"以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む単離された免疫グロブリンであって、a該重鎖可変領域が配列番号323のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が配列番号188もしくは配列番号190のアミノ酸配列を含む;またはb該重鎖可変領域が配列番号321のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が配列番号188もしくは配列番号190のアミノ酸配列を含む;またはc該重鎖可変領域が配列番号325のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が配列番号182、配列番号188、もしくは配列番号190のアミノ酸配列を含む、上記免疫グロブリン。以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む単離された免疫グロブリンであって、a該軽鎖可変領域が配列番号196のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号335、配列番号349、配列番号351、配列番号353、配列番号355、もしくは配列番号359のアミノ酸配列を含む;またはb該軽鎖可変領域が配列番号204のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号349もしくは配列番号355のアミノ酸配列を含む;またはc該軽鎖可変領域が配列番号202のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号349のアミノ酸配列を含む;またはd該軽鎖可変領域が配列番号192のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号357、配列番号359、もしくは配列番号369のアミノ酸配列を含む;またはe該軽鎖可変領域が配列番号194のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号335、配列番号349、もしくは配列番号351のアミノ酸配列を含む、上記免疫グロブリン。重鎖可変領域が配列番号323のアミノ酸配列を含み;軽鎖可変領域が配列番号188のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された免疫グロブリン。軽鎖可変領域が配列番号196のアミノ酸配列を含み;重鎖可変領域が配列番号353のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の単離された免疫グロブリン。軽鎖可変領域が配列番号202のアミノ酸配列を含み;重鎖可変領域が配列番号349のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の単離された免疫グロブリン。重鎖可変領域が配列番号325のアミノ酸配列を含み;軽鎖可変領域が配列番号190のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された免疫グロブリン。単離された免疫グロブリンが抗体または抗体フラグメントを含む、請求項1または請求項2に記載の単離された免疫グロブリン。IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4を含む、請求項7に記載の単離された免疫グロブリン。モノクローナル抗体を含む、請求項7に記載の単離された免疫グロブリン。ヒト抗体を含む、請求項9に記載の単離された免疫グロブリン。a配列番号113のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号110のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;またはb配列番号125のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号122のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;またはc配列番号101のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号98のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;またはd配列番号119のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号116のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖、を含む請求項10記載の単離された免疫グロブリン。1から24個の薬理活性を有する化学的部分を、結合してさらに含む、請求項1~6または8~11のいずれか一項に記載の単離された免疫グロブリン。薬理活性を有する化学的部分が薬理活性を有するポリペプチドである、請求項12に記載の単離された免疫グロブリン。免疫グロブリンが組換え技術によって産生される、請求項13に記載の単離された免疫グロブリン。免疫グロブリンが少なくとも1個の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1個の免疫グロブリン軽鎖を含み、薬理活性を有するポリペプチドが免疫グロブリン重鎖のFcドメインの内部ループ内の、免疫グロブリン重鎖の一次アミノ酸配列に挿入された、請求項14に記載の単離された免疫グロブリン。免疫グロブリンが少なくとも1個の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1個の免疫グロブリン軽鎖を含み、薬理活性を有するポリペプチドが免疫グロブリン重鎖のN末端またはC末端に結合した、請求項13に記載の単離された免疫グロブリン。免疫グロブリンが少なくとも1個の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1個の免疫グロブリン軽鎖を含み、薬理活性を有するポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖のN末端またはC末端に結合した、請求項13に記載の単離された免疫グロブリン。薬理活性を有するポリペプチドが、トキシンペプチド、IL-6結合ペプチド、CGRPペプチド拮抗薬、ブラジキニンB1受容体ペプチド拮抗薬、PTH作動薬ペプチド、PTH拮抗薬ペプチド、ang-1結合ペプチド、ang-2結合ペプチド、ミオスタチン結合ペプチド、EPO-模倣体ペプチド、FGF21ペプチド、TPO-模倣体ペプチド、NGF結合ペプチド、BAFF拮抗薬ペプチド、GLP-1もしくはそのペプチド模倣薬、またはGLP-2もしくはそのペプチド模倣薬である、請求項13に記載の単離された免疫グロブリン。トキシンペプチドがShKまたはShKペプチド類似体である、請求項18に記載の単離された免疫グロブリン。請求項1~19のいずれかに記載の免疫グロブリン;および薬剤的に許容できる希釈剤、賦形剤または担体を含む、医薬組成物。請求項1~11のいずれかに記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。請求項3に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。請求項4に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。請求項5に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。請求項6に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。請求項11に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。請求項13~19のいずれかに記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。請求項21に記載の単離された核酸を含むベクター。請求項22~26のいずれかに記載の単離された核酸を含むベクター。請求項27に記載の単離された核酸を含むベクター。発現ベクターを含む、請求項28に記載のベクター。発現ベクターを含む、請求項29に記載のベクター。発現ベクターを含む、請求項30に記載のベクター。請求項31~33のいずれかに記載の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。a発現ベクターにコードされた免疫グロブリンの発現を可能にする条件下、請求項34に記載の宿主細胞を培地中で培養すること;およびb培地から免疫グロブリンを回収すること、を含む方法。表面プラズモン共鳴結合アッセイで測定した場合に、生理条件下でインキュベートされた水溶液中で、30マイクロモル濃度の免疫グロブリンが、30ナノモル濃度の可溶性ヒトIL-17R配列番号89と有意には結合しない、請求項1に記載の免疫グロブリン。表面プラズモン共鳴結合アッセイで測定した場合に、生理条件下でインキュベートされた水溶液中で、10マイクロモル濃度の免疫グロブリンが、10ナノモル濃度の可溶性ヒトTR2配列番号82と有意には結合しない、請求項2に記載の免疫グロブリン。本明細書で使用される節の表題は、構成上の目的のためのみであり、記載された発明の主題を限定するものであるとは見なされるべきではない。定義本明細書に別段の定めがない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって共通に理解される意味を持つものとする。さらに、文脈上別段の必要がなければ、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。従って、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、別段の明確な指示がない限り、単数形のa、anおよびtheは複数の指示対象を含む。例えば、タンパク質aproteinへの言及には、複数のタンパク質も含まれ;細胞acellへの言及には複数の細胞集団も含まれる。ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書では同義的に用いられ、ペプチド結合を介して共有結合的に連結した2つ以上のアミノ酸から成る分子鎖を含む。前記用語は生成物の具体的な長さについては言及していない。従って、ペプチド、およびオリゴペプチドは、ポリペプチドの定義内に含まれる。これらの用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等を含む。さらに、タンパク質断片、類似体、変異mutatedorvariantタンパク質、融合タンパク質等が、ポリペプチドの意味の中に含まれる。これらの用語は、既知のタンパク質操作技法を用い、組換え発現できるように、一つまたは複数のアミノ酸類似体または非標準もしくは非天然のアミノ酸が含まれる分子も含む。さらに融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、公知の有機化学的技法によって誘導体化可能である。言及される単離されたタンパク質という用語は、対象タンパク質が、1天然において通常は共に存在するであろう少なくともいくつかの他のタンパク質を含んでいないこと、2同一の供給源由来、例えば、同一種由来の他のタンパク質を本質的に含まないこと、3異なる種もしくは種類の細胞によって、組換え発現されること、4天然では結合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは他の物質のうちの少なくとも約50から分離されていること、5天然では結合しないポリペプチドと、共有結合または非共有結合的な相互作用によって機能的に結合していること、および/または6天然には存在しないこと、を意味する。通常、単離されたタンパク質は、所与の試料の少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約25、または少なくとも約50を構成する。ゲノムDNA、cDNA、mRNAもしくは合成起源の他のRNA、またはそれらのいかなる組み合せも、そのような単離されたタンパク質をコードすることができる。単離されたタンパク質は、その治療用途、診断用途、予防用途、研究用途または他の使用を妨げるであろう、その天然環境に存在するタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の混入物を、実質的に含まないことが好ましい。ポリペプチド例えば、免疫グロブリン、または抗体の変異体は、別のポリペプチド配列と比較して、アミノ酸配列において一つまたは複数のアミノ酸残基が挿入、欠失および/または置換されたアミノ酸配列を含む。変異体には融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質という用語は、タンパク質が、2つ以上の親タンパク質または親ポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含んでいることを表す。通常、融合タンパク質は、あるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と、インフレームで付加され、所望によりリンカーによって隔てらた、融合遺伝子から発現される。次いで、融合遺伝子は組換え宿主細胞によって、単一のタンパク質として発現され得る。分泌タンパク質とは、分泌シグナルペプチド配列によって、ER、分泌小胞、または細胞外間隙へと方向付け可能なタンパク質、並びに、必ずしもシグナル配列の含有を必要とせずに、細胞外間隙に放出されるタンパク質を表す。分泌タンパク質が細胞外間隙に放出されると、該分泌タンパク質は、細胞外プロセシングを受けることで、成熟タンパク質を生成することができる。細胞外間隙への放出は、エキソサイトーシスおよびタンパク質切断を含む多くの機序によって引き起こされ得る。本発明の組成物の他のいくつかの実施形態では、トキシンペプチド類似体が分泌タンパク質として宿主細胞によって合成される場合があり、それをその後、細胞外間隙および/または培地からさらに精製することができる。本明細書で使用される場合、宿主細胞中で組換えDNA技術により産生されたタンパク質に関連する場合の可溶性とは、水溶液中に存在するタンパク質であり;タンパク質が双アルギニンtwinarginineシグナルアミノ酸配列を含む場合、可溶性タンパク質はグラム陰性細菌宿主の細胞膜周辺腔へと輸送されるか、または、分泌ができる真核生物宿主細胞によって、もしくは適切な遺伝子例えば、kil遺伝子を保有する細菌の宿主によって、培地中に分泌される。従って、可溶性タンパク質は、宿主細胞内の封入体には存在しないタンパク質である。あるいは、文脈によっては、可溶性タンパク質は、細胞膜への組み込みが見られないタンパク質であり;対照的に、不溶性タンパク質は、宿主細胞の細胞質顆粒封入体と称される内に修飾型で存在するタンパク質であるか、あるいはまた、文脈によっては、不溶性タンパク質は、限定はされないが例えば、細胞膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、小胞体膜等の細胞膜中に存在するタンパク質である。可溶性ヒトIL-17Rとは、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドhuIL-17R-FpHである:LRLLDHRALVCSQPGLNCTVKNSTCLDDSWIHPRNLTPSSPKDLQIQLHFAHTQQGDLFPVAHIEWTLQTDASILYLEGAELSVLQLNTNERLCVRFEFLSKLRHHHRRWRFTFSHFVVDPDQEYEVTVHHLPKPIPDGDPNHQSKNFLVPDCEHARMKVTTPCMSSGSLWDPNITVETLEAHQLRVSFTLWNESTHYQILLTSFPHMENHSCFEHMHHIPAPRPEEFHQRSNVTLTLRNLKGCCRHQVQIQPFFSSCLNDCLRHSATVSCPEMPDTPEPIPDYMPLWEPRSGSSDYKDDDDKGSSHHHHHH//配列番号89。可溶性ヒトTR2とは、単量体型または二量体型の、以下のアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドhuTR2long-huFcIgG1である:MEQRGQNAPAASGARKRHGPGPREARGARPGPRVPKTLVLVVAAVLLLVSAESALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTSSPGTPASPCSLSGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//配列番号82。緩衝液および免疫グロブリン、または他の結合アッセイ試薬をインキュベートすることに関する生理的条件下とは、非共有結合反応等の生化学反応が起こることを可能にする温度、pH、およびイオン強度の条件下でのインキュベーションを意味する。典型的には、温度は、最大約37°Cの室温または周囲温度、pH6.5~7.5である。組換え型という用語は、その物質例えば、核酸またはポリペプチドが人の介在により人為的にまたは合成的にすなわち、自然にではなく改変されたことを表す。改変は、物質に対し、その天然の環境または状態の中で、またはそこから離れて、行われ得る。例えば、組換え核酸とは、例えば、クローニング、DNAシャフリングまたは他の公知の分子生物学的手法の実施中に、核酸を組換えることによって生成されるものである。そのような分子生物学的手法の例は、ManiatisetalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarbourLaboratoryColdSpringHarbourNYに見出される。組換えDNA分子とは、そのような分子生物学的手法を用いることによって連結されたDNAのセグメントから成る。組換えタンパク質または組換えポリペプチドという用語は、本明細書で使用される場合、組換えDNA分子を用いて発現されるタンパク質分子を表す。組換え宿主細胞とは、組換え核酸を含有および/または発現する細胞である。ポリヌクレオチドまたは核酸という用語は、2つ以上のヌクレオチド残基を含有する一本鎖および二本鎖のヌクレオチド重合体の両方を含む。ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド残基は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのヌクレオチド型の修飾型であり得る。前記修飾は、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体等の塩基修飾、2’,3’-ジデオキシリボース等のリボース修飾、並びにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデートおよびホスホロアミデート等のヌクレオチド間架橋修飾を含む。オリゴヌクレオチドという用語は、200個以下のヌクレオチド残基から構成されるポリヌクレオチドを意味する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは10~60の塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、12、13、14、15、16、17、18、19、または20~40のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、突然変異遺伝子の作製における使用のために、一本鎖または二本鎖であってよい。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイ用の放射標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識を含む標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、PCRのプライマー、クローニングのプライマーまたはハイブリダイゼーションのプローブとして使用することができる。ポリヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列または核酸配列とは、本明細書で同義的に用いられる場合、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド残基の一次配列であり、例えば、文脈にも依るが、核酸であるオリゴヌクレオチド、DNAおよびRNAの一次配列、またはヌクレオチド残基の一次配列を表す文字列が含まれる。いかなる特定のポリヌクレオチド配列からも、所与の核酸配列または相補的ポリヌクレオチド配列のいずれかを決定することができる。一本鎖でも二本鎖でもよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAも含まれる。特に指定がない限り、本明細書で論じられる一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は全て、5’末端であり;二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は5’方向と称される。新生RNA転写物の5’から3’への付加の方向は、転写方向と称され;RNA転写物の5’から5’末端であるRNA転写物と同一の配列を有するDNA鎖上の配列領域は、上流配列と称され;RNA転写物の3’から3’末端であるRNA転写物と同一の配列を有するDNA鎖上の配列領域は、下流配列と称される。本明細書で使用される場合、単離された核酸分子または単離された核酸配列とは、1特定され、該核酸の天然源において通常付随する少なくとも1つの混入核酸分子から分離された核酸分子、または2クローン化された、増幅された、標識された、あるいは、目的の核酸の配列を決定できるようにバックグラウンドの核酸と区別された核酸分子である。単離された核酸分子は、それが天然で見出される形態または設定とは異なる。しかし、単離された核酸分子には、免疫グロブリン例えば、抗体を通常発現する細胞に含有される核酸分子が含まれ、その場合、例えば、核酸分子は天然の細胞のとは異なる染色体上の位置に存在する。本明細書で使用される場合、~をコードする核酸分子、~をコードするDNA配列、および~をコードするDNAという用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順番または配列を表す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順番は、mRNA鎖に沿ったリボヌクレオチドの順番を決定し、また、ポリペプチドタンパク質鎖に沿ったアミノ酸の順番も決定する。従って、DNA配列はRNA配列およびアミノ酸配列をコードする。遺伝子という用語は、生物学的機能に関わるあらゆる核酸について言及するのに広く使用される。遺伝子は通常、そのようなコード配列の発現に必要なコード配列および/または制御配列を含む。遺伝子という用語は、特定のゲノム配列または組換え配列、並びにその配列にコードされるcDNAまたはmRNAに適用される。融合遺伝子は、トキシンペプチド類似体をコードするコード領域を含有する。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する非発現核酸セグメントを含む。転写因子等の調節タンパク質が結合し、それによって隣接または近傍配列の転写が起こる、転写制御因子を含む非発現調節配列。遺伝子の発現または核酸の発現とは、RNAへのDNAの転写所望によりRNAの修飾、例えば、スプライシングを含む、ポリペプチドへのRNAの翻訳それに続くポリペプチドの翻訳後修飾も含まれ得る、または文脈によって示される場合、転写および翻訳の両方を意味する。本明細書で使用される場合、コード領域またはコード配列という用語は、構造遺伝子との関連で使用される場合、mRNA分子の翻訳の結果として、新生ポリペプチド中に存在するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を表す。コード領域は、真核生物では、5’側は開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレットATGと境を接しており、3’側は終止コドンすなわち、TAA、TAG、TGAを指定する3つのトリプレットのうちの1つと境を接している。制御配列または制御シグナルという用語は、特定の宿主細胞において、連結しているコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド配列を表す。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み得る。真核生物の制御配列は、1つまたは複数の転写因子認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列または要素、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を含み得る。制御配列はリーダー配列および/または融合パートナー配列fusionpartnersequenceを含み得る。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関わる細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いDNA配列から成るManiatisetalScience2361237。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫および哺乳類細胞およびウイルスの遺伝子を含む、様々な真核生物源から単離されている類似の調節領域、すなわち、プロモーターは、原核生物にも存在する。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、目的のタンパク質を発現するために使用されるべき細胞型が何かに依存する。真核生物のプロモーターおよびエンハンサーのいくつかは幅広い宿主範囲を有するが、一方他の種類は、限られた一部の細胞型でのみ機能する概説として、VossetalTrendsBiochemSci11287andManiatisetalScience2361237を参照。ベクターという用語は、情報をコードするタンパク質を宿主細胞に導入するのに用いる、いかなる分子または独立体例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルスをも意味する。発現ベクターまたは発現コンストラクトという用語は、本明細書で使用される場合、所望のコード配列および、特定の宿主細胞中で機能的に連結したコード配列の発現に必要な適切な核酸制御配列を含有する組換えDNA分子を表す。発現ベクターは、転写、翻訳に影響または制御を及ぼし、イントロンが存在する場合、機能的に連結したコード領域のRNAスプライシングに影響を及ぼす配列を含むが、これらに限定はされない。原核生物での発現に必要な核酸配列は、プロモーター、所望によりオペレーター配列、リボソーム結合部位を含み、他の配列を含む可能性もある。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、並びに終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。所望により、分泌シグナルペプチド配列が、目的のコード配列に機能的に連結して、発現ベクターにコードされていてもよく、それによって、発現されたポリペプチドは、所望であれば、目的のポリペプチドの細胞からのより容易な単離のために、組換え宿主細胞によって分泌され得る。そのような技術は、当該技術分野において周知である。機能的な組み合せで、機能的な順序でおよび機能的に連結したという用語は、本明細書で使用される場合、所与の遺伝子の転写および/または所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が産生されるような、核酸配列の連結を表す。この用語は、機能的なタンパク質が産生されるような、アミノ酸配列の連結も表す。例えば、タンパク質コード配列に機能的に連結したベクター中の制御配列は、制御配列の転写活性に適合する条件下でタンパク質コード配列の発現が達成されるために、タンパク質コード配列に連結される。宿主細胞という用語は、核酸によって形質転換された、または形質転換可能であることで、目的の遺伝子を発現可能な細胞を意味する。この用語は、目的の遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫細胞も含み、該子孫細胞が元の親細胞に対し、形態において、または遺伝子構造において同一であるか否かは関係しない。多数の利用可能な、公知の宿主細胞のいずれも、本発明を実施する際に使用することができる。特定の宿主の選択は、当該技術分野で認められているいくつかの要素に依存する。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、DNA分子にコードされるペプチドの毒性、形質転換率、ペプチド回収の容易さ、発現特性、バイオセイフティおよび費用が含まれる。全ての宿主が特定のDNA配列の発現に対して等しく効果的であり得るわけではないことを理解して、これらの因子の釣り合いを決定しなければならない。これらの一般的な指針の中で、培養液中で有用な微生物宿主細胞には、細菌大腸菌種等、酵母サッカロマイセス種等および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類例えばヒト細胞、例えば、CHO細胞およびHEK-293細胞が含まれる。変更はDNAレベルでも同様になされ得る。ペプチドをコードするDNA配列は、選択された宿主細胞により適合するコドンに変化させてもよい。大腸菌Ecoliの場合、最適化されたコドンが当該技術分野において周知である。制限酵素認識部位を除去するために、または、選択された宿主細胞におけるDNAのプロセシングで役立ち得るサイレント制限酵素認識部位を含むために、コドンを置換することができる。次に、形質転換された宿主は培養および精製される。所望の化合物が発現されるために、宿主細胞を従来の発酵条件下で培養してもよい。そのような発酵条件は、当該技術分野において周知である。トランスフェクションという用語は、細胞による外来foreignorexogenousDNAの取り込みを意味し、外来性DNAが細胞膜の内側に導入されている場合、細胞はトランスフェクトされている。いくつかのトランスフェクション技術が当該技術分野において周知であり、本明細書で開示される。例えば、Grahametal1973Virology52456Sambrooketal2001MolecularCloningALaboratoryManualsupraDavisetal1986BasicMethodsinMolecularBiologyElsevierChuetal1981Gene13197を参照されたい。そのような技術を、一つまたは複数の外来性DNA部分を適切な宿主細胞に導入するのに使用することができる。形質転換という用語は、細胞の遺伝的特徴における変化を表し、細胞が新規のDNAまたはRNAを含有するように改変されている場合、細胞は形質転換されている。例えば、トランスフェクション、形質導入、または他の技術を介して新規の遺伝物質を導入することによって、その天然状態から遺伝子改変された場合に、細胞は形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入後、形質転換DNAは、細胞の染色体への物理的な組み込みによって細胞のDNAと再結合する場合もあり、エピソームエレメントとして、複製されることなく一時維持される場合もあり、プラスミドとして独立に複製する場合もある。形質転換DNAが細胞の分裂と共に複製される場合、細胞は安定に形質転換されたとみなされる。組成物の生理学的に許容される塩、例えば抗体等の免疫グロブリンの塩が意味するものは、薬剤的に許容できることが、知られているまたは、後に発見される、あらゆる塩である。薬剤的に許容できる塩のいくつかの非限定例は、酢酸塩;トリフルオロ酢酸塩;塩酸塩および臭化水素酸塩等のハロゲン酸塩;硫酸塩;クエン酸塩;マレイン酸塩;酒石酸塩;グリコール酸塩;グルコン酸塩;コハク酸塩;メシル酸塩;ベシル酸塩;ペンタガロイルグルコースPGGおよび没食子酸エピガロカテキンEGCG等の没食子酸エステルの塩没食子酸は、3,4,5トリヒドロキシ安息香酸としても知られている、コレステロール硫酸の塩、パモ酸塩、タンニン酸塩およびシュウ酸塩である。タンパク質のドメインまたは領域本明細書では同義的に用いられるは、タンパク質全体のあらゆる部分であり、最大では完全タンパク質をも含むが、典型的には、完全タンパク質に満たないものが含まれる。ドメインは、タンパク質鎖の残りとは独立して折り重なることも可能であるが、そうである必要はなく、および/または、特定の生物学的、生化学的、または構造的な機能または部位例えば、リガンド結合ドメイン、または細胞質ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞外ドメインと関連付けられ得る。処置または処置することとは、ある疾患の、発生を予防する、または病状を変化させるという意図を持って行われる、介入である。従って、処置とは、治療的な処置および予防的なprophylacticorpreventative措置の両方を表す。処置を必要としているものには、障害を既に抱えているもの、および障害が予防されるべきものが含まれる。処置は、寛解;軽快;症状の縮小、または該損傷、病状もしくは状態を患者がより許容できるものにすること;変性または衰弱速度の緩徐化;変性の終結点をより消耗性の低いものにすること;患者の身体的または精神的な健全性を向上させること等、あらゆる客観的または主観的パラメータを含む、損傷、病状または状態の改善における、いかなる成功の兆候をも含む。症状の処置または改善は、理学的検査、患者による自己報告、神経精神医学的検査、および/または精神医学的評価の結果を含む、客観的または主観的パラメータに依存し得る。有効量とは、一般的には、重症度および/もしくは症状の頻度を低減させ、症状および/もしくは根本原因を取り除き、症状および/もしくはその根本原因の発生を予防し、並びに/または片頭痛の結果生じる、もしくは片頭痛に付随する障害を改善もしくは修復するのに十分な量である。一部の実施形態では、有効量は治療有効量または予防有効量である。治療有効量とは、病状例えば、移植拒絶反応もしくはGVHD、炎症、多発性硬化症、がん、糖尿病、神経障害、疼痛または症状、具体的には、病態に伴う状態または症状を治療、または、病態もしくは、疾患に多少であっても関連している他のあらゆる望ましくない症状の進行を防ぐ、妨げる、遅延させるまたは逆行させるのに十分なすなわち治療効果を与える量である。予防有効量とは、対象に投与された場合に、意図された予防効果を有する、例えば、片頭痛もしくは多発性硬化症の発生または再発を予防もしくは遅延し、または片頭痛、片頭痛症、もしくは多発性硬化症の発生率または再発率を低減する、医薬組成物の量である。完全な治療または予防の効果は、必ずしも1回用量の投与によって発生するわけではなく、一連の用量の投与後にのみ発生する場合がある。従って、治療有効量または予防有効量は、一回または複数回の投与において投与され得る。処置を行うための哺乳類とは、哺乳動物に分類されるいかなる動物をも表し、例えば、ヒト、飼育動物および家畜、およびイヌ、ウマ、ネコ、雌ウシ、ラット、マウス、サル等の動物園の動物、競技用動物、または愛がん動物が挙げられる。哺乳動物はヒトであることが好ましい。天然のという用語は、ポリペプチド、核酸、宿主細胞等の生物由来物質に関連して本明細書の全体を通じて使用されるが、これは、天然に存在する物質を指す。抗体、または同義のAbという用語は、最も幅広い意味で使用され、該用語には、所望の生物活性を提示する限り、上記の相補性決定領域CDRを含む、完全構築抗体、モノクローナル抗体ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体を含む、ポリクローナル抗体、多特異的抗体例えば、二重特異性抗体、および抗原と結合可能な抗体フラグメント例えば、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、一本鎖抗体、二重特異性抗体diabodyが含まれる。化学的に誘導体化された抗体を含む、インタクトな分子および/またはフラグメントの多量体または凝集体が企図される。IgG、IgM、IgD、IgA、およびIgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2、またはあらゆるアロタイプを含む、あらゆるアイソタイプクラスまたはサブクラスの抗体が企図される。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し;例えば、IgG1およびIgG3アイソタイプは抗体依存性細胞傷害ADCC活性を有する。抗原結合性タンパク質ABPという用語は、目的の標的抗原と特異的に結合するような所望の抗原-結合特性を有するCDR由来の配列を含有する、上記で定義されるような抗体または抗体フラグメント、および組換えペプチドまたは他の化合物を含む。一般的に、抗原結合性タンパク質、例えば、抗体または抗体フラグメントは、その抗原に対して、同様の結合アッセイ条件下の他の無関係のタンパク質に対するその親和性と比較して、有意により高い結合親和性を有し、それによりその抗原を識別することができる場合に、目的の抗原例えば、IL-17RまたはTR2に特異的に結合する。通常、抗原結合性タンパク質は、解離定数KDが10-8M以下である場合に、その標的抗原と特異的に結合すると言われる。抗体は、KDが≦5×10-9M以下である場合は高い親和性で、KDが5×10-10M以下である場合は非常に高い親和性で、抗原と特異的に結合する。一実施形態では、抗体は、約10-8M~10-10MのKDで、目的の抗原に結合し、さらに別の実施形態では、抗体は5×10-9以下のKDで結合する。抗原結合領域または抗原結合部位とは、特定の抗原、例えば、IL-17RまたはTR2と特異的に結合する、タンパク質の一部分を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性および親和性を抗原結合性タンパク質に与えるアミノ酸残基を含有する抗原結合性タンパク質のその部分は、抗原結合領域と称される。抗原結合領域は通常、一つまたは複数の相補性決定領域complementarybindingregionCDRを含む。ある抗原結合領域はまた、一つまたは複数のフレームワーク領域FRを含む。CDRは、抗原結合特異性および親和性に寄与するアミノ酸配列である。フレームワーク領域は、CDRの適切な高次構造の維持を助けることで、抗原結合領域と抗原の間の結合を促進することができる。従来の抗体においては、CDRは重鎖および軽鎖の可変領域のフレームワーク内に埋め込まれており、そこでCDRは抗原結合および抗原認識に関与する領域を構成する。免疫グロブリン抗原結合性タンパク質の可変領域は、フレームワーク領域内に所定のフレームワーク領域1~4、FR1、FR2、FR3、およびFR4、Kabatetal1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterestPublicHealthServiceNIHBethesdaMD;またChothiaandLesk1987JMolBiol196901917も参照、少なくとも3つの重鎖CDRまたは軽鎖CDRを含む上記参照上記Kabatetal1991;また上記ChothiaandLesk1987;Chothiaetal1989Nature342877883も参照。単離された免疫グロブリン、例えば、抗体または抗体フラグメントは、特定され、その天然環境の、または、産生細胞によってそれが分泌された培地の、一つまたは複数の成分から分離されたものである。その天然環境または培地の混入成分は、抗体の診断用途または治療用途を妨げるであろう物質であり、例えば、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を挙げることができる。いくつかの実施形態では、抗体は、所望により染色、例えば、クーマシーブルーまたは銀染色を用いて、還元または非還元条件下、SDS-PAGEによって、1抗体含有量95重量超、最も好ましくは99重量超まで、または2均一となるまで、精製される。単離された天然抗体は、抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないために、組換え細胞内の原位置の抗体を含む。しかし、通常は、単離された抗体は少なくとも1回の精製工程で製造される。モノクローナル抗体という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、少量存在し得る自然に生じる可能性がある変異以外は同一である集団を含む個々の抗体を表す。抗原結合性タンパク質であるモノクローナル抗体は、異なるエピトープを対象とする異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、個々の抗原部位またはエピトープを対象としている、非常に特異的な結合剤である。モノクローナル抗体の非限定的な例としては、マウス抗体、ウサギ抗体、ラット抗体、ニワトリ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体、完全構築抗体、多特異的抗体二重特異性抗体を含む、抗原と結合できる抗体フラグメントFab、Fab’、Fab’2、Fv、一本鎖抗体、ヘミボディを含む、マキシボディmaxibody、ナノボディnanobody、および所望の生物活性を提示する限り上記のCDRを含む組換えペプチド、またはその変異体または誘導体が挙げられる。モノクローナルという修飾語句は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特性を表し、何らかの特定の方法による抗体産生を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、KohleretalNature2564951975に最初の記載があるハイブリドーマ法で製造することができ、あるいは、組換えDNA法で製造することもできる例えば、米国特許第4,816,567号を参照。モノクローナル抗体は、例えばClacksonetalNature3526246281991andMarksetalJMolBiol222581597に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリからも単離することができる。多特異的な結合剤または抗原結合性タンパク質もしくは抗体は、2つ以上の抗原またはエピトープを標的とするものである。二重特異性bispecificdualspecific、または二機能性の結合剤または抗原結合性タンパク質または抗体とは、2つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッドである。二重抗原結合性タンパク質、抗原結合性タンパク質および抗体は、複数抗原結合性タンパク質、抗原結合性タンパク質または多特異的な抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合またはFab’フラグメントの連結を含むがこれらに限定されない種々の方法で製造することができる。例えば、SongsivilaiandLachmann1990ClinExpImmunol79315321Kostelnyetal1992JImmunol14815471553を参照されたい。二重特異的抗原結合性タンパク質または抗体の2つの結合部位は、同一または異なるタンパク質標的に存在し得る2つの異なるエピトープに結合する。免疫グロブリンという用語は、それぞれ軽鎖LCに共有結合的に連結される2つの二量化した重鎖HCを含む完全抗体;単独の二量化していない免疫グロブリン重鎖および共有結合的に連結された軽鎖HCLC、またはキメラ免疫グロブリン軽鎖重鎖-Fcのヘテロ三量体いわゆるヘミボディを包含する。免疫グロブリンは、タンパク質ではあるが、必ずしも抗原結合性タンパク質であるわけではない。抗体においては、それぞれの四量体は、各対が約220個のアミノ酸約25kDaから成る1つの軽鎖および約440個のアミノ酸約50~70kDaから成る1つの重鎖を有する、2つの同一のポリペプチド鎖対から成る。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識に主に関わる約100~110以上のアミノ酸から成る可変V領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を規定する。可変領域は異なる抗体間で異なる。定常領域は異なる抗体間で同一である。抗原結合性タンパク質である抗体の場合、各重鎖または軽鎖の可変領域内には、抗体の抗原に対する特異性の決定を助ける3つの超可変性小領域が存在する。しかし、本発明の範囲内で、免疫グロブリン、例えば抗体の実施形態は、抗原結合性タンパク質である必要も、抗原に特異的に結合することが既知である必要もない。超可変領域間の可変領域残基は、フレームワーク残基と称されており、通常、異なる抗体の間で多少類似している。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。ヒト軽鎖は、カッパκおよびラムダλ軽鎖として分類される。軽鎖および重鎖内では、可変領域および定常領域は、約12個以上のアミノ酸から成るJ領域で連結されており、また、重鎖は約10個のさらなるアミノ酸からなるD領域も含んでいる。FundamentalImmunologyCh7を参照されたい。本発明の範囲内では、抗体は、組換えによって生成された抗体、およびグリコシル化された、またはグリコシル化を欠いた抗体も包含する。軽鎖または免疫グロブリン軽鎖という用語は、結合特異性を与えるのに十分な可変領域配列を有する完全長の軽鎖およびそのフラグメントを含む。完全長の軽鎖は、可変領域ドメインであるVL、および定常領域ドメインであるCLを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する。軽鎖には、κ鎖およびλ鎖が含まれる。重鎖または免疫グロブリン重鎖という用語は、完全長の重鎖、および結合特異性を与えるのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを含む。完全長の重鎖は、可変領域ドメインであるVH、および3つの定常領域ドメインであるCH1、CH2、およびCH3を含む。VHドメインはポリペプチドのアミノ末端に存在し、CHドメインはカルボキシル末端に存在し、そこではCH3がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近く位置している。重鎖は、ミューμ、デルタΔ、ガンマγ、アルファα、およびイプシロンεとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれIgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEと定義する。本発明の別々の実施形態において、重鎖は、IgG例えばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4サブタイプ、IgA例えばIgA1およびIgA2サブタイプ、IgMおよびIgEを含む、いかなるアイソタイプであってもよい。これらのうちのいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2等にさらに分類することができる。異なるIgGアイソタイプは、抗体依存性細胞傷害ADCCおよび補体依存性細胞傷害CDC等の、異なるエフェクター機能Fc領域を介するを有する場合がある。ADCCでは、抗体のFc領域は、ナチュラルキラーおよびマクロファージ等の免疫エフェクター細胞の表面に存在するFc受容体FcγRに結合し、それによってファゴサイトーシスまたは標的細胞の溶解を引き起こす。CDCでは、抗体は、細胞表面で補体カスケードを始動させることによって、標的細胞を死滅させる。Fc領域、または本明細書で同義的に用いられる、Fcドメインもしくは免疫グロブリンFcドメインは、2つの重鎖フラグメントを含有し、それらは完全抗体において、抗体のCH1ドメインおよびCH2ドメインを含む。2つの重鎖フラグメントは、2つ以上のジスルフィド結合およびCH3ドメインの疎水性相互作用によって、結合している。サルベージ受容体結合エピトープsalvagereceptorbindingepitopeという用語は、IgG分子のinvivoでの血清半減期の増加に関わるIgG分子例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域のエピトープを表す。アロタイプは、免疫原となり得、ヒトの特定の対立遺伝子によってコードされる、抗体の配列における、しばしば定常領域における変動である。アロタイプは、ヒトIGHC遺伝子である、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHA2およびIGHE遺伝子の5つに対して確認されており、それぞれは、G1m、G2m、G3m、A2m、およびEmアロタイプと称される。少なくとも18種のGmアロタイプ:nG1m1、nG1m2、G1m1、2、3、17もしくはG1ma、x、f、z、G2m23もしくはG2mn、G3m5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28もしくはG3mb1、c3、b5、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5が知られている。2種のA2mアロタイプ、A2m1およびA2m2が存在する。抗体の構造および発生の詳細な記述については、RothDBandCraigNLCell94411414参照によってその全体が本明細書に組み込まれるを参照されたい。