"核酸のナノ細孔解離依存配列決定のための分子ビーコンMBのライブラリであって、複数のMBを含み、各MBが、1検出可能な標識と、2検出可能な標識ブロッカーと、3修飾基と、を含む、オリゴヌクレオチドを含み、前記MBは、2本鎖ds核酸を形成するための、1本鎖核酸中のA、U、T、C、またはGヌクレオチドで表される定義された配列との配列特異的相補的ハイブリッド形成が可能である、ライブラリ。前記オリゴヌクレオチドは、4~60のヌクレオチドを含む、請求項1に記載のライブラリ。前記MBの前記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸DNA、リボ核酸RNA、ペプチド核酸PNA、ロックド核酸LNA、およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴPMOまたはモルホリノから成る群から選択される核酸を含む、請求項1または2に記載のライブラリ。前記検出可能な標識は、前記オリゴヌクレオチドの一端上で結合され、かつ前記ライブラリ中の全てのオリゴヌクレオチドにおいて同じ端上に存在し、前記検出可能な標識が前記ブロッカーによって阻害されないとき、前記検出可能な標識は、検出および/または測定され得るシグナルを発する、請求項1~3のいずれかに記載のライブラリ。前記MBは、固相担体に結合されない、請求項1~4のいずれかに記載のライブラリ。前記オリゴヌクレオチド上の前記検出可能な標識、前記検出可能な標識ブロッカー、および前記修飾基は、MBの、1本鎖核酸中のA、U、T、C、またはGヌクレオチドで表される前記定義された配列との配列特異的相補的ハイブリッド形成に干渉しない、請求項1~5のいずれかに記載のライブラリ。前記検出可能な基のシグナルは、光学的に検出される、請求項1~6のいずれかに記載のライブラリ。前記検出可能な基は、フルオロフォアであり、前記シグナルは、蛍光である、請求項1~7のいずれかに記載のライブラリ。前記検出可能な標識ブロッカーは、前記フルオロフォアのクエンチャーである、請求項1~8のいずれかに記載のライブラリ。前記検出可能な標識ブロッカーは、前記修飾基でもある、請求項1~9のいずれかに記載のライブラリ。前記修飾基は、前記オリゴヌクレオチドの5’端または3’端に位置する、請求項1~10のいずれかに記載のライブラリ。前記修飾基は、前記修飾基の前記オリゴヌクレオチドへの結合点で、ds核酸の幅を2.0ナノメートルnm超に増加させ、前記ds核酸が、前記MBの、A、U、T、C、またはGで表される前記定義された配列とのハイブリッド形成によって形成される、請求項1~11のいずれかに記載のライブラリ。前記修飾基の前記オリゴヌクレオチドへの結合点での、前記ds核酸の前記幅は、約3~7nmである、請求項12に記載のライブラリ。前記修飾基は、ナノスケール粒子、タンパク質分子、有機金属粒子、金属粒子、および半導体粒子から成る群から選択される、請求項1~13のいずれかに記載のライブラリ。前記修飾基は、3~5nmである、請求項1~14のいずれかに記載のライブラリ。前記修飾基は、前記ds核酸が、ナノ細孔配列決定を受けるとき、前記ds核酸の前記解離を容易にする、請求項1~15のいずれかに記載のライブラリ。MBの2つ以上の種が存在し、MBの各種は、別々の検出可能な標識を有する、請求項1~16のいずれかに記載のライブラリ。核酸のナノ細孔解離依存配列決定のために2本鎖ds核酸を解離する方法であって、a.請求項1~17に記載の分子ビーコンMBのライブラリを、A、U、T、C、またはGで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される1本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、前記修飾基の存在によって形成されるD3の幅の2本鎖ds核酸を形成することと、b.ステップaで形成されたds核酸を、D3はD1より大きい、D1の幅のナノ細孔の開口部と接触させることと、c.配列決定される前記1本鎖核酸から前記ハイブリッド形成された分子ビーコンを解離するために、前記ナノ細孔全体に電位を適用することと、を含む、方法。前記ナノ細孔径は、配列決定される1本鎖核酸に前記細孔を通過させるが、前記ds核酸に前記細孔を通過させない、請求項18に記載の方法。D1は、2nmより大きい、請求項18または19に記載の方法。D1は、3~6nmである、請求項18~20のいずれかに記載の方法。D3は、2nmより大きい、請求項18~21のいずれかに記載の方法。D3は、約3~7nmである、請求項18~22のいずれかに記載の方法。前記ハイブリッド形成された1本鎖核酸とMBとの間の結合親和性は、前記修飾基と前記MBのオリゴヌクレオチドとの前記結合親和性より低く、そのため、前記ds核酸が電位の影響下で前記ナノ細孔の前記開口部を通過しようとするとき、前記1本鎖核酸とMBとの間の結合は壊れるが、前記修飾基と前記MBのオリゴヌクレオチドとの間の結合は壊れない、請求項18~23のいずれかに記載の方法。配列決定される前記核酸は、DNAまたはRNAである、請求項18~24のいずれかに記載の方法。核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、a.請求項1~17に記載の分子ビーコンMBのライブラリを、A、U、T、C、またはGで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される1本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、前記修飾基の存在によって形成されるD3の幅の2本鎖ds核酸を形成するステップと、b.ステップaで形成されたds核酸を、D1の幅のナノ細孔の開口部と接触させるステップであって、D3がD1より大きい、ステップと、c.配列決定される前記1本鎖核酸から前記ハイブリッド形成されたMBを解離するために、前記ナノ細孔全体に電位を適用するステップと、d.それが前記細孔で生じるときに、前記MBが前記ds核酸から分離する際に、各MBからの検出可能な標識によって発せられるシグナルを検出するステップと、を含む、方法。前記検出されたシグナルの配列を前記核酸の前記ヌクレオチド塩基配列に解読することをさらに含む、請求項26に記載の方法。前記ナノ細孔径は、配列決定される前記1本鎖核酸に前記細孔を通過させるが、前記ds核酸に前記細孔を通過させない、請求項26または27に記載の方法。D1は、2nmより大きい、請求項26~28のいずれかに記載の方法。D1は、約3~6nmである、請求項26~29のいずれかに記載の方法。D3は、2nmより大きい、請求項26~30のいずれかに記載の方法。D3は、約3~7nmである、請求項26~31のいずれかに記載の方法。前記ハイブリッド形成された1本鎖核酸とMBとの間の結合親和性は、前記修飾基と前記MBのオリゴヌクレオチドの前記結合親和性より低く、そのため、前記ds核酸が電位の影響下で前記ナノ細孔の前記開口部を通過しようとするとき、前記1本鎖核酸とMBとの間の前記結合は壊れるが、前記修飾基と前記MBのオリゴヌクレオチドとの間の前記結合は壊れない、請求項26~32のいずれかに記載の方法。前記配列決定される前記核酸は、DNAまたはRNAである、請求項26~33のいずれかに記載の方法。特に説明のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。特に記載のない限り、本発明は、例えば、CurrentProtocolsinProteinScienceCPPSJohnE.Coligan,et.al.,ed.,JohnWileyandSons,Inc.に記載される当該技術分野に公知の標準的な手順を使用して実施され、その全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に制限されず、そのようなものとして変動し得ることを理解するべきである。本明細書で使用される用語は、単に、特定の実施形態を説明する目的のためであり、本発明の範囲を制限することを意図せず、これは、特許請求の範囲によってのみ定義される。操作例または別に示される場合を除き、本明細書に使用される成分の量また反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において、約という用語によって修飾されるものと理解するべきである。約という用語は、パーセンテージに関して使用されるとき、±1を意味することができる。a、[an、およびtheという単数用語は、特に明確に文脈に記載されない限り、複数対象物を含む。同様に、またはという用語は、特に明確に文脈に記載されない限り、およびを含むことが意図される。核酸に与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は、近似であり、説明のために提供されることをさらに理解するべきである。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が、本開示の実践または試験に使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。e.g.という略記は、ラテン語のexempligratiaに由来し、本明細書において、非限定的な例を示すために使用される。よって、e.g.という略記は、例えばforexampleという用語と同義語である。特定される全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論の説明および開示の目的のため、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の提出日前に、単にそれらの開示について提供される。この点におけるいずれも、発明者が従来の発明のため、またはいかなる他の理由のために、そのような開示に先行する権利がないと承認するものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述、またはこれらの資料の内容に関する説明は、出願人に利用可能な情報に基づき、これらの資料の日付および内容の正確性に関していかなる承認も制定しない。本発明の実施形態は、DNAおよびRNA等の核酸のナノ細孔解離依存配列決定と共に使用される分子ビーコンMBに対する修飾の例示的な実例に基づく。核酸のナノ細孔解離依存配列決定において、2本鎖dsDNAの解離は、dsDNAを含むMBからのシグナルを顕在化するために必要である。MBからの顕在化されたシグナルの時間的配列は、配列決定される核酸の配列に対応する。dsDNAを解離するために使用されるナノ細孔のサイズは、いずれの外来性分子に付着されないまたは結合されない標準的なdsDNAの幅未満に限定され、その幅は、約2.2nmである。約1.5であるが、2.2nm未満である細孔径は、dsDNAが電界の影響下、細孔を通過しようとするとき、dsDNAを解離することができる、すなわち、DNAの2本の鎖が分離し、1本の鎖が細孔を通過し、一方、複数の非共有結合的に連結されたMBを含むもう一方の相補鎖は、経時的かつ時間的に検出され、後に残される図1aを参照。2.2nmより大きいあらゆる細孔経は、MBからのシグナルを顕在化するために必要である解離事象を促進せず、顕在化されたシグナルは、配列決定されるDNAの配列に対応する。2.2nmより大きいあらゆる細孔径は、単純に、いかなる鎖分離なしにdsDNAに細孔を通過させる。dsDNA構造において、ハイブリッド形成されたMBは、いかなるシグナルも顕在化しない。発明者は、配列決定中にナノ細孔を通過しようとするdsDNAの幅を増加することによって、特に、MBに修飾基を結合することによって、この細孔径の制限を回避した。図9に模式的に示されるように、修飾基103は、修飾されたMB111を伴う1本鎖核酸ds核酸109によって形成されたds核酸が、修飾されないMBで形成されたds核酸の幅D2113と比較したとき、より大きな幅D3115を有するように、MB111に大きさを付加する。結果として、細孔幅D1101が、MB上の大きい修飾基の結合点でdsDNAの幅D3115より小さい限り、約2.2nmより大きい細孔幅D1101は、解離事象、したがって配列決定に使用され得る。概念の証として、発明者は、MBをビオチン化し、ビオチン化MBにアビジン4.0×5.5×6.0nm20を結合した。それらは、アビジン-ビオチン化MBを含むdsDNAを解離し、これらのアビジン-ビオチン化MBからのシグナルを顕在化するために、3~6nmのナノ細孔を正常に使用した図3a。さらに、発明者は、2ビットの実験に示されるように、そのような修飾が、2つの異なるMBの種を含むdsDNAの解離に適用され得ることも示し図3a、ここで、2つのMBの種は、例えば、1つのMBの種が赤い蛍光を発光するフルオロフォアで標識され、第2のMBの種が青い蛍光を発光するフルオロフォアで標識される、異なるフルオロフォアで標識される。特に大量生産製作において約2nm以下のサイズのナノ細孔を製作するとき、一貫性のある結果を得ることが困難であるため、開示される修飾の利点の1つは、より大きい細孔径がdsDNAの解離に依存するナノ細孔に基づくDNA配列決定に使用され得ることである。この修飾は、同時に、多重細孔検出の簡単な方法を導くナノ細孔アレイの大規模な製作を容易にする。別の利点は、より大きい細孔径がdsDNAの捕獲速度を少なくとも10倍増加させ、これもアレイにおける多重細孔検出に有利に働く13。したがって、核酸のナノ細孔解離依存配列決定のための分子ビーコンMBのライブラリを本明細書において開示し、本ライブラリは、各MBが、1検出可能な標識、2検出可能な標識ブロッカー、および3修飾基を含むオリゴヌクレオチドを含む、複数のMBを含み、MBは、2本鎖ds核酸を形成するための、1本鎖核酸中のA、U、T、C、またはGヌクレオチドで表される定義された配列と配列特異的相補的ハイブリッド形成が可能である。一実施形態の典型的なMBの概略図を図10に示す。一実施形態では、MBのオリゴヌクレオチドは、2つの親和性アームを含む。一実施形態では、MBのオリゴヌクレオチドは、5’親和性アームと、3’親和性アームと、を含む。好適な一実施形態では、MBのオリゴヌクレオチドは、5’フルオロフォアアームと、3’クエンチャーアームと、を含む。一実施形態では、修飾基は、4本鎖DNAである。一実施形態では、4本鎖DNAは、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの一部、またはその内にある。一実施形態では、核酸のナノ細孔解離依存配列決定のための2本鎖dsオリゴヌクレオチドを解離する方法を本明細書において提供し、本方法は、a本明細書に記載される分子ビーコンMBのライブラリを、A、U、T、C、またはGで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される1本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、MB上の修飾基の存在によって形成されるD3の幅の2本鎖ds核酸を形成することと、bステップaで形成されたds核酸を、D3がD1より大きい、D1の幅のナノ細孔の開口部と接触させることと、c配列決定される1本鎖核酸からハイブリッド形成されたMBを解離するために、ナノ細孔全体に電位を適用することと、を含む。別の実施形態では、a本明細書に記載される分子ビーコンMBのライブラリを、A、U、T、C、またはGで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される1本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、修飾基の存在によって形成されるD3の幅の2本鎖ds核酸を形成するステップと、bステップaで形成されたds核酸を、D3がD1より大きいD1の幅のナノ細孔の開口部と接触させるステップと、c配列決定される1本鎖核酸からハイブリッド形成されたMBを解離するために、ナノ細孔全体に電位を適用するステップと、dそれが生じるとき、MBがds核酸から分離する細孔で各MBからの検出可能な標識によって発せられるシグナルを検出するステップと、を含む、核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法を本明細書に提供する。