"細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮する方法であって:a心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の該細胞の集団を提供する工程;ならびにb該集団からSIRPAを発現している細胞を単離する工程;を包含し、ここで、該細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む、方法。前記ヒト多能性幹細胞が、胚性幹細胞である、請求項1に記載の方法。前記ヒト多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項1に記載の方法。前記ヒト多能性幹細胞が、細胞分化を誘導するのに有効な量の少なくとも1つの誘導因子に曝露される、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記少なくとも1つの誘導因子の量が、前記集団中のSIRPA濃度に基づいて最適化される、請求項4に記載の方法。前記少なくとも1つの誘導因子が、サイトカインを含む、請求項4および5のいずれか1項に記載の方法。前記少なくとも1つの誘導因子が、好ましくは40ng/mlまでの濃度、さらに好ましくは約6ng/mlまたは約30ng/mlの濃度の、アクチビンAを含む、請求項4~6のいずれか1項に記載の方法。前記少なくとも1つの誘導因子が、好ましくは40ng/mlまでの濃度、さらに好ましくは約10ng/mlの濃度の、骨形成タンパク質4を含む、請求項4~7のいずれか1項に記載の方法。前記ヒト多能性幹細胞が、さらに骨形成タンパク質インヒビターに曝露される、請求項4~8のいずれか1項に記載の方法。前記骨形成タンパク質インヒビターが、Dorsomorphin、Nogginおよび可溶性骨形成タンパク質レセプターからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。前記ヒト多能性幹細胞が、さらにVEGF、DKKおよびbFGFのうちの少なくとも1つに曝露される、請求項4~10のいずれか1項に記載の方法。前記ヒト多能性幹細胞が、約1日間~約5日間、好ましくは約3日間、前記誘導因子に曝露される、請求項4~11のいずれか1項に記載の方法。前記ヒト多能性幹細胞の誘導の開始と前記SIRPAを発現している細胞を単離する工程との間の時間が、約5日間~約45日間、好ましくは約8日間~約25日間である、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。前記SIRPAを発現している細胞が、該細胞によるNkx2.5発現の開始時点ごろに現われる、該細胞によるSIRPAの発現の開始後に単離される、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。SIRPA細胞表面抗原を有する前記細胞が、該細胞によるNkx2.5発現の開始時と、該細胞による収縮および心臓特異的構造タンパク質発現の開始時との間に単離される、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。CD90、CD31、CD140BおよびCD49Aのうちの少なくとも1つを発現している細胞を前記集団から枯渇させる工程をさらに包含する、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。CD90、CD31、CD140BおよびCD49Aのうちの1つを発現している前記細胞が、対応する抗体を用いて枯渇される、請求項16に記載の方法。前記SIRPAを発現している細胞が、SIRPA特異的リガンドを用いて単離される、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。前記SIRPAを発現している細胞が、抗SIRPA抗体もしくは抗体フラグメントまたは抗体様分子、好ましくは抗SIRPA抗体を用いて単離される、請求項18に記載の方法。前記SIRPAを発現している細胞が、磁気ビーズを用いて単離される、請求項18または19に記載の方法。前記SIRPAを発現している細胞が、フローサイトメトリーを用いて単離される、請求項1~20のいずれか1項に記載の方法。前記集団中の細胞が、SIRPA遺伝子座の制御性調節エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、ここで、該レポーター遺伝子は、SIRPAを発現する細胞において発現され、該SIRPAを発現している細胞を単離する工程は、該レポーター遺伝子を発現している細胞を単離する工程を包含する、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。前記レポーター遺伝子が、細胞傷害性因子に対する耐性を付与する、請求項22に記載の方法。前記レポーター遺伝子が、細胞表面タグである、請求項22に記載の方法。前記細胞の濃縮された集団が、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を少なくとも60、好ましくは少なくとも90、さらに好ましくは98含む、請求項1~24のいずれか1項に記載の方法。請求項1~24に記載の方法のいずれか1つを用いて得られた心筋細胞および心筋細胞前駆細胞の濃縮された集団。心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮された細胞の単離された集団であって、該細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を少なくとも60、好ましくは少なくとも90、さらに好ましくは98含む、集団。細胞の集団から心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を単離するためのSIRPAの使用であって、ここで、該細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む、使用。細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について枯渇させる方法であって:a心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が枯渇される予定の該細胞の集団を提供する工程;ならびにb該集団からSIRPAを発現している細胞を枯渇させる工程;を包含し、ここで、該細胞の集団は、心筋細胞、心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む、方法。