hFIXを発現するAAV2およびAAV8を包含した。ボルテゾミブMillenniumPharmaceuticalCo、Cambridge、MAを、注射のために、リン酸緩衝生理食塩水PBS中で希釈した。MG132Calbiochem、LaJolla、CAを、70エタノールを用いて溶解させて、保存液としての20mMとした。デキサメタゾンを、SicorPharmaceuticalsInc、Irvine、CAから、注射用液剤として購入した。<細胞培養およびFACScan解析>293T細胞を、9ウシ胎仔血清および1ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を補充したダルベッコ変法イーグル培地Mediatech、Herndon、VA中で増殖し、1の感染効率で形質導入を行った。形質導入後の第3~5日に、細胞を、収集し、2ホルムアルデヒド/0.2グルタルアルデヒドを含有するリン酸緩衝生理食塩水PBS中に固定し、以前の記載に従って40FACScanにより解析した。<動物の飼育および研究:マウス>FVIII欠損マウスFVIII-/-は、FVIIII遺伝子のエクソン16の標的欠失を有する。C57Bl/6FIX-/-マウスは、FIX遺伝子の第3エクソンからのプロモーターの標的欠失を有する。FVIII-/-マウスおよびFIX-/-マウスは、組織内で繁殖させた。野生型C57B6マウスは、7~8週齢におけるルシフェラーゼベクターの送達のために、JacksonLaboratoryBarHarbor、MEから購入した。血友病マウスに、麻酔を、全ての手順について2.5アベルチンAvertinを使用して施した。全ての血漿試料を、後眼窩神経叢から、3.2クエン酸ナトリウム中に収集し、-80°Cで保存した。後眼窩からの血液の収集およびバイオルミネセンスの撮像は、イソフルラン麻酔下で実施した。FIX-/-マウスに、200μlの総体積中の3×1010gc/動物のAAV2.hFIXベクターまたはAAV8.hFIXベクターの門脈注射を、AAV送達時に単回用量のボルテゾミブ0.5mg/kgを加えてまたは加えずに与えた。FVIII-/-KOマウスに、3×1010gc/マウスのAAV2.cFVIIIまたはAAV8.cFVIIIの門脈注射を、ボルテゾミブまたはMG1320.5mg/kg体重と併せて与え、週術期の止血を支持するために、1mg/kgの組換えヒト第VIIa因子NovoSeven、NovoNordisk、デンマークの単回用量も与えた。予期されたイヌFVIII導入遺伝子に対する抗体媒介型免疫応答を回避するために、以前の記載に従って6、全てのFVIII-/-マウスに、第-3、0および3日に、シクロホスファミドSigmaAldrich、StLouis、MO各100μgを3回腹腔内注射して与えた。C57B6マウスに、1011ベクターゲノム/マウスの、ホタルルシフェラーゼをCMVエンハンサー/ニワトリβ-アクチンプロモーターの転写制御下で発現するAAV8を、尾静脈を介して与えた。デキサメタゾン療法を与える群は、AAV送達の1~2時間前に、腹腔内からの0.2mg/動物を用いて処理した。<動物の飼育および研究:血友病Aイヌ>血友病Aイヌは、最初はScott-RitcheyResearchCenter、AuburnUniversityで飼育されていたが、現在はUABMedicalSchoolで飼育されている血友病Aコロニーに由来する雑種のイヌであった。全ての動物を、AAALAC公認の施設において飼育した。治療したイヌは、重度血友病Aを有する雄n=4または雌n=3であった。7匹のイヌ全てに、出生の3~4週間後に、AAV8.cFVIIIを腸間膜静脈投与により投与した41。また、4匹のイヌ2匹の雌/2匹の雄には、ベクターの投与時に、ボルテゾミブ1.3mg/m2も投与した。1匹の雄イヌおよび1匹の雌イヌには、ベクターおよびボルテゾミブの投与の時に、IVデキサメタゾン1.0mg/kgを投与した。