"明細書中に記載の発明。発明の要旨本発明は、例えば以下の項目を提供する。項目1配列番号2のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。項目2項目1に記載される前記ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。項目3項目2に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、配列番号1の配列を有する核酸を含む、ポリヌクレオチド分子。項目4項目2に記載される単離されたポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。項目5項目4に記載されるベクターを含む、宿主細胞。項目6方法であって、以下:aCorynebacterium種の宿主細胞を、項目2に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程であって、ここで、該単離されたポリヌクレオチド分子が該宿主細胞の染色体に組み込まれ、これによって該宿主細胞染色体中のアミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加させる、工程;およびb形質転換された宿主細胞を選択する工程、を包含する、方法。項目7項目6に記載の方法であって、増加したアミノ酸産生についてスクリーニングする工程をさらに包含する、方法。項目8項目6に記載の方法であって、ここで、前記ポリヌクレオチド分子が、さらに、以下:aCorynebacterium種リジン経路asdアミノ酸配列をコードする、核酸分子;bCorynebacterium種リジン経路dapAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;cCorynebacterium種リジン経路dapBアミノ酸配列をコードする、核酸分子;dCorynebacterium種リジン経路ddhアミノ酸配列をコードする、核酸分子;eCorynebacterium種リジン経路‘lysAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;fCorynebacterium種リジン経路lysAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;およびgCorynebacterium種リジン経路ORF2アミノ酸配列をコードする、核酸分子、のうちの少なくとも1つを含む、方法。項目9項目8に記載の方法であって、さらに、増加したアミノ酸産生についてスクリーニングする工程を包含する、方法。項目10項目6に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下:a配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする、核酸分子;b配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;c配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする、核酸分子;d配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする、核酸分子;e配列番号21の‘lysAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;f配列番号14のlysAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;およびg配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする、核酸分子、のうちの少なくとも1つを含む、方法。項目11項目6に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下:a配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする、核酸分子;b配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;c配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする、核酸分子;およびd配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする、核酸分子、を含む、方法。項目12項目6に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下:a配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする、核酸分子;b配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;c配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする、核酸分子;d配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする、核酸分子;およびe配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする、核酸分子、を含む、方法。項目13項目6に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下:a配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする、核酸分子;b配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;c配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする、核酸分子;d配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする、核酸分子;e配列番号21の‘lysAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;およびf配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする、核酸分子、を含む、方法。項目14項目6に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下:a配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする、核酸分子;b配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;c配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする、核酸分子;d配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする、核酸分子;e配列番号14のlysAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;およびf配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする、核酸分子、を含む、方法。項目15項目6に記載の方法であって、さらに、以下:a前記形質転換された宿主細胞を培地中で増殖させる工程;およびb該形質転換された宿主細胞によって産生されるアミノ酸を精製する工程、を包含する、方法。項目16単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下:a項目2に記載されるポリヌクレオチド分子;ならびにb以下のi~vii:iasdポリペプチドをコードする、核酸分子;iidapAポリペプチドをコードする、核酸分子;iiidapBポリペプチドをコードする、核酸分子;ivddhポリペプチドをコードする、核酸分子;v‘lysAポリペプチドをコードする、核酸分子;vilysAポリペプチドをコードする、核酸分子;およびviiORF2ポリペプチドをコードする、核酸分子、からなる群より選択される、少なくとも1つのさらなるCorynebacterium種リジン経路遺伝子、を含む、ポリヌクレオチド分子。項目17項目16に記載の単離された核酸分子であって、ここで:a前記asdポリペプチドが配列番号4であり;b前記dapAポリペプチドが配列番号6であり;c前記dapBポリペプチドが配列番号8であり;d前記ddhポリペプチドが配列番号10であり;e前記‘lysAポリペプチドが配列番号21であり;f前記lysAポリペプチドが配列番号14であり;そしてg前記ORF2ポリペプチドが配列番号16である、核酸分子。項目18単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下:a項目2に記載のポリヌクレオチド分子;b配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする、核酸分子;c配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;d配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする、核酸分子;およびe配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする、核酸分子、を含む、ポリヌクレオチド分子。項目19単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下:a項目2に記載のポリヌクレオチド分子;b配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする、核酸分子;c配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;d配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする、核酸分子;e配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする、核酸分子;およびf配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする、核酸分子、を含む、ポリヌクレオチド分子。項目20単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下:a項目2に記載のポリヌクレオチド分子;b配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする、核酸分子;c配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;d配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする、核酸分子;e配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする、核酸分子;f配列番号21の‘lysAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;およびg配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする、核酸分子、を含む、ポリヌクレオチド分子。項目21単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下:a項目2に記載のポリヌクレオチド分子;b配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする、核酸分子;c配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;d配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする、核酸分子;e配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする、核酸分子;f配列番号14のlysAアミノ酸配列をコードする、核酸分子;およびg配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする、核酸分子、を含む、ポリヌクレオチド分子。項目22pK184-KDABを含む、項目18に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。項目23pD11-KDABH’Lを含む、項目20に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。項目24pD2-KDABHLを含む、項目21に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。項目25項目16に記載されるポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。項目26項目25に記載されるベクターを含む、宿主細胞。項目27項目26に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、BrevibacteriumflavumNRRL-B30218、BrevibacteriumflavumNRRL-B30219、BrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30220、BrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30221、BrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30222、BrevibacteriumflavumNRRL-B30234およびBrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30235からなる群より選択されるBrevibacteriumである、宿主細胞。項目28項目26に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞が、EscherichiacoliDH5αMCRNRRL-B30228である、宿主細胞。項目29項目26に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、C.glutamicumNRRL-B30236およびC.glutamicumNRRL-B30237からなる群より選択されるC.glutamicumである、宿主細胞。項目30リジンを産生する方法であって、該方法が項目5に記載される宿主細胞を培養する工程を包含し、ここで、前記宿主細胞が、以下:a遺伝子改変されていない宿主細胞と比較した1以上のリジン生合成経路酵素の酵素活性の増加;bリジン生合成経路酵素をコードする各遺伝子の1以上のコピー;およびcリジン生合成経路酵素をコードする1以上の遺伝子の転写を調節する1以上の転写因子の改変、のうちの1以上を含み、ここで、該宿主細胞は、該培養培地中でリジンを産生する、方法。項目31項目30に記載の方法であって、ここで、前記増加した酵素活性が、1以上のリジン生合成経路酵素をコードする1以上の遺伝子の過剰発現を含む、方法。項目32項目31に記載の方法であって、ここで、前記1以上の遺伝子が、1以上のプロモーター配列に直接的にまたは間接的に作動可能に連結される、方法。項目33項目32に記載の方法であって、ここで、前記作動可能に連結されたプロモーター配列が、異種、内因性、またはハイブリッドである、方法。項目34項目33に記載の方法であって、ここで、前記プロモーター配列が、以下:C.glutamicumに内因性の遺伝子の5’末端由来のプロモーター配列、C.glutamicumにおいて複製するプラスミド由来のプロモーター配列、およびC.glutamicumに感染するファージのゲノム由来のプロモーター配列、の1つ以上である、方法。項目35項目33または34に記載の方法であって、ここで、前記プロモーター配列の1つ以上が、改変されている、方法。項目36項目35に記載の方法であって、ここで、前記改変が、5’末端における短縮、3’末端における短縮、1つ以上のヌクレオチドの非末端挿入、1つ以上のヌクレオチドの非末端欠失、5’末端における1つ以上のヌクレオチドの付加、3’末端における1つ以上のヌクレオチドの付加、およびこれらの組み合わせを含む、方法。項目37項目30に記載の方法であって、ここで、前記増加した酵素活性が、1つ以上の改変されたリジン生合成経路酵素の活性から生じ、ここで、該酵素活性の改変が、その改変を欠いている酵素と比較した、反応速度論的パラメーター、アロステリック調節またはその両方における変化を生じる、方法。項目38項目37に記載の方法であって、ここで、前記反応速度論的パラメーターにおける変化が、Km、Vmaxまたはその両方における変化である、方法。項目39項目37に記載の方法であって、ここで、前記アロステリック調節における変化が、1つ以上の酵素アロステリック調節部位における変化である、方法。項目40項目37に記載の方法であって、ここで、前記改変が、前記酵素をコードするヌクレオチド配列における変化の結果である、方法。項目41項目40に記載の方法であって、ここで、前記ヌクレオチド配列における前記変化が、1つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせである、方法。項目42項目30に記載の方法であって、前記1つ以上の転写因子の改変が、転写インヒビタータンパク質における1以上の変異、転写アクチベータータンパク質における1以上の変異、あるいはその両方を含み、ここで、該1以上の変異は、該改変を欠いている該1以上の転写因子による転写と比較して、標的ヌクレオチド配列の転写を増加する、方法。項目43項目42に記載の方法であって、前記1つ以上の変異が、前記転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列における変化である、方法。項目44項目43に記載の方法であって、ここで、前記ヌクレオチド配列における前記変化が、1つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせである、方法。項目45単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、配列番号19のアミノ酸配列に対する少なくとも95の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。項目46項目45に記載のポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、配列番号19のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。項目47項目45に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。