細胞増殖性の病気もしくは疾患を有する対象の治療において使用するための、チモシン-1-アルファポリペプチドと複製レトロウイルスベクターとを含む治療用の組み合わせであって、該複製コンピテントレトロウイルスベクターが、レトロウイルスGAGタンパク質レトロウイルスPOLタンパク質レトロウイルスエンベロープレトロウイルスポリヌクレオチドであって、その3末端の長い末端反復配列、その5末端にある、哺乳類細胞での発現に適したプロモーター配列、gag核酸領域、pol核酸領域およびenv核酸領域を含む前記レトロウイルスポリヌクレオチド異種のポリヌクレオチドと機能可能に連結された配列内リボソーム進入部位を含み、3LTRの5側およびレトロウイルスのエンベロープをコードするenv核酸領域の3側に位置するカセットならびに逆転写、パッケージングおよび標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列を含む、前記組み合わせ。異種のポリヌクレオチドが、毒性のないプロドラッグを毒性のある薬剤に変換するポリペプチドを発現する自殺遺伝子を含む請求項1記載の組み合わせ。標的細胞ががん細胞である請求項1記載の組み合わせ。標的細胞が細胞増殖性疾患を有する請求項1記載の組み合わせ。細胞増殖性疾患が、肺がん、結腸-直腸がん、乳がん、前立腺がん、尿路がん、子宮がん、脳のがん、頭および首のがん、すい臓がん、黒色腫、胃がんおよび卵巣がん、関節リウマチもしくは他の自己免疫疾患からなる群から選択される請求項4記載の組み合わせ。レトロウイルスベクターがチモシン-アルファ-1ポリペプチドに先立って投与される請求項1記載の組み合わせ。レトロウイルスポリヌクレオチド配列が、マウス白血病ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒヒ内在性レトロウイルス、ブタ内在性ウイルス、ネコ由来のレトロウイルスRD114、リスザルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス、トリ細胞内皮症ウイルス、またはテナガザル白血病ウイルスに由来する請求項1記載の組み合わせ。レトロウイルスのエンベロープが広宿主性のMLVエンベロープである請求項1記載の組み合わせ。レトロウイルスがガンマレトロウイルスである請求項1記載の組み合わせ。チモシン-アルファ-1ポリペプチドが配列番号73と少なくとも85の同一性を有し、チモシン-アルファ-1活性を有している請求項1記載の組み合わせ。異種のポリヌクレオチドがシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている請求項1記載の組み合わせ。異種のポリヌクレオチドが自殺遺伝子および免疫増強遺伝子で構成されるグループから選択される請求項1記載の組み合わせ。レトロウイルスがさらにmiRNAを含む請求項1記載の組み合わせ。複製コンピテントレトロウイルスが、レトロウイルスGAGタンパク質レトロウイルスPOLタンパク質レトロウイルスエンベロープレトロウイルスポリヌクレオチドの3末端に長い末端反復配列、レトロウイルスポリヌクレオチドの5末端にプロモーター配列該プロモーターは哺乳類細胞での発現に適している、gag核酸領域、pol核酸領域およびenv核酸領域を含むレトロウイルスポリヌクレオチドシトシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドと機能可能に連結された配列内リボソーム進入部位を含むカセット該カセットは3LTRの5側およびレトロウイルスのエンベロープをコードするenv核酸領域の3側に位置するおよび逆転写、パッケージングおよび標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列を含む請求項1記載の組み合わせ。チモシン-1-アルファおよびレトロウイルスベクターが同時に送達されるように配合される請求項1記載の組み合わせ。細胞増殖性疾患を有する被験者を治療する方法であって、複製コンピテントレトロウイルスの投与の前、投与中もしくは投与後にチモシン-アルファ-1ポリペプチドを被験者に投与することを含んでおり、該コンピテントウイルスがレトロウイルスGAGタンパク質レトロウイルスPOLタンパク質レトロウイルスエンベロープレトロウイルスポリヌクレオチド配列の3末端に長い末端反復配列、レトロウイルスポリヌクレオチドの5末端にプロモーター配列該プロモーターは哺乳類細胞での発現に適している、gag核酸領域、pol核酸領域およびenv核酸領域を含むレトロウイルスポリヌクレオチド異種のポリヌクレオチドと機能可能に連結された配列内リボソーム進入部位を含むカセット該カセットは3LTRの5側およびレトロウイルスのエンベロープをコードするenv核酸領域の3側に位置するおよび逆転写、パッケージングおよび標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列を含む、前記方法。レトロウイルスポリヌクレオチド配列が、マウス白血病ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒヒ内在性レトロウイルス、ブタ内在性ウイルス、ネコ由来のレトロウイルスRD114、リスザルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス、トリ細胞内皮症ウイルス、またはテナガザル白血病ウイルスに由来する請求項16記載の方法。レトロウイルスのエンベロープが広宿主性のMLVエンベロープである請求項16記載の方法。レトロウイルスがガンマレトロウイルスである請求項16記載の方法。標的細胞が腫瘍性の細胞である請求項16記載の方法。細胞増殖性疾患が、肺がん、結腸―直腸がん、乳がん、前立腺がん、尿路がん、子宮がん、脳のがん、頭および首のがん、すい臓がん、黒色腫、胃がんおよび卵巣がん、関節リウマチもしくは他の自己免疫疾患からなる群から選択される請求項16記載の方法。チモシン-アルファ-1ポリペプチドが配列番号73と少なくとも85の同一性を有し、チモシン-アルファ-1活性を有している請求項16記載の方法。異種のポリヌクレオチドがシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている請求項16記載の方法。異種のポリヌクレオチドが自殺遺伝子および免疫増強遺伝子で構成されるグループから選択される請求項16記載の方法。レトロウイルスがさらにmiRNAを含む請求項16記載の方法。複製コンピテントレトロウイルスが、レトロウイルスGAGタンパク質レトロウイルスPOLタンパク質レトロウイルスエンベロープレトロウイルスポリヌクレオチド配列の3末端に長い末端反復配列、レトロウイルスポリヌクレオチドの5末端にプロモーター配列該プロモーターは哺乳類細胞での発現に適している、gag核酸領域、pol核酸領域およびenv核酸領域を含むレトロウイルスポリヌクレオチドシトシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドと機能可能に連結された配列内リボソーム進入部位を含むカセット該カセットは3LTRの5側およびレトロウイルスのエンベロープをコードするenv核酸領域の3側に位置するおよび逆転写、パッケージングおよび標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列を含む請求項16記載の方法。本明細書および特許請求の範囲において使用される用語について、文章中で特に明示しない限り単数形の用語は複数の対象を含むものとする。したがって例えば、細胞に関しては複数のそのような細胞を含み、薬剤に関しては当業者に知られている1以上の薬剤を含み、その他も同様である。また、または、もしくはは別に言及しない限りおよびまたはを意味する。同様に、包含する、含む、などは互換性があり制限されない。さらに様々な実施形態の詳細な説明で用語含むを使用するが、当業者には理解されるように、ある特定の状況において、ある実施例はその用語の代わりに本質的に構成される、からなる等を用いて記載することができるものと了解されたい。明細書中で特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術科学用語は本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと同様もしくは同等の材料および方法を本発明の方法および組成物の実施の際に使用することができるが、本明細書では典型的な方法、装置および材料について記載する。ベクター、プロモーターおよび他の多くの関連するトピックの利用を含む本発明に有用な分子生物学的手法を説明した一般書は、BergerおよびKimmelのGuidetoMolecularCloningTechniquesMethodsinEnzymologyVolume152Sambrookら、MolecularCloningALaboratoryManual2dedVol13ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNY1989およびCurrentProtocolsinMolecularBiologyFMAusubelら、edsCurrentProtocolsajointventurebetweenGreenePublishingAssociatesIncandJohnWileySonsIncを含む。例えば、本発明における同種の核酸の生成のために、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、Qβレプリカーゼ増幅および他のRNAポリメラーゼを用いた技術を含めて、invitroの増幅技術によって当業者を導くのに充分なプロトコルの例は、Berger、Sambrook、およびAusubel、ならびにMullisらUSPatNo4683202Innisら、edsPCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplicationsArnheimLevinsonCEN3647TheJournalOfNIHResearch38194Kwohら、ProcNatlAcadSciUSA861173Guatelliら、ProcNatlAcadSciUSA871874Lomellら、JClinChem351826Landegrenら、Science24110771080VanBruntBiotechnology8291294WuandWallaceGene4560Barringerら、Gene89117およびSooknananandMalekBiotechnology13563564に見られる。invitroで増幅された核酸をクローニングするための改善法はWallaceら、USPatNo5426039に述べられている。大きい核酸を増幅するための改善法は、ChengらNature369684685およびそこに引用されている参考文献に要約されており、そこでは40kbに及ぶPCR増幅産物が生成されている。実質的にいかなるRNAも、逆転写酵素とポリメラーゼを用いて、制限酵素による消化、PCRによる延長および配列決定に適した二本鎖DNAに変換できることが当業者には理解されるだろう。たとえば、AusubelSambrookおよびBerger全て上掲参照。本文中で述べられる全ての刊行物は、単に本出願の出願日より前の開示内容として提供されている。いずれも、先行開示によって、本発明者がこれらの開示に先立つ権利を与えられないことを認めたものと解釈されてはならない。本発明は細胞増殖性疾患の治療に有用な方法と組成物を提供する。本発明は遺伝子送達および併用療法のための複製コンピテントレトロウイルスベクターを提供する。用語ベクター、ベクター構築物および発現ベクターはDNAやRNA配列を宿主細胞に導入し、それにより宿主を形質転換し導入配列の発現を促進することができる媒体ベヒクルを意味する。ベクターは典型的には伝達性媒介物作用物質のDNAを含み、その中にはタンパク質をコードする異種のDNAが制限酵素技術によって挿入されている。ベクターの代表例はプラスミドであり、これは一般に、容易に追加のDNAを受け入れることができる自己内蔵の二本鎖DNA分子であり、容易に適切な宿主細胞に導入することができる。様々な原核および真核の宿主における複製およびもしくは発現のためのプラスミドや真菌のベクターを始めとする多くのベクターが、既に記載されている。例として、pKKプラスミド、pUCプラスミド、pETプラスミド、pRSETもしくはpREPプラスミド、もしくはpMALプラスミド、および本明細書で開示されもしくは引用された方法または関連分野における当業者に知られているその他の方法を使用する多くの適切な宿主細胞があるが、これらに限定されるものではない。組み換えクローニングベクターはしばしば、クローニングもしくは発現のための一もしくはそれ以上の複製システム、例えば抗生物質耐性のような宿主での選抜のための一もしくはそれ以上のマーカー、および一もしくはそれ以上の発現カセットを含む。用語発現すると発現は遺伝子もしくはDNA配列の情報の顕在化を可能にしあるいは引き起こすことを意味し、例えば対応する遺伝子もしくはDNA配列の転写および翻訳に関わる細胞機能の活性化によるタンパク質の生産を意味する。DNA配列は細胞内もしくは細胞により発現され、タンパク質のような発現産物を形成する。例えば結果として生じるタンパク質のような発現産物はそれ自身も、細胞によって発現されたと表現できる。ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組み換えによって発現され、例えば、異種のもしくは天然のプロモーターの制御下で異種の宿主細胞において、もしくは異種のプロモーターの制御下で天然の宿主細胞において発現もしくは生産される。本発明は例えば、細胞もしくは被験者に送達可能なシトシンデアミナーゼもしくはその変異体をコードする異種のポリヌクレオチドを含む複製コンピテントウイルスベクターを提供する。ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、水泡性口内炎ウイルスベクターのようなラブドウイルスベクター、レオウイルスベクター、SenecaValleyウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、パルボウイルスベクター、アルファウイルスベクターもしくはこの分野における通常の知識を有する者に知られている他のウイルスベクターであってもよい。ある実施形態では、ウイルスベクターは増殖中の哺乳類細胞にのみ感染する複製コンピテントレトロウイルスベクターであってもよい。ある実施形態では、複製コンピテントレトロウイルスベクターは例えばシトシンデアミナーゼなどをコードする異種のポリヌクレオチドの5側に配列内リボソーム進入部位を含む。ある実施形態では、ポリヌクレオチドはレトロウイルスベクターのENVポリヌクレオチドの3側に位置する。ある実施形態ではウイルスベクターは標的細胞に対して複数回感染することができるレトロウイルスベクターである。本発明は従来のレトロウイルスベクターと比較してより安定である複製コンピテントレトロウイルスベクターもまた提供する。