"不死化ヒト血液細胞、好ましくは骨髄性白血病を起源とする細胞またはそれに由来する細胞の懸濁物を培養するための方法であって、1つまたは複数の以下の特徴を有する方法:a該懸濁物は、結果として生じる特定の電力入力が、少なくとも0.005W/kgとなるように、撹拌される、b該懸濁物は、該懸濁物の限定流の気体供給を可能にするのに適した強度で撹拌される、c該懸濁物は、結果として生じる剪断力が、少なくとも0.1N/m2となるように、撹拌される、d撹拌機が撹拌のために使用される場合、該懸濁物は、該撹拌機の先端における結果として生じる剪断速度が、少なくとも300s-1となるように、撹拌される、e該細胞に、限定流によって少なくとも1つの気体が供給される、f該細胞に、リアクター容積の1リットル当たり多くとも0.05l/時間の流速で少なくとも1つの気体が供給される、g該気体供給が、0.05vvm以下の最大流速を有する。前記懸濁物の撹拌のための前記特定の電力入力が、少なくとも0.01W/kgであり、前記気体供給が、限定気流によって達成される、請求項1に記載の方法。最大気体流量が、0.05vvm以下である、請求項2に記載の方法。ヒト不死化ヒト血液細胞、好ましくはヒト骨髄性白血病を起源とする細胞、またはそれに由来する細胞における、対象とする産物、好ましくは糖タンパク質の組換え産生のための方法であって、該細胞が、対象とする該産物をコードする遺伝子を含み、該細胞が、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法によって培養される方法。発現された対象とする前記産物が、好ましくは細胞培養培地から対象とする該産物を精製することによって、細胞培養物から得られる、請求項4に記載の方法。前記ヒト骨髄性白血病細胞が、K562細胞またはそれに由来する細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記細胞が、細胞保持を伴う連続発酵灌流によって培養される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。連続遠心分離機が、灌流に使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。細胞が、培養の間に、好ましくはブリーディングによって除去される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記細胞培養物中の細胞密度が、少なくとも1×106/mlに達する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記細胞培養物中の細胞生存率が、少なくとも70である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記発酵が、少なくとも80μg/mld、好ましくは少なくとも90μg/mldの最大生産性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。撹拌機が、撹拌に使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。リングスパージャー、マイクロスパージャー、および膜から成る群から選択されるデバイスが、エアレーションに使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。エアレーションのために、少なくとも1種の気体のパルスが、培養プロセス中に与えられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。エアレーションによって引き起こされる気泡発生が、選ばれるエアレーション方法によって制限され、生成される該気泡が、好ましくは、>5mm、好ましくは10mmのサイズを有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。エアレーションのために、純酸素が供給される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記細胞培養物中の酸素値が決定され、酸素のレベルが、所定のレベルより下に下がった場合、酸素および/または酸素を含有する気体もしくは気体混合物が、前記細胞培養培地の中にパルスとして導入される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。所定のレベルのpHまたはpH範囲を維持するために、前記培養中に塩基が添加される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。特徴a~fのどれも含まない対応する方法に対して、細胞凝集の形成が低減する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記細胞培養培地が、剪断保護剤を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記細胞が、無血清培地中で培養される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。細胞培養が、6.5~8、好ましくは7~7.5の間のpH範囲、30~50、好ましくは35~45のpO2、および/または30~40°C、好ましくは37°Cの温度で実行される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。対象とする糖タンパク質のグリコシル化構造および/または前記細胞の産生速度が、培養容積によって実質的に影響を受けない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。発酵槽が、少なくとも1l~1000l、好ましくは10l~250lの容積を有する細胞培養に使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記電力入力がスケールアップ基準として使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法において使用される前記培養プロセスをアップスケールするための方法。本発明は、中でも、細胞培養物の撹拌を増加させると、剪断力がそれに伴って増加するにもかかわらず、スケールアップの間にも良好な収量および品質を有する対象とする産物の産生を可能にする、かなり改善された培養条件がもたらされるという、驚くべき発見に基づく。治療用の使用のための糖タンパク質などの、対象とする産物を産生する場合、これは特に重要な利点である。そのような適用に関しては、異なる発酵槽容積を使用する場合の産物の品質における変化は、GMPプロセスにおいて許容されず、それぞれ、規制当局から承認を得るために必要な労力を増加させる。特に、本発明による培養方法により細胞密度および細胞生存率を改善することができることが分かった。細胞培養培地における栄養素の移送が改善され、エアレーション速度を低下させることができ、これは、気泡発生による細胞の損傷を低下させる。その上、エアレーションにより発生する気泡のサイズおよび/または量が、不死化ヒト血液細胞、好ましくはヒト骨髄性白血病を起源とする細胞を培養する場合に最小限に保たれる場合、培養プロセスが改善されることが分かった。第1の態様によれば、不死化ヒト血液細胞、好ましくはヒト骨髄性白血病を起源とする細胞またはそれに由来する細胞の懸濁物を培養するための方法であって、1つまたは複数の以下の特徴を有する方法が提供される:a前記懸濁物は、結果として生じる特定の電力入力powerinputが、少なくとも0.005W/kg、好ましくは少なくとも0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04、0.05、0.075、または0.1W/kg、より好ましくは0.015~0.03の範囲、より好ましくは0.018~0.025W/Kgとなるように、撹拌される、b前記懸濁物は、前記懸濁物の限定流exclusiveflowの気体供給を可能にするのに適した強度で撹拌される、c前記懸濁物は、結果として生じる剪断力が、少なくとも0.1N/m2、好ましくは少なくとも0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.9、1.0、1.2、1.5、または2.0N/m2となるように、撹拌される、d撹拌機が撹拌のために使用される場合、前記懸濁物は、撹拌機の先端における結果として生じる剪断速度が、少なくとも300s-1、好ましくは少なくとも500、700、900、1100、または1300s-1となるように、撹拌される、e前記細胞に、限定流によって少なくとも1つの気体が供給される、f前記細胞に、リアクター容積の1リットル当たり多くとも0.05l/時間、好ましくは多くとも0.02、0.01、または0.005l/時間の流速で少なくとも1つの気体が供給される、g気体供給は、0.05vvm以下、好ましくは0.02、0.01、または0.005vvm以下の最大流速を有する。本発明の第2の態様によれば、ヒト不死化ヒト血液細胞における対象とする産物の組換え産生のための方法であって、前記細胞が、対象とする産物をコードする遺伝子を含み、前記細胞が、本発明の第1の態様による方法によって培養される方法が提供される。その上、本発明はまた、産物の収量および品質を維持しながら、発酵の好結果のスケールアップを可能にする方法およびツールをも提供する。本発明の第1および第2の態様による方法は、1つまたは複数の以下の目標の達成を可能にする:細胞に対する損傷、とりわけ、気体供給、エアレーション、および/または気泡形成によって引き起こされる損傷を最小限にすること、糖タンパク質が発現される場合の、グリコシル化構造の高い安定性および同一性、良好な産生速度、取扱いの容易さ、細胞凝集の数の低下、スケールアップの容易さ、ならびにプロセスパラメーター変動に対する頑健性。その他に示されない限り、用語本発明による方法複数可は、本発明の第1の態様による方法および本発明の第2の態様による方法の両方を指す。本発明による方法は、撹拌の強度激しさがきわめて高い場合に、本発明によって使用される細胞が、特に良好な増殖特性たとえば生存率および組換えタンパク質の特に良好な産生を示すという驚くべき発見に一部基づく。細胞が、通常、激しい撹拌によって引き起こされる剪断力によって損傷を受ける傾向があるので、これは予想外であった。驚くべき発見は、本発明によって使用されることとなる細胞が、撹拌によって引き起こされる剪断力および空気の気泡によって引き起こされる剪断力に対して異なる感受性を有するということであった。本発明によって使用される細胞は、撹拌機で引き起こされた剪断力に対して非常に頑健であるたとえば、それらは、たとえば0.9N/m2の剪断力およびたとえば1000s-1の剪断速度に対して耐性があるが、それらは、エアレーションに対してきわめて感受性である。