"リアソータントインフルエンザウイルスを調製する方法であって、該方法は:i培養宿主を、第1のインフルエンザ株および第2のインフルエンザ株に感染させる工程;ii工程iの該培養宿主と、阻害因子とを、接触させる工程であって、ここで該阻害因子は、iの該インフルエンザ株のうちの少なくとも一方のヘマグルチニン遺伝子および/もしくはノイラミニダーゼ遺伝子の転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる、工程;iiiリアソータントウイルスを生成するために、該培養宿主を培養する工程、を包含する、方法。iv工程iiiにおいて得られた前記ウイルスを精製する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。リアソータントインフルエンザウイルスを調製する方法であって、該方法は:i培養宿主を、少なくとも1つの標的セグメントを有する第1のインフルエンザウイルス株に感染させる工程;ii該培養宿主に、第2のインフルエンザウイルス株に由来する標的セグメントをコードする1つ以上の発現構築物を導入する工程;iii該培養宿主と、該第1のインフルエンザ株の標的セグメントの転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる阻害因子とを、接触させる工程;ivリアソータントウイルスを生成するために、該培養宿主を培養する工程;ならびに必要に応じて、v工程ivにおいて得られた該ウイルスを精製する工程、を包含する、方法。a培養宿主を、請求項1に記載の工程iii、請求項2に記載の工程iv、または請求項3に記載の工程ivもしくは工程vにおいて得られた前記ウイルスに感染させる工程;b工程aからの該宿主を培養して、さらなるウイルスを生成する工程;およびc工程bにおいて得られた該ウイルスを精製する工程、をさらに包含する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。インフルエンザウイルスを生成するための方法であって、該方法は:a培養宿主を、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法によって得られたリアソータントインフルエンザウイルスに感染させる工程;b工程aからの該宿主を培養して、該ウイルスを生成する工程;および必要に応じて、c工程bにおいて得られた該ウイルスを精製する工程、を包含する、方法。ワクチンを調製する方法であって、該方法は、a前述の請求項のいずれかに記載の方法によってリアソータントウイルスを調製する工程、およびb該ウイルスからワクチンを調製する工程、を包含する、方法。前記培養宿主は、孵化鶏卵である、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記培養宿主は、哺乳動物細胞である、請求項1~4に記載の方法。前記細胞は、MDCK細胞、Vero細胞もしくはPerC6細胞である、請求項6に記載の方法。前記細胞は、付着して増殖する、請求項7に記載の方法。前記細胞は、懸濁物中で増殖する、請求項7に記載の方法。前記MDCK細胞は、細胞株MDCK33016DSMACC2219である、請求項9に記載の方法。工程bは、前記ウイルスを不活性化する工程を包含する、請求項4~10のいずれか1項に記載の方法。前記ワクチンは、全ビリオンワクチンである、請求項4~11のいずれか1項に記載の方法。前記ワクチンは、スプリットビリオンワクチンである、請求項4~11のいずれか1項に記載の方法。前記ワクチンは、表面抗原ワクチンである、請求項4~11のいずれか1項に記載の方法。前記ワクチンは、ビロソームワクチンである、請求項4~11のいずれか1項に記載の方法。前記ワクチンは、1用量あたり、10ng未満の残留宿主細胞DNAを含む、請求項1~4または6~15のいずれか1項に記載の方法。前記インフルエンザ株のうちの少なくとも1つは、H1サブタイプ、H2サブタイプ、H5サブタイプ、H7サブタイプもしくはH9サブタイプである、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記株のうちの少なくとも1つは、H1N1株、H5N1株、H5N3株、H9N2株、H2N2株、H7N1株もしくはH7N7株である、請求項17に記載の方法。前記インフルエンザ株のうちの1つは、高増殖株である、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記インフルエンザ株は、A/PR/8/34、AA/6/60、AA/1/66、A/Chile/1/83およびA/California/04/09からなる群より選択される、請求項19に記載の方法。発現構築物を含む細胞であって、該発現構築物は:i第1のインフルエンザA型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザB型ウイルスのゲノムの8個のウイルスセグメントすべて;ii第2のインフルエンザA型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザB型ウイルスのゲノムのうちの少なくとも1つの標的セグメントであって、ここで該第2のインフルエンザ株の標的セグメントは、該第1のインフルエンザ株の標的セグメントとは配列において異なる、少なくとも1つの標的セグメント;ならびにiii阻害因子であって、ここで該阻害因子は、該第1のインフルエンザ株における標的セグメントの転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる、阻害因子、をコードする、細胞。好ましい実施形態の要旨本発明者らは、今や、ウイルス生成の間に例えば、RNA阻害を使用することによって上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNA遺伝子の転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させると、リアソータントウイルスが生成される速度を大いに増大させることができるということを、驚くべきことに発見した。上記方法は、抗体の使用に依存しないので、動物由来生成物の使用が回避され得るという利点をさらに有する。さらに、リアソータントウイルスを得るために必要とされる継代がより少ないので、自発的変異の可能性がより低い。本発明は、リアソータントインフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、i培養宿主を、第1のインフルエンザ株および第2のインフルエンザ株に感染させる工程;ii上記工程iの培養宿主と、阻害因子とを接触させる工程であって、ここで該阻害因子は、上記工程iのインフルエンザ株のうちの1つのヘマグルチニン遺伝子および/もしくはノイラミニダーゼ遺伝子の転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる、工程;iiiリアソータントウイルスを生成するために、上記培養宿主を培養する工程、ならびに必要に応じて、iv上記工程iiiにおいて得られたウイルスを精製する工程、を包含する。本発明の方法は、v培養宿主を、上記工程iiiもしくは工程ivにおいて得られたリアソータントウイルスに感染させる工程;vi上記工程vからの宿主を培養して、上記ウイルスをさらに生成する工程;および必要に応じて、vii工程viにおいて得られたウイルスを精製する工程、をさらに包含し得る。本発明は、リアソータントインフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、i培養宿主を、少なくとも1つの標的セグメントを有する第1のインフルエンザウイルス株に感染させる工程;ii上記培養宿主に、第2のインフルエンザウイルス株に由来する標的セグメントをコードする1つ以上の発現構築物を導入する工程;iii上記培養宿主と、上記第1のインフルエンザ株の標的セグメントの転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる阻害因子とを、接触させる工程;ivリアソータントウイルスを生成するために、上記培養宿主を培養する工程;および必要に応じて、v上記工程ivにおいて得られたウイルスを精製する工程、を包含する。本発明は、発現構築物を含む細胞を提供し、上記発現構築物は、i第1のインフルエンザA型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザB型ウイルスのゲノムのうちの8つのウイルスセグメントすべて;ii第2のインフルエンザA型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザB型ウイルスのゲノムのうちの少なくとも1つの標的セグメントであって、ここで上記第2のインフルエンザ株の標的セグメントは、上記第1のインフルエンザ株の標的セグメントとは配列において異なる、少なくとも1つの標的セグメント;ならびにiii阻害因子であって、ここで上記阻害因子は、上記第1のインフルエンザ株における標的セグメントの転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる、阻害因子、をコードする。本発明はまた、リアソータントインフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、リアソータントウイルスを生成するために、この細胞を培養する工程を包含する。上記方法は、培養宿主を、上記細胞から得られたリアソータントウイルスに感染させる工程、次いで、上記宿主を培養して、さらなるウイルスを生成する工程、および次いで、必要に応じて、このようにして得られた上記さらなるウイルスを精製する工程、をさらに包含する。本発明はまた、インフルエンザウイルスを生成するための方法を提供し、上記方法は、a培養宿主を、本発明の方法によって得られたリアソータントウイルスに感染させる工程;b上記工程aからの宿主を培養して、上記ウイルスを生成する工程;および必要に応じて、c上記工程bにおいて得られたウイルスを精製する工程、を包含する。本発明はまた、ワクチンを調製するための方法を提供し、上記方法は、d上記実施形態のうちのいずれか1つの方法によって、ウイルスを調製する工程、およびe上記ウイルスからワクチンを調製する工程、を包含する。インフルエンザ株インフルエンザウイルスは、セグメント化マイナス鎖RNAウイルスである。インフルエンザA型ウイルスおよびインフルエンザB型ウイルスは、8つのセグメントPB2、PB1、PA、HA、NP、NA、MおよびNSを有するのに対して、インフルエンザC型ウイルスは、7つのセグメントを有するNAセグメントはない。上記ウイルスは、ゲノム複製を開始するには、少なくとも4つのウイルスタンパク質PB1、PB2、PAおよびヌクレオタンパク質の存在を必要とする。本発明の方法は、インフルエンザバックボーン株およびワクチン株を使用する。上記使用されるバックボーン株およびワクチン株は、通常、以下に記載されるように、阻害因子によって差次的に阻害され得る1つ以上の例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つもしくは8つのウイルスセグメントにおいて異なる。上記バックボーン株は、所望のセグメントについて上記ワクチン株よりも多く阻害され、従って、リアソータント株の生成が好都合である。上記ワクチン株は、汎流行性でありかつ汎流行性間期の流行期seasonalインフルエンザ株であり得る。上記ワクチン株は、インフルエンザA型ウイルスのHAサブタイプH1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15もしくはH16を含み得る。上記ワクチン株は、インフルエンザA型ウイルスNAサブタイプN1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8もしくはN9を含み得る。上記ワクチン株が、流行期インフルエンザ株である場合、上記ワクチン株は、H1もしくはH3サブタイプを有し得る。本発明の一局面において、上記ワクチン株は、H1N1株もしくはH3N2株である。上記ワクチン株はまた、汎流行性の株もしくは潜在的に汎流行性の株であり得る。汎流行性のアウトブレイクを引き起こす可能性を与えるインフルエンザ株の特徴は、以下である:a現在循環しているヒト株におけるヘマグルチニンと比較して、新たなヘマグルチニンを含むすなわち、10年を超えてヒト集団において顕性でなかったもの例えば、H2、または上記ヒト集団において以前に全く認められなかったもの例えば、一般に、トリ集団においてのみ見いだされてきたH5、H6もしくはH9。その結果、上記ヒト集団は、上記株のヘマグルチニンに対して免疫学的にナイーブである;b上記ヒト集団において水平伝播し得る;およびcヒトに対して病原性である。