<マウスにおける、凝固第VIII因子および凝固第IX因子の活性アッセイ、ならびにイヌ第VIII因子のベセスダBethesdaインヒビター抗体アッセイ>マウス血漿中のイヌFVIII活性を、CoatestSP4キットChromogenix、DiPharma、WestChester、OHにより、製造元の指示に改変を加えて従って測定した。正常イヌ血漿100パーセント活性=1IU/mlとみなすを、プールしたFVIII-/-マウス血漿中に段階希釈して、検量線を生成した。マウス中のイヌFVIIIに対する中和抗体を、記載に従って42、ベセスダアッセイにより、START4CoagulationAnalyzerDiagnosticaStago、Asnieres、フランスを使用して測定した。ヒト第IX因子を、以前の記載に従って、一段階第IX因子活性アッセイFIX特異的aPTTに基づいて、START4CoagulationAnalyzerDiagnosticaStago、Asnieres、フランスを使用して測定した43。<イヌにおける、FVIII活性、凝固アッセイおよびベセスダアッセイ>血液試料を、記載に従って44、正常対照、未治療のFVIII対照、および治療した血友病Aイヌから得た。全血凝固時間WBCTおよびベセスダ力価を、以前の記載に従って測定した。WBCTアッセイを、凝血塊を形成するに至らない場合には、第20分時に止めた。<肝臓の細胞核および細胞質の抽出物の調製>核および細胞質の画分を、記載45に、軽微な改変を加えて従って単離した。マウス肝臓を、リン酸緩衝生理食塩水PBSを用いて灌流し、氷上で刻み、加圧型細胞破砕装置を使用してホモジナイズした緩衝液:250mMスクロース、50mMTris-HClpH7.5、25mMKCl、5mMMgCl2、0.5NP-40、1mMフッ化フェニルメチルスルホニルPMSF。核およびその他のオルガネラを、Sorvall臨床用遠心分離機中、3,000rpmで10分間遠心分離することにより収集した。上清を、40μmのポアサイズのフィルターを使用してろ過し、細胞質として使用した。多層化ペレットをさらに処理して、蒸留水中に溶解させた核の抽出物を得た。<invivoにおけるバイオルミネセンスの撮像>AAV8.ルシフェラーゼベクターの注射の1週後、マウスに、150μg/gのD-ルシフェリンBiotium、Hayward、CA/PBSを腹腔内注射した。バイオルミネセンスの撮像を、CCDカメラIVIS、Xenogenを用いて、注射のぴったり15分後に開始した。生きている全身の撮像から得られたシグナル強度を、総光子束光子/秒/cm2として表す。<イヌ第VIII因子導入遺伝子およびホタルルシフェラーゼ導入遺伝子の定量的PCRQ-PCR>cFVIIIのDNAのQ-PCRを、第VIII因子ベクター送達の2週間後に、マウス肝臓から単離したゲノムDNAに対して、Bio-RadHercules、CA製のiQSYBRGreenキットを使用して実施した11。cFVIIIのDNAのコピー数を、イヌBDD-FVIIIのDNAをコードする直線化されたプラスミドを用いて生成し、プールしたナイーブC57マウス由来のゲノムDNA中に1×107~1個のコピー/反応物に段階希釈した標準に対して定量化し、マウスβ-アクチンについて正規化した。イヌFVIIIについて使用したプライマー配列は、以前に記載された配列と同一であった11,17。ルシフェラーゼDNAについてのQ-PCRを、ルシフェラーゼベクターの送達の1週間後に実施した。バイオルミネセンスの撮像に続いて、マウスを屠殺し、ゲノムDNAを、肝臓、脳、心臓、肺、脾臓、胃、腎臓、回腸、筋肉および精巣から抽出した。ルシフェラーゼおよびベータアクチンのQ-PCRを、Bio-RadHercules、CA製のiQSYBRGreenキットを使用して、単離したゲノムDNAに対して実施した。ルシフェラーゼ遺伝子産物およびイヌFVIII遺伝子産物のコピー数を、定量化し、マウスβ-アクチンについて正規化し、細胞当たりのベクターのコピー数として表した。