発せられるシグナルの時間的配列は、1本鎖核酸の配列に対応する。核酸のヌクレオチド配列を決定するこの方法の一実施形態では、方法は、配列決定される核酸を、MBのライブラリによってハイブリッド形成される代表的な1本鎖核酸に変換することを含む。一実施形態では、核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法は、核酸の実際のヌクレオチド塩基配列を引き出すために、検出されたシグナルの配列を解読することをさらに含む。本明細書に記載されるライブラリおよび方法は、あらゆる核酸またはオリゴヌクレオチドの配列、例えば、突然変異の検出、DNA指紋法、単一ヌクレオチド多型、および生物の全ゲノム配列決定が所望されるあらゆる状況で使用され得ることを包含する。一般に、当該技術分野に知られるMBは、ステム-ループ構造図10を参照を形成し、溶液中の特定の核酸の存在を報告するために使用される、オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブである。ステム-ループ構造は、ヘアピンまたはヘアピンループとしても、当該技術分野において知られる。MBは、分子ビーコンプローブとも称される。例として、また制限するものと解釈されるべきではないが、典型的なMBオリゴヌクレオチドプローブの一般的な設計および特色は、以下の通りである図10を参照:MBは、様々な長さ、例えば、15~35ヌクレオチドの長さのものであり得る。MB内にDNAの4本鎖部分が存在する実施形態では、MBの長さは、より長く、例えば、最大60ヌクレオチドの長さであり得る。一実施形態では、中間部分は、特定の標的DNAもしくはRNAまたはオリゴヌクレオチドに相補的である5~25ヌクレオチドを含む、ループを形成する。MBに関して使用される、標的核酸、標的DNA、標的配列、標的RNA、または標的オリゴヌクレオチドは、MBがワトソン-クリック型のハイブリッド形成において、塩基と相補的にハイブリッド形成する、すなわち、それと塩基対合することができる核酸である。一実施形態では、相互に相補的である、すなわち、相互に塩基対合することができるMBの各端に、少なくとも2つのヌクレオチドが存在する。MBの各端または親和性アームのこれらの2つのヌクレオチドは、一緒にアニールされ、MBのステムを形成し、MBがその標的核酸とハイブリッド形成されないとき、ステム-ループ構造を生成する。ステム-ループ構造は、典型的に、両端が相互に相補的である配列で、2~7ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、染料または検出可能な標識は、MBの5’端/アームに向かって結合され、一般に、相補的標的の存在下で蛍光を発する5’フルオロフォアと呼ばれる。一実施形態では、クエンチャー染料または検出可能な標識ブロッカーは、MBの3’端/アームに共有結合され、一般に、3’クエンチャーと呼ばれる。ビーコンが閉ループ形状であるとき、クエンチャーは、フルオロフォアが光を発するのを防止する。一般に、MBは、それらが標的核酸配列に結合するとき、蛍光が復元される内部的に消光されたフルオロフォアとステム-ループ形状の分子を形成する。以下はMBの例である。5’端のフルオロフォア、5’-GCGAGCTAGGAAACACCAAAGATGATATTTGCTCGC-3’-DABCYL配列番号2。非蛍光発色団であるDABCYLは、MB中のあらゆるフルオロフォアの汎用クエンチャーとしての機能を果たす。別の実施形態では、MBは、非ステム-ループ構造を有する。MBの各端に相互に相補的であるヌクレオチドは存在せず、したがって、ステム-ループ構造は形成されない。一実施形態では、ライブラリのMBは、ステム-ループ構造を形成しない。一実施形態では、MBは、検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチドである。さらなる実施形態では、MBは、検出可能な標識および検出可能な標識ブロッカーを有するオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、MBは、それらが適切な温度およびイオン強度の条件下例えば、ステム-ループ構造のTmを下回るの溶液中で遊離であるとき、蛍光を発しない。MBがMBプローブまたはループ領域に相補的である核酸とハイブリッド形成されるとき、MBは、それらが明るく蛍光を発することができる立体構造変化を受ける。相補的核酸の不在下では、ステムは、フルオロフォアおよびクエンチャーが過渡的に電子を共有し、フルオロフォアが蛍光を発する能力を排除する蛍光クエンチャーに非常に近くにフルオロフォアを配置するため、プローブは、暗い。プローブが適切な相補的核酸分子に衝突するとき、ステムハイブリッドより長く、かつ安定したプローブ-標的ハイブリッドを形成する。プローブ-標的ハイブリッドの強剛性および長さは、ステムハイブリッドの同時現存を不可能にする。その結果として、MBは、ステムハイブリッドを分離させ、フルオロフォアおよびクエンチャーを相互から離れさせる自発的な立体構造の再構築を受け、それによって、適切な光源を用いた励起により、フルオロフォアに蛍光を発することを可能にする。一実施形態では、MBの全オリゴヌクレオチドが、標的核酸に相補的である。DNAナノ細孔解離方法において、標的核酸は、A、U、T、C、またはGで表される、特異的核酸配列またはポリマーであるだろう。一実施形態では、MBのオリゴヌクレオチドの3’および5’親和性アームは、標的核酸の不在下で、相互に相補的である。標的核酸の存在下では、MBのオリゴヌクレオチドの3’および5’親和性アームは、標的核酸に相補的である。本明細書に記載されるライブラリのMBの標的核酸は、A、U、T、C、またはGで表される、核酸配列またはポリマーである。標的核酸配列の不在下では、MBの3’および5’親和性アームは、アニールされ、MBステム-ループ構造のステムを形成する。一部の実施形態では、MBの全オリゴヌクレオチドは、4~60ヌクレオチドを有する配列である。他の実施形態では、MBの全オリゴヌクレオチドは、8~32ヌクレオチドを有する配列である。例えば、MBのライブラリは、全てのMBが8ヌクレオチドの長さのものであり得る。他の場合において、MBのライブラリは、全てのMBが16ヌクレオチドの長さ、32ヌクレオチドの長さ、45または60ヌクレオチドの長さのものであり得る。一実施形態では、MBのライブラリは、少なくとも2つのMBの種を含み、2つの種は、MBの異なる長さのオリゴヌクレオチドを有する。例えば、2つの種しか含まないライブラリにおいて、一方の種は、8ヌクレオチドの長さであり、もう一方は、16ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、ループ領域は、標的核酸、例えば、A、U、T、C、またはGで表される核酸配列またはポリマーと相補的にハイブリッド形成される。特定の実施形態では、ループ領域は、標的核酸上に4~32ヌクレオチドを有する配列と相補的にハイブリッド形成される。特定の実施形態では、MBのステムの親和性アームは、4~25ヌクレオチドを有する標的配列とも相補的にハイブリッド形成される。一実施形態では、MBのオリゴヌクレオチドは、4本鎖部分を含む。G4本鎖は、水素結合されたグアニン塩基の4分子の周りに構築されるG豊富配列から形成される、高次DNAおよびRNA構造である。そのような4本鎖配列は、例えば、Burge,S.etal.,NucleicAcidsResearch,2006,34:5402-5415、Borman,S.,ChemicalandEngineeringNews,2007,85:12-17、Hammond-KosackandK.Docherty,FEBsLetters,1992,301:79-82、およびChenCYetal.,SexTransm.Infect.,2008,84:273-6等に記載されるように、当該技術分野において周知である。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、当業者は、4本鎖を設計し、それをライブラリのMBの中に組み込むことができる。一実施形態では、4本鎖部分は、A、U、T、C、またはGで表される標的核酸配列またはポリマーと相補的にハイブリッド形成されない。一実施形態では、4本鎖部分は、大きい修飾基としての機能を果たす。一実施形態では、MBの4本鎖部分は、MBのオリゴヌクレオチドの3’または5’端で見られる。一実施形態では、MBの4本鎖部分は、MBのオリゴヌクレオチドの3’または5’端から2~7ヌクレオチドに位置する。別の実施形態では、MBの4本鎖部分は、MBのオリゴヌクレオチドの3’または5’端から1~7ヌクレオチドに位置する。オリゴヌクレオチドに関して、配列特異的相補的ハイブリッド形成ができる、または配列に相補的とは、オリゴヌクレオチドが、配列との水素結合により標準的なワトソン-クリックヌクレオチド塩基対合を形成することを意味し、DNAにおいて、アデニンAは、チミンTと塩基対を形成し、同様に、グアニンGはシトシンCと塩基対を形成する。RNAにおいて、チミンは、ウラシルUに置換される。ナノ細孔解離依存配列決定の目的における特定の実施形態では、配列決定される核酸は、最初に代表的な配列に変換される。代表的な配列は、配列決定される核酸中の各単一塩基をより大きい配列に拡大するための機能である。より大きい代表的な配列は、A、T、C、G、およびUの各塩基について定義され、固有で、固定される、配列のブロックにより構成され、コードまたはブロック配列とも呼ばれる。例えば、配列決定される核酸中のAは、ATTTATTAGG配列番号3の伸長された10-merブロック配列によって表され、Tは、CGGGCGGCAA配列番号4の伸長された10-merブロック配列によって表され、Cは、CCTTTCCTTA配列番号5の伸長された10-merブロック配列によって表され、Gは、AGCGCCGAAC配列番号6の伸長された10-merブロック配列によって表される。結果として、TGGCAを有する核酸は、5つの10-merブロック配列を有するCGGGCGGCAA-AGCGCCGAAC-AGCGCCGAAC-CCTTTCCTTA-ATTTATTAGG配列番号7の代表的な配列に変換される。塩基A、T、C、Gは、この例において、4つの固有の10-merブロック配列によって表されるため、これは、ユニコードまたは単一コード方式の配列変換である。塩基が一対のブロック配列によって表されるとき、バイナリコード方式の配列変換である。例えば、バイナリコードは、2つの固有のブロック配列:ATTTATTAGG配列番号3およびCGGGCGGCAA配列番号4であり、それらは、それぞれ、コード0および1と称され得る。各塩基は、一対のブロック配列、例えば、Aは、0,1またはATTTATTAGG-CGGGCGGCAA配列番号8によって表され、Tは、0,0またはATTTATTAGG-ATTTATTAGG配列番号9によって表され、Cは、1,0またはCGGGCGGCAA-ATTTATTAGG配列番号10によって表され、Gは、1,1またはCGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA配列番号11によって表される。一対のブロック配列またはコードの連鎖配置は、重要であり、上記の例において、0,1は、Aをコードし、一方で、1,0は、[Cをコードするため、0,1は、1,0と同じではないことを意味する。したがって、本明細書に記載されるバイナリコード方式を使用するとき、GATGGCA配列を有する核酸は、11-01-00-11-11-10-01のバイナリコード、または代表的な配列であるCGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA-ATTTATTAGG-CGGGCGGCAA-ATTTATTAGG-ATTTATTAGG-CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA-ATTTATTAGG-ATTTATTAGG-CGGGCGGCAA配列番号12に変換される。配列決定される核酸の変換および変換のためのコード方式のより詳細な説明は、SoniandMeller200729,Melleretal.,2009米国特許出願公開第2009/0029477号およびMellerandWengPCT出願第PCTUS2009/034296号に見出され得る。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、1本鎖核酸中のA、U、T、C、またはGヌクレオチドで表される定義された配列は、ブロック配列を含み、ブロック配列は、1本鎖核酸中のA、U、T、C、または、Gで表される。一実施形態では、MBのオリゴヌクレオチドは、1本鎖核酸中のA、U、T、C、またはGヌクレオチドで表される定義された配列のブロック配列に相補的である。一実施形態では、ライブラリは、いくつかのMBの種を含み、1本鎖核酸中のA、U、T、C、またはGヌクレオチドで表される各ブロック配列に少なくとも1つのMBの種が存在する。各種は、ライブラリ中の他の種と異なる別々の検出可能な標識を有する。例えば、ライブラリ中に4つのMBの種が存在する場合、検出可能な標識としてのフルオロフォアにおいて、4つの別々の検出可能な標識、例えば、赤、緑、青、および黄が存在する。各種は、ライブラリ中のMBの他の種と異なる別々のオリゴヌクレオチド配列も有する。例えば、ライブラリ中に4つのMBの種が存在する場合、ライブラリのMBに4つの別々のオリゴヌクレオチド配列、例えば、ATTTATTAGG配列番号3、CGGGCGGCAA配列番号4、CCTTTCCTTA配列番号5、およびAGCGCCGAAC配列番号6が存在する。ユニコードまたは単一コード方式の配列変換が利用される実施形態では、ライブラリは、少なくとも4つのMBの種を含む。一実施形態では、ライブラリは、少なくとも2つのMBの種と、最大4つのMBの種と、を含み、各種は、異なるフルオロフォアおよび別々の配列を有する。一実施形態では、ライブラリは、少なくとも2つのMBの種と、最大6つのMBの種と、を含み、各種は、異なるフルオロフォアおよび別々の配列を有する。一実施形態では、ライブラリは、最大8つのMBの種を含み、各種は、異なるフルオロフォアおよび別々の配列を有する。一実施形態では、ライブラリは、4つのMBの種、例えば、各種類が異なるフルオロフォアおよび別々の配列を有する、4つの異なる種類のMBを含む。バイナリコード方式の配列変換が利用される実施形態では、ライブラリは、少なくとも2つのMBの種、例えば、1つの種類がフルオロフォアおよびコード0の固有の配列を有し、もう一方の種類のMBが、異なるフルオロフォアおよびコード1の固有の配列を有する、2つの異なる種類のMBを含む。一実施形態では、ライブラリは、2つのMBの種を含む。各MBの種は、その特異的ブロック配列と相補的にハイブリッド形成することができるそれ自身の固有のオリゴヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、各MBの種は、別々の検出可能な標識を有する。一実施形態では、各MBの種は、同じ検出可能な標識ブロッカーを有する。別の実施形態では、各MBの種は、同じ修飾基を有する。一実施形態では、本明細書に記載されるライブラリは、そのMB上に少なくとも2つの別々の検出可能な標識を含み、1つの検出可能な標識のみが各MB上に存在する。一実施形態では、本明細書に記載されるライブラリは、そのMB上に2つの別々の検出可能な標識を含み、1つの検出可能な標識のみが各MB上に存在する。一実施形態では、本明細書に記載されるライブラリは、そのMB上に4つの別々の検出可能な標識を含み、1つの検出可能な標識のみが各MB上に存在する。例えば、本明細書に記載されるバイナリコード方式において、ライブラリは、2つのMBの種を有し、最初の1つのMBの種は、ATTTATTAGG配列番号3を有する0コードを補完することができる配列を有し、ライブラリの第2のMBの種は、CGGGCGGCAA配列番号4の配列を有する1コードを補完することができる配列を有する。一実施形態では、2つ以上のMBの種が存在し、各MBの種は、別々の検出可能な標識を有する。