H5ヘマグルチニンタイプを有するワクチン株は、好ましい。ここで上記リアソータントウイルスは、汎流行性インフルエンザ例えば、H5N1株に対して免疫化するためのワクチンにおいて使用される。他の考えられる株としては、H5N3、H9N2、H2N2、H7N1およびH7N7、ならびに任意の他の潜在的に出現する汎流行性株が挙げられる。本発明は、非ヒト動物集団からヒトへと拡がり得るかもしくは拡がってしまった潜在的汎流行性株例えば、ブタ起源のH1N1インフルエンザ株に対して防御するためのワクチンにおける使用のために、リアソータントウイルスを生成するのに特に適している。上記バックボーン株は、任意の公知のインフルエンザウイルス株であり得るが、上記バックボーン株が細胞および/もしくは卵の尿膜腔液において迅速に増殖するインフルエンザウイルス株であることは好ましい。これは、ワクチン生成のために迅速に増殖するインフルエンザウイルスを得るために、リアソータントインフルエンザウイルスがしばしば生成されるので、好ましい。このようなバックボーン株の例としては、A/PuertoRico/8/34、A/AnnArbor/6/60およびB/AnnArbor/1/66が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って生成されるリアソータントインフルエンザA型ウイルスは、A/PR/8/34ウイルスに由来する1つ以上のRNAセグメント代表的には、A/PR/8/34に由来する6つのセグメントであり、上記HAおよびNAセグメントは、ワクチン株由来であるすなわち、6:2リアソータントを含み得る。上記リアソータントインフルエンザA型ウイルスはまた、ワクチン調製のために、A/WSN/33ウイルスもしくはリアソータントウイルスを生成するために有用な任意の他のウイルス株に由来する1つ以上のRNAセグメントを含み得る。リアソータントインフルエンザA型ウイルスは、AA/6/60インフルエンザウイルスA/AnnArbor/6/60に由来する6つより少ないすなわち、1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのウイルスセグメントを含み得る。リアソータントインフルエンザB型ウイルスは、AA/1/66インフルエンザウイルスB/AnnArbor/1/66に由来する6つより少ないすなわち、1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つのウイルスセグメントを含み得る。本発明のリアソータントインフルエンザ株は、A/California/4/09株に由来する1つ以上のゲノムセグメント、好ましくは、上記HAセグメントおよび/もしくは上記NAセグメントなぜなら、これらは、主要なワクチン抗原であるからであるを含み得る。従って、例えば、上記HA遺伝子セグメントは、配列番号8より、配列番号7に密に関連しているすなわち、同じアルゴリズムおよびパラメーターを使用して、配列番号7と比較した場合に、配列番号8よりも高い程度の配列同一性を有するH1ヘマグルチニンをコードし得る。配列番号7および配列番号8は、80同一である。同様に、上記NA遺伝子は、配列番号10よりも配列番号9に密に関連するN1ノイラミニダーゼをコードし得る。配列番号9および配列番号10は、82同一である。リアソータントインフルエンザB型ウイルスはまた、生成され得る。インフルエンザB型ウイルスは、異なるHAサブタイプを現在示さないが、2つの別個の系統に入る:B/Victoria/2/87様およびB/Yamagata/16/88様。これら系統は、1980年代後期に出現した。そしてこれら系統は、互いに抗原的におよび/もしくは遺伝的に区別され得るHAを有する[1]。本発明のリアソータントインフルエンザB型株は、B/Victoria/2/87様株もしくはB/Yamagata/16/88様株に由来するHAを含み得る。A/PR/8/34株、A/AA/6/60株、B/AA/1/66株、およびA/California/04/09株に由来するウイルスセグメントおよび配列は、広く入手可能である。それらの配列は、公のデータベース上で入手可能である例えば、GI:89779337、GI:89779334、GI:89779332、GI:89779320、GI:89779327、GI:89779325、GI:89779322、GI:89779329配列番号1~6もまた参照のこと。バックボーン株の選択は、一緒に使用される上記ワクチン株に依存し得る。一般に、そのHAセグメントおよび/もしくはNAセグメントが、核酸レベルもしくはアミノ酸レベルでより高い程度の同一性を示さない株を選択することは望ましい。なぜなら、このことは、上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNAセグメントの転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる阻害因子を見いだすことをより容易にし得るからである。例えば、同一性の程度は、99未満、95未満、90未満、85未満、80未満もしくは75未満であり得る。上記バックボーン株および上記ワクチン株のHAおよび/もしくはNAウイルスセグメントは、異なるサブタイプであり得る。例えば、H3N2株がワクチン株として使用される場合、H1N1サブタイプを有するバックボーン株例えば、A/PR/8/34が、使用され得るか、逆もまた同様である。しかし、本発明の方法において同じHAおよび/もしくはNAサブタイプを有するバックボーン株およびワクチン株例えば、H1ワクチン株およびH1バックボーン株を使用することもまた可能であるが、ただし上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNA遺伝子の転写および/もしくは翻訳は、優先的に低下させられ得る。阻害因子本発明において使用するのに適した阻害因子は、上記ワクチン株のHAおよび/もしくはNA遺伝子と比較して、上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNA遺伝子の転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させ得るものである。転写レベルもしくは翻訳レベルのいずれかにおける上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNAタンパク質レベルの優先的な低下は、リアソータントインフルエンザウイルスの形成に好都合である。なぜなら、その可能性は、それらの相対的な存在量が増大するにつれて、上記ワクチン株のHAおよび/もしくはNAタンパク質が組み込まれることを増大させるからである。上記阻害因子が転写インヒビターである場合、上記阻害因子は、少なくともx5例えば、x10、x20、x30、x40だけ上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNA遺伝子の転写を低下させる場合に、転写を優先的に低下させるとみなされるが、ただし、上記阻害因子は、上記ワクチン株のHAおよび/もしくはNA遺伝子の転写を、x以下例えば、x-5、x-10、x-20、x-30もしくはx-40だけ低下させる。ここで上記低下は、上記阻害因子で処理しなかったコントロールサンプルと比較して測定される。この状況において、xは、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95もしくは99であり得る。従って、例えば、上記バックボーン株のHA遺伝子の転写が30だけ低下させられる場合、上記ワクチン株のHAの転写は、最大25だけ低下させられるべきである。上記阻害因子による上記遺伝子の転写低下を測定するための適した方法は、当業者には明らかである。例えば、2つの別個の細胞培養物が、上記目的のインフルエンザウイルスに感染させられ得る。上記感染させた培養物のうちの一方は、上記目的の阻害因子と接触させられると同時に、他方の感染させた培養物は、処理されないか、または上記培養物が感染させられた上記インフルエンザウイルスのHAおよび/もしくはNA遺伝子の転写を低下させないことが公知の物質例えば、リン酸緩衝化生理食塩水PBSもしくは関連しない遺伝子に対して特異性を有する阻害因子で処理される。次いで、RNAは、両方のサンプルから単離され得、cDNAは、上記単離されたRNAから転写され得、リアルタイムPCRが、上記両方のサンプルに由来するcDNAで、上記阻害因子の存在下および非存在下で上記HAおよび/もしくはNA遺伝子の発現レベルと比較するために、上記遺伝子に特異的なプライマーを使用して行われ得る。翻訳インヒビターは、上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNAタンパク質レベルを、少なくともy5例えば、x10、x20、x30、x40だけ低下させる場合に、上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNA遺伝子の翻訳を優先的に低下させるとみなされるが、ただし、上記阻害因子は、上記ワクチン株のHAおよび/もしくはNA遺伝子の転写を、y以下例えば、x-5、x-10、x-20、x-30もしくはx-40だけ低下させる。ここで上記低下は、上記阻害因子で処置しなかったコントロールサンプルとの比較において、測定される。この状況において、yは、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95もしくは99であり得る。従って、例えば、上記バックボーン株のHA遺伝子の翻訳が、30だけ低下させられる場合、上記ワクチン株のHAの転写は、最大25だけ低下させられるべきである。上記HAおよび/もしくはNA遺伝子の翻訳の低下を測定するために適した方法は、当業者に明らかである。例えば、2つの別個の細胞培養物は、上記インフルエンザウイルスに感染させられ得る。上記感染させた培養物のうちの一方は、上記目的の阻害因子と接触させられると同時に、他方の感染させた培養物は、処理されないか、または上記培養物が感染させられた上記インフルエンザウイルスのHAおよび/もしくはNAタンパク質の翻訳を阻害しないことが公知の物質例えば、PBSもしくは関連しない遺伝子に対して特異性を有する阻害因子で処理されるかのいずれかである。タンパク質は、両方のサンプルから単離され得、上記HAおよび/もしくはNAタンパク質のタンパク質レベルは、分析され得、そして定量的ウェスタンブロット分析によって比較される例えば、参考文献2の第57章を参照のこと。1つより多くのバックボーン株が、本発明の方法において使用される場合、阻害因子は、上記使用されるバックボーン株のうちの少なくとも1つのHAおよび/もしくはNA遺伝子の転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる場合に、適切である。インフルエンザウイルスが、本発明に従って再集合されるたびに上記阻害因子の適切さを試験することは一般には必要ではない。なぜなら、再集合のために使用されるバックボーン株は、種々の異なるワクチン株に使用され得るからである。従って、いったん特定のバックボーン株に適した阻害因子が同定されたら、その特定のバックボーン株が使用されるすべての方法に関して同じ因子を使用することは可能であり、上記阻害因子が、上記使用されるワクチン株の上記HAおよび/もしくはNA遺伝子と比較して、上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNA遺伝子の転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させることを確認することのみが必要である。適切な阻害因子は、当業者に公知であり、短い干渉RNAsiRNA、二本鎖RNAdsRNA、マイクロRNAmiRNA、短いヘアピンRNAshRNA、または低分子干渉DNAsiDNAs様の例えば、ホスホロチオエートオリゴマーPSOもしくはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーPMOが挙げられるが、これらに限定されない。短い干渉RNAsiRNAは、本発明の方法における使用に特に適している。これは、それらが迅速にかつ安価に合成され得、かつ高い特異性で遺伝子の発現を抑制し得ることが理由である。上記標的配列とオフ標的off-target配列との間の単一ヌクレオチドの差異すら、上記標的配列の特異的サイレンシングを達成し得る[3]。卵におけるsiRNAの使用は、例えば、参考文献4に記載された。目的の遺伝子を特異的にサイレンシングするsiRNAを設計するための方法は、当業者に公知である。例えば、遺伝子特異的siRNAの設計を可能にする種々のプログラムが利用可能である[5,6]。