"メタニューモウイルスMPVを生成する方法であって、a異種RNAポリメラーゼを発現する宿主細胞に、MPVのcDNAを含むDNA分子であって、異種RNAポリメラーゼによって転写されるDNA分子を導入すること、及び、b前記宿主細胞によって生成されるウイルスを単離することを含む方法。メタニューモウイルスを生成する方法であって、aT7RNAポリメラーゼを発現する宿主細胞に、MPVのcDNAを含むDNA分子であって、T7RNAポリメラーゼによって転写されるDNA分子を導入すること、及び、b前記宿主細胞によって生成されるウイルスを単離することを含む方法。メタニューモウイルスを生成する方法であって、apolI及びpolIIポリメラーゼを発現する宿主細胞に、MPVのcDNAを正方向に含むDNA分子であって、前記polIポリメラーゼによって転写されるDNA分子を導入すること、及びb前記宿主細胞によって生成されるウイルスを単離することを含む方法。転写調節配列に機能的に連結した、ウイルスのN、P、及びLタンパク質をコードする1つ又は複数のDNA分子を、polI及びpolIIポリメラーゼを発現する宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項1、2、又は3に記載の方法。前記メタニューモウイルスが哺乳動物メタニューモウイルスである、請求項1、2、又は3に記載の方法。前記メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項1、2、又は3に記載の方法。前記宿主細胞がM2-1をコードするDNA分子をさらに含む、請求項1、2、又は3に記載の方法。前記宿主細胞がBHK細胞系である、請求項1、2、又は3に記載の方法。前記宿主細胞が293T細胞である、請求項1、2、又は3に記載の方法。前記宿主細胞がVero細胞である、請求項1、2、又は3に記載の方法。ウイルスを生成する方法であって、転写調節配列に機能的に連結したウイルスのN、P、及びLタンパク質をコードする1つ又は複数のDNA分子を宿主細胞に導入することを含み、前記N、P、及びLタンパク質が、レスキューしようとするウイルス種以外のウイルス種に由来する、上記方法。単離された哺乳動物メタニューモウイルスであって、前記哺乳動物メタニューモウイルスがパラミクソウイルス科Paramyxoviridaeのニューモウイルス亜科Pneumovirinaeに属するマイナスセンス1本鎖RNAウイルスであり、かつ、前記哺乳動物メタニューモウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスTRTVに関連するよりも、I-2614としてCNCMパリに寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関係しているものであり、i前記ウイルスの少なくとも1つの領域が、哺乳動物メタニューモウイルスの異なる分離株からの類似の領域に置き換えられており、又は、ii前記ウイルスの少なくとも1つの領域が除去されており、又は、iii前記ウイルスの少なくとも1つの領域が、哺乳動物メタニューモウイルスの異なる分離株からの類似の領域に置き換えられおり、かつ、前記ウイルスの少なくとも1つの領域が除去されている、哺乳動物メタニューモウイルス。前記領域の長さが、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチドnt、少なくとも10nt、少なくとも25nt、少なくとも50nt、少なくとも75nt、少なくとも100nt、少なくとも250nt、少なくとも500nt、少なくとも750nt、少なくとも1kb、少なくとも1.5kb、少なくとも2kb、少なくとも2.5kb、少なくとも3kb、少なくとも4kb、又は少なくとも5kbである、請求項12に記載のウイルス。前記領域が、N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1ORF、M2-2ORF、SH遺伝子、G遺伝子、L遺伝子、リーダー領域、トレーラー領域、又は非コード領域の断片である、請求項12に記載のウイルス。前記領域が、N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1ORF、M2-2ORF、SH遺伝子、G遺伝子、L遺伝子、リーダー領域、トレーラー領域、又は非コード領域である、請求項12に記載のウイルス。前記ウイルスが弱毒化されている、請求項12、13、又は14に記載のウイルス。以下のアミノ酸位置、すなわち、Fタンパク質のアミノ酸99位から102位までのRQSR、Lタンパク質のアミノ酸456位のPhe、Lタンパク質のアミノ酸749位のGlu、Lタンパク質のアミノ酸1246位のTyr、Lタンパク質のアミノ酸1094位のMet、及び、Lタンパク質のアミノ酸746位のLysの1つ又は複数に、少なくとも1つの改変をもたらす少なくとも1つの遺伝子組換えを含む弱毒化hMPV。前記遺伝子組換えが欠失、置換、又は付加である、請求項17に記載の弱毒化ウイルス。少なくとも1つの遺伝的改変が、1コドンあたり2又は3ヌクレオチドの置換又は欠失からなる、請求項17に記載の弱毒化ウイルス。弱毒化哺乳動物メタニューモウイルスであって、前記哺乳動物メタニューモウイルスのゲノム中の少なくとも1つのオープンリーディングフレームの位置が変化している、弱毒化哺乳動物メタニューモウイルス。前記オープンリーディングフレームが、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2タンパク質、SHタンパク質、Gタンパク質、又はLタンパク質をコードする、請求項20に記載の弱毒化哺乳動物メタニューモウイルス。ウイルスを増殖する方法であって、ウイルスに感染している細胞を、前記細胞の成長に最適な温度より低い温度で培養することを含む方法。ウイルスを増殖する方法であって、iウイルスに感染させる前に、第1の温度で細胞を培養すること、ii細胞をウイルスに感染させること、及び、iii細胞をウイルスに感染させた後に、第2の温度で細胞を培養することを含み、第2の温度が第1の温度より低いものである、上記方法。ウイルスを増殖する方法であって、血清の非存在下でウイルスに感染している細胞を培養することを含む方法。ウイルスを増殖する方法であって、iウイルスに感染させる前に、血清の存在下で細胞を培養すること、ii細胞をウイルスに感染させること、及び、iii細胞をウイルスに感染させた後に、血清の非存在下で細胞を培養すること含む方法。ウイルスを増殖する方法であって、ウイルスに感染している細胞を、前記細胞の成長に最適である温度より低い温度で、無血清で培養することを含む方法。前記ウイルスがマイナス鎖RNAウイルスである、請求項22、23、24、25、又は26に記載の方法。前記ウイルスがメタニューモウイルスである、請求項22、23、24、25、又は26に記載の方法。前記ウイルスが哺乳動物メタニューモウイルスである、請求項22、23、24、25、又は26に記載の方法。前記ウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項22、23、24、25、又は26に記載の方法。細胞が哺乳動物メタニューモウイルスに感染するのを阻害する方法であって、細胞を7回反復配列に接触させることを含み、前記7回反復配列が、哺乳動物メタニューモウイルスのHRに対して少なくとも50、60、70、80、90、95、98、99、又は少なくとも99.5同一である、上記方法。哺乳動物が哺乳動物メタニューモウイルスに感染するのを予防、治療、又は管理する方法であって、治療上有効な量の7回反復配列を前記哺乳動物に投与することを含み、前記7回反復配列が、前記哺乳動物メタニューモウイルスのHRに対して少なくとも50、60、70、80、90、95、98、99、又は少なくとも99.5同一である、上記方法。前記7回反復配列が、HRA、HRB、又はこれらの組合せである、請求項31又は32に記載の方法。前記哺乳動物メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項31又は32に記載の方法。サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、選択される第2の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、サンプルとを接触させることを含み、第2の核酸の配列が、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21である、上記方法。サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、タンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含み、前記タンパク質の配列が、配列番号322、配列番号366、配列番号374、配列番号358、配列番号314、配列番号338、配列番号346、配列番号382、配列番号330、配列番号325、配列番号369、配列番号377、配列番号361、配列番号317、配列番号341、配列番号349、配列番号385、配列番号333、配列番号323、配列番号367、配列番号375、配列番号359、配列番号315、配列番号339、配列番号347、配列番号383、配列番号331、配列番号324、配列番号368、配列番号376、配列番号360、配列番号316、配列番号340、配列番号348、配列番号384、又は配列番号332である、上記方法。サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、配列番号366に対して少なくとも90同一である、配列番号374に対して少なくとも70同一である、配列番号358に対して少なくとも90同一である、配列番号314に対して少なくとも82同一である、配列番号338に対して少なくとも85同一である、配列番号346に対して少なくとも60同一である、配列番号330に対して少なくとも85同一である、配列番号322に対して少なくとも20同一である、配列番号382に対して少なくとも30同一であるタンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。第1の核酸が、サブタイプA1、B1、A2、又はB2のhMPVのゲノムに対して特異的にハイブリダイズする、請求項36又は37に記載の方法。第1の核酸の長さが、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、又は少なくとも25ヌクレオチドである、請求項36又は37に記載の方法。サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、タンパク質、又はタンパク質の断片を特異的に認識する抗体又はそのフラグメントと、前記サンプルとを接触させることを含み、前記タンパク質の配列が、配列番号374、配列番号358、配列番号314、配列番号338、配列番号346、配列番号330、配列番号322、配列番号382、配列番号366、配列番号324、配列番号368、配列番号376、配列番号360、配列番号316、配列番号340、配列番号348、配列番号384、配列番号332、配列番号325、配列番号369、配列番号377、配列番号361、配列番号317、配列番号341、配列番号349、配列番号385、配列番号333、配列番号323、配列番号367、配列番号375、配列番号359、配列番号315、配列番号339、配列番号347、配列番号383、又は配列番号331である、上記方法。サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、配列番号374に対して少なくとも70同一である、配列番号358に対して少なくとも90同一である、配列番号314に対して少なくとも82同一である、配列番号338に対して少なくとも85同一である、配列番号346に対して少なくとも60同一である、配列番号330に対して少なくとも85同一である、配列番号322に対して少なくとも20同一である、配列番号382に対して少なくとも30同一である、配列番号366に対して少なくとも90同一であるタンパク質又はタンパク質の断片を特異的に認識する抗体又はそのフラグメントと、前記サンプルとを接触させることを含む方法。哺乳動物のMPV感染を血清診断する方法であって、前記哺乳動物から得たサンプル中における、MPV又はその構成要素に対して特異的な抗体又はそのフラグメントの存在を、配列番号374に対して少なくとも70同一である、配列番号358に対して少なくとも90同一である、配列番号314に対して少なくとも82同一である、配列番号338に対して少なくとも85同一である、配列番号346に対して少なくとも60同一である、配列番号330に対して少なくとも85同一である、配列番号322に対して少なくとも20同一である、配列番号382に対して少なくとも30同一である、配列番号366に対して少なくとも90同一であるタンパク質又はタンパク質の断片と、前記サンプルとを反応させることによって検出することを含み、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスTRTVに関連するよりも、I-2614としてCNCMパリに寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連している、上記方法。哺乳動物のMPV感染を血清診断する方法であって、前記哺乳動物から得たサンプル中における、MPV又はその構成要素に対して特異的な抗体又はそのフラグメントの存在を、MPV又はその構成要素と前記サンプルとを反応させることによって検出することを含み、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスTRTVに関連するよりも、I-2614としてCNCMパリに寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連している、上記方法。サンプル中の変種B1哺乳動物MPVを検出する方法であって、i哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質配列番号324に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列、ii哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質配列番号368に対して少なくとも98.5同一であるアミノ酸配列、iii哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質配列番号376に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、iv哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質配列番号360に同一であるアミノ酸配列、v哺乳動物MPV変種B1のFタンパク質配列番号316に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、vi哺乳動物MPV変種B1のM2-1タンパク質配列番号340に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列、vii哺乳動物MPV変種B1のM2-2タンパク質配列番号348に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、viii哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質配列番号384に対して少なくとも83同一であるアミノ酸配列、又はix哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質配列番号332に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。サンプル中の変種A1哺乳動物MPVを検出する方法であって、i哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質配列番号322に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列、ii哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質配列番号366に対して少なくとも99.5同一であるアミノ酸配列、iii哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質配列番号374に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、iv哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質配列番号358に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、v哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質配列番号314に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列、vi哺乳動物MPV変種A1のM2-1タンパク質配列番号338に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、vii哺乳動物MPV変種A1のM2-2タンパク質配列番号346に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、viii哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質配列番号382に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列、又は、ix哺乳動物MPV変種A1のウイルスのLタンパク質配列番号330に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。サンプル中の変種B2哺乳動物MPVを検出する方法であって、i哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質配列番号325に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列、ii哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質配列番号369に対して少なくとも97同一であるアミノ酸配列、iii哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質配列番号377に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、iv哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質配列番号361に同一であるアミノ酸配列、v哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質配列番号317に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、vi哺乳動物MPV変種B2のM2-1タンパク質配列番号341に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列:vii哺乳動物MPV変種B2のM2-2タンパク質配列番号349に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、viii哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質配列番号385に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列、又は、ix哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質配列番号333に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。サンプル中の変種A2哺乳動物MPVを検出する方法であって、i哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質配列番号323に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列、ii哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質配列番号367に対して少なくとも99.5同一であるアミノ酸配列、iii哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質配列番号375に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、iv哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質配列番号359に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、v哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質配列番号315に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列、vi哺乳動物MPV変種A2のM2-1タンパク質配列番号339に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、vii哺乳動物MPV変種A2のM2-2タンパク質配列番号347に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、viii哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質配列番号383に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列、又は、ix哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質配列番号331に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。第1の核酸の長さが、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、又は少なくとも25ヌクレオチドである、請求項44、45、46、又は47のいずれか一項に記載の方法。サンプル中の変種B1哺乳動物MPVを検出する方法であって、i哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質配列番号324に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列、ii哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質配列番号368に対して少なくとも98.5同一であるアミノ酸配列、iii哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質配列番号376に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、iv哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質配列番号360に同一であるアミノ酸配列、v哺乳動物MPV変種B1のFpタンパク質配列番号316に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、vi哺乳動物MPV変種B1のM2-1タンパク質配列番号340に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列、vii哺乳動物MPV変種B1のM2-2タンパク質配列番号348に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、viii哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質配列番号384に対して少なくとも83同一であるアミノ酸配列、又は、ix哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質配列番号332に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。サンプル中に変種A1哺乳動物MPVを検出する方法であって、i哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質配列番号322に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列、ii哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質配列番号366に対して少なくとも99.5同一であるアミノ酸配列、iii哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質配列番号374に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、iv哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質配列番号358に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、v哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質配列番号314に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列、vi哺乳動物MPV変種A1のM2-1タンパク質配列番号338に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、vii哺乳動物MPV変種A1のM2-2タンパク質配列番号346に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、viii哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質配列番号382に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列、又は、ix哺乳動物MPV変種A1のウイルスのLタンパク質配列番号330に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。サンプル中の変種B2哺乳動物MPVを検出する方法であって、i哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質配列番号325に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列、ii哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質配列番号369に対して少なくとも97同一であるアミノ酸配列、iii哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質配列番号377に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、iv哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質配列番号361に同一であるアミノ酸配列、v哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質配列番号317に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、vi哺乳動物MPV変種B2のM2-1タンパク質配列番号341に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列、vii哺乳動物MPV変種B2のM2-2タンパク質配列番号349に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、viii哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質配列番号385に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列、又は、ix哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質配列番号333に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。サンプル中の変種A2哺乳動物MPVを検出する方法であって、i哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質配列番号323に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列、ii哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質配列番号367に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、iii哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質配列番号375に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、iv哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質配列番号359に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、v哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質配列番号315に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列、vi哺乳動物MPV変種A2のM2-1タンパク質配列番号339に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列、vii哺乳動物MPV変種A2のM2-2タンパク質配列番号347に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列、viii哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質配列番号383に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列、又は、ix哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質配列番号331に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。サンプル中のMPVを検出する方法であって、核酸又はその断片と、前記サンプルとを接触させることを含み、前記核酸が、配列番号378、配列番号362、配列番号318、配列番号342、配列番号350、配列番号326、配列番号334、配列番号386、配列番号370、配列番号379、配列番号363、配列番号319、配列番号343、配列番号351、配列番号327、配列番号335、配列番号387、配列番号371、配列番号380、配列番号364、配列番号320、配列番号344、配列番号352、配列番号328、配列番号336、配列番号388、配列番号372、配列番号381、配列番号365、配列番号321、配列番号345、配列番号353、配列番号329、配列番号337、配列番号389、配列番号373、又は配列番号357である、上記方法。サンプル中のMPVを検出する方法であって、核酸又はその断片と、前記サンプルとを接触させることを含み、前記核酸が、配列番号84~118、配列番号154~233、配列番号318~321、配列番号326~329、配列番号334~337、配列番号342~345、配列番号350~357、配列番号362~365、配列番号370~373、配列番号378~381、及び配列番号386~389からなる群より選択される、上記方法。前記断片の長さが、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも750、又は少なくとも1000ヌクレオチドである、請求項53又は54に記載の方法。サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、iレポーター遺伝子をコードするミニレプリコンを含む細胞と、前記サンプルとを接触させること、及び、ii前記レポーター遺伝子の発現を測定することを含む方法。前記ミニレプリコンが、前記細胞で増幅された哺乳動物メタニューモウイルスのウイルス粒子中にパッケージングされる、請求項56に記載の方法。前記レポーター遺伝子の発現が、前記哺乳動物メタニューモウイルスの存在下で刺激される、請求項56に記載の方法。サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、第3の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれぞれハイブリダイズする第1の核酸及び第2の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含み、第3の核酸が、配列番号18、配列番号19、配列番号20、及び配列番号21、又はその断片である、上記方法。サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、a配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21に特異的にハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させること、及び、b第1の核酸配列がハイブリダイズした位置からMPV核酸の断片を増幅することを含み、前記断片は、断片の全長にわたって、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21に対して少なくとも89、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99同一、配列番号366に対して少なくとも90同一、配列番号374に対して少なくとも70同一、配列番号358に対して少なくとも90同一、配列番号314に対して少なくとも82同一、配列番号338に対して少なくとも85同一、配列番号346に対して少なくとも60同一、配列番号330に対して少なくとも85同一、配列番号322に対して少なくとも20同一、あるいは配列番号382に対して少なくとも30同一である、上記方法。前記断片が、断片の全長にわたって、配列番号366、配列番号374、配列番号358、配列番号314、配列番号338、配列番号346、配列番号330、配列番号322、又は配列番号382に対して少なくとも90、95、98、99、99.5、又は100同一である、請求項60に記載の方法。第1の核酸の長さが、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、又は少なくとも25ヌクレオチドである、請求項60に記載の方法。前記断片の長さが、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも250、少なくとも500、又は少なくとも1000ヌクレオチドである、請求項60に記載の方法。第1の核酸が、配列番号22~83からなる群より選択される核酸配列の核酸配列を含む、請求項60に記載の方法。i配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21に特異的にハイブリダイズする第2の核酸を、前記サンプルと接触させ、かつ、ii第1及び第2の核酸がそれぞれ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、それぞれの少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、又は少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも1000ヌクレオチド、少なくとも2000ヌクレオチド、少なくとも3000ヌクレオチド、又は少なくとも4000ヌクレオチド以内の範囲で、第3の核酸配列にハイブリダイズし、第3の核酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号84~118、配列番号154~233、配列番号318~321、配列番号326~329、配列番号334~337、配列番号342~345、配列番号350~357、配列番号362~365、配列番号370~373、配列番号378~381、及び配列番号386~389からなる群より選択される、請求項60に記載の方法。前記増幅断片の検出をさらに含む、請求項60に記載の方法。哺乳動物のMPV感染を診断する方法であって、前記哺乳動物のサンプル中で、MPV又はその構成要素の存在を、F、L、N、M、P、M2、G、及びSHからなる群より選択されるMPVタンパク質を特異的に認識する抗体と、前記サンプルとを接触させることによって決定することを含む方法。ヒトのMPV感染を診断する方法であって、ヒトのサンプル中で、MPV又はその構成要素の存在を、F、L、N、M、P、M2、G、及びSHからなる群より選択されるhMPVタンパク質を特異的に認識する抗体と、前記サンプルとを接触させることによって決定することを含む方法。MPVを検出するためのキットであって、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスTRTVに関連するよりも、I-2614としてCNCMパリに寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連しており、配列番号366に対して少なくとも90同一、配列番号374に対して少なくとも70同一、配列番号358に対して少なくとも90同一、配列番号314に対して少なくとも82同一、配列番号338に対して少なくとも85同一、配列番号346に対して少なくとも60同一、配列番号330に対して少なくとも85同一、配列番号322に対して少なくとも20同一、配列番号382に対して少なくとも30同一であるタンパク質を、1つ又は複数の容器の中に含むキット。タンパク質を検出する手段をさらに含む、請求項6971に記載のキット。MPVを検出するためのキットであって、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスTRTVに関連するよりも、I-2614としてCNCMパリに寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連しており、配列番号366に対して少なくとも90同一、配列番号374に対して少なくとも70同一、配列番号358に対して少なくとも90同一、配列番号314に対して少なくとも82同一、配列番号338に対して少なくとも85同一、配列番号346に対して少なくとも60同一、配列番号330に対して少なくとも85同一、配列番号322に対して少なくとも20同一、配列番号382に対して少なくとも30同一であるタンパク質に特異的に結合する抗体を1つ又は複数の容器の中に含むキット。前記抗体を検出する手段をさらに含む、請求項71に記載のキット。MPVを検出するためのキットであって、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスTRTVに関連するよりも、I-2614としてCNCMパリに寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連しており、配列番号366に対して少なくとも90同一、配列番号374に対して少なくとも70同一、配列番号358に対して少なくとも90同一、配列番号314に対して少なくとも82同一、配列番号338に対して少なくとも85同一、配列番号346に対して少なくとも60同一、配列番号330に対して少なくとも85同一、配列番号322に対して少なくとも20同一、配列番号382に対して少なくとも30同一であるタンパク質をコードす3.発明の概要本発明は、単離された哺乳動物マイナス鎖RNAウイルス、すなわちパラミクソウイルスParamyxoviridae科のニューモウイルスPneumoviridae亜科に属するメタニューモウイルスMPVに関する。また本発明は、メタニューモウイルス属及びその構成要素に系統学的に一致し又は関連するものとして同定可能な、単離された哺乳動物マイナス鎖RNAウイルスにも関する。特に本発明は、C型APVに関連するものよりも、I-2614としてCNCMパリに寄託されたウイルス分離株に、系統学上より近縁の哺乳動物MPVに関する。より具体的な実施形態で、哺乳動物MPVは、変種A1、A2、B1、又はB2哺乳動物MPVでありうる。しかし本発明の哺乳動物MPVは、まだ同定されていない追加の変種を包含することができ、変種A1、A2、B1、又はB2に限定されない。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株、特にヒトメタニューモウイルスの分離株のゲノムヌクレオチド配列に関する。本発明は、診断及び治療方法を目的とした、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株の配列情報の使用に関する。本発明は、種々のメタニューモウイルス分離株間でのゲノムヌクレオチド配列の相違と、この相違を本発明の診断及び治療方法に使用することに関する。特定の実施形態では、N、M、F、L、P、M2-1,M2-2,SH、又はGORFをコードする哺乳動物MPVのヌクレオチド配列を使用して、本発明のウイルスを同定することができる。他の特定の実施形態では、N、M、F、L、P、M2-1、M2-2、SH、又はGORFをコードする哺乳動物MPVのヌクレオチド配列を使用して、哺乳動物MPVを変種A1、A2、B1、又はB2に分類することができる。特定の実施形態では、本発明は、診断を目的とした、種々のメタニューモウイルス分離株における1塩基多型SNPの使用に関する。本発明は、哺乳動物MPV又はトリニューモウイルスAPV由来の組換えウイルス及びキメラウイルスに関する。本発明によれば、組換えウイルスは、内在性の又は天然のゲノム配列あるいは非天然のゲノム配列によってコードされた哺乳動物MPV又はAPVから得られたものである。本発明によれば、非天然配列は、天然の又は内在性のゲノム配列に対する、限定されるものではないが、点変異、再配列、挿入、欠失などを含めた1つ又は複数の変異によって、これらのゲノム配列とは異なっているものであるが、これらの変異は表現型の変化を生じるものであってもよいし又は生じなくてもよい。本発明によれば、本発明のキメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えMPV又は組換えAPVである。本発明によれば、キメラウイルスは、その配列中で、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているヌクレオチド配列、あるいは、内在性の又は天然のヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列に置換されているヌクレオチド配列によってコードされうる。ある実施形態で、本発明のキメラウイルスは、その中で、1つ若しくは複数のORF又はその一部が、別の株のメタニューモウイルスの相同なORF又はその一部に置換されているMPV又はAPVに由来する。例示的な実施形態では、哺乳動物MPVのF遺伝子のORFを、APVのF遺伝子のORFに置換する。別のある実施形態では、本発明のキメラウイルスは、1つ又は複数のORFを哺乳動物MPVの相同なORFに置換したAPVから得られる。本発明は、メタニューモウイルス哺乳動物株及びトリ株を含むのゲノム又はその一部をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明は、メタニューモウイルスの遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に関する。特に本発明は、MPVのFタンパク質、Gタンパク質、Mタンパク質、SHタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、M2タンパク質、又はLタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関するが、これらに限定されない。特に本発明は、MPVの変種A1、A2、B1、又はB2などであるがこれらに限定されない哺乳動物MPVの変種のFタンパク質、Gタンパク質、Mタンパク質、SHタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、M2タンパク質、又はLタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明はさらに、哺乳動物メタニューモウイルス及びトリメタニューモウイルスの両方を含めたメタニューモウイルスのゲノム又はその一部をコードするcDNA又はRNAに関し、加えて、これらのウイルスのゲノムに対して異種又は非天然のヌクレオチド配列にも関する。本発明はさらに、前記cDNA又はRNAによってコードされたキメラウイルス又は組換えウイルスを包含する。本発明はさらに、哺乳動物MPV及び哺乳動物MPVの種々の変種の、Fタンパク質、Gタンパク質、Mタンパク質、SHタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、M2タンパク質、又はLタンパク質のポリペプチド及びアミノ酸配列に関する。本発明はさらに、哺乳動物MPV及び哺乳動物MPVの種々の変種の、Fタンパク質、Gタンパク質、Mタンパク質、SHタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、M2タンパク質、又はLタンパク質に対する抗体に関する。抗体は、診断及び治療方法で使用することができる。より具体的なある実施形態では、抗体は哺乳動物MPVに特異的である。ある実施形態では、抗体は、哺乳動物MPVの変種に特異的である。本発明はさらに、下記のもの、すなわち哺乳動物MPVのFタンパク質、Gタンパク質、Mタンパク質、SHタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、M2タンパク質、及び/又はLタンパク質の1つ又は複数を含むワクチン製剤及び免疫原性組成物に関する。本発明はさらに、哺乳動物又はトリのメタニューモウイルス該ウイルスの組換え形態又はキメラ形態を含むを含む、ワクチン製剤又は免疫原性組成物に関する。特に本発明は、MPV及び/又はAPVの組換え形態又はキメラ形態を含むワクチン製剤を包含する。本発明はさらに、1つ又は複数のAPVタンパク質をコードし、任意選択でさらに1つ又は複数の異種配列又は非天然配列を発現する、キメラMPVを含むワクチンに関する。また本発明は、1つ又は複数のhMPVタンパク質をコードし、任意選択でさらに1つ又は複数の異種配列又は非天然配列を発現する、キメラAPVを含むワクチンにも関する。また本発明は、2価及び3価のワクチンを含めた多価ワクチンにも関する。特に本発明の多価ワクチンは、同じ又は異なるニューモウイルスベクターにより発現される2つ以上の抗原ポリペプチドを包含する。多価ワクチンの抗原ポリペプチドには、MPV、APV、PIV、RSV、インフルエンザ又は別のマイナス鎖RNAウイルス、あるいは麻疹ウイルスなど別のウイルスの抗原ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明はさらに、被験体における呼吸器感染を治療する方法に関する。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVを含むワクチン製剤を被験体に投与することによって、被験体の呼吸器感染症を治療することに関する。特定の実施形態で、被験体の呼吸器感染症を治療する方法は、組換え又はキメラの哺乳動物MPV又はAPVを含むワクチン製剤又は免疫原性組成物を、被験体に投与することを含む。より具体的な実施形態では、組換え又はキメラの哺乳動物MPVを弱毒化させる。特定の実施形態では、本発明は、組換えAPV又はキメラAPV、あるいはAPVのFタンパク質、Gタンパク質、Mタンパク質、SHタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、M2タンパク質、又はLタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むワクチン製剤をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者の呼吸器感染症の治療に関する。本発明は、パラミクソウイルスParamyxoviridae科ニューモウイルスPneumovirinae亜科に属し、かつメタニューモウイルスMetapneumovirus属に系統学上相当するものとして同定可能な、単離されたマイナスセンス1本鎖RNAウイルスMPVを提供し、このウイルスは、トリ鼻気管炎の病因物質であるシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスよりも、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のヌクレオチド配列を含むウイルス分離株に、系統学上より近縁のものである。ある実施形態では、本発明は、単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスであってそのウイルスのゲノムが配列番号18のヌクレオチド配列を含むものを提供する。ある実施形態では、本発明は、単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスであってそのウイルスのゲノムが配列番号19のヌクレオチド配列を含むものを提供する。ある実施形態では、本発明は、単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスであってそのウイルスのゲノムが配列番号20のヌクレオチド配列を含むものを提供する。ある実施形態では、本発明は、単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスであってそのウイルスのゲノムが配列番号21のヌクレオチド配列を含むものを提供する。ある実施形態では、本発明は単離された核酸を提供し、この核酸は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21に対して少なくとも70が同一であるヌクレオチド配列を有し、この場合、配列の同一性は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21の全長にわたり決定されるものである。ある実施形態では、本発明は、核酸が、i哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質配列番号324に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質配列番号368に対して少なくとも98.5同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質配列番号376に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質配列番号360に同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種B1のFタンパク質配列番号316に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種B1のM2-1タンパク質配列番号340に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種B1のM2-2タンパク質配列番号348に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質配列番号384に対して少なくとも83同一であるアミノ酸配列;又は、ix哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質配列番号332に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、単離された核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、核酸が、i哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質配列番号322に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質配列番号366に対して少なくとも99.5同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質配列番号374に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質配列番号358に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質配列番号314に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種A1のM2-1タンパク質配列番号338に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種A1のM2-2タンパク質配列番号346に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質配列番号382に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列;又は、ix哺乳動物MPV変種A1のウイルスのLタンパク質配列番号330に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、単離された核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、核酸が、i哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質配列番号332に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質配列番号367に対して少なくとも99.5同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質配列番号375に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質配列番号359に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質配列番号315に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種A2のM2-1タンパク質配列番号339に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種A2のM2-2タンパク質配列番号347に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質配列番号383に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列;又は、ix哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質配列番号331に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、単離された核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、核酸が、i哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質配列番号325に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質配列番号369に対して少なくとも97同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質配列番号377に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質配列番号361に同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質配列番号317に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種B2のM2-1タンパク質配列番号341に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種B2のM2-2タンパク質配列番号349に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質配列番号385に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列;又は、ix哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質配列番号333に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、単離された核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、核酸が、哺乳動物MPVの核酸に対して高いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、又は低いストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする、単離された核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、配列番号18~21のヌクレオチド配列又はその断片を含むウイルスを提供する。ある実施形態では、本発明は、タンパク質が、i哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質配列番号324に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質配列番号368に対して少なくとも98.5同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質配列番号376に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質配列番号360に同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種B1のFタンパク質配列番号316に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種B1のM2-1タンパク質配列番号340に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種B1のM2-2タンパク質配列番号348に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質配列番号384に対して少なくとも83同一であるアミノ酸配列;又は、ix哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質配列番号332に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。ある実施形態では、本発明は、タンパク質が、i哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質配列番号322に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質配列番号366に対して少なくとも99.5同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質配列番号374に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質配列番号358に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質配列番号314に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種A1のM2-1タンパク質配列番号338に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種A1のM2-2タンパク質配列番号346に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質配列番号382に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列;又は、ix哺乳動物MPV変種A1のウイルスのLタンパク質配列番号330に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。ある実施形態では、本発明は、タンパク質が、i哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質配列番号323に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質配列番号367に対して少なくとも99.5同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質配列番号375に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質配列番号359に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質配列番号315に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種A2のM2-1タンパク質配列番号339に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種A2のM2-2タンパク質配列番号347に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質配列番号383に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列;又は、ix哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質配列番号331に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。ある実施形態では、本発明は、タンパク質が、i哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質配列番号325に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質配列番号369に対して少なくとも97同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質配列番号377に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質配列番号361に同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質配列番号317に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種B2のM2-1タンパク質配列番号341に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種B2のM2-2タンパク質配列番号349に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質配列番号385に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列;又は、ix哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質配列番号333に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。ある実施形態では、本発明は、i哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質配列番号324に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質配列番号368に対して少なくとも98.5同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質配列番号376に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質配列番号360に同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種B1のFタンパク質配列番号316に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種B1のM2-1タンパク質配列番号340に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種B1のM2-2タンパク質配列番号348に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質配列番号384に対して少なくとも83同一であるアミノ酸配列;ix哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質配列番号332に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。ある実施形態では、本発明は、i哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質配列番号322に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質配列番号366に対して少なくとも99.5同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質配列番号374に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質配列番号358に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質配列番号314に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種A1のM2-1タンパク質配列番号338に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種A1のM2-2タンパク質配列番号346に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質配列番号382に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列;ix哺乳動物MPV変種A1のウイルスのLタンパク質配列番号330に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。ある実施形態では、本発明は、i哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質配列番号323に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質配列番号367に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質配列番号375に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質配列番号359に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質配列番号315に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種A2のM2-1タンパク質配列番号339に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種A2のM2-2タンパク質配列番号347に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質配列番号383に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列;ix哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質配列番号331に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。ある実施形態では、本発明は、i哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質配列番号325に対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列;ii哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質配列番号369に対して少なくとも97同一であるアミノ酸配列;iii哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質配列番号377に対して少なくとも96同一であるアミノ酸配列;iv哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質配列番号361に同一であるアミノ酸配列;v哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質配列番号317に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;vi哺乳動物MPV変種B2のM2-1タンパク質配列番号341に対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列;vii哺乳動物MPV変種B2のM2-2タンパク質配列番号349に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列;viii哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質配列番号385に対して少なくとも84同一であるアミノ酸配列;又は、ix哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質配列番号333に対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。ある実施形態では、本発明は、サンンプル中の変種B1哺乳動物MPVを検出する方法を提供し、前記方法は、サンプルを、変種B1に特異的な抗体と接触させることを含む。ある実施形態では、本発明は、サンプル中の変種A1哺乳動物MPVを検出する方法を提供し、前記方法は、サンプルを、変種A1に特異的な抗体と接触させることを含む。ある実施形態では、本発明は、サンプル中の変種A2哺乳動物MPVを検出する方法を提供し、前記方法は、サンプルを、変種A2に特異的な抗体と接触させることを含む。ある実施形態では、本発明は、サンプル中の変種B2哺乳動物MPVを検出する方法を提供し、前記方法は、サンプルを、B2に特異的な抗体と接触させることを含む。ある実施形態では、本発明は、ウイルス分離株を哺乳動物MPVとして同定する方法を提供し、前記方法は、前記分離株又はその構成要素を哺乳動物MPVに特異的な抗体と接触させることを含む。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物のMPV感染をウイルス学的に診断する方法であって、前記哺乳動物のサンプルをMPVに特異的な抗体と接触させることにより、前記サンプル中のウイルス分離株又はその構成要素の存在を決定する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、被験体における哺乳動物MPV感染をウイルス学的に診断する方法であって、被験体からサンプルを得ること、及びそのサンプルをMPVに特異的な抗体と接触させることを含む方法を提供し、その抗体がサンプルに結合する場合には被験体が哺乳動物MPVに感染している状態にある。ある実施形態では、本発明は感染性組換えウイルスを提供し、この組換えウイルスは、哺乳動物MPVのゲノムを含み、さらに非天然MPV配列を含むものである。ある実施形態では、本発明は、iMPVA1変種のGポリペプチドをコードする核酸と、ii非天然MPVポリペプチドをコードする核酸とを含む組換え核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、iMPVA2変種のGポリペプチドをコードする核酸と、ii非天然MPVポリペプチドをコードする核酸とを含む組換え核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、iMPVB1変種のGポリペプチドをコードする核酸と、ii非天然MPVポリペプチドをコードする核酸とを含む組換え核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、iMPVB2変種のGポリペプチドをコードする核酸と、ii非天然MPVポリペプチドをコードする核酸とを含む組換え核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、感染性キメラウイルス、すなわちキメラウイルスが第1の変種の哺乳動物MPVのゲノムを含み、この第1の変種の哺乳動物MPVのゲノムにおけるオープンリーディングフレームの1つ又は複数を第2の変種の哺乳動物MPV由来の類似のオープンリーディングフレームに置換したものである感染性キメラウイルスを提供する。ある実施形態では、本発明は、感染性キメラウイルス、すなわちキメラウイルスが第1の変種の哺乳動物MPVのゲノムを含み、第2の変種の哺乳動物MPVのオープンリーディングフレームの1つ又は複数を第1の変種の哺乳動物MPVのゲノムに挿入したものである感染性キメラウイルスを提供する。ある実施形態では、本発明は、感染性キメラウイルス、すなわちキメラウイルスが哺乳動物MPVのゲノムを含み、哺乳動物MPVのゲノムにおけるオープンリーディングフレームの1つ又は複数を、トリMPVFタンパク質、トリMPVGタンパク質、iiiトリMPVSHタンパク質、ivトリMPVNタンパク質、vトリMPVPタンパク質、viトリMPVM2タンパク質、viiトリMPVM2-1タンパク質、viiiトリMPVM2-2タンパク質、又はixトリMPVLタンパク質の1つ又は複数をコードするORFに置換したものである感染性キメラウイルスを提供する。ある実施形態では、本発明は、感染性キメラウイルス、すなわちキメラウイルスがトリMPVのゲノムを含み、トリMPVのゲノムにおけるオープンリーディングフレームの1つ又は複数を、i哺乳動物MPVFタンパク質、ii哺乳動物MPVGタンパク質、iii哺乳動物MPVSHタンパク質、iv哺乳動物MPVNタンパク質、v哺乳動物MPVPタンパク質、vi哺乳動物MPVM2タンパク質、vii哺乳動物MPVM2-1タンパク質、viii哺乳動物MPVM2-2タンパク質、又はix哺乳動物MPVLタンパク質の1つ又は複数をコードするORFに置換したものである感染性キメラウイルスを提供する。ある実施形態では、本発明は感染性のキメラウイルス又は組換えウイルスを提供し、このキメラウイルス又は組換えウイルスは、種間又は種内ポリメラーゼinterspeciesorintraspeciespolymeraseを使用してレスキューされる。一実施形態では、本発明はキメラウイルス又は組換えウイルスを提供し、このキメラウイルス又は組換えウイルスは、MPVポリメラーゼを使用してレスキューされる。一実施形態では、本発明は、レスキューされるウイルスのポリメラーゼとは異なるウイルス、すなわち、異なるクレード、サブタイプ、又は他の種に由来するポリメラーゼを使用する。別の実施形態では、本発明は、感染性のキメラウイルス又は組換えウイルスを提供し、このキメラウイルス又は組換えウイルスは、限定されるものではないが、PIV、APV又はRSVのポリメラーゼを含めた、別のウイルス由来のポリメラーゼを使用してレスキューされる。可能な組合せの制限としてではなく、例として挙げれば、MPVをレスキューするのにRSVポリメラーゼを使用することができ、RSVをレスキューするのにMPVポリメラーゼを使用することができ、あるいは、MPVをレスキューするのにPIVポリメラーゼを使用することができる。本発明のさらに別の実施形態では、組換えウイルスをレスキューするのに使用されるポリメラーゼ複合体が、異なったウイルス由来のポリメラーゼタンパク質によってコードされる。可能な組合せの制限としてではなく、例として挙げれば、一実施形態では、MPVのN遺伝子、PIVのL遺伝子、RSVのP遺伝子、及びMPVのM2-1遺伝子によって、ポリメラーゼ複合体タンパク質がコードされる。他の実施形態では、M2-1遺伝子がポリメラーゼ複合体の構成要素とならない。本発明の別の実施形態では、RSVのN遺伝子、RSVのL遺伝子、APVのP遺伝子、及びRSVのM2-1遺伝子によって、ポリメラーゼ複合体タンパク質がコードされる。本発明の別の実施形態では、本発明の組換えウイルスをレスキューするのに、M2-1遺伝子を必要としない。当業者ならば、ポリメラーゼ複合体タンパク質をコードするのに使用でき、それによって本発明の組換えキメラウイルスがレスキューされるような組合せのタイプに精通しているであろう。ある実施形態では、本発明は、本発明の感染性組換えウイルスを含む免疫原性組成物を提供する。ある実施形態では、本発明は、サンプルを本発明の核酸配列と接触させることを含む、サンプル中の哺乳動物MPVを検出する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、本発明の感染性組換えウイルスを含む医薬品組成物を提供する。ある実施形態では、本発明は、MPVに関連した核酸、プロセシングされた産物、又はその誘導体に対する増幅又はプローブ検出を含む、サンプル中の哺乳動物MPVを検出する方法を提供する。より具体的な実施形態では、本発明は、サンプル中のMPVの検出を行うポリメラーゼ連鎖反応に基づく方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、MPVに関連した核酸、プロセシングされた産物、又はその誘導体の存在の特異的な検出に使用できるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、ウイルスに感染した宿主内のMPV抗体を検出する診断方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスを含むワクチンを投与することを含む、哺乳動物における呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、本発明の組換え哺乳動物メタニューモウイルスを含むワクチンを投与することを含む、哺乳動物における呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、トリメタニューモウイルスを含むワクチンを投与することを含む、哺乳動物の呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、トリメタニューモウイルスを含むワクチンを投与することを含む、ヒトの呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、本発明の組成物を被験体に投与することを含む、被験体の呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVによる感染の治療に有用な化合物を同定する方法を提供し、この方法は、a動物を哺乳動物MPVに感染させるステップと、bその動物に試験化合物を投与するステップと、cその試験化合物が動物の感染に及ぼす影響を決定するステップとを含み、感染の範囲を減少させ又は感染に伴う症状を軽くする試験化合物を、哺乳動物MPVによる感染の治療に有用な化合物であると定める。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVによる感染の治療に有用な化合物を同定する方法を提供し、この方法は、a細胞培養物を哺乳動物MPVに感染させるステップと、bその細胞培養物を試験化合物と共にインキュベートするステップと、cその試験化合物が細胞培養物の感染に及ぼす影響を決定するステップとを含み、感染の範囲を減少させる試験化合物を、哺乳動物MPVによる感染の治療に有用な化合物であると同定する。ある実施形態では、本発明は、動物の哺乳動物MPV感染を診断する方法を提供し、この方法は、動物のサンプルを、トリニューモウイルスの構成要素に対して反応性を有する核酸又は抗体と反応させることによって、前記サンプル中のウイルス分離株又はその構成要素の存在を決定することを含み、前記核酸又は抗体は、MPVの構成要素と交差反応するものである。