"a対象からの生体試料中のガレクチン-3のレベルを定量し;次いでb心不全の危険性を示すガレクチン-3のレベルを標準のレベルと比較し、ここに、レベルの上昇が、心不全の合併症の危険性を示すことを特徴とする、心不全の合併症の危険性がある対象の検査方法。該生体試料が末梢血液に由来する血清または血漿試料である請求項1記載の方法。マーカーのレベルが酵素結合免疫吸着検定法ELISAによって測定される請求項1または2記載の方法。本発明の目的は、心不全のごとき終末器官損傷を発症する特別な危険にあるか、または、心不全の合併症を発症する特別な危険にある患者を同定できる方法を提供することにある。同定後、それらの患者は、例えば、心不全またはその合併症が発症する前に処置することができ、それは臨床的に非常に重要である。これは、高血圧性終末器官損傷を発症する危険にある対象を同定する方法を提供する本発明により達成され、その方法は、以下の:a対象の生体試料を採取し;b該試料中の少なくとも1の非筋細胞マーカーのレベルを定量し;c該マーカーのレベルを標準レベルと比較し;d該マーカーのレベルが高血圧性終末器官損傷を発症する危険を示すか否かを決定するステップを含む。本発明にいたる調査において、肥大した心臓が不全となりそうであるかを予想するのに用いることができる特定のマーカーが同定された。高血圧症が心臓肥大を引き起こし、それが心不全の最も重大な危険因子であることは一般的に知られている。しかしながら、全ての肥大心臓が最終的に不全となるわけではない。これらの観察は、代償された心肥大から不全にいたる進行の間に、肥大を引き起こすメカニズムに加えて、さらなるメカニズムが参画していることを示唆する。最近の研究は、心肥大に内在する多くの分子または細胞変化を報告するが[LorellBHetalCirculation1024704792000PanidisetalJAmCollCardiol3130913201984]、心不全に寄与するさらなる因子が今でも依然として不明のまま残されている。Boluytらは、例えば、心不全の自発性高血圧ラットspontaneouslyhypertensiveratSHRにおいて細胞外基質extracellularmatrixECM成分をコードする遺伝子のアップレギュレーションを立証した[BoluytetalCasrdiovascRes4623992492000Hypertension30136213681997CardiovascRes308368401995EurHeartJ16supplN19301995]。しかしながら、これらの遺伝子の過剰発現が心不全の顕在的な臨床的症状に先行していたのかどうか、また、それらの過剰発現がすでに発症した能動的不全の過程の結果であったのかどうかは明らかではない。いくつかの他のバイアスされていない手法も採用され、心不全に特異的なメカニズムが同定されている[KorstinSetalCircRes927157242003HeinSetalCirculation1079849912003]。しかしながら、これらの以前の研究は、しばしば、最終段階かつ薬物治療した心筋と正常心筋とを比較する。それゆえ、得られた差異は、不全およびその治療に対して二次的なものであり、その研究は、代償された肥大心臓の不全をもたらし、危険にある患者を同定するためのマーカーとして用いることができる因子を同定しない。本発明にいたる調査において、不全となりつつある肥大心臓由来の多数の遺伝子の遺伝子発現プロファイルが代償されている肥大心臓と比較された。かくして、遺伝子は、不全となりつつある肥大心臓対代償されたものとで、異なって発現された。特に、本発明は、特定の非心筋遺伝子が疾患心臓組織において異常発現されるという発見に基づく実施例1および2。本発明によれば、非心筋性マーカーを使用する。すなわち、心筋以外の細胞由来のマーカーである。これは、本発明の方法が、ストレスを受けた心筋において生じる既知の心筋変化の他のプロセスをプローブするという利点を有する。これは、心不全を診断のみならず、既知の心不全の患者を連続的にモニターする、すなわち、主たる不利なイベントを告知するであろう不利な非心筋プロセス例えば、炎症、瘢痕等が生じるかどうかをモニターする機会も開く。本発明の方法によれば、生体試料を個々の患者から採取する。引き続き、その試料中の1以上のマーカーのレベルをよく知られた方法で測定する。典型的に、そのレベルを標準レベルと比較して、そのマーカーのレベルがその個人が心不全に進行する可能性を示すかどうかを決定する。この標準レベルは、健康な対象におけるそのマーカーのレベルに基づく。そのマーカーのレベルが標準レベルよりも上昇していれば、その対象はCFHを発症するかまたは心不全の合併症を発症する危険にある。生体試料は、血液、血漿、血清、尿等のごとき体液、または、心臓バイオプシーのごとき組織試料のいずれかの試料である。しかしながら、本発明の好ましい具体例によれば、生体試料は末梢血由来の血漿試料である。末梢血試料は患者から簡単に採取でき、カテーテル法のごとき複雑な非浸襲性手順も必要ない。生体試料は、よく知られた技術に準じてプロセスされて試験用試料が調製される。本発明の好ましい具体例によれば、マーカーは蛋白質である。蛋白質のレベルは、当該蛋白質に対する特異的抗体を用いる免疫学的方法のごとき単純かつ信頼性ある方法によって容易に定量できる。好ましくは、蛋白質は、ガレクチン-3である。ガレクチン-3のレベルは不全しそうな心臓において早期かつ特異的に発現されることが立証されているからである。本発明のもう1つの好ましい具体例において、蛋白質はトロンボスポンジン-2である。TSP2の増大した心臓発現が、明らかな心不全に進行しそうな肥大心臓を同定することが立証されている。それらのマーカーのレベルはいずれかのよく知られた適当な方法によって定量することができる。好ましくは、マーカーのレベルは、酵素結合免疫吸着検定法ELISAによって測定し、かくして、単純で、再現性があり、かつ、信頼性のある方法を提供する。本発明は、さらに、鬱血性心不全のごとき高血圧性終末器官損傷を発症する危険にある対象を同定するための1以上の非心筋マーカーの使用に関する。