"細胞集団のうち、85超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している、細胞集団。細胞集団のうち、85超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している、細胞集団を生成する方法であって、a.多能性幹細胞集団を培養する工程、及びb.多能性幹細胞集団を、無血清であり、BSAと、インスリン及びIGF-1からなる群から選択される因子と、を添加した培地で、85超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程を含む、方法。前記多能性幹細胞集団を、アクチビンAとWntリガンドを用い、細胞集団のうち85超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化させる、請求項2に記載の方法。前記多能性幹細胞集団を、GDF-8と、アニリン-ピリジノトリアジン、環状アニリン-ピリジノトリアジン、N-{[1-フェニルメチルアゼパン-4-イル]メチル}-2-ピリジン-3-イルアセトアミド、4-{[4-4-{[2-ピリジン-2-イルアミノエチル]アミノ}-1,3,5-トリアジン-2-イルピリジン-2-イル]オキシ}ブタン-1-オール、3-{3-[4-{2-[メチルピリジン-2-イルアミノ]エチル}アミノ-1,3,5-トリアジン-2-イル]ピリジン-2-イル}アミノプロパン1-オール、N~4~-[2-3-フルオロフェニルエチル]-N~2~-[3-4-メチルピペラジン-1-イルプロピル]ピリド[2,3-d]ピリミジン-2,4-ジアミン、1-メチル-N-[4-ピリジン-3-イル-2-{[3-トリフルオロメチルフェニル]アミノ}-1,3-チアゾール-5-イルメチル]ピペリジン-4-カルボキサミド、1,1-ジメチルエチル{2-[4-{5-[3-3-ヒドロキシプロピルフェニル]-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル}アミノフェニル]エチル}カルバマート、1,1-ジメチルエチル{[3-{5-[5-3-ヒドロキシプロピル-2-メチルオキシフェニル]-1,3-オキサゾール-2-イル}アミノフェニル]メチル}カルバマート、1-{5-[6-{4-[4-メチルピペラジン-1-イルスルホニル]フェニル}アミノピラジン-2-イル]チオフェン-2-イル}メチルピペリジン-4-オール、1-{4-[6-{4-[4-メチルピペラジン-1-イルスルホニル]フェニル}アミノピラジン-2-イル]チオフェン-2-イル}メチルピペリジン-4-カルボキサミド、並びに2-{[4-1-メチルエチルフェニル]アミノ}-N-2-チオフェン-2-イルエチル-7,8-ジヒドロピリド[4,3-d]ピリミジン-65H-カルボキサミドからなる群から選択される少なくとも1つの他の因子と、を用い、細胞集団のうち85超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化させる、請求項2に記載の方法。少なくとも1つの他の因子が14-プロパ-2-エン-1-イル-3,5,7,14,17,23,27-ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]ヘプタコサ-125,227,3,5,826,9,11,21,23-ノナエン-16-オンである、請求項4に記載の方法。前記多能性幹細胞を、無血清であり、並びに、BSAと、インスリン及びIGF-1からなる群から選択される因子と、を添加した培地で、少なくとも6日間分化させる、請求項2に記載の方法。前記多能性幹細胞を、無血清であり、並びに、BSAと、インスリン及びIGF-1からなる群から選択される因子と、を添加した培地で、少なくとも7日間分化させる、請求項2に記載の方法。よりβ細胞に類似している、機能性のインスリン発現細胞を生成するためのinvitro法の開発が未だに強く求められている。本発明は、細胞集団の85超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を生成することにより、ヒト胚性幹細胞からの、インスリンを発現する細胞への分化効率を改善させるという代替アプローチを取る。一実施形態では、本発明は、細胞集団を提供し、この細胞集団のうち、85超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している。一実施形態では、多能性幹細胞集団は、BSAと、インスリン及びIGF-1からなる群から選択される因子とを添加した培地中で多能性幹細胞を培養することにより、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化する。一実施形態では、多能性幹細胞集団の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団への分化は、多能性幹細胞をアクチビンA及びWntリガンドにより活性化処理することで実施される。一実施形態では、多能性幹細胞集団の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団への分化は、多能性幹細胞を、GDF-8と、次のもの:アニリン-ピリジノトリアジン、環状アニリン-ピリジノトリアジン、N-{[1-フェニルメチルアゼパン-4-イル]メチル}-2-ピリジン-3-イルアセトアミド、4-{[4-4-{[2-ピリジン-2-イルアミノエチル]アミノ}-1,3,5-トリアジン-2-イルピリジン-2-イル]オキシ}ブタン-1-オール、3-{3-[4-{2-[メチルピリジン-2-イルアミノ]エチル}アミノ-1,3,5-トリアジン-2-イル]ピリジン-2-イル}アミノプロパン1-オール、N~4~-[2-3-フルオロフェニルエチル]-N~2~-[3-4-メチルピペラジン-1-イルプロピル]ピリド[2,3-d]ピリミジン-2,4-ジアミン、1-メチル-N-[4-ピリジン-3-イル-2-{[3-トリフルオロメチルフェニル]アミノ}-1,3-チアゾール-5-イルメチル]ピペリジン-4-カルボキサミド、1,1-ジメチルエチル{2-[4-{5-[3-3-ヒドロキシプロピルフェニル]-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル}アミノフェニル]エチル}カルバマート、1,1-ジメチルエチル{[3-{5-[5-3-ヒドロキシプロピル-2-メチルオキシフェニル]-1,3-オキサゾール-2-イル}アミノフェニル]メチル}カルバマート、1-{5-[6-{4-[4-メチルピペラジン-1-イルスルホニル]フェニル}アミノピラジン-2-イル]チオフェン-2-イル}メチルピペリジン-4-オール、1-{4-[6-{4-[4-メチルピペラジン-1-イルスルホニル]フェニル}アミノピラジン-2-イル]チオフェン-2-イル}メチルピペリジン-4-カルボキサミド、並びに2-{[4-1-メチルエチルフェニル]アミノ}-N-2-チオフェン-2-イルエチル-7,8-ジヒドロピリド[4,3-d]ピリミジン-65H-カルボキサミド、からなる群から選択される少なくとも1つのGDF-8以外の因子とで処理することで実施される。