ある実施形態では、本発明は、動物由来のサンプルを本発明のタンパク質と接触させることを含む、動物の哺乳動物MPV感染を血清診断する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、動物由来のサンプルをAPVのタンパク質と接触させることを含む、動物の哺乳動物MPV感染を血清診断する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、動物由来のサンプルを本発明のタンパク質と接触させることを含む、トリのAPV感染を診断する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、パラミクソウイルスParamyxoviridae科ニューモウイルスPneumovirinae亜科に属しかつ系統学上メタニューモウイルスMetapneumovirus属に相当するものとして同定可能な単離されたマイナスセンス1本鎖RNAウイルスMPVを提供し、このウイルスは、トリ鼻気管炎の病因物質であるシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスよりも、I-2614としてCNCMパリに寄託されたウイルス分離株に、系統学上より近縁のものである。3.1慣用語と略語cDNA相補的DNAL大タンパク質Mマトリックスタンパク質エンベロープの内側の線F融合糖タンパク質HN血球凝集素-ノイラミニダーゼ糖タンパク質N、NP又はNC核タンパク質RNAに関係しポリメラーゼ活性に必要Pリンタンパク質MOI感染多重度NAノイラミニダーゼエンベロープ糖タンパク質PIVパラインフルエンザウイルスhPIVヒトパラインフルエンザウイルスhPIV3ヒトパラインフルエンザウイルス3型APV/hMPVhMPV配列を有する組換えAPVhMPV/APVAPV配列を有する組換えhMPV哺乳動物MPV哺乳動物メタニューモウイルスntヌクレオチドRNPリボ核タンパク質rRNP組換えRNPvRNAゲノムウイルスRNAcRNA抗ゲノムウイルスRNAhMPVヒトメタニューモウイルスAPVトリニューモウイルスMVA改変ワクシニアウイルスアンカラFACS蛍光活性化細胞分取器CPE細胞変性効果1位転写されるウイルスゲノムの第1遺伝子の位置2位天然のウイルスゲノムの第1オープンリーディングフレームと第2オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第2遺伝子の位置3位天然のウイルスゲノムの第2オープンリーディングフレームと第3オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第3遺伝子の位置4位天然のウイルスゲノムの第3オープンリーディングフレームと第4オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第4遺伝子の位置5位天然のウイルスゲノムの第4オープンリーディングフレームと第5オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第5遺伝子の位置6位天然のウイルスゲノムの第5オープンリーディングフレームと第6オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第6遺伝子の位置dpi感染後の日数F融合HAI血球凝集抑制HN血球凝集素-ノイラミニダーゼhpi感染後の時間MOI感染多重度POI感染時bPIV-3ウシパラインフルエンザウイルス3型hPIV-3ヒトパラインフルエンザウイルス3型RSV呼吸器合胞体ウイルスSFM血清不含培地TCID5050組織培養感染用量4図面の簡単な説明5.発明の詳細な説明本発明は、単離された哺乳動物マイナス鎖RNAウイルス、すなわちパラミクソウイルス科ニューモウイルス亜科内の、メタニューモウイルスMPV及びその変種に関する。また本発明は、メタニューモウイルス属及びその構成要素componentに系統学的に一致し又は関連するものとして同定可能な、単離された哺乳動物マイナス鎖RNAウイルスにも関する。本発明の哺乳動物MPVは、変種A1、A2、B1、又はB2哺乳動物MPVでありうる。しかし本発明の哺乳動物MPVは、まだ同定されていないMPVの追加の変種を包含することができ、変種A1、A2、B1、又はB2に限定されない。本発明は、変種A1、A2、B1、及びB2の分離株も含めた哺乳動物メタニューモウイルスMPV分離株、特にヒトメタニューモウイルスの分離株の、種々の変種のゲノムヌクレオチド配列に関する。本発明は、診断及び治療方法を目的とした、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株の配列情報の使用に関する。本発明は、種々のメタニューモウイルス分離株でのゲノムヌクレオチド配列の相違と、この相違を本発明の診断及び治療方法に使用することに関する。詳細には本発明は、診断及び治療方法を目的とした、種々のメタニューモウイルス分離株での1塩基多型SNPの使用に関する。また本発明は、診断及び治療方法を目的として、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株の血清学上の特徴を単独で又は種々の分離株の配列情報と組み合わせて使用することにも関する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスとトリメタニューモウイルスAPVの両方を含めたメタニューモウイルスの、ゲノム又はその一部をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスとトリメタニューモウイルスの両方を含めたメタニューモウイルスの、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明はさらに、ウイルスゲノムに対して異種の又は非天然のヌクレオチド配列の他、哺乳動物メタニューモウイルス及びトリメタニューモウイルスの両方を含めたメタニューモウイルスのゲノム又はその一部をコードする核酸DNA及びRNAを含むに関する。本発明はさらに、前記ヌクレオチド配列によってコードされる、組換え又はキメラウイルスを包含する。本発明において、組換えウイルスは、内在性の又は天然のゲノム配列あるいは非天然のゲノム配列によってコードされる哺乳動物MPV又はAPVに由来するものである。本発明においては、非天然配列は、ゲノム配列に対する点変異、再構成、挿入、欠失などを含むがこれらに限定されない1つ又は複数の変異があることに起因して天然の又は内在性のゲノム配列とは異なるものであるが、それは表現型の変化をもたらしてももたらさなくてもよい。本発明においては、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えMPV又はAPVである。本発明において、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されあるいは内在性の又は天然のヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列に置換されたヌクレオチド配列によりコードされうる。本発明はさらに、哺乳動物又はトリのメタニューモウイルス該ウイルスの組換え形態を含むを含む、ワクチン製剤に関する。詳細には本発明は、MPV若しくはAPVの糖タンパク質及び/又は非天然MPV若しくはAPV糖タンパク質を含む抗原性糖タンパク質を発現するMPV又はAPVの組換え又はキメラ形態を含むワクチン製剤を包含する。また本発明は、別のマイナス鎖RNAウイルスPIV又はRSVを含むの抗原性配列をコードするMPV又はAPVの組換え形態、あるいはメタニューモウイルスの別の種又は株の異種糖タンパク質を含む、ワクチン製剤も包含する。本発明はさらに、1つ又は複数のAPVタンパク質をコードし、また任意選択でさらに1つ又は複数の異種配列又は非天然配列を発現するキメラhMPVを含むワクチンに関する。また本発明は、1つ又は複数のhMPVタンパク質をコードし、任意選択でさらに1つ又は複数の異種配列又は非天然配列を発現するキメラAPVを含むワクチンにも関する。また本発明は、2価及び3価のワクチンを含めた多価ワクチンにも関する。詳細には、本発明の2価及び3価のワクチンは、MPV、APV、PIV、RSV、インフルエンザウイルス又は別のマイナス鎖RNAウイルス、あるいは麻疹ウイルスの抗原タンパク質をコードする、同じ又は異なるニューモウイルスベクターにより発現される2つ以上の抗原ポリペプチドを包含する。5.1哺乳動物メタニューモウイルス哺乳動物メタニューモウイルスの構造的特徴本発明は哺乳動物MPVを提供する。哺乳動物MPVは、パラミクソウイルス科paramyxoviridaeのニューモウイルス亜科Pneumovirinaeに属するマイナスセンス1本鎖RNAである。さらに哺乳動物MPVは系統発生的にメタニューモウイルス属に属するものとして同定され、ここで哺乳動物メタニューモウイルスは、系統発生的に、トリ鼻気管炎の原因物質である七面鳥鼻気管炎ウイルスより、CNCMパリにI-2614として寄託されているウイルス分離株配列番号19に、より近縁である。ウイルスは、例えばウイルスの核酸配列情報を得て、これを系統発生分析で試験することにより、系統発生的にメタニューモウイルス属に対応するとして同定される。当業者に公知の任意の方法を使用して、ウイルス株の間の系統発生的関係を決定することができる。方法の例はセクション5.9を参照のこと。WO02/057302号として公開された国際特許出願PCT/NL02/00040号これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれるに、他の方法が開示されている。特にPCT/NL02/00040号は、12頁27行~19頁29行これは参照することにより本明細書に組み込まれるで系統発生解析に適した核酸配列を開示している。ウイルスは、下記でさらに詳述されるような配列類似性の基づいて哺乳動物MPVとしてさらに同定することができる。本明細書に開示の哺乳動物MPVに対するウイルスの系統発生的関連性と配列類似性以外に、本明細書に開示の哺乳動物MPVのゲノム構成に対するウイルスのゲノム構成の類似性を使用して、ウイルスを哺乳動物MPVとして同定することもできる。哺乳動物MPVの代表的なゲノム構成については図27を参照のこと。ある実施形態において哺乳動物MPVのゲノム構成は、パラミクソウイルス科paramyxoviridaeのニューモウイルス亜科Pneumovirinae内のニューモウイルスのゲノム構成とは異なる。メタニューモウイルスとニューモウイルスの2つの属の分類は主にその遺伝子配置に基づく:メタニューモウイルスは一般的にNS1又はNS2のような非構造タンパク質が欠如しRandhawaら、1997JVirol7198499854も参照、遺伝子の順序はニューモウイルスとは異なるRSV:3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5’、APV:3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’Lungら、1992JGenVirol7317091715;Yuら、1992Virology186426434;Randhawaら、1997JVirol7198499854。さらに本発明の哺乳動物MPVは、その免疫学的性質により同定することができる。ある実施形態において、哺乳動物MPVを中和できる哺乳動物MPVに対する特異的抗血清を作製することができる。哺乳動物MPVを中和することもできるMPVに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を作製することができるWO02/057302号の~頁を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明の哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主すなわち哺乳動物培養細胞又は哺乳動物に感染できる能力をさらに特徴とする。APVと異なり哺乳動物MPVは、ニワトリや七面鳥中で複製しないか又は低レベルでのみ複製する。しかし哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主、例えばマカークザルcynomolgousmacaques中で複製する。より具体的なある実施形態において哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主中で複製できる能力をさらに特徴とする。より具体的なある実施形態において哺乳動物MPVは、哺乳動物MPVのゲノムにコードされるタンパク質を哺乳動物宿主に発現させる能力をさらに特徴とする。さらに具体的な実施形態において哺乳動物MPVにより発現されるウイルスタンパク質は、哺乳動物宿主の細胞質膜中に挿入される。ある実施形態において本発明の哺乳動物MPVは哺乳動物宿主に感染することができ、哺乳動物MPVの新しい感染性ウイルス粒子を哺乳動物宿主に産生させることができる。本発明の哺乳動物MPVの機能的特徴のさらに詳細な説明については、セクション5.1.2を参照のこと。ある実施形態において電子顕微鏡でのウイルスの出現又はクロロホルムに対するその感受性を使用して、哺乳動物MPVとしてウイルスを同定することができる。本発明の哺乳動物MPVは、電子顕微鏡でパラミクソウイルス様粒子として現れる。哺乳動物MPVは、一貫してクロロホルムによる処理に対して感受性である;哺乳動物MPVはtMK細胞又はこれと機能的同等の細胞で培養することが最適であり、これは基本的にほとんどの細胞培養物中でトリプシン依存性である。さらに哺乳動物MPVは典型的な細胞変性作用CPEを有し、赤血球の分子種に対して血球凝集活性が欠如している。MPV分離株により誘導されるCPEは、hRSVにより誘導されるCPEと同様であり、特徴的なシンシチウム形成の後に細胞の迅速な内部破壊と培養プレートからの以後のはく離が起きる。ほとんどのパラミクソウイルスは血球凝集活性を有し、ほとんどのニューモウイルスはこれを持たないPringleCR、TheParamyxoviruses;DWKingsbury139中プレヌムプレスPlenumPress、ニューヨーク、1991。哺乳動物MPVは、M2タンパク質をコードする核酸断片中に第2の重複ORFM2-2を含有する。この第2の重複ORFの存在は、Ahmadinaら、1999JGenVir8020112016中に示されるように他のニューモウイルス中に存在する。ある実施形態において、本発明は、ウイルス分離株を哺乳動物MPVとして同定する方法を提供する。試験サンプルは、例えば動物又はヒトから得られる。次にサンプルを、ニューモウイルス亜科のウイルスの存在について試験する。ニューモウイルス亜科のウイルスが存在するなら、本明細書に記載のように哺乳動物MPVの任意の特徴、例えば特に限定されないが、哺乳動物MPVに対する系統発生的関連性、哺乳動物MPVのヌクレオチド配列とのヌクレオチド配列同一性、哺乳動物MPVのアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性/相同性、及びゲノム構成について試験することができる。さらにウイルスは、MPV分離株からの核酸配列を使用して交差ハイブリダイゼーション実験により、哺乳動物MPVに特異的なプライマーを使用してRT-PCRにより、又は哺乳動物MPV分離株に対する抗体を使用して古典的交差血清学実験により、哺乳動物MPVとして同定することができる。他のある実施形態において哺乳動物MPVは、動物の抗血清による定量的中和により測定されるようなその免疫学的特殊性に基づいて同定することができる。抗血清は、例えば哺乳動物MPVに感染したフェレット、ブタ又はマカークザルから得ることができる例えば実施例8参照。ある実施形態において血清型は、哺乳動物MPV以外のウイルスと交差反応しない。他の実施形態において血清型は、両方向に同種対異種の力価比>16を示す。中和がいずれか又は両方の方向に2つのウイルスの間である程度の交差反応同種対異種の力価比が8又は16を示すなら、DNA配列の実質的な生物物理的/生化学的相違が存在するなら血清型の特殊性が仮定される。中和がいずれか又は両方の方向に2つのウイルスの間で顕著な交差反応同種対異種の力価比が8より小さいを示すなら、試験中の分離株の血清型の同一性が仮定される。本明細書においてMPV分離株00-1としても知られている分離株I-2614は、プロトタイプとして使用することができる。ある実施形態においてウイルスは、配列又は寄託により本明細書に開示されるウイルス分離株のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列と比較して、ウイルスタンパク質又は核酸の配列相同性/同一性を用いて哺乳動物MPVとして同定することができる。特に、ウイルスのゲノムが、I-2614としてCNCMパリに寄託されたウイルス分離株とパーセント核酸同一性これは、APV-Cと比較して本発明において下記で同定されるLタンパク質、Mタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質又はFタンパク質をコードする核酸について本発明で同定されるパーセントより高いを有する核酸配列を含有する時、ウイルスは哺乳動物MPVとして同定される表1を参照PCTWO02/05302号、12~19頁を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。理論に拘束されるつもりは無いが一般に、ウイルス種、特にRNAウイルス種は、しばしばウイルス群のメンバーが配列不均一性を示す準種を構成する。すなわちそのような個々の分離株は、APV-Cと比較するといくぶん異なるパーセントの配列同一性を有するかも知れないと予測される。今日までのMPVのタンパク質と同じファミリーの既知の他の任意のウイルスとの最も高いアミノ配列同一性は、APV-CとヒトMPVとの同一性である。ヒトMPVとAPV-Cの間では、図30に示す配列を比較した場合に推定されるように、マトリックスタンパク質のアミノ酸配列同一性は87、核タンパク質について88、リンタンパク質について68、融合タンパク質について81、及びポリメラーゼタンパク質の部分について56~64である表1も参照のこと。これらの最大値と比較してより高い相同性を有するタンパク質をコードするORFを含有するウイルス分離株は、哺乳動物MPVであると見なされる。他のウイルスと同様に、哺乳動物MPVの異なる分離株の間にある程度の変動がある。ある実施形態において、本発明は、哺乳動物MPVを提供し、該哺乳動物MPVのSHタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号382分離株NL/1/00のSHタンパク質:表14を参照のアミノ酸配列と少なくとも30、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一である。配列番号382分離株NL/1/00のSHタンパク質:表14を参照と少なくとも30同一であるSHタンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号382分離株NL/1/00のSHタンパク質:表14を参照と少なくとも30同一であるSHタンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。ある実施形態において哺乳動物MPVは、配列番号382分離株NL/1/00のSHタンパク質:表14を参照と少なくとも30同一であるSHタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。ある実施形態において、本発明は、哺乳動物MPVを提供し、該哺乳動物MPVのGタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号322分離株NL/1/00のGタンパク質:表14を参照のアミノ酸配列と少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一である。配列番号322分離株NL/1/00のGタンパク質:表14を参照と少なくとも20同一であるGタンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号322分離株NL/1/00のGタンパク質:表14を参照と少なくとも20同一であるGタンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。ある実施形態において哺乳動物MPVは、配列番号322分離株NL/1/00のGタンパク質:表14を参照と少なくとも20同一であるGタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。ある実施形態において、本発明は、哺乳動物MPVを提供し、該哺乳動物MPVのLタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号330分離株NL/1/00のLタンパク質:表14を参照のアミノ酸配列と少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一である。配列番号330分離株NL/1/00のLタンパク質:表14を参照と少なくとも85同一であるLタンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号330分離株NL/1/00のLタンパク質:表14を参照と少なくとも85同一であるLタンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。ある実施形態において哺乳動物MPVは、配列番号330分離株NL/1/00のLタンパク質:表14を参照と少なくとも20同一であるLタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。ある実施形態において、本発明は、哺乳動物MPVを提供し、該哺乳動物MPVのNタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号366のアミノ酸配列と少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも98同一である。配列番号366アミノ酸配列と少なくとも90同一であるNタンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号366とアミノ酸配列が少なくとも90同一であるNタンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。ある実施形態において哺乳動物MPVは、配列番号366のアミノ酸配列と少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも98同一であるNタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。本発明はさらに哺乳動物MPVを提供し、該哺乳動物MPVのPタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号374のアミノ酸配列と少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも98同一である。配列番号374とアミノ酸配列が少なくとも70同一であるPタンパク質を含む哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号374とアミノ酸配列が少なくとも70同一であるPタンパク質を含む哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主中で複製することができる。アミノ酸同一性は、Pタンパク質の全長にわたって計算される。ある実施形態において哺乳動物MPVは、配列番号374のアミノ酸配列と少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも98同一であるPタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。本発明はさらに哺乳動物MPVを提供し、該哺乳動物MPVのMタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号358のアミノ酸配列と少なくとも90、少なくとも95又は少なくとも98同一である。配列番号358とアミノ酸配列が少なくとも90同一であるMタンパク質を含む哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号358とアミノ酸配列が90同一であるMタンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。アミノ酸同一性は、Mタンパク質の全長にわたって計算される。ある実施形態において哺乳動物MPVは、配列番号358のアミノ酸配列と少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも98同一であるMタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。本発明はさらに哺乳動物MPVを提供し、該哺乳動物MPVのFタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号314のアミノ酸配列と少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも98同一である。配列番号314とアミノ酸配列が少なくとも85同一であるFタンパク質を含む哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号314とアミノ酸配列が85同一であるFタンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。アミノ酸同一性は、Fタンパク質の全長にわたって計算される。ある実施形態において哺乳動物MPVは、配列番号314のアミノ酸配列と少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも98同一であるFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。本発明はさらに哺乳動物MPVを提供し、該哺乳動物MPVのM2-1タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号338のアミノ酸配列と少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも98同一である。配列番号338とアミノ酸配列が少なくとも85同一であるM2-1タンパク質を含む哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号338とアミノ酸配列が85同一であるM2-1タンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。アミノ酸同一性は、M2-1タンパク質の全長にわたって計算される。ある実施形態において哺乳動物MPVは、配列番号338のアミノ酸配列と少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも98同一であるM2-1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。本発明はさらに哺乳動物MPVを提供し、該哺乳動物MPVのM2-2タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号346のアミノ酸配列と少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも98同一である。配列番号346とアミノ酸配列が少なくとも60同一であるM2-2タンパク質を含む単離された哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号346とアミノ酸配列が60同一であるM2-2タンパク質を含む単離されたマイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。アミノ酸同一性は、M2-2タンパク質の全長にわたって計算される。ある実施形態において哺乳動物MPVは、配列番号346のアミノ酸配列と少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも98同一であるM2-1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。ある実施形態において、本発明は哺乳動物MPVを提供し、マイナスセンス1本鎖RNAメタニューモウイルスは、i配列番号366と少なくとも90のアミノ酸配列同一性を有するNタンパク質;ii配列番号374と少なくとも70のアミノ酸配列同一性を有するPタンパク質;iii配列番号358と少なくとも90のアミノ酸配列同一性を有するMタンパク質;iv配列番号314と少なくとも85のアミノ酸配列同一性を有するFタンパク質;v配列番号338と少なくとも85のアミノ酸配列同一性を有するM2-1タンパク質;及びvi配列番号346と少なくとも60のアミノ酸配列同一性を有するM2-2タンパク質よりなる群から選択される、少なくとも2つのタンパク質、少なくとも3つのタンパク質、少なくとも4つのタンパク質、少なくとも5つのタンパク質、又は6つのタンパク質をコードする。本発明は2つのサブグループサブグループAとサブグループBの哺乳動物MPVを提供する。本発明はまた、4つの変異体A1、A2、B1及びB2を提供する。哺乳動物MPVが、分離株99-1配列番号18より分離株00-1配列番号19に系統発生的により近いなら、サブグループAのメンバーとして同定することができる。哺乳動物MPVが、分離株00-1配列番号19より分離株99-1配列番号18に系統発生的により近いなら、サブグループBのメンバーとして同定することができる。他の実施形態において個々のORFのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列相同性を使用して、サブグループA又はBに属するとして哺乳動物MPVを分類することができる。哺乳動物MPVの異なる分離株は4つの変種変種A1、変種A2、変種B1、変種B2に分けられる図21と22を参照。分離株00-1配列番号19は、哺乳動物MPVの変種A1の例である。分離株00-1配列番号18は、哺乳動物MPVの変種B1の例である。こうして哺乳動物MPVは、哺乳動物MPVの他の変種のメンバーに系統発生的に関連するより、変種の既知のメンバーに系統発生的により密接に関連するなら、特定の変種に属する。任意のORF及びコードされるポリペプチドを、特定のサブグループ又は変種N、P、L、M、SH、G、M2又はFポリペプチドに属するとしてMPV分離株を型判定するのに使用してもよい。具体的な実施形態において変種への哺乳動物MPVの分類は、Gタンパク質の配列に基づく。理論に拘束されるつもりは無いが、哺乳動物MPVの異なる変種のGタンパク質の中の変動の程度が大きいため、Gタンパク質配列は、系統発生分析に非常に適している。本発明のある実施形態において配列相同性は、後述のようにある条件下でハイブリダイズする2つの配列の能力により決定される。哺乳動物MPVの核酸にハイブリダイズ可能な核酸、又はその逆相補体、又はその相補体は、配列相同性及び互いの同一性を決定するために本発明の方法で使用することができる。ある実施形態において核酸は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション条件例えば特に限定されないが、温度、塩濃度、pH、ホルムアミド濃度は当業者に公知である。例えば、Sambrookら、1989第9~11章、MolecularCloningALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、ニューヨークを参照されたい。参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。ある実施形態においてハイブリダイゼーションは水溶液中で行われ、溶液のイオン強度は一定に維持されるが、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイズされる配列の間の配列相同性の程度に応じて変化する。互いに100同一であり200塩基対より長いDNA配列については、ハイブリダイゼーションは完全なハイブリッドの融解温度Tmの約15~25°C低い温度で行われる。融解温度Tmは以下の式を使用して計算されるBoltonとMcCarthy1962ProcNatlAcadSciUSA841390:Tm=81.5°C-16.6log10[Na]GC-0.63ホルムアミド-600/lここで、Tmは融解温度であり、[Na]はナトリウム濃度であり、GCはグアニンとシトシン含量であり、lは塩基対中のハイブリッドの長さである。配列間のミスマッチの影響は、Bonnerらの式を使用して計算することができるBonnerら、1973JMolBiol81123135:ハイブリッド中の塩基のミスマッチの各1について、融解温度は1~1.5°C低下する。すなわち、2つの配列がハイブリダイズする温度を測定することにより、当業者はある配列が既知の配列にどの程度似ているかのを推定することができる。これは、例えば経験的に決定されたハイブリダイゼーション温度を、その完全な一致でハイブリダイズする既知の配列について計算されたハイブリダイゼーション温度と比較することにより行われる。Bonnerらの式を使用することにより、ハイブリダイゼーション温度とパーセントミスマッチの関係を利用して配列類似性についての情報が得られる。例えば特に限定されないが、そのような高ストリンジェンシー条件を使用する方法は以下の通りである。DNAを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションは、6×SSC、50mMトリス塩酸pH7.5、1mMEDTA、0.02PVP、0.02フィコール、0.02BSA及び500μg/mlの変性サケ精子DNAからのバッファー中で65°Cで8時間から一晩行われる。フィルターは、100μg/mlの変性サケ精子DNAと5~20×106cpmの32P標識PBを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中で65°Cで48時間行われる。フィルターの洗浄は、2×SSC、0.01PVP、0.01フィコール、0.01BSAを含有する溶液中で37°Cで1時間行われる。次に0.1×SSCで50°Cで45分洗浄した後、オートラジオグラフィーを行う。使用される他の高ストリンジェンシー条件は当該分野で公知である。本発明の他の実施形態においてハイブリダイゼーションは、中~低ストリンジェンシー条件下で行われ、そのような条件は当業者に公知である例えば、Sambrookら、1989第9~11章、MolecularCloningALaboratoryManual、第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、ニューヨーク;また、Ausubelら、CurrentProtocolsinMolecularBiologyの研究室技術マニュアルシリーズ、1987~1997CurrenProtocols登録商標1994~1997、JohnWileyandSonsIncを参照されたい。これらのそれぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。低ストリンジェンシー条件の例が以下のバッファー系により提供される:35ホルムアミド、5×SSC、50mMトリス塩酸pH7.5、5mMEDTA、0.02PVP、0.02フィコール、0.2BSA、100μg/mlの変性サケ精子DNA、及び10w/wのデキストラン硫酸を含むバッファー中で40°Cで18~20時間ハイブリダイゼーション、2×SSC、25mMトリス塩酸pH7.4、5mMEDTA及び0.1SDSからなるバッファー中で洗浄し、2×SSC、25mMトリス塩酸pH7.4、5mMEDTA及び0.1SDSからなるバッファー中で60°Cで1.5時間洗浄。ある実施形態において哺乳動物MPVは、哺乳動物MPVの特定の変種に特異的なプローブを使用して、変種の1つの中に分類することができる。そのようなプローブには、RT-PCRのプライマー及び抗体がある。哺乳動物MPVを特定の変種のメンバーとして同定するための方法の例は以下のセクション5.9において説明する。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVの異なる変種は、異なるウイルスタンパク質のアミノ酸配列により互いに区別することができる例えば図42b参照。他の実施形態において哺乳動物MPVの異なる変種は、ウイルスゲノムにコードされる異なるORFのヌクレオチド配列により区別することができる例えば図42b参照。哺乳動物MPVの変種は、特に限定されないがA1、A2、B1又はB2でもよい。しかしながら本発明はまた、まだ同定されていない別の変種のメンバーである哺乳動物MPVの分離株も包含する。本発明はまた、ウイルスが、1つの変種に近縁の1以上のORF及び別の変種に系統発生的に近縁の1以上のORFを有している可能性も包含する。そのようなウイルスは、そのORFの大部分が系統発生上近縁である変種に分類されることになりうる。系統発生の関係を調べるために非コード配列を使用してもよい。哺乳動物MPVの分離株は、系統発生的にそれが以下の任意の他のウイルス分離株:NL/1/00配列番号19、NL/17/00配列番号20及びNL/1/94配列番号21に関連するより、ウイルス分離株NL/1/99配列番号18により密接に関連するなら、変種B1として分類される。哺乳動物MPVの1つ以上のORFを使用して、哺乳動物MPVを変種に分類することができる。もしそのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99配列番号324により示される哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質と少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99配列番号368により示される哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質と少なくとも98.5、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99配列番号376により示される哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質と少なくとも96、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99配列番号360により示される哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質と同一なら;もしそのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99配列番号316により示される哺乳動物MPV変種B1のFタンパク質と少なくとも99同一なら;もしそのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99配列番号340により示される哺乳動物MPV変種B1のM2-1タンパク質と少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99配列番号348により示される哺乳動物MPV変種B1のM2-2タンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99配列番号384により示される哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質と少なくとも83、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99配列番号332により示される哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら、哺乳動物MPVはMPV変種B1として分類することができる。哺乳動物MPVの分離株は、系統発生的にそれが以下の任意の他のウイルス分離株:NL/1/99配列番号18、NL/17/00配列番号20及びNL/1/94配列番号21に関連するより、ウイルス分離株NL/1/00配列番号19により密接に関連するなら、変種A1として分類される。哺乳動物MPVの1つ以上のORFを使用して、哺乳動物MPVを変種に分類することができる。もしそのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00配列番号322により示される哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質と少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00配列番号366により示される哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質と少なくとも99.5同一なら;もしそのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00配列番号374により示される哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質と少なくとも96、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00配列番号358により示される哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00配列番号314により示される哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質と少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00配列番号338により示される哺乳動物MPV変種A1のM2-1タンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00配列番号346により示される哺乳動物MPV変種A1のM2-2タンパク質と少なくとも96、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00配列番号382により示される哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質と少なくとも84、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00配列番号330により示される哺乳動物MPV変種A1のLタンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら、哺乳動物MPVはMPV変種A1として分類することができる。哺乳動物MPVの分離株は、系統発生的にそれが以下の任意の他のウイルス分離株:NL/1/99配列番号18、NL/1/00配列番号19及びNL/1/94配列番号21に関連するより、ウイルス分離株NL/17/00配列番号20により密接に関連するなら、変種A2として分類される。哺乳動物MPVの1つ以上のORFを使用して、哺乳動物MPVを変種に分類することができる。もしそのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00配列番号332により示される哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質と少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00配列番号367により示される哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質と少なくとも99.5同一なら;もしそのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00配列番号375により示される哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質と少なくとも96、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00配列番号359により示される哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00配列番号315により示される哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質と少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00配列番号339により示される哺乳動物MPV変種A2のM2-1タンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00配列番号347により示される哺乳動物MPV変種A2のM2-2タンパク質と少なくとも96、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00配列番号383により示される哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質と少なくとも84、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00配列番号331により示される哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら、哺乳動物MPVはMPV変種A2として分類することができる。哺乳動物MPVの分離株は、系統発生的にそれが以下の任意の他のウイルス分離株:NL/1/99配列番号18、NL/17/00配列番号19及びNL/17/00配列番号20に関連するより、ウイルス分離株NL/1/94配列番号21により密接に関連するなら、変種B2として分類される。哺乳動物MPVの1つ以上のORFを使用して、哺乳動物MPVを変種に分類することができる。もしそのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94配列番号325により示される哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質と少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94配列番号369により示される哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94配列番号377により示される哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質と少なくとも96、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94配列番号361により示される哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質と同一なら;もしそのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94配列番号317により示される哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94配列番号341により示される哺乳動物MPV変種B2のM2-1タンパク質と少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94配列番号349により示される哺乳動物MPV変種B2のM2-2タンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;もしそのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94配列番号385により示される哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質と少なくとも84、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら;及び/又は、もしそのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94配列番号333により示される哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質と少なくとも99、又は少なくとも99.5同一なら、哺乳動物MPVはMPV変種B2として分類することができる。ある実施形態において配列同一性のパーセントは、完全長タンパク質のアライメントに基づく。他の実施形態において配列同一性のパーセントは、タンパク質の連続的アミノ酸配列のアライメントに基づき、ここでアミノ酸配列は、25アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、225アミノ酸、250アミノ酸、275アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、375アミノ酸、400アミノ酸、425アミノ酸、450アミノ酸、475アミノ酸、500v750アミノ酸、1000アミノ酸、1250アミノ酸、1500アミノ酸、1750アミノ酸、2000アミノ酸、又は2250アミノ酸の長さでありうる。5.2哺乳動物MPVの機能的特徴哺乳動物MPVの構造的定義以外に、哺乳動物MPVはその機能的特徴により規定することができる。ある実施形態において本発明の哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができる。哺乳動物宿主は、哺乳動物細胞、組織、臓器又は哺乳動物でもよい。具体的な実施形態において哺乳動物宿主は、ヒト又はヒト細胞若しくは臓器である。当業者に公知の任意の方法を使用して、哺乳動物宿主が哺乳動物MPVに感染しているかどうかを試験することができる。ある実施形態においてウイルスは、哺乳動物細胞に結合する能力について試験される。他のある実施形態においてウイルスは、哺乳動物細胞中にゲノムを輸送する能力について試験される。具体的な実施形態においてウイルスのゲノムは、検出可能なように例えば放射能標識される。次にウイルスを、哺乳動物細胞と少なくとも1分、少なくとも5分、少なくとも15分、少なくとも30分、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも5時間、少なくとも12時間、又は少なくとも1日インキュベートする。次に細胞を洗浄し、細胞からウイルス粒子を除去し、次に細胞を検出可能な標識物によりウイルスゲノムの存在について試験する。別の実施形態において細胞中のウイルスゲノムの存在は、RT-PCRを使用して哺乳動物MPV特異的プライマーを使用して検出されるPCTWO02/057302号、37~44頁を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。ある実施形態において哺乳動物ウイルスは哺乳動物宿主に感染することができ、哺乳動物MPVの一部が哺乳動物宿主の細胞質膜中に挿入されるようにする。哺乳動物宿主は、培養哺乳動物細胞、臓器、組織、又は哺乳動物でもよい。具体的な実施形態において哺乳動物細胞は、哺乳動物ウイルスとインキュベートされる。次に細胞は、細胞の表面からウイルスを除去する条件下で洗浄する。当業者に公知の任意の方法を使用して、哺乳動物細胞の細胞質膜に挿入される新に発現されたウイルスタンパク質を検出することができる。例えばウイルスで細胞を感染後、細胞は、検出可能な標識アミノ酸を含む培地中で維持される。次に細胞を採取し、溶解し、細胞質画分を膜画分から分離する。次に膜画分の部分を可溶化し、次に哺乳動物MPVの部分に特異的な抗体例えば特に限定されないが、Fタンパク質又はGタンパク質を使用して免疫沈降する。免疫沈降タンパク質は次に、SDS-PAGEに付す。次にウイルスタンパク質の存在は、オートラジオグラフィーにより検出することができる。別の実施形態において宿主細胞の細胞質膜中のウイルスタンパク質の存在は、哺乳動物MPVの部分に特異的な1つ以上の抗体を使用して免疫細胞化学により検出することができる。さらに別の実施形態において、本発明の哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができ哺乳動物宿主中で複製することができる。哺乳動物宿主は、培養哺乳動物細胞、臓器、組織、又は哺乳動物でもよい。当業者に公知の任意の方法を使用して、ウイルスが哺乳動物細胞に感染することができるか、及び哺乳動物宿主中で複製することができるかを決定することができる。具体的な実施形態において哺乳動物細胞にウイルスに感染させる。次に細胞を、少なくとも30分、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも5時間、少なくとも12時間、少なくとも1日、又は少なくとも2日維持する。細胞中のウイルスゲノムRNAのレベルは、ノーザンブロット解析、RT-PCR、又はインサイチューハイブリダイゼーションを使用して、ウイルスゲノムに特異的なプローブを使用して追跡することができる。ウイルスゲノムRNAの増加は、ウイルスが哺乳動物細胞に感染することができ、哺乳動物細胞内に複製することができることを証明する。さらに別の実施形態において、本発明の哺乳動物MPVは哺乳動物宿主に感染することができ、ここで感染は哺乳動物宿主に新しい感染性哺乳動物MPVを産生させる。哺乳動物宿主は、培養哺乳動物細胞又は哺乳動物でもよい。ウイルスが哺乳動物宿主に感染することができ、かつ新しい感染性ウイルス粒子を哺乳動物宿主に産生させることができるかどうかを調べるのに、当該分野で公知の任意の方法を使用することができる。例として哺乳動物細胞に哺乳動物ウイルスを感染させる。次に細胞を洗浄し、少なくとも30分、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも5時間、少なくとも12時間、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも1週間、又は少なくとも12日インキュベートする。ウイルスの力価は、当業者に公知の任意の方法によりモニターする。方法の例はセクション5.8に記載される。ある実施形態において、哺乳動物MPVはヒトMPVである。このセクションに記載の試験はまた、ヒトMPVを用いて行うことができる。ある実施形態においてヒトMPVは、哺乳動物宿主例えば哺乳動物又は哺乳動物培養細胞に感染することができる。ある実施形態においてヒトMPVは哺乳動物宿主に感染することができ、ヒトMPVの一部が哺乳動物宿主の細胞質膜中に挿入されるようにする。さらに別の実施形態において、本発明のヒトMPVは哺乳動物宿主に感染することができ、哺乳動物宿主中で複製することができる。さらに他の実施形態において本発明のヒトMPVは、哺乳動物宿主に感染することができ、哺乳動物宿主中で複製することができ、ここで感染と複製は、哺乳動物宿主が新しい感染性ヒトMPVを産生しパッケージングするようにする。ある実施形態において哺乳動物MPVは、たとえ哺乳動物宿主に感染することができても、トリ宿主例えばトリ又はトリ培養細胞に感染することもできる。ある実施形態において哺乳動物MPVはトリ宿主に感染することができ、哺乳動物MPVがトリ宿主の細胞質膜中に挿入されるようにする。さらに他の実施形態において本発明の哺乳動物MPVは、トリ宿主に感染することができ、トリ宿主中で複製することができる。さらに他の実施形態において本発明の哺乳動物MPVは、トリ宿主に感染することができ、トリ宿主中で複製することができ、ここで感染と複製は、トリ宿主が新しい感染性ヒトMPVを産生しパッケージさせるようにする。5.3組換え及びキメラメタニューモウイルス本発明は、哺乳動物変種及びトリ変種を含む、メタニューモウイルスのゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされる組換え又はキメラウイルスを包含する。本発明によれば、組換えウイルスは、内在性の又は天然のゲノム配列あるいは非天然のゲノム配列によってコードされる哺乳動物MPV及びAPVから得られたものである。本発明によれば、非天然配列は、天然の又は内在性のゲノム配列とは異なるものであるが、それは表現型の変化をもたらしてももたらさなくてもよいゲノム配列に対する点変異、再配列、挿入、欠失などを含むがこれらに限定されない1つ又は複数の変異があることに起因する。本発明の組換えウイルスは、哺乳動物変種及びトリ変種を含む、メタニューモウイルスのゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされたウイルスを包含し、ウイルスゲノムに対して非天然の核酸を含んでも含まなくてもよい。本発明によれば、メタニューモウイルスのゲノムから得られたウイルスベクターは、哺乳動物メタニューモウイルスの1つのORFの少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するものであり、ORFによってコードされるポリペプチドは、前掲のセクション5.1及び表1で述べたアミノ酸配列同一性を有している。本発明によれば、本発明の組換えウイルスは、哺乳動物メタニューモウイルスMPV、特にヒトメタニューモウイルスのゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされるウイルスを包含する。本発明の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、メタニューモウイルスA1、A2、B1、又はB2変種のゲノムから得られる。本発明によれば、これらのウイルスベクターは、ウイルスゲノムに対して非天然の核酸を含んでも含まなくてもよい。本発明によれば、本発明の組換えウイルスは、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスTRTVとも呼ばれるトリニューモウイルスAPVのゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされるウイルスを包含する。本発明の特定の実施形態で、ウイルスベクターは、APVサブグループA、B、C、又はDのゲノムから得られる。好ましい実施形態で、ウイルスベクターはAPVサブグループCのゲノムから得られる。本発明によれば、これらのウイルスベクターは、ウイルスゲノムに対して非天然の核酸を含んでも含まなくてもよい。本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の組換えウイルスは、APVサブグループCのF-ORFをコードする核酸配列を含有するAPVのゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされたウイルスを包含する。ある実施形態で、APVのゲノムから得られたウイルスベクターは、少なくともAPVのN-ORF、P-ORF、M-ORF、F-ORF、M2-1-ORF、M2-2-ORF、又はL-ORFをコードする核酸配列を含有するものである。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えMPV又はAPVである。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているヌクレオチド配列、あるいは内在性の又は天然のヌクレオチド配列を異種ヌクレオチド配列に代えたヌクレオチド配列によって、コードすることができる。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む本発明のウイルスベクターによってコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、ウイルスゲノムに対して非天然の核酸を含んでも含まなくてもよいウイルスベクターによってコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列が付加され、挿入され、あるいは天然の又は非天然の配列で置換されているウイルスベクターによってコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、哺乳動物MPVの種々の株から得られたヌクレオチド配列によってコードすることができる。特にキメラウイルスは、MPVの種々の株から得られた抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、MPVの1つ又は複数の株から得られた抗原ポリペプチドをコードする異種配列をさらにコードするAPV、特にサブグループCのゲノムから得られたウイルスベクターによって、コードすることができる。キメラウイルスは、2種以上のウイルスから保護する組換えワクチンの生成に特に有用なものでよいTao他、JVirol72、2955~2961Durbin他、2000、JVirol74、6821~6831Skiadopoulos他、1998、JVirol72、1762~1768Teng他、2000、JVirol74、9317~9321。例えば、MPVの1つ又は複数のタンパク質を発現するRSV又はRSVベクターなど、別のマイナス鎖RNAウイルスの1つ又は複数のタンパク質を発現するMPV又はAPVウイルスベクターは、そのようなベクターが接種された個体を両方のウイルス感染から保護すると考えることができる。PIV又はその他のパラミクソウイルスに関しては同様の手法を考えることができる。弱毒化した複製欠陥ウイルスは、他のウイルスに関して示されたように、生ワクチンを用いたワクチン接種に有用なものでよい本明細書に参照により援用するPCTWO02/057302号、第6及び23頁参照。本発明によれば、本発明の組換え又はキメラウイルスをコードするウイルスベクターに組み込む異種配列には、種々のメタニューモウイルスの株、トリニューモウイルスの株、その他のマイナス鎖RNAウイルスの株であってRSV、PIV、及びインフルエンザウイルスを含むがこれらに限定されないもの、麻疹ウイルスを含むその他のウイルスから得られ又は誘導された配列が含まれる。本発明のある実施形態で、本発明のキメラ又は組換えウイルスは、1つ又は複数の配列、遺伝子間領域、終端配列、あるいは一部又は全体のORFが異種配列又は非天然配列で置換されているウイルスゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされる。本発明のある実施形態において、本発明のキメラウイルスは、1つ又は複数の異種配列がベクターに付加されているウイルスゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされる。ある実施形態において、本発明のウイルスは、異種核酸を含有する。好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの位置1に挿入され又は付加される。別の好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの位置2に挿入され又は付加される。さらに別の好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの位置3に挿入され又は付加される。ウイルスゲノムのより低い数字の位置に核酸配列を挿入し又は付加すると、ウイルスゲノム全体にわたる転写勾配が原因となって、より高い数字の位置に挿入した場合に比べて異種ヌクレオチド配列の発現がより強く又はより高いレベルになる。したがって、異種ヌクレオチド配列の高い発現レベルが望まれる場合、より低い数字の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入し又は付加することは、本発明の好ましい実施形態である。理論に拘泥するものではないが、異種配列の挿入又は付加の位置は、組換え又はキメラウイルスの複製速度に影響を及ぼす。異種配列をウイルスゲノムの位置2又は位置1に挿入し又は付加する場合、より高い複製速度を実現することができる。異種配列を位置3、位置4、位置5、又は位置6に挿入し又は付加する場合、複製速度は低下する。理論に拘泥するものではないが、ウイルス遺伝子と異種配列との間の遺伝子間領域のサイズは、ウイルスの複製速度及び異種配列の発現レベルをさらに決定する。ある実施形態において、本発明のウイルスベクターは、2つ以上の異なる異種ヌクレオチド配列を含有する。好ましい実施形態において、1つの異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置1にあり、第2の異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置2にある。別の好ましい実施形態において、1つの異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置1にあり、第2の異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置3にある。さらに別の好ましい実施形態において、1つの異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置2にあり、第2の異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置3にある。その他のある実施形態では、異種ヌクレオチド配列を、ウイルスゲノムのその他のより高い数字の位置に挿入する。本発明によれば、異種配列の位置は、配列がウイルスゲノムから転写される順序を指し、例えば位置1の異種配列は、ゲノムから転写される最初の遺伝子配列になる。ウイルスベクターの選択は、ウイルス感染を治療し又はウイルス感染から保護する被験体の種に依存すると考えられる。被験体がヒトである場合、抗原性配列を得るために、弱毒化した哺乳動物メタニューモウイルス又はトリニューモウイルスを使用することができる。本発明によれば、メタニューモウイルスによる感染に対して予防を行う抗原性配列が得られるように、すなわち哺乳動物メタニューモウイルス、ヒトメタニューモウイルス、MPV変種A1、A2、B1、又はB2から得られた配列と、APVサブグループA、B、C、又はDを含むがCであることが好ましいトリニューモウイルスから得られた配列を含めた抗原性配列が得られるように、ウイルスベクターを設計製作することができる。ウイルスベクターは、インフルエンザ、RSV、又はPIVであってPIV3も含めたマイナス鎖RNAウイルスを含む、別のウイルスによる感染又は疾患に対して予防を行う抗原性配列が得られるように、設計製作することができる。ウイルスベクターは、1つ、2つ、3つ、又はそれ以上の抗原性配列が得られるように設計製作することができる。本発明によれば、抗原性配列は、同じウイルスから、あるいは同型ウイルスの異なる株又は変種から、あるいは麻疹ウイルスを含めた異なる変種から得ることができる。本発明のある実施形態では、本発明のウイルスのゲノムに挿入する異種ヌクレオチド配列がメタニューモウイルスから得られる。本発明のある特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列がヒトメタニューモウイルスから得られる。別の特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列がトリニューモウイルスから得られる。より具体的には、本発明の異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスのF遺伝子をコードする。より具体的には、本発明の異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスのG遺伝子をコードする。より具体的には、本発明の異種ヌクレオチド配列は、トリニューモウイルスのF遺伝子をコードする。より具体的には、本発明の異種ヌクレオチド配列は、トリニューモウイルスのG遺伝子をコードする。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、配列番号1から配列番号5までと配列番号14及び配列番号15のいずれか1つでよい。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号6から配列番号13までと配列番号16及び配列番号17のいずれか1つのタンパク質をコードする。本発明の特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列はキメラFタンパク質をコードする。例示的な実施形態において、キメラFタンパク質の外部ドメインはヒトMPVの外部ドメインであり、膜貫通ドメイン及び管腔ドメインは、トリメタニューモウイルスのFタンパク質から得られる。理論に拘泥するものではないが、ヒト外部ドメイン及びトリルミノール/膜貫通ドメインからなるキメラFタンパク質をコードするキメラヒトMPVは、Fタンパク質のトリ部分により弱毒化されるが、依然として、ヒト外部ドメインによりhMPVに対する免疫原性が高い。ある実施形態では、哺乳動物及びトリを含むメタニューモウイルスゲノムから得られた、2つの異なる異種ヌクレオチド配列を、本発明のウイルスベクターに挿入し又は付加する。例えば異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルス、トリニューモウイルス、RSV、PIV、又はインフルエンザから得られる。好ましい実施形態において、異種配列は、ヒトメタニューモウイルス、トリニューモウイルス、RSV、又はPIVのFタンパク質をそれぞれコードする。別の実施形態において、異種配列は、インフルエンザのHAタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明のウイルスベクターは2つの異なる異種ヌクレオチド配列を含有し、第1の異種ヌクレオチド配列がヒトメタニューモウイルスやトリニューモウイルスなどのメタニューモウイルスから得られ、第2のヌクレオチド配列が呼吸器合胞体ウイルスから得られる表2参照。特定の実施形態において、呼吸器合胞体ウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスのF遺伝子である。その他の特定の実施形態において、呼吸器合胞体ウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスのG遺伝子である。特定の実施形態において、メタニューモウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列よりも低い数字の位置に挿入される。別の特定の実施形態において、メタニューモウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列よりも高い数字の位置に挿入される。ある実施形態では、本発明のウイルスは2つの異なる異種ヌクレオチド配列を含有し、第1の異種ヌクレオチド配列がヒトメタニューモウイルスやトリニューモウイルスなどのメタニューモウイルスから得られ、第2のヌクレオチド配列が、PIV3などであるがこれに限定されないパラインフルエンザウイルスから得られる表2参照。特定の実施形態において、PIVから得られた異種ヌクレオチド配列はPIVのF遺伝子である。その他の特定の実施形態において、PIVから得られた異種ヌクレオチド配列はPIVのG遺伝子である。特定の実施形態において、メタニューモウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、PIVから得られた異種ヌクレオチド配列よりも低い数字の位置に挿入される。別の特定の実施形態において、メタニューモウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、PIVから得られた異種ヌクレオチド配列よりも高い数字の位置に挿入される。本発明により得られた発現産物及び/又は組換え若しくはキメラウイルス粒子は、ワクチン製剤に利用できることが有利である。本発明の発現産物及びキメラウイルス粒子は、ウイルス及び細菌抗原、腫瘍抗原、アレルゲン抗原、自己免疫異常に関わる自己抗原を含めた広範な病原体に対するワクチンが生成されるように、設計製作することができる。特に本発明のキメラウイルス粒子は、PIV、RSV、及び/又はメタニューモウイルスによる感染から被験体を保護するワクチンが生成されるように設計製作することができる。別の実施形態では、抗HIVワクチンが生成されるように本発明のキメラウイルス粒子を設計製作することができ、脊椎動物の体液及び細胞媒介型の両方の免疫応答を誘発させることができるワクチンが構成されるように、HIVのgp160及び/又は内部タンパク質由来の免疫原性ポリペプチドを糖タンパク質HNタンパク質に設計製作する。さらに別の実施形態において、本発明は、組換えメタニューモウイルスベクターと、変異抗原をコードするよう設計製作されたウイルスに関する。変異抗原は、野生型ウイルスタンパク質、すなわちそこから変異抗原が得られる野生型ウイルスタンパク質に対し、少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有する。ある実施形態では、本発明は、本発明の組換え又はキメラウイルスを含む3価ワクチンに関する。特定の実施形態において、3価ワクチンの主成分として使用されるウイルスは、RSVから得られた第1の異種ヌクレオチド配列とPIVから得られた第2の異種ヌクレオチド配列を含有するキメラトリ-ヒトメタニューモウイルス又はキメラヒト-トリメタニューモウイルスである。例示的な実施形態において、そのような3価ワクチンは、aキメラトリ-ヒトメタニューモウイルスを使用するのか又はキメラヒト-トリメタニューモウイルスを使用するのかに応じてそれぞれヒトメタニューモウイルス又はトリニューモウイルスのF遺伝子及び/又はG遺伝子の遺伝子産物に、bRSVから得られる異種ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に、cPIVから得られる異種ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に、特異的なものになる。特定の実施形態において、第1の異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスのF遺伝子であり位置1に挿入され、第2の異種ヌクレオチド配列は、PIVのF遺伝子であり位置3に挿入される。さらに多くの組合せが本発明に包含され、その一部を例として表2に示す。さらに、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を使用することができる前掲参照。いくつかのそれほど好ましくはない実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムのより高い数字の位置に挿入することができる。ある実施形態では、ウイルス抗原、腫瘍抗原、及び自己免疫障害に関わる自己抗原を含めた広範な病原体に対するワクチンが生成されるように、本発明の発現産物と組換え又はキメラウイルス粒子を設計製作することができる。この目標を達成する1つの方法では、既存のメタニューモウイルス遺伝子がそのそれぞれの外部ドメインに外来の配列を含有するよう変性させる。異種配列が病原体のエピトープ又は抗原である場合、これらのキメラウイルスは、これらの決定基が得られる病原体に対して防御免疫応答を誘発させるのに使用することができる。したがって本発明は、広範なウイルス及び/又は抗原に対するワクチンを処方するために、ウイルスベクターと組換え又はキメラウイルスを使用することに関する。本発明のウイルスベクター及びキメラウイルスは、体液性免疫応答、細胞性免疫応答を刺激することによって、又は抗原に対する寛容性を刺激することによって被験体の免疫系を調節するのに使用することができる。本明細書で使用する被験体とは、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、トリの各種とげっ歯類を意味する。本発明は、限定しようとするのではなくただ説明することを目的として以下の段階に分けることができ、すなわちa組換えcDNA及びRNA鋳型の構築、b組換えcDNA及びRNA鋳型を使用した異種遺伝子産物の発現、c組換えウイルス粒子での異種遺伝子のレスキュー、及びd本発明の組換えウイルス粒子を含むワクチンの生成及び使用に分けることができる。5.4組換えcDNA及びRNAの構築ある実施形態では、ウイルスベクターが、本発明のヒト又は哺乳動物メタニューモウイルスのゲノムから得られる。その他の実施形態では、ウイルスベクターはトリニューモウイルスのゲノムから得られる。ある実施形態では、ウイルスベクターは哺乳動物MPV及びAPVから得られた配列を含有し、したがってキメラヒトMPV/APVウイルスはこのウイルスベクターによってコードされるようになる。例示的な実施形態では、キメラhMPV/APVウイルスが構成されるように、ヒトメタニューモウイルスのF遺伝子及び/又はG遺伝子をトリニューモウイルスのF遺伝子及び/又はG遺伝子に置き換えている。その他の実施形態では、ウイルスベクターが、APV及び哺乳動物MPVから得られた配列を含有し、その結果、キメラAPV/hMPVウイルスがウイルスベクターによってコードされるようになる。さらに例示的な実施形態では、キメラAPV/hMPVウイルスが構築されるように、トリニューモウイルスのF遺伝子及び/又はG遺伝子がヒトメタニューモウイルスのF遺伝子及び/又はG遺伝子に置き換えられている。本発明は、ウイルスゲノムに対して内在性の又は天然の配列を含有し、かつウイルスゲノムに対して非天然の配列を含有しても含有しなくてもよい、哺乳動物MPV又はAPVゲノムから得られたウイルスベクターを含む組換えウイルスも包含する。非天然の配列には、表現型に変化をもたらしてももたらさなくてもよい、天然の又は内在性の配列とは異なるものが含まれる。本発明の組換えウイルスは、ワクチン製剤に使用するのにより適した表現型を有するウイルス、例えば弱毒化表現型を有し又は抗原性が高められたウイルスをもたらす配列を含有することができる。変異及び変性は、ウイルスのコード領域、遺伝子間領域、リーダー及びトレーラー配列内でよい。ある実施形態では、本発明のウイルスベクターは、hMPV、APV、hMPV/APV、又はAPV/hMPVから得られたヌクレオチド配列を含み、天然のヌクレオチド配列が異種配列で置換されており、又は異種配列が天然のメタニューモウイルス配列に付加されている。より具体的な実施形態では、キメラウイルスが、MPV、APV、APV/hMPV、又はhMPV/APVから得られたウイルスベクターを含み、これはPIVから得られた異種配列が付加されているものである。より具体的な実施形態では、組換えウイルスが、MPV、APV、APV/hMPV、又はhMPV/APVから得られたウイルスベクターを含み、配列は、PIVから得られた異種配列で置換されている。その他の具体的な実施形態では、キメラウイルスが、MPV、APV、APV/hMPV、又はhMPV/APVから得られたウイルスベクターを含み、これはRSVから得られた異種配列が付加されているものである。より具体的な実施形態では、キメラウイルスが、MPV、APV、APV/hMPV、又はhMPV/APVから得られたウイルスベクターを含み、配列は、RSVから得られた異種配列で置換されている。ウイルスポリメラーゼ結合部位/プロモーターの補体、例えば本発明の3’-hMPVウイルス末端の補体complement、又は3’-及び5’-hMPVウイルス末端の両方の補体で挟まれる異種遺伝子コード配列は、当技術分野で知られている技法を使用して構築することができる。より具体的な実施形態では、本発明の組換えウイルスが、hMPV又はAPVのリーダー及びトレーラー配列を含有する。ある実施形態では、遺伝子間領域がhMPV又はAPVから得られる。得られるRNA鋳型は、極性が負のものと考えられ、ウイルスRNA合成装置でその鋳型を認識することが可能な適切な末端配列を含有する。あるいは、ウイルスRNA合成装置で鋳型を認識することが可能な適切な末端配列を含有する、極性が正のRNA鋳型を使用してもよい。これらのハイブリッド配列を含有する組換えDNA分子は、バクテリオファージT7やT3、SP6ポリメラーゼ又は真核性ポリメラーゼであってポリメラーゼIなどの、DNA誘導型RNAポリメラーゼでクローニングし転写することができ、それによって、ウイルスポリメラーゼの認識及び活動を可能にする適切なウイルス配列を持った組換えRNA鋳型を、生体外又は生体内で生成することができる。より具体的な実施形態において、RNAポリメラーゼは鶏痘ウイルスT7RNAポリメラーゼ又はMVAT7RNAポリメラーゼである。これらのハイブリッド分子を構築するための例示的な手法は、異種ヌクレオチド配列をhMPV、APV、APV/hMPV、又はhMPV/APVゲノムのDNA補体complementに挿入することであり、したがって異種配列は、ウイルスポリメラーゼ活性に必要なウイルス配列、すなわちウイルスポリメラーゼ結合部位/プロモーターで挟まれ、以後これをウイルスポリメラーゼ結合部位、及びポリアデニル化部位と呼ぶ。好ましい実施形態において、異種コード配列は、5’及び3’末端の複製プロモーター、遺伝子開始配列及び遺伝子終止配列、5’及び/又は3’末端に見出されるパッケージングシグナルを含むウイルス配列で挟まれる。代替の手法では、ウイルスポリメラーゼ結合部位、例えば3’末端の補体あるいはウイルスゲノムセグメントの両端の補体をコードするオリゴヌクレオチドを異種コード配列にライゲートして、ハイブリッド分子を構築することができる。外来遺伝子又は外来遺伝子のセグメントを標的配列内に配置することは、以前はその標的配列内に適切な制限酵素部位を存在させることによって行っていた。しかし分子生物学における近年の進歩により、この問題が大幅に解消されている。制限酵素部位は、部位指向性の変異誘発性を用いることによって、標的配列内のどこにでも容易に配置することができる例えば、Kunkel、1985、ProcNatlAcadSciUSA82488に記述されている技法を参照。