全てのQ-PCR反応を、iCyclerBio-RadLaboratories、Hercules、CA上で実施した。<血友病Bマウスにおける、プロテアソーム阻害剤の、野生型のサイズの第IX因子発現カセットを運ぶAAV血清型に対する効果>ボルテゾミブを使用する組合せ療法の、血友病動物のinvivoにおける矯正に対する効果を試験するための研究を実施した。最初に、野生型AAVとおよそ同じサイズのゲノムを運ぶベクターを、マウスモデルにおける血友病Bの矯正のために使用した。以前に記載された22CMVエンハンサー/ニワトリβ-アクチンプロモーターにより推進されるヒト第IX因子発現カセットを運ぶAAVベクターを、ベクターの送達時に単回用量のボルテゾミブを加えてまたは加えずに、門脈を介して血友病Bマウスに注入した。図2Aに示すように、ssAAV2.FIX治療マウスは、20週間の観察にわたり、平均して2.4の第IX因子の活性を示した。ボルテゾミブによる治療の結果、同じ期間にわたり、平均して4.3の第IX因子の発現が生じた。このことは、第IX因子の発現の83の増加に相当する。AAV8を使用する、肝臓に方向付けた第IX因子の発現は、AAV2よりも効率的であり、ベクター単独を与えたマウスは、20週間にわたり、平均して40の第IX因子の活性を発現した。20週間にわたる第IX因子の発現は、単回用量のボルテゾミブを、AAV8ベクターと同時投与して与えたマウスにおいては中程度に増大し、平均して約24高い第IX因子の活性を示した図2B。<血友病Aマウスにおける、プロテアソーム阻害剤の、野生型よりも大きなサイズのcFVIII発現カセットを運ぶAAV血清型に対する効果>大型の導入遺伝子カセットFVIIIを使用する組合せ療法の、同じ遺伝的背景C57B1/6を使用する血友病Aマウスにおける効果を解析するための研究を実施した。第VIII因子のcDNA~7.1kbは、血液凝固に寄与しない大型のBドメイン約2.7kbを含有する。Bドメインをコードする大半の配列を除去したら、4.5kbのcFVIIIのcDNA配列を、AAVベクター中に組み込むことができる。にもかかわらず、プロモーターおよびその他の必要な転写調節エレメントを付加すると、これらのベクターは、5.6kbの過大なAAV発現カセットとなる。AAV2ベクターおよびAAV8ベクターは、5.6kbのFVIII発現プラスミドを使用して生成した。ウイルスを、qPCRによる総粒子数、電子顕微鏡法によるウイルス粒子の完全性、銀染色によるキャプシドの比、およびアルカリゲル電気泳動によるDNAゲノムのサイズについて特徴付けた。ベクターのパラメータは全て、マウスおよびイヌの両方の研究のための複数生成工程間において、以前の研究を用いて一貫性をもたせた。FVIII研究のために、プロテアソーム阻害剤であるMG-132Z-LLLともまた呼ばれるおよびボルテゾミブを選び、したがって、MG-132を、臨床的に承認を得ているが未試験の薬剤であるボルテゾミブと比較することができた。MG-132およびボルテゾミブの両方から、ベクター単独を与えたマウスと比較して、FVIII導入遺伝子の発現の増加が生じた図2Cおよび2D。図2Cで示すように、FVIII活性は、AAV2ベクター単独の投与後の第8週まで検出不能であり、一方、第VIII因子は、MG132の同時投与を与えたマウスにおいては第2週に検出可能となり、ボルテゾミブを与えたマウスにおいては第1週に検出可能となった。発現は、平均して、MG132により、150超、およびボルテゾミブにより、550超、増加した。プロテアソーム阻害剤なしでAAV2ベクターを与えたマウスにおいて観察された発現開始の遅延とは対照的に、AAV8ベクター単独を与えたマウス図2Dは、形質導入後の第1週における最も早い検査において、検出可能なイヌFVIIIを有した。これらのマウスにおいては、イヌ第VIII因子は、第8週にピークに達し、次いで、減少し始めた。