簡潔に説明すると、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするDNAを生成するプロセスは、発生途中のB細胞で主に起こる。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの再編成および連結の前は、V、D、Jおよび定常C遺伝子セグメントは通常、単一の染色体上で比較的かなり近位に存在している。B細胞分化の間、V、D、Jまたは、軽鎖遺伝子の場合はVおよびJのみ遺伝子セグメントのそれぞれの適切なファミリーメンバーのうちの1つが、組み換えられて、機能的に再編成された重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子の可変領域を形成する。この遺伝子セグメントの再編成プロセスは順次的であるように思われる。最初に、重鎖D-J連結がつくられ、続いて重鎖V―DJ連結および軽鎖V―J連結がつくられる。V、DおよびJセグメントの再編成に加えて、軽鎖のVおよびJセグメントが連結し、且つ重鎖のDおよびJセグメントが連結する部位での、可変部の組換えによって、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の初期レパートリーにさらなる多様性が生み出される。そのような軽鎖における変動は、通常、V遺伝子セグメントの最後のコドンおよびJセグメントの最初のコドンの中で生じる。連結の際の同様の不明確性がDセグメントとJHセグメントの間の重鎖染色体上で生じ、10ヌクレオチドにもわたる場合がある。さらに、ゲノムDNAにはコードされていない、いくつかのヌクレオチドが、DとJH遺伝子セグメントの間、およびVHとD遺伝子セグメントの間に挿入され得る。これらのヌクレオチドの追加は、N領域の多様性として知られている。そのような可変領域遺伝子セグメントにおける再編成、およびそのような連結の間に生じ得る可変組換えの正味の影響は、一次抗体レパートリーの生成である。超可変領域という用語は、抗原結合性に関わる抗体のアミノ酸残基を表す。超可変領域は、相補性決定領域またはCDR由来のアミノ酸残基を含む[すなわち、KabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterest5thEdPublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthBethesdaMdに記載される、軽鎖可変領域の残基24~34L1、50~56L2および89~97L3、並びに重鎖可変領域の31~35H1、50~65H2および95~102H3]。全てのCDRを含有する全体の抗原結合部位よりも親和性は低くなるが、単独のCDRであっても、抗原を認識し、結合することができる。超可変性ループ由来の残基の別の定義は、ChothiaetalJMolBiol196901917に、軽鎖可変領域における残基26~32L1、50~52L2および91~96L3、並びに重鎖可変領域における26~32H1、53~55H2および96~101H3であると記載されている。フレームワークまたはFR残基とは、超可変領域残基以外の可変領域残基である。抗体フラグメントは、インタクトな完全長抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab’、Fab’2、およびFvフラグメント;ダイアボディ;線状抗体ZapataetalProteinEng810571062;一本鎖抗体分子;並びに抗体フラグメントから形成される多特異的抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化によって、Fabフラグメントと称される2つの同一の抗原結合性フラグメントが生成され、それぞれは単一の抗原結合部位、および定常領域を含有する残留Fcフラグメントを有する。Fabフラグメントは、全可変領域、並びに軽鎖の定常領域および重鎖の第一の定常領域CH1を含有する。Fcフラグメントは炭水化物を提示しており、あるクラスの抗体を別のクラスの抗体と区別する多くの抗体エフェクター機能結合性補体bindingcomplementおよび細胞受容体等に関わる。ペプシン処置によって、抗体のVHドメインおよびVLドメインを含有し、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖に存在する、2つの一本鎖FvすなわちscFv抗体フラグメントを有するFab’2フラグメントが生じる。Fabフラグメントは、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端における、抗体ヒンジ領域由来の一つまたは複数のシステインを含む少数の追加残基の含有によって、Fab’フラグメントと異なる。Fvポリペプチドは、Fvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするVHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含むことが好ましい。scFvの概説としては、PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodiesvoll13RosenburgandMooreedsSpringerVerlagNewYorkpp269315を参照されたい。Fabフラグメントは、1本の軽鎖、並びに1本の重鎖のCH1および可変領域から成る。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Fab’フラグメントは、鎖間ジスルフィド結合が2つのFab’フラグメントの2本の重鎖の間に形成されて、Fab’2分子を形成することができるように、1本の軽鎖および1本の重鎖のVHドメインおよびCH1ドメイン、さらにCH1ドメインとCH2ドメインの間の領域を含む部分を含有する。Fab’2フラグメントは、2本の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、2本の軽鎖、並びにCH1とCH2ドメインの間の定常領域の一部分を含む2本の重鎖を含有する。従って、Fab’2フラグメントは、2本の重鎖間のジスルフィド結合で結合している2つのFab’フラグメントから成る。Fvは、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。この領域は、堅固な非共有結合で会合した状態の、1つの重鎖可変領域および1つの軽鎖可変領域の二量体から成る。各可変領域の3つのCDRが相互作用することで、VHとVLの二量体の表面上に抗原結合部位が示されるのは、この立体配置においてである。単一の可変領域またはある抗原に特異的な3つのCDRのみから成るFvの半分は、全体の結合部位よりも低い親和性でだが、抗原を認識し、結合する能力を有する。一本鎖抗体とは、Fv分子であって、それにおいて、重鎖および軽鎖の可変領域は可動性リンカーによって連結され、一本のポリペプチド鎖を形成し、そしてそれが抗原結合性領域を形成している。一本鎖抗体については、国際公開第88/01649号および米国特許第4,946,778号および第5,260,203号で詳細に論じられており、その開示の全体が参照によって組み込まれる。一本鎖FvすなわちscFv抗体フラグメントは、抗体のVHドメインおよびVLドメインを含有し、そこではこれらのドメインは一本のポリペプチド鎖の状態で存在し、所望によりVHドメインおよびVLドメインの間に、Fvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを含んでいるBirdetalScience2424234261988andHustonetalProcNatlAcadSciUSA85587958831988。Fdフラグメントは、VHおよびCH1ドメインから成る。二重特異性抗体という用語は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを表し、そのフラグメントは同一のポリペプチド鎖VHVLに、軽鎖可変領域VLに連結された重鎖可変領域VHを含む。同一鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするには短過ぎるリンカーを用いることで、ドメインは別の鎖の相補性ドメインとの対合を余儀なくされ、2つの抗原結合部位が生じる。二重特異性抗体については、例えば、EP404097国際公開第93/11161号andHollingeretalProcNatlAcadSciUSA9064446448に、より十分な記載がある。ドメイン抗体domainantibodyは、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。場合によっては、2つ以上のVH領域がペプチドリンカーで共有結合的に連結されて、二価ドメイン抗体を生成する。二価ドメイン抗体の2つのVH領域は、同じ抗原または異なる抗原を標的とし得る。競合するという用語は、同一のエピトープに対し競合する抗原結合性タンパク質例えば、中和抗原結合性タンパク質または中和抗体との関連で用いられる場合、抗原結合性タンパク質間の競合がアッセイによって決定され、該アッセイにおいて、試験用の抗原結合性タンパク質例えば、抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメントが、参照の抗原結合性タンパク質例えば、リガンド、または参照抗体の、共通の抗原例えば、IL-17Rもしくはそのフラグメント、またはTR2もしくはそのフラグメントへの特異的結合を阻止または阻害することを意味する。多くの種類の競合的結合アッセイが使用可能であり、例えば:固相直接または間接ラジオイムノアッセイRIA、固相直接または間接酵素免疫測定法EIA、サンドイッチ競合アッセイ例えば、Stahlietal1983MethodsinEnzymology9242253を参照;固相直接ビオチン-アビジンEIA例えば、Kirklandetal1986JImmunol13736143619を参照固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ例えば、HarlowandLane1988AntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarborPressを参照;I-125標識を用いる固相直接標識RIA例えば、Moreletal1988MolecImmunol25715を参照;固相直接ビオチン-アビジンEIA例えば、Cheungetal1990Virology176546552を参照;直接標識RIAMoldenhaueretal1990ScandJImmunol327782;および表面プラズモン共鳴BIAcore商標登録;例えば、FischeretalApeptideimmunoglobulinconjugate、国際公開第2007/045463A1号、実施例10、これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、またはKinExA等が挙げられる。通常、そのようなアッセイは、固体表面に結合した精製された抗原またはこれらのいずれかを担持する細胞、未標識の試験免疫グロブリンまたは抗原結合性タンパク質、および標識された参照抗原結合性タンパク質使用が含まれる。競合的阻害は、試験抗原結合性タンパク質の存在下で固体表面または細胞に結合した標識量を決定することにより測定される。通常、試験免疫グロブリンまたは抗原結合性タンパク質は過剰量で存在する。競合アッセイによって特定された抗原結合タンパク質競合的抗原結合性タンパク質は、参照抗原結合性タンパク質と同一のエピトープに結合する抗原結合性タンパク質、および参照抗原結合性タンパク質が結合したエピトープに、立体障害が生じる程近位に存在する、隣接エピトープに結合する抗原結合性タンパク質を含む。競合的結合を測定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例にて提供される。通常、競合性抗原結合性タンパク質が過剰量で存在する場合、参照抗原結合性タンパク質の、共通の抗原への特異的結合が、少なくとも40、45、50、55、60、65、70または75阻害される。場合によっては、結合は、少なくとも80、85、90、95、または97またはそれ以上、阻害される。免疫グロブリン例えば、抗体または抗体フラグメントが抗原と有意には結合しない場合、それは、過剰量の特定の免疫グロブリンが、参照抗原結合性タンパク質と、例えば、正の対照抗体と競合せずに、標的抗原へのその結合を、39超、または30超、または20超、または10超だけ阻害することがないことを意味する。可溶性ヒトIL-17Rへの特異的結合について、正の対照抗体は、本明細書に記載の抗体16429である。可溶性ヒトTR2への特異的結合について、正の対照抗体は、本明細書に記載の抗体16449である。抗体抗原相互作用は、M-1s-1単位の会合速度定数ka、またはs-1単位の解離速度定数kd、あるいはM単位の解離平衡定数KDによって特徴付けることができる。会合速度定数、解離速度定数、または解離平衡定数は、表面プラズモン共鳴BIAcore商標登録;例えば、FischeretalApeptideimmunoglobulinconjugate、国際公開第2007/045463A1号、実施例10、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、または製造業者によって概説される一般的な手順もしくは当該技術分野において周知の他の方法を用いるKinExA等の動態解析技術を用いて容易に決定することができる。BIAcore商標登録またはKinExAで得られた速度論データは、製造業者により記述された方法によって分析することができる。試験免疫グロブリンが有意に結合しないかどうかを決定することに関して表面プラズモン共鳴結合アッセイで測定されるとは、表面プラズモン共鳴に基づく免疫グロブリンの結合活性を評価するために、本明細書に記載の溶解平衡結合アッセイで測定されることを意味する。参照抗原結合性タンパク質例えば、ヒトIL-17Rに対する抗体16429またはヒトTR2に対する抗体16449は、製造業者の取扱説明書BIACoreInc、ニュージャージー州ピスカタウェイに従って、BIACore商標登録2000、研究用グレードセンサーチップCM5表面に固定化される。センサーチップ表面のカルボキシル基は、0.2MN-エチル-N’-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDCおよび0.05MN-ヒドロキシスクシンイミドNHSを含有する60μLの混合物を注入することで活性化される。参照抗原結合性タンパク質は、pH4.0の10mM酢酸ナトリウム中に希釈され、活性化されたチップ表面全体に30μL/分で6分間注がれる。表面上の過剰な反応性基は、60μLの1Mエタノールアミンを注ぐことで不活性化される。最終的な固定化レベルは通常、およそ6600共鳴単位resonanceunitRUである。可溶性抗原結合性タンパク質例えば、抗体の非存在下の可溶性標的抗原例えば、10nMの可溶性ヒトIL-17Rまたは30nMの可溶性ヒトTR2は、固定された参照抗原結合性タンパク質例えば、正の対照抗体に対する100の結合シグナルを確立するために用いられる。試験免疫グロブリンのインキュベーション後における標的抗原の結合シグナルの減少は、溶液中の標的抗原に対するその結合レベルを示す。抗原という用語は、抗原結合性タンパク質例えば、抗体またはその免疫学的に機能するフラグメントを含む等の選択的結合剤と結合でき、そしてさらに、抗体を動物に使用して、その抗原に結合できる抗体を生産可能な分子または分子の一部分を表す。抗原は、異なる抗原結合性タンパク質、例えば抗体と相互作用可能な一つまたは複数のエピトープを有し得る。エピトープという用語は、抗原結合性タンパク質例えば、抗体が結合する分子の部分である。この用語は、抗体等の抗原結合性タンパク質またはT細胞受容体に特異的に結合可能な、いかなる決定基をも含む。エピトープは、隣接していても隣接していなくてもよい例えば、一本鎖ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列中で互いに隣接していないが、その分子上で、抗原結合性タンパク質が結合するアミノ酸残基。ある実施形態では、エピトープは、それらが抗原結合性タンパク質を生成するのに用いられるエピトープと類似した三次元構造を含むが、抗原結合性タンパク質を生成するのに用いられるそのエピトープ中に存在するアミノ酸残基を全くまたはほとんど含まないという点で、模倣剤になり得る。エピトープはほとんどの場合タンパク質に存在するが、いくつかの例では、核酸等の他の種類の分子に存在する場合もある。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基等の、分子の化学活性を有する表面基群surfacegroupingを含む場合があり、特定の三次元構造特性、および/または特定の電荷特性を有する場合がある。通常、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および/または高分子の混合物中で、標的抗原上のエピトープを選択的に認識する。同一性という用語は、配列を整列および比較することで決定される、2つ以上のポリペプチド分子または2つ以上の核酸分子から成る配列間の関係を表す。相同性パーセントとは、比較された分子におけるアミノ酸間またはヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較されている分子の中で最も小さな分子のサイズに基づいて計算される。これらの計算のためには、整列におけるギャップを仮にあれば、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラムすなわち、アルゴリズムによって対処しなければならない。整列された核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法としては、ComputationalMolecularBiology1988NewYorkOxfordUniversityPressBiocomputingInformaticsandGenomeProjects1993NewYorkAcademicPressComputerAnalysisofSequenceDataPartI1994NewJerseyHumanaPressvonHeinjeG1987SequenceAnalysisinMolecularBiologyNewYorkAcademicPressSequenceAnalysisPrimer1991NewYorkMStocktonPressandCarilloetal1988SIAMJAppliedMath481073に記載される方法が挙げられる。例えば、配列同一性は、2つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似性を比較するために一般的に使用される、標準的な方法で決定することができる。BLASTまたはFASTA等のコンピュータプログラムを用いて、2つのポリペプチドまたは2つのポリヌクレオチド配列が、一方もしくは両方の配列の全長に沿って、または一方もしくは両方の配列の所定の部分に沿ってそれらの各残基が最適にマッチングするように、整列される。それらのプログラムは、初期設定の開始ペナルティおよび初期設定のギャップペナルティを提供し、PAM250標準的なスコアリングマトリックスscoringmatrixDayhoffetalAtlasofProteinSequenceandStructurevol5supp3を参照等のスコアリングマトリックスを、それらのコンピュータプログラムと組み合わせて使用することができる。例えば、相同性は、そこで次のように計算できる。完全一致の総数に100を乗じ、次に、一致した範囲内の長い方の配列の長さと、2つの配列を整列させるために長い方の方の配列に導入されたギャップの数の合計で除算される。相同性パーセントを計算する際、比較される配列は、配列間に最大の一致を与えるように整列される。GCGプログラムパッケージは、相同性パーセントの決定に使用することができるコンピュータプログラムであり、このパッケージはGAPを含むDevereuxetal1984NuclAcidRes12387GeneticsComputerGroup、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン。コンピューターアルゴリズムGAPは、配列相同性パーセントが決定されるべき2つのポリペプチドまたは2つのポリヌクレオチドを整列するのに使用される。配列は、それらの各アミノ酸またはヌクレオチドが最適マッチングするように、整列されるアルゴリズムによって決定される一致範囲。ギャップ開始ペナルティ3×平均対角averagediagonalとして算出され、ここで平均対角は、使用されている比較マトリックスの対角の平均である;対角diagonalは、特定の比較マトリックスによって各々の完全アミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数値であるおよびギャップ伸長ペナルティー通常、0.1×ギャップ開始ペナルティーである、ならびにPAM250またはBLOSUM62などの比較マトリックスが、前記アルゴリズムと組み合わせて用いられる。ある実施形態では、標準的な比較マトリックスPAM250比較マトリックスについてはDayhoffetal1978AtlasofProteinSequenceandStructure5345352BLOSUM62比較マトリックスについては、Henikoffetal1992ProcNatlAcadSciUSA891091510919を参照がまた、このアルゴリズムによって用いられる。GAPプログラムを用いてポリペプチドまたはヌクレオチド配列の相同性パーセントを決定するための推奨パラメータには、以下が含まれる。アルゴリズム:Needlemanetal1970JMolBiol48443453;比較マトリックス:上記Henikoffetal1992からのBLOSUM62;ギャップペナルティ:12ただし末端ギャップにはペナルティ無しギャップ長ペナルティ:4類似性の閾値:02つのアミノ酸配列を整列するためのある整列スキームによって、2つの配列の短い領域だけの一致を得られる場合があり、2つの完全長配列の間に有意な関連性がないにしても、この短いアライメントされた領域は、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、選択されたアラインメント法GAPプログラムは、標的ポリペプチドの少なくとも50の隣接アミノ酸に渡るアラインメントが得られるように、所望であれば、調整することができる。修飾という用語は、本発明の、抗体および抗体フラグメントを含む免疫グロブリンとの関連で使用される場合、一つまたは複数のアミノ酸変化置換、挿入または欠失を含む;化学修飾;治療薬または診断用薬への結合による共有結合修飾;標識例えば、放射性核種または種々の酵素による;PEG化等の共有結合性ポリマー結合ポリエチレングリコールによる誘導体化および化学合成による非天然アミノ酸の挿入または置換を含むが、これらに限定はされない。本発明の修飾免疫グロブリンは、本発明の無修飾の分子の結合または非結合特性を保持する。誘導体という用語は、本発明の免疫グロブリン抗体および抗体フラグメントを含むとの関連で使用される場合、治療薬または診断用薬への結合、標識例えば、放射性核種または種々の酵素による、PEG化等の共有結合性ポリマー結合ポリエチレングリコールによる誘導体化および化学合成による非天然アミノ酸の挿入または置換によって共有結合的に修飾された免疫グロブリンを表す。本発明の誘導体は、本発明の誘導体化されていない分子の結合特性を保持する。免疫グロブリンの実施形態完全長の免疫グロブリン軽鎖および重鎖では、可変領域および定常領域は約12個またはそれ以上のアミノ酸から成るJ領域によって連結されており、重鎖には約10個またはそれ以上のアミノ酸から成るD領域も含まれる。例えば、FundamentalImmunology2ndedCh71989NewYorkRavenPressあらゆる目的で、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるを参照。各軽鎖/重鎖対の可変領域は、通常は抗原結合部位を形成する。ヒトIgG2重鎖HC定常領域の一例は、以下のアミノ酸配列を有する:ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//配列番号86。IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4免疫グロブリンアイソタイプを所望であれば有する本発明の免疫グロブリンの組換え体を作成するための、他のIgGアイソタイプの定常領域配列が、当該技術分野において周知である。一般的に、ヒトIgG2はエフェクター機能が所望されない標的に用いることができ、ヒトIgG1は、そのようなエフェクター機能例えば、抗体依存性細胞傷害ADCCが所望される状況で用いることができる。ヒトIgG3は比較的短い半減期を有し、ヒトIgG4は抗体半分子halfmoleculeを形成する。ヒトIgG1は、4種のアロタイプが知られている。好ましいアロタイプはhIgG1zと称され、KEEMアロタイプとしても知られている。ヒトIgG1アロタイプhIgG1zaKDEL、hIgG1fREEM、およびhIgG1faも有用であり;その全てがADCCエフェクター機能を有すると思われる。ヒトhIgG1z重鎖HC定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する:ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//配列番号87。ヒトhIgG1za重鎖HC定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する:ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//配列番号88。ヒトhIgG1f重鎖HC定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する:ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK配列番号127。ヒトhIgG1fa重鎖HC定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する:ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK配列番号90。ヒト免疫グロブリン軽鎖LC定常領域の配列の一例は、以下のものであるCL-1と命名:GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS配列番号91。CL-1は抗体のpIを増加させるのに有用であり、好都合である。CL-2、CL-3およびCL-7と命名された、3種のヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域が他に存在し、それらも本発明の範囲内で使用することができる。CL-2およびCL-3は、ヒト個体群により多くみられる。CL-2ヒト軽鎖LC定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する:Gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs//配列番号92。CL-3ヒトLC定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する:gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshksyscqvthegstvektvaptecs//配列番号93。CL-7ヒトLC定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する:Gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclvsdfypgavtvawkadgspvkvgvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscrvthegstvektvapaecs//配列番号94。ヒトLCκ定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する:RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC//配列番号129。免疫グロブリン鎖の可変領域は、通常、同じ全体構造を示し、3つの超可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域FRを含み、これらの超可変領域は、相補性決定領域またはCDRと称されることがより多い。上述の各重鎖/軽鎖対の2本の鎖のCDRは、通常、フレームワーク領域によって整列されて、標的例えば、ヒトIL-17RまたはヒトTR2の特定のエピトープまたはドメインと特異的に結合する構造を形成するが、本発明の範囲内において、元のCDR配列は、ヒトIL-17RまたはTR2標的に有意に結合しないように、意図的に修飾されている。N末端からC末端まで、天然の軽鎖および重鎖可変領域は両方、典型的には、以下のエレメントの順序に従う:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4。これらの各ドメインの位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるために、付番方式が考案された。この付番方式は、KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest1987年および1991年、NIH、メリーランド州ベセスダ、またはChothiaLesk1987JMolBiol196901917Chothiaetal1989Nature342878883で規定されている。提供される抗体のいくつかの完全長軽鎖および重鎖並びにそれらの対応するアミノ酸配列の具体例が、以下の表1Aおよび表1Bで要約されている。表1Aは例示的な軽鎖配列を示す。表1Bは例示的な重鎖配列を示し、そのいくつかは定常領域ヒトIgG2配列番号86を含み、そのいくつかは定常領域ヒトIgG1f配列番号127を含む。しかし、本発明に包含されるのは、表1Aおよび/または表1B例えばIgG4対IgG2、CL2対CL1に列挙されるもののうち、定常領域またはフレームワーク領域に配列変化がある免疫グロブリンである。また、表1Aおよび表1B中の全配列のシグナルペプチドSP配列には、例えば、以下が含まれる:VK1SPシグナルペプチドMDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC配列番号103、MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG配列番号104、MEWTWRVLFLVAAATGAHS配列番号105、METPAQLLFLLLLWLPDTTG配列番号106、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS配列番号107、しかし、他のいかなる好適なシグナルペプチド配列も、本発明の範囲内で使用することができる。有用なシグナルペプチド配列の別の例は、VH21SPMEWSWVFLFFLSVTTGVHS配列番号95である。他の例示的なシグナルペプチド配列は、表1A~Bに示される。抗体または抗体フラグメントを含む、単離された免疫グロブリンのいくつかの有用な実施形態は、以下を含む:a配列番号113のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号110のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;またはb配列番号125のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号122のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;またはc配列番号101のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号98のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;またはd配列番号119のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号116のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖。いくつかの場合、そのような抗体は少なくとも1つの重鎖および1つの軽鎖を含むが、他の場合では、変異型は2つの同一の軽鎖および2つの同一の重鎖を含有する。重鎖および/または軽鎖が、例えば、翻訳後修飾によって、表1Aおよび表1Bに記載された重鎖および軽鎖のうちのいずれか1つに対して、N末端またはC末端またはその両方から、1,2,3,4または5個のアミノ酸残基が欠失されていてもよいことは、本発明の範囲内である。例えば、CHO細胞は通常、C末端のリジンを切断除去cleaveoffする。本明細書に記載されるような、薬理活性を有するポリペプチド等の一つまたは複数の薬理活性を有する化学的部分との結合を含む特定の実施形態は、図1F~1N表2Dも参照に模式的に示されるような、一価のヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ四量体等のヘテロ多量体を含み得る。免疫グロブリン、例えば、抗体の可変ドメイン本明細書で提供される種々の重鎖および軽鎖可変領域は、表2A~Bに示される。これらの可変領域はそれぞれ、上記重鎖および軽鎖定常領域に結合して、それぞれ完全な抗体重鎖および抗体軽鎖を形成することができる。さらに、そのように生成された重鎖および軽鎖配列のそれぞれは、組み合わされて、完全な抗体構造を形成する。本明細書で提供される重鎖および軽鎖可変領域が、上記の例示的な配列と異なる配列を有する他の定常領域にも結合できることは理解されるべきである。下記の表2Aに示されるような、VL2、VL3、VL4、およびVL5から選択される少なくとも1つの免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに下記の表2Bに示されるような、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、およびVH11から選択される少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖可変領域を含有する、もしくは含む、抗体または抗体フラグメントを含む免疫グロブリン、並びにこれらの軽鎖および重鎖可変領域の免疫学的に機能的なフラグメント、誘導体、変異タンパク質および変異体も提供される。そのような実施形態の例は、下記の表2Cおよび表2Dに記載される。下記の表2Aに示されるような、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15およびVL16から選択される少なくとも1つの免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに下記の表2Bに示されるような、VH13、VH14、VH15、VH16、VH17、VH18、VH19、VH20、VH21、VH22、VH23、VH24、VH25、VH26、VH27、VH28、VH29、VH30、VH31、VH32、VH33、VH34、VH35およびVH36から選択される少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖可変領域を含有する、もしくは含む、抗体または抗体フラグメントを含む免疫グロブリン、並びにこれらの軽鎖および重鎖可変領域の免疫学的に機能的なフラグメント、誘導体、変異タンパク質および変異体も提供される。そのような実施形態の例は、下記の表2Cおよび表2Dに記載される。本発明の免疫グロブリンの実施形態例としては、以下のようなものが挙げられる:該重鎖可変領域が配列番号323[VH10]のアミノ酸配列を含み;該軽鎖可変領域が配列番号188[VL4]のアミノ酸配列を含む;または該軽鎖可変領域が配列番号196[VL8]のアミノ酸配列を含み;該重鎖可変領域が配列番号353[VH25]のアミノ酸配列を含む;または該軽鎖可変領域が配列番号202[VL11]のアミノ酸配列を含み;該重鎖可変領域が配列番号349[VH23]のアミノ酸配列を含む;または該重鎖可変領域が配列番号325[VH11]のアミノ酸配列を含み;該軽鎖可変領域が配列番号190[VL5]のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン。このタイプの免疫グロブリンは、一般的に式VHx/VLyによって命名することができ、式中、xは免疫グロブリンに含まれる重鎖可変領域の数に該当し、yは免疫グロブリンに含まれる軽鎖可変領域の数に該当する一般的に、xおよびyはそれぞれ1または2である。一部の実施形態では、免疫グロブリン抗体および抗体フラグメントを含むは、単独であっても他の治療薬との併用であっても、所望の効果を達成するために使用することができる治療用分子として、有用であり得る。そのような実施形態では、本発明の免疫グロブリン抗体および抗体フラグメントを含むは、小分子であってもポリペプチドであってもよい、1~24個の、1~16個の、1~8個の、または1~4個の、薬理活性を有する化学的部分を結合してさらに含む。薬理活性を有する小分子またはポリペプチドである化学的部分は、免疫グロブリン単量体例えば、LCまたはHC単量体のN末端もしくはC末端の残基において、当該技術分野において周知であり本明細書にさらに記載されている化学反応で、またはそれらを介して、結合することができる。あるいは、本発明の免疫グロブリンの主鎖内に含まれるアミノ酸残基の一つまたは複数の側鎖上の官能基における、またはそれを介した、薬理活性を有する化学的一部分、または複数部分の結合が、本発明に包含される。有用な方法および免疫グロブリン鎖内の内部結合部位例えば、特定のシステイン残基は、当該技術分野において周知である例えば、GeggetalModifiedFcMolecules、国際公開第2007/022070号および米国特許出願公開第20070269369号で公開、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。薬理活性を有する化学的部分がポリペプチドである本発明の他の実施形態では、組換え融合タンパク質は、薬理活性を有するポリペプチドが、N末端および/またはC末端にではなく、免疫グロブリン重鎖のFcドメインの内部ループ内で、免疫グロブリン重鎖の一次アミノ酸配列に挿入されることで生成することができ、本明細書の実施例および当該技術分野例えば、Geggetal、米国特許第7,442,778号;米国特許第7,655,765号;米国特許第7,655,764号;米国特許第7,662,931号;米国特許第7,645,861号;米国特許出願公開第2009/0281286号;および第2009/0286964号、これらはそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれるにおいてさらに記載される。結合したとは、少なくとも2つの化学的部分が、直接的に、または所望により、自身が該部分の両方に共有結合的に連結するペプチジルもしくは非ペプチジルリンカー部分を介して、互いに共有結合的に連結、または結合していることを意味する。例えば、共有結合は、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基を介したもの、例えば、αアミノ基、αカルボキシル基を介したもの、または側鎖を介したものであり得る。共有結合が達成される方法、例えば、結合が化学合成的な手段によるもの、または融合タンパク質において融合されたすなわち、結合したパートナーの組換え発現によるもののどちらであるかは、重要ではない。上述のように、本発明のいくつかの実施形態の組成物は、薬理学的に不活性な本発明の免疫グロブリンに結合した少なくとも1つの薬理活性を有するポリペプチド部分を含み、例えば、薬理学的に不活性な本発明の免疫グロブリンに結合した薬理活性を有するポリペプチド部分の組換え融合タンパク質を構成している。薬理活性を有するという用語は、そのように記載されている物質が、あるとすれば物質の単なる免疫原性は除いて、医学的パラメータ例えば、血圧、血液細胞数、コレステロールレベル、痛覚または病状例えば、がん、自己免疫障害、慢性疼痛に影響を及ぼす活性を有することが判定されていることを意味する。反対に、薬理学的に不活性なという用語は、仮にあったとしても物質の単なる免疫原性は除いて、医学的パラメータまたは病状に影響を及ぼす活性が、その物質について判定できないことを意味する。従って、薬理活性を有するぺプチドまたはタンパク質は、以下に定義されるような作動薬または摸倣薬および拮抗薬として働くペプチドを含む。本発明は、約5~約80のアミノ酸残基長に渡るアミノ酸配列を有し、組換え発現に適している、いかなる薬理活性を有するタンパク質の使用をも包含する。本発明のいくつかの有用な実施形態では、薬理活性を有するタンパク質は、必須の生物活性が維持される限り、アミノ酸の付加もしくは挿入、アミノ酸欠失、ペプチド切断、アミノ酸置換、またはアミノ酸残基の化学誘導体化既知の化学的手法によって達成されるを含む一つまたは複数の方法で、目的の天然配列に対して、修飾される。-模倣体ペプチド、ペプチド模倣薬、および-作動薬ペプチドという用語は、目的の天然タンパク質、例えば、限定はされないが、トキシンペプチド分子、例えば、ShKもしくはOSK1トキシンペプチド、またはそのペプチド類似体と同等の生物活性を有するペプチドまたはタンパク質を表す。これらの用語には、天然分子の効果を高める等により、天然ペプチド分子の活性を間接的に模倣するペプチドがさらに含まれる。-拮抗薬ペプチド、ペプチド拮抗薬、および阻害剤ペプチドという用語は、目的の受容体の生物活性を遮断する、もしくは何らかの方法で干渉する、または、目的の受容体限定はされないが、イオンチャネルまたはGタンパク質共役受容体GPCR等の既知の拮抗薬もしくは阻害剤と同等の生物活性を有するペプチドを表す。本発明内で使用することができる薬理活性を有するタンパク質の例としては、トキシンペプチド例えば、OSK1またはOSK1ペプチド類似体;ShKまたはShKペプチド類似体、IL-6結合ペプチド、CGRPペプチド拮抗薬、ブラジキニンB1受容体ペプチド拮抗薬、副甲状腺ホルモンPTH作動薬ペプチド、副甲状腺ホルモンPTH拮抗薬ペプチド、ang-1結合ペプチド、ang-2結合ペプチド、ミオスタチン結合ペプチド、エリスロポエチン摸倣体EPO摸倣体ペプチド、FGF21ペプチド、トロンボポエチン摸倣体TPO摸倣体ペプチド例えば、AMP2またはAMP5、神経成長因子NGF結合ペプチド、B細胞活性化因子BAFF結合ペプチド、グルカゴン様ペプチドGLP-1もしくはそのペプチド模倣薬またはGLP-2もしくはそのペプチド模倣薬が挙げられるが、これらに限定はされない。グルカゴン様ペプチド1GLP-1および関連ペプチドグルカゴンは、プログルカゴンの異なるプロセシングを介して生成され、対立する生物活性を有する。プログルカゴンそれ自体は、膵臓のα細胞において、および主に末端小腸および結腸に位置する腸内分泌L細胞において、産生される。膵臓において、グルカゴンはプログルカゴンから選択的に開裂される。腸においては、対照的に、プログルカゴンはプロセシングを受けてGLP-1およびグルカゴン様ペプチド2GLP-2を形成し、それぞれはプログルカゴンのアミノ酸残基の78~107番目および126~158番目に対応している例えば、IrwinandWong1995MolEndocrinol9267277およびBelletal1983Nature304368371を参照。慣例により、GLP-1のアミノ酸の番号付けは、プログルカゴンの開裂から生成されたGLP-11~37に基づくものとなる。生物活性を有する形態は、このペプチドのさらなるプロセシングから生成され、これにより、ある番号付けの慣例で、GLP-17~37-OHおよびGLP-17~36-NH2がもたらされる。GLP-17~37-OHまたは単にGLP-17~37およびGLP-17~36-NH2の両方は、同じ活性を有している。便宜上、GLP-1という用語は、これらの形態の両方を表すのに用いられる。これらのプロセシングを受けたペプチドの最初のアミノ酸は、この番号付け慣例では、His7である。しかし、当該技術分野において認められている別の番号付け慣例では、プロセシングを受けたペプチドの番号付けが、位置7としてのHisからではなく、位置1としてのHisから開始されると仮定される。従って、この番号付けスキームでは、GLP-11~31はGLP-17~37と同一であり、GLP-11~30はGLP-17~36と同一である。GLP-1模倣体のポリペプチド配列の例としては、以下が含まれる:HGEGTFTSDQSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG配列番号290;HGEGTFTSDQSSYLEGQAAKEFIAWLQKGRG配列番号291;HGEGTFTSDVSSYQEGQAAKEFIAWLVKGRG配列番号292;HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAQLVKGRG配列番号293;HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAQLQKGRG配列番号294;HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLQKGRG配列番号295;HNETTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG配列番号296HGEGTFTSDVSSYLENQTAKEFIAWLVKGRG配列番号297;HGEGTFTSDVSSYLEGNATKEFIAWLVKGRG配列番号298;HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVNGTG配列番号299;HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKNRT配列番号300;HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRNGT配列番号301;HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGTGNGT配列番号302;およびHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGNGT配列番号303。ヒトGLP-2およびGLP-2模倣類似体mimeticanalogも、当該技術分野において周知である例えば、PrasadetalGlucagonlikepeptide2analogueenhancesintestinalmucosalmassafterischemiaandreperfusionJPediatrSurg2000Feb3535759YustaetalGlucagonlikepeptide2receptoractivationengagesbadandglycogensynthasekinase3inaproteinkinaseAdependentmannerandpreventsapoptosisfollowinginhibitionofphosphatidylinositol3kinaseJBiolChem27724896906を参照。トキシンペプチドには、毒液から単離することが可能な天然の薬理活性を有するぺプチドまたはポリペプチドの、同一アミノ酸配列を有するペプチドおよびポリペプチドが含まれ、また、そのような天然分子の修飾ペプチド類似体も含まれる例えば、KalmanetalShKDap22apotentKv13specificimmunosuppressivepolypeptideJBiolChem27332697707Kemetal、米国特許第6,077,680号MouhatetalOsK1derivatives、国際公開第2006/002850A2号ChandyetalAnalogsofSHKtoxinandtheirusesinselectiveinhibitionofKv13potassiumchannels、国際公開第2006/042151号SullivanetalToxinPeptidetherapeuticagents、国際公開第2006/116156A2号を参照;これら全ては、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ヘビ、サソリ、クモ、ミツバチ、カタツムリおよびイソギンチャクは、強力且つ選択的にイオンチャネルおよび受容体を標的とする小分子生理活性トキシンペプチドまたはトキシンの豊富な源としての役割を果たす、毒液生産生物の数少ない例である。トキシンペプチドの一例は、Orthochirusscrobiculosusサソリ毒液から単離されたトキシンペプチドである、OSK1OsK1としても知られているである例えば、MouhatetalKchanneltypestargetedbysyntheticOSK1atoxinfromOrthochirusscrobiculosusscorpionvenomBiochemJ38595104MouhatetalPharmacologicalprofilingofOrthochirusscrobiculosustoxin1analogswithatrimmedNterminaldomainMolecPharmacol6935462MouhatetalOsK1derivatives、国際公開第2006/002850A2号。