いくつかの非心筋マーカーを本発明により用いる。好ましくは、マーカーは、ガレクチン-3および/またはトロンボスポンジン-2である。本発明により同定されたマーカーは、さらに、本発明、および/または高血圧性終末器官損傷の治療、特に鬱血性心不全の予防および/または治療に用いることができる。例えば、ガラクチン-3の例えば抗体による阻害、および/または、TSP-2の適当なモジュレーターによる活性化が、心不全の発生を防ぐのに有益であろう。それゆえ、本発明は、さらに、高血圧性終末器官損傷の予防および/または治療用の医薬の製造のためのガラクチン-3および/またはそのモジュレーターの使用に関する。本発明は、さらに、高血圧性終末器官損傷の予防および/または治療用の医薬の製造のためのトロンボスポンジン-2の使用に関する。本発明は、以下の実施例および図面によってさらに例示される。実施例1トロンボスポンジン-2:増大した発現は不全となりそうな心肥大を同定する心肥大は心不全HFの危険を増大するが、いままでのところ、どの肥大心筋が急速にHFに進行するかを予想するのは困難であった。本発明によれば、肥大関連遺伝子から離れ、個別の不全関連遺伝子を不全が明確になる前に発現し、かくして、不全しがちな肥大心臓の分子予測を可能とすることが考え出された。12~14週齢でHFに進行する高血圧性ホモ接合レニン過剰発現Ren-2ラットの心遺伝子発現12336クローンは17週間代償されたままの同腹仔による発現と比較した。代償された肥大10週齢の段階で採取された心臓バイオプシーは、発明者らが、同定した遺伝子の変化した発現が後のHFへの進行に先行するかどうかを試験することを可能にした。HFラットの心筋において過剰発現した49遺伝子を同定し、それらのマトリックス遺伝子は最大群を構成した。トロンボスポンジン-2TSP2は、後にHFに進行したラットからのバイオプシーにおいてのみ選択的に過剰発現し、一方、脳内ナトリウム排泄増大ペプチドBNPは、この初期段階で、全てのラットにおいて上昇した。心臓マトリックスに対するTSP2の不存在の影響を試験するため、心筋梗塞MIをTSP2-不存在マウスにおいて誘発させた;この手順は全てのTSP2不存在マウスにおいて心臓破裂を生じたが、野生型WTマウスには全く見られなかった。結論として、TSP2は心臓マトリックスの剛直性の新規かつ重要なレギュレータであると同定された。原料および方法トランスジェニックラットおよび血流力学実験ホモ接合Ren-2ラットは、MaxDelbruckZentrumfurMolekularMedizinBerlinGermanyから入手した。SpragueDawleyバックグラウンド上の30匹の雄Ren-2ラットおよび、対象として、9匹の齢適合SDラットを実験した。30匹のRen-2ラットのうち、8匹を10週齢で犠牲にし、8匹を、7~13週齢から、0.05mg/kg/日のカンデサルタン、アンジオテンシンII受容体I型ブロッカーARB、で処理した。残りの14匹の未処理ラットのうち、6匹を、心不全の臨床的徴候の発症から13週で犠牲にし、HF-Sラットと命名した。残りの8匹のRen-2ラットを綿密にモニターし、不全の臨床的徴候がまだ表れていない17週で犠牲にした。これらのラットをHF-Rラットと命名した。犠牲前に血流力学パラメータを定量し、犠牲後に心臓、肺および体重を測定した。動物の世話および処理は動物実験委員会に承認された。10週齢のRen-2ラットからのバイオプシー12匹のRen-2および4匹のSDラットからなる第2群を麻酔し、前胸部を胸骨にて剃毛した。ラットを自作ループの助けを借りて、保温パッド上の堅い板に固定した。先の丸い20ゲージ針を気管に入れて気管カニューレとして機能させた。このカニューレを、室内空気で2.5ないし3mlの周期体積および80呼吸/分の呼吸レートの従量式齧歯類呼吸器model683HarvardApparatusSouthNatickMAに連結した。さらなる手順は、マイクロ手術用顕微鏡の視覚的な助けを借りて行った。左の第4肋間に5mmの切開をして、胸郭に接近した。心臓の明瞭な視界を得た後、ゆっくりと回転するドリルに連結した特注の0.35mm針を用いてバイオプシーを採取した。全手順は、約15分間続いた。手術で生き延びた9匹のRen-2ラットのうち、5匹は12~14週齢の間に心不全を発症し、一方、残りの4匹のラットは17週間代償されたままでいた。RNAの単離および逆転写RNeasyProtocolに準じて、RNeasyMiniKitで、RNAを左心室から単離し、-80°Cで保存した。抽出物の品質は、2100Bioanalyserで、真核生物全RNAナノアッセイを用いて測定した。RNAは、PicoPureRNAIsolationKitで、製造者の指示書に準じて、10週齢ラットの心臓バイオプシーから単離した。RNAは、リバーストランスクリプターゼでcDNAに転写し、250mgのランダムプライマーを用いた。cDNAマイクロアッセイIncyteGEM-2/GEM-3ラットcDNAライブラリー全12336遺伝子を用いるマイクロアレイ上の分析のため、正規化ラットcDNAライブラリーから単離したcDNAクローンを選んだ。各cDNAのPCR増幅インサートを処理ガラス面上に印刷して高密度アレイとした。これらのアレイ素子上で、2匹のSDおよび6匹のRen-2ラットの心筋mRNAを用いて、3つの異なる時点で、重複ハイブリダイゼーションを行った。数値の対数変換を行って、データを均質にし、>1.7倍の発現差のみが異なって発現されると考えられた。すでに詳細に記載されたように[TanetalProcNatlAcadSci9911387113922002BandmanetalAnnNYAcadSci97577902002]、データマイニングおよびバリデーションのプロトコルを採用した。配列決定、膜スポッティング、およびマクロアレイ用cDNAハイブリダイゼーションマイクロアレイによって同定された異なって発現された遺伝子のクローンをIncytegenomicsから入手し、5GGTGAGACTATAGAAGAGC3プライマーで配列決定した。