項目48配列番号18の配列を有する核酸を含む、項目47に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。項目49項目47に記載されるポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。項目50項目49に記載されるベクターを含む、宿主細胞。項目51項目50に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、NRRLB30360である、宿主細胞。項目52方法であって、以下:aCorynebacterium種の宿主細胞を、項目47に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、およびb形質転換された宿主細胞を選択する工程、を包含する、方法。項目53単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、配列番号21のアミノ酸配列に対する少なくとも95の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ポリペプチド。項目54配列番号21のアミノ酸配列を有する、項目53に記載のポリペプチド。項目55項目53に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。項目56配列番号20の配列を有する核酸を含む、項目55に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。項目57項目55に記載のポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。項目58項目57に記載のベクターを含む、宿主細胞。項目59項目58に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、NRRLB30218、NRRLB30220、およびNRRLB30222からなる群より選択される、宿主細胞。項目60方法であって、以下:aCorynebacterium種の宿主細胞を、項目55に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、およびb形質転換された宿主細胞を選択する工程、を包含する、方法。項目61項目2に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、さらに、プロモーター配列を含み、ここで、該プロモーター配列が、配列番号17に対する少なくとも95の配列同一性を有する、ポリヌクレオチド分子。項目62項目61に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記プロモーター配列が、配列番号17のヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド。項目63項目61に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、ここで、前記プロモーターが、LysA遺伝子に作動可能に直接連結されている、ポリヌクレオチド分子。項目64項目61に記載される単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。項目65項目64に記載されるベクターを含む、宿主細胞。項目66項目65に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、NRRLB30359である、宿主細胞。項目67方法であって、以下:aCorynebacterium種の宿主細胞を、項目61に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、およびb形質転換された宿主細胞を選択する工程、を包含する、方法。本発明の目的は、Corynebacterium種におけるアミノ酸の産生を増加する方法を提供することであり、これは、宿主細胞におけるアミノ酸生合成経路の遺伝子単数または複数の数を増幅すなわち、増加することによる。特に好ましいCorynebacterium種としては、Corynebacteriumglutamicum、BrevibacteriumflavumおよびBrevibacteriumlactofermentumが挙げられる。本発明の目的は、単離されたフィードバック耐性アスパルトキナーゼ酵素を提供することであり、ここで、このフィードバック感受性形態における天然に存在するトレオニンアミノ酸残基380が、ATCC21529のask遺伝子においてイソロイシンに変化されている。本発明の目的は、配列番号2のアミノ酸配列を含む単離されたaskポリペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、配列番号2のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明の別の目的は、配列番号1の配列を有する核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明の別の目的は、以下の工程を含む方法を提供することである:Corynebacterium種宿主細胞を、配列番号2のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子で形質転換する工程であって、この単離されたポリヌクレオチド分子は、この宿主細胞の染色体に組み込まれ、これによって、この宿主細胞染色体におけるこのアミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加する、工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程。本発明のさらなる目的は、増加されたアミノ酸産生についてスクリーニングする工程を包含する方法を提供することである。この方法はさらに、この形質転換された宿主細胞を培地中で増殖させる工程およびこの形質転換された宿主細胞によって産生されたアミノ酸を精製する工程を包含する。別の実施形態において、アミノ酸の産生を増加するための方法は、Corynebacterium種宿主細胞を、配列番号2のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子で形質転換する工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程、を包含する方法であって、ここで、この単離された核酸分子は、この宿主細胞染色体に組み込まれ、それによって、この宿主細胞染色体におけるこのアミノ酸の生合成経路遺伝子の総数を増加し、かつここで、この単離された核酸分子は、以下のうちの少なくとも1つをさらに含む:Corynebacterium種リジン経路のasdアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;Corynebacterium種リジン経路のdapAアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;Corynebacterium種リジン経路のdapBアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;Corynebacterium種リジン経路のddhアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;Corynebacterium種リジン経路の‘lysAアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;Corynebacterium種リジン経路のlysAアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;Corynebacterium種リジン経路のORF2アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。この方法はさらに、この形質転換された宿主細胞を培地中で増殖させる工程およびこの形質転換された宿主細胞によって産生されたアミノ酸を精製する工程を包含する。用語‘lysAとは、出願人によって使用されかつ以下に記載される、短縮型lysAの遺伝子またはアミノ酸配列をいう。用語lysAとは、出願人によって使用されかつ以下に記載される、全長lysAの遺伝子またはアミノ酸配列をいう。本発明の別の目的は、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することであって、このポリヌクレオチドは、配列番号2のCorynebacteriumglutamicumリジン経路のaskアミノ酸配列をコードする核酸分子;および以下からなる群より選択される少なくとも1つのさらなるCorynebacterium種のリジン経路遺伝子を含む:asdポリペプチドをコードする核酸分子、dapAポリペプチドをコードする核酸分子、dapBポリペプチドをコードする核酸分子、ddhポリペプチドをコードする核酸分子、‘lysAポリペプチドをコードする核酸分子、lysAポリペプチドをコードする核酸分子およびORF2ポリペプチドをコードする核酸分子。本発明の好ましい実施形態において、この単離されたポリヌクレオチド分子は、pK184-KDABH’Lを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、この単離された核酸分子は、pK184-KDABを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、この単離された核酸分子は、pD2-KDABHLを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、この単離された核酸分子は、pD11-KDABH’Lを含む。本発明の別の目的は、単離されたポリヌクレオチド分子で形質転換された宿主細胞であって、このポリヌクレオチド分子が、配列番号2のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞を提供することであり、ここで、この単離された核酸分子は、この宿主細胞染色体に組み込まれ、それによって、この宿主細胞染色体中のアミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加する。1つの実施形態において、このポリヌクレオチドは、以下からなる群より選択される少なくとも1つのさらなるCorynebacterium種のリジン経路遺伝子をさらに含む:asdポリペプチドをコードする核酸分子;dapAポリペプチドをコードする核酸分子;dapBポリペプチドをコードする核酸分子;ddhポリペプチドをコードする核酸分子;‘lysAポリペプチドをコードする核酸分子;lysAポリペプチドをコードする核酸分子;およびORF2ポリペプチドをコードする核酸分子。別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、このasdポリペプチドが配列番号4であり;このdapAポリペプチドが配列番号6であり;このdapBポリペプチドが配列番号8であり;このddhポリペプチドが配列番号10であり;この‘lysAポリペプチドが配列番号21であり;このlysAポリペプチドが配列番号14であり;そしてこのORF2ポリペプチドが配列番号16である、ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む。別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、このasdポリペプチドが配列番号4であり;このdapAポリペプチドが配列番号6であり;このdapBポリペプチドが配列番号8であり;このddhポリペプチドが配列番号10であり;この‘lysAポリペプチドが配列番号21であり;このlysAポリペプチドが配列番号14であり;そしてこのORF2ポリペプチドが配列番号16である、核酸分子をさらに含む。別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号21の‘lysAアミノ酸配列をコードする核酸分子;および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号14のlysAアミノ酸配列をコードする核酸分子;および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。1つの実施形態において、形質転換された宿主細胞は、以下からなる群より選択されるBrevibacteriumである:BrevibacteriumflavumNRRL-B30218、BrevibacteriumflavumNRRL-B30219、BrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30220、BrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30221、BrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30222、BrevibacteriumflavumNRRL-B30234およびBrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30235。別の実施形態において、宿主細胞は、EscherichiacoliDH5αMCRNRRL-B30228である。別の実施形態において、宿主細胞は、C.glutamicumNRRL-B30236およびC.glutamicumNRRL-B30237からなる群より選択されるC.glutamicumである。本発明の別の目的は、リジンを産生する方法を提供することであり、この方法は、配列番号2のアミノ酸配列を含む宿主細胞を培養する工程を包含し、ここで、この宿主細胞は、a遺伝子改変されていない非ヒト宿主細胞と比較した1以上のリジン生合成経路酵素の酵素活性の増加;bリジン生合成経路酵素をコードする各遺伝子の1以上のコピー;およびcリジン生合成経路酵素をコードする1以上の遺伝子の転写を調節する1以上の転写因子の改変、のうちの1以上を含み、ここで、この宿主細胞は、この培養培地中でリジンを産生する。本発明の1つの実施形態において、この酵素活性の増加としては、1以上のリジン生合成経路酵素をコードする1以上の遺伝子の過剰発現が含まれる。本発明の別の実施形態において、この酵素活性の増加は、1以上の改変されたリジン生合成経路酵素の活性から生じ、ここで、この酵素の改変は、その改変を欠いている酵素と比較した、反応速度パラメーター、アロステリック調節またはその両方における変化を生じる。本発明の別の実施形態において、1以上の転写因子の改変としては、転写インヒビタータンパク質における1以上の変異、転写アクチベータータンパク質における1以上の変異、あるいはその両方を含み、ここで、この1以上の変異は、この改変を欠いているこの1以上の転写因子による転写と比較して、標的ヌクレオチド配列の転写を増加する。本発明の目的は、単離されたポリペプチドを提供することであり、このポリペプチドは、配列番号19のアミノ酸配列に少なくとも95の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる目的は、配列番号19のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、配列番号18の配列を有する核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供することである。本発明の別の目的は、宿主細胞NRRLB30360を提供することである。本発明の目的は、単離されたポリペプチドを提供することであり、このポリペプチドは、配列番号21のアミノ酸配列に少なくとも95の配列同一性を有するポリペプチドを含む。本発明のさらなる目的は、配列番号21のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、配列番号20の配列を有する核酸を含むポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明の目的は、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することであり、このポリヌクレオチド分子は、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、プロモーター配列をさらに含み、ここで、このプロモーター配列は、配列番号17に対して少なくとも95の配列同一性を有する。本発明のさらなる目的は、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することであり、このポリヌクレオチド分子は、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このポリヌクレオチド分子は、配列番号17の配列をさらに含む。本発明のさらなる目的は、宿主細胞NRRLB30359を提供することである。本発明のさらなる目的および利点は、以下の説明から明らかである。好ましい実施形態の詳細な説明A.定義本明細書および特許請求の範囲このような用語に与えられる範囲を含むの明確でかつ整合性のある理解を提供するために、以下の定義を提供する。用語aまたはanという構成要素が、一つ以上の構成要素を言及することもまた、注目されるべきである;例えば、ポリヌクレオチドという表現は、一つ以上のポリヌクレオチドを表わすことが理解される。アロステリック調節本明細書中で使用される場合、この用語は、一つ以上のリガンドアロステリックエフェクターが一つ以上の結合部位に結合することによる、酵素活性の調節を表している。このリガンドは、同じ分子または、異なった分子であり得る。これらの分子は、酵素活性部位以外の酵素上の結合部位で結合する。結合の結果、コンフォメーション変化が酵素の中で誘導され、これは基質または他のリガンドに対する活性部位の親和性を調節する。アロステリックエフェクターは、触媒部位の基質親和性を増大するアロステリックアクチベーター役割または親和性を減少するアロステリックレプレッサー役割を果たし得る。アロステリックエフェクターは、例えばフィードバックループのような、代謝制御機構の基礎を形成するCopeland,RobertA.、Enzymes.APractica1IntroductiontoStructure、Mechanism、andDataAnalysis,279~296頁、Wiley-VCH、NewYork1996を参照のこと。アミノ酸生合成経路遺伝子本明細書中で使用される場合、用語アミノ酸生合成経路遺伝子は、直接アミノ酸合成に関与する、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素をコードする、遺伝子および遺伝子フラグメントを含むことを意味する。これらの遺伝子は、宿主細胞の中で天然に存在して、宿主細胞の中でアミノ酸特にリジンの合成に関わる遺伝子と同一である。あるいは、このような遺伝子の改変体または変異体が存在し得、例えば、この遺伝子はこのコードされるタンパク質の活性に有意な影響を与えない改変体および変異体を含み得る。例えば、天然の遺伝子は、変異誘発、または一つ以上のヌクレオチドの導入もしくは置換、またはこの遺伝子の非必須領域を欠失させることにより改変され得る。