細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮する方法であって:a心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の該細胞の集団を提供する工程;ならびにbCD90、CD31、CD140BおよびCD49Aのうちの少なくとも1つを発現している細胞を該集団から枯渇させる工程;を包含し、ここで、該細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む、方法。発明の要旨ある態様において、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について細胞の集団を濃縮する方法が提供され、その方法は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の細胞の集団を提供する工程;およびその集団からSIRPAを発現している細胞を単離する工程を包含し;ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。さらなる態様において、本明細書中に記載される方法のいずれか1つを用いて得られた心筋細胞および心筋細胞前駆細胞の濃縮された集団が提供される。さらなる態様において、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮された単離された細胞の集団が提供され、ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を少なくとも60、好ましくは少なくとも90含む。さらなる態様において、細胞の集団から心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を単離するためのSIRPAの使用が提供され、ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。さらなる態様において、細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について枯渇させる方法が提供され、その方法は:心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が枯渇される予定の細胞の集団を提供する工程;およびその集団からSIRPAを発現している細胞を枯渇させる工程を包含し;ここで、その細胞の集団は、心筋細胞、心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。さらなる態様において、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について細胞の集団を濃縮する方法が提供され、その方法は:心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の細胞の集団を提供する工程;ならびにCD90、CD31、CD140BおよびCD49Aのうちの少なくとも1つを発現している細胞をその集団から枯渇させる工程を包含し;ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。本発明の実施形態は、以下の説明および添付の図面を参照することによって最も良く理解され得る。詳細な説明ヒト心筋細胞に特異的な細胞表面マーカーを同定するためのハイスループットフローサイトメトリースクリーニングの使用が本明細書中に記載される。ここで、本発明者らは、細胞表面レセプターSIRPAが、hPSCに由来する心筋細胞上ならびにヒト胎児心筋細胞上に発現されることを報告する。本発明者らは、SIRPAに対する抗体を用いた細胞選別を使用して、最大98の心筋細胞からなる集団をhPSC分化培養物から単離することが可能であることを実証する。細胞表面抗原であるSIRPACD172a、BIT、SHPS1としても知られるは、適切な分化条件下でヒト多能性幹細胞hPSCから発生される心臓前駆細胞上およびトロポニンT陽性心筋細胞上にもっぱらかつ特異的に見出され得る。本願より前には、当該分野において、発生中のマウスまたはヒトの心臓血管細胞上にSIRPAが発現されるという示唆または証拠はなかった。ヒトSIRPAのRNA発現は、脳の種々の部分ならびに血液において、および低レベルで肺において、見出されている。しかしながら、SIRPARNAの発現は、心臓では見出されていないhttp://biogps.gnf.org。SIRPAタンパク質発現は、脳、血液およびリンパ系組織および結腸において、ならびに中程度から弱いレベルで胎盤、膵臓、脾臓、膀胱および胃において検出されているhttp://www.proteinatlas.org/。しかしながら、タンパク質発現は、成人ヒト心臓について報告されていない。したがって、SIRPAがhPSCに由来する心臓前駆細胞および心筋細胞において発現されるという発見は、新規であり、かつ驚くべきことである。1つの例において、SIRPA抗体などのSIRPA結合部分を使用することによって、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞に由来する集団から心筋細胞およびその前駆細胞を識別する、モニターする、および単離する簡便かつ新規の方法が提供される。細胞の単離は、容易かつ効率的であり、1つの実施形態において、生存可能なままで、本明細書中に開示される用途のために使用され得る、90を超える心筋細胞からなる集団が得られる。SIRPAは、OntarioInstituteforCancerResearchAntibodyCoreFacilityによって供給される350を超える商業的に入手可能な抗体のスクリーニングにおいて、有望な心臓マーカーとして同定された。それらの抗体は、以前に公開されたプロトコルYangら、20083を用いて、hESCの定方向分化directeddifferentiationによってもたらされた心臓発生の種々の段階を代表するhESC由来集団に対してスクリーニングされた。分化培養物中の心筋細胞集団心臓トロポニンTcTnT染色によって定義されるようなと同様のサイズの細胞集団を染色する抗体をさらに研究し、細胞選別のために使用した。その350個の表面抗体のうち、1つの抗体であるSIRPAが、hESCに由来する心筋細胞集団をもっぱらかつ特異的に染色した。SIRPAの発現に基づいて単離される細胞は、様々な用途患者特異的疾患モデルの確立、ならびに正常および患者特異的な多能性幹細胞由来の心臓前駆細胞および心筋細胞の遺伝的解析、エピジェネティック解析およびプロテオミクス解析が挙げられるがこれらに限定されないのための、多能性幹細胞に由来する高度に濃縮された心筋細胞前駆細胞例えば、Nkx2.5の発現開始時であるが、細胞の収縮および心臓特異的構造タンパク質の発現の前および心筋細胞の新しい供給源となる。