"複数の標的ヌクレオチド配列における1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の1以上を同定するための方法であって:複数の配列相違を有する1以上の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のあるサンプルを準備し;1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットはa標的特異的部分と5’上流プライマー特異的部分を保持する第1オリゴヌクレオチドプローブ、およびb標的特異的部分と3’下流プライマー特異的部分を保持する第2オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし特定セットにおける標的ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適し、しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミスマッチがある;リガーゼを準備し;サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とし;リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む1以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、ハイブリダイゼーション処理により、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して、連結反応産物配列を形成し、この産物配列は、a5’上流プライマー特異的部分、b一緒に結合した標的特異的部分およびc3’下流プライマー特異的部分を含み、各セットの連結反応産物配列は連結検出反応混合物中の他の核酸と識別可能であり、オリゴヌクレオチドプローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、1以上のミスマッチの存在によって連結せず、そして、次の変性処理の際に個々に分離している;1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを準備し、各セットは、a連結反応産物配列の5’上流プライマー特異的部分と同じ配列を含有する上流プライマー、およびb連結反応産物配列の3’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴としプライマーの1つは検出可能レポーターを有する;ポリメラーゼを準備し;リガーゼ検出反応混合物を1または複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよびポリメラーゼと混合して、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成せしめ;ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ変性処理において、ハイブリダイズ核酸配列が分離され、ハイブリダイゼーション処理において、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイブリダイズし、伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、プライマーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成し、第1サイクルにおいて、下流プライマーが連結反応産物配列の3’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成し、次のサイクルにおいて、上流プライマーが連結反応産物に相補的な伸長産物の5’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、3’下流プライマーが連結反応産物配列の3’下流部分にハイブリダイズする;レポーター標識を準備し;伸長産物を識別して、サンプルの1以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す;ことを含む方法。請求項1の方法において、セット中のオリゴヌクレオチドプローブの1つに制限部位を含有するものであり、該方法がさらに、制限部位で各伸長産物を制限消化して、標識伸長産物フラグメントを産生し制限部位が各オリゴヌクレオチドプローブセットに位置して、該制限消化後にポリメラーゼ連鎖反応混合物における他の核酸と識別され得るように、ユニーク長を有する伸長産物フラグメントを産生し;伸長産物フラグメントをサイズまたは電気泳動運動性によって分離する該識別がサイズの異なる伸長産物フラグメントを区別する;ことを含む請求項1の方法。請求項1の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列が、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別され得るように、ユニーク長の伸長産物を産生するものであり、該方法がさらに、伸長産物フラグメントをサイズまたは電気泳動運動性によって分離する該識別がサイズの異なる伸長産物フラグメントを区別する;ことを含む請求項1の方法。請求項1の方法において、オリゴヌクレオチドが、各セットの連結反応接合部を通してのその連結反応産物配列がユニークであり、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別できるように、立体配座されるものであり、該方法がさらに、相違する特定部位で固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し捕捉オリゴヌクレオチドが与えられたプローブセットの連結接合部を通ってユニークヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有している1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する該検出は、連結反応接合部のまわりのユニークヌクレオチド配列部分を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表し、それによってサンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の存在を検出する;ことを含む請求項1の方法。請求項1の方法において、各プライマーセットで、1つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー5’末に連結するアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであり、該方法がさらに、相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し捕捉オリゴヌクレオチドは与えられたプライマーセットの連結反応接合部を通してユニークヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する;1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する該検出が連結反応接合部のまわりのユニークヌクレオチド配列を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表し、それによってサンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の存在を検出する;ことを含む請求項1の方法。請求項1の方法において、2以上の複数配列の相対量が、1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座によって相違し、定量しようとする複数の標的ヌクレオチド配列の未知量でサンプル中に存在し、そしてオリゴヌクレオチドプライマーが特定のプローブ群におけるオリゴヌクレオチドプローブセットで形成される全連結反応産物配列の増幅に有用であり、オリゴヌクレオチドプライマーセットが複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を形成し、各群が2以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、そのうちにおいて、同じ群のオリゴヌクレオチドプローブセットが同じ5’上流プライマー特異的部分と同じ3’下流プライマー特異的部分とを含有するものであり、該方法がさらに、該識別後に伸長産物の相対量を定量し;産生した伸長産物の相対量を比較して、サンプル中の2以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルの定量を行う;ことを含む請求項1の方法。請求項6の方法において、各セット中のオリゴヌクレオチドプローブの1つが制限部位を含有するものであり、該方法がさらに、制限部位で各伸長産物を制限消化して、標識伸長産物フラグメントを産生し制限部位が各オリゴヌクレオチドプローブセットに位置して、該制限消化後にポリメラーゼ連鎖反応混合物における他の核酸と識別され得るように、ユニーク長を有する伸長産物フラグメントを産生する;伸長産物フラグメントをサイズまたは電気泳動運動性によって分離する該識別がサイズの異なる伸長産物フラグメントを区別する;ことを含む請求項6の方法。請求項6の方法において、同じ群のオリゴヌクレオチドプローブセットが同じ5’上流プライマー特異的部分と同じ3’下流プライマー特異的部分とを有し、そして特定セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別できるようにユニーク長産物を有するものであり、該方法がさらに、伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離する該検出および該識別が標識が標識伸長産物中のサイズの相違により実施される;ことを含む請求項6の方法。請求項6の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列が、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別され得るように、連絡接合部を通ってユニーク配列を含有するものであり、該方法がさらに、相違する特定部位で固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し捕捉オリゴヌクレオチドが与えられたプローブセットの連結接合部を通ってユニークヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有している1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する該検出は、連結反応接合部を通ってユニークヌクレオチド配列部分を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表す;ことを含む請求項6の方法。請求項1の方法において、特定セットの1つまたは両方のオリゴヌクレオチドプローブがその非連結末端にブロック群を有し、ブロック群がエクソヌクレアーゼ消化に実質的に抵抗性である特定セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物を減少するものであり、該方法がさらに、リガーゼ検出反応混合物を1以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけた後に、リガーゼ検出反応混合物をエクソヌクレアーゼ消化にかけエクソヌクレアーゼがブロックされないオリゴヌクレオチドプローブを実質的に破壊し、連結反応産物の実質部分を破壊せず、そして元の標的ヌクレオチド配列の存在を減少するエクソヌクレアーゼを不活性化する該エクソヌクレアーゼ処理が連結反応独立伸長産物の形成を、ポリメラーゼ連鎖反応混合物の1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理の際に減少する;ことを含む請求項1の方法。請求項10の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長産物を産生するものであり、該方法がさらに、伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離し該識別がサイズの相違する伸長産物を分別する;ことを含む請求項10の方法。請求項11の方法において、1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する1以上の複数の配列が定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法がさらに、1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し;1または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む2以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し特定セットの1または両方のオリゴヌクレオチドプローブはその非連結末端でブロックされ、同じ群のオリゴヌクレオチドプローブセットは同じ5’上流プライマー特異的部分または同じ3’下流プライマー特異的部分のいずれか、あるいは同じ5’上流プライマー特異的部分と同じ3’下流プライマー特異的部分の両方を有し、該リガーゼ検出反応混合物はさらにマーカー標的ヌクレオチド配列を含有し、プローブセットはマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む、該方法がさらに;1または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が2以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し各群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは同じ5’上流プライマーまたは同じ3’下流プライマーのいずれか、あるいは5’上流プライマーと同じ3’下流プライマーの両方を含有し、オリゴヌクレオチドプライマー群は与えられた群での全連結反応産物配列の増幅に有用である;該識別後に伸長産物量を定量し;未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の1以上のヌクレオチド配列レベルを定量する;ことを含む請求項11の方法。請求項10の方法において、各プライマーセットで、1つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー5’末に連結し、単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであり、該方法がさらに、相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し捕捉オリゴヌクレオチドがアドレス可能アレイ特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を有す;1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位でアドレス可能アレイ特異的部分を固体支持物に捕捉する該検出がアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、そして特定部位で個体支持物に固定された伸長産物の存在を表す;ことを含む請求項10の方法。請求項13の方法において、1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する1以上の複数の配列は、定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在し、1つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理した後にそのプライマーの5’末に連結し、そして単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有し、同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーが5’上流プライマーか、同じ3’下流プライマーのいずれかを含有し、オリゴヌクレオチドプライマー群が与えられた群の全連結反応産物配列を増幅するのに用い得るものであり、該方法がさらに、1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し;1または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む2以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し同じ群のオリゴヌクレオチドプローブセットの1つまたは両方は、同じ5’上流プライマー特異的部分または同じ3’下流プライマー特異的部分のいずれかを含有する;1または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が2以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは、同じ5’上流プライマーまたは同じ3’下流プライマーのいずれかを含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの1群は群中の全連結反応産物配列の増幅に使用される;マーカー標的ヌクレオチド配列とマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットとを連結反応検出反応混合物に混合し;伸長産物量を定量し;未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の1以上のヌクレオチド配列レベルを定量する;ことを含む請求項13の方法。請求項1において、特定セットの1または2のオリゴヌクレオチドプローブがデオキシチミジンの代わりにデオキシウラシルを含有し、デオキシウラシルがオリゴヌクレオチドプローブおよびウラシルN-グリコシラーゼに実質的に感受性である連結反応産物配列を減少するものであり、該方法がさらに、リガーゼ検出反応混合物の1以上のリガーゼ検出反応サイクル処理の後で、かつポリメラーゼ連鎖反応混合物の1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理の前に、リガーゼ検出反応混合物を、連結反応産物配列の3’下流プライマー特異的部分に相補的な1または複数の下流プライマーおよびポリメラーゼと混合して、伸長混合物を形成し;伸長混合物をハイブリダイズ処理にかけ下流プライマーは連結反応産物配列の3’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長して、連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成する;ポリメラーゼを不活性化し;該不活性化後に伸長混合物をウラシルN-グリコシラーゼと混合して、ウラシルN-グリコシラーゼ消化混合物を形成し;伸長混合物を実質的にウラシルN-グリコシラーゼ消化にかけて、オリゴヌクレオチドプローブ、連結反応産物配列、およびプライマーとして5’上流プライマーを用いる元の標的からの伸長産物を破壊し、連結反応産物配列からの下流プライマー伸長産物を破壊せず;ウラシルN-グリコシラーゼを不活性化し;該ウラシルN-グリコシラーゼ不活性化後にポリメラーゼをウラシルN-グリコシラーゼ消化混合物と混合して、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し;ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ、デオキシウラシルの代わりにデオキシチミジンを含むこと以外は実質的に同じ連結反応産物配列である第1サイクルにおいて伸長産物を形成し、続くサイクルにおいて、5’上流プライマーが連結反応産物配列に相補的な伸長産物の5’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、3’下流プライマーが伸長処理、連結反応産物配列に実質的に同じ伸長産物配列の3’下流部分にハイブリダイズしそれにより、伸長混合物のウラシルN-グリコシラーゼ消化処理が、連結反応産物配列、1または2のオリゴヌクレオチドプローブおよびポリメラーゼ連鎖反応混合物の1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理からの連結反応独立伸長産物の量を減少する;ことを含む請求項1の方法。