"ヒトTGFαに対する抗体であって、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して増殖抑制活性を示す抗体。天然型のヒトTGFαと比較して、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFαとの反応性が低い抗体。79位のグリシンに変異を有するヒトTGFαが、G79A置換型のヒトTGFαである、請求項2に記載の抗体。EGFRのチロシンリン酸化を抑制する活性を有する、請求項1から3のいずれかに記載の抗体。血管内皮細胞の誘引を抑制する活性を有する、請求項1から4のいずれかに記載の抗体。下記aからhのいずれかに記載の特徴を有する、請求項1に記載の抗体。a配列番号:19から21に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:22から24に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するb配列番号:25から27に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:28から30に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するc配列番号:31から33に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:34から36に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するd配列番号:37から39に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:40から42に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するe配列番号:43から45に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:46から48に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するf配列番号:49から51に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:52から54に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するg配列番号:55から57に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:58から60に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するh配列番号:61から63に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:64から66に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する下記aからhのいずれかに記載の特徴を有する、請求項1に記載の抗体。a配列番号:3に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:4に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するb配列番号:5に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:6に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するc配列番号:7に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:8に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するd配列番号:9に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:10に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するe配列番号:11に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:12に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するf配列番号:13に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:14に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するg配列番号:15に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:16に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するh配列番号:17に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:18に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する受領番号FERMABP-11377で特定されるハイブリドーマにより産生される抗体。請求項7または8に記載の抗体のエピトープに結合する、請求項1に記載の抗体。請求項1から9のいずれかに記載の抗体をコードするDNA。請求項1から9のいずれかに記載の抗体を産生する、または、請求項10に記載のDNAを含む、ハイブリドーマ。請求項1に記載の抗体の製造方法であって、aヒトTGFαに結合する抗体を調製する工程、b調製した抗体から、天然型のヒトTGFαと比較して、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFαとの反応性が低い抗体を選抜する工程、を含む方法。79位のグリシンに変異を有するヒトTGFαが、G79A置換型のヒトTGFαである、請求項12に記載の方法。79位のグリシンに変異を有するヒトTGFα。G79A置換型のヒトTGFα。請求項1から9のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、抗癌剤。癌がRas遺伝子に変異を有する癌である、請求項16に記載の抗癌剤。請求項2、3、6から8のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、癌の診断剤。癌がRas遺伝子に変異を有する癌である、請求項18に記載の診断剤。本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して優れた増殖抑制効果を有する抗体を提供することにある。さらなる本発明の目的は、このような抗体を有効成分とする抗癌剤を提供することにある。本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、天然型TGFαに反応性を示す抗体のうち、G79A置換型TGFαとの反応性が低い抗体が、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して、優れた増殖抑制効果を有することを見出した。さらに、本発明者らは、これら抗体の多くが、EGFRのチロシンリン酸化を阻害する活性および/または血管内皮細胞の誘引抑制活性をも有することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して優れた増殖抑制効果を有する抗TGFα体、並びにその製造方法および用途に関し、より詳しくは、下記の発明を提供するものである。<1>ヒトTGFαに対する抗体であって、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して増殖抑制活性を示す抗体。<2>天然型のヒトTGFαと比較して、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFαとの反応性が低い抗体。<3>79位のグリシンに変異を有するヒトTGFαが、G79A置換型のヒトTGFαである、<2>に記載の抗体。<4>EGFRのチロシンリン酸化を抑制する活性を有する、<1>から<3>のいずれかに記載の抗体。<5>血管内皮細胞の誘引を抑制する活性を有する、<1>から<4>のいずれかに記載の抗体。<6>下記aからhのいずれかに記載の特徴を有する、<1>に記載の抗体。a配列番号:19から21に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:22から24に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するb配列番号:25から27に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:28から30に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するc配列番号:31から33に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:34から36に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するd配列番号:37から39に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:40から42に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するe配列番号:43から45に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:46から48に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するf配列番号:49から51に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:52から54に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するg配列番号:55から57に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:58から60に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するh配列番号:61から63に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:64から66に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<7>下記aからhのいずれかに記載の特徴を有する、<1に記載の抗体。