"骨芽細胞または軟骨細胞への細胞の分化を促進する方法であって、前記方法は、a配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を備える、115残基以下のペプチド、b配列番号2のアミノ酸配列を備える、115残基以下のペプチド、およびc配列番号2のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するペプチド、からなる群より選択されるペプチドで細胞を処理することを備え、ここで、ペプチドa~cの各々が骨誘導活性または軟骨誘導活性を有する、方法。前記細胞が前駆細胞または成体幹細胞である、請求項1に記載の方法。前記前駆細胞または前記成体幹細胞が、胎盤、骨髄、脂肪組織、血管、羊水、滑液、滑膜、心膜、骨膜、硬膜、末梢血、臍帯血、月経血、乳歯、髄核、脳、皮膚、毛包、腸陰窩、神経組織、または筋肉から誘導される、請求項2に記載の方法。前記細胞が誘導多能性幹細胞である、請求項1に記載の方法。組織中の細胞の骨形成を促進する方法であって、前記方法は、a配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を備える、115残基以下のペプチド、b配列番号2のアミノ酸配列を備える、115残基以下のペプチド、およびc配列番号2のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するペプチド、からなる群より選択されるペプチドで組織を処理することを備え、ここで、ペプチドa~cの各々が骨形成活性を有する、方法。処理された組織中の細胞の骨形成活性が、未処理組織中の細胞の骨形成活性よりも高い、請求項5に記載の方法。前記組織が骨組織または結合組織である、請求項5または6に記載の方法。骨誘導活性または軟骨誘導活性を有する、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を備える、115残基以下の単離されたペプチド。前記アミノ酸配列が、配列番号2のアミノ酸配列に対して100同一であるアミノ酸配列を備える、請求項8に記載の単離されたペプチド。前記ペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなる、請求項9に記載の単離されたペプチド。a請求項8~10のいずれか1項に記載のペプチド、およびb第2のペプチドを備え、前記第2のペプチドが、配列番号3のアミノ酸配列に対して70未満同一であるアミノ酸配列を備える、融合タンパク質。請求項8に記載のペプチドと、少なくとも1種のプロテアーゼとを備える組成物。前記少なくとも1種のプロテアーゼが、コラゲナーゼ、クロストリパイン、ディスパーゼ、トリプシン、BMP-1骨形成タンパク質-1、MMP-13マトリックスメタロプロテイナーゼ-13、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項12に記載の組成物。タンパク質切断を促進する条件下で、成熟BMP-4をプロテアーゼと接触させること、およびペプチドを収集することを備える、請求項8~10のいずれか1項に記載のペプチドを作製する方法。前記少なくとも1種のプロテアーゼが、コラゲナーゼ、クロストリパイン、ディスパーゼ、トリプシン、BMP-1骨形成タンパク質-1、MMP-13マトリックスメタロプロテイナーゼ-13、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項14に記載の方法。請求項8~11のいずれか1項に記載のペプチドをコードするベクター。請求項16に記載のベクターを備えた宿主細胞。タンパク質発現のために適切な条件下で宿主細胞を培養すること、およびタンパク質を収集することを備え、宿主細胞が前記ペプチドをコードするベクターを備える、請求項8~11のいずれか1項に記載のペプチドを作製する方法。請求項8~11のいずれか1項に記載のペプチドを備える薬学的組成物。少なくとも1種のプロテアーゼおよび成長因子とともに細胞を処理することを備える、細胞の成長因子活性を増加させる方法であって、前記成長因子が配列番号2のアミノ酸配列を備えるペプチドであり、前記ペプチドが骨誘導活性または軟骨誘導活性を有する、方法。請求項20に記載の方法であって、前記ペプチドが、a配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を備える、115残基以下のペプチド、b配列番号2のアミノ酸配列を備える、115残基以下のペプチド、およびc配列番号2のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するペプチド、からなる群より選択される、方法。請求項20に記載の方法であって、前記ペプチドが、a配列番号2のアミノ酸配列を備えるペプチド、およびb第2のペプチドを備える融合タンパク質であって、前記第2のペプチドが、配列番号3のアミノ酸配列に対して70未満同一であるアミノ酸配列を備える、方法。前記組成物が2種以上のプロテアーゼを備える、請求項20に記載の方法。前記少なくとも1種のプロテアーゼが、コラゲナーゼ、クロストリパイン、ディスパーゼ、トリプシン、BMP-1骨形成タンパク質-1、MMP-13マトリックスメタロプロテイナーゼ-13、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項20に記載の方法。前記少なくとも1種のプロテアーゼがコラゲナーゼである、請求項23に記載の方法。前記細胞が前駆細胞または成体幹細胞である、請求項20に記載の方法。前記前駆細胞または前記成体幹細胞が、胎盤、骨髄、脂肪組織、血管、羊水、滑液、滑膜、心膜、骨膜、硬膜、末梢血、臍帯血、月経血、乳歯、髄核、脳、皮膚、毛包、腸陰窩、神経組織、または筋肉から誘導される、請求項25に記載の方法。前記細胞が誘導多能性幹細胞である、請求項20に記載の方法。本発明は、配列番号2のアミノ酸配列に少なくとも95同一であるアミノ酸配列を備えるペプチドを有する、115残基以下の単離されたペプチドに関する。本発明はまた、第2のペプチドに融合させられた、本明細書に記載された本発明のペプチドを備える融合タンパク質に関し、ここで、第2のペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列に対して70未満同一であるアミノ酸配列を備える。本発明はまた、細胞を本明細書に記載された本発明のペプチドと接触させることを備える方法を用いて、骨誘導性または軟骨誘導性を促進する方法に関する。本発明はまた、本明細書に記載された本発明のペプチドをマトリックスに投与する方法に関する。本発明はまた、本明細書に記載された本発明のペプチドを細胞に投与することを備える、細胞中の骨形成または軟骨形成を増加させる方法に関する。本発明はまた、少なくとも1種のプロテアーゼおよび配列番号2を備える成長因子を細胞に投与することを備える、細胞成長因子活性を増加させる方法に関する。ある実施形態において、組成物は2種以上のプロテアーゼを備える。発明の詳細な説明本発明は、単離されたポリペプチドに関する。ある実施形態において、単離されたポリペプチドは115アミノ酸残基以下である。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質という用語は、本明細書では交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、単離されたポリペプチドは、そのネイティブな環境から完全にまたは部分的に取り出されたポリペプチドを意味することを意図している。例えば、細胞から取り出された、または精製されたポリペプチドは、単離されたと見なされる。加えて、宿主細胞中に含有されている組換え産生されたポリペプチド分子は、本発明の目的のために単離されたと見なされる。さらに、あるペプチドが通常は発現しないか見い出されない細胞、組織、またはマトリックスにおいて見い出される場合、そのペプチドもまた、本発明の目的のために単離されたと見なされる。同様に、合成されたポリペプチドは単離されたポリペプチドであると見なされる。他方、精製されたは当該分野において十分に理解されており、一般には、ペプチドが、細胞材料、細胞成分、化学前駆体、または、おそらくは緩衝液または溶媒は別として、他の化学物質を実質的に含まないことを意味する。実質的に含まないは、新規なペプチド以外の他の成分が検出不可能であることを意味することは意図していない。本発明のペプチドは単離されてもよく、または精製されてもよい。配列番号1のアミノ酸配列は、骨形成タンパク質4BMP-4の全長プレプロペプチドを表す。ペプチドのBMPファミリーのメンバーの多くと同様に、BMP-4は全長プレプロペプチドとして形成され、これは、通常は、N末端からC末端まで、シグナル配列、プロペプチドドメイン、および成熟ペプチドを含有する。BMP-4については、シグナル配列は配列番号1のアミノ酸残基1~19に存在し、プロペプチドドメインは残基20~292であり、成熟ペプチドは残基293~408である。hBMP-4のアミノ酸配列もまた、UniProtアクセッション番号P12644としてUniProtConsortiumDatabaseにおいて入手可能であり、この記録の全体が参照により組み込まれる。通常、BMP-4は、成長因子のBMPファミリーの他のメンバーと同様に、全長プレプロペプチドに翻訳される。引き続く翻訳後プロセシングによって、シグナルペプチドおよびプロペプチドドメインは、成熟型の成長因子として認識されるペプチドの残りの部分を伴って切断される。プロセシング後、成熟型のタンパク質は通常は二量体化し、活性ホモ二量体またはさらにはヘテロ二量体の骨形成タンパク質が細胞から分泌され、そしてこの二量体は、一般には、その受容体、例えばIA型BMP受容体BMPR1Aに結合して、典型的にはBMP-4活性と関連する細胞シグナル伝達カスケードを開始する。配列番号2のアミノ酸配列は成熟BMP-4の新規な短縮を表し、配列番号1のアミノ酸残基303~408に対応する。本明細書で使用される場合、修飾成長因子または短縮型成長因子とは、任意の型のBMP-4のこれらの新規な短縮をいい、これには、BMP-4の全長プレプロペプチド、プロペプチドシグナル配列を伴わない全長ペプチド、および成熟型が含まれる。それゆえに、本発明は、115残基以下の単離されたペプチドを提供し、このペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列に対して、少なくとも約75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100同一であるアミノ酸配列を備える。1つの特定の実施形態において、単離されたペプチドは115残基以下であり、かつ配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を備える。さらなる実施形態において、本発明のペプチドは115残基以下であり、かつ配列番号2のアミノ酸配列に対して100同一であるアミノ酸配列を備える。なおさらなる実施形態において、単離されたペプチドは、115残基以下、114残基以下、113残基以下、112残基以下、111残基以下、110残基以下、109残基以下、108残基以下、107残基以下、または106残基以下であり、各ペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100同一であるアミノ酸配列を独立して備える。なおさらなる実施形態において、本明細書に記載されたペプチド改変体は、例えば、IA型BMPRBMPR1A、およびより低い程度ではII型BMPRであるがこれらに限定されない、その対応する骨形成タンパク質受容体BMPRと少なくとも部分的に特異的に相互作用するそれらのペプチド改変体の能力をなお保持している。さらなる実施形態において、本明細書に記載されたペプチド改変体は、機能的であり、かつ骨誘導の促進、骨芽細胞の増殖の刺激、および/または骨発生の促進が可能である。なおさらなる実施形態において、本発明の修飾成長因子は、非修飾成長因子と比較して、活性が増強している。なおさらなる実施形態において、これらのペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列、すなわち、106アミノ酸長からなり、配列番号2に対して100同一である。参照アミノ酸配列、例えば配列番号2に対して、少なくとも、例えば約95同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのポリペプチドのアミノ酸配列が参照アミノ酸配列の100アミノ酸あたり約5個までの修飾を含んでもよいこと以外は、そのポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意味すると理解される。換言すれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも約95同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基の約5までが欠失もしくは別のアミノ酸で置換されてもよく、または参照配列中のアミノ酸全体の約5までの数のアミノ酸が参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこれらの修飾は、参照アミノ酸配列のN末端もしくはC末端の位置において、またはこれらの末端位置の間の任意の場所に存在してもよく、参照配列中のアミノ酸の間に個別に、または参照配列中の1つ以上の連続する基に散在している。本明細書で使用される場合、同一性は、参照ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較した、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、これらの配列は、最も高次の一致が得られるように整列させられる。同一性は、本質的に、当該分野で認識される意味を有し、周知の技術を使用して計算することができる。2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、同一性という用語は当業者には周知であるCarillo1988J.AppliedMath.48,1073。2つの配列間の同一性および類似性を決定するためのコンピュータプログラム法の例としては、GCGプログラムパッケージDevereux1984NucleicAcidsResearch12,387、BLASTP、ExPASy、BLASTN、FASTAAtschul1990J.Mol.Biol.215,403、およびFASTDBが挙げられるが、これらに限定されない。同一性および類似性を決定するための方法の例は、Michaels2011CurrentProtocolsinProteinScience,Vol.1,JohnWileySonsにおいて議論されている。本発明の1つの実施形態において、2つ以上のポリペプチド間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムは、BLASTPである。本発明の別の実施形態において、2つ以上のポリペプチド間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムはFASTDBであり、これは、Brutlag1990Comp.App.Biosci.6,237-245のアルゴリズムに基づいている。FASTDB配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列と参照配列はアミノ配列である。配列アラインメントの結果は、同一性パーセントである。1つの実施形態において、同一性パーセントを計算するためのアミノ酸配列のFASTDBアラインメントにおいて使用してもよいパラメーターとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない:Matrix=PAM、k-tuple=2、MismatchPenalty=1、JoiningPenalty=20、RandomizationGroupLength=0、CutoffScore=1、GapPenalty=5、GapSizePenalty0.05、WindowSize=500または対象アミノ酸配列の長さ、いずれか短い方。内部の付加または欠失によるものではなく、N末端およびC末端の付加または欠失により、問い合わせ配列よりも参照配列が短いかまたは長い場合は、FASTDBプログラムは、同一性パーセントを計算するときに参照配列のN末端およびC末端の短縮または付加を考慮しないので、手動の修正を行うことができる。参照配列と比べて、N末端またはC末端で短縮している問い合わせ配列については、同一性パーセントは、問い合わせ配列の塩基全体のパーセントとして、一致/整列していない参照配列に対してN末端またはC末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって修正される。FASTDB配列アラインメントの結果は一致/整列を決定する。次いで、アラインメントのパーセンテージは、特定のパラメーターを使用して上記のFASTDBプログラムによって計算された同一性パーセントから減算され、最終同一性パーセントスコアに到達する。