"細胞における特異的分子事象の発生を証明する方法であって、特異的分子事象の発生についての直接的または間接的マーカーである結合したマーカータンパク質の可溶化あるいは可溶化マーカータンパク質の結合を検出し、上記マーカータンパク質が、上記検出の前に細胞中に存在し、検出前に、細胞の原形質膜の透過性を上昇させて、可溶化したタンパク質を細胞外媒質中に放出させ、次に、可溶化あるいは、結合が起こったかどうか、従って相当する分子事象を決定することができる適当な手段によって、マーカータンパク質の存在を、細胞中または細胞外媒質中に検出することを特徴とする、方法。タンパク質の細胞内アンカーリング、好ましくは膜アンカーリングによって、または、細胞内レベルでのタンパク質の区画化によって、タンパク質の細胞結合を行う、請求項1に記載の方法。タンパク質の細胞可溶化を、細胞質ゾル中のマーカータンパク質の放出によって行う、請求項1または2に記載の方法。マーカータンパク質が蛍光断片を含む融合タンパク質である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。マーカータンパク質が発現ベクターによって細胞中に産生される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。マーカータンパク質が細胞によって構成的に産生する、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。膜の透過性を上昇させた後、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法によって、細胞における蛍光タンパク質の可溶化あるいは結合を検出する、請求項4~6のいずれか一項に記載の方法。分子事象の発生によりマーカータンパク質が開裂または修飾され且つそれが可溶化される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。分子事象の発生により、マーカータンパク質の細胞内アンカーリング断片、好ましくは膜アンカーリング断片が出現し、マーカータンパク質が結合し、またはマーカータンパク質が区画化される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。検出する分子事象がBax活性化であり、マーカータンパク質がBax-蛍光タンパク質融合タンパク質であり、蛍光タンパク質がBaxのN-末端に融合しており且つBax活性化の事象においてBaxが結合している、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。検出する分子事象がプロテアーゼの活性化であり、マーカータンパク質がプロテアーゼ開裂部位と、いずれかの側に細胞内アンカーリング部位、好ましくは膜アンカーリング部位と蛍光タンパク質を含む融合タンパク質であり、プロテアーゼが発現するときにマーカー分子が開裂によって可溶化し、蛍光タンパク質が放出される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。プロテアーゼがカスパーゼである、請求項11に記載の方法。分子事象の発生の証明を、細胞サイクルの測定、特に細胞サイクルの様々な段階における細胞個体群の分布の測定と結びつけて考える、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。分子事象がBaxの活性化またはカスパーゼの活性化である、請求項13に記載の方法。可溶化結合を行う感受性成分と検出できるようにする標識成分を含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法で用いるマーカータンパク質。融合タンパク質であって、その標識成分が蛍光タンパク質である、請求項15に記載のタンパク質。感受性成分の配列が、配列番号1、3、5、7、9、11および13の配列から選択される配列を含んでなる核酸によってコードされる、請求項15または16に記載のマーカータンパク質。感受性成分の配列が、配列番号2、4、6、8、10、12および14の配列から選択される配列を含んでなる、請求項15~17のいずれか一項に記載のマーカータンパク質。細胞環境において、請求項15~18のいずれか一項に記載のマーカータンパク質を発現する、ベクター。請求項15~18のいずれか一項に記載のマーカータンパク質を発現する、形質転換細胞。マーカータンパク質の発現が安定である、請求項20に記載の細胞。腫瘍細胞、好ましくはヒト腫瘍細胞である、請求項20または21に記載の細胞。少なくとも1種類の細胞が請求項15~18のいずれか一項に記載のマーカータンパク質を発現する、非ヒトトランスジェニック動物。