a配列番号:3に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:4に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するb配列番号:5に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:6に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するc配列番号:7に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:8に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するd配列番号:9に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:10に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するe配列番号:11に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:12に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するf配列番号:13に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:14に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するg配列番号:15に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:16に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持するh配列番号:17に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:18に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<8>受領番号FERMABP-11377で特定されるハイブリドーマにより産生される抗体。<9><7>または<8>に記載の抗体のエピトープに結合する、<1>に記載の抗体。<10><1>から<9>のいずれかに記載の抗体をコードするDNA。<11><1>から<9>のいずれかに記載の抗体を産生する、または、<10>に記載のDNAを含む、ハイブリドーマ。<12><1>に記載の抗体の製造方法であって、aヒトTGFαに結合する抗体を調製する工程、b調製した抗体から、天然型のヒトTGFαと比較して、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFαとの反応性が低い抗体を選抜する工程、を含む方法。<13>79位のグリシンに変異を有するヒトTGFαが、G79A置換型のヒトTGFαである、<12>に記載の方法。<14>79位のグリシンに変異を有するヒトTGFα。<15>G79A置換型のヒトTGFα。<16><1>から<9>のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、抗癌剤。<17>癌がRas遺伝子に変異を有する癌である、<16>に記載の抗癌剤。<18><2>、<3>、<6>から<8>のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、癌の診断剤。<19>癌がRas遺伝子に変異を有する癌である、<18>に記載の診断剤。本発明により、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して、優れた増殖抑制効果を有する抗TGFα抗体が提供された。特に、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFαとの反応性が低い抗TGFα抗体は、共通して、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対する優れた増殖抑制活性を有していた。本発明の抗体を用いれば、癌の治療が可能となる。本発明の抗体は、既存薬に対して抵抗性の高いRas変異癌の治療に対しても効果的である。また、本発明の抗体は、癌の診断への応用も可能である。本発明は、ヒトTGFαに対する抗体であって、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して増殖抑制活性を示す抗体を提供する。本発明においてRas遺伝子に変異を有する癌細胞に対して増殖抑制活性を示すとは、invitroおよびまたはinvivoにおいて、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して増殖抑制活性を示すこと意味する。本発明の抗体は、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して増殖抑制活性を有する限り、さらに、Ras遺伝子に変異を有しない癌細胞に対して増殖抑制活性を有していてもよい。invitroにおける活性は、例えば、ゲル化させた培地で細胞を培養する3次元細胞培養系を用いて、Ras遺伝子例えば、KRas遺伝子に変異を有する癌細胞例えば、A427やSW620を増殖させ、その培養系に、被検抗体を添加し、その後、これら癌細胞の増殖を検出することにより評価することができる実施例5参照のこと。また、invivoにおける活性は、例えば、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞例えば、A427やSW620を皮下移植したヌードマウスに、被検抗体を皮下投与し、その後の腫瘍サイズを計測することにより評価することができる実施例4参照のこと。当該活性を有する抗体としては、本実施例に記載のMBL00915、MBL0168、MBL0181、MBL0231、MBL1441、MBL1846、MBL2593、MBL2921、およびMBL35234が挙げられる。本発明の抗体が結合するヒトTGFαの典型的なアミノ酸配列天然型のアミノ酸配列を配列番号:2に、そのコードする遺伝子の典型的な塩基配列を配列番号:1に示す。本発明の抗体の好ましい態様は、天然型のヒトTGFαと比較して、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFα例えば、G79A置換型のヒトTGFαとの反応性が低い抗体である。本発明の抗体のより好ましい態様は、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFα例えば、G79A置換型のヒトTGFαとの反応性が消失した抗体である。本実施例においてRas遺伝子に変異を有する癌細胞に対して増殖抑制活性を示した上記MBL00915、MBL0168、MBL0181、MBL0231、MBL1441、MBL1846、MBL2593、MBL2921、およびMBL35234は、共通に、G79A置換型のヒトTGFαとの反応性が著しく低かった。従って、抗体における、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFα例えば、G79A置換型のヒトTGFαとの反応性の低さと、抗体の、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対する増殖抑制活性とは、高い相関関係を有する。本発明の抗体の他の好ましい態様は、EGFRのチロシンリン酸化を抑制する活性を有する抗体である。抗体によるEGFRのチロシンリン酸化の抑制は、例えば、次のように評価することができる。無血清培地で培養したEGFR高発現細胞例えば、A431に対して、TGFαを添加するとEGFRのチロシンリン酸化PTyr1173レベルが一過的に上昇する。被検抗体がEGFRのチロシンリン酸化を抑制する活性を有する場合、予めTGFα溶液を被検抗体と反応させてから当該EGFR高発現細胞を処理した場合、EGFRのリン酸化レベルが陰性対照例えば、PBSに比べて低い値を示す。このように、陰性対照を用いた場合と比較した、被検抗体を用いた場合のEGFRのリン酸化レベルを測定することにより、被検抗体のEGFRのチロシンリン酸化を抑制する活性を評価することができる実施例2参照のこと。本発明の抗体は、好ましくは、抗体添加濃度10μgmLにおいて、EGFRのチロシンリン酸化PTyr1173を50以上抑制する抗体であり、より好ましくは70以上例えば、80以上、90以上、100以上抑制する抗体である。当該活性を有する抗体としては、本実施例に記載のMBL35234、MBL2921、MBL1846、MBL0168、MBL1441、MBL0231、およびMBL0181が挙げられる。本発明の抗体の他の好ましい態様は、血管内皮細胞の誘引を抑制する活性を有する抗体である。当該活性の評価には、例えば、マウス皮下における血管新生評価系を利用することができる。例えば、当該活性は、市販のDirectedInVivoAngiogenesisAssayを用い、ヒトTGFαによるアンジオリアクター内への血管内皮細胞の遊走を被検抗体が抑制する活性として評価することができる実施例6参照のこと。当該活性を有する抗体としては、本実施例に記載のMBL00915、MBL0168、MBL0181、MBL0231、MBL2921、およびMBL35234が挙げられる。本発明の抗体は、上記の活性を複数併せ持つ抗体であることが特に好ましい。本発明の抗体の他の好ましい態様は、本実施例に記載の抗体の軽鎖CDR1~CDR3を含む軽鎖可変領域と、重鎖CDR1~CDR3を含む重鎖可変領域を保持する抗体あるいはそれらのアミノ酸配列変異体である。具体的には、下記aからhのいずれかに記載の特徴を有する抗体である。