目的のポリペプチドを発現する一つ又は複数の細胞を選択する方法であって、前記ポリペプチドを発現する少なくとも一つの細胞を含む細胞集団を提供する工程と、細胞集団を、細胞の表面上の前記ポリペプチドに結合する標識と接触させる工程と、前記細胞の表面上のポリペプチドに対する前記標識の結合を検出する工程と、前記細胞の表面上のポリペプチドに結合した前記標識の存在に基づいて前記細胞を選択する工程とを含み、標識がポリクローナル抗体ではない、方法。標識が抗体ではない、請求項1に記載の方法。標識がプロテインA、プロテインG又はプロテインLである、請求項1又は2に記載の方法。前記プロテインA、プロテインG又はプロテインLが組換え型である、請求項3に記載の方法。前記プロテインA、プロテインG又はプロテインLが蛍光性である、請求項3又は4に記載の方法。標識が組換え型で蛍光性のプロテインAである、請求項1、2、3、4又は5に記載の方法。前記検出工程が、前記細胞の表面に結合した前記標識の相対量を検出することを含む、請求項1~6のいずれかに記載の方法。前記選択工程が、最も多い量の結合標識を示す集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項1~7のいずれかに記載の方法。前記検出工程が、細胞の相対サイズを検出することを更に含み、前記選択工程が、集団から最も大きな一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項1~8のいずれかに記載の方法。細胞の相対サイズを検出する工程が、細胞の前方散乱特性を検出することを含み、前記選択工程が、最も高いFSCWを有する集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項9に記載の方法。細胞の相対サイズを検出する工程が、細胞の前方散乱特性を検出することを含み、前記選択工程が、最も高いFSCAを有する集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項9に記載の方法。細胞の相対サイズを検出する工程が、細胞の前方散乱特性を検出することを含み、前記選択工程が、最も高いSSCAを有する集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項9又は11に記載の方法。細胞集団から前記選択した一つ又は複数の細胞を単離する工程、を更に含む、請求項1~12のいずれかに記載の方法。ポリペプチドが免疫グロブリンCH1、CH2又はCH3ドメインを含む、請求項1~13のいずれかに記載の方法。ポリペプチドが抗体である、請求項1~14のいずれかに記載の方法。ポリペプチドがドメイン抗体である、請求項1~15のいずれかに記載の方法。細胞が真核細胞である、請求項1~16のいずれかに記載の方法。細胞が哺乳動物細胞である、請求項1~16のいずれかに記載の方法。細胞がCHO、CHOK1、CHODG44、NSO、COS1、COS7、HEK293、HK21、PerC6、HEK293、293T、Vero、AGE1CR、HT1080、TE671、Namalwa又はSP20からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。細胞がCHO細胞である、請求項18に記載の方法。前記細胞を検出する前記工程、選択する前記工程及び/又は単離する前記工程が、蛍光活性化細胞選別により実施される、請求項1~20のいずれかに記載の方法。前記標識が、蛍光性プロテインA、プロテインG、又はプロテインLであり、前記検出工程が、細胞の表面上のポリペプチドに結合した前記標識の相対蛍光を決定することを含み、比較的高い蛍光が、前記ポリペプチドのより高い相対発現を示し、選択工程が、比較的高いレベルの蛍光を有する集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項21に記載の方法。異種ポリペプチドを発現する細胞の集団から高発現細胞を選択する方法であって、前記異種ポリペプチドを発現する細胞の集団を提供する工程と、集団内の特定の細胞に関して細胞の相対サイズを検出する工程と、集団から最も大きな一つ又は複数の細胞を選択する工程と、細胞の集団から前記選択した一つ又は複数の細胞を単離する工程とを含む方法。細胞の相対サイズを検出する工程が、細胞の前方散乱特性を検出することを含み、前記選択工程が、最も高いFSCWを有する集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項23に記載の方法。細胞の相対サイズを検出する工程が、細胞の前方散乱特性を検出することを含み、前記選択工程が、最も高いFSCAを有する集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項23に記載の方法。細胞の相対サイズを検出する工程が、細胞の前方散乱特性を検出することを含み、前記選択工程が、最も高いSSCAを有する集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項23又は25に記載の方法。ポリペプチドを発現する細胞の集団から細胞を選択する方法であって、前記異種ポリペプチドを発現する細胞の集団を提供する工程と、細胞集団を、細胞の表面上の前記ポリペプチドに結合する標識と接触させる工程と、集団内の特定の細胞に関して、i前記細胞の表面上のポリペプチドに結合した前記標識の相対量ii細胞の相対サイズを検出する工程と、前記細胞の表面上のポリペプチドに結合した前記標識の相対量及び/又は細胞の相対サイズに基づいて集団から少なくとも一つの細胞を選択する工程と、細胞の集団から前記選択した少なくとも一つの細胞を単離する工程とを含む方法。前記選択工程が、集団から最も大きな一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項27に記載の方法。細胞の相対サイズを検出する工程が、細胞の前方散乱特性を検出することを含む、請求項27又は28に記載の方法。細胞の相対サイズを検出する工程が、細胞の前方散乱特性を検出することを含み、前記選択工程が、最も高いFSCWを有する集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項27、28又は29に記載の方法。細胞の相対サイズを検出する工程が、細胞の前方散乱特性を検出することを含み、前記選択工程が、最も高いFSCAを有する集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項27、28又は29に記載の方法。細胞の相対サイズを検出する工程が細胞の前方散乱特性を検出することを含み、前記選択工程が、最も高いSSCAを有する集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項27、28、29又は31に記載の方法。前記選択工程が、最も多い量の結合標識を示す一つ又は複数の細胞を選択することを含む、請求項27~32のいずれかに記載の方法。前記選択工程が、最も多い量の結合標識を示す最も大きな細胞を選択することを含む、請求項27~32に記載の方法。前記標識が、プロテインA、プロテインG又はプロテインLである、請求項27~34のいずれかに記載の方法。前記選択した細胞をクローン条件において増殖させる工程を更に含む、請求項1~35のいずれかに記載の方法。前記増殖工程が更なる細胞の集団を生成する、請求項36に記載の方法であって、その方法が、前記更なる細胞の集団から一つ又は複数の細胞を選択する工程と、その更なる細胞の集団から前記一つ又は複数の細胞を単離する工程とを更に含む、方法。培地中で前記選択及び/又は単離した一つ又は複数の細胞を増殖させる工程を更に含み、それにより、前記ポリペプチドを生成する、請求項1~37のいずれかに記載の方法。前記培地から前記ポリペプチドを精製する工程を更に含む、請求項38に記載の方法。動物由来の成分を利用しない、請求項1~39のいずれかに記載の方法。利用する全ての成分が非動物及び組換え供給源由来である、請求項1~40のいずれかに記載の方法。請求項1~41のいずれかに記載の方法により選択された細胞。請求項42に記載の細胞から生成した細胞バンク。当該技術分野において、改良された細胞選択法についての要請が存在する。本発明は、所望のポリペプチドの高力価を発現する個々の細胞株を同定及び選択するための改良された方法を提供する。本発明は、任意の段階で血清などの動物由来成分の使用を必要とせず、更に、最適な高産生クローンを同定するのに動物由来の抗血清及び標準的なプロトコルを用いる場合と同じか若しくはより効果的である、新規の直接的な染色法を提供する。従って、ヒトに使用するための生物製剤を発現する産生細胞株になり得る選択される細胞は、過度に外来性及び感染性因子に曝露されない。本発明は、細胞膜上の産物を直接染色することより高産生クローンを選択するために動物由来成分を含まないFACS選別プロトコルを用いる技術的課題を克服する。本発明はまた、半固体培地を使用する必要性及び細胞外ハロ形成に要する時間を克服する。本発明はまた、高産生細胞/細胞株のより良い同定及びその後の単離を可能にする細胞の前方散乱特性に基づいた新規ゲーティングストラテジーを提供する。加えて、本発明の結果として、細胞株作製の非常に初期の段階から、即ち96ウェル段階と同程度に初期の段階から高産生クローンが同定されるので、多数のクローンをスクリーニングする必要性を減少させる。この結果として、細胞株作製に関する労力が顕著に減少する。これは、単一細胞選別のために直接標識FACSアプローチを用いて96ウェル段階からでさえ高産生細胞株の同定の実現可能性を実証する最初の報告である。第1の態様において、目的のポリペプチドを発現する一つ又は複数の細胞をスクリーニングする方法であって、前記ポリペプチドを発現する少なくとも一つの細胞を含む細胞集団を提供する工程と、その細胞集団を、細胞の表面上の前記ポリペプチドに結合する標識と接触させる工程と、前記細胞の表面上のポリペプチドに対する前記標識の結合を検出する工程と、前記細胞の表面上のポリペプチドに結合した前記標識の存在に基づいて前記細胞を選択する工程とを含み、標識がポリクローナル抗体ではない方法を提供する。別の態様において、目的のポリペプチドを発現する一つ又は複数の細胞を選択する方法であって、前記ポリペプチドを発現する少なくとも一つの細胞を含む細胞の集団を提供する工程と、その細胞集団を、細胞の表面上の前記ポリペプチドに結合する標識と接触させる工程と、前記細胞の表面上のポリペプチドに対する前記標識の結合を検出する工程と、前記細胞表面上のポリペプチドに結合した前記標識の存在に基づいて前記細胞を選択する工程とを含み、標識が動物由来成分を含まない方法を提供する。別の態様において、異種ポリペプチドを発現する遺伝子操作した細胞の集団から高発現細胞を選択する方法であって、前記異種ポリペプチドを発現する細胞の集団を提供する工程と、集団内の特定の細胞に関して細胞の相対サイズを検出する工程と、集団から最も大きな一つ又は複数の細胞を選択する工程と、細胞の集団から前記選択した一つ又は複数の細胞を単離する工程とを含む方法を提供する。別の態様において、分泌された異種ポリペプチドを発現する細胞の集団から高発現細胞を選択する方法であって、前記異種ポリペプチドを発現する細胞の集団を提供する工程と、その細胞集団を、細胞の表面上の前記ポリペプチドに結合する標識と接触させる工程と、集団内の特定の細胞に関して、前記細胞の表面上のポリペプチドに結合した前記標識の相対量、その細胞の相対サイズを検出する工程と、前記細胞の表面上のポリペプチドに結合した前記標識の相対量及び/又はその細胞の相対量に基づいて集団から少なくとも一つの細胞を選択する工程と、細胞の集団から前記選択した少なくとも一つの細胞を単離する工程とを含む方法を提供する。