第VIII因子の発現の若干の増加が、AAV8のMG-132との同時投与後の最初の1カ月間は観察されたが、第VIII因子の発現の改善は、ボルテゾミブを使用して観察された改善ほどには顕著でも持続性でもなかった。ボルテゾミブの同時投与により、最初のイヌ第VIII因子の発現が改善され、その持続性も改善された。平均して、第VIII因子の発現は、単回用量のボルテゾミブを与えたマウスにおいては、AAV8.cFVIIIベクター単独を与えたマウスと比較した場合、259高かった。肝臓のアラニンアミノトランスフェラーゼALTおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼASTならびに全血球数の解析は、ベクター単独を与えたマウスまたはボルテゾミブと組み合わせて与えたマウスのいずれにおいても、肝臓のまたは血液学的な毒性のいかなる証拠も示さなかった。プロテアソーム阻害剤の、wtAAVサイズの第IX因子導入遺伝子および過大な第VIII因子導入遺伝子から生成したベクターに対する効果の比較を容易にするために、同じ時点を、図2Aおよび2B第IX因子ならびに図2Cおよび2D第VIII因子のグラフに描く。ボルテゾミブによる治療は、過大な導入遺伝子の発現の、より小さな導入遺伝子の増大と比して、大きさに比例したより大きな増大を伴った。この結果は、同一のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子-CAT導入遺伝子カセットまたは異種のCFTR導入遺伝子カセットを使用したinvitroにおける研究3を裏付けた。<プロテアソーム阻害剤は、invivoにおいて、ゲノムの核の蓄積を増加させる>次に、血友病Aマウスを、第VIII因子ベクターとプロテアソーム阻害剤との組合せ療法を用いて治療し、ベクター配列の存在量を、細胞質中と核コンパートメント中とで比較した。ベクターの投与の2週間後に、ボルテゾミブを加えた場合または加えなかった場合の、AAV8.FVIII治療マウスに由来する肝臓細胞の細胞質総画分および核総画分を、ベクターのゲノムが細胞内で蓄積する場所を決定するために、精製し、調べた。細胞質ではなく核中に持続するゲノムの比が、単回用量のボルテゾミブにより増加し、このことは、ウイルスの感染に影響する役割を支持している。これらの結果は、過大なベクターのゲノムを、細胞質から核構造へ差し向け、それに続く、ベクターの脱コートおよび/またはゲノムの補完のステップが生じ得る経路を示唆しており、こうした経路は、最近の報告によっても示唆されている表1。<デキサメタゾンは、異所性のAAVベクターの散乱を低下させて、肝臓に方向付けた遺伝子療法の間の肝臓への形質導入を比例的に増加させる>ボルテゾミブおよびデキサメタゾンは一般に、臨床における腫瘍学的療法において一緒に使用されている。ボルテゾミブ療法単独と比較して、デキサメタゾンとボルテゾミブとの組合せが、ボルテゾミブ単独療法に対する不完全な臨床応答の状況におけるデキサメタゾンの追加と同様に、有効性を増加させている24、25、26。また、この臨床パラメータは、過大な導入遺伝子カセットのベクターの形質導入を増強するのにも重要であるかどうかを決定するために、多剤組合せ療法におけるベクターの形質導入の成果を評価した。以前の研究は、肝臓に方向付けた遺伝子療法の間に、レポーター遺伝子を発現するAAVベクターの異所部位における取込みを減少させることを目指して、いくつかの追加の、薬理作用を示す物質を調べるために実施された。これらの早期の研究の間に、デキサメタゾンをベクターと同時投与した場合に、異所性のベクターの散乱を減少させる傾向が観察された。このことは、心臓、脾臓および膵臓を含めた、いくつかの臓器におけるより低い遺伝子の発現およびゲノムの持続に反映され、肝臓への送達は、中程度の増加を示した図3および表2。