"RNA標的核酸の増幅のための方法であって、以下の工程:a1個以上の生細胞を含む第1の量を有する液体試料を容器の中に移し、b前記の容器に第2の量を有する1ステップRT-PCR反応緩衝液を添加し、一方で前記の第2の量は前記の第1の量の少なくとも2倍の大きさであり、c前記の容器を少なくとも90°Cで少なくとも20秒間加熱し、d前記の容器中の前記の標的を、中間の精製工程を実施せずに1ステップRT-PCRを実施することが可能な熱安定性DNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅する;を含み、前記の工程bの間に添加される1ステップRT-PCR反応緩衝液が1ステップRT-PCRを実施することが可能な熱安定性DNAポリメラーゼおよびdNTPを含む、前記方法。前記の工程bのRT-PCR反応緩衝液が追加で少なくとも一対の増幅プライマーおよび場合により少なくとも1種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖DNA結合蛍光化合物のどちらかを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。前記の容器が少なくとも一対のPCR増幅プライマーおよび場合により少なくとも1種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖DNA結合蛍光化合物のどちらかの乾燥組成物を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。前記の熱安定性DNAポリメラーゼの活性が工程cの間に熱的に活性化されることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。前記のポリメラーゼがTthポリメラーゼである、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。工程aの前に前記の少なくとも1個以上の生細胞を含む液体が細胞選別法により得られていることを特徴とする、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。前記の工程aの生細胞の数のその中で工程dのポリメラーゼ連鎖反応が実施される液体の量に対する比率が2細胞/μlより大きくない、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。前記の比率が少なくとも1細胞/25μlである、請求項7に記載の方法。前記の試料が2μl未満の量を有し、工程bおよびcの間に前記の試料が37°C~65°Cの温度で30秒間~5分間保温される、請求項7または8に記載の方法。以下:-サーマルサイクラー機器の中に取りつけられるように設計された複数の反応容器-1ステップRT-PCRを実施することが可能な熱安定性DNAポリメラーゼおよびdNTPを含むPCR反応緩衝液を含むキット。さらに少なくとも一対の増幅プライマーおよび場合により少なくとも1種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖DNA結合蛍光化合物のどちらかを含む、請求項10に記載のキット。前記の反応容器が少なくとも一対のPCR増幅プライマーおよび場合により少なくとも1種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖DNA結合蛍光化合物のどちらかの乾燥組成物を含む、請求項10に記載のキット。前記の複数の反応容器がマイクロタイタープレートまたは反応容器の線状細片の形態で互いに物理的に連結されている、請求項10~12のいずれか一項に記載のキット。前記の熱安定性ポリメラーゼが90°Cで少なくとも1分間の保温により熱的に活性化される、請求項10~13のいずれか一項に記載のキット。一般的に言って、本発明は、細胞試料を液体環境中で溶解させ、それを後で一切の中間の精製工程または複雑な液体取り扱い手順なしで1ステップRT-PCRを適用することによるRNA発現分析のために直接用いることを可能にする方法を提供する。より正確には、本発明は、以下の工程を含む、RNA標的核酸の増幅のための方法を提供する:a1個以上の生細胞を含む第1の量を有する液体試料を容器の中に移し、b前記の容器に第2の量を有する1ステップRT-PCR反応緩衝液を添加し、一方で前記の第2の量は前記の第1の量の少なくとも2倍の大きさであり、c前記の容器を少なくとも90°Cで少なくとも20秒間保温し、それにより前記の1個以上の生細胞を前記の容器内で溶解させ、d前記の標的核酸を、中間の精製工程を実施せずに、逆転写酵素活性ならびにDNA依存性ポリメラーゼ活性を含む熱安定性DNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。本発明の1観点によれば、工程a、b、cおよびdの全てを同じ反応容器内で実施することが可能である。実施例により実証されると考えられるように、本発明は、驚くべきことに最初の試料物質として単一の生細胞のみから出発する1ステップRT-PCR分析を実施するために適用可能である方法を提供する。さらに、少数の細胞のみ、またはさらには単一の細胞のみから単一コピー遺伝子からの標的DNAを再現性よく増幅および分析することが可能である。その標的核酸は、それぞれのRNAの発現レベルを監視する目的でのmRNAが含まれるがそれに限定されないあらゆるRNAであってよい。従って、RNA標的核酸を、RNA鋳型依存性ポリメラーゼ活性逆転写酵素活性およびDNA鋳型依存性活性の両方を含む熱安定性ポリメラーゼで増幅することが必要である。そのような酵素の卓越した例は、TthDNAポリメラーゼRocheAppliedScienceカタログ番号:11480022001である。あるいは、逆転写酵素活性ならびにDNA依存性ポリメラーゼ活性を含む熱安定性DNAポリメラーゼは、逆転写酵素活性を有する酵素およびDNA依存性ポリメラーゼ活性の混合物であってよい。例えば、C.thermポリメラーゼシステムRocheAppliedScienceカタログ番号:12016346001は、C.thermポリメラーゼおよびTaqポリメラーゼの混合物からなる。