選択する工程は、生細胞集団の平均FSCA又はFSCWと比べて、より高い平均FSCA又はより高いFSCWを有する細胞を選択することを含んでもよい。非ポリクローナル抗体標識の使用により、血清などの動物由来の成分、又は動物から誘導される成分を使用せずに所望のプロファイルを有する細胞を選択することができる。一実施形態において、標識は抗体ではない。本発明の一実施形態において、標識は、組換え型プロテインA、組換え型プロテインG又は組換え型プロテインLである。従って、標識は動物供給源から誘導されず、例えば、動物供給源の血清又は他の潜在的な外来性因子に曝露されていない。これにより、安全性に対する懸念が減少するので、ポリペプチドが生物製剤としての使用を目的とするタンパク質である場合、そのポリペプチド産物の下流の処理を改善する。標識は、細胞の表面に結合した標識の検出を容易にするためにマーカーにコンジュゲートされてもよい。好適なマーカーは蛍光マーカー、磁気マーカー、又はビオチンマーカーである。典型的に、マーカーは、FITC、RPE、DYLIGHT、ALEXAFLUOR、CYDYE、LICOR、PE、Cy5、Cy7、PerCP及びAPCなどのFACS装置による検出に好適な蛍光マーカーである。誤解を避けるために、マーカーのコンジュゲーションは、直接的であっても、又は間接的であってもよい。従って、典型的な標識には蛍光性プロテインA、G又はLが含まれる。この方法は、細胞の表面に結合した標識、より具体的には、細胞の表面上のポリペプチドに結合した標識の相対量の検出を含んでもよい。FACSに対する抗産物抗体に基づいたアプローチで示されているように、細胞の表面上に見られるポリペプチドに対する標識の結合は、その細胞により発現されるポリペプチドの量の指標を提供する。従って、細胞集団の他の細胞と比べて、細胞の表面に対する標識の相対結合を検出する工程は、細胞がポリペプチドの高発現体である可能性があるという指標を提供できる。一実施形態において、検出する工程は、細胞の相対サイズを検出することを更に含む。本発明者らは、細胞の亜集団が、細胞集団内の他の細胞と比べて、より大きいことを発見した。この亜集団は、例えば、前方散乱幅又は前方散乱領域により分析した場合、主要集団とは異なる。この亜集団からの細胞が培養される場合、クローンは驚くべきことに、サイズが小さい主要細胞集団の細胞より多くの目的のポリペプチドを発現する。この観察は特に、これらのより大きな細胞が、時間と共に平均細胞サイズに戻る動的な亜集団であるので驚くべきことである。この大きな細胞亜集団はまた、本明細書中でHFA細胞亜集団と称され、より小さい細胞亜集団はLFA細胞亜集団と称される。一実施形態において、選択する工程は、最も多い量の結合標識を示す集団から一つ又は複数の細胞を選択することを含む。選択する細胞の数は、最終的にクローニング及び/又は培養することを目的とする細胞数、及びそれによる利用可能な資源に依存する。当業者は、細胞に結合した標識を最も多くの量で有するこれらの細胞を選択するために選択基準を定義できる。例えば、標識が蛍光標識である場合、当業者は、最も強く蛍光を発する細胞を選択するために選択基準を定義できる。FACSプロトコルにおいて、当業者は、最も強い蛍光を発する細胞を選択するためにゲーティング基準を容易に定義できる。最も強い蛍光を発する細胞は細胞集団内で最も高発現する細胞である可能性がある。典型的な実施形態において、細胞集団内で最も多くの結合の20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2若しくは1又はそれより少ない細胞が選択される。一実施形態において、選択する工程は、集団から、より大きな又は最も大きな又は増殖している一つ又は複数の細胞を選択することを含む。選択する細胞の数は、最終的にクローニング及び/又は培養することを目的とする細胞数、及びそれによる利用可能な資源に依存する。当業者は、細胞集団内から、より大きな又は最も大きな細胞を選択するために選択基準を定義できる。例えば、FACSプロトコルにおいて、当業者は、より大きな又は最も大きな細胞を選択するためにゲーティング基準を定義できる。これは、FSCHFSCAプロット、FSCWFSCAプロット、FSCWヒストグラム又はFSCASSCAプロットにより細胞集団の試料を分析した後、FACSのゲートを設定することを含んでもよい。本明細書で使用する場合、より大きな及び最も大きなという用語は、一つ又は複数の細胞がそれらの前方散乱特性、即ちFSCA又はFSCWに基づいて選択されることを意味する。より大きな又は最も大きな一つ又は複数の細胞は、主要な生細胞亜集団より高い平均FSCA及びより高いFSCWを有する生細胞の亜集団内の任意の細胞である。同様に、本明細書で使用する場合、最も高いという用語は、細胞の前方散乱特性を説明し、細胞が、集団内の全生細胞の平均FSCA又はFSCWより高いそれらのFSCA又はFSCWに基づいて選択されることを意味する。典型的な実施形態において、細胞集団のうち最も大きな20若しくはそれ以下、15若しくはそれ以下、10若しくはそれ以下、9若しくはそれ以下、8若しくはそれ以下、7若しくはそれ以下、6若しくはそれ以下、5若しくはそれ以下、4若しくはそれ以下、3若しくはそれ以下、2若しくはそれ以下、1若しくはそれ以下が選択される。本明細書に記載されているものに加えて、多種多様の好適なゲーティングストラテジーが存在し、それらは、本明細書に記載されている同じ亜集団を区別し、選択するために使用されてもよいことは理解されるだろう。フローサイトメーターの熟練した操作者は、従って、本発明の教示に基づいて亜集団を同定し、ゲートできる。従って、HFA細胞亜集団又は強い蛍光を発する亜集団を選択するためのかかる代替のゲーティングストラテジーもまた、本発明に意図される。加えて、亜集団の選択及び/又は単離が得られる、異なる/追加の標識ストラテジーもまた、本発明に意図される。選択する工程は、典型的に、集団から生細胞のみを選択することを含む。集団内の細胞が生細胞であることを決定することは、当業者の通常の能力の範囲内である。従って、例えば、FACSプロトコルにおいて、当業者はサイトメーターの生ゲーティングを定義できる。これは典型的にFSCASSCAプロットによって細胞の集団の試料を分析することを含む。例えばヨウ化プロピジウムを用いる更なる染色も使用されてもよい。この方法は更に、細胞の集団から前記選択した一つ又は複数の細胞を単離する工程を含む。典型的に、これは細胞集団からの個々の細胞の選択及び単離を含む。選択した個々の細胞を96ウェルプレートのウェルなどの別個の容器内に沈殿させてもよい。一つ又は複数の容器は通常、選択及び単離した細胞のクローン性増殖に好適な培地を含有する。典型的に、培地は血清を含まない培地である。一実施形態において、培地は動物由来の成分を含まない培地である。細胞間接触の欠如又は細胞集団から放出される必須因子に起因して、少数の細胞はかかる状態で増殖するのが困難であることは理解されている。従って、一実施形態において、培地は、馴化培地であるか、又は馴化及び新鮮な培地の混合物を含有してもよい。代替の実施形態において、容器は、本質的に自己由来であり得る支持細胞を含有する。代替の実施形態において、新鮮又は馴化培地は、アルブミン、トランスフェリン又はインスリン増殖因子などの単一細胞増殖を支持する補足物を含有する。一実施形態において、標識は、蛍光性プロテインA、プロテインG、又はプロテインL、典型的にはプロテインAである。検出する工程は典型的に、細胞の表面上のポリペプチドに結合した標識の相対蛍光を決定する工程を含み、ここで、比較的高い蛍光は、前記ポリペプチドのより高い相対発現を示す。選択する工程は典型的に、検出する工程に続いて、全体として細胞集団と比べて、検出する工程において検出した集団から、比較的高いレベルの蛍光を有する一つ又は複数の細胞を選択する工程を含む。単離する工程は典型的に、細胞集団から一つ又は複数の選択した細胞を分離する工程と、選択した細胞を別個の容器、通常96ウェルプレートのウェル内に各々独立して沈殿させる工程とを含む。これらの条件において、選択した高発現細胞はクローン条件下で増殖され得る。ポリペプチドは非ポリクローナルIgG又は非抗体標識で標識され得る任意のポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、例えば、限定されないが、合成であるか、又は天然であるかに関わらず、抗体、ホルモン、酵素、増殖因子、受容体、融合タンパク質、抗原、生物製剤又は任意の他のポリペプチドを含む、任意の好適な可溶性又は膜結合型ポリペプチド若しくは多量体ポリペプチドであってもよい。典型的に、ポリペプチドは治療用タンパク質である。一実施形態において、ポリペプチドは分泌されたポリペプチドである。一実施形態において、ポリペプチドは、免疫グロブリンCH1、CH2若しくはCH3ドメイン、CH2及びCH3ドメイン、又は免疫グロブリンFcドメインを含む。典型的に、ポリペプチドは抗体である。典型的に、ポリペプチドは組換え又は異種ポリペプチドである。組換え/異種ポリペプチドを発現する細胞を得るために、通常、発現される遺伝子をコードする好適な発現ベクターによる細胞のトランスフェクションを必要とする。ベクターは通常、目的のポリペプチドを発現する細胞の選択を可能にするために抗生物質耐性をコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含有する。代替として、マーカー遺伝子は、目的のポリペプチドをコードするベクターと同時に細胞内に導入される第2のベクターから発現されてもよい。典型的な実施形態において、細胞株はdhfr細胞株であり、細胞内にトランスフェクトされる一つ又は複数の発現ベクターはDHFR及び抗生物質耐性を含有する。しかしながら、他のトランスフェクション法及び選択手順も好適であり、当業者により任意に選択されてもよい。細胞の集団は、限定されないが、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥細胞、魚細胞、又はそれらに基づいた不死化若しくは形質転換細胞集団を含む、それらの任意の誘導体などの任意の原核生物又は真核生物種であってもよい。一実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、又は不死化若しくは形質転換細胞の哺乳動物細胞である。一実施形態において、細胞は、CHO、CHOK1、CHODG44、NSO、COS1、COS7、HEK293、HeLa、HK21、PerC6、293T、Vero、AGE1CR、HT1080、TE671、Namalwa又はSP20から選択される。典型的な細胞株は、限定されないが、CHOK1、CHOK1Chk2、CHODG44、CHODXB11を含む、CHO細胞株、又はそれら由来の細胞株である。CHO細胞株は、CHODG44dhfr株などのdhfr細胞株であってもよい。例えば修飾された糖鎖を発現するように操作された哺乳動物細胞株もまた、本発明における使用に好適である。かかる細胞株の例には、CHOFUT8ノックアウト細胞株又はGnTIIIの発現を上方制御するように操作された細胞株が含まれる。一実施形態において、細胞集団は、CHROMOS由来のACE系などの人工染色体を含有する細胞からなってもよい。細胞の集団はバルクトランスフェクション由来の細胞であってもよいか、又は樹立/クローン細胞株であってもよい。一実施形態において、本発明の方法は、フローサイトメトリー法、より典型的には、蛍光活性化細胞選別法である。典型的には、検出する工程は蛍光活性化細胞選別機又は分析装置において実施される。典型的には、選択する工程は蛍光活性化細胞選別機又は分析装置において実施される。典型的には、単離する工程は蛍光活性化細胞選別機において実施される。一実施形態において、この方法は、接触させる工程の前に細胞を洗浄する工程を更に含む。