例えば、ライブラリは、2つのMBの種を含み、最初の1つのMBの種は、検出可能な基としてATTO647Nフルオロフォアを有し、ライブラリの第2のMBの種は、検出可能な基としてATTO488フルオロフォアを有する実施例のセクションを参照。ATTO647N-MBおよびATTO488-MBの両方とも、同じ検出可能な標識ブロッカーである、クエンチャーBHQ-2を有する。加えて、ATTO647N-MBおよびATTO488-MBの両方とも、同じ修飾基であるアビジン-ビオチンを有する。ナノ細孔解離依存配列決定において、複数のMBが、直列配置で、dsポリマーを形成する配列に結合される。例えば、本明細書に記載されるバイナリコード方式を使用することにより、11-01-00-11-11-10-01のバイナリコードを有する配列、または代表的な配列CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA-ATTTATTAGG-CGGGCGGCAA-ATTTATTAGG-ATTTATTAGG-CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA-CGGGCGGCAA-ATTTATTAGG-ATTTATTAGG-CGGGCGGCAA配列番号12は、dsポリマーを形成するために、直列配置で配列と相補的にハイブリッド形成される14のMBを有する。MBの直列配置は、前のMBの3’クエンチャーが、後続のMBの5’フルオロフォアの蛍光によって消光されるものである図1を参照。MBを使用するナノ細孔解離依存配列決定のより詳細な開示は、SoniandMeller200729および米国特許出願公開第2009/0029477号に記載されており、その全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、MBは、DNAおよびRNA等のオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、1本鎖オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、MBは、グリコール核酸GNA、ロックド核酸LNA、ペプチド核酸PNA、トレオース核酸TNA、およびモルホリノ等のオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、MBのオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸DNA、リボ核酸RNA、グリコール核酸GNA、ペプチド核酸PNA、ロックド核酸LNA、トレオース核酸TNA、およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴPMO/モルホリノから成る群から選択される核酸を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、MBは、DNA、RNA、GNA、PNA、LNA、TNA、およびモルホリノの混合物または組み合わせを含む、キメラオリゴヌクレオチドである。例としては、DNA/RNAキメラMB、DNA/LNAキメラMB、およびRNA/PNAキメラMBを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、MBのオリゴヌクレオチドは、4~60のヌクレオチドを含む。他の実施形態では、MBのオリゴヌクレオチドは、7~32のヌクレオチド、4~25のヌクレオチド、4~16のヌクレオチド、4~32のヌクレオチド、7~16のヌクレオチド、または7~25のヌクレオチドを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、8~16のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、7、8、16、または32のヌクレオチドを含む。一実施形態では、ライブラリ中の全てのMBの種は、同じ数のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを有する。別の実施形態では、ライブラリ中のMBの種は、いくつかのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを有する。一実施形態では、ヌクレオチドは、デオキシリボ核酸DNA、リボ核酸RNA、グリコール核酸GNA、ペプチド核酸PNA、ロックド核酸LNA、トレオース核酸TNA、およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴPMO/モルホリノから成る群から選択される。オリゴヌクレオチドは、一般に、長さが少なくとも約6~約25ヌクレオチド、時折、少なくとも約10~約20ヌクレオチド、頻繁に、少なくとも約11~約16ヌクレオチドである。本明細書に記載される16-merおよび32-merオリゴヌクレオチドMBは、例であり、決して制限されるものではない。一部の実施形態では、MBのオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド、ヌクレオ塩基、またはモノマーのポリマーである。GNAは、DNAまたはRNAと類似するポリマーであるが、その骨格の組成が異なる。GNAは、天然に生じることが知られていない。DNAおよびRNAは、デオキシリボースおよびリボース糖骨格を有するが、GNAの骨格は、リン酸ジエステル結合によって連結される反復グリセロール単位から構成される。グリセロール分子は、ちょうど3個の炭素原子を有し、ワトソン-クリック塩基対合を可能にする。ワトソン-クリック塩基対合は、GNAの2本鎖を融解するのに高温を必要とするため、その天然の対応物であるDNAおよびRNAより、GNAにおいて非常により安定している。GNAの例としては、Uedaetal.1971JournalofHeterocyclicChemistry85,827-9により最初に調製された、2,3-ジヒドロキシプロピルヌクレオシド類似体である。他のGNAポリマーおよびそれらの調製物および特性は、Seitaetal.1972DieMakromolekulareChemie,154:255-261、Cooketal.1995PCT国際出願第WO9518820,126pp.、米国特許第5886177号、AcevedoandAndrews1996TetrahedronLetters3723:3931-3934、およびZhangetal.,2005,J.Am.Chem.Soc.12712:4174-5に開示されている。これらの参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。TNAは、DNAまたはRNAと類似するポリマーであるが、その骨格の組成が異なる。TNAは、天然に生じることが知られていない。それぞれデオキシリボースおよびリボース糖骨格を有するDNAおよびRNAと違い、TNAの骨格は、リン酸ジエステル結合によって連結される反復トレオース単位から構成される。トレオース分子は、リボースより組み立てが容易である。TNAは、特異的に、RNAおよびDNAと塩基対合する。JAmChemSoc.2005,127:2802-3。TNAの例は、3’-2’-α-l-トレオース核酸である。他のTNAは、Orgel,Leslie,2000,Science2905495:1306-1307、Watt,Gregory,2005,NatureChemicalBiology、およびSchoning,K.etal.,2000,Science290:1347によって説明されている。これらの参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。PNAは、1991年に、PeterE.Nielsenと共同研究者Science,254:1497によって発明された、DNAまたはRNAに類似する人工の合成ポリマーである。PNAの骨格は、ペプチド結合によって連結される反復N-2-アミノエチル-グリシン単位から構成される。様々なプリンおよびピリミジン塩基が、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。PNAは、ペプチドのように示され、N末端が最初左の位置で、C末端が右である。したがって、PNAは、偽ペプチド骨格を有するDNA模倣物である。PNAは、DNAまたはRNAの非常に良好な構造模倣物である。PNAの骨格は、荷電リン酸基を含有しないため、PNA/DNA鎖間の結合は、静電気反発の欠如によりDNA/DNA鎖間より強い。PNAオリゴマーは、ワトソン-クリック相補的DNA、RNAまたはPNAオリゴマーと非常に安定した2本鎖構造を形成することができ、それらは、らせん体侵入により2本鎖DNA中の標的と結合することもできる。Egholm,M.,etal.,1993Nature,365,566-568、Wittung,P.,etal.,1994Nature,368,561-563を参照。これらの参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。LNAは、修飾RNAヌクレオチドである。LNAヌクレオチドのリボース部分は、2’酸素および4’炭素を結合する余分な架橋で修飾される。架橋は、リボースを3’エンド北立体構造に固定し、これは、DNAまたはRNAのA形態に見られることが多い。LNAヌクレオチドは、所望される場合、いつでもオリゴヌクレオチドのDNAまたはRNA塩基と混合され得る。固定されたリボース立体構造は、塩基積重ね、および骨格の前組織化を強化する。これは、オリゴヌクレオチドの熱安定性融解温度を大幅に増加するKaur,H,etal.,2006,Biochemistry4523:7347-55。LNAヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに基づく、DNAマイクロアレイ、FISHプローブ、リアルタイムPCRプローブ、および他の分子生物学技法における発現の感度および特異性を増加するために使用されてきた。LNAの合成およびそれらのハイブリッド形成特性は、AlexeiA.,etal.,1998,Tetrahedron5414:3607-30、YouY.,etal.,2006,NucleicAcidsRes.348:e60によって説明されている。これらの参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。モルホリノは、標準的な核酸塩基対合により相補的配列とハイブリッド形成することができる合成分子である。モルホリノは、デオキシリボース環の代わりにモルホリン環に結合され、リン酸の代わりにホスホロジアミデート基を通して連結されるヌクレオチド塩基を有する。アニオンリン酸の非荷電ホスホロジアミデート基との置換は、通常の生理的pH範囲でのイオン化を排除し、そのため、モルホリノは、一般に非荷電分子である。モルホリノの全骨格は、これらの修飾されたサブユニットから作製される。モルホリノは、1本鎖オリゴヌクレオチドとして最も一般的に使用されるが、モルホリノ鎖および相補的DNA鎖のヘテロ2本鎖が、カチオン性細胞基質送達試薬と組み合わせて使用され得る。モルホリノはまた、細菌またはウイルス等の病原生物を標的とする薬学的治療薬として、および遺伝的疾患の寛解のために、開発中である。例えば、アンチセンス技術における、遺伝子発現の抑制であるMoulton,Jon2007.UsingMorpholinostoControlGeneExpressionUnit4.30inBeaucage,Serge.CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry.NewJersey:JohnWileySons,Inc。この参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。その完全に非天然骨格のため、モルホリノは、細胞タンパク質によって認識されない。ヌクレアーゼは、モルホリノを分解せず、またそれらは、血清また細胞中にも分解されない。モルホリノは、toll様受容体を活性化せず、そのため、それらは、インターフェロン誘発またはNF-κΒ媒介炎症応答等の先天性免疫応答を活性化しない。モルホリノがDNAのメチル化を修飾することは知られていない。一実施形態では、本明細書に記載されるライブラリのMBは、ガラススライドまたはミクロビーズ等の固相担体に結合されない。一実施形態では、本明細書に記載されるライブラリのMBは、溶液中で遊離である。別の実施形態では、本明細書に記載されるライブラリのMBは、溶液中で遊離であるとき、検出可能な標識基ブロッカーが、MBをアニールするために、標的核酸の不在下で、検出可能な基がシグナルを発することを遮断できるようにするループーステム立体構造を取る。別の実施形態では、本明細書に記載されるライブラリのMBは、溶液中で遊離であるとき、検出可能な標識基ブロッカーが、MBをアニールするために、標的核酸の不在下で、検出可能な基がシグナルを発することを遮断できるようにする立体構造を取る。また別の実施形態では、本明細書に記載されるライブラリのMBは、溶液中で遊離であるとき、ループ-ステム立体構造を取らない。一実施形態では、MBは、それらが適切な温度およびイオン強度の条件下例えば、ステム-ループ構造のTmを下回るの溶液中で遊離であるとき、蛍光を発しない。一実施形態では、検出可能な標識は、MBのオリゴヌクレオチドの一端上に位置し、かつライブラリ中のMBの全てのオリゴヌクレオチドにおいて同じ端上に存在し、検出可能な標識がブロッカーによって阻害されないとき、検出可能な標識は、検出および/または測定され得るシグナルを発する。一実施形態では、検出可能な標識は、MBのオリゴヌクレオチドの5’端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識は、ライブラリ中のMBの全てのオリゴヌクレオチドの5’端に位置する。別の実施形態では、検出可能な標識は、MBのオリゴヌクレオチドの3’端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識は、ライブラリ中のMBの全てのオリゴヌクレオチドの3’端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識は、MBのオリゴヌクレオチドの1つのアームの端、好ましくは、オリゴヌクレオチドの5’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドの5’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、検出可能な標識は、MBのオリゴヌクレオチドの3’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、MBのオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基は、MBの、1本鎖核酸中のA、U、T、C、またはGヌクレオチドで表される定義された配列との配列特異的相補的ハイブリッド形成に干渉しない。一実施形態では、検出可能な基のシグナルは、光学的に検出される。検出可能な基のシグナルに関して、本明細書で使用される光学的に検出されるとは、検出可能な基によって発せられた光エネルギーの測定値を指す。一実施形態では、光エネルギーは、380~760nmの範囲の波長を有する。別の実施形態では、発せられる光エネルギーは、700nm~1400nmの範囲の波長を有する。別の実施形態では、検出可能な基のシグナルは、光学的に検出されない。一実施形態では、検出可能な基は、フルオロフォアであり、シグナルは、蛍光である。MBは、広範なフルオロフォアを利用することによって、多くの異なる色で作製され得るTyagiS,etal.,NatureBiotechnology1998;16:49-53。