デキサメタゾンのボルテゾミブとの臨床における使用、およびこれらの結果に基づいて、研究を実施し、この場合、AAV8.cFVIII/ボルテゾミブマウスの追加の群を、単回用量の副腎皮質ステロイドのデキサメタゾンを同時に用いて治療し、持続性の導入遺伝子の発現に対する効果を調べた。<FVIIIノックアウトマウスにおける、AAV.cFVIIIの発現の薬理学的増強の長期観察>ボルテゾミブが第VIII因子の発現を増強する可能性を確立するに至り、追加のマウスを、AAV2ベクターおよびAAV8ベクターを用いて治療して、ボルテゾミブの増強の持続期間を決定した。AAV2単独を与えたマウス中の、循環している第VIII因子の活性は、最初に、第8週に検出可能となり、1年の観察全体を通して、このアッセイの検出の下限値約1の活性=0.01IU/ml付近で変動した図4。しかし、ボルテゾミブの同時投与の結果、ほとんどのマウスにおいて、第1週に、検出可能な第VIII因子の活性が生じ、活性は、第8週にピーク0.11±0.06IU/mlに達し、3超で1年間維持された。AAV8ベクターからのcFVIIIの発現は、第8週にピーク0.51±0.38IU/mlに達してから、徐々に減少して、正常なヒトの第VIII因子の活性の約10のプラトーに達し、この状態は、第52週まで維持された最後の観察、0.10±0.019IU/ml。対照的に、AAV8.cFVIIIと単回用量のボルテゾミブとを用いて治療したマウスは、図4に示すように、最初の時点第1週でさえ、ベクターのみの群のピーク値を超え、1年の観察全体を通して、正常の>50のcFVIII活性を維持した第52週におけるcFVIII活性、0.67±0.58IU/ml。これらの研究では、ボルテゾミブ治療マウスにおける全体的な発現パターンは、デキサメタゾンの追加の有無にかかわらず類似した。<FVIIIノックアウトマウスにおける、イヌFVIII中和抗体の発生>表3に示すように、各治療群中の数匹のマウスが、Sarkarらが概要を述べているスケジュール6に従って、シクロホスファミドの投与を実施したにもかかわらず、ベクターへの暴露後の第2~20週の種々の時間において、FVIII中和抗体を発生させた。インヒビター力価は、抗体を発生させたそれら数匹のAAV2.cFVIII治療マウスにおいては、検出の下限値付近であり、これらのボーダーラインの力価の意義は、不明確である。Jiangらが以前に報告したように16、インヒビターは、AAV2.cFVIIIに関してよりも、AAV8.cFVIIIに関して頻繁に発生し、インヒビターが、プロテアソーム阻害剤なしで、AAV8.cFVIIIを与えた6匹/10匹のマウスにおいて見られた。ボルテゾミブの同時投与は、AAV8血清型を用いて治療した動物におけるインヒビターの形成の発生率を減少させるように見えた5匹/15匹のマウス、33.3。副腎皮質ステロイドとボルテゾミブとの組合せには、インヒビターの形成の最も低い率を伴いAAV8.cFVIII/ボルテゾミブ/デキサメタゾンマウスの20対ベクターのみのマウスの60、このことは、この組合せ療法から利益が得られる可能性があることを示唆している。<ボルテゾミブを、AAVベクターと同時に与えた血友病Aイヌの表現型の改善>同一のAAV-cFVIIIベクターカセットを使用して、研究を実施して、プロテアソーム阻害剤による大型の導入遺伝子の発現の増大が、イヌ血友病Aモデルを変えるかどうかを決定した。表4に示すように、総数7匹の血友病Aイヌを、AAV8.cFVIIIを用いて治療し、経過観察を少なくとも10カ月間行った最も長い経過観察=32カ月間。3匹の血友病Aの仔イヌに、1×1013vg/kgの限界用量のAAV8.cFVIIIAAV8を、門脈を介して与えた。4匹の血友病Aの仔イヌに、同じAAV療法を与え、FDAの承認を得ている用量1.3mg/m2のプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブの単回I.V.投与も与えた。ベクターおよびプロテアソーム阻害剤は、忍容性良好であった。