"少なくとも一つの内因性タンパク質にタグを付けるための方法であって、該方法が:ai少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼあるいは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、該標的エンドヌクレアーゼは標的部位に結合し、かつ内因性タンパク質をコードする染色体配列内の切断部位を切断することができるものである、およびiiタグ配列を含む少なくとも一つのドナーポリヌクレオチド、該タグ配列は上流配列および下流配列に挟まれ、該上流配列および下流配列は染色体配列における切断部位の両側と実質的な配列同一性を共有するものである、を細胞内に導入すること、ならびに、b標的エンドヌクレアーゼにより切断部位で導入された二本鎖切断が、タグ付き内因性タンパク質が生成されるように、ドナーポリヌクレオチド内のタグ配列が、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされるように、相同性指向過程により修復されるような条件下で、細胞を維持すること、を含む方法。標的エンドヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。細胞がほ乳類細胞である、請求項1に記載の方法。細胞が、ヒトU2OS細胞、ヒトMCF10A細胞、ヒトSKOV3細胞、またはヒトiPS細胞である、請求項1に記載の方法。内因性タンパク質が、チューブリン、アクチン、ラミン、HER2、およびHMGAから選ばれる、請求項1に記載の方法。内因性タンパク質が表Aに記載されるタンパク質である、請求項1に記載の方法。内因性タンパク質がC末端でタグ付けされる、請求項1に記載の方法。内因性タンパク質がN末端でタグ付けされる、請求項1に記載の方法。タグ配列が、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質から選ばれる蛍光タンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。ジンクフィンガーヌクレアーゼが、配列番号1、2、13、14、18、19、22、23、25および26から選ばれる配列と、少なくとも約80の配列同一性を有する配列に結合する、請求項2に記載の方法。配列同一性が約85、90、95、99または100である、請求項10に記載の方法。細胞が少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現するように、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を含む、細胞。細胞がほ乳類細胞である、請求項12に記載の細胞。細胞が、ヒトU2OS細胞、ヒトU2OS細胞、ヒトMCF10A細胞、ヒトSKOV3細胞、またはヒトiPS細胞である、請求項12に記載の細胞。内因性タンパク質が、チューブリン、アクチン、ラミン、HER2、およびHMGAから選ばれる、請求項12に記載の細胞。内因性タンパク質が表Aに記載されるタンパク質である、請求項12に記載の細胞。内因性タンパク質がC末端でタグ付けされる、請求項12に記載の細胞。内因性タンパク質がN末端でタグ付けされる、請求項12に記載の細胞。タグ配列が、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質から選ばれる蛍光タンパク質をコードする、請求項12に記載の細胞。細胞が一つの蛍光タグ付けされた内因性タンパク質を発現する、請求項12に記載の細胞。細胞が二以上の蛍光タグ付けされた内因性タンパク質を発現する、請求項12に記載の細胞。細胞が:ai少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼあるいは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、該標的エンドヌクレアーゼは標的部位に結合し、かつ内因性タンパク質をコードする染色体配列内の切断部位を切断することができるものである、およびiiタグ配列を含む少なくとも一つのドナーポリヌクレオチド、該タグ配列は上流配列および下流配列に挟まれ、該上流配列および下流配列は染色体配列における切断部位の両側と実質的な配列同一性を共有するものである、を親細胞内に導入すること、ならびに、b標的エンドヌクレアーゼにより切断部位で導入された二本鎖切断が、ドナーポリヌクレオチド内のタグ配列が、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされるように、相同性指向過程により修復されるような条件下で、細胞を維持すること、によって生成される、請求項12に記載の細胞。標的エンドヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項22に記載の細胞。ジンクフィンガーヌクレアーゼが、配列番号1、2、13、14、18、19、22、23、25および26から選ばれる配列と、少なくとも約80の配列同一性を有する配列に結合する、請求項23に記載の細胞。配列同一性が約85、90、95、99または100である、請求項23に記載の細胞。少なくとも一つの内因性タンパク質の局在を観察するためのキットであって、細胞が少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現するように、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を有する細胞を含む、キット。細胞がほ乳類細胞である、請求項26に記載のキット。細胞が、ヒトU2OS細胞、ヒトU2OS細胞、ヒトMCF10A細胞、ヒトSKOV3細胞、またはヒトiPS細胞である、請求項26に記載のキット。内因性タンパク質が、チューブリン、アクチン、ラミン、HER2、およびHMGAから選ばれる、請求項26に記載のキット。内因性タンパク質が表Aに記載されるタンパク質である、請求項26に記載のキット。内因性タンパク質がC末端でタグ付けされる、請求項26に記載のキット。内因性タンパク質がN末端でタグ付けされる、請求項26に記載のキット。内因性タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質から選ばれる蛍光タンパク質でタグ付けされる、請求項26に記載のキット。細胞が一つの蛍光タグ付けされた内因性タンパク質を発現する、請求項26に記載のキット。細胞が二以上の蛍光タグ付けされた内因性タンパク質を発現する、請求項26に記載のキット。一態様では、本開示は、少なくとも一つの内因性タンパク質にタグを付けるための方法を提供する。該方法は、ai少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼあるいは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、該標的エンドヌクレアーゼは標的部位に結合し、かつ内因性タンパク質をコードする染色体配列内の切断部位を切断することができるものである、およびiiタグ配列を含む少なくとも一つのドナーポリヌクレオチド、該タグ配列は上流配列および下流配列に挟まれflanked、該上流配列および下流配列は染色体配列における切断部位の両側と実質的な配列同一性を共有するものである、を細胞内に導入すること;ならびに、b標的エンドヌクレアーゼにより切断部位で導入された二本鎖切断が、該ドナーポリヌクレオチド内のタグ配列が、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされ、ここにタグ付き内因性タンパク質が生成されるものであるように、相同性指向過程により修復されるような条件下で、細胞を維持すること、を含む。別の態様では、本開示は、細胞が少なくとも一つのタグ付きタンパク質を発現するように、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を含む細胞を提供する。さらに別の態様では、本開示は、内因性タンパク質の局在を観察するためのキットを提供する。該キットは、細胞が少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現するように、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を有する細胞を含む。本開示の他の態様および繰り返しiterationは、以下に、より詳細に記載される。カラー図面の参照本願は、カラーで制作された少なくとも一つの写真を含む。カラー写真付きの本特許出願公報の写しは、請求および必要手数料の支払いにより、特許庁から提供されるであろう。発明の詳細な説明本開示は、細胞内の内因性タンパク質にタグを付けるための方法を包含する。該方法は、標的エンドヌクレアーゼおよびタグ配列を含むドナーポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含む。標的エンドヌクレアーゼは、内因性タンパク質をコードする染色体配列内の特定の部位で二本鎖切断を導入する。二本鎖切断は、鋳型としてドナーポリヌクレオチドを用いる、相同組換えおよび二本鎖切断の修復を引き起こす、細胞DNA修復過程を誘導する。結果として、ドナーポリヌクレオチド内のタグ配列は、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされる。タグ配列が内因性コード配列とインフレームでインテグレートされるため、内因性タンパク質は、生成される際、タグ配列を含む。有利なことに、実施例で説明されるように、本方法は、内因性タンパク質の発現パターンを反映する内因性調節経路の制御下で、タグ付きタンパク質を発現するために利用することができる。本開示はまた、細胞が少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現するように、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を含む細胞を提供する。また本明細書において、少なくとも一つの内因性タンパク質の局在を観察するためのキット、ここに該キットは、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を有する細胞を含むものである、も提供される。I.タグ付き内因性タンパク質を含む細胞本開示の一態様は、細胞が少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現するように、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を含む細胞を提供する。適したタグの例があるように、適した内因性タンパク質の例が以下に詳述される。a内因性タンパク質本明細書における用語内因性タンパク質は、細胞の遺伝物質によりコードされるタンパク質をさす。一般的に、任意の対象の内因性タンパク質は、様々なタグ配列でタグ付けされるであろう。一つの実施形態では、内因性タンパク質はチューブリンタンパク質であってもよい。様々な実施形態では、チューブリンタンパク質は、TUBA1A、TUBA1B、TUBA1C、TUBA3C、TUBA3D、TUBA3E、TUBA4AおよびTUBA8遺伝子によってコードされるα-チューブリンタンパク質;TUBB、TUBB1、TUBB2A、TUBB2B、TUBB2C、TUBB3、TUBB4、TUBB4QおよびTUBB6遺伝子によってコードされるβ-チューブリンタンパク質;TUBG1、TUBG2、TUBGCP2、TUBGCP3、TUBGCP4、TUBGCP5およびTUBGCP6遺伝子によってコードされるγ-チューブリンタンパク質;TUBD1遺伝子によってコードされるδ-チューブリンタンパク質、またはTUBE1遺伝子によってコードされるε-チューブリンタンパク質などの、ヒトチューブリンタンパク質であってもよい。例示的な実施形態では、内因性チューブリンは、ヒト12番染色体上のTUBA1B遺伝子登録番号NM_006082によってコードされるヒトα-チューブリンアイソフォーム1Bタンパク質であってもよい。別の実施形態では、内因性タンパク質はアクチンタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、アクチンタンパク質は、ACTA1遺伝子によってコードされるα-アクチンタンパク質、ACTB遺伝子によってコードされるβ-アクチンタンパク質、またはACTG1遺伝子によってコードされるγ-アクチンタンパク質などの、ヒトアクチンタンパク質であってもよい。例示的な実施形態では、ヒト7番染色体上のACTB遺伝子登録番号NM_001101によってコードされるヒトβ-アクチンタンパク質であってもよい。また別の実施形態では、内因性タンパク質はラミンlaminタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、LMNB1遺伝子およびLMNB2遺伝子によって発現されるB1ラミンおよびB2ラミンなどのヒトラミンタンパク質、または、ラミンAおよびCタンパク質、LMNA遺伝子のスプライスバリアントsplicevariantであってもよい。