配列決定によって同一性が確認された後、プラスミドインサートを、5ACCATGATTACGCCAAGCTC3よび3ACGACGGCCAGTGAATTGAA5プライマーとのPCR反応によって増幅した。次いで、各クローンをナイロン膜マクロアレイ上に重複してスポットした。ドットブロットをパーソナルfx-ホスホイメージャーで走査した。個々のハイブリダイゼーションシグナルを同定し、QuantityOneVersion423ソフトウェアを用いて、密度測定で定量した。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼGAPDHをブロットの内部標準用のハウスキーピング遺伝子として選択した。バイオインフォマティック分析マイクロアレイ分析および多段階データマイニングストラテジーから選択された49のHF-特異的候補遺伝子から転写された蛋白質配列のバイオインフォマティック分析を行った。それらの生物学的機能の注釈に基づき、以前は心筋内で同定されず、マトリックス関連蛋白質をコードする3つの候補遺伝子をリアルタイムPCRによるさらなる試験用に選択した。プライマー、プローブおよびリアルタイムPCRプライマーおよびプローブは、PrimerExpressSoftwareを用いてGenBankTMで入手可能なラット配列から設計した。プローブは、EnsemblMouseGenomeSequencingConsortiumandEnsemblHumanGenomeBrowserから誘導された保存されたエクソンスプライス部位から設計し、かくして、いずれの潜在的に汚染するゲノムDNA表1のアッセイによる認識を防止する。最適PCR条件は、2mlの全量中、12.5ml2×TaqmanTMアッセイ用PCRMasterMix、最終濃度5mMMgCl2、300nMの各プライマー、200nMプローブ、および10ngcDNA鋳型であることが分かった。増幅および検出は、ABIPrism7700SequenceDetectionSystemを用いて行った。PCRデータは、ハウスキーピング遺伝子シクロフィリンAの発現レベルの相対で報告された。TSP2-/-マウスにおける実験的MIおよびモルホメトリー22匹の野生型129SvJ株および16匹のTSP2不存在変異体TSP2-/-において、左腹側下行冠状動脈を結索することによって心筋梗塞を誘発させた。2匹の擬手術マウスを対照として用いた。エーテル麻酔後、1mlの0.1MCdCl2を大静脈に注射することによって、これらのマウスを殺した。心臓を10分間5バッファー化ホルマリンで潅流固定し、10バッファー化ホルマリン中で一晩浸漬固定した。標準電子顕微鏡技術を用いて、野生型およびTSP2-/-マウスの組織標本を評価した。線維症形成の程度を定量するために、コンピュータ化面積測定を、1切片あたり7カ所の無作為に選んだ視野で行った。各視野は400μm2の面積であった。コラーゲン面積を、末梢血管および心外膜コラーゲンを除外し、選択的に左心室間質から定量した。コラーゲン面積フラクションは、1視野あたり、全心筋面積に対するピクロシリウス-レッド染色した面積の比率として計算した。この手順の詳細は以前に報告されている[CherayiletalProcAcadSciUSA87732473281990CleutjensetalAmJpathol1473253381995]。統計分析データは平均±SEMで表す。ワンウェイ分散分析ANOVAをDunnettポストホック分析と組み合わせて用いて、各実験群カンデサルタン処理および2群の未処理レニン-トランスジェニックラットのデータを比較して、多重比較のために補正した。SDラットを内部対照コホートとして用いた。分析は統計パッケージSPSS10.0を用いて行った。P値<0.05は統計的に有意であるとみなした。結果Ren-2ラットのサブセットの顕在的な心不全および死亡への急展開左右の心室の肥大が、10週目に犠牲にした8匹のラットおよびそれよりも遅い日に犠牲にした他の未処理ラットにも見られた。SD対照にはLVHは見られなかった。プラセボの14匹のラットのうち6匹が12ないし14週齢の間に顕在的な臨床HFに急展開し、17週間の観察期間中代償されたままの8匹のラットと比較して抑制された心機能インデックスを有していた。胸膜滲出液およびdP/dtmaxにおける急下降がHF-Sラットに見られ;これらの変化はHF-Rラットには見られなかった表2。アンジオテンシンIIブロックは、13週で犠牲にした動物を評価したとき、心臓の肥大および不全の発症を完全に防止したLV重量/体重、2.52±0.36、dP/dtmax、8400±202。マイクロアレイは心不全の疑いのあるラットにおいて過剰発現した49の遺伝子を明らかにした。マイクロアレイ分析について、本発明者らは、まず、HF-SおよびHFR群の間で、遺伝子発現における生態多様性を調査した。HF-SおよびHF-Rの2つの群におけるほとんどの遺伝子の発現レベルは非常に似通っていた。発現用にプロファイルした総数12336の遺伝子から、49の遺伝子のみが多段階データマイニングストラテジーを生き残り図1、HF-Sラットにおいて過剰発現した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドNADトランスハイドロゲナーゼが、心筋欠如で低下した発現を示した唯一の遺伝子であった。特に、オステオアクチジン、TSP2、いくつかのプロコラーゲンおよびトロンボスポンジン-1が増加した。同定された遺伝子の多くが既知の機能を持つ蛋白質をコードし、一方、それ以外は、未知の機能の遺伝子に対応し、新規遺伝子および心臓で今まで見出されていない遺伝子を含む。バイオインフォマティック分析は、3つの心臓マトリクス関連遺伝子に指向した。HFにおける過剰発現遺伝子の多くの機能に関して情報が入手できなかったので、本発明者らは、49の遺伝子全てをバイオインフォマティック分析にかけた。最初、本発明者らは、いくつかの調査/整列ツールを組み合わせて急速かつ正確に遺伝子ファミリーを提供するGeneFINDシステムhtppwwwnbrfgeorgetowneduを用いて、HFの疑いのある遺伝子の広い機能的分類を行った。