感染および複製中のそのような増大した安定性は細胞増殖性疾患の治療にとって重要である。形質導入効率、導入遺伝子の安定性および標的選択性の組み合わせが本複製コンピテントレトロウイルスによって提供される。本発明の組成物および方法は挿入断片の安定性をもたらし、導入遺伝子の転写活性およびコードされているポリペプチドの翻訳の有効性を維持する。本発明は改変レトロウイルスベクターを提供する。改変レトロウイルスベクターはレトロウイルス科に由来していてもよい。レトロウイルス科は3つのグループで構成されるヒトフォーミーウイルスのようなスプーマウイルス、レンチウイルスおよび羊のビスナウイルス、ならびにがんウイルスである。用語レンチウイルスは慣習上、逆転写酵素を有するウイルスの属をあらわすために用いられる。レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスタイプ1およびタイプ2やサル免疫不全ウイルスを含む免疫不全ウイルスを含む。がんウイルスは、ウイルスの成熟の最中に電子顕微鏡でみられる粒子の形態に基づいて、さらにA、B、CおよびDグループに歴史的に細分化されている。A型の粒子は感染した細胞の細胞質でみられるBおよびD型のウイルスの未熟な粒子を表している。これらの粒子は感染性ではない。細胞質内のA型粒子を包み込むことによって、B型の粒子は成熟したビリオンとして原形質膜から出芽する。この膜においてウイルスはドーナツ型の75nmの核を有しており、そこから長い糖タンパクのスパイクが突出する。出芽後、B型の粒子は偏心的に位置した高電子密度の核を有する。B型ウイルスのプロトタイプはマウス乳がんウイルスである。C型のウイルスが感染した細胞では細胞質内に粒子は認められない。代わりに、三日月のCの形をした縮合物を介して成熟した粒子が細胞表面から直接出芽し、その後それ自身が徐々に取り囲まれ原形質膜によって包み込まれる。均一に電子密度の高い核とともに、エンベロープの糖タンパクのスパイクが見られる。出芽は表面原形質膜から、もしくは直接細胞内の液胞中に起こり得る。C型のウイルスは最もよく研究されており、トリ白血病ウイルスやマウス白血病ウイルスの多くが含まれている。ウシ白血病ウイルス、およびヒトT細胞白血病ウイルスタイプIおよびIIは細胞表面からの出芽の形態からC型の粒子として同様に分類される。しかしながら、それらは規則的な六角形の形態も有し、またマウス白血病ウイルスのようなプロトタイプのC型ウイルスよりも複雑なゲノム構造を有する。D型の粒子は感染細胞の細胞質においてリングの様な構造を示す点でB型の粒子と似ており、細胞表面から出芽するが、ビリオンは短い表面糖タンパクのスパイクを取り込む。また、高電子密度の核は粒子の中で偏心的に位置している。マソンファイザーサルウイルスはD型のウイルスのプロトタイプである。レトロウイルスは様々な方法で分類されるがこの10年間で命名法が標準化されたatncbinlmnihgovICTVdbICTVdBおよび教科書RetrovirusesEdsCoffinHughsおよびVarmusColdSpringHarborPress1997を参照その開示内容を参照し本明細書に組み込む。ある実施形態では、複製コンピテントレトロウイルスベクターはオルソレトロウイルスもしくはより典型的なものとしてガンマレトロウイルスベクターを含んでもよい。レトロウイルスはその遺伝物質を複製する方法によって特徴づけられる。複製の際RNAはDNAに変換される。細胞への感染に続いて、ウイルス粒子中の二分子のRNA分子から、逆転写として知られる分子的な過程によって二本鎖のDNA分子が作られる。DNAはプロウイルスとして宿主細胞のゲノムの中に共有結合的に組み込まれ、そこからウイルスのRNAは細胞およびもしくはウイルスの因子を用いて発現される。発現されたウイルスのRNAは粒子中にパッケージされ感染性のあるビリオンとして放出される。レトロウイルス粒子は二つの同一なRNA分子で構成される。野生型のゲノムは各々が、5末端がキャップされており3末端がポリアデニル化されているRNA単鎖分子であるポジティブセンスを有する。二倍体のウイルス粒子はgagタンパク質、ウイルスの酵素およびgagタンパク質の核の構造の中にある宿主のtRNA分子と複合体を形成した二つのRNA鎖を含む。このカプシドを囲み保護しているのは宿主の細胞膜に由来し、ウイルスエンベロープタンパク質を含む脂質二重層である。envタンパク質はウイルスにとっての細胞側のレセプターに結合し、通常粒子はレセプターが介在するエンドサイトーシスおよびまたは膜融合によって宿主細胞に進入する。外側のエンベロープが脱落した後、ウイルスRNAは逆転写によりDNA中にコピーされる。これはpol領域にコードされている逆転写酵素によって触媒され、DNA合成のためのプライマーとしてビリオンにパッケージされた宿主細胞のtRNAを用いる。このようにしてRNAゲノムはより複雑なDNAゲノムに変換される。逆転写によって作られた二本鎖の直鎖DNAは核の中で環状化されなければならないことがある。プロウイルスは両末端に長い末端反復配列として知られる二つの同一の反復配列を有する。これら二つのLTR配列の末端は組み込みを触媒するpol産物―インテグラーゼタンパク質―によって認識される部位を形作り、それによりプロウイルスは常にLTRの末端から二つの塩基対のところで宿主DNAに進入する。細胞の配列の複製は両方のLTRの末端で観察され、転移可能な遺伝要素の組み込みパターンを連想させる。レトロウイルスは自身のDNAを宿主DNAの多くの場所に組み込むことができるが、異なるレトロウイルスは異なる組み込みサイトの嗜好性を有する。HIV1とサル免疫不全ウイルスのDNAは発現される遺伝子中に優先的に組み込まれ、マウス白血病ウイルスDNAは転写開始位置の近くに優先的に組み込まれ、トリ肉腫白血病ウイルスおよびヒトT細胞白血病ウイルスのDNAはほとんど不規則に組み込まれ遺伝子の嗜好性は軽微であるHumanTcellleukemiavirustype1integrationtargetsitesinthehumangenomecomparisonwiththoseofotherretrovirusesJVirol8167316741LewinskiMKらRetroviralDNAintegrationviralandcellulardeterminantsoftargetsiteselectionPLoSPathog2e601。組み込まれたウイルスDNAの転写、RNAスプライシングおよび翻訳は宿主細胞のタンパク質に仲介される。さまざまな種類のスプライシングされた転写産物が作られる。ヒトレトロウイルスHIV12およびHTLVIIIの場合にはウイルスのタンパク質もまた遺伝子発現の調節のために使われる。細胞とウイルスの因子間の相互作用は、ウイルスの潜伏期間およびウイルス遺伝子の発現する時間的順序の制御の際の1つの要因となる。レトロウイルスは水平的にも垂直的にも伝播されうる。レトロウイルスの効率的な感染性伝達にはウイルスのエンベロープタンパク質を特異的に認識するレセプターの標的細胞での発現が必要であるが、ウイルスはレセプター非依存性の非特異的で低効率な進入経路を用いることもある。通常ウイルス感染においては、レセプターのマスキングもしくは発現抑制のために細胞あたり1もしくは少数のコピーウイルスゲノムが生じ、そのため重複感染に対する抵抗性をもたらす。組織培養の条件を操作することにより、ある程度複数回感染させることが可能となるが、通常は二倍体のゲノムに対して5コピー未満である。さらに、標的細胞タイプはウイルスが結合し侵入した後の複製サイクルの全てのステージを支持できなければならない。ウイルスゲノムが宿主の生殖系列に組み込まれたときには、垂直伝播が起こる。プロウイルスは細胞の遺伝子であるかのように世代から世代へ伝わる。こうして、しばしば潜伏するが、宿主が適切な薬剤にさらされたときに活性化される内在性プロウイルスが確立される。組み換え複製コンピテントレトロウイルスを治療的に用いる多くの場面では、組み換え複製コンピテントレトロウイルスにコードされている導入遺伝子の高レベルの発現を得ることが有利である。例えば、プロドラッグを活性化するシトシンデアミナーゼ遺伝子のような遺伝子を用いて、より高いレベルのCDタンパクを細胞内で発現させプロドラッグである5FCを5FUにより効率的に変換できるようにすることは有利である。本発明は標的細胞もしくは標的細胞集団に複数回感染し、二倍体のゲノムに対して平均して5もしくはそれ以上のコピーを作ることができる組み換え複製コンピテントレトロウイルスを提供する。また標的細胞もしくは標的細胞集団に複数回感染し、二倍体のゲノムに対して平均して5もしくはそれ以上のコピーを作ることができる組み換え複製コンピテントレトロウイルスを用いて細胞増殖性疾患を治療する方法も提供する。さらに別の実施形態では、チモシン-アルファ-1を含む組み合わせ療法を用いて、アポトーシスおよび本発明のRCRによる治療効果を促進する。上述したように、組み込まれたDNA中間体はプロウイルスと呼ばれる。従前の遺伝子治療もしくは遺伝子送達システムでは、プロウイルスの転写および感染性のウイルスへの組み立てを必要とする方法およびレトロウイルスが用いられ、これは適切なヘルパーウイルスの存在下において、もしくは混入したヘルパーウイルスの同時生産なしにキャプシド形成を可能にする適切な配列を有する株化細胞においてなされる。以下に述べるように、ヘルパーウイルスは本発明の組み換えレトロウイルスの生産にとって必要ではない。なぜなら、キャプシド形成に必要な配列はゲノムに用意されており、従って遺伝子送達や治療のための複製コンピテントレトロウイルスベクターが得られるからである。他の現存の複製コンピテントレトロウイルスベクターもまた、不安定でありがちであり、感染細胞や宿主細胞への水平伝播や垂直伝播の際および複製の際に配列を失ってしまう傾向がある。これは、反復配列を含むかもしくはポリメラーゼの効率を下げる余分なヌクレオチド配列の存在に部分的に起因し得る。本発明におけるレトロウイルスゲノムとプロウイルスDNAは少なくとも3つの遺伝子:gag、polおよびenvを有し、これらの遺伝子は一つもしくは二つの長い末端反復配列と隣接しているか、もしくはプロウイルスでは二つの長い末端反復配列およびpsiのようなシス作用性配列を含む配列に隣接している。gag遺伝子は内部構造のタンパク質をコードしている。pol遺伝子はRNA依存性DNAポリメラーゼ、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードしておりenv遺伝子はウイルスエンベロープの糖タンパク質をコードしている。5およびもしくは3LTRはビリオンRNAの転写およびポリアデニル化を促すのに役立つ。LTRはウイルスの複製に必要な他の全てのシス作用性配列を含んでいる。レンチウイルスはさらにvif、vpr、tat、rev、vpu、nefおよびvpxを含む遺伝子を有する。5LTRの隣接部位にはゲノムの逆転写に不可欠な配列およびウイルスRNAの粒子への効率的なキャプシド形成に必要な配列がある。もしキャプシド形成に不可欠な配列がウイルスゲノムから欠失すると、その結果シス欠損となりゲノミックなウイルスRNAのキャプシド形成が妨げられる。このタイプの改変ベクターは、既存の遺伝子送達システムにおいて、パッケージ可能だが複製できないRNAゲノムをパッケージするウイルスタンパク質をトランスにおいて提供するヘルパー要素として、一般に用いられてきた。最初の実施形態では、本発明は分裂細胞もしくは細胞増殖性疾患を有する細胞に感染可能な組み換えレトロウイルスを提供する。本発明の組み換え複製コンピテントレトロウイルスはウイルスGAG、ウイルスPOL、ウイルスENVをコードするポリヌクレオチド配列、ビリオン内に封入された配列内リボソーム進入部位が先行する異種のポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では異種のポリヌクレオチドはシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている。また別の実施形態では、レトロウイルスベクターと同時、投与前、もしくは投与後にチモシン-アルファ-1活性を有するポリペプチドを投与する。用語非分裂細胞は有糸分裂をしない細胞を意味する。非分裂細胞は細胞が活発に分裂していない限り、細胞周期のどの点であっても阻止されうる。exvivoの感染では分裂細胞は、照射、アフイディコリン処置、血清飢餓および接触の阻害を含む当業者により用いられる標準的な方法によって細胞分裂を阻止するよう処置されうる。しかしながら、多くの細胞はすでに停止しているためexvivo感染は多くの場合細胞のブロッキングなしで行われるものと理解されたい。例えば、組み換えレンチウイルスベクターは非分裂細胞に感染可能である。身体においてもともと存在する非分裂細胞の例には、神経、筋肉、肝臓、皮膚、心臓、肺、および骨髄細胞やそれらに由来するものが含まれる。分裂細胞のためにはがんレトロウイルスベクターを用いることができる。分裂細胞は活発な有糸分裂もしくは減数分裂を行っている細胞を意味する。そのような分裂細胞は幹細胞、皮膚細胞、生殖細胞および当業者に知られている他の分裂細胞を含む。分裂細胞という用語に含まれ、かつとりわけ興味深いのは腫瘍細胞のような細胞増殖性疾患を有する細胞である。用語細胞増殖性疾患は異常な数の細胞で特徴付けられる状態を意味する。この状態には、肥大的なおよび発育不全的な細胞の増殖または体内のある部分への細胞の過剰な流入もしくは転移が含まれる。その細胞集団は必ずしもがん化、腫瘍化または悪性化しておらず、通常の細胞もまた含まれ得る。細胞増殖性疾患は、強皮症、関節炎、および肝硬変を含む様々な線維症のような結合組織の異常増殖に関連する疾患を含む。細胞増殖性疾患は頭および首の細胞腫のような腫瘍性の疾患を含む。頭および首のがんは例えば、口、食道、のど、喉頭、甲状腺、舌、唇、唾液腺、鼻、副鼻腔、上喉頭、上鼻腔がん、感覚神経芽腫、扁平上皮がん、悪性黒色腫、鼻腔の未分化がん、脳もしくは血液腫瘍が含まれる。また、頸部リンパ節、喉頭前リンパ節、食道傍リンパ節および顎下リンパ節を含む局所リンパ節のがんもまた含まれる。他のがんのタイプには、肺がん、結腸-直腸がん、乳がん、前立腺がん、尿路がん、子宮がんリンパ腫、口のがん、すい臓がん、白血病、黒色腫、胃がん、皮膚がん、卵巣がんが含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞増殖性疾患はまた、間接リウマチおよび多くの場合免疫系の細胞の不適切な増殖によって特徴づけられる他の自己免疫疾患を含んでいる。異種の核酸配列は機能可能にIRESと連結される。本明細書で用いられる用語異種核酸配列もしくは導入遺伝子は野生型のレトロウイルスでは通常存在しない配列、異なる種に由来する配列、もしくは同じ種に由来するものであっても、元の配列から実質的に改変されているものを意味する。また変化していない核酸配列で、細胞において通常発現していないものも異種の核酸配列である。本発明のレトロウイルスベクターの使用目的によって、任意の数の異種のポリヌクレオチドもしくは核酸配列をレトロウイルスベクターに挿入することができる。