検体中に含まれるLチロシンを定量する方法であって、検体の一部をバチルスバディウスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素及びNADとpHが90以上、110未満の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量する工程、前記検体の残りの少ないとも一部をバチルススフェリカスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素及びNADとpHが110以上、120未満の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量する工程、工程で得られたNADH量及び工程で得られたNADH量の差分から、前記検体に含まれるLチロシンを定量する方法。工程をpHが100以上、104以下の緩衝液中で行う請求項1に記載の方法。工程をpHが110以上、115以下の緩衝液中で行う請求項1に記載の方法。工程及び工程を1枚のマイクロウェルアレイプレート上の異なるウェルで並行して行い、各ウェル中の溶液のNADHの吸収に対応する吸光度を並行してまたは交互に測定することを含む、請求項1に記載の方法。複数の検体のLチロシン定量を1枚のマイクロウェルアレイプレートにて行う請求項4に記載の方法。チロシン血症の検査に用いられる、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。被験者からサンプリングした検体のLチロシン濃度を請求項1~5のいずれか1項に記載の方法により測定し、前記測定されたLチロシン濃度と、健常人が示すLチロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すLチロシン濃度範囲と対比することを含む、チロシン血症の検査方法。以下の~の試薬を含むLチロシン定量用キット。バチルスバディウスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素バチルススフェリカスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素NADpHが90以上、110未満のPheDHBB用緩衝液pHが110以上、120未満のPheDHBS用緩衝液PheDHBB用緩衝液はNADを含有する請求項8に記載のキット。PheDHBS用緩衝液はNADを含有する請求項8に記載のキット。マイクロウェル中の溶液の吸収度の測定が可能な構造のマイクロウェルアレイプレートをさらに含む請求項8~10のいずれか1項に記載のキット。チロシン血症の検査に用いられる、請求項8~11のいずれか1項に記載のキット。健常人が示すLチロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すLチロシン濃度範囲を表示する説明書をさらに含む、請求項12に記載のキット。バチルスバディウスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものであることを特徴とするLチロシン定量に用いるための酵素センサー。前記検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNADとをpHが90以上、110未満の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量するために用いられる請求項14に記載の酵素センサー。バチルススフェリカスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものであることを特徴とするLチロシン定量に用いるための酵素センサー。前記検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNADとpHが110以上、120未満の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量するために用いられる請求項16に記載の酵素センサー。請求項14または15に記載の酵素センサーと請求項16または17に記載の酵素センサーの組合せであって、PheDHBB酵素センサーで得られたNADH量及びPheDHBS酵素センサーで得られたNADH量の差分から、検体に含まれるLチロシンを定量するために用いられる、組合せ。チロシナーゼによるL-チロシンの定量方法は、定量方法としては適していない。何故なら、チロシナーゼは安定性に乏しいために新鮮な物を使用する必要があり、調製には誘導工程を必要とし、多数のサンプルの処理に対しては適していないからである。さらに、チロシンデカルボキシラーゼを用いる方法は、3タイプの酵素反応を必要とし、比較的多量の試料が必要であり、多数の試料のスクリーニングには不便である通常の分光光度計を用いて行われるという問題がある。フェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いる方法は、マイクロプレートによる定量法を用いて反応の終点で決定することができる。しかし、この定量法には2時間の保温時間が必要であるという問題がある。そこで本発明の目的は、従来とは異なる新たな酵素を用いて、短時間にかつ簡便に、電気化学センサーとしても利用でき、多数の処理の同時測定も可能な、L-チロシンの新たな定量方法を提供することにある。本発明は以下の通りである。1検体中に含まれるLチロシンを定量する方法であって、検体の一部をバチルスバディウスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素及びNADとpHが90以上、110未満の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量する工程、前記検体の残りの少ないとも一部をバチルススフェリカスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素及びNADとpHが110以上、120未満の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量する工程、工程で得られたNADH量及び工程で得られたNADH量の差分から、前記検体に含まれるLチロシンを定量する方法。2工程をpHが100以上、104以下の緩衝液中で行う1に記載の方法。3工程をpHが110以上、115以下の緩衝液中で行う1に記載の方法。4工程及び工程を1枚のマイクロウェルアレイプレート上の異なるウェルで並行して行い、各ウェル中の溶液のNADHの吸収に対応する吸光度を並行してまたは交互に測定することを含む、1に記載の方法。5複数の検体のLチロシン定量を1枚のマイクロウェルアレイプレートにて行う4に記載の方法。6チロシン血症の検査に用いられる、1~5のいずれか1項に記載の方法。7被験者からサンプリングした検体のLチロシン濃度を1~5のいずれか1項に記載の方法により測定し、前記測定されたLチロシン濃度と、健常人が示すLチロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すLチロシン濃度範囲と対比することを含む、チロシン血症の検査方法。8以下の~の試薬を含むLチロシン定量用キット。バチルスバディウスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素バチルススフェリカスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素NADpHが90以上、110未満のPheDHBB用緩衝液pHが110以上、120未満のPheDHBS用緩衝液9PheDHBB用緩衝液はNADを含有する8に記載のキット。10PheDHBS用緩衝液はNADを含有する8に記載のキット。11マイクロウェル中の溶液の吸収度の測定が可能な構造のマイクロウェルアレイプレートをさらに含む8~10のいずれか1項に記載のキット。12チロシン血症の検査に用いられる、8~11のいずれか1項に記載のキット。13健常人が示すLチロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すLチロシン濃度範囲を表示する説明書をさらに含む、12に記載のキット。14バチルスバディウスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものであることを特徴とするLチロシン定量に用いるための酵素センサー。15前記検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNADとをpHが90以上、110未満の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量するために用いられる14に記載の酵素センサー。16バチルススフェリカスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものであることを特徴とするLチロシン定量に用いるための酵素センサー。17前記検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNADとpHが110以上、120未満の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量するために用いられる16に記載の酵素センサー。1814または15に記載の酵素センサーと16または17に記載の酵素センサーの組合せであって、PheDHBB酵素センサーで得られたNADH量及びPheDHBS酵素センサーで得られたNADH量の差分から、検体に含まれるLチロシンを定量するために用いられる、組合せ。本発明は上記従来技術の問題を解決した、簡便な操作で短時間に実施できる方法であって、ハイスループットスクリーニングにも適した方法である。