"タンパク質を、C末端カルボキシル基の選択的修飾に供し、修飾タンパク質を得る工程と、前記修飾タンパク質を、グルタミン酸及びアスパラギン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化、又は、グルタミン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のN末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化に供し、C末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、前記消化物を、酸性条件下、固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記C末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、タンパク質のC末端ペプチドを回収する方法。前記C末端カルボキシル基の選択的修飾が、酸無水物、活性エステル化剤存在下における酸無水物とカルボン酸との混合物、若しくは、塩基触媒、酸触媒及び/又はフェノール触媒存在下における、蟻酸と酸無水物との混合物、蟻酸と酸ハロゲン化物との混合物、及び/又はホルミル基を有する酸無水物を用いた前記C末端カルボキシル基の選択的活性化を行い、求核試薬を反応させることによって行われる、請求項1に記載の方法。前記求核試薬が、トリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウム基を有する化合物である、請求項2に記載の方法。前記固相担体が、ヒドラジノ基、ヒドロキシアミノ基、アミノ基からなる群から選ばれる基によって官能基化された担体である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。C末端がブロックされているタンパク質を、グルタミン酸及びアスパラギン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化、又は、グルタミン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のN末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化に供し、C末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、前記消化物を、固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記C末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、タンパク質のC末端ペプチドを回収する方法。分離された前記C末端ペプチド断片のN末端アミノ基を修飾する工程をさらに含む、請求項5に記載の方法。前記修飾試薬が、トリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウム基を有する化合物である、請求項6に記載の方法。請求項1~7のいずれか1項に記載の方法によって前記タンパク質から前記C末端ペプチド断片を回収する工程と、回収された前記C末端ペプチド断片を、質量分析測定に供し、アミノ酸配列を決定する工程とを含む、タンパク質のC末端アミノ酸配列決定法。しかしながら、従来の方法は、リジン残基の側鎖アミノ基を介した捕捉によってペプチド断片の分離を行うため、C末端アミノ酸残基がリジン残基であるタンパク質には原理的に適用することができない。そこで本発明の目的は、C末端アミノ酸残基がリジン残基であるか否かに関わらず、C末端ペプチド断片を回収する方法を提供することにある。本発明者らは、鋭意検討の結果、C末端修飾タンパク質を、グルタミン酸及びアスパラギン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化シングルダイジェスチョン、又は、グルタミン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のN末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化ダブルダイジェスチョンに供して生じる、C末端ペプチド断片及びその他のペプチド断片が、カルボキシル基を結合する官能基を有する固相担体への結合能において有効な差を有することを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、以下の発明を含む。1タンパク質を、C末端カルボキシル基の選択的修飾に供し、修飾タンパク質を得る工程と、前記修飾タンパク質を、グルタミン酸及びアスパラギン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化、又は、グルタミン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のN末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化に供し、C末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、前記消化物を、酸性条件下、固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記C末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、タンパク質のC末端ペプチドを回収する方法。