本発明における使用のためのこのようなsiRNAの例は、表1に示される。表1中のsiRNA配列HA1-HA24およびNA1-NA24は、A/Perth/16/09の存在下でA/PR/8/34のHAおよびNAを差次的に阻害するように設計された。本発明の方法におけるsiDNAの使用もまた、好ましい。これらは、上記標的配列に対する匹敵する特異性を示すなお示すと同時に、合成しやすく、より安定で、かつ上記細胞によってより容易に取り込まれ、siRNAより早く作用するという利点を有する[7]。上記siRNAおよびsiDNAの使用は、上記バックボーン株および上記ワクチン株が、上記HAおよび/もしくはNA遺伝子をコードするそれらのウイルスセグメントにおいて高い程度の同一性を有する場合に、例えば、それらが同じインフルエンザウイルスサブタイプに由来する場合に、特に有利である。なぜなら、これらインヒビターは、高い配列特異性を示すことが公知であるからである。上記ワクチン株のHAおよび/もしくはNAタンパク質レベルと比較して、上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNAタンパク質レベルの優先的な低下を達成するために、上記siRNAおよび/もしくはsiDNAは、これらが上記バックボーン株および上記ワクチン株に由来する上記HAおよび/もしくはNA遺伝子の間の配列バリエーションの領域を標的とするように、設計され得る。配列バリエーションの領域は、2つの株に由来する配列を整列させることによって決定され得る。siDNAの具体例は、PMOである。これらは、リボソーム開始複合体の、5’キャップから開始コドンへの進行を干渉し得る翻訳開始部位に結合するように通常は設計される合成アンチセンスオリゴマーである。上記PMOの利点は、これらがRNAもしくはさらにはDNAと比較して、より安定であることである[8]。PMOを設計するための方法は、当該分野で公知である[9]。他の適切な阻害因子は、PSOである。これらは、酸素原子が、上記DNAのオリゴホスフェートバックボーンにおいて非架橋硫黄によって置換される合成オリゴマーである。PSOは、非改変DNAオリゴマーおよびRNAオリゴマーと比較して、より安定であるので有利である。shRNAが使用される場合、これらは、通常、上記shRNAを発現し得るDNA発現構築物として、上記培養宿主に導入される。これらshRNA発現構築物は、代表的には、siRNA分子をコードする配列および同じDNA鎖上で短いリンカー配列によって分離された上記siRNA分子の逆相補配列reversedcomplementarysequenceを含む。上記siRNA配列は、上記で記載されるように設計され得、いったん上記siRNA配列が既知になれば、逆相補配列を同定することは、当業者の手段内である。本発明における使用に適したshRNAをコードするDNA配列の例は、表2に示される。この表中の配列は、例示的リンカー配列としてGGGGGGGを利用するが、当業者は、これを他の適切な配列で容易に置換し得る。本発明の方法において1つより多い種の阻害因子を使用することもまた、想定される。上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNA遺伝子に対して特異性を有する阻害因子に加えて、もしくはその代わりに、さらなる阻害因子を使用することもまた、本発明の範囲内である。例えば、上記ワクチン株のバックボーンセグメントのうちの1種以上の転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させ得る1種以上の阻害因子を添加することは可能である。これは、所望のリアソータントウイルスを形成する可能性が、さらに増大されるという利点を有する。適切な阻害因子は、上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNA遺伝子の転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる阻害因子について、必要な変更を加えて上記と同じ手段によって同定され得る。上記阻害因子は、当業者に公知の任意の手段によって、上記細胞培養物もしくは上記卵尿膜腔液中の個々の細胞に導入され得る。例えば、上記阻害因子は、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、マイクロインジェクション、もしくは微粒子銃microparticle-bombardmentによって導入され得る。上記リアソータントウイルスが細胞培養物中で生成される場合、上記阻害因子をコードする1つ以上の発現構築物で安定したトランスフェクトされた細胞を使用することは、可能である。これは、同じ細胞株が、特定のバックボーン株が使用されるたびに使用され得るという利点を有し、従って、本発明の方法が実施されるたびに阻害因子を別個に導入する必要性を排除する。上記1種以上の阻害因子は、上記インフルエンザウイルスでの感染の前、その間もしくはその後に、上記宿主細胞もしくは尿膜腔液へと導入され得る。ウイルス再集合リアソータントインフルエンザウイルスは、培養宿主通常は、細胞培養物もしくは卵を、バックボーン株およびワクチン株に共感染させることによって頻繁に生成される。リアソータントウイルスは、上記ワクチン株のHAおよび/もしくはNAタンパク質を含むリアソータントウイルスを選択するために、上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNAタンパク質に対して特異性を有する抗体を添加することによって、選択される。この処理の数回の継代にわたって、上記ワクチン株のHAおよび/もしくはNAセグメントを含む、迅速に増殖するリアソータントウイルスが選択され得る。2種、3種もしくはそれより多い異なるインフルエンザ株の間のリアソータントインフルエンザウイルスが、生成され得る。上記生成されるリアソータントウイルスは、上記バックボーン株に由来する少なくとも1種すなわち、1つ、2つ、3つ、4つ、5つもしくは6つのバックボーンウイルスセグメントを含む。上記バックボーンウイルスセグメントは、HAもNAもコードしないものである。従って、バックボーンセグメントは、代表的には、上記インフルエンザウイルスのPB1、PB2、PA、NP、M1、M2、NS1およびNS2ポリペプチドをコードする。上記リアソータントウイルスは、代表的には、たとえ、上記バックボーン株に由来する上記HAもしくは上記NAのいずれかしかし両方ではないを含むリアソータントウイルスがまた、想定されるとしても、上記バックボーン株に由来するHAおよびNAをコードするセグメントを含まない。上記リアソータントウイルスが、2つのインフルエンザ株の間のリアソータントである場合、上記リアソータントウイルスは、一般に、1:7、2:6、3:5、4:4、5:3、6:2もしくは7:1の比において、上記バックボーン株および上記ワクチン株に由来するセグメントを含む。上記バックボーン株に由来する大部分のセグメントを、特に、6:2の比率で有することは、代表的である。本発明のリアソータントウイルスが、3つの株のリアソータントである場合、上記リアソータントウイルスは、一般に、1:1:6、1:2:5、1:3:4、1:4:3、1:5:2、1:6:1、2:1:5、2:2:4、2:3:3、2:4:2、2:5:1、3:1:2、3:2:1、4:1:3、4:2:2、4:3:1、5:1:2、5:2:1もしくは6:1:1の比率において、上記バックボーン株、上記ワクチン株および第3の株に由来するセグメントを含む。例えば、上記リアソータントインフルエンザ株は、1つより多くのバックボーン株および/もしくは1つより多くのワクチン株に由来するウイルスセグメントを含み得る。本発明の方法において使用される上記第2のインフルエンザ株は、それらのウイルスセグメントのうちの1つ以上例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、もしくは8つが異なることを意味する上記第1のインフルエンザ株に対して異なる。逆遺伝学本発明は、通常、伝統的な再集合技術の状況において適用されるが、また、逆遺伝学RGシステムにおいて、もしくは伝統的な再集合技術およびRGシステムの組み合わせにおいて、使用され得る。いくつかのRGシステムでの問題は、必要とされる発現構築物を培養宿主の中に導入しがたい可能性があることである例えば、トランスフェクション効率の低さに起因する。このことは、上記RGシステムを非効率的にし得る。本発明は、上記リアソータントインフルエンザウイルスの上記ウイルスセグメントのうちのいくつかが、上記培養宿主をインフルエンザウイルスに感染させることによって提供される方法を提供すると同時に、他は、1種以上の発現構築物上で提供されることによって、この問題を克服する。本発明の方法において、培養宿主は、8つのゲノムセグメントそのうち、少なくとも1つ例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つが標的セグメントであるを有する第1のインフルエンザA型株もしくはB型株に感染させられる。上記第1のインフルエンザ株に由来する標的セグメントは、本発明の方法に従って生成されるリアソータントインフルエンザウイルスにおいて存在しないウイルスセグメントである。上記第2のインフルエンザウイルス株の標的セグメントは、1種以上の発現構築物に導入される。上記第2のインフルエンザ株の標的セグメントは、本発明の方法に従って生成されるリアソータントインフルエンザウイルスに存在するそれらのセグメントである。上記第1のインフルエンザ株の標的セグメントの転写および/もしくは翻訳は、上記阻害因子によって優先的に低下させられる。代表的には、上記第1のインフルエンザ株は、1つもしくは2つの標的セグメント通常は、HAおよび/もしくはNAを有し、よって、上記第2のインフルエンザ株に由来する1つもしくは2つの標的セグメントは、1種以上の発現構築物に導入される。上記阻害因子は、上記第2のインフルエンザ株のセグメントと同じ構築物もしくは異なる構築物上にコードされ得る。例えば、上記ワクチン株のHAセグメントが上記培養宿主の中に発現構築物上で導入され、かつ上記培養宿主が上記バックボーン株に感染させられる場合、上記阻害因子は、上記バックボーン株のHAセグメントに対して特異的である。同様に、上記ワクチン株のNAが、上記1種以上の発現構築物上で導入される場合、上記阻害因子は、上記バックボーン株のNAセグメントに対して特異的である、上記HAおよびNAセグメントがともに、上記1種以上の発現構築物上で導入される場合、上記阻害因子は、上記バックボーン株のHAおよびNAセグメントに対して特異的である。上記標的セグメントは、代表的には、HAおよび/もしくはNAである。上記1種以上の発現構築物上で導入されるウイルスセグメントは、上記ワクチン株のHAおよび/もしくはNAセグメントであり得る一方で、上記バックボーンセグメントは、上記培養宿主を感染させるために使用されるインフルエンザウイルスによって提供される。この実施形態において、上記培養宿主は、上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNAセグメントの転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる阻害因子と接触させられ得る。上記発現構築物上の1つ以上のバックボーンセグメントを提供することもまた可能である。上記第1および上記第2のインフルエンザウイルスは、異なる。さらに、本発明の方法において、i上記培養宿主を、ウイルスに感染させる工程、ii上記1種以上の発現構築物を上記培養宿主の中に導入する工程、およびiii上記培養宿主と、阻害因子とを接触させる工程は、任意の順序において行われ得る。さらに、大部分のRGシステムが、バックボーン株のセグメントの容易な省略を可能にするが、他のシステムにおいて、これは、それほど容易ではない。例えば、いくつかのRGシステムは、第1のプラスミド上で6つのウイルスセグメントを、加えて、第2のプラスミドの上で上記HAおよびNA遺伝子をコードする。従って、上記第1のプラスミドのセグメントのうちの1つが置換されるリアソータント株を作ることは、煩わしいことであり得るが、本発明は、この課題を克服する。例えば、第1の株をコードするRGシステムは、第2の株に由来するセグメントをコードし、また、上記第1の株に関する対応するセグメントを阻害するように改変され得、それによって、上記第2の株に関するこのセグメントが、上記第1の株のセグメントを置換するリアソータントを提供する。