"式I式中、nは1~7の整数を表す。で表される化合物またはその塩を含有する抗菌剤。式Iで表される化合物が、式IIで表される化合物である、請求項1に記載の抗菌剤。上記状況において、ストレプトスリシンに対し、原核細胞に対する抗生物質活性を失わせることなく、真核細胞に対する抗生物質活性すなわち、毒性を低減することができる活性を有する酵素、原核細胞に対する抗生物質活性を保持しつつ真核細胞に対する毒性が低減されたストレプトスリシン誘導体およびその製造方法などが望まれていた。本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が、ストレプトスリシンのラクタムを開環させる活性を有することを見出した。さらに、該酵素によってラクタムが開環されたストレプトスリシンDの誘導体STDacidが、原核細胞に対する抗生物質活性を保持しつつ真核細胞に対する毒性が低減されていることを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、1以下の~のいずれかに記載のポリヌクレオチド:配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16に記載のアミノ酸配列に対して60以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、2以下の~のいずれかである上記1に記載のポリヌクレオチド:配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16に記載のアミノ酸配列または配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16のアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16に記載のアミノ酸配列に対して90以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、3配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記1に記載のポリヌクレオチド、4配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記1に記載のポリヌクレオチド、5DNAである、上記1~4のいずれかに記載のポリヌクレオチド、6上記1~5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質、7配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16に記載のアミノ酸配列からなる上記6に記載のタンパク質。8配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなる上記7に記載のタンパク質。9上記1~5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、10上記9に記載の組換えベクターが導入された形質転換体、11上記10に記載の形質転換体を培養し、上記6に記載のタンパク質を生成させる工程を含む、上記6に記載のタンパク質の製造方法、12上記6に記載のタンパク質を用いてラクタムを開環する工程を含む、ラクタムが開環したストレプトスリシン誘導体またはその塩の製造方法、13ラクタムが開環したストレプトスリシン誘導体が、式I式中、nは1~7の整数を表す。で表される化合物である、上記12に記載の製造方法、14式Iで表される化合物が、式IIで表される化合物である、上記13に記載の製造方法、15式IIで表される化合物またはその塩を含有する抗菌剤などを提供する。本発明のタンパク質は、ストレプトスリシンのラクタムを開環させることにより、原核細胞に対する抗生物質活性を失わせることなく真核細胞に対する抗生物質活性すなわち、毒性を低減させることができるので、臨床開発可能な、または創薬におけるリード化合物にできるストレプトスリシン誘導体の製造に使用することができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、ストレプトスリシンに対する耐性を真核細胞例えば、酵母に付与することができるので、抗生物質耐性マーカー遺伝子として、組換えDNA技術に好適に使用することができる。さらに、STDacidは、原核細胞に対する抗生物質活性を保持しつつ真核細胞に対する抗生物質活性すなわち、毒性が低減されているので、臨床開発可能な抗菌剤として、または、そのような抗菌剤の創薬におけるリード化合物として使用することができる。以下、本発明をさらに詳細に説明する。本発明者らは、ストレプトスリシンST非産生菌株と考えられているStreptomycesalbulusNBRC14147からの、新たな機序を示すST耐性付与遺伝子sttHの単離に成功した。SttHのinvivoおよびinvitroでの分析により、この酵素がstreptolidineラクタムのアミド結合の加水分解を触媒することにより、ST耐性が付与されることが証明された。興味深いことに、STFβリジン残基1個では、SttHの作用により原核細胞と真核細胞酵母の両方に対する毒性が失われるが、3個のβリジン残基をもつSTDの選択毒性は、streptolidinelactamの加水分解により広域性から細菌特異性に変換する。STは哺乳類に毒性を示すことから、臨床開発されたことはない。しかし、本研究において、SttHにより加水分解され、ラクタムが開環されたSTDSTDacidと称することがあるは、真核細胞に対する毒性が減少しても、依然として強い抗菌活性を示すことが明らかにされ、STDacidを臨床開発できる、または創薬における新たなリード化合物にできる可能性が示唆された。さらに、sttH遺伝子と組み合わせたSTDの使用は、酵母などの真核細胞を用いる組換えDNA技術における非常に有力な手法となると考えられる。本発明は、これらの知見に基づき、ストレプトスリシンSTの原核細胞に対する抗生物質活性を失わせることなく真核細胞に対する抗生物質活性すなわち、毒性を低減させることができるタンパク質新規ラクタム開環酵素、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含有するベクター、当該ベクターまたはポリヌクレオチドが導入された形質転換体、当該形質転換体を用いる当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いる原核細胞に対する抗生物質活性を保持しつつ真核細胞に対する抗生物質活性すなわち、毒性が低減されたストレプトスリシン誘導体の製造方法、STDacidを含有する抗菌剤などを提供するものである。1.本発明のポリヌクレオチド本明細書中、配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドをsttH遺伝子と称することがある。