<MBL00915>a配列番号:19から21に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:22から24に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL0168>b配列番号:25から27に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:28から30に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL0181>c配列番号:31から33に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:34から36に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL1441>d配列番号:37から39に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:40から42に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL1846>e配列番号:43から45に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:46から48に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL2593>f配列番号:49から51に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:52から54に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL2921>g配列番号:55から57に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:58から60に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL35234>h配列番号:61から63に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:64から66に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する本発明の抗体の他の好ましい態様は、本実施例に記載の抗体の軽鎖可変領域と、重鎖可変領域を保持する抗体あるいはそのアミノ酸配列変異体である。具体的には、下記aからhのいずれかに記載の特徴を有する抗体である。<MBL00915>a配列番号:3に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:4に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL0168>b配列番号:5に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:6に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL0181>c配列番号:7に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:8に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL1441>d配列番号:9に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:10に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL1846>e配列番号:11に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:12に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL2593>f配列番号:13に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:14に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL2921>g配列番号:15に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:16に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する<MBL35234>h配列番号:17に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:18に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する本発明の抗体の他の好ましい態様は、本実施例に記載のMBL0231抗体である。当該抗体を産生するハイブリドーマは、2011年4月20日より、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6郵便番号3058566に寄託されており、受領番号FERMABP11377が付与されている。従って、MBL0231抗体は、具体的には、受領番号FERMABP11377で特定されるハイブリドーマにより産生される抗体である。一旦、上記抗体例えば、本実施例の抗体が得られた場合、当業者であれば、その抗体が認識するエピトープを認識する種々の抗体を作製することができる。本発明における抗体は、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスを含む。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また、抗体の機能的断片の形態も含む意である。ポリクローナル抗体は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また、モノクローナル抗体とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体抗体断片を含むを意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、および/または回収された即ち、単離された抗体である。本発明の抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および、これら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体が望ましい。本発明においてキメラ抗体とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部可変領域を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部定常領域遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる例えば、特開平7194384号公報、特許3238049号公報、米国特許第4816397号公報、米国特許第4816567号公報、米国特許第5807715号公報。また、本発明においてヒト化抗体とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位CDRの遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植CDRグラフティングした抗体であり、その作製方法は、公知である例えば、特許2912618号、特許2828340号公報、特許3068507号公報、欧州特許239400号公報、欧州特許125023号公報、国際公開9007861号公報、国際公開9602576号公報参照。本発明において、ヒト抗体とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物例えばマウスを利用することが可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である例えば、Nature362:255258、InternRevImmunol13:6593、JMolBiol222:581597、NatureGenetics15:146156、ProcNatlAcadSciUSA97722727、特開平10146194号公報、特開平10155492号公報、特許2938569号公報、特開平11206387号公報、特表平8509612号公報、特表平11505107号公報。本発明において抗体の機能的断片とは、抗体の一部分部分断片であって、ヒトTGFαを特異的に認識するものを意味する。具体的には、Fab、Fab’、F、ProteinEngineeringDesignSelection21:485493、国際公開第2002051870号、JBiolChem280:2488024887、ProteinEngineeringDesignSelection21:345351。CDR以外のアミノ酸の改変されるアミノ酸数は、好ましくは、10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、最も好ましくは3アミノ酸以内例えば、2アミノ酸以内、1アミノ酸である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において保存的な置換とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸アスパラギン酸およびグルタミン酸、塩基性アミノ酸リシンアルギニンヒスチジン、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸グリシンアラニンバリンロイシンイソロイシンプロリン、ヒドロキシ基を持つアミノ酸セリントレオニン、硫黄を含むアミノ酸システインメチオニン、アミド基を持つアミノ酸アスパラギングルタミン、イミノ基を持つアミノ酸プロリン、芳香族基を持つアミノ酸フェニルアラニンチロシントリプトファンで分類することができる。また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数、位置、種類を変化させるなどの抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のADCC活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、N結合またはO結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入または欠失などの公知の方法で行うことができる特開2008113663号公報、特許4368530号公報、特許4290423号公報、米国特許第5047335号公報、米国特許第5510261号公報、米国特許第5278299号公報、国際公開第9954342号公報。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原TGFα、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞などで免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなどによって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えDNA法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラーおよびミルスタインの方法KohlerMilsteinNature256:495が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原ヒトTGFα、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞などで免疫された動物例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギの脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞およびミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ヒトTGFαに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ヒトTGFαに対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。