従って、本発明は、発現構築物を含む細胞を提供し、上記発現構築物は、i第1のインフルエンザA型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザB型ウイルスのゲノムの8つすべてのゲノムセグメント;ii第2のインフルエンザA型ウイルスのゲノムもしくはインフルエンザB型ウイルスのゲノムのうちの少なくとも1つの標的セグメントであって、ここで上記第2のインフルエンザ株の標的セグメントは、上記第1のインフルエンザ株の標的セグメントとは配列において異なる、少なくとも1つの標的セグメント;ならびにiii阻害因子であって、上記阻害因子は、上記第1のインフルエンザ株における標的セグメントの転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる、阻害因子、をコードする。上記標的セグメントは、代表的には、HAおよび/もしくはNAを含む。例えば、上記細胞は、発現構築物を含み得、上記発現構築物は、iバックボーン株の8つすべてのセグメント;iiワクチン株インフルエンザのうちの少なくともHAセグメントであって、ここで上記ワクチン株のHAセグメントは、上記バックボーン株のHAセグメントとは配列において異なる、少なくともHAセグメント;およびiii阻害因子であって、ここで上記阻害因子は、上記バックボーン株のHAセグメントの転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させる、阻害因子、をコードする。上記細胞は、バックボーン株およびワクチン株のセグメントのリアソータント混合物を含むインフルエンザウイルスを生成し得る。上記細胞によって生成されるウイルスは、本明細書で記載されるように、ワクチン製造に使用され得る。上記バックボーン株のセグメントは、代表的には、上記ワクチン株のセグメントとは異なる発現構築物上でコードされる。上記阻害因子は、上記ワクチン株のセグメントと同じ構築物もしくは異なる構築物上でコードされ得る。例えば、第1の構築物は、インフルエンザウイルスの8つすべてのセグメントをコードし得る。ワクチン株のHAおよびNAセグメントをコードしかつ上記バックボーン株のHAおよびNAセグメントのインヒビターもコードする第2の構築物が、添加され得る。ウイルスRNAvRNA分子は、例えば、polIプロモーター、細菌RNAポリメラーゼプロモーター、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターなどの制御下で、構築物において発現され得る。特定のタンパク質が、感染性ウイルスを形成するために必要とされる場合に、上記RGシステムは、これらタンパク質を提供し得る。例えば、上記システムは、DNAの両方のタイプの発現が、完全な感染性ウイルスのアセンブリをもたらすように、ウイルスタンパク質をコードするDNA分子をさらに含む。培養宿主本発明の方法において使用するための培養宿主は、孵化鶏卵もしくは細胞であり得る。インフルエンザウイルス増殖のための現在標準的な方法は、特定病原体除去specificpathogen-freeSPF孵化鶏卵を使用し、ウイルスは、上記卵の内容物尿膜腔液から精製される。しかし、より最近になって、ウイルスは、速度および患者のアレルギーという理由から、動物細胞培養物中で増殖させられ、この増殖法が好ましい。卵ベースのウイルス増殖が使用される場合、1個以上のアミノ酸が、上記ウイルスと一緒に、上記卵の尿膜腔液の中に導入され得る[10]。細胞が使用される場合、本発明は、代表的には、細胞株を使用するが、例えば、初代細胞が、代替として使用されてもよい。上記細胞は、代表的には、哺乳動物のものである。適切な哺乳動物起源細胞としては、ハムスター、ウシ、霊長類ヒトおよびサルを含むおよびイヌの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。種々の細胞タイプが使用され得る例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など。適切なハムスター細胞の例は、名称BHK21もしくはHKCCを有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞例えば、Vero細胞株のような腎臓細胞である[11~13]。適切なイヌ細胞は、例えば、CLDKおよびMDCK細胞株のような腎臓細胞である。従って、適切な細胞株としては、MDCK;CHO;293T;BHK;Vero;MRC-5;PER.C6;WI-38などが挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるための好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる:メイディンダービーイヌ腎臓由来に由来するMDCK細胞[14~17];アフリカミドリザルCercopithecusaethiops腎臓に由来するVero細胞[18~20];もしくはヒト胚性網膜芽細胞に由来するPER.C6細胞[21]。これら細胞株は、広く入手可能である例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションATCCから[22]、CoriellCellRepositories[23]から、もしくはEuropeanCollectionofCellCulturesECACCから。例えば、上記ATCCは、カタログ番号CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586およびCRL-1587の下で種々の異なるVero細胞を供給し、カタログ番号CCL-34の下でMDCK細胞を供給する。PER.C6は、寄託番号96022940の下でECACCから入手可能である。哺乳動物細胞株の余り好ましくない代替として、ウイルスは、トリ細胞株[例えば、参考文献24~26]アヒル例えば、アヒル網膜もしくはニワトリに由来する細胞株例えば、ニワトリ胚性線維芽細胞CEFなどが挙げられるで増殖させられ得る。例としては、トリ胚性幹細胞[24,27]ニワトリ胚性幹細胞に由来するEBx細胞株、EB45、EB14、およびEB14-074が挙げられる[28]が挙げられる。本発明における使用に好ましい細胞は、メイディンダービーイヌ腎臓細胞に由来するMDCK細胞[29~31]である。元々のMDCK細胞は、CCL-34としてATCCから入手可能である。MDCK細胞の派生物もまた、使用され得る。例えば、参考文献14は、懸濁培養における増殖に適合されたMDCK細胞株DSMACC2219として寄託されたMDCK33016を開示する。同様に、参考文献32は、無血清培養において懸濁物中で増殖するMDCK由来細胞株FERMBP-7449として寄託されたB-702を開示する。参考文献33は、非腫瘍形成性MDCK細胞MDCK-SATCCPTA-6500、MDCK-SF101ATCCPTA-6501、MDCK-SF102ATCCPTA-6502およびMDCK-SF103PTA-6503が挙げられるを開示する。参考文献34は、感染に対して高い感受性を有するMDCK細胞株MDCK.5F1細胞ATCCCRL-12042が挙げられるを開示する。これらMDCK細胞株のうちのいずれかが、使用され得る。細胞株例えば、MDCK細胞での増殖のために、ウイルスは、懸濁物中[14,35,36]もしくは接着培養において細胞で増殖させられ得る。懸濁培養のための1つの適切なMDCK細胞株は、MDCK33016DSMACC2219として寄託である。代替として、マイクロキャリア培養が使用され得る。インフルエンザウイルス複製を支援する細胞株は、好ましくは、無血清培養培地および/もしくは無タンパク質protein-free培地中で増殖させられる。培地は、ヒトもしくは動物起源の血清に由来する添加物が含まれなければ、本発明の状況において、無血清培地として言及される。無タンパク質は、上記細胞の増殖が、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除して生じる培養物を意味することが理解されるが、必要に応じて、ウイルス増殖に必要であり得るタンパク質例えば、トリプシンもしくは他のプロテアーゼを含み得る。このような培養において増殖している細胞は、天然には、タンパク質自体を含む。インフルエンザウイルス複製を支持する細胞株は、好ましくは、例えば、ウイルス複製の間に、37°C未満[37]例えば、30~36°C、または約30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°Cにおいて増殖させられる。ウイルスが細胞株で増殖させられる場合、増殖培養物、同様に、培養を開始するために使用されるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、RSウイルス、パラインフルエンザウイルス3、SARSコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および/もしくはパルボウイルスが存在しないすなわち、これらによる夾雑について試験されたか、これらによる夾雑についてネガティブな結果を与えない[38]。ウイルスが哺乳動物細胞株で増殖させられる場合、上記組成物は、有利には、卵タンパク質例えば、オボアルブミンおよびオボムコイドおよびニワトリDNAを含まず、それによって、アレルギー性が低下させられる。アレルゲンの回避は、Th2応答を最小化するために有用である。ウイルス調製さらなる局面において、本発明は、インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供する。細胞が、本発明の方法において培養宿主として使用される場合、細胞培養条件例えば、温度、細胞密度、pH値などが、使用される上記細胞株および上記インフルエンザウイルス株に依存する広い範囲にわたって変動性であり、本願の要件に適合され得ることは公知である。従って、以下の情報は、ガイドラインを表すに過ぎない。細胞は、好ましくは、無血清培地もしくは無タンパク質培地中で培養される。上記細胞の増殖は、当業者に公知の方法に従って行われ得る。例えば、上記細胞は、遠心分離もしくは濾過のような通常の補助的方法を使用する灌流システムにおいて培養され得る。さらに、上記細胞は、感染前に、流加システムfed-batchsystemで、本発明に従って増殖させられ得る。本発明の状況において、培養システムは、上記細胞が最初にバッチシステムで培養され、培地中の栄養分もしくは栄養分の一部の枯渇が、濃縮された栄養分の制御された供給によって補償される流加システムに関して言及される。感染前の細胞の増殖の間に上記培地のpH値を、pH6.6~pH7.8の値に、および特に、pH7.2~pH7.3の間の値に調節することは、有利であり得る。細胞の培養は、好ましくは、30°C~40°Cの間の温度で行われる。上記インフルエンザウイルスでの感染後、上記細胞は、好ましくは、30°C~36°Cの間の温度もしくは32°C~34°Cの間の温度、または約33°Cで培養される。これは、特に好ましい。なぜなら、この温度範囲での感染細胞のインキュベーションが、ワクチンへと処方される場合に改善された効率を生じるウイルスの生成を生じることが示されたからである[39]。酸素分圧は、感染前の培養の間に、好ましくは、25~95の間の値において、および特には、35~60の間の値において調節され得る。本発明の状況において示される酸素分圧の値は、空気の飽和に基づく。細胞の感染は、バッチシステムにおいては、好ましくは、約8~25×105細胞/mLの細胞密度で、もしくは灌流システムにおいては、好ましくは、約5~20×106細胞/mLの細胞密度で行われる。上記細胞は、10-8~10の間、好ましくは、0.0001~0.5の間のウイルス用量MOI値感染多重度;感染時の細胞あたりのウイルス単位の数に対応するで感染させられ得る。ウイルスは、接着培養もしくは懸濁物中で、細胞において増殖させられ得る。マイクロキャリア培養が使用され得る。上記細胞はまた、懸濁物中での増殖に適合され得る。本発明に従う方法は、ウイルスの採取および単離、またはウイルスによって生成されるタンパク質の採取および単離を含み得る。ウイルスもしくはタンパク質の単離の間に、上記細胞は、分離、濾過もしくは限外濾過のような標準的な方法によって培養培地から分離される。次いで、上記ウイルスもしくは上記タンパク質は、勾配遠心分離、濾過、沈殿、クロマトグラフィーなどの当業者に十分公知の方法に従って濃縮され、次いで、精製される。上記ウイルスが精製の間もしくは精製後に不活性化されることは好ましい。ウイルス不活性化は、上記精製プロセス内のいずれかの時点で、例えば、β-プロピオラクトンもしくはホルムアルデヒドによって行われ得る。ワクチン本発明は、上記方法に従って生成されるウイルスを利用して、ワクチンを生成する。インフルエンザワクチンは、一般に、生のウイルスもしくは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。不活性化ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、もしくは精製表面抗原に基づき得る。