"以下の工程を含む、植物または細菌の1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼDXS活性を向上し、テルペンの産生量を増加する方法:a配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22および配列番号23を含む群から選択される参照配列および植物,細菌または酵母の配列との間の配列比較をすることにより植物、細菌または酵母のDXS活性を有するポリペプチド上の少なくとも1つの変異部位、好ましくは2つの変異部位を決定する工程;b少なくとも1つの変異部位、好ましくは2つの変異部位上で変異を進める工程;c典型的なDXSと比較して向上したDXS活性を有するポリペプチドを得る工程。請求項1に記載の方法で得られ得る前記植物または細菌の典型的なDXSと比較して向上したDXS活性を有する植物または細菌のポリペプチド。配列番号21の配列またはその断片と少なくとも90の同一性を有する配列を含み、配列番号21の位置213のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ/または配列番号21の位置234のアミノ酸がシステインである、DXS活性を有する単離されたポリペプチド。配列番号22の配列またはその断片を有し、配列番号22の位置213のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ/または配列番号22の位置234のアミノ酸がシステインである、請求項3に記載の単離されたポリペプチド。前記ポリペプチドが配列番号19の配列を含む、請求項3または4に記載のポリペプチド。前記ポリペプチドが配列番号20の配列を含む、請求項3または4に記載のポリペプチド。配列番号1の配列またはその断片と少なくとも90の同一性を有する配列を含み、配列番号1の位置310のアミノ酸がシステインであり、かつ/または配列番号1の位置288のアミノ酸がアスパラギンである、DXS活性を有する単離されたポリペプチド。前記ポリペプチドが、配列番号2の配列またはその断片と少なくとも90の同一性を有する配列を含み、配列番号2の位置306のアミノ酸がシステインでありかつ/または配列番号2の位置284のアミノ酸がアスパラギンである、請求項7に記載のポリペプチド。前記ポリペプチドが配列番号4の配列を含む、請求項8に記載のポリペプチド。前記ポリペプチドが配列番号6の配列を含む、請求項8に記載のポリペプチド。請求項2~10のいずれか1項に記載のポリペプチドをコード化した配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。請求項11に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。請求項11に記載のポリヌクレオチドまたは請求項12に記載のベクターを含む、形質転換された宿主細胞。前記形質転換された宿主細胞が、真正細菌細菌、古細菌およびシアノバクテリア細胞を含む群から選択される原核細胞であり、好ましくは前記原核細胞が、大腸菌細胞である、請求項13に記載の形質転換された宿主細胞。前記宿主細胞が、動物細菌、真菌細菌、酵母細菌、および植物細胞を含む群から選択される真核細胞であり、好ましくは、ヴィティスヴィニフェラ、タバコ、およびシロイヌナズナの細胞を含む群から選択される植物細胞である、請求項13に記載の形質転換された宿主細胞。請求項11に記載のポリヌクレオチドまたは請求項12に記載のベクターを含む、遺伝子組み換え細菌。請求項11に記載のポリヌクレオチド、請求項12に記載のベクター、または請求項13、14または15に記載の宿主細胞を含む、遺伝子組み換え植物。以下の工程を含む、請求項17に記載の遺伝子組み換え植物の調製方法:a請求項12に記載のベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程;b請求項2~10および21のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現する形質転換された植物細胞を選択する工程;およびc前記形質転換された植物細胞から遺伝子組み換え植物を生成する工程。以下の工程を含む、植物または細菌中でテルペンの産生量を増加させることを高められたDXS酵素の製造方法:a請求項13~15のいずれか1項に記載の形質転換された宿主細胞を培養する工程;b植物、細菌または酵母中のテルペンの産生量を増加することを可能とする高めあられたDXS酵素を得る工程。請求項19に記載の方法により得られ得る向上したDXS活性を有するポリペプチド。以下の工程を含む、宿主細胞中でのテルペンの製造方法:aテルペンを製造するのに効果的な条件下で、請求項13~15のいずれか1項に記載の形質転換された宿主細胞を培養する工程;b前記宿主細胞から前記テルペンを得る工程。特定のジテルペノイドは、商業的に、特に医薬品部門で有効に使用されている。特にタキサン類、パクリタキセルおよびドセタキセルのジテルペノイドは、乳癌および卵巣癌の治療に実際に使用されている。パクリタキセルは、イチイタキサス種から抽出される天然分子であり、一方で、ドセタキセルは、同じくイチイから抽出されるパクリタキセルの前駆体である10-デアセチルバッカチンIIIまたは10-DABIIIにから誘導される半合成分子である。イチイの多くのパクリタキセルの生合成遺伝子は記載されている。これらの分子は、イチイエキス中の10-DABIIIおよびとりわけパクリタキセルは比較的少量のせいで、およびその分子構造の複雑さのため工業的にスケールアップする方法がないせいで、生産するにコストがかかる。従って、注目したテルペンのより安価な製造方法だけでなく、未だ容易に合成できないテルペン誘導体の製造方法の需要が高い。伝統的な化学プロセスにより有機分子を製造する化学工業は、次第に微生物細胞工場を利用する製造プロセスに変わっている。グリーンケミストリーへのこの発展の鍵となる要素は、いわゆるバイオテクノロジープロセスがより環境にやさしいこと、多くの微生物により製造される化合物は、複雑すぎて有機合成により得にくいこと、および微生物細胞工場では、特定の化合物の限定されない供給を表すこと、である。最近、イソプレノイドは、植物からの抽出または化学合成により大量スケールで製造されている。これらの両方の方法の主な欠点は、収率が低く、高価であることである。第3のオプションはインビトロの酵素変換により、所望のイソプレノイドを製造することであるが、このアプローチは利用可能な前駆体が限られ、それゆえほとんどの場合経済的に実行可能ではない。イソプレノイド製造のための微生物の代謝工学は、発酵プロセスで安価な炭素源から大量のイソプレノイドの製造をもたらし、これにより、工業的なイソプレノイド製造における現在の問題の多くを解決するかもしれない一方で、天然化合物のイソプレノイド群に見出される大きな多様性のバイオテクノロジーの開発を可能とする。いくつかのイソプレノイド生成物は、リモネン、カロテノイド、エピセドロール、タキサジエン等を含む遺伝子改変の微生物により製造される。大腸菌内でイソプレノイド産生量を向上させるため、遺伝子dxsDXPシンターゼをコード化する、dxrDXPレダクトイソメラーゼおよびidiIPP異性化酵素は、過剰発現され、上記のイソプレノイド生成物のいくつかのよい結果を有するMAURYら2005年にレビューされている。大腸菌によるアモルファジエン産生量の更なる増加は、大腸菌のアモルファジエン産生菌中で出芽酵母サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeからメバロン酸経路を発現することによりなされている。いくつかのイソプレノイド化合物は、また出芽酵母中のエピセドロール、出芽酵母およびトルラ酵母中のリコピンおよびβ-カロチンを含む酵母中でも製造される。いくつかの場合、酵母中でイソプレノイド生産量は、HMG1コード化HMG-COAレダクターゼの過剰発現により向上することが示されているMAURYら2005年にレビューされている。上記されている背景技術にも関らず、テルペンおよびテルペノイドを製造するためのプロセス、および特に、従来から知られている方法におけるより高収率で、より安価かつ短時間で微生物中にテルペンを蓄積する方法の要求がまだある。それゆえ、この要求を満たすテルペンまたはテルペノイドの製造方法を提供することが本発明の目的である。