"ペプチダーゼインヒビター16PI16と結合することができる少なくとも1つのモノクローナル抗体可変領域を含む単離タンパク質であって、前記タンパク質がまた、PTA-10685の受託番号でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマにより産生された抗体のPI16への結合を競合的に阻害することができる単離タンパク質。CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマにより産生される抗体と結合するエピトープと重複するエピトープに結合する、請求項1に記載のタンパク質。CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマにより産生される抗体と同じエピトープに結合する、請求項1に記載のタンパク質。配列番号32または38に記載された配列を含むエピトープに特異的に結合する、請求項3に記載のタンパク質。配列番号33~37、39、およびその混合体からなる群から選択される配列内に含まれるエピトープに特異的に結合する、請求項3または4に記載のタンパク質。PI16の立体構造エピトープに結合する、請求項1~5のいずれか1項に記載のタンパク質。前記立体構造エピトープがPI16中でのジスルフィド結合形成に依存する、請求項6に記載のタンパク質。前記タンパク質が、還元型であるPI16には実質的に結合しない、請求項1~8のいずれか1項に記載のタンパク質。前記可変領域が抗体重鎖可変領域VHまたは抗体軽鎖可変領域VLである、請求項1~8のいずれか1項に記載のタンパク質。前記タンパク質が少なくとも2つの可変領域を含み、該可変領域のうちの1つが抗体重鎖可変領域VHでありもう一つが抗体軽鎖可変領域VLである、請求項1~8のいずれか1項に記載のタンパク質。モノクローナル抗体である、請求項1~10のいずれか1項に記載のタンパク質。i前記可変領域1つまたは複数がヒト可変領域であるか;ii前記可変領域1つまたは複数が非ヒト可変領域であるか;またはiii前記可変領域1つまたは複数が非ヒト可変領域の3つの相補性決定領域CDRを有する、請求項1~10のいずれか1項に記載のタンパク質。i前記非ヒト可変領域がPTA-10685の受託番号でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマにより産生された抗体に由来する;またはii前記可変領域が配列番号8に記載された配列を有する重鎖可変領域のCDRおよび/または配列番号10に記載された配列を有する軽鎖可変領域のCDRを有する、請求項12に記載のタンパク質。キメラ抗体、脱免疫化抗体、またはヒト化抗体である、請求項11~13のいずれか1項に記載のタンパク質。i配列番号8に記載された配列を含む重鎖可変領域のCDRと配列番号10に記載された配列を含む軽鎖可変領域のCDRとを有する重鎖可変領域;またはii配列番号8に記載された配列と少なくとも約80の同一性をもつ配列と、配列番号10に記載された配列と少なくとも約80の同一性をもつ配列を有する軽鎖可変領域とを有する重鎖可変領域、を有する、請求項1~14のいずれか1項に記載のタンパク質。PTA-10685の受託番号でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマにより産生された抗体である、単離タンパク質。前記タンパク質と複合体化する化合物を有する、請求項1~16のいずれか1項に記載のタンパク質。請求項1~17のいずれか1項に記載のタンパク質と薬剤的に許容可能な担体とを含む組成物。請求項1~18のいずれか1項に記載のタンパク質をその上に固定化する固形担体または半固形担体。請求項1~16のいずれか1項に記載のタンパク質を発現する単離細胞。PTA-10685の受託番号でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマである請求項20に記載の細胞。試料中のペプチダーゼインヒビター16PI16またはPI16発現細胞を検出する方法であって、前記方法は、試料を請求項1~17のいずれか1項に記載のタンパク質または請求項18に記載の組成物または請求項19に記載の固形担体もしくは半固形担体に接触させて、タンパク質が試料中の、もし存在するならば、PI16に結合するようにすること、および、結合タンパク質を検出することを含む方法。前記細胞が制御性TTreg細胞である、請求項22に記載の方法。前記Treg細胞が内在性Treg細胞である、請求項23に記載の方法。内在性制御性TnTreg細胞を誘導性TregiTreg細胞と区別する方法であって、前記方法がTreg細胞を含む試料を請求項1~17のいずれか1項に記載のタンパク質または請求項18に記載の組成物または請求項19に記載の固形担体もしくは半固形担体に接触させて、タンパク質が試料中のPI16発現Treg細胞に結合するようにすること、および、PI16発現Treg細胞を検出することを含み、前記PI16発現Treg細胞がnTreg細胞である方法。細胞を単離する方法であって、前記方法が、請求項23または24に記載の方法を実施することにより細胞を検出すること、および、検出した細胞を単離することまたは請求項25に記載の方法を実施することによりnTreg細胞を区別して、前記区別したnTreg細胞を単離することを含む方法。PI16発現細胞が濃縮されている細胞集団を産生する方法であって、前記方法がPI16発現細胞を含む細胞集団を請求項1~17のいずれか1項に記載のタンパク質または請求項18に記載の組成物または請求項19に記載の固形担体もしくは半固形担体に接触させて、タンパク質が試料中のPI16発現細胞に結合するようにすること、および、前記タンパク質と結合する細胞を選択することを含む方法。前記濃縮細胞が制御性TTreg細胞である、請求項26または27に記載の方法。PI16、ならびにCLA、HLADRおよびCCR4からなる群から選択される1つ以上のタンパク質を発現する制御性TTreg細胞が濃縮されている細胞集団。細胞が対象の炎症部位または皮膚に移動することができる、請求項26または28に記載の方法により単離された細胞または請求項27もしくは28に記載の方法により産生された細胞集団または請求項29に記載の細胞集団。炎症部位または皮膚に優先的に移動する、請求項30に記載の細胞または細胞集団。対象の症状を診断および/または予後予測する方法であって、前記方法が請求項22~24のいずれか1項に記載の方法を実施してPI16もしくはPI16発現細胞を検出すること、または、対象由来の試料中のPI16もしくは前記細胞のレベルを測定することを含み、PI16もしくはPI16発現細胞の検出、または、PI16もしくはPI16発現細胞またはPI16もしくはPI16発現細胞のレベルの未検出が症状の診断または予後予測となる方法。病状を治療または予防する方法であって、前記方法が請求項1~17のいずれか1項に記載のタンパク質または請求項18に記載の組成物または請求項19に記載の固形担体もしくは半固形担体または請求項26もしくは28に記載の方法により単離された細胞または請求項27もしくは28に記載の方法により産生された細胞集団または請求項29に記載の細胞集団をそれを必要とする対象に投与することを含む方法。前記症状が制御性TTreg細胞関連症状である、請求項32または33に記載の方法。PI16発現細胞に化合物を送達する方法であって、前記細胞を請求項1~17のいずれか1項に記載のタンパク質に接触させることを含む方法。請求項1~17のいずれか1項に記載のタンパク質または請求項18に記載の組成物または請求項19に記載の固形担体もしくは半固形担体または請求項26もしくは28に記載の方法により単離された細胞または請求項27もしくは28に記載の方法により産生された細胞集団または請求項29に記載の細胞集団の医薬における使用。請求項1~17のいずれか1項に記載のタンパク質、または、請求項18に記載の組成物、または、請求項19に記載の固形担体もしくは半固形担体または請求項26もしくは28に記載の方法により単離された細胞、または請求項27または28に記載の方法により産生された細胞集団または請求項29に記載の細胞集団の制御性TTreg細胞関連症状の治療用薬剤の製造における使用。PI16発現制御性TTreg細胞を投与することを含む、TH17介在性症状を治療する方法。前記Treg細胞が全身投与され、TH17介在性症状の部位に移動する、請求項38に記載の方法。PI16発現制御性TTreg細胞を炎症部位に投与することを含む、炎症を治療する方法。前記炎症部位はインターロイキンIL1βおよび/またはIL6の発現を特徴とする、請求項40に記載の方法。Treg関連炎症を診断する方法であって、前記方法が対象の炎症部位由来の試料におけるPI16-Treg細胞に対するPI16制御性TTreg細胞の割合を検出することを含み、PI16-Treg細胞に対するPI16Treg細胞の割合の変化が前記状態の指標である方法。前記割合の変化がPI16-Treg細胞に対するPI16Treg細胞の減少である、請求項42に記載の方法。前記炎症部位が滑液である、請求項42または43に記載の方法。Treg細胞の除去が、例えば、自己抗原、または、非自己抗原に対する免疫反応を改善する魅力的な方法を提供することが先の考察から明らかであるであろう。しかしながら、上で考察したように、Treg細胞を除去することを可能にするマーカーが不十分であることがこれらの細胞を標的とする治療戦略を妨げてきた。例えば、細胞表面マーカーCD25はTreg細胞でよく発現し、そして、これらの細胞を単離する、または、標的とするために伝統的に使用されてきたが、一方、このタンパク質はまた、活性型B細胞、いくつかの胸腺細胞、骨髄前駆細胞、および、オリゴデンドロサイトに加えて他のT細胞集団例えば、活性型T細胞で発現する例えば、Robbら,1981年、および、Zolaら,1989年を参照のこと。したがって、例えば、診断目的で、予後予測目的で、治療目的で、および/または、予防目的でTreg細胞の検出と単離、または、Treg細胞の除去と破壊を可能にする新規のマーカー、好ましくは、細胞表面マーカーが当該分野において必要である。本発明をもたらした研究において、本発明者らはTreg細胞の新しい細胞表面マーカーを同定しようと努めた。本発明者らは、ヘルパーT細胞のようなその他のT細胞と比較してTreg細胞で発現が上昇するペプチダーゼインヒビター16PI16を同定した。本発明者らはまた、PI16の発現がTreg細胞転写因子FoxP3と相関することを明らかにした。これらのデータに基づき、PI16はTreg細胞のバイオマーカーであると本発明者らは結論した。本発明者らは次にPI16に結合できるタンパク質を作製した。例えば、本発明者らは、一連のモノクローナル抗体を作製し、そのうちの1つは細胞表面のPI16に結合し、そして、Treg細胞の細胞表面マーカーを発現する細胞集団を単離する能力を持つことを明らかにした。このモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをCRCBT-02-001と名付ける。このモノクローナル抗体、および、このモノクローナル抗体の結合を競合的に阻害するタンパク質は、細胞、例えば、Treg細胞、好ましくはメモリーnTreg細胞、または、休止メモリーnTreg細胞のようなnTreg細胞の同定、または、単離、PI16関連症状例えば、Treg細胞関連症状の診断、または、予後予測、ならびに、PI16、および/または、Treg細胞関連症状の治療を含む様々な用途に有用である。したがって、本発明は、ペプチダーゼインヒビター16PI16に結合する能力がある少なくとも1つの抗体例えば、モノクローナル抗体の可変領域を含む単離されたタンパク質を提供し、このタンパク質は、PTA-10685の受託番号でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマが産生する抗体のPI16への結合を競合的に阻害することもできる。1つの例において、前記タンパク質は、CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマが産生する抗体が結合するエピトープと重複するエピトープに結合する。あるいは、そのタンパク質は、CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマが産生する抗体と同じエピトープに結合する。1つの例において、前記タンパク質は、例えば、配列番号1のC末端21アミノ酸を含む膜結合型のPI16に結合する。1つの例において、前記タンパク質は、配列番号32、または、配列番号38に記載の配列を含有するエピトープに特異的に結合する。1つの例において、前記タンパク質は、配列番号33~37、配列番号39、および、その混合物から成る群より選択される配列に含まれるエピトープに特異的に結合する。1つの例において、前記タンパク質は、配列番号32~39、および、その混合物からなる群より選択される配列からなるペプチドに特異的に結合する。1つの例において、前記タンパク質は、PI16中の立体構造的エピトープに結合する。例えば、立体構造的エピトープはPI16内のジスルフィド結合に依存している。例えば、前記タンパク質が結合する立体構造的エピトープはジスルフィド結合を欠くPI16、例えば、還元型のPI16には存在しない。1つの例において、前記タンパク質は還元型のPI16に実質的に結合しない。例えば、前記タンパク質は還元型のPI16に検出できるほど結合することはない。1つの例において、前記タンパク質はグリコシル化PI16、または、脱グリコシル化PI16に結合する。例えば、前記タンパク質はN-グリコシル化PI16、または、非N-グリコシル化PI16に結合する。1つの例において、前記タンパク質は少なくとも約5nM、例えば、少なくとも約4nM、例えば、少なくとも約3nMの親和性KDでPI16に結合する。1つの例において、前記タンパク質は、少なくとも約1.25nMの親和性KDでPI16に結合する。1つの例において、Fcに融合したPI16の細胞外領域を固定化し、前記タンパク質例えば、Fabの固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでKDを評価する。1つの例において、前記タンパク質は、少なくとも約2.56nMの親和性KDでPI16に結合する。1つの例において、前記タンパク質を固定化し、Fcに融合したPI16の細胞外領域の固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでKDを評価する。1つの例において、前記タンパク質は1nMと3nMの間の、例えば、約1.1nMと2.7nMの間の、例えば、約1.2nMと2.6nMの間の、例えば、約1.25nMと2.56nMの間の親和性KDを有する。1つの例において、前記タンパク質は、少なくとも約2x105の、例えば、約2.4x105の、例えば、約2.6x105の、例えば、約2.8x105の、例えば、少なくとも約2.97x105のKaを有する。1つの例において、Fcに融合したPI16の細胞外領域を固定化し、前記タンパク質例えば、Fabの固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでKaを評価する。1つの例において、前記タンパク質は少なくとも約5x104の、例えば、少なくとも約5.2x104の、例えば、少なくとも約5.3x104の、例えば、少なくとも約5.5x104の、例えば、少なくとも約5.7x104の、例えば、少なくとも約5.82x104のKaを有する。1つの例において、前記タンパク質を固定化し、Fcに融合したPI16の細胞外領域の固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでKaを評価する。1つの例において、前記タンパク質は少なくとも約4.5x10-4、例えば、少なくとも約4.2x10-4、例えば、少なくとも約4.0x10-4、例えば、少なくとも約3.8x10-4、例えば、少なくとも約3.72x10-4のKdを有する。1つの例において、Fcに融合したPI16の細胞外領域を固定化し、前記タンパク質例えば、Fabの固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでKdを評価する。1つの例において、前記タンパク質は少なくとも約2.5x10-4、例えば、少なくとも約2.2x10-4、例えば、少なくとも約2.0x10-4、例えば、少なくとも約1.8x10-4、例えば、少なくとも約1.49x10-4のKdを有する。1つの例において、前記タンパク質を固定化し、Fcに融合したPI16の細胞外領域の固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでKdを評価する。1つの例において、前記タンパク質はマウスPI16に検出できるほど結合することはない。1つの例において、前記タンパク質はヒトPI16に結合する。1つの例において、本発明のタンパク質の可変領域は抗体重鎖可変領域VH、または、抗体軽鎖可変領域VLである。あるいは、前記タンパク質は少なくとも2つの可変領域を含み、その可変領域のうちの1つは抗体重鎖可変領域VHであり、もう1つの可変領域は抗体軽鎖可変領域VLである。例えば、そのタンパク質は、VLがVHに結合して抗原結合部位を形成するFvを含む。抗原結合部位を形成するVLとVHは単一のポリペプチド鎖に例えば、scFvに、または、異なるポリペプチド鎖に例えば、抗体、または、二重特異性抗体に存在することができる。前記タンパク質は抗体、例えば、モノクローナル抗体であることが好ましい。1つの例において、そのタンパク質は、任意の例に従い、本明細書において考察される抗体重鎖可変領域VH、または、抗体軽鎖可変領域VLを含む抗体である。本発明の1つの例において、可変領域はヒト可変領域である。例えば、本発明の抗体はヒトの抗体であり得る。別の例において、可変領域は非ヒト可変領域である、または、その可変領域は非ヒト可変領域の3つの相補性決定領域を含むものである。例えば、そのタンパク質はキメラタンパク質、もしくは、キメラ抗体、脱免疫化タンパク質、もしくは、脱免疫化抗体、または、ヒト化タンパク質、もしくは、ヒト化抗体であり得る。1つの例において、非ヒト可変領域は、受託番号PTA-10685でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマが産生する抗体に由来する。1つの例において、前記タンパク質は、配列番号8に記載の配列を含む重鎖可変領域のCDR、および、配列番号10に記載の配列を含む軽鎖可変領域のCDRを含む重鎖可変領域を含む。任意の公知の方法であって、例えば、本明細書に記載される方法に従って、CDRの特質を決定する。1つの例において、CDRは図21で示される配列を含む。1つの例において、前記タンパク質は、配列番号8に記載の配列に少なくとも約80、または、85、または、90、または、91、または、92、または、93、または、94、または、95、または、96、または、97、または、98、または、99同一である配列を含む重鎖可変領域を含み、および、配列番号10に記載の配列に少なくとも約80、または、85、または、90、または、91、または、92、または、93、または、94、または、95、または、96、または、97、または、98、または、99同一な配列を含む軽鎖可変領域を含む。1つの例において、前記タンパク質は、配列番号8に記載の配列を含む重鎖可変領域を含み、および、配列番号10に記載の配列を含む軽鎖可変領域を含む。配列番号8に記載の重鎖可変領域、および/または、配列番号10に記載の軽鎖可変領域と受託番号PTA-10685でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマが産生する抗体のそのそれらの領域の配列との間に相違がある場合、CRCBT-02-001が産生する抗体の配列が優先する。本発明はまた受託番号PTA-10685でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマが産生する抗体である単離されたタンパク質を提供する。1つの例において、本発明のタンパク質はTreg細胞の機能を阻害する、または、妨害する。別の例において、本発明のタンパク質はTreg細胞の機能を活性化する、または、強化する。本発明のいくつかの例において、前記タンパク質はそのタンパク質と複合体化する化合物を有する。化合物の例は、放射性同位体、検出可能な標識物質、治療用化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象中で前記タンパク質の半減期を増加させる化合物、および、それらのうちの2つ以上の混合物からなる群より選択される。本発明は本発明のタンパク質、および、薬剤的に許容可能な担体を含む組成物をさらに提供する。本発明はまた本発明のタンパク質を固定化する固形担体、または、半固形担体を提供する。本発明は本発明のタンパク質をコードする単離された核酸をさらに提供する。受託番号PTA-10685でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマが産生する抗体のVHをコードする核酸の例は配列番号8に記載の配列を含む。受託番号PTA-10685でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマが産生する抗体のVLをコードする核酸の例は配列番号10に記載の配列を含む。1つの例において、その核酸は発現コンストラクト中のプロモーターに機能的に結合する。本発明は本発明のタンパク質を発現する単離された細胞をさらに提供する。例えば、その細胞は本発明の核酸、および/または、本発明の発現コンストラクトを含む。あるいは、前記細胞はハイブリドーマ、例えば、受託番号PTA-10685でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマである。本発明は、本発明のタンパク質を製造する方法であって、本発明の核酸、および/または、本発明の発現コンストラクトを細胞、または、無細胞系で発現させることを含む方法をさらに提供する。1つの例において、その方法は、前記タンパク質が発現するように受託番号PTA-10685でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマを培養することを含む。いくつかの形態において、その方法は前記タンパク質を単離することをさらに含む。本発明は、試料中のPI16、または、PI16発現細胞を検出する方法であって、もしあれば、試料中のPI16に本発明のタンパク質が結合するように、本発明のいずれか1つのタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体と試料を接触させることを含み、結合したタンパク質を検出する方法をさらに提供する。1つの例において、前記方法は、iもしあれば、試料中のPI16に本発明のタンパク質が結合するように、試料をそのタンパク質と接触させること、iiもしあれば、試料中のPI16に他のタンパク質が結合するように、本発明のタンパク質が結合するのとは異なるPI16中のエピトープに結合する別のタンパク質に試料を接触させること、および、結合したタンパク質のうちの1つ、または、他方、または、両方を検出することを含む。1つの例において、本発明のタンパク質、または、その他のタンパク質は固形担体、または、半固形担体に固定化される。1つの例において、前記方法は、PI16発現細胞がCD4、および/または、CD25、および/または、CD127を発現するかどうか判定することをさらに含む。1つの例において、前記細胞はTreg細胞である。前記細胞はnTreg細胞であることが好ましい。別の例において、前記細胞は、CD45RO、および/もしくは、CD27、および/もしくは、CD95、および/もしくは、CCR6HLADR、および/もしくは、CCR4、および/もしくは、CLAを発現する、ならびに/または、低レベルのCD45RA、および/もしくは、CD146、および/もしくは、CXCR5、および/もしくは、CD69を発現する。例えば、前記細胞はメモリーT細胞、好ましくはメモリーTreg細胞例えば、CD4、CD25、CD27、CD45RO、CD95、HLADR、CCR4、および、CCR6を発現し、ならびに、低レベルのCD127を発現しすなわちCD127-であり、低レベルのCD45RAを発現しすなわちCD45RA-であり、低レベルのCD146を発現しすなわちCD146-であり、低レベルのCD69を発現しすなわちCD69-であり、および、低レベルのCXCR5を発現するすなわちCXCR5-である細胞である。別の例において、前記細胞はメモリーT細胞、好ましくは、メモリーTreg細胞例えば、CD4、および/もしくは、CD25、ならびに/または、低レベルのCD127、および/もしくは、CD45RAを発現する細胞である。本発明の1つの好ましい形態において、前記細胞はメモリーnTreg細胞、好ましくは休止nTreg細胞、または、非活性型nTreg細胞である。1つの例において、前記方法は、CLAを発現する細胞を検出することをさらに含む。CLAの発現は、その細胞が。例えば、炎症性皮膚病例えば、乾癬の治療のために、皮膚へ移動する能力を持つ、または、皮膚に選択的に移動することを示している。1つの例において、前記方法は、Treg特異的脱メチル化領域のメチル化のレベルを検出することをさらに含み、その方法では、低減されたレベルのメチル化、または、メチル化が検出されないことは、その細胞がTreg細胞であることを示す。核酸のメチル化のレベルを測定する方法例えば、バイサルファイト処理後のメチル化特異的PCR、または、制限酵素消化、および/または、シークエンシングは当業者に明らかであり、および/または、本明細書に記載される。本発明はまた内在性制御性TnTreg細胞を誘導性TregiTreg細胞から区別する方法でを提供し、その方法は、本発明のタンパク質が試料中のPI16を発現するTreg細胞に結合するようにTreg細胞を含む試料を本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体と接触させること、およびPI16を発現するTreg細胞を検出することを含み、PI16を発現するTreg細胞はnTreg細胞である。1つの例において、前記方法は、CD4、および/もしくは、CD25を発現し、ならびに/または、低レベルのCD127を発現するPI16発現細胞を検出することをさらに含む。1つの例において、前記方法は、CD45RO、および/または、CD45RA、および/または、CD27、および/または、CD95、および/または、CCR6、および/または、CCR4、および/または、CD146、および/または、CXCR5、および/または、CD39、および/または、CD73、および/または、CD69、および/または、HLADR、および/または、CCR5、および/または、CXCR3、および/または、CXCR4、および/または、CLAを発現するPI16発現細胞を検出することをさらに含む。1つの例において、前記方法は、CD4、CD25、CD27、CD45RO、CD95、HLADR、CLA、CCR4、および、CCR6を発現し、ならびに、低レベルのCD45RA、CD146、CD69、および、CXCR5を発現する細胞を検出することをさらに含む。1つの例において、前記方法は、LRRC32、CD33、TIGIT、IL1R1、ITGAM、NPAL2、CD88、IFNGR2、および、PERPからなる群より選択される1つ以上のタンパク質の上昇したレベルを検出することをさらに含む。1つの例において、前記方法は、CD274、LASS6、ACVR2、CD200R1、CD82、CYBRD1、CYSLTR1、GPR174、NKG7、CD9、LRRN3、NRP2、GPR183、IER3、TMEM200A、LPCAT2、および、ITGA1からなる群より選択される1つ以上のタンパク質の減少したレベルを検出することをさらに含む。本発明は、細胞を単離する方法をさらに提供し、その方法は、本発明の方法を実行して細胞を検出し、検出された細胞を単離すること、または、本発明の方法を実行してnTreg細胞を区別し、区別されたnTreg細胞を単離することを含む。本発明は、PI16を発現する細胞を濃縮した細胞集団を作製する方法をされに提供し、その方法は、本発明のタンパク質が試料中のPI16発現細胞と結合するようにPI16発現細胞を含む細胞集団を本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体と接触させること、およびそのタンパク質が結合した細胞を選択することを含む。1つの例において、濃縮された細胞はTreg細胞、例えば、CD4CD25CD127-である細胞である。いくつかの形態において、前記方法は単離された細胞を培養することをさらに含む。前記細胞を単離する方法は、薬剤的に許容可能な担体とその細胞を製剤し、それによって医薬組成物を製造することをさらに含むことができる。本発明はまた、任意の例に従い、本明細書に記載される方法により単離された細胞、または、任意の例に従い、本明細書に記載される方法により作製された細胞集団を提供する。1つの例において、前記細胞、もしくは、細胞集団は内在性制御性TTreg細胞であり、または、その集団ではnTreg細胞が濃縮されている。1つの例において、nTreg細胞は、PI16を発現しないTreg細胞よりも、炎症性サイトカインへの曝露後の免疫反応を抑制する、より高い能力を有する。1つの例において、nTreg細胞は、対象中の炎症部位での免疫反応を抑制するより高い能力を有する。1つの例において、nTreg細胞は、誘導性TregiTreg細胞よりも、炎症性サイトカイン、例えば、IL-1、および、IL-6への曝露後の免疫反応を抑制する、より高い能力を有する。本開示はまた、PI16、ならびに、CLA、HLADR、および、CCR4からなる群より選択される1つ以上のタンパク質を発現する制御性TTreg細胞が濃縮した細胞集団を提供する。1つの例において、前記細胞はCCR4、および/または、CCR6を発現する。1つの例において、前記細胞は、CD4、および、CD25、ならびに、所望により低レベルの、または、検出できないレベルのCD127をさらに発現する。1つの例において、前記細胞はCD27、および/または、CD95、および/または、CCR6をさらに発現する。1つの例において、前記細胞は低レベルのCD45RAを発現しすなわちCD45RA-であり、低レベルのCD146を発現しすなわちCD146-であり、および、低レベルのCXCR5を発現するすなわちCXCR5-である。1つの例において、前記細胞は対象中の炎症部位に移動する能力を持つ。1つの例において、前記細胞は炎症部位に優先的に移動する。1つの例において、前記細胞はTH17介在性炎症部位に優先的に移動する。1つの例において、前記細胞は対象中の皮膚例えば、皮膚の炎症部位に移動する能力を持つ。1つの例において、前記細胞は皮膚例えば、皮膚の炎症部位に優先的に移動する。1つの例において、前記細胞はTH17介在性皮膚炎の部位に優先的に移動する。本開示はまた、受託番号PTA-10685でATCCに寄託されたCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマが産生する抗体と反応する制御性TTreg細胞が濃縮した細胞集団を提供する。本発明はまた対象の症状を診断する、および/または、予後予測する方法を提供し、その方法は、本発明の方法を実行して対象由来の試料中のPI16、または、PI16発現細胞を検出することを含み、その方法においてPI16、または、PI16発現細胞の検出、または、未検出がその症状の診断に役立つ、または、その症状の予後予測に役立つ。1つの例において、前記方法は、i試料、または、その一部の中のPI16、または、PI16発現細胞の量を測定する、または、推定すること、ii正常な対象、および/または、健康な対象に由来する試料中のPI16、または、PI16発現細胞の量を比較すること、を含み、正常な対象、および/または、健康な対象に由来する試料中のPI16、または、PI16発現細胞の量と比較して上昇した、または、減少したiでのPI16、または、PI16発現細胞の量は、その対象がその症状を患っていることを示す。別の例において、本発明は、ある症状の治療の効力をモニターする方法であって、i本発明の方法を実行して試料、または、その一部の中のPI16、または、PI16発現細胞の量を測定、または、推定すること、ii対照の対象に由来する試料の中のPI16、または、PI16発現細胞の量を比較することを含む方法を提供し、その方法において、a対照試料は正常な、または、健康な対象に由来し、そして、対照試料中のPI16、または、PI16発現細胞の量と比較して類似のiのPI16、または、PI16発現細胞の量は、その対象がその症状の治療に応答していることを示す、b対照試料は正常な、または、健康な対象に由来し、そして、対照試料中のPI16、または、PI16発現細胞の量と比較して上昇した、または、減少したiのPI16、または、PI16発現細胞の量は、その対象がその症状の治療に応答していないことを示す、c対照試料は以前の時点の対象例えば、治療開始前に由来し、そして、対照試料中のPI16、または、PI16発現細胞の量と比較して類似のiのPI16、または、PI16発現細胞の量は、その対象がその症状の治療に応答していないことを示す、または、d対照試料は以前の時点の対象例えば、治療開始前に由来し、そして、対照試料中のPI16、または、PI16発現細胞の量と比較して上昇した、または、減少したiのPI16、または、PI16発現細胞の量は、その対象がその症状の治療に応答していることを示す。好ましい例において、前記症状はTreg細胞関連症状である。例えば、iTreg細胞関連症状は、試料中のPI16発現Treg細胞レベルの低減、または、PI16レベルの低減を検出することにより診断される/予後予測される自己免疫疾患である、iiTreg細胞関連症状は、試料中のPI16発現Treg細胞レベルの上昇、または、PI16レベルの上昇を検出することにより診断される/予後予測される炎症である、または、iiiTreg細胞関連症状は、試料中のPI16発現Treg細胞レベルの上昇、または、PI16レベルの上昇を検出することにより診断される/予後予測される癌である。1つの例において、Treg細胞関連症状は、炎症部位に由来する試料中のPI16発現Treg細胞のパーセンテージの変化を検出することにより診断される/予後予測される炎症である。その細胞のパーセンテージの変化はレベルの上昇、または、レベルの減少である可能性があり、好ましくは、レベルの減少である。この点について、PI16発現Treg細胞のパーセンテージがPI16-Treg細胞に対するPI16Treg細胞のパーセンテージとして表されることが好ましい。1つの例において、Treg細胞関連症状は、炎症部位に由来する試料中のPI16-Treg細胞に対するPI16Treg細胞の割合の変化を検出することにより診断される/予後予測される炎症である。