このストラテジーは、ほとんどの過剰発現遺伝子がマトリクス関連蛋白質をコードすることを示した。特に、選択された3つの疑いのある遺伝子オステオアクチビン、トロンポスポンディン-2およびコラーゲンVIの機能は、今まで、心筋において報告されていない。マクロアレイはアンジオテンシンIIブロックによるHFの疑いのある遺伝子の正常化を示した。このアンジオテンシン主導型心不全モデルにおけるレニン-アンジオテンシン系RAS活性化の役割を確かめるために、本発明者らは、7ないし13週齢のRen-2ラットのサブグループをのカンデサルタンで処理した後マイクロアレイによって同定された標的遺伝子の発現を再評価した。血流力学の向上に加えて、ARB処理は全てのHF関連候補遺伝子の過剰発現を防止したデータ示さず。10週間の心筋バイオプシーは後にHFに急進行するラットにおいてTSP-2アップレギュレーションを示した。HFが血流力学的および臨床的に顕在化する前に心筋における3つのマトリクス関連遺伝子の発現状態を評価するために、本発明者らは、自発鼓動するラット心臓の心臓バイオプシーを得る技術を開発した。バイオプシー後、ラットを回復させて、それが心不全に対して耐性または感受性であることを証明するかどうかを決定した。この新規アプローチは、われわれが、不全が顕在化する前に遺伝子発現のレベルを立証することを可能とした。TSP2発現は、12~14週以内に急性心臓代償不全を起こしたラットにおいてのみ、早期肥大段階10週間にて著しく増大したが図2a、その後も代償されたままのラット心臓でも非トランスジェニック対照ラット心臓でも、この段階ではアップレギュレートされなかった。オステオアクチビン図2bおよびコラーゲンVI図2cのごとき、他のHF関連遺伝子の発現レベルは、後に不全を起こすラットおよび対照と比較して代償されたままのラットの双方において、早期肥大段階で増大した。重要なことに、心臓の肥大および不全の広汎に用いられるマーカーは、後の代償または不全にかかわりなく、全てのラットにおいて10週バイオプシーでアップレギュレートし、それゆえ、不全耐性ラットから不全感受性ラットを識別できなかった図2d。本発明者らによる初期のマイクロアレイ実験によれば、これら3つの遺伝子の発現は、心不全の進行によって、10週発現レベルの2倍以上にまでさらに増大した。代償ラットは、10週にて高いオステオアクチビン、コラーゲンVIおよびBNPを有するにもかかわらず、17週にて犠牲にした時点でこれら遺伝子の発現レベルにさらなる著しい増大は見られなかったデータ示さず。TSP-2ノックアウトTSP-/-マウスは急性心筋梗塞で生き残れなかった。心不全の様々なラットモデルに反して、丹念に記録された過負荷に応答して確実に心不全を発症するラットモデルはない。それゆえ、本発明者らは、22匹の野生型ラットおよび16匹のTSP2-/-マウスにおいて腹側心筋を梗塞させて、急性の心筋構造損傷およびその結果の急速心臓再構築におけるTSP2の生物学的役割の解決に努力した。梗塞はTSP2なしマウスには耐えられなかった。全てのマウスがMIの最初72時間以内に死亡したからである。一方、手術直後の合併症により死亡しなかった野生型マウスの100が生き残った図3。MIの48時間後のコンピュータ化モルフォメトリーは、野生型マウスと比較してTSP2なしマウスにおいて、心筋コラーゲンの反応性増大が完全に欠如していることを示した各々、0.38±0.05および0.70±0.04;p<0.05図4。光電子顕微鏡はTSP2なしマウスにおいて心筋マトリクスの広範囲にわたる分裂を明らかにした。野生型マウスは一匹もこの発現型を示さなかった図5。考察この実験で、TSP2の増大した心発現は顕在化した心不全に進行しがちな肥大心臓を同定することが立証された。さらに、TSP2は急速心負荷に対する効果的な応答を行うのに必要とされることが示された。その反対に、肥大様BNPの既知のマーカーは、全ての形態の心肥大において例外なく増大し、それゆえ、不全感受性および不全耐性の肥大を区別できなかった。トロンボスポンジンのファミリーは、血管および血栓の疾患において広汎に研究されているが、心不全におけるトロンボスポンジンについて重要な役割を実現させる報告はない。本発明者らの発見は、TSP2は、直接的または間接的に、心臓マトリクス生物学における重要な機能を行うのであろうことを示唆する。TSP2は、その機能が多様であり完全には理解されていない分泌性マトリックス細胞間蛋白質である。TSP2に近接した相同体は、線虫またはショウジョウバエのゲノムには見つかっていないので、この蛋白質は、脊椎動物における細胞マトリクス相互作用の増大した複雑性を対処するために進化したようである。細胞外マトリックスの組織化におけるTSP2の役割についての証拠として、TSP2-不存在マウスにおける以前の研究は、TSP2発現の喪失の結果、不規則な輪郭を持つ異常に大きなコラーゲルフィブリルが得られることを示している、さらに、TSP2-不存在マウスの皮膚はもろく、低下した聴力を有する。TSP2-ふそん剤の皮膚線維芽細胞は、基底へのその付着に欠陥があり、それらの培養において増大したレベルのマトリックスのメタロプロテイナーゼ-2MMP-2を有する。現在の研究は、心筋におけるTSP2に対して2つの明らかに矛盾する機能を同定する。Ren-2ラットにおける慢性高血圧症において、TSP2の増大した心臓発現は、心不全の傾向がある動物を同定する。この応答は、TSP2の発現が有害であることを示すようであるが、該応答が、延長された期間の間、以前として代償されるラットにおける応答と比較して、後に明白な不全に進行するラットにおける強調された従前に活性化された負傷応答を反映するようである。TSP2の発現は成体動物における負傷に対する応答に特徴的であることがよく確立されている。他方、マウスにおける実験的心筋梗塞においては、TSP2の存在は心臓破裂に対して明らかに保護する。2つの実験系は異なる種が関連し、TSP2-不存在マウスの場合には複雑な代償変化が存在しそうな故に比較するのが困難であるが、結果の双方の組は、代償後における十分に機能的な細胞該マトリックスを生じさせるにおいて、TSP2に対する重要な役割に合致する。