例示的な実施形態では、ヒト5番染色体上のLMNB1遺伝子登録番号NM_005573によってコードされるヒトラミンB1タンパク質であってもよい。さらに別の実施形態では、内因性タンパク質はERBB2遺伝子によってコードされるヒト上皮成長因子受容体2HER2タンパク質であってもよい。HER2は、細胞膜表面結合受容体チロシンキナーゼであり、細胞成長および分化を導くシグナル伝達経路に関わる。ERBB2遺伝子の増幅またはそのタンパク質生成物の過剰発現は、乳癌、卵巣癌、および胃癌に関連する。内因性HER2タンパク質はヒトHER2タンパク質であってもよいUniProtKB/Swiss-Prot登録番号:P04626。代替的な実施形態では、内因性タンパク質はHMGAである。HMGAは、ATリッチ領域に結合することにより、DNA構造を変化させることによって、遺伝子発現を制御する高移動度グループの染色体タンパク質をさす。それらは、最も大きくかつ最も特徴づけられた非ヒストン性核タンパク質グループの一つである。HMGA1遺伝子は、細胞成長、増殖、分化および死滅を含む多種多様の正常な生物学的過程を調節する。この遺伝子に対して、2種の異なるアイソフォームをコードする少なくとも7種の転写バリアントが発見されている。いくつかの実施形態では、内因性タンパク質はヒトHMGAタンパク質であってもよい。本発明において使用することができるヒトHMGAタンパク質の非限定的な例には、HMGA1遺伝子登録番号NM_145899によって発現される、HMGAアイソフォームaおよびアイソフォームbが挙げられる。さらなる実施形態では、内因性タンパク質は表Aに記載されるタンパク質とすることができる。bタグ配列本明細書においてタグは、タグ付き内因性タンパク質を構築するために内因性タンパク質に融合されるタンパク質をさす。タグ配列は、融合タンパク質が生成されるように、内因性タンパク質コード配列にインフレームで融合される。インフレームは、タンパク質をコードする染色体配列のオープンリーディングフレームORFが、タグ配列の挿入後、維持されることを意味する。インフレーム挿入は、挿入されたヌクレオチドの数が3によって割り切れる際に起こり、可能な場合には、タグタンパク質コード配列に、任意の数のヌクレオチドのリンカーを付加することによって達成することができる。内因性タンパク質は、該内因性タンパク質の機能に影響しないことを条件に、タンパク質ポリペプチド配列内であればどこでも、タグ付けされてもよい。一般的にタグ付けは、タンパク質のN末端またはC末端である。内因性タンパク質は、例えば、タンパク質のN末端でタグ付けされてもよい。あるいは、内因性タンパク質は、タンパク質のC末端でタグ付けされてもよい。タグ配列は、核酸配列によってコードされる任意のペプチド配列であってもよい。タグ配列は、エピトープタグ、アフィニティータグ、レポーター、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない、様々なタグをコードすることができる。タグ配列は、例えば、エピトープタグであってもよい。エピトープタグは、無作為のアミノ酸配列または公知のアミノ酸配列を含んでもよい。公知のアミノ酸配列は、例えば、それに対して生成された抗体を有してもよく、または、その配列に対して生成された公知の抗体が存在しなくてもよい。エピトープタグは、それに対する市販の抗体が入手できる抗体エピトープタグであってもよい。適した抗体エピトープタグの非限定的な例は、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、マルトース結合タンパク質、nus、Softag1、Softag3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、BCCPおよびカルモジュリンである。例示的なタグはレポーターであってもよい。適したレポーターは当分野において知られている。レポーターの非限定的な例には、アフィニティータグ、視覚的レポーター、または選択的マーカーレポーターが挙げられる。アフィニティータグの非限定的な例には、キチン結合タンパク質CBP、チオレドキシンTRX、ポリNANP、タンデムアフィニティー精製TAPタグ、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼGSTが挙げられる。視覚的レポーターは典型的に、細胞における色彩変化、または細胞の蛍光もしくは発光などの、視覚的シグナルをもたらす。例えば、βーガラクトシダーゼをコードする、レポーターLacZは、X-galなどの適した基質が存在する中で、細胞を青色に変化させるであろう。視覚的レポーターの他の非限定的な例には、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、ベータ-ラクタマーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、およびそれらの変種が挙げられる。さらに、ルシフェラーゼが使用されてもよい。選択的マーカーレポーターは、典型的に薬物耐性例えば、抗生物質耐性などの選択可能な特徴を細胞へ与える。例示的なタグは蛍光タンパク質視覚的レポーターである。蛍光タンパク質視覚的レポーターの非限定的な例には、緑色蛍光タンパク質例えば、GFP、GFP-2、タグGFPtagGFP、turboGFP、EGFP、エメラルドEmerald、アザミグリーンAzamiGreen、単量体アザミグリーン、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1、黄色蛍光タンパク質例えば、YFP、EYFP、シトリンCitrine、ビーナスVenus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1、青色蛍光タンパク質例えば、EBFP、EBFP2、アズライトAzurite、mKalama1、GFPuv、サファイアSapphire、T-サファイア、シアン蛍光タンパク質例えば、ECFP、セルリアンCerulean、CyPet、AmCyan1、ミドリイシMidoriishi-シアン、赤色蛍光タンパク質例えば、mKate、mKate2、mPlum、DsRedモノマー、mCherry、mRFP1、DsRed-エクスプレス、DsRed2、DsRed-モノマー、HcRed-タンデム、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred、およびオレンジ色蛍光タンパク質例えば、mOrange、mKO、クサビラ-オレンジKusabira-Orange、単量体クサビラ-オレンジ、mTangerine、tdTomato、または任意の他の適した蛍光タンパク質が挙げられる。例示的なタグは、緑色蛍光タンパク質、または赤色蛍光タンパク質である。非限定的な例にはまた、アミノ部分およびカルボキシル部分が入れ替えられ、かつ本来の末端を結合する短いスペーサーと再結合され、同時にまだ蛍光性である、緑色蛍光タンパク質の環状変異体circularpermutationも挙げられる。蛍光タンパク質のこれらの環状変異体は、pKa値および発色団の配向orientationが変化した。さらに、いくつかの蛍光タンパク質内の特定の位置は、タンパク質全体の挿入を許容し、挿入における構造変化は色彩増強または色彩変化などの、蛍光に重大な影響を及ぼす。例えば、GFPの黄色変異体EYFP、高感度黄色蛍光タンパク質のTyr-145の位置におけるカルモジュリンまたはジンクフィンガードメインの挿入は、金属結合するとすぐにその蛍光を数倍増強させることができる、指標タンパク質indicatorproteinをもたらす。高感度黄色蛍光タンパク質へのカルモジュリングラフトcalmodulingraftは、単一のほ乳類細胞における細胞質Ca2を観察することができる。内因性タンパク質は、例えば、ペプチドリンカーを介してタグに融合されてもよい。リンカーペプチドの配列は、適切なフォールディングを可能にし、タグ付けされるタンパク質およびタグポリペプチドの立体障害を妨げるために、ペプチド断片segmentの公知の構造的寄与および立体配座的寄与conformationalcontributionに基づき選択されている。リンカーペプチドは通常、当分野で使用され、かつ知られており、約3から約40アミノ酸長であってもよい。内因性タンパク質は二以上のタグでタグ付けされてもよい。例えば、内因性タンパク質は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、または9個のタグでタグ付けされてもよい。二以上のタグは、対象の内因性タンパク質に融合された単一のポリペプチドとして、発現されてもよい。内因性タンパク質に融合された二以上のタグは、翻訳後に個々のタグポリペプチドへと切断される単一のポリペプチドとして、発現されてもよい。非限定的な例として、タグポリペプチド間、またはタグポリペプチドと内因性タンパク質の間に挿入されたピコルナウイルスの2Aポリペプチドが、タグの共翻訳切断をもたらし、等モルレベルでの多数のタンパク質の発現を引き起こすことができる。一つの例示的な実施形態では、細胞は蛍光タンパク質でタグ付けされる一つの内因性タンパク質を発現する。別の例示的な実施形態では、細胞は2つの蛍光タグ付けされた内因性タンパク質を発現する。また別の例示的な実施形態では、細胞は3つの蛍光タグ付けされた内因性タンパク質を発現する。さらなる実施形態では、細胞は4つ以上のタグ付き内因性タンパク質を発現する。c細胞型一般的に、細胞は真核細胞であろう。適した細胞には、ピキアパストリスPichiapastorisもしくはサッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeなどの、真菌または酵母;スポドプテラフルギペルダSpodopterafrugiperda由来のSF9細胞もしくはドロソフィアメラノガスターDrosophilamelanogaster由来のS2細胞などの、昆虫細胞;植物細胞;マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、非ヒト霊長類細胞、もしくはヒト細胞などの、動物細胞が挙げられる。例示的な細胞はほ乳類である。ほ乳類細胞は、初代細胞primarycellであってもよい。一般的に、二本鎖切断に感受性である任意の初代細胞を用いることができる。細胞は、例えば、線維芽細胞、筋芽細胞、TもしくはB細胞、マクロファージ、上皮細胞など、様々な細胞型であってもよい。ほ乳類細胞はほ乳類細胞株細胞であってもよい。細胞株は任意の樹立された細胞株または初代細胞株であってもよい。細胞株は接着性もしくは非接着性であってもよく、あるいは、細胞株は、当業者に知られた標準的な技術を使用して、接着性、非接着性もしくは器官型の生育を促す条件下で成長させることができる。適したほ乳類細胞株の非限定的な例には、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、SV40により形質転換されたサル腎臓CVI株COS7;ヒト胎児腎臓株293;ベビーハムスター腎臓細胞BHK;マウスセルトリ細胞TM4;サル腎臓細胞CVI-76;アフリカミドリザル腎臓細胞VERO-76;ヒト子宮頸癌細胞HELA;イヌ腎臓細胞MDCK;バッファローラット肝細胞BRL3A;ヒト肺細胞W138;ヒト肝細胞HepG2;マウス乳癌細胞MMT;ラット肝臓癌細胞HTC;HIH/3T3細胞、ヒトU2-OS骨肉腫細胞株、ヒトA549細胞株、ヒトK562細胞株、ヒトHEK293細胞株、ヒトHEK293T細胞株、およびTRI細胞が挙げられる。ほ乳類細胞株の広範なリストに関して、当業者は、アメリカンタイプカルチャーコレクションカタログATCC登録商標、Mamassas、VAを参照することができる。一般的に、細胞は、例えば、線維芽細胞、筋芽細胞、TもしくはB細胞、マクロファージ、上皮細胞など、様々な種類の細胞であってもよい。本開示による、例示的な細胞株は、ヒトU2OS骨肉腫細胞株である。代替的な例示的なヒト細胞株は、A549細胞株、K562細胞株細胞株、HEK293細胞株、HEK293T細胞株細胞株である。別の例示的なヒト細胞株は、MCF10a、乳腺上皮癌細胞株、である。まだ別の例示的なヒト細胞株は、SKOV3、上皮細胞株、である。代替的な例示的なヒト細胞株には、線維芽細胞または他の細胞型から生成された、誘導性多能性幹細胞であるiPS細胞が挙げられる。さらに他の実施形態では、細胞は幹細胞であってもよい。適した幹細胞には、胚性幹細胞、ES様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、多能性pluripotent幹細胞、誘導性多能性幹細胞、複能性multipotent幹細胞、少能性oligopotent幹細胞、単能性unipotent幹細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらなる実施形態では、細胞は一細胞胚one-cellembryoであってもよい。