その細胞の割合の変化はレベルの上昇PI16-Treg細胞に対するPI16Treg細胞の数の増加、または、レベルの減少PI16-Treg細胞に対するPI16Treg細胞の数の減少である可能性があり、好ましくは、レベルの減少である。1つの例において、炎症部位は滑液を含む。1つの例において、炎症は関節炎である。1つの例において、炎症は若年性特発性関節炎である。本発明のタンパク質はまた、インビボでPI16、または、PI16発現細胞を検出する画像化方法を容易にする。したがって、本発明はまたPI16発現細胞関連症状の位置を特定し、および/または、その症状を検出し、および/または、その症状を診断し、および/または、その症状の予後予測をする方法であって、インビボで本発明のタンパク質に結合した化合物を検出することを含む方法を提供し、その方法において、結合した化合物の検出がその症状の位置を特定し、および/または、その症状を検出し、および/または、その症状を診断し、および/または、その症状の予後予測をする。1つの例において、本発明は、PI16発現細胞関連症状の位置を特定し、および/または、その症状を検出し、および/または、その症状を診断し、および/または、その症状の予後予測をする方法であって、iもしあれば、PI16発現細胞に本発明のタンパク質が結合するように、化合物例えば、検出可能な標識物質と複合体化した本発明のタンパク質を対象に投与すること、および、iiそのタンパク質に結合する化合物をインビボで検出し、結合する化合物の検出がその症状の位置を特定し、および/または、その症状を検出し、および/または、その症状を診断し、および/または、その症状の予後予測をすることを含む方法を提供する。1つの例において、前記方法は本明細書に記載される診断方法/予後予測方法/位置特定方法/検出方法の結果を、紙上で、または、機械可読形式で提供することをさらに含む。本発明はまたある症状を治療する、または、予防する方法であって、本明細書に記載される診断方法、または、予後予測方法の結果を得ること、および、適切な治療化合物、または、予防化合物を投与することを含む方法を提供する。例えば、その症状が癌であるとき、その化合物は化学療法化合物であり得、または、その症状が自己免疫症状であるとき、その化合物は抗炎症薬、および、抗TNF化合物、抗CD20化合物などであり得る。本発明はまたある症状を治療、または、予防する方法であって、本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体、または、本発明の方法により単離された細胞、または、本発明の細胞集団をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。1つの例において、その方法は制御性TTreg細胞の数、もしくは、活性の低減に関連する症状を治療し、もしくは、抑制し、および/または、免疫抑制を誘導し、および/または、細胞傷害性T細胞CTL、もしくは、ヘルパーT細胞の活性を対象中で低下させ、そして、その方法は、i本発明の方法を実行することでTreg細胞が濃縮した集団を単離すること、または、本発明の細胞集団を得ること、および、iiiの細胞を対象に投与することを含む。1つの例において、前記方法はTreg細胞機能を活性化する、または、強化する本発明のタンパク質を投与することを含む。別の例において、前記方法は制御性TTreg細胞の数、もしくは、活性の低減に関連する症状を治療し、もしくは、予防し、および/または、免疫抑制を誘導し、および/または、細胞傷害性T細胞CTL、もしくは、ヘルパーT細胞の活性を対象中で低下させ、そして、その方法は本発明の固形担体、もしくは、半固形担体を対象内のある部位に投与する、または、移植することを含み、そのタンパク質がTreg細胞に結合し、そして、その部位にその細胞を固定化する。1つの例において、その固形担体、または、半固形担体は、投与、または、移植の前にTreg細胞をその上に固定化させる。例えば、前記対象は自己免疫疾患を患っている、もしくは、自己免疫疾患を発生する危険にある、および/または、前記対象は移植を受ける予定である、もしくは、受けるところである、もしくは、受けたところである。別の例において、前記症状は対象の免疫系の制御性TTreg細胞介在による抑制に関連し、および、前記方法はその対象に本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体を投与することを含む。例えば、前記対象は癌を患っており、そして、前記タンパク質、または、組成物、または、固形担体、もしくは、半固形担体の投与がその対象中のTreg細胞の数、および/または、活性を低減し、そして、その対象の免疫系がより効率的に癌に応答することを可能にする。1つの例において、前記タンパク質はTreg細胞を殺し、および/または、Treg細胞に毒性化合物を送達し、および/またはTreg細胞の機能を阻害する。別の例において、本発明は、ある症状を治療する、または、予防する方法であって、前記タンパク質がPI16を発現する細胞に結合するように対象の血液を本発明の固形担体、もしくは、半固形担体に接触させることを含み、そして、その血液からその細胞を除去する方法を提供する。そのような方法は対象の血液からTreg細胞を取り除くこと、および、免疫反応を誘導すること、または、免疫反応が起こることを可能にすることに有用である。この例において、固形担体、もしくは、半固形担体は、例えば、除去療法に使用される担体であることができる。処理された血液が対象に戻されることが好ましい。本発明はまた対象中の免疫反応を調節する方法であって、本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体、または、本発明の方法により単離された細胞、または、本発明の細胞集団をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。1つの例において、前段落の方法は対象において免疫反応を誘導し、刺激し、または、促進するための方法であり、そして、その方法は本発明のタンパク質、または、本発明の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。別の例において、前記方法は、対象の血液を本発明の固形担体、もしくは、半固形担体に接触させることを含み、前記タンパク質が制御性TTreg細胞に結合し、そして、血液からその細胞を除去する。1つの例において、免疫反応は抗体の産生、および/または、細胞傷害性T細胞介在性免疫反応である。対象で免疫反応を誘導する、刺激する、または、促進する方法の1つの例において、前記タンパク質は免疫原性化合物を含む組成物の投与の前に、または、投与と同時に投与される。別の例において、前記方法は、本発明の方法によって単離されたTreg細胞を投与して、それによって免疫反応を抑制する、または、妨害することを含む。1つの例において、Treg細胞を細胞または組織とともに、例えば、骨髄とともに投与して、それによって移植片対宿主反応、または、宿主対移植片反応を低減させる、または、防止する。Treg細胞は、前記対象、または、別の対象、好ましくは、健康な対象のTreg細胞であり得る。本発明はまた化合物をPI16発現細胞に送達する方法であって、化合物と複合体化している本発明のタンパク質とその細胞を接触させることを含む方法を提供する。1つの例において、対象にそのタンパク質を投与することでその細胞をインビボで接触させる。本発明はまた本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体、または、本発明の方法を実行することにより単離された細胞、または、本発明の細胞集団の医薬品での利用を提供する。例えば、本発明は、PI16の発現に関連する症状の治療用医薬の製造における前記タンパク質、組成物固形担体、もしくは、半固形担体、または、細胞の利用を提供する。1つの例において、その症状はTreg細胞関連症状である。1つの例において、前記医薬は本発明の方法を実行することにより単離された細胞を含み、および、それは自己免疫疾患の治療用であり、および/または、前記対象は移植を受ける予定である、もしくは、受けるところである、もしくは、受けたところである。1つの例において、前記医薬は前記タンパク質、または、前記組成物を含み、そして、前記症状は対象の免疫系のTreg細胞介在性抑制と関連する。本発明はまた対象の免疫系を調節する医薬の製造における本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体、または、本発明の方法を実行することにより単離された細胞の利用を提供する。本発明者らはまた、PI16発現Treg細胞は、TH17細胞によっても発現されるケモカイン受容体、例えば、CCR4、および/または、CCR6を発現し、ならびに、CCR4、および/または、CCR6のリガンドに応答して移動することを示した。したがって、これらの細胞はTH17細胞と同じ部位に移動し、炎症反応を抑制するので、このことがPI16発現Treg細胞をTH17介在性症状の治療に特に有益なものとする。したがって、本開示はまたPI16を発現する制御性TTreg細胞を投与することを含むTH17介在性症状を治療する方法を提供する。1つの例において、前記Treg細胞はCCR4、および/または、CCR6をさらに発現する。1つの例において、前記Treg細胞は全身に投与され、そして、TH17介在性症状の部位に移動する。本発明者らはまた、PI16を発現するTreg細胞例えば、CRCBT-02-001抗体を用いて単離したTreg細胞はCLAを発現することを示した。このことは、その細胞は皮膚に移動することができることを、または、優先的に皮膚に移動することを示している。したがって、本開示はまたPI16を発現する制御性TTreg細胞を投与することを含む皮膚病を治療する方法を提供する。1つの例において、前記Treg細胞はCCR4、および/または、CCR6をさらに発現する。1つの例において、前記Treg細胞は全身に投与され、そして、皮膚病の部位に移動する。1つの例において、前記皮膚病は炎症性皮膚病、例えば、TH17介在性皮膚病である。本発明者らはまた、PI16発現Treg細胞は炎症性サイトカインに曝露された後にエフェクターT細胞を抑制する活性を維持し、一方、PI16-iTreg細胞はその活性を維持しないことを明らかにした。したがって、炎症反応を起こしている部位にPI16発現Treg細胞を直接投与して治療上の利益をもたらすことができる。したがって、本開示はまた、炎症部位にPI16を発現する制御性TTreg細胞を投与することを含む炎症の治療方法を提供する。1つの例において、前記炎症部位はインターロイキンIL1β、および/または、IL6の発現を特徴とする。1つの例において、前記炎症は若年性特発性関節炎である。対象に投与するのに適切な細胞は、PI16発現Treg細胞が濃縮した細胞集団を含む。1つの例において、その細胞集団は、受託番号PTA-10685でATCCに寄託されたCRCBT-02-001と反応するTreg細胞が濃縮された細胞集団である。本発明者らはまた、炎症部位で、例えば、若年性特発性関節炎でPI16発現Treg細胞のパーセンテージが減少し、一方、CD4CD25CD127-Treg細胞の総数は上昇することを示した。したがって、本開示はまた、Treg細胞関連炎症の診断方法であって、炎症部位に由来する試料中のPI16発現Treg細胞のパーセンテージを検出することを含む方法を提供し、その方法においてPI16発現Treg細胞のパーセンテージの減少は前記症状の指標である。この点について、PI16発現Treg細胞のパーセンテージがPI16-Treg細胞に対するPI16Treg細胞のパーセンテージとして表されることが好ましい。別の例において、本開示は、Treg細胞関連炎症を診断する方法であって、炎症部位に由来する試料中のPI16-Treg細胞に対するPI16Treg細胞の割合を判定することを含む方法を提供し、その方法においてPI16-Treg細胞に対して減少したPI16Treg細胞の割合は前記症状の指標である。1つの例において、前記炎症部位は滑液である。1つの例において、前記症状は関節炎である。1つの例において、前記症状は若年性特発性関節炎である。診断方法の1例において、PI16発現Treg細胞のレベルは、前記対象の血流、および/または、正常な、もしくは、健康な対象の血流におけるレベルと比較して低下する。本発明はまた内在性制御性TnTreg細胞を誘導性TregiTreg細胞と区別する方法であって、LRRC32、CD33、TIGIT、IL1R1、ITGAM、NPAL2、CD88、IFNGR2、および、PERPからなる群より選択される1つ以上のタンパク質の発現レベルが上昇したTreg細胞を検出することを含む方法を提供し、その方法においてそのタンパク質の発現レベルが上昇したTreg細胞はnTreg細胞である。本発明はまた内在性制御性TnTreg細胞を誘導性TregiTreg細胞と区別する方法であって、CD274、LASS6、ACVR2、CD200R1、CD82、CYBRD1、CYSLTR1、GPR174、NKG7、CD9、LRRN3、NRP2、GPR183、IER3、TMEM200A、LPCAT2、ITGA1からなる群より選択される1つ以上のタンパク質の発現レベルが減少したTreg細胞を検出することを含む方法を提供し、その方法においてそのタンパク質の発現レベルが減少したTreg細胞はnTreg細胞である。1つの例において、前記の上昇した、または、減少した発現レベルはiTreg細胞、または、CD25-細胞の発現レベルに関連がある。本発明はまた誘導性制御性TiTreg細胞を内在性TregnTreg細胞と区別する方法であって、TIGIT、CD88、IFNGR2、PERP、LASS6、GPR174、NKG7、CD9、LRRN3、MRP2、GPR183、IER3、TMEM200A、LPCAT2、および、ITGA1からなる群より選択される1つ以上のタンパク質の発現レベルが上昇したTreg細胞を検出することを含む方法を提供し、その方法においてそのタンパク質の発現レベルが上昇したTreg細胞はiTreg細胞である。本発明はまた誘導性制御性TiTreg細胞を内在性TregnTreg細胞と区別する方法であって、LRRC32、CD33、IL1R1、ITGAM、NPAL2、CD274、CD82、および、CYBRD1からなる群より選択される1つ以上のタンパク質の発現レベルが減少したTreg細胞を検出することを含む方法を提供し、その方法においてそのタンパク質の発現レベルが減少したTreg細胞はiTreg細胞である。1つの例において、前記の上昇した、または、減少した発現レベルはCD25-細胞の発現レベルに関連がある。本発明はまた免疫グロブリンFc領域に融合したPI16の細胞外ドメインを含む単離されたタンパク質を提供する。例えば、PI16の細胞外ドメインは抗体、例えば、IgG1抗体のFc領域に融合した。1つの例においてPI16の細胞外ドメインは配列番号40に記載の配列を含む、または、それから成る。配列表の解説配列番号1はヒトHomosapiensPI16のアミノ酸配列である。配列番号2はマウスMusmusculusPI16のアミノ酸配列である。配列番号3はラットRattusnovigenicusPI16のアミノ酸配列である。配列番号4はチンパンジーPantroglodytesPI16のアミノ酸配列である。配列番号5はヒトPI16オープンリーディングフレームを増幅するためのオリゴヌクレオチドの配列である。配列番号6はヒトPI16オープンリーディングフレームを増幅するためのオリゴヌクレオチドの配列である。配列番号7はハイブリドーマCRCBT-02-001で産生される抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列である。配列番号8はハイブリドーマCRCBT-02-001で産生される抗体の重鎖をコードするアミノ酸配列である。配列番号9はハイブリドーマCRCBT-02-001で産生される抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。配列番号10はハイブリドーマCRCBT-02-001で産生される抗体の重鎖をコードするアミノ酸配列である。配列番号11はマウス免疫グロブリン軽鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号12はマウス免疫グロブリン軽鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号13はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号14はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号15はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号16はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号17はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号18はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号19はFoxP3の領域を増幅するプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号20はFoxP3の領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号21はPI16の領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号22はPI16の領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号23はRPL13aの領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号24はRPL13aの領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号25はPI16の28~443アミノ酸をコードする核酸を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号26はPI16の28~443アミノ酸をコードする核酸を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号27はPI16のペプチド断片のアミノ酸配列である。配列番号28はTSDRを増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号29はTSDRを増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号30はM13ユニバーサル順方向プライマーのヌクレオチド配列である。配列番号31はM13ユニバーサル逆方向プライマーのヌクレオチド配列である。配列番号32はCRCBT-02-001抗体が結合するヒトPI16のペプチド断片のアミノ酸配列である。配列番号33はファージクローン15が発現するPI16の断片のアミノ酸配列である。配列番号34はファージクローン12が発現するPI16の断片のアミノ酸配列である。配列番号35はファージクローン10が発現するPI16の断片のアミノ酸配列である。配列番号36はファージクローン7が発現するPI16の断片のアミノ酸配列である。配列番号37はファージクローン4が発現するPI16の断片のアミノ酸配列である。配列番号38はファージクローン15、12、10、7、および、4の配列の重複領域のアミノ酸配列である。配列番号39はファージクローン4、および、7に共通のヒトPI16のペプチド断片のアミノ酸配列である。配列番号40はヒトPI16外部ドメインのアミノ酸配列である。全般的な説明この明細書を通して、特に記述のない限り、または、文脈から必要とされない限り、1つのステップ、1つの組成物、1群のステップ、または、1群の組成物への言及は、単数の、および、複数のすなわち、1つ以上のそれらのステップ、組成物、群のステップ、または、群の組成物を包含すると理解されるものとする。当業者は、本明細書に記載される本発明は具体的に記載されているもの以外に変形と改変の余地があること理解するであろう。本発明はそのような変形と改変の全てを含むと理解されるものとする。本発明はまたこの明細書で言及される、または、示されるステップ、特徴、組成物、および、化合物の全てを個々に、または、まとめて含み、そして、前記のステップ、または、特徴のありとあらゆる組合せ、または、任意の2つ以上の前記のステップ、または、特徴を含む。本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によってその範囲が限定されるものではなく、具体的な実施形態は例示の目的のみで用いられることを意図している。同等の機能を持つ製品、組成物、および、方法は明らかに本明細書に記載される発明の範囲に入る。本明細書に記載のどの実施形態も、特に記載のない限り、その他のどの実施形態にも必要な変更を加えて適用されると理解されるものとする。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、および、科学用語は例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および、生化学における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有すると理解されるものとする。特に示されない限り、本発明で使用される組換えタンパク質技術、細胞培養技術、および、免疫学的技術は当業者に周知の標準的技法である。そのような技術は、様々な文献、例えば、Perbal1984年、Sambrookら1989年、Brown1991年、GloverおよびHames1995年、および、1996年、ならびに、Ausubelら1988年、現時点までの全ての最新情報を含む、HarlowおよびLane,1988年、Coliganら現時点までの全ての最新情報を含む、ならびに、Zola1987年を通して記述され、および、説明されている。本明細書における可変領域、および、その部分、免疫グロブリン、抗体、および、その断片の叙述と定義をKabat,1987年および/もしくは1991年、Borkら,1994年、ならびに/または、ChothiaおよびLesk,1987年および/もしくは1989年、または、Al-Lazikaniら,1997年での議論によってさらに明確にすることができる。および/またはという用語、例えば、X、および/または、Yは、X、および、YかX、または、Yのどちらかを意味すると理解され、両方、または、どちらかを明示的に意味するものとして理解されるものとする。この明細書を通じて、含むcompriseという言葉、または、含むcomprises、または、含んでいるcomprisingのような変形形態は、明示された要素、完全体、または、ステップ、要素の群、複数の完全体、または、ステップの包含を意味するが、他の要素、完全体、または、ステップ、要素の群、複数の完全体、または、ステップの排除を意味しないと理解されるであろう。本明細書で使用される由来するという用語は、特定された完全体を特定の出所から、必ずしもその出所から直接というわけではないが、得ることができることを意味すると理解されるものとする。定義選集当業者は、抗体は、少なくとも1つの可変領域に含有される抗原結合部位によって1つの抗原、または、少数の近縁の抗原例えば、PI16に特異的に結合する能力を持つ免疫タンパク質を含むことを理解するであろう。この用語は4本鎖抗体例えば、2本の軽鎖、および、2本の重鎖、組換え、または、修飾抗体例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、半抗体、二重特異性抗体、ならびに、ドメイン抗体、および、重鎖のみ抗体のような単一ドメイン抗体例えば、ラクダ類抗体、または、軟骨魚類免疫グロブリン新規抗原受容体IgNARsを含む。抗体は一般的に定常ドメインを含み、それらのドメインが並べられて定常領域、または、定常断片、または、結晶化可能断片Fcになることができる。好ましい形態の抗体はその基本単位として4本鎖構造を含む。完全長の抗体は、共有結合で連結した2本の重鎖約50~70kDと2本の軽鎖約23kDずつを含む。軽鎖は可変領域と定常ドメインを一般に含み、そして、哺乳類ではκ軽鎖かλ軽鎖のどちらかである。重鎖は可変領域、および、1つの、または、2つの定常ドメイン、および、その定常ドメインとヒンジ領域で連結されたその他の定常ドメインを一般に含む。哺乳類の重鎖は、α、δ、ε、γ、または、μのうちのどれかである。各軽鎖はまた重鎖のうちの1本と共有結合する。例えば、2本の重鎖、ならびに、重鎖、および、軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合と非共有結合性相互作用によって1つにまとめられる。鎖間ジスルフィド結合の数は様々な種類の抗体の間で変わることができる。各鎖はN末端可変領域VH、または、VL、それぞれ長さが約110アミノ酸である。と1つ以上の定常ドメインをC末端に持つ。軽鎖の定常ドメイン長さが約110アミノ酸であるCLは重鎖の第1定常ドメイン長さが約330~440アミノ酸のCHと整列し、ジスルフィド結合で結合する。軽鎖可変領域は重鎖の可変領域と整列する。抗体の重鎖は2つ以上のその他のCHドメイン例えば、CH2、CH3などを含むことができ、そして、CH1定常ドメインとCm定常ドメインの間に特定することができるヒンジ領域を含むことができる。抗体は、どのようなタイプ例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、および、IgY、クラス例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、および、IgA2、または、サブクラスでもあり得る。抗体はネズミ科マウス、または、ラット抗体、または、霊長類好ましくは、ヒト抗体であることが好ましい。本明細書で使用される可変領域という用語は、抗原に特異的に結合する能力を持ち、好ましくは、CDRs、すなわち、CDRl、CDR2、および、CDR3、および、FRのアミノ酸配列を含む、本明細書で定義される抗体の軽鎖、および/または、重鎖の部分を意味する。可変領域が3つ、または、4つのFR例えば、FR1、FR2、FR3、および、所望によりFR4を3つのCDRとともに含むことが好ましい。VHは重鎖の可変領域を意味する。VLは軽鎖の可変領域を意味する。本発明の実行にあたって、Kabat1987年、および、1991年、または、その他の付番方式、例えば、Clothia、および、Leskの超可変ループ付番方式1987年および/もしくは1989年、ならびに/または、Al-Lazikaniら,1997年に従ってCDRとFRに割り当てられたアミノ酸位置を定義することができる。例えば、Kabatの付番方式によれば、VHのFRsとCDRsの位置は次のように残基1~25、または、1~30FRl、31~25CDR1、36~49FR2、50~65CDR2、66~94FR3、95~102CDR3、および、103~113FR4とKabatの付番方式に従って番号を付けて示される。1つの例において、VHは、前記重鎖と複数の好ましくは、3つの、または、4つの定常ドメインを含む抗体に由来する、または、定常断片Fcに結合する。好ましくは、VLは、次のように残基1~23FRl、24~34CDR1、35~49FR2、50~56CDR2、57~88FR3、89~97CDR3、および、98~107FR4とKabatの付番方式に従って番号を付けて位置を示されるFRとCDRを含む。1つの例において、VLは、1つの定常ドメインに結合した前記VLおよび/または定常断片Fcに結合しない前記VLを含む抗体に由来する。本明細書で使用される相補性決定領域CDR、すなわちCDRl、CDR2、および、CDR3と同義という用語は、その存在が抗原の結合に必要な抗体可変ドメインのアミノ酸残基を意味する。各可変ドメインは、典型的には、CDRl、CDR2、および、CDR3として特定される3つのCDR領域を有する。各相補性決定領域はKabatら1991年によって定義される相補性決定領域のアミノ酸残基、および/または、Chothia、および、Lesk1987年の超可変ループのアミノ酸残基、または、IMGT付番方式LeFrancら,2003年を含む全ての公知の付番技法、または、それらの組合せのアミノ酸残基を含むことができる。例えば、重鎖可変領域では、CDRH1は残基31~35の間にあり、CDRH2は残基50~65の間にあり、および、CDRH3は残基95~102の間にある。軽鎖において、CDRL1は残基24~34の間にあり、CDRL2は残基50~56の間にあり、および、CDRL3は残基89~97の間にある。これらのCDRsはまた、多数の挿入、例えば、Kabat1987年および/または1991年に記載される挿入を含むことができる。フレームワーク領域これ以降、FRはCDR残基以外のそれら可変ドメイン残基である。本明細書で使用されるFvという用語は、複数のポリペプチドから成るにせよ、または、単数のポリペプチドから成るにせよ、VLとVHが結合して抗原結合部位を有する複合体を形成する、すなわち、抗原に特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質を意味すると理解されるものとする。抗原結合部位を形成するVHとVLは1つのポリペプチド鎖、または、異なるポリペプチド鎖の中にあり得る。さらに、本発明のFvはならびに、本発明の任意のタンパク質は、同じ抗原に結合することができる、または、できない複数の抗原結合部位を有することができる。この用語は、抗体、ならびに、組換え技術を用いて作製されたそのような断片に対応するタンパク質に直接由来する断片を包含すると理解されるものとする。いくつかの例、例えば、ドメイン抗体、または、単一ドメイン抗体では、VHは重鎖定常ドメインCH1に結合せず、および/または、VLは軽鎖定常ドメインCLに結合しない。例となるFv含有ポリペプチド、または、Fv含有タンパク質は、Fab断片、Fab’断片、Fab’断片、scFv、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、または、高次複合体、または、定常領域、もしくは、そのドメイン、例えば、CH2、もしくは、CH3ドメイン、に結合する先述の例のいずれか、例えば、ミニ抗体を含む。Fab断片は免疫グロブリンの一価抗原結合断片から成り、そして、酵素パパインで抗体全体を消化して軽鎖全体と重鎖の一部からなる断片を作り出すことで作製され得る、または、組換え技術を用いて作製され得る。抗体のFab’断片は、抗体全体をペプシンで処理し、引き続いて還元処理し、軽鎖全体、および、VHと1つの定常ドメインを含む重鎖の一部から成る分子を作り出すことで得ることができる。この方法で処理された1つの抗体から2つのFab’断片を得る。Fab’断片はまた組換え技術で作製されることができる。抗体のFab’2断片は、2本のジスルフィド結合によって1つにまとめられた2つのFab’断片でできた二量体から成る。そして、抗体全体を酵素ペプシンで処理し、次に還元処理しないことでFab’2断片を得る。Fab2断片は、例えば、ロイシンジッパー、または、CH3ドメインを用いて結合された2つのFab断片を含む組換え断片である。単鎖Fv、または、scFvは、軽鎖の可変領域、および、重鎖の可変領域が適切で柔軟なポリペプチドリンカーによって共有結合で結合されている抗体の可変領域断片Fvを含有する組換え分子である。この用語の範囲内にあるタンパク質を含むFvの例についての詳細な考察は本明細書において以下に提供される。本明細書で使用される抗原結合部位という用語は、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質によって作られる構造を意味すると理解されるものとする。抗原結合部位は一連の連続するアミノ酸、または、単一ポリペプチド鎖の形状のアミノ酸である必要もない。例えば、2本の異なるポリペプチド鎖から作製されるFvでは、抗原結合部位は、抗原と相互作用し、および、常にというわけではないが、一般に各可変領域につき1つ以上のCDRsを有するVLとVHの一連の領域からなる。本明細書で使用される定常領域という用語はCR、または、結晶化可能断片、または、Fcと同義、少なくとも1つの定常ドメインを含み、ならびに、一般に必ずというわけではないがグリコシル化されており、ならびに、1つ以上のF受容体、および/または、例えば、エフェクター機能を与える補体カスケードの構成要素に結合する抗体の一部分を意味する。重鎖定常領域はα、δ、ε、γ、または、μの5つのアイソタイプのいずれかより選択されることができる。さらに、重鎖のIgGサブクラスのような様々なサブクラスの重鎖が様々なエフェクター機能の原因であり、したがって、望ましい重鎖定常領域を選択することにより、望ましいエフェクター機能を有するタンパク質を作製することができる。好ましい重鎖定常領域はγ1IgG1、γ2IgG2、および、γ3IgG3である。定常ドメインは、抗体/同じ種類の抗体、例えば、IgG、または、IgM、または、IgEにおいて非常に類似した配列を持つ抗体中のドメインである。抗体の定常領域は一般に複数の定常ドメインを含み、例えば、γ重鎖、α重鎖、および、δ重鎖の定常領域は3つの定常ドメインを含み、そして、γ重鎖、α重鎖、および、δ重鎖のFcは2つの定常ドメインを含む。μ重鎖、および、ε重鎖の定常領域は4つの定常ドメインを含み、そして、Fc領域は2つの定常ドメインを含む。単離されたという用語は、タンパク質がその天然環境から実質的に取り除かれること、例えば、タンパク質が異種性の環境中にあることを意味し、および/または、タンパク質に夾雑する物質が実質的に無いこと、例えば、夾雑する物質が少なくとも約70、もしくは、75、もしくは、80、もしくは、85、もしくは、90、もしくは、95、もしくは、96、もしくは、97、もしくは、98、もしくは、99無いことを意味する。タンパク質という用語は、1本のポリペプチド鎖すなわち、ペプチド結合で連結した一連の連続するアミノ酸、または、共有結合で、もしくは、非共有結合で互いに連結する一連のポリペプチド鎖すなわち、ポリペプチド複合体を含むと理解されるものとする。例えば、前記の一連のポリペプチド鎖は、適切な化学結合、または、ジスルフィド結合を用いて共有結合で連結されることができる。非共有結合の例は、水素結合、イオン性結合、ファンデルワールス力、および、疎水性相互作用を含む。本発明で考えられている非共有結合は、例えば、ある形状の二重特異性抗体、または、三重特異性抗体、または、四重特異性抗体、または、FvにおけるVHとVLの間の相互作用である。ポリペプチド鎖という用語は、ペプチド結合で連結する一連の連続するアミノ酸を意味することを前段落から意味すると理解されるであろう。本明細書で使用される特異的に結合するという用語は、本発明のタンパク質が特定の抗原、または、特定の複数の抗原、または、前記のものを発現する細胞と、別の抗原、または、細胞と反応する、または、結合するよりも頻繁に、急速に、長い時間反応する、または、結合することを意味すると理解されるものとする。