少なくとも請求項20~22のいずれか一項に記載の形質転換細胞、および/または請求項19に記載のベクター、および/または請求項23に記載のトランスジェニック動物を含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。請求項22に記載の細胞中で、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法を実施すること包含する、抗癌化合物候補の活性を評価する方法。例1:Baxタンパク質の活性化下記の実施例は、アポトーシスの誘導の際のBaxタンパク質のコンホメーション変化を検出することができる簡単な試験を説明する。上記で示唆したように、正常な細胞では、Baxは疎水性の高いC末端が分子の静止によって保護されるように折りたたまれる2。アポトーシスの誘導の際には、タンパク質はその特性を変更するコンホメーション変化を行い、そのC末端の露出によりBaxのミトコンドリア再局在化を誘導する。この形態では、Baxは外部ミトコンドリア膜に安定に挿入された膜タンパク質のような挙動をとる。BaxのN末端におけるGFPの融合によって得られるキメラタンパク質を用いると、Baxの局在化を示す組換え蛍光プローブが得られる。キメラタンパク質は、天然タンパク質と同じ特性、特にコンホメーション変化を行うおよびアポトーシスの誘導中にミトコンドリアへ再局在化する能力を保持している。実行したモデルは、クローン10と呼ばれるクローンを用いている。これらは、ウイルスCMVプロモーターの制御下でキメラ融合タンパク質をコードするpEGFP-Baxプラスミドを用いるリン酸カルシウム法によってトランスフェクションし且つゲネテシン耐性を付与するHeLaヒト子宮頸部腫瘍細胞である。用いられる基本的ベクターはClontech製の市販のPEGFP-C3図5であり、5’末端において停止コドンを欠いているGEPcDNAと同じ位相で融合したBaxcDNAが挿入されている。トランスフェクションの4日後、細胞を1mg/ml濃度のゲネテシンG418に暴露すると、これは次週中に次第に0.1mg/mlまで減少する。2週間後、ゲネテシン耐性の若干数のクローンを蛍光顕微鏡下で選択することによって単離する。クローン10は、高比率の均一な蛍光細胞を細胞質ゾル水準で含み、この標識は経時的に安定である約10回の実行。細胞は、10FCSおよび0.1mg/mlゲネテシンを補足したDMEM中で培養保持される。次に、試験は蛍光顕微鏡下でまたはフローサイトメトリーによる、Baxが活性化されておらず従って細胞質ゾルに均一に分布されている細胞、およびアポトーシスの誘導後にBaxが活性化されている細胞の観察に基づいている。後者の場合には、蛍光シグナルはミトコンドリアの周りに集まり、従ってBaxタンパク質は結合していると考えられる。Baxの結合または可溶化を証明するため、コントロール個体群とアポトーシス剤で処理した個体群をトリプシンで処理し、それらを培養皿から分離する。次に、細胞をジギトニン50μMの存在下で細胞内食塩溶液に再懸濁した後、フローサイトメトリーによって分析し、GFPの蛍光をチャンネルFL1で測定する。このようにして処理した細胞は図1に示されており、蛍光強度の非常に大きな降下がBaxが活性化されていない細胞で観察され、初期には、画像は均一に蛍光を示しているが、この蛍光は300秒後にはほとんど消失することを示している。反対に、Baxが活性化されているときには、相当する曲線から得られる定量的測定値から決定することができるように、蛍光はミトコンドリアに再分布し、透過性化を阻害することが注目される。図2は、FL1における様々なプロアポトーシス剤の存在下にて透過性化を有するおよびのないクローン10の個体群の蛍光の様々なプロフィールを示す。Aは、透過性化を有するおよびのないクローン10の個体群コントロールの蛍光プロフィールを示す。分布ピークの左への移行が示すように、蛍光シグナルはジギトニンによる処理に感受性を有する。Bは、FL1におけるBaxを活性化するプロ-アポトーシス剤20μMセレナイト、6時間で処理した個体群のサイトメトリープロフィールを示す。誘導物質を用いまたは用いることなく透過性化の後に得られるプロフィールを比較することによって、アポトーシス誘導物質の下では、蛍光シグナルは透過性化処理に耐性になっていることを観察することができる。Cでは、スタウロスポリン1μM,6時間またはTNF-α10ng/ml,6時間10μMCHXによるアポトーシスの誘導下では、同じ差が見られる。例2:アポトーシス誘導下でのBaxのミトコンドリアへの再局在化の定量この手法により、Baxのミトコンドリアへの再局在化が起こった細胞の比率を測定することによってBaxの誘導を評価することができる。この方法では、遺伝子の発現がBax活性化を誘導するかどうかを分析し、薬剤のプロ-アポトーシスまたは細胞保護能力を定量的に評価することができる。