例えば、invitroの試験においては抗生物質耐性もしくは蛍光分子を含む一般的に用いられるマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子が用いられてもよい。任意の所望のポリペプチド配列をコードする付加的なポリヌクレオチド配列が本発明のベクターに挿入されてもよい。異種核酸配列のinvivo送達を目的とする場合には治療的および非治療的な配列を用いてもよい。例えば、異種の配列はアンチセンス分子を含む治療的な分子や、細胞増殖性疾患もしくは他の遺伝子関連病もしくは疾患に関連する特定の遺伝子に関するリボザイムをコードしていてもよく、異種の配列は自殺遺伝子、成長因子もしくは治療的なタンパク質であってもよい。本発明に利用できる他の治療的なタンパク質は当業者によって容易に特定される。ある実施形態では、ベクター中の異種のポリヌクレオチドはヒト細胞での発現に最適化されたシトシンデアミナーゼを含む。さらに別の実施形態では、シトシンデアミナーゼはヒトのコドンに最適化された配列を含み、また野生型のシトシンデアミナーゼと比較して、シトシンデアミナーゼの安定性を向上するための変異を含む。また別の実施形態では、異種のポリヌクレオチドは、UPRTもしくはOPRT活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能可能に連結させたシトシンデアミナーゼを含む融合構築物をコードする。他の実施形態では、異種のポリヌクレオチドは本発明のCDポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、複製コンピテントレトロウイルスベクターは、シトシンデアミナーゼを含むポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含むことができ、さらにウイルスプロモーターの一次転写物の一部として、または細胞タイプもしくは組織特異的であることができるプロモーターに連結したmiRNAもしくはsiRNA分子を含むポリヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、がんにおいて発現抑制されるmiRNAは抗がん剤として有用であることができよう。例としてmir1281、let7、miR26、miR124、およびmiR137が含まれる。miR128の発現は中枢神経系で強いと報告されており、神経膠芽腫では発現抑制されることが認められている91259130。miR128はmiR1281およびmiR1282の二つの異なる遺伝子によりコードされている。どちらも同一の成熟配列にプロセシングされる。Bmi1およびE2F3aはmiR128の直接の標的であることが報告されている91259130Zhangら、2009JMolMed874351。さらに、Bmi1の発現は、神経膠腫、マントル細胞リンパ種、非小細胞性肺がん、B細胞非ホジキンリンパ腫、胸、結腸直腸および前立腺がんを含む様々なヒトのがんで上昇制御されることが認められている。さらにBmi1は、神経幹細胞と同様に神経膠腫での幹細胞に似た細胞集団も含む異なる組織からの幹細胞の自己複製に必要であることが実証されている。ある実施形態では、本発明はIRESに連結させたyCD2もしくはGFPのような導入遺伝子の下流に1コピーのmiR1423p標的配列を含む組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターを提供する。miR181およびmiR223に加えて、特定の組織や細胞タイプにおけるウイルスの伝播を制限するために他の組織もしくは細胞で豊富なmiRNAの標的配列をベクターに組み込んでもよい。例えば、miR133およびmiR206の発現は筋肉細胞で非常に強い。他の実施形態では、本発明はIRESに連結させたyCD2もしくはGFPのような導入遺伝子の下流に4コピーの1423pTを含む組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターを提供する。miR181およびmiR223に加えて、特定の組織や細胞タイプにおけるウイルスの伝播を制限するために他の組織もしくは細胞で豊富なmiRNAの標的配列をベクターに組み込んでもよい。またさらに別の実施形態では、異種のポリヌクレオチドはインターロイキン、インターフェロンγもしくは同様のもののようなサイトカインを含んでもよい。本発明におけるレトロウイルスベクターから発現されるサイトカインにはIL1α、IL1β、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、およびIL21、antiCD40、CD40L、IFNγおよびTNFα、可溶性TNFα、リンホトキシンα、LTβ、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、41BBL、DcR3、OX40L、TNFγ、AIMI、エンドカインα、OPG、およびニュートロカインα、OX40、および神経成長因子、可溶性Fas、CD30、CD27、CD40および4IBB、TR2、DR3、DR4、TR5、TRANK、TR9、TR10、312C2、およびTR12、および可溶性CD154、CD70、およびCD153が含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、特に株化細胞からのタンパク生産には血管新生タンパク質が有用であるかもしれない。該血管新生因子には、神経膠腫由来成長因子、血小板由来成長因子A、血小板由来成長因子B、胎盤成長因子、胎盤成長因子2、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子A、血管内皮増殖因子2、血管内皮増殖因子B、血管内皮増殖因子B186、血管内皮増殖因子D、および血管内皮増殖因子Eがあるが、これらに限定されるものではない。線維芽細胞増殖因子が本発明のベクターを用いて送達されてもよく、限定されるものではないが、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14およびFGF15を含む。造血性の成長因子が本発明のベクターを用いて送達されてもよく、該成長因子には、限定されるものではないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、幹細胞因子、巨核球コロニー刺激因子、PIXY321融合タンパクや同様のものが含まれる。用語調節性の核酸配列は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流の調節領域、複製開始点、エンハンサーや同様のもの全体を意味し、これらは全体としてレシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞で複製、転写および翻訳され得る限り、これらの全ての調節領域が常に必要となるわけではない。当業者は、公共のデータベースや参考資料から調節性の核酸配列を容易に特定することができる。さらに、当業者は、例えばinvivo、exvivo、もしくはinvitroなどの使用意図のために適用可能な調節配列を特定することができる。配列内リボソーム進入部位はたいていIRESの3側にあるコード配列の翻訳中にリボソームが侵入しもしくは保持されるのを促す核酸の領域を意味する。いくつかの実施形態ではIRESはスプライシングの受容部位供与部位を含んでいてもよいが、スプライシングの受容部位供与部位がないほうが好ましい。通常、リボソームのメッセンジャーRNAへの進入は全ての真核生物のmRNAの5末端に位置するキャップを経由して起こる。しかしながらこの一般法則には例外がある。ある種のウイルスmRNAにおいてキャップが欠如していることは、これらのRNAの内部部位にリボソームが侵入できる代わりの構造が存在することを示唆している。現在までに、これらの多数の構造その機能からたIRESとされるがキャップされていないウイルスmRNAの5非コード領域において同定されている。その中には、特にポリオウイルスおよびEMCVウイルスのようなピコナウイルスがある。本発明は複製コンピテントレトロウイルスベクターにおけるIRESの使用を提供する。用語プロモーター領域は本明細書において通常の意味で、DNA調節配列を含むヌクレオチド領域を意味し、ここで調節配列はRNAポリメラーゼと結合し下流のコード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。調節配列は所望の遺伝子配列にとって同種のものでも異種のものであってもよい。例えば、上述したウイルスもしくは哺乳類のプロモーターを含む様々なプロモーターが利用されている。異種の核酸配列は一般的にウイルスLTRプロモーターエンハンサーのシグナルもしくは内部のプロモーターのいずれかの支配下にあり、レトロウイルスのLTR中に保持されたシグナルはまだ宿主細胞ゲノムへの効率的なベクターの組み込みを引き起こすことができる。したがって、本発明の組み換えレトロウイルスベクター、所望の配列、遺伝子およびもしくは遺伝子断片は幾つかの部位および異なる調節配列の下に挿入することができる。例えば、挿入のための部位はウイルスのエンハンサープロモーターの近くの部位であってもよい。あるいは、所望の配列は調節配列の遠くの部位に挿入されてもよく、また二つもしくはそれ以上の異種の配列が存在している場合、一つの異種の配列は最初の調節領域の支配下に、二つ目の異種の配列は二つ目の調節領域の支配下にあってもよい。他の遠くの部位としてウイルスのプロモーター配列があり、所望の配列の発現がプロモーター近くのシストロンのスプライシングを介して起こる場合、SV40もしくはCMVのような内部の異種プロモーター、または内部リボソーム進入部位を使用することができる。ある実施形態では、本発明のレトロウイルゲノムは所望異種のポリヌクレオチドを挿入するためのIRES下流のクローニング部位を含むIRESを有している。ある実施形態では、IRESはレトロウイルスベクターのenv遺伝子の3側に位置するが、所望の異種のポリヌクレオチドの5側に位置する。したがって、所望のポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドは機能可能にIRESと連結され得る。他の実施形態では、目的のポリヌクレオチド配列は本発明の組み換えレトロウイルスベクターの一部として含まれている。目的のポリヌクレオチド配列は、目的のリガンド、組織特異的もしくは細胞タイプ特異的調節要素、もしくは目的のリガンドと組織特異的細胞タイプ特異的調節要素の組み合わせである。好適には、目的のリガンドはレトロウイルスのenvタンパク質と機能可能に連結され、キメラレトロウイルスenvタンパク質を形成する。ウイルスGAG、ウイルスPOLおよびウイルスENVタンパク質は適したいずれのレトロウイルス由来であってもよい。他の実施形態では、ウイルスENVタンパク質はレトロウイルスに由来しない。ある実施形態では、本発明の組み換えレトロウイルスは特定の細胞タイプを標的とするよう遺伝的に改変されており、それによりレトロウイルスベクターの組み換えゲノムは標的とする非分裂細胞、標的とする分裂細胞、もしくは標的とする細胞増殖性疾患を有する標的細胞に送達される。ある実施形態では、レトロウイルスベクターは細胞外表面に分子を有する細胞に結合することにより細胞を標的とする。レトロウイルスによるこの標的方法は、レトロウイルスの外被上の標的リガンドの発現を利用して、レトロウイルスの表面にある標的リガンドと相互作用する受容体もしくは結合分子を有する細胞や組織へのウイルスのターゲティングを補助する。ウイルスにより細胞が感染した後に、ウイルスは核酸を細胞に注入し、レトロウイルスの遺伝物質は宿主の細胞のゲノムに組み込まれる。他の実施形態では、以下でより詳細に述べるように、調節要素を積極的に利用する標的細胞においてウイルスゲノムの発現および転写を促すために、細胞または組織特異的な調節要素をターゲティングに用いる。伝達されたレトロウイルスの遺伝物質はその後宿主細胞の中でタンパク質に転写および翻訳される。標的調節要素は一般にLTRの5およびもしくは3側に連結し、キメラLTRを形成する。例えば特定の標的細胞にある受容体のリガンドをコードしている他の遺伝子とともに、目的の異種のポリヌクレオチドを本発明のウイルスベクターに挿入することにより、ベクターは標的に特異的なものになる。ウイルスベクターは例えば、糖、糖脂質もしくはタンパク質を付加することにより標的特異的にすることができる。ターゲティングはウイルスベクターを標的とする抗体を用いて達成することもできる。当業者は、ウイルスゲノムに挿入することができる特定のポリヌクレオチド配列、またはウイルスのエンベロープに付加することができるタンパク質を知っているかまたは容易に確かめて、目的の核酸配列を含むウイルスベクターの標的特異的な送達を可能とすることができる。したがって、本発明はある実施形態で、標的ポリペプチドと機能可能に連結させたレトロウイルスのENVタンパク質を含むキメラenvタンパク質を含んでいる。標的ポリペプチドは、細胞特異的な受容体分子、細胞特異的な受容体のリガンド、細胞特異的な抗原エピトープに対する抗体もしくは抗体断片または当業者が容易に特定できる標的細胞と相互作用もしくは結合できる他のいずれのリガンドであってもよい。標的ポリペプチドもしくは標的分子の例としてビオチン―ストレプトアビジンをリンカーとして用いた2価抗体Rouxら、ProcNatlAcadSciUSA8690799083、ハプテンに対する単鎖抗体の可変領域をコードしている配列をエンベロープ中に含む組み換えウイルス、レトロウイルスのエンベロープ中にペプチドホルモンリガンドをクローニングしたもの、キメラEPOenv構築物、狭宿主性のMLVのエンベロープ中の低密度リポタンパク質受容体に対する単鎖抗体LDL受容体を発現するHeLa細胞に特異的に感染することになるがあり、同様にALVの宿主範囲は、インテグリンリガンドの導入によって変更して、ウイルスを種を超えてラット神経膠芽腫細胞に特異的に感染できるようにすることができ、Dornbergおよび共同研究者MEngelstadterら、GeneTherapy812021206は腫瘍マーカーに対する単鎖抗体を含むエンベロープを用いた脾臓壊死ウイルスspleennecrosisvirus、トリレトロウイルスの組織特異的なターゲティングを報告している。本発明は標的細胞に感染可能な組み換えレトロウイルスの生産方法を提供し、その方法は、ウイルスgag、ウイルスpolおよびウイルスenvをコードしているポリヌクレオチド配列ならびに調節性の核酸配列と機能可能に連結させた異種のポリヌクレオチドを含むベクターを、適した宿主細胞にトランスフェクションし、組み換えウイルスを回収することを含む。本発明のレトロウイルスおよび方法は、増殖しビリオンを生産するためにヘルパーウイルスまたは追加の核酸配列もしくはタンパク質を必要としない複製コンピテントレトロウイルスを提供する。例えば上述したように、本発明のレトロウイルスの核酸配列はグループ特異的な抗原および逆転写酵素をコードしている。ウイルスgagとpolはレンチウイルス例えばHIVもしくはがんウイルスもしくはガンマレトロウイルス例えばMoMLVに由来してもよい。