"止血障害の正常化を必要としている哺乳動物のその正常化方法であって、1FII、2FII、FVIIaおよびFXの組み合わせ、3フィブリノーゲンとFII、FVIIaおよびFXの組み合わせ、並びに4フィブリノーゲンとFIIからなる群から選択される凝固因子治療薬を投与することを含む、方法。止血障害を有する哺乳動物の最大血餅硬度MCFを増大させる方法であって、1FII、2FII、FVIIaおよびFXの組み合わせ、3フィブリノーゲンとFII、FVIIaおよびFXの組み合わせ、並びに4フィブリノーゲンとFIIからなる群から選択される凝固因子治療薬を投与することを含む、方法。止血障害を有する哺乳動物の凝固時間CTを短縮する方法であって、1FII、2FII、FVIIaおよびFXの組み合わせ、3フィブリノーゲンとFII、FVIIaおよびFXの組み合わせ、並びに4フィブリノーゲンとFIIからなる群から選択される凝固因子治療薬の投与を含む、方法。止血障害を有する哺乳動物のトロンビン生成を改善する方法であって、1FII、2FII、FVIIaおよびFXの組み合わせ、3フィブリノーゲンとFII、FVIIaおよびFXの組み合わせ、並びに4フィブリノーゲンとFIIからなる群から選択される凝固因子治療薬を投与することを含む、方法。前記止血障害が、出血障害、出血、大量失血または外傷性出血事象と関係している、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。前記大量失血が凝固障害と関係している、請求項5に記載の方法。前記出血障害が血友病である、請求項5に記載の方法。前記出血または外傷性出血事象が、周術期出血、術後出血または分娩後出血と関係している、請求項5に記載の方法。前記FIIが組換えヒトFIIrhFIIである、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。前記FVIIaが組換えヒトFVIIarhVIIaである、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。前記FXが組換えヒトFXrhFXである、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。治療を必要としている前記哺乳動物が、約2g/L未満、約1g/L未満または約0.5g/L未満の血中フィブリノーゲン濃度レベルを有する、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。治療を必要としている前記哺乳動物が、約200mg/dL未満、約150mg/dL未満、約100mg/dL未満または約50mg/dL未満の血中フィブリノーゲン濃度レベルを有する、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。前記止血障害が、哺乳動物の推定全血液体積の約30、約40、約50、約60、約70、約80または約85を超える失血と関係している、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。前記凝固障害が、正常血液量または血行力学的安定性の回復に起因する希釈性凝固障害である、請求項6に記載の方法。血中フィブリノーゲン濃度を約0.5g/L、約1g/L、約1.5g/Lまたは約2mg/Lよりも上昇させるのに十分な量のフィブリノーゲンが投与される、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。フィブリノーゲンが12.5~200mg/kgの用量で投与される、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。前記FIIがrhFIIであり、1~10mg/kgの用量で投与される、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。前記凝固因子治療薬が、凝固時間を約40秒~約60秒短縮する用量で投与される、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。前記凝固因子治療薬が、最大血餅硬度を約10mm~約30mmに増大させる用量で投与される、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。前記凝固因子治療薬の投与により、投与後少なくとも2時間、正常化された凝固が維持される、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。前記凝固因子治療薬が、1FII、または2フィブリノーゲンとFIIであり、ここで前記凝固因子治療薬がFVIIaと共投与される、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。前記凝固因子治療薬が、1前記FII、FVIIaおよびFXの組み合わせ、または2前記FII、FVIIaおよびFXの組み合わせとフィブリノーゲンであり、ここでFIIとFVIIaが少なくとも1:90の比で投与される、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。前記凝固因子治療薬が、1FIIまたは2フィブリノーゲンとFIIであり、ここで前記凝固因子治療薬の投与が、凝固因子FV~FXIIIからの他のいかなる凝固因子も共投与せずに行われる、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。止血を回復するための組成物および方法が各種提案され、研究されてきたにもかかわらず、希釈性凝固障害などの止血障害を治療する改良された方法に対するニーズが当該技術分野で依然存在する。出血障害または失血患者の止血を達成するには、十分な量のトロンビンと十分な凝固性基質フィブリノーゲンが必要である。凝固における重要な観点は、血小板表面でのトロンビンの生成と、フィブリンを生成するためのトロンビンによるフィブリノーゲンの開裂である。十分なトロンビンが生成され、十分なフィブリノーゲンが存在するならば、フィブリノーゲンが安定なフィブリンに変換される。これは第XIII因子FXIIIの存在下で形成される血餅の硬度を決定する。本発明は、組換えヒト第II因子rhFII単独、または3つの組換えヒト凝固因子、rhII、rhFXおよびrhVIIa3Fの組み合わせを含む組換え止血剤を使用する、無制御出血の治療または最小化であって、止血剤はフィブリノーゲンを併用または併用しない治療または最小化を提供する。