この修正スコアは、アラインメントがいかにして互いに一致するかを決定し、ならびに同一性パーセントを決定する目的のために使用できる。以前の問い合わせ配列のN末端またはC末端を延長する参照配列の残基を、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的のために考慮してもよい。すなわち、比較配列のN末端またはC末端と一致/整列させられない残基を、同一性パーセントスコアまたはアラインメント番号付けを手動で調整する際に計数してもよい。例えば、90アミノ残基の問い合わせ配列は、同一性パーセントを決定するために100残基の参照配列と整列させられる。欠失は、問い合わせ配列のN末端に存在し、それゆえに、FASTDBアラインメントはN末端の最初の10残基の一致/アラインメントを示さない。10個の対合しない残基は参照配列の10一致していないN末端およびC末端における残基の数/参照配列中の残基の総数を表し、従って、FASTDBプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから10が差し引かれる。残りの90残基が完全に一致するならば100アラインメント、最終的な同一性パーセントは90である100アラインメント-10不一致突出。別の例において、欠失が内部欠失である場合を除いて、90残基の問い合わせ配列は100個の参照配列と比較される。この場合において、問い合わせと一致/整列しない対象配列のN末端またはC末端には残基が存在しないので、FASTDBによって計算された同一性パーセントは手動で修正されない。さらに別の例において、同一性パーセントを決定するために、110アミノ酸問い合わせ配列が100残基参照配列と整列させられる。問い合わせにおける付加は問い合わせ配列のN末端に存在し、それゆえに、FASTDBアラインメントはN末端の最初の10残基の一致/アラインメントを示さないかもしれない。問い合わせ配列の残りの100アミノ酸残基が、参照配列の全長に対して95同一性を有する場合、問い合わせのN末端付加は無視され、参照配列に対する問い合わせの同一性パーセントは95である。本明細書で使用される場合、に対応するおよびに対応しているという用語は、これらが配列アラインメントに関連するとき、参照タンパク質、例えば、野生型BMP-4の中の列挙された位置、および参照タンパク質上の位置と整列する修飾BMP-4中のこれらの位置を意味することが意図される。従って、対象BMP-4のアミノ酸配列が参照BMP-4のアミノ酸配列、例えば配列番号2と整列させられるとき、参照配列の特定の列挙された位置に対応する対象配列中のアミノ酸は、参照配列、例えば、配列番号2のこれらの位置と整列するが、必ずしも参照配列の正確な数字の位置にはないアミノ酸である。配列間の対応するアミノ酸を決定するために配列を整列させるための方法が、本明細書に記載される。従って、本発明は、その配列が配列番号2の配列に対応する新規なペプチドを提供する。本発明は、本発明の修飾成長因子に対応するアミノ酸配列を有する他の種、好ましくは哺乳動物のホモログをさらに包含する。種ホモログはオルトログとも称し、一般には、ヒトにおける成長因子と、少なくとも35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99の配列同一性を共有する。このような対応する配列は、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、サルなどの様々な種からのBMP-4の修飾成長因子を構成している。別の実施形態において、本発明は、その配列が配列番号2の配列に対応し、かつ少なくともある程度の最低限の機能を保持している新規なペプチドを提供する。-1位にさらなるメチオニン残基を伴う修飾成長因子産物Met-1-ペプチドが、-2位および-1位にさらなるメチオニン残基およびリジン残基を有する改変体Met-2-Lys-1-ペプチドと同様に意図される。さらなるMet残基、Met-Lys残基、またはLys残基を有する修飾成長因子の改変体または一般には1個以上の塩基性残基が、細菌宿主細胞中での組換えタンパク質産生の増強のために特に有用である。修飾成長因子をコードするポリヌクレオチドの発現ベクター系への挿入から生じる改変体もまた意図される。例えば、改変体通常は挿入は、修飾成長因子のアミノ末端および/またはカルボキシ末端が別のポリペプチドに融合されるときから生じてもよい。別の態様において、本発明は、修飾成長因子ペプチド中の1つ以上のアミノ酸残基が除去されている欠失改変体を提供する。欠失は、修飾成長因子ペプチドの一方または両方の末端で、または修飾成長因子ペプチドの1つ以上の非末端アミノ酸残基の除去を伴ってもたらすことができる。それゆえに、欠失変異体は、修飾成長因子ペプチドのすべてのフラグメントを含む。開示された同一性パーセントの境界内で、本発明はまた、本発明の開示されたポリペプチドの置換改変体に関する。置換改変体としては、短縮成長因子の1つ以上のアミノ酸残基が除去され、別の残基で置き換えられているポリペプチドが挙げられる。1つの態様において、置換は保存的性質を有する;しかし、本発明は、非保存的でもある置換を包含する。この目的のための保存的置換は、以下の表に提示するように定義することができる。アミノ酸は物理的特性ならびに二次および三次タンパク質構造への寄与によって分類できる。保存的置換は、当該分野において、1つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸との置換であると認識されている。例示的な保存的置換を以下に提示する。表1:保存的置換あるいは、保存的アミノ酸は、以下に示すように、Lehninger1975Biochemistry,SecondEdition;WorthPublishers、pp.71-77に記載されるようにグループ分けできる。表2:保存的置換そしてさらに他の代替的な、例示的な保存的置換を以下に示す。表3:保存的置換本発明のポリペプチドは、二量体に関与してもよく、関与しなくてもよい。1つの実施形態において、本発明は二量体を提供し、この二量体は、本明細書に記載された少なくとも1つの新規な修飾成長因子を備える。1つの特定の実施形態において、これらの二量体は、新規な修飾成長因子のホモ二量体である。別の実施形態において、これらの二量体は、新規な修飾成長因子の少なくとも1つを備えるヘテロ二量体である。本明細書で使用される場合、ヘテロ二量体とは、2つのペプチドの二量体を意味し、ここで、ペプチドのアミノ酸配列は互いに100同一であるわけではない。従って、ヘテロ二量体は、同じ成長因子の正常な成熟バージョンとともに二量体化された本発明の修飾成長因子ペプチドを含んでもよい。明細書および特許請求の範囲において本明細書中で使用される場合、1つ以上の構成要素の列挙に関連する少なくとも1つという語句は、構成要素の列挙における任意の1つ以上の構成要素から選択される少なくとも1つの構成要素を意味するが、構成要素の列挙の中に具体的に列挙された各々のおよびすべての構成要素の少なくとも1つを必ずしも含まず、かつ構成要素の列挙の中の構成要素の任意の組み合わせを除外しないことが理解されよう。ある実施形態において、少なくとも1つとは、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10をいう。本発明のペプチドまたはポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾を保有するポリペプチドを含むことが意図されることが理解されよう。例として、修飾は、共有結合性であってもよく、例えば、ポリマー、脂質、他の有機および無機部分との化学結合を含む。このような誘導体を、ポリペプチドの循環半減期を増加させるように調製してもよく、または所望の細胞、組織、もしくは器官へのポリペプチドの標的化能力を改善するように設計してもよい。同様に、本発明はさらに、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールなどの1種以上の水溶性ポリマー付加物を含むように共有結合的に修飾された修飾成長因子ペプチドを包含する。修飾成長因子がポリマーに連結されている化学修飾された成長因子組成物は、本発明の範囲内に含まれる。ポリマーは、生理学的環境などの水性環境中でタンパク質の沈殿を妨害するように水溶性であってもよい。適切な水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコールPEG、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ-N-ビニルピロリドンポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド/エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール例えば、グリセリン、およびポリビニルアルコールからなる群より選択することができる。選択されたポリマーは、通常、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドなどの単一の反応基を有するように修飾され、その結果、重合度を制御することができる。ポリマーは任意の分子量であってもよく、分岐状または非分岐状であってもよく、このようなポリマーの混合物もまた使用することができる。化学修飾されたNgRポリマーが治療用途に向けられている場合、薬学的に許容されるポリマーが使用のために選択される。修飾成長因子ペプチドのpeg化は、当該分野において公知であるpeg化反応のいずれかによって実施することができる。好ましくは、peg化は、反応性ポリエチレングリコール分子または類似の反応性水溶性ポリマーとのアシル化反応またはアルキル化反応によって実施される。ポリペプチドのpeg化のための好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールPEGであり、例としては二官能性PEGが挙げられるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、ポリエチレングリコールは、他のタンパク質を誘導体化するために使用された任意の型のPEG、例えばモノCl-ClOアルコキシ-またはアリールオキシ-ポリエチレングリコールを包含することが意図される。修飾成長因子の化学的誘導体化は、活性化ポリマー分子を有する生物学的に活性な物質と反応するために使用される任意の適切な条件下で実施することができる。peg化修飾成長因子を調製するための方法は、一般に、a修飾成長因子ポリペプチドが1つ以上のPEG基に結合されるようになる条件下で、ポリペプチドを、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコールと反応させる工程、およびb反応生成物を得る工程を備える。既知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは当業者には明らかである。peg化および他のポリマー修飾された成長因子ポリペプチドは、一般に、本明細書に記載された修飾成長因子ポリペプチドの投与によって緩和または調節される可能性がある状態を治療するために使用することができる。しかし、本明細書に開示される、化学的誘導体化されたポリマー:修飾成長因子ポリペプチド分子は、誘導体化されていない分子と比較した場合に、さらなる活性、増強もしくは減少した生物学的活性、または半減期の増加もしくは減少などの他の特性を有してもよい。修飾成長因子ポリペプチド、そのフラグメント、改変体、および誘導体は、単独で、一緒に、または他の薬学的組成物と組み合わせて使用されてもよい。例えば、サイトカイン、成長因子、抗生物質、抗炎症剤、および/または化学療法剤は、治療される徴候に適切であるように同時投与されてもよい。本発明は、本発明の精製ポリペプチドを備えた組成物を提供する。好ましい組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、薬学的ビヒクル、賦形剤、または培地の役目をする、薬学的に許容されるすなわち、滅菌および非毒性の液体、半固体、または固体の希釈剤を備える。当該分野において公知である任意の希釈剤を使用することができる。例示的な希釈剤としては、水、生理食塩水、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチル-およびプロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、アルギン酸塩、デンプン、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、グリセリン、リン酸カルシウム、ミネラルオイル、およびココアバターが挙げられるが、これらに限定されない。1つの実施形態において、本発明は、少なくとも第1および第2の融合ペプチドを備える融合タンパク質を提供する。融合パートナーは、一般的に言えば、融合ペプチド間の典型的なアミン結合を介して互いに共有結合しており、従って、1つの連続するアミノ酸鎖を作る。1つの特定の実施形態において、融合タンパク質の第1のペプチドは115残基以下のペプチドを備え、このペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも約75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100同一であるアミノ酸配列を備える。1つの特定の実施形態において、第1の融合ペプチドは115残基以下であり、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を備える。さらなる実施形態において、第1の融合ペプチドは115残基以下であり、配列番号2のアミノ酸配列に対して100同一であるアミノ酸配列を備える。なおさらなる実施形態において、第1の融合ペプチドは、114、113、112、111、110、109、108、107、または106残基以下であり、各第1の融合ペプチドは、独立して、配列番号2のアミノ酸配列に対して、少なくとも75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100同一であるアミノ酸配列を備える。さらなる実施形態において、第1の融合ペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列、すなわち、106アミノ酸長かつ配列番号2に対して100同一であるアミノ酸配列からなる。1つの特定の実施形態において、第2の融合ペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列を含まないアミノ酸配列を備える。より特定の実施形態において、本発明の第2の融合ペプチドは、配列番号3に対して、70、80、90、または100未満同一であるアミノ酸配列を備える。本発明の融合タンパク質は、配列番号1を含まない。本発明によって提供される他の型の融合タンパク質としては、分泌シグナルおよび他の異種機能領域との融合物が挙げられるが、これらに限定されない。従って、例えば、さらなるアミノ酸、特に、荷電アミノ酸の領域がタンパク質のN末端に加えられて、精製の間または引き続く取り扱いおよび貯蔵の間に、宿主細胞中での安定性および持続性を改善してもよい。さらなる融合タンパク質には、細胞膜を超えたタンパク質の移行を増強するための融合物が含まれる。例えば、Tatは、1型ヒト免疫不全ウイルスHIV-1の複製に関与する86アミノ酸タンパク質である。HIV-1Tatトランス活性化タンパク質は、細胞によって効率的に取り込まれ、HIV-1プロモーターから発現されたレポーター遺伝子をトランス活性化するためには低濃度nMで十分であることが実証されている。外因性Tatタンパク質は細胞膜を超えて移行することができ、ウイルスゲノムをトランス活性化するために核に到達する。Tatペプチドが媒介する細胞の取り込みおよび核移行は、いくつかの系において実証されている。いくつかのタンパク質へのTat誘導ペプチドTatの残基37~72の化学カップリングは、いくつかの細胞株または組織においてそれらの内在化を生じるFawell1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,664-668。塩基性アミノ酸のクラスターの中心にあるTatタンパク質の領域は、この移行活性の原因であることが周知である。フルオレセインマレイミドに結合したC末端のシステイン残基を有する、Tat塩基性アミノ酸48~60からなる合成ペプチドは、蛍光顕微鏡法によって決定されるように、細胞核に移行する。加えて、β-ガラクトシダーゼアミノ酸9~1023にTatアミノ酸のアミノ末端により融合したTatアミノ酸48~59からなる融合タンパク質Tat-NLS-β-Galは、ATP依存性で細胞質因子非依存性の様式で細胞核に移行する。従って、本発明の融合タンパク質は、Tatタンパク質塩基性ペプチドモチーフ37-7237-CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ-72配列番号4の任意の連続する残基などの、HIV-Tatのすべてまたは一部を備えてもよい。アミノ酸残基の最小数は、約3から約6までの範囲であり得る。1つの実施形態において、融合タンパク質のTat部分は、約3個から約5個までの長さの連続するアミノ酸である。