具体的には、肝臓トランスアミナーゼの上昇、神経学的症状、または血液学的パラメータの変化は観察されなかった。血漿凝固の矯正の可能性を、全血凝固時間WBCTを使用して定量化した。止血が正常なイヌにおいて凝固が生じるまでの時間は、6~10分のWBCTであり、未治療の血友病AイヌにおけるWBCTは、20分超である。最も早い時点における組合せ療法の潜在的な効果を検査すると、AAV8単独の送達後の第1週における平均WBCTは、16分超であり、それに比較して、ボルテゾミブAAV8を与えたイヌでは、8.8分であった図5および表4。目覚しいことに、単回用量のボルテゾミブの効果は、数カ月にわたり明らかであった。ベクター送達に続く最初の10カ月7匹のイヌ全てについて入手可能である経過観察の最低限の量の間の矯正を検査すると、AAV8単独を与えた2匹の雄イヌについては、総数40回の個々のWBCT測定のうち4回のみ10が正常範囲にあった。ボルテゾミブAAV8を与えた雄については、同じ観察期間の間に、44回の個々のWBCTアッセイのうち33回75が完全に正常に戻った。AAV2およびAAV8の遺伝子療法のベクターを使用する肝臓への形質導入は、雌においては、雄においてよりも効率が低いことが以前に報告されたことがある11、29。ボルテゾミブAAV8を与えた雌イヌについては、10カ月の経過観察にわたり、40回の個々のWBCT測定のうち12回30が正常範囲に矯正された。PIなしで、ベクターを与えた雌については、20個のWBCT値のうち1つ5のみが正常範囲にあった。重要なことには、組合せ療法の血漿凝固を増大させる可能性が、出血の表現型の矯正に直接移行した表4。この系統の血友病Aイヌは典型的には、出血を約6回/年経験する。同じコロニーに由来する、年齢が一致する未治療の血友病イヌ3匹はそれぞれ、この研究と同時に観察した22カ月の間に、10、10および13回出血し、結果として、0.50±0.08回の出血/月の1カ月当たりの出血率を得た。AAV8.FVIIIベクター単独を与えたイヌは、0.80±0.26回の出血/月の平均出血頻度を示し、未治療の血友病イヌと有意には異ならなかったP=0.23。ボルテゾミブをベクターと共に与えたイヌは、0.07±0.08回の出血/月の平均を示し、このことは、一致、未治療の血友病イヌP<0.0001、およびベクターのみにより治療したイヌP<0.003と比較して特筆すべき改善であった。元々の治療群n=4を、現在、32カ月超にわたり追跡してきている。ボルテゾミブベクターのイヌは、1および2回の自然出血をそれぞれ示したことがある。同じ期間の間に、ベクターのみイヌは、12および16回の出血をそれぞれ示してから、ベクターによる治療後の第16および25月に致命的な出血をそれぞれ経験した。血友病Aを、遺伝子療法を通して矯正することは、依然として現代医学の目標である。AAVベクターを使用する戦略には興味をそそられるが、第VIII因子のcDNAの送達は、wtAAVのパッケージング能力を上回ることから、これまでは制限されていた。過大な導入遺伝子カセットを運ぶAAVベクターの、細胞への形質導入は、効率が低いことが示されてきた。この効率の悪さは、薬理作用を示す物質、例として、プロテアソーム阻害剤の使用により顕著に克服することができる3。これらの研究は、FDAの承認を得ているプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブとAAVベクターとを同時に投与することによって、大型の導入遺伝子の発現を必要とする疾患の持続性の矯正を改善することができることを示している。また、これらの研究は、血友病のマウスおよびイヌにおいて、AAVにより送達される過大な第VIII因子のcDNAの発現が、数倍増強され得ることも示している。発現の増強を、2つの異なる血清型のAAVベクターを使用して実証した。invivoにおいて、効果は、さらなるプロテアソームによる治療がなくても、血友病マウスにおいては、1年間超、および血友病イヌにおいては、2.5年間超持続した。