MBと一緒に使用するためのフルオロフォアの例としては、AlexaFluor登録商標350、MarinaBlue登録商標、Atto390、AlexaFluor登録商標405、PacificBlue登録商標、Atto425、AlexaFluor登録商標430、Atto465、DY-485XL、DY-475XL、FAM登録商標494、AlexaFluor登録商標488、DY-495-05、Atto495、OregonGreen登録商標488、DY-480XL500、Atto488、AlexaFluor登録商標500、RhodaminGreen登録商標、DY-505-05、DY-500XL、DY-510XL、OregonGreen登録商標514、Atto520、AlexaFluor登録商標514、JOE520登録商標TET.TM.521、CALFluor登録商標Gold540、DY-521XL、Rhodamin6G登録商標、YakimaYellow登録商標526、Atto532、AlexaFluor登録商標532、HEX535、VIC538、CALFluorOrange560、DY-530、TAMRA商標、Quasar570、Cy3商標550、NED.TM.、DY-550、Atto550、AlexaFluor登録商標555、DY-555、AlexaFluor登録商標546、BMN商標-3、DY-547、PET登録商標、RhodaminRed登録商標、Atto565、CALFluorRED590、ROX、AlexaFluor登録商標568、TexasRed登録商標、CALFluorRed610、LCRed登録商標610、AlexaFluor登録商標594、Atto590、Atto594、DY-600XL、DY-610、AlexaFluor登録商標610、CALFluorRed635登録商標、Atto620、DY-615、LCRed640、Atto633、AlexaFluor登録商標633、DY-630、DY-633、DY-631、LIZ638、Atto647N、BMN商標-5、Quasar670、DY-635、Cy5商標、AlexaFluor登録商標647、CEQ8000D4、LCRed670、DY-647652、DY-651、Atto655、AlexaFluor登録商標660、DY-675、DY-676、Cy5.5商標675、AlexaFluor登録商標680、LCRed705、BMN商標-6、CEQ8000D3、IRDye登録商標700Dx689、DY-680、DY-681、DY-700、AlexaFluor登録商標700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-732、DY-750、AlexaFluor登録商標750、CEQ8000D2、DY-751、DY-780、DY-776、IRDye登録商標800CW、DY-782、およびDY-781、Oyster登録商標556、Oyster登録商標645、IRDye登録商標700、IRDye登録商標800、WellREDD4、WellREDD3、WellREDD2Dye、RhodamineGreen商標、RhodamineRed商標、フルオレセイン、MAX550531560JOENHSエステルVic様、TYE登録商標563、TEX615、TYE商標665、TYE705、ODIPY493/503商標、BODIPY558/568商標、BODIPY564/570商標、BODIPY576/589商標、BODIPY581/591商標、BODIPYTR-X商標、BODIPY-530/550商標、carboxy-X-Rhodamine商標、カルボキシナフトフルオレセイン、carboxyrhodamine6G商標、CascadeBlue商標、7-メトキシクマリン、6-JOE、7-アミノクマリン-X、ならびに2’,4’,5’,7’-テトラブロモスルホンフルオレセインシアニン染料が挙げられるがこれらに限定されず、チアゾールオレンジ、ジゴキシゲニン、フルオレセインFAM、ローダミンxROX、テトラクロロ-6-カルボキシフルオレセインTET、テトラメチルローダミンTAMRA、AlexaFluor、BODIPY登録商標、OREGONGREEN登録商標、CASCADEBLUE登録商標、MarinaBlue登録商標、PACIFICBLUE商標、RHODAMINEGREEN商標、RHODAMINERED登録商標、およびTEXASRED登録商標は、MolecularProbes,Inc.から商業的に入手可能なフルオロフォアである。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、フルオロフォアのクエンチャーである。MBと一緒に使用するためのフルオロフォアのクエンチャーの例としては、3’IOWABLACK商標FQ、3’BLACKHOLEQUENCHER登録商標-1、および3’Dabcyl、BHQ-1登録商標、BHQ-2登録商標、BBQ-650、DDQ-1、IowaBlackRQ商標、IowaBlackFQ商標、QSY-21登録商標、QSY-35登録商標、QSY-7登録商標、QSY-9登録商標、QXL商標490、QXL商標570、QXL商標610、QXL商標670、QXL商標680、DNP、ならびにEDANSが挙げられるが、これらに限定されない。多くのクエンチャー-フルオロフォアの組み合わせが存在し、それぞれ固有の色または蛍光発光プロファイルを生成するmolecularbeacons.orgのウェブサイトおよびそこに引用される参考文献を参照。当業者は、個別のフルオロフォアおよびクエンチャーが、それぞれ、特定の波長または波長の範囲で光学的に活性であることを認識する。したがって、当業者は、フルオロフォアの最適な励起および発光スペクトルがクエンチャーの効率的な範囲に一致するように、フルオロフォアおよびクエンチャー対を選択することが分かっている。想定されるクエンチャー-フルオロフォア対の例は、3’-ダブシルを伴う6-FAM、HEX、またはTET、3’-ダブシルを伴う5’-クマリンまたはエオシン、3’-BLACKHOLEQUENCHER登録商標を伴う5’-TexasRedまたはテトラメチルローダミン、およびEDANSおよび3’-DABCYLである。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーおよび検出可能な標識の両方とも、MBのオリゴヌクレオチドの同じ端、すなわち、両方ともMBのオリゴヌクレオチドの3’端、または両方ともその5’端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、MBのオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識のすぐ隣に位置しない。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーおよび検出可能な標識は、MBのオリゴヌクレオチド上で少なくとも3ヌクレオチドもしくはモノマー、MBのオリゴヌクレオチド上で、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドもしくはモノマーによって分離される。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、MBのオリゴヌクレオチドの一端に位置し、一方、検出可能な標識は、MBのオリゴヌクレオチドのもう一端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、MBのオリゴヌクレオチドの1つのアーム、好ましくは、MBのオリゴヌクレオチドの3’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、MBのオリゴヌクレオチドの3’アームに共有結合的に連結される。別の実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、MBのオリゴヌクレオチドの5’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、MBのオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識の対向する端に位置する。例えば、検出可能な標識ブロッカーがMBのオリゴヌクレオチドの5’端に位置する場合、検出可能な標識は、同じMBのオリゴヌクレオチド上の3’端に位置する。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、MBのオリゴヌクレオチドの1つのアームの端に共有結合的に連結され、検出可能な標識は、同じオリゴヌクレオチドのもう一方のアームの端に共有結合的に連結される。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、MBのオリゴヌクレオチドの3’アームに共有結合的に連結され、検出可能な標識は、同じオリゴヌクレオチドの5’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、MBのオリゴヌクレオチドの5’アームに共有結合的に連結され、検出可能な標識は、同じオリゴヌクレオチドの3’アームに共有結合的に連結される。一実施形態では、フルオロフォアは、MBのオリゴヌクレオチドの1つのアームの端に共有結合的に連結され、蛍光クエンチャーは、同じオリゴヌクレオチドのもう一方のアームの端に共有結合的に連結される。好ましい一実施形態では、蛍光クエンチャーは、MBのオリゴヌクレオチドの3’アームに共有結合的に連結され、フルオロフォアは、同じオリゴヌクレオチドの5’アームに共有結合的に連結される。別の好ましい実施形態では、MBのオリゴヌクレオチドの3’アームは、MBのオリゴヌクレオチドの3’端を指し、MBのオリゴヌクレオチドの5’アームは、MBのオリゴヌクレオチドの5’端を指す。特定の実施形態では、検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基は、共有結合連結によって、MBのオリゴヌクレオチドに結合される。一実施形態では、共有結合連結は、スペーサー、好ましくは直鎖状アルキルスペーサーを含む。結合とは、少なくとも2つの分子の共有結合連結を意味する。スペーサーの性質は、重要ではない。例えば、EDANSおよびDABCYL等の蛍光クエンチャーは、当該技術分野において周知であり、一般的に使用される6炭素長アルキルスペーサーを介して連結され得る。アルキルスペーサーは、検出可能な標識および検出可能な標識ブロッカーに、効率的な蛍光共鳴エネルギー転移、したがって、効率的な消光のために相互に相互作用するのに十分な柔軟性を与える。適切なスペーサーの化学成分は、当業者に理解される。炭素鎖スペーサーの長さは、かなり変動することができ、例えば、少なくとも1~最大15炭素、または30炭素長アルキルスペーサーである。一実施形態では、検出可能な標識ブロッカーは、修飾基でもある。そのような修飾基の非限定的な例は、金である。金ナノ粒子は、フルオロフォアを消光することが示されており、例えば、Ghoshetal.ChemicalPhysicsLetters,2004,395:366-372、Dulkeithetal.NanoLett.,2005,5:585-589、Mayiloetal.NanoLett.,2009,9:4558-4563、Dulkeithetal.PhysicalReviewLetters,2002,89:203002、Fanetal.PNAS,2003,100:6297-6301に記載されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。修飾基の主な機能は、MBのオリゴヌクレオチドに大きさを付加することであり、そうすることにより、複数のMBが、ds核酸を形成するために1本鎖核酸中のA、U、T、C、またはGヌクレオチドで表される定義された配列とハイブリッド形成されるときに形成されるds核酸に大きさを付加する。ds核酸上の付加された大きさは、1ds核酸が2.2nmより大きい直径開口部を有する細孔を通過するのを阻止する、2ナノ細孔解離依存核酸配列決定のためのより大きい細孔径のナノ細孔の使用を容易にする、および3ナノ細孔解離依存核酸配列決定中、1本鎖核酸上でハイブリッド形成される複数のMBの解離に役立つ働きをする。解離は、順次プロセスである。1本の鎖がナノ細孔120通って転位するときに、ds核酸が解離プロセスを受けることが、図9に示される。D1101の細孔幅を有するナノ細孔120を通って転位する1本鎖核酸109は、配列決定される核酸中のA、U、T、C、またはGヌクレオチドで表される定義された配列である。配列決定される核酸は、このナノ細孔解離DNA配列決定法で使用するために、1本鎖109の代表的な定義された配列に変換されている。ds核酸は、1本鎖配列109と、その上に相補的にハイブリッド形成された複数のMB111と、を含む。各MBは、末端フルオロフォア105およびフルオロフォアクエンチャー107を伴うオリゴヌクレオチド117と、修飾基103と、を含む。図9に示されるMBは、別個および別々のブロッカーならびに修飾基を有する。図9に示される、大きい修飾基を含まないds核酸の幅は、D2113である。D1がD2より大きいとき、大きい修飾基を含まないds核酸は、D1幅のナノ細孔を通って転位することができる。修飾基103の存在は、大きい修飾基を有するds核酸の幅を、D1101より大きいD3115に増加する。ナノ細孔120への入口で、修飾基を有するMB111は、MB111と1本鎖核酸109との間の親和性が、MB111に対する修飾基103の親和性よりも弱いため、1本鎖核酸109から落とされる。MB111の1本鎖核酸109との相補的ハイブリッド形成は、MB上のヌクレオ塩基と1本鎖核酸との間の弱い非共有水素結合による。一部の実施形態では、修飾基103は、MB111に共有結合的に連結される。共有結合は、水素結合より強いため、ds核酸が電界にある間にナノ細孔を転位しようとするとき、より弱い水素結合が壊れ、MB111がds核酸から解放される。他の実施形態では、修飾基103は、MB111に非共有結合的に連結されるが、この非共有結合連結は、水素結合より強い。水素結合より強い非共有結合連結は、イオン性相互作用および疎水性相互作用である。そのような非共有結合連結の例は、当該技術分野において周知であるアビジン-ビオチン連結のものであるが、これに限定されない。アビジンの解離定数は、Kd≒10-15Mであると測定され、最も強い公知の非共有結合のうちの1つである。一実施形態では、ハイブリッド形成された1本鎖核酸とMBとの間の結合親和性は、修飾基とMBのオリゴヌクレオチドの結合親和性より低く、そのため、ds核酸が電位の影響下でナノ細孔の開口部を通過しようとするとき、1本鎖核酸とMBとの間の結合は壊れるが、修飾基とMBのオリゴヌクレオチドとの間の結合は壊れない。一実施形態では、ハイブリッド形成された1本鎖核酸とMBとの間の水素結合は、修飾基とMBのオリゴヌクレオチドとの間のイオン性および/または疎水性相互作用より弱い。一実施形態では、修飾基は、MBのオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。別の実施形態では、修飾基は、MBのオリゴヌクレオチドに非共有結合的に連結される。一実施形態では、修飾基は、ナノスケール粒子、タンパク質分子、有機金属粒子、金属粒子、および半導体粒子から成る群から選択されるが、これらに限定されない。以下は、本明細書において想定される修飾基の種類の非限定的な例である。MBに連結されたときに、MBに大きさを付加することができるが、相補的塩基対合に干渉しないあらゆる分子が修飾基として使用され得ることが想定される。ナノスケール粒子:1000nmを下回るあらゆる粒径、例えば、TiO2、金、銀、またはラテックスビーズ、フラーレンbuckyball、リポソーム、シリカ-金ナノシェル、および量子ドット。例えば、INVITROGENのDYNABEADS、PROMEGAのMAGNESPHERE、およびBIOCLONEの磁気ビーズ等の、きわめて多様なナノ粒子が市販されている。ポリスチレンラテックスナノビーズのDNAへの結合が、HuangらによってAnalyticalBiochemistry1996,237:115-122に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。タンパク質分子:DNA結合タンパク質、例えば、Znフィンガータンパク質およびヒストン、tatペプチド、核移行シグナルNLSペプチド、ストレプトアビジン、アビジン、ならびにアビジンの様々な修飾形態、例えば、ニュートラアビジン。DNA結合タンパク質は、自然にDNAに結合する。