"セルロース及び又はヘミセルロース由来の、セロビオース、セロオリゴ糖類、キシロース、アラビノース、グルコースからなる群より選択されるいずれかを基質として含む環境mediumで、L乳酸を生産可能な乳酸菌を培養し、L乳酸を得る工程を含む、L乳酸の生産方法。乳酸菌が、エンテロコッカスムンヅティEnterococcusmundtiiに属する乳酸菌である、請求項1に記載の生産方法。環境がセロオリゴ糖類を基質として含み、セロオリゴ糖類が、セロトリオース及びセロテトラオースを含む、請求項1又は2に記載の生産方法。環境がキシロースを基質として含み、さらにグルコース及び又はセロビオースを基質として含み、キシロースの濃度が、10gL~150gLである、請求項1~3のいずれか1項に記載の生産方法。開放系、及び又は非滅菌の環境で実施される、請求項1~4のいずれか1項に記載の生産方法。回分式で繰り返し実施される、請求項5に記載の生産方法。バイオマス原料が、非食用バイオマス原料である、請求項1~5のいずれか1項に記載の生産方法。請求項1~7のいずれか1項に定義されたL乳酸の生産のための工程、及びL乳酸を重合する工程を含む、ポリL乳酸の生産方法。非食用バイオマスのL乳酸発酵に際しては、同時糖化発酵ができるように、セルロースやヘミセルロースを酵素的又は物理化学的に処理してできるオリゴ糖C6オリゴ糖、C5オリゴ糖などや混合糖C6糖、C5糖などからなる混合物を原料とできることが望ましい。本発明は以下を提供する:[1]セルロース及び又はヘミセルロース由来の、セロビオース、セロオリゴ糖類、キシロース、アラビノース、グルコースからなる群より選択されるいずれかを基質として含む環境mediumで、L乳酸を生産可能な乳酸菌を培養し、L乳酸を得る工程を含む、L乳酸の生産方法。[2]乳酸菌が、エンテロコッカスムンヅティEnterococcusmundtiiに属する乳酸菌である、[1]に記載の生産方法。[3]環境がセロオリゴ糖類を基質として含み、セロオリゴ糖類が、セロトリオース及びセロテトラオースを含む、[1]又は[2]に記載の生産方法。[4]環境がキシロースを基質として含み、さらにグルコース及び又はセロビオースを基質として含み、キシロースの濃度が、10gL~150gLである、[1]~[3]のいずれか一に記載の生産方法。[5]開放系、及び又は非滅菌の環境で実施される、[1]~[4]のいずれか一に記載の生産方法。[6]回分式で繰り返し実施される、[5]に記載の生産方法。[7]バイオマス原料が、非食用バイオマス原料である、[1]~[5]のいずれか一に記載の生産方法。[8][1]~[7]のいずれか一に定義されたL乳酸の生産のための工程、及びL乳酸を重合する工程を含む、ポリL乳酸の生産方法。本発明により、乳酸菌を用いた高純度L乳酸の効率的な生産方法が提供される。[乳酸菌]本発明で乳酸菌というときは、特に記載した場合を除き、多量に乳酸を生産すると共に、炭水化物を含む培地によく繁殖し、グラム陽性で、運動性がなく、胞子をつくらない菌群をいう。本発明でいう乳酸菌は、エンテロコッカス属に属する微生物、ラクトバシラス属に属する微生物、ビフィドバクテリウム属に属する微生物、ラクトコッカス属に属する微生物、ペディオコッカス属に得する微生物、及びロイコノストック属に属する微生物を含む。本発明に用いるのに適した乳酸菌は、天然源から得た試料から、次のようにスクリーニングすることにより、得ることができる。少量の試料を改変MRS培地例えば、MRS培地に、セロビオース又はグルコースを各2wtvol濃度で添加したものに加え、30°Cで3日又は7日間、嫌気的条件で培養し、培養物の一部を段階的に希釈し、CMセロビオース寒天プレートに広げ、コロニーの採取、希釈、画線培養を適宜行い、単一のコロニー群を得る。単離菌は、定法により、カタラーゼについて試験し、カタラーゼ陰性のものについて、CMセロビオース寒天培地を用いてさらに選抜し、乳酸の収率及び光学純度が高いものを選択する。本発明には、エンテロコッカスムンヅティEnterococcusmundtiiに属する乳酸菌を好適に用いることができる。特に、EnterococcusmundtiiNITEBP965を好適に用いることができる。この菌株は、本発明者らが、日本国福岡市動物園日本国福岡県福岡市中央区南公園1番1号で集められた羊の糞試料から単離したものであり、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター〒2920818千葉県木更津市かずさ鎌足258へ、2010年7月15日付で受託番号NITEBP965として寄託されている。本明細書では、この菌株をQU25と称することがある。このQU25は、乳酸発酵に関し、下記の性質を有する:1光学純度が990以上好ましくは995以上、より好ましくは9975以上、更に好ましくは999以上であるL乳酸を生産可能であり;かつ220gLのセロビオースを含む培地で、pHを70に制御し、43°Cで20時間以上培養したときに、20gLのL乳酸を生産可能である。本発明で乳酸を生産可能というときは、特に記載した場合を除き、特定の範囲であることが規定された条件項目例えば、温度、時間については、その範囲で、また特定されていない条件項目例えば、攪拌速度、通気の有無程度については発酵生産に適する条件とした場合に、その純度及び濃度で生産できることをいう。