"野生型ウイルスにおけるように免疫優性ではないインフルエンザの免疫原性エピトープを含む、単離された組成物。ヘマグルチニンを含む、請求項1に記載の組成物。ノイラミニダーゼを含む、請求項1に記載の組成物。インフルエンザウイルス粒子を含む、請求項1に記載の組成物。前記の粒子が不活化されている、弱毒化されている、または非感染性である、請求項4に記載の組成物。前記の組成物が糖鎖付加部位の追加または除去を含む、請求項1に記載の組成物。前記の組成物がアミノ酸の追加、置換または欠失を含む、請求項1に記載の組成物。ウイルス様粒子を含む、請求項1に記載の組成物。インフルエンザウイルスの表面上に発現した、請求項1に記載の組成物。さらに医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤または賦形剤を含む、請求項1に記載の組成物。前記のインフルエンザがヒトインフルエンザ、トリインフルエンザ、ブタインフルエンザ、イヌインフルエンザまたはウマインフルエンザである、請求項1に記載の組成物。0032インフルエンザは、本明細書において、A型、B型およびC型が含まれるウイルスとして定義される。そのウイルスは、鳥類および様々な哺乳類、例えばネコ、イヌ、ウマ、ブタ等において見付けることができる。A型はヒトにおいて最も毒性が強く、結果として季節性の流行、または時折、そしてより稀に、より致死的な世界的流行のエピソードのどちらかをもたらし得る。その型はいくつかの血清型により定義され、それはそのウイルス粒子の表面上に発現された抗原に対する宿主の免疫応答の反映である。ワクチン保護と相関するエピトープの大部分を有するウイルス表面上の2種類の構造物が、ヘマグルチニンHAまたはHおよびノイラミニダーゼNAまたはNである。少なくとも16種類の既知のH亜型および少なくとも9種類の既知のN亜型が存在する。HAはウイルスの付着および融合を仲介する。NAはシアリダーゼ活性を有する。0033野生型は、天然起源の生物またはその一部を指す。その用語は、天然のプロセスから生じた天然起源の集団の天然起源の生物中に見出される、例えば自然変異から生じ、遺伝的浮動、自然選択等により維持されている多型において見られる核酸およびタンパク質にも関連し、それには例えば組み替えの手段により得られた配列を有する核酸またはタンパク質は含まれない。0034免疫原および抗原は、本明細書において、例えばその分子に結合する抗体またはその分子を発現する細胞、例えばウイルスに感染した細胞を認識するCD4もしくはCD8T細胞を含む、抗体体液性に仲介されるおよび/またはT細胞由来細胞に仲介されるの特異的な免疫応答を誘発する分子として互換的に用いられる。その分子は、それに特異的な抗体またはT細胞が結合する1個以上の部位を含有することができる。当技術において既知であるように、そのような部位はエピトープまたは決定基として知られている。抗原は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、脂質等、およびそれらの組み合わせ、例えば糖タンパク質またはリポタンパク質であることができる。免疫原性化合物もしくは生成物、または抗原性化合物もしくは生成物は、特異的免疫応答を誘発する化合物もしくは生成物であり、それは体液性、細胞性、または両方であることができる。0035ワクチンは、免疫防御的応答、すなわち、宿主において免疫原もしくは抗原または同じものを発現するものの負の影響を低減する応答、例えば抗体を生じさせるために用いられる免疫原または抗原である。その投与量は、当技術で既知であるような前臨床および臨床試験から引き出される、推定される、および/または決定される。多数回の用量を、当技術で既知であるように、および長期の予防的または非反応的状態を確実にするために必要である際に、投与することができる。本開示の目的に関するワクチンの有用性の成功したエンドポイントは、結果として例えば目的の抗原または免疫原に結合する血清抗体、または宿主によりいずれかの組織もしくは器官において作られる抗体の産生をもたらす、結果として起こる宿主における誘導された例えば体液性および/またはT細胞に仲介される免疫応答の存在である。一部の態様において、その何らかの方法で誘導された抗体は、同族の抗原もしくは免疫原を有する化合物、分子および同様のものと結合し、または宿主が病原体を中和する、病原体を低減する、病原体が感染する、および/または臨床疾患を引き起こすのを妨げる、および/または病原体を排除するように誘導する。その免疫応答は、当技術で既知の方法、例えばELISA、ウェスタンブロット等を実施することにより監視することができる。本開示の目的に関する免疫保護は、曝露された宿主におけるそのような抗病原体、抗免疫原、抗ウイルスおよび同様の免疫応答例えばその免疫原または感染した細胞に結合する抗体および/またはT細胞の存在である。それは、あらゆる既知の免疫アッセイ、例えばELISAおよび/またはヘマグルチニン阻害アッセイを用いて決定することができる。あるいは、例えば循環している中和性抗ウイルス抗体の存在を確かめるために、ウイルス中和アッセイを用いることができる。本開示の目的に関して、宿主において免疫保護、すなわち循環する抗インフルエンザ抗体の存在が少なくとも7日間、少なくとも14日間、少なくとも17日間、少なくとも21日間、少なくとも30日間、またはより長い間観察されることが、目的のワクチンの有効性の証拠である。あるいは、一般に、そのワクチンを作るために用いられたインフルエンザの相同の単一の株に対しておおよそ1:40の赤血球凝集阻害HI力価が、候補ワクチンが得られたことを合図するエンドポイントであり得る。動物モデルにおいて、曝露後の致死性におけるあらゆる遅延は、本開示の目的に関する保護の証拠であり得る。従って、インフルエンザの病原性株に曝露されたマウスの場合では、しばしば曝露後約10日の時点で最初のマウスが死ぬ可能性がある。従って、曝露されたマウスが死ぬ最初の日が少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、またはより長い日数延長された場合、本開示の目的に関する保護であると考えられる。免疫保護の時間は、少なくとも14日間、少なくとも21日間、少なくとも28日間、少なくとも35日間、少なくとも45日間、少なくとも60日間、少なくとも3ヶ月間、少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも1年間、少なくとも2年間、またはより長い期間であることができる。好ましくは、その免疫保護は、非近交系の集団において、ならびに病原体の異なる形、亜型、株、変異株、アレルallelesおよび同様のものに対して観察される。目的の組成物は、ウイルス粒子、不活化もしくは弱毒化された改変された生きたそのウイルス、または例えばNAもしくはHAのようなそのウイルスのサブユニットを含むことができる。その組成物は、完全な複製するビリオン上に見出されるようなウイルスタンパク質および抗原を発現する構造物として当技術において既知であるが、本開示の文脈においては免疫的に鈍らせたimmunodampened免疫優性エピトープを発現する、ウイルス様粒子VLPも含むことができる。通常、VLPは核酸の複製を可能にするウイルス核酸またはその一部を欠いており、それによりVLPを非感染性にしている。0036別の態様において、抗原、決定基またはその一部を野生型のウイルスのゲノムの中にクローニングし、相同な野生型の遺伝子単数または複数を置き換えることができる。そうすると、その組み換えウイルスはその免疫的に鈍らせた分子の他は野生型のウイルスと同じである。そのウイルスはインフルエンザまたは別のウイルスキャリヤーであることができる。従って、例えば卵において十分に増殖するインフルエンザウイルスの株を免疫的に鈍らせた分子を発現するように操作することができ、その組み換えウイルスを既存の卵を用いるワクチン生産の材料および方法を用いて増殖させて免疫的に鈍らせたワクチンを得ることができる。そのワクチンを、1種類の抗原、2種類の抗原、またはより多くの抗原に対する;1種類のウイルスに対する、ウイルスの2種類以上の別々の系統、株、クレード等に対する;1つのエピトープ、2つのエピトープ、またはより多くのエピトープに対する;1つの血清型、2つの血清型、またはより多くの血清型に対する;等の免疫応答を生じさせるように合わせることができる。それは、複数の構成要素、組成物、ウイルス、VLP等を含ませることにより得ることができ、ここで前記の構成要素、組成物、ウイルス、VLP等の1つは目的の免疫的に鈍らせた抗原を発現し、それは複数のHA型、NA型または両方に対する応答を生じさせることができる。あるいは、その複数の要素を単一の多機能組成物中で連結することができる。0037免疫優性エピトープは、その抗原上の他のエピトープおよびその抗原の他のエピトープを効果的または機能的に排除するように宿主において選択的に免疫応答を誘発するエピトープであり、それは部分的または完全であってよい。0038エピトープを免疫的に鈍らせることは、エピトープをその宿主の免疫系がそのエピトープに対する抗体、ヘルパーまたは細胞傷害性T細胞を生成するのを実質的に妨げるように改変することである。しかし、免疫的に鈍らせることは必ずしも結果として前記のエピトープまたはそのエピトープに対する反応性の完全な除去をもたらさない。0039免疫再焦点化IRまたは免疫再焦点化技術IRTは、免疫優性エピトープを発現する病原体に対する有効なワクチンを作り出すために用いることができる。その技法は、例えば高レベルの抗原連続変異を示す免疫優性エピトープを有することにより宿主の免疫応答を回避するために見せかけの刷り込みとして知られる戦略を進化させた生物において適用されるのが最も適切である。そのような免疫優性エピトープは通常はその病原生物の生存可能性に影響を及ぼすことなく変化させることができる複数のアミノ酸の形をとる。免疫再焦点化は免疫的に鈍らせることの同意語である。0040抗原の免疫優性エピトープを免疫的に鈍らせることは、結果として宿主生物におけるその抗原上の非優性エピトープに対する高力価の抗体またはT細胞応答の生成、および/またはそうでなければ比較的免疫的に沈黙しているimmunesilentエピトープに対する抗体またはT細胞応答の新しい力価をもたらすことができる。そのような免疫的に鈍らせた抗原は、中程度に、または高度に可変性の、および/または保存された免疫優性エピトープ単数または複数を有する抗原を有する生物に対する有効なワクチンとしての役目を果たすことができる。そのような免疫優性エピトープまたは抗原に対して産生された抗体は、同族の生物に対する有効なワクチンとしての役目を果たすことができる。0041免疫優性エピトープは、その病原生物に感染した宿主生物からの血清またはT細胞反応性を調べることにより同定することができる。その血清を、宿主生物において免疫応答を引き起こしそうなその同定された抗原に結合する抗体の含有量に関して評価する。免疫優性エピトープが存在する場合、血清中の実質的に多くの抗体がその免疫優性エピトープに結合し、その抗原上に、またはその抗原中に存在する他のエピトープにはほとんどまたは全く結合しないであろう。0042免疫優性エピトープを同定した後、その免疫優性エピトープを、本明細書において教示する材料および方法を用いて本明細書で教示するように、および当技術で設計的事項designchoiceとして既知であるように、免疫的に鈍らせる。そのような操作は、核酸レベルで、タンパク質のレベルで、炭水化物等のレベルで、またはそれらの組み合わせで、本明細書で教示する、および当技術で既知の方法を実施して行うことができる。0043例えば、N結合型炭水化物CHOの存在は、そのポリペプチドの一次アミノ酸配列により決定することができる。アスパラギン、続いていずれかのアミノ酸、およびセリンまたはスレオニンでの終結からなる三つ組アミノ酸配列N-X-S/TここでXはプロリンまたはアスパラギン酸以外のあらゆるアミノ酸であるは、N結合型CHO付加の標的である。当技術で既知の方法および材料を実施してN結合型糖鎖付加部位をエピトープに付加する、またはエピトープから除去することができる。0044例えば、結果として免疫優性V3ドメイン中の過剰なN結合型グリカンの付加をもたらす分子的に導入されたN結合型シークオンsequonNXT/Sを示すHIVの組み換えgp120は、野生型のV3エピトープを認識する抗体に結合することができない一方で他の以前は沈黙していた、または免疫原性がより低かったエピトープに対する抗体反応を誘導するような、新規の抗原特性を示した。過剰な炭化水素部分の存在は、そのHIV-1組み換えウイルスの感染的生存能力を弱めなかった。その組み換え糖タンパク質を用いて免疫した試験動物は、相同および非相同両方の野生型HIV-1に対する感染をインビトロで中和する抗体の中程度~高い力価を示した。従って、gp120/160のV3ドメイン内の免疫優性エピトープを免疫的に鈍らせることは、同じ抗原上に位置する他の中和エピトープ上に再焦点化するように免疫応答を引き起こした米国特許第5,585,250号および第5,853,724号を参照。0045あるいは、その免疫優性エピトープの特定のアミノ酸を置き換えて、置換して、または欠失させて免疫原性を鈍らせることができる。免疫的に鈍らせることは、その免疫優性エピトープの1個のアミノ酸、2個のアミノ酸、3個のアミノ酸またはより多くのアミノ酸を、例えばその抗原をコードする核酸の部位特異的変異誘発により置き換える、置換する、または欠失させることにより起こすことができる。核酸および/またはポリペプチドを変化させるための方法は本明細書において提供され、当技術において既知である。