限定流の気体供給または低流速での気体供給もまた、これらの手段が気泡によって引き起こされる剪断力を低下させるので、本発明の利点を達成するために使用されてもよい。本発明によって使用される細胞が、限定流の気体供給の適用を可能にするのに十分に激しい撹拌を可能にする程度まで、撹拌によって引き起こされる剪断力に対してかなり非感受性であるのは予想外であった。激しい撹拌は、すべての細胞についての均質な混合および均質な増殖条件を確実にするという有利な効果を有する。好ましい実施形態では、細胞懸濁物は、得られた特定の電力入力が、少なくとも0.005W/kgとなるように、撹拌される。特定の電力入力は、特に、細胞培養物の質量たとえばkgまたは容積たとえばm3当たりの撹拌に使用される電力たとえば、撹拌機を回転させるためのまたは細胞培養物および/もしくは細胞培養容器を回転させる、揺らす、振る、もしくは他の場合には撹拌するためのである。好ましくは、撹拌のための特定の電力入力は、少なくとも0.01、少なくとも0.015、少なくとも0.02、少なくとも0.025、少なくとも0.03、少なくとも0.04、少なくとも0.05、少なくとも0.075、または少なくとも0.1W/kg、より好ましくは0.015~0.03W/kgの範囲、最も好ましくは0.018~0.025W/Kgである。本発明によって使用されることとなる細胞は、ヒトグリコシル化を有する糖タンパク質の産生を可能にし、これは、一般的に、生物学的利用率および機能性の改善につながる。これは、主に、げっ歯動物起源のものであるたとえばCHO細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、現在利用可能な産生系に勝る重要な利点である。その細胞系の主な利点は、他のヒト翻訳後修飾に加えて、ヒトグリコシル化である。本発明によって使用されることとなる不死化ヒト血液細胞は、好ましくは、ヒト骨髄性白血病を起源とする細胞またはそれに由来する細胞である。好ましくは、細胞は、細胞系から、特に、K562細胞系たとえばATCCCCL243として入手可能なK562細胞系またはそれに由来する細胞系からのものである。それぞれの細胞、細胞系、および宿主細胞は、参照によって本明細書に組み込まれるWO2008/028686に詳細に記載される。しかしながら、本発明による方法はまた、高い剪断応力に対して耐性のある他の懸濁細胞または細胞系、特に、真核生物懸濁細胞または細胞系、好ましくはヒト懸濁細胞または細胞系にも適している。不死化ヒト血液細胞、好ましくは骨髄性白血病を起源とする細胞、またはそれに由来する細胞における、対象とする産物、好ましくは糖タンパク質の組換え産生のための方法は、異なる培養容積を使用する場合でさえ、また、撹拌によって引き起こされる高い剪断力をかける場合でさえ、良好な収量および均質な品質を有する対象とする産物を産生することを可能にする。宿主細胞は、対象とする産物をコードする遺伝子を含み、前記細胞は、請求項1に記載の方法によって培養される。対象とする産物をコードする前記遺伝子は、好ましくは組換えで導入される。前記組換え技術は、周知であり、したがって、ここで詳細な記載は必要でない。たとえば、対象とする産物をコードする前記遺伝子は、その後安定してまたは一時的に宿主細胞へと導入される発現ベクター中に含むことができる。対象とする産物は、任意の性質のものとすることができる、好ましくは、それは、タンパク質またはポリペプチドである。好ましくは、前記産物は、グリコシル化される。特に、抗体などの薬学的に活性な産物または他の治療上活性なタンパク質の組換え産生は、重要である。それぞれの産物の大規模産生については、異なる培養容積が使用される場合でさえ良好な収量および良好で均質な品質を有する対象とする産物の産生を可能にする発酵方法が必要である。その上、産物の品質および好ましくは収量もまた、好ましくは、種々の生産費用productionchargeの間で同等であるべきである。これらの利点は、本発明による方法により達成することができる。対象とする発現産物は、たとえば、細胞を破壊することによってまたは細胞培養培地から対象とする分泌産物を収集することによって、細胞培養物から得られる。好ましくは、対象とする産物は、細胞培養培地から精製される。本実施形態では、産物は、好ましくは、細胞によって分泌される。好ましくは、細胞は、細胞保持を伴う連続発酵灌流によって培養され、これは特に良好な結果を示す。本発明による方法において使用される細胞は、定常期の間に識別可能な量の組換えタンパク質を産生しない。したがって、灌流は、ほとんどのタンパク質が産生される指数関数対数増殖期を延長するように役目を果たし得る。そのため、培養に灌流を使用することは、K562細胞などの不死化ヒト血液細胞またはそれに由来する細胞を培養する場合、有利である。灌流モードにおいて、新鮮な培地は、好ましくは連続的に供給される。同じやり方において、無細胞上清が、好ましくは、バイオリアクターから採取され、一方、細胞は、好ましくは、発酵槽中に保持される。灌流発酵槽の重要な特徴は、細胞の保持システムである。細胞は、様々な技術を適用して保持することができる。たとえば、ろ過、遠心分離、または沈降を使用することができる。本発明による灌流方法において、細胞の保持は、好ましくは、スピンフィルター、中空繊維、連続遠心分離機、および音波細胞保持システムacousticcellretentionsystemから成る群から選択されるデバイスによって達成される。好ましくは、CentritechLab連続遠心分離機などの連続遠心分離機が、灌流に使用される。CentritechLab連続遠心分離機を使用する灌流は、0.5l/d~120l/dの間の灌流容積に適しており、より大きな細胞培養については、CentritechCell連続遠心分離機が、使用され得る。この広範囲の容積にわたって、Centritechは、様々なタイプの操作を使用している。いくつかの連続モード:ポンプモード、バルブモード、およびフィードモードならびにポンプモードの変形である非連続周期性モードがある。非連続モードにおいて、遠心分離機は、待ち時間によって中断される実行時間の間に作動している。待ち時間の間、管系は、無細胞であるべきであり、これは、無細胞上清を使用して、各実行後に系を洗い流すことによって保証される。灌流は、Centritechのフィードポンプを設定し、収集ポンプを制御することによって制御される。一実施形態によれば、灌流の速度は、0.5V/d1日当たりの細胞培養容積~2.5V/dの間に設定される。細胞の必要量に対して灌流速度を適切に調整するために、鍵となるパラメーター制御パラメーターが好ましくは選ばれる。理想的には、制御パラメーターは、増殖/産生を制限し、測定するのが容易である。それにもかかわらず、制御パラメーターが増殖を制限する因子ではないことの方が多い。たとえば、グルコースが、制御パラメーターとして設定される。本発明によって使用される細胞の灌流プロセスは、高密度発酵の間の高い細胞生存率を特徴とする。発酵の間に、主な基質、たとえば酸素、グルコース、グルタミンに関する制限も、タンパク新生アミノ酸の制限のいずれもない。さらに、灌流プロセスは、一定の産物品質およびとりわけ一定のグリコシル化パターンを特徴とする。発酵プロセスは、好ましくは、pH7.2、40のDOT溶存酸素圧、および37°Cの温度に制御される。前記不死化血液細胞を用いる発酵は、細胞が、特に撹拌タンクバイオリアクターにおける高い剪断力に対して耐性があるので、高い電力入力たとえば0.022W/m3により実行することができる。灌流条件下では、細胞濃度は、限界に遭遇するまで、通常増加する。この限界は、栄養素または廃棄物の蓄積のいずれかとすることができる。バッチまたはフェドバッチ発酵と比較して、一定の培地供給および廃棄物洗い流しにより、はるかに高い細胞密度に達することができる。それらのより高い細胞密度に基づいて、優れた空時収量が達成される。一実施形態によれば、細胞は、培養中に、好ましくはブリーディングbleedingによって除去される。ブリーディングが適用される場合、ある量の細胞たとえば全容積の10が、発酵槽から採取される。ブリーディングは、細胞がより長い時間、増加した生存率で、増殖期に保たれるという利点を有し、これは、より安定した培養物をもたらす。いくつかのブリーディング戦略は、参照によって本明細書に組み込まれる、Dalmおよび共同研究者による文献において議論されている[Dalmら2004年]、[Dalmら2007年]。対象とするグリコシル化産物の組換え産生にとって重要である、本発明の培養方法の特有の利点は、たとえば糖タンパク質を発現する場合、前記方法が均質で、高度に再現可能な糖構造glycostructureをもたらすということである。好ましい実施形態では、対象とする産物のグリコシル化構造および/または細胞の産生速度は、培養容積によって実質的に影響を受けない。例として、1lリアクターおよび100lリアクターにおける培養物好ましくは灌流培養物が比較される場合である。好ましくは、全体的な産物品質は、培養容積によって実質的に影響を受けない。実施例は、本発明による方法がこれらの利点を達成することができることを示す。一実施形態によれば、細胞培養物中の細胞密度は、少なくとも1×106/mlに達する。好ましくは、細胞密度は、一層高く、たとえば、少なくとも1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、または10×106細胞/mlである。一実施形態によれば、細胞培養物中の細胞生存率は、少なくとも70、好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも85、少なくとも90、または少なくとも95である。一実施形態によれば、本発明による方法において、細胞密度は、少なくとも90の細胞生存率で、一時点で少なくとも5×106/mlに達する。細胞生存率は、特に、試料中のすべての細胞生細胞および死細胞の数と比較した生細胞の数のパーセンテージを示す。好ましい達成可能な最大産生速度は、少なくとも25μg/mld1日当たり細胞培養物1ml当たり25μg産物、好ましくは少なくとも50μg/mld、少なくとも80μg/mld、少なくとも90μg/mld、または少なくとも100μg/mldである。本発明による方法では、好ましくは、撹拌機、特に羽根車が、撹拌に使用される。細胞の培養物は、一般的に、容器中に含有され、これは、たとえば、細胞培養物を含有するためのバッグ、好ましくは使い捨てのバッグ、またはその代わりにバッグ以外の容器、たとえばタンク、コンテナーなどであってもよい。バッグが使用される場合、それは、好ましくは、撹拌に使用される撹拌機と組み合わせられてもよい。