一実施形態では、1~20nmの範囲のタンパク質粒径が使用され得る。4~20nmの範囲の他のタンパク質粒径は、アミド結合形成を通してタンパク質に共有結合的に連結され得、これは、Taylor,J.R.elal.,AnalyticalChemistry2000,72:1979-1986、Pagratis,N.Nucl.AcidsRes.1996,24:3645-3646、Niemeyer,C.elal.,Nucl.AcidsRes.1999,27:4553-4561、Stahl,S.elal.,NucleicAcidsResearch1988,16:3025-3038、Sun,H.elal.,BiosensorsandBioelectronics2009,24:1405-1410に記載されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。有機金属粒子:ジメトキシトリチルヌクレオシドホスホラミダイトカップリングによって結合され得るフェロセン0.5nm、Ihara,TらによってNucl.AcidsRes.1996,24:4273-4280、およびNavarro,A.-E.etal.,BioorganicMedicinalChemistryLetters2004,14:2439-2441に記載されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。金属粒子:金および銀で被覆された金サイズは1.4~100nmの範囲である、および銀25~30nm。これらは、環式ジスルフィド、ジスルフィド、チオールスルフヒドリル、およびアミン官能基を介して、ならびにビオチンによって、MBオリゴヌクレオチドに結合され得る。これらの方法は、Mirkin,C.A.elal.,Nature1996,382:607-609、Alivisatos,A.elal.,Nature1996,382:609-611、Mucic,R.Celal.,J.Amer.Chem.Soc.1998,120:2674-12675、Taton,T.A.elal.,Science2000,289:1757-1760、Taton,T.A.elal.,J.Amer.Chem.Soc.2001,123:5164-5165、SegondvonBanchet,G.,andHeppelman,B.:J.Histochem.Cytochem.,43,8211995、Letsinger,R.Lelal.,BioconjugateChemistry2000,11:289-291、Tokareva,I.andHutter,E.J.Amer.Chem.Soc.2004,126:15784-15789、Lee,J.-S.etal.,NanoLetters2007,7:2112-2115、Sun,H.elal.,BiosensorsandBioelectronics2009,24:1405-1410により詳細に記載されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。半導体粒子:量子ドットおよびZnS。例えば、INVITROGEN商標を通して、様々な半導体種類のナノ粒子が市販されている。一実施形態では、15~20nmの範囲のサイズを有する半導体粒子が使用され得る。これらの粒子は、ビオチン、金属-チオール相互作用、グリコシド結合、静電的相互作用、または粒子のシステインキャッピングを介してMBオリゴヌクレオチドに連結され得る。本方法は、Wu,S.-M.elal.,Chem.Phys.Chem.2006,7:1062-1067、Xiao,Y.andBarker,P.E.Nucl.AcidsRes.2004,32:e28、Yu,W.W.elal.,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications2006,348:781-786、Artemyev,M.elal.,J.Amer.Chem.Soc.2004,126:10594-10597、Li,Y.elal.,SpectrochimicaActaPartA:MolecularandBiomolecularSpectroscopy2004,60:1719-1724によって説明されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、修飾基は、MBのオリゴヌクレオチドの5’端または3’端に位置する。別の実施形態では、修飾基は、MBのオリゴヌクレオチドの3’端または5’端のいずれかから2~7ヌクレオチド内に位置する。修飾基は、MBのオリゴヌクレオチドの3’端または5’端のいずれかから第2ヌクレオチド、第3ヌクレオチド、第4ヌクレオチド、第5ヌクレオチド、第6ヌクレオチド、または第7ヌクレオチドに位置し得る。一実施形態では、修飾基は、MBのオリゴヌクレオチドの骨格に連結される。核酸の基本構造および構成要素は、当該技術分野において公知である。核酸は、骨格およびヌクレオ塩基から構成されるポリマーであり、骨格は、代替糖およびリン酸または、モルホリノを含む。別の実施形態では、修飾基は、MBのオリゴヌクレオチドのヌクレオ塩基に連結される。一部の実施形態では、修飾基は、炭素リンカーによって、MBのオリゴヌクレオチドに連結される。一部の実施形態では、炭素リンカーは、1~30炭素アルキル残基を有する。一実施形態では、修飾基は、修飾基のオリゴヌクレオチドへの結合点D3で、ds核酸の幅を2.0ナノメートルnm超に増加させ、ds核酸が、MBの、A、U、T、C、またはGで表される定義された配列とのハイブリッド形成によって形成される。一実施形態では、修飾基は、幅D3を2.2nm超に増加する。さらなる実施形態では、修飾基は、幅D3を3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5,8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6,6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、または10nm超に増加する。一実施形態では、修飾基のMBのオリゴヌクレオチドへの結合点でのds核酸の幅D3は、約3~7nmである。一実施形態では、幅D3は、約3~7nmである。一実施形態では、修飾基の1本鎖核酸への結合点でのds核酸の幅は、サイドリンカー、例えば、C20、C15、C12、C9、C8、C6、C5、C4、C3、およびC2リンカーによってさらに増加され得る。一実施形態では、MBのオリゴヌクレオチド上の修飾基は、3~5nmである。一実施形態では、修飾基は、0.5nm~1000nmの範囲である。一実施形態では、修飾基は、90~944nmの範囲である。一実施形態では、修飾基は、4~20nmの範囲である。一実施形態では、修飾基は、1.4~100nmの範囲である。一実施形態では、修飾基は、25~30nmの範囲である。一実施形態では、修飾基は、15~20nmの範囲である。一実施形態では、修飾基は、15~30nmの範囲である。一実施形態では、修飾基は、150~300nmの範囲である。一実施形態では、修飾基は、9~50nmの範囲である。一実施形態では、修飾基は、10~100nmの範囲である。他の実施形態では、修飾基は、3~1000nm、3~944nm、3~30nm、3~100nm、3~25nm、3~50nm、3~300nm、3~90nm、3~15nm、3~9nm、および3~4nmの範囲であり、3~1000nmの小数点以下2桁までの全ての数字を含む。一実施形態では、修飾基は、ds核酸が、ナノ細孔配列決定を受けるとき、ds核酸の解離を容易にする。本明細書に記載される方法の一実施形態では、ナノ細孔径は、配列決定される1本鎖核酸に細孔を通過させるが、ds核酸に細孔を通過させず、ds核酸は、本明細書に記載されるMBの、1本鎖核酸またはA、C、T、G、もしくはUを代表とする定義された配列とのハイブリッド形成によって形成される。本明細書に記載される方法の一実施形態では、ナノ細孔の開口部は、2nmより大きいが、1000nmより小さい。一実施形態では、ナノ細孔の開口部は、2nmより大きいが、修飾基がMBのオリゴヌクレオチドに結合する点では、ds核酸の幅より小さい。本明細書に記載される方法の一実施形態では、細孔D1は、約3nm~約6nmの開口径を有する。本明細書に記載される方法のさらなる実施形態では、細孔は、約3nmから、MBのオリゴヌクレオチドに連結される修飾基の幅の最大75までの開口径を有する。本明細書に記載される方法の特定の実施形態では、細孔は、約2.2nm~10nm、約2.2nm~75nm、または約2.2nm~100nmの直径を有する。さらなる実施形態では、細孔D1は、例えば、直径が、約3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5,8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6,6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、または10nmの直径を有する。本明細書に記載される方法の一実施形態では、修飾基がMBのオリゴヌクレオチドに結合する点でのds核酸の幅D3は、2nmより大きい。本明細書に記載される方法の別の実施形態では、修飾基がMBのオリゴヌクレオチドに結合する点でのds核酸の幅D3は、2.2nmより大きい。本明細書に記載される方法のさらなる実施形態では、修飾基がMBのオリゴヌクレオチドに結合する点でのds核酸の幅D3は、直径が約3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5,8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6,6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、または10nmより大きく、D3は、常に、D1より大きい。本明細書に記載される方法の一実施形態では、修飾基がMBのオリゴヌクレオチドに結合する点でのds核酸の幅D3は、約3~5nmである。本明細書に記載される方法の一実施形態では、修飾基がMBのオリゴヌクレオチドに結合する点でのds核酸の幅D3は、約3~6nmである。他の実施形態では、D3は、約3~7nm、3~8nm、3~9nm、3~10nm、3~12nm、3~15nm、3~17nm、または3~20nmである。本明細書に記載される方法の一実施形態では、D3は、2nmより大きい。本明細書に記載される方法の別の実施形態では、D3は、2.2nmより大きい。一実施形態では、D3は、約3~7nmである。本明細書に記載される方法の一実施形態では、D1は、2nmより大きい。本明細書に記載される方法の別の実施形態では、D1は、2.2nmより大きい。一実施形態では、D1は、約3~6nmである。本明細書に記載される方法の一実施形態では、修飾基がポリマーに結合する点でのds核酸の幅D3は、ナノ細孔の開口部の幅D1より大きく、そのため、ds核酸が電位の影響下でナノ細孔開口部を通過しようとするとき、修飾基は、ds核酸上のMBが開口部に侵入するのを阻止し、MBがds核酸から解離される。本明細書に記載される方法の一実施形態では、D3は、D1より大きい。一実施形態では、D1は、D3の幅の最大75である。本明細書に記載される方法の一実施形態では、ハイブリッド形成された1本鎖核酸とMBとの間の結合親和性は、修飾基とMBのオリゴヌクレオチドの結合親和性より低く、そのため、ds核酸が電位の影響下でナノ細孔の開口部を通過しようとするとき、1本鎖核酸とMBとの間の結合は壊れるが、修飾基とMBのオリゴヌクレオチドとの間の結合は壊れない。一実施形態では、1本鎖核酸とMBとの間の結合は、非共有水素結合である。一実施形態では、修飾基とMBのオリゴヌクレオチドとの間の結合は、共有結合である。一実施形態では、1本鎖核酸とMBとの間の結合は、非共有水素結合であり、修飾基とMBのオリゴヌクレオチドとの間の結合は、イオン性および疎水性相互作用等の非共有結合である。本明細書に記載される方法の一実施形態では、ds核酸が電位の影響下で開口部を通過しようとするとき、修飾基は、ds核酸上のMBオリゴヌクレオチドが開口部に侵入するのを阻止し、1本鎖核酸とMBオリゴヌクレオチドとの間の非共有水素結合が壊れる。MBオリゴヌクレオチドは1つずつ、経時的かつ時間的に分離され、ナノ細孔の入口で1本鎖核酸から解放され、1本鎖核酸はナノ細孔に侵入し、一方、分離されたMBは侵入しない。本明細書に記載される方法の一実施形態では、配列決定される核酸は、DNAまたはRNAである。本明細書に記載される方法の一実施形態では、単一細孔が利用される。別の実施形態では、複数の細孔が利用される。MBの合成および外来性基のオリゴヌクレオチドとの結合の方法は、当業者に公知である。所望の官能基を伴う分子ビーコンは、標準的なオリゴヌクレオチド合成技法を使用して合成されるか、または購入例えば、IntegratedDNATechnologiesからすることができる。当業者は、多くのさらなる分子ビーコン配列が市販されており、さらなる分子ビーコン配列が本発明の方法に使用するために設計され得ることを認識する。効果的な分子ビーコンヌクレオチド配列を設計するための基準のより詳細な考察は、分子-ビーコン組織団体のウェブサイトおよびMarrasetal.2003Genotypingsinglenucleotidepolymorphismswithmolecularbeacons.InKwok,P.Y.ed.,Singlenucleotidepolymorphisms:methodsandprotocols.TheHumanaPressInc.,Totowa,N.J.,Vol.212,pp.111-128、およびVetetal.2004Designandoptimizationofmolecularbeaconreal-timepolymerasechainreactionassays.InHerdewijn,P.ed.,Oligonucleotidesynthesis:MethodsandApplications.HumanaPress,Totowa,N.J.,Vol.288,pp.273-290に見出すことができ、それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。分子ビーコンは、PremierBiosoftInternationalPaloAlto,Calif.から市販されているBeaconDesignerと呼ばれる専用ソフトウェア等を使用することによっても設計され得、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヌクレオシドへの組み込みに適した多くの修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および様々な塩基が、SIGMAchemicalcompanySaintLouis,Mo.、RDsystemsMinneapolis,Minn.、PharmaciaLKBBiotechnologyPiscataway,N.J.、CLONTECHLaboratories,Inc.PaloAlto,Calif.、ChemGenesCorp.、AldrichChemicalCompanyMilwaukee,Wis.、GlenResearch,Inc.、GIBCOBRLLifeTechnologies,Inc.Gaithersberg,Md.、FlukaChemica-BiochemikaAnalytikaFlukaChemieAG,Buchs,Switzerland、INVITROGEN商標,SanDiego,Calif.、およびAppliedBiosystemsFosterCity,Calif.、ならびに当業者に公知の他の多くの市販供給源を含む様々な製造業者から市販されている。塩基を糖部分に結合して、ヌクレオシドを形成する方法が知られている。例えば、LukevicsandZablocka1991,NucleosideSynthesis:OrganosiliconMethodsEllisHorwoodLimitedChichester,WestSussex,Englandおよびその中の参考文献を参照されたい。