大量のテルペンを蓄積し、および/または周囲媒質に分泌する微生物を製造することが本発明の目的である。そのような微生物によるテルペンの製造は、好ましく、長時間安定である。さらに、本発明の目的は、農作物の栄養価を増加する手段として、イソプレノイド成分の純度を高める、または草食動物、害虫または病原体への耐性を増加することにより植物自体の環境適応度を向上させる目的で、向上したイソプレノイド産生量を有する植物へ遺伝子を操作することである。本発明は、典型的には、dxs遺伝子を発現する植物、細菌または酵母と比較して、これらの2つの遺伝子の1つを発現し、かつテルペンの蓄積をかなり向上し得る遺伝子組み換えの植物、細菌または酵母を提供することにより本発明の先行技術の本質的な欠点および他の欠点を解決することを目的とする。本発明は、以下の工程を含む、植物または細菌の1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼDXS活性を向上し、テルペンの産生量を増加する方法に関する:a配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22および配列番号23を含む群から選択される参照配列および植物,細菌または酵母の配列との間の配列比較をすることにより植物、細菌または酵母のDXS活性を有するポリペプチド上の少なくとも1つの変異部位、好ましくは2つの変異部位を決定する工程;b少なくとも1つの変異部位、好ましくは2つの変異部位上で変異を進める工程;c典型的なDXSと比較して向上したDXS活性を有するポリペプチドを得る工程。第1の本発明の目的は、以下の工程を含む、テルペンの産生量を増加するために植物または細菌の1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼDXS活性を向上する方法に関する:a配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22および配列番号23を含む群から選択される参照配列と植物または細菌の配列との配列比較を行うことにより、植物または細菌のDXS活性を有するポリペプチドにおいて、少なくとも1つ、好ましくは2つの変位部分を決定する工程;b少なくとも1つの変位部分、好ましくは2つの変位部分において変位を進行させる工程;c典型的なDXSと比較して向上したDXS活性を有するポリペプチドを得る工程。変位部分を決定する工程aは、配列比較を連続して行うことによりなされうる。変位する植物または細菌の配列は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22および配列番号23を含む群から選択される参照配列とともに最適にアライメントする。好ましくは、参照配列は、配列番号4、配列番号6、配列番号19および配列番号20を含む群から選択される。より好ましくは、配列番号4または配列番号6は、植物のポリペプチドの変位部分を決定するために参照配列として使用され、および配列番号19または配列番号20は、細菌のポリペプチドの変位部分を決定するために参照配列として使用される。一例として、ヴィティスヴィニフェラ由来のDXS中のK284およびR306に対応するアミノ酸は、ClustalWThompsonら、1994年またはMUSCLEEdgar、2004年のような多配列アライメントコンピュータープログラムを使用して別の生物由来のDXSタンパク質中に確認され得る。本明細書で使用する場合、用語DXS活性の向上と向上したDXSは、本発明において、典型的なDXS遺伝子を発現する宿主細胞と比較して、この組み替えられたDXSにより形質転換された宿主細胞、例えば、植物、細菌または酵母中でのテルペンの産生量および/または蓄積を増加させることを可能とする組み替えられたDXSを意味する。本明細書で使用する場合、典型的なDXS遺伝子の表現は、高頻度で現れる遺伝子であり、例えば、配列番号8としても知られるDXSMoDXS1の野生型である。本明細書で使用する場合、用語変異は、オリジナルの核酸配列の配列での任意の組み替えに対応する。これらの変異は、少数の変異、または多数の変異を含む。少量の変異は、DNA中の1以上の余剰ヌクレオチドの点変異、挿入または欠失を含み、DNA中の1または少数のヌクレオチドで遺伝子に影響を与える変異である。点変異は、無症状変異、ミスセンス変異およびナンセンス変異であり得る。影響を与える遺伝子重複、欠失、または変異のようなゲノム構造での大量の変異は、DNAのかねての分離部分を並べて、分離した遺伝子を一緒にして機能的に異なった融合遺伝子を形成する可能性をもたらす。これらの最後の変異は、染色体転座、中間部欠損、染色体逆位およびヘテロ接合性の消失を含む。好ましくは、本発明の変異は点変異である。点変異は、1つのアミノ酸または数パーセント典型的には、5未満、より典型的には、4未満、2未満または1未満のアミノ酸を置換し、付加しまたは欠失させる個々の置換、欠失または付加である。本明細書で使用する場合、用語組み替え部分は、これまでに記載された変異を受ける1ヌクレオチドまたは複数ヌクレオチドによって表されるポリヌクレオチドの遺伝子座を意味する。その変異をするための方法は、当業者にとっては周知である。例えば、部位特異的変異誘発は、クイックチェンジQuikChangeキットカルフォルニア州ラホヤのストラタジーンStratagene製を使用してなされうる。部位特異的変異誘発の方法は、ZollerとSmithにより、Oligonucleotide-directedmutagenesisusingM13-derivedvectors:anefficientandgeneralprocedurefortheproductionofpointmutationsinanyDNAfragmentNucleicAcidsRes.、第10巻、p6487-6500、1982年に記載されている。本明細書で使用する場合、テルペンの産生量を増加するの表現は、この組み替えられたDXSにより形質転換された宿主細胞、例えば、植物、細菌または酵母中で製造されおよび/または蓄積されるテルペンの量が、典型的なDXS遺伝子を発現する宿主細胞中で製造されおよび/または蓄積されるテルペンの量より高いことを意味する。好ましくは、本発明におけるテルペンの産生量は、10倍増加される。一例として、大腸菌のDXS酵素をコード化するポリヌクレオチドに導入されるK234⇒Cの変異は、少なくとも10倍テルペンの産生量を増加する。本発明の第2の目的は、本発明の方法により得られるであろう、植物または細菌の典型的なDXSと比較して向上したDXS活性を有する植物または細菌のポリペプチドに関する。本発明の第3の目的は、配列番号21の配列またはそれらの断片と少なくとも90同一性を有する配列を含むDXS活性を有する単離されたポリペプチドに関し、ここで、配列番号21の位置213のアミノ酸はアスパラギンであり、かつ/または配列番号21の位置234のアミノ酸はシステインである。配列番号21は、文献でしばしば特徴付けられているデイノコックスラジオデュランスを含む細菌性DXS配列のコンセンサスである。好ましい実施形態では、本発明の単離されたポリペプチドは、配列番号22の配列またはそれらの断片を有し、ここで、配列番号22の位置213のアミノ酸はアスパラギンであり、および/または配列番号22の位置234のアミノ酸はシステインである。配列番号22は、デイノコックスラジオデュランスのDXS配列を包含しないことを除いて、配列番号21と類似していることを特徴とする細菌性DXS配列のコンセンサスである。より好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは配列番号19の配列を含む。より好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは配列番号20の配列を含む。本発明の第4の目的は、配列番号1の配列またはそれらの断片と少なくとも90の同一性を有する配列を含むデオキシ-D-キシルロースシンターゼDXS活性を有する単離されたポリペプチドに関し、ここで、配列番号1の位置310のアミノ酸はシステインであり、および/または配列番号1の位置288のアミノ酸はアスパラギンである。本明細書で使用する場合、用語アミノ酸は、すべての天然に生じるL-α-アミノ酸またはそれらの残査を意味する。