0046免疫的に鈍らせることは、様々な技術のいずれか、例えばそのエピトープの特定のアミノ酸を変化させる、置換する、もしくは欠失させること、または例えばそのエピトープに、もしくはそのエピトープの近くに糖鎖付加部位を追加することにより影響を及ぼすことができる。本明細書で教示するように、その変化は当技術で既知の方法を実施することによりポリペプチドのレベルで、またはポリヌクレオチドのレベルで達成することができる。従って、ポリペプチドは1個以上の分子、基、化合物および同様のものをエピトープ上または中の標的部位に付加する、それから欠失させる、または置換することにより変化させることができる。例えば、特定のアミノ酸を化学的に誘導体化することができ、または余分な基、例えば多糖類、例えばポリエチレングリコールを有するように修飾することができる。0047免疫原性構造物の操作の後、その変異タンパク質muteinすなわち、目的の操作された抗原、すなわち、目的の免疫的に鈍らせた抗原の、インフルエンザの1種類以上の免疫優性エピトープに結合する定められた既知の抗体への結合のスクリーニング分析を用いて、免疫的に鈍らせることが起きたかどうかを決定することができる。例えば、その免疫優性エピトープの一次アミノ酸配列に1個以上の変化を含有させるようにポリペプチドを合成することができる。あるいは、その免疫優性エピトープの核酸配列を、免疫的に鈍らせたエピトープを発現するように改変することができる。従って、その核酸配列を、アミノ酸置換、挿入、欠失等を発現するように例えば部位特異的変異誘発により改変することができ、そのいくつかはその免疫優性エピトープに、またはその近くにさらに修飾を導入する、例えば糖鎖付加部位、例えばその免疫優性エピトープに、またはその近くにN-糖鎖付加またはO-糖鎖付加を引き起こす変異等を導入することができる。0048従って、目的のポリペプチド中の1個以上の免疫的に鈍らせたエピトープをコードする目的の核酸を、設計的事項として、当技術で既知であるような、および一般に商業的に入手可能な材料および方法を実施して、クローニングおよび/または発現ベクター中に配置することができる。例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、レプリコン等を用いることができ、また、多くのものが商業的に入手可能である。ウイルスベクターには、アデノウイルス、AAV、アルファウイルス、ファージ等から得られたウイルスベクターが含まれる。インフルエンザを用いることもできる。目的のベクターを増殖させるための適切な宿主細胞は既知であり、それには原核細胞、真核細胞、細菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等が含まれる。その細胞がその目的の組み換えタンパク質を分泌するように設計することができる。そのポリペプチドを精製して免疫原として用いることができる。0049あるいは、そのポリペプチドをインフルエンザゲノムを含むベクターまたはインフルエンザウイルスの中に、一般にそのポリペプチドが由来する相同なコード配列を置き換えることにより挿入して、前記のインフルエンザウイルス、ウイルス様粒子または構造物、ウイルス表面構造構成要素、サブユニット等の上でのその免疫再焦点化されたポリペプチドの発現を可能にすることができる。0050従って、その免疫再焦点化技術はベクター技術に依存せず、多数の発現系に適用することができる。従って、その免疫再焦点された抗原は多くの現在利用されている、および新規のワクチンベクターの中に組み込むことができ、それには以下のものが含まれるが、それらに限定されない:1現在許容できる技術を用いて、例えば培養哺乳類細胞またはニワトリ胚中で産生されるための組み換えインフルエンザウイルス;2組み換え温度感受性インフルエンザウイルス、例えばFlu-Mist;3スプリットワクチン;4昆虫、哺乳類、酵母、細菌、または他の細胞において発現されるサブユニットワクチン;5DNA発現プラスミド;ならびに6異種ウイルス発現系、例えば、組み換えワクシニアウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、および同様のもの。0051その免疫再焦点化されたHA抗原を含有する免疫原の精製のための多数の方法が、当技術において既知である。その免疫再焦点化されたHA抗原を組み込む組み換えウイルスを、認可されたワクチンの調製において現在用いられている、確立されて認可された技法を用いて精製する。0052昆虫、哺乳類または他のインビトロ発現系において生成されたサブユニットワクチンは、一般に行われるクロマトグラフィー、分離および生成、例えばイオン交換、レクチン結合樹脂、サイズ分画、抗体親和性等を用いて精製することができる。加えて、その免疫原を、精製を容易にするように設計された融合ドメインと共に発現させることができる。例えば、HA抗原を例えばポリヒスチジン融合物として発現させ、金属で活性化された樹脂上での迅速かつ単純化された精製を可能にすることができる。そのような融合パートナーは、そのように望まれるならば、当技術で既知の方法を用いる特異的なタンパク質分解的切断により除去することができる。0053エピトープ変異タンパク質野生型と異なる変異体エピトープおよび同様のものを得るための1つの手順は、アラニンスキャン変異誘発であるおよびCunninghamWellsProcNatlAcadSciUSA8464346437。1個以上の残基をアラニンAlaまたはポリアラニン残基単数または複数により置き換える。次いでその置換に機能的感受性を示す残基を、その置換の部位において、またはその置換の部位に関してさらなる、または他の変異を導入することにより精密化することができる。従って、アミノ酸配列の変化を導入するための部位は予め決められているが、その変異の性質自体は予め決められている必要はない。そのスキャンされた残基の望まれる特性に依存して、他のアミノ酸を用いて類似の置換を試みることができる。加えて、代用されるアミノ酸は、例えばその置き換えられるアミノ酸の大きさ、形状または他のパラメーターに基づいて選択されてよい。例えば、大きさおよび形状における変化を最小限にしてエピトープの電荷を低減するために、グルタミンをグルタミン酸の代わりに用いることができる。0054改変すべきアミノ酸残基を同定するためのより体系的な方法は、免疫系の刺激または免疫優性抗体認識に関わる残基および免疫系の刺激または免疫優性抗体認識にほとんどまたは全く関わりのない残基を同定することを含む。関わっている残基のアラニンスキャンを実施し、それぞれのAla変異体を、免疫優性エピトープに対する免疫系の刺激または免疫優性抗体認識の低減に関して試験する。別の態様において、免疫系の刺激にほとんどまたは全く関わりのない残基を選択して改変する。改変には、1個以上の残基の削除、残基の置換または目的の残基に隣接する1個以上の残基の挿入が含まれ得る。1態様において、その改変には別のアミノ酸によるその残基の置換が含まれる。保存的置換が最初の置換であり得る。そのような置換が結果として免疫系の刺激の誘導または既知の免疫優性抗体による増大した反応性をもたらす場合、別の保存的置換を行ってより実質的な変化が得られるかどうかを決定することができる。0055免疫系の応答をその免疫優性エピトープから離れるように変化させるための能力におけるさらにもっと実質的な改変は、ある部位に通常存在しているアミノ酸と特性がより実質的に異なるアミノ酸を選択することにより成し遂げることができる。従って、そのような置換は:aその置換の領域におけるポリペプチド主鎖の、例えばシートもしくはらせん状立体構造のような構造;bその標的部位におけるその分子の電荷もしくは疎水性、またはcその側鎖のかさbulkを維持しながら行うことができる。0056例えば、その天然起源のアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる:00571疎水性:メチオニンMまたはMet、アラニンAまたはAla、バリンVまたはVal、ロイシンLまたはLeuおよびイソロイシンIまたはIle;00582中性、親水性:システインCまたはCys、セリンSまたはSer、スレオニンTまたはThr、アスパラギンNまたはAsnおよびグルタミンQまたはGln;00593酸性:アスパラギン酸DまたはAspおよびグルタミン酸EまたはGlu;00604塩基性:ヒスチジンHまたはHis、リシンKまたはLysおよびアルギニンRまたはArg;00615鎖の方向付けに影響を与える残基:グリシンGまたはGlyおよびプロリンPまたはPro、ならびに00626芳香族:トリプトファンWまたはTrp、チロシンYまたはTyrおよびフェニルアラニンFまたはPhe。0063非保存的置換は、アミノ酸を別のグループからのアミノ酸と交換することを伴うことができる。保存的置換は、1つのアミノ酸のグループ内からの別のアミノ酸との交換を伴うことができる。0064好ましいアミノ酸置換は免疫優性エピトープを鈍らせるアミノ酸置換であるが、例えば:1タンパク質分解の受けやすさを低減する、2酸化の受けやすさを低減する、3免疫系刺激活性を変化させる、および/または4そのような類似体の他の物理化学的または機能的特性を与える、または改変するアミノ酸置換も含まれ得る。類似体には、その天然由来のペプチド配列以外の配列の様々な変異タンパク質も含まれ得る。例えば、その天然由来の配列または変異タンパク質の配列において単独または多数のアミノ酸置換例えば、保存的アミノ酸置換がなされてよい。保存的アミノ酸置換は一般に、そのR基または側鎖のかさまたは立体構造における変化に関するものを除いて、その親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきではない例えば、置き換えアミノ酸は親配列もしくは変異タンパク質配列において生じるらせんを壊す、またはその親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を混乱させる傾向があるべきではないIntroductiontoProteinStructureBrandenToozeedsGarlandPublishingニューヨーク州ニューヨークおよびThorntonetalNature354105。0065通常、変化した生物学的特性を有するエピトープ変異体は、その親分子のアミノ酸配列と少なくとも75のアミノ酸配列の同一性または類似性、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90およびしばしば少なくとも95の同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。親アミノ酸配列に関する同一性または類似性は、本明細書において、その配列を整列させて必要ならばギャップを導入して最大パーセントの配列の同一性を達成した後の、その親分子の残基と同一すなわち同じ残基または類似すなわち共通の側鎖の特性に基づく同じグループ上記からのアミノ酸残基であるその候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。0066例えば分子を免疫的に鈍らせるための、または機能的均等物を得るための目的の分子の共有結合的修飾は本開示の範囲内に含まれ、それは免疫的に鈍らせることを除いて増進された、追加の、または異なる特徴または特性を有していてよく、または有していなくてよい。そのようなものは、化学合成により、または適用可能であればその分子の酵素的もしくは化学的切断により作ることができる。その分子の他のタイプの共有結合的修飾を、その分子の標的とするアミノ酸残基を、選択された側鎖と、またはN末端もしくはC末端残基と反応することができる有機性誘導体化剤と反応させることにより、その分子の中に導入することができる。0067また、様々な有機化学の材料および方法を実施してエピトープの構成要素を修飾することができる。例えば、WO05/35726は、生体分子上に見出される置換基を導入する、修飾する、変更する、置き換える、等のための様々な方法を教示している。0068例えば、システイニル残基はα-ハロアセテート類および対応するアミン類、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応してカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じることができる。システイニル残基は、例えばブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-5-イミドゾイルプロピオン酸αbromoβpropionicacid、クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド類、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロメルクリベンゾエート、2-クロロメルクラ-4-ニトロフェノール2chloromercura4nitrophenolまたはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応によっても誘導体化することができる。0069ヒスチジル残基は、pH5.5~7.0でのジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化することができる。p-ブロモフェナシルブロミドを用いることもでき、その反応は好ましくは0.1Mカコジル酸ナトリウム中でpH6.0で実施される。0070リシニルおよびαアミノ末端残基をコハク酸または他のカルボン酸の無水物と反応させてその残基の電荷を逆転させることができる。