まず、本発明は、配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド具体的には、DNA、以下、これらを単にDNAとも称する;及び配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のStreptomycesalbulusNBRC14147由来の新規ラクタム開環酵素をコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつラクタム開環活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16のアミノ酸配列において、例えば、1~100個、1~70個、1~50個、1~30個、1~15個、1~10個、1~9個、1~8個、1~7個、1~6個1~数個、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクタム開環活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および/または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16のアミノ酸配列と約80以上、85以上、88以上、90以上、92以上、95以上、97以上、98以上、99以上、993以上、995以上、997以上、998以上、999以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつラクタム開環活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、BLAST例えば、AltzshulSFetalJMolBiol215403、など参照やFASTAPearsonWRMethodsinEnzymology18363、など参照等の解析プログラムを用いて決定できる。BLASTまたはFASTAを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。ここで、ラクタム開環活性は、通常の方法またはそれに準じた方法によって、例えば、後述の実施例に記載の方法によって測定することができる。本発明におけるラクタム開環活性は、より具体的にはストレプトスリシンのラクタムを開環する活性であり、さらに具体的には、ストレプトスリシンのstreptolidineラクタムを開環する活性である。ラクタムの開環は、具体的には、加水分解によって行われる。また、本発明は、配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドDNAとは、配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAまたは配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16に記載のアミノ酸配列をコードするDNAの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAをいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0.7~1.0mol/LのNaCl存在下、65°Cでハイブリダイゼーションを行った後、0.1~2倍濃度のSSCSalinesodiumcitrate溶液1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mmol/L塩化ナトリウム、15mmol/Lクエン酸ナトリウムよりなるを用い、65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、SambrookJetalMolecularCloningALaboratoryManualThirdEditionColdSpringHarborLaboratoryPress以下、モレキュラークローニング第3版と略す、AusbelFMetalCurrentProtocolsinMolecularBiologySupplement1~38JohnWileyandSons、GloverDMandHamesBDDNACloning1CoreTechniquesApracticalApproachSecondEditionOxfordUniversityPress等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。本明細書でいうストリンジェントな条件は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。低ストリンジェントな条件は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、05SDS、50ホルムアミド、32°Cの条件である。また、中ストリンジェントな条件は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、05SDS、50ホルムアミド、42°Cの条件である。高ストリンジェントな条件は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、05SDS、50ホルムアミド、50°Cの条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphosDirectLabellingReagentsアマシャムファルマシア社製を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55°Cの条件下で01SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号:2、4、6、8、10、12、14または16に記載のアミノ酸配列をコードするDNAと約80以上、85以上、88以上、90以上、92以上、95以上、97以上、98以上、99以上、993以上、995以上、997以上、998以上、999以上の同一性を有するDNAをあげることができる。あるアミノ酸配列に対して、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異導入法例えば、GotohTetalGene152271275、ZollerMJandSmithMMethodsEnzymol100468500、KramerWetalNucleicAcidsRes1294419456、KramerWandFritzHJMethodsEnzymol154350367、KunkelTAProcNatlAcadSciUSA82488492、KunkelMethodsEnzymol8527632766、など参照、アンバー変異を利用する方法例えば、Gappedduplex法、NucleicAcidsRes1294419456、など参照などを用いることにより得ることができる。また目的の変異欠失、付加、置換および/または挿入を導入した配列をそれぞれの5’端に持つ1組のプライマーを用いたPCR例えば、HoSNetalGene7751、など参照によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。