特に、本発明は、希釈性凝固障害の治療における、そのような組換え止血剤の効果を示す。驚いたことに、rhFIIの単独、またはフィブリノーゲンとの併用投与は、正常な止血を回復するのに十分である。rhFIIの単独、またはフィブリノーゲンとの併用投与は、出血障害または失血を制御するために現在提供されている他の標準形態の治療では起こり得る潜在的に深刻な血栓閉塞症の合併症を避けることができる。本明細書における刊行物への参照はいかなるものも、そのような刊行物が以下に開示する本発明の先行技術であることを認めるものであると解釈されるべきでないことに留意すべきである。止血障害の治療または止血の正常化は、1FII単独;2PCC;および3FII、FXおよびVIIaの3因子の組み合わせからなる群から選択される凝固因子治療薬の投与を含み得る。凝固因子治療薬止血剤は、任意選択により、フィブリノーゲンと組み合わせて投与することができる。止血剤は、組換えヒト因子、例えば、rhFII、rhFXおよびrhVIIa組み合わせヒト因子の、この3種の因子の組み合わせは、3Fと略記し得る、またはrhFII単独とすることができる。いくつかの実施形態では、止血障害または止血正常化の有効な治療は、フィブリノーゲンとrhFIIを共投与することを含み得る。治療は他の凝固因子を実質的に補給せずに行うことができる。したがって、いくつかの実施形態では、止血障害の有効な治療は、1FII単独、例えばrhFII;23F;3フィブリノーゲン、並びにFII、FVIIaおよびFXの組み合わせ;または4フィブリノーゲンとFIIからなる群から選択される凝固因子治療薬を投与することを含み得る。本発明は、凝固因子治療薬または1種以上の凝固因子の組み合わせの投与による、無制御出血の治療または止血の正常化を提供する。特に、本発明は、FIIまたは3因子組み合わせFII、FXおよびVIIaの投与による、無制御出血の治療または止血の正常化を提供する。ある実施形態では、止血剤または凝固因子は、組換えヒト凝固因子である。他の実施形態では、凝固因子はフィブリノーゲンと併用または併用せずに投与される。ある他の実施形態では、凝固因子治療薬はPCCFII、FVII、FIXおよびFX、任意選択により少量のヘパリンを含むである。希釈性凝固障害の発病および治療の効果は、回転式トロンボエラストメトリーROTEM登録商標などの従来の凝固試験や、1pMのTF活性化剤を使用して行う較正自動トロンボグラムCATで測定されるトロンビン生成により測定することができる。凝固およびそれに続く線維素溶解過程における凝固因子、それらの阻害剤、抗凝固剤、血液細胞、特に血小板の相互作用は、ROTEM登録商標により調べられる。レオロジー条件は、静脈中の血液の緩慢な流れを模擬している。簡単に説明すると、血液を電子ピペットを使用して使い捨てキュベットに入れる。細いスプリングと結合されていてゆっくりと前後に振動するシャフトに、使い捨てのピンを装着する。血液試料中に懸垂しているピンの信号は、光学検出システムにより伝送される。この機器は、形成または分解中の血餅の全段階における弾性の変化を測定し、図示する。通常の試験温度は37°Cであるが、別の温度を選択することもできる。一次的結果は、血餅が形成または分解するときの弾性対時間を示す反応曲線である。ルーチンの使用では、凝固曲線は4つのパラメータで説明される。凝固時間CTは血液に開始薬剤を加えてから血餅の形成が開始するまでの待ち時間である。CTが延びるのは、凝固障害、主として凝固因子またはヘパリン使用した試験に依るによる結果であり得る。CTの短縮は凝固性の亢進を示す。アルファ角は、曲線の接線の角度であり、血餅形成時間CFTは、CTから血餅硬度が20mmに達するまでの時間である。これらのパラメータは固体の血餅の形成速度を意味し、主に血小板の作用の影響を受けるが、フィブリノーゲンおよび凝固因子も関与している。CFTの延長または、アルファ角の縮小は、通常、乏しい血小板作用、少ない血小板数、フィブリン重合障害、またはフィブリノーゲンの欠乏によって引き起こされる。CFTの短縮または、アルファ角の増大は、凝固性の亢進を示す。最大血餅硬度MCFは曲線の垂直方向の最大幅である。これはフィブリンおよび血小板血餅の絶対強度を反映している。MCFの低さは、血小板の数の減少もしくは作用の低下、フィブリノーゲン濃度の低下もしくはフィブリン重合障害、または第XIII因子の活性低下を示す。機械的強度の小さい血餅は、重大な出血のリスクを表す。異なるパラメータおよび効果を強調するために、ROTEM登録商標の変形を使用してもよい。例えば、EXTEMは、外因性の止血システムに対するスクリーニング試験である。EXTEM試薬は、組織因子を使用して止血を穏やかに活性化させる。その後、この結果は、外因性の凝固因子、血小板およびフィブリノーゲンの影響を受ける。較正自動トロンボグラムCATはHemkerらによって説明されているPathophysiolHaemostThromb,2002年,32:249-253。蛍光を発する遅いトロンビン基質を使用し、同時に使用している校正物質と連続的に比較することにより、トロンビン生成を自動的にモニターすることができる。得られるトロンボグラムから、貧血小板血漿中における凝固性低下および凝固性亢進が測定される。止血障害の治療または止血の正常化は、凝固因子治療薬、例えばFIIおよび任意選択のFXとFVIIa、またはフィブリノーゲンとFIIとの組み合わせ、任意選択によりさらにFXとFVIIaを組み合わせた治療薬を投与することを含んでもよい。止血剤は組換えヒト因子、例えばrhFII、rhFXおよびrhVIIa、またはrhFII単独とすることができる。いくつかの実施形態では、止血障害の有効な治療は、FIIの投与、またはFII、FXおよびFVIIaの共投与、あるいはフィブリノーゲンとFIIとの共投与、任意選択によりさらにFXとFVIIaとの共投与で構成することができ、ここで、FII、FXおよび/またはFVIIaは、組換え技術で製造されたヒト因子とすることができる。止血の治療または正常化は、他の凝固因子を実質的に補給せずに行うことができる。いくつかの実施形態では、止血障害の治療は、FII、またはフィブリノーゲンとFIIとの共投与から構成することができ、ここで、FIIは組換えヒトFIIrhFIIとすることができる。用語実質的な補給は、本発明で記載したものに加えて、凝固因子などの他の成分を追加することであって、そのような追加の凝固因子を補給したときの1種以上の止血剤の効果が、補給なしの1種以上の止血剤を投与したときの効果と相当に異なるような量で追加することをいう。