抗原はまた、ビロソームの形態で提示され得る。本発明は、これらタイプのワクチンのうちのいずれかを製造するために使用され得る。不活性化インフルエンザウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、もしくは精製表面抗原ヘマグルチニンを含み、通常はまた、ノイラミニダーゼを含むを含み得る。ウイルスを不活性化するための化学的手段としては、以下の薬剤のうちの1つ以上の有効量での処理が挙げられる:洗剤、ホルムアルデヒド、β-プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレンC60、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、もしくはこれらの組み合わせ。ウイルス不活性化の非化学的方法は、当該分野で公知である例えば、UV光もしくはγ線照射。ビリオンは、ウイルス含有流体例えば、尿膜腔液もしくは細胞培養上清から、種々の方法によって採取され得る。例えば、精製プロセスは、必要に応じて、上記ビリオンを破壊するために洗剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心分離またはアフィニティクロマトグラフィー法を含み得る。次いで、抗原は、ダイアフィルトレーションによって、必要に応じた希釈の後に精製され得る。スプリットビリオンは、精製されたビリオンを洗剤例えば、エチルエーテル、ポリソルベート80、デオキシコレート、トリ-N-ブチルホスフェート、TritonX-100、TritonN101、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、TergitolNP9などで処理して、サブビリオン調製物を生成するTween-エーテルスプリットプロセスを含むことによって得られる。インフルエンザウイルスをスプリットするための方法は、例えば、当該分野で周知である例えば、参考文献40~45などを参照のこと。上記ウイルスのスプリットは、代表的には、感染性であろうと非感染性であろうと、破壊濃度のスプリット薬剤で全ウイルスを破壊するかもしくはフラグメント化することによって行われる。上記破壊は、上記ウイルスタンパク質の完全なもしくは部分的な可溶化を生じ、上記ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリット薬剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性例えば、カチオン性界面活性剤例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、N,N-ジアルキル-グルカミド、Hecameg、アルキルフェノキシ-ポリエトキシエタノール、NP9、4級アンモニウム化合物、サルコシル、CTABセチルトリメチルアンモニウムブロミド、トリ-N-ブチルホスフェート、Cetavlon、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびDOT-MA、オクチル-もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール例えば、Triton界面活性剤例えば、TritonX-100もしくはTritonN101、ポリオキシエチレンソルビタンエステルTween界面活性剤、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルpolyoxyethleneesterなどである。1つの有用なスプリット手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的効果を使用し、スプリットは、最初のビリオン精製の間に起こり得る例えば、スクロース密度勾配溶液において。よって、スプリットプロセスは、上記ビリオン含有材料の清澄化非ビリオン材料を除去するために、上記採取したビリオンの濃縮例えば、吸着法例えば、CaHPO4吸着を使用して、非ビリオン材料からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離工程においてスプリット薬剤を使用する例えば、デオキシコール酸ナトリウムのようなスプリット薬剤を含むスクロース勾配を使用するビリオンのスプリット、次いで、望ましくない物質を除去するための濾過例えば、限外濾過を含み得る。スプリットビリオンは、有用には、リン酸ナトリウム緩衝化等張性塩化ナトリウム溶液中で再懸濁され得る。スプリットインフルエンザワクチンの例は、BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETMおよびFLUSHIELDTM製品である。精製されたインフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは、表面抗原であるヘマグルチニン、および代表的には、同様にノイラミニダーゼを含む。精製形態でこれらタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野で周知である。上記FLUVIRINTM、AGRIPPALTMおよびINFLUVACTM製品は、インフルエンザサブユニットワクチンである。別の形態の不活性化抗原は、ビロソーム[46]核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子である。ビロソームは、洗剤でのウイルスの可溶化、続いて、ヌクレオキャプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって、調製され得る。ビロソームを調製するための代替法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加して、それらの膜中においてリポソームにウイルスタンパク質を与えることを含む。本発明の方法はまた、生ワクチンを精製するために使用され得る。このようなワクチンは、通常、ビリオン含有流体からビリオンを精製することによって調製される。例えば、上記流体は、遠心分離によって清澄化され得、緩衝液例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含むで安定化され得る。インフルエンザウイルスワクチンの種々の形態が、現在利用可能である例えば、参考文献47の第17章および第18章を参照のこと。生ウイルスワクチンとしては、MedImmuneのFLUMISTTM製品三価生ウイルスワクチンが挙げられる。上記ウイルスは、弱毒化され得る。上記ウイルスは、温度感受性であり得る。上記ウイルスは、低温適合cold-adaptedされ得る。これら3つの特徴は、生のウイルスを抗原として使用する場合に特に有用である。HAは、現在の不活性化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、HAレベルを参照することによって標準化されている代表的には、SRIDによって測定される。既存のワクチンは、代表的には、1株あたり約15μgのHAを含むが、より低い用量が、使用され得る例えば、小児に関して、もしくは汎流行的状況において、またはアジュバントを使用する場合。分割量例えば、1/2すなわち、7.5μgHA/株、1/4および1/8が使用されてきたことと同様に、より高い用量も使用されてきた例えば、3×もしくは9×用量[48、49]。従って、ワクチンは、0.1~150μgの間のHA/インフルエンザ株、好ましくは、0.1~50μgの間例えば、0.1~20μg、0.1~15μg、0.1~10μg、0.1~7.5μg、0.5~5μgなどを含み得る。特定の用量としては、1株あたり、例えば、約45、約30、約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約3.75、約1.9、約1.5などが挙げられる。生ワクチンに関して、投与は、HA含有量よりむしろ、50組織培養感染量mediantissuecultureinfectiousdoseTCID50によって測定され、1株あたり106~108の間の好ましくは、106.5~107.5の間のTCID50が、代表的である。本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見いだされる天然のHA、もしくは改変HAを有し得る。例えば、HAを改変して、ウイルスをトリ種において非常に病原性にさせる決定基例えば、HA1/HA2切断部位の周りの非常に塩基性の領域を除去することは、公知である。逆遺伝学の使用は、このような改変を促進する。本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見いだされる天然のHA、もしくは改変HAを有し得る。例えば、HAを改変して、ウイルスをトリ種において非常に病原性にさせる決定基例えば、HA1/HA2切断部位の周りの非常に塩基性の領域を除去することは、公知である。逆遺伝学の使用は、このような改変を促進する。汎流行性間期の株に対して免疫化するために適しているのに加えて、本発明の組成物は、汎流行性もしくは潜在的に汎流行性の株に対して免疫化するために特に有用である。本発明は、ヒトおよび非ヒト動物にワクチン接種するのに適している。抗原が上記組成物中に有用に含まれ得る他の株は、抗ウイルス治療に抵抗性である例えば、オセルタミビル[50]および/もしくはザナミビルに抵抗性である株である耐性汎流行性株を含む[51]。本発明の組成物は、1つ以上の例えば、1つ、2つ、3つ、4つもしくはこれ以上のインフルエンザウイルス株インフルエンザA型ウイルスおよび/もしくはインフルエンザB型ウイルスを含むに由来する抗原を含み得る。ワクチンが1より多くのインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、代表的には、別個に増殖させられ、上記ウイルスが採取された後に混合され、抗原が調製されてきた。従って、本発明のプロセスは、1より多くのインフルエンザ株に由来する抗原を混合する工程を包含し得る。三価ワクチンは、代表的である2つのインフルエンザA型ウイルス株および1つのインフルエンザB型ウイルス株に由来する抗原を含む。四価ワクチンもまた有用である[52]2つのインフルエンザA型ウイルス株および2つのインフルエンザB型ウイルス株に由来する抗原を含むか、または3つのインフルエンザA型ウイルス株および1つのインフルエンザB型ウイルス株に由来する抗原を含む。薬学的組成物本発明に従って製造されるワクチン組成物は、薬学的に受容可能である。それらは、通常、上記抗原に加えて、成分を含む。例えば、それらは、代表的には、1種以上の薬学的キャリアおよび/もしくは賦形剤を含むこのような成分の詳細な議論は、参考文献53で入手される。以下に記載されるように、アジュバントもまた含まれ得る。ワクチン組成物は、一般に、水性形態にある。しかし、いくつかのワクチンは、乾燥形態、例えば、注射可能な固体、またはパッチ上の、乾燥したかもしくは重合した調製物の形態にあり得る。ワクチン組成物は、チオメルサールもしくは2-フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは、実質的に水銀物質を実質的に含まないべきであるすなわち、5μg/ml未満ことが好ましい例えば、チオメルサールを含まない[44、54]。水銀を含まないワクチンは、より好ましい。α-トコフェロールスクシネートは、水銀化合物の代替として含まれ得る[44]。保存剤非含有ワクチンは、特に好ましい。張度を制御するために、組成物は、生理学的塩例えば、ナトリウム塩を含み得ることは好ましい。塩化ナトリウムNaClが好ましく、塩化ナトリウムは、1~20mg/mlの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウムdisodiumphosphatedehydrate、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。ワクチン組成物は、一般に、200mOsm/kg~400mOsm/kgの間好ましくは、240~360mOsm/kgの間の重量オスモル濃度を有し、より好ましくは、290~310mOsm/kgの範囲内に入る。ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に対して影響を有さない重量オスモル濃度が以前に報告されている[55]が、この範囲において重量オスモル濃度を維持することは好ましい。ワクチン組成物は、1種以上の緩衝剤を含み得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる:リン酸塩緩衝剤;Tris緩衝剤;ホウ酸塩緩衝剤;コハク酸塩緩衝剤;ヒスチジン緩衝剤特に、水酸化アルミニウムアジュバントで;またはクエン酸塩緩衝剤。