請求項15の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列が、プライマーまたは他の連結反応産物配列と識別し得るユニーク長産物を産生するものであり、該方法がさらに、伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離する該識別がサイズの相違する伸長産物を分別する;ことを含む請求項15の方法。請求項16の方法において、1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する1以上の複数の配列は定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法はさらに、1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し;1以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプライマーセットを準備し、各セットは、a標的特異的部分および5’上流プライマー特異的部分を有する第1オリゴヌクレオチドプローブおよびb標的特異的部分および3’下流プライマー特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし特定セットの1または2オリゴヌクレオチドプローブはデオキシチミジンの代わりにデオキシウラシルを含有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは対応するマーカー標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒の連結反応に適しており、しかし、サンプル中または加えられたマーカー配列中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときは、該連結反応を妨害するミスマッチを有し、該オリゴヌクレオチドプローブセットおよび該マーカー特異的オリゴヌクレオチドセットは複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長産物を産生し、そして同じ群または他の群におけるプローブまたは他の連結反応産物配列と識別され得る;マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出混合物に混合し;1または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が2以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは同じ5’上流プライマーまたは同じ3’下流プライマーのいずれか、あるいは5’上流プライマーと同じ3’下流プライマーの両方を含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの1群は与えられた群での全連結反応産物配列の増幅に使用される;伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離し;該識別後に伸長産物量を定量し;未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列レベルを定量する;ことを含む請求項16の方法。請求項15の方法において、各プライマーセットにおいて、1つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー5’末に連結し、単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであり、該方法がさらに、相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し捕捉オリゴヌクレオチドがアドレス可能アレイ特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を有する;1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位でアドレス可能アレイ特異的部分を固体支持物に捕捉する該検出がアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定された伸長産物の存在を表す;ことを含む請求項15の方法。請求項18の方法において、1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する1以上の複数の配列は定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法がさらに、1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し;1または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む2以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列は、同じ群または他の群のプローブまたは他の連結反応産物配列と識別される;マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出混合物に混合し;1または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が2以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは同じ5’上流プライマーまたは同じ3’下流プライマーのいずれかを含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの1群は与えられた群での全連結反応産物配列の増幅に使用される;該識別後に伸長産物量を定量し;未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列レベルを定量する;ことを含む請求項18の方法。各変性処理が温度約80-105°Cである、請求項1の方法。変性処理またはハイブリダイゼーション処理を含むリガーゼ検出反応の各サイクルが約30秒-約5分間の長さである、請求項1の方法。リガーゼ検出反応混合物の1以上のリガーゼ検出反応サイクル処理が2-50サイクルで反復される、請求項1の方法。リガーゼ検出反応混合物の1以上のリガーゼ検出反応サイクル処理についての全時間が1-250分である、請求項1の方法。リガーゼがThermusaquaticusリガーゼ、Thermusthermophilusリガーゼ、Ecoliリガーゼ、T4リガーゼおよびPyrococcusリガーゼからなる群より選ばれる、請求項1の方法。検出レポーター標識が発色団、蛍光分子、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、燐光性基、放射活性物質、化学ルミネセント分子および電気化学的検出分子からなる群より選ばれる、請求項1の方法。オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分各々がハイブリダイゼーション温度50-85°Cを有する、請求項1の方法。オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が20-28ヌクレオチドの長さである、請求項1の方法。オリゴヌクレオチドプローブセットがリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、修飾ホスフェート-糖-骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項1の方法。複数の標的ヌクレオチド配列における1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の2以上を同定するための方法であって:複数の配列相違を有する1以上の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のあるサンプルを準備し;1以上の1次オリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群は1以上の1次オリゴヌクレオチドプライマーセットを含み、各セットはa標的特異的部分と5’上流2次プライマー特異的部分を保持する第1オリゴヌクレオチドプライマー、およびb標的特異的部分と5’上流2次プライマー特異的部分を保持する第2オリゴヌクレオチドプライマーを特徴とし同じ群の各セットの第1オリゴヌクレオチドプライマーが同じ5’上流2次プライマー特異的部分を含有し、同じ群の各セットの第2オリゴヌクレオチドプライマーが同じ5’上流2次プライマー特異的部分を含有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプライマーは対応する標的ヌクレオチド配列の相補的な鎖でハイブリダイズして、ポリメラーゼ連鎖反応を形成するのに適しており、しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときは、該ポリメラーゼ連鎖反応の形成を妨害するミスマッチを有し、該オリゴヌクレオチドプローブセットおよび該マーカー特異的オリゴヌクレオチドセットは複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、特定セットのポリメラーゼ連鎖反応産物が同じ群または他の群における他のポリメラーゼ連鎖反応産物配列と識別され得る;ポリメラーゼを準備し;サンプル、1次オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼを混合して、1次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し;1次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ変性処理において、ハイブリダイズされた核酸配列が分離され、ハイブリダイゼーション処理において、1次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、伸長処理において、ハイブリダイズされた1次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、1次オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補的な1次伸長産物を形成する;1または複数の2次オリゴヌクレオチドプライマーセットを準備し、各セットは、a第1の1次オリゴヌクレオチドプライマーの5’上流部分と同じ配列を含有する第1の2次オリゴヌクレオチドプライマー、およびb第1の2次プライマーにより含有される第1の1次オリゴヌクレオチドと同じ1次オリゴヌクレオチドプライマーセットに由来する第2の1次オリゴヌクレオチドプライマーの5’上流部分と同じ配列を含有する第2の2次オリゴヌクレオチドプライマーを有し2次オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、与えられた群において1次伸長産物のすべてを増幅するのに使用され得る;1次伸長産物、2次オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼを混合して、2次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とし;2次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ変性処理において、ハイブリダイズされた核酸遺伝子が分離し、ハイブリダイゼーションにおいて、2次オリゴヌクレオチドプライマーが1次伸長産物にハイブリダイズし、伸長処理において、ハイブリダイズ2次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、1次伸長産物に相補的な2次伸長産物を形成する;複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが準備され、各セットは、a2次伸長産物特異的部分と検出可能レポーター標識を保持する第1オリゴヌクレオチドプローブ、およびb2次伸長産物特異的部分を保持する第2オリゴヌクレオチドプローブを有し特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的2次伸長産物特異的部分に互いに隣接してハイブリダイズしたときに一緒に連結反応するのに適し、しかし、サンプル中の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を妨害するミスマッチがある;リガーゼを準備し;2次伸長産物、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とし;リガーゼ検出反応混合物を、変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む1以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドが2次伸長産物から分離され、ハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは、隣接部位で塩基特異的に、もし存在すれば夫々の2次伸長産物にハイブリダイズし、互いに連結して、一緒に結合しているa検出可能レポーター標識およびb2次伸長産物特異的部分を含有する連結産物配列を形成し、オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の相補的2次伸長産物以外のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るが、1以上のミスマッチの存在のために一緒に連結しないで、変性処理の際に個々に分離する;連結反応産物配列のレポーター標識が検出されて、それによりサンプル中の2以上の標的ヌクレオチド配列の存在が表される;ことを含む方法。請求項29の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列が、リガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別できるように、ユニーク長を有するものであり、該方法はさらに、サイズまたは電気泳動運動性により連結反応産物配列を分離し;該検出後に、サイズの異なる連結反応産物配列を識別する;ことを含む請求項29の方法。請求項29の方法において、各セットの第2オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有するものであり、該方法がさらに、相違する特定部位で固定化された相違の捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を有する;1以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけた後に、リガーゼ検出反応混合物を、リガーゼ配列産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉する該検出がアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定化された連結反応産物配列の存在を表し、それによってサンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す;ことを含む請求項29の方法。請求項29の方法において、1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違し、未知量のサンプル中に存在する1以上の複数の配列の相対量を1以上の標的ヌクレオチド配列で定量するものであり、該方法がさらに、2次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に、2次伸長産物を定量し;1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し;マーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む1以上の配列特異的プローブセットを準備し;マーカー標的ヌクレオチド配列、および標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と混合し;連結反応産物配列を定量し;未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルを定量する;ことを含む請求項29の方法。請求項32の方法において、第2オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能特異的部分を有し、該方法がさらに、相違する特定部位で固定化された相違の捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を有する;1以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけた後に、リガーゼ検出反応混合物を、リガーゼ配列産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉する;アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉し、特定部位で固体支持物に固定した連結反応産物配列を定量し;未知のサンプルから産生した捕捉連結反応産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した捕捉連結反応産物量と比較して、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルを定量する;ことを含む請求項32の方法。1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列が1以上の単一ヌクレオチド位置で標的ヌクレオチド配列と相違する、請求項32の方法。請求項32の方法において、オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子相違を識別するために設計された1以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、2次伸長産物特異的部分と検出可能レポーター標識を有する共通の1次オリゴヌクレオチドプローブ、および与えられた対立遺伝子またマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする2次伸長産物特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第2オリゴヌクレオチ本発明は核酸配列の相違を検出するための方法を提供することを目的とする。本発明は、組み合せたLDRおよびPCRプロセスを用いて核酸配列の相違を検出することに関する。本発明は次の3実施態様の1つによって行われる。1LDPと組み合せたPCR、21次PCRと組み合せた2次PCRと組み合せたLDR、および31次PCRと組み合せた2次PCR。これらの実施態様の各々がある種の性質を検出するのに特定の適用性を有する。しかし、各々において核酸配列の相違を多重的に検出するのに組み合せた反応を利用するものであり、そこでは各プロセスの初期段階由来のオリゴヌクレオチドがプロセスの後期段階由来のオリゴヌクレオチドで使用され得る配列を含有している。