胚は、脊椎動物または無脊椎動物であってもよい。適した脊椎動物には、ほ乳類、鳥類、爬虫類、両生類および魚類が挙げられる。適したほ乳類の例には、齧歯類、コンパニオンアニマル、家畜、および非霊長類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。齧歯類の非限定的な例には、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、およびモルモットが挙げられる。適したコンパニオンアニマルには、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミおよびフェレットが挙げられるが、これらに限定されるものではない。家畜の非限定的な例には、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラマおよびアルパカが挙げられる。適した非霊長類には、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザルおよびオナガザルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鳥類の非限定的な例には、鶏、七面鳥、アヒルおよびガチョウが挙げられる。あるいは、動物は、昆虫、線虫等などの無脊椎動物であってもよい。昆虫の非限定的な例には、ショウジョウバエDrosophilaおよび蚊が挙げられる。II.タグ付き内因性タンパク質のための方法本開示の別の態様は、細胞内で少なくとも一つの内因性タンパク質にタグを付けるための方法を包含する。本方法は、インフレームでの内因性コード配列とタグ配列のインテグレーションを介在するために、標的エンドヌクレアーゼを使用することを含む。より具体的には、本方法は、少なくとも一つのジンクフィンガーヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸、および少なくとも一つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入することを含む。ドナーポリヌクレオチドは、内因性染色体配列内にインフレームでインテグレートされるタグ配列、タグ配列を挟む上流配列および下流配列を含み、ここに該上流配列および下流配列は、タンパク質をコードする内因性染色体配列における切断部位の両側と実質的な配列同一性を共有するものである。細胞は次いで、該ジンクフィンガーヌクレアーゼにより切断部位で導入された二本鎖切断が、該ドナーポリヌクレオチド内のタグ配列が、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされるような、相同性指向過程により修復されるような条件下で、維持される。少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現する、本方法によって生成された細胞は、上記I節に詳述される。本方法の構成要素は、以下に詳しく記載される。a標的エンドヌクレアーゼ本方法は、一つには、少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼまたは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞内に導入することを含む。標的エンドヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質または人工タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼとすることができる。他の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、転写活性化物質様エフェクターTALE-ヌクレアーゼであってもよい。好ましい実施形態では、標的エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼとすることができる。典型的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、以下に記載される、DNA結合ドメインすなわち、ジンクフィンガーおよび切断ドメインすなわち、ヌクレアーゼを含む。iジンクフィンガー結合ドメインジンクフィンガー結合ドメインは、任意の最適な核酸配列を認識し、結合するように操作されてもよい。例えば、Beerlietal.2002Nat.Biotechnol.20:135-141;Paboetal.2001Ann.Rev.Biochem.70:313-340;Isalanetal.2001Nat.Biotechnol.19:656-660;Segaletal.2001Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637;Chooetal.2000Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416;Zhangetal.2000J.Biol.Chem.27543:33850-33860;Doyonetal.2008Nat.Biotechnol.26:702-708;およびSantiagoetal.2008Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:5809-5814を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質に比べて、新規の結合特異性を有してもよい。操作方法は、合理的設計および様々な型の選択が挙げられるが、これらに限定されるものではない。合理的設計には、例えば、二重鎖、三重鎖、および/または四重鎖ヌクレオチド配列ならびに個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含み、ここに各二重鎖、三重鎖、および/または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖または四重鎖配列に結合するジンクフィンガーの一以上のアミノ酸配列と会合されるものである、データベースを使用することが挙げられる。例えば、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,453,242号および同第6,534,261号を参照されたい。例として、米国特許第6,453,242号において記載されるアルゴリズムを使用して、事前に選択された配列を標的とするためのジンクフィンガー結合ドメインを設計することができる。また、非縮重認識コード表を使用する合理的設計などの代替方法を使用して、特定の配列を標的とするためのジンクフィンガー結合ドメインを設計することができるSeraetal.2002Biochemistry41:7074-7081。DNA配列における標的部位候補を同定し、ジンクフィンガー結合ドメインを設計するための、公的に利用可能なウェブをベースとするツールが、http://www.zincfingertools.orgおよびhttp://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/にそれぞれ見つかり得るMandelletal.2006Nuc.AcidRes.34:W516-W523;Sanderetal.2007Nuc.AcidRes.35:W599-W605。ジンクフィンガー結合ドメインは、約3ヌクレオチドから約21ヌクレオチド長、または約8から約19ヌクレオチド長の範囲であるDNA配列を認識し、結合するように設計することができる。一般的に、本明細書に開示されるジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも3つのジンクフィンガー認識領域すなわち、ジンクフィンガーを含む。一つの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは4つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは5つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。また別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは6つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の適した標的DNA配列に結合するように設計されてもよい。例えば、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,607,882号、同第6,534,261号および同第6,453,242号を参照されたい。ジンクフィンガー認識領域を選択するための例示的な方法には、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムが挙げられ、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,789,538号、同第5,925,523号、同第6,007,988号、同第6,013,453号、同第6,410,248号、同第6,140,466号、同第6,200,759号、および同第6,242,568号、ならびに、国際公開第98/37186号;国際公開第98/53057号;国際公開第00/27878号;国際公開第01/88197号、および英国特許第2,338,237号に開示される。さらに、ジンクフィンガー認識領域に対する結合特異性の増強が、例えば、国際公開第02/077227号に記載される。ジンクフィンガー結合ドメイン、ならびに融合タンパク質および同一物をコードするポリヌクレオチドの設計および構築のための方法は当業者に知られており、全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20050064474号および同第20060188987号に詳しく記載される。ジンクフィンガー認識領域および/またはマルチ-フィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば5以上のアミノ酸長のリンカーを含む、適したリンカー配列を使用して、共に結合することができる。6以上のアミノ酸長のリンカー配列の非限定的な例に関して、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,479,626号、同第6,903,185号、および同第7,153,949号を参照されたい。本明細書に記載されるジンクフィンガー結合ドメインは、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適したリンカーの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼはさらに核局在化シグナルまたは配列NLSを含んでもよい。NLSは、染色体における標的配列で二本鎖切断を導入するために、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を核内に標的化させることを促進する、アミノ酸配列である。核局在化シグナルは当分野において知られている。例えば、Makkerhetal.1996CurrentBiology6:1025-1027を参照されたい。例示的なジンクフィンガーDNA結合ドメインは、配列番号1、2、13、14、18、19、22、23、25および26から選択される配列と、少なくとも約80の配列同一性を有する配列を認識し、結合する。他の実施形態では、配列同一性は、約81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100であってもよい。ii切断ドメインジンクフィンガーヌクレアーゼは切断ドメインも含有する。本明細書で開示されるジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、2002-2003Catalog,NewEnglandBiolabs,Beverly,Mass.;およびBelfortetal.1997NucleicAcidsRes.25:3379-3388またはwww.neb.comを参照されたい。DNAを切断するさらなる酵素が知られている例えば、S1ヌクレアーゼ;マングビーンヌクレアーゼ;膵臓DNaseI;ミクロコッカスヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ。Linnetal.eds.Nucleases,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1993も参照されたい。これらの酵素またはそれらの機能的断片の一以上を、切断ドメインの供給源として使用してもよい。