栄養素要求株本明細書中で使用される場合、この用語は、増殖のために獲得性の遺伝子欠陥のために合成され得ない特定の代謝産物の外部の供給源を必要とする、微生物の株をいう。アミノ酸補充物本明細書中で使用される場合、この用語は、増殖のために必要とされ、そして栄養素要求株の増殖を支持するために、最少培地に添加される、アミノ酸をいう。染色体組込み本明細書中で使用される場合、この用語は外因性DNAフラグメントを、宿主生物の染色体へ挿入することをいい、より具体的には、この用語は、外因性DNAフラグメントと宿主細胞の染色体の適切な領域との間での相同組換えのために使用される。エンハンサー本明細書中で使用される場合、この用語は、プロモーター活性を刺激し、そして、そのレベルすなわち、プロモーターの強さを増大させるために挿入された内因性エレメントまたは異種起源のエレメントであり得る、DNA配列をいう。高収率誘導体本明細書中で使用される場合、この用語は、それが由来する親株と比較した場合、ブドウ糖から特定のアミノ酸を高収率を産生する、微生物の株をいう。宿主細胞本明細書中で使用される場合、用語宿主細胞は、用語微生物と置換え可能であると意図される。違いが意図される場合は、その違いは明確にされる。単離された核酸分子本明細書中で使用される場合、この用語は、天然の環境から取り出された、核酸分子、DNAまたはRNAを意味することを意図される。例えば、ベクターの中に含まれる組換えDNA分子は、本発明の目的のために単離されると考えられる。単離されたDNA分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において保持された組換えDNA分子、または部分的に、または実質的に精製された溶液中の組換えDNA分子を含む。単離されたRNA分子は、インビボまたはインビトロでの本発明のDNA分子のRNA転写物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は合成的につくられたこのような分子をさらに含む。リジン生合成経路タンパク質本明細書中で使用される場合、用語リジン生合成経路タンパク質は、アスパラギン酸塩からリジンの合成に直接関与する、これらのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素を含むことを意味する。オープンリーディングフレームORFがリジン生合成経路オペロンに関係している場合、ORFにコードされるアミノ酸配列もまた、含まれる。これらのタンパク質は、宿主細胞の中で天然に存在し、そして宿主細胞の中でリジンの合成に関与する、タンパク質と同一である。あるいは、このようなタンパク質の改変体または変異体も存在し得、例えば、このタンパク質はこのタンパク質の生物学的活性に有意な影響を与えない、改変体または変異体を含む。例えば、天然のタンパク質は、突然変異により、または一つ以上のアミノ酸を導入もしくは置換することにより、好ましくは、保存的アミノ酸置換により、またはこのタンパク質の非必須領域を除去することにより、改変され得る。このような改変は、標準的な技術により容易に行なわれる。あるいは、リジン生合成タンパク質は特定の宿主細胞に対しては、異種であり得る。このようなタンパク質は、同じまたは類似の生合成的な役割を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する任意の生物由来であり得る。変異誘発本明細書中で使用される場合、この用語は、DNA中に変異が生じるプロセスをいう。ランダム変異誘発を用いた場合、変異の正確な部位は予測不可能であり、微生物のゲノムの任意の場所で起こり、そして変異は、放射線または化学的処置のような因子により生じた物理的な損傷の結果生じる。rDNA変異誘発は、クローン化された目的のDNAを対象とし、そしてこの変異誘発は、ランダムであるか、または部位特異的であり得る。変異本明細書中で使用される場合、この用語は、目的のヌクレオチド配列中における、一つ以上の塩基対変化、挿入もしくは欠失、またはそれらの組合せをいう。作動可能に連結される本明細書中で使用される場合、用語作動可能に連結されるとは、機能的な関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結をいう。核酸が、別の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合、核酸は作動可能に連結される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、これがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されるとは、連結しているDNA配列が代表的には連続であって、必要であれば、連続でありかつ読取り枠中にあるように、2つのタンパク質コード領域を連結することを意味する。しかし、エンハンサーは一般に、プロモーターから数キロベース離れていて、そしてイントロン性intronic配列が様々な長さであり得る場合に、機能するのため、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは作動可能に連結し得るが連続ではない。オペロン本明細書中で使用される場合、この用語は、転写複合体transcriptionalcomplexの連続な部分をいい、この中ではポリペプチドをコードする2つ以上のオープンリーディングフレームが、シス作用するプロモーターおよび効率的な転写にとって必要なシス作用する配列、ならびに効率的な転写および翻訳にとって重要な、さらなるシス作用する配列例えば、mRNA安定性調節領域および転写終結領域により制御される多シストロン性multi-cistronicのメッセンジャーRNAとして、転写される。この用語はまた、一般に、遺伝子の発現および調節DNA中の、構造遺伝子および調節エレメントを含むの単位を言う。親株本明細書中で使用される場合、この用語は、本発明の宿主細胞を生み出すように処置のいくつかの形態を受けた、宿主細胞の株をいう。ブドウ糖からの収率パーセント本明細書中で使用される場合、この用語は、以下の式で定義されたブドウ糖からのアミノ酸の収率をいう:[産生されたアミノ酸g/消費されたブドウ糖g100]=パーセント収率。表現型本明細書中で使用される場合、この用語は、宿主細胞の遺伝子構成に依存的な観察可能な身体的な特徴をいう。プロモーター本明細書中で使用される場合、用語プロモーターは、当該分野で認識された意味を有し、RNAポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の部分を示し、従って、コード配列または機能的なRNAの発現を制御し得るDNA配列をいう。プロモーター配列は一般に、しかし常にではないが、遺伝子の5’非コード領域に見出される。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して3’に位置する。転写開始において機能するプロモーター内の配列エレメントはしばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴付けられる。プロモーター配列は、近位および、より遠位の上流エレメントエンハンサーからなる。本明細書中で使用される場合、用語内因性プロモーターは、宿主微生物中に天然に存在するプロモータ-配列であるプロモーター配列をいう。用語異種プロモーターとは、その宿主微生物中に天然に存在しないプロモータ-配列であるプロモーター配列をいう。異種として存在するプロモーター配列は、任意の原核生物または真核生物由来であり得る。合成プロモーターは、プロモーター活性を有するが、天然には通常は見出されない、ヌクレオチド配列である。プロモーターは全体として、天然の遺伝子に由来し得るか、またはハイブリッドプロモーターであり得る。ハイブリッドプロモーターは、天然において見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されるか、または合成DNAセグメントを含みさえする。ハイブリッドプロモーターは、構成的、誘導的または環境応答的であり得る。有用なプロモーターは構成的および誘導的プロモーターを含む。多くのこのようなプロモーター配列は当該分野で公知である。例えば、米国特許第4,980,285号;同5,631,150号;同5,707,828号;同5,759,828号;同5,888,783号;同5,919,670号およびSambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual、第2版、ColdSpringHarborPress1989を参照のこと。他の有用なプロモーターは、ある特定のまたは公知のインデューサー分子に対して構成的でも応答的でもないプロモーターを含む。このようなプロモーターは、発生上の手掛かり例えば、培養の増殖期、または環境的な手掛かり例えばpH、浸透圧osmoticum、熱、または細胞密度に応答するプロモーターを含み得る。誘導的プロモーターにより転写に影響を与え得る環境条件の例としては、嫌気性条件、上昇した温度、または光の存在が挙げられる。異なったプロモーターが異なった細胞のタイプにおいて、または異なった環境条件に応答して、遺伝子の発現を方向づけ得ることが、当業者に理解される。ほとんどの時間で、ほとんどの細胞のタイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に構成的プロモーターとして言及される。多くの場合において、調節配列の正確な境界は、完全に規定されていないので、異なった長さのDNAフラグメントが同一または類似のプロモーター活性を有し得ることが、さらに認識される。相対的増殖本明細書中で使用される場合、この用語は、規定した時間および規定した培地において、親株の増殖と子孫株の増殖を直接的に比較することにより、増殖の評価を提供する測定をいう。転写因子本明細書中で使用される場合、用語転写因子は、RNAポリメラーゼ、および、DNAと配列特異的な様式で相互作用して転写調節効果を発揮する他のタンパク質をいう。転写因子は、転写阻害タンパク質または転写アクチベータータンパク質であり得る。本発明における状況で、転写因子または、転写複合体についての結合部位はしばしば、転写調節エレメントに含まれる。転写因子認識部位本明細書中で使用される場合、転写因子認識部位および転写因子結合部位は、頻繁に直接的なタンパク質-DNA結合の形態をとる、一つ以上の転写因子の配列特異的相互作用のための部位として同定されるポリヌクレオチド配列また配列モチーフをいう。代表的には、転写因子結合部位は、DNAフットプリンティング、ゲル移動度シフトアッセイgelmobilityshiftassaysなどにより同定され得、そして/または公知のコンセンサス配列モチーフに基づいて、もしくは他の当業者に公知の方法により予測され得る。転写複合体本明細書中で使用される場合、用語転写単位または転写複合体は、構造遺伝子一つ以上のエキソン、シス作用的に連結するプロモーターおよび構造配列の効率的な転写に必要な一つ以上の別のシス作用する配列、この構造配列の適切な転写に必要な遠位の調節エレメント、ならびに効率的な転写または翻訳に重要なさらなるシス配列例えば、ポリアデニル部位、mRNA安定性調節配列を含む、ポリヌクレオチド配列をいう。例えば、米国特許第6,057,299号を参照のこと。転写調節エレメント本明細書中で使用される場合、用語転写調節エレメントは、単独または一つ以上の他のDNAと組合せて転写を活性化するDNA配列をいう。転写調節エレメントとして、例えば、プロモーター、応答エレメント、ネガティブ調節エレメント、サイレンサーエレメント、遺伝子サプレッサ-および/またはエンハンサーが挙げられる。例えば、米国特許第6,057,299号を参照のこと。B.微生物および組換えDNAの方法論本明細書中で提供されたような本発明は、微生物学および組換えDNA技術の当業者に公知の、いくつかの方法および技術を使用する。細菌細胞の増殖、単離したDNA分子の宿主細胞への導入、ならびに単離した核酸分子の単離、クローニング、および塩基配列決定などについての、方法および技術は、このような方法および技術のわずかばかりの例である。これらの方法および技術は、例えば以下に示すような多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている:Davisら、BasicMethodsInMolecularBiology1986、J.H.Miller、ExperimentsinMolecularGenetics、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NewYork1972;J.H.Miller、AShortCourseinBacterialGenetics、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NewYork1992;M.SingerおよびP.Berg、GenesGenomes、UniversityScienceBooks、MillValley、California1991;J.Sambrook、E.F.FritschおよびT.Maniatis、MolecularCloning:ALaboratoryManual、第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NewYork1989;P.B.Kaufmanら、HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine、CRCPress、BocaRaton、Florida1995;MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology、B.R.GlickおよびJ.E.Thompson、編、CRCPress、BocaRaton、Florida1993;ならびにP.F.Smith-Keary、MolecularGeneticsofEscherichiacoli、TheGuilfordPress、NewYork、NY1989。これらは、本明細書中で全体が参考として援用される。別段に示されなければ、本明細書中で新たに記載される全てのヌクレオチド配列は、自動DNAシークエンサー例えば、AppliedBiosystems,Inc.製theModel373を使用して決定された。それゆえに、当該分野で公知のように、この自動化されたアプローチにより決定された任意のDNA配列について、本明細書中で決定された任意のヌクレオチド配列は、いくつかの誤差を含み得る。自動化により決定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたDNA分子の現実のヌクレオチド配列に対して、代表的には、少なくとも約90同一であり、より代表的には少なくとも約95~少なくとも約99.9同一である。現実の配列は、当該分野で周知の手動によるDNA配列決定方法を含む別のアプローチにより、より正確に決定され得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号17、配列番号18および配列番号20、またはこれらの相補的な配列からなる群より選択された配列に少なくとも、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99同一な配列の核酸を含む。核酸の配列が、参照したヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば、95同一である、核酸を含むヌクレオチドにより、この核酸配列が、参照した核酸配列の各100ヌクレオチドあたり5つのミスマッチまでを含み得るをことを除いては、参照配列に同一であることが意図される。換言すれば、核酸の配列が参照する核酸配列に対して、少なくとも95同一である核酸を得るために、参照配列中での5までヌクレオチドが、欠失もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照した配列の中の、全ヌクレオチドの5までの数のヌクレオチドが、参照配列に挿入され得る。参照問合せ配列は、以下に記載するように、配列番号17、配列番号18、もしくは配列番号20に示された全ヌクレオチド配列の任意の1つの配列、またはこれらの配列中の任意のものの任意のフラグメントである。実際的な問題として、任意の特定の核酸配列が、例えば、配列番号17、配列番号18、もしくは配列番号20、またはこれらに相補的な配列からなるヌクレオチド配列に対して、少なくとも、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99同一である否かは、従来どおり、OMIGA登録商標のWindows登録商標用のVersion2.0OxfordMolecular、Ltd.Oxford、U.K.で入手可能のような配列解析コンピュータプログラムを使用することにより決定され得る。OMIGAは、オープンギャップペナルティーが10、そして伸長ギャップペナルティが5.0である初期設定値で、遅い完全なslowfullダイナミックプログラミングアライメント法を用いるCLUSTALWアライメントアルゴリズムを、2つのヌクレオチド配列間における最良のアライメントを求めるために使用する。CLUSTALWまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明に関する参照配列に対して95同一であるか否かを決定する場合、当然、参照配列中のヌクレオチドの総数の5までのギャップ、ミスマッチ、または挿入が認められるように、参照配列の全長に亘って同一性パーセントを計算するように、パラメータを設定する。当該分野で公知である他の配列解析プログラムが、本発明の実施において使用され得る。本発明のこの実施形態は、核酸を含むポリヌクレオチドに関し、この核酸の配列は、これらが機能的な活性を有しているか否かは関係がなく、配列番号17、配列番号18、および配列番号20、またはこれらの相補配列の核酸配列に対して少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99同一である。これは、たとえ特定のポリヌクレオチドが機能的活性を有していない場合でさえ、当業者は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、S1ヌクレアーゼマッピングプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応PCRプライマーをとして、この核酸分子の使用の方法を知っているからである。しかし、配列番号17、配列番号18、または配列番号20、あるいはこれらの相補配列の核酸配列に対して少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99同一である、核酸配列であって、実際にCorynebacterium種において、での機能活性を有する核酸配列を含有する、ポリヌクレオチドが好ましい。例えば、ポリペプチドの参照核酸配列に対して少なくとも、95同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、以下のことが意図される:請求されるポリペプチド配列が、そのポリペプチドの参照アミノ酸配列の各100アミノ酸当たり5つまでのアミノ酸の改変を含み得ることを除いては、特許請求されるポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一である。