別の例は、イソギンチャクであるStichodactylahelianthusの毒液から単離されたShKである例えば、TudoretalIonisationbehaviourandsolutionpropertiesofthepotassiumchannelblockerShKtoxinEurJBiochem25113341PenningtonetalRoleofdisulfidebondsinthestructureandpotassiumchannelblockingactivityofShKtoxinBiochem381454958KemetalShKtoxincompositionsandmethodsofuse、米国特許第6,077,680号LebrunetalNeuropeptidesoriginatinginscorpion、米国特許第6,689,749号BeetonetalTargetingeffectormemoryTcellswithaselectivepeptideinhibitorofKv13channnelsfortherapyofautoimmunediseasesMolecPharmacol67136981。トキシンペプチドは、通常約20~約80のアミノ酸長であり、2~5個のジスルフィド結合を含有し、非常にコンパクトな構造を形成する。トキシンペプチド例えば、サソリ、イソギンチャクおよびイモガイの毒液由来が単離され、イオンチャネルに対するそれらの影響について特徴付けられている。そのようなペプチドは、作用強度および安定性という重大な問題に対処するのにとりわけよく適している、比較的少数の構造骨組structuralframeworkから進化してきたように思われる。サソリおよびイモガイのトキシンペプチドの大多数は、例えば、10~40個のアミノ酸および最大5個のジスルフィド結合を含有しており、しばしばタンパク質分解に耐性を示す、極めてコンパクトで拘束された構造ミクロタンパク質を形成する。コノトキシンおよびサソリトキシンペプチドは、それらのジスルフィド結合およびペプチド折り畳みに基づいて、いくつかのスーパーファミリーに分類することができる。これらの多くの溶液構造が、NMR分光分析法によって決定されており、それらのコンパクトな構造が明らかにされ、それらの系統的な折り畳みの保存が確かめられている例えば、TudoretalIonisationbehaviourandsolutionpropertiesofthepotassiumchannelblockerShKtoxinEurJBiochem25113341PenningtonetalRoleofdisulfidebondsinthestructureandpotassiumchannelblockingactivityofShKtoxinBiochem381454958JaravineetalThreedimensionalstructureoftoxinOSK1fromOrthochirusscrobiculosusscorpionvenomBiochem36122332delRioPortilloetalNMRsolutionstructureofCn12anovelpeptidefromtheMexicanscorpionCentruroidesnoxiuswithatypicalbetatoxinsequencebutwithalphalikephysiologicalactivityEurJBiochem271250416ProchnickaChalufouretalSolutionstructureofdiscrepinanewKchannelblockingpeptidefromthealphaKTx15subfamilyBiochem4517951804。本発明の実施が有用であり得る薬理活性を有するトキシンペプチドの例としては、ShK、OSK1、カリブドトキシンChTx、カリオトキシン1kaliotoxin1,KTX1、もしくはマウロトキシンmaurotoxin、または一つまたは複数のアミノ酸残基で天然配列から修飾された、それらいずれかのトキシンペプチド類似体が挙げられるが、これらに限定はされない。他の例は、当該技術分野において周知であるか、以下:Sullivanetal、国際公開第06116156A2号または米国特許公開第11/406,454号題名:ToxinPeptideTherapeuticAgents、US2007/0071764として公開;MouhatetalOsK1derivatives、国際公開第2006/002850A2号;Sullivanetal、米国特許公開第11/978,076号題名:ConjugatedToxinPeptideTherapeuticAgents、2007年10月25日出願、米国特許出願公開第20090291885号として2009年11月26日公開、Sullivanetal、国際公開第2008/088422号Lebrunetal、米国特許第6,689,749号、およびSullivanetal、SelectiveandPotentPeptideInhibitorsofKv13、2009年3月20日出願の米国仮特許出願第61/210,594号に見出すことができ、それぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ペプチド類似体という用語は、少なくとも1つのアミノ酸残基の置換、少なくとも1つのアミノ酸の内部付加もしくは内部欠失、および/またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の切断、もしくは付加によって、天然に存在するペプチド配列と異なる配列を有するペプチドを表す。内部欠失とは、天然ではNまたはC末端以外の位置に存在するアミノ酸が、配列に存在しないことを表す。同様に、内部付加とは、天然ではNまたはC末端以外の位置に存在するアミノ酸が、配列中に存在することを表す。トキシンペプチド類似体とは、例えば、限定はされないが、OSK1ペプチド類似体、ShKペプチド類似体、またはChTxペプチド類似体等であり、目的の未変性トキシンペプチド配列に対する、目的の未変性トキシンペプチド配列の修飾例えば、アミノ酸残基置換、内部付加もしくは挿入、内部欠失、および/またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の切断、または上記のような付加を含んでいる。CGRPペプチド拮抗薬とは、CGRPペプチド類似体等が挙げられるがこれらに限定はされないCGRP1受容体と選択的に結合し、生理条件の温度、pH、およびイオン強度の下で、完全長の未変性ヒトαCGRPまたはβCGRPによるCGRP1受容体の活性化を拮抗、遮断、減少、低減、妨害、または阻害する、ペプチドである。CGRPペプチド拮抗薬には、完全拮抗薬および部分的拮抗薬が含まれる。そのような拮抗薬の活性は、既知のinvitroにおける方法またはinvivoにおける機能分析法によって検出することができる例えば、SmithetalModificationstotheNterminusbutnottheCterminusofcalcitoningenerelatedpeptideproduceantagonistswithincreasedaffinityJMedChem4624272435を参照。有用なCGRPペプチド拮抗薬の例は、GeggetalCGRPpeptideantagonistsandconjugates、国際公開第2007/048026A2号および米国仮特許出願第USSerialNo11/584,177号2006年10月19日出願、米国特許出願公開第US2008/0020978A1号として公開に開示されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。副甲状腺ホルモンPTH作動薬およびPTH作動薬という用語は、完全長未変性ヒト副甲状腺ホルモンと同様に、PTH-1またはPTH-2受容体に結合して、一つまたは複数のPTH活性アッセイパラメータを増加もしくは減少させる分子を表す。有用なPTH作動薬ペプチドの例は、Modulatorsofreceptorsforparathyroidhormoneandparathyroidhormonerelatedproteinという表題の米国特許第6,756,480号の表1に開示されており、その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。例示的なPTH活性アッセイは、米国特許第6,756,480号の実施例1に開示されている。副甲状腺ホルモンPTH拮抗薬という用語は、PTH-1またはPTH-2受容体に結合し、完全長未変性ヒト副甲状腺ホルモンによるこれらのパラメータに対する正常効果を遮断または防止する分子を表す。有用なPTH拮抗薬ペプチドの例は、米国特許第6,756,480号の表2に開示されており、その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。例示的なPTH活性アッセイは、米国特許第6,756,480号の実施例2に記載されている。ブラジキニンB1受容体拮抗薬ペプチドおよびブラジキニンB1受容体ペプチド拮抗薬という用語は、ヒトブラジキニンB1受容体hB1に対して拮抗薬活性を有するペプチドを意味する。有用なブラジキニンB1受容体拮抗薬ペプチドは、NgetalAntagonistofthebradykininB1receptor、米国特許出願公開第2005/0215470A1号2005年9月29日に公開、米国特許第7,605,120号;米国特許第5,834,431号または第5,849,863号として発行に記載されるように、同定または誘導することができる。例示的なB1受容体活性アッセイは、米国特許出願公開第2005/0215470A1号の実施例6~8に記載される。トロンボポエチンTPO模倣体ペプチドおよびTPO模倣体ペプチドという用語は、CwirlaetalScience27616969、米国特許第5,869,451号および第5,932,946号全体が参照により組み込まれる;2003年9月18日に公開された米国特許出願第2003/0176352号全体が参照により組み込まれる;2003年4月17日に公開された国際公開第03/031589号;2000年5月4日に公開された国際公開第00/24770号に記載されるように、特定または誘導することができるペプチド;並びに、米国特許出願公開第2006/0140934号2005年9月23日に出願された米国仮特許出願第USSerialNo11/234,731号、表題ModifiedFcMolecules、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるの表5に現れるあらゆるペプチドを表す。当業者であれば、これらの各参照により、異なるペプチドライブラリを用い、開示された手順に従うことによって、実際に開示されたものとは異なるペプチドを選択することが可能となることに気づくだろう。EPO模倣体ペプチドおよびエリスロポエチン模倣体ペプチドという用語は、WrightonetalScience27345863およびNarandaetalProcNatlAcadSciUSA96756974これらは共に、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるに記載されるように、特定または誘導することができるペプチドを表す。有用なEPO模倣体ペプチドとしては、米国特許公開出願第2007/0269369A1号の表5および米国特許第6,660,843号これらは共に、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるに列挙されたEPO模倣体ペプチドが挙げられる。ang-2結合ペプチドという用語には、2003年12月11日に公開された米国特許出願第2003/0229023号;2003年7月17日に公開された国際公開第03/057134号;2003年12月25日に公開された米国特許出願公開第2003/0236193号それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるに記載のように、特定または誘導できるぺプチド;並びに、米国特許出願公開第2006/0140934号2005年9月23日に出願された米国仮特許出願第USSerialNo11/234,731号、表題ModifiedFcMolecules、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるの表6に現れるあらゆるペプチドが含まれる。当業者であれば、これらの各参照により、異なるペプチドライブラリを用い、開示された手順に従うことによって、実際に開示されたものとは異なるペプチドを選択することが可能となることに気づくだろう。神経成長因子NGF結合ペプチドおよびNGF結合ペプチドという用語には、2004年4月1日に公開された国際公開第04/026329号に記載のように同定または誘導できるペプチド、並びに米国特許出願公開第2006/0140934号2005年9月23日に出願された米国仮特許出願第USSerialNo11/234,731号、表題ModifiedFcMolecules、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるの表7に現れるあらゆるペプチドが含まれる。当業者であれば、これらの各参照により、異なるペプチドライブラリを用い、開示された手順に従うことによって、実際に開示されたものとは異なるペプチドを選択することが可能となることに気づくだろう。ミオスタチン結合ペプチドという用語には、2003年12月19日に出願された米国仮特許出願第USSerialNo10/742,379号その全体が参照によって本明細書に組み込まれるに記載されるように特定または誘導できるペプチド、並びに米国特許出願公開第2006/0140934号2005年9月23日に出願された米国仮特許出願第USSerialNo11/234,731号、表題ModifiedFcMolecules、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるの表8に現れるあらゆるペプチドが含まれる。当業者であれば、これらの各参照により、異なるペプチドライブラリを用い、開示された手順に従うことによって、実際に開示されたものとは異なるペプチドを選択することが可能となることに気づくだろう。BAFF拮抗薬ペプチドおよびBAFF結合ペプチドという用語には、米国特許出願公開第2003/0195156A1号その全体が参照によって本明細書に組み込まれるに記載されるように特定または誘導できるペプチド、並びに米国特許出願公開第2006/0140934号2005年9月23日に出願された米国仮特許出願第USSerialNo11/234,731号、表題ModifiedFcMolecules、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるの表9に現れるペプチドが含まれる。当業者であれば、上記参照により、異なるペプチドライブラリを用い、開示された手順に従うことによって、実際に開示されたものとは異なるペプチドを選択することが可能となることに気づくだろう。上記は、本発明の免疫グロブリン抗体および抗体フラグメントを含むに有用に結合または融合可能な薬理活性を有するポリペプチドの単なる非限定的な例として意図されるものである。薬理活性を有するポリペプチド部分を含むものはすべて、本発明の範囲内で使用可能であり、例えば、いわゆるアビマーavimer構造を有するポリペプチドが挙げられる例えば、KolkmanetalNovelProteinswithTargetedBinding、米国特許出願公開第2005/0089932号;BakeretalIL6BindingProteins、米国特許出願公開第2008/0281076号StemmeretalProteinScaffoldsandUsesThereof、米国特許出願公開第2006/0223114号および米国特許出願公開第2006/0234299号を参照。有用な前臨床の動物モデルが、目的の治療指標における薬の妥当性検証用に、当該技術分野では周知である例えば、anadoptivetransfermodelofperiodontaldiseasebyValverdeetalJBoneMineralRes19155anultrasonicperivascularDopplerflowmeterbasedanimalmodelofarterialthrombosisinGruneretalBlood105149299pulmonarythromboembolismmodelaortaocclusionmodelandmurinestrokemodelinBraunetal、国際公開第2009/115609A1号。例えば、多発性硬化症の養子移入実験的自己免疫性脳脊髄炎AT-EAEモデルは、多発性硬化症等の免疫疾患に関する研究のために、説明がなされているBeetonetalJImmunol166936BeetonetalPNAS9813942Sullivanetal、国際公開第2008/088422A2号の実施例45、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。AT-EAEモデルにおいて、有効量の本発明の医薬組成物による処置がなされた動物には、疾患重症度の有意な低減および生存増加が期待されるが、一方、無処置動物は深刻な疾患および/または死亡に至ることが予期される。AT-EAEモデルを運用するために、ミエリン塩基性タンパク質MBPに特異的な、脳骨髄性myelogenicCD4ラットT細胞株、PASが、EvelyneBeraud博士により考案された。これらの細胞のinvitroにおいての維持およびAT-EAEモデルにおいてのそれらの使用は、以前に記載がなされているBeetonetalPNAS9813942。PAST細胞は、MBPおよび照射を受けた胸腺細胞2日目による交互の一連の抗原刺激または活性化、およびT細胞増殖因子5日目による増殖によって、invitroで維持される。PAST細胞3×105/mlの活性化は、細胞を、10μg/mlのMBPおよび15×106/mlの同系の被照射3500rad胸腺細胞と共に、2日間インキュベートすることを必要とする。invitroでの活性化から2日後、10~15×106個の生存PAST細胞を、6~12週齢の雌Lewisラットチャールズリバー社CharlesRiverLaboratoriesに、尾静脈内注射によって注入する。ビヒクルPBS中2Lewisラット血清または試験医薬組成物の皮下注射を毎日、-1~3日目に与え、ここで-1日目とは、PAST細胞0日目の注射の1日前を表す。ビヒクル処置ラットでは、PAST細胞注入後4~5日目に、急性EAEが発生することが予期される。通常は、阻害剤のレベルの分析用に、血清を、4日目に尾静脈出血により、および8日目試験の終わりに心穿刺により、採血する。通常、ラットは-1、4、6、および8日目に体重測定する。動物は、細胞移入0日目の日から3日目までは1日1回、そして4日目から8日目までは1日2回、盲検方式でスコア化してもよい。臨床兆候は、各肢および尾の不全麻痺の程度の総得点として評価する。臨床スコアリング:0=兆候なし、0.5=遠位尾の引きずり、1.0=尾のひきずり、2.0=中等度の不全対麻痺、運動失調、3.0=中等度の不全対麻痺、3.5=後肢一本の麻痺、4.0=後肢の完全麻痺、5.0=後肢完全麻痺および失調症、5.5=四肢麻痺、6.0=瀕死状態または死亡。スコアが5.0に達したラットは、通常は安楽死させる。免疫グロブリンの抗体実施形態の産生ポリクローナル抗体.ポリクローナル抗体は、関連する抗原およびアジュバントの複数回の皮下scまたは腹腔内ip注射によって、動物において産生されるのが好ましい。あるいは、抗原は動物のリンパ節に直接注射してもよいKilpatricketalHybridoma163813891997を参照。二機能性物質または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステルシステイン残基を介した結合、N-ヒドロキシスクシンイミドリジン残基を介する、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当該技術分野において周知の他の物質を用いて、免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を結合することによって、抗体応答の向上を得ることができる。例えば、100μgのタンパク質または複合体マウス用と3倍量のフロイント完全アジュバントとを混合し、その溶液を複数の部位に皮内注射することによって、動物を抗原、免疫原性複合体、または誘導体に対し免疫化する。1ヶ月後、複数の部位への皮下注射による、最初の量の1/5~1/10倍量のフロイント完全アジュバント中ペプチドまたは複合体で、動物を追加免疫する。追加抗原注射の7~14日後に、動物を出血させ、血清を抗体価につきアッセイする。力価がプラトーとなるまで動物を追加免疫する。動物は、異なるタンパク質に対しおよび/または異なる架橋剤を介して結合している以外は同一の抗原の複合体で、追加免疫されることが好ましい。複合体は、タンパク質融合として組換え細胞培養で作成することもできる。また、ミョウバン等の凝集剤は、免疫応答の増強に用いるのに適している。モノクローナル抗体提供される本発明の免疫グロブリンにはモノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、当該技術分野において周知のいかなる技術をも用いて生産され得、例えば、免疫スケジュール完了後の遺伝子導入動物から採取した脾臓細胞の不死化によって生産することができる。脾臓細胞は、当該技術分野において周知のいかなる技術をも用いて不死化することができ、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作成することによって行うことができる。例えば、モノクローナル抗体は、Kohleretal.,Nature,256:4951975で最初に記述されたハイブリドーマ法を用いて作成することができ、または、本発明において有用であるような、所定配列の組換えDNA法によって作成することができ例えば、CabillyetalMethodsofproducingimmunoglobulinsvectorsandtransformedhostcellsforusetherein、米国特許第6,331,415号、例えば、抗体をグリコシル化することができる哺乳類細胞株例えば、CHO細胞を所望により用いて、通常は等モルの軽鎖および重鎖の産生を促進する、スプリットDHFRsplitDHFR法等の方法が挙げられる例えば、PageAntibodyproduction、EP0481790A2および米国特許第5,545,403号を参照。ハイブリドーマ法は、本発明の免疫グロブリン生成においては有用でないが、抗原結合性タンパク質の生成においては有用であり、通常この方法において、マウス、またはラット、ハムスターもしくはマカクサル等の他の適切な宿主哺乳動物が、本明細書に記載のように免疫化されて、免疫化に用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、または産生可能であるリンパ球を誘導する。あるいは、invitroでリンパ球を免疫化してもよい。その後、ポリエチレングリコール等の適切な細胞融合剤fusingagentを用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させるGodingMonoclonalAntibodiesPrinciplesandPracticepp59103。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリン配列を有する遺伝子導入動物を免疫原で免疫化すること;該免疫動物から脾臓細胞を採取すること;採取された脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させて、ハイブリドーマ細胞を生じさせること;ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を確立し、目的の抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定すること、によってハイブリドーマ細胞株を作製する。そのようなハイブリドーマ細胞株、およびそれらにより産生されるモノクローナル抗体は、本発明の態様である。ハイブリドーマ細胞を、作製したらすぐに、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する一つまたは複数の物質を好ましくは含有する適切な培地中に播種して増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼHGPRTまたはHPRTを欠乏している場合、ハイブリドーマ用培地には典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンHAT培地が含まれ、それらの物質によってHGPRT欠乏細胞の成長が妨害される。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定的に高いレベルの抗体産生を支援し、培地に対する感受性が高いものである。ヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、ヒトモノクローナル抗体の産生についても記述されているKozborJImmunol1333001BrodeuretalMonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplicationspp5163。ハイブリドーマ作製融合法用の骨髄腫細胞は、好ましくは、抗体を産生しないものであり、高い融合効率、および所望の融合細胞ハイブリドーマのみの成長を支援するある種の選択培地においてそれらが成長できないようにする酵素欠損を有する。マウス細胞融合mousefusion用に適切な細胞株の例としては、Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7およびS194/5XXOBulが挙げられ;ラット細胞融合ratfusionで用いられる細胞株の例としては、R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983Fおよび4B210が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6である。ハイブリドーマ細胞が成長中の培養液を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはラジオイムノアッセイRIAもしくは酵素結合免疫吸着検定法ELISA等のinvitro結合アッセイによって、決定されることが好ましい。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、BIAcore商標登録またはスキャチャード解析によって決定することができるMunsonetalAnalBiochem107220FischeretalApeptideimmunoglobulinconjugate、国際公開第2007/04563A1号、実施例10、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。所望の特異性、親和性、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、クローンを限界希釈法によりサブクローン化し、標準方法で増殖させてもよいGodingMonoclonalAntibodiesPrinciplesandPracticepp59103。この目的に適切な培地としては、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物においては腹水腫瘍としてinvivoで増殖させることができる。ハイブリドーマまたはmAbを、さらにスクリーニングして、Kv1.xチャネルを介したK1流動を阻害する能力等の特定の特性を有するmAbを特定することができる。そのようなスクリーニングの例は下記の実施例で提供される。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質A-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー、または当該技術分野において周知の他のあらゆる適切な精製技術等の、従来の免疫グロブリン精製法によって培地、腹水、または血清から適切に分離される。抗体の組換え体生産本発明は、宿主細胞により認識される制御配列に所望により機能的に連結した抗体ポリクローナルおよびモノクローナル本明細書に記載の本発明の抗体フラグメントを含むのいずれかをコードする単離された核酸、該核酸を含むベクターおよび宿主細胞、並びに、該核酸が発現するように宿主細胞を培養すること、および、所望により、宿主細胞培養または培地から抗体を回収することを含み得る抗体を生産するための組み換え技術を提供する。同様の物質および方法は、ポリペプチドをベースとした免疫グロブリンの産生にも適合する。目的の免疫グロブリンまたはポリペプチドからの関連アミノ酸配列は、直接的なタンパク質構造解析によって決定することができ、適切なコードヌクレオチド配列を一般的なコドン表に従って設計することができる。あるいは、モノクローナル抗体をコードするゲノムDNAまたはcDNAは、そのような抗体を産生する細胞から、従来の方法を用いて例えば、該モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、単離および配列決定することができる。DNAのクローニングは、標準的な技術を用いて実行される例えば、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryGuideVols13ColdSpringHarborPressを参照、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、cDNAライブラリは、ポリAmRNA、好ましくは膜結合性mRNA、およびヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてスクリーニングしたライブラリの逆転写によって、構築することができる。しかしながら一実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応PCRが、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント例えば、軽鎖または重鎖可変セグメントをコードするcDNAまたは完全長cDNAの部分の増幅に用いられる。増幅された配列は、あらゆる適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクターに、容易にクローン化することができる。目的の免疫グロブリンポリペプチドのいくつかの部分の配列を決定することができるのであれば、使用されるクローニングの具体的な方法は重要でないことが理解されよう。抗体核酸の一つの供給源は、目的の抗原で免疫した動物からB細胞を得て、それを不死細胞に融合させることにより作製されるハイブリドーマである。あるいは、核酸は免疫動物のB細胞または脾臓全体から単離することができる。抗体をコードする核酸のさらに別の供給源は、例えば、ファージディスプレイ技術によって生成されたそのような核酸のライブラリである。目的のペプチド、例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、パニング等の標準的な技術によって特定することができる。免疫グロブリンポリペプチドの可変領域全体をコードする配列を決定してもよいが、可変領域の一部分のみ、例えば、CDRコード部分を配列決定することで、場合によっては十分である。配列決定は標準的な技術を用いて行われる例えば、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryGuideVols13ColdSpringHarborPressandSangerFetalProcNatlAcadSciUSA7454635467を参照、参照によって本明細書に組み込まれる。クローン化された核酸配列と、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびcDNAの発表された配列とを比較することによって、配列決定された領域に応じて、当業者は容易に、iハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド重鎖のアイソタイプを含むの生殖系セグメントの使用、並びにiiN領域付加および体細胞突然変異の過程からもたらされる配列を含む、重鎖および軽鎖可変領域の配列を決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の1つの供給源は、国立バイオテクノロジー情報センターNationalCenterforBiotechnologyInformation、国立医療図書館NationalLibraryofMedicine、国立衛生研究所NationalInstitutesofHealthメリーランド州ベセスダである。単離されたDNAは、制御配列に機能的に連結されるか、または発現ベクター中に配置され、それが次に他の形では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞に形質移入して、組換え宿主細胞中にモノクローナル抗体の合成を指示することができる。抗体の組換え体産生は当該技術分野において周知である。核酸が別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、核酸は、機能的に連結される。例えば、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合は、プレ配列または分泌リーダーsecretoryleaderのDNAがポリペプチドのDNAに機能的に連結され;配列の転写に影響を及ぼす場合は、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に機能的に連結され;あるいは、翻訳を促進するために位置付けられる場合は、リボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結される。一般に、機能的に連結されることは、連結されるDNA配列が隣接していることを意味し、また、分泌リーダーの場合は、連結されるDNA配列が隣接し、リーディングフェーズreadingphase内であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接することを必要としない。連結は、都合が良い制限酵素認識部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、慣習に従って使用される。多くのベクターが当該技術分野において周知である。ベクター構成要素には、以下のうちの一つまたは複数が含まれ得る:シグナル配列例えば、抗体の分泌を指示し得る;例えば、VK-1シグナルペプチド配列MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC//配列番号103をコードする、ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCGCGCTGT//配列番号102、複製開始点、一つまたは複数の選択的なマーカー遺伝子例えば、抗生物質耐性または他の薬剤耐性を与える、栄養要求性欠乏を補完する、または培地中で獲られない不可欠な栄養物を供給することができる、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列で、これらのすべては当該技術分野において周知である。細胞、細胞株、および細胞培養は、しばしば同義的に使用され、本明細書における全てのそのような名称には子孫細胞が含まれる。形質転換体および形質転換細胞には、形質転換の数を問わず、初代対象細胞およびそれ由来の培養物が含まれる。意図的または偶然の変異によって、全ての子孫細胞が、DNA内容において正確には同一でない場合もあることも理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたのと同一の機能または生物活性を有する変異子孫細胞が含まれる。例示的な宿主細胞には、原核生物、酵母、または高等真核生物細胞が含まれる。原核宿主細胞には、グラム陰性菌またはグラム陽性菌等の真正細菌、例えば、大腸菌類Escherichia、例えば、大腸菌Ecoli、エンテロバクター属Enterobacter、エルウィニア属Erwinia、クレブシエラ属Klebsiella、プロテウス属Proteus、サルモネラ属Salmonella、例えば、ネズミチフス菌Salmonellatyphimurium、セラチア属Serratia、例えば、霊菌属Serratiamarcescans、および赤痢菌属Shigella等の腸内細菌科Enterobacteriaceae、並びに枯草菌Bsubtilisおよびリケニホルミス菌Blicheniformis等の炭疽菌Bacillus、シュードモナス属Pseudomonas、並びにストレプトマイセス属Streptomycesが含まれる。糸状菌または酵母等の真核微生物は、組換えポリペプチドまたは組換え抗体の適切なクローニングまたは発現用宿主である。出芽酵母saccharomycescerevisiae、または通常のパン酵母が、下等な真核生物宿主微生物の中でもっとも一般的に使用される。しかし、ピキア属Pichia、例えばピキアパストリスPpastoris、分裂酵母Schizosaccharomycespombe;クリベロマイセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia;カンジダ属Candida;トリコデルマリーシアTrichodermareesia;ニューロスポラクラッサNeurosporacrassa;スクワニオミセスオクシデンタリスSchwanniomycesoccidentalis等のスクワニオミセス属Schwanniomyces;並びに、例えば、ニューロスポラ属Neurospora、ペニシリウム属Penicillium、トリポクラミジウム属Tolypocladium、並びにA.ニデュランスAnidulansおよびA.ニガーAniger等のアスペルギルス属Aspergillus宿主等の糸状菌等の、いくつかの他の属、種、および株は、一般に入手可能で且つ本明細書において有用である。抗体を含む、グリコシル化された免疫グロブリンの発現のための宿主細胞は、多細胞生物に由来し得る。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体並びにスポドプテラフルギペルダSpodopterafrugiperdaイモムシ、アエデスアエギプティAedesaegypti蚊、アエデスアルボピクタスAedesalbopictus蚊、ドロソフィラメラノガスタDrosophilamelanogasterショウジョウバエおよびボンビクスモリBombyxmori等の宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、オートグラファカリフォルニアAutographacalifornicaNPVのL-1変異体およびボンビクスモリNPVのBm-5菌株が公的に利用できる。脊椎動物宿主細胞もまた適切な宿主であり、そのような細胞からの抗原結合性タンパク質抗体を含むの組換え体生産は、通常の方法となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例としは、チャイニーズハムスター卵巣細胞、例えば、CHOK1細胞ATCCCCL61、DXB-11、DG-44、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFRCHO、UrlaubetalProcNatlAcadSciUSA774216;SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1系統COS-7、ATCCCRL1651;ヒト胚腎臓系統浮遊培養での増殖のためにサブクローニングされた293または293細胞GrahametalJGenVirol3659;サル腎細胞CV1ATCCCCL70;アフリカミドリザル腎細胞VERO-76、ATCCCRL-1587;ヒト子宮頸癌細胞HELA、ATCCCCL2;イヌ腎細胞MDCK、ATCCCCL34;バッファローラット肝臓細胞BRL3A、ATCCCRL1442;ヒト肺細胞W138、ATCCCCL75;ヒト肝細胞腫細胞HepG2、HB8065;マウス乳腺腫瘍MMT060562、ATCCCCL51;TRI細胞MatheretalAnnalsNYAcadSci3834468;MRC5細胞もしくはFS4細胞;または哺乳類骨髄腫細胞が挙げられる。宿主細胞は、免疫グロブリン産生用の前述の核酸またはベクターで形質転換または形質導入され、プロモーター誘導、形質転換体選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、必要に応じて改変された従来の栄養培地中で培養される。さらに、選択的マーカーによって分離された転写単位の複数コピーを有する新規ベクターおよび形質導入細胞株は、免疫グロブリンの発現に特に有用である。本発明の免疫グロブリンを生産するのに用いられる宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。ハムF10シグマ社、最小必須培地MEM,シグマ社、RPMI-1640シグマ社、およびダルベッコー修飾イーグル培地DMEM、シグマ社等の市販の培地が、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、HametalMethEnz5844BarnesetalAnalBiochem102255、米国特許第4,767,704号;第4,657,866号;第4,927,762号;第4,560,655号;もしくは第5,122,469号;国際公開第90103430号;国際公開第87/00195号;または米国再発行特許第30,985号に記載される培地のいずれも、宿主細胞の培地として使用され得る。これらの培地のうちいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび/または他の増殖因子インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子等、塩塩化ナトリウム、カルシウム塩calcium、マグネシウム塩magnesium、およびリン酸塩等、緩衝液HEPES等、ヌクレオチドアデノシンおよびチミジン等、抗菌剤Gentamycin商標薬等、微量元素マイクロモル範囲の最終濃度に通常は存在する無機化合物として定義される、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充されていてもよい。いかなる他の必要な補助剤も、当業者には知られているであろう適切な濃度で、含まれ得る。温度、pH等の培養条件は、発現用に選択された宿主細胞に以前に使用されたものであり、当業者には明らかである。宿主細胞を培養すると、免疫グロブリンは、細胞膜周辺腔で細胞内に産生され得、または直接的に培地に分泌され得る。免疫グロブリンが最初のステップとして細胞内で産生される場合、粒状の残骸、宿主細胞または溶解したフラグメントは、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。免疫グロブリン例えば、抗体または抗体フラグメントは、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、陽イオンもしくは陰イオン交換クロマトグラフィー、または、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーを用い、親和性リガンドとして目的の抗原またはタンパク質Aもしくはタンパク質Gを用いて、精製することができる。タンパク質Aは、ヒトγ1、γ2、またはγ4重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質を精製するのに使用することができるLindmarketalJImmunolMeth62113。タンパク質Gは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ3に推奨されるGussetalEMBOJ515671575。親和性リガンドが結合する基質は、ほとんどの場合アガロースであるが、他の基質が利用可能である。制御多孔質ガラスcontrolledporeglassまたはポリスチレンジビニルベンゼン等の機械的に安定な基質は、アガロースで達成することができる流速とプロセシング時間よりも速い流速と短いプロセシング時間を可能にする。タンパク質がCH3ドメインを含む場合、BakerbondABX商標樹脂J.T.ベーカー社JTBaker、ニュージャージー州フィリップスバーグが精製に有用である。エタノール沈殿、逆相HPLC、等電点電気泳動、SDS-PAGE、および硫安塩析等のタンパク質精製の他の技術も、回収されるべき抗体によって使用される可能性がある。キメラ、ヒト化およびヒト改変商標モノクローナル抗体げっ歯類モノクローナル抗体の可変Igドメインがヒト定常Igドメインに融合されるキメラモノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の標準的な手順を用いて生成することができるMorrisonSLetalChimericHumanAntibodyMoleculesMouseAntigenBindingDomainswithHumanConstantRegionDomainsProcNatlAcadSciUSA8168416855andBoulianneGLetalNature312643646を参照。いくつかの技術が、抗体配列をよりヒトに類似するようにヒト化または改変することについて記載しており、例えば、1非ヒト相補性決定領域CDRをヒトフレームワークおよび定常領域に移植当該技術分野でCDRグラフティングによるヒト化と称される方法することによって、または2非ヒト可変領域全体を移植するが、それらを表面残基の置き換えによりヒト様の表面で覆い隠すこと当該技術分野で化粧張りveneeringと称される方法によって、または3各残基の、抗原結合性または抗体構造への関与の見込み、およびその免疫原性の見込みに基づいて、選択された非ヒトアミノ酸残基をよりヒトへと改変することによる。例えば、JonesetalNature321522525MorrisonetalProcNatlAcadSciUSA8168516855MorrisonandOiAdvImmunol446592VerhoeyeretalScience23915341536PadlanMolecImmun28489498PadlanMolecImmunol31169217andKettleboroughCAetalProteinEng477383CoMSetalJImmunol15229682976StudnickaetalProteinEngineering7805814を参照;これらの各々はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの技術が、抗体配列をよりヒトに類似するようにヒト化または改変することについて記載しており、例えば、1非ヒト相補性決定領域CDRをヒトフレームワークおよび定常領域に移植当該技術分野でCDRグラフティングによるヒト化と称される方法することによって、または2非ヒト可変領域全体を移植するが、それらを表面残基の置き換えによりヒト様の表面で覆い隠すこと当該技術分野で化粧張りveneeringと称される方法によって、または3各残基の、抗原結合性または抗体構造への関与の見込み、およびその免疫原性の見込みに基づいて、選択された非ヒトアミノ酸残基をよりヒトへと改変することによる。例えば、JonesetalNature321522525MorrisonetalProcNatlAcadSciUSA8168516855MorrisonandOiAdvImmunol446592VerhoeyeretalScience23915341536PadlanMolecImmun28489498PadlanMolecImmunol31169217andKettleboroughCAetalProteinEng477383CoMSetalJImmunol15229682976StudnickaetalProteinEngineering7805814を参照;これらの各々はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明の一つの態様では、本明細書で提供される抗体の軽鎖および重鎖可変領域表2A~Bを参照は、同一、または異なる、系統発生的種phylogeneticspecies由来の抗体から得られたフレームワーク領域FRに移植される。コンセンサスヒトFRを作製するために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖のアミノ酸配列から得られたFRを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を特定することができる。他の実施形態では、本明細書で開示される重鎖または軽鎖のFRは、異なる重鎖または軽鎖から得られたFRと置き換えられる。一つの態様では、抗体の重鎖および軽鎖のFRにおける希アミノ酸は置換されないが、残りのFRアミノ酸は置換される。希アミノ酸は、この特定のアミノ酸がFRにおいて通常は存在しない位置に存在する、特定のアミノ酸である。あるいは、1つの重鎖または軽鎖から得られた移植可変領域は、本明細書に記載されるようなその特定の重鎖または軽鎖の定常領域とは異なる定常領域と共に使用され得る。他の実施形態では、移植可変領域は一本鎖Fv抗体の部分である。