洗浄する工程は、周囲培地中に細胞により分泌されているポリペプチドを除去し、それによって、標識が細胞表面に発現したポリペプチドに結合することを確実にし、細胞特異的染色を増加させる。細胞を洗浄する工程は、典型的には、限定されないが、PBSなどの緩衝液中に細胞を懸濁することと、続いて細胞ペレットを生成するために細胞を遠心分離することと、上清から細胞ペレットを分離することとを含む。本発明はまた、フローサイトメトリーにより目的のポリペプチドを発現する一つ又は複数の細胞を選択する方法であって、蛍光結合標識で細胞を染色する工程を含み、動物由来成分を利用しない方法を提供する。本発明はまた、フローサイトメトリーにより、蛍光結合標識を用いて目的のポリペプチドを発現する一つ又は複数の細胞を選択する方法であって、利用される全ての成分が組換え及び非動物供給源由来である方法を提供する。本発明によれば、単一の選択した細胞を、その細胞の増殖及び分裂を可能にする条件で増殖又は培養してもよく、それにより、それらの細胞由来の第二の細胞集団を生成する。本明細書中で、クローン集団から単一細胞を再クローニングする工程は、細胞の力価を増加できることと示される。それ故、一実施形態において、この方法は、前記選択した細胞をクローン条件下で増殖させる工程を含む。この増殖させる工程は、本明細書中でクローン集団又は更なる細胞集団と称される、更なる細胞の集団を生成できる。この方法は、前記更なる細胞の集団から一つ又は複数の細胞を選択する工程と、更なる細胞の集団から前記一つ又は複数の細胞を単離する工程とを更に含んでもよい。このプロセスは、安定及び/又はより高い産生細胞株を生成するために所望又は必要な限り何度も反復してもよい。各場合において、更なるものから細胞を単離する工程は、高発現細胞を選択するために、本発明の方法に従って実施されてもよい。従って、別の態様において、本発明は、細胞をクローニングする方法であって、複数の細胞を含む集団から細胞を単離する工程と、クローン集団を生成するためにクローン条件下で前記単離した細胞を増殖させる工程とを含む方法を提供する。一実施形態において、増殖させる工程は馴化培地中で実施される。一実施形態において、細胞は異種遺伝子及びDHFR遺伝子でトランスフェクトしたdhfr細胞であり、増殖させる工程はメトトレキサートを含む培地中で実施される。一実施形態において、細胞はまた、ネオマイシン耐性遺伝子でトランスフェクトされ、増殖させる工程はG418を含む培地中で実施される。この実施形態において、培地はメトトレキサートを更に含んでもよい。本明細書中で、培地中の組換え型血清アルブミン及び/又は組換え型トランスフェリンの添加は、クローニング効率を増加させることが見出されている。それ故、培地は、組換え型血清アルブミン及び/又は組換え型トランスフェリンを更に含んでもよい。血清アルブミンの濃度は、01~10mgmL、より典型的には、05~5mgmL、より典型的には更に075~25mgmL、最も典型的には約05~1mgmLであってもよい。トランスフェリン濃度も同様に変化されてもよいが、典型的にはmgL範囲、最も典型的には約5mgLである。本明細書中で、単一細胞の単離後、続いてクローン条件において増殖したその細胞株の生存能力及び/又は生産性が、一定の期間、選択圧を除去することによって改良され得ることが更に見出される。従って、一実施形態において、細胞は異種遺伝子及びDHFR遺伝子でトランスフェクトされたdhfr細胞である。この実施形態において、集団から細胞を単離する工程の後、単離した細胞を、メトトレキサート又はG418などの抗生物質を含まない馴化培地であってもよい培地中で第一の期間増殖させる。第一の期間に続いて、メトトレキサート及びG418が培地に加えられる第二の期間があってもよい。典型的には、第一の期間は12~100時間、より典型的には24、26、48、64又は72時間である。それ故、別の態様において、本発明は、細胞をクローニングする方法であって、異種タンパク質を発現する細胞を単離する工程と、第一の増殖期の間は選択/増幅剤、例えばメトトレキサート及び/又は抗生物質の非存在下の培地中で、第二の増殖期では選択/増幅剤を含む培地中で、前記単離した細胞を増殖させる工程とを含む方法を提供する。本発明の方法は、万能細胞バンクを生成するためのクローン条件において前記選択した細胞を増殖させる工程を更に含んでもよい。この方法は、クローン条件において前記選択した細胞を増殖させる工程であって、細胞が前記ポリペプチドを発現する工程と、細胞からポリペプチドを分離する工程と、前記ポリペプチドを精製する工程とを更に含んでもよい。本発明はまた、本発明に係る方法によって選択した細胞と、かかる細胞によって生成されたポリペプチドを提供する。他の利点は、図面と併せて読んだ場合、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。本明細書において、本発明は、明確且つ簡潔な明細書の記載を可能にするように実施形態を参照して記載されている。本発明から逸脱することなく実施形態を様々に組み合わせ、又は分離させてもよいことを意図するものであり、またこのように理解されるものとする。他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者により一般に理解されているものと同様の意味を有する。標準的な技術が、分子、遺伝及び生化学的方法ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarborNYandAusubelら、ShortProtocolsinMolecularBiology第4版、JohnWileySonsIncを参照されたい並びに化学的方法に使用される。本方法は、産物特異的細胞膜染色のための動物由来の抗産生抗体の代わりに、組換え型プロテインA、プロテインG又はプロテインLなどの非動物由来の非抗体標識を利用する。本発明の方法に使用される成分の全ては、血清又はBSAなどの動物由来の物質を使用せずに産生したので、最終産物の細胞株の外来性及び感染性因子に対する曝露の危険性が顕著に減少される。CHODG44細胞についての典型的な細胞株生成プロトコルを図1Aに概説し、これによれば、細胞株はトランスフェクト細胞の低密度の播種により生成される。本明細書に使用されるベクターを図1Cに示す。G418選択及び培養物増大後、低密度播種の更なる工程を、遺伝子増幅のためのメトトレキサートの添加により実施する。培養増殖後、初期の安定性試験を、最良のクローンの限界希釈又はFACS選別によって単一細胞クローニングの前に実施する。他のCHO細胞株についても同様のプロトコルに従った。このプロセスは、抗体の商業的製造に好適な細胞株を首尾よく産生できるが、本発明者らは、表面発現について染色した細胞を選択することが、より高いIgG産生を有するクローンの選択につながる可能性を調査した。クローン株を産生することに加えて、本発明者らは、このプロセスが、より高い分泌株を同定するのに必要とされる時間及びスクリーニングするクローンの数を減少させ得ると考えた。本発明の一実施形態に係る改良されたプロトコルを図1Bに概説し、これによれば、選択及びメトトレキサート遺伝子増幅をバルクトランスフェクト集団で実施し、かかるバルクトランスフェクト細胞培養物を静置培養から振盪フラスコに迅速に移動させる。次いで細胞を染色し、表面IgGを最も高発現するクローンをバルク集団から単一細胞選別する。あるいは、又はそれに加えて、細胞をまた、それらの前方散乱特性に基づいて選別し、これにより、より高い平均FSCAを有する細胞を選択/選別する。最も高発現するクローンを単離する場合と同様に、この新規の方法により、後でバッチ産生培養物中で高レベルのIgGを産生するクローンの単離が可能となる。この方法は、96ウェル段階と同程度の早期から更なる開発のための高発現細胞の同定を可能にし、その結果として、100未満のクローンの分析、並びに24未満のクローン、及び多くの場合、わずか10クローンのスケールアップが得られる。以下の実施例は、動物由来のタンパク質標識法を用いる典型的な方法によって生成されたデータを、動物由来のタンパク質/成分を完全に含まない新規方法と比較する。加えて、それらは、より高いFSCAの特徴を有する細胞を選択/選別する利点を実証する。フローサイトメトリー装置は、その装置が利用可能なレーザー及び検出器の数に依存する最大数のパラメーターを用いて前方散乱、側方散乱及び蛍光などのいくつかのパラメーターを検出できる。FSCは、細胞サイズの尺度であり、小角度、典型的に05~5°におけるレーザーからの光の散乱と定義される。より高いFSCはより大きな細胞又は事象と相関する。SSCは、15~150°の間のレーザーからの光の偏向と定義され、細胞の粒度と関連付けられる。従って、選択した特徴を有する特定の細胞は、サイトメーターにより生成したデータプロットをゲートすることにより選択できる。フローサイトメトリーにおける各パラメーターは、三つの値最も広範に使用される値である、シグナルの面積、シグナルの高さ及びシグナルの幅により特徴付けられる。シグナルが時間に対してプロットされる場合、その面積、幅及び最大の高さは図9Aに示すように決定される。FSCの例として、FSCA、FSCH及びFSCWが存在する。本出願の目的のために、パラメーターの名称の隣にA、H又はWがない場合、それは面積の値を指す。本明細書で使用する場合、用語HFA又はとは、集団内のより大きな細胞を指す。これらの細胞は顕微鏡により調査され、主に大きな単一細胞からなり、細胞は凝集しない。それらは有糸分裂/増殖細胞であり得る。本明細書において、この亜集団から高発現細胞を選択することは、集団内のより小さな細胞から選択する場合よりも高いポリペプチド産生を示す細胞を選択する可能性の増加をもたらすことを示す。これらの細胞の正確なサイズは、勿論、細胞の種類、増殖条件などに応じて変化する。HFA又は大きな細胞亜集団は、当業者により細胞の各々の特定の集団について確立され得る。このように、本明細書において、選択する工程は、生細胞集団内の別の細胞集団を同定する工程と、この別の集団から細胞を選択するようにFACSサイトメーター又は分析器でゲートする工程と、この別の集団から細胞を選択する工程とを含んでもよい。上述のように、この亜集団の細胞が、サイトメーターにおいてゲートされ、選択され得る種々の方法が存在する。細胞の任意の特定の集団に関して、HFA細胞亜集団は、平均FSCWより高い、又は平均FSCAより高い生細胞である。前述のように、選択される細胞の数は、最終的にクローンし、培養することを目的とする細胞の数、並びにそれにより、利用可能な資源及び時間に依存する。当業者は細胞集団内から最も大きな細胞を選択するために選択基準を定義できる。しかしながら、典型的には、HFA亜集団は、生細胞集団の中で、最も高いFSCW値を有する20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1又はそれ未満の細胞である。HFA細胞亜集団の平均FSCAもまた、集団内の全ての生細胞の平均FSCAより高い。典型的には、HFA亜集団は、生細胞亜集団の中で、最も高い平均FSCA値を有する20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1又はそれ未満の細胞である。平均SSCAもまた、平均より高くなり得る。HFA亜集団はまた、多くのSSCA細胞を含み得る。典型的には、HFA細胞亜集団のFSCHは、集団内の全ての生細胞のFSCHと実質的に同一である。一実施形態において、HFA細胞亜集団の平均FSCHは、生細胞集団中の細胞の残りの約10010、5、4、3、2、1又は0のFSCHである。一実施形態において、HFA細胞亜集団は、最も高いFSCW及び最も高い平均FSCAを有する生細胞集団中の上位20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1の細胞であり、任意選択でその集団の平均と実質的に同一のFSCHを有する。