また欠失変異体の一種であるタンパク質の部分断片をコードするポリヌクレオチドは、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド中の作製したい部分断片をコードする領域の5’端の塩基配列と一致する配列を有するオリゴヌクレオチドおよび3’端の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型にしたPCRを行うことにより取得できる。本発明のポリヌクレオチドとしては、具体的には、上記a~fのいずれかに記載のポリヌクレオチドがあげられる。本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16に記載のアミノ酸配列または配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16のアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16に記載のアミノ酸配列に対して90以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;および配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクタム開環活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドが好ましく、さらに、配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドおよび配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドが好ましい。なかでも、コードされるタンパク質のラクタム開環活性の点で、配列番号:2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドおよび配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドが好ましい。2.本発明のタンパク質本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質も提供する。より具体的には、上記ポリヌクレオチドa~iのいずれかにコードされるタンパク質であり、好ましくは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつラクタム開環活性を有するタンパク質であり、より好ましくは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。なかでも、ラクタム開環活性の点で、配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつラクタム開環活性を有するタンパク質としては、配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16に記載のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクタム開環活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号:2、4、6、8、10、12、14もしくは16に記載のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつラクタム開環活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、モレキュラークローニング第3版、カレントプロトコールズインモレキュラーバイオロジー、NucAcidsRes106487、ProcNatlAcadSciUSA796409、Gene34315、NucAcidsRes134431、ProcNatlAcadSciUSA82488等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および/または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び/又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2アミノブタン酸、メチオニン、oメチルセリン、tブチルグリシン、tブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン;B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2アミノアジピン酸、2アミノスベリン酸;C群:アスパラギン、グルタミン;D群:リジン、アルギニン、オルニチン、24ジアミノブタン酸、23ジアミノプロピオン酸;E群:プロリン、3ヒドロキシプロリン、4ヒドロキシプロリン;F群:セリン、スレオニン、ホモセリン;G群:フェニルアラニン、チロシン。また、本発明のタンパク質は、Fmoc法フルオレニルメチルオキシカルボニル法、tBoc法tブチルオキシカルボニル法等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。3.本発明の組換えベクター及び形質転換体さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドDNAを含有する組換えベクター及び形質転換体を提供する。本発明の組換えベクターは、上記a~iのいずれかに記載のポリヌクレオチドDNAを含有する。本発明の形質転換体には、本発明の組換えベクターが、本発明のポリヌクレオチドDNAが発現可能なように導入されている。1組換えベクターの作成本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチドDNAを連結することにより得ることができる。より具体的には、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド例えばpBR322pBR325pUC118pUC119等、枯草菌由来のプラスミド例えばpUB110pTP5等、酵母由来のプラスミド例えばYEp13YEp24YCp50等などがあげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージなどがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス例えば、バキュロウイルスなどなどがあげられる。本発明のポリヌクレオチドは、通常、適当なベクター中のプロモーターの下流に、発現可能なように連結される。用いられるプロモーターとしては、形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Trpプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH1プロモーター、GALプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。