外来遺伝子がBaxを活性化する能力を評価するため、クローン10を、GFPからスペクトル的に識別可能であり且つ細胞内膜または区画化抗透過性化した局在化、例えば、ミトコンドリアマトリックスに対して指定したDsRedを有する蛍光マーカーをコードする別のcDNAと会合した目的のタンパク質のcDNAでトランスフェクションする。後者の場合には、透過性化の後、チャンネルFL1で記録される蛍光強度GFPは常にBax活性化の水準を示すが、FL3におけるシグナルの強度DsRedは、細胞が目的のタンパク質を過剰発現するかどうかを示している。クローン10について二重パラメーター測定biparametricmeasurementを行うことによって、Bax活性化を目的のタンパク質の過剰発現に相関させることができる。図3Aおよび3Bに示された結果は、薬剤処理の後にBaxのミトコンドリアへの再局在化を行う細胞個体群の比率を示している。図3Aは、阻害剤の非存在下曲線Dおよび阻害剤の存在下曲線Eにおいて20μMセレナイト、および同じ阻害剤Bの非存在下および存在下で40nMスタウロスポリンで処理した細胞個体群の経時的進展を表す。この手法によって、Bax活性化の動態はセレナイトでの処理中に阻害剤によって変更されないが、一方反対に、この阻害剤はスタウロスポリンには活性である。同様に、図4の棒グラフは、シクロヘキシミドの存在下にてUV放射線の影響下で40nMスタウロスポリン、50μMセラミドまたは0.1ng/mlTNFで24時間処理した後のBaxが活性化されている細胞の比率を表す。この手法は、このように様々な薬剤のプロ-アポトーシス特性を識別することができる。この手法は、Bax活性化およびそのミトコンドリアへの再局在化について現在利用可能な手法であって亜細胞分画化および様々な画分に含まれるBaxタンパク質の量のウェスタンブロット法による定量に基づく、または活性化のコンホメーション変化を行ったタンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫蛍光による手法に関して、多くの利点を提示する。これらの手法と比較して、先に記載した方法は1つの大きく減少した実験操作しか必要とせず累積時間は、他の手法については24時間であるのに対して30分未満である、目的のパラメーターを、細胞内であっても、分画化または固定に関する人工生成物を誘発することなく且つ多量の洗浄剤免疫蛍光を用いることなく測定することができ、実験費用を低くする。例3:アポトーシス中のカスパーゼ3の活性の測定アポトーシスの主要なエフェクターはカスパーゼであり、これは開裂部位におけるP1位のアスパルテートに対する絶対的特異性を特徴とするシステインプロテアーゼである。これらの酵素はいずれも、その活性部位に同一のペンタペプチド配列を含んでおり、カルパインのような他のプロテアーゼと共にアポトーシスの際の細胞で起こる多くのタンパク質分解事象に関与しており、正常な細胞機能に重要な役割を果たしているタンパク質基質の開裂を生じる細胞骨格タンパク質、核タンパク質、またはDNA修復酵素。カスパーゼ活性化は、2つの主要な経路をとることができる。第一はミトコンドリア経路であって、タンパク質Apaf-1がdATPおよびミトコンドリアの膜間空間から放出されるチトクロームcの存在下にてプロカスパーゼ-9と相互作用し、アポトソームapoptosomeを形成することによって、カスパーゼ-9を活性化プロカスパーゼ-9の自己触媒的開裂した後にカスパーゼ-3を活性化することができる。他の経路は、原形質膜上のTNF受容体の上科の受容体の経路である。TNFR1またはFasCD95またはAPO-1とそれらの天然リガンドまたはモノクローナル抗体作動薬との相互作用により、DISC死誘導シグナリング複合体と呼ばれる多タンパク質細胞質複合体を集合させて、プロカスパーゼ-8の活性化によるアポトーシスカスケードを開始することができる。現在のところ、既に以前に記載されている限られた数の方法があるが、いずれもカスパーゼの活性を測定するには完全に満足なものではない。本発明の構成中では、アポトーシス細胞でのカスパーゼ活性を測定する顕微鏡法およびサイトメトリーに適当な新たな組換えプローブを用いる。この新規なプローブは、DsRed2またはEGFPのような蛍光タンパク質がカスパーゼ3コンセンサス部位を含む短いリンカーによって膜貫通配列に連結して、プローブを外部ミトコンドリア膜への特異的アンカーリングを確実に行う融合タンパク質からなっている。相当する配列は、配列番号1に記載されている。下線部分はカスパーゼ3開裂配列と、次に、特異的ミトコンドリアアドレッシングが付与されている突然変異したチトクロームb5の膜貫通ドメインを含む合成リンカーに相当する。アポトーシスの誘導の際に、活性化したカスパーゼ3は、蛍光タンパク質と膜貫通配列との間に挿入されたリンカーに含まれるDEVD配列を開裂する。以前に結合したGFPは、細胞の細胞質ゾル中の可溶性タンパク質となる。カスパーゼ3が活性化されていない細胞に結合したシグナルは、カスパーゼが活性化されている細胞中で可溶性になる。