別の実施形態において、融合タンパク質のTat部分は約4アミノ酸長、すなわち、1つのアルファへリックスターンのための最小限の要件である。別の実施形態において、融合タンパク質のTat部分は、Tatタンパク質残基48~57GRKKRRQRRR配列番号5を備える。融合タンパク質のさらなる態様において、精製を容易にするための領域が加えられてもよい。例えば、ヒスチジンタグhisタグまたはリジンタグ第2の融合ペプチドが、第1の融合ペプチドに付加されてもよい。ヒスチジンタグの例としては、ヘキサH、ヘプタH、およびヘキサHNが挙げられるが、これらに限定されない。リジンタグの例としては、ペンタL、ヘプタL、およびFLAGが挙げられるが、これらに限定されない。このような領域は、タンパク質の最終調製の前に除去されてもよい。第2の融合ペプチドの他の例としては、グルタチオンS-トランスフェラーゼGSTおよびアルカリホスファターゼAPが挙げられるが、これらに限定されない。とりわけ安定性を改善するため、および精製または移行を容易にするためのタンパク質へのペプチド部分の付加は、分泌を生じさせるためであるか排出を生じさせるためであるかに拘わらず、当該分野においてよく知られておりかつ日常的な技術であり、タグを収容するために末端のアミノ酸を修飾することを含んでもよい。例えば、配列番号2において、N末端アミノ酸は、タグを収容するために、例えばアルギニンおよび/またはセリンに修飾されてもよい。当然、C末端のアミノ酸残基もまた、タグを収容するために修飾されてもよい。1つの特に有用な融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するために使用できる免疫グロブリンからの異種領域を備える。例えば、EPA0464533は、別のヒトタンパク質またはその一部と一緒に免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分を備える融合タンパク質を開示している。多くの場合において、融合タンパク質のFc部分は、治療および診断における使用、およびそれによる結果のために、例えば薬物動態学的特性の改善において、非常に有利であるEPA0232262。一方、ある用途のために、融合タンパク質が、記載された有利な様式で発現され、検出され、精製された後で、Fc部分を削除できることが所望される。本発明の融合タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、例えば、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーIMAC、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない周知の方法によって組換え細胞培養物から回収および精製できる。高速液体クロマトグラフィーHPLCもまた、精製のために使用することができる。融合タンパク質が単離および/または精製の間に変性されるとき、タンパク質を再フォールディングするための周知の技術を、活性コンホメーションを再生するために使用してもよい。本発明の融合タンパク質としては、化学合成手順の産物や、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の細胞を含む、原核生物または真核生物宿主から組換え技術によって産生された産物が挙げられるが、これらに限定されない。組換え産生手順において使用される宿主に応じて、本発明の融合タンパク質は、グリコシル化されてもよいし、グリコシル化されなくてもよい。加えて、本発明の融合タンパク質はまた、ある場合において、宿主媒介性プロセスの結果として、開始修飾メチオニン残基を含んでもよい。本発明はまた、単離された核酸、およびこれらの核酸を備える構築物に関する。本発明の核酸は、DNAまたはRNA、例えばmRNAであり得る。核酸分子は二本鎖または一本鎖であり得;一本鎖RNAまたはDNAは、コード鎖もしくはセンス鎖、または非コード鎖もしくはアンチセンス鎖であり得る。特に、核酸は、本発明の融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない本発明の任意のポリペプチドをコードしてもよい。例えば、本発明の核酸は、グルタチオンS-トランスフェラーゼGST融合タンパク質、ポリ-ヒスチジン例えば、His6、ポリ-HN、ポリ-リジン、ヘマグルチニン、HSV-TagおよびHIV-Tatの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド配列を含む。所望される場合、単離された核酸のヌクレオチド配列は、非コード3’および5’配列などのさらなる非コード配列例えば、調節配列を含むを含むことができる。ある実施形態において、本発明の単離された核酸は、さらに、配列番号6の核酸配列に対して少なくとも95同一である核酸配列からなる核酸に関する。さらなる実施形態において、従って、本発明は、配列番号6の核酸配列に対して、少なくとも約75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100同一である核酸配列からなる核酸を提供する。本発明の核酸分子は単離されることができる。本明細書で使用される場合、単離された核酸分子またはヌクレオチド配列は、遺伝子もしくはヌクレオチド配列に通常は隣接しているヌクレオチド配列によって隣接されないかゲノム配列中の場合および/またはそのネイティブな環境例えば、細胞、組織から完全にもしくは部分的に取り出されている、核酸分子またはヌクレオチド配列を意味することが意図される。例えば、細胞から取り出された、または精製された核酸分子は、単離されたものと見なされる。ある例において、単離された物質は、組成物例えば、他の物質を含有する粗抽出物、緩衝系、または混合試薬の一部を形成する。他の状況において、材料は、例えば、PAGEまたはHPLCなどのカラムクロマトグラフィーによって決定されるように、ほぼ均質になるまで精製されてもよい。従って、単離された核酸分子またはヌクレオチド配列は、組換えDNA技術を使用して、または任意の他の適切な方法を使用して化学的に合成された核酸分子またはヌクレオチド配列を含むことができる。明確に述べると、ベクター中に含有される核酸は、本明細書で使用されるような単離されたの定義に含まれる。また、単離されたヌクレオチド配列には、異種生物中での組換え核酸分子例えば、DNA、RNA、ならびに溶液中の部分的または実質的に精製された核酸が含まれる。一方、精製されたは、当該分野において十分に理解されており、一般には、核酸分子が、おそらくは緩衝液または溶媒は別として、細胞材料、細胞成分、化学前駆体、または他の化学物質を実質的に含まないことを意味する。実質的に含まないは、新規な核酸分子以外の他の成分が検出できないことを意味することを意図するのではない。本発明の核酸分子は、単離または精製されてもよい。本発明のDNA分子のインビボとインビトロの両方のRNA転写物もまた、単離されたヌクレオチド配列に包含される。本発明はまた、上記のようなポリペプチドの機能的フラグメントまたは改変体をコードする配列などの、本発明のヌクレオチド配列のバリエーションを包含する。このような改変体は、天然に存在するか、または天然に存在しないものであり得、例えば、様々な変異原および変異原性プロセスによって誘導される改変体などである。意図されるバリエーションとしては、1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、および置換が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、付加および欠失を含む保存的または非保存的アミノ酸変化を生じ得る。本明細書に記載された発明はまた、本明細書に記載された単離された核酸分子のフラグメントに関する。フラグメントという用語は、少なくとも約20個の連続するヌクレオチドから少なくとも約50個以上連続するヌクレオチドの長さである、本明細書に記載されたヌクレオチド配列の一部を包含することを意図する。このようなフラグメントは、プローブおよびプライマーとして有用である可能性がある。特に、プライマーおよびプローブは、本明細書に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に選択的にハイブリダイズしてもよい。例えば、以下に記載するように、活性を保持するポリペプチドをコードするフラグメントが特に有用である。本発明はまた、本明細書に記載されたヌクレオチド配列に対して、例えば、選択的ハイブリダイゼーションのために、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子も提供する例えば、本明細書に記載されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし、かつ修飾成長因子をコードする核酸分子。ハイブリダイゼーションプローブとしては、核酸の相補鎖に対して、塩基特異的な様式で結合する合成オリゴヌクレオチドが挙げられる。このような核酸分子は、特異的ハイブリダイゼーションによって、例えば、高ストリンジェンシー条件下で、検出および/または単離できる。ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件は、特定の核酸の第2の核酸へのハイブリダイゼーションを許容する、インキュベーションおよび洗浄の条件、例えば、温度および緩衝液濃度の条件をいう当該分野の用語であり;第1の核酸が第2の核酸に対して完全に相補的、すなわち100であってもよく、または第1の核酸および第2の核酸は、完全未満、例えば60、75、85、95以上である、ある程度の相補性を共有してもよい。例えば、完全に相補的な核酸をより低い相補性の核酸から区別する、特定の高ストリンジェンシー条件が使用できる。核酸ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件および低ストリンジェンシー条件は、CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySonsの中で説明されている。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、洗浄緩衝液のイオン強度、例えば0.2×SSC、0.1×SSC、温度、例えば室温、42°C、68°Cなど、およびホルムアミドなどの不安定化剤またはSDSなどの変性剤の濃度のみならず、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチパーセント、および他の同一でない配列の中のその配列のサブセットの存在の頻度などの因子にも依存する。従って、高、中程度、または低ストリンジェンシー条件は、経験的に決定してもよい。ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェンシーのレベルからハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルまでハイブリダイゼーション条件を変化させることによって、所定の配列がサンプル中の最も類似の配列とハイブリダイズすることを許容する条件が決定できる。例示的な条件は、Krause1991MethodsinEnzymology,200:546-556に記載されている。洗浄は、ハイブリッドの相補性の最低レベルを決定するために条件が通常設定される工程である。一般に、SSC濃度を一定に保持しながら、相同ハイブリダイゼーションのみが起こる最低温度から開始して、最終洗浄温度が1度°C低下するごとに、ハイブリダイズする配列間でのミスマッチの最大範囲が1増加する。一般に、SSCの濃度を2倍にすると、Tmが増加する。これらのガイドラインを使用して、洗浄温度は、求めるミスマッチのレベルに応じて、高、中程度、または低ストリンジェンシーについて経験的に決定できる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、37°Cでの50ホルムアミド、1MNaCl、1SDSでのハイブリダイゼーション、および60°Cでの0.1×SSCでの洗浄が挙げられるが、これに限定されない。次第に高くなるストリンジェンシー条件の例としては、ハイブリダイゼーション後、ほぼ室温での0.2×SSCおよび0.1SDSでの洗浄低ストリンジェンシー条件;約42°Cでの0.2×SSCおよび0.1SDSでの洗浄中程度ストリンジェンシー条件;ならびに約68°Cでの0.1×SSCでの洗浄高ストリンジェンシー条件が挙げられる。洗浄は、これらの条件の1つのみ、例えば、高ストリンジェンシー条件のみを使用して実施でき、洗浄は、ストリンジェンシーが低い方から順に2つ以上のストリンジェンシー条件を包含してもよい。最適条件は、関与する特定のハイブリダイゼーション反応に応じて変動し、経験的に決定できる。等価な条件は、当該分野において公知であるように、標的核酸分子と使用されるプライマーまたはプローブとの間の同一性または類似性の類似の程度を維持しながら、1つの例として与えられたパラメーターのうち1つ以上を変化させることによて決定できる。ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列は、例えば、本発明の核酸を備える生物の同定のため、および/または本発明の核酸を単離するためのプローブおよびプライマーとして有用である。プライマーという用語は、当該分野におけるのと同様に本明細書で使用され、適切な緩衝液中および適切な温度で適切な条件下で、鋳型によって方向付けられるDNA合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さはプライマーの意図する用途に応じて決まるが、典型的には、約15~約30ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、一般に、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を要求する。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。プライマー部位という用語は、プライマーがハイブリダイズする標的DNAの領域をいう。プライマー対という用語は、増幅されるDNA配列の5’末端とハイブリダイズする5’上流プライマー、および増幅される配列の3’末端の相補物とハイブリダイズする3’下流プライマーを含むプライマーのセットをいう。本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のタンパク質の産生に関する。本発明のこの態様に従って、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、一本鎖もしくは二本鎖ファージベクター、または一本鎖もしくは二本鎖RNAもしくはDNAウイルスベクターであってもよい。このようなベクターは、DNAおよびRNAを細胞に導入するための周知の技術によって、ポリヌクレオチド、例えば、DNAとして細胞に導入されてもよい。ウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であってもよい。後者の場合において、ウイルス伝播は、一般に、宿主細胞を相補する際にのみ起こる。ある点において、使用されるベクターは、本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質の発現のためのものである。一般に、このようなベクターは、発現されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された、宿主における発現のために有効であるシス作用性制御領域を備える。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され、相補ベクターによって供給され、または宿主への導入の際にベクターそれ自体によって供給される。非常に多様な発現ベクターが、本発明のタンパク質を発現するために使用できる。このようなベクターとしては、染色体、エピソーム、およびウイルスに由来するベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来ベクター、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、SV40などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、ならびにこれらの組み合わせに由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝エレメントに由来するベクター、例えばコスミドおよびファージミドが挙げられる。すべてを本発明のこの態様に従う発現のために使用することができる。一般に、宿主中でポリヌクレオチドまたはタンパク質を維持、増殖、または発現させるために適切な任意のベクターを、この点において発現のために使用することができる。