本発明のアミノ酸は、一文字または三文字記号AspDアスパラギン酸;IleIイソロイシン;ThrTトレオニン;LeuLロイシン;SerSセリン;TyrYチロシン;GluEグルタミン酸;PheFフェニルアラニン;ProPプロリン;HisHヒスチジン;GlyGグリシン;LysKリジン;AlaAアラニン;ArgRアルギニン;CysCシステイン;TrpWトリプトファン;ValVバリン;GlnQグルタミン;MetMメチオニン;AsnNアスパラギンの何れかで特定される。天然アミノ酸は、化学的に組み替えられたアミノ酸によって置換されてもよいことも理解されるだろう。典型的には、そのような化学的に組み替えられたアミノ酸は、本発明のポリペプチドの半減期を増加しうる。本明細書で使用される場合、用語1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼDXSと略すは、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド-3-リン酸GAPが関与し、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸を形成するトランスケトラーゼ型縮合を触媒することができる酵素を意味する。その酵素の活性は、Loisら1998年によって記載されているように放射標識された基質を使用して簡単に決定され得る。本発明の酵素反応混合物は、最終体積50μL中に50mMのトリス-HClpH=7.5、2.5mMのMgCl2、1mMのチアミン二リン酸、5mMの2-メルカプトエタノール、0.2mMの[2-14C]ピルビン酸15.9mCi/mmol、NEN、50mMのピルビン酸、50mMのDL-グリセルアルデヒド-3-リン酸を含む。37°Cで2時間のインキュベーションの後、その反応は、3分間80°Cで熱することでとめられる。13,000g、5分間の遠心分離の後、その上清2~5mlの10μLはTLCプレートMerck製のシリカゲル60上に載せる。ラベルされたD-1-デオキシキシルロース-5-リン酸は、溶媒としてn-プロピルアルコール/酢酸エチル/H2O6:1:3を使用して[2-14C]ピルビン酸から分離されオートラジオグラフィーまたはシンチレーション測定によって定量される。あるいは、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼの蛍光分析は、Querolら2001年によって記載されるとおりに使用され得る。好ましくは、本発明の単離されたポリペプチドは、配列番号2のポリペプチド配列またはそれらの断片と少なくとも90アミノ酸配列の同一性を有する配列を含み、ここで、配列番号2の位置306のアミノ酸は、システインであり、および/または配列番号2の位置284のアミノ酸は、アスパラギンである。さらに好ましくは、本発明のポリペプチドは、酵素活性を有し、この活性はポリペプチドの配列番号3と比べて少なくとも50優位であり、好ましくは少なくとも70、最も好ましくは少なくとも100優位である。より好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号4の配列を含む。より好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号6の配列を含む。本明細書で使用する場合、2つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、配列の最良のアライメントで得られ、比較される2つの配列の間での同一のアミノ酸の割合を意味し、この割合は、完全に統計的であり、これらの2つの配列の間での違いは、本発明のアミノ酸配列に無作為に広がる。本明細書で使用する場合、最良のアライメントまたは最適なアライメントは、決定される同一性の割合以下を参照が最も高いアライメントであることを意味する。2つのアミノ酸配列の配列の比較は、最良のアライメントについて前もって整列されているこれらの配列を比較することにより通常現実化される;この比較は、類似の局部を確認し、および比較するために比較セグメントで現実化される。比較を達成する最良の配列のアライメントは、手作業の他に、SMITHとWATERMANにより開発された全体的な相同性アルゴリズムAd.App.Math.、第2巻、p482、1981年を使用することによって、NEDDLEMANとWUNSCHによって開発された局所的な相同性アルゴリズムJ.Mol.Biol.,vol.48,p:443,1970を使用することによって、PEARSONとLIPMANによって開発された類似の方法Proc.Natl.Acd.Sci.USA、第85巻、p2444、1988年を使用することによって、アルゴリズムを使用するコンピューターソフトウェアウィスコンシンジェネティックスソフトウェアパッケージ米国ウィスコンシン州マディソンサイエンスドライブ575のジェネティクスコンピューターグループ中のGAP、BESTFIT、BLASTP、BLASTN、FASTA、TFASTAを使用することによって、MUSCLEマルチプルアラインメントアルゴリズムEdgar,RobertC.,NucleicAcidsResearch、第32巻、p1792、2004年を使用することによって実現されうる。最良の部分的なアライメントを得るため、当業者は好ましくはBLOSUM62マトリクス、またはPAM30マトリクスと一緒にBLASTソフトウェアを使用し得る。2つのアミノ酸配列の同一性の割合は、最適に配列されたこれらの2つの配列、を比較することにより決定され、そのアミノ酸配列は、これらの2つの配列の最適のアライメントを得るために本発明の参照配列に対して、付加または欠失を含みうる。同一性の割合は、これらの2つの配列の間の同一性のパーセントを得るために、2つの配列の間の同じ位置の数を決定することにより、比較する位置の総数でこの数量を割り算することにより、および得られた結果を100倍することにより計算される。好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも95、好ましくは少なくとも99、最も好ましくは100の同一性を有する。本明細書で使用する場合、配列番号1または配列番号2の断片は、少なくとも300のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも400アミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも500のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを意味する。DXS活性を有する配列番号1または配列番号2の断片の一例として、当業者は、切断されたMODXS2のポリペプチドに対応する配列番号5、または切断されたGWDXS2のポリペプチドに対応する配列番号7を引用することができる。一例として、植物のDXS配列のコンセンサスは、配列番号23である。それは、ヴィティスヴィニフェラのDXS配列MO_DXS1、およびシロイヌナズナ、ピヌスデンシフローラ、クラミドモナスレインハードティおよびドナリエラサリナのDXS配列を含む。本発明の第5の目的は、本発明に係るポリペプチドをコード化する単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態、またはDNAの形態であってよく、好ましくはDNAの形態であってよい。本発明のDNAは、二本鎖または一本鎖であってよい。好ましい実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号9MODXS2、配列番号10GWDXS2、配列番号15E.coliDXS-K213Nおよび配列番号16E.coliDXS-K234Cを含む群から選択される配列を含む。本発明の第6の目的は、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクターに関する。そのベクターは、クローニングまたは発現ベクターであり得、好ましくは発現ベクターであり得、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってよい。そのようなベクターは、細菌性プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組み合わせ由来のベクター、ワクチニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルス性DNAを含んでいてよい。