好ましくは、発酵槽は、灌流方法に適した、好ましくはよく使用される容器として使用される。本発明による好ましい方法では、リングスパージャー、マイクロスパージャー、および膜から成る群から選択されるデバイスが、エアレーションに使用される。本発明による方法は、本発明によって使用されることとなる細胞の、空気の気泡に対する高い感受性により、本発明でなければ実現可能ではないであろう、気体供給用のスパージャーの使用を可能にする。一実施形態によれば、少なくとも1つの気体のパルスが、エアレーションのために培養プロセスの間に与えられる。一実施形態によれば、エアレーションによって引き起こされる気泡の発生は、選ばれるエアレーション方法によって制限され、生成される気泡は、好ましくは、2mmを超える、好ましくは5mmを超える、より好ましくは10mm以上のサイズを有する。上記に議論されるように、2mmよりも大きな、特に10mmよりも大きな気泡は、より小さな剪断応力をもたらし、したがって、本発明によって使用される細胞に対してそれほど致死的ではない。上記に議論されるように、一般に気体供給またはエアレーションは、好ましくは、限定気流によって達成される。用語限定流は、特に、気体が連続的な様式で供給される定常流とは反対に、非連続的な様式で気体を供給することを指す。用語エアレーションは、特に、酸素たとえば空気、好ましくは純酸素を含むまたはそれから成る気体の供給を指す。好ましくは、エアレーションは、限定流によって実行される。気体供給たとえば酸素を含む気体、好ましくはすべての気体のパルスは、一実施形態によれば、持続時間が多くとも30秒間または多くとも10秒間、3秒間、もしくは1秒間とすることができる。気体が供給される時間の割合は、少なくとも1時間または少なくとも2時間もしくは5時間を超える培養培養する時間のうちの多くとも25または多くとも10、5、2.5、もしくは1とすることができる。好ましくは、懸濁物における酸素飽和度を検出するための手段が、使用される。検出された酸素飽和度が、たとえば、10、好ましくは20、25、30、またはより好ましくは35のpO2またはDOTなどの、あらかじめ定められた閾値よりも低い場合、酸素を含む気体が、好ましくは供給される。好ましくは、エアレーションのために、純酸素が、供給される。したがって、一実施形態によれば、細胞培養物における酸素値、それぞれ、酸素飽和度は、決定され、酸素および/または酸素を含有する気体もしくは気体混合物は、酸素のレベルが、たとえば上記に定められるような所定のレベルより下に下がった場合、細胞培養培地の中にパルスとして導入される。これは、好都合にも、エアレーション、したがって気泡形成を最小限にする。好ましい実施形態では、細胞に、リアクター容積の1リットル当たり多くとも0.05l/時間、好ましくは多くとも0.02、0.01、または0.005l/時間の流速で少なくとも1つの気体が供給される。特に、細胞培養物の全気体供給は、リアクター容積1リットル当たり0.05l/時間以下、好ましくは、リアクター容積1リットル当たり0.02、0.01、または0.005l/時間以下である。用語流速および気体供給は、この点で、好ましくは、全培養プロセスにわたる平均の流速か気体供給を指す。それは、気体が周期的な間隔で細胞培養物に導入される限定気流を使用する場合、供給インターバル中の実際の流速は、上記の値よりも速くてもよいことを意味する。しかしながら、平均して、供給インターバルおよび気体が細胞培養物に導入されないインターバルを考慮すると、全体的な流速または気体供給は、好ましくは、上記に定められるように、リアクター容積1リットル当たり多くとも0.05l/時間である。気体供給が限定気流によって達成される好ましい実施形態では、供給インターバル中の随時の流速最大流速は、0.05vvm1分当たりのリアクター容積当たりの容積以下、好ましくは0.02、0.01、または0.005vvm以下である。あるとりわけ好ましい実施形態では、本発明による方法において、i懸濁物の撹拌のための特定の電力入力が、少なくとも0.01W/kgであり、かつii-1懸濁物に対する少なくとも1つの気体を用いる気体供給もしくは懸濁物に対する全気体供給が、リアクター容積1リットル当たり0.05l/時間以下である、またはii-2気体供給が、限定気流によって達成され、最大流速が0.05vvm以下である。好ましくは、懸濁物の撹拌のための特定の電力入力が、少なくとも0.015W/kgであり、懸濁物に対する少なくとも1つの気体を用いる気体供給もしくは懸濁物に対する全気体供給が、リアクター容積1リットル当たり0.02l/時間以下であるまたは気体供給が、限定気流によって達成される場合、最大流速が0.02vvm以下である。これらの実施形態では、懸濁物の撹拌に起因する剪断力が、少なくとも0.1N/m2、好ましくは0.3N/m2であるおよび/または撹拌機の先端における剪断速度が、少なくとも300s-1、好ましくは500s-1である。一実施形態によれば、塩基が、所定のレベルのpHまたはpH範囲を維持するために培養中に添加される。好ましいpH範囲または値は、5~9の間、より好ましくは6~8.5の間、6.5~8の間、または最も好ましくは7~7.5の間である。塩基の添加は、通常、たとえば乳酸形成を中和するまたはCO2形成を中和するために必要とされる。先行技術において公知の方法では、塩基の添加により、おそらく塩基によって引き起こされる細胞凝集が生じ、細胞溶解が引き起こされ得る。凝集は、死細胞の集合である。凝集は、特に、より大規模で問題となる。本発明による方法は、おそらくより激しい撹拌により、凝集形成を低下させる。本発明による方法は、細胞凝集の形成を低減する。細胞懸濁物に添加されることとなる塩基は、より迅速に均等に分布し得る。本発明による好ましい方法では、細胞凝集の形成が、特徴a~fのどれも含まない対応する方法とは反対に、低減する。好ましくは、塩基が、撹拌機領域のすぐ近くに添加される。その上、塩基が、好ましくは、細胞懸濁物の中に直接添加される、つまり、添加の部位が、懸濁物の表面の下であり、塩基は、懸濁物に滴下されない。細胞は、好ましくは、無血清培地、たとえば既知組成chemicallydefinedGTM培地において培養される。本発明による方法の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、剪断保護剤、たとえば血清、ポリエチレングリコールPEG、ポリビニルピロリドンPVP、ポリビニルアルコールPVA、またはPluronic-F68を含む。剪断保護剤は、好ましくは、<0.01~3g/lの濃度で使用される。好ましくは、細胞培養培地は、無血清である。一実施形態によれば、細胞培養は、6.5~8、好ましくは7~7.5の間のpH範囲、10~90、好ましくは30~50、より好ましくは35~45のpO2、および/または30~40°C、好ましくは37°Cの温度で実行される。好ましい実施形態によれば、対象とする産物のグリコシル化構造および/または細胞の産生速度は、培養容積によって実質的に影響を受けない。好ましくは、本明細書に開示の好ましい実施形態は、互いに組み合わせられる。特に、以下の好ましい組合せが提供される:特徴eと特徴a特徴fと特徴a特徴gと特徴a特徴eおよび特徴gと特徴a特徴eと特徴c特徴fと特徴c特徴gと特徴c特徴eおよび特徴gと特徴c特徴eと特徴d特徴fと特徴d特徴gと特徴d特徴eおよび特徴gと特徴d特徴gと特徴e特徴eおよび特徴gおよび特徴cならびに/または特徴dと特徴a。これらの組合せでは、特に、上記に定められる好ましい値および範囲が、使用されてもよい。ある実施形態では、上記の組合せが、本明細書において定められる1つまたは複数の実施形態、特に特徴bとさらに組み合わせられる。一実施形態によれば、発酵槽は、少なくとも1l、好ましくは少なくとも10l、少なくとも20l、少なくとも50l、少なくとも100l、少なくとも200l、少なくとも500l、または少なくとも1000lの容積、特に1l~1000l、1l~500l、10l~250l、または20l~100lの範囲の容積を有する細胞培養に使用される。上記に議論されるように、驚くべきことに、特に、産物品質だけでなく、生産性もまた、発酵槽のサイズによって影響を受けない。生産プロセスの規模を変更する場合、これは特有の利点である。一実施形態によれば、電力入力は、スケールアップ基準として使用され、よって、特定の電力入力は、異なる発酵槽サイズの間で一定に保たれるしかしながら、好ましくは、およそ25、20、15、10、5の偏差を許容する。好ましくは、特定の電力入力は、少なくとも0.005W/kg、好ましくは少なくとも0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04、0.05、0.075、または0.1W/kg、より好ましくは0.015~0.03の範囲、より好ましくは0.018~0.025W/Kgである。さらなる態様によれば、本発明は、本発明による方法において使用される、培養または生産プロセスをアップスケールするための方法であって、電力入力が、スケールアップ基準として使用される方法に関する。特に、電力入力は、スケールアップの間に、一定に保たれる、すなわち、最初の小規模培養方法のための特定の電力入力は、最終のアップスケールされた大規模培養方法のための特定の電力入力の75~125、好ましくは、80~120、85~115、90~110、または95~105の範囲にある。特に、小規模培養方法および/または大規模培養方法のための特定の電力入力は、少なくとも0.005W/kg、好ましくは少なくとも0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04、0.05、0.075、または0.1W/kg、より好ましくは0.015~0.03の範囲、最も好ましくは0.018~0.025W/Kgである。大規模培養は、好ましくは、小規模培養の細胞培養容積よりも少なくとも25大きい細胞培養容積を有する。より好ましくは、大規模培養の細胞培養容積は、小規模培養の細胞培養容積よりも少なくとも50大きい、少なくとも100大きい、少なくとも1.5倍大きい、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍大きい。