例えば、ある抗原に特異的に結合するタンパク質は、そのタンパク質がその他の抗原に結合するよりも高い親和性で、より強い結合力で、より容易に、および/または、より長い時間、その抗原に結合する。例えば、第1の抗原に特異的に結合するタンパク質は第2の抗原に特異的に結合することができる、または、できないということもまたこの定義を読むことにより理解される。それ故、特異的な結合は排他的な結合、または、別の抗原の検出限界以下の結合を必ずしも必要とせず、選択的な結合という用語がこのことを意味する。一般に、必ずというわけではないが、結合と言えば特異的結合を意味し、そして、各用語は他方の用語を明示的にに裏付けると理解されるものとする。本明細書で使用される実質的に結合しないという表現は、タンパク質が、そのタンパク質が結合すると知られている抗原に結合するレベルの20、または、15、または、10、または、9、または、8、または、7、または、6、または、5、または、4、または、3、または、2を超えるレベルで、ある抗原に結合することがないことを意味すると理解されるものとする。1つの例において、結合は、ウェスタンブロッティング、および/または、FACS、および/または、ELISA、および/または、例えば、粒子、例えば、ファージの表面上の抗体可変領域による抗体パニング、および/または、BIAcore解析によって検出される。例えば、本発明のタンパク質は、正しく折りたたまれ、ジスルフィド結合で結合したPI16に結合するレベルの20以下、または、15以下、または、10以下のレベルで還元型アルキル化PI16に結合する。本明細書で使用される検出できるほど結合しないという表現は、バックグラウンドを有意に超えるレベルで抗原にタンパク質が結合しないことを、例えば、バックグラウンドよりも10未満、または、8、または、6、または、5高いレベルでPI16に結合することを意味すると理解されるものとする。ある抗体の場合、その抗体はアイソタイプ対照抗体よりも10未満、または、8、または、6、または、5高いレベルで抗原に結合する。1つの例において、結合は、ウェスタンブロッティング、および/または、FACS、および/または、ELISA、および/または、例えば、粒子、例えば、ファージの表面上の抗体可変領域による抗体パニング、および/または、BIAcore解析によって検出される。本明細書で使用されるある配列を含むエピトープに特異的に結合するという用語は、タンパク質が列挙された配列内の1つ以上の残基に結合する、または、その残基と接触することを意味すると理解されるであろう。その用語は、結合に関わるPI16のその他の成分を排除するものではない。例えば、本明細書に例示されるタンパク質はある配列に結合するが、しかしながら、結合した配列の外側にあるPI16中のジスルフィド結合の存在が結合に影響を与える。1つの例において、そのタンパク質はPI16中の他のどんなエピトープにも結合しない。本明細書で使用されるある配列に含有されるエピトープという用語は、列挙された配列内にタンパク質が結合する配列が含有されることを意味すると理解されるであろう。その用語は、結合に関わるPI16のその他の要素を排除しない。例えば、本明細書に例示されるタンパク質はある配列に結合するが、しかしながら、結合した配列の外側にあるPI16中のジスルフィド結合の存在がその結合に影響を与える。1つの例において、そのタンパク質はPI16中の他のどんなエピトープにも結合しない。エピトープはPI16内のジスルフィド結合の形成に依存している。という表現は、PI16がジスルフィド結合を含むとき、あるタンパク質が結合するが、しかしながら、それは、PI16がジスルフィド結合を含まないとき例えば、還元化された、および/または、アルキル化されたとき、実質的に結合しないエピトープを意味すると理解されるであろう。本明細書で使用される還元型という用語は、ジスルフィド結合を壊すように処理されたタンパク質、および/または、タンパク質中のスルフヒドリルSH基の酸化を還元するように処理されたタンパク質を意味すると理解されるものとする。本明細書で使用されるCRCBT-02-001という名称のハイブリドーマという用語は、受託番号PTA-10685でATCCに寄託された米国標準培養コレクションATCCという名称のハイブリドーマを意味すると理解されるものとする。本明細書のいくつかの場合において、CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマによって分泌される抗体はCRCBT-02-001と称される。本明細書で使用されるペプチダーゼインヒビター16、または、PI16高システイン分泌タンパク質9、CRISP9、PSP96結合タンパク質、または、PSPBPと同義は、前立腺分泌タンパク質PSP94と相互作用する高システイン分泌タンパク質CRISPファミリーのタンパク質を意味すると理解されるであろう。PI16の例はReevesら2005年に記載される。ヒトPI16の配列の例は配列番号1に示される。マウスPI16の配列の例は配列番号2に示される。ラットPI16の配列の例は配列番号3に示される。チンパンジーPI16の配列の例は配列番号4に示される。図1に示される配列アラインメントにおいて明らかにされるように、ヒト、マウス、ラット、および、チンパンジーのPI16という最も多様な配列は52の配列同一性を共有する。したがって、PI16という用語と関連の用語は、配列番号1~4の1つ以上に記載の配列と少なくとも約52同一の配列を含むタンパク質を包含する。好ましくは、PI16はヒトPI16である。本明細書で使用される、エピトープ抗原決定基と同義は、CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマが産生する抗体が結合するPI16の領域を意味すると理解されるものとする。この用語は、その抗体が接触する特定の残基、または、構造に必ずしも限定されない。例えば、この用語は、その抗体が接触する数アミノ酸に及ぶ領域、および/または、この領域の外側の5~10アミノ酸、または、2~5アミノ酸、または、1~3アミノ酸を含む。ある例において、前記エピトープはPI16の一連の連続するアミノ酸である。しかしながら、あるエピトープはまた、PI16が折りたたまれるときに互いに近接する一連の非連続的なアミノ酸、すなわち、立体構造的エピトープを含むことができる。当業者はまた、エピトープという用語はペプチド、または、ポリペプチドに限定されないということを理解するであろう。前記のものを含むエピトープ、または、ペプチド、または、ポリペプチドを、そのエピトープに対する抗体を作成するために動物に投与することができる。競合的に阻害するという用語は、CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマによって産生されるPI16に対する抗体の結合を本発明のタンパク質が低減させる、または、妨害することを意味すると理解されるものとする。CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマによって産生される抗体の結合をそのタンパク質が完全に阻害する必要はなく、むしろ、統計学的に有意な量まで、例えば、少なくとも約10、または、20、または、30、または、40、または、50、または、60、または、70、または、80、または、90、または、95まで結合を低減する必要があるだけであると上述のことから明らかであるだろう。結合の阻害を競合的に測定する方法は当該分野において公知であり、および/または、本明細書に記載される。例えば、前記タンパク質が存在する状態で、または、存在しない状態で前記抗体はPI16に曝露される。前記タンパク質が存在しない状態よりも、前記タンパク質が存在する状態で少ない抗体が結合するとき、前記タンパク質は抗体の結合を競合的に阻害したと考えられる。前記タンパク質と抗体が実質的に同時にPI16に曝露されることが好ましい。2つのエピトープの関係において重複するという表現で、1つのエピトープに結合する抗体が、他方のエピトープに結合する抗体の結合を競合的に阻害することを可能にするほどに十分な数のアミノ酸残基を2つのエピトープが共有することを意味すると理解されるものとする。例えば、本発明は、CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマによって産生される抗体がそのエピトープに結合するのを阻害するのに十分な数の残基を共有するあるエピトープと結合するタンパク質を包含する。本明細書で使用される、Treg、または、制御性T細胞という用語は、Treg細胞以外のT細胞の活性を低減させる、もしくは、抑制する能力を持ち、および/または、T細胞を殺す能力を持つ、少なくともCD4、および/または、CD25を発現するT細胞を意味すると理解されるものとする。この用語は、低レベルのIL-2、IL-4、IL-5、および、IL-1を産生し、そして、免疫系の活性化を抑制するように作用するT細胞を含む。制御性T細胞は、活性化シグナルによって例えば、抗原、および、抗原提示細胞、またはMHCについて抗原を模倣するシグナルによって、例えば、抗CD3抗体、および、抗CD28抗体によって培養液中で刺激を受けたTH1、TH2、または、ナイーブT細胞の増殖とサイトカイン産生を活発に抑制する。1つの例において、Treg細胞はFoxP3を発現するしかしながら、ある細胞がTreg細胞であるか、または、そうではないか決定するためにFoxP3の発現を検出することは必要ではない。。この用語はまた変異型のTreg細胞、例えば、Treg細胞に由来するが、表現型のレベルで、または、機能のレベルで、または、構造的なレベルで少なくとも1つの差異を示す細胞を包含する。例えば、治療用タンパク質、すなわち、Treg細胞の機能を変化させる、または、強化するタンパク質を発現するように変異体、または、変異型が作り変えられている可能性がある。そのような変化は、自然突然変異的に生じる、または、例えば、細胞株の作成を達成するために細胞が意図的に癌化される、または、形質移入されるときのように、指向された操作の結果として生じる可能性がある。Treg細胞の活性という用語は、免疫反応、例えば、本明細書に記載されるもののような混合リンパ球反応を用いて評価される、および/または、本明細書に記載されるインビボアッセイを用いて評価される免疫反応を抑制する、または、低減させる能力を含む。この用語はまた、ある細胞の抗炎症性サイトカイン、例えば、トランスフォーミング増殖因子βTGF-β、および、IL-10を分泌する能力を包含する。Treg細胞の別の活性はFoxP3の発現である。Treg細胞関連症状という用語は、Treg細胞の数、および/または、活性の調節が有益な作用をもたらすことができる任意の疾病、または、疾患、または、病状を包含すると理解されるものとする。この用語は対象の免疫系の制御性T細胞介在性抑制に関連する症状、例えば、例えば、ヘルパーT細胞、または、CTL細胞、または、TH17細胞、または、1つ以上のT細胞によって調節されるその他の細胞による過剰な免疫反応に関連する、または、それが原因の症状を包含する。したがって、この用語は炎症、および/または、自己免疫症状を包含する。Treg細胞関連症状の例として、神経系の炎症性疾患例えば、多発性硬化症、または、粘膜炎症性疾患例えば、炎症性腸疾患、喘息、または、扁桃炎、または、炎症性皮膚疾患例えば、皮膚炎、乾癬、または、接触過敏症、または、自己免疫性関節炎例えば、リウマチ性関節炎が挙げられる。好ましいTreg細胞関連症状として、リウマチ性関節炎が挙げられる。ある実施形態において、炎症性疾患はアレルギー性炎症性疾患である。Treg細胞関連症状のその他の例として、Treg細胞の過剰な数、および/または、活性を特徴とする症状が挙げられる。例えば、移植片に対する免疫反応、または、移植片対宿主病、または、宿主対移植片病もまたTreg細胞関連症状である。この用語はまた、癌を含み、例えば、その癌では、Treg細胞が癌細胞に対する免疫細胞の活性を抑制し、それによってその疾患が発生することが可能になる。本明細書で使用されるTH17介在性症状という用語は、TH17細胞の過剰な数、または、活性によって特徴づけられる、または、それが原因の任意の症状を意味すると理解されるものとする。TH17細胞は、IL17を発現するCD4T細胞であることを当業者は理解するであろう。TH17細胞はまた、一般にCCR6、および/または、CCR4を発現する。TH17介在性症状の例として、自己免疫/炎症例えば、乾癬、炎症性腸疾患、関節炎例えば、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、および、炎症性腸疾患例えば、クローン病、および、移植片対宿主病が挙げられる。本明細書で使用される優先的に移動するという用語は、対象中の特定の部位例えば、炎症部位、および/または、皮膚にに、対象中のその他の細胞よりも速く、または、高濃度で、好ましくは、PI16および、所望によりCCR6,および/または、CCR4を発現しないTreg細胞よりも速く、または、高濃度で移動する細胞を意味する。本明細書で使用される予防することpreventing、予防するprevent、または、予防preventionという用語は、特定の疾患、または、症状の少なくとも1つの症状の発生を止める、または、妨げるのに十分な治療上有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む。本明細書で使用される治療することtreating、治療するtreat、または、治療treatmentという用語は、特定の疾患、または、症状の少なくとも1つの症状を低減させる、または、除去するのに十分な治療上有効量の本明細書に記載のタンパク質を投与することを含む。本明細書で使用される対象という用語は、ヒトを含む任意の動物、好ましくは哺乳類を意味すると理解されるものとする。対象の例にヒト、霊長類、家畜例えば、ヒツジ、ウシ、ロバ、ブタ、愛玩動物例えば、イヌ、ネコ、実験動物例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、捕らえられた野生の動物例えば、キツネ、シカが含まれるが、これらに限定されない。前記動物はヒト、または、霊長類であることが好ましい。前記動物はヒトであることがさらに好ましい。試料という用語は、列挙された試料例えば、血液試料、および、その任意の画分例えば、血漿、血清、または、白血球層、または、それに由来する細胞例えば、末梢血単核球細胞、または、その加工された形状を包含すると理解されるものとする。本明細書で使用される、細胞集団について濃縮されたenriched、または、濃縮するenrichという用語は、Treg細胞の数、または、パーセンテージが天然の細胞集団における細胞数、または、パーセンテージよりも大きいことを意味すると理解されるものとする。例えば、Treg細胞が濃縮された集団は、前記細胞の少なくとも約0.02、または、前記細胞の少なくとも約0.05、または、前記細胞の少なくとも約0.1、または、前記細胞の少なくとも約0.2、または、前記細胞の少なくとも約0.5、または、前記細胞の少なくとも約0.5、または、前記細胞の少なくとも約0.8、または、前記細胞の少なくとも約1、または、前記細胞の少なくとも約2、または、前記細胞の少なくとも約3、または、前記細胞の少なくとも約4、または、前記細胞の少なくとも約5、または、前記細胞の少なくとも約10、または、前記細胞の少なくとも約15、または、前記細胞の少なくとも約20、または、前記細胞の少なくとも約25、または、前記細胞の少なくとも約30、または、前記細胞の少なくとも約40、または、前記細胞の少なくとも約50、または、前記細胞の少なくとも約60、または、前記細胞の少なくとも約70、または、前記細胞の少なくとも約80、または、前記細胞の少なくとも約85、または、前記細胞の少なくとも約90、または、前記細胞の少なくとも約95、または、前記細胞の少なくとも約97、または、前記細胞の少なくとも約98、または、前記細胞の少なくとも約99から成る。PI16ポリペプチド好ましいポリペプチドPI16は配列番号1~4のいずれか1つ以上に少なくとも約52の配列同一性を示す配列を含む。配列同一性の程度は少なくとも約53、または、55、または、60、または、62、または、70、または、75、または、80、または、85、または、90、または、95、または、99であることが好ましい。当業者に知られることになるであろうが、インシリコ解析を含む標準的な技法を用いて、例えば、BLASTを用いて前記核酸、および/または、タンパク質の天然の変異型、および/または、変異体を同定することが可能である。核酸、または、ポリペプチドのパーセント同一性は、ギャップクリエーションペナルティーgapcreationpenalty=5、および、ギャップエクステンションペナルティーgapextensionpenalty=0.3を用いるGAP解析GCGプログラムNeedlemanおよびWunsch,1970年で決定される。クエリー配列の長さが少なくとも50残基であり、そして、GAP解析が少なくとも50残基の領域にわたって2つの配列を整列させる。クエリー配列の長さが少なくとも100残基であり、そして、GAP解析が少なくとも100残基の領域にわたって2つの配列を整列させることがさらにずっと好ましい。2つの配列がその全長にわたって整列することが最も好ましい。可変領域含有タンパク質本発明は、抗体CDRを含むタンパク質であって、PI16に結合し、そして、CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマによって産生される抗体のPI16への結合を競合的に阻害するタンパク質を含む任意のタンパク質を企図する。本発明はまた、少なくとも3つの抗体CDRsを含むおよび、いくつかの実施形態において、6つの抗体CDRsを含む任意のタンパク質であって、PI16に結合し、そして、CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマによって産生される抗体のPI16への結合を競合的に阻害するタンパク質を提供する。本発明は、PI16に結合し、そして、CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマによって産生される抗体のPI16への結合を競合的に阻害する抗体可変領域を含む任意のタンパク質を企図する。抗体可変領域の例は、モノクローナル抗体、および、その修飾型例えば、ヒト化抗体、および、ラクダ類免疫グロブリン、および、IgNARのような重鎖抗体の可変領域である。抗体抗体を作成する方法は当該分野において公知であり、ならびに/または、HarlowおよびLane1988年、もしくは、Zola1987年に記載される。一般的に、そのような方法では、PI16タンパク質、または、免疫原性断片、または、そのエピトープ、または、前記のものを発現し、および、提示する細胞すなわち、免疫原は、所望により任意の適切な、または、望ましい担体、アジュバント、または、薬剤的に許容可能な賦形剤と製剤されて、非ヒト動物対象、例えば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、または、ブタに投与される。前記免疫原は鼻腔内投与経路で、筋肉内投与経路で、皮下投与経路で、静脈内投与経路で、皮内投与経路で、腹腔内投与経路で、または、その他の公知の投与経路で投与されることができる。免疫後に様々な時点で免疫した動物の血液試料を採取することによりポリクローナル抗体の産生をモニターすることができる。望ましい抗体の力価を達成することが必要である場合、1回以上の免疫を行うことができる。適切な力価に達するまで、追加免疫と力価測定のステップが繰り返される。望ましいレベルの免疫原性が得られたとき、免疫した動物から採血し、そして、血清が単離され、保存される、および/または、モノクローナル抗体Mabsを作成するためにその動物を使用する。モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体、または、MAbという用語は同じ抗原に、好ましくは、その抗原内の同じエピトープに結合する能力を持つ均一な抗体の集団を意味する。この用語は、抗体の出所、または、抗体の作製方法に関して限定的であることを意図するものではない。Mabsの作製について、例えば、米国特許第4,196,265号、または、HarlowおよびLane1988年、または、Zola1987年に例示される技法のような多くの公知の技術のうちのいずれか1つを用いることができる。例えば、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件で、効果量のタンパク質、または、免疫原性断片、または、そのエピトープ、または、前記のものを発現する細胞で適切な動物を免疫する。ウサギ、マウス、および、ラットのようなげっ歯類動物が好ましい動物であり、マウスが最も好ましい。例えば、国際公開第2002/066630号、Lonbergら,1994年、Tomizukaら,2000年、および、Jakobovitsら,2007年に記載されるヒト免疫グロブリンタンパク質を発現し、および、好ましくは、ネズミ科免疫グロブリンタンパク質を発現しないように遺伝子操作されたマウスもまた本発明の抗体を作成するために好ましい。免疫の次に、抗体、特にBリンパ球B細胞を産生する可能性がある体細胞を、MAb作成プロトコルにおいて使用するために選択する。これらの細胞は脾臓、扁桃、もしくは、リンパ節の生体検査材料から、または、末梢血試料から得ることができる。次に、免疫した動物のB細胞を、一般に免疫原で免疫した動物と同種の動物に由来する不死化骨髄腫細胞と融合する。細胞膜の融合を促進する化学的、または、電気的な1つの作動因子、または、複数の作動因子の存在下で前記細胞種の混合物をインキュベートしてB細胞と不死化細胞の細胞を融合する。センダイウィルスを用いる融合方法がKohlerおよびMilstein,1975年、ならびに、KohlerおよびMilstein,1976年によって記述されている。ポリエチレングリコールPEG、例えば、37体積/体積PEGを用いる方法がGefterら1977年によって詳述されている。電気的融合促進方法の使用もまた適切である。組織培養培地中にヌクレオチドの新規合成を妨げる薬剤を含む選択培地でハイブリッド細胞を培養して増殖させた。好ましい薬剤の例はアミノプテリン、メトトレキサート、および、アザセリンである。例えば、フローサイトメトリー、および/または、免疫組織化学、および/または、免疫アッセイ例えば、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫アッセイなどで増殖したハイブリドーマを抗体特異性、および/または、力価についての機能選択に供する。本発明はまた、例えば、本明細書に例示される抗体産生細胞のサブクローニングを企図する。あるいは、MAbを分泌する細胞株を作成するために例えば、Largaespadaら,1996年、および、Kumarら,1999年に記載されるようにABL-MYC技術NeoClone、マジソン、ウィスコンシン州53713、米国を用いる。米国特許第6,300,064号、欧州特許第0368684号、および/または、米国特許第5,885,793号に記載されるように、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングして抗体を作製、または、単離することもできる。キメラ抗体、および、キメラタンパク質1つの例において、本発明の抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体という用語は、重鎖、および/または、軽鎖の一部分が、特定の種例えば、マウスのようなネズミ科動物に由来する抗体に対応する配列と同一であり、もしくは、相同であり、または、特定の抗体クラス、もしくは、サブクラスに属し、一方、その鎖の残りの部分は別の種例えば、ヒトのような霊長類由来の抗体に対応する配列と同一であり、もしくは、相同であり、または、別の抗体のクラス、もしくは、サブクラスに属する抗体を意味し、ならびに、望ましい生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を意味する。典型的には、キメラ抗体は、主としてヒトのドメインを用いる抗体を作製するために、げっ歯類動物の、または、ウサギの可変領域とヒト定常領域を利用する。キメラ抗体の作製方法は、例えば、米国特許第4,816,567号、および、Morrisonら,1984年に記載される。本発明はまたキメラタンパク質、例えば、ある種、または、抗体サブタイプの可変領域が別の種、または、抗体サブタイプのタンパク質のある領域に融合するキメラタンパク質を含む。例えば、本発明は、ある種の1つの定常ドメインに融合した別の種の可変領域を含むタンパク質を企図する。ヒト化、および、ヒト抗体/タンパク質本発明の抗体、または、タンパク質はヒト化抗体、もしくは、ヒト抗体、または、ヒト化タンパク質、もしくは、ヒトタンパク質であり得る。ヒト化抗体という用語は、キメラ分子であって、組換え技術を用いて一般に調製され、ヒトではない種の抗体に由来する抗原結合部位、または、可変領域、ならびに、前記分子の残りの抗体構造にヒト抗体の構造、および/もしくは、配列に基づく抗体構造を有するキメラ分子を意味すると理解されるものとする。その抗原結合部位は、ヒト抗体の可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域に融合した非ヒト抗体由来の相補性決定領域CDRs、および、ヒト抗体由来の残りの領域を含むことが好ましい。抗原結合部位は野生型であり得るし、または、1つ以上のアミノ酸置換によって修飾され得る。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、受容側抗体にも移入されるCDR配列、または、フレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。非ヒト抗体、または、その部分例えば、可変領域をヒト化する方法は当該技術分野において公知である。米国特許第5,225,539号、または、米国特許第US5,585,089号の方法に従い、げっ歯類のCDR、または、CDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することでヒト化を本質的に行うことができる。抗体をヒト化するその他の方法を排除することはない。抗体分子、および、結合タンパク質との関連で本明細書において使用されるヒト抗体という用語は、ヒト、例えば、ヒト生殖系列細胞、または、体細胞に見られる配列由来の、または、配列に対応する可変抗体領域例えば、VH、VL、CDR、および、FR領域、および、所望により定常抗体領域を有する抗体を意味する。ヒト抗体という用語はヒト配列にコードされないアミノ酸残基、例えば、無作為突然変異、または、インビトロで部位特異的突然変異特に、保存的置換を含む突然変異、または、前記抗体の少数の残基、例えば、前記抗体の1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは、5つの残基、好ましくは、例えば、前記抗体の1つ以上のCDRを構成する1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは、5つの残基の突然変異を含むことができる。実際には、これらのヒト抗体をヒトが産生する必要はなく、むしろ、組換え技術を用いてそれらを作製することができ、ならびに/または、例えば、上述したようなヒト抗体の定常領域、および/もしくは、可変領域をコードする核酸を含む形質導入動物例えば、マウスからそれらを単離することができる。例えば、HoogenboomおよびWinter,1991年、Marksら,1991年、米国特許第5,885,793号に記述されるファージディスプレイライブラリーを含む当該分野に公知の様々な技術を用いてヒト抗体を作製することもできる。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体をガイデッドセレクションと呼ばれる技術を用いて作成することもできる。この取り組みにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導くために用いるJespersら,1988年。本発明のヒトタンパク質はヒト抗体の可変領域を含む。脱免疫化抗体、および、脱免疫化タンパク質本発明はまた脱免疫化抗体、および、脱免疫化タンパク質を企図する。脱免疫化抗体、および、脱免疫化タンパク質は1つ以上のエピトープ、例えば、B細胞エピトープ、または、T細胞エピトープを除去させてすなわち、変異させて、それによって対象がその抗体、または、タンパク質に対して免疫反応を生じる可能性を低減させる。脱免疫化抗体、および、脱免疫化タンパク質の作製方法は当該技術分野において公知であり、および、例えば、国際公開第00/34317号、国際公開第2004/108158号、および、国際公開第2004/064724号に記載される。適切な変異を導入する方法、ならびに、その結果生じるタンパク質を発現させ、および、検定する方法は、本明細書における解説に基づき当業者に明らかであるだろう。重鎖抗体重鎖抗体は、それらが重鎖を含むが、軽鎖を含まない限りにおいて、多くのその他の形態をとる抗体と構造的に異なる。したがって、これらの免疫グロブリンはまた重鎖のみ抗体とも称される。例えば、ラクダ類、および、軟骨魚類IgNARとも呼ばれるで重鎖免疫グロブリンが見られる。天然重鎖抗体に存在する可変領域は、それらを通常の4本鎖抗体に存在するVHドメインと称される重鎖可変用域、および、通常の4本鎖抗体に存在するVLドメインと称される軽鎖可変領域と区別するために、一般にラクダ類抗体ではVHHドメイン、および、IgNARではV-NARと称される。ラクダ類の重鎖抗体、および、その可変領域、ならびに、その作製、および/または、単離、および/または、利用の方法の一般的な解説は、特に次の引用文献、国際公開第94/04678号、国際公開第97/49805号、および、国際公開第97/49805号に見られる。軟骨魚類の重鎖免疫グロブリン、および、その可変領域、ならびに、その作製、および/または、単離、および/または、利用の方法の一般的な解説は、特に国際公開第2005/118629号、Shaoら2007年、ならびに/または、DooleyおよびFlajnik2006年に見られる。可変領域含有タンパク質単一ドメイン抗体いくつかの例において、本発明のタンパク質は単一ドメイン抗体であるそれはドメイン抗体、または、dAbという用語と互換的に使用される。単一ドメイン抗体はある抗体の重鎖可変ドメインの全部、または、一部分を含む一本鎖ポリペプチドである。ある実施形態において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体であるDomantis,Inc.、ウォルサム、マサチューセッツ州、例えば、米国特許第6,248,516号、国際公開第90/05144号、国際公開第2003/002609号、および/または、国際公開第2004/058820号を参照のこと。。二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体抗体可変領域を含む好ましいタンパク質の例は二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、および、国際公開第98/044001号、および、国際公開第94/007921号に記載されるもののような高次タンパク質複合体である。例えば、二重特異性抗体は、2本の結合したポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、各ポリペプチド鎖は構造VL-X-VH、または、VH-X-VLを含み、VLは抗体軽鎖可変領域であり、VHは抗体重鎖可変領域であり、Xは一本鎖ポリペプチド中のVH、および、VLが結合するもしくは、Fvを形成することを可能にするには不十分な残基を含むリンカーであり、または、Xは存在せず、および、1つのポリペプチド鎖のVHは他方のポリペプチド鎖のVLに結合して抗原結合部位を形成する、すなわち、1つ以上の抗原に特異的に結合する能力を持つFv分子を形成する。各ポリペプチド鎖においてVL、および、VHは同じであることができ、または、各ポリペプチド鎖においてVL、および、VHは、二特異的なすなわち、異なる特異性を持つ2つのFvsを含む二重特異性抗体を形成するように、異なっていることができる。当業者は二重特異性抗体、三重特異性抗体、および/または、四重特異性抗体、ならびに、その作製方法を理解するであろう。二重特異性抗体、三重特異性抗体、および/または、四重特異性抗体について記述する文献の例として、国際公開第94/07921号、国際公開第98/44001号、Holligerら1993年、HudsonおよびKortt1999年、HolligerおよびHudson2005年、ならびに、それらで引用される文献が挙げられる。単鎖FvscFv断片当業者は、scFvが一本鎖ポリペプチド中にVH領域、および、VL領域を含むことを理解するであろう。そのポリペプチド鎖が、scFvが抗原結合にとって望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをVH、および、VLの間にさらに含むすなわち、一本鎖ポリペプチドのVH、および、VLが互いに結合してFvを形成するために、ことが好ましい。例えば、そのリンカーは、scFvにとってより好ましいリンカーのうちの1つであるグリシン4セリン3を有する12アミノ酸より多いアミノ酸残基を含む。本発明はまたジスルフィド結合で安定化されたFvまたは、diFv、もしくは、dsFvを考慮し、そのFvでは1つのシステイン残基がVHのFR、および、VLのFRに導入され、ならびに、そのシステイン残基がジスルフィド結合によって連結されて安定的なFvを生じる例えば、Brinkmannら,1993年を参照のこと。。代わりに、または、加えて、本発明は、二量体型scFv、すなわち、非共有結合、または、共有結合で、例えば、例えば、Fos、または、Jun由来のロイシンジッパードメインにより連結された2つのscFv分子を含むタンパク質例えば、KruifおよびLogtenberg,1996年を参照のこと。を提供する。あるいは、十分な長さのペプチドリンカーで2つのscFvを連結して、例えば、米国特許第20060263367号に記載されるように、両方のscFvが抗原を形成し、および、抗原に結合するのを可能にする。scFvの概説については、Pluckthun1994年を参照のこと。ミニ抗体当業者は、ミニ抗体はある抗体のCH2ドメイン、および/または、CH3ドメインに融合したある抗体のVHドメイン、および、VLドメインを含むことを理解するであろう。所望により、そのミニ抗体はVH、および、VLの間にヒンジ領域を含んでいてよく、時には、この立体構造はFlexミニ抗体Huら,1996年と称される。ミニ抗体はCH1、または、CLを含まない。