組換えDNA法は、上記本発明の抗体またはペプチドをコードするDNAをハイブリドーマやB細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞などに導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である例えば、PJDelvesAntibodyProductionEssentialTechniques1997WILEY、PShepherdandCDeanMonoclonalAntibodies2000OXFORDUNIVERSITYPRESS、VandammeAMetalEurJBiochem192767775。本発明の抗体をコードするDNAの発現においては、重鎖または軽鎖をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖および軽鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい国際公開9411523号公報参照。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内または培養液から分離精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタなどを作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。本発明は、上記本発明の抗体またはペプチドをコードするDNA、該DNAを含むベクター、該DNAを保持する宿主細胞、および該宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む抗体の生産方法をも提供するものである。上記の通り、本発明において、抗ヒトTGFα抗体における、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFα例えば、G79A置換型のヒトTGFαとの反応性の低さと、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対する増殖抑制活性とは、高い相関関係を有することが見出された。かかる知見に基づき、天然型のヒトTGFαと比較して、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFα例えば、G79A置換型のヒトTGFαとの反応性が低い抗体を選抜することにより、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して増殖抑制活性を示す抗ヒトTGFα抗体を製造することが可能である。従って、本発明は、aヒトTGFαに結合する抗体を調製する工程、およびb調製した抗体から、天然型のヒトTGFαと比較して、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFαとの反応性が低い抗体を選抜する工程、を含む、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して増殖抑制活性を示す抗ヒトTGFα抗体の製造方法をも提供するものである。天然型のヒトTGFαまたは79位のグリシンに変異を有するヒトTGFα例えば、G79A置換型のヒトTGFαと抗体との反応性は、例えば、各TGFαを表面に発現させた293T細胞を調製し、当該細胞と被検抗体との反応性をフローサイトメトリにより解析することで評価することが可能である実施例7参照のこと。さらに、本発明は、このような抗ヒトTGFα抗体の製造方法において有用な、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFα例えば、G79A置換型のヒトTGFαをも提供するものである。本発明の抗体は、Ras遺伝子に変異を有する癌細胞に対して増殖抑制活性を有することから、抗癌剤として利用することができる。従って、本発明は、本発明の抗体を有効成分とする抗癌剤、および、本発明の抗体を、治療上の有効量、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、癌の治療の方法をも提供するものである。本発明の治療の方法は、ヒト以外にも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む各種哺乳動物に応用することが可能である。本発明の抗体は、既存薬に対して抵抗性の高いRas変異癌の治療においても効果的である。本発明の抗体を有効成分とする抗癌剤は、本発明の抗体と任意の成分、例えば生理食塩水、葡萄糖水溶液または燐酸塩緩衝液などを含有する組成物の形態で使用することができる。本発明の抗癌剤は、必要に応じて液体または凍結乾燥した形態で製形化しても良く、任意に薬学的に許容される担体もしくは媒体、例えば、安定化剤、防腐剤、等張化剤などを含有させることもできる。薬学的に許容される担体としては、凍結乾燥した製剤の場合、マンニトール、ラクトース、サッカロース、ヒトアルブミンなどを例として挙げることができ、液状製剤の場合には、生理食塩水、注射用水、燐酸塩緩衝液、水酸化アルミニウムなどを例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明の抗癌剤の投与方法は、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態などにより異なるが、経口投与、非経口投与例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与のいずれかの投与経路で投与することができる。好ましい投与方法は、非経口投与である。本発明の抗癌剤の投与量は、患者の年齢、体重、性別、健康状態、癌の進行の程度および投与する抗癌剤の成分により変動しうるが、一般的に、静脈内投与の場合、成人には体重1kg当たり1日01~1000mg、好ましくは1~100mgである。本発明の抗体は、癌の治療のみならず、癌の診断への応用も考えられる。本発明者らにより見出された、天然型のヒトTGFαと比較して、79位のグリシンに変異を有するヒトTGFα例えば、G79A置換型のヒトTGFαとの反応性が低い抗体は、特に、Ras遺伝子に変異を有する癌の診断にも有用である。本発明の抗体を癌の診断に用いる場合あるいは癌の検出に用いる場合、本発明の抗体は、標識したものであってもよい。標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素を用いることが可能であり、具体的には、ラジオアイソトープ、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチーム、ビオチン/アビジンなどが挙げられる。本発明の抗体を診断剤として調剤するには、合目的な任意の手段を採用して任意の剤型でこれを得ることができる。例えば、精製した抗体についてその抗体価を測定し、適当にPBS生理食塩を含むリン酸緩衝液等で希釈した後、01アジ化ナトリウム等を防腐剤として加えることができる。また、例えば、ラテックス等に本発明の抗体を吸着させたものについて抗体価を求め、適当に希釈し、防腐剤を添加して用いることもできる。以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。材料および方法1.抗TGFαモノクローナル抗体の作製方法1免疫原ならびに抗体スクリーニング用抗原の調製TGFαに対するマウスモノクローナル抗体を取得するための以下の2つの免疫原を調製した。一つ目は、ヒトTGFαのアミノ酸配列24番目から89番目塩基配列70番から267番目に相当する遺伝子を胎盤cDNAライブラリーからPCR法によって増幅し、得られたPCR産物を動物培養細胞発現ベクターpSecTag2インビトロジェン社にクローニングを行い、さらにpSecTag2由来のリーダーシーケンスを含むヒトTGFα塩基配列70番から267番目をレトロウイルスベクターのpQCXIPタカラバイオ社にサブクローニングした。TGFαのC末側にタグとしてmycとHisが連続して融合されるようにベクターはデザインされている。作製したベクターとenvベクターpVSVGと共に、ウイルスパッケージング細胞のGP293細胞にリポフェクトアミン2000を用いて遺伝子導入を行った。次に培養上清から得たウイルス液を用いて293T細胞に感染を行い、TGFα安定産生細胞株を得た。10日間培養後に得られた上清を、TALON樹脂タカラバイオ社を充填したカラムに通し、樹脂の10倍量の5mMのイミダゾールを含む結合緩衝液にてカラムを洗浄後、100mMのイミダゾール溶液にて結合物を溶出した。PBSにて一晩透析した後、溶出物の一部についてSDS電気泳動を行い、分子量1922kDa付近に目的のバンドを確認し図1a、これを免疫原とした以下、当該免疫原をproTGFαmHと称す。二つ目は、ヒトTGFαのアミノ酸配列1番目から89番目塩基配列1番から267番目に相当する遺伝子を胎盤cDNAライブラリーからPCR法によって増幅し、pCAGGS大阪大学大学院医学系研究科教授宮崎純一先生より譲渡して戴いた。Gene108193199にクローニングした。3’側にマウス免疫グロブリンG2aのFc部の遺伝子が融合するようにベクターをデザインした。遺伝子導入試薬のリポフェクトアミン2000インビトロジェン社を用いてヒト培養細胞293Tに導入し、その培養上清を遠心操作にて回収した。プラスミドDNAの量、細胞数、リポフェクトアミンの量は製品能書に従った。得られた上清についてはProteinGビーズGE社を充填したカラムに通し、ビーズの10倍量の結合緩衝液にてカラムを洗浄後、pH23のグリシン塩酸溶液にてカラム吸着物を溶出させた。pH80のTrisHCl緩衝液にて迅速に中和した後、PBSにて一晩透析を行った。抽出物の一部についてSDS電気泳動を行い、分子量4044kDa付近に目的のシングルバンドを確認し図1b、これを免疫原とした以下、当該免疫原をproTGFαmFcと称す。また、得られた抗体のTGFαとの反応性を確認するためのスクリーニング用抗原を調製するために、下記の4つの発現ベクターを構築した。一つ目のベクターにおいては、ヒトTGFαのアミノ酸配列40番目から89番目塩基配列118番から267番目の成熟型TGFαに相当する遺伝子を胎盤cDNAライブラリーからPCR法によって増幅し、得られたPCR産物を動物培養細胞発現ベクターpSecTag2にクローニングを行った後、pSecTag2由来のリーダーシーケンスを含むヒトTGFα塩基配列118番から267番目をpcDNA31ベクターインビトロジェン社にサブクローニングした。