開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、発明を実施するための形態を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を説明又は例示する下記の小項目に分割する。定義幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し、分化して後代細胞を生成するという、これらの両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉層内胚葉、中胚葉及び外胚葉から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉層の組織を生じ、胚盤胞への注入後、すべてではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。幹細胞は、発生能によって、1全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、2全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、3細胞系の小集合を生じるが、すべて特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じる能力を意味する複能性例えば、造血幹細胞HSCは、HSC自己再生、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素例えば、血小板を含む後代を産生できる、4複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系統の小集合を生じる能力を意味する寡能性、並びに51つの細胞系例えば、精子形成幹細胞を生じる能力を意味する単能性に分類される。分化は、専門化されていない中立の又は比較的専門化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの専門化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化誘導した細胞は、細胞系内でより専門化された分化決定された状況を示す細胞である。分化プロセスに適用した際の用語傾倒したは、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系統内で比較的特殊化されて又は傾倒していない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系統は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞に由来するか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系とは、発生及び分化の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。本明細書で使用するとき、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞又はステージ1細胞又はステージ1とは、以下のマーカー、すなわち、SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、短尾奇形、Mix-様ホメオボックスタンパク質、FGF4、CD48、eomesoderminEOMES、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99、又はOTX2のうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。本明細書で使用するとき、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞とは、以下のマーカー、すなわち、PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9、又はPROX1のうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。膵内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。本明細書で使用するとき、胚体内胚葉は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99、及びMIXL1を発現する。本明細書で使用するときマーカーとは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出限界は、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。本明細書で使用するとき、膵臓内分泌細胞又は膵臓ホルモン発現細胞又は膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することが可能な細胞を指す。多能性幹細胞の単離、増殖及び培養多能性幹細胞の特徴付け多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原SSEA3及び4、並びにTra-1-60及びTra-1-81と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの1つ以上を発現するThomsonら、Science282:1145,1998。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、SSEA-4、Tra-1-60、及びTra-1-81の発現が減少し存在する場合、SSEA-1の発現が上昇する。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を4パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者VectorLaboratoriesBurlingameCalif.によって記載されるようにVectorRedを基質として現像することによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有しする。未分化の多能性幹細胞はまた、RT-PCRにより検出されるように、一般にOCT4及びTERTも発現する。