α-アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、イミドエステル類、例えばメチルピコリンイミデート、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素および2,4-ペンタンジオンが含まれ、そのアミノ酸はグリオキシル酸と共にトランスアミナーゼに触媒されることができる。0071アルギニル残基は、1種類の、またはいくつかの一般に用いられる試薬、例えばフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応により修飾することができる。アルギニン残基の誘導体化は、しばしばアルカリ性の反応条件を必要とする。さらに、その試薬はアルギニンと同様にリシンのεアミノ基と反応する可能性がある。0072チロシル残基の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンを用いて行うことができる。例えば、N-アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いてそれぞれO-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成することができる。0073カルボキシル側鎖アスパルチルまたはグルタミルは、カルボジイミド類R-N=C=C-R’ここでRおよびR’は異なるアルキル基であることができる、例えば1-シクロヘキシル-3-2-モルホリニル-4-エチルカルボジイミドまたは1-エチル-3-4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチルカルボジイミドとの反応により修飾することができる。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換することができる。0074グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、中性または塩基性条件下で頻繁に脱アミド化されてそれぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になる。それらの残基の脱アミド化された形は、本開示の範囲内に入る。0075他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリニルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジンのαアミノ基のメチル化、ならびにN末端アミンのアセチル化およびあらゆるC末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。0076別のタイプの共有結合性修飾には、グリコシド類、糖、糖類、および同様のものの目的の分子への化学的または酵素的カップリングが含まれる。用いられるカップリング方式に依存して、その糖単数または複数を:aアルギニンおよびヒスチジン;b遊離のカルボキシル基;c遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのスルフヒドリル基;d遊離のヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基;e芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンの芳香族残基;またはfグルタミンのアミド基に結合させることができる。そのような方法は、WO87/05330において、およびAplinWristonCRCCritRevBiochempp259306において記述されている。糖残基は、例えばグルコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ等を用いて酵素的に付加することもできる。0077目的の分子上に存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に成し遂げることができる。例えば化学的糖鎖除去は、その分子の、結果として連結している糖N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミン以外のほとんどまたは全ての糖の開裂をもたらす一方でその分子の残りの部分を完全なままにしておく化合物、トリフルオロメタンスルホン酸、または均等な化合物への曝露を必要とする可能性がある。化学的糖鎖除去は、例えばHakimuddinetalArchBiochemBiophys25952において、およびEdgeetalAnalBiochem118131において記述されている。分子上の炭水化物部分の酵素的開裂は、例えばThotakuraetalMethEnzymol138350において記述されているような様々なエンドグリコシダーゼ類およびエキソグリコシダーゼ類のいずれかにより達成することができる。従って、マンノシダーゼ、フコシダーゼ、グルコサミノシダーゼglucosaminosidase、ガラクトシダーゼ等を用いることができる。0078インフルエンザのHA、NA等をコードしているRNAまたはDNAは容易に単離され、一般に用いられる手順を用いて例えばその関連する遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより;InnisetalinPCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplicationsAcademicおよびSangeretalProcNatlAcadSci745463配列決定される。一度単離すると、そのDNAを発現ベクター中に入れることができ、次いでそれを宿主細胞、例えば大腸菌細胞、NS0細胞、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞または骨髄腫細胞中に入れて、その組み換え宿主細胞中で目的のタンパク質の合成を得る。そのRNAまたはDNAはまた、例えば塩基を置換して特定の宿主細胞におけるコドン使用頻度に関して最適化することにより、または異種のポリペプチドのコード配列に共有結合的に連結することにより修飾することができる。0079このように、本明細書で教示するように、1個以上の免疫的に鈍らせたエピトープをコードし、発現する目的のポリヌクレオチドを、当技術で既知であるような分子生物学ならびに組み換えの材料および方法を実施して発現させ、目的の組み換えポリペプチドの源を得ることができる。0080別の態様において、1個以上の免疫的に鈍らせたエピトープをコードする目的のポリヌクレオチドを、インフルエンザゲノム中の相同な野生型の配列と置き換えて、その1個以上の免疫的に鈍らせたエピトープを発現するウイルス、ウイルス様構造物またはそのサブユニットをもたらすことができる。従って、そのウイルス株を標準的な技法、例えば現在用いられている卵に基づく技術を用いて増殖させて免疫原を生成することができ、それをワクチンとして単独で用いることができ、または現在の二価および三価ワクチンを模するために他の有効薬剤、例えば改変されていないウイルスもしくは複数のウイルスと組み合わせることができる。0081インフルエンザウイルス、抗原、それらの構成要素、サブユニット、HA、NAおよび同様のものの機能性断片、部分、変種、派生物または類似体および同様のもの、ならびにそれらの形formsという語句および用語、ならびにそれらの組み合わせは、その変種、派生物、類似体および同様のものが由来する野生型または親要素または元の免疫的に鈍らせていない抗原と共通する質的生物学的活性を有する要素を指す。例えば、HAの機能性部分、断片または類似体は、天然のHAが刺激するように免疫応答を刺激する機能性部分、断片または類似体であるが、その応答はそのHA上の異なるエピトープに対してであってよい。0082従って、目的のウイルスの機能的均等物、またはその部分もしくは派生物は、本開示の範囲内に含まれる。用語機能的均等物には、インフルエンザに対する免疫応答を刺激する能力を有するウイルスおよびその部分が含まれる。0083従って、一度候補となる免疫的に鈍らせたポリペプチドが同定されたら、免疫的に鈍らせる、および以前は沈黙していたエピトープを発掘するuncovering目的を維持しながらそのアミノ酸配列に改変を行うことは、十分に当業者の技術の範囲内である。従って、例えば、そのコード核酸を本明細書で言及する2つの目標に悪影響を及ぼさないアミノ酸挿入、欠失または置換をコードするように改変することができる。別の態様において、そのアミノ酸は、本明細書で言及する2つの目標に悪影響を及ぼさない限りで当技術で既知の材料および方法を実施して修飾、誘導体化、置換等がなされる。本明細書で教示するように、元の免疫的に鈍らせたポリペプチドからのそのような変化および改変は、その機能的均等物であると考えられる。免疫的に鈍らせることの程度は、本明細書で教示するような、または当技術で既知であるようなインビトロまたは動物アッセイにおいて定量化することができる。同様に、以前は沈黙していたエピトープに対する応答を可能にすることの程度は、本明細書で教示するような、または当技術で既知であるようなインビトロまたは動物アッセイにおいて定量化することができる。元の免疫的に鈍らせた配列に対して改変がなされた場合、本明細書で教示する2つの目標の一方の程度における許容できる低減の程度は設計的事項である。一般に、反応性の25より大きくない低減は、通常、その望みはその免疫優性エピトープに対する反応を可能な限り少なくすることであるため、許容される。従って、元の免疫的に鈍らせた配列に対する改変が例えば、例えばその免疫優性エピトープに対する抗体を用いるELISAにおいて決定されるようなそれに対する反応性の元の免疫的に鈍らせたエピトープにおける無反応と比較した25の復帰を示す場合、それは機能的均等物に関する反応性における許容できる低減と考えることができるであろう。20より大きくない低減、15より大きくない低減、10より大きくない低減、5より大きくない低減、または低減なしは、免疫的に鈍らせた抗原の機能的均等物に関して許容できると考えられる可能性がある。同様に、以前は沈黙していたエピトープに対する今の反応性に関して、25より大きくない低減は、通常、その望みはその以前は沈黙していたエピトープに対する反応を可能な限り多くすることであるため、許容される。従って、元の免疫的に鈍らせた配列に対する改変が例えば、例えばその以前は沈黙していたエピトープに対して産生された抗体を用いるELISAにおいて決定されるようなその以前は沈黙していたエピトープに対する反応性の元の免疫的に鈍らせたエピトープにおける最大限の反応性と比較した25の低下を示す場合、それは機能的均等物に関する反応性における許容できる低減と考えることができるであろう。20より大きくない低減、15より大きくない低減、10より大きくない低減、5より大きくない低減、または低減なしは、以前は沈黙していたエピトープを発現する抗原の機能的均等物に関して許容できると考えられる可能性がある。0084目的のインフルエンザウイルスの一部、例えばHA、NA、M2または組み合わせを有する膜または非膜製剤、およびあらゆる他のインフルエンザ抗原の製剤は、当技術で既知の方法を実施して得ることができる。1個以上の免疫優性非保護的エピトープimmunodominantnon-protectiveepitopesIDNPE、それには株特異的であるがより幅の狭い免疫を刺激するエピトープも含まれるを、例えば分子内改変例えば削除、電荷の変更、1個以上のN結合型シークオンの追加等により除去して、または鈍らせて抗原として未処置の動物に与える場合、IDNPEに対する変更は、BおよびT細胞レベルのどちらかまたは両方において、準優性subdominantの、または以前は沈黙していたエピトープに対して新しい免疫応答のヒエラルキーを誘導し得る15927989。本明細書において記述されるその技術は免疫再焦点化として知られている。0085一度変更がなされたら、その変更がここで改変された免疫優性エピトープ、その鈍らせたエピトープ、抗原等の反応性を変化させる、例えば低減するかどうかは、本明細書で教示するように、または当技術で既知であるように決定される。それは、その鈍らせた抗原のその優性エピトープと反応することが知られている定められた抗血清との反応性を、例えばELISAまたはウェスタンブロットにより決定することにより、インビトロで試験することができる。それらの定められた抗血清との低減した反応性を示す候補を、それらの鈍らせた抗原が免疫原性でありその宿主がそれに対する免疫応答を生じるかどうかを決定するためのインビボでの試験のために選択する。従って、例えば、当技術で既知であるようにマウスをその鈍らせた抗原に対して免疫し、血清を得てそれとの反応性に関してインビトロアッセイで試験する。次いでその抗血清を野生型のウイルスに対して試験して、その抗体がまだその野生型のエピトープまたはその野生型の抗原を認識するかどうかを決定することができる。それは例えばELISAまたはウェスタンブロットにおいて行うことができる。後者は情報価値があり、その特定の免疫優性エピトープが結合するかどうか、ならびにその抗血清がインフルエンザと反応性であるままである場合、そのマウス抗血清と反応性であるエピトープを有する分子の大きさ、およびおそらく正体を明らかにすることができる。0086免疫再焦点化されるワクチンの候補は、適切な免疫応答の刺激のために、正確に折りたたまれるように、および天然同様の立体構造的エピトープの形をとるように設計される。抗原性試験の前に、精製したHA抗原の立体構造依存性抗体および細胞表面上のウイルス受容体に結合する能力を評価するのが慣習的である。そのような相互作用を評価するための方法は当技術で周知であり、広く利用可能である。0087商業的ワクチンとしての免疫再焦点化された抗原の開発の前に、非臨床試験がしばしば必要とされる。