最も重要なことには、血友病Aイヌにおいては、単回用量のプロテアソーム阻害剤による療法が、限定的なAAVベクターの投与を安全に増大させた。AAVベクターは、薬物の不在下では、疾患の表現型を矯正することができなかった。結果として、ボルテゾミブの組合せ療法を与えたイヌのみが、重度の第VIII因子欠損の慢性、再発性かつ致死性の出血の合併症からの持続性の防御を示した。従来の単鎖ssAAVまたは自己相補性のゲノム構造scAAVのいずれかを有するAAVベクターを特徴付けることを目的とする研究では、AAV2.GFPの形質導入およびボルテゾミブの同時投与の後に、導入遺伝子を発現する細胞のパーセントの増加が観察された図1。invitroにおいて、首尾よく形質導入された細胞の集団からの蛍光の量が、75~890の平均蛍光指数からさらにより大きな程度で増大した。ボルテゾミブによる、自己相補性のベクターからの発現の増大は、ssAAVを用いて見られた増大とほとんど同一であり、このことは、ベクター鋳型の立体構造にかかわらず、共通の経路があることを示唆している。<AAVベクターを用いたさらなる研究>第VIII因子-/-マウスに、3×1010vg/動物の、過大な第VIII因子導入遺伝子をコードする一本鎖AAV血清型8ベクターを与えたn=5マウス/治療群。ベクター中に組み込まれているイヌ第VIII因子のcDNA配列を工学的に作製して、最適な哺乳動物のコドンの使用およびGCヌクレオチド含有量を得た。マウスに、門脈へのベクターの注入を、単独で、または0.5mgのプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブPI/kgと組み合わせて与えた。コドン最適化が、凝固第VIII因子ベクターおよび凝固第IX因子ベクターからの発現を増加させることが確立されているが、PIが、より効率的なコドン最適化ベクターをさらに増大させることができるかどうかは確立されていなかった。ボルテゾミブの単回投与に続く、コドン最適化第VIII因子の発現の増大が、研究の長さ12週間全体を通して持続した図6、上部の直線。プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブPIの0.5mg/kgI.V.を加えてまたは加えずに生理食塩水NSを用いる後肢膝関節の治療を与えた血友病のFVIII-/-マウスは、それに続く膝の傷害を加えた場合、破壊性滑膜炎の発症から防御されなかった滑膜炎スコア、>5。過大な導入遺伝子第VIII因子をコードするAAV血清型5ベクターを用いる治療を与え、それに続いて、傷害を与えたマウスは、病的な変化から部分的に防御された滑膜炎スコア、3.89±0.86が、PIとAAV5.FVIIIとを同時投与した結果、それに続く傷害からの最も大きな防御が生じた滑膜炎スコア、2.77±0.45図7。さらに、滑液を、AAV5.FVIIIを与えたマウスの関節から灌流しても、第VIII因子の活性を、一段階第VIII因子活性アッセイの感受性のレベルの範囲内では検出することができない1未満の第VIII因子。しかし、AAV5.FVIIIの送達時にPIを用いて治療したマウスからの滑液は、測定可能な第VIII因子の活性を示す1.1~2.3の活性。これまでの実施例の記載は、本発明を例示するものであり、本発明を制限すると解釈してはならない。本発明は、以下の特許請求の範囲により定義され、それら請求項の均等物もそこに包含されるものとする。刊行物、特許出願、特許、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列例えば、GenBank登録商標データベース受託番号により同定されるもの、および本明細書に引用するその他の参考文献は全て、参照される文および/または段落および/または表と関連性がある教示のために、それらの全体が参照により組み込まれている。[参考文献]"