心臓細胞上およびその前駆体上のSIRPAの特異的発現は、心臓の発生および分化の間のこのレセプターおよびその下流のシグナル伝達経路に対する機能を示唆する。SIRPAは、非心臓性PSCに由来する系統例えば、体節骨格筋、骨および軟骨/軟骨細胞の前駆細胞に由来する系統を含むについて濃縮する細胞選別実験のための陰性マーカーとしても使用され得る。ゆえに、1つの態様において、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について細胞の集団を濃縮する方法が提供され、その方法は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の細胞の集団を提供する工程;およびその集団からSIRPAを発現している細胞を単離する工程を包含し;ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。1つの実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。別の実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、細胞分化を誘導するのに有効な量の少なくとも1つの誘導因子inducingagentに曝露される。好ましい実施形態において、その少なくとも1つの誘導因子は、サイトカインを含む。その少なくとも1つの誘導因子は、好ましくは40ng/mlまでの濃度、さらに好ましくは約6ng/mlまたは約30ng/mlの濃度のアクチビンAを含み得る。その少なくとも1つの誘導因子はまた、独立して、好ましくは40ng/mlまでの濃度、さらに好ましくは約10ng/mlの濃度の骨形成タンパク質4を含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞はさらに、好ましくはDorsomorphin、Nogginおよび可溶性骨形成タンパク質レセプターからなる群から選択される骨形成タンパク質インヒビターに曝露される。いくつかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞はさらに、VEGF、DKKおよびbFGFのうちの少なくとも1つに曝露される。いくつかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、約1~約5日間、好ましくは約3日間、誘導因子に曝露される。いくつかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞の誘導の開始とSIRPAを発現している細胞の単離との間の時間は、約5日間~約45日間、好ましくは約8~約25日間である。いくつかの実施形態において、SIRPAを発現している細胞は、その細胞によるSIRPAの発現その細胞によるNkx2.5の発現の開始時点ごろに現われるの開始後に単離される。好ましくは、SIRPA細胞表面抗原を有する細胞は、その細胞によるNkx2.5の発現の開始時と、その細胞による収縮および心臓特異的構造タンパク質発現の開始時との間に単離される。いくつかの実施形態において、上記方法はさらに、CD90、CD31、CD140BおよびCD49Aのうちの少なくとも1つを発現している細胞を、好ましくは対応する抗体を使用して、上記集団から枯渇させる工程を包含する。特定の分子、この場合、SIRPAを発現している細胞を単離するための方法は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、SIRPA特異的リガンドを使用することによって、好ましくは抗SIRPA抗体もしくは抗体フラグメントまたは抗体様分子、およびさらに好ましくは抗SIRPA抗体を使用することによって細胞を単離するために、SIRPAの存在は直接用いられる。いくつかの実施形態において、次いで、それらの細胞は、磁気ビーズおよび/またはフローサイトメトリーを使用して単離される。あるいは、SIRPAを発現している細胞は、間接的に選択され得る。例えば、いくつかの実施形態において、その集団中の細胞は、SIRPA遺伝子座の制御性調節エレメントregulatorycontrolelementsに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、ここで、そのレポーター遺伝子は、SIRPAを発現する細胞において発現され、SIRPAを発現している細胞を単離する工程は、そのレポーター遺伝子を発現している細胞を単離する工程を包含する。1つの好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、細胞傷害性因子に対する耐性を付与する。別の好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、細胞表面タグである。いくつかの実施形態において、濃縮された細胞集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を少なくとも60、好ましくは少なくとも90、さらに好ましくは98含む。さらなる態様において、本明細書中に記載される方法のいずれか1つを用いて得られる心筋細胞および心筋細胞前駆細胞の濃縮された集団が提供される。さらなる態様において、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮された単離された細胞の集団が提供され、ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を少なくとも60、好ましくは少なくとも90、さらに好ましくは98含む。さらなる態様において、細胞の集団から心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を単離するためのSIRPAの使用が提供され、ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。さらなる態様において、細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について枯渇させる方法が提供され、その方法は:心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が枯渇される予定の細胞の集団を提供する工程;およびその集団からSIRPAを発現している細胞を枯渇させる工程を包含し;ここで、その細胞の集団は、心筋細胞、心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。さらなる態様において、細胞の集団を心筋細胞および心筋細胞前駆細胞について濃縮する方法が提供され、その方法は:心筋細胞および心筋細胞前駆細胞が単離される予定の細胞の集団を提供する工程;ならびにCD90、CD31、CD140BおよびCD49Aのうちの少なくとも1つを発現している細胞をその集団から枯渇させる工程を包含し;ここで、その細胞の集団は、心筋細胞および心筋細胞前駆細胞および非心筋細胞に分化するように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を含む。