本発明は、バチルスバディウスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素PheDH及びバチルススフェリカスに由来するPheDHを用いてLチロシンを定量する方法に関する。より具体的には、本発明は、検体中に含まれるLチロシンを定量する方法であって、検体の一部をPheDHBB及びNADとpHが90以上、110未満の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量する工程、前記検体の残りの少ないとも一部をPheDHBS及びNADとpHが110以上、120未満の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量する工程、工程で得られたNADH量及び工程で得られたNADH量の差分から、前記検体に含まれるLチロシンを定量する方法に関する。PheDHBSは、NADを補酵素として用いて、スキーム1a及び1bに従って、LフェニルアラニンとLチロシンをそれぞれフェニルピルビン酸と4ヒドロキシピルビン酸に変換する反応を触媒する。Lフェニルアラニン及びLチロシンに対する基質特性は、実施例において示すように、pHが90以上、110未満の範囲であれば、Lフェニルアラニン及びLチロシンの両方に対してほぼ同等の反応性を示す。特に、pHが100以上、104以下の範囲であれば、活性も高く、かつ両方の基質にほぼ同等の反応性を示す。従って、工程は、pHが100以上、104以下の緩衝液中で行うことが好ましい。工程における酵素反応は、例えば、25~40°Cの範囲で行うことができる。工程における酵素反応の時間は、例えば、5~60分の範囲で適宜行うことができる。PheDHBSは、AsanoYらNovelPhenylalanineDehydrogenasefromSporosarcinaureaeandBacillussphaericusJBiologicalChemistryVol21No21pp1034610354に記載されている。この文献においては、PheDHBSの基質特異性は、pH105においてのみ確認されており、それ以外のpH範囲における基質特異性についての記載はない。PheDHBBは、pHが110以上、120未満の範囲においては、Lフェニルアラニンのフェニルピルビン酸へ変換する反応を触媒するスキーム1aが、Lチロシンの4ヒドロキシピルビン酸への変換反応は実質的に触媒しない。この点は、実施例においてデータをもって示されている。特に、pHが110以上、115以下の範囲であれば、Lフェニルアラニンは高く、かつLチロシンに対しては実質的に活性を示さない。従って、工程は、pHが110以上、115以下の緩衝液中で行うことが好ましい。工程における酵素反応は、例えば、25~40°Cの範囲で行うことができる。工程における酵素反応の時間は、例えば、5~60分の範囲で適宜行うことができる。PheDHBBは、AsanoYらPhenylalanineDehydrogenaseofBacillusbadiusEurJBiochem168153159に記載されている。この文献においては、PheDHBBの基質特異性は、pH104においてのみ確認されており、上記の如く、pHが110以上、120未満の範囲における基質特異性についての記載はない。検体中にLフェニルアラニンとLチロシンが存在する場合、工程では、両方の基質が、PheDHBSによって、完全に酸化されて、それぞれ等モルのフェニルピルビン酸と4ヒドロキシピルビン酸になるように実験条件、特に反応時間を調整する。その際、各酸化反応において、検体中に存在するLフェニルアラニン及びLチロシンとそれぞれ等モル数のNADHが生成する。生成したNADHは、340nmにおいて622mM1cm1の減衰係数extinctioncoefficientで分光光度計にて定量できる。反応の終点における吸光度は、LフェニルアラニンとLチロシンの合計モル濃度に相当する。事前にNADHの濃度と340nmにおける吸光度との検量線を作成しておくことで、反応の終点における吸光度から、LフェニルアラニンとLチロシンの合計モル濃度を算出できる。LフェニルアラニンとLチロシンを含有する工程と同じ検体について、PheDHBBを用いる場合には、Lフェニルアラニンのみが完全に酸化されて、等モルのフェニルピルビン酸を生じるように実験条件、特に反応時間を調整する。Lフェニルアラニンの酸化反応において等モル数のNADHが生成する。但し、この酵素反応ではLチロシンが酸化されることは実質的にはなく、従って、Lチロシンの酸化に起因するNADHは実質的には生成しない。上記と同様に、生成したNADHは、340nmにおいて622mM1cm1の減衰係数extinctioncoefficientで分光光度計にて定量できる。反応の終点における吸光度は、Lフェニルアラニンのモル濃度に相当する。事前にNADHの濃度と340nmにおける吸光度との検量線を作成しておくことで、反応の終点における吸光度から、Lフェニルアラニンのモル濃度を算出できる。