生細胞集団は、FSCA対SSCAのプロットによって当業者により決定され、ゲートされ得る。任意選択で、それらはまた、PIでの染色時にPI陰性細胞としての追加のプロットにおいて決定され得る。生細胞のHFA亜集団は、FSCH対FSCAプロット、FSCWヒストグラム、FSCW対FSCAプロット、又は任意選択でFSCA対SSCAプロットによって決定され、ゲートされ得る。一実施形態において、HFA亜集団の平均FSCAはLFA亜集団の18倍である。一実施形態において、HFA亜集団の平均FSCHはLFA亜集団の11である。対照的にLFAという用語は、集団内のより小さな細胞を指す。上記と一致して、当業者は、任意の所与の細胞の集団に関して、LFA細胞集団を決定できる。本明細書で述べられる場合、高又は最も高い発現をする細胞は、細胞表面上の目的のポリペプチドのより多い又は最も多い量を発現する細胞集団内の細胞である。典型的には、かかる細胞は、それらが、大規模培養条件で増殖した場合、目的のポリペプチドの高力価を生じる可能性がより高いとみなされるので、クローニングのために選択される。集団内の細胞は更に、HFA及びLFA細胞に分けられてもよい。本発明の一実施形態によれば、HFA細胞もまた、培養条件で増殖した場合、目的のポリペプチドの高力価を生じることが観察されるので、かかる細胞が選択される。更なる実施形態において、高発現HFAが選択される。集団から高発現体として選択される細胞の数は、勿論、全体として集団中の細胞の数、その集団内の細胞の中のポリペプチド発現の範囲及び選別される細胞の数に依存する。典型的には、当業者は、細胞集団の最も高い発現の5~20、任意選択で細胞集団の最も高い発現の15、10、5、4、3、2又は1を選択する。つまり、当業者は、細胞の表面上のポリペプチドに結合した最も多い量の標識を含む細胞集団の約20、15、10、5、4、3、2又は1又は1未満を選択する。相対サイズ又は相対量に関連して本明細書で使用される、相対という用語は、細胞の集団全体について推定されるその可変物の値と比べて、特定の細胞に対する可変物の値を意味することを意図する。通常、細胞の特定の割合は、細胞選別プロセスの前に、選択した細胞亜集団を選択するための適切なゲーティング値を定義するために、操作者が細胞サイズ又は蛍光などの集団内の選択した可変物を分析できるサイトメーターで分析される。選別プロセスの間、サイトメーターは、全体として細胞集団に対する可変物の値と比べて、特定の細胞についての可変物の値を決定する。FACS中の細胞は、フローサイトメーターにより記録され、表示される個々の事象として定義される。抗体という用語は、最も広い範囲の意味で本明細書において使用され、免疫グロブリン様ドメインを有する分子を指し、モノクローナル、組換え型、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合断片、免疫学的に有効な断片、一本鎖Fv、ダイアボディ、Tandabsなどを含む。反対に、本発明の方法に使用される標識を説明する非抗体という用語は、標識中に任意のかかる分子が存在しないことを示す。誤解を避けるために、プロテインA、プロテインG及びプロテインLは非抗体標識である。単一可変ドメインという語句は、異なる可変領域又はドメインとは独立して抗原又はエピトープを特異的に結合する抗原結合タンパク質可変ドメインを指す。ドメイン抗体又はdAbは、抗原に結合できる単一可変ドメインと同様とみなされ得る。単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、また、齧歯動物、テンジクザメ及びラクダVHHdAbsなどの他の種由来の単一抗体可変ドメインを含む。ラクダ類VHHは、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、及びグアナコを含む種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。かかるVHHドメインは、当該技術分野において利用可能な標準的な技術に従ってヒト化されてもよく、かかるドメインはドメイン抗体とみなされる。本明細書で使用する場合、VHはラクダ類VHHドメインを含む。本明細書で使用する場合、ドメインという用語は、タンパク質の残部とは独立した三次構造を有するフォールドされたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインはタンパク質の明確な機能特性に関わり、そして、多くの場合、タンパク質及び/又はドメインの残部の機能を喪失することなく、他のタンパク質に加えるか、除去するか、又は伝達することができる。単一可変ドメインは抗体可変ドメインの特徴的な配列を含むフォールドされたポリペプチドドメインである。それ故に、単一可変ドメインには、完全な抗体可変ドメイン、並びに、例えば1又は複数のループが、抗体可変ドメインの特徴でない配列により置き換えられている修飾された可変ドメイン、或いは末端切断されているか又はN若しくはC末端伸長部を有する抗体可変ドメイン、並びに全長ドメインの少なくとも結合活性及び特異性を保持する可変ドメインのフォールドされた断片が含まれる。ドメインは異なる可変領域又はドメインとは独立して抗原又はエピトープに結合できる。クローン集団は、単一の共通の祖先の子孫である複数の細胞、例えば全ての他の細胞から単離された単一の起源細胞の子孫である細胞の集団である。本明細書で使用する場合、クローン条件は、クローン集団内で一つの細胞のみを首尾よく増加させ得ることを確実にするのに好適な条件である。典型的に、これは、その容器又はウェル中の培養環境がクローン性増殖を支持できる単一容器又はウェル内に一つの細胞のみを入れることによって行われる。後に記載した実施例において以下の方法を使用した。この研究に利用したベクター哺乳動物細胞において生物製剤抗体及び抗体に関連した種及び他のタンパク質を発現させるために、標準的な哺乳動物発現及び選択カセットをこの研究の全ての態様において利用した。標準的なオリゴヌクレオチド及び遺伝子合成、クローニング、サブクローニング及びシークエンシングの方法を、かかる発現カセットのための設計において利用した。タンパク質産物のORF設計の際、Kotsopoulouら18693及びWO2009024567A1に記載されている方法に従ってコドン最適化を実施した。代表的なORFCAIが09より大きい、かかるコドン最適化は、発現が十分に高くなることを確実にするのに役立つ。発現カセットの細胞への送達一つ又は複数の所望の発現カセットの所望の細胞宿主への送達に好適な当該技術分野における周知の多くの方法が存在する。一部のものはトランスフェクションを必要とするのに対して、他のものはウイルスベクター形質導入などの他の方法を利用する。任意のかかる方法が本発明の目的のために利用されてもよい。本明細書に典型的に記載される抗体及び抗体関連生物薬剤の発現のために、本発明者らは、プラスミドベースの発現カセットを利用し、次いでそれを脂質を用いて、又はエレクトロポレーションにより、又は最も好ましくはそれらの組合せによりトランスフェクトする。Amaxaの方法は、本発明者らにより、安定なポリクローナルプールの迅速な選択及び好適にはプロテインA染色試薬を用いる検出についての高発現を確保するための十分に高いトランスフェクション率を確保することが見出されているが、エレクトロポレーションもこれに関して成功裏に使用されている。細胞宿主及び組織培養任意の哺乳動物細胞を本発明の目的のために利用できる。典型的には、チャイニーズハムスター卵巣細胞は、生物製剤を製造するのに長く且つ証明された実績を有するため、それらを、生物製剤タンパク質産物を発現させるために利用する。多くの異なる変異CHO亜株が存在するが、最も典型的には、CHODG44又はCHOK1宿主が利用される。CHO細胞に加えて、生物製剤を作製するために利用される他の細胞には一般に、細菌細胞、酵母細胞、不死化ヒト細胞、及び不死化非ヒト哺乳動物細胞が含まれる。本明細書に記載しているこのような細胞の培養のために標準的なADCF培地を使用した。エレクトロポレーションによるトランスフェクションaDNA調製等量の重鎖及び軽鎖発現ベクターを、200μl容量のエッペンドルフ反応中で完了するまで直鎖化し、次いでエタノール/酢酸ナトリウム沈殿した。次いでペレットを70エタノール中で洗浄し、風乾し、50μLの分子生物学グレードの水に再懸濁した。bトランスフェクション前のCHODG44細胞の調製健康な増殖中の細胞、12×107細胞を15又は50mlチューブ中で遠心し、15mlの氷冷PBS/スクロース中で洗浄し、再度遠心し、次いで800μlの氷冷PBSスクロース中に再懸濁した。次いでこの細胞懸濁液を、予め調製したDNAに添加し、15分間氷上に置き、その後、冷却したエレクトロポレーションキュベットに移した。cエレクトロポレーション調製したDNA及び細胞を含有するキュベットを、25μF及び038kVに設定したGenePulser中でエレクトロポレーションし、次いで10分間氷に戻した。次いで細胞を取り出し、240mlの非選択培地に添加し、次いで40×96ウェルディッシュに非選択培地中で2~5×103細胞ウェルで播種した。次いでプレートを37°C及び5CO2で48時間インキュベートした。d選択、増殖及びクローン同定エレクトロポレーションの48時間後、150μLの選択培地を各ウェルに添加した。この選択培地はG418を含有し、ヌクレオシドを含有していない。任意選択で、その1週間後、140μlの培地を、定着した細胞層を崩さないように新鮮な選択培地と注意深く交換し、3~4週間後、全ての増殖中のクローンを、抗体産生について力価測定した。次いで同定した上位にランキングしたクローンを、同じ選択培地中で24ウェルディッシュから6ウェルディッシュまでスケールアップした。次いでこれらのクローンを96ウェルディッシュに1000細胞ウェルで播種し、次いで200μlウェルの容量で5nMのメトトレキサートも含有する選択培地にて選択した。更なる2~3週間後のインキュベーション後、最良クローンを再度スケールアップした。50nM及び150nMメトトレキサートを用いて第2及び時々第3ものラウンドの増幅を実施して、高力価細胞株を得た。発現させるORFがコドン適合化されている場合18693及びWO2009024567A1に記載されている、5nMでの単一ラウンドの増幅で十分であった。産生能について最終的なクローンを評価するために、次いで最後のメトトレキサート増幅工程における最良クローンをスケールアップし、生成される産物の力価及び質について振盪フラスコ産生モデルで評価した。AmaxaトランスフェクションCHODG44細胞をトランスフェクションの前日に継代した。トランスフェクションの日に、細胞をViCellにより計数し、5分間1000rpmにて遠心分離によりペレットにし、その細胞ペレットを滅菌PBSで一度洗浄した。次いでCHO細胞を、Amaxaヌクレオフェクション緩衝液中に107~108細胞mLにて再懸濁し、次いで106~107個の細胞を、等量の重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて、典型的には、CHO細胞懸濁液用の製造業者により推奨されるプロトコルを使用して目的の抗体をコードする1~6μgの軽鎖プラスミド及び1~6μgの重鎖プラスミドを用いて滅菌キュベットにトランスフェクトした。バルク選択及び増幅トランスフェクション直後、いくつかの別個のAmaxaトランスフェクションを1~3つのプールでプールし、新鮮な培地に添加し、滅菌T75cm2組織培養フラスコ中で増殖させた。エレクトロポレーションに関して、単一のエレクトロポレーションを細胞の単一のプールとして使用した。