"ポックスウイルスゲノムへの異種なコーディング配列の挿入に使用するベクターであって、以下のa~cからなる群の中から選択された1以上の因子から構成される核酸配列を含むベクター:a配列番号1による核酸配列またはその相補鎖;b厳格な条件下でaに定義する配列とハイブリダイズする1つの核酸配列;caまたはbに定義される核酸配列のうち少なくとも連続的な30塩基対を含む断片。前記核酸配列が改変されたワクシニアアンカラウイルスMVAに由来する請求項1に記載のベクター。付加的に少なくとも1つの転写制御因子が当該核酸配列の中のクローニング部位に導入されている請求項1または2に記載のベクター。前記転写制御因子がポックスウイルスゲノム由来であるか、またはポックスウイルス由来の転写制御因子のコンセンサス配列である請求項3に記載されたベクター。付加的に少なくとも1つの異種コーディング配列を含み、該異種コーディング配列は請求項3または4に記載された転写制御因子と機能的に関連するものである、請求項1~4の何れか1項に記載のベクター。前記異種コーディング配列がマーカー遺伝子、治療用遺伝子、ホスト域遺伝子および/または免疫原性抗原決定基のグループから選択される請求項5に記載のベクター。マーカー遺伝子、ホスト域遺伝子および/または請求項3~5に記載の転写制御因子をコードする1以上の異種コーディング配列に接している組換え型の配列を含む、請求項3~6の何れか1項に記載のベクター。請求項3~7の何れか1項に記載のベクターにより転移された核酸配列をそのゲノム中に含む、組換え型ポックスウイルス。ポックスウイルスが改変されたワクシニアアンカラウイルスMVAである請求項8に記載の組換え型ポックスウイルス。ポックスウイルスゲノムに異種配列を導入する方法であって、a請求項3~7の何れか1項に記載のベクターを用いて、ホスト細胞を形質導入することと;b上述のホスト細胞をポックスウイルスで感染させることと;c組換え型ポックスウイルスを分離することとを含む方法。請求項8または9に記載の組換え型ポックスウイルス、および/または請求項1~7の何れか1項に記載のベクターを含む標的細胞。感染症もしくは増殖性の障害の治療および/または予防のための、前述の請求項1~7の何れか1項に記載のベクター、請求項8もしくは9記載の組換え型ポックスウイルス、および/または請求項11に記載の標的細胞。請求項1~7の何れか1項に記載のベクター、請求項8もしくは9に記載の組換え型ポックスウイルス、および/または請求項11に記載の標的細胞の使用であって、感染症もしくは増殖性障害の治療および/または予防のための薬物を製造するための使用。請求項1~7の何れか1項に記載のベクター、請求項8または9の何れか1項に記載の組換え型ポックスウイルス、および/または請求項11に記載の標的細胞、並びに薬学的に許容可能な担体および/または希釈剤を含む薬学的組成物。前述の請求項1~7の何れか1項に記載のベクター、何れかのポックスウイルス請求項8もしくは請求項9に記載された組換え型ポックスウイルスを除く、並びに薬学的に許容可能な担体および/または希釈剤を含む薬学的組成物。動物生体ヒトを含むの感染症もしくは増殖性の障害を治療および/または予防する方法であって、前記動物生体に対して、請求項8もしくは9に記載の組換え型ポックスウイルス、および/または請求項1~7の何れか1項に記載のベクターの適用、或いは他の何れかの組換え型ポックスウイルスに含まれる前記ベクターの適用を含む方法。前記組換え型ポックスウイルスがオルソポックスウイルスに由来する請求項16に記載の方法。本発明の目的は、ポックスウイルスゲノムにおける新規の挿入部位を同定し、該挿入部位への異種DNA配列の直接的な組込みに適したベクターを提供することである。前述の目的および他の目的を達成するために、本発明は、配列番号1による核酸配列またはそれの相補鎖を含むベクターを提する。配列番号1による核酸配列は、ポックスウイルスゲノムの部分的なゲノム配列と高度に相同性がある。この相同性ゆえに、本発明による核酸配列は、上述の配列とポックスウイルスの相当するゲノム配列の間で相同組換えを起す能力がある。従って本発明は、異なるオルソポックスウイルスゲノム中に、好ましくは改変されたワクシニアウイルスアンカラMVAのゲノム中に、さらにまた、例えばワクシニアウイルス株であるウエスタンリザーブ、コペンハーゲンというのような関連するオルソポックスウイルスなどのゲノム中に、DNA配列を直接的に組込むために有用な手段を提供する。実施例1挿入ベクターの構築ポックスウイルスゲノムへの組換えに適した配列を得るために、改変されたワクシニアアンカラウイルス寄託番号V94012707でEuropeanCollectionofAnimalCellCultures,Salisbury,UKにブタペスト条約により保管されたに由来するDNA断片が、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した通常のPCR法により増幅された。A24R_1;5’-CCGAAGCTTAATGAACGCCAGAGG-3’,配列番号2A27L_1c;5’-AGGCTCGAGTAAGAGCGGCTATGAT-3’,配列番号3オリゴヌクレオチドプライマーは、クローニングベクターへの生成した増殖断片のサブクローニングのために、5’端の近くに下線で示された制限酵素HindIII配列番号2もしくはXhoI配列番号3の認識配列を含んでいる。それにより、1.7kbの特異的に増幅された配列配列番号1がpUC19クローニングプラスミドGenBankAccessionNo.:X02514にSalI/HindIIIでサブクローニングされた。