工程で得られたNADH量及び工程で得られたNADH量の差分から、検体に含まれるLチロシンを定量することができる。即ち、Lチロシンの濃度は、PheDHBBを用いることで定量したLフェニルアラニン量とPheDHBSを用いることで定量したLフェニルアラニン及びLチロシンの合計量の差分として計算できる。本発明においては、上記工程及び工程を1枚のマイクロウェルアレイプレート上の異なるウェルで並行して行い、各ウェル中の溶液のNADHの吸収に対応する吸光度を並行してまたは交互に測定することを含むことができる。さらに複数の検体のLチロシン定量を1枚のマイクロウェルアレイプレートにて行うこともできる。このようにすることで、多数の検体について、比較的短時間にかつ簡便にLチロシンの定量を行うことができる。このようなマイクロウェルアレイプレートを用いる場合には、マイクロウェル中の溶液の吸収度の測定は、例えば、マイクロプレートリーダーを用いて適宜実施できる。本発明の上記方法は、例えば、チロシン血症の検査に用いることかできる。チロシン血症の検査は、具体的には、被験者からサンプリングした検体のLチロシン濃度を上記本発明の方法により測定することで実施できる。検体のLチロシン濃度が測定されたら、測定されたLチロシン濃度と、健常人が示すLチロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すLチロシン濃度範囲と対比する。それにより上記被験者がチロシン血症に罹患しているか否かの検査をすることができる。一般的に健常人が示すLフェニルアラニン及びLチロシン濃度範囲は、それぞれ68~72μM及び30~76μMである。一方、チロシン血症患者が示すLチロシン濃度範囲は370~2000μMである。これまで、チロシン血症患者であるか否かのスクリーニングにおいては、Lチロシン濃度が305μM以上を分別値として用いている。本発明の方法を用いる場合にも同様のLチロシン濃度及び濃度範囲を参考にすることができる。但し、被験者がチロシン血症に罹患しているか否かの判断は医師により実施される。参考文献1OkamotoNMiyagiYChibaAAkaikeMShiozawaMImaizumiAYamamotoHAndoTYamakadoMTochikuboODiagnosticmodelingwithdifferencesinplasmaaminoacidprofilesbetweennoncachecticcolorectalbreastcancerpatientsandhealthyindividualsIntJMedMedSci10010082LarochelleJMortezaiABelangerMTremblayMClaveauJCAubinGExperiencewith37infantswithtyrosinemiaCanadMedAssJ97105110543ParkHLeeDHChoiTLeeYKKimJKiCLeeYClinicalbiochemicalandgeneticanalysisofaKoreanneonatewithhereditarytyrosinemiatype1ClinChemLabMed47930933本発明は、以下の~の試薬を含むLチロシン定量用キットも包含する。バチルスバディウスに由来するPheDHバチルススフェリカスに由来するPheDHNADpHが90以上、110未満のPheDHBB用緩衝液pHが110以上、120未満のPheDHBS用緩衝液PheDHBB及びPheDHBSは、各菌体から調製することもできるが、遺伝子工学的操作により調製することもできる。PheDHBB及びPheDHBSの遺伝子工学的操作による調製方法は、後述の実施例で引用する文献1を参照することができる。NADは、正式名称はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであり、例えば、市販の試薬として入手可能である。NADは、βNADとも表記される。pHが90以上、110未満のPheDHBB用緩衝液としては、例えば、グリシンKClKOH緩衝液、グリシンNaOH緩衝液、2アミノ2メチル13プロパンジオールHCl緩衝液、ClarkLubs緩衝液ホウ酸緩衝液を挙げることができる。pHが110以上、120未満のPheDHBS用緩衝液としては、例えば、グリシンKClKOH緩衝液、リン酸緩衝液、Hydroxidechlroride緩衝液を挙げることができる。PheDHBB用緩衝液は、所定濃度のNADを含有するものであることが、測定操作を容易にするという観点から好ましい。同様に、PheDHBS用緩衝液も、所定濃度のNADを含有するものであることが好ましい。本発明のキットは、上記~に加えて、マイクロウェル中の溶液の吸収度の測定が可能な構造のマイクロウェルアレイプレートをさらに含むこともできる。マイクロウェルアレイプレートは、高分子材料などで作成し、一平方センチメートル当たり、数個から数万個のウエルからなり、そこで酵素反応が行えるプレートを指す。