I.1次PCR/2次PCR/LDRプロセス本発明の一つの実施態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の2以上を同定するための方法に関する。この方法は、第1ポリメラーゼ相、第2ポリメラーゼ相およびリガーゼ検出相を含む。このプロセスは、複数の配列相違がある1以上の標的ヌクレオチド配列を含有するかも知れないサンプルを分析することを含む。第1ポリメラーゼ連鎖反応相において、1以上の1次オリゴヌクレオチドプライマー群が準備される。各群は1以上の1次オリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し、各セットは、標的特異的部分と5’上流2次プライマー特異的部分を有する第1ヌクレオチドプライマー、および標的特異的部分と5’上流2次プライマー特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプライマーを含む。同じ群の各セットの第1オリゴヌクレオチドプライマーは同じ5’上流2次プライマー特異的部分を有し、同じ群の各セットの第2オリゴヌクレオチドプライマーは同じ5’上流2次プライマー特異的部分を有している。特定のセットのオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する標的ヌクレオチド配列の相補的鎖でのハイブリダイゼーションに適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成をもたらす。しかし、1次オリゴヌクレオチドプライマーがサンプル中に他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに、該ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成に妨害するミスマッチがある。特定のセットにおけるポリメラーゼ連鎖反応産物は、同じ群での他のポリメラーゼ連鎖反応産物と識別され得る。1次オリゴヌクレオチドプライマー、サンプルおよびポリメラーゼは混合されて、1次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。1次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、1次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。伸長処理によってハイブリダイズした1次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、1次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補的な1次伸長産物を形成する。1次オリゴヌクレオチドプライマーの上流2次プライマー特異的部分は標的DNAに存在しないが、その配列は1次ポリメラーゼ連鎖反応相の第2以後のサイクルで複写される。結果として、第2サイクル後に産生された1次伸長産物は、その5’末端に2次プライマー特異的部分、およびその3’末端にプライマー特異的部分の補体を有する。次は、第2ポリメラーゼ連鎖反応相である。この相では1つまたは複数の2次オリゴヌクレオチドプライマーセットが準備される。各セットは、第1の1次オリゴヌクレオチドプライマーの5’上流部分と同じ配列を含有する第1の2次オリゴヌクレオチドプライマー、および第1の2次プライマーに相補的な第1の1次オリゴヌクレオチドと同じ1次オリゴヌクレオチドプライマーセットに由来する第2の1次オリゴヌクレオチドプライマーの5’上流部分と同じ配列を含有する第2の2次オリゴヌクレオチドプライマーを有する。2次オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、特定の群において1次伸長産物のすべてを増幅するのに使用され得る。2次オリゴヌクレオチドプライマーを1次伸長産物およびポリメラーゼと混合して、2次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。2次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、2次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異部分が1次伸長産物上に存在する相補的配列にハイブリダイズし、元の標的配列にハイブリダイズしない。伸長処理によってハイブリダイズ2次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、1次伸長産物に相補的な2次伸長産物を形成する。本発明の態様における最後の相はリガーゼ検出反応相である。ここでは、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが準備され、各セットは、2次伸長産物特異的部分と検出可能レポーター標識を保持する第1オリゴヌクレオチドプローブ、および2次伸長産物特異的部分を保持する第2オリゴヌクレオチドプローブを有する。特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的2次伸長産物特異的部分に互いに隣接してハイブリダイズしたときに一緒に連結反応するのに適している。しかし、オリゴヌクレオチドプローブがサンプル中の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を妨害するミスマッチがある。特定セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物は、プローブまたは他の連結反応産物のいずれかと識別され得る。複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを2次伸長産物およびリガーゼと混合して、リガーゼ検出反応混合物とする。リガーゼ検出反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理およびハイブリダイゼーション処理を有する1以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは、隣接部位で塩基特異的に、もし存在すれば夫々の2次伸長産物にハイブリダイズする。結果として、隣接プローブは互いに連結して、一緒に結合している検出可能レポーター標識および2次伸長産物特異的部分を含有する連結産物配列を形成する。オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の相補的2次伸長産物以外のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るが、1以上のミスマッチの存在のために一緒に連結しないで、変性処理の際に個々に分離している。リガーゼ検出反応サイクルに続いて、連結反応産物配列のレポーター標識が検出されて、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の存在が示される。本発明の1次PCR/2次PCRLDRプロセスは、単一ヌクレオチドおよび縦列反復多形性の多重的検出においてPCRのみの使用よりも顕著な利点をもたらす。上記したように、PCRのみの使用では、多重検出を行うための操作条件において厳しい最適化をなすことを要する。さらに、多数の標的ヌクレオチド配列を検出するためには、オリゴヌクレオチドプライマーの量を増加しなければならない。しかし、これが起きると、標的独立反応例えばプライマー二量体作用の可能性が増加する。加うるに、変異を知らねばならず、偽の正反応が正常なタンプレットのポリメラーゼ伸長によって生じることがあり、重複しているプライマーの干渉による近接クラスター部位では多重検出はできず、小さい反復配列における単一塩基または小さい挿入や欠失は検出できず、そして正常DNAの高バックグランドにおける変異DNAの定量が難しい。結果として、単一の多重PCRプロセスにおいて検出される標的ヌクレオチド配列の数は限られてくる。直接的配列決定は、配列を正しく得るには豊富な変異サンプルを必要とし、多くのエクソン含有の大きい遺伝子について多重反応を必要とし、産物の電気泳動分離を必要とし、時間がかかり、正常DNAのバックグランド5以下での変異DNA検出には用いることができない。ミニ配列決定においては、変異を知らねばならず、重複しているプライマーの干渉による近接クラスター部位では多重検出はできず、小さい反復配列における単一塩基または小さい挿入や欠失は検出できず、そして4種の分離反応を必要とする。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションASOにおいては、変異を知らねばならず、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を知らねばならず、交叉反応を防ぐのは難しく、重複するプライマーの干渉による近接クラスター部位では多重検出はできず、正常DNAのバックグランドの5以下では変異DNAは検出できない。プライマー調節RELPは、正常DNAから変異体を識別するのに電気泳動分離を必要とし、制限部位に移行し得る部位に適用するには限界があり、変異の性質を調べるのに追加の解析を必要とし、変異DNAが正常のDNAの高バックグランドにあるときは用いるのが難しい。単鎖立体配座多形性解析SSCPは、変異配座体を正常配座体と区別するのに電気泳動分離を必要とし、可能性のある変異の30を誤り、変異の性質を調べるために追加の解析を要し、サイレント多形性と変異を識別できない。ジデオキシヌクレオチドフィンガープリントddFの場合、正常DNAの高いバックグランドにおいては変異を検出するのは困難であり、変異配座体を正常配座体と区別するのに電気泳動を必要とし、変異の性質を調べるために追加の解析を要し、サイレント多形性と変異を識別できない。変性勾配ゲル電気泳動DGGEは、変異配座体を正常配座体から電気泳動的に分離しなければならず、可能性のある変異の30を誤り、変異の性質を調べるために追加の解析を要し、サイレント多形性と変異を識別できない。そして前に得た結果を再現するのに技術的に熟練を要する。RNaseミスマッチ開裂法は、変異の性質を調べるのに追加の解析を要し、RNase抵抗性ミスマッチを排除するために両鎖の解析を必要とし、正常DNAの高いバックグランドにおいては変異を検出するのに困難がある。化学的ミスマッチ分裂法は、正常DNAのバックグランドが5以下では変異DNAを検出することができず、すべての変異を検出するのに両鎖の解析を必要とする。T4EndoVIIミスマッチ分裂法では、変異の性質を調べるのに追加の解析を要し、変異とサイレント多形性を区別できず、エンドヌクレアーゼが結果の注意深い解釈に必要なコントロールDNAを分裂し、そして正常DNAの高いバックグランドでは変異の検出が困難である。PCRの感受性とLDRの特異性を組み合せた本発明の1次PCR/2次PCR/LDRプロセスにおいては、上記のような問題がない。1次PCR相は2次プライマー特異的部分を有する1次伸長産物を産生する。この最初の相は、1次伸長産物の産生を最大にするのに効果的で、PCRのみのプロセスにおいて時々起きる有害反応を生じることのない条件で実施される。特に、本発明の1次PCR相は、15-20PCRサイクルで実施され、PCRのみのプロセスで用いられるであろうよりも少ないプライマーが使用される。本発明の1次PCR相は、いくつかの標的ヌクレオチド配列がよく増幅し、一方あるものは増幅しないので、非常に多様で、予想外に伸長産物を生み出す。しかし、2次PCR相においては、すべての1次伸長産物が同じ2次プライマー特異的部分を有するので、ほぼ等しく増幅される。サンプル中に元から存在している標的ヌクレオチド配列は、これらの配列が2次プライマー特異的部分を含有しないので、2次PCR相によっては増幅されない。結果として、本発明の1次PCR/2次PCR/LDRプロセスは、単一のチューブにおける数百のヌクレオチド配列相違の多重検出を、分析に供せられる各特定サンプルについての操作条件をその都度つくることなしに、達成することができる。変異配列の選択がPCRよりもむしろLDRで調節されるので、1次PCR/2次PCR/LDRプロセスは偽の正標的生成には感受性が低い。さらに、1次PCR/2次PCR/LDRプロセスは、近接クラスター変異の検出、小さい反復配列における単一塩基または小さい挿入や欠失の検出、正常DNAの高いバックグランドにおける1以下の変異の定性的検出、およびアドレス可能アレイを用いる連結反応産物配列の検出を可能とする。唯一の主要な必要事項は、変異を知り、多数のオリゴヌクレオチドを合成することである。単一ヌクレオチドおよび縦列反復多形性の検出ができることは、法医学的DNA同定および遺伝子疾患の診断に特に重要である。II.LDR/PCRプロセス本発明の第2態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失および転座によって相違している1以上の複数配列を同定する方法に関する。この方法はリガーゼ検出反応相に続いてポリメラーゼ連鎖反応相を有する。この方法は、複数の配列相違を有する1以上の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のあるサンプルを準備することを含む。リガーゼ検出反応相において1以上のオリゴヌクレオチドプローブが準備される。各セットは、標的特異的部分と5’上流プライマー特異的部分を保持する第1オリゴヌクレオチドプローブ、および標的特異的部分と3’下流プライマー特異的部分を保持する第2オリゴヌクレオチドプローブを有する。特定セットにおける標的ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適している。しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミスマッチがある。サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とする。リガーゼ検出反応混合物は1以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる。これらのサイクルには変性処理とハイブリダイゼーション処理が含まれる。変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離される。ハイブリダイゼーション処理によって、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在しておればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ハイブリダイズされると、オリゴヌクレオチドプローブセットは互いに連結して、連結反応産物配列を形成する。この産物は、5’上流プライマー特異的部分、一緒に結合した標的特異的部分および3’下流プライマー特異的部分を含む。各セットの連結反応産物配列は連結検出反応混合物中の他の核酸と識別可能である。オリゴヌクレオチドプローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、1以上のミスマッチの存在によって連結せず、そして、次の変性処理の際に個々に分離している。ポリメラーゼ連鎖反応において、1または複数のオリゴヌクレオチドプローブが準備される。各セットは、連結反応産物配列の5’上流プライマー特異的部分に同じ配列を含有する上流プライマー、および連結反応産物配列の3’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを有している。うち、1つのプライマーは検出可能レポーター標識を有する。リガーゼ検出反応混合物を1または複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびポリメラーゼと混合すると、ポリメラーゼ連鎖反応混合物が形成する。ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。変性処理においてハイブリダイズ核酸配列が分離される。ハイブリダイゼーション処理によって、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイブリダイズする。伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、プライマーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成する。ポリメラーゼ連鎖反応相の第1サイクルにおいて、下流プライマーが連結反応産物配列の3’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成する。次のサイクルにおいて、上流プライマーが連結反応産物に相補的な伸長産物の5’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、下流プライマーが連結反応産物配列の3’下流部分にハイブリダイズする。このプロセスのポリメラーゼ連鎖反応相に続いて、レポーター標識が検出され、伸長産物が識別されて、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の存在が表される。本発明のLDR/PCRプロセスの一つの実施態様は、細胞中の遺伝子コピーの数すなわち遺伝子量の測定においてLDRのみの使用に比べて改良された成果をもたらす。LDRのみを使用すると、複数の遺伝子を定量するの必要とする十分な標的コピーを産生するのが難しい。本発明のLDR/PCRプロセスの他の実施態様において、LDR連結反応産物配列がサンプル中に誘導された遺伝子の比率に応じた比率で産生される。同じプライマー特異的部分をLDR相のためのオリゴヌクレオチドプローブに合体することにより、PCR相が連結反応産物配列をその比率の保持と同じ程度に増幅する。解析しようとするサンプル中に元から存在する標的配列は、この標的配列がPCRプライマー特異的部分を含有しないので、PCR相で増幅されない。さらに、PCR相のためのオリゴヌクレオチドプライマーのみがレポーター標識を有し、この標識のある伸長産物のみが検出される。遺伝子量の変化の測定は多くの生物医学での利用において重要である。X染色体上の遺伝子が男性と女性では相違しており、女性は2コピーに対し男性は1コピーである。女性はX染色体について欠失の保持者となることがある。もしX染色体の欠失領域が1以上の遺伝子を含むとすると、女性は他のX-染色体の対応する非欠失域にこれらの遺伝子1コピーのみを有する。この結果X-連結遺伝子の1コピーを有することは、男性細胞における状況に類似しており、遺伝された障害を発揮することなく、常に寛容されている。しかし、もしその女性の息子が彼女の欠失X染色体を受け継ぐと、彼は欠失領域に遺伝子コピーを所有しないので、遺伝子不存在によるX-関連障害にかかる。このように、染色体欠失の検出は、本発明のLDR/PCRプロセスの適用例である。受精卵が染色体の異常補体を有すると、先天性の染色体障害が起きる。最も多い先天性染色体障害はダウン症候群であって、各細胞に追加の染色体47、XX21または47、XY21と表されるが存在するときに、これは生じる。本発明のLDR/PCRプロセスは先天性染色体障害を同定できるように設計され得る。本発明のLDR/PCRプロセスは、モノヌクレオチドおよびジヌクレオチド反復配列における多形性を識別するのに有用でもある。クローン性の検出のためにユニーク多形性を含有すの少数の細胞を識別するのにも有用である。LDR/PCRプロセスはゲルおよび非ゲルすなわちDNAアレイの両方の技法で用いられる。多くの遺伝子の増幅および欠失の同時の多重分析、定量分析を可能にし、外部標準を必要としない。LDR/PCRプロセスにおける唯一の比較的小さい問題点は、染色体における大きい欠失の境界を測定するのが難しいことである。一方、ミクロサテライトマーカー分析は、欠失または増幅した小さい領域を検出するのに用いることはできず、増幅領域の同時検出に適合せず、情報マーカーの利用性に依存している。競合的PCRすなわち分別的PCRは、いくつもの欠失および増幅を同時に検出するために多重的に使用できないし、特に精密でない。