本発明の組換えベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列SD配列、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがあげられる。2形質転換体の作成このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチドすなわち、本発明のタンパク質をコードするDNAを含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒアコリなどがあげられる。シュードモナス属菌としては、例えば、シュードモナスプチダなどがあげられる。リゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウムメリロティなどがあげられる。酵母としては、例えば、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベなどがあげられる。動物細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21などがあげられる。組換えベクターの宿主への導入方法およびこれによる形質転換方法は、一般的な各種方法によって行うことができる。組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、例えば、例えばリン酸カルシウム法Virology52456457、リポフェクション法ProcNatlAcadSciUSA847413、エレクトロポレーション法EMBOJ1841845などがあげられる。エシェリヒア属菌の形質転換方法としては、例えば、ProcNatlAcadSciUSA692110、Gene17107などに記載の方法などがあげられる。バチルス属菌の形質転換方法としては、例えば、MolecularGeneralGenetics,168111に記載の方法などがあげられる。酵母の形質転換方法としては、例えば、ProcNatlAcadSciUSA751929に記載の方法などがあげられる。動物細胞の形質転換方法としては、例えば、Virology52456に記載の方法などがあげられる。昆虫細胞の形質転換方法としては、例えば、BioTechnology64755に記載の方法などがあげられる。このようにして、本発明のタンパク質をコードするDNAを含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。4.本発明のタンパク質の製造また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明のタンパク質を生成させる工程を含む、本発明のタンパク質の製造方法を提供する。本発明のタンパク質は、前記形質転換体を本発明のタンパク質をコードするDNAが発現可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質を生成蓄積させ、分離精製することによって製造することができる。形質転換体の培養本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明のタンパク質が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明のタンパク質が蓄積される。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピルβDチオガラクトピラノシドなどを、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15~43°Cで約3~24時間行い、必要により、通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30~40°Cで約6~24時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、たとえばバークホールダーBurkholder最小培地ProcNatlAcadSciUSA774505や05カザミノ酸を含有するSD培地ProcNatlAcadSciUSA815330があげられる。培地のpHは約5~8に調整するのが好ましい。培養は通常約20°C~35°Cで約24~72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する培地としては、たとえば約5~20の胎児牛血清を含むMEM培地Science122501,DMEM培地Virology8396などが用いられる。pHは約6~8であるのが好ましい。培養は通常約30°C~40°Cで約15~60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する培地としては、GracesInsectMediumNature195788に非働化した10ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2~6.4に調整するのが好ましい。培養は通常約27°Cで約3~5日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。本発明のタンパク質の分離精製上記培養物から、本発明のタンパク質を分離精製することによって、本発明のタンパク質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のタンパク質の分離精製は、通常の方法に従って行うことができる。具体的には、本発明のタンパク質が培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解などで菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法例えば、遠心分離、ろ過などにより本発明のタンパク質の粗抽出液を得ることができる。本発明のタンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法例えば、遠心分離、ろ過などにより菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明のタンパク質を含む培養上清を得ることができる。このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、通常の分離精製方法に従って行うことができる。分離精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。5.ラクタムが開環したストレプトスリシン誘導体の製造さらに、本発明は、本発明のタンパク質を用いてラクタムを開環する工程を含む、ラクタムが開環したストレプトスリシン誘導体STacidと称することがある。の製造方法を提供する。