1つの方法において、動物、例えばマウス、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ラット、フェレット等にその免疫再焦点化されたワクチンの候補を注射し、またはそうでなければそれで免疫する。免疫処置の後、その免疫血清の集団panelを、精製された抗原またはウイルスに対する反応性結合活性、赤血球凝集阻害ウイルス受容体相互作用の阻害、HIおよびウイルス中和培養細胞の感染の阻害、および/または培養細胞における複製の阻害、VNが含まれる多数の活性に関して評価する。血清反応性を評価するための方法は、当技術で周知である。0088免疫再焦点化された抗原で免疫した動物からの血清の非相同HIおよびVN活性の、変異していない抗原で免疫した動物からの血清との比較を用いて、防御免疫の幅の広がりおよび防御免疫への向上を評価する。従って、HIおよびVNアッセイを、その抗原性試験において産生された様々な免疫血清を用いて、H1N1の非相同株またはインフルエンザウイルスの他の血清型に対して実施する。試験血清のHIまたはVN力価の、改変されていない抗原での免疫処置からの血清と比較した増大は、前記の試験血清を産生させるために用いられた抗原が、幅の広がった、および向上した免疫を刺激することを示す。0089目的のワクチン候補の選択の分析の範例をさらに例示するため、図1の表1において仮定的なデータセットを提供する。免疫再焦点化されたHA抗原MutH1、MutH2、MutH3およびMutH4はA/カリフォルニア/04/2009株に由来しており、それを相同および非相同のウイルスに対する抗ウイルス活性に関して試験する。非相同のウイルス株2~4を、親であるカリフォルニア/04/2009Cal/04/09株からの抗原性の相違の増大の順に示す。全ての免疫原は、改変されていない抗原WT-HAにより誘導されたHIおよびVNの力価と同等のHIおよびVNの力価を刺激した。Mut-H1からの血清は、両方のアッセイにより決定した際に、株2~4に対して、WT-HAからの力価と比較して統計的により高いレベルの抗ウイルス活性を含有する。Mut-H2およびMut-H3からの血清は株2に対して2倍の高さのHIおよびVN活性の力価を有するが、それはその血清希釈系列が2倍希釈で行われた場合、統計的に有意ではない可能性がある。しかし、Mut-H2およびMut-H3からの血清は、より高度に異なる株3および4に対して、有意により高いHIおよびVNの力価を有する。表1において示すデータの分析は、Mut-H1またはMut-H2が通常インフルエンザの前臨床試験において相関物として測定される最も高いレベルの抗ウイルス活性を刺激することを示唆している。0090追加の動物モデル試験を実施して、免疫再焦点化された抗原の候補の防御免疫をさらに評価することができる。そのような試験の1例において、フェレットのグループを改変されていない抗原またはリードするleading免疫再焦点化された候補例えば表1で示したMut-H2で免疫する。免疫処置後、そのフェレットの2つのグループをサブグループに分け、それぞれのサブグループに、インフルエンザの相同または非相同の株のどちらか、例えば表1において言及した株からのウイルスを接種する負荷をかける。負荷後2週間の間、疾患、病理発生およびウイルス複製の測定結果を集める。Mut-H2で免疫し、非相同の株で負荷をかけたフェレットがWT-HAで免疫したグループと比較して疾患およびウイルス複製を低減させたことを示すその測定結果の分析は、Mut-H2は幅の広がった免疫を刺激し、向上したワクチン候補であることを示している。0091もはや親免疫優性抗原に結合する既知の抗血清とはほとんどまたは全く反応しないが宿主において免疫原性のままである、それらの候補となる免疫的に鈍らせた抗原を、さらなる試験のための候補ワクチンとして選択する。候補は、免疫認識のための免疫再焦点化されたエピトープを標的化する一方で、親免疫優性抗原に対する増進された反応性を刺激してもよい。例えば、それに対するマウス抗血清を標準化された抗ウイルスに基づくアッセイにおいていくつかのインフルエンザ株との反応性に関して試験して、その抗体の反応性がどの程度包括的であるか、すなわち、その鈍らせた抗原上の新規に認識されるエピトープがより広い範囲のインフルエンザ株まで包括的であるかどうか、およびその抗体が広い抗ウイルス活性を有するかどうかを決定することができる。0092従って、組み換えHArHAサブユニットタンパク質ワクチンは、インフルエンザウイルスの相同な株からの負荷に対して保護するのに十分であることができる。rHAは、より高齢の成人においても免疫原として用いることができる。本明細書で教示するような第2世代の免疫再焦点化されたHAサブユニットワクチンは、非相同の株に対しても防御免疫を誘導することができるであろう。従って、例えば、目的の候補ワクチンは同族の抗原、例えばH1に対してだけでなく、HIの異なる株または分離株に対して、およびH2、H3、H4等に対しても保護することができる。00931態様において、インフルエンザのHAおよびNAを、宿主の免疫応答を免疫防御的応答、好ましくは多種多様な株等に対して有効な広い範囲およびスペクトルの免疫防御的応答のための新規の標的としてのHAおよびNA上の他の非優性部位に再焦点化するための標的として選択した。0094例えば、HAはA~Eとして知られる5個の免疫優性部位またはエピトープを有する。部位AにはHA型株のアミノ酸140~146が含まれ、それは配列KRRSNKSSEQIDNO:1を有する。ワイオミング株において、その部位は既に香港株と比較してそれと関係する3個の糖鎖付加部位を有する。従って、1つのアプローチは、部位Aにより定められるループ構造を、例えばKRRSNKSSEQIDNO:1配列の例えばGGによる置き換えにより除去することである。0095部位Bには、配列SDQISLYAQSEQIDNO:2を有するHAのアミノ酸189~197が含まれる。それは配列KYKYSEQIDNO:3を有するアミノ酸158~161と相互作用するらせんを形成する。QISの代わりにNASを用いる;SLYの代わりにNITを用いる;158においてKYKの代わりにNSTを用いる;そして159においてYKYの代わりにNTSを用いるなど、いくつかの可能性のある変更をB部位に対して行うことができ、それらの変更の全てがそれらの4つの部位にN-糖鎖付加配列を導入する。0096部位Cには、配列KCNを有するアミノ酸276~278が含まれる。KCNの代わりにNCTを用いることができる。0097部位Dには、アミノ酸201~220における大きな逆並行ループが含まれる。そのループ全体を削除することができる。また、部位201~203において糖鎖付加部位NITをRITの代わりに用いることができる。0098部位Eには、アミノ酸79~82、FQNKSEQIDNO:4が含まれる。糖鎖付加部位NETをQNKの代わりに用いることができる。0099上記の変更は組み合わせることができ、例えば、部位BにおけるNSTおよびNTSの変更のどちらかを、部位Cおよび/またはEに対する提案された典型的な変更と組み合わせることができる。00100上記の免疫優性部位に対する変化は、本明細書で教示するような、および当技術で既知であるようなクローニング、部位特異的変異誘発、遺伝子合成増幅等により得ることができる。00101従って、上記のA部位の変更は、プライマーATop:GGAACAAGCTCTGCTTGCggcggtTTCTTTAGTAGATTGAATTGGSEQIDNO:5およびABottom:CCAATTCAATCTACTAAAGAAaccgccGCAAGCAGAGCTTGTTCCSEQIDNO:6を用いる部位特異的変異誘発により得ることができ、上記の欠失およびその欠失部位におけるGGジペプチドの挿入を含有する配列GTSSACGGFFSRLNSEQIDNO:7が得られる。00102そのB部位の変更は、プライマーB1Top:CAAATCAGCCTATATGCTaatGCATCAGGAAGAATCACSEQIDNO:8およびB1bottom:GTGATTCTTCCTGATGCattAGCATATAGGCTGATTTGSEQIDNO:9を用いて配列QISLYANASGRISEQIDNO:10を生じる;プライマーB2Top:CACCACCCGGTTACGGACaatGACacAATCAGCCTATATGCTCAAGCSEQIDNO:11およびB2bottom:GCTTGAGCATATAGGCTGATTgtGTCattGTCCGTAACCGGGTGGTGSEQIDNO:12を用いて配列HHPVTDNDTISLYAQSEQIDNO:13を生じる;プライマーB3Top:CGGACAGTGACCAAATCAatCTAtcTGCTCAAGCATCAGGAAGSEQIDNO:14およびB3Bottom:CTTCCTGATGCTTGAGCAgaTAGatTGATTTGGTCACTGTCCGSEQIDNO:15を用いて配列DSDQINLSAQASGSEQIDNO:16を生じる;プライマーB4top:GAATTGGTTGACCCACTTAAAtTACAcATACCCAGCATTGAACGTGACSEQIDNO:17およびB4bottom:GTCACGTTCAATGCTGGGTATgTGTAaTTTAAGTGGGTCAACCAATTCSEQIDNO:18を用いて配列NWLTHLNYTYPALNVSEQIDNO:19を生じる;ならびにプライマーB5top:GAATTGGTTGACCCACTTAAAAaACAAAacCCCAGCATTGAACGTGACTATGSEQIDNO:20およびB5bottom:CATAGTCACGTTCAATGCTGGGgtTTTGTtTTTTAAGTGGGTCAACCAATTCSEQIDNO:21を用いて配列NWLTHLKNKTPALNVTMSEQIDNO:22を生じることにより得ることができる。00103そのC部位の変更は、プライマーC1top:GATCAGATGCACCCATTGGCAAtTGCAgTTCTGAATGCATCACTCCSEQIDNO:23およびC1bottom:GGAGTGATGCATTCAGAAcTGCAaTTGCCAATGGGTGCATCTGATCSEQIDNO:24を用いて配列SDAPIGNCSSECITSEQIDNO:25を生じることにより得ることができる。00104そのD部位の変更は、プライマーD1Top:CTATATGCTCAAGCATCAGGAAatATCACAGTCTCTACCAAAAGSEQIDNO:26およびD1Bottom:CTTTTGGTAGAGACTGTGATatTTCCTGATGCTTGAGCATATAGSEQIDNO:27を用いて配列LYAQASGNITVSTKRSSEQIDNO:28を得ることにより得ることができる。00105そのE部位の変更は、プライマーE1Top:GATGGCTTCCAAAATAAGAcATGGGACCTTTTTGTTGAACSEQIDNO:29およびE1bottom:GTTCAACAAAAAGGTCCCATgTCTTATTTTGGAAGCCATCSEQIDNO:30を用いて配列DGFQNKTWDLFVESEQIDNO:31を生じることにより得ることができる。00106HAS1:CAGTCCTCATCAGATCCTTGSEQIDNO:32、HAS2:GGTAAGGGATATCTCCAGCAGSEQIDNO:33プライマーを、HAS3:cgcgattgcgccaaatatgccSEQIDNO:34を陰性negativeとして用いて、配列決定のために用いることができる。00107その抗原部位の多くは荷電したアミノ酸残基に富む。別のアプローチは、それらの荷電した残基を、それの変わりにアラニン残基を用いることにより置き換えることである。そのような変更の例には以下のものが含まれる:部位AにおいてKRRをAGAに;部位BにおいてKYKYSEQIDNO:3をAYKYSEQIDNO:35に、およびSDQIをSAQISEQIDNO:36に;部位CにおいてKCNをACNに、ならびに部位DにおいてRITをAITに。00108加えて、部位Bにおける疎水性チロシン残基の機能を評価するための変異は、SLYをSLTで置き換えることで得ることができる。00109B細胞エピトープに加えて、T細胞エピトープも免疫的に鈍らせることができる。残基177~199の領域における主なCD4エピトープは、既に標的としたB部位の外側のMHCクラスII結合エピトープを含む。残基LYIWGVHHPSEQIDNO:37における、T細胞応答を鈍らせるための変異には、LYIWをVYIWSEQIDNO:38またはVTIWSEQIDNO:39で置き換えること;およびVHHPをIHAGSEQIDNO:40で置き換えることが含まれる。00110別の態様において、1個以上の免疫的に鈍らせたエピトープを含む目的の組み換えポリペプチド、または同じものを含むビヒクル、例えばウイルス様粒子、ウイルスのサブユニット組成物を免疫原として用いて、それに対する特異的な抗体または抗血清を得ることができ、それは通常は免疫原性ではないが今は免疫優性エピトープ単数または複数を免疫的に鈍らせたため免疫原性であるエピトープを認識する。その抗体は、当技術で既知の材料および方法を用いて作ることができ、従って、動物を免疫して血清を集めることによりポリクローナルであることができ、または免疫グロブリンの投与の現在の実施と同様に同じものに曝露されたヒトから得ることができると考えられ、または既知の材料および方法を実施してモノクローナルであることができる。ヒト化またはヒト抗体を得るための方法を実施すること、ならびに前記の抗体を免疫原性を最小限にするために操作すること、例えば当技術で既知であるように炭水化物、例えばPEG分子、および他の置換基を付加して、通常は免疫優性ではないエピトープに対するそのインフルエンザ抗体上の免疫原性部位を隠すことは、有益である可能性がある;例えば米国特許第5,821,337号およびWO09/32661を参照。