換言すると、参照配列に対して少なくとも95同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列内でアミノ酸残基5までが欠失または別のアミノ酸と置換され得るか、あるいは、参照配列中の全アミノ酸残基における5までの複数のアミノ酸が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置またはカルボキシ末端位置あるいはこれらの末端位置間の任意の位置で起こり得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列中の一つ以上の連続した群のいずれかに散在する。実際的な問題として、任意の特定ポリペプチドが、例えば、配列番号2で示されたアミノ酸配列または核酸によりコードされたアミノ酸配列に対して、少なくとも、80、85、90、92、95、96、97、98、または99同一であるか否かは、BestfitprogramWisconsinSequenceAnalysisPackage,Version8forUnix登録商標,GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,WI53711のような公知のコンピュータプログラムを使用して慣用的に決定され得る。Bestfitまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明に従った参照配列に対して95同一か否かを決定する場合、当然、同一性パーセントを、参照アミノ酸配列の全長に亘って計算し、参照配列のアミノ酸残基の総数の5までの相同性におけるギャップが認められるように、パラメータを設定する。特定の実施形態において、参照配列問合せ配列、本発明の配列と対象配列subjectsequenceとの間の同一性はまた、グローバル配列アライメントと呼ばれ、BrutlagらのアルゴリズムComp.App.Biosci.6:237-2451990に基づいたFASTDBコンピュータプログラムを用いて、決定される。FASTDBアミノ酸アライメントで使用される好ましいパラメータは、以下である:マトリックス=PAM0、k-タプルk-tuple=2、ミスマッチペナルティMismatchPenalty=l、結合ペナルティJoiningPenalty=20、乱雑化グループ長RandomizationGroupLength=0、カットオフスコア=l、ウインドウサイズ=配列長、ギャップペナルティ=5、ギャップサイズペナルティ=0.05、ウインドウサイズ=500あるいは対象アミノ酸配列の長さのうち、どちらか短い方。この実施形態に従って、対象配列が、内部欠失に起因したわけではなく、N末端またはC末端の欠失に起因して、問合せ配列より短い場合、FASTDBプログラムは、グローバルの同一性パーセントを計算する際に、対象配列のNおよびC末端が打ち切られることを考慮しないという事実を考慮して、手動による修正が結果に対して行われる。NおよびC末端が打ち切られた対象配列について、問合せ配列に関して、同一性パーセントは、対応する対象残基と一致/アライメントされていない、対象配列のNおよびC末端である問合せ配列の残基数を、問合せ配列の全塩基のパーセントとして、計算することにより修正される。残基が一致/アライメントしたか否かの決定は、FASTDB配列アライメントの結果によって決定される。次いで、このパーセントを、特定のパラメータを使用して上記のFASTDBプログラムにより計算された、同一性パーセントから差し引くことにより、最終的な同一性パーセントの値に帰着する。この最終的な同一性パーセント値が、この実施形態の目的のために使用されるものである。問合せ配列と一致/アライメントがなされていない、対象配列のNおよびC末端に対する残基のみが、同一性パーセント値を手動で調節する目的のために考慮される。すなわち、問合せ残基のみが、対象配列の最も遠位にあるN末端およびC末端残基の外側に位置する。例えば、90アミノ酸残基の対象配列は100残基の問合せ配列とアライメントして、同一性パーセントを決定する。欠失が対象配列のN末端において起こり、そして、それゆえにFASTDBアライメントは、N末端における最初の10残基の一致/アライメントを示さない。10つの不対残基は、この配列の10を表すN末端およびC末端の不一致である残基数/問合せ配列における残基の総数。従って、10が、FASTDBプログラムにより計算された同一性パーセント値から差し引かれる。仮に残りの90残基が完全に一致していた場合、最終的な同一性パーセントは90となる。別の実施例において、90残基の対象配列は、100残基の問合せ配列と比較される。この時、欠失が内部欠失であるので、問合せ配列と一致/アライメントをしない対象配列のNまたはC末端において残基は存在しない。この場合、FASTDBにより計算された同一性パーセントは、手動により修正されない。今一度、これらは問合せ配列と一致/アライメントしていない対象配列のNおよびC末端の外側に位置する残基のみが、FASTDBアライメントにおいて示されているように、手動で修正される。他の手動による修正は、この実施形態の目的のためになされない。C.本発明の方法およびプロセス本発明の種々の実施形態は、アミノ酸の産生を増加させるための方法、およびCorynebacterium種宿主細胞由来のアミノ酸の産生のためのプロセスを提供する。特に、本発明の方法およびプロセスの好ましいCorynebacterium種としては、当該分野で公知のCorynebacteriumglutamicum、Brevibacteriumflavum、Brevibacteriumlactofermentum、ならびに他のCorynebacteria種およびBrevibacteria種が挙げられる。当業者によって理解されるように、用語Corynebacterium種は、以前に、文献中でBrevibacterium種として同定されたそれらの生物例えば、現在ではCorynebacterium属に種別変更されたBrevibacteriumflavumおよびBrevibacteriumlactofermentumを含むInt.J.Syst.Bacteriol.41:2551981。本明細書に記載される方法およびプロセスによって具体化されるアミノ酸生合成経路遺伝子は、L-グリシン、L-アラニン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-プロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-システイン、L-チロシン、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、およびL-バリンの生合成についての遺伝子を含む。特に好ましい実施形態は、L-リジンSahmら、Ann.N.Y.Acad.Sci.782:25-391996、L-トレオニン、L-イソロイシン、L-トリプトファン、およびL-バリンについての生合成経路遺伝子に関する。例示の目的で、リジン生合成についてのアミノ酸経路は、Corynebacterium種におけるアミノ酸生産の当業者に周知である。L-アスパラギンのL-リジンへの変換のために重要である酵素をコードする遺伝子は、ask遺伝子、asd遺伝子、dapA遺伝子、dapB遺伝子、ddh遺伝子およびlysA遺伝子を含む図1。従って、本発明は、本明細書中において、例示的な目的のみのために、L-リジン生合成経路遺伝子を利用する特定の実施形態を提供する。他のアミノ酸の合成についての生合成経路遺伝子の使用に関する他の実施形態はまた、本明細書中に記載される本発明によって含まれる。アミノ酸の産生を増加させるための方法および本発明のアミノ酸の産生のためのプロセスは両方とも、Corynebacterium種宿主細胞への、単離された核酸分子の形質転換を必要とする工程を利用する。当業者に公知のように、単離された核酸分子の宿主細胞への形質転換は、エレクトロポレーション、形質導入または他の方法によってもたらされ得る。これらの方法は、本明細書において参考および援用されかつ組み込まれる多数の標準的な実験室取り扱い説明書中に記載される。アミノ酸の産生を増加させるための方法および本発明のアミノ酸の産生のためのプロセスは両方とも、少なくとも1つのアミノ酸生合成経路遺伝子の増幅を必要とする工程を利用する。当業者に対して公知のように、用語増幅は、アミノ酸生合成経路の遺伝子の数を、当該分野で公知の任意の手段によって増加させることを意味する。特に増幅の好ましい手段としては、以下が挙げられる:1挿入による例えば、相同組換えによる、生合成経路の遺伝子のコピーを含む単離された核酸分子の宿主細胞の染色体への付加、および2自己複製する染色体外ベクター例えばプラスミドによる、生合成経路の遺伝子のコピーを含む単離された核酸分子の宿主細胞への付加。アミノ酸の産生を増加させる本発明の別の方法は、少なくとも1つのアミノ酸生合成経路遺伝子の発現を増加させる工程を包含する。発現を増加させる好ましい方法は、異種プロモーター、調節されたプロモーター、調節されていないプロモーター、およびこれらの組み合わせを使用する工程を包含する。単離された核酸分子を宿主細胞の染色体へ挿入する方法は、当業者に公知である。例えば、単離された核酸分子のCorynebacterium種の染色体への挿入は、Jobling,M.ら、NucleicAcidsResearch1817:5315-53161990提出によって記載されるpK184プラスミドを利用して行われ得る。これらのベクターはCorynebacterium種の複製の起点を欠失し、かつカナマイシンkanのような選択マーカーを含むので、このベクターが相同組換えによって宿主細胞染色体へ挿入される場合、細胞は選択下で成長することのみ可能である。代替の実施形態において、本発明はまた、アミノ酸産生を増加させるための方法およびアミノ酸の産生のためのプロセスを提供し、ここで生合成経路遺伝子の増幅は、アミノ酸生合成経路遺伝子をコードする単離された核酸分子を含む自己複製する染色体外ベクター例えば、プラスミドの宿主細胞への導入を通じて達成される。これらの実施形態について適切なプラスミドは、pSR1、およびpSR1の他の誘導体を含むArcher,J.ら、J.Gen.Microbiol.139:1753-17591993。アミノ酸の産生を増加させるための方法に関する本発明の種々の実施形態について、アミノ酸例えば、L-リジンの増加された産生をスクリーニングする工程は、Corynebacterium種宿主株によって培養物中に産生されたL-リジンの量を、アミノ酸生合成遺伝子が増幅されるCorynebacterium種の形質転換された宿主細胞株の量と直接的に比較することによって決定され得る。選択されたアミノ酸の産生のレベルは、ブドウ糖から生成されるパーセントを計算するための以下の式によって簡便に決定され得る:[gアミノ酸/L/g消費されたブドウ糖/L]100。1つの実施形態において、本発明は、以下の工程を包含するアミノ酸の産生を増加させるための方法を提供する:a配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子で、Corynebacterium種宿主細胞を形質転換する工程;b上記宿主細胞の染色体中の、少なくとも1つの上記アミノ酸についての生合成経路遺伝子の数を増幅する工程;c形質転換された宿主細胞を選択する工程;およびd上記形質転換された宿主細胞由来のアミノ酸の、上記宿主細胞と比較して増加された生産についてスクリーニングする工程。特に好ましい実施形態において、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含みかつさらに以下の少なくとも1つを含む単離されたポリヌクレオチド分子で、Corynebacterium種宿主細胞を形質転換する工程を包含するアミノ酸の産生の増加させるための方法を提供する:Corynebacterium種リジン経路asdアミノ酸配列をコードする核酸分子;Corynebacterium種リジン経路dapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;Corynebacterium種リジン経路dapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;Corynebacterium種リジン経路ddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;Corynebacterium種リジン経路‘lysAアミノ酸配列をコードする核酸分子;Corynebacterium種リジン経路lysAアミノ酸配列をコードする核酸分子;およびCorynebacterium種リジン経路ORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子。本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下の少なくとも1つを含む:配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号21の‘lysAアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号14のlysAアミノ酸配列をコードする核酸分子;および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子。本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む:配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子。本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む:配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子。本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む:配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号21の‘lysAアミノ酸配列をコードする核酸分子;および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子。本方法の別の特定の実施形態において、ポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む:配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;配列番号14のlysAアミノ酸配列をコードする核酸配列;および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子。本方法の別の実施形態において、この方法はさらに、培地中の上記形質転換された宿主細胞を増殖させる工程;および上記形質転換された宿主細胞によって産生されたアミノ酸を精製する工程を包含する。本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチドを提供することである:配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;ならびに、asdポリペプチドをコードする核酸分子、dapAポリペプチドをコードする核酸分子、dapBポリペプチドをコードする核酸分子、ddhポリペプチドをコードする核酸分子、‘lysAポリペプチドをコードする核酸分子、lysAポリペプチドをコードする核酸分子、ORF2ポリペプチドをコードする核酸分子からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるCorynebacterium種リジン経路遺伝子。好ましい実施形態において、上記asdポリペプチドは配列番号4;上記dapAポリペプチドは配列番号6;上記dapBポリペプチドは配列番号8;上記ddhポリペプチドは配列番号10;上記‘lysAポリペプチドは配列番号21;上記lysAポリペプチドは配列番号14;および上記ORF2ポリペプチドは配列番号16である。本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである:配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子、および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子。本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである:配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする核酸分子、および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子。本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである:配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号21の‘lysAアミノ酸配列をコードする核酸配列、および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子。本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである:配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;配列番号4のasdアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号6のdapAアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号8のdapBアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号10のddhアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号14のlysAアミノ酸配列をコードする核酸配列、および配列番号16のORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子。本発明のさらなる目的は、pK184-KDABを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、pK184-KDABH’Lを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、pD11-KDABH’Lを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、pD2-KDABHLを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含みかつさらに以下からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるCorynebacterium種リジン経路遺伝子を含むベクターを提供することである:asdポリペプチドをコードする核酸分子;dapAポリペプチドをコードする核酸分子;dapBポリペプチドをコードする核酸分子;ddhポリペプチドをコードする核酸分子;‘lysAポリペプチドをコードする核酸分子;lysAポリペプチドをコードする核酸分子;およびORF2ポリペプチドをコードする核酸分子。