以下に述べるポリメラーゼ連鎖反応PCR技術の変化によっても、配列の特異的挿入が可能になりすなわち制限酵素部位、ハイブリッド分子を容易に構成することが可能になる。あるいは、PCR反応を使用することにより、クローニングの必要なく組換え鋳型を調製することができた。例えばPCR反応を使用して、DNA誘導型RNAポリメラーゼプロモーター例えばバクテリオファージT3、T7、又はSP6を含有する2本鎖DNA分子と、異種遺伝子及びPIVポリメラーゼ結合部位を含有するハイブリッド配列を調製することができた。次いでこの組換えDNAからRNA鋳型を直接転写することができた。さらに別の実施形態においては、RNAリガーゼを使用して、異種遺伝子の負の極性を指定するRNAとウイルスポリメラーゼ結合部位とをライゲートすることにより、組換えRNA鋳型を調製することができる。さらに、ウイルスのレスキューを得るのに重要と考えられる6の法則RuleofSixに従って、1つ又は複数のヌクレオチドを非翻訳領域に付加することができる。6の法則は数多くのパラミクソウイルスに適用され、この法則によれば、RNAヌクレオチドゲノムは6分割可能で機能するものでなければならない。ヌクレオチドの付加は、QuickChange変異誘発キットStratageneなどの商用の変異誘発キットを使用するような、当技術分野で知られている技法によって実現することができる。適切な数のヌクレオチドを付加した後、適切な制限酵素による消化及びゲル精製によって妥当なDNA断片を単離することができる。本発明により使用することができるウイルスポリメラーゼの活性及び構成に関する配列要件については、以下のサブセクションで述べる。理論に拘泥するものではないが、いくつかのパラメータは、組換えウイルスの複製速度及び異種配列の発現レベルに影響を与える。特に、hMPV、APV、hMPV/APV、又はAPV/hMPVにおける異種配列の位置と、この異種配列を挟む遺伝子間領域の長さは、複製速度と異種配列の発現レベルを決定する。ある実施形態において、ウイルスのリーダー配列及び/又はトレーラー配列は、野生型ウイルスに対して変更が加えられる。あるより具体的な実施形態においては、リーダー及び/又はトレーラーの長さが変わる。その他の実施形態において、リーダー及び/又はトレーラーの配列は、野生型ウイルスに対して変異している。より詳細に関してはセクション5.7を参照されたい。本発明の組換えウイルスの生成は、マイナスセンスイルスRNAvRNAゲノムの部分又は完全長コピー、あるいはその相補的コピーcRNAの複製を利用する。このvRNA又はcRNAは、核酸のinvitro転写により生成され、又は核酸のトランスフェクションによって細胞内で生成された、感染性ウイルスから単離することができる。第2に、組換えマイナス鎖ウイルスの生成は、機能性ポリメラーゼ複合体を利用する。典型的な場合、ニューモウイルスのポリメラーゼ複合体は、N、P、L、及びおそらくはM2タンパク質からなるが、これらにかならずしも限定する必要はない。ポリメラーゼ複合体又はその構成要素は、ウイルス粒子から単離することができ、構成要素の1つ又は複数を発現する細胞から単離することができ、あるいは特異的な発現ベクターのトランスフェクションによって生成することができる。MPVの感染性コピーは、上記ポリメラーゼ複合体16によって上記vRNA、cRNA、又はこれらのRNAを発現するベクターを複製する場合に得ることができるSchnell他、1994、EMBOJ134195~4203Collins他、1995、PNAS9211563~11567Hoffmann他、2000、PNAS976108~6113Bridgen他、1996、PNAS9315400~15404Palese他、1996、PNAS9311354~11358Peeters他、1999、JVirol735001~5009Durbin他、1997、Virology235323~332。本発明は、本発明による核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。MPVのポリメラーゼ構成要素おそらくはN、P、L、及びM2であるが必ずしもこれらに限定しないを含有するプラスミドベクター又はウイルスベクターを原核細胞内で生成し、関係ある細胞型細菌、昆虫細胞、真核細胞でその構成要素を発現させる。MPVゲノムの完全長又は部分コピーを含有するプラスミドベクター又はウイルスベクターが原核細胞内で生成され、ウイルス核酸が生体外又は生体内で発現する。後者のベクターは、キメラウイルス又はキメラウイルスタンパク質を生成するために他のウイルス配列を含有してよく、複製欠陥ウイルスを生成するためにウイルスゲノムの一部が欠けてもよく、さらに、弱毒化ウイルスを生成するために、変異、欠失、又は挿入が含まれていてもよい。MPVの感染性コピー野生型、弱毒化、複製欠陥、又はキメラは、上記現況技術によるポリメラーゼ構成要素の共発現によって生成することができる。さらに、1つ又は複数の完全長又は部分MPVタンパク質を一時的に又は安定して発現する真核細胞を使用することができる。そのような細胞は、トランスフェクションタンパク質又は核酸ベクター、感染ウイルスベクター、又は形質導入ウイルスベクターによって作製することができ、上記野生型ウイルス、弱毒化ウイルス、複製欠陥ウイルス、又はキメラウイルスの相補性に役立てることができる。5.4.1挿入する異種遺伝子配列本発明によれば、本発明のウイルスベクターはさらに、異種配列を発現するよう設計製作することができる。本発明の実施形態において、異種配列は、ウイルスベクター以外の供給源から得られる。限定するのではなく一例として、異種配列は、ウイルスベクターが得られる種、サブグループ、又は変種よりも、メタニューモウイルスの様々な種、サブグループ、又は変種に属するウイルスの抗原タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする。限定するのではなく一例として、異種配列は、メタニューモウイルス以外のウイルスの抗原タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする。限定するのではなく一例として、異種配列は、その出所源がウイルスではない。この実施形態によれば、異種配列は、所望の生物学的性質又は活性を有する部分、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードすることができる。そのような異種配列は、タグ又はマーカーをコードすることができる。そのような異種配列は、生体応答調節物質、すなわちその例にはリンホカイン、インターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及び顆粒球コロニー刺激因子が含まれる生体応答調節物質をコードすることができる。ある実施形態において、挿入する異種ヌクレオチド配列は、メタニューモウイルスから得られる。より具体的には、挿入する異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルス及び/又はトリニューモウイルスから得られる。ある実施形態において、異種配列は、PIVヌクレオカプシドリンタンパク質、PIVLタンパク質、PIVマトリックスタンパク質、PIVHN糖タンパク質、PIVRNA依存性RNAポリメラーゼ、PIVY1タンパク質、PIVDタンパク質、PIVCタンパク質、PIVFタンパク質、又はPIVPタンパク質をコードする。ある実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、PIVヌクレオカプシドリンタンパク質、PIVLタンパク質、PIVマトリックスタンパク質、PIVHN糖タンパク質、PIVRNA依存性RNAポリメラーゼ、PIVY1タンパク質、PIVDタンパク質、PIVCタンパク質、PIVFタンパク質、又はPIVPタンパク質に対して少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99が同種であるタンパク質をコードする。異種配列は、PIV1型、PIV2型、又はPIV3型から得ることができる。より具体的な実施形態においては、異種配列は、ヒトPIV1型、PIV2型、又はPIV3型から得ることができる。その他の実施形態においては、異種配列は、RSV核タンパク質、RSVリンタンパク質、RSVマトリックスタンパク質、RSV疎水性小タンパク質、RSVRNA依存性RNAポリメラーゼ、RSVFタンパク質、RSVGタンパク質、あるいはRSVM2-1又はM2-2タンパク質をコードする。ある実施形態では、異種配列は、RSV核タンパク質、RSVリンタンパク質、RSVマトリックスタンパク質、RSV疎水性小タンパク質、RSVRNA依存性RNAポリメラーゼ、RSVFタンパク質、RSVGタンパク質に対して少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99同種であるタンパク質をコードする。異種配列は、RSVサブタイプA及びRSVサブタイプBから得ることができる。より具体的な実施形態では、異種配列は、ヒトRSVサブタイプA及びRSVサブタイプBから得られる。その他の実施形態で、異種配列は、APV核タンパク質、APVリンタンパク質、APVマトリックスタンパク質、APV疎水性小タンパク質、APVRNA依存性RNAポリメラーゼ、APVFタンパク質、APVGタンパク質、あるいはAPVM2-1又はM2-2タンパク質をコードする。ある実施形態において、異種配列は、APV核タンパク質、APVリンタンパク質、APVマトリックスタンパク質、APV疎水性小タンパク質、APVRNA依存性RNAポリメラーゼ、APVFタンパク質、又はAPVGタンパク質に対して少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99が同種であるタンパク質をコードする。トリニューモウイルスは、APVサブグループA、APVサブグループB、又はAPVサブグループCでよい。その他の実施形態においては、異種配列は、hMPV核タンパク質、hMPVリンタンパク質、hMPVマトリックスタンパク質、hMPV疎水性小タンパク質、hMPVRNA依存性RNAポリメラーゼ、hMPVFタンパク質、hMPVGタンパク質、あるいはhMPVM2-1又はM2-2をコードする。ある実施形態においては、異種配列は、hMPV核タンパク質、hMPVリンタンパク質、hMPVマトリックスタンパク質、hMPV疎水性小タンパク質、hMPVRNA依存性RNAポリメラーゼ、hMPVFタンパク質、又はhMPVGタンパク質に対して少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99が同種であるタンパク質をコードする。ヒトメタニューモウイルスは、hMPV変種A1、hMPV変種A2、hMPV変種B1、又はhMPV変種B2でよい。ある実施形態においては、PIV、RSV、ヒトメタニューモウイルス、又はトリニューモウイルス由来の種々の異種配列の任意の組合せを、本発明のウイルスに挿入することができる。本発明のある好ましい実施形態においては、挿入する異種ヌクレオチド配列が、RSV、PIV、APV、又はhMPV由来のF遺伝子から得られる。ある実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、キメラタンパク質をコードする。より具体的な実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、RSV、PIV、APV、又はhMPVのキメラFタンパク質をコードする。キメラFタンパク質は、ヒトメタニューモウイルスやトリニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルスなどの種々のウイルス由来のFタンパク質の一部を含むことができる。その他のある実施形態においては、異種配列はキメラGタンパク質をコードする。キメラGタンパク質は、ヒトメタニューモウイルスやトリニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルスなどの種々のウイルス由来のGタンパク質の一部を含むことができる。特定の実施形態において、Fタンパク質は、メタニューモウイルスのFタンパク質の外部ドメイン、パラインフルエンザウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメイン、及びパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の管腔ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本発明の異種ヌクレオチド配列は、配列番号1から配列番号5までと配列番号14及び配列番号15のいずれか1つである。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号6から配列番号13までと配列番号16及び配列番号17のいずれか1つのタンパク質をコードする。呼吸器合胞体ウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列に関しては、例えば参照によりその全体を本明細書に援用するPCT/US98/20230号を参照されたい。好ましい実施形態において、本発明の組換えウイルス内に発現することのできる異種遺伝子配列には、センダイウイルスや感染性喉頭気管炎ウイルスILVなどの呼吸器疾患をもたらすウイルスの抗原エピトープや糖タンパク質、例えばインフルエンザ糖タンパク質であって特に血球凝集素H5、H7、呼吸器合胞体ウイルスエピトープ、ニューカッスル病ウイルスエピトープなどが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態においては、異種ヌクレオチド配列はRSV又はPIVから得られる。本発明のさらに別の実施形態において、本発明のキメラウイルスに設計製作することができる異種遺伝子配列には、ウイルスエピトープ及びウイルスの糖タンパク質であって、例えばB型肝炎表面抗原、A又はC型肝炎表面糖タンパク質、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルス、シミアンウイルス5又は流行性耳下腺炎ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルスの糖タンパク質、ヘルペスウイルスの糖タンパク質、ポリオウイルスのVPI、及びレンチウイルスから得られた配列であるがこれらに限定されないものが含まれ、ヒト免疫不全ウイルスHIV1型又は2型が好ましいがこれらに限定されない。さらに別の実施形態において、本発明のキメラウイルスに設計製作することができる異種遺伝子配列には、マレック病ウイルスMDVエピトープ、感染性ファブリキウス嚢病ウイルスILVのエピトープ、ニワトリ貧血ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルスILV、トリインフルエンザウイルスAIV、狂犬病、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、及び豚痘ウイルスのエピトープが含まれるが、これらに限定されない参照によりその全体を本明細書に援用するFields他、1991、FundamentalVirology、第2版、RavenPress、NewYork参照。本発明のその他の異種配列は、自己免疫疾患に特有の抗原を含む。これらの抗原は、典型的な場合、哺乳動物組織の細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリアなどから得られ、糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、悪性貧血、アジソン病、強皮症、自己免疫性萎縮性胃炎、若年性糖尿病、及び円板状エリテマトーデスに特有の抗原が含まれる。アレルゲンである抗原は、一般にタンパク質又は糖タンパク質を含み、花粉、ダスト、カビ、胞子、フケ、昆虫、及び食物由来の抗原が含まれる。さらに、腫瘍抗原に特有の抗原は、典型的な場合、腫瘍組織細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官などから得られる。その例には、腫瘍タンパク質に特有の抗原、すなわち変異した発癌遺伝子によりコードされたタンパク質、腫瘍に関連したウイルスタンパク質、及び糖タンパク質が含まれる。腫瘍には、口唇癌、鼻咽頭癌、咽頭及び口腔癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、喉頭癌、肺及び気管支癌、皮膚黒色腫、乳癌、子宮頚癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮癌、脳及びその他の神経系部分の腫瘍、甲状腺癌、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、及び白血病などの癌のタイプから得られたものが含まれるが、これらに限定されない。本発明の1つの特定の実施形態においては、異種配列が、ヒト免疫不全ウイルスHIVのゲノム、好ましくはヒト免疫不全ウイルス1型又はヒト免疫不全ウイルス2型のゲノムから得られる。本発明の別の実施形態においては、メタニューモウイルスタンパク質内に異種ペプチド配列を含有するキメラ遺伝子産物が発現するように、異種コード配列を、ウイルス骨格の遺伝子コード配列内に挿入することができる。本発明のそのような実施形態においては、異種配列を、ヒト免疫不全ウイルス、好ましくはヒト免疫不全ウイルス1型又はヒト免疫不全ウイルス2型のゲノムから得てもよい。異種配列がHIV由来のものである場合、そのような配列には、env遺伝子すなわちgp160、gp120、及び/又はgp41の全て又は一部をコードする配列、pol遺伝子すなわち逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、及び/又はインテグラーゼの全て又は一部をコードする配列、gag遺伝子すなわちp7、p6、p55、p17/18、p24/25の全て又は一部をコードする配列、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、及び/又はvpxから得られた配列を含めることができるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態においては、キメラウイルスに設計製作することができる異種遺伝子配列が、免疫強化活性を有するタンパク質をコードするものを含む。免疫強化タンパク質の例には、サイトカイン、インターフェロン1型、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-12が含まれるが、これらに限定されない。さらに、キメラウイルスに設計製作することができるその他の異種遺伝子配列には、細菌表面糖タンパク質などの細菌から得られた抗原、真菌から得られた抗原、様々なその他の病原体及び寄生虫から得られた抗原が含まれる。細菌性病原体から得られる異種遺伝子配列の例には、以下の属の種、すなわちサルモネラSalmonella、シゲラShigella、クラミジアChlamydia、ヘリコバクターHelicobacter、エルシニアYersinia、ボルダテラBordatella、シュードモナスPseudomonas、ナイセリアNeisseria、ビブリオVibrio、ヘモフィラスHaemophilus、マイコプラズマMycoplasma、ストレプトマイセスStreptomyces、トレポネマTreponema、コキシエラCoxiella、エーリキアEhrlichia、ブルセラBrucella、ストレプトバチルスStreptobacillus、フゾスピロヘータFusospirocheta、スピリラムSpirillum、ウレアプラズマUreaplasma、スピロヘータSpirochaeta、ミオコプラズマMyocoplasma、アクチノマイセテスActinomycetes、ボレリアBorrelia、バクテロイデスBacteroides、トリコモラスTrichomoras、ブランハメラBranhamella、パスツレラPasteurella、クロストリジウムClostridium、コリネバクテリウムCorynebacterium、リステリアListeria、バチルスBacillus、エリシペロスリックスErysipelothrix、ロドコッカスRhodococcus、エッシェリヒアEscherichia、クレブシエラKlebsiella、シュードマナスPseudomanas、エンテロバクターEnterobacter、セラチアSerratia、スタフィロコッカスStaphylococcus、ストレプトコッカスStreptococcus、レジオネラLegionella、マイコバクテリアMycobacterium、プロテウスProteus、カムピロバクターCampylobacter、エンテロコッカスEnterococcus、アシネトバクターAcinetobacter、モルガネラMorganella、モラクセラMoraxella、シトロバクターCitrobacter、リケッチアRickettsia、ロクリメRochlimeaeから得られた抗原、並びにP.アエルギノーサ、大腸菌、P.セパシア、S.エピデルミス、E.ファエカリス、S.ニューモニアス、黄色ブドウ球菌S.アウレウス、髄膜炎菌N.メニンギチジス、化膿連鎖球菌S.ピロゲネス、パスツレラ菌パスツレラムルトシダ、梅毒トレポネーマトレポネーマパリダム及びP.ミラビリスなどの細菌種から得られた抗原が含まれるが、これらに限定されない。病原真菌由来の異種遺伝子配列の例には、クリプトコッカスネオホルマンス;ブラストマイセスデルマティティジス;アイエロマイセスデルマティティジス;ヒストプラズマカプスラタム;コクシジオイデスイミティス;C.アルビカンス、C.トロピカリス、C.パラプシローシス、C.ギリエルモンジイ、及びC.クルセイを含めたカンジダ種;A.フミガタス、A.フラバス、及びA.ニジェールを含めたアスペルギルス種;リゾプス種;リゾムコール種;クンニンガメラ種;A.サクセナエ、A.ムコール、及びA.アブシジアを含めたアポフィソマイセス種;スポロスリックスシェンキイ;パラコクシジオイデスブラジリエンシス;シューダレシェリアボイジイ;トルロプシスグラブラータ;トリコフィトン種;ミクロスポラム種;及びデルマトフィレス種などの真菌から得られた抗原、並びに任意のその他の酵母菌あるいは現在知られており又は後に病原性であると同定される菌などから得られた抗原が含まれるが、これらに限定されない。最後に、寄生虫由来の異種遺伝子配列の例には、例えばバベシアBabesia、トキソプラズマToxoplasma、プラスモジウムPlasmodium、アイメリアEimeria、イソスポラIsospora、アトキソプラズマAtoxoplasma、シストイソスポラCystoisospora、ハンモンジアHammondia、ベスニオイチアBesniotia、サルコシスティスSarcocystis、フレンケリアFrenkelia、ヘモプロテウスHaemoproteus、ロイコシトゾーンLeucocytozoon、テイレリアTheileria、ペルキンサスPerkinsus、及びグレガリナGregarina種などのアピコンプレクサ門のメンバー;ニューモシスティスカリニイPneumocystiscarinii;例えばノセマNosema、エンテロシトゾーンEnterocytozoon、エンセファリトゾーンEncephalitozoon、セプタータSeptata、ムラゼキアMrazekia、アムブリオスポラAmblyospora、アメゾンAmeson、グルゲアGlugea、プレイストフォーラPleistophora、及びミクロスポリジウムMicrosporidium種などの微胞子虫門のメンバー;例えばハプロスポリジウムHaplosporidium種などのアセトスポラ門のメンバー、並びに熱帯熱マラリア原虫Plasmodiumfalciparum、三日熱マラリア原虫Pvivax、卵形マラリア原虫Povale、四日熱マラリア原虫Pmalariaを含めた種;トキソプラズマ原虫Toxoplasmagondii;メキシコリーシュマニアLeishmaniamexicana、熱帯リーシュマニアLtropica、L.マジョールLmajor、L.アエチオピカLaethiopica、ドノバンリーシュマニアLdonovani、クルーズトリパノソーマTrypanosomacruzi、T.ブルーセイTbrucei、マンソン住血吸虫Schistosomamansoni、ビルハルツ住血吸虫Shaematobium、日本住血吸虫Sjaponium;旋毛虫Trichinellaspiralis;バンクロフト糸状虫Wuchereriabancrofti;マレー糸状虫Brugiamalayli;赤痢アメーバEntamoebahistolytica;ヒトギョウチュウEnterobiusvermiculoarus;有鉤条虫Taeniasolium、無鉤条虫Tsaginata、膣トリコモナスTrichomonasvaginatis、T.ホミニスThominis、T.テナックスTtenax;ランブル鞭毛虫Giardialamblia;クリプトスポリジウムパルバムCryptosporidiumparvum;ニューモシスティスカリニイPneumocytiscarinii、バベシアボビスBabesiabovis、B.ディヴァージェンスBdivergens、B.ミクロティBmicroti、イソスポラベリIsosporabelli、L.ホミニスLhominis;ジエンタモエバフラギリスDientamoebafragilis;回旋糸状虫Onchocercavolvulus;回虫Ascarislumbricoides;アメリカ鉤虫Necatoramericanis;ズビニ鉤虫Ancylostomaduodenale;糞線虫Strongyloidesstercoralis;フィリピン毛頭虫Capillariaphilippinensis;広東住血線虫Angiostrongyluscantonensis;ヒメノレピスナナHymenolepisnana;広節裂頭条虫Diphyllobothriumlatum;単包条虫Echinococcusgranulosus、多包条虫Emultilocularis;ウェステルマン肺吸虫Paragonimuswestermani、P.カリエンシスPcaliensis;クロノルチスシネンシスChlonorchissinensis;ネコ肝吸虫Opisthorchisfelineas、G.ビベリーニGViverini、肝蛭Fasciolahepatica、ヒゼンダニSarcoptesscabiei、ヒトジラミPediculushumanus;フチルラスプビスPhthirluspubis;及びヒトヒフバエDermatobiahominis、並びに現在知られており又は後に病原性であると同定される任意のその他の寄生虫から得られた抗原が含まれるが、これらに限定されない。5.4.2異種遺伝子配列の挿入本発明のウイルスベクターへの外来遺伝子配列の挿入は、ウイルスコード領域を異種配列で完全置換することによって、又は部分置換することによって、又はウイルスゲノムに異種ヌクレオチド配列を付加することによって行うことができる。完全置換は、PCR誘導型の変異誘発性を使用することにより、おそらく最良に行われると考えられる。簡単に説明すると、PCRプライマーAは、5’末端から3’末端まで、クラスIIS制限酵素部位などの固有の制限酵素部位すなわちシフター酵素;特定の配列を認識するがその配列の上流又は下流でDNAを切断する;置換される遺伝子の領域に相補的なヌクレオチドの伸長部;及び異種配列のカルボキシ末端コード部分に相補的なヌクレオチドの伸長部を含有すると考えられる。PCRプライマーBは、5’末端から3’末端まで、固有の制限酵素部位;置換される遺伝子に相補的なヌクレオチドの伸長部;及び異種又は非天然遺伝子の5’コード部分に対応するヌクレオチドの伸長部を含有すると考えられる。これらのプライマーを使用して、クローニングした異種又は非天然遺伝子のコピーについてPCR反応させた後、固有の制限部位を使用して生成物を切り出しクローニングすることができる。クラスIIS酵素による消化、及び精製したファージポリメラーゼによる転写によって、結果的に異種又は非天然遺伝子の挿入を持つようになったウイルス遺伝子の正確な非翻訳末端を含有するRNA分子が生成されると考えられる。代替の実施形態においては、PCRによる刺激を受けた反応を使用して、バクテリオファージプロモーター配列及びハイブリッド遺伝子配列を含有する2本鎖DNAを調製することができ、その結果、RNA鋳型をクローニングすることなく直接転写できるようになる。異種ヌクレオチド配列は、本発明のウイルスの様々な位置に付加し又は挿入することができる。一実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置1に付加し又は挿入する。別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置2に付加し又は挿入する。別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置3に付加し又は挿入する。別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置4に付加し又は挿入する。別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置5に付加し又は挿入する。さらに別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置6に付加し又は挿入する。本明細書で使用する位置という用語は、転写するウイルスゲノム上の異種ヌクレオチド配列の位置を指し、例えば位置1は、第1の遺伝子が転写されることを意味し、位置2は、第2の遺伝子が転写されることを意味する。ウイルスのより低い数字の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入すると一般に、より大きい数字の位置に挿入した場合比べて異種ヌクレオチド配列の発現が強くなるが、これはウイルスのゲノム全体にわたって生ずる転写勾配が原因である。しかしこの転写勾配は、特定の割合のウイルスmRNAももたらす。外来遺伝子を挿入するとこの割合が乱れ、その結果、種々の量のウイルスタンパク質が合成されて、ウイルスの複製に影響を及ぼす可能性がある。このように、挿入部位を選択する場合には、転写勾配と複製動態の両方を考慮しなければならない。より低い数字の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入することは、異種ヌクレオチド配列の強力な発現が望まれる場合、本発明の好ましい実施形態になる。好ましい実施形態においては、異種配列を位置1、2、又は3に付加し又は挿入する。本発明のウイルスに異種ヌクレオチド配列を挿入する場合、所望の効果が実現されるように、異種遺伝子のコード配列の終端と下流遺伝子のコード配列の開始点との間の遺伝子間領域を変化させることができる。本明細書で使用する遺伝子間領域という用語は、1つの遺伝子の停止シグナルと、その隣の下流にあるオープンリーディングフレームのコード配列の開始コドン例えばAUGとの間のヌクレオチド配列を指す。遺伝子間領域は、遺伝子の非コード領域、すなわち遺伝子の転写開始部位とコード配列の開始点AUGとの間を構成することができる。この非コード領域は、いくつかのウイルス遺伝子内で自然に生ずる。様々な実施形態において、異種ヌクレオチド配列とその下流の遺伝子との間の遺伝子間領域は、互いに独立に、少なくとも長さ10ntに、少なくとも長さ20ntに、少なくとも長さ30ntに、少なくとも長さ50ntに、少なくとも長さ75ntに、少なくとも長さ100ntに、少なくとも長さ125ntに、少なくとも長さ150ntに、少なくとも長さ175ntに、又は少なくとも長さ200ntになるように設計製作することができる。ある実施形態において、異種ヌクレオチド配列とその下流の遺伝子との遺伝子間領域は、互いに独立に、最大でも長さ10ntに、最大でも長さ20ntに、最大でも長さ30ntに、最大でも長さ50ntに、最大でも長さ75ntに、最大でも長さ100ntに、最大でも長さ125ntに、最大でも長さ150ntに、最大でも長さ175ntに、又は最大でも長さ200ntになるように設計製作することができる。様々な実施形態において、ウイルスゲノム内の所望の遺伝子の非コード領域も、互いに独立に、少なくとも長さ10ntに、少なくとも長さ20ntに、少なくとも長さ30ntに、少なくとも長さ50ntに、少なくとも長さ75ntに、少なくとも長さ100ntに、少なくとも長さ125ntに、少なくとも長さ150ntに、少なくとも長さ175ntに、又は少なくとも長さ200ntになるように設計製作することができる。ある実施形態において、ウイルスゲノム内の所望の遺伝子の非コード領域も、互いに独立に、最大でも長さ10ntに、最大でも長さ20ntに、最大でも長さ30ntに、最大でも長さ50ntに、最大でも長さ75ntに、最大でも長さ100ntに、最大でも長さ125ntに、最大でも長さ150ntに、最大でも長さ175ntに、又は最大でも長さ200ntになるように設計製作することができる。異種ヌクレオチド配列を挿入する場合、所望の効果を実現するために、位置的な作用と遺伝子間領域の操作を組み合わせて用いることができる。例えば異種ヌクレオチド配列は、位置1、2、3、4、5、及び6からなる群から選択された位置に付加し又は挿入することができ、異種ヌクレオチド配列とこれに隣接する下流の遺伝子との間の遺伝子間領域を変化させることができる表3参照。本発明に包含される組合せのいくつかを、例として表3に示す。挿入された異種ヌクレオチド配列の目的例えば強力な免疫原性をもたせるなどに応じ、挿入の位置と挿入された異種ヌクレオチド配列の遺伝子間領域の長さとは、以下の非限定的なアッセイ例、すなわちプラークアッセイ、蛍光焦点fluorescentfocusアッセイ、感染中心アッセイ、形質転換アッセイ、終点希釈アッセイ、平板効率、電子顕微鏡法、血球凝集素、ウイルス酵素活性の測定、ウイルス中和、血球凝集素抑制、補体結合法、免疫染色、免疫沈降及び免疫ブロット法、酵素結合免疫吸着アッセイ、核酸検出例えばサザンブロット分析、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、増殖曲線、レポーター遺伝子の使用例えば、タンパク質発現を観察するために、対象の異種遺伝子と同じ手法でウイルスゲノムに組み込まれた緑色蛍光タンパク質GFPや増強緑色蛍光タンパク質eGFPなどのレポーター遺伝子の使用、又はこれらの組合せによって測定された、複製動態及びタンパク質又はmRNAの発現レベルも含むがこれらに限定されない様々な指標によって、決定することができる。これらのアッセイを行う手順は、当技術分野で周知であり例えば、Flint他、PRINCIPLESOFVIROLOGYMOLECULARBIOLOGYPATHOGENESISANDCONTROL、2000、ASMPress、第25~56頁参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する、非限定的な例を以下の実施例のセクションに示す。例えば発現レベルは、培養中の細胞を本発明のウイルスに感染させ、その後、例えば異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析やELISAでタンパク質発現レベルを測定することによって、又は例えば異種配列に特異的なプローブを使用したノーザンブロット分析でRNA発現レベルを測定することによって決定することができる。同様に異種配列の発現レベルは、動物モデルに感染させて、動物モデルにおける本発明の組換えウイルスの異種配列から発現したタンパク質のレベルを測定することによって、決定することができる。タンパク質のレベルは、感染した動物から組織サンプルを得、次いでその組織サンプルを、異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析又はELISAにかけることによって、測定することができる。さらに、動物モデルを使用する場合、異種配列の遺伝子産物に対する動物によって産生された抗体の力価は、ELISAを含むがこれに限定されない当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。異種配列は、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列と同種である可能性があるので、プローブ及び抗体が異種配列又はその遺伝子産物に対して確かに特異的になるように注意を払うべきである。ある特定の実施形態において、キメラトリ-ヒトメタニューモウイルス由来のhMPVのFタンパク質の発現レベルは、当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。Fタンパク質の発現レベルは、培養中の細胞を本発明のキメラウイルスに感染させ、例えばhMPVのFタンパク質及び/又はGタンパク質に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析やELISAなどでタンパク質発現レベルを測定することによって、あるいは例えばヒトメタニューモウイルスのF遺伝子及び/又はG遺伝子に特異的なプローブを使用したノーザンブロット分析でRNA発現レベルを測定することによって決定することができる。同様に異種配列の発現レベルは、動物モデルを使用し、その動物モデルに感染させて動物モデルにおけるFタンパク質及び/又はGタンパク質のレベルを測定することにより、決定することができる。タンパク質のレベルは、感染した動物から組織サンプルを得、次いでその組織サンプルを、異種配列のFタンパク質及び/又はGタンパク質に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析又はELISAにかけることによって、測定することができる。さらに、動物モデルを使用する場合、Fタンパク質及び/又はGタンパク質に対する動物によって産生された抗体の力価は、ELISAを含むがこれに限定されない当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。本発明の組換えウイルスの複製速度は、当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。ある実施形態においては、ウイルスゲノムにおける異種配列の最適な位置と遺伝子間領域の最適な長さの特定を容易にするために、異種配列がレポーター遺伝子をコードする。最適なパラメータを決定したら、そのレポーター遺伝子を、選ばれた抗原をコードする異種ヌクレオチド配列に置き換える。当業者に知られる任意のレポーター遺伝子は、本発明の方法と共に使用することができる。より詳細に関してはセクション5.8を参照されたい。組換えウイルスの複製速度は、当業者に知られている任意の標準的技法により決定することができる。複製速度はウイルスの増殖率で表され、感染後の時間に対してウイルス力価をプロットすることにより決定することができる。ウイルス力価は、当業者に知られている任意の技法によって測定することができる。ある実施形態においては、ウイルスを含有する懸濁液を、ウイルスに感染し易い細胞と共にインキュベートする。本発明の方法と共に使用することができる細胞型には、Vero細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF1043HEL細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、tMK細胞、293T細胞、QT6細胞、QT35細胞、又はニワトリ胚線維芽細胞CEFが含まれるがこれらに限定されない。ウイルスを細胞と共にインキュベートした後、感染した細胞の数を決定する。ある特定の実施形態においては、ウイルスがレポーター遺伝子を含む。したがってレポーター遺伝子を発現する細胞の数は、感染した細胞の数を表す。特定の実施形態においては、ウイルスが、eGFPをコードする異種ヌクレオチド配列を含み、eGFPを発現する細胞の数、すなわちウイルスに感染した細胞の数は、FACSを使用して決定される。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスの複製速度は、その組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下での複製速度に対し、最大でもその20である。同じ条件とは、ウイルスの初期力価が同じであり、細胞株が同じであり、インキュベーション温度、増殖培地、細胞数、及びその他の複製速度に影響を及ぼす可能性のある試験条件が同じであることを指す。例えば位置1におけるPIVのF遺伝子によるAPV/hMPVの複製速度は、最大でもAPVの複製速度の20である。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下での複製速度に対し、最大でもその5、最大でも10、最大でも20、最大でも30、最大でも40、最大でも50、最大でも75、最大でも80、最大でもその90である。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下での複製速度に対し、少なくともその5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも80、少なくともその90である。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下での複製速度に対し、その5から20の間、10から40の間、25から50の間、40から75の間、50から80の間、又は75から90の間である。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下でのFタンパク質の発現レベルに対し、最大でもその20である。同じ条件とは、ウイルスの初期力価が同じであり、細胞株が同じであり、インキュベーション温度、増殖培地、細胞数、及びその他の複製速度に影響を及ぼす可能性のある試験条件が同じであることを指す。例えば、hMPVの位置1におけるPIV3のFタンパク質の異種配列の発現レベルは、hMPVのFタンパク質の発現レベルに対して最大でも20である。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下でのFタンパク質の発現レベルに対し、最大でもその5、最大でも10、最大でも20、最大でも30、最大でも40、最大でも50、最大でも75、最大でも80、最大でもその90である。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下でのFタンパク質の発現レベルに対し、少なくともその5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも80、少なくともその90である。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下でのFタンパク質の発現レベルに対し、その5から20の間、10から40の間、25から50の間、40から75の間、50から80の間、又は75から90の間である。5.4.3異種遺伝子配列のG遺伝子への挿入Gタンパク質は、メタニューモウイルスの膜貫通タンパク質である。特定の実施形態においては、ウイルスエンベロープの表面に発現するように、外部ドメインをコードするG-ORFの領域に異種配列を挿入する。1つの手法では、いかなるウイルス配列も欠失させることなく、異種配列を抗原部位に挿入することができる。別の手法では、異種配列がG-ORFの配列に取って代わる。そのような構築物の発現産物は、外来抗原に対するワクチンに役立てることができ、ワクチン接種した宿主での組換えウイルスの増殖に伴う問題を確かに回避することができる。抗原部位のみが置換されている無傷のG分子によって、G機能が可能になり、したがって生存可能なウイルスの構築物が可能になる。したがってこのウイルスは、さらなるヘルパー機能を必要とせずに、増殖することができる。ウイルスは、あらゆる偶発的な逸脱の危険性が回避されるように、その他の方法で弱毒化してもよい。その他のハイブリッド構築物は、細胞表面にタンパク質が発現するように、又はタンパク質が細胞から遊離するように作製することができる。5.4.42シストロンRNAの構築物2シストロン性mRNAは、ウイルス配列の翻訳の内部開始が可能になるように、また規則的な末端開始部位から外来タンパク質コード配列の発現が可能になるように、構築することができる。あるいは2シストロン性mRNA配列は、ウイルス配列が規則的な末端オープンリーディングフレームから翻訳されるがその一方で外来配列が内部部位から開始するものを構成することができる。ある特定の内部リボソーム進入部位IRES配列を利用することができる。選択されるIRES配列は、MPVパッケージングの限界に影響を与えないように、十分短いものであるべきである。したがって、そのような2シストロン的手法を目的として選択されるIRESは、その長さが500ヌクレオチド以下であることが好ましい。特定の実施形態において、IRESは、1つのピコルナウイルスから得られ、いかなる追加のピコルナウイルス配列も含まない。特定のIRES要素には、哺乳動物BiPIRESとC型肝炎ウイルスIRESが含まれるが、これらに限定されない。あるいは外来タンパク質を、転写単位が開始部位及びポリアデニル化部位を有する新しい内部転写単位から発現させることができる。別の実施形態においては、得られる発現タンパク質が融合タンパク質になるように、外来遺伝子をMPV遺伝子に挿入する。5.5組換えcDNA及びRNA鋳型を使用した異種遺伝子産物の発現上述のように調製されたウイルスベクター及び組換え鋳型は、適切な宿主細胞に異種遺伝子産物が発現するように、又は異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスが生成されるように、様々な方法で使用することができる。一実施形態においては、組換えcDNAを使用して適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができ、得られたRNAを用いて異種遺伝子産物の発現を高いレベルで実施することができる。高レベルの発現をもたらす宿主細胞系は、それぞれAPV又はMPVに重感染した細胞系、APV又はMPV機能を補完するよう設計製作された細胞系など、ウイルス機能を提供する連続した細胞系を含む。本発明の代替の実施形態においては、異種遺伝子産物の発現を実現するために、組換え鋳型を使用して、ウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系をトランスフェクトすることができる。このため、Lタンパク質などのポリメラーゼタンパク質を発現する形質転換された細胞系を、適切な宿主細胞として利用することができる。宿主細胞は、その他のウイルス機能又はGやNなどの追加の機能が得られるように同様に設計製作することができる。別の実施形態において、ヘルパーウイルスは、異種遺伝子産物の発現を実現するために、細胞によって利用されるRNAポリメラーゼタンパク質を提供することができる。さらに別の実施形態においては、細胞に、N、P、L、及びM2-1タンパク質などのウイルスタンパク質をコードするベクターをトランスフェクトすることができる。5.6組換えウイルス粒子のレスキュー本発明のキメラ及び組換えウイルスを調製するために、プラス又はマイナスセンスで本発明の組換え又はキメラウイルスのゲノムをコードするcDNAを使用して、複製及びレスキューに必要なウイルスタンパク質及び機能をもたらす細胞にトランスフェクトすることができる。あるいは、本発明の組換えウイルスをコードするDNA又はRNA分子によるトランスフェクションの前、間、又は後に、細胞にヘルパーウイルスをトランスフェクトすることができる。本発明の合成組換えプラスミドDNA及びRNAは、例えば1992年11月24日発行の米国特許第5,166,057号;1998年12月29日発行の米国特許第5,854,037号;1996年2月20日公開の欧州特許公開EP0702085A1;米国特許出願第09/152,845号;1997年4月3日公開の国際特許公開PCTWO97/12032号;1996年11月7日公開のWO96/34625;欧州特許公開EP-A780475;1999年1月21日公開のWO99/02657;1998年11月26日公開のWO98/53078号;1998年1月22日公開WO98/02530号;1999年4月1日公開のWO99/15672号;1998年4月2日公開のWO98/13501号;1997年2月20日公開のWO97/06270号;及び1997年6月25日公開のEPO78047SA1であって、その全体が参照により本明細書に援用されているものに記載されているような、当技術分野で知られている数多くの技法によって、感染性ウイルス粒子に複製し又はレスキューすることができる。本発明の一実施形態においては、ウイルスポリメラーゼによる認識に不可欠でありかつ成熟したウイルス粒子の生成に必要とされるパッケージングシグナルに不可欠な、マイナス鎖ウイルスRNAの非コード領域リーダー及びトレーラーを含有する合成組換えウイルスRNAを調製することができる。逆遺伝学的手法をレスキューマイナス鎖RNAウイルスに適用するのに使用することが可能な、いくつかの異なる手法がある。まず、組換えRNAを組換えDNA鋳型から合成し、精製したウイルスポリメラーゼ複合体を用いて生体外で再構成し、それによって、細胞にトランスフェクトするのに使用することができる組換えリボ核タンパク質RNPを形成する。別の手法では、生体外又は生体内での合成RNAの転写中にウイルスポリメラーゼタンパク質が存在する場合、より効率的なトランスフェクションを実現する。この手法によれば、合成RNAをcDNAプラスミドから転写することができるが、これは、ポリメラーゼタンパク質をコードするcDNAプラスミドと共に生体外で同時転写され、又はポリメラーゼタンパク質の存在下で生体内で転写され、すなわちポリメラーゼタンパク質を一時的に又は構造上の要素として発現する細胞内で転写されたものである。本明細書で述べる追加の手法では、感染性のキメラ又は組換えウイルスは、メタニューモウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する宿主細胞系内で複製され例えばウイルス/宿主細胞発現系内で;ポリメラーゼタンパク質を発現するように設計製作された形質転換細胞系など、したがって感染性のキメラ又は組換えウイルスが複製され、レスキューされる。この場合、この機能は、発現するウイルスポリメラーゼタンパク質によって得られるので、ヘルパーウイルスを利用する必要がない。本発明によれば、当業者に知られている任意の技法を使用して、組換え及びキメラウイルスの複製及びレスキューを実現することができる。ある手法では、宿主細胞をトランスフェクトする前に生体外での複製に必要なウイルスタンパク質及びウイルス機能を提供する。そのような実施形態においては、ウイルスタンパク質を、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、精製ウイルスタンパク質、又は組換え発現したウイルスタンパク質の形で提供することができる。ウイルスタンパク質は、キメラウイルスをコードする合成cDNA又はRNAを転写する前、転写する間、又は転写した後に提供することができる。宿主細胞をトランスフェクトするには、混合物全体を使用することができる。別の手法では、複製に必要とされるウイルスタンパク質及びウイルスの機能を、キメラウイルスをコードする合成cDNA又はRNAを転写する前、又は転写する間に提供することができる。そのような実施形態において、複製に必要とされるウイルスタンパク質及びウイルスの機能は、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、ウイルス抽出物、合成cDNA又はRNAであってウイルスタンパク質を発現する形で提供され、これらが感染又はトランスフェクションによって宿主細胞内に導入される。この感染/トランスフェクションは、キメラウイルスゲノムをコードする合成cDNA又はRNAを導入する前、又は導入と同時に行う。特に望ましい手法では、本発明の全てのウイルス遺伝子あるいはキメラ又は組換えウイルスを発現するように設計製作された細胞、すなわちAPV、MPV、MPV/APV、又はAPV/MPVを発現するように設計製作された細胞により、所望の遺伝子型を含有する感染姓ウイルスが産生され、したがって選択系の必要性がなくなる。理論上、MPVの構造タンパク質をコードするORFのいずれか1つ、又はそのようなORFのいずれか1つの一部を、外来の配列に代えることができる。しかしこのような状況で必要な部分とは、欠陥ウイルス正常なウイルス遺伝子の産物が失われ又は変化しているので欠陥があるを増殖させる能力である。この問題を回避するため、いくつかの可能な手法が存在する。ある手法では、変異タンパク質を有するウイルスを、同じタンパク質の野生型バージョンを恒常的に発現するよう構成された細胞系内で増殖させることができる。この方法により、細胞系は、ウイルス内の変異体を補完する。同様の技法を使用して、MPV遺伝子のいずれかを恒常的に発現する形質転換細胞系を構成することができる。ウイルスタンパク質を発現するように作製されたこれらの細胞系を使用して、キメラ又は組換えウイルスの欠陥を補完し、それによって増殖させることができる。あるいは、ある特定の範囲の天然宿主系を利用して、キメラ又は組換えウイルスを増殖させることができる。さらに別の実施形態において、複製に必要とされるウイルスタンパク質及びウイルスの機能は、合成cDNA又はRNAの形の遺伝物質として提供することができ、その結果、キメラウイルスをコードする合成cDNA又はRNAと共転写されるようになる。特に望ましい手法では、キメラウイルス及びウイルスポリメラーゼ及び/又はその他のウイルス機能を発現するプラスミドが、宿主細胞内に同時にトランスフェクトされる。例えば、1つ又は複数の異種配列を持つか又は持たないゲノム又は抗ゲノムAPV、MPV、MPV/APV、又はAPV/MPVRNAをコードするプラスミドを、メタニューモウイルスポリメラーゼタンパク質N、P、L、又はM2-1をコードするプラスミドと共に宿主細胞内に同時にトランスフェクトすることができる。あるいは、本発明の組換えウイルスのレスキューは、T7RNAポリメラーゼをコードする変性ワクシニアウイルスAnkaraMVAの使用、又はポリメラーゼタンパク質N、P、及びLをコードするプラスミド及びMVAの組合せによって実現することができる。例えば、MVA-T7又はFowlPox-T7を、Vero細胞、LLC-MK-2細胞、HEp-2細胞、LF1043HEL細胞、tNK細胞、LLC-MK2、HUT292、FRHL-2アカゲザル、FCL-1ミドリザル、WI-38ヒト、MRC-5ヒト細胞、293T細胞、QT6細胞、QT35細胞、及びCEF細胞に感染させることができる。MVA-T7又はFowlPox-T7に感染した後、本発明の組換えウイルスをコードする完全長抗ゲノム又はゲノムcDNAを、N、P、L、及びM2-1コード発現プラスミドと共に細胞にトランスフェクトすることができる。あるいはポリメラーゼは、プラスミドのトランスフェクションによって得ることができる。その後、細胞及び細胞の上澄みを収集し、凍結融解サイクルに1回かけることができる。次いで得られた細胞溶解産物を使用して、1-β-D-アラビノフラノシルシトシンaraC、ワクシニアウイルスの複製阻害剤の存在下、新しいVero細胞の単層に感染させ、それによってウイルスストックを生成することができる。次いでこれらのプレートからの上澄み及び細胞を収集し、一度凍結融解することができ、本発明の組換えウイルス粒子の存在を、特定のウイルスに特異的な抗血清を使用するウイルスプラークの免疫染色によってアッセイすることができる。キメラ又は組換えウイルスを増殖させる別の手法では、野生型ウイルスと共に培養することができる。これは、単に組換えウイルスを得て、このウイルス及び別の野生型ウイルスを細胞に共感染させることにより行われる。野生型ウイルスは、欠陥遺伝子産物を補完して、野生型ウイルスと組換えウイルスの両方の成長を可能にすべきである。あるいは、ヘルパーウイルスを使用して、組換えウイルスの増殖を支援することができる。別の手法では、メタニューモウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する組換えウイルスを共感染させた細胞内で、合成鋳型を複製することができる。実際に、この方法を使用して、本発明による組換え感染性ウイルスをレスキューすることができる。このために、ウイルス発現ベクター例えばワクシニアウイルスやアデノウイルス、バキュロウイルスなど又はポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系例えばKrystal他、1986、ProcNatlAcadSciUSA832709~2713参照を含むがこれらに限定されない任意の発現ベクター/宿主細胞系内で、メタニューモウイルスポリメラーゼタンパク質を発現させることができる。さらに、全てのメタニューモウイルスタンパク質を発現する宿主細胞の感染により、感染性キメラウイルス粒子の産生が生じる。ウイルスの生存能力を変化させることなく、組換えウイルスを構成することが可能と考えられることに、留意すべきである。次いでこれらの変化したウイルスは増殖能力を持ち、複製するのにヘルパー機能を必要としないと考えられる。本発明の方法に従って組換えによってウイルスを生成するためには、ウイルスゲノムをコードする遺伝物質が転写されなければならない転写ステップ。このステップは、invitro宿主細胞の外でもinvivo宿主細胞内でも達成できる。ウイルスゲノムを遺伝物質から転写して、ウイルスゲノムのプラスセンスコピーアンチゲノムコピー、又はウイルスゲノムのマイナスセンスコピーゲノムコピーのいずれかを生成することができる。次のステップでは、ウイルスゲノムを複製し、さらに、複製されたゲノムをウイルス粒子中にパッケージングする必要がある複製及びパッケージングのステップ。このステップは、十分なレベルのウイルスポリメラーゼと、ウイルスの複製及びパッケージングに必要な構造タンパク質とを供給するように設計製作された宿主細胞の細胞内で行われる。転写ステップがinvitroで行われる場合、それに続いて、ウイルスゲノムの細胞内複製及びパッケージングが行われる。転写ステップがinvivoで行われる場合、ウイルスゲノムの転写は、当業者に知られている様々な方法を用いて、ウイルスゲノムをコードするウイルス性遺伝物質の発現の前に、同時に、又は後で行うことができ、このウイルスゲノムは様々な供給源から得られるか、又は生成することできる。遺伝物質は、ウイルスそれ自体から単離されたものでよい。例えば、ウイルスRNAゲノムとポリメラーゼタンパク質との複合体リボ核タンパク質複合体RNPを、ウイルス全体から単離することができる。その後、ウイルスRNAゲノムから付随タンパク質、例えばウイルスRNAポリメラーゼ及び核タンパク質が取り除かれる。ウイルスゲノムをコードする遺伝物質は、標準的な組換え技法を用いて生成できる。遺伝物質は完全長ウイルスゲノムをコードする場合も、その一部をコードする場合もある。あるいは、遺伝物質は、ウイルスゲノムのリーダー配列及び/又はトレーラー配列が隣接している異種配列をコードするものでよい。完全長ウイルスゲノムは、当技術分野で知られている技法を用いて、いくつかの、より小さなPCR断片から構成することができる。hMPVにおける種々の分離株の制限マップを図28に示す。完全長構築体を組み立てるのに、それらの制限部位を用いることができる。ある実施形態では、PCR反応から生成する断片が、その5’末端近傍の制限部位と、その3’末端近傍の制限部位とを有するように、PCRプライマーを設計する。その後、PCR産物をそれぞれの制限酵素で消化し、次に隣接するPCR断片と連結することができる。ウイルスゲノムの複製及びパッケージングを実現するためには、リーダー配列及びトレーラー配列が、ウイルスポリメラーゼによる認識に必要なシグナルを保持していることが重要である。ウイルスRNAゲノム用のリーダー配列及びトレーラー配列は、ウイルスの複製及びレスキューを改善及び促進するために、最適化又は改変することができる。あるいは、ウイルスの複製及びパッケージングの効率を低下させて、その結果として、弱毒化表現型を有するウイルスをレスキューするために、リーダー配列及びトレーラー配列を改変することもできる。種々のリーダー配列及びトレーラー配列の例には、パラミクソウイルスのリーダー配列及びトレーラー配列が含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態では、リーダー配列及びトレーラー配列は、野生型hMPV又は変異されたhMPVの配列である。本発明の別の実施形態では、リーダー配列及びトレーラー配列が、PIV、APV、又はRSVの配列である。本発明のさらに別の実施形態では、リーダー配列及びトレーラー配列が、異なったウイルス出自のものを組み合わせた配列である。可能な組合せの制限としてではなく、例として挙げれば、リーダー配列及びトレーラー配列は、hMPV、PIV、APV、RSV、又は任意の他のパラミクソウイルスのリーダー配列及びトレーラー配列のうちの任意のものの組合せでよい。リーダー配列及びトレーラー配列に対する改変の例には、ウイルスプロモータに対する間隔の変更、配列の変更、例えばG残基の数通常0~3の変更、並びに、デルタ肝炎ウイルスHDVリボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、又はリボザイム触媒能を保持したその断片を含めたリボザイム配列の使用、及びinvitroで生成されたランオフRNAに対する制限酵素の使用による5’末端又は3’末端の決定が含まれる。代替の一実施形態では、ウイルスゲノムが六量体長である場合に、ウイルスの複製及びレスキューの効率が改善されうる。ウイルスゲノムが適切な長さのものであることを確実にするために、デルタ肝炎ウイルスHDVリボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、又はリボザイム触媒能を保持したそれらの断片を含めたリボザイム配列を使用し、invitroで生成されたランオフRNAに対して制限酵素を使用して、5’末端又は3’末端を決定することができる。ウイルスゲノムをコードする遺伝物質が転写されるには、その遺伝物質が適切な転写制御配列、例えば、ポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列の制御下に配置されるように設計製作する。好ましい実施形態では、プロモーター配列がT7、Sp6、又はT3ポリメラーゼによって認識される。さらに別の実施形態では、プロモーター配列が、RNAポリメラーゼIPolI又はRNAポリメラーゼIIPolIIなどの、細胞性のDNA依存性RNAポリメラーゼによって認識される。ウイルスゲノムをコードする遺伝物質は、ウイルスゲノムのプラス鎖コピー又はマイナス鎖コピーのいずれかが転写されるように、転写制御配列の制御下に配置することができる。ウイルスゲノムをコードする遺伝物質は、プラスミドベースのベクター、例えば、CMVの即時型プロモーターなどのpolIIプロモーターを備えたプラスミド、T7プロモーターを備えたプラスミド、又はウイルスベースのベクター、例えば、ワクシニアベクター、MVA-T7、及び鶏痘ベクターを含めた痘疹ウイルスベクターなど、発現ベクター中において転写制御配列に機能的に連結されるように、組換えによって設計製作する。ウイルスゲノムをコードする遺伝物質は、選択されたポリメラーゼによる発現を促進するように改変すること、例えば、T7プロモーターから発現を最適化するためにリーダー配列又はトレーラー配列の上流にあるG残基の数通常0から3を変化させることができる。ウイルスゲノムの複製及びパッケージングは、ウイルスの複製及びパッケージングを許容する宿主細胞の細胞内で起こる。宿主細胞を設計製作するいくつかの方法があり、それらによって複製及びパッケージングに必要なウイルスポリメラーゼ及び構造タンパク質を十分なレベルで提供するように宿主細胞を設計製作することができるが、そのような宿主細胞には、適切なヘルパーウイルスに感染している宿主細胞、ウイルスポリメラーゼ及び構造タンパク質を安定的又は構成的に発現するように設計製作されている宿主細胞、あるいは、ウイルスポリメラーゼ及び構造タンパク質を一時的に、若しくは誘導によって発現するように設計製作されている宿主細胞が含まれる。MPVウイルスの複製及びパッケージングに必要なタンパク質機能には、ポリメラーゼタンパク質P、N、L、及びM2-1が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、発現されるタンパク質が天然又は野生型のMPVタンパク質である。別の実施形態では、発現されるタンパク質を、標準的な組換え技法の使用によって、それらの発現レベル及び/又はポリメラーゼ活性を促進するように改変することができる。あるいは、ポリメラーゼ活性を保持するポリメラーゼタンパク質の断片、誘導体、類似体、又は末端切断型を発現させることもできる。さらに別の実施形態では、APVなどの他のニューモウイルス又は任意の他のパラミクソウイルスに由来する類似のポリメラーゼタンパク質を発現させることができる。さらに、MPVのある株のタンパク質を別の株のゲノムと共に発現させることによって弱毒化ウイルスを生成することもできる。例えば、MPVのある株のポリメラーゼタンパク質を別の株のゲノムと共に発現させて、弱毒化表現型を生成することができる。ウイルスポリメラーゼタンパク質は、ヘルパーウイルスによって提供することができる。本発明に従って使用できるヘルパーウイルスには、MPVやAPVなど、ポリメラーゼウイルスタンパク質を天然に発現するものが含まれる。あるいは、ポリメラーゼウイルスタンパク質を提供するように組換えによって設計製作されたヘルパーウイルスを使用することもできる。あるいは、発現ベクターによってウイルスポリメラーゼタンパク質を提供することもできる。ウイルスポリメラーゼタンパク質をコードする配列は、適切な転写制御配列、例えばポリメラーゼによって認識されたプロモーター配列の制御下に配置されるように設計製作する。好ましい実施形態では、プロモーター配列がT7、Sp6、又はT3ポリメラーゼによって認識される。さらに別の実施形態では、プロモーター配列がPolI又はPolIIポリメラーゼによって認識される。あるいは、プロモーター配列は、CMVなどのウイルスのポリメラーゼによって認識される。ウイルスポリメラーゼタンパク質をコードする配列は、プラスミドベースのベクター、例えば、CMV駆動のプラスミド、T7駆動のプラスミドや、ウイルスベースのベクター、例えば、ワクチニアベクター、MVA-T7、及び鶏痘ベクターを含めた痘疹ウイルスベクターなどの発現ベクター中において転写制御配列に機能的に連結されるように組換えによって設計製作する。ウイルスの効率的な複製及びパッケージングを実現するためには、ポリメラーゼタンパク質の発現レベルが高いことが好ましい。そのようなレベルは、パラミクソウイルスのタンパク質をコードするL/pCITEプラスミド100~200ng、N/pCITEプラスミド200~400ng、P/pCITEプラスミド200~400ng、及びM2-1/pCITEプラスミド100~200ngを、MVA-T7に感染している細胞にトランスフェクトされている完全長ウイルスcDNAをコードするプラスミド2~4μgと共に使用して得る。別の実施形態では、pSH25CATを発現する0.1~2.0μg、pRF542T7ポリメラーゼを発現する0.1~3.0μg、NcDNAインサートを有するpCITEベクター0.1~0.8μg、並びに、P、L、及びM2-1cDNAインサートを含有する3つのpCITEベクター各0.1~1.0μgを使用する。あるいは、精製されたリボ核タンパク質で細胞をトランスフェクトすることによって、遺伝物質と共に、1つ又は複数のポリメラーゼ及び構造タンパク質を細胞に導入することができる。MPVウイルスの複製及びパッケージングを許容する宿主細胞が好ましい。好ましい宿主細胞の例には293T、Vero、tMK、及びBHKが含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞の他の例には、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF1043HEL細胞、LLC-MK2、HUT292、FRHL-2アカゲザル、FCL-lミドリザル、WI-38ヒト、MRC-5のヒト細胞、QT6細胞、QT35細胞、及びCEF細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明の代替的実施形態では、トランスフェクション及び/又は感染の効率、タンパク質発現のレベルを向上させるために、ウイルスの複製及びパッケージングを最適化するために、いくつかの方法を用いて宿主細胞の処理を行うことができる。そのような処理方法には、超音波処理、凍結/解凍、及び熱ショックが含まれるが、これらに限定されない。さらに、限定されるものではないが、DEAE-デキストラン媒介型のトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクチン処理、リポソーム媒介型のトランスフェクション、エレクトロポレーションを含めた、当業者に知られている標準的な技法を使用して、トランスフェクション及び/又は感染プロトコールを最適化することができる。当業者ならば、トランスフェクション/感染プロトコールの最適化に利用可能な標準的な技法にも精通しているであろう。利用可能な技法を限定するのではなく例として挙げれば、使用することのできる方法には、必要なタンパク質の提供にウイルスを使用する際に、トランスフェクションとの比較における感染のタイミングを操作すること、異なるプラスミドのトランスフェクションのタイミングを操作すること、及び、ウイルスとトランスフェクトされたプラスミドとの相対量に影響を与えることが含まれる。別の実施形態では、本発明は、レスキューされるもの以外のウイルスに由来するポリメラーゼを使用して、cDNAから生きているウイルスをレスキュー又は生成することに関する。ある実施形態では、限定されるものではないが、種間ポリメラーゼ及び種内ポリメラーゼを含めたいくつかのポリメラーゼのうち任意のものを使用して、hMPVをcDNAからレスキューする。ある実施形態では、hMPV複製に必要な最小限の複製単位を発現する宿主細胞内で、hMPVをレスキューする。例えば、限定されるものではないが、RSV、APV、MPV、又はPIVのポリメラーゼを含めたいくつかのポリメラーゼを使用して、hMPVをcDNAからレスキューすることができる。本発明の特定の実施形態では、RNAウイルスのポリメラーゼを使用してhMPVをレスキューする。本発明のより具体的な実施形態では、マイナス鎖RNAウイルスのポリメラーゼを使用してhMPVをレスキューする。本発明のさらに具体的な実施形態では、RSVポリメラーゼを使用してhMPVをレスキューする。本発明の別の実施形態では、APVポリメラーゼを使用してhMPVをレスキューする。本発明のさらに別の実施形態では、MPVポリメラーゼを使用してhMPVをレスキューする。本発明の別の実施形態では、PIVポリメラーゼを使用してhMPVをレスキューする。本発明のさらに特定の実施形態では、hMPVポリメラーゼタンパク質の複合体を使用して、hMPVをcDNAからレスキューする。例えば、L、P、N、及びM2-1タンパク質からなるポリメラーゼ複合体を使用してhMPVミニレプリコンをレスキューすることができる。本発明の別の実施形態では、ポリメラーゼ複合体がL、P、及びNタンパク質からなる。本発明のさらに別の実施形態では、限定されるものではないが、RSV、PIV、及びAPVなどの他のウイルスに由来するポリメラーゼタンパク質からなるポリメラーゼ複合体を使用してcDNAからhMPVをレスキューする。詳細には、RSV、PIV、APV、MPV、又はこれらの任意の組合せのL、P、N、及びM2-Iタンパク質からなるポリメラーゼ複合体を使用しても、hMPVをcDNAからレスキューすることができる。本発明のさらに別の実施形態では、cDNAからhMPVをレスキューするのに使用されるポリメラーゼ複合体がRSV、PIV、APV、MPV、又はこれらの任意の組合せのL、P、及びNタンパク質からなる。本発明のさらに別の実施形態では、ポリメラーゼ複合体を形成するのに様々なウイルスに由来する異なったポリメラーゼタンパク質を使用することができる。そのような実施形態では、RSV、PIV、APV、又はMPVポリメラーゼの異なった構成要素によって、hMPVをレスキューするのに使用されるポリメラーゼを形成することができる。複合体を形成する際の可能な組合せを制限としてではなく、例として挙げれば、Nタンパク質は、RSV、APV、PIV、又はMPVのN遺伝子でコードされたものでよく、一方、Lタンパク質は、RSV、APV、PIV、又はMPVのL遺伝子によってコードされたものでよく、そして、Pタンパク質は、RSV、APV、PIV、又はMPVのP遺伝子でコードされたものでよい。当業者ならば、cDNAからhMPVをレスキューするのに必要なポリメラーゼ複合体を形成するのに使用できる可能な組合せを決定することができよう。ある実施形態では、頑健でありかつ生産性の高い細胞培養これは例えば、本発明のウイルスワクチン候補の製造に有益であろうを生成するのにウイルス増殖の条件を最適化する。重要なパラメータを特定することができ、生産工程は、まず、拡張性、頑健さ、及び再現精度を決定する小規模実験で最適化することができ、後に、ウイルスの大規模生産に適合させることができる。ある実施形態では、本発明の方法を使用して増殖が行われるウイルスがhMPVである。ある実施形態では、本発明の方法を使用して増殖が行われるウイルスが組換えhMPV又はキメラhMPVである。ある実施形態では、本発明の方法を使用して増殖が行われるウイルスが、以下のウイルス科、すなわち、アデノウイルス科Adenoviridae、アレナウイルス科Arenaviridae、アストロウイルス科Astroviridae、バキュロウイルス科Baculoviridae、ブンヤウイルス科Bunyaviridae、カリシウイルス科Caliciviridae、カウリモウイルスCaulimovirus、コロナウイルス科Coronaviridae、シストウイルス科Cystoviridae、フィロウイルス科Filoviridae、フラビウイルス科Flaviviridae、ヘパドナウイルス科Hepadnaviridae、ヘルペスウイルス科Herpesviridae、ハイポウイルス科Hypoviridae、イダエオウイルスIdaeovirus、イノウイルス科Inoviridae、イリドウイルス科Iridoviridae、レビウイルス科Leviviridae、リポスリックスウイルス科Lipothrixviridae、ルテオウイルスLuteovirus、マクロモウイルスMachlomovirus、マラフィウイルスMarafivirus、ミクロウイルス科Microviridae、ミオウイルス科Myoviridae、ネクロウイルスNecrovirus、ノダウイルス科Nodaviridae、オルトミクソウイルス科Orthomyxoviridae、パポバウイルス科Papovaviridae、パラミクソウイルス科Paramyxoviridae、パルチチウイルス科Partitiviridae、パルボウイルス科Parvoviridae、フィコドナウイルス科Phycodnaviridae、ピコルナウイルス科Picornaviridae、プラズマウイルス科Plasmaviridae、ポドウイルス科Podoviridae、ポリドナウイルス科Polydnaviridae、ポティウイルス科Potyviridae、ポックスウイルス科Poxviridae、レオウイルス科Reoviridae、レトロウイルス科Retroviridae、ラブドウイルス科Rhabdoviridae、セキウイルス科Sequiviridae、シフォウイルス科Siphoviridae、ソベモウイルスSobemovirus、テクチウイルス科Tectiviridae、テヌイウイルスTenuivirus、テトラウイルス科Tetraviridae、トバモウイルスTobamovirus、トブラウイルスTobravirus、トガウイルス科Togaviridae、トムブスウイルス科Tombusviridae、トチウイルス科Totiviridae、トリコウイルスTrichovirus、モノネガウイルス目Mononegaviralesのうちの1つのウイルスである。ある実施形態では、本発明の方法で増殖が行われるウイルスがRNAウイルスである。ある実施形態では、このウイルスは、Herpesviridae科のウイルスではない。ある実施形態では、このウイルスは、HSVではない。ある実施形態では、対象のウイルス又はウイルス構築体に感染している細胞培養を、培養される細胞の標準的な培養温度と比較して、それより低い感染後培養温度でインキュベートする。特定の実施形態では、対象のウイルス構築体に感染している細胞培養を、33°C又は約33°C例えば、33±1°Cでインキュベートする。ある実施形態では、感染後培養温度が、約25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、又は37°Cである。ある実施形態では、ウイルスに感染させる前に、細胞を細胞の成長に最適化された温度でインキュベートし、細胞をウイルスに感染させた後、すなわち感染後に、温度をさらに低い温度に移行させることによってウイルスの増殖を行う。ある実施形態では、温度移行が少なくとも1°C、2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、又は少なくとも12°Cである。ある実施形態では温度移行が、最大でも1°C、2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、又は最大でも12°Cである。特定の実施形態では、温度移行が4°Cである。ある実施形態では、対象のウイルス又はウイルス構築体に感染させる前には、血清を含有する培地中で細胞を培養し、そのウイルス又はウイルス構築体に感染させた後には、無血清の培地中で細胞を培養する。無血清で感染細胞を増殖させることに関するより詳細な記述には、無血清培地中のウイルスのプラスミドのみの回収という題のセクションを参照されたい。特定の実施形態では、血清がウシ胎仔血清であり、培養容積の5、培養容積の2、又は培養容積の0.5の濃度で存在する。ある実施形態では、ウイルスに感染した細胞を血清の非存在下でインキュベートすることによってウイルスの増殖を行う。ある実施形態では、ウイルスに感染した細胞を、5未満の血清、2.5未満の血清、1未満の血清、0.1未満の血清、0.01未満の血清、又は0.001未満の血清を含有している培地中でインキュベートすることによってウイルスの増殖を行う。ある実施形態では、ウイルスに感染させる前に、血清を含有している培地中で細胞をインキュベートする。ある実施形態では、細胞をウイルスに感染させた後に、血清の非存在下で細胞をインキュベートする。他の実施形態では、最初に、血清を含有している培地中で細胞をインキュベートし;次に細胞を無血清の培地に移し;そしてその後、ウイルスに感染した細胞をウイルスの非存在下でさらにインキュベートする。ある実施形態では、細胞から血清含有培地を除去し、そして無血清の培地を添加することによって、血清を含有している培地から血清を含有しない培地に細胞を移行させる。他の実施形態では、細胞を遠心し、血清を含有している培地を除去し、そして無血清の培地を添加する。ある実施形態では、ウイルスに一旦感染した細胞が血清の非存在下でインキュベートされることを確実にするために、細胞を無血清の培地で洗浄する。ある特定のより具体的な実施形態では、細胞を無血清培地で少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、又は少なくとも10回洗浄する。さらに他の実施形態では、ウイルス又はウイルス構築体に感染させる前には、細胞の成長に最適の温度で、血清を含有している培地で細胞を培養し、そして、対象のウイルス構築体に感染させた後には、より低い温度対応するウイルス又はウイルスベクターにとって標準的な培養温度と比較してで細胞培養をインキュベートする。特定の実施形態では、対象のウイルス構築体に感染させる前には、血清を含有している培地中で細胞を37°Cで培養し、そして、対象のウイルス構築体に感染させた後には、33°C又は約33°C例えば33±1°Cで細胞培養をインキュベートする。さらに他の実施形態では、ウイルス又はウイルス構築体に感染させる前には、細胞の成長に最適の温度で、血清を含有している培地で細胞を培養し、そして、対象のウイルス構築体に感染させた後には、より低い温度対応するウイルス又はウイルスベクターにとって標準的な培養温度と比較してで、無血清で細胞培養をインキュベートする。特定の実施形態では、対象のウイルス構築体に感染させる前には、血清を含有している培地中で細胞を37°Cで培養し、そして、対象のウイルス構築体に感染させた後には、33°C又は約33°C例えば33±1°Cで、無血清で細胞培養をインキュベートする。本発明のウイルス構築体及び方法は、ウイルスの商業生産、例えばワクチン生産に使用することができる。ワクチンの商業生産では、ワクチンが不活性化ウイルスのみを含有しているか、あるいは感染性ウイルス若しくは混入ウイルス核酸を全く含まないウイルスタンパク質のみを含有しているか、あるいは、病原性に戻らない弱毒化生ワクチンを含有していることが好ましい。また、生産中における外来性物質の導入によるワクチンの汚染も回避するべきである。本発明のワクチンの商業生産には、当技術分野で知られている、ウイルス又はウイルスタンパク質を大規模生産する方法を使用することができる。一実施形態では、本発明のワクチンを商業生産するのに、バイオリアクター又は発酵槽中で細胞を培養する。バイオリアクターは、1リットル未満から100リットル超までの容積で利用可能であり、例えば、Cyto3バイオリアクターOsmonics、MinnetonkaMN;NBSバイオリアクターNewBrunswickScientific、EdisonNJ;並びに、BBraunBiotechInternational製の実験規模及び商業規模のバイオリアクターBBraunBiotech、Melsungen、Germanyがある。別の実施形態では、ウイルスの商業生産の前に小規模のプロセス最適化研究を行い、最適化された条件を選択し、ウイルスの商業生産に使用する。無血清培地でのプラスミドレスキュー本発明のある実施形態では、ヘルパーウイルスなしでウイルスを回収することができる。より詳細には、ウイルスゲノムをコードするプラスミドと、複製及びレスキューに必要なウイルスタンパク質をコードするプラスミドとを細胞内に導入することによってウイルスを回収することができる。