TSP2-不存在マウスにおける切開皮膚創傷治癒の場合には、TSP2の不存在は有利であるようにも見える。なぜなら、創傷治癒のその特別な形態においては、脈管形成およびMMP-2における得られた増加は、この組織に存在することが知られているコラーゲン線維の予め存在する構造的変化にもかかわらず治癒を加速するからである。しかしながら、心臓組織の以前の固有の弱点が、心筋のマトリックスにおける同様な異常性のため、梗塞後に心臓破裂に対する素因があることが示唆されている。本データは、不全への進行に対してTSP2の増大した心臓発現が先行することを示唆している。トロンボスポンジンはインテグリンに結合できることが知られているので、TSP2はインデグリンシグナリングを介してプロ-線維症効果を媒介する可能性がある。最近、Zhangetalは、アダプター蛋白質遺伝子Grb2のハプロ不全を持つマウスが圧力過剰負荷に応答する心臓線維症に対する抵抗性であると報告している。Grb2は、機械的なストレスに由来し得る病巣接着キナーゼのインテグリン-媒介活性化で補充される。我々の研究においては、我々は、β1インテグリンが、その発現が高血圧Renラットの心臓で明らかに増加しており、かつ不全心臓においてさらに増大した遺伝子の中にあることを見出した。この知見が、インビトロでの心臓線維芽細胞の伸長がβ1インデグリンの蛋白質レベルを増加させたという我々の最近の観察によって実質化された。コラーゲンの定量のためのピクロシリウスpicrosirius赤色染色技術は、オレンジ色-赤色の目に見える偏光を示すコラーゲン線維のサイズ、整列、およびパッキングに依拠することに注意すべきである。TSP2-不存在マウスは、異常なコラーゲンフィブリルおよび線維構造、特にあまり組織化されていない線維および不規則かつより大きなフィブリルを有するので、測定された複屈折はこれらの変化によって影響された。結論として、本発明によると、TSP2が心臓マトリックスの一体性の非常に重要なレギュレーターとして機能することが提唱される。増大した細胞外マトリックス形成は、圧力過剰負荷-誘導心不全の実験的および臨床的形態を共に特徴付けるので、TSP2の初期の発現は、代償された肥大から心不全への転移で非常に重要であるマトリックス応答を反映するであろう。これらの観察は、TSP2の心臓過剰発現の初期の検出が、心不全にかかりやすい肥大心臓を同定でき、心不全に進行する傾向がある患者の初期同定およびおそらくは該患者の治療を促進することであろうことを示している。実施例2ガレクチン-3は不全にかかりやすい肥大心臓における活性化されたマクロファージをマークする。マクロファージ化学誘因蛋白質および種々のサイトカインの増大した心筋発現は、マクロファージが心不全HFに関与することを示唆した。しかしながら、マクロファージが既に確立された負傷に単に応答するのか、あるいはHFの初期段階に積極的に関与するのかは明らかではない。高血圧HFにおけるこれらのメカニズムを調べるために本発明者らは、ホモ接合性高血圧TGRmRen227Ren-2ラットを使用した。これらのラットは10週齢までに不変的に心臓肥大を発生し、その後、いくらかは17週までに代償され、他方、他は12ないし14週齢程度までに不全および死亡まで進行する。この研究は、心臓ガレクチン-3の発現が不全へ進行する傾向がある肥大心臓を特異的にマークする。マクロファージは不全の傾向がある肥大心臓において初期にかつ特異的に活性化されるように見え、マクロファージ由来メディエーター様ガレクチン-3は心臓線維症の発生およびHFに向けての進行に寄与するであろう。材料および方法トランスジェニックラットおよび血流力学的研究ホモ接合性Ren-2ラットはMaxDelbruckZentrumfurMolekulareMedizinBerlinGermanyから入手した。我々は、非-トランスジェニックバックグラウンドでSpragueDawleyラットからの16匹の雄Ren-2ラットおよび8匹の年齢が合致した対照を実験した。16匹のRen-2ラットのうち、8匹を、7ないし13週齢から、0.05mg/kg/日のカンデサルタン、アンジオテンシンII受容体I型ブロッカーARDで処理した。8匹の未処理Ren-2ラット内では、HFの発生に際して4匹を13週において犠牲にした。残りの4匹のRen-2ラットをモニターし、17週において犠牲にし、その時、臨床的不全の兆候は出現しなかった。血流力学を10週において、および犠牲にする前に取った。心臓、肺および体重を犠牲にした後に測定した。動物のケアおよび治療の手法は、動物愛護協会によって認められたものであった。10週齢Ren-2ラットからの心筋バイオプシー12匹のRen-2および4匹のSDラットの第2の群を麻酔し、平滑な20-ゲージ針を気管に入れて、気管カニューレとして供し、これを2.5ないし3mlの周期体積容量および80呼吸/分の呼吸速度にて部屋内の空気中の周期体積齧歯類呼吸器に連結した。ミクロ-切開顕微鏡の視覚的助けを借りて、左第4肋間空間において5mnの切開を行って、胸部にアクセスした。特注の0.35mn針を用いてバイオプシーを採取した。cDNAマイクロアレイ正規化されたラットcDNAライブラリー合計12,336遺伝子から単離されたcDNAクローンを、マイクロアレイでの分析ように選択した。各cDNAのPCR増幅インサートをガラス表面上の高密度アレイとして印刷した。2匹のSDおよび6匹のRen-2ラット心筋mRNAを含む3つのガラスチップにて3つの異なる時点で2連ハイブリダイゼーションを行った。HF-S群における少なくとも2倍の過剰発現を伴う発現の統計学的に有意なP<0.001変化を示した標的遺伝子を、該遺伝子が独立して4回評価して、信頼性のレベルを改善するように、さらなる分析用のサブ-アレイに再度印刷した。データのマイニングおよび確証のためのプロトコルを、従前に詳細に記載されているように採用した。