切断ドメインはまた、上述のような、切断活性のために二両体化を必要とする、酵素またはその部分であってもよい。2つのジンクフィンガーヌクレアーゼが、活性酵素二量体の単量体を含む各ヌクレアーゼとして、切断のために必要とされ得る。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼが、活性酵素二量体を構築するための両方の単量体を含むことができる。本明細書で用いる場合、活性酵素二量体とは核酸分子を切断することができる酵素二量体である。2つの切断単量体が同一のエンドヌクレアーゼあるいはその機能的な断片に由来してもよく、または、各単量体が異なるエンドヌクレアーゼあるいはその機能的な断片に由来してもよい。2つの切断単量体を使用して活性酵素二量体を形成する場合、2つのジンクフィンガーヌクレアーゼのための認識部位は、それら各々の認識部位との2つのジンクフィンガーヌクレアーゼの結合が、例えば二量体化によって、切断単量体に活性酵素二両体を形成させる、互いに対する空間的配向で切断単量体を設置するように、配置されるのが好ましい。結果として、認識部位の近端は、約5から約18ヌクレオチドにより分離され得る。例えば、近端は、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18ヌクレオチドにより分離され得る。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、2つの認識部位の間に介入し得ることが認識される例えば、約2から約50ヌクレオチド対以上。例えば、本明細書で詳細に記載されるものなど、ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の近端は、6ヌクレオチドにより分離され得る。一般的に、切断部位は認識部位の間に位置する。制限エンドヌクレアーゼ制限酵素は多数の種に存在し、かつ、DNAに配列特異的に認識部位で結合し、結合部位またはその付近で、DNAを切断することが可能である。特定の制限酵素例えば、タイプIISは、認識部位から移動した部位でDNAを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、タイプIIS酵素FokIは、一方の鎖のその認識部位から9ヌクレオチド、他方のその認識部位から13ヌクレオチドのところで、DNAの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第5,356,802号;同第5,436,150号および同第5,487,994号;ならびにLietal.1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279;Lietal.1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768;Kimetal.1994aProc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887;Kimetal.1994bJ.Biol.Chem.269:31,978-31,982を参照されたい。それゆえ、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、操作されてもされなくてもよいが、少なくとも一つのタイプIIS制限酵素由来の切断ドメインおよび一以上のジンクフィンガー結合ドメインを含むことができる。例示的なタイプIIS制限酵素は、例えば、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、国際公開第07/014,275号に記載される。さらなる制限酵素はまた、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含有し、これらもまた本開示によって企図される。例えば、Robertsetal.2003NucleicAcidsRes.31:418-420を参照されたい。切断ドメインが結合ドメインから分離可能である、例示的なタイプIIS制限酵素は、FokIである。この特定の酵素は、二量体として活性であるBitinaiteetal.1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。したがって、本開示の目的のため、ジンクフィンガーヌクレアーゼにおいて使用されるFokI酵素の部分は、切断単量体であるとみなされる。それゆえ、FokI切断ドメインを使用する標的化二本鎖切断のために、各々がFokI切断単量体を含む、2つのジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、活性酵素二量体を再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび2つのFokI切断単量体を含有する単一のポリペプチド分子が用いられてもよい。特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20050064474号、同第20060188987号および同第20080131962号に記載されるように、ホモ二量体化を最小化するまたは防ぐ、一以上の操作された切断単量体を含むことができる。非限定的な例として、FokIの446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537、および538位のアミノ酸残基は、全て、FokI切断ハーフ-ドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。強制的なヘテロ二量体を形成する、例示的なFokIの操作された切断単量体には、第一の切断単量体がFokIのアミノ酸残基490位および538位での変異を含み、第二の切断単量体がアミノ酸残基486位および499位での変異を含むものである、ペアが挙げられる。それゆえ、一つの実施形態では、アミノ酸490位での変異はGluEをLysKで置換し;アミノ酸538位での変異はIsoIをLysKで置換し;アミノ酸486位での変異はGlnQをGluEで置換し;かつ、アミノ酸499位での変異はIsoIをLysKで置換する。特に、操作された切断単量体は、E490K:I538Kで示される操作された切断単量体を生成するために、一つの切断単量体において、490位をEからKへ、538位をIからKへ変異させること、および、Q486E:I499Lで示される操作された切断単量体を生成するために、別の切断単量体において、486位をQからEへ、499位をIからLへ変異させることにより、調製され得る。上述の操作された切断単量体は、異常な切断が最小化または撤廃された、強制されたヘテロ二量体変異体である。操作された切断単量体は、例えば、米国特許出願公開第20050064474号に記載されるような、野生型切断単量体FokIの部位特異的変異導入site-directedmutagenesisにより、適した方法を用いて調製されてもよい実施例5を参照されたい。上述のジンクフィンガーヌクレアーゼは、インテグレーションの標的化部位で二本鎖切断を導入するように操作されてもよい。二本鎖切断はインテグレーションの標的化部位であってもよく、インテグレーションの部位から最大1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、または1000ヌクレオチド離れてもよい。いくつかの実施形態では、二本鎖切断はインテグレーションの部位から最大1、2、3、4、5、10、15、または20ヌクレオチド離れてもよい。他の実施形態では、二本鎖切断はインテグレーションの部位から最大10、15、20、25、30、35、40、45、または50ヌクレオチド離れてもよい。さらに他の実施形態では、二本鎖切断はインテグレーションの部位から最大50、100、または1000ヌクレオチド離れてもよい。iv標的化切断のためのさらなる方法染色体配列における標的部位を有する任意のヌクレアーゼが、本明細書に開示される方法において用いられてもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは非常に長い認識配列を有し、そのうちのいくつかは、統計的に、ヒトサイズのゲノムにおいて一度ぐらい、存在する可能性がある。細胞内ゲノムにおいて固有の標的部位を有する任意のこのようなヌクレアーゼを、細胞染色体の標的化切断のために、ジンクフィンガーヌクレアーゼの代わりに、または、加えて、使用してもよい。ホーミングエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-Scell、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevIlおよびI-TevIIIが挙げられる。これらの酵素の認識配列は当分野において知られている。米国特許第5,420,032号;米国特許第6,833,252号;Belfortetal.1997NucleicAcidsRes.25:3379-3388;Dujonetal.1989Gene82:115-118;Perleretal.1994NucleicAcidsRes.22,1125-1127;Jasin1996TrendsGenet.12:224-228;Gimbleetal.1996J.Mol.Biol.263:163-180;Argastetal.1998J.Mol.Biol.280:345-353およびNewEnglandBiolabsカタログも参照されたい。ほとんどのホーミングエンドヌクレアーゼの切断特異性は、それらの認識部位に対して絶対的ではないが、その部位は、ほ乳類サイズのゲノムあたり単一の切断事象が、単コピーのその認識部位を含有する細胞においてホーミングエンドヌクレアーゼを発現することにより得られる、十分な長さである。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性を、非天然標的部位に結合するよう操作してもよいということもまた、報告されている。例えば、Chevalieretal.2002Molec.Cell10:895-905;Epinatetal.2003NucleicAcidsRes.31:2952-2962;Ashworthetal.2006Nature441:656-659;Paquesetal.2007CurrentGeneTherapy7:49-66を参照されたい。vジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸として細胞内に導入されてもよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸は、DNAまたはRNAとすることができる。一つの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸はDNAとすることができる。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼコード配列を含むプラスミドDNAが、細胞内に導入されてもよい。別の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸は、RNAまたはmRNAであってもよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸がmRNAである場合、該mRNA分子は5’キャップされてもよい。同様に、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸がmRNAである場合、該mRNA分子はポリアデニル化されてもよい。それゆえ、本方法による核酸は、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする、キャップされ、ポリアデニル化されたmRNAとすることができる。mRNAをキャップする方法およびポリアデニル化する方法は当分野において知られている。bドナーポリヌクレオチド標的とされる染色体配列内にインフレームでタグ配列をインテグレートするための方法は、タグ配列を含む少なくとも一つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入することをさらに含む。ドナーポリヌクレオチドは、上記Ib節に詳述されるようにタグ配列を含むだけでなく、上流配列および下流配列も含む。該上流および下流配列は、ドナーポリヌクレオチドにおいてタグ配列を挟む。さらに、該上流および下流配列は、内因性染色体配列におけるインテグレーション部位の両側と実質的な配列同一性を共有する。ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列およびドナーポリヌクレオチドの間の組換えを促進するように選択される。上流配列とは、本明細書で用いられる場合、インテグレーションの標的化部位の上流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列をいう。