増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、3つの胚葉のすべて、すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば細胞を重症複合型免疫不全症SCIDマウスに注入し、4パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、それらを3つの胚葉由来の細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を3つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なGバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は正常な核型を有することが望ましく、正常な核型とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がすべて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性幹細胞の供給源使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期必ずしもではないが、通常は妊娠約10~12週よりも前に採取した前胚性組織例えば胚盤胞など、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例としては、例えばヒト胚性幹細胞株H1、H7及びH9WiCellなどのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株が挙げられる。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される1次多能性細胞である。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、BG01vBresaGen,Athens,GAなどの変異型ヒト胚幹細胞株も好適である。一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Thomsonらに開示される方法の通りに調製される米国特許第5,843,780号;Science282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff.,1998;Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:7844,1995。多能性幹細胞の培養一実施形態において、多能性幹細胞は、フィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。代替的に、多能性幹細胞は、基本的にフィーダー細胞が存在しないにも関わらず、ほぼ分化を受けないで多能性幹細胞の増殖を支持する培養液システム中で培養される。多能性幹細胞を分化させずに無フィーダー培養液中で増殖させる際には、以前に他の細胞種を予め培養しておいて馴化させた培地を使用することでこの操作が支持される。代替的に、多能性幹細胞を無フィーダー培養液中で分化させずに増殖させる際は、合成培地を使用することでこの操作が支持される。一実施形態において、多能性幹細胞は、ReubinoffらNatureBiotechnology18:399~4042000に開示されている方法に従って、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Thompsonらに開示されている方法に従ってマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよいScience6November1998:Vol.282.no.5391,pp.1145~1147。あるいは、多能性幹細胞は、RichardsらStemCells21:546~556,2003に開示されているフィーダー細胞層の任意の1つの上で培養されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞は、WangらStemCells23:1221~1227,2005に開示されている方法に従って、ヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。代替実施形態では、多能性幹細胞は、StojkovicらStemCells200523:306~314,2005に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、MiyamotoらStemCells22:433~440,2004に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、AmitらBiol.Reprod68:2150~2156,2003に開示されるヒトフィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、InzunzaらStemCells23:544~549,2005に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞は、米国特許出願公開第2002/0072117号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第6642048号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第2005014799に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、XuらStemCells22:972~980,2004に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2007/0010011号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0233446号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第6800480号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第2005065354号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞は、CheonらBioReprodDOI:10.1095/biolreprod.105.046870,October19,2005に開示される方法に従って培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、LevensteinらStemCells24:568~574,2006に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0148070号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0244962号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第2005086845号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。