プライマーおよびプローブガレクチン-3に対して特異的なプライマー順方向、5CCCGACTGGACCACTGACA3逆方向、5CAGCATGCGAGGCATGACT3およびプローブ、5TGCCCTACGATATGCCCTTGCCTG3をPrimerExpressSoftwareを用いるGenBankTMで入手可能な配列から設計した。RNA単離およびリアルタイムPCRRNeasyMiniProtocolに従ったRNeasyMiniKitで、RNAをラット左心室から単離し、-80°Cで貯蔵した。製造業者の指示に従って、PicoPureRNAIsolationKitでラット心臓パイオプシーからRNAを単離した。最適なPCR条件は、25μlの合計容量中の、最終濃度5MMgCl2を含むTaqmanTMアッセイ用の12.5μm2×PCRMasterMix、300nMの各プライマー230nMのプローブおよび10ngcDNA鋳型であることが判明した。マクロアッセイのための配列決定、膜スポッティングおよびcDNAハイブリダイゼーションマイクロアレイによって同定された異なって発現された遺伝子のクローンはIncytegenomicsから入手され、5GGTGACACTATAGAAGAGC3プライマーで配列決定した。同一性を確認した後、プラスミドインサートは5ACCATGATTACGCCAAGCTC3および3ACGACGGCCAGTGAATTGAA5プライマーでのPCR反応によって増幅した。次いで、各クローンをナイロン膜マイクロアレイに二連でスポットした。ドットブロットをパーソナルfx-phpsphoイメージャーでスキャンした。蛋白質の単離およびウエスタンブロッティング蛋白質の単離およびウエスタンブロッティングは、従前に記載されているように行った、一次抗体ガレクチン-3生物試薬;ED-1およびOX-6,DrMdeWintherDepartmentofMolecularGeneticsUniversityofMaastrichtTheNetherlandsからの親切な贈り物をTWEEN-20を含むトリス-緩衝生理食塩水で1/1000希釈した。二次抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲーテッドIgG,CellSignalingTechnologyをTBS-Tに1/2000希釈した。製造業者の指示に従って増強されたケミルミネセンスによって蛋白質バンドを可視化した。免疫組織化学、ガレクチン細胞化学および共焦点顕微鏡ガレクチン-3および接近可能な結合部位の発現は、従前に記載されているように特異的抗-ガレクチン-3モノクローナル抗体およびビオチニル化ガレクチン-3によって可視化された。他の文献に詳細に記載されているように、、ガレクチン-3を活性-維持条件下でビオチニル化した。共焦点レーザー走査型顕微鏡において、ガレクチン結合部位がFITC-標識アビジンによって検出された。テキサスレッド標識二次抗体を用いて、増殖する核抗原PCNAを免疫細胞化学的に可視化した。該手法についてのさらなる詳細は他の文献で入手できる346334751999。心臓線維芽細胞増殖およびプロリン取り込みアッセイラット心臓線維芽細胞は従前に記載されているように2日齢新生SpragueDawleyから単離した。1L-グルタメート、50U/mLペニシリンおよび0.1g/mLストレプトマイシンと共に10胎児ウシ血清FBSを補足したイーグル培地DMEMのダルベッコウ修飾培地中で細胞を培養し、湿潤化5CO2雰囲気中にて37°Cでインキュベートした。接種から24時間後に0.5FBSを含有する培地との24時間のインキュベーションによって細胞を休止させた。次いで、細胞をネズミ組換えガレクチン-3対照,10μg/ml、30μg/mlで24時間処理した。分裂する細胞の数を放射線標識メチル-[3H]チミジン取り込みウエル当たり0.5μCi沸性によって測定した。放射能は、LKD-Wallaceベータカウンタを用いて線維芽細胞およびシンチレーション液体中で測定した。分泌したコラーゲンを、[3H]プロリン取り込みアッセイを用いて測定した。簡単に述べれば、心臓線維芽細胞を90ないし100密集にて6-ウエルプレート中に接種した。インキュベーションの最後の24時間の間に15Ci/mlL-[3H]プロリンを加えた。条件培地から取り込まれた[3H]プロリンを10トリクロロ酢酸TCAで沈殿させ、シンチレーションカウンタでカウントした。統計学的解析データは平均±SEMとして表す。各実験についてのデータをDunnettのポスト-hoc分析と組み合わせて、ワン-ウェイ偏差分析ANOVAを用いて比較して、内部対照コホルトとしてSDラットを用いて複数の比較につき修正した。統計学的パッケージSPSS10.0Chicago,ILUSAを用いて解析を行った。P-値<0.05は統計学的に有意であると考えられている。結果HF-Sラットにおける損なわれた心機能および心臓線維症8匹のプラセボ処理ラットにおける肥大した左および右心室を観察した。対照的に、カンデサルタン処理ラットおよび非-トランスジェニック対照においてLVの増加はなかった。処理無しの8匹のラットのうち、4匹は12ないし14週齢の間に明白な臨床的HFを発症し、これには機能低下した心臓機能の支障が伴った。残りの4匹のラットは17週間の実験期間の間に代償されたままであった。胸膜滲出を持つ明白なHF肺重量/体重HF-S,10.61±0.7vsHF-R,4.97±0.2,P<0.001および上昇した左心室終末/弛緩期圧力LVEDTは、HFラットにおいて明らかである。これはHF-Rおよび/またはARB処理ラットには存在しなかった図6a、bおよびc。10週において、全てのプラセボ-処理Ren-2ラットはLVHを有したが、代償不全に対する血流力学的証拠は有しなかった。LV重量/体重:Ren-2,3.88±0.08vs非トランスジェニック対照2.15±0.2、およびdP/dtmax:Ren-2,8556±296vs非-トランスジェニック対照8780±373。コンピューター援助電子トメトリーによって測定された心筋コラーゲン含有量は、HF-Rラットと比較してHF-Sラットにおけるより高度な心臓線維症を明らかにした。ARBは、それが正常血圧バックラウンド株のそれと匹敵したままであるように、LVHおよび心筋コラーゲン含有量を正規化した図7。