この段階で選択培地は使用しなかった。トランスフェクションの48~64時間後、G418を含有し、ヌクレオシドを含まない培地をトランスフェクタントの選択のために添加した。続いて、培養物を一週間に二回計数し、必要に応じて培地を添加/交換して容量を調整することにより、可能な場合には、生存数を05e6より多い細胞mlに維持した。可能な限り早く、通常、トランスフェクション後の5~14日の間に、生存細胞数に応じて、細胞を振盪フラスコに移して37C、5CO2、130~150rpmで増殖させた。70より多くの生存細胞を回収後、通常、トランスフェクションの25~4週間後、メトトレキサートを5nMの最終濃度まで培地に添加した。この段階で、培地中のG418の継続は任意選択である。10~25日の間の期間のメトトレキサートに対する曝露後、表面抗体発現について細胞を分析し、続いて、FACSAriaIを使用して単一細胞を選別した。FACSに使用するための蛍光試薬の調製DyLight649IgGウサギにおいて産生したアフィニティー精製したポリクローナル抗IgGを、市販のキットであるDyLight649Thermoカタログ番号53050を使用して以下のように標識した50mMホウ酸ナトリウム緩衝液中の抗体を、標識するためにDyLight649バイアルに添加し、10回、反転させることにより穏やかに混合した。結合していない色素を除去するためにフィルターカラムに通過させる前に、試料を、暗所で室温にて60分間インキュベートした。標識した試料を回収し、IgG濃度を測定し、その試料を20°Cにて保存するためにアリコートにした。FITCIgGウサギにおいて産生したアフィニティー精製したフルオレセインにコンジュゲートしたポリクローナル抗IgGをRocklandから購入した。Alexa647プロテインAこれはInvitrogenから購入した。プロテインAは、1mgmLまで滅菌PBS中で凍結乾燥したタンパク質から再構成し、使用前に20°Cにて凍結前に無菌でアリコートにした。使用当日に、凍結したアリコートを染色する直前に解凍し、追加の滅菌PBSを用いて01mgmLの作業ストックに更に希釈し、その後、染色する細胞に適切な量まで添加した。代替として、及び以下の実施例に具体的に記載した場合、プロテインAはRepligenから購入し、製造業者の指示書のように、Invitrogen製のAlexaFluor647標識キットを使用して標識した。蛍光標識試薬を上記のように使用したが、間接標識も使用できる。例えば、ビオチン化試薬は、FACS分析/選別のための二次試薬として蛍光色素がコンジュゲートしたアビジン又はストレプトアビジンと共に使用できる。細胞染色プロトコルaFITC又はDyLight649コンジュゲート化抗IgGを用いる染色FACSの流れを遮断し得る細胞の集合を除去するために、染色する細胞を計数する前に滅菌ナイロンの40μm篩に通した。計数後、細胞を滅菌PBS中で一回又は二回洗浄し、その後、蛍光標識した抗産物IgGとインキュベートした。洗浄により、蛍光シグナルを減少させ得る、分泌された非細胞結合IgG産物を除去する。洗浄は、各FACSチューブ内に106細胞チューブで細胞の正確な容量をピペット操作することにより実施し、次いで細胞にPBSを添加し、1000rpmにて5分間、細胞を遠心分離した。最終洗浄上清をデカントした後、抗ヒトIgG抗体を細胞ペレットに直接添加し、暗所で20分間、氷上でインキュベートした。これらのタンパク質を用いる細胞の最適な染色を、5~10μgの抗ヒトIgG106細胞で達成し、非常に良好なシグナル対ノイズ比を得た。染色後、1~2回の洗浄をPBS又は細胞増殖培地中で実施し、その後、増殖培地中で細胞ペレットを再懸濁し、分析及び/又は選別の準備ができるまで暗所にて氷上でチューブを保存した。bAlexa647プロテインAを用いる染色FACSの流れを遮断し得る細胞の集団を除去するために、染色する細胞を計数する前に滅菌ナイロンの40μm篩に通した。計数後、細胞を滅菌PBS中で一回又は二回洗浄し、その後、蛍光標識したプロテインAとインキュベートした。洗浄により、蛍光シグナルを減少させ得る、分泌された非細胞結合IgG産物を除去する。洗浄は、各FACSチューブ内に106細胞チューブで細胞の正確な容量をピペット操作することにより実施し、次いで細胞にPBSを添加し、1000rpmにて5分間、細胞を遠心分離した。二回目の洗浄上清をデカントした後、プロテインAを細胞ペレットに直接添加し、暗所で少なくとも20分間、氷上でインキュベートした。IgG試薬で達成したものより多くの低いシグナルを得た。より高いバックグラウンドに加えて、染色を観察し、結果として、シグナル対ノイズ比はIgGについてのものより低かった。しかしながら、025~1μgのプロテインA106細胞を使用した場合、細胞の最適染色を達成した。染色後、二回の洗浄をPBS又は細胞増殖培地中で実施し、その後、600μlの増殖培地チューブ中で細胞ペレットを再懸濁し、分析及び/又は選別の準備ができるまで暗所にて氷上でチューブを保存した。選別プロトコルフローサイトメトリー全てのFACSに基づいた選別に関して、本発明者らはFACSAriaを利用し、選別後のクローンの滅菌性を確実にするために70エタノールを使用して滅菌サイクルを実施した。残留エタノールを除去するために滅菌PBSで機器をフラッシュした後、選別するための装置を最適化するためにBectonDickinsonAccudropビーズ及びDivaソフトウェアv503を使用して滴下遅延を設定した。FACS選別前に、細胞又は樹立細胞株の非染色及び/又は染色ポリクローナルプールを滅菌ナイロンの40ミクロンメッシュを通して篩にかけて、流れを遮断する細胞の大きな集団を除去した。非染色及び染色親CHO細胞を、検出電圧を設定するため、また、以下の節に記載したように正確なゲーティングのために使用した。FACSAria設定試料を、単一細胞選別についての低い設定及び低いシース流圧で100μmノズルを使用して選別した。レーザー光を、FSC対SSCプロットにおいてCHO細胞の最良の分解能を得るために15中性密度フィルターに通過させた。488nm青色レーザーからのシグナルを、FITC及びPIのそれぞれについて53030又は57525バンドパスフィルターを用いて検出した。APCからの蛍光を、66020バンドパスフィルターを用いて赤色ダイオード633nmレーザーからの励起後に捕捉した。選別するための安定にトランスフェクトした細胞を、保存データ上で最適化した選別のための試料データ及びゲートを読み取り、記録することにより分析した。選別する試料を、選別に必要とするまで、染色タンパク質の内在化及び蛍光シグナルの分解を最小化するために暗所で氷上に維持した。捕捉プレートは選別当日に準備し、必要とするまで、高湿度で37°C、5CO2に維持した。FACSAria装置を、96ウェル捕捉プレートの各ウェルの中心に送達するために最適化した。プレートを選別し終えた直後、通常は1分以内に、選別したプレートをインキュベーターに戻した。本発明の所望の細胞集団を同定し、単離するための選別ゲーティングストラテジー図2は、以下の実施例において行ったゲーティングストラテジー決定のフロー図を提供する。適切な非染色又は染色対照細胞を使用してゲートを設定した。試料を記録し、最初に生細胞ゲートを確立した。細胞のヨウ化プロピジウム染色もまた、一部の場合において、生細胞集団と死細胞集団とを区別するために実施した。しかしながら、FSCSSCゲーティングは、生細胞と死細胞とを区別するのに十分であることを見出したので、PI染色はほとんどの場合において行わなかった。FSCA対FSCHの更なるドットプロットを一部の実験について設定し、実施例8に記載されるようにHFA亜集団を選択するためにゲートを描いた。次いでFITCA又はAPCAヒストグラムを、生ゲート細胞について並びに一部の場合、HFA及びLFA細胞について設定した。ほとんどの場合において、上位5又は2の蛍光生細胞の間で選別ゲートを設定し、必要な場合、このゲートをLFA及びHFA細胞のFITCA又はAPCAヒストグラム上にコピーした。図11は一部の例示した選別プロットを示す。FSCSSCゲーティングもまた、実施例14及び図22に示すようにHFA亜集団を選択するのに好適である。IgG力価分析以下に記載した二つの方法を、96ウェル及び一部の6ウェル力価分析に使用したaIGEN96ウェルプレートから得た培地試料に関して、抗体力価を、製造業者の推奨及び標準的な方法を用いてIGENMSeriesM8384分析器で自動化96ウェルサンドイッチELISA様式の方法により決定した。サンドイッチは、ストレプトアビジンでコーティングした磁性コーティングビーズ、ビオチン化プロテインA及びルテニウムで標識したF2断片から構成された。次いで試験試料のために生成したシグナルを、抗体参照基準物の連続希釈物と比較した。96ウェル培養における細胞増殖変動性と組み合わせたアッセイの変動によって高感度アッセイであるが、アッセイ中間物の精度及び再現性は、高収率の増幅した細胞株についてのこのアッセイに関して比較的低い。bMSDELISA法可溶性IgG測定を、プロテインAでコーティングしたELISAプレートを使用してMSDアッセイにより実施した。アッセイは製造業者の指示書に従って実施した。手短に述べると、プレートを最初にブロックして、室温にて60分間、専用の遮断剤を用いて非特異的結合を減少させた。次いでプレートを、3回連続して005Tween20を含有する150μlウェルのPBSで洗浄し、洗浄の間に紙タオルで吸い取った。IgG対照標準物を調製し、以下の濃度5、4、3、2、1、05、025、0125、00625、0031、0015及び0mgLで25μlウェルにて播種した。試験する試料もまた、25μlウェルに添加した。TagIgG検出抗体を、抗体希釈液中で0255μgmLに希釈し、75μlウェルで添加した。プレートを室温にて60分間、750rpmで振盪した。3回より多い洗浄を上記のように実施し、150μlウェルの1×リード緩衝液を添加し、プレートをMSD1200プレートリーダーで読み取った。未知の試料についてのIgG力価を、MSDプレートリーダーソフトウェアを使用して標準曲線から逆算した。cフラスコを振盪している間に得た培地試料及びバイオリアクター産生モデルのために、BeckmanCoulter画像システム及び製造業者の推奨及び標準的な方法を使用して反応液中の不溶性免疫沈降素により光シグナルが散乱される比濁分析法を用いて抗体力価を測定した。試験試料について生成したシグナルは、再度、抗体参照基準の連続希釈物と比較される。バイオリアクター振盪フラスコ産生モデルもまた、増殖曲線と称される典型的に、120mlの容量で通気口付きの蓋を備える標準的な250mlの組織培養振盪フラスコ又は60mlの容量で通気口付きの蓋を備える標準的な125mlの組織培養振盪フラスコのいずれかにおいて動物由来成分を含まない培地中で細胞を200000~800000細胞mlにて播種した。次いでそれらを二酸化炭素富化空気中で攪拌しながらインキュベートして、細胞増殖を促進し、維持する温度に設定した。各クローンを、種々の条件、例えば種々の温度条件で試験した。本明細書に報告した結果において、試験した各クローンについての最も高い力価を例示する。典型的には、本明細書に報告したように産生モデルエンドポイント力価を、標準的なViCellCHOパラメーター設定及び製造業者の推奨したプロトコルを使用するViCellでのトリパンブルー色素排除ベースのアッセイにより決定した場合、細胞生存が約50まで落ちる時点で記録した。通常、このエンドポイント力価は10~20日のインキュベーション後に生成される。小規模産生モデル上記のバイオリアクターモデルに関する。典型的に、24ウェルプレートにおいて15mLの最終容量で動物由来の成分を含まない培地中で細胞を800000個の細胞mlにて播種した。