本明細書では、組換えタンパク質には、組換え技術で作られたタンパク質が含まれる。そのようなタンパク質には、天然タンパク質に似たものや、活性、タンパク質の半減期、タンパク質の安定性、タンパク質の局在性、および有効性を増進するように修飾したものが含まれる。米国特許出願公開第2005/0164367号明細書を参照されたい。これは、参照することにより本明細書中に組み込まれる。本明細書では、治療とは、有益または所望の臨床結果を得る方法である。有益または所望の臨床結果には、症状の緩和、出血の減少、個体の安定化および出血の防止が含まれるが、これらに限定されない。句実質的に構成されるは、患者に対し他の従来の治療を同時に行うのをやめる必要があることを意味するものではなく、例えば、実質的に、FIIの投与または有効量のフィブリノーゲンとFIIとの共投与からなる治療が、他の凝固因子、特に、ローマ数字V~XIIIで記載されるものなどのタンパク質凝固因子のかなりの補給が、その直前にも、同時にもあるいは直後にも行われないことを意味する。いくつかの実施形態では、実質的にFIIの単独投与、または有効量のフィブリノーゲンとFIIの共投与からなる治療は、輸血、凍結血小板、回収血液細胞、晶質および/またはコロイドを含む液体の投与、並びに、輸血血液、凍結血小板製剤などにおいて内因性であり得るものを超える凝固因子の積極的な補給を含まない他の従来の治療などの別の処置と同時に行われる。他の実施形態では、実質的に、有効量のFII、3F、フィブリノーゲンとFIIまたはフィブリノーゲンと3Fの投与からなる治療を行っているとき、かなりの量の凝固因子例えば、第V~XIII因子を含む組成物の別の投与を含む処置を同時に行うことを必要としないか、または所望されない場合があり得る。いくつかの実施形態では、治療を必要としている哺乳動物の外傷性出血障害を治療する方法は、aPCCFII、FX、FIX、FVIIおよびタンパク質C;brhFII、rhFVIIaおよびrhFX;並びにcrhFII単独からなる群から選択される凝固因子治療薬を投与することを含むことができる。ここで、a、bまたはcは任意選択によりフィブリノーゲンと組み合わせて提供される。同様に、哺乳動物の外傷性出血と関連する止血障害を正常化する方法は、aPCCFII、FX、FIX、FVIIおよびタンパク質C;brhFII、rhFVIIaおよびrhFX;並びにcrhFII単独からなる群から選択される凝固因子治療薬を投与することを含むことができる。ここでa、bまたはcは任意選択によりフィブリノーゲンと組み合わせて提供される。さらに、外傷性出血障害による死亡率を低下させる方法は、aPCCFII、FX、FIX、FVIIおよびタンパク質C;brhFII、rhFVIIaおよびrhFX;並びにcrhFII単独からなる群から選択される凝固因子治療薬を投与することを含むことができる。ここで、a、bまたはcは任意選択によりフィブリノーゲンと組み合わせて提供される。止血障害の治療または止血の正常化方法は、FIIおよび任意選択によりフィブリノーゲンを含む1種以上の止血剤を含むか、または実質的にそれらからなる組み合わせ治療薬を投与することにより、最大血餅硬度MCFを増加させること、凝固時間CTを短縮させること、および/または、哺乳動物の外傷性出血障害に関連する出血または大量失血後のトロンビンの生成を改善することを含むことができる。これらの方法のいずれにおいても、凝固因子治療薬は、aPCCFII、FX、FIX、FVIIおよびタンパク質C;brhFII、rhFVIIaおよびrhFX;並びにcrhFIIからなる群から選択することができる。1つの実施形態では、凝固因子治療薬は、FII、FVIIaおよびFXの組み合わせである。他の1つの実施形態では、凝固因子治療薬は、FIIまたはrhFII単独である。他の実施形態では、凝固因子治療薬は、他の止血因子、特に他のローマ数字表記の凝固因子を実質的に補給しない、rhFII、rhFVIIaおよびrhFXの組み合わせ、またはrhFII単独とすることができる。すなわち、いくつかの実施形態では、方法は、他の止血因子、特に第V~XIII因子を実質的に補給せずに、rhFII、および任意選択によるフィブリノーゲンを投与することを含むことができる。代替の実施形態では、治療を必要としている哺乳動物の外傷性出血障害を治療する方法は、上記凝固因子治療薬を投与することから構成することができる。同様に、哺乳動物の外傷性出血障害と関連する止血障害の正常化方法は、上記凝固因子治療薬を投与することから構成することができる。さらに、外傷性出血障害による死亡率を低下させる方法は、上記凝固因子治療薬を投与することから構成することができる。止血障害の治療または止血の正常化方法は、凝固因子治療薬を投与することから構成することができる方法により、最大血餅硬度MCFを増加させること、凝固時間CTを短縮すること、および/または、哺乳動物の外傷性出血障害と関連する出血または大量失血後のトロンビンの生成を改善することを含むことができる。ある実施形態では、最大血餅硬度は、約10mm~約40mm、約10mm~約30mm、約10mm、約15mm、約20mm、約25mm、または約30mmに増加する。他の実施形態では、凝固時間は、約35~約75秒、あるいは約35秒、約40秒、約45秒、約50秒、約55秒、約60秒、約65秒、約70秒、または約75秒に短縮する。上記のように、凝固因子治療薬は、aPCCFII、FX、FIX、FVIIおよびタンパク質C;brhFII、rhFVIIaおよびrhFX;並びにcrhFII単独からなる群から選択することができ、ここで、a、bまたはcは任意選択によりフィブリノーゲンと組み合わせて提供される。いくつかの好ましい実施形態では、凝固因子治療薬は、1FII、FVIIaおよびFXの組み合わせ;または2FII単独のいずれかである。凝固因子治療薬は、組換えヒト因子、すなわち、1rhFII、rhFVIIaおよびrhFXの組み合わせ、2rhFII単独のいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、方法は、rhFII、および任意選択によりフィブリノーゲンを共投与することから構成することができる。共投与するまたは共治療するとは、成分の混合物を投与するか、あるいは共治療薬の成分を、互いに近接した時刻に別々に投与する、例えば、共投与される成分を時間的にオーバーラップした時間内に投与するか、または共投与成分の投与開始もしくは完了から約1時間、または30分、または15分以内に1成分の投与を開始することを意味する。