抗体は、内因性の免疫グロブリンを産生せず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作された遺伝子導入動物を用いて生成することもできる。例えば、国際公開第98/24893号は、ヒトIg遺伝子座を有する遺伝子導入動物を開示しており、その動物は、内因性の重鎖および軽鎖遺伝子座の不活性化により機能的な内因性免疫グロブリンを産生しない。また、国際公開第91/10741号は、免疫原に対して免疫応答を開始することができる遺伝子導入した非霊長類哺乳類宿主を開示しており、それにおいては、抗体は霊長類の定常領域および/または可変領域を有しており、遺伝子座をコードする内因性免疫グロブリンは置換されているか、不活性化されている。国際公開第96/30498号は、定常領域または可変領域の全てまたは一部分を置換して改変された抗体分子を形成させるため等に、哺乳動物における免疫グロブリン遺伝子座を改変するためのCre/Lox系の使用を開示している。国際公開第94/02602号は、不活性化された内因性Ig遺伝子座および機能的なヒトIg遺伝子座を有する非ヒト哺乳類宿主を開示している。米国特許第5,939,598号は、遺伝子導入マウスを作製するための方法を開示しており、その方法において、該マウスは内因性重鎖が欠損しており、一つまたは複数の異種定常領域を含む外因性の免疫グロブリン遺伝子座を発現する。上記の遺伝子導入動物を用いることで、選択された抗原性分子に対して免疫応答を発生させることが可能であり、抗体産生細胞は、動物から採取可能で、ヒト由来モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するのに用いることができる。免疫方法、アジュバント等は、当該技術分野において周知であり、例えば、国際公開第96/33735号に記載されるような、遺伝子導入マウスの免疫化に用いられる。モノクローナル抗体を、対応するタンパク質の生物活性または生理作用を阻害または中和する能力について、試験することができる。JakobovitsetalProcNatlAcadSciUSA902551JakobovitsetalNature362255258BruggermannetalYearinImmuno733MendezetalNatGenet15146156;および米国特許第5591669号、米国特許第5589369号、米国特許第5545807号;および米国特許出願第20020199213号も参照されたい。米国特許出願第20030092125号は、所望のエピトープに対する動物の免疫応答を偏向させる方法について記載している。ヒト抗体は、invitro活性化B細胞によっても産生され得る米国特許第5,567,610号および第5,229,275号を参照。ファージディスプレイ技術による抗体生産組換え型ヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製するための技術の発達、およびコードされた抗体フラグメントの糸状バクテリオファージ表面への提示は、ヒト由来抗体を生成するための別の手段を提供している。ファージディスプレイは、例えば、Doweretal、国際公開第91/17271号、McCaffertyetal、国際公開第92/01047号、およびCatonandKoprowskiProcNatlAcadSciUSA8764506454に記載され、これらの各々はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ファージ技術によって生成される抗体は、通常、抗原結合性フラグメント、例えばFvまたはFabフラグメントとして細菌中で産生され、そのためにエフェクター機能が欠損している。2つの方法のうちの1つによって、エフェクター機能を導入することができる。フラグメントは、哺乳類細胞中で発現されるために完全抗体中に、またはエフェクター機能を誘起可能な第二の結合部位を有する二重特異性抗体フラグメント中のいずれかに操作、導入することができる。通常、抗体のFdフラグメントVH-CH1および軽鎖VL-CLは、PCRによって別々にクローン化され、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリにおいて無作為に組み換えられた後に、特定の抗原への結合に選択され得る。抗体フラグメントはファージ表面に発現され、FvまたはFab従って、ファージは抗体フラグメントをコードするDNAを含有するの抗原結合による選別は、数回にわたる抗原結合および再増幅パニングと名付けられた手順を通じて達成される。抗原に特異的な抗体フラグメントは、濃縮され、最後に単離される。ファージディスプレイ技術は、げっ歯類モノクローナル抗体のヒト化へのアプローチにも使用することができ、誘導選別guidedselectionと呼ばれるJespersLSetalBioTechnology12899903を参照。このために、マウスモノクローナル抗体のFdフラグメントを、ヒト軽鎖ライブラリと組み合わせて提示することができ、その後抗原を用いて、得られたハイブリッドFabライブラリを選別することができる。従ってマウスFdフラグメントは、選別を誘導するためのテンプレートを提供するものである。次に、選択されたヒト軽鎖をヒトFdフラグメントライブラリと組み合わせる。得られたライブラリを選別することによって完全なヒトFabが得られる。ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の誘導について、様々な手順が記載されている例えば、HoogenboometalJMolBiol227381MarksetalJMolBiol222581597;米国特許第5,565,332号および第5,573,905号;ClacksonTandWellsJATIBTECH12173184を参照。特に、invitroでの選別およびファージディスプレイライブラリから誘導される抗体の進化は、強力な手段となっているBurtonDRandBarbasIIICFAdvImmunol57191280andWinterGetalAnnuRevImmunol12433455;米国特許出願第20020004215号および国際公開第92/01047号;2003年10月9日に公開された米国特許出願第20030190317号および米国特許第6,054,287号;米国特許第5,877,293号を参照されたい。WatkinsScreeningofPhageExpressedAntibodyLibrariesbyCaptureLiftMethodsinMolecularBiologyAntibodyPhageDisplayMethodsandProtocols178187193および2003年3月6日に公開された米国特許出願公開第20030044772号は、ファージ発現抗体ライブラリまたは他の結合分子を捕捉リフトcaptureliftによってスクリーニングする方法について記載しており、方法には候補結合分子の固体基板への固定化が含まれる。免疫グロブリンの他の実施形態:抗体フラグメント上で言及したように、抗体フラグメントは、インタクトな完全長抗体の一部分、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含み、抗体フラグメントから形成される線状抗体および多特異的抗体を含む。抗体フラグメントの非制限的な例としては、抗体が所望の生物活性を保持していればよく、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、Fd、ドメイン抗体dAb、相補性決定領域CDRフラグメント、一本鎖抗体scFv、一本鎖抗体フラグメント、マキシボディmaxibody、二重特異性抗体、トリアボディtriabody、テトラボディtetrabody、ミニボディminibody、線状抗体、キレート化組換え抗体、トリボディtribodyもしくはバイボディbibody、細胞内抗体、ナノボディnanobody、小モジュラー免疫医薬smallmodularimmunopharmaceutical、SMIP、抗原結合性ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化camelized抗体、VHH含有抗体、またはそれらの変異タンパク質もしくは誘導体、並びに、CDR配列等の、ポリペプチドへの特異的抗原結合性を与えるのに十分なだけの免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが挙げられる。そのような抗原フラグメントは、抗体全体の改変によって生成することができ、あるいは組換えDNA技術またはペプチド合成によって新規に合成することができる。さらなる抗体フラグメントとしては、VHドメインを含有するドメイン抗体dAbフラグメントWardetalNature3415445461989が挙げられる。線状抗体linearantibodyは、1対の抗原結合領域を形成する1対のタンデムFdセグメントVH-CH1-VH-CH1を含む。線状抗体は二重特異性であっても単一特異性であってもよいZapataetalProteinEng8105762。ペプチドリンカーを介してヒンジなし、またはIgGヒンジを介してCH3に融合したscFvから成るミニボディminibodyについては、OlafsenetalProteinEngDesSel2004Apr1731523に記載がなされている。マキシボディmaxibodyという用語は、免疫グロブリンのFc領域に共有結合した二価のscFvを表し、例えば、FredericksetalProteinEngineeringDesignSelection1795106およびPowersetalJournalofImmunologicalMethods251123135を参照されたい。軽鎖がない機能的な重鎖抗体は、コモリザメnurseshark、テンジクザメwobbegongshark、並びにラクダ科Camelidae、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびラマ等の、ある種の動物において天然に存在する。これらの動物において、抗原結合部位は、VHHドメインである単一ドメインに減少されている。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成する。すなわち、これらの機能的抗体は、構造H2L2のみを有する重鎖のホモ二量体である重鎖抗体またはHCAbと呼ばれる。ラクダ化VHHは、報告によれば、ヒンジ、CH2およびCH3ドメインを含有し、CH1ドメインを欠くIgG2定常領域およびIgG3定常領域で組み換えられる。古典的なVHのみのフラグメントは、可溶型で作製するのが困難であるが、フレームワーク残基が、よりVHH様に改変された場合、溶解性および特異的結合の向上がもたらされ得る例えば、ReichmanetalJImmunolMethods19992312538を参照。ラクダ化VHHドメインは、高親和性で抗原に結合することが見出されておりDesmyteretalJBiolChem27626285902001、溶液中での安定性が高いEwertetalBiochemistry413628362002。ラクダ化重鎖を有する抗体を作製するための方法は、例えば、米国特許公報第2005/0136049号および第2005/0037421号に記載されている。別の足場を、サメのV-NAR足場とより近く一致するヒト可変様ドメインから作製することが可能であり、長貫通型ループ構造のためのフレームワークを提供し得る。重鎖抗体の可変領域は、分子量がたった15kDaの、完全な機能を有する最小の抗原結合フラグメントであるため、この独立体はナノボディと呼ばれているCortezRetamozoetalCancerResearch642853572004。ナノボディライブラリは、Conrathetalに記載されているような、免疫化ヒトコブラクダから作製することができる。細胞内抗体intrabodyは、細胞内発現を示し、細胞内タンパク質の機能を操作することができる一本鎖抗体であるBioccaetalEMBOJ91011081990ColbyetalProcNatlAcadSciUSA10117616212004。細胞内領域に抗体構築物を保持するという細胞シグナル配列を含むイントラボディは、MhashilkaretalおよびWheeleretalに記載されているように作製することができる。トランスボディtransbodyは、タンパク質形質導入ドメインPTDが一本鎖可変フラグメントscFv抗体と融合されている細胞透過性抗体であるHengetalMedHypotheses64110582005。標的タンパク質に特異的なSMIPまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体が本発明によりさらに包含される。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を発揮するのに必要な免疫グロブリン領域に融合された抗原結合領域を含む一本鎖ポリペプチドである。例えば、国際公開第03/041600号、米国特許公報第20030133939号および米国特許公報第20030118592号を参照されたい。抗体フラグメント作製のための様々な技術が開発されている。これらのフラグメントは、慣例ではインタクトな抗体のタンパク質消化を介して誘導されたが、組換え宿主細胞によって直接的に産生可能でもある。例えば、BetteretalScience24010411043SkerraetalScience24010381041CarteretalBioTechnology10163167を参照されたい。免疫グロブリンの他の実施形態:多価抗体一部の実施形態では、多価モノクローナル抗体または多重特異性例えば、二重特異性、三重特異性等のモノクローナル抗体を作製することが望ましい場合がある。そのような抗体は、標的抗原の少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有し得るか、あるいは、2つの異なる分子、例えば、標的抗原および細胞表面タンパク質または受容体に結合し得る。例えば、二重特異性抗体は、標的発現細胞に細胞防御機構を集中させるために、標的に結合する腕、並びにT細胞受容体分子等の白血球上のトリガー分子例えば、CD2またはCD3またはFcγRICD64、FcγRIICD32およびFcγRIIICD16等の、IgGに対するFc受容体FcγRに結合する別の腕を含み得る。別の例として、二重特異性抗体は、標的抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化させるために使用され得る。これらの抗体は、標的に結合する腕および細胞傷害性薬剤例えば、サポリン、抗インターフェロン60、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテンに結合する腕を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして作製することができる。さらに、本発明の免疫グロブリン例えば、抗体および抗体フラグメントおよび複合体は、多価形態に折り畳まれるよう構築することも可能であり、これにより、血液中の半減期を向上させ得る。多価形態は、当該技術分野において周知の技術により作製することができる。二重特異性抗体または多特異的抗体は、架橋結合した、またはヘテロ複合体の抗体を含む。例えば、ヘテロ複合体における抗体の一方は、アビジンに結合され得、他方は、ビオチンに結合され得る。ヘテロ複合体抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は当該技術分野において周知であり、いくつかの架橋手法とともに米国特許第4,676,980号に開示されている。scFvのC末端にストレプトアビジンコード配列を付加することにより四量体を作製するための別の方法が設計される。ストレプトアビジンは4個のサブユニットから成るため、scFv-ストレプトアビジンが折り畳まれるとき、4個のサブユニットが結合して四量体を形成するKipriyanovetalHumAntibodiesHybridomas693101:この開示は、全体が参照によって本明細書に組み込まれる。二重特異性抗体を作製するための別のアプローチに従って、1対の抗体分子間の接触部分は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するよう操作することができる。1つの接触部分は、抗体定常領域のCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子の接触部分からの一つまたは複数の小型アミノ酸側鎖は、大型側鎖例えば、チロシンまたはトリプトファンと置換される。大型側鎖と同一または同様の大きさの代償性空洞cavityが、大型アミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖例えば、アラニンまたはトレオニンで置換することによって第二の抗体分子の接触部分に作製される。これは、ホモ二量体等の他の望まれない最終産物よりも多くヘテロ二量体の生産量を増加させるための機構を提供する。1996年9月6日に公開された国際公開第96/27011号を参照されたい。抗体フラグメントから二重特異性抗体または多特異的抗体を作製する技術は、文献にも記載されている。例えば、二重特異性抗体または三重特異性抗体は、化学結合を用いて作製することができる。BrennanetalScience22981には、インタクトな抗体をタンパク質分解によって切断してFab’2フラグメントを生成する手順が記載されている。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元し、隣接するジチオールを安定化させ、分子間のジスルフィド形成を妨害する。次に、生成されたFab’フラグメントをチオニトロベンゾエートTNB誘導体に変換する。次に、Fab’-TNB誘導体の1つを、メルカプトエチルアミンで還元することによってFab’-チオールに再変換し、等モル量のもう一方のFab’-TNB誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成させる。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための作用物質として使用可能である。BetteretalScience24010411043には、細菌由来の機能的抗体フラグメントの分泌が開示されている例えば、BetteretalSkerraetalScience24010381041を参照。例えば、Fab’-SHフラグメントは、大腸菌から直接回収し、化学的に結合させて二重特異性抗体を形成させることができるCarteretalBioTechnology10163167ShalabyetalJExpMed175217225。ShalabyetalJExpMed175217225には、完全ヒト化二重特異性抗体Fab’2分子の生成が記載されている。各Fab’フラグメントは、大腸菌Ecoliから別々に分泌され、指示されたinvitroでの化学的結合を受けることで、重特異性抗体を形成した。二重特異性抗体または多特異的抗体フラグメントを組換え細胞培養物から直接作製および単離するための様々な技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパー、例えばGCN4を用いて生産されている一般には、KostelnyetalJImmunol14815471553を参照。FosおよびJunタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって2つの異なる抗体のFab’部分に連結された。抗体ホモ二量体はヒンジ領域で還元されることにより、単量体を形成し、その後再酸化されて抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法は、抗体ホモ二量体の生成にも利用できる。上記のダイアボディは、二重特異性抗体の一例である。例えば、HollingeretalProcNatlAcadSciUSA9064446448を参照されたい。二価の二重特異性抗体はジスルフィド結合によって安定化することができる。安定な単一特異性または二重特異性のFv四量体は、scFv22立体配置の非共有結合性会合によって、つまりビス-テトラボディとして、生成することもできる。あるいは、2つの異なるscFvは、縦一列に連結されて、ビス-scFvを形成し得る。一本鎖FvsFv二量体の使用により二重特異性抗体フラグメントを作製する別の方法も報告されている。GruberetalJImmunol1525368を参照されたい。1つのアプローチは、2つのscFv抗体をリンカーまたはジスルフィド結合で連結することであったMallenderandVossJBiolChem2691992061994、国際公開第94/13806号、および米国特許第5,989,830号、これらの開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。あるいは、二重特異性抗体は、ZapataetalProteinEng810571062に記載されるように生成された線状抗体であってもよい。簡潔に説明すると、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対の直列FdセグメントVH-CH1-VH-CH1を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。3つ以上の価を有する抗体も企図される。例えば、三重特異性抗体を作製することができるTuttetalJImmunol14760。キレート化組換え抗体は、標的抗原の隣接する非オーバーラップエピトープを認識する二重特異性抗体であり、両方のエピトープに同時に結合するのに十分なだけの融通性を有するNerietalJMolBiol246367731995。二重特異性Fab-scFvバイボディbibodyおよび三重特異性Fab-scFv2トリボディtribodyの作製については、SchoonjansetalおよびWillemsetalに記載がなされている。バイボディまたはトリボディについて、scFv分子は、VLCLLおよびVHCH1Fd鎖の一方または両方に融合される。例えば、トリボディを作製するために、2つのscFvをFabのC末端に融合し、バイボディでは、一方のscFvをFabのC末端に融合する。さらに別の方法では、遊離システインが親タンパク質に導入された後に、二量体、三量体、および四量体が作製される。変動する数2~4個のマレイミド基を有するペプチドベースの架橋剤が、目的のタンパク質を遊離システインに架橋するのに使用されたCochranetalImmunity1224150、この開示はその全体が本明細書に組み込まれる。免疫グロブリンの他の実施形態本発明の免疫グロブリンには、ぺプチボディpeptibodyも含まれる。ぺプチボディという用語は、少なくとも1個のペプチドに結合した抗体Fcドメインを含む分子を表す。ペプチボディの作製は、2000年5月4日に公開されたPCT公報WO00/24782に一般的に記述される。これらのペプチドのいずれも、リンカーを用いても用いなくても、直列にすなわち、連続的に連結することができる。システイニル残基を含有するペプチドは、別のCys含有ペプチドと架橋結合することができ、その一方または両方がビヒクルに連結され得る。2つ以上のCys残基を有するペプチドはいずれも、ペプチド内ジスルフィド結合も形成し得る。これらのペプチドのいずれもが、誘導体化され得る。例えばカルボキシル末端はアミノ基でキャッピングされ得、システインはキャップcappeであり得、またはアミノ酸残基はアミノ酸残基以外の部分によって置換され得る例えば、BhatnagaretalJMedChem3938149およびCuthbertsonetalJMedChem40287682を参照これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。抗体に対する親和性成熟と同様に、ペプチド配列は最適化されるか、あるいはアラニンスキャニングまたはランダムもしくは定方向突然変異誘発によって改変され、その後最良の結合剤を特定するためにスクリーニングが行われ得る。LowmanAnnRevBiophysBiomolStruct2640124。免疫グロブリンの所望の活性を保持しつつ、種々の分子を、免疫グロブリン構造、例えば、ペプチド部分それ自体の内部またはペプチドと免疫グロブリンのビヒクル部分の間に挿入することができる。例えば、Fcドメインもしくはそのフラグメント等の分子、ポリエチレングリコールまたはデキストラン、脂肪酸、脂質、コレステロール基、小分子炭水化物、ペプチド、本明細書に記載のような検出可能部分蛍光剤、放射性同位元素等の放射標識を含む、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、干渉または他のRNA、酵素、ホルモン等の他の関連分子は、容易に挿入され得る。この様式での挿入に適切な他の分子は、当業者には明らかであり、本発明の範囲内に包含される。これには、例えば、所望により適切なリンカーで連結された2つの連続したアミノ酸の間にある所望の分子の挿入が含まれる。リンカーリンカーまたはリンカー部分とは、本明細書で同義的に使用される場合、本発明の組成物に含有されるポリペプチド鎖例えば、免疫グロブリンHCまたは免疫グロブリンLCまたは免疫グロブリンFcドメインのアミノ酸残基に共有結合する、生物学的に許容できるペプチジルまたは非ペプチジル有機基を表し、リンカー部分は、ポリペプチド鎖を、分子中の別のペプチドもしくはポリペプチド鎖に、または生物活性を有する小分子もしくはオリゴペプチド等の治療的部分に、または半減期延長部分に、共有結合的に連結または結合する。例えば、SullivanetalToxinPeptideTherapeuticAgents、US2007/0071764SullivanetalToxinPeptideTherapeuticAgents、PCT/米国特許出願公開第2007/022831号国際公開第2008/088422号として公開;および2009年3月20日に出願された米国仮特許出願第61/210,594、を参照されたいこれらは全てその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明の免疫グロブリンにおけるいかなるリンカー部分の存在も、任意のである。リンカーは、存在する場合、本発明の免疫グロブリンの分子の一つまたは複数の他の機能的部分に対し、1つの機能性部分の提示または位置を、配置する、連結する、接続する、または最適化するためのスペーサーとして主に機能するため、リンカーの化学構造は重要ではない。リンカー部分の存在は、本発明の免疫グロブリン抗体および抗体フラグメントを含むのいくつかの実施形態の薬理活性pharamcologialactivityを最適化する際に有用であり得る。リンカーは、ペプチド結合によって結合しているアミノ酸で構成されることが好ましい。リンカー部分は、存在する場合、本発明の免疫グロブリンに存在し得るあらゆる他の一つまたは複数のリンカーと、独立に同じであっても異なっていてもよい。上述のように、リンカー部分は、もし存在する場合免疫グロブリンの一次アミノ酸配列内にあっても、または治療的部分または半減期延長部分を本発明の免疫グロブリンに結合させるためのリンカーとしてであっても、ペプチジルの性質を有しすなわち、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸から構成される、好ましくは、1から最大約40アミノ酸残基長、より好ましくは、1から最大約20アミノ酸残基長、最も好ましくは1から約10アミノ酸残基長で構成され得る。リンカー中のアミノ酸残基は、20個の標準canonicalアミノ酸、より好ましくは、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、および/またはセリンの中から選択されるのが好ましいが、必ずしもそうである必要はない。さらにより好ましくは、ペプチジルリンカーは、ペプチド結合で連結したグリシン、セリン、およびアラニン等の立体的に障害にならないアミノ酸の過半数から構成される。また、ペプチジルリンカーは、もし存在する場合、invivo循環における急速なタンパク分解による代謝回転を回避するよう選択されることが望ましい。当業者には十分に理解されるように、これらのアミノ酸のいくつかは、グリコシル化される場合がある。例えば、シアリル化部位を構成する有用なリンカー配列は、X1X2NX4X5G配列番号148であり、ここでX1、X2、X4およびX5はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である。他の実施形態では、ペプチジルリンカー部分の1~40個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。リンカーは、グリシンおよびアラニン等の立体的に障害にならないアミノ酸の過半数から構成されることが好ましい。従って、好ましいリンカーには、ポリグリシン、ポリセリン、およびポリアラニン、またはこれらのうちいずれかの組み合わせが含まれる。いくつかの例示的なペプチジルリンカーは、ポリGly1-8、特にGly3、Gly4配列番号149、Gly5配列番号150およびGly7配列番号151、並びに、ポリGly4Ser配列番号152、ポリGly-Ala2-4およびポリAla1-8である。他のペプチジルリンカーの具体例としては、Gly5Lys配列番号154、およびGly5LysArg配列番号155が挙げられる。有用なペプチジルリンカーの他の例は:有用なペプチジルリンカーの他の例は以下のとおりである:Gly3LysGly4配列番号159;Gly3AsnGlySerGly2配列番号156;Gly3CysGly4配列番号157;およびGlyProAsnGlyGly配列番号158。上記命名法を説明すると、例えば、Gly3LysGly4は、Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly配列番号159を意味する。GlyおよびAlaの他の組み合わせも有用である。一般に使用されるリンカーは、本明細書においてL5GGGGS;またはG4S;配列番号152、L10GGGGSGGGGS;配列番号153、L25GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;配列番号146と特定され得るリンカー、および本明細書中下記の実施例で使用されるあらゆるリンカーを含む。ペプチドリンカー部分を含む本発明の組成物の一部の実施形態では、酸性残基、例えば、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基が、リンカー部分のアミノ酸配列に配置される。例としては、以下のペプチドリンカー配列が含まれる:GGEGGG配列番号160;GGEEEGGG配列番号161;GEEEG配列番号162;GEEE配列番号163;GGDGGG配列番号164;GGDDDGG配列番号165;GDDDG配列番号166;GDDD配列番号167;GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS配列番号168;WEWEW配列番号169;FEFEF配列番号170;EEEWWW配列番号171;EEEFFF配列番号172;WWEEEWW配列番号173;またはFFEEEFF配列番号174。他の実施形態では、リンカーはリン酸化部位、例えば、X1X2YX4X5G配列番号175ここで、X1、X2、X4、およびX5はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である;X1X2SX4X5G配列番号176ここで、X1、X2、X4およびX5はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である;またはX1X2TX4X5G配列番号177ここで、X1、X2、X4およびX5はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基であるを構成する。本明細書に示されるリンカーは例示的なものであり;本発明の範囲内のペプチジルリンカーはさらにより長い場合もあり、他の残基を含む場合もある。ペプチジルリンカーは、半減期を延長させる部分と結合させるための、例えば、システイン、別のチオール、または求核試薬を含有し得る。別の実施形態では、リンカーは、官能性の半減期延長部分であるマレイミド、ヨードアセトアミドまたはチオエステルへの結合のための、システインもしくはホモシステイン残基、または他の2-アミノ-エタンチオールもしくは3-アミノ-プロパンチオール部分を含有する。別の有用なペプチジルリンカーは、無作為のGly/Ser/Thr配列、例えば:GSGSATGGSGSTASSGSGSATH配列番号178またはHGSGSATGGSGSTASSGSGSAT配列番号179を含む、大型の可動性リンカーであり、約1kDaのサイズのPEG分子であると推定される。あるいは、有用なペプチジルリンカーは、当該技術分野において周知のアミノ酸配列から構成されて、強固な螺旋構造例えば、リジットリンカー:-AEAAAKEAAAKEAAAKAGG-配列番号180を形成し得る。さらに、ペプチジルリンカーは、式-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-の六炭素脂肪族分子等の非ペプチジルセグメントを含んでいてもよい。ペプチジルリンカーは、改変されて本明細書に記載のような誘導体を形成してもよい。所望により、非ペプチジルリンカー部分は、半減期延長部分結合トキシンペプチド類似体のペプチド部分に、半減期延長部分を結合させるのにも有用である。例えば、-NH-CH2s-CO-式中、s=2~20等のアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル例えば、C1~C6、低級アシル、ハロゲン例えば、Cl、Br、CN、NH2、フェニル等の、任意の非立体的な障害基hinderinggroupでさらに置換されてもよい。例示的な非ペプチジルリンカーは、ポリエチレングリコールPEGリンカー例えば、以下に示される:I[0002]式中、nはリンカーが約100~約5000ダルトンDa、好ましくは約100~約500Daの分子量を有するようなものである。一実施形態では、非ペプチジルリンカーはアリールである。リンカーは、当該技術分野において記述されているのと同じ方法で、改変されて誘導体を形成してもよく、例えば、SullivanetalToxinPeptideTherapeuticAgentsUS20070071764SullivanetalToxinPeptideTherapeuticAgents、PCT/米国特許出願公開第2007/022831号国際公開第2008/088422号として公開;および2009年3月20日に出願された米国仮特許出願第61/210,594号に記述されており、これらは全てその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。さらに、PEG部分は、PEGアルデヒドを用いての還元的アルキル化またはヒドロキシスクシンイミドもしくはPEGの炭酸エステルを用いてのアシル化によって、またはチオール結合によって、N末端のアミンまたは選択された側鎖アミンに結合され得る。アリールは、フェニルまたは飽和、部分飽和、または不飽和の、3、4、または5員の炭素架橋と近傍融合したフェニルであり、該フェニルまたは架橋はC1-8アルキル、C1-4ハロアルキルまたはハロから選択される0、1、2または3個の置換基によって置換されている。ヘテロアリールは、不飽和の5、6もしくは7員の単環式環、または部分飽和もしくは不飽和の6、7、8、9、10もしくは11員の二環式環であり、ここで、少なくとも1個の環は不飽和であり、該単環式および該二環式環はN、OおよびSから選択される1、2、3または4個の原子を含有し、該環はC1-8アルキル、C1-4ハロアルキルおよびハロから選択される0、1、2または3個の置換基によって置換されている。非ペプチジルリンカーまたは非ペプチド半減期延長部分等の本発明の組成物の非ペプチド部分は、従来の有機化学反応によって合成することができる。以上は単に説明のためのものであり、本発明に従って所望により使用され得るリンカーの種類を包括的に扱うものではない。免疫グロブリン変異体の生成上で言及したように、組換えDNA介在性および/もしくはRNA介在性のタンパク質発現およびタンパク質工学技術、またはペプチド作製のいかなる他の方法も、本発明の組成物の作製に適用可能である。例えば、ポリペプチドは、形質転換された宿主細胞において作製することができる。簡潔に説明すると、ペプチドをコードする組換えDNA分子、すなわちコンストラクトが作製される。そのようなDNA分子を作製するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ペプチドをコードする配列を、適切な制限酵素を用いてDNAから切除することができる。多くの入手可能で周知の宿主細胞はいずれも、本発明の実施に使用することができる。具体的な宿主の選択は、当該技術分野で認められるいくつかの因子に依存する。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、DNA分子にコードされるペプチドの毒性、形質転換率、ペプチド回収の容易さ、発現特性、バイオセイフティおよび費用が含まれる。全ての宿主が特定のDNA配列の発現に対して等しく効果的であり得るわけではないことを理解して、これらの因子の釣り合いを決定しなければならない。これらの一般的な指針の中で、培養液中で有用な微生物宿主細胞には、細菌大腸菌Escherichiacoli種等、酵母サッカロマイセスSaccharomyces種等および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類例えばヒト細胞、例えば、CHO細胞およびHEK-293細胞、並びに本明細書に記載された、または当該技術分野において周知の他の種類が含まれる。変更はDNAレベルでも同様になされ得る。ペプチドをコードするDNA配列は、選択された宿主細胞により適合するコドンに変化させてもよい。大腸菌Ecoliの場合、最適化されたコドンが当該技術分野において周知である。制限酵素認識部位を除去するために、または、選択された宿主細胞におけるDNAのプロセシングで役立ち得るサイレント制限酵素認識部位を含むために、コドンを置換することができる。次に、形質転換された宿主は培養および精製される。所望の化合物が発現されるために、宿主細胞を従来の発酵条件下で培養してもよい。そのような発酵条件は、当該技術分野において周知である。さらに、DNAは所望により、5’から融合タンパク質のコード領域まで、発現された免疫グロブリンに機能的に連結したシグナルペプチド配列例えば、分泌シグナルペプチドをさらにコードする。適切な組換え法のさらなる例、および哺乳類細胞による本発明の組成物の組換え発現に有用な例示的DNAコンストラクト、例えば本発明の特異的結合剤に結合した二量体Fc融合タンパク質ペプチボディpeptibodyまたはキメラ免疫グロブリン軽鎖重鎖-Fcヘテロ三量体ヘミボディhemibodyについては、例えば、SullivanetalToxinPeptideTherapeuticAgents、US2007/0071764SullivanetalToxinPeptideTherapeuticAgents、PCT/米国特許出願公開第2007/022831号国際公開第2008/088422号として公開;および2009年3月20日に出願された米国仮特許出願第61/210,594号を参照されたいこれらは全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる。所望の免疫グロブリンのアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化をコードDNAに導入することにより、またはペプチド合成により、作製することができる。そのような変異体には、例えば、免疫グロブリンまたは抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および/または挿入および/または置換が含まれる。欠失、挿入、および置換のいかなる組み合わせも、最終構築物が所望の特徴を持つことを条件として、最終構築物に到達する。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させる等の、免疫グロブリンの翻訳後プロセシングも変化させ得る。ある場合においては、免疫グロブリン変異体は、エピトープ結合に直接関わるアミノ酸残基を改変する目的で作製される。他の実施形態では、エピトープ結合に直接には関わらない残基、またはエピトープ結合に何ら関わりもない残基の改変は、本明細書で論じられる目的には望ましい。CDR領域および/またはフレームワーク領域のいずれかの内部における変異誘発が企図される。抗体または抗体フラグメントを含む免疫グロブリンのアミノ酸配列における有用な改変を設計するために、当業者は共分散分析技術を使用することができる。DemarestetalOptimizationoftheAntibodyCH3DomainbyResidueFrequencyAnalysisofIgGSequencesJMolBiol3354148HugoetalVLposition34isakeydeterminantfortheengineeringofstableantibodieswithfastdissociationratesProteinEngineering1638186AuroraetalSequencecovariancenetworksmethodsandusesthereofUS20080318207A1GlaseretalStabilizedpolypeptidecompositions米国特許出願公開第2009/0048122A1号UrechetalSequencebasedengineeringandoptimizationofsinglechainantibodies、国際公開第2008/110348A1号BorrasetalMethodsofmodifyingantibodiesandmodifiedantibodieswithimprovedfunctionalproperties、国際公開第2009/000099A2号。共分散分析により決定されたそのような改変は、免疫グロブリンの作用強度、薬物動態学的特徴、薬力学的特徴、および/または製造性の特徴を向上させることができる。免疫グロブリンまたは抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において周知の種々の方法によって作製される。そのような方法には、免疫グロブリンの以前に作製された変異体または非変異体バージョンの、オリゴヌクレオチドを介したまたは部位特異的な変異誘発、PCR変異誘発、およびカセット変異導入が含まれる。超可変領域すなわちCDR領域またはフレームワーク領域のいずれか内部における置換変異誘発が企図される。変異誘発にとって好ましい位置にある、免疫グロブリンの特定の残基または領域を特定するための有用な方法は、アラニンスキャニング変異誘発と呼ばれており、CunninghamandWellsScience24410811085に記載されるようなものである。本明細書において、残基または標的残基の群が特定され例えば、Arg、Asp、His、LysおよびGluなどの電荷を有する残基、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を及ぼすよう、中性または負の電荷を有するアミノ酸最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニンで置換される。次いで、置換に対し機能感受性を示すアミノ酸部位を、置換部位にまたはその代わりに、さらなる変異体またはその他の変異体を導入することによって改良する。従って、アミノ酸配列変化を導入する部位は予め決定されているが、変異の性質自体は、予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位での変異の動向を分析するために、Alaスキャニングまたはランダム変異誘発を、標的コドンまたは領域で実施し、発現された改変体を、所望の活性についてスクリーニングする。本発明の免疫グロブリンのいくつかの実施形態は、合成法によっても作製可能である。固相合成は、小分子ペプチドを調製するのに最も対費用効果の高い方法であるため、それぞれのペプチドを調製するのに好ましい技術である。例えば、周知の固相合成技術には、保護基、リンカー、および固相担体の使用、並びに、特定の保護および脱保護の反応条件、リンカーの切断条件、スカベンジャーの使用、並びに固相ペプチド合成の他の態様が含まれる。適切な技術は当該技術分野において周知である例えば、MerrifieldChemPolypeptidespp33561MerrifieldJAmChemSoc852149DavisetalBiochemIntl10394414StewartandYoungSolidPhasePeptideSynthesis米国特許第3,941,763号FinnetalTheProteins2105253andEricksonetalTheProteins2257527ProtectingGroupsinOrganicSynthesis3rdEditionTWGreeneandPGMWutsEdsJohnWileySonsInc1999NovaBiochemCatalog2000SyntheticPeptidesAUsersGuideGAGrantEdWHFreemanCompanyNewYorkNY1992AdvancedChemtechHandbookofCombinatorialSolidPhaseOrganicChemistryWDBennetJWChristensenLKHamakerMLPetersonMRRhodesandHHSaneiiEdsAdvancedChemtech1998PrinciplesofPeptideSynthesis2ndedMBodanszkyEdSpringerVerlag1993ThePracticeofPeptideSynthesis2ndedMBodanszkyandABodanszkyEdsSpringerVerlag1994ProtectingGroupsPJKocienskiEdGeorgThiemeVerlagStuttgartGermany1994FmocSolidPhasePeptideSynthesisAPracticalApproachWCChanandPDWhiteEdsOxfordPress2000GBFieldsetalSyntheticPeptidesAUsersGuide199077183。本発明の組成物の作製に適用可能な、当該技術分野において周知の合成方法および精製方法のさらなる例としては、例えば、SullivanetalToxinPeptideTherapeuticAgents、US2007/0071764およびSullivanetalToxinPeptideTherapeuticAgents、PCT/米国特許出願公開第2007/022831号国際公開第2008/088422A2号として公開を参照されたいこれらの両方はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書における免疫グロブリンのいずれか、並びに変異体をさらに説明する際、天然ペプチドおよびタンパク質表3に一般に組み入れられる20個の標準canonicalアミノ酸残基の種類を表すために、一文字略号方式がしばしば適用される。このような一文字略号は、意味の上で、三文字略号または省略されていないアミノ酸名と完全に同義である。本明細書に使用されている一文字略号方式において、大文字はLアミノ酸を示し、小文字はDアミノ酸を示す。例えば、略号RはL-アルギニンを表し、略号rはD-アルギニンを表す。本明細書において、アミノ酸配列中のアミノ酸置換は、特定の位置におけるアミノ酸残基に対する一文字略号に続き、元の目的配列に対する数字のアミノ酸位置、次いで、これに続く、置換されたアミノ酸残基に対する一文字記号によって典型的に表される。例えば、T30Dは、元の目的配列に対して、アミノ酸位置30におけるアスパラギン酸残基によるトレオニン残基の置換を表す。別の例として、W101Fは、元の目的配列に対して、アミノ酸位置101におけるフェニルアラニン残基によるトリプトファン残基の置換を表す。非標準アミノ酸残基は、組換え的に発現している細胞を使用するタンパク質工学の公知の技術を使用することにより、本発明の範囲内でポリペプチドに組み込むことができる。例えば、LinketalNoncanonicalaminoacidsinproteinengineeringCurrentOpinioninBiotechnology14603609を参照。非標準アミノ酸残基という用語は、天然タンパク質中に一般的に取り込まれる20個の標準アミノ酸に属さないD又はL型のアミノ酸残基、例えば、β-アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び誘導体化された側鎖を有するアミノ酸を表す。例としては、L型またはD型のβ-アラニン、β-アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプリオ酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Nα-エチルグリシン、Nα-エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ-ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、ω-メチルアルギニン、Nα-メチルグリシン、Nα-メチルイソロイシン、Nα-メチルバリン、γ-カルボキシグルタミン酸、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、Nα-アセチルセリン、Nα-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、および他の同様なアミノ酸、並びに下記表4に列挙されるもの、並びに本明細書に記載のこれらのうちいずれかの誘導体化型が挙げられる。