本発明のキットは、チロシン血症の検査に用いることができる。チロシン血症の検査用キットにおいては、健常人が示すLチロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すLチロシン濃度範囲を表示する説明書をさらに含むことができる。本発明の第1の態様の酵素センサーは、バチルスバディウスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものである、Lチロシン定量に用いるための酵素センサーである。このPheDHBB酵素センサーは、検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNADとをpHが90以上、110未満の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量するために用いられる。検体や緩衝液などは、前記定量方法と同様である。本発明の第2の態様の酵素センサーは、バチルススフェリカスに由来するフェニルアラニン脱水素酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものであることを特徴とするLチロシン定量に用いるための酵素センサーである。このPheDHBS酵素センサーは、検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNADとpHが110以上、120未満の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量するために用いられる。検体や緩衝液などは、前記定量方法と同様である。これらの酵素センサーは、酵素センサーを構成する検出用電極にPheDHBBまたはPheDHBSを直接または間接的に固定化または配置したものであり、Lチロシンの定量に用いるためのものである。本発明の酵素センサーは、好ましくは、PheDHBBまたはPheDHBSによりLチロシンから生成する生成物を直接的に定量的に検出できるものであることが好ましい。加えて、本発明の酵素センサーは、上記酵素以外に、酵素と電極の間の電子の授受を容易にする電気化学メディエーターなどを、上記検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものであることもできる。それ以外の構成は、公知の酵素センサーで採用されている構成をそのまま、または適宜改変して利用することができる。本発明の酵素センサーは、検体を含有する試験溶液に少なくとも検出用電極部分を浸漬し、試験溶液に、PheDHBBまたはPheDHBSによりLチロシンから生成される生成物を検出用電極で検出する。より具体的には、Lチロシンから生成する生成物の1つであるNADHを検出できる電極をPheDHBBまたはPheDHBSとの組合せで用いることができる。NADHを検出できる電極としては、前述の電気化学メディエーターにジアホラーゼやNADHオキシダーゼと組み合わせることもできる。また、PheDHBBまたはPheDHBS及びジアホラーゼ、NADHオキシダーゼは、遊離の状態で使用する事もできるが、公知の方法により直接あるいは、間接的に電極へ固定化する事も出来る。その他のNADHを検出できる電極としては、例えば、特開平7280769号公報および特開平7310194号公報に記載のものを例示できるが、これらの限定される意図ではない。本発明は、上記PheDHBB酵素センサーとPheDHBS酵素センサーとの組合せも包含する。この組合せは、PheDHBB酵素センサーで得られたNADH量及びPheDHBS酵素センサーで得られたNADH量の差分から、検体に含まれるLチロシンを定量するために用いられる。NADH量の差分からの、検体に含まれるLチロシンの定量の方法は、上記定量方法の説明を参照できる。以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。但し、本発明は実施例の記載に限定される意図ではない。1PheDHBSおよびPheDHBBの調製11フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子を有する大腸菌形質転換株の培養、PheDHBSおよびPheDHBBの調製PheDHBSpUC18Hプラスミドを有するEcoliJM109形質転換株参考文献4を、05mMアンピシリンを含む05mlのLB培地に37°Cで12時間培養した。この前培養液を、2リッターのフラスコに02mMアンピシリンを含む500mlのLB培地に加え、さらに37°Cで12時間培養した。その時点で、IPTGを05mMの濃度で加え、PheDHBSおよびPheDHBBの誘導を開始し、さらに37°Cで4時間培養を継続した。形質転換株の菌体を4°Cで5000×g、10分間遠心分離し、生理的食塩水で2度洗浄した。菌体を03MNaClおよび25mMイミダゾールを含む20mMTrisHCl緩衝液に懸濁し、4°C、20分間の超波処理により破砕した。