TthDNAポリメラーゼ活性の高い温度55°C~70°Cが最適、最大で95°Cは、RNA二次構造により引き起こされる問題を克服する。結果として得られるcDNAは、Mg2イオンの存在下での同じ酵素を用いるPCRにより増幅され得る。高い温度で逆転写およびDNA増幅の両方を行うTthDNAポリメラーゼの能力は、この酵素を定量的RT-PCR、クローニング、および遺伝子発現分析のために用いることを可能にする。TthDNAポリメラーゼは、1kbまでのRNAのRT-PCR増幅のために用いられる。TthDNAポリメラーゼ活性は高温95°Cでの延長された保温に耐性であり、従ってPCR増幅のために用いることができる。マンガンイオンMn2の存在下では、TthDNAポリメラーゼは非常に効率的な逆転写酵素RT活性を有し、それは大腸菌のDNAポリメラーゼおよびTaqDNAポリメラーゼに関して報告されている活性よりもはるかに高い487491。工程a工程aに従う1個以上の生細胞は、好ましくはヒト、動物または植物由来の真核細胞である。その細胞は、細胞株、血液または生検由来のものであってよい。その細胞を含有する液体試料は、その中で前記の細胞が少なくとも一定の期間の間生存するあらゆる液体、緩衝液または培地であってよく、それは好ましくは30分間より長い。そのような液体は、例えばその中で細胞の懸濁状態での生存および増殖がうまく培養されてきたcultivated培地であってよい。接着細胞の場合、その液体は、その中でその細胞が固体支持体から脱離されてきた緩衝液であってよい。しかし、好ましくは、そのような緩衝液は、その後のポリメラーゼに仲介されるPCRまたはRT-PCR増幅反応への阻害作用を有する可能性のあるあらゆるプロテアーゼを含まない。そのような作用は、観察された場合、その細胞にその容器中への沈着depositionの前に追加の洗浄工程を施すことにより回避することができる。その液体のその容器中への移動は、まず細胞試料の適切な希釈系列を調製し、次いで1個のみまたは数個の細胞に相当するものをピペットで前記の容器中に入れることにより、手作業で達成することができる。好ましくは、その移動は、適切な自動化されたピペット操作ステーション、または大抵は好ましくは細胞選別機を用いて達成される。そのような細胞選別機械は当技術で周知であり、いくつかの異なる製造業者から商業的に入手可能である。細胞選別機の基礎をなす技術のため、細胞破壊片の大きな粒子が細胞選別機により細胞と誤認されることが時々起こるであろう。この作用により、単一細胞分析の場合、それに続くPCRまたはRT-PCR反応の間に一部の試料が結果を与えない可能性がある。好ましくは、一切の精製工程なしではより高い濃度の細胞破砕片の存在がそれに続く増幅反応を阻害する可能性があるため、その反応容器に移される細胞の数は制限されるべきである。好都合には、その反応容器に移される細胞の数は、下記で開示する工程dがその試料が2細胞相当数equivalents/μlの比率を超えないような方式で実施されるように調節される。やはり好ましくは、その反応容器に移される細胞の数は低いべきではなく、これはそうでなければ低い存在量abundancyでのみ発現しているRNAの増幅のためのPCRまたはRT-PCR反応を実施するのが難しくなる可能性があるためである。従って、その反応容器に移される細胞の数は、下記で開示する工程dがその試料が少なくとも1細胞相当数/25μlの比率を含むような方式で実施されるように調節される。その液体の量は、工程bにおける1ステップRT-PCR反応緩衝液の添加および-必要であれば-それに続く増幅反応に必要なさらなる化合物の添加が最終的に結果として前記のRT-PCRの実施に関してなお合理的に小さい最終的な量をもたらすように、十分に小さい。前記の量は絶対に100μlを超えるべきではなく、決して200μlを超えるべきではない。好都合には、前記の量は50μlより大きくない。20μl未満、さらには10μlの量が非常に好ましい。1個以上の細胞を含有する液体の自動化された沈着の場合、μlより下の範囲で非常に少ないことが可能である。特に、細胞選別機を用いる場合、1細胞相当数のみを含有する量は約100nl未満である。たとえ後者の場合においてその試料が乾燥しても、その新規の方法はなお有効であることが本発明者により証明されている。単一細胞分析の特定の態様において、その最終的な量は好ましくは25μlを超えない。その反応容器は、その中で増幅反応を実施することができるあらゆるタイプの反応容器であってよい。従って、唯一の本質的な制限はその容器が十分な熱耐性を有することであり、これはその熱サイクルプロトコルの間にそれが90°C以上の高温に繰り返しさらされることになると考えられるためである。1態様において、その反応容器は、サーマルサイクラー機器中に入れられるように適合された、または設計されたマイクロタイタープレートのウェルである。これは本発明の方法を高度に並行した様式で多くの試料に対して実行することを可能にする。96、384、および1536ウェルを含むマイクロタイタープレートが当技術において既知であり、多数の異なる供給業者から商業的に入手可能である。当技術で入手可能なマイクロタイタープレートは、少なくとも2μlの反応量を可能にする。そのようなマイクロタイタープレートは、それらを適切な加熱ブロック上に置く、あるいはマイクロタイタープレートを組み込むように設計されたPCRサーマルサイクラー機器中に直接入れることにより、少なくとも90°Cの高温にさらされ得る。第2態様において、その反応容器は単独の反応チューブまたはそれらをサーマルサイクラー機器の加熱ブロックの中に一緒に入れることができるように互いに連結されている反応チューブの細片の一部である反応チューブであってよい。さらなる態様において、その反応容器は毛細管LightCycler機器RocheAppliedScienceカタログ番号023531414001の中に入れることができる特別な毛細管である。工程b本発明の文脈において、本発明の工程bにおいて添加される1ステップRT-PCR反応緩衝液という用語は、その中でその試料に対して後で一切の中間の精製工程なしでRT-PCR反応を行うことができるあらゆる液体として理解される。前記の添加される反応緩衝液の第2の量は、その第1の量の少なくとも2倍2×の大きさ、好ましくは5倍5×の大きさであるべきである。