細胞株安定性評価細胞株の関連増殖培地中で50継代まで細胞株を培養し、バッチ産物曲線を、生産性の傾向を評価するために上記の段落に記載したように約10継代ごとに設定した。単一細胞クローニング後のクローン増殖及び選択種々の方法が哺乳動物細胞のクローニングに関する文献に存在する。かかる方法は本発明の使用に好適である。哺乳動物細胞をクローニングするための更なる新規の方法は以下に記載され、本明細書で使用されている。以下の方法/条件を本発明の目的のために使用し、例示としてのみ使用する。実施例に記載するように、連続希釈又はFACS選別のいずれかにより単一細胞を96ウェルプレート中で個々のウェルに沈殿させた。プレートはあらかじめ、100~200μlウェルの25~50の細胞を含まない馴化培地、非馴化培地、又は支持細胞を含有する培地のいずれかを含有していた。馴化培地は、新鮮な細胞増殖培地を、増殖中の非トランスフェクト親細胞の3~4日の古い培養物から収集し、遠心分離し、02μmの濾過した培地と混合することにより生成した。非馴化培地は、実施例に記載したように、トランスフェリン又は組換え型アルブミンなどの補足物を添加した、又は添加していない、クローニング前に細胞を増殖させていた培地と同じ組成の新鮮な培地であった。使用する場合、支持細胞は、通常、クローニングの0~24時間前に500~2500細胞ウェルで沈殿させた非トランスフェクト親CHO細胞であった。以下の実施例において、選択及び増幅剤である、400~1000μgmlのG418及び最終濃度5nMのメトトレキサートを、単一細胞の沈殿から0~64時間後に添加し、その後、培地中に維持した。任意選択で、96ウェルプレート中での単一細胞の沈殿後、一週間に一度、140μlの培地を、定着した細胞層を崩さないように新鮮な培地と注意深く交換し、2~4週間後、全ての増殖しているクローンを24ウェルにスケールアップした。一部の場合においてクローンを無作為に選択し、他の場合において300までを抗体産生について96ウェルにて力価測定し、少量のみ、典型的に20~100を24ウェルにスケールアップした。次いでクローンの評価は、スケールアップするための通常の細胞株作製プロトコル及び産生評価に従った。細胞表面IgG発現のための染色がない細胞選別既存細胞株のサブクローニングプロットに基づいて、もっぱら生細胞についてのゲーティングに関して、初期のFACS選別を、モノクローナル抗体を発現する樹立細胞株で実施した。標準的な単一細胞選別プロトコルを使用して細胞をクローニングし、図3の結果は、任意の抗IgG細胞表面染色の非存在下で高分泌型をクローンアウトする能力を示す。そのデータは、計画5dについて2倍の力価、計画10について15倍の増加、及び計画7bについて2回の連続選別後、力価の35倍の増加を示す。計画6dは限界希釈によりクローニングした。可能性のある高分泌型の選択を可能にすることに加えて、単一細胞選別はまた、計画7bについて図3に示すように50継代にわたって良好な安定性を有する株の誘導を導く。これらのFACS研究から生成したデータに勧められて、その後の研究は、安定にトランスフェクトした集団及び/又は樹立細胞株由来の最も高い分泌型に焦点を当て、それらをクローンアウトしようとして表面IgGについての染色を進めた。バルクトランスフェクション/選択/増幅及び細胞表面IgG発現を染色することによる発現レベルの検出。抗体などの生物製剤を発現する高産生細胞株を同定及び選別するための最新の直接染色FACS選別プロトコルは動物由来の成分を利用する。典型的なプロトコルを以下に記載する。ウシ血清アルブミンを含有する緩衝液中のアフィニティー精製した抗ヒトIgGを利用した。この抗体は、最初は、ウサギ抗血清として生成させ、ウシ血清アルブミンを含有する緩衝液中での最終形成前にアガロースビーズに結合したヒトIgGを使用してイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。抗体はFITC又はDyLight649にコンジュゲートさせた。上記の方法の節において記載したように、CHODG44細胞を、Amaxaトランスフェクションレジームを使用して計画10の軽鎖及び重鎖をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を選択し、バルクで増幅させた。図4は、非トランスフェクト細胞の抗体染色後及びG418選択後にトランスフェクトした細胞並びに選択及びメトトレキサート増幅の両方の後に達成した蛍光レベルを示す。この図は、細胞表面IgG発現が、この方法を用いてバックグラウンドレベルより上で検出可能であることを実証する。実際に、増幅前でさえ、蛍光のシフトは非トランスフェクト細胞からトランスフェクト細胞を分離するのに十分である。プロテインA対抗血清染色次に本発明者らは、プロテインA及び抗ヒトIgGの両方を使用して表面染色を比較した。本発明者らは、プロテインAでの染色が減少したシグナル及びより低いシグナル対ノイズ比を生じることを観察した。このことは、標準的なIgG染色試薬に対するプロテインAの減少した親和性によると考えられた。しかしながら、本発明者らは染色プロトコルを最適化しようと試みた。この目的のために、樹立細胞株を使用して、使用する最適量のプロテインAを定義した。細胞を染色前に2回洗浄して、トランスフェクトした細胞から可溶性の分泌抗体を除去し、次いで106個の細胞の試料を染色する、可変量の抗体又はプロテインAのいずれかを用いて染色し、その後、2回の更なる洗浄により過剰な抗体/プロテインAを洗い落とし、サイトメトリーを実施するまで氷上に維持した。この染色レジームを使用して検出した蛍光レベルを図5に示す。染色のための最適量は、抗ヒトIgGについて5~10μg106個の細胞又はプロテインAについて025~1μg106個の細胞であると計算し、全ての場合において染色は暗所において氷上で20分間実施した。最適化の後でさえも、図5におけるデータは、プロテインAがポリクローナル抗IgG抗体より低いレベルの蛍光を与えることを示す。このことに対する一つの説明は、そのポリクローナルの性質に起因して、抗体により認識されるより多くの数のエピトープが存在する可能性が高いことである。続いて、IgG対プロテインA染色により生成されるシグナルを樹立株及びバルクトランスフェクションの両方について分析した。計画12及び14のそれぞれについての実施例の結果を図6に示す。それらはプロテインA染色が樹立株で容易に可視化できることを示す。驚くべきことに、バルク異種集団はより少ない程度に染色したが、プロテインAで達成した蛍光染色は、バックグラウンド染色から最も明るい染色細胞を分離するのに十分であった。抗血清について与えられた利点を考慮して、作業をバルク及び樹立細胞株で継続した。高プロテインA蛍光と高レベルIgG分泌細胞の同定/選別との相関関係。抗ヒトIgG抗体で標識した後の高IgG分泌クローンの単離は、生物製剤細胞株作製のために既に使用していた方法であり、それは、高い蛍光がより高い力価に対応することが示されている。本発明者らの染色プロトコルを検証するために、特に、実際に高産生細胞を同定するプロテインAを用いて、本発明者らは、dAbFc融合分子を用いてトランスフェクトしたCHOK1ベースのCHROMOS細胞で四方向選別を実施し、IgG染色とプロテインA染色とを比較した。可溶性抗体を洗い流し、細胞を、20分間、暗所において氷上で4μg106個の細胞にて抗ヒトIgG又は05μg106個の細胞にてプロテインAとインキュベートした。PBS中での2回の更なる洗浄後、細胞を選別した。四方向強化選別を、生細胞の蛍光ヒストグラムプロットにわたるゲーティングに基づいて実施した。一つのゲート当たり10万個の細胞を選別し、続いて滅菌24ウェル培養プレート中で5日間増殖させた。次いで可溶性IgG力価をMSDにより測定し、読み取り値をウェル中の生細胞数で割って細胞産生当たりの指標を得た。プロテインA染色を用いて蛍光シグナルは約10倍低くなったが、このデータは、プロテインA染色のレベルと、抗ヒトIgG標識を用いて見られるものと同様の細胞のIgG分泌との間の明確な相関関係を実証する。方法の節において記載したように社内で標識した第二の供給源のプロテインAもまた首尾よく使用した。IgGを用いる選別は成功したが、細胞を含まない捕捉プレートを使用した場合のメトトレキサートで増幅したバルクトランスフェクション対予めクローニングした株からのクローン増殖は減少した。一般に、プレートが支持細胞を含有する場合、細胞が捕捉プレート中で選別した単一細胞である時、その支持細胞は個々にクローニングした細胞の増殖を促進する。プロトコルを維持するために、単純で再生可能な細胞を含まない捕捉プレートを利用した。この目的のために、捕捉プレートのみが、G418及び適量のMTXを含有する50馴化培地を含有した。抗ヒトIgG染色後、抗体計画14についてのメトトレキサートで増幅させたバルクトランスフェクションを単一細胞FACS選別に供した。同じ単一細胞選別プロトコルを、樹立株について使用し、結果を以下の表1に示す。プレート捕捉データは、条件が樹立細胞株を再クローニングするのに、及びバルクトランスフェクトした細胞を選別するのに好適であるが、バルクトランスフェクションから生成したクローン数を向上させるために最適化が所望され得ることを示唆する。選別後のクローン増殖についての捕捉プレート条件の最適化バルクトランスフェクションからの単一細胞クローンの選別後に生成したクローンの数を増加させるために、本発明者らは、様々な捕捉プレート条件を、広範に使用される支持細胞標準物と比較した。CHODG44細胞を、計画13についての抗体をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした。次いでトランスフェクトした細胞をG418選択及びヌクレオシド除去、次いで遺伝子増幅のための5nMメトトレキサートに供した。六つの異なる捕捉プレート条件を比較した1選別の64時間後に添加したG418及びメトトレキサートを含む培地中の2000個のDG44CHO細胞ウェル2選別前に存在するG418及びメトトレキサートを含む培地中の2000個のDG44CHO細胞ウェル3選別の64時間後に添加したG418及びメトトレキサートを含む50馴化培地4選別前に存在するG418及びメトトレキサートを含む50馴化培地5組換え型血清アルブミン及び組換え型トランスフェリンと共に選別前に存在するG418及びメトトレキサートを含む50馴化培地及び6組換え型血清アルブミン及び組換え型トランスフェリンと共に選別前に存在するG418及びメトトレキサートを含む新鮮培地。G418を400μgmLにて使用し、メトトレキサートを5nMにて使用し、組換え型血清アルブミンを1mgmLにて及び組換え型トランスフェリンを5μgmLにて使用した。培地及びG418はInvitrogenUKから供給された。メトトレキサートは固体から50μMストックとして調製し、動物タンパク質を含まないままにし、組換え型アルブミン及びトランスフェリンの両方は、NovozymeUKから組換え型タンパク質として供給された。五つのプレートを条件1~4及び6について選別し、三つのプレートを条件番号5について選別した。一つのプレート当たりに生成したクローンの数を表2に示す。一つのプレート当たりに生成したコロニーの数を単一細胞選別の20日後に計数した。このデータは、捕捉プレート培地中にG418及びメトトレキサートを含有することが、支持細胞プレートにおいて、及び細胞を含まない捕捉プレート条件下の両方でより少ないクローンを生じることを示す。馴化培地中に組換え型ヒト血清アルブミン及びトランスフェリンを含有することにより、その間中、クローン増殖の数の増加が生じた。支持細胞の非存在下で観察されたクローンの増殖は、細胞間接触が馴化培地に存在するものなどの可溶性要因より重要でないこと及び/又は組換え型アルブミン及びトランスフェリン捕捉物により置換されてもよいことを示す。