ある実施形態では、細胞を無血清培地で成長させ、維持する。ある実施形態では、エレクトロポレーションによってプラスミドを細胞内に導入する。特定の実施形態では、ウイルスのアンチゲノムcDNAをT7プロモーターの制御下にコードするプラスミドと、T7RNAポリメラーゼをコードするプラスミドと、Nタンパク質、Pタンパク質、及びLタンパク質をそれぞれT7プロモーターの制御下にコードするプラスミドとを、エレクトロポレーションでSFVero細胞の中に導入する。Vero細胞は、ATCCから入手して、以下のステップMikeBerryの研究室で開発されたに従って、無血清培地中で成長するように適合させた。1.T-25フラスコ内、DMEM5v/vFBS中のATCCCCL-81バイアルを解凍する、P121;2.DMEM5v/vFBS中で5代継代培養する、P126;3.FBS生育細胞をT-225フラスコ中のOptiPROInvitrogenCorporationに直接移す;4.OptiPRO中で7代継代培養する;5.継代数133~7でプレマスター細胞バンク株を凍結させる;6.OptiPRO中で4代継代培養する;7.継代数137でマスター細胞バンク株を凍結させる;8.OptiPRO中で4代継代培養する;9.継代数141で作業細胞バンク株WorkingCellBankStockを凍結させる;10.解凍させて、エレクトロポレーション及びウイルス増幅用に増殖させる。ウイルス粒子をレスキューする方法は、組換えウイルス粒子のレスキューとういう題のセクション5.6に記述する。ある実施形態では、ウイルスのレスキューに使用される細胞は、動物又はヒトに由来する成分を添加しなくても生育及び/又は維持できる細胞である。ある実施形態では、ウイルスのレスキューに使用される細胞は、無血清での成長に適合させる細胞である。特定の実施形態では、SFVero細胞をウイルスのレスキューに使用する。ある実施形態では、4mMのL-グルタミンを添加したOptiPROSFMInvitrogenCorporation中で、細胞を生育及び/又は維持する。ある実施形態では、血清を添加した培地中で細胞を生育するが、ウイルス粒子のレスキュー用には、細胞を無血清培地中に移す。特定の実施形態では、ウイルスのレスキューが無血清環境で行われることを確実にするために、細胞を無血清培地で洗浄する。細胞内へのプラスミドの導入は、その細胞で使用することができる、当業者に知られている方法のうち任意のものによって、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、又はリポソーム媒介型のトランスフェクションによって行われるShortProtocolsinMolecularBiology、1999、Ausubel他編、JohnWileySonsInc、Chapter9を参照。特定の実施形態では、細胞内にプラスミドDNAを導入するのにエレクトロポレーションを使用する。SFVero細胞は、リポフェクションに対して抵抗性を有する。必要なプラスミドでトランスフェクトされた細胞を選択するために、プラスミドは特定のマーカーを保持することもできる。そのようなマーカーには、限定されるものではないが、特定の抗生物質例えば、カナマイシン、ブラストサイジン、アンピシリン、ハイグロマイシンB、プロマイシン、及びゼオシン商標に対する耐性、特定の独立栄養特性を、マーカーなしではこの特性を持たない細胞に付与するマーカーが含まれ、あるいは、マーカーは、細胞の成長に必要であるが、プラスミドが導入される細胞では変異している遺伝子でもよい。ウイルスゲノム及び/又はウイルス遺伝子の転写は、プロモーターによる転写制御を受ける。したがって、ウイルスゲノム又はウイルスタンパク質をコードする配列はプロモーター配列に機能的に連結される。本発明の方法では、当業者に知られている任意のプロモーター/RNAポリメラーゼ系を使用することができる。ある実施形態では、プロモーターが、その細胞の内在的なRNAポリメラーゼによる転写を可能にするプロモーター、例えば、RNAポリメラーゼIPolIやRNAポリメラーゼIIPolIIなど、細胞性のDNA依存性RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列でありうる。ある実施形態では、プロモーターが誘導性のプロモーターでありうる。ある実施形態では、プロモーターが、その細胞に内在しないRNAポリメラーゼによる転写を可能にするプロモーターでありうる。ある特定のより具体的な実施形態では、プロモーターがT3プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター、又はCMVプロモーターである。使用されるプロモーターのタイプに応じて、そのプロモーターを認識するRNAポリメラーゼをコードしているプラスミドも、適切なRNAポリメラーゼを提供するために、細胞内に導入する。特定の実施形態では、RNAポリメラーゼは、T3RNAポリメラーゼ、T7RNAポリメラーゼ、SP6RNAポリメラーゼ、又はCMVRNAポリメラーゼである。特定の実施形態では、ウイルス遺伝子及びウイルスゲノムの転写がT7プロモーターの制御下にあり、T7RNAポリメラーゼを提供するためにT7RNAポリメラーゼをコードするプラスミドを導入する。ポリメラーゼの転写は、使用される細胞型で機能する任意のプロモーター系の制御下に置くことができる。特定の実施形態では、CMVプロモーターを使用する。ウイルスゲノムの方向はプラスでもマイナスでもよい。したがって、ウイルスゲノムを遺伝物質から転写させることによって、ウイルスゲノムのプラスセンスコピーアンチゲノムコピー又はウイルスゲノムのマイナスセンスコピーゲノムコピーのいずれかを生成させることができる。ある実施形態では、ウイルスゲノムが、本発明の組換えの、キメラの、かつ/又は弱毒化されたウイルスである。ある実施形態では、ウイルスゲノムが六量体長である場合に、ウイルスの複製及びレスキューの効率が促進されることがある。ウイルスゲノムが適切な長さのものであることを確実にするために、デルタ肝炎ウイルスHDVリボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、又はリボザイム触媒能を保持したそれらの断片を含めたリボザイム配列を使用して、5’末端又は3’末端を決定することができる。ある実施形態では、複製及びレスキューに必要なウイルスタンパク質に、N、P、及びL遺伝子が含まれる。ある特定のより具体的な実施形態では、複製及びレスキューに必要なウイルスタンパク質に、N、P、M2-1、及びL遺伝子が含まれる。5.7組換えウイルスの弱毒化本発明の組換えウイルスはさらに、弱毒化表現型を示すよう遺伝子組換えを行うことができる。特に本発明の組換えウイルスは、ウイルスがワクチンとして投与される被験体において、弱毒化表現型を示す。弱毒化は、当業者に知られている任意の方法によって実現することができる。理論に拘泥するものではないが、組換えウイルスの弱毒化表現型は、例えば意図される宿主において自然な状態では十分に複製されないウイルスを使用する例えばヒトにおけるAPVを使用することによって、また、野生型のウイルス株に比べ、ウイルスゲノムの複製を減少させることによって、ウイルスが宿主細胞に感染する能力を低下させることによって、又はウイルスタンパク質が感染性ウイルス粒子に構成する能力を低下させることによって、引き起こすことができる。リーダー配列やトレーラー配列など、ウイルスのある配列の生存能力は、ミニゲノムアッセイを使用して試験することができるセクション5.8参照。本発明の組換えウイルスの弱毒化表現型は、当業者に知られている任意の方法によって試験することができる例えばセクション5.8参照。例えば候補ウイルスは、それが宿主に感染できるかどうかについて、又は細胞培養系での複製速度について試験することができる。ある実施形態では、変化した遺伝子がN、P、L、M2、F、G、M2-1、M2-2、又はこれらの組合せである場合、ミニゲノム系を使用して弱毒化ウイルスの試験をする。ある実施形態では、種々の温度での増殖曲線を使用して、ウイルスの弱毒化表現型について試験をする。例えば弱毒化ウイルスは35°Cで増殖することができるが、39°C又は40°Cでは増殖することができない。ある実施形態では、種々の細胞系を使用して、ウイルスの弱毒化表現型を評価することができる。例えば弱毒化ウイルスは、サルの細胞系で増殖することができるだけでヒト細胞系では増殖することができず、又は種々の細胞系で実現可能なウイルス力価は、弱毒化ウイルスによって異なる。ある実施形態で、ハムスター、コットンラット、マウス、及びモルモットを含むがこれらに限定されない小動物モデルの気道におけるウイルス複製は、ウイルスの弱毒化表現型を評価するのに使用される。その他の実施形態では、抗体力価例えばプラーク減少中和アッセイ又はELISAによってアッセイされるを含むがこれに限定されないウイルスによって誘発される免疫応答が、ウイルスの弱毒化表現型を評価するのに使用される。特定に実施形態では、プラーク減少中和アッセイ又はELISAを低用量で実施する。ある実施形態では、組換えウイルスが動物モデルにおいて病理学的症状を誘発させる能力に関し、試験をすることができる。動物モデルにおいて、ウイルスが病理学的症状を誘発させる能力が低下することは、弱毒化表現型であることを示している。特定の実施形態では、候補ウイルスを、粘膜産生によって示される鼻感染に関してサルのモデルで試験する。本発明のウイルスは、ウイルスの機能的特徴の1つ又は複数が損なわれるよう弱毒化することができる。ある実施形態において、弱毒化は、弱毒化ウイルスが得られる野生型のウイルス株と比較して測定される。その他の実施形態において、弱毒化は、異なる宿主系での弱毒化ウイルスの増殖と比較することによって決定される。したがって非限定的な例で、ヒト宿主におけるAPVの増殖がトリ宿主におけるAPVの増殖に比べて減少している場合、APVは、ヒト宿主で増殖させた場合に弱毒化すると言える。ある実施形態において、本発明の弱毒化ウイルスは宿主に感染することができ、感染性ウイルス粒子が産生されるように宿主内で複製することができる。しかし野生型の株と比較すると、弱毒化した株はより低い力価に増殖し、又はよりゆっくりと増殖する。弱毒化ウイルスの増殖曲線を決定し、それを野生型ウイルスの増殖曲線と比較するには、当業者に知られている任意の技法を使用することができる。例示的な方法に関しては、以下の実施例のセクションを参照されたい。特定の実施形態において、弱毒化ウイルスは、例えば実施例22で述べる条件下、Vero細胞内で105pfu/ml未満、104pfu/ml未満、103pfu/ml未満、又は102pfu/ml未満の力価まで増殖する。ある実施形態において、本発明の弱毒化ウイルス例えばキメラ哺乳動物MPVはヒト細胞内で複製することができないが、野生型ウイルス例えば野生型哺乳動物MPVは複製することができる。しかし弱毒化ウイルスは、Vero細胞などインターフェロン機能に欠けている細胞系内では、十分に複製することができる。その他の実施形態において、本発明の弱毒化ウイルスは、宿主に感染することができ、宿主内で複製することができ、本発明のウイルスのタンパク質を細胞質膜に挿入することができるが、弱毒化ウイルスは、宿主に新たな感染性ウイルス粒子を産生させることができない。ある実施形態において、弱毒化ウイルスは、野生型哺乳動物ウイルスと同じ効率で、宿主に感染し、宿主内で複製し、ウイルスタンパク質を宿主の細胞質膜に挿入することができる。その他の実施形態において、弱毒化ウイルスがウイルスタンパク質を宿主細胞内の細胞質膜に挿入する能力は、野生型ウイルスに比べて低下している。ある実施形態において、弱毒化哺乳動物ウイルスが宿主内で複製する能力は、野生型ウイルスに比べて低下している。当業者に知られる任意の技法を使用して、ウイルスが哺乳動物細胞に感染できるかどうか、宿主内で複製できるかどうか、ウイルスタンパク質を宿主の細胞質膜に挿入できるかどうかを決定することができる。例示的な方法に関してはセクション5.8を参照されたい。ある実施形態において、本発明の弱毒化ウイルスは、宿主に感染することができる。しかし野生型哺乳動物MPVとは対照的に、弱毒化哺乳動物MPVは、宿主内で複製することができない。特定の実施形態において、弱毒化哺乳動物ウイルスは宿主に感染することができ、その宿主によってウイルスタンパク質をその細胞質膜に挿入することができるが、弱毒化ウイルスは宿主内で複製することができない。弱毒化哺乳動物MPVが宿主に感染したがどうか、さらにその宿主によってウイルスタンパク質がその細胞質膜に挿入されたかどうか、当業者に知られている任意の方法を使用して試験することができる。ある実施形態において、弱毒化哺乳動物ウイルスが宿主に感染する能力は、同じ宿主に野生型ウイルスが感染する能力に比べて低下している。当業者に知られている任意の技法を使用して、ウイルスが宿主に感染可能かどうか決定することができる。例示的な方法に関してはセクション5.8を参照されたい。ある実施形態においては、変異例えばミスセンス変異をウイルスゲノムに導入して、弱毒化表現型を持つウイルスを生成する。変異例えばミスセンス変異は、組換えウイルスのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、又はL遺伝子に導入することができる。変異は、付加、置換、欠失、又はこれらの組合せでよい。特定の実施形態においては、N、P、L、F、G、M2-1、M2-2、又はM2タンパク質に対して単一のアミノ酸欠失変異を導入し、これを、ミニゲノムアッセイ系で機能性に関してスクリーニングすることができ、ウイルス内で予測される機能性に関して評価することができる。より具体的な実施形態において、ミスセンス変異は低温感受性変異である。その他の実施形態において、ミスセンス変異は熱感受性変異である。一実施形態において、ウイルスのPタンパク質の主なリン酸化部位は除去される。別の実施形態においては、1つ又は複数の変異がウイルスのL遺伝子に導入されて、温度感受性株を生成する。さらに別の実施形態において、F遺伝子の切断部位は、切断が生じないように又は切断が非常に低い効率で生じるように変異する。特定のより具体的な実施形態において、hMPVのFタンパク質のアミノ酸第99~102位にアミノ酸配列RQSRを有するモチーフを変異する図9参照。変異は、限定されるものではないが、1以上のアミノ酸の欠失、1以上のアミノ酸の付加、1以上のアミノ酸の置換保存若しくは非保存置換、又はそれらの組合せでありうる。hMPVのいくつかの株では、切断部位がRQPRである実施例P101S参照。特定の実施形態において、アミノ酸配列内の切断部位はRQPRが変異されている。より具体的な実施形態において、hMPVのFタンパク質の切断部位は、hMPVの感染性が低減するように変異される。特定の実施形態において、hMPVの感染性は、少なくとも5、10、50、100、500、103、5×103、104、5×104、105、5×105又は少なくとも106分の1に低減される。特定の実施形態において、hMPVの感染性は、最大5、10、50、100、500、103、5×103、104、5×104、105、5×105又は最大106分の1に低減される。その他の実施形態においては、組換えウイルスのゲノムに欠失を導入する。さらに具体的な実施形態においては、組換えウイルスのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、又はL遺伝子に欠失を導入する。特定の実施形態において、欠失は、本発明の組換えウイルスのM2遺伝子にある。その他の具体的な実施形態において、欠失は、本発明の組換えウイルスのSH遺伝子にある。さらに別の具体的な実施形態においては、M2遺伝子とSH遺伝子の両方が欠失している。ある実施形態においては、組換えウイルスの遺伝子間領域が変化している。一実施形態においては、遺伝子間領域の長さが変化している。別の実施形態においては、遺伝子間領域が、ウイルスゲノムの5’末端から3’末端まで組み替えられている。その他の実施形態においては、組換えウイルスの1つ又は複数の遺伝子のゲノム位置が変化している。一実施形態においては、F又はG遺伝子が、ゲノムの3’末端に移動している。別の実施形態においては、N遺伝子がゲノムの5’末端に移動している。ある実施形態において、ウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスの遺伝子を異なる種例えば、RSV、APV、PIV3若しくはマウスニューモウイルス、異なるサブグループ、又は異なる種のウイルスの類似遺伝子に代えることによって実現される。例示的な実施形態においては、哺乳動物MPVのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、又はL遺伝子を、それぞれAPVのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、又はL遺伝子に代える。その他の例示的な実施形態においては、APVのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、又はL遺伝子を、それぞれ哺乳動物MPVのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、又はL遺伝子に代える。好ましい実施形態において、ウイルスの弱毒化は、1つ又は複数のポリメラーゼ関連遺伝子例えばN、P、L、又はM2を異なる種のウイルスの遺伝子に代えることで実現される。ある実施形態において、ウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスタンパク質の1つ又は複数の特定のドメインを、異なる種のウイルスの対応するタンパク質から得られたドメインに代えることによって実現される。例示的な実施形態においては、APVのFタンパク質の外部ドメインを、哺乳動物MPVのFタンパク質の外部ドメインに代える。好ましい実施形態においては、L、N、又はPタンパク質の1つ又は複数の特定ドメインを、異なる種のウイルスの対応するタンパク質から得られたドメインに代える。その他のある実施形態において、ウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスのタンパク質の1つ又は複数の特定ドメインを欠失させることによって実現される。特定の実施形態においては、Fタンパク質の膜貫通ドメインを欠失させる。本発明のある実施形態においては、本発明の組換えウイルスのリーダー配列及び/又はトレーラー配列を改変することによって、弱毒化表現型を実現することができる。より具体的なある実施形態においては、リーダー及び/又はトレーラー配列の長さを、野生型ウイルスよりも少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、又は少なくとも6ヌクレオチドだけ短くする。その他のより具体的なある実施形態においては、組換えウイルスのリーダー及び/又はトレーラー配列を変異させる。特定の実施形態において、リーダー配列とトレーラー配列は、互いに100相補的である。その他の実施形態において、1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、又は10ヌクレオチドは互いに相補的ではなく、リーダー及びトレーラー配列の残りのヌクレオチドは互いに相補的である。ある実施形態において、非相補的ヌクレオチドは互いに同一である。その他のある実施形態において、非相補的ヌクレオチドは互いに異なっている。その他の実施形態においては、トレーラー内の非相補的ヌクレオチドがプリンである場合、リーダー配列内の対応するヌクレオチドもプリンである。その他の実施形態においては、トレーラー内の非相補的ヌクレオチドがピリミジンである場合、リーダー配列内の対応するヌクレオチドもプリンである。特定の実施形態において、本発明の組換えウイルスのリーダー及び/又はトレーラー配列は、別のウイルスのリーダー及び/又はトレーラー配列と、例えばRSV、APV、PIV3、マウスニューモウイルスのリーダー及び/又はトレーラー配列と、又は組換えウイルスのタンパク質コード部分が由来するヒトメタニューモウイルスとは異なるサブグループ又は変異体のヒトメタニューモウイルスのリーダー及び/又はトレーラー配列と、置換しうる。弱毒化生ワクチンを使用する場合、その安全性についても考慮しなければならない。ワクチンは、疾患を引き起こしてはならない。本発明では、ワクチンを安全なものにすることができる当技術分野で知られている任意の技法を使用することができる。弱毒化技法に加え、その他の技法を使用することができる。1つの非限定的な例は、ウイルス粒子膜に組み込むことができない可溶性の異種遺伝子を使用することである。例えば、可溶性のRSVF遺伝子の単一のコピー、すなわち膜貫通及びサイトゾルドメインが欠けているRSV遺伝子変種を、使用することができる。ウイルス粒子膜に組み込むことができないので、ウイルスの屈性の変化が期待されない。ワクチンの安全性について試験をするには、様々なアッセイを使用することができる。以下のセクション5.8を参照されたい。特に、ショ糖勾配アッセイと中和アッセイを使用して、安全性を試験することができる。異種タンパク質がウイルス粒子に挿入されるかどうかを決定するには、ショ糖勾配アッセイを使用することができる。異種タンパク質がウイルス粒子に挿入される場合、そのウイルス粒子は、親株が症状を引き起こさない場合であっても症状を引き起こすことができるかどうかについて、試験をすべきである。理論に拘泥するものではないが、異種タンパク質がウイルス粒子に組み込まれる場合、ウイルスは、獲得された新しい、おそらくは病理学的性質を有する可能性がある。特定の実施形態において、1以上の遺伝子がhMPVゲノムから削除されて弱毒化ウイルスが生成される。より具体的な実施形態において、M2-2ORF、M2-1ORF、M2遺伝子、SH遺伝子及び/又はG2遺伝子が削除される。他の実施形態において、小さな単一アミノ酸欠失をウイルス複製に関与する遺伝子に導入して、弱毒化ウイルスを生成する。より具体的な実施形態において、小さな単一アミノ酸欠失をN、L又はP遺伝子に導入する。特定の具体的な実施形態において、以下の1以上のアミノ酸を組換えhMPVのL遺伝子において変異させて、弱毒化ウイルスを生成する:アミノ酸456位のPhe、アミノ酸749位のGlu、アミノ酸1246位のTyr、アミノ酸1094位のMet、及びアミノ酸746位のLys。変異は、例えばアミノ酸の欠失又は置換でありうる。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であってもよいし又は非保存的アミノ酸置換であってもよい。保存的アミノ酸交換の具体例は、アミノ酸側鎖の構造的及び/又は機能的性質を維持するアミノ酸置換であり、例えば芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸で置換し、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置換し、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換し、脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸で置換する。一方、非保存的アミノ酸交換の例は、アミノ酸側鎖の構造的及び/又は機能的性質を維持しないアミノ酸置換であり、例えば、芳香族アミノ酸を塩基性、酸性又は脂肪族アミノ酸で置換し、酸性アミノ酸を芳香族、塩基性又は脂肪族アミノ酸で置換し、塩基性アミノ酸を酸性、芳香族又は脂肪族アミノ酸で置換し、脂肪族アミノ酸を芳香族、酸性又は塩基性アミノ酸で置換する。さらにより具体的な実施形態において、アミノ酸456位のPheをLeuで置換する。特定の実施形態において、1つの核酸を、1つのアミノ酸交換をコードするように置換する。他の実施形態において、2又は3つの核酸を1つのアミノ酸交換をコードするように置換する。2又は3つの核酸を置換して、野生型タンパク質配列に復帰するリスクを低減することが好ましい。他の実施形態において、小さな単一アミノ酸欠失をウイルス構築に関与する遺伝子に導入して、弱毒化ウイルスを生成する。より具体的な実施形態において、小さな単一アミノ酸欠失をM遺伝子又はM2遺伝子に導入する。好ましい実施形態において、M遺伝子を変異させる。さらに他の実施形態において、ウイルスゲノムにおける遺伝子の順序を野生型ウイルスの遺伝子順序と変化させて、弱毒化ウイルスを生成する。より具体的な実施形態において、F、SH及び/又はG遺伝子をウイルスゲノムの3’末端に移動する。別の実施形態において、N遺伝子をウイルスゲノムの5’末端に移動する。他の実施形態において、1以上の遺伝子開始部位遺伝子開始部位の位置については、例えば表8参照を、変異させるか、あるいは別のウイルス例えばRSV、PIV3、APV若しくはマウスニューモウイルスの、又は組換えウイルスのタンパク質コード部分が由来するヒトメタニューモウイルスとは異なるヒトメタニューモウイルスのサブグループ若しくは変種の、類似の遺伝子開始部位と置換する。より具体的な実施形態において、N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子及び/又はL遺伝子の遺伝子開始部位を変異させる、あるいは別のウイルス例えばRSV、PIV3、APV若しくはマウスニューモウイルスの、又は組換えウイルスのタンパク質コード部分が由来するヒトメタニューモウイルスのとは異なるヒトメタニューモウイルスのサブグループ若しくは変種の、それぞれのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子及び/又はL遺伝子の遺伝子開始部位と置換する。5.7.1ウイルス遺伝子の置換による弱毒化本発明の特定の実施形態において、弱毒化は、ウイルスの1以上の遺伝子を、異なるウイルス、異なる株又は異なる分離体の類似遺伝子と置換することにより達成する。特定の実施形態において、メタニューモウイルス、例えばhMPV又はAPVなどの哺乳動物メタニューモウイルスの1以上の遺伝子を、別のパラミクソウイルスの類似遺伝子と置換する。より具体的な実施形態において、哺乳動物メタニューモウイルス例えばhMPVのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1ORF、M2-2ORF、SH遺伝子、G遺伝子若しくはL遺伝子、又はこれらの2つ以上の遺伝子の任意の組合せを、他のウイルス種、株又は分離体の類似遺伝子と交換し、ここで別のウイルス種は、例えば限定されるものではないが、別の哺乳動物メタニューモウイルス、APV又はRSVでありうる。より具体的な実施形態において、ヒトメタニューモウイルスの1以上の遺伝子をヒトメタニューモウイルスの別の分離株の類似遺伝子と置換する。例えば、分離株NL/1/9999-1、NL/1/0000-1、NL/17/00又はNL/1/94のN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1ORF、M2-2ORF、SH遺伝子、G遺伝子若しくはL遺伝子、又はこれらの2以上の遺伝子の任意の組合せを、異なる分離株、例えばNL/1/9999-1、NL/1/0000-1、NL/17/00又はNL/1/94の類似遺伝子又は遺伝子の組合せ、すなわちN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1ORF、M2-2ORF、SH遺伝子、G遺伝子若しくはL遺伝子と置換する。特定の実施形態において、ウイルスのゲノムの1以上の領域を、異なるウイルス種、株又は分離体のゲノムに由来する類似領域と置換する。特定の実施形態において、領域は、ウイルスゲノムのコード領域内の領域である。他の実施形態において、領域は、ウイルスゲノムの非コード領域内の領域である。特定の実施形態において、2つのウイルスの2つの領域は、その2つの領域が2つのウイルスにおいて同じ又は類似の機能を担う場合には、互いに類似している。特定の他の実施形態において、2つのウイルスの2つの領域は、その2つの領域が2つのウイルスにおいて同じ又は類似の構造エレメントを提供する場合に類似している。より具体的な実施形態において、2つの領域は、2つのウイルスにおいて類似するタンパク質ドメインをコードしている場合に類似しており、類似するタンパク質ドメインは、同じ又は類似の機能及び/又は機能を有するドメインである。特定の実施形態において、メタニューモウイルス、例えばhMPV又はAPVなどの哺乳動物メタニューモウイルスのゲノムの1以上の領域を別のパラミクソウイルスのゲノムの類似領域と置換する。特定の実施形態において、パラミクソウイルスのゲノムの1以上の領域を、哺乳動物メタニューモウイルス例えばhMPV又はAPVのゲノムの類似領域と置換する。より具体的な実施形態において、哺乳動物メタニューモウイルス例えばhMPVのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1ORF、M2-2ORF、SH遺伝子、G遺伝子若しくはL遺伝子の領域、又はこれらの遺伝子の2以上の領域の任意の組合せを、別のウイルス種、株、又は分離体の類似領域と置換する。別のウイルス種としては、限定されるものではないが、別の哺乳動物メタニューモウイルス、APV又はRSVが挙げられる。より具体的な実施形態において、ヒトメタニューモウイルスの1以上の領域をヒトメタニューモウイルスの別の分離株の類似領域と置換する。例えば、分離株NL/1/9999-1、NL/1/0000-1、NL/17/00又はNL/1/94のN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1ORF、M2-2ORF、SH遺伝子、G遺伝子若しくはL遺伝子の1以上の領域、又は2以上の領域の任意の組合せを、hMPVの異なる分離株、例えばNL/1/9999-1、NL/1/0000-1、NL/17/00又はNL/1/94の類似領域と置換する。特定の実施形態において、領域は、少なくとも5ヌクレオチドnt長、少なくとも10nt長、少なくとも25nt長、少なくとも50nt長、少なくとも75nt長、少なくとも100nt長、少なくとも250nt長、少なくとも500nt長、少なくとも750nt長、少なくとも1kb、少なくとも1.5kb、少なくとも2kb、少なくとも2.5kb、少なくとも3kb、少なくとも4kb、又は少なくとも5kb長である。特定の実施形態において、領域は、最大5ヌクレオチドnt長、最大10nt長、最大25nt長、最大50nt長、最大75nt長、最大100nt長、最大250nt長、最大500nt長、最大750nt長、最大1kb、最大1.5kb、最大2kb、最大2.5kb、最大3kb、最大4kb、又は最大5kb長である。5.8本発明と共に使用されるアッセイ細胞培養系、動物モデル系、又は被験体におけるキメラ又は組換えウイルスの増殖速度を決定するために、本発明においていくつかのアッセイを用いることができる。キメラ及び組換えウイルスがウイルス粒子の感染、複製、又はパッケージングを行う要件を決定するために、本発明によるいくつかのアッセイを用いることもできる。本明細書で述べるアッセイは、経時的なウイルス力価をアッセイしてウイルスの増殖特性を決定するのに使用することができる。特定の実施形態において、ウイルス力価は、感染した細胞又は感染した被験体からサンプルを得、そのサンプルの連続希釈液を調製し、単一のプラークを出現させるウイルスの希釈度でウイルスに感染しやすい細胞の単層に感染させることによって決定される。次いでこのプラークをカウントし、ウイルス力価を、サンプル1ミリリットル当たりのプラーク形成単位として表すことができる。本発明の特定の実施形態において、被験体における本発明のウイルスの増殖速度は、被験体内のウイルスに対する抗体の力価によって評価される。理論に拘泥するものではないが、被験体の抗体力価は、被験体におけるウイルス力価だけではなく抗原性も反映している。ウイルスの抗原性が一定である場合、被験体内での抗体力価の増大を使用して、被験体におけるウイルスの増殖曲線を求めることができる。好ましい実施形態において、動物又はヒトにおけるウイルスの増殖曲線は、感染後の複数の時点での宿主の生物学的流体をサンプリングし、ウイルス力価を測定することによって、最良に試験される。細胞培養系又は被験体での異種遺伝子配列の発現は、当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。ある実施形態においては、異種遺伝子の発現は、転写物のレベルを定量することにより測定する。転写物のレベルは、転写物に特異的なプローブ又はプライマーをそれぞれ使用するノーザンブロット分析又はRT-PCRによって、測定することができる。ウイルスはアンチセンス方向にあり、一方、転写物はセンス方向にあるので、転写物はウイルスのゲノムと区別することができる。ある実施形態において、異種遺伝子の発現は、異種遺伝子のタンパク質産物のレベルを定量することによって測定される。タンパク質のレベルは、タンパク質に特異的な抗体を使用するウェスタンブロット分析によって、測定することができる。特定の実施形態においては、異種遺伝子にペプチドタグを付ける。ペプチドタグは、このペプチドタグに対する抗体を使用して検出することができる。検出されたペプチドタグのレベルは、異種遺伝子から発現したタンパク質のレベルを表している。あるいは異種遺伝子から発現したタンパク質は、ペプチドダグによって単離することができる。精製したタンパク質の量は、異種遺伝子の発現レベルと相関している。そのようなペプチドタグと、そのようなペプチドタグに融合したタンパク質を単離する方法は、当技術分野で周知である。免疫グロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列Petty、1996、Metalchelateaffinitychromatography、CurrentProtocolsinMolecularBiology、第1~3巻、AusubelFM、BrentR、KunstonRE、MooreDD、SeidmanJG、SmithJA、及びStruhlK編、JohnWileyandSonsInc、USA、GreenePublishAssocWileyInterscience発行、グルタチオンSトランスフェラーゼGST;Smith、1993、MethodsMolCellBio4220~229、大腸菌マルトース結合タンパク質Guan他、1987、Gene6721~30、様々なセルロース結合ドメイン米国特許第5,496,934;第5,202,247号;第5,137,819号;Tomme他、1994、ProteinEng7117~123、FLAGエピトープShortProtocolsinMolecuarBiology、1999、Ausubel他編、JohnWileySonsInc、Unit1011などであるがこれらに限定することのない異種遺伝子の修飾には、当技術分野で知られている様々なペプチドタグを使用することができる。その他のエピトープタグは、特異的な結合パートナーによって認識され、したがって、好ましくは固定化されかつ/又は固体支持体上にある結合パートナーへの親和性結合により、単離が促進される。当業者に理解されるように、上記ペプチドダグのコード領域を得るために、DNAクローニング、DNA増幅、及び合成方法を含むがこれらに限定することのない数多くの方法を使用することができる。ペプチドタグのいくつか及びそれらを検出し単離するための試薬は市販されている。被験体由来のサンプルは、当業者に知られている任意の方法によって得ることができる。ある実施形態において、サンプルは、鼻吸引液、咽頭スワブ、痰、又は気管支肺胞洗浄液からなる。5.8.1ミニレプリコン構築cDNAからの生ウイルスの作製は、hMPVを特性決定する手段と、弱毒化ワクチン及び免疫原性化合物の作製のための手段を提供する。この目的を達成するため、レポーター遺伝子を含有するvRNAをコードするcDNA及びミニレプリコンは、ウイルスをレスキューするため、そしてまたRNAの増幅、発現及びビリオンへの組込みに関与するヌクレオチド配列及びタンパク質を同定するために用いることができる。当業者に知られている任意のレポーター遺伝子を本発明で使用することができるセクション5.8.2参照。例えば、使用しうるレポーター遺伝子としては、限定されるものではないが、GFP、HRP、LUC及びAPをコードする遺伝子が挙げられるレポーターの例のさらなるリストについてはセクション5.8.2も参照のこと。一つの特定の実施形態において、使用するレポーター遺伝子はCATをコードする。本発明の別の特定の実施形態において、レポーター遺伝子はリーダー配列とトレーラー配列に挟まれている。レポーター遺伝子と隣接して配置するために使用しうるリーダー及びトレーラー配列は、任意のマイナスセンスイルス、例えば限定されるものではないが、MPV、RSV、及びAPVのものである。例えば、レポーター遺伝子は、肝炎デルタリボザイムHep-dRibo及びT7ポリメラーゼ終結T-T7シグナルに結合しているマイナスセンスhMPV又はAPVリーダーと、T7RNAポリメラーゼプロモーターの後に続くhMPV又はAPVトレーラー配列によって挟むことができる。ある実施形態においては、ミニレプリコンをコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする。宿主細胞は、T7RNAポリメラーゼ、N遺伝子、P遺伝子、L遺伝子、及びM2.1遺伝子を発現する。ある実施形態においては、T7RNAポリメラーゼ、N遺伝子、P遺伝子、L遺伝子、及びM2.1遺伝子をコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする。その他の実施形態においては、ミニレプリコンをコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし、その宿主細胞にヘルパーウイルスを感染させる。hMPVミニレプリコンは、いくつかのポリメラーゼ、例えば限定されるものではないが、種内及び種間ポリメラーゼを用いてレスキューしうる。特定の実施形態において、hMPVミニレプリコンは、hMPV複製に必要な最小複製単位を発現する宿主細胞においてレスキューする。例えば、hMPVは、いくつかのポリメラーゼ、例えば限定されるものではないが、RSV、APV、MPV又はPIVのポリメラーゼを用いてcDNAからレスキューしうる。本発明の特定の実施形態において、hMPVは、RNAウイルスのポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明のより具体的な実施形態において、hMPVはマイナス鎖RNAウイルスのポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明のさらにより具体的な実施形態において、hMPVはRSVポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明の別の実施形態において、hMPVはAPVポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明のさらに別の実施形態において、hMPVはMPVポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明の別の実施形態において、hMPVはPIVポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明の別の実施形態において、hMPVは、hMPVポリメラーゼタンパク質の複合体を用いてcDNAからレスキューする。例えば、hMPVミニレプリコンは、L、P、N及びM2-1タンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いてレスキューしうる。本発明の別の実施形態において、ポリメラーゼ複合体は、L、P、及びNタンパク質からなる。本発明のさらに別の実施形態において、hMPVミニレプリコンは、他のウイルス、例えば限定されるものではないがRSV、PIV及びAPVに由来するポリメラーゼタンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いてレスキューしうる。特に、hMPVミニレプリコンは、RSV、PIV又はAPVのL、P、N及びM2-1タンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いてレスキューしうる。本発明のまた別の実施形態において、hMPVミニレプリコンをレスキューするために使用するポリメラーゼ複合体は、RSV、PIV又はAPVのL、P、及びNタンパク質からなる。本発明のさらに別の実施形態において、種々のウイルス由来の種々のポリメラーゼタンパク質を用いて、ポリメラーゼ複合体を形成してもよい。そのような実施形態において、hMPVミニレプリコンをレスキューするために用いるポリメラーゼは、RSV、PIV又はAPVポリメラーゼの種々の構成要素により形成されうる。例えば、可能性ある組合せを限定するものではないが、複合体の形成においては、Nタンパク質はRSV、APV又はPIVのN遺伝子によりコードされ得、それに対してLタンパク質はRSV、APV又はPIVのL遺伝子によりコードされ得、Pタンパク質はRSV、APV又はPIVのP遺伝子によりコードされ得る。当業者であれば、hMPVミニレプリコンをレスキューするために必要なポリメラーゼ複合体を形成するために用いることができる組合せの可能性を決定することができるだろう。ミニレプリコン系において、レポーター遺伝子の発現を測定して、ウイルスのレスキューの成功を確認し、そしてまたウイルスの特性を決定することができる。レポーター遺伝子の発現レベル及び/又はその活性は、セクション5.8.2に記載されている方法などであるがこれらに限定することのない、当業者に知られている任意の方法によってアッセイすることができる。より具体的なある実施形態において、ミニレプリコンは、以下のエレメント、T7RNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼ、リーダー配列、遺伝子開始点、GFP、トレーラー配列、肝炎デルタリボザイム配列又はRNAポリメラーゼI終結配列を、列挙した順番で含む。T7をRNAポリメラーゼとして使用する場合、肝炎デルタリボザイム配列は終結配列として使用すべきである。RNAポリメラーゼIを使用する場合、RNAポリメラーゼI終結配列は、終結シグナルとして使用することができる。レスキュー系に応じて、ミニレプリコンの配列をセンス方向又はアンチセンス方向にすることができる。ある実施形態においては、リーダー配列をhMPVの野生型リーダー配列に対して変化させることができる。リーダー配列の前には、任意選択でACを置くことができる。T7プロモーター配列は、Gダブレット又はトリプレットを持ち又は持たないものでよく、Gダブレット又はトリプレットによって転写が増加する。特定の実施形態においては、T0で細胞にhMPVを感染させる。24時間後、T24で、細胞にミニレプリコン構築物をトランスフェクトする。T0後48時間及びT0後72時間で、細胞を、レポーター遺伝子の発現に関して試験する。蛍光レポーター遺伝子産物を使用する場合例えばGFP、レポーター遺伝子の発現は、FACSを使用して試験することができる。別の実施形態においては、細胞に、T=0時間で6個のプラスミドをトランスフェクトする。次いで細胞をT=40時間及びT=60時間で収集し、CAT又はGFP発現に関して分析する図25参照。別の特定の実施形態においては、細胞に、T0でMVA-T7を感染させる。1時間後、T1で、細胞にミニレプリコン構築物をトランスフェクトする。T0後24時間で、細胞にhMPVを感染させる。T0後72時間で、細胞を、レポーター遺伝子の発現に関して試験する。蛍光レポーター遺伝子産物を使用する場合例えばGFP、レポーター遺伝子の発現は、FACSを使用して試験することができる。5.8.2レポーター遺伝子ある実施形態においては、組織培養物又は動物モデルでのレポーター遺伝子発現を測定するアッセイを、本発明の方法で使用することができる。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列を、APVやhMPV、hMPV/APV、APV/hMPVなどのウイルスにクローニングするが、この場合、iレポーター遺伝子の位置が変化しており、iiレポーター遺伝子を挟む遺伝子間領域の長さは様々なものである。種々の組合せについて試験をして、レポーター遺伝子の最適な発現速度、及びレポーター遺伝子を含むウイルスの最適な複製速度を決定する。ある実施形態において、ミニレプリコン構築物は、レポーター遺伝子を含むように生成される。ミニレプリコン構築物の構築については本明細書で述べる。レポーター遺伝子産物の存在量は、当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。そのような技法には、レポーター遺伝子に特異的なプローブ又は抗体をそれぞれ使用するノーザンブロット分析又はウェスタンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、レポーター遺伝子は、FACS中で検出することができる蛍光シグナルを放出する。FACSは、レポーター遺伝子が内部で発現する細胞を検出するのに使用することができる。本発明の特定の態様を実施するための技法は、他に特に示さない限り、当業者により日常的に実施されている分子生物学、微生物学、組換えDNA操作及び生成の従来の技法を用いることになる。例えば、Sambrook他、Molecularcloning、alaboratorymanual、第2版、第1~3巻ColdSpringHarborLaboratory、1989、ALaboratoryManual、第2版DNACloning、第I及びIIGlover編、1985;及びTranscriptionandTranslationHamesHiggins編、1984を参照されたい。レポーター遺伝子産物の生化学的活性は、レポーター遺伝子の発現レベルを表す。レポーター遺伝子の活性の全体的レベルは、本発明の組換えウイルスの複製速度にも依存する。したがって組換えウイルス由来のレポーター遺伝子の真の発現レベルを決定するには、全発現レベルを細胞培養物又は動物モデルにおける組換えウイルスの力価で割るべきである。本発明の方法で使用することができるレポーター遺伝子には、以下の表4に列挙する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。レポーター遺伝子の存在量は、とりわけウェスタンブロット分析又はノーザンブロット分析によって、あるいはヌクレオチド配列の転写、そのmRNAタンパク質の存在量を定量するために使用される任意のその他の技法によって、測定することができるShortProtocolsinMolecularBiology、Ausubel他、JohnWileySonsInc、第4版、1999参照。ある実施形態において、レポーター遺伝子産物の活性は、組換えウイルス由来のレポーター遺伝子発現の読取り値として測定される。レポーター遺伝子産物の活性の定量では、レポーター遺伝子産物の生化学的特性を用いることができる表4参照。レポーター遺伝子産物の生化学的活性を測定する方法は、当業者に周知である。本発明の方法で使用することができる例示的なレポーター遺伝子のより詳細な記述を以下に示す。5.8.3感染率の測定感染率は、例えば臨床サンプル例えば鼻腔ぬぐい分泌液について本発明のウイルスが存在するかどうか、抗APV抗原抗体、抗hMPV抗原抗体、抗APV抗原抗体、及び/又は抗体であって異種ヌクレオチド配列の遺伝子産物に特異的なものを使用する免疫蛍光アッセイIFAによってそれぞれ試験をすることであるがこれに限定することのない、当技術分野で周知の任意の方法によって決定することができる。ある実施形態においては、無傷の細胞を含有するサンプルを直接処理することができるが、無傷の細胞を持たない分離株は、許容細胞系例えばHEp-2細胞でまず培養すべきである。例示的な実施形態においては、培養細胞懸濁液を、例えば室温で300×gの遠心単離に5分間かけ、その後、同じ条件下でPBS、pH7.4Ca及びMg含まずで洗浄することによって、清澄にすべきである。細胞ペレットを、少量のPBSに再懸濁して分析にかける。無傷の細胞を含有する一次臨床分離株をPBSと混合し、室温で5分間、300×gの遠心分離にかける。粘液を、滅菌ピペットの先端との界面から除去し、細胞ペレットを同じ条件下でもう一度PBSで洗浄する。次いでペレットを少量のPBSに再懸濁し、分析にかける。アセトン洗浄した12ウェルHTCスーパーキュアガラススライド上の5mmウェル当たり、各細胞懸濁液5~10マイクロリットルをスポッティングし、空気乾燥させる。スライドを冷-20°Cアセトン中に10分間固定する。各ウェルにPBS-1BSAを添加し、その後室温で10分間インキュベートすることによって、反応を阻止する。スライドをPBS-0.1Tween-20で3回洗浄し、空気乾燥する。ブロッキング緩衝液中250ng/mlに希釈した各一次抗体試薬10マイクロリットルで、ウェルごとにスポットし、反応物を、加湿した37°Cの環境下で30分間インキュベートする。次いでスライドを、PBS-0.1Tween-20を3回交換して十分に洗浄し、空気乾燥する。ブロッキング緩衝液中250ng/mlに希釈した適切な二次複合抗体試薬10マイクロリットルで、それぞれのウェルごとにスポットし、反応物を、加湿した37°Cの環境下でさらに30分間インキュベートする。次いでスライドを、PBS-0.1Tween-20を3回交換して洗浄する。5マイクロリットルのPBS-50グリセロール-10mMTrispH8.0-1mMEDTAで反応ウェルごとにスポットし、スライドにカバーガラスを取り付ける。その後、各反応ウェルを、B-2AフィルタEX450~490nmを使用する200×の倍率での蛍光顕微鏡法により分析する。染色していない細胞又は二次試薬のみで染色した細胞から得られた自己蛍光バックグラウンドに対して、陽性反応を記録する。陽性反応は、感染した細胞の細胞質内にある小封入体で強調された、明るい蛍光を特徴とする。5.8.4血清力価の測定抗体血清力価は、当技術分野で周知の任意の方法によって決定することができ、例えば、血清サンプル中の抗体又は抗体断片の量をサンドイッチELISAで定量することができるが、これに限定するものではない。簡単に説明すると、ELISAは、血清中の抗体又は抗体断片を認識する抗体で、4°Cで一晩マイクロタイタープレートを被覆することからなる。次いでこのプレートを、室温で約30分間、PBS-Tween-0.5BSAで遮断する。PBS-TWEEN-BSA中に希釈した精製済みの抗体又は抗体断片を使用して標準曲線を構成し、サンプルをPBS-BSA中に希釈する。サンプル及び標準液を、アッセイプレートの2つ組のウェルに加え、室温で約1時間インキュベートする。次に非結合抗体をPBS-TWEENで洗い落とし、結合抗体については、室温で約1時間、標識二次抗体例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgGで処理する。標識に特異的な色素生成基質を添加し、例えば分光光度計によって基質の代謝回転速度を測定することにより、標識抗体の結合を検出する。血清中の抗体又は抗体断片レベルの濃度は、サンプルに関する基質の代謝回転速度と標準曲線での基質の代謝回転速度とを、ある希釈率で比較することによって決定する。5.8.5血清検査本発明のある実施形態においては、哺乳動物MPVの構成要素に結合する抗体が存在するかどうか検出する。特に、哺乳動物MPVのタンパク質に対する抗体の存在は被験体内で検出することができ、それによって、被験体内の哺乳動物MPVの存在を診断する。哺乳動物MPVの構成要素に対する抗体の存在を検出するには、当業者に知られている任意の方法を使用することができる。別の実施形態において、血清検査は、MPVに感染していることが疑われる宿主由来のサンプルと、MPV又はその構成要素に対する抗体とを接触させ、複合体の形成を検出することにより実施しうる。そのような実施形態において、血清検査は、MPVへの曝露に応答した宿主の抗体応答の存在を検出しうる。宿主の抗体又はMPV構成要素を検出するための本発明のアッセイで用いることができる抗体は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて作製することができる。そのような抗体は、種々のエピトープ、例えば限定されるものではないが、核酸、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、タンパク質、炭水化物又はそれらの任意の組合せ、を検出するために操作しうる。本発明の別の実施形態において、血清検査は、MPVに感染していることが疑われる宿主由来のサンプルと、MPVの構成要素とを接触させ、複合体の形成を検出することにより実施しうる。そのような方法の例は当技術分野で周知であり、例えば限定されるものではないが、直接免疫蛍光法、ELISA、ウエスタンブロット、イムノクロマトグラフィなどがある。例示的な実施形態においては、哺乳動物MPVの構成要素を固体支持体に結合させる。特定の実施形態において、哺乳動物MPVの構成要素はFタンパク質又はGタンパク質であるが、これらに限定されない。その後、哺乳動物MPVに対する抗体の存在に関して試験をする物質を、哺乳動物MPV構成要素と抗体との結合に至る条件下で、固体支持体と共にインキュベートする。その後、固体支持体を、非特異的に結合している抗体全てが除去される条件下で洗浄する。洗浄ステップの後、結合した抗体の存在を、当業者に知られている任意の技法を使用して検出することができる。特定の実施形態においては、検出可能に標識された抗体と哺乳動物MPVの構成要素に結合した抗体との結合に至る条件下で、哺乳動物MPVタンパク質-抗体複合体を、被験体の種に応じて生成された抗体を認識する検出可能に標識された抗体と共にインキュベートするが、例えば被験体がコットンラットである場合、検出可能に標識された抗体はラット抗体を対象とする。特定の実施形態において、検出可能に標識された抗体は、酵素活性に結合する。別の実施形態において、検出可能に標識された抗体は、放射性標識されたものである。次いで哺乳動物MPVタンパク質-抗体-検出可能に標識された抗体の複合体を洗浄し、その後、検出可能に標識された抗体の存在を、当業者に知られている任意の技法によって定量するが、ここで使用される技法は、検出可能に標識された抗体の標識のタイプに応じて異なるものである。5.8.6ビアコアアッセイ抗体結合の動態パラメータの決定は、例えば、0.05Tween-20を含有するHBS緩衝液にモノクローナル抗体mAbを様々な濃度で溶かしたもの250μLを、抗原が固定されているセンサチップ表面に注入することによって、決定することができる。抗原は、哺乳動物MPVの任意の構成要素でよい。特定の実施形態において、抗原は哺乳動物MPVのFタンパク質又はGタンパク質でよいが、これらに限定されない。流量は、75uL/分で一定に維持する。解離データを15分間、又は必要に応じてそれ以上収集する。各注入/解離サイクルの後、希釈酸、典型的な場合には10~100mMHClの短い1分間のパルスを使用して、抗原表面から結合mAbを除去するが、状況が許すならその他の再生剤を使用する。より具体的には、会合速度kon及び解離速度koffの測定では、標準的なアミンカップリングの化学的性質、すなわちEDC/NHS法を用いて、抗原をセンサチップ表面に直接固定化するEDC=N-ジエチルアミノプロピル-カルボジイミド。簡単に説明すると、10mMNaOAcに溶かした抗原の5~100nM溶液pH4又はpH5を調製し、約30~50RUBiacoreResonanceUnit相当の抗原が固定化されるまで、この溶液をEDC/NHS活性化表面に通す。この後、未反応の活性エステルを、1MEt-NH2を注入することによってキャップする。参照用として、同一の固定条件下で抗原を含まないブランク表面を調製する。適切な表面を調製したら、抗体試薬のそれぞれに関して適切な連続希釈液をHBS/Tween-20で調製し、連続して接続されている抗原と参照用の両方の細胞表面に通す。調製される抗体濃度の範囲は、平衡結合定数KDがどのような値になるかに応じて異なる。上述のように、適切な再生剤を使用して、各注入/解離サイクルの後の結合抗体を除去する。全データ集合を収集したら、機器製造業者BIAcoreIncPiscataway、NJから供給されたアルゴリズムを使用して、得られる結合曲線を全体的に当てはめる。全てのデータは、1:1のラングミュア結合モデルに適合する。これらのアルゴリズムはkonとkoffの両方を計算し、そこから見掛けの平衡結合定数KDが2つの速度定数の比すなわちkoff/konとして推定される。個々の速度定数をどのように導き出すかについてのより詳細な処理は、BIAevaluationSoftwareHandbookBIAcoreInc、Piscataway、NJに見出すことができる。5.8.7微量中和アッセイ抗体又はその抗原結合フラグメントがウイルス感染力を中和する能力を、微量中和アッセイにより決定する。この微量中和アッセイは、Anderson他1985、JClinMicrobiol221050~1052、その開示全体を参照により本明細書に援用するにより記述された手順に変更を加えたものである。この手順は、その開示全体を参照により本明細書に援用するJohnson他、1999、JInfectiousDiseases18035~40にも記載されている。抗体希釈液を、96ウェルプレートを使用して3本作製する。106TCID50の哺乳動物MPVを、抗体又はその抗原結合フラグメントの連続希釈液と共にインキュベートして、これを96ウェルプレートのウェル内で、37°Cで2時間の試験にかける。次いでVero細胞2.5×104などであるがこれに限定することのない、哺乳動物MPVに感染し易い細胞を各ウェルに添加し、5CO2中37°Cで5日間培養する。5日後に培地を吸引し、80メタノール及び20PBSで細胞を洗浄しプレートに固定する。次いでFタンパク質発現など、ウイルス抗原によってウイルスの複製を決定する。固定された細胞を、抗Fタンパク質モノクローナル抗体例えばpanFタンパク質、C部位特異的MAb133-1Hなどのビオチン結合抗ウイルス抗原と共にインキュベートし、洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合アビジンをウェルに添加する。ウェルを再び洗浄し、基質TMBチオニトロ安息香酸の代謝回転を450nmで測定する。中和力価は、ウイルスのみの対照細胞から450nmの吸光度OD450で少なくとも50の低下を引き起こす抗体濃度として表す。本明細書で述べる微量中和アッセイは、単なる一例である。別法として、ウイルスが抗体によってどのように大きな影響を受けるかを決定する際、標準的な中和アッセイを使用することができる。5.8.8ウイルス融合阻害アッセイこのアッセイは、抗体を添加する前に細胞をそれぞれのウイルスに4時間感染させ、読取りが細胞の融合の存否に関するものであること以外、基本的に微量中和アッセイと同一であるTaylor他、1992、JGenVirol732217~2223。5.8.9等温滴定熱量測定熱力学的結合親和性及びエンタルピーを、抗体とそれに対するそれぞれの抗原との相互作用に関して等温滴定熱量測定ITCから決定する。抗体を透析液中に希釈し、その濃度を、280nmのピーク最大値で吸光係数217,000M-1cm-1を使用して、PerkinElmerLambda4B分光光度計を用いたUV分光分析吸収測定により決定した。希釈した哺乳動物MPV-抗原濃度は、当初のサンプルの質量と希釈したサンプルの質量との比から計算するが、それはこの吸光係数が、大量のサンプルを用いることなくまた失うことなく正確な濃度を決定するのに低すぎるからである。ITC測定抗体の結合熱力学を、MicrocalIncVP滴定熱量計を使用したITC測定により決定する。VP滴定熱量計は、断熱性エンクロージャ内に封入されたサンプル用と参照用容器1.409mlの一対の組合せと、このサンプル容器に対してリガンド溶液を滴定するための回転スターラ-シリンジとからなる。ITC測定は、25°C及び35°Cで行う。サンプル容器には、抗体を加えたリン酸緩衝液が入っていたが、参照容器には緩衝溶液のみ入っている。リン酸緩衝溶液は、HyCloneInc製の生理食塩水67mMPO4pH7.4である。5~10μlという一定量の0.05~0.1mMRSV-抗原、PIV-抗原、及び/又はhMPV-抗原溶液を、3~4分間あけて、熱交換シグナルが失われることからわかるように結合が飽和するまで抗体サンプル溶液中に滴定する。Microcal,Inc.からの非線形最小2乗法による最小化ソフトウェアプログラムOrigin5.0を使用して、以下の方程式Iに従い、全熱量Qtのi回目の滴定での増分熱量ΔQiを全滴定液濃度Xtに当てはめる:Qt=nCtΔHb○V1XtnCt1nKbCt24XtnCt122ΔQ=QdVi2VQQQ上式でCtは、サンプル容器中の初期抗体濃度であり、Vはサンプル容器の容積であり、nは結合反応の化学量論的な量であり、これによってKb、ΔHb○、及びnの値を得る。Kbを決定するのに最適なサンプル濃度の範囲はKbの値に応じて異なり、以下の関係式によって定義される。CtKbn≦5002したがって1μMで決定することのできる最大Kbは2.5×108M-1未満である。最初の滴定液添加が結合等温式に適合しない場合、シリンジ開口と溶液との界面での気泡の放出を示す可能性があるので、それは最終分析で無視される。5.8.10イムノアッセイ免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼ及び/又はプロテアーゼ阻害剤例えばEDTA、PMSF、159手法ニン、バナジン酸ナトリウムを添加したRIPA緩衝液1NP-40又はTritonX-100、1デオキシコール酸ナトリウム、0.1SDS、0.15MNaCl、0.01Mリン酸ナトリウムpH7.2、1Trasylolなどの溶解緩衝液に細胞集団を溶解し、対象の抗体を細胞溶解産物に添加し、4°Cである時間例えば4時間インキュベートし、タンパク質A及び/又はタンパク質Gセファロースビーズを細胞溶解産物に添加し、4°Cで約1時間以上インキュベートし、ビーズを溶解緩衝液中で洗浄し、ビーズをSDS/サンプル緩衝液中に再懸濁することを含む。対象の抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウェスタンブロット分析によって評価することができる。当業者なら、抗体と抗原との結合が増加しまたバックグラウンドが低下するように例えばセファロースビーズで細胞溶解産物をプレクリアする修正可能なパラメータが理解されよう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察に関しては、例えばAusubel他編、1994、CurrentProtocolsinMolecularBiology、第1巻、JohnWileySonsInc、NewYork、第10、16、1頁を参照されたい。ウェスタンブロット分析は一般に、タンパク質サンプルを調製し、ポリアクリルアミドゲルでタンパク質サンプルの電気泳動をし例えば抗原の分子量に応じて8~20のSDS-PAGE、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースやPVDF、ナイロンなどの膜に移し、膜を遮断溶液例えば3BSAや脱脂乳をを含むPBS中に遮断し、膜を洗浄緩衝液例えばPBSTween20で洗浄し、膜を、遮断緩衝液で希釈した一次抗体対象の抗体と共にインキュベートし、膜を洗浄緩衝液中で洗浄し、膜を、遮断緩衝液で希釈した酵素基質例えば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ又は放射性分子例えば12Pや121Iに結合した二次抗体一次抗体、例えば抗ヒト抗体を認識すると共にインキュベートし、膜を洗浄緩衝液中で洗浄し、抗原の存在を検出することを含む。当業者なら、検出されるシグナルを増大させまたバックグラウンドノイズを低減させるように修正可能なパラメータが理解されよう。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えばAusubel他編1994、GinTentProtocolsinMolecularBiology、第1巻、JohnWileySonsInc、NewYork、1081を参照されたい。ELISAは、抗原を調製し、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原で被覆し、ウェルに結合しなかった抗原を洗い落とし、酵素基質例えば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの検出可能な化合物に結合された対象の抗体をウェルに添加して、ある時間インキュベートし、結合していない抗体又は非特異的結合抗体を洗い落とし、ウェルを被覆している抗原に特異的に結合された抗体の存在を検出することを含む。ELISAでは、対象の抗体が、検出可能な化合物に結合していなくてもよく、代わりに、検出可能な化合物に結合している二次抗体対象の抗体を認識するをウェルに添加することができる。さらに、ウェルを抗原で被覆する代わりに、抗体をウェルに被覆してもよい。その場合、検出可能な分子は、酵素基質例えばホースラディッシュペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの検出可能な化合物に結合した抗原でよい。シグナル検出及びその他のELISAの変化が増大するように修正可能なパラメータは、当業者に周知である。ELISAに関するさらなる考察については、例えばAusubel他編1994、CurrentProtocolsinMolecularBiology、第1巻、JohnWileySonsInc、NewYork、1121を参照されたい。抗原に対する抗体scFv、あるいは抗体フラグメント又はその変種を含み、あるいは抗体フラグメント又はその変種からなるその他の分子を含むの結合親和性と、抗体抗原相互作用のオフレートは、競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの一例は、標識されていない抗原の量が増加している状態で、標識抗原例えば3Hや121Iと問題にされている抗体とをインキュベートすること、及び標識抗原に結合している抗体を検出することを含む、ラジオイムノアッセイである。5.8.11ショ糖勾配アッセイ異種タンパク質がウイルス粒子に組み込まれるかどうかという問題は、当業者に知られている任意の生化学的アッセイを使用することによってさらに調べることができる。特定の実施形態においては、異種タンパク質がウイルス粒子に組み込まれるかどうかを決定するのに、ショ糖勾配アッセイを使用する。感染細胞溶解産物は、20~60ショ糖勾配に分画することができ、様々な画分を収集して、例えばウェスタンブロット分析により異種タンパク質及びベクタータンパク質の存在及び分布について分析する。画分及びウイルスタンパク質は、プラークアッセイにより、ピークウイルス力価に関してアッセイすることもできる。異種タンパク質がウイルス粒子を共に移行する場合、異種タンパク質はウイルス粒子と会合する。5.9MPVの新しい分離株を同定する方法本発明は、哺乳動物MPV、特にhMPVに関する。本発明は、MPVの2つの血清学的サブグループA及びBの特性決定と、MPVA1、A2、B1、及びB2の4つの変種の特性決定を行うが、本発明はこれらのサブグループ及び変種に限定されない。本発明は、本明細書に記載されるサブグループ及び変種に属すると特性決定し、あるいはまだ特徴付けられていないサブグループ又は変種に属すると特性決定されたものも含めた、任意のまだ同定されていないMPV分離株を包含する。所与のサンプル中に存在するタンパク質構成要素を特性決定するために、イムノアッセイを使用することができる。イムノアッセイは、同定のためウイルスのペプチド構成要素を使用してウイルス分離株を比較するのに効果的な方法である。例えば本発明は、本明細書において、本明細書で提供されたMPVの別の分離株を同定する方法を提供し、この方法は、本質的にMPVに感染していないか又は特異的な病原体のないモルモット又はフェレット詳細な説明では、動物は鼻内に接種されているが、筋肉内接種や皮内接種などその他の手法で接種したもの、及びその他の実験動物を使用することも可能であるにプロトタイプの分離株I-2614又は関係する分離株を接種することを含むものである。この動物から、接種後0日、2週間、及び3週間経過したときに血清を収集する。ウイルス中和VNアッセイVNアッセイの例に関しては実施例16参照及び間接的IFAIFAの例に関しては実施例11又は14参照で測定されたように、それぞれの分離株I-2614に対して特異的に血清変換された動物と、血清変換された動物由来の血清を、前記別の分離株の免疫学的検出で使用する。一例として本発明は、パラニューモウイルス科の新しいメンバー、すなわち重篤なRTIをヒトに引き起こす可能性のあるヒトメタニューモウイルス又はメタニューモウイルス様ウイルスその最終的な分類についてはウイルス分類学委員会による議論が待たれるので、本明細書でMPVは、例えば分類学上APVに相当すると記載するMPVの特性決定を行う。MPVにより引き起こされる疾患の臨床症状は、咳や筋肉痛、嘔吐、発熱性細気管支炎又は肺炎、可能な結膜炎、あるいはこれらの組合せなど、本質的にhRSVにより引き越されたものと同様である。hRSVに感染した子供に見られるように、特に非常に幼い子供の場合は入院が必要になる可能性がある。一例として、2001年1月19日にCNCM、InstitutePasteurパリにI-2614として寄託されたMPV、又はそれに系統学上相当するウイルス分離株を、本明細書では提供する。それと共に本発明は、核酸、又は配列番号19の核酸配列に系統学上相当する機能的断片、あるいはこれに構造上相当するものを含むウイルスを提供する。詳細には本発明は、100回のブートストラップ及び3回のジャンブルを使用して最尤樹を生成する系統樹分析で試験した後で、トリ鼻気管炎の病因物質であるシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスTRTVとも呼ばれるトリニューモウイルスAPVのウイルス分離株に関係するよりも、CNCMパリにI-2614として寄託されたウイルス分離株のほうに対して系統学上より密接に相当することが見出されることを特徴とするウイルスを提供する。特に前記系統樹分析では、本質的に非哺乳動物ウイルスではあるが最も近い類縁にあるAPV-Cウイルス分離株を、外集団として使用することが有用である。5.9.1バイオインフォマティックスによる配列アライメント2つ以上のアミノ酸配列をBLASTAltschulSF他、1990、JMolBiol215403~410によって比較して、それらの互いの配列相同性及び配列同一性を決定することができる。2つ以上のヌクレオチド配列は、これらをBLASTAltschulSF他、1990、JMolBiol215403~410によって比較して、互いの配列相同性及び配列同一性を決定することができる。BLAST比較は、ClustalW法MacVectorを使用して実施することができる。ある特定の実施形態においては、コンピュータプログラムによる2つ以上の配列のアライメントの後に、マニュアルで再調整することができる。2つの配列同士の同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin及びAltschul、1990、ProcNatlAcadSciUSA872264~1168のアルゴリズムであって、Karlin及びAltschul、1993、ProcNatlAcadSciUSA905873~5877で修正が加えられたものである。そのようなアルゴリズムは、Altschul他、1990、JMolBiol215403~410のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド比較は、NBLASTプログラムを用いて実施することができる。BLASTアミノ酸配列比較は、XBLASTプログラムを用いて実施することができる。比較を目的としたギャップ付きアライメントを得るには、Altschul他、1997、NucleicAcidsRes253389~3402に記載されているようなGappedBLASTを利用することができる。あるいはPSI-Blastを使用して、分子同士の類縁関係を検出する反復探索を実行することができるAltschul他、1997、前掲。BLAST、GappedBLAST、及びPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム例えばXBLASTやNBLASTのデフォルトパラメータを使用することができるhttpwwwncbinlmnihgov参照。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers及びMiller、1988、CABIOS411~17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラムバージョン2.0に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重量算分表を使用することができる。ギャップ長ペナルティは当業者により設定することができる。2つの配列間の同一性は、ギャップを考慮し又は考慮しない状態で、上述と同様の技法を使用して決定することができる。同一性の計算では、典型的には厳密にマッチしているものしかカウントしない。5.9.2ハイブリダイゼーション条件本発明の方法では、哺乳動物MPVの核酸と、又はその逆相補鎖と、又はその相補鎖とのハイブリダイゼーションが可能な核酸を使用して、それらの配列の互いの相同性及び同一性を決定することができる。ある実施形態においては、ストリンジェンシーの高い条件下で核酸をハイブリダイズする。限定ではなく一例としての、そのような高ストリンジェンシー条件を使用する手順は、以下の通りである。DNAを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを、6×SSC、50mMTris-HClpH7.5、1mMEDTA、0.02PVP、0.02Ficoll、0.02BSA、及び500μg/ml変性サケ精子DNAからなる緩衝液中、65Cで8時間から一晩にわたり実施する。フィルタは、100μg/ml変性サケ精子DNA及び5~20×106cpmの32P標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、65Cで48時間ハイブリダイズする。フィルタの洗浄は、2×SSC、0.01PVP、0.01Ficoll、及び0.01BSAを含有する溶液中、37Cで1時間行う。この後、0.1×SSC中、50Cで45分間洗浄してから、オートラジオグラフィにかける。使用することができるその他の高ストリンジェンシー条件は、当技術分野で周知である。本発明のその他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、穏かな低ストリンジェンシー条件下で実施するが、そのような条件は問う業者に周知である例えば、Sambrook他、1989、MolecularCloningALaboratoryManual、第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NewYork参照またAusubel他編、theCurrentProtocolsinMolecularBiologyseriesoflaboratorytechniquemanuals、1987~1997CurrentProtocols、1994~1997JohnWileyandSonsIncも参照。5.9.3系統学的分析本発明は、哺乳動物MPV分離株間の系統学上の関係の推論に関する。系統学上の関係の分析では、多くの方法又は手法を利用することができ、そのような方法には、距離法、最尤法、及び最大節約法が含まれるSwoffordDL他、PhylogeneticInferenceMolecularSystematicsHillisDM、MortizC、及びMableBK編、1996SinauerAssociatesMassachusetts、USA第407~514頁FelsensteinJ、1981、JMolEvol17368~376。この他ブートストラップ技法は、得られる系統樹の信頼区間を準備し調べるのに有効な手段であるFelsensteinJ、1985、Evolution29783~791。系統学上の関係を確立するには、哺乳動物MPV分離株を比較するためにヌクレオチド又はペプチド配列情報を使用する任意の方法又は手法を使用することができ、距離法、最尤法、及び最大節約法又は手法が含まれるが、これらに限定されない。系統学的データの質を分析するには、ブートストラップを含むがこれに限定することのない当技術分野で知られている任意の方法を使用することができる。系統学的手法に使用されるヌクレオチド又はペプチド配列データのアライメントには、マニュアルアライメント、コンピュータペアワイズアライメント、及びコンピュータマルチプルアライメントが含まれるが、これらに限定されない。当業者なら、必要とされる情報及び許される時間に基づいて使用される好ましいアライメント法又は系統学的手法に精通しているであろう。一実施形態においては、hMPV分離株同士の関係を推測するために、DNA最尤法を使用する。別の実施形態においては、前記系統学的手法の1つを使用して作成された系統学的データの確実性を決定するために、ブートストラップ技法を使用する。別の実施形態においては、系統学的分析に対する配列順序エントリーの影響を最小限に抑えるために、データ入力の前に、ジャンブル技法を系統学的手法に適用する。ある特定の実施形態においては、DNA最尤法をブートストラップと共に使用する。別の特定の実施形態においては、DNA最尤法をブートストラップ及びジャンブルと共に使用する。別のさらに具体的な実施形態においては、DNA最尤法を50回のブートストラップと共に使用する。別の具体的な実施形態においては、DNA最尤法を50回のブートストラップ及び3回のジャンブルと共に使用する。別の特定の実施形態においては、DNA最尤法を100回のブートストラップ及び3回のジャンブルと共に使用する。一実施形態においては、hMPV分離株由来の核酸又はペプチド配列情報を、他のhMPV分離株の配列と比較し又はアライメントする。アミノ酸配列は、Lタンパク質、Mタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、又はFタンパク質のアミノ酸配列でよい。別の実施形態では、1つのhMPV分離株又はいくつかのhMPV分離株由来の核酸又はペプチド配列情報を、他のウイルスの配列と比較し又はアライメントする。別の実施形態では、系統学上の関係を推測することができかつ/又は系統樹を構成することができるように、系統学的手法を配列アライメントデータに適用する。HMPV分離株と比較するためにヌクレオチド又はペプチド配列情報を使用する任意の方法又は手法は、前記系統学上の関係を推測するのに使用することができ、距離法、最尤法、及び最大節約法又は手法が含まれるがこれらに限定されない。系統学的分析のためのその他の方法は、WO02/057302号として公開された国際特許出願PCT/NL02/00040号に開示されており、その全体を本明細書に援用する。特にPCT/NL02/00040号は、第12頁27行目から第19頁29行目に、系統学的分析に適切な核酸配列を開示しており、これを参照により本明細書に援用する。系統学的分析では、ウイルスと比較される外集団として、MPVではない核酸配列を得ることが最も有用であり、非常に有用な外集団分離株はトリニューモウイルス血清型CAPV-Cから得ることができ、例えば図16を参照されたい。BioEdit、ClustalW、TreeView、及びNJPlotが含まれるがこれらに限定されない数多くの方法及びプログラムが当技術分野で知られており、系統学上の関係の推測に使用することができる。配列をアライメントし、系統樹又はその関係を生成するのに使用される方法は、比較される配列情報の入力が必要になる。FASTA、NBRF、EMBL/SWISS、GDEタンパク質、GDEヌクレオチド、CLUSTAL、及びGCG/MSFが含まれるがこれらに限定されない数多くの方法又はフォーマットが当技術分野で知られており、配列情報を入力するのに使用することができる。配列をアライメントし、系統樹又はその関係を生成するのに使用される方法は、結果の出力が必要になる。情報又は結果の出力では、CLUSTAL、NBRF/PIR、MSF、PHYLIP、及びGDEを含むがこれらに限定されない数多くの方法又はフォーマットを使用することができる。一実施形態では、系統学上の関係を生成するために、100回のブートストラップ及び3回のジャンブルによるDNA最尤法と併せて、ClustalWを使用する。5.10抗体の作製本発明は、哺乳動物MPVによりコードされたタンパク質に対する抗体の作製にも関する。詳細には本発明は、哺乳動物MPVのFタンパク質、Nタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、Gタンパク質、又はPタンパク質を含めた、全てのMPV抗原に対する抗体の作製に関する。本発明によれば、哺乳動物MPV、その誘導体、類似体、又は断片によりコードされた任意のタンパク質を免疫原として使用して、そのような免疫原と免疫特異的に結合する抗体を産生することができる。本発明の抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、Fab発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ抗Id抗体例えば本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む、及びエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用する抗体という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち免疫学的に抗原に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY、クラス例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2又はサブクラスでよい。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、抗体をペプシンやパパインなどの酵素で処理することによって産生することができるFab及びFab’2フラグメントが含まれる。特定の実施形態では、ヒトMPVによりコードされたタンパク質に対する抗体が産生される。別の実施形態では、ヒトMPVによりコードされたタンパク質のドメインに対する抗体が産生される。