その抗体を集めて受動的なワクチンpassivevaccineとして投与することができる。00111試験のため、例えば前臨床データを得る目的で、目的の免疫原を非ヒト哺乳類に投与する。典型的な非ヒト哺乳類には、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類および他の哺乳類が含まれる。そのような哺乳類は、その配合物を用いて処置する予定の疾患に関する確立された動物モデルであってよく、または目的の免疫原の毒性を研究するために用いられてよい。それらの態様のそれぞれにおいて、用量段階的増大doseescalation試験をその哺乳類において実施することができる。00112規制当局、例えばヒト用の製品に関して米食品医薬品局または欧州医薬品庁からの承認を得るため、生物学的医薬はその関係する規制当局により定められた純度、安全性および効力の基準を満たさなければならない。それらの基準を満たすワクチンを生産するため、その組み換え生物は、例えば伝達性海綿状脳症本明細書においてTSEと呼ぶを含まないことを保証されている培地中で維持することができる。00113従って、好ましい態様は組み換えサブユニットワクチンの使用に関するが、細菌においてヒトにおける使用のために設計されたプラスミドを選択および維持するために抗生物質耐性マーカーを用いるのがいつも理想的であるとは限らないため、そのワクチンをコードする配列を有するプラスミドは例えば非抗生物質選択マーカーを有することができる。従って、1態様において、本開示は、例えば分解酵素を、前記の分解酵素の基質を炭素の源として含有する培地における細菌の増殖を可能にすることにより、選択マーカーとして利用する選択戦略を提供する。そのような分解酵素の例には、ラクトースの取り込みおよびβ-ガラクトシダーゼをコードするlacYZGenBank番号J01636、J01637、K01483またはK01793が含まれるが、それに限定されない。定められた培地において代謝的利点を提供する他の選択マーカーには以下のものが含まれるが、それらに限定されない:ガラクトースの利用に関してgalTKGenBank番号X02306、スクロースの利用に関してsacPAGenBank番号J03006、トレハロースの利用に関してtrePARGenBank番号Z54245、キシロースの利用に関してxylABGenBank番号CAB13644およびAAB41094、等。あるいは、その選択は毒性アレル、例えばsacBアレルGenBank番号NP_391325を阻害するためのアンチセンスmRNAの使用を含むことができる。00114本明細書で記述する新規ワクチンおよび配合物を配合するために用いられる具体的な方法は本開示に重要ではなく、以下のものから選択することができ、またはそれらが含まれることができる:生理的緩衝液;リン酸アルミニウムまたはアルミニウムヒドロキシホスフェート、モノホスホリルリピドAMPLまたはMPLAとも呼ばれる;SchneersonetalJImmunol14721362140;例えば、SasakietalInfImmunol6535203528;およびLodmelletalVaccine1810591066、QS-21サポニン;デキサメタゾン;CpGDNA配列;インターフェロンα194197、リポ多糖類LPS拮抗薬等。アジュバントの使用および商業的入手可能性は、当技術で既知であるように、設計的事項である。00115目的の免疫再焦点化技術はアジュバントおよび免疫変調成分とは無関係であるため、本明細書で教示する方法を実施して生成された抗原またはそれと反応する抗体は、アジュバント、例えばAlhydrogelならびにNovartisおよびGlaxoSmithKlineのような会社により開発された新規組成物例えば、MF59およびAS03と、ならびに変調成分および増進剤、例えばCpGおよびサイトカイン類と適合する。00116本明細書における配合物は、処置される特定の適応症に必要である際は、1種類より多くの有効化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する有効化合物を含有してもよい。例えば、さらにアジュバントを提供することが望ましい可能性がある。そのような分子はその意図される目的に有効である量での組み合わせで存在するのが適切である。そのアジュバントは順次、抗原投与の前または後に投与することができる。00117目的の免疫原は、第2の構成要素、例えば同じものにコンジュゲートした、または同じものと混合された療法的部分と共に、コンジュゲートとして、組み合わせで別々に、使用前に混合して等で療法薬として投与して用いることができ、例えばLevineetaledsNewGenerationVaccines第2版、MarcelDekkerIncニューヨーク州ニューヨーク1997を参照。その他の療法剤単数または複数は、意図される目的のために用いられるあらゆる薬物、ワクチンおよび同様のものであることができる。従って、その療法剤は、生物学的物質、小分子等であることができる。目的の免疫原は、例えば免疫的に鈍らせた、または免疫的に鈍らせていない、第2のインフルエンザ免疫原性組成物、第3の第2のthirdsecondインフルエンザ免疫原性組成物等と共に同時に、または順次投与することができる。従って、目的の免疫的に鈍らせた抗原を既存のワクチンと組み合わせて二価ワクチン、三価ワクチン等を形成することができるが、そのアプローチはその既存のワクチンが卵において作られる場合、その使用を最小限にするであろう。あるいは、目的の免疫的に鈍らせた抗原を1種類より多くの他の抗原、サブユニット、構成要素、VLP等と組み合わせて多価ワクチンを形成することができる。00118用語小分子および類似の用語には、ペプチド、ペプチド模倣薬、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、モルあたり約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物すなわち、ヘテロ有機heterorganicおよび有機金属化合物が含まれる、モルあたり約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、モルあたり約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、モルあたり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、およびそれらの塩類、エステル類、組み合わせ、ならびに免疫応答を刺激する、または免疫原性である、または望まれる薬理的活性を有するそのような化合物の他の医薬的に許容できる形が含まれるが、それらに限定されない。00119従って、本開示の免疫原は単独で、または第2の免疫原もしくはその処置される疾患に関する処置が含まれる他のタイプの処置との組み合わせで投与されてよい。その第2の構成要素は免疫賦活薬であることができる。00120加えて、本開示の免疫原を様々なエフェクター分子、例えば異種のポリペプチド、薬物等にコンジュゲートさせてよく、例えばWO92/08495;WO91/14438;WO89/12624;米国特許第5,314,995号;およびEPO396,387を参照。免疫原は、療法的部分、例えば抗生物質例えば療法剤またはアジュバントにコンジュゲートさせてよい。00121本開示の療法化合物は、インフルエンザと関係する少なくとも1種類の症状を緩和する。本開示の製品は、当技術で既知であるような、または本明細書で記述するような医薬的に許容できる組成物中で提供されてよい。用語生理的に許容できる、医薬的に許容できる等は、連邦もしくは州政府の規制当局により承認されていること、またはヒトにおける使用に関して米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に載っていることを意味する。00122目的の製品は、あらゆる許容できる方法で哺乳類に投与することができる。導入の方法には、非経口、皮下、経皮、腹腔内、肺内、鼻腔内、硬膜外、吸入および経口経路、ならびに免疫抑制処置に関して望まれるならば病巣内投与が含まれるが、それらに限定されない。非経口注入には、筋肉内、皮内、静脈内、動脈内または腹腔内投与が含まれる。その製品または組成物は、あらゆる好都合な経路により、例えば注入または大量瞬時注射により、上皮または粘膜皮膚の裏層例えば口の粘膜、直腸および腸の粘膜等を通した吸収により投与されてよく、他の生物学的に有効な薬剤と一緒に投与されてよい。投与は全身的または局所的であることができる。加えて、本開示の療法的製品または組成物を、脳室内および髄腔内注射が含まれるいずれかの適切な経路により中枢神経系の中に導入するのが望ましい可能性があり;脳室内注射は、例えばオマヤリザーバーのようなリザーバーに取り付けた脳室内カテーテルにより容易になる可能性がある。加えて、その製品は、特に目的の製品の低下する用量のパルス注入により適切に投与することができる。好ましくは、その投与は注射、好ましくは部分的にその投与が短期であるか長期であるかに依存して静脈内または皮下注射により与えられる。00123様々な他の送達系が知られており、本開示の製品を投与するために用いることができ、それには例えばリポソーム、微粒子またはマイクロカプセルへの封入encapsulationが含まれるLiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancerLopezBeresteinetaleds参照。00124その有効成分は、コロイド性薬物送達系例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセルにおいて、またはマクロエマルジョンにおいて、それぞれ例えばコアセルベーションcoascervation技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメチルメタシレートpoly-methylmethacylateマイクロカプセル中に捕捉されてよい。そのような技法は、RemingtonsPharmaceuticalSciences第16版AOsalEdにおいて開示されている。00125肺投与も、例えば吸入器または噴霧器の使用およびエアロゾル化剤を用いた配合により利用することができる。目的の組成物を患者の肺の中に乾燥粉末組成物の形で投与してもよく、例えば米国特許第6,514,496号を参照。00126本開示の療法的製品または組成物を処置を必要とする領域に局所的に投与するのが望ましい可能性があり;それは例えば限定としてではない局所的注入、局所適用により、注射により、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、またはインプラントを用いて達成することができ、前記のインプラントは多孔性、非多孔性、またはゼラチン状物質からなり、それにはヒドロゲル類または膜、例えばsilastic膜または線維が含まれる。好ましくは、本開示の製品を投与する場合、それにそのタンパク質が吸収または吸着しない物質を用いるように注意する。00127さらに別の態様において、その製品は制御放出系で送達することができる。1態様において、ポンプを用いてよいSeftonCRCCritRefBiomedEng14201BuchwaldetalSurgery88507およびSaudeketalNEJM321574参照。別の態様において、ポリマー性物質を用いることができるControlledDrugBioavailabilityDrugProductDesignandPerformanceSmolenetaledsWileyRangeretalJMacromolSciRevMacromolChem2361参照LevyetalScience228190DuringetalAnnNeurol25351およびHowardetalJNeurosurg71105も参照。さらに別の態様において、制御放出系をその療法的標的の近くに配置することができる。00128目的の製品の使用のために持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の適切な例には、その免疫原を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは成形された物品、例えば薄膜またはマトリックスの形である。そのような持続放出マトリックスの適切な例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類例えば、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリラクチド類米国特許第3,773,919号、L-グルタミン酸およびエチル-L-グルタメートのコポリマー、分解不能なエチレン-酢酸ビニル、分解可能な乳酸-グリコール酸コポリマー類例えば乳酸-グリコール酸コポリマーからなる注射可能なマイクロスフェア類およびポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。ポリマー、例えばエチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸は100日間を越える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲル類はより短い期間の間forandduring細胞、タンパク質および製品を放出する。