さらに、本発明のレトロウイルスの核酸ゲノムはウイルスエンベロープタンパク質をコードする配列を含む。env遺伝子はいずれのレトロウイルスに由来してもよい。envはヒトおよび他の種の細胞への形質導入を可能とする広宿主性のエンベロープタンパク質であってもよいし、マウスおよびラット細胞にしか形質導入されない狭宿主性のエンベロープタンパク質であってもよい。また、エンベロープタンパク質を抗体または特定の細胞タイプの受容体を標的とする特定のリガンドと結合させることにより、組み換えウイルスを標的化させることも望ましいかもしれない。上述したように、レトロウイルスベクターは、例えば糖脂質もしくはタンパク質を挿入することにより標的特異的にすることができる。ターゲティングはしばしばレトロウイルスベクターを特定の細胞タイプの抗原を標的化させる抗体を用いて達成される。当業者は過度の実験なしに、レトロウイルスベクターを特異的な標的に送達するための別の方法を知っているかまたは容易に確かめることができる。ある実施形態では、env遺伝子はレトロウイルスではないウイルスに由来する。レトロウイルス由来のenv遺伝子の例として、限定されるものではないがモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳がんウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスが含まれる。水泡性口内炎ウイルスV、サイトメガロウイルスエンベロープ、もしくはインフルエンザウイルスのヘマグルチニンのような他のenv遺伝子もまた用いることができる。ある実施形態では、レトロウイルスゲノムはがんレトロウイルス、より詳しく言えば哺乳類のがんレトロウイルスに由来する。さらに別の実施形態では、レトロウイルスゲノムはガンマレトロウイルス、より詳しく言えば哺乳類のガンマレトロウイルスに由来する。由来するは親となるポリヌクレオチドが野生型がんウイルスであって、天然の配列の除去もしくは挿入により改変されていることを意味する。他の実施形態では、本発明は調節配列を用いて標的化されるレトロウイルスベクターを提供する。細胞もしくは組織特異的な調節配列を特定の細胞集団での遺伝子配列の発現を標的とするために用いることができる。本発明に適した哺乳類とウイルスのプロモーターは本明細書の別の箇所で述べる。したがってある実施形態では、本発明はレトロウイルスゲノムの5末端に組織特異的なプロモーター要素を有するレトロウイルスを提供する。一般的に、組織特異的な調節要素配列、例えば腫瘍性の細胞にとっての細胞もしくは組織特異的なプロモーターやエンハンサーおよび誘導性のプロモーターはレトロウイルスゲノムのLTRのU3領域に存在する。本発明における転写調節配列は、スーパー抗原、サイトカインまたはケモカインをコードしている遺伝子にもともと関連している天然の転写調節領域もまた含む。ある状況においては、発現を制御することが望ましいかもしれない。例えば、望んだ発現のレベルに応じて活性の強さが異なる別々のウイルスプロモーターが用いられてもよい。哺乳類の細胞においては、CMV即時型プロモーターが強い転写活性を提供するためにしばしば用いられる。導入遺伝子の発現レベルの抑制が必要なときには、CMVプロモーターをあまり強くないものに改変したものもまた用いられている。造血性の細胞での導入遺伝子の発現が望まれるときには、MLVもしくはMMTVのLTRのようなレトロウイルスのプロモーターが用いられてもよい。用いることが可能な他のウイルスプロモーターには、SV40、RSVLTR、HIV1およびHIV2LTR、アデノウイルスプロモーター例えばE1A、E2A、もしくはMLP領域由来、AAVLTR、カリフラワーモザイクウイルス、HSVTK、およびトリ肉腫ウイルスが含まれる。同様に組織特異的もしくは選択的なプロモーターを、特定の組織または細胞での転写に用いて、標的ではない組織への潜在的な毒性または望ましくない効果を抑制してもよい。例えば、PSAのようなプロモーター、プロバシン、前立腺酸性フォスファターゼもしくは前立腺特異的腺性カリクレインが前立腺での遺伝子発現を標的とするために用いられてもよい。乳組織での発現のために乳清アクセサリータンパク質Wheyaccessoryproteinが用いられてもよい。用いられる他のプロモーター調節ドメインを下記表1に記載する。組織特異的調節要素は、他の組織タイプではほぼ沈黙を保つ一方で、ある組織で遺伝子の転写を促すことができる調節要素である。しかしながら、組織特異的なプロモーターはそれらが沈黙している組織において背景または基礎の検出可能な量の活性を有している点は理解されるだろう。プロモーターが標的組織において選択的に活性化される程度は選択比selectivityratioを用いて表すことができる。この点において、本発明において実際に有用な組織特異的プロモーターは一般に約5より大きい選択比を有する。好適には、選択比は約15以上である。ある症状においては、本発明の組み換え複製コンピテントレトロウイルスの投与の特定の時間経過後に転写が活性化されることが望ましいこともあるかもしれない。これはホルモンまたはサイトカインにより調節可能なプロモーターによりなされてもよい。例えば、特定のステロイドが生産されまたは送られてくる性腺組織が指標となる治療の応用場面においては、アンドロゲンもしくはエストロゲンに調節されるプロモーターの使用が有利かもしれない。ホルモンにより調節可能なそのようなプロモーターはMMTV、MT1、エクジソンおよびルビスコを含む。胸腺、下垂体および副腎ホルモンのようなホルモンに反応性のある、他のホルモン調節性プロモーターが用いられてもよい。用いることができるサイトカインおよび炎症性タンパク質応答性のプロモーターには、KおよびTキニノーゲン、cfos、TNFalpha、C反応性タンパク質、ハプトグロビン、血清アミロイドA2、CEBPalpha、IL1、IL6、補体C3、IL8、α1酸性糖タンパク質、α1アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ、アンジオテンシノーゲン、フィブリノーゲン、cjun、コラゲナーゼ、メタロチオネイン、ストロメライシン、α2マクログロブリンおよびアンチキモトリプシンが含まれる。オステオカルシン、低酸素応答性領域hypoxiaresponsiveelement、MAGE4、CEA、αフェトプロテイン、GRP78BiPおよびチロシナーゼのようながん特異的プロモーターもまた、がん細胞での遺伝子発現を調節するために用いてもよい。さらに、このプロモーターの一覧表は網羅しあるいは限定するために作られたものではなく、当業者は本明細書で開示したプロモーターおよび方法と併せて用いることができる他のプロモーターを知っているだろう。表1組織特異的プロモーターさらに、一つの組織タイプに活性が制限されない一方で、にもかかわらず一つの組織グループでは活性であり、他の組織グループではあまり活性でないか沈黙しているという選択性をある種のプロモーターが示すことは理解されるだろう。そのようなプロモーターもまた組織特異的という用語が用いられ、本発明の使用のために熟慮される。例えば、様々な中枢神経系のニューロンにおいて活性なプロモーターは、脳の多くの異なった領域のいずれかに影響を及ぼしうる脳卒中によるダメージを保護する際の治療に有用である。したがって、本発明で用いられる組織特異的な調節要素は本レトロウイルスベクターの標的ポリヌクレオチド配列として適用性があるだけでなく、異種のタンパク質の調節にも適用性がある。また別の実施形態では本発明は組み換えレトロウイルスに由来する構築物を含むプラスミドを提供する。プラスミドはNIH3T3もしくは他の組織の培養細胞のような培養細胞もしくは標的細胞に直接導入することができる。得られる細胞は細胞の培地中にレトロウイルスベクターを放出する。本発明は5から3に向けて以下を含むポリヌクレオチド構築物を提供する転写を開始するために有用なプロモーターもしくは調節領域;psiパッケージングシグナル;gagをコードする核酸配列、polをコードする核酸配列;envをコードする核酸配列;配列内リボソーム進入部位核酸配列;マーカー、治療もしくは診断のためのポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチド;およびLTR核酸配列。本明細書の別の箇所や次に述べるように、本発明におけるポリヌクレオチド構築物の様々な部分は目的の宿主細胞、発現のタイミングもしくは量、および異種のポリヌクレオチドに部分的に依存して設計されている。本発明の複製コンピテントレトロウイルス構築物はいくつかのドメインに分割することができ、それらは当業者によって各々改変されうる。例えば、プロモーターは配列番号19、20もしくは22のヌクレオチド1から約582に記載の配列を有するCMVプロモーターを含んでもよいし、改変されたプロモーターが転写を誘導し開始させることができる限りにおいて、一もしくは複数の改変を含んでもよい。ある実施形態では、プロモーターもしくは調節領域はCMVRU5ドメインのポリヌクレオチドを含む。CMVRU5ドメインはMLVのRU5領域に連結されたヒトサイトメガロウイルス由来の即時型のプロモーターを含む。ある実施形態では、CMVRU5ドメインのポリヌクレオチドは配列番号19、20もしくは22のヌクレオチド約1から約1202に記載の配列、もしくは配列番号19、20もしくは22の配列と少なくとも95の同一性を有する配列を含み、そのポリヌクレオチドはそれに対して機能可能に連結された核酸分子の転写を促す。ポリヌクレオチドのgagドメインはいずれの数のレトロウイルスに由来してもよいが、一般的にはがんレトロウイルス、より具体的には哺乳類のがんレトロウイルスに由来する。ある実施形態ではgagドメインはヌクレオチド約1203から約2819までの配列、もしくはそれに対して少なくとも95、98、99もしくは998の同一性を有する配列を含む。ポリヌクレオチドのpolドメインはいずれの数のレトロウイルスに由来してもよいが、一般的にはがんレトロウイルス、より具体的には哺乳類のがんレトロウイルスに由来する。ある実施形態ではpolドメインはヌクレオチド約2820から約6358までの配列、もしくはそれに対して少なくとも95、98、99もしくは999の同一性を有する配列を含む。ポリヌクレオチドのenvドメインはいずれの数のレトロウイルスに由来してもよいが、一般的にはがんレトロウイルスまたはガンマレトロウイルス、より具体的には哺乳類のがんレトロウイルスまたはガンマレトロウイルスに由来する。幾つかの実施形態ではenvをコードするドメインは広宿主性のenvドメインを含む。ある実施形態ではenvドメインはヌクレオチド約6359から約8323までの配列、もしくはそれに対して少なくとも95、98、99もしくは998の同一性を有する配列を含む。ポリヌクレオチドのIRESドメインはいずれの数の配列内リボソーム進入部位から取得されてもよい。ある実施形態では、IRESは脳心筋炎ウイルスに由来する。ある実施形態ではIRESドメインはヌクレオチド約8327から約8876までの配列、もしくはドメインがリボソームの進入を許容する限りにおいて、それに対して少なくとも95、98、もしくは99の同一性を有する配列を含む。異種のドメインは本発明のシトシンデアミナーゼを含んでもよい。ある実施形態では、CDポリヌクレオチドはヒトコドンに最適化された配列を含む。また別の実施形態では、CDポリヌクレオチドはシトシンデアミナーゼを有する変異体のポリペプチドをコードしており、その変異は熱安定性の向上に寄与し、融点を10°C上げ、それにより広い温度域で動力学的活性が維持され蓄積されるタンパク質の量が増加する。ある実施形態では、シトシンデアミナーゼは配列番号19もしくは22のヌクレオチド数約8877から約9353に記載の配列を有する。異種のドメインの後ろにはポリプリンが豊富なドメインが続き得る。3LTRはいずれの数のレトロウイルス、特にがんレトロウイルス好ましくは哺乳類のがんレトロウイルスに由来してもよい。ある実施形態では、3LTRはU3RU5ドメインを含む。また別の実施形態ではLTRは配列番号19もしくは22のヌクレオチド約9405から約9998に記載の配列、もしくはそれに対して少なくとも95、98、もしくは995の同一性を有する配列を含む。本発明は5から3にかけて、CMVRU5、MLVのRU5領域に連結されたヒトサイトメガロウイルス由来の即時型のプロモーターの融合物;PBS、逆転写酵素のためのプライマー結合部位;5スプライシング部位;psiパッケージングシグナル;gag、MLVグループ特異的な抗原のためのORF;pol、ポリメラーゼポリタンパク質のためのORF3スプライシング部位4070Aenv、MLV4070A株のエンベロープタンパク質のためのORF;IRES、脳心筋炎ウイルスの配列内リボソーム進入部位;改変されたシトシンデアミナーゼ;PPT、ポリプリントラクト;およびU3RU5、MLV末端反復配列を含む組み換えレトロウイルスベクターもまた提供する。図3にこの構造をより詳細に示す。本発明は配列番号19、20もしくは22に記載される配列を含むレトロウイルスベクターもまた提供する。レトロウイルスベクターは、多数の細胞増殖性の病気および疾患を含む広範囲の病気および疾患を治療するために用いることができる。本発明は細胞増殖性疾患の治療のための遺伝子治療法もまた提供する。該治療法は適切な治療のためのポリヌクレオチドを増殖性疾患を有する対象の細胞に導入することによりその治療効果を達成する。ポリヌクレオチド構築物の送達は本発明の組み換えレトロウイルスベクター、特に分裂細胞に感染可能なMLVに由来するものを用いて達成されうる。さらに、本明細書で説明される治療法はinvivoもしくはexvivoで実施することができる。遺伝子治療に先立って、例えば外科的にあるいは放射線によってがんの大部分が除去されていることが望ましいかもしれない。状況によって、レトロウイルス治療は外科的治療、化学療法または放射線治療に先立ってもあるいはその後になされてもよい。本発明の方法と組成物は、ベバシズマブによる治療法を含む組み合わせ療法において有用である。本明細書で述べるように、治療的な遺伝子を含む本発明の複製コンピテントレトロウイルスは細胞増殖性疾患の治療に有用である。本発明のRCRの利点として、増殖中の細胞やがん細胞に感染できる能力がある。ベクターの導入遺伝子が細胞毒性の遺伝子を含む場合には、これががん細胞を殺す能力をもたらす。他の実施形態では、本発明の方法および組成物はアポトーシスを促す作用剤もしくはサイトカインやアポトーシスを促す作用剤の発現を改変する作用剤との組み合わせにおいて有用である。例えば、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む本発明のレトロウイルスベクターは、チモシン-アルファ-1活性を有するペプチドまたはポリペプチドの投与に先立って、同時に、または投与後に投与することができる。ある実施形態では、チモシン-アルファ-1ポリペプチドは約0116mgkg投与される。チモシン-アルファ-1はアポトーシス促進性のタンパク質を発現上昇させることで腫瘍性の細胞の化学療法剤への感受性を増加させることによりはたらく。具体的には、チモシン-アルファ-1はアポトーシス促進性のFasL、FasRおよびTNFαR1を発現上昇させる。