消化工程においてグルタミン酸及びアスパラギン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化以下、シングルダイジェスチョンと記載する場合があるを行う場合の本発明の一例の概要を、図1に示す。消化工程においてグルタミン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のN末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化以下、ダブルダイジェスチョンと記載する場合があるを行う場合の本発明の一例の概要を、図2に示す。C末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とは、分離工程において、カルボキシル基を介して捕捉可能な固相担体カルボキシル基をスカベンジングする固相担体への結合能が異なり、この結合能の差によって互いに分離が可能となる。2前記C末端カルボキシル基の選択的修飾が、酸無水物、活性エステル化剤存在下における酸無水物とカルボン酸との混合物、若しくは、塩基触媒、酸触媒及び/又はフェノール触媒存在下における、蟻酸と酸無水物との混合物、蟻酸と酸ハロゲン化物との混合物、及び/又はホルミル基を有する酸無水物を用いた前記C末端カルボキシル基の選択的活性化を行い、求核試薬を反応させることによって行われる、1に記載の方法。タンパク質C末端カルボキシル基の選択的活性化においては、より具体的には、タンパク質C末端におけるオキサゾロン環形成を含む反応が行われる。3前記求核修飾試薬が、トリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウム基を有する化合物である、2に記載の方法。4前記固相担体が、トシルヒドラジノ基によって官能基化された担体である、1~3のいずれかに記載の方法。5C末端がブロックされているタンパク質を、グルタミン酸及びアスパラギン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化、又は、グルタミン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のN末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化に供し、C末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、前記消化物を、固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記C末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、タンパク質のC末端ペプチドを回収する方法。上記5の本発明の一例の概要を、図3に示す。6分離された前記C末端ペプチド断片のN末端アミノ基を修飾する工程をさらに含む、5に記載の方法。7前記修飾試薬が、トリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウム基を有する化合物である、6に記載の方法。81~7のいずれかに記載の方法によって前記タンパク質から前記C末端ペプチド断片を回収する工程と、回収された前記C末端ペプチド断片を、質量分析測定に供し、アミノ酸配列を決定する工程とを含む、タンパク質のC末端アミノ酸配列決定法。本発明により、C末端アミノ酸残基がリジン残基であるか否かに関わらず、C末端ペプチド断片を回収する方法が可能になる。[1.タンパク質]本明細書において、タンパク質とは、オリゴペプチド及びポリペプチドを含む意味で用いる。本発明の方法に供されるタンパク質は、C末端カルボキシル基がフリーであるか否かを問わない。C末端カルボキシル基がフリーでないタンパク質は、すなわち、C末端カルボキシル基において誘導体化されているタンパク質であり、本明細書においては、C末端がブロックされたタンパク質と記載する場合がある。C末端がブロックされているタンパク質の代表的な例としては、C末端がアミド化されたものが挙げられるが、その他の例として、置換されたアミン化合物によるアルキルアミド化、エステル化なども挙げられる。本発明の方法に供されるタンパク質は、C末端残基が側鎖アミノ基を有するリジンであるか否かを問わない。消化後のC末端ペプチド断片の分離において用いられる固相担体が、カルボキシル基を介して捕捉することができるものであるためである。本発明の方法に供されるタンパク質は、通常の前処理として還元アルキル化等の処理を経たものであってよい。[2.C末端カルボキシル基の選択的修飾]タンパク質のC末端カルボキシル基は、選択的に修飾される。すなわち、選択的修飾においては、グルタミン酸残基やアスパラギン酸残基の側鎖に存在するカルボキシル基は修飾されない。