破砕物を4°C28000×gで15分間遠心し、無細胞抽出液とした。無細胞抽出液を透析後、NiSepharoseTM6FastFlowカラムに通し、75mMイミダゾールを含む20mMTrisHCl緩衝液で洗浄後、500mMイミダゾールを含む20mMTrisHCl緩衝液で溶出した。活性フラクションを、20mMTrisHCl緩衝液で透析した。12酵素活性の測定Lチロシンの酸化活性は、NADの還元をHitachiU3210分光光度計を用いて、30°Cにおいて、340nmで観測することによって行った。反応混液1mlは、10mMLチロシンあるいはLフェニルアラニン、25mMNAD、100mMglycineKClKOH緩衝液pH100を含んでいた。反応は、適当量の酵素を加えることにより開始した。13酵素濃度の測定酵素濃度は、BioRadproteinassaykitによりウシ血清アルブミンで作成した検量線を用いて測定した。14SDSPAGE分析SDSPAGE分析は、Laemmli34の方法を用いた。各種標準たんぱく質を用いて、SDSPAGEやゲルろ過クロマトグラフィーにより定法に従って分子量測定を行った。結果分析に用いたPheDHBSおよびPheDHBBは、大腸菌菌体の破砕物から、Niキレートカラムを用いてSDSPAGEで単一バンドまで精製した。無細胞抽出液における酵素の比活性は、PheDHBS351UmgおよびPheDHBB276Umgであった。カラムクロマトグラフィーで精製後の比活性は、PheDHBS637UmgおよびPheDHBB724Umgに上昇した。酵素は、4°Cで一か月以上安定であり、50グリセロール中で20°Cで保存すると、数か月以上安定であった。2PheDHBSによるLフェニルアラニンおよびLチロシンの同時定量、およびPheDHBBによるLフェニルアラニンの選択的な定量21Standardpreparation標準のLチロシン液はMilliQ水を用いて作成し、使用するまで20°Cで保存した。22PheDHBSおよびPheDHBBを用いるエンドポイント法によるマイクロプレート測定PheDHBSによるLフェニルアラニンおよびLチロシン定量では、96ウエルのUVプレート中で酵素反応を行い、InfiniteM200マイクロプレート測定装置を用いてアッセイを行った。反応混液は粗酵素抽出液、NAD最終濃度4mM、グリシンKClKOH緩衝液pH104、最終濃度100mMを、総容量200μlとなるように含む。NADが還元されNADHとなることを340nmで計測した。NADHの分子吸光係数として、622mM1cm1を用いた。酵素の添加により反応を開始し、30°Cで530分間でエンドポイントに達したところで吸光度を測定した。LフェニルアラニンおよびLチロシンのモル濃度は、それぞれの検量線より求めた。PheDHBBによるLフェニルアラニンの定量は、上記のPheDHBSを用いる方法と同様に行った。Lチロシン濃度は次の式を用いて計算した。CTCPTCP結果LフェニルアラニンPheDHBSおよびLチロシンPheDHBBの検量線を、それぞれ図2aおよび2bに示した。PheDHBSによるLフェニルアラニンおよびLチロシンの検量線を図1aに示す。PheDHBSは、この条件では、LフェニルアラニンおよびLチロシンに等しく作用する。LフェニルアラニンおよびLチロシンの回帰直線は、y00003x、相関係数をRとすると、R20996であった。一方、PheDHBBによるLフェニルアラニンの検量線は、直線となった。Lフェニルアラニンに対する回帰直線は、y00003x、相関係数をRとすると、R20996である。PheDHBBは、基質濃度依存的に、わずかにLチロシンにも作用した。PheDHBSとPheDHBBをLチロシンおよびLフェニルアラニンが混合されたサンプルの定量に使用した。その結果を図2aに示す。PheDHBSの利用により、LフェニルアラニンにLチロシンを加えた際の濃度のエンドポイント法による定量が可能であった。一方、PheDHBBを用いて、LフェニルアラニンにLチロシンを加えたサンプルを定量した場合、検量線は加えたLフェニルアラニン量より多く検出された。高濃度でのLチロシン濃度は、加えた量より低く検出された。つまり、アミノ酸混液に高濃度に加えたLチロシンは、低いLチロシン濃度としか検出されない。これは、PheDHBBの基質特異性が、Lフェニルアラニンを100とした場合、Lチロシンでは、9の相対活性しかないことに起因する。PheDHBBによる定量では、Lフェニルアラニン量は正確であるといえる。3PheDHBBおよびPheDHBSのLフェニルアラニンおよびLチロシンに対する基質特異性PheDHBBおよびPheDHBSのLフェニルアラニンおよびLチロシンに対する基質特異性、glycineKClKOH緩衝液pH90115の範囲で活性を測定した。結果図3aに示すように、PheDHBSは、LフェニルアラニンおよびLチロシンに対して、pHの変化により、異なった活性を示した。