発現ベクター中のDNA配列は、例えばmRNA転写を方向付けるためのプロモーターを含む、適切な発現制御配列に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代表としては、周知のプロモーターのほんのいくつかの例を挙げると、ファージラムダPLプロモーター、E.colilac、trpおよびtacプロモーター、HIVプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスLTRのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、発現構築物は、転写、開始、および終結のための部位、ならびに転写領域の中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分には、翻訳されるポリペプチドの最初に翻訳を開始するAUG、および翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終結コドンUAA、UGA、またはUAGが含まれる。加えて、構築物は、発現を調節するとともに発現を生じさせる制御領域を含有してもよい。一般に、このような領域は、転写を制御することによって作動し、例えば、とりわけリプレッサー結合部位およびエンハンサーである。増殖および発現のためのベクターは、一般に、選択可能マーカーを含む。このようなマーカーは増幅のためにもまた適切であってもよく、またはベクターはこの目的のためのさらなるマーカーを含有してもよい。この点に関して、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための1つ以上の選択可能マーカーを含有してもよい。好ましいマーカーとしては、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、ならびにE.coliおよび他の細菌を培養するためのテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切なDNA配列、ならびに適切なプロモーター、および他の適切な制御配列を含有するベクターは、所望のポリペプチドの宿主中での発現のために適切な様々な周知の技術を使用して、適切な宿主に導入されてもよい。適切な宿主の代表的な例としては、例えば、E.coli、Streptomyces、Bacillus、およびSalmonella細胞であるがこれらに限定されない細菌細胞;酵母細胞などの真菌細胞;DrosophilaS2およびSpodopteraSf9細胞などの昆虫細胞;CHO、COS、およびBowesメラノーマ細胞などの動物細胞;ならびに植物細胞が挙げられる。非常に様々な発現構築物のための宿主が周知であり、当業者は、本開示によって本発明のタンパク質のうちの1つを発現するために適切な宿主を選択することができる。融合タンパク質のために有用であり得るベクターの例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGST、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させる、pGEXPharmacia、pMALNewEnglandBiolabs、およびpRIT5Pharmaciaが挙げられるが、これらに限定されない。しばしば、融合物発現ベクターにおいて、タンパク質分解的切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入されることにより、融合タンパク質の精製に続いて融合部分からの組換えタンパク質の分離が可能になる。このような酵素およびこれらの同種認識配列としては、第Xa因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。酵母S.cerevisiaeにおける発現のためのベクターの例としては、pYepSeclBaldari1987EMBOJ.6,229-234、pMFaKurjan1982Cell30,933-943、pJRY88Schultz1987Gene54,115-123、pYES2Invitrogen、およびpicZInvitrogenが挙げられる。あるいは、修飾成長因子は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中で発現させることができる。培養昆虫細胞例えば、SF9細胞中でのタンパク質の発現のために使用可能であるバキュロウイルスベクターとしては、pAcシリーズSmith1983Mol.Cell.Biol.3,21562165およびpVLシリーズLucklow1989Virology170,31-39が挙げられる。なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、pCDM8Seed1987Nature329,840およびpMT2PCKaufman1987EMBOJ.6,187195が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用されるとき、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによって提供されることが多い。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、2型アデノウイルス、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス40から誘導される。原核細胞と真核細胞の両方のための他の適切な発現系については、Sambrook2010MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPressを参照のこと。別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型の中で優先的に、核酸の発現を方向付けることが可能である例えば、組織特異的調節エレメントが核酸を発現するために使用される。組織特異的調節エレメントは当該分野において公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、ほんのいくつか例を挙げると、肝臓特異的プロモーター例えば、アルブミンプロモーター、例えば、T細胞受容体および免疫グロブリンであるがこれらに限定されないリンパ系特異的プロモーター、神経細胞特異的プロモーター例えば、ニューロフィラメントプロモーター、膵臓特異的プロモーター、乳腺特異的プロモーター例えば、乳清プロモーター、骨特異的プロモーター例えば、オステオカルチン、オステオポンチン、または骨シアロプロテイン、プロモーター領域、軟骨特異的プロモーター例えば、WARP、および筋肉特異的プロモーターデスミン、ミオグロビンなどが挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた包含され、例えば、マウスhoxプロモーターKesselandGruss1990Science249,374379およびα-フェトプロテインプロモーターCampesandTilghman1989GenesDev.3,537546である。本発明はまた、上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞、または酵母細胞などの下等真核細胞であり得、あるいは宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞であり得る。宿主細胞は、構築物で安定にまたは一過性にトランスフェクトできる。ポリヌクレオチドは、単独でまたは他のポリヌクレオチドとともに導入されてもよい。このような他のポリヌクレオチドは、独立して導入され、同時導入され、または本発明のポリヌクレオチドに結合させて導入されてもよい。本明細書で使用される場合、宿主細胞は、通常は本発明のヌクレオチドのいずれも含有せず、本発明のヌクレオチドの少なくとも1つのコピーを含有する細胞である。従って、本明細書で使用される場合、宿主細胞は培養環境の中にある細胞であり得、または宿主細胞は、宿主細胞が生物、器官、または組織の一部である生物環境の中にあり得る。本発明のポリペプチドの発現のために適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母、および真核生物が挙げられるが、これらに限定されない。原核生物発現ベクターが使用される場合、適切な宿主細胞は、クローニングされた配列を発現可能である任意の原核細胞である。適切な原核細胞としてには、Escherichia、Bacillus、Pseudomonas、Staphylococcus、およびStreptomyces属の細菌が挙げられるが、これらに限定されない。真核生物発現ベクターが使用される場合、適切な宿主細胞は、クローニングされた配列を発現可能である任意の真核細胞である。1つの実施形態において、真核細胞は高等真核生物の細胞である、適切な真核細胞としては、非ヒト哺乳動物組織培養細胞およびヒト組織培養細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の宿主細胞としては、昆虫細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞COS細胞、ヒト293細胞、およびマウス3T3線維芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、酵母細胞を宿主細胞として使用することができる。酵母細胞としては、Saccharomyces、Pichia、およびKluveromyces属が挙げられるが、これらに限定されない。1つの実施形態において、酵母宿主は、S.cerevisiaeまたはP.pastorisである。酵母ベクターは、2T酵母プラスミドからの複製起点配列、自己複製配列ARS、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含有してもよい。酵母とE.coliの両方における複製のためのシャトルベクターもまた、本発明に含まれる。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によって行うことができる。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞のほんの少量のみがそれらのゲノムに外来DNAを組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体を同定および選択するために、選択可能マーカー例えば、抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が、一般に、関心対象の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。様々な選択可能マーカーとしては、G418、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素DHFR、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択可能マーカーをコードする核酸は、修飾成長因子をコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入でき、または別個のベクター上で導入できる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされる細胞は、薬物選択によって同定できる例えば、選択可能マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するのに対して、他の細胞は死滅する。1つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞中で発現される。上記のように調製される修飾成長因子発現ベクターは、リン酸カルシウム法およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない任意の公知の方法によって、CHO細胞に導入される。発現ベクターを有する形質転換体は、上述の選択可能マーカーに基づいて選択される。選択可能マーカーを使用する形質転換体の反復クローン選択により、修飾成長因子構築物を発現する安定な細胞株の選択が可能になる。選択培地の濃度の増加により、所望の修飾成長因子の遺伝子発現およびより高い発現が可能になる。組換え修飾成長因子を含有する宿主細胞、例えばCHO細胞は、修飾成長因子構築物を構成的に発現する、修飾成長因子発現ベクターを含有するCHO細胞を培養することによって産生できる。従って、本発明はまた、修飾成長因子が発現されるような条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、および上記タンパク質を回収することを備える、修飾成長因子を製造する方法に関する。本発明のタンパク質を発現するために要求される培養条件は、本発明のポリヌクレオチドを保有している宿主細胞に応じて決まる。各々の細胞型についての培養条件は当該分野において周知であり、必要な場合、容易に最適化できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸を備える構築物は、核酸が本明細書に記載されたような1つ以上の発現制御エレメントに作動可能に連結されるように、選択された宿主細胞に対して適切な方法、例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染によって適切な宿主細胞に導入できる。宿主細胞は、インビトロまたはインビボでの発現のために適切な条件下で維持でき、それによって、コードされたポリペプチドが産生される。例えば、宿主細胞は、タンパク質発現を容易にし得る、インデューサー、適切な塩、成長因子、抗生物質、栄養補助剤などを補充した適切な培地の存在下で維持することができる。さらなる実施形態において、本発明の修飾成長因子は、化学合成によって、または任意の他の適切な方法によって、修飾成長因子をコードする核酸のインビトロ翻訳によって産生できる。所望される場合、修飾成長因子は、宿主細胞、またはタンパク質が産生もしくは分泌される他の環境から単離できる。それゆえに、修飾成長因子を産生する方法は、トランスジェニック動物または植物の宿主細胞中でのポリペプチドの発現を包含することが理解されよう。米国特許第6,013,857号、同第5,990385号、および同第5,994,616号を参照のこと。修飾BMP-4が主として細胞内で見い出される状況において、細胞内材料グラム陰性細菌の封入体を含むは、当業者に公知である任意の標準的な技術を使用して、宿主細胞から抽出できる。このような方法としては、例としてではあるが限定としてではなく、フレンチプレスによってペリプラスム/細胞質の内容物を放出させるために宿主細胞を溶解すること、均質化、および/または超音波処理、その後の遠心分離が挙げられる。修飾BMP-4が細胞質ゾル中で封入体を形成した場合、このような封入体は、しばしば内側および/または外側の細胞膜に結合し得る。遠心分離の際に、封入体は、主としてペレット材料中に見い出される。次いで、ペレット材料は、封入体を放出し、ばらばらにし、可溶化するために、極端なpHで、または洗剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体などの1種以上のカオトロピック剤を用いて、アルカリpHでのジチオスレイトールなどの還元剤、または酸性pHでのトリス-カルボキシエチルホスフィンの存在下で処理できる。一旦可溶化されると、修飾成長因子ペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈殿などを使用して分析できる。修飾成長因子ペプチドを単離する様々な方法が当業者に明白であり、例えば、単離は、下記およびMarstonetal1990Meth.Enzymol.182、264-275に示される方法のような標準的な方法を使用して達成することができる。使用された単離手順後に、修飾成長因子ペプチドが生物学的に活性ではない場合、ポリペプチドをその三次元構造に再フォールディングまたは転換するため、およびジスルフィド結合を生成するための様々な方法が、生物学的活性を回復するために使用できる。当業者に公知である方法としては、可溶化ポリペプチドのpHを特定のpH、通常は7より高いpHに調整すること、および特定濃度のカオトロープの存在が挙げられる。カオトロープの選択は、封入体可溶化のために使用される選択に非常に似ているが、通常はより低い濃度であり、必ずしも可溶化のために使用されるのと同じカオトロープではない。タンパク質のシステイン架橋の形成の間に、ジスルフィドシャッフリングを可能にする特定の酸化還元ポテンシャルを生成するために、還元剤、または特定の比率の還元剤プラスその酸化型を使用することが必要である場合がある。一般に使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン/システイン、グルタチオンGSH/ジチオビスGSH、塩化第二銅、ジチオスレイトールDTT/ジチアンDTT、2-メルカプトエタノールbME/ジチオ-bMEが挙げられる。再フォールディングの効率を上昇させるために、様々な分子量のグリセリン、ポリエチレングリコールなどの共溶媒およびアルギニンを使用することが必要である場合がある。本発明の修飾成長因子を調製するための他の方法としては、1つの型のBMP-4をプロテアーゼと接触させることが挙げられるが、これらに限定されない。