ヌクレオシドをリン酸化してヌクレオチドを形成し、ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに組み込む方法も知られている。例えば、Agrawaled1993ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogues,SynthesisandProperties,MethodsinMolecularBiologyvolume20,HumanaPress,Towota,N.J.およびその中の参考文献を参照されたい。加えて、例えば、モルホリノ用のGENETOOLLLC、PNAおよびキメラPNA用のBIO-SYNTHESISInc.、ならびにLNA用のEXIQON等の特注設計のMBも、市販されている。修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および様々な塩基は、本明細書に記載される検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基を連結するための適切なリンカーを提供する。リンカーは、MBオリゴヌクレオチドの3’末端、5’末端、またはその内部に配置され得る。当業者は、適切なリンカーを選択し、MBの合成中にそれらを組み込むことができるだろう。アミノリンカーの非限定的な例は、2’-デオキシアデノシン-8-C6アミノリンカー、2’-デオキシシチジン-5-C6アミノリンカー、2’-デオキシシチジン-5-C6アミノリンカー、2’-デオキシグアノシン-8-C6アミノリンカー、3’C3アミノリンカー、3’C6アミノリンカー、3’C7アミノリンカー、5’C12アミノリンカー、5’C6アミノリンカー、C7内部アミノリンカー、チミジン-5-C2およびC6アミノリンカー、チミジン-5-C6アミノリンカーである。可逆的ジスルフィド結合、またはマレイミドを用いた安定したチオールエーテル連結のいずれかを形成するために、チオールリンカーが使用され得る。チオールリンカーの非限定的な例は、3’C3ジスルフィドリンカー、3’C6ジスルフィドリンカー、および5’C6ジスルフィドリンカーである。他のリンカーは、3’用のアルデヒドリンカー、5’端用のアルデヒドリンカー、ビオチン化dT、カルボキシdT、およびDADEリンカーを含むが、これらに限定されない。外来性基の結合のための修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および様々な塩基は、例えば、TriLINKBIOTECHNOLOGIESから市販されている。一部の実施形態では、検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基は、スペーサー、好ましくは直鎖状アルキルスペーサーを通して共有結合連結によって、MBオリゴヌクレオチドに結合される。適切なスペーサーの化学成分は、当業者に理解される。炭素鎖スペーサーの長さは、かなり変動することができ、少なくとも1~30炭素である。一部の実施形態では、MBオリゴヌクレオチドは、それに連結される外来性基複数可を有する。例えば、基は、負に電荷されたリン酸骨格との静電的相互作用により、または主溝もしくは副溝での水素結合相互作用を通して2本鎖を安定化することができるヌクレオシド糖環上、またはプリン環もしくはピリジン環上の様々な位置に連結され得る。例えば、アデノシンおよびグアノシンヌクレオチドは、N2位置で、イミダゾリルプロピル基で任意に置換され、2本鎖安定性を増加する。塩基の積重ね相互作用を通して2本鎖の安定性を向上するために、3-ニトロピロールおよび5-ニトロインドール等の一般的な塩基類似体が、オリゴヌクレオチドプローブに含まれる。特定の実施形態では、検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基の連結は、Mbオリゴヌクレオチドおよび標識/ブロッカーもしくは修飾基上の利用可能な一級アミン-NH2もしくは二級アミン、カルボキシル-COOH、スルフヒドリル/チオール-SH、一級もしくは二級ヒドロキシル基、およびカルボニル-CHO官能基により生じる。当業者は、本明細書に記載される利用可能な官能基を認識するか、または結合の目的で、所望の官能基を用いて、MBオリゴヌクレオチドまたは標識/ブロッカーもしくは修飾基を設計し、合成することができるだろう。例えば、ペプチドが化学的架橋のための利用可能な反応性チオール基を含有しない場合において、内在性ジスルフィドの還元ならびにアミンまたはカルボン酸基のチオール基への変換を含むがこれらに限定されない、チオール基のタンパク質およびペプチドへの導入のためのいくつかの方法が利用可能である。そのような方法は、当業者に公知であり、その目的のために、INVITROGEN商標Inc.の分子プローブ部門およびPierceBiotechnology等からの多くの市販のキットが存在する。一実施形態では、結合は、MBオリゴヌクレオチド上のアミノリンカー上のタンパク質のカルボキシル基とアミン基との間で生じることができる。アミノリンカーは、MBオリゴヌクレオチドの3’、5’、または内部に位置することができる。化学架橋剤を使用したいくつかの分子の結合が当該技術分野におい周知である。架橋試薬は、市販されているか、または容易に合成することができる。当業者は、例えば、結合に利用可能であるタンパク質中のシステインアミノ酸残基間のジスルフィド結合等の、官能基に基づき適切な架橋剤を選択することができる。制限するものと解釈されるべきではないが、架橋剤の例は、グルタルアルデヒド、ビスイミドエステル、ビススクシンイミジルエステル、ジイソシアネート、および塩化二酸である。化学架橋剤の広範なデータは、INVITROGEN’sMolecularProbeのセクション5.2に見出すことができる。図11A~Cは、ペプチドを分子ビーコンに連結するための3つの異なる結合戦略の例である。結合戦略は、選択されたあらゆる修飾基に適用することができる。図11Aは、分子ビーコンが炭素-12スペーサーを通してビオチン-dTをステムのクエンチャーアームに導入することにより修飾される、ストレプトアビジン-ビオチン連結を示す。ビオチン修飾されたペプチドは、4つのビオチン結合部位を有するストレプトアビジン分子を通して、修飾された分子ビーコンに連結される。選択されたビオチン-dTは、0個の炭素から最大18個の炭素まで、様々な長さのスペーサーを有することができる。図11Bは、分子ビーコンステムのクエンチャーアームが、直接的な安定した連結を形成するように、ペプチドのC末端に配置されるマレイミド基と反応できるチオール基を加えることにより修飾される、チオール-マレイミド連結を示す。図11Cは、ペプチドが、チオール修飾された分子ビーコンとジスルフィド架橋を形成するC末端で、システイン残基を加えることにより修飾される、切断可能なジスルフィド架橋を示す。チオール-dTは、チオール基をオリゴヌクレオチドに加える最も一般的な方法である。チオール-dTは、0個の炭素から最大18個の炭素まで、様々な長さのスペーサーを有することができる。一実施形態では、修飾基は、MBオリゴヌクレオチドの検出可能な標識アームに連結される。一実施形態では、修飾基は、MBオリゴヌクレオチドのフルオロフォアアームに連結される。一実施形態では、修飾基は、MBオリゴヌクレオチドの検出可能な標識ブロッカーアームに連結される。一実施形態では、修飾基は、MBオリゴヌクレオチドのフルオロフォアクエンチャーアームに連結される。一実施形態では、検出可能な基によって発せられるシグナルは蛍光である。蛍光を検出し、測定する方法は、当業者に公知であり、例えば、米国特許第6,191,852号および米国特許出願公開第20090056949号に記載されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。合成または天然のナノ細孔を含むナノ細孔デバイスは、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。例えば、Heng,J.B.etal.,BiophysicalJournal2006,90,1098-1106、Fologea,D.etal.,NanoLetters2005510,1905-1909、Heng,J.B.etal.,NanoLetters2005510,1883-1888、Fologea,D.etal.,NanoLetters200559,1734-1737、Bokhari,S.H.andSauer,J.R.,Bioinformatics2005217,889-896、Mathe,J.etal.,BiophysicalJournal200487,3205-3212、Aksimentiev,A.etal.,BiophysicalJournal200487,2086-2097、Wang,H.etal.,PNAS200410137,13472-13477、Sauer-Budge,A.F.etal.,PhysicalReviewLetters20039023,238101-1-238101-4、Vercoutere,W.A.etal.,NucleicAcidsResearch2003314,1311-1318、Meller,A.etal.,Electrophoresis200223,2583-2591を参照されたい。ナノ細孔およびそれらを利用する方法は、米国特許第7,005,264B2号および第6,617,113号、米国特許出願公開第2009/0029477号および第20090298072号、ならびにSoniandMeller,Clin.Chem.2007,53:11に開示されている。これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、以下のアルファベット順のパラグラフのいずれかにおいて定義され得る。[A]核酸のナノ細孔解離依存配列決定のための分子ビーコンMBのライブラリであって、本ライブラリは、各MBが、1検出可能な標識、2検出可能な標識ブロッカー、および3修飾基を含むオリゴヌクレオチドを含む、複数のMBを含み、MBは、2本鎖ds核酸を形成するための1本鎖核酸中のA、U、T、C、またはGヌクレオチドで表される定義された配列と配列特異的相補的ハイブリッド形成が可能である。[B]オリゴヌクレオチドは、4~60のヌクレオチドを含む、パラグラフ[A]に記載のライブラリ。[C]MBのオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸DNA、リボ核酸RNA、ペプチド核酸PNA、ロックド核酸LNA、およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴPMOまたはモルホリノから成る群から選択される核酸を含む、パラグラフ[A]または[B]に記載のライブラリ。[D]検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドの一端上で結合され、かつライブラリ中の全てのオリゴヌクレオチドにおいて同じ端上に存在し、検出可能な標識がブロッカーによって阻害されないとき、検出可能な標識は、検出および/または測定され得るシグナルを発する、パラグラフ[A]~[C]のいずれかに記載のライブラリ。[E]MBは、固相担体に結合されない、パラグラフ[A]~[D]のいずれかに記載のライブラリ。[F]オリゴヌクレオチド上の検出可能な標識、検出可能な標識ブロッカー、および修飾基は、MBの、1本鎖核酸中のA、U、T、C、またはGヌクレオチドで表される定義された配列との配列特異的相補的ハイブリッド形成に干渉しない、パラグラフ[A]~[E]のいずれかに記載のライブラリ。[G]検出可能な基のシグナルは、光学的に検出される、パラグラフ[A]~[F]のいずれかに記載のライブラリ。[H]検出可能な基は、フルオロフォアであり、シグナルは、蛍光である、パラグラフ[A]~[G]のいずれかに記載のライブラリ。[I]検出可能な標識ブロッカーは、フルオロフォアのクエンチャーである、請求項[A]~[H]のいずれかに記載のライブラリ。[J]検出可能な標識ブロッカーは、修飾基でもある、パラグラフ[A]~[I]のいずれかに記載のライブラリ。[K]修飾基は、オリゴヌクレオチドの5’端または3’端に位置する、パラグラフ[A]~[J]のいずれかに記載のライブラリ。[L]修飾基は、修飾基のオリゴヌクレオチドへの結合点で、ds核酸の幅を2.0ナノメートルnm超に増加させ、ds核酸が、MBの、A、U、T、C、またはGで表される定義された配列とのハイブリッド形成によって形成される、パラグラフ[A]~[K]のいずれかに記載のライブラリ。[M]修飾基のオリゴヌクレオチドへの結合点での、ds核酸の幅は、約3~7nmである、パラグラフ[L]に記載のライブラリ。[N]修飾基は、ナノスケール粒子、タンパク質分子、有機金属粒子、金属粒子、および半導体粒子から成る群から選択される、請求項[A]~[M]のいずれかに記載のライブラリ。[O]修飾基は、3~5nmである、パラグラフ[A]~[N]のいずれかに記載のライブラリ。[P]修飾基は、ds核酸が、ナノ細孔配列決定を受けるとき、ds核酸の解離を容易にする、パラグラフ[A]~[O]のいずれかに記載のライブラリ。[Q]MBの2つ以上の種が存在し、MBの各種は、独特の検出可能な標識を有する、パラグラフ[A]~[P]のいずれかに記載のライブラリ。[R]核酸のナノ細孔解離依存配列決定のために2本鎖ds核酸を解離する方法であって、a.請求項[A]~[Q]の分子ビーコンMBのライブラリを、A、U、T、C、またはGで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される1本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、修飾基の存在によって形成されるD3の幅の2本鎖ds核酸を形成することと、b.ステップaで形成されたds核酸を、D3がD1より大きい、D1の幅のナノ細孔の開口部と接触させることと、c.配列決定される1本鎖核酸からハイブリッド形成された分子ビーコンを解離するために、ナノ細孔全体に電位を適用することと、を含む、方法。[S]ナノ細孔径は、配列決定される1本鎖核酸に細孔を通過させるが、ds核酸に細孔を通過させない、パラグラフ[R]に記載の方法。[T]D1は、2nmより大きい、パラグラフ[R]または[S]に記載の方法。[U]D1は、3~6nmである、パラグラフ[R]~[T]のいずれかに記載の方法。[V]D3は、2nmより大きい、パラグラフ[R]~[U]のいずれかに記載の方法。[W]D3は、約3~7nmである、パラグラフ[R]~[V]のいずれかに記載の方法。[X]ハイブリッド形成された1本鎖核酸とMBとの間の結合親和性は、修飾基とMBのオリゴヌクレオチドとの結合親和性より低く、そのため、ds核酸が電位の影響下でナノ細孔の開口部を通過しようとするとき、1本鎖核酸とMBとの間の結合は壊れるが、修飾基とMBのオリゴヌクレオチドとの間の結合は壊れない、パラグラフ[R]~[W]のいずれかに記載の方法。[Y]配列決定される核酸は、DNAまたはRNAである、パラグラフ[R]~[X]のいずれかに記載の方法。[Z]核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、a.請求項[A]~[Q]の分子ビーコンMBのライブラリを、A、U、T、C、またはGで表される定義された配列を含むポリマーである、配列決定される1本鎖核酸とハイブリッド形成し、それによって、修飾基の存在によって形成されるD3の幅の2本鎖ds核酸を形成するステップと、b.ステップaで形成されたds核酸を、D3がD1より大きい、D1の幅のナノ細孔の開口部と接触させるステップと、c.配列決定される1本鎖核酸からハイブリッド形成されたMBを解離するために、ナノ細孔全体に電位を適用するステップと、d.それが細孔で生じるときに、MBがds核酸から分離する際に、各MBからの検出可能な標識によって発せられるシグナルを検出するステップと、を含む、方法。[AA]検出されたシグナルの配列を核酸のヌクレオチド塩基配列に解読することをさらに含む、パラグラフ[Z]に記載の方法。[BB]ナノ細孔径は、配列決定される1本鎖核酸に細孔を通過させるが、ds核酸に細孔を通過させない、パラグラフ[Z]または[AA]に記載の方法。