用語濃縮することは、本発明の文脈において使用されるとき、細胞の集団中の所望の細胞型複数含むの相対存在量を増加させる任意の単離または選別プロセスを含む。本明細書中で使用されるとき、用語心筋細胞とは、心筋を構成する細胞をいう。用語心筋細胞前駆細胞とは、心筋細胞に分化する能力を有するヒト多能性幹細胞に由来する前駆細胞を意味する。本明細書中で使用されるとき、細胞を単離するプロセスとは、細胞を選別するための当業者に公知の任意の方法を指し、それらとしては、フローサイトメトリー、蛍光励起細胞分取、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、および物理的特性の差異の利用例えば、密度勾配遠心分離が挙げられるがこれらに限定されない。胚性幹細胞ESCは、初期胚に由来する多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞iPSCは、本発明の文脈において使用されるとき、特定の遺伝子の発現を誘導することによって非多能性細胞から人工的に得られた多能性幹細胞の1タイプである。用語細胞表面抗原とは、免疫系によって認識されることが可能であり、かつ抗体に特異的に結合することができる、細胞の表面上の抗原を指す。本明細書中で使用されるとき、句分化するように誘導されたとは、ヒト多能性幹細胞が特殊化された細胞型に分化するのを惹起するために使用される当該分野で公知の任意の方法を指す。これらの方法は、ヒト多能性幹細胞を誘導因子に曝露することを包含し得る。本明細書中で使用されるとき、用語誘導因子とは、hPSCが特殊化された細胞型心筋細胞および心筋細胞前駆細胞を含むに分化するのを惹起することができる任意の因子を指す。ゆえに、誘導因子は、サイトカインを含み、それらとしては、アクチビンA、骨形成タンパク質4BMP4、塩基性線維芽細胞成長因子FGF2としても知られるbFGF、血管内皮成長因子VEGFAとしても知られるVEGF、dickkopfホモログ1DKK1およびそれらからの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。心筋細胞および心筋細胞前駆細胞に分化するようにヒト多能性幹細胞を誘導するための方法は、当業者に公知である例えば、Yangら3およびLaflammeら19を参照のこと。いくつかの実施形態において、誘導条件例えば、誘導因子の濃度およびそれを使用するタイミングは、得られる濃縮された集団におけるSIRPA濃度を測定することによって最適化され得る。ヒト多能性幹細胞hPSC胚性幹細胞;hESCおよび人工多能性幹細胞;hiPSCを含むから心臓系統の細胞を発生させることができることにより、1予測薬物毒性学および創薬、2循環器疾患の処置のための移植、ならびに3インビトロにおける心臓血管の発生および疾患のモデル化のために有用であるヒト心筋細胞の新規かつ無制限の供給がもたらされる。以下の実施例は、本発明の様々な態様の例証であり、本明細書中に開示されるような本発明の広範な態様を限定しない。材料および方法HPSCの維持および分化HPSCを、記載されているように26維持した。胚様体EBを、以前に記載されているように2,3心臓血管系統に分化させた図1a。簡潔には:0日目d0にEBを作製し、分化の初日にわたってd0~d1BMP41ng/mlを加えた。d1に、EBを回収し、誘導培地塩基性線維芽細胞成長因子bFGF;2.5ng/ml、アクチビンA6ng/mlおよびBMP-410ng/mlに再懸濁した。その培地をd4に交換し、血管内皮成長因子VEGF;10ng/mlおよびDKK150ng/mlを補充した。培地を再度d8に交換し、VEGF20ng/mlおよびbFGF10ng/mlを補充した。EBを、この実験全体にわたってStemPro-34Invitrogenにおいて培養した。培養物を、d0~d12は5CO2、5O2、90N2環境において維持し、次いで、残りの培養期間は5CO2/大気環境に移した。以前に記載されたプロトコル27を用いて、GFPをコードする配列をHES3細胞のNKX2-5遺伝子座に標的化することによって、NKX2-5-GFPhESCを作製したD.E.、A.G.E.およびE.G.S.、投稿済み。ヒト組織の採取および解析を含む作業は、UniversityHealthNetworkにおけるHumanEthicsCommitteeに従って行われ、そこによって承認された。フローサイトメトリーおよび細胞選別5日目~12日目のEBに対する解離手順:hPSC分化実験から作製されたEBを、0.25トリプシン/EDTAを用いて解離した。13日目以降のEBおよびヒト胎児組織に対する解離手順:hPSC分化培養物から得られたEBを、Hanks溶液NaCl136mM、NaHCO34.16mM、NaPO40.34mM、KCl5.36mM、KH2PO40.44mM、デキストロース5.55mM、Hepes5mM中のII型コラゲナーゼ1mg/ml;Worthington,LS004176において、静かに振盪しながら一晩室温でインキュベートした28。翌日、その細胞懸濁液に、等量の解離溶液Hanks溶液中:タウリンtaurin、10mM、EGTA0.1mM、BSA1mg/ml、II型コラゲナーゼ1mg/mlを加え、完全に解離するためにEBを静かにピペッティングした。細胞を遠心分離し1000rpm,5分、濾過した。分化の40日目を過ぎたEBの場合、単一の細胞に完全に解離するために、0.25トリプシン/EDTAによるさらなる処理が必要な場合がある。細胞を、2.5×106細胞/mlの濃度において、抗KDR-アロフィコシアニンRDSystems;1:10および抗PDGFRA-フィコエリトリンRDSystems;1:20、抗SIRPA-IgG-フィコエリトリン-Cy7クローンSE5A5;BioLegends;1:50010,29、抗SIRPA-IgG-ビオチンクローンSE5A5;BioLegends;1:50010、抗心臓トロポニンTcTNTアイソフォームクローン13-11;NeoMarkers;1:400、ヤギ抗マウスIgG-アロフィコシアニンBD;1:200、ストレプトアビジン-アロフィコシアニンBD:1:200、抗IgG1κ-フィコエリトリン-Cy7クローンMOPC-21;BioLegends;1:500、抗IgG1κ-ビオチンクローンMOPC-21;BioLegends;1:500で染色した。細胞表面マーカーの場合、染色は、10FCSを含むPBS中で行った。