生成したプラスミドはpSW1図2と名づけられた。サブクローニングされたインサートの配列が調べられ、そしてこの配列はワクシニアウイルス株であるコペンハーゲン、WR、MVAからの他の既知の配列と比較された。上述の配列はMVA-ATI領域の部分配列を含むことがわかった。大抵のオルソポックスウイルスのATI遺伝子は、感染した細胞で光学顕微鏡により観察しうる、いわゆる封入体inclusionbodiesと称する成熟したウイルス体に埋め込まれた密集した細胞質間充質を形成する。推測上のATIの機能は、一般的な環境下での感染性ウイルス粒子の高い安定性と伝播性の延長である。オルソポックスウイルスはエクトロメリアウイルス、牛痘ウイルス、アライグマポックスウイルスを含むいくつかのグループであり、130kDaから160kDaの典型的な封入体蛋白質を産生する。しかしながら、例えばワクシニアウイルスウエスタンリザーブWR、ワクシニアウイルスコペンハーゲンもしくはMVAのようなオルソポックス属の他のメンバーは、そのような封入体を形成しない。これは配列の削除もしくはフレームシフト変異の結果であり、コーディング配列の欠失を導き、またATIホモログの欠如を生じる。例えば、ワクシニアウイルスWRは94kDaのATIホモログを発現するが、一方、MVAとワクシニアウイルスコペンハーゲンはそのようなATIホモログを発現しない。挿入ベクターのさらなる構築のために、自然発生した制限酵素EcoRIの認識部位が、増幅した配列を2つの部分に分離するために使用された。これらの分節はフランキング領域flank1、flank2として働き、ポックスウイルスゲノムとの相同組換えを起こさせる。それらのフランキング領域の間に、操作される異種遺伝子の挿入のためのマルチプルクローニングサイトに加え、例えば、7.5プロモーター7.5、および/または合成したプロモーターによるワクシニアウイルスのプロモーター配列が挿入された。生成したプラスミドはpSW-7.5-sP,pSW-7.5,pSW-sPと名づけられた。また、EGFPフュージョン遺伝子pEGFP,Clonetech,GenBankAccession:U76561から分離されたと融合させたワクシニアウイルスのホスト域遺伝子K1Lから成る発現カセットと、天然に存在するK1Lプロモーターが上記のフランキング領域の間に挿入された。この発現カセットは組換え型のウイルスの効率的な選択と分離に特に有用である。生成したプラスミドはpSWk1lgfpと名づけられた。組換え型ウイルスの産生組換え型ウイルスを産生するために、およそ80コンフルエントの単層培養細胞を有する6ウェルの組織培養プレートが使用された。組換え型MVAを産生するために、ニワトリ胚繊維芽細胞のような許容細胞permissivecellが使用された。組換え型WR株ワクシニアウイルスを産生するために、アフリカミドリ猿の細胞Veroが使用された。最初に、細胞培養の培地を除去し、MOImultiplicityofinfectionが0.01例えば、1ウェル5x105細胞1ml培地中に接種物5x103IU感染単位の野生型のポックスウイルスを含んだ無血清培地が細胞の上に層状に加えられた。この混合物は、37°C、5CO2存在下で1時間インキュベーションされた。そして、接種物が除かれ、細胞がウェル毎に2mlのOptiMEMで2回洗浄された。引き続き、単層細胞は、メーカーGIBCOBRL記載の方法により調整したリポフェクチン/プラスミドDNA混合物全量:1mlおよびpSWk1lgfpのプラスミドDNA15μgでカバーされた。この混合物は、5CO2の存在下において、37°Cで5-12時間インキュベーションされた。次いで、リポフェクチン/プラスミドDNA混合物が除かれ、細胞は、1.5mlの10FCSが添加された新鮮な培地でカバーされた。感染の48時間後に、単層細胞はセルスクレーパーではがされて、細胞および培地は2mlの遠心チューブに移された。トランスフェクション回収物は、‐20~‐80°Cで保存された。ポックスウイルス感染細胞へのpSWk1lgfpプラスミドのトランスフェクションに際して、EGFP遺伝子に融合したホスト域遺伝子K1Lは、ベクタープラスミドのフランキング領域と相同性のあるポックスウイルスゲノムの部位に正確に組換えられる。非組換え型のMVAウイルスから組換え型MVAウイルスを分離するために、ホスト域細胞であるウサギ腎臓RK13が、上記のトランスフェクション実験で得られたウイルス成分で感染された。以前の研究において、RK13細胞でのMVA感染は、ウイルスRNAの中間生成物の合成損傷およびウイルスDNAの複製欠如を特徴とするウイルス複製の早期阻害に至ることが示された。しかしながら、このRK13細胞での非生産的MVA感染は、ワクシニアウイルスのホスト域遺伝子であるK1Lの過剰発現によって克服することができたSutteretal.,1994b。従って、RK13培養細胞に対する上記トランスフェクション実験で得られたウイルス成分の接種は、K1L遺伝子を共発現する組換え型のみの高選択的繁殖を生じた。6ウェルもしくは96ウェルの組織培養プレートにおいて培養されたRK13細胞上で連続的に5回継代した後に、MVA-K1LGFPウイルスが分離された。非組換え型のMVAが存在しないことはPCR法により証明された。また、融合されたEGFP遺伝子の発現は、GFPの蛍光によって組換え型ウイルス感染の直接的なモニタリングを可能にした。また、直接的なモニタリングは、K1L選択に対して感受性でない組換え型ワクシニアウイルスのWR株の同定、およびその後の分離に使用される。"