表4は、本発明に基づく有用ないくつかの例示的な非標準アミノ酸残基、および本明細書で通常使用される関連略号を含むが、異なる略号および命名法が同じ物質に適用可能であり、本明細書に同義的に現れることは熟練した実施者ならば理解するであろう。UPAC-IUB生物化学の命名法に関する合同委員会JCBNによるアミノ酸及びペプチドに対する命名法及び記号表記は、以下の文書に公表されている:BiochemJ1984219345373EurJBiochem19841389371985152119932132InternatJPeptProtRes198424p84に従うJBiolChem19852601442PureApplChem198456595624AminoAcidsandPeptides198516387410BiochemicalNomenclatureandRelatedDocuments2ndeditionPortlandPress1992pages3969。本発明の免疫グロブリンのペプチドドメインに対する一つまたは複数の有用な改変には、既知の化学的手法によって達成される、アミノ酸の付加もしくは挿入、アミノ酸欠失、ペプチド切断、アミノ酸置換、および/またはアミノ酸残基の化学誘導体化が含まれ得る。例えば、このように改変されたアミノ酸配列には、目的の天然配列のアミノ酸配列に対して、そこに挿入または置換された少なくとも1つのアミノ酸残基が含まれ、その中で該挿入または置換されたアミノ酸残基は求核性または求電子性の反応性官能基を含む側鎖を有し、それによってペプチドはリンカーおよび/または半減期延長部分に結合する。本発明によると、そのような求核性または求電子性の反応性官能基の有用な例としては、チオール、一級アミン、セレノ、ヒドラジド、アルデヒド、カルボン酸、ケトン、アミノオキシ、マスクされた保護アルデヒド、またはマスクされた保護ケト官能基が挙げられるが、これらに限定はされない。求核性の反応性官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基の例としては、リジン残基、ホモリジン、α,β-ジアミノプロピオン酸残基、α,γ-ジアミノ酪酸残基、オルニチン残基、システイン、ホモシステイン、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、またはセレノシステイン残基が挙げられるが、これらに限定はされない。アミノ酸残基は一般に、異なる化学的特徴および/または物理的特徴に従って分類される。酸性アミノ酸残基という用語は、酸性基を含む側鎖を有するD型またはL型のアミノ酸残基を表す。例示的な酸性残基としては、アスパラギン酸aspartaticacidおよびグルタミン酸glutamaticacid残基が挙げられる。アルキルアミノ酸残基という用語は、直鎖、分岐鎖、または環状であってよいC1-6アルキル側鎖を有するD型またはL型のアミノ酸残基を表し、例えば、プロリン等中におけるアミノ酸アミンを表し、ここでC1-6アルキルは、C1-4ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、-C=ORb、-C=OORa、-C=ONRaRa、-C=NRaNRaRa、-NRaC=NRaNRaRa、-ORa、-OC=ORb、-OC=ONRaRa、-OC2-6アルキルNRaRa、-OC2-6アルキルORa、-SRa、-S=ORb、-S=O2Rb、-S=O2NRaRa、-NRaRa、-NRaC=ORb、-NRaC=OORb、-NRaC=ONRaRa、-NRaC=NRaNRaRa、-NRaS=O2Rb、-NRaS=O2NRaRa、-NRaC2-6アルキルNRaRaおよび-NRaC2-6アルキルORaから選択される0、1、2または3個の置換基により置換されており;ここでRaは独立して、それぞれの場合において、HまたはRbであり;Rbは独立して、それぞれの場合において、ハロ、C1-4アルキル、C1-3ハロアルキル、-OC1-4アルキル、-NH2、-NHC1-4アルキル、および-NC1-4アルキルC1-4アルキルから選択される0、1、2または3個の置換基によって置換されたC1-6アルキルであり;あるいは、あらゆるそのプロトン化形態、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、ヒドロキシプロリンを表すが、その残基にはアリールも芳香族基も含有されない。芳香族アミノ酸残基という用語は、芳香族基を含む側鎖を有するD型またはL型のアミノ酸残基を表す。例示的な芳香族残基としては、トリプトファン、チロシン、3-1-ナフチルアラニン、またはフェニルアラニン残基が挙げられる。塩基性アミノ酸残基という用語は、塩基性基を含む側鎖を有するD型またはL型のアミノ酸残基を表す。例示的な塩基性アミノ酸残基としては、ヒスチジン、リジン、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、N-メチル-アルギニン、ω-アミノアルギニン、ω-メチル-アルギニン、1-メチル-ヒスチジン、3-メチル-ヒスチジン、およびホモアルギニンhR残基が挙げられる。親水性アミノ酸残基という用語は、極性基を含む側鎖を有するD型またはL型のアミノ酸残基を表す。例示的な親水性残基としては、システイン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、およびシトルリンCit残基が含まれる。親油性アミノ酸残基という用語は、無電荷の、脂肪族または芳香族の基を含む側鎖を有するD型またはL型のアミノ酸残基を表す。例示的な親油性側鎖としては、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。アラニンAは両親媒性であり、親水性残基としてまたは親油性残基として作用可能である。従って、アラニンは、親油性残基および親水性残基の両方の定義内に含まれる。非機能性アミノ酸残基という用語は、酸性基、塩基性基、または芳香族基を欠いている側鎖を有するD型またはL型のアミノ酸残基を表す。例示的な中性アミノ酸残基としては、メチオニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、およびノルロイシンNle残基が挙げられる。さらなる有用な実施形態は、本明細書で開示されるポリペプチドのアミノ酸配列の保存的な改変からもたらされ得る。保存的改変は、そのような改変がなされる結合される例えば、PEG結合ペプチドと同様の機能的、物理的、および化学的特徴を有する半減期延長部分結合ペプチドを生成する。本明細書で開示される結合ポリペプチドのそのような保存的改変型もまた、本発明の実施形態であることが企図される。対照的に、ペプチドの機能的特徴および/または化学的特徴における実質的な改変は、a例えば、αらせん高次構造等の、置換の領域中の分子の主鎖構造、b標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、またはc分子の大きさの維持に対するそれらの影響という点で大きく異なる、アミノ酸配列における置換を選択することで達成できる。例えば、保存的アミノ酸置換は、元のnativeアミノ酸残基を、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に対する影響がほとんどない別のnonnative残基で置換することを含み得る。さらに、ポリペプチド中のあらゆる天然残基は、アラニンスキャニング変異誘発について以前に記載されたように、アラニンで置換することもできる例えば、アラニンスキャニング変異誘発について論じている、MacLennanetalActaPhysiolScandSuppl6435567Sasakietal1998AdvBiophys35124を参照。所望のアミノ酸置換保存的であるか非保存的であるかに関わらずは、そのような置換が所望された時に、当業者によって決定され得る。例えば、ペプチド配列の重要な残基を特定するために、または本明細書に記載のペプチドもしくはビヒクル結合ペプチド分子の親和性を増加もしくは減少させるために、アミノ酸置換を利用することができる。天然残基は共通の側鎖性質に基づいて分類できる:1疎水性:ノルロイシンNorまたはNle、Met、Ala、Val、Leu、Ile;2中性且つ親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;3酸性:Asp、Glu;4塩基性:His、Lys、Arg;5鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;および6芳香族:Trp、Tyr、Phe。保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうち1つの構成要素を、同じクラスの別の構成要素で置換することを含み得る。保存的アミノ酸置換は、非天然アミノ酸残基を含んでもよく、これらは通常、生物系での合成によってではなく、化学的なペプチド合成によって組み込まれる。これらにはペプチド模倣薬、およびアミノ酸部分を逆転または反転させた他の形態も含まれる。非保存的置換は、これら種類の1つのうちのあるメンバーを、別の種類からのあるメンバーに置換することを含み得る。そのような置換された残基は、トキシンペプチド類似体の領域に導入することができる。そのような変更を行う際、ある特定の実施形態によれば、アミノ酸のハイドロパシー指標が考慮され得る。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づくハイドロパシー指標が割り当てられている。それらは、イソロイシン4.5;バリン4.2;ロイシン3.8;フェニルアラニン2.8;システイン/シスチン2.5;メチオニン1.9;アラニン1.8;グリシン-0.4;トレオニン-0.7;セリン-0.8;トリプトファン-0.9;チロシン-1.3;プロリン-1.6;ヒスチジン-3.2;グルタミン酸-3.5;グルタミン-3.5;アスパラギン酸-3.5;アスパラギン-3.5;リジン-3.9;およびアルギニン-4.5である。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与える上でのハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当該技術分野では理解されていることである例えば、Kyteetal1982JMolBiol157105131を参照。あるアミノ酸が同様のハイドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換されて、なお同様の生物活性を保持する場合があることが知られている。ハイドロパシー指標に基づいて変更を行う際、ある実施形態では、ハイドロパシー指標が±2以内であるアミノ酸の置換も含まれる。いくつかの実施形態では、±1以内であるものが含まれ、別の実施形態では、±0.5以内のものが含まれる。また、類似アミノ酸の置換が親水性に基づいて効率的に行われ得ることは、特に、本明細書に記載されるように、それによって生成された生物学的な機能を持つタンパク質またはペプチドが免疫学的な実施形態での使用を意図したものである場合、当該技術分野において理解されていることである。ある実施形態では、隣接するアミノ酸の親水性によって規定される、あるタンパク質の最大の局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわち該タンパク質の生物学的特性と相関関係を持つ。以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン30;リジン30;アスパラギン酸30±1;グルタミン酸30±1;セリン03;アスパラギン02;グルタミン02;グリシン0;トレオニン04;プロリン05±1;アラニン05;ヒスチジン05;システイン10;メチオニン13;バリン15;ロイシン-1.8;イソロイシン18;チロシン23;フェニルアラニン25およびトリプトファン34。同様の親水性値に基づき変更を行う際、ある実施形態では、親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態では、±1以内のものが含まれ、ある実施形態では、±0.5以内のものが含まれる。親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域はエピトープコア領域とも称される。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンノルロイシン、アラニン、もしくはメチオニン等の1つの無極性疎水性アミノ酸残基の、別のものへの置換、例えばアルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、グリシンとセリン等の1つの極性親水性アミノ酸残基の別のものへの置換、リジン、アルギニンもしくはヒスチジン等の1つの塩基性アミノ酸残基の別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸等の1つの酸性残基の別のものへの置換が挙げられる。保存的アミノ酸置換という表現には、誘導体化されていない残基に代わって、化学的に誘導体化された残基を使用することも含まれるが、ただしそのようなポリペプチドが必須の生物活性を示すという条件がある。本発明に従い、有用であり得る他の例示的なアミノ酸置換を以下の表5に記載する。通常、免疫グロブリンのアミノ酸配列変異体は、元の免疫グロブリンまたは重鎖もしくは軽鎖の可変領域の抗体アミノ酸配列と、少なくとも60のアミノ酸配列同一性、または少なくとも65、または少なくとも70、または少なくとも75または少なくとも80同一性、より好ましくは少なくとも85同一性、さらにより好ましくは少なくとも90同一性、最も好ましくは、例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、および100を含む、少なくとも95同一性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性または相同性は、本明細書では、配列を整列させ、必要ならばギャップを導入して、最大の配列同一性を達成した後、いかなる保存的置換も配列同一性の部分と見なさなかった場合の、元の配列と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。免疫グロブリンまたは抗体の配列中への、N末端、C末端、または内部の、伸長、欠失、または挿入はいずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼさないと解釈されるものとする。アミノ酸配列挿入には、長さが1残基から100個以上の残基を含有するポリペプチドまで及ぶ、アミノ末端および/またはカルボキシル末端の融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の内部配列挿入も含まれる。末端挿入の例としては、N末端にメチオニル残基を有する免疫グロブリン、またはエピトープ標識もしくはサルベージ受容体結合エピトープと融合された免疫グロブリン抗体または抗体フラグメントを含むが挙げられる。免疫グロブリンまたは抗体分子の他の挿入による変異体には、免疫グロブリンの血清半減期を増加させる、例えばN末端またはC末端における、ポリペプチドへの融合が含まれる。エピトープ標識の例としては、fluHA標識ポリペプチドおよびその抗体12CA5FieldetalMolCellBiol821592165;c-myc標識並びにその抗体である8F9、3C7、6E10、G4、B7および9E10EvanetalMolCellBiol536103616;並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質DgD標識およびその抗体PaborskyetalProteinEngineering3547553が挙げられる。他の例示的な標識は、ニッケルキレート化を用いてそのように標識された化合物の単離を可能にする、通常は約6個のヒスチジン残基のポリヒスチジン配列である。FLAG商標登録標識イーストマンコダック社、ニューヨーク州ロチェスター等の他のラベルおよびタグは、当該技術分野において周知であり慣例で使用されるものである。抗体および抗体フラグメントを含む本発明の免疫グロブリンのアミノ酸置換変異体の、いくつかの具体的で非限定的な実施形態を、以下に例示する。免疫グロブリンの適切な高次構造の維持に関わらないシステイン残基はいずれも、通常はセリンと置換されることで、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合が免疫グロブリンに追加されることで、その安定性を向上させることが可能である特に、免疫グロブリンがFvフラグメント等の抗体フラグメントである場合。ある場合において、免疫グロブリン変異体は、開始配列においてエピトープ結合に直接関わっているアミノ酸残基を改変する目的で、作製される。他の実施形態では、エピトープ結合には直接関わらない残基、またはエピトープ結合に全く関わっていない残基の改変は、本明細書で論じられる目的には望ましい。CDR領域および/またはフレームワーク領域のいずれかの内部での変異誘発が企図される。どの抗原結合性タンパク質アミノ酸残基がエピトープの認識および結合に重要であるかを決定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って置換変異体を生成してもよい。例えば、CunninghametalScience24410811085を参照されたいこの開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。この方法では、個々のアミノ酸残基が1つずつアラニン残基と置換され、得られた抗体は、非改変ポリペプチドと比較して、その特異的エピトープとのその結合能についてスクリーニングされる。結合能が減少した改変抗原結合性タンパク質は、配列決定されて、どの残基が変化したかが決定され、それによって、結合または生物学的特性におけるその重要性が示される。抗原結合性タンパク質の置換変異体は、ランダムなアミノ酸変化が親ポリペプチド配列に導入される親和性成熟によって、作製することができる。例えば、OuwehandetalVoxSang742232321998RaderetalProcNatlAcadSciUSA95891089151998Dall’AcquaetalCurrOpinStructBiol84434501998を参照されたいこれらの開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。親和性成熟には、抗原結合性タンパク質、またはその変異体の作製およびスクリーニング、並びに得られた変異体からの、親抗原結合性タンパク質と比較して結合親和性の増加等の改変された生物学的特性を有するものの、選択が含まれる。置換変異体を生成するための都合の良い方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟である。簡潔に説明すると、いくつかの超可変領域部位が変異導入されて、各部位における全ての可能なアミノ置換が生成される。そのように生成された変異体は、各粒子内に封入されたM13の遺伝子III産物への融合体として、繊維状ファージ粒子の表面上に一価の様式で発現される。次に、ファージにより提示された変異体は、それらの生物活性例えば、結合親和性についてスクリーニングされる。例えば、国際公開第92/01047号、国際公開第93/112366号、国際公開第95/15388号および国際公開第93/19172号を参照されたい。現在の抗体親和性成熟方法は、2つの変異誘発カテゴリー、すなわち、確率論的および非確率論的なものに分けられる。誤りがちなPCRerrorpronePCR、変異誘発菌種LowetalJMolBiol260359681996、および飽和変異誘発NishimiyaetalJBiolChem27512813202000ChowdhuryPSMethodsMolBiol178269852002は、確率論的な変異誘発法の典型例であるRajpaletalProcNatlAcadSciUSA1028466712005。非確率論的技術では、特定の変異タンパク質の限定された収集物を生成するために、しばしばアラニンスキャニングまたは部位特異的突然変異誘発が用いられる。いくつかの方法を以下に詳細に記載する。パニング法による親和性成熟組換え抗体の親和性成熟は一般的には、漸減量の抗原の存在下における、候補抗体の数回に渡るパニングを通して行われる。1回当たりの漸減量の抗原によって抗原に最も高い親和性を有する抗体が選択され、それにより、出発物質の大きなプールから高親和性の抗体が得られる。パニングによる親和性成熟は当該技術分野において周知であり、例えば、Hulsetalに記載がなされている。ファージディスプレイ技術を用いた親和性成熟の方法は、本明細書の別の部分に記載されており、当該技術分野において周知である例えば、DaughertyetalProcNatlAcadSciUSA972029342000を参照。ルックスルー変異誘発lookthroughmutagenesisルックスルー変異誘発LTMRajpaletalProcNatlAcadSciUSA1028466712005は、抗体結合部位を迅速にマッピングするための方法を提供する。LTMのために、20個の天然アミノ酸により提供される主要な側鎖化学の代表である9個のアミノ酸が選択され、抗体の全6個のCDRにおける全ての位置での、機能的側鎖の結合への関与が分析される。LTMは、CDR内に、位置的に連続したapositionalseriesof単一突然変異を生み出し、そこでは、それぞれの野生型残基は9個の選択されたアミノ酸のうちの1つにより意図的に置換される。変異したCDRは組み合わされて、全ての変異タンパク質の定量的表示に対し阻害的にならずに、複雑性およびサイズが増加していく一本鎖可変領域フラグメントscFvのコンビナトリアルライブラリが作製される。ポジティブ選択の後、向上した結合能を有するクローンが配列決定され、有益な変異がマッピングされる。誤りがちのPCR誤りがちのPCRには、異なる選択ラウンド間における核酸の無作為化が含まれる。無作為化は、使用されるポリメラーゼの内因的エラー率でもって低速で行われるが、転写中に高い内因的エラー率を有するポリメラーゼを使用するHawkinsetalJMolBiol226889961992、誤りがちのPCRZaccoloetalJMolBiol2857757831999によって促進され得る。変異サイクルの後、抗原に対して向上した親和性を有するクローンが、当該技術分野における通例の方法により選択される。遺伝子シャフリングおよび指向性進化を利用する技術が、所望の活性を目的として抗原結合性タンパク質、またはその変異体を作製およびスクリーニングするのに使用されてもよい。例えば、JermutusetalProcNatlAcadSciUSA987580では、リボソーム提示法に基づく、場合に応じたinvitroでの選択戦略が、DNAシャフリングによるinvitroでの多様化と組み合わされることで、scFvのオフ速度offrateまたは熱力学的安定性のいずれかが進化したことが示され;FermeretalTumourBiol2004JanApr25713では、DNAシャフリングと組み合わされたファージディスプレイの使用により、親和性がおよそ3桁上昇したことが報告された。DoughertyetalProcNatlAcadSciUSA2000Feb299720292034では、i機能的なクローンが超変異ライブラリにおいて、予想外に高頻度で発生すること、ii機能獲得型変異体がそのようなライブラリにかなり存在すること、およびiiiより高い親和性に至るscFv変異体の過半数が、結合部位から遠い残基に対するものであることが報告された。あるいは、または、さらに、抗原抗体複合体の結晶構造を解析して抗体と抗原の接触点を特定すること、またはコンピュータソフトウェアを使用してそのような接触点のモデルを作ることが有益な場合がある。本明細書で詳しく述べられる技術によれば、そのような接触残基および隣接残基は置換の候補である。そのような変異体が生成されると、それらは本明細書に記載されるようなスクリーニングを受け、一つまたは複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体が、さらなる開発のために選択され得る。修飾された炭水化物を有する免疫グロブリン例えば、免疫グロブリンに結合した炭水化物部分のうちの一つもしくは複数を付加もしくは除去して、および/または免疫グロブリン中の一つまたは複数のグリコシル化部位を付加もしくは除去して、親ポリペプチドに対して、修飾されたグリコシル化パターンを有する免疫グロブリン変異体を作製することもできる。抗体を含むポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、N結合型またはO結合型のいずれかである。N結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を表す。アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-トレオニンというトリペプチド配列ここでXは、プロリン以外の任意のアミノ酸であるが、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的な結合に対する認識配列である。ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が形成される。従って、N結合型グリコシル化部位は、これらのトリペプチド配列の1つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を変化させることによって免疫グロブリンに付加することができる。O結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も多いのはセリンまたはトレオニンへの、糖N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうち1つの結合を表すが、5ヒドロキシプロリンまたは5ヒドロキシリジンもまた、使用することができる。O結合型グリコシル化部位は、1つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基を元の免疫グロブリンまたは抗体の配列に挿入するか、または置換することによって、免疫グロブリンに付加することができる。変更されたエフェクター機能抗体またはFc含有ポリペプチドのFc領域において、システイン残基を除去または導入して、それにより、この領域での鎖間ジスルフィド結合形成を排除または増加することができる。このようにして作製されたホモ二量体免疫グロブリンは、向上した内部移行能力ならびに/または増加した補体媒介性細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害ADCCを有し得る。CaronetalJExpMed17611911195andShopesBJImmunol14829182922を参照されたい。ホモ二量体の免疫グロブリンまたは抗体は、WolffetalCancerResearch5325602565に記載されているように、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは、二重Fc領域を有する免疫グロブリンが操作され得、それによって、増強された補体溶解能力およびADCC能力を有し得る。StevensonetalAntiCancerDrugDesign3219230を参照されたい。重鎖または軽鎖のN末端の20個のアミノ酸残基例えば、シグナル配列のうちの一つまたは複数が除去されることも企図される。血清半減期を延長させるための修飾も望ましく、例えば、サルベージ受容体結合エピトープの組み込みまたは付加による修飾例えば、適切な領域の変異による、または、エピトープをペプチド標識に組み込み、その後いずれかの末端または中間で該免疫グロブリンに融合することによる修飾、例えば、DNA合成またはペプチド合成による修飾例えば、国際公開第96/32478号を参照、またはPEG等の分子、もしくは多糖類ポリマーを含む他の水溶性ポリマーを付加することによる修飾が挙げられる。サルベージ受容体結合エピトープは、任意の一つまたは複数のアミノ酸残基が、Fcドメインの1つまたは2つのループから、免疫グロブリンまたはフラグメントの類似の位置に移される、領域を構成することが好ましい。さらにより好ましくは、Fcドメインの1つまたは2つのループから3つ以上の残基が移される。さらにより好ましくは、エピトープは、Fc領域例えば、IgGののCH2ドメインから取り出され、免疫グロブリンまたは抗体の、CH1、CH3、もしくはVH領域、または2つ以上のそのような領域に移される。あるいは、エピトープはFc領域のCH2ドメインから取り出され、免疫グロブリンフラグメントのCL領域もしくはVL領域、または両方に移される。Fc変異体およびそれらのサルベージ受容体との相互作用について記述している、国際出願第97/34631号および第96/32478号も参照のこと。C1q結合部位等の、補体依存性細胞傷害CDC、および/または抗体依存性細胞傷害ADCCに関与する定常領域の他の部位およびアミノ酸残基が特定されている例えば、特定の位置における変異の影響について記載している、MolecImmunol296339ShieldsetalJBiolChem27665916604LazaretalProcNat’lAcadSci1034005を参照されたいそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。Fc受容体結合部位内の残基の変異は、Fc受容体に対する変更された親和性、変更されたADCC活性もしくはCDC活性、または変更された半減期等の変更されたすなわち増加または減少したエフェクター機能をもたらし得る。上記のように、起こり得る変異としては、一つまたは複数の残基の挿入、欠失または置換が挙げられ、例えば、アラニンとの置換、保存的置換、非保存的置換、または異なるサブクラスの同じ位置にある対応するアミノ酸残基との置換例えばIgG1残基の、その位置にある対応するIgG2残基との置換が含まれる。本発明はまた、変更された炭水化物構造を有し、その結果として変更されたエフェクター活性を有する、抗体および抗体フラグメントを含む免疫グロブリン分子の作製も包含し、例えば、向上したADCC活性を示す、フコシル化が欠けているまたは減少している抗体分子が挙げられる。これを達成するための様々な方法が当該技術分野において周知である。例えば、ADCCエフェクター活性は、抗体分子のFcγRIII受容体への結合によって仲介され、それは、CH2ドメインのAsn-297におけるN結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、増加した親和性でもってこの受容体と結合し、FcγRIII介在性エフェクター機能を、未変性のフコシル化抗体よりもより効率的に誘起する。例えば、α-1,6-フコシル基転移酵素がノックアウトされているCHO細胞中での非フコシル化抗体の組換え産生は、100倍増加したADCC活性を有する抗体をもたらすYamaneOhnukietalBiotechnolBioeng2004Sep58761422。同様の効果は、フコシル化経路におけるこの酵素または他の酵素の活性の減少を通して、例えば、該酵素をノックアウトするよう細胞株を操作し、または選択的グリコシル化阻害剤と一緒に培養する、siRNAまたはアンチセンスRNA処理を通して、達成され得るRothmanetalMolImmunol1989Dec26111323。いくつかの宿主細胞株、例えばLec13またはラットハイブリドーマYB2/0細胞株は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する。ShieldsetalJBiolChem2002Jul262772673340ShinkawaetalJBiolChem2003Jan31278346673。例えばGnTIII酵素を過剰発現する細胞での抗体の組換え産生による、二分されたbisected炭水化物のレベルの増加は、ADCC活性も増加させることが測定されている。UmanaetalNatBiotechnol1999Feb1717680。2つのフコース残基のうち1つのみの欠如が、ADCC活性を増加させるのに十分であり得ることが予想されているFerraraetalJBiolChem2005Dec5。免疫グロブリンの他の共有結合的修飾免疫グロブリンの他の特定の共有結合修飾も、本発明の範囲内に含まれる。それらは、適用可能な場合、化学合成によって、または免疫グロブリンもしくは抗体の酵素的もしくは化学的切断によってなされ得る。他のタイプの共有結合修飾は、標的アミノ酸残基を、選択された側鎖またはNもしくはC末端の残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることによって導入することができる。システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド等のα-ハロ酢酸塩および対応するアミンと反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-5-イミドゾイルプロピオン酸、リン酸クロロアセチル、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p‐クロロ第二水銀安息香酸塩、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。ヒスチジル残基は、pH5.5~7.0でのジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化されるが、それは、この試薬がヒスチジル側鎖に比較的特異的であるためである。パラ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり;pH6.0の0.1Mカコジル酸ナトリウム中にて反応が行われることが好ましい。リジニルlysinylおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの試薬による誘導体化は、リジニル残基の電位を逆転させる効果を有する。α-アミノ含有残基の誘導体化に適切な他の試薬としては、メチルピコリンイミダート、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロホウ化水素、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4-ペンタンジオン等のイミドエステル、およびアミノ基転移酵素により触媒されるグリオキシレートとの反応が挙げられる。アルギニル残基は、1または数種類の従来試薬、中でも、フェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のpKaが高いことから、アルカリ性条件で反応が行われることを必要とする。さらに、これらの試薬はリジン基、およびアルギニンのε-アミノ基と反応し得る。チロシル残基の特定の修飾は、スペクトルラベルspectrallabelをチロシル残基に導入するという特別な関心のもと、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により達成され得る。最も一般的には、N-アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンが用いられて、それぞれO-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイ用の標識化タンパク質の調製のために、125Iまたは131Iによってヨウ素化される。カルボキシル側鎖アスパルチルまたはグルタミルは、カルボジイミドR-N=C=N-R’式中、RおよびR’は、1-シクロヘキシル-3-2-モルホリニル-4-エチルカルボジイミドまたは1-エチル-3-4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチルカルボジイミド等の異なるアルキル基であるとの反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に、しばしば脱アミドされる。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内である。他の修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化TECreightonProteinsStructureandMolecularPropertiesWHFreemanCoSanFranciscopp7986、N末端アミンのアセチル化、並びにあらゆるC末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。共有結合修飾の別の種類には、化学的または酵素的に、グリコシドを免疫グロブリン例えば、抗体または抗体フラグメントにカップリングすることが含まれる。これらの手順は、NまたはO結合型グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞での免疫グロブリンの産生を必要としないという点で都合が良い。使用されるカップリング様式に応じて、糖は、aアルギニンおよびヒスチジン、b遊離カルボキシル基、cシステイン等における遊離スルフヒドリル基、dセリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリン等における遊離ヒドロキシル基、eフェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファン等における芳香族残基、またはfグルタミンのアミド基に結合し得る。これらの方法については、1987年9月11日に公開された国際公開第87/05330号、およびAplinandWristonCRCCritRevBiochempp259306に記載されている。免疫グロブリンに存在するいかなる炭水化物部分の除去も、化学的に、または酵素的に達成することができる。化学的な糖鎖除去は、免疫グロブリンの、トリフルオロメタンスルホン酸化合物、または同等の化合物への暴露を必要とする。この処理は、免疫グロブリンをインタクトのままにしつつ、連結している糖N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミン以外の大部分または全ての糖類の切断をもたらす。化学的な糖鎖除去については、HakimuddinetalArchBiochemBiophys25952およびEdgeetalAnalBiochem118131に記載がなされている。免疫グロブリン上の炭水化物部分の酵素的切断は、ThotakuraetalMethEnzymol138350に記載されているように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することで達成することができる。本発明の免疫グロブリン抗体および抗体フラグメントを含むの、別の種類の共有結合修飾には、免疫グロブリンを種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、またはデキストラン等の多糖類ポリマーのうちの1つへの連結が含まれる。そのような方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号、第4,179,337号、第4,766,106号、第4,179,337号、第4,495,285号、第4,609,546号またはEP315456を参照されたい。単離された核酸本発明の別の態様は、本発明の免疫グロブリンをコードする単離された核酸であり、例えば、本発明の抗体または抗体フラグメントをコードする単離された核酸等が挙げられるが、これに限定はされない。そのような核酸は、当該技術分野において周知の、および/または本明細書で開示される組み換え技術により、作製される。他の実施形態では、単離された核酸は、以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む免疫グロブリンをコードする:a該重鎖可変領域が配列番号323のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が配列番号188もしくは配列番号190のアミノ酸配列を含む;またはb該重鎖可変領域が配列番号321のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が配列番号188もしくは配列番号190のアミノ酸配列を含む;またはc該重鎖可変領域が配列番号325のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が配列番号182、配列番号188、もしくは配列番号190のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン。また、いくつかの実施形態では、単離された核酸は、以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む免疫グロブリンをコードする:a該軽鎖可変領域が配列番号196のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号335、配列番号349、配列番号351、配列番号353、配列番号355、もしくは配列番号359のアミノ酸配列を含む;またはb該軽鎖可変領域が配列番号204のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号349もしくは配列番号355のアミノ酸配列を含む;またはc該軽鎖可変領域が配列番号202のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号349のアミノ酸配列を含む;またはd該軽鎖可変領域が配列番号192のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号357、配列番号359、もしくは配列番号369のアミノ酸配列を含む;またはe該軽鎖可変領域が配列番号194のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号335、配列番号349、もしくは配列番号351のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン。他の例では、単離された核酸は、以下の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む免疫グロブリンをコードする:a該重鎖可変領域が配列番号323のアミノ酸配列を含み;該軽鎖可変領域が配列番号188のアミノ酸配列を含む;またはb該軽鎖可変領域が配列番号196のアミノ酸配列を含み;該重鎖可変領域が配列番号353のアミノ酸配列を含む;またはc該軽鎖可変領域が配列番号202のアミノ酸配列を含み;該重鎖可変領域が配列番号349のアミノ酸配列を含む;またはd該重鎖可変領域が配列番号325のアミノ酸配列を含み;該軽鎖可変領域が配列番号190のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン。または、一部の実施形態では、単離された核酸は、以下を含む免疫グロブリンをコードする:配列番号113のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号110のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;または配列番号125のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号122のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;または配列番号101のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号98のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;または配列番号119のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号116のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖。本発明は、ベクター、例えば、本発明の任意の単離された核酸を含む発現ベクターも対象としている。該技術分野において周知の、および/または本明細書で開示される分子生物学的手法によって作製される、発現ベクターを含む単離された宿主細胞も、本発明に包含される。本発明は、発現ベクターにコードされる免疫グロブリンの発現を可能にする条件下で、宿主細胞を培地中で培養すること;および免疫グロブリンを培地から回収すること、を含む方法も対象とする。免疫グロブリンの回収は、限定はされないが、本明細書の実施例1および別の場所で開示される抗体精製技術等の、抗体精製の既知の方法により達成される。遺伝子治療適切な細胞への治療的免疫グロブリンの送達は、当該技術分野において周知の任意の適切なアプローチを用いることで、exvivo、insitu、またはinvivoでの遺伝子治療を介して達成することができる。例えば、invivo治療の場合、所望の免疫グロブリンまたは抗体をコードする核酸は、単独で、またはベクター、リポソーム、もしくは沈殿物と併せて、対象に直接注射される場合があり、一部の実施形態では、免疫グロブリン化合物の発現が所望される部位に注射される場合もある。exvivo治療の場合、対象の細胞が採取され、核酸がこれらの細胞に導入され、その改変された細胞が直接的に対象に戻されるか、または、例えば、多孔質膜内に封入されて患者に埋め込まれる。例えば、米国特許第4,892,538号および第5,283,187号を参照されたい。核酸を生細胞に導入するのに利用可能な様々な技術が存在する。核酸が培養細胞に導入されるのがinvitroであるか目的の宿主の細胞中のinvivoであるかに応じて、技術は異なる。invitroで哺乳類細胞中に核酸を導入するのに適切な技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、化学的処置、DEAE-デキストラン、およびリン酸カルシウム沈殿の使用が含まれる。他のinvivoにおける核酸導入技術としては、ウイルスベクターアデノウイルス、単純ヘルペスIウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス等および脂質ベースの系を用いたトランスフェクションが挙げられる。核酸およびトランスフェクション試薬は所望により微小粒子と結合される。例示的なトランスフェクション試薬としては、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、四級アンモニウム両親媒性物質DOTMAGIBCO-BRLによりリポフェクチンとして商品化されている臭化ジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムFelgneretalProcNatlAcadSciUSA8474137417MaloneetalProcNatlAcadSciUSA8660776081;トリメチルアンモニウムのペンダントヘッドを有する親油性グルタミン酸ジエステルItoetalBiochemBiophysActa1023124132;陽イオン脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミンDOGS、Transfectam、プロメガ社およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミンDPPESなどの代謝可能な親脂質JPBehrTetrahedronLett2758615864JPBehretalProcNatlAcadSciUSA8669826986;代謝可能な第四級アンモニウム塩DOTB、メチル硫酸N-1-[2,3-ジオレオイルオキシ]プロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムDOTAPベーリンガーマンハイム社、ポリエチレンイミンPEI、ジオレオイルエステル、ChoTB、ChoSC、DOSCLeventisetalBiochimInter22235241;3β[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDC-Chol、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPE/3β[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDC-Cholの1対1の混合物GaoetalBiochimBiophysActa1065814、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミンBehretalBioconjugateChem19945382389、親油性ポリリシンLPLLZhouetalBiochimBiophysActa939818、過剰ホスファチジルコリン/コレステロールを伴う水酸化[[1,1,3,3-テトラメチルブチルクレゾキシ]エトキシ]エチル]ジメチルベンジルアンモニウム水酸化DEBDABallasetalBiochimBiophysActa939818、臭化セチルトリメチルアンモニウムCTAB/DOPE混合物PinnaduwageetalBiochimBiophysActa9853337、DOPE、CTAB、DEBDA、臭化ジドデシルアンモニウムDDABとグルタミン酸との親油性ジエステルTMAG、およびホスファチジルエタノールアミンと混合されたステアリルアミンRoseetalBiotechnique10520525、DDAB/DOPETransfectACE、ギブコ社GIBCOBRL、ならびにオリゴガラクトース担持脂質が挙げられる。