本明細書中に開示した方法において投与する成分は、この分野で十分に確立された手法により処方され、かつ投与される。例えば、フィブリノーゲンとFII、rhFIIまたは3Fは、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して、静脈注射または点滴により投与することができる。活性薬剤の製剤に適した担体および賦形剤としては、その成分を摂取した個体に有害な免疫応答を誘起せず、かつ過度の毒性を伴わずに投与することができる医薬品が挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤としては、水などの液体、生理食塩水、グリセロール、砂糖およびエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能な塩も挙げることができる。そのような塩としては、塩化水素、臭化水素、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸の塩;酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を含む。さらに、そのようなビヒクル中に、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤などの補助物質が含まれていてもよい。薬剤として許容可能な賦形剤についての徹底した議論は、Remington’sPharmaceuticalSciencesMackPub.Co.,18thEdition,Easton,Pa.,1990年で得られる。止血障害は、凝固障害例えば、希釈性凝固障害、外傷性出血、周術期出血、術後出血、分娩後出血などに関係する。止血障害は、約2~約1.5g/L未満、約1g/L未満、または約0.5g/L未満の血中フィブリノーゲン濃度と関係し得る。止血障害は、哺乳動物の推定全血体積の約30~約85、例えば、約30超、約40超、約45超、約50超、約55超、約60超、約70超、約80超、または約85超の失血と関係し得る。いくつかの実施形態では、希釈性凝固障害は、正常血液量の回復、または血行力学的安定性の回復に起因する。したがって、本明細書で開示する治療を必要とする哺乳動物は、これらの判定基準の1つ以上に合致する哺乳動物であり得る。止血障害にはまた、血友病AおよびB、抑制抗体を有する血友病AおよびBの患者、凝固因子、例えばフィブリノーゲン、FII、FV、FVII、FIX、FVIII、FX、FXI、FXIIおよびFXIIIの欠乏、フォンヴィレブランド因子、FV/FVIIの複合欠乏、ビタミンKエポキシドレダクターゼC1欠乏、ガンマカルボキシラーゼ欠乏;外傷、傷害、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固障害、播種性血管内凝固症候群DICに伴う出血;ヘパリン、低分子量ヘパリン、ペンタサッカリド、ワルファリン、小分子抗血栓薬すなわち、FXa阻害剤に関係する過剰抗凝固;およびベルナールスーリエ症候群、グランツマン血小板無力症および貯蔵プール欠乏症などの血小板障害が含まれ得る。止血障害にはまた、深部静脈血栓症、心血管疾患もしくは悪性腫瘍に伴う血栓症、留置カテーテルもしくは他の侵襲性外科的処置に起因する血栓症、および狼瘡などの自己免疫疾患に伴う血栓症などの血栓疾患に関係する出血が含まれ得る。本明細書に記載の方法は、血中フィブリノーゲン濃度を約0.5、約1、約1.5または約2g/L超へと増加させるのに十分な量のフィブリノーゲンを共投与することを含むか、または実質的にそれから構成され得る。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、12.5~200mg/kgの用量、例えば約12.5、25、50、100または200mg/kgの用量が投与される。いくつかの実施形態では、rhFIIは、12、48または10mg/kgの用量が投与される。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンと1種以上の止血剤の投与により、投与後少なくとも2時間は、ほぼ正常な凝固が維持される。いくつかの実施形態では、治療用活性薬剤をキットに組み立てることができる。キットは、フィブリノーゲンと、FII、rhFIIおよび/または3Fだけでなく、これらに限定されないが、生理食塩水およびスクロース溶液などの適当な賦形剤、並びに、これらに限定されないが、糖類、抗酸化剤およびアルブミンなどの、組成物の成分の安定化または有効性のために追加する補助因子を含み得るであろう。キットは、さらに、活性薬剤を注入する器具例えば、シリンジ、止血帯、および注入部位を清浄にするアルコールスワブなどの、活性薬剤の送達に関係する他の要素を含むことができる。キットには、縫合材料、針およびピンセットなどの創傷閉鎖に関係する要素を含む他の要素もまた含めることができる。本明細書に開示する方法を、その実施形態を参照しながら詳細に説明してきたが、当業者であれば、本開示の範囲から逸脱することなく、各種の変更が可能であり、かつ等価のものを使用し得ることは明らかであろう。同様に、以下の実施例は、開示の方法の説明として提示するのであって、開示の方法を限定すると解釈されるべきではない。フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン濃縮液は、最終の血餅強度を高めるために、1種以上の止血剤と共に投与することができる。ある実施形態では、フィブリノーゲンとPCC、rhFIIまたは3Fとの組み合わせは、凝固時間を短縮し、トロンビンの生成を改善する。フィブリノーゲンと組み合わされたPCCまたはrhFIIは、無制御出血の治療において、死亡率を低下させるために使用することができる。PCCとフィブリノーゲンの組み合わせの投与は、投与後0.5時間、1時間または2時間まで、凝固を強化するために使用することができる。したがって、rhFIIの使用、特にフィブリノーゲンと組み合わせた使用は、PCCの代替とすることができ、同等の効能を有するが、血栓閉塞性合併症に対するリスクはより低減される。他のいかなる止血剤も補給せずに、フィブリノーゲンとrhFIIの共投与することを含む治療は、少なくとも約60の血液希釈にも達する重篤な失血後の止血障害を、合併症に対するより低いリスクで正常化するのに有効であり得る。