TGFαのC末側にヒト免疫グロブリンG1のFc部の遺伝子が融合するようにベクターをデザインした以下、当該発現ベクターによって調製される抗原をTGFαhFcと称す。二つ目のベクターにおいては、ヒトTGFαのアミノ酸配列1番目から89番目塩基配列1番から267番目に相当する遺伝子を胎盤cDNAライブラリーからPCR法によって増幅し、得られたPCR産物を動物培養細胞発現ベクターpcDNA31にクローニングした。TGFαのC末側にヒト免疫グロブリンG1のFc部が融合するようにベクターをデザインした以下、当該発現ベクターによって調製される抗原をproTGFαhFcと称す。三つ目のベクターとして、ヒト免疫グロブリンG1のFc部に対する抗体の非特異反応を検討するために、ヒトGITRの細胞外領域の部分長遺伝子配列1495塩基をヒト免疫グロブリンG1のFc部遺伝子と融合させたベクターpcDNAGITRhFcを構築した以下、当該発現ベクターによって調製される抗原をGITRhFcと称す。各発現ベクターをヒト培養細胞293Tにリポフェクションによって導入し、34日後に培養上清を回収した。培養上清中に含まれる抗体スクリーニング用抗原TGFαhFc、proTGFαhFcそしてGITRhFcの回収精製は、上記の免疫原の調製法に従った図1ce。四つ目の発現ベクターは、細胞表面に発現する膜型TGFαとの反応性を検討することを目的に構築した。ヒトTGFαのアミノ酸配列1番目から160番目塩基配列1番から480番目に相当する遺伝子を動物細胞発現ベクターpcDNA31にクローニングした。TGFα遺伝子の3’側にリボソームエントリーサイトのIRESならびに蛍光タンパク質GFPセルバイオラボス社の遺伝子が繋がるようにベクターをデザインした以下、該発現ベクターをpDIGTGFαと称す。この発現ベクターの特徴は、293T細胞にリポフェクションによって一過性に導入されると、膜型TGFαを発現している細胞だけ、GFPの蛍光が発するような仕組みを有することである。この細胞に対して一次抗体ならびに、PE標識した二次抗体を反応させた後、フローサイトメトリにて二次元展開を行うと、抗原抗体反応が生じている場合には、GFPの蛍光を発する細胞だけが右上にドットがシフトするデータが得られる図1f以下、当該発現ベクターを一過性導入された293T細胞をTGFα293Tと称する。2免疫原の免疫とハイブリドーマの樹立免疫原としてproTGFαmFc単独、あるいはproTGFαmFcとproTGFαmHを用いた。これら溶液にフロイントの完全アジュバントCompleteFreund’sAdjuvantを等量混ぜた後、BALBc系統、C57BL6系統、C3H系統、そしてMRL系統のマウス計60匹に週2回、合計6~8回の免疫を行った。最終投与後から3日目に免疫マウスから脾臓あるいはリンパ節を摘出し、組織内部からリンパ球を採取した。マウス骨髄腫細胞株P3U1と回収したリンパ球を混ぜ、RPMI培地シグマ社にて2回洗浄した後、細胞沈殿に対して、RPMIで50に希釈したポリエチレングリコール4000溶液和光純薬社を等量添加した。細胞懸濁液に1分間のピペッティングを施した後、20倍量のRPMIにて細胞を3回洗浄した。その後、細胞を15のウシ血清エキテック社、2のHATインビトロジェン社、1100量のBM培地ロシュ社、終濃度5ngmLのストレプトマイシンとペニシリンを含むRPMI培地で懸濁し、96ウェルプレートに播種して37度のCO2インキュベーター内で静置培養を行った。播種から5日目に培養液を新しい培地と交換し、さらに5日間の培養を継続した。3抗体スクリーニング1:抗原固相ELISA播種から10日目にハイブリドーマが増えているウェルから培養上清を回収し、スクリーニング用抗原proTGFαhFcを02μgウェル量固相化した96ウェルプレートを用いて、酵素免疫測定法EnzymeLinkedImmunoSorbentAssayを実施した以下、ELISAと称す。ELISA発色のOD値450nm620nm吸光度が0205以上の上清を一次陽性と判断し、1007種類のハイブリドーマを選択した。陽性ハイブリドーマは24ウェルプレートに移してさらに3日間培養を行った。4抗体スクリーニング2:フローサイトメトリTGFαの全長を293T細胞に一過性に発現させたTGFα293T細胞を用いて、上述した24ウェルプレート上清に対するフローサイトメトリ解析を下記の方法で実施した。ハイブリドーマ上清1サンプル50μLに対し、1x105細胞数のTGFα293Tを4度で60分反応させた。細胞を2mMEDTAと05BSAを含むPBSで洗浄した後、PE標識した抗マウスIgG抗体MBL社と4度で30分反応させた。さらに、細胞を400xgで遠心洗浄した後、細胞沈殿を500μLの2mMEDTAと05BSAを含むPBSに懸濁し、フローサイトメトリFC500、ベックマンコールター社にて解析を行った。5抗体スクリーニング3:免疫沈澱法フローサイトメトリにて膜型TGFαとの反応性を示したハイブリドーマ上清について、さらに、proTGFαmHを抗原に以下の方法で免疫沈澱を実施した。1ハイブリドーマ当たり700μLの培養上清を回収し、15μLのproteinGセファロースGE社を添加した後、4度で攪拌しながら一晩反応させた。PBSでセファロースを4回洗浄して得られたセファロース沈殿に、3μgmLのproTGFαmHを1mL添加し、さらに4度で一晩攪拌反応させた。PBS洗浄後に得られたセファロース沈殿に対して、沈殿と等量のSDSサンプルバッファー溶液を添加した後、10分間の煮沸を行い、その上清を得た。15のSDS電気泳動用ゲルに15μL量ずつアプライした。免疫沈降の陽性対照抗体としては、市販の抗myc抗体MBL社ならびに抗TGFαポリクローナル抗体RDsystems社を用いた。また、イムノブロットの陽性対照として、proTGFαmHを同時にアプライした。SDS電気泳動を行い、PVDF膜にタンパク質を転写した後、膜に対して5のスキムミルクを含むPBSで室温1時間のブロッキング処理を行った。検出用抗体は500倍希釈した抗myc抗体MBL社を使い、PVDF膜と1時間室温で反応させた。005のTween20を含むPBS以下、洗浄液と称すで膜を洗浄した後、市販の化学発光基質ミリポア社を用いて目的バンドの検出を行った図4。抗原固相ELISA、フローサイトメトリならびに免疫沈降の結果から、ハイブリドーマ上清を選抜し、限外希釈法によってハイブリドーマのモノクローン化を行った。精製抗体とTGFαとの反応性を確認するため、図2にはGITRhFc、TGFαhFc、proTGFαhFc、およびproTGFαmH各02μgウェル量固相化したELISAプレートを用いた精製抗体ビオチン標識との反応性を検討したデータの一部を示す。陰性対照のGITRhFcとはOD値が01以上に反応せず、TGFαhFc、proTGFαhFcおよびproTGFαmHとOD値が05以上に反応することを確認した。図3にはTGFα293T細胞に対する精製抗体の反応性をフローサイトメトリによって確認した結果を示す。各抗体のアイソタイプはアイソストリップキットロシュ社を用いて決定した。その結果、39種類のハイブリドーマが産生する単一抗体を抗TGFαモノクローナル抗体としてリスト化し、以後の実験に用いた表1。2.EGFRのチロシンリン酸化を阻害する抗TGFα抗体の選択1抗チロシンリン酸化EGFR抗体を用いたウエスタンブロッティングEGFRを高発現するヒト扁平上皮癌細胞株A431を用いて、TGFα刺激によるEGFRのチロシンリン酸化を阻害する抗TGFα抗体の探索を下記の方法で実施した。A431細胞は10ウシ血清を含むDMEM培地で培養を行い、アッセイの2日前に24ウエルプレートに1x105細胞ずつ播種した。アッセイの前日に上清を廃棄した後、血清を添加していないDMEMで細胞表面を一度洗浄し、同じ無血清培地を500μLずつ添加した。アッセイ当日、大腸菌生合成による市販の分泌型TGFαRDsystems社を20ngmL含むDMEMを調製した。そこに39種類の抗TGFα抗体あるいは抗EGFR抗体クローン225セツキシマブの元抗体、カルビオケム社を図5に示した濃度の2倍量を添加し、4度にて1時間攪拌反応させた。その後、500μL量ずつA431細胞の培養ウェルに添加した。30分後に上清を廃棄し、速やかに150μL量のSDSサンプル緩衝液を添加した。ピペッティングで攪拌した後、15mLチューブに移し、5分間の煮沸処理を行い、遠心後、その上清を回収した。続いて75のSDS電気泳動用ゲルに各試料を15μLずつ添加し、電気泳動を行った。PVDF膜にタンパク質を転写後、膜を5BSAを含むPBS以下、ブロッキング液と称すにて4度で一晩ブロッキングを行った。洗浄液にて膜を洗浄した後、ブロッキング液で200倍希釈した抗チロシンリン酸化EGFRPTyr1173抗体9H2と室温で1時間反応させた。洗浄液で膜を洗浄後、ブロッキング液で5000倍希釈したPOD標識抗マウスIgG抗体MBL社と室温で1時間反応させた。膜を洗浄液で洗浄後、市販の化学発光基質ミリポア社を用いて目的バンドの検出を行い、LAS3000を用いて画像データを記録した。2抗EGFR抗体によるリブロッティング続いて、使用したPVDF膜から抗体を除去するために、膜を02のNaOHを含む蒸留水で室温5分間の処理を行い、その後、迅速に洗浄液にて洗浄を実施した。5のスキムミルク雪印を含むPBSを用いて4度にて一晩ブロッキングを行い、抗EGFR抗体MBL社と室温で1時間反応させた。膜を洗浄した後、ブロッキング液で5000倍に希釈したPOD標識抗マウスIgG抗体MBL社と室温で1時間反応させ、洗浄後、市販の化学発光基質ミリポア社を用いてEGFR由来のバンドの検出を行った図5。3.抗TGFα抗体MBL2593を用いた株化癌細胞に対するフローサイトメトリ解析TGFαを強制発現させた293T細胞を用いたフローサイトメトリ解析において、比較的強い反応性が認められた抗TGFα抗体MBL2593を用いて、各株化癌細胞に対するフローサイトメトリを下記の通り、実施した。大腸癌由来の細胞株SW620KRasG12Vホモ変異は10ウシ血清を含むL15液体培地インビトロジェン社を、肺癌由来の細胞株A427KRasG12Dヘテロ変異は10ウシ血清を含むMEM培地インビトロジェン社を用いて10cmプレート上にて継代培養を行った。細胞密度が7080コンフルエントになった段階で、上清を廃棄して、10mLのPBSで細胞表面を洗浄した。その後、プレートから細胞を剥がす目的で5mMEDTAPBSを3mL添加し、37度のCO2インキュベーター内で5分間処理した。7mLのPBSを追加添加した後、10mLピペットで細胞をよく懸濁し、得られた細胞懸濁液を70μmセルストレイナーBDファルコン社を通しながら、15cc遠心チューブBDファルコン社に移した。400xgの遠心を3分行った後、上清を捨て、5mLのPBSに再懸濁を行った。細胞懸濁液を50100μL量チューブに分注した後、終濃度が100μgmLになるようにヒトIgGMBL社を添加し、4度で15分間静置した。400xgで2分間の遠心後、上清を捨てた後、終濃度が10μgmLの抗TGFα抗体MBL2593あるいはアイソタイプ対照のマウスIgGを添加して、4度で1時間反応を行った。