導入効率を増加させる例示的なトランスフェクションエンハンサー試薬としては、例えば、DEAE-デキストラン、ポリブレン、リソソーム崩壊ペプチドOhmoriNIetalBiochemBiophysResCommunJun2719972357269、コンドロイタンchondroitanベースのプロテオグリカン、硫化プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリシンPollardHetalJBiolChem1998273750711、インテグリン結合ペプチドCYGGRGDTP配列番号235、線状デキストランノナサッカリドnonasaccharide、グリセロール、オリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシド間結合に係留したコレステリル基LetsingerRL1989ProcNatlAcadSciUSA8665536、リソホスファチド、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、および1-オレオイルリソホスファチジルコリンが挙げられる。場合によっては、核酸含有ベクターを標的細胞に方向付ける薬剤と共に核酸を送達することが望ましい場合がある。そのような標的化分子としては、標的細胞上の細胞表面の膜タンパク質に特異的な抗原結合性タンパク質、または標的細胞上の受容体に対するリガンドが挙げられる。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスに関わる細胞表面の膜タンパク質に結合するタンパク質が、標的化および/または取り込み促進のために使用される場合がある。そのようなタンパク質の例としては、特定の細胞型指向性のカプシドタンパク質およびそのフラグメント、循環中に内部移行を起こすタンパク質に対する抗原結合性タンパク質、並びに細胞内局在を標的とし、細胞内半減期を延長するタンパク質が挙げられる。他の実施形態では、受容体介在性のエンドサイトーシスが利用され得る。そのような方法は、例えば、Wuetal1987またはWagneretal1990に記載がなされている。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコルの概説としては、Anderson1992を参照されたい。また、国際公開第93/25673号およびそれに記載される参照も参照されたい。遺伝子治療技術の追加の概説としては、FriedmannScience24412751281AndersonNaturesupplementtovol392no6679pp2530VermaScientificAmerican6884およびMillerNature357455460を参照されたい。治療製剤の投与および調製本発明の方法の実施において使用される免疫グロブリンまたは抗体は、所望の送達方法に適切な担体を含む医薬組成物および薬剤に製剤化されてもよい。適切な担体には、免疫グロブリンまたは抗体と組み合わされる場合はあらゆる物質が含まれ、対象の免疫系と反応性を持たない。例としては、無菌リン酸緩衝食塩溶液、静菌水等のいくつかの標準的な医薬担体のいずれかが含まれるが、これらに限定はされない。様々な水性担体、例えば、水、緩衝化水、0.4食塩水、0.3グリシン等が使用されてよく、軽度の化学修飾等を受けたアルブミン、リポ蛋白、グロブリン等の安定性増強のための他のタンパク質も含まれてもよい。製剤中の例示的な免疫グロブリン濃度は、約0.1mg/ml~約180mg/mlもしくは約0.1mg/mL~約50mg/mL、もしくは約0.5mg/mL~約25mg/mL、もしくは約2mg/mL~約10mg/mLの範囲であってよい。免疫グロブリンの水性製剤は、例えば、pHが約4.5~約6.5、または約4.8~約5.5の範囲の、または約5.0のpH緩衝液中で、調製することができる。この範囲内のpHに適切な緩衝液の例としては、酢酸塩例えば酢酸ナトリウム、コハク酸塩コハク酸ナトリウム等、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液および所望の製剤の等張性に依存して、約1mM~約200mM、または約10mM~約60mMであってよい。免疫グロブリンを安定化することもできる等張化剤が製剤中に含まれてもよい。例示的な等張化剤としては、マンニトール、スクロースまたはトレハロース等のポリオールが挙げられる。水性製剤は等張であることが好ましいが、高張液または低張液が適切である場合もある。製剤中のポリオールの例示的な濃度は、約1~約15w/vの範囲であり得る。界面活性剤を、配合された免疫グロブリンの凝集の低減および/または製剤中での微粒子形成の最小化および/または吸着低減のために、免疫グロブリン製剤に添加してもよい。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート例えばポリソルベート20、またはポリソルベート80またはポロキサマー例えばポロキサマー188等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。例示的な界面活性剤の濃度は、約0.001~約0.5、または約0.005~約0.2、または約0.004~約0.01w/vの範囲であり得る。一実施形態では、製剤は、上で特定した薬剤すなわち、免疫グロブリン、緩衝液、ポリオールおよび界面活性剤を含有し、ベンジルアルコール、フェノール、m‐クレゾール、クロロブタノールおよび塩化ベンゼトニウム等の一つまたは複数の保存剤を本質的に含まない。別の実施形態では、保存剤は、例えば、約0.1~約2、または約0.5~約1の範囲の濃度で、製剤中に含まれる場合がある。製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさないという条件で、Remington’sPharmaceuticalSciences16theditionOsolAEdに記載されるもの等の、1つまたは複数の他の薬剤的に許容できる担体、賦形剤または安定剤が、製剤中に含まれる場合がある。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で受容者に対し毒性を持たず、追加の緩衝剤;助溶剤;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;EDTA等のキレート化剤;金属錯体例えばZn-タンパク質複合体;ポリエステル等の生分解性ポリマー;および/またはナトリウム等の塩形成対イオンを含む。免疫グロブリンの治療的製剤は、所望の純度を有する免疫グロブリンを、所望の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤Remington’sPharmaceuticalSciences16theditionOsolAEdと混合することによって、凍結乾燥した製剤または水溶液の形態で、保存用に調製される。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度で受容者に対して毒性を持たないものであり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等の緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;メチルパラベンもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm‐クレゾール等;低分子の約10残基未満ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸;単糖類、二糖類、および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、マルトース、もしくはデキストリン;EDTA等のキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール等の糖類;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体例えば、Zn-タンパク質複合体;および/またはTWEEN商標、PLURONICS商標もしくはポリエチレングリコールPEG等の非イオン性界面活性剤を含むものである。一実施形態では、請求の範囲に記載されている発明の適切な製剤は、ポリオール、ソルビトール、スクロースまたは塩化ナトリウム等の、等張化および安定化をする等張化剤と組み合わせて、リン酸塩、酢酸塩、またはトリス緩衝液等の等張緩衝液を含有する。そのような等張化剤の一例は、5ソルビトールまたはスクロースである。さらに、製剤は、凝集を防ぐため、および安定化等のために、0.01~0.02wt/volで、所望により界面活性剤を含む場合がある。製剤のpHは、4.5~6.5または4.5~5.5の範囲であってよい。抗体用医薬製剤の他の例示的な記述は、米国特許出願公開第2003/0113316号および米国特許第6,171,586号に見出すことができ、それぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書の製剤は、必要に応じて、治療される特定の兆候に対する、2つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼし合わない相補的な活性を有するものを含有してもよい。例えば、免疫抑制剤をさらに提供することが望ましい場合がある。そのような分子は、本来の目的に効果的な量で組み合わされて、存在することが適切である。活性成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合、例えば、ヒロドキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-メチルメタシラートマイクロカプセルによって、それぞれ、コロイド性薬物送達系例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル剤において、またはマクロエマルションにおいて、調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよい。そのような技術は、Remington’sPharmaceuticalSciences16theditionOsolAEdで開示されている。免疫グロブリンの懸濁剤および結晶形も企図される。懸濁剤および結晶形を作製するための方法は、当業者に知られている。invivoでの投与に使用されるべき製剤は無菌でなければならない。本発明の組成物は、従来の、周知の滅菌法によって滅菌することができる。例えば滅菌は、無菌濾過膜を通す濾過によって、容易に達成される。得られた溶液は、使用用にパッケージ化、または無菌状態下で濾過および凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥した調製物は投与前に無菌液と混合される。凍結乾燥の工程は、特にポリペプチドが液体組成物では比較的不安定な場合に、長期保存のためにポリペプチドを安定化させるのにしばしば採用される。凍結乾燥サイクルは通常3つの工程、すなわち凍結、一次乾燥、および二次乾燥から成るWilliamsandPolliJournalofParenteralScienceandTechnologyVolume38Number2pages4859。凍結工程では、溶液は十分に凍結するまで冷却される。溶液中のバルク水がこの段階で氷を形成する。氷は一次乾燥段階で昇華するが、それは、真空によってチャンバ圧を氷の蒸気圧未満に減少させることで行われる。最終的に、吸着水または結合水が、減圧したチャンバ圧および上昇した棚温度下で、第二乾燥段階で除去される。前記工程によって、凍結乾燥ケーキとして知られている物質が生成される。その後、前記ケーキは使用前に再構成される。凍結乾燥物質に対する標準的な再構成の実行は、ある量の純水典型的には凍結乾燥の間に除去された体積と等量を加え戻すことであるが、時として、抗菌剤の希釈溶液が非経口投与用の医薬品の生産時に用いられるChenDrugDevelopmentandIndustrialPharmacyVolume18Numbers11and12pages13111354。賦形剤が、ある場合では、凍結乾燥製品の安定剤として働くことが述べられている;CarpenteretalDevelopmentsinBiologicalStandardizationVolume74pages225239。例えば、既知の賦形剤としては、ポリオールマンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む;糖類グルコースおよびスクロースを含む;およびアミノ酸アラニン、グリシンおよびグルタミン酸が挙げられる。さらに、ポリオールおよび糖類はまた、ポリペプチドを凍結および乾燥によって生じる損傷から保護し、乾燥状態において保存中の安定性を増強させるためにもしばしば使用される。一般に、糖類、具体的には二糖類は、凍結乾燥工程中および保存中の両方で効果的である。単糖類および二糖類並びにPVP等のポリマーを含む他のクラスの分子も、凍結乾燥製品の安定剤として報告されている。注射用に、医薬製剤および/または薬剤は上記のような適切な溶液を用いた再構成に適した粉末であってよい。これらの例としては、凍結乾燥粉末、回転乾燥rotarydried粉末または噴霧乾燥粉末、非晶質粉末、粒剤、沈殿物、または微粒子が挙げられるが、これらに限定はされない。注射用に、製剤は所望により、安定剤、pH調節剤、界面活性剤、生物学的利用能調節剤およびそれらの組み合わせを含有してよい。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、免疫グロブリンを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形品の形態、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態にある。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル例えば、ポリ2-ヒドロキシエチル-メタクリレート、またはポリビニルアルコール、ポリ乳酸米国特許第3,773,919号、L-グルタミン酸およびyエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、分解不可性エチレン酢酸ビニル、LupronDepot商標乳酸グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから成る注射用ミクロスフェア等の分解性乳酸グリコール酸コポリマー、並びにポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸グリコール酸等のポリマーは100日間以上の分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短期間で放出する。カプセルに入れられたポリペプチドが長期間体内に留まると、それらは37°Cの水分への暴露の結果として変性または凝集し、その結果、生物活性の喪失および免疫原性の変化の可能性をもたらし得る。関与する機序に応じ、合理的な戦術を安定化のために工夫が講じられ得る。例えば、凝集の機序が、チオールジスルフィド相互交換thiodisulfideinterchangeによる分子間のSS結合形成であることが発見された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液の凍結乾燥、水分量の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマーマトリックス組成物の開発により、安定化を達成してもよい。本発明の製剤は、本明細書に記載のように、短時間作用性、即時放出性fastreleasing、長時間作用性、または徐放性となるように設計してもよい。従って、医薬製剤は、制御放出用または持続放出用に製剤化してもよい。具体的な投与量は、対象の疾患の状態、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食事、薬剤の投与間隔、投与経路、排出速度、並びに組み合わせによって調節されてよい。有効量を含有する上記剤形のいずれも、通例の実験法の十分に範囲内であり、従って、十分に本発明の範囲内である。免疫グロブリンは、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、および鼻腔内投与、並びに、所望であれば局所療法、病巣内投与を含む、任意の適切な方法で投与される。非経口注入としては、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮内投与または皮下投与が挙げられる。さらに、免疫グロブリンは、パルス注入によって、具体的には免疫グロブリンまたは抗体の投与量を減少させつつ、適切に投与される。投与は、投与が短期間であるか長期間であるかに部分的に依存して、注射によって、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によってなされることが好ましい。局所的投与、具体的には経皮投与、経粘膜的投与、直腸投与、経口的投与、または例えば所望の部位の近位に配置されたカテーテルを介した局所投与を含む、他の投与方法が企図される。最も好ましくは、本発明の免疫グロブリンは、生理溶液中で静脈内に、0.01mg/kg~100mg/kgの範囲の投与量で、毎日から毎週、毎月までの範囲例えば、毎日、1日おき、2日おき、または1週間に2、3、4、5、もしくは6回の頻度で、好ましくは0.1~45mg/kg、0.1~15mg/kgまたは0.1~10mg/kgの範囲の投与量で、1週間に2もしくは3回の頻度で、または最大45mg/kgの投与量で、1ヶ月に1回の頻度で、投与される。本発明の実施形態または態様には、限定はされないが、以下が含まれ得る:1以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む単離された免疫グロブリンであって、a該重鎖可変領域が配列番号323のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が配列番号188もしくは配列番号190のアミノ酸配列を含む;またはb該重鎖可変領域が配列番号321のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が配列番号188もしくは配列番号190のアミノ酸配列を含む;またはc該重鎖可変領域が配列番号325のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が配列番号182、配列番号188、もしくは配列番号190のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン。2.以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む単離された免疫グロブリンであって、a該軽鎖可変領域が配列番号196のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号335、配列番号349、配列番号351、配列番号353、配列番号355、もしくは配列番号359のアミノ酸配列を含む;またはb該軽鎖可変領域が配列番号204のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号349もしくは配列番号355のアミノ酸配列を含む;またはc該軽鎖可変領域が配列番号202のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号349のアミノ酸配列を含む;またはd該軽鎖可変領域が配列番号192のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号357、配列番号359、もしくは配列番号369のアミノ酸配列を含む;またはe該軽鎖可変領域が配列番号194のアミノ酸配列を含み、該重鎖可変領域が配列番号335、配列番号349、もしくは配列番号351のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン。3.該重鎖可変領域が配列番号323のアミノ酸配列を含み;該軽鎖可変領域が配列番号188のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された免疫グロブリン。4.該軽鎖可変領域が配列番号196のアミノ酸配列を含み;該重鎖可変領域が配列番号353のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の単離された免疫グロブリン。5.該軽鎖可変領域が配列番号202のアミノ酸配列を含み;該重鎖可変領域が配列番号349のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の単離された免疫グロブリン。6.該重鎖可変領域が配列番号325のアミノ酸配列を含み;該軽鎖可変領域が配列番号190のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された免疫グロブリン。7.単離された免疫グロブリンが抗体または抗体フラグメントを含む、請求項1または請求項2に記載の単離された免疫グロブリン。8.IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の単離された免疫グロブリン。9.モノクローナル抗体を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の単離された免疫グロブリン。10.ヒト抗体を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の単離された免疫グロブリン。11以下を含む、請求項10に記載の単離された免疫グロブリン:a配列番号113のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号110のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;またはb配列番号125のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号122のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;またはc配列番号101のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号98のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖;またはd配列番号119のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖;および配列番号116のアミノ酸配列を含むか、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸残基がN末端もしくはC末端、もしくは両方から欠如している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖。12.1~24個の薬理活性を有する化学的部分を結合によってさらに含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の単離された免疫グロブリン。13.薬理活性を有する化学的部分が薬理活性を有するポリペプチドである、請求項1~12のいずれか一項に記載の、単離された免疫グロブリン。14.免疫グロブリンが組換え技術によって産生される、請求項1~13のいずれか一項に記載の単離された免疫グロブリン。15.免疫グロブリンが少なくとも1個の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1個の免疫グロブリン軽鎖を含み、薬理活性を有するポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖のFcドメインの内部ループ内の、免疫グロブリン重鎖の一次アミノ酸配列に挿入された、請求項14に記載の単離された免疫グロブリン。16.免疫グロブリンが少なくとも1個の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1個の免疫グロブリン軽鎖を含み、薬理活性を有するポリペプチドが免疫グロブリン重鎖のN末端またはC末端に結合されている、請求項13または14に記載の単離された免疫グロブリン。17.免疫グロブリンが少なくとも1個の免疫グロブリン重鎖および少なくとも1個の免疫グロブリン軽鎖を含み、薬理活性を有するポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖のN末端またはC末端に結合された、請求項13または14に記載の単離された免疫グロブリン。18.薬理活性を有するポリペプチドが、トキシンペプチド、IL-6結合ペプチド、CGRPペプチド拮抗薬、ブラジキニンB1受容体ペプチド拮抗薬、PTH作動薬ペプチド、PTH拮抗薬ペプチド、ang-1結合ペプチド、ang-2結合ペプチド、ミオスタチン結合ペプチド、EPO-模倣体ペプチド、FGF21ペプチド、TPO-模倣体ペプチド、NGF結合ペプチド、BAFF拮抗薬ペプチド、GLP-1もしくはそのペプチド模倣薬、またはGLP-2もしくはそのペプチド模倣薬である、請求項13または14に記載の単離された免疫グロブリン。19.トキシンペプチドがShKまたはShKペプチド類似体である、請求項18に記載の単離された免疫グロブリン。20.請求項1~19のいずれか一項に記載の免疫グロブリン;および薬剤的に許容できる希釈剤、賦形剤または担体を含む医薬組成物。21.請求項1~11のいずれか一項に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。22.請求項3に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。23.請求項4に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。24.請求項5に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。25.請求項6に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。26.請求項11に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。27.請求項13~19のいずれか一項に記載の免疫グロブリンをコードする、単離された核酸。28.請求項21に記載の単離された核酸を含むベクター。29請求項22~26のいずれか一項に記載の単離された核酸を含むベクター。30.請求項27に記載の単離された核酸を含むベクター。31.発現ベクターを含む、請求項28に記載のベクター。32.発現ベクターを含む、請求項29に記載のベクター。33.発現ベクターを含む、請求項30に記載のベクター。34.請求項31~33のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。35.以下を含む方法:a発現ベクターにコードされた免疫グロブリンの発現を可能にする条件下、培地中で請求項34に記載の宿主細胞を培養すること;およびb培地から免疫グロブリンを回収すること。36.表面プラズモン共鳴結合アッセイで測定した場合に、生理条件下でインキュベートされた水溶液中で、30マイクロモル濃度の免疫グロブリンが、30ナノモル濃度の可溶性ヒトIL-17R配列番号89と有意には結合しない、請求項1に記載の免疫グロブリン。37.表面プラズモン共鳴結合アッセイで測定した場合に、生理条件下でインキュベートされた水溶液中で、10マイクロモル濃度の免疫グロブリンが、10ナノモル濃度の可溶性ヒトTR2配列番号82と有意には結合しない、請求項2に記載の免疫グロブリン。本発明は、以下のさらなる例によって説明されるが、それらは決して、限定を意図するものではない。実施例1ヒトIL-17Rに対する抗体の生成およびスクリーニングクローニングおよび操作。huIL-17Rに対する抗体の免疫グロブリン重鎖VH1を含むサブユニットと軽鎖VL1を含むサブユニットをコードする抗体16429のDNA配列を、Tockerら国際公開第2008/054603A2号から取得して、標準の組換え技術を用いてクローニングした。これらの抗体の結合能を排除するため、ポリメラーゼ連鎖反応PCR増幅を用いて、一連の部位特異的変異誘発クローンを生成した。相補性決定領域CDR内の位置、生殖系配列からの変化、推定される溶媒露出、および芳香族と電荷の性質に基づき、変更すべきアミノ酸を選定した。初期の変異体群は、生殖系でアラニン置換の変異体であった。続いて突然変異を組み合わせた。いくつかの場合では、アラニン置換変異体を変異させ、アラニンをグルタミン酸に置換することにより負電荷を導入し、あるいはアラニンをアルギニンに置換することにより正電荷を導入した。PCR部位特異的変異手順の代表例は、抗IL17軽鎖のCDR3におけるトリプトファンに代えてアラニンを導入することである。PCR増幅は、変異を導入するための5’PCRと3’PCR、および変異後の抗IL17R軽鎖の両端を連結する最終オーバーラップPCR、の3段階のプロセスとして行った。5’PCRには、順方向プライマー5’-AAGCTCGAGGTCGACTAGACCACCATGGAAGCCCCAGCGCAG-3’配列番号31と、逆方向プライマー5’-GAAAGTGAGCGGAGCGTTATCATACTGCTGACA-3’配列番号32を使用する。3’PCRには、順方向プライマー5’-TGTCAGCAGTATGATAACGCTCCGCTCACTTTC-3’配列番号33と、逆方向プライマー5’-AACCGTTTAAACGCGGCCGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’配列番号34を使用する。オーバーラップPCRには、順方向プライマー5’-AAGCTCGAGGTCGACTAGACCACCATGGAAGCCCCAGCGCAG-3’配列番号31と、逆方向プライマー5’-AACCGTTTAAACGCGGCCGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’配列番号34を使用する。PCRは、PhusionHFDNAポリメラーゼフィンザイムを用いて行った。5’PCRと3’PCRのPCR反応サイクルは、抗IL-17R軽鎖DNAの変性を94°Cで20秒間、次いで、各サイクル94°C、20秒間からなる増幅を3サイクル;55°C、30秒間;72°C、30秒間、加えて94°C、20秒間のサイクルを27サイクル;60°C、30秒間;および72°C、30秒間で構成した。次いで、最終PCRサイクルに続いて72°Cで反応物を7分間インキュベートして、完全に伸長させた。オーバーラップPCRのPCR反応サイクルは、5’PCRDNAと3’PCRDNAの変性を94°Cで20秒間、次いで、各サイクル94°C、20秒間の増幅を3サイクル;55°C、60秒間;72°C、40秒間、加えて94°C、20秒間のサイクルを27サイクル;60°C、30秒間;および72°C、40秒間で構成した。次いで、最終PCRサイクルに続いて72°Cで反応物を7分間インキュベートして、完全に伸長させた。オーバーラップPCR産物をpTT5発現ベクターNRCCへとクローニングして、その配列をABIDNAシークエンシング機器パーキンエルマーを用いて決定した。構築物の形成に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例5と実施例6に記述する。表6下記は、本段落に記載のPCRサイクルと同一の条件に基づき、本発明の免疫グロブリンおよび抱合体の種々の実施形態の構成サブユニットをクローニングする際に用いたプライマーと鋳型の詳細を含む。組換えモノクローナル抗体作製のための一過性発現HEK2936E細胞において、一過性トランスフェクションを以下のように行った。エプスタインバーウイルス核抗原1を安定的に発現するヒト胎児腎293細胞系を国家研究会議NationalResearchCouncilカナダ、モントリオールから入手した。6mMLグルタミンインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド、1.1F68プルロニックインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド、および250μg/μlジェネテシンインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッドを添加したF17培地インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッドを用いて、細胞を無血清懸濁培養物として維持した。この懸濁細胞培養物を、エルレンマイヤー振とうフラスコ培養物内に維持した。この培養フラスコを、加湿した5CO2雰囲気中、37°C、65rpmで振とうした。25kDaの直線状PEIポリサイエンス、ペンシルベニア州ウォリントンのストック溶液1mg/mlを水中で調製し、溶解するまでHClでpH2.0に酸性化し、次いで、NaOHで中和し、ろ過0.2μmにより滅菌し、分注して、使用するまで-20°Cで保管した。トリプトンN1をオルガノテクニーS.A.テクニサイエンス、カナダケベック州から入手した。ストック溶液20、w/vをFreestyle培地インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド中で調製し、0.2μmフィルターによるろ過で滅菌し、使用するまで4°Cで保管した。通常、トランスフェクションは1Lのスケールで行った。細胞2936Eを1.1×106の生細胞密度まで増殖させ、次いで、トランスフェクション複合体を最終培養体積の1/10の体積で調製した。1Lのトランスフェクション培養物用に、トランスフェクション複合体を100mlのF17基本培地中で調製し、500μgのプラスミドDNA重鎖および軽鎖DNA、1:1の比を最初に100mlのF17培地中に希釈した。5分間の室温でのインキュベーション後、1.5mlのPEI溶液を加えた。複合体を穏やかにボルテックスし、次いで、室温で15分間インキュベートした。振とうフラスコ培養液中の細胞にトランスフェクション複合混合物を加えることにより、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、トリプトンN1を、トランスフェクトされた培養物に0.5の最終濃度になるまで加え、トランスフェクトされた培養物を、加湿した5CO2の雰囲気中、37°C、65rpmの振とう器上でさらに5日間維持した後、それらを回収した。馴化培地を4000rpmでの遠心分離により回収し、次いで、0.2μmフィルターコーニング社によるろ過で滅菌した。抗体の精製。一過性に発現した抗体を、組換えプロテインAセファロースGEヘルスケアを使用し、馴化培地を直接、5ml/分、7°Cのカラムに装填することにより精製した。次いで、二価陽イオンを含まない10カラム体積のダルベッコPBSでカラムを洗浄してから、100mM、pH3.5の酢酸で溶出した。溶出した抗体をクロマトグラフプロファイルに基づきプールし、2Mのトリス塩基を用いてpHを5.0に調整した。次に、このプールを0.8/0.22μmのシリンジフィルターでろ過し、次いで10mM酢酸、9スクロース、pH5.0に対して透析した。次に、緩衝液交換された抗体をVivaspin30kDa遠心濃縮ザルトリウスを用いて濃縮し、濃縮した産物を0.22μmの酢酸セルロースフィルターでろ過した。BIAcore登録商標結合アッセイ。BIAcore分析により、IL-17R細胞外ドメインとの結合の欠如を測定し、これを基にリード候補を選定した。抗体16429は、huIL-17Rと特異的に結合するヒト抗体である。huIL-17Rに対する抗体群の結合活性を評価するための溶解平衡結合アッセイを開発した。製造者BIACore社、ニュージャージー州ピスカタウェイの指示に従って、抗体16429を、BIACore登録商標2000リサーチグレードセンサーチップCM5の表面に固定化した。手短に述べると、0.2MN-エチル-N’-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDCと0.05MN-ヒドロキシスクシンイミドNHSを含有する60μLの混合物を注入することにより、センサーチップ上のカルボキシル基を活性化した。抗体16429をpH4.0、10mMの酢酸ナトリウム中で希釈し、活性化したチップ表面上に6分かけて30μL/分の速度で注入した。チップ表面の過剰反応基は、60μLの1Mエタノールアミンを注入することにより不活性化した。最終の固定化レベルは、約6600レゾナンスユニットRUであった。図2Aに示すように、可溶性抗体の存在しない10nMのIL-17Rを使用して、固定化した16429抗体に対するIL-17Rの100結合シグナルを確立した。溶液中の抗体結合を測定するため、10nM、100nM、1000nMの抗体試料を10nMのIL-17Rと共にインキュベートした。抗体のインキュベーション後にIL-17Rの結合シグナルが減少しているのは、溶液中で抗体がIL-17Rに結合していることを示す。このアッセイに基づき、抗体16435、16438、16439、16440、16441、および16444は、IL-17R結合能の実質的減少を示した。図2Bに示すように、30nMのIL-17Rと30μMの抗体試料を使用して、選択されたこれらの抗体がIL-17R結合活性を失ったことをさらに実証した。このアッセイでは、試験した6つの抗体すべて16435、16438、16439、16440、16441、および16444が、最大30μMの抗体でIL-17Rとの有意な結合活性をまったく示さなかった。細胞ベース活性アッセイ。IL-17が細胞表面のIL-17Rと相互作用すると、細胞から様々な因子増殖関連癌遺伝子アルファGRO-αを含むの産生が誘発される。サンドイッチELISAを用いて放出GRO-αを測定するため、細胞ベースの特徴付けアッセイを開発した。このELISAにおいて、GRO-α捕捉抗体を利用してGRO-αと結合させ、次いでビオチン標識したGRO-α検出抗体を使用して、捕捉されたタンパク質を検出した。次に、西洋わさびペルオキシダーゼHRPを抱合したストレプトアビジンを加えて、ビオチン標識され結合したGRO-α検出抗体の量を検出した。結合HRPの量の測定は、450nmでの吸光度を評価することにより行った。450nmでの吸光度の上昇は、産生GRO-αの量の増加を表す。このアッセイにおいて、ヒト包皮線維芽細胞HFFを5ng/mlのIL-17、および0.1μM、1μM、10μMの抗体試料と共にインキュベートする。次いで、馴化細胞培地を回収し、GRO-αサンドイッチELISAを用いたGRO-αレベルの評価のための処理をする。6つの実験用担体抗体16435、16438、16439、16440、16441、16444のいずれも、最大10μM抗体での本アッセイでは、有意なブロッキング活性をまったく示さなかった図3。均一性の分析。一過性発現により産生された抗体に対して、100mMリン酸ナトリウム、250mMNaCl、pH6.8、流速0.5mL/分の移動相を用いた、連続した2つサイズ排除カラムTSK-GELG3000SWXL、粒子径5mm、7.8×300mm、東ソーバイオサイエンス、08541により均一性を分析した図4A~B。すべての抗体が比較的低レベルの高分子種を示したが、16439と16435は最も低く、16440は最も高かった。これらのリード抗体に対して、さらに、還元ローディングバッファー図6と非還元ローディングバッファー図5を用いた1.0mmトリス-グリシン4~20SDS-PAGENovex上で産物品質を分析した。非還元SDS-PAGE、還元SDS-PAGEの両方とも、すべての候補がかなり類似しているようであったが、還元SDS-PAGE上で、16433がいくらか追加的な高分子量物質を示した。SEC動作、SDS-PAGEの均一性、BIAcore結合分析、細胞ベースアッセイの結果、および発現レベルに基づき、リード候補をさらに絞り込んだ。これらの基準に基づき、さらなる評価対象として16435と16444を選定した。抗体の安定発現。CHODHFR-宿主細胞を、標準的なエレクトロポレーション手順を用いて、対応するHCおよびLC発現プラスミドセットでトランスフェクトすることにより、抗体16435および16444の発現プールを作出した。各抗体分子当たり、3~4つの異なるトランスフェクションを行い、複数のプールを作製した。トランスフェクション後に、細胞を無血清-GHT選択増殖培地中のプールとして増殖させ、プラスミド含有細胞の選択および回収を可能にした。GHT選択培地で増殖させた細胞プールを、それらが85を超える生存率に達するまで培養した。選択された細胞プールを150nmのMTXで増幅した。MTX増幅プールの生存率が85を超える生存率に達したとき、補強した産生培地で、簡略化した6日間のバッチ産生アッセイを用いてプールをスクリーニングし、発現を評価した。6日間のアッセイ力価および正確な質量確認に基づき、最良のプールを選択した。続いて、11日間の流加培養プロセスを用いたスケールアップ産生を実施して抗体を産生した後、回収し精製した。PorosAカラム、20μm、2.1×30mmアプライドバイオシステムズ、部品番号1-5024-12を用いたHPLCアッセイにより、力価を測定した図7A~B。手短に述べると、HPLCによる分析の前に、馴化培地中の抗体をSpin-Xカラムコーニング、部品番号8160でろ過し、試験抗体の注入前と各分析実行の後に1×PBSインビトロジェン、部品番号14190-144のブランクを注入した。加えて、分析前に、抗体を含まない馴化培地を注入してカラムをコンディショニングし、新規のカラムは100μgの対照抗体を3回注入して調整した。PBSを用いて0.6ml/分で9分間洗浄した後、ImmunoPureIgGElutionBufferピアス、部品番号21009で抗体を溶出させ、280nmでの吸光度を観察した。対照抗体の濃度とピーク領域の標準プロット図に照らして、抗体の力価を定量化した。対照抗体ストックを4mg/ml濃度で調製し、抗体対照ストックを一定量のPBS中に希釈することにより5つの標準抗体濃度を調製した0.1μg/μl~1.6μg/μl。検量線を伸ばした結果、抗体の下側の検出限界は0.02μg/μl、定量化の上側限界は4μg/μlである。試験抗体が対照と同様の吸光度特性を持つと仮定したが、試験抗体の消衰係数に対する対照抗体の消衰係数の比率を力価に乗算することにより、力価を調節することができる。力価アッセイの結果は、流加培養プロセスにスケールアップした後、16435抗体の方が16444担体抗体よりわずかに良好な発現を示した。安定発現した抗体の精製。安定的に発現した抗体を、洗浄緩衝液として二価陽イオンを含まない8カラム体積のダルベッコPBS、溶出緩衝液として100mM、pH3.5の酢酸を7°Cで使用して、MabSelectSureクロマトグラフィーGEライフサイエンスにより精製した。溶出ピークをクロマトグラムに基づきプールし、2Mのトリス塩基を用いてpHを約5.0に上昇させた。次に、このプールを少なくとも3倍量の水で希釈し、0.22μmの酢酸セルロースフィルターでろ過してから、SP-HPセファロースカラムGEライフサイエンスに充填し、10カラム体積のS緩衝液A20mM酢酸、pH5.0で洗浄し、次いで、20カラム体積の50までの勾配のS-緩衝液B20mM酢酸、1MNaCl、pH5.0を用いて7°Cで溶出した。クロマトグラムおよびSDS-PAGE分析に基づきプールを作製し、次いで、材料を約6倍に濃縮し、30kDa膜を有するVivaFlowTFFカセットを用いて、約5倍体積の10mM酢酸、9スクロース、pH5.0に対して透析ろ過した。次いで、透析した材料を0.8/0.2μm酢酸セルロースフィルターによりろ過し、280nmでの吸光度により濃度を測定した。16435、16444の各変異体のイオン交換クロマトグラフィープロファイルを比較したところ、有意差を示していなかった図8A~B。安定発現した抗体の分析。これらの変異体に対する、還元ローディングバッファーと非還元ローディングバッファーを用いた1.0mmトリス-グリシン4~20SDS-PAGENovexによる分析でも、変異体間の有意差を示していなかった図9A~B。しかし、100mMリン酸ナトリウム、250mMNaCl、pH6.8、流速0.5mL/分の移動相を用いた、連続した2つのサイズ排除カラムTSK-GELG3000SWXL、粒子径5mm、7.8×300mm、東ソーバイオサイエンス、08541を使用した分析では、16444の方が高い高分子種を示し、16435の方がプレピークが顕著であった図10。また、MicroCalVP-DSCを用いて試料を毎分1°Cの割合で20°Cから95°Cに加熱するDSCにより、抗体の熱耐性も分析した。DSCは、温度の上昇および低下の制御時に生体分子に生じる熱変化を直接測定することにより、物質を天然状態において試験することを可能にする。DSCでは、熱変性によるアンフォールディングのエンタルピーΔHを測定する。溶液中の生体分子は、天然の折り畳まれた高次構造と変性した折り畳みがほどけた状態の間で平衡状態にある。生体分子の50の折り畳みがほどける熱遷移中間点Tmが高いほど、分子の安定性が高い。DSCは、変性の熱容量ΔCpの変化の測定にも使われる図11参照。対象のタンパク質を、10mM酢酸ナトリウム、9スクロース、pH5.0中の0.5mg/mlでインキュベートした図11。16435抗体の方が二次遷移温度が高く、最も望ましい融解プロファイルを示した。還元CE-SDSと非還元CE-SDSにより、抗体を分析した図12A~D。どのCESDS実験も、UVダイオード検出器付きBeckmanPA800CEシステムカリフォルニア州フラートンを使用し、波長221nmと220nmを用いて行った。露出した石英ガラスキャピラリー50μm×30.2cmを使用して、分離分析を行った。ベックマンコールターのIgGPurity/Heterogeneityマニュアルの記載に従って、バッファーバイアルを調製、充填し、キャピラリーカートリッジを設置した。還元CE-SDSと非還元CE-SDSの動作条件は、ベックマンコールターのIgGPurity/Heterogeneityマニュアルの記載と同様であったが、いくつか修正を加えた。以下、この修正について簡単に説明する。非還元条件については、抗体試料150μgを20μlのSDS反応緩衝液および5μlの70mMN-エチルマレイミドに加えた。次に、水を加えて最終容量を35μlにし、タンパク質濃度を4.3mg/mlにした。SDS反応緩衝液は、4SDS、0.01Mリン酸クエン酸緩衝液シグマ、および0.036Mリン酸二ナトリウムで作製した。調製物を十分にボルテックスし、45°Cで5分間加熱した。次に、調製物を追加の115μlの4SDSと合わせた。ボルテックスし、遠心分離した後、調製物を200μLのPCRバイアルに入れ、PA800機器に装填した。30秒間の-10kVを用いた逆極性により試料をアノードに注入し、キャピラリーの両端に20psi圧力の-15kVをかけて、35分の分離中に分離させた。還元条件については、純H2Oを加えて抗体試料を2.1mg/mlに希釈し、95μlの抗体を、5.6β-メルカプトエタノールを有する105μLのSDS試料緩衝液ベックマンに加えた。次に、調製物を十分にボルテックスしてから、70°Cで10分間加熱した。遠心分離の後、上清を200μlのPCRバイアルに入れ、PA800機器に装填した。20秒間の-5kVを用いた逆極性により試料をアノードに注入し、キャピラリーの両端に20psi圧力の-15kVをかけて、30分の分離中に分離させた。還元CE-SDSと非還元CE-SDSの両方とも、抗体16435、16444は非常によく似たプロファイルを示した図12A~D。抗体の光感受性を測定するため、抗体を実験室の周囲蛍光灯に当てるかアルミホイルで覆って、室温で3日間インキュベートした。光に当てた抗体および遮光状態に管理した抗体に対して、100mMリン酸ナトリウム、250mMNaCl、pH6.8、流速0.5mL/分の移動相を用いた、連続した2つのサイズ排除カラムTSK-GELG3000SWXL、粒子径5mm、7.8×300mm、東ソーバイオサイエンス、08541により分析した。SECクロマトグラムに基づき、16444は16435より有意に大きい光感受性を示した図13。次に、これらの抗体に対し、移動相Aとして1M硫酸アンモニウム、20mM酢酸ナトリウム、pH5.0、移動相Bとして20mM酢酸ナトリウム、5アセトニトリル、pH5.0を用いた、連続した2つのDionexProPacHIC-10カラムを使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICによる分析を行った。50分間で0~100の直線勾配を用いて0.8ml/分の割合で試料を溶出し、220nmでの吸光度を観察した。HICクロマトグラムに基づき、16435の方がメインピークが狭く、産物の均一性がより高いことが判明した図14。光感受性が低く、精製収率が高く1219mg/L対1008mg/L、DSCプロファイルが良好で、SECプロファイルが良好で、親抗体からの変異が少ないことから、この抗体ファミリーの第一リードとして、16435を選定した。実施例2ヒトTRAILR2に対する抗体の生成およびスクリーニングクローニングおよび操作。抗huTR2抗体の免疫グロブリン重鎖VH12を含むサブユニットと軽鎖VL6を含むサブユニットをコードする抗体16449のDNA配列をGliniakら米国特許第7,521,048号から取得して、標準の組換え技術を用いてクローニングした。これらの抗体の結合能を排除するため、ポリメラーゼ連鎖反応PCR増幅を用いて、一連の部位特異的変異誘発クローンを生成した。相補性決定領域CDR内の位置、生殖系配列からの変化、推定される溶媒露出、および芳香族と電荷の性質に基づき、変更すべきアミノ酸を選定した。初期の変異体群は、生殖系でアラニン置換の変異体であった。続いて突然変異を組み合わせた。いくつかの場合では、アラニン置換変異体を変異させ、アラニンをグルタミン酸に置換することにより負電荷を導入し、あるいはアラニンをアルギニンに置換することにより正電荷を導入した。