また基質濃度をいうときは、特に記載した場合を除き、培養開始時の培地の基質濃度初発濃度ということもある。をいう。本願は、QU25のみならず、それと均等な微生物、具体的には下記の微生物も、好適に用いることができる。1下記の性質を有するEnterococcusmundtiiに属する乳酸菌:1光学純度が990以上好ましくは995以上、より好ましくは9975以上、更に好ましくは999以上であるL乳酸を生産可能であり;かつ220gLのセロビオースを含む培地で、pH70、43°Cで20時間以上培養したときに、20gLのL乳酸を生産可能であるもの;2QU25と同じ、下記の菌学的性質を有する、乳酸菌;1形態:球菌である。2生化学的性質:カタラーゼ陰性である。3運動性:なし4酸素要求性:通性嫌気性である。5グルコースを基質としてホモ乳酸発酵によりL乳酸を産生する。6下記の糖資化性を有する。なお本発明における乳酸発酵に関する各種の値例えば、pH、糖濃度、光学純度は、慣用な方法で適宜測定可能であるが、測定法により値が異なる場合は、特に記載した場合を除き、本明細書の実施例の項に記載した方法により測定した値である。また本発明における乳酸発酵に関する各種の発酵パラメータは、当業者にはよく知られているが、特に記載した場合を除き、本明細書の実施例の項に定義されたものを指す。QU25及びその均等微生物は、蒸留水1L中に、ペプトンを10g、牛肉エキスを8g、酵母エキスを4g、グルコースを20g、Tween80を1g、K2HPO4を2g、酢酸ナトリウム三水和物を5g、クエン酸水素二アンモニウムを2g、MgSO4H2Oを02g、MnSO4nH2Oを005g含むMRS培地又はその改変培地にグルコース、セロビオース等の基質を適切な濃度になるように添加したものを用いて良好に培養することができる。なお、本明細書においては、本発明をQU25を用いた場合を例に説明することがあるが、特に記載した場合を除き、その説明は、QU25の均等微生物を含む他の好適な乳酸菌を用いた場合にも当てはまる。[pHの影響]QU25は、pHを55~60に低く制御した場合、pH65~75にpH制御した場合に比較して、細胞増殖が阻害されうる。低いpHで増殖できないのは遊離酸Hに対する抵抗性が低いことに起因すると思われる。pH55~60では、糖消費はきわめて低速で進行し、完全に消費されない場合がある。最大乳酸生産速度は、pHが高いほど大きくなり得、pH75付近で最大となり得る。pH制御により、制御しない場合に比較して、数倍高い最大乳酸生産速度が得られうる。したがって、生産効率の観点からは、本発明においては、環境のpHは、60以上、より好ましくは65以上、さらに好ましくは67以上であることが好ましい。pHの上限値は、いずれの場合も、75未満であることが好ましく、74未満であることがより好ましく、73未満であることがさらに好ましい。至適なpHの一例は、70である。このような環境pHの範囲は、生成乳酸の光学純度の観点からも好ましいであろう。[温度の影響]QU25は、乳酸産生及び乳酸収率に関して30~45°Cの広い温度範囲にわたって良好な生物活性を保ちうる。特に、40~44°Cにおいて、最大増殖速度及び最大乳酸生産速度を発揮しうる。45°Cを超える高い温度では、QU25は良好な細胞増殖も高い乳酸産生も示さない場合がある。したがって、効率的にL乳酸を生産するとの観点からは、本発明においては、温度は、30°C以上、より好ましくは35°C以上、さらに好ましくは40°C以上であることが好ましい。温度の上限値は、いずれの場合も、45°C未満であることが好ましく、44°C未満であることがより好ましいであろう。至適な温度の一例は、43°Cである。[基質炭素源の影響]本発明において、乳酸菌のための環境に含まれる成分に関し、基質としてというときは、特に記載した場合を除き、その微生物が資化可能な量で、その成分が含まれていることをいう。QU25は、様々な濃度のセロビオースをグルコースと同じように消費しうる。糖消費速度に関しては、グルコースとセロビオースとでは近似しうる。したがって、本発明によれば、グルコースとセロビオースの糖混合物を用いて、高純度、高濃度のL乳酸を、高収率で生産することができる。リグノセルロースからの一般的な糖化プロセスでは、多種類の糖を含有する原料が得られる。そのため、リグノセルロース由来の糖化物原料を用いて生成物収率及び生産性を最大にするためには、混合糖を完全利用することができれば望ましい。一方、大部分の微生物がグルコースを他の糖より優先的に利用するため、混合糖を乳酸生産に用いる場合、糖類の逐次利用のために、生産性が低下することが多い。しかしながら本発明によれば、セロビオースを効率的に利用するだけでなく、セロビオースとグルコースを同時に消費することができ、これによりセルロース系材料から糖化により生成する糖類を、高効率高速度で完全に利用することが期待できる。本発明は、微生物による乳酸生産のためのグルコースとセロビオースの同時利用に関する最初の発明である。本発明における環境のグルコース濃度、セロビオース濃度は、当業者であれば基質の総量が、培地に対して05~50重量の範囲内で適宜設計することができる。