細胞をガラススライド上で培養して、以前に記載したベクターでトランスフェクションを行った後、インキュベーションチャンバー中の食塩水媒質に固定して、蛍光顕微鏡下で観察する。観察前または中は、それらはプロ-アポトーシス剤で処理する。カスパーゼ3の活性化およびその動態は、カスパーゼが一旦活性化されるとミトコンドリアから細胞質ゾルへと直ちに変化する蛍光シグナルの細胞内分布の変更を単に観察することによって明らかにすることができるしかし、カスパーゼ活性化をフローサイトメトリーによって測定するのが一層好都合である。コントロール個体群とアポトーシス剤で処理した個体群を、トリプシン処理によってそれらの培養皿から取り出した後、細胞を50μMジギトニンの存在下にて細胞内食塩水溶液に再懸濁する。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、GFPの蛍光をチャンネルFL1で測定する。提示した手法は、蛍光センサーの開裂が起こっている細胞の比率を測定することによってカスパーゼ3の活性化を評価することができる。この方法を用いると、遺伝子の発現がカスパーゼ3の活性化を誘導するかどうかを分析し、薬剤のプロ-アポトーシスまたは細胞保護能力を定量的に評価することができる。従って、図6は、様々なアポトーシス誘導物質で処理したHeLa細胞の個体群におけるカスパーゼ3の作用の定量を表している:UV照射200mJ/cm2、TNFα100μg/ml、スタウロスポリン1μM6時間、およびカスパーゼ阻害剤ZVAD50μMの存在下でのスタウロスポリン1μM。もう一つのアポトーシスパラメーターの定量は平行して表されるこのアポトーシス誘導モデルでは、カスパーゼ活性化によって変化するミトコンドリアの脱分極。この方法は、様々な系に導入することができる総てのカスパーゼおよび多のプロテアーゼに直接一般化することができ、また当業者であれば相当するベクターを作製することができるであろう。例4:他の亜細胞プローブアンカーリング法上記のカスパーゼ3プローブは、外部ミトコンドリア膜に埋設されている短い膜貫通ドメインからなる膜アンカーリングを基剤としている突然変異チトクロームb5C末端セグメント。従って、このタンパク質ドメインは融合タンパク質にミトコンドリア分布と、原形質膜の選択的透過性化に関して抵抗する特性を付与する。この実施例では、試験の原理を、原形質膜の透過性化に対する蛍光シグナルの抵抗性を含む他の細胞内アンカーリング法に拡張することができることが示されている。アンカーリングの種類は、必ずしも膜貫通ドメイン自身によって表すことはできないが、その分子相互作用またはその翻訳後修飾によって、融合している蛍光タンパク質に目的のプロテアーゼによる開裂の後に細胞質ゾルまたは細胞外環境でアンカーリングしているが潜在的に拡散可能な状態を付与するタンパク質ドメインによって極めて単純に表すことができる。更に、特異的な細胞内局在化原形質膜、核、膜間ミトコンドリア空間は、プロテアーゼに対する基質の接近可能性についての追加の情報、および従ってタンパク質分解活性の分子内局在化についての情報を与えることができる。例4a:原形質膜の内部表面にアンカーリングしたカスパーゼ3プローブこの融合タンパク質では、細胞内アンカーリングドメインはネズミSNAP-25タンパク質の一部から構成されている。SNAP-25は分泌小胞融合過程に含まれるタンパク質であり、3個のシステイン残基のパルミトイル化によって原形質膜の細胞質ゾル表面に配置される。アミノ酸80-136配列番号4によって構成されている最小SNAP-25パルミトイル化ドメインを単離して、カスパーゼ3開裂部位を含むリンカーを介して蛍光タンパク質に融合した。この融合タンパク質は、従って原形質膜に配置されており、その蛍光シグナルはジギトニンによる透過性化に抵抗性である。カスパーゼ3のタンパク質分解活性はリンカーを開裂し、細胞質ゾルにおける蛍光の再分布を引き起こし、シグナルは透過性化の後には失われる図7。フローサイトメトリーでは、このプローブは以前に報告された外部ミトコンドリア膜にアンカーリングしたプローブと完全に比較できる結果を与える。例4b:内部ミトコンドリア膜の外部表面にアンカーリングしたカスパーゼ3プローブこの第二の実施例では、プローブのアンカーリングに用いたタンパク質ドメインは、ミトコンドリアアデニントランスロケーターANT2配列番号8の全配列によって表される。これは、N末端が膜間空間に露出している内部ミトコンドリア膜の内在性タンパク質である。開裂性リンカーを有する蛍光タンパク質は、この末端で融合した。従って、iこの融合タンパク質はミトコンドリアに適性に配置されており、ii蛍光タンパク質はカスパーゼ3によって開裂可能であり、細胞死経路の細胞小器官特異的開始.NatCellBiol3E255632SuzukiMYouleRJTjandraNBaxの構造:二量体形成と細胞内局在化の同時調節.Cell1010364554"