構築物の形成に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例5と表6に記述する。組換えモノクローナル抗体作製のための一過性発現。HEK2936E細胞において、一過性トランスフェクションを以下のように行った。エプスタインバーウイルス核抗原12936E細胞を安定的に発現するヒト胎児腎293細胞系を国家研究会議NationalResearchCouncilカナダ、モントリオールから入手した。6mMLグルタミンインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド、1.1F68プルロニックインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド、および250μg/μlジェネテシンインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッドを添加したF17培地インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッドを用いて、細胞を無血清懸濁培養物として維持した。この懸濁細胞培養物を、エルレンマイヤー振とうフラスコ培養物内に維持した。この培養フラスコを、加湿した5CO2雰囲気中、37°C、65rpmで振とうした。25kDaの直線状PEIポリサイエンス、ペンシルベニア州ウォリントンのストック溶液1mg/mlを水中で調製し、溶解するまでHClでpH2.0に酸性化し、次いで、NaOHで中和し、ろ過0.2μmにより滅菌し、分注して、使用するまで-20°Cで保管した。トリプトンN1をオルガノテクニーS.A.テクニサイエンス、カナダケベック州から入手した。ストック溶液20、w/vをFreestyle培地インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド中で調製し、0.2μmフィルターによるろ過で滅菌し、使用するまで4°Cで保管した。通常、トランスフェクションは1Lのスケールで行った。細胞2936Eを1.1×106の生細胞密度まで増殖させ、次いで、トランスフェクション複合体を最終培養体積の1/10の体積で調製した。1Lのトランスフェクション培養物用に、トランスフェクション複合体を100mlのF17基本培地中で調製し、500μgのプラスミドDNA重鎖および軽鎖DNA、1:1の比を最初に100mlのF17培地中に希釈した。5分間の室温でのインキュベーション後、1.5mlのPEI溶液を加えた。複合体を穏やかにボルテックスし、次いで、室温で15分間インキュベートした。振とうフラスコ培養液中の細胞にトランスフェクション複合混合物を加えることにより、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、トリプトンN1を、トランスフェクトされた培養物に0.5の最終濃度になるまで加え、トランスフェクトされた培養物を、加湿した5CO2の雰囲気中、37°C、65rpmの振とう器上でさらに5日間維持した後、それらを回収した。馴化培地を4000rpmでの遠心分離により回収し、次いで、0.2μmフィルターコーニング社によるろ過で滅菌した。抗体の精製。一過性に発現した抗体を、組換えプロテインAセファロースGEヘルスケアを使用し、馴化培地を直接、5ml/分、7°Cのカラムに装填することにより精製した。次いで、二価陽イオンを含まない10カラム体積のダルベッコPBSでカラムを洗浄してから、100mM、pH3.5の酢酸で溶出した。溶出した抗体をクロマトグラフプロファイルに基づきプールし、2Mのトリス塩基を用いてpHを5.0に調整した。次に、このプールを0.8/0.22μmのシリンジフィルターでろ過し、次いで10mM酢酸、9スクロース、pH5.0に対して透析した。次に、緩衝液交換された抗体をVivaspin30kDa遠心濃縮器ザルトリウスを用いて濃縮し、濃縮した産物を0.22μmの酢酸セルロースフィルターでろ過した。BIAcore結合アッセイ。抗体16449は、Trail受容体2TR2と特異的に結合するヒト抗体である。TR2に対する抗体群の結合活性を評価するための溶解平衡結合アッセイを開発した。上記実施例1に記載のように、抗体を16449をCM5センサーチップ面に固定化した。最終の固定化レベルは、約8000レゾナンスユニットRUであった。抗体の存在しないTR21nMを使用して、溶液中に抗体結合がないTR2の100結合シグナルを確立した。溶液中の抗体結合を測定するため、7pM~10nMの範囲で段階的に希釈した抗体試料を1nMのTR2と共にインキュベートした。抗体のインキュベーション後にTR2の結合シグナルが減少しているのは、溶液中で抗体がTR2に結合していることを示す。図15に示す結果は、新しい3つの抗体構築物16449、1869、1870のすべてが、元の構築物と同様のTR2結合活性を保持していることを表している。他の実験において、10nMのTR2を、本アッセイの50nMおよび1μMの抗体試料と共に上記のようにインキュベートした。10nMのTR2を、100結合シグナルを定義するために使用した。50nMでは、いくつかの抗体が結合の有意な欠如を示したが16613、1919、1913、1910、1920、および1922、1000nMでは、完全な結合欠如を示したものはなかった結果を図16に示す。追加の点突然変異により、TR2親和性の低い抗体が得られた図17。2つの部位重鎖Y125と軽鎖Y53、特に位置Y125に荷電置換を有する部位が、変異誘発に対して特に大きな感受性を示した。二重アラニン置換により、TR2結合親和性がさらに低い変異体が産生された図18。アラニン変異体と荷電変異体を対にするか、またはそれより大きいオーダーで組み合わせた結果、10μM抗体でもTR2との有意な結合を示さない分子がいくつか産生された図19。これらのデータから、5つの最良の変異体10186、10184、4341、10183、および4241を、50μM抗体での結合実験に進ませた図20A~B。10186以外は、50μMでもTR2との有意な結合を示さなかった。細胞ベース活性アッセイ。Colo205は、TRAILの存在に感受性を有するヒト結腸癌細胞株である。Colo205の表面にあるTR2に陽性対照であるIgG1抗TR2mAb分子抗体16449が結合すると、細胞アポトーシスが生じる。抗体の細胞死滅効力を検証するため、Colo205をベースにした細胞アッセイを開発した。抗体16449抗TRAIL-R2抗体のinvitro生物活性を、ヒト腹水結腸直腸腺癌細胞株Colo205においてアポトーシスを誘発するその能力により分析する。カスパーゼ3活性化の検出を、アポトーシスの陽性マーカーとして用い、製造者の指示に従って、Apo-One商標Homogeneouscaspase商標-3/7アッセイキットプロメガ社、ウィスコンシン州マディソンを使用するNilesetalTheApoOne商標HomogeneousCaspase商標37assayasimplifiedsolutionforapoptosisdetectionCellNotes223を参照。この方法では、Colo205細胞において抗TRAIL-R2に誘発されたカスパーゼ活性化を、発光カスパーゼ3/7試薬が敏感かつ強力にモニタリングする。発光量は、存在するカスパーゼ活性の量に比例する。各試料の発光量を、プレートごと読み取るルミノメーターで測定する。試験試料の応答を標準試料の応答と比較することにより、試験試料の生物活性を決定する。試料を標準の対照抗体と比較するため、200nMおよび10μMの抗体試料を、1μg/mlまたは100μg/mlのプロテインGと共にプレインキュベートした。次に、この混合物をColo205培養液に加えた。図20Cは、対照の抗TR2mAb分子と異なり、抗体試料は非常に高濃度例えば30μg/mLの抗体でも殺細胞能力を持たないことを示している。均一性の分析。これらのリード抗体に対して、還元ローディングバッファー図21Bと非還元ローディングバッファー図21Aを用いた1.0mmトリス-グリシン4~20SDS-PAGENovex上で産物品質を分析した。非還元SDS-PAGE、還元SDS-PAGEの両方とも、すべての候補がかなり類似しているようであった。さらに、50mMリン酸ナトリウム、250mMNaCl、pH6.8、流速1.0mL/分の移動相を用いた1つのサイズ排除カラムPhenomenexSEC3000、7.8×300mmを使用して、抗体の均一性を分析した代表的結果を図22に示す。すべての抗体が比較的低レベルの高分子種を示したが、10185と10184は、わずかに高い高分子量物質を示した。SEC動作、BIAcore結合分析、細胞ベースアッセイの結果、推定されるタンパク質分解脆弱性、および計算値等電点の移動の低さに基づき、リード候補を選定した。これらの基準に基づき、さらなる評価の対象として4241と4341を選定した。安定発現のための構築物の形成。CHODHFR-宿主細胞を、標準的なエレクトロポレーション手順を使用して、対応するHCおよびLC発現プラスミドセットでトランスフェクトすることにより、安定発現抗体4241、4341のプールを作出した。各抗体分子当たり、3~4つの異なるトランスフェクションを行い、複数のプールを作製した。トランスフェクション後に、細胞を無血清-GHT選択増殖培地中のプールとして増殖させ、プラスミド含有細胞の選択および回収を可能にした。GHT選択培地で増殖させた細胞プールを、それらが85を超える生存率に達するまで培養した。選択された細胞プールを150nmのMTXで増幅した。MTX増幅プールの生存率が85を超える生存率に達したとき、補強した産生培地で、簡略化した6日間のバッチ産生アッセイを用いてプールをスクリーニングし、発現を評価した。6日間のアッセイ力価および正確な質量確認に基づき、最良のプールを選択した。続いて、11日間の流加培養プロセスを用いたスケールアップ産生を実施して抗体を産生した後、回収し精製した。PorosAカラム、20μm、2.1×30mmアプライドバイオシステムズ、部品番号1-5024-12を用いたHPLCアッセイにより、力価を測定した。手短に述べると、HPLCによる分析の前に、馴化培地中の抗体をSpin-Xカラムコーニング、部品番号8160でろ過し、試験抗体の注入前と各分析実行の後に1×PBSインビトロジェン、部品番号14190-144のブランクを注入した。加えて、分析前に、抗体を含まない馴化培地を注入してカラムを調整し、新規のカラムは100μgの対照抗体を3回注入して調整した。PBSを用いて0.6ml/分で9分間洗浄した後、ImmunoPureIgGElutionBufferピアス、部品番号21009で抗体を溶出させ、280nmでの吸光度を測定した。対照抗体の濃度とピーク領域の標準プロット図に照らして、抗体の力価を定量化した。対照抗体ストックを4mg/ml濃度で調製し、抗体対照ストックを一定量のPBS中に希釈することにより5つの標準抗体濃度を調製した0.1μg/μl~1.6μg/μl。検量線を伸ばした結果、抗体の下側の検出限界は0.02μg/μl、定量化の上側限界は4μg/μlである。試験抗体は対照と同様の吸光度特性を持つと仮定されるが、試験抗体の消衰係数に対する対照抗体の消衰係数の比率を力価に乗算することにより、力価を調整することができる。力価アッセイの結果は、流加培養プロセスにスケールアップした後、4241抗体の方が4341抗体よりわずかに良好な発現を示した図23A~B。安定発現した抗体の精製。安定的に発現した抗体を、洗浄緩衝液として二価陽イオンを含まない8カラム体積のダルベッコPBS、溶出緩衝液として100mM、pH3.5の酢酸を7°Cで使用して、MabSelectSureクロマトグラフィーGEライフサイエンスにより精製した。溶出ピークをクロマトグラムに基づきプールし、2Mのトリス塩基を用いてpHを約5.0に上昇させた。次に、このプールを少なくとも3倍量の水で希釈し、0.22μmの酢酸セルロースでろ過してから、SP-HPセファロースカラムGEライフサイエンスに充填し、10カラム体積のS-緩衝液A20mM酢酸、pH5.0で洗浄し、次いで、20カラム体積の50までの勾配のS-緩衝液B20mM酢酸、1MNaCl、pH5.0を用いて7°Cで溶出した。クロマトグラムおよびSDS-PAGE分析に基づきプールを作製し、次いで、材料を約6倍に濃縮し、30kDa膜を有するVivaFlowTFFカセットを用いて、約5倍体積の10mM酢酸、9スクロース、pH5.0に対して透析ろ過した。次いで、透析した材料を0.8/0.2μm酢酸セルロースフィルターによりろ過し、280nmでの吸光度により濃度を測定した。精製処理した試料を、1.0mmトリス-グリシン4~20SDS-PAGENovex還元ローディングバッファーを使用して分析した図24A~B。これらのデータは、抗体4241、4341の両方とも、予想外の試料損失を生じる段階なしに同様の精製特性を有することを示した。安定発現した抗体の分析。4241、4341の各変異体のイオン交換クロマトグラフィープロファイルを比較したところ図25、4341の方がメインピークが狭く、4241より不均一性が低いことを示した。これらの変異体に対する、還元ローディングバッファーと非還元ローディングバッファーを用いた1.0mmトリス-グリシン4~20SDS-PAGENovexによる分析では、両者の間に有意差はなかった図26A~B。100mMリン酸ナトリウム、250mMNaCl、pH6.8、流速0.5mL/分の移動相を用いた、連続した2つのサイズ排除カラムTSK-GELG3000SWXL、粒子径5mm、7.8×300mm、東ソーバイオサイエンス、08541による分析でも、変異体4241と4341の間に有意差はなかった図27A~B。MicroCalVP-DSCを用いて試料を毎分1°Cの割合で20°Cから95°Cに加熱するDSCにより、抗体の熱耐性を分析した。タンパク質の濃度は、10mM酢酸ナトリウム、9スクロース、pH5.0中0.5mg/mlであった図28。抗体4341と比較して、4241抗体の方が二次遷移温度が高く、最も望ましい融解プロファイルを示した。還元CE-SDSと非還元CE-SDSにより、抗体4241と4341を分析した図29A~D。どのCESDS実験も、UVダイオード検出器付きBeckmanPA800CEシステムカリフォルニア州フラートンを使用し、波長221nmと220nmを用いて行った。露出した石英ガラスキャピラリー50μm×30.2cmを使用して、分離分析を行った。ベックマンコールターのIgGPurity/Heterogeneityマニュアルの記載に従って、バッファーバイアルを調製、充填し、キャピラリーカートリッジを設置した。還元CE-SDSと非還元CE-SDSの動作条件は、ベックマンコールターのIgGPurity/Heterogeneityマニュアルの記載と同様であったが、いくつか修正を加えた。以下、この修正について簡単に説明する。非還元条件については、抗体試料150μgを20μlのSDS反応緩衝液および5μlの70mMN-エチルマレイミドに加えた。次に、水を加えて最終容量を35μlにし、タンパク質濃度を4.3mg/mlにした。SDS反応緩衝液は、4SDS、0.01Mリン酸クエン酸緩衝液シグマ、および0.036Mリン酸二ナトリウムで作製した。調製物を十分にボルテックスし、45°Cで5分間加熱した。次に、調製物を追加の115μlの4SDSと合わせた。ボルテックスし、遠心分離した後、調製物を200μlのPCRバイアルに入れ、PA800機器に装填した。30秒間の-10kVを用いた逆極性により試料をアノードに注入し、キャピラリーの両端に20psi圧力の-15kVをかけて、35分の分離中に分離させた。還元条件については、純H2Oを加えて抗体試料を2.1mg/mlに希釈し、95μlの抗体を、5.6β-メルカプトエタノールを有する105μLのSDS試料緩衝液ベックマンに加えた。次に、調製物を十分にボルテックスしてから、70°Cで10分間加熱した。遠心分離の後、上清を200μlのPCRバイアルに入れ、PA800機器に装填した。20秒間の-5kVを用いた逆極性により試料をアノードに注入し、キャピラリーの両端に20psi圧力の-15kVをかけて、30分の分離中に分離させた。CE-SDS分析では、どちらの抗体も有意差を示さなかった図29A~D。高速イオン交換クロマトグラフィーSP-5PW、粒径10μm、内径7.5mm×7.5cm、東ソーバイオサイエンス、08541を使用し、緩衝液Aとして20mM酢酸、pH5.0、緩衝液Bとして20mM酢酸、1MNaCl、pH5.0を用いて、緩衝液Bの0~40の直線勾配で80分間、流速1mL/分で流すことにより、抗体の均一性も分析した。この方法による高速イオン交換プロファイルでは、精製された抗体4241、4341のどちらも有意差を示さなかった図30。抗体の光感受性を測定するため、抗体を実験室の周囲蛍光灯に当てるかアルミホイルで覆って、室温で3日間インキュベートした。次に、これらの抗体に対し、1M硫酸アンモニウム、20mM酢酸ナトリウム、pH5.0の移動相A、および20mM酢酸ナトリウム、5アセトニトリル、pH5.0の移動相Bを用いて、連続した2つのDionexProPacHIC-10カラムを使用した疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分析を行った。50分間で0~100の直線勾配を用いて0.8ml/分の割合で試料を溶出し、220nmでの吸光度を観察した。HICクロマトグラムでは、露光の有無によらず、どちらの抗体も有意差を示さなかった図31A~B。精製時のイオン交換クロマトグラフィーのピークがより均一であったことを主な根拠として、この抗体ファミリーの第一リードとして4341を選定した。実施例3ヒト組織交差反応性の評価PointstoConsiderintheManufactureandTestingofMonoclonalAntibodyProductsforHumanUseに記載されているガイダンスに概ね従って、予備的な非GLP試験を実施して、本発明の抗体と各種ヒト組織との交差反応性を測定した。薬剤開発を目的とした抗体の場合は、GLP条件下のより広範な試験が必要である。AlexaFluor488で標識した形態の試験物質を使用して、選択されたヒト組織の凍結切片に対する抗体16435、4341の組織交差反応性を評価したチャールズリバーラボラトリーズ、プリンシパルサービス、ネバダ州リノ。NationalDiseaseResearchInterchangeNDRI、ペンシルベニア州フィラデルフィア、キュアライン社カリフォルニア州バーリンゲーム、Cybrdiメリーランド州ロックビル、ロッキーマウンテンライオンズアイバンクコロラド州オーロラのいずれかが2名の個人から収集した正常ヒト組織別段の指定がある場合を除くを、SpecialPathologyServicesHumanTissueBankから入手した。試験組織には、ヒトの小脳、肺、大脳皮質、卵巣成熟女性由来、眼、胎盤、胃腸管小腸、皮膚1名、心臓、脾臓、腎臓1名、甲状腺、肝臓、精巣が含まれていた。新しい凍結ヒト組織切片および対照ビーズブロックヒト血清アルブミン[HSA]ビーズを低温保持装置上で切断し、キャピラリーギャップスライド上に載せて解凍した。組織および対照ビーズのスライドを、低温アセトン中-10°C~-25°Cで約10分固定した。固定したスライドを少なくとも1時間~一晩かけて乾燥させた。凍結保存した場合は、固定したスライドを実験の前の日にフリーザーから取り出し、使用前に一晩かけて解凍した。別段の指定がない限り、以下の手順はすべて室温で実施した。スライドを1×Morphosave商標と共に約15分インキュベートして組織形態を保全した後、1×リン酸緩衝食塩水PBSで2回、それぞれ約5分間洗浄した。内因性ペルオキシダーゼをブロックするため、スライドをグルコースオキシダーゼ溶液中で約1時間、37°Cでインキュベートした。スライドを1×PBSで2回、それぞれ約5分間洗浄した。アジビンおよびビオチン溶液中での逐次的インキュベーションそれぞれ約15分により、内因性ビオチンをブロックした。ビオチン中のインキュベーションの後、組織切片をブロック抗体溶液で約25分間ブロックした。AlexaFluor488-Ab16435およびAlexaFluor488anti-Ab4341を、約25分間、最適濃度2.0μg/mLまたは最適濃度の5倍10.0μg/mLで切片に適用した。スライドを洗浄緩衝液で3回洗浄してから、二次抗体ウサギ抗AlexaFluor488と共に約25分間インキュベートした。二次抗体とのインキュベーションの後、スライドを洗浄緩衝液で4回洗浄し、次いで、三次抗体西洋わさびペルオキシダーゼを抱合したヤギ抗ウサギIgG抗体と共に約25分インキュベートし、ジアミノベンジジンDAB色素原基質で結合を可視化した。HSAビーズを陰性対照として使用した。組織は、CD31すなわち血小板内皮細胞接着分子PECAM-1に対する抗体抗CD31での染色により、免疫組織化学検査に適していると認められた。濃度2.0μg/mLと10.0μg/mLのいずれの試験抗体も、検査したヒト組織において具体的な染色はまったくなかった。実施例4ラットおよびカニクイザルにおける本発明の抗体実施形態の薬物動態PK試験成体Sprague-Dawleyラット8~12週齢に5mg/kgを皮下注射し、投与から0、0.25、1、4、24、48、72、96、168、336、504、672、840、および1008時間後に側尾静脈から血液約250μLをMicrotainer登録商標血清分離チューブに回収することにより、担体抗体16435、16444、4241、および4341の薬物動態プロファイルを特定した。回収後、各試料を室温に維持し、30~40分の凝固時間の後、較正済みのEppendorf5417R遠心分離システムブリンクマンインスツルメンツ社、ニューヨーク州ウエストベリーを用いて2~8°C、11,500rpmで約10分間、遠心分離した。次に、各ラットに対して事前にラベル表示した極低温保存チューブに回収済み血清を移し、その後の分析用に-60°C~-80°Cで保存した。PK試験試料から血清試料濃度を測定するため、以下の方法を用いた:半面積黒色プレートCorning3694を、2μg/mlの抗huFc抗体1.35.1のPBS溶液でコーティングして、4°Cで一晩インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、I-Block商標アプライドバイオシステムズを用いて4°Cで一晩ブロッキングした。試料を希釈する必要がある場合は、ラットSD対照血清で希釈した。標準試料と試料をI-Block商標5BSAで1:20に希釈して、380μlの希釈緩衝液にした。プレートを洗浄した後、前処置した50μLの標準試料および試料を、抗体1.35.1をコーティングしたプレートに移し、室温で1.5時間インキュベートした。プレートを洗浄してから、I-Block商標5BSA中の100ng/mlの抗huFc抗体21.1-HRP抱合体50μlを加えて、1.5時間インキュベートした。プレートを洗浄してから、50μlのPico基質を加えて、プレートを直ちにルミノメーターで分析した。4つの抗体のいずれも、薬物動態プロファイルに有意差はなく図32、抗体16435、16444、4241、4341のAUC0-t±標準偏差は、それぞれ18,492±2,104、21,021±2,832、24,045±2,480、24,513±972μg/h/mLであった。カニクイザルMacacafascicularisにおける抗体16435の薬物動態プロファイルを決定することにより、invivoのパラメーターを評価した。手短に述べると、1mg/kgまたは10mg/kgの16435を、成熟した雄のカニクイザルn=2/グループに単回で静脈内にボーラス投与した。抗体の投与前、ならびに投与から0.25、0.5、1、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、360、408、456、504、552、600、648、および672時間後の時点に血清試料を採取した。抗IgGサンドイッチELISAを用いて、試料の16435抗体レベルを評価した。WinNonLin登録商標Enterpriseversion5.1.1,2006、Pharsight登録商標社、カリフォルニア州マウンテンビューを用いた非区画化方法により、時間濃度データを分析した。得られた薬物動態プロファイルは、有意な異常をまったく示していなかった図33。実施例5抗体16435-ShK[1-35,Q16K]融合物のクローニング、精製、および分析クローニングおよび発現。一価16435-ShK融合物抗体3742の構成要素には、以下のものが含まれる:a16435κLC配列番号109;b16435IgG2HC配列番号112;およびc16435IgG2-ShK[1-35,Q16K]配列番号377:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAQLYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//配列番号377。所望の産物である抗体融合物3742は、1つの重鎖のC末端と融合したShK[1-35,Q16K]ペプチド配列番号76を有する完全抗体であった図34の概略図を参照。2つの異なる重鎖が1種類の軽鎖を共有しているため、重鎖:軽鎖:重鎖ShK[1-35,Q16K]の比は1:2:1であった。予想される発現産物は、16435IgG2、一価16435IgG2-ShK[1-35,Q16K]、および二価16435IgG2-ShK[1-35,Q16K]である。本明細書に記載のように、陽イオン交換イオンクロマトグラフィーを使用して、混合物から一価16435IgG2-Shk融合タンパク質を単離した。鋳型として配列番号389をコードする構築物pTT5-aKLH120.6-IgG2-HC-L10-ShK[1-35,Q16K]を使用してShK[1-35,Q16K]断片を生成し、StuIとNotIで消化し、PCR精製キットキアジェンで精製した。同時に、pDC324配列番号111をStuIとNotIで消化し、仔ウシ腸ホスファターゼCIPで処理して、1アガロースゲル上で泳動した。大きい方の断片を切り出し、キアジェンのゲル精製キットでゲル精製した。精製したShk[1-35,Q16K]を大ベクター断片と連結し、OneShotTop10細菌中に形質転換した。形質転換した細菌コロニーからDNAを単離して、配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と100マッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には1クローンのみを選択した。最終的なpDC324-16435-IgG2-HC-L10-ShK[1-35,Q16K]構築物は、IgG2-HC-L10-ShK[1-35,Q16K]融合ポリペプチド配列番号377をコードした。精製。プロテインAセファロースGEヘルスケアを用いた親和性FPLCでのFc領域の捕捉により、3742馴化培地の最初の精製を行った後、二価陽イオンを含まないダルベッコPBSインビトロジェンでのカラム洗浄および100mM酢酸、pH3.5による段階的溶出を行った。タンパク質含有画分をプールし、10NNaOHを用いてpHを5.0に中和し、水で5倍体積に希釈した。この材料を0.45μm酢酸セルロースフィルターコーニングによりろ過し、陽イオン交換FPLCSPSepharoseHighPerformance;GEヘルスケアによりさらに精製した。100緩衝液A50mM酢酸、pH5.0で平衡化したカラム上に試料を充填し、0~800mMNaClの勾配を用いた30カラム体積で溶出した。一価種を含有するピークをプールし、10mM酢酸ナトリウム、9スクロース、pH5.0中に調合した。分析。3742プールに対して、2μgのタンパク質と4~12トリス-グリシンゲルインビトロジェンを使用し、QuickBlueボストンバイオロジカルズで染色することにより、還元および非還元SDS-PAGE分析を行った。このSDS-PAGEによれば、プール間の有意差はまったくなかった図35。移動相として50mMリン酸ナトリウム、250mMNaCl、pH6.9を使用した定組成溶出により、BiosepSEC-S3000カラムフェノメネックスを使用して、流速1ml/分で分析用SECを行った図36A~D。SECデータでは、4つのプールすべてが比較的低レベルの凝集を示したが、プール1は、他のプールと比べて多少高いレベルを示した。還元状態の重鎖図38A~Dおよび軽鎖図37A~DのLC-MS分析により、最終的な3742試料を特徴付けした。WatersACQUITYUPLCシステムを使用して、産物をWatersMassPREPマイクロ脱塩カラムに通してクロマトグラフィーを行った。カラムは80°Cに設定し、0.1ギ酸中、直線勾配で増加させたアセトニトリル濃度を用いてタンパク質を溶出した。カラム溶出物を、質量分析用にWatersLCTPremierESI-TOF質量分析器に回した。機器はポジティブVモードで作動させた。キャピラリー電圧を3,200V、コーン電圧を80Vに設定した。800~3000m/zの質量スペクトルを得て、機器製造業者により提供されたMaxEnt1ソフトウェアを用いてデコンボリュートした。4つのプールのすべてが機器の誤差の範囲内の予想質量を示し、全プールが予想産物を産生していることを示した図37A~D、図38A~D。全血分析。exvivoのアッセイを用いて、毒素ペプチド類似体Kv1.3阻害剤がIL-2およびIFN-γの分泌に及ぼす影響を調べた。以前に説明されているexvivoのアッセイ国際公開第2008/088422A2号の実施例46を参照。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるを用いて、ヒト全血中でのT細胞の炎症のブロックにおけるShK類似体および結合体の効力を試験した。手短に言えば、50ヒト全血をタプシガルギンで刺激して、貯蔵枯渇、カルシウム動員、およびサイトカイン分泌を誘発させた。T細胞サイトカイン分泌のブロックにおける分子の効力を評価するため、タプシガルギン刺激を加える前に、様々な濃度のKv1.3ブロッキングペプチドおよびペプチド結合体を、ヒト全血試料と共に30~60分間プレインキュベートした。37°C、5CO2で48時間経過した後、馴化培地を回収し、メソスケールディスカバリーの提供する4スポット電気化学発光イムノアッセイを用いてサイトカイン分泌レベルを測定した。タプシガルギン刺激を用いて、複数の供与者から分離した血液からサイトカインIL2およびIFNgを強力に分泌させた。タプシガルギン刺激の後にヒト全血中で産生させたIL2およびIFNgは、細胞内サイトカイン染色および蛍光標示式細胞分取FACS分析から明らかなように、T細胞から産生された。Kv1.3は、T細胞上に存在する主要な電位依存性カリウムチャネルである。Kを流出させることにより、Kv1.3は、効率的なT細胞活性化およびサイトカイン分泌に必要な細胞内カルシウムの持続的な上昇に必要とされる、継続的なCa2流入の駆動力を供給する。Kv1.3阻害剤が、TCR連結反応によりこのカルシウム流動を抑制することが以前に示されているGCKooetal1999CellImmunol19799107。タプシガルギン誘導性の貯蔵枯渇およびTCR連結反応は、単離T細胞において同様のパターンのCa2動員を誘発するEDonnadieuetal1991JBiolChem2672586425872が、本発明者らは、タプシガルギンが全血においてより強力な応答を引き起こすことを見出した。したがって、本発明者らは、ヒト全血中においてタプシガルギンにより誘導されるT細胞からのサイトカイン分泌をブロックするKv1.3阻害剤の能力を調べることによりその生物活性を評価するための、バイオアッセイを利用した。全血は高濃度のタンパク質を含有する複雑な流体であるため、この全血アッセイにおけるペプチドおよびペプチド結合体の活性は、生体関連流体中での48時間にわたる分子の安定性の評価においてさらなる利点を有する。電気生理学ePhysアッセイは一般に持続時間が短く<1~2時間、タンパク質を含有しない生理的食塩水を使用するため、ePhysにより判定されたKv1.3の分子効力の重要な確認が全血アッセイで得られる。全血アッセイの持続時間が長いほど、持続時間が短いePhys実験に比べて、平衡結合速度のより有効な判定が可能となり得る。表7A下記から分かるように、3742-ShK1-35,Q16Kの4つのプールすべてがヒト全血アッセイで良好な効力を示した。このことは、単離された分子が適切な三次構造を獲得し、48時間中、血清内で適度に安定していることを表している。表7B下記は、この効力が他のShK結合分子に匹敵することを示す。実施例6Ab4341-ShK1-35,Q16K、4341-FGF21、16435-FGF21融合構築物の生成抗体16435-huFGF21融合物Ab10162。16435-huFGF21融合物の構成要素には、以下のものが含まれる:a16435κLC配列番号109;b16435HCR118A;配列番号112;およびc16435IgG2-HC-huFGF21[1-181]配列番号384:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAQLYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGSGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS//配列番号384。鋳型として構築物pTT5-aKLH120.6-IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181]配列番号130を用いて、16435huIgG2-HC-L15-huFGF21[1-181]断片を生成し、BsmBIとNotIで消化し、キアジェンのゲル精製キットで精製した。同時に、pTT5-16435IgG2HCをBsmBIとNotIで消化し、1アガロースゲル上で泳動した。16435の重鎖可変領域を含むベクター断片を切り出し、キアジェンのゲル精製キットでゲル精製した。精製したhuIgG2-HC-L15-huFGF21[1-181]断片を、16435の重鎖可変領域を含むベクター断片と連結し、DH10b細菌中に形質転換した。形質転換した細菌コロニーからDNAを単離して、配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と100マッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には1クローンのみを選択した。最終的なpTT5-16435-IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181]構築物は、IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181]融合ポリペプチド配列番号384をコードした。抗体4341-huFGF21融合物Ab10163。4341-ShK[1-35,Q16K]融合物Ab10163の構成要素には、以下のものが含まれる:a4341κLC配列番号115;b4341HCY125A;配列番号118;およびc4341IgG2-HC-huFGF21[1-181]配列番号386:QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYFWSWIRQLPGKGLEWIGHIHNSGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKKQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRGGDYAYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGSGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS//配列番号386。鋳型として構築物pTT5-aKLH120.6-IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181]を用いて、huIgG2-HC-L15-huFGF21[1-181]断片を生成し、BsmBIとNotIで消化し、キアジェンのゲル精製キットで精製した。同時に、pTT5-4341IgG2HCをBsmBIとNotIで消化し、1アガロースゲル上で泳動した。4341の重鎖可変領域を含む大きい方の断片を切り出し、キアジェンのゲル精製キットでゲル精製した。精製したhuIgG2-HC-L15-huFGF21[1-181]断片を、4341の重鎖可変領域を含む大ベクター断片と連結し、DH10b細菌中に形質転換した。形質転換した細菌コロニーからDNAを単離して、配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と100マッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には1クローンのみを選択した。最終的なpTT5-4341-IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181]構築物は、IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181]融合ポリペプチド配列番号386をコードした。4341-ShK[1-35,Q16K]融合物抗体10164。4341-ShK[1-35,Q16K]融合物Ab10164の構成要素には、以下のものが含まれる:a4341κLC配列番号115;b4341HCY125A;配列番号118;およびc4341IgG2-HC-ShK[1-35,Q16K]配列番号388:QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYFWSWIRQLPGKGLEWIGHIHNSGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKKQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRGGDYAYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//配列番号388。鋳型として構築物pDC324-16435-HC-L10-IgG2-ShK[1-35,Q16K]配列番号376を用いて、huIgG2-HC-L10-ShK[1-35,Q16K]断片を生成し、BsmBIとNotIで消化し、キアジェンのゲル精製キットで精製した。同時に、pTT5-4341IgG2HCをBsmBIとNotIで消化し、1アガロースゲル上で泳動した。4341の重鎖可変領域を含む大きい方の断片を切り出し、キアジェンのゲル精製キットでゲル精製した。精製したhuIgG2-HC-L10-ShK[1-35,Q16K]断片を、4341の重鎖可変領域を含む大ベクター断片と連結し、DH10b細菌中に形質転換した。形質転換した細菌コロニーからDNAを単離して、配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と100マッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には1クローンのみを選択した。最終的なpTT5-4341-IgG2-HC-L10-ShK[1-35,Q16K]構築物は、IgG2-HC-L10-ShK[1-35,Q16K]融合ポリペプチド配列番号388をコードした。実施例7Ab4341-ShK、4341-FGF21、および16435-FGF21融合物の発現、精製、および分析HEK293-6E細胞において、一過性トランスフェクションを以下のように行った。エプスタインバーウイルス核抗原1293-6E細胞を安定的に発現するヒト胎児腎293細胞系を国家研究会議NationalResearchCouncilカナダ、モントリオールから入手した。6mMLグルタミンインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド、1.1F68プルロニックインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド、および250μg/μlジェネテシンインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッドを添加したF17培地インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッドを用いて、細胞を無血清懸濁培養物として維持した。この懸濁細胞培養物を、エルレンマイヤー振とうフラスコ培養物内に維持した。この培養フラスコを、加湿した5CO2雰囲気中、37°C、65rpmで振とうした。25kDaの直線状PEIポリサイエンス、ペンシルベニア州ウォリントンのストック溶液1mg/mlを水中で調製し、溶解するまでHClでpH2.0に酸性化し、次いで、NaOHで中和し、ろ過0.2μmにより滅菌し、分注して、使用するまで-20°Cで保管した。トリプトンN1をオルガノテクニーS.A.テクニサイエンス、カナダケベック州から入手した。ストック溶液20、w/vをF17培地中で調製し、0.2μmフィルターによるろ過で滅菌し、使用するまで4°Cで保管した。通常、トランスフェクションは1Lのスケールで行った。細胞2936Eを1.1×106の生細胞密度まで増殖させ、次いで、トランスフェクション複合体を最終培養体積の1/10の体積で調製した。1Lのトランスフェクション培養物用に、トランスフェクション複合体を100mlのF17基本培地中で調製し、500μgのプラスミドDNA重鎖および軽鎖DNA、1:1の比を最初に100mlのF17培地中に希釈した。5分間の室温でのインキュベーション後、1.5mlのPEI溶液を加えた。複合体を穏やかにボルテックスし、次いで、室温で15分間インキュベートした。振とうフラスコ培養液中の細胞にトランスフェクション複合混合物を添加することにより、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、トリプトンN1を、トランスフェクトされた培養物に0.5の最終濃度になるまで加え、トランスフェクトされた培養物を、加湿した5CO2の雰囲気中、37°C、65rpmの振とう器上でさらに5日間維持した後、それらを回収した。馴化培地を4000rpmでの遠心分離により回収し、次いで、0.2μmフィルターコーニング社によるろ過で滅菌した。一過性に発現した抗体を、組換えプロテインAセファロースGEヘルスケアを使用し、馴化培地を直接、5ml/分、7°Cのカラムに装填することにより精製した。次いで、二価陽イオンを含まない10カラム体積のダルベッコPBSでカラムを洗浄してから、100mM、pH3.5の酢酸で溶出した。溶出した抗体をクロマトグラフプロファイルに基づきプールし、2Mのトリス塩基を用いてpHを5.0に調整した。次いで、プールを0.8/0.22μmのシリンジフィルターでろ過してから、10mM酢酸、9スクロース、pH5.0に対して透析した。次いで、緩衝液交換された抗体をVivaspin30kDa遠心濃縮ザルトリウス社を用いて濃縮し、濃縮した産物を0.22μmの酢酸セルロースフィルターでろ過した。偽トランスフェクションを含むすべての馴化培地を、1.0mmトリス-グリシン4~20SDS-PAGEを使用し、10μlの馴化培地を載せて、35mA/1000V/250Wで55分間泳動して分析した図39A。偽トランスフェクション試料には観察されない250分子量マーカーより上のバンドが、発現産物であると予想される。3つの実験用トランスフェクションすべてが、SDS-PAGE上で有意な量の予想産物を示した。抗体融合物に対して、還元ローディングバッファーと非還元ローディングバッファーを用いた1.0mmトリス-グリシン4~20SDS-PAGENovex上で産物品質を分析した図39B。非還元SDS-PAGE、還元SDS-PAGEのどちらも、すべての候補が予想通りに電気泳動したが、10162と10163は予想バンドより多少遅く移動した。このことはおそらく、部分的グリコシル化を示す。さらに、50mMリン酸ナトリウム、250mMNaCl、pH6.8、流速1.0mL/分の移動相を用いた1つのサイズ排除カラムPhenomenexSEC3000、7.8×300mmを使用して、抗体の均一性を分析した図40。10162融合物と10163融合物は予想通りに溶出し、比較的低レベルの高分子種を示したが、10164融合物は予想より早く溶出した。このことはおそらく、凝集を示している。最終的な試料4341-ShK、4341-FGF21、および16435-FGF21の還元状態の軽鎖図41A~C、重鎖図42A~Cに対し、それぞれLC-MS分析を行った。FGF21融合物試料を、還元の前に、製造者QAバイオLLC、カリフォルニア州パームデザートの説明に従いPNGaseF手法を用いて脱グリコシル化した。ただし、基質対酵素の比率は基質10μgに対して酵素1μLとした。アジレントの1100キャピラリーHPLCシステムを使用し、産物をZorbaxSB300C850×1mm3ミクロンカラムに通してクロマトグラフィーを行った。カラムは75°Cに設定し、0.1トリフルオロ酢酸中、n-プロパノール濃度の勾配を増加させてタンパク質を溶出した。カラム流出物を、質量分析用にアジレントのTOF質量分析器に回した。キャピラリー電圧を3,200V、フラグメンター電圧を225Vに設定した。800~3000m/zの質量スペクトルを得て、機器製造業者により提供されたMassHunterソフトウェアを用いてデコンボリュートした。すべての試料が機器の誤差の範囲内の予想質量を有し、全プールが予想産物を含むことを示した。実施例8一価または多価の免疫グロブリン-および/またはFcドメイン-毒素ペプチド類似体融合物の発現および精製実施例5の表7Bに示す本発明の代表的実施形態を含む、一価構造、二価構造、および三価構造の組み合わせを発現させ、比較のため精製した。この中には抗体IgG2-またはIgG1-ShK融合変異体が含まれた図1F~Lを参照。例えば、二価のFc-L10-ShK[1-35]、一価の免疫グロブリン重鎖-[Lys16]ShK融合抗体図1F参照である。IgG2Fc/Fc-ShK変異体図1A参照、二価のFc-L10-ShK[2-35]、一価のFc/Fc-L10-ShK[2-35]も、比較のため、Sullivanら、国際公開第2008/088422A2号、特にその実施例1、2、および56この文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれるに記載の、または本明細書で修正される組換え方法により作製した。毒素ペプチド類似体Fc融合物ペプチボディまたは他の免疫グロブリン融合物の実施形態を作製するために使用する一過性発現系。HEK2936E細胞を、3Lのフェルンバッハエルレンマイヤーフラスコ内で、Lグルタミン6mMおよびジェネテシン25μg/mlを添加したF17培地中、37°C、5CO2で2e5~1.2e6細胞/mlの間で維持し、65RPMで振とうした。トランスフェクション時に、最終培養体積の90の上記F17培地中、細胞を1.1×106細胞/mLまで希釈した。DNA複合体を、最終培養体積の10でFreestyle293培地中で調製した。DNA複合体には、培養物1リットル当たり500μgの総DNAおよび培養物1リットル当たり1.5mlのPEImaxが含まれる。成分を加えたら、DNA複合体を短時間振とうし、室温で10~20分間インキュベートした後、細胞培養物に添加して、恒温器内に戻す。トランスフェクションの翌日、トリプトンN15g/Lを液体20ストックから培養物に添加した。トランスフェクションの6日後、培養物を4,000RPMで40分間遠心分離して細胞をペレット化し、その培養培地を0.45μmフィルターを通して回収した。DNA複合体調製の際、プラスミドの比は、目的の生成物を生成するのに必要なペプチドの所望のモル比に比例していた。IgG2Fc/FcShKの構成要素として、IgG2FcとIgG2FcShKが1:1の比で含まれる。発現の間に、これらが会合してIgG2Fcホモ二量体、IgG2Fc/FcShKヘテロ二量体、およびIgG2FcShKホモ二量体となる。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製の間に、IgG2Fc/FcShKヘテロ二量体一価型が単離された。IgG2Fc-ShK[2-35];IgG2FcShk[2-35,Q16K];IgG2Fc-Shk[1-35];IgG2Fc-ShK[1-35,Q16K]の哺乳動物での発現。Kv1.3阻害ペプチドShK[235]または変異ShK[235,Q16K]の単量体とインフレームで融合されたヒトIgG2の免疫グロブリンFcドメイン:MEWSWVFLFFLSVTTGVHSERKVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//配列番号1をコードするDNA配列を、標準的なPCR技術を用いて構築した。分子のShK[235]またはShK[235,Q16K]および10アミノ酸リンカー部分を、鋳型としてpcDNA3.1CMVi中の原型Fc2xLShK[235]を用いてPCR反応において生成したSullivanら、国際公開第2008/088422A2号、実施例2、図15A~15Bを参照。ShK[135]を、鋳型としてpcDNA3.1CMVi中の原型Fc2xLShK[135]を用いてPCR反応において生成したSullivanら、国際公開第2008/088422A2号、実施例1、図14A~14B。これらのShK構築物は、以下のオリゴ:5’-CATGAATTCCCCACCATGGAATGGAGCTGG-3’配列番号3;および5’-CACGGTGGGCACTCGACTTTGCGCTCGGAGTGGACACC-3’配列番号4を有するpSelexisVh21hIgG2Fc鋳型から生成された、以下の改変VH21シグナルペプチドアミノ酸配列:MEWSWVFLFFLSVTTGVHS//配列番号2を有する。N末端リンカー伸長を有する野生型ShK[235]アミノ酸配列GGGGSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//配列番号6は、以下のDNA配列:GGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCCAGTGCAAGCACAGCATGAAGTACCGCCTGAGCTTCTGCCGCAAGACCTGCGGCACCTGC//配列番号5によりコードされた。