フィブリノーゲンとrhFII含有3Fとの共投与もまた有効である。さらに、有効な治療は、フィブリノーゲンを補給または補給せずにrhFIIまたは3Fを投与することにより実質的に構成することができる。実施例1方法外科的準備および測定:研究は、50匹の健康な豚を使用して行った。これらの動物にアザペロン4mgkg-1IM、神経遮断薬、Stresnil商標、Janssen、Vienna、Austriaおよびアトロピン0.1mgkg-1IMによる麻酔前投薬を研究開始の1時間前に行った。プロポフォール1~2mgkg-1IVにより麻酔を導入し、維持した。鎮痛用にピリトラミドを注射した30mg、半減期が約4~8時間のオピオイド、Dipidolor商標、Janssen社、Vienna、Austria。気管内麻酔後に、筋弛緩用として0.2mgkg-1hr-1のパンクロニウムを注射した。挿管後、血液試料の採取のために7.5フレンチカテーテルを大腿動脈に挿入し、血圧を連続測定した。血液抜き取り、コロイドおよび晶質の投与、並びに試験薬剤の投与用に、2本の7.5フレンチカテーテルを両大腿静脈に挿入した。Swan-Ganzカテーテルを右頸静脈に挿入した。実験計画:補液4mlkg-1の基本的必要性を、晶質リンゲルの乳酸塩溶液により試験の全過程で満たした。標準の希釈性凝固障害を誘導するために、6HES130/0.4Voluven登録商標、FreseniusCo.,BadHomburg、Germanyにより正常血液量性血液希釈を行った:大きいカテーテルにより動物から血液を抜き取り、1:1の比でコロイドにより置換した。血液希釈の完了後、抜き取った血液をCellSaverSystemCats登録商標、Fresenius社、Vienna、Austriaで処理し、濃縮し、血行力学的に関係する貧血を避けるために再輸液した。得られた凝固障害がROTEM登録商標およびEXTEM試薬による測定される臨界レベル:凝固時間CT>100秒および最大血餅硬度MCF<40mmに達したとき、正常血液量性血液希釈を終了した。動物に、200mgkg-1のフィブリノーゲン濃縮液HaemocomplettanHS登録商標、CSL-Behringフィブリノーゲン群、200mgkg-1のフィブリノーゲン濃縮液と35IUkg-1のPCCBeriplex登録商標、CSLBehring社、Marburg、GermanyPCC群、200mgkg-1のフィブリノーゲン濃縮液と4mgkg-1のrhFII濃縮液AstraZenecaRDMoelndal社、SweedenFII群、200mgkg-1のフィブリノーゲン濃縮液と、4mgkg-1のrhFII、0.32mgkg-1のrhFXおよび0.006mgkg-1のrhFVIIaを含む3因子組み合わせ濃縮液AstraZenecaRDMoelndal社、Sweeden3F群、または同量の通常生理食塩水サリン群をランダムに与えた。フィブリノーゲン濃縮液およびPCCの用量は、以前に刊行された動物実験のデータに基づいた。SperryらJTrauma2008年,64:9-14;InnerhoferPらAnesthAnalg2002年,95:858-65。上述の凝固因子または凝固因子の組み合わせを投与した後、直ちに、テンプレートを使用して標準肝臓傷害長さ12cm、深さ3cmを誘発した。創傷を肝臓の右肝葉上に形成した。研究は、組織検査、凝固分析、血行力学の文書化、肝臓切開を行ったスタッフ、または生起している失血の採取および測定に参加した人々に知らせないでおいた。肝臓の切開後、続いて起こった失血を、動物が出血ショックで死亡するまでの時間の長さで評価した。トロンボエラストメトリー測定に加えて、標準凝固分析PT、aPTT、フィブリノーゲン、血小板数を実施し、活性化凝固のパラメータD-ダイマーおよびTATと、トロンビン生成能力を推定するためのトロンビン生成試験較正自動トロンボグラム、CATを実施した。肝臓外傷の2時間後、生存している動物をカリウム注入により犠牲にした。心臓、肺、腸の一部および腎臓を除去し、微小血管の血栓の発生を調べた。血液サンプリングおよび分析方法:動脈の血液サンプリングを、ベースラインBL、血液抜き取り後BW、血液希釈後HD、試験薬剤による治療後TH、および肝臓切開の120分後または予想される死の直前ENDに実施した。全ての血液試料は大腿動脈から抜き取ったが、最初の5mlの血液は捨てた。ROTEM登録商標用および凝固分析用の血液試料を、0.3mL0.106モル/Lの緩衝化pH5.5クエン酸ナトリウムSarstedt社、Nuembrecht、Germanyを入れた3mLのチューブに採取した。血液細胞計数用血液試料は、1.6mgEDTA/mLSarstedt社、Nuembrecht、Germanyを入れた2.7mLのチューブに採取した。DadeBehring社、Marburg、GermanyおよびAmelungCoagulometer社、Baxter、UKの適切な試験を使用する標準の研究室的方法により、プロトロンビン時間PT、部分トロンボプラスチン時間PTT-LA1、フィブリノーゲン濃度、抗トロンビンATおよびトロンビン-抗トロンビン複合体TATを測定した。D-ダイマーの測定には、分析法D-dimer0020008500登録商標InstrumentationLaboratoryCompany社,Lexington,USAを使用した。血液細胞の計数はSysmexPoch-100i登録商標counterSysmex社,LakeZurich,IL,USAを使用して実施した。凝固システムの機能的評価に、トロンボエラストメトリーROTEM登録商標、Pentapharm社,Munich,Germanyを使用した。加速とより良好な標準化のために、EXTEM試薬を使用した。Luddington,ClinLabHaematol2005年,27:81-90。丸底の96ウェルプレートGreinermicrolon、U型、高結合性、USA中で較正自動トロンボグラムCAT分析を行った。クエン酸血漿試料80μlおよび1pMのTFを含有するトリガー溶液20μllowCatTS31.00のPPP試薬、Thrombinoscope社、Maastricht、TheNetherlandsを試料ウェル内で混合した。これと並行して、20μlの較正器と80μlのプールした正常な豚のクエン酸血漿とを、試料ウェルと結合したウェル中で混合することにより、較正器CatTS20.00、Thrombinoscope社を分析した。