1つの実施形態において、これらの方法は、成熟型のBMP-4をプロテアーゼと接触させて、本発明の修飾成長因子を産生することを備える。1つの実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、またはグルタミン酸プロテアーゼである。このようなプロテアーゼの例は当該分野において周知であり、これらとしては真核生物と原核生物の両方の供給源からのプロテアーゼが挙げられる。セリンプロテアーゼの例としては、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、スブチリシン、およびアルファ/ベータヒドロラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。システインプロテアーゼの例としては、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、いくつかのカテプシン、クロストリパイン、およびパパインが挙げられるが、これらに限定されない。アスパラギン酸プロテアーゼの例としては、いくつかのカテプシン、キモシン、レニン、ペプシン、およびHIV-1プロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。メタロプロテイナーゼの例としては、いくつか例を挙げると、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-18、および膜型MMPMT-MMPなどのマトリックスメタロプロテイナーゼMMPファミリーのプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。これらのMMPの多くは当該分野において他の名前で知られており、当業者は、様々な酵素の異名に詳しい。例えば、コラゲナーゼのいくつかはMMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-14、MMP-18、およびディスパーゼであり、ゼラチナーゼのいくつかはMMP-2、MMP-9、およびMMP-12であり;ストロメリシンのいくつかはMMP-3、MMP-10、およびMMP-11であり、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼのいくつかはMMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24、およびMMP-25である。コラゲナーゼは、ネイティブなコラーゲンまたはゼラチンを分解するメタロプロテイナーゼの例である。多様な微生物および多くの様々な型の動物細胞がコラゲナーゼを産生する。細菌コラゲナーゼは、組織を消化し、個々の細胞を単離するために実験室内で使用されることが多い。ClostridiumhistolyticumC.histolyticumによって産生されるコラゲナーゼは、様々な型のコラーゲンおよびゼラチンを分解する亜鉛メタロプロテイナーゼである。メタロプロテイナーゼのさらなる例は、例えば、アスタシン、トロイド、キソロイド、哺乳動物トロイド様mTLL、BMP-1、メプリンAおよびB、ならびにマトリライシンなどであるがこれらに限定されないアスタシンファミリーのメタロプロテイナーゼ、ならびにADAMTS-1、ADAMTS-2、ADAMTS-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5などであるがこれらに限定されないアグリカナーゼADAMTSファミリーのメタロプロテイナーゼである。当然、これらの方法は、連続的にまたは同時に、1つの型のBMP-4を1種より多くのプロテアーゼと接触させることを含む。加えて、本明細書で使用されるプロテアーゼは、組換え体であり得るか、または様々な供給源から単離され得る。本明細書で使用されるプロテアーゼは、成熟型BMP-4と同じ細胞または動物の供給源から単離される必要はない。例えば、多くのプロテアーゼは、原核生物中でのみ見い出されるが、それでもこれらのプロテアーゼは、真核生物からのタンパク質に対して機能的である。酵素活性に影響を与える因子としては、緩衝液の塩濃度、pH、および温度が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、使用される酵素に基づいて、ペプチド切断を促進するために必要な条件を容易に理解する。ある実施形態において、プロテアーゼの量対成長因子の量の比率は、プロテアーゼ約1モル:成長因子1000モル~約1000モル:1モル、プロテアーゼ約1モル:成長因子100モル~約1000モル:1モル、約1モル:10モル~約1000モル:1モル、約1モル:10モル~約100モル:1モル、約1モル:10モル~約10モル:1モル、または約1モル:1モル~約10モル:1モルであってもよい。さらなる実施形態において、コラゲナーゼの量対成長因子の量の比率は、コラゲナーゼ約1モル:成長因子100モル~約1000モル:1モル、約1モル:10モル~約1000モル:1モル、約1モル:10モル~約100モル:1モル、または約1モル:1モル~約10モル:1モルであってもよい。トリプシンの量対成長因子の量の比率は、トリプシン約1モル:成長因子1000モル~約1000モル:1モル、約1モル:100モル~約1000モル:1モル、約1モル:10モル~約100モル:1モル、または約1モル:10モル~約10モル:1モルであってもよい。クロストリパインの量対成長因子の量の比率は、クロストリパイン約1モル:成長因子1000モル~約1000モル:1モル、約1モル:100モル~約1000モル:1モル、約1モル:10モル~約100モル:1モル、または約1モル:1モル~約10モル:1モルであってもよい。ディスパーゼの量対成長因子の量の比率は、ディスパーゼ約1モル:成長因子1000モル~約1000モル:1モル、約1モル:100モル~約1000モル:1モル、約1モル:10モル~約100モル:1モル、または約1モル:10モル~約10モル:1モルであってもよい。ある実施形態において、プロテアーゼを用いての成長因子の処理は、約0°C~約40°C、約4°C~約40°C、または約37°C以下の温度で実施してよい。特定の実施形態において、成長因子を、約30分間~3日間の間、約1時間~約48時間の間、約2時間~約48時間の間、または約2時間~約24時間の間、コラゲナーゼで処理してもよい。成長因子を、約5分間~3日間の間、約15分間~約48時間の間、約15分間~約24時間の間、または約30分間~約18時間の間、トリプシンまたはクロストリパインで処理してもよい。成長因子を、約5分間~2日間の間、約15分間~約24時間の間、約15分間~約18時間の間、または約15分間~約8時間の間、ディスパーゼで処理してもよい。すべてのこれらの条件は、処理混合物中での余分のタンパク質またはペプチド基質を計算に入れていない。処理は、混合および/またはインキュベーションを含んでもよい。インキュベーションは、静的または動的な条件下で実施されてもよく、例えば、かき混ぜ、振盪、撹拌、混合、水平運動、揺らし、およびその他を用いる。ある実施形態において、プロテアーゼは組換えタンパク質またはペプチドフラグメント、化学合成したタンパク質またはペプチドフラグメントであってもよく、あるいはプロテアーゼは、天然の供給源から抽出され、任意に、例えば、切断、熱不活化、化学修飾、または他の方法によって修飾されてもよい。他の実施形態において、プロテアーゼの酵素活性の特定の態様は、阻害または変更されてもよく、変更した活性を有するプロテアーゼを、成長因子の生物学的活性を変化させるために、1種以上の成長因子に加えてもよい。さらなる実施形態において、プロテアーゼの活性を、少なくとも1種の成長因子のプロテアーゼでの処理の前、その間、またはその後に調節してもよい。例えば、コラゲナーゼのプロテアーゼ活性は、成長因子を処理するために使用される前に顕著に減少させてもよい。別の例において、プロテアーゼの活性を、細胞への投与の前、その間、またはその後に調節してもよい。特定の実施形態において、プロテアーゼの活性を、とりわけ、熱不活化、放射線不活化、、プロテアーゼ基質中和、または化学阻害を備える方法によって調節してもよい。メタロプロテイナーゼの活性を調節するために使用される化学阻害剤は、EDTAなどの金属キレート剤;N-エチルマレイミド、フェニルメチルスルホニルフルオリドPMSF、およびロイペプチンなどのシステインおよびセリンプロテアーゼ阻害剤;ホスホラミドンおよびベスタチンなどの古典的メタロプロテイナーゼ阻害剤;α2-マクログロブリンなどの一般的なタンパク質阻害剤、または、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4などの天然もしくは合成のメタロプロテイナーゼの組織阻害剤TIMP;ならびに他の阻害剤から選択してよい。これらの方法において使用されるBMP-4の型は組換え体でもあり得、または種々の細胞もしくは動物の供給源から単離できる。本発明の1つの実施形態において、少なくとも1種のプロテアーゼと接触させられる任意の型のBMP-4は、組換えBMP-4である。1つの特定の実施形態において、組換えBMP-4はメタロプロテイナーゼと接触させられて、新規な短縮型の本発明のBMP-4ペプチドを生成する。より特定の実施形態において、組換えBMP-4はコラゲナーゼと接触させられて、新規な短縮型の本発明のBMP-4ペプチドを生成する。さらにより特定の実施形態において、コラゲナーゼと接触させられる組換えBMP-4は、組換え成熟型のBMP-4である。なおより特定の実施形態において、組換え成熟BMP-4はコラゲナーゼおよび/またはクロストリパインと接触させられて、新規な短縮型の本発明のBMP-4ペプチドを生成する。別の特定の実施形態において、組換え成熟BMP-4はトリプシンまたはディスパーゼと接触させられて、新規な短縮型の本発明のBMP-4ペプチドを生成する。一旦、少なくとも1種のプロテアーゼで処理されると、ある実施形態において、生じるペプチドは、当該分野における日常的な方法を使用して単離および精製される。精製方法の例としては、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、ウェスタンブロッティングおよび引き続く膜の処理が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の1つの実施形態において、プロテアーゼ処理後に精製される得られるペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を備える。他の実施形態において、プロテアーゼで処理された後で、得られるペプチドは単離または精製されず、プロテアーゼの存在下で細胞に投与される。別の実施形態において、得られるペプチドは単離または精製され、次いでプロテアーゼとともに細胞に投与される。さらに別の実施形態において、プロテアーゼでの処理後、単離および精製せずに、得られるペプチドはプロテアーゼの存在下で細胞に投与され、次いで別のプロテアーゼが一緒に投与される。本発明の修飾成長因子ペプチドはまた、固相合成技術を使用する合成方法によって調製されてもよい。合成されたポリペプチドは、適切な条件下で正確なフォールディングパターンに再生されてもよく、適切な緩衝液および条件を使用して生物活性二量体が単量体から誘導できる。正確にフォールディングした二量体は、適切なカラムを使用して単量体からさらに分離されて、機能的生物活性因子の収率を増大させてもよい。調製の方法が、組換え的であるか、酵素的であるか、合成的であるかに拘わらず、単量体または二量体としての新規な修飾成長因子は、組成物として調製することができる。1つの実施形態において、この組成物は薬学的組成物である。例えば、1種以上のコファクターを本発明の短縮型成熟生物活性因子に加えて組成物を形成してもよい。加えてもよいコファクターとしては、ヘパリン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、エラスチン、ラミニン、アルブミン、プロテオグリカン、コラーゲン、ゼラチン、二価カチオン、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはリン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、タンパク質またはタンパク質フラグメントを、本発明の修飾成長因子ペプチドに対するコファクターとして加えてもよい。核酸分子またはポリペプチドを備える組成物または薬学的組成物は、典型的には、核酸分子またはタンパク質、および薬学的に許容されるキャリアを備える。本明細書で使用される場合、薬学的に許容されるキャリアまたは薬学的キャリアは、薬学的投与と適合可能である溶媒、分散媒、コーティング、抗微生物剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのすべてを含むことが意図される。薬学的キャリアまたは他の成分の性質は、具体的な投与経路および投与される本発明の特定の実施形態によって決まる。この状況において有用である技術およびプロトコルの例は、特に、Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy2010,Lippincott,WilliamsWilkinsにおいて見い出される。このような薬学的なキャリアまたは希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および5ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム、および固定油などの非水性ビヒクルもまた使用してよい。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および剤の使用は当該分野で周知である。任意の従来の媒体または剤が活性化合物と適合可能でない場合を除き、組成物中でのその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合可能であるように製剤化される。投与経路の例としては、経口および非経口例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、経皮局所的、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液としては、注射用の水などの滅菌希釈液、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調節するための剤を挙げることができるが、これらに限定されない。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整できる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量バイアルの中に封入できる。注射用途のために適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液水溶性の場合または分散液、および注射可能な滅菌溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために適切な薬学的キャリアとしては、生理食塩水、静菌水、CremophorEL商標BASF、またはリン酸緩衝生理食塩水PBSが挙げられる。すべての場合において、組成物は滅菌状態でなければならず、容易にシリンジを通過する程度の流動性を有するべきである。これは製造および貯蔵の条件下で安定でなくてはならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。薬学的キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなどを含有する溶媒または分散媒、ならびにそれらの適切な混合物であり得る。適度な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には要求される粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合において、糖類などの等張剤、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどのポリアルコールを組成物中に含めることが所望され得る。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。滅菌注射溶液は、活性化合物例えば、修飾成長因子を、要求される量で、上記に列挙した成分の1つまたはその組み合わせとともに適切な溶媒に導入することによって、そして要求される場合、その後のろ過滅菌によって調製できる。一般に、分散液は、上記に列挙したものの中からの基本分散媒および要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を導入することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、以前に滅菌ろ過したその溶液から、活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末が生じる。