サザンハイブリダイゼーションは、時間と労力がかかり、試験する各プローブについて多工程を要して多重化には適しておらず、そして大量のDNAを必要とする。蛍光インシトゥハイブリダイゼーションFISHは、特別の技術を要し、時間がかかり、調べようとする欠失または増幅領域を解析する大きいプローブを必要とする。このように本発明のLDR/PCRプロセスは先行プロセスに優れる顕著な進歩がある。III.1次PCR/2次PCRプロセス本発明の第三の実施態様は、1以上の標的ヌクレオチド配列における1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の2以上を同定するための方法に関する。この方法は、複数の配列相違がある1以上の標的ヌクレオチド配列を含有するかも知れないサンプルを2つの連続するポリメラーゼ連鎖反応相にかけることを含む。第1ポリメラーゼ連鎖反応相において、1以上の1次オリゴヌクレオチドプライマー群が準備される。各群は2以上の1次オリゴヌクレオチドプライマーセットを含有する。各セットは、標的特異的部分と5’上流第2プライマー特異的部分を保持する第1オリゴヌクレオチドプライマー、および標的特異的部分と5’上流第2プライマー特異的部分を保持する第2オリゴヌクレオチドプライマーを有する。同じ群の各セットの第1オリゴヌクレオチドプライマーは同じ5’上流第2プライマー特異的部分を有し、同じ群の各セットの第2オリゴヌクレオチドプライマーは同じ5’上流第2プライマー特異的部分を有している。特定のセットのオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する標的ヌクレオチド配列の相補鎖でのハイブリダイゼーションに適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成をもたらす。しかし、1次オリゴヌクレオチドプライマーがサンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに、該ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を妨害するミスマッチがある。特定のセットにおけるポリメラーゼ連鎖反応産物は、同じ群または他の群を有する他のポリメラーゼ連鎖反応産物と識別され得る。1次オリゴヌクレオチドプライマーをサンプルおよびポリメラーゼと混合して、第1ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。1次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、1次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。伸長処理によってハイブリダイズ1次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、1次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補的な1次伸長産物を形成する。1次オリゴヌクレオチドプライマーの上流2次プライマー特異的部分は標的DNAに存在しないが、その配列は1次ポリメラーゼ連鎖反応相の第2以後のサイクルで複写される。結果として、第2サイクル後の1次伸長産物は、その5’末端に2次プライマー特異的部分、そしてその3’末端にプライマー特異的部分の補体を有する。本発明のこの実施態様での第2ポリメラーゼ連鎖反応相において1つまたは複数の2次オリゴヌクレオチドプライマーセットが準備される。各セットは、検出可能レポーター標識を保持し、かつ第1の1次オリゴヌクレオチドプライマーの5’上流部分と同じ配列を含有する第1の2次プライマー、および第1の2次プライマーに相補的な第1の1次オリゴヌクレオチドと同じ1次オリゴヌクレオチドプライマーセットに由来する第2の1次オリゴヌクレオチドプライマーの5’上流部分と同じ配列を含有する第2の2次プライマーを有する。2次オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、各群において1次伸長産物を増幅する。2次オリゴヌクレオチドプライマーを1次伸長産物およびポリメラーゼと混合して、2次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。2次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、2次オリゴヌクレオチドプライマーが1次伸長産物にハイブリダイズする。伸長処理によって、ハイブリダイズした2次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、1次伸長産物に相補的な2次伸長産物を形成する。2次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに掛けた後に、標識2次伸長産物が検出される。これはサンプル中おける1以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す。本発明の1次PCR/2次PCRプロセスは、サザンハイブリダイゼーション、競合的PCR、および異型接合の損失を起こすヌクレオチド欠失の検出におけるミクロサテライトマーカー解析法を上回る顕著な利点を有する。サザンハイブリダイゼーションは、競合的PCRより精密であるが、非常に労力を要し、多量のDNAを必要とし、いかなる技法でも多重化されていない。現在の多重ミクロサテライトマーカー法はプライマー濃度と増幅条件に非常な注意を要する。本発明の1次PCR/2次PCRプロセスは、これら先行技術における困難性を解決する。1次PCR相において、1次オリゴヌクレオチドプライマーがジヌクレオチドまたは他の反復配列の両側に置かれ、2次プライマー特異的部分を含む。1次PCR相は、これらのプライマーの低濃度で実施されて、同時にいくつかの部座の増幅を可能とする。2次PCR相によって、選択される標的特異的2次プライマーと同じ速度で増幅が続けられて、隣接のセットからミクロサテライトマーカーの1セットが並べられる。1次PCR/2次PCRプロセスは、単一PCRチューブで、単一ゲルレーン解析で多重検出を実施するのに用いられる。本発明のこの実施態様は、ミクロサテライトマーカー分析を実施して遺伝子中のヌクレオチド欠失を同定するのに有用である。このような多重検出は単一の反応チューブで実施され得る。しかし、1次PCR/2次PCRプロセスは、増幅と欠失を識別できないので、かかる識別をなそうとするときは、上記のLDR/PCRプロセスすなわち分別PCRプロセスを併用しなければならない。発明の詳細な記述I.1次PCR/2次PCR/LDRプロセス本発明の一つの実施態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の2以上を同定するための方法に関する。この方法は、第1ポリメラーゼ相、第2ポリメラーゼ相およびリガーゼ検出相を含む。このプロセスは、複数の配列相違がある1以上の標的ヌクレオチド配列を含有するかも知れないサンプルを分析することを含む。第1ポリメラーゼ連鎖反応相において、1以上の1次オリゴヌクレオチドプライマー群が準備される。各群は1以上の1次オリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し、各セットは、標的特異的部分と5’上流2次プライマー特異的部分を有する第1ヌクレオチドプライマー、および標的特異的部分と5’上流2次プライマー特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプライマーを含む。同じ群の各セットの第1オリゴヌクレオチドプライマーは同じ5’上流2次プライマー特異的部分を有し、同じ群の各セットの第2オリゴヌクレオチドプライマーは同じ5’上流2次プライマー特異的部分を有している。特定のセットのオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する標的ヌクレオチド配列の相補的鎖でのハイブリダイゼーションに適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成をもたらす。しかし、1次オリゴヌクレオチドプライマーがサンプル中に他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに、該ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成に妨害するミスマッチがある。特定のセットにおけるポリメラーゼ連鎖反応産物は、同じ群での他のポリメラーゼ連鎖反応産物と識別され得る。1次オリゴヌクレオチドプライマー、サンプルおよびポリメラーゼは混合されて、1次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。1次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、1次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。伸長処理によってハイブリダイズした1次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、1次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補的な1次伸長産物を形成する。1次オリゴヌクレオチドプライマーの上流2次プライマー特異的部分は標的DNAに存在しないが、その配列は1次ポリメラーゼ連鎖反応相の第2以後のサイクルで複写される。結果として、第2サイクル後に産生された1次伸長産物は、その5’末端に2次プライマー特異的部分、およびその3’末端にプライマー特異的部分の補体を有する。次は、第2ポリメラーゼ連鎖反応相である。この相では1つまたは複数の2次オリゴヌクレオチドプライマーセットが準備される。各セットは、第1の1次オリゴヌクレオチドプライマーの5’上流部分と同じ配列を含有する第1の2次オリゴヌクレオチドプライマー、および第1の2次プライマーに相補的な第1の1次オリゴヌクレオチドと同じ1次オリゴヌクレオチドプライマーセットに由来する第2の1次オリゴヌクレオチドプライマーの5’上流部分と同じ配列を含有する第2の2次オリゴヌクレオチドプライマーを有する。2次オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、特定の群において1次伸長産物のすべてを増幅するのに使用され得る。2次オリゴヌクレオチドプライマーを1次伸長産物およびポリメラーゼと混合して、2次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。2次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、2次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異部分が1次伸長産物上に存在する相補的配列にハイブリダイズし、元の標的配列にハイブリダイズしない。伸長処理によってハイブリダイズ2次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、1次伸長産物に相補的な2次伸長産物を形成する。本発明の態様における最後の相はリガーゼ検出反応相である。ここでは、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが準備され、各セットは、2次伸長産物特異的部分と検出可能レポーター標識を保持する第1オリゴヌクレオチドプローブ、および2次伸長産物特異的部分を保持する第2オリゴヌクレオチドプローブを有する。特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的2次伸長産物特異的部分に互いに隣接してハイブリダイズしたときに一緒に連結反応するのに適している。しかし、オリゴヌクレオチドプローブがサンプル中の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を妨害するミスマッチがある。特定セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物は、プローブまたは他の連結反応産物のいずれかと識別され得る。複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを2次伸長産物およびリガーゼと混合して、リガーゼ検出反応混合物とする。リガーゼ検出反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理およびハイブリダイゼーション処理を有する1以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは、隣接部位で塩基特異的に、もし存在すれば夫々の2次伸長産物にハイブリダイズする。結果として、隣接プローブは互いに連結して、一緒に結合している検出可能レポーター標識および2次伸長産物特異的部分を含有する連結産物配列を形成する。オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の相補的2次伸長産物以外のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るが、1以上のミスマッチの存在のために一緒に連結しないで、変性処理の際に個々に分離している。リガーゼ検出反応サイクルに続いて、連結反応産物配列のレポーター標識が検出されて、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の存在が示される。図1、2および3は2種の検出手法のいずれかを用いた本発明の1次PCR/2次PCR/LDRプロセスを表す流れ図である。1つの方法として、毛管電気泳動またはゲル電気泳動と蛍光定量の使用がある。他方、捕捉オリゴヌクレオチドアドレスのアレイ上の捕捉と蛍光定量によって検出が実施される。図1は生殖細胞系変異例えば、点変異の検出に関し、図2はバイ対立遺伝子多形性の検出であり、図3は癌関連変異の検出を示す。図1は生殖系点変異の検出を表す。第1工程において、DNAサンプル作成後、TaqすなわちThermusaquaticusポリメラーゼを用いた1次PCR増幅に、ホットスタート条件で、標的特異的部分と2次プライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチドプライマーと共に、多重エクソンをかける。1次PCR相の終了点で、Taqポリメラーゼは、100°Cで10分間加熱するか、または凍結/解凍工程により不活性化される。1次PCR増幅相の産物は、第2工程でTaqポリメラーゼを用いホットスタート条件で2次オリゴヌクレオチドプライマーと共に、2次PCR増幅にかける。2次PCR相の終了点で、Taqポリメラーゼは、100°Cで10分間加熱するか、または凍結/解凍工程により不活性化される。第3工程において、2次PCR相の産物は、対立遺伝子特異的部分と共通部分を有するLDRオリゴヌクレオチドプローブを含有する新鮮なLDR緩衝液に20倍に希釈する。第4工程は、LDR相であって、ホットスタート条件でTaqリガーゼを加えることにより始まる。LDRの際にオリゴヌクレオチドプローブはその隣接のオリゴヌクレオチドプローブに、接合部で完全な相補性を与える標的配列の存在においてのみ、連結する。産物は2種の相違するホーマットにおいて検出される。第1ホーマット5aでは、蛍光標識LDRプローブが相違する長さのポリAまたはヘキサエチレンオキシドテイルを含有する。このように各連結反応産物配列正常DNA上でハイブリダイズされた2プローブの連結反応の結果であるは、いくつかの連結反応産物配列がピークの段差を与えるように、少し相違する長さと運動性を有する。生殖細胞系変異は電気泳動濃度図上に新しいピークをつくることがある。他方、生殖細胞系変異連結反応産物配列が正常DNA連結反応産物配列と同じ運動性を有して泳動するが、相違する蛍光レポーターで識別されるようにLDRプローブは設計され得る。新しいピークのサイズはほぼ元のサンプルに存在する変異の量である。すなわち、ホモ接合正常は0、ヘテロ接合保持は50、そしてホモ接合変異は100である。第2ホーマット5bにおいて、各対立遺伝子特異的プローブは、例えばその5’末に24追加ヌクレオチド塩基を含有する。これらの配列はユニークアドレス可能配列であって、アドレス可能アレイ上でその相補的アドレス配列に特異的にハイブリダイズする。LDR反応において、各対立遺伝子特異的プローブは、対応する標的配列の存在において隣接の蛍光標識共通プローブに連結できる。野生型および変異の対立遺伝子に対応する連結反応産物配列は、アレイ上の隣接アドレスに捕捉される。未反応のプローブは洗浄して除く。黒点は野生型対立遺伝子についての100シグナルを表す。白点は変異対立遺伝子についての0シグナルを表す。灰色点は生殖細胞系変異の1つの位置、各対立遺伝子についての50シグナルを表す。図2は、バイ対立遺伝子多形性の検出を表す。第1工程において、Taqポリメラーゼを用いた1次PCR増幅に、ホットスタート条件で、標的特異的部分と2次プライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチドプライマーと共に、多重エクソンをかける。1次PCR増幅相の産物は、第2工程でTaqポリメラーゼを用いホットスタート条件で2次オリゴヌクレオチドプライマーと共に、2次PCR増幅にかける。2次PCR相の終了点で、Taqポリメラーゼは、100°Cで10分間加熱するか、または凍結/解凍工程により不活性化される。第3工程において2次PCR相の産物は対立遺伝子特異的部分と共通部分を有するLDRオリゴヌクレオチドプローブを含有する新鮮なLDR緩衝液に20倍に希釈する。第4工程は、LDR相であって、ホットスタート条件でTaqリガーゼを加えることにより始まる。LDRの際にオリゴヌクレオチドプローブはその隣接のオリゴヌクレオチドプローブに、接合部で完全な相補性を与える標的配列の存在においてのみ、連結する。第1ホーマット5aでは、蛍光標識LDRプローブが相違する長さのポリAまたはヘキサエチレンオキシドテイルを含有する。各連結反応産物は、いくつかの連結反応産物配列がピークの段差を与えるように、少し相違する長さと運動性を有する。他方、多形性対立遺伝子の連結反応産物配列が同じ位置で移動するが、相違する蛍光レポーターで識別されるようにLDRプローブは設計され得る。ピークのサイズはほぼ各対立遺伝子の量である。第2ホーマット5bにおいて、各対立遺伝子特異的プローブは、例えばその5’末に24の追加ヌクレオチド塩基を有するユニークアドレス可能配列を含有する。これらの配列は、捕捉オリゴヌクレオチドアレイ上でその相補的アドレス配列に特異的にハイブリダイズする。LDR反応において、各対立遺伝子特異的プローブは、対応する標的配列の存在において隣接の蛍光標識共通プローブに連結できる。各対立遺伝子に対応する連結反応産物配列は、アレイ上の隣接アドレスに捕捉される。未反応のプローブは洗浄して除く。黒点は両染色体が与えられた対立遺伝子を有すことを表す。白点はいずれの染色体もこの対立遺伝子を有さないことを表す。灰色点は1つの染色体が与えられた対立遺伝子を有することを表す。図3は、癌関連変異を表す。第1工程において、DNAサンプル作成後、Taqポリメラーゼを用いた1次PCR増幅に、ホットスタート条件で、標的特異的部分と2次プライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチドプライマーと共に、多重エクソンをかける。1次PCR増幅相の産物は、第2工程でTaqポリメラーゼを用いホットスタート条件で2次オリゴヌクレオチドプライマーと共に、2次PCR増幅にかける。2次PCR相の終了点で、Taqポリメラーゼは、100°Cで10分間加熱するか、または凍結/解凍工程により不活性化される。PCR産物の蛍光定量は第3工程において毛管またはゲル電気泳動により行うことができる。第4工程において、産物はマーカーDNAの1/100希釈フラグメントの各々につきでスパイクされる。このDNAは、癌サンプルにみられないが、適当なLDRプローブで容易に検出される変異を有することを除けば、野生型DNAに相同的である。