典型的には、初発の、又は培養期間を通じてのグルコース濃度及びセロビオース濃度は、それぞれ独立して、5gL以上とすることができ、20gL以上とすることが好ましく、50gL以上とすることがよりに好ましく、100gL以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合においても、グルコース濃度及びセロビオース濃度は、それぞれ独立して、400gL以下とすることができ、300gL以下とすることもでき、250gL以下とすることもできる。環境のグルコース濃度及びセロビオース濃度はまた、グルコース:セロビオースの重量比が1001~100、より特定すると101~10となるように決定することができる。なお本発明において、成分の濃度又は比について値を示す場合は、特に記載した場合を除き、その値は重量に基づく値である。また環境中の濃度又は比について示した値は、特に記載した場合を除き、初発培養開始時の、又は培養期間を通じての値である。本発明者らの検討によると、本明細書の実施例の条件では、QU25の増殖挙動は、環境のセロビオース濃度が150gLの場合であっても、より低濃度である場合と類似していた。増殖挙動が高糖濃度においても変わらないことは、QU25の増殖に対する基質阻害がほとんどないことを示唆している。しかしながら、乳酸収率に関しては、セロビオース濃度が上昇するのに伴って低下した。このことは、基質濃度は一般には収率及び生産量に対しては大きな作用をもたないと報告されていることから、生成物阻害若しくは乳酸生成のために必要な栄養素の枯渇、又はそれらの組み合わせによるものと考えられる。一方、乳酸生産において高い糖濃度を使用することは、経済的な側面からは望ましい。本発明におけるセロビオース濃度の上限値は、このような観点からも設計することができる。本発明においては、環境のセロビオースの濃度の上限を、100gLとしてもよい。本発明者らの検討によると、QU25はキシロースの濃度によって発酵収率が変化しうる。詳細には、キシロースのみを基質とする場合、キシロースが比較的低濃度の場合は、副産物が生成され、乳酸の収率は低くなる場合があるが、キシロースが比較的高濃度である場合は、副産物はほとんど生産されず、高収率で乳酸が得られうる。その一方で、キシロースに関しては、さらに高い濃度においては、生産速度や収率が減じる場合がある。これは高い基質濃度による阻害によるものだと理解される。参考のため、QU25における、予想されるキシロース代謝経路を図6に示した。したがって、このような観点からは、本発明におけるキシロースの濃度は、20gL以上であることが好ましく、40gL以上であることがより好ましい。いずれの場合においても、150gL以下であることが好ましく、103gL以下691mM以下であることがより好ましい。本発明によれば、キシロースがよく消費され、またキシロースを用いる場合も、グルコースやセロビオースを用いる場合と同様、pH70、43°C付近で乳酸を生産することができる。本発明によれば、グルコース及びキシロースの混合物を基質として、乳酸を生産することができる。混合物が用いられる場合、典型的には、初発のグルコース濃度及びキシロース濃度は、それぞれ独立して、5~250gLとすることができる。また、環境のグルコース濃度及びキシロース濃度は、それぞれ独立して決定してもよく、グルコース1重量部に対し、キシロースが1重量部未満、より特定すると075重量部未満となるように決定してもよい。このような重量比であれは、いずれの濃度においても、同じように糖が消費されうる。本発明においては、グルコース、キシロース及びセロビオースの混合物を基質として、乳酸を生産することができる。この場合のそれぞれの濃度は、独立して決定してもよく、グルコース1重量部に対し、キシロース及びセロビオースが、それぞれ独立して、1重量部未満、より特定すると075重量部未満となるように決定してもよい。このような態様においては、まず、グルコース及びセロビオースが迅速に消費されうる。有力なセルラーゼインヒビターでもあるセロビオースの迅速な消費は、リグノセルロース系バイオマスからの商業的な乳酸生産において、非常に有利であると考えられる。上述したように、本発明においては、キシロースを、それのみを基質として比較的低い濃度で用いる場合に、少量の副産物が生成しうるが、グルコース、セロビオースと混合してキシロースを用いる場合には、副産物の生成が減少しうる。総じて、本発明において他の糖とともにキシロースを用いる場合、キシロースの濃度は、5gL以上とすることができ、10gLとすることが好ましく、15gLとすることがより好ましい。いずれの場合も、上限値は150gLとすることができ、103gLとすることが好ましい。QU25は、セロオリゴ糖類、すなわちセロトリオースC6三糖、セロテトラロースC6四糖及びセロペントースC6五糖を資化しうる。特に、セロトリオース及びセロテトラロースから、約100の収率でl乳酸光学純度、100を生産することができる。したがって、本発明によれば、次の効果が期待できる:1非食用バイオマスの前処理工程の簡便化コストダウン;2非食用バイオマスからのl乳酸収率の実質的な向上;3前処理工程に酵素分解反応を用いる場合、オリゴ糖による酵素反応阻害を考慮する必要性の低下。非食用バイオマスは、主としてセルロース、ヘミセルロース、リグニンより構成される。