なお、C末端カルボキシル基の選択的修飾は、原理的には、本発明に供されるタンパク質のC末端がフリーのカルボキシル基である場合に行われる。しかしながら、本発明に供されるタンパク質のC末端の態様すなわちブロックされているか否かが不明である場合も、この工程を行うことができる。選択的修飾の具体的手法としては、タンパク質のC末端において、分子内でオキサゾロン環を形成し、オキサゾロン環を開環することによって、C末端が修飾されたタンパク質を得ることができる。以下項目2-1~2-3に、選択的修飾法について3態様を挙げるが、これらの態様に限らず、当業者が適宜その方法を選択することができる。[2-1.C末端選択的修飾法1]オキサゾロン環形成後、求核試薬を作用させることによって、オキサゾロン環の開環と同時にC末端が修飾されたタンパク質を得る。オキサゾロン環形成のための試薬としては、酸無水物を用いることが好ましい。酸無水物としては、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水安息香酸、オルトスルホ安息香酸無水物、無水プロピオン酸等を用いることができる。次に、求核基を有する化合物求核試薬を反応させる。求核基としては、アミノ基-NH2、ヒドロキシル基-OH、チオール基-SH、ヒドラジノ基-NHNH2、ヒドロキシアミノ基-NHOH、セミカルバジド基-NHCONHNH2、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基-CHNH2-CHSH-、アミノ基及びチオール基で置換されたエテン基-CNH2=CSH-、システイニル基-COCHNH2CH2SH、活性メチレン基などの求核基から選ぶことができる。ここで、活性メチレン基は、カルボニル基に隣接したメチレン基、カルボニル基にはさまれたメチレン基、及び不飽和結合にはさまれたメチレン基をいう。求核基を有する化合物としては、上記求核基が適当な構造に結合したものを用いることができる。例えば、上記求核基は、芳香族環やイミダゾリン環などに結合していてよい。芳香族環としては、ベンゼン環の他、ピリミジン環などの複素環が挙げられる。また、上記求核基は、電荷を有する基に結合していることが好ましい。正電荷を有する基の例として、ホスホニウム基、グアニジノ基などが挙げられ、負電荷を有する基の例として、スルホニル基などが挙げられる。求核基を有する化合物が電荷を有する態様は、質量分析を用いたアミノ酸配列解析法において有効である点で好ましい。本発明においては、求核基を有する化合物がトリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウム基含有化合物であることが好ましい。より具体的には、求核基を有する化合物がトリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウムアルキルアミンアルキル鎖長は例えば炭素数1~10であることが好ましい。図1及び2においては、この求核試薬を用いてC末端修飾が行われた態様を例示している。[2-2.C末端選択的修飾法2]オキサゾロン環形成後、オキサゾロンを開環して活性エステルに一旦変換し、その後、求核試薬を作用させることによってC末端が修飾されたタンパク質を得る。オキサゾロン環形成のための試薬として、酸無水物とカルボン酸との混合物酸-酸無水物混合物を用いることができる。カルボン酸としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などを用いることができる。酸無水物としては、上述項目2-1のC末端選択的修飾法1におけるものと同様のものを用いることができる。特に好ましい酸-酸無水物混合物の一例としては、ギ酸と酸無水物とからなる混合物が挙げられる。カルボン酸と酸無水物との混合物を用いるオキサゾロン環形成は、活性エステル化剤の存在下で行うと、生成したオキサゾロン環を速やかに活性エステルに変換することができるため好ましい。活性エステル化反応は、上述のオキサゾロン環形成反応のための条件と同様の条件の下で行うことができる。活性エステル化剤としては、一般にペプチド合成に用いられる比較的酸性度の高い水酸基を有する化合物を用いることができる。例えば、ペンタフルオロフェノール、4-スルホ-2,3,5,6-テトラフルオロフェノール、pニトロフェノール、Nヒドロキシコハク酸イミドHNOSu、NヒドロキシベンズトリアゾールHOBtなどが挙げられる。この態様は、オキサゾロン環形成と同時にタンパク質の側鎖アミノ基や側鎖水酸基もカルボン酸によってアシル化されうることにより不活性化する点で好ましい。カルボン酸にギ酸を用いた場合は、これら側鎖官能基はホルミル化される。上述のように活性エステル化されたタンパク質のC末端は、求核基を有する化合物をカップリングさせることによって修飾することができる。求核基を有する化合物としては、上述項目2-1のC末端選択的修飾法1で述べたものと同様のものを用いることができる。[2-3.C末端選択的修飾法3]オキサゾロン環の形成と同時にオキサゾロン環をホルミル化し、脱炭酸によって開環してアルデヒド基へ変換し、その後、求核試薬を作用させることによってC末端が修飾されたタンパク質を得る。