細胞内タンパク質の場合、染色は、PBS中の4パラホルムアルデヒドElectronMicroscopySciences,Hatfield,PA,USAで固定された細胞に対して行い、10FCSおよび0.5サポニンSigmaを含むPBS中で染色を行った。染色された細胞は、LSRIIフローサイトメーターBDを使用して解析した。蛍光励起細胞分取の場合、FACSAriaTMIIBD細胞選別機SickKids-UHNFlowCytometryFacility,Toronto,ON,Canadaを使用して、IMDM/6FCS中、106細胞/mlの濃度で細胞を選別した。圧力および剪断応力に起因する細胞死を防ぐために、すべての選別を、100ミクロンのノズルを用いて行った。磁気ビーズ選別の場合、MiltenyiMACSビーズ選別システムを使用し、製造者のガイドラインおよび発現強度が弱いdimマーカー用の選別条件に従って実験を行った。ハイスループットフローサイトメトリー解析の場合、LSRII用のBDハイスループットサンプラーHTSを、製造者のガイドラインに従って使用した。FlowJoソフトウェアTreestar,Ashland,OR,USAを使用して、データを解析した。免疫染色免疫染色は、以下の1次抗体:ウサギ抗心臓トロポニンIAbcam;1:100、マウス抗SIRPABioLegends;1:100を使用して、以前に記載されたように13行った。使用された二次抗体は:ヤギ抗マウスIgGCy3JacksonImmunoResearch;1:400、ロバ抗マウスIgG-Alexa488Invitrogen;1:400だった。核を対比染色するためにDAPIを使用した。ミトコンドリアを染色するためにMitoTrackerRedInvitrogenを使用した。染色された細胞は、蛍光顕微鏡LeicaCTR6000を使用して可視化し、LeicaApplicationSuiteソフトウェアを使用して画像を得た。定量的リアルタイムPCRRNAqueous-MicroKitAmbionを用いて全RNAを調製し、RNaseフリーDNaseAmbionで処理した。SuperscriptIII逆転写酵素InvitrogenとともにランダムヘキサマーおよびOligodTを使用して、500ng~1μgのRNAをcDNAに逆転写した。以前に記載されたように13、QuantiFastSYBRGreenPCRKitQiagenを使用し、MasterCyclerEPRealPlexEppendorfにおいて、QPCRを行った。発現レベルをハウスキーピング遺伝子TATAボックス結合タンパク質TBPに対して正規化した。サンプル間の正規化のためのTBPに加えて、ゲノムDNAをDNA標準物質として使用した。ゲノムDNAに存在する標的遺伝子のコピー数は、直接計算され得るヒトゲノムサイズ:2.7×109bp=1.78×1012ダルトンは、単一コピー遺伝子の6.022×1023コピーに相当し;1μgのゲノムDNAは、単一コピー遺伝子の3.4×105コピーに相当する。RT-qPCRグラフのY軸は、TBPのコピー数で除した目的の遺伝子のコピー数であり、ゆえに、実験間を比較し得る任意単位であるが絶対単位である。全ヒト成人心臓RNAをAmbionから購入し、全ヒトRNAマスターパネルをClontechから購入した。結果および考察hESC由来心筋細胞上に発現される新規マーカーの同定HES2hESC株は、適切な濃度のアクチビンAおよびBMP4で誘導されたとき図1a、効率的かつ再現可能に分化して、心臓血管系統細胞を発生する2,3。分化培養物の動態解析から、BRACHYURYTの発現によって定義される原始線条様の集団2~4日目から、初期中胚葉の発生MESP1;3~4日目ならびにNKX2-5およびISLET1ISL1陽性心臓前駆体の出現4~8日目への段階的な発生の進行が明らかになった。MYH6αMHC、MYH7βMHCおよびMYL7MLC2aのアップレギュレーションならびにその後のMYL2MLC2vの発現と一致して図1b、分化の9~12日目に初めて収縮する心筋細胞が検出された。hESCに由来する集団における心臓特異的遺伝子のいくつかの発現レベルは、胎児および成人の心臓組織において見られるレベルよりもかなり低かった。低レベルのNEUROD1およびFOXA2の発現は、それらの培養物に、神経外胚葉または内胚葉に由来する相当な数の細胞が混入していなかったことを示す。心筋細胞の発生をリアルタイムでモニターすることを可能にするために、本発明者らは、上記プロトコルを、HES3hESCのNKX2-5遺伝子座に挿入されたEGFPcDNAを含むNKX2-5-GFPレポーターhESC株に適用したElliottら、投稿済み。最初のNKX2-5-GFP細胞は、分化の7~8日目に発生した。NKX2-5-GFP集団のサイズは、時間と共に増大し、12~20日目に最大に達した図8。NKX2-5-GFPESCに由来する胚様体EBの落射蛍光下での解析によって、それらの細胞の大部分において核のGFP発現が確認された。NKX2-5-GFP発現の動態が、HES2培養物におけるNKX2-5発現の開始と密接に対応することから、両方のhESC株由来の心臓の特異化specificationが、分化の6~8日目に起こると示唆される図1b、図8。20日目の培養物における高い割合のNKX2-5-GFP細胞は、使用された分化プロトコルが、このhESC株からの心筋細胞の発生を効率的に促進することを実証する。上記の発生段階が細胞表面マーカーによって区別され得るか否かを決定するために、本発明者らは、GFP-NKX2-5細胞株から発生した8、12および20日目の集団を使用して、370個の公知の抗体http://data.microarrays.ca/AntibodyWebのスクリーニングを行った。最初のスクリーニングは、NKX2-5-GFP集団上に存在する抗原を認識する抗体を同定することに焦点を当てた。このスクリーニングから、抗SIRPA抗体10が、NKX2-5-GFP細胞の大部分を染色し、かつ陰性細胞のほとんどを染色しなかったので図2a、本発明者らは、シグナル調節タンパク質アルファSIRPA、SHPS-1としても知られるSIRPAを潜在的な心臓特異的マーカーとして同定した。解析された抗体のパネルのうち、SIRPAは、この心筋細胞特異的な発現パターンを示す唯一の抗体だった。SIRPAは、分化の8日目に、発生の心臓前駆体段階に相当すると考えられる集団である新生のGFP-NKX2-5細胞上で初めて検出された。発現は、20日間の実験経過全体にわたってGFP-NKX2-5集団上で維持された図2a、図9a。SIRPA細胞は、未分化なhESC集団またはKDRとPDGFRAとの同時発現を特徴とする5日目の心臓中胚葉集団では検出されなかった図2aおよびデータ示さず2。遺伝的に改変されていないHES2株から作製したEBの解析は、抗SIRPA抗体を用いたとき、類似の染色パターンを明らかにした。SIRPA細胞は、分化の7~8日目に初めて検出され、陽性細胞のパーセンテージは、次の2~4日間にわたって有意に増加した図2b、図9b。