[CC]D1は、2nmより大きい、パラグラフ[Z]~[BB]のいずれかに記載の方法。[DD]D1は、約3~6nmである、パラグラフ[Z]~[CC]のいずれかに記載の方法。[EE]D3は、2nmより大きい、パラグラフ[Z]~[DD]のいずれかに記載の方法。[FF]D3は、約3~7nmである、パラグラフ[Z]~[EE]のいずれかに記載の方法。[GG]ハイブリッド形成された1本鎖核酸とMBとの間の結合親和性は、修飾基とMBのオリゴヌクレオチドとの結合親和性より低く、そのため、ds核酸が電位の影響下でナノ細孔の開口部を通過しようとするとき、1本鎖核酸とMBとの間の結合は壊れるが、修飾基とMBのオリゴヌクレオチドとの間の結合は壊れない、パラグラフ[Z]~[FF]のいずれかに記載の方法。[HH]配列決定される核酸は、DNAまたはRNAである、パラグラフ[Z]~[GG]のいずれかに記載の方法。本発明は、制限するものとは解釈されるべきではない、以下の実施例によってさらに図示される。本出願全体を通して引用される全ての参考文献の内容および図面は、参照により本明細書に組み込まれる。ナノ細孔アレイを用いた単一分子DNA配列決定のための個別のヌクレオ塩基の光学認識はじめに高処理DNA配列決定技術は、比較ゲノム学、生物医学研究、および個別化医療に大きく影響を与えている1。特に、単一分子DNA配列決定技法は、必要とされるDNA材料の量を最小に抑え、したがって、広範なDNA読み取りの長さを標的とする、低コストで高処理の配列決定を供給するための優れた候補であると考えられている1~4。固体状態のナノ細孔は、DNA構造およびDNA薬物またはDNAタンパク質相互作用の特徴付けを含む、広い用途を有する単一分子プローブ技術の1クラスである5-12。他の単一分子技法と違い、ナノ細孔を用いた検出は、表面上への巨大分子の固定化を必要とせず、よって試料の調製が単純化される。さらに、固体状態のナノ細孔は、大量の平行検出の開発を可能にする、高密度形式で製作され得る。ナノ細孔は、イオン溶液を含有する2つのチャンバを分離する超薄膜のナノメートルサイズの細孔である。膜全体に適用される外電界は、単一ファイル様式でバイオポリマーを引き込み、それに細孔を通過させる、細孔付近にイオン電流および局所電位勾配を作り出す6、13。バイオポリマーが細孔に入ると、電解質の画分が移動し、電位計を使用して直接測定され得る細孔の伝導性の変化を引き起こす。いくつかのナノ細孔に基づくDNA配列決定法が、最近提案されており14、主要な課題を2つ強調する:151個別のヌクレオチドnt内で識別する能力。系は、単一分子レベルで4つの塩基を区別することが可能でなければならない。2方法は、平行読み出しが可能でなければならない。単一のナノ細孔が1度に単一の分子しか探索できないため、多くのナノ細孔を製造し、かつそれらを同時に監視するための戦略が必要である。最近、DNA塩基をエキソヌクレアーゼで切断した後に修飾されたα溶血素タンパク質細孔を使用して、個別のヌクレオチドが識別され得ることが示された16。酵素活性の動態は、しかしながら、読み出しにおいて律速段階のままである。さらに、読み取り段階で酵素を伴うこの方法ならびに他の単一分子法の処理量は、分子毎に大きく変動する酵素の処理能力により制限される。今まで、いずれかのナノ細孔に基づく方法による平行読み出しは、まだ示されていない。発明者は、読み出し段階中の酵素の必要性を除去し、多重細孔検出のための簡単な方法を提供する、高処理塩基認識のための新規ナノ細孔に基づく方法を提示する。標的DNA分子の生化学調製は、未修飾固体状態のナノ細孔を使用して、直接読み取ることができる形態に各塩基を変換する。読み出し速度および長さは、したがって、酵素限定されない。以前の発表では、ナノ細孔の生体分子を探索するために電気シグナルを利用したが、ここで、発明者は、DNA配列を検出するために光学感知を使用する。発明者は、ナノ細孔を通した個別のDNA分子転位の高空間時間的解析広視野光学検出を可能にする、特注の全内反射TIR法を開発した17。ここで、発明者は、複数のナノ細孔からの同時光学検出を達成するために、この系を使用する。よって、発明者は、ナノ細孔に基づく単一分子配列決定法の主要な構成要素の全ての原理の検証を示す。方法電気計測:LPCVDを使用して、30nmの厚さの低応力SiNで被覆された両面が研磨されたシリコンウェハから開始して、自社でナノチップを製作した。標準的な手順を使用して、SiN窓30×30μm2を作製した。前述28される集束電子ビームを使用して、ナノ細孔直径3~5nmを製作した。穴をあけたナノチップを清浄し、制御された湿度および温度下で、ガラスカバースリップ底を組み込んだ特注設計のCTFEセル上に取り付けた詳細は参考文献17を参照。以下に説明するトランスチャンバを通した全内反射TIR撮像を容易にするために、脱気し、濾過した1MのKC1電解質をシスチャンバに加え、8.6Mの尿素を含む1MのKC1をトランスチャンバに加えることにより、ナノ細孔を水和した。10mMのTris-HClを使用して、全ての電解質をpH8.5に調節した。Ag/AgCl電極をセルの各チャンバに浸漬し、膜全体に固定電圧全ての実験において300mVを適用し、必要なときにイオン電流を測定するために使用される、Axon200Bヘッドステージに接続した。ノイズ拾得を削減するために、改良した倒立顕微鏡上に載置された特注のファラデー箱の中に液体セルを設置した。50kHzの低域Butterworthフィルタを使用して、ナノ細孔の電流をフィルタにかけ、250kHz/16ビットのDAQボードPCI-6154,NationalInstruments,TXを使用してサンプリングした。前述9される特注のLabViewプログラムを使用して、シグナルを取得した。電気/光学検出およびシグナルの同期化:懸濁されたSiN膜付近の個別のフルオロフォアの高速単一分子検出を達成するために、蛍光背景を大幅に低減する特注のTIR撮像を開発した17。TIRがSiN膜で作製され、光がシスチャンバの中に進行するのを防止し、よってさらなる背景を低減し得るように、トランスチャンバ溶液の屈折率を調節した。高NA対物レンズOlympus60X/1.45上にセルを載置し、640nmレーザー20mW,iFlex2000,Point-SourceUKの入射レーザービームをその背面焦点面の軸外点に集束し、それによって入射角を制御することにより、TIRを最適化した。SemrockFF685Di01ダイクロイックミラーを使用して、蛍光発光を2つの別個の光路に分け、2つの像をEM-CCDカメラAndor,iXonDU-860上に並べて映し出した。最大利得および1msの積分時間でEM-CCDを作動した。電気シグナルと光学シグナルとの間の同期は、主DAQボードと同じように、同じサンプリングクロックおよび開始トリガを使用する、カウンタボードPCI-6602,NationalInstruments,TXにカメラの発射パルスを接続することにより達成された。混合されたデータストリームは、イオン電流サンプリングと同期した、各CCDフレームの最初の固有の時間スタンプを含む。各事象を分類するために、2つの別個の基準を使用した。最初に、イオン電流は、ユーザ定義閾値レベルより下に突然降下し、元の状態に戻る前に、少なくとも100μsの間、そのレベルに留まらなければならない。第2に、事象滞留時間中シグナルが閾値より下に留まる時間、対応するCCDフレームは、細孔の領域でのみ、フォトン計数の増加を示さなければならない。2色強度分析は、細孔位置に中心がある3×3ピクセル領域での強度を読み取ることにより実施された図4aの例を参照。2つのチャネルにおける強度の生データは、2つのビット間を区別するために使用された、R=Ch2/Chlの比率を計算するために使用された。区別は、較正データを使用して、特注のLabViewコードで自動的に行われた図4c。データ分析は、IGORProWavemetricsを使用して実施され、適合は、カイ二乗を最適化するために行われた。アビジンビオチン化分子ビーコンの調製アビジン/ストレプトアビジン分子は4つの結合部位を含有するため、単一分子ビーコンのみが1つのアビジンタンパク質分子に結合することが必須であった。そのようなものとして、Tris-EDTA緩衝液中の遊離ビオチンのアビジン/ストレプトアビジンに対するモル比が3:1の30分の前保温が、非常に適したプライミングステップとしての機能を果たしたことが分かった。その後、ビーコンのアビジン/ストレプトアビジンに対する比率が5:1であるように、ビオチン化DNAビーコンが溶液に添加された。これは、1つのビーコンのみが1つのアビジンタンパク質分子に結合することを確実にした。結果アプローチは2つのステップを含む図1a:最初に、標的DNA、すなわち配列決定されるDNA中の4つのヌクレオチドA、C、G、およびTのそれぞれが、特定のフルオロフォアを保有する分子ビーコンとハイブリッド形成される予め定義されたオリゴヌクレオチドの配列に変換される。2色読み出しすなわち、2種類のフルオロフォアにおいて、4つの配列は、Aが1,1、Gが1.0、Tが0,1、および最後にCが0,0であるような、2つの予め定義された固有の配列ビッド0およびビット1の組み合わせである図1a、左側パネル。2種類のフルオロフォアを保有する2種類の分子ビーコンは、0および1の配列と特異的にハイブリッド形成される。第2に、変換されたDNAおよびハイブリッド形成された分子ビーコンは、ビーコンが順次剥離される固体状態の細孔に電気泳動的に通される。ビーコンが剥離されるごとに、新しいフルオロフォアは消光されず、フォトンのバーストを引き起こし、細孔の位置で記録される図1a、右側パネル。各細孔位置での一連の2色のフォトンバースト色は、図1において異なる灰色の色相に変換されているは、標的DNA配列のバイナリコードである。発明者のアプローチは、ナノ細孔配列決定に直面している2つの課題に対処する:1個別の塩基を検出するための必要性を解決し、酵素を含まない読み出しを容易にする、ならびに2広視野撮像および空間的に固定された細孔は、電子増倍型電荷結合素子EM-CCDカメラを用いた複数の細孔の同時検出への簡単な適応を可能にする図1bに模式的に図示される。図2は、環状DNA分子が各変換サイクル中に形成されるため、環状DNA変換CDCと呼ばれるプロセスとしての標的DNAの変換を図示する。図2aは、3つのCDCステップを模式的に表し、図2bは、単一変換サイクルの結果を表す。原理の検証のために、4つの1本鎖DNAssDNA鋳型が合成され、4つ全ての鋳型は100-ntの長さであり、それらはそれらの5’端ヌクレオチドでのみ異なる。これらの鋳型は、ストレプトアビジン被覆された磁気ビーズ上に固定するための、ビオチン部分を含有する。最初のステップにおいて、これらの鋳型は、それぞれ、2本鎖中央部分と、2つの1本鎖オーバーハングを有するDNA分子プローブと呼ばれるのライブラリとハイブリッド形成される。2本鎖部分は、鋳型分子の5’端ヌクレオチドと一致する予め定義されたオリゴヌクレオチドコードを含有する。3’オーバーハングが鋳型の5’端と完全に補完するそれらのプローブのみが、鋳型とハイブリッド形成することができる。プローブの5’オーバーハングは、同じ鋳型の3’端とハイブリッド形成して、環状分子を形成する。変換の第2ステップにおいて、プローブの両端を鋳型と連結するために、T4DNAリガーゼが使用される2つの連結位置は、図2aの赤いドットによって示される。T4DNAリガーゼは、他の酵素と比較して、その非常に高度な忠実度により、他のDNA配列決定法で使用されている18。最後に、プローブの2本鎖部分は、IIS型制限酵素の認識部位Rで標識されるを含有し、鋳型の5’端ヌクレオチドの直後で切断されるようにそれを位置付ける。短時間の熱的に誘発された融解、それに続く洗浄後、新しく形成されたssDNAは、その3’端で、バイナリコード、続いて元の鋳型の5’端ヌクレオチドを含有する。このプロセスは、必要に応じて何度でも繰り返すことができ、対応するコードと互いにかみ合わされた鋳型の5’端から3’端にヌクレオチドを移送する。異なる鋳型分子の変換は、同期化される必要がなく、非生産的なハイブリッド形成は、連結および切断が後に続かない限り、誤差を生じない。環状DNA変換CDC変換プロセスの目的は、DNA鋳型中の各個別の塩基がより長い予め定義された配列によって表されることである。概念目的の検証のため、各鋳型が末端5’塩基の同一性だけ異なる、4つのDNA鋳型分子それぞれ100-merが合成された。これらの鋳型は、ストレプトアビジン被覆された磁気ビーズINVITROGENDYNABEADSMYONEStreptavidinC1上に鋳型を固定するためのビオチン部分を含有する。この固定ステップは、DNA試料の損失を最小限にしならが、変換プロセスの異なる段階中の緩衝溶液の迅速な除去および交換を可能にする。鋳型分子は、10分間、緩衝溶液2MNaCl、2mMEDTA、20mMTris中のビーズと最初に懸濁され、固定を生じさせる。この後に洗浄ステップが続き、固定緩衝溶液が除去される。次いで、被覆されたビーズは、本明細書においてプローブと称されるDNA分子のライブラリを含有する溶液に再懸濁される。各プローブは、図2aに示すように、特定の塩基について予め定義されたオリゴヌクレオチドコードを含有する付着末端2本鎖分子である。3’オーバーハングが鋳型の5’端と完全に補完するそれらのプローブのみが、鋳型とハイブリッド形成することができる。ライブラリプローブは、鋳型分子の3’端がプローブの5’端オーバーハングとハイブリッド形成するのを可能にするように設計される。次いで、試料は、徐冷プロセスを通して、ライブラリプローブをそれらの相補的鋳型分子とハイブリッド形成させる。このプロセスは、ハイブリッド形成を促進するために、高食塩100mMNaCl、10mMMgCl2で実行される。プロセスのこの段階で、環状分子が作製された。次いで、試料を10mMのTris緩衝溶液で洗浄し、固定された鋳型分子とハイブリッド形成しなかったいくらかの過剰なライブラリプローブを除去する。その後、試料を連結緩衝溶液に再懸濁し、新しくハイブリッド形成された分子を一緒に連結させる。連結緩衝溶液は、QuickT4DNAリガーゼNewEnglandBioLabsと、QuickLigationReaction緩衝液NewEnglandBioLabsとを含有する。連結は、室温で5分間実行された。このステップの後、10mMのTris緩衝溶液でさらに洗浄を行い、リガーゼおよび連結緩衝溶液を除去した。変換プロセスの最後から2番目のステップは、BseGl制限酵素と、FASTDIGEST緩衝液両方ともFermantesからとを含有する緩衝溶液中に、新しく環状化され、かつ固定された分子を再懸濁することである。このプロセスは、予め定義されたコードと、さらにそれが表す塩基が、この時点で鋳型分子の3’端に存在し、新しい塩基がこの時点で5’端に位置し、変換のプロセスを受けられる状態にあるように環状化分子を再度直線化する。試料がこの分解緩衝液に懸濁されたら、37°Cで15分間放置し、分解を起こさせる。ナノ細孔またはゲルを使用して分子を分析するために、変換されたDNAをビーズから除去する。これは、固定された試料を95のホルムアミド緩衝液に懸濁し、95°Cで10分間加熱することによって行われる。次いで、試料は、変換を検証するために、変性ゲル図2bおよび図7にかけられる。図7は、プロセスの主要な段階のうちのいくつかの変性ゲルを表すここでは、C末端鋳型のみが明確化のために示される。このゲルは、SYBRGreenIIINVITROGENを使用して染色された。ゲルは、A.元のDNA鋳型分子、B.参照として示される直鎖状の150merssDNA、C.参照として示される環状150merDNA、D.BseGlを使用した、直線化後の変換された生成物、E.直線化前の変換された環状化生成物を示す。これらは、ハイブリッド形成、連結、および分解ステップ後の分子の伸長された長さを表す。環状DNA変換CDCの原理の検証のために使用されたDNA配列以下は、実施例で前述される変換された生成物の同一性を検証するために使用された分子ビーコンの配列である。以下の全てのビーコン配列は、EurogentecNASanDiegoによって合成された。A.1ビットに相補的である16-mer。5’-TAAGCGTACGTGCTTA-3’配列番号13。この配列は、5’アミン修飾を有し、ATTO647NAtto-Tec染料は、5’端で結合された。