一実施形態において、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体-リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリクス成分である。一実施形態において、好適な培養基材はMATRIGEL登録商標BectonDickensonである。MATRIGEL登録商標は、Engelbreth-HolmSwarm腫瘍細胞由来の可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。他の細胞外マトリクス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な希釈率にて播かれてもよい。これらの特徴のすべては、播種分布に細心の注意を払うことで利益を得られるものであり、当業者は容易に決定することができる。好適な培地は、以下の成分、すなわち例えば、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、Gibco11965-092;ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地KODMEM、Gibco10829-018;ハムF12/50DMEM基本培地;200mML-グルタミン、Gibco15039-027;非必須アミノ酸溶液、Gibco11140-050;β-メルカプトエタノール、SigmaM7522;ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF、Gibco13256-029等から調製することもできる。多能性幹細胞からの胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の生成本発明は、多能性幹細胞集団からの、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団の生成方法を提供する。一実施形態では、本発明は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系マーカーを発現する細胞へと更に分化させる方法を提供する。一実施形態では、この操作は、段階的分化プロトコルを用いて実施される。このプロトコルでは、まず始めに、多能性幹細胞集団は胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化される。次に、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団は膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化される。次に、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団は膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化される。本発明は、85超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を提供する。この細胞集団は更に処理されて、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を生成してもよい。この膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団は更に処理されて、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を生成してもよい。分化の効率は、処理した細胞集団を、所望の細胞型に特徴的なマーカーを発現している細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する作用剤例えば、抗体などに暴露することにより測定することができる。培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。この方法としては、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR、ノーザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelら、eds.2001supplementを参照されたい、並びにイムノアッセイ、例えば、免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティング、及びインタクトな細胞で利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析FACS例えば、Harlow及びLane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress1998参照が挙げられる。多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81の1つ以上の発現が挙げられる。多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現される、例えばCXCR4等のタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤例えば、抗体等に暴露することにより、分化した細胞を精製することができる。本発明で用いるのに好適な多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞株H9NIHコード:WA09、ヒト胚性幹細胞株H1NIHコード:WA01、ヒト胚性幹細胞株H7NIHコード:WA07、及びヒト胚性幹細胞株SA002Cellartis,Swedenが挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すなわち、ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、及びTra1-81のうちの少なくとも1つを発現する細胞も本発明で用いるのに好適である。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、短尾奇形、Mix様ホメオボックスタンパク質、FGF4、CD48、エオメソダーミンEOMES、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99、及びOTX2からなる群から選択される。