緩衝剤は、代表的には、5~20mM範囲で含まれる。ワクチン組成物のpHは、一般に、5.0~8.1の間、より代表的には、6.0~8.0の間例えば、6.5~7.5の間、または7.0~7.8の間である。本発明のプロセスは、従って、バルクワクチンのpHを、パッケージ前に調節する工程を包含し得る。上記ワクチン組成物は、好ましくは、無菌である。上記ワクチン組成物は、好ましくは、非発熱性である例えば、1用量あたり<1EUエンドトキシン単位、標準的な尺度、好ましくは、<0.1EU/用量を含む。上記ワクチン組成物は、好ましくは、グルテン非含有である。本発明のワクチン組成物は、洗剤例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤Tweenとして公知、オクトキシノール例えば、オクトキシノール-9TritonX-100もしくはt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、セチルトリメチルアンモニウムブロミドCTAB、またはデオキシコール酸ナトリウム特に、スプリットワクチンもしくは表面抗原ワクチンのためにを含み得る。上記洗剤は、微量においてのみ存在し得る。従って、上記ワクチンは、オクトキシノール-10およびポリソルベート80の各々について1mg/ml未満で含み得る。他の残りの微量の成分は、抗生物質例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンBであり得る。ワクチン組成物は、1回の免疫化のための物質を含んでいてもよいし、複数回の免疫化のための物質を含んでいてもよいすなわち、複数用量キット。保存剤を含めることは、複数用量の構成arrangementにおいて好ましい。複数用量組成物中に保存剤を含める代替としてもしくはそれに加えて、上記組成物は、物質の取り出しのための無菌アダプタを有する容器中に含まれ得る。インフルエンザワクチンは、代表的には、約0.5mlの投与体積で投与されるが、半用量すなわち、約0.25mlが、小児に投与され得る。組成物およびキットは、好ましくは、2°C~8°Cの間で貯蔵される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、遮光して保持されるべきである。宿主細胞DNAウイルスが単離され、そして/または細胞株上で増殖させられた場合、最終ワクチン中に残っている細胞株DNAのいかなる潜在的な腫瘍形成活性をも最小限にするために、上記DNAの量を最小限にすることは、標準的な実施である。従って、本発明に従って調製されるワクチン組成物は、好ましくは、1用量あたり10ng好ましくは、1ng未満、より好ましくは、100pg未満の残留宿主細胞DNAを含むが、微量の宿主細胞DNAが存在し得る。あらゆる残留宿主細胞DNAの平均長が500bp未満例えば、400bp未満、300bp未満、200bp未満、100bp未満などであることは、好ましい。夾雑するDNAは、標準的精製手順例えば、クロマトグラフィーなどを使用するワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞DNAの除去は、ヌクレアーゼ処理によって例えば、DNaseを使用することによって増強され得る。宿主細胞DNA夾雑物を減らすための便利な方法は、2工程処理第1は、DNase例えば、Benzonaseこれは、ウイルス増殖の間に使用され得るを、次いで、カチオン性洗剤例えば、CTABこれは、ビリオン破壊の間に使用され得る使用するを含む参考文献56および57において開示される。アルキル化剤例えば、β-プロピオラクトンでの処理はまた、宿主細胞DNAを除去するために使用され得、有利なことには、ビリオンを不活性化するためにも使用され得る[58]。アジュバント本発明の組成物は、有利には、アジュバントを含み得る。これは、上記組成物を受ける被験体において誘発される免疫応答液性および/もしくは細胞性を高めるように機能し得る。好ましいアジュバントは、水中油型エマルジョンを含む。種々のこのようなアジュバントは公知であり、それらは、代表的には、少なくとも1種の油および少なくとも1種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性代謝可能かつ生体適合性である。上記エマルジョン中の油滴は、一般に、直径5μm未満であり、理想的には、サブミクロンの直径を有し、これら小さなサイズは、マイクロフルイダイザーmicrofluidiserで達成されて、安定なエマルジョンを提供する。220nm未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得るので、好ましい。前記エマルジョンは、動物例えば魚類供給源または植物供給源からのものなどの油を含むことができる。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に利用できる堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油を使用することができる。種子油としては、紅花油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油およびこれらに類するものが挙げられる。穀粒の群の中で、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、他の穀類の穀粒、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギおよびこれらに類するものの油も使用することができる。グリセロールおよび1,2-プロパンジオールの6~10炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であり、従って、本発明の実施の際に使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段についての手順は、当該技術分野において周知である。殆どの魚類は、容易に回収できる代謝性の油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば鯨ろうが、ここで使用することができる魚油のいくつかの例である。多数の分岐鎖油が5炭素イソプレン単位で生化学的に合成されており、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサン、として公知の、分岐した不飽和テルペノイドを含有し、これは、ここで特に好ましい。スクワラン、スクアレンの飽和類似体、も好ましい油である。スクアレンおよびスクワランを含む、魚油は、商業的供給源から容易に入手することができ、または当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。別の好ましい油は、α―トコフェロール下記参照である。油の混合物を使用することができる。界面活性剤をそれらのHLB親水親油バランスによって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、およびさらに好ましくは少なくとも16のHLBを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤一般にTweenと呼ばれる、特にポリソルベート20およびポリソルベート80;商品名DOWFAXTMで販売されている、エチレンオキシドEO、プロピレンオキシドPOおよび/またはブチレンオキシドBOのコポリマー、例えば、線状EO/POブロックコポリマー;反復エトキシオキシ-1,2-エタンジイル基の数が様々であり得るオクトキシノール、オクトキシノール-9TritonX-100、すなわちt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールが特に興味深い;オクチルフェノキシポリエトキシエタノールIGEPALCA-630/NP-40;リン脂質、例えばホスファチジルコリンレシチン;ノニルフェノールエトキシレート、例えばTergitolTMNPシリーズ;ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテルBrij界面活性剤として公知、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテルBrij30;ならびにソルビタンエステル一般にSPANとして公知、例えばソルビタントリオレエートSpan85およびソルビタンモノラウレートを含むしかしこれらに限定されない界面活性剤と共に用いることができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。前記エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、Tween80ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Span85ソルビタントリオレエート、レシチンおよびTritonX-100である。界面活性剤の混合物、例えばTween80/Span85混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTween80、およびオクトキシノール、例えばt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールTritonX-100、の組み合わせも適する。別の有用な組み合わせは、ラウレス9とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび/またはオクトキシノールを含む。界面活性剤の好ましい量重量は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル例えば、Tween800.01から1、特に約0.1;オクチル-またはノニルフェノキシポリオキシエタノール例えば、TritonX-100、またはTritonシリーズの他の洗剤0.001から0.1、特に0.005から0.02;ポリオキシエチレンエーテル例えば、ラウレス90.1から20、好ましくは0.1から10および特に0.1から1または約0.5である。上記ワクチンがスプリットウイルスを含む場合、上記ワクチンは、水相中に遊離界面活性剤を含むことが好ましい。これは、上記遊離界面活性剤が、上記抗原に対してスプリット効果を発揮し得、それによって、他の状態で存在し得る任意の非スプリットビリオンおよび/もしくはビリオン凝集物を破壊するので、有利である。これは、スプリットウイルスワクチンの安全性を改善し得る[59]。好ましいエマルジョンは、<1μmの平均液滴サイズ例えば、≦750nm、≦500nm、≦400nm、≦300nm、≦250nm、≦220nm、≦200nm、もしくはこれより小さいを有し得る。これら液滴サイズは、便利なことには、微小流動化microfluidisationのような技術によって達成され得る。本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。スクアレン、Tween80、およびSpan85のサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの体積での組成は、約5スクアレン、約0.5ポリソルベート80および約0.5Span85であり得る。重量では、これらの比は、4.3スクアレン、0.5ポリソルベート80および0.48Span85になる。このアジュバントは、引用文献63の第10章および引用文献64の第12章により詳細に記載されるように、MF59として公知である[60~62]。上記MF59エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン例えば、10mMクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。スクアレン、DL-α-トコフェロール、およびポリソルベート80Tween80のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。これはまた、Span85たとえば、1および/またはレシチンを含み得る。これらエマルジョンは、2~10スクアレン、2~10トコフェロールおよび0.3~3Tween80を有し得、スクアレン:トコフェロールの重量比は、好ましくは、≦1である。なぜなら、これは、より安定なエマルジョンを提供するからである。スクアレンおよびTween80は、約5:2の体積比もしくは約11:5の重量比で存在し得る。