物理化学的に分解する場合、単糖までの分解は可能であるが、厳しい条件を必要とし、その場合はコスト労力がかかる上、単糖がさらに分解してしまう恐れがある。一方、やや穏やかな条件で処理を行うこと、単糖以外に、大量のオリゴ糖が生じることとなる。本発明によれば、キシロオリゴ糖及びセロオリゴ糖が、有効に資化されうる。混合糖、キシロース、セロオリゴ糖に対する特性から、本発明は、バイオマス原料からの同時糖化発酵に適用可能であるといえる。特に、非食用バイオマスを用いた同時糖化発酵への適用が期待できる。同時糖化発酵については、前掲の非特許文献8及び9を参照することができる。L乳酸を生産するための基質としては、効率速度、収率の両方で。副産物は作らない。の観点からは、グルコースが最適である。しかしながら、非食用バイオマスを原料とする場合、グルコース単独の炭素源はあり得ず、セルロースやヘミセルロースの前処理によってできてくるグルコースのようなヘキソースのほか、キシロースやアラビノースのようなペントース、さらにはそれらのオリゴ糖等の混合物が、現実の炭素源となる。それらの炭素源に対応可能であり、かつL乳酸を効率よく速度、収率の両方で、副産物は作らない。生産でき、基質生成物阻害が少なく、カタボライト抑制が少ない、等の種々の特性を備えた菌株があるとよい。本発明の好ましい態様においては、このような菌株としてQU25を用いることができる。[開放系培養]本発明による乳酸生産は、開放系として、又は非滅菌条件下で、実施することができる。開放系又は非滅菌は、生産のために用いる培地を滅菌しないこと、回分式で乳酸を生産する場合に、ある回分培養から次の回分培養への引き継ぎの無菌条件下での実施を要しないことを含む。本発明による乳酸生産は、反復回分式で、実施することができる。開放又は非滅菌生産系はi滅菌中のメイラード反応が回避可能であり;ii装置の必要性及びエネルギー消費を低下させることも可能であり;そしてiii工程を単純化し、そして労力を省くことも可能であるため、好ましいBioresourceTechnology10164946498。さらに、反復回分repeatedbatch操作は、回分式と比較して、時間及び労力両方の点で節約につながる。これらには、発酵槽の洗浄及び滅菌に必要な時間がより少ないこと、シードを調製する時間が省略できること、増殖率が高いこと、そして初期の菌体接種体積が大きいため、本培養時間が短いことが含まれる。開放系及び反復回分操作を組み合わせることによって、さらにエネルギー効率が優れ、労力及び時間が節約された操作戦略を確立することも可能である。開放反復回分系は、乳酸菌に関しては報告されてきていない。開放反復回分系は、L乳酸産生を、はるかにより取り扱いやすくそしてエネルギー効率の優れたものにすると考えられる。一方、この系に用いる株は頑強である必要があり、特に光学的に非常に純粋な乳酸を産生するとの観点からは、開放反復中の汚染の可能性増加に抵抗するものでなければならない。なお、現在まで、細菌による乳酸の開放発酵産生に関して公表された論文は1報のみである前掲BioresourceTechnology10164946498。この論文の著者らは、乳酸菌であるLactobacilluscasiの株及び非乳酸菌であるBacillus属の株を用いている。しかし、彼らの報告においては、Bacillus属の株については、種々のデータ及び動力学パラメータが示されているが、96~984の光学純度を除いては、Lactobacillus属の株に関するデータには言及されていない。本発明者らの見解としては、ここでの乳酸濃度は低く、そしてまた残存グルコース濃度が高いようでありほとんどの場合、約30~50gLである、また、発酵時間が長く~3747時間、そして本発明者らのデータに比較して生産性が低い。本発明は、乳酸菌を用いた開放反復回分式の乳酸生産を初めて報告するものであり、また本発明の開放反復回分式の態様によれば、光学純度の高いL乳酸を、141gLhという高い生産速度で生産しうる。[バイオマス原料]本発明でバイオマスというときは、特に記載した場合を除き、再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたものをいう。本発明には、発生場所、現在の利用状況及び形態に制限されず、乳酸発酵のための原料として用いることができるあらゆるバイオマス原料を用いることができる。バイオマス原料の例は、さとうきび、米、とうもろこし、さつまいも、菜種、落花生、大豆、バカス、葉茎、稲わら、もみ殻、籾殻、麦わら、ゴルフ場などで大量に発生する刈芝、林地残材、間伐材、オイルパーム樹木、製材所の廃材、建設廃材、古紙、畜糞尿、屠場残渣、水産加工残渣、廃棄物として発生するバイオマス有機汚泥、パルプ廃液、食品加工残渣、使用済み食用油、生ごみ、下水汚泥、魚貝類、昆布類、植物プランクトンが含まれる。本発明で食用バイオマスというときは、特に記載した場合を除き、ヒト又は家畜食糧とすることもできるバイオマス原料をいう。食用バイオマスは、さとうきび、米、とうもろこし、さつまいもを含む。本発明で非食用バイオマスというときは、特に記載した場合を除き、食用以外のバイオマス原料をいう。本発明には、非食用バイオマス原料を適用することが好ましい。[用途]本発明を用いて産生したL乳酸は、ポリL乳酸の原料として用いることができる。