多くの好適なベクターは、当業者にとって公知であり、市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性:pQE70、pQE60、pQE-9キアゲン製、pbs、pD10、フェージスクリプトphagescript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46Aストラタジーン製、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5ファルマシア製。真核性:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSGストラタジーン製、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLファルマシア製。しかしながら、任意の他のベクターが、本発明の宿主に複製可能かつ実行可能な限り使用されてもよい。その発現ベクター中の本発明のポリヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列は、mRNAの合成に向けられるために、適切な発現制御配列プロモーターに操作可能に結合される。そのようなプロモーターの代表例として、当業者は、CMVの即時型のような原核性または真核性プロモーター、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期のSV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネイン-Iを意図し得る。本発明の発現ベクターは、翻訳開始用のリボソーム結合部位および転写ベクターも含む。本発明のベクターは、発現を増幅するための適切な配列を含んでよい。加えて、本発明の発現ベクターは、真核細胞培養のジヒドロ葉酸還元酵素耐性またはネオマイシン耐性のような、または大腸菌中のテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性のような形質転換宿主細胞の選択用の表現型形質を提供する、好ましくは1以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。本明細書で上記されているような適切なポリヌクレオチド配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含む本発明のベクターは、宿主にそのポリペプチドを発現することを可能とする形質転換するために用いられてもよい。一例として、これまでに記載されたポリペプチドをコード化するDNAを高等真核生物によって転写することは、そのベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加されうる。エンハンサーは、DNAのシス作用エレメントであって、通常、DNAの転写を増加するためにプロモーターに作用する約10~300pbである。エンハンサーの例は、SV40エンハンサー、CMV初期プロモーターエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。本発明の第7の目的は、これまでに記載されたポリヌクレオチドまたはベクターを含む形質転換された宿主細胞に関する。用語形質転換された宿主細胞、形質転換のおよび形質転換は、細胞へのDNAの導入を意味する。当該細胞は、宿主細胞と呼ばれ、および原核細胞または真核細胞であってもよい。典型的な原核宿主細胞は、大腸菌の種々の系統を含む。典型的な真核性宿主細胞は、トウモロコシ細胞のような植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または動物細胞である。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると認められる。本発明に係る形質転換された宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。宿主細胞への、これまでに記載されたポリヌクレオチドまたはベクターの導入は、リン酸カルシウムの形質移入、DEAE-デキストランを介在した形質移入、または電気穿孔のような、当業者に周知の方法によってもたらされうる。好ましい実施形態によれば、本発明に係る形質転換された宿主細胞は、真正細菌細胞、古細菌細胞およびシアノバクテリア細胞を含む群から選択される原核細胞である。より好ましくは、本発明に係る形質転換された宿主細胞は、原核細胞であり、さらにより好ましくは、大腸菌細胞である。原核生物は、本発明の初期のクローニング工程の宿主細胞として使用されてもよい。それらは、大量のDNAの迅速な製造に、部位特異的変異誘発に使用される一本鎖のDNA鋳型の製造に、多くの突然変異体を同時にスクリーニングするために、および生成された突然変異体のDNA配列を決定をするために特に有用である。好適な原核宿主細胞は、大腸菌K12系統94ATCC第31,446、大腸菌系統W3110ATCC第27,325、大腸菌X1776ATCC第31,537、および大腸菌Bを含む;しかしながらHB101、JM101、NM522、NM538、NM539のような大腸菌の他の系統の多く、およびバチルススブチリスBacillussubtilisのような桿菌、他のサルモネラチフィリウムSalmonellatyphimuriumまたはセラチアマルセッセンスSerratiamarcesansのような腸内細菌、および種々のシュードモナスPseudomonas種を含む多くのの他の種および属の原核生物は、すべて、宿主として使用されてもよい。別の好ましい実施形態によれば、本発明に係る形質転換された宿主細胞は、動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、および植物細胞を含む群から選択される真核細胞である。好ましくは、本発明の真核細胞は、真菌性微生物であり、より具体的には酵母である。好適な微生物の包括的でないリストは、以下のものを含む:酵母菌属に属する種例えば、出芽酵母S.cerevisiae、サッカロマイセスバヤナスS.bayanus、サッカロマイセスパストリアヌスS.pastorianus、サッカロマイセスパラドキサスS.paradoxus、サッカロマイセスエキシグウスS.exiguous、サッカロマイセスセルバッジS.servazzi、サッカロマイセスウバルムS.uvarum、サッカロマイセスクルイベリS.kluyveri、およびサッカロマイセスカステリS.castellii、クリベロマイセスKluyveromyces属に属する種例えば、クルイベロマイセスラクチスK.lactis、クルイベロマイセスマルキシアヌスバールマルキシアヌスKmarxianusvar.marxianus、クルイベロマイセスサーモトレランスK.thermotolorens、クルイベロマイセスワルチK.waltii、クルイベロマイセスデルフェンシスK.delphensis、クルイベロマイセスノンファメンタスK.nonfermentas、およびクルイベロマイセスヴィッケルハミイK.Wickerhamii、カンジダ属に属する種例えば、カンジダウチリスC.utilis、カンジダトロピカリスC.tropicalis、カンジダカステリC.castellii、およびカンジダヒュミリスC.humilis、チゴサッカロマイセスZygosaccharomyces属に属する種例えば、チゴサッカロマイセスルーキシィZ.rouxii、チゴサッカロマイセスバイリーZ.bailii、チゴサッカロマイセスフェルメンタチZ.fermentati、チゴサッカロマイセスビスポラスZ.bisporus、およびチゴサッカロマイセスフロレンティナスZ.florentinus、ピキアPichia属に属する種例えば、ピキアスティピディスP.stipidis、ピキアパストリスP.pastoris、ピキアソルビトフィアP.sorbithophilaおよびピキアアノマーラP.anomala、または他の種例えば、ハンゼヌラポリモルファHansenulapolymorpha、ヤローウィアリポリティカYarrowialipolytica、デバロマイセスハンセニィDebaromyceshansenii、シゾサッカロマイセスポムベSchizosaccharomycespombe、トルラスポラデルブルッキィTorulasporadelbueckii、アッシュビヤゴッシピィAshbyagossipie、クロコウジカビAspergillusniger、アスペルギルスアワモリAspergillusawamori、アスペルギルスオリザエAspergillusoryzae、アスペルギルスニデュランスAspergillusnidulans、ペニシリウムクリゾゲナムPenicilliumchrysogenum、リゾプスオリーゼRhizopusoryzae、およびムコールサーシネロイデスMucorcircenelloides。