その後、プレートを蛍光光度計Ascentreader,ThennolabsystemsOY社,Helsinki,Finlandに移し、蛍光発生基質とCaCl2を含む20μlのFluCa溶液CatTS50.00、Thrombinoscope社を、器具を使って分配した。蛍光シグナルを、390nmのλex、460nmのλemで60分間測定した。試薬を加える間、96ウェルプレートを37°Cの加熱ブロック上に置いた。ThrombinoscopeBV社Maastricht,Netherlands製のソフトウェアThrombinoscopeバージョン3.0.0.29を使用して、トロンビン活性の開始遅れ時間、トロンビン活性がピークに達するまでの時間ttPeak、ピークのトロンビン活性Peak、および全トロンビン活性、すなわち内因性トロンビンポテンシャルETPを算出した。統計解析:全ての統計解析はSPSS15.0統計パッケージSPSS社、Chicago、ILを使用して実施した。正常性を試験するためにシャピロ-ウィルク検定を使用した。正規分布していない変数は、パラメータ解析を可能にするために対数変換を行った。階層的処理を適用して分散の解析を行いANOVA、オーバーオールの群と時間の効果を検出したP<0.5を有意であると見做した。顕著な差がある場合には、分散の解析を行いANOVA、群間の差異を検出した。多重比較の補正にはボンフェローニ-ホルムの方法を使用した。P<0.005を有意であると見做した。顕著な差がある場合には、群内の対応T検定および群間の独立したT検定を実施した。P<0.001を有意であると見做した。カプラン-マイヤー法を、治療群の累積生存のログランクマンテルコックス比較と共に使用して、群間の生存を解析した。結果平均体重が36.98kg±4.23、4~5月齢の50匹の豚を調べた。ベースラインでは、血行力学的または凝固パラメータ、血小板または赤血球細胞の数に関して、群間で統計的に有意な差は検知されなかった。全ての凝固試験の結果は、正常な範囲内であった。Velik-SalchnerらThrombRes2006年,117:597-602。生存期間:rhFVIIP=0.029またはPCCP=0.017と組み合わせたフィブリノーゲンで治療した動物は、無制御の出血を伴う肝臓傷害の後、コントロール群のものより、かなり長生きした。少なくとも1種の血液因子で治療した全ての群の動物は、コントロール群と比較して生存期間が延長したが、フィブリノーゲン単独またはフィブリノーゲンと3Fとの組み合わせも、コントロール群と比較して、肝臓傷害後の生存に関して類似の効果を示した。血栓閉塞性の合併症により、PCC投与後直ぐに1匹の動物が死亡した。失血:図1に示すように、無制御の出血を伴う肝臓傷害の後、失血は、生理食塩水群と比較して全ての群で顕著に減少した。ROTEM登録商標:PCCまたは3Fと組み合わせたフィブリノーゲンの投与後、凝固時間CTは、生理食塩水またはフィブリノーゲン単独の治療と比べて顕著に短縮された。図2aに示すように、観察期間の終了時END、フィブリノーゲンと3Fの組み合わせで治療した動物では、生理食塩水またはフィブリノーゲン単独の場合と比べて、CTは依然短縮されていた。フィブリノーゲンとPCCの組み合わせは、生理食塩水と比べてCTを顕著に短縮した。図2bに示すように、3FまたはrhFIIと組み合わせたフィブリノーゲンの投与により、最大血餅硬度MCFは、生理食塩水単独による治療と比べて、顕著に増大した。希釈後、MCFは、全ての群で同じ量だけ顕著に減少した。フィブリノーゲンの投与後、MCFは、生理食塩水で治療したコントロールの動物と比べて顕著に増大した。観察期間の終了時、フィブリノーゲンと3Fの濃縮液、またはフィブリノーゲンとrhFIIの組み合わせを与えられた豚3F群では、生理食塩水群と比べてMCFは依然増大していた。トロンビンの生成CAT:遅れ時間およびピークまでの時間は、群内で差がなかった。PCC、rhFIIまたは3Fと組み合わせたフィブリノーゲンの投与により、フィブリノーゲン単独で治療された動物と比べて、ピーク値が顕著に高くなった。ピーク値はまた、フィブリノーゲンとrhFIIの投与後、およびフィブリノーゲンと3Fの投与後、コントロール群と比較して、顕著に増大した。肝臓傷害の2時間後、他の全ての群に比べて、フィブリノーゲンとPCCの組み合わせで治療した動物でピーク値は顕著に増大した。フィブリノーゲンとrhFIIの組み合わせで治療した動物も、フィブリノーゲンと3Fで治療した動物も、フィブリノーゲン単独で治療した動物より、顕著に高いETPを有した一方、フィブリノーゲンとrhFIIの組み合わせはまた、コントロール群と比較してETPを顕著に増大させた。観察期間の終了時、フィブリノーゲンとPCCの組み合わせは、他の全ての群より顕著に高いETPを有した。結論上で示したように、フィブリノーゲンと組み合わせたPCCまたはrhFIIの投与は、生理食塩水またはフィブリノーゲン単独の場合と比べて、正常血液量性血液希釈および肝臓傷害後の失血に顕著な減少をもたらした。フィブリノーゲンと組み合わせたPCCまたはrhFIIの投与はまた、肝臓傷害後の動物の生存期間を顕著に延長させた。凝固時間は、コントロールに比べてフィブリノーゲンと組み合わせたrFIIの投与により顕著に短縮され、最大血餅硬度もまたフィブリノーゲンと組み合わせたrhFIIの治療で顕著に増大した。これらの結果は、rhFIIの投与この場合、フィブリノーゲンと組み合わせてが、正常な止血の回復、失血の防止、および死亡率の低下に十分に有効な治療法であることを示すものである。出血障害および失血の治療でrhFIIを使用することは、したがって有効であり、複数の凝固因子の組み合わせを投与することに伴って起こり得る、重症になる可能性がある血栓閉塞症の合併症を避けることができよう。実施例2方法麻酔と止血の維持:筋肉内注射により豚にDormicum2mg/kgおよびKetaminol10mg/kgを麻酔前投薬した。約20分後、麻酔薬およびリンゲル液の投与に使用するために、ポリエチレンカテーテルVenflon1.0×32mm、BectonDickinson社、Helsingborg、Swedenを耳の静脈に挿入した。挿管を可能にするため、初めに、豚に、ペントバルビタールナトリウムApoteksbolaget社、Umea、Swedenを静脈内注射で急速投与量15mg/kg与え、麻酔した。実験の間、麻酔は維持し、準備中、1.8イソフルランIsoba登録商標vet、Schering-Plough社、Denmarkを補充したペントバルビタール10~15mg/kg/hを引き続き注入した。