これは、それに続く1ステップRT-PCR反応の間のその標的核酸の効率的な増幅を可能にするであろう。その1ステップRT-PCR反応緩衝液は、少なくとも逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を含む熱安定性DNAポリメラーゼ、ならびにデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物dNTPを含む。1態様において、その1ステップRT-PCR反応緩衝液は、PCR反応の実施にさらに必要である化合物を既に含有している。従って、前記の1ステップRT-反応緩衝液は、さらに少なくとも1種類の適切な増幅プライマーの対を含んでいてよい。その1ステップRT-PCR反応緩衝液は、適切なpH緩衝化合物例えばトリス、Mg2塩、Mn2塩、ホットスタート構成要素等も含んでいてよい。特定の態様において、その1ステップRT-PCR反応緩衝液は、その標的DNAの増幅をリアルタイムで監視するのに必要な化合物を既に含んでいてよい。特に、これらの化合物は蛍光ハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖DNA結合色素のどちらかである。様々な可能な検出形式の詳細は下記で論じられるであろう。あるいは、前記の構成要素の一部、いずれかもしくは全て、またはあらゆる他の追加の化合物が、溶解工程cの後に、しかし工程dに従う実際の増幅反応の実施の前に添加される場合も、本発明の範囲内である。工程c本発明によれば、その細胞の溶解は、当技術において従来法で用いられる特定の溶解工程試薬を一切事前添加せずに、1ステップRT-PCR反応緩衝液内で起こる。むしろ、その1個以上の生細胞の溶解は、その試料を少なくとも90°Cにおいて少なくとも20秒の期間の間保温することにより起こる。通常、1分未満の期間の高温での保温は中程度の数の細胞64個より多くない細胞の完全な溶解に十分であり、それはそれに続く低い存在量で発現された転写産物の増幅および検出を可能にする。しかし、前記の期間が30分の期間まで、しかし好ましくは15分より長くない期間まで延長される場合も、本発明の範囲内である。細胞の溶解のために用いられる温度は100°Cを超えるべきではなく、好ましくは95°C未満であり、これはより高い温度ではそれに続くPCR反応に必要であるその反応緩衝液に含有される構成要素が破壊される危険性が増大するためである。例えば、TaqDNAポリメラーゼのような熱安定性DNAポリメラーゼでさえも、100°Cより上の温度では実質的に変性または分解した状態になる。工程d実施例により明示されるように、1ステップRT-PCR反応はその溶解物を中間の精製工程なしで直接用いて実施することができる。しかし、態様次第で、前記の反応に必要な追加の化合物がその溶解の後にその試料に添加される場合は、本発明の範囲内である。本発明は非常に少数の細胞のみ、またはさらには単一の細胞のみに由来する核酸の分析に適用可能であるため、分析される細胞の数およびその中で工程dに従う実際のRT-PCR反応が起こる量の間の比率を考慮すれば、本発明に従う実験の設計に好都合である。一方で、そのような少量の出発物質が分析されることになるのであれば、その反応は最適な程度の感度を達成するために最小限の量の中で実施されるべきである。従って、前記の工程aの細胞の数の、その中で工程dのポリメラーゼ連鎖反応が実施される液体の量に対する比率が、少なくとも1細胞/20μl反応量であれば好都合であることが証明されている。中間の精製工程がないため、その溶解された試料はそのPCR反応の効率を損なう可能性のある細胞破砕片を含有しているであろう。この状況において、前記の工程aの生細胞または細胞相当物の数の、その中で工程dのポリメラーゼ連鎖反応が実施される液体の量に対する比率が、2細胞/μlより大きくなければ好都合であることが証明されている。1細胞/25μl~2細胞/μlの比率がさらにもっと好都合である。実験により決定されているように、この範囲内の比率は、単一の細胞のみ、ならびにはるかに多い細胞数に由来するDNAに対する単一コピー分析を可能にする。1ステップRT-PCR反応のために用いられる化合物は、当技術で用いられる従来の化合物であってよい:その反応の反応構成には、標的RNA、dNTP、本発明の方法を遺伝子発現の監視のために用いるために1ステップRTPCRを実施することもできる熱安定性DNAポリメラーゼ、および少なくとも一対の増幅プライマーが含まれる。好都合には、そのプライマーは、その生成される増幅産物が比較的小さいような方式で設計される。1kbまでの大きさを有する増幅産物が本発明に従う方法により定量的に生成されているが、300bp未満またはさらには120bp未満のアンプリコンの大きさが非常に好ましい。やはり好都合には、本発明に従うプライマーはそれらがイントロン配列にまたがるような方式で設計され、すなわち、それぞれのプライマーの一部は第1エキソンに対して向けられ、前記のプライマーのその他の部分は第2の連続したエキソンに対して向けられる。そのような設計はその試料中のRNAに由来する増幅産物を特異的に作り出すことを可能にし、それぞれのゲノムDNA断片に由来する可能性のある増幅産物を生成する可能性を排除する。その1ステップRT-PCRの逆転写部分は、サーマルサイクラー機器内の別個のプログラム作成を必要としない。代わりに、その逆転写工程はその熱サイクルプロトコルの最初の温度変動ramping、アニーリングおよび伸長工程の間に起こる。これは、欧州特許第1978109号において開示されている観察に従う。しかし、2μl未満の少ない試料量に関して、本発明者らは、驚くべきことに、実際の熱溶解工程の前の前保温工程が逆転写酵素反応に最適な温度に近い温度である場合に、発現の検出がさらにもっと高感度であることを観察している。従って、特定の態様において、前記の試料は2μl未満の量を有し、工程bおよびcの間に前記の試料を37°C~65°Cの温度で30秒間~5分間保温する。おそらく、そのようなプラスの作用は2μl未満の少ない試料量によるものであり、それは結果としてその少数の選別された細胞の膜の即時の乾燥およびそれに続く破壊をもたらす。結果として、その細胞のRNAは逆転写反応に利用可能になることができる。