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞は本発明での使用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。膵内胚葉系に特徴的なマーカーは、PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9、及びPROX1からなる群から選択される。膵内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。膵内分泌系に特徴的なマーカーは、NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、NGN3、及びPTF1αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することができる。本発明で使用するに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも1つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、PDX1と、以下の転写因子、すなわち、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4、及びPAX6のうちの少なくとも1つを発現している。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞である。多能性幹細胞からの胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の生成本発明の一態様では、多能性幹細胞を、無血清であり、かつBSAと、インスリン及びIGF-1からなる群から選択される因子とを添加した培地で培養することで、多能性幹細胞集団を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化させることができる。一実施形態では、多能性幹細胞集団の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団への分化は、多能性幹細胞をアクチビンA及びWntリガンドにより活性化処理することで実施される。別の実施形態では、多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団への分化は、GDF-8と、次の:アニリン-ピリジノトリアジン、環状アニリン-ピリジノトリアジン、N-{[1-フェニルメチルアゼパン-4-イル]メチル}-2-ピリジン-3-イルアセトアミド、4-{[4-4-{[2-ピリジン-2-イルアミノエチル]アミノ}-1,3,5-トリアジン-2-イルピリジン-2-イル]オキシ}ブタン-1-オール、3-{3-[4-{2-[メチルピリジン-2-イルアミノ]エチル}アミノ-1,3,5-トリアジン-2-イル]ピリジン-2-イル}アミノプロパン1-オール、N~4~-[2-3-フルオロフェニルエチル]-N-2~-[3-4-メチルピペラジン-1-イルプロピル]ピリド[2,3-d]ピリミジン-2,4-ジアミン、1-メチル-N-[4-ピリジン-3-イル-2-{[3-トリフルオロメチルフェニル]アミノ}-1,3-チアゾール-5-イルメチル]ピペリジン-4-カルボキサミド、1,1-ジメチルエチル{2-[4-{5-[3-3-ヒドロキシプロピルフェニル]-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル}アミノフェニル]エチル}カルバマート、1,1-ジメチルエチル{[3-{5-[5-3-ヒドロキシプロピル-2-メチルオキシフェニル]-1,3-オキサゾール-2-イル}アミノフェニル]メチル}カルバマート、1-{5-[6-{4-[4-メチルピペラジン-1-イルスルホニル]フェニル}アミノピラジン-2-イル]チオフェン-2-イル}メチルピペリジン-4-オール、1-{4-[6-{4-[4-メチルピペラジン-1-イルスルホニル]フェニル}アミノピラジン-2-イル]チオフェン-2-イル}メチルピペリジン-4-カルボキサミド、及び2-{[4-1-メチルエチルフェニル]アミノ}-N-2-チオフェン-2-イルエチル-7,8-ジヒドロピリド[4,3-d]ピリミジン-65H-カルボキサミドからなる群から選択される少なくとも1つの他の因子とで多能性幹細胞を処理することで実施される。使用に好適な因子の例は、米国特許出願公開第12/494,789号に見ることができる。一実施形態では、少なくとも1つの他の因子は14-プロパ-2-エン-1-イル-3,5,7,14,17,23,27-ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]ヘプタコサ-125,227,3,5,826,9,11,21,23-ノナエン-16-オンである。多能性幹細胞集団は、無血清であり、かつBSAと、インスリン及びIGF-1からなる群から選択される因子とを添加した培地で約1日~約7日培養され得る。あるいは、多能性幹細胞集団は、無血清であり、かつBSAと、インスリン及びIGF-1からなる群から選択される因子とを添加した培地で約1日~約6日培養され得る。あるいは、多能性幹細胞集団は、無血清であり、かつBSAと、インスリン及びIGF-1からなる群から選択される因子とを添加した培地で約1日~約5日培養され得る。あるいは、多能性幹細胞集団は、無血清であり、かつBSAと、インスリン及びIGF-1からなる群から選択される因子とを添加した培地で約1日~約4日培養され得る。あるいは、多能性幹細胞集団は、無血清であり、かつBSAと、インスリン及びIGF-1からなる群から選択される因子とを添加した培地で約4日培養され得る。一実施形態では、GDF-8は約5ng/mL~約500ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、GDF-8は約5ng/mL~約50ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、GDF-8は約5ng/mL~約25ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、GDF-8は約25ng/mLの濃度で使用される。アクチビン-Aは、約1pg/mL~約100μg/mLの濃度で使用されてもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約1pg/mL~約1μg/mLであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約1pg/mL~約100ng/mLであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約50ng/mL~約100ng/mLであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約100ng/mLであってもよい。