第5工程において、2次PCR相産物中の混合DNA産物は、対立遺伝子特異的部分と共通部分を含有するLDRオリゴヌクレオチドプローブを含む新鮮なLDR緩衝液に20倍に希釈される。第6工程は、LDR相であって、ホットスタート条件でTaqリガーゼを加えることにより始まる。LDRの際に、接合部に完全な相補性を与える標的配列の存在においてのみ、オリゴヌクレオチドプローブがその隣接のオリゴヌクレオチドプローブに連結する。産物は上記と同じホーマットで検出される。第7a工程のホーマットにおいて、毛管またはゲル電気泳動により産物が分離され、そして蛍光シグナルが定量される。変異ピークのマーカーピークに対する割合は、元のサンプル中に存在する癌変異の概量を100で除して算出される。第7b工程のホーマットにおいて、アドレス可能アレイ上の相補的配列についての特異的ハイブリダイゼーションによって産物が検出される。マーカー点に対する変異点中の蛍光シグナルの割合は、元のサンプル中に存在する癌変異の概量を100で除して算出される。図4に示すように、興味ある2種のDNAフラグメントを本発明の1次PCR/2次PCR/LDRプロセスで処理する。最初に2重鎖DNA分子を変性して、鎖をほどく。これは80-105°Cに加熱することによりなされる。3-標的特異的部分影の部分と5’2次プライマー特異的部分黒い部分を有する1次PCRオリゴヌクレオチドプライマーを低濃度で加えて、典型的に50-85°Cで鎖にハイブリダイズせしめる。熱安定性ポリメラーゼ例えば、Taqaquanticusポリメラーゼも加え、温度を50-85°Cに調節して、プライマーがハイブリダイズする核酸の長さに沿ってプライマーを伸長する。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長相の後に、得た2重鎖分子を80-105°Cに加熱して、分子を変性し、鎖を分離する。これらのハイブリダイゼーション、伸長、変性工程は数回繰り返して、標的を適当なレベルにまで増幅する。2次PCR相において、1次PCR相産物を2次PCRオリゴヌクレオチドプライマーと混合して、典型的には50-85°Cで互いにハイブリダイズせしめる。2次オリゴヌクレオチドプライマーは1次オリゴヌクレオチドプライマーよりも常に高い濃度で使用する熱安定性ポリメラーゼも加え、温度を50-85°Cに調節して、プライマーがハイブリダイズする核酸の長さに沿ってプライマーを伸長する。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長相の後に、得た2重鎖分子を80-105°Cに加熱して、分子を変性し、鎖を分離する。これらのハイブリダイゼーション、伸長、変性工程は数回繰り返して、標的を適当なレベルにまで増幅する。2次PCR相が完了すると、図4に示すように、連結検出反応相が始まる。標的核酸変性後、もし存在すれば二重鎖DNA分子として、温度80-105°C、好ましくは94°Cで、標的ヌクレオチド配列の1本鎖のための連結検出反応オリゴヌクレオチドプローブがリガーゼと共に加えられる例えば、図4に示すように、Taqaquanticusポリガーゼのような熱安定性リガーゼ。オリゴヌクレオチドプローブは標的核酸分子とハイブリダイズし得て、典型的には45-85°C、好ましくは65°Cで連結する。連結部に完全な相補性があるとオリゴヌクレオチドは一緒に連結する。変わり得るヌクレオチドがTまたはAであると、標的ヌクレオチド配列におけるTの存在は、F1レポーター標識を有するオリゴヌクレオチドプローブを5’ポリAテイルAnを有する共通オリゴヌクレオチドプローブと連結せしめ、標的ヌクレオチド配列中のAの存在は、F2レポーター標識を有するオリゴヌクレオチドプローブをAnを有する共通のオリゴヌクレオチドプローブと連結せしめる。同様に、変わり得るヌクレオチドがAまたはGであると、標的ヌクレオチド配列におけるTの存在は、F3AAレポーター標識すなわち、5’ポリAスペーサーを形成する2追加塩基にカップルしたF3レポーター標識を有するオリゴヌクレオチドプローブを5’ポリAテイルAn4を有する共通オリゴヌクレオチドプローブと連結せしめ、標的ヌクレオチド配列中のCの存在は、F3レポーター標識を有するオリゴヌクレオチドプローブをAn4を有する共通のオリゴヌクレオチドプローブと連結せしめる。連結反応後に材料を変性にかけてハイブリダイズ鎖を分離する。ハイブリダイゼーション/連結反応および変性工程は1以上のサイクル例えば1-50サイクルで実施されて、標的シグナルが増幅される。両F3-標識オリゴヌクレオチドの等モル連結反応は個体がその座についてヘテロ接合型であることを示し、一方、F2標識オリゴヌクレオチドの連結反応は個体が他の座についてホモ接合型であることを示す。図4において、定量が毛管またはゲル電気泳動で実施されるとき、ポリAnおよびポリAn4テイルが用いられる。異なった長さのテイルによって、対応する相違の連結反応産物配列がゲルまたは毛管における異なる位置でバンドを形成する。異なる位置でのバンドの存在は、解析されるDNAにおける対応ヌクレオチド相違の同定を可能にする。連結反応産物配列が異なるレポーター標識の使用に基づいて識別できるけれども、異なるレポーター標識と異なる長さのテイルの組み合せは、より多数のヌクレオチド相違の識別を可能とする。これは多重検出プロセスに重要である。図1-3について述べたように、ゲルまたは毛管電気泳動に代わって、アドレス可能アレイ上での検出を実施できる。かかるアドレス可能アレイの使用には、レポーター標識すなわちテイルAnおよびAn4を含有しないLDRオリゴヌクレオチドプローブ上のポリAが相違するアドレス可能アレイ特異的オリゴヌクレオチド部分で置き換えられることを要する。上記でより完全に説明したように、固体支持物は捕捉オリゴヌクレオチドのアレイと共に準備され、そのいくつかは相違するアドレス可能アレイ特異的オリゴヌクレオチド部分に相補的である。相補的捕捉オリゴヌクレオチドプローブのこれらの部分のハイブリダイゼーションは対応するヌクレオチド相違の存在を示す。図5は、本発明のよる1次PCR/2次PCR/LDRプロセスについての模式図であり、興味ある2DNA分子における可能性ある塩基が識別される。1次および2次PCRプロセスは、図4で述べたのと実質的に同じように実施される。左手のDNA分子と併せた蛍光レポーター標識F1、F2、F3およびF3の出現は、夫々DNA分子におけるA、G、CおよびT対立遺伝子の存在を表す。図5に示すように、等量のF1およびF3レポーター標識は問題の個体がAおよびC対立遺伝子についてヘテロ接合型であることを表す。図5における右手のDNA分子の分析について、同じレポーター標識が異なる対立遺伝子の存在を表すのに用いられる。しかし、識別塩基を有する各オリゴヌクレオチドプローブ上で、異なる5’ポリAテイルが存在する。より特異的に2単位ポリAテイル、4単位ポリAテイル、6単位ポリAテイルおよび8単位ポリAテイルが、夫々DNA分子におけるT、C、GおよびA対立遺伝子に対応する。図5に示すように、A6およびA4テイルを有する等量のF1レポーター標識は、問題の個体がGおよびC対立遺伝子についてヘテロ接合型であることを表す。図6は、図5は、本発明のよる1次PCR/2次PCR/LDRプロセスについての模式図であり、興味ある2DNA分子における2近接部位で可能性ある塩基が識別される。1次および2次PCRプロセスは、図4で述べたのと実質的に同じように実施される。ここではLDRプローブは重複可能であり、接合部で完全な相補性が存在すると連結がなお可能である。これがLDRを他の方法と区別することであって、対立遺伝子特異的PCRなどでは、重複プライマーが互いに妨害し合う。図6において、識別オリゴヌクレオチドプローブは、そのプローブの3末に識別塩基を有するレポーター標識を含有する。ポリAテイルは共通オリゴヌクレオチドプローブの3’末上にある。左手のDNA分子において、レポーター標識F1およびF3を有する連結反応産物配列の等量の存在は、問題の個体が第1位置でAおよびC対立遺伝子についてヘテロ接合であることを示す。同様に、左手のDNA分子の第2位置において、レポーター標識F2、F3およびF4を有する連結反応産物配列の存在は、問題の個体がG、CおよびT対立遺伝子についてヘテロ接合であることを示す。右手のDNA分子にもどって、A6およびA4テイルを持つレポーター標識F1を有する連結反応産物配列の等量の存在は、問題の個体が第1位置でGおよびC対立遺伝子についてヘテロ接合であることを示す。右手のDNA分子の第2位置において、A8およびA2テイルを持つレポーター標識F1を有する連結反応産物配列の等量の存在は、問題の個体がAおよびT対立遺伝子についてヘテロ接合であることを示す。図7は、正常配列の過剰存在で低存在量の変異を検出するための本発明の1次PCR/2次PCR/LDRプロセスを表す模式図である。左手のDNA分子はK-ras遺伝子のコドン12、配列GGTでグリシンGlyをコードする。小さい比率の細胞がGATにおけるGからAへの変異を含有し、アスパラギン酸Aspをコードする。野生型すなわち正常配列についてのLDRプローブが反応から抜けている。正常LDRプローブGである識別塩基と共が挿入されると、このプローブは共通プローブに連結し、変異標的由来のいかなるシグナルにも打ち勝つ。代わりに、図7に示されるように、蛍光標識F1およびAn2テイルを有する連結反応産物配列の存在は変異をコードするアスパルギン酸の存在を表している。右手のDNA分子において、K-ras遺伝子のコドン61配列CAGがあり、グルタミンGlnをコードする。小さい比率の細胞がGAGにおけるCからGへの変異を含有し、グルタミン酸Gluをコードする。さらに、LDRオリゴヌクレオチドプローブが野生型に見られるCおよびA塩基を含まず、変異シグナルに打ち勝つことはない。このDNA分子について、蛍光標識F2An4テイルを有する連結反応産物配列の存在は変異をコードするグルタミン酸の存在を表す。II.LDR/PCRプロセス本発明の第2態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における1以上の単一塩基の変更、挿入、欠失および転座によって相違している1以上の複数配列を同定する方法に関する。この方法はリガーゼ検出反応相に続いてポリメラーゼ連鎖反応相を有する。この方法は、複数の配列相違を有する1以上の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のあるサンプルを準備することを含む。リガーゼ検出反応相において1以上のオリゴヌクレオチドプローブが準備される。各セットは、標的特異的部分と5’上流プライマー特異的部分を保持する第1オリゴヌクレオチドプローブ、および標的特異的部分と3’下流プライマー特異的部分を保持する第2オリゴヌクレオチドプローブを有する。特定セットにおける折後ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適している。しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミスマッチがある。サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とする。リガーゼ検出反応混合物は1以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる。これらのサイクルには変性処理とハイブリダイゼーション処理が含まれる。変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離される。ハイブリダイゼーション処理によって、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在しておればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ハイブリダイズされると、オリゴヌクレオチドプローブセットは互いに連結して、連結反応産物配列を形成する。この産物は、5’上流プライマー特異的部分、一緒に結合した標的特異的部分および3’下流プライマー特異的部分を含む。各セットの連結反応産物配列は連結検出反応混合物中のたの核酸と識別可能である。オリゴヌクレオチドプローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、1以上のミスマッチの存在によって連結せず、そして、次の変性処理の際に個々に分離している。ポリメラーゼ連鎖反応において、1または複数のオリゴヌクレオチドプローブが準備される。各セットは、連結反応産物配列の5’上流プライマー特異的部分に同じ配列を含有する上流プライマー、および連結反応産物配列の3’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを有している。うち、1つのプライマーは検出可能レポーター標識を有する。リガーゼ検出反応混合物を1または複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびポリメラーゼと混合すると、ポリメラーゼ連鎖反応混合物が形成する。ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。変性処理においてハイブリダイズ核酸配列が分離される。ハイブリダイゼーション処理によって、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイブリダイズする。伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、プライマーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成する。ポリメラーゼ連鎖反応相の第1サイクルにおいて、下流プライマーが連結反応産物配列の3’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成する。次のサイクルにおいて、上流プライマーが連結反応産物に相補的な伸長産物の5’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、下流プライマーが連結反応産物配列の3’下流部分にハイブリダイズする。このプロセスのポリメラーゼ連鎖反応相に続いて、レポーター標識が検出され、伸長産物が識別されて、サンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の存在が表される。図8は、制限エンドヌクレアーゼ消化の有無および毛管電気泳動検出を用いた本発明のLDR/PCRプロセスを表す流れ図である。第1工程において、DNAサンプルは、Taqリガーゼ、および標的特異的部分およびプライマー特異的部分を含有するオリゴヌクレオチドプローブと混合する。混合物はLDRプロセスにかけられて、連結標的特異的部分およびプライマー特異的部分を含有する連結反応産物配列を産生する。第2工程で、連結反応産物配列をポリメラーゼおよびプライマーと混合し、この混合物をPCRプロセスにかける。次の工程で連結反応産物配列が同じかまたは相違するサイズであるかの機能について測定する。連結反応産物配列が相違するサイズであると、第3a工程が選ばれてPCRからの伸長細胞が毛管電気泳動またはゲル電気泳動にかけられる。いずれも続いて蛍光定量がなされる。連結反応産物配列が同じサイズのときは第3b工程が用いられ、PCR相からの伸長産物は制限エンドヌクレアーゼ消化にかけられる。毛管電気泳動またはゲル電気泳動にかけられるユニークサイズの消化フラグメントが産生され、第4b工程による蛍光定量が行われる。第3a工程が選択されたときは、電気泳動の結果のカーブは、104、107および110に移行する3種の連結反応産物配列があり、ピーク域はそれぞれHer2遺伝子増幅、p53遺伝子のヘテロ接合の喪失およびコントロールSOD遺伝子を表す。第3bおよび4b工程による電気泳動曲線は、3種の連結反応産物配列制限フラグメントを58、70および76に有し、ピーク域はそれぞれHer2遺伝子増幅、p53遺伝子のヘテロ接合の喪失およびコントロールSOD遺伝子を表す。図8の別法として、図9は本発明のLDR/PCRプロセスを表し、第3工程で伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドアドレスのアレイ上に捕捉される。捕捉オリゴヌクレオチドプローブは連結反応接合部を通じてヌクレオチド配列に相補的であり得る。捕捉オリゴヌクレオチドのアレイ上に捕捉された遺伝子コピー数は既知のコントロールと比較して蛍光定量で測定される。図8において、アレイのこのような分析は遺伝子特異的アドレスにハイブリダイズしている連結反応産物配列を表し、蛍光の強度がHer-2遺伝子増幅、p53遺伝子へテロ接合の喪失およびコントロールSOD遺伝子をそれぞれ示す。図10は、遺伝子増幅および欠失の多重検出のためのLDR/PCRプロセスを表す模式図である。染色体17q由来のHer-2/neu、染色体17p由来のp53遺伝子および染色体21q由来のSOD遺伝子の比率が検出される。94°CでのDNAの変性に続いて、標的特異的部分とプライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチドプローブの対が標的核酸上で互いに隣接してアニールし、互いに連結するミスマッチの不存在で。このリガーゼ検出反応はTthリガーゼでもってハイブリダイゼーション/連結反応温度65°Cで実施され、この温度はオリゴヌクレオチドプローブについてのTm値75°Cより十分低い。次いで、連結反応産物配列は、Taqポリメラーゼとプライマー特異的部分に相補的な2つの共通プライマーうち1つは蛍光標識されているとを用いるPCRによって増幅される。サンプル中に最初に存在していた標的配列の比率は保持される。伸長産物は、サンプル中に存在の各標的配列についてのユニークサイズ蛍光標識フラグメントを放出するHaeIIIおよびHinp1Iで消化される。消化産物を分離し、373ADNAシークエンサーAppliedBiosystemsIncFosterCityCalifで分析する。ピークの高さおよび面積は最初の標的サンプルに存在する遺伝子の相対コピーに関する。図11は、対立遺伝子特異的LDR/PCRプロセスにおいて生じ得る問題を表す模式図である。PCR/LDRプロセスは非常に強力であるが、本発明の多重対立遺伝子特異的LDR/PCRプロセスが好ましくなる状況が存在する。LDRオリゴヌクレオチドプローブの1以上のセットを用い、各セットは、a標的特異的部分と5’上流プライマー特異的部分とを有する第1オリゴヌクレオチドプライマー、およびb標的特異的部分と3’下流プライマー特異的部分とを有する第2オリゴヌクレオチドプライマーを特徴とする。図11の第1工程に示すように、LDRオリゴヌクレオチドプローブは標的配列上で互いに隣接してアニールする。熱安定性リガーゼを用いるLDR反応黒点は、連結反応接合部に完全な相補性があれば、連結反応産物配列を形成する。第2工程において、連結反応産物配列はプライマーセットでPCR増幅される。この各セットは、a連結反応産物配列の5’上流プライマー特異的部分と同じ配列を含有する上流プライマー、およびbこの連結反応産物配列の3’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴とする。プライマーは第2工程に黒線として示される。1つのプライマーが蛍光標識されていると、様々な検出方法において検出され得る蛍光細胞を産生する。特異的であるべきLDR/PCRプロセスについて、PCR伸長産物は連結反応の不存在では形成されるべきでない。不都合にも、ポリメラーゼが第1LDRオリゴヌクレオチドプローブ正常標的から離れてを伸長して、標的配列の長さと5’末のプライマー特異的部分を含有する産物を形成する可能性がある。一方、ポリメラーゼは、下流プライマーを用いる下流LDRプローブのいくつかの相補的コピーをつくり得る。第2増幅サイクルにおいて、この下流LDRプローブ伸長産物は標的配列から離れた上流LDRプローブ伸長産物にアニールし、2つのプライマー特異的配列で両側から挟まれた標的領域を含有する配列を生み出す。この産物はLDR産物として増幅され、偽の正シグナルをもたらす。図12は、中間エクソヌクレアーゼ消化工程を用いて対立遺伝子特異的LDR/PCR問題の解決を表す模式図である。対立遺伝子特異的LDR/PCRは、バックグランド連結反応独立正しくない標的増幅を顕著に低下して、達成することができる。