また、ポリL乳酸とポリD乳酸とのステレオコンプレックスを製造するための原料として用いることができる。このようなステレオコンプレックスは、耐熱性が高い生分解性プラスチックとなり得る。光学的に純粋なL乳酸は、重合して繊維及び配向フィルムの製造に適した高結晶ポリマーになり、液晶の製造にも有用であると期待される。さらに、ポリL乳酸は現在、多数の医療用途に用いられている。例えば、縫合糸、ステント、透析媒体、及び薬物送達デバイスである。それは組織工学のための材料としても評価されつつある。それは生分解性であるのでバイオプラスチックの製造にも使用でき、ルーズフィルloosefillパッケージング、コンポストバッグ、食品パッケージング、及び使い捨て食器の製造に有用である。したがってポリL乳酸は、将来の持続的な社会システムにおいて使用するのに適切な資源リサイクル材料としての可能性をもつ。なお、本発明はL乳酸の生産に関するが、本明細書では便宜上、本発明による生産物を単に乳酸と表現している場合がある例えば、乳酸生産速度という場合、等。当業者であれば、文脈から、乳酸がL乳酸を指すものであることは適宜理解できる。分析法実施例全体を通じて、特に記載した場合を除き、下記の方法又はそれと同等の分析方法を用いた。細胞密度は、波長562nmにおける細胞懸濁液の光学濃度OD562を分光光度計UV1600可視光線分光光度計、Biospec、島津、日本、東京で測定することにより分析した。OD562対乾燥重量に関する予め決定した標準曲線から乾燥細胞重量を計算した。pHは、卓上pHメーターHM25Rで測定した。セロビオース及び発酵生成物は、SUGARSH1011カラムShodex、日本、東京を備えたHPLCUSHPLC1210、Jasco、日本、東京の使用により測定した。1mlの試料培養物を卓上遠心機Tomy、マイクロ遠心機、モデルMX300の使用により2000gで10分間、4°Cにおいて遠心した後、上清を超純水で希釈し、Dismic13HP045フィルターAdvantec、日本、東京で濾過し、次いで下記の条件下でクロマトグラフに注入した:カラム温度50°C、移動相としての流速10ml分の3mMHClO4、及び注入容量20μl。標準溶液から求めた検量曲線を用いて、残留糖類及び発酵生成物の濃度を計算した。乳酸の光学純度は、BF5バイオセンサー王子計測器、日本、兵庫により製造業者のプロトコルに従って測定した。発酵パラメーター実施例で評価した発酵パラメーターは、特に記載した場合を除き、以下のものであった。比増殖速度μ下記のように計算した。ここでxはOD562であり、tはサンプリング時間hである。消費された基質を基準とした乳酸の収率Y,gg消費された糖gLに対する生成した乳酸gLの比率として定義した。乳酸生産速度発酵時間hに対する生成した乳酸濃度gLの比率として計算した各サンプリング期間の間で計算。L乳酸の純度下記のように評価した。発酵の全糖類取込みqs及び比乳酸生産率qp次式により計算した。ここで△s及び△pはそれぞれ、期間△tにわたる糖濃度及び乳酸濃度の変化であり;χavは△tにわたる細胞密度の平均である。[培地]特に記載した場合を除き、mMRS培地を用いた。これは、下記のものを含有していたリットル当たり:10gのペプトンDifco、ミシガン州デトロイト、8gの牛肉エキスNacalaiTesque、日本、京都、4gの酵母エキスNacalaiTesque、2gのK2HPO4NacalaiTesque、5gのCH3COONa3H2ONacalaiTesque、2gのクエン酸三アンモニウムNacalaiTesque、02gのMgSO47H2ONacalaiTesque、005gのMnSO44H2ONacalaiTesque、1mlのTween80NacalaiTesque。特に示した場合を除き、リフレッシュ及び前培養のためには10gL1、主発酵のためには20gLのグルコースを含んでいた。また、場合により、DセロビオースSigma、グルコース、アラビノース等を所定の濃度で含んでいた。[実施例1:培養条件の検討]1材料及び方法QU25をこの研究に用いた。Aフラスコ培養1mlのグリセロール保存培養物を、15mlスクリューキャップ試験管に9mlのmMRS糖1[wtvol]を入れた試験管に接種し10[volvol]、30°Cで24時間インキュベートした。得られた培養物の一部を、200ml容フラスコ中の100mlのmMRSセロビオース2wtvol培地に接種し10[volvol]、30°Cで72時間培養した。培養開始時のpHは65であった。Bジャーファーメンター培養フラスコ培養の場合と同様にリフレッシュして得た培養物4mlを、同じ培地36mlを入れた50mlスクリューキャップ試験管中の新たな増殖培地へ移した。接種物を30°Cで8時間インキュベートした後、10[volvol]でジャーファーメンターへ接種した。発酵は、200rpmの撹拌速度で、1L容のジャーファーメンターBiott、日本、東京内において、種々の量の糖を補充したmMRSを用い、04Lスケールでただし、糖濃度150gL培養では02Lスケールで実施した。糖溶液を独立してオートクレーブ処理し、そして残りのmMRS培地と混合した。各サンプリング時点で5mlの培養物を無菌的に各ジャーから分離し、その後の分析のために20°Cで凍結した。