さらなる目的は、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子含みかつさらに以下からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるCorynebacterium種リジン経路遺伝子を含むベクターを含む宿主細胞を提供することである:asdポリペプチドをコードする核酸分子;dapAポリペプチドをコードする核酸分子;dapBポリペプチドをコードする核酸分子;ddhポリペプチドをコードする核酸分子;‘lysAポリペプチドをコードする核酸分子;lysAポリペプチドをコードする核酸分子;およびORF2ポリペプチドをコードする核酸分子。さらなる目的は、宿主細胞を提供することであり、ここでこの宿主細胞は、以下からなる群から選択されるBrevibacteriumである:BrevibacteriumflavumNRRL-B30218、BrevibacteriumflavumNRRL-B30219、BrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30220、BrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30221、BrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30222、BrevibacteriumflavumNRRL-B30234およびBrevibacteriumlactofermentumNRRL-B30235。別の実施形態において、宿主細胞は、EscherichiacoliDH5αMCRNRRL-B30228である。別の実施形態において、宿主細胞は、C.glutamicumNRRL-B30236およびC.glutamicumNRRL-B30237からなる群から選択されるC.glutamicumである。本発明はアミノ酸の産生のためのプロセスを提供する。1つの実施形態において、本発明は、以下の工程を包含するアミノ酸を生産するためのプロセスを提供する:aCorynebacterium種宿主細胞を単離された核酸分子で形質転換する工程;b上記核酸に対する少なくとも1つの生合成経路遺伝子の染色体コピーの数を増幅する工程;c形質転換された宿主細胞を選択する工程;d培地中で上記形質転換された細胞を増殖させる工程;およびe上記アミノ残を精製する工程。本発明はまた、配列番号19のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。本発明の1つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号19のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有する。本発明はまた、配列番号19のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子に関する。1つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号18の配列を有する核酸を含む。本発明はまた、配列番号19のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターに関する。1つの実施形態において、本発明は、配列番号19のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞に関する。1つの実施形態において、この宿主細胞は、NRRLB30360である。本発明はまた、Corynebacterium種宿主細胞を、配列番号19のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子で形質転換する工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程を包含する方法に関する。1つの実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。好ましい実施形態において、スクリーニングされるアミノ酸は、リジンである。1つの実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、上記宿主細胞の染色体に結合され、それにより、上記宿主細胞の染色体中の上記アミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加させる。別の実施形態において、ポリヌクレオチド分子はさらに、以下の少なくとも1つを含む:aCorynebacterium種リジン経路askアミノ酸配列をコードする核酸分子;bCorynebacterium種リジン経路asdアミノ酸配列をコードする核酸分子;cCorynebacterium種リジン経路dapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;dCorynebacterium種リジン経路dapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;eCorynebacterium種リジン経路ddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;fCorynebacterium種リジン経路‘lysAアミノ酸配列をコードする核酸分子;gCorynebacterium種リジン経路lysAアミノ酸配列をコードする核酸分子;およびh配列番号16を有するORF2ポリヌクレオチドをコードする核酸分子。この実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。別の実施形態において、スクリーニングされるアミノ酸は、リジンである。本方法の別の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、さらに以下を含む:a配列番号2を有するaskアミノ酸配列をコードする核酸分子;bCorynebacterium種リジン経路asdアミノ酸配列をコードする核酸分子;cCorynebacterium種リジン経路dapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;dCorynebacterium種リジン経路ddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;およびeCorynebacterium種リジン経路lysAアミノ酸配列をコードする核酸分子。この方法の1つの実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。本発明はまた、配列番号21のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。1つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有する。本発明はまた、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも95配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、配列番号20の配列を有する核酸を含むポリヌクレオチド分子を含む。1つの実施形態において、本発明は、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターを含む。本発明は、さらに、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターを含む宿主細胞を含む。1つの実施形態において、本発明は、NRRLB30218、NRRLB30220およびNRRLB30222からなる群より選択される宿主細胞を含む。本発明は、さらに配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子でCorynebacterium種宿主細胞を形質転換する工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程を包含する方法に関する。この方法はさらに、増加されたアミノ酸産物、特に、リジン産物をスクリーニングする工程を包含する。1つの実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、上記宿主細胞の染色体に結合され、それにより、上記宿主細胞の染色体中の上記アミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加させる。1つの実施形態において、本方法はさらに、以下の少なくとも1つを含むポリヌクレオチド分子を含む:aCorynebacterium種リジン経路askアミノ酸配列をコードする核酸分子;b配列番号2を有するCorynebacterium種リジン経路askアミノ酸配列をコードする核酸分子;cCorynebacterium種リジン経路asdアミノ酸配列をコードする核酸分子;dCorynebacterium種リジン経路dapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;eCorynebacterium種リジン経路dapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;fCorynebacterium種リジン経路ddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;gCorynebacterium種リジン経路ORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子;およびh短縮型Corynebacterium種リジン経路ORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子。1つの実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。別の実施形態において、スクリーニングされるアミノ酸は、リジンである。本発明の別の実施形態はまた、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子に関し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、配列番号17を有するプロモーター配列を含む。1つの実施形態において、このプロモーター配列は、配列番号17に対して少なくとも95同一な配列を有する。1つの実施形態において、配列番号17に対して少なくとも95同一な配列を有するこのプロモーター配列は、LysA遺伝子に作動可能に直接連結される。本発明の別の実施形態において、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含むベクターが存在し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、プロモーター配列を含み、ここで、このプロモーター配列は、配列番号17に対して少なくとも95同一な配列を有する。本発明の別の局面において、ベクター配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含むを含む宿主細胞が存在し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、配列番号17に対して少なくとも95同一な配列を有するプロモーター配列を含む。1つの実施形態において、宿主細胞は、NRRLB30359である。本発明はまた、Corynebacterium種の宿主細胞を配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、そして形質転換された宿主細胞を選択する工程を包含する方法に関し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、配列番号17に対して少なくとも95同一な配列を有するプロモーターを含む。1つの実施形態において、本方法はさらに、増加したアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。別の実施形態において、スクリーニングされたアミノ酸は、リジンである。本方法の別の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、この宿主細胞の染色体に組込まれ、それによってこの宿主細胞の染色体においてアミノ酸生合成経路の遺伝子の総数を増加する。本方法の別の実施形態において、このポリヌクレオチド分子はさらに、以下の少なくとも1つを含む:aCorynebacterium種リジン経路asdアミノ酸配列をコードする核酸分子;bCorynebacterium種リジン経路dapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;cCorynebacterium種リジン経路dapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;dCorynebacterium種リジン経路ddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;eCorynebacterium種リジン経路ORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子;f短縮型Corynebacterium種リジン経路ORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子;gCorynebacterium種リジン経路lysAアミノ酸配列をコードする核酸分子;および、h短縮型Corynebacterium種リジン経路lysAアミノ酸配列をコードする核酸分子。この実施形態において、本方法はさらに、増加したアミノ酸産物;特に、リジン産物についてスクリーニングする工程を包含する。本方法の異なる実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、以下を含む:aCorynebacterium種リジン経路asdアミノ酸配列をコードする核酸分子;bCorynebacterium種リジン経路dapAアミノ酸配列をコードする核酸分子;cCorynebacterium種リジン経路dapBアミノ酸配列をコードする核酸分子;dCorynebacterium種リジン経路ddhアミノ酸配列をコードする核酸分子;eCorynebacterium種リジン経路ORF2アミノ酸配列をコードする核酸分子;およびfCorynebacterium種リジン経路lysAアミノ酸配列をコードする核酸分子。この実施形態において、本方法はさらに、増加したアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。好ましい実施形態において、このアミノ酸は、リジンである。当業者に公知の種々の培地を用いて、アミノ酸産生のための細胞の増殖を補助し得る。適切な炭素源の具体的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:炭水化物例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン水解物、セルロース水解物、および糖蜜;有機酸例えば、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸;ならびに、アルコール例えば、グリセロール。適切な窒素源の具体的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:アンモニアアンモニアガスおよびアンモニア水を含む;無機酸のアンモニア塩または有機酸のアンモニア塩例えば、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム;ならびに他の窒素含有供給源食肉抽出物、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン水解物、大豆粕水解物、尿素および酵母抽出物を含む。アミノ酸の産生に関するdrawnto本発明のプロセスにおいて利用され得る種々の発酵技術が、当該分野で公知である。一般に、アミノ酸は、発酵プロセス例えば、回分型または流加fed-batch型において、本発明から商業的に産生され得る。回分型発酵において、全ての栄養素は、発酵開始時に添加される。流加型発酵または長時間extended流加型発酵において、発酵の最初からかまたは培養物が熟成certainageに達した後にか、あるいは供給される栄養素が培養液から消耗された場合に、1つかまたは多数の栄養素が培養液中へ持続的に供給される。流加型発酵である長時間回分extendedbatchの改変型は、反復流加発酵または満杯時汲み出しfill-and-draw発酵であって、ここで、例えば、発酵槽が満杯の場合、発酵槽の内容物の一部はそのうち除去されるが、栄養素の供給は続けられる。この方法において、発酵は、長期間延長され得る。別の型の発酵持続的発酵またはケモスタット培養では、完全培地の持続的供給を用いるが、培養液は、発酵槽におけるブロスの容量がおよそ一定であるように、持続的または半持続的に廃棄され得る。持続的発酵は、原則として無限に継続され得る。回分発酵において、生物体は、培地において必須栄養素のうちの1つが消耗されてしまうまでか、または、発酵条件が好ましくなくなる例えば、pHが微生物の増殖に対して阻害性の値まで低下するまで増殖する。通常、流加発酵において、例えば、pHの制御を用いることによって好ましい増殖条件を継続するように措置がなされ、そして培養物へこれらの栄養素を供給することによって、1つ以上の必須栄養素の消耗が妨げられる。微生物は、栄養素の供給速度によって決定づけられる増殖速度で成長し続ける。一般に、単一の栄養素頻繁には、炭素源が、増殖を制限するようになる。同じ原理が持続的発酵に適用され、通常、培地に供給される1つの栄養素が限定され、他の栄養素全ては過剰にある。この限定される栄養素は、非常に低いしばしば、測定不可能な低い濃度で培養液中に存在する。種々の型の栄養素の限定が、利用され得る。炭素源の限定が、最も頻繁に用いられる。他の例としては、窒素源による限定、酸素による限定、特定の栄養素例えば、ビタミンまたはアミノ酸微生物がこのような化合物に対する栄養素要求株である場合による限定、硫黄による限定、およびリンによる限定が挙げられる。アミノ酸は、当該分野で公知の任意の方法によって回収され得る。具体的な手順は、以下において提供される:VanWalsem,H.J.Thompson,M.C.,J.Biotechnol.59:127-1321997、および米国特許第3,565,951号、これらの両方は、本明細書において参考として援用される。本明細書において記載される本発明は、少なくとも1つのL-リジンアミノ酸生合成遺伝子を含む単離された核酸分子を提供する。