pH104では、それぞれ88および86の相対活性で、また、pH100ではそれぞれ、81および82の相対活性で、pH110では、Lフェニルアラニンに対して最大の100の活性に対して、Lチロシンに対しては40の相対活性を示した。pH110以上では、活性が減少した。このように、PheDHBSを用いるLフェニルアラニンおよびLチロシンの両者を等しく定量するために、pH104を選択するのが望ましい。図3bに示すように、PheDHBSは、LフェニルアラニンおよびLチロシンを基質とした際に、pHによって異なる酵素活性を示した。pH104における酵素活性の測定で、PheDHBSは、LフェニルアラニンおよびLチロシンに対して、それぞれ、55および16の相対活性で作用した。PheDHBBのLフェニルアラニンに対する活性は、pHが小さくなると低下したが、Lチロシンに対する活性は、pH95で少し上昇しpH90で減少した。Lフェニルアラニンに対する最大活性は、pH110であり、Lチロシンに対する活性は、4と最小になり、pHが115から120では、さらに低くなった。Lチロシンに対する活性を最小限にし、Lフェニルアラニンを選択的に定量するために、pH110を選択した。4PheDHBSおよびPheDHBBを異なったpHで用い、エンドポイント法によりマイクロプレートで測定する方法InfiniteM200マイクロプレートリーダーを用い、96穴のUVプレートを容器として定量を行った。PheDHBSを用いるLフェニルアラニンおよびLチロシンの定量では、反応混液は酵素液、NAD最終濃度4mM、グリシンKClKOH緩衝液pH104、最終濃度100mMを、総容量200μlとなるように含む。PheDHBSの添加により反応を開始し、30°Cで530分間でエンドポイントに達したところで吸光度を測定した。NADが還元されNADHとなることを340nmで計測した。LフェニルアラニンおよびLチロシンのモル濃度は、それぞれの検量線より求めた。尚、エンドポイントに達したことは、反応速度が減少し、それ以上反応が進行しなくなったことで判断する。PheDHBBを用いるLフェニルアラニンの定量は、PheDHBSを用いる上記の方法に準じて行った。反応混液は酵素液、NAD最終濃度4mM、グリシンKClKOH緩衝液pH110、最終濃度100mMを、総容量200μlとなるように含む。PheDHBSの添加により反応を開始し、30°Cで530分間でエンドポイントに達したところで吸光度を測定した。NADが還元されNADHとなることを340nmで計測した。Lフェニルアラニンのモル濃度は、検量線より求めた。Lチロシン濃度は、以下の式より求めた。CTCPTCP結果LチロシンおよびLフェニルアラニンの混合液中のLチロシンの定量は、pHの選択によるPheDHBBの基質特異性の強化に基づいて行った。Lチロシン濃度は上記の方法によった。図4に示すとおり、Lチロシン濃度は、直線性がある部分で定量した。アミノ酸混合液中のLチロシン定量が正確に行われた。本法は、生体試料、食品、飲料などのLチロシン定量に有効である。5Lチロシン定量によるチロシン血症のスクリーニング51基準およびサンプルの調製ヒト血漿およびヒト血清は市販品CosmoBioCoLTDTokyoを購入した。これらのサンプルは、4°Cで膜を通過させタンパク質や高分子物質を除去した。これらのヒト血清や血漿にさらに種々の濃度のLチロシンを加えて実験に供した。52PheDHBS活性のマイクロプレートでの活性測定テカン社のInfiniteM200マイクロプレートリーダーで、Greiner社製の96ウエル培養プレートを30°Cで用いて、PheDHBSの酵素活性のアッセイを行った。反応混液は粗酵素抽出液20μl、NAD最終濃度4mM、除タンパク質を行ったサンプル、グリシンKClKOH緩衝液pH104、最終濃度100mMを、総容量200μlとなるように含む。PheDHBSの添加により反応を開始し、30°Cで1030分間でエンドポイントに達したところで吸光度を測定した。NADが還元されNADHとなった吸光度変化をマイクロプレートリーダーによって340nmで計測した。実験は3連で行った。1ユニットの酵素活性は、標準条件において、1分間に1μmolのNADHを生成する酵素量と定義した。53超高速アミノ酸分析システムによるアミノ酸の分析Lチロシン定量の比較対象として、超高速アミノ酸分析システムを用いたプレカラム誘導体化法による定量を行った。前述の前処理済み血清及び血漿試料10μLをWatersAccQTagUltraderivatizationkitを用いて誘導化し、超高速アミノ酸分析システムWatersAcquityultraperformanceLCを用いて分析を行った。誘導体化条件としては、トータルリカバリーバイアルに試料10μLに対し70μLのAccQTaqUltraホウ酸塩緩衝液を加え混和後20μLのAccQTagUltra試薬を加え攪拌後室温で1分静置したのち、55°Cで10分間加温し誘導体化試料とした。