乾燥細胞重量drycellweightDCW、残留糖類及び発酵生成物をアッセイした。最適pHを調べるために、発酵中に自動pH制御装置PHC2201、Biottに接続した蠕動ポンプで5MNaOHを添加することによりpHを制御し、及び制御せずに、アッセイを実施した。pHをそれぞれ55、60、65、70及び75に制御した。この菌株の発酵プロファイルを30°Cで24時間の増殖後に測定した。乳酸生産に対する温度の作用を調べるために、それぞれ30、37、43、45、47及び50°Cに制御した種々の温度で、5MNaOHの自動添加により70に設定したpH制御発酵においてアッセイを実施した。発酵はmMRSセロビオース20[wtvol]中で実施した。糖混合物の作用を、発酵培地に比率1:1のグルコースセロビオースをそれぞれ10、15及び20gLの濃度で補充することにより調べた。基質濃度の作用を、セロビオース濃度50、100g若しくは150gL、又はグルコース濃度150gLのmMRS培地を用いて調べた。発酵はいずれも、43°C、pH70に制御下10M又は15MのNaOHの自動添加で実施した。糖濃度150gLの培養では、酵母エキスを培養8時間、60時間、96時間の時点で、それぞれ1、025、025wtvolで補った。2結果Aタイムコース試験からの増殖及び乳酸産生プロファイルフラスコ培養によりタイムコース試験を実施して、pHを制御しない条件下でのQU25の増殖及び乳酸プロファイルを作成した。この回分発酵において、セロビオース消費の速度容量当たりはきわめて低速で起きた。DCW測定に基づくと、QU25は速やかに増殖し、約091gLで水平になった図1。21時間後にpHが485に落ちた。L乳酸の最大生産濃度は、60時間後、704gLであった。副生産物の生成はなかった。BpH制御条件下での乳酸発酵結果を下表に示した。HPLC分析により、本発酵はホモ乳酸発酵であり、わずかな量の酢酸の生成があったほかは、他の副生産物のピークは見られなかった。図2に、収率、光学純度及び最大生産速度を示した。pHを55~60に低く制御した場合、pH65~75にpH制御した場合に比較して、細胞増殖が明らかに阻害された。pH55~60では、セロビオース消費はきわめて低速で進行し、発酵の終了時まで枯渇しなかった。最大乳酸生産速度は、pHが高いほど大きく、pH70で21gLhと高い値が得られた。これはpH制御しない発酵で得られたものより4倍高い数値であった。表2に示した結果より、乳酸収率なども考慮した結果、最適pHは7であると考えられる。このpHではセロビオースの完全枯渇に要したのはわずか16~20時間であった。C種々の温度下での乳酸発酵結果を下表に示した。QU25は、乳酸産生及び乳酸収率に関して30~45°Cの広い温度範囲にわたって良好な生物活性を示した。43°Cにおいて、20時間の培養ですべてのセルビオースが消費された。しかし、乳酸濃度は30~43°Cでほぼ同じであったが、最大乳酸生産率は20°Cでの254gLhから43°Cでの344gLhまで、温度とともに上昇した。同様に、最大増殖速度も温度の上昇に伴って43°Cでの0675h1まで上昇した。細胞増殖は、高い温度ではセロビオース基質が枯渇した直後に死滅期に入り、一方、より低い温度では長い定常期を示した。45°Cを超える高い温度では、QU25は良好な細胞増殖も高い乳酸産生も示さなかった。したがって、最適温度は43°Cであると考えられる。Dグルコースセロビオース混合物からの乳酸発酵結果を下表に示した。図3に、グルコース及びセロビオース濃度が各10gLの場合の糖消費と乳酸生産を示した。QU25はセロビオースをグルコースと同じように消費し、発酵は6時間以内に終了た。糖消費速度は、グルコース及びセロビオースについてそれぞれ169gLh及び153gLhで、ほぼ類似していた。糖混合物に関して、高濃度の乳酸が高収率で生産された。これらのデータは、QU25が糖混合物を単一の炭素源と同じように同時利用することを示唆している。Eセロビオース濃度の影響結果を下表に示した。図4にセロビオース濃度が150gLである場合のプロファイルを示した。プロファイルは、基質濃度に伴って延長する発酵時間以外は、基質濃度が異なっても全般的に類似していた。興味深いことに、きわめて短い誘導期があり、その後、対数期においては細胞増殖速度は多かれ少なかれ同じであった。増殖挙動は、QU25の増殖に対する基質阻害作用がないことを示唆している。細胞増殖曲線は短い静止期を経過し、次いで死滅期に入った。50gLのセロビオースについて、発酵は20時間でほぼ完了したが、100gLを消費するにはさらに約50時間、150gLを消費するには約76時間を要した。また、150gLのグルコースについても150gLのセロビオースとほぼ同様の発酵プロファイルを示した。以上から、乳酸発酵における基質阻害作用は無視しうると結論できる。[実施例2:キシロースの影響]1方法培地として、前述の実施例において使用したmMRS培地において、糖としてキシロースを補充したものを用いた。キシロース濃度は、リフレッシュの際は10gLとした。また、pH制御及び温度の影響の検討の際には、ジャーファーメンター1L容のものを使用を用い、最終キシロース濃度は166mM25gLとした。また、334mM、480mM及び691mMの3つのレベルの最終キシロース濃度で発酵プロファイルを検討した。