プレート中の支持細胞の非存在は、96ウェルプレート中のクローンの視覚的同定を改善させ、それらのより早期の同定を可能にする。上記のデータは、捕捉プレートを含有する培地へのより多量のアルブミン及び/又はトランスフェリンの添加は、クローン数を増加させる可能性があり、馴化培地の使用の必要性を取り除くことを示す。以前の実施例と併せてこれらのデータは、種々の異なる条件が、その間中、細胞増殖の割合は様々ではあるが、CHO細胞の単一細胞クローニングを支持し得ることを示す。続いて、生成されたコロニーを抗体発現について分析した。表3に示す結果は、支持層を含まない培地を使用する場合、選択圧がクローニングの2日後に添加される場合により高い力価が得られることを示す。クローニング条件を更に改良するため、及び上記で得られた有望な結果を考慮して、別の実験を設計し、それにより、CHODG44細胞を、抗体をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした。次いでトランスフェクトした細胞をG418選択及びヌクレオシド除去、次いで遺伝子増幅のために5nMメトトレキサートに供した。三つの異なる捕捉プレート条件を比較した1組換え型血清アルブミン及び組換え型トランスフェリンと共に選別前に存在するG418及びメトトレキサートを含む50馴化培地2選別後48時間に添加したG418及びメトトレキサートを含む並びに選別前に存在する組換え型血清アルブミン及び組換え型トランスフェリンを含む50馴化培地3選別後48時間に添加したメトトレキサート及びG418、選別前に存在する組換え型血清アルブミン及び組換え型トランスフェリンを含む50馴化培地3週間後、単一細胞選別コロニーを計数し、また抗体力価を測定した。表4にまとめた結果は、選別の2日後に選択圧を加える明確な利点を再び示す。従来の方法から誘導されるクローンと比較した場合のFACS選別したクローンの早期回収及びバッチ産生に供給するためのより良い反応計画13に関して、本発明者らは、低密度播種及び染色した増幅したバルクプールから高蛍光を発する細胞の単一細胞選別の後に選択した細胞の回収を比較した。本発明者らは、スケールアップでの生存能力を調べ、累積的IgG力価を、T75cmフラスコからバッチ小規模産生モデル設定において達成した。そのデータを図8に示す。驚くべきことに、より多くの急速な回収が存在し、FACSプロトコルから誘導されるクローンの振盪培養に適合した及び8を参照されたい。大多数のFACSクローンが、T75段階で80より高い生存率で及び振盪フラスコにおいて最初の継代で90より高くまで回収されたのに対して、振盪フラスコ段階でさえ、大多数の従来のプロトコル株はまだ80より低い生存率であった。優れた細胞生存に加えて、FACSプロトコルから生成した細胞は、図8に示すようにIgG産生に関してそれらの従来のプロトコルから誘導された同等のものより優れていた。加えて、高蛍光細胞の単一細胞選別から誘導されたクローンを、バッチ産生振盪フラスコ法における供給に対するそれらの反応に関して従来の方法から誘導されたクローンと比較したの単一のボーラス供給を培養の7日目に加えた。表5は、FACSクローンの96が、従来のクローンの25と比べて供給によりより高い力価を生成したことを示す。加えて、FACSクローンは、供給バッチ力価においてより多くの平均の増加、45対19、及びより多くの最大の力価増加105対34を有した。これらのデータは、FACSクローニングが、生物製剤産生のためのより強力且つ供給反応性のクローンを生成するためのより良い方法であることを示唆している。細胞をそれらのFSCA対FSCHプロファイルに従って分析した場合に観察された向上した蛍光FSCH対FSCAプロットにおいてより高いFSCAを有する生細胞事象の別々の亜集団をフローサイトメーターで観察した。この細胞亜集団は、より大きい細胞サイズの指標である、その高い前方散乱領域に起因して、HFA亜集団と命名した。この集団は、主要な細胞集団として同じFSCH境界内にある。実際に、これらのHFA細胞のFSCHは、FSCH境界内の他の細胞のものの11倍であった。この他の細胞亜集団は、LFAと命名した。FSCHの類似点にも関わらず、HFA亜集団の平均FSCAは、LFA亜集団の18倍である。しかしながら、FSCH対FSCAプロットにおいて、FSCA軸においてHFAとLFA亜集団との間の重複が存在している。n22に関して、71のHFA細胞は、38の最小及び100の最大に関して、重複領域より高いFSCAを有する。それにもかかわらず、細胞のHFA亜集団は、フローサイトメトリーの当業者により明確に同定され得、各集団のゲーティングがそれに応じて決定され得る。代表的な例として、図9Bにおける斜線は生細胞亜集団を二つの明確に異なる亜集団に分け、HFA細胞亜集団は、FSCH対FSCAプロットにおける主要集団の底縁を追跡するように描かれている斜線の右側に存在する。同じデータがヒストグラムとしてプロットされている場合、HFA細胞亜集団のFSCW値は、LFA細胞亜集団のものより高い。従って、HFA細胞は、FSCHFSCAプロット又はFSCWヒストグラム、又はFSCWFSCAプロットのいずれかでゲートされ得る、より高いFSCWを有する生細胞の亜集団として定義される。実施例14に示すように、FSCA対SSCプロットにおいてHFA細胞を直接ゲートすることも可能である。選別後の顕微鏡検査時に、細胞のこの亜集団は主により大きな単一細胞からなり、細胞凝集体/集団ではない。高FSCW細胞は、それらが細胞二重性を除去するためにゲーティングストラテジーの一部を形成する場合、慣例的に、分析選別から除外されることに留意されるべきである。これは例えばFSCW又はFSCH対FSCAプロットにおいて行われ得る。しかしながら、最近、かかる亜集団がむしろ高い活性/増殖細胞を含有するT細胞が示されている。選別及びその後のこのHFA亜集団の培養は、それらのLFA亜集団と同等のものを超える強力な細胞増殖及び抗体力価を産生した。HFA集団は、生細胞の全集団の約2~20、より典型的には5~10を構成する。本発明者らは、この集団が、サンプリング時点に応じてその数を変化させる、生細胞集団の動的部分、恐らく活発に増殖する一部を表すと仮定する。加えて、選別後、HFA細胞は一般集団であるFSCA対FSCHプロファイルに戻る。しかしながら、HFA亜集団は、一貫して、LFA亜集団より高いレベルの蛍光を生成した。この集団のより高い蛍光を、使用した染色方法、プロテインA又は抗IgGに関わらず、観察した。バルクトランスフェクションに関して重要なことは、HFA亜集団のみからのクローニングは、陽性に染色したプロテインA細胞の明確な分離を可能にする。上記に基づいて、異なる抗体計画を含む樹立株及びバルクトランスフェクションの数を、HFA並びにHFA及びLFA細胞のIgG又はプロテインA染色について分析し、その結果を図12に示す。それらは、蛍光標識したプロテインA又は抗ヒトIgGのいずれかで染色した場合、HFA亜集団がより多くの割合の上位蛍光細胞を形成することを示す。それらはまた、HFA亜集団における細胞の平均蛍光が、LFA亜集団のものと比較して顕著に高いことを示す。HFA細胞の選別は、高産生体の選択の向上及び等しい又は高い安定性を有する細胞株の生成を生じる。以下に提示した二つの異なる選別を、高産生体のFACS選別によって同定及び単離するためにFSCA対FSCH特性を使用する価値を評価するために実施した1樹立株、計画10株MTX8は、三つの異なるアプローチを使用してクローニングした単一細胞であった限界希釈、SSC対FSCプロット上で単に生ゲートした細胞のFACSクローニング、並びにFSCH対FSCAプロット上で生及び次いでHFAでゲートする、HFA細胞のFACSクローニング。図13Bに示すように、最も高い産生クローンはHFAクローンのものであり、また、50継代後でさえ安定であることが証明された。2樹立株、計画3MFACS選別を実施し、HFA細胞亜集団を単一細胞レベルにて選別した。選別前の株は不安定であり、継代を多くするとバッチ力価は減少し、その減少は20継代後に顕著になり始めた。得られたデータは、HFA由来のクローン株が、親と比べて非常に高いバッチ力価及び安定性を有することを示し、一つのクローンについての代表的なデータを図14Bに示す。HFA、又はHFA高細胞の選別は、高産生体の選択の向上を生じる。以下に提示した四つの異なる選別を、高産生体の同定のためにFSCA対FSCHの特徴と併せてプロテインA染色を使用して価値を評価するために実施したi樹立株、計画3M、IgG選別単一細胞選別を、生細胞、HFA細胞、高蛍光を有する生細胞又は高蛍光を有するHFA細胞で蛍光抗ヒトIgGを用いる染色後に実施した。その結果は、高産生体を単離するために前方散乱特性及び高蛍光に基づいた選別の利点を示す。図15Aは選別後の6ウェル段階における個々のクローン力価及びクローンの数を示す。このデータは、高蛍光を有するHFA細胞が、6ウェル段階において他の三つの選別基準より非常に高い力価を有すること、及びこの傾向が、これらのクローンが多数の最も高いSPRクローンを形成する振盪フラスコ段階において抗体分泌の間、継続することを示す。全ての四つの選別由来の上位の少数のクローンは更に向上し、選別前の親株と比較してより高いバッチ力価及び安定性を示したことは留意されるべきである。iiバルクトランスフェクション、計画10、IgG及びプロテインA選別バルクトランスフェクション、選択、増幅及び染色を以前の実施例に記載したように実施した。バルクは、ポリクローナル抗ヒトIgG又はプロテインAのいずれかでの染色後に選別した。図16の結果は96ウェルプレート段階において産生したクローンの数及び分泌したIgGの平均レベルを示す。それらの生選別と同等のものと比較して、高蛍光を有するHFA細胞の副選別により、より多くのクローン及び一貫してより高いレベルのIgG産生を生じた。細胞を細胞株作製の後期段階で調べた場合、この傾向は保持されたは示したように異なる段階における各条件についての最良クローンについての分泌した力価を示す。また、上位の生細胞選別したクローンは、その上位のHFA高蛍光の同等のものと比較して、2回目の振盪フラスコ継代において類似のIgG力価を産生したが、更に培養すると、増殖曲線段階となったクローンはHFA、高蛍光クローンのみであった。図16は、供給されていないバッチ産生モデルにした細胞についてのデータを示し、ここで力価は15日目に取得し、プロテインAが高産生クローンを選択するための抗IgG血清より潜在的に優れていることを示す。iii第2のバルクトランスフェクション、計画14、プロテインA選別バルクトランスフェクション、選択、増幅及び染色を、以前の実施例に記載したように実施した。染色はプロテインAを用いて実施した。HFA及びHFA高蛍光細胞集団の選別に加えて、LFA及びLFA、高蛍光集団はまた、クローニングした単一細胞であった。図17は、関連FACSプロット及び選別ゲートを並びにこの選別の単一細胞クローンからの96ウェルプレートデータを示す。このデータは、HFA細胞集団が、プロテインAで染色したか、又は染色していないかに関わらず、LFA細胞より高い発現クローンを生成することを実証する。しかしながら、HFA細胞についてのゲーティングと併せて染色を使用した場合、非常により多くの割合のクローンは、高レベルの分泌されたIgG産生を有した。その結果は、再び、プロテインAが、ポリクローナル動物由来の標識抗体の代わりに首尾よく使用され得ること、HFAゲートを適用することは高い力価を生じること及びHFA高蛍光ゲートを適用することは一貫してより多くの高力価を生じることを実証する。続いて、クローンをスケールアップし、6ウェル及び振盪フラスコ産生段階で再分析し、ここで再び、HFAゲートを適用することが高い力価を生じること並びにHFA高蛍光ゲートを適用することが多くの一貫した高力価及びより多くの数の高産生細胞株を生じることが明らかになった。