05BSAと2mMEDTAを含むPBSで細胞を2回洗浄した後、洗浄液で200倍希釈したPE蛍光標識抗マウスIgG抗体MBL社を4度で1時間反応させた。洗浄液を用いて400xgで2分間による洗浄を3回行った後、細胞を500μLの洗浄液に懸濁し、フローサイトメトリ解析をFC500ベックマンコールター社にて行った図6。4.Ras変異癌を移植したマウス担癌モデルにおける抗TGFα抗体の腫瘍抑制効果移植に用いたSW620およびA427細胞は上述した培養方法で継代を行い、各種の抗TGFα抗体あるいはセツキシマブメルク社を含むPBSで5x107個mLに懸濁した。BALBcヌードマウス4週齢メスの右背部皮下に、23G針1mLシリンジを用いて100μL匹で癌細胞を移植した。その後、各抗TGFα抗体ならびにセツキシマブを週2回、300μg匹で、26G針1mLシリンジにて計6あるいは7回、癌組織内に直接投与を行った。陰性対照として、PBSあるいはマウスIgG2aを使用した。腫瘍サイズの計測は、試薬投与前に癌の長径と短径をノギスにて毎回2~3名の測定者がそれぞれ単独で測定し、腫瘍体積長径×短径2×π6にて腫瘍体積を算出、各測定者による算出値の平均をグラフにプロットした図7と図8。5.3次元培養系における各種癌細胞に対する抗TGFα抗体の増殖阻害効果各種癌細胞の3次元培養は市販の3DCultureBMECellProliferationAssayを用いて以下の方法で実施した。35μLウェルのBMEBasementmembraneextractを96ウェルプレートに分注した後、気泡を完全に消失させるために800xg4度の遠心操作を10分間行った。BMEがウェル全体に均一になっているのを目視した後、37度、5CO2環境下で1時間インキュベートしてBMEをゲル化させた。各種の癌細胞SW620A427およびA431は5mMEDTAを含むPBSで処理することでプレートから剥がし、PBSで2回洗浄後、2BMEを含む液体培地で1x105個mLにて懸濁した。100μLウェルの細胞懸濁液をゲル化したBMEの上に播種し、37度5CO2環境下で培養して細胞をゲル上に定着させた。その後、終濃度が50μgmLになるように、抗TGFα抗体溶液あるいはセツキシマブを100μLウェルで添加した。陰性対照として、アイソタイプのマウスIgG2aを使用した。抗体添加から80時間培養後に3DCultureCellProliferationReagentを15μLウェルで添加し、3時間反応させた。その後、450nm620nmの吸光度をプレートリーダーUltramark、バイオラッド社で測定した図9。6.マウス皮下血管新生評価系における抗TGFα抗体の血管新生阻害効果マウス皮下における血管新生評価系は、市販のDirectedInVivoAngiogenesisAssayを用いて以下の方法で実施した。氷上で解凍したGrowthFactorReducedBMEを市販のヒトTGFα、ヘパリン溶液、および抗TGFα抗体と混合した。このとき添加物の総体積がBMEの10となるようにPBSで補正した。陰性対照として、PBSを10添加したBMEを用いた。また、実験系の陽性対照として、血管新生誘導因子のVEGFとFGF2を添加したBMEに、抗VEGF抗体であるベバシズマブ商品名Avastin:ロシュ社を25μgあるいは125μgangioreactorを加えたものを用いた。上記の混合溶液をシリコン製チューブangioreactor1個あたり20μL注入し、37度5CO2下で1時間静置反応させ、BMEをゲル化させた。1mgのペントバルビタールシェリングプラウ社を腹腔内投与で麻酔した7週齢メスのBALBcヌードマウスの両側背部皮下に、Angioreactorを片側に2本ずつ、1匹あたり計4本挿入し、皮膚をAUTOCLIP9mmで留めた。15日間飼育後、ヌードマウスをジエチルエーテル吸入によって安楽死させ、埋め込んだAngioreactorを摘出した。Angioreactorの注入口と反対側をメスで切りはずし、中のBMEゲルを滅菌15mLチューブへ押し出すように回収した。さらに300μLのCellSperse液でAngeoreactorの中を洗い、洗液を回収した。回収したゲルを37度で3時間インキュベートした後、250xgで5分間の遠心処理を施し、リアクター内に遊走した細胞を沈殿画分として回収した。細胞沈殿は500μLの10FCS含有DMEMで懸濁し、37度で1時間静置した。その後、室温で250xgの遠心を10分間行い、細胞を洗浄した。キットに添付されたWashBufferで細胞をさらに2回洗浄した後、沈殿に200μLのFITCLectinを加えて懸濁し、4度で一晩反応させた。WashBufferで細胞を3回洗浄した後、100μLのWashBufferに懸濁し、蛍光光度計Arvoパーキンエルマ社で蛍光量を測定した。データは相対値[各サンプルの蛍光強度陰性対照の蛍光強度平均値]で表し、各条件の平均値と標準偏差を算出してスチューデントT検定で統計的解析を行った図10。7.免疫組織染色法大腸癌由来の細胞株SW620KRasG12Vホモ変異は10ウシ血清を含むL15液体培地インビトロジェン社を用いて10cmプレート上にて継代培養を行った。細胞密度が7080コンフルエントになった段階で、10mLのPBSで細胞表面を一度洗浄した。5mMEDTAPBSを3mL添加し、37度のCO2インキュベーター内で5分間処理した後、7mLのPBSを追加添加し、10mLピペットで細胞をよく懸濁した。得られた細胞懸濁液を15cc遠心チューブBDファルコン社に移した。400xgの遠心を3分行った後、上清を捨て、5mLのPBSに細胞を再懸濁した。5mLの8ホルマリン緩衝溶液を加え、軽く攪拌した後、氷上で1時間静置した。400xgの遠心を3分行い、沈殿細胞塊を一度PBSにて洗浄した後、脱水処理する目的で、70エタノールに10分間2回、80エタノールに10分間2回、90エタノールに10分間1回、95エタノールに10分間1回、100エタノールに10分間2回、キシレンに10分間3回、キシレンパラフィンに10分間2回、そして60度のパラフィンに10分間3回の処理を行った。作製したパラフィンブロックは染色試験までの期間、30度の冷凍庫にて保管した。SW620の細胞塊パラフィンブロックをミクロトームにて35μmの厚さにスライスした後、得られた切片をスライドガラスの上に乗せた。また大腸癌患者由来のパラフィン包埋済みの癌組織切片は中国の上海Outdo社より購入した。SW620細胞塊切片ならびに大腸癌由来組織切片を脱パラフィン処理するために、キシレンに5分間3回、100エタノールに5分間2回、90エタノールに5分間1回、80エタノールに5分間1回、70エタノールに5分間1回、そしてPBSに5分間3回すべて室温にて処理した。次に抗原賦活化を目的に、切片をpH60の005Tween20を含む10mMクエン酸緩衝液に浸し、125度のオートクレーブで5分間処理を行った。次に、内在性のペルオキシダーゼ活性を消滅させるために、3過酸化水素水を含むPBSに室温10分間処理を行った後、5正常ラット血清と05BSAを含むPBSブロッキング溶液で室温30分処理を行った。過剰な溶液を布で拭った後、ブロッキング溶液で10μgmLに希釈した抗TGFa抗体MBL2593ならびにアイソタイプ対照mouseIgG2a、MBL社を適量添加し組織切片が十分に浸る程度、室温で2時間反応させた。005Tween20を含むPBSで室温5分間3回洗った後、ENVISIONキットダコ社の二次抗体反応溶液を適量添加し組織切片が十分に浸る程度、室温で60分間反応させた。005Tween20を含むPBSで室温5分間3回洗った後、DAB基質液を10分間反応させた。反応は組織切片を水で洗浄することで止めた。ヘマトキシリンによる染色の後、エタノールとキシレンで脱水処理を行い、標本作製液松浪硝子社で標本を作製し、明視野顕微鏡IX71オリンパス社にて検鏡ならびに記録を行った図11。8.抗TGFα抗体の抗原エピトープ解析1TGFαのアミノ酸点置換体を用いたフローサイトメトリ解析による抗原部位の検討成熟型TGFαのアミノ酸配列40番89番目のうち、ヒトとマウスとの間でアミノ酸配列が異なる4アミノ酸残基について1つずつマウス型アミノ酸に置換したアミノ酸点置換TGFαD46KF54YD67EおよびA80Vの発現ベクターを、pDIGTGFαをベースにAMAPMultiSiteDirectedMutagenesisKitを用いて構築した。また、44番目、49番目、54番目、64番目、69番目、74番目、79番目、そして84番目のアミノ酸をそれぞれ1残基ずつアラニンに置換をしたアミノ酸点置換TGFαも同じキットを用いて作製した。またマウス野生型TGFα発現ベクターを作製するために、マウス野生型TGFα遺伝子塩基配列1番から477塩基オリジーン社を動物細胞発現ベクターphmAG1アマルガム社にクローニングした。マウスTGFα遺伝子の3’側にIRESならびに蛍光タンパク質のアザミグリーンの遺伝子が繋がるようにベクターをデザインした以下、当該ベクターをpDIATGFαと称す。これらのアミノ酸点置換TGFαの発現ベクターならびに、ヒト野生型TGFα発現ベクター、マウス野生型TGFα発現ベクターの計15種類の発現ベクターをそれぞれリポフェクションインビトロジェン社によって293T細胞に一過性で発現させた。該細胞1試料あたり、1x105個を洗浄バッファーで2回洗浄した後、各種の抗TGFα抗体洗浄バッファーで5μgmLに希釈を4度で60分間反応させた。洗浄バッファーで細胞を2回洗浄した後、200倍希釈したPE標識抗マウスIgG抗体MBL社を4度で60分間反応させた。洗浄バッファーで細胞を2回洗浄後、500μLの洗浄バッファーに懸濁した細胞をFC500ベックマンコールター社でフローサイトメトリ解析し、各TGFα抗体におけるヒト野生型TGFαとアミノ酸点置換TGFαとの反応性を比較検討した図12。2オーバーラップペプチドを用いた抗原部位解析成熟型TGFαの配列を基に、以下の11種類のOLPを人工合成した。OLP1VVSHFNDCP配列番号:67OLP2VVSHFNDCPDSHTQF配列番号:68OLP3PDSHTQFC配列番号:69OLP4SHTQFCFHGT配列番号:70OLP5FHGTCRFLVQE配列番号:71OLP6FHGTCRFLVQEDKPA配列番号:72OLP7RFLVQEDKPACV配列番号:73OLP8VCHSGYVGAR配列番号:74OLP9HSGYVGARCEHADLLA配列番号:75OLP10YVGARCEHADLLA配列番号:76OLP11ARCEHADLLA配列番号:77陽性対照抗原としてproTGFαhFcを利用した。また、陰性対照抗体としては、アイソタイプ対照のマウスIgG2aMBL社を使用した。OLPおよび陽性対照抗原を1μgmL含むPBSを50μLずつ、96ウェルプレートF96MaxisorpNUNCImmunoplateに添加し、4度で一晩反応させることで抗原をプレートに吸着させた。上清を捨てた後、ブロッキング液を100μLウェルで添加し、4度で一晩静置した。