QU25の培養条件は、実施例1に準じた。2結果ApH制御及び温度の影響結果を下表に示した。30°Cでは、pH70で最も高い乳酸生産速度が観察された。pHを70とした場合には、30°C~43°Cの範囲においては、温度が上昇するに従い、乳酸生産速度が高くなった。QU25は、キシロースをよく消費し、またキシロース消費の観点からも、pH70、43°C付近での培養条件が適することが分かった。Bキシロース濃度の影響結果を下表及び図5に示した。334mM、480mM及び691mMの3つのレベルのキシロース濃度で発酵プロファイルを検討した。わずかな量の酢酸≦17mM、ギ酸≦13mM、及びエタノール≦34mMの生成が観察されたに過ぎなかった。この現象はC5糖からの野生株を用いた乳酸発酵としてはきわめて珍しく、C5糖から高効率で乳酸が得られることを示している。キシロース濃度が691mMでは、生産速度や収率が減じたデータ示さず。これは高い基質濃度による阻害によるものだと理解された。高い糖濃度で発酵を行うことは、経済的な観点からは望ましいが、QU25による乳酸生産における現実的なキシロース濃度は、691mMであると考えられた。[実施例3:発酵様式に与えるキシロース濃度の検討]当初の研究で、キシロース濃度がその発酵特性、すなわち乳酸などの生産物の割合に影響を与えていることが明らかとなっていたので、ここではその詳細を調べた。1方法最適発酵条件であるpH70、43°Cにおいて、キシロース濃度を変え、QU25の回分培養を行った。2結果結果を下表に示した。QU25は基質濃度によって発酵収率が変化することが明らかとなった。すなわち、キシロース低濃度下では、副産物が生成され、乳酸の収率は低くなるが、キシロース高濃度下では、酢酸やギ酸といった副産物はほとんど生産されず、乳酸の収率は高い値を示した。この結果より、QU25を用いて、キシロース高濃度仕込みから高濃度のl乳酸を副産物をほとんど伴わずに高収率で生産することができることが明らかとなった。[実施例4:セロオリゴ糖の資化性試験]1方法培地として、前述の実施例において使用したmMRS培地において、糖としてセロオリゴ糖Cellotriose423gL、Cellotetraose267gL、又はCellopentose364gLを用いた。QU25は、mMRScellobiose培地で培養したものを、10接種することにより培養を開始した。培養は、43oC、初発pH70で行った。2結果結果を下表に示した。Mediumcomponentsは糖源なしの培地を用いた系、μmaxは最大比増殖速度、Xmaxは最大菌体量を表す。上表に示すように、セロトリオースC6三糖、セロテトラロースC6四糖及びセロペントースC6五糖を用いて資化性試験を行った結果、セロトリオース及びセロテトラロースから、約100の収率でl乳酸光学純度、100を生産した。QU25は、セロオリゴ糖を効率よく代謝し、l乳酸を生産することが示された。実施例4アラビノースの資化性実験QU25株の、キシロースと同様のペントースであるアラビノースの発酵特性について検討した。41アラビノースから乳酸生産に及ぼすpHの影響方法培地として、mMRSにアラビノースを添加したものを用いた。培地に、mMRSアラビノース培地で培養した増殖期にあるQU25を10接種し、43°Cで、培養開始時のpH70でその後は制御せず、又はpH60、65、70若しくは75に制御10M又は15MのNaOHの自動添加によるして、培養した。結果結果を下表に示した。pHを制御せず、43°Cで培養した結果、アラビノースを約46mM資化して約72mMの乳酸を生産した。乳酸収率は157molmolであった。この高い乳酸収率は、PP解糖系経路を経由する最大理論収率167molmolに近い結果となった。また、ギ酸、酢酸などの副産物が少ないことから、低コストで乳酸精製を行うことができると考えられる。pH60で制御しながら培養すると、副産物が最も少なく、約193mMの乳酸を生産した。このときの乳酸収率は、144molmolであった。最大菌体量は、pH65から75までで得られた量より少なかった。一方、pH65で培養した結果、乳酸生産量は、224mMであり、最も高かったが、同時に高い濃度の副産物も生産された。さらに、pH70以上での培養では、副産物の産生が多くなり、乳酸収率が大きく低下した。このような観点から、pH60又は65に制御するとよいと考えられる。42アラビノース濃度の検討方法41と同様、mMRSアラビノース培地で培養した増殖期にあるQU25を10接種し、43°Cで、pHを65又は60に制御して培養した。培地のアラビノース濃度は、1076、19955、20214、326、47702、60693mMとした。結果pHを65に制御した場合の結果を下表に示した。pH65で培養を行った結果、初発濃度6069mMのアラビノースから763mMの乳酸を生産した。副産物を生産せず、乳酸の対アラビノース収率は129molmolであった。しかしながら、326mM以下のアラビノース濃度では、副産物が生産された。主に、ギ酸が副生されたことから、PP解糖系経路がアラビノースの主な代謝経路であることを示唆された。この結果から、QU25株での代謝とその制御は同じペントースであるキシロースとアラビノースでは異なることが予想される。