当技術分野で知られている様々な手順は、哺乳動物MPV、その誘導体、類似体、又は断片によってコードされたタンパク質に対するポリクローナル抗体を産生するために使用することができる。抗体の産生では、天然のタンパク質、又はその合成変種、又はその誘導体例えば断片を注射することにより、ウサギやマウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない様々な宿主動物を免疫化することができる。免疫学的応答を増大させるために、宿主の種に応じて様々なアジュバントを使用することができ、そのようなアジュバントには、フロイント完全及び不完全、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、表面活性物質であって例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールと、BCGカルメット-ゲラン杆菌やコリネバクテリウム-パルヴムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントなどが含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物MPV、その誘導体、類似体、又は断片によってコードされたタンパク質に対するノクローナル抗体の調製では、培養中の連続細胞系により抗体分子の産生を行う任意の技法を使用することができる。例えば、Kohler及びMilsteinによって当初開発されたハイブリドーマ技法1975、Nature256495~497、並びにトリオーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法Kozbor他、1983、ImmunologyToday472、及びヒトモノクローナル抗体を産生するEBVハイブリドーマ技法Cole他、1985、MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy、AlanRLissInc、第77~96頁がある。本発明の別の追加の実施形態では、最近の技術を利用してPCT/US90/02545号モノクローナル抗体を無菌動物で産生することができる。本発明によればヒト抗体を使用してよく、このヒト抗体は、ヒトハイブリドーマを使用することによってCote他、1983、ProcNatlAcadSciUSA802026~2030又はヒトB細胞を生体外でEBVウイルスで形質転換することによってCole他、1985、MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy、AlanRLiss、第77~96頁、そのヒト抗体を得ることができる。実際に本発明によれば、適切な生物学的活性を持つヒト抗体分子由来の遺伝子と共に、哺乳動物MPV、その誘導体、類似体、又は断片によりコードされたタンパク質に特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライスすることによって、キメラ抗体を産生するために開発された技法Morrison他、1984、ProcNatlAcadSciUSA816851~6855Neuberger他、1984、Nature312604~608Takeda他、1985、Nature314452~454を使用することができるが、そのような抗体は本発明の範囲内にある。本発明によれば、一本鎖抗体の産生に関して述べた技法米国特許第4,946,778号を、特異的一本鎖抗体の産生に適用することができる。本発明の追加の実施形態は、哺乳動物MPV、その誘導体、類似体、又は断片によってコードされたタンパク質に対して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントを、迅速かつ容易に同定できるように、Fab発現ライブラリーの構成に関して述べた技法Huse他、1989、Science2461275~1281を利用する。イディオタイプの分子を含有する抗体フラグメントは、既知の技法により産生することができる。例えばそのような抗体には、抗体分子のペプシン消化により産生することができるFab’2フラグメント、Fab’2フラグメントのジスルフィド架橋の還元により産生することができるFab’フラグメント、抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することにより産生することができるFabフラグメント、及びFvフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。抗体の産生では、例えばELISA酵素結合免疫吸着検査法などの当技術分野で知られている技法によって、所望の抗体のスクリーニングを行うことができる。例えば、哺乳動物MPVによりコードされたタンパク質の特異的ドメインを認識する抗体を選択するために、そのようなドメインを含有する哺乳動物MPVによってコードされたタンパク質の断片に結合する産物に関して産生されたハイブリドーマをアッセイすることができる。本発明により提供される抗体は、MPVを検出するために、またMPVによる感染を治療するための治療方法に使用することができる。本発明の方法により作製された抗体の特異性及び結合親和性は、当業者に知られている任意の技法によって試験をすることができる。ある実施形態で、本発明の方法により産生された抗体の特異性及び結合親和性は、セクション5.8.5、5.8.6、5.8.7、5.8.8、又は5.8.9で述べたように試験をすることができる。5.11抗ウイルス剤を同定するためのスクリーニングアッセイ本発明は、哺乳動物MPVが宿主又は宿主細胞に感染する能力を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVが宿主又は宿主細胞内で複製する能力を低下させる化合物を同定するための方法を提供する。哺乳動物MPVが宿主に感染しかつ/あるいは宿主又は宿主細胞内に複製する能力を消失させ又は低下させる化合物をスクリーニングするには、当業者に周知の任意の技法を使用することができる。特定の実施形態では、哺乳動物MPVがヒトMPVである。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVが哺乳動物又は哺乳動物細胞内で複製する能力を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。より具体的には、本発明は、哺乳動物MPVが哺乳動物又は哺乳動物細胞に感染する能力を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVが哺乳動物細胞内で複製する能力を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞がヒト細胞である。ウイルス力価の決定に使用することができるアッセイの詳細な記述に関しては、セクション5.7を参照されたい。ある実施形態では、細胞を試験化合物に接触させ、哺乳動物MPVに感染させる。ある実施形態では、試験化合物が存在しない状態で、対照培養物に哺乳動物ウイルスを感染させる。細胞は、哺乳動物MPVを感染させる前に、又は感染と同時に、又は感染させた後に、試験化合物に接触させることができる。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。より具体的な実施形態の場合、細胞はヒト細胞である。ある実施形態では、細胞を試験化合物と共に少なくとも1分間、少なくとも5分間、少なくとも15分間、少なくとも30分間、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも5時間、少なくとも12時間、又は少なくとも1日インキュベートする。ウイルスの力価は、アッセイ中の任意の時間で測定することができる。ある実施形態では、培養物中のウイルス増殖の時間的経過を求める。試験化合物の存在下でウイルス増殖が阻害され又は低下する場合、その試験化合物は、哺乳動物MPVの増殖又は感染を阻害し又は低下させるのに有効であることが確認される。特定の実施形態では、哺乳動物MPVの増殖を阻害し又は低下させる化合物について、その哺乳動物MPVに対する特異性を試験するために、他のウイルスの増殖速度を阻害し又は低下させるかどうか試験をする。ある実施形態では、試験化合物をモデル動物に投与し、そのモデル動物を哺乳動物MPVに感染させる。ある実施形態では、試験化合物を投与せずに、対照モデル動物を哺乳動物ウイルスに感染させる。試験化合物は、哺乳動物MPVに感染させる前に、又は感染させると同時に、又は感染させた後に投与することができる。特定の実施形態では、モデル動物が哺乳動物である。さらにより具体的な実施形態では、モデル動物は、コットンラット、マウス、又はサルでよいが、これらに限定されない。モデル動物内のウイルスの力価は、アッセイ中の任意の時間で測定することができる。ある実施形態では、培養物中のウイルス増殖の時間的経過を求める。ウイルス増殖が試験化合物の存在下で阻害され又は減少する場合、その試験化合物は、哺乳動物MPVの増殖又は感染を阻害し又は低下させるのに有効であることが確認される。特定の実施形態では、モデル動物における哺乳動物MPVの増殖を阻害し又は低下させる化合物について、その哺乳動物MPVに対する特異性を試験するために、他のウイルスの増殖速度を阻害し又は低下させるかどうか試験をする。5.12ワクチン、抗体、及び抗ウイルスの製剤好ましい実施形態で、本発明は、本発明による核酸によってコードされたタンパク様分子又はメタニューモウイルス特異的ウイルスタンパク質又はその機能的断片を提供する。有用なタンパク様分子は、例えば、本発明によるウイルスから得ることが可能な遺伝子又はゲノム断片のいずれかから得られる。本明細書で提供されるような分子又はその抗原性断片は、例えば、診断方法又はキットに有用であり、またサブユニットワクチンなどの医薬品組成物に有用である。特に有用なものは、抗原又はサブユニット免疫原として含まれるF、SH及び/又はGタンパク質あるいはその抗原性断片であるが、不活性化した全ワクチンを使用することもできる。系統学的分析で同定された、組換え核酸断片によってコードされたタンパク様物質も特に有用であるが、当然ながら、生体内であろうと例えば保護する目的で、又は診断用抗体を提供するために生体外であろうと例えばファージディスプレイ技術によって、又は合成抗体を産生するのに有用な別の技法によって、特にMPV特異的抗体又はT細胞応答を誘発するために、系統学的分析に有用なORFの好ましい境界内にあるものが好ましい。本明細書では、天然のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体あるいは合成例えばファージライブラリー由来の結合分子抗体であって、本発明によるタンパク様分子又はそのMPV特異的機能性断片を含む抗原と特異的に反応する抗体も提供する。そのような抗体は、ウイルス分離株がMPVであると同定する方法、すなわち前記ウイルス分離株又はその化合物を本明細書で示した抗体と反応させることを含む方法に有用である。これは例えば、ELISA、RIA、FACS、又は種々のフォーマットの抗原検出アッセイCurrentProtocolsinImmunologyを使用し、精製され又は精製されていないMPVあるいはその一部タンパク質、ペプチドを使用することによって、実現することができる。あるいは、従来の蛍光抗体法又は免疫組織法を使用してウイルス抗原を同定するために、感染した細胞又は細胞培養物を使用することができる。本発明によるウイルス、核酸、タンパク用分子又はその断片、抗原、及び/又は抗体を含む医薬品組成物は、例えば、MPV感染及び/又は呼吸器疾患を治療又は予防する方法、すなわち本発明による医薬品組成物を個体に与えることを含む方法で、使用することができる。これは、前記個体がヒトである場合、特に前記ヒトが5才以下である場合に最も有用であるが、それはこのような乳児及び幼児が本明細書で述べたヒトMPVに最も感染し易いからである。一般に急性期の患者は、他の呼吸器疾患又はその他の疾患の素因となる上気道の症状に苦しむことになる。また、より重篤な疾患及びその他の重篤な疾患の素因となる下気道疾患も生じる可能性がある。本発明の組成物は、癌患者、被移植者、及び高齢者を含めた免疫無防備状態の個人を治療するのに使用することができる。また本発明は、本発明によるウイルスを含む細胞培養物又は実験動物を確立すること、前記培養物又は動物を候補抗ウイルス薬で治療すること、及び前記ウイルス又はその前記培養物又は動物への感染に対する前記薬剤の影響を決定することを含む、気道疾患の治療に有用な抗ウイルス薬を得る方法を提供する。そのような抗ウイルス薬の例には、本明細書で提供するMPV中和抗体又はその機能的構成要素が含まれるが、その他の性質の抗ウイルス薬も同様に得られる。また本発明は、医薬品組成物を調製するために、特に、具体的にはMPV感染又は関連する疾患によって引き起こされた気道疾患又は関連する疾患を治療するための医薬品組成物を調製するために、本発明による抗ウイルス薬を使用することも提供し、また、MPV感染又は呼吸器疾患を治療又は予防するための方法であって、個体にそのような医薬品組成物を与えることを含む方法に有用な、本発明による抗ウイルス剤を含む医薬品組成物も提供する。本発明のある実施形態において、本発明のワクチンは、本明細書で定義した哺乳動物メタニューモウイルスを含む。より具体的なある実施形態においては、哺乳動物メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである。好ましい実施形態においては、ワクチン製剤に使用される哺乳動物メタニューモウイルスが、弱毒化表現型を有する。弱毒化表現型を実現する方法については、セクション5.6を参照されたい。本発明は、PIV、RSV、APV、及び/又はhMPVによる感染を予防し治療するためのワクチン製剤を提供する。ある実施形態において、本発明のワクチンは、本発明の組換え及びキメラウイルスを含む。ある実施形態において、ウイルスは弱毒化される。特定の実施形態において、ワクチンはAPVを含み、ワクチンは、ヒトのhMPV感染を予防し治療するために使用される。理論に拘泥するものではないが、APVのFタンパク質とhMPVのFタンパク質との相同性の程度が高いので、APVに感染すると、宿主内では抗体が産生され、hMPVと交差反応し、hMPVによる感染及び関連する疾患から宿主を保護する。別の特定の実施形態においては、ワクチンはhMPVを含み、このワクチンは、シチメンチョウなどであるがこれに限定されないトリへのAPV感染を予防し治療するために使用される。理論に拘泥するものではないが、APVのFタンパク質とhMPVのFタンパク質との相同性の程度が高いので、hMPVに感染すると、宿主内で抗体が産生され、APVと交差反応し、APVによる感染及び関連する疾患から宿主を保護する。特定の実施形態において、本発明は、APV及び/又はhMPVから保護するために、ワクチン製剤に改変されている組換え及びキメラAPV/hMPVウイルスを使用することを包含する。ある実施形態において、APV/hMPVは、APVによる感染からトリを保護するために、トリに投与するワクチンに使用される。理論に拘泥するものではないが、APV遺伝子又はヌクレオチド配列をhMPV遺伝子又はヌクレオチド配列に置き換えることにより、弱毒化表現型が得られ、キメラウイルスをワクチンとして使用することが可能になる。その他の実施形態においては、APV/hMPVキメラウイルスをヒトに投与する。理論に拘泥するものではないが、APVウイルスベクターは、ヒトに弱毒化表現型をもたらし、hMPV配列の発現によって、hMPV特異的免疫応答が誘発される。特定の実施形態において、本発明は、APV及び/又はhMPVから保護するために、ワクチン製剤に改変されている組換え及びキメラhMPV/APVウイルスを使用することを包含する。ある実施形態においては、hMPVによる感染からヒトを保護するために、ヒトに投与するワクチンにhMPV/APVを使用する。理論に拘泥するものではないが、hMPV遺伝子又はヌクレオチド配列をAPV遺伝子又はヌクレオチド配列に置き換えることによって、弱毒化表現型が得られ、キメラウイルスをワクチンとして使用することが可能になる。その他の実施形態においては、hMPV/APVキメラウイルスをトリに投与する。理論に拘泥するものではないが、hMPVの骨格は弱毒化表現型をトリにもたらし、APV配列の発現によってAPV特異的免疫応答が誘発される。ある好ましい実施形態において、本発明のワクチン製剤は、メタニューモウイルスによる感染及び関連する疾患から保護するために使用される。より具体的には、ヒトメタニューモウイルス及び/又はトリニューモウイルスによる感染と、関連する疾患から保護するために、本発明のワクチン製剤を使用する。ある実施形態において、本発明のワクチン製剤は、aヒトメタニューモウイルス及び呼吸器合胞体ウイルス、及び/又はbトリニューモウイルス及び呼吸器合法体ウイルスによる感染から保護するのに使用される。ある実施形態において、本発明のワクチン製剤は、aヒトメタニューモウイルス及びヒトパラインフルエンザウイルス、及び/又はbトリニューモウイルス及びヒトパラインフルエンザウイルスによる感染と、関連する疾患から保護するのに使用される。ある実施形態において、本発明のワクチン製剤は、aヒトメタニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びヒトパラインフルエンザウイルス、及び/又はbトリニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びヒトパラインフルエンザウイルスによる感染と、関連する疾患から保護するのに使用される。ある実施形態において、本発明のワクチン製剤は、ヒトメタニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びヒトパラインフルエンザウイルスによる感染と、関連する疾患から保護するのに使用される。その他のある実施形態において、本発明のワクチン製剤は、トリニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びヒトパラインフルエンザウイルスによる感染と、関連する疾患から保護するのに使用される。例示的なアミノ酸配列の比較については図9を参照されたいが、異なるウイルス種のFタンパク質同士の相同性の程度が高いので、本発明のワクチン製剤は、Fタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が得られたものとは異なるウイルスから保護するために使用することができる。特定の例示的な実施形態において、ワクチン製剤は、トリニューモウイルスA型由来の異種ヌクレオチド配列を含むウイルスを含むウイルスを含有し、このワクチン製剤は、トリニューモウイルスA型及びトリニューモウイルスB型による感染から保護するのに使用される。本発明は、APV-C及びAPV-Dを含めたAPV、hMPV、PIV、インフルエンザ、RSV、センダイウイルス、流行性耳下腺炎、喉頭気管炎ウイルス、シミアンウイルス5、ヒト乳頭腫ウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、並びにその他のウイルス及び病原体と、関連する疾患から保護するのに有用な、ヒト及び動物に投与するワクチン製剤を包含する。本発明はさらに、ヒトメタニューモウイルス感染及びトリニューモウイルス感染と、関連する疾患から保護するのに有用な、ヒト及び動物に投与するワクチン製剤を包含する。一実施形態において、本発明は、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルスFLV、及びイヌジシテンパーウイルスを含めた家畜の疾患を引き起こす物質に対して有用な、ワクチン製剤を包含する。さらに別の実施形態において、本発明は、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、牛疫ウイルス、豚痘ウイルスから家畜を保護し、さらに狂犬病ウイルスから野生動物を保護するのに有用な、ワクチン製剤を包含する。逆遺伝学的手法によって産生された弱毒化ウイルスは、本明細書で述べたワクチン及び医薬品製剤に使用することができる。逆遺伝学的技法は、ワクチン産生に重要な他のウイルス遺伝子に対して追加の変異を設計製作するのにも使用することができ、すなわち有用なワクチン株変種のエピトープを弱毒化ウイルスに設計製作することができる。あるいは、その他のウイルス性又は非ウイルス性病原体由来の抗原を含めた完全に外来のエピトープを、弱毒化した株に設計製作することができる。例えば、HIVgp160、gp120、gp41寄生虫抗原例えばマラリアや細菌又は真菌抗原、腫瘍抗原など、関係のないウイルスの抗原を、弱毒化した株に設計製作することができる。あるいは、生体内でウイルスの屈性を変化させるエピトープを、本発明のキメラ弱毒化ウイルスに設計製作することができる。事実上任意の異種遺伝子配列を、ワクチンに使用される本発明のキメラウイルスに構築することができる。好ましくは生物学的応答調節剤として作用する部分及びペプチドである。様々な病原体のいずれかに保護免疫応答を引き起こすエピトープ、又は中和抗体に結合する抗原を、キメラウイルスによって又はキメラウイルスの一部として発現できることが好ましい。例えば、本発明のキメラウイルスに構成することができる異種遺伝子配列には、インフルエンザ及びパラインフルエンザ血球凝集素ノイラミニダーゼと、ヒトPIV3のHN及びF遺伝子などの融合糖タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態において、キメラウイルスに設計製作することができる異種遺伝子配列には、免疫調節活性を備えたタンパク質をコードするものが含まれる。免疫調節タンパク質の例には、サイトカイン、インターフェロンI型、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-12、及びこれらの薬剤の拮抗物質が含まれるが、これらに限定されない。さらに、ワクチンに使用される本発明のキメラウイルスに構成することができる異種遺伝子配列には、ヒト免疫不全ウイルスHIV、好ましくは1型又は2型由来の配列が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態においては、抗原の供給源になり得る免疫原性HIV由来ペプチドはキメラPIVに構築することができ、次に使用して、脊椎動物の免疫応答を誘発させることができる。そのようなHIV由来ペプチドには、env遺伝子すなわちgp160、gp120、及び/又はgp41の全て又は一部をコードする配列、pol遺伝子すなわち逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、及び/又はインテグラーゼの全て又は一部をコードする配列、gag遺伝子すなわちp7、p6、p55、p17/18、p24/25の全て又は一部をコードする配列、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、及び/又はvpx由来の配列が含まれるが、これらに限定されない。その他の異種配列は、2~3例を挙げると、B型肝炎ウイルス表面抗原HBsAg;A型又はC型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタイン-バーウイルスの糖タンパク質;ヒト乳頭腫ウイルスの糖タンパク質;呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス5、又は流行性耳下腺炎ウイルスの糖タンパク質;インフルエンザウイルスの糖タンパク質;ヘルペスウイルスの糖タンパク質;ポリオウイルスのVP1;細菌や寄生虫など非ウイルス性病原体の抗原決定基から得ることができる。別の実施形態においては、免疫グロブリン遺伝子の全て又は一部を発現することができる。例えば、そのようなエピトープを模倣する抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域を、本発明のキメラウイルスに構成することができる。その他の異種配列は腫瘍抗原から得ることができ、得られたキメラウイルスを使用して、腫瘍細胞に対する免疫応答を発生させ、その結果、生体内で腫瘍の退縮に至る。これらのワクチンは、腫瘍の治療のため、化学療法、放射線療法、外科手術、骨髄移植などを含むがこれらに限定することのないその他の治療法と組み合わせて使用することができる。本発明によれば、組換えウイルスは、T細胞によって認識されるヒト腫瘍抗原参照によりその全体を本明細書に援用するRobbins及びKawakami、1996、CurrOpinImmunol8628~636、メラノサイト系タンパク質、gp100、MART-1/MelanA、TRP-1gp75、チロシナーゼを含む;腫瘍特異的な広く共用される抗原、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-1、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、p15;腫瘍特異的変異抗原、β-カテニン、MUM-1、CDK4;乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、及び膵臓癌、HER-2/neu、ヒト乳頭腫ウイルス-6E、-E7、MUC-1に対する非メラノーマ抗原を含むがこれらに限定することのない、腫瘍関連抗原TAAを発現するように設計製作することができる。さらに他の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を、ヒトメタニューモウイルス及び/又はトリニューモウイルスなどのメタニューモウイルスから得る。さらに他の実施形態においては、本発明のウイルスは2つの異なる異種ヌクレオチド配列を含有し、この場合、一方の配列はヒトメタニューモウイルス及び/又はトリニューモウイルスなどのメタニューモウイルスから得られ、他方の配列は呼吸器合胞体ウイルスから得られる。異種ヌクレオチド配列は、それぞれのウイルスのFタンパク質又はGタンパク質をコードする。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列はキメラFタンパク質をコードし、このキメラFタンパク質は、メタニューモウイルスのFタンパク質の外部ドメイン、及び膜貫通ドメイン、並びにパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の管腔ドメインを含有するものである。組換えウイルス生ワクチン又は不活性化した組換えウイルスワクチンを処方することができる。生ワクチンが好ましいと考えられるが、それは、宿主内での分裂増殖によって、自然感染の場合に生じるものと同様の種類及び大きさの刺激が延び、したがって実質的に長く続く免疫性がもたらされるからである。そのような組換えウイルス生ワクチン製剤の生成は、ニワトリ胚の細胞培養物又は尿膜でウイルスを増殖させ、その後に精製を行う従来の方法を使用して、行うことができる。特定の実施形態において、組換えウイルスは、これを投与する被験体に対して非病原性である。この点に関し、ワクチンを目的とした遺伝子組換えウイルスの使用は、これらの株に弱毒化特性が存在することが望まれると考えられる。トランスフェクションに使用される鋳型に適切な変異例えば欠失を導入することによって、弱毒化特性を持つ新規なウイルスを得ることができる。例えば、温度感受性又は低温適応性に関連した特異的ミスセンス変異を、欠失変異にすることができる。これらの変異は、低温又は温度感受性変異体に関連した点変異よりも安定であるべきであり、復帰変異頻度は極めて低いものであるべきである。あるいは、自殺特性を持つキメラウイルスを構成することができる。そのようなウイルスは、宿主内で1回だけ、又は2~3回しか複製行わないと考えられる。ワクチンとして使用する場合、組換えウイルスは限られた複製サイクルを経て十分なレベルの免疫応答を引き起こすが、ヒト宿主ではさらに複製されず、疾患を引き起こす。それぞれ野生型APV及びhMPVの遺伝子の1つ又は複数が欠けており、あるいは野生型の株に比べて変異している遺伝子を持つ組換えウイルスは、連続して何回も複製を行うことができない。欠陥ウイルスは、そのような遺伝子を永久に発現する細胞系で生成することができる。必須の遺伝子が欠けているウイルスはこれらの細胞系で複製されるが、ヒト宿主に投与した場合は、1回の複製を終了することができない。そのような調製物は、免疫応答を引き起こすのに十分な数の遺伝子を、この不完全なサイクルで転写し翻訳する。あるいは、より多くの量の株を投与することができ、したがってこれらの調製物は、負活性化死滅したウイルスワクチンとしての役割をする。不活性化ワクチンでは、異種遺伝子産物をウイルスの構成要素として発現させることが好ましく、したがって遺伝子産物はウイルス粒子に関連したものである。そのような調製物の利点は、天然のタンパク質を含有し、ホルマリン又はその他の死菌ウイルスワクチンの製造に使用される薬剤を用いた処理によって不活性化しないことである。あるいは、cDNAから作製された本発明の組換えウイルスは、数回しか複製されないように大幅に弱毒化される。ある実施形態においては、本発明のワクチンは、弱毒化哺乳動物MPVを含む。理論に拘泥するものではないが、ウイルスタンパク質が宿主の細胞質膜に挿入され、それによって免疫応答を刺激するので、弱毒化ウイルスによって細胞から新しい感染性ウイルス粒子を発生させることができない場合であっても、弱毒化ウイルスをワクチンとして有効にすることができる。本発明のこの態様の別の実施形態においては、キメラウイルスを死滅させる従来の技法を使用して、不活性ワクチン製剤を調製することができる。不活性ワクチンは、その感染力が失われているという意味で死んでいる。ウイルスの感染力は、その免疫原性に影響を与えずに失われることが理想的である。不活性ワクチンを調製するために、キメラウイルスをニワトリ胚の細胞培養物中又は尿膜中で増殖させ、ゾーン超遠心分離によって精製し、ホルムアルデヒド又はβ-プロピオラクトンにより不活性化し、貯蔵することができる。得られたワクチンを、通常は筋肉内に接種する。不活性ウイルスは、免疫学的応答を高めるために、適切なアジュバントと共に処方することができる。そのようなアジュバントには、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム;リゾレシチンやプルロニックポリオール、ポリアニオンなどの表面活性物質;ペプチド;油性エマルジョン;BCGやコリネバクテリウムパルヴム、ISCOMS、ビロソームなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。上述のワクチン製剤を導入するのに数多くの方法を使用することができ、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、及び鼻内、及び吸入経路が含まれるが、これらに限定されない。キメラウイルスワクチン製剤は、ワクチンの設計対象である病原体の自然な感染経路を経て導入することが好ましいと考えられる。ある実施形態においては、本発明は、免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物は、哺乳動物MPVを含む。特定の実施形態において、免疫原性組成物はヒトMPVを含む。ある実施形態において、免疫原性組成物は、弱毒化哺乳動物MPV又は弱毒化ヒトMPVを含む。ある実施形態において、免疫原性組成物はさらに、医薬品として許容可能な担体を含む。5.13投薬計画、投与、及び製剤本発明は、弱毒化形態のウイルス、組換え形態のMPV及びAPV、1つ又は複数の異種又は非天然の抗原性配列を発現するキメラMPV及びAPVを含めたMPV及びAPVを含む、ワクチン及び免疫原性調製物を提供する。本発明のワクチン又は免疫原性調製物は、1価、あるいは2価又は3価のワクチンを含めた多価ワクチンを包含する。本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、様々なウイルス感染からの保護を行うのに有用である。特に本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、宿主を呼吸器感染症から保護する。本発明の組換えウイルス及び/又はワクチン又は免疫原性製剤は、単独で、又はその他のワクチンと組み合わせて投与することができる。本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、呼吸器合胞体ウイルスワクチンやインフルエンザワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、肺炎ワクチン、リケッチアワクチン、ブドウ球菌ワクチン、百日咳ワクチン、又は呼吸器癌に対するワクチンなどであるがこれらに限定することのない、呼吸器疾患からの保護を行うその他のワクチン又は免疫原性製剤と組み合わせて投与することが好ましい。好ましい実施形態において、本発明のウイルス及び/又はワクチンは、対応年齢で推奨される小児科ワクチンと同時に投与する。例えば、2、4、又は6カ月の月齢では、本発明のウイルス及び/又はワクチンを、DtaPIM、HibIM、ポリオIPV又はOPV、及びB型肝炎IMと同時に投与することができる。12カ月又は15カ月の月齢では、本発明のウイルス及び/又はワクチンを、HibIM、ポリオIPV又はOPV、MMRII登録商標SubQ;Varivax登録商標SubQ、及びB型肝炎IMと同時に投与することができる。本発明の方法と共に使用することができるワクチンは、様々な文献、例えばその内容全体を参照により本明細書に援用するTheJordanReport2000、DivisionofMicrobiologyandInfectiousDiseases、NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases、NationalInstitutesofHealth、UnitedStatesで検討されている。本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、そのものを、あるいは医薬品又は治療用組成物の形態で被験体に投与することができる。本発明のアジュバント及び免疫原性抗原例えばウイルス、キメラウイルス、変異ウイルスを含む医薬品組成物は、従来の混合、溶解、造粒、糖衣作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスを用いて製造することができる。医薬品組成物は、本発明の免疫原性抗原を医薬品として使用することのできる調製物に処理するのを容易にする、1つ又は複数の生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、又は補助剤を使用した、従来の手法で処方することができる。適正な製剤は、とりわけ選択される投与経路に応じて異なる。本発明のワクチン又は免疫原性組成物がアジュバントを含み、あるいは1つ又は複数のアジュバントと共に投与する場合、使用することができるアジュバントには、無機塩アジュバント、又は無機塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、微粒子状アジュバント、粘膜アジュバント、及び免疫刺激性アジュバントが含まれるが、これらに限定されない。アジュバントの例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、スクアレン又はスクアレン水中油アジュバント製剤、生分解性及び生体適合性ポリエステル、重合リポソーム、トリテルペノイドグリコシド又はサポニン例えば、STIMULON、ISCOPREPという商標でも販売されているQuilA及びQS-21、N-アセチル-ムラミル-トレオニル-D-イソグルタミンTERMURTIDEという商標で販売されているThreonyl-MDP、LPS、モノホスホリル脂質AMPLという商標で販売されている3D-MLAが含まれるが、これらに限定されない。本発明のワクチン又は免疫原性組成物を投与する被験体は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトであるが、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽例えばニワトリ、シチメンチョウ、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、げっ歯類を含むがこれらに限定されないヒト以外の動物であってもよい。本発明のワクチン又は免疫原性組成物を導入するには、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、鼻内、及び吸入経路を含むがこれらに限定されない数多くの方法を使用することができ、また乱刺例えば二又状の針bifurcatedneedleを使用して皮膚の最上層を掻爬するによって導入することができる。局所投与では、当技術分野で知られているように、本発明のワクチン又は免疫原性調製物を、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液などとして処方することができる。鼻内又は吸入による投与では、本発明により使用される調製物を、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又はその他の適切な気体を用いて、加圧パック又はネブライザからエアロゾルスプレイを噴出させる形で都合良く送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量分が送達されるように弁を設けることにより決定することができる。例えば吸入器又は注入器で使用されるゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物の粉末混合物及びラクトースやデンプンなどの適切な粉末基材を含有するものを処方することができる。注射の場合、ワクチン又は免疫原性調製物は、水溶液として処方することができ、好ましくはハンクス液やリンガー液、生理食塩水などの、生理学的に適合性のある緩衝液として処方することができる。この溶液は、懸濁剤や安定剤、及び/又は分散剤などの、処方可能な薬剤を含有してよい。あるいはタンパク質は、使用前に、例えば滅菌した発熱性物質を含まない水などの適切な賦形剤と共に構成するために、粉末形態にすることができる。投与するためのワクチン又は免疫原性製剤の有効な量の決定は、特に本明細書に記載される詳細な開示に照らし、十分に当業者の能力の範囲内である。有効量は、invitroアッセイで最初に推定することができる。例えば、ある用量は、当技術分野で周知の技法を使用して、免疫応答の誘発を実現させるために動物モデルで処方することができる。当業者なら、本明細書で述べる結果に基づいて、全ての動物種への投与を容易に最適化することができよう。投薬量及び投薬間隔は、個々に調節することができる。例えば免疫原性組成物として使用する場合、適切な用量とは、上述のように投与したときに抗体応答を誘発することが可能な組成物の量である。ワクチンとして使用する場合、本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、1~36週間で約1~3回の服用として投与することができる。好ましくは、約2週間~約4カ月の間隔で1回又は2回服用として投与し、その後周期的にブースターワクチン接種を行ってよい。個々の動物には代替のプロトコルが相応しい。適切な用量とは、上述のように投与したときに、免疫化した動物が少なくとも4~12カ月間感染から保護されるよう、その動物の免疫性応答を十分高めることが可能なワクチン製剤の量である。一般に、1回の用量に含まれる抗原の量は、宿主1kg当たり約1pgから約100mgにわたり、典型的な場合は約10pgから約1mgにわたり、好ましくは約100pgから約1μgにわたる。適切な用量範囲は、注入経路及び患者のサイズと共に変化することになるが、典型的な場合、約0.1mLから約5mLにわたる。特定の実施形態において、本発明のウイルス及び/又はワクチンは、開始時の単回用量を少なくとも103TCID50、少なくとも104TCID50、少なくとも105TCID50、少なくとも106TCID50として投与する。別の特定の実施形態において、本発明のウイルス及び/又はワクチンは、複数回用量として投与する。好ましい実施形態においては、2、4、及び6カ月の月齢では1次投薬計画を使用し、生後2年目の開始時にはブースター用量を使用する。複数回投薬計画では、各用量が少なくとも105TCID50又は少なくとも106TCID50とであることがより好ましい。5.13.1チャレンジ調査このアッセイを使用して、本発明の組換えウイルス及び本発明のワクチンが、コットンラットやハムスターなどを含むがこれらに限定されない動物モデル系の下気道ウイルス感染を予防できるかどうか決定する。組換えウイルス及び/又はワクチンは、静脈内IV経路によって、筋肉内IM経路によって、又は鼻内経路INによって投与することができる。組換えウイルス及び/又はワクチンは、当業者に周知の任意の技法によって投与することができる。このアッセイは、抗体が結合する肺のウイルス力価の減少に、抗体の血清濃度を相関させるのにも使用する。第0日目、コットンラットSigmodonhispidis、平均100gカニクイザル平均重量2.0kgなどであるがこれらに限定されない動物群に、筋肉内注射によって、又は静脈内注射によって、又は鼻内経路によって、対象の組換えウイルス又はキメラウイルス又はワクチン、あるいはBSAを投与する。本発明の組換えウイルス又はワクチンを投与する前に、あるいは投与と同時に、あるいは投与した後に、野生型ウイルス、すなわち生成されたワクチンの対象であるウイルスを、動物に感染させる。ある実施形態においては、本発明の組換えウイルス及び/又はワクチンを投与した後、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、1週間、又は1カ月以上経てから、動物に野生型ウイルスを感染させる。感染後、コットンラットを犠牲にし、その肺組織を収集し、プラーク力価測定によって肺性ウイルス力価を決定する。ウシ血清アルブミンBSA10mg/kgを陰性対照として使用する。上記組換えウイルス又はワクチン投与時の血清中の抗体濃度を、サンドイッチELISAを使用して決定する。同様にマカクでも、鼻及び肺の洗浄液中のウイルス力価を測定することができる。5.13.2標的集団本発明のある実施形態においては、本発明の治療及び診断法を目的とした標的集団を、年齢によって定義する。ある実施形態においては、本発明の治療及び/又は診断法を目的とした標的集団は、呼吸器感染の他に疾患又は障害を特徴とする。特定の実施形態において、標的集団は、2才未満の幼児を包含する。より具体的な実施形態において、2才未満の子供は呼吸器感染以外の病気に罹っていない。その他の実施形態において、標的集団は、5才を超える年齢の患者を包含する。より具体的な実施形態において、5才を超える年齢の患者は、嚢胞性線維症、白血病、及び非ホジキンリンパ腫を含めた別の疾患又は障害に罹っており、あるいは最近、骨髄又は腎臓移植を受けている。本発明の特定の実施形態において、標的集団は、hMPV感染が宿主の免疫抑制に関連している被験体を包含する。特定の実施形態において、被験体は、免疫無防備状態の個体である。ある実施形態において、本発明の方法を目的とした標的集団は、高齢者を包含する。特定の実施形態において、本発明の方法により治療し又は診断する被験体は、冬季数カ月でhMPVに感染したものである。5.13.3臨床試験invitroアッセイ及び動物モデルで試験をする本発明のワクチン又はその断片は、さらに、健常な成人志願者群において、安全性、耐性、及び薬物動態について調べることができる。志願者に、筋肉内、静脈内、又は肺送達系によって、単回用量の本発明の組換えウイルス及び/又は本発明のワクチンを投与する。単回用量の本発明の組換えウイルス及び/又は本発明のワクチンを受ける前に少なくとも24時間、各志願者をモニターし、その投与を受けた後少なくとも48時間は、各志願者の臨床部位をモニターする。次いで志願者を、外来患者として投与後3日、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、及び56日目にモニターする。血液サンプルを、留置カテーテル又は直接静脈穿刺により10mlの赤いキャップredtopの採血管Vacutainertubeを使用して、以下の間隔で、すなわち:1服用量の本発明の組換えウイルス及び/又は本発明のワクチンを投与する前;2服用量の本発明の組換えウイルス及び/又は本発明のワクチンを投与している間;3服用量の本発明の組換えウイルス及び/又は本発明のワクチンを投与してから5分、10分、15分、20分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、及び48時間後;4服用量の本発明の組換えウイルス及び/又は本発明のワクチンを投与してから3日、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、及び56日後に収集する。サンプルを室温で凝固させ、遠心分離後に血清を収集する。患者由来のサンプル中の、本発明の組換えウイルス及び/又は本発明のワクチンに対して生成された抗体の量は、ELISAによって定量することができる。PBMC中、及び肺及び鼻の洗浄液中のT細胞免疫性細胞障害性及びヘルパー応答もモニターすることができる。志願者の血清中の抗体レベルの濃度は、服用量の本発明の組換えウイルス及び/又は本発明のワクチンを投与した後それぞれの収集間隔での血清レベルから投与前の血清レベルバックグラウンドレベルを差し引くことによって、補正する。各志願者ごとに、補正された血清抗体又は抗体断片濃度から、モデル依存型手法Gibaldi他編、1982、Pharmacokinetics、第2版、MarcelDekker、NewYorkに従い薬物動態パラメータを算出する。5.14哺乳動物MPVを検出及び診断するための方法本発明は、MPVを診断及び/又は検出する手段及び方法を提供し、前記手段及び方法は、MPV及びその構成要素と、その転写、翻訳、発現、増殖、及び代謝プロセスの産物の検出に用いられるものである。より詳細には、本発明は、動物及びヒトのMPV感染を診断する手段及び方法を提供し、前記手段及び方法には、MPVの構成要素、MPVのライフサイクルによる産物、及びMPV曝露又は感染に対する宿主の応答による産物の検出が含まれるが、これらに限定するものではない。MPV又はその構成要素、並びにその転写、翻訳、発現、増殖及び代謝過程の産物を検出するために用いることができる方法は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、分子に基づく方法、抗体に基づく方法、細胞に基づく方法が挙げられる。分子に基づく方法の例としては、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、逆転写酵素PCRRT-PCR、リアルタイムRT-PCR、核酸配列に基づく増幅NASBA、オリゴヌクレオチドプローブ検出、サザンブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、サンプルとMPVに相補的な又はMPVと類似若しくは同一の核酸とを接触することを含む任意の方法、並びにこれらの方法の組合せ又は当技術分野の方法との組合せが挙げられる。使用しうる同一又は類似の核酸は本明細書に記載しており、また当業者に周知であり、MPVと、他のウイルス及び生物のゲノム物質又は関連する産物とを区別することが可能である。抗体に基づく方法の例としては、限定されるものではないが、抗体とMPVの含有が疑われるサンプルとを接触させること、直接免疫蛍光法DIF、酵素結合免疫吸着アッセイELISA、ウエスタンブロット、イムノクロマトグラフィが挙げられる。細胞に基づく方法の例としては、限定されるものではないが、MPV、その構成要素又はその産物に曝露された場合にシグナルを放出することができるレポーターアッセイが挙げら得る。別の実施形態において、レポーターアッセイは、invitroアッセイであり、それによりリポーターがMPV、その構成要素又はその産物に曝露された際に発現される。上記方法の例は当技術分野で周知であり、本明細書にも記載している。より具体的な実施形態において、NASBAを用いて、総核酸のプールから特異的なRNA又はDNAを増幅する。一実施形態において、本発明は、MPVを診断及び検出する手段及び方法であって、前記手段及び方法が、MPVに関連し又はMPVに相補的なゲノム物質及びその他の核酸の検出と、処理済みであるものと未処理であるものの両方の、MPVの転写産物及び翻訳産物の検出と、MPVへの曝露又は感染に対する宿主応答の構成要素の検出を含むがこれらに限定されないものを提供する。一実施形態において、本発明は、核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド、及びMPVのゲノム内に存在する核酸配列の転写産物を、調製しかつ使用することによるMPVの検出に関する。さらに本発明は、MPVゲノム及びその転写物の特定領域をコピーし又は増幅するために前記オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、MPVのゲノム及びその転写産物内に存在する核酸又はその配列を検出することに関する。コピーし又は増幅することができるMPVゲノム及びその転写物の領域には、以下の物質、すなわちN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、及びL遺伝子の1つ又は複数の完全及び不完全伸長部が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、同定を行うために、MPVのN遺伝子又はその転写物をコピーし又は増幅する方法と併せてオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する。前記方法には、PCRアッセイ、RT-PCRアッセイ、リアルタイムRT-PCRアッセイ、プライマー伸長又はランオンアッセイrunonassay、NASBA、MPVの遺伝物質あるいはその転写物又は相補体を前記オリゴヌクレオチド由来の核酸配列伸長用の鋳型として用いるその他の方法が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態においては、方法を組み合わせて用いてサンプル中のMPVの存在を検出する。当業者であれば、各アッセイの必要条件及び適用性に精通しているはずである。例えば、PCR及びRT-PCRは、核酸の増幅又は検出に有用でありうる。より具体的な実施形態において、リアルタイムRT-PCRは、PCR産物の慣用のかつ信頼性ある定量に使用される。別の実施形態においては、本発明は、核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドと、MPVのゲノム内に存在する核酸配列の転写産物とを調製し使用することによってMPVを検出することに関する。さらに本発明は、MPVゲノム及びその転写物内にあり又はそれらに相補的な特定領域にハイブリダイゼーションしかつその特定領域を検出するためのプローブとして前記オリゴヌクレオチド配列を使用して、MPVのゲノム及びその転写産物中に存在し又はそれらに相補的な核酸又はその配列を検出することに関する。ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出することができるMPVゲノム及びその転写物の領域には、以下の物質、すなわちN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、及びL遺伝子の1つ又は複数の完全及び不完全伸長部が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、同定を行うため、MPVのN遺伝子又はその転写物を検出し、アニールし、又はそれらにハイブリダイズする方法と併せて、オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する。前記方法には、ノーザンブロット、サザンブロットと、MPVゲノム内にあり又はMPVゲノムに相補的な配列又は配列伸長部をハイブリダイゼーションし、アニールし、又は検出するために標的としてMPVの遺伝物質又はその転写物及び補体を用いるその他の方法が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物MPVの核酸又はその逆相補体又はその相補体にハイブリダイズ可能な核酸を本発明で使用して、哺乳動物MPVの存在を検出することができる。ある実施形態においては、核酸を高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。限定しようとするのではなく一例として、そのような高ストリンジェンシー条件を使用する手順は以下の通りである。DNAを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを、6×SSC、50mMTris-HClpH7.5、1mMEDTA、0.02PVP、0.02Ficoll、0.02BSA、及び500μg/ml変性サケ精子DNAからなる緩衝液中、65Cで8時間から一晩かけて実施する。フィルタを、100μg/ml変性サケ精子DNA及び5~20×106cpmの32P-標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、65Cで48時間ハイブリダイズする。フィルタの洗浄を、2×SSC、0.01PVP、0.01Ficoll、及び0.01BSAを含有する溶液中、37Cで1時間行う。この後、0.1×SSC中50Cで45分間洗浄し、その後オートラジオグラフィにかける。使用することが可能なその他の高ストリンジェンシー条件は、当技術分野で周知である。本発明のその他の実施形態においては、ハイブリダイゼーションを、当業者に周知であるような穏かな低ストリンジェンシー条件下で実施する例えばSambrook他、1989、MolecularCloning、ALaboratoryManual第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NewYork参照またAusubel他編、theCurrentProtocolsinMolecularBiologyseriesoflaboratorytechniquemanuals、1987~1997、CurrentProtocols、1994~1997JohnWileyandSonsIncも参照。任意のサイズのオリゴヌクレオチドを本発明の方法において用いることができる。本明細書に記載するように、そのようなオリゴヌクレオチドは、種々の方法、例えば種々の検出又は分析手順におけるプライマー又はプローブとして有用である。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、少なくとも5塩基、少なくとも8塩基、少なくとも10塩基、少なくとも12塩基、少なくとも15塩基、少なくとも20塩基、少なくとも25塩基、少なくとも30塩基、少なくとも35塩基、少なくとも40塩基、少なくとも45塩基、少なくとも50塩基、少なくとも55塩基、少なくとも60塩基、少なくとも70塩基、少なくとも80塩基、少なくとも100塩基、少なくとも200塩基、少なくとも300塩基、少なくとも400塩基、少なくとも500塩基、少なくとも1000塩基、少なくとも2000塩基、少なくとも3000塩基、少なくとも4000塩基、又は少なくとも5000塩基である。別のより特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、MPVゲノム配列又はその相補配列などの標的配列に対して少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも99、少なくとも99.5の相同性を有する、少なくとも5塩基、少なくとも8塩基、少なくとも10塩基、少なくとも12塩基、少なくとも15塩基、少なくとも20塩基、少なくとも25塩基、少なくとも30塩基、少なくとも35塩基、少なくとも40塩基、少なくとも45塩基、少なくとも50塩基、少なくとも55塩基、少なくとも60塩基、少なくとも70塩基、少なくとも80塩基、少なくとも100塩基、少なくとも200塩基、少なくとも300塩基、少なくとも400塩基、少なくとも500塩基、少なくとも1000塩基、少なくとも2000塩基、少なくとも3000塩基、少なくとも4000塩基、又は少なくとも5000塩基を含む。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も3’末端の塩基の少なくとも8塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も3’末端の塩基の少なくとも10塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も3’末端の塩基の少なくとも12塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も3’末端の塩基の少なくとも15塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も3’末端の塩基の少なくとも20塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も3’末端の塩基の少なくとも25塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、特異的な位置又はヌクレオチドが置換されるようにオリゴの縮重セットを用いる。縮重は、標的配列に対しストリンジェントな条件でハイブリダイズする領域内の、任意の位置又は任意の数の位置で生じてもよく、最も好ましくは少なくとも1つの位置で生じるが、さらに少なくとも2つの位置、少なくとも3つの位置、少なくとも10の位置で生じてもよい。当業者であれば、当技術分野で公知のアッセイによってオリゴヌクレオチドの構造上の必要条件を十分に理解しうる。また、より体系的な手法を用いてオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを設計することも可能である。例えば、当業者であれば、好ましいアッセイに基づいてオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブの適当な長さ及び配列を、アニーリング温度及びオリゴの構造すなわち配列を決定しうる。さらに当業者であれば、標的配列に対するオリゴの特異性を温度に応じて高める又は低減するために、アッセイの温度を調節することによりオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを用いたアッセイの特異性を決定しうる。好ましい実施形態において、プライマー又はプローブのアニーリング温度を、当技術分野で公知の方法を用いて決定し、アッセイを当該アニーリング温度にて実施する。当業者であれば、その特異的な標的配列に対するオリゴヌクレオチドに関連するアニーリング温度を計算する方法に精通している。例えば、アニーリング温度は、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにおける各G又はCヌクレオチドに対してアニーリング温度に4°Cを割り当てることによって大まかに計算することができる。別の例において、アニーリング温度は、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにおける各A又はTヌクレオチドに対してアニーリング温度に2°Cを割り当てることによって大まかに計算することができる。オリゴヌクレオチドのアニーリング温度は、オリゴヌクレオチドの長さ及び配列、並びに標的配列に対するオリゴの相補性に応じて必ずしも異なるものではなく、オリゴプライマー又はプローブとの結合事象のみがアニーリング温度に影響する。本明細書に記載のアニーリング温度の計算例は、例示を意味し、他のアニーリング温度の決定方法から本発明を限定することを意味するものではない。当業者であれば使用可能な他の方法に精通しており、そしてまたオリゴヌクレオチドのアニーリング又は融解温度を計算するための他のより最新の方法が本明細書に記載されている。より具体的な実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、少なくとも30°C、少なくとも35°C、少なくとも40°C、少なくとも45°C、少なくとも50°C、少なくとも55°C、少なくとも60°C、少なくとも65°C、少なくとも70°C、少なくとも80°C、少なくとも90°C、又は少なくとも99°Cの温度でアニーリングする。本発明は、サンプル中のMPVを同定又は検出するための細胞系アッセイ及び無細胞アッセイを提供する。本発明の細胞系アッセイ及び無細胞アッセイを実施するために種々の方法、例えば限定されるものではないがレポーターを用いる方法を用いることができる。レポーターの例は本明細書に記載しており、ハイスループットスクリーニングを用いてMPVを同定又は検出するため、そして当業者に周知の他の任意の目的のために用いることができる。本発明のレポーターアッセイにおいてはいくつかの方法を用いることができる。例えば、細胞系アッセイは、サンプルとレポーター遺伝子を含む核酸配列を含有する細胞とを接触させここでレポーター遺伝子はMPV遺伝子のプロモーターと結合しているか又はMPV遺伝子産物により認識されるプロモーターと結合している、MPV又はMPVの構成要素への曝露の際にレポーター遺伝子の発現を測定することにより実施しうる。細胞系アッセイのさらなる実施形態において、MPVが感染しうる宿主細胞は、1以上のレポーター遺伝子をコードする核酸構築物でトランスフェクトし、その結果、該レポーター遺伝子からの発現がMPV又はMPV構成要素の存在下で生じる。そのような実施形態において、レポーター遺伝子の発現は、MPV又はその構成要素により認識される核酸配列と機能的に結合し、それによりレポーター遺伝子の発現が生じる。サンプル中のMPVの存在は、当技術分野で公知でありまた本明細書セクション5.8.2に記載する任意の方法を用いて検出することができるレポーター遺伝子の発現を誘導する。細胞系検出アッセイにおいて検出され用いられる宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、Vero、tMK、COS7細胞がある。別の実施形態において、宿主細胞は、MPVを感染させうる任意の細胞である。それによりレポーター遺伝子の発現は、MPV又はその構成要素の存在の指標となる。無細胞アッセイにおいて、サンプルは核酸配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸と接触させ、その結果、MPV又はその構成要素の存在がinvitroにおけるレポーター遺伝子の発現を誘導する。例えば、無細胞アッセイは、MPV又はその構成要素を含有することが疑われるサンプルとレポーター遺伝子を含む核酸とを接触させここでレポーター遺伝子はMPVのプロモーターと結合しているか又はMPV遺伝子産物により認識されるプロモーターと結合されている、MPV又はMPVの構成要素への曝露の際にレポーター遺伝子発現を測定することにより実施し得る。それによりレポーター遺伝子の発現は、MPV又はその構成要素の存在の指標となる。多数のレポーター化合物が当技術分野で公知であり、種々の例を本明細書において提供する例えばセクション5.8.2参照。別の実施形態において、本発明は、ミニレプリコン系を用いたMPV感染の検出に関する。例えば、宿主細胞を、1以上のレポーター遺伝子をコードするhMPVミニレプリコン構築物でトランスフェクトし、それによりhMPV又はhMPVポリメラーゼの存在下でレポーター遺伝子からの発現が生じるようにする。レポーター遺伝子の例は、本明細書のセクション5.8.2に記載する。そのような実施形態において、hMPVは、ミニレプリコン系によりコードされる1若しくは複数のレポーター遺伝子の発現を促進するようヘルパーウイルスとして作用する。何らかの制限に拘束されるものではないが、hMPVは、ミニレプリコン系のレスキューを駆動し、それゆえ1若しくは複数のレポーター遺伝子の発現を駆動するポリメラーゼを提供する。特定の実施形態において、レポーター遺伝子をコードする、hMPVミニレプリコンでトランスフェクトされた宿主細胞を、hMPVを含有することが疑われるサンプルと接触させる。サンプル中のhMPVの存在が、当技術分野で公知でありまた本明細書セクション5.8.2に記載する任意の方法を用いて検出することができるレポーター遺伝子の発現を誘導する。宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、Vero、tMK、COS7細胞がある。別の実施形態において、宿主細胞は、MPVを感染させうる任意の細胞である。別の実施形態においては、本発明は、MPV又はその遺伝子産物に特有のペプチド又は核酸に特異的でありそれらを認識することができる抗体、例えばモノクローナル抗体MAbを、調製し使用することによって、動物又はヒト宿主におけるMPV感染を検出することに関する。前記MAbによって認識されたエピトープ又は抗原決定基には、MPVの増殖に関わるライフサイクル及び代謝プロセス中に合成されるタンパク様及び核酸産物が含まれるが、これらに限定されない。適切な抗体を生成するために抗原決定基として使用することができるタンパク様又は核酸産物には、MPVの以下の構成要素、すなわちN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、及びL遺伝子の1つ又は複数の完全及び不完全な転写及び発現産物が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態においては、生物学的サンプル中、例えば体液中に、MPV発現Gペプチドが存在するかどうかを検出し又は確認するその他の方法と併せて、G遺伝子又はその一部のタンパク様産物に対して産生されたMAbを使用する。前記方法には、ELISA、ラジオイムノ又は競合アッセイ、免疫沈降と、転写され又は発現したMPVの遺伝子産物を標的として用いて前記標的又はその一部及び類縁体に対して産生されたMAbによって検出を行うその他の方法が含まれるが、これらに限定されない。本発明の別の実施形態においては、hMPVの検出に使用しうる抗体は、4つのサブタイプ全てのF、G、N、L、M、M2-1、P及びSHタンパク質を認識する。別の実施形態においては、本発明は、MPVへの曝露又は感染に対する宿主の免疫応答に関連し、またそのような応答に特有のものである因子を検出することに関する。MPVに曝露され又は感染すると、宿主の免疫系は前記曝露又は感染に対する応答を誘発するが、これは、ウイルスの作用及び/又は増殖を排除し又は弱めることを目標とした抗体の宿主による生成を伴うものである。本発明は、宿主がMPVに曝露され又は感染することにより生成される前記抗体を検出することによって、MPVに関連する疾患を診断する手段及び方法を提供する。前記抗体によって認識されるエピトープには、ペプチドとその露出した表面、すなわち宿主の免疫応答を受け易く、かつウイルスに対する宿主の免疫応答発生の際に抗原決定基として働くことのできる表面が含まれるが、これらに限定されない。抗体を生成するためのエピトープとして、宿主の免疫応答によって使用されるタンパク様及び核物質の一部には、MPVの以下の構成要素、すなわちN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、及びL遺伝子の1つ又は複数の産物が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態においては、MPVのN遺伝子コード化ペプチドの、部分的に又は完全に接触可能な部分に対する抗体を、宿主サンプル中で検出する。特定の実施形態においては、生物学的サンプル中、例えば体液中に、宿主由来の抗体が存在するかどうかを検出するその他の方法と併せて、G遺伝子又はその一部のタンパク様産物を使用する。前記方法には、ELISA、ラジオイムノ又は競合アッセイと、その他の方法、すなわち転写され又は発現したMPVの遺伝子産物を標的として用い、前記産物を認識しかつ生物学的サンプル中に見出される宿主抗体によって検出を行うその他の方法が含まれるが、これらに限定されない。また本発明は、診断アッセイ又は試験キットに関する手段及び方法と、生物学的サンプル、例えば体液を含むがこれらに限定されない様々な供給源からMPV感染物質を検出する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、MPVの核酸又はその相補体を同定するのに適したアッセイ、キット、プロトコル、及び手順に関する。別の実施形態では、本発明は、MPV発現ペプチド又はその一部を同定するのに適したアッセイ、キット、プロトコル、及び手順に関する。別の実施形態では、本発明は、MPVへの曝露又は感染に対する宿主免疫応答の構成要素を同定するのに適したアッセイ、キット、プロトコル、及び手順に関する。宿主のMPV感染の診断確認の他、本発明は、MPV分離株を異なる系統学上の群又はサブグループに分類する手段及び方法も提供する。一実施形態では、より有効でサブグループに特異的な治療を設計するために、この特徴を有利に使用して、種々のMPV変種、変種A1、A2、B1、及びB2を区別することができる。MPVの変種は、以下の物質、すなわちN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、及びL遺伝子の1つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて差別化することができる。特定の実施形態で、MPVは、Gタンパク質又は糖タンパク質のヌクレオチド又はアミノ酸配列と、G糖タンパク質も認識するモノクローナル抗体を使用した中和試験とを使用して、特定のサブグループに差別化することができる。一実施形態において、ヒトにおけるMPV感染の診断は、当業者に周知の任意の技法、例えばイムノアッセイを使用して行う。免疫特異的結合及び交差反応性を分析するのに使用することができるイムノアッセイには、2~3の例を挙げると、ウェスタンブロットやラジオイムノアッセイ、ELISA酵素結合免疫吸着アッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、蛍光イムノアッセイなどの技法を使用した競合及び非競合アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。そのようなアッセイは日常的なもので、当技術分野で周知であり例えば、その全体を参照により本明細書に援用するAusubel他編、1994、CurrentProtocolsinMolecularBiology、Vol1、JohnWileySonsInc、NewYork参照、イムノアッセイの非限定的な例をセクション5.8に記載する。一実施形態において、本発明は、MPVゲノムの領域、例えばN、M、F、G、L、M、P、及びM2遺伝子などの遺伝子又は遺伝子の一部であるがこれらに限定されないものが含まれるMPVゲノムの領域をコピーし又は増幅するPCR又はプライマー伸長法と共に、オリゴヌクレオチドを使用して、MPV感染を検出することに関する。特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドをRT-PCR法と併せて使用する。他の実施形態においては、増幅産物及び/又は遺伝物質を、様々なhMPV株の間に保存され又は様々なhMPV株の中で明らかに異なる特定の配列に相補的なオリゴヌクレオチドでプローブ検出することができる。後者の組のオリゴヌクレオチドにより、宿主の感染の原因であるhMPVの特定の株を同定することが可能になる。本発明は、宿主に感染することが可能なhMPVの種々のサブグループ及び変種を区別する方法を提供する。ある特定の実施形態においては、宿主感染の原因であるhMPVを、特定のサブグループ、例えばサブグループA又はサブグループBに分類する。別の特定の実施形態においては、宿主感染の原因であるhMPVを、サブグループの特定の変種、例えば変種A1、A2、B1、又はB2として分類する。別の実施形態においては、本発明は、宿主感染の原因であるhMPVを新しいサブグループに、かつ/あるいは新しく又は既存のサブグループの新しい変種に分類する手段及び方法を提供する。hMPV株をサブグループ及び/又は変種のグループに分類することができる方法は、当業者に知られている。一実施形態においては、感染の病因物質がhMPV株であると特定するのにポリクローナル抗体を使用し、前記株がhMPVの新しく又は知られているサブグループ及び/又は新しく又は知られている変種に特有のものであると識別するのに二次抗体を使用する。一実施形態においては、hMPVに対して選択的な抗体を、免疫反応アッセイ、例えばELISAやRIAと併せて使用し、それによって、生物学的サンプル中のhMPVへの曝露又は感染の存在を特定する。他の実施形態においては、hMPVタンパク質のペプチド配列中の特定のエピトープに対して選択的な二次抗体を使用することにより、前記特定されたhMPV感染の病因物質をさらにサブグループ又は変種に分類する。ある特定の実施形態では、hMPVの全てのサブグループの間で共用されるペプチドエピトープに対して産生された抗体を使用して、感染の病因物質がhMPVであると特定する。他の特定の実施形態では、hMPVの種々のサブグループ及び/又は変種にそれぞれ固有のペプチドエピトープに対して産生された抗体を使用して、宿主感染の原因であるhMPVを、既知の又は新しいサブグループ及び/又は変種に分類する。ある特定の実施形態において、hMPVの種々のサブグループ及び/又は変種を区別することができる抗体は、サブグループ又は変種に固有のhMPVペプチドのセグメントを認識する。前記ペプチドには、N、M、F、G、L、M、P、及びM2遺伝子によってコードされたものが含まれるが、これらに限定するものではない。種々のhMPVサブグループ又は変種同士を区別することが可能な抗体を生成するのに使用することができるペプチド又はペプチドのセグメントは、様々なhMPVタンパク質の既知のペプチド配列中の相違と共に、診断アッセイで曝露され又は接触可能な溶媒であることが期待される適切なペプチドセグメントを同定する親水性プロットを使用して、選択することができる。一実施形態において、hMPVの種々のサブグループ同士を区別することが可能な抗体は、hMPVの種々のサブグループに固有のFタンパク質における相違、例えば、完全長Fタンパク質の286位、296位、312位、348位、及び404位のアミノ酸を認識する。別の特定の実施形態において、hMPVの種々のサブグループ及び/又は変種同士を区別することが可能な抗体は、特定のサブグループ又は変種に固有であるhMPVのGタンパク質のセグメントを認識し、例えば、配列番号119のアミノ酸50から60までに対応するGペプチド配列を使用して、サブグループAとBを区別し、同様に変種A1、A2、B1、及びB2を区別することができる。本発明の別の実施形態においては、hMPV分離株のヌクレオチド配列を使用して、hMPVの種々のサブグループ及び/又は種々の変種同士を区別する。一実施形態においては、当業者に知られている方法、例えばRT-PCRやPCR、プライマーランオンアッセイ、及び様々なブロット技法と共に、hMPVゲノム内の配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列、プライマー、及び/又はプローブを使用して、hMPV感染の病因物質を別個のサブグループ及び/又は変種に分類する。ある特定の実施形態では、RT-PCRを使用してhMPVゲノムの特定のセグメントをコピーし複製するのに、生物学的サンプルを使用する。他の実施形態では、前記セグメントの配列を得、既知のhMPV配列と比較し、前記比較を使用して、hMPV株を別個のサブグループ又は変種として単離し、あるいはhMPV株を新しいサブグループ又は変種に分類する。別の実施形態では、本発明は、hMPVの種々のサブグループ及び/又は変種同士を区別するのに使用することが可能な診断キットに関する。好ましい実施形態において、特定のウイルス感染の診断及び/又は治療は、前記感染を引き起こす前記特定のウイルスに最も特異的な試薬を用いて行う。この場合、MPV感染の前記診断及び/又は治療は、MPVに最も特異的な試薬を用いて行うことが好ましいことを意味する。しかしこれは、特異性が低いが十分な交差反応性を有する試薬を、より容易に入手可能で当面の課題に十分対処できるなどの理由で代わりに使用する可能性を、決して排除するものではない。本明細書では、例えば、哺乳動物におけるMPV感染のウイルス学的及び/又は血清学的な診断を、APV由来の試薬、特にAPV-C由来の試薬を用いて行うことを提供し、本明細書の詳細な記述では、例えば、トリのAPV抗体が検出されるよう特異的に設計されたELISAを使用することによって、哺乳動物におけるMPV感染の十分に信頼できる血清学的診断を実現できることが示されている。このために特に有用な試験は、APV抗体例えば血清又は卵黄中を検出するように設計されたELISA試験であり、その市販されているものの1つは、SVANOVABiotechAB、UppsalScienceParkGluntenSE75183Uppsala、スウェーデンにより作製されたAPV-AbSVANOVIR登録商標として知られている。逆の状況についても言えるが、その場合は例えば、哺乳動物におけるAPV感染のウイルス学的及び/又は血清学的診断を、MPV由来の試薬を用いて行うことが提供され、本明細書の詳細な記述では、例えば、MPV抗体が検出されるように設計されたELISAを使用することによって、トリのAPV感染の十分信頼性ある血清学的診断を実現できることが示されている。抗原及び抗体が鍵と鍵穴の関係を有することを考えると、様々な抗原の検出は、十分な交差反応性を有する適切な抗体を選択することによって実現することができる。当然ながら、そのような交差反応性を利用する場合、様々なウイルスの様々な糖タンパク質間に存在するアミノ酸の相同性に基づいて試薬抗原や抗体などを選択することが最良であり、その場合、最も相当性の高いタンパク質に関する試薬が、前記交差反応性を利用する試験で使用するのに最も有用になる。核酸の検出ではさらに簡単であり、様々なウイルスの異種核酸配列に基づいてプライマー又はプローブを設計し、したがって本質的に哺乳動物又はトリのメタニューモウイルス同士の相違を検出する代わりに、高い相同性を示すウイルス特異的核酸配列の伸長部に基づいてプライマー又はプローブを設計し又は選択すれば十分である。一般に核酸配列の場合、相同性が90以上であると、十分な交差反応性が、ハイブリダイゼーションのストリンジェント条件を利用する診断試験で利用されることが保証される。本発明は例えば、動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトのMPV感染をウイルス学的に診断する方法であって、前記動物サンプル中のウイルス分離株又はその構成要素の存在を、前記サンプルと本発明によるMPV特異的核酸又は抗体とを反応させることによって決定することを含む方法と、哺乳動物のMPV感染を血清学的に診断する方法であって、前記哺乳動物サンプル中の、MPV又はその構成要素を特異的に対象とする抗体の存在を、前記サンプルと本発明によるMPV特異的タンパク様分子又はその断片又は抗原とを反応させることによって決定することを含む方法を提供する。また本発明は、MPV感染を診断するための診断キットも提供し、このキットは、本発明によるMPV、MPV特異的核酸、タンパク様分子又はその断片、抗原及び/又は抗体と、好ましくは前記MPV、MPV特異的核酸、タンパク様分子又はその断片、抗原及び/又は抗体を検出するための手段とを含み、前記手段は、例えば蛍光体などの励起しうる基又は当技術分野で使用される酵素検出系を含むものである適切な診断キットフォーマットの例には、IF、ELISA、中和アッセイ、RT-PCRアッセイが含まれる。核酸やタンパク様分子又はその断片など、今のところまだ同定されていないウイルス構成要素又はその合成類似体がMPVに特異的なものであると特定することができるかどうかを決定するには、前記構成要素の核酸又はアミノ酸配列、例えば前記核酸又はアミノ酸の伸長部、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも40のヌクレオチド又はアミノ酸それぞれを、例えば本明細書で述べるような系統学的分析を使用して、既知のMPV配列及び既知の非MPV配列APV-Cを使用することが好ましいとの配列相同性を比較することにより分析すれば十分である。前記MPV又は非MPV配列との関係の程度に応じて、構成要素又は合成類似体を同定することができる。また本発明は、哺乳動物のMPV感染をウイルス学的に診断する方法であって、前記哺乳動物サンプル中のウイルス分離株又はその構成要素の存在を、前記サンプルと、APV由来の交差反応性核酸好ましくは血清型C又は前記APVと反応しやすい交差反応性抗体とを反応させることによって決定することを含む方法と、哺乳動物のMPV感染を血清学的に診断する方法であって、前記哺乳動物サンプル中の、APV又はその構成要素も対象とする交差反応性抗体の存在を、前記サンプルと、タンパク様分子又はその断片あるいはAPV由来の抗原とを反応させることによって決定することを含む方法を提供する。さらに本発明は、当初AVP又はAVP抗体検出用に設計された診断キットを、MPV感染の診断用に、特にヒトにおける前記MPV感染の検出用に使用することを提供する。また本発明は、トリのAPV感染をウイルス学的に診断する方法であって、前記トリのサンプル中のウイルス分離株又はその構成要素の存在を、前記サンプルと、MPV由来の交差反応性核酸又は前記MPVと反応しやすい交差反応性抗体とを反応させることによって決定することを含む方法と、トリのAPV感染を血清学的に診断する方法であって、前記トリのサンプル中の、MPV又はその構成要素も対象とする交差反応性抗体の存在を、前記サンプルと、タンパク様分子又はその断片あるいはMPV由来の抗原とを反応させることによって決定することを含む方法を提供する。さらに本発明は、当初MPV又はMPV抗体検出用に設計された診断キットを、APV感染の診断用に、特にニワトリやアヒル、シチメンチョウなど家禽における前記APV感染の検出用に使用することを提供する。治療に関する診断では、特に当面の状況によって、より相同性のある手法を使用することがそれほど簡単ではない場合、種々の哺乳動物MPVの中で、またMPVとその他のウイルス、例えばAPVとの間での、程度の高い相同性を利用することができる。