マイクロアレイはHF罹患性ラットにおける免疫-関連遺伝子の豊富さを明らかにする。まず、我々はHF-SおよびHF-R群の間の遺伝子発現の生物学的変動を調べた。双方の群からの試料の対の間のほとんどの遺伝子の発現レベルは高度に相関した。我々は、不全および非-不全肥大心臓の間の異なって発現された遺伝に焦点を当てた。該値のLog変換を行い、2倍閾値を超える発現レベルの統計学的に有意なp<0.05差のみが異なって発現されたと考えられた。ガレクチン-3は最も顕著に過剰発現された遺伝子として出現し、HFラットにおいて、5倍を超える上昇であった表3。興味深いことには、主要組織適合性複合体抗原IIMHC-IIおよび免疫グロブリン受容体遺伝子はこれらの過剰発現された遺伝子内にあった。マイクロアレイは、アンジオテンシンII遮断によるHF罹患性遺伝子の正規化を明らかにする。HFにおいて、異なって発現された遺伝子を確認するために、我々は、まず、配列決定によってクローンの同一性を確認し、その結果、別々の生体試料における反復ハイブリダイゼーションのためにこれらの遺伝子をナイロン膜マイクロアレイ上に再度スポットした。これにより、最初にマイクロアレイによって同定された7つの主な指標遺伝子の過剰発現が得られた。HFのこのアンジオテンシン駆動モデルにおけるレイン-アンジオテンシン系RAS活性化の役割を確認するために、我々は、Ren-2ラットのサブ群を7週齢から13週齢までにサブプレッサー用量のカンデサルタンで処理した後に、マイクロアレイによって同定された標的遺伝子の発現を再度評価した。アンジオテンシンII遮断は、心臓の肥大および不全の活性を完全に妨げた。遺伝子発現のレベルにおいては、それは全てもHF-関連候補遺伝子の過剰発現を妨げた。顕著にはガレクタン-3遺伝子の発現も妨げられた。ウエスタンブロッティングは不全心筋層において高いガレクチン-3発現を示す。ガレクチン-3の頑強なトランスクリプトマル増加を仮定し、我々は心筋層におけるその蛋白質レベルに焦点を当てた。ミクロ/マクロアレイで得られた結果と匹敵して、ガレクチン-3発現の最高レベルが、最高程度の心臓線維症を有し、13週までに心臓代償不全を迅速に発生した動物の同一群で観察されたHF-S,94.6±8.9;HF-R,35±5.6;P<0.01図8aおよびb。CD68陽性、MHCII抗原およびガレクチン-3の共-局所化我々は、免疫組織化学によってラット心筋層におけるガレクチン-3の分布をモニターした。組織学的には、HF罹患性ラットは線維症のパッチ領域を明らかにした。非-患部領域における組織の人工物がよく保存されていた。対照的に、高線維症のこれらの領域はARB処理およびSDラットでは観察されず、また、肥大した非-不全HR-Rラットでも観察されなかった。重要なことには、ガレクチン-3陽性領域は、顕著な組織損傷および高レベルの線維症を示した。形態学的には、ガレクチン-3陽性細胞はかなり大きかった。これらの細胞はマクロファージであるという仮定を確認するために、我々は、マクロファージ特異的抗体ED-1で系列的切片を分析した。ガレクチン-3陽性領域はマクロファージ特異的染色と共-局所化された。これらのマクロファージはMHC-II抗原もまた強く発現し、これは、抗原提示におけるこれらの細胞の能動的な役割を示す。これらの特徴はHF-Rラットおよび非-トランスジェニック対照においては明らかでなかった。心臓線維芽細胞におけるガレクチン-3結合部位マクロファージにおけるガレクチン-3の強い発現を定義し、我々は、ガレクチン-3が心臓線維芽細胞に結合するか否かを決定した。我々は、ビオチニル化ガレクチン-3を用いて心臓線維芽細胞上のガレクチン-3の結合部位を可視化した。0.1トリトン-浸透において、ガレクチン-3結合部位の存在の結果、散漫な細胞質ならびに周辺染色が休止細胞において生じた図10a。対照的に、増殖する線維芽細胞は核の周りに増強された染色を示し、これは、染色プロフィールにおける有糸分裂-関連改変を明らかとする図10b。このパターンは、共焦点顕微鏡によって独立してモニターされた。事実、これらの実験は、ガレクチン-3が過剰発現された状態での反映する細胞周期活性化を喚起する増殖するすなわち、PCNA陽性心臓線維芽細胞における核の周りでの接近可能なガレクチン-3リガンドのコンパクトな存在を確認した図10c、dおよびe。ガレクチン-3は線維芽細胞の増殖およびコラーゲンの生産を誘導した。心臓線維芽細胞における接近可能な部位の存在に対する証拠をそのようにして提供し、我々は、ガレクチン-3が心臓線維芽細胞の増殖を刺激するか否かを決定した。組換えガレクチン-3を用い、我々は増殖アッセイを行った。ガレクチン-3は血清を豊富化するまたは豊富化することなく異なる濃度で加えた0、10および30μg/ml。我々は、24時間にわたって10および30μg/ml外因性ガレクチン-3での心臓線維芽細胞増殖の有意な増加を観察した30μg/mlにおけるガレクチン-3、1分あたり347±17.5カウントcpm;10μg/mlにおけるガレクチン-3309±4.8cpm;対照、145±4.8;p<0.01。次いで、我々は、放射性プロリン-取り込みアッセイを用いて、外因性ガレクチン-3を添加した心臓線維芽細胞によるコラーゲン生産をモニターした。培地中30μg/mlのガレクチン-3にて、プロリン取り込みはほぼ66だけ増加した30μg/mlにおけるガレクチン-3、1066±56cpm;対照、707±52.8cpm;p<0.05。より低い濃度のガレクチン-3は有意な効果を生じなかった10μg/mlにおけるガレクチン-3、992±72cpm;p=0.13。10週における心筋層バイオプシーは、後に迅速にHFまで進行したラットにおいて高いガレクチン-3発現を示した。HFは血流力学的かつ臨床的に明らかとなる前にすなわち、10週齢心筋層におけるガレクチン-3の発現状態を評価するために、我々は、自然発生拍動ラット心臓において心臓バイオプシーを得るための技術を開発した。バイオプシーの後、ラットを回復させ、それがHFに対して回復性であるか、またはむしろ罹患性であるかを決定した。