ブロッキング液を完全に除いた後、各抗TGFα抗体を5μgmL含むPBSを50μLずつウェルに添加して、室温で1時間反応させた。プレートをPBSで5回洗浄した後、POD標識抗マウスIgGを50μLウェルで添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSで5回洗浄した後、TMBを50μLウェルで添加して室温で30分間インキュベートして発色させた。05Nのリン酸溶液を50μLウェルで添加して反応を停止させ、450nm620nmで吸光度を測定した図13。9.抗体配列の決定PCR法による配列の決定をAntibodyEngineeringJMcCAFFERTYHRHoogenboomDJChiswell編に従って実施した。抗TGFα抗体を産生するハイブリドーマを1x105細胞収集し、RNeasyminikitにてトータルRNAを精製し回収した。マウスIgGの可変領域は、下記のクローニング用プライマーとDNA合成酵素としてKODPlusを用いたPCR法により、増幅した。L鎖に対するセンスプライマーMKV15’ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG3’配列番号:78MKV25’ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG3’配列番号:79MKV35’ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG3’配列番号:80MKV45’atgaggRcccctgctcagWttYttggMWtcttg3’配列番号:81MKV55’atggatttWcaggtgcagattWtcagcttc3’配列番号:82MKV65’atgaggtKcYYtgYtSagYtYctgRgg3’配列番号:83MKV75’atgggcWtcaagatggagtcacaKWYYcWgg3’配列番号:84MKV85’atgtggggaYctKtttYcMMtttttcaattg3’配列番号:85MKV95’atggtRtccWcaSctcagttccttg3’配列番号:86MKV105’atgtatatatgtttgttgtctatttct3’配列番号:87MKV115’atggaagccccagctcagcttctcttcc3’配列番号:88L鎖に対するアンチセンスプライマーMKC5’ACTGGATGGTGGGAAGATGG3’配列番号:89H鎖に対するセンスプライマーMHV15’atgaaatgcagctggggcatSttcttc3’配列番号:90MHV25’atgggatggagctRtatcatSYtctt3’配列番号:91MHV35’atgaagWtgtggttaaactgggttttt3’配列番号:92MHV45’atgRactttgggYtcagcttgRttt3’配列番号:93MHV55’atggactccaggctcaatttagttttcctt3’配列番号:94MHV65’atggctgtcYtrgSgctRctcttctgc3’配列番号:95MHV75’atggRatggagcKggRtctttMtctt3’配列番号:96MHV85’atgagagtgctgattcttttgtg3’配列番号:97MHV95’atggMttgggtgtggaMcttgctattcctg3’配列番号:98MHV105’atgggcagacttacattctcattcctg3’配列番号:99MHV115’atggattttgggctgattttttttattg3’配列番号:100MHV125’atgatggtgttaagtcttctgtacctg3’配列番号:101IgG1に対するアンチセンスプライマーMHCG15’CAGTGGATAGACAGATGGGGG3’配列番号:102IgG2aに対するアンチセンスプライマーMHCG2a5’CAGTGGATAGACAGATGGGGC3’配列番号:103PCRによる増幅産物をクローニングベクターに組み込み、遺伝子配列の解析を行ったABI3130、ライフテクノロジーズ社。IgBLASTを利用して、得られた抗体配列のフレームワークとCDRの特定を行った。次に、得られた可変領域がTGFαを認識すること検証するために、H鎖とL鎖の可変領域遺伝子を用いてヒト型キメラ抗体を下記の方法で作製した。ヒト定常領域としては、Kabatらが非特許文献SequenceofproteinsofImmunologicalinterestにおいて示したHumanIgG1定常領域を利用した。H鎖定常領域に対するセンスプライマー5’AAGCTTCGTACGCCCGCTCTTCGCCTCCACCAAGGGCCCATC3’配列番号:104アンチセンスプライマー5’CGCCTGACGCGTCCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGACTCTTCTGCGTGTAG3’配列番号:105L鎖定常領域に対するセンスプライマー5’AAGCTTCGTACGCCCGCTCTTCACTGTGGCTCACCATCTGT3’配列番号:106,アンチセンスプライマー:5’CGCCTGACGCGTCCCCTAACACTCTCCCCTGTTGA3’配列番号:107を用いて遺伝子の増幅を行い、得られたH鎖定常領域遺伝子配列断片ならびにL鎖定常領域遺伝子配列断片を、制限酵素SmaIで消化したpEHX11、pELX21に、InFusionPCRクローニングキットを用いて導入した以下、当該発現ベクターを、それぞれhHCpEHX、hLCpELXと称する。次に、以下に示すヒト型キメラ抗体作製用のプライマーで増幅させて得た各抗TGFα抗体のH鎖およびL鎖のDNA断片を、制限酵素SapIで消化したhHCpEHX、hLCpELXにそれぞれInFusion法にて導入した。<MBL00915>H鎖センス5GCCCGCTCTTCGCCTATGAGAGTGCTGATTCTTTTGT3配列番号:108アンチセンス5GGCCCTTGGTGGAGGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT3配列番号:109L鎖センス5GCCCGCTCTTCACTGATGGTGTCCTCAGCTCAGTTCCTTG3配列番号:110アンチセンス5ATGGTGCAGCCACAGTTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC3配列番号:111<MBL016‐8>H鎖センス5GCCCGCTCTTCGCCTATGAAATGCAGCTGGGGCATG3配列番号:112アンチセンス5GGCCCTTGGTGGAGGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT3配列番号:113L鎖センス5GCCCGCTCTTCACTGATGAGGTTCTCTGTTGAGTTC3配列番号:114アンチセンス5ATGGTGCAGCCACAGTTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC3配列番号:115<MBL0181>H鎖センス5GCCCGCTCTTCGCCTATGGAATGTAACTGGATACTT3配列番号:116アンチセンス5GGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT3配列番号:117L鎖センス5GCCCGCTCTTCACTGATGGGCATCAAGATGGAGTCA3配列番号:118アンチセンス5ATGGTGCAGCCACAGTTCTGATTTCCAGTTTGGTGCC3配列番号:119<MBL1441>H鎖センス5GCCCGCTCTTCGCCTATGATGGTGTTAAGTCTTCTG3配列番号:120アンチセンス5GGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3配列番号:121L鎖センス5GCCCGCTCTTCACTGATGGTATCCTCAGCTCAGTTC3配列番号:122アンチセンス5ATGGTGCAGCCACAGTTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC3配列番号:123<MBL1846>H鎖センス5GCCCGCTCTTCGCCTATGAAATGCAGCTGGGGCATC3配列番号:124アンチセンス5GGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3配列番号:125L鎖センス5GCCCGCTCTTCACTGATGAAGTTTCCTTTTCAACTT3配列番号:126アンチセンス5ATGGTGCAGCCACAGTTTTGATTTCCAGTTTGGTGCC3配列番号:127<MBL2593>H鎖センス5GCCCGCTCTTCGCCTATGAAATGCAGCTGGGGCATG3配列番号:128アンチセンス5GGCCCTTGGTGGAGGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT3配列番号:129L鎖センス5GCCCGCTCTTCACTGATGAGTGTGCTCACTCAGGTC3配列番号:130アンチセンス5ATGGTGCAGCCACAGTTTTTATTTCCAGTTTGGTCCC3配列番号:131<MBL2921>H鎖センス5GCCCGCTCTTCGCCTATGAAATGCAGCTGGGGCATC3配列番号:132アンチセンス5GGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3配列番号:133L鎖センス5GCCCGCTCTTCACTGATGAAGTTTCCTTTTCAACTT3配列番号:134アンチセンス5ATGGTGCAGCCACAGTTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC3配列番号:135<MBL35234>H鎖センス5GCCCGCTCTTCGCCTATGAAATGCAGCTGGGGCATG3配列番号:136アンチセンス5GGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3配列番号:137L鎖センス5GCCCGCTCTTCACTGATGAAGTTTCCTTTTCAACTT3配列番号:138アンチセンス5ATGGTGCAGCCACAGTTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC3配列番号:139作製したヒト型キメラ抗体発現ベクターを293T細胞に共トランスフェクトした。その培養上清について、膜型TGFαを発現させた293T細胞への反応性を、前述と同様のフローサイトメトリ解析によって確認した。上述のPCR法で配列が決定されなかった抗体遺伝子については、5’RACE法で抗体遺伝子のクローニングを行った。5’RACE法はGeneRacerキットを用いて以下の方法で実施した。RNeasyminikitにて回収したトータルRNAを、ウシ腸由来ホスファターゼで処理した。