VHドメイン、および、VLドメインが抗体のヒンジ領域、および、CH3ドメインに融合することが好ましい。前記ミニ抗体の可変領域の少なくとも1つは本発明の方法でPI16に結合する。ミニ抗体の例、および、その製造方法は、例えば、国際公開第94/09817号に記載される。その他の可変領域含有タンパク質本発明はまたその他の可変領域含有タンパク質、例えば、i米国特許第5,731,168号に記載の鍵と鍵穴二特異性タンパク質、ii例えば、米国特許第4,676,980号に記載のヘテロ複合体タンパク質、iii例えば、米国特許第4,676,980号、または、Brennan1985年に記載の化学架橋剤を用いて作製したヘテロ複合体タンパク質、ivShalaby1992年に記載のFab’-SH断片、v単鎖Fab例えば、Hustら,2007年、または、vi例えば、欧州特許第19930302894号に記載のFab3を企図する。定常領域融合体本発明は、可変領域、および、定常領域例えば、Fc、または、そのドメイン、例えば、CH2ドメイン、および/または、CH3ドメインを含むタンパク質を包含する。当業者は、本明細書における開示、および、本明細書において考察される引用文献に基づいて、定常領域、および、定常ドメインという用語の意味を理解するであろう。本発明のタンパク質の作製に有用である定常ドメイン配列を数多くの異なる出所から得ることができる。いくつかの例において、前記タンパク質の定常ドメイン、または、その一部分はヒト抗体に由来する。さらに、定常ドメイン、または、その一部分は、IgM、IgG、IgD、IgA、および、IgEを含む任意の抗体クラス、ならびに、IgG1、IgG2、IgG3、および、IgG4を含む任意の抗体アイソタイプに由来することができる。好ましい例において、ヒトIgG1アイソタイプが使用される。様々な定常ドメイン遺伝子配列例えば、ヒト定常ドメイン遺伝子配列は公に利用可能な寄託物の形で入手可能であり、または、その配列は公に利用可能なデータベースから入手可能である。特定のエフェクター機能を持つまたは、特定のエフェクター機能を欠く、または、免疫原性を低下させるために特定の修飾を有する定常ドメインを選択することができる。本明細書で使用されるエフェクター機能という用語は、Fc領域、または、その一部分例えば、CH2ドメインが免疫系のタンパク質、および/または、細胞に結合し、そして、様々な生物学的作用を媒介する機能上の能力を意味する。エフェクター機能は抗原依存的、または、非抗原依存的であり得る。抗原依存性エフェクター機能は、ある抗体の対応する抗原への結合に引き続いて通常誘導されるエフェクター機能を意味する。典型的な抗原依存性エフェクター機能には、補体依存性細胞毒性、抗体依存性細胞食作用ADCP、抗体依存性T細胞介在細胞毒性ADCC、炎症メディエーターの放出、免疫系細胞活性化の調節、胎盤通過、および、抗体産生の制御が挙げられる。本明細書で使用される非抗原依存性エフェクター機能という用語は、免疫グロブリンがその対応する抗原に結合しているかに関わらず、それによって誘導され得るエフェクター機能を意味する。典型的な非抗原依存性エフェクター機能には、抗体の細胞輸送、循環半減期、および、排除速度、ならびに、精製の容易化が挙げられる。1つの例において、本発明のタンパク質変異体は、あるいは、より定常領域ドメインが部分的に、または、完全に欠質されている合成変異型定常領域ドメイン欠質型定常領域を含む。本発明はまた、エフェクター機能を変化した、例えば、エフェクター機能を改善した、または、低減させた修飾型Fc領域、または、部分を包含する。多くのそのような修飾型Fc領域は当該技術分野において公知であり、および、例えば、国際公開第2005/035586号、国際公開第2005/063815号、または、国際公開第2005/047327号に記載される。親和性成熟さらなる例において、現有の抗体、例えば、CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマによって分泌される抗体、または、そのヒト化型は親和性成熟を受けて、高くなった親和性でPI16に結合する能力を有する抗体を産生する。例えば、VL、および/または、VHをコードする配列を単離し、ならびに、1つ以上のアミノ酸置換を導入してCDRをコードする領域例えば、VL、および/または、VHのCDR3をコードする領域に突然変異を起こさせる。次に、その結果生じた変異型タンパク質をPI16への結合について、例えば、競合アッセイでスクリーニングにかける。本発明に従うタンパク質は可溶性分泌タンパク質であり得る、または、細胞、もしくは、粒子例えば、ファージ、または、その他のウィルス、リボソーム、または、胞子の表面上に融合タンパク質として提示されることができる。ファージディスプレイ法の例は、例えば、米国特許第5,821,047号、米国特許第6,248,516号、および、米国特許第6,190,908号に記載される。標的抗原、例えば、PI16への結合に十分な立体構造を持つ提示されたタンパク質を同定するために、これらの方法を用いて作製されるファージディスプレイ粒子を次にスクリーニングされる。タンパク質の作製1つの例において、本発明のタンパク質は、そのタンパク質を産生するのに十分な条件で、例えば、本明細書に記載される、および/または、当該技術分野において公知である条件の下で本発明のハイブリドーマを培養することで、作製される。組換え発現組換えタンパク質の場合、前記のものをコードする核酸を発現ベクターに組み込むことが好ましく、そのベクターは次に宿主細胞、好ましくは、ジスルフィド架橋、または、ジスルフィド結合を生じることができる細胞、例えば、大腸菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または、哺乳類細胞、例えば、本来は免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、または、骨髄腫細胞に、組換え宿主細胞でタンパク質の合成を得るために形質移入される。免疫グロブリンをコードするDNAの細菌での組換え発現についての総説には、Skerraら1993年、および、Pluckthun1992年が挙げられる。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、および、例えば、Ausubel、または、Sambrookにおいて記載される。様々なクローニング方法、および、インビトロ増幅方法が組換え核酸の構築に適切である。組換え抗体の作製方法がまた当該技術分野において公知である。米国特許第4,816,567号、および、Queenら1989年を参照のこと。単離に引き続いて、本発明のタンパク質をコードする核酸をさらなるクローニングのためにDNAの増幅のために、または、無細胞系、もしくは、細胞での発現のために発現コンストラクト、または、複製可能なベクターに挿入することが好ましい。その核酸がプロモーターに機能的に結合することが好ましい、本明細書で使用されるプロモーターという用語は、その最も広い文脈で理解されるものとし、ならびに、例えば、発生刺激、および/もしくは、外部刺激に応答して、または、組織特異的な様式で核酸の発現を変化させるその他の調節要素例えば、上流域活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー、および、サイレンサーと共に、または、それら調節要素無しで正確な転写開始に必要なTATAボックス、または、転写開始エレメントを含むゲノム遺伝子の転写調節性配列を含む。本明細書において、プロモーターという用語はまた、それに機能的に結合する核酸が発現するようにし、発現を活性化し、または、発現を増大させる組換え核酸、合成核酸、もしくは、融合核酸、または、派生物を説明するために用いられる。好ましいプロモーターは、前記核酸の発現をさらに増大するため、ならびに/または、空間的発現、および/もしくは、時間的発現を変化させるために1つ以上の特定の調節要素のコピーをさらに含有することができる。本明細書で使用される~に機能的に結合するという用語は、ある核酸について、その核酸があるプロモーターによって制御されるようにそのプロモーターが位置することを意味する。無細胞発現系がまた本発明よって企図される。例えば、本発明のタンパク質をコードする核酸は適切なプロモーター、例えば、T7プロモーターに機能的に結合し、そして、その結果生じる発現コンストラクトを転写、および、翻訳に十分な条件に曝す。インビトロ発現、または、無細胞発現に典型的な発現ベクターが説明されてきており、および、TNTT7システム、および、TNTT3システムPromega、pEXP1-DESTベクター、および、pEXP2-DESTベクターInvitrogenを含むが、これらに限定されない。細胞での発現のために多くのベクターが利用可能である。ベクター要素は一般に、シグナル配列、例えば、本明細書で提供される情報に由来する本発明のタンパク質をコードする配列、エンハンサー要素、プロモーター、および、転写終結配列うちの1つ以上を含むが、これらに限定されない。当業者はタンパク質の発現に適切な配列を理解するであろう。例えば、シグナル配列の例には、原核生物分泌シグナル例えば、pelBシグナル、アルカリホスファターゼシグナル、ペニシリナーゼシグナル、Ippシグナル、または、熱安定性エンテロトキシンIIシグナル、酵母分泌シグナル例えば、インベルターゼリーダー配列、α因子リーダー配列、または、酸ホスファターゼリーダー配列、または、哺乳類動物分泌シグナル例えば、ヘルペスシンプレックスgDシグナルが含まれる。プロモーターの例には、原核生物で活性があるプロモーター例えば、phoAプロモーター、β-ラクタマーゼプロモーター、および、乳糖プロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファンtrpプロモーター系、および、tacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。哺乳類細胞で活性があるプロモーターの例には、サイトメガロウィルス最初期immediateearlyプロモーターCMV-IE、ヒト伸長因子1αプロモーターEF1、核内低分子RNAプロモーターU1a、および、U1b、αミオシン重鎖プロモーター、シミアンウィルス40プロモーターSV40、トリ肉腫ウィルスプロモーターRSV、アデノウィルス主要後期プロモーター、βアクチンプロモーター、CMVエンハンサー/βアクチンプロモーターを含むハイブリッド調節要素、または、免疫グロブリンプロモーター、もしくは、その活性断片が含まれる。有用な哺乳類動物宿主細胞株の例は、SV40で形質変換されたサル腎臓CV1株COS-7、ATCCCRL1651、ヒト胚性腎臓細胞株293細胞、または、懸濁培養での増殖に適したサブクローンされた293細胞、ハムスター幼体腎臓細胞BHK、ATCCCCL10、または、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOである。例えば、ピチアパストリスPichiapastoris、出芽酵母、および、分裂酵母を含む群より選択される酵母細胞のような酵母細胞での発現に適した典型的なプロモーターには、ADH1プロモーター、GAL1プロモーター、GAL4プロモーター、CUP1プロモーター、PHO5プロモーター、nmtプロモーター、RPR1プロモーター、または、TEF1プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。前記のものを含む核酸分子、または、遺伝子コンストラクトを発現のために細胞に導入する方法は当業者に公知である。所与の細胞に用いられる技術は公知の成功した技術による。細胞に組換えDNAを導入する方法には、数ある中でも、マイクロインジェクション、DEAEデキストラン介在性形質移入、リポソームが介在する形質移入、例えば、リポフェクタミンGibco、メリーランド州、米国、および/または、セルフェクチンGibco、メリーランド州、米国を使用することが介在する形質移入、PEG介在性DNA取り込み、電気穿孔法、および、例えば、DNA被覆タングステン粒子、または、DNA被覆金粒子AgracetusInc.、ウィスコンシン州、米国を用いることによる微小粒子銃法が含まれる。本発明のタンパク質を作製するために使用する宿主細胞は、使用される細胞種に応じて、様々な培地で培養されることができる。ハムFl0Sigma、最小基本培地MEM、Sigm、RPMI-1640Sigm、および、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、Sigmのような市販の培地が哺乳類細胞の培養に適している。本明細書において議論されるその他の細胞種の培養のための培地は当該技術分野において公知である。タンパク質の単離本発明のタンパク質は単離されることが好ましい。本発明のタンパク質の精製方法は当該技術分野において公知であり、および/または、本明細書に記載される。組換え技術を使用するとき、本発明のタンパク質は細胞内に、周辺質の空間に産生される、または、培地中に直接分泌されることができる。そのタンパク質が細胞内に産生されるとき、第1ステップとして、特定の破片、宿主細胞か溶解された細胞の断片のどちらかが、例えば、遠心分離、または、限外濾過によって除去される。そのタンパク質が培地中に分泌される場合、そのような発現系の上清は一般に、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン、または、Milliporeのペリコン限外濾過ユニットを用いて濃縮される。タンパク質分解を阻害するためにPMSFのようなプロテアーゼ阻害剤を前述のステップのいずれのステップにも含むことができ、および、外来性の汚染菌の増殖を防ぐため抗生物質を含むことができる。前記細胞から調製されるタンパク質を、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィー例えば、プロテインA親和性クロマトグラフィー、または、プロテインGクロマトグラフィー、または、上述のものの任意の組合せを用いて精製することができる。これらの方法は当該技術分野において公知であり、および、例えば、国際公開第99/57134号、または、Zora1997年に記載される。当業者はまた、精製、または、検出を容易にするためにタグ、例えば、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、または、インフルエンザウィルスヘマグルチニンHAタグ、または、シミアンウィルス5V5タグ、または、FLAGタグ、または、グルタチオンS-トランスフェラーゼGSTタグを含むように本発明のタンパク質を改変することができるを理解するであろう。そのタグはヘキサヒスチジンタグであることが好ましい。その結果生じたタンパク質は次に当該技術分野において公知である方法を用いて、例えば、親和性精製を用いて精製される。例えば、ヘキサヒスチジンタグを含むタンパク質は、そのタンパク質を含む試料を固形担体、または、半固形担体に固定化された、ヘキサヒスチジンタグと特異的に結合するニトリロ三酢酸ニッケルNi-NTAに接触させ、結合していないタンパク質を除去するために試料を洗浄し、および、その後、結合したタンパク質を溶出することによって精製される。代わりに、または、加えて、タグに結合するリガンド、または、抗体が親和性精製方法で用いられる。複合体本発明はまた任意の実施形態に従う本明細書に記載されるタンパク質の複合体を提供する。タンパク質が複合体化することができる化合物の例は、放射性同位体、検出可能な標識物質、治療用化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象中で前記タンパク質の半減期を増加させる化合物、および、その混合物を含む群より選択される。治療薬剤の例には、抗血管新生剤、抗新血管形成薬剤、および/もしくは、その他の抗血管形成薬剤、抗増殖薬剤、アポトーシス促進薬剤、化学療法薬剤、または、治療用核酸が含まれるが、これらに限定されない。毒素には、細胞に有害な例えば、細胞を殺す任意の薬剤が含まれる。当該技術分野において公知であるこれらの部類の薬剤、および、その作用機序の解説については、Goodmanら1990年を参照のこと。免疫グロブリン-免疫毒複合体の調製に関する追加の技術は、例えば、Vitetta1993年、および、米国特許第5,194,594号に提供される。毒素の例として、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、緑膿菌PseudomonasaeruginosaのエクソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、αサルシン、シナアブラギリAleuritesfordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウPhytolacaamericanaタンパク質PAPI、PAPII、および、PAP-S、ツルレイシmomordicacharantia阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウsapaonariaofficinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリンmitogellin、レストリクトシンrestrictocin、フェノマイシンphenomycin、エノマイシンenomycin、および、トリコテセン系が挙げられる。例えば、国際公開第93/21232号を参照のこと。本発明の免疫複合体を形成するのに適した化学療法剤には、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシドtenoposide、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオンdihydroxyanthracindione、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デ-ヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、および、ピューロマイシン、抗代謝薬類例えば、メトトレキサート、6‐メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5‐フルオロウラシル、デカルバジンdecarbazine、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン、アルキル化剤類例えば、メクロレタミン、チオエパthioepa、クロラムブチル、メルファラン、カルムスチンBSNU、ロムスチンCCNU、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジンDTIC、プロカルバジン、マイトマイシンC、シスプラチン、および、他のプラチナ派生物、例えば、カルボプラチン、抗生物質例えば、ダクチノマイシン以前のアクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン以前のダウノマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシンAMCが挙げられる。1つの例において、任意の実施形態に従う本明細書に記載されるタンパク質は、例えば、本明細書に記載される抗体、または、それに由来するタンパク質のような本発明の別のタンパク質、または、抗体可変領域を含むタンパク質を包含する別のタンパク質と複合体化する、または、結合する。他のタンパク質が排除されることはない。さらなるタンパク質は当業者に明らかであろう。そして、その他のタンパク質には、数ある中でも例えば、免疫調節因子、または、半減期延長タンパク質、もしくは、ペプチド、または、血清アルブミンに結合するタンパク質が含まれる。血清アルブミン結合ペプチド、または、タンパク質の例は、米国特許第20060228364号、または、米国特許第20080260757号に記載される。放射性複合体化タンパク質の作製のために様々な放射性核種が利用可能である。13C、15N、2H、125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、111In等のような例えば、診断目的に適切な低エネルギー放射性核種が例に含まれるが、これらに限定されない。その放射性核種は、投与から画像化部位への局在化まで時間が経過した後の放射活性、または、検出を可能にするのに適した半減期を有するγ線放出核種、光子放出核種、または、陽電子放出核種であることが好ましい。本発明はまた、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、および、188Reのような例えば、治療目的の高エネルギー放射性核種を包含する。これらの同位体は、典型的に、短飛程の高エネルギーα粒子、または、β粒子を発生する。そのような放射性核種は近傍にある細胞、例えば、前記複合体が付着した、または、入り込んだ新生物細胞を殺す。それらは、それらが局在していない細胞にはほとんど、または、全く作用を持たず、および、本質的に非免疫原性である。あるいは、本来は安定な同位体の熱照射、例えば、ホウ素中性子捕捉療法Guanら,1998年のような熱照射によって高エネルギー同位体を作成することができる。別の実施形態において、前記タンパク質は細胞プレターゲティングに用いるストレプトアビジンのような受容体と複合体化し、その複合体は患者に投与され、引き続いて、除去剤を用いて血流から結合していない複合体が除去され、そして、治療薬剤例えば、放射性ヌクレオチドと複合体化しているリガンド例えば、アビジンが投与される。当該技術分野において公知であるさらなる非タンパク質性部分を含有するように、本発明のタンパク質を修飾することができる。そのタンパク質の誘導体化に適した部分は生理的に許容できる高分子であることが好ましく、水溶性高分子であることが好ましい。そのような高分子は本発明のタンパク質の安定性の増大、および/または、例えば、腎臓による排除の低減、および/または、免疫原性の低減に有用である。水溶性高分子の非限定的な例にポリエチレングリコールPEG、ポリビニルアルコールPVA、または、プロプロピレングリコールPPGが含まれるが、これらに限定されない。1つの例において、任意の実施形態に従う本明細書に記載されるタンパク質は検出、および/または、単離を容易にする1つ以上の検出可能なマーカーを含む。例えば、前記化合物は、例えば、フルオレセインFITC、5,6-カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イルNBD、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、4’-6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPI、および、シアニンダイ類Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、および、Cy7、フルオレセイン5-カルボキシフルオレセイン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ローダミン5,6-テトラメチルローダミンのような蛍光標識を含む。これらの蛍光物質の最大吸光波長、および、最大発光波長は、それぞれ、FITC490nm、520nm、Cy3554nm、568nm、Cy3.5581nm、588nm、Cy5652nm、672nm、Cy5.5682nm、703nm、および、Cy7755nm、778nmである。代わりに、または、加えて、任意の実施形態に従う本明細書に記載されるタンパク質は、例えば、例えば、米国特許第6,306,610号に記載される蛍光量子ドットで標識される。代わりに、または、加えて、前記タンパク質は、例えば、鉄、鋼、ニッケル、コバルト、希土類、ネオジム-鉄-ホウ素、鉄-クロム-コバルト、ニッケル-鉄-コバルト-プラチナ、または、ストロンチウムフェライトのような磁性、または、常磁性化合物で標識される。固定化タンパク質1つの例において、タンパク質は固形の、または、半固形の基材に固定化される。固定化という用語は、タンパク質を、例えば、国際公開第99/56126号、または、国際公開第02/26292号に記載の特定の基材に固定化する様々な方法、および、技術を含むと理解されるものとする。例えば、固定化はタンパク質を安定化するように役立つことができ、その結果、特に保存の間に、または、1回分使用している間に、生物学的、化学的、または、物理的曝露によってタンパク質の活性が低下することがない、または、不利に改変されることがない。例えば、Treg細胞を捕捉するように、および/または、基材に植え付けたTreg細胞を保持するように、対象への移植を可能にする基材にタンパク質を固定化することができる。あるいは、試料、好ましくは、血液試料を前記基材と、例えば、連続的に反応させる。本発明の趣旨において、3つの基本的な方法が固定化のために用いられ得る。タンパク質を基材に固定化する様々な方法は当該技術分野において公知であり、および、架橋、担体への結合、半透過性基材内での保持を含む。基材の例に、多孔性ゲル、酸化アルミニウム、ベントナイト、アガロース、デンプン、ナイロン、または、ポリアクリルアミドが含まれる。本発明のタンパク質の活性試験競合的結合の決定CRCBT-02-001により分泌される抗体の結合を競合的に阻害するタンパク質の測定試験は、当業者に明らかであろう。例えば、CRCBT-02-001により分泌される抗体を、検出可能な標識、例えば蛍光標識または放射性標識と複合体化する。次いで、標識抗体および試験用タンパク質を混合してPI16もしくはそのエピトープと接触またはこれらを発現する細胞と接触させる。次いで標識抗体レベルを測定し、タンパク質の非存在下で標識抗体をPI16、エピトープ、または細胞と接触させた場合に測定されたレベルと比較する。試験用タンパク質存在下での標識抗体レベルが、非存在下と比較して減少している場合、タンパク質がCRCBT-02-001により分泌される抗体の結合を競合的に阻害している。任意で、試験用タンパク質をCRCBT-02-001により分泌される抗体とは異なる標識と複合体化する。これにより、試験用タンパク質のタンパク質、エピトープ、または細胞に対する結合レベルを検出することができる。別の例において、タンパク質のエピトープがCRCBT-02-001により分泌される抗体と結合したエピトープと同じ、または重複しているかどうかを、タンパク質のエピトープをマッピングして決定する。エピトープマッピングの方法は、当業者に明らかであろう。例えば、PI16配列に及ぶ一連の重複ペプチド例えば10~15アミノ酸を含むペプチドを産生する。次いで、タンパク質を各ペプチドと接触させて、タンパク質が結合したペプチドを決定する。これにより、タンパク質が結合したエピトープを含むペプチドの測定が可能となる。複数の非近接ペプチドがタンパク質と結合している場合、タンパク質は立体構造エピトープに結合している。あるいは、またはさらに、PI16中のアミノ酸残基を、例えばアラニン系統的変異導入法alaninescanningmutagenesisにより突然変異させ、タンパク質の結合を減少させるまたは防ぐ突然変異体を決定する。任意のタンパク質の結合を減少させるまたは防ぐ突然変異株体は、タンパク質により結合されたエピトープ内にある可能性が高い。あるいは、またはさらに、タンパク質はCRCBT-02-001により分泌される抗体が結合するエピトープを用いて産生し、したがってタンパク質は同じエピトープに結合する可能性が高い。任意で、PI16またはそのエピトープに関するタンパク質の解離定数Kd。本発明のPI16結合タンパク質に関するKdまたはKd値は、放射性標識PI16結合試験RIAにより測定されるものの一例である。この試験は、非標識PI16の滴定系列の存在下でタンパク質と放射性PI16の最小濃度の平衡を保たせる。非結合PI16を除去するための洗浄に続いて、タンパク質のKdを示す放射能量を測定する。別の例によると、KdまたはKd値を、BIAcore表面プラズモン共鳴BIAcore、Piscataway、ニュージャージー州を用いてPI16を固定する表面プラズモン共鳴試験を用いることにより測定する。好ましくは、CRCBT-02-001により分泌される抗体と同様のKdまたはこれより高いKdを有するタンパク質が選択され、これらのタンパク質はPI16への結合と競合する可能性が高い。インビトロ機能試験本発明のタンパク質を用いて単離された細胞のTreg活性への効果または本発明のタンパク質の効果を測定するインビトロの例示的方法は、例えば、混合リンパ球反応MLRまたは混合リンパ球培養MLCである。そのような方法は、細胞混合物例えば本明細書に記載の方法により単離されたTreg細胞とアロタイプが異なるT細胞を一緒に培養することを含む。次いでTreg活性を測定するため数種類の計測が行われることができ、例えば細胞増殖を標準的手法、例えば、13Hチミジン取り込み試験Treg細胞の不活性状態を示す活性T細胞の増殖を示す;および/またはTreg細胞またはTregの活性もしくは不活性を示し得る他のT細胞のいずれかによるサイトカイン分泌試験を用いて計測する。そのような方法は、制御能力をもつTreg細胞を同定するおよび/またはTreg活性を誘発する/増強するもしくは抑制する/防止する化合物を同定するのに有用である。例示的なMLRについてはWangら,2008年に記載される。あるいは、またはさらに、タンパク質のTreg細胞への効果を測定するインビトロな方法は、5,6-カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステルCFSEサプレッサー試験、例えば実施例において本明細書に記載の方法である。そのような試験では、CD4CD25-細胞をCFSEで標識化する。次いで、CD4CD25-のCFSE標識T細胞を、本発明に従って単離された様々な量の細胞の存在下で、照射PBMCで培養する。十分な時間の後、CD4CD25-CFSE標識T細胞の増殖をフローサイトメトリにより試験する。各CFSEシグナルピークは1つの分裂周期を表す。Treg細胞の細胞増殖抑制能を、制御性細胞集団が存在しないCD4CD25-CFSE標識T細胞のCFSEシグナルピークと比較することにより評価する。例示的なCFSEサプレッサー試験についてはVenkenら,に記載されている。さらなる例において、本発明に従って単離されたTreg細胞をエフェクタT細胞の存在下で培養し、CD154CD40Lを発現するエフェクタT細胞CD4CD25-数を測定する。Treg細胞非存在下でのCD154細胞数と比較してCD154を発現する細胞すなわち活性化T細胞数を減少させる細胞は、Treg活性を有すると考えられる。この試験については、以下でより詳細に記載する。あるいは、またはさらに、Treg細胞を本明細書に記載のように単離し、試験用化合物の存在下または非存在下で培養し、活性化させる。次いでIL-10および/またはTGF-βの分泌を標準的な方法、例えばELISAまたはFLISAを用いて評価する。本発明のタンパク質の転移細胞に対する活性を評価する例示的方法は、例えばマトリゲルでの細胞遊走アッセイまたはコロニー形成である。遊走アッセイでは、PI16を発現する転移細胞集団を細胞培養装置のチャンバ内に、すなわち液体伝達内に、転移細胞を誘引する化合物化学誘引物質を含む別のチャンバと共に留置する。この2つのチャンバは膜、例えば、対象に見られる細胞外マトリックスを模倣した膜により分離されている。膜を介した一方のチャンバから別のチャンバへの細胞遊走量が、タンパク質の存在下または非存在下で評価され、タンパク質を含有しない対照試料と比較して遊走量が減少したタンパク質は、転移を阻害すると考えられる。例示的方法についてはAlbiniら,およびRepeshに記載されている。本発明のタンパク質の心筋細胞に対する活性を評価する例示的方法は、PI16を過剰発現する心筋細胞集団をタンパク質と接触させることである。PI16の過剰発現は心筋細胞の発育不全を誘発するまたは成長を防止する。したがって結果として心筋細胞を拡大させて心筋細胞にPI16を過剰発現させるタンパク質は、心疾患の治療に有用であると考えられる。当業者に明らかであるように、スクリーニング方法は、細胞死、細胞増殖および/または細胞生存のレベルの検出が関与し得る。そのような方法は当業者に公知である。ある実施形態では、タンパク質活性での細胞死を、例えばアポトーシスなどの細胞死に関連する細胞成分の検出方法を用いて、例えば、細胞を殺す化合物を単離するため評価する。細胞における細胞死の検出方法は当業者に公知である。例えば、APOPTESTImmunotechから入手可能は細胞をアポトーシス初期に染色し、細胞試料を固定する必要がない。この方法は、アポトーシスを起こしている細胞に特徴的な細胞膜再構成を検出するアネキシンV抗体を利用する。この方法により染色されたアポトーシスを起こした細胞は、次いで固定したアネキシンV抗体を用いて、蛍光標識細胞分取FACS、ELISAのいずれかにより、または接着とパニングにより分別され得る。あるいは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ビオチン化UTPニックエンドラベル化TUNEL試験を用いて細胞死のレベルを測定する。TUNEL試験は酵素の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてアポトーシスの際に生じる3’-OHDNA末端を標識し、ヌクレオチドをビオチン化する。次いでビオチン化ヌクレオチドを、検出可能なマーカーと複合体化されたストレプトアビジンを用いることにより検出する。TUNEL染色キットは、例えば、IntergenCompany、Purchase、ニューヨーク州から入手可能である。Treg細胞を選択的に殺す化合物を同定および/または単離するために、そのような試験を他の細胞、例えばヘルパーT細胞および/またはCTLにより実施することができる。あるいは、細胞生存率または細胞代謝を検出および/または評価することができる。例として、非蛍光性レザズリンを、本発明のタンパク質存在下で培養した細胞に添加する。生存細胞はレザズリンを、例えば顕微鏡または蛍光プレートリーダーを用いて容易に検出できる赤色蛍光レゾルフィンに還元する。この細胞生存率マーカーは細菌から高等真核細胞まで種々の異なる細胞型に有用である。細胞生存率分析キットは例えばMolecularProbes、Eugene、OR、USAから入手可能である。細胞生存率に関する他の試験として、例えば、生細胞内での水溶性テトラゾリウムGLT008WST-8のホルマザン塩への還元を検出する試験AlexisBiochemicals、細胞内エステラーゼにより蛍光性カルセインに変換する細胞透過性カルセイン-アセトキシメチルカルセインAMによる生細胞の染色、3′-{1-[フェニルアミノカルボニル]-3,4-テトラゾリウム}-ビス4-メトキシ-6-ニトロベンゼンスルホン酸水和物]XTTのホルマザン塩への還元検出Intergen、または4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-5-3-カルボキシメトキシフェニル-2-4-スルホフェニル-2H-テトラゾリウムPES:フェナジンエトスルファートMTSのホルマザン塩への還元PromegaCorporationが挙げられる。