本発明のRCRとの組み合わせにおいては、チモシン-アルファ-1は腫瘍性の細胞の5FUへの感受性を増加させるアジュバントとして機能し、Toca511として知られるT50002に由来するRCRの投与後の化学療法剤として、Toca511の5FCから5FUへの変換の効率を上げる。チモシン-アルファ-1はまた免疫成分の補充および活性を増加させる免疫調節性の因子としても機能し、それがRRV治療のワクチンの効率性の向上につながる。チモシン-アルファ-1活性を有するポリペプチドはチモシン-アルファ-1を含むポリペプチドもしくはその変異体もしくはその相同体を意味する。チモシン-アルファ-1は28アミノ酸のペプチドであり、胸腺を循環する天然起源のホルモンの合成形を含む。TA1は胸腺細胞の増殖と分化、IL2、T細胞IL2受容体、IFNγおよびIFNαの生産を刺激する。TA1の投与計画についてはよく知られている。どうあろうと、ヒトにおける投与量は1投与につき、1から100mgのような広い範囲を超えてもよい。本発明はしたがって、がん治療効果を強めるために、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種の遺伝子を含む本発明の複製コンピテントレトロウイルスベクターと併せてαチモシンペプチドを投与することを提供する。チモシンペプチドはチモシン-アルファ-1およびTA1に構造的な相同性を有するペプチドを含む。TA1はアミノ酸配列SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGluIleThrThrLysAspLeuLysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsnを有するペプチドである。TA1のアミノ酸配列はUSPatNo4079137に開示されており、その開示内容を参照により本明細書に組み込む。TA1はアセチル化されたN末端を有するグリコシル化されていない28アミノ酸のペプチドであり、約3108の分子量を有する。TA1の合成品は商品名ZADAXINとして幾つかの国において商業的に入手可能である。チモシンペプチドは特にToll様受容体9を活性化し、それによりTh1細胞、B細胞およびNK細胞を増加させることで、結果としてワクチンの効率性の向上につながると考えられている。例えば、TA1はリンパ球性の浸潤、化学走性のサイトカインの分泌、樹状細胞の成熟および分化、IFNα、IL7およびIL15を含むチモポエイティックthymopoieiticなサイトカインの分泌、B細胞による抗体の生産を増加または亢進させうる。本発明のベクターおよび方法と併せた使用が見出されたチモシンペプチドは、合成のTA1や組み換えのTA1と同様に天然起源のTA1を含む。いくつかの実施形態では、チモシンペプチドは配列番号73のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、チモシンペプチドは実質的にTA1に類似するアミノ酸配列を含み、TA1の免疫調節活性を維持している。実質的に類似する配列は、TA1に対して例えば約1から約10のアミノ酸の欠失、挿入およびもしくは置換を有していてもよい。例えば、天然起源のチモシンに関連する1もしくはそれ以上の活性をペプチドが有する限りにおいて、チモシンペプチドはTA1に対して約1から約5のアミノ酸の欠失、挿入およびもしくは置換を有していてもよい。したがって、本発明の方法において有用なチモシンペプチドは例えば、TA1に対して1から約10もしくは約1から5、または12もしくは3つのアミノ酸の欠失を有する短縮されたTA1配列を含んでもよい。ペプチドの活性が実質的に維持される限りにおいて、そのような欠失はN末端もしくはC末端およびもしくは内部にあってもよい。代わりに、またはさらに、実質的に類似する配列は、TA1に対して約1から約5のアミノ酸が挿入されていてもよく、このときTA1の免疫調節活性は実質的に維持される。代わりに、またはさらに、実質的に類似する配列は、TA1の免疫調節活性が実質的に維持される限りにおいて、TA1に対して1から約10のアミノ酸が置換されていてもよい。例えば、実質的に類似する配列は1から約5、もしくは12もしくは3のアミノ酸置換を有していてもよく、それには保存な置換と非保存的な置換が含まれる。いくつかの実施形態では、置換は保存的である。一般的に、保存的な置換は化学的に類似のアミノ酸の置換を含む。置換アミノ酸は標準の20アミノ酸から選択されてもよいし、または非標準アミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、チモシンペプチドは配列番号73と少なくとも70の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む一方で、天然起源のTA1の活性を維持している。例えば、チモシンペプチドは配列番号73に対して少なくとも80、90もしくは95の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。チモシンペプチドは配列番号73に対して100の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いずれの場合であっても、N末端は任意にアシル化もしくは、例えばC110またはC1C7アシルまたはアルキル基によってアルキル化されていてもよい。本発明はチモシンペプチドの投与に先立って、同時にまたは続いて本発明のRCRベクターを投与することを含む、がんや腫瘍のような細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。他の実施形態ではRCRとチモシンの組み合わせの後に化学療法剤または抗がん剤による治療を実施してもよい。ある状況では、RCRの感染と複製を可能とする化学療法または抗がん剤の投与に先立ってしばらくの間RCRベクターが被験者に投与される。被験者はその後、増殖を抑制し、もしくはがん細胞を殺す投与量および期間の間、化学療法剤もしくは抗がん剤で治療される。ある状況では、化学療法または抗がん剤による治療ががん腫瘍を縮小させるが、殺すことはできないならば、被験者はその後RCR由来の細胞毒性遺伝子を発現する細胞で毒性の治療薬に変換される、非毒性の治療薬で処置され得る。本発明の方法と組成物は他の組み合わせ療法においても有用であり、例えば、チモシン-アルファ-1、トラスツヅマブ、ロイコボリンや他の葉酸アナログ、またはジヒドロピリミジン脱水素酵素DPD阻害剤のような他の5FU活性の促進剤と併せた治療があり、その作用は全身というよりも、5FCの投与に由来するがんを標的とした5FU生産および本発明のベクターに由来するCD発現と併せて用いられることを目的としている。ロイコボリンもしくは他の葉酸アナログは5FUのチミジル酸合成酵素への結合を促し、それにより核酸合成においてこの重要な酵素を不活化し、5FUの効率を高める。DPD阻害剤は通常全身に投与された5FUの約80を分解するジヒドロピリミジン脱水素酵素の活性を阻害する。DPDの阻害は結果として5FUの保持率を上昇させしばしば5FUをより強い毒性にする。実際、DPD欠損を有する患者においては、これは命を脅かすものになりうる。しかしながら、本発明のベクターにおいては、5FUは腫瘍においてのみ局所的に生産され、したがって毒性の増加は腫瘍の領域に限定されるので、これには利点がある。本発明は細胞増殖性疾患を有する被験者の治療方法を提供する。被験者はどの哺乳類であってもよく、好ましくはヒトである。被験者は本発明の組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターに接触させられる。接触はinvivoまたはexvivoであってもよい。本発明のレトロウイルスベクターを投与する方法は当業者に知られており、腫瘍や細胞増殖性疾患の部位への直接投与と同様に、例えば全身投与、局所的投与、腹腔内投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、脳脊髄投与を含む。他の投与経路も当業者に知られている。したがって、本発明は細胞増殖性疾患を治療するために有用な様々な医薬組成物を含む。本発明に係る医薬組成物は、本発明に係る細胞増殖性疾患を治療しもしくは調節するために有用な異種のポリヌクレオチド配列を含むレトロウイルスベクターを、担体、賦形剤および添加剤もしくは補助剤を用いて被験者への投与に適した形にすることによって、作成される。よく用いられる単体や補助剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、ミルクタンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースとその誘導体、動物油および植物油、ポリエチレングリコールおよび無菌水のような溶媒、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールが含まれる。静脈内の媒体には流体や栄養補充剤が含まれる。保存剤には抗菌剤、抗酸化剤、キレートおよび不活性ガスが含まれる。他の医薬的に使用可能な担体には水溶液、塩を含む毒性のない賦形剤、保存剤、緩衝液や同様のものが含まれ、例えば、RemingtonsPharmaceuticalSciences15thedEastonMackPublishingCo1405141214611487およびTheNationalFormularyXIV14thedWashingtonAmericanPharmaceuticalAssociationにおいて説明されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。医薬組成物中の様々な成分のpHや正確な濃度は当分野における通常の技術にしたがって調整される。GoodmanandGilmansThePharmacologicalBasisforTherapeuticsを参照のこと。例えば、限定されるものではないが、細胞増殖性疾患の治療に有用なレトロウイルスベクターは広宿主性のENVタンパク質、GAG、およびPOLタンパク質、レトロウイルスゲノムのU3領域におけるプロモーター配列、そして複製、パッケージングおよびレトロウイルスゲノムの標的細胞への組み込みに必要な全てのシス作用性配列を含む。以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。これらの実施形態は本発明で使用し得る一般的なものであって、当業者に知られる他の方法が代わりに用いられてもよい。実施例1pACEGFPemdのベクター骨格のpAC3GFPemdへの改変およびGFPの同位置へのシトシンデアミナーゼ遺伝子配列の挿入pACEGFPemdプラスミドの以前の骨格を図3Eに示したように3つの方法で改変した。改変はPCRを用いてオリゴヌクレオチド指定突然変異により行った。以下の改変を行った。1広宿主性のenv遺伝子の3末端p15領域の核酸配列はもともと狭宿主性のエンベロープに由来していたが、この配列を4070A広宿主性のエンベロープの対応する配列によって置換した;コードされているエンベロープのアミノ酸は二つの構築物で同一である。2IRES配列3末端をPstI1部位の挿入によって目的の導入遺伝子の挿入が容易となるように改変し、IRES遺伝子導入部位の両端の小さな不完全反復を除いた。33LTRの下流の残余のウイルス配列を除いた。結果としてできたプラスミドpACEemdGFPを、シトシンデアミナーゼおよび変異体をコードするベクターのための基礎として用いた。コード配列カセットの挿入には、初め二つの方法を用いた。最初の方法では5TTATAAT3配列を、二番目の方法では5TTATAA3配列を、ATG開始コドンのすぐ上流に作成した。ベクターおよび合成のシトシンデアミナーゼ遺伝子を単にPstI1およびNot1酵素で切断した後再連結するという点で二番目の方法の方が単純である。シトシンデアミナーゼを挿入したベクターは、CDoptおよびCDopt3ptのコード配列ならびに実施例3で説明するように293T細胞の一過性トランスフェクションによって作られた感染性ウイルスの調製物を用いて両方の方法で作った。その後U87細胞を培養中に01のMOIで感染させ、細胞が100感染するまで増殖させた。100感染した細胞の細胞抽出物のシトシンデアミナーゼ活性を実施例6で述べるようにして測定したところ、酵素の比活性はどちらの上流配列を用いた構築物であっても同等であると認められ、これらの構築物はその他の点では同一であった。したがって、図2の表で、pACEeGFPとpACEyCDは一番目の上流配列を有しており、一方で他のさらに試験を行った他の全ての構築物は二番目の配列を有している。その後、異なる挿入遺伝子を有するベクターはPStI1およびNotIの直接の切断によって通常通り構築された。最初のトランスフェクトさせた複製コンピテントレトロウイルスのためのベクター構築物の図である図3Aを参照されたい。CMVはヒトCMV即時型プロモーターであり、U3、RおよびU5はウイルス末端反復配列に対応する領域である。gag、polおよびenvはウイルスタンパク質をコードしている領域である。図3Bおよび3Dは本発明のプラスミドの構造と配列を示している。本発明のベクターはTaiら、MolTher128422005のベクターと比べていくつかの差異がある。Taiらのベクターは、3LTRから下流のMLV配列が約70bp除去されるように変更されている。エンベロープにあるClaI部位の下流のDNA配列は広宿主性のエンベロープ配列に変更された。この変更はエンベロープのアミノ酸配列は変化させない。さらに、IRESCDカセットの両端の小さな反復は相同組み換えによる不安定化を回避するために除去されている。これらの変更はまた、予期しなかったことに宿主細胞での複製や継代中の安定性を増加させることにつながった。逆転写、および処置した細胞への最初の組み込み事象の後に、DNAプロウイルスおよびそれに続くいずれの後代のレトロウイルスがMLV由来の通常のLTR構造を両端に有していることが認識される。この配置は多数の感染サイクルの後で安定であることが示された。実施例2野生型酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子の遺伝子的強化二組の変更がなされた酵母シトシンデアミナーゼタンパク質の熱安定性を向上させるための三つのアミノ酸を変える三つの位置での変異およびアミノ酸配列のさらなる変更を伴わずに、ヒト細胞でのタンパク質の翻訳効率を改善するためのヒトコドン利用配列を増すための、追加の遺伝子配列の変更。CDの配列の設計には最適化されたCD、CDUPRTおよびCDOPRTaseを含む。最終的なシトシンデアミナーゼコード配列は、5末端にPSI1部位および3末端にPSI1Not1カセットに基づく計画のためのNotI部位とポリAテイルを含んでいてもよい。配列カセットは商業上の売主に注文し、供給を受けた。酵母シトシンデアミナーゼを含む以下の配列がクローニング、最適化および変異のために用いられた以下の表は遺伝子および作成したプラスミドベクターとそれらの名前を要約している。