同様に、下流配列とは、インテグレーションの標的化部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列をいう。ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列と約75、80、85、90、95または100配列同一性を有してもよい。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列と約95、96、97、98、99、または100配列同一性を有してもよい。例示的な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列と約99または100配列同一性を有してもよい。上流または下流配列は、約20bpから約2500bpを含んでもよい。一つの実施形態では、上流または下流配列は、約50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、または2500bpを含んでもよい。例示的な上流または下流配列は、約200bpから約2000bp、約600bpから約1000bp、またはより具体的には約700bpから約1000bpを含んでもよい。典型的には、ドナーポリヌクレオチドはDNAであるだろう。ドナーポリヌクレオチドは、DNAプラスミド、細菌人工染色体BAC、酵母人工染色体YAC、ウイルスベクター、線状断片linearpieceDNA、PCR断片、ネイキッドなnaked核酸、またはリポソームあるいはポロキサマーpoloxamerなどの送達媒体deliveryvehicleと複合体化された核酸であってもよい。一つの実施形態では、タグ配列を含むドナーポリヌクレオチドは、DNAプラスミドとすることができる。別の実施形態では、タグ配列を含むドナーポリヌクレオチドは、BACとすることができる。当業者は、周知の標準的な組換え技術を使用して、本明細書に記載されるようなドナーポリヌクレオチドを構築できるであろう例えば、Sambrooketal.,2001およびAusubeletal.,1996を参照されたい。c細胞への送達本方法は、標的エンドヌクレアーゼまたは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸およびドナーポリヌクレオチドを、細胞内に導入することを含む。適した細胞は上記Ic節に詳述される。適した送達方法には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃biolistics、リン酸カルシウム介在トランスフェクションcalciumphosphate-mediatedtransfection、陽イオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクションimpalefection、オプティカルトランスフェクションopticaltransfection、専売薬剤proprietaryagentで促進された核酸の取り込み、およびリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、あるいは人工ビリオンを介する送達、が挙げられる。一つの実施形態では、分子はヌクレオフェクションにより細胞内に導入することができる。別の実施形態では、分子はマイクロインジェクションにより細胞内に導入することができる。分子は、細胞の核内あるいは細胞質内にマイクロインジェクションすることができる。標的エンドヌクレアーゼまたは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸に対する、タグ配列を含むドナーポリヌクレオチドの割合は、変化でき、変化するであろう。好ましい実施形態では、標的エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼとすることができる。一般的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ分子に対するドナーポリヌクレオチドの割合は、約1:10から約10:1の範囲であってもよい。様々な実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ分子に対するドナーポリヌクレオチドの割合は、約1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、または10:1であってもよい。一つの実施形態では、割合は約1:1であってもよい。二以上の標的エンドヌクレアーゼ分子および二以上のドナーポリヌクレオチドが細胞内に導入される実施形態では、分子は同時にあるいは順に導入されてもよい。例えば、各々異なる認識配列に特異的である標的エンドヌクレアーゼ分子、ならびに、対応するドナーポリヌクレオチドを、同時に導入してもよい。あるいは、各標的エンドヌクレアーゼ分子、ならびに、対応するドナーポリヌクレオチドを順に導入してもよい。d細胞培養本方法はさらに、標的エンドヌクレアーゼ介在インテグレーションが起こり得るような、適切な条件下で細胞を維持することを含む。必要であれば、細胞は、標的エンドヌクレアーゼの発現を可能とする標準手順を使用して、培養することができる。標準的な細胞培養技術は、例えば、Santiagoetal.2008PNAS105:5809-5814;Moehleetal.2007PNAS104:3055-3060;Urnovetal.2005Nature435:646-651;およびLombardoetal2007Nat.Biotechnology25:1298-1306に記載される。当業者は、細胞を培養するための方法が当分野において知られ、かつ、細胞型によって変化でき、変化するであろうことを十分理解している。いかなる場合でも、特定の細胞型のための最良の技術を決定するために、所定の最適化を用いることができる。細胞が一細胞胚である実施形態では、胚をインビトロで培養することができる例えば、細胞培養。典型的には、胚は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを可能とする、必須のO2/CO2比を備える、適切な温度かつ適切な培地で培養される。培地の適した非限定的な例には、M2、M16、KSOM、BMOC、およびHTF培地が挙げられる。当業者は、培養条件が、胚の種類によって変化でき、変化するであろうことを十分理解しているであろう。いかなる場合でも、特定の胚の種類のための最良の技術を決定するために、所定の最適化を用いることができる。場合によっては、胚は、メス宿主の子宮内に胚を移植するtransferことにより、インビボで培養することができる。一般的に言えば、メス宿主は、胚と同種または類似種に由来する。好ましくは、メス宿主は偽妊娠である。偽妊娠メス宿主の調製方法は当分野において知られている。さらに、胚をメス宿主に移植する方法も知られている。インビボで胚を培養することは胚の発生developをもたらし、その胚に由来する動物の生児出生livebirthを引き起こす。過程のこの段階の間、場合によっては、導入された核酸から発現した標的エンドヌクレアーゼは、染色体内の標的配列を認識し、結合し、切断する。標的エンドヌクレアーゼにより導入された二本鎖切断は、ドナーポリヌクレオチドのタグ配列が染色体位置内にインフレームでインテグレートされるように、ドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを介して、修復される。ドナーポリヌクレオチドは物理的にphysicallyインテグレートされてもよく、またあるいは、染色体内へのドナーポリヌクレオチドのタグ配列ならびに上流および下流配列の全部または一部のインテグレーションを引き起こす、切断の修復のための鋳型として、ドナーポリヌクレオチドを使用してもよい。当業者は、細胞の培養のための方法が当分野において知られ、かつ、細胞型によって変化でき、変化するであろうことを十分理解している。いかなる場合でも、特定の細胞型のための最良の技術を決定するために、所定の最適化を用いることができる。e多重インテグレーション上記発明のさらなる実施形態は、二以上の内因性タンパク質がタグ付けされるように、二以上の標的化インテグレーションと共に細胞を発生developさせるよう、本発明の方法を連続的に実行することを含む。例えば、第一の標的化インテグレーションを備える細胞を、第二の標的化インテグレーションを構築するために、次いで、本発明の方法において使用することができる。同じ過程を繰り返して、3、4、5、6、7、8、9、10、または11以上の標的化インテグレーションを備える細胞を構築することができる。あるいは、多重インテグレーションを備える細胞は、各々異なるインテグレーション部位に特異的である、二以上の標的エンドヌクレアーゼを導入すること、および、対応する数のドナーポリヌクレオチドを導入することによって、発生developさせることができる。各ドナーポリヌクレオチドは、上記に詳述されるような、インテグレートされる核酸配列ならびにインテグレーションの染色体部位と相同である上流および下流配列を含むであろう。細胞内に注入される、標的エンドヌクレアーゼおよび対応するドナーポリヌクレオチドの数は、2、3、4、5、または6以上であってもよい。III.内因性タンパク質にタグを付けるためのキット。本開示はまた、細胞内の少なくとも一つの内因性タンパク質の局在を観察するためのキットを包含する。該キットは、細胞が少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現するように、該内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を有する細胞を含む。該細胞はほ乳類細胞であってもよい。好ましくは、該細胞はヒト細胞である。ヒト細胞は、ヒトU2OS細胞、ヒトMCF10A細胞、ヒトSKOV3、またはヒトiPS細胞から選ばれる細胞株細胞であってもよい。タグ付き内因性タンパク質は、チューブリン、アクチン、ラミン、HER2、およびHMGAから選ぶことができる。あるいは該キットは、表Aに記載されるものから選ばれる少なくとも一つのタグ付きタンパク質を発現することができる。好ましい実施形態では、内因性タンパク質のタグは、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質から選ばれる蛍光タンパク質とすることができる。例示的なタグは、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質である。定義別段の定めがない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、この発明の属する分野における当業者により通常理解される意味を有する。以下の参考文献は、この発明で用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する:Singletonetal.,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology2nded.1994;TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnologyWalkered.,1988;TheGlossaryofGenetics,5thEd.,R.Riegeretal.eds.,SpringerVerlag1991;およびHaleMarham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology1991。本明細書で用いられる場合、特に指定がない限り、以下の用語はそれらに与えられた意味を有する。本開示またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞a、an、theおよびsaidは、一以上の要素が存在するということを意味することを目的としている。用語含むcomprising、含むincluding、および有するhavingは、包括的であり、記載された要素以外のさらなる要素が存在してもよいということを意味することを目的としている。本明細書で用いられる遺伝子は、遺伝子産物をコードするエキソンおよびイントロンを含むDNA領域、ならびに、そのような調節配列が、コード配列および/または転写配列に隣接しているか否かを問わず、遺伝子産物の生成を調節する、全てのDNA領域をさす。従って、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位internalribosomeentrysiteなどの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、バウンダリーエレメントboundaryelement、複製起点、マトリックス付着部位matrixattachmentsite、および遺伝子座制御領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。