他に示されない限り、本明細書において記載される全てのヌクレオチド配列は、自動化DNAシーケンサー例えば、AppliedBiosystems,Inc.からのModel373を用いて決定され、そして本明細書において記載されるDNA分子によってコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、関連DNA配列の翻訳によって予測された。従って、当該分野で公知であるように、この自動化アプローチによって決定された任意のDNA配列について、本明細書において決定された任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含み得る。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、代表的には、配列決定されたDNA分子の実際のヌクレオチド配列に対して少なくとも約90同一、より代表的には、少なくとも約95~少なくとも約99.9同一である。実際の配列は、当該分野で周知の手動のDNA配列決定方法を含む他のアプローチによってより正確に決定され得る。当該分野で公知であるように、実際の配列と比較して決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列が、このような挿入または欠失の箇所を起点として、配列決定されたDNA分子によって正確にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。本発明は、Corynebacteriumglutamicumの少なくとも1つのL-リジンアミノ酸生合成経路遺伝子を含むいくつかの単離された核酸分子を提供する。より詳細には、本発明は、以下の単離された核酸分子を提供する:ATCC21529株由来のask遺伝子のヌクレオチド配列配列番号1;ATCC21529株由来のasd遺伝子のヌクレオチド配列配列番号3;NRRL-B11474株由来のdapA遺伝子のヌクレオチド配列配列番号5;NRRL-B11474株由来のdapB遺伝子のヌクレオチド配列配列番号7;NRRL-B11474株由来のddh遺伝子のヌクレオチド配列配列番号9、およびNRRL-B11474株由来のORF2遺伝子のヌクレオチド配列配列番号15。さらに、プラスミドpRS6由来のlysA遺伝子のヌクレオチド配列配列番号13がまた、本明細書において提供されるMarcel,T.ら,MolecularMicrobiology4:1819-18301990。アミノ酸が一つ以上のコドンコード縮重によって核酸レベルでコードされることは、当該分野で公知である。選り抜きのコドンが特定のアミノ酸配列タンパク質、ポリペプチドなどの発現に影響し得ることはまた、当該分野で公知である。従って、本発明はさらに、配列番号2のaskアミノ酸配列をコードする核酸分子に関し、ここで、この核酸分子は、特定のアミノ酸をコードすることが公知である任意のコドンを含む。本発明はまたさらに、タンパク質またはポリペプチドの発現が最適となるように代替コドンを含む核酸配列配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号18、および配列番号20に関する。上記の単離された核酸分子に加えて、本発明はまた、1つより多いL-リジンCorynebacteriumglutamicum生合成遺伝子を含む単離された核酸分子を提供する。このような単離された核酸分子は、カセット構築物といわれる。これらのカセット構築物は、専門家のために、L-リジン生合成遺伝子の遺伝子増幅を達成するために要求される組換えDNA操作の数を簡略化する。カセット構築物に関する1つの実施形態において、本発明は、以下を含む単離された核酸分子を提供する:a配列番号2のCorynebacteriumglutamicumL-リジン経路askアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;ならびにb以下からなる群より選択される少なくとも1つのさらなるCorynebacterium種L-リジン経路遺伝子:1asdポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;2dapAポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;3dapBポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;4ddhポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;5‘lysAポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および6ORF2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。本発明の単離された核酸分子は、好ましくは、適切な核酸ベクターにおいて、増殖および保持される。本発明の単離された核酸分子の単離およびクローニングのための方法は、組換えDNA技術の当業者に周知である。原核生物宿主および真核生物宿主を用いる使用のために適切なベクターおよび方法は、Sambrookら,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989年、によって記載され、この開示は、本明細書において参考として援用される。多種多様なベクターは、本発明において使用され得る。このようなベクターとしては、染色体のベクター、エピソームのベクターおよびウイルス由来ベクター例えば、細菌性プラスミド由来ベクターおよびバクテリオファージ由来ベクター、ならびにそれらの組合せ由来のベクター例えば、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝要素例えば、コスミドおよびファージミド由来のベクターが挙げられ、これらのベクターの全てが本発明のこの局面に従って使用され得る。一般に、細菌宿主においてポリヌクレオチドを保持および増殖させるために適切である任意のベクターは、この点において使用され得る。細菌における使用のための適切な大多数のベクターおよびプロモーターは、公知であり、これらの多くが市販されている。好ましい原核生物ベクターとしては、プラスミド例えば、E.coli例えば、pBR322、ColEl、pSC101、pACYC184、πVXにおいて複製可能なベクターが挙げられる。このようなプラスミドは、例えば、Maniatis,T.らによるMolecularClofiing,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY1982に開示される。以下のベクターは、例示の目的で提供される:pETNovagen、pQE70、pQE60、pQE-9Qiagen、pBs、phagesciipt、psiX174、pBlueScriptSK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46aStratagene、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5Pharmacia。本発明の単離された核酸分子に好ましいベクターは、コンビナトリアルクローニングベクターLonsdale,D.M.ら,PlantMolecularBiologyReporter13:343-3451995のpFC1~pFC7の新規ファミリー、pK184ベクターJobling,M.G.およびHomes,R.K.,NucleicAcidResearch18:5315-53161990を含む。好ましいベクターの別の群は、Corynebacterium種において自律的複製可能であるベクターである。このようなベクターは、微生物発酵の目的でのアミノ酸産生の当業者に周知であり、これらの例としては、pSRI、pMF1014αおよびこれら由来のベクターが挙げられる。本発明は、ATCC21529株のaskポリペプチドの単離されたアミノ酸配列配列番号2を提供する。本明細書において開示された単離されたaskアミノ配列は、培養培地中のL-リジンおよびL-スレオニンの蓄積されたレベルに対するask酵素活性のフィードバック抵抗に関する独特の性質を保有する。他のCorynebacteriumglutamicumask-asd遺伝子配列のDNA配列と比較される場合、本発明は、フィードバック阻害に対して抵抗性を生じるアミノ酸残基380でのスレオニンからイソロイシンへの変化を開示する。本発明はまた、L-スレオニンおよび/またはL-リジンに対するask酵素の感受性の減少を生じる残基380での他のアミノ酸の変化を含む。さらに、本明細書においてより詳細に記載されるように、ベクターは、発現を調節ならびに発現を引き起こす制御領域を含み得る。一般に、このような領域は、転写を制御することによって作動する例えば、とりわけ、インデューサー結合部位またはリプレッサー結合部位およびエンハンサー。本発明のベクターは、一般に選択マーカーを含む。このようなマーカーはまた、増幅に適切であり得るか、またはこれらのベクターは、本目的のためにさらなるマーカーを含み得る。この点において、ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するために1つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。このようなマーカーは、以下を含むが、これらに限定されない:抗生物質耐性遺伝子例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、もしくはカナマイシン耐性遺伝子、または、宿主細胞株が、正常に栄養要求性であるのに対して、栄養素の欠乏においても宿主細胞が増殖することを可能にする自己栄養遺伝子。このベクターが宿主細胞の染色体外に保持されるべきことが意図される場合、このベクターがCorynebacterium種の宿主細胞において複製することを可能にするさらなる複製起点を含む。あるいは、ベクターがCorynebacterium種の染色体中に組込まれることを所望する場合、このベクターは、Corynebacterium中で複製され得ないように構築される。例えば、このようなベクターは、別の生物体例えば、E.coliにおいて増殖可能であり得るが、Corynebacteriumにおいて増殖されるための適切な複製起点を欠く。この実施形態の別の局面において、このベクターは、1つより多い宿主細胞種において複製し得、そして保持され得るシャトルベクターである例えば、このようなシャトルベクターは、Corynebacterium宿主細胞例えば、C.glutamicum宿主細胞において、そしてE.coli宿主細胞においてもまた、複製可能であり得る。本発明はさらに、以下の単離されたアミノ酸配列を提供する:ATCC21529株のasdポリペプチドのアミノ酸配列配列番号4;NRRL-B11474株のdapAポリペプチドのアミノ酸配列配列番号6;NRRL-B11474株のdapBポリペプチドのアミノ酸配列配列番号8;NRRL-B11474株のddhポリペプチドのアミノ酸配列配列番号10、およびNRRL-B11474株のORF2ポリペプチドのアミノ酸配列配列番号16。さらに、lysApRS6のアミノ酸配列がまた、本明細書において提供されるMarcel,T.ら,Mol.Microbiol.4:819-8301990配列番号14。上記に開示される特定の配列開示によって規定される単離されたポリペプチド配列に加えて、本発明はまた、寄託されたクローンによってコードされるアミノ酸配列を提供する。本発明のいくつかのアミノ酸配列が本明細書に開示されたタンパク質の構造または機能に顕著な影響を与えることなくに変化され得ることは、当該分野において認識される。含まれる改変体は、酵素活性が顕著に影響されない限り、欠失、挿入、転換、反復、および型置換を構成し得る。表現型的にサイレントであるべきようなアミノ酸の変化を考慮する手引きは、Bowie,J.U.ら,DecipheringtheMessageinProteinSequences:TolerancetoAminoAcidSubstitutionsScience247:1306-13101990において見出され得る。本発明のこれらの株は、当業者において公知でかつ利用可能な任意の方法および技術によって調製され得る。本発明の遺伝子構築物の宿主細胞への導入は、エレクトロポレーション、形質導入、または他の方法によってもたらされ得る。これらの方法は、本明細書において参照され、かつ援用される多数の標準的な実験室マニュアルにおいて記載される。本発明の種々の実施形態は、遺伝子増幅の結果として増加したL-リジン産生を有する株を提供する。遺伝子増幅によって、2個、3個、4個、5個、10個以上のコピーの因子によりコピー数をL-リジン生合成経路遺伝子の正常な単一コピー数より多く増加させることが、意味される。本発明の1つの実施形態において、L-リジン生合成経路遺伝子のさらなるコピーが、染色体中に組込まれ得る。本発明の別の実施形態は、L-リジン生合成経路遺伝子のさらなるコピーが染色体外に保有されることを提供する。5個以下の因子による増幅は、単一事象の相同組換えの目的で宿主株の染色体中にさらなる遺伝子コピーを導入することによって得られ得る。最も好ましい実施形態において、この組換え事象は、目的の遺伝子のコピーのさらなる1つのコピーの導入を生じる。5個よりも多い遺伝子のコピーが所望される場合、次いで、本発明はまた、本発明の組換えDNA構築物を保有する多コピープラスミドの使用について提供する。本発明の単離された核酸分子に対して適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:細菌細胞例えば、C.glutamicum細胞、Escherichiacoli細胞、Streptomyces細胞およびSalmonellatyphimuriufn細胞;および、真菌細胞例えば、酵母細胞。上記の宿主細胞について適切な培養培地および培養条件は、当該分野において公知である。本発明の特に好ましい宿主細胞としては、以下が挙げられる:Corynebacteriumglutamicum、BrevibacteriumflavumおよびBrevibacteriumlactofermentum。出願人は、特許手続の目的のために、theBudapestTreatyontheInternationalRecognitionoftheDepositofMicroorganismsに従って、受託可能なInternationalDepositaryAuthorityでpK184-KDABH’L多重遺伝子構築物を保有するクローンを寄託した。この寄託物は、AgriculturalResearchService,CultureCollectionNRRL,1815NorthUniversityStreet,Peoria,Illinois61604で作製されている。宿主細胞の染色体中に組込まれたpK184-KDABまたはpK184-KDABH’Lの多重遺伝子構築物において作製された寄託物としては、以下が挙げられる:1NRRL-B30219およびNRRL-B30221として寄託された、pK184-KDABプラスミド染色体中に組込まれる、ならびに2NRRL-B30218、NRRL-B30220、およびNRRL-B30222として寄託された、pK184-KDABH’Lプラスミド染色体中に組込まれる。さらに、E.coliDH5αMCRに保有された、プラスミド構成中のpK184-KDABH’L多重遺伝子の構築物は、NRRL-B30228として寄託された。6個の遺伝子構築物pDElia2-KDABHLは、E.coliNRRL-B30233において寄託された。pK184-KDABH’Lを含むC.glutamicumは、NRRL-B30236として寄託された。pK184-KDABHLを含むC.glutamicumは、NRRL-B30237として寄託された。pDElia2-KDABHLを含むBrevibacteriumflavumは、NRRL-B30234として寄託された。pDElia2-KDABHLを含むBrevibacteriumlactofefnnentumは、NRRL-B30325として寄託された。配列番号2のアミノ酸配列を含む宿主細胞を培養する工程を包含するリジンを産生する方法を提供することが、本発明の目的であって、ここで、この宿主細胞は、以下:a遺伝的に変更されていない宿主細胞と比較して1つ以上のリジン生合成経路酵素の増加した酵素活性;bリジン生合成経路酵素をコードする各遺伝子の1つ以上のコピー;cリジン生合成経路酵素をコードする1つ以上の酵素の転写を調節する1つ以上の転写因子の変更、を含み、ここで、この宿主細胞は、この培養培地中にリジンを産生する。本方法の1つの実施形態のおいて、この増加した酵素活性は、1つ以上のリジン生合成経路酵素をコードする1つ以上の遺伝子を過剰発現させる工程を包含する。本方法の1つの実施形態において、この1つ以上の遺伝子は、1つ以上のプロモーター配列に対して、直接的にかまたは間接的に作動可能に連結される。本方法の別の実施形態において、この作動可能に連結されたプロモーター配列は、異種性であるか、内在性であるか、またはハイブリッドである。本方法の好ましい実施形態において、このプロモーター配列は、以下の1つ以上である:C.glutamicumに対して内在性である遺伝子の5’末端由来のプロモーター配列、C.glutamicumにおいて複製するプラスミド由来のプロモーター配列、およびC.glutamicumを感染するファージのゲノム由来のプロモーター配列。本方法の好ましい実施形態において、1つ以上のこのプロモーター配列は、改変される。別の好ましい実施形態において、この改変は、以下を含む:5’末端での短縮、3’末端での短縮、1つ以上のヌクレオチドの非末端の挿入、1つ以上のヌクレオチドの非末端の欠失、5’末端での1つ以上のヌクレオチドの付加、3’末端での1つ以上のヌクレオチドの付加、およびこれらの組合せ。本方法の別の実施形態において、この増加した活性は、1つ以上の改変されたリジン生合成経路酵素の活性から生じ、ここで、この酵素改変は、この改変を欠く酵素と比較して、動力学的パラメーター、アロステリック調節、またはこれらの両方において、変化を生じる。本方法の1つの実施形態における、動力学的パラメーターにおけるこの変化は、Km、Vmax、またはその両方における変化である。本方法の別の実施形態において、アロステリック調節におけるこの変化は、1つ以上の酵素アロステリック調節部位における変化である。1つの実施形態における、アロステリック調節におけるこの変化は、リガンドに対する1つ以上の酵素アロステリック調節部位の親和性における変化である。これらのリガンドは、同一であり得るかまたは異なり得る。1つの実施形態において、この酵素改変は、この酵素をコードするヌクレオチド配列における変化の結果である。1つの実施形態において、このヌクレオチド配列のこの変化は、1つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはこれらの組合せである。この方法の別の実施形態において、1つ以上の転写因子のこの改変は、転写インヒビタータンパク質における1つ以上の変異、転写アクチベータータンパク質における1つ以上の変異またはその両方を含む。ここで、この1つ以上の変異は、この改変を欠く1つ以上の転写因子による転写と比較して、標的ヌクレオチド配列の転写を増大する。