本発明のタンパク質は、ストレプトスリシンのラクタムを開環する活性を有するので、本発明のタンパク質を用いることにより、ストレプトスリシンを原料として、ラクタムが開環したストレプトスリシン誘導体を製造することができる。以下、下記反応式1に従って、本発明のラクタムが開環したストレプトスリシン誘導体の製造方法について説明する。[反応式1]式中、nは1~7の整数を表す。化合物IIIは、原料となるストレプトスリシンであり、β-リシン側鎖の長さが異なるストレプトスリシンXn=7、An=6、Bn=5、Cn=4、Dn=3、En=2、Fn=1が知られている。ストレプトスリシンすなわち、化合物IIIは、市販されているか、文献記載の方法文献1,梅沢濱夫、竹内富雄、黒須英二、JAntibiot3232235;文献2,TaniyamHSawadsYKitagawaTJAntibiot24390392;文献3,MiyashiroSAndoTHirayamaKKidaTShibaiHMuraiAShiioTUdakaSJAntibiot3616381643;文献4,AndoTMiyashiroSHirayamaKKidaTShibaiHMuraiAUdakaSJAntibiot4011401145に従って得ることができる。反応に用いられる溶媒としては、リン酸ナトリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液があげられる。反応液のpHは、通常約4.5~8.0、好ましくは約6.0~8.0、より好ましくは約6.5である。反応温度は、通常約25~65°C、好ましくは約35~65°C、より好ましくは約45°Cである。反応時間は、通常30分~2時間程度であるが、反応速度などに応じて適宜設定することができる。上記の反応によって生成された化合物Iは、逆相高速液体クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、抽出などの通常用いられる方法によって単離精製することができる。このようにして得られた化合物Iが遊離体で得られた場合には、通常の方法によって塩に変換することができる。逆に、化合物Iが塩で得られた場合には、通常の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。このような塩としては、生理学的に許容される酸例えば、無機酸、有機酸などや塩基例えば、アルカリ金属などなどとの塩が好ましい。無機酸との塩としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸などとの塩があげられる。有機酸との塩としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、グルコン酸、酒石酸、乳酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アジピン酸、プロピオン酸、ソルビン酸、安息香酸、アスコルビン酸などとの塩があげられる。塩基との塩としては、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩などがあげられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩との塩;カルシウム、マグネシウム、バリウムなどのアルカリ土類金属との塩;アルミニウム塩などがあげられる。有機塩基との塩としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N-ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩があげられる。6.本発明のストレプトスリシン誘導体を含有する抗菌剤また、本発明は、ラクタムが開環されたストレプトスリシンDの誘導体STDacidまたはその塩などの、本発明のストレプトスリシン誘導体またはその塩を含有する抗菌剤を提供する。上記の製造方法によって製造することができるラクタムが開環されたストレプトスリシンD誘導体STDacidまたはその塩などは、真核細胞に対する抗生物質活性すなわち、毒性は低減されているが、原核細胞に対する抗生物質活性は保持している。したがって、ヒトを含む哺乳動物例、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシなど、鳥類、は虫類などの真核生物に対して安全に使用しうる抗菌剤として使用することができる。本発明の抗菌剤に用いられる、ラクタムが開環されたストレプトスリシン誘導体としては、原核細胞に対する抗生物質活性の点で、ラクタムが開環されたストレプトスリシンD誘導体STDacid、すなわち、上記式IIで表される化合物が好ましい。本発明のラクタムが開環されたストレプトスリシン誘導体が抗菌活性を示す原核生物例、細菌などとしては、大腸菌などのグラム陰性菌;結核菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌などの病原性細菌などがあげられる。本発明のラクタムが開環されたストレプトスリシン誘導体またはその塩を上述の抗菌剤として使用する場合、通常の方法によって実施することができる。具体的には、例えば、以下に記載するようにして実施することができる。本発明のラクタムが開環されたストレプトスリシン誘導体またはその塩を抗菌剤として使用する場合には、それ自体または医薬組成物として、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由で投与することができるが、経口的に投与するのが好ましい。経口投与のための医薬組成物としては、錠剤糖衣錠、コーティング錠、有核錠、舌下錠、口腔内貼付錠、口腔内崩壊錠を含む、丸剤、カプセル剤ハードカプセル、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む、散剤、顆粒剤、細粒剤、トローチ剤、液剤シロップ剤、乳剤、懸濁剤を含むなどが挙げられる。非経口投与のための医薬組成物としては、注射剤、クリーム剤、軟膏剤、坐剤などが挙げられる。このような医薬組成物は、例えば、生理学的に許容される賦形剤、担体などと混合し、常法に従って製造することができる。生理学的に許容される賦形剤、担体などとしては、例えば、固形製剤における賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤;液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、緩衝剤、増粘剤、乳化剤などがあげられる。また、必要に応じて、着色剤、甘味剤、抗酸化剤などの製剤添加剤も用いることができる。賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、D-マンニトール、D-ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース例えば、微結晶セルロースなど、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、デキストリン、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、マクロゴール、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、D-マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロースHPC、ヒドロキシプロピルメチルセルロースHPMC、ポリビニルピロリドンPVPなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、架橋ポリビニルピロリドン、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、陽イオン交換樹脂、部分α化でんぷん、トウモロコシデンプンなどがあげられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ワックス類、コロイドシリカ、DL-ロイシン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、マクロゴール、エアロジルなどがあげられる。溶剤としては、例えば、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、中鎖脂肪酸トリグリセリドMCT、植物油例えば、サフラワー油、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、大豆レシチンなどなどがあげられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D-マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどがあげられる。懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤;例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子;ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などがあげられる。緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などがあげられる。増粘剤としては、例えば、天然ガム類、セルロース誘導体などがあげられる。乳化剤としては、例えば、脂肪酸エステル類例えば、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルなど、ワックス例えば、ミツロウ、菜種水素添加油、サフラワー水素添加油、パーム水素添加油、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、ブラシカステロール、カカオ脂粉末、カルナウバロウ、ライスワックス、モクロウ、パラフィンなど、レシチン例えば、卵黄レシチン、大豆レシチンなどなどがあげられる。着色剤としては、例えば、水溶性食用タール色素例、食用赤色2号および3号、食用黄色4号および5号、食用青色1号および2号などの食用色素、水不溶性レーキ色素例、前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など、天然色素例、β-カロチン、クロロフィル、ベンガラなどなどがあげられる。甘味剤としては、例えば、ショ糖、乳糖、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどがあげられる。抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸及びそれらのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩などがあげられる。錠剤、顆粒剤、細粒剤などに関しては、味のマスキング、光安定性の向上、外観の向上あるいは腸溶性などの目的のため、コーティング基材を用いて通常の方法でコーティングしてもよい。そのコーティング基剤としては、糖衣基剤、水溶性フィルムコーティング基材、腸溶性フィルムコーティング基材などがあげられる。糖衣基剤としては、例えば、白糖があげられ、さらにタルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、カルナバロウなどから選ばれる1種または2種以上を併用してもよい。水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースHPC、ヒドロキシプロピルメチルセルロースHPMC、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース系高分子;ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーEオイドラギットE登録商標ポリビニルピロリドンなどの合成高分子;プルランなどの多糖類などがあげられる。腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどのセルロース系高分子;メタアクリル酸コポリマーLオイドラギットL登録商標、メタアクリル酸コポリマーLDオイドラギットL-30D55登録商標メタアクリル酸コポリマーSオイドラギットS登録商標などのアクリル酸系高分子;セラックなどの天然物などがあげられる。これらのコーティング基剤は、単独で、または2種以上を適宜の割合で混合してコーティングしてもよく、また2種以上を順次コーティングしてもよい。本発明の抗菌剤における本発明のラクタムが開環されたストレプトスリシン誘導体またはその塩の含有量は、通常0.01重量~100重量、好ましくは1~99重量である。本発明のラクタムが開環されたストレプトスリシン誘導体またはその塩の投与量は、抗菌作用の有効量の範囲内であればよく、対象疾患、投与対象、投与方法、症状などによっても異なるが、通常、体重1kg当たり、1日につき、約0.001~約1000mgである。より具体的には、例えば、前記したような病原性細菌に感染した患者に、経口的に投与する場合、体重1kg当たり、1日につき、本発明のラクタムが開環されたストレプトスリシン誘導体を約0.01~100mg、好ましくは0.05~50mg、より好ましくは、0.1~10mg投与する。非経口的に投与する場合、体重1kg当たり、1日につき、本発明のラクタムが開環されたストレプトスリシン誘導体を約0.001~50mg、好ましくは0.005~20mg、より好ましくは、0.01~10mg投与する。以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。[材料と方法]まず、本発明で用いた材料、実験方法について説明する。1化学薬品ストレプトスリシンSTクローンNAT、STFとSTDの混合物;STFとSTDの割合は約5:1はWERNERBioAgentsMeisenweg、イェナ、ドイツから入手した。