MPV感染に対する緊急のワクチン接種など、待つことのできないワクチン接種は、より相同性の高いMPVワクチンを入手することができない場合、例えばAPV好ましくはC型分離株から得られたワクチン調製物を用いて行うことができ、逆にAPV感染に対するワクチン接種は、MPVから得られたワクチン調製物を用いて行うことが考えられる。また、逆遺伝学的技法によれば、所望のレベルにまで弱毒化されるそれぞれの株の個々のフィールド分離株とは十分に異なった、ワクチンとして有用なキメラAPV-MPVウイルス構築物を生成することが可能になる。同様の逆遺伝学的技法によれば、ワクチン調製物で使用されるRSV-MPVやP13-MPV構築物などの、キメラパラミクソウイルス-メタニューモウイルス構築物を生成することも可能になる。そのような構築物は、呼吸器疾患と闘う併用ワクチンとして特に有用である。MPVCPEは、tMK又はその他の細胞培養物中でhRSV又はhPIV-1により誘発されたものとは事実上区別できなかったので、MPVはこれまで十分に注目されていなかったと考えられる。tMK3次サル腎臓細胞、すなわち細胞培養における第3継代のMK細胞は、初代又は2次培養と比較して低コストであるので、これを使用することが好ましい。CPEは、従来のパラミクソウイルス科の一部の場合と同様に、合胞体を形成し、その後細胞が急速に内部分裂し、単層から細胞が離れることを特徴とする。細胞は、通常常にとは限らない、ウイルスを当初の物質から3回継代した後に、すなわち接種後10~14日目にCPEを提示したが、これはhRSVやhPIV-1などのその他のウイルスによって引き起こされたCPEよりも若干遅いものである。一例として本発明は、重篤なRTIに罹患している28人の子供から得た鼻咽頭吸引液サンプルから、まだ同定されていないパラミクソウイルスを提供する。これらの子供の臨床症状は、hRSVによって引き起こされた症状とかなり類似していた。これらの患者のうち27人は年齢5才未満の子供であり、その半分は1~12月齢であった。その他の患者は18才であった。全ての患者は上気道感染症に罹患しており、咳、筋肉痛、嘔吐、及び熱から細気管支炎及び重篤な肺炎に至る症状があった。これらの患者の大多数は、1~2週間入院した。これらの患者由来のウイルス分離株は、陰性対照電子顕微鏡検査においてパラミクソウイルス形態を有していたが、既知のヒト及び動物パラミクソウイルスに対して特異的な抗血清とは反応しなかった。分離株の2つに対して産生された血清を用いた間接的な免疫蛍光アッセイIFAによって求められたように、これらは全て互いに密接に関係していた。これらの分離株のうち9個の配列分析では、ウイルスがAPVに若干関係していることが明らかになった。ウイルス学的データ、配列相同性、並びにゲノム組織に基づいて、本発明者等は、ウイルスがメタニューモウイルス属のメンバーであることを提唱する。血清学的調査では、オランダにおける血清保有率が、年齢5才までのヒトの100に近付いていることから、このウイルスが比較的一般的な病原体であることが示された。さらに、この血清保有率は、1958年にヒトから収集された血清においても同様に高いことがわかったが、これは、ウイルスが40年以上にもわたってヒトの集団内を循環していたことを示している。この提示された新しいメタニューモウイルス属のメンバーの同定は、診断アッセイ又は試験キット用の手段及び方法と、ウイルス呼吸器感染に関するワクチン又は血清又は抗体の組成物の開発ももたらし、さらにMPV感染の治療に有用な抗ウイルス剤に関して試験をし又はスクリーニングするための方法も提供する。本明細書で提供する方法及び手段は、ウイルス学的診断によるものであろうと血清学的診断によるものであろうと、MPV感染を診断するための診断キットに特に有用である。そのようなキット又はアッセイは、例えば、本発明によるウイルス、核酸、タンパク様分子又はその断片、抗原、及び/又は抗体を含んでよい。本発明によるウイルス、核酸、タンパク様分子又はその断片、抗原、及び/又は抗体の使用は、例えば、特にヒトにおけるMPV感染を治療又は予防するための、かつ/又は呼吸器疾患を治療又は予防するための医薬品組成物の製造も提供する。ウイルスの弱毒化は、この目的で開発された、その他の種の関連するウイルスの使用、実験室用動物及び/又は組織/細胞培養による連続継代、分子クローンの部位特異的変異誘発、及び関連するウイルス同士での遺伝子又は遺伝子断片の交換を含むがこれらに限定されない方法を確立することによって実現することができる。4つの別個のhMPVのサブタイプサブタイプA1、A2、B1及びB2と称するを記載した。本発明は、4つのサブタイプ全てについて感度を有する単一アッセイを用いた、宿主におけるhMPVの検出に関する。当技術分野で公知の任意の方法を用いて、宿主におけるhMPVの存在を検出することができる。本発明のより具体的な実施形態において、感受性のTaqmanアッセイを用いて、宿主におけるhMPVの存在を検出する。当業者であれば、そのようなアッセイで使用するためのオリゴヌクレオチド及びプローブの設計に必要な条件に精通している。かかるオリゴヌクレオチド及びプローブは、hMPVゲノム、転写産物又はプロセシングされた及びプロセシングされていない産物の任意の領域を特異的に認識するように設計しうる。本発明のより具体的な実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド及びプローブは、hMPVの全てのサブタイプ例えばA1、B1、A2及びB2における配列、その転写産物又はプロセシングされた及びプロセシングされていない産物に対し相補性であるか、又は同一若しくは類似するものである。特に、オリゴヌクレオチド及びプローブは、hMPVの4つ全てのサブタイプにおける配列、その転写産物又はプロセシングされた及びプロセシングされていない産物のマイナス又はプラスコピーに対し、少なくとも50、60、70、80、90、95、98、99又は99.5同一性を有する。別の実施形態において、hMPVの4つ全てのサブタイプにおける配列のマイナスコピー又はプラスコピーに対し相補的である。本発明のアッセイの検出には、任意の長さのオリゴヌクレオチド及びプローブを用いることができる。用いることができる典型的なハイブリダイゼーション及び洗浄条件は当技術分野で公知である。好ましくは、条件は、プローブが特異的に結合可能であり、非特異的結合の結合又は簡単な除去を防止するような条件である。本発明のまた別のより具体的な実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド及びプローブは、hMPVゲノム内のオープンリーディングフレーム、例えば限定されるものではないが、N遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子及びL遺伝子、又はそのプロセシングされた及びプロセシングされていない産物のいずれかに対して相補的である。本発明のさらにまた具体的な実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド及びプローブは、N遺伝子、その転写産物、又はそのプロセシングされた及びプロセシングされていない産物を認識する。また別の実施形態において、4つ全てのサブタイプに由来するhMPVは等しい特異性で認識される。ウイルスは、宿主から得ることができる任意の生物学的サンプルから単離することができる。本発明のより具体的な実施形態において、鼻咽頭サンプルを本発明の検出アッセイにおいて使用するために宿主から採取する。ウイルスは、hMPVを補助することができる種々の細胞系例えば限定されるものではないが、Vero及びtMK細胞において検出目的で増殖させることができる。ウイルスRNAの検出は、当業者に公知のいくつかの方法を用いて実施しうる。一つの特定の実施形態において、ウイルスRNA検出は、TaqmanPCRに基づく方法を用いて実施する。5.15本発明の組成物及び哺乳動物メタニューモウイルスの構成要素本発明は、哺乳動物MPVの核酸配列、哺乳動物MPVのタンパク質、及び哺乳動物MPVのタンパク質に対する抗体に関する。本発明はさらに、哺乳動物MPVの核酸配列の相同体、及び哺乳動物MPVのタンパク質の相同体に関する。本発明はさらに、融合タンパク質をコードする核酸配列に関し、この融合タンパク質は、哺乳動物MPVのタンパク質又はその断片と、哺乳動物MPV由来ではない1つ又は複数のペプチド又はタンパク質を含有するものである。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、哺乳動物MPVのタンパク質又はその断片と、ポリヒスチジンタグなどであるがこれに限定することのないペプチドタグを含有する。本発明はさらに、哺乳動物MPVのタンパク質又はその断片と、哺乳動物MPV由来ではない1つ又は複数のペプチド又はタンパク質を含有する融合タンパク質に関する。また本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質をコードする核酸の誘導体にも関する。また本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質の誘導体にも関する。誘導体は、付加、欠失、切断、置換、及び逆位などであるがこれらに限定されないタンパク質の変異形態でよいが、これらに限定するものではない。誘導体は、さらに、哺乳動物MPVのタンパク質のキメラ形態でよく、そのタンパク質の少なくとも1つのドメインが異なるタンパク質から得られたものである。誘導体は、例えば薬物などの別の分子に共有結合し又は非共有結合している哺乳動物MPVのタンパク質の形態でもよい。NL/1/00又は00-1と呼ばれるウイルス分離株は、変種A1の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号19で示される。NL/17/00と呼ばれるウイルス分離株は、変種A2の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号20で示される。NL/1/99又は99-1と呼ばれるウイルス分離株は、変種B1の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号18で示される。NL/1/94と呼ばれるウイルス分離株は、変種B2の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号21で示される。本願で開示される配列とそれに対応する配列番号のリストを表14に示す。哺乳動物MPVのタンパク質は、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、又はM2-2タンパク質、あるいはその断片でよい。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、その長さが、少なくとも25アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも75アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、少なくとも125アミノ酸、少なくとも150アミノ酸、少なくとも175アミノ酸、少なくとも200アミノ酸、少なくとも225アミノ酸、少なくとも250アミノ酸、少なくとも275アミノ酸、少なくとも300アミノ酸、少なくとも325アミノ酸、少なくとも350アミノ酸、少なくとも375アミノ酸、少なくとも400アミノ酸、少なくとも425アミノ酸、少なくとも450アミノ酸、少なくとも475アミノ酸、少なくとも500アミノ酸、少なくとも750アミノ酸、少なくとも1000アミノ酸、少なくとも1250アミノ酸、少なくとも1500アミノ酸、少なくとも1750アミノ酸、少なくとも2000アミノ酸、又は少なくとも2250アミノ酸でよい。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、その長さが、多くとも25アミノ酸、多くとも50アミノ酸、多くとも75アミノ酸、多くとも100アミノ酸、多くとも125アミノ酸、多くとも150アミノ酸、多くとも175アミノ酸、多くとも200アミノ酸、多くとも225アミノ酸、多くとも250アミノ酸、多くとも275アミノ酸、多くとも300アミノ酸、多くとも325アミノ酸、多くとも350アミノ酸、多くとも375アミノ酸、多くとも400アミノ酸、多くとも425アミノ酸、多くとも450アミノ酸、多くとも475アミノ酸、多くとも500アミノ酸、多くとも750アミノ酸、多くとも1000アミノ酸、多くとも1250アミノ酸、多くとも1500アミノ酸、多くとも1750アミノ酸、多くとも2000アミノ酸、又は多くとも2250アミノ酸でよい。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、APVC型のNタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21これらの配列番号の記述に関しては表14も参照のウイルスゲノムによってコードされたNタンパク質など哺乳動物MPVのNタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているNタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、APVC型のNタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたPタンパク質など哺乳動物MPVのPタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているPタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、APVC型のMタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたMタンパク質など哺乳動物MPVのMタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているMタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、APVC型のFタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたFタンパク質など哺乳動物MPVのFタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているFタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、APVC型のM2-1タンパク質に関連するよりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたM2-1タンパク質など哺乳動物MPVのM2-1タンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているM2-1タンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、APVC型のM2-2タンパク質に関連するよりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたM2-2タンパク質など哺乳動物MPVのM2-2タンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているM2-2タンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、APVC型の任意のタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたGタンパク質など哺乳動物MPVのGタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているGタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、APVC型の任意のタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたSHタンパク質など哺乳動物MPVのSHタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているSHタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、APVC型の任意のタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたSHタンパク質など哺乳動物MPVのLタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているLタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたNタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一のNタンパク質であるそれぞれのNタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号366~369に開示されている;表14も参照。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質はNタンパク質であり、Pタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたPタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるそれぞれのPタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号374~377に開示されている;表14も参照。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたMタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一のMタンパク質であるそれぞれのMタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号358~361に開示されている;表14も参照。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたFタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一のFタンパク質であるそれぞれのFタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号314~317に開示されている;表14も参照。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたM2-1タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一のM2-1タンパク質であるそれぞれのM2-1タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号338~341に開示されている;表14も参照。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたM2-2タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一のM2-2タンパク質であるそれぞれのM2-2タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号346~349に開示されている;表14も参照。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたGタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一のGタンパク質であるそれぞれのGタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号322~325に開示されている;表14も参照。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたSHタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一のSHタンパク質であるそれぞれのSHタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号382~385に開示されている;表14も参照。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスゲノムによってコードされたLタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一のLタンパク質であるそれぞれのLタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号330~333に開示されている;表14も参照。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、その断片と同種のタンパク質部分について、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスによってコードされた同種タンパク質に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一である。特定の例示的な実施形態においては、本発明は、Fタンパク質の外部ドメインを含有する哺乳動物MPVのFタンパク質の断片とその相同体を提供する。外部ドメインを含有するFタンパク質の断片の相同体は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のウイルスによってコードされたFタンパク質の外部ドメインを含有する対応断片に対して少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるそれぞれのFタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号314~317に開示されている;表14も参照。ある実施形態では、本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのタンパク質及びその断片を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのNタンパク質であって、配列番号18又は配列番号21によってコードされたウイルスによりコードされたNタンパク質に関係するよりも、配列番号19又は配列番号20のウイルスによってコードされたNタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するNタンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのGタンパク質であって、配列番号18又は配列番号21によってコードされたウイルスによりコードされたGタンパク質に関係するよりも、配列番号19又は配列番号20のウイルスによってコードされたGタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するGタンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのPタンパク質であって、配列番号18又は配列番号21によってコードされたウイルスによりコードされたPタンパク質に関係するよりも、配列番号19又は配列番号20のウイルスによってコードされたPタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するPタンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのMタンパク質であって、配列番号18又は配列番号21によってコードされたウイルスによりコードされたMタンパク質に関係するよりも、配列番号19又は配列番号20のウイルスによってコードされたMタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するMタンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、Fタンパク質は、配列番号18又は配列番号21によってコードされたウイルスによりコードされたFタンパク質に関係するよりも、配列番号19又は配列番号20のウイルスによってコードされたFタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-1タンパク質であって、配列番号18又は配列番号21によってコードされたウイルスによりコードされたM2-1タンパク質に関係するよりも、配列番号19又は配列番号20のウイルスによってコードされたM2-1タンパク質のほうに系統学上より密接に関係するM2-1タンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-2タンパク質であって、配列番号18又は配列番号21によってコードされたウイルスによりコードされたM2-2タンパク質に関係するよりも、配列番号19又は配列番号20のウイルスによってコードされたM2-2タンパク質のほうに系統学上より密接に関係するM2-2タンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのSHタンパク質であって、配列番号18又は配列番号21によってコードされたウイルスによりコードされたSHタンパク質に関係するよりも、配列番号19又は配列番号20のウイルスによってコードされたSHタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するSHタンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのLタンパク質であって、配列番号18又は配列番号21によってコードされたウイルスによりコードされたLタンパク質に関係するよりも、配列番号19又は配列番号20のウイルスによってコードされたLタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するLタンパク質を提供する。その他の実施形態では、本発明は、サブグループBの哺乳動物MPVのタンパク質又はその断片を提供する。本発明は、サブグループBの哺乳動物MPVのNタンパク質であって、配列番号19又は配列番号20によってコードされたウイルスによりコードされたNタンパク質に関係するよりも、配列番号18又は配列番号21のウイルスによってコードされたNタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するNタンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのGタンパク質であって、配列番号19又は配列番号20によってコードされたウイルスによりコードされたGタンパク質に関係するよりも、配列番号18又は配列番号21のウイルスによってコードされたGタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するGタンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのPタンパク質であって、配列番号19又は配列番号20によってコードされたウイルスによりコードされたPタンパク質に関係するよりも、配列番号18又は配列番号21のウイルスによってコードされたPタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するPタンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのMタンパク質であって、配列番号19又は配列番号20によってコードされたウイルスによりコードされたMタンパク質に関係するよりも、配列番号18又は配列番号21のウイルスによってコードされたMタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するMタンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、Fタンパク質は、配列番号19又は配列番号20によってコードされたウイルスによりコードされたFタンパク質に関係するよりも、配列番号18又は配列番号21のウイルスによってコードされたFタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-1タンパク質であって、配列番号19又は配列番号20によってコードされたウイルスによりコードされたM2-1タンパク質に関係するよりも、配列番号18又は配列番号21のウイルスによってコードされたM2-1タンパク質のほうに系統学上より密接に関係するM2-1タンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-2タンパク質であって、配列番号19又は配列番号20によってコードされたウイルスによりコードされたM2-2タンパク質に関係するよりも、配列番号18又は配列番号21のウイルスによってコードされたM2-2タンパク質のほうに系統学上より密接に関係するM2-2タンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのSHタンパク質であって、配列番号19又は配列番号20によってコードされたウイルスによりコードされたSHタンパク質に関係するよりも、配列番号18又は配列番号21のウイルスによってコードされたSHタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するSHタンパク質を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのLタンパク質であって、配列番号19又は配列番号20によってコードされたウイルスによりコードされたLタンパク質に関係するよりも、配列番号18又は配列番号21のウイルスによってコードされたLタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するLタンパク質を提供する。本発明はさらに、変種A1、A2、B1、又はB2の哺乳動物MPVのタンパク質を提供する。本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVの種々の変種のタンパク質は、それらのアミノ酸配列の同一性を用いて互いに区別することができる例えば図42b参照。哺乳動物MPVの変種は、A1、A2、B1、又はB2でよいが、これらに限定されない。しかし本発明は、別の変種のメンバーである哺乳動物MPVの分離株も企図するものである。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質は、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のGタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のGタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のGタンパク質に関係するよりも、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のGタンパク質のほうに、系統学上より密接に関係している。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質配列番号324に対して少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質であって、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のNタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のNタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のNタンパク質に関係するよりも、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のNタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質配列番号368に対して少なくとも98.5、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質であって、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のPタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のPタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のPタンパク質に関係するよりも、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のPタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質であって、そのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質配列番号376に対して少なくとも96、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質であって、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のMタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のMタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のMタンパク質に関係するよりも、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のMタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質配列番号360と同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のFタンパク質であって、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のFタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のFタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のFタンパク質に関係するよりも、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のFタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B1のFタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変種B1のFタンパク質配列番号316に対して少なくとも99同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のM2-1タンパク質であって、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-1タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-1タンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-1タンパク質に関係するよりも、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-1タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B1のM2-1タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のM2-1タンパク質であって、そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変種B1のM2-1タンパク質配列番号340に対して少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のM2-2タンパク質であって、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-2タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-2タンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-2タンパク質に関係するよりも、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-2タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B1のM2-2タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のM2-2タンパク質であって、そのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変種B1のM2-2タンパク質配列番号348に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質であって、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のSHタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のSHタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のSHタンパク質に関係するよりも、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のSHタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質配列番号384に対して少なくとも83、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質であって、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のLタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のLタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のLタンパク質に関係するよりも、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のLタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質配列番号332に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のGタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のGタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のGタンパク質に関係するよりも、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のGタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質配列番号322に対して少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のNタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のNタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のNタンパク質に関係するよりも、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のNタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質配列番号366に対して少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のPタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のPタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のPタンパク質に関係するよりも、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のPタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質であって、そのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質配列番号374に対して少なくとも96、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のMタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のMタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のMタンパク質に関係するよりも、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のMタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質配列番号358に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のFタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のFタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のFタンパク質に関係するよりも、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のFタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質配列番号314に対して少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のM2-1タンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-1タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-1タンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-1タンパク質に関係するよりも、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-1タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A1のM2-1タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のM2-1タンパク質であって、そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変種A1のM2-1タンパク質配列番号338に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のM2-2タンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-2タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-2タンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-2タンパク質に関係するよりも、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-2タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A1のM2-2タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のM2-2タンパク質であって、そのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変種A1のM2-2タンパク質配列番号346に対して少なくとも96、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のSHタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のSHタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のSHタンパク質に関係するよりも、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のSHタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質配列番号382に対して少なくとも84、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のLタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のLタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のLタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のLタンパク質に関係するよりも、変種A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のLタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A1のLタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A1のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変種A1のウイルスのLタンパク質配列番号330に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のGタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のGタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のGタンパク質に関係するよりも、変種A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のGタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質配列番号332に対して少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のNタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のNタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のNタンパク質に関係するよりも、変種A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のNタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質配列番号367に対して少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のPタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のPタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のPタンパク質に関係するよりも、変種A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のPタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質であって、そのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質配列番号375に対して少なくとも96、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のMタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のMタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のMタンパク質に関係するよりも、変種A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のMタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質配列番号359に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のFタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のFタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のFタンパク質に関係するよりも、変種A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のFタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質配列番号315に対して少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のM2-1タンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-1タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-1タンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-1タンパク質に関係するよりも、変種A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-1タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A2のM2-1タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のM2-1タンパク質であって、そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変種A2のM2-1タンパク質配列番号339に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のM2-2タンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-2タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-2タンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-2タンパク質に関係するよりも、変種A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-2タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A2のM2-2タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のM2-2タンパク質であって、そのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変種A2のM2-2タンパク質配列番号347に対して少なくとも96、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のSHタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のSHタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のSHタンパク質に関係するよりも、変種A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のSHタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質配列番号383に対して少なくとも84、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のLタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のLタンパク質、又はB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のLタンパク質に関係するよりも、変種A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のLタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質配列番号331に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のGタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のGタンパク質、又はA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のGタンパク質に関係するよりも、変種B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のGタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質配列番号325に対して少なくとも66、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のNタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のNタンパク質、又はA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のNタンパク質に関係するよりも、変種B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のNタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質配列番号369に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のPタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のPタンパク質、又はA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のPタンパク質に関係するよりも、変種B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のPタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質であって、そのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質配列番号377に対して少なくとも96、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のMタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のMタンパク質、又はA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のMタンパク質に関係するよりも、変種B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のMタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質配列番号361に対して同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のFタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のFタンパク質、又はA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のFタンパク質に関係するよりも、変種B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のFタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質配列番号317に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のM2-1タンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-1タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-1タンパク質、又はA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-1タンパク質に関係するよりも、変種B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-1タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B2のM2-1タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のM2-1タンパク質であって、そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変種B2のM2-1タンパク質配列番号341に対して少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のM2-2タンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-2タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-2タンパク質、又はA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-2タンパク質に関係するよりも、変種B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-2タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B2のM2-2タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のM2-2タンパク質であって、アミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変種B2のM2-2タンパク質配列番号349に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のSHタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のSHタンパク質、又はA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のSHタンパク質に関係するよりも、変種B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のSHタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質配列番号385に対して少なくとも84、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質であって、変種B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のLタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のLタンパク質、又はA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のLタンパク質に関係するよりも、変種B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のLタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質配列番号333に対して少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるものを提供する。ある実施形態では、配列同一性は完全長タンパク質のアライメントに基づく。その他の実施形態では、配列同一性は、隣接するタンパク質のアミノ酸配列のアライメントに基づいており、アミノ酸配列は、その長さが25アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、225アミノ酸、250アミノ酸、275アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、375アミノ酸、400アミノ酸、425アミノ酸、450アミノ酸、475アミノ酸、500アミノ酸、750アミノ酸、1000アミノ酸、1250アミノ酸、1500アミノ酸、1750アミノ酸、2000アミノ酸、又は2250アミノ酸でよい。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号119~153;配列番号322~325で示されるアミノ酸配列の1つ又はその断片を有する、哺乳動物MPVのGタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号234~317で示されるアミノ酸配列の1つを有する、哺乳動物MPVのFタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号330~333で示されるアミノ酸配列の1つ又はその断片を有する、哺乳動物MPVのLタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号338~341で示されるアミノ酸配列の1つ又はその断片を有する、哺乳動物MPVのM2-1タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号346~349で示されるアミノ酸配列の1つ又はその断片を有する、哺乳動物MPVのM2-2タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号358~361で示されるアミノ酸配列の1つ又はその断片を含む、哺乳動物MPVのMタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号366~369で示されるアミノ酸配列の1つ又はその断片を有する、哺乳動物MPVのNタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号374~377で示されるアミノ酸配列の1つ又はその断片を有する、哺乳動物MPVのPタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号382~385で示されるアミノ酸配列の1つ又はその断片を有する、哺乳動物MPVのSHタンパク質を提供する。本発明のある実施形態では、断片の長さが少なくとも25アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、225アミノ酸、250アミノ酸、275アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、375アミノ酸、400アミノ酸、425アミノ酸、450アミノ酸、475アミノ酸、500アミノ酸、750アミノ酸、1000アミノ酸、1250アミノ酸、1500アミノ酸、1750アミノ酸、2000アミノ酸、又は2250アミノ酸である。本発明のある実施形態では、断片の長さが最大でも25アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、225アミノ酸、250アミノ酸、275アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、375アミノ酸、400アミノ酸、425アミノ酸、450アミノ酸、475アミノ酸、500アミノ酸、750アミノ酸、1000アミノ酸、1250アミノ酸、1500アミノ酸、1750アミノ酸、2000アミノ酸、又は2250アミノ酸である。本発明はさらに、哺乳動物MPV由来の核酸配列を提供する。また本発明は、哺乳動物MPV由来の核酸配列の誘導体も提供する。ある特定の実施形態では、核酸は修飾されている。ある実施形態で、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVのサブグループAのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVのサブグループBのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変種A1のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変種A2のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変種B1のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変種B2のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質をコードする。ある実施形態においては、本発明は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のヌクレオチド配列に対して少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であるヌクレオチド配列を提供する。ある実施形態において、本発明の核酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のヌクレオチド配列の断片に対して少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5同一であり、この断片の長さは少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも75ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも750ヌクレオチド、少なくとも1,000ヌクレオチド、少なくとも1,250ヌクレオチド、少なくとも1,500ヌクレオチド、少なくとも1,750ヌクレオチド、少なくとも2,000ヌクレオチド、少なくとも2,00ヌクレオチド、少なくとも3,000ヌクレオチド、少なくとも4,000ヌクレオチド、少なくとも5,000ヌクレオチド、少なくとも7,500ヌクレオチド、少なくとも10,000ヌクレオチド、少なくとも12,500ヌクレオチド、又は少なくとも15,000ヌクレオチドである。特定の実施形態において、本発明の核酸配列は、配列番号84~118;配列番号154~233;配列番号318~321;配列番号326~329;配列番号334~337;配列番号342~345;配列番号350~353;配列番号354~357;配列番号362~365;配列番号370~373;配列番号378~381;又は配列番号386~389のヌクレオチド配列の1つに対して少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、又は少なくとも99.5、又は少なくとも100同一である。本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸配列は、低ストリンジェンシー条件下、又は中程度のストリンジェンシー条件下、又は高ストリンジェンシー条件下で、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21の核酸配列の1つとハイブリダイズすることが可能である。本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸配列は、低ストリンジェンシー条件下、又は中程度のストリンジェンシー条件下、又は高ストリンジェンシー条件下で、配列番号84~118;配列番号154~233;配列番号318~321;配列番号326~329;配列番号334~337;配列番号342~345;配列番号350~353;配列番号354~357;配列番号362~365;配列番号370~373;配列番号378~381;配列番号386~389の核酸配列の1つとハイブリダイズすることが可能である。ある実施形態において、核酸は、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも75ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも750ヌクレオチド、少なくとも1,000ヌクレオチド、少なくとも1,250ヌクレオチド、少なくとも1,500ヌクレオチド、少なくとも1,750ヌクレオチド、少なくとも2,000ヌクレオチド、少なくとも2,00ヌクレオチド、少なくとも3,000ヌクレオチド、少なくとも4,000ヌクレオチド、少なくとも5,000ヌクレオチド、少なくとも7,500ヌクレオチド、少なくとも10,000ヌクレオチド、少なくとも12,500ヌクレオチド、又は少なくとも15,000ヌクレオチドの長さ全体にわたり、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のヌクレオチド配列とハイブリダイズする。本発明はさらに、哺乳動物MPVのタンパク質と特異的に結合する抗体及び抗原結合断片を提供する。本発明の抗体は、哺乳動物MPVのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質に特異的に結合する。特定の実施形態において、抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。ある実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループAのウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質に特異的に結合する。その他のある実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループBのウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質に特異的に結合する。より具体的なある実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物MPVの変種A1のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質に特異的に結合する。その他の実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループA2のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質に特異的に結合する。ある実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループB1のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質に特異的に結合する。その他のある実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループB2のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、又はLタンパク質に特異的に結合する。5.167回反復配列を使用したウイルス細胞融合の阻害ウイルスと宿主細胞の融合は、MPVを含めたいくつかのエンベロープウイルスの感染性生活環における必須ステップである。したがって、ウイルス細胞融合の阻害は、これらのウイルスを制御するための新規手法の一典型となるものである。この阻害方法は、宿主におけるMPVの増殖と、MPVによる宿主の感染とを予防する代替的方法の一典型である。ウイルス細胞融合の阻害は、必要とされる付着タンパク質のタイプに依存している。Wang他、BiochemBiophysResComm302469~475。したがって、本発明の一実施形態においては、アッセイを用いて、様々な付着タンパク質に対するウイルス細胞融合の依存性の同定を行う。ある実施形態においては、本発明は、被験体におけるhMPV感染を予防、治療、又は管理する方法を提供し、この方法は、薬学的に有効な量の7回反復配列HRペプチドを投与することを含む。ある実施形態においては、薬学的に有効な量によって、ウイルス宿主細胞融合が少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99、少なくとも99.5低減される。特定の実施形態においては、HRが被験体における感染を引き起こすウイルスのHRである。ある実施形態においては、HRがhMPVサブタイプA1のHRである。より具体的な実施形態においては、HR配列がhMPVのFタンパク質におけるHR配列の1つであるが、これらはHRA又はHRBと呼ばれ、HRAはこのペプチドのN末端近傍にある7回反復配列であり、HRBはC末端近傍にある。ある実施形態においては、被験体におけるhMPV感染を治療、予防、又は管理するために投与するHRがhMPVサブタイプA1、B1、A2、又はB2のHRである。ある実施形態においては、HRは、被験体における感染を引き起こすウイルスのHRに対して少なくとも50、60、70、80、90、95、98、99、又は少なくとも99.5同一である。ある実施形態においては、ウイルスの融合を阻止するのに、HRの誘導体を使用することができる。そのような誘導体には、非天然のアミノ酸で置換されているか、末端切断されて、アミノ酸の連続が除去されているか、あるいは延長されて、単一アミノ酸、又はアミノ酸の連続が付加されているHRペプチドが含まれるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態においては、hMPV感染を治療、管理、又は予防するのに、単一のHRペプチドを使用する。さらになお別の実施形態においては、hMPV感染を治療、管理、又は予防するのに、HRペプチドの組合せを投与する。下記に示す試験は、hMPVが細胞と融合するのを阻止する、HRの有効性を決定するのに使用することができ、したがって、被験体におけるhMPV感染を治療、予防、又は管理するのに、いずれのHR、又はその類似体若しくは誘導体が最も適しているかを決定するのに使用することができる。本発明の別の実施形態においては、可溶性の合成HRペプチドのアッセイを行い、そのペプチドがウイルス細胞融合を阻止できるかどうか決定する。hMPVウイルスと細胞の融合を阻害するのに、限定されるものではないが、RSV、PIV、APV、及びhMPVに対するHR配列を含めたいかなるHR配列も使用することができる。好ましい実施形態においては、HR配列がhMPVの配列である。より具体的な実施形態においては、HR配列がhMPVのFタンパク質におけるHR配列の1つであるが、これらはHRA又はHRBと呼ばれ、HRAはこのペプチドのN末端近傍にある7回反復配列であり、HRBはC末端近傍にある。本発明の別の実施形態においては、hMPVウイルスと細胞の融合を阻害するのに使用されるHRA派生ペプチド及びHRB派生ペプチドに、RSV、APV、及びPIVのHRAペプチド及びHRBペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明のさらに別の実施形態においては、hMPVウイルスと細胞の融合を阻害するのに、HRAペプチド及びHRBペプチドの誘導体を使用する。例えば、HRAペプチド又はHRBペプチドにおける少なくとも1つのアミノ酸残基を変異させることによって生成される誘導体が、hMPVウイルスと細胞の融合を阻害するのに使用される。本発明の別の実施形態においては、HRAペプチド又はHRBペプチドの特定の領域のトランケーション又は切除によって、誘導体を生成する。さらになお別の実施形態においては、使用されるHRAペプチド又はHRBペプチドが、内在性のHR配列と比較して延長されている。さらになお別の実施形態においては、hMPVウイルスと細胞の融合を阻害するのに、HRAペプチド又はHRBペプチドの異なった領域の配列からなる短いペプチドのグループを使用する。本発明の別の実施形態においては、hMPVのHRA及びHRBから派生したペプチドを、hMPVの相同株に対して又はhMPVの異種株に対して使用する。本発明のさらに別の実施形態においては、ウイルスと細胞の融合を阻害するのに、HRAペプチド及びHRBペプチド、又はそれらの類似体若しくは誘導体を併用する。さらに好ましい実施形態においては、HRAペプチド若しくはHRBペプチド、又はその類似体若しくは誘導体を単独で使用する。別の実施形態においては、使用されるHRAペプチド誘導体又はHRBペプチド誘導体が、内在性のHRペプチドに対して少なくとも90、80、70、60、又は50同一である。ウイルスの融合を阻害する7回反復配列の能力を検査するために、7回反復ペプチドを発現させ、さらに精製することができ、それによって、ウイルスの融合を阻害するそれらの能力を試験することができる。可溶性の7回反復ペプチドを発現させて、さらに精製することができ、それに続いて、ウイルス融合の遮断を試験するために、それらをアッセイで使用して内在性7回反復配列と競合させることができる。本発明の一実施形態においては、それぞれHRA及びHRBと呼ばれる、hMPVにおけるFタンパク質の7回反復配列をコードする、合成の組換えDNAを調製することができる。本発明の別の実施形態においては、精製を容易にするのに有用な配列タグも含有する7回反復ペプチドをコードする、合成の組換えDNAを調製することができる。本発明の好ましい実施形態においては、7回反復ペプチドの活性が、その精製を容易にするタグによって妨害されない。本発明のさらに別の実施形態においては、ペプチド末端の1つにおける一連のヒスチジン残基、例えば、連続した6つのヒスチジンによってタグが構成され、これをヒスチジンタグと呼ぶ。可溶性のHRA及びHRBを発現させて、精製するのに、いくつかの異なった手法を用いることができる。最初に、当業者に知られている方法を使用して、HRAをコードするDNAベクターと、HRBをコードするDNAベクターとを調製する。次に、形質転換によって、これらのプラスミドを、例えば大腸菌株BL21DE3など、適切な発現宿主細胞中に導入し、当技術分野で慣用の方法を使用してタンパク質を発現させて、精製する。例えば、ヒスチジンタグを備えたHRペプチドをコードする遺伝子の発現は、IPTGを使用してpETベクターから誘導することができる。その後、細胞を溶解させることができ、そして、発現されたペプチドは、Niキレートのセファロースアフィニティーカラムに固定させた後、それに続いて反対に荷電した分子種、例えばイミダゾールを用いて溶出することで単離することができる。発現された7回反復ペプチドがウイルスの融合を阻害する潜在的有効性を決定するために、HRペプチド相互の複合体形成を確認するアッセイを用いることができる。この方法は、ウイルス融合阻害の有効性を決定するために、ペプチドの無細胞スクリーニングを可能にするであろう点において、細胞ベースのアッセイより有利であろう。本発明の一実施形態においては、複数のHRペプチドを同時に、複合体の形成を可能にするのに十分な時間インキュベートする。より具体的な実施形態においては、複合体を形成させるための時間が28°Cで1時間である。複合体形成は、限定されるものではないが、クロマトグラフィー、UV-可視光分光法、NMR分光法、エックス線結晶法、遠心法、又は電気泳動法を含めた、当技術分野で知られているいかなる方法を用いて検出してもよい。本発明の別の特定の実施形態においては、複合体形成は、複合体の分子量を決定するための電気泳動と組み合わせたゲル濾過法を使用して検出する。本発明のさらに別の実施形態においては、この複合体形成アッセイを用いて、ウイルスの融合を阻害するのに有用な候補の同定、例えば、変異されたHRペプチドがウイルスの融合を阻害する有効性の決定を行う。本発明のさらになお別の実施形態においては、ウイルス融合の阻害におけるHRペプチド誘導体の有効性を、この複合体形成アッセイを使用して測定する。これらのペプチドの7回反復配列セグメントは、自然において螺旋状であることが知られている。この理由から、ウイルス融合の阻害に使用するのに適当な候補を同定するために、いくつかの方法を用いて、発現されたHRペプチドがアルファへリックスを形成しているかどうか決定することができる。そのような方法には、分光法、エックス線結晶法、及び顕微鏡法が含まれるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態においては、HRペプチドの構造上の特性を決定するのに、CD円二色性分光法を使用する。ウイルス融合の阻害における、HRペプチドの有効性を決定するのに細胞ベースのアッセイを用いることができる。