経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食の薬学的キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入したり、錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに導入することができ、錠剤、トローチ、またはカプセルの剤形で使用できる。経口組成物は、マウスウォッシュとしての使用のために液体薬学的キャリアを使用してもまた調製でき、ここで、液体薬学的キャリア中の化合物は、経口的に適用され、口をすすいだ後にはき出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合可能な結合剤、および/またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、類似の性質の以下の成分または化合物のいずれかを含有してもよく、これらは、例えば、微結晶セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Primogel、またはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesなどの滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味料、あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料などの香料であるが、これらに限定されない。1つの実施形態において、活性化合物は、移植物およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、身体からの迅速な排出から化合物を保護する薬学的キャリアを用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生物分解性の生物適合性ポリマーが使用できる。このような製剤の調製のための方法は当業者には明白である。これらの材料はまた、AlzaCorporationおよびNovaPharmaceuticals,Inc.からも市販されている。リポソーム懸濁液ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されているリポソームを含むも、薬学的に許容されるキャリアとして使用できる。これらの組成物は、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されるように、当業者に公知である方法に従って調製できる。投与の容易さおよび投薬の均一性のために、単位剤形で経口または非経口組成物を製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される場合、単位剤形とは、治療される被験体のための単位剤形として適している物理的に別個の単位をいい;各単位が、要求される薬学的キャリアと関連して所望の治療効果を生じるように計算された、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有する。本発明の投薬量単位剤形の詳細は、活性化合物の独特な特徴および達成される特定の治療効果によって、これらに直接的に依存して決まる。薬学的組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パック、またはディスペンサーの中に含めることができる。BMP-4ペプチドの投薬量は、治療される疾患の状態または症状、ならびにヒトまたは動物の体重および状態などの他の臨床的因子、ならびに化合物の投与経路によって決まる。ヒトまたは動物を治療するために、約0.005mg/kg体重~500mg/kg体重の化合物が投与できる。治療は、典型的には、これより低い用量で投与でき、所望の治療結果が観察されるまで継続される。患者に投与される化合物の投薬量および生物に化合物を投与する様式を決定する方法は、例えば、WO96/22976に開示されている。当業者は、このような説明が本発明に適用可能であり、本発明に容易に適合させることができることを理解している。適切な投薬量は、治療される疾患の種類、使用される特定の組成物、および患者のサイズおよび生理学的状態などの様々な因子によって決まる。本明細書に記載された化合物の治療的に有効な用量は、最初は細胞培養物および動物モデルから見積もることができる。例えば、細胞培養アッセイにおいて決定されるIC50を最初に考慮に入れた循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおける用量を製剤化できる。動物モデルデータは、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用できる。本発明はまた、細胞を本発明のペプチドのうち少なくとも1種と接触させることを備える、細胞の細胞内シグナル伝達を変化させる方法に関し、ここで、細胞は、本発明の修飾成長因子に特異的に結合する受容体を保有する。これらの方法において使用されるペプチドは、単量体型、ホモ二量体型、またはヘテロ二量体型であり得る。修飾成長因子のその受容体への特異的結合は、次には、通常は非修飾型の成長因子と関連する細胞内シグナル伝達カスケードを開始する。例えば、成熟型のBMP-4は、通常、そのI型および/またはII型受容体、例えばBMPR1Aに結合する。これらの受容体は、Smadタンパク質ファミリーを含む細胞質標的をリン酸化する。Smadは、TGF-β分泌ポリペプチドスーパーファミリーについての細胞内シグナル伝達エフェクターとして機能するタンパク質のクラスである。活性化I型BMP受容体は、Smad1、Smad5、および/またはSmad8をリン酸化する。リン酸化されたSmad1、5、および8タンパク質は、次には、Smad4と複合体を形成し、次いで核に移行し、標的遺伝子の発現を調節する転写因子と相互作用する。従って、本発明は、細胞と少なくとも1種の本発明の修飾成長因子とを接触させることを備える、細胞中でのSmad1、Smad5および/またはSmad8のリン酸化を刺激する方法を提供する。これらの方法において使用されるペプチドは、単量体型、ホモ二量体型、またはヘテロ二量体型であり得る。Smadタンパク質をリン酸化することに関する新規なペプチドの活性は、正常な成熟成長因子と比べて、変更されてもよいしされなくてもよい。例えば、新規な修飾成長因子は、正常な成熟成長因子の受容体結合と比較して、Smad1、5、および/または8のリン酸化を増加または減少させてよい。別の例として、新規な修飾成長因子は、正常な成熟成長因子の受容体結合と比較して、その受容体に対して、より強固にまたはより緩やかに結合してもよいより低いKd。当業者は、レポーター遺伝子の転写、ELISAアッセイなどの周知の技術を使用して、特定のタンパク質が対照群と比較してより高度にリン酸化されるかリン酸化の程度が低いかを容易に決定できる。本発明のさらなる方法は、細胞を本発明の新規なペプチドと接触させる前と後の両方で、Smad、例えば、Smad1、Smad5、またはSmad8のリン酸化のレベルを評価すること、および本発明の新規なペプチドに応答したSmadリン酸化の増加または減少を決定することを備える。別の実施形態において、本発明は、細胞または細胞の集団におけるプロモーター活性を刺激する方法を提供し、ここで、プロモーターは、活性化されたSmad複合体に対して応答性であり、これらの方法は、細胞を少なくとも1種の本発明の修飾成長因子ペプチドと接触させることを備える。これらの方法において使用されるペプチドは、単量体型、ホモ二量体型、ヘテロ二量体型であり得る。当業者は、活性化されたSmad複合体に応答するプロモーターを知っている。例えば、Massague2000Cell,103:295-309を参照のこと。Smad応答性プロモーターを刺激することに関する新規なペプチドの活性は、正常な成熟成長因子と比較して変更されてもよいしされなくてもよい。例えば、新規な修飾成長因子は、正常な成熟成長因子の受容体結合と比較して、Smad応答性プロモーターの活性化をを増加または減少させてもよい。当業者は、レポーター遺伝子の転写、ELISAアッセイなどの周知の技術を使用して、プロモーターが対照群と比較してより高度に活性化されるか活性化の程度が低いかを容易に決定できる。本発明のさらなる方法は、細胞を本発明の新規なペプチドと接触させる前と後の両方で、Smad応答性プロモーターの活性を評価すること、および本発明の新規なペプチドに応答したプロモーターの増加または減少を決定することを備える。本明細書で使用される場合、接触させることは、本発明の方法との関連で使用される場合、単量体型、ホモ二量体型、またはヘテロ二量体型の新規なペプチドを標的細胞の近傍に持って行き、その結果、特異的結合事象または生物学的効果が可能になることを意味する。このように、接触させることは、培養培地中に新規なペプチドを加えること、および培養中の細胞に培養培地を適用することを含むことができる。接触させることはまた、本明細書に記載された少なくとも1種のベクターで細胞をトランスフェクトすること、および細胞が修飾成長因子を産生することを可能にすることを包含する。当然、接触させることはまた、インタクトな生物中の細胞への、本発明の修飾成長因子ペプチド、またはその薬学的組成物の投与を含む。本発明の新規なペプチドを投与するための組成物を、本明細書に記載した。本明細書で使用される場合、投与することおよび投与するは、少なくとも1種の新規な修飾成長因子ペプチドを備える化合物を被験体に導入することを意味するために使用される。投与方法において使用されるペプチドは、単量体型、ホモ二量体型、またはヘテロ二量体型であり得る。投与が治療の目的のためであるとき、この物質は、治療の必要がある徴候または状態の発症の際に、またはその後に提供される。この物質の治療的投与は、任意の徴候を軽減するため、またはさらなる徴候が生じることを予防するために役立つ。投与が状態の発生を予防する目的のためであるとき予防的投与、この物質は、任意の目に見えるかまたは検出可能な徴候の前に提供される。この物質の予防的投与は、引き続いて生じる徴候を軽減するため、または徴候が生じることを完全に予防するために役立つ。化合物の投与経路としては、本明細書で先に開示したように、局所、経皮、鼻内、膣内、直腸、経口、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、腹腔内、硬膜外、およびくも膜下が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、これらの方法はまた、本発明の新規なペプチドに加えて、1種以上の物質を同時投与することを含む。同時投与するという用語は、生物学的活性または効果のそれぞれの期間が重複している時間枠の間に、少なくとも2種の化合物の各々が投与されることを示す。このように、この用語は、本発明の化合物の連続的ならびに同時期の投与を含む。そして化合物を投与することと同様に、2種以上の物質の同時投与は、治療目的および/または予防目的のためであり得る。2種以上の物質が同時投与される場合、2種以上の物質の投与経路は同じである必要はない。本発明はまた、骨誘導性を促進する方法に関し、これらの方法は、細胞を1種以上の本発明の修飾成長因子ペプチドまたは本明細書に記載された組成物と接触させることを備える。本明細書で使用される場合、骨誘導性とは、細胞を、表現型がより骨芽細胞様である細胞に分化させることをいうことがあり、またはこの用語は、骨芽細胞の増殖を増加させることをいうことがあり、またはその両方である。本発明の修飾成長因子ペプチドとの接触前には、これらの細胞は、未分化細胞または部分的に未分化の細胞であってもよい。これらの細胞は、培養物中、または組織、器官、もしくはその一部の中、または生物の中に存在してもよい。新規なペプチドの骨誘導活性は、正常な成熟成長因子と比べて、変更されてもよいしされなくてもよく、変更としては活性の増強が含まれるがこれに限定されない。本発明はまた、軟骨誘導性を促進する方法に関し、これらの方法は、細胞を1種以上の本発明の修飾成長因子ペプチドまたは本明細書に記載された組成物と接触させることを備える。本明細書で使用される場合、軟骨誘導性とは、細胞を、表現型がより軟骨細胞様である細胞に分化させることをいうことがあり、またはこの用語は、軟骨細胞の増殖を増加させることをいうことがあり、またはその両方である。本発明の修飾成長因子ペプチドとの接触前には、これらの細胞は、未分化細胞または部分的に未分化の細胞であってもよい。これらの細胞は、培養物中、または組織、器官、もしくはその一部の中、または生物の中に存在してもよい。新規なペプチドの軟骨誘導活性は、正常な成熟成長因子と比べて、変更されてもよいしされなくてもよく、変更としては活性の増強が含まれるがこれに限定されない。例えば、本発明は、本明細書に記載された1種以上の修飾成長因子ペプチドまたは組成物の存在下で、細胞を増殖および/または培養することを提供する。の存在下で、細胞を増殖および/または培養することは、伝統的な細胞培養方法、ならびに天然または合成のマトリックスまたは組織中などの任意の環境にある修飾成長因子の存在下に細胞を配置することを含む。細胞は哺乳動物細胞であってもよく、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、その他のものであってよいが、これらに限定されない。ある実施形態において、細胞は、脂肪細胞由来幹細胞、胚性幹細胞、前駆細胞、分化細胞、未分化細胞、および/または誘導多能性幹細胞などの間葉系幹細胞であってもよい。適切な細胞としては、外胚葉系統の細胞、中胚葉系統の細胞、および内胚葉系統の細胞も挙げられ得るが、これらに限定されない。外胚葉系統の細胞の例としては、ケラチノサイト、骨芽細胞、軟骨細胞、神経細胞が挙げられるが、これらに限定されない。中胚葉系統の細胞の例としては、筋芽細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、内皮細胞、または間質細胞が挙げられるが、これらに限定されない。外胚葉系統の細胞としては、耳管、気管、気管支、および肺胞などの気道、胃腸管、膀胱の上皮細胞、ならびにすべての腺の内側の上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞はまた、組織または器官から誘導された初代細胞であり得る。本発明において使用される適切な細胞株としては、間葉細胞株、前骨芽細胞株、骨芽細胞株、および軟骨芽細胞株が挙げられ得るが、これらに限定されない。修飾成長因子ペプチドが投与された細胞は、組織、生物、または骨マトリックスが挙げられるがこれに限定されないマトリックスなどの他の環境に直接的に配置されてもよい。ある実施形態において、細胞は、自系または同種異系の供給源から誘導されてもよい。これらの細胞は、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、および骨膜細胞などの分化した細胞であってもよい。加えて、これらの細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、前駆細胞幹細胞、または成体体性幹細胞であってもよい。幹細胞は、胚、胎盤、骨髄、脂肪組織、血管、羊水、滑液、滑膜、心膜、骨膜、硬膜、末梢血、臍帯血、月経血、乳歯、髄核、脳、皮膚、毛包、腸陰窩、神経組織、筋肉から誘導されてもよい。これらの幹細胞は、骨格筋、平滑筋、および心筋から誘導されてもよい。幹細胞は、誘導多能性幹細胞iPSCなどの成熟細胞の遺伝的再プログラミングから誘導されてもよい。本明細書に記載された任意の細胞を、特定の実施形態において、本明細書に記載された1種以上の修飾成長因子または組成物とともに、約15分間~約4週間、約2時間~約2週間、約2時間~約1週間、約2時間~約72時間、約24時間~約72時間、または約24時間~約96時間の間、約20°C~約40°Cまたは約30°C~約37°Cで、約1CO2~約10CO2または約4CO2~約6CO2を含有する雰囲気中で培養してもよい。本発明のある実施形態において、細胞を、1種以上の修飾成長因子、および1組織もしくは器官、2マトリックス、または3これらの組み合わせの存在下で培養してもよい。細胞培養培地中の1種以上の修飾成長因子の存在下で培養された細胞を、特定の実施形態において、引き続き、マトリックス、組織、器官、またはこれらの組み合わせに適用してもよい。ある実施形態において、処理された細胞は凍結保存される。特定の実施形態において、処理された細胞を保存するために凍結保存剤を使用してもよい。ある実施形態において、処理された細胞はマトリックスに播種され、細胞を播種されたマトリックスを、少なくとも1種の凍結保存剤を使用して保存してもよい。ある実施形態において、少なくとも1種のコファクターを処理された細胞に加えてもよい。任意に使用されてもよいコファクターは、とりわけヘパリン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、エラスチン、ラミニン、プロテオグリカン、コラーゲン、またはゼラチンである。特定の実施形態において、二価カチオン、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、またはリン酸ナトリウムを、処理された細胞にコファクターとして加えてもよい。