そのために、連結反応産物配列の情報内容を除去しないで、連結反応独立PCR増幅に要する1以上の成分をなくすことが必要である。1つの解決法は、第2工程においてエクソヌクレアーゼを用い、第1工程からの未反応LDRオリゴヌクレオチドプローブを消化することである。連結していない末端、例えば下流オリゴヌクレオチドプローブの3’末をブロックすることにより、1つのプローブが実質的に消化に対し抵抗性となり、他は感受性となる。全長連結反応産物配列の存在のみが上流プライマーの消化を防止する。ブロック群には、骨格としてチオホスフェート類および/または20-メチルリボース糖類がある。エクソヌクレアーゼにはExoI、ExoIIIおよびExoIVがあり、後者は両側のブロックを必要とする。両プローブをブロックする便利な方法は、1つの長いパドロックpadlockプローブ参照、MNilssonetalPadlockProbesCircularizingOligonucleotidesforLocalizedDNADetectionScience265208588出典明示により本明細書の一部とするを用いることであるが、必ずしも必要としない。エクソヌクレアーゼを用いる利点は、例えばExoI単鎖特異的とExoIII二重鎖特異的との併用は、両標的および1つのプローブを破壊し得ることであり、連結反応産物配列は実質的に未消化で止まっていることである。PCRに先立つエクソヌクレアーゼ処理により、第3および4工程において、各セットの1つまたは両オリゴヌクレオチドプローブは実質的に減少し、残存のオリゴヌクレオチドプローブと元の標的DNAこれもエクソヌクレオチド処理により実質的に減少とのハイブリダイゼーション、およびオリゴヌクレオチドプローブセットによるPCR増幅のための適当な基質である連結反応産物配列の形成が実質的に低下させられる。換言すれば連結反応独立標識伸長産物の形成は実質的に減少し、またはなくなる。図13は、サイズまたはDNAアレイのいずれかによる検出でエクソヌクレアーゼ消化を用いる対立遺伝子特異的LDR/PCRプロセスを表す流れ図である。この流れ図は、多重対立遺伝子特異的LDR/PCRプロセスに要する3反応を示す。第1工程において、LDRオリゴヌクレオチドプローブ下流プローブがその3’末でブロックされているが、TaqDNAリガーゼを用いて、正しい対立遺伝子標的の存在で連結される。第2工程で、未反応の上流プローブはエクソヌクレアーゼで消化され、同時に標的も消化される。最後に第3工程で、プライマーセットが用いられて、連結反応産物配列のプライマー特異的部分にハイブリダイズすることにより連結反応産物配列を増幅する。第4a工程において、与えられた特定のセットのLDRオリゴヌクレオチドプローブがユニーク長産物を産生し、オリゴヌクレオチドプローブまたは他の連結反応産物と識別される。LDR反応の後に産物は産物はサイズまたは電気泳動運動性により分別される。PCRプライマー上の標識が検出され、サイズで産物が識別される。第4b工程において、特定セットのLDRオリゴヌクレオチドプローブが、PCRプライマー配列での相違によってオリゴヌクレオチドプローブまたは他の連結反応産物配列と識別される。複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを使用することによりすべての産物が識別される。各セットは、a連結反応産物配列の5’上流プライマー特異的部分に同じ配列を含有する上流プライマーおよびb連結反応産物配列の3’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴とし、1つのプライマーは検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーはその5’末に連結したアドレス可能ヌクレオチド配列アドレス可能ヌクレオチド配列がPCR反応後単鎖を残すようにを含有する。後者は、ポリメラーゼが伸長し得ないPCRプライマー内の非天然塩基を用いて達成され、単鎖テイルを有するPCR産物を産生する。参照、NewtonetalTheProductionofPCRProductswith5SinglestrandedTailsUsingPrimersthatIncorporateNovelPhosphoramiditeIntermediatesNuclAcidsRes21115562出典明示により本明細書の一部とする。相違する特定の部位に固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有するDNAアレイを準備して捕捉オリゴヌクレオチドはプライマー上のアドレス可能ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する、PCR伸長産物がDNAアレイにハイブリダイズできる。最後に、特定部位でDNAアレイに固定されたアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉された伸長産物配列の標識が検出される。これはサンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す。図14は、サイズを基とする、またはDNAアレイを基とする検出によるエクソヌクレアーゼ消化を用いる対立遺伝子特異的LDR/PCRプロセスを表す流れ図である。この流れ図は、LDR反応の開始点で第2工程マーカー配列を加えること第1工程により相違する標的量特に低存在癌変異をいかに定量するかを示す。生化学的反応すなわちPCR第4工程に続いて、図13に示すように、マーカー産物に対する変異産物の相対量が毛管またはゲル電気泳動第5a工程またはアドレス可能アレイ上の捕捉第5b工程を用いて定量される。元のサンプル中の変異標的の量が決定される。図15は、変異または多形性の検出のためのエクソヌクレアーゼ消化第2工程を有する対立遺伝子特異的LDR/PCRプロセスを表す模式図である。変異および多形性は図12に記載のように識別される。本例において、第1工程で、標的特異的部分の3’末に識別対立遺伝子特異的塩基を有する上流LDRオリゴヌクレオチドプローブは、相違する5’上流プライマー特異的部分を有する。このように、相違するプライマーPCR増幅工程すなわち第3工程におけるが相違する蛍光群FamおよびTetで標識されて、産物の識別が可能となる第4工程。アレイに基づく検出法も用いられ、上流対立遺伝子特異的プローブが相違する5’上流プライマー特異的部分を有し、および相違するPCRプライマーがPCR反応後に単鎖を残す相違するアドレス可能ヌクレオチド配列を含有する。図16は、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチド反復多形性検出のためにエクソヌクレアーゼ消化を用いる第2工程対立遺伝子特異的LDR第1工程/PCR第3工程を表す模式図である。LDR/PCRの最も強力な使用の1つは、ヌクレオチド反復多形性の検出であって、対立遺伝子特異的PCRでは達成できず3’ヌクレオチドが常に同じであるから、またPCR産物サイズ変化の観察でも容易に達成できない増幅中にTaqポリメラーゼが滑ることによるものである。図16において、LDRオリゴヌクレオチドプローブはA9とA10モノヌクレオチド反復配列を熱安定性DNAリガーゼの特異性によって識別する。LDR産物のみが正しい長さの標的配列上で形成し、そしてこの標的の存在が識別される第4工程。図17は、低存在量のモノヌクレオチドまたはジヌクレオチド反復変異の検出のためにエクソヌクレアーゼ消化第2工程を用いる対立遺伝子特異的LDR/PCRプロセスを表す模式図である。モノヌクレオチド反復長変異は図12に記載のように識別される。図17において、LDRオリゴヌクレオチドプローブ第1工程はA8、A9変異およびA10正常モノヌクレオチド反復配列を熱安定性DNAリガーゼの特異性によって識別する。2つの上流LDRオリゴヌクレオチドプローブは、その標的特異的部分の3’末でモノヌクレオチド配列の長さが異なり、相違する5’上流プライマー特異的部分を有する。このように、相違するプライマーPCR増幅工程第3工程におけるは異なる蛍光群FamおよびTetで標識されて、産物の識別が可能となる第4工程。これには、サイズに代わり蛍光標識を基にしてモノヌクレオチド反復多形性が識別できるという顕著な利点がある。サイズによる識別はポリメラーゼ滑りのために偽の正反応をもたらしやすい。アレイに基づく検出法においては、上流対立遺伝子特異的プローブは相違する5’上流プライマー特異的部分を有し、相違するPCRプライマーはPCR反応後に単鎖を残す相違のアドレス可能ヌクレオチド配列を含有する。図18は、サイズを基とする、またはDNAアレイを基とする検出においてウラシルN-グリコシラーゼ選択を用いる対立遺伝子特異的LDR/PCRプロセスを表す流れ図である。流れ図は、多重対立遺伝子特異的LDR/PCRに要する4反応を示す。LDRオリゴヌクレオチドプローブセットうち、1または両方のプローブがデオキシチミジンの代わりにデオキシウラシルを含有するは、第1工程においてTaqDNAリガーゼを用いて正しい対立遺伝子標的の存在下に連結される。連結反応産物配列の相補的コピーが第2工程においてシクエナーゼでつくられる。シクエナーゼは修飾T7ポリメラーゼであって有用な容易に不活性化されるポリメラーゼすなわちEcoliポリメラーゼなどの中温性ポリメラーゼを有する。連結反応産物配列および未反応プローブの両方が第3工程においてウラシルN-グリコシラーゼで破壊される。ウラシルN-グリコシラーゼを用いる利点は、PCRの持ち越し防止についてその証明された能力である。最後にPCRプライマーセットが利用されて、第4工程においてシクエノーゼ伸長産物が増幅される。第5a工程において、特定セットのLDRオリゴヌクレオチドプローブがユニーク長産物を産生し、プローブまたは他の連結反応産物と識別される。PCR反応後、産物はサイズまたは電気泳動運動性により分離される。PCRプライマー上の標識が検出され、産物はサイズにより識別される。第5b工程において、特定セットのLDRオリゴヌクレオチドプローブがユニーク長産物を産生し、プローブまたは他の連結反応産物と識別される。複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを使用することにより、すべての産物が識別される。各セットは、a連結反応産物配列の5’上流プライマー特異的部分に同じ配列を含有する上流プライマーおよびb連結反応産物配列の3’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴とする。1つのプライマーは検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーはその5’末に連結したアドレス可能ヌクレオチド配列アドレス可能ヌクレオチド配列がPCR反応後単鎖を残すようにを含有する。相違する特定の部位に固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有するDNAアレイを準備して捕捉オリゴヌクレオチドはプライマー上のアドレス可能ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する、PCR伸長産物がDNAアレイにハイブリダイズできる。最後に、特定部位でDNAアレイに固定されたアドレス可能アレイ特異的部分を用いて、捕捉された伸長産物配列の標識が検出される。これはサンプル中の1以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す。図19は、サイズを基とする、またはDNAアレイを基とする検出によるウラシルN-グルコシラーゼ選択を用いる定量的対立遺伝子特異的LDR/PCRプロセスを表す流れ図である。この流れ図は、第2工程のLDR相開始点で第1工程におけるマーカー配列を加えることにより相違する標的特に低存在量の癌変異をいかに定量するかを示す。図18で記載したように、生化学反応すなわちシクエナーゼ処理およびFBaranyGeneticDiseaseDetectionandDNAAmplificationUsingClonedThermostableLigaseProcNatlAcadSciUSA88189193出典明示により本明細書の一部とするに一般的に記載されている。本発明において、リガーゼ検出反応で2セットの相補的オリゴヌクレオチドが用いられる。これはリガーゼ鎖反応として知られるもので上記3引用に記載されている。他方、リガーゼ検出反応には、オリゴヌクレオチド連結反応検出法として知られる単一サイクル法もある。参照、LandegrenetalALigaseMediatedGeneDetectionTechniqueScience241107780LandegrenetalDNADiagnosticsMolecularTechniquesandAutomationScience24222937およびLandegrenetalによる米国特許第4988617号出典明示により本発明の一部とする。リガーゼ検出反応相において、変性処理は温度80-105°Cでなされ、ハイブリダイゼーションは50-80°Cで行われる。各サイクルは変性処理と熱ハイブリダイゼーションを含み、合計で約1-5分間の長さである。典型的には、連結検出反応は変性およびハイブリダイゼーションが2-50サイクル反復される。リガーゼ検出反応相の全時間は1-250分である。オリゴヌクレオチドプローブセットまたはプライマーは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、修飾ホスフェート-糖-骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物であり得る。一つの変法において、オリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチド各々、ハイブリダイゼーションすなわち溶融温度すなわち、Tm66-70°Cを有する。これらのオリゴヌクレオチドは長さが20-28ヌクレオチドである。上記したように、オリゴヌクレオチドプローブセットまたはプライマーは検出に適したレポーター標識を有する。有用な標識には、発色団、蛍光分子、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、燐光性基、放射活性物質、化学ルミネセント分子および電気化学的検出分子がある。ポリメラーゼ連鎖反応法はHErlichetalRecentAdvancesinthePolymeraseChainReactionScience252164350MInnisetalPCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplicationsAcademicPressNewYorkおよびRSaikietalPrimerdirectedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymeraseScience23948791出典明示により本明細書の一部とするに完全に記載されている。本発明の特に重要な態様は、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を定量できる能力である。これは、内部すなわち、標準確立物質をサンプルと共に増幅および検出するときまたは外部すなわち、標準確立物質を増幅せずに、サンプルと共に検出するとき的であり得る基準を確立して、多くの方法で達成される。一つの定量法に従い、レポーター標識により発生したシグナルを検出する。このシグナルは、分析するサンプルから製造された連結反応産物を捕捉して得られる。このシグナルの強度は、サンプル中の連結反応産物配列の捕捉で生じるシグナルを既知量の標的ヌクレオチド配列とを比較して目盛曲線から得られる。結果として、分析サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量が測定できる。この技法は外部標準を用いる。本発明に関する別の定量法は内部標準を用いるものである。この方法では、サンプルに1以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を加える。さらに、複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを加えて、リガーゼ、前記のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびサンプルと共に混合物とする。マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、1マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第1オリゴヌクレオチドプローブ、および2マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第2オリゴヌクレオチドプローブおよび検出可能レポーター標識を含有する。特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列が互いに隣接してハイブリダイズするときに、連結反応するのに適している。しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列または添加したマーカー配列がハイブリダイズするときに、このような連結反応を妨害するミスマッチがある。連結反応産物配列の存在は、レポーター標識の検出によって同定される。サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量は、マーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から生じた連結反応産物配列の量と他の連結反応産物配列の量を比較することにより測定される。本発明の別の定量法は、複数の配列相違を有する2以上の複数の標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルの分析である。標的ヌクレオチド配列に対応する連結反応産物配列は、前記の方法により検出および識別される。サンプル中の標的ヌクレオチド配列の相対量は、発生した捕捉連結反応産物配列の相対量と比較することにより定量される。これはサンプル中の標的ヌクレオチド配列の相対レベルの定量測定を提供する。好ましい熱安定性リガーゼはThermusaquaticusから誘導される。この酵素は生体から単離される。MTakahashietalThermophillicDNALigaseJBiolChem2591004147出典明示により本明細書の一部とする。他方、これは組換え法でもつくられる。この単離方法およびThermusaquaticusリガーゼThermusthemopilusリガーゼも同様の産生は、BaranyetalによるWO9017239およびFBaranyetalCloningOverexpressionandNucleotideSequenceofaThermostableDNALigaseEncodingGeneGene109111出典明示により本明細書の一部とするに開示されている。これらの引用には、このリガーゼおよびコードDNAについての完全な配列情報が含まれている。他の適当なリガーゼにはEcoliリガーゼ、T4リガーゼおよびPycoccusリガーゼがある。連結検出反応混合物は担体DNAやサケ精子DNAを含み得る。連結検出反応でのハイブリダイゼーション段階は、好ましくは熱ハイブリダイゼーション処理であり、連結反応の接合部において識別されるヌクレオチドを基にしたヌクレオチド配列の間を識別する。標的ヌクレオチド配列間の相違は、例えば、単一核酸塩基の相違、核酸欠失、核酸挿入または再配置である。1以上の塩基を含むこのような配列相違もまた検出できる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブセットは、実質的に同じハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、実質的に同じ長さである。結果として、本発明のプロセスは、感染性疾患、遺伝的疾患および癌の検出を可能とする。環境監視、法医学および食物科学においても有用である。広範囲の感染性疾患が本発明プロセスで検出できる。典型的には、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌感染作用因子によって起きる。