オキサゾロン環の形成及びホルミル化のための試薬としては、オキサゾロン環形成及びオキサゾロン環へのホルミル基の導入を実現し、且つオキサゾロン環におけるホルミル化で導入されるホルミル基の供給源を含む試薬が用いられる。具体的には、蟻酸と酸無水物との混合物蟻酸-酸無水物混合物、蟻酸と酸ハロゲン化物との混合物蟻酸-酸ハロゲン化物混合物、及びホルミル基を有する酸無水物から少なくとも1種が選ばれる。蟻酸-酸無水物混合物における酸無水物としては、例えば、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水安息香酸、オルトスルホ安息香酸無水物、無水プロピオン酸、無水ペンタフルオロプロピオン酸などを挙げることができる。蟻酸-酸ハロゲン化物混合物における酸ハロゲン化物としては、例えば、蟻酸塩基物、塩化アセチル、臭化アセチル、塩化ベンゾイルなど挙げることができる。ホルミル基を有する酸無水物は、少なくとも蟻酸から誘導される酸無水物であり、蟻酸と蟻酸以外の酸との混合酸無水物及び無水蟻酸が挙げられる。蟻酸と蟻酸以外の酸との混合酸無水物としては、例えば、蟻酸と酢酸との混合酸無水物などが挙げられる。この態様は、オキサゾロン環形成及びホルミル化と同時にタンパク質の側鎖アミノ基や側鎖水酸基もホルミル化され、不活性化される点で好ましい。一方、オキサゾロン環形成後のC末端アミノ酸残基のCα-水素の引き抜き、及び引き続くホルミル化と脱炭酸反応とにおいては、触媒が必要である。触媒は、塩基触媒、酸触媒及びフェノール触媒から1種又は複数種が選ばれる。塩基触媒としては、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアミノピリジンDMAPなどの典型的な塩基が挙げられる。また、フェノール触媒は、蟻酸或いはその他のホルミル基含有物質中で塩基触媒として作用すると考えられるが、場合により酸触媒として作用する可能性も考えられる。フェノール触媒の例としては、ペンタフルオロフェノール、p-ニトロフェノールなどが挙げられる。次に、求核基を有する化合物を反応させる。求核基を有する化合物としては、上述項目2-1のC末端選択的修飾法1で述べたものと同様のものを用いることができる。[3.消化]C末端修飾工程に供されて得られたタンパク質は、特定のアミノ酸残基での切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下に供され、C末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る。本発明では、下記のシングルダイジェスチョン及びダブルダイジェスチョンのいずれかによって、所望の消化が行われる。[3-1.シングルダイジェスチョン]シングルダイジェスチョンでは、グルタミン酸及びアスパラギン酸両方のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境を構築する。グルタミン酸及びアスパラギン酸両方のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境としては、リン酸バッファー中にGluCを含む環境が挙げられる。GluCは、より具体的にはStaphylococcusaureusV8由来のものが知られている。この環境において、pHは4~9、好ましくは8~8.5である。シングルダイジェスチョンによって得られる消化物においては、図1に示すように、C末端ペプチド断片がカルボキシル基を有さない点で特徴的であり、その他のペプチド断片がカルボキシル基を有する点と異なる。[3-2.ダブルダイジェスチョン]シングルダイジェスチョンにおけるリン酸バッファー中で作用させるGluCは、基質によっては、アスパラギン酸のC末端における切断がされにくい場合がある。このような場合、ダブルダイジェスチョンを行うことが好ましい。ダブルダイジェスチョンでは、グルタミン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境及びアスパラギン酸のN末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境をそれぞれ構築する。なお、ダブルダイジェスチョンにおいては、それぞれの消化の順番は問わない。グルタミン酸のC末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境としては、重炭酸アンモニウム及び/又は酢酸アンモニウム中にGluCを含む環境が挙げられる。また、シングルダイジェスチョンと同じ環境であることも許容する。アスパラギン酸のN末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境としては、AspNを使用する環境が挙げられる。この環境においては、リン酸バッファーを用いることができ、pHは7.0~8.0である。ダブルダイジェスチョンによって得られる消化物においては、図2に示すように、C末端ペプチド断片がカルボキシル基を有する場合があるが、この場合、C末端ペプチド断片のカルボキシル基がN末端アミノ酸残基の側鎖に存在する点で特徴的であり、他のペプチド断片におけるカルボキシル基がC末端アミノ酸残基に存在する点と異なる。[4.