インビボ機能試験本発明のタンパク質は、Treg機能および/またはTreg数例えば、Treg細胞を殺すことによるを抑制するその機能を試験し、本発明のタンパク質を試験対象に投与し、Treg細胞の細胞数を標準的手法または本明細書に記載の方法を用いて検出/単離し得る。未治療対象由来のTreg細胞数と比較した際のTreg細胞数の減少は、そのタンパク質がTreg数を減少させることを示す。あるいは、またはさらに、タンパク質を、腫瘍細胞投与の際に、投与前に、または投与後に試験対象に投与する。次いで、結果として生じる任意の腫瘍の存在/非存在および/またはそのサイズを評価し、タンパク質ではなく腫瘍細胞を投与した対象と比較する。腫瘍サイズを減少させおよび/または腫瘍形成を防止するタンパク質は、Treg機能を減少させ、また腫瘍細胞への免疫応答を引き起こすことができると考えられる。例示的な方法についてはJonesら,により記載されている。別の例において、本発明の試験用タンパク質を、免疫原性化合物を含む組成物の投与の際または投与前に投与する。次いで、免疫応答を、免疫原性化合物に対して、例えば、抗体応答例えば、ELISA/FLISAによりまたはT細胞応答例えば、ELISPOTまたはFluorospotに対して計測する。あるいは、またはさらに、免疫原性化合物および組成物を、免疫応答により治療可能な症状、例えば感染または腫瘍に罹患しているまたは発症した対象に投与する。良好なモデルは、当業者に公知および/または本明細書に記載されている。別の例において、本発明のタンパク質を使用して単離された細胞集団を、細胞をTreg細胞に関連する症状の動物モデルに投与することにより、決定する。例えば、細胞を、例えば骨髄破壊の結果によりTreg細胞が欠如した動物または、例えばAsanoSuriPayer;およびMcHughに記載されたFoxP3発現が欠如したマウスに投与する。自己免疫応答を抑制する、防止する、減少させる、または遅延させる細胞は、制御性T細胞機能を有すると考えられる。あるいは、またはさらに、任意の実施形態に従った本明細書に記載の方法により単離された細胞を、自己免疫疾患を誘発するCD4CD25-の移入の際、移入前、または移入後に、例えばSakaguchiら,に記載のようにヌードマウスに投与する。自己免疫応答を抑制する、防止する、減少させる、または遅延させる細胞は、制御性T細胞機能を有すると考えられる。単離細胞はまた、糖尿病を抑制する、防止する、治療する、または遅延させる能力を試験するためのNODマウス例えば、Tangら,に記載におよび/またはGVHDのマウスモデルに例えばTrenadoに記載および/または乾癬のマウスモデルに例えばWangら,2008に記載および/または関節リュウマチのモデル、例えば、マウスのSKG株にSakaguchiら,1995年、ラット2型コラーゲン関節炎モデル、マウス2型コラーゲン関節炎モデルもしくは数種において関節炎モデルを誘発する抗原Bendele2001年および/または多発性硬化症のモデル例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎EAE;BradlおよびLinington1996年および/または炎症性気道疾患例えばOVAチャレンジまたはゴキブリ抗原チャレンジChenら,2007年Lukacsら,2001年および/または炎症性腸疾患のモデル例えば、デキストラン硫酸ナトリウムDSS誘発大腸炎もしくは大腸炎のMuc2欠損マウスモデルVanderSluisら,2006年もしくは大腸炎のCD45Rb養子移入モデル例えば、Kanaiら,2006年に投与し得る。上記列挙したモデルのそれぞれを、好ましくは照射されヒト造血細胞により再生した造血系をもつマウスを用いて産生し、これによりヒト化モデルを得る。これらのモデルはまた、Treg機能を増強または増大させる能力について、化合物を試験するのに有用である。さらなる例において、本発明のタンパク質の効果を、転移モデルに関し評価する。例えば、転移細胞を、マウスの例えば静脈内または腹腔内、または肺などの臓器の近傍に接種し、臓器例えば肺で成長する腫瘍数を評価する。細胞を、例えば蛍光色素で標識化して検出を容易することができる。臓器で成長する腫瘍数が、タンパク質により治療してきた動物での腫瘍数と比較して減少している本発明のタンパク質は、転移を減少させると考えられる。例示的手法については、PriceおよびKerbelに記載されている。医薬組成物および治療方法本発明のタンパク質活性成分と同義語は、非経口、局所、経口、もしくは局所投与、エアロゾル投与、または経皮投与用の医薬組成物、予防的治療用の医薬組成物、または療法的治療用の医薬組成物に製剤するのに有用である。医薬組成物を、投与方法に依存して様々な単位剤形で投与し得る。例えば、経口投与に適する単位剤形として、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、およびトローチ剤が挙げられる。本発明の医薬組成物は、経口投与される場合、消化から保護すべきであることが認識される。これは、典型的には、ある組成物で化合物を錯化して酸加水分解および酵素加水分解に耐性を与えるか、またはリポソームなどの適切な耐性をもつ担体に化合物をパッケージングすることにより、達成される。タンパク質を消化から保護する手段は、当業者に公知である。本発明の医薬組成物は特に、静脈内投与または臓器もしくは関節の体腔もしくは管腔への投与などの非経口投与に有用である。投与用の組成物は通常、薬剤的に許容可能な担体、好ましくは水性担体中に溶解した本発明のタンパク質の溶液を含む。様々な水性担体、例えば緩衝食塩水などが使用され得る。組成物は、生理的条件に近づけるのに必要な薬剤的に許容可能な補助物質、例えばpH調整剤や緩衝剤、毒性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有することができる。これらの製剤での本発明の化合物濃度は多種多様であてよく、また液量、粘度、体重などに基づいて、選択した特定の投与モードと患者の必要性に従って選択され得る。例示的な担体として、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および5ヒト血清アルブミンが挙げられる。混合油やオレイン酸エチルなどの非水賦形剤もまた使用することができる。リポソームもまた、担体として使用することができる。賦形剤は、等張性および化学安定性を増強する少量の添加剤、例えば緩衝液や保存料を含有することができる。本発明のタンパク質は、非経口投与用に製剤され得、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、または例えば腫瘍部位もしくは疾病部位への蠕動投与および直接的点滴注入腔内投与などの他のそのような経路を介する注入用に製剤され得る。活性成分として本発明の化合物を含有する水溶性組成物の調製は、当業者に公知であろう。本発明による好適な医薬組成物は、一般に本発明のタンパク質を許容できる薬学的希釈剤または賦形剤、例えば滅菌水溶液と混合した量で、使用目的によって様々な最終濃度にする量を含む。調製手法は一般にRemington’sPharmaceuticalSciences16thEdMackPublishingCompany1980年、引用により本明細書に援用されるなど、当技術分野で公知である。製剤後、本発明の化合物を、剤形に適合する方法で、および治療効果/予防効果がある量で投与し得る。本発明の化合物の好適な用量は、特定の化合物、治療すべき症状および/または治療を受ける対象により様々であり得る。例えば最適以下の用量で開始して、最適なまたは有効な用量を決定するために徐々に用量を変更していくことにより好適な用量を決定することは、当業者の能力の範囲内である。PI16はまた、腫瘍転移、心拍停止に続く心筋細胞肥大の減少または予防に関与することが示されている。したがって、本発明はさらに対象での転移を治療する方法を提供し、前記方法は本発明のタンパク質を転移に苦しむまたは転移を起こしやすい対象に投与することを含む。1つの例において、対象は乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌に罹患している。好ましくは、対象は乳癌またはその転移を罹患している。本発明はまた、心機能障害を治療する方法を提供し、前記方法は、本発明のタンパク質を心機能障害または心機能障害を起こしやすい対象に投与することを含む。あるいは、またはさらに、本発明は心臓機能を改善する方法を提供し、前記方法は投与を必要とする対象に本発明のタンパク質を投与することを含む。あるいは、本発明は、対象にて心筋細胞肥大を誘導する方法を提供し、前記方法は投与を必要とする対象に本発明のタンパク質を投与することを含む。細胞の単離または濃縮本発明はまた、PI16発現に基づく細胞の検出および/または単離を企図する。1つの例において、細胞はTreg細胞、例えばnTreg細胞、好ましくはメモリーnTreg細胞、好ましくは、休止メモリーnTreg細胞である。1つの例において、方法は、別のマーカー、例えばTreg細胞のマーカーを検出することを含む。例示的なさらなるタンパク質または核酸としては、CD4、CD25、FoxP3、細胞傷害性Tリンパ球抗原4CTLA-4、CD62リガンドCD62L、CD134OX40、グルココルチコイド誘発性腫瘍壊死因子レセプターGITR、膜結合型TGF-β、CD196CCR6、プログラム細胞死リガンド1PD-L1、α4β7インテグリンまたはα4β1インテグリンが挙げられる。さらに好ましいタンパク質または核酸はCD4および/またはCD25である。好ましくは、CD25を高いレベルで発現する。別の例において、Treg細胞を検出または単離する方法はさらに、非Treg細胞により発現される核酸またはタンパク質の低レベルまたは検出不可能な発現を検出することを含む。例示的な核酸および/またはタンパク質としては、CD19および/またはCD20および/またはCD14および/またはCD56および/またはCD127が挙げられる。好ましくは、本発明はCD127CD127negを検出可能に発現しない、または低レベルのCD127CD127loを発現する細胞を検出または単離することを含む。本明細書に使用される用語正の発現またはは、アイソタイプ対照化合物、例えば抗体を用いて検出した場合のバックグラウンドのレベルを上回る発現を意味するものとする。本明細書に使用される用語アイソタイプ対照化合物は、化合物、好ましくは、タンパク質の発現を検出するために使用されるものと同様のアイソタイプであるが、タンパク質の特異性に関連せずにタンパク質の発現を検出するために使用される化合物と同じ検出可能部分と複合体化する抗体を意味するものとする。そのような対照は、特異的結合から非特異的なバックグラウンド結合を識別するのに役に立つ。高いレベルまたはハイレベルな発現に対する言及は、FACS解析を用いて測定した場合に、列挙したマーカー例えば、PI16を最も高いレベルで発現する細胞集団のうち、細胞の50、好ましくは40、30、またはより好ましくは20、より好ましくは細胞の10を意味する。本明細書に使用される用語負の発現または-は、アイソタイプ対照化合物、例えば抗体を用いて検出した場合のバックグラウンドのレベルと同等か下回る発現を意味するものとする。例えばCD127発現との関連において低いレベルまたはローレベルな発現に対する言及は、細胞集団の列挙した核酸またはタンパク質発現が最も低いレベルである細胞が50または60または70または80または90であることを意味するものとする。所望の細胞を濃縮する一つの例示的な手法は、磁気細胞分離法MACSまたは磁気を利用するその他の細胞分離方法、例えばDynabeads登録商標である。従来のMACS手順はMiltenyiら,により記載されている。この手順では、細胞を、細胞表面マーカーまたはタンパク質に結合する抗体または他の化合物に結合する電磁ビーズで標識し、その細胞を、常磁性分離カラムを通過させるかまたは別の形状の磁場に曝露させる。分離カラムを強力な磁石に置き、これによりカラム内に磁場を形成する。磁気標識された細胞をカラムに捕捉し;すなわち細胞は通過しない。次いで、捕捉細胞をカラムから溶出する。本発明の細胞を、MACSを用いて好適な試料から濃縮して、好適なタンパク質を発現する細胞を分離し得る。試料をタンパク質に結合する免疫磁性ビーズと共にインキュベートする。インキュベーション後に、試料を洗浄して再懸濁して磁場を通過させて免疫磁性ビーズに結合した細胞を取り除き、タンパク質に結合した細胞を回収する。これらの技術は、陰性選択、例えばTreg細胞の場合の好ましくないマーカーを発現する細胞、CD8の除去に同様に適用される。別の例において、タンパク質または細胞表面マーカーに結合する化合物を固体表面上に固定して、細胞集団を固体表面と接触させる。洗浄して未結合細胞を取り除いた後、化合物に結合した細胞を回収し、例えば溶出することにより、化合物と結合するタンパク質を発現する細胞について単離および濃縮する。あるいは、所望であれば化合物に結合しない細胞を回収することができる。好ましい例において、細胞を、蛍光標識細胞分取FACSを用いて単離または濃縮し得る。FACSは、粒子例えば細胞を粒子の蛍光特性に基づき分離する、例えばKamarch1987年に記載の公知の方法である。一般にこの方法は、細胞集団が1以上のタンパク質または細胞表面マーカーと結合することができる化合物と接触することを伴い、このうち区別可能なマーカーに結合する化合物は、様々な蛍光部分、例えば蛍光体で標識化される。流れが速い狭小の液体の流れの中心に細胞が乗って移動する。この流れは、細胞が細胞の寸法に関連して細胞同士が分離しているように配置されている。振動膜により、細胞にストリームが生じ、個々の液滴に分解する。その系を調整し、1以上の細胞を液滴にする確率が低くなるようにする。ストリームが液滴に分解する直前に、その流れを蛍光測定位置に貫通させ、そこで各細胞対象の蛍光特性、例えば標識化合物が対象と結合しているか否かを測定する。荷電リングをストリームが液滴に分解する点に配置する。電荷を蛍光強度測定の直前にリング上に配置し、ストリームから分解されたとき、対立する電荷を液滴上で捕捉する。次いで、荷電した液滴が静電偏向系を通り抜けて液滴を、その電荷例えば標識化合物が細胞と結合している場合は一方の容器に、そうでない場合は別の容器に移す。いくつかの系では、電荷が直接ストリームに印加され、分解した液滴はそのストリームと同じサインの電荷を保持する。次いで、液滴分離後にストリームを中性に戻す。細胞培養単離後、本発明の細胞を標準の細胞培養条件下で維持し得る。例えば細胞は、ダルベッコ最少必須培地DMEM、または当技術分野で公知の、例えば上記のその他の適する細胞培養培地で維持し得る。他の適する培地として、例えば、MCDB、最少必須培地MEM、IMDM、およびRPMIが挙げられる。細胞培養を、好ましくは加湿インキュベータにて約37°Cでインキュベートする。細胞培養条件は本発明の細胞により大幅に異なり得る。好ましくは、細胞を細胞増殖に好適な環境、例えば、空気中に5O2、10CO2、85N2または10CO2を含む環境で維持する。1つの例において、Treg細胞を、任意でIL-2および/またはTGF-βの存在下で増殖を促進するために抗CD3抗体の存在下で増殖させる。1つの例において、細胞をビーズ例えば、CD3およびCD28に対する抗体で被覆された鉄デキストラン磁気ビーズ-Dynabeadsの存在下で培養する。抗CD28抗体は例において低増殖性Treg細胞の増強活性と成長に関する信号をもたらす。低い比率抗CD28と比較して低い抗CD3のビーズにより増殖したCD4CD25ははるかに安定性があり、従来のT細胞による異常増殖が起こりにくい。ビーズは磁気カラムによる培養細胞の通過により容易に除去できる。細胞選別の必要はない。Treg細胞をまた、T細胞および/またはIL-10の生存率を高め、制御性T細胞および/またはIL-15の産生に部分的に関与し、IL-2と共に相乗作用を与えてCD4CD25T細胞の増殖を誘発することが示されているサイトカイン、例えばIL-4および/またはIL-7の存在下で培養し得る。いくつかの例において、自己CD4T細胞を支持細胞として使用する。あるいは、feeder-freeの培養は例えばIL-2と共に上記のビーズを用いて実施し得る。さらに培養拡大を宿主APC例えばDCにより、またはそれなしで達成し得る。細胞組成物1つの例において、本発明にしたがって単離された細胞例えば、Treg細胞および/またはその子孫細胞は、組成物の形態で投与される。好ましくは、そのような組成物は、薬剤的に許容可能な担体を含む。好適な本発明のための担体としては従来使用される担体が挙げられ、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンゲル液、緩衝液、ヒアルロナン、およびグリコール類が、特に等張である場合の溶液に関しては好ましい液体担体である。好適な医薬担体としてはまた、スターチ、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。別の例において、担体は、例えば細胞を成長または懸濁させる媒体組成物である。好ましくは、そのような媒体組成物は、投与された対象にいかなる副作用も誘発しない。好ましい担体は、細胞の生存性および/または細胞活性例えばTreg関連症状を減少させる、防止する、もしくは遅延させるための細胞能力に不都合な影響を与えない。1つの例において、担体は細胞および/または可溶性因子を好適なpHで維持する緩衝作用をもたらし、これにより生物活性を発揮する。例えば、担体または無効成分はリン酸緩衝生理食塩水PBSである。PBSは、細胞や因子との相互作用が最小限であり、また細胞や因子の迅速な遊離を可能にするため、魅力あるの担体または無効成分である。そのような場合、本発明の組成物は、血流にまたは組織もしくは組織の周辺や近傍内に例えば注入により直接適用するために、液体として作製することができる。本発明に従って単離された細胞例えば、Treg細胞および/またはその子孫細胞はまた、受容者適合性であり受容者に有害でない産物に分解する足場内に組み込まれるか埋め込まれることができるそのような。例示的な足場としては、ポリグリコール酸の骨格例えばVacantiら,1988年Cimaら,1991年Vacantiら,1991年に記載された;またはポリ酸無水物、ポリオルトエステル類、および、ポリ乳酸などの合成高分子が挙げられる。好ましくは、組成物は、有効量または治療有効量もしくは予防有効量の細胞を含む。例えば、組成物は、細胞を約1x105細胞/kgから約1x109細胞/kgまたは約1x106細胞/kgから約1x108細胞/kgまたは約1x106細胞/kgから約1x107細胞/kg含む。投与する細胞の正確な量は、様々な要因、例えば患者の年齢、体重、および性別、ならびに治療または防止する症状の範囲と重症度に依る。本発明の細胞組成物は、任意の周知方法により対象の全身にまたは局所部位に投与され得る。免疫応答の刺激または増強本明細書の基づき当業者に明らかであるように、本発明はまた、対象でTreg細胞を減少または枯渇させることにより対象での免疫応答を増強する方法を企図する。1つの例において、対象でのTreg細胞を減少または激減させることは、例えば、腫瘍に対しおよび/または病原体に対し例えば、免疫原性組成物の投与なしに免疫応答を十分に誘発する。別の例において、対象に免疫応答を誘発する方法は、対象でのTreg細胞を減少または激減させること、および免疫原性化合物を含む組成物を投与することを含む。本明細書に使用される、用語免疫原性化合物は、対象に取り込まれた場合に免疫応答を引き起こす免疫状態を作る任意の物質または有機体を意味する。いくつかの実施形態では、免疫原をワクチン形態での治療枠で使用し得る。本明細書に使用される場合、特定の定めがないかぎり用語増強した免疫応答は免疫原を本発明のタンパク質と組み合わせて投与した場合に、当技術分野でのまたは本明細書に記載の任意の標準的手法を用いて測定された、投与を受けた対象での免疫応答、好ましくはT細胞応答および/または抗体応答が本発明の化合物を投与されていない対象と比較して増加していることを意味する。本発明の方法で使用される免疫原性化合物は、癌抗原または腫瘍抗原であり得る。当業者に知られる任意の癌または腫瘍抗原は、本発明の免疫原性組成物に応じて使用されることができ、免疫原性組成物として、これに限定されないが、KS1/4汎腫瘍性抗原PerezおよびWalker1990年、悪性卵巣腫瘍抗原CA125Yuら1991年、前立腺酸性リン酸塩Tailorら1990年、前立腺特異的抗原HenttuおよびVihko1989年、黒色腫関連抗原p97Estinら1989年、黒色腫抗原gp75Vijayasardahlら1990年、高分子量黒色腫抗原HMW-MAANataliら1987年、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原CEAFoonetal1994、TAG-72Yokataら1982年、CO17-1ARagnhammarら1993年;ヒトB-リンパ腫抗原-CD20Reffら1994年、GD2Salehら1993年、ガングリオシドGM2Livingstonら,1994年、EGFR上皮成長因子受容体、HER2抗原が挙げられる。さらなる腫瘍抗原は、例えばNovellinoら,2005に記載されている。別の例において、免疫原は癌細胞またはその溶解物である。1つの例において癌は乳癌である。別の例において、癌は脳腫瘍、例えば、神経膠腫である。さらなる例において、癌は胃癌である。別の例において、癌は前立腺癌である。別の例において、癌は黒色腫である。別の例において、癌はリンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫である。本発明の方法で使用される免疫原はまた、感染症薬剤であることができ、感染症薬剤としてはこれに限定されないが、インフルエンザウイルス血球凝集素GenbankAccessionNoJO2132Air1981年、B型肝炎ウイルス表面抗原Itohら1986年、B型肝炎ウイルスコアタンパク質および/もしくはB型肝炎ウイルス表面抗原またはそれらのフラグメントもしくは誘導体例えば英国特許第2034323号明細書を参照のことが挙げられる。1つの例において、免疫原性化合物はポリペプチド抗原をコードするDNAである。1つの例において、免疫原性組成物はさらにアジュバントを含む。アジュバントは、抗原免疫原性を向上させる分子および調製物である。好適なアジュバントとしては、サイトカインなどの全ての許容できる免疫刺激化合物、毒素、または合成組成物が挙げられる。多くの場合好ましいアジュバントの例としては、これに限定されないが、完全フロインドアジュバント死滅結核菌Mycobacteriumtuberculosisを含有する免疫応答の非特異的刺激剤、不完全フロインドアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。抑制および免疫応答本発明はまた、対象において、Treg細胞数またはTreg活性の減少に関連する症状を治療または予防する、および/または免疫抑制を誘発するおよび/またはCTLもしくはヘルパーT細胞活性を減少させる方法を提供し、前記方法は:i本明細書に記載の方法を任意の実施形態にしたがって実施することによりTreg細胞集団を単離すること;およびii対象にiの細胞を投与すること、を含む。別の例において、方法は、Treg機能を活性化する本発明のタンパク質を投与することを含む例えば、本明細書に記載の方法を用いて評価される。別の例において、方法は、固形または半固形担体を移植することを含み、固形または半固形担体には本発明のタンパク質が固定され、また任意でTreg細胞が結合している。1つの例において、対象は、Treg数および/またはTreg活性の減少に関連する症状に罹患しているかまたはその発症の危険性があり、および/または対象はCTLもしくはヘルパーT細胞活性の減少を必要とし例えば、対象は自己免疫疾患に罹患しているか発症の危険性がある、および/または対象は免疫抑制例えば、移植を受けているもしくは受けようとしている、または移植片対宿主病に罹患しているを必要とする。ある症状に罹患している対象を決定する方法は、本明細書の記載に基づき当業者に明らかであろう。1つの例において、対象は1型糖尿病に罹患している。別の例において、対象は多発性硬化症に罹患している。さらなる例において、対象は炎症性腸疾患に罹患している。好ましい例において、対象は関節炎例えば関節リュウマチに罹患している。さらなる例において、細胞は移植片例えば細胞移植片または組織移植片または臓器移植片を用いて投与され、これにより移植片対宿主または宿主対移植片の免疫応答を抑制または減少させる。治療用にTreg細胞を同定および/または単離および/または培養および/または製剤する方法は、本明細書に記載されている。診断検査/予後予測試験本発明がPI16発現に関する症状、特にTreg関連症状を診断/予後予測する様々な方法を提供することは、本明細書の記載から明らかであろう。PI16は転移、前立腺癌、および心拍停止において脱制御されていることが示されている。したがって、本発明の方法は、転移を診断または予後予測する方法例えば、乳癌転移に準用することを理解されるべきであり、PI16またはPI16発現細胞レベルの増加は転移を示す。本発明の方法は、心臓肥大または心拍停止を診断または予後予測する方法に準用することを理解されるべきであり、PI16またはPI16発現細胞レベルの増加は、心臓肥大または心拍停止を示す。本発明の方法は、前立腺癌を診断または予後予測する方法に準用することを理解されるべきであり、PI16またはPI16発現細胞レベルの増加は、前立腺癌を示す。タンパク質検出試験本発明の一例は、PI16またはこれを発現する細胞の有無を検出する。タンパク質または細胞の量、レベル、または有無は、当業者が周知の様々な技術、例えば、フローサイトメトリ、免疫組織化学的検査、免疫蛍光検査、免疫ブロット法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、酵素結合免疫吸着測定法ELISA、ラジオイムノアッセイRIA、酵素免疫測定法、蛍光共鳴エネルギー移動FRET、マトリクス支援レーザー脱離イオン化MALDI-TOF、エレクトロスプレーイオン化ESI、質量分析法タンデム質量分析法、例えばLCMS/MSなど、バイオセンサ技術、エバネセント光ファイバ技術evanescentfiberopticstechnology、またはタンパク質技術チップからなる群から選択される技術のいずれかを用いて測定される。一実施形態ではタンパク質の量またはレベルを測定するために使用される試験法は半定量分析である。別の実施形態では、タンパク質の量またはレベルを測定するために使用される試験法は定量分析である。好ましくは、タンパク質は、イムノアッセイにより検出される。好ましくは、免疫組織化学的検査、免疫蛍光検査、酵素結合免疫吸着測定法ELISA、蛍光結合免疫吸着測定法FLISA、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイRIA、バイオセンサ試験、タンパク質チップアッセイ、および免疫染色例えば免疫蛍光検査からなる群から選択される試験を用い、好ましくは、検出方法はフローサイトメトリ法であり、例えばTreg細胞数の検出は当技術分野に知られているおよび/または本明細書に記載の蛍光標識細胞分取FACSを用いる。標準的な固相ELISAまたはFLISA形式は特に様々な試料由来のタンパク質濃度を測定する際に有用である。一形態では、ELISAまたはFLISAは、本発明のタンパク質またはPI16の異なるエピトープに結合するタンパク質を固体マトリックス、例えば、薄膜、ポリスチレンもしくはポリカーボネートマイクロウェル、ポリスチレンもしくはポリカーボネート製ディップスティック、またはガラスサポート上で固定化することを含む。次いで、試料を固定したタンパク質と物理的に関係をもたせ、PI16を結合または捕捉捕捉するする。次いで、結合したPI16を異なるPI16のエピトープ例えば本発明のタンパク質に結合する第2の標識化合物を用いて検出する。あるいは第2の検出抗体に結合する第3の標識抗体を用い得る。別の形態では、本発明のタンパク質を用いて、PI16を発現する細胞を捕捉する。次いで、異なるタンパク質に結合する第2のタンパク質を用いて、この細胞を検出する。例えば、Treg細胞の場合、第2のタンパク質はCD4またはCD25に結合し得る。当然、第2のタンパク質に結合する第3のタンパク質を検出試薬として使用し得る。本明細書に記載の試験形式がハイスループットフォーマット、例えばMendozaら,1999に記載されているスクリーニングフォーマットまたはマイクロアレイの自動化などに適していることは、当業者に明らかであろう。さらにまた、上記試験の変形が、例えば競合ELISAなどが、当業者には明らかであろう。代替的な実施形態では、ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法、例えば、免疫組織化学的検査または免疫蛍光検査などを用いて細胞内または細胞上にて検出される。免疫蛍光検査を用いる方法が、定量的または少なくとも半定量的であるので好ましい。染色した細胞の蛍光強度を定量化する方法は、当業者に公知であり、例えばCuello1984年に記載されている。バイオセンサ装置は一般に電極表面を、装置に組み込まれた素子を試験基質基質と組み合わせて測定する電流またはインビーダンスと組み合わせて利用する例えば米国特許第5,567,301号などに記載される。本発明のタンパク質をバイオセンサ装置とこの装置に接触した生体試料の表面に取り込む。バイオセンサ装置により検出した電流またはインビーダンスの変化が前記タンパク質と結合するタンパク質を示す。当技術分野で公知のバイオセンサのなかにはまた、表面プラズモン共鳴に頼りタンパク質の相互作用を検出するものもあり、これにより、表面プラズモン共鳴の反射面の変化がタンパク質のリガンドまたは抗体への結合を示す米国特許第5,485,277号および米国特許第5,492,840号。バイオセンサは、そのようなシステムをマイクロまたはナノスケールに適応させることが容易であるので、ハイスループット解析の際に特に使用される。さらにまた、そのようなシステムは好都合に適応されて数種類の検出試薬が組み込まれ、単一のバイオセンサ単位で診断試薬を多重化することができる。これにより、少量の体液で数種類のタンパク質またはペプチドを同時に検出することができる。画像検査方法前述から、当業者に明らかであるように、本発明はまた、本発明のタンパク質を用いた画像検査方法を企図する。画像検査では、タンパク質を一般に検出可能な標識と複合体化するが、前記検出可能な標識は画像検査により検出可能な信号を発し得る任意の分子または薬剤であり得る。しかし、本発明のタンパク質に特異的に結合する二次標識化合物もまた使用することができる。例示的な検出可能な標識としては、タンパク質、放射性同位体、蛍光体、可視発光蛍光体、赤外線発光蛍光体、金属、強磁性体、電磁放射体、特異的な核磁気共鳴MRの分光学的特徴をもつ物質、X線吸収またはX線反射物質、または音変換物質soundalteringsubstanceが挙げられる。本発明のタンパク質および使用するなら二次標識化合物は、全身にまたは局所の臓器もしくは組織もしくは癌の場合は腫瘍に投与され画像化し得、その後画像処理される。一般には、タンパク質は、腫瘍、組織、または臓器の所望の光学イメージングをなし得るのに効果的な用量で投与される。そのような用量は、使用される特定のタンパク質、画像化する状態、画像処理する組織または臓器、使用される画像処理装置などに依存して、大幅に変化し得る。本発明のいくつかの例において、タンパク質は、これに限定されないが、腫瘍の画像化、臓器の断層画像化、臓器機能の監視、冠動脈造影、蛍光内視鏡検査、レーザー誘導手術、光音響法、および音響蛍光法sonofluorescencemethodなど様々な生物医学的応用での組織および臓器のインビボ光学造影剤として使用される。画像検査方法の例としては、核磁気共鳴映像法MRI、MR、X線撮影、コンピュータ断層撮影CT、超音波、プラナー像のガンマ線カメラ映像、単光子放射型コンピュータ断層撮影法SPECT、ポジトロン放出断層撮影法PET、他の核医学に基づくイメージング、可視光を用いた光学イメージング、ルシフェラーゼを用いた光学イメージング、蛍光体を用いた光学イメージング、他の光学イメージング、近赤外光を用いた画像化、または赤外光を用いた画像化が挙げられる。いくつかの例において、造影剤は、ヒト例えば本明細書に記載のモデルに使用する前に、インビトロまたはインビボ試験を用いて検査される。試料本発明の方法が、インビボに基づくスクリーニングとしてよりむしろ単離組織試料でのインビトロで実施される範囲において、用語試料は、これに限定されないが、体液例えば、血液または滑液または髄液、細胞物質例えば組織の吸引物組織吸引物、組織生検標本、または外科的標本などの動物由来の生体物質の任意の試料を意味することを理解すべきである。好ましくは、試料はTreg細胞を含むか、またはTreg細胞を含む可能性が高い。本発明の方法にしたがって使用される試料は、直接使用されることができるか、または使用前に何らかの処理を必要とし得る。例えば、生検試料または外科的試料は、使用前に均質化または細胞分散の他の形式を必要とすることができる。さらにまた、生体試料が液体形態でないに限りでは、そのような形式が必要とされるまたは所望される場合緩衝液などの試薬を添加して試料を動態化する必要があり得る。上記説明から明らかなように、そのような試験は、例えば定量化するために好適な対照例えば正常もしくは健常な個体または典型的な個体群を使用する必要があり得る。本明細書に使用される用語正常な個体は、対象が、その対象のPI16発現細胞例えば対象由来の試料でのTreg細胞が異常な数でないという前提で選択されることを意味するものとする。健常な個体は、症状例えばTreg関連症状に罹患していると診断されていないおよび/またはその症状を発症する危険性がない個体である。あるいは、またはさらに、好適な対照試料は、ある症状の罹患が知られていない対象の典型的な個体群に関し試験されるマーカー測定を含む対照用データセットである。一実施形態では、基準試料は試験において含まれない。むしろ好適な基準試料は、典型的な個体群から以前産生した既存のデータセットに由来する。試験用試料の処理、分析および/または試験から得られるデータは、次いで試料個体群のために得られたデータと比較される。キット本発明はまた、本発明の検出/単離/診断/予知/治療/予防方法で用いる、本発明の化合物を含む治療//予防/診断キットを提供する。そのようなキットは、一般に好適な容器手段内に本発明のタンパク質を収容し得る。キットはまた、例えば検出/単離/診断/画像検査または併用療法のための他の化合物を収容することができる。