Wntリガンドは、Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a及びWnt-7aからなる群より選択されてもよい。一実施形態において、Wntリガンドは、Wnt-1である。代替的な実施形態において、Wntリガンドは、Wnt-3aである。Wntリガンドは、約1ng/mL~約1000ng/mLの濃度で使用されてもよい。代替実施形態では、Wntリガンドは、約10ng/mL~約100ng/mLの濃度で使用されてもよい。一実施形態では、Wntリガンドの濃度は約20ng/mLである。一実施形態では、インスリンは約1ng/mL~約100ng/mLの濃度で使用される。一実施形態では、IGF-1は、約1ng/mL~約200ng/mLの濃度で使用される。膵内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の生成一実施形態では、本発明の方法により生成された胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団は、当該技術分野の任意の方法により、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと更に分化する。例えば、本発明の方法に従って得られた胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団は、D’Amourら、NatureBiotechnology24,1392~14012006に開示される方法に従って処理することで、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、本発明の方法に従って得られた胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第11/736,908号に開示される方法に従って処理することで、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の生成一実施形態において、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団は、当技術分野における任意の方法により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと更に分化する。例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団は、D’Amourら、NatureBiotechnology,2006に開示されている方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団は、D’Amourら、NatureBiotechnology,2006に開示されている方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団は、米国特許第11/736,908号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、米国特許出願第11/779,311号に開示の方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと更に分化させることもできる。例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団は、米国特許第60/953,178号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団は、米国特許第60/990,529号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと更に分化させることができる。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。実施例1ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化におけるインスリンの役割:クラスタ播種これまでの研究から、高濃度のFBSは、骨髄細胞からの胚体内胚葉DEの形成に有害であることが示されている。例えば、D’Amourら、NatureBiotechnology,2005を参照されたい。この文献では、FBS濃度を10から0.5~2FBSに下げた場合に、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉の誘導率が有意に増加したことを示している。MEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地でのES細胞の培養にあたり、培地に25ng/mLのIGF又は200ng/mLのインスリンと、2FBSとを添加した場合に、アクチビンAによる処理後のSOX17発現が約70減少したという同様の観察結果が報告されている。McLeanら,StemCells25:29~38,2007を参照されたい。観察された阻害効果は、FBS中にインスリン又はIGFが存在したために、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ経路が活性化されたことに起因する可能性が高い。McLeanら,StemCells25:29~38,2007.を参照されたい。PI-3キナーゼシグナル伝達経路を阻害したところ、MEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地で培養したヒトES細胞のうちSox17陽性細胞の割合が増加した。McLeanら,StemCells25:29~38,2007.を参照されたい。これらのデータは、アクチビンAと、低濃度のFBS0.5~2FBSとを含有している培地に、わずか25ng/mLのIGF又は200ng/mLのインスリンを添加することで、胚体内胚葉の形成が阻害され得る可能性があることを示す。FBS中に含まれる一般的なIGF及びインスリン濃度は、それぞれ約70ng/mLJ.Clin.Invest.76:4,1985及び約60ng/mLInVitroCellDevBiol.32:8~12,1996である。これはすなわち、2FBS中には約1.4ng/mLのIGFと、約1.2ng/mLのインスリンが含まれると言い換えられる。