続いて、増幅されたDNAの分析を、通常はゲル電気泳動により達成することができる。しかし、より重要な態様において、そのRT-PCR反応はリアルタイムPCR反応であってよく、ここでその増幅の進行は、例えば以下の検出形式のいずれかを用いて連続的に監視される:-TaqMan加水分解プローブ形式:一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを2種類の構成要素で標識する。第1構成要素が適切な波長の光で励起された際に、吸収されたエネルギーが第2構成要素いわゆるクエンチャーに、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って移動する。そのPCR反応のアニーリング工程の間に、そのハイブリダイゼーションプローブが標的DNAに結合し、それに続く伸長段階の間にTaqポリメラーゼの5’-3’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。結果として、その励起された蛍光構成要素およびクエンチャーが空間的に互いから分離され、そうして第1構成要素の蛍光放射を測定することができる。TaqManプローブアッセイは、米国特許第5,210,015号、米国特許第5,538,848号、および米国特許第5,487,972号において詳細に開示されている。TaqManハイブリダイゼーションプローブおよび化合物の混合物は、米国特許第5,804,375号において開示されている。特定の態様において、そのTaqManハイブリダイゼーションプローブは、RocheAppliedSciencesから入手可能であるようなカタログ2010/2011,p.577ユニバーサルプローブライブラリーからのUPLプローブである。-分子ビーコン:これらのハイブリダイゼーションプローブも第1構成要素およびクエンチャーで標識されており、その標識は好ましくはそのプローブの両端に位置している。そのプローブの二次構造の結果として、両方の構成要素は溶液中で空間的に近くにある。標的核酸へのハイブリダイゼーションの後、両方の構成要素は、適切な波長の光による励起後にその第1構成要素の蛍光放射を測定することができるように、互いから分離される米国特許第5,118,801号。-FRETハイブリダイゼーションプローブ:FRETハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、全ての種類の相同ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である125。それは、同時に用いられ、増幅された標的核酸の同じ鎖の隣接部位に相補的である2種類の一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。両方のプローブは異なる蛍光構成要素で標識されている。適切な波長の光で励起された際に、第1構成要素は、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出する予定の標的分子の隣接する位置に結合した際に第2構成要素の蛍光放射を測定することができるように、吸収したエネルギーを蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って第2構成要素に移動させる。FRETアクセプター構成要素の蛍光の増大を監視する代わりに、FRETドナー構成要素の蛍光の減少をハイブリダイゼーション事象の定量的測定として監視することも可能である。特に、そのFRETハイブリダイゼーションプローブ形式は、増幅された標的DNAを検出するためにリアルタイムPCRにおいて用いることができる。リアルタイムPCRの技術分野で既知の全ての検出形式の中で、FRETハイブリダイゼーションプローブ形式は非常に高感度、正確かつ信頼できることが証明されているWO97/46707;WO97/46712;WO97/46714。2種類のFRETハイブリダイゼーションプローブの使用に対する代替策として、蛍光標識されたプライマーおよび1種類のみの標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いることも可能である101107。この点について、そのプライマーがFRETドナー化合物で標識されるか、またはFRETアクセプター化合物で標識されるかは任意に選択されてよい。-二本鎖DNA結合色素形式:増幅産物が二本鎖核酸結合部分を用いて検出される場合に、リアルタイムPCRが本発明に従う添加物の存在下で実施される場合も、本発明の範囲内である。例えば、それぞれの増幅産物を本発明に従って蛍光DNA結合色素により検出することもでき、それは二本鎖核酸との相互作用の際に、適切な波長の光による励起後に、対応する蛍光シグナルを放射する。色素SybrGreenIおよびSybrGoldMolecularProbesが当技術において頻繁に用いられる。別の特に有用な色素は、LightCycler480Resolight色素RocheAppliedScienceカタログ番号:04909640001である。ホットスタートPCRそのPCR反応構成は、ホットスタート効果、すなわち、時々結果としてプライマーダイマーのような非特異的増幅産物の形成をもたらす周囲温度での非特異的なプライマーのアニーリングおよびそれに続く伸長の阻害を提供するいくつかの化合物を含有することができる。温度が上昇した際、そのホットスタート化合物があらゆる結合パートナーから遊離するため、この阻害が除去された状態になり、その結果その熱安定性DNAポリメラーゼが熱的に活性化された状態になり、特異的なポリメラーゼに触媒されるプライマー伸長が起こることができる。そのような化合物に関する多くの例が当技術において既知である。具体的な例が米国特許第5,338,671号において与えられており、それはホットスタート化合物としてのポリメラーゼ抗体を開示している。そのようなホットスタート化合物に関するより最近の例が欧州特許第1989324A号および欧州特許第2163556号において開示されている。前記のホットスタート化合物は、溶解の後に、工程dの前にポリメラーゼおよびあらゆる他のRT-PCR化合物と一緒にその試料に添加されてよい。