Kasaharaらによって記載された複製コンピテントレトロウイルスベクターであるpACECDをさらなる改変のための基礎として用いた。ベクターは本明細書で述べた改変された酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現するように改変され、構築物に使用された。最初に感染させた複製コンピテントレトロウイルスのためのベクター構築物の図である図3Aを参照されたい。CMVはヒトCMV即時型プロモーターであり、U3、RおよびU5はウイルス末端反復配列に対応する領域である。gag、polおよびenvはウイルスタンパク質をコードしている領域である。図3Bと3Dは本発明のプラスミドの構造および配列を示している。外注先によって合成された後、遺伝子はpAC3ベクター骨格のPsi1Not1部位に挿入された。通常、プラスミドの骨格はpAC3eGFPプラスミドをPsiIとNotIによって切断し、プラスミドとレトロウイルスの骨格をコードしている大きな断片を精製することにより作られた。Aヒトコドンに最適化したCD遺伝子ConradらおよびPCTWO9960008のヒトコドンに最適化したシトシンデアミナーゼを比較したところ、両方において合計91の最適化されたコドンが示され、36のコドンは同一であり、47のコドンは3番目の塩基対が置換を起こしており、9つのコドンは異なっていた。異なっていた9つのコドンとして以下のものがあるAGCからTCCCGTからAGGCCAからCCT全てが等価なGC含量を有し、同じアミノ酸をコードしている。上述の天然の酵母遺伝子配列は個々にコドン最適化され以下のCD遺伝子を与え、複製コンピテントレトロウイルスをコードしているpAC3プラスミドベクターにIRESと共に挿入された場合にT50001と呼ぶ。B熱安定化されたCD遺伝子シトシンデアミナーゼの安定性を高めるためにさらなる改変がなされた。野生型の酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子に遺伝子的強化を施し、三つのアミノ酸を変更する三つの位置で変異を起こさせて、酵母シトシンデアミナーゼタンパク質の熱安定性を向上させた。本発明のシトシンデアミナーゼポリペプチドの遺伝子の生産には以下のプライマー対が用いられた部位特異的変異誘発プライマーセンスプライマー5tcgaggatatcggcgagtgaaacccgttattctttttggc3、アンチセンスプライマー5gccaaaaagaataacgggtttcactcgccgatatcctcga3、センスプライマー5tcggcgagtgatccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgccaacccgttatt3、アンチセンスプライマー5aataacgggttggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggatcactcgccga3。天然の酵母CDタンパク質の安定性を向上させるために、タンパク質に三つのアミノ酸の置換がなされた。これらの置換は単独で、もしくはヒトコドンの最適化と共になされた。三つのアミノ酸の置換はA23L、V108I、I140Lである。これらの置換アミノ酸をコードしている配列を以下に示した。コードされたポリペプチドは以下の配列を含む好ましいコドンを利用した3つのアミノ酸置換A23LV108II140Lを組み込み、配列の全体において好ましいヒトコドン利用を用いた最終構築物の設計は以下のとおりである。下線を付したコドンはアミノ酸置換にとって好ましいコドンを意味する。タンパク質の翻訳配列のアラインメントは、好ましいコドンの変更およびアミノ酸の変更が結果として望んだタンパク質の構造につながることを示している。最適化されたCD配列の設計CCDUPRT融合遺伝子の構築UPRTポリペプチドに連結されて最適化されたCDUPRTを形成する上述したCDポリペプチドを含んだ融合構築物もまた開発された。CDとUPRTの間の終止開始を除くために以下のプライマーが用いられた。プライマー配列結果として生じる融合ポリヌクレオチドは1296bpを含み、その配列はすぐ下に記載する。DCDリンカーUPRT融合遺伝子の構築4ドメインをクローニングすることにより、最適化されたCDリンカーUPRT配列を形成するように融合構築物はまた開発された。リンカーを挿入するために以下の配列が用いられた。結果として生じた構築物は1356bpを有し、その配列はすぐ下に記載する。ECDOPRT融合遺伝子の構築OPRTポリペプチドと連結させCD最適化OPRTaseを形成した上述のCDポリペプチドを含んだ融合構築物もまた開発された。結果として生じた構築物は1269bpを有し、その配列はすぐ下に記載するFCDリンカーOPRT融合遺伝子の構築CDポリペプチドとOPRTポリペプチドの間およびフレーム内にリンカー4ドメインをクローニングすることにより、最適化されたCDリンカーOPRT配列を形成するように融合構築物はまた開発された。結果として生じた構築物は1329bpを有し、その配列はすぐ下に記載する図4は感染させたU87細胞において、安定性向上のために三つの変異を有し、ヒトコドンに最適化されたものについて、野生型yCDタンパク質と比較して、高いレベルの発現が認められたことを示している。実施例3一過性のトランスフェクションによるベクターの生産ベクターは多くの方法により作成することができるが、最初のステップは感染性の粒子の生産を可能とするためにDNAベクターを細胞に導入することであり、感染性の粒子はその後細胞の上清から回収することができる。ひとたび感染性の粒子が生産されれば、他の生産方法が当業者によって実施可能である。ベクター粒子は293T細胞の一過性のトランスフェクションによって生産された。293T細胞は解凍され培地中に播種され、その後、DMEM高グルコース培地とFBS、Lグルタミン、NEAA、およびPenicillinstrepを混合することにより調製されたDMEM培地を15ml含むT75フラスコで二回継代された。フラスコは37°Cおよび5CO2の条件でインキュベートされた。3回目の継代の後、細胞は18x106cellsT25の細胞濃度で、それぞれ5mLの培地を含む6つのT25フラスコに播種された。T25フラスコに播種した一日後、Promegaのリン酸カルシウムトランスフェクションキットを用いて、ウイルスベクターを発現するT50002プラスミドを細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの18時間後フラスコの1セットの培地を10mMNaBを含む新鮮な培地に取り替えた。フラスコの2セット目の培地は取り替えず、対照として扱った。NaB処置の8時間後全てのフラスコの培地をNaBを含まない新鮮な培地に交換した。両方のフラスコのセットにおいて発現は翌日まで続くようになされた。フラスコの両方のセットの上清を回収し、qPCRによって力価を検定し、形質導入単位mlで表した。力価の結果は次の表に示す。その後のベクター調製物は酪酸ナトリウムを用いないで、この方法で生産された。他のベクタープラスミドは力価が1E5TUmlおよび1E7TUmlの間のベクター調製物を作るために同じ方法で使用された。該材料はさらに精製や濃縮されてもよく、必要に応じて以下に述べるものも参照するUS5792643TRodriguesら、JGeneMed92332007。本発明のいくつかの実施形態では投与量は脳の重量グラムによって算出された。そのような実施形態では、治療の方法に有用な本発明の複製コンピテントレトロウイルスベクターの投与量は、脳の重さ1グラムあたり104から106TUの範囲であってもよい。実施例4力価測定における定量的PCR機能的なベクター濃度もしくは力価は、定量的PCRに基づく方法を用いて決定される。この方法では、形質導入可能な宿主株化細胞に標準的な量のベクターを感染させ、形質導入の後に宿主細胞の中に存在するプロウイルスが生じた量を測る事によりベクターの力価が決定される。細胞とベクターを標準的な培養条件で24時間インキュベートして完全な感染を可能とした後、ベクターの複製を止めるために抗レトロウイルスAZTを添加する。次に細胞は培養シャーレから回収され、ゲノムDNAがInvitrogenPurelinkgDNA精製キットを用いて精製され、RNaseDNaseを含まない無菌水を用いて精製カラムから溶出される。A260A280の吸光度比はサンプルの濃度と相対的な純度を決定するために分光光度計により測定される。gDNA濃度は、追加のRNaseDNaseを含まない無菌水により所与の全てのgDNA調製サンプルのセットの最も低い濃度に対して標準化され、それにより解析した全てのサンプルに対してqPCRに入力されるDNAは一定となる。ゲノムDNAの純度はさらにそれぞれのサンプルの一定分量をエチジウムブロマイド染色した08アガロースゲルで電気泳動することにより評価される。サンプルが1820のA260A280吸光度範囲を越え、かつgDNAの単一のバンドを示せば、ベクターのプロウイルスのコピー数のqPCR解析のためのサンプルの準備ができている。プロウイルスのLTR領域を識別するプライマーを用いてqPCRを行って、既知の数の細胞に形質導入するのに既知の量のベクターが使用されたときに起こった形質導入現象の合計回数を推定する。107から10コピーまで連続希釈し、サンプルと同一のqPCR条件下で測定した既知のコピー数の標的担持プラスミドを利用した標準曲線から、反応あたりの形質導入現象の数を計算する。各qPCRにおいて使用されたゲノム当量、および反応あたりに起こった形質導入現象の数から、形質導入時に存在した総細胞数に基づいて起こった形質導入の総数が決定される。この値は最初の形質導入の間に、細胞を含む培地中に希釈された後のベクターの力価である。補正された力価を計算するには、希釈は培養液の容量と力価の容量をかけ、力価の容量で割ることにより補正した。これらの実験は複製中の培養液で行われ、平均力価およびその標準偏差と変動係数を決定するためにそれぞれの条件で三回の測定によるqPCRにより解析される。実施例5ベクターのテスト有効であるためには、ベクター構築物およびそれらに由来する感染性の粒子は、一過性のトランスフェクションによって良好な力価のウイルスを生じること、複数の継代中安定であること、5FCの存在下で効率的に細胞を死滅させること、および標的細胞の感染の際に酵素活性を発現することが必要である。実施例3はベクターから有用な力価が得られうる事を示している。ウイルスベクターの遺伝的安定性安定性を実証するために以下の実験がなされた。およそ106の未処理のU87細胞に最初ウイルスベクターを001のMOIで感染させ、単一の感染サイクルが完了するように完全に感染するまで培養した。その後上清を非感染細胞に再度移し、サイクルを繰り返した。本実験においては、12回のサイクルの試験が二度行われた。yCD2もしくは他の導入遺伝子配列の遺伝的安定性は、導入遺伝子の挿入部位の隣接部のMLV特異的なプライマーを用いて、感染細胞の組み込まれたプロウイルスのPCR増幅により評価される。全長の増幅産物より短いいずれのバンドの出現も、ベクターの不安定性の指標となる。図5は、本発明のベクターがpACECDよりも多くの継代に対して安定性を維持することを実証する。さらにT50004とT50005がpACECDと同程度安定であるように見える一方、T50003はいくらか不安定である。pACECDはマウスのがん研究において用いられており、マウスモデルにおいて良好な抗腫瘍効果を示す。しかしながら、特に多くの回数の5FC処置が必要とされる場合には、ウイルスゲノムが安定であるほど、動物およびヒトの治療においてより強力に長く続くだろう。継代の後期において小さなバンドの存在が抑制される事によって示されるように、T50001とT50002は両方顕著にT50007より安定であり、これはタンパク質をコードしている配列のサイレントな変更や点突然変異にいたる小さな変更が、より安定的なベクターゲノムをもたらすとともに、予期できない優れた性質をもたらしうることを示している。細胞死滅試験CellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferationAssayは増殖アッセイにおいて生存細胞の数を決定するための比色法である。我々はこのアッセイを5フルオロシトシンおよびフルオロウラシルへの様々な株化細胞の用量反応を決定するのと同様に、細胞増殖動態を決定するために利用した。ベクターが100感染した細胞は96ウェルプレートに1000cellswellで播種された。様々な濃度の5FC処置の後、それらの細胞を8日間にわたって観察した。細胞の増殖の解析は二日毎にPromegasCellTiter96AQueousOneSolutionreagentを用いて評価した。手短に言えば、20μlのMTSと100μlの培地を混合し、96ウェルプレート中のサンプルに添加した。サンプルは37°C5CO2インキュベーターで60分間インキュベートした。その後、490nmの波長においてプレートリーダー上で吸光度の測定がなされた。図6AはAC3yCD2もしくはAC3yCDのどちらかを感染させたU87細胞において5FCの滴定を行うことによって、yCD2タンパク質を発現する細胞のシトシンデアミナーゼが野生型のCDタンパク質を発現する細胞のそれと少なくとも同程度活性であることを実証する実験結果を示している。手短に言えば、AC3yCDベクターもしくはAC3yCD2ベクターのどちらかを01の感染効率で感染させた5日後のU87細胞に、量を増加させた5FCもしくはポジティブコントロールとして01mMの5FUに8日間曝露した。8日目に、MTSアッセイを用いて培養細胞の生存率を評価した。5FC処置用量の増加によって二つのレトロウイルスベクターで同等の死滅がみられたことをデータは示している。RG2細胞を用いた同様のinvitroの培養細胞の試験では、RG2株化細胞に5つの異なるベクターを形質導入した。次に量を増加させた5FCに8日間曝露し、上述したように観察した。結果は図2に示してある。野生型酵母シトシンデアミナーゼを除く試験した全てのベクターにおいて、完全な死滅の誘導には001mMの濃度で十分であった。野生型は感受性がより弱く、完全な死滅には10mMの5FCが必要であった。CD発現アッセイU87細胞は01の感染効率で形質導入され、ウイルスを伝播させるために5日間培養し、形質導入5日後の細胞を回収した。800xg、5分間の遠心分離により細胞を集めた。細胞のペレットから上清を吸引除去し、5mLのリン酸緩衝食塩水で洗浄し、800xg、5分間遠心分離した。得られた細胞ペレットは15mLのPBS中に取り上げ、ピペットチップを通過させることによって再懸濁させ、20°Cの冷凍庫に配置した。細胞は凍結融解法により溶解させた。再懸濁した細胞が室温で解凍され、ピペットチップを通過させ、プロテアーゼインヒビター混合物と混ぜて20°Cで再凍結した。酵素アッセイの前に、サンプルは再び室温で解凍し、ピペットチップを通過させた。その後、懸濁液はテーブルトップ遠心機で14000rpm、5分間遠心分離した。上清はデカントでペレットから新しいエッペンドルフチューブに移し、氷上に配置した。yCDの酵素活性はHPLCアッセイを用いて評価した。