より好ましくは、本発明の真核細胞は、酵母であり、さらにより好ましくは、本発明の微生物は、出芽酵母である。例えば、それは、DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH.MascheroderWeg1b,D-38124Braunschweig、ドイツ、受入番号:DSMZ179002006年1月27日で寄託されている出芽酵母株である。本発明の目的で、異種の経路は、明確な出発物質から明確な中間段階で化合物を形成する活性を有し、微生物の野生型で存在しない経路である。より好ましくは、この異種の経路は、異種のDNAに由来する経路である。あるいは、本発明の真核細胞は、植物細胞であり、より好ましくは、ヴィティスヴィニフェラ、タバコ、およびシロイヌナズナの細胞を含む群から選択される植物細胞であり、さらにより好ましくは、その植物細胞は、ヴィティスヴィニフェラ細胞であり、好ましくはヴィティスヴィニフェラCvマスカットオットネルまたはヴィティスヴィニフェラCvゲヴェルツトラミナー細胞であり、より好ましくはヴィティスヴィニフェラCvゲヴェルツトラミナー細胞である。本発明の第8の目的は、これまでに記載されたポリヌクレオチドまたはベクターを含む遺伝子組み換え細菌に関する。本発明の第9の目的は、これまでに記載されたポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を含む遺伝子組み換え植物に関する。培養された植物の宿主細胞の形質転換は、普通、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumifaciensを経てなされる。このようにして、遺伝子組み換え植物は、例えば、本発明のベクターすなわち1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼをコード化するおよび選択可能なマーカー遺伝子例えば、カナマイシンに対する耐性をコード化しているKan遺伝子をHOECKEMAらNature、第303巻、p179-181、1983年に記載されているようにヘルパーTiプラスミドを含むアグロバクテイウムツメファシエンスAgrobacteriumtumifaciensに転移することにより、およびANらPlantPhysiology、第81巻、p301-305、1986年に記載されているように、このアグロバクテリウムAgrobacterium細胞を植物の葉の切片、または他の組織もしくは細胞と培養し、形質転換することにより得られうる。しかしながら、細胞にDNAを導入する方法、例えば、ポリブレンKawaiとNishizawa、Mol.Cell.Biol.、第4巻、p1172、1984年、プロトプラスト融合Schaffner,Proc.Natal.Acad.Sci.USA、第77巻、p2163、1980年、電気穿孔Neumannら,EMBOJ.、第1巻、p841、1982年、および直接、核への微量注入Capecchi,Cell、第22巻、p479、1980年のような他の方法が使用されうる。形質転換の植物カルスcalliは、例えば、カナマイシン、およびカルス組織および芽誘導のための適切な量のナフタリン酢酸およびベンジルアデニンのような植物ホルモンを含む培地で細胞を成長させることにより、選択可能なマーカーを通して選択されてもよい。成長した植物細胞は、その後、再生され、および得られる植物は当業者にとっては周知である技術を使用して土壌に移植されてもよい。好ましい実施形態によれば、本発明の遺伝子組み換え植物は、これまでに記載されたようにポリヌクレオチドまたはベクターをそのゲノムに組み込む。好ましくは、上記植物は、木、野菜、多肉植物および観賞植物を含む群から選択される。さらに好ましくは、その遺伝子組み換え植物は、ジメタゾンFMC57020;2-2-クロロフェニルメチル-4,4-ジメチル-3-イソオキサリジノンとも呼ばれるクロマゾンに耐性を有する。本明細書で使用する場合、クロマゾンに耐性を有する遺伝子組み換え植物は、10μMのクロマゾン存在下で成長する植物に対応するCarretero-PauletL,CairoA,Botella-PaviaP,BesumbesO,CamposN,BoronatA,Rodriguez-ConcepcionM.のEnhancedfluxthroughthemethylerythritol4-phosphatepathwayinArabidopsisplantsoverexpressingdeoxyxylulose5-phosphatereductoisomerase.PlantMolBiol、第62巻、p683-95、2006年。さらに好ましくは、その遺伝子組み換え植物は、向上した芳香を有する。一例として、本発明の遺伝子組み換え植物は、シソ科例えば、オシマムOcimumバジル、ラベンダー、オレガノ属オレガノ、ハッカ属ミント、サルビアセージ、ロスメシナスRosmecinusローズマリー、ジャコウソウタイム、キダチハッカ属およびヤグルマハッカ属;セリ科例えば、カルム属キャラウェイ、イノンドディル、フェニクラムFeniculumウイキョウおよびダウクス属ニンジン;キク科Asteraceaeキク科Compositae例えば、ヨモギ属タラゴンTarragon、ヤマヨモギ、およびヨモギキク属タンジーTansy;ミカン科例えば、柑橘類植物;バラ科例えば、バラ;フトモモ科例えば、ユーカリ、コバノブラシノキ属;イネ科例えば、オガルカヤ属シトロネラ;フウロソウ科ゼラニウムGeraniumおよび、モミ属例えば、カナダバルサム、ヒマラヤスギ属ヒマラヤスギおよびクロベ属およびビャクシン属を含む特定の針葉樹を含む群から選択される。本発明の第10の目的は、本発明の遺伝子組み換え植物の任意の世代の子孫であって、これまでに記載されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含む子孫に関する。その子孫は、植物または種子を形成し得る。本発明の第11の目的は、以下の工程を含む、これまでに記載されたとおりの遺伝子組み換え植物の調製方法に関する:a.これまでに記載されたとおりのベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程;b.これまでに記載されたとおりのポリペプチドを発現する形質転換された植物細胞を選択する工程:およびc.その形質転換された植物細胞から遺伝子組み換え植物を生成させる工程。形質転換の工程aは、電気穿孔、形質移入、裸のDNAの取得、原形質体生成、花粉、胚または多能性植物細胞へDNAの直接移転、アグロ細菌媒介形質転換、粒子銃、または微粒子銃のようなこれまでに記載されたとおりの周知の方法によりなされ得る。選択の工程bは、周知の方法でなされ得る。クロマゾン耐性の遺伝子組み換え植物を、その形質転換した植物細胞から生成する工程cは、その形質転換した植物細胞から多能正植物細胞の生成のような周知の方法によりなされ得る。好ましい実施形態によれば、その方法は、植物の種子を準備するためのものであり、この方法は、以下の工程をさらに含む:d.その遺伝子組み換え植物から種子を得る工程。特定の実施形態によれば、本発明の方法は、クロマゾンへの耐性のある遺伝子組み換え植物を得るためである。好ましくは、その遺伝子組み換え植物は、KleeH,HorschR,RogersSのAgrobacterium-MediatedPlantTransformationanditsFurtherApplicationstoPlantBiology.AnnualReviewofPlantPhysiology、第38巻、p467-486、1987年およびPotrykusIのGeneTransfertoPlants:AssessmentofPublishedApproachesandResults.AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology、第42巻、p205-225、1991年に記載されているような周知の方法により得られる。