その他すべての試薬は分析用特級とした。2細菌株、プラスミド、DNA操作の一般的手法SalbulusNBRC14147のDNAをsttH遺伝子のクローニングに使用した。SalbulusNBRC14147の培地と生育条件は以前報告したとおりであるTakagiHHoshinoYNakamoriSInouyeSJBiosciBioeng899496。Ecoli-StreptomycesシャトルベクターであるpWHM3KieserTBibbMJButtnerMJChaterKFHopwoodDAPracticalStreptomycesGeneticsとSlividansTK23KieserTBibbMJButtnerMJChaterKFHopwoodDAPracticalStreptomycesGeneticsをsttH遺伝子のクローニングに使用した。ST産生株として、SlavendulaeNBRC12789を使用した。STに対するNATをコードするnat遺伝子は、pHN15プラスミドWERNERBioAgentsから切り出した。pQE30プラスミド、EcoliM15pREP4Qiagen、およびEcoliXL1BlueMRFPracticalStreptomycesGeneticsSambrookJRussellDWMolecularCloningALaboratoryManual。サザンブロット分析はECL直接核酸標識検出システムAmershamBioscience、ニュージャージー州ピスカタウェイを用いて行った。ScerevisiaeにおけるsttHとnat遺伝子の発現には、ScerevisiaeCKY8菌株MATMethodsEnzymol194321またはYPD培地ShermanFMethodsEnzymol194321で生育させた。STおよびSTacidの最小発育阻止濃度MIC試験では、微生物としてScerevisiaeS288CCKY8菌株と同じ遺伝子背景のもの、SpombeL972、EcoliW3110、BsubtilisNBRC13169、SaureusAB、およびSaureusFIR1169IgarashiHFujikawaHUsamiHKawabataSMoritaTInfectImmun44175181を使用した。3Streptomyces菌株のN-アセチルトランスフェラーゼNATをコードする遺伝子のPCR増幅SlavendulaeHorinouchiSFuruyaKNishiyamaMSuzukiHBeppuTJBacteriol16919291937、SrocheiFernandezMorenoMAVallinCMalpartidaFJBacteriol17969296936、SnourseiKrugelHFiedlerGHauptISarfertESimonHGene62209217GrammelNPankevychKDemydchukJLambrechtKSaluzHPKrugelHEurJBiochem269347357の高度に保存されたNATのアミノ酸配列に基づいて、5GAGCATCGAGCTGA3GTTGTACTCAGCCA3PracticalStreptomycesGeneticsMolecularCloningALaboratoryManual上で決定した。6SttHの組換え酵素rSttHにより生成されたSTFおよびSTD由来化合物の同定とrSttHの速度反応試験反応速度論的解析製造者Qiagenのプロトコルに従って、反応液500μLは、リン酸ナトリウム緩衝液100mMpH65、STFまたはSTD1mgmL、pQE30SHF6Rを保有するEcoliM15pREP4から精製したrSttH100μgmLを用いて作製した。反応液をrSttHとともに、またはrSttHを添加せずに、30°Cで1時間反応させた後、タンパク質除去のためのクロロフォルム抽出を行った。イオン対試薬を用いた逆相HPLCにより水層を分析した。分析条件は、カラム、C18逆相カラム[COSMOSIL5C18ARII250×46mmナカライテスク、日本、京都府];カラム温度、30°C;検出、210nm;流速、1mL分、とした。ヘプタフルオロ酪酸01アセトニトリル18STF反応用、およびヘプタフルオロ酪酸01アセトニトリル23STD反応用の、2つの異なる移動相を使用した。反応速度試験は、安定状態の反応速度パラメータの測定に適合させるために酵素濃度2μgmLと反応時間5分を減少させた以外は、上述と同様の条件で実施した。全試験は直線性の範囲内で実施した。2NHClを15μl添加して反応を終了させたあとに、HPLCを用いて分析した。ラインウィーバーバークプロットを用いて反応速度定数を推定した。硫酸ナトリウム100mMを含むリン酸ナトリウム緩衝液20mMpH70で緩衝化したCOSMOSIL5Diol30078mm×600mmカラムナカライテスクを用いたゲルろ過により、rSttHのネイティブの分子量を推定した。7ST化合物STおよびST由来化合物の精製逆相HPLCにより、カラムサイズ250×10mm、流速472mLmin、アセトニトリル濃度25以外は基本的に上述と同様の条件で、市販のSTからSTFおよびSTDを精製した。HPLC分画から有機溶媒を除去後、水相を凍結乾燥して化合物の白色粉末を作製した。酵素的に合成したSTFacidおよびSTDacidを、STFおよびSTDの精製について記した手順と同様の手順で精製した。8STFacidおよびSTDacidの構造決定FinniganMATTSQ7000四重極型タンデム質量分析計を用いてST化合物のESIMSMSスペクトルを算出した。STFacidおよびSTDacidの1HNMRスペクトルデータは、JEOLLNMLA500分光計を用いて500MHzで記録した。STFacid1HNMRδ160251262286294308349355398399405414431459495STDacid1HNMRδ1431511602402432482502532572852862943053083453483543983994064144314584949sttH遺伝子またはnat遺伝子を過剰発現するEcoliおよびScerevisiae菌株のSTD耐性プロフィールの検討nat遺伝子を過剰発現するEcoli菌株を作製するため、以下のプライマーを設計してPCRに使用した。5Gene30157166により、2つのORFORF1および2と1つの部分ORFORF3が示された図2。個別のORFの機能を解明するため、BLASTAltschulSFGishWMillerWMyersEWLipmanDJJMolBiol215403410および3DPSSMKelleyLAMacCallumRMSternbergMJJMolBiol299499520を用いてこれらの翻訳産物についてのデータベースUniPro検索を行った。結果を図2にまとめた。要約すると、各ORFは、エステラーゼおよびβラクタマーゼORF1、isochorismataseなどの加水分解酵素ORF2、リパーゼORF3と類似していた。したがって、いずれの遺伝子についてもnat遺伝子に対する相同性はこの断片上では認められなかった。