ヒト胚性幹細胞株H1p40~p52細胞を、MATRIGEL登録商標1:30希釈BDBiosciences;カタログ番号356231コートしたディッシュ内で、16ng/mLのFGF2カタログ番号100-18B,PeproTech,NJを添加したMEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地中で培養し、次の通りに胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させた:a.2脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IAと100ng/mLアクチビンARDSystems,MNに加え、20ng/mLWNT-3aカタログ番号1324-WN-002,RDSystems,MNを添加したRPMI培地で1日培養し、次にb.2BSAと100ng/mLアクチビンAを添加したRPMI培地で更に3日培養した。一部の培養物では、細胞を次の希釈率のITS-Xカタログ番号51500-056,Invitrogen,CAで処理した:0、1:106、1:5×105、1:105、1:104。ITS-Xは血清代替物であり、1mg/mlインスリン、0.55mg/mlトランスフェリン、0.00067mg/ml亜セレン酸ナトリウム、及び0.2mg/mlのエタノールアミンから構成される。ITS-Xの希釈範囲は、インスリン濃度が0、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL及び100ng/mLになるような範囲に相当する。対照の場合、分化1日目には0.2FBSカタログ番号SH30070.03,Hyclone,UTを用い、2日目には0.5FBSを用い、3~4日目には2FBSを用いた。FBS処理した培養物にはITS-Xは添加しなかった。4日目に、FACS、並びにリアルタイムPCRによる遺伝子発現解析のために試料を回収した。驚くべきことに、図1に示すように、細胞分化用の培地にインスリンを1~100ng/mL添加したところで、胚体内胚葉に関連するマーカーFOXA2、SOX17、及びCXCR4、間葉に関連するマーカーT、Brachとしても既知、又は胚体外胚葉に関連するマーカーSOX7、AFPの発現に有意な影響は見られなかった。更に、2BSAを添加した培地で処理した培養物は、0.5~2FBSを添加した培地で処理した培養物と比べ、胚体内胚葉に関連するマーカーの発現の発現が有意に高かった。これらの観察結果は、各種処理に関しFACSにより測定されたCXCR4及びCD9の発現により更に支持された。図2を参照されたい。これまでに、細胞表面受容体CXCR4は胚体内胚葉マーカーとなることが示されている。CD9は、未分化のES細胞のマーカーである。これらを踏まえると、細胞集団におけるCXCR4の発現増加及びCD9の発現減少は、胚体内胚葉の形成の指標になる。表Iに要約した通り、BSAを添加した培地で処理した細胞は、試験したいずれのインスリン濃度においても、CXCR4又はCD9の発現において有意な変化を示さなかったことが観察された。これらのデータは、インスリンは、試験濃度では、これらの試験で使用した培養培地において分化を阻害しないことを示唆する。実施例2ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化におけるインスリンの役割:MATRIGEL登録商標1:30希釈BDBiosciences;カタログ番号356231コーティングしたディッシュで、ヒト胚性幹細胞株H1の細胞p40~p52を、16ng/mLのFGF2カタログ番号100-18B,PeproTech,NJ及び10μMのY-27632Rock阻害剤、カタログ番号Y0503Sigma、MOを添加したMEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地に、個別の細胞として密度100000個/cm2で播種した。播種の72時間後、培養物を次の通りに胚体内胚葉DEへと分化させた:a.2脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IAと0.0025g/mlの重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187,Sigma,MOと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079,Invitrogen,Caと100ng/mLのアクチビンARDSystems,MNと20ng/mlのWNT-3aカタログ番号1324-WN-002,RDSystems,MNを添加したMCDB-131カタログ番号10372-019,Invitrogen,CA培地で1日培養し、次にb.2BSAと重炭酸ナトリウムとGlutamaxと100ng/mLのアクチビンAを添加したMCDB-131培地で更に3日間培養した。一部の培養物では、細胞を次の濃度のインスリンカタログ番号I9278,Sigma,MOで処理した:0、1、10、100、1000、又は10000ng/mL。4日目に、FACS、並びにリアルタイムPCRによる遺伝子発現解析のために試料を回収した。細胞を分化させるために追加で1~100ng/mlインスリンを培地に加えたところ、胚体内胚葉に関連するマーカーFOXA2、SOX17、CER1、及びCXCR4の発現に有意な影響はなかった。同様にして、胚性マーカーNANOG、又は胚体外胚葉マーカーSOX7、AFPの発現にも影響はなかった。図3を参照されたい。しかしながら、1~10μg/mlのインスリンを加えたところ、NANOGの発現が増加した。これらのデータは、更に胚体内胚葉マーカーSOX17カタログ番号AF1924,RDsystems,MNに対する免疫蛍光IF染色によっても支持された図4。図5は、各種処理に関し、FACS解析により測定された、CXCR4及びCD9発現プロファイルを示す。表IIに要約されるように、インスリン濃度が生理的濃度を超える場合1~10μg/mlにのみ、CXCR4CD9-細胞の割合は減少し、かつCXCR4-CD9の発現画分の割合は増加した。これらのデータは、インスリン濃度は、本実験条件下では、生理的濃度を超える場合にのみ胚体内胚葉の形成を阻害することを示す。実施例3ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化におけるIGFの役割:MATRIGEL登録商標1:30希釈BDBiosciences;カタログ番号356231コーティングしたディッシュで、ヒト胚性幹細胞株H1の細胞p40~p52を、16ng/mLのFGF2カタログ番号100-18B,PeproTech,NJ及び10μMのY-27632Rock阻害剤、カタログ番号Y0503Sigma、MOを添加したMEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地に、個別の細胞として密度100000個/cm2で播種した。