豚に10O2が供給される室内空気で人工呼吸ServoVentilator900C,SiemensElema社、Solna、Swedenした。呼吸数は15回/分の一定値に維持し、呼気体積を調節して呼気終末CO2を約5.5kPaに維持した。1.5mL/kg/hのリンゲル液FreseniusKabiAS社、Halden、Norwayを連続的に与え、補液を行った。動物を覆い、かつ外部から加熱することにより、実験の間、体温を36~39°Cに維持した。実験終了時、動物に致死量のペントバルビタール>150mg/kgを注入した。外科的準備:連続的な動脈圧の測定と血液試料の採取のために、ポリエチレンカテーテルIntramedicPE-200ClayAdams社、Parsippany、NJ、USAを右大腿動脈に挿入した。血液の抜き取りと、処理済赤血球PRC、ヒドロキシエチルデンプンHESおよび試験薬剤/ビヒクルの投与のために、ポリエチレンカテーテルIntramedicPE-200ClayAdams社、Parsippany、NJ、USAを両大腿静脈に挿入した。中心静脈圧を監視するために、第4のポリエチレンカテーテルIntramedicPE-200ClayAdams社、Parsippany、NJ、USAを右頸静脈に挿入した。体温を直腸検温により測定した。最後に、肝臓を露出させるために、約35cmの正中開腹を行った。肝臓切開を行うまで、創傷は止血鉗子で閉ざし、生理食塩水含浸スワブにより乾燥から保護した。実験計画:ベースライン血液試料BS0採取後、動物の全血液体積70mL/kgの約60を、60mg/mLのHESVoluven登録商標、FreseniusKabiAB社、Uppsala、Swedenで、等容的、かつ正常体温で交換した。5mL、0.109Mのクエン酸ナトリウムを入れて準備した50mLのシリンジで、平均動脈血圧MAPが30mmHg~35mmHgの危険レベルに達するまで、可能な限り多くの血液を抜き取った。その後、動物はMAPが安定レベルに増大するまで、安静にした約10分。その後、MAPが最低限の30mmHgに降下するまで、血液の抜き取りを継続し、圧力カフにより直ちにHESを静脈内に投与した1mLHES:1mL血液。通常は、最初の血液-HES交換ラウンド中に、凝固障害を引き起こすのに必要な、計算した容積の血液を採ることは困難である。ROTEM解析でチェックして、もし凝固障害のレベルがあまりに低いならば、さらに多くの血液を抜き取り、HESで置換する1:1、最初の交換ラウンドで血液は希釈されるが。第2の、そしてその後の全てのラウンドの間、平均動脈圧は60mmHg未満に降下しないであろうから、回復のために中断する必要はない。最初の交換ラウンドで抜き取る血液の体積を最大にするために、たとえMAPが降下しつつあっても、静脈内に塩酸フェニレフリンApoteketAB社、Moelndal、Swedenを投与して、末梢血管から血液を搾り取ることができる。MAPが約40mmHgに降下したなら、10分間の回復のための中断の後、塩酸フェニレフリン0.1mg/mLを約2mLを与える。MAPの短時間で、かつ即座の増加の間に、何本かの追加のシリンジを血液で満たすことができる。流れた血液を、クオリティーウオッシュプログラムを使用してセルセーバーCATS登録商標、FreseniusKabiAB社、Uppsala、Sweden上で処理し、HESによる容積回復後、ヘモグロビン値を50g/L超に維持するために、動物に適当な容積の処理済赤血球を投与し、これにより重篤な貧血による早期の死を回避する。血液希釈後、ROTEM解析を行い、凝固障害の程度を測定した。凝固障害の判断基準は、以下の通りとした:CTEx-TEM≧100で、かつMCF≦40mm。凝固障害の確立後、血液試料を採取したBS2。その後、試験薬剤を投与した。試験薬剤は次のものに対応させた:1生理食塩水コントロール;28mg/kgの組換えヒトFIIrhFII;3それぞれ4.0、0.32および0.006mg/kgのrhFIIrhFXrhFVIIaに対応する3因子の組み合わせ低用量;4それぞれ8.0、0.64および0.012mg/kgのrhFIIrhFXrhFVIIaに対応する3因子の組み合わせ高用量;540U/kgのFEIBAVH登録商標抗阻害剤凝固複合体AICC;Baxter;6200100μg/kgのNovoSeven登録商標凝固第VIIa因子;NovoNordisk;またはHaemocomplettan登録商標HSフィブリノーゲン濃縮液;CSL-Behring。注入完了の十10分後、別の血液試料を採取したBS3。自作のテンプレートを右肝葉にあてがい、外科用メス11番をテンプレート長さ8cm、深さ3cmのスリットを通して引くことにより、標準切開を実施して無制御出血を引き起こした。肝臓切開後の最大観察時間は120分とした。死の直前に、最後の血液試料を採取したBS4。腹から血液を吸引し、全失血量および生存期間を測定した。死を、パルスを伴わない電気的活動、15mmHg未満のMAP、または1.5kPa未満の呼気終末二酸化炭素で定義した。血液サンプリング:ROTEM測定用として、クエン酸チューブS-Monovette登録商標9NC/2.9mL、Sarstedt社、Nuembrecht、Germanyに動脈血を採取し、血漿は、トロンビン生成、およびトロンビン-抗トロンビン複合体の分析用として保存した。組換えヒト第II因子rhFII、組換えヒト第X因子rhFX、FVIIa、ヒトフィブリノーゲンおよび細胞数の血漿中濃度決定用血液を、カリウムEDTAチューブS-Monovette登録商標2.6mLK3E、Sarstedt社、Nuembrecht、Germanyに採取した。全血分析ROTEM:実験を通して、連続した血液試料を得、回転式トロンボエラストメトリーROTEM登録商標、PentapharmGmbH社、Munich、Germanyの標準凝固試験EXTEM登録商標、INTEM登録商標、PentapharmGmbH社、Munich、Germanyを使用して、血餅の弾力性発達に関する止血システムの能力を評価した。商業的に入手可能な溶液と類似の濃度を有する、自社製の塩化カルシウム溶液以外は、商業的に入手可能な試薬を使用した。製造業者からの使用説明書に従った。この研究では、凝固時間CT、血餅形成時間CFTおよび最大血餅硬度MCFを評価した。血液ガスおよび電解質:実験中に、動脈血のガス、酸-塩基パラメータおよび電解質を分析したABL700、RadiometerMedicalApS社、Broenshoej、Denmark。