特に、本発明は、対象とするタンパク質の組換え産生の規模を変更するための方法であって、以下のステップ:-細胞を培養するための第1の容器を提供するステップ、-不死化ヒト血液細胞またはそれに由来する細胞を提供するステップ、-前記細胞の第1の懸濁物を提供するステップ、-第1の容器に第1の懸濁物を導入するステップ、-本発明による培養または産生方法、特に請求項1~25のいずれかに記載の方法を実行するステップ、-必要に応じて、第1の懸濁物中で産生される対象とする糖タンパク質のグリコシル化構造および/または第1の懸濁物の細胞の産生速度を書き留めるステップ、-第1の容器と異なる内部容積を有する、細胞を培養するための第2の容器を提供するステップ、-前記細胞の第2の懸濁物を提供するステップ、-第2の容器に第2の懸濁物を導入するステップ、-本発明による培養または産生方法、特に請求項1~25のいずれかに記載の方法を実行するステップ、-必要に応じて、第2の懸濁物中で産生される対象とする糖タンパク質のグリコシル化構造および/または第2の懸濁物の細胞の産生速度を書き留めるステップ、-必要に応じて、両方の懸濁物中で産生される対象とする糖タンパク質のグリコシル化構造および/または両方の懸濁物の細胞の産生速度を比較するステップ、を含む方法に関する。用語規模を変更するは、好ましくは、アップスケール、つまり、培養容積を増加させることを指す。本発明による方法たとえば強い撹拌および少ないエアレーションは、本発明により使用されることとなる細胞の良好な増殖を可能にする。それらは、容積および形状が均質でない撹拌タンクバイオリアクターならびに本明細書において、総称して、発酵槽とも呼ばれる多くの他の容器たとえばT型フラスコ、スピナー、およびウェーブバイオリアクターにおいて培養されてもよいことが分かった。撹拌タンクについては、高い生存率>95に加えて約2106細胞/mlの生存細胞密度を達成することができる。灌流モードにおいて、細胞は、>90の高い生存率に加えて107細胞/mlまでの高い細胞密度まで増殖する。良好な比生産性は、たとえば、灌流によって得られてもよい。本発明による方法はプロセスパラメーター変動に関して頑健であるが、標準的な条件は、pH7.2、溶存酸素圧DOT40、および温度37°Cである。少ない気体流量およびリングスパージャーの使用は、驚くべきことに、良好な結果を与える。本発明による方法によって得られる産物品質は、非常に高く、したがって、産生方法に対する選択は、生産性および経済上の考慮に基づいて成すことができる。本発明による方法を使用して抗体を発現した場合、様々な形状比率の10lおよび100lバイオリアクターと比較して1l規模を使用する場合に、グリコシル化パターンが同等であり、したがって不変であることが分かった。本発明により使用される細胞の高い剪断応力の頑健性CHO細胞と比較して少なくとも10倍の増加に基づいて、スケールアップは、一定の特定の電力入力で実行され得る。1l、10l、および100lバイオリアクターの質的および量的性能評価ならびに生化学的特徴付け試験のパネルは、プロセス方法および産物の同等性が、スケールアップのプロセスの間に十分に維持されたことを示す。引用文献実施例1前培養前培養物を、細胞培養フラスコTPP/Biochrom、Germany中で増殖させる。フラスコは、5mlT25、25cm2面積、30mlT75、75cm2、および75mlT150、150cm2の懸濁容積まで使用する。細胞は、2~3日毎に分割し、分割の後に0.15106細胞/mlに細胞濃度を設定することによって、対数増殖期に維持する。メトトレキサートSigma-Aldrich、GermanyおよびピューロマイシンTakaraBioEurope、Franceの添加は、様々な濃度で、週単位でまたは持続的に、クローン依存のやり方で行う。細胞は、37°C、8二酸化炭素、および95相対湿度でインキュベーターIntegraBiosciencesIBS、Biosafeplus、SwitzerlandまたはThermo/HeraeusBBD6220、Germanyにおいて培養する。実施例2スピナー培養容積125mlの細胞懸濁物から始めて、スピナー前培養を、スピナーフラスコIntegraBiosciencesIBS、Cellspin、Switzerlandを使用して実施する。3つの異なる容積0.25l、0.5l、1lのスピナーフラスコを使用する。37°C、8二酸化炭素、および95相対湿度でインキュベーターIntegraBiosciencesIBS、Biosafeplus、Switzerlandの内部で系を作動させながら、スピナー速度を60rpmに設定する。スピナーフラスコに0.15106~0.3106細胞/mlを接種する。前培養の目的のために、細胞は、2~3日毎に懸濁容積を増加させ、分割の後に細胞濃度を0.15106細胞/mlに設定することによって、対数増殖期に維持する。GlycoExpressAおよびGlycoExpressB細胞K562に由来する細胞系の細胞であるについて発酵プロセスを確立する前に、増殖をスピナー培養において分析する。T型フラスコに加えて、スピナーおよび振盪フラスコを前培養の目的のために使用する。T型フラスコと比較して、スピナーフラスコおよび振盪フラスコの両方は、物質移動masstransfer特性を改善し、kla値の増加をもたらす。増殖プロファイルは、バッチ実験において、GlycoExpressAhPM細胞について並行して分析した。細胞は、3つの異なる系すべてにおいて同等に増殖する。T型フラスコ中の細胞濃度は、スピナー培養および振盪培養と比較してわずかに低い。T型フラスコ中の細胞培養物は、より低い細胞密度に達するが、最も高いラクテート濃度を示す。結論付けると、スピナーボトルおよび振盪フラスコは、細胞の培養に等しく十分に適している。両方とも、T型フラスコと比較して、わずかにより良好な増殖を提供するようであり、そのため、発酵前の前培養に十分に適している。これはまた、培養に関する細胞系の頑健性を暗示する。実施例3発酵BiostatB-DCU2l実験室規模発酵を、SartoriusBiostatB-DCU2l系Sartorius、Germanyを使用して実施する。二重壁Univessel2lSartorius、Germany発酵容器は、最小0.8および最大2リットルの、作業容積を有する。一般的に、発酵は、1リットルの作業容積で実行される。発酵槽はすべて、SystecV-150オートクレーブSystec、Germanyにおいて滅菌する。気体混合により、4つの異なる気体を維持する:窒素、酸素、二酸化炭素、および圧縮空気。酸素、二酸化炭素、および圧縮空気は、マスフローコントローラーによって操作するが、窒素は、面積式流量計Q-FlowVoegtlinInstruments、Germanyを使用して制御する。エアレーションもまた、すべての気体について全流量を設定することによって制御することができる。気体供給および排気は、SartoriusMidisart20000.2μmPTFEフィルターSartorius、Germanyを使用してろ過する。溶存酸素濃度は、MettlerTorledoInPro6800電極Mettler-Torledo、Switzerlandを使用してオンラインで測定する。塩基0.5MNaOHの添加および二酸化炭素の添加は、pH値を制御するために使用する。pH値は、Mettler-Torledo405-DPAS-SC-K8S電極Mettler-Torledo、Switzerlandを使用してオンラインで測定する。塩基は、WatsonMarlow100OEMポンプWatsonMarlow、Englandによって添加する。2本の追加のWatsonMarlow100OEMポンプWatsonMarlow、Englandおよび1本のWatsonMarlow313OEMポンプWatsonMarlow、Englandを細胞収集、接種、または他の目的のために使用する。フィード培地は、SartoriusLE10001はかりSartorius、Germanyおよび重量式流量コントローラーgravimetricflowcontrollerを使用してWatsonMarlow101U/RWatsonMarlow、Englandによって添加する。リアクター重量は、EconomySeriesEA60EDE-1はかりSartorius、Germanyを使用して測定した。細胞を、1つまたは2つの3枚羽根弓形羽根車1-2l,adjust,compl.,Φ54/10H7Sartorius、Germanyにより撹拌する。アジテーターのシャフトに、KollmorgenSeidel65M27LL-4.500モーターKollmorgenSeidel、Germanyによって電力を供給する。リアクター容積に依存して、1つまたは2つの撹拌機を適用する:たとえばBiostatB-DCU2lについては、1l作業容積で作業する場合、1つの撹拌機を使用するが、2l発酵のためには2つの撹拌機を使用する。プロセスの冷却は、自律ループautonomousloopおよびFrigomix1000冷却機Sartorius、Germanyを使用して遂行する。バッチ発酵この作業におけるほとんどの発酵は、0.8~2リットル好ましい容積は1lであるの間の作業容積を有するSartoriusBiostatB-DCU系を使用して実行する。その他に示されない限り、発酵は、37°C、pH7.2、および40DOTの空気飽和度で0.15106~0.3106細胞/mlの細胞密度で始める。二酸化炭素気体流量/0.5NaOHを、pHを調節するために使用する。DOTは、圧縮空気または純酸素を使用することによって40に保つ。pHおよびDOTの両方をPID制御する。電力入力の最適化前に、様々なエアレーションシステムを試験する。これらの発酵は、1.5l作業容積で、50rpm撹拌機速度、37°C、40DOT、pH7.2で実行する。リングスパージャー、マイクロスパージャー、および膜エアレーションSartorius、Germanyを並列運転で試験する。連続発酵連続発酵は、細胞の保持のために4つの異なる技術を使用して実施する。発酵はすべて、1~1.5リットルの間の作業容積を有するSartoriusBiostatB-DCUシステムを使用して実行する。1.連続遠心分離機:CentritechLabIIまたはCentritechLabIIIBerryWehrmiller、CarrCentritech、USA2.内部スピンフィルター:SartoriusSpinfilter2l20μmSartorius、Germany3.外部中空繊維:AmershamBiosciencesCFP-4E5A、0.45μm、1200cm2AmershamBiosciences、USA4.音波細胞保持:BiosepAPS990Applisens/Applikonbiosciences、Netherlands。プロセス開発の後期段階において、連続発酵はすべて、CentritechLabIIまたはCentritechLabIIIBerryWehrmiller、CarrCentritech、USA連続遠心分離機を使用して実施した。Centritechは、様々なサイズのリアクター容積に対して様々な操作モードを提供する。遠心分離は、1l作業容積での実験室規模発酵のために周期性ポンプモードを使用して実行する。10lまたは100l規模の発酵は、連続操作においてポンプモードまたはフィードモードを使用する。灌流は、2つのはかりによって制御する。