アッセイには、MPVに感染させることのできるいかなる細胞を用いてもよく、それらには、tMK、Hep2、又はVero細胞が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、使用される細胞のタイプがHep2細胞である。宿主細胞をMPVに感染させた上で、細胞をHRタンパク質調製物とインキュベートし、適当な時間インキュベートした後、融合したものの数を記録する。その後、ウイルス細胞融合が行われたかどうかを決定するために、細胞を染色してシンシチウム/多核体形成を検査する。6.ウイルスの単離及び特性解析6.1実施例1:検体の採取、ウイルスの単離、ウイルスの特性解析ウイルスの存在についてアッセイするため、また同定されたウイルスを特性解析するために宿主から鼻咽頭吸引液の試料を得た。鼻咽頭吸引液は、気道感染症RTIを罹患している子供から採取した。病気の原因が何であるかを決定するために、A型及びB型インフルエンザウイルス、hRSV、並びに1、2及び3型ヒトパラインフルエンザウイルスhPIVに対する蛍光標識抗体を用いた直接免疫蛍光アッセイDIFですべての鼻咽頭吸引液を試験した実施例9の方法を参照。ウイルスはまた、VERO細胞、第3カニクイザル腎臓tMK細胞、ヒト内皮肺HEL細胞及びマービンドックmarbindock腎臓MDCK細胞を含めた様々な細胞系で、高速シェルバイアル技法Rothbarth他、1999、JofVirolMethods、78163169を用いて鼻咽頭吸引液から単離した。DIFアッセイで陰性であった2又は3回の継代後に細胞変性効果CPEを示す試料を、A、B及びC型インフルエンザウイルス、A及びB型hRSV、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、1~4型ヒトパラインフルエンザウイルスhPIV、センダイウイルス、5型サルウイルス、並びにニューカッスル病ウイルスに対するウイルス特異的抗体を用いた間接免疫蛍光アッセイIFA実施例11の方法を参照によって試験した。多くの場合に病原体を同定することができたが、一部の検体は試験したすべてのウイルスに対して陰性であった。これら28種の未同定のウイルス分離株は、tMK細胞中でゆっくりと増殖し、VERO細胞及びA549細胞中であまり増殖せず、MDCK細胞やニワトリ孵化線維芽細胞でほとんど増殖しなかった。ほとんどのウイルス分離株が10~14日目の間にtMK細胞でCPEを誘発した。これは、hRSVやhPIVなど他のウイルスに引き起こされるCPEよりもいくらか遅かった。このCPEはtMK細胞又は他の細胞培養物中のhRSV又はhPIVに引き起こされたCPEと実質上区別不可能であり、合胞体の形成を特徴とした。細胞内で観察された効果の一部には、迅速な内部破壊、次いで単層からの細胞の剥離が含まれる。感染tMK細胞の上清を電子顕微鏡EM分析に用い、これにより、13~17ナノメートルの範囲の短いエンベロープ突起を有する直径150~600ナノメートルの存在が明らかとなった。標準のクロロホルム又はエーテル処理によりOsterhaus他、1985、ArchofVirol、8623925tMK細胞の感染力が104TCID50より大きく低下し、これは、パラミクソウイルス科のウイルスなどエンベロープを有するウイルスの生化学的特性と矛盾がなかった。ウイルスに感染したtMK細胞の培養物上清は、シチメンチョウ、ニワトリ及びモルモットの赤血球で赤血球凝集活性を示さなかった。培養中、ウイルス複製はトリプシン依存性であるように見えた。これらのウイルスデータを合わせると、新しく同定されたウイルスがパラミクソウイルス科の分類学上のメンバーであることが実証された。15種の未同定のウイルス分離株に感染したtMK細胞のRNAを、逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR分析で使用するために、hPIV1~4、センダイウイルス、5型サルウイルス、ニューカッスル病ウイルス、hRSV、麻疹、流行性耳下腺炎、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ツパイTupaiaウイルス及びマプエラMapueraウイルスなどのパラミクソウイルス科に特異的なプライマー組を用いて抽出したKBChua他、2000、Science、28814321435。RT-PCRアッセイは、潜在的に関連しているウイルスを検出するために低ストリンジェンシー条件下で行った。同一源のウイルスストック由来のRNA分離株を対照として用いた。利用できる対照が関連するウイルス特異的プライマーで陽性に反応したのに対し、新しく同定したウイルス分離株はどのプライマー組とも反応せず、これは、このウイルスが試験したウイルスと近縁関係にないことを示している。ウイルスに感染したtMK細胞の培養物上清のうち2種を、モルモット及びフェレットに鼻腔内に接種した。接種後0日目、2週間目、及び3週間目にこれらの動物から血清試料を採取した。動物は臨床的症状は示していなかったが、すべての動物で抗体陽転が検出され、ウイルス中和VN実施例16の方法を参照アッセイ及び同種ウイルスに対する間接IFAで測定した。血清は、間接IFAにおいて上述の既知のパラミクソウイルスのどれとも反応せず、またマウスのニューモウイルスPVMとも反応しなかった。モルモット及びフェレットの感染前及び感染後の血清を用いて、現在までに未同定のウイルス分離株をスクリーニングした。これらのうち、28種が間接IFAで明らかに陽性であり、感染後の血清は、ここまでに未同定のウイルス分離株が近縁である又は同一であることを示唆している。ウイルスをさらに特性解析するために、細胞系におけるウイルス感染の表現効果を観察した。簡単に説明すると、ガラス製スライドを含む24ウェルプレートCostar、CambridgeUKで、10ウシ胎児血清BioWhittaker、VervierBelgiumを添加した以下に述べる培地中でtMK細胞を培養した。接種前にプレートをPBSで洗浄し、0.5Lに0.26gのNaHCO3、0.025MのHepesBiowhittaker、2mMのL-グルタミンBiowhittaker、100単位のペニシリン、100μgのストレプトマイシンBiowhittaker、0.5gのラクトアルブミンSigmaAldrich、ZwijndrechtTheNetherlands、1.0gのD-グルコースMerck、AmsterdamTheNetherlands、5.0gのペプトンOxoid、HaarlemTheNetherlands及び0.02のトリプシンLifeTechnologies、BethesdaMDを添加した、ハンクス塩を含むイーグルMEMICN、CostamesaCAを入れた。プレートに鼻咽頭吸引液試料の上清を接種し1ウェルあたり0.2mlを3つ組で、次いで840×gで1時間遠心した。接種後、プレートを37°Cで最大14日間インキュベートし、この間培地を週に1回交換し、培養物を毎日CPEについて検査した。14日後に細胞を2代目継代から掻き取り、14日間インキュベートした。このステップを3代目継代で繰り返した。ガラス製スライドは、以下に述べるようにウイルスの存在を間接IFAによって実証するために使用した。CPEは一般に、分離株に応じて3代目継代の後、すなわち8~14日目で観察された。hRSVが4日目前後にCPEを誘発する以外は、tMK細胞又は他の細胞培養物中のhRSV又はhPIVに引き起こされたCPEは実質上区別不可能である。CPEは合胞体の形成によって特徴づけられ、その後、細胞は迅速な内部破壊、次いで単層からの細胞の剥離を示した。一部の分離株では、CPEの観察は困難であり、これらの培養物中のウイルスの存在を確認するためにIFAを用いた。このCPEが他のウイルス由来のCPEと区別不可能であるという観察により、臨床的症状の目視検査によって診断を行うことができないことが示された。6.2実施例2:ヒト集団における血清陽性率ヒト集団におけるこのウイルスの血清陽性率を調査するために、様々な年齢区分のヒト由来の血清を、未同定のウイルス分離株のうち1種に感染させたtMK細胞を用いた間接IFAによって分析した。調査により、このウイルスに対する抗体が6カ月齢~12カ月齢の子供の25で検出されることが明らかとなった。さらに、5歳までには、子供のほぼ100が血清陽性であった。全体で56個の血清試料を間接IFA及びVNアッセイで観察した。試料の51個又は91で、VNアッセイの結果、すなわち8を超える力価が、間接IFAの結果、すなわち32を超える力価と一致した。IFAで陽性であることが判明した4個の試料試料がVNアッセイで陰性であった、すなわち力価が8未満であった。1個の血清試料がIFAで陰性であった、すなわち、力価が32未満であり、VN試験で陽性であった、すなわち、力価が16であった図2。1958年に、8~99歳の範囲のヒトから採取した72個の血清試料で実施したIFAでは100の血清陽性率が明らかとなり、このウイルスが40年以上もヒト集団内で循環していることが示された。さらに、これら血清試料のうちいくつかを、IFAデータを裏づけるためにVNアッセイで使用した図2。血清陽性率データは、このウイルスは長年の間ヒト集団における顕著な感染源であったことを示している。重度のRTIに罹患している子供由来の臨床試料からこのウイルスを繰り返し単離することは、MPVの臨床的及び経済的影響が大きいかもしれないことを示している。ウイルス検出及び血清学に基づいた新しい診断的アッセイにより、罹患率並びにこのウイルス病原体の臨床的及び経済的影響のより詳細な分析が得られるであろう。IFAとVNの結果の僅かな差異5個の試料は、IFAではIgG血清抗体のみを検出するが、VNアッセイでは抗体のクラスとサブクラスとの両方を検出することが原因であるかもしれない。あるいは、この差異は、両アッセイの感度の差が原因であるかもしれない。IFAでは閾値16を使用したが、VNでは閾値8を使用した。また、IFAアッセイとVNアッセイの結果の差異は、この新しく同定されたウイルスで存在する可能性のある血清型の差異も示しているかもしれない。MPVがAPVに最も近縁であると考えられるので、このヒトウイルスがトリ起源であり得ることが推測された。1958年にヒトから採取した血清試料の分析により、MPVが40年以上もヒト集団において蔓延していたことが明らかになり、これは、1958年よりもかなり前に動物原性感染事象が起こったことが推定されることを示している。6.3実施例3:HMPV分離株00-1のゲノム配列未知のウイルス分離株の配列情報を得るために、RAP-PCRWelsh他、1992、NAR、2049654970として知られるランダムPCR増幅戦略実施例21参照。簡単に説明すると、tMK細胞をウイルス分離株のうち1種分離株00-1並びに陽性対照として役割を果たすhPIV-1に感染させた。両方の培養物が同等のレベルのCPEを示した後、培養物上清中のウイルスを連続的な20~60スクロース勾配で精製した。EMによって勾配画分をウイルス様粒子について検査し、約50のスクロースを含む分画からRNAを単離し、これ中にヌクレオカプシドが観察された。両方のウイルス分画から単離したRNA分離株を等量ずつRAP-PCRで使用し、その後、試料を隣り合わせで3NuSieveアガロースゲルに流した。次いで、未同定のウイルスに特異的な20個の示差的に現れたバンドをゲルから精製し、プラスミドpCR2.1Invitrogenにクローニングし、ベクター特異的プライマーを用いて配列決定した実施例22参照。NationalLibraryofMedicineから入手可能なBLASTプログラムを用いて、Genbankデータベースで配列に対する相同性を検索することによって、20個の断片のうち10個がAPV/TRTV配列との類似性を示していることが判明した。これら10個の断片は、核タンパク質N;断片1及び2、マトリックスタンパク質M;断片3、融合タンパク質F;断片4、5、6、7及びポリメラーゼタンパク質L;断片8、9、10をコードしている遺伝子中に位置していた図3。PCRプライマーは、本発明者らのRAPPCR断片並びにニューモウイルス科の発表されているリーダー配列及びトレーラー配列Randhawa他、1997、JVirol、7198499854に基づいて、ウイルスゲノムの3’末端の配列情報を完成するように設計した。3個の断片を増幅した、そのうち断片AはNオープンリーディングフレームORFの3’最末端に及んでおり、断片Bはリンタンパク質FのORFに及んでおり、断片CはMORFとFORFとの間のギャップを埋めていた図16。これら3個の断片を配列分析することで、ウイルスゲノムの3’最末端にNS1及びNS2ORFが存在しないこと、並びにFORFがMORFのすぐ隣に位置することが明らかとなった。このゲノム機構は、やはり配列相同性と矛盾がなかったメタニューモウイルスAPVのゲノム機構に似ていた。様々なウイルス間の関係は、図4のアミノ酸配列と他のウイルスのそれぞれのNタンパク質のアミノ酸配列とを比較することによって推定することができる。全般的に、N、P、M及びFORFの翻訳された配列は、ニューモウイルス属のメンバーと平均30~33の相同性を示し、メタニューモウイルス属のメンバーと66~68の相同性を示した。SH及びGORFでは、どちらの属のメンバーとも認識できる相同性が見出されなかった。NORFのアミノ酸配列で見つかったアミノ酸の相同性では、hRSVと約40、及び遺伝学的に最も近縁であるAPV-Cと88の相同性が示された。PORFのアミノ酸配列ではhRSVと約25及びAPV-Cと約66~68の相同性が示され、MORFではhRSVと約36~39及びAPV-Cと約87~89が示され、FORFではhRSVと約40及びAPV-Cと約81の相同性が示され、M2-1ORFではニューモウイルスと約34~36及びAPV-Cと84~86の相同性が示され、M2-2ORFではニューモウイルスと15~17及びAPV-Cと56の相同性が示され、LORFから得た断片ではニューモウイルスと平均44及びAPV-Cと64が示された。N、M、P及びF遺伝子の遺伝子分析により、MPVがニューモウイルス属よりも最近提示されたメタニューモウイルス属とより高い配列相同性を有し、したがってAPV/TRTVに類似かつ似ているゲノム機構を示すことが明らかになった。RSVのゲノム機構3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5’とは対照的に、メタニューモウイルスはNS1及びNS2遺伝子を欠いており、また異なるゲノム機構を有する具体的にはMとL3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’遺伝子との間。本発明のウイルス分離株中のM遺伝子とF遺伝子との間のORFを欠いていること、Nに隣接するNS1及びNS2を欠いていること、並びにAPV内で見つかった高いアミノ酸配列相同性により、ヒトから単離したMPVを哺乳動物、特にヒトのメタニューモウイルス属の最初のメンバーとして分類する提案に至った。系統的分析により、配列情報を得た9個のMPV分離株が近縁であることが明らかとなった。配列情報は限定されていたが、トリメタニューモウイルスのいずれとよりも、互いにより近縁であると思われる。記載したAPVの4つの血清型のうち、血清型CがMPVに最も近縁であると思われる。この結論は、N、P、M及びF遺伝子のヌクレオチド配列の類似性に基づいている。しかし、血清型DではF遺伝子の部分的な配列のみがGenbankから入手可能であり、血清型BではM、N、F配列のみが入手可能であったことを留意されたい。本発明者らのMPV分離株は系統樹内で2つの集団を形成した。hRSV及びAPVのいずれもで、異なる遺伝子学的及び血清学的サブタイプが記載されている。MPV分離株の2つの遺伝子学的集団が機能的にも異なる血清学的サブグループを表すかどうかは、現在ではまだ不明である。本発明者らの血清学的調査では、MPVが一般的なヒトの病原体であることが示された。6.4実施例4:関連遺伝子のさらなる特性解析MPVの核タンパク質N、リンタンパク質P、マトリックスタンパク質M及び融合タンパク質F遺伝子の配列分析により、米国において主としてトリで見つかるAPV血清型Cとの最も高い度合の配列相同性が明らかとなった。また、これらの分析により、ウイルスゲノムの3’末端に非構造タンパク質NS1及びNS2が存在しないこと、並びに融合タンパク質がマトリックスタンパク質のすぐ隣に位置することも明らかになった。22KM2遺伝子、小さな疎水性SH遺伝子、結合G遺伝子、ポリメラーゼL遺伝子、遺伝子間領域、及びトレーラー配列の配列を決定した。既に記載した配列と組み合わせると、ここで提示する配列により、ゲノム末端の最末端の12~15個のヌクレオチドを除いてMPVのゲノム配列が完成し、MPVのゲノム機構が確立した。MPVゲノムの配列をAPVサブタイプA、B及びC、RSVサブタイプA及びB、PVM並びに他のパラミクソウイルスの配列と並べて比較することにより、メタニューモウイルス属におけるMPVの分類の強力な証拠が提供される。核タンパク質Nをコードしている遺伝子:上で示したように、MPVのゲノムマップの最初の遺伝子は394個のアミノ酸aaのタンパク質をコードしており、他のニューモウイルスのNタンパク質と高い相同性を示す。NORFの長さはAPV-CのNORFの長さと同じであり表5、他のパラミクソウイルスの長さより短いBarr他、1991、JGenVirol、7267785。アミノ酸配列の分析により、APV-Cと最も相同性が高いこと88、及び他のパラミクソウイルスとは7~11しかないことが明らかとなった表6。モノネガウイルス目に属するウイルス間における3つの類似領域、A、B及びCを同定した図22Barr他、1991、JGenVirol、7267785。類似性は同一ウイルス科内の場合に最も高いが、これらの領域は観察したウイルス科の間で高度に保存されている。3つの領域すべてで、MPVはAPV-Cと97、APV-Bと89、APV-Aと92、並びにRSV及びPYMと66~73のアミノ酸配列の同一性を示した。アミノ酸残基160と340との間の領域がメタニューモウイルスの間で高度に保存されており、ニューモウイルス科でいくらか低い程度で保存されていると思われるMiyahara他、1991、ArchViral、12425568Li他、1996、VirusRes、4118591Barr、1991、JGenVirol、7267785。リンタンパク質Pをコードしている遺伝子:ゲノムマップの第2のORFは、APV-CのPタンパク質と68の配列相同性を共有し、RSVのPタンパク質とは22~26しか共有しない表7294aaのタンパク質をコードしている。MPVのP遺伝子は1つの実質的なORFを含み、この点では、多くの他のパラミクソウイルスのPと類似しているLamb他、Fieldsvirology、、Philadelphia、1996Sedlmeier他、1998、AdvVirusRes、5010139で総説。APVA及びB並びにPVMとは対照的に、またRSV並びにAPV-Cと類似して、MPVのPORFはシステイン残基を欠いている。すべてのニューモウイルス間で類似性が高い領域アミノ酸185~241は、RNA合成プロセス又はヌクレオカプシド複合体の構造的完全性の維持のいずれかにおいて役割を果たすLing他、1995、VirusRes、3624757。この類似性の高い領域は、特に保存的置換を考慮した場合にMPV中でも見つかり図6、APYCと100、APV-A及びBと93、並びにRSVと約81の類似性を示す。MPVのPタンパク質のC末端は、APVについて記載されているようにLing他、1995、VirusRes、3624757、グルタミン酸残基に富んでいる。マトリックスMタンパク質をコードしている遺伝子:MPVゲノムの第3のORFは、他のニューモウイルスのMORFに似ている254aaのタンパク質をコードしている。MPVのMORFは他のメタニューモウイルスのMORFと全く同じサイズを有しており、APVのマトリックスタンパク質と高いアミノ酸配列の相同性を示し78~87、iRSV及びPVMのマトリックスタンパク質とより低い相同性を示し37~38、他のパラミクソウイルスのマトリックスタンパク質と10未満の相同性を示すパラミクソウイルス表6。すべてのニューモウイルスのマトリックスタンパク質の配列を比較し、残基14~19で保存された7ペプチドがMPV中でも保存されていることが判明した図7Easton他、1997、VirusRes、482733。RSV、PVM及びAPVでは、Mの主ORFの内部又はそれと重複する小さい二次的ORFが同定されたbRSVで52aa及び51aa、RSVで75aa、PVMで46aa、並びにAPVで51aaYu他、1992、Virology、18642634Easton他、1997、VirusRes、482733Samal他、1991、JGenVirol、7271520Satake他、1995、JVirol、50929。ヌクレオチド2281から開始する54aa残基の1つの小さなORFが主MORFの内部に見つかり断片1、図8、ヌクレオチド2893から開始する33aa残基の1つの小さなORFがMの主なORFと重複して見つかった断片2、図8。RSV及びAPVの二次的ORFと同様に、これらの二次的ORF間及び他のニューモウイルスの二次的ORFと有意な相同性はなく、明らかな開始コドンや停止コドンが欠如している。さらに、これらの二次的なORFからタンパク質合成が起こるという報告はない。融合タンパク質をコードしている遺伝子:MPVのFORFはMORFに隣接して位置し、これは、メタニューモウイルス属のメンバーに特徴的な特徴である。MPVのF遺伝子は、APV-CのFよりも2aa残基長い539aaタンパク質をコードしている。アミノ酸配列の分析により、APV-Cと81、APV-A及びBと67、ニューモウイルスFタンパク質と33~39、並びに他のパラミクソウイルスとはわずか10~18の相同性が示された表6。パラミクソウイルスのFタンパク質間で保存されており、MPVでも見られる特徴の1つは、システイン残基の分布であるMorrison他、1988、VirusRes、1011335Yu他、1991、JGenVirol、727581。メタニューモウイルスはE1で12個7個はすべてのパラミクソウイルスで保存されている、及びE2で2個のシステイン残基1個はすべてのlパラミクソウイルスで保存されているを共有している。MPVのFORF中に存在する3つの潜在的なN結合グリコシル化部位のうち、RSVとはまったく共有されておらず、2個74位及び389位がAPVと共有されている。MPVの第3の、独特な、潜在的なN結合グリコシル化部位は206位に位置している図9。他のパラミクソウイルスとの配列相同性が低いにもかかわらず、MPVのFタンパク質は、他のパラミクソウイルス科のメンバーのFタンパク質に記載された特徴と矛盾しない、典型的な融合タンパク質の特徴を示したMorrison他、1988、VirusRes、1011335。パラミクソウイルス科のメンバーのFタンパク質は不活性な前駆物質F0として合成され、これが宿主細胞のプロテアーゼによって切断され、アミノ末端のE2サブユニット及びカルボキシ末端の大きなF1サブユニットが生成される。提案された切断部位Collins他、Fieldsvirology、、Philadelphia、1996はパラミクソウイルス科のすべてのメンバー間で保存されている。MPVの切断部位は残基RQSRを含む。いずれのアルギニンR残基もAPV及びRSVで共有されているが、グルタミンQ及びセリンS残基は1型ヒトパラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルスなどの他のパラミクソウイルスで共有されている。F1のアミノ末端の疎水性領域は膜融合ドメインとして機能すると考えられており、パラミクソウイルス及び麻疹ウイルス間で高い配列類似性を示し、より低い程度でニューモウイルスと配列類似性を示すMorrison他、1988、VirusRes、1011335。これら26個の残基137~163位、図9はMPV及びAPV-C間で保存されており、これは、この領域がメタニューモウイルス間で高度にの保存されていることと一致しているNaylor他、1998、JGenVirol、7913931398Seal他、2000、VirusRes、6613947。APV及び他のパラミクソウイルスのF2サブユニットで見られたように、MPVは、RSVと比較して22aa残基の欠失を示す107~128位、図9。さらに、RSV及びAPVではシグナルペプチド及びアンカー固定ドメインがサブタイプ内で保存されていることが判明し、サブタイプ間で高度な可変性を示したPlows他、1995、VirusGenes、113745Naylor他、1998、JGenVirol、17913931398。F2のアミノ末端のMPVのシグナルペプチドアミノ酸10~35、図9はAPV-Cといくらかの配列類似性を示し26aa残基中18個が類似である、他のAPVやRSVとより低い保存性を示す。E1のカルボキシ末端の膜固定ドメインではサブタイプ間ではるかに高い可変性が見られるが、それでもAPV-Cと多少の相同性が見られる。M2タンパク質をコードしている遺伝子:M2遺伝子はニューモウイルス科に独特であり、すべてのニューモウイルスで2つの重複するORFが観察されている。第1の主なORFはウイルスポリメラーゼの処理能力processivityCollins他、1995、ProcNatlAcadSciUSA、92115637Collins他、Fieldsvirology、、Philadelphia、1996、及びそれによる遺伝子間領域のリードスルーHardy他、1998、JVirol、725206Fearns他、1999、JVirol、73585264を促進する、M2-1タンパク質を表す。F遺伝子に隣接して位置するMPVのM2-1遺伝子は187aaのタンパク質をコードし、APV-CのM2-1と最も高い84相同性を示す。すべてのニューモウイルスM2-1タンパク質を比較することにより、タンパク質のアミノ末端側の半分で最も高く保存されていることが明らかとなりCollins他、1990、JGenVirol、71301520Zamora他、1992、JGenVirol、7373741Ahmadian他、1999、JGenVirol、8020116、これは、MPVがタンパク質の最初の80aa残基でAPV-Cと100の類似性を示すことと一致している図10。MPVのM2-1タンパク質は、最初の30aa残基内に位置し、すべてのニューモウイルスで保存されている3個のシステイン残基を含む。このようなシステインの濃度はしばしば亜鉛結合タンパク質で見つかるCuesta他、2000、GenVirol74、985867。ニューモウイルスのM2-1ORFと重複する第2のORFM2-2は、位置は保存されているが配列は保存されておらず、ウイルスのRNA複製と転写との切替えの制御に関与していると考えられているCollins他、1985、JVirol、546571Elango他、1985、JVirol、5510110Baybutt他、1987、JGenVirol、68278996Collins他、1990、JGenVirol、71301520Ling他、1992、JGenVirol、73170915Zamora他、1992、JGenVirol、7373741Alansari他、1994、JGenVirol75401404Ahmadian他、1999、JGenVirol、8020116。MPVでは、M2-2ORFはM2-1ORFのヌクレオチド512から開始し図8、これはAPV-Cと全く同じ開始位置アミノ酸である。M2-2ORFの長さはAPV-CとMPVとで同じであり、71aa残基である。M2-2ORFの配列の比較により図10、MPVとAPV-Cとの間に64のアミノ酸配列の相同性があり、MPVとAPV-A及びBとの間には44~48のアミノ酸配列の相同性しかないことが明らかとなった。小さな疎水性SH遺伝子ORF:hMPVのM2に隣接する遺伝子は、恐らく183aaのSHタンパク質をコードしている図8。このORFと他のRNAウイルス遺伝子又は遺伝子産物との間に識別可能な配列同一性はない。ニューモウイルスのSHタンパク質間の配列類似性は一般的に低いので、このことは驚くべきことではない。SHORFのアミノ酸組成はAPV、RSV及びPVMのものと比較的類似しており、スレオニン及びセルン残基の割合が高いhMPV、APV、RSVA、RSVB、bRSV及びPVMでそれぞれ22、18、19、20.0、21及び28。hMPVのSHORFは10個のシステイン残基を含み、APVSHは16個のシステイン残基を含む。hMPVのSHORFは2個の潜在的なN結合グリコシル化部位アミノ酸76及び121を含み、APVは1個、RSVは2個又は3個、PVMは4個有する。推定hMPVSHタンパク質並びにAPV及びRSVのSHの親水性プロファイルでは、類似した特徴が明らかとなった図11B。APV及びhMPVのSHORFは親水性のN末端、潜在的な膜貫通ドメインである中心疎水性ドメインhMPVではアミノ酸30~53、第2の疎水性ドメインアミノ酸155~170及び親水性のC末端を有する。対照的に、RSVSHはAPV及びhMPVORFのC末端部分を欠いているように思われる。すべてのニューモウイルスSHタンパク質で、疎水性ドメインには塩基性アミノ酸残基が隣接しており、これもhMPVのSHORF中で見つかるアミノ酸29及び54。結合糖タンパク質Gをコードしている遺伝子:hMPVの推定GORFは推定SH遺伝子に隣接して位置し、236aaのタンパク質をコードしているnt6262~6972、図8。このORFのすぐ後に第2の小さなORFが見つかり、これは潜在的に68aa残基をコードしているがnt6973~7179、開始コドンを欠いている。第2のリーディングフレーム中の194aa残基の第3の潜在的なORFはこれらのORFのいずれとも重複しているが、やはり開始コドンを欠いているnt6416~7000。このORFに続いて、同じリーディングフレーム中に65aa残基の第4の潜在的なORFがありnt7001~7198、これもまた開始コドンを欠いている。最後に、97aa残基の潜在的なORF開始コドンを欠いているが第3のリーディングフレーム中に見つかるnt6444~6737、図8。第1のORFとは異なり、他のORFは明らかな遺伝子開始配列又は遺伝子停止配列を有さない以下参照。236aaのGORFは恐らくhMPV結合タンパク質の少なくとも一部を表しているが、何らかのRNA編集事象によって追加のコード配列が別のタンパク質として、又は結合タンパク質の一部として発現されることを排除することはできない。APV及びRSVでは、第1のGORFの後に第2のORFはまったく同定されておらず、APV及びRSVのどちらもがGの主ORF内に第2のORFを有することに注目されたい。しかし、これらのORFが発現される証拠はなく、様々なウイルスで予想されたアミノ酸配列間に配列同一性はないLing他、1992、JGenVirol、73170915。hMPVG中の第2のORFはGタンパク質の特徴を示さず、追加のORFが発現されているかどうかにはさらなる調査が必要である。すべてのORFでのBLAST分析では、ヌクレオチド又はアミノ酸配列レベルで、他の既知のウイルス遺伝子又は遺伝子産物との識別可能な配列同一性は示されなかった。これは、hRSVA及びB53Johnson他、1987、JVirol、611636並びにAPVA及びB38Juhasz及びEaston、1994、JGenVirol、75287380など、他のGタンパク質で見られる低い割合の配列同一性と一致している。hMPVORFのほとんどが長さ及び配列のいずれについてもAPVのものと似ているが、236aa残基のhMPVの推定GORFはAPVのGORFよりも相当小さい表4。アミノ酸配列はセリン及びスレオニンの含有率34を示し、これはRSVの32及びAPVの24よりもさらに高い。推定GORFはまた、8.5のプロリン残基を含み、これはRSVの8及びAPVの7よりも高い。APV、RSV及びhMPVのGタンパク質中にプロリン残基が異常に豊富に存在することは糖タンパク質でも観察され、これは、タンパク質3次元構造の主要な決定因子であるCollins及びWertz、1983、PNAS、80320812Wertz他、1985、PNAS、8240759Jentoft、1990、TrendsBiochemSci、152914。hMPVのGORFは5個の潜在的なN結合グリコシル化部位を含み、hRSVは7個、bRSVは5個、APVは3~5個有する。hMPVGの予想された親水性プロファイルにより、他のニューモウイルスに類似した特徴が明らかとなった。N末端は親水性領域、次いで短い疎水性の領域hMPVではアミノ酸33~53及び主に親水性のC末端を含む図12B。この全体的な機構は、APV及びRSVのGタンパク質内の領域とよく対応している。hMPVの推定GORFは、RSV及びAPVとは対照的にそれぞれ5個及び20個、1個のシステイン残基しか含まない。注目すべきことに、G遺伝子中の4つの第2のORFのうち2つだけが1つの追加のシステイン残基を含んでおり、これら4つの潜在的なORFは12~20のセリン及びスレオニン残基並びに6~11のプロリン残基を示した。ポリメラーゼ遺伝子L:他のマイナス鎖ウイルスと類似したMPVゲノムの最後のORFは、複製及び転写複合体のRNA依存性RNAポリメラーゼ構成要素である。MPVのL遺伝子は、APV-Aタンパク質よりも1残基長い2005aaのタンパク質をコードしている表5。MPVのLタンパク質は、APV-Aと64、RSVと42~44、他のパラミクソウイルスと約13の相同性を共有している表6。セグメント化されていないマイナス鎖RNAウイルスのLタンパク質内の6つの保存されたドメインが同定された。ドメイン3がポリメラーゼ機能に必須の4つのコアポリメラーゼモチーフを含むことが判明したPoch他、1990、JGenVirol、71115362Poch他、1989、EMBOJ、8386774。これらのモチーフA、B、C及びDはMPVLタンパク質内でよく保存されている。モチーフA、B及びCでは、MPVはすべてのニューモウイルスと100の類似性を共有していおり、モチーフDでは、MPVはAPVと100、RSVと92の類似性を共有している。ドメインIIIのすべてでLORFのアミノ酸627~903、MPVはAPVと77、RSVと61~62、他のパラミクソウイルスと23~27の同一性を共有する図13。ポリメラーゼモチーフに加えて、ニューモウイルスLタンパク質はコンセンサスATP結合モチーフKX21GEGAGNX20Kと一致する配列を含むStec他、1991、Virology、18327387。MPVのLORFはAPVと類似したモチーフを含み、ここでは中間残基の間隔が残基1個シフトしている:KX22GEGAGNX19K。6.5実施例5:HMPV分離株1-99のゲノム配列決定hMPVの別の分離株1-99も同定かつ配列決定した。これを行うために、hMPV分離株1-99を第3サル腎臓細胞で、既に記載された方法と全く同じように増殖させたvandenHoogen他、2001、NatureMedicine、7719724。MagnaPureLC単離システムRocheAppliedScience及び全核酸キットのプロトコルを用いてウイルスRNAを単離した。標準のプロトコルを用い、ランダム6量体ProgemaIncLeidenをプライマーとして使用して、RNAをcDNAへと変換した。このcDNAは、配列分析で使用するまで-20°C又はそれより低い温度に維持した。このプロジェクトの全体で使用したプライマーは、プロトタイプhMPV1-00株から入手可能な配列に基づいているか、又はhMPV株1-99を用いて配列分析の後に得られた。重複する断片を作製するために、1600塩基対までの大きさの範囲のPCR断片を作製した。標準の技術及びABI3100キャピラリー配列装置AppliedBiosystems、NieuwerkerkIsselを使用して、PCR断片で配列分析を行った。作製されたヌクレオチド配列をまず最初に比較のためにプロトタイプhMPV株1-00と比較した。GenBankデータベース内の関連配列と比較するためにBlastソフトウェアを使用した。配列のさらなる分析にはDNASTARソフトウェアそ使用しDNASTARInc、MadisonWIUSA、系統的分析にはClustalWソフトウェアプログラムを使用した。最初に、1-00分離株の配列情報に基づいて設計されたプライマーを用いて1-99分離株の配列を得た。しかし、ゲノムのいくつかの部分は1-00分離株の情報に基づいて配列決定することができなかったので、1-99分離株の配列情報、並びに1-00分離株の3’及び5’末端を配列決定することによって利用可能となった情報に基づいた新しいプライマーを使用した。hMPV分離株1-99のプロトタイプ配列は13,223塩基対を含んでおり、これは、平均の長さが404塩基対の全部で227個の個別の配列で配列決定した。この配列は配列番号18である。hMPV1-99及び他のパラミクソウイルスのオープンリーディングフレームの長さの、絶対的な長さ及びアミノ酸同一性の割合を表7に示す。1-99株と1-00株との間の同一性は、Nタンパク質95.2、M97.3、F93.7、L94.1及びM2-194.1をコードしている遺伝子中で最も観察され、相同性の割合は90を超えていた。両株間のP及びM2-2遺伝子の相同性はそれぞれ86.1及び88.9であることが見出された。また、この分離株はトリメタニューモウイルスのサブタイプCと最も関連しており、Nタンパク質88.6、Mタンパク質87.1及びM2-1タンパク質84.3でアミノ酸同一性が見られた。P及びM2-2タンパク質との同一性はそれより低く、それぞれ67.8及び56.9であった。プロトタイプ1-00及び1-99株の遺伝子はゲノムマップ上で同一であり、N、P、M、F、M21及びM2-2タンパク質でアミノ酸の数が同じである。推定SH遺伝子はアミノ酸6個短く、Gタンパク質はアミノ酸12個短く、1-00及び1-99株のL遺伝子は同じ大きさである。最後に、ゲノムマップにおける遺伝子の開始、及び遺伝子間に位置する非コード配列を表8に要約した。要約すると、ヒトメタニューモウイルスの1-99株の配列情報は、同一のゲノムマップ機構を共有している1-99とプロトタイプ株1-00との遺伝的関係を明らかに実証している。APVのサブタイプCではより系統性の低い関係が観察される。6.6実施例6:系統的関係ウイルス群の間、すなわちMPVと他のウイルス間の関係を同定するために系統的な手法を用いることができる。さらに、同型のウイルスの様々な分離株について系統的関係を決定することができる。MPVと他のウイルスとの間の関係性を決定するために、またhMPVの様々な分離株間の関係性を決定するために、系統樹を決定した。たとえば、MPVと様々なウイルスとの間の関係性を例示するために、ヌクレオチド又はタンパク質の配列データを使用して系統樹を作製することができる。あるいは、hMPVの様々な分離株間の関係性を例示するために、ヌクレオチド又はタンパク質の配列データを使用して系統樹を作製することができる。HMPVと様々なウイルスとの間の系統的関係:未同定のウイルス分離株から得たヌクレオチド配列を用いたBLAST検索により主にニューモウイルス科のメンバーとの相同性が明らかとなったが、タンパク質配列に基づいた相同性では他のパラミクソウイルスとのある程度の類似性も明らかとなった。新しく同定されたウイルス分離株とニューモウイルス科のメンバーとの間の関係性の指標として、これらのウイルスのN、P、M及びFORFに基づいて系統樹を構築した。4つの系統樹すべてで、新しく同定されたウイルス分離株がAPVに最も近縁であった図14。記載されているAPVの4つの血清型からBayonAuboyer他、2000、JGenVirol、8127232733、米国において主にトリで見つかるメタニューモウイルスであるAPV血清型Cが、新しく同定されたウイルスと最も近い類似性を示した。しかし、APV血清型Dの配列情報は部分的にしか入手可能でないことに注意されたい。すべての系統樹で、DNA配列はClustalWソフトウェアパッケージを使用してアラインメントをとり、最大尤度の系統樹はPhylip3.5プログラムのDNA-MLソフトウェアパッケージを使用して、50又は100回のブートストラップbootstrap及び3回のジャンブルjumbleを用いて作製したBrandenburg他、1997、JMedVirol、5297104。系統樹の作製に用いた既に発表されている配列は以下の寄託番号の下でGenbankから入手可能である。すべてのORF:hRSV:NC001781;bRSV:NC001989;FORF:PYM、D11128;MV-A、D00850;MV-B、Y14292;MV-C、AF187152;NORF:PVM、D10331;MV-A、U39295;MV-B、U39296;MV-C、M176590;MORF:PMV、U66893;MV-A、X58639;MV-B、U37586;MV-C、AE262571;PORF:PVM、09649;MV-A、U22110、MV-C、AF176591。MPVとニューモウイルス科のメンバーとの間の関係性の指標として、N、P、M、及びFORFに基づいた系統樹が既に構築されておりvandenHoogen他、2001、NatMed、71924、これによりMPVとAPV-Cの間に近い関係性があることが明らかとなった。MPVのSH及びG遺伝子と他のパラミクソウイルスのそれらの遺伝子の相同性が低いので、これらの遺伝子について信頼性のある系統樹を構築することができない。さらに、ニューモウイルス属及びメタニューモウイルス属のメンバー間のゲノム機構が明白に異なることにより、全ゲノム配列に基づいた系統樹を作製することが不可能となる。既に発表されているものに加えて、M2及びL遺伝子の系統樹を構築した。これらの系統樹はどちらも、ニューモウイルス亜科内におけるAPVとMPVとの間の関係性が近いことを裏づけた図15。系統樹を構築するために、ClustalWソフトウェアパッケージを使用してDNA配列のアラインメントを行い、Phylip3.5プログラムのDNA-MLソフトウェアパッケージを使用して、100回のブートストラップ及び3回のジャンブルを用いて最大尤度の系統樹を作製した。ブートストラップ値は、PHYLIPコンセンサスパッケージで作製したコンセンサスの系統樹用に計算した。ここまでに得られたhMPVの様々な分離体の系統的分析に基づいて2つの主な遺伝型が同定され、ウイルス分離株00-1が遺伝型Aのプロトタイプであり、分離株99-1が遺伝型Bのプロトタイプである。遺伝型がサブタイプに関連しており、既に存在している免疫の存在下で両方のサブグループ由来のウイルスによる再感染が起こり、また再感染が起こるために抗原の変異が厳密に必要でないかもしれないという仮説が立てられている。さらに、hMPVは主に家禽で見つかるウイルスであるトリニューモウイルスに近縁であると考えられる。両ウイルスのヌクレオチド配列は、SH及びGタンパク質以外は高い割合の相同性を示す。これらのウイルスは、主に核タンパク質及びマトリックスタンパク質に基づいた試験で交差反応すると考えられるが、結合タンパク質に基づいた試験において異なる反応を示す。ウイルス中和力価における差異は、hMPVの2つの遺伝型は1つのウイルスの2つの異なる血清型であり、APVは異なるウイルスであるというさらなる証拠を提供する。異なるHMPV分離体間の系統的関係:MPVの異なる分離株間の関係性を同定するために、系統的手法も用いることができる。たとえば、様々な対照から得られたいくつかのMPV分離株間の関係性を例示するために、ヌクレオチド又はタンパク質の配列データを用いて系統樹を作製することができる。この手法は、MPVウイルス集団内で起こる差異の理解に有用である。本発明者らの様々な新しく同定されたウイルス分離株の関係性を決定するために、8~9個の分離株Fで8個、N、M及びLで9個から得た配列情報に基づいて系統樹を構築した。N、M、F、P、SH及びLORF中の短い断片を増幅するために設計したプライマーでRT-PCRを用い、その後それらを直接配列決定した。血清学的な観点から関連していると判明した9つのウイルス分離株上記参照は、遺伝学的にも近縁であることが判明した。実際、9つの分離株すべてが、APVとよりも互いにより近縁であった。これらの系統樹に用いた配列情報は限定されているが、9つの分離株は2つのグループ、すなわち分離株94-1、99-1及び99-2が1つのグループの集団、他の6つの分離株94-2、93-1、93-2、93-3、93-4、00-1が他方の集団に分けられると考えられる図16。4つの変種すべて、すなわち変種A1、A2、B1、又はB2のhMPVの様々な分離株のF遺伝子のアラインメントを図17に示す。4つの変種すべて、すなわち変種A1、A2、B1、又はB2のhMPVの様々な分離株のFタンパク質のアラインメントを図18に示す。4つの変種すべて、すなわち変種A1、A2、B1、又はB2のhMPVの様々な分離株のG遺伝子のアラインメントを図19に示す。4つの変種すべて、すなわち変種A1、A2、B1、又はB2のhMPVの様々な分離株のGタンパク質のアラインメントを図20に示す。様々なhMPV分離株の系統的関係性、及び対応するhMPVの変種とのその関係性を示す、F遺伝子配列に基づいた系統樹を図21に示す。さらに、様々なhMPV分離株の系統的関係性、及び対応するhMPV変種とのその関係性を示す、G遺伝子配列に基づいた系統樹を図22に示す。これらの系統樹は、DNA最大尤度を使用して、50回のブートストラップ及び3回のジャンブルを用いて計算した。hMPV分離株00-1の様々な遺伝子とhMPV分離株99-1、APV血清型C、及びAPV血清型Aの様々な遺伝子との間の配列同一性を表9に示す。最初、系統的関係性は9つの異なる単離対でのみ推測していた。2つの潜在的な遺伝学的集団は、ウイルス分離株のN、M、F及びLORFの部分的ヌクレオチド配列を分析することによって同定した。90~100のヌクレオチド同一性が同一集団内で観察され、81~88の同一性が異なる集団間で観察された。さらに多くのウイルス分離株で得た配列情報により、2つの遺伝子型が存在することが確認された。集団Aのプロトタイプとしてのウイルス分離株00-1、及び集団Bのプロトタイプとしてのウイルス分離株99-1を交差-中和アッセイで使用して、遺伝型が様々な血清型又はサブグループと関連しているかどうかを試験した。ポリメラーゼ遺伝子内に位置するプライマーを用いたRT-PCRアッセイを使用して、鼻咽頭吸引液試料から30個のさらなるウイルス分離株を同定した。これら新しい分離株の基質及びポリメラーゼ遺伝子の部分的な配列情報を、先の9つの分離株の配列情報と共に用いて系統図を構築した図15。これらの系統樹を分析することにより2つの遺伝学的集団、すなわちグループAのプロトタイプウイルスとしてのウイルス分離株00-1及びグループBのプロトタイプウイルスとしてのウイルス分離株99-1の存在が確認された。同一グループ内におけるヌクレオチド配列の同一性は92を超えており、異なる集団間の同一性は81~85であった。6.7実施例7:ヒトメタニューモウイルスHMPVNL/1/00ゲノムRNAのリーダー配列ゲノム組成の大部分が決定したが、最末端にある真のauthenticの末端配列が欠けていた。ウイルスRNAのライゲーション、次いでライゲートした接合点のPCR増幅並びにポリアデニル化及び3’RACE法を組み合わせて用いて、真のヌクレオチド配列を決定した図54。ウイルスRNA末端のライゲーションによって作製したPCR断片の配列分析により、図26に示すリーダー配列及びトレーラー配列が明らかとなった配列番号18~21参照。このようにして得たトレーラー配列は、APVを含めた他のパラミクソウイルスのトレーラー配列から予測された配列と矛盾がなかった。しかし、配列分析した71個のクローンのうち2個のリーダー配列しか、現在までにすべてのパラミクソウイルスで見つかっている末端ヌクレオチド残基としてのACを含んでいなかった。したがって、次いでポリアデニル化及び3’RACE法を組み合わせて用いてhMPV/NL/1/00リーダーの末端ヌクレオチド配列を確認した。さらに、hMPVNL/1/00の3’リーダー末端に2つの追加のヌクレオチドが同定された。本研究ではVeroで増殖させたhMPVNL/1/00ウイルスを使用した。対照として、同定された末端配列と類似したゲノムサイズを有する、関連するマイナス鎖RNAウイルスである呼吸器合胞体ウイルスRSVA2を含めた。ウイルスRNAは、QIAampウイルスRNAミニキットQiagenを用いて、製造者の指示に従って単離した。ウイルスRNAをポリAポリメラーゼAmbionと共に、37°Cで1時間インキュベートし、次いでNucAwayスピンカラムAmbionを用いてクリーンアップすることによって、ウイルスRNAをポリアデニル化した。その後、ポリAテール領域に相補的なプライマー及び逆転写酵素、SuperscriptIInvitrogenを用いてウイルスRNAを逆転写した。配列決定分析用の、予想される大きさの所望の産物を増幅するために、末端に並列なjuxtaposedhMPV特異的プライマーを使用してPCR及びNestedPCR反応を行った。TAクローニングキットInvitrogenを用いてPCR産物をさらにpCRIIベクターにクローニングした。末端の真のヌクレオチド配列を明らかにするために、PCRDNA及びクローニングしたPCR産物の直接配列決定を実施した。hMPVデータのみを図55に示す。RSV-A2RNAを用いた対照実験により、RSV-A2のリーダー配列が元の形のまま保たれ、同じ手法で検出可能であることが示された。PCR産物の直接の配列決定分析図55及びPCRクローンの配列決定分析はどちらも、hMPVのリーダー領域がリーダー配列の最も3’近位の20個のヌクレオチドで5’ACGCGAAAAAAACGCGTATAプラス鎖センスcDNA方向で表すからなることを示した。2つの新しく同定されたヌクレオチドを図101中で下線を引いた。6.8実施例8:MPV分離株の血清型決定及びサブグループ化hMPVのウイルス分離株を血清型又は遺伝型によって区別できるかどうかを決定するために、ウイルス中和アッセイを使用したたとえば実施例16参照。ウイルス特異的抗血清を産生させるために、ウイルス分離株00-1及び99-1をフェレットに接種した。00-1分離株では、個別の加圧したグローブボックス内で飼育した2匹の特定病原体除去フェレット及び2匹のモルモットを実験的に鼻腔内感染させることによって、ウイルスに対するフェレット及びモルモット特異的抗血清を産生させた。2~3週間後、すべての動物を心室穿刺によって出血させ、その血清を対照血清として用いた。血清は、以下に記載のように間接IFAで、既に記載したすべてのウイルスについて試験した。これらの抗血清と99-1分離株を用いて調製した抗血清とを、両方のウイルスでのウイルス中和アッセイで使用した表10。さらに6匹のモルモットにいずれか一方のウイルスすなわち00-1及び99-1を接種した。鼻咽頭吸引液試料でのRT-PCRアッセイにより、感染後2日目~10日目までウイルス複製が示された。感染後70日目に、モルモットを同種又は異種ウイルスのいずれかに感染させ、4つの事例すべてでウイルス複製が認められた。最初の感染後における抗血清を用いたウイルス中和アッセイでは、フェレットで行ったVNアッセイと本質的に同じ結果が示されたVN力価で>16倍の差。本実施例で提示する結果は、MPVの2つの血清型に対応する2つの遺伝型が存在することを裏づけており、また異種及び同種ウイルスに繰り返し感染することの可能性を示している表11。7.診断的アッセイ/検出方法7.1実施例9:直接免疫蛍光アッセイDIF法RTIを罹患している患者由来の鼻咽頭吸引液を、記載のようにDIFによって分析したRothbarth他、1999、JofVirolMethods、78163169。試料は-70°Cで保存した。簡単に説明すると、鼻咽頭吸引液を5mlのダルベッコMEMBioWhittaker、WalkersvilleMDで希釈し、ボルテックスミキサーで1分間、よく攪拌した。懸濁液を10分間、840×gで遠心した。沈降物をマルチスポットスライドNutacon、LeimuidenTheNetherlands上に広げ、上清をウイルス単離に使用した。乾燥させた後、細胞をアセトン中で1分間、室温で固定した。スライドを洗浄した後、これをインフルエンザA及びB、hRSV及びhPIV1~3などのウイルスに特異的な市販のFITC標識抗血清Dako、GlostrupDenmarkと共に15分間37°Cでインキュベートした。PBSで3回、水道水で1回洗浄した後、スライドをグリセロール/PBS溶液Citifluor、UKO、CanterburyUKに浸して覆った。その後、Axioscop蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析した。7.2実施例10:MPVのウイルス培養物宿主由来の培養試料中におけるウイルスの検出は、宿主が現在かつ/又は過去にウイルスに曝された又は感染していたことの直接の指標である。第1継代の後にCPEを示した試料を用いて、24ウェルプレート中の培地中にサブコンフルエントな状態のtMK細胞の単層に接種した。培養物を毎日CPEについて検査し、培地を週に1回交換した。CPEが各分離株で異なっていたので、すべての培養物を、新しいウイルス分離体に対するフェレット抗体を用いた間接IFAで、12~14日目に試験した。陽性の培養物を3回凍結-解凍し、その後、低速遠心によって上清を清浄にし、一定量に分割し、-70°Cで凍結保存した。記載のように、培養物上清中のウイルスの50組織培養物感染用量TCID50を決定したLennetteDA他、DIAGNOSTICPROCEDURESFORVIRALRICKETTSIALANDCHLAMYDIALINFECTIONS、第7版、、325、37138、431463、481494、539563、。7.3実施例11:間接免疫蛍光アッセイIFAによる抗原検出感染細胞又は組織中のウイルスタンパク質を可視化するために抗体を使用することができる。間接免疫蛍光アッセイIFAとは、蛍光指標にカップリングさせた第2の抗体がウイルスに特異的な抗体上の共通のエピトープを認識する感受性のある手法である。IFAは、その感度のレベルが高いのでDIFよりも有利である。間接IFAを行うために、採取した検体を5mlのダルベッコMEM培地BioWhittaker、WalkersvilleMDで希釈し、ボルテックスミキサーで1分間、よく攪拌した。その後、懸濁液を10分間、840×gで遠心した。沈降物をマルチスポットスライド上に広げた。乾燥させた後、細胞をアセトン中で1分間、室温で固定した。あるいは、ガラス製スライドを含む24ウェルスライド中のtMK細胞でウイルスを培養した。これらのガラス製スライドをPBSで洗浄し、アセトン中で1分間、室温で固定した。2種類の間接IFAを行った。第1の間接IFAでは、感染tMK細胞を含むスライドをPBSで洗浄し、その後、ウイルス特異的抗血清と共に30分間、37°Cでインキュベートした。インフルエンザA、B及びC、1~3型hPIV、並びにhRSVに対するモノクローナル抗体を使用した。4型hPIV、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、5型サルウイルス、及びニューカッスル病ウイルスでは、ポリクローナル抗体RIVM並びにフェレット及びモルモットの参照血清を使用した。PBSで3回、水道水で1回洗浄した後、スライドを第1のインキュベーションで使用した血清に対する二次抗体で染色した。ポリクローナル抗血清の二次抗体は、ヤギ抗フェレットKPL、GuilfordUK、40倍希釈、マウス抗ウサギDako、GlostrupDenmark、20倍希釈、ウサギ抗ニワトリKPL、20倍希釈液及びマウス抗モルモットDako、20倍希釈であった。第2のIFAでは、PBSで洗浄した後、スライドを30分間、37°CでPBS中で1:50~1:100の希釈率の20種のポリクローナル抗体と共にインキュベートした。ポリクローナル抗体を得るために免疫したフェレット及びモルモットを使用したが、これらの抗体は様々な動物で産生させることができ、ポリクローナル抗体の作業希釈率はそれぞれの免疫で変動し得る。PBSで3回、水道水で1回洗浄した後、スライドを37°Cで30分間、FITC標識のヤギ抗フェレット抗体KPL、GuilfordUK、40倍希釈と共にインキュベートした。PBSで3回、水道水で1回洗浄した後、スライドをグリセロール/PBS溶液Citifluor、UKO、CanterburyUKに浸して覆った。Axioscop蛍光顕微鏡CarlZeissBV、WeesptheNetherlandsを用いてスライドを分析した。7.4実施例12:赤血球凝集アッセイ、クロロホルム感受性試験及び電子顕微鏡観察ウイルスの検出には、ウイルスの様々な特徴を利用することができる。たとえば、多くのウイルスが赤血球に結合することができるタンパク質を含み、これにより格子が生じる。この特性は赤血球凝集と呼ばれ、ウイルスを検出するための赤血球凝集アッセイで使用することができる。電子顕微鏡EMの下でウイルスを可視化することもでき、またPCR技法によって検出することもできる。赤血球凝集アッセイ及びクロロホルム感受性試験は、記載のように行ったOsterhaus他、1985、ArchofVirol、8623925Rothbarth他、JofVirolMethods、78163169。EM分析では、4°C、17000×gの微量遠心で感染細胞の培養物上清からウイルスを濃縮し、その後、ペレットをPBSに再懸濁させて陰性造影EMで検査した。7.5実施例13:IgG、IgA及びIgMクラスのhMPV/AVP抗体の検出感染/病気中には、ウイルスに対する特異的抗体が産生される。したがって、宿主におけるウイルスに特異的な抗体の検出は、宿主が現在かつ/又は過去にそのウイルスに感染していたことの指標となる。hMPV抗体のIgGクラスを検出するために、間接酵素免疫アッセイEIAを用いた。このアッセイは、基本的にRothbarth他、1999、JofVirMethods、78163169に既に記載されているとおりに、マイクロタイタープレート中で行った。簡単に説明すると、1のトリトンX-100で処理することによって濃縮したhMPVを可溶化した。交差力価測定によって至適作業希釈率を決定した後、これをPBS中で、室温で16時間、マイクロタイタープレートにコーティングした。次いで、EIA緩衝液で1:100に希釈した100ul体積のヒト血清試料をウェルに加え、1時間、37°Cでインキュベートした。ヒトIgGの結合は、ヤギ抗ヒトIgGペルオキシダーゼコンジュゲートBiosource、USAを加え、TMBを基質として加え、プレートを展開しsubstratedevelopedplate、450nmで吸光度ODを測定することによって検出した。結果は、ODのSシグナル/N陰性比として表した。S/N比が陰性対照基準物質の3倍であった場合に、血清がIgGについて陽性であるとみなした。IgM及びIgAクラスのhMPV抗体は、基本的にRothbarth他、1999、JVirMethods、78163169に既に記載されているとおりに、捕捉EIAによって血清中で検出した。IgA及びIgMの検出には、抗ヒトIgM又はIgA特異的モノクローナル抗体でコーティングされた市販のマイクロタイタープレートを使用した。血清を1:100に希釈した。1時間37°Cインキュベートした後、至適作業希釈率のhMPVを各ウェルに加え100μl、1時間37°Cでインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼで標識したポリクローナル抗hMPV抗体を加え、プレートを1時間37°Cでインキュベートした。TMBを基質として加え、プレートを展開し、450rimでODを測定した。結果は、ODのSシグナル/N陰性比として表した。S/N比が陰性対照基準物質の3倍であった場合に、IgGについて陽性の結果とした。AVP抗体をAVP阻害アッセイで検出した。APV阻害試験のプロトコルは、SVANOVABiotechAB、UppsalaScienceParkGluntenSE75183UppsalaSweden製造のAPV-AbSVANOVIR登録商標酵素免疫アッセイに含まれている。結果は、ODのSシグナル/N陰性比として表した。S/N比が陰性対照基準物質の3倍であった場合に、血清がIgGについて陽性であるとみなした。7.6実施例14:ELISAによるヒト、哺乳動物、反芻動物又は他の動物内の抗体の検出ウイルスに特異的な抗体の検出には、MPVを感染させたtMK細胞を上述のようにアセトンでカバーガラス上に固定し、PBSで洗浄し、1~16の希釈率の血清試料と共に30分間37°Cでインキュベートした。PBSで2回、水道水で1回洗浄した後、スライドを37°Cで30分間、FITC標識の使用した種に対する二次抗体Dakoと共にインキュベートした。上述のようにスライドを処理した。抗体を蛍光色素で直接標識することができ、これにより直接免疫蛍光アッセイがもたらされる。FITCを任意の蛍光色素で置き換えることができる。7.7実施例15:ELISAによるヒト、哺乳動物、反芻動物又は他の動物内の抗体の検出パラミクソウイルス科ではNタンパク質が最も豊富なタンパク質であり、このタンパク質に対する免疫応答が感染の初期に起こる。そのため、MPVに対する抗体を検出するためのELISAアッセイを開発するためにNタンパク質の組換え源を使用することが好ましい。抗体の検出に適した抗原には、MPVウイルスに曝された又はそれに感染した患者の任意のMPV特異的抗体と結合する、任意のMPVタンパク質が含まれる。本発明の好ましい抗原には、MPVに曝された患者において免疫応答を優先的に引き起こし、したがって典型的には患者の抗体によって最も容易に認識されるものが含まれる。特に好ましい抗原には、MPVのN、F、M及びGタンパク質が含まれる。免疫学的技法に用いられる抗原は、未改変抗原であっても、それを改変した形であってもよい。分子生物学における周知の技術を用いてMPV抗原のアミノ酸配列を変化させ、免疫学的技法で使用し得る改変した形の抗原を生成することができる。遺伝子をクローニングする方法、遺伝子を発現ベクター内へ及び発現ベクターから外へ操作する方法、並びにその遺伝子にコードされているタンパク質を異種製宿主中で発現させる方法は周知であり、このような技術を使用して、発現ベクター、宿主細胞、及び診断的アッセイで使用するための組換え抗原を産生させるために抗原をコードしているクローニングした遺伝子を宿主内で発現させる方法を提供することができる。たとえばMOLECULARCLONINGALABORATORYMANUALANDCURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY参照。MPV抗原を産生させるために様々な発現系を使用し得る。たとえば、大腸菌、枯草菌、酵母菌、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞中でタンパク質を産生させるのに適した様々な発現ベクターが記載されており、これらのうち任意のものを使用して、曝露した患者で抗MPV抗体を検出するのに適したMPV抗原を産生させ得る。バキュロウイルス発現系はタンパク質の必要なプロセシングを提供するという利点を有しているので、これが好ましい。この系は、MPV抗原の発現を指揮するためにポリヘドリンプロモーターを利用するMatsuura他、1987、JGenVirol、6812331250。組換えバキュロウイルスによって産生させた抗原は、患者において抗MPV抗体を検出するために様々な免疫学的アッセイで使用することができる。ウイルス特異的抗体を検出する実質的にどの免疫学的アッセイにおいても天然ウイルスの代わりに組換え抗原を使用することができることは、確立されている。アッセイには、直接及び間接アッセイ、サンドイッチアッセイ、とりわけプレートやビーズを使用するものなどの固相アッセイ、及び液相アッセイが含まれる。適切なアッセイには、一次抗体及び二次抗体を使用するもの、並びにプロテインAなどの抗体結合試薬を使用するものが含まれる。さらに、本発明では比色法、蛍光法、リン光法、化学発光法、発光法、及び放射能法を含めた様々な検出方法を使用することができる。たとえば、組換えNタンパク質昆虫Sf9細胞中で組換えバキュロウイルスを用いて産生したを抗原として用いる間接IgGEIAを行うことができる。抗原の調製には、Sf9細胞を組換えバキュロウイルスに感染させ、感染後3~7日目に採取する。細胞懸濁液をPBS、pH7.2で2回洗浄し、5.0×106個の細胞/mlの細胞密度に調節し、3回凍結-解凍する。大きな細胞細片を低速遠心500×g、15分間によってペレット化し、上清を収集し、使用時まで-70°Cで保存する。陰性対照の抗原には、未感染の細胞を同様に処理する。抗原を調製した後、100μlの凍結-解凍した溶菌液を用いて、1:50~1:1000の範囲の希釈率でマイクロタイタープレートをコーティングする。未感染細胞の溶菌液を2つ組のウェルで流し、これは陰性対照として役割を果たす。終夜インキュベートした後、プレートをPBS/0.05Tweenで2回洗浄する。試験血清をELISA緩衝液2の正常ヤギ血清、並びに0.5のウシ血清アルブミン及び0.1の乳を添加したPBSで1:50~1:200に希釈し、次いでウェル内で1時間、37°Cでインキュベートする。プレートをPBS/0.05Tweenで2回洗浄する。ELISA緩衝液で1:3000~1:5000に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒト又は他の種に対するものIgGをウェルに加え、1時間37°Cでインキュベートする。その後、プレートをPBS/0.05Tweenで2回、水道水で1回洗浄し、Sigmaから入手したものなど酵素基質TMB、すなわち3,3’,5,5’テトラメチルベンジジンと共に室温で15分間インキュベートし、100μlの2Mリン酸で反応を停止させる。自動マイクロタイタープレート読取機を用いて450nmの比色値を測定する。7.8実施例16:ウイルス中和アッセイ被験体がウイルスに感染すると、そのウイルスに対する抗体のアレイが産生させる。これらの抗体の一部はウイルス粒子に結合してその感染力を中和することができる。ウイルス中和アッセイVNは通常、血清又はモノクローナル抗体の希釈液をウイルスと混合し、これをインキュベートし、培養細胞、孵化卵、又は動物を用いて残存感染力をアッセイすることによって実施する。中和抗体はウイルス粒子上の型特異的な抗原ウイルス粒子を定義するために使用することができる。たとえば、ウイルスの血清型を定義するために中和抗体を使用することができる。さらに、幅広く中和する抗体も存在し得る。8倍希釈から開始して、ヒト及び動物の血清の連続2倍希釈液を用いてVNアッセイを行った。希釈した血清を100TCID50のウイルスと共に1時間インキュベートした後、96ウェルプレート中で増殖させたtMK細胞に接種し、その後、プレートを840×gで遠心した。3~6日後に培地を交換し、接種後8日目にMPVに対するFTIC標識のフェレット抗体でIFAを実施した。VN力価は、細胞培養物において陰性IFA及びCPEの阻害をもたらす血清試料の最も低い希釈率として定義した。7.9実施例17:RNAの単離宿主におけるウイルスの存在は、宿主から採取した試料中でウイルス核酸を検出することによっても診断することができるたとえば実施例18のRT-PCR及び実施例21のRAP-PCR参照。RNAは、感染細胞培養物の上清から、又はスクロース勾配分画からHighPureRNA単離キットRocheDiagnostics、AhnereTheNetherlandsを用いて、製造者の指示に従って単離した。RNAはまた、当分野で知られている他の手順に従っても単離することができるたとえば、CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY、第13巻、AusubelFM他偏、JohnWileyandsonsInc、USA出版参照。7.10実施例18:MPVを検出/診断するためのRT-PCR生物学的サンプル中のウイルスの検出は、ウイルスのゲノム物質を複製又は増幅する方法を用いて行うことができる。既知のパラミクソウイルスにおけるRT-PCRアッセイのためのウイルスに特異的なオリゴヌクレオチド配列を本実施例中で以下に記載する。50mMのTris.HClpH8.5、50mMのNaCl、4mMのMgCl2、2mMのジチオトレイトール、200μMずつの各dNTP、10単位の組換えRNAsinPromega、LeidentheNetherlands、10単位のAMVRTPromega、LeidentheNetherlands、5単位のAmplitaqGoldDNAポリメラーゼPEBiosystems、NieuwerkerkaandeIjsselTheNetherlands、及び5μlのRNAを含む50μlの反応液中で、1ステップのRT-PCRを行った。サイクル条件は、42°Cで45分間及び95°Cで7分間を1回、95°Cで1分間、42°Cで2分間、及び72°Cで3分間を40回繰り返し、72°Cで10分間を1回である。プライマーの配列は配列表で提供する。より具体的には、核タンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号28及び29に対応するヌクレオチド配列を有するN3及びN4であり、これらを用いて151個のヌクレオチドの断片を増幅した。マトリックスタンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号30及び31に対応するヌクレオチド配列を有するM3及びM4であり、これらを用いて252個のヌクレオチドの断片を増幅した。ポリメラーゼタンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号34及び35に対応するヌクレオチド配列を有するL6及びL7であり、これらを用いて173個のヌクレオチドの断片を増幅した。Fタンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号32及び33に対応するヌクレオチド配列を有するF7及びF8であり、これらを用いて221個のヌクレオチドの断片を増幅した。さらに、プローブを用いてhMPVゲノム配列が存在することを確認した。M遺伝子の検出に用いたプローブは、配列番号36に対応するヌクレオチド配列を有していた。N遺伝子の検出に用いたプローブは、配列番号37に対応するヌクレオチド配列を有していた。L遺伝子の検出に用いたプローブは、配列番号38に対応するヌクレオチド配列を有していた。別の例では、既知の、又は配列決定によって得られたMPV配列に基づいてプライマー及びプローブを設計することができる。同様に、プライマーの様々な配列並びに特定の目的で使用するための様々な緩衝液及びアッセイ条件は、当業者には知られているであろう。既知のパラミクソウイルスの検出にもRT-PCRを使用した。hPIV-1~4、流行性耳下腺炎、麻疹、ツプシアTupsia、マプエラ、及びヘンドラのプライマーを、入手可能な配列のアラインメントに基づいて所内で開発した。ニューカッスル病ウイルスのプライマーはSealJJ他、ClinMicrob、26242630、1995から得た。ニパ及び一般パラミクソウイルスのPCRのプライマーはChua他、2000、Science、288から得た。他の既知のパラミクソウイルスの検出に使用したプライマーは以下のとおりである。hPIV-1は配列番号58及び59の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、hPIV-2は配列番号60及び61の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、hPIV-3は配列番号62及び63の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、hPIV-4は配列番号64及び65の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、流行性耳下腺炎は配列番号66及び67の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、NDVは配列番号68及び69の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、ツパイは配列番号70及び71の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、マプエラは配列番号72及び73の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、ヘンドラは配列番号74及び75の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、ニパは配列番号76及び77の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、HRSVは配列番号78及び79の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、麻疹は配列番号80及び81の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出し、一般パラミクソウイルス科は配列番号82及び83の配列に対応するプライマーそれぞれフォワード及びリバースプライマーで検出した。7.11実施例19:PCRを使用したhMPVの検出サンプル中のhMPVの存在を検出するために、迅速かつ単純なPCRベースのアッセイを開発した。hMPVのL配列及びN配列を標的とした標準通りのRT-PCR分析を、以下のプライマーセット、すなわち、L-フォワード5’CACCCCAGTCTTTCTTGAAA3’及びL-リバース5’CATGCCCACTATAAAAGGTCAG3’、並びに、プライマー、N-フォワード5’CATGCTATATTAAAAGAGTCTC3’及びN-リバース5’TCTGCAGCATATTTGTAATCA3’を用いて実施した。反応混合物全容積50μlは、RNA5μl、各プライマー200nM、AmpliTaqGold緩衝液AppliedBiosystemsNieuwerkerkadIJsselTheNetherlands、dNTP600μM、DTT2μM、MgCl22mM、RNAsin20U、Taqポリメラーゼ5U、及びAMV逆転写酵素10U全ての酵素はPromega社から購入した。RT-PCRのパラメータは、42°Cで60分、そして95°Cで7分、続いて、95°Cで1分と、45°Cで2分と、72°Cで3分とを40サイクルであった。全ての新規DNA鎖の伸長が確実に完了するように、72°Cで10分の最終インキュベーションを含めた。PCR産物の検出は、PCR反応試料10μlをHybondN膜AmershamPharmaciabiotechに転写し、続いて、ビオチン標識されたプローブ両方のアッセイに、それぞれ、N-プローブ5’ACAACTGCAGTGACACCTTCATCATTGCA3’及びL-プローブ5’CTGTTAATATCCCACACCAGTGGCATGC3’をハイブリダイズさせることによって行った。次に、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体をプローブに結合させ、ECL検出試薬AmershamPharmaciabiotechを添加した。DNA断片は、ブロットをエックス線フィルムに曝露することによって可視化した図58。これらの結果は、N配列又はL配列のいずれかに対する1セットのオリゴヌクレオチドを使用することによって、このRT-PCRベースのアッセイを用いて、4つのクレード全てのMPV株を検出できることを実証するものである。7.12実施例20:ヒトメタニューモウイルスの4つのサブタイプ全てを検出する単一アッセイの開発全てのhMPVサブタイプ、すなわちA1、A2、B1、及びB2の検出を可能にするため、感度のよい単一アッセイを開発した。このアッセイは、様々なサブタイプのhMPV株の検出を、一定のセットの診断用設備と試薬とを使用して行うことを可能にしたので有利であった。この新規でかつ感度のよいTaqmanアッセイは、4つのサブタイプ全てに対して等しく感度がよいと判定された。2セットのTaqmanプライマー及びプローブは、53株の臨床分離株から得られたhMPVヌクレオキャプシド遺伝子の配列情報に基づいて、hMPVの4つのサブクレードsubclade全てを同定するように設計した。4つのhMPVサブタイプ全てが、分離株のこのパネル中に存在していた。選択されたプライマー及びプローブは、全てのサブタイプで最もよく保存されている配列中に位置するものであった。アッセイ用に設計されたTaqmanプライマーは、Medi-N-フォワード5’CAACAACATAATGCTAGGACATGTATC3’及びMedi-N-リバース5’CCGAGAACAACACTAGCAAAGTTG3’であり、プローブは、Medi-N-プローブ5’FAMTGGTGCGAGAAATGGGTCCTGAATCTGGTAMRA3’であった。NL-Nアッセイ用に設計されたプライマーは、RF9305’CATATAAGCATGCTATATTAAAAGAGTCTC3’及びRF9315’CCTATTTCTGCAGCATATTTGTAATCAG3’であり、プローブはRF9285’FAMTGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTGTAMRA3’であったが、配列中、Yは、C又はT残基のいずれかである。HMPV分離株は、冷凍の診断用鼻咽腔試料から得た。ウイルスは、tMK細胞で増殖させて、-70°Cで保存した。設計したプライマー及びプローブを試験するために、全ての臨床hMPV分離株の中から、プロトタイプ分離株として、各サブタイプあたり1株の4株を選択した。これらのプロトタイプウイルスの完全な配列は、GenBankデータベースから入手することができる。すなわち、hMPVサブタイプA1のプロトタイプウイルス株NL/01/00;アクセッション番号AF371337、A2のプロトタイプウイルス株NL/17/00;申請中、B1のプロトタイプウイルス株NL/99101;申請中、及びB2のプロトタイプウイルス株NL/94/01;申請中である。ウイルスゲノムのコピー数を定量することができるように、標準曲線を作成するためにRNAランオフ転写産物を生成させた。hMPVA1プロトタイプウイルスのN配列は、改変pCITEベクター中に、T7プロモーターの制御下となるようにクローニングした。ランオフ転写産物は、製造者の指示に従って、リボプローブシステム-T7システムPromegaを使用して生成させた。RNAランオフ転写産物の純度は、ゲル電気泳動によって検査し、分光計でA260を測定することによって定量した。RNAは、製造者の指示に従って、HighPureRNA単離キットRocheDiagnostics、AlmereTheNetherlandsを用いて単離した。RNAの単離には、0.2mlのサンプルを使用した。カラムへの結合、DNアーゼI消化、及び洗浄を行った後、ヌクレアーゼ不含の再蒸留水50μlにRNAを溶出させた。cDNAの生成は、最終容積20μl中に5μlのRNAサンプルを使用し、特異的なプライマーを用い、製造者の指示に従ってsuperscriptIII逆転写酵素酵素Invitrogenを使用して行った。リアルタイムPCTの各反応には、5μlアリコートのcDNAを使用した。ウイルスRNAの検出は、RTステップを別々に行い、製造者の指示に従ってTaqmanユニバーサルPCRマスター混和物AppliedBiosystems、NieuwerkerkadIJesselTheNetherlandsを使用して行った。ワンステップ反応には、EZRT-PCRキットAppliedBiosystemsを使用した。増幅及び検出は、ABIPrism7000TaqmanマシーンAppliedBiosystemsで行った。各反応混合物は、フォワードプライマーRF930500nm、リバースプライマーRF931250nm、及び、5’末端をFAM6-カルボキシ-フルオレセインで、そして3’末端をTAMRA6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミンで標識されたエンドヌクレアーゼプローブRF928500nMを含有していた。増幅パラメータは、95°Cで5分間の変性/活性化、そして、95°Cで30秒と、60°Cで1分とを45サイクルであった。ワンステップ反応では、これらのサイクル条件に先行して、RTステップとして、50°Cで2分そして60°Cで30分を行った。hMPVの4つのサブクレード全てを検出するように、2セットのプライマー及びプローブMedi-Nアッセイ用及びNL-Nアッセイ用を設計した。プライマー及びプローブは、hMPVのヌクレオキャプシド遺伝子中で最も保存されている配列を標的にして、hMPVの4つのサブクレード全てとハイブリダイズするように設計した。4つのプロトタイプhMPVウイルスの標的配列を検出する感度に関して、両アッセイを試験した。プロトタイプウイルス株のN配列からのランオフ転写産物を、両アッセイの感度を決定するのに使用した。両アッセイMedi-N及びNL-N相互の比較によって、両アッセイとも、hMPVの4つのサブクレード全てからの標的配列を検出できることが明らかになった。ランオフ転写産物及びウイルス分離株の連続希釈は、A1及びA2プロトタイプウイルス株の標的配列を検出する際に、NL-Nアッセイがより高い感度を有することを示した。したがって、その後の開発及び試験には、NL-Nアッセイを選択した。NL-Nアッセイ用に設計したプライマー及びプローブがhMPVに特異的であるかどうかを試験するために、他の15の一般的な呼吸器ウイルス物質から得た鋳型RNAをリアルタイムRT-PCR分析に使用した。これらの鋳型は、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎、SV5、NDV、RSVA及びB、APV-A、B、及びC、HPIV-1、2、3、及び4、並びにインフルエンザウイルスA及びBからのRNAを含めたウイルスストックから単離した。陽性対照試料は、hMPVA1RNA鋳型であった。hMPV以外のウイルスストックから単離されたRNA鋳型は、いずれも陽性シグナルを与えず、これによって、設計したプライマー及びプローブがhMPVに特異的であることが確認された。最適の増幅シグナルを得るために、様々な量のフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブを試験した。予備実験は、リバースプライマーRF931との比較においてフォワードプライマーRF930の量を2倍にした非対称の混合物によって、最も感度のよい反応混合物が得られることを明らかにした。発明者らのアッセイの感度を決定するために、hMPVの4つのプロトタイプウイルス全てから得たウイルスRNAの連続希釈を試験した。hMPVA1及びB1のプロトタイプ株からの連続希釈は104の希釈まで陽性の結果を与え、hMPVA2及びB2プロトタイプ株からの、力価がより高いウイルスストックからのRNAは、105倍まで希釈することができた図59A。