しかし、好ましくは、前記のホットスタート化合物は工程bの間に添加されている1ステップRT-PCR反応緩衝液内に既に含まれている。結果として、その熱安定性DNAポリメラーゼの熱的活性化は、工程cの間の少なくとも90°Cでの保温により既に達成されていることができる。特定の態様において、そのDNAポリメラーゼは化学修飾の結果として可逆的に不活性化される。より正確には、熱不安定性ブロック基をそのポリメラーゼ中に導入し、それはその酵素を室温で不活性にする米国特許第5,773,258号。これらのブロック基は前PCR工程の間に、その酵素が活性化された状態になるように高温で除去される。そのような熱不安定性修飾は、例えばシトラコン酸無水物またはアコニチン酸無水物をその酵素のリシン残基に結合させることにより得ることができる米国特許第5,677,152号。好ましい態様において、そのホットスタートの特徴は、TthDNAポリメラーゼをアプタマーとの組み合わせで用いることにより達成される。TthDNAポリメラーゼはRNA依存性逆転写酵素活性およびDNA依存性ポリメラーゼ活性を有する熱安定性酵素であり、単一チューブでの反応における逆転写RTおよびPCRの組み合わせを可能にする。アプタマーは、Tth酵素の最適反応温度より下の温度でそのポリメラーゼの活性中心に結合して核酸標的への付着を妨げる専用のオリゴヌクレオチドである。従って、反応の準備およびそれに続くRT工程の前の加熱段階の間にはプライマーの伸長は起こらない。より高い温度において、そのアプタマーはその酵素から遊離し、RTまたはDNAの重合が開始され得る。TthDNAポリメラーゼによるRTに関する推奨される保温温度61°Cは、RNAの二次構造を克服することができる。これは結果として高度に特異的かつ効率的なcDNA合成をもたらし、それは高度に特異的かつ高感度なPCRをもたらす。アプタマーを用いるホットスタートは、それが追加の保温工程、ピペット操作工程、または反応時間の延長を必要としないため、高度に効果的かつ非常に便利である。アプタマーを用いるホットスタートプロトコルは他の酵素的プロセス、増幅産物のオンライン検出、またはそれに続く取り扱い工程を妨げない。PCR試薬の乾燥組成物を含むマイクロタイタープレート上記で開示したように、本発明に従う方法を実施するためにマイクロタイタープレートを用いることができる。この場合、そのマイクロタイタープレートのそれぞれの容器または反応ウェルは、既にその表面上に、その後でPCRに必要である試薬の乾燥組成物を含んでいてよい。そのマスター混合物の乾燥組成物は、工程bにおける1ステップRT-PCR反応緩衝液の添加により溶解される。本発明の文脈において、句乾燥組成物は、溶媒の、好ましくは水性溶媒の量が5重量未満に低減されていることを強調するために用いられる。例えば、そのような乾燥組成物は、少なくとも一対の増幅プライマーを含んでいてよく、またはそれのみで構成されていてよい。この場合、その1ステップRT-PCR反応緩衝液は増幅プライマーを一切含まない。マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルは同じ増幅プライマーの対を含んでいてよく、それにより多数の試料の並行分析が可能になり、または実質的にそれぞれのウェルは異なる増幅プライマーの対を含んでいてよく、それにより1種類もしくはごく少数の異なる試料の多パラメーター分析が可能になる。当然、そのプレートのレイアウトはその2つの概念を混合したものに従って、ならびに二重、三重または四重の分析のために設計することもできる。PCR増幅プライマーのような核酸の乾燥組成物を生成するための方法は当技術で周知であり、それには冷凍乾燥freezedrying、凍結乾燥lyophyllizationまたは真空乾燥の方法が含まれるが、それらに限定されない。WO2008/36544は乾燥組成物を提供するためのいわゆる充填物質の使用を記述しており、前記の充填物質は例えば炭水化物、例えばFICOLL商標、スクロース、グルコース、トレハロース、メレチトース、DEXTRAN商標またはマンニトール、タンパク質、例えばBSA、ゼラチンまたはコラーゲン、およびポリマー、例えばPEGまたはポリビニルピロリドンPVPである。その生物学的物質を炭水化物ポリマー母材中で乾燥させるために、冷凍乾燥米国特許第5,593,824号または真空乾燥米国特許第5,565,318号が開示されている。加えて、そのような乾燥組成物は場合により、リアルタイムPCRでの監視を可能にするために、少なくとも1種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖DNA結合蛍光化合物のどちらかを含んでいてよい。さらに、前記の乾燥した組成物は追加で熱安定性DNAポリメラーゼおよび/またはdNTPを含んでいてよい。この場合、その1ステップRT-PCR反応緩衝液にはその乾燥組成物の一部である試薬は一切含まれない。タンパク質または酵素を含む乾燥組成物を製造するいくつかの方法も当技術において開示されている。凍結乾燥または冷凍乾燥はタンパク質の貯蔵のための十分に確立された技法であり、それは多くの現状技術の文書において開示されている例えば、PassotSetalPharmaceuticalDevelopmentandTechnology12543553CarpenterJFetalPharmaceuticalResearch14969975SchwegmanJJetalPharmaceuticalDevelopmentandTechnology10151173。特に、米国特許第7,407,747号は、Taqポリメラーゼを緩衝溶液、ヌクレオチド、BSAおよびトレハロースからなる混合物中で乾燥させることができることを開示している。また、US2010/0159529は、アプタマーのその液体溶液への添加がTaqポリメラーゼの安定性を高め、ここで前記の安定化は乾燥させるだけでなくその乾燥混合物を保存するのにも十分に優れていたことを開示している。当業者には理解されるであろうが、開示された方法は多くの変形を含む。例えば、その乾燥組成物が増幅プライマーのみを含む場合、熱安定性DNAポリメラーゼ、dNTPおよび増幅に必要な全ての他のPCR化合物を含む1ステップRT-PCRマスター混合物は1ステップRT-PCR反応緩衝液として工程bの間に添加されてよい。