別の特定の実施形態で、本発明の方法は、テルペンの生合成の能力を向上した遺伝子組み換え植物を得るためのものである。向上したテルペンの生合成の能力を有する植物は、遺伝子組み換え植物の野生型と比べて、少なくとも50多くの、好ましくは少なくとも70多くの、より好ましくは少なくとも100多くのテルペンを合成する。好ましくは、テルペンは、ゲラニオール、リナノール、シトロネロール、ネロールおよびα-テルピネオールに関する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、酵素活性を有し、配列番号3のポリペプチドと比べて少なくとも50優れた、好ましくは少なくとも70、最も好ましくは配列番号3と比べて少なくとも100優れている。そのテルペンの生合成の能力を有している植物は、芳香性植物であってよく、その芳香性植物は、例えばメンタピペリタMenthapiperita、ラヴェンデュララティフォリアLavandulalatifolia、またはロスマリヌスオフィキナリスRosmarinusofficinalis、および薬用植物、例えば、アルテミシアアヌアArtemisiaannua、タキサスバッカータTaxusbaccata、カタランツスロセウスCatharanthusroseus、またはリトスペルマムエリスロリゾンLithospermumerythrorhizon、および価値のあるテルペン化合物を製造する任意の植物種、例えば、リコペルシコンエクスレンタムLycopersiconesculentum、マニホトエスクレンタManihotesculentaまたはオリザサティバOryzasativaのような、カルテノイドを合成する植物である。好ましくは、その遺伝子組み換え植物は、Kleeら1987年およびPotrykus1991年に記載されているような周知の方法により選択される。本発明の第12の目的は、以下の工程を含む、植物、細菌または酵母中でのテルペンの産生量を増加する向上したDXS酵素の製造方法に関する:a.これまでに画定されたとおりの形質転換された宿主細胞を培養する工程;b.植物または細菌中でテルペンの産生量を増加することを可能とする向上したDXS酵素を得る工程。好ましくは、向上したDXS活性を有するポリペプチドは、これまでに記載された方法により得られるだろう。本発明の第13の目的は、以下の工程を含む、宿主細胞中でのテルペンの製造方法に関する:a.DXS2酵素により、より多いテルペン基質モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、および/またはポリテルペンを製造するのに効果的な条件の下、これまでに画定されたようなテルペンを製造するのに効果的な条件の下例えば、植物、細菌または酵母細胞、形質転換された宿主細胞を培養する工程であって、より多いテルペン基質の製造が、そのテルペン基質の酵素による組み換えによる、より多くのテルペンの製造をもたらす工程、b.その宿主細胞からテルペンを得る工程。テルペンは、飽和または不飽和のイソプレンユニットC5、イソプレンユニットC5に基づく任意に置換された炭化水素、または実質的にイソプレンユニットC5からなるものである。テルペンは、非環状または環状であってもよい。本明細書で使用する場合、テルペンは、テルペン、テルペン誘導体、およびテルペノイドと言われている化合物を含み、前述の化合物の2つの属の1つに含まれてもよくまたは含まれなくてもよい。テルペン誘導体は、例えば、ヒドロキシル化、異性化、酸化還元またはアシル化のような官能基化の1以上の工程を経ている化合物を含む。好ましくは、本発明の目的で、テルペンは、上記の条件を満たし、かつ/または炭素骨格が、少なくとも一部、しかし、好ましくは全部、MEPおよび/またはMEV経路に由来する化合物である。従って、テルペンは、テルペンアルコール、例えば、パチュロール、エピセドロール、クベボール、リナロール、ネロリドール、および例えばスクラレオールなどのジアルコール、のようなC15H26OおよびC10H18O化合物を含む。テルペンは、広大なテルペンの属の複数の種の例を挙げるだけでも、ボルニル二リン酸モノテルペンおよびコパリル二リン酸ジテルペンのような二リン酸化合物も含む。本明細書で使用する場合、誘導体は、公知のまたは推定上の化合物から得られ、かつ、その親物質の本質的要素を含む任意の化合物である。例えば、テルペンは、C10、C15、C20、C30、C40、C45などの炭素骨格を有する化合物である。従って、用語テルペンは、モノ、セスキ、ジ、トリ、テトラおよび/またはポリテルペンを包含する。好ましくは、本発明のテルペンは、ゲラニオール、リナノール、シトロネロール、ネロールおよびα-テルピネオールを含む。好ましい実施形態によれば、本発明の微生物は、その微生物の生体重1gにつき、少なくとも30μg、より好ましくは少なくとも100μgのテルペンの収量を提供する。本発明の微生物のテルペンの収量は、好ましくは実施例2のプロトコルによって確立される。テルペンは、本発明の細胞に蓄積していてよい。例えば、テルペンは、その細胞質、ミトコンドリア、細胞膜または他の細胞小器官に蓄積されてもよい。多くのテルペンは、親油性の化合物であり、その細胞の細胞膜に蓄積される。本発明の目的で、用語培地に蓄積することは、2相発酵プロセスの間の溶媒中への蓄積も包含する。本発明の方法は、テルペンの製造につながる条件の下、本発明の形質転換された宿主細胞を培養する工程を含む。これらの条件は、当業者に公知である。一般的に、その条件は、適当な媒体、発酵容器、温度、およびpHの選択によって調整されてよい。テルペンを製造するための方法は、2相発酵がなされる場合、その培地から、その細胞からおよび/または有機溶媒からテルペンを単離する工程を含んでいてよい。そのテルペンは、限定されないが、例えば、クロマトグラフィ、抽出および蒸留、を含む当該技術分野で使用される任意の方法により単離されていてよい。例えば、モノテルペンは、プラスチド中で普通に製造され、およびセスキテルペン類は、サイトゾル中で普通に製造されることは、当該技術分野の当業者に周知である。植物と対照的に、微生物系は、大規模な遺伝子操作プロジェクトの影響をより受けやすく、多くの異なる組み換えは比較されおよび結び付けられてよい。しかしながら、微生物は、植物と比較していくつかの技術的な欠点があり、それは、異種の遺伝子を発現するときである。本発明の第14の目的は、以下の工程を含む、芳香植物の選択方法に関する:a向上したテルペンの合成および/または植物の生物サンプル中のテルペンの蓄積の分析に従って、DXSの対立遺伝子変異をもたらすDXSの少なくとも1つの変異を特定する工程、b変異を含む植物を選択する工程。本発明の第15の目的は、以下の工程を含む、クロマゾンへより耐性のあるDXS酵素の製造方法に関する:aこれまでに記載されたような形質転換された宿主細胞を培養する工程;bその形質転換された宿主細胞の細胞抽出物、細胞懸濁液、タンパク分屑、結晶画分、細胞培養物、細胞ホモジネート、細胞ライゼート、細胞上清、細胞濾液、または細胞ペレットからのクロマゾンへより耐性のあるDXS酵素を得る工程。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれている。以下の実施例に開示される技術は、本発明者によって発見された限り、本発明の実施に良く機能する技術を表しており、従ってその実施に好ましい条件を構成すると考えられうるということが、当業者に理解されるはずである。1ヴィティスヴィニフェラcvマスカットオットネルおよびゲヴェルツトラミナー由来のDXScDNAのクローン化ヴィティスヴィニフェラcvマスカットオットネルMOおよびゲヴェルツトラミナーGw由来のDXScDNAを、RT-PCRを使用して増幅し、クローン化した。これらのクローンの配列は、MOおよびGwの両方が、そのDXS遺伝子座でヘテロ接合であることを明らかとした。MOおよびGwは、同一の対立遺伝子で指定されたMoDXS1図1を共有する。加えて、MoおよびGwは、それぞれMoDXS2およびGwDXS2の対立遺伝子を持つ。MoDXS2およびGwDXS2の対立遺伝子は、それぞれ、2および1の一塩基多型SNPの点でMoDXS1と異なり、対応するタンパク質のアミノ酸配列を組み替える図2。