関係する機構に応じた安定化のために、合理的な戦略を考案することができる。00129その組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出配合物、デポー剤および同様のものの形をとることができる。その組成物は、伝統的な結合剤およびキャリヤー、例えばトリグリセリド類を用いて坐剤として配合することができる。経口配合物には標準的なキャリヤー、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等が含まれることができる。適切なキャリヤーの例がRemingtonsPharmaceuticalSciencesMartinにおいて記述されている。そのような組成物は、有効量のその免疫原を、好ましくは精製された形で、その患者に適当な投与のための形を提供するために適切な量のキャリヤーと一緒に含有するであろう。当技術で既知であるように、その配合物は投与の方式に合うように構成されるであろう。00130その製品の療法配合物は、凍結乾燥された配合物または水溶液としての貯蔵のために、望まれる程度の純度を有するその製品を任意の当技術において典型的に用いられる医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤、賦形剤または安定剤、すなわち緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤isotonifiers、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤および他の種々の添加剤と混合することにより調製されてよい;RemingtonsPharmaceuticalSciences第16版Osoled参照。そのような添加剤は一般に、用いられる投与量および濃度においてその受容者に対して非毒性であり、従ってその賦形剤、希釈剤、キャリヤー等は医薬的に許容でき、または一般に安全であるとみなされている。00131免疫再焦点化されたポリペプチドそれには、他のウイルス性もしくは非ウイルス性ポリペプチドとの組み合わせでの、他のインフルエンザタンパク質が含まれる、混入タンパク質を実質的に含まないサブユニットとして;組み換えウイルス、VLPにおいて、もしくはウイルスもしくは細胞由来の1種類以上のタンパク質との組み合わせで発現もしくは生成することができる目的のIRポリペプチドとして;単離された分子として発現もしくは生成することができ、次いでウイルスもしくは細胞由来の1種類以上のタンパク質と組み合わせることができるIRポリペプチドとして;等で生成することができる抗原、その一部、エピトープ、決定基等、またはそれに対する抗体が含まれるは、実質的に純粋な形で得る、または作ることができる。単離されたまたは精製された免疫原またはワクチンは、それからその免疫原もしくはワクチンが得られた培地からの混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成された構成要素を含有する用いられた培地の中の化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。用語細胞下の物質を実質的に含まないには、細胞を破壊して構成要素にして、それをその細胞の細胞下の構成要素死細胞および細胞の一部、例えば細胞膜、細胞形骸ghostsおよび同様のものが含まれるから分離することができ、それからその免疫原もしくはワクチンを単離する、または組み換えにより生成する、細胞の調製が含まれる。従って、細胞下の物質を実質的に含まない免疫原またはワクチンには、乾燥重量により約30、25、20、15、10、5、2.5または1未満の細胞下の混入物または目的の生成物と異なるあらゆる他の要素を有するその免疫原またはワクチンの製剤が含まれる。00132本明細書で用いられる際、免疫原またはワクチンを含む液体配合物の文脈における用語安定性および安定なは、配合物中のその免疫原またはワクチンの、所与の製造、調製、輸送および貯蔵条件下での熱的および化学的凝集、分解または断片化への、例えば1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、またはより長い期間の耐性を指す。本開示の安定な配合物は、所与の製造、調製、輸送および貯蔵条件下で、80、85、90、95、98、99または99.5以上の生物学的活性を保持する。前記の免疫原またはワクチン製剤の安定性は、当業者に既知の方法により凝集、分解または断片化の程度により評価することができ、それには基準と比較した例えば顕微鏡を用いる物理的観察、粒子の大きさおよび数の決定等が含まれるが、それらに限定されない。00133用語キャリヤーは、それと共にその療法的物質が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような生理的キャリヤーは、無菌の液体、例えば水ならびに石油、動物、植物または合成由来の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油および同様のものが含まれる油であることができる。水はその医薬組成物が静脈内に投与される場合に適切なキャリヤーである。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射可能な溶液のための液体キャリヤーとして用いることができる。適切な医薬的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、エタノールおよび同様のものが含まれる。その組成物は、望まれるならば、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはpHもしくは緩衝剤も含有することができる。そのキャリヤーには塩および/または緩衝剤が含まれることができる。00134緩衝剤は、pHを生理的条件に近い範囲に維持するのを助ける。緩衝剤は好ましくは約2mMから約50mMまでの範囲の濃度で存在する。本開示と共に使用するための適切な緩衝剤には、有機酸および無機酸の両方、ならびにそれらの塩類、例えばシトレート緩衝剤例えばクエン酸一ナトリウム-クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸一ナトリウム混合物等、スクシネート緩衝剤例えば、コハク酸-コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸-水酸化ナトリウム混合物、コハク酸-コハク酸二ナトリウム混合物等、タルタレート緩衝剤例えば酒石酸-酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸-酒石酸カリウム混合物、酒石酸-水酸化ナトリウム混合物等、フマレート緩衝剤例えばフマル酸-フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸-フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム-フマル酸二ナトリウム混合物等、グルコネート緩衝剤例えばグルコン酸-グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸-水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸-グルコン酸カリウム混合物等、オキサレート緩衝剤例えばシュウ酸-シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸-水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸-シュウ酸カリウム混合物等、ラクテート緩衝剤例えば乳酸-乳酸ナトリウム混合物、乳酸-水酸化ナトリウム混合物、乳酸-乳酸カリウム混合物等およびアセテート緩衝剤例えば酢酸-酢酸ナトリウム混合物、酢酸-水酸化ナトリウム混合物等が含まれる。ホスフェート緩衝剤、カーボネート緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、トリメチルアミン塩類、例えばトリス、HEPESおよび他のそのような既知の緩衝剤を用いることができる。00135微生物の増殖を遅くするために保存剤を添加してよく、それは0.2から1までw/vの範囲の量で添加されてよい。本開示と共に使用するための適切な保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、m-クレゾール、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウムbenzyaconiumhalide例えば、塩化物、臭化物およびヨウ化物、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン類、例えばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび3-ペンタノールが含まれる。00136本開示の液体組成物の生理的等張性を確実にするために等張剤が存在していてよく、それには多価糖アルコール類、好ましくは三価またはより多価の糖アルコール類、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが含まれる。多価アルコール類は、その他の成分の相対的な量を考慮して、約0.1重量~約25重量、好ましくは約1重量~約5重量の量で存在することができる。00137安定剤は、機能が充填剤から療法剤を可溶化する、または変性もしくは容器壁面への接着を防ぐのを助ける添加剤まで及び得る、広いカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール類;アミノ酸、例えばアルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、L-ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等;有機性の糖または糖アルコール類、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、アラビトール、エリトリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトールmyoinisitol、ガラクチトール、グリセロールおよび同様のものシクリトール類、例えばイノシトールが含まれる;ポリエチレングリコール;アミノ酸ポリマー類;硫黄を含有する還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム;低分子量ポリペプチドすなわち約10残基より小さい;タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン類;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、糖類、単糖類、例えばキシロース、マンノース、フルクトースまたはグルコース;二糖類、例えばラクトース、マルトースおよびスクロース;三糖類、例えばラフィノース;多糖類、例えばデキストラン等であり得る。安定剤は、免疫原の部あたり0.1から10,000w/wまでの範囲で存在することができる。00138追加の種々の賦形剤には、充填剤例えばデンプン、キレート剤例えばEDTA、抗酸化剤例えばアスコルビン酸、メチオニンまたはビタミンEおよび共溶媒が含まれる。00139本明細書で用いられる際、用語界面活性剤は、両親媒性構造を有する有機物質、すなわち反対の溶解度傾向solubilitytendenciesを有する基、典型的には油溶性炭化水素鎖および水溶性イオン基からなる有機物質を指す。界面活性剤は、界面活性部分の電荷に応じて、陰イオン性、陽イオン性および非イオン性界面活性剤に分類することができる。界面活性剤はしばしば様々な医薬組成物および生物学的物質の製剤のための湿潤剤、乳化剤、可溶化剤および分散剤として用いられる。00140その療法剤の可溶化を助けるため、およびその療法的タンパク質を撹拌に誘導される凝集に対して保護するため、非イオン性界面活性剤または洗浄剤湿潤剤としても知られているを添加してよく、それはその配合物がそのタンパク質の変性を引き起こすことなく剪断表面応力に曝露されることも可能にする。適切な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート類20、80等、ポリオキサマー類polyoxamers184、188等、Pluronic登録商標ポリオール類およびポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル類TWEEN-20登録商標、TWEEN-80登録商標等が含まれる。非イオン性界面活性剤は、約0.05mg/ml~約1.0mg/ml、好ましくは約0.07mg/ml~約0.2mg/mlの範囲で存在していてよい。00141本明細書で用いられる際、用語無機塩は、金属または金属のように作用する基による酸の水素または酸の一部または全部の置き換えの結果として生じる、炭素を含有しないあらゆる化合物を指し、それはしばしば医薬組成物および生物学的物質の製剤において張性tonicity調節化合物として用いられる。最も一般的な無機塩類は、NaCl、KCl、NaH2PO4等である。00142本開示は、約5.0から約7.0まで、または約5.5から約6.5まで、または約5.8から約6.2まで、または約6.0、または約6.0から約7.5まで、または約6.5から約7.0までの範囲のpHを有する免疫原またはワクチンの液体配合物を提供することができる。