分離]分離工程においては、酸性条件下で、消化物を固相担体に接触させ、その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、C末端ペプチド断片を分離する。固相担体は、酸性条件下でカルボキシル基と共有結合可能な官能基と担体部とを有するものであればよい。酸性条件下でカルボキシル基と共有結合可能な官能基は、より具体的には、酸性条件下において、C末端残基に存在するカルボキシル基と共有結合可能であって、N末端残基に存在するカルボキシル基とは共有結合しない官能基である。例えば、ヒドラジノ基、ヒドロキシアミノ基、アミノ基等によって官能基化された担体を用いることができる。担体部としては特に限定されないが、例えば、ガラスやレジンを用いることができる。より具体的には、シリカゲル、ガラス多孔質ガラス、ポリスチレン、などが挙げられる。分離工程における条件としては、固相担体における官能基とカルボキシル基とが反応可能な酸性条件であればよく、官能基の種類に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、反応系のpHを1~5、好ましくは2~3とすることができる。反応温度は24~80°C、好ましくは40~50°Cであり、反応時間は0.5~5時間、好ましくは0.5~2時間でありうる。消化工程で得られたC末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とは、固相担体への結合能において有効な差を有する。例えば、消化工程におけるシングルダイジェスチョンによって得られた消化物においては、C末端ペプチド断片はカルボキシル基を有さず、その他のペプチド断片はカルボキシル基を有する。固相担体へは、カルボキシル基を有するその他のペプチド断片がカルボキシル基を介して結合し、カルボキシル基を有さないC末端ペプチド断片は結合することなく溶出する。また、消化工程におけるダブルダイジェスチョンによって得られた消化物が、N末端アミノ酸残基の側鎖にカルボキシル基を有するC末端ペプチド断片を含む場合、その他のペプチド断片のみがC末端カルボキシル基を介して結合し、C末端ペプチド断片は、カルボキシル基を有していても結合することなく溶出する。C末端ペプチド断片がカルボキシル基を有しているにも関わらず固相担体に結合しないのは、C末端ペプチド断片が有するカルボキシル基がN末端アミノ酸残基の側鎖に存在しており、この位置におけるカルボキシル基が、その他のペプチド断片がそのC末端に有するカルボキシル基よりも酸性度が高いことに起因する。この高い酸性度のため、固相担体の官能基と反応せず、C末端ペプチド断片は固相担体に結合することなく溶出する。[5.N末端修飾]分離されたC末端ペプチド断片は、そのN末端が修飾されることができる。このN末端修飾が行われる場合を挙げると、本発明に供されるタンパク質のC末端がブロックされていた場合図3や、C末端選択的修飾工程において電荷を有しない基で修飾した場合が挙げられる。N末端修飾法としては、アミノ基を修飾可能な方法を特に限定されることなく、当業者が適宜選択することができるものである。好ましくは、N末端のαアミノ基が選択的に修飾される一方で、側鎖に存在しうるεアミノ基は修飾を受けない方法が用いられる。N末端修飾工程において用いられる修飾試薬は、前述の選択的C末端修飾工程で用いられる修飾試薬における求核基と同様、電荷を有する求核基を有する化合物であることが好ましい。例えば、修飾試薬の例としては、トリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウム酢酸、及びその誘導体が挙げられる。トリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウム酢酸の誘導体としては、トリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウム酢酸のエステル、活性エステル、酸ハロゲン化物、酸無水物、及び酸アジドなどが挙げられる。トリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウム酢酸の活性エステルとしては、トリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウム酢酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルTMPPAcOSu、トリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウム酢酸のスルホスクシンイミジルエステルなどが挙げられる。さらに具体的な修飾試薬の例としては、スクシンイミジルオキシカルボニルメチルトリス2,4,6-トリメトキシフェニルホスホニウムブロミドが挙げられる。図3においては、この求核試薬を用いてN末端修飾が行われた態様を例示している。上記以外にも、修飾試薬として、以下のものを使用してもよい。例えば、5-ブロモニコチン酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルBrNANHS、4-スルホフェニルイソチオシアネートSPITCを用いることができる。[6.