フィードは、重量式流量コントローラーを使用するが、収集は、Centritech制御パラメーターを変化させることによって設定する。CentritechLabIIおよびLabIII遠心分離機は、DCUに直接接続しない。100l規模の灌流は、フィードを制御するレベルセンサーによって制御するが、Centritechは、連続的に収集する。実施例4DASGIPバイオリアクターシステム追加の実験室規模発酵は、DASGIPバイオリアクターシステムDASGIP、Juelich、Germanyを使用して実施する。異なるモジュールから成るので、DASGIPバイオリアクターシステムは、各リアクターについて、独立して、pHモジュールPH4/PO4、DOTモジュールPH4/PO4、温度モジュールTC4/SC4、撹拌モジュールTC4/SC4、および液体フィードモジュールMP8を制御しながら、4つのバイオリアクターを同時に操作することができる。発酵容器DASGIP、Germanyは、0.6~1lの作業容積を有する。温度制御は、加熱スリーブを使用して保証される。DASGIPシステムは、変速駆動を特徴とする蠕動ポンプを装備している。ポンプ毎の流速は、オンラインデータに基づいて別々の機能によって制御するためにユーザーによりプログラムすることができる。栄養素および代謝物質の両方についての複数の分析の同時フィードバック制御を達成することができる。気体供給は、MX4/4モジュールを使用して制御する。気体混合により、4つの異なる気体を維持する:マスフローコントローラーによって操作される窒素、酸素、二酸化炭素、および圧縮空気。気体供給および排気は、SartoriusMidisart20000.2μmPTFEフィルターSartorius、Germanyを使用してろ過する。塩基0.5MNaOHの添加および二酸化炭素の添加は、pH値を制御するために使用する。pHは、Mettler-Torledo405-DPAS-SC-K8S電極Mettler-Torledo、Switzerlandを使用してオンラインで測定する。発酵槽はすべて、SystecV-150オートクレーブSystec、Germanyにおいて滅菌する。細胞は、1つの3枚羽根弓形羽根車DASGIP、JuelichGermanyにより撹拌する。アジテーターのシャフトには磁気撹拌機によって電力を供給する。実施例5発酵10l実験室規模実験室規模発酵を、SartoriusBiostatC-DCU310l系Sartorius、Germanyを使用して実施する。ステンレス鋼発酵容器は、最小4および最大10リットルの作業容積で使用する。一般的に、バッチ発酵は、10l作業容積で実行するが、灌流は、5l作業容積で実施する。10lCDCUは、2lB-DCUバイオリアクターと同様に構成される。気体混合により、4つの異なる気体を維持する:窒素、酸素、二酸化炭素、および圧縮空気。酸素、二酸化炭素、および圧縮空気は、マスフローコントローラーによって操作するが、窒素は、面積式流量計Q-FlowVoegtlinInstruments、Germanyを使用して制御する。エアレーションもまた、すべての気体について全流量を設定することによって制御することができる。気体供給および排気は、SartoriusMiniまたはSartoriusJunior0.2μmPTFEフィルターSartorius、Germanyを使用してろ過する。溶存酸素濃度は、MettlerTorledoInPro6100/120/T/N電極Mettler-Torledo、Switzerlandを使用してオンラインで測定する。塩基0.5MNaOHの添加および二酸化炭素の添加は、pH値を制御するために使用する。pH値は、Mettler-Torledo405-DPAS-SC-K8S電極Mettler-Torledo、Switzerlandを使用してオンラインで測定する。塩基は、WatsonMarlow100OEMポンプWatsonMarlow、Englandによって添加する。2本の追加のWatsonMarlow100OEMポンプWatsonMarlow、Englandを細胞収集、接種、または他の目的のために使用する。フィード培地は、SartoriusEA150CEはかりSartorius、Germanyおよび重量式流量コントローラーを使用してWatsonMarlowSCI323WatsonMarlow、Englandによって添加する。細胞を、1つまたは2つの3枚羽根弓形羽根車5-10l,adjust,compl.,Φ54/10H7Sartorius、Germanyにより撹拌する。アジテーターのシャフトに、KollmorgenSeidel65M57SL-3000モーターKollmorgenSeidel、Germanyによって電力を供給する。リアクター容積に依存して、1つまたは2つの撹拌機を適用する:たとえば10lC-DCUについては、5lについて1つの撹拌機、10lについて2つの撹拌機。プロセス冷却は、Frigomix1000冷却機Sartorius、Germanyまたは水道水による冷却のいずれかと共に、自律ループを使用して遂行する。実施例6発酵100l生産規模生産規模発酵は、クリーンルーム条件下で実施する。産生操作には、細胞培養用のApplikon100lApplikon、Belgium発酵槽を使用する。ソフトウェアBioXpertXPをプロセスのモニタリングとデータロギングのために使用する。実験室規模発酵と同様に、気体混合により、4つの異なる気体を維持する:マスフローコントローラーによって操作される窒素、酸素、二酸化炭素、および圧縮空気。pHおよびDOTは、Mettler-Torledo電極Mettler-Torledo、Switzerlandを測定に使用して制御する。実施例7発酵-使い捨て追加の実験室規模発酵をWaveバイオリアクターにより操作する。温度、揺動速度、および揺動角度は、WaveCellbase20SPSプラットフォームWaveBiotechAG、Switzerlandを使用して測定し、制御する。DOT、pH、およびエアレーションは、Wavepod-RGEHealthcare、USAバージョンによって制御する。設定点は、温度37°C、pH7.2、揺動速度:12rpm、および角度9°である。最初の細胞濃度は、1.5105細胞/mlに設定する。灌流は、それぞれ、CentritechLabIIおよびLabIIIBerryWehrmiller、CarrCentritech、USAを使用して操作した。ウェーブ細胞培養バッグは、ディップチューブを使用して設計した。チューブは、Luer-LockまたはMPCアダプターのいずれかを使用して接続する。接続はすべて、層流ThermoScientific、USA下で実行する。実施例8ELISA抗体濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイELISAを使用して一般的に決定する。50μlの容積の抗ヒト抗Igカッパ抗体BDBiosciences、USAを、4°Cで、少なくとも12時間、PBS中1μg/mlで、コーティング抗体として使用する。非特異的結合部位は、PBS中2ウシ血清アルブミンBSARoth、Germanyにより30分間、ブロッキングする。試料は、1BSA/PBS中で希釈し、50μlを1時間インキュベートする。データの定量化は、標準物質としてErbituxを使用することによって達する。Erbituxは、10μg/ml、8μg/ml、6μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.75μg/ml、0.5μg/ml、および0.25μg/mlで使用する。50μlのウサギ抗ヒトIgGHLPODJacksonImmunoResearch、Unitedkingdomを二次抗体として使用する。インキュベーションは1時間とする。最後に、100μlテトラメチルベンジジンTMBOneComponentHRPMicrowellSubstrateTebu-BioLaboratories、Germanyを検出のために適用する。反応は50μl2.5NH2SO4Sigma、Germanyにより停止し、450/630nm波長で測定する。抗原結合ELISAヒトPankoMabの抗原結合は、抗原ELISAにおいてグリコシル化および非グリコシル化MUC1-ペプチドへの結合によって測定する。グリコシル化MUC1ペプチドは、4°Cで、少なくとも12時間、PBS中で等モル濃度でコーティングする。非特異的結合部位は、PBS中2ウシ血清アルブミンBSARoth、Germanyにより30分間、ブロッキングする。ヒトPankoMabの試料を、0.4μg/mlおよび0.8μg/mlの濃度まで1BSA/PBS中で希釈し、50μlを1時間インキュベートする。較正は、細胞培養上清標準物質希釈:1:100;1:200;1:400を使用して実行する。50μlのウサギ抗ヒトIgGHLPODJacksonImmunoResearch、Unitedkingdomを二次抗体として使用する。インキュベーションは1時間とする。最後に、100μlテトラメチルベンジジンTMBOneComponentHRPMicrowellSubstrateTebu-BioLaboratories、Germanyを検出のために適用する。反応は50μl2.5NH2SO4Sigma、Germanyにより停止し、450/630nm波長で測定する。抗原ELISAは、上清標準物質に対する回帰を使用して分析する。高い産物品質のための基準は、0.3よりも高い光学密度ODを有するグリコシル化ペプチドへの結合である。さらに、グリコシル化MUC1に対する非グリコシル化MUC1ペプチドの結合比は、基準を満たすために<5でなければならない。実施例9サイズ排除クロマトグラフィー単量体抗体のパーセンテージは、サイズ排除クロマトグラフィーSECを使用することによって決定する。クロマトグラフィーは、AektaprimeGEHealthcare、USAシステムでSuperdex20010/300GCGEHealthcare、USAカラムを使用して実行する。試料は、およそ50~200μgのタンパク質を含有する250μlの試料サイズまでPBSにより希釈する。試料は、200μl試料ループを使用して気泡が発生しないやり方でインジェクトする。分析のためのランニングバッファーは、PBSであり、流速は、0.5ml/分に設定する。溶離の後、クロマトグラムピーク面積を単量体、二量体、および多量体含有量に関して分析する。実施例10グリカン分析単糖分析グリカン単糖分析のために、グリコシル化抗体は、トリフルオロ酢酸trifluoraceticacidにより加水分解して、グリカン鎖からの単糖成分の放出をもたらす。さらに、N-アセチルグルコサミンおよびN-アセチルガラクトサミンは、トリフルオロ酢酸の作用を通してグルコサミンおよびガラクトサミンに脱アセチル化する。