HPLCアッセイはフォトアレイの検出器およびオートインジェクターに直列でつながっているShimadzuLC20AT装置を用いて行われた。固定相は粒子サイズが5μmでありカラム寸法が40x250mmのHypersilBDSC18HPLCカラムである。移動相はpH21で、001の過塩素酸三級ブチルアンモニウムおよび5のメタノールを含む50mMリン酸アンモニウムであり系は22°Cで平衡にした。全ての試薬はACSグレードであり溶媒はHPLCグレードである。反応混合物は800μL、5FCの最終濃度はPBS中に0125mgmLであり、15mLのオートサンプラーバイアルに配置された。その後反応は各細胞溶解液を200μL加えることにより開始させた。反応オートサンプラーのバイアルはオートサンプラー中に配置し反応混合物の5μLが注入された。各反応バイアルからとった5μLの分量を回収しHPLCカラム上で解析することによりタイムポイントが周期的にとられた。5FCから5FUへの変換率は、先立って作られた5FUの標準曲線から既知の量とピーク面積との比較により計算した。5FCの5FUへの変換の割合は対応する時間間隔に対して生産された5FUの量をプロットすることにより求めた。細胞サンプルのタンパク質濃度を求め、変換率をアッセイにおいて用いられるタンパク質のmg量で割ることによって、細胞溶解サンプルの比活性を計算した。図6Bは01のMOIで形質導入した5日後の様々なベクターの比活性を示している。組織の培養細胞におけるシトシンデアミナーゼの比活性の点に関して、pACEyCDpAC3yCD1pAC3CD2であることをデータは実証している。実施例6ベクターの精製と濃縮本発明のベクターは293T細胞への一過性のトランスフェクションにより作られ、続いて細胞上清の回収、ろ過、ベンゾナーゼ処置、透析ろ過濃縮および透析を行った。さらに当業者に知られるカラムクロマトグラフィーのステップが含まれていてもよい。ベクターはまた恒常的に感染させた株化細胞から産生され、上述のような手順で処理されてもよい。臨床の材料は無菌性、マイコプラズマやエンドトキシン、加えて製品特有の効力、強さや純度テストなどの標準的な試験に基づいて用いられる。力価は、標的細胞に組み込まれたウイルスベクターDNAのPCRによる定量によって形質導入単位として決定した。最終産物は109TUmlまでの力価を有することを目標としており、無菌で注入可能な等張のトリス緩衝ショ糖溶液中に配合された。一般に、ベクターのロットの強さを正確かつ的確に決定するために、定量的なPCRに基づく力価アッセイが開発された。アッセイの手順の詳細は以下のステップで構成される。形質導入形質導入は安定なヒト前立腺がんに由来するPC3株化細胞を用いて12ウェルプレートでなされる。各試験サンプルのために、三つのウェルにおいてPC3細胞に形質導入するのに、力価測定していない3つの希釈度のベクター調製物を用いた。ウイルスの複製は形質導入の24時間後にアジドチミジンを用いて停止させた。細胞は回収およびゲノムDNAの精製の前にさらに2464時間維持された。ゲノムDNAの調製QiagenDNeasyDNAMinikitsを、形質導入し回収した細胞からゲノムDNAを調製するために製造者のプロトコルに従って用いた。DNA濃度および純度はA260およびA260A280比を決定するためのUVvis分光光度法を用いて直接吸光度を測定することにより評価した。Realtime定量的PCRBioRadCFX96realtimePCR装置もしくは同等のものを定量PCRを行うために用いた。各試験サンプルに存在するプロベクターのコピー数は、特異的なDNAオリゴヌクレオチドプライマーおよび、CMVPsiプラスミドプロモーターに対する、組み込まれたもしくはプロレトロウイルスのU3Psiパッケージングを増幅するために設計されたTaqManprobeを併せて用いることにより測定した。ベクターの力価はコピー数の標準曲線に対して表される。ベクターのコピー数の標準曲線を作成するために、PC3細胞のゲノムDNAにプロレトロウイルスのU3Psi配列を有する独特なプラスミドが追加された。ベクター試験サンプルの力価は、希釈液あたりの反応数を用いて、複数の希釈液で形質導入されたゲノムの数を計算することにより求めた。それぞれの力価の評価系では、鋳型を含まないコントロールおよびネガティブコントロールが3回試験された。力価はミリリットルあたりの形質導入単位で表される。本発明のベクターの効力はベクターの複製および結果としての標的細胞内でのシトシンデアミナーゼ活性の両方に依存する。それゆえ効力のアッセイはそれまで非感染の組織培養の株化細胞にベクターの感染が広がるときの、経時的なCD活性の増加を測定する。逆相HPLCによる分離およびUV検出を用いて5フルオロシトシンから5フルオロウラシルへの変換を観察することによって、アッセイは感染の初期、中期、および後期の形質導入細胞における導入されたyCD2タンパク質の酵素活性を測定する。感染過程におけるCD活性の増加は、経時的な感染細胞の割合の関数であり、TOCA511ベクターの複製能力の指標である。5FCから5FUへの変換率に基づくCD活性は各タイムポイントでタンパク質1mgあたりのCDの単位として測定される。SAの増加は時間の経過にともなってプロットされ、培養中のウイルス複製の結果としての形質導入された細胞の割合の増加および、結果としてCD活性が伝達されたことの両方を反映している。複数のアッセイとベクターロットから蓄積したデータは、産物の放出のためのCDの比活性SAの増加の適切な規格値を決定するために用いられる。MOI約01での最初の感染および非感染対照における1、3および5日後でアッセイのタイムポイントがとられた。後期の感染細胞のCD活性を、この活性の同定試験への利用性を評価するためにロット間で比較した。アッセイは以下のステップを含む。形質導入形質導入はマルチウェルプレート上でU87細胞に対して行われた。それぞれの形質導入において、適した三つの希釈液が用いられ、それぞれ三回行われた。細胞は形質導入の0、1、3および5日後に回収された。CD反応の準備細胞を溶解し、BSAを標準として用いたBCAタンパク質アッセイにより全タンパク質濃度を決定した。yCD2酵素アッセイのために、37°C、12時間の条件で5FUの生成の割合が直線を保たれるように、適切な量の細胞溶解物を5FCを含む緩衝液に加えた。反応溶液の最終的な容量は100μLである。2時間後、酵素反応をトリクロロ酢酸の添加によって終了させ、短くボルテックスして次のHPLC解析のために準備した。非形質導入細胞からの細胞溶解物はネガティブコントロールとして用いた一方で、100感染細胞からのサンプルを用いた同様のアッセイはポジティブコントロールとして用いた。HPLC解析反応を終了させた混合物は12000rpm、5分間、室温で微量遠心機により遠心分離した。その後上清はデカントでペレットから除き、pHが約40のリン酸緩衝液を含む水性の移動相で事前に平衡化した逆相HPLCカラムに注入する前に、さらに微粒子を除くために02μフィルターを通過させた。クロマトグラムは基質の消費および産物の生成の両方を観察するため260nmおよび280nmで調査した。基質または産物の濃度は、GraphPadの描図と解析能を用いて、既知濃度の基質又は産物から計算して事前に作った標準曲線と比較することにより決定した。12時間で作られた5FUの量は活性のCD単位を決定するために用いられ、この値をアッセイで用いたタンパク質量で割ることにより比活性を計算した。実施例7CTLA4に対する一本鎖抗体をコードするベクターの構築と利用一本鎖抗体は好ましい効果を有する既知の完全な抗体の配列に由来する。そのような配列は利用可能である。そのような通常の抗体遺伝子配列は、当業者に知られている一般に用いられる方法で一本鎖抗体配列に変換される。CTLA4に対するファージの一本鎖抗体もまたファージscFvライブラリーを直接スクリーニングすることにより利用可能であり、本発明の複製レトロウイルスベクターに挿入するために直接用いることができる。配列の由来がどのようなものであるかに関わらず、scFvは一般的に約700900bpの長さであり商業的な売主によって、先に述べたように5末端にPsiI部位および3末端にNotIに適合する部位をともなって合成される。この配列はその後yCD2配列の除去後にPsiINotI部位でpAC3yCD2由来の複製レトロウイルス骨格に挿入される。ベクターは説明したとおりに作製および力価測定され、上述のとおり必要であればさらに精製された。ヒトおよびマウスのCTLA4は配列がよく類似しており、本発明の複製レトロウイルスは最初、当業者においてよく知られるCT26BALBcモデルやS91マウス黒色腫モデルのような適した同系の免疫適格性のマウスモデルにおいて試験された。結果は一またはそれ以上のがん成長の調節毒性の欠如抗腫瘍反応の発生全身免疫の指標となる離れた病変の縮小によって測定された。投与量はマウスに対して103から107TUの範囲に及ぶ。患者においてベクターはがんへの病巣内注射によって、もしくはその後ウイルスをがんへと運ぶ血液循環内投与によって投与された。投与量は105から1011TUの範囲に及ぶ。実施例8抗CD152一本鎖抗体を発現するベクターを用いたマウス黒色腫モデルにおける抗腫瘍有効性試験目的本試験の目的は、表面抗原152とも呼ばれる細胞傷害性Tリンパ球抗原4に対する一本鎖抗体を有する新規のMLVを基礎とする複製コンピテントレトロウイルスベクターの、皮下の黒色腫を有するDBA2マウスに腫瘍内注入を介して送達されたときの、黒色腫の増殖に対する効果を評価することである。マウスメスのDBA2もしくはBALBcマウスをJacksonLaboratoriesより購入した。マウスは試験を始める前に、到着後7日間順応させた。細胞クラウドマンS91細胞はDBA2マウスに由来する自然に生じた黒色腫である。10のウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、およびGlutamaxを含むダルベッコ変法イーグル培地により細胞を培養した。細胞は移植のためPBSに再懸濁した。S91細胞はDBA2マウスの腹部右側に注入された。ベクターベクター調製物は一過性のトランスフェクションによりおよそ7E6TUmlの力価で作成された。最初の試験ではベクターはさらなる精製や濃縮は行っていない。次に続く完全な用量反応曲線を決定する試験のために、高い力価の精製されたサンプルを、およそ108mlの力価となるように調製した。ベクターは腫瘍内に50100μLの容量および静脈内に100μLの容量で投与され、全体の投与量マウスはおよそ7E5~7E6~7E7TUマウスとした。αCD152を発現するベクターはTocaαCD152とした。がんの移植とベクターの注入5つのグループのメスのDBA2にS91黒色腫細胞を皮下移植し次に、投与したビヒクルとともに、コントロールベクターAC3GFPとともに、TocaαCD152ベクターの腫瘍内注入、もしくはTocaαCD152ベクターの静脈内注入とともに。グループ5のマウスはがんの移植をせずTocaαCD152のみを静脈内注入した。データの解析がんの増殖解析は大きさが2000mm3になっとき、もしくは60日後のうち、どちらかが最初に訪れたときに行われた。各グループの10頭のマウスについて、時間経過ごとににがんのサイズをプロットした。統計上の有意性は分散分析を用いて決定した。P値005が全ての解析において統計的に有意であると考えられ、解析はPrism5statisticalsoftwareまたは同等のものを用いて行われた。治療中のαCD152発現の何らかの有害な現象を評価するために生涯にわたる観察もまた行われた。結果複製MLVの腫瘍内注入によるαCD152の送達は、コントロールと比較して統計的に有意な増殖遅延を示した。複製MLVの静脈内注入によるαCD152の送達は、コントロールと比較して統計的に有意な増殖遅延を示し、DBA2クラウドマンS91マウス黒色腫モデルの黒色腫の負担を抑制した。それ以上の動物実験は以下により詳細に述べるとおりに行われた。実施例9AC3yCD2ウイルスベクターはヌードマウス中の頭蓋内のヒト異種移植片において治療効果があるヌードマウス宿主中でのRCRベクターによるシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子治療の治療効果だけでなく、RCRベクターの伝播および体内分布を試験するために、U87ヒト神経膠腫株化細胞を用いた頭蓋内異種移植モデルが確立された。順応に続いて、マウスは8つの処置グループの一つにランダムに割り当てられた。7つのグループは右線条体に1頭の投与マウスあたり1x105のU87細胞を0日目に頭蓋内投与した。グループ8のマウスは腫瘍を移植されなかった。5日目に、マウスに調合物の緩衝液のみ、もしくは9x1055μl、9x1045μl、もしくは9x1035μlのRCRベクターを注入した。ベクターを受け入れていないマウス、もしくは9x1055μlもしくは9x1035μlのベクターを受け入れたマウスはランダム化されて19日目の最初に一回の腹腔内投与で5FCを与え、もしくは5FCを与えなかった。ベクターを受け入れたマウスは中央の濃度で全て5FCを受けた。5FCの投与は7日間連続して毎日続いた後に15日間無処置とした。休止と薬のサイクルは4回まで繰り返された。グループ8を除く各グループの10頭のマウスをランダムに生存解析カテゴリーに割り当てた。残ったマウスは定めたスケジュールにしたがって屠殺した。静脈内投与は尾部の静脈への注入によりなされた。腹腔内投与は膀胱を避けるよう注意を払いながら腹部への注入によりなされた。頭蓋内注入のためにマウスはイソフルランをもちいて麻酔し、とがっていないイヤーバーを有する定位固定性の装置に配置した。皮膚は剪毛され、外科部位を準備するために頭皮を処理するのにベタジンを使用した。動物は加熱パッドの上に配置され、皮膚の正中線に切り込みを作るためにメスが無菌条件下で使用された。切り込み部位の皮膚の収縮と筋膜の反射により頭蓋骨を見ることが可能になった。35mmの突起を有するキャップを装着した3mmの突起を有するガイドカニューレが、頭蓋骨の穿頭孔をとおして挿入され、歯科用のセメントおよび三つの小さなねじで頭蓋骨に取り付けられた。セメントが固まった後、皮膚は縫合で閉じられる。突起の定位座標はAP0510mm、ML1820mm、DV30mmである。パイロット実験において染料を注入しその位置を決定することにより、入手した同齢集団の動物のための正確な定位座標を決定する。麻酔からの回復の間動物は観察される。鎮痛剤、ブプレノルフィンは手順の最後の前に皮下で投与され、その後ブプレノルフィンが3日間までおよそ12時間毎に投与される。動物は毎日観察した。細胞もしくはベクターは、ガイドカニューレを通して挿入された35mmの突起を有する注入カニューレを通して頭蓋内に注入された。ハミルトンシリンジおよび柔軟な管を装着したシリンジポンプを用いて注入速度が調整された。細胞の注入では、1分間につき02マイクロリットルの流速で1マイクロリットルの細胞が送達された。ベクターの注入では、1分間につき033マイクロリットルの流速で5マイクロリットルのベクターが送達された。ベクターは送達され、マウスの脳重量1gに対する形質転換単位が計算された。そのような計算を利用することで、ヒトを含む他の哺乳類に対する投与量の変換を計算することができる。