このコード配列配列番号5を含む断片を、下のオリゴ配列番号7および配列番号8ならびに鋳型としてpcDNA3.1CMVi中の原型FcL10ShK[235]を用いて生成したSullivanら、国際公開第2008/088422A2号、実施例2、図15A~15B。この文献は参照により組み込まれる:5’-GTCCACTCCGAGCGCAAAGTCGAGTGCCCACCGTGCC-3’配列番号7;および5’-TCCTCCTCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’//配列番号8。ストラタジーン社のQuikChangeMultisite-DirectedMutagenesisキットカタログ番号200531で部位特異的突然変異誘発を製造者の説明書に従い使用して、変異体ShK[235,Q16K]を生成した。突然変異誘発を生じさせるために使用したオリゴは:5’-GCTGCACCGCCTTCAAGTGCAAGCACAGC3’配列番号9;および5’-GCTGTGCTTGCACTTGAAGGCGGTGCAGC-3’配列番号10;であり、鋳型としてpcDNA3.1CMVi中の原型Fc-L10-ShK[2-35]を用いてSullivanら、国際公開第2008/088422A2号、実施例2、図15A~15B、N末端リンカー伸長を有するShk2-35,K16アミノ酸配列:ggggsggggsscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtc//配列番号12をコードするDNAコード配列:Ggaggaggaggatccggaggaggaggaagcagctgcatcgacaccatccccaagagccgctgcaccgccttcaagtgcaagcacagcatgaagtaccgcctgagcttctgccgcaagacctgcggcacctgc//配列番号11を得た。ShK[1-35]WT断片を、pcDNA3.1CMVi中の原型Fc-2xL-ShK[1-35]Sullivanら、国際公開第2008/088422A2号、実施例1、図14A~14Bを鋳型として、ならびに以下のオリゴ:5’-GTCCACTCCGAGCGCAAAGTCGAGTGCCCACCGTGCC-3’配列番号7;および5’-TCCTCCTCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’配列番号8を用いて生成した。IgG2Fc領域を以下のオリゴ:5’-CCGGGTAAAGGAGGAGGAGGATCCGGAG-3’配列番号13;および5’-CATGCGGCCGCTCATTAGCAGGTG-3’配列番号14ならびにアミノ酸配列:appvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk配列番号16をコードする以下のDNAコード配列:gcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa//配列番号15を含む断片を生じるpSelexisVh21-hIgG2-Fc鋳型を用いて生成した。PCR断片を生成し、産物をゲル上で泳動させた。ゲル精製の後、DNA断片をPCRチューブにまとめて入れ、外側プライマー:5’-CATGAATTCCCCACCATGGAATGGAGCTGG-3’配列番号3;および5’-CATGCGGCCGCTCATTAGCAGGTG-3’配列番号14で繋ぎ合わせた。PCR産物をEcoRIおよびNotIロシュ制限酵素で消化し、ゲル精製キットによりアガロースゲル精製した。同時に、pTT14ベクターCMVプロモーター、ポリAテールおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含むアムジェン社のベクターをEcoRIおよびNotI制限酵素で消化し、大断片をゲル精製キットにより精製した。各精製PCR産物を大断片に連結し、OneShotTop10細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のDNAを単離して、EcoRIおよびNotI制限酵素消化を施し、1パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたDNAを、配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と100のマッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には各構築物の1クローンのみを選択した。最終的なpTT14-VH1SP-IgG2-Fc構築物は、以下の配列:Mewswvflfflsvttgvhserkvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsscidtipksrctafqckhsmkyrlsfcrktcgtc//配列番号17を有するIgG2-Fc-L10-ShK2-35融合ポリペプチドをコードした。pTT14-VH21SP-IgG2-Fc-L10-ShK2-35,Q16K構築物は、IgG2-FcL10-ShK2-35,Q16K融合ポリペプチド配列:MewswvflfflsvttgvhserkvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsscidtipksrctafKckhsmkyrlsfcrktcgtc//配列番号18をコードし;pTT14-VH21SP-IgG2-FcShK1-35構築物は、以下の配列:mewswvflfflsvttgvhserkvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsrscidtipksrctafqckhsmkyrlsfcrktcgtc//配列番号19を有するIgG2Fc-L10-ShK1-35融合ポリペプチドのコード配列を含んでいた。pYD16CMVプロモーター、ポリAテールおよびヒグロマイシン耐性遺伝子を含むアムジェン社のベクター中でのVH21SP-IgG2-Fcのみの構築物生成は、以下のように行った:VH21シグナルペプチドを以下のオリゴ:5’-CATAAGCTTCCCACCATGGAATGGAGCTGG-3’配列番号20;および5’-CACGGTGGGCACTCGACTTTGCGCTCGGAGTGGACACC-3’配列番号4を用いて、ならびに上記のpSelexis鋳型を用いて生成した。Fc領域を、上記のpSelexis鋳型ならびに以下のオリゴ:5’-GTCCACTCCGAGCGCAAAGTCGAGTGCCCACCGTGCC-3’配列番号7;および5’-CATGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3’配列番号21を用いて生成した。PCR断片をゲル精製し、外側プライマーGGTTGAGAGGTGCCAGATGTCAGGGCTGCAGCAGCGGC//配列番号391およびCAGCTGCACCTGACCACCACCTCCACCGCTATGCTGAGCGCG//配列番号392を用いた1回のPCR反応で繋ぎ合わせた。得られたPCR断片をゲル精製し、HindIIIおよびBamHIにより消化した。同時に、pYD16ベクターCMVプロモーター、ポリAテールおよびヒグロマイシン耐性遺伝子を含むアムジェン社のベクターもHindIIIおよびBamHIにより切断し、大ベクター断片をキアジェン社のゲル精製キットにより精製した。精製PCR産物を大断片に連結し、OneShotTop10細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のDNAを単離して、HindIIIおよびBamHI制限酵素消化を施し、1パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたDNAを、配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と100マッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には1クローンのみを選択した。最終的なpYD16-VH21SP-IgG2-Fc構築物は、ヒトIgG2-Fc上記配列番号1をコードした。IgG2-FcShK[1-35,Q16K]の哺乳動物での発現。DNApTT5-aKLH120.6-VK1SP-IgG2-HC-L10-ShK[1-35,Q16K]構築物を用いて、DNAコード配列:ggatccggaggaggaggaagccgcagctgcatcgacaccatccccaagagccgctgcaccgccttcaagtgcaagcacagcatgaagtaccgcctgagcttctgccgcaagacctgcggcacctgctaatgagcggccgctcgaggccggcaaggccggatcc//配列番号22を含む断片を、BamHI/BamHIを用いて切断した。このコード配列配列番号23は、N末端リンカー配列:GSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//配列番号23を有するShK1-35,Q16Kをコードする。同時に、pTT14-hIgG2-Fc-ShK[1-35]WT構築物もBamHI/BamHIで消化することにより、Shk[1-35]コード領域を除去し、アミノ酸配列:mewswvflfflsvttgvhserkvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggg//配列番号25をコードするコード配列:Atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccgagcgcaaagtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaggaggagga//配列番号24を得た。ShKを除去したpTT14-hIgG2-Fcベクターを、仔ウシ腸ホスファターゼCIPで処理して5’リン酸基を除去し、フェノール/クロロホルム抽出を行って、ベクターのそれ自体との再連結を防止した。挿入ShK[1-35,Q16K]断片をそのベクターからゲル精製により取り出し、キアジェン社のゲル精製キットでクリーンアップした。精製挿入物を大ベクター断片に連結し、OneShotTop10細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のDNAを単離して、BamHI制限酵素消化を施し、1パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたDNAを、配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と100マッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には1クローンのみを選択した。最終的なpTT14-IgG2-Fc-ShK[1-35,Q16K]構築物は、以下のIgG2Fc-L10-ShK1-35,Q16K融合タンパク質配列:mewswvflfflsvttgvhserkvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsrscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtc//配列番号26をコードした。IgG2Fc-L10-ShK1-35のアミノ酸配列は、次のとおりである。mewswvflfflsvttgvhserkvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsrscidtipksrctafqckhsmkyrlsfcrktcgtC//配列番号30所望のaKLHIgG2/Fc-ShK産物は、図1Eにおいて構成されるように、すぐ上の各構成要素a~cの1コピーを含んでいた。このため、その比は1:1:1であった。この産物は、Fcドメインで結合された半抗体と半Fcの融合物ヘミボディhemibodyと表現することができる。培養物から除去する必要のあるさらなるペプチド集合体は、aKLHAbおよびFc-ShKホモ二量体であった。ShK[1-35]WT断片を、pcDNA3.1CMVi中の原型Fc-L10-ShK[1-35]を鋳型としてSullivanetalToxinPeptideTherapeuticAgents、国際出願PCT/米国特許出願公開第2007/022831号国際公開第2008/088422号として公開の実施例1、図14A~14Bに記載。この文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、ならびに以下のオリゴ:5’-TCCCTGTCTCCGGGTGGAGGAGGAGGATCCGGAG-3’配列番号47;および5’-CATGCGGCCGCTCATTAGCAGGTG-3’配列番号14を用いて生成した。PCR産物を1アガロースゲル上で泳動した。バンドをアガロースプラグ用に切り取り、このプラグを新たなPCR反応チューブに入れた。次いで、配列番号357および配列番号330の外側プライマーを用いて、PCRによりアガロースプラグを増幅した。次いで、PCR産物を、XbaIおよびNotIにより消化し、PCRクリーンアップキットキアジェンで精製した。同時に、pTT5ベクターCMVプロモーターおよびポリAテールを含むアムジェン社のベクターをXbaIおよびNotIにより切断した。pTT5ベクターを1アガロースゲル上で泳動し、大きい方の断片を切り出して、キアジェン社のゲル精製キットでゲル精製した。精製PCR産物を大ベクター断片と連結し、OneShotTop10細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のDNAを単離して、XbaIおよびNotI制限酵素消化を施し、1パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたDNAを、配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と100マッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には1クローンのみを選択した。最終的なpTT5-aKLH120.6-VK1SP-IgG2-HC-L10-ShK[1-35]構築物は、アミノ酸配列:Mdmrvpaqllgllllwlrgarcqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyhmhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardrgsyywfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsrscidtipksrctafqckhsmkyrlsfcrktcgtc//配列番号48を有するIgG2-HC-L10-ShK[1-35]融合ポリペプチドをコードした。この構築物のShK[1-35,Q16K]変異体型を生成するために、ストラタジーン社のQuikchangeMultisiteDirectedMutagenesisキットカタログ番号200531を製造者の説明書に従って、ならびにオリゴ:5’-GCTGCACCGCCTTCAAGTGCAAGCACAGC3’配列番号9;および5’-GCTGTGCTTGCACTTGAAGGCGGTGCAGC-3’配列番号10を用いて、部位特異的変異誘発を行った。最終的な構築物pTT5-aKLH120.6-VK1SP-IgG2-HC-L10-ShK[1-35,Q16K]は、以下のアミノ酸配列:Mdmrvpaqllgllllwlrgarcqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyhmhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardrgsyywfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsrscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtc//配列番号49を有するIgG2-HC-L10-ShK[1-35,Q16K]融合ポリペプチドをコードした。aKLH-IgG2重鎖-L10-ShK[2-35,Q16K]の哺乳動物での発現。DNA構築物pTT5-aKLH120.6-VK1SP-IgG2-HC-L10-ShK[1-35]をベクターとして使用し、ShK[1-35]をBamHI/BamHIを用いて切り出した。ShK[1-35]を含まないpTT5-aKLH120.6-VK1SP-IgG2-HC由来のベクター断片は、アミノ酸配列:mdmrvpaqllgllllwlrgarcqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyhmhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardrgsyywfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggg//配列番号51をコードするコード配列:atggacatgagggtgcccgctcagctcctggggctcctgctgctgtggctgagaggtgccagatgtcaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccggctaccacatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaaccctaacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagatcgtgggagctactactggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggaggagga//配列番号50を含んだ。次いで、ベクター断片を、仔ウシ腸ホスファターゼCIPで処理して5’リン酸基を除去し、フェノール/クロロホルム抽出を行って、ベクターのそれ自体との再連結を防止した。挿入物は、IgG2Fc-L10-ShK2-35,Q16K:mewswvflfflsvttgvhserkvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtc//配列番号18をコードするpTT14-VH21SP-IgG2-Fc-ShK[2-35,Q16K]由来であり、この挿入物もBamHI/BamHIを用いて消化した。挿入ShK[2-35,Q16K]断片をそのベクターからゲル精製により取り出し、キアジェン社のゲル精製キットでクリーンアップした。アミノ酸配列:gsggggsscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtc配列番号53をコードするコード配列:ggatccggaggaggaggaagcagctgcatcgacaccatccccaagagccgctgcaccgccttcaagtgcaagcacagcatgaagtaccgcctgagcttctgccgcaagacctgcggcacctgctaatga//配列番号52を含む精製DNA挿入物を大ベクター断片と連結し、OneShotTop10細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のDNAを単離して、BamHI制限酵素消化を施し、1パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたDNAを、配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と100マッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には1クローンのみを選択した。最終的な構築物pTT5-aKLH-IgG2HC-L10-ShK[2-35,Q16K]は、IgG2HC-L10-ShK[2-35,Q16K]融合ポリペプチド:Mdmrvpaqllgllllwlrgarcqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyhmhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardrgsyywfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtc//配列番号54をコードした。VH21SP-N末端ShK[1-35]野生型IgG1-Fcの哺乳動物での発現。ヒトIgG1のN末端Fc領域とインフレームで融合したKv1.3阻害ペプチドShK[135]の単量体をコードするDNA配列を、以下に記載のように構築した。VH21SP-ShK1-35-L10-IgG1Fc発現ベクター構築のために、PCR法を用いて、HindIIIおよびBamHI制限部位に隣接する4グリシンおよび1セリンアミノ酸と連結したVH21シグナルペプチドShK1-35遺伝子を生成し、BamHIおよびNotI制限部位に隣接するIgG1Fc断片と連結した4グリシンおよび1セリンアミノ酸を、pcDNA3.1CMVi中のFc-L10-OSK1を鋳型として用いたPCR反応Sullivanら、国際公開第2008/088422A2号の実施例41および図42A~42Bに記載。この文献は参照により組み込まれるで生成した。VH21SP-ShK1-35-G4Sを生成するために、PfuTurboHotStartDNAポリメラーゼストラタジーンを用いた、95°C-30秒、55°C-30秒、75°C-45秒で35サイクルのPCR反応において、下に示す配列の2つのオリゴを使用した;HindIIIaagcttおよびBamHIggatcc制限部位には下線を付す:順方向プライマー:tgcagaagcttctagaccaccatggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcccgcagctgcatcgacaccatccccaagagccgctgcaccgccttccagt//配列番号55;および逆方向プライマー:Ctccggatcctcctcctccgcaggtgccgcaggtcttgcggcagaagctcaggcggtacttcatgctgtgcttgcactggaaggcggtgcagcggctcttggggatggtgtcgat//配列番号56。得られたPCR産物は、2パーセントのアガロースゲル上で202bpのバンドとして分離された。202bpのPCR産物を、PCR精製キットキアジェンを用いて精製し、次いで、HindIIIおよびBamHIロシュ制限酵素で消化し、アガロースゲルをゲル抽出キットキアジェンで精製した。G4S-IgG1Fcを生成するために、PfuTurboHotStartDNAポリメラーゼストラタジーンを用いた、95°C-30秒、55°C-30秒、75°C-1分で30サイクルのPCR反応において、下に示す配列の2つのオリゴを使用した;BamHIggatccおよびNotIgcggccgc制限部位に下線を付す:順方向プライマー:gtaggatccggaggaggaggaagcgacaaaactcacac//配列番号57;および逆方向プライマー:Cgagcggccgcttactatttacccggagacaggga//配列番号58。得られたPCR産物は、1パーセントのアガロースゲル上で721bpのバンドとして分離された。721bpのPCR産物を、PCR精製キットキアジェンを用いて精製し、次いで、BamHIおよびNotIロシュ制限酵素で消化し、アガロースゲルをゲル抽出キットキアジェンで精製した。pcDNA3.1CMVi-Fc-L10-OSK1ベクターをBamHIおよびNotI制限酵素で消化し、大断片をゲル抽出キットにより精製した。ゲル精製した4GS-IgG1Fc断片を精製大断片と連結し、OneShot登録商標Top10インビトロジェン中に形質転換して、pCMVi-Fc-L10-IgG1Fcベクターを作出した。次いで、pCMVi-Fc-L10-IgG1FcベクターをHindIIIおよびBamHI制限酵素で消化し、大断片をゲル抽出キットにより精製した。ゲル精製したVH21SP-ShK1-35-4GS断片を精製大断片に連結し、OneShot登録商標Top10インビトロジェン中に形質転換して、pCMVi-VH21SP-ShK1-35-L10-IgG1Fc構築物を得た。形質転換細菌コロニー由来のDNAを単離して、BamHIおよびNotI制限酵素で消化し、1パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたDNAを、配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と100のマッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には各遺伝子由来の1クローンのみを選択した。pCMViベクター中のVH21SP-ShK1-35-L10-IgG1Fc由来のDNAを再配列決定してFcおよびリンカー領域を確認し、配列は上記配列と100一致していた。断片H21SP-ShK1-35-L10-IgG1Fcは、VH21SP-ShK1-35-L10-IgG1Fcのアミノ酸配列:mewswvflfflsvttgvhsrscidtipksrctafqckhsmkyrlsfcrktcgtcggggsggggsdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk//配列番号60をコードするコード配列:atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcccgcagctgcatcgacaccatccccaagagccgctgcaccgccttccagtgcaagcacagcatgaagtaccgcctgagcttctgccgcaagacctgcggcacctgcggaggaggaggatccggaggaggaggaagcgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatagtaa//配列番号59を含んだ。N末端ShK[1-35,Q16K]-aKLHHC;およびN末端ShK[1-35Q16K]-aKLHLCの哺乳動物での発現。N末端ShK[1-35]野生型L10-IgG1-Fcをコードする構築物を用いて、以下のオリゴ:5’-GCTGCACCGCCTTCAAGTGCAAGCACAGC-3’//配列番号9;および5’-GCTGTGCTTGCACTTGAAGGCGGTGCAGC-3’配列番号10を使用して部位特異的変異誘発を行い、ShK領域におけるQ16K変異を生じさせた。ストラタジーン社のQuikChangeMultiSiteDirectedMutagenesisキットを製造者の説明書に従って使用した。pCMViN末端ShK[1-35Q16K]-L10-IgG1-Fcの最終構築物は、以下のシグナルペプチドVH21SP-ShK[1-35,Q16K]-L10-IgG1-Fc融合ポリペプチド:Mewswvflfflsvttgvhsrscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtcggggsggggsdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk//配列番号61をコードした。N末端ShK[1-35,Q16K]-aKLHHC構築物を生成するために、シグナルペプチドShK[1-35Q16K]-L10リンカーを含むPCR産物を、以下のオリゴ:5’-CATTCTAGACCACCATGGAATGG-3’配列番号62;5’-CAGCTGCACCTGGCTTCCTCCTCCTCCGG-3’配列番号63;および鋳型pCMVi-N末端ShK[1-35,Q16K]-L10-IgG1-Fcを用いて作製し、VH21SP-ShK1-35,Q16K-L10のアミノ酸配列:MEWSWVFLFFLSVTTGVHSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTCGGGGSGGGGS//配列番号65をコードするコード配列:atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcccgcagctgcatcgacaccatccccaagagccgctgcaccgccttcaagtgcaagcacagcatgaagtaccgcctgagcttctgccgcaagacctgcggcacctgcggaggaggaggatccggaggaggaggaagc//配列番号64を含む断片を得た。aKLH-HC断片を生成するために、オリゴ:5’-GGAGGAGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAG-3’配列番号66;5’-CATGCGGCCGCTCATTTACCC-3’配列番号67;および鋳型pTT5-aKLH120.6-HCを用いてPCR産物を作出し、アミノ酸配列:qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyhmhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardrgsyywfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk//配列番号69をコードするコード配列:caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccggctaccacatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaaccctaacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagatcgtgggagctactactggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga//配列番号68を含むDNA断片を得た。2つのPCR産物をゲル上で泳動し、適当なサイズのバンドをアガロースプラグ用に切り取った。アガロースプラグを新たな単一のPCR反応に供し、最外プライマー配列番号62および配列番号67を用いて断片を繋ぎ合わせた。XbaIおよびNotIを用いてPCR断片を切断し、キアジェン社のPCRクリーンアップキットでクリーニングした。同時に、pTT5ベクターもXbaIおよびNotIにより切断し、ゲル精製した。精製挿入物を、大ベクター断片に連結し、OneShotTop10細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のDNAを単離して、XbaIおよびNotI制限酵素消化を施し、1パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたDNAを、配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と100マッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には1クローンのみを選択した。最終構築物のpTT5N末端ShK[1-35Q16K]-L10-aKLH120.6-HCは、VH21SP-ShK[1-35,Q16K]-L10-aKLH120.6-HC融合ポリペプチド:Mewswvflfflsvttgvhsrscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtcggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyhmhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardrgsyywfdpwgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk//配列番号70をコードした。最後に、N末端ShK[1-35,Q16K]-L10-aKLH120.6軽鎖LCを上と同じ方法で生成した。シグナルペプチドShK[1-35,Q16K]-L10を含むPCR産物を、オリゴ:5’-CATTCTAGACCACCATGGAATGG-3’配列番号62;および5’-CATCTGGATGTCGCTTCCTCCTCCTCCGG-3’配列番号71;ならびに鋳型pCMVi-N末端ShK[1-35Q16K]-L10-IgG1-Fcを用いて作出し、シグナルペプチドVH21SP-ShK1-35,Q16K-L10リンカーのアミノ酸配列:mewswvflfflsvttgvhsrscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtcggggsggggs//配列番号65をコードするコード配列:atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcccgcagctgcatcgacaccatccccaagagccgctgcaccgccttcaagtgcaagcacagcatgaagtaccgcctgagcttctgccgcaagacctgcggcacctgcggaggaggaggatccggaggaggaggaagc//配列番号64を含むDNA断片を得た。鋳型およびオリゴ:5’-GGAGGAGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGTC-3’配列番号72;および5’-CATCTCGAGCGGCCGCTCAAC-3’配列番号73の使用。得られたクローンPCR断片は、N末端シグナルペプチドを有するN末端VH21SP-ShK[1-35,Q16K]-L10-aKLH120.6軽鎖LCのアミノ酸配列:mewswvflfflsvttgvhsrscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtcggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirndlgwyqqkpgkapkrliyaasslqsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyyclqhnsypltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec//配列番号75をコードするコード配列:atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcccgcagctgcatcgacaccatccccaagagccgctgcaccgccttcaagtgcaagcacagcatgaagtaccgcctgagcttctgccgcaagacctgcggcacctgcggaggaggaggatccggaggaggaggaagcgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaaacgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtctacagcataatagttacccgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttga//配列番号74を含んだ。両方のPCR断片配列番号64のコード配列を含むDNA断片および配列番号74のコード配列を含むaKLH120.6軽鎖LC断片をゲル上で泳動し、適当なサイズのバンドをアガロースプラグ用に切り取った。アガロースプラグを新たな単一のPCR反応に供し、最外プライマー配列番号62および配列番号73を用いて断片を繋ぎ合わせた。得られたPCR断片をXbaIおよびNotIを用いて切断し、キアジェン社のPCRクリーンアップキットでクリーニングした。同時に、pTT14ベクターCMVプロモーター、ポリAテールおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含むアムジェン社のベクターもXbaIおよびNotIで切断し、ゲル精製した。精製挿入物を、大ベクター断片に連結し、OneShotTop10細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のDNAを単離して、XbaIおよびNotI制限酵素消化を施し、1パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたDNAを、配列決定に供した。シグナルペプチドShK[1-35,Q16K]-L10-aKLH120.6-LC融合ポリペプチド配列すなわち、配列番号75をコードする最終構築物pTT14-N末端ShK[1-35Q16K]-L10-aKLH120.6-LC。実施例9コンパレーター分子の精製および評価:一価Fc/Fc-L10-ShK[2-35]ヘテロ二量体、一価または二価Fc/Fc-ShK1-35Q16KIgG2ヘテロ二量体、その他のポリペプチド分子一価または二価のFc-L10-ShK[2-35]、一価または二価のFc-L10-ShK[1-35]、一価または二価のFc-L10-ShK1-35,Q16K、および、表7B本明細書の実施例5に列記されているその他のShK関連ポリペプチド分子を、本明細書に記載の方法で発現し、単離し、精製した。表7Bに記載のPEG化および未PEG化毒素ペプチドコンパレーターを、以下のとおり合成により調製した。ペプチド合成。NαFmoc側鎖保護アミノ酸およびHCysTrt2ClTrtレジンを、ノバビオケム社、バーケム社、またはシグマアルドリッチ社から購入した。以下の側鎖保護ストラテジーを用いた:AspOtBu、ArgPbf、CysTrt、GluOtBu、HisTrt、LysNε-Boc、SerOtBu、ThrOtBu、およびTyrOtBu。ShKRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//配列番号378、[Lys16]ShKRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC//配列番号76または他の毒素ペプチド類似体アミノ酸配列を、H-CysTrt-2Cl-Trtレジン0.2mmol、0.32mmol/g負荷を用いた0.2mmol当量基準のDIC/HOBtカップリング化学を用いたSPPSにより、CSBioペプチド合成装置で段階的に合成した。各カップリングサイクルに対して、1mmolNα-Fmoc-アミノ酸をN,NジメチルホルムアミドDMF中、2.5mLの0.4M1ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBtに溶解させた。この溶液に、DMF中1.0mLの1.0MN,N-ジイソプロピルカルボジイミドDICを加えた。溶液を窒素バブリングにより15分間撹拌して予備活性化を行い、次いで、レジンに加えた。混合物を2時間振とうした。レジンをろ過し、DMFで3回、ジクロロメタンDCMで2回、およびDMFで3回洗浄した。DMF中20ピペリジンによる処理5mL、2×15分によりFmoc脱保護を行った。最初の23残基を、上記Fmocアミノ酸カップリングおよびFmoc除去ステップを繰り返して単一カップリングした。残りの残基を、Fmoc除去を進める前にカップリングステップを2回行うことにより二重カップリングした。合成に続いて、レジンを排出し、DCM、DMF、DCMで順次洗浄し、次いで減圧下で乾燥させた。ペプチド-レジンを250mLのプラスチック丸底フラスコに移した。トリイソプロピルシラン1.5mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオールDODT、1.5mL、水1.5mL、トリフルオロ酢酸TFA、20mL、および撹拌子での処理により、ペプチドを脱保護してレジンから切り離し、混合物を3時間撹拌した。混合物を150mLの焼結ガラス漏斗を通して250mLのプラスチック丸底フラスコ内にろ過した。混合物を150mLの焼結ガラス漏斗を通して250mLのプラスチック丸底フラスコ内にろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテルの添加により沈殿させ、遠心分離により回収し、減圧下で乾燥させた。ペプチドのフォールディング。乾燥粗直鎖状ペプチド約600mg、例えば[Lys16]ShKペプチド配列番号76または[Lys16]ShK-Ala[Lys16,Ala36]-ShKとしても知られる;配列番号379ペプチドを、16mLの酢酸、64mLの水および40mLのアセトニトリル中に溶解した。混合物を15分間急速に撹拌して完全に溶解させた。ペプチド溶液を、1700mLの水および大型の撹拌子の入った2Lのプラスティックボトルに加えた。こうして希釈した溶液に、20mLの濃縮水酸化アンモニウムを加えて溶液のpHを9.5に上げた。必要に応じて、少量の酢酸またはNH4OHでpHを調節した。溶液を80rpmで一晩撹拌し、LCMSによりモニターした。通常、24~48時間でフォールディング完了と判断し、酢酸とTFApH=2.5を添加して溶液をクエンチした。水溶液をろ過した0.45μmセルロース膜。逆相HPLC精製。逆相高速液体クロマトグラフィーを、分析C18、5μm、0.46cm×25cmまたは分取C18、10μm、2.2cm×25cmカラムで行った。クロマトグラフィーによる分離は、A中の緩衝液BA=0.1TFA水溶液;B=0.09TFAを含む90ACN水溶液の直線勾配を用いて行い、通常、解析的分析では5~95で、流速1mL/分で35分にわたり、分取の分離では、5~65で、流速20mL/分で90分にわたり行った。分析および分取HPLC画分をESMSおよびフォトダイオードアレイPDAHPLCにより特徴付けし、一緒にして凍結乾燥させた。質量分析。イオンスプレー大気圧イオン化源を装備した単一四重極質量分析器で質量スペクトルを得た。試料25μLを、石英ガラスキャピラリー接続部分内径50μmを介して直接イオン化源と接続した移動溶媒10μL/分;0.05TFAを含む30:50:20ACN/MeOH内に注入した。試料の液滴を5kVの正電位でイオン化し、境界プレート、次いで開口部直径100~120μmを通して、60Vの電位で分析器に入れた。0.1Daのスキャンステップサイズで質量範囲400~2200Daにわたりフルスキャン質量スペクトルを得た。観察されたm/z値から分子量を導き出した。PEG化、精製、および解析。ペプチド、例えば[Lys16]ShK配列番号76または[Lys16]ShK-Ala配列番号379を、活性化された直鎖状または分岐PEGを用いて、そのN末端で還元的アルキル化により選択的にPEG化した。20mMシアノ水素化ホウ素ナトリウムおよび2モルの過剰20kDaモノメトキシ-PEG-アルデヒドNOF、日本を含有する50mMNaH2PO4、pH4.5の反応緩衝液中、2mg/mlで結合を行った。結合反応物を約5時間、室温で撹拌し、その進行をRP-HPLCによりモニターした。完了した反応物を、20mMNaOAcpH4による4倍希釈によりクエンチし、4°Cまで冷却した。次いで、PEGペプチドを40°Cでクロマトグラフィーにより精製したが、ここではSPセファロースHPカラムGEヘルスケア、ニュージャージー州ピスカタウェイを使用し、20mMNaOAcpH4.0中0~1MNaClの直線勾配で溶出した。溶出したピーク画分をSDS-PAGEおよびRP-HPLCにより解析し、プーリングを純度>97で決定した。観察された主要な夾雑物はジ-PEG化毒素ペプチド類似体であった。選択されたプールを3kDaMWCO膜に対する遠心ろ過により2~5mg/mlまで濃縮し、5ソルビトールを含む10mMNaOAcpH4中に透析した。次いで、透析したプールを0.2ミクロンのフィルターにより無菌ろ過し、SDSPAGEデータ非表示により純度が>97であることを判定した。アジレント1100モデルHPLCで、0.1TFA/H2O中、1ml/分でZorbax登録商標5μm300SB-C84.6×50mmカラムアジレントに流し、カラム温度を40°Cに維持して、逆相HPLCを行った。PEG-ペプチド20μg試料を注入し、波長215nmをモニターしながら、6~60の直線勾配で溶出した。融合タンパク質。概して、図1Aと図2Bはそれぞれ、一価と二価のFc毒素ペプチドまたは毒素ペプチド類似体融合タンパク質すなわちペプチボディの概略図を示す。二価のFcShK分子は、2本のFcShK鎖を含むホモ二量体である。一価のFcShK毒素ペプチドまたは毒素ペプチド類似体分子は、1本のFc鎖と1本のFcShKまたは類似体鎖を含むヘテロ二量体である。一価のFcShK分子は、二量体につき単一のShKペプチドのみを含むため、一価とみなされる。Fc毒素ペプチド類似体と称される構築物または鎖は、N末端Fc領域を含み、かつ任意で、毒素ペプチドまたは毒素ペプチド類似体と共有結合する可動性リンカー配列例えば、L10ペプチジルリンカーGGGGSGGGGS;配列番号153を含み、これにより、N末端からC末端の配向がFc-リンカー-毒素ペプチドまたは毒素ペプチド類似体となる。Sullivanら、国際公開第2008/088422A2号の実施例1および2には、哺乳類細胞から発現した二価のFc-ShKペプチボディ、Fc-L10-ShK1-35、およびFc-L10-ShK2-35の活性について記載されている。国際公開第2008/088422A2号の実施例1には、発現中に少量の最終生成物として形成される一価のFc-L10-ShK1-35分子の単離についても記載されている。一価抗体3742-ShK1-35,Q16K結合体は、ヒト全血のT細胞サイトカイン分泌を強力に遮断した本明細書の実施例5の表7A~Bを参照。実施例10ラットおよびカニクイザルにおける薬物動態PK試験ラットのPK。成体Sprague-DawleySDラットn=3/グループに抗体5mg/kgを皮下注射し、投与から0、0.25、1、4、24、48、72、168、336、504、672、840、および1008時間後に側尾静脈から血液約250μLをMicrotainer登録商標血清分離チューブを回収することにより、抗体16435および4341の薬物動態プロファイルを測定した。回収後、各試料を室温に維持し、30~40分の凝固時間の後、較正済みのEppendorf5417R遠心分離システムブリンクマンインスツルメンツ社、ニューヨーク州ウエストベリーを用いて2~8°C、11,500rpmで約10分間、遠心分離した。次に、各ラットに対して事前にラベル表示した極低温保存チューブに回収済み血清を移し、その後の分析用に-60°C~-80°Cで保存した。PK実験試料で得た血清試料濃度を測定するため、以下の方法を用いた:半面積黒色プレートCorning3694を、2μg/mlの抗huFc抗体1.35.1のPBS溶液でコーティングして、4°Cで一晩インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、I-Block商標アプライドバイオシステムズを用いて4°Cで一晩ブロッキングした。試料を希釈する必要がある場合は、ラットSD血清で希釈した。次に、標準試料および試料を、1×PBS1MNaCl0.5Tween20および1BSA緩衝液5血清で1:20に希釈した。プレートを洗浄してから、希釈した標準試料および試料の50μl試料を、抗体1.35.1をコーティングしたプレートに移し、室温で1.5時間インキュベートした。プレートを洗浄してから、I-Block商標5BSA中の100ng/mlの抗huFc抗体21.1-HRP抱合体50μlを加えて、1.5時間インキュベートした。プレートを洗浄してから、50μlのPico基質を加えて、プレートを直ちにルミノメーターで分析した。WinNonLin登録商標Enterpriseversion5.1.1,2006、Pharsight登録商標社、カリフォルニア州マウンテンビューを用いた非区画化方法により、時間濃度データを分析した図34.0。Sprague-Dawleyラットにおける、この2つの抗体の薬物動態プロファイルを図43に示す。SDラットにおける16435と4341のPKパラメーターの一覧を、表8下記に示す。どちらの分子も良好なPKプロファイルを示し、半減期は10日を超えていた。カニクイザルのPK。カニクイザルn=2/グループに対しても、0日目に1mg/kg、57日目に5mg/kgの用量を続けて2回皮下注射することにより、抗体16435と4341の薬物動態プロファイルを測定した。投与前、1mg/kgの1回目投与から0.5、2、4、8、12、24、48、96、168、336、504、672、840、1008、1176、1344時間後2回目の投与前、および5mg/kgの2回目投与から0.5、2、4、8、12、24、48、96、168、336、360、384、432、504、672、840、1008、1176、1344時間後に血清試料を採取した。上記の抗IgGサンドイッチELISAを用いて、試料の16435および4341抗体レベルを測定した。時間濃度データの解析は、WinNonLin登録商標を用いた非区画的方法により行った。カニクイザルにおける、この2つの抗体の薬物動態プロファイルを図44に示す。カニクイザルにおける16435と4341のPKパラメーターの一覧を、表9下記に示す。どちらの分子も、カニクイザルにおいて良好なPKプロファイルを示し、半減期は16435が約12日、4341が約21日であった。4341抗体の方が16435より良好なPK特性を有し、FcRnの結合および標的媒介性の薬物動態targetmediateddrugdispositionTMDDクリアランス機構の不存在に基づき、4341抗体はサルにおける正常なhuIgGクリアランスを示した。加えて、図44の結果から、カニクイザルに複数回投与した場合でも、抗体16435と4341のいずれも、カニクイザルの免疫応答に媒介されるクリアランスの有意な変化をまったく示していないことが分かる。仮に、異常な抗体クリアランスを引き起こす有意な免疫応答が存在していたとすれば、1回目の投与による免疫系初回刺激により、2回目の投与後にそうした免疫応答が予期されていたであろうと推定される。"