単糖の混合物は、電流滴定検出を備えた高速液体陰イオン交換クロマトグラフィーHPAEC-PADの手段によって分離し、定量化する。グリコプロファイリンググリコプロファイリングのために、無傷のN-グリカンを、PNGaseによるゲル消化でタンパク質コアから放出させる。N-グリカンをゲルから洗い出し、続いて、蛍光マーカー2-アミノベンズアミドにより標識する。標識N-グリカンの精製試料は、蛍光検出を備える順相クロマトグラフィーNP-HPLCまたは親水性相互作用クロマトグラフィーHILICの手段によって分離する。NP-HPLCは、ほとんどのN-グリカンの分離を可能にする。HILIC-HPLCは、NP-HPLCとは対照的に、バイセクト型N-アセチルグルコサミンを含有するN-グリカン構造の分離を可能にする。保持時間のデータベースとの比較によって、ピークにグリカン構造を割り当てる。さらに、構造は、MALDI-TOF質量分析法およびエキソグリコシダーゼを用いる酵素的消化のアレイによって確認する。Fc/Fabグリコシル化の分離分析Fcグリコシル化は、抗体のエフェクター機能に影響力を有するが、Fabグリコシル化は、抗原との抗体の相互作用に影響を与える。そのため、グリカン分析の基本的な関心は、両方の部分、Fc、およびFabがグリコシル化されているかどうか、そして、第2に、どの差異が両方の部位のグリコシル化パターンの間で観察されるかを決定することである。パパインによる抗体の完全な切断は、1つのFc断片および2つのFab断片の生成をもたらす。断片の分離は、プロテインA固相上でのアフィニティークロマトグラフィーを用いて実行する。プロテインAは、Fc断片および未消化抗体に特異的に結合する。Fc断片および未消化抗体はプロテインAに結合するが、Fabはフロースルー中に見出すことができる。pH2.2での0.1Mシトレート、0.15M塩化ナトリウムによる溶離ステップは、未消化抗体に対して、Fc断片の放出を可能にする。Fab部分からのFcの分離の後に、各断片のN-グリカンは、グリコプロファイリングに適用する。スペクトルの所見に基づいて、対応する構造を以下の特徴に対して分類する:フコースの存在または不在、バイセクト型GlcNAcの存在または不在、ガラクトシル化状態の分布、シアリル化レベルの分布N0、A1、A2、および分岐性antennarity。実施例11産物特徴付けスピナー培養GlycoExpressAhPMヒトPankoMabのスピナー培養上清は、プロテインAカラムを使用して精製する。溶離の後に、精製抗体を特徴付ける。精製抗体は、生物活性抗原ELISAへの特異的結合を示し、それは基準を満たしており、SDS-PAGEにおける明確なバンドは高純度であることを示し、それはまた、高度に単量体の抗体構造97のものでもある。グリカンプロファイルに関して、産物は、高い値のシアリル化およびガラクトシル化に加えて二分岐構造を示す。グリカンプロファイルは、固定相の抗体から分析する。異なる増殖期の間の産物品質を分析するために、3つの異なる増殖期を代表する3つの異なる収集を実行する。第1の収集指数期は、培養のおよそ48時間後に採取する。細胞は、指数増殖しているμ>0。第2の収集は、定常期における培養のおよそ140時間後に集める。この時点で、細胞は著しく増殖しないμ=0が、生存率は高いおよそ95。第3の収集は、およそ210時間後の死滅の間に採取する。生存率は著しく下がりおよそ80、生細胞濃度は下降するμ<0。抗体は、収集し、プロテインAを使用して精製し、異なる段階の増殖について分析する。結果は、重および軽抗体鎖についての明確なバンドを示す。異なる段階の増殖の間に目に見える産物分解はない。結論付けると、スピナー培養は、抗原ELISAにおいて特異的に結合し、SDS-PAGEにおいて不純物を示さない高度に単量体の産物サイズ排除クロマトグラフィーSECによって決定を提供する。グリカンプロファイルはまた、定常増殖期についても分析する。さらなるプロセス開発の間、主な目標は、この高い産物品質を維持することである。実施例12バッチ発酵GlycoExpress細胞系の増殖がプロセス条件に関して非常に頑健で、撹拌によって引き起こされる剪断力によってほとんど影響を受けないことが分かった。対照的に、細胞は、気泡サイズおよび気体流速に関しエアレーションに対して非常に感受性である。12.1エアレーション酸素供給が動物細胞にとって不可欠なので、エアレーションは、生物工学プロセスに決定的である。しかし、気泡は、強い剪断力を作り出し得る。T型フラスコまたはスピナーボトルにおける培養中に、エアレーションは使用されない。一般的にはるかに大きな容積を有する発酵槽では、酸素制限を予防するために酸素または空気を供給しなければならない。さらに、pH制御は、一般的に、供給する必要がある二酸化炭素の添加により機能する。そのため、3つの異なる種類の気体供給をバイオリアクターにおいて試験する。GlycoExpressAhPMを使用する並行のバッチ発酵を、たとえば異なる前培養に基づく変動を最小限にするように実施する。発酵は、リングスパージャー、マイクロスパージャー、および膜エアレーションを使用して実行する。リングスパージャーは、バイオリアクターにかなり大きな気泡を供給する。これとは対照的に、マイクロスパージャーは、多孔質の気体透過性構造を使用することによってはるかに小さな気泡を作り出す。リングスパージャーおよびマイクロスパージャーは、バイオリアクターへの電力入力によって誘導される対流を使用して細胞に供給する。より高い電力入力では、はるかに良好な物質移動があり、これは、溶存酸素圧DOT設定点を維持するために必要とされる気体流速を低下させることができる。最後に、膜エアレーションは、気泡を全く作り出さず、拡散のみに基づいて細胞に供給する。そのため、膜エアレーションは、細胞に気体を供給するための最も注意を払う方法である。膜エアレーションを適用する場合、気泡に基づく剪断応力はない。3つの異なるタイプすべてのエアレーションを、GlycoExpressAhPMのクローンに対して試験する。並行の発酵を、生存細胞濃度、生産性、および生存率に関して分析する。結果は、マイクロスパージャーおよび膜エアレーションの両方について、2106細胞/mlの最大細胞密度およびおよそ20~25μg/mlの抗体濃度までの、同様の増殖を示す。膜エアレーションは、95という非常に高い生存率をもたらすが、マイクロスパージャーエアレーションは、約90の生存率をもたらす。したがって、リングスパージャーを使用すると、細胞は、0.7106細胞/mlの最大細胞密度および10μg/mlの産物濃度まで増殖する。リングスパージャーおよびマイクロスパージャーの生存率は、発酵の中および後期段階において下がるが、膜エアレーションは、プロセスの間に非常に高い生存率を確実にする。これは、リングスパージャーまたはマイクロスパージャーにより作業する場合に、気泡が細胞損傷を引き起こすことを示す。最も高度な損傷はリングスパージャー気泡によって引き起こされ、92から74まで生存率が低下する。マイクロスパージャー生存率は、84に低下するが、膜エアレーションは、プロセス全体の間、95という非常に高い生存率を保つ。リングスパージャーを、さらなる開発のために選ぶ。これは、大きな容器の発酵における技術的で、GMPに関連する制限に基づく。第1に、膜エアレーションは、生産規模において大きな膜面積により非常にコストが高く、たとえば、GMPの原則により発酵の後毎に膜チューブを交換しなければならない。第2に、必要とされる膜面積は、生産規模においてより一層増加し、これは、流動障害による混合上の問題につながり得る。マイクロスパージャーに関しては、生産規模において大量の起泡の問題につながることが想定され、これは、下流の処理において分解するのが難しい消泡試薬の必要をもたらし得る。その結果として、リングスパージャーにより作業すると、電力入力の増加は、物質移動が増加するにつれ、気体流速の低下をもたらすたとえば、シャーウッド数は、レイノルズ数の増加と共に増加する。12.2定常流対限定流発酵槽においてエアレーションの2つの異なるモードがある。第1は、一定の流速を適用し、細胞の必要量に基づいて4つの気体空気、酸素、窒素、および二酸化炭素を混合するものである。第2は、定常気流を混合するのではなく、必要とされる気体のパルスを排他的に与えるものである。限定流システムは、はるかに良好な増殖および生存率を与える。定常流速では、細胞は、流速の増加と共に、より損傷を受ける。0.01l/時間、0.05l/時間、および0.1l/時間の流速で実行した一組のバッチ発酵は、リアクター容積1リットル当たり0.01l/時間を超える流速で生存率の減損を示した。その結果として、限定流システムを、バイオリアクターにおいてGlycoExpress細胞の発酵を制御するために選ぶ。さらに、ウェーブバイオリアクター系における発酵は、有望な結果を示した。このタイプのエアレーションを使用すると、GlycoExpress細胞は、非常によく増殖する。要約すると、エアレーションは、非常に決定的なパラメーターである。エアレーションによる細胞損傷は、様々な機会に観察されている。損傷を低下させるためにエアレーション速度をできるだけ低く設定しなければならない。下記において、発酵はすべて、定常流での気体混合の代わりに限定流での気体混合により実行する。気泡制限に基づくエアレーションは、開発のすべてのステップの間にきわめて重大である。そのため、発酵は、好ましくは、圧縮空気の代わりに純酸素供給を使用して実行する。12.3電力入力エアレーションのタイプを設定した後に、最適化における次のステップは異なる電力入力を試験することであった。発酵槽における可能性のある剪断損傷により、第1の発酵を、50rpmの非常に低い撹拌機速度で実行するこれは、0.14m/sの先端速度および910-5W/kgの電力入力と等しい、下記の表2を参照されたい。エアレーションに関連する実験は、低い電力入力をもたらす100rpmの撹拌機速度を使用して行う。とりわけ高い細胞密度でだけでなく、より高度な発酵槽規模で均質性を保つために、より高い電力入力が好ましい。より高い電力入力はまた、エアレーションに必要である気体流速を低下させることも想定され、これは、より少ない気泡に基づく損傷をもたらすはずである。電力入力を、種々の撹拌機速度を使用し、バッチモードで試験する。実験の最初の組において、100rpm、200rpm、および300rpmを試験する。表1は、50~400rpmの間の異なる撹拌機速度についての撹拌の特徴電力入力、先端速度、剪断先端速度、およびレイノルズ数を示す。表1:種々の撹拌速度についての2lSartoriusB-DCUバイオリアクターにおける撹拌の特徴。データは、1l培養容積および撹拌用の1つの3枚羽根弓形羽根車の利用に基づく。結果を図1に示す。