リアルタイムTCRによって測定して、ガレクチン-3遺伝子の心筋発現は後にHFまで進行したラットにおいてのみ増加し任意単位、5.8±0.17、他方、引き続いて代償されたラットにおいては比較的低いレベルで発現され3.4±0.2、および非-トランスジェニック対照ラット心臓においてもそうであった2.5±0.033図12。考察本実験は、肥大した心室において特異的に補充されたメカニズムが不全に至ることを突き止めることを目的としたものであった。我々は、ガレクチン-3、マクロファージ発現蛋白質が、不全-傾向がある肥大した心臓で初期においてかつ特異的に発現されることを証明した。さらに、我々は、ガレクチン-3が心臓線維芽細胞において細胞内結合部位に結合し、心臓線維芽細胞の増殖およびコラーゲンの生産を活性化することを確立し、これは、これが心筋の強さおよびおそらくはHFへの進行に寄与し得ることを示唆する。以前の実験は、HFにおけるマクロファージおよび炎症応答に対する役割を提唱した。しかしながら、これらの実験は、マクロファージの活性化がHFに先行するか、または単にそれに伴うものであるかという答えられていない疑問を残した。さらに、マクロファージを心臓線維症に結びつける特異的なメカニズムに対する説明は未だなされていない。腹膜マクロファージの表面上の抗原として最初に同定され、ガレクチン-3はガレクチンファミリーの唯一のキメラ-タイプのメンバーである。それは、β-ガラクトシドならびに蛋白質に対するカルシウム-依存性特異性を有するレクチン基を有し、マクロファージの食作用カップおよびファゴソームに位置する。その抗-アポトーシスおよび成長促進作用以外に、ガレクチン-3は単球化学走性、ケモキネシスを調節し、サイトカインの利用性を変調する。さらに、最近の研究は、ガレクチン-3が、Fcγ受容体FcγRによって架橋された場合に、マクロファージによるファゴサイトーシスにおいて非常に重要な役割を演じることも検証している。興味深いことに、我々は、我々のHFモデルにおいてFcγRの過剰発現も観察した表3。10週齢ラットから得られたバイオプシーが、迅速な不全に移行したラットにおいてのみ増大したガレクチン-3発現を示した。ガレクチン-3のプロ-炎症および線維芽細胞増殖促進作用を仮定すれば、この段階における増大した発現は不全に誘導する環境に寄与し得る。我々の知見によれば、マクロファージすなわち、クッパー細胞の肝臓-アナログによって発現されたガレクチン-3は、肝臓における過剰なフィブリル-形成コラーゲンの合成を誘導することに関連付けられている。これは、ガレクチン-3がマクロファージ関連プロ-線維症メディエーターであり、マクロファージ浸潤によって特徴付けられる条件における心臓再形成に影響する能力を持つなおもう1つの炎症浸潤サイトカインであることを示唆する。どのようにしてガレクチン-3がHFに向けての進行に加わるかについての別の仮定は、コラーゲン架橋および心筋層の固さにおいて非常に重要な役割を有する進歩したグリコシル化最終産物RAGE-3に対する第3の受容体としてのガレクチン-3の発見から現れるものである。我々は、また、ガレクチン-3が細胞内受容体に結合し、心臓線維芽細胞の増殖を誘導し、コラーゲンの生産を強めることを記載する。炭水化物結合性蛋白質として元来は発見されたが、ガレクチン-3がグリココンジュゲート以外に細胞内標的と特異的に相互作用することが知られている。以前の研究は、Mac-2結合蛋白質、およびラミニンを含めたガレクチン-3結合部位としていくつかの分子を提案している。しかしながら、何が増殖する細胞におけるガレクチン-3結合エレメントの迅速な核周囲の移動を誘導するかは依然として知られていない。それが分裂する核からのガレクチン-3結合部位の輸出である遠心移動か、あるいはそれがこれらの受容体の核転移に対する細胞質に向けられているか求心移動はさらに探求する必要がある。現在の研究は、HFに対する左心室肥大からの進行において免疫系活性化およびガレクチン-3の生産に対して鍵となる役割を示唆しており、およびプロ-免疫およびプロ-線維症因子の間のリンクを証明する。Fに先行するガレクチン-3の増大した発現は、肥大した不全心室におけるマクロファージの初期の異常な活性化を反映し得る。ガレクチン-3は、今度は、活性化されたマクロファージから心臓線維芽細胞へのシグナルをリレーすることができる。ガレクチン-3の末梢検出は、HFのプレディクター、およびガレクチン-3の作用の治療的阻害として働くことができ、過剰な心臓線維症に逆作用する新規な治療的標的となることができる。実施例3ヒト血清におけるガレクチン-3の評価ガレクチン-3のレベルを、心血管病を持つ患者の血清で測定した。ELISAによってガレクチン-3を測定するための商業的に入手可能なキットを使用した。結果を表4ないし6にまとめる。ガレクチン-3は心不全、LVHのような心血管病を持つ患者の血清で有意に上昇した。さらに、健康なコントロール対象におけるガレクチン-3レベルに対する上限が見出されており、これはほとんどのCHF患者において顕著である。本発明によると、ヒト対象の血清中のガレクチン-3の測定は、信頼性よく、非-病気の対象から病気を区別し、従って、既知の筋肉細胞マーカーBNPと組み合わせて、非筋肉細胞病プロセスについてのさらなる情報を最初に提供した。データテーブル:LVH=高血圧症、肥大CHF=心不全Infl=炎症性血管病Poscon=病気の混合した群Infarct=梗塞患者Healthy=健康なコントロールプローブは5’および3’の位置を、各々、6-カルボキシフルオレセインレポーターおよび6-カルボキシテトラメチルローダミンクエンチャーで標識した。プライマーおよびプローブの位置はGenbankからの配列に従って注記した。かっこに受託番号を入れる。Fwd、順方向;Rev、逆方向。プローブは5’および3’の位置を、各々、6-カルボキシフルオレセインレポーターおよび6-カルボキシテトラメチルローダミンクエンチャーで標識した。プライマーおよびプローブの位置はGenbankからの配列に従って注記した。かっこに受託番号を入れる。Fwd、順方向;Rev、逆方向。"