図8はこのモデルマウスにおけるベクター投与量の効果を示している。実施例10AC3yCD2は脳がんの同系マウスモデルにおいて治療効果を有するRCRベクターによるシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子治療の治療効果およびその免疫学的影響だけでなく、RCRベクターの伝播と体内分布を試験するために、同系のBALBcマウスにおいてCT26結腸直腸がん株化細胞を用いた頭蓋内異種移植モデルが確立された。本試験は129頭の動物、0頭のオス、119頭のメスおよび10頭の予備動物を含む。順応に続いて、マウスは8つの処置グループの一つにランダムに割り当てられた。7つのグループは右線条体に1頭の投与マウスあたり1x104のCT26細胞を0日目に頭蓋内投与した。グループ8のマウスは腫瘍の移植をしなかった。4日目に、マウスに調合物の緩衝液のみ、または9x1055μl、9x1045μl、もしくは9x1035μlのベクターを注入した。ベクターを受け入れていないマウス、または9x1055μlもしくは9x1035μlのベクターを受け入れたマウスはランダム化されて13日目の最初に腹腔内投与で5FCを与え、もしくは5FCを与えなかった。ベクターを受け入れたマウスは中央の濃度で全て5FCを受けた。5FCの投与は7日間連続した後無処置の10日間が続いた。休止と薬のサイクルは4回まで繰り返された。グループ8を除く各グループの10頭のマウスをランダムに生存解析カテゴリーに割り当てた。残ったマウスは定めたスケジュールにしたがって屠殺した。未処置の監視マウスは屠殺を予定された動物と共に飼育し、排出を介するベクターの伝達を評価するために同じタイムポイントで屠殺した。静脈内投与は尾部の静脈への注入によりなされた。腹腔内投与は膀胱を避けるよう注意を払いながら腹部への注入によりなされた。頭蓋内注入のために、37mmの突起を有するキャップを装着し、右線条体に挿入された32mmの突起を有するガイドカニューレを有するマウスが用いられた。突起の定位座標はAP0510mm、ML1820mm、DV30mmである。細胞もしくはベクターは、ガイドカニューレを通して挿入された37mmの突起を有する注入カニューレを通して頭蓋内に注入された。ハミルトンシリンジおよび柔軟な管を装着したシリンジポンプを用いて注入速度が調製された。細胞の注入では、1分間につき02マイクロリットルの流速で1マイクロリットルの細胞が送達された。ベクターの注入では、1分間につき033マイクロリットルの流速で5マイクロリットルのベクターが送達された。ベクターは送達され、マウスの脳重量1gに対する形質転換単位が計算された。そのような計算を利用することで、ヒトを含む他の哺乳類に対する投与量の変換を計算することができる。図9はベクターが頭蓋内に送達されたときのこのモデルマウスにおけるベクター投与量の効果を示している。実施例11miR1281およびmiR1282を発現するRCRベクターの構築と試験ヒトprimiRNA1281の異種のポリヌクレオチド配列を有する組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの構築miR1281を発現する複製コンピテントレトロウイルスベクターpAC3miR1281は一つの実施形態で述べたpAC3yCD2の骨格に由来している。pAC3miR1281ベクターのpAC3骨格は、IRESyCD2ポリヌクレオチド配列を除くために、MluIおよびNotIを用いてpAC3yCD2プラスミドのDNAのエンドヌクレアーゼ消化により単離された。primiR1281のポリヌクレオチドDNA配列はpEPmir1281発現ベクターのプロダクトシートから得られた。primiR1281のDNA配列は、二本鎖DNA断片の5末端にMluI制限酵素部位、および3末端にNotI制限酵素部位を有するように合成され、次にMluIおよびNotIで消化した上述のpAC3yCD2プラスミドDNAの対応する部位に挿入された。結果としてできた構築物であるpAC3miR1281は3つの遺伝子gag、pol、およびenvをコードし、そしてprimiR1281非コード配列を有する。miR128を有する組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの形質導入細胞からの成熟miR128の発現試験miR128を有する組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの形質導入細胞からのmiR128の発現を確かめるために、感染度が最大に達する感染から9日後の細胞を、成熟miRNAの発現の検出を目的とした全RNAの抽出のために膨張させ回収した。TaqmanmicroRNAアッセイの結果は、pAC3miR1281、pAC3miR1282、およびpAC3H1shRNAmiR128で形質転換させたHT1080およびU87MG細胞の両方において、それぞれ形質転換していない細胞と比較して、成熟miR128が過剰に発現したことを示した。両方の株化細胞において、pAC3miR1281およびpAC3H1shRNAmiR128ベクターで形質転換させた細胞は、pAC3miR1282ベクターで形質転換した細胞よりも高いレベルの成熟miR128を発現した。実施例12IRES、yCD2、ヒトH1プロモーターおよびヒトpremiR1281の異種ポリヌクレオチド配列を含む組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの構築と試験構築複製コンピテントレトロウイルスベクターpAC3yCD2H1shRNAmiR128は一つの実施形態で述べたpAC3yCD2の骨格に由来している。NotIを用いてpAC3yCD2プラスミドのDNAをエンドヌクレアーゼ消化することにより、pAC3yCD2H1shRNAmiR128ベクターのpAC3yCD2骨格は単離された。ヒトH1プロモーターのポリヌクレオチドDNA配列はpSilencer31H1hygro発現ベクターの製品情報から得、そして短いヘアピン構造を有するpremiR1281のポリヌクレオチドDNA配列はthehttpwwwmirbaseorgから得た。ヒトH1プロモーターと連結させたpremiR1281のDNA配列は、二本鎖DNA断片の両端にNotI制限酵素部位を有するよう合成され、次にNotIで消化した上述のpAC3yCD2プラスミドDNAの対応する部位に挿入された。結果としてできた構築物であるpAC3H1shRNAmiR128は4つの遺伝子gag、pol、envおよびyCD2をコードし、そして短いヘアピン構造を有するpremiR1281非コード配列を有する。ベクターストックはベクターをコードするプラスミドDNAの293T細胞へのリン酸カルシウム法を用いた一過性トランスフェクションにより作られた。トランスフェクションの18時間後、培養液は新鮮な培地に交換した。培地交換の24時間後、ベクターを含む上清は回収され045μmフィルターを通してろ過され、直ちに用いられるか、もしくは後の使用のために一定量で80°Cで保存された。回収したベクターストックの20マイクロリットルを、ヒト前立腺がん細胞であるPC3に感染させるために用いた。感染の24時間後、それ以上のウイルスの複製を阻害するために細胞にAZTを添加した。感染の48時間後、感染P3細胞のゲノムDNAは力価測定のため抽出された。ベクターストックの力価は既知のコピー数の標準を含んだqPCRにより決定した。pAC3yCD2H1shRNAmiR128組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの培養液中での複製動態の試験H1premiR1281の組み込みが正常に複製されていることを確かめるために、新鮮なヒト線維肉腫細胞、HT1080およびヒト神経膠腫細胞、U87MGにそれぞれ01のMOIで感染させるのに、上述の一過性のトランスフェクションで回収された各ベクターストックの算出された量が用いられた。形質転換した細胞は感染の後3、6、9日後に継代された。各タイムポイントにおいて、qPCRを目的とするゲノムDNAの抽出のために一定の割合の細胞が回収された。qPCRへのゲノムの入力を等しい量にするために、一定分量のゲノムDNAを同じ濃度で生じるようにゲノムDNAの希釈液が調製された。各ベクターの複製動態は反転したC値をタイムポイントに対してプロットすることにより作成した。結果はコントロールのMLVウイルスと比較して同様の動態でベクターが複製していることを示している。pAC3yCD2H1shRNAmiR128組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの形質導入細胞からの成熟miR128の発現試験pAC3yCD2H1shRNAmiR128組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの形質導入細胞からのmiR128の発現を確かめるために、感染度が最大に達する感染から9日後の細胞を、成熟miRNAの発現の検出を目的とした全RNAの抽出のために膨張させ回収した。TaqmanmicroRNAアッセイの結果は、pAC3yCD2H1shRNAmiR128を形質転換させたHT1080およびU87MG細胞の両方において、形質転換していない細胞と比較して、成熟miR128が過剰に発現したことを示す。miR128の標的の関与を示すための、pAC3yCD2H1shRNAmiR128組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの形質導入細胞からのBmi1発現試験Bmi1の発現は神経膠芽腫を含むヒトの様々ながんにおいて上方制御されることが観察されており、miR128の標的であることが示されている。miR128の標的の関与を確かめるために、pAC3yCD2H1shRNAmiR128形質導入細胞からのBmi1の発現をqRTPCRにより検出した。結果はpAC3yCD2H1shRNAmiR128を形質導入したU87MG細胞が形質導入していない細胞よりも低い量のBmi1を発現する一方で、HT1080細胞では形質導入細胞と形質導入していない細胞の間に有意な差が観察されなかったことを示している。このデータはmiR128が中枢神経系において重要な機能的役割を果たしているという考えを支持する。pAC3yCD2H1shRNAmiR128の形質導入細胞からのyCD2発現の免疫ブロットによる試験pAC3yCD2H1shRNAmiR128組み換え複製コンピテントレトロウイルスベクターの形質導入細胞からのyCD2の発現を確かめるために、感染度が最大に達する感染から9日後の細胞をyCD2発現の検出を目的とした全タンパク抽出のために膨張させ回収した。免疫ブロットの結果は、pAC3yCD2H1shRNAmiR128を形質導入させたHT1080およびU87MG細胞の両方において、pAC3yCD2形質導入細胞と比較して正常なyCD2の発現がみられたことを示している。実施例13マウスヒト異種移植モデルにおけるmiRNA発現ベクターによる抗腫瘍有効性試験目的本試験の目的は、miR128配列を担持する新規のMLVベースの複製コンピテントレトロウイルスベクターAC3miR1282AC3miR1283が生存へ与える影響を評価することであり、その評価はヒト神経膠腫異種移植片を有するヌードマウスへ頭蓋内注入を介して、Toca511が三段階の投与量で送達されたときに行う。マウスメスの胸腺欠損のnudeFoxn1nuマウスはHarlanから購入した。マウスは到着後7日間順応させた。35mmの突起を有するキャップを装着し、右線条体に移植された30mmの突起を有する留置ガイドカニューレをマウスに外科的に配置した。突起の定位座標はAP05mm、ML18mmである。細胞U87MG細胞は44歳のコーカサス人女性の悪性の神経膠腫に由来する。10のウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、およびGlutamaxを含むダルベッコ変法イーグル培地により細胞を培養した。細胞は移植のためPBSに再懸濁した。U87MG細胞はガイドカニューレを通して挿入された35mmの突起を有する注入カニューレを通して、1分間につき02μLずつ頭蓋内注入された。ベクター調製物は一過性のトランスフェクションにより作られ、全ておよそ5E6TUmlの力価を有していた。最初の試験ではベクターはさらなる精製もしくは濃縮は行っていない。次に続く完全な用量反応曲線を決定するための試験のために、およそ10E8mlの力価で、高い力価の精製されたサンプルを調製した。ベクターは頭蓋内に5μL以下で投与され、最小のマウスあたりの全体投与量はおよそ25E4TUマウスとした。がんの移植およびベクターの注入メスの胸腺欠損のnudeFoxn1nuマウスの6つのグループにU87がん細胞を頭蓋内移植しその後ICに、ビヒクル、コントロールベクター、グループ2、またはAC3miR1281AC3miR1282AC3miR1283を頭蓋内投与した。グループ6のマウスはがんもしくはベクターを移植しなかった。データ解析60日目までの生存解析はグループ16からの各10頭のマウスにおいて行われ、カプランマイヤープロットとしてプロットされた。生存曲線はログランク検定により比較した。P値005が全ての解析において統計的に有意であると考えられ、解析はPrism5統計ソフトウェアまたは同等のものを用いて行われた。ベクター処置の結果は、このヒト神経膠腫異種移植片モデルにおいて、コントロールベクターもしくはビヒクル単独処置と比較して統計的に有意に生存に有利であることを示している。実施例14チモシン組み合わせ療法チモシンアルファ1を用いた実験がTu2449B6C3F1神経膠腫マウスモデルへのToca511処置と併せて行われたHMSmilowitzら、JNeurosurg1066526592007。最初の頭蓋内の細胞接種が104細胞であり、5FCの投与が一日につき二回腹腔内で500mgkgで行われ、薬剤のない日が10日間に続いて5FCの4日間の投与があることを除いて、BALBcCT26モデルにおいてそれらと同様の方法で実験を行った。ベクターおよび5FCの投与に加えて、幾つかのグループにはチモシンアルファ1を投与した。チモシンアルファ1はSigmaAldrichcatT3641から得て、滅菌水で400μgmLの濃度でストック溶液を作った。TA1は7日目から28日間、一日一回腹腔内に投与された。結果は図10に示してある。最適以下の用量のToca511および標準のBID5FC投与量を用いたところ、チモシンアルファ1の添加はToca511の最適なE5用量と同程度まで生存割合を増加させた。緩衝液のみと比較して動物は有意に生存に有利であった。さらに、最適以下の用量のToca511、チモシンアルファ1投与、および標準BID5FCの投与量の使用は、最適以下の用量のToca511およびチモシンアルファ1のみの投与と比較して、生存に有利な結果となった。本発明の多数の実施形態を述べてきた。しかしながら、本発明の考えおよび範囲から離れない限り、様々な改変がなされてもよい点は理解されるだろう。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内に含まれる。