200rpmおよび300rpmは、2.5106細胞/mlまで同様の細胞密度を示すが、撹拌機速度を100rpmに設定した場合、細胞は、1106細胞/mlを上回って増殖しない。力価濃度は、3つの発酵すべてにおいて約25μg/mlという同様のレベルに達する。剪断力の増大にもかかわらず、生存率は、200rpmおよび300rpmで最も高い。100rpmを使用する場合、生存率は、80未満まで下がる。その後、100l規模にスケールアップして作業すると、混合は再び緊急の懸念点になった。200rpmおよび400rpmの撹拌機速度を使用する発酵は、同等の結果を示す。400rpmで作業すると、細胞は、わずかに速く増殖するようであるが、高い生存細胞濃度および生産性に達しない。それにもかかわらず、400rpmは、400rpmが対数増殖の間に非常に高い生存率>90をもたらし、剪断誘導性の損傷を示さないので、発酵に適しているようである。要約すると、200rpm~400rpmの間の撹拌機速度は、同等の増殖を示す。気泡は、撹拌機誘導性の剪断力よりもはるかに否定的に生存率に影響を与える。300rpm電力入力:0.02W/kgの撹拌機速度は、2l実験室規模における発酵についての標準的な撹拌速度として設定する。12.4プロセスパラメーターに対する頑健性バッチ発酵は、リングスパージャーおよび0.022Withkgの電力入力を適用して実行する。GlycoExpressAhPMを使用する合計16回の実行について分析する。プロセス値は、以下のように設定した:pH7.0;7.2;7.4、DOT20;40;60、および温度36°C、37°C、38°C。バッチ発酵の間に試験した範囲の、プロセスパラメーターpH、DOT、および温度を変化させることで、増殖および生産性に関して影響はなかった。これは、プロセスパラメーターを変化させることとその応答に関して相関がないことを意味する。最初の細胞数約1.2~1.8105細胞/mlの間で変動および最終のバッチ生産性または最大細胞密度の間にいずれも相関はなかった。結果として、接種のプロセスもまた、その結果として、頑健であると見なすことができる。その他に示されない限り、発酵はすべて、pH7.2、DOT40空気飽和度、および37°Cの温度の標準的な条件下で実施する。これらの条件はまた、灌流プロセスにも適用する。12.5増殖依存性の産生細胞がバッチ発酵において増殖するにつれて、生産性および増殖は、細胞が定常増殖期の間に産生しないので、互いに密接に関連付けられることが分かった。GlycoExpressAhPMのバッチ培養物を、それらの増殖および生産性に関して分析した。抗体産生は、細胞増殖に強く依存性であった。発酵における定常期の間に、抗体濃度は、増加しなかった。統計試験を、作用変数influencevariableとして細胞濃度を使用し、応答変数として生産性を使用して、適用した。細胞濃度と生産性の間の線形回帰を使用すると、強い相関が見出されるR2=0.994。その結果として、産生は、増殖に関連付けられ、細胞は、定常期の間にいかなる抗体をも産生しない。これは、ほとんどの産物が定常増殖期の間に産生されるCHO細胞のような他の産生系に対して主要な差異を与える。この結果は、プロセス開発にとって非常に重要である。それは、ほとんどのフェドバッチ作業が産物蓄積のための定常期延長であるフェドバッチプロセスの代わりの灌流プロセスの好ましい使用をもたらす。別の結果として、細胞増殖は、灌流およびフェドバッチプロセス開発の両方についての主要な目的であるはずである。増殖依存性の生産性のさらなる分析のために、定量的m-RNAレベルを、対数増殖期および定常増殖期について逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRを使用して分析した。結果は、組換え発現タンパク質VHおよびVLについての一定のレベルのmRNAと共に、対数期および定常期の両方において一定のレベルのハウスキーピング遺伝子発現アクチンおよびGAPDHを示した。これらの結果は、両方とも対数増殖期および定常増殖期において等しく発現されるということの証拠を与える。定常期において生産性を下降させる理由は、転写後である可能性があるということが結論付けられ得る。12.6バッチ発酵についての産物品質の確認バッチ発酵は、産物品質を分析し、かつ結果をスピナー産物の品質と比較するために標準的な条件pH7.2、DOT40、37°C下で実行した。一般的に、GlycoExpressAhPMの産物品質は、スピナー産生産物スピナー産物を表1に示すとほとんど異ならない。バッチ培養物では抗体多量体が約2という低い量であり、多量体の数はほとんど影響を受けないスピナー培養産物における3と比較して。さらに、生物活性ELISAは、スピナーおよびバッチ発酵の両方において高度な特異的結合を示し、SDS-PAGEもまた、影響を受けない。グリコシル化プロファイルは、スピナー培養物のグリカンプロファイルと同等である。12.7結論バッチ発酵骨髄性白血病myloidleukemiaを起源とするヒト細胞は、バッチ発酵において培養することができる。スピナー培養と比較して、バッチ発酵は、わずかに高い生産性約10の増加、データ示さずと共にわずかに改善された細胞密度をもたらす。細胞が撹拌機誘導性の剪断力に感受性でないので、発酵プロセスは、激しい撹拌で実行することができる。さらに、そのプロセスは、広範囲のpH、DOT、および温度設定点についての良好な増殖および生産性を与える発酵プロセス条件に対し高度な頑健性を示す。しかしながら、細胞は、エアレーションに対して感受性であり、よって、気泡は、限定流エアレーションを使用することによって避けられるべきである。そのため、高電力入力の適用は、物質移動が増加するので、有用である。生産性を増加させるために、灌流発酵を、下記に記載されるように実行する。灌流プロセスのために、プロセス条件を、バッチ培養から引き継ぐ。実施例13灌流細胞保持を伴う連続発酵灌流が、良好な比生産性および高度に安定したグリコシル化と共に高い細胞密度で骨髄性白血病を起源とするヒト細胞の発酵を可能にすることが分かった。13.1結果CentritechLabCentrifugeを使用すると、細胞は非常に高い生存率で増殖し、10106細胞/mlを超える細胞密度が達成された。結果図2を参照は、高度に再現可能であることが判明し、産物グリコシル化GlycoExpressAhPMに関する不均質性は、見出さなかった。プロセスは、少なくとも300時間の培養時間の間実行した。比生産性は、1日当たり2バイオリアクター容積の灌流速度で、最大約100μg/mldに達する。平均の比生産性は、実験室規模発酵規模について約70μg/mldであった。好ましい灌流プロセスを表2に示す。表2:好ましい灌流プロセス13.2連続発酵における産物品質の確認バッチ発酵においてすでに認められたように、産物品質は、顕著に頑健である。産物を生化学的に分析した。多量体に関して、3の非単量体抗体の構成部分が存在し、これは、バッチ発酵と同等である。抗原ELISAは、それが高度な特異的結合を示すので、基準内におさまる。さらに、GlycoExpressAhPMのグリコシル化パターンは、2つの独立に実行した灌流操作において同様であるが、スピナー/バッチ産生産物と比較しても同様である。SDS-PAGE還元条件において、別々の軽および重抗体鎖についての明確なバンドがあった。重鎖=50kDaおよび軽鎖=25kDaは、予想されるようなサイズを示す。13.3灌流の間のグリコシル化産物グリコシル化が、たとえば培地、機械的ストレス、または溶存酸素圧の変化によって影響を及ぼされ得るので、発酵の間に、グリコシル化パターンの発生を分析することは非常に重要になる。プロセスの頑健性に関して、産物グリコシル化は、分析されるべき最も重要なパラメーターのうちの1つである。GlycoExpress細胞系の産物グリコシル化は、GlycoExpressBを使用するGTM培地を用い、37°C、40DOT、pH7.2で実行する灌流操作について分析した。産物は、灌流プロセスの3日目~20日目の間に取得した試料について分析した。いくつかの変化にもかかわらず、グリコシル化パターンは、安定していると見なすことができる。結論付けると、プロセスの間のグリコシル化に変動はない。プロセスの頑健性および細胞系の頑健性に関して、発酵は、安定した産物グリコシル化を提供する。GlycoExpressAhPMの灌流発酵は、高度に純粋な生化学活性産物をもたらす。13.4.結論GlycoExpress細胞系の灌流プロセスは、高密度発酵の間の高い細胞生存率を特徴とする。灌流プロセスは、一定の産物品質およびとりわけ一定のグリコシル化パターンを特徴とする。発酵プロセスは、pH7.2、DOT40、および37°Cの温度で制御する。細胞が高い剪断力に対して耐性であるので、GlycoExpress細胞による発酵は、高い電力入力0.022W/m3により実行することができる。実施例14種々の産生方法の比較生化学的産物品質に関して、プロセススピナー、バッチ、フェドバッチデータ示さず、および灌流はすべて、同様の高度に単量体の生物活性抗体を提供した。サイズ排除クロマトグラフィーSECを使用する分析により、多量体抗体が2~3の構成部分を占めるという結果が得られた。バッチおよびフェドバッチ発酵産物は、約2の多量体を示したが、灌流は、なおスピナー産物と同等である約3の多量体を示した。2~3の多量体の部分は、下流の処理DSPの間に容易に除去することができ、GlycoExpressAhPMについて、多モードの陰イオン交換カラムを適用する。DSPのこのステップの間に、宿主細胞タンパク質hcpおよびヒト血清アルブミンHSAもまた、除去される。SDS-PAGEにおける追加の分析は、すべてのプロセスについての同等のタンパク質純度を示した。産物は、非還元条件下抗体構造全体および還元条件下重および軽鎖の分離で分析した。抗体鎖の同一性は、ウエスタンブロットを使用して確認した。生物活性に関して、試料はすべて、抗原結合ELISAにおいて分析する。試料は、グリコシル化MUC1ペプチドに対する高度な結合、および非グリコシル化MUC1ペプチドに対する非常にわずかな結合を示し、これは、すべてのプロセスについての基準を満たしていた。最も重要な特徴のうちの1つとして、抗体グリコシル化を、スピナー、バッチ、フェドバッチ、および灌流培養物について分析した。グリコシル化パターンは、非常に均質であった。グリコプロファイリングの複雑性によりセクション4.5.4もまた参照されたい、/-4の標準偏差を測定する。そのため、グリコシル化における変化>5のみを、有意であるとみなす要約すると、グリコシル化パターンは、非常に頑健である。それは、弱い撹拌で、非通気のスピナー培養物と比較して変化がない。さらに、バッチ、フェドバッチ、および灌流プロセスが、それらの特性において異なるので灌流は、より高い細胞濃度を示し、フェドバッチは、収集時のより低い生存率を示す、それは、細胞濃度または細胞生存率に対して著しく感受性であるようではない。