異種タンパク質とは、対象の細胞または生命体に対して天然でない例えば、外来性のタンパク質である。用語核酸およびポリヌクレオチドは、線状または環状構造で、かつ、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーをさす。本開示のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関する制限と解釈されることはない。該用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに、塩基、糖、および/またはリン酸部分において修飾された例えば、ホスホロチオエート骨格ヌクレオチドを包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同一の塩基対合特異性を有する;すなわち、AのアナログはTと塩基対合するであろう。用語ポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸残基のポリマーをさすために区別しないで用いられる。用語組換えは、2つのポリヌクレオチド間での、遺伝情報の交換過程をさす。本開示のため、相同組換えは、例えば、細胞における二本鎖切断の修復の間で起こる、そのような交換の特殊な形態をさす。この過程は、2つのポリヌクレオチド間の配列相同性sequencesimilarityを必要とし、標的分子すなわち、二本鎖切断を経験したものの鋳型修復に対しドナーまたは交換分子を使用し、かつ、非クロスオーバーnon-crossover遺伝子変換またはショートトラクトshorttract遺伝子変換として、さまざまに知られている、というのも、ドナーから標的への遺伝情報の移動を導くからである。特定の理論に拘束されるつもりはないが、このような移動は、切断された標的とドナーの間に形成されるヘテロ二重鎖DNAのミスマッチ修正、および/または、標的の一部分となる遺伝情報の再合成のためにドナーが使用される合成依存鎖アニーリングsynthesis-dependentstrandannealing、および/または関連過程を伴うことができる。そのような特殊な相同組換えは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような、標的分子配列の変更をもたらす。用語配列同一性とは、2つのヌクレオチド配列が変化していない度合い、すなわち、2つの配列が同一の位置に同一のヌクレオチドを有する度合いをさす。配列同一性は一般的にパーセントとして表される。配列および長さにおいて同一である2つのヌクレオチド配列は、100の配列同一性を有する。本明細書で用いられる場合、用語標的部位または標的配列は、改変editされる染色体配列の部分を定義する核酸配列であって、結合のために十分な条件が存在するという条件で、ジンクフィンガーヌクレアーゼが認識かつ結合するために操作されるものをさす。核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は当分野において知られている。典型的にそのような技術には、ある遺伝子のためのmRNAのヌクレオチド配列を決定すること、および/または、それによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第二のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列と比較すること、が含まれる。ゲノム配列もまたこのような方法で決定され、比較され得る。一般的に同一性とは、それぞれ、2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をさす。二以上の配列ポリヌクレオチドまたはアミノ酸を、それらの同一性パーセントを決定することにより比較することができる。2つの配列の同一性パーセントは、核酸配列であるかアミノ酸配列であるかを問わず、2つの整列された配列間の正確な合致数をより短い方の配列の長さで割り、100をかけたものである。核酸配列の近似アラインメントは、SmithandWaterman,AdvancesinAppliedMathematics2:482-4891981の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff,AtlasofProteinSequencesandStructure,M.O.Dayhoffed.,5suppl.3:353-358,NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.,USA,より開発され、Gribskov,Nucl.AcidsRes.146:6745-67631986により規格化されたスコアリング行列を用いて、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施態様は、GeneticsComputerGroupMadison,Wis.により、BestFitユーティリティアプリケーションによって提供されている。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを算出するための他の適したプログラムは、当分野において広く知られており、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータで使用されるBLASTである。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下のデフォルトパラメータ用いて使用することができる:遺伝コードgeneticcode=標準standard;フィルターfilter=なしnone;鎖strand=両方both;カットオフcutoff=60;期待数expect=10;行列Matrix=BLOSUM62;表示Descriptions=50配列;分類方法sortby=高スコアHIGHSCORE;データベースDatabases=非重複non-redundant、GenBankEMBLDDBJPDBGenBankCDStranslationsSwissproteinSpupdatePIR。これらのプログラムの詳細はGenBankウェブサイト上に見出すことができる。本明細書に記載する配列に関して、望ましい配列同一性の度合の範囲は約80から100およびその間の任意の整数値である。典型的に、配列間の同一性パーセントは、少なくとも70-75、好ましくは80-82、より好ましくは85-90、さらに好ましくは92、より一層好ましくは95、最も好ましくは98の配列同一性である。あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の度合いは、配列類似性の度合いを共有する領域間で安定な二重鎖を形成させるような条件下での、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、ならびに消化された断片のサイズ決定により、決定することができる。2つの核酸配列、または2つのポリペプチド配列は、配列が、上記の方法を用いて決定して、規定された長さの分子にわたって、少なくとも約70-75、好ましくは80-82、より好ましくは85-90、さらに好ましくは92、より一層好ましくは95、最も好ましくは98の配列同一性を示す場合に、実質的に互いに相同である。本明細書で用いる場合、実質的に相同というのはまた、特定のDNAまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をさす。実質的に相同なDNA配列は、例えば、その特定の系に対して規定されるようなストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験により同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の規定は、当分野の技術の範囲内にある。例えば、Sambrooketal.,supra;NucleicAcidHybridization:APracticalApproach,editorsB.D.HamesandS.J.Higgins,1985Oxford;Washington,DC;IRLPressを参照されたい。2つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、次のように決定することができる。2つの核酸分子間の配列同一性の度合いは、そのような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強さに影響する。部分的に同一な核酸配列は、少なくとも部分的に、標的分子への完全に同一な配列のハイブリダイゼーションを阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当分野においてよく知られたハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価することができる例えば、サザンDNAブロット、ノーザンRNAブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,1989,ColdSpringHarbor,N.Y.を参照されたい。そのようなアッセイは、さまざまな度合いの選択性を使用して、例えば低から高ストリンジェンシーへと変化する条件を使用して実施することができる。低ストリンジェンシー条件を使用する場合、非特異的結合が存在しないことは、部分的な度合いの配列同一性さえ失った第2プローブ例えば標的分子と約30未満の配列同一性を有するプローブを用いて評価することができ、そのため、非特異的結合事象が存在しないと、第2プローブは標的にハイブリダイズしない。ハイブリダイゼーションに基づく検出システムを利用する場合は、参照核酸配列に相補的な核酸プローブが選ばれ、次に適当な条件を選択することにより、プローブと参照配列とが互いに選択的にハイブリダイズし、または結合し、二本鎖分子を形成する。適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約70の配列同一性を有する、少なくとも約10-14ヌクレオチドの長さを有する標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と約90-95を上回る配列同一性を有する、少なくとも約10-14ヌクレオチドの長さの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ/参照配列ハイブリダイゼーションに役立つハイブリダイゼーション条件は、プローブおよび参照配列が特定の配列同一性の度合いを有する場合、当分野で公知であるように決定することができる例えばNucleicAcidHybridization:APracticalApproach,editorsB.D.HamesandSJ.Higgins1985Oxford;Washington,DC;IRLPressを参照されたい。ハイブリダイゼーションのための条件は当業者には周知である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を嫌う度合いをさし、より高いストリンジェンシーはミスマッチしたハイブリッドに対する許容度がより低いことと相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は当業者によく知られており、温度、pH、イオン強度、および有機溶媒、例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどの濃度が挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者に知られているように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度により増大する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、例えば、以下の因子:配列の長さおよび性質、さまざまな配列の塩基組成、塩類および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤例えば、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコールの有無、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータを変化させると共に、洗浄条件を変化させることにより、数多くの等価な条件を使用して、ある特定のストリンジェンシーを確立することができることが、当分野においてよく知られている。特定のハイブリダイゼーション条件の組の選択は、当分野の標準的方法に従って選択することができる例えば、Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,1989ColdSpringHarbor,N.Y.