1つの実施形態において、この1つ以上の変異は、この転写因子をコードするこのヌクレオチド配列における改変である。別の実施形態において、このヌクレオチド配列におけるこの改変は、1つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはその組み合わせである。本明細書中で言及されるすべての特許および刊行物は、その全体が参考として明確に援用される。実施例実施例1:L-リジン経路多重遺伝子構築物pK184-KDABおよびpK184-KDABH’Lの調製出願人は、Corynebacterium種の染色体におけるL-リジンアミノ酸生合成経路の1つ以上の遺伝子の数を増幅するためにL-リジンアミノ酸生合成経路多重遺伝子構築物を作製した。また、ATCC21529株のL-リジン生合成遺伝子の注意深い研究を通じて、出願人は、ATCC21529のask遺伝子のアミノ酸残基380におけるスレオニンからイソロイシンのアミノ酸改変を同定した。他のCorynebacteriumglutamicumask遺伝子のDNA配列と比較して、アミノ酸残基380におけるスレオニンからイソロイシンへの改変が認められた図19。これは、アスパラギン酸キナーゼ酵素調節に関する異常なフィードバック抵抗性の性質の原因である。本発明において使用されるアミノ酸生合成経路遺伝子である、L-リジンをコードする単離された核酸分子は、以下の供給源由来である。当業者が理解するように、本発明の単離した核酸分子に関して、本発明は、出願人が示す特定の株の起源に限定されない。Corynebacterium種の任意の株特にCorynebacteriumglutamicumの株を、核酸分子の単離に利用し得、この核酸分子を染色体に位置されるアミノ酸生合成経路遺伝子の数を増幅するのに使用する。特に好ましい株として、以下が挙げられる:NRRL-B11474、ATCC21799、ATCC21529、ATCC21543およびE12。本明細書中に引用および援用される多くの実験手引き書例えば、J.Sambrook,F.F.FritschandT.Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual、第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork1989に見られるようにに見られ得るような、組換えDNA技術の分野に共通の方法と技術を、本発明の多重遺伝子の構築物の作製に使用した。ポリメラーゼ連鎖反応法PCR技術を、本発明の多重遺伝子構築物の作製において広く使用する。典型的な反応において、標準10×ストック溶液100mMTris-HClpH8.3、500mMKCl、1.5mMMgCl2を、1×に希釈して使用する。PCR増幅のために、以下の典型的な反応条件を使用した:10mMTrispH8.3、50mMKCl、1.5mMMgCl2、0.01ゼラチン、200μMデオキシヌクレオチド、0.2~1.0μMプライマーおよび2.5U/100μlpfuポリメラーゼ。以下の標準サイクルパラメーターをまた、PCR反応において使用した:テンプレート変性を94°Cで1分間行い;55°Cのアニーリング温度または特定のプライマーの対に適切なアニーリング温度を1分間行い;産生物の伸長を72°Cで1分間産物が、<500bpである場合、3分間産物が>500bpである場合行った;これらを30サイクル、およびサイクルの最後に、72°C、7分間の最後の伸長を行った。クローニング実験に使用されるプライマーとして、以下が挙げられる:内部的にlysAにアニーリングするプライマーlysAの端から約500bp上流。‘LysAは、lysAから得られた短縮型形態である。出願人は、ask-asd、dapB-ORF2-dapA、ddh、‘lysAおよびlysAのコード領域のクローニングにおいて標準PCRおよびサブクローニング手順を利用した。構築手順および中間体プラスミドを、図18に示す。出願人は、L-リジン生合成経路に使用される以下のベクターの構築において、以下の工程図18を実行した:1.pGEMT-ask-asd:プライマーaskおよびasdを使用するATCC21529のask-asdオペロンを含むおよそ2.6KbのPCR産物を、pGEM-TPromegapGEM-Tvectorsystemにクローニングした;2.pADM21:NRRL-B11474ddhコード領域のおよそ1.3KbのPCR産物両プライマー上に操作されたKpnl部位を有するをpADM20にクローニングした;3.pUC18-ddh:ddhNRRL-B11474を含むpADM21のおよそ1.3KbのKpnIフラグメントを、pUC18のKpnI部位にサブクローニングした;4.pLIC1.7-argS-‘lysA:テンプレートNRRL-B11474ゲノムDNAならびにプライマーargSおよびlysAを使用するPCR産物を、pPMG-LICクローニングベクターPharMingenにクローニングした;5.pM4-dapB-ORF2-dapA:プライマーdapBおよびdapAを使用するおよそ3KbのPCR産物をpM4のXbaI部位にクローニングした;6.pFC3-ask-asd:pGENT-ask-asdのおよそ2.6KbのNsiI-ApaIフラグメントを、PstIおよびApaIで切ったpFC3にクローニングした;7.pFC1-ddh:pUC18-ddhの約1.3KbのSalI-EcoRIフラグメントを、SalIおよびEcoRIで切ったpFC1にクローニングした;8.pFC1-ddh-‘lysA:pLIC1.7-argS-‘lysAのおよそ1.5KbのEcoRIフラグメント短縮型lysADNAを含むを、pFC1-ddhのEcoRI部位にクローニングした;9.pFC5-dapB-ORF2-dapA:pM4-dapB-ORF2-dapAのおよそ3.4kbのBamHI-BgIIIフラグメントをpFC5のBamHI部位にクローニングした;10.pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysA:pFCI-ddh-‘lysAの約2.8KbのNheIフラグメントを、pFC5-dapB-ORF2-dapAのNheI部位にクローニングした;11.pFC-3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysA:pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysAの約6.2KbのNotIフラグメントを、pFC3-ask-asdのNotI部位にクローニングした;12.pDElia9-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysApDElia9-KDABH’L:pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysAの約8.8kbのPmeIフラグメントを、pDElia9のEcoRV部位にクローニングした;そして13.pK184-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysApK184-KDABH’L:pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysAのおよそ8.8KbのPmeIフラグメントを、pK184のHincII部位またはSmaI部位にクローニングした。14.pFC5-ask-asd-dapB-ORF2-dapApFC5-KDAB:pFC3-ask-asdの約2.6KbのKpnI-SmaIフラグメントを、KpnIおよびSmaIで切ったpFC5-dapB-ORF2-dapAにクローニングしたプラスミド。15.pK184-ask-asd-dapB-ORF2-dapApK184-KDAB:pFC5-ask-asd-dapB-ORF2-dapAの約7KbのKpnI-PmeIフラグメントを、KpnIとHincIIで切ったpK184にクローニングしたプラスミド。従って、出願人は、以下のL-リジン多重遺伝子構築物を作製した。1.pK184-KDABH’L、ここで、Kは、askポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す;Dは、asdポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す;Aは、dapAポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す;Bは、dapBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す;H’は、ddhポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す;そして’Lは、‘lysAポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。この構築物を、短縮型6遺伝子構築物と称する。以下で構築された、pK184-KDABHL構築物を、全長6遺伝子構築物と称する。2.pK184-KDAB、ここで、Kは、askポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す;Dは、asdポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す;Aは、dapAポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す;そしてBは、dapBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。この構築物を、4遺伝子構築物と称する。pK184-KDABH’LおよびpK184-KDABの両方は、本明細書中で言及される他の構築物がそうであるように、ORF2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。K、D、A、B、H、Lおよび‘Lによって示される単離された核酸配列によってコードされる示されたポリペプチド配列に加えて、これらの単離された核酸配列はまた、本明細書中に示されたオペロンのための天然のプロモーターエレメントを含むことが、記述されるべきである。従って、ask-asd配列を、それぞれ、以下の天然のプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした;dapAおよびdapB配列オペロンdapB-ORF2-dapAを表すを、それぞれのプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした;ddh配列を、それぞれの天然のプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした、そしてlysAおよび‘lysAの配列を、天然のプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした。選択的遺伝子プロモーターエレメントは、本発明の構築物において利用され得る。例えば、本発明においてこの使用に適切な公知の細菌のプロモーターは、E.colilacIおよびlacZプロモーター、T3およびT7プロモーター、gptプロモーター、lambdaPRおよびPLプロモーター、trpプロモーターまたは本発明の細菌細胞に内在性のプロモーターを含む。本発明に有用な他のプロモーターは、制御されたプロモーター、制御されていないプロモーターおよび異種なプロモーターを含む。このようなプロモーターの多くは、当業者に公知である。Sambook,E.F.ら、MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork1989を参照のこと。実施例2:L-リジンアミノ酸生合成経路遺伝子の2倍増幅例示的な目的に関してのみ、出願人は、本明細書中の実施例を提供する。ここで、少なくとも1つのL-リジンアミノ酸生合成経路遺伝子を、以下よって2倍に増幅する:aCorynebacteriumglutamicum宿主細胞への単離された核酸分子の導入、そしてbこのCorynebacteriumglutamicum宿主細胞の染色体へのこの単離された核酸分子を導入する後の単一交叉相同組換え現象。当業者に理解されるように、少なくとも1または2または3または4または5または6または7または8または9または10またはそれ以上のアミノ酸生合成経路遺伝子を、増幅し得るすなわち、本明細書中の実施例の少数の改変体に少なくとも1または2または3または4または5または6または7または8または9または10倍の因子まで数を増大し得る。pK184-KDABプラスミド、pK184-KDABH’LプラスミドおよびpD2-KDABHLプラスミド実施例4において構築された全長6遺伝子の構築物を、本発明の高収量誘導化細胞株の構築において使用した。これを、単一交叉相同組換え現象を介する宿主細胞の染色体へのpK184-KDAB、pK184-KDABH’LまたはpD2-KDABHLの取り込みを生じる、Corynebacterium種に、プラスミドpK184-KDAB、pK184-KDABH’LおよびpD2-KDABHLDNAを導入する方法によって達成した。本発明のプラスミド構築物の染色体性の組込みによるアミノ酸生合成経路遺伝子の増幅は、いくつかのCorynebacterium株において増大したL-リジン産生を提供する。本発明の単離された核酸分子を用いる細胞形質転換実験に関して、コンピテント細胞の増殖および調製を、以下の手順に従って行ない得る:1Corynebacteriumglutamicumの新鮮な、シングルコロニーを選ぶ工程、そして攪拌しながら30°Cで、250mL攪拌フラスコ中の10mLCMSM1において、一晩培養物を増殖する工程;2500mL攪拌フラスコ中での660nmの光学密度O.D.が0.1になるまで一晩培養した培養物を、200mLの増殖培地に播種する工程;3攪拌しながら30°Cで5~6時間、培養物を増殖する工程;4冷却、密封、滅菌した250mLの遠心管に培養物を注ぐ工程;4°Cで、RefrigeratedSorvallにおいて8~10Kで、10分間遠心分離をする工程;5徹底的に上清を流す工程そして等量の氷冷、滅菌した脱イオン水で細胞ペレットを再懸濁する工程;6同じ条件下で再度、サンプルを遠心分離する工程;7全てのものを氷冷し続けることを忘れずに水で洗浄を繰り返す工程;8徹底的に上清を流す工程そして1mLの氷冷、滅菌した10グリセロール中に細胞ペレットを再懸濁する工程そして冷却、滅菌した1.5mLの微小遠心チューブに細胞を移す工程;9冷却遠心において10分間サンプルを遠心する工程;10上清をピペッティングする工程そして捨てる工程、そしてペレット容積200~400μlの2~3倍の10グリセロールでペレットを再懸濁する工程;そして11必要ならば、冷却したチューブに細胞をアリコートし、そして-70°Cで凍結する工程。pK184-KDAB、pK184-KDABH’LおよびpD2-KDABHLプラスミドDNAを、以下のエレクトロポレーション手順によってCorynebacteriumglutamicum宿主細胞に導入した:1冷却した0.1cmエレクトロキュベットの側壁に35μL細胞/グリセロール溶液をピペッティングする工程;2溶液に約2~4μLのプラスミドをピペッティングする工程そして穏やかな上下のピペッティングによってサンプルを混合する工程;3泡の発生をさけるように、穏やかなタッピングによってエレクトロキュベットの底に全溶液を移す工程4電気ショックの工程の準備ができるまで氷上にサンプルを置いておく工程、電気ショックを与える前にエレクトロキュベットの外壁の任意の曇りを拭く工程そして1度に1.5kV、200Ω、25μFで、細胞にショックを与える工程。細胞を、以下の工程によってエレクトロポレーションからの回復を可能にする:1即座に、エレクトロキュベットに1mLの温めた回復培地をピペッティングする工程、そして徹底的に、ピペッティングによって溶液を混合する工程;2抗生物質抵抗性発現および細胞の回復のために少なくとも3時間、30°Cで溶液をエレクトロキュベット内でインキュベートする工程そして3選択培地にプレートする工程そして30°Cで、3日間インキュベートする工程。実施例3:L-リジン産生が改善された株のスクリーニングおよび選択3日間の増殖後、抗生物質抵抗性の細胞のシングルコロニーを、個々に選択し、親の宿主細胞株による産生を越えてL-リジン産生が増大しているかを決定する。これらの実験で使用した全ての培地の調製法は、表1および表2に見られる。L-リジン産生を、攪拌フラスコ内で増殖した形質転換された、抗生物質抵抗性細胞培養物において決定する。簡潔には、播種培地表1を、深いバッフル付きbaffled250mlBellco攪拌フラスコに20mlのアリコートに分配し、そして20分間オートクレイブした。室温まで冷した後、次いで、これらの播種フラスコに、試験するべき株を播種し、そしてロータリーシェーカーに設置した。これらを、一晩攪拌しながら、30°Cでインキュベートし、翌朝に、各播種の光学密度波長=660nmを記録し、そして各播種フラスコからの2mlの培養物を21mlアリコートのFM3培地また深いバッファル攪拌フラスコ内にに移した。次いで、これらの主フラスコを、シェーカーに戻し、そして30°Cでインキュベートした。48時間のインキュベーション後、1mlの主培養物を各フラスコから除去し、そして、フラスコを、直ぐにシャーカーに戻した。1mlのサンプルに関して、光学密度を、0.1NのHClで1:50に希釈することによって決定し、培地に存在する炭酸カルシウムを溶かした。次いで、各サンプルの残りを遠心分離し、細胞および炭酸カルシウムをペレット化した。上清の1:50の希釈には、水を使用し、ブドウ糖濃度を、この希釈物から決定した。細胞外L-リジン濃度をまた、HPLCによって、この時点で決定した。高収量の誘導化細胞を、ブドウ糖からの収量パーセントすなわち、式[産生されたアミノ酸g/消費されたブドウ糖g100]=収量によって定義されるブドウ糖からのアミノ酸収量を決定することによって簡便に同定し得る。結果を、以下に示す。ここで、親株のE12。NRRL-B11474およびATCC21799を、pK184-KDA、pK184-KDABH’LおよびpDElia2-KDABHLとして同定された本発明の単離されたL-リジン多重遺伝子の核酸分子で形質転換する。pD2-KDABHL構築物を、実施例4と同様に作製した。一旦、高収量の誘導化細胞の系統を、同定したら、この細胞の系統を、さらに、スクリーニングし、アミノ酸生合成経路遺伝子の増幅が、起こっていることを決定する。増幅スクリーニングを、1遺伝子のコピー数を決定するための標準サザンブロット法によってか、または2宿主細胞に導入された、単離された核酸分子のそれぞれの生合成経路遺伝子によってコードされた酵素の全酵素活性の決定によってかのいずれかによって簡便に達成し得る。サザンブロット法による遺伝子コピー数の決定は、本明細書中に参照および援用される実験手引書に記載されるような例えば、J.Sambrook,E.F.FritschおよびT.Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork1989に見られるような、組換えDNA技術の分野で公知の標準の手順を利用して行われる。実施例4L-リジン経路多重遺伝子構築物の調製本発明は、PCR技術を用いて構築される、さらなるL-リジン多重遺伝子構築物をさらに含む。