エタノール沈殿で回収した5’脱リン酸化RNAを、タバコ酸ピロホスファターゼで処理し、5’キャップ構造を除去した。エタノール沈殿で回収した5’脱キャップ化RNAに、GeneRacerRNAoligoをT4RNAリガーゼを用いて付加した。この付加RNAをエタノール沈殿で回収し、SuperScriptIIIRTで逆転写反応を行った。合成されたcDNAを鋳型に、GeneRacer5’primer、L鎖とH鎖それぞれに特異的なアンチセンスプライマーH鎖5’GATGGGGGTGTCGTTTTGGC3’配列番号:140L鎖GTTGGTGCAGCATCAGCCCG3’配列番号:141、およびKODplusを用いて、抗体遺伝子を増幅した。増幅したDNAをpCRBluntIITOPOベクターに導入し、遺伝子配列を決定したABI3130。ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築ならびに得られたヒト型キメラ抗体の活性の確認は上述の方法に従った。実施例1抗TGFαモノクローナル抗体の取得免疫原にはproTGFαmFc単独、あるいはproTGFαmFcとproTGFαmHを用いた。この溶液を、フロインドの完全アジュバントとともに、各種系統のマウス計60匹に免疫した図1aとb。免疫マウスのリンパ球とミエローマを融合したハイブリドーマの上清を用いて、免疫原またはスクリーニング用抗原との反応性を抗原固相ELISAにて評価した。次に、TGFαの全長を293T細胞に一過性に発現させたTGFα293T細胞を用いて、フローサイトメトリ解析を行い、膜型TGFαと反応性を示すハイブリドーマ上清、さらには分泌型抗原のproTGFαmHを免疫沈降できるハイブリドーマ上清図4を選択した。限外希釈法によってハイブリドーマをモノクローン化した後、再度、免疫原固相ELISAと免疫沈降を実施し、合計39種類の抗TGFαモノクローナル抗体を選抜した表1。精製抗体によるTGFαへの反応性を確認するため、各種TGFαならびに陰性対照を固相したELISA図2、ならびにTGFα293T細胞を用いたフローサイトメトリによる反応性の確認を行った図3。実施例2TGFαとEGFRの結合を阻害するTGFα中和抗体の選択得られた抗TGFα抗体から、TGFαとEGFRの結合を阻害する活性を有する抗体中和抗体を選択する目的で、EGFR高発現癌細胞A431を用いて次の実験を行った。無血清培地で培養したA431に対して、TGFαを添加するとEGFRのチロシンリン酸化レベルが一過的に上昇する。予めTGFα溶液を各抗TGFα抗体と反応させてからA431に処理した場合において、EGFRのリン酸化レベルを、PBS対照に比べて上昇させない抗体を検索した。その結果、抗体添加濃度10μgmLにおいて、MBL35234、MBL2921、MBL1846、MBL0168、MBL1441、MBL0231、およびMBL0181がEGFRのチロシンリン酸化PTyr1173を70100以上阻害することが判明した図5aとb。一方、対照に用いたTGFα中和抗体1892130非特許文献50およびEGFRのブロック抗体225は、EGFRリン酸化をそれぞれ20と40程度しか阻害しなかった。実施例3癌細胞における膜型TGFαあるいは膜結合型TGFαの検討次に、KRas遺伝子変異を持つ癌細胞の細胞表面におけるTGFαの存在を検証するために、TGFα293T細胞に対する反応性が比較的良好であったMBL2593を用いてフローサイトメトリ解析を行った。その結果、KRas遺伝子G12Vホモ変異癌細胞である大腸癌由来のSW620と肺癌由来のKRas遺伝子G12Dヘテロ変異細胞株であるA427がMBL2593と反応した図6。実施例4KRas遺伝子変異癌を移植した担癌マウスモデルにおける抗TGFα抗体の腫瘍抑制効果図6で抗TGFα抗体との反応性が認められたKRas遺伝子変異癌細胞A427とSW620をそれぞれヌードマウスに皮下移植し、同時に各種の抗TGFα抗体を皮下に投与した。その後、抗体を週2回の割合で6あるいは7回投与し、腫瘍サイズを計測した。その結果、A427担癌マウスでは、EGFRブロック抗体のセツキシマブ投与群に一定の癌の増殖抑制が認められたが、本発明者らが取得した抗TGFα抗体のうち、MBL0231、MBL2593、およびMBL2921投与群は、セツキシマブよりも顕著な癌の抑制が認められた図7aとb。また、SW620担癌マウスでは、セツキシマブ投与群では抗腫瘍効果が認められなかったのに対し、抗TGFα抗体のMBL1441、MBL2593、およびMBL2921投与群では顕著な癌の増殖抑制が認められた図8aとb。実施例53次元細胞培養系における抗TGFα抗体の増殖抑制効果TGFαは癌細胞の増殖に直接作用するだけでなく、癌組織に栄養を運ぶ血管を誘引し、また足場となるストローマの増殖を促進することで、総合的に癌組織の増大を助けている。そこで、担癌マウスモデルで腫瘍抑制効果が認められた抗TGFα抗体が、癌の増殖を直接抑制しているのか、血管新生を抑制しているのか、あるいは両方を抑制しているのかを調査した。始めに、ゲル化させた培地で細胞を培養する3次元細胞培養系を用いて、A427ならびにSW620を増殖させ、その培養系に各種の抗TGFα抗体を添加することで、癌細胞の増殖に対する影響を調査した図9。その結果、抗TGFα抗体のMBL00915、MBL0168、MBL0181、MBL0231、MBL1441、MBL1846、MBL2921、およびMBL35234が濃度依存的にA427とSW620の増殖を抑制した。一方で、TGFα中和抗体1892130非特許文献50やEGFRブロック抗体のセツキシマブには増殖抑制効果がほとんど確認できなかった。また、実験に使用したセツキシマブが失活していないことを確認するために、A431に対して増殖阻害試験を実施したところ、セツキシマブに強い増殖抑制活性が確認された。なお、この実験系においても本発明者らが取得した抗TGFα抗体は強い増殖抑制効果を示した。実施例6血管新生に対する抗TGFα抗体の阻害効果次に、マウス皮下に血管新生を誘導する血管新生実験系を用いて、抗TGFα抗体による血管新生阻害効果を評価した。陽性対照実験として、VEGFFGF2によるアンジオリアクター内への血管内皮細胞の遊走を抗VEGF抗体のベバシズマブで濃度依存的に抑制することを確認した。アンジオリアクターにTGFαを加えると、PBSのみ添加した場合と比較して、血管内皮細胞の遊走は亢進した。この系に、各抗TGFα抗体MBL00915、MBL0168、MBL0181、MBL0231、MBL2921、MBL35234を添加すると血管内皮細胞の誘引抑制が確認された。特にMBL2921はPBSのみ添加の場合と同程度にまで遊走が抑制された図10b。以上の結果から、癌細胞に対する増殖抑制効果を示した抗TGFα抗体の多くは、TGFαのEGFRへの結合に拮抗する活性を有し、さらに血管新生の誘導も抑制する活性を示すことが判明した。実施例7免疫組織染色によるKras遺伝子変異大腸癌細胞SW620ならびに大腸癌患者由来検体に対する抗TGFα抗体の反応性パラフィン包埋したKRas遺伝子変異癌SW620の薄切切片に対して、抗TGFα抗体MBL2593を用いた免疫組織染色を実施したところ、アイソタイプ対照抗体に比べて明らかな染色が確認された図11aと図11b。さらに大腸癌患者由来のパラフィン包埋癌組織切片に対してもMBL2593は癌組織を強く染色した。またこのとき癌部周辺に発達した間質の一部にも染色が確認された。実施例8癌細胞に対して増殖抑制効果を示す抗TGFα抗体の抗原エピトープ解析癌細胞に対して増殖抑制を示した抗TGFα抗体の共通の特徴を探るため、TGFαのアミノ酸を1アミノ酸ずつ改変させたアミノ酸点置換TGFαを作製し、各抗TGFα抗体との反応性を検討した。実験に用いるアミノ酸点置換型TGFαとして、ヒトTGFαからマウスTGFαへアミノ酸を点置換させたD46K置換型、F54Y置換型、D67E置換型、およびA80V置換型を作製した。また、44番目、49番目、54番目、64番目、60番目、74番目、79番目、および84番目のアミノ酸をそれぞれ1残基ずつアラニンに置換をしたF44A置換型、D49A置換型、F54A置換型、V64A置換型、P69A置換型、H74A置換型、G79A置換型、そしてH84A置換型TGFαを準備した。これらをそれぞれ293T細胞の細胞表面に発現させ、各抗TGFα抗体との反応性をフローサイトメトリによって検討した。その結果、invivoあるいはinvitroにおいてKRas遺伝子変異癌に対する増殖抑制効果が認められた抗TGFα抗体9クローンMBL00915、MBL0168、MBL0181、MBL0231、MBL1441、MBL1846、MBL2593、MBL2921、およびMBL35234の全てにおいて、共通して、G79A置換体に対する反応性が著しく低下した図12。一方、中和活性はあるが癌の増殖抑制効果の認められなかった抗体1892130非特許文献50においては、G79A置換体に対する反応性の低下は確認されなかった。1892130はH74A置換体で反応性が低下したが、本発明者ら取得した抗TGFα抗体はいずれもH74A置換体に対してヒト野生型と同程度に強く反応した。また、本発明者らの開発した抗TGFα抗体のうち、SW620に対して増殖抑制効果のなかったMBL04621、MBL0923、MBL1591、MBL21020、MBL28712、MBL3053、およびMBL3245表1は、G79A置換体に対する反応性はヒト野生型TGFαに対する反応性と変わらず、強く反応した。一方で、TGFαのオーバーラップペプチドOLPを人工合成し、上記の抗TGFα抗体9クローンとの反応性をELISAにて検討した。その結果、これら9クローンは、陽性対照抗原として用いたproTGFαhFcと反応したが、11種類のOLPに対してはいずれの抗体も陽性対照抗原と比べてその反応性が著しく低かった。また、OLPをproTGFαhFc溶液に添加することで抗原抗体反応を競合させたが、いずれの抗体もproTGFαhFcに対する反応性の低下は確認されなかった。したがって、TGFαのポリペプチド断片を利用して抗体の反応性を分析しても、抗腫瘍効果を有する抗TGFα抗体は選択できないことが判明した。以上の結果から、G79A置換TGFαとの反応性を指標に抗TGFα抗体を選抜することで、癌Ras遺伝子変異型を含むに対する増殖抑制効果を発揮する抗TGFα抗体の取得が可能となることが判明した。実施例9Ras遺伝子変異癌に対して増殖抑制効果を発揮した抗TGFα抗体の配列解析各抗体産生細胞から抗体遺伝子をPCR法あるいは5’RACE法によって回収し、H鎖とL鎖の遺伝子配列を決定した。H鎖とL鎖の組み合わせが正しいことを確認するために、H鎖、L鎖の抗体遺伝子を表11のプライマーを利用して増幅させた後、動物発現ベクターに導入し、それらを293T細胞に共発現させた。培養上清に得られたリコンビナント抗体がTGFαに反応することを確認するために、実施例1と同様に、膜型TGFα293Tと培養上清とを反応させ、フローサイトメトリ解析を行った。その結果、リコンビナント抗体は、すべて膜型TGFαと反応することを確認した図14。"