場合により、その1ステップRT-PCR反応緩衝液または1ステップRT-PCRマスター混合物のどちらかが、リアルタイムで増幅を監視するための手段、例えば蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブ、あるいは蛍光二本鎖DNA結合色素を追加で含んでいてよい。別の例では、その乾燥組成物は増幅に必要な全ての化合物、すなわち、少なくとも一対の増幅プライマー、熱安定性DNAポリメラーゼ、dNTPおよび場合により少なくとも1種類の蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは蛍光二本鎖DNA結合色素を含んでいてよい。その場合、工程bの1ステップRT-PCR反応緩衝液は単に水であってよく、または必要な場合には追加の補助的化合物、例えばpH緩衝系例えばトリス塩、Mg2塩等を含んでいてよい。本発明に従うキット本発明は、リアルタイムPCR分析を実施するための新規のタイプのキットも提供する。そのキットは試薬構成要素および使い捨ての構成要素を含み、それは一緒に上記で開示した方法のいずれかのために用いることができ、特にそれに適合している。従って、そのようなキットは、サーマルサイクラー機器の中に取りつけられるように設計された複数の反応容器、ならびに逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含む熱安定性DNAポリメラーゼまたは一緒にそのような活性の両方を提供するポリメラーゼの混合物ならびにdNTPを含む1ステップRT-PCR反応緩衝液を含む。従って、そのようなキットは、遺伝子発現分析に必要な全ての試薬および使い捨て用品の完全なセットを含有する有用な道具を初めて科学者に提供する。適切な酵素の卓越した例は、TthポリメラーゼRocheAppliedScienceカタログ番号:11480022001またはC.thermポリメラーゼシステムRocheAppliedScienceカタログ番号:12016346001である。非常に好ましい態様において、ホットスタートの特徴は、TthDNAポリメラーゼをアプタマーと組み合わせて用いることにより実施される。TthDNAポリメラーゼはRNA依存性逆転写酵素活性およびDNA依存性ポリメラーゼ活性を有する熱安定性酵素であり、単一チューブでの反応における逆転写RTおよびPCRの組み合わせを可能にする。好ましくは、そのようなキット内の前記の熱安定性ポリメラーゼは、90°Cで少なくとも1分間の保温により熱的に活性化されることができる。好ましくは、その反応容器はマイクロタイタープレートの形態で物理的に互いに連結されている。そのマイクロタイタープレートは好ましくは96、384または1536ウェルマイクロタイタープレートであってよい。あるいは、前記の反応容器は反応容器の線状細片の形態で互いに物理的に連結されている。1態様において、前記のキットはさらに、少なくとも一対の増幅プライマー、および場合により少なくとも1種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖DNA結合蛍光化合物のどちらかを含む。これらの試薬は別々の容器内で保管され、その実験の開始前にPCR反応緩衝液に添加されてよい。代わりの態様において、前記のキット内の前記の反応容器は少なくとも一対のPCR増幅プライマーおよび場合により少なくとも1種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖DNA結合蛍光化合物のどちらかを含む。実施例1選別されたマウスハイブリドーマ細胞からのGAPDH遺伝子およびRPLI13A遺伝子の増幅のためのqPCR定められた数のマウスハイブリドーマ細胞を、細胞選別機BecktonDickinson,FACSAriaIを用いて96ウェルマイクロタイタープレートの別々のウェルの中に、その液体ビームが常にそのウェルの中心に向けられるような方式で沈着させた。しかし、細胞選別機の基礎をなす技術のため、その選別された粒子の小さい割合が無傷の細胞全体ではなく細胞破砕片であることを排除できなかった。従って、以下において、選別された物質の数を細胞相当数と呼ぶことにする。開示したように選別された細胞を、LC480リアルタイムPCR機器RocheAppliedScienceカタログ番号:05015278001のために設計された96ウェルマイクロタイタープレートRocheAppliedScienceカタログ番号:04729692001の中に、以下のピペット操作スキームに従って分配した:1細胞相当数/縦列1~4のウェル2細胞相当数/縦列5~6中のウェル4細胞相当数/縦列7~8中のウェル8細胞相当数/縦列9中のウェル16細胞相当数/縦列10中のウェル32細胞相当数/縦列11中のウェル64細胞相当数/縦列12中のウェルそれぞれのウェルに、以下:0.4μM順方向プライマーagcttgtcatcaacgggaagSEQIDNO:10.4μM逆方向プライマーtttgatgttagtggggtctcgSEQIDNO:20.2μMUPLプローブRocheAppliedScienceカタログ番号:04685075001,No.91×LC480ProbeMasterRocheAppliedScienceカタログ番号:04902343001を含有するマスター混合物を添加した。その順方向および逆方向プライマーは、マウスゲノム中に高いコピー数で存在することが既知であるマウスGAPDH遺伝子を増幅するように設計された。別々のプレート上で、その同じマスター混合物を添加したが、プライマーおよびプローブはマウスゲノムの12コピーのみ存在する遺伝子RPLI13Aを増幅するように設計された。プライマーおよびプローブは以下の通りであった:0.4μM順方向プライマーcatgaggtcgggtggaagtaSEQIDNO:30.4μM逆方向プライマーgcctgtttccgtaacctcaaSEQIDNO:40.2μMUPLプローブRocheAppliedScienceカタログ番号:04686993001,No.25LightCyclerProbeMasterは熱安定性FastStartDNAポリメラーゼを含み、それは化学修飾されたホットスタート酵素である。