ナノ細孔光学読み出し実験において、同じオリゴヌクレオチド分子ビーコンは、3’端のクエンチャーBHQ-2,BiosearchTechnologiesを用いて合成された。B.0ビットに相補的な16mer:5’-CCTGATTCATGTCAGG-3’配列番号14。この配列は、5’アミン修飾を有し、ATTO488Atto-Tec染料は、5’端で結合された。ナノ細孔光学読み出し実験において、同じオリゴは、3’端のクエンチャーBHQ-2,BiosearchTechnologiesを用いて合成され、ATTO680Atto-Tec染料は、5’端で結合された。C.01配列に相補的な32mer:5’-CCTGATTCATGTCAGGTAAGCGTACGTGCTTA-3’配列番号15。この配列は、5’アミン修飾を有し、ATTO647NAtto-Tec染料は、5’端で結合された。D.10配列に相補的な32mer:5’-TAAGCGTACGTGCTTACCTGATTCATGTCAGG-3’配列番号16。この配列は、5’アミン修飾を有し、TMRINVITROGEN商標染料は、5’端で結合された。発明者は、磁気ビーズからそれらを除去した後の反応生成物を分析することによって、CDCの実行可能性を広く試験した。図2bの左側パネルは、変換を1回実行した後の生成物を含有する変性ゲル8Mの尿素を表す。4つの異なる鋳型のそれぞれの>50が約50nt100から約150ntへ伸長したことが観察され、鋳型のプローブとの良好な連結を示す。正しいプローブが各例で使用されたことを証明するために、分子ビーコンとしても知られる4種類のオリゴヌクレオチドが以下の通りに合成された:1赤いフルオロフォアを用いた、1ビットに相補的な16-mer、2青いフルオロフォアを用いた0ビットに相補的な16-mer、3緑のフルオロフォアを用いた102ビット配列に相補的な32-mer、および4赤いフルオロフォアを用いた01に相補的な32-mer。最初の2つのオリゴヌクレオチドの混合物は、各CDC生成物とハイブリッド形成され、かつ対照として、4つ全ての初期鋳型とハイブリッド形成された。ゲル分離後、3色レーザースキャナを使用して、画像分析を実行し、それを図2cに表す。色は、図においてグレースケールに変換された。それぞれ、11および00とコードされる列2および3、[A生成物の赤いバンドが1つだけ観察され、C生成物の青いバンドが1つだけ観察された。それらがそれぞれ10および01でコードされる列4および5とき、他の2つの生成物であるGおよびTは、赤と青のバンドの両方を示す。変換されたGとTを区別するために、それらは、前述の2つの32-merオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成された。Gのみが、10コードに対応する、緑のフルオロフォアで標識されたバンド列6を示し、Tのみが、01コードに対応する、赤いフルオロフォアで標識されたバンド列7を示す。対照群は、鋳型自体が標識された分子ビーコンのいずれともハイブリッド形成せず、標識された分子ビーコン自体は、約150nt生成物と比較して非常に短いため、ゲル中に示されないことを示す列1、8、および9。これらの結果は、単一CDCサイクルが正しい変換コードを用いて純粋な生成物を生成するという結論を示す。発明者のアプローチの第2のステップは、ハイブリッド形成された分子ビーコンを変換されたssDNAから剥離するために、固体状態のナノ細孔を使用する。2本鎖DNAdsDNAの断面直径が2.2nmであるため、これは、2nm未満範囲の細孔の使用を必要とする19。DNA分子のそのような小さい細孔への侵入の確率は、より大きい細孔へのそれらの侵入より非常に小さく9,13、より大量のDNAの使用を余儀なくする。さらに、小さい細孔の製造は、誤差の公差がほとんどなく、高密度ナノ細孔アレイについての問題が増大するため、多くの技術的な課題を提起する。3~5nmの大きさの大きな基例えば、タンパク質またはナノ粒子を分子ビーコンに共有結合的に結合することにより、複合体の分子断面を5~7nmに効果的に増加させ、3~6nmの範囲のサイズのナノ細孔の使用を可能にすることが分かった。これは、DNA分子の捕獲率を10倍以上に増加させ、ナノ細孔アレイの製作プロセスを大幅に容易にする。概念の検証のため、アビジン4.0×5.5×6.0nm20分子を、フルオロフォア-クエンチャー対ATTO647N-BHQ2、A647-BHQと略されるを含有するビオチン化分子ビーコンに結合した。このビーコンと、1端にクエンチャーを含有し、もう1端にフルオロフォアを含有しない、同様に構築された分子ビーコンの両方が、標的ssDNA1ビット試料とハイブリッド形成された。図3aに模式的に示されるように、2つのビーコン分子2ビット試料を含有する同様の複合体を合成した。バルク蛍光試験BHQ-2の消光プロセスの効率を試験するために、バルク蛍光実験を実行した。各フルオロフォアにおいて、2つの分子を設計した図8aおよびbの差し込みを参照。その5’端に蛍光染色を含有する16merから成る分子の1つを66merとハイブリッド形成した。第2の分子は、同様に、同じ16merと、さらにその3’端にBHQ-2クエンチャーを含有する第2の16merを含有した。これらの2つの16merは、66merとハイブリッド形成された。2つの16mer分子は、1つの5’端上の蛍光プローブが他方の3’端上のBHQ-2クエンチャーに近接するようにハイブリッド形成された。使用された2つのフルオロフォアは、ATTO647NAtto-TecおよびATTO680Atto-Tecであった。ATTO647Nは、644nmで最大吸収ピークを、そして669nmで励起ピークを有し、一方、ATTO680は、680nmで最大吸収ピークを、そして700nmで励起ピークを有する。各分子において、我々は、複合体の蛍光発光を測定するために、蛍光光度計JASCOFP-6500を使用した。最初に、分子の発光スペクトルは、非消光フルオロフォアで測定された図8のaおよびbの上の跡。その後、クエンチャー-フルオロフォア対の分子の発光スペクトル図8のaおよびbの下の跡が測定された。各実験は、約100nΜのハイブリッド形成された試料を含有した。これらの実験は、図8に示されるように、これらの大きい分子で生じる消光が95~97あることを測定した。したがって、バルク試験は、そのハイブリッド形成状態にあるとき、分子ビーコン上のA647フルオロフォアが隣接するBHQクエンチャーにより約95消光されることを示した。この非常に高い消光効率を考えると、蛍光バーストは、鎖分離が、フルオロフォアがハイブリッド形成された2本鎖状態の隣接するクエンチャーに隣接しないときに生じる場合のみ、単一分子レベルで検出され得る。1ビットおよび2ビット試料の両方のナノ細孔実験は、640nmレーザーを使用して実行され、EM-CCDカメラを使用して1秒当り1,000フレームで撮像された。図3aは、1ビット試料において複合体当り1つのビーコン、2ビット試料において複合体当り2つのビーコンでの、2つの試料の典型的な解離事象を表す。電気シグナルは、黒で示され、細孔位置で電気シグナルと同期的に測定された光学シグナル17は、薄灰色または濃灰色の跡で示される。電流の急激な減少は、分子の細孔への侵入を意味し、細孔が空くと、電気シグナルは、開細孔の上側の状態に戻る19。光学シグナルは、1ビットおよび2ビットの試料の解離事象の大多数において、それぞれ、1つまたは2つのフォトンバーストを明らかに示す。これは、フルオロフォアが細孔に到達する前に消光され、ビーコンが鋳型から解離された直後に再度自己消光するため、予想される21。電気シグナルによって定義される各解離事象中の光学強度を合計して2つの試料のポアソン分布図3bの実線を得、1ビット試料において、平均値は1.30±0.06であり、2ビット試料において、2倍の値2.65±0.08であった各例においてn>600の事象、誤差は標準を表す。これは、フォトンバーストを定義するために使用されたモデルに関わらず、平均して、単一解離事象が1ビット試料の各複合体で生じ、2つの解離事象が2ビット試料で生じたことを証明する。さらに、強度閾値分析の使用により平均強度2標準で選択される、1ビット試料の収集された事象のほぼ90が、単一蛍光バーストを含有し、一方、2ビット試料において、収集された事象の約80が2つのそのようなバーストを示したことが観察された図3c。このデータは、3~5nm細孔を使用して実施された個別の解離事象において、1ビットと2ビットの試料を光学的に区別することが可能であることを示す。4つ全てのヌクレオチドを区別するために、同じ640nmレーザーにより同時に励起される、A647ATTO647NおよびA680ATTO680の2つの高量子収率フルオロフォアを使用して、現行の系を1色から2色のコードスキームに拡張した。ダイクロイックミラーを使用して、光学発光シグナルをチャネル1および2に分け、同じEM-CCDカメラ上に並べて映し出した。2つのフルオロフォアの発光スペクトルが重複するとき、A647発光の画分は、チャネル2に漏れ、A680の画分は、チャネル1に漏れる。2つの較正測定値は、A647またはA680フルオロフォアで標識された1ビット複合体を使用して実施された図4a。各例の>500解離事象の集積後、ナノ細孔の位置に対応する、各チャネルでの単一の別々のピークが明らかに見られる。チャネル2対チャネル1Rの蛍光強度の比率は、A647の試料で0.2、A680の試料で0.4である。2つの試料のそれぞれの代表的な事象>500のうち、および対応するRの分布は、それぞれ、図4bおよび4cに示される。単一の明瞭な蛍光ピークは、各転位事象中に観察され電流跡は黒で示される、強度は、ベースラインの蛍光変動より>3倍大きかった。全ての検出された事象を集計すると、A647およびA680において、それぞれ、R=0.20±0.06および0.40±0.05平均±標準となり、図4aに示される集積された蛍光全ての事象においての比率と完全に一致する。図4cに一致する実線によって与えられるRは、ガウス分布をとる。これらの対照測定値は、Rが個別のフルオロフォアの同一性を決定するために使用され得ることを示す。図4cに与えられる較正分布を使用することにより、4つの2ビットの組み合わせ、つまり、0および1が、それぞれ、A647およびA680ビーコンに対応する、11A、00C、01Tおよび10Gを含有するCDCから生成物を識別する能力が試験された。>2000の解離事象の分析は、0.21±0.05および0.41±0.06の2つのモードのRの二峰性分布を明らかにし図5b、較正測定値と完全に一致した図4c。R<0.30の全てのフォトンバーストは、0と分類され、R>030のものは、1と分類された0.30は、図5bにおいて、分布の局所最小である。Rの分布は、誤分類の確率を算出するためにも使用された。これは、2つのフルオロフォアの間の最適な識別のために、2つのチャネルを較正するための統計的平均をさらに提供する。図5cは、4つ全てのDNA塩基の単一分子識別を示す、代表的な2色蛍光強度事象を表す。2色識別の頑健性は、主に、フォトンバーストの優れたシグナル対ノイズ比と、2つのチャネルのフルオロフォア強度比間の分離とに起因する。蛍光シグナルの自動ピーク識別を実施するために、コンピュータアルゴリズムを開発した。アルゴリズムは、蛍光シグナル中のランダムなノイズ例えば、偽スパイクを除去し、較正分布図4cを使用してビット配列を識別し、その後、塩基呼び出しを実施する。アルゴリズムは、1つがビット呼び出し、そしてもう一方が塩基呼び出しの、2つの確実度スコアを出力する。典型的な結果を図5cに示す。強度の生データから自動的に抽出された各塩基の確実度値0と1の間の範囲は、括弧で表される。現在の広視野光学に基づく検出スキームの主な利点の1つは、複数の細孔を平行して探索することができる単純さにあり、最終的に高処理読み出しを可能にする。平行読み出しの概念の検証として、同じSiN膜上の3~5nmのサイズのナノ細孔を、数ミクロン離して製作した。図6aでは、1つ、2つ、または3つのナノ細孔を含有する膜を使用して、3つの別個の実験で得た、集積された蛍光強度画像を示す。単一細孔実験と同様、膜の全ての細孔からの蛍光バーストが記録された。各実験の数千の解離事象からの集積フォトン計数から、各ピクセルでのフォトン強度の表面地図が得られた図6a。図に反映されるように、検出されたピークの数は、各膜に製作された細孔の数と等しい。2細孔膜の2つのピーク間の距離は、1.8μmであり、3細孔膜の3つのピーク間の距離は、1.8μmおよび7.7μmであり、製作プロセス中に測定された細孔間の距離と完全に一致する。このデータは、広視野光学検出スキームの実行可能性の直接的な証拠を提供する。図6bは、系が単一膜の複数のナノ細孔からフォトンバーストを同時に探索する能力を示した。4つの代表的な跡は、電流黒および3つのナノ細孔から探索された1ビット試料を使用した光学シグナルそれぞれ、緑、赤、および青のマーカーを示す。各細孔での各分子の侵入および解離は、確率プロセスである。この実験で使用された条件下において、>3,000の解離事象のうちの約50は、分子が2つの細孔に同時に侵入することを伴った。全ての細孔から集積した電流跡は、はっきりとした2つの遮断レベルを表し、細孔が占有されたかの情報は含まない、特定の時点での占有された細孔の総数を示す。一方、光学跡は、明確に占有された細孔を示す。これは、方法がより大きなアレイに拡張するとき、電流測定値の必要性を最終的に排除し、光学測定値にのみ依存し、計装要求を単純化する。考察および結論単一分子DNA配列決定法は、既に、遺伝子研究を転換し始めており、費用および処理に高い制約を設定している3、22、23。配列決定の費用は、さらに減少し、ヒトゲノム再配列決定は、幅広く、かつ手頃な医療診断ツールとなることが予想される1。ここで、低費用で超高処理の可能性を有する、新しい単一分子DNA配列決定の概念の実行可能性を示してきた。その最も単純な形態において、2つのフルオロフォアと結合され、光学検出系により読み取られるDNA配列を表すために、バイナリコード塩基当り2ビットが使用された。その現段階で、現在の系は、他の単一分子アプローチに引けを取らない、ナノ細孔当り1秒で50~250の塩基を読み取ることができる2、3。4色の単純な適応および最適化した試薬の使用は、系がナノ細孔当り1秒に>500塩基を達成することを可能にすることが予想される。最も重要なことは、多重細孔読み出しの実行可能性が、ナノ細孔に基づく方法について始めて示された。ナノ細孔アレイからの光学検出は、統計的占有に依存する酵素法とは異なり、効率的に細孔の数に対応する。発明者のアプローチは、標的DNAを、標準的な固体状態のナノ細孔を用いて直接探索され得るより長いDNA分子に変換する準備的なステップを含む。時間および複雑性の追加にも関わらず、このステップは、以下の利点をもたらす:1他の配列決定プラットホームと異なり24、このアプローチは、誤りを起こしやすい可能性があるPCRに基づく増幅ステップを必要としない2。2読み出し段階は、ポリメラーゼ、リガーゼ、またはエキソヌクレアーゼ等のいずれの酵素も使用せず、したがって、読み出しの長さ、速度、および忠実度は、酵素限定されない4。3読み出しの速度は、ナノ細孔全体にわたる電圧、または2つのチャンバ内のイオン強度等の物理的パラメータを調節することにより、個別の配列決定反応について容易に調節され得る。酵素依存法は、関与する酵素の生体工学を必要とするだろう。4変換されたDNAは、二次構造をほとんど保有しないように設計され得、これは、ゲノムの高度に構成された領域および/または反復領域の配列決定を非常に容易にすることができ、読み出しステップにおいて強い変性剤の必要性を回避する。5読み出し系は、一斉に製造され得る、サイズが3~6nmの範囲の標準的な固体状態のナノ細孔アレイを使用する。本明細書における発明者の結果は、最初に、全ての固体状態のDNA配列の読み出し、および大きな基の組み込みが3~6nm細孔の使用を可能にすることを示す。これらの結果は、DNA配列決定のための、固体状態のナノ細孔の使用の実行可能性を強く示す。近年、いくつかの刊行物が、固体状態の材料で、同様の規模のアレイの製作を示している25、26。参考文献1.Shendure,J.,etal.,Advancedsequencingtechnologies:M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