播種の72時間後、培養物を次の通りに胚体内胚葉DEへと分化させた:a.2脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IAと0.0025g/ml重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187,Sigma,MOと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079,Invitrogen,Caと100ng/mLのGDF8カタログ番号120-00,PeproTech,NJに加え2.5μMのGSK3B阻害剤14-プロパ-2-エン-1-イル-3,5,7,14,17,23,27-ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]ヘプタコサ-125,227,3,5,826,9,11,21,23-ノナエン-16-オンを添加したMCDB-131カタログ番号10372-019,Invitrogen,CA培地で1日培養し、次にb.2BSAと重炭酸ナトリウムとGlutamaxと100ng/mLのGDF-8を添加したMCDB-131培地で更に3日間培養した。一部の培養物では、細胞を次の濃度のIGFカタログ番号AF100,PeproTech,NJで処理した:0、1、10、50、又は200ng/mL。対照の場合、BSAの代わりに、分化1日目には0.2FBSカタログ番号SH30070.03,Hyclone,UTを用い、2~4日目には2FBSを用いた。FBSで処理した一部の培養物を、各種濃度のIGFでも処理した。4日目に、FACS、並びにリアルタイムPCRによる遺伝子発現解析のために試料を回収した。驚くべきことに、1~200ng/mLのIGFをBSA処理培養物に加えた場合、IGFでの処理を行なっていない対照試料と比較して、胚体内胚葉に関連するマーカーFOXA2、SOX17、CER1、及びCXCR4の発現に有意な影響は見られなかった図6。同様の結果が胚体外胚葉マーカーSOX7、AFPについても得られた。更に50~200ng/mLのIGFを加えた場合にも胚性マーカーNANOGの発現は増加しなかった。FBS添加培地で処理した培養物は、IGFの阻害効果に対してかなり感受性が高かった。これらの培養物では、SOX17、HNF3B及びCXCR4の発現は、IGF濃度が増加するにつれ減少した。これらのデータは、更にDEマーカーSOX17カタログ番号AF1924,RDsystems,MNに対する免疫蛍光IF染色によっても支持された図8~9。表IIIに要約されるように、IGF濃度が生理的濃度を超える場合50~200ng/mLにのみ、CXCR4CD9-細胞の割合は減少し、かつCXCR4-CD9の発現画分の割合は増加した。しかしながら、IGFの投与量が増加するにつれて、BSA処理群と比較して、FBS処理培養物のCXCR4CD9-発現画分の割合は有意に減少した。総じて上記の例は、FBSの非存在下、生理的濃度のIGF又はインスリンは、DEマーカーの誘導を阻害しないことを示す。実施例4FBSの各種ロットに含まれるIGFの濃度DiagnosticSystemsLaboratoriesDSLカタログ番号DSL-10-2800からIGF-1キットを購入し、検出に使用した。20μLの血清2つ組みを前処理し、次に20μLの希釈試料をアッセイに使用した。培地試料については、20μLの試料をアッセイに直接使用した。キットに付属の取扱説明書に従ってアッセイを実施した。このキットは、相同ペプチド配列に対するキットに関し使用された2種のモノクローナル抗体として、ヒト及びウシのIGF-1を検出することができるものである。試験サンプル:次の試験試料を用いた:対照サンプル:次の対照サンプルを使用した:バックグラウンド:0IGF-1非存在陰性対照,キットに包含;上記のF12試料も陰性対照として使用する。2種の陽性対照127ng/mL及び241ng/mL;キットに包含。結果:アッセイの検出限界は血清に対しては10ng/mL超であり、培地に対しては0.1ng/mL超であった。実施例5ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞への分化におけるインスリン/IGF及びFBSの役割:MATRIGEL登録商標1:30希釈BDBiosciences;カタログ番号356231コーティングしたディッシュで、ヒト胚性幹細胞株H1の細胞p40~p52を、16ng/mLのFGF2カタログ番号100-18B,PeproTech,NJ及び10μMのY-27632Rock阻害剤、カタログ番号Y0503Sigma、MOを添加したMEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地に、個別の細胞として密度100000個/cm2で播種した。播種の72時間後、培養物を次の通りに胚体内胚葉DEへと分化させた:a.0.2FBSカタログ番号SH30070.03Hyclone、UTと0.0025g/ml重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187Sigma、MOと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079Invitrogen、Caと100ng/mLのGDF8カタログ番号120-00PeproTech、NJに加え2.5μMのGSK3B阻害剤14-プロパ-2-エン-1-イル-3,5,7,14,17,23,27-ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]ヘプタコサ-125,227,3,5,826,9,11,21,23-ノナエン-16-オンを添加したMCDB-131カタログ番号10372-019Invitrogen、CA培地で1日培養し、次にb.FBSと重炭酸ナトリウムとGlutamaxと100ng/mLのGDF-8を添加したMCDB-131培地で更に3日間培養した。0.5FBSを用い2日培養し、2FBSを用い3~4日培養した。通常のFBSとは別に、加熱処理したFBSカタログ番号F4135Sigma、MO並びに活性炭処理済みFBSカタログ番号F6765Sigma、MOも処理した。FBS処理した培養物の一部のものは各種濃度のIGF10~100ng/mL又はインスリン10~100ng/mLでも処理した。4日目に、FACS並びにリアルタイムPCRによる解析のため試料を回収した。FBSの存在下でBSA処理した培養物前出の実施例を参照されたいとは対照的に、インスリン又はIGFを投与した培養物では、胚体内胚葉に関連するSOX17及びCCXR4などのマーカーの発現は投与量依存的に下方制御された。図9を参照されたい。また、多能性マーカーNANOGの発現は上方制御された。本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。"