を参照されたい。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を行うために含まれる。内因性α-チューブリンアイソフォーム1Bタンパク質のタグ付け。内因性α-チューブリンアイソフォーム1Bタンパク質を、ZFN誘導相同組換えを使用して、GFPでタグ付けした。要するに、ZFNを使用して、TUBA1B遺伝子座によりコードされる、α-チューブリンアイソフォーム1Bタンパク質をコードする染色体領域内に、二本鎖切断を導入した。二本鎖切断は、染色体内へのGFPコード領域のインテグレーションを引き起こす、TUBA1B遺伝子座染色体領域と相同である核酸配列に挟まれたGFPコード配列を含むドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導する。ドナーポリヌクレオチドを構築して、N末端においてGFPでタグ付けされたタンパク質を生成するために、α-チューブリンアイソフォーム1Bコード配列とインフレームでGFPタグを融合した。GFPタグ付きα-チューブリンアイソフォーム1Bタンパク質を、内因性チューブリンプロモーターの制御下で発現させた。一対のZFNが、TUBA1B標的部位内へのタグの標的化インテグレーションのために設計された。さらなる情報は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、Science2009325:433を参照されたい。細胞のZFN処理プールにおける、標的化ZFNペア二本鎖切断発生の頻度を、Cel-1ヌクレアーゼアッセイを使用することにより決定した。このアッセイは、ZFN誘導DNA二本鎖切断の非相同末端結合NHEJ介在性の不完全な修復の結果として、野生型から逸脱する、標的遺伝子座のアレルalleleを検出する。ZFN処理細胞のプールからの標的化領域のPCR増幅は、WTおよび変異アンプリコンの混合物を生成する。この混合物の融解および再アニーリングは、WTおよび変異アレルのヘテロ二重鎖間で生じるミスマッチを引き起こす。ミスマッチの部位で形成されたDNAバブルは、サーベイヤーヌクレアーゼsurveyornucleaseCel-1により切断され、切断産物がゲル電気泳動により確認できる。親バンドと比較した切断産物の相対強度が、ヘテロ二重鎖のCel-1切断のレベルの測定量である。これは、同様に、その後にNHEJによって不完全な修復を受けた内因性標的遺伝子座のZFN介在切断の頻度を反映する。α-チューブリンアイソフォーム1Bタンパク質にタグを付けるために使用されるZFNペアのため、一方のZFNは5’CTTCGCCTCCTAATC3’配列番号1配列に結合するように設計され、他方のZFNは5’CACTATGGTGAGTAA3’配列番号2配列に結合するように設計された図1A。次いで、ZFNペアをコードする、キャップされポリアデニル化されたmRNAを公知の分子生物学的手法を用いて生成した。結合するとすぐに、ZFNペアは、相同組換えを誘導するために、認識部位間のCCTAGC染色体配列内に二本鎖切断を導入する図1Aおよび1B。U2OSヒト細胞株のTUBA1B遺伝子座内へのGFPタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミド図2が構築された。該プラスミドは、1Kbおよび700塩基対の、ZFNペアにより導入される切断部位の上流および下流のTUBA1B遺伝子座配列に挟まれたGFPコード配列を含んだ図1CおよびD。該プラスミドにおけるタグ配列は、TUBA1B遺伝子座が発現された場合、図1Eで詳述されるように、N末端でGFPタグに融合されたα-チューブリンアイソフォーム1Bタンパク質が生成されるような方法で、上流および下流のTUBA1B遺伝子座に融合された。GFP-チューブリン融合はまた、GFPコード配列が導入された、TUBA1B遺伝子座の第一エキソンのスプライスシグナルsplicesignalが、無傷intactのままであるように、設計された。U2OS細胞におけるチューブリンのタグ付け。ドナープラスミドおよびZFNをコードするRNAのペアを、U2OS、A549、K562、HEK293、MCF10a、またはHEK293T細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のZFNRNAに対し、一部のドナーDNAを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。37°Cおよび30°Cで実行されるジャンクションPCRを用いて、ドナーDNAがチューブリンTUBA1B遺伝子座にインテグレートされたことを確認した。図3に示されるように、GFP2配列がU2OS細胞においてTUBA1B遺伝子座内へインテグレートされたことを、配列解析で確認した配列番号4。U2OS細胞でTUBA1B領域において確認されたRFP配列のインテグレーションは、図4に示される配列番号5。右ジャンクションを挟むプライマーを使用するPCR解析でインテグレーションを確認した。このために、100ngの鋳型DNAを、25μl反応混合液内で増幅した26サイクルの95°C、5分;95°C、30秒;51°C、30秒;70°C、1.1分;70°C、7分;4°C、ホールド。図5は、14細胞クローンがGFPインテグレーションを示すPCR断片サイズを含んでいたことを示す。次いで、蛍光顕微鏡を用いて、GFPタグ付きα-チューブリンアイソフォーム1Bタンパク質を視覚化した、U2OS細胞図6A-C、A549細胞図6D-E、K562細胞図6FおよびHEK293細胞図6G-H。MCF10a細胞株におけるチューブリンのタグ付け。MCF10aヒト細胞株のTUBA1B遺伝子座内へのRFPタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミド図7が構築された。MCF10a細胞株のTUBA1B遺伝子座内へのRFPタグインテグレーションは、チューブリンプライマー5’CCCCTCCGCAGCCGCTACT3’配列番号6;tub80Uおよび5’GGACCGCACCCAGGACACAGT3’配列番号7;tub511Lを使用する、ゲノムPCRおよびジャンクションPCRにより検証した。ゲノムPCRおよびサザンブロッティングは、数個のクローンにおけるTUBA1B内へのRFPタグのインテグレーションを示した図8。MCF10a細胞株におけるTUBA1B遺伝子座内へのタグ配列のインテグレーションを確認する配列解析が、図9配列番号8に示される。トランスフェクトされたMCF10aのクローン5が、さらなる検証のために選択された図10。RFPインテグレーションのジャンプスタートJumpstartPCR検証において:95ngのゲノムDNAMCF10a細胞の野生型およびクローン5、ならびにU2OS細胞の野生型およびクローン9、5が増幅されたtub80Uプライマーおよびtub522Lプライマーを用いて、35X、69°Cでアニーリングかつ72°Cで伸長。トランスフェクトされたMCF10aクローン5はインテグレートされた配列を有することが確認された図10を参照されたい。MCF10aクローン5の左ジャンクションおよび右ジャンクションのサイズは、RFP特異的プライマーおよびチューブリン特異的プライマーを用いて確認され、それぞれ、452塩基対および408塩基対の予測されたサイズであることがわかった図11。RFP-チューブリンタンパク質の発現はウェスタンブロッティングを通して検証された図12。ブロットは、抗-RFP抗体または抗-チューブリン抗体のいずれかを用いて調べられた。RFP発現もまた蛍光顕微鏡で観察され、内因性TUBA1B発現と共存することが観察された図13。トランスフェクトされたMCF10a細胞の成長特性を親細胞株と比較した。トランスフェクトされたMCF10a細胞の倍化時間doublingtimeは、親細胞株のものの/-20であった。トランスフェクトされたMCF10a細胞の表現型安定性を評価した。8週かつ16分割後、99の細胞がRFPシグナルを維持したことが観察された表1。蛍光顕微鏡でMCF10aクローン5細胞におけるRFPタグ付きチューブリンの発現を確認した図14。STAT3によりコードされるシグナル伝達性転写活性化因子3タンパク質へのタグ付けの試み。GFPまたはRFPタグ付きのSTAT3によりコードされるシグナル伝達性転写活性化因子3タンパク質の生成への試みは成功しなかった。シグナル伝達性タンパク質のN末端に融合されたGFPまたはRFPをコードするポリヌクレオチドを挟む、上流および下流STAT3遺伝子座配列を含むドナープラスミドが生成された図15。ZFNは上記の実施例に記載されるように設計された。一方のZFNは5’AGCTACAGCAGCTTG3’配列番号9配列に結合するように設計され、もう一方のZFNは、STAT3遺伝子座を含み、5’CGGTACCTGGAGCAG3’配列番号10配列に結合するように設計された図16。上述のCel-1アッセイを用いて、ZFNペアが適切な部位でSTAT3遺伝子座を効率よく切断することを確認した図17。ドナープラスミドおよびZFNをコードするRNAのペア図18を、細胞にトランスフェクトした。蛍光活性化セルソーティングFACS解析では、蛍光シグナルは全く検出されず、それゆえ、標的化インテグレーションは成功しなかった図19。これらの結果は、β-アクチンタンパク質をコードするACTB遺伝子座での、GFPおよびRFPをコードするタグ配列の標的化インテグレーションを検出すると同時に、STAT3遺伝子座内でのGFPのいかなる標的化インテグレーションも検出できなかった、ジャンクションPCRにより確認された図20。それゆえ、たとえ設計されたZFNペアが正しい染色体位置へ二本鎖切断を導入することができても、GFPタグのインテグレーションは達成されなかった。MAPRE3によりコードされる微小管結合タンパク質RP/EBファミリーメンバー3へのタグ付けの試み。GFPタグ付きのMAPRE3によりコードされる微小管結合タンパク質RP/EBファミリーメンバー3の生成への試みは成功しなかった。第一に、N末端での微小管結合タンパク質のタグ付けが試みられた。上記実施例1に記載されるように、多重ZFNを設計して、微小管結合タンパク質のN末端でタグ配列をインテグレートした。MAPRE3のN末端付近で染色体DNAの切断に成功したZFNが見出されたペア6/8および16/17;図22および表2。しかしながら、所望のタグ付き融合タンパク質を生成するために適した位置で染色体を切断したZFNペアはなかった。N末端での微小管結合タンパク質のタグ付けが成功しなかったので、C末端での該タンパク質のタグ付けが試みられた。多重ZFNを設計して、微小管結合タンパク質のC末端でタグ配列をインテグレートした。対照として、ZFNペアを設計して、ラミンタンパク質のN末端でタグ配列をインテグレートした図23および表4。一つのZFNペアが、MAPRE3のC末端またはその付近で染色体DNAの切断に成功したことが見出されたペア31/32;図23および表3。このペアにおいて、一方のZFNは5’TTCCTCTCTCTCCCAC3’配列番号11配列に結合するように設計され、もう一方のZFNは、MAPRE3遺伝子座を含み、5’AGGAAGGATTCGCAC3’配列番号12配列に結合するように設計された。GFPをコードするポリヌクレオチドを挟む、上流および下流MAPRE3遺伝子座配列を含むプラスミドが生成された図21。ドナープラスミドおよびZFNをコードするRNAの31/32ペアを細胞内にトランスフェクションし、ジャンクションPCRによりMAPRE3遺伝子座内のGFPタグの予想される挿入が示された図24。しかしながら、FACS解析では蛍光シグナルは全く検出されず、それゆえ標的化インテグレーションは成功しなかった図25。内因性β-アクチンタンパク質のタグ付け。内因性β-アクチンタンパク質を、ZFN誘導相同組換えを使用してタグ付けした。要するに、ZFNを使用して、ACTB遺伝子座によりコードされる、β-アクチンをコードする染色体領域内に、二本鎖切断を導入した。二本鎖切断は、染色体内へのGFPコード領域のインテグレーションを引き起こす、ACTB遺伝子座染色体領域と相同である核酸配列に挟まれたGFPコード配列を含むドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導する。ドナーポリヌクレオチド図28を構築して、N末端においてGFPでタグ付けされたタンパク質図26Dを生成するために、β-アクチンコード配列図26、v.2とインフレームでGFPタグをインテグレートした。GFPタグ付きβ-アクチンタンパク質を、内因性アクチンプロモーターの制御下で発現させた。一対のZFNが、上記に詳述されるように、ACTB標的部位内へのタグの標的化インテグレーションのために設計された。β-アクチンタンパク質にタグを付けるために使用されるZFNペアのため、一方のZFNは5’GTCGTCGACAACGGCTCC3’配列番号13配列に結合するように設計され、他方のZFNは5’TGCAAGGCCGGCTTCGCGG3’配列番号14配列に結合するように設計された図26A。