分析条件注入量:1μL検出:蛍光検出器移動相:A10AccQTagUltra溶離濃縮液ABAccQTagUltra溶離濃縮液B原液分析温度:60°Cメソッド:FLRCellCultSeq07標準試料として、AminoAcidStandardHによりリテンションタイムの設定を行い、上記酵素法と同じLリジン塩酸塩溶液を用いて検量線を作成した。AccQTaqUltraカラムおよびAcquityFLR検出器を装着したウォーターズAcquityUPLCシステムを使用した。260nmで検出を行った。Lチロシンは、683分に溶出された。ヒト血漿及び血清中のLチロシン定量の酵素法および超高速アミノ酸分析システムとの比較を行った。各定量法による結果を図3に示す。図3が示すとおり、いずれの試料においてもLリジンα-オキシダーゼを用いた酵素法に比べ本発明によるLリジンε-オキシダーゼによる方法は、超高速アミノ酸分析システムと近い値を示した。したがってLリジンε-オキシダーゼは、Lリジンα-オキシダーゼに比べ、正確な定量が可能であることが分かった。結果1アッセイでの酵素濃度条件PheDHBSの酵素濃度と反応時間との関係を調べ、結果を図5に示した。PheDHBSの濃度は、反応液当り、001025051U反応とした。2000μMofLチロシンを加え、30°Cで反応し、340nmにおける吸光度変化を計測した。高濃度のPheDHBS05および1U反応液では、5分間で反応を終え、吸光度は一定の結果を与えた。よって酵素濃度を05U反応液とした。PheDHBS酵素を加えないコントロール実験では、吸光度変化は認められなかった。2検量線とアッセイ感度ヒト血清中のLチロシン濃度は、0から2000μMとして20分間吸光度を測定した。図6に示したように、最初の5分間を過ぎると、エンドポイントに達した。Lチロシン濃度が0μMでは、吸光度の増加は認められなかった。エンドポイントに達する時間は、10分間で十分と判断した。図7に示すように、チロシン濃度の10μMから2000μMに至るまで、次の式に従って、y00003xR20999良好な定量性が認められた。Lチロシン濃度10μMが、定量限界であり、2000μM以上の濃度についても、希釈をすることにより問題無く定量できる。3他のアミノ酸による妨害Lチロシン以外のアミノ酸による定量の妨害について検討した。Lチロシンを定量する際、種々のアミノ酸を同濃度で添加した。表3に示すように、他のアミノ酸による妨害は認められなかったが、Lフェニルアラニンのみが影響を及ぼした。LフェニルアラニンがLチロシンと同濃度で加えられているからである。しかし、このLフェニルアラニン濃度は、通常の血漿濃度の1520倍の高濃度である。チロシン血症では、3362000μM程度であるので、通常のLフェニルアラニン濃度では、高濃度のLチロシンの定量にほとんど影響を及ぼさない。表4では、Lチロシンに対して、種々の濃度のLフェニルアラニンを添加して、定量性について検討したが、定量の収率は100であり、エラーは10以内であった。参考文献54ヒト血清および血漿にLチロシンを加えての定量性種々のLチロシンを含有する6種類のヒト血清および血漿に、外からLチロシンを加えて、定量性を検討した。定量は、PheDHBSを用いて、上記の方法で定量した。図8に示すように、加えたLチロシン量は、995の回収率で定量された。サンプルが最初から含んでいたLフェニルアラニンは、これらの濃度のLチロシン定量に影響を及ぼさなかった。5正確性Lチロシン定量の実験間の変動係数を表5に示した。5回の実験で、各種のLチロシン濃度での変動係数は、079258となった。1回の実験内で6種類のサンプルを12の異なる条件で定量した時の変動係数は、0842となった。6PheDHBSを用いるLチロシンのマイクロプレート法によるエンドポイント定量とUPLCによる分析の比較血清サンプル11種類についてLチロシンを異なる濃度で加え、PheDHBSを用いるマイクロプレート法とUPLC法による定量性について比較した。Lチロシン50to1500μMの濃度範囲で、定量性の相関係数は0999であった回帰性は。本酵素は、UPLC法と同様信頼のおけるものであった。参考文献4TachibanaSKuwamoriYAsanoYDiscriminationofaliphaticsubstratebyasingleaminoacidsubstitutioninBacillusbadiusandBacillussphaericusphenylalaninedehydrogenaseBiosciBiotechnolBiochem737297325OkamotoNMiyagiYChibaAAkaikeMShiozawaMImaizumiAYamamotoHAndoTYamakadoMOsamuTDiagnosticmodelingwithdifferencesinplasmaaminoacidprofilesbetweennoncachecticcolorectalbreastcancerpatientsandhealthyindividualsIntJMedMedSci1001008