製造業者の説明書にしたがって分析を行った。全ての動物は実験期間を通して良好な血液ガスの状態を示した。細胞計数:血液細胞の濃度のあり得る変化を監視するために、血液のサンプリングが行われる度に、自動血球計数装置KX-21N、シスメックス株式会社、神戸、日本で動脈血試料を分析した。分析は製造業者の説明書に従って行った。血漿分析トロンビン-抗トロンビン複合体TAT:サンドイッチ酵素免疫測定法Enzygnost登録商標TATmicro、DadeBehringGmbH社、Marburg、Germanyを使用して、TATの血漿中濃度を測定した。製造業者の説明書に従った。>90μg/mLの濃度が得られたときは、試料を希釈緩衝液中に加えて10倍に希釈して分析した。血漿試料中に血餅が観察されれば、それらについてはTATの分析を行わなかった。CAT:実施例1に記載のようにしてCAT分析を行った。結果データ解析:自社製のソフトウェアPharmLabV6.0、AstraZenecaRDMoelndal社を使用して、平均動脈圧、中心静脈圧および心拍数データを収集した。結果を、全血凝固時間およびTAT濃度の結果を除いて、平均値±平均値の標準誤差SEMとともに記述統計として示す。これらの結果を、これらのデータ中の異常値が平均値に誤解を与えるような影響を及ぼすため、中央値として示す。実験終了と称する各実験における最後の血液試料を、大部分の動物で実験中の異なる時点で生じる死の前に採取する。失血:図3は、ビヒクル、試験物質およびコントロール物質の投与後、並びに肝臓の切開後の、体重1kg当たりの失血をmlで表したものである。データは、横棒で示す中央値とともに個々の値を示している。生存期間:図4は、異なる治療群の生存曲線を示す。ビヒクル群では、25の動物が全実験期間を通じて生き延びた。2時間の観察で治療群の生存は、それぞれ、3因子組み合わせの低用量で67、3因子組み合わせの高用量、NovoSeven登録商標およびHaemocomplettan登録商標で80、rhFIIおよびFEIBA登録商標で100であった。ROTEM:ベースライン、希釈後、薬剤投与後および実験終了時に抜き取った全血試料の、EXTERM活性化、すなわちTFによる活性化の結果を図5aおよび4bに示す。ベースラインでは、CTおよびMCFは全ての治療群で類似である。希釈後、CTはベースラインレベルの2倍に増大するが、MCFはベースラインレベルの約半分に低下する。希釈後、両変数はベースラインと比べて、群間で大きな変動性を示す。治療薬投与後、CTは、含まれる治療薬の全てでベースライン値に向かって類似の移行を示したが、完全に正常化するには至らなかった。薬剤投与後にはほぼ正常なMCFを示すHaemocomplettan登録商標フィブリノーゲンを除いて、異なる治療薬のMCFに対する影響は僅かであった。CAT:ベースライン、希釈後、薬剤投与後、そして実験の終了時点で抜き取った血漿試料の較正自動トロンボグラム分析の結果を図6a~dに示す。希釈後は、ベースライン値に比べて、遅れ時間LTおよびピークまでの時間ttPeakは短縮し、ピークおよび内因性トロンビンポテンシャルETPは増大した。物質が投与された後は、LTはrhFIIで約50増大し、Haemocomplettan登録商標で僅かな増大が認められたが、他の物質ではLTは僅かな短縮となった。さらに、ttPeakはLTと同じパターンを示した。ピーク値は、希釈後の値と比べて、rhFIIで100、3因子の組み合わせ低用量で30、3因子の組み合わせ高用量で150そしてFEIBA登録商標で150増大した。ビヒクル、NovoSeven登録商標およびHaemocomplettan登録商標は、希釈直後の値と比べて、変化しなかった。最後にFTP値は、希釈工程後の値と比べて、rhFII、3因子の組み合わせ高用量およびFEIBA登録商標でほぼ200増大した。低用量3因子の組み合わせは、希釈後と比べて、約30増大した。実験の終了時では、rhFIIが希釈工程後と同一レベルに短縮したことを除いて、LTは用量投与後の場合と同じ時間に対応した。ttPeak値はLTと同様であった。ピークの状況からは、FEIBA登録商標を除くすべての物質群が、最終希釈後のレベルに戻ったことが示された。FEIBA登録商標は、依然、物質投与の直後見られたレベルと同等のピークを示した。実験終了時のETP値は全て、ピークのパターンと類似していた。TAT:図7に示すように、希釈工程後の全ての治療群でTATレベルは類似であった。薬剤投与後は、プロトロンビンを含む全ての治療薬、すなわち、3因子の組み合わせ、rhFIIおよびFEIBA登録商標でTATレベルの2~3倍の増加が見られた。実験終了時には、薬剤投与後に得られたパターンと依然一致しており、投与後と比べてTATレベルの減少を示すrhFII単独を除いて、プロトロンビン含有治療薬のTATレベルは一層増大した。Haemocomplettan登録商標およびNovoSeven登録商標もまた、希釈後および投与後の両方と比べて、実験終了時のTATレベルを2~3倍増大した。結論上述のように、rhFIIの単独投与は、生理食塩水または他の治療薬と比べて、正常血液量性血液希釈および肝臓傷害後の失血を顕著に減少させる。トロンボグラム分析によれば、遅れ時間の増大がrhFII単独で約50、ピーク値の増加がrhFII単独で100、そしてETP値の増加がrhFII単独でほぼ200であることがわかった。これらの結果は、さらに、rhFII単独投与が、正常化した止血の回復、失血の防止、および生存期間の増加に十分有効な治療法であることを示すものである。rhFIIの単独使用または3因子組み合わせの使用は、無制御出血の複雑な動物モデルでは、希釈性凝固障害のために、これまで試験されていなかった。したがって、本発明は、出血障害および失血の治療に対するrhFII単独の効能または3Fの効能を初めて提供するものである。上記実施例2で記載したように、実験終了時のTATレベルおよびトロンビン生成データは、すべての試料で投与前のレベルまで減少した。rhFII単独などの凝固因子の投与については、これは、危険な出血の発現過程で、または失血中に、より良好な治療計画の調節を可能にする点で有利である。持続時間が長引くと、治療計画の必要な調節ができなくなり得る。さらに、rhFII単独投与は、上述したように、複数の凝固因子の組み合わせを投与することにしばしば伴う、重症になる可能性がある血栓閉塞症の合併症を、治療中に避けることができる。"