産物品質がすべてのバッチ、フェドバッチ、および灌流について高いので、焦点がGMPに適したプロセスの開発に置かれるので、生産プロセスに対する選択は、生産性および経済上の考慮に基づいて成すことができる。実施例15スケールアップスピナー培養からGMP生産プロセスへの上流の処理スケールアップ>1000倍が、産物品質およびとりわけグリコシル化プロファイルを変えることなく、90gまでの精製抗体を提供することが分かった。発酵を種々の規模で実行した。最も小さな規模作業容積0.6lについては、DASGIPの並列バイオリアクターシステムを使用した。1lおよび10l作業容積規模における培養を、Sartoriusガラス製バイオリアクターB-DCU2l、B-DCU5lおよびSartoriusステンレス鋼リアクターC-DCU10lにおいて実行する。さらに、10lApplikonガラス製バイオリアクターを使用した。最も大きな規模100lは、100lApplikonステンレス鋼発酵槽において実施した。したがって、発酵は、4つの異なる規模においてだけではなく、3つの異なる会社の発酵槽においても行った。係数166までの全スケールアップは、以下のステップを使用して行った:1:1.5:16:166。形状特性に関して異なる特徴を示す、異なる会社の発酵槽を発酵に使用するので、エアレーションおよび撹拌、スケールアップは、さらに一層決定的になる。15.1スケールアップ条件スケールアップを実行する場合、細胞は、剪断力に関してとりわけ頑健でなければならない。2lSartorius容器において400rpmを使用する場合、細胞が剪断力によって損傷を被らないので、電力入力は、細胞が高度に剪断力抵抗性であるようなので、スケールアップ基準となるように選んだ。その結果として、特定の電力入力容積当たりの電力入力は、すべての異なる発酵槽サイズにおいて一定となるように選択する。一旦、電力入力がスケールアップ基準として選ばれたら、約Pspec=0.02W/kgの特定の電力入力を選択する。これは、Sartorius2l発酵槽における300rpmの撹拌機速度と等しい。この撹拌機速度は、優良な混合および均質化特性を示す。形状の類似性は、普通は、スケールアップにとって重要な前提条件であるが、好結果のアップスケールは、非常に多様な容器において実行することができる。表6は、基準として電力入力を使用する、好結果のアップスケールの結果を示す。Applikon10l発酵槽に加えて、発酵槽はすべて、同様の特定の電力入力を維持することができる。両方のApplikon発酵槽が最大の可能性のある撹拌速度rpmを使用することに注意すべきである。そのため、他の発酵槽と同じ特定の電力入力速度でApplikon10lを操作することは可能ではない。表3:用いられる発酵容器の形状特性。最も共通の作業容積についての一定の電力入力に基づく撹拌機の撹拌[rpm]。凡例:Di:撹拌機直径;Dt:発酵槽直径;H:発酵槽高;Ht:上部の撹拌機の液体表面までの距離;Hi:撹拌機の間の距離;Hb:下部の撹拌機より下の距離。電力入力が、スケールアップの間に一定に保たれるので設計の制限のためApplikon10lを除いて、剪断力は、スケールアップの間に増加する。計算した剪断力[N/m2]を表4に示す。最大剪断力を、撹拌機先端について計算する。なぜなら、この区域が最も高度なエネルギー散逸の領域と見なされるからである。細胞増殖は影響を及ぼされないようであり、生存率はリアクター規模の増加と共に下がらないので、GlycoExpressAhPM細胞は、少なくとも0.9N/m2の持続的な撹拌機誘導性の剪断応力に対して剪断抵抗性である。これは、0.1N/m2の剪断速度で損傷を受けるCHO細胞と比較して、剪断抵抗の少なくとも10倍増加に等しい[Motobuら1998年]。表4:剪断および混合特性を示す種々の発酵槽についてのスケールアップの結果。計算は、表6に示すとおりバイオリアクター装置について実行する。15.2種々の規模の比較灌流発酵のスケールアップは、1リットル、10リットル、および100リットルの規模での発酵を使用して実行した。図3は、37°C、pH7.2、および40のDOTで制御したGlycoExpressAhPMの3つの同様の発酵についての例示的な結果を示す。発酵は、図3Dにおいて示されるように、同様のフィーディング戦略を適用する灌流で実行する。灌流速度は、グルコース消費に依存して設定する。増殖および生産性に関して、実験室規模プロセスおよび100lの生産規模の間にいくつかの差がある。>10106細胞/mlの最大細胞濃度が達成される、より小規模の発酵1l作業容積と比較して、細胞は、10lおよび100l灌流において、6106細胞/mlを超える高い濃度まで増殖しない。したがって、規模の増加と共にグルコース消費はより少なく、グルコース濃度は、100l規模について1.5g/l超で保たれる。細胞が通常、より高い濃度まで増殖する小規模発酵において、グルコースは1g/l未満の濃度まで消費される。異なる生存率および生存細胞濃度とは対照的に、すべての規模においてほとんど同じレベルの生産性がある。発酵はすべて、>100μg/mldの最大生産性を有し、非常に同等の生産性曲線をも示す。要約すると、スケールアップは、大量の産物を産生することができるプロセスを提供する。産物濃度は、すべての規模において同様である。最大の生産性は、>100μg/mldにおいてである。しかしながら、規模を増加させることで認識されることとなる生存率および最大細胞濃度において有意な減少がある。最大細胞濃度に関して、遠心分離機の細胞の保持は、有意な作用を有する。実験室規模においては>99であるが、それは、生産規模において約90まで下がる。これは、最大細胞濃度の低下につながる一定のブリーディングをもたらす。15.3大規模灌流大規模灌流操作は、Applikon100l発酵槽において実施する。灌流を使用して、100l作業容積で操作する場合、最大で250l培地/日を使用する。図4は、GMP条件下で実行する3つの同等の100l灌流操作についての結果を示す。それらの発酵は、高度に再現可能である。発酵はすべて、確立された灌流プロセス条件を使用して実行した上記を参照されたい。3つの発酵はすべて、生産性および細胞増殖に関して同様の挙動を示す。最大細胞濃度は、6106細胞/mlでピークに達し、その後著しく下がる。灌流の後期段階において、約3~4106細胞/mlの細胞密度が得られる。その結果として、細胞増殖が生産性と密接に関連付けられるので、比生産性で最大にもなる。比生産性は、約100μg/mldでピークに達する。後期段階の間に、比生産性は、<40μg/mldまで下がる。生存率に関して、発酵は、>90で始められるが、灌流の開始に際して約80まで下がる。グリコシル化パターンは測定変動の範囲内で3つの発酵すべてについて一定であった。15.4結論スケールアップスケールアップは、Centritech連続遠心分離機を使用する灌流プロセスに適用した。発酵設備は、ある限界、たとえば異なるエアレーション装置を使用する異なるバイオリアクタータイプ、異なる形状特性、撹拌における制限速度、撹拌機の数を設ける。細胞が、高度に剪断力抵抗性であることが判明しているので、電力入力をスケールアップ基準として使用する。これは、発酵槽サイズの増加と共に、撹拌機誘導性の剪断力の増加をもたらすが、実験室規模において十分な混合を提供する。それにもかかわらず、スケールアップは、一定の産物グリコシル化を伴う高生存の高密度培養物をもたらした。産物品質SEC、バイオアッセイ、グリコプロファイルglycoprofileによって測定されるは、スケールアップによって一般的に不変である。発酵は、90gまでの抗体下流の処理の前の量の産生について好結果に実現される。1l、10l、および100lバイオリアクターの質的および量的性能評価を通して、また、生化学的特徴付け試験のパネルを通して、プロセスおよび産物の同等性は、スケールアップのプロセスの間に十分に維持されたことが実証された。実施例16培養培地細胞は、異なる培地を使用して、懸濁物中で培養した。主に使用した培地は、x-Vivo20Lonza、Belgium、GTM-1Biochrom、Germany、GTM-2Biochrom、Germany、GTM-3Biochrom、Germany、GTM-4Biochrom、Germany、GTM-5Biochrom、Germany、GTM-6Biochrom、Germany、GTM-7Biochrom、Germany、GTM-8Biochrom、Germany、およびGTMFeedMediumBiochrom、Germanyである。培地は、追加の栄養素を補充した基礎培地に基づく。GTM培地の一般的な命名法を表6に示す。表6:GTM培地の概要上記に議論されるように、電力入力は、好ましくは、スケールアップ基準として使用される。続く等式は、撹拌機速度N、撹拌機直径di、培地密度p、および撹拌機定数Neに依存性の電力入力P計算の基本的な式を示す。理論上、容器直径に対する羽根車直径の比di=dtが一定に保たれる場合、スケールアップの間の撹拌機速度は、一定に保つことができる。それにもかかわらず、これは、バイオリアクター容器寸法によりほとんどの場合、可能ではない。発酵容積に対して電力入力を相関させるために、特定の電力入力Pspecを計算することができる。特定の電力入力は、よく使用されるスケールアップ基準である。プロセスにそれを適用するために、細胞は、バイオリアクター容積Vと共に増加する剪断力に対してかなり非感受性でなければならない。続く等式は、特定の電力入力の計算を示す。先端速度は、撹拌機直径および撹拌速度とともに直線的に増加する。そのため、一定の先端速度vTipは、大きな容器において毎分回転数rpmの減少をもたらす。これは、大きな容器における、より大きな撹拌機直径に直接依存する。これは、弱い混合または細胞沈降さえもたらし得る十分な電力入力がない可能性がある。その結果として、一定の撹拌機先端剪断速度でのスケールアップは、極度に剪断感受性の細胞に対してのみ適用することができる。続く等式は、撹拌機直径および撹拌機速度に依存性の撹拌機先端速度についての計算を示す。バイオリアクターにおいて、最大の剪断力は撹拌機の外側で起こる。そのため、剪断速度は、上記の式を使用して、撹拌機先端で計算されるべきである。剪断速度は、撹拌速度N、撹拌機直径di、および動粘性率vに依存性である。この作業において、たとえ高細胞濃度がそれを増加させるかもしれなくても、動粘性率は、一定として仮定される。スケールアップ基準として撹拌機先端剪断速度を使用することは、発酵槽サイズの増加と共に撹拌速度rpmの減少をもたらす。前に述べられるように、弱い混合または細胞沈降さえ生じ得る。その結果として、極度に剪断感受性の細胞では、一定の撹拌機先端剪断速度でのスケールアップが好ましい。本発明により使用される細胞は、剪断抵抗性である。"