1種のこのようなエマルジョンは、Tween80をPBS中に溶解して、2溶液を与え、次いで、この溶液90mlと、5gのDL-α-トコフェロールおよび5mlスクアレンの混合物とを混合し、次いで、上記混合物を微小流動化するmicrofluidiseことによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、例えば、100~250nmの間、好ましくは、約180nmの平均直径を有するサブミクロン油滴を有し得る。上記エマルジョンはまた、3-脱-O-アシル化モノホスホリルリピドA3-de-O-acylatedmonophosphoryllipidA3d-MPLを含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、ヒトの用量あたり、0.5~10mgスクアレン、0.5~11mgトコフェロール、および0.1~4mgポリソルベート80を含み得る[65]。スクアレン、トコフェロール、およびTriton洗剤例えば、TritonX-100のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、3d-MPL下記を参照のことを含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。ポリソルベート例えば、ポリソルベート80、Triton洗剤例えば、TritonX-100およびトコフェロール例えば、α-トコフェロールスクシネートを含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約75:11:10例えば、750μg/mlポリソルベート80、110μg/mlTritonX-100および100μg/mlα-トコフェロールスクシネートの質量比でこれら3種の成分を含み得、これら濃度は、抗原由来のこれら成分の何らかの寄与を含むはずである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、3d-MPL下記を参照のことを含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。スクアラン、ポリソルベート80およびポロキサマー401PluronicTML121のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水pH7.4中に処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、SAF-1アジュバント中でトレオニル-MDPとともに使用されてきた[66]0.05~1Thr-MDP、5スクアラン、2.5PluronicL121および0.2ポリソルベート80。このエマルジョンはまた、AFアジュバントでのように[67]5スクアラン、1.25PluronicL121および0.2ポリソルベート80、上記Thr-MDPなしでも使用され得る。微小流動化が好ましい。スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤例えば、ポリオキシエチレン12セトステアリルエーテルおよび疎水性非イオン性界面活性剤例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステルmannideester例えば、ソルビタンモノオレエートmonoleateもしくはSpan80を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして/または上記油滴のうちの少なくとも90体積でが、200nm未満のサイズを有する[68]。上記エマルジョンはまた、アルジトール;凍結保護剤cryoprotectiveagent例えば、糖例えば、ドデシルマルトシドおよび/もしくはスクロース;および/またはアルキルポリグリコシドのうちの1種以上を含み得る。上記エマルジョンは、TLR4アゴニストを含み得る[69]。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。スクアレン、ポロキサマー105およびAbil-Careのエマルジョン[70]。アジュバント添加ワクチン中のこれら成分の最終濃度重量は、5スクアレン、4ポロキサマー105プルロニックポリオールおよび2Abil-Care85ビス-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16ジメチコン;カプリル/カプリントリグリセリドである。0.5~50の油、0.1~10のリン脂質、および0.05~5の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献71に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。非代謝性の油例えば、軽油lightmineraloilおよび少なくとも1種の界面活性剤例えば、レシチン、Tween80もしくはSpan80のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る例えば、QuilAサポニン、コレステロール、サポニン-親油性結合体例えば、参考文献72に記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンを、デスアシルサポニンdesacylsaponinに添加することにより生成されるGPI-0100、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドdimethyidioctadecylammoniumbromideおよび/もしくはN,N-ジオクタデシル-N,N-ビス2-ヒドロキシエチルプロパンジアミン。サポニン例えば、QuilAもしくはQS21およびステロール例えば、コレステロールが螺旋状ミセルとして会合されるエマルジョン[73]。鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび/もしくはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含むエマルジョン[74]。鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび/もしくはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含むエマルジョン[74]。いくつかの実施形態において、エマルジョンは、送達時に抗原と即座に混合され得、従って、上記アジュバントおよび抗原は、パッケージされたもしくは配布されたワクチン使用時に最終処方物の準備ができているでは別個に保持され得る。他の実施形態において、エマルジョンは、製造の間に抗原と混合され、従って、上記組成物は、液体アジュバント添加形態liquidadjuvantedformにおいてパッケージされる。上記抗原は、一般に、水性形態にあり、その結果、上記ワクチンは、2種の液体を混合することによって最終的に調製される。混合するための上記2種の液体の体積比は、変動し得る例えば、5:1~1:5の間が、一般に、約1:1である。成分濃度が、上記の特定のエマルジョンの説明において与えられる場合、これら濃度は、代表的には、非希釈組成物に関するものであり、したがって抗原溶液と混合した後の濃度は低下する。ワクチン組成物のパッケージング本発明の組成物もしくはキット成分に適した容器としては、バイアル、シリンジ例えば、使い捨てシリンジ、鼻スプレーなどが挙げられる。これら容器は、滅菌であるべきである。組成物/成分がバイアル中に配置される場合、上記バイアルは、好ましくは、ガラス材料もしくはプラスチック材料から作製され得る。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が上記バイアルに添加される前に、滅菌される。ラテックス感受性患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有ストッパーでシールされ、全てのパッケージング材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。上記バイアルは、ワクチンの単一用量を含んでいてもよいし、1用量より多い用量複数用量バイアル、例えば、10用量を含んでいてもよい。好ましいバイアルは、無色ガラスから作製される。バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適合されたキャップ例えば、ルアーロックを有し得、上記シリンジの内容物は、上記バイアルへと排出され得例えば、その中の凍結乾燥物質を再構成するために、上記バイアルの内容物は、取り出されて上記シリンジへと戻され得る。上記バイアルから上記シリンジを取り出した後、次いで、ニードルが取り付けられ得、上記組成物が、患者へと投与され得る。上記キャップは、好ましくは、シールもしくはカバーの内部に配置され得る。その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップに到達し得る前に除去されなければならない。バイアルは、特に、複数用量バイアルについては、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有し得る。成分がシリンジにパッケージされる場合、上記シリンジは、これに取り付けられるニードルを有し得る。ニードルが取り付けられていない場合、別個のニードルが、組み立ておよび使用のために、上記シリンジと共に供給され得る。このようなニードルは、鞘に入れられ得る。安全ニードルsafetyneedleが好ましい。1インチ23ゲージ、1インチ25ゲージおよび5/8インチ25ゲージのニードルが代表的である。シリンジは、記録保持を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ流行期、および内容物の使用期限がプリントされ得るピールオフラベルとともに提供され得る。上記シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、上記プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されてしまわないように、ストッパーを有し得る。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび/もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは、一般に、ニードルの取り付け前に、先端をシールするために先端キャップを有し、上記先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製され得る。上記シリンジおよびニードルが別個にパッケージされる場合、上記ニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドと適合させられる。好ましいシリンジは、商品名Tip-LokTMの下で市販されるものである。容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半用量の体積を示すために印が付けられ得る。例えば、0.5ml用量を含むシリンジは、0.25ml体積を示す印を有し得る。ガラス容器例えば、シリンジもしくはバイアルが使用される場合、ソーダ石灰ガラスよりむしろホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用することが好ましい。キットもしくは組成物は、例えば、同じボックスの中に上記ワクチンの詳細例えば、投与の説明書、上記ワクチン内の抗原の詳細などを含むリーフレットとともにパッケージされ得る。上記説明書はまた、警告例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に容易に利用可能なアドレナリン溶液を保持することなどを含み得る。処置方法、および上記ワクチンの投与本発明は、本発明に従って製造されるワクチンを提供する。これらワクチン組成物は、ヒト被験体もしくはヒト以外の動物被験体例えば、ブタへの投与に適しており、本発明は、上記被験体に本発明の組成物を投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供し、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造のための、本発明の組成物の使用を提供する。これら方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答好ましくは、防御的抗体応答を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野で周知である。