ある実施形態において、タンパク質またはタンパク質フラグメントが、処理された細胞に加えられるコファクターであってもよい。さらなる実施形態において、本明細書に記載されたプロテアーゼが、処理された細胞に加えられるコファクターであってもよい。特定の実施形態において、凍結保存された処理された細胞は、組織もしくは器官の欠陥、組織、器官、マトリックス、またはこれらの2つ以上の混合物に適用される前に、約10°C~約37°Cの温度で任意に復活させられる。特定の実施形態において、処理された細胞は、これらの細胞が組織または器官の欠陥を治療するために使用される前に、1種以上の体液、例えば、とりわけ血液、多血小板血漿、血漿、骨髄、および臍帯血、ならびに等張溶液、低張溶液、または高張溶液、例えば生理食塩水、または乳酸加リンガー液、およびその他と合わせられてもよい。ある実施形態において、処理された細胞は、組織もしくは器官の間に細胞を注入もしくは挿入することによって、または欠陥の上に細胞を配置することによって、組織または器官の欠陥に適用されてもよい。ある実施形態において、修飾成長因子は、インビトロ、インビボ、またはインサイチュで細胞に投与されてもよい。ある実施形態において、修飾成長因子は、組織または器官から単離された、組織または器官の中にある細胞に投与されてもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載された少なくとも1種の修飾成長因子または組成物は、1細胞培養培地、2組織または器官、3マトリックス、または4これらの2つ以上の組み合わせの中の細胞に投与されてもよい。骨誘導性または軟骨誘導性をそれぞれ評価するために測定できる、種々の骨芽細胞または軟骨細胞の分化マーカーが存在している。例えば、細胞は、骨芽細胞株に向かう分化の初期段階の間、アルカリホスファターゼを発現する。それゆえに、インビトロアルカリホスファターゼアッセイを、本発明の修飾成長因子ペプチドと接触させられた細胞中の骨誘導性を評価するために使用することができる。筋芽細胞C2C12細胞などのアルカリホスファターゼ発現がなければ非骨形成細胞の中でアルカリホスファターゼ発現を刺激または誘導する、本発明の修飾成長因子ペプチドの能力は、本発明の修飾成長因子ペプチドが骨誘導活性を有することを示す。これらのアッセイにおいて、いかなる種の成長因子も加えずに、本発明の修飾成長因子ペプチドを加えずに培養された細胞は、非骨形成細胞上でのベースラインアルカリホスファターゼ発現を示すためのネガティブ対照として使用される。ネガティブ対照における骨芽細胞マーカーのベースラインはゼロである必要はなく、これは、ネガティブ対照群の細胞が少なくともある程度のレベルの骨芽細胞と関連する表現型マーカーを有する可能性があることを意味する。従って、本発明の骨誘導性ペプチドは、対照に対して実験細胞中で所定の骨芽細胞マーカーの増加をはっきりと引き起こす。同様に、いくつか例を挙げると、X型コラーゲン、II型コラーゲン、Sox9、アグリカン、マトリリン-1、およびCEP-68が挙げられるが、これらに限定されない軟骨細胞マーカーは、軟骨誘導性の能力を評価するために使用できる。さらに、骨誘導性および/または軟骨誘導性は、本発明の修飾成長因子ペプチドが、初代細胞、細胞株、または移植片などの培養細胞中で骨芽細胞表現型または軟骨細胞表現型を分化または誘導する能力を調べることによって、組織培養物中で決定されてもよい。例えば、細胞は、アルカリホスファターゼなどの骨芽細胞および/または軟骨細胞のマーカー特性の産生の増加を示す可能性がある。例えば、修飾成長因子の骨誘導性または軟骨誘導性の能力は、非修飾成長因子と比較して、修飾成長因子について0.2倍、0.4倍、0.6倍、0.8倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍よりも大きい可能性がある。別の例において、修飾成長因子の骨誘導性または軟骨誘導性の能力は、非修飾成長因子と比較して、修飾成長因子について10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍、またはさらには1000倍よりも大きい可能性がある。当然、このことは、同じ効果を達成するために必要な非修飾成長因子と比較して、修飾成長因子の濃度が低いことを示す。筋肉などの場所における本発明の修飾成長因子ペプチドによって誘導される骨または軟骨形成能を評価するために、骨誘導性または軟骨誘導性を、適切な動物モデルを使用して評価してもよい。例えば、齧歯動物への筋肉内移植は、生物活性因子の骨誘導活性を評価するためのモデルとして使用されてきた。本発明はまた、骨芽細胞および/または軟骨細胞および/または本明細書に開示される任意の細胞型の増殖を促進し、または分化状態を維持する方法に関し、これらの方法は、骨芽細胞または軟骨細胞に、本明細書に記載された修飾成長因子ペプチドまたは組成物を投与することを備える。新規なペプチドの増殖活性は、変更されてもされなくてもよく、これには、正常な成熟成長因子と比べて増強した活性が挙げられるが、これに限定されない。マイトジェン活性は、MTT[3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド]アッセイ、alamarBlue登録商標、アッセイなどの代謝活性を測定する様々なインビトロアッセイを使用して、修飾成長因子ペプチドによって誘導される細胞増殖を調べることによって評価することができる。alamarBlue登録商標アッセイは、細胞代謝活性を測定するために、非細胞傷害性還元-酸化指標を使用し、これを修飾成長因子のマイトジェン活性を評価するための非破壊的アッセイにする。増殖はまた、PicoGreen商標DNAアッセイの使用などによるDNA定量化、[3H]チミジン標識またはBrdU取り込みなどのDNA合成の放射性標識を測定することによってもまた評価できる。増殖はまた、トリパンブルー血球計の使用などの手動細胞計数によっても評価できる。本発明はまた、少なくとも1種のプロテアーゼおよび成長因子を細胞に投与することを備える、細胞成長因子活性を増加させる方法に関する。プロテアーゼは本明細書に記載されたプロテアーゼであり、コラゲナーゼ、クロストリパイン、ディスパーゼ、トリプシン、BMP-1、MMP-13、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、成長因子は本明細書に記載された修飾成長因子を備える。細胞は本明細書に記載された細胞であり、分化細胞、成体幹細胞、前駆細胞、および誘導多能性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。先に記載したように、本明細書に開示されるような成長因子の修飾はまた、BMP-4の活性を増強する。特定の実施形態において、本明細書に記載された修飾成長因子と一緒にプロテアーゼを投与することは、骨誘導活性または軟骨誘導活性などの修飾成長因子の活性をさらに増強する。ある実施形態において、組成物中への本明細書に記載されたプロテアーゼの添加は、同じ組成物中での成長因子の安定性を増強する。先に記載したように、本明細書に開示されるような成長因子の修飾もまた、成長因子の安定性を増強する。特定の実施形態において、修飾成長因子を備える組成物へのプロテアーゼの添加は、修飾成長因子の安定性をさらに増強する。さらなる実施形態において、細胞成長因子活性を増加させる際に細胞に投与される組成物は、2種以上のプロテアーゼを備える。ある実施形態において、第2のプロテアーゼがプロテアーゼおよび成長因子を備える組成物に混合でき、またはプロテアーゼおよび成長因子を備える組成物とは別個に投与できる。本発明はさらに、少なくとも1種の修飾成長因子ペプチド、ならびに組織、器官、マトリックス、および/またはこれらの2種以上の混合物を備えた、組織または器官の修復または再生組成物に関する。この組織または器官の修復組成物は、脱灰骨および均質化した結合組織を備えてもよい。本明細書に記載された組成物を用いる使用のための移植可能生体適合マトリックスは、修飾成長因子ペプチドに適切な送達または支持系として機能できる。生体適合性マトリックスは、非毒性で、重篤な炎症性応答または免疫拒絶を誘発または刺激せず、移植部位において他の望ましくない反応を起こさないべきである。適切なマトリックスはまた、例えば、移植部位において、長時間にわたってゆっくりとした持続性の放出を促進するように、修飾成長因子ペプチドの放出を提供してもよい。1つの実施形態において、マトリックスは、骨マトリックスまたは軟骨である。その一般的な通常の意味に加えて、マトリックスに投与することは、少なくとも1種の修飾成長因子ペプチドを産生可能である宿主細胞を、1つまたは複数のマトリックスに埋め込むことを含む。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される少なくとも1種の修飾成長因子ペプチドまたは組成物で細胞を処理する方法、および骨マトリックスまたは軟骨などであるがこれらに限定されないマトリックスにこれらの処理された細胞を移植する方法を提供する。適切なマトリックスとしては、骨細胞または前駆細胞が移動してもよい多孔質足場が挙げられるが、これらに限定されない。骨形成細胞または軟骨形成細胞、すなわち、それぞれ、新たな骨材料または軟骨材料の沈着のプロセスに関与する細胞は、しばしば、このような多孔性マトリックスに結合でき、次いで、これらは、骨および軟骨組織の成長のための足場として役立つことができる。特定の適用のために、マトリックスは、その三次元構造を維持するために十分な機械的強度を有し、一体化されるか一緒に移植される骨セグメントの固定化の支持を補助するべきである。組織成長のための足場を提供する多孔性マトリックスは、新たな骨の沈着または骨成長の速度を加速でき、骨伝導性であると言われる。骨伝導性マトリックスは、本明細書に記載された薬学的組成物中でとりわけ有用である。組織成長のための足場を提供する多孔性マトリックスは、新たな軟骨の沈着または軟骨成長の速度を加速でき、軟骨伝導性であると言われる。骨伝導性マトリックスは、本明細書に記載された薬学的組成物中でとりわけ有用である。軟骨伝導性マトリックスは、本明細書に記載された薬学的組成物中でとりわけ有用である。新規なペプチドの骨誘導活性または軟骨誘導活性は、変更されてもされなくてもよく、これには、正常な成熟成長因子と比べて増強した活性が挙げられるが、これに限定されない。このように、本発明の処理されたマトリックスの骨伝導活性または軟骨伝導活性は、修飾成長因子で処理されていないマトリックスと比較して、増強している可能性がある。当然、マトリックス中の細胞が、より多くの骨芽細胞様または軟骨細胞様の外見または機能の細胞に分化し始める場合、マトリックスは、それぞれ、骨伝導性または軟骨伝導性と見なされる。マトリックスは天然の供給源から誘導でき、またはマトリックスは合成であり得、またはその両方の混合物である。天然の供給源からのマトリックスは、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、アルブミン、フィブリノーゲン-フィブリン、キトサン、エラシン、ラミニン、結合組織、皮質骨または海綿骨、脱灰骨または石灰化骨、大腿筋膜、真皮、筋肉、靱帯、腱、これらの混合物、および再構成された組織の混合物が挙げられるがこれらに限定されない天然のポリマーもまた含んでもよい。合成供給源からのマトリックスは、生物によって産生されない任意の材料をいい、これらとしては、有機成分、無機成分、またはそれらの混合物から作られる合成材料が挙げられ得るが、これらに限定されない。ある実施形態において、合成マトリックスは、ポリ乳酸-コ-グリコール酸、ポリカプロラクトンPCL、ポリグリコール酸PGA、ポリ乳酸PLA、ポリヒドロキシブチレートPHB、ポリエチレングリコールPEG、ポリエチレンオキサイドPEO、およびその他などの有機合成ポリマーを備えてもよい。ある実施形態において、アルギン酸塩、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、エラスチン、ラミニン、およびプロテオグリカンのうち少なくとも1つを含む組織、器官、またはマトリックスを使用してもよい。特定の実施形態において、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウム、リン酸オクタカルシウム、リン酸カルシウム、マクロ多孔質メタリン酸カルシウムセラミック、β-トリカルシウムホスフェート、金属、金属合金、およびその他などの無機成分を備えるマトリックスを使用してもよい。本発明の特定の実施形態において使用されるマトリックスは、組織または器官の脱灰化、脱細胞化、または活力除去によって調製されてもよく、細胞がマトリックスに播種されてもよい。ある実施形態において、本明細書に記載された少なくとも1種の修飾成長因子または組成物はマトリックスに適用されてもよく、処理されたマトリックスの生成を可能にする条件でインキュベートされてもよい。ある実施形態において、インキュベーションは、約40°C以下、または約10°C~約37°C、または約20°C~約37°Cの間で実施してよい。特定の実施形態において、インキュベーションを、少なくとも約2分間~約120分間、約3分間~約100分間、約4分間~約80分間、約5分間~約60分間、および約5分間~約30分間実施してもよい。インキュベーションは、静的または動的な条件下で実施してよく、例えば、かき混ぜ、振盪、撹拌、混合、水平運動、揺らし、およびその他を用いる。本発明のある実施形態において、本明細書に記載された少なくとも1種の修飾成長因子または組成物がマトリックスに投与される前に、マトリックスを凍結乾燥してもよい。特定の実施形態において、1種以上の修飾成長因子をマトリックスに投与してもよく、処理されたマトリックスは、引き続き凍結乾燥されてもよい。次いで、凍結乾燥された処理されたマトリックスは、使用される前に水を加えて元にもどすことができる。さらに、細胞を、移植前にマトリックスに播種することができる。適切な骨伝導性または軟骨伝導性マトリックスの例としては、コラーゲンウシ皮膚コラーゲン、フィブリン、リン酸カルシウムセラミックス例えば、ヒドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウム、硫酸カルシウム、グアニジン抽出した同種異系骨、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、および線維状コラーゲンの混合物であるCollograft商標CollagenCorporation、ならびに海のサンゴ炭酸カルシウムの結晶性ヒドロキシアパタイトへの変換によって形成されたヒドロキシアパタイトバイオマトリックスであるInterpore商標InterporeInternationalなどの多数の適切なマトリックスが市販されている。多数の合成生物分解性ポリマーが、持続放出特性を有する骨伝導性または軟骨伝導性マトリックスとして役立ち得る。これらのポリマーの記載は、Behravesh1999ClinicalOrthopaedics367,S118およびLu2000PolymericDeliveryVehiclesforBoneGrowthFactorsinControlledDrugDelivery:DesigningTechnologiesfortheFuture,ParkandMrsnyeds.,AmericanChemicalSocietyに見い出され得る。これらのポリマーの例としては、ポリ乳酸/ポリグリコール酸ホモポリマーおよびコポリマー、ポリホスファゼンPPHOS、ポリ無水物、およびポリプロピレンフマレートなどのポリα-ヒドロキシエステルが挙げられる。ポリ乳酸/ポリグリコール酸PLGAホモおよびコポリマーは、持続放出ビヒクルとして当該分野において周知である。放出の速度は、ポリ乳酸対ポリグリコール酸の比率の変更およびポリマーの分子量によって当業者が調整できるAnderson1997Adv.DrugDeliv.Rev.28:5を参照のこと。微粒子マトリックスを形成するためのブレンドとしてのポリマーへのPEGの組み込みによって、活性成分の放出プロフィールのさらなる変更が可能になるCleek1997J.ControlRelease48,259を参照のこと。リン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイトなどのセラミックスもまた、機械的品質を改善するために製剤に組み込んでよい。1つの実施形態において、本発明の組成物および方法において使用されるマトリックスは骨マトリックスである。本明細書で使用される場合、骨マトリックスは、天然の骨の成分に由来するか、またはそれを含むマトリックスである。ある実施形態において、天然の骨は、石灰化骨、部分的に脱灰した骨、脱灰骨、海綿骨、皮質骨、または皮質海綿骨である。本明細書で使用される骨マトリックスは、骨組織において典型的には見い出されないさらなる合成成分を含んでもよいし、含まなくてもよい。他の実施形態としては、軟骨、真皮などの他の軟組織、結合組織、筋膜、小腸粘膜下層、漿膜、心膜、腱、靱帯、筋肉、脂肪組織、ミエリン、血管、基底膜、羊膜、およびその他から誘導されたマトリックスを使用する組成物および方法が挙げられる。ある実施形態において、硝子軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨から調製されたマトリックスを使用できる。