種々の感染作用因子の薬剤に対する耐性も本発明を用いて測定できる。本発明により検出できる細菌感染作用因子は、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、クレブシエラ、シュードモナス、リステリアモノサイトゲネス、マイコバクテリウムツベルクローシス、マイコバクテリウムアビウム-イントラセルラレ、エルシニア、フランシセラ、パスツレラ、ブルセラ、クロストリディア、ボルデテラペルツシス、バクテリア状物、スタフィロコッカスアウレウス、スタフィロコッカスニューモニア、B-溶血性連鎖球菌、コリネバクテリアレジオネラ、ミコプラズマ、ウレアプラズマ、クラミジア、ナイセリアゴノレア、ナイセリアメニンギティデス、ヘモフィラスインフルエンザ、エンテロコッカスファエカリス、プロテウスブルガリス、プロテウスミラビリス、ヘリコバクターピロリ、トレポネマパラジウム、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアレクレンティス、リケッチア病原菌、ノカルディアおよびアクチノマイセテスを含む。本発明で検出できる真菌感染作用因子は、クリプトコッカスネオフォルマンス、ブラストミセスデルマティティディス、ヒストプラスマカプスラタム、コシディオイデスイミティス、パラコシシオイデスブラシリエンシス、カンジダアルビカンス、アスペルギルスフミガウトゥス、フィマイセテス、スポロスリックスシェンキー、クロモマイコシスおよびマドゥロマイコシスを含む。本発明により検出できるウイルス感染作用因子は、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトTリンパ球好性ウイルス、肝炎ウイルス、エプスタイン-バールウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニャウイルス、アレナウイルス、ルベラウイルスおよびレオウイルスを含む。本発明により検出できる寄生虫作用因子は、プラスモジウムファルシパルム、プラスモジウムマラリア、プラスモジウムビバックス、プラスモジウムオバレ、オンコベルバボルブルス、レイシュマニア、トリパノソーマ種、シストソーマ種、エンタモエバヒストリティカ、クリプトスポリジウム、ギアルディア種、トリコモナス種、バラチジウムコリ、ウシェレリアバンクロフティ、トキソプラスマ種、エンテロビウスバーミクラリス、アスカリスルンブリコイデス、トリシュリストリシウラ、ドラクンクルスメディネシス、吸虫類、ジフィロボスリウムラトゥム、タエニア種、ニューモシスティスカリニおよびネカターアメリカニスを含む。本発明はまた感染作用因子による医薬耐性の検出にも有用である。例えば、バンコマイシン耐性エンテロコッカスファエシウム、メチシリン耐性スタフィロコッカスアウレウス、ペニシリン耐性ストレプトコッカスニューモニアエ、多剤耐性マイコバクテリウムツベルクローシスおよびAZT耐性ヒト免疫不全ウイルスを本発明によりまた同定できる。遺伝的疾患もまた本発明の方法により検出できる。これは染色体および遺伝的異常のための出生前スクリーニングまたは遺伝的疾患のための出生後スクリーニングにより行い得る。検出可能な遺伝的疾患の例は:21ヒドロキシラーゼ欠損症、嚢胞線維症、フラジレX症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ダウン症候群または他のトリソミー、心臓疾患、単一遺伝子疾患、HLAタイピング、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球性貧血、テイサックス病、サラセミア、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リピドーシス、肥満欠損、血友病、代謝の先天性異常および糖尿病を含む。本発明の方法により検出できる癌は、一般的にオンコジーン、腫瘍抑制遺伝子またはDNA増幅、複製、組換えまたは修復に関与する遺伝子を含む、これらの例は:BRCA1遺伝子、p53遺伝子、APC遺伝子、Her2Neu増幅、BcrAbl、K-ras遺伝子、ヒト乳頭腫ウイルスタイプ16および18を含む。下記の一般的なヒト癌における上記遺伝子の増幅、大きい欠失、点変異および小さい欠失/挿入を同定するために、本発明の様々な態様が用いられる。白血病、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱癌、黒色腫、肝臓癌、骨肉腫および他の骨癌、精巣および卵巣癌、頭部頚部腫瘍および脳新生物を含む。環境監視の領域で、本発明は、天然および工学的生態系ならびに都市廃棄水浄化システムおよび貯水槽中または生物改善を行っている汚染領域のような微小生態系における病原性および常在性微生物の検出、同定および追跡に使用できる。新陳代謝生体異物であり得る遺伝子を含むプラスミドの検出もまた可能であり、集団機能的研究における特異的標的微生物の追跡、または環境的および工学的植物における遺伝的に修飾された微生物の検出、同定または追跡をする。本発明は、また、軍務上の人的あるいは犯罪上の検査、父親検定および家族関係解析のためのヒト同定、HLA適合性タイプ分類、および汚染に関する血液、精液または移植臓器のスクリーニングを含む種々の領域または法医学領域で使用できる。食物および飼料産業において、本発明は広範囲の適用を有する。例えば、ビール、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パン等の製造のための酵母のような製造生物の同定および特徴付けのために使用できる。使用の他の領域は汚染に対する産物および処理の品質コントロールおよび保証に関する。他の使用は、育種目的の植物、球根および種子の特徴付け、植物特異的病原体の同定および種々の家畜感染の検出および同定を含む。望ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、連結反応の接合部における完全相補性のため、対応する標的ヌクレオチド配列と互いに隣接してハイブリダイズするとき、連結反応の接合部で互いに連結するのに適している。しかしながら、セット中のオリゴヌクレオチドプローブがサンプル内に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするとき、連結を妨害する連結反応の接合部の塩基ミスマッチがある。最も好ましくは、ミスマッチは連結反応の接合部の3塩基に隣接した塩基である。あるいは、ミスマッチは連結反応の接合部に隣接した塩基であり得る。上述のように、検出および定量は、毛管またはゲル電気泳動あるいはアレイ捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物で実施され得る。この目的のための毛管またはゲル電気泳動の使用は既知である。参照、例えば、GrossmanetalHighdensityMultiplexDetectionofNucleicAcidSequencesOligonucleotideLigationAssayandSequencecodedseparationNuclAcidsRes22452734出典明示により本明細書の一部とする。捕捉オリゴヌクレオチドアレイを有する固体支持物の使用は、米国特許出願第60011359出典明示により本明細書の一部とするに完全に開示されている。このようなアレイを使用するときには、上記のPCR相およびLDR相において用いられるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブはアドレス可能アレイ特異的部分を有する。LDR相またはPCR相が完了した後、その産物についてのアドレス可能アレイ特異的部分は、単鎖を残し、捕捉相の際に捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。CNewtonetalTheProductionofPCRProductsWith5SingleStrandedTailsUsingPrimersThatIncorporateNovelPhosphoramiditeIntermediatesNuclAcidsRes21115562出典明示により本明細書の一部とする。本方法の捕捉相において、混合物は固体支持物と温度45-90°Cおよび60分間までの時間で接触する。ハイブリダイゼーションはカチオン、量排除またはカオトロピック剤を加えることにより促進される。アレイが何10から100アドレスよりなるとき、正しい連結反応産物配列が適切なアドレスにハイブリダイズする機会を持つことが重要である。これは、用いた高温でのオリゴヌクレオチドの熱運動、アレイ表面に接触する液体の機械的運動または電場でのアレイを通るオリゴヌクレオチドの運動により達成される。ハイブリダイゼーション後、アレイを低ストリジェンシー緩衝液および高ストリジェンシー緩衝液で順次洗う。安定な状態でハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドおよびアドレス可能ヌクレオチド配列を選択することが重要である。それには、捕捉オリゴヌクレオチドがアドレス可能アレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりも低い温度で、オリゴヌクレオチドセットが標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチドセットと捕捉オリゴヌクレオチドが立体配座することが必要である。このようにオリゴヌクレオチドが設計されていないと、標的にハイブリダイズする同じオリゴヌクレオチドセットからの隣接未反応オリゴヌクレオチドの捕捉によって、偽の正シグナルが起きる。捕捉オリゴヌクレオチドには、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、ペプチドヌクレオチドアナログ、修飾ペプチドヌクレオチドアナログ、修飾ホスフェート-糖-骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物がある。アレイを使用するとき、本方法の検出相は、LDRまたはPCR産物が生じているかを走査および同定し、かかる産物の存在を試験サンプル中の標的ヌクレオチド配列の存在不存在と相関せしめることを含む。走査は、走査電子顕微鏡、共焦顕微鏡、電子結合装置、走査透過電子顕微鏡、赤外線顕微鏡、原子力顕微鏡、電気的コンダクタンスおよび蛍光および燐光造影により行うことができる。相関処理はコンピューターで行う。LDRPCRプロセス実施例1―ゲノムDNAの調製ゲノムDNAを男女2人の健常者ボランティアの血液から標準技術に従って調製した。簡単に説明すると、EDTAを含有する集血管で約12mlの血液を採取した。そのサンプル血を4容量の溶解緩衝液に混合して赤血球を溶解した。10分間氷上でときどき攪拌した後、懸濁物を遠心分離し上澄み液をデカントした。白血球ペレットを20mlの溶解緩衝液に再懸濁させ、上記のプロセスを繰り返した。その後、各ペレットを15mlの消化緩衝液に懸濁し、それに3mgのプロテイナーゼKを加えた。細胞を37°Cで5時間消化した。消化産物を等量のフェノールで2度抽出し、それから等量の1:1フェノール:クロロホルム混合液で1度抽出し、最後に等量のクロロホルムで抽出した。抽出をするごとに混合液を遠心分離し、次の抽出に使用するために水相を除去した。最後の抽出の後に、水相を除去してから110量の3M酢酸ナトリウム、pH65を加えた。次いで2倍量の氷温100EtOHをそれぞれの溶液に加えてゲノムDNAを沈澱させ、溶液からガラスピペットにスプールした。そのDNA沈澱物を075ml量の70EtOH中で2度洗った。つまり、2度とも手短かに遠心分離して上澄み液を除去できるようにした。2度目に上澄み液を除去した後、残存するEtOHを蒸発させてDNAを05mlのTE、20μlの水性MEを含む水、および400UのTagI制限エンドヌクレアーゼと混合した。消化物を鉱油で覆い、65°Cで1時間インキュベートした。12μlの500mMEDTAを加え、標本を85°Cで10分間加熱して、反応を停止した。DNAの完全な消化を1アガロースゲル上の電気泳動アリコートでチェックした。実施例2-LDRプローブおよびPCRプライマーのためのオリゴヌクレオチド調製すべてのオリゴヌクレオチドは394ADNAシンセサイザーで合成した。6-FAM標識のオリゴヌクレオチドは、合成サイクルに製造業者の指示する修飾AppliedBiosystemsInc1994を使用して、合成し、55°Cで4時間経過して脱保護した。LDRオリゴヌクレオチドは、55°Cで一晩脱保護した後、エタノール沈澱で精製した。PCR増幅に使用するオリゴヌクレオチドのプライマー特異的部分は10Aアクリルアミド7M尿素ゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。オリゴヌクレオチドは電気泳動の後に照明スクリーン上で紫外線遮蔽法で視覚化し、ゲルAppliedBiosystemsInc1192から削除した。次いでそれらオリゴヌクレオチドはTNE緩衝液の中で64°Cで一晩溶離し、業者の指示に従ってSepPakカートリッジMilliporeCorpMilfordMAを使用して溶解液から回収した。オリゴヌクレオチドを100μlTE中で再懸濁した。それらの元からのLDRプローブ溶液の典型的な濃度は、下記の公式で定義されるように、およそ1μgμlすなわち約74pmμlである。濃度X106長さX325pmμlLDRプローブの濃度を表1に示す。リガーゼ検出反応のオリゴヌクレオチドプローブに相補的なオリゴヌクレオチドの濃度は他と比較して高かった。上記の公式で算出すると、ZipALg1Fは375μgμl、ZipBLg2Rは201μgμl、すなわち、それぞれ524pmμlおよび281pmμlであった。LDR相のために前もって必要な下流LDRオリゴヌクレオチドプローブをT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。200pmに等しい5下流オリゴヌクレオチドのアリコート表1参照を10μlの10Xキナーゼ緩衝液500mMTrisHCl、pH80、100mMMgCl、10μlの10mMATP、20UT4キナーゼ、および十分な水MEと混合して、最終容量を100μlとした。リン酸化を37°Cで30分間実施し、次いで10分間85°CのインキュベーションによってT4酵素を不活性化した。その結果のキナーゼ化LDRプローブ溶液濃度はプローブごとに2pmμlすなわち2000fmμlであった。キナーゼの反応は次のように要約される。2μl=20単位T4キナーゼ37°Cで30分間ヒートキルキナーゼ、85°Cで10分間最終濃度=2pmμl2000fmμlLDRおよびPCRオリゴヌクレオチド溶液を実験に適した濃度に調節した。キナーゼLDRプローブ溶液を水で4倍に希釈して、500fmμlの濃度を得た。200pmに等しい容量のプローブを十分な水と合わせて上流LDRプローブ溶液をつくり、最終濃度400μlとなるようにした。これによって上流LDRプローブの各溶液は500fmμlとなった。キナーゼおよび非キナーゼLDRのアリコートを次に行う実験に使用するために冷却した。95μlのZipALg1Fおよび178μlのZipBLg2Rと十分な水とを混合して、元の溶液からPCRプライマーの標準溶液10pmμlをつくり、総容量500μlとした。これらの溶液をLDRPCRプロセスにおいて使用するために冷却した。非キナーゼプローブを次の方法で製造した。最終濃度05pmμl500fmμl図24は、LDRPCRプロセスにおける遺伝子増幅および欠失を定量するためのLDRオリゴヌクレオチドプローブの設計図である。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、p53腫瘍抑制遺伝子の中のエクソン8、int2のエクソン3、HER2neu中の内在エクソン中のエクソン3、G6PD中のエクソン6などを確認できるように設計されている。それぞれの対をなすLDRオリゴヌクレオチドプローブは次のような特徴をもっている:左手のヌクレオチドプローブは5’から3’までの18塩基配列を含み、これは蛍光標識の2次オリゴヌクレオチドプライマー、アジャストメント配列および75°CのTmを有する22から28までの塩基の標識特異的配列模様棒と同一である。ii右手のオリゴヌクレオチドプローブは、75°CのTmを有する5’から3’までの2025塩基の標的特異的配列、標的特異的配列内でわずかにずれた位置を占める一つのHaeIIIまたはHinPlI制限部位およびアジャストメント配列白棒を含有する。この2つのオリゴヌクレオチドプローブはこのように設計されているので、それらの合わせた長さは正確に96塩基で50GC塩基および46AT塩基を有する。ユニーク制限部位の位置は少なくとも2つの塩基の差で他と異なる産物を生じる。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブセットは、選択されたエクソン特異的領域を有し、C↓Cの接合配列を連結する。この接合配列はプロリン残基か、トリプトファン残基に相補的な配列かのいずれかに対応する。これらの配列は、連結反応速度の相違および連結反応接合部における多形性の機会を最少にするように選択される。LDRプローブ配列PCRプライマー:下線をほどこした配列は、LDRプローブとZipALg1FまたはZipBLg2Rとの補体の間で共通である。実施例3-緩衝液および試薬A.LDR緩衝液および試薬:次のLDR緩衝液および試薬を選択した。10XSTリガーゼ緩衝液これはまたTrispH76でもって試験した。10XTTリガーゼ緩衝液02MTrispH76、05MKCL、01MMgCl2、5mMEDTANADDTT各LDRプライマー混合液の110の濃度を含むLDRプライマー溶液1μlにつき各LDRプライマー50fmTthDNAリガーゼ625UμlBPCR緩衝液および試薬:次のPCR緩衝液および試薬を選択した。10XStoffel緩衝液01MKCl、01MTrisHClpH83、PerkinElemerdNTP溶液。この溶液をdHOH中で5倍に希釈して、各dNTP5mMの最終濃度にした。ZipALg1FZipBLg2R実施例4LDRおよびPCRプロセス各DNAについて、4つのLDR/PCRプロセスを実施して、22、24、26、30サイクルに増幅したPCR増幅反応管で試験し1つの反応が指数増殖期において停止するかどうかを確認した。各LDR反応20μlは熱循環であり、次いでLDRプローブのプライマー特異的部分に相補的な部分を有するプライマーを含むPCR混合物30μlを各標本に加えて指数増幅した。反応管のあいだの差異を最小にするために、LDRおよびPCR試薬の原混合液を作成した。LDR試薬の原混合液は、すべての反応管に使用するに充分な量を作成した。1つの反応に対する混合比率および量は、次のとおりである。各反応管の標識DNAおよびLDRプローブの混合度は次の比率で作成した。各反応に際して、試薬10μlを薄壁PCR管に入れ、急速に10μlのLDR試薬液と混合し、鉱油で覆い、PerkinElmer9600熱循環器に入れた。LDRは96°Cで2分間保持することから始め、次の10サイクルの94°C30秒間および65°C4分間でDNAを変性した。各反応管に使用するPCR試薬混合液はつぎの比率で作成した。LDR反応の完結でそれぞれの管を94°Cで維持し、一方で30mlのPCR試混合液をそれらの管に加えた。PCR増幅を94°Cで15秒、次いで60°Cで50秒間の熱循環により実施した。それぞれ22、24、26、30サイクルで、それら4つの各DNA標本の同一反応管の1つを取りだしドライアイスおよびETOHのスラリー中でクエンチした。実施例5-アガロースゲルによる検定26および30サイクル反応標本10マイクロリッターアリコートを2アガロースゲル上で検定した。臭化エチジウムによる染色で予想したサイズ104bpのバンドが現れた。実施例6-産物の消化、希釈剤の調製、および遺伝子スキャナーにおける装填遺伝子特異的LDR/PCR産物を分離するために、10μlアリコートの22、24、26サイクル反応物を各5UのHaeIIIおよびHinP1I制限酵素、2μlの10X制限酵素緩衝液No2NewEnglandBioLabs製、および8μlのdHOHを含有する10μlの溶液を加えて消化した。消化物を37°Cで1時間インキュベートし、次いで1μlの05MEDTAを加えて消化を停止した。