ivクローンをまた、上記のに記載したように別の計画のために生成し、ここでHFA及びHFA高プロテインAのみのクローンを選別し、分析し、スケールアップした。再び、両方であるが、96ウェルにおいてより、振盪フラスコ産生において多く、高産生細胞株を同定するためにHFA高蛍光ゲートを使用することに明確な利点が存在する。FACSプロトコルの実施後の生産性及び非常に少ない数のクローンをスケールアップする必要性の改良された予測可能性これまでの全ての細胞株作製プロトコルは、生物製剤製造レジームに好適な細胞株を生成するための数千のクローンが存在しない場合、数百のスクリーニング及びスケールアップを必要とする。本発明者らは、バッチ産生モデルにおける最も高い産生クローンの単離を保証するために最も早期の96ウェルプレート段階からスケールアップするのに必要なクローンの数を決定しようとした。この目的のために、本発明者らは、以下に提示した四つの異なる実験を分析し、上位4~5位のクローンを順位付けし、次いで培養中の以前の段階にてそれらの順位を調べた。そのデータを以下に提示する。1計画14、プロテインAで標識した細胞選別バルクトランスフェクション、選択、増幅及び染色を以前の実施例に記載したように実施した。そのバルクは、プロテインAでの染色後に選別された単一細胞であり、その結果を以下の表7及び8に示す。表7は、計画14のベクターでトランスフェクトした細胞をプロテインAで標識し、示した四つの選別基準で選別した後の96ウェル及び振盪フラスコ段階で評価したクローンの数を示す。このデータは、HFA又はHFA高選別から得たコロニーの数が、LFA又はLFA高選別についてのものより顕著に高いことを示す。表8は、異なる早期段階にてクローンを達成する最も高いバッチ産生力価の順位付けを示す。驚くべきことに、これらのデータは、上位5個の産生クローンのうち4個が、96ウェル段階においてさえ上位5個のクローンから予測され得ることを実証する。2計画14、IgG標識した細胞選別バルクトランスフェクション、選択、増幅及び染色を以前の実施例に記載したように実施した。そのバルクはIgGでの染色後の単一細胞選別であり、その結果を以下の表9及び10に示す。表9は、計画14のベクターでトランスフェクトした細胞を抗IgGで標識し、それらを示した選別基準で選別した後の96ウェル及び振盪フラスコ段階で評価したクローンの数を示す。LFA高蛍光細胞に関して、支持細胞を含む捕捉プレートを使用してクローニングを実施したのに対して、HFA高蛍光細胞に関して、二つの異なる条件を使用した支持細胞又は馴化培地。このデータから、高蛍光の副選別を用いてHFA細胞から産生したクローンの数は再びより高かった。バッチ産生モデルにおいて上位5個のクローンのうちの4個もHFA高選別細胞であった。そのデータはまた、上位5個の増殖曲線産生クローンのうちの4個が96ウェル段階において上位5個のクローンから予測され得ることを実証する。これらのクローンのうちの3個に関して、この順位は、6ウェル及び振盪フラスコ段階を通して保持される。3計画10、IgG又はプロテインAで標識した細胞選別バルクトランスフェクション、選択、増幅及び染色を以前の実施例に記載したように実施した。そのバルクはIgGでの染色後に選別し、その結果を以下の表11及び12に示す。表11は、計画10のベクターでトランスフェクトした抗IgG又はプロテインAで標識し、それらを二つの選別基準、生ゲート又は高蛍光を有するHFA細胞のいずれかで選別した後の96ウェル及び振盪フラスコ段階で評価したクローンの数を示す。これらのデータから、高蛍光を有するHFA細胞の副選別から生成したクローンの数は、やはり、生選別した細胞についてのものより多かった。加えて、増殖曲線における全ての上位5個のクローンはHFA高細胞由来であり、最も高いのものはHFA高プロテインAで選別したクローンである。そのデータはやはり、96ウェル段階における上位8個のクローンからの予測が良好であり、それらのうちの4個が増殖曲線において上位5個に到達することを実証する。4計画3MHFA細胞IgG又はプロテインAで標識した細胞選別計画3Mの株BP0044の二つのサブクローンをFACSにより再クローニングした細胞株C1、及び細胞株D16。C1及びD16は、蛍光性プロテインA又は抗ヒトIgGのいずれかで細胞を標識した後、上位5の蛍光及びHFA細胞集団から再選別されたた選択単一細胞であった。その結果を以下の表13及び14に示す表13は、6ウェル及び振盪フラスコ段階で評価したクローンの数を示す。96ウェル力価データはこの場合得なかったので示していない。これらのデータから、増殖曲線段階において上位5個のクローンのうちの4個が6ウェル段階における上位10個のクローンに由来している。まとめると、上記のこれらの四つの例の知見は、本発明に係る新規プロトコルの結果、96ウェル段階ほどの早期から最も高い産生クローンが同定されることを実証する。これは、初期の96ウェルスクリーニングの上位5~10以内からの最終細胞株の同定を記載しているCHOに基づいた生物製剤細胞株作製についての最初のプロトコルであると考えられる。加えて、合計で及び他の選別基準と比較して、高蛍光を有するHFA細胞が一貫して、バッチ産生モデルにおいて多数の最も高い産生クローンを生成する。更なる分析を、以前に使用した従来のCLDプロトコルを用いて本明細書に記載したようにFACSベースのプロトコルを比較するために実施した。この目的のために、本発明者らは七つの異なる抗体計画を分析し、ここでバルクトランスフェクション/増幅及びFACSプロトコルによるクローニングを使用した。また、従来の播種/増幅プロトコルを使用した七つの計画を分析した。両方の場合において、振盪フラスコ産生モデルにおいて順位付けした上位1~2個のクローンを追跡し、それらの順位をそれらの選択の96ウェル及び6ウェル段階で記録した。従来のプロトコルにおいてこれらの順位は最終増幅段階でのみ追跡しただけであった。表15に示す結果は、FACSプロトコルを実施すると、クローン性能のより高い予測可能性が存在することを示し、少数のクローンのみが、製造に好適な高い産生細胞株を選択するためにスケールアップすることを必要とすることを示す。本発明者らはまた、多数の場合において従来のプロトコルについて考慮した場合、これは最初の順位付けではないが、以下に記録した最後のラウンドに先行した一つ又は複数の増幅/選択ラウンドであり、これらの結果はより印象的でさえある。抗IgG及びプロテインAを使用するクローンの再選別を通じたバッチ力価における改良メトトレキサート増幅バルクトランスフェクションを用いて達成された染色は、プロテインAでは比較的低かったが、蛍光シグナルは単一細胞選別後に増加する。これは、高発現細胞の後の選択/再クローニングを容易にする。加えて、プロテインA染色で生成した蛍光シグナルの増加は、単一細胞クローニングの各分離工程を用いて増加する。再選別は細胞株作製についてのプロトコルに対する時間を追加するが、それは、高い力価を有するだけでなく、それらの親より高い安定性も示す、クローンを産生する利点を有する。図18は、複数の選別した細胞の増殖曲線研究からの可溶性IgGレベルにおいて観察された漸進的増加を示す。IgG力価の増加を計画3Mについて更に分析したところ、3~5の別々の継代にわたって得られた平均SPR値の増加と対応することが示された。力価の増加が細胞数の増加に起因した最初の再選別を除いて以下の表16を参照されたい。この実施例に記載したデータは、細胞株の生産性を増加させるための複数の再クローニングラウンドの利点を実証する。それらはまた、3を超える及び3以上の追加の再クローニングが、更にもっと産生力価を増加させ得る可能性を支持する。FACSの比較及び高発現細胞を選択するためのCLONEPIXからの選択ARH77細胞を、任意に本明細書でプロテインXと命名した膜タンパク質をコードするベクターを用いてAmaxaヌクレオフェクションキットを使用してバルクトランスフェクトした。安定な形質転換体は、続いて、PEコンジュゲートした抗プロテインX抗体で標識した後に単一細胞FACS選別したか、又はDyLight649コンジュゲートした抗プロテインX検出抗体を含有する半固体培地から選択したクローンのいずれかであった。に関して、細胞を抗プロテインX抗体で染色し、最も明るい、及び最も薄暗い陽性細胞の両方は、50馴化培地中で96ウェルフォーマットにおいて選別した単一細胞であった。に関して、1e5細胞を、補足物及びまた検出抗体を含有するGenetix半固体培地中でペトリ皿に播種した。最も明るいクローンを播種の7~10日後に製造業者の指示書に従って選択した。Clonepixから選択したクローンの蛍光を、FACSクローニングから選択した低及び高発現クローンの両方と比較した。図19は、FACS選別について以前に使用した同じ抗プロテインX抗体を使用してFACS分析により測定した場合の全てのクローンの平均蛍光強度を示す。その結果は、FACS法が、非常に高発現クローンの同定/選択を生じることを実証する。実際に、最も高い発現FACS由来のクローンは、最も高い発現Clonepix由来のクローンより6倍高いMFIを有した。FSCAゲートの使用、及びまた選別ゲートの改良最も高いレベルの蛍光強度を示すプロテインA染色細胞と得られたクローン生産性との相関関係を調べるため、及びそれにより、単一細胞選別についての最適ゲーティングパラメーターを定めるために、モノクローナル抗体をコードするプラスミドでバルクトランスフェクトした細胞を使用して選別を実施し、以前に記載したプロトコルを使用して選択し、増幅させた。バルクトランスフェクトした細胞を最初に生亜集団、次いでHFA亜集団についてゲートし、その後、プロテインA細胞表面染色のに従って選別した。それぞれ上位10、5、2及び1の蛍光を示す細胞は、96ウェルプレートでクローニングした単一細胞であった。加えて、代替のゲーティング法として、サブゲートを、高いFSCAの特徴を有する全ての細胞を組み込むように生細胞集団内で設定した。これは低及び高SSCA細胞を含んだ。これらの高FSCA細胞はHFA亜集団の細画分である。続いてこれらの細胞をプロテインA細胞表面染色について評価し、上位5の蛍光の範囲内の蛍光を示す細胞は、96ウェルプレートで選別した単一細胞であった。96ウェル段階における生産性の分析は、異なるの蛍光強度ゲート又は高FSCA及び上位5のプロテインA染色ゲートのいずれかから選別した細胞クローンについて記録した平均及び最大力価に関してわずかな相違を表した。最も高い産生クローンからなる補足したバッチ振盪フラスコ培養におけるIgG産生もまた、異なる選別基準の中でわずかな相違を表したが、産生収率と相関する細胞表面染色のレベルに関する傾向が観察された。このデータはまた、類似の生産性のクローンが、FSCH対FSCAプロット又はFSCA対SSCAプロットのいずれかから高FSCAに基づいてゲーティング細胞集団から単離され得ることを実証する。プロテインGの使用本発明者らは更に、高産生細胞の染色/同定/選別について他の試薬を使用する可能性を評価しようとした。この目的のために、本発明者らはプロテインGを評価した。プロテインGAlexa488は、Invitrogenから購入し、力価測定後、最適な染色が、106個の細胞当たり025~05μgのプロテインGで達成することを見出した。図24に見られるように、良好な標識をプロテインGで達成した。生成されたデータは、低産生バルク集団で観察された低レベルとは対照的に、標識したプロテインGを用いて高レベルの蛍光を示すクローン細胞株を有する細胞から分泌された可溶性抗体レベルを維持している。以前の実施例におけるプロテインAと同様に、より高いプロテインG蛍光をHFAゲート集団において観察した。要約すれば、プロテインAと同様に、プロテインGは、標識試薬として使用するのに、及びバルク又は事前にクローニングした株から高IgG発現CHO細胞を選別するのに好適であるはずである。