マトリックスは、関節丘、脛骨プラトー、大腿骨頭、上腕頭、肋軟骨にある硝子軟骨、椎間板にある線維軟骨、または喉頭蓋もしくは耳にある弾性軟骨から調製されてもよい。特定の実施形態において、任意に洗浄され、消毒され、化学修飾され、脱細胞化され、粒子化され、均質化され、凍結乾燥され、ガンマ腺照射され、および/または可塑化された天然の供給源から誘導されたマトリックスが使用されてもよい。本明細書で使用される任意のマトリックスは、このような組織中では典型的には見い出されないさらなる合成成分を含んでもよいし、含まなくてもよい。1つの特定の実施形態において、骨マトリックスまたは軟骨マトリックスは、それぞれ、脱灰されるか、脱細胞化されてもよい。脱灰されたマトリックスの例および作成方法は、米国特許第6,189,537号および同第6,305,379号に記載されている。本発明の特定の実施形態において使用されるマトリックス、組織、または器官は、とりわけ、粉末、粒子、シート、繊維、ゲル、パテ、ペースト、ブロック、円筒、スポンジ、メッシュ、フィルム、スライス、カール、フレーク、またはくさびの形態であってもよい。本発明の特定の実施形態において、修飾成長因子ペプチドを備えるマトリックス、組織、または器官は、粉末、繊維、パテ、またはスポンジの形態であってもよい。さらなる実施形態において、スポンジとしては、例えば、2009年8月7日に出願された、同時継続中の同一出願人によるCompositionforaTissueRepairImplantandMethodsofMakingtheSameという標題の特許出願PCT/US09/04556に開示されているスポンジ様構造を有する移植物が挙げられ得る。処理されたマトリックスは、本発明のいずれの方法においても使用できる。本発明はまた、細胞中の骨形成または軟骨形成を増加または促進する方法に関する。これらの方法は、本明細書に記載された少なくとも1種の修飾成長因子ペプチドまたは組成物で、マトリックス中の細胞を処理することを包含してもよい。本明細書で使用される場合、骨形成は、新たな骨材料の沈着または新たな骨の形成であり、膜内骨形成および軟骨内骨形成が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、軟骨形成は、新たな軟骨材料の沈着または新たな軟骨の形成である。新規なペプチドの骨形成または軟骨形成を誘導する活性は、変更されてもされなくてもよく、これには、正常な成熟成長因子と比べて増強した活性が挙げられるが、これに限定されない。修飾成長因子が投与されてもよい細胞としては、骨または軟骨形成が所望される任意の組織中の細胞が挙げられ、例えば骨、軟骨、靱帯、筋肉などであるが、これらに限定されない。本発明はまた、組織または器官の欠陥または損傷、例えば動物の筋骨格、歯、または軟組織の欠陥または損傷を治療する方法に関し、この方法は、1本明細書に記載の1種以上の修飾成長因子もしくは組成物の存在下で培養した細胞、および/または2本明細書に記載の1種以上の修飾成長因子もしくは組成物をその組織または器官の欠陥に投与することを備える。本発明はさらに、組織または器官の欠陥または損傷、例えば動物の筋骨格、歯、または軟組織の欠陥に処理したマトリックスを適用することによって、この欠陥を治療する方法に関し、欠陥への適用は、処理したマトリックスを欠陥に注入すること、組織もしくは器官の間に処理したマトリックスを挿入すること、または欠陥の上に処理したマトリックスを配置することによって達成されてもよい。本発明はまた、同様の様式で、器官における欠陥または損傷を治療することに関する。ある実施形態において、少なくとも1種のコファクターを、修飾成長因子を備えたマトリックスなどの処理されたマトリックスに加えてもよい。なお別の実施形態において、細胞は、処理されたマトリックスに播種されてもよい。処理されたマトリックスに播種された細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、前駆細胞、および本明細書に開示されるか、当該分野において公知である幹細胞などであるがこれらに限定されない任意の細胞であり得る。播種された細胞は、増殖させられ、おそらくマトリックスに結合させられ得る。コラーゲンなどのマトリックスに細胞を播種する方法は、当該分野において周知である。あるいは、細胞は、最初に、本明細書に記載された少なくとも1種の修飾成長因子または組成物で処理されてもよく、次いで処理された細胞は、処理されたかまたは処理されていないマトリックスに播種されてもよい。本発明の方法のいずれも、インビボ、エキソビボ、インサイチュ、またはインビトロ環境などの実質的に任意の環境で実施できる。例えば、細胞中で骨形成を促進する方法は、細胞培養物中で実施されてもよく、またはインタクトな生物中で実施されてもよい。さらに、本明細書に記載された任意の実施形態のうち任意の2つ以上の任意の組み合わせが意図される。本発明を、様々な具体的な材料、手順、および例に言及して記載および例証してきたが、本発明は、その目的のために選択された材料および手順の特定の組み合わせに限定されないことが理解される。当業者によって認識されるように、このような詳細の多数のバリエーションが、当然意図され得る。明細書および実施例は単なる例示と見なされ、本発明の真の範囲および技術思想は、以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。本願において引用されるすべての参考文献、特許、および特許出願は、それらの全体が参照により組み込まれる。以下の実施例は例示であり、本明細書に記載された本発明の範囲を限定することを意図しない。実施例1-修飾BMP-4の調製および配列決定コラゲナーゼSigmaAldrichをセファロースビーズに連結し、結合していないコラゲナーゼを広範な洗浄によって除去した。コラゲナーゼ連結されたセファロースビーズを使用して、穏やかに混合しながら、37°Cで一晩のインキュベーションによって成熟rhBMP-4を処理した。処理された成熟rhBMP-4を、SDS-PAGEゲル電気泳動によって分離し、続いてPVDFメンブレンへのタンパク質転写を行った。PVDFメンブレン上のタンパク質を、Coomassieブルーによって染色し、関連するバンドを、Edman分解化学を使用し、ABIProcise494シークエンサーを用いるN末端配列決定のために切断した。PVDFメンブレン上のタンパク質をまた、rhBMP-4のC末端に対する抗体を使用して、ウェスタンブロットによって検出した。コラゲナーゼ処理された成熟rhBMP-4バンドを未処理成熟rhBMP-4対照バンドと比較することによって、17~22kDa周辺の余分なバンドをN末端配列決定のために切断した。コラゲナーゼ処理された成熟rhBMP-4のN末端の10アミノ酸を、Edman分解化学を使用し、ABIProcise登録商標494シークエンサーを用いて検出した。処理されたrhBMP-4のN末端の推定アミノ酸配列は、KKNKNCRRHS配列番号7であった。処理されたrhBMP-4のN末端は、未処理の成熟rhBMP-4配列と一致し、このことは、コラゲナーゼが、最初の10アミノ酸の後で成熟BMP-4を切断したことを示している。ウェスタンブロットによって、コラゲナーゼ処理されたrhBMP-4群のバンドが検出され、これは、未処理成熟rhBMP-4のバンドよりも約1~2kDa小さい。実施例2-修飾rhBMP-4の骨誘導能アルカリホスファターゼは、骨誘導性の生物学的または生物学的に由来するはっきりとした指標の1つである。APアッセイは、基質パラ-ニトロフェニルホスフェートpNPPの細胞溶解物との37°Cで60分間のインキュベーション後に、405nmの波長で生成物パラ-ニトロフェノールpNPを測定する。1日目に、C2C12細胞ATCCCRL-1772を、24ウェルプレートに、約25,000細胞/cm2の密度で播種した。コラゲナーゼと様々な濃度の成熟rhBMP-4とを、約1:10~約1000:1のモル濃度比で微量遠心チューブの中で混合し、37°Cで一晩インキュベートした。2日目に、コラゲナーゼ処理されたrhBMP-4または未処理のrhBMP-4を、24ウェルプレートに播種されたC2C12細胞の各ウェルに導入した。rhBMP-4の最終濃度は、1、5、10、および30ng/mLであった。37°Cおよび5CO2での3日間のインキュベーション後、細胞を培養プレートから収集し、APアッセイおよびBCA総タンパク質アッセイのために細胞溶解物を調製した。インビトロAPアッセイの結果を図1に示す。10ng/mL以下の濃度の処理されたまたは未処理の成熟rhBMP-4とともに細胞を培養した場合、アルカリホスファターゼ活性の違いは無視できた。30ng/mLの濃度では、コラゲナーゼ処理されたrhBMP-4で処理された細胞は、未処理の成熟rhBMP-4で処理された細胞よりも有意に高いAP活性を発現した。実施例3-プロテアーゼを伴うかまたは伴わない修飾rhBMP-4の骨誘導能1日目に、マウス筋芽細胞株由来であるC2C12細胞ATCCCRL-1772を、24ウェルプレートに25,000細胞/cm2の密度で播種する。コラゲナーゼとrhBMP-4とを、約1:10~約100:1のモル濃度比で微量遠心チューブ中で混合し、37°Cで一晩インキュベートする。処理された成熟rhBMP-4を、上記のHPLC精製をさらに伴うかまたは伴わずに、アリコートに小分けする。さらなるHPLC精製を伴うアリコート精製修飾BMP-4をELISAによって定量する。さらなるHPLC精製を伴わないアリコート非精製修飾BMP-4はアリコート中にコラゲナーゼを保持していた。これらのアリコートは、C2C12筋芽細胞の骨形成能に対する処理した成熟rhBMP-4の効果を試験するために使用される。同じ濃度のrhBMP-4対照、および精製修飾rhBMP-4、および非精製修飾rhBMP-4の各々を、C2C12細胞が播種された24ウェルプレートのウェルに導入する。培地中で単独で培養されたC2C12細胞rhBMP-4または修飾rhBMP-4の添加なしを、ネガティブ対照として使用する。37°C、5CO2での3日間のインキュベーション後、上述したAPアッセイを実施する。精製修飾rhBMP-4または非精製修飾rhBMP-4とともに培養された細胞のアルカリホスファターゼ活性は、未処理rhBMP-4対照とともに培養した細胞のそれよりも有意に高い。非精製修飾rhBMP-4とともに培養された細胞のアルカリホスファターゼ活性もまた、精製修飾rhBMP-4とともに培養された細胞のそれよりも有意に高い。これらの結果は、精製修飾rhBMP-4を投与することと比較して、非精製修飾rhBMP-4を投与することによる、アルカリホスファターゼ活性の有意な増加を実証する。さらに、上記のように培養されたC2C12細胞の別のセットを用いて、精製修飾rhBMP-4を、138ng/mLの活性ディスパーゼもしくは不活性ディスパーゼ、または100μg/mLのコラゲナーゼもしくは不活性コラゲナーゼとともにC2C12細胞のウェルに導入する。上記のようにAPアッセイを実施し、その結果は、精製修飾rhBMP-4サンプルへの活性または不活性ディスパーゼまたはコラゲナーゼを加えることもまた、アルカリホスファターゼ活性を増加させることを示す。加えて、クロストリパイン、ディスパーゼ、およびこれらの混合物によって処理された、さらなる精製を伴わないrhBMP-4もまた、非修飾rhBMP-4対照と比較して、アルカリホスファターゼ活性を増加させる。加えて、BMP1またはMMP13によって処理され、さらなる精製を伴わないrhBMP-4もまた、非修飾rhBMP-4対照と比較して、アルカリホスファターゼ活性を増加させる。実施例4-プロテアーゼを伴う修飾rhBMP-4の骨誘導能C2C12細胞ATCCCRL-1772を上記のように培養する。コラゲナーゼとrhBMP-4とを、約1:10~約100:1のモル濃度比で微量遠心チューブ中で混合し、撹拌しながら37°Cで一晩インキュベートする。処理された成熟rhBMP-4をアリコートに小分けし、アリコートを、以下のようにC2C12筋芽細胞の骨形成能に対する処理された成熟rhBMP-4の効果を試験するために使用する。骨誘導能の評価のために、1FBS、50μg/mLのアスコルビン酸、および10mMのβ-グリセロホスフェートを含有するDMEMの基本培地を対照群として使用する。50ng/mLのrhBMP-4の添加を伴う基本培地対照を、BMP-4ポジティブ対照群として使用する。50ng/mLの修飾rhBMP-4の添加を伴う精製なしの基本培地対照を試験群として使用する。培地を、チャンバースライド上に播種されたC2C12細胞に加え、3~4日毎に交換する。37°C、5CO2での数日間のインキュベーション後、各群における細胞培養物について写真も撮影する。C2C12細胞の結節形成は、修飾rhBMP-4群においてのみ見られるが、他の2つの対照群には見られない。インキュベーション日数がさらに経過した後、培地をチャンバースライドから除去し、スライドをAlizarinRedSで染色する。AlizarinredSを培養物または組織切片において細胞によるカルシウムが豊富な沈着物を同定するために使用し、これは、細胞の骨形成能に対する骨誘導性物質の効果を示す。基本培地対照群については、試験のどの時点でもポジティブなAlizarinredS染色は見い出されない。rhBMP-4対照群については、ある程度のAlizarinredS染色がインキュベーションの6または12日後に検出される。修飾rhBMP-4群については、6日間のインキュベーション後、有意な量の結節がAlizarinredSによってポジティブに染色される。12日間のインキュベーション後、非修飾rhBMP-4とともに培養されたC2C12細胞におけるよりも、修飾rhBMP-4とともに培養されたC2C12細胞において、より大きなサイズのより多くのAlizarinredSでポジティブに染色された結節が観察される。このデータは、修飾rhBMP-4が、非修飾成熟rhBMP-4対照と比較した場合に、C2C12筋芽細胞の骨形成能に対して有意により高い能力を有することを示唆する。実施例5-細胞培養物中にプロテアーゼを伴うかまたは伴わない修飾rhBMP-4の安定性C2C12細胞を培養し、精製し、非精製修飾rhBMP-4を上記の実施例3に記載されるように調製する。2日目に、同じ濃度の精製修飾rhBMP-4、非精製修飾rhBMP-4、または未処理成熟rhBMP-4を、C2C12細胞が播種された24ウェルプレートの各ウェルに導入する。rhBMP-4または修飾rhBMP-4の添加を伴わずに培養されたC2C12細胞をネガティブ対照として使用する。様々な期間24時間、48時間、または72時間の間の37°C、5CO2でインキュベーション後、使用済みの培養培地をこれらの元の24ウェルプレートから収集し、前日に播種された新鮮なC2C12細胞を含有する新たな24ウェルプレートに移し、新たな24ウェルプレートを、さらに3日間、37°C、5CO2でインキュベートする。元の24ウェルプレートおよび新たな24ウェルプレートからの細胞を、各培養期間の最後に収集し、細胞溶解物を、APアッセイおよびBCA総タンパク質アッセイのために調製する。24時間後、48時間後、および72時間後に収集された未処理rhBMP-4使用済み培地中でC2C12細胞を3日間培養する対照群については、アルカリホスファターゼ活性は、新鮮なrhBMP-4培地で3日間培養した細胞のそれと比較して減少している。24時間後、48時間後、および72時間後に収集された精製修飾rhBMP-4使用済み培地中でC2C12細胞を3日間培養する実験群についても、アルカリホスファターゼ活性は減少し、対照群よりも低かった。しかし、24時間後、48時間後、および72時間後に収集された非精製修飾rhBMP-4使用済み培地中でC2C12細胞を3日間培養する実験群については、アルカリホスファターゼ活性は、新鮮な非精製修飾rhBMP-4培地で3日間培養した細胞のそれと比較して、同様またはより高いレベルに維持される。このことは、プロテアーゼの存在が、培養培地中の修飾BMP-4の安定性をさらに増強できることを実証する。実施例6-プロテアーゼを伴うかまたは伴わない修飾rhBMP-4の保存安定性精製および非精製の修飾rhBMP-4を上記の実施例3に記載されるように調製する。同じ量および濃度の精製および非精製の修飾rhBMP-4のアリコートを様々な期間の間2日間から2週間37°Cでインキュベートする。各時点の後で、各群からの1つのアリコートを、最後の時点が完了するまで-20°Cのフリーザーに移す。異なる時点からの精製修飾rhBMP-4または非精製修飾rhBMP-4のアリコートを、上記のように培養されたC2C12細胞の各ウェルに導入する。rhBMP-4またはコラゲナーゼの添加なしで培養されたC2C12細胞をネガティブ対照として使用する。37°C、5CO2での3日間のインキュベーション後、上記のようなAPアッセイを実施する。7日間または14日間棚の上で37°C精製修飾rhBMP-4とともに培養した細胞のアルカリホスファターゼ活性は、2日間棚の上で37°C精製修飾rhBMP-4とともに培養した細胞のそれと比較して減少している。7日間または14日間棚の上で37°C非精製修飾rhBMP-4とともに培養した細胞のアルカリホスファターゼ活性は、精製修飾rhBMP-4とともに培養された細胞のそれより少なく減少する。このことは、プロテアーゼの存在が、修飾BMP-4の保存安定性をさらに増強できることを実証する。"