例えばそのようなキットは、様々な抗炎症薬および/または化学療法薬もしくは放射線治療薬;血管新生阻害剤;抗腫瘍細胞抗体;および/または抗腫瘍血管系もしくは抗間質腫瘍免疫毒素、またはコアグリガンドまたはワクチンのうちいずれか1つまたはそれ以上を含むことができる。1つの例において、キットはPI16の検出用であり、またさらに検出を容易にする試薬検出可能な標識および/または検出可能な標識の基質を含む。そのようなキットはさらに陽性対照を含むことができる。別の例において、キットは、細胞または細胞個体群の単離用である。そのようなキットでは、本発明のタンパク質を、FACSを容易にするために検出可能な標識で標識化することができる。タンパク質をまた、MACSを容易にするために磁性粒子または常磁性粒子により標識化することができる。タンパク質をまた、単離を容易にするために固形または半固形基質上に固定することができる。さらなる例において、キットは病状の治療または予防用である。そのようなキットでは、タンパク質を溶液としてまたは凍結乾燥形態任意で再懸濁用溶液とともにで供与することができる。タンパク質を、治療化合物と複合体化することが可能であり、またはキットがタンパク質と複合体化するための治療化合物を含むことができる。上記説明のように、キットはまた、さらなる治療化合物または予防化合物を含むことができる。微生物寄託詳細CRCBT-02-001という名称のハイブリドーマを、2010年2月24日に、寄託番号PTA10685で米国標準培養コレクションATCCに寄託した。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびその下位の規則に従い行った。これにより、寄託日から30年間にわたり生存培養の維持が保証される。本生物は、培養物の子孫の永続的および非制限的入手を保証するブタペスト条約の条件のしたがいATCCにより利用可能となる。本出願の譲渡人は、好適な条件下で培養した際に寄託培養物が死滅または消失、または損なわれた場合、直ちに通知し生存可能な同じ培養物の標本と置き換えることに同意している。寄託株の入手可能性は、政府の権限下でその特許法に準拠して付与された特許権に違反し本発明を実行する権利と解釈されるべきではない。以下の非制限的な実施例で、本発明をさらに説明する。実施例1Treg細胞でのPI16の同定1.1材料および方法1.1.1臍帯血T細胞集団の単離およびインビトロ増殖および特性解析臍帯血を、Children’s,YouthandWomen’sHealthServiceResearchEthicsCommitteeが定める母体インフォームドコンセントinformedmaternalconsentにより得た。単核細胞MNCを、抗凝血剤を含有する採血バッグFenwell中の分娩後の臍帯血から単離した。臍帯血CD4CD25TregおよびCD4CD25-ヘルパーT細胞を、DynabeadsRegulatoryCD4CD25T細胞キットInvitrogenを用いてMNCから単離した。各細胞型の純度をCD4およびCD25の発現のために2色フローサイトメトリにより常に90超にした。T細胞集団24穴プレートにて1x106細胞/穴の生体外での増殖を、20mMHEPESpH7.4、5熱不活性化ヒトプール血清Lonza、2mMl-グルタミン、および500U/ml組み換えヒトインターロイキン-2rhIL2;RDresearchを補充したX-Vivo15培地BioWhittickerにて、細胞比が3:1のビーズであるDynabead登録商標CD3/CD28T細胞増殖刺激ビーズInvitrogen;Cat111-41Dの存在下で行った。細胞を8日間Dynabeadsの存在下で増殖し、その後ビーズの磁気除去を行い、100U/mlのrhIL2を除く上記成分を補充したX-Vivo15培地で培養した。使用当日、増殖した細胞の表現型について、BeckmanCoulterのEpicsEliteESPフローサイトメータでの3色フローサイトメトリによるFoxP3FoxP3-Alexa488、BDクローン259D/C7;ヒトFoxP3緩衝液セット、BDカタログ番号560098の細胞内検出と組み合わせた、CD4PEcy5、ebioscienceクローンRPA-T4、CD25PE、BDクローンM-A251、およびCD127PE、ebioscienceクローンebioRDR73の表面発現の特性解析を行った。1.1.2RNAの調製および発現アレイ差次的発現解析をAffymetrixヒトExon1.0ST試験を用いて実施した。総RNAを、およそ60時間静止させ次いで8日間の増殖手順の後に、賦形剤DMSOまたはイオノマイシン処理2時間のいずれかを行った増殖CD425-ヘルパーTおよびCD425Treg細胞より単離した。低分子量RNAを含む総RNAを、QIAshredderおよびmiRNeasyminiキットQIAGENを用いて単離した。AffymetrixヒトExon1.0STアレイへの標識化とハイブリダイゼーションを、BiomolecularResourceFacilityJohnCurtinSchoolofMedicalResearch、AustralianNationalUniversityにて基本的に製造業者のプロトコルに従って行い、AgilentSystemsBioanalyzerを用いてRNA品質の試験を行った。1.1.3RNA発現アレイデータ正規化プローブ標識データを、RMAモデルIrizarryら,2003年を用いて、プローブレベルモデル化probelevelmodellingBolstadら,2003年を用いたEntrezGenecentriccdfDaiら,2004年のv11.0に基づき得られた最終転写レベル予想で、処理した。全処理を、統計ソフトウェアRRDevelopmentCoreTeamを用いて、aroma.affymetrixフレームワークBengtssonら,2006年、ならびに、BengtssonおよびHossjer2006年のもとで行った。各試験に関するハイブリダイゼーション品質を、偽像pseudoimageプロット、NUSE、RLEBolstadら,2001年およびプローブレベルデータのヒストグラムを用いて評価した。Loess正規化後、個体ドナー中のCD4CD25Treg細胞対CD4CD25-ヘルパーT細胞のfourwaycomparisonの静止処理と刺激処理とのログ比Logfoldchangeを推定した。最終の発現解析をアレイレベル重量arraylevelweightおよびRpackagelimmaSmythら,2005年、ならびに、WettenhallおよびSmyth2004年を用いて行った。各項の生P値を全体的に調整し、FDRの推定値HochbergおよびBenjamini1990年を得た。1.1.4半定量的リアルタイムPCR発現アレイ解析により同定された別々に制御される標的遺伝子の検証を、5つの別個のドナーからの増殖したCD4CD25およびCD4CD25-細胞より単離したRNAで行った。増殖、刺激、およびRNA単離条件は、発現アレイ実験で使用されるものと同じであった。無作為にプライミングされたcDNAを、QuantiTectreversetranscriptaseキットQIAGENを用いて総RNAから調製した。cDNAを、1.25UnitsFastTaqDNAポリメラーゼRoche、2.5mMMgCl2、200μMの各プライマー、200μMdNTPmix、1.1xSYBRgreenMolecularProbes、Invitrogen1xFastTaqPCR緩衝液からなる25μlのqPCR反応物中にて使用した。qPCRに関する遺伝子特異的プライマー対をプライマーバンクWangおよびSeedNucleicAcidsRes31e1542003年から選択した。RPL13aに特異的なプライマーセットを内部対照として用いた。サイクル条件は94°Cで50秒、60°Cで25秒、および72°Cで50秒を40サイクルであり、その後Rotorgene6000PCRmachineCorbetResearchを用いた融解曲線を作製した。結果を、Rotor-Gene6000、Q-geneソフトウェアMullerら,2002年およびRを用いて解析した。1.1.5細胞表面分子発現の検証表面分子解析について、成人末梢血CD4CD25TregまたはCD4CD25-ヘルパーT細胞を、CD3/CD28ビーズビーズ細胞比、1:1および100U/mlのIL2の存在下で新たに単離または単離および一晩刺激し、その後、CD4、CD25、FoxP3およびPI16に対する抗体を用いた4色フローサイトメトリを行った。1.2結果1.2.1ヒト臍帯血Tregの単離および検証発現プロファイリング検査のための十分なヒトTregを産生するため、ヒト臍帯血から単離したおよそ1x106のCD4CD25hi細胞を抗CD3/CD28ビーズを用いてインビトロで増殖させた。生体外での1ラウンドの増殖後、臍帯血Tregの100倍から200倍の増殖が常に得られた。これらの細胞は増殖においてTreg表現型を維持し、増殖した細胞の90超がCD4、CD25hi、およびFoxP3陽性に染色した。これらの細胞はまたCD127dimであった。増殖後、細胞が不適合ドナーの混合白血球抑制試験でCD4CD25-細胞の増殖をインビトロで確実に抑制することができたことから、細胞は制御機能を保持していた。増殖した機能的なTreg細胞を発現プロファイリング実験に用いた。1.2.2静止および活性化Treg細胞での差次的遺伝子発現発現プロファイリングを、単離およびインビトロで増殖した臍帯血Tregで実施した。4ウェイTreg遺伝子発現アレイ実験を考案してTregおよび適合ヘルパーT細胞の刺激または静止状態での発現プロファイルを明らかにした。この4ウェイ比較はTregの内因性発現パターンを有する遺伝子、Treg特異的活性サインの一因となる遺伝子、およびT細胞活性化に通常応答することが示される遺伝子を同定した。全体で、1851遺伝子がTregのヘルパーTと比較した作用に有意差を示すとみなされ、さらに746遺伝子が細胞型両方での活性化に同様の応答を示した。同定された遺伝子の1つであるPI16は静止および活性化ヒトTreg細胞の両方においてかなりの割合で発現した。Tregアレイでの遺伝子発現プロファイルを確実にするため、遺伝子特異的な半定量的リアルタイムPCRqPCRを実施した。PI16を含む差次的に発現した候補遺伝子のグループを選択し、Treg対ヘルパーT細胞の5つの生物学的複製でのその発現を検査した。定量的RT-PCRおよび低密度アレイによりPI16の差次的発現が確実なものとなり、またその結果はアレイ解析で同定した遺伝子の作用と比較的に一致していた。1.2.3Treg上のPI16細胞表面分子解析上記説明したアレイデータを解析して、Treg細胞を同定するためのFoxP3発現の代わりとなるものとして使用され得るバイオマーカーを同定した。これらのデータより、PI16をそのようなバイオマーカーの1つとして同定した。CD25陽性成人CD4細胞をPI16とFoxP3の共発現について抗PI16ポリクローナル抗体を用いてスクリーニングし、PI16がFoxP3と正の相関を有することが見いだされた図2。PI16の発現をまたTGFb誘導性Tregにて試験を行ったiTreg;図3。TGFbは実質的にCD25およびFoxP3発現を上方制御したが、PI16は一過的に誘発したこれらの細胞では実質的に発現されず、PI16発現が内在性Tregと誘導性Tregとを区別し得ることを示唆している。実施例2PI16に対する抗体の作製および特性解析2.1材料および方法2.1.1末梢血単核細胞単離末梢血単核球PBMCを全血Children’s、YouthandWomen’sHealthService、SouthAustraliaの研究所倫理審査委員会からの倫理的許可に準拠してインフォームドコンセントにより健常者から得られたからLymphoprepNycomed,オスロ上での密度遠心法により単離し、PBS-アジ化物で2回洗浄した。血液を、ヘパリンリチウム抗凝血剤を用いて収集した。2.1.2PI16発現細胞の産生pCMV-SPORT6の完全長PI16コード配列を含む構築物を、OpenBiosystemsThermo,MHS1010-708293より購入した。GatewayvectorsystemInvitrogenに適合する挿入物を産生するため、PI16コード配列を本ベクターから次のプライマーを用いて増幅した:PI16-F:5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccATGCACGGCTCCTGCAGTT-3’配列番号5NCBIRefSeqNM_153370のヌクレオチド329~347に対応するおよびPI16-R:5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcGAAGATTCCAGCCAACACCA-3’配列番号6参照配列のヌクレオチド1698~1717の逆方向配列および相補配列。プライマーの大文字部はPI16コード配列に特異的であるが、プライマーの下線部はGatewayvectorのためのアダプターである。PCR産物を精製し、およびGatewayvectorpDONR201Invitrogen中にクローン化してエントリークローンpDONR201/PI16を作製した。クローン挿入物の同一性を、pDONR201/PI16をGatewayTechnologyInstructionManualに記載の順方向および逆方向配列プライマーを用いて配列決定することにより、確かめた。PI16挿入物をpDONR201ベクターからpDEST40ベクターまで、GatewayTechnologyInstructionManualに記載の手順を用いて転写した。複数の単一コロニーを単離し、PCRによりスクリーニングして、挿入物が存在することを確認した。pDEST40/PI16構築物のプラスミドDNAをQiagenMidi-PrepキットQiagenを用いて調製した。免疫化のため、pDEST40/PI16ベクターを用いて一過的な形質移入L929マウス線維芽細胞ATCCおよび安定的な形質移入NIH3T3細胞ATCCを産生した。細胞を2mML-グルタミンGlutamax、Gibco、0.5U/mlのペニシリンSigma、0.5μg/mlのストレプトマイシンSigma、および10のFCSSAFCBioscienceを補充したDMEM培地中に維持した。20μgのプラスミドDNA、20μlのLipofectamineLTXInvitrogen、20ulのPLUS試薬の混合物を、Opti-MEMを用いて4000μlにした。この混合物を用いて半集密性60~80の集密性L929およびNIH3T3細胞をT75フラスコ75cm2中で形質移入した。6時間後、形質移入混合物を取り除き、DMEMと置き換えた。pDEST40/PI16プラスミドを含有する形質移入細胞を、G418Invitrogenを500μg/mlの濃度で培養培地に添加することにより選択した。安定的な形質移入細胞を産生するため、PI16発現NIH3T3細胞を3回選別したFACSAriaII;BDBiosciences。2.1.3免疫化およびハイブリドーマ産生PI16タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するため、6~8週齢の雌性Balb/cマウスを、PI16タンパク質を発現するL929細胞により免疫化した。非免疫性血清試料を全マウスから取り出し第1回目の免疫化を行った。マウス2匹でのグループのいくつかを、500ulのPBS中の5000万細胞を皮下注射することにより最初に免疫化した。4週間後、マウスを500ulのPBS中の5000万細胞を皮下注射することにより追加免疫した。2回目の注射後6日間検査出血を行い、以下に記載の反応性についてスクリーニングを行った。14日後、マウスを500ulのPBS中の5000万細胞により最終の追加免疫に処し、および4日後に殺して脾臓をハイブリドーマの調製のために回収した。融合のため、SP2/0骨髄腫細胞をATCCから得た。ハイブリドーマ細胞をMacardleおよびBaileyの指示に従って、108マウス脾臓細胞および107SP2/0骨髄腫細胞比率10:1を用いて産生した。選択したウェルからのハイブリドーマ細胞を、PBMCおよびPI16-形質移入NIH3T3細胞上にてスクリーニングし、ACDUを備えたFACSAriaIIセルソータBDBiosciencesを用いて単一細胞ソーティングにより増殖およびクローン化した。選別した細胞から生じるコロニーを再びフローサイトメトリによりスクリーニングした。市販のPI16ポリクローナル抗体が末梢血の区別可能な染色パターンを示したので、フローサイトメトリを用いて、末梢血リンパ球の同じ画分と反応する抗体のためのハイブリドーマコロニーをスクリーニングした。染色は以下に記載のように行った。選択したウェルからのハイブリドーマ細胞を単一細胞ソーティングにより増殖および再クローン化した。選別した細胞から生じるコロニーを、親ハイブリドーマと同様のPBMCとの反応性を持つ抗体の発現に関し、フローサイトメトリによりスクリーニングした。CRCBT-02-001ハイブリドーマがポリクローナルPI16抗体と同様の反応性を持つモノクローナル抗体を発現するとみなされた。2.1.4フローサイトメトリCRCBT-02-001の反応性解析を、three-step高感度染色プロトコルMavrangelosら,2004年を用いて末梢血の単核細胞PBMCおよびPI16-形質移入NIH3T3細胞に対して実施した。末梢血単核球を全血健常者より採取からLymphoprepNycomed、オスロ上での密度遠心法により単離し、PBS-アジ化物Sigmaで2回洗浄した。血液を、ヘパリンリチウム抗凝血剤を用いて収集した。PI16完全長組み換えタンパク質に対して産生したマウスのポリクローナル抗体をAbnova社台北、台湾より購入した。CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD27、CD127、FoxP3、CD154、CD45RA、CD45RO、CD73、CD95、CD69、CD44、HLA-DR、CLA、CCR4、CCR5、CCR6、CXCR3、CXCR4に対するモノクローナル抗体の染色用緩衝液、TregカクテルCD4-APC、CD127-FITCおよびCD25-PE/Cy7の最適化した混合物および蛍光体-ストレプトアビジン複合体をBDBiosciencesSanJose、カリフォルニア州より得た。CD39に対するモノクローナル抗体をeBioscienceSanDiego、カリフォルニア州により、ビオチン化ウマ抗マウスIgをVECTORLaboratoriesBurlingame、カリフォルニア州により、および正常マウス血清をDakoGlostrup、デンマークにより購入した。PI16発現をPBMCにより特性解析する多重パラメータフローサイトメトリ実験を、FACSAriaIIセルソータを用いて行った。複合体化していない抗体を用いた実験を、three-step高感度染色プロトコルを用いて、基本的にはZolaら,に記載のように実施した。簡単には、PBMCを複合体化していない一次抗体と30分間氷上でインキュベートし、洗浄した。ビオチン化ウマ抗マウスIg試薬を添加して、30分間氷上でインキュベートした。洗浄後、正常マウス血清を添加し抗マウスIg試薬での遊離型Ig-結合部位を阻害するため、10分間インキュベートし、その後、蛍光体-ストレプトアビジン複合体検出試薬と直接複合体化する任意の抗体を添加した。マウスIgのインキュベーションと最終試薬の添加の間に洗浄は行わなかった。細胞を上記のようにインキュベートし、2回洗浄した。細胞内抗原に対する抗体を用いる実験では、上記のような表面染色をまず行い、次いで細胞を製造者の指示に従って透過処理および染色を行った。2.1.5免疫蛍光検査によるCRCBT-02-001の表面染色の検証細胞を8-ウェルのチャンバースライドLab-Tek、Naperville、イリノイ州上で培養し、PBSで洗浄し、2パラホルムアルデヒド溶液pH7.4で15分間固定し、その後洗浄し、0.2TritonX-100を含有するPBS中で透過処理を行った。PBS中で1ウシ血清により30分間ブロッキングした後、細胞を一次抗体、いずれのマウス対照IgG1μg/mlBDBiosciences、SanJose、カリフォルニア州、IgG1対照X-63ニート、100μl/ウェルin-house、PI16マウスポリクローナル抗体1μg/mlAbnova、Taipei、Taiwan、マウス抗V5抗体1:300Invitrogen、Carsbad、カリフォルニア州およびCRCBT-02-001培養上清neat、100μl/ウェルin-houseを用いて1時間、室温で免疫染色を行った。次いで、細胞を洗浄して、ビオチン化ウマ抗マウスIgG1:50VECTOR、Burlingame、カリフォルニア州によりインキュベートし、その後ストレプトアビジンAlexaFlour488複合体1:500MolecularProbes、Eugene、オレゴン州により1時間、室温で標識化した。最後に、細胞を核染色のためDAPI溶液と共にインキュベートし、封入剤DakoCytomation、Carpinteria、カリフォルニア州により封入して顕微鏡検査のために調製した。画像を、蛍光顕微鏡Leica、ドイツにより、ライフサイエンス用顕微鏡のためのOlympus細胞FImagingソフトウェアを搭載するOlympusDP-72カメラを用いて取得した。2.1.6PBMCの刺激PBMCを、2mML-グルタミンGlutamax、Gibco、0.5U/mlペニシリンSigma、0.5μg/mlストレプトマイシンSigma、および10FCSSAFCBioscienceを補充したRPMI1640中で培養した。細胞を96U-ウェル培養皿0.5-1x106/ウェル中でブドウ状球菌StaphylococcusエンテロトキシンBSigma;1μg/mlにより18時間、または製造者Dynabeads登録商標CD3/CD28T細胞増殖刺激ビーズ、Dynal/Invitrogenの指示に従って固定された抗CD3抗体および抗CD28抗体により3日間刺激した。刺激後、細胞を採取し、PBSで洗浄し、およびフローサイトメトリにより分析した。2.1.7抗体サブクラスの決定マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットRocheを用いて、CRCBT-02-001のサブクラスを製造業者の指示に基本的に従って決定した。2.1.8CRCBT-02-001により分泌される抗体の精製CRCBT-02-001を、10FCS、0.5Uペニシリン/ml、0.5μgストレプトマイシン/ml、および200mMGlutamaxGibcoを含むRPMI-1640中で成長させた。上清を500xgで遠心分離し、0.45μm、次いで0.22μmのシリンジフィルタMillex;Milliporeでろ過する前に細胞残屑およびサイズの大きい物質を除去した。精製を、BioLogicLPクロマトグラフィ装置Bioradを用いて行い、カラム5mlProteinGカラム;InvitrogenrProteinGアガロースを用いたBioRadを10カラム体積超のPBSpH7.4で1mL/分で洗浄した。CRCBT-02-001上清をカラム上に2回1mL/分で適用した。通過画分をその後の解析のために回収した。カラムをPBSpH7.4により基準UV吸光度まで洗浄した。結合IgGを溶出するため、0.1MグリシンHClpH2.8Amrescoをカラム上に、1ml/分にて20~40カラム体積に0~100の勾配で適用した。溶出した抗体を、回収した画分の体積の20に等しくなるように1MTrisHClpH7.4でチューブに回収した。回収する画分を、読み出し部分からUVピーク内に認めた。次いで、選択した画分をプールし、体積を測定し、少量の試料をさらに分析した。残余試料をGEスピンカラム100kDaMWCOGEHealthcareを用いて、脱塩/PBSpH7.4中への緩衝液交換を行った。次いで抗体を定量し、最終PBS体積で1~2mg/mlまで1BSAおよび0.05アジ化ナトリウムSigmaを用いて希釈した。2.1.9CRCBT-02-001の増殖および細胞生存効果PBMCを、上記のように18時間および3日間刺激した。CRCBT-02-001から分泌された精製アジド遊離抗体を2μg/ml、5μg/mlおよび10ug/ml、ならびに未精製CRCBT-02-001-含有上清無血清および血清含有を培地に培養物に添加した。さらに精製IgGBDBiosciences、CD28mAbおよびCD49dmAbBDBiosciencesおよび培地を陰性対照として添加した。SEBおよびCD3/CD28ビーズを陽性対照として添加した。刺激された細胞を、活性化マーカー、CD25およびCD69のために上記のように染色した。細胞死を決定するため、細胞を取得する前に7-アミノアクチノマイシンD7AAD;SigmaAldrichにて15分間インキュベートしておき、その後フローサイトメトリにより解析した。CRCBT-02-001から分泌される固定された抗体が増殖および細胞生存に対するいかなる効果を持つかどうかを検査するため、2μg/ml、5μ/mlおよび10μ/mlの精製抗体無アジ化物を一晩培地中でインキュベートし、培地を廃棄して、PBMCを添加した。1日後および3日後に細胞を採取して、アポトーシスおよび活性化マーカーのために染色した。2.1.10スロットブロット100μlの試料表示のようにを、真空下で各スロットのニトロセルロース膜Protran;SchleicherSchuell上に負荷した。負荷後、ブロットを、3スキムミルク粉末DiplomaのPBSTween0.05ブロッキングバッファーにより、1時間、室温にてブロッキングした。一次AbCRCBT-02-001から分泌された、または、Abnova社のポリクローナルPI16抗体をブロッキングバッファー中にて2倍に希釈し、プラットホーム型振とう器で1時間、室温でインキュベートした。ブロットを3x5分間、PBStweenで洗浄した。ブロッキングバッファー中の1/1000希釈ビオチン化ウマ抗マウスVECTORを添加して、rockingplatform上で1時間、室温でインキュベートした。ブロットを3x5分間PBStweenで洗浄した。1/1000希釈SA:HRPGEHealthcareのブロッキングバッファーを添加して、rockingplatform上で1時間、室温でインキュベートした。ブロットを3x5分間、PBStweenで洗浄した。ECL溶液AおよびBの適当量膜表面を覆うほどの量;ECLAdvanceウエスタンブロットキット、GEHealthcareを添加し、一定で振とうしながら1分間インキュベートした。ブロットを15秒のUV曝露後すぐにG:BoxSyngeneにて読み取った。2.1.11サイトカイン分泌の特性解析PI16およびCD25を用いて特定したCD4陽性細胞から分泌されたサイトカインのプロファイルを同定するため、TH1/TH2/TH17CytometricBeadArrayCBA;BDBiosciencesを用いて細胞上清中のサイトカインIL2、IL4、IL6、IL10、IL17A、TNFalpha、IFNgammaのレベルを測定し、続いてインビトロで刺激した。CD4陽性リンパ球を、RosetteSepCD4T細胞濃縮キットを用いて軟膜から単離し、CD25およびPI16に対する抗体により染色した。CD25およびPI16により特定した4つのCD4陽性サブセットを、FACSAriaIIセルソータを用いて無菌条件下で選別した。細胞を刺激するため、5.0x105の選別細胞集団を、CD3/CD28ビーズDynalTcellexpanderkit;Invitrogenにより3日間インキュベートした。非刺激対照細胞をビーズなしでインキュベートした。インキュベーション後、上清を回収して、TH1/TH2/TH17CBAキットを用いて製造者の指示に従ってサイトカインについて試験を行った。各サブセットについて、サイトカイン濃度を、非刺激細胞の濃度値を刺激細胞の濃度値から減算することにより算出した。2.1.12CRCBT-02-001の配列決定メッセンジャーRNAmRNAを、RNeasymidikitQiagen、ドイツを用いてCRCBT-02-001ハイブリドーマ細胞から単離した。RT-PCRをone-stepRTPCRkitQiagenを用いて製造者の指示に従い実施した。簡潔に述べると、1μgのmRNAをcDNA合成のテンプレートとして使用し、Zangetal、2005に記載のように縮重プライマーによりマウス可変軽鎖および重鎖を増幅した。軽鎖を、10pMの5’-GGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA-3’配列番号11および5’-GGTGCATGCGGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’配列番号12、それぞれ順方向および逆方向プライマーを用いて増幅した。重鎖を、等モル濃度10pM最終濃度の以下の順方向プライマー:2.2結果ヒトPI16Abnovaに対するマウスポリクローナル抗体を、多色フローサイトメトリに用いた図2。この抗体は、およそ18のリンパ球を染色し、その大部分がCD4陽性でもあった。PI16がTreg細胞により発現されることを確実にするため、細胞を、PI16抗体に加えてCD4、CD25およびFoxP3に対する抗体により染色した。図2に示すように、CD25brightPI16細胞の50超がまた、FoxP3を発現した。ポリクローナル抗体の使用による特異的事象を避けるため、ヒトPI16タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を産生した。ヒトおよびマウスアミノ酸配列の比較図1により、免疫応答を誘発する十分な分化が存在する可能性があることが示された。マウスを、PI16を発現するL929細胞により免疫化し、フローサイトメトリを用いて抗体産生のためのスクリーニングを行った図4。PI16発現L929細胞に反応性の抗体を産生するマウスを、ハイブリドーマ産生のために選択した。融合後、ハイブリドーマ培養上清を、フローサイトメトリを用いてスクリーニングしてPI16発現L929細胞への結合を検出した。図5に示すように、ハイブリドーマウェルP1G5P15Gでの細胞が、以前検査したポリクローナル抗体と同じ様式でC3細胞を染色する抗体を分泌した。次いで、P1G5を単一細胞ソーティングにより再クローン化し、フローサイトメトリによりCD4T細胞への結合を検査した。図6に示すように、クローンP1G5-P2B3は、以前検査したポリクローナル抗体と同じ様式を示したが、一方でクローンP1G5-P1B7およびP1G5-P1G8は同じ様式でなかった。P1G5-P2B3を増殖のため選択し、CRCBT-02-001と称した。CRCBT-02-001はマウスIgG1κであると判断される。PI16発現NIH3T3細胞を用いてCRCBT-02-001により産生されたハイブリドーマ培養上清の反応性を確証し、以前検査した市販のポリクローナル抗体の反応性ちと比較した。図7に示すように、ポリクローナル抗体およびハイブリドーマ上清は、同じ染色様式であることが立証された。CRCBT-02-001上清により検出されたPI16の細胞内局在性を確認にするため、非形質移入または安定的形質移入NIH3T3細胞をチャンバースライドにて成長させた。図8に示すようにCRCBT-02-001の上清が細胞膜に貯留し、細胞の表面染色を立証した。図8はまた、CRCBT-02-001上清図8A’の形質移入細胞表面への染色が市販の抗PI16ポリクローナル抗体図8C’より強い事を示す。モノクローナル抗体が結合するタンパク質を決定するため、スロットブロットを実施した。図9は、CRCBT-02-001上清およびPI16ポリクローナル抗体Abnovaの両方がPI16安定トランスフェクタントNIH3T3細胞PI16形質移入細胞溶解物と結合するが非トランスフェクタントNIH3T3細胞非形質移入細胞溶解物には結合しないことを実証するスロットブロットを示す。両抗体がまた、PI16安定トランスフェクタントNIH3T3細胞PI16形質移入細胞上清の上清に結合し、これは、形質移入細胞がその表面からPI16を分泌および放出することを示唆する。CRCBT-02-001はAbnova社の組み換えタンパク質Abnova社由来組換えタンパク質に結合しない。これらの結果は、CRCBT-02-001およびPI16ポリクローナル抗体Abnovaの両方がPI16と結合することを示唆する。CRCBT-02-001モノクローナル抗体がAbnova社の小麦胚芽無細胞系を用いて発現させた組み換えPI16タンパク質に結合しないことは、モノクローナル抗体が、ポリクローナル抗体よりも例えば真核細胞などの細胞で産生されたPI16に対してより選択的であることを示唆する。これらのデータは、モノクローナル抗体が天然哺乳類PI16と反応性があり、モノクローナル抗体が天然哺乳類タンパク質、例えば天然ヒトタンパク質と同様のタンパク質を取得する方法で処理および/または組み合わせていないPI16との交差反応を制限していることを示す。CRCBT-02-001上清がTreg細胞と結合することができることを確認するため、上清を用いてCD4細胞をCD25とCD127の共発現に関して解析した。図10に示すように、CRCBT-02-001は、市販のポリクローナル抗体より多くのCD4CD25hiCD127-Treg細胞を検出した。新鮮PBMC由来の様々なリンパ球サブセットをまた、CRCBT-02-001上清の免疫反応性のために染色した。この染色は、PI16発現細胞の大部分がCD4陽性リンパ球CD4陽性サブセットのおよそ20;図11Bであり、残余細胞はCD8陽性T細胞CD8-brightサブセットのおよそ10;図11Cであることを示した。ごくわずかなCD19陽性リンパ球B細胞がCRCBT-02-001上清図11Dと反応する。CRCBT-02-001上清免疫反応性CD4T細胞の大部分がメモリー表現型CD45RA-図11Eをもち、大部分がまたCD27を発現する図11F。さらにまた、CRCBT-02-001-免疫反応性細胞のごく一部がエフェクタメモリー細胞サブセットに属しているCD45RA-/CD27-;図11G。CRCBT-02-001上清免疫反応性CD4T細胞の大部分はCD25を発現し図11H、CD4/CRCBT-002-001上清陽性細胞の約4分の3がCD127を発現する図11I。なかでもCD4/CRCBT-002-001上清陽性細胞のおよそ20がTreg表現型CD25/CD127-を発現する図11J。PI16の発現をTreg細胞および他のTH細胞によりさらに特性解析するために、末梢血単核細胞をCRCBT-002-01モノクローナル抗体ならびにCD4、CD25およびCD127に対する抗体で染色し、Seddikiらのゲーティング戦略を用いてCD25-bright/CD127-dimTregおよびCD127陽性Th細胞サブセットを同定した図12。染色により、PI16がCD4陽性リンパ球のTregとThサブセットの両方のうちごくわずかにより発現され、Tregのより高い比率がPI16を発現することが示される。さらなるPI16陽性Treg細胞の特性解析を、CD4、CD25、PI16CRCBT-02-001、CD45RAおよびCD45ROに対するモノクローナル抗体によりリンパ球を染色することにより実施した。