00143本開示は、診療所または実験室で見られる市販の冷蔵庫および冷凍庫で見られる温度、例えば約-20°Cから約5°Cまでにおいて安定性を有する液体配合物のような配合物を含み、前記の安定性は、例えば約60日間、約120日間、約180日間、約1年間、約2年間またはより長い期間の貯蔵目的に関して、例えば顕微鏡分析により評価される。本開示の液体配合物は、使用前に室温で少なくとも数時間、例えば1時間、2時間または約3時間の、例えば粒子分析により評価されるような安定性も示す。00144希釈剤の例には、リン酸緩衝生理食塩水、膀胱における胃酸に対する緩衝のための緩衝剤、例えばスクロースを含有するシトレート緩衝剤pH7.4、ビカーボネート緩衝剤pH7.4単独、またはアスコルビン酸、ラクトース、もしくはアスパルテームを含有するビカーボネート緩衝剤pH7.4が含まれる。キャリヤーの例には、例えば脱脂乳中に見出されるタンパク質、糖類、例えばスクロース、またはポリビニルピロリドンが含まれる。典型的にはこれらのキャリヤーは約0.1~90w/vの濃度で用いられるが、好ましくは1~10w/vの範囲で用いられるであろう。00145インビボでの投与のために用いられる予定の配合物は、無菌でなければならない。それは、例えば滅菌濾過膜を通した濾過により成し遂げることができる。例えば、本開示の細胞下配合物は、濾過により滅菌することができる。00146経口製剤の場合、目的の配合物には、摂取のためのより口に合う形を提供するため、香味料、臭気物質、香り、着色料、界面活性剤、結合剤等の1種類以上が含まれることができる。00147その免疫原またはワクチン組成物は、優れた医療行為と調和する方法で配合、投薬および投与されるであろう。考慮のための要因には、その疾患の重篤さ、処置される特定の哺乳類、その個々の患者の臨床状態、その障害の原因、その薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール作成、および医師に既知の他の要因が含まれる。投与する予定のその免疫原またはワクチンの療法上有効量は、そのような考慮すべき事柄により支配されると考えられ、それは標的とする疾患、病気または障害を予防する、改善する、または処置するのに必要な最小限の量であることができる。00148抗原またはワクチンの量は、標的の宿主において望まれる体液性および/または細胞に仲介される免疫応答または保護を誘導するのに十分な量である。投与される本開示の免疫原またはワクチンの量は、その対象の種、その宿主の身体的特徴、例えば年齢、体重等、好まれる送達方式等に依存して様々であろう。一般に、用いられる投与量は約10~約1500μg/用量であることができる。比較すると、現在のサブユニット製剤はウイルスの3種類の亜型からの要素を含有する。その三価ワクチンは一般に、約7~約25μgのその3種類の寄与している株のそれぞれからのHAを含有する。それは目的のワクチン組成物を用量設定するための出発点として役立つ可能性がある。00149本明細書で用いられる際、用語有効量は、標的とされる疾患の重篤さおよび/または期間を低減する、その1種類以上の症状を改善する、標的とされる疾患の前進を防ぐ、もしくは標的とされる疾患の後退を引き起こすのに十分である、または結果として標的とされる疾患もしくはその1種類以上の症状の発現、再発、開始、もしくは進行の予防をもたらすのに十分である、療法例えば予防または療法剤の量を指す。例えば、目的の処置は、ベースラインまたは正常なレベルに基づいて少なくとも5、好ましくは少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、または少なくとも100その宿主の生存可能性を増大させる、または疾患の重篤さを低減することができる。別の態様において、療法または予防剤の有効量は、標的とされる疾患の症状、例えばインフルエンザの症状または病気の期間を少なくとも5、好ましくは少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、または少なくとも100低減する。用語療法上有効量も本明細書において同義語として用いられる。00115必要な場合、その組成物には可溶化剤および注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔薬、例えばリドカインまたは他のカイン麻酔薬も含まれていてよい。00151一般に、その成分は別々に、または単位剤形中で一緒に混合されてのどちらかで、例えば有効薬剤の量を示す密封された容器、例えばアンプルまたは小さい袋sachetの中の乾燥した凍結乾燥された粉末または水を含まない濃縮物として供給される。その組成物が注入により投与される予定である場合、それは無菌の医薬グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配することができる。その組成物が注射により投与される場合、その成分を投与の前に混合することができるように、注射のための滅菌水のアンプルを例えばキット中で提供することができる。あるいは、そのアンプルは目的の有効薬剤を含有する流体を、例えば使用前に希釈するための濃縮物として、または投与の準備ができた形で含むことができる。別の態様において、目的の配合物は、単一の、使用の準備ができたプレゼンテーションpresentationに適した用量および体積で提供される。00152本明細書の上記で記述した障害の処置に有用な物質を含有する製品が提供される。その製品は容器およびラベルを含むことができる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。その容器は様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成されてよい。その容器には目的の組成物が入っており、無菌のアクセスポートaccessportを有していてよい例えば、その容器は皮下注射針により突き通すことができる栓を有する静脈注射用の溶液の袋またはバイアルであってよい。その容器上の、またはその容器に付随するラベルには、その組成物がインフルエンザを処置するために用いられることが示されている。その製品はさらに、医薬的に許容できる緩衝剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液を含む第2の容器を含んでいてよい。それにはさらに、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用のための指示を含む添付文書が含まれる、商業的および使用者の立場から望ましい他の材料が含まれていてよい。00153本開示には例えば、例えば能動的または受動的なワクチンとしての使用のための目的の免疫原性またはワクチン組成物、その相同体、誘導体等、および同じものの使用のための説明書等を含むキットも含まれる。その説明書には、その組成物、誘導体等を調製するための指示が含まれていてよい。その組成物は液体の形であることができ、または一般に乾燥した、または凍結乾燥された固体の形で与えられることができる。そのキットは適切な他の試薬、例えば緩衝剤、再構成溶液および意図される使用のための他の必要な成分を含有することができる。予め決められた量の試薬とその使用のための、例えば療法的使用のための説明書の包装された組み合わせが意図される。加えて、他の添加剤、例えば安定剤、緩衝剤および同様のものが含まれてよい。その様々な試薬の相対的な量は試薬の溶液の濃縮物を提供するように変更されてよく、それは使用者に柔軟性、空間の節約、試薬の節約等を提供する。そのキットは送達の手段、例えば針を含有する道具、例えばシリンジを含むことができ、それは場合により必要な時の送達のために目的の組成物を予め装填することができる。00154本明細書の上記で論じた参考文献の全ての引用は、あらゆるそのような参考文献が本開示に対する先行技術であるという自認であると解釈されてはならない。本明細書で引用される全ての参考文献を、本明細書にそのまま援用する。00155本開示はここで以下の限定的でない実施例により例示されるであろう。実施例100156上記のように、ワイオミング株H3N2由来の8種類の免疫的に鈍らせた、および再焦点化されたヘマグルチニン遺伝子を設計し、操作した。例えば、ヌクレオチドを部位特異的変異誘発により置換して、複合炭水化物修飾につながるN結合型シークオン、および/またはアミノ酸の欠失および/または電荷の変化を、株特異的エピトープを含有する5個の主要な免疫原性であり高度に変動可能な部位に導入した。00157特により大きな抗原性部位において、それぞれの変化による免疫的に鈍らせることの大きさを最大限にする一方で鈍らせるために必要な野生型アミノ酸の変更の数を低減し、一方でその糖タンパク質および受容体結合ドメインの立体構造的複雑さへのあらゆる影響を最小限にするため、N結合型シークオンの導入を用いた。場合によっては、3アミノ酸ほどの少ない変更しか必要でない。抗原部位B187~196は、B細胞およびCD4ヘルパーT細胞のIDNPEの両方を標的とする。00158研究をはかどらせるため、DNAおよびタンパク質サブユニットワクチンの両方を操作した。DNA免疫処置のため、完全長のヘマグルチニン遺伝子をpTriExベクターInvitrogenの中に、サイトメガロウイルスCMVプロモーターの後ろにクローニングした。哺乳類細胞のpTriEx-HAコンストラクトによる一過性形質移入は、天然のウイルスタンパク質に似ているその完全長のヘマグルチニン遺伝子は三量体として発現され、細胞膜抽出物から可溶化することができることを実証した。001599グループの非近交系マウスをその8種類の変異導入した、および1種類の未改変の完全長野生型HA糖タンパク質を含有するDNAコンストラクトで免疫した。10番目のグループを、陰性対照のために空のpTriExベクターで免疫した。00160DNA発現ベクターに加えて、組み換えタンパク質を免疫処置のために生成した。そのHA外部ドメインは、その三量体糖タンパク質スパイクの組み立ておよび宿主細胞受容体の結合のためのドメインを含有する。加えて、その膜貫通および細胞質ドメインの除去は、組み換えHA三量体を培養上清の中に放出させる。従って、その変異導入したHA遺伝子のそれぞれをその外部ドメインの末端で切り詰め、ファージT7プロモーターを有するベクターの中にクローニングした。その外部ドメインベクターの、ファージT7RNAポリメラーゼを発現する組み換えワクシニアウイルスを感染させた細胞中への形質移入は、結果としてその培地中に分泌されるHA三量体の産生をもたらした。その外部ドメイン三量体を、タンパク質免疫原としての使用のために精製した。00161マウスを予め採血しておいた。マウスの1つのグループを陰性対照として用いて、他方のグループを未改変野生型の抗原で免疫した。00162実験の別のセットにおいて、主なグループのマウスを、10マイクログラムの変異導入したHA糖タンパク質のDNA0.1mLの滅菌水中のそれぞれの大腿4頭筋中への注射により免疫した。残りの5週間の後、そのマウスを第2のDNA免疫処置で追加免疫した。さらに4~5週間後、そのマウスをそれぞれ10マイクログラムの精製した外部ドメイン糖タンパク質の2回の皮下免疫処置により再度追加免疫した。第1のタンパク質免疫処置は完全フロイントアジュバント中で配合し、第2のタンパク質免疫処置は不完全フロイントアジュバント中で配合した。最後の免疫処置の2週間後、そのマウスを安楽死させ、血清のために血を抜いた。00163その血清を、1ウェスタンブロットおよびELISA形式における変異体および野生型HAタンパク質への反応性、2ペプチドELISAによる線状エピトープの認識、3立体構造エピトープのプロテアーゼによる分解からの保護、ならびに4相同および非相同のインフルエンザ株の赤血球凝集阻害およびウイルス中和による機能的試験に関して試験した。00164免疫再焦点化されたHAサブユニットで操作された抗原の集団で免疫したマウスからの血清は、結果としてHA特異的ELISAにより測定した際に高い力価の抗血清の生成をもたらした。マウスの全てのグループは、野生型のHAに対して1:100~300,000の範囲の力価を示した。様々な変異導入したHA糖タンパク質のダウンセレクションDownselectionを、その抗血清の標準的なHIアッセイにおいて亜型をまたぐHI抗体を示す能力に基づいて行った。00165H3N2A/ワイオミング/03/2003の変異体A2、B1、B2、B3、CE、CEB4、CEB5、およびD1は、そのアッセイにおいて用いた非相同ウイルス亜型の集団に対して等しい、またはより高い亜型をまたぐHIおよび/またはウイルス中和力価を示した。従って、免疫的に鈍らせることおよび再焦点化は、結果として、標準化され受け入れられている代用のHIおよびウイルス中和アッセイによりインビトロで測定した際に有意に向上した亜型をまたぐ抗ウイルス保護を誘導することができるHA糖タンパク質サブユニットワクチンの候補の生成をもたらした。00166変異体A2はHAのAエピトープにおける変異であり、ここでKRRSNKSSEQIDNO:1がGGにより置き換えられている。B1はHAのBエピトープにおける変異であり、ここでアミノ酸197において糖鎖付加部位が導入されているQISがNASに。B2はHAのBエピトープにおける変異であり、ここでアミノ酸189において糖鎖付加部位が導入されているSDQがNVTに。B3はHAのBエピトープにおける変異であり、ここでアミノ酸193において糖鎖付加部位が導入されているSLYがNITに。CEは2つの変異を含有しており、糖鎖付加部位がCエピトープ中に位置276において導入されておりKCN→NCT、糖鎖付加部位がEエピトープ中に位置83において追加されているNKK→NKT。