本発明のK284⇒NおよびR306⇒Cの変異配列番号2に関連するは、それぞれMoDXS2およびGwDXS2の特徴を示し、データベースで利用可能な全植物のDXS配列において保存されるアミノ酸に影響を及ぼす図3。さらに、アミノ酸K284およびR306は、その酵素の活性部位に属しXiangら、2007年、MoDXS1と比較して、K284⇒NおよびR306⇒Cの変異はそのMoDXS2およびGwDXS2の対立遺伝子の活性を改質してもよいことを示した。2ブドウ果実中のテルペノールの含有量に対するMoDXS2およびGwDXS2対立遺伝子の影響材料および方法:遊離および結合されたモノテルペノールの固相抽出SPEによる単離各サンプリングポイントで、テルペノール分析の3つの複製物を作製した。各複製物に、少なくとも25の果実を使用した。種子を除去しおよび果皮を中果皮から分離した。計量後、果皮を液体窒素下ですりつぶし、次いで40mgの亜硫酸ナトリウムの添加後、40mLの水中に懸濁した。15分間遠心分離11400g、4°Cして得た上清を、ガラスファイバー前置フィルターおよびガラスフィルターに通した。20μLの4-ノナノール溶液1g/Lを外部標準として加え、主なテルペノールの定量化を可能とした。テルペノールの抽出は、Mateoら1997年から適応されていて、メタノールの代わりにエタノールを使用した。その濾液をおよそ1滴/sの速度で、前もって5mLのメタノールおよび15mLの超純水で洗浄した1gの相C18シリカの結合した非極性SPEカラムBONDELUTJR.を通した。そのサンプルは、その後、2つの同等のサブサンプルに分離し、1つを、遊離およびグリコシド結合したモノテルペノールの分析用に、および遊離のテルペノールの分析用とした。遊離および結合されたモノテルペノールの全画分を、4mLの無水エタノールで溶離した。この全テルペノール抽出物を40mLのクエン酸/リン酸緩衝液pH4.5で希釈し、得られた溶液を50mgのAR2000糖分解酵素フランス、スクリンのGist-Brocades製とともに、一晩、37.5°Cでインキュベーションし、グリコシド結合したテルペノールを遊離させたTamborraら、2004年。その遊離されたテルペノールをC18カラム上でSPEにより分離し、3×5mLの水で洗浄した後に4mLのジクロロメタンで溶離した。遊離のテルペノールの分析については、加水分解工程を行わず、テルペノールを水で洗浄した後に直接ジクロロメタンで溶離した。抽出物を、0.5gの無水亜硫酸ナトリウムの満たされたパスツールピペット内で乾燥し、緩やかな窒素流動下、500μLに濃縮した。20μLのm-クレゾール1g/L溶液を、内部標準として各サンプルに加えた。サンプルを、-20°Cで保存した後にガスクロマトグラフィGC分析した。結果:実施例2は、MO図4中およびGW図5子孫中、DXS対立遺伝子の関数としてテルペノールの含有量の結果に示されているように、DXS対立遺伝子がブドウ果実中のテルペノールの含有量に大きな影響を与えることを示した。ヘテロ接合のまたはDXS2ホモ接合の遺伝子型が大量のテルペノールを蓄積するのに対して、MoDXS1=GwDXS1ホモ接合の遺伝子型は、テルペノールのレベルが極めて低いこと示した。3植物中、DXS対立遺伝子の機能的特性解析DXS対立遺伝子活性を特性化するために、本発明者らは、タバコの葉の中の迅速かつ効率的な遺伝子発現を可能とするアグロバクテリウムAgrobacteriumを媒体とするタバコベンサミアナタバコNicotianabenthamianaの一過性の形質転換を用いたBatokoら、2000年。このアプローチは、既にブドウの二次代謝に関連する遺伝子を特性化することに使用され成功したSchmidlinら、2008年;Hugueneyら、2009年。MoDXS1、MoDXS2およびGwDXS2の対立遺伝子は、バジルスイートバジル由来の酵素ゲラニオールシンターゼGESをコード化しているcDNAと一緒に、タバコの葉に発現されたIijimaら、2004。GESは、この系で、通常、タバコには蓄積されないモノテルペノールであるゲラニオールの生合成に関与しているレポーター遺伝子として使用された。DXS活性が植物でのテルペン生合成を制限していると示されているようにEstevezら、2001年;Enfissiら、2005年、GES活性により形成されるゲラニオールの量は、DXP基質の有効性に直接依存し、それゆえ、タバコの葉のDXS活性に直接依存した。そして、GESおよびDXS対立遺伝子を共発現するタバコの葉のGC-MS分析は、植物体でDXS対立遺伝子活性の精密な比較を可能とした。材料および方法:ブドウDXScDNAを、上流のプライマー5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTTCCGCGTGGATCAATGGCTCTCTGTACGCTCTCATTTCC-3’配列番号11および下流のプライマー5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACTATAACATGATCTCCAGGGCCTCC-3’配列番号12を使用してPCRにより増幅して、製造業者の説明書に従ってゲートウェイBPクロナーゼインビトロジェン製を使用して、pDONR207ゲートウェイと相性のよいベクターカルフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン製にクローン化した。DXScDNAを、変異が誘導されないことをかくにんするために配列した。アグロバクテリウムAgrobacteriumに媒体された一過性発現については、その後、DXScDNAをゲートウェイバイナリーベクターpMDC32CurtisとGrossniklaus.、2003年に移植した。バジルスイートバジル由来のゲラニオールシンターゼcDNAIijimaら,2004年を、ゲートウェイ二値ベクターpMDC83CurtisとGrossniklaus.、2003年にクローン化し、およびGFP融合タンパク質として発現させた。全構成物を電気穿孔によりアグロバクテリウムAgrobacteriumtumefaciens株C58pMP90に導入した。ベンサミアナタバコNicotianabenthamianaの葉は、Voinnetら2003年によると、アグロバクターツメファシエンス培地OD6000.5に湿潤された。葉の部分を、アグロバクテリウムAgrobacteriumの浸潤後96時間でテルペン含有量を分析した。そして、タバコの葉からテルペノールの抽出を行った:各サンプリングポイントで、テルペノール分析の3つの複製物を作製した。計量後、タバコの葉の部分約1gを液体窒素下ですり潰し、次いで2mLの超純水に懸濁した。5分間の遠心分離後4°Cで6000g、その上清を集め、および20μLの4-ノナノール溶液1g/Lを外部標準として添加した。その上清を、前もって5mLのメタノールおよび15mLの超純水で洗浄した、1gの相C18シリカの結合した非極性SPEカラムバリアン製のBondElutJr.を通した。全テルペノールを、2mLの無水エタノールで溶離した。この全テルペノール抽出物を、20mLのクエン酸/リン酸塩緩衝液pH4.5で希釈し、および得られた溶液を25mgのAR2000糖分解酵素フランス、スクリンのGist-Brocades製とともに、一晩、37.5°Cでインキュベーションした。遊離されたテルペノールをC18カラム上でSPEにより分離し、3×5mLの水で洗浄した後に4mLのジクロロメタンで溶離した。抽出物を、0.5gの無水亜硫酸ナトリウムの満たされたパスツールピペット内で乾燥し、および緩やかな窒素流動下、500μLに濃縮した。20μLのm-クレゾール1g/L溶液を、内部標準として各サンプルに加えた。サンプルをガスクロマトグラフィGC分析をする前に-20°Cで保存した。最後に、そのテルペンを、GerstelMPS2XLサンプラーを備え、かつAgilent5975Binert質量分析計AgilentTechnologies製を組み合わせたAgilent6890Nガスクロマトグラフを使用して、ガスクロマトグラフィおよび質量分析GC-MSによって分析した。そのガスクロマトグラフに、DB-WAX毛細管カラム60m×0.32mmi.d.×0.5μmフィルム厚さ、JWScientific製を装着し、ヘリウムをキャリアガス1ml/分の一定流量として使用した。