PI16およびCD25の両方を発現したCD4陽性リンパ球の大部分がCD45RO陽性/CD45RA陰性メモリー表現型をもっていた図13。Tregを転写因子FoxP3の発現により特定する。CD4、CD25、PI16CRCBT-02-001およびFoxP3に対する抗体はまた、PI16の有無により特定したTregサブセットによるFoxP3の発現を試験するものであった図14。FoxP3発現の高いレベルが、PI16陰性/CD25陽性画分MFIが1062と比較してPI16陽性/CD25陽性画分個体群は1457の蛍光強度MFIを意味するで検出された。PI16陽性/CD25陰性画分MFIが613でのFoxP3レベルは、PI16陰性/CD25陰性エフェクタ細胞画分480のMFIのバックグラウンドレベルと同様であった。ゲーティング戦略を基本的にはMiyaraらに記載のように使用し、PI16陽性メモリーTregがまたFoxP3転写因子を発現することを示した図15。CD4CD25細胞をさらに、CRCBT-02-001上清とTregサブセットマーカーとの共染色に関しフローサイトメトリにより解析した。この解析の結果を表2に示す。CD45RO、CD45RA、CD39およびCCR6を用いた分別染色から、PI16陽性Treg個体群が、両PI16陰性Treg個体群からおよび他のPI16陽性TH細胞から表現型上で区別可能なメモリーTregのサブセットであることが示される。図16はさらに、メモリーTreg細胞に結合するCRCBT-02-001分泌抗体の機能を裏付ける。簡単には、CD4細胞をCRCBT-02-001上清およびCD45RAかCD45ROのいずれかに対する抗体で標識化した。CD45RAの染色は、メモリー細胞サブセットCD45ROに属するCD45RA-細胞によりメモリー細胞を天然細胞から識別するために広く使用されている。したがって、CRCBT-02-001は、CD4CD25CD45RA-CD45ROメモリーTreg細胞集団を同定するようだ。CytometricBeadArrayCBAを用いて、どのサイトカインがT細胞レセプターを介した刺激の後にPI16発現Tregにより発現されかを決定した図17。これらの実験により、PI16陽性Treg細胞のサイトカイン発現プロファイルがPI16陰性Treg細胞と同じであり、PI16陽性TH細胞がそのPI16陰性TH細胞と同じサイトカインを発現することが示される。PI16陽性メモリーTregをさらに特性解析するため、PI16陽性メモリーTregによる数種類のケモカインレセプターの発現を、PI16陰性メモリーTregと他のPI16陽性メモリーTH細胞と比較した表3参照。CCR4およびCCR6ケモカインレセプターは、PI16陰性TregまたはTH画分のメモリー要素と比較してメモリーPI16陽性TregとメモリーPI16陽性TH細胞のより高い比率により発現される図18。ケモカインレセプターの差次的発現は、TH細胞サブセットの遊走を予測する、またTh細胞の機能的サブセットを同定するために使用され得る。本明細書に提供されるデータにより、PI16陽性メモリーTregにより発現されたケモカインレセプターのプロファイルが、PI16陰性メモリーTregおよび他のPI16陽性TH細胞の両方と異なることが示される。CCR4およびCCR6などのケモカインレセプターの発現から、PI16陽性メモリーTregが、TH17細胞が遊走し得る炎症部位と同じ部位に遊走し得ることが示される。図19に示すようにCD25の上方制御にもかかわらず、PI16に相当する上方制御は存在しない。PBMCを一晩および3日間刺激した。CRCBT-02-001から分泌された精製抗体無アジ化物を培地に2μg/ml、5μg/mlおよび10μg/ml添加するか、または細胞を固定した抗体と接触させて活性化マーカーCD25およびCD69のために染色した。細胞死を決定するために、細胞を7AADと共に15分間インキュベートし、その後回収してフローサイトメトリにより解析した。結果を表4および5に示す。表3および4に提示される結果は、CRCBT-02-001はTreg表現型をもつ細胞を、エフェクタ細胞非存在下で殺さないまた分化を起こさないことを示す。これは、この抗体または同抗体のエピトープに結合するタンパク質を使用して細胞に多大な悪影響をもたらすことなくTreg細胞を単離するのに有用である。図20に示すように、CRCBT-02-001により分泌される抗体は、刺激したPBMCを含む上清でPI16を検出し、これはPI16が刺激後すぐに放出または分泌され得ることを示唆する。CD4細胞溶解物で検出された信号は存在しなかった。しかしながら、PI16はCD4細胞の5しかないので、この抽出物はPI16の抽出のために最も希釈しやすかった1:100。CRCBT-02-001は、CD4CD25刺激および静止細胞溶解物にのみ結合し、CD4CD25-細胞溶解物とは結合しない抗体を分泌した。CRCBT-02-001分泌抗体は、刺激したTregCD4CD25PI16の上清でPI16を検出し、これはPI16がTreg細胞刺激後すぐに発散または分泌され得ることを示唆する。CRCBT-02-001により分泌される抗体はまた、ヒトPI16に結合することが見出されているが、マウスPI16に検出可能に結合していなかった。CRCBT-02-001の可変領域をコードする核酸配列およびそのコードアミノ酸が推測された。重鎖可変領域をコードする配列を配列番号配列番号7に記載し、またコードアミノ酸を配列番号8に記載する。軽鎖可変領域をコードする配列を配列番号配列番号9に記載し、またコードアミノ酸を配列番号10に記載する。図21では、CDRの配列を強調して示している。VHのCDRは、Komatsuら,により公表されたAB089648.1との比較により見いだされた。実施例3:CRCBT-02-001を用いて単離されたTregによる免疫応答の抑制3.1.抑制試験のための新鮮な成人型TregおよびエフェクタTサブセットの単離RosetteSepCD4T細胞濃縮キットStemCellTechnologies、Vancouver、カナダを用いてCD4T細胞をまず濃縮した後、軟膜からTreg細胞を単離した。CD4CD25brightPI16およびCD4CD25brightPI16-を、無菌条件下でFACSAriaIIセルソータを用いて基本的には実施例2に記載のように選別した。CD4CD25-エフェクタ細胞を第2ドナー軟膜から単離し、magnetic-activatedcell-sortingMACSビーズMiltenyiBiotechを用いて精製した。3.1.2.ヒト臍帯nTreg細胞およびiTreg細胞の増殖CD4CD25およびCD4CD25-T細胞を新鮮臍帯血から抽出しInvitrogenDynalBeadRegulatoryT細胞キットcat113.63Dを用いて精製した。単離CD4CD25Treg細胞をDynalBeadHumanTExpanderCD3/CD28ビーズ比率3:1cat111.41Dおよび500U/mlのIL-2のX-Vivo15完全培地Lonzacat04-418Qで7日間インキュベートした。CD4CD25-T細胞を、Treg対照群を示す同じ条件下で増殖した。iTreg細胞を、CD4CD25-T細胞をCD3/CD28ビーズ3:1ビーズ細胞比、10μM全トランスレチノイン酸ATRASigmaを含有する500U/mlのIL-2および5ng/mlのTGF-βによりインキュベートすることにより産生した。全Treg細胞サブセットを7日間増殖させた。7日目に、CD3/CD28ビーズを取り除き、細胞をさらに7日間、100U/mlのIL-2を含むX-Vivo15完全培地中で静止させた。3.2チミジン取り込み試験増殖した臍帯血からのPI16nTregCRCBT-02-001およびPI16-nTregCRCBT-02-001-を、混合リンパ球反応MLRに対する抑制活性について試験した。CD4CD25-エフェクタT細胞およそ2x104を96ウェルプレートで培養し、1x105照射された30GyPBMC存在下で成長させた。CD4CD25PI16細胞を、基本的に実施例2に記載のような方法で単離した。細胞を1:1、2:1、4:1、8:1、16:1、32:1、64:1の比率で添加した。細胞を100ng/mlの抗CD3OKT3モノクローナル抗体eBioscienceにより活性化した。ウェルを4日目に3H-チミジンを用いて培養の最後の16時間パルス処理した。全時点を3連にて測定した。結果を1分あたりのシンチレーション計数で表した。図22Aは、増加した臍帯血からのチミジン試験がそれぞれエフェクタ細胞のPI-16およびPI-16-nTregによる抑制を実証していることを示す。図22Bに示すように、CRCBT-02-001により単離したPI16Treg細胞は、PI-16-nTregn=6と同じ有効性を伴い1:1から16:1の比率においてエフェクタ細胞の増殖を抑制する。3.35、6-カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステルCFSEサプレッサー試験混合リンパ球反応でのエフェクタ細胞の細胞分裂をまた、CFSE希釈Venkenら,2009年により解析した。エフェクタCD4CD25-細胞を3.1に記載のように単離し、PBS中で1mMCFSEInvitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州により10分間、37°Cで標識化した。2x104CFSE標識エフェクタ細胞を、1:1、2:1、4:1、8:1、16:1、32:1のTeffector/Treg比率でTreg細胞によりインキュベートした。エフェクタおよびTreg細胞を、96ウェルU-ボトムプレートにおいて、1x105の照射された30GyPBMCおよび100ng/mlの抗CD3OKT3モノクローナル抗体eBioscienceにより200μlのcRPMI中でインキュベートした。共培養物をインキュベーションの5日後に採取し、レスポンダー個体群の増殖を、フローサイトメトリにより、細胞分裂に伴うCFSE蛍光を希釈することにより可視化した。図23Aは増殖臍帯血Tregを用いた典型的なCFSEサプレッサー試験を提供するPI-16およびPI-16-。6つの増殖臍帯血TregPI-16/-に関する累積結果を図23Bに示す。PI-16およびPI-16-Tregは、正常培養条件下で、同等の効力で抑制する。末梢血から新鮮単離PI16発現Treg細胞は、刺激CD25-Tエフェクタ細胞の増殖を抑制することができた図23C。これらのデータは、CRCBT-02-001により単離したPI16/CD25細胞がPI-16-Tregと同様な抑制能をもつ機能的Treg細胞であることを確証する。累積CFSEサプレッサー試験の新鮮な成人型nTregPI-16およびPI-16-における結果は、末梢血から単離したPI-16Tregの抑制能力を確証するn=4図23D。正常細胞培養条件下での、成人血液からのPI-16およびPI-16-Treg間の抑制能の違いはない。3.4CD154抑制試験増殖臍帯血由来のPI16nTregCRCBT-02-001およびPI16-nTregCRCBT-02-001-サブセットを、基本的に実施例2に記載のように単離し、完全X-Vivo15培地Lonzaにて一晩、37°Cで静止し、その後試験に添加した。新たに回収もしくは以前凍結乾燥したMACSまたはFACS単離CD4CD25-細胞をこの試験でエフェクタ細胞として使用した。新たに回収したCD4CD25-エフェクタ細胞は回収の12時間以内に使用され、凍結乾燥したCD4CD25-エフェクタ細胞は、試験に使用する前に完全RPMI培地にて12~20時間、37°Cで静止させる。Treg細胞サブセットを、96ウェルプレートに1:1、2:1、4:1、8:1、16:1および32:1のEffector/Treg細胞比率でプレーティングした。CD4CD25-エフェクタ細胞を5x104細胞/50μl/ウェルでプレーティングし、Tregを5x104細胞/50μl/ウェル1:1でプレーティングして、1.56x103細胞/50ul/ウェルまで連続的に希釈した。およそ5x104のTreg単独およびCD4CD25-エフェクタ単独刺激と非刺激の両方の対照ウェルが含まれた。非刺激ウェルはCD154-APCBDBiosciencesBD;1ウェルあたり5μlを含有するカクテルを受け;刺激ウェルはCD154-APC1ウェルあたり5ulとCD3/CD28T細胞増殖刺激ビーズ0.25:1ビーズ/細胞の比率を含有するカクテルを受けた。培養物を暗所で7~8時間、37°Cにてインキュベートした。インキュベーション後、96ウェルプレートを最大15時間冷蔵した後、染色した。細胞をCD4FITC、BDおよびCD25PECy7、BDの表面発現のために、96ウェルプレート中室温で30分間染色し、次いで洗浄した。細胞を、BDFACSCantoフローサイトメータでの3色フローサイトメトリにより、CD154発現について解析した。解析の際、TregCD4CD25bright細胞応答はCD4CD25-細胞上にgatingすることにより除外される。T細胞活性の抑制を、刺激CD4CD25-エフェクタ単独でのCD154発現とTregで共培養した刺激CD4CD25-エフェクタでのCD154発現とを比較することにより評価した図24A。図24Bに示すように、4つの増殖臍帯血試料からのCRCBT-02-001を用いて単離したTreg細胞はCD154発現を抑制することができ、このことはこれらの細胞がT細胞活性化を抑制することを示す。正常細胞培養条件下での、PI-16およびPI-16-Treg間の抑制能の違いはない。実施例4:nTreg細胞およびiTreg細胞サブセットの特性解析4.1増殖nTregおよびiTregのフローサイトメトリnTregおよびiTreg細胞サブセット基本的に3.1.2に記載を、7日間の増殖と7日間の低レベルのIL-2での静止後に、多色フローサイトメトリおよびリアルタイムRT-PCRにより解析した。インビトロで産生したnTreg細胞およびiTreg細胞を基本的に実施例2に記載のようにFACS解析によりプロファイル化し、CD4、CD25、PI16およびFoxP3の発現を比較した。図25Aにより、nTreg細胞およびiTreg細胞の両方が高いレベルのCD4、CD25およびFoxP3を発現したが増殖nTregは増殖臍帯血iTregより著しくPI16を発現したことが示される。これは、7つの増殖臍帯血試料および7つの増殖成人血液試料において確証された図25B、n=7、p<0.05。4.2増殖したnTregおよびiTreg定量的リアルタイムPCRRNAをまた、セクション4.1に記載のTregサブセットより抽出し、リアルタイムRT-PCRを実施して、PI16およびFoxP3の相対的発現を調査した。総RNAをRNeasyキットQiagen、Hildenドイツを用いて抽出し、その後QuantitectReverseTranscriptionキットQiagenを用いてcDNAに変換した。半定量的RT-PCRをKAPASYBRFastUniversalqPCRキットKAPABiosystems、Cambridge、マサチューセッツ州、米国を用いて3連にて実施した。PCR反応をCorbettリアルタイムPCR装置Rotorgene6000にて実施した。6つの個々の実験結果をRotor-Gene6000ソフトウェアを用いて解析し、基準転写物、リボソームタンパク質L13aRPL13aの発現へ正規化した。RTPCRプライマー配列は次のとおりであった;FoxP3順方向-5’-ATGGCCCAGCGGATGAG-3’配列番号19および逆方向5’-GAAACAGCACATTCCCAGAGTTC-3’配列番号20;PI16順方向5’-GAGAATCTGTTCGCCATCACA-3’配列番号21および逆方向5’-GAAACAGCACATTCCCAGAGTTC-3’配列番号22;およびRPL13a順方向5’-CGAGGTTGGCTGGAAGTACC-3’配列番号23および逆方向5’-CTTCTCGGCCTGTTTCCGTAG-3’配列番号24。図26Aは、PI16がnTreg細胞個体群にてメッセージレベルで発現することを確証する。nTregは、CD25-細胞と比較した場合に、Foxp3の2.2log2foldの増加p<0.01およびPI-16の4.48log2foldの増加P<0.01を表す表6。FOXP3およびPI16はnTregおよびiTregの両方に存在するが、FOXP3p<0.001およびPI16p<0.05は統計的にnTregよりiTregにおいてのほうが少ない表7。図26BはCRCBT-02-001を用いて単離した3つの新鮮単離成人末梢血PI16およびPI16-Tregから抽出したRNAのRT-PCRデータを表す。このデータは、細胞表面PI16陰性である細胞中に成人血液TregPI16が存在しないことを実証する。このことは、区別可能なTregのPI16サブセットとCRCBT-02-001を用いて単離し得るPI16-サブセットが存在することを示唆し重要である。4.3RNA調製およびCustomTaqMan登録商標低密度配列による発現解析総RNAを、増殖した臍帯血CD25-ヘルパーT、nTreg、およびiTreg細胞7日間の増殖プロトコル後に7日間静止させたから単離した。総RNAをQIAshredderおよびRNeasyminiキットQIAGENを用いて単離した。総RNA2μgをHighCapacitycDNATranscriptionキットAppliedBiosysytemsを用いてcDNAに変換した。各cDNA合成反応をTaqMan登録商標UniversalPCRmastermixと組み合わせて、CustomTaqMan登録商標低密度配列Format96bの4つの試料液体リザーバに均等にロードした。増幅およびデータ収集を900HTReal-TimePCRSystemAppliedBiosystems.で行った。ドナー適合対照ヘルパーT、nTreg、およびiTreg試料を同じアレイ上にロードした。CustomTaqMan登録商標低密度配列を有効なTaqMan登録商標遺伝子発現試験を用いて構築した。データをRPL13aへの正規化を伴うΔΔCT法を用いて解析した。比比を細胞型間で算出し、T検定を各遺伝子について実施した。nTregとiTreg図27A、およびnTregとCD25図27Bとの比較により、iTregはFOXP3を発現するが、PI16またはnTregでPI16と共発現する遺伝子のいくつかを発現しないが実証される。このことから、PI16がnTregには強力な代理マーカーであるがiTregでは代理マーカーではないことが示唆される。4.4メチル化ゲノムDNAをCRCBT-02-001で標識化された新鮮な成人型Tregから単離し、また基本的に実施例2に記載のようにCD4CD25brightPI16およびCD4CD25brightPI16-個体群に選別した。両個体群からのDNAをQIAampDNA血液MiniキットQiagenを用いて抽出し、次いでEpiTectBisulfiteキットQiagenを用いてメチル化解析のためのDNAの変換および清浄化を行った。Treg細胞特異的脱メチル化領域TSDRのためのPCRを基本的にBaronらに記載のように実施した。PCRプライマーは以下のとおりである;順方向-5’-TGTTTGGGGGTAGAGGATTT-3’配列番号28および逆方向-5’-TATCACCCCACCTAAACCAA-3’配列番号29。PCR産物をゲル抽出し、QiaquickGelExtractionキットQiagenを用いて清浄化した。次いで、PCRフラグメントを、配列決定用TOPOTAクローニングキットInvitrogenを用いてpCR4-TOPOへクローン化し、OneShotTop10Chemicallycompetent大腸菌中に形質転換し、アンピシリン寒天プレートにプレーティングした。コロニーを掻き取りアンピシリン含有LuriaBroth培地にて一晩培養し、その後QuickLyseMini-prepキットQiagenを用いてDNAを単離した。プラスミドDNAを、M13universal順方向および逆方向プライマー、順方向5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’配列番号30および逆方向5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’配列番号31を適用して配列決定し、その後ABIBigDyeTerminatorlabellingAppliedBiosystems、およびAB3730xlでのcapilletaryseparationを行った。次いで、配列ファイルをCpGモチーフでGからAへの変更について解析した。図28に示すように、CRCBT-02-001を用いて単離したPI16Tregは、FOXP3のイントロン1のTSDRで脱メチル化された表現型を示す。逆に、PI16発現に欠けるTregは部分的にメチル化された、誘導性Tregと一致した表現型である。実施例5:nTregおよびiTregサブセットの機能的特性解析とその後の炎症性サイトカインへの曝露PI16の表面発現に基づき単離した増殖臍帯血Tregサブセットに、炎症性サイトカインへの曝露後の適合した比較対照個体群への機能的特徴の変化が見られるかを決定するために、CD25-レスポンダー細胞の抗CD3OKT3刺激を用いる混合白血球反応試験を用いた。チミジンサプレッサー試験を、実質的に実施例3に記載のように実施した。増殖臍帯血nTregPI16およびPI16-およびiTregPI16-をフローサイトメトリにより単離し、次いで完全X-vivo培地にて3日間静止させた。PI16、PI16-nTregおよびPI16-iTregのサブグループを、10ng/mlのIL-1βおよび50ng/mlのIL-6中で3日間インキュベートした。細胞を十分に洗浄し、その後サプレッサー試験のために細胞を封入した。図29Aは、サプレッサー試験に添加前に3日間炎症性サイトカインIL1βおよびIL6への曝露の場合と比較した、正常細胞培養条件下でのPI16nTreg細胞によるエフェクタ細胞の抑制レベルを示す。PI16nTregの機能をチミジンおよびCFSEサプレッサー試験により測定した。炎症性環境に曝露した時、抑制は変化せず、これらの細胞は抑制機能を維持したn=2。図29Bは、正常細胞培養条件下とIL1βおよびIL6が存在する炎症状態下とでのPI16-nTregの抑制機能を、チミジンおよびCFSEサプレッサー試験を用いて比較している。PI16-nTregは炎症環境下で抑制能力を維持しているn=2。図29Cは同様に、TGF-βおよびATRAと共に、実質的に実施例3.1.2に記載のように臍帯血から増殖したiTregPI16-の機能特性解析を比較している。これらの細胞を、正常細胞培養条件下またはIL1βおよびIL6が存在する炎症状態下のいずれかで、培地にて3日間静止した。抑制機能を、チミジンおよびCFSEサプレッサー試験を用いて測定した。個体群と異なり、増殖したiTregは正常条件下では良好に抑制したが、IL1βおよびIL6への事前の曝露後では全ての抑制機能を失った。これらのデータは、PI16Treg細胞は、通常炎症部位で見られる炎症性サイトカインへの曝露後であっても抑制活性を保持する強力なrobust細胞型であることを実証する。PI16-iTreg細胞は炎症性サイトカインの存在下では抑制活性を保持しない。実施例6:PI16Treg細胞はHLADRを発現するCD25およびPI16CRCBT-02-001の共発現を用いて特定されたメモリーCD4陽性細胞のサブセットによる、MHCクラス2タンパク質HLADRの発現を評価した。CD4陽性リンパ球のサブセットを図14に示すように特定し、各メモリー画分をCD45ROの発現により同定した。図30に提示したデータは、PI16陽性Treg細胞CD25陽性PI16陽性のより高い比率でCD4陽性T細胞と抗原提示細胞との抗原特異的同族相互作用に関連するHLADRを発現することを示す。いかなる理論または作用機序に縛られるものではないが、Treg細胞によるHLADRの発現により、Treg細胞がCD4陽性T細胞および抗原提示細胞の正常な同族相互作用を妨げ、これによりエフェクタT細胞の正常な抗原特異的活性化を混乱させることができる。実施例7:若年性特発性関節炎でのPI16Treg細胞成人および若年性特発性関節炎JIAに罹患する患者からのPBMCおよびJIA患者からの滑液をTregカクテルCD4、CD25、CD127およびCRCBT-02-001と共に染色し、FACSAriaIIで解析した。図31に示すように、適合血液試料および成人健常者ドナーからの血液試料と比較して、JIAに罹患している患者の滑液でのTregで著しい増加がみられる。いっぽうで、適合血液試料および成人健常者ドナーからの血液試料と比較して、炎症関節でのPI16陽性Tregで著しい減少がみられる。JIA患者の炎症関節でTreg細胞の濃縮が見られるが、これらのTregは末梢でのTreg細胞よりもきわめて少量がPI16を発現する。いかなる理論または作用機序に縛られるものではないが、本明細書に提示される結果は、健常者ではPI16陽性Treg細胞およびTH17細胞がTH17免疫応答を制御するTreg細胞と同じ炎症部位に存在し得ることを示す。一方で、PI16陽性Treg細胞での異常、または該細胞の不足または減少が自己免疫の一因となり得る。いかなる理論または作用機序に縛られるものではないが、本明細書に提示される結果は、健常者ではPI16陽性Treg細胞およびTH17細胞がTH17免疫応答を制御するTreg細胞と同じ炎症部位に存在することを示す。一方で、PI16陽性Treg細胞での異常が自己免疫の一因となり得る。実施例8:PI16Treg細胞はCLAを発現する規定のメモリーCD4細胞サブセットによる、CD25とPI16CRCBT-02-001との共発現を用いた皮膚リンパ球抗原CLA発現を評価した。図32に示されるデータから、より高い比率のPI16Treg細胞CD25PI16は細胞の皮膚への遊走を伴うCLAを発現する事が示される。いかなる理論または作用機序に縛られるものではないが、CLAのPI16Treg細胞による発現により、これらの細胞が皮膚の炎症に遊走し得、一方でPI16-Treg細胞はCLAを発現せず、皮膚へ遊走し得ない。実施例9:CRCBT-02-001を用いて単離したPI16発現Treg細胞の走化性9.1走化性試験組み換えヒト胸腺および活性化調節ケモカインCCL17、CCR4へのリガンドおよび組み換えヒトマクロファージ炎症性タンパク質-3アルファCCL20、CCR6へのリガンドをRaybiotechNorcross、GAより購入した。走化性試験を5-μm孔Corningをもつトランスウェルプレートを用いて実施した。ボトムウェルには培地単独、CCL17およびCCL20両方の100ng/mlのCCL17、100ng/mlのCCL20、または100ng/mlのいずれを入れた。末梢血単核球PBMCおよび滑液単核細胞SFMCを標準的な密度勾配遠心法により単離した。アッパーウェルに1ウェルあたり1x106の細胞をロードし、細胞を2時間、37°Cで遊走させた。走化性後、トップおよびボトム遊走済みウェル中の細胞を回収し、CD4、CD25、CCR4、CCR6およびCRCBT-02-001に対するモノクローナル抗体で染色した。成人健常者PBMCからのCD4CD25brightCRCBT-02-001細胞のCCR4およびCCR6リガンド、CCL17およびCCL20に対する応答での遊走能力を、5μm孔Transwells商標を用いて検査した。CD4CD25brightCRCBT-02-001細胞はCCL17、CCL20および複合CCL17/CCL20リガンドへ遊走した図33A。若年性特発性関節炎に罹患した対象からのPI16Tregの能力ついても評価した。成人健常者と同様に、健常児からのCD4CD25brightCRCBT-02-001Treg細胞NormalJuvenilePBMCおよびJIA患者からのCD4CD25brightCRCBT-02-001Treg細胞はリガンドCCL17、CCL20およびCCL17およびCCL20に遊走することができた図33B.一方で、JIA患者からの滑液単核細胞SFMCsはリガンド、CCL17、CCL20およびCCL17およびCCL20への遊走能力が見られなかった。上記提示したデータは、PI16CRCBT-02-001で検出するこの場合はケモカインCCL17およびCCL20への遊走能力をもつ機能的安定なメモリーTregの区別可能なサブセットを同定し、したがって炎症誘発TH17細胞と同様の炎症部位である可能性が最も高いことを示す。JIAの場合、炎症関節をPI16-Treg細胞中で濃縮するおよびTH17細胞中で濃縮するが、PI16Treg細胞中では濃縮しない。実施例10:PI16に結合するCRCBT-02-001の確証10.1質量分析を用いたCRCBT-02-001と結合したタンパク質の同定CRCBT-02-001を用いて精製したタンパク質を10mMDTTの50mMTrispH8.0で1時間、60°Cで還元し、50mMヨードアセトアミドで30分間、室温でアルキル化し、その後0.5μgトリプシンを添加し、タンパク質を2時間、40°Cで消化した。消化物をRPカラム150mmx150μmVydaceverestC18上に接種し、溶離液を2,4α-シアノ桂皮酸飽和溶液と共にMALDI-MStargetplate上にスポッティングし、放置して乾燥させた。次いで試料を、質量分析法を用いて解析した。10.2結果質量分析法を用いてまた、CRCBT-02-001がPI16に結合することを確証した。CRCBT-02-001は、質量2926.31DaのPI16の配列からのペプチドの予測分子量に適合するイオン質量をもつペプチドを含むタンパク質に結合することが認められた。このペプチドはペプチド80GENLFAITDEGMDVPLAMEEWHHER105配列番号27の予測質量に対応した。その後MALDI-tof/tof-MS解析でペプチド配列を確かめた。実施例11:CRCBT-02-001と結合したエピトープのマッピング11.1手法の概略:エピトープの特性解析まず、エピトープが立体不連続、3-D構造に依存してであるか線形順次的なアミノ酸であるかを決定する。還元およびアルキル化RAステップを実施して、PI16組み換え抗原のジスルフィド結合構造を隠した。mAbが依然としてRAタンパク質に結合している場合、ジスルフィドは必要なく、エピトープがアミノ酸の線状伸長部内に大部分含まれている可能性が最も高い。エピトープがグリコシル化されているか決定するため、PI16を糖タンパク質からアスパラギン結合高マンノースならびにハイブリッドオリゴ糖および複合オリゴ糖を切断する酵素ペプチド-N4-アセチル-β-グルコサミニルPNGaseFで処理した。mAbが脱グリコシル化されたPI16に結合する場合、エピトープはエピトープに結合する糖鎖構造に依らない。mAbのPI16への最小結合領域を決定する。ファージディスプレイ法を用いて、ヒトPI16ORFを断片化しバクテリオファージ表面でフラグメントを発現させることにより遺伝子フラグメントライブラリ構築した。目的は、パニングと呼ばれる選択処理を用いて、ライブラリから抗体またはエピトープとしても特定された最小結合断片に結合する遺伝子の最小結合部分を選択することである。11.2方法:溶解性Fc-融合としてのヒトPI16の細胞外ドメインのクローニングPI16-FcヒトPI16のシグナルペプチドアミノ酸28~443を差し引いた細胞外ドメインをコードするDNAを以下のプライマーを用いて増幅した:PI16_pFUSE_EcoRVFnew:5’ttgatatcactcacagatgaggagaaacgtttgat3’配列番号25PI16_pFUSE_BglII_R:5’aaagatctaccctgaaaatacaggttttcatgaccagggcccgagttcagccct3’配列番号26。5’EcoRV部位、3’tev-プロテアーゼ切断部位、およびBglII部位を添加した。次いで、増幅した配列をベクターpFUSE-hIgG1-Fc2INVIVOGEN中にクローニングし、結果としてN末端分泌ペプチド、PI16アミノ酸28~443、tevプロテアーゼ切断部位およびC末端ヒトFc部分を含む構築物を得た。この構築物をPI16-Fcと称する。PI16-Fcの発現および精製PI16-Fcをコードする作製構築物を、Lipofectamine2000Invitrogenを用いて、製造者の指示に従ってHEK293T細胞に形質移入した。形質移入して16時間後で、培養培地を、FCSを含まない不完全DMEMに変更し、細胞を6日間、37°C、5CO2で培養した。培養上清を0.22μmでの無菌濾過により回収した。上清を1/3体積の結合緩衝液20mMリン酸ナトリウムpH7.0/150mM塩化ナトリウムで希釈し、200μlのProteinASepharose6MBスラリGEHealthcare、蒸留水および結合緩衝液で前洗浄したにより、4°Cで16時間インキュベートした。混合物を空カラムEcono、1.5x15cm、BIO-RADに適用し、通過画分を廃棄した。3x15ml結合緩衝液で洗浄後、結合タンパク質の溶出を3x0.5ml0.1MグリシンpH2.2を添加することにより実施した。25μlの1.5MTrispH11.0/0.5ml溶出画分をすぐに添加し、試料のpHを平衡に保った。クマシー染色前のSDS-PAGE解析により、タンパク質バンドが、質量スペクトル解析により標的PI16-Fc構築物であることを確かめた全ての溶出画分中に存在することが明らかになった。CRCBT-02-001mAbは免疫検出試験にて得られた溶出画分のSDS-PAGEおよびウェスタン転写後に同じバンドを同様に認識したデータは非表示。CRCBT-02-001の天然ならびに還元化およびアルキル化RAPI16-Fcへの結合精製構築物PI16-Fcを用いて、ウエスタンブロット法解析によりCRCBT-02-001との結合を解析した。CRCBT-02001エピトープの性質を明らかにするため、精製PI16-Fc試料を、セクション8で先に述べたように還元しアルキル化した。天然およびRAPI16試料を4~12NuPAGEゲルを用いて分離し、クマシーbrilliantblue染色で染色、またはPVDF膜上で電気ブロッティングした。膜を5スキムミルクでブロッキングし、CRCBT-02-001を用いて抗体、続いてペルオキシダーゼ複合体化抗マウスまたは抗ヒト抗体およびECLを展開した。CRCBT-02-001の天然および脱グリコシル化されたPI16-Fcへの結合精製構築物PI16-Fcをまた使用してCRCBT-02-001への結合が任意のN-グリコシル化残基に依存的であるかどうかを解析した。この疑問に取り組むため、精製PI16-Fc試料をPNGaseFにより以下のように処理した:8μgPI16-Fcを80ngのPNGaseFSIGMAと共に最終体積300μlのPBS中で35°C、3時間インキュベートした。同量のPI16-Fcを含有するが酵素は含まない対照試料を、同じ方法でインキュベートした。処理PNGaseFとPI16-Fcの未処理試料との両方を用いて、並行してELISAプレートNuncMaxisorpflatbottom96ウェルをコート3μg/mlのタンパク質濃度でPBSにて4°C、16時間した。