直接結合体化された抗体SIRPA-PE-CY7とビオチン化された抗体SIRPA-bioの両方が、20日目のEB集団の同様の部分を染色した図10a~e。興味深いことに、20日目のEBにおいて検出されたSIRPA細胞は、SIRPA-集団に見られる細胞よりも実質的に大きいとみられることから図10f、これらの集団の細胞のサイズがフローサイトメトリーによって評価され得ると示唆される。SIRPA抗体の特異性を確かめるために、本発明者らは、ウエスタンブロット解析、および免疫沈降に続いてウエスタンブロット解析を行った図11。これらの実験は、3つの独立した20日目のEB由来集団においてSIRPAタンパク質の存在を実証したが、未分化なhESCには存在しなかった図11a。免疫沈降解析は、SIRPAタンパク質に対して以前に記載されたサイズのバンドを明らかにした図11b11。フローサイトメトリーによるSIRPAとcTNTとの同時染色は、それらの2つのマーカーの明らかな同時発現を示したことから図12a/b、SIRPAが、改変されていないHES2細胞株から発生し分化した集団中の心筋細胞系統上で特異的に発現されたと示唆される。RT-qPCR解析から、フローサイトメトリーの抗体染色プロファイルを細密に反映したSIRPAに対する発現パターンが明らかになった分化の6~8日目にSIRPAmRNAがアップレギュレートした後、42日間の時間経過にわたって発現が持続した。SIRPAに対するリガンドであるCD47の発現は、SIRPAに対して観察された発現と対応した図2c。CD47のフローサイトメトリー解析は、その遺伝子発現パターンを反映し、未分化なES細胞上および5日目の分化培養物上での低レベルの染色、それに続く8および20日目の集団全体における広範な染色を示したデータ示さず。20日目のEBに由来する単層培養物の免疫蛍光解析から、心臓トロポニンIcTNIとの同時発現を特徴とするもっぱら心筋細胞上でのSIRPAの表面発現が明らかになった図2d。それぞれのコントロールIgGおよび二次抗体のみは、いかなるシグナルも示さなかったデータ示さず。まとめると、これらの動態研究は、NKX2-5前駆体細胞の出現から始まり、収縮する集団の発生および増殖を通じて続くSIRPAの発現が、hESC分化培養物中の心臓系統を一意的に特徴付けることを示す。Hattoriらは、最近、mitotracker色素mitotrackerdyeの保持によって測定されるミトコンドリア含有量に基づいて心筋細胞を単離することが可能であることを実証した9。mitotracker色素による標識とSIRPA染色との比較から、両方の手順が、20日目のEB中の同じ心筋細胞集団を標識すると示唆された図13c。しかしながら、その色素が、分化の12日目にそれほど明確ではない集団を標識し、8日目ではほとんどの細胞を標識しなかったので、その色素保持アプローチは、心臓血管の発生開始の追跡ではそれほど有用でなかった図13a/b。対照的に、相当なSIRPA集団が、これらの両方の時点において明らかに分離され得ることから、この表面マーカーが、種々の心臓発生段階の細胞をモニターすることおよび単離することを可能にする一方で、mitotracker色素による標識は、比較的成熟した心筋細胞を含む集団に対してのみ使用され得ると示唆される。ヒト細胞とは対照的に、Sirpaは、抗体染色によってマウスESC由来心筋細胞上では検出されなかった図14a。その培養物中のSirpa集団は、心臓トロポニンTcTnT陰性かつCD45陽性だったことから、それらが造血細胞に相当すると示唆される図14a/b。遺伝子発現解析は、フローサイトメトリーデータを裏付け、脳における高発現と比べて、mESC由来心筋細胞ならびに成体マウスの心房および心室組織における低レベルのSirpamRNAのみを示した図14c。これらの組織のいずれにおいても、マウスにおける他の公知の唯一のSirpファミリーメンバーであるSirpbの発現を、qPCRによって検出できなかったデータ示さず。コントロールおよびSirpa欠損マウス組織のウエスタンブロット解析から、コントロールマウスの脳において高Sirpa発現が確かめられたが、Sirpa欠損マウス由来の組織のいずれにおいても確かめられなかった図14d。最も重要なことには、Sirpaの発現は、コントロールマウスの心臓、腎臓またはmESC由来心筋細胞において検出されなかった。マウスおよびヒトについてのSIRPAの機能およびタンパク質相同性の差異は、マクロファージと赤血球との相互作用について以前に記載されている12。hESC由来集団からの心筋細胞の精製心筋細胞の濃縮された集団を作製するためにSIRPA表面レセプターの発現を使用することができるか否かを評価するために、SIRPA陽性SIRPAおよびSIRPA陰性SIRPA-の画分を、分化の8、12および20日目におけるHES2由来EBから細胞選別によって単離し、細胞内フローサイトメトリーによって心臓トロポニンTcTNTの発現について解析した図3a。選別前未選別,PS集団の解析は、cTNTの発現が、分化中の対応する段階において、SIRPAの発現と密接に対応することを実証したPS:d8、d12、d20。選別後、各段階からのSIRPA画分は、cTNT心筋細胞について高度に濃縮された一方で、SIRPA-画分では、これらの細胞が枯渇していた。SIRPA-画分中に存在する少数のcTNT細胞が、選別手順からの夾雑物であるのか、または真のSIRPA陰性心筋細胞に相当するのかは、不明である。複数の実験におけるFACSベースの分離は、有意に濃縮された心筋細胞集団を再現可能にもたらしたSIRPA:8日目95.2±1.9、12日目94.4±1.7、20日目89.6±3.6;SIRP-:8日目13.0±2.1、12日目14.3±3.9、20日目15.7±6.0図3b。SIRPAおよびSIRPA-の選別された集団の純度ならびに選別手順からの細胞回収の効率は、図15および図20表1にまとめられている。分子解析によって、SIRPA細胞が、SIRPA-集団よりも有意に高いレベルのNKX2-5、MYH6、MYH7およびMYL7を発現することが明らかになったことから図3c、心筋細胞の濃縮がさらに実証された。予想どおり、SIRPAの発現は、SIRPA集団に分離した。心臓マーカーとは対照的に、非筋細胞マーカー例えば、線維芽細胞マーカーDDR2およびTHY1CD90、データ示さずおよび内皮マーカーPECAMCD31は、SIRPA-集団においてより高レベルに発現された図3c。SIRPA-画分とSIRPA画分の両方からの細胞は、単層培養物で平板培養されると、数週間にわたって容易に維持され得る生存可能集団を形成した。収縮する細胞は、未選別の集団PSおよびSIRPA由来集団において検出されたが、SIRPA-細胞から発生した集団では検出されなかった。免疫組織化学的解析によって、これらの培養物における高い割合の心筋細胞を裏付ける、SIRPA集団における広範なcTNI発現が明らかになった。