ヒトでの研究から、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体力価が、防御と相関する約30~40の血清サンプル赤血球凝集阻害力価が、同種のウイルスによる感染から約50防御を与えることが示された[75]。抗体応答は、代表的には、赤血球凝集阻害によって、マイクロ中和によって、単一放射免疫拡散singleradialimmunodiffusionSRIDによって、および/もしくは単一放射溶血SRHによって、測定される。これらアッセイ技術は、当該分野で周知である。本発明の組成物は、種々の方法において投与され得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射例えば、腕もしくは脚へのによるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内[76~78]、経口[79]、皮内[80、81]、経皮的transcutaneous、経皮的transdermal[82]などが挙げられる。本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、6ヶ月齢からの小児および成人での免疫化における使用に関して現在推奨されている。従って、ヒト被験体は、1歳未満、1~5歳、5~15歳、15~55歳、もしくは少なくとも55歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢例えば、≧50歳、≧60歳、および好ましくは、≧65歳、若年齢例えば、≦5歳、入院している被験体、ヘルスケアワーカー、軍隊および軍職員、妊婦、慢性疾患の、免疫不全の被験体、上記ワクチンを受ける7日前までに抗ウイルス化合物例えば、オセルタミビルおよびザナミビル化合物;以下を参照のことを摂取している被験体、卵アレルギーがある人々、および外国に旅行する人々である。上記ワクチンは、これらの群に適しているのみではないが、一般に、集団においてより多く使用され得る。汎流行性株については、すべての年齢群への投与が好ましい。好ましい本発明の組成物は、効力についてCPMP基準のうちの1つ、2つもしくは3つを満たす。成人18~60歳において、これら基準は、以下である:1≧70血清保有率seroprotection;2≧40セロコンバージョン;および/もしくは3GMT増加≧2.5倍。高齢者>60歳において、これら基準は、以下である:1≧60血清保有率;2≧30セロコンバージョン;および/もしくは3GMT増加≧2倍。これら基準は、少なくとも50名の患者でのオープンラベル研究に基づく。処置は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、初回免疫化スケジュールおよび/もしくは追加免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて上記種々の用量は、同じ経路もしくは異なる経路によって与えられ得る例えば、非経口の初回免疫primeおよび粘膜の追加免疫boost、粘膜の初回免疫および非経口の追加免疫など。1より多くの用量の投与代表的には、2用量は、免疫学的に経験したことがない患者例えば、これまでインフルエンザワクチンを受けたことのない人に関してにおいて、または新たなHAサブタイプ汎流行性アウトブレイクにおけるようなに対するワクチン接種のために、特に有用である。複数用量は、代表的には、少なくとも1週間空けて例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など投与される。本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチン例えば、麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、MMRワクチン、水痘ワクチン、MMRVワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、DTPワクチン、結合体化H.influenzaeタイプbワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、B型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン例えば、四価A-C-W135-Yワクチン、RSウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなどと実質的に同時例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家およびワクチン接種施設への訪問の間にに患者に投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび/もしくは髄膜炎菌ワクチンと実施的に同時の投与は、高齢の患者において特に有用である。同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物例えば、オセルタミビルおよび/もしくはザナミビルと実質的に同時例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家への訪問の間にに、患者に投与され得る。これら抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター例えば、3R,4R,5S-4-アセチルアミノ-5-アミノ-31-エチルプロポキシ-1-シクロヘキセン-1-カルボン酸もしくは5-アセチルアミノ-4-[アミノイミノメチル-アミノ]-2,6-アンヒドロ-3,4,5-トリデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノン-2-エノン酸enonicacidそのエステル例えば、そのエチルエステルおよびその塩例えば、そのリン酸塩を含むが挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、3R,4R,5S-4-アセチルアミノ-5-アミノ-31-エチルプロポキシ-1-シクロヘキセン-1-カルボン酸、エチルエステル、ホスフェート1:1オセルタミビルホスフェートTAMIFLUTMとしても公知である。一般用語含むcomprisingは、含むincludingおよびからなるconsistingを含み、例えば、Xを含む組成物は、もっぱらXからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい例えば、XY。語句実質的には、完全にを排除しない。例えば、Yを実質的に含まない組成物は、完全にYを含まなくてもよい。必要であれば、語句実質的には、本発明の定義から省略され得る。数値xに関する用語約とは、任意であり、例えば、x±10を意味する。別段示されなければ、2種以上の成分を混合する工程を包含するプロセスは、いかなる特定の混合する順序も必要としない。従って、成分は、任意の順序で混合され得る。3つの成分が存在する場合、2つの成分が、互いに合わされ得、次いで、その組み合わせが、第3の成分と合わせられ得るなど。動物および特にウシの物質が、細胞培養において使用される場合、それら物質は、伝染性海綿状脳症TSEを含まない、特に、ウシ海綿状脳症BSEを含まない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来物質が完全に存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代わりに、適切なプロドラッグによって置換され得る。2つのアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、整列された場合、アミノ酸のパーセンテージが、上記2つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム例えば、参考文献83の第7.7.18節において記載されるものを使用して決定され得る。好ましいアラインメントは、アフィンギャップ検索と、キャップオープンペナルティー12およびギャップ伸長ペナルティー2、BLOSUMマトリクス62を使用するSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムによって決定される。上記Smith-Waterman相同性検索アルゴリズムは、参考文献84に教示される。2つの核酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、整列された場合、塩基のパーセンテージが、上記2つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム例えば、参考文献83の第7.7.18節において記載されるものを使用して決定され得る。好ましいアラインメントプログラムは、好ましくは、デフォルトパラメーターこれは、以下のとおりである:オープンギャップ=3;伸長ギャップ=1を使用する、GCGGapGeneticsComputerGroup,Wisconsin,SuiteVersion10.1である。発明を実施するための態様実施例1リアソータントインフルエンザウイルスを、バックボーン株としてA/PR/8/34インフルエンザ株を、およびワクチン株としてA/Brisbane/10/07様またはA/Perth/16/09様インフルエンザ株を使用して生成する。阻害因子例えば、siRNA、PSOもしくはPMOを、これらが上記A/PR/8/34株のHAおよび/もしくはNA遺伝子の転写および/もしくは翻訳を優先的に低下させるように、設計する。上記阻害因子の適切性を、上記阻害因子を培養宿主に導入し、その後、上記培養宿主を、上記バックボーン株および上記ワクチン株に共感染させることによって試験する。タンパク質を、上記感染細胞から抽出し、上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNAタンパク質レベルの優先的な低下を、上記ワクチン株のHAおよび/もしくはNAタンパク質のタンパク質レベル、ならびに上記バックボーン株のHAおよび/もしくはNAタンパク質のタンパク質レベルを定量的ウェスタンブロット分析で比較することによって評価する。リアソータントインフルエンザウイルスを、上記阻害因子を上記培養宿主に導入し、上記培養宿主を、上記バックボーン株および上記ワクチン株に感染させることによって生成する。上記培養宿主を、上記リアソータントインフルエンザウイルスを生成するのに適した条件下で培養する。実施例2本発明の阻害因子を、上記バックボーン株の増殖に対するそれらの効果と、上記ワクチン株の増殖に対するそれらの効果とを比較することによって選択した。以下のウイルス株を試験した:A/PR/8/34バックボーン株;およびA/VictoriaH3N2ワクチン株。それらを、A/Perth/16/09の存在下でA/PR/8/34を阻害するために設計したが、以下のsiRNAを試験した:表1から、HA2、HA7-HA12およびHA19HAを標的とする;および表1から、NA4、NA6-NA9、NA11、NA12およびNA22NAを標的とする。実験コントロールは、処理なしTFなし、siRNAなし、トランスフェクションのみすなわち、siRNAなし;TF、siRNAなしおよび上記ウイルスを標的としないコントロールsiRNAK1、K2。上記siRNAを、並行実験においてMDCK細胞に導入した。その後、上記MDCK細胞を上記ウイルスに感染させ、上記ウイルス力価を測定した。その結果を、図1および図2に示す。HAを標的とするすべての試験したsiRNAは、A/PR/8/34増殖の低下を示す。siRNAであるNA4、NA6、NA7、NA12およびNA22は、A/PR/8/34増殖の低下を示す。siRNAであるHA7、HA8、HA10、NA7、NA9、NA11およびNA12は、A/Victoria増殖を有意に阻害しない。本発明の適切な阻害因子は、バックボーン株複製をブロックするが、上記ワクチン株の増殖を可能にする。従って、siRNAであるHA7、HA8、HA10、NA7およびNA9は、A/PR/8/34およびA/Victoriaを使用する場合に、本発明の適切な阻害因子である。本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、改変が行われ得る一方で、本発明の範囲および趣旨内にとどまっていることが理解される。以下の配列は、DNA形式で提供され、各siRNAのアンチセンス鎖のみが示される。実験に関しては、本発明者らは、以下の配列に基づいて、二本鎖RNAすなわち、G、A、CおよびUリボヌクレオチドを使用した。そして両方のsiRNA鎖は、それらの3’末端に、オーバーハングとして2個のさらなるUヌクレオチドを含んだ。参考文献"