このアッセイは、4つのプロトタイプウイルス全てに対して等しく感度がよいことが立証されており、検出限界は、hMPVA2プロトタイプウイルスに対してTCID50が少なくとも0.006、そして、他のプロトタイプウイルスに対しては、TCID50が0.01であった。標準物質として、hMPVA1N配列からのRNAランオフ転写産物を生成した。これらのRNA転写物を定量し、連続希釈を作製したころ、最少ではRNA5コピーでも、発明者らのTaqmanRT-PCRアッセイで陽性シグナルが得られた図59B。発明者らの新規のRT-PCRアッセイ用のプライマー及びプローブは、4つのhMPVサブタイプ全てからのN遺伝子の配列に基づいたものである。しかし、以前に記載されているアッセイは、hMPVのN配列MacKay他、JClinMicrobiol41100~105又はL配列VanDenHoogen、2003、印刷中を標的とするが、hMPVA1プロトタイプウイルスの配列のみに基づいたプライマーを使用するものであった。試験した様々なプライマー/プローブセットに関する、4つのプロトタイプhMPV株におけるオリゴヌクレオチドアニーリング部位のエントロピープロットを図59Cに示す。これらのアッセイがhMPVの4つのサブタイプ全てを検出できるかどうか決定するために、それらを試験した。プロトタイプウイルスのRNA連続希釈におけるこれらのアッセイの結果は、NL-Nアッセイより低い感度ではあるが、それらがhMPVAウイルスを検出し、しかしBクレードからのウイルスは検出しないことを示した図59D。7.13実施例21:RAP-PCRMPV又は他のウイルスの遺伝物質は、ゲノム内の領域にハイブリダイズし、遺伝物質が増幅されるように特定の方向に伸張するプライマーを用いて検出又は増幅することができる。この種の技法は、特定の配列情報が入手不可であるか、また遺伝物質の最初の増幅を試料中で行う場合に有用である。このような技法の1つはRAP-PCRと呼ばれている。RAP-PCRは、基本的に記載されているとおりに行ったWelsh他、1992、NAR、2049654970。RT反応には、10ng/μlのオリゴヌクレオチド、10mMのジチオトレイトール、それぞれ500μmずつの各dNTP、25mMのTris-HClpH8.3、75mMのKCl及び3mMのMgCl2を含む10μlの反応液中で、2μlのRNAを使用した。反応混合液を70°Cで5分間及び37°Cで5分間インキュベートし、その後、200単位のSuperscriptRT酵素LifeTechnologiesを加えた。37°Cでインキュベーションを55分間続け、72°Cで5分間インキュベートすることによって反応を停止させた。RT混合液を希釈して、8ng/μlのオリゴヌクレオチド、それぞれ300μlずつの各dNTP、15mMのTris-HClpH8.3、65mMのKCl、3.0mMのMgCL2及び5単位のTaqDNAポリメラーゼFEBiosystemsを含む50μlのPCR反応液を得た。サイクル条件は、94°Cで5分間40°Cで5分間、及び72°Cで1分間を1回、次いで94°Cで1分間及び56°Cで2分間を40回繰り返し、72°Cで5分間を1回であった。RAP-PCRに使用したプライマーは以下のとおりである。配列番号46に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーZF1、配列番号47に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーZF4、配列番号48に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーZF7、配列番号49に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーZF10、配列番号50に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーZF13、配列番号51に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーZF16、配列番号52に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーCS1、配列番号53に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーCS4、配列番号54に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーCS7、配列番号55に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーCS10、配列番号56に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーCS13、及び配列番号57に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーCS16である。生成物は、3のNuSieveアガロースゲルFMCBioProducts、HeerhugowaardTheNetherlandsに隣り合わせて流した。Qiaquickゲル抽出キットQiagen、LeusdenTheNetherlandsを用いてMPVに特異的な示差的に表れた断片をゲルから精製し、pCR2.1ベクターInvitrogen、GroningenTheNetherlands内に、製造者の指示に従ってクローニングした。20個の断片の精製及び配列決定に成功した。10個の断片でAPVに対する配列相同性が見つかった。すなわち、ZF7プライマーを用いて単離した断片1ではN遺伝子に相同性を有する335bpの断片が得られ、ZF10プライマーを用いて単離した断片2ではN遺伝子に相同性を有する235bpの断片が得られ、ZF10プライマーを用いて単離した断片3ではM遺伝子に相同性を有する800bpの断片が得られ、CS1プライマーを用いて単離した断片4ではF遺伝子に相同性を有する1250bpの断片が得られ、CS10プライマーを用いて単離した断片5ではF遺伝子に相同性を有する400bpの断片が得られ、CS13プライマーを用いて単離した断片6ではF遺伝子に相同性を有する1450bpの断片が得られ、CS13プライマーを用いて単離した断片7ではF遺伝子に相同性を有する750bpの断片が得られ、ZF4プライマーを用いて単離した断片8ではL遺伝子に相同性を有するタンパク質レベル780bpの断片が得られ、ZF10プライマーを用いて単離した断片9ではL遺伝子に相同性を有するタンパク質レベル330bpの断片が得られ、ZF10プライマーを用いて単離した断片10ではL遺伝子に相同性を有するタンパク質レベル250bpの断片が得られた。遺伝子の発現のレベルを測定するためにTaqManアッセイを使用することができる。L遺伝子及びN遺伝子の発現を検査するためにTaqManアッセイを適合させた。これらのアッセイで使用したプライマーはhMPVグループのいずれか1つに特異的である必要はないが、以下に例を示す。反応は、50μlの全反応体積中、500nM濃度のフォワードプライマー、250nM濃度のリバースプライマー、250nM濃度のオリゴヌクレオチドプローブ、25μlのユニバーサルPCRマスターミックスABIから入手可能、及び5μlのcDNAで実施した。サイクル条件はABI7000配列検出システムで、95°Cで10分間の第1ステップ、次いで95°Cで30秒間及び60°Cで60秒間からなる45サイクルの第2ステップであった。TaqManアッセイで使用するhMPVのN遺伝子のプライマーの他の例は以下のとおりである。すべてサブグループA1である分離株NL/1/00、BI/1/01、FI/4/01、NL/8/01、及びFI/2/01では、配列番号39のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループA1の分離株NL/30/01では、配列番号40のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループA2の分離株NL/22/01及びNL/23/01では、配列番号41のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループA2の分離株NL/17/01では、配列番号42のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループA2の分離株NL/17/01では、配列番号43のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループB1の分離株NL/1/99、NL/5/01、NL/21/01及びNL/9/01では、配列番号44のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループB1の分離株FI/1/01及びFI/10/01では、配列番号45のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループA1で使用することができる潜在的なプローブは配列番号390に対応し、サブグループB1で使用することができるプローブは配列番号391に対応し、サブグループB2で使用することができるプローブは配列番号392に対応する。7.14実施例22:RAP-PCR産物の配列分析RAP-PCRを用いてセグメントを増幅した後、増幅したセグメントについて配列情報を得ることができる。これを行うためには、配列決定の前に作製した断片をベクター内にクローニングすることが有利である。ベクターpCR2.1Invitrogen内にクローニングしたRAP-PCR産物をM13特異的オリゴヌクレオチドを用いて配列決定した。Qiaquickゲル抽出キットQiagen、LeusdenTheNetherlandsを用いてRT-PCRによって得たDNA断片をアガロースゲルから精製し、PCRで使用したものと同じオリゴヌクレオチドを用いて直接配列決定した。配列分析は、DyenamicETターミネーター配列決定キットAmershamPharmaciaBiotech、RoosendaalTheNetherlands及びABI373自動DNA配列決定装置PEBiosystemを用いて行った。すべての技法は、製造者の指示に従って行った。7.15実施例23:RT-PCRによるゲノム断片の作製RAP-PCR法は配列中に、増幅又は複製されていないギャップを残す場合がある。完全な配列を得るために、RT-PCRを用いてギャップの配列情報を得ることができる。RAP-PCR断片の間のギャップA、B及びCを含むPCR断片を作製するために図3、ウイルス分離株00-1から単離したRNA試料について既に記載したようにRT-PCRアッセイを使用した。断片Aを作製するために以下のプライマーを使用した:配列番号22のヌクレオチド配列に対応する、リーダー中に設計されたTR1、及び配列番号23の配列に対応する、Nで得られたRAP-PCR断片の3’末端に設計されたN1。断片Bを作製するために以下のプライマーを使用した:配列番号24のヌクレオチド配列に対応する、Nで得られたRAP-PCR断片の5’末端に設計されたN2、及び配列番号25のヌクレオチド配列に対応する、Mで得られたRAP-PCR断片の3’末端に設計されたM1。断片Cを作製するために以下のプライマーを使用した:配列番号26のヌクレオチド配列に対応する、Mで得られたRAP-PCR断片の5’末端に設計されたM2、及び配列番号27のヌクレオチド配列に対応する、Fで得られたRAP-PCR断片の3’末端に設計されたF1。既に記載のように、電気泳動の後に断片を精製し、クローニングし、配列決定した。7.16実施例24:組換え核タンパク質を用いた捕捉抗MPVIgMEIAhMPVウイルスを検出するために、様々な宿主内で抗体の存在を検出する免疫学的アッセイ。最も豊富に産生されるタンパク質であるので、一例では、Nタンパク質に対する抗体を使用する。この特徴は、ウイルスのゲノムに渡って起こる転写の勾配によるものである。Erdman他、1990、JClinMicrob、2914661471に既に記載されているアッセイを改変することによって、抗原として組換え核タンパク質又は任意の他の組換えタンパク質を使用する捕捉IgMEIAを行うことができる。マイクロタイタープレートのウェルに、Dakoから入手したものなどのアフィニティー精製した抗ヒトIgM捕捉抗体又は他の種に対するものを、0.1Mの炭酸緩衝液pH9.6中で1ウェルあたり250ngの濃度で加えた。室温で終夜インキュベートした後、プレートをPBS/0.05Tweenで2回洗浄する。ELISA緩衝液で1:200~1:1000に希釈した100μlの試験血清を3つ組のウェルに加え、37°Cで1時間インキュベートした。その後、プレートをPBS/0.05Tweenで2回洗浄する。凍結-乾燥した組換えウイルスに感染させたSf21細胞の溶菌液をELISA緩衝液で1:100~1:500に希釈し、ウェルに加え、37°Cで2時間インキュベートした。未感染細胞の溶菌液は陰性対照として役割を果たし、これを2つ組のウェルで流す。その後、プレートをPBS/0.05Tweenで3回洗浄し、ELISA緩衝液で至適希釈率に希釈したMPVに対するポリクローナル抗体100μlと共に、37°Cで1時間インキュベートした。PBS/0.05Tweenで2回洗浄した後、プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の二次抗体ウサギ抗フェレットなどと共にインキュベートし、プレートを37°Cで20分間インキュベートした。その後、プレートをPBS/0.05Tweenで5回洗浄し、たとえばSigmaから入手した酵素基質TMB、すなわち3,3’,5,5’テトラメチルベンジジンと共に室温で15分間インキュベートし、100μlの2Mリン酸で反応を停止させた。自動マイクロタイタープレート読取機を用いて450nmの比色値を測定した。組換え核タンパク質又は他の組換えタンパク質及び全MPVウイルスを用いた捕捉IgMEIAの感度を、臨床MPVウイルス感染を罹患している人由来の急性期及び回復期の血清の対を用いて比較した。組換え核タンパク質捕捉EIAの特異性は、健康な人及び他のパラミクソウイルス感染を罹患している人由来の血清検体を試験することによって決定した。バキュロウイルスでの発現によって産生した組換えMPV融合タンパク質及び糖タンパク質の使用におけるEIAの潜在性。糖タンパク質G及びFはMPVビリオンの2つの膜貫通型エンベロープ糖タンパク質であり、主要な中和及び防御抗原を表す。バキュロウイルス系などのベクターウイルス系におけるこれら糖タンパク質の発現により、MPVに特異的な抗体を検出するアッセイで使用するための組換え抗原源が提供される。さらに、たとえば核タンパク質と組み合わせたそれらの使用により、MPVに対する抗体の検出において酵素免疫アッセイの感度がさらに増強される。様々な他の免疫学的アッセイCurrentProtocolsinImmunology、第13巻、ColiganJE、KruisbeekAM、MarguliesDH、ShevachEM及びStrobeW、JohnWileyandsonsInc、USA出版を、本明細書中に記載した方法の代替方法として使用し得る。ウイルス分離株を見つけるために、鼻咽頭吸引液、咽頭及び鼻スワブ、気管支肺胞洗浄液並びにそれだけには限定されないが好ましくはヒト、食肉動物イヌ、ネコ、アザラシなど、ウマ、反芻動物ウシ、ヒツジ、ヤギなど、ブタ、ウサギ、トリ家禽類、オーストリッジなど由来の咽頭スワブを検査することができる。トリからは、総排泄腔及び腸管スワブ並びに糞も検査することができる。すべての試料で、ウイルスを検出するために血清学的技法抗体及び抗原の検出など、ウイルス単離及び核酸検出の技術を行うことができる。モノクローナル抗体は、マウス又は他の動物を精製MPV又はその一部タンパク質、ペプチドで免疫し、次いで確立されたハイブリドーマ技術CurrentProtocolsinImmunology、JohnWileyandsonsInc、USA出版を使用することによって産生させることができる。あるいは、この目的のためにファージディスプレイ技術を使用することができるCurrentProtocolsinImmunology、JohnWileyandsonsInc、USA出版。同様に、ポリクローナル抗体は、感染したヒト又は動物から、あるいは免疫化したヒト又は動物から得ることができるCurrentProtocolsinImmunology、JohnWileyandsonsInc、USA出版。NS1及びNS2タンパク質が存在すること又は存在しないことの検出は、ウェスタンブロット、IFA、様々な抗体調製物を用いた免疫沈降技術を使用して行うことができる。ウイルス分離株中にNS1及びNS2遺伝子又はその相同体が存在すること又は存在しないことの検出は、既知のNS1及び/又はNS2遺伝子に基づいて設計されたプライマー組を用いたPCR、並びに様々な核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて行うことができる。NS1及びNS2遺伝子がウイルスゲノムの3’末端に存在するかどうかを決定するために、ゲノムのこの3’末端に特異的なプライマーを用いてPCRを行うことができる。本発明の場合、本発明者らはウイルスゲノムの3’非翻訳領域に特異的なプライマー及びNORF中のプライマーを使用した。同じ目的のために他のプライマーを設計し得る。NS1/NS2遺伝子が存在しないことは、PCR産物の長さ及び/又はヌクレオチド配列によって明らかとなる。NS1及び/又はNS2遺伝子に特異的なプライマーを、ウイルスゲノムの3’末端の他の部分非翻訳領域やN、M又はFORFなどに特異的なプライマーと組み合わせて使用して、NS1又はNS2遺伝子が存在することの確実な同定が可能になり得る。PCRに加えて、同じ目的のために分子クローニング、核酸ハイブリダイゼーションなど様々な技術を使用し得る。8.MPV及びMPVの組換え操作のための細胞培養物系及び動物モデル8.1実施例25:様々な細胞系におけるhMPVの増殖各ウイルスの特徴を検査するためにウイルス分離株を様々な細胞系で培養することができる。たとえば、培養物中で測定される力価レベルに基づいて様々なウイルス分離株の感染力を特徴とし、かつ区別することができる。あるいは、さらに分析するために、細胞を使用して培養物中のウイルス株を増殖又は増幅させることができる。一例では、hMPVを増幅するために第3サル腎臓細胞を使用した。しかし、第3サル腎臓細胞は限られた回数しか継代し得ない一次細胞由来であり、かつinvivoで3回継代培養されている。どの種類の不死化細胞系がhMPVウイルスの増殖を高い力価まで支持するかは知られていなかった。Vero、LLC-MK2、HEp-2、及び肺線維芽細胞LF1043細胞などのいくつかのサル細胞系を、それがhMPVウイルスの複製を支持するかどうかを見るために試験した表12。使用したトリプシンは、0.001mg/mlの濃度のTPCK-トリプシンWorthingtonであった。受精した10日齢のニワトリの卵におけるこのウイルスの増殖も試験した。感染した卵は、AF収集の前に2及び3日間37°Cでインキュベートした。ウイルス力価は、10日間35°Cでインキュベートしたトリプシンを含まないVero細胞で、感染細胞の溶菌液のプラークアッセイによって決定し、モルモットhMPV抗血清を用いて免疫染色した。結果は、Vero細胞及びLLC-MK2細胞がhMPVウイルス複製に最も適した基質細胞であり、106~107pfu/mlのウイルスストック力価がもたらされた。この力価はtMK細胞で得られたものと類似していた。0.01mg/mlの濃度でトリプチンを加えても、感知できるほどはウイルス力価は増加しなかった表12。Vero細胞におけるhMPVウイルス増殖のウイルス動力学を調査するために、0.1のMOIを用いて増殖曲線を行った図23。細胞及び細胞上清を24時間毎に収集し、ウイルス力価を定量するためにプラークアッセイによって分析した。結果は、5日目にhMPVのピークに近い力価が観察されたことを示した。8日目に5.4log10pfu/mlの絶対ピーク力価が得られた。ウイルス力価は10日目まで非常に安定していた。細胞上清のみで同時に実施した増殖曲線では、非常に低いウイルス力価しか示されなかった。このデータにより、hMPVの複製は、用いた条件下0.1のMOIでは感染後8日目にピークに達し、またhMPVが概して細胞内RNAウイルスであることが実証された。293細胞のトランスフェクション:293細胞ヒト腎臓上皮細胞をFCS10、L-グルタミン1:100及びPen/Strep1:100を添加したDMEMに入れ、3~4日毎に1:10に分割した。形質転換性を高めるために、細胞がコンフルエントになるまで増殖させないよう注意を払った。細胞はあまり接着性がなかった。これらをプラスチックの表面から放出させるためには、通常トリプシン-EDTA中で非常に短い2分間以下間インキュベーションすることで十分である。トリプシン処理のすぐ後に細胞を培地で希釈した。トランスフェクションの前日に細胞を分割した。トランスフェクションの際、細胞は約50~75コンフルエントであった。トランスフェクション手順の間中、細胞が脱離するのを防ぐためにゼラチン化したプラスチック製器具を使用した。プレート又はフラスコを0.1のゼラチン2ストックの1:20希釈で10分間覆い、PBSで1回洗浄した。正しい細胞密度を得るために、細胞は、T75フラスコ又は100mmプレートあたり1×107個の細胞10ml中、あるいは6ウェルプレートの1ウェルあたり1×106個の細胞2ml中の濃度で使用した。トランスフェクションは最低7時間続けたが、終夜かけてトランスフェクションを行わせることが好ましい。滅菌チューブ内で以下を合わせ、簡単に混合した:30mgのDNA及び62mlの2MCaCl2並びにH2Oを500mlまでT75、又は3mgのDNA及び6.2mlの2MCaCl2並びにH2Oを50mlまで6ウェルプレート。500又は50mlの2×HBSの添加は滴下によって行い、沈殿物が形成されるまで溶液を5分間混合した。穏やかな対処方法を使用した、すなわち、ボルテックスは適用しなかった。古い培地を新しい事前に温めた培地と交換したT75フラスコあたり10ml又は6ウェルプレートの1ウェルあたり1ml。ギルソンピペットでチューブに気泡を通すことによってDNAを注意深く混合し、細胞を覆っている培地に沈殿物を滴下した。37°CのCO2雰囲気下で細胞をインキュベートした。細胞は小さな斑点に覆われているように見えた沈殿物。トランスフェクション培地を細胞から除去し、細胞PBSで丁寧に洗浄し、その後、新しい培地で入れ替えた。細胞は、必要になるまで、通常は8~24時間の間、37°CのCO2雰囲気下でインキュベートした。8.18のNaCl、5.94のHepes及び0.2のNa2HPO4すべてw/vを用いてHBSの10×ストックを調製した。溶液を濾過滅菌し、4°Cで保存した。10×ストックをH2Oで希釈し、1MのNaOHでpHを7.12に調節することによって、2×溶液を調製した。溶液は一定分量ずつ-20°Cで保存した。溶液のpHを正確に滴定するよう注意を払った。pHは、溶液をトランスフェクションに用いる直前に調節した。8.2実施例26:MPVのミニレプリコン構築体ミニレプリコン構築体を、アンチセンスレポーター遺伝子を含むように作製することができる。ミニレプリコンの例であるCAT-hMPVを図24に示す。ミニレプリコン構築体の作製に使用したリーダー配列及びトレーラー配列を図26に示す。比較のために、APV、RSV及びPIV3のリーダー配列及びトレーラー配列のアラインメントも図26に示す。2種類のミニレプリコン構築体を試験した。一方はリーダー末端に末端AC残基を有しLeAC、他方はリーダー末端に末端AC残基を有さないLe-AC。2種類の構築体は、いずれもこのアッセイで機能的であった図25。図25から、24時間後と比べて48時間後にはるかに高いCAT発現が起こったことが見られる。48時間後では、トランスフェクションした細胞500,000個あたり約14ngのCATが観察された。この実験は、完全にプラスミドによって駆動されていた。レプリコンをT7ポリメラーゼプラスミドで共トランスフェクションさせ、N、P、L、M2.1遺伝子をpCITE-2a/3aから発現させたpCiteプラスミドはT7プロモーター、次いで脳心筋炎ウイルスEMCV由来のIRES要素を有する。L、P及びNを排除した場合、CAT発現は完全になくなった。M2.1発現をベクターから排除した場合、CAT発現の顕著な低減が見られた。ミニレプリコンをトランスフェクションさせた細胞をhMPVポリメラーゼ構成要素NL/1/00及びNL/1/99あるいはAPV-A、APV-C、RSV又はPIV由来のポリメラーゼ構成要素で重感染させることによって、ミニレプリコン系の特異性異種ウイルスに起因する及びリーダーの末端残基の効果同種ウイルスに起因するも試験することができる。至適条件を決定するために、6つのプラスミドのそれぞれを様々な量で試験することもできる。CATの代わりに他のレポーター遺伝子を使用することができる。他の例では、CATの代わりにGFPをミニレプリコン構築体に挿入することができる。8.3実施例27:RSV、APV、MPV又はPIVポリメラーゼを用いたミニレプリコンからのhMPVのレスキューhMPVをレスキューするために、ミニレプリコン構築物は、レポーター遺伝子を含有するように作製しうる。ミニレプリコンの一例、すなわちCAT-hMPVを図24に示す。レポータータンパク質クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCATをコードするcDNAを、5’と3’の非コードウイルス配列の間にマイナス鎖配向でクローニングしうる。T7RNAポリメラーゼプロモーター配列及び制限酵素の認識配列は、構築物を挟むように配置しうる。invitro転写により、精製されたポリメラーゼタンパク質と混合した場合に再構成されたRNP複合体を形成しうるウイルス様RNAが生じる。RNPを、例えばヘルパーウイルスを用いて、真核細胞にトランスフェクトしうる。あるいは、レスキューは、完全にプラスミドが駆動するものであってもよい、すなわちミニレプリコンは、T7ポリメラーゼプラスミドと共トランスフェクトしてもよく、N、P、L及びM2-1遺伝子はpCITE-2a/3aから発現された。hMPVをレスキューするために使用されるポリメラーゼ構成要素は、RSV、APV、PIV、MPV又はその任意の組合せのものでありうるセクション5.8.1参照。ウイルスは、CAT活性を検出することができるいくつかのアッセイの任意のものを用いて検出しうる実施例24参照。別の代替法において、ミニレプリコン系を用いたhMPVのレスキューはまた、ミニレプリコンをトランスフェクトした細胞に、MPV、APV、RSV、PIV、又はその任意の組合せからの1又は複数のhMPVポリメラーゼ構成要素NL/1/00及びNL/l/99を重複感染させることにより実施し得る。より詳細には、リーダー領域及び隣接する遺伝子のcDNAは、合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発法により改変しうる。同様に、別のhMPV遺伝子例えばL遺伝子の下流末端のcDNA及び隣接するトレーラー領域は、隣接するT7DNAポリメラーゼプロモーターを含有するように改変しうる。リーダー及びトレーラー断片は、発現ベクター例えばpUC19のCAT遺伝子の挿入のいずれか一方の側にクローニングしうる。別のhMPVウイルス類似体をコードするcDNAは同じように構築することができる。構築物の構造は、配列決定を用いて確認しうる。ミニレプリコン構築物の作製に使用しうるリーダー及びトレーラー配列の例を図26に示す。比較のため、APV、RSV及びPIV3のリーダー及びトレーラー配列のアライメントもまた図26に示す。8.4実施例28:完全長の感染性cDNAの作製hMPVウイルスの遺伝子を発現する完全長cDNAを構築して、感染性のウイルスを生成することができる。たとえば、hMPVのすべての遺伝子又はすべての必須の遺伝子をコードしているcDNAを構築することができる。その後、ゲノムを発現させて感染性ウイルスを生成することができる。hMPVの遺伝子操作を行うためにこのRNAウイルスのゲノムをクローニングした。hMPVの00-1分離株では1~3kbの長さが異なるPCR断片を作製した図27。PCR断片の配列決定を行い、Genbankに寄託されているhMPV配列と比較することによって配列の誤りについて分析した。2つのサイレント変異SH遺伝子中のヌクレオチド5780のile:ile、L遺伝子中のヌクレオチド12219のcys:cysは訂正しなかった。L遺伝子中のヌクレオチド8352の別の変更trp:leuも訂正しなかった。これは、この変異が2つの個別に作製したPCR断片C及びH、並びにhMPV99-1配列でも観察されたからである。同様に、F-M2の遺伝子間領域中のヌクレオチド4715における5個のヌクレオチドの挿入も訂正しなかった。これらの変更はどちらもhMPVの野生型配列に反映されているかもしれない。一方、N-P遺伝子間領域中のヌクレオチド1242で1個のA残基を除去し、F遺伝子中のヌクレオチド3367でser:proを訂正し、G遺伝子のヌクレオチド6296でasp:valを変更し、L遺伝子のヌクレオチド7332で停止コドンをgluに変更した。hMPVの様々な分離株の制限マップを図28に示す。この制限部位を使用して完全長構築体を構成するassembleことができる。その後、固有の制限酵素部位を利用して図29、8つの訂正したPCR断片を配列へと構成した。遺伝子マーカーをヌクレオチド75に導入して、アミノ酸配列を変化させずにAflII制限酵素部位を作製した。hMPV配列の3’末端に唯一の制限酵素部位、XhoIを付加した。ファージT7ポリメラーゼプロモーター、次いで2個のG残基もhMPV配列の3’末端に付加した。hMPVゲノムの5’末端には、デルタ型肝炎リボザイムの配列及びBssHII制限酵素部位を付加した。pCITEプラスミド中のhMPVL、N、P及びM2-1遺伝子をコードしているヘルパープラスミドも作製した。完全長hMPVcDNAを作製した後、T7ポリメラーゼ源として伝染性上皮腫T7又はMVA-T7を使用して、逆遺伝学によるウイルスの回復をVero細胞で行った。8.5実施例29:POLI-POLIIプロモーター系を利用したhMPVの回収非セグメント化RNAウイルスの逆遺伝学系は、ゲノムRNA発現用のT7プロモーターを備えたプラスミドに基づいているが、これとは異なり、細胞の転写機構を利用する系は、より効率的である可能性があり、さらに、バクテリオファージT7由来のRNAポリメラーゼを共発現する必要がない。ウイルスRNA分子を細胞内で発現させるのに、一方向性又は双方向性のpolI-polII転写システムを使用することができる。このシステムは、クローニングされたcDNAからのインフルエンザウイルスの生成に非常に効率的であることが立証されたHoffmann他、PNAS、976108~6113。RNAポリメラーゼII転写産物とは異なり、RNAポリメラーゼI転写産物は、それらの5’末端にキャップ構造を含有せず、そして、3’末端にポリAテールを有しない。したがって、細胞の転写機構を利用するシステムは、polIIプロモーターからはタンパク質を発現し、そして、polIプロモーターからはキャップ構造もポリAテールも有しないウイルス-vRNA又はcRNAを発現するように設計される。ウイルスの複製及び転写には末端構造が重要であるので、余分な非ウイルス配列を含有しないウイルス様一次転写物を提供することは極めて重要である。RNAポリメラーゼIによるhMPVcDNAsの-vRNA転写又はcRNA転写がより効率的であるかどうかを評価するために、ミニゲノムシステムを、それぞれの複製効率を比較するように設計することができる。複製効率は、ミニゲノムによって発現されるレポーター分子、例えばCAT遺伝子の転写によって測定することができる。この手法では、hMPVのL、N、P、及びM2-1遺伝子をpolIIプロモーターの制御下で発現するプラスミドを、CAT-ミニゲノム-プラスミドと共に宿主細胞内に共トランスフェクションする。複製の相対的効率は、CATレポーター分子の相対的発現レベルを決定することによって測定される。例えば、hMPVウイルスゲノムcRNAのプラス鎖コピーを合成するのに、RNApolIを使用することができる。簡単に説明すると、ウイルスcDNAをRNApolIプロモーターとターミネーター配列との間に挿入する。polI転写ユニット全体をRNApolIIプロモーターとポリアデニル化部位との間にプラスセンスの方向で挿入する。2つのタイプのプラスセンスRNAが合成される。polIIプロモーターからは、5’キャップ構造を有するmRNAが転写される。polIプロモーターからは、5h’端に三リン酸基を有する完全長プラスセンスhMPVcRNAが細胞性RNAポリメラーゼIによって転写される。任意のcDNA断片を挿入するのにクローニングベクター、例えばpHW11を使用することができるHoffmann及びWebster、JGenVirol、2000年12月、812843~7。このプラスミドは、polIIプロモーターヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーターと、polIターミネーター配列及びポリA部位の上流にあるヒトpolIプロモーターを含有する。ウイルスcRNAを表す一次転写物を複製するために、ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーターなどのpolIIプロモーターを備えたプラスミドベクターによって、ウイルスポリメラーゼタンパク質を提供する。これらのプラスミドは、hMPVの4つの遺伝子セグメント、すなわち、L遺伝子、N遺伝子、P遺伝子、及びM2-1遺伝子を表すcDNAを含有する。それらの4つのプラスミド1~5μgを、hMPVの完全長ゲノムを表すpolI/polIIプラスミド1~5μgと共に、106~107の293T細胞、COS-7又はVero細胞内に共トランスフェクションする。系の効率及び信頼性を向上させるために、293T細胞を、Vero細胞やtMK細胞など、MPVを許容する細胞と共培養することができる。細胞培地にトリプシンを添加すると、その結果感染性ウイルス粒子が生成される。MDCK細胞と霊長類細胞の共培養は、インフルエンザAウイルスの効率的なレスキューに利用されたHoffmann他、PNAS、976108~6113。ウイルス力価を測定するために、トランスフェクション後の様々な時間すなわち3日から10日に上清の力価決定を行い、新たなVero細胞に移した。polIIプロモーターから全ウイルス構造タンパク質すなわち、M、M2-2、SH、F、及びGを共発現させることによって、ウイルス回収の効率が改善されるかもしれない。完全長cDNAを有するpolI/polIIプラスミドからは、キャップつきRNAと、キャップなしのRNAとが生成されるので、N遺伝子を表す第1のオープンリーディングフレームはN-タンパク質に翻訳されることが予測される。したがって、polI/polII手法を利用することによって、ウイルスレスキューに必要なプラスミドは4種類のみとなる。すなわち、L、P、及びM2-1タンパク質を発現する3種類のpolII-プラスミドと、Nタンパク質及びMPVの完全長RNAを発現する1種類のpolI/polIIプラスミドである。8.6実施例30:マイナス鎖ウイルス回収用のT7RNAポリメラーゼ発現細胞系T7RNAポリメラーゼを発現する細胞系を、組換えMPVゲノムの複製及びパッケージングに使用することができる。例えば、CMVプロモーターの制御下にT7RNAポリメラーゼを発現するように、Vero細胞を設計製作することができる。この手法は、T7RNAポリメラーゼを発現するポックスウイルスなどのヘルパーウイルスで共感染させる必要性を排除するので、有用である。この方法の別の利点は、ヘルパーウイルスを除去するのに必要な選択系の必要性を排除することである。簡潔に言うと、hMPVのL、N、P、及びM2-1遺伝子をコードするcDNAをクローニングし、組換えによって、発現ベクター中にT7プロモーター配列の制御下となるように設計製作する。プラス又はマイナス方向のMPVゲノムをコードするcDNAをクローニングし、組換えによって、発現ベクター中にT7プロモーター配列の制御下となるように設計製作する。これらの発現ベクターは、T7発現性の細胞系、例えばT7ポリメラーゼを発現するBHK細胞系に同時にトランスフェクションすることができる。これらのcDNA構築物のinvivo転写は、T7RNAポリメラーゼによって媒介される。感染細胞溶解物のプラークアッセイによって、ウイルスの力価を決定することができる。8.7実施例31:CMV又はSV40プロモーターからT7RNAポリメラーゼを一時的に発現するプラスミドの、hMPVレスキューのための使用CMV又はSV40プロモーターの制御下でT7RNAポリメラーゼを発現するプラスミドを設計製作して、それが細胞内で組換えMPVゲノムの複製及びパッケージングに使用される細胞の中に一時的にトランスフェクトすることができる。例えば、Vero細胞及び293T細胞を、CMVプロモーターの制御下でT7RNAポリメラーゼを発現するように設計製作することができる。特定の一実施形態においては、T7RNAポリメラーゼをコードする遺伝子を、CMVMIEプロモーターの制御下に保持するプラスミドを、T7プロモーターによって駆動される選択マーカー例えばネオマイシンと組み合わせて用いることができる。これによって、T7RNAポリメラーゼを発現する細胞系の効率的な選択が可能となるであろう。T7RNAポリメラーゼを発現する細胞系を用いた手法は、T7ポリメラーゼを発現するポックスウイルスなどのヘルパーウイルスで共感染させる必要性を排除するので有用である。この方法の別の利点は、ヘルパーウイルスの混入を除去するための選択系の必要性が排除されることである。さらに、この手法は、293T細胞やCOS7細胞など、トランスフェクション効率が高い細胞系の使用を可能にする。したがって、トランスフェクトされた細胞は、複数コピーのT7ポリメラーゼ発現プラスミドを有し、この結果、1コピーしか有しない安定細胞系と比較して、一時的にトランスフェクトされた細胞より、1細胞あたりのT7ポリメラーゼタンパク質の量が多くなっている。簡潔に言うと、hMPVのL、N、P、及びM2-1遺伝子をコードするcDNAをクローニングし、組換えによって、発現ベクター中にT7プロモーター配列の制御下となるように設計製作する。あるいは、それらの4つの遺伝子を、ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーターなどのRNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で発現させる。プラス又はマイナス方向のMPVゲノムをコードするcDNAをクローニングし、組換えによって、発現ベクター中にT7プロモーター配列の制御下となるように設計製作する。これらの発現ベクターは、T7ポリメラーゼを発現するプラスミドと共に、hMPVの複製を補助する細胞、例えば、Vero細胞系、tMK細胞系、293T細胞系、又は複数の細胞系の共培養の中に共トランスフェクトする。これらのcDNA構築物のinvivo転写は、T7RNAポリメラーゼによって媒介される。感染細胞溶解物のプラークアッセイによって、ウイルスの力価を決定することができる。T7、T3、又はSP6RNAポリメラーゼを供給する代替の手法は、T7、T3、又はSP6プロモーターの制御下にあるN、P、L、M2-1、及び完全長のゲノムcDNA又はアンチゲノムcDNAのプラスミドで細胞を、脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトする前に、後に、又はこれと同時に、T7ポリメラーゼタンパク質を細胞内にトランスフェクトすることからなる。8.8実施例32:hMPVのレスキュー組換えhMPVをレスキューするための、成功した系が開発された。簡単に説明すると、様々なポリメラーゼタンパク質をコードする発現プラスミドを、レスキューするべきクローニングされたhMPVと共に適切な宿主細胞内に共トランスフェクトした。収集及び処理を行い、細胞及び上清を使用してVero細胞に接種した。レスキューされた感染性のウイルスが、免疫染色法を用いて検出された。hMPVをレスキューするために、TC6ウェルプレート中の293T細胞のコンフルエントな単層培養に、MOI感染多重度=0.5で鶏痘ウイルスを接種した。細胞は、その後35°Cで1時間インキュベートした。以下の量の発現プラスミドと、レスキューするべきクローニングされたhMPVとをoptiMEM100μl1ウェルあたりに混合した。すなわち、hMPVP遺伝子をコードするプラスミドpCITE2a/3a中、クローン41-6と称する0.4μg、hMPVN遺伝子をコードするプラスミドpCITE2a/3a中、クローン35-11と称する0.4μg、hMPVM2遺伝子をコードするプラスミドpCITE2a/3a中、クローン25-6と称する0.3μg、hMPVL遺伝子をコードするプラスミドpCITE2a/3a中、クローン2と称する0.2μg、及び、APV様のリーダー及びトレーラーを有するクローン2、又は、hMPVのリーダー配列及びトレーラー配列を有するクローン10のhMPVプラスミド4μgである。使用された発現プラスミドが、第2のアミノ酸位置に回復された野生型配列を有することは、注目に値する。次のステップでは、トランスフェクション試薬Lipofectamine20008μlを100μlのoptiMEMと混合し、その後、プラスミド混合物に添加した。この併せた混合物を293T細胞に適用した。トランスフェクションの6日後に、細胞及び上清を収集し、冷凍し、解凍させて、Vero細胞に接種するのに使用した。接種の9日後に、感染した細胞をメタノールで固定し、モルモットのポリクロナール抗体で免疫染色し、抗モルモットHRP及びDAKOAEC基質がそれに続いた。プラーク形成によって、レスキューされたウイルスが感染性であることが示された図56。陽性の赤色免疫染色は、クローン2及び10の両方のウェルで明らかであったが、hMPVのリーダー及びトレーラーを有するクローン10と比較して、APVのリーダー及びトレーラーを有するhMPVクローン2のウェルに、より多くの免疫染色された細胞があった。陽性の免疫染色を、図57に示す。レスキューされた配列を確認するために、感染の10日後に収集されるであろうウイルスでRT-PCRを実施するであろう。これらの結果は、組換えhMPVが成功裏にレスキューされたこと、そして、感染性ウイルスが生成されたことを示す。8.9実施例33:hMPVのサブタイプを用いた動物宿主の感染MPV株の病原性を特性解析すために動物宿主を感染させることができる。たとえば、それぞれの株が生物内でどれほど感染性があるかを決定するために、様々な宿主を用いることができる。hMPVの小動物モデルは確認されていない。1.3×106pfu/匹の用量で、Balb/cマウス、コットンラット、及びシリアンゴールデンハムスターをhMPVに感染させた。1.3×106pfuのhMPVを0.1mlの体積で、動物の鼻腔内に接種した。組織試料はプラークアッセイによって定量した。これは、9日目にhMPVモルモット抗血清で免疫染色した。感染後4日目に動物を屠殺し、鼻甲介及び肺を摘出し、免疫染色のプラークアッセイによってhMPV力価を定量した表13。結果は、hMPVがシリアンゴールデンハムスター内で高い力価で複製されたことを示した。組織1gあたり5.3及び2.3log10pfuの力価がそれぞれ鼻甲介及び肺で得られた。hMPVはコットンラットの気道中では感知できるほどの力価レベルまでに複製されなかった。マウスでは、気道上部及び下部でそれぞれ組織1gあたり2.7及び2.2log10pfuの力価が示された。これらの結果は、シリアンゴールデンハムスターがhMPVの複製及び免疫原性を研究するため、並びにhMPVのワクチン候補を評価するために適切な小動物であることを示唆している。モルモットの感染:2つのウイルス分離株、すなわち00-1サブタイプA及び99-1サブタイプBを各サブタイプ6匹ずつのモルモットに接種した気管内、鼻及び眼。6匹のモルモットをhMPV00-1に感染させた10e6、5TCID50。6匹のモルモットをhMPV99-1に感染させた10e4、1TCID50。モルモットに同種及び異種のサブタイプを接種した場合は10e4TCID50/ml一次感染を54日間進行させた、すなわち、異種感染を成すために2匹のモルモットで00-1により一次感染及び99-1による二次感染を行い、同種感染を成すために3匹のモルモットで00-1により一次感染及び00-1による二次感染を行い、異種感染を成すために2匹のモルモットで99-1により一次感染及び00-1による二次感染を行い、同種感染を成すために3匹のモルモットで99-1により一次感染及び99-1による二次感染を行った。感染後12日一次感染又は8日二次感染において、咽頭及び鼻スワブを採取し、RT-PCRアッセイによってウイルスの存在について試験した。RT-PCRアッセイの結果図32により、ウイルス分離株00-1を接種したモルモットが感染後1~10日目に気道上部の感染を示したことが示された。99-1を接種したモルモットは、感染後1~5日目に気道上部の感染を示した。99-1によるモルモットの感染は、00-1による感染よりも重篤度が低いように見えた。上で説明したように、異種ウイルスによるモルモットの2回目の接種では、4匹中3匹のモルモットで再感染がもたらされた。同様に、同種ウイルスの場合、再感染は6匹中2匹のモルモットで起こった。再感染した動物では臨床的症状は僅かしか見られない又は全く見られず、再感染に対して保護された動物では臨床的症状が全く見られず、これは、野生型ウイルスを用いた場合でも1回目の感染による保護効果が起こったかもしれないことを実証している。また、これにより異種及び同種分離体をワクチンとして使用できることも示された。hMPVのどちらのサブタイプでもモルモットを感染させることができたが、サブタイプB99-1による感染の方が重篤度が低いように見えた、すなわち、ウイルスが鼻及び咽頭に存在している期間がサブタイプA00-1による感染よりも短かった。これは、サブタイプAをより高い用量で与えたこと、又はサブタイプBの病原性がより低いことが原因であるかもしれない。既存の免疫によっては同種及び異種ウイルスのいずれにおける再感染に対しても完全に保護されなかったが、ウイルスが存在する期間がより短く、すべての動物でウイルスが陽性となったわけではないという点で、感染はそれほど顕著ではないように見えた。hMPVの両方のサブタイプに感染させたモルモットの血清学を観察した。0、52、70、80、90、110、126及び160日目にモルモットから血清を採取し、1:100の希釈率で00-1及び99-1抗原に対する全ウイルスELISAで試験した。それぞれのモルモット個体について00-1及び99-1に対するIgG応答を示す図33A及びBを参照。00-1及び99-1ELISAの特異性を示す図34も参照。ただし、同種再感染のモルモットからのデータを使用したことに注意。3匹の同種感染すなわち00-1及び00-1、2匹の同種感染すなわち99-1及び99-1、2匹の異種感染すなわち99-1及び00-1、並びに2匹の異種感染すなわち00-1及び99-1のモルモットの、00-1及び99-1ELISAに対する平均IgG応答を示す図35も参照。2種の異なるELISAでは僅かな応答差しか観察されなかった。00-1又は99-1に対する全ウイルスELISAは、2つのサブタイプを区別するために使用することができなかった。モルモット中でhMPVに対して産生させた血清の、APV抗原に対する反応性を検査した。感染モルモットから血清を採取し、APV阻害ELISAで試験した。hMPVに感染したモルモットにおけるAPV阻害の平均の割合を示す図36参照。モルモット中でhMPVに対して産生させた血清は、そのhMPVIgGELISAにおける反応と同様の様式で、APV阻害試験で反応した。99-1に対して産生させた血清は、APV阻害ELISAにおいて00-1に対して産生させた血清よりも低い割合の阻害を示した。99-1に感染させたモルモットは、hMVPELISAで見られた力価よりも低い力価を有していたかもしれない。あるいは、99-1のAPVとの交差反応は00-1のそれよりも低かったかもしれない。それでもなお、モルモットにおいてhMPV抗体を検出するためにAPVAb阻害ELISAを使用することができる。モルモット中でhMPVに対して産生させた血清を用いてウイルス中和アッセイを行った。感染後0日目、52日目、70日目及び80日目に血清を採取し、00-1、99-1、及びAPV-Cを用いたウイルス交差-中和アッセイで使用した。使用した開始希釈率は、1ウェルあたり1~10及び100TCID50のウイルスであった。中和後、ウイルスをtMK細胞に曝し15mm、3500RPMで遠心し、その後、培地を新しくした。APV培養物は4日間増殖させ、hMPV培養物は7日間増殖させた。細胞を80のアセトンで固定し、標識したサル抗hMPVを用いてIFAを実施した。染色後に陰性であったウェルを中和力価として定義した。各ウイルスには10log力価のウイルスストック及び2倍力価の作業溶液が含まれていた。00-01及び99-1に感染したモルモットの、00-1、99-1、及びAPV-Cに対するウイルス中和力価を示す図37参照。カニクイマカクCYNOMOLOGOUSMACAGUEの感染:ウイルス分離株00-1サブタイプA及び99-1サブタイプB1e5TCID50を各サブタイプ2匹ずつのカニクイマカクに接種した気管内、鼻及び眼。一次感染の6カ月後、00-1を用いてマカクに2回目の接種を行った。感染後14日一次感染又は8日二次感染において、咽頭スワブを採取し、RT-PCRアッセイによってウイルスの存在について試験した図38。00-1を接種したモルモットは、感染後1~10日目に気道上部の感染を示した。臨床的症状には化膿性鼻炎が含まれていた。同種ウイルスを用いてマカクに2回目の接種を行った結果、再感染が起こった。これはPCRによって実証されたが、臨床的症状は見られなかった。一次感染の後6カ月の間に00-1を受けたマカクから血清を採取した再感染は、サル3では240日目、サル6では239日目に起こった。血清は、00-1又はAPVのいずれかに対するIgG抗体の存在図39B、並びに00-1に対するIgA及びIgM抗体の存在図39Aついて試験するために使用した。2匹のマカクを00-1に感染させることに成功し、00-1に対する抗体の存在下で異種ウイルスで再感染させた。IgA及びIgM抗体に対する応答では、一次感染後にIgM抗体が産生されること、及び再感染後にそれが存在しないことが示された。IgA抗体は再感染後でのみ検出され、これにより、一次感染後の免疫応答の即時性が示された。マカク中でhMPVに対して産生させた血清をAPV阻害ELISAで試験すると、hMPVIgGELISAと類似した応答が示された。hMPVELISAと同様の感度を用いて、APV阻害ELISAでカニクイマカク中のhMPVに対する抗体が検出された。したがって、APV阻害EIAはヒト試料をhMPV抗体の存在について試験するのに適していた。hMPVに感染したカニクイマカクから採取した血清でウイルス交差-中和アッセイを行った。一次感染後0~229日目に血清を採取し、これは00-1に対して低いウイルス中和力価しか示さず0~80、二次感染後に採取した血清は高い、すなわち1280を超える00-1に対する中和力価を示した。二次感染後に採取した血清のみが99-1に対する中和力価を示し80~640、どの血清もAPV-Cウイルスを中和することができなかった。ウイルス交差-中和アッセイではAPV-CとhMPVとの間に交差反応は起こらなかったが、抗体応答のブースト後に00-1と99-1との間に交差反応が起こった。ヒトの感染:6カ月未満~20歳を超える年の範囲の患者の血清は、IFA及び00-1に対するウイルス中和アッセイを用いて既に試験されている。血清を、00-1に対するELISAでIgG、IgM及びIgA抗体の存在について試験した。試料は、APVELISAを阻害するその能力についても試験した。ヒト血清におけるIgG抗体の検出についてhMPVELISA及びAPV阻害ELISAの使用を比較し、IgGhMPV試験とAPV-Ab試験との間に強い相関性が認められた。したがって、APV-Ab試験によって、本質的にヒトにおいてhMPVに対するIgG抗体を検出することができた図40。家禽類の感染:APVに対するIgG抗体の存在についてニワトリを試験するために、APV阻害ELISA及び00-1ELISAを使用した。hMPVELISA及びAPV阻害ELISAのどちらによってもAPVに対する抗体が検出された。8.10実施例34:ヒトにおけるワクチンとしてのAPVAPVは、ヒトMPVによる感染を予防するため、又はヒト宿主におけるヒトMPVの感染力を低減させるためのワクチンとして使用することができる。ワクチンはAPV全体あるいはAPVの配列及び加えて別のメタニューモウイルスの異種配列からなるそのキメラ若しくは組換え型又は誘導体であることができる。組換えウイルスワクチンを作製するバックボーンとしてAPVのゲノムを使用することができる。たとえば、APVのF遺伝子及び/又はG遺伝子をヒトMPVのF遺伝子又はG遺伝子で置換したワクチンを作製することができる。あるいは、APVバックボーンの配列をPIV由来の配列をAPVバックボーンに置換した又は付加した配列を含むワクチンを作製することができる。組換え/キメラワクチンのさらなる情報については、たとえばConstructionoftheRecombinantcDNAandRNAを参照されたい。ワクチンは、それだけには限定されないが、皮下注射、鼻腔内投与、又は吸引を含めた、当業者に周知の様々な方法によって候補に投与することができる上記セクション5.13参照。本発明のウイルス及び/又は少なくとも103TCID50~106TCID50の開始用量で投与する。ウイルス及び/又はワクチンは、単一用量又は複数用量で投与する。たとえば、初回用量は、宿主生命の間中ずっと定期的な間隔で投与する1回又は複数回の後続又はブースター用量と共に投与することができる。臨床治験では、有効な用量レジメンが決定できるように、ウイルスの複製速度をワクチンの用量を調節する指標として使用することができる。研究集団内のウイルスの複製速度と有効であることが知られている所定の速度とを比較することができる。本発明は、本発明の個別の態様の単一の例示として意図される具体的な記載した実施形態によって範囲が限定されるべきでない。また、機能的に等価なすべての構築体、ウイルス又は酵素も本発明の範囲内にある。実際、前述の説明及び添付の図から、本明細書中に示しかつ記載したものに加えて、本発明の様々な改変が当業者には明らかとなるであろう。このような改変は添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。8.11実施例35:トリにおけるワクチンとしてのMPVヒトMPVは、APVによる感染を予防するため、又はトリ宿主におけるAPVの感染力を低減させるためのトリ用ワクチンとして使用することができる。ワクチンはMPV全体あるいはMPVの配列及び加えて別のメタニューモウイルスの異種配列からなるそのキメラ若しくは組換え型又は誘導体であることができる。組換えウイルスワクチンを作製するバックボーンとしてMPVのゲノムを使用することができる。たとえば、ヒトMPVのF遺伝子及び/又はG遺伝子をAPVのF遺伝子又はG遺伝子で置換したワクチンを作製することができる。組換え/キメラワクチンのさらなる情報については、たとえばConstructionoftheRecombinantcDNAandRNAを参照されたい。ワクチンは、それだけには限定されないが、皮下注射、鼻腔内投与、又は吸引を含めた様々な方法によって候補に投与することができる。本発明のウイルス及び/又は少なくとも103TCID50~106TCID50の開始用量で投与する。ウイルス及び/又はワクチンは、単一用量又は複数用量で投与する。たとえば、初回用量は、宿主生命の間中ずっと定期的な間隔で投与する1回又は複数回の後続又はブースター用量と共に投与することができる。臨床治験では、有効な用量レジメンが決定できるように、ウイルスの複製速度をワクチンの用量を調節する指標として使用することができる。研究集団内のウイルスの複製速度と有効であることが知られている所定の速度とを比較することができる。様々な出版物が本明細書中に引用されており、それらの開示はその全体で参照として組み込まれている。8.12実施例36:hMPVのFタンパク質7回反復配列を使用したhMPV融合の阻害ウイルス細胞融合の阻害は、エンベロープウイルスを制御するための新規手法の一典型となるものである。この手法は、hMPVウイルスの感染及び/又は増殖を阻止するのに有利であろう。融合過程中、Fタンパク質の7回反復配列HRセグメントが露出する。融合過程中に可溶性のHRペプチドを添加して、競合させれば、ウイルス融合が阻止されるであろう。Fタンパク質のHRペプチドによるhMPV細胞融合の阻害は、強いウイルス細胞融合阻害活性を示すと予測される。hMPVのFタンパク質7回反復配列がウイルス融合を阻害する能力を検査するために、HRペプチドを精製して、様々なアッセイで使用して、ウイルス融合に対するそれらの効果を決定することができる。hMPVFタンパク質のHRセグメントをコードする遺伝子、すなわち、HRA及びHRBと名付けられている遺伝子下記参照を発現ベクター、例えばpET30aNovagenにクローニングする。このクローニングストラテジーは、hMPVのFタンパク質HRセグメントに対応する融合タンパク質を産生するだろう。4株の分離株において、hMPVFタンパク質のアミノ末端近傍にあるHRセグメントの配列は、HRAと名付けられており、であると推定されている。同様に、hMPVFタンパク質のカルボキシ末端近傍にあるHRセグメントの配列は、HRBと名付けられており、であると推定されている。タンパク質の発現及び精製7回反復配列がウイルス融合を阻害する能力を検査するために、それらがウイルス融合を阻害する能力を試験できるように、7回反復ペプチドを発現させ、精製することができる。組換え発現ベクターで適当な細菌宿主、例えば大腸菌BL21DE3を形質転換して、光学濃度が600nmで0.8~1.0の時に発現を誘導する。IPTG1.0mMを使用した25°Cで5時間の誘導に続いて、細菌細胞を収集して、リン酸緩衝食塩水中で超音波処理によって溶解させる。その後、TritonX-100を最終濃度3となるように添加して、溶解物を氷上で30分間インキュベートし、その後、4°C、12000×gで15分間遠心することによって清澄化する。発現されたHRタンパク質は、その後精製する。複合体形成及びゲル濾過による分析発現された7回反復ペプチドがウイルス融合を阻害する潜在的有効性を決定するために、アッセイを用いて、HRペプチド相互の複合体形成を確認することができる。それを行うために、等モル量のHRA及びHRBを混合して、室温で1時間インキュベートする。融合タンパク質の形態にあるHRA及びHRBの両方によるHRA/B複合体の形成を評価する。ゲル濾過には、AktaExplorerFPLCシステムAmersham-Pharmacia上で機能するHiloadSuperdexG75カラムPharmaciaにサンプルを添加する。ピーク画分を収集して、トリス-トリシンSDS-PAGEにかける。ピークの分子量を、同じカラム上を移動するタンパク質標準物質Pharmaciaと比較して推定した。CD分光法これらのペプチドの7回反復配列セグメントは、自然において螺旋状であることが知られている。この理由から、ウイルス融合の阻害に使用するのに適当な候補を同定するために、いくつかの方法を用いて、発現されたHRペプチドがアルファへリックスを形成しているかどうか決定することができる。CDスペクトルは、PBS10mMリン酸ナトリウム、pH7.3;150mMNaCl中のタンパク質を用いて分光光度計で行う。波長スペクトルを、37°Cで0.1cm経路長のキュベットを用いて記録する。この分析には約20μg/mlのタンパク質濃度を用いる。細胞融合アッセイHRペプチドがウイルス融合を阻害する有効性を決定するのに、細胞ベースのアッセイを用いることができる。HRAペプチド及びHRBペプチドによるウイルス細胞融合の阻害を試験するために、阻害試験を行う。Vero細胞の単層培養を10~100TCID50でhMPVに感染させる。感染の2時間後に、上清を吸引して、ウイルス種菌を除去するために細胞をリン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄する。新たな培地L-グルタミン2mM、ペニシリン100U/ml、ストレプトマイシン100μg/ml、及び0.3ウシ血清アルブミンを含有するIscoveの改変ダルベッコ培地IMDMを添加して、細胞を37°Cでインキュベートする。HRAペプチド及びHRBペプチドは、個別にhMPV感染細胞とインキュベートされる。あるいは、様々な量のHRAペプチド及びHRBペプチドを、hMPV感染細胞とインキュベートする。APV、RSV、又はPIV由来の対応するHRペプチドも、hMPV感染細胞とのインキュベーションによってhMPVウイルス融合を阻害するのに用いることができる。インキュベーションの24~72時間後に、免疫蛍光分析IFAを用いて細胞の記録を行う。IFAにおける染色は、感染細胞をモルモット抗hMPV血清と共にPBS中で1時間インキュベートして、それに続いて、FITC標識されたウサギ抗モルモットポリクロナール抗体調製物と、PBS中で1時間インキュベートすることによって行う。最後に、免疫蛍光顕微鏡で分析する前に、エリオクロムブラックでバックグランド染色を行う。高倍率320×下の5つのフィールド中で感染細胞の計数を行った。あるいは、細胞と細胞の融合を行った細胞を、感染後の適当な時期に記録する。クリスタルバイオレットで染色した後、シンシチウム/多核体形成によって細胞融合を測定し、核の総数に対する多核体の核数の比率として記録する。光学顕微鏡下における異なった5つの無作為のフィールドを計数し、Reed-Muench法に従ってIC50を計算する。9.弱毒化ウイルス9.1実施例36:ウイルス遺伝子の置換によって起こる弱毒化様々なウイルス遺伝子のオープンリーディングフレームの置換を、クローニングされたウイルスゲノムのcDNAで標準的な組換えDNA技法を使用して行う。様々なウイルス構築体におけるCAT活性に関しては、図60を参照されたい。9.2実施例37:M2欠失変異体hMPV株hMPV/NL/1/00のM2遺伝子マップを図61に示す。M2遺伝子の欠失を生成するために、BspE1部位をヌクレオチド位置4741に構築し、さらに第2のBspE1部位をヌクレオチド位置5444に構築する。制限部位は部位特異的変異誘発によって構築する。制限エンドヌクレアーゼBspE1を使用して、2箇所のBspE1部位で組換えゲノムの制限消化を行い、続いて連結させると、その結果、ヌクレオチド位置4741とヌクレオチド位置5444との間の配列の欠失が得られる。M2遺伝子のM2-1オープンリーディングフレームの欠失を生成するために、ヌクレオチド位置4744及び5241にNheI部位を導入する。制限部位は部位特異的変異誘発によって構築する。制限エンドヌクレアーゼNheIを使用して、2箇所のNheI部位で組換えゲノムの制限消化を行い、続いて連結させると、その結果、ヌクレオチド位置4744とヌクレオチド位置5241との間の配列の欠失が得られる。M2遺伝子のM2-2オープンリーディングフレームの欠失を生成するために、ヌクレオチド位置5311及び5453にSwaI部位を導入する。制限部位は部位特異的変異誘発によって構築する。制限エンドヌクレアーゼSwaIを使用して、2箇所のSwaI部位で組換えゲノムの制限消化を行い、続いて連結させると、その結果、ヌクレオチド位置5311とヌクレオチド位置5453との間の配列の欠失が得られる。以下のプライマーセットを用いた:制限酵素部位を導入するのに使用したプライマー:4741から5444までのM2欠失を作製するために、hMPV/NL/1/00にBspEIを導入するため:プライマーセット及びプライマーセット4744から5241までのM2-1欠失を作製するために、hMPVにNheI部位を導入するため、そして、nt4742における開始部位をatgからacgに変えるため:プライマーセットプライマーセット5311から5453までのM2-2欠失を作製するために、hMPVにSwaI部位を導入するため:プライマーセット及びプライマーSHの中に欠失を有するhMPVhMPV/NL/1/00株を作製するために5472から6026までの欠失を有するクローンを回収し、このクローンはVero細胞培養で良好に増殖した。SH欠失を有するhMPV/NL/1/00ウイルスをクローニングするためのプライマーセットは以下の通りである。プライマーセットプライマーセット10.実施例:エレクトロポレーションによる無血清Vero細胞におけるhMPVのプラスミドのみの回収緒言この方法は、ヘルパーウイルスの非存在下における、プラスミドのみを使用した組換えhMPVの回収を可能にする。hMPVの回収は、SFVero細胞を使用して実施し、これらは、動物及びヒトに由来する産物の非存在下に増殖される。この方法は、ヘルパーウイルスT7ポリメラーゼを発現する組換えワクチニアウイルス又は鶏痘ウイルスを使用した以前の方法と同様の効率で組換えhMPVを回収するのを可能にする。この回収方法はヘルパーウイルスを必要としないので、ワクチンウイルスは混入物質を含まず、下流のワクチン生産を単純化する。ワクチンウイルス回収に使用される細胞は、動物又はヒトに由来する産物を含有しない培地で生育される。これは伝染性海綿状脳症例えばBSEに関する製品エンドユーザーの心配を取り除く。この方法は、動物又はヒトに由来する成分を全く含まない組換えワクチンシードの作製を可能にする。このシードは、混入ヘルパーウイルスも含まない。cDNAからウイルスをレスキューするためのプラスミドベースの発現系については、例えば、RALerch他、WyethVaccines、PearlRiverNYUSAXIIInternationalConferenceonNegativeStrandVirusesの要旨206、2003年6月14~19日、PisaItaly、及びGNeumann他、JVirol、76、406~410頁に記載されている。方法及び結果無血清培地中でエレクトロポレーションを使用してSFVero細胞内に、hMPVNプラスミド4μg;マーカー:カナマイシン抵抗性、hMPVPプラスミド4μg;マーカー:カナマイシン抵抗性、hMPVLプラスミド2μg;マーカー:カナマイシン抵抗性、hMPVアンチゲノムcDNAをコードするcDNA5μg;マーカー:カナマイシン抵抗性、及びT7RNAポリメラーゼをコードするpADT7NDpT75μg;マーカー:ブラストサイジンを導入する。hMPVウイルスのレスキューには、4種類の発現プラスミドを使用する。それらはhMPVの遺伝子N、P、L、及びM2のためのものである。詳細には以下のプラスミドを使用する。すなわち、hMPVNpCITEプラスミド4μg、hMPVPpCITEプラスミド4μg、hMPVM2pCITEプラスミド3μg、hMPVLpCITEプラスミド2μg、T7RNAポリメラーゼプラスミド5μg、及び、レスキューするべきウイルスゲノムをコードするウイルスcDNA5μgである。pCITEプラスミドは、Vero細胞の細胞質で機能する配列内リボソーム進入部位を有し、それによって、N、P、M2、及びLのタンパク質が細胞質で生成される。これらのタンパク質はウイルスポリメラーゼ複合体を形成する。レスキューするべきウイルスゲノムは、T7プロモーターを有する完全長プラスミドの中にある。理論に拘泥するものではないが、T7DNA依存性RNAポリメラーゼは、この完全長プラスミドを使用して完全長ウイルスRNAゲノムの転写を行う。ウイルスゲノムが生成された後、ウイルスポリメラーゼ複合体がウイルスゲノムを転写し、ウイルスメッセンジャーRNAを生成するであろう、そして、その後、ウイルスが回収される。電気穿孔のためのパルスは、220V、950マイクロファラッドである。電気穿孔1回あたり5.5×106のSFVero細胞を使用する。電気穿孔された細胞は、OptiCGIBCOInvitrogenCorporation製のカスタム処方の存在下、33°Cで一晩かけて回復させる。回復した細胞は、カルシウム及びマグネシウムを含有する1mLのPBSで2回洗浄し、2mLのOptiCをかぶせた。電気穿孔された細胞を、さらに5~7日間、33°Cでインキュベートする。インキュベーション期間の最後に、細胞を培地中にこすり落とし、hMPVが存在するかどうか全細胞溶解物を分析する。ウイルスの回収は、hMPV特異的なポリクロナール抗体を使用して、プラークアッセイの免疫染色によって確認する。11.実施例:ヒトメタニューモウイルスFタンパク質の切断部位におけるプロリンからセリンへの変化によってVero細胞における切断及び感染性が抑制される最近になって記載されたパラミクソウイルスであるヒトメタニューモウイルスhMPVは、呼吸器疾患を引き起こし、それには、重度の咳、細気管支炎、及び肺炎が含まれることがある。ニューモウイルスPneumovirus亜科の他のメンバー、トリメタニューモウイルスAPV、及び呼吸器合胞体ウイルスRSVと同様に、hMPVは、2つの表面糖タンパク質、すなわち1つの付着糖タンパク質Gと、1つの融合タンパク質Fとを発現する。hMPVの結合及び進入の研究は、いまだ報告されていないが、他のパラミクソウイルスのFタンパク質との配列アラインメントは、保存されている機能ドメインの存在を明らかにした例えば図9参照。理論に拘泥するものではないが、完全長融合タンパク質F0がF1及びF2に切断されることによって、F1断片のN末端にある融合ペプチドが露出し、これはウイルス膜が宿主細胞膜と融合するための前提条件である。株hMPV/NL/1/00配列番号19は、Fタンパク質の切断部位に配列RQPRを含有するが、他のhMPV株の大部分は、Fタンパク質の切断部位にアミノ酸配列RQSRを含有する。Fタンパク質のアミノ酸位置101にプロリン又はセリンのいずれかを有する完全長hMPV/NL/1/00をクローニングした。両ウイルスを、実施例32で記載した通りに、トリプシンの存在下でレスキューし、増幅した図62及び63。しかし、トリプシンの非存在下では、セリン置換によって、Fタンパク質の切断図64と、ウイルスの感染性が抑制された。切断、及びそれに続く感染性は、トリプシンの添加によって回復することができたが、101S変異体のプラークサイズは101Pウイルスより小さかった。これらの結果は、Fの切断がhMVP/NL/1/00の感染性の前提条件であることを実証する。配列決定されたhMPV株の他の多くは、Fタンパク質の位置101にセリンを有し、切断される可能性が高い。例えば、株CAN99-81のFタンパク質は、切断されることがウエスタンブロットを用いて示されている。12.実施例:組換えhMPVの増殖挙動実施例28で記述したように、いくつかの組換えhMPVが構築された。実施例32で記述したように、様々な組換えhMPVがレスキューされた。トリプシンの存在下及び非存在下における組換えhMPV/NL/1/00の増殖曲線を図65に示す。細胞Vero細胞はMOI0.1で感染させた。ハムスターの上気道及び下気道における野生型hMPV/NL/1/00及び組換えhMPV/NL/1/00の複製を図66に示す。ハムスターは、実施例33で記述した通りに感染させた。Fタンパク質のアミノ酸位置93におけるグルタミン酸がバリンにアミノ酸置換されている組換えhMPV/NL/1/00の、トリプシンの存在下及び非存在下における増殖曲線を図67に示す。細胞Vero細胞は、MOI1で感染させた。13.hMPV/GFP2を使用した微量中和試験ウイルスを動物に接種したときに、ウイルスに対する一群の抗体が産生される。これらの抗体の一部は、ウイルス粒子に結合して、ウイルスの感染性を中和することができる。この実施例では、微量中和試験を用いて、抗体を含有する血清の希釈液でウイルスをインキュベートした後におけるウイルスの残留感染力を分析した。連続希釈のために、96ウェルプレートを、i行A希釈率1:32;B1:64;C1:128;D1:256;E1:512;F1:1024;G1:2048;及びH抗体なしに、そして、ii様々な試料用に列1~12第1の試料:列1~3;第2の試料:列4~6;第3の試料:列7~9;第4の試料:列10~12に分割した。230μlの試料希釈液を行Aに添加する。115μlのOpti-MEMを行B~Hに添加する。次に、1B、2B、及び3Bのウェルに第1の試料、4B、5B、及び6Bのウェルに第2の試料、7B、8B、及び9Bのウェルに第3の試料、そして、10B、11B、及び12Bのウェルに第4の試料の1:32希釈液115μlを添加する。血清及び培地は、3回、上下にピペッティングすることよって穏やかに混合する。これらのステップを、行BからCに、行CからDに、行DからEに、行EからGに繰り返す。希釈された試料を行Gに添加して、混合した後に、行Gから115μlを取り除き、廃棄する。微量中和試験は以下の通りに行った。血清は連続希釈した。各試験試料及び各対照は、22.5μlの血清を697.5μlのOpti-MEM培地1×に添加することによって1:32に希釈した。血清及び培地は、反転によって穏やかに3回混合し、氷上に置いた。血清の各希釈液をhMPV/GFP2ウイルスと共にインキュベートした。細胞をリン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄した。ATCCから入手したVero細胞は、10ウシ胎仔血清、2mMのL-グルタミン、非必須アミノ酸、及び100単位/mlのペニシリンG、100μg/mlの硫酸ストレプトマイシンを添加したMEMTRHBiosciences中に維持する。ウイルス/血清混合物を細胞に添加して、35°Cで1時間インキュベートした。培地はウイルスを含有していたが、全ての培地を除去し、細胞をPBSで洗浄した。Opti-MEM培地を細胞に添加して、細胞培養を3日間インキュベートした。Opti-MEMI血清使用量低減培地1×GIBCO31985070は、中でも、HEPES緩衝液、2400mg/L重炭酸ナトリウム、ヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、微量元素、成長因子、及び1.1mg/Lに低減したフェノールレッドを含有する。ウイルスの残留感染力は、蛍光顕微鏡で捕捉されたイメージに現れたeGFPグリーンの細胞増殖巣を定量することによって測定した。微量中和試験の感度を比較するために、野生型ウイルス、例えば野生型hMPV/NL/1/00を使用したプラーク減少アッセイ実施例16を参照を行った。結果を表16、表17、表18、表19、及び図68に示す。結果は、hMPV/GFP2を使用する微量中和試験が信頼性と再現性とを備えた結果を提供することを実証するものである。微量中和試験におけるhMPV-GFPの使用は、フェレットやサルなどの動物モデルシステムにおける種々のワクチン及び抗体の高スループットスクリーニングを容易にする。この技法は、ヒトにおける感染を診断して、モニターするための効率的な方法も提供する。14.実施例:アフリカミドリザルにおける、MPVの抗原性タンパク質を発現するb/hPIV3の有効性及び免疫原性を評価するMPV/RSV2価ワクチン候補株、例えば、ヒトRSVの可溶性型Fタンパク質など、RSVの抗原性タンパク質を発現するhMPVhMPV/RSVFSOLを、アフリカミドリザルなどの非ヒト霊長類モデルにおける有効性及び免疫原性に関して評価する。この可溶性型RSVFタンパク質は、膜貫通ドメイン及び管腔ドメインを欠失している。Vero細胞は、2mML-グルタミン、非必須アミノ酸NEAA、抗生物質、及び10FBSを添加した改変イーグル培地MEMJRHBiosciences中に維持する。RSVの抗原性タンパク質を発現するhMPV、例えばhMPV/RSVFSOL、野生型MPV、例えばhMPV/NL/100、及び野生型RSV、例えば野生型RSVA2をVero細胞で増殖させる。細胞は、0.1PFU/細胞の感染多重度MOIでウイルスに感染させる。感染の3~5日後に、細胞及び上清を収集し、10×SPG10×SPGは、2.18Mショ糖、0.038MKH2PO4、0.072MK2HPO4、0.054ML-グルタミン酸であるを最終濃度が1×になるように添加することによって安定化させる。ウイルスストックは-70°Cで保存する。ウイルス力価は、プラークアッセイによってVero細胞で決定する。PIV3VMRD又はMPVのヤギポリクローナル抗血清Biogenesisを使用した免疫ペルオキシダーゼ染色の後に、プラークを定量する。MPV及びRSVに対して血清陰性のアフリカのミドリザルCercopithecusaethiops3.5から6.5歳、2.6から5.8kgは、研究開始日の14日前に採取する霊長類プレ血清のMPVFIgGELISAImmunoBiologicalLaboratories及びRSVFIgGELISAImmunoBiologicalLaboratoriesを用いて同定する。MPVFIgGELISAは次の通りに行う。製造者の指示に従ってELISAキットImmunoBiologicalLaboratories、HamburgGermanyを使用して、MPVFIgGが存在するかどうか、1、28、及び56日目にワクチン接種された動物から得た霊長類血清を分析する。サル二次抗血清RocklandIncを、1:1000希釈で使用する。MPVFIgG抗体価は、log2IgGU/mlとして表す。製造者の指示に従ってELISAキットImmunoBiologicalLaboratories、Hamburg、Germanyを使用して、RSVFIgGが存在するかどうか、1、28、及び56日目にワクチン接種された動物から得た霊長類血清を分析する。サル二次抗血清RocklandIncを、1:1000希釈で使用する。RSVFIgG抗体価は、log2IgGU/mlとして表す。霊長類は、個別のMicro-Isolator商標ケージに収容する。サルをケタミン-バリウム混合物で麻痺させ、それぞれ、RSVの抗原性タンパク質を発現するhMPVベクター、例えばhMPV/RSVFSOL、野生型MPV、例えばhMPV/NL/100、及び野生型RSV、例えば野生型RSVA2に鼻腔内及び気管内感染させる。鼻腔用量容積は鼻孔あたり0.5mlであり、気管内用量容積は1mlである。1日目に、2~3×105PFUのウイルスを含有する2ml用量を各動物に与える。プラセボ動物群には、同じ用量容積のOpti-MEMを与える。28日目に、7×105PFUの野生型RSVA2各部位に1mlを用いて、全動物に対して気管内及び鼻腔内でチャレンジを行う。鼻咽腔NPスワブは11日間毎日採取し、気管洗浄TL試料は免疫化及びチャレンジの1、3、5、7、及び9日後に採取する。大腿静脈から得られる血液試料は、血清学的解析のために0、7、14、21、28、35、42、49、及び56日目に採取する。発熱を示す体温変化、風邪の徴候、鼻水、くしゃみ、食欲不振、及び体重について動物をモニターする。霊長類のNP試料及びTL試料中に存在するウイルスは、MPVヤギポリクローナル抗血清で免疫染色されるVero細胞を使用したプラークアッセイによって定量する。平均ピークウイルス力価は、免疫化又はチャレンジの後の任意の11日間に各動物で測定されたピークウイルス力価の平均を表す。プラーク減少中和アッセイPRNAは、hMPV/RSVFSOLに感染した霊長類から、投与の1、28、及び56日後に得られた血清に関して行う。霊長類血清は、2倍の連続希釈を行い、100PFUの野生型RSVA2又は野生型MPV、例えばhMPV/NL/100とそれぞれモルモット補体の存在下、4°Cで1時間インキュベートする。ウイルス血清混合物をVero細胞単層培養に移し、2FBS及び1抗生物質を含有するEMEM/L-15培地JRHBiosciences、LenexaKS中に調製した1メチルセルロースをかぶせる。35°Cで6日間インキュベートした後、定量のため、それぞれRSVヤギポリクローナル抗血清又はhMPVヤギポリクローナル抗血清を使用して、単層培養を免疫染色する。中和力価は、50のウイルスプラークを阻害する最大の血清希釈率の逆数のlog2として表される。hMPV微量中和試験及びRSVA2微量中和試験をそれぞれVero細胞で行う。1:4に始まる、霊長類血清の2倍連続希釈を、それぞれ、100TCID50のhMPV又はRSVA2と共に37°Cで、60分間インキュベートする。続いて、ウイルス血清混合物を96ウェルプレート中の細胞単層培養に移し、37°Cで、6日間インキュベートし、その後、全てのウェルをCPEに関して観測する。中和力価は、CPEを阻害した最も高い血清希釈の逆数として表される。≦1:4試験された最も低い血清希釈の中和抗体価には、力価の逆数のlog2として2を割り当てる。MPV/RSV2価ワクチン候補株の複製効率を検査するために、以下の通りに実験が設計されている。1日目に、MPVワクチン候補株、例えばhMPV/RSVFSOLを2~3×105PFUの用量で鼻腔内投与及び気管内投与することによって、MPV及びRSVに対して血清陰性のアフリカミドリザル一群あたり8頭の動物を免疫する。陽性対照群の1つは野生型MPV、例えばhMPV/NL/100に感染し、別の陽性対照群は野生型RSVA2に感染し、そして、陰性対照群にはプラセボ培地が投与される。28日目に、各群を2つのセクションに分割し、各群における1セクション全ての動物に対して、7×105PFUの野生型MPV、例えばhMPV/NL/100を用いて、鼻腔内及び気管内でチャレンジを行う。各群のもう一方のセクションにおける全ての動物に対して、7×105PFUの野生型RSVA2を用いて、鼻腔内及び気管内でチャレンジを行う。この検査の間、動物はMicro-Isolatorケージに収容する。鼻咽腔スワブは免疫及びチャレンジの後11日間、毎日採取し気管洗浄試料は免疫及びチャレンジの2、4、6、8、及び10日後に採取する。抗体分析用の血清試料は、検査期間中を通して7日間毎に採取する。それぞれ、MPV感染及びRSV感染に対する免疫防御を評価するために、ワクチン接種された霊長類に対して、免疫化の4週間後に、それぞれ、高用量の野生型MPV、例えばhMPV/NL/100と、高用量の野生型RSVA2とを用いてチャレンジを行った。有効性は、感染動物のURT及びLRTで除去されたチャレンジMPVウイルスの力価の減少として測定する。MPV/RSV2価ワクチン候補株の有効性は、さらに、免疫化の4週間後に産生されたMPV中和抗体の抗体価のレベル、及び、RSVFIgG血清抗体の抗体価のレベルによって評価する。MPV中和抗体の抗体価は、50プラーク減少中和アッセイPRNAを用いて決定する。MPV/RSV2価ワクチン候補株によって誘発される免疫応答は、RSVFタンパク質に特異的なIgGレベルを、投与前1日、投与の4週間後28日目、そして誘発の4週間後56日目に測定することによっても分析される。RSVFIgG血清抗体の存在は、ELISAを用いて判定する。血清中のMPV中和活性の存在は、hMPV微量中和試験の使用によっても決定できる。MPV/RSV2価ワクチンによって、RSV感染から保護できるかどうかを評価するために、RSV中和の存在に関してもプラーク減少中和アッセイ又は微量中和試験を用いて霊長類血清を分析する。"