SIRPA-集団では、ほんのわずかなcTNI陽性細胞しか検出されなかった図3d。SIRPAとNKX2-5-GFPとの同時発現から予測されるように、抗SIRPA抗体を用いた選別によってNKX2-5-GFPHES3由来培養物から心臓系統細胞について濃縮された集団を単離することも可能だった。遺伝子発現およびcTNT染色によって定義される心臓前駆体8日目および心筋細胞12および20日目は、SIRPA画分に分離した一方で、SIRPA-集団では非筋細胞が濃縮された図16。多数の細胞の迅速な処理を可能にするために、本発明者らは、磁気ビーズ選別によるSIRPA細胞の単離も試みた。このアプローチによるNKX2-5-GFP分化培養物からのSIRPA細胞の単離は、FACS実験から得られた集団と類似の、心筋細胞について高度に濃縮された集団をもたらした図17a~c。しかしながら、この磁気ビーズ選別プロトコルを用いると、このプロセス中に相当量の細胞が失われ、FACSと比べてこのアプローチの効率は低くなる図17dと図20表1とを比較のこと。まとめると、これらの細胞選別研究からの知見は、SIRPAの発現が、hESCに由来する分化培養物中の心臓系統を特徴付けること、および抗SIRPA抗体を用いた細胞選別が、心筋細胞について高度に濃縮された集団の単離を可能にすることを明らかに実証する。ヒト人工多能性幹細胞からの心筋細胞の精製SIRPAの発現が、他のhPSC由来集団中の心臓系統を特徴付けるか否かを決定するために、本発明者らは次に、2つの異なるhiPSC株であるMSC-iPS1Y2-1としても知られるおよび38-2から作製したEBを解析した13,14。cTNT細胞の割合によって実証されるように、両方の株からの心臓分化の効率は低かったMSC-iPS1:12.2±5.6、38-2:26.7±5.7;図4a。同様の低レベルのSIRPA発現が、両方のEB集団において検出された。両方のiPSC株由来のSIRPA細胞のFACSは、cTNT心筋細胞について有意に濃縮された集団をもたらしたSIRPA:MSC-iPS167.0±3.6、38-271.4±3.8;SIRPA-:MSC-iPS14.9±2.1、38-26.2±0.9図4a,b。これらのSIRPA集団は、対応するSIRPA-細胞よりも有意に高いレベルのNKX2-5、MYH6、MYH7、MYL2およびMYL7を発現した。hESC由来細胞を用いたときに観察されたように、DDR2、PDGFRB、THY1およびNEURODを含む非筋細胞マーカーは、SIRPA-画分に分離した図4b、cおよびデータ示さず。これらのデータは、このプロトコルを用いたときの、心臓系統に効率的に分化しない細胞株を含む一連の多能性幹細胞株から濃縮された心臓集団をもたらすためのこのマーカーの有用性を明らかに実証するものである。ヒト胎児および成人の心臓細胞におけるSIRPAの発現SIRPAが、初代ヒト心筋細胞上で発現されるか否かを決定するために、本発明者らは次に、RT-qPCRによって胎児妊娠18~20週および成人の心臓組織の発現パターンを解析した。図5aに示されるように、SIRPA転写物は、すべての胎児由来心臓組織左心房LAおよび右心房RA細胞、左心室LVおよび右心室RV細胞、心尖部APならびに房室接合部AVJにおいて、20日目のhESC由来細胞に見られるレベルに匹敵するレベルで検出された図3a。SIRPAは、未分化なhESCd0またはコントロールHEKヒト胎児腎細胞では発現されなかった。胎児の心臓と同様に、成人の心臓においてもSIRPAの発現が検出されたことから、その発現が、ヒト心臓発生の種々の段階において心筋細胞を特徴付けると示唆される。高レベルのSIRPAが、成人の脳および肺において検出され図18a、多くの他の組織では低レベルで見られた。これらの低レベルは、このレセプターを発現すると知られる組織マクロファージの存在を反映し得る15,16。SIRPAリガンドであるCD47が、ほとんどの組織において発現されたことから、以前の研究において記載されたパターンが裏付けられた図18b15。免疫蛍光染色は、SIRPAが、胎児の心室細胞の表面膜上に局在するが、MitoTrackerRedで同時染色されなかったことによって示唆されるようにミトコンドリア膜などの他の膜画分上には存在しないことを示した図5b。フローサイトメトリー解析から、すべての胎児心臓組織における高い割合のSIRPA細胞がそれぞれの画分中のcTNT細胞のパーセンテージと相関するレベルで明らかになった図5c、d。これらの知見は、SIRPAが、胎児心筋細胞上、ならびに成人心臓において発現されることを明らかに実証し、その心臓特異的発現が、多能性幹細胞に由来する培養物のアーティファクトでないことが実証される。hPSCの分化効率をモニターするためのSIRPA発現の使用最近、本発明者らは、KDRとPDGFRAとの同時発現が、BMP4およびアクチビンAで処理した後の心臓中胚葉の誘導をモニターする信頼性のある方法を提供することを報告した2図6a。この研究は、KDRPDGFRA集団の誘導が、心筋細胞集団の発生において必要不可欠な最初の工程であることを示したが、すべてのKDRPDGFRA集団が分化して心臓系統細胞を生じるわけでなかったこのタイプの集団の例:30ng/mlのBMP4および外来性のアクチビンAなしA0によって誘導されたもの。SIRPAが、分化中の集団の心臓になる潜在能力を初期段階においてより正確に予測し得るか否かを決定するために、本発明者らは、種々の濃度のアクチビンAおよびBMP4を用いて誘導された9日目のEBにおいてその発現をモニターした図6b。同じ集団を、5日目にKDRおよびPDGFRAの発現について図6aならびに20日目にcTNTの発現について図6c評価した。5日目におけるKDRPDGFRA集団のサイズと20日目におけるcTNT細胞の割合との間に相関はほとんどなかったが、9日目における最も大きいSIRPA集団を含む培養物アクチビンA6ng/ml、BMP410ng/mlは、その後の時点において最大数のcTNT細胞を含んだ。SIRPAの発現は、試験されたほとんどの条件に対するcTNTの出力outputとよく相関し、最も高いレベルのSIRPAは、20日目における最も高い心筋細胞の発生を予測した図6d。これらのデータは、9日目におけるSIRPAの発現が、心筋細胞になる潜在能力の信頼性のある指標であること、ならびに同様に、hPSCが心臓系統に定方向分化するための誘導プロトコルをモニターするためおよび最適化するために使用され得ることを実証する。非筋細胞系統細胞の枯渇によるhPSC由来心筋細胞の濃縮本発明者らのフローサイトメトリースクリーニングは、心筋細胞を認識する抗体に加えて、分化培養物中の非筋細胞集団を標識する抗体のパネルも同定した。