その後に、コートしたウェルをPBSで2回洗浄し、5ミルク粉末のPBS溶液にて2時間ブロッキングした全ての洗浄およびブロッキングステップは、特に記載がない限り200μlの緩衝液体積を含んだ。非コート対照ウェルを、これに応じてブロッキングした。PBSで2回洗浄後、CRCBT-02-001溶液をウェルにPBS中5μg/ml濃度で添加し、22°C、60分インキュベートした。非コート対照ウェルをCRCBT-02-001でこれに応じてインキュベートした。PBSで2回洗浄後、ウェルを抗マウス二次抗体HRP複合体化抗体、PBS中1:2000と共にインキュベートした。処理/未処理PI16-FcPNGaseでコートした対照ウェルを、精製融合タンパク質のC末端Fc部分に対する抗Fc抗体HRP複合体化抗体、PBS中1:4000ででプローブ化した。22°Cで1時間30分インキュベーションを行った後、ウェルをPBSで3回洗浄し、各ウェルを100μlの基質溶液120mMクエン酸、1mMABTS、0.03過酸化水素でプローブ化し、22°C、30分間インキュベートした。その後、プレートをプレートリーダーで414nmにて読み取った4連で試料を処理。バクテリオファージにディスプレイされたヒトPI16遺伝子フラグメントライブラリの構築およびパニング本方法の変形Coleyら,2001年を用いてM13バクテリオファージ上で発現されるヒトPI16遺伝子フラグメントライブラリを調製した。ファージミドベクターpHENH6Hoogenboomら,1991年は、ファージ粒子表面上のpIIIタンパク質と周辺質標的配列およびその機能遺伝子III配列間のマルチクローニング部位とをコードするM13バクテリオファージ遺伝子IIIのコピーを含有する。dsDNAのマルチクローニング部位へのライゲーションの結果、遺伝子III産物に融合した挿入フラグメントが発現し、次いでM13バクテリオファージ表面上に融合タンパク質がディスプレイされる。ヒトPI16のコード領域に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、鋳型としてPI16ORFDNAを用いたポリメラーゼ連鎖反応により細胞外のリーディングフレームを増幅した。その後PI16PCR産物をDNaseIで消化し、様々な時点の消化産物をアガロースゲル電気泳動で試験して最適反応条件を決定した。最も広いフラグメントサイズ分布を示す条件を選択し、5μgのDNAを20ngのDNAseIを用いて反応緩衝液50mMTris、pH7.6、10mMMnCl2、0.1mg/mlBSA中にて2時間消化した。反応を、EDTAを50mMの最終濃度になるまで添加することにより終了させ、70°C、10分間で熱失活させた。消化したDNAを精製して末端をVentDNAポリメラーゼを用いて平滑末端化した。5.4μgのpHENH6ファージミドベクターをPstIで消化し、その後VentDNAポリメラーゼを用いて平滑末端化した。ベクターの再環状化を避けるため、アルカリホスファターゼCIPで処理した。次いで、ランダム消化物により産生した平滑末端化したPI16遺伝子フラグメントを、1:9の比率で挿入するベクターを用いて調製pHENH6ベクター中にライゲートした。ライゲート産物をWizard登録商標SVGelおよびPCRClean-UpSystemPROMEGAを用いて精製し、電気穿孔法によりE.coliTG1コンピテント細胞Stratageneに形質転換した。形質転換細菌細胞を数回希釈して、遺伝子ライブラリサイズを約1×107個体クローンであると推定した。一方向性のクローニングのため、およそ6クローン中1つがフレーム内にあり40、ワークライブラリのおよそのサイズは1x106であると推定された。ライブラリでのフラグメントサイズの多様性をポリメラーゼ連鎖反応PCRにより試験し、個体クローンの配列決定を行った。配列の包含はランダムであると思われた。ライブラリグリセロールストックを200mlの2YT培地にて増幅し、実質的にColeyら,2001年に記載されるようにファージ粒子をヘルパーファージによりレスキューした。パニングの3つのラウンドを、イムノチューブNUNCmaxisorpを10μg/mlのmAbCRC-BT-02-001で一晩、4°Cでコーティングすることにより実施した。チューブを、5スキムミルク粉末を含むPBSでブロッキングし、ライブラリ1011ファージミド粒子をmAbに結合させた。1時間後、チューブをPBSで洗浄し、mAbに結合していないファージを取り除き、付着ファージを0.1MグリシンpH2.2で溶出し、1.5MTRIS緩衝液で中和させた。溶出ファージをTG1大腸菌細胞中で再感染させ、レスキューし、増幅し、パニングの次のラウンドのために実質的にColeyら,2001年に記載のようにPEG沈殿を行った。パニングの第2ラウンドのために、PBS含有0.1TWEEN20PBSTによる2回の洗浄を行い、その後2回のPBSによる洗浄、およびラウンド3にて2回のPBSTによる洗浄を追加した。CRC-BT-02-001mAbに結合するPI16のフラグメントの同一性を明らかにするため、ラウンド3からのクローンをDNA配列決定し、パニングのより初期のラウンドとクローンを比較した。遺伝子フラグメントの結合がファージ外で生じるかを決定するため、R34およびR37の重複領域からなるビオチン化ペプチドを合成したGLBiochem、中国配列番号39。ペプチドをPBS中で可溶化し、neutrAvidinPierceで前コーティングしたマイクロ力価プレートと結合させた。ウェルを洗浄し、モノクローナル抗体CRCBT-02-001をペプチドおよび対照ペプチドとカップリングしたウェルに添加する。対照として、別のアイソタイプコントロール抗体ICをペプチドでコートしたウェルに添加した。抗マウスHRPを用いて結合抗体を検出し、TMB基質を用いてELISAを展開した。11.3結果PI16のCRCBT-02-001エピトープはジスルフィド結合の有無に依存する。CRCBT-02-001mAbは結合のためにPI16抗原内にジスルフィド結合3D構造の存在が必要であるかを評価するため、ヒトPI16-Fcの還元およびアルキル化を行った。図34A~Cのデータは、CRCBT-02-001mAbは天然PI16に結合するがRAPI16には結合しないことを説明している。図34A~Cは組み換えタンパク質PI16-FcのFc部分が検出され得ることを確証し、これはPI16の完全性がRA後に保持されていることを確証している。図34A~CはELISA、SDSPAGEゲル、およびウエスタンブロット法が、CRCBT-02-001はRAPI16に結合しないことを確証する。CRCBT-02-001の結合は抗原のN-グリコシル化状態と無関係であるアスパラギン結合型糖鎖構造を除去するための、PI16-FcのPNGaseFによる脱グリコシル化は、CRCBT-02-001の結合への影響を測定可能に有していなかった。対照抗体抗ヒトFcは融合タンパク質のFc部分が認められる図35。このことはCRCBT-02-001のエピトープが抗原のN-グリコシル化状態に依存していないことを示す。PNGaseF処理および未処理PI16-Fcの両方をSDSPAGEおよびWesterntransferにより解析した。PNGaseF処理後のPI16-Fcに関し分子量の明確な変化が認められたマイナス約5kDaデータ非表示。エピトープを狭小化したPI16に結合するCRCBT-02-001の特性解析精製PI16-Fcは試料の熱処理後に区別可能な分解産物を示していた図36。SDS-PAGEを用いて解析しCRCBT-02-001で免疫修飾される際、PI16-Fcのフラグメントは、約35kDaの分子量の抗体を認めた。使用したタンパク質構築物でのPI16の細胞外ドメインに融合されるC末端Fcタグに対する対照抗体抗Fcは、記載した分解産物といかなる結合も示さなかったデータは非表示。試料をSDS-PAGEに処し、クマシー染色後、対応するタンパク質バンドをゲルから切り取った。トリプシンを含むゲル断片のゲル中消化後、抽出したトリプシンペプチドを解析し、PI16のN末端CAPドメインに属するペプチドを、MALDI-tof/tof-MS法を用いて配列決定した:PI16アミノ酸59~68配列:WDEELAAFAK配列番号32。これらの結果は、PI16のN末端CAPドメインがmAbCRCBT-02-001の実際の結合部位において関与していることを示す。ランダムなPI16フラグメントを発現するファージライブラリの産生PI16アミノ酸28~443細胞外ドメインのコード領域を増幅し、DNaseIで消化した。1200から100bp間のフラグメントをもたらす条件を用いてファージミドベクターpHENH6中にクローン化したPI16遺伝子フラグメント図37の混合物を産生し、遺伝子フラグメントライブラリを作製した。無作為に選択したクローンのいくつかは、遺伝子フラグメントの広範囲の分布を示した図37。mAbCRC-BT-02-001でのPI16遺伝子フラグメントライブラリのパニング3ラウンドのパニングを実施してmAbCRC-BT-02-001に結合したPI16の遺伝子フラグメントを選択した。PI16遺伝子フラグメントクローンのmAbへの結合性をELISAにより解析し、その結果を図38Aに示す。ラウンド3R34、7、10、1215で選択された、抗PI16mAbに強力に結合する5つのクローンはELISA高シグナルを示し、一方でラウンド2およびラウンド0での非クローンはmAbと結合した。これらの配列は、フレーム外、図40で示される配列データの概略外であり得る。図38Bに示す9E10または抗mycシグナルは、mycタグが遺伝子フラグメントのC末端遺伝子IIIのN末端に存在するため、ファージの相対量を反映している。抗myc抗体への高い結合シグナルが、ファージ表面で良好に発現する指標である図38B。フラグメントのなかには、陽性抗Mycシグナルに示されるファージ上で発現するが抗PI16mAbには結合しないものもあった。個々のクローンをラウンド3にて選択し、PCRを行い、遺伝子フラグメントを配列決定した。パニングしていないライブラリラウンド0およびラウンド1において、フラグメントサイズの広範囲の広がりが存在した一方でラウンド3ではフラグメントの多くがごく小さいサイズであった図39。ラウンド3選択PI16遺伝子フラグメントの配列同一性を図40に示す。これらのフラグメントはCRCBT-01-001の最小結合領域を示すPI16配列に重複し、このことは、この領域が、抗体が結合するPI16のエピトープを形成することを示す。遺伝子フラグメントライブラリからのCRCBT-02-001結合性クローンの重複配列を図40Cの下線部に示す。上記提示したデータにより、CRCBT-02-001に関するエピトープは分子内ジスルフィド結合の有無に依存的であるが、N結合炭水化物に依存的でないことが示される。本データは、CRCBT-02-001に関するエピトープはN末端CAPドメインとファージディスプレイにより同定された短配列、RWDEELAAFAKAYARQ配列番号38に配置されているいずれかがエピトープを含むまたは含有することを示唆する。ファージディスプレイにより同定された最小結合領域はシステインまたはジスルフィド結合を含まない。エピトープはファージ外のジスルフィド結合に依存し得る可能性がある。しかしペプチドLHMRWDEELAAFFAKAYARQCVWGHNKER-ビオチン配列番号39が合成され、mAbCRCBT-02-001に結合することがELISAにより示された図41。このペプチドは同定された最小結合領域含む下線。このことは、mAbCRCBT-02-001が単離の際にPI16のこの領域に結合するが、全PI16抗原中に存在する場合には同族エピトープと反応するために抗原中に存在するさらなる構成成分を必要とすることを実証する。発明者らは、CRCBT-02-001のエピトープが一次配列RWDEELAAFAKAYARQ内に含まれ、また全PI16抗原中に存在する場合にジスルフィド結合が完全であることによりmAbに接触容易性をもたらすことを結論付けている。実施例12:CRCBT-02-001の親和性2つの方法を比較してCRCBT-02-001の親和性を測定した。解析を、BIO-RADProteonXPR36商標タンパク質相互作用アレイシステムを用いて、表面プラズモン共鳴に基づき実施した:方法1:チップに直接抗原PI16-Fcをカップリングして分析物CRCBT-02-001Fabの上に流す方法。方法2:抗PI16Mabを捕捉し、分析物としてのPI16-Fc上に流す抗マウス捕捉方法。12.1方法方法1:センサーチップにカップリングしたPI16-FcとCRCBT-02-001Fabとの相互作用ProteOnセンサーチップGLCを、0.2MN-エチル-N’-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDCおよび0.05Mスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドスルホ-NHSの混合物をチップ150μl、30μl/分で5分間に流すことにより活性化した。組み換えPI16-Fcを、150μlの50μg/mL溶液を含む10mM酢酸緩衝液pH4.5を30μl/分で流すことにより、垂直方向にチップにカップリングした。次いで、残余活性化カルボキシル基を、150μLの1Mエタノールアミン-HClpH8.5を30μl/分で流すことにより、非活性化した。PBSTween200.005に希釈した抗PI16Fabフラグメントを、次の濃度:50nM、25nM、12.5nM、6.25nMおよび3.125nMでの5つのチャネルで、リガンドに水平方向に通過させた100μl、100μl/分接触時間60秒および解離時間600秒。PBSTween200.005のみを残余チャネルに通過させた。結合しているセンサグラムを回収して、ラングミュア動態モデルを用いたProteOnManager2.1XPR36ソフトウェアで解析し、データを適合し親和性定数KDを測定した。方法2:CRCBT-02-001Mabと抗マウス捕捉試薬を用いたPI16-Fcとの相互作用proteOnセンサーチップGLMを、0.2MEDCおよび0.05Msulpho-NHSの混合物をチップ150μl、30μl/分で5分間に流すことにより活性化した。次いで、ウサギ抗マウスIgG全分子SigmaM-7023を、150μlの50μg/mL溶液を含む10mM酢酸緩衝液pH4.5を30μl/分で流すことにより、チップに垂直方向にカップリングした。次いで、残余カップリング部位を、150μlの1Mエタノールアミン-HClpH8.5を30μl/分で流すことにより、非活性化した。次いで、マウスモノクローナル抗PI16IgGを流して、150μLの100μg/mLIgG、25μl/分でセンサーチップのシングルチャンネル上を平行方向に流すことによりカップリングした抗マウスIgG抗体により捕捉した。次いで、PBSTween200.005に希釈した組み換えPI16-Fcを、次の濃度:50nM、25nM、12.5nM、6.25nMおよび3.125nMでの5つのチャネルで、GLMセンサーチップに垂直方向に通過させた150μl、25μl/分、接触時間240秒および解離時間1200秒。PBSTween200.005のみを残余チャネルに通過させて、参照用とした。結合しているセンサグラムを回収して、ラングミュア動態モデルを用いたProteOnManager2.1XPR36ソフトウェアで解析し、データを適合し親和性定数KDを測定した。12.2結果方法1このカップリング方法を、PI16-FcのGLCチップへのカップリングを最適化するための様々なpHを用いて実施した。最適カップリングpHは4.5であった。結合曲線および解離曲線ならびに親和性測定を、図42および表8に示すPI16の3つの希釈により実施した。データは、全体的適合を用いたラングミュア動態モデルに良好に適合した曲線のすべてが同時に適合した。方法2公開された方法Nahsholら,2008年を用いて、PI16mabの動態を抗マウス捕捉により測定した。これは比較的穏やかな方法、カップリング方法であり、結合曲線および解離曲線ならびに親和性測定を、PI16-Fcの4種類の希釈で実施した図43および表9。データは、全体的適合を用いたラングミュア動態モデルに良好に適合した曲線のすべてが同時に適合した。CRCBT-02-001のPI16-fcへの親和性は方法2を用いて測定された。両方法を用いた親和性KDは同程度の1.25~2.56nMである。実施例13:GVHDの治療骨髄移植を必要とする対象は放射線治療される。好適な時間に続き、対象は骨髄移植または造血幹細胞の移植を受ける。検査患者では、移植片はさらに実施例2および3に記載のように単離したTreg細胞を含む。次いで、生存率を測定し、Treg細胞を受ける対象の生存率が伸びている場合は細胞が機能的であることを示す。実施例14:自己免疫疾患の治療自己免疫疾患に罹患する対象に、実施例2および3に記載のように単離した精製Treg細胞または担体単独を投与する。自己抗体、サイトカインのレベルおよび自己免疫性症状を測定する。症状の緩和および/または炎症性サイトカインの血清レベルの減少の検出が、単離Treg細胞が自己免疫疾患を治療または予防し得ることが示す。例示的な自己免疫疾患は、関節リュウマチである。この疾患の場合、対象に実施例2および3に記載のように単離した精製Treg細胞または担体単独を投与する。抗コラーゲン抗体レベル、サイトカインおよび/または関節炎の症状を測定する。関節炎症状の緩和ならびに/またはTNF-alphaおよび/もしくはIL-6などのサイトカインの血清レベルの減少の検出は、単離Treg細胞が関節リュウマチを治療または予防し得ることが示す。実施例15:糖尿病治療前糖尿病性の表現型に罹患する対象症候性1型得糖尿病、および好ましくは自己反応性Bおよび/またはT細胞で検出されるレベルではないが例えば耐糖能異常を、実施例2および3に記載のように単離された精製Treg細胞または担体単独で処理する。処理後、対象を糖尿病の症状、例えば血糖値の増加、インスリン反応異常、耐糖能異常、または自己抗体レベルなどについて評価する。糖尿病の1以上の症状の発症の防止または遅延は、単離Treg細胞が自己免疫性糖尿病を治療し得ることの指標となる。実施例16CRCBT-02-001により分泌される抗体の可変領域のクローニングおよび配列決定メッセンジャーRNAを、CRCBT-02-001ハイブリドーマ細胞から、産生およびオリゴ-dTプライマーを用いて逆転写することにより調製しcDNAを作製する。別個のPCR反応のいくつかを、リーダー配列、可変領域および下流配列のいくつかに結合し、これらの配列をコードするcDNAの増幅を容易にするプライマーにより実施する。PCR単位複製配列をアガロースゲル上に分離する。単位複製配列をゲルから単離し、クローニングし、配列決定する。実施例17―CRCBT-02-001により分泌される抗体の可変領域を含むキメラ抗体の作製CRCBT-02-001により分泌される抗体の可変領域を、ヒトIgG1Fc領域と融合することにより全抗体に変換する。可変領域を実施例1または16に記載のクローニングベクターよりPCR増幅し、抗体配列の直前のリーダー配列により抗体発現ベクター内にインフレームでクローン化する。ベクターでは、軽鎖および重鎖に関する全定常領域のゲノムDNA配列がすでにベクターにて遺伝子操作されている。発現はヒトサイトメガロウイルスCMV早期プロモーター、次いでSV40ポリアデニル化信号により促進される。可変領域のインフレーム融合により、全抗体の適切な発現が可能となる。設計により、マウス軽鎖および重鎖からのリーダー配列を、抗体オープンリーディングフレームの直前に含む。組み合わせた軽鎖および重鎖プラスミドDNAまたは1:1の混合比の対応する軽鎖および重鎖プラスミドDNAの混合物のいずれかをリポフェクションによりCHO細胞中に形質移入する。培養培地を採取して、ろ過し、低速MilliporeCentricon登録商標遠心分離濃縮器を用いて濃縮する。実施例18:CRCBT-02-001により分泌される抗体のヒト化CRCBT-02-001により分泌される抗体のヒト化形態を、基本的に国際公開第92/22018号に記載のように作製する。簡単には、CRCBT-02-001により分泌される抗体と高い相同性を持つ配列を有するPI16ヒト抗体の結合親和性を保持するヒト化抗体を作製するために選択され、アクセプター軽鎖および重鎖ヒトフレームワークの両方を得る。本明細書で決定される配列を用いて、コンピュータープログラムABMODおよびENCADLevitt、1983年およびZilberら,1990年にて各マウス抗体の可変領域モデルを構築する。このモデルを使用して、アミノ酸と潜在的に相互作用するほどCDRに近い各フレームワークでのアミノ酸を決定する。各ヒト化抗体を設計する際、各位置にて、アミノ酸は、以下の1つ以上のカテゴリ1~4に該当する場合を除いては、ヒトアクセプター配列でのアミノ酸と同様であるものを選択した:カテゴリ1:アミノ酸位置がKabatらにより特定されたCDR内にある;カテゴリ2:ヒトアクセプター免疫グロブリンのフレームワーク内でのアミノ酸が異常な場合すなわちまれであり、本明細書に使用される場合、アミノ酸がその位置で、代表的なデーターバンクでのヒト重鎖各軽鎖V領域配列の約20未満であるが通常約10未満で生じることを示す、またその位置でのドナーのアミノ酸がヒト配列に典型的なものである場合すなわち本明細書に使用される場合一般的はアミノ酸が代表的なデーターバンクでの配列の約25超であるか通常約50超で生じることを示す、アクセプターよりむしろドナーアミノ酸が選択され得る;カテゴリ3:ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列での3つのCDRのうち1以上とごく近接する位置において、アクセプターアミノ酸よりむしろドナーアミノ酸が選択され得る。カテゴリ4:本来のドナー抗体の典型である3次元モデルがCDR外の特定のアミノ酸がCDRに近接し、またCDRでのアミノ酸と、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などにより良い確率の相互作用をもつ。これらのアミノ酸位置で、アクセプター免疫グロブリンアミノ酸よりむしろドナー免疫グロブリンアミノ酸が選択され得る。上記カテゴリのいずれかに該当するマウスドナー配列でのアミノ酸を用いる。ヒト化抗体をコードする遺伝子の構築のために、ヒト化重鎖および軽鎖のタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列を選択し、典型的にはマウス抗体鎖からのシグナルペプチドを含み、一般にマウス配列に見られるコドンを利用する。数種類の縮重コドンを変更して反応部位を作製するか、好ましくない部分を取り除く。ヌクレオチド配列はまた、免疫グロブリン遺伝子の典型的なものとしてスプライスドナーシグナルを含んでいた。重複する合成オリゴヌクレオチドから構築された各遺伝子。各可変ドメイン遺伝子について、交互ストランド上の2対の重複オリゴヌクレオチドは、全コード配列ならびにシグナルペプチドおよびそのスプライスドナーシグナルを包含するように合成される。二重鎖DNAフラグメントはKlenowまたはTaqポリメラーゼを用いてまたはオリゴヌクレオチドの各対からの配列を用いて合成され、制限酵素で消化され、pUC18ベクターにライゲートされ、また配列決定する。次いで、各々正確な2つのフラグメント半配列を発現ベクター中に適する方向でライゲートし、完全重鎖および軽鎖遺伝子を作製する。重鎖および軽鎖プラスミドを、リポフェクションによりCHO細胞内に形質移入させる。培養上清でのヒト抗体の産生を、捕捉試薬としての組み換えPI16または実施例1もしくは2に記載のFACSを用いてELISAにより試験することにより、クローンをスクリーニングし、抗体を最適に産生されたクローンから精製する。ProteinAカラムに組織培養上清を通すことにより抗体を精製する。結合抗体を酸性溶出緩衝液により溶出し、該緩衝液はPD10カラムPharmaciaを通過させることによりPBSに変換する。次いで、対応する抗原を発現する細胞型へのヒト化抗体の結合性を、実施例3に記載のように検査する。実施例19:ヒト化抗体の親和性成熟実施例18に記載のヒト化抗体の可変重鎖および可変軽鎖をコードするDNAを、FabファージディスプレイベクターまたはscFvファージディスプレイベクターにてクローン化する。次いで、クローンDNAを、可変重鎖および軽鎖CDR3領域各ライブラリは>108機能多様性をもつにて無作為に突然変異する。ついで結果としてできた変異株を、標準的なファージディスプレイパニングプロトコル例えばファージディスプレイ法:ALaboratoryManual2001年ColdSpringHarborLaboratoryPressを参照を用いて、PI16実施例2に記載を発現する細胞に対してパニングする。パニングの各後続周期続くラウンドにおいて標的細胞濃度を低下させることによりパニングのストリンジェンシーを効果的に上昇させ、これにより、各後続周期にてより増大した高い親和性ファージを濃縮する。ファージELISAを一次試験として用いて、ファージ結合組み換えFabsまたはscFvのPI16発現細胞認識能力を測定する。PI16発現細胞と結合することができるフラグメントを、発現、産生および特性解析のため、ヒトサブクラスIgG1の完全長抗体へ変換する。実施例20:競合的結合試験CRCBT-02-001により産生された抗体を蛍光標識で標識化し、キメラ抗体実施例17、ヒト化抗体実施例18、親和性成熟抗体実施例19、またはナイーブ完全ヒトファージディスプレイライブラリディスプレイscFvと1:1の割合で混合した。対照のため、標識CRCBT-02-001を単独で使用した。PI16を安定的に発現する実施例2NIH3T3細胞のほぼ同等量が、94ウェルプレートで培養される。細胞は、抗体の存在下で、結合する抗体ために十分な時間培養される。上清は単離され、細胞は洗浄される。細胞に結合したおよび/または上清での蛍光レベルが次いで測定される。細胞に結合した蛍光レベルが減少する抗体および/または上清で蛍光性が増大する抗体は、CRCBT-02-001により分泌される抗体の結合を競合的に阻害すると考えられる。任意の競合的ファージディスプレイscFvはヒトアイソタイプIgG1完全抗体中にて遺伝子操作される。実施例21:免疫応答の誘発対象に腫瘍細胞株、例えばNeuro-2AまたはCT26結腸直腸癌細胞を投与する。細胞投与に続いてまたは投与時点で、対象に実施例20で同定された競合的抗体を投与する。あるいは、対象を、Treg細胞を捕捉するCRCBT-02-001により分泌される抗体を用いて白血球除去療法により治療する。対象のサブセットにもまた死滅癌細胞を投与する。腫瘍細胞に対する免疫応答をまたELISAおよび/またはELISPOTを用いて測定する。抗体単独または抗体および細胞のワクチンで治療した対象と対比した、抗体治療なしで腫瘍細胞を投与したマウスでの生存率、腫瘍の存在、腫瘍サイズおよび/または腫瘍に対する免疫応答の程度を測定する。細胞および抗体を投与された、または抗体単独もしくは抗体/白血球除去療法に対比して白血球除去療法を受けたマウスでの、生存率または免疫応答のさらなる増加および/または腫瘍の存在またはサイズの減少により、治療がワクチン治療に対するより強力な応答を可能にすることを示す。参考文献AlbinietalCancerResearch47323932451987AlLazikanietalJMolBiol2739279481997AnderssonEngelsetalPhysMedBiol428158241997AsanoetalJExpMed1843873961996AusubeletalCurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenePubAssociatesandWileyInterscienceBaecherAllanetalJImmunol167124512532001BaronetalEurJImmunol37237823892007BassunyetalImmunogenetics551491562003BendeleJMusculoskelNeuronInteract13773852001BengtssonetalBMCBioinformatics7962006BengtssonandHossjerBMCBioinformatics71002006BluestoneetalNatRevImmunol32532000BolstadetalBioinformatics191851932003BorketalJMolBiol2423093201994BoyeretalBlood103342834302004BrinkmannetalProcNatlAcadSciUSA90753875421993BrownEssentialMolecularBiologyAPracticalApproachVolumes1and2IRLPressCaoetalArthritisResTher6R35R462004ChenetalNature4462032072007ChothiaandLeskJMolBiol1969019171987ChothiaetalNature3428778831989CimaetalBiotechnolBioeng381451991CohenetalHumGeneTher10270127071999ColeyetalProteinEngineering146916982001ColiganetalCurrentProtocolsinImmunologyJohnWileySonsCrispinetalJAutoimmun212732762003CurieletalNatMed109429492004DaietalJBioinformComputBiol16276452004DeKleeretalJImmunol172643564432004DejacoetalImmunology1172893002005DooleyandFlajnikDevCompImmunol3043562006EstinetalJNatlCancerInstil814454461989FoonetalProcAmSocClinOncol132941994GefteretalSomaticCellGenet32312361977GloverandHamesDNACloningAPracticalApproachVolumes14IRLPressGoforthetalCancerImmunolImmunother2008GoodmanetalGoodmanandGilmansThePharmacologicalBasisofTherapeutics8thEdMacmillanPublishingCo1990GregorietalJImmunol167194519532001HarlowandLaneAntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarbourLaboratoryHenttuandVihkoBiochemBiophysResComm1609039101989HochbergandBenjaminiStatMed98118181990HolligeretalProcNatlAcadSciUSA90644464481993HollingerandHudsonNatureBiotechnology23112611362005HoogenboomandWinterJMolBiol2273811991HoogenboometalNuclAcidsRes19413341371991HuetalCancerRes56305530611996HudsonandKorttJImmunolMethods2311771891999ItohetalNature308191986IrizarryetalBiostatistics42492642003JakobovitsetalNatureBiotechnology25113411432007JespersetalBiotechnology128999031988JonesetalNature3215225251989JonesetalCancerImmun22212002KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterestNationalInstitutesofHealthBethesdaMd1987and1991KamarchMethodsEnzymol1511501651987KanaietalInflammBowelDis1289992006KerbelCancerMetastasis173013041998KingsleyetalJImmunol16810802002KoeneckeetalEurJImmunol39309130962009KohlerandMilsteinNature2564954971975KohlerandMilsteinEurJImmunol65115191976KomatsuetalJImmunolMethods2721611752003KruifandLogtenbergJBiolChem271763076341996KumaretalImmunoLetters651531591999LargaespadaetalJImmunolMethods19785951996LeFrancetalDevCompImmunol2755772003LevittJMolBiol1685951983LonbergetalNature368856859LonbergNTransgenicApproachestoHumanMonoclonalAntibodiesHandbookofExpermentalPharmacology11349101LiuetalScandJImmunol591982022004LivingstonetalJClinOncol12103610441994LonghietalJHepatol4131372004LukacsetalJExpMed1945515552001MacardleandBaileyCellBiologyALaboratoryHandbookChapter57PreparationofMonoclonalAntibodies2006MarksetalJMolBiol2225815971991MavrangelosetalJImmunolMethods2891691782004McHughetalJImmunol168597959832002MiltenyietalCytometry112312381990MiyaraetalImmunity308999112009MorrisonetalProcNatlAcadSciUSA81685168551984MottetetalJImmunol170393939432003MulleretalBioTechniques32137213741376137813792002NakamuraetalJExpMed1946296442001NahsholetalAnalBiochem38352602008NatalietalCancer5955631987NovellinoetalCancerImmunolImmunother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