結合するとすぐに、ZFNペアは、相同組換えを誘導するために、認識部位間のGGCATG染色体配列内に二本鎖切断を導入する図26Aおよび26B。次いで、ZFNペアをコードする、キャップされポリアデニル化されたmRNAを公知の分子生物学的手法を用いて生成した。細胞のZFN処理プールにおける、標的化ZFNペア二本鎖切断発生の頻度を、Cel-1ヌクレアーゼアッセイを使用することにより決定した図27。このアッセイは、ZFN誘導DNA二本鎖切断の非相同末端結合NHEJ介在性の不完全な修復の結果として、野生型から逸脱する、標的遺伝子座のアレルを検出する。ZFN処理細胞のプールからの標的化領域のPCR増幅は、WTおよび変異アンプリコンの混合物を生成する。この混合物の融解および再アニーリングは、WTおよび変異アレルのヘテロ二重鎖間で生じるミスマッチを引き起こす。ミスマッチの部位で形成されたDNAバブルは、サーベイヤーヌクレアーゼCel-1により切断され、切断産物がゲル電気泳動により確認できる。親バンドと比較した切断産物の相対強度が、ヘテロ二重鎖のCel-1切断のレベルの測定量である。これは、同様に、その後にNHEJによって不完全な修復を受けた内因性標的遺伝子座のZFN介在切断の頻度を反映する。ヒト細胞株のACTB遺伝子座内へのGFPタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミド図28が構築された。該プラスミドは、861および593ヌクレオチドの、ZFNペアにより導入される切断部位の上流および下流のACTB遺伝子座配列に挟まれたGFPコード配列を含んだ図26C。該プラスミドにおけるタグ配列は、ACTB遺伝子座が発現された場合、図26Dで詳述されるように、N末端でGFPタグに融合されたβ-アクチンタンパク質が生成されるような方法で、上流および下流のACTB遺伝子座に融合された。GFP-アクチン融合はまた、GFPコード配列が導入された、ACTB遺伝子座の第一エキソンのスプライスシグナルsplicesignalが、無傷intactのままであるように、設計された。ドナープラスミドおよびZFNをコードするRNAのペアを、細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のZFNRNAに対し、一部のドナーDNAを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。蛍光顕微鏡を用いて、GFPタグ付きβ-アクチンタンパク質を視覚化した図29。U2OS細胞内のGFP2インテグレーションを備えるACTB遺伝子座の確認された配列は、図30に示される配列番号16。U2OS細胞内のRFPインテグレーションを備えるACTB遺伝子座の確認された配列は、図31に示される配列番号17。2Aペプチドを利用するGFPタグ付きβ-アクチン。β-アクチンはまた、β-アクチンの最初の15アミノ酸をコードする核酸配列を、代替のコドン使用を有する核酸配列で同時に置換しながら、N末端においてGFPでタグ付けされる。GFPと翻訳的に融合された全長β-アクチンをもたらすであろう、タグ配列をZFN切断部位図26、V.1付近でインテグレートするために、β-アクチンの最初の15アミノ酸が変更された、新たなドナープラスミドが構築された図32。該ドナープラスミドは、順に、3アラニンアミノ酸リンカーを介して、代替コドンによりコードされるβ-アクチンの最初の15アミノ酸に融合される、GFPに融合した2aペプチドをコードするポリヌクレオチドを挟む、上流および下流ACTB遺伝子座配列を含んだ図33。2aペプチドの共翻訳切断co-translationalcleavageは、新しいコドンによりコードされるβ-アクチンの最初の15アミノ酸を除き、N末端においてGFPでタグ付けされたβ-アクチンを生成する図26D。ZFNは実施例4に記載されるとおりであった。ドナープラスミド、およびZFNをコードするRNAのペアを細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のZFNRNAに対し、一部のドナーDNAを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。蛍光顕微鏡を用いて、GFPタグ付きβ-アクチンタンパク質の発現を確認した図29。内因性ラミンB1タンパク質のタグ付け。内因性ラミンB1タンパク質を、ZFN誘導相同組換えを使用して、GFPでタグ付けした。要するに、ZFNを使用して、LMNB1遺伝子座によりコードされる、ラミンB1をコードする染色体領域内に、二本鎖切断を導入した。二本鎖切断は、染色体内へのGFPコード領域のインテグレーションを引き起こす、LMNB1遺伝子座染色体領域と相同である核酸配列に挟まれたGFPコード配列を含むドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導する。ドナーポリヌクレオチドを構築して、N末端においてGFPでタグ付けされたタンパク質を生成するために、ラミンB1コード配列とインフレームでGFPタグを融合した。GFPタグ付きラミンB1タンパク質を、内因性ラミンプロモーターの制御下で発現させた。一対のZFNが上述のように設計された。細胞のZFN処理プールにおける、標的化ZFNペア二本鎖切断発生の頻度を、Cel-1ヌクレアーゼアッセイを使用することにより決定した。ラミンB1タンパク質にタグを付けるために使用されるZFNペアのため、一方のZFNは5’CCTCGCCGCCCCGCT3’配列番号18配列に結合するように設計され、他方のZFNは5’GCCGCCCGCCATGGCG3’配列番号19配列に結合するように設計された図34A。結合するとすぐに、ZFNペアは、相同組換えを誘導するために、認識部位間のGTCTCC染色体配列内に二本鎖切断を導入する図34Aおよび34B。次いで、ZFNペアをコードする、キャップされポリアデニル化されたmRNAを公知の分子生物学的手法を用いて生成した。U2OSヒト細胞株のLMNB1遺伝子座内へのGFPタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミドが構築された。該プラスミドは、633塩基対および629塩基対の、ZFNペアによって導入される切断部位の上流および下流のLMNB1遺伝子座配列に挟まれたGFPコード配列を含んだ図34Cおよび34D。該プラスミドにおけるタグ配列は、LMNB1遺伝子座が発現された場合、図34Eで詳述されるように、N末端でGFPタグに融合されたラミンB1タンパク質が生成されるような方法で、上流および下流のLMNB1遺伝子座に融合された。ドナープラスミド、およびZFNをコードするRNAのペアを細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のZFNRNAに対し、一部のドナーDNAを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。37°Cおよび30°Cで実行されるジャンクションPCRを用いて、ドナーDNAがLMNB1遺伝子座にインテグレートされたことを確認した。次いで、蛍光顕微鏡を用いて、GFPタグ付きラミンB1タンパク質を視覚化した図35。U2OS細胞内のラミンコード領域におけるGFP2のインテグレーション部位で確認された配列は、図36に示される配列番号21。RFPコード配列を含みラミン配列を挟むドナープラスミド、およびZFNをコードするRNAのペアを、線維芽細胞または他の細胞型から生成された人工多能性幹細胞である、iPS細胞にもトランスフェクトした。RFPタグ付きラミンを含むiPS細胞の画像は図37に示される。内因性HER2タンパク質のタグ付け。内因性HER2タンパク質を、ZFN誘導相同組換えを使用して、GFPでタグ付けした。要するに、ZFNを使用して、ERBB2遺伝子座によりコードされる、HER2をコードする染色体領域内に、二本鎖切断を導入した。二本鎖切断は、染色体内へのGFPコード領域のインテグレーションを引き起こす、ERBB2遺伝子座染色体領域と相同である核酸配列に挟まれたGFPコード配列を含むドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導する。ドナーポリヌクレオチドを構築して、N末端においてGFPでタグ付けされたタンパク質を生成するために、HER2コード配列とインフレームでGFPタグを融合した。GFPタグ付きHER2タンパク質を、内因性ERBB2プロモーターの制御下で発現させた。一対のZFNが上述のように設計された。細胞のZFN処理プールにおける、標的化ZFNペア二本鎖切断発生の頻度を、Cel-1ヌクレアーゼアッセイを使用することにより決定した。HER2タンパク質にタグを付けるために使用されるZFNペアのため、一方のZFNは5’TACCTGGGTCTGGAC3’配列番号22配列に結合するように設計され、他方のZFNは5’AGTGTGAACCAGAAGGCC3’配列番号23配列に結合するように設計された。結合するとすぐに、ZFNペアは、相同組換えを誘導するために、認識部位間のGTGCC染色体配列内に二本鎖切断を導入する図38。次いで、ZFNペアをコードする、キャップされポリアデニル化されたmRNAを公知の分子生物学的手法を用いて生成した。ERBB2遺伝子座内へのGFPタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミドが構築された図39。該プラスミドにおけるタグ配列は、ERBB2遺伝子座が発現された場合、N末端でGFPタグに融合されたHER2タンパク質が生成されるような方法で、上流および下流のERBB2遺伝子座に融合された。ドナープラスミド、およびZFNをコードするRNAのペアをSKOV3細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のZFNRNAに対し、一部のドナーDNAを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。37°Cおよび30°Cで実行されるジャンクションPCRを用いて、ドナーDNAがトランスフェクトされたSKOV3細胞内のERBB2遺伝子座にインテグレートされたことを確認した図40。次いで、蛍光顕微鏡を用いて、GFPタグ付きHER2タンパク質を視覚化した図41。内因性HMGAタンパク質のタグ付け。HMGAタンパク質を、ZFN誘導相同組換えを使用して、GFPでタグ付けした。要するに、ZFNを使用して、HMGA1遺伝子座によりコードされる、HMGAをコードする染色体領域内に、二本鎖切断を導入した。二本鎖切断は、染色体内へのGFPコード領域のインテグレーションを引き起こす、HMGA1遺伝子座染色体領域と相同である核酸配列に挟まれたGFPコード配列を含むドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導する。ドナーポリヌクレオチドを構築して、N末端においてGFPでタグ付けされたタンパク質を生成するために、HMGA1コード配列とインフレームでGFPタグを融合した。GFPタグ付きHMGA1タンパク質を、内因性HMGA1プロモーターの制御下で発現させた。内因性HMG1タンパク質にタグを付けるため、一対のZFNが上述のように設計された。一方のZFNは5’CACACCAACAACTGCCCA3’配列番号25配列に結合するように設計され、他方のZFNは5’GGAGAAGGAGGAAGA3’配列番号26配列に結合するように設計された図42。結合するとすぐに、ZFNペアは、相同組換えを誘導するために、認識部位間のCCTCACA染色体配列内に二本鎖切断を導入する図44。次いで、ZFNペアをコードする、キャップされポリアデニル化されたmRNAを公知の分子生物学的手法を用いて生成した。HMGA1遺伝子座内へのGFPタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミドが構築された図43。該プラスミドは、806塩基対および747塩基対の、ZFNペアによって導入される切断部位の上流および下流のHMGA1遺伝子座配列に挟まれたGFPコード配列を含めた図43。該プラスミドにおけるタグ配列は、HMGA1遺伝子座が発現された場合、N末端でGFPタグに融合されたHMGAタンパク質が生成されるような方法で、上流および下流のHMGA1遺伝子座に融合された。ドナープラスミド、およびZFNをコードするRNAのペアをU2OS細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のZFNRNAに対し、一部のドナーDNAを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。ゲノムPCRおよびサザンブロッティングは、選択されたクローンにおけるHMGA1遺伝子座内へのタグ配列のインテグレーションを示した図44Aおよび図44B。配列解析で標的とされる染色体領域内へのインテグレーションを確認した図45配列番号28。次いで、蛍光顕微鏡を用いて、GFPタグ付きHMGA1タンパク質を視覚化した図46。"