抗CD90THY1、線維芽細胞上で発現される、抗CD31PECAM1、内皮細胞上で発現される、抗CD140BPDGFRB、平滑筋細胞上で発現されるおよび抗CD49AINTEGRIN1Aを含むこの抗体のセットはすべて、20日目のHES2由来EBの種々の割合のSIRPA-集団を認識した図7a/d。これらの抗体の組み合わせは、培養物中の非筋細胞SIRPA-の大部分を特徴付けた図7c,選別前。非筋細胞マーカーを発現している細胞を枯渇させることによって心筋細胞について濃縮することが可能であるか否かを決定するために、本発明者らは、これらの抗体を組み合わせ、20日目のEBを系統陽性LINおよび系統陰性LIN-画分に選別した図7b。このアプローチは、いかなる結合した抗体または磁気ビーズも含まない濃縮された集団を作製する際に有利である。予想どおり、LIN-集団は、SIRPA細胞について有意に濃縮された一方で、LIN集団では、心筋細胞が枯渇していた図7c/e。LIN-およびLIN細胞に対するFACS後の細胞回収の効率は、図21表2にまとめられている。遺伝子発現解析によって、PECAM1、PDGFRB、THY1およびDDR2を含む非筋細胞特異的遺伝子が、LIN画分において主に発現される一方で、心臓遺伝子発現が、LIN-画分に限定されることが明らかになった図7f。LIN-画分は、ゼラチンコートされたディッシュ上に平板培養されるか、または細胞塊として再凝集されると、高い割合の収縮する心筋細胞を含む集団を作製したデータ示さず。同じ抗体の系統カクテルもまた、iPSCMSC-iPS1由来の20日目のEB集団の非筋細胞SIRPA-画分を標識したことから図19、この枯渇アプローチが、変動する分化効率を有する種々のPSC株に適用され得ることが示唆される。まとめると、これらのデータは、心筋細胞が、非筋細胞non-myocte系統の枯渇によってhPSC由来分化培養物から濃縮され得ること実証する。ゆえに、この方法は、高度に精製された心筋細胞培養物を得る代替アプローチであることから、いかなる結合した抗体も含まない精製された心筋細胞集団を必要とするストラテジーのために使用され得る。系統の特異化を制御するシグナル伝達経路に関する本発明者らの理解が進んだことにより、hPSCから特定の細胞型への効率的かつ再現性のある定方向分化のためのストラテジーに至った1。心臓系統の発生に関しては、ヒトの心臓に見られる主要な細胞型心筋細胞、内皮細胞、血管平滑筋細胞および線維芽細胞を含むに相当する心臓血管の混合集団の発生を促進するプロトコルが確立された。心筋細胞は、代表的には、使用されるPSC株に応じてそのような混合集団の10~70に相当する2,3。そのような混合集団は、予測毒性学5、インビトロにおけるヒト疾患のモデル化17,18、および心臓疾患のための移植に基づく治療19のためのPSC由来細胞の潜在的な有用性を実証するために使用されているが、最終的には、この潜在性を実用化に移すために、高度に濃縮され、十分に定義された細胞集団が必要とされ得る。本発明者らがSIRPAを心筋細胞特異的マーカーとして同定したことにより、hESCおよびhiPSCから高度に濃縮された心筋細胞の集団を容易かつ日常的に入手することがここで初めて可能になる。これらの心筋細胞が濃縮された集団は、FACSまたは磁気ビーズ選別によって単離され得、後者のアプローチは、インビボ研究に必要な多数の細胞の単離を可能にする。簡便な選別アプローチによる高度に濃縮された心筋細胞集団の入手は、明確なハイスループット創薬および毒性学アッセイの開発、患者特異的hPSCから得られる細胞の詳細な表現型評価、ならびに移植にとって安全な定義された集団の産生を可能にし得る。SIRPAが、心臓の最も初期の段階から、収縮しかつより成熟した心筋細胞までの心臓系統細胞上で発現されるという事実は、その種々の集団のインビボにおける潜在能力の比較を可能にし得る。本発明者らのスクリーニングは、SIRPAに加えて、PSC由来の心臓血管集団の非筋細胞画分を定義するマーカーのパネルも同定した。使用されたマーカーは、それらの画分が、線維芽細胞CD90、THY120、血管平滑筋細胞CD140B、PDGFRB21および内皮細胞CD31、PECAM1の組み合わせに相当することを示唆する。心筋細胞とともにこれらの各細胞型の濃縮された集団を入手することは、可能であり得る。PSC由来心筋細胞に対して提案される用途の多くは、成体の心臓の薬物反応および機能をより正確に反映するために、3次元の創出された組織を必要とし得る。最近の研究から、インビトロまたはインビボにおいて心臓細胞、内皮細胞および線維芽細胞が最も良く機能するためには、それらの細胞の適切な組み合わせが、そのような組織構築物に組み込まれる必要があると示唆されている22-24。本発明者らが純粋な筋細胞集団および非筋細胞集団を作製できることによって、様々な割合の異なる細胞型からなる創出された構築物を作製することが可能になり得、ヒト心臓と最も類似の構造的特性および機能的特性を備えた心臓組織を形成するために必要な各々の最適な割合を決定することが可能になり得る。PSC由来集団および胎児心臓組織におけるSIRPAの特異的な発現パターンは、このレセプターが、おそらく早くも発生の前駆体段階に、ヒト心筋細胞系統においていくらか機能的な役割を果たすことを示唆する。リガンドであるCD47の発現が、EBにおいてSIRPAと平行してアップレギュレートされ、CD47が、その培養物中の高い割合の細胞上に見られるという事実は、このリガンド/レセプター対がヒト心筋細胞の発生および/または機能において役割を果たすという解釈をさらに支持する。SIRPAに対する1つの徹底的に研究された役割は、マクロファージにおけるものであり、それは、リガンドCD47を発現しない細胞を身体から排除するシグナルを媒介するとみられる16。ヒト細胞において提唱されている他の唯一の機能は、平滑筋系統におけるものであり、SIRPAは、IGF-1によって誘導される分裂促進的なシグナル伝達の媒介において重要な役割を果たすと示されている25。SIRPAが、マウス心筋細胞において検出されないならば、ヒト細胞におけるその機能は、それらの2種間で異なる心筋細胞の生理学および/または機能の局面に関し得る可能性がある。要約すると、本明細書中で報告された知見は、SIRPAの発現が、PSC分化培養物中の心筋細胞系統を一意的に特徴付けることを実証する。FACSまたは磁気ビーズ選別によるSIRPA細胞の単離は、このプロトコルを使用したとき、心臓血管の系統に効率的に分化しない集団を含む、幅広いPSC株から高度に濃縮された心筋細胞の集団を作製するための簡便なアプローチを提供する。本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されてきたが、当業者は、本発明の精神または添付の請求項の範囲から逸脱することなく、それらに対して変更が行われ得ることを理解するだろう。以下の参考文献のリスト中の参考文献を含む、この説明におけるすべての参考文献が、本明細書によって参考として援用される。"