制限消化物は元のLDT/PCR産物の12希釈で得た。5μlの各制限消化物を20μlのTE緩衝液に加えて各サンプルの1/10希釈液調製した。ABI373ADNAシーケンサーにサンプルを装填する前に、2のブルーデキストランおよび非イオン化ホルムアミドを含む50mMEDTAと15の混合液を作成した。5μlのEDTAブルーデキストラン溶液に、5μlの消化LDT/PCR産物の希釈液および1μlのGENESCAN1000ROXマーカーを加えた。これらの溶液を85°Cまで10分間加熱し、素早く氷で冷却した後に55μlを変性ゲルに装填した。サンプルを可視距離12cm、厚味04mmの10ポリアクリルアミド7M尿素ゲル上で、AppliedBiosystems373ADNAシーケンサーの中で分析した。ゲルマトリックスを12xTBEおよび、06×TBEを含む電気泳動チェンバー緩衝液とで処理した。ゲルを電極逆方向性ゲルの頂上にあるサンプルウエルを有するチェンバーの陽極でもって、サンプル装填に先立って1600ボルトで30分間試運転した。装填の後、遺伝子特異的LDR/PCR産物を1200ボルトで電気泳動し、ABI762DataCollectionSoftware、V11を使用して第一次のデータを得た。ABI672GeneScanAnalysisSoftware、V122を使用して、結果のデータを電気泳動濃度図で表示し、ピーク値とピーク域を計算した。健常女性において、ErbB2ピーク値は低く、p53ピーク値は他の3つのピーク値よりわずかに低い。図25ADを参照されたい。いくつもの実験において、ErbB2ピーク値は常に低く、G6PD、Int2、p53およびSODなどのピーク域はいくぶん異なるが、実験でサンプルを取り替えても、5つのピーク値すべてが同じ相対的なプロフィルを示す。男性のDNAを女性のと比較してみると、G6PDピーク値が他のピーク値のおよそ半分の範囲であり、男性の1個のX染色体と一致し、一方、その他のピーク値は基本的に同じであった。NM10乳癌細胞ラインについてのErB2ピークはわずかに上昇しており、これら細胞ラインにおける既知のErbB2遺伝子の増幅を反映して、細胞ラインSKBR3におけるErB2ピークは健常女性のコントロール値より幾倍か大きい。加えて、NM10細胞ラインはp53のLOHを経たようであり、一方、SKBR3細胞ラインは、G6PDおよびp53のLOHを経たようである。SKBR3細胞ラインにおける細胞のいくつかは、p53遺伝子の両方の複製を喪失しているようである。ErbB2プライマーを欠いた状態でこれらの増幅の繰り返しを行い、これらの追加遺伝子欠失下記参照の存在を確認した。これらの結果は、各ピーク値におけるピーク域を当該実験についての標準値の各ピークSODピーク域に対する割合と比較することで定量化できる。ピーク域の生データおよび割合は下記に表示する。各割合はそれぞれの遺伝子によって相異するが、これは各遺伝子に対するLDRPCRの効率の差異によるG6PDSODの割合を除けば、それぞれ割合の値は男女間で概して同じである。女性のG6PD値は男性のおよそ2倍であり、それぞれX染色体が女性に2つ、男性に1つ存在することを正確に反映している。健常者DNAと癌細胞ラインとのピーク域の割合を比較することにより、ErbB2増幅を定量できる。これらの割合から、健常男女は17q、17p、11qの染色体に同じ数の遺伝子を持つが、女性は2倍のG6PD遺伝子すなわちX染色体をもつと結論できる。さらにこれに加えて、細胞ラインNM10はわずかなErbB2遺伝子の増幅を示したが、一方で、細胞ラインSKBR3はErbA2遺伝子、G6PDおよびp53でのLOHの顕著な増幅を示した。追加的遺伝子増幅および欠失を確認するために、大増幅の原因となるプライマー対をLDRPCR反応から除去される下記参照。健常女性において、ErbB2ピーク値は残りの4つのピーク値より低い。いくつかの実験において、G6PD、Int2、p53、SOD等のピーク値は幾分の差異はあるが、サンプルを変えても同じ相対的プロフィルを示す。図26A-Cを参照されたい。ErbB2ピーク値は常に低く、理由はわからないがG6PDおよびSODピーク値においてわずかな特性曲線の肩が観察される。両方の細胞ラインサンプルにおけるErbB2のピーク値は、健常女性コントロール値より幾倍か大きく、それら2つの細胞ラインの既知のErbB2遺伝子増幅を反映している。さらに、ZR7530ラインはp53のLOHを示すようであり、一方、SKGT2細胞ラインはInt2領域のわずかな増幅を持つようである。ErbB2プライマーの不存在でLDRPCRの実験を繰り返すことにより、これらの結果が高レベルのErbB2増幅の産物ではないことが判明した。図27A-Cを参照されたい。LDRPCRフォーマットを使用した多重対立遺伝子の増幅および欠失について示した。図26A-Cおよび27A-Cを参照されたい。繰り返すが、これらの結果は、各ピーク値におけるピーク域をその実験について標準値の各ピークSODピーク域に対する割合と比較することによって定量できる。ピーク域の生データおよび割合を次に示す。4つのプライマーセットと5つのプライマーセットの実験間で、比率は見事に一致している。唯一の例外はSKGT2細胞ラインに対するG6PDピーク値で、この場合は、ErbB2に対する大きなピーク値がG6PDピーク値に追加されているようである。ErbB2およびInt2の増幅量をp53の欠失と同様に、正常DNAと癌細胞ラインとのピーク域割合を表8に示すように比較することで定量できる。それに加えて、4つのセットのプライマー使用からの割合を5セットのプライマーと比較して、本技術の内在的一貫性を確かめることができる。表8における上半分の数値は、4つまたは5つのプライマーを使用して、LDRPCR技術が内在的に一貫しているならば、すべて10に近くなるはずである。すべての数値が10に非常に近くなっている。繰り返すが、SKGT2に対するG6PDの数値は、すでに述べた理由で少し低い。表8における下半分の数値は、ErbB2増幅の程度を示す。数字は4プライマーおよび5プライマー増幅についてかなり一致している。ただし、上記のとおりSKGT2-G6PDの場合は例外である。ZR7530細胞ラインはp53に対する明確なLOHを示し、一方で、SKGT2細胞ラインはInt-2領域および存在する両p53遺伝子の増幅を示す。一次PCR二次PCRLDRプロセス実施例7-オリゴヌクレオチド合成法オリゴヌクレオチドを標準ホスホラミジト化学によってExpediteDNAシンセサイザーPerspectiveBiosystemsFraminghamMAの上に集めた。6-FAM、TET、HEXによる5’-末標識のオリゴヌクレオチドを適切なダイホスホルアミジドPerkinElmerAppliedBiosystemsを使用して合成し、製造業者のプロトコルに従って、オリゴヌクレオチド精製カートリッジPerkinElmerAppliedBiosystemsで精製した。すべてのオリゴヌクレオチドを、mPAGE-3カラムJWScientificFolsomCAを使用してAppliedBiosystems270-HTの毛管電気泳動器で精製度をチェックした。精製度95以上のオリゴヌクレオチドだけを実験に使用した。オリゴヌクレオチドを250mlTE中に再懸濁した。典型的濃度は未精製貯蔵溶液で300~500mMであり、OPCについて100-200mMである。PCRおよびLDRについては、オリゴヌクレオチドを希釈して、10mMまたは5mMを使用溶液とした。実施例8-LDRオリゴヌクレオチドのリン酸化12LDR共通オリゴヌクレオチドを5’末で蛍光標識オリゴヌクレオチドとに連結反応できるようにリン酸化した。そのオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。表9LDRオリゴヌクレオチドの配列対立遺伝子オリゴヌクレオチドはFAM、TETまたはHEXのいずれかで5’末が標識されている。全共通オリゴヌクレオチドは5’末でリン酸化される。下線は標的配列に相補的でないテイルを表す。LDRプライマーは2方法により設計された:i対立遺伝子プライマーは同じ長さであるが、FAMまたはTET標識のいずれかを含有する、対立遺伝子プライマーは両者ともにHEXで標識されるが、2塩基の長さで相違する。このリン酸化は、製造業者の指示に従うPhosphateONでの合成工程の間か、あるいはT4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して合成後かのいずれかで達成した。後者の場合には共通オリゴマーを50μlのキナーゼ緩衝液50mMTrisHCl、10mMMgCl2、1mMATPで希釈し、最終濃度を1mMとした。10単位のT4キナーゼを加え、37°Cで30分間培養した。T4キナーゼを95°Cで10分間加熱して不活性化した。キナーゼ反応を次のように実施した。37°Cで30分間95°Cで10分間最終濃度=10mM実施例9-多重PCRの増幅12の遺伝子領域を同時PCR増幅のために選んだ。これは下記の表10に示すHumanGenomeDatabaseから購入できる資料に基づいている。部位番号は、それぞれの遺伝子内に位置する特異的単鎖点変異である。すべての表記した変異はセンス鎖により定義する。遺伝子銀行番号は内の番号で示す。表10の参考文献2M.ArmstrongetalAPolymorphicCfoISiteInExon6oftheHumanCytochromeP450CYPD6GeneDetectedbythePolymeraseChainReactionHumanGenetics9161617whichisherebyincorporatedbyreference3SCBocketalAntithrombinIIIUtahProline407toLeucineMutationinaHighlyConservedRegionNeartheInhibitorReactiveSiteBiochemistry283628whichisherebyincorporatedbyreference4GDewaldetalPolymorphismofHumanComplementComponentC6AnAminoAcidSubstitutionWithintheSecondThrombospondinRepeatDifferentiatesBetweentheTwoCommonAllotypesC6AandC6BBiochemBiophysResCommun19445864whichisherebyincorporatedbyreference5PAVeldenetalAminoAcidDimorphisminIL1AisDetectablebyPCRAmplificationHumMolGenet21753whichisherebyincorporatedbyreference6RMCawthonetalIdentificationandCharacterizationofTranscriptsFromTheneurofibromatosis1RegionTheSequenceandGenomicStructureofEV12andMappingofOtherTranscriptsGenomics755565whichisherebyincorporatedbyreference7CCBrooksetalAssociationoftheWidespreadA149PHereditaryFructoseIntoleranceMutationWithNewlyIdentifiedSequencePolymprphismsintheAldolaseBGeneAmJHumanGenetics5283540whichisherebyincorporatedbyreference8WPolleretalSequencePolymorphismintheHumanAlpha2MacroglobulinGeneNucleicAcidRes19198whichisherebyincorporatedbyreference9TGloudemansAnAvaIIRestrictionFragmentLengthPolymorphismintheInsulinLikeGrowthFactorIIGeneandtheOccurrenceofSmoothMuscleTumorsCancerRes53575458whichisherebyincorporatedbyreference10CMDiepstratenetalACCACCGNeutralDimorphismintheCodonforPro626oftheHumanProteinSGenePaNucleicAcidsRes195091whichisherebyincorporatedbyreference11MReinaetalSSCPPolymorphismintheHumanHepaticTriglycerideLipaseGeneHumMolGenet1453whichisherebyincorporatedbyreference12SMatuuraetalInvestigationofthePolymorphicAvaIISitebyaPCRbasedAssayattheHumanCD18GeneLocusHumanGenetics93721whichisherebyincorporatedbyreference13LWarnichetalDetectionofaFrequentPolymorphisminExon10oftheLowDensityLipoproteinReceptorGeneHumanGenetics89362whichisherebyincorporatedbyreferenceそれぞれの領域はよく特徴が出ており、2つの公知の対立遺伝子だけが単塩基変異として表れている。PCR増幅は全血から製造業者の掲示に従ってパージーンDNA単離キットで分離したゲノムDNAを使用して実施した。25μlのPCR緩衝液、10-100ngのゲノム標識DNA、バイブリッドPCRプライマー対1~12各プライマー2pmol、13単位のAmpliTaqDNAポリメラーゼStoffelフラグメント等を薄肉MicroAmp反応管AppliedBiosystemsに入れた。それぞれのハイブリッドプライマーは、遺伝子特異的3’領域および5’領域から成り、1ないし2セットのユニバーサルすなわち、プライマー特異的部分のプライマー図4参照。F1Tet、F2Fam、F3Hetと対応する。これらのプライマーについては表11に示す。表111次PCRプライマー配列遺伝子座1,3,5,7,10,12における順方向および逆方向ハイブリッドプライマーはユニバーサルプライマーALg1およびBLg2のそれぞれと同一の5’末端領域を含んでいた。座2、4、6、8、9および11についての順逆プライマーはそれぞれ、ユニバーサルプライマーCLg3およびDLg4に同じ5’末端領域を含有していた。PCR相において、低密度のハイブリッドプライマーを使用する根本理由は、反応過程中にハイブリッドプライマーを空にするためである。これは、理論的には低増幅効率の産物が高増幅効率の産物に追いつくことが可能であることを示す。増幅は、96°Cで15秒間の1サイクルで変性させる熱循環と、それに次いで94°Cで15秒間の15サイクルで変性させ、65°Cで60秒間アニールして伸張することで達成した。高濃度の2対のユニバーサルプライマー各プライマーが25pmol;表2参照と、それと同容量のAmplitaqDNAポリメラーゼStoffelフラグメントの13単位をMicroamp反応管に加え、別の25サイクルに対してアニール温度を55°Cに下げて熱循環を実行した。上流ユニバーサルプライマーALg1およびCLg3をそれぞれ6-FAMおよびTETで蛍光標識した。すべての熱循環をGeneAmpPCRSystem9600熱循環器AppliedBiosystemsで達成した。一次PCRプロセスを次の條件で実行した。一次PCR循環條件は次の通り:96°C1594°C15、65°C1’x1565°CHold二次PCRプロセスを次の條件で実行した。二次PCR循環條件は次の通り:94°C15、55°C1’×254°CHoldPCR産物をAplliedBisystems373DNAシーケンサーで分離した。3mlアリコートのPCRサンプルを蛍光標識Genescan-2500TAMRAサイズスタンダードを含む3mlのホルムアミドと混合した。50mlGenescan-2500サイズスタンダードTAMRを450mlのホルムアミドに加えることによって、ホルムアミドのスタンダード溶液を調製した。サンプルを95°Cで2分間加熱し、氷中で急速に冷却し、Genescanのバージョン12ソフトウェアでAppliedBiosystems373DNAシーケンサー中の変性化8ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動させた。蛍光標識産物のサイズをGenescan分析ソフトウェアによって、局所サザン法を使って自動的に計算した。電気泳動濃度図で12の産物がはっきりと判明した、を含む20μlのLDR混合液で希釈した。各LDRオリゴヌクレオチドプローブセットは、2つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよび1つの共通ヌクレオチドを含む。LDRオリゴヌクレオチドプローブセット1,2,3,4,5,6,7,8,9における識別可能な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの各一対は、サイズが等しく一方のオリゴヌクレオチドは6FAM標識であり、他のオリゴヌクレオチドはTET標識であった。LDRオリゴヌクレオチドプローブセット5,10,11,12に対して、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの各一対は、2つの塩基大きい方のオリゴヌクレオチドは標的配列に相補的でない5’テイルを有するで相異し、両方のオリゴヌクレオチドはHEX標識である。熱循環を実施して95°C2分間1サイクルで変性し、次いで95°C30秒間20サイクルで変性し、65°C4分間で連結反応した。LDRプロセスを次のとおり実行した。リガーゼのストック:05μlの625uml32μl10X緩衝液275μlH2OLDRサイクリングの條件は次のとおり:94°C2’94°C3065°C×204°CHold3μlアリコートのLDRサンプルを3μlの標準サイズAppliedBiosystems蛍光標識Genescan-2500TAMRAと混合せしめた。サンプルを95°Cで2分間加熱し、氷中で急速冷却し、Genescanの12バージョンソフトウエアでAppliedBiosystems373DNAシーケンサー中の変性化10ポリアクリルアミドゲルを通して、電気泳動させた。蛍光標識産物のサイズをGenescan分析ソフトウエアによって、局所サザン法を使って自動的に計算した。2つの固体のLDRプロフィルを図29に示す。それぞれの蛍光着色を独立して分析すると図29、パネルB-DF-H、各遺伝座ごとに存在する対立遺伝子の測定は非常に容易であった。各LDR産物表12に単純なAあるいはBコードをつけて、遺伝子型にコードを割り当てるのに使用した。次の表13を参照されたい。表13PCRLDRで測定した5個体の遺伝子型最初の個体図29A~D;表13の個体1は、多形体部位においてヘテロ接合体である。個体部位1~4および6~7におけるヘテロ接合体は、電気泳動濃度図上のそれぞれの位置における6FAMおよびTET標識の産物両方を検出することによって判明した。個体部位5,11,12におけるヘテロ接合体はそれらの各遺伝子座図29、パネルDに対して2つの塩基のサイズが相異する2つのHEX標識産物の存在によって判明した。それに反して、個体部位8および9で検出した1つの産物によって、それらの各遺伝子座がそれぞれホモ接合体であることが立証された。第2の個体図29E~FおよびG~H、表13の個体2がヘテロ接合体であったのは、個体部位3,5,6,9だけであり、1,2,4,7,8,10,11,12の個体部位でホモ接合体であった。2人の試験者の間のこれらの位置における遺伝子型には合計8つの相異があった。3人の試験者を加えて型を判別した結果、5人のすべての試験者が12遺伝子座表13に基づいた明確な遺伝子型をもっていた。本発明は、説明するために詳細に記載したが、説明のためのみに詳述したのであり、以下の請求の範囲で定義している本発明の精神および範囲からそれない限り、当業者は修飾を施すことができることを理解されたい。"