CEB4はBエピトープにおいて追加の変異を有するCEであり、位置158において糖鎖付加部位が追加されているKYK→NST。CEB5はBエピトープにおいて追加の変異を有するCEであり、位置159において糖鎖付加部位が追加されている。D1はHAのDエピトープにおける変異であり、ここでアミノ酸201において糖鎖付加部位が導入されているRITがNITに。00167実験の別のセットにおいて、再焦点化されたポリペプチド抗原を、H3N2ウイルスの異なる株と比較した場合のヘマグルチニン阻害力価および血清中和力価に関して試験した。その変異体はA/ワイオミング/2003株に由来していた。上記のように、M3はB2エピトープを有し;M5はCEエピトープを有し;そしてM6はB4CEエピトープを有する。A/ワイオミング/2003株ウイルスを野生型陽性対照として、キャリヤー単独を陰性対照として、マウスを様々な変異タンパク質に曝露させた。次いでマウスの血清を、3種類の株:同族のワイオミング株、パナマ/1999およびウェリントン/2004株に対するヘマグルチニン阻害力価に関して試験した。他のマウス血清を、同族のワイオミング株、コリア/2003、コリア/2002、福建/2002、ブリスベン/09/2006およびブリスベン/10/2007株に対する血清中和力価に関して試験した。キャリヤー単独に曝露されたマウスからの対照血清はワイオミング、パナマおよびウェリントン株と反応する特異的なヘマグルチニン阻害抗体を生成しなかった力価=10。00168野生型のワイオミングウイルスに曝露されたマウスは、ワイオミングおよびウェリントン株と反応し力価=1280、パナマ株とわずかに反応する力価=226抗血清を生成した。M5変異体は、ワイオミングおよびウェリントン株と野生型の2倍強く反応し力価=2560、パナマ株とごくわずかに弱く反応する力価=1920抗血清を生成した。M6変異体は、パナマ株およびワイオミング株とM5変異体が反応するのとおおよそ同じレベルで反応するそれぞれ力価=2560および1280抗血清を生成した。しかし、そのM6変異体は、ウェリントン株に曝露された際に全ての他の力価よりも4倍高い力価を有する高度に阻害する抗血清を生成した力価=10240。00169従って、免疫再焦点化は結果として、三重に改変された変異タンパク質を用いた場合のウェリントン株に対する非常に高い応答と共に、同族の株とは別に2種類の他の株に対する幅の広がった応答をもたらした。中和試験において、キャリヤーに曝露されたマウスは特異的な抗体を産生しなかった。ワイオミングに曝露されたマウスはワイオミングと強く反応する抗血清を生成し力価=640;コリアおよびブリスベン2006に関する力価はワイオミングの力価の4分の1であり力価=160;ブリスベン2007とは本質的に反応性がなかった力価=20。M3変異タンパク質はマウスにおいてワイオミング、ブリスベン2006およびブリスベン2007に対して野生型免疫原の4倍反応性である力価=2560マウス抗血清を生成した。その抗血清はコリアとは反応しなかった力価=3。M5に曝露されたマウスはワイオミングと反応する力価=80抗血清を生成し、それはブリスベン2006と2倍反応性であり力価=160、コリアと30倍反応性であった力価=2560。その抗血清はブリスベン2007とは実質的に反応しなかった力価=20。このように、目的の免疫再焦点化された抗原を用いて、3種類の他の株に対する幅の広がった応答が得られた。00170従って、目的の組成物は、親株と比較して未来に存在するウイルスに対する、および過去により一般的に見付けられたウイルスに対する防御免疫を刺激した。従って、ブリスベン/07に基づく免疫再焦点化されたH3N2ワクチンはまだ進化していないウイルスに対する保護的応答を刺激し、それにより次の数年にわたって再配合の必要性を回避するであろう。過去および未来両方の全てのH3N2株に対して保護するように、免疫再焦点化されたワイオミングに基づく、またはブリスベンに基づくワクチンを開発することができる。実施例200171ブタ様H1N1vA/カリフォルニア/04/2009株の免疫再焦点化されたヘマグルチニン抗原の設計は、免疫優性エピトープ、進化および配列の多様性ならびに構造データの分析が含まれる多数の考慮すべき事柄に基づく。免疫応答を免疫優性の非常に可変性の部位から離れ、より幅の広い保護的エピトープに向けて再焦点化するように、以下の変異を設計する。00172本明細書で教示するように、免疫再焦点化変異は、糖鎖付加部位の削除、追加または減算subtraction、およびエピトープの電荷、ハイドロパシー、またはいくつかの他の化学的特性に影響を与える置換が含まれるいくつかの形をとることができる。糖鎖付加の追加は、比較的大きい部分を有するエピトープを隠す一方で、電荷が抗体が抗原と相互作用する特定の部位上に焦点を変える利点を有する。様々なインフルエンザ株および血清型のHAタンパク質の間の高い程度の構造的類似性のため、関連するA/PR8/34の3D構造の分析を用いてそのHA配列の推定されるループおよび他の柔軟な部位を同定した。A/カリフォルニア/04/2009のHAをA/PR8/34のHAと整列させて、PR8の同定された残基をCal/04/09に置き換えた。00173図2は、免疫をより幅広く保護する応答に向けて再焦点化するように意図された一部位変異を示す表2を提供する。最初の提案された変異は、主に糖鎖付加のパターンおよび/または局所的な電荷の要素に影響を及ぼすアミノ酸置換で構成されている。その変異は、株特異的応答に寄与する免疫優性エピトープを同定するために用いられた入手可能な配列および構造データに基づいて選択された。00174その配列および変異は表2において、N末端から開始してHA糖タンパク質に沿ってエピトープ部位に関連付けるように配列されている。D部位のC末端部分214から始まるおよび融合ドメイン314から始まるを含む残基は、表中の空間を節約して使うために埋め合わせた。00175その変異は以下のように設計された:00176iエピトープCの変異M1およびM3ならびにエピトープEのM6およびM7は、モノクローナル抗体との結合に関わりがあることが示されている部位の中にある、または密接にその近くにあるものとして選択された。それらは高度に柔軟なループ中にあり、高い配列の可変性を有する領域にあるため、我々はそれらが株特異的免疫に寄与していると予想する;ii変異M1、M2、M5、M6、M8、M9、M10、M14、M16、M18、M20、M22、M23、およびM25は、糖鎖付加部位を免疫優性の株特異的部位の中に導入する一方で同時にそのエピトープ中のアミノ酸と関係する電荷を変化させるという二重の目的にかなう;00177iii変異M3、M4、M7、M11、M12、M13、M15、M17、M19、M21、M24、およびM26は、荷電したアミノ酸残基を荷電していない残基で置換する;00178iv変異M5は、糖鎖付加をEエピトープに追加して他のCおよびE変異が再焦点化するように免疫を融合ドメインまたはHA-1HA-2融合部位中の保存された要素に向けて再焦点化する特定の目的にかなう;ならびにv変異M25およびM26は、HA1-HA2切断部位および融合ドメイン表1において部位‘f’で表すに近接して位置する免疫優性部位を標的として、免疫をこれらの高度に保存された部位に再焦点化する。00179図3は、A/PR8/34HA構造の構造上に重ね合わせた一部位変異の部分集合を同定する。図1は、その変異が主に高度に柔軟なループ中に挿入されて、その組み換えタンパク質の天然同様の折りたたみを乱すことなくエピトープを隠していることを示している。変異のその可変性のループ中への挿入は、ほとんどの立体構造的なエピトープが形成され得ることを確実にする。実施例300180HA変異は、例えば既知の方法、例えば部位特異的変異誘発クイックチェンジまたは例えば遺伝子合成を用いて操作することができる。一般に、クイックチェンジ変異は単一または二重変異の誘導のために用いることができ、一方で遺伝子合成はより複雑な組み合わせのために用いることができる。00181一部位変異はそれぞれのエピトープの特定の残基に向けられた免疫再焦点化技法を評価するのに最も有用である。しかし、病原体は長期の免疫圧力を回避するために1個より多くの免疫優性の可変性エピトープ見せかけのエピトープまたはデコトープdecotopeを利用するため、向上した免疫再焦点化された抗原は変異を多数の抗原性部位に組み込むことができる。2または3個のエピトープ中に変異を含有する免疫再焦点化されたHA抗原の例を、表3を示す図4において提供する。5個のエピトープ全てにおいて変異を含有する免疫再焦点化されたHA抗原の例を、表4を示す図5において提供する。表3および4の両方において、その変異は表2を示す図2において示した一部位変異の組み合わせで構成される。表3で示すような構造モデルの分析は、選択された変異が電荷、立体阻害、または他の好ましくない結果の点で互いを妨害する見込みが低減されると考えられるような組み合わせ変異の設計において有用である。00182免疫再焦点化されたHAの候補の評価の目的に関して、一部の組み合わせが糖鎖付加の挿入からなり、一方で他の組み合わせが主にそのエピトープにおける静電荷を低減するだけの置換からなる変異の組み合わせを試験することはためになる。00183表中の変異のリストは当技術における教習における例を目的とするものであり、一度教習されたら、類似の部位において、または類似の目的のために設計された追加の変異を、本明細書で教示した材料および方法を実施することにより得ることができる。00184実施例3で記述したH1N1HA配列に基づく抗原をワクチンとして用いて、全てのH1N1変異株に対する幅の広がった免疫を刺激することができる。本明細書で教示したように、そのH1N1に基づく抗原が他の血清型、例えばH2、H5等からのインフルエンザ株に対する防御免疫を刺激することができるように追加の変異を作ることができる。00185本明細書で教示した抗原設計法を用いて、インフルエンザの他の血清型、例えばH2N2、H5N1、H7、H9および他のものに基づくワクチンまたは抗体を生成することができる。00186そのような変異は、療法、診断または他の適用のために用いることができる幅広く反応する抗体を生成する目的のために免疫を刺激するように設計することができる。00187アジュバントのそのような変異との組み合わせた使用は、交差反応性免疫の幅広さにおける追加の向上をもたらし得る。実施例400188組み換え免疫原の安全性、毒性および効力を、i一般的な安全性試験、ならびに急性および慢性毒性試験が含まれる21CFR610における指針に従って評価する。00189免疫原性のデータは、ヒトインフルエンザワクチンに十分に応答する、受け入れられている動物モデル例えばモルモット、マウス、フェレットまたはコトンラットに由来する。その研究には、その最終製品に関して意図される株を含有するワクチンを用いる用量および投与間隔に従う免疫応答の評価が含まれる。関連する動物モデルにおける免疫原性試験を用いて、特に新規のインフルエンザウイルスのためのワクチンの製造プロセスの実証段階の間の生産の一貫性に証拠を提供する。動物試験のために選択される適切な非臨床エンドポイントには、死亡、体重の低下、ウイルスの排出速度、臨床徴候、例えば発熱、眼鼻分泌等が含まれる。00190フェレットまたは他の適切な動物のグループに、300μgの目的の免疫原を含有する100μlの免疫原を腹腔内に接種する。適切な陰性および陽性対照を用いる。00191その動物を、全身の健康状態および体重に関して、感染後14日間監視する。偽薬を与えられた動物と同様に、免疫原を与えられた動物はその観察期間の間健康なままであり、体重が低下せず、疾患の明白な徴候も示さない。00192より厳重な安全性試験のため、動物のグループに300μgのその免疫原を注射する。00193接種の1日後、それぞれのグループ中の3匹の動物を安楽死させ、その脾臓、肺および肝臓のホモジェネートを免疫原に関して分析する。感染後4、8、12、および16週の時点で、それぞれのグループ中の3匹の動物を安楽死させ、脾臓、肝臓および肺のホモジェネートを得て、免疫原の存在を評価するために分析する。00194その免疫原は、有害な健康への作用が観察されず、その動物の体重が内部標準としての偽薬を接種した動物と比較して正常な速度で増加する場合、安全であると考えられる。00195免疫原の急性および慢性毒性を評価するため、フェレットのグループに300μgのその免疫原を段階的用量で、または生理食塩水を皮内接種する。00196接種の3日後、それぞれのグループ中の8匹の動物を安楽死させ、その免疫原のその動物への急性作用を評価する。接種後28日の時点で、それぞれのグループ中の残りの8匹の動物を安楽死させ、その動物へのあらゆる慢性作用を評価する。両方の時点において、それぞれの動物の体重を得る。加えて、その注射部位の肉眼的病理および外観を調べる。それぞれの時点において血液化学のために血液を採取し、内臓および注射部位の組織病理学を実施する。00197他の動物には0、14および60日の時点で合計3用量のワクチンを与え、ヘマグルチニンに対する免疫応答をその動物から10日間隔で収集した血清を用いてELISAにより測定する。インフルエンザウイルスの中和を、例えばその最初のワクチン接種の80日後に収集した血清において測定する。00198本明細書で記述した現在好まれる態様に対する様々な変更および修正は当業者には明らかであろうことは理解されるべきである。そのような変更および修正は、本主題の精神および範囲から逸脱することなく、ならびにその意図される利点を減らすことなく行うことができる。従って、そのような変更および修正は添付される特許請求の範囲に含まれることを意図する。00199本明細書で引用された全ての参考文献を、本明細書にそのまま援用する。参考文献"