質量分析]C末端ペプチド断片は、好ましくはその末端に電荷を有する基で修飾を受けた態様で、質量分析に供される。末端に電荷を有する基で修飾されているC末端ペプチド断片は、末端に付与された電荷によって、質量分析に供された場合に好ましい効果を生じさせる。具体的には、質量分析におけるフラグメンテーションで生じるフラグメントイオンの中で、電荷を有する基を持つイオン種の感度を上げる正電荷を有する場合、或いは下げる負電荷を有する場合ことができる。その結果、観測されるフラグメントイオンの複雑さが減少しアミノ酸配列解析が容易となる。すなわち、C末端ペプチド断片を電荷を有する基で修飾しておくことは、質量分析におけるアミノ酸配列解析を容易にさせる点で好ましい。アミノ酸配列の同定は、ESIElectrosprayIonization法を利用した質量分析装置によるMSMS解析、MALDIMatrixAssistedLaserDesorptionIonization-TOFTimeOfFlight型質量分析装置によるPSDPostSourceDecay解析やCIDCollisionInducedDissociation解析、及びMALDI法を利用した質量分析装置によるMSMS解析などによって行うことができる。以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。本実施例では、CALMBOVIN、CYCCOLLI、TPISRABIT及びGalaninいずれもSigma社製をそれぞれ解析すべきタンパク質として、以下の操作に供した。解析すべきタンパク質0.5ナノモルを定法によりSS結合還元を行い、ヨードアセトアミドでアルキル化した。還元-アルキル化されたタンパク質溶液をアセトン中に加え、タンパク質を沈殿させることによって不要な試薬等を除去した。得られたタンパク質を減圧下乾燥させ、HCOOHAcOHpentafluorophenolを加えてC末端COOH基のみを活性化した。ここにTMPPpropylamineの溶液を加え、活性化されたCOOH基をアミド化した。このようにしてC末端が選択的に修飾されたタンパク質を、アセトン沈殿により精製し、乾燥させた。乾燥させた修飾タンパク質をリン酸バッファーpH8に溶解し、GluCを加えて37°Cで3時間消化を行った。消化物液に10mmolのHClを加えてpH2程度に調整し、予め1mmolのHClで洗浄したSiliaBondTosylHydrazineシリサイクル社製トシルヒドラジノ基で官能基化されたガラスビーズに加えて50°Cで30分反応させた。反応後、上澄みを回収し、さらにHCOOHでガラスビーズを洗浄し、洗浄後の上澄みも回収した。回収した上澄みを併せたものを、質量分析測定によるC末端ペプチド断片の回収の確認、及びMS/MSPSD測定によるdenovo配列解析に供した。なお、CYCCOLLI及びTPISRABITの場合においては、以下のダブルダイジェスチョンをさらに行った。この場合は、GluCでの消化後、AspNを加えて37°Cで3時間消化した。その後の工程は、上記と同様に行った。CALMBOVINから単離されたC末端ペプチド断片Ctermpeptideを検出した質量分析結果を図4に、当該C末端ペプチド断片のPSDによるdenovo配列解析結果を図5に示す。解析された配列は、FVQMMTAK配列番号1である。配列番号1のペプチドはKのεアミノ基がホルミル化formylationされており、且つカルボキシル基がTMPPtrisphosphoniumpropylamido化されている。CYCCOLLIから単離されたC末端ペプチド断片Ctermpeptideを検出した質量分析結果を図6に、当該C末端ペプチド断片のPSDによるdenovo配列解析結果を図7に示す。解析された配列は、DLIAYLKQATAK配列番号2である。配列番号2のペプチドはKのεアミノ基がホルミル化formylationされており、且つカルボキシル基がTMPPtrisphosphoniumpropylamido化されている。TPISRABITから単離されたC末端ペプチド断片Ctermpeptideを検出した質量分析結果を図8に、当該C末端ペプチド断片のPSDによるdenovo配列解析結果を図9に示す。C末端ペプチド断片は、内部アミノ酸残基Kのεアミノ基がホルミル化formylationされているものと、アセチル化されているものとの両方が検出された。配列解析には、ホルミル化されているものを用いた。解析された配列は、DIINAKQ配列番号3である。配列番号3のペプチドはKのεアミノ基がホルミル化formylationされており、C末端アミノ酸残基Qのαカルボキシル基がTMPPtrisphosphoniumpropylamido化されている。Galaninから単離されたC末端ペプチド断片Ctermpeptideを検出した質量分析結果を図10に、当該C末端ペプチド断片のPSDによるdenovo配列解析結果を図11に示す。解析された配列は、KHGLT配列番号4である。配列番号4のペプチドはKのεアミノ基がホルミル化formylationされており、且つαアミノ基がTMPPActrisphosphoniumacetyl化されており、C末端アミノ酸残基Tのカルボキシル基がアミド化されている。この例はC末端がアミド化されたタンパク質のC末端解析例である。"