pH60で培養を行った結果を下表に示した。初発濃度3294mMのアラビノースから44514mMの乳酸を生産した。副産物を生産せず、139molmolの収率であった。しかし、より高いアラビノース濃度329mMでは、基質阻害により、アラビノース消費と乳酸生産の両方に著しい減少が見られた。Table25のpH65での培養挙動と明らかに異なるものであり、60と65という僅かに異なるpH制御値によって大きく代謝が変化する興味深い発酵現象であった。実施例5糖混合物からの乳酸生産Aグルコースキシロース混合物グルコースキシロースの重量比21の混合物からの乳酸発酵について検討した。発酵はいずれも、43°C、pH70に制御下10M又は15MのNaOHの自動添加で実施した。結果を下表に示した。また、初発グルコース濃度40gLにおける培養結果を図7に示した。QU25は、いずれの濃度においても、同じように糖を消費した。副産物はなく、光学純度も高かった。Bグルコースキシロースセロビオース混合物本実施例のAと同様に、ただしさらにセロビオースを添加して、混合物からの乳酸発酵について検討した。結果を図8に示した。グルコース及びセロビオースが迅速に消費された。有力なセルラーゼインヒビターでもあるセロビオースの迅速な消費は、セルロースやヘミセルロースを多く含むバイオマスからの商業的な乳酸生産において、非常に有利であると考えられる。また、キシロースのみを炭素源として、低い濃度25gL用いた場合には、少量の副産物の生成がみられたが、他の糖と混合して用いた場合には、副産物の生成が顕著に減少した図9。実施例6QU25による非滅菌反復発酵]本発明者らの検討によると、他の乳酸菌と比較して、QU25は熱耐性株であり、非滅菌発酵において使用可能であることが分かっている。本実施例では、QU25を用いて、非滅菌条件下で、反復回分発酵を試みた。方法リフレッシュし、そして前培養MRS-20gLグルコースしたQU25を、43°Cで、培養した。pHは70に制御した。中和には、1~7回分に関しては、10NNaOH、8~12回分に関しては、15NNaOHを用いた。12回分すべてで、培地を滅菌しなかった。各回分実行周期終了時に遠心分離によって細胞を収集し、そして次の回分実行に10接種したが、例外として、回分6では接種は14とした。開放反復発酵を12周期行った。周期1~10、及び12は回分培養であり;周期11のみ流加培養とした。各回分の培養時間は、培養条件次第で多様であった。最初の5回の実行では、100gLグルコースを含むmMRS培地を用いて、L-乳酸産生に対する回分反復の影響を調べた。回分6では、14より高い細胞密度を用いて、最初の5回の回分で用いたのと同じ栄養が、より高い初期細胞密度の増殖を補助しうるかどうかを試験した。回分7~10では、5、10、及び各実行で言及するような多様なグルコース濃度を用いることによって、栄養必要条件を研究した。回分11では、流加回分を行って、より高い基質濃度を用いた。回分12では、混合糖発酵を行った。2結果結果を下表に示した。最初の6回分では、乳酸生産性は、細胞密度が増加するにつれて次第に増加した図10。乳酸生産性は、第一の回分の221gL時間から、回分番号6の141gL時間まで有意に増加した。乳酸収率は~80でほぼ同じであった上表。回分7では、5gLの酵母エキスのみmMRS培地の4gL酵母エキス10gLペプトン8gL牛肉エキスの代わりにを用いることによって、乳酸産生及び生産性に対する栄養条件の影響を研究した。興味深いことに、初期細胞密度が先の回分すなわち回分4~6より低いにもかかわらず、先の回分と同じ収率で、わずかにより高いレベルの乳酸が産生された図12。さらに興味深いことに、先の回分と同じ培地5gLの酵母エキスのみを添加とともに、より高い濃度の基質を添加することによって回分8、乳酸収率及び産生レベルが改善された。対照的に、乳酸生産性は有意に半分まで減少したすなわち1061gLh~529gLh上表及び図13。回分9において、同じ初期グルコース濃度130gLで、10gLの酵母エキス5gLの代わりにを用いた。乳酸濃度、収率、及び生産性がわずかに改善されることが見出された上表。窒素供給源として少量の酵母エキスのみ5gLを用いた場合、発酵中に細胞密度が次第に減少する一方、MRS培地の4gL酵母エキス10gLペプトン8gL牛肉エキスでは、細胞密度が増加することがわかった図11。回分10において、130gLグルコースを含むMRSを用いた。すべての発酵パラメータが増加した上表。090ggの収率及び819gLhの高い生産性で、1147gLの乳酸を得ることができた図13。発酵様式を周期実行番号11で流加培養に変更した。それぞれ、774gLh及び085ggの高い生産性及び収率で、1445gLグルコースから1316gLの乳酸を得ることができた図14。最後に、当モル比で、混合糖グルコース及びキシロースを用いた。興味深いことに、乳酸は、082ggの高収率及び464gLhの高生産性で、ホモ発酵的に産生された。乳酸の光学純度は、すべての培養区で高く維持された≧99上表。本実施例のデータは、光学的に純粋な乳酸産生に関する、乳酸菌を用いた反復開放回分の能力を立証する最初の報告である。QU25を用いた開放反復回分は、発酵能のいかなる喪失も伴わずに、12周期に関して、成功裡に実行された。"