前記の修飾を高温での保温により除去することにより、活性化が誘導される。以下の熱サイクルプロトコルに従って、LC480リアルタイムPCR機器においてqPCRを実施した:前保温:1×95°C10’変性45×95°C10’’アニーリング45×60°C30’’伸長45×72°C1’’冷却温度変動速度2.2°C/s加熱温度変動速度4.4°C/s増幅シグナルの検出およびcp値の計算低いcp値は高レベルの増幅を示すを、製造業者の説明書の指示に従って実施した。以下の表は、分析した異なる細胞数に関して得られた平均cp値を開示する:その表から理解できるように、高コピー数のマウスGAPDH遺伝子ならびにマウスゲノム中に12コピー存在するRPLI13A遺伝子に由来するシグナルは、たとえ出発物質として1個の細胞しか用いなくても検出することができる。さらに、cp値はウェルあたりの細胞の数と逆相関することを観察することができる。従って、PCR反応緩衝液の添加およびそれに続く95°Cで10’の保温は明らかに細胞を定量的様式で溶解させるのに十分であったと明らかに結論付けることができる。実施例2選別されたマウスハイブリドーマ細胞からのKcnj2遺伝子の増幅のためのqPCRその実験は本質的に実施例1に関して開示したように実施され、プライマーおよびプローブが単一コピーのマウス遺伝子Kcnj2を増幅するように設計されたという変更があった。プライマーおよびプローブは以下の通りであった:順方向プライマーctgtcttgccttcgtgctctSEQIDNO:5逆方向プライマーagcagggctatcaaccaaaaSEQIDNO:6UPLプローブRocheAppliedScienceカタログ番号:04688996001,No.76以下の表は、分析した異なる細胞数に関して得られた平均cp値を開示する:その表から理解できるように、単一コピー数のマウス遺伝子Kcnj2に由来する増幅シグナルは、たとえ出発物質として1個の細胞しか用いなくても得ることができる。言い換えれば、本発明は単一細胞試料からの単一コピー遺伝子の増幅のための溶液を提供する。さらに、その試料がより高い細胞数、例えば64細胞に由来する場合、cp値が増大することを観察することができる。これは、95°CにおけるそのPCR反応緩衝液内での溶解のため、所与の反応体積内の細胞破砕片の濃度が増大し、従ってそれがそのPCR反応の増幅効率を抑制し得るという事実により説明することができる。本発明は、より低い細胞数に由来する試料に対するPCRに特に適用可能であると結論付けることができる。さらに、以下の表は、個々の単一細胞試料から得られたcp値を開示する:その表から推測できるように、16の並行した反応からの約4において増幅シグナルが得られなかった。全ての単一選別事象が結果として実際の単一細胞の反応容器中への分離および送達をもたらすわけではないことを証明する実施例2の結果を考慮すると、この結果を説明することができる。言い換えれば、一部の場合において増幅シグナルが観察されない事実はその個々のウェルが細胞を含有していなかったという事実によるものであるが、それはその溶解および増幅手順自体が一定の失敗率を有するという事実によるものではない。実施例3乾燥試薬を含有するマイクロタイタープレートを用いる選別されたマウスハイブリドーマ細胞からのKcnj2遺伝子の増幅のためのqPCRその実験は本質的に実施例2に関して開示したように実施され、以下の変更があった:必要なプライマーおよびプローブを含有する10μlの溶液を、マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルの中に入れた。そのマイクロタイタープレートを、そのプライマーおよびプローブがそのマイクロタイタープレートのそれぞれの反応ウェルの表面上に乾燥するように、25°Cおよび200mBarで12時間、続いて25°Cおよび50mBarで4時間保温した。続いて、細胞の沈着を以下のように実施した:1細胞相当数/縦列1~6のウェル2細胞相当数/縦列7中のウェル4細胞相当数/縦列8中のウェル8細胞相当数/縦列9中のウェル16細胞相当数/縦列10中のウェル32細胞相当数/縦列11中のウェル64細胞相当数/縦列12中のウェル20μlのマスター混合物を添加した後、リアルタイムPCR分析を実施した。以下の表は、分析された異なる細胞数に関して得られた平均cp値を開示する:単一細胞分析のために用いられた48のウェルから10の増幅反応のみが陰性であったことを特筆するのも重要である。これらの反応は平均cp値の計算には含まれなかった。実施例4乾燥試薬を含有するマイクロタイタープレートを用いる単一のマウスハイブリドーマ細胞からのKcnj2遺伝子の増幅のためのqPCR細胞相当物のどれだけ多くの割合が細胞破砕片ではなく実際に生細胞に対応するのかを分析するため、3×30の選別された相当物をそれぞれ顕微鏡スライド上に沈着させ、計数した。顕微鏡による目視検査により、それぞれ28、28および29個の細胞を確認することができた。これは、細胞相当物選別事象あたり94の生細胞対6の細胞破砕片に対応する。以下において、実験は本質的に2個の実施例3に関して開示したようなマイクロタイタープレートにおいて実施され、両方のマイクロタイタープレートにおいてそれぞれの反応ウェルは単一細胞相当物のみを含有していたという変更があった。結果は以下の通りであった:その結果は、本発明により提供されるようなPCR法に従って単一細胞分析を実施することが可能であることを示している。さらに、単一細胞分析が意図される場合も、そのプライマーおよびプローブはそのマイクロタイタープレートの表面上に乾燥させられる。実施例5ActB、およびB2Mおよび1の発現の検出のための1ステップRT-PCR細胞を選別し、実施例1で開示したようにマイクロタイタープレート上に配置し、結果として2μl未満の試料量をもたらした。それぞれのウェルに、1×LC480RNAMaster加水分解プローブRocheAppliedScienceカタログ番号04991885001、T.thポリメラーゼおよびホットスタートアプタマーを含有を添加した。