どの遺伝子がST耐性に関与しているかを確認するため、ORF1およびORF2~3のそれぞれをもつpWHM3orf1およびpWHM3orf23プラスミドを作製し図2、SlividansTK23に導入した。MIC試験により、pWHM3orf23を保有する形質転換体がST耐性を示すことが確認された表1。pWHM3orf23プラスミドがORF3の一部をもつという事実から考えて、ORF2がST耐性を付与することが示された。本研究では、加水分解酵素遺伝子に対する類似性が認められたORF2をsttHと名付けた。実施例2:sttH遺伝子の開始コドンの推定塩基配列決定とフレーム解析の結果に基づいて、8つの開始コドン候補図2に示した第1~8ポジションのATGおよびGTGがsttH遺伝子中に確認された。さらに、一般的に知られているStreptomyces菌株のプロモーター領域とリボソーム結合部位のセットの明白で特徴的な塩基配列がないため、塩基配列の情報による開始コドンの予測が困難であった。そこでわれわれは、それぞれ異なるN末端領域をもつ6種類のSttHの組換え酵素rSttHと略記する場合がある。を、N末端6×HisTag融合タンパク質として作製し、MIC値により判断したそれぞれの酵素活性に基づいて、開始コドンを推定した。Ecoliの発現プラスミドとなるpQE30SHF1R第1ポジションからsttH遺伝子をもつ、pQE30SHF2R第2ポジション、pQE30SHF3R第3および第4ポジション、pQE30SHF4R第5ポジション、pQE30SHF5R第6および第7ポジション、pQE30SHF6R第8ポジションを作製した。第9ポジションのGTGコドンは、翻訳産物のペプチド鎖が極めて短かったため開始コドン候補とはみなされなかったが、pQE30SHF7Rも作製した。これらの7つのプラスミドとpQE30挿入なしをEcoliに導入後、STのMICは、12.5μg/mLpQE30を保有するEcoli菌株、50μg/mLpQE30SHF1R、50μg/mLpQE30SHF2R、50μg/mLpQE30SHF3R、100μg/mLpQE30SHF4R、100μg/mLpQE30SHF5R、>100μg/mLpQE30SHF6R、および12.5μg/mLpQE30SHF7Rであり、第8ポジションのコドンがSalbulusNBRC14147の開始コドンであることが示唆された。実施例3:rSttHにより変換されたSTFおよびSTD由来化合物の同定と構造決定Niアフィニティクロマトグラフィを用いて高度精製したrSttHをSTFと反応させた。溶出したrSttH依存性生成物は、逆相HPLC上の保持時間がSTFより長く、特に補因子や金属イオンなどのいかなる添加物も含まない反応液で検出された図3C。同様に、STDを基質に用いた場合にも、rSttH依存性生成物が検出された。このようにして得られたrSttH依存性生成物の構造を決定するため、これらの化合物を精製し、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化質量分析ESIMSおよびNMRにより分析した。ESIMS分析の結果、STF由来化合物の分子量は521であり、STFの分子量503Daより分子量が18増加していることが確認された図4。また、タンデム質量分析ESIMSMSにより、この分子量変化はstreptolidineラクタム基で起こっていることが示された。同様の事象がSTD由来化合物でもみられた。これらの結果から、rSttHがstreptolidineラクタムのアミド結合の加水分解を触媒することが強く示唆された。これらの予測された構造を確認するためにNMR分析を行ったところ、得られたstreptolidine基の1HNMRスペクトルの特徴材料と方法を参照は、ZabriskieらJacksonMDGouldSJZabriskieTMJOrgChem6729342941により報告された化学合成streptolidineの特徴と完全に一致していた。したがって、rSttHの作用により生成されたSTFおよびSTD由来化合物は、それぞれ、STFacid前記式Iにおいて、n=1である化合物およびSTDacid前記式Iにおいて、n=3である化合物であることが確認された。実施例4:rSttHの酵素特性pHの異なる数種類の緩衝液100mMリン酸ナトリウムNaPB、pH45~7;トリス塩酸、pH7~10を用いて最適pHを測定した。pH65で最大活性が認められ、pHが低下約4すると、活性は急速に低下した。また、温度が酵素活性に与える影響を、NaPB緩衝液100mMpH65を用いて25~75°Cの範囲で検討した。酵素活性は45°Cで最大であったが、65°Cでも最大活性の約90が検出された。反応速度パラメータを表2にまとめた。rSttHのKm値はSTFで096±019mM、STDで574±099mMと算出され、この酵素は短鎖βリジンポリマーをもつST化合物に対する親和性が高いことが示された。しかし、rSttHのVmax値は、STDのほうがSTFと比べてわずかに高かった。STFとの反応におけるVmaxKm値を算出したところ、STDより4倍高かった。rSttHORF2のネイティブの分子量は、ゲルろ過により50kDaと推定され、rSttHがホモダイマーとして存在していることが示唆された。実施例5:SttH遺伝子またはnat遺伝子を過剰発現するEcoliおよび酵母細胞ならびにその他の微生物におけるSTD耐性プロフィールの検討化学合成STFacidの生物学的活性は、微生物や植物において無視できるレベルであることが以前に報告されているが2021、STDacidについては依然として不明である。そこでわれわれは、sttH遺伝子またはnat遺伝子を過剰発現するEcoliおよびSaccharomycescerevisiaeにおけるSTFおよびSTDのMICをそれぞれ検討した表3。以前報告されたとおり、nat遺伝子をもつEcolipQEnatおよびScerevisiaepAD4natの菌株は、STFおよびSTDの両方に耐性を示した。しかし、興味深いことに、STDのMIC値は、rSttHを過剰発現するScerevisiaepAD4sttHでの結果とは対照的に、rSttHを過剰発現するEcolipQE30SHF6Rでは極めて低いことが判明し、STDacidは依然として原核細胞に対して抗生物質活性を示すことが示唆された。このことを確認するため、グラム陽性およびグラム陰性細菌、臨床的に単離された病原細菌、酵母などのさまざまな微生物に対するSTacidとSTの選択毒性を検討した。MIC試験により、STFacidの抗生物質活性が原核細胞および真核細胞のどちらにおいてもほぼ完全に失われていたのとは対照的に、STDacidは、ScerevisiaeやSchizosaccharomycespombeなどの真核細胞に対しては活性を示さなかったが、Ecoli、Bacillussubtilis、およびStaphylococcusaureusなどの細菌に対しては実際高い活性を示した表3。表中のカッコ内のc/aはSTFacidとSTFの最小発育阻止濃度の比を表し、d/bはSTDacidとSTDの最小発育阻止濃度の比を表す。"