上述のように、標準のPCR手順およびサブクローニング手順を利用し、実施例1におけるものと同様の5遺伝子構築物を生成した。本実施例の構築物は、抗生物質耐性遺伝子、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼCATを含む。CAT遺伝子を、Corynebacteriaにおける発現のためにCorynebacteriaホスホフルクトキナーゼプロモーターに作動可能に連結した。以下の工程を、CAT遺伝子を含む以下の構築物を構築することにおいて実施した:1.pGEMT-ask-asd:プライマーaskおよびasdを用いたATCC21529のask-asdオペロンを含む約2.6KbのPCR産物を、pGEM-TPromegapGEM-Tベクター系にクローン化した;2.pUC18-ddh:ddhを含むpADM21の約1.3KbKpnIフラグメントNRRLB11474を、pUC18へ、KpnI部位においてサブクローン化した;3.pLIC1.7-argS-‘lysA:テンプレートBF100ゲノムDNAならびにプライマーargSおよびlysAを用いた約3KbのPCR産物を、pPMG-LICクローニングベクターPharMingenへクローン化した;4.pM4-dapB-ORF2-dapA:プライマーdapBおよびdapAを用いた約3KbのPCR産物を、pM4へ、平滑末端XbaI部位においてクローン化した;5.pFC3-ask-asd:pGEMT-ask-asdの約2.6KbのNsiI-ApaIフラグメントを、PstIおよびApaIを用いて切断したpFC3へクローン化した;6.pFC1-ddh:pUC18-ddhの約1.3KbのSalI-EcoRIフラグメントを、SalIおよびEcoRIを用いて切断したpFC1へクローン化した;7.pFC1-ddh-‘lysA:pLIC1.7-argS-‘lysAの約1.5KbのEcoRIフラグメント短縮型lysADNAを含むを、pFCI-ddhへ、EcoRI部位においてクローン化した;8.pFC1-ddh-lysA:pRS6の約2.1KbのEcoRI-PstIフラグメントインタクトなlysADNAを含むを、EcoRIおよびPstIを用いて切断したpFC1-ddhへクローン化した;9.pFC5-dapB-ORF2-dapA:pM4-dapB-ORF2-dapAの約3.4KbのBamHI-BglIIフラグメントを、pFC5へ、BamHI部位においてクローン化した;10.pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysA:pFC1-ddh-‘lysAの約2.8KbのNheIフラグメントを、pFC5-dapB-ORF2-dapAへ、NheI部位においてクローン化した;11.pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysA:pFC1-ddh-lysAの約3.4KbのNheIフラグメントを、pFC5-dapB-ORF2-dapAへ、NheI部位においてクローン化した;12.pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysApFC3-KDABH’L:pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysAの約6.2KbのNotIフラグメントを、pFC3-ask-asdへ、NotI部位においてクローン化した;13.pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysApFC3-KDABHL:pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysAの約6.8KbのNotIフラグメントを、pFC3-ask-asdへNotI部位においてクローン化した;14.pK184-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysApK184-KDABH’L:pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysAの約8.8KbのPmeIフラグメントを、pK184へHincIIまたはSmaI部位においてクローン化した;15.pDElia2-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysApD2-KDABHL:pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysAの約9.4KbのPmeIフラグメントを、pDElia2へ、HincII部位においてクローン化したkan遺伝子を含む;全長6遺伝子構築物である;16.pDElia11-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysApD11-KDABH’L:pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-‘lysAの約8.8KbのPmeIフラグメントを、pDElia11へ、HincIIまたはSmaI部位においてクローン化したCAT遺伝子を含む;短縮型6遺伝子構築物である;17.pDElia11-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysApD11-KDABHL:pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysAの約9.4KbのPmeIフラグメントを、pDElia11へ、HincII部位においてクローン化したCAT遺伝子を含む;全長6遺伝子構築物である;18.pDElia2:pUC19の約1.75KbのDraI-SspIフラグメントに連結されたpUC4Kの約1.24Kbの平滑末端PstIフラグメント;19.pDElia11:C.glutamicumfdaプロモーターによって発現されるクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む約1KbのPCR産物を、プライマーUCdraIおよびUCsspIならびにテンプレートとしてpM4を用いて得て、そしてpUC19の約1.75KbのDraI-SspIフラグメントと連結した;クローニング手順のために利用されたプライマーは、以下を含んだ:lysAに対して内部的lysAの末端に対して約500bp上流にアニールするプライマー。K、D、A、B、H、Lおよび‘Lは、上記と同じ意味を持つ。実施例5:L-リジンアミノ酸生合成経路遺伝子の3倍増幅例示の目的のためにのみ、出願人らは、本明細書において、少なくとも1つのL-リジンアミノ酸生合成経路遺伝子が3倍に増幅される例を提供する。プラスミドpD11-KDABH’L実施例4において構築されたを本発明の高収量誘導細胞株の構築に用いた。本発明の単離された核酸分子を用いる細胞形質転換実験のために、コンピテント細胞の増殖調製、および相対的な増殖の決定は、上記のような手順にしたがって実施し得る。プラスミドpD11-KDABH’LDNAをNRRL-B30220pK184-KDABH’Lを含むへ上記のエレクトロポレーション法を用いて導入した。pD11-KDABH’LプラスミドDNAのNRRL-B30220への導入は、単一交差相同組換え事象を経て宿主細胞染色体への1コピーのpD11-KDABH’Lの取り込みを生じた。2コピーの5遺伝子pD11-KDABH’LおよびpK184-KDABH’Lを含む宿主細胞をNRRL-B30222として寄託した。3コピーの5遺伝子1つの内因性コピーならびにpD11-KDABH’LおよびpK184-KDABH’Lの各々の1コピーを有するC.glutamicumATCC21799宿主細胞によって生産されるリジンの量を、以下に示す。実施例6本実施例は、上記のこれらの6遺伝子の各々の発現レベルを増大させるためのプロモーターの変更を記載する。L-アスパラギン酸からL-リジンへの生合成経路の6つの異なる酵素をコードする6つの遺伝子が、Corynebacteriumglutamicumの染色体に挿入されている。各遺伝子のさらなるコピーは、C.glutamicum株由来である。各遺伝子についての発現のレベルを調節するヌクレオチド配列プロモーターは、ネイティブの座においてC.glutamicum染色体上で見出されるものと同じであった。発現の増大は、酵素の比活性の増大、およびアスパラギン酸からリジンへの炭素の流動の改善を生じ得る。グルコースからのリジンの収率は、本技術によって改善され得る。プロモーター配列由来の発現のレベルは、強さと呼ばれる。強いプロモーターは、弱いものより高い発現を示す。プロモーターの強さを決定する機構は、記載されているRecord,M.T.ら大腸菌RNAポリメラーゼ、プロモーターおよび転写開始段階の速度論EscheridchiacoliandSalmonella:CellularandMolecularBiology,ASMPress1996,pp792~881。プロモーター源は、以下に由来するヌクレオチド配列を含む:C.glutamicum染色体に対してネイティブな遺伝子の5’末端、C.glutamicumにおいて複製するプラスミド上の配列、C.glutamicumに感染するファージのゲノム中の配列、またはヒトによって構築されそして天然には見出されない配列tac、trc。リボソームタンパク質の遺伝子、リボソームRNAおよび延長因子は、高い発現レベルを示す。これらの遺伝子のプロモーターは、アミノ酸生合成経路遺伝子の発現を増大させるための候補である。生合成経路における遺伝子のプロモーターを変更する別の理由は、この経路を野生型生物においてこの経路を制御する因子から独立させることである。例えば、C.glutamicumのリジン生合成経路のジアミノピメレートdiaminopimelate脱炭酸酵素を含むオペロンのネイティブプロモーターは、増殖培地においてアルギニンまたはリジンに応答し得る。アルギニンは、転写を3倍増大し、そしてリジンは、転写を3分の1減じたOguizaら,JBact.175:7356~73621993。ジアミノピメレート脱炭酸酵素活性は、10mmMリジンを補充した最小培地で増殖される細胞において60減少したCremerら,JGenMicrobiol.134:3221~32291988。ジアミノピメレート脱炭酸酵素をコードするlysAのプロモーターを置換することは、リジン生合成を培地中のアルギニンレベルおよびリジンレベルから独立させる1つの方法である。実施例6Aアスパラギン酸キナーゼアスパラギン酸からリジンへの経路中の第1の酵素についての遺伝子を調節するaskP1プロモーターより強いプロモーターの例を、以下に示す。E12は、リジンを生産しないC.glutamicum株である。E12は、ATCC13059由来の実験室株である。BF100は、高レベルのリジン生産者であるNRRL-B11474。TACは、商業的に利用可能なプロモーターであり、これは強いプロモーターの例として用いられる。ネイティブのアスパルトキナーゼプロモーターより強いC.glutamicum染色体由来の4つのプロモーターおよびファージ由来の3つのプロモーターが同定された。実施例6BC.glutamicumにおいて発現される場合にアスパルトキナーゼの酵素比活性を増大させる強いプロモーターの例を、以下に示す。実施例6C振盪フラスコ中のリジン生産に対するlacI/trc-askの影響の例を以下に示す。BF100によるリジンの生産は、アスパルトキナーゼプロモーターの強さを増大することによって改善された。実施例7本実施例は、本発明の高収率細胞株の構築におけるベクターpDElia2-ask-asd-dapA-ORF2-dapB-ddh-P1lysApDElia2KDABHP1Lの使用を示す。P1プロモーターを含むHpaI-PvaIIフラグメントを、MarcelT.ら,MolecularMicrobiology4:1819~18301990に記載されるように調製した。出願人らは、上記のように標準PCRおよび標準サブクローニング手順を利用した。本発明の単離された核酸分子を用いた細胞形質転換実験のために、コンピテント細胞の増殖調製、および相対的増殖の決定を上記のような手順にしたがって実施し得る。出願人らは、L-リジン生合成経路において用いられる以下のベクターを構築することにおいて以下の工程を実施した。1.pGEMT-ask-asd:プライマーaskおよびasdを用いてATCC21529のask-asdオペロンを含む約2.6KbのPCR産物をpGEM-TPromegapGEM-Tベクター系にクローン化した。2.pUC18-ddh:ddhを含むpADM21の約1.3KbKpnIフラグメントBF100座をpUC18へ、KpnI部位においてサブクローン化した。3.pFC3-ask-asd:pGEMT-ask-asdの約2.6KbのNsiI-ApaIフラグメントをPstIおよびApaIを用いて切断したpFC3へクローン化した。4.pFC3-dapB-ORF2-dapA:NRRL-B11474のdapB-ORF2-dapAコード領域の約2.9KbのPCR産物をpFC3へ、EcoRV部位においてクローン化した。5.pFC1-ddh:pUC18-ddhの約1.3KbのPstI-EcoRIフラグメントをPstIおよびEcoRIを用いて切断したpFC1へクローン化した。6.pUC19-P1:pRS6のHpaI-PvuIIフラグメント約550bpargS-lysAオペロンの第1のプロモーターP1を含むをpUC19へ、SmaI部位においてクローン化した。7.pUC19-P1lysA:プライマーLysAATGおよびLysA3Bを用いた、NRRL-B11474lysAコード領域のPCR産物約1.45Kbプロモータを含まないをpUC19-P1へ、HincII部位においてクローン化する。8.pFC1-P1lysA:pUC19-P1lysAの約2KbのEcoRI-HindIIIフラグメントをEcoRIおよびHindIIIを用いて切断したpFC1へクローン化した。9.pFC1-P1lysA-ddh:pFC1-ddhの約1.3KbのEcoRI-NotIフラグメントをEcoRIおよびNotIを用いて切断したpFC1-P1lysAへクローン化した。10.pFC1-ask-asd-ddh-P1lysA:pFC3-ask-asdの約2.6KbのSwaI-FseIフラグメントをSwaIおよびFseIを用いて切断したpFC1-ddh-P1lysAへクローン化した。11.pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-P1lysApFC3-KDABHP1L:pFC1-ask-asd-ddh-P1lysAの約5.9KbのSpeIフラグメントを、pFC3-dapB-ORF2-dapAへ、SpeI部位においてクローン化した。12.pDElia2-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-P1lysApDElia2-KDABHP1L:pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-P1lysAの約8.8KbのPmeIフラグメントをpDElia2へ、HincII部位においてクローン化した。プロモータP1を含むHpaI-PvuIIフラグメントのヌクレオチド配列配列番号17を図20に示す。pDElia2-ask-asd-dapA-ORF2-dapB-ddh-P1lysApDElia2-KDABHP1L構築物を含むNRRL-B11474におけるリジン生成の結果を以下に示す。実施例8本実施例は、本発明の高収率細胞株の構築におけるベクターpDElia2FC5-ask-asd-dapB-ddh-lysApDElia2FC5KDBHLの使用を示す。pDElia2FC5KDBHLベクターは、短縮型ORF2遺伝子を含み、そしてdapA遺伝子を欠く。ORF2遺伝子を、内部ClaI部位において切断し、3’領域およびdapA遺伝子を除いた。プロモーターのないlysA遺伝子をNRRL-B11474より得た。本発明の単離された核酸分子を用いた細胞形質転換実験のために、コンピテント細胞の増殖調製、および相対的増殖の決定を上記の手順にしたがって実施し得る。出願人らは、L-リジン生合成経路において用いられる以下のベクターを構築することにおいて以下の工程を実施した。1.pGEMT-ask-asd:プライマーaskおよびasdを用いてATCC21529のask-asdオペロンを含む約2.6KbのPCR産物をpGEM-TPromegapGEM-Tベクター系にクローン化した。2.pFC3-ask-asd:pGEMT-ask-asdの約2.6KbのNsiI-ApaIフラグメントをPstIおよびApaIを用いて切断したpFC3へクローン化した。3.pFC3-dapB-ORF2-dapA:NRRL-B11474のdapB-ORF2-dapAコード領域の約2.9KbのPCR産物をpFC3へ、EcoRV部位においてクローン化した。4.pFC3-dapB:pFC3-dapB-ORF2-dapAの大きなClaIフラグメントを再連結した。5.pUC18-ddh:ddhを含むpADM21の約1.3KbのKpnIフラグメントNRRLB11474座をpUC18へ、KpnI部位においてサブクローン化した。6.pFC1-ddh:pUC18-ddhの約1.3KbのSalI-EcoRIフラグメントをSalIおよびEcoRIを用いて切断したpFC1へクローン化した。7.pFC1-ddh-lysA:pRS6の約2.1KbのEcoRI-PstIフラグメントインタクトのlysADNAを含むをEcoRIおよびPstIを用いて切断したpFC1-ddhへクローン化した。8.pFC1-ask-asd-ddh-lysA:pFC3-ask-asdの約2.6KbSwaI-FseIフラグメントをSwaIおよびFseIを用いて切断したpFC1-ddh-lysAへ、クローン化した。9.pFC3-ask-asd-dapB-ddh-lysA:pFC1-ask-asd-ddh-lysAの約6KbのSpeIフラグメントをpFC3-dapBへ、SpeI部位においてクローン化した。10.pDElia2FC5-ask-asd-dapB-ddh-lysApDElia2FC5-KDBHL:pFC3-ask-asd-dapB-ddh-lysAの約7.3KbのNotI-PmeIフラグメントをNotIおよびPmeIを用いて切断したpDElia2FC5へクローン化した。11.pDElia2FC5:pFC5の小さなPvuIIフラグメントをpDElia2の大きなPvuIIフラグメントと連結した。pDElia2FC5-ask-asd-dapB-ddh-lysApDElia2FC5KDBHLを含むNRRL-B11474におけるリジン生成の結果を以下に示す。理解を明確にすることを目的として例証および実施例によって、いくぶん詳細に本発明を十分に記載しているが、同じことが、これらの条件、形態、および他のパラメータの広くかつ等価な範囲を伴って本発明を改変または変更することによって実施され得ること、およびこのような改変または変更は、添付される請求項の範囲に含まれることが意図されることは、当業者にとって明らかである。本明細書において言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術水準を示し、かつ各個々の刊行物、特許または特許出願が、参考として援用されるように詳細かつ個別に示したものと同じ程度に、本明細書において参考として援用される。"