そのマスター混合物は、追加で以下のプライマーおよびプローブを含有していた:横列1~2:ActBの1ステップRT-PCR0.4μM順方向プライマーAAGGCCAACCGTGAAAAGATSEQIDNO:70.4μM逆方向プライマーGTGGTACGACCAGAGGCATACSEQIDNO:80.2μMUPLプローブRocheAppliedScienceカタログ番号:56横列3~4:B2Mの1ステップRT-PCR0.4μM順方向プライマーTACGCCTGCAGAGTTAAGCASEQIDNO:90.4μM逆方向プライマーGGTTCAAATGAATCTTCAGAGCASEQIDNO:100.2μMUPLプローブRocheAppliedScienceカタログ番号:117横列5~6:18sRNAの1ステップRT-PCR0.4μM順方向プライマーGCCGCTAGAGGTGAAATTCTTSEQIDNO:110.4μM逆方向プライマーCGTCTTCGAACCTCCGACTSEQIDNO:120.2μMUPLプローブRocheAppliedScienceカタログ番号:93第1プレートにおいて、LC480リアルタイムPCR機器中で、以下の熱サイクルプロトコルに従って1ステップRT-PCRを実施した:前保温:1×95°C30’’変性45×95°C10’’アニーリング45×60°C30’’伸長45×72°C1’’冷却温度変動速度2.2°C/s加熱温度変動速度4.4°C/s第2プレートにおいて、LC480リアルタイムPCR機器中で、61°Cでのさらなる前保温工程を含む熱サイクルプロトコルに従って1ステップRT-PCRを実施した:前保温:1×61°C3’前保温:1×95°C30’’変性45×95°C10’’アニーリング45×60°C30’’伸長45×72°C1’’冷却温度変動速度2.2°C/s加熱温度変動速度4.4°C/s増幅シグナルの検出およびcp値の計算低いcp値は高レベルの増幅を示すを、製造業者の説明書の指示に従って実施した。測定されたcp値がDNAではなく実際にmRNAの発現の検出を反映していることを証明するため、続いてアンプリコンの正確な大きさをゲル電気泳動により確認したconfimred。以下の表は、分析された異なる細胞数に関して得られた平均cp値を開示する。その表から理解できるように、出発物質として用いられた1個の細胞のみに由来する物質において、試験した遺伝子の発現を検出することができる。そのcp値はウェルのあたりの細胞の数と逆相関することを観察することができる。逆転写工程は、その熱サイクルプロトコルの最初の温度変動、アニーリングおよび伸長工程の間に起こる。その表からさらに推測できるように、驚くべきことに発現の検出は95°Cにおける実際の溶解の前の61°Cで3分間の前保温工程の場合にさらにもっと高感度である。おそらく、そのようなプラスの作用は、結果としてその少数の選別された細胞の、その細胞のRNAが逆転写反応に利用可能になるような即時の乾燥および破壊をもたらす、2μl未満の少ない試料量によるものである。実施例618s標的に対するDNAPCRおよび1ステップRT-PCRの間の比較以下のピペット操作スキームに従って、細胞を実施例1で開示したように選別し、マイクロタイタープレート上に配置した:番号1~3の3個の同一のプレートに関して、RNAを1ステップRT-PCR反応で増幅するために、1×LC480RNAMaster加水分解プローブRocheAppliedScienceカタログ番号04991885001、T.thポリメラーゼおよびホットスタートアプタマーを含有を添加した。プライマーは、この反応の間にRNAおよびその対応するゲノムDNA断片の両方が増幅できるような方式で設計された。4番目のプレート番号4に関して、逆転写酵素活性を一切有しない熱安定性DNA依存性DNAポリメラーゼを含むRealTimereadyDNAprobesmasterRocheAppliedScienceカタログ番号:05502381001を用いた。加えて、その4種類の構成は18sRNAおよびDNAの増幅に適した以下のプライマーおよびプローブを含有していた:0.4μM順方向プライマーGCCGCTAGAGGTGAAATTCTTSEQIDNO:110.4μM逆方向プライマーCGTCTTCGAACCTCCGACTSEQIDNO:120.2μMUPLプローブRocheAppliedScienceカタログ番号:93プレート1に関して、LC480リアルタイムPCR機器中で、以下の熱サイクルプロトコルに従って、61°Cでの前保温工程を含む1ステップRT-PCRを実施した:前変性:1×95°C1’前保温:1×61°C3’前保温:1×95°C30’’変性45×95°C10’’アニーリング45×60°C30’’伸長45×72°C1’’冷却温度変動速度2.2°C/s加熱温度変動速度4.4°C/sプレート2および3に関して、61°Cでの前保温一切なしでRT-PCRを実施した:前保温:1×95°C30’’プレート2または2’プレート3変性45×95°C10’’アニーリング45×60°C30’’伸長45×72°C1’’冷却温度変動速度2.2°C/s加熱温度変動速度4.4°C/s逆転写活性一切なしでPCRを実施するために、プレート3に関するプロトコルと同じプロトコルをプレート4に関して用いた。増幅シグナルの検出およびcp値の計算低いcp値は高レベルの増幅を示すを、製造業者の説明書の指示に従って実施した。測定されたcp値がDNAではなく実際にmRNAの発現の検出を反映していることを証明するため、続いてアンプリコンの正確な大きさをゲル電気泳動により確認した。以下の表は、分析された異なる細胞数に関して得られた平均cp値を開示する。その表から理解できるように、RT-PCRからの結果は対応するPCR反応からの結果と比較してより低いcp値を提供する。これは標的核酸のより高い出発濃度を示しており、選択されたような条件に従うそれは、そのRT-PCR構成内のそれぞれのRNAおよびその対応する遺伝子配列の両方の増幅に起因する。61°Cで3分間の前保温を含む、および61°Cでの前保温なしのRT-PCRの結果を比較すると、前保温は必須ではないが結果として増大したRNA検出の感度をもたらすことは明らかである。実施例5で開示したように、後者の観察された作用は、結果としてその少数の選別された細胞の、その細胞のRNAが逆転写反応に利用可能になるような即時の乾燥および破壊をもたらす、2μl未満の少ない試料量によるものである可能性がある。"