そのGCのオーブン温度を初期保持時間なしで、20°C/分の速度で45°Cから82°Cとし1分保持、その後2.7°C/分の速度で82°Cから235°C15分保持とプログラムした。そのインジェクターを250°Cに設定し、およびパルススプリットレスモード0.50分間25psi約0.17MPaで使用した。そのインターフェース、MSイオン源および四重極の温度は、それぞれ、270°C、230°Cおよび150°Cだった。その質量分析計は、電子衝突イオン化モードEI、70eVで操作され、その質量は、29~300amuのm/z範囲で解析された。AgilentMSDケムステーションソフトウェアG1701DA、RevD.03.00を測定器制御とデータ処理のために使用した。質量スペクトルは、Wileyライブラリーレファレンススペクトルバンクと比較された。結果:アグロバクテリウムに媒体されたGESだけの一過性発現は、かなりの量のゲラニオールの蓄積をもたらし、ゲラニオールの生合成は、タバコ内の内在的なDXS活性に依存した図6、図7。GESおよびMoDXS1の共発現は、向上したDXP基質の利用可能性のため、ゲラニオール生合成での実質的な増加をもたらした。しかしながら,GESとMoDXS2またはGwDXS2との共発現は、平均してタバコの葉の中のゲラニオール蓄積を3倍増加をもたらし図7、これは、これらの対立遺伝子は、MoDXS1と比較して向上したDXS活性を持つことを示していた。それゆえ,本発明者らは、MOおよびGW内でのテルペノールの大量の蓄積は、MoDXS2またはGwDXS2の存在のためであると結論する。K284⇒NおよびR306⇒C変異は、その酵素の活性部位でアミノ酸に影響を及ぼし、MoDXS1と比較して向上したDXS活性を与え、ひいては植物体内へのテルペンの蓄積を増加する原因となる。以下の実験の目的は、これらの変異の役割が他の源からのDXS酵素に拡張されうるかどうかを示すことである。モデルとして、本発明者らは、酵素特性が十分に特性付けられているQuerolら,2001年;Xiangら,2007年大腸菌由来のDXSを選択した。大腸菌およびヴィティスヴィニフェラ由来のDXSタンパク質配列の比較は、ブドウDXS中のアミノ酸K284およびR306が、それぞれ大腸菌由来のDXS中のK213およびK234に対応することを示す図10。非植物のDXSの活性に対するMO様およびGW様変異の影響を評価するため、本発明の変異K213⇒NおよびK234⇒Cを、大腸菌のDXSタンパク質内に導入した。大腸菌のテルペンの生合成の能力におけるこれらの変異の影響を、その後調査した。4大腸菌由来のDXSの遺伝子のクローニングおよび部位特異的変異誘発材料および方法:大腸菌由来のDXS遺伝子Loisら,1998を、上流のプライマーGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTTCCGCGTGGATCAATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCC配列番号24および下流のプライマーGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTG配列番号25を使用してPCRにより増幅して、製造業者の説明書に従ってそのpDONR207ゲートウェイと相性のよいベクター1以上の遺伝子の迅速なクローン化を可能とする技術。そのエントリーベクターは、ゲンタマイシンへの耐性を与えるカリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン製に、BPクロナーゼクローン由来のPCR生成物またはDNA画分のインビトロでの再結合を触媒するタンパク質の混合物をクローン化した。DXS遺伝子は、その後、そのゲートウェイと相性のよい発現ベクターpHGWABussoら,2003年にLRクロナーゼエントリークローンとデスティネーションベクターとのインビトロでの再結合を触媒し、発現クローンを生成させる酵素の混合物インビトロジェン製を使用して導入し、プラスミドpHGWA-EcoliDXSを生成した。このプラスミドは、本発明のK213⇒NおよびK234⇒C変異を大腸菌由来のDXSタンパク質に誘導するために、部位特異的変異誘発のために使用された。部位特異的変異誘発は、製造業者の指示に従って、クイックチェンジキットカルフォルニア州ラホヤのストラタジーン製を使用して達成された。クイックチェンジキットは、変異原性のプライマーおよびDNAポリメラーゼに基づく。アミノ酸の変化、挿入または欠失を伴った酵素突然変異体を製造するために選択された遺伝子に単点変異または多点変異を誘導するためにデザインされている。順方向プライマーGCGCGAAGGCGGGAACAAAGTTTTCTCTGGCGTGCC配列番号26および逆方向プライマーGGCACGCCAGAGAAAACTTTGTTCCCGCCTTCGCGC配列番号27を使用して、K213⇒N変異を導入し、プラスミドpHGWA-EcoliDXS-K213Nを生成した。順方向プライマーCGCACCGAAGAACATATTTGCGGCATGGTAGTGCCTGG配列番号28および逆方向プライマーCCAGGCACTACCATGCCGCAAATATGTTCTTCGGTGCG配列番号29を使用して、K234⇒C変異を導入して、プラスミドpHGWA-EcoliDXS-K234Cを生成した。結果:本発明の部位特異的変異誘発の間、フレームシフトを提供する変異体DXS遺伝子を単離した。このフレームシフトは、切断されたDXSタンパク質の合成をもたらし、コントロールとして使用された。この切断されたDXSをコード化するプラスミドを、pHGWA-truncated-EcoliDXSと言う。5大腸菌中での野生型E.coliDXSタンパク質および変異E.coliDXSタンパク質の発現材料および方法:pHGWA-EcoliDXS、pHGWA-truncated-EcoliDXS、pHGWA-EcoliDXS-K213NおよびpHGWA-EcoliDXS-K234Cのプラスミドを、BL21-GoldDE3pLysS大腸菌系統カルフォルニア州ラホヤのストラタジーン製に形質転換した。BL21-GoldDE3pLysS大腸菌系統は、増加した形質転換効率を提供するコンピテント細胞である。そのコンピテント細胞は、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールに耐性がある。形質転換体を、アンピシリン100μg/mL、クロラムフェニコール25μg/mL、およびテトラサイクリン2μg/mLの存在下、グルコース10g/Lを添加した50mLのLB培地中、28°Cで培養した。その培養物が0.1のODに達した時、DXS発現を、1mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノヂドIPTGで誘導しおよびその培養物を24時間培養した。6大腸菌中でのテルペンの生合成に対するDXS突然変異体の影響大腸菌由来のDXS酵素の活性に対するMO-およびGW様変異それぞれ、K213⇒NおよびK234⇒Cの影響を、DXS発現の導入後、培地中でテルペンを定量化することにより評価した。材料および方法:大腸菌培地中でのテルペンの分析培地中のテルペンを、Coelhoら2009年から適用されている方法を使用して、スターバー抽出法SBSEを使用して分析した。PDMSコーティングを持つ撹拌棒0.5mm×10mm;ドイツ、ミュルハイムのゲステル製Twisterを、各培地サンプル10mLに導入した。20°C、150分間、800rpmの回転速度で抽出した。その後、上記のゲステルMPS2XLサンプラーを備え、かつAgilent5975B質量分析計AgilentTechnologies製を組み合わせたAgilent6890Nガスクロマトグラフを使用して、ガスクロマトグラフィおよび質量分析GC-MSによって分析した。結果:実施例は、大腸菌由来のDXSに導入される変異が、培地中のモノテルペン含有量に影響することを示す図5。特に、本発明の大腸菌由来のDXSにおける変異K234⇒Cは、培地中、テルペンのかなり向上した蓄積をもたらした。それゆえ、本発明者らは、DXS活性を改善するために、非植物DXS酵素は、ブドウのDXSタンパク質中のK284およびR306に対応する位置で組み替えうる、と結論する。そのような改善されたDXS突然変異体は、注目するイソプレノイドの産生量を向上させるために、微生物の代謝工学のため使用されてもよい。"