"哺乳動物から得られたサンプル中の哺乳動物細胞の特定の型及び/又は状態を同定する方法であって、a前記細胞のゲノム内の細胞型及び/又は細胞状態に特異的な領域中の接近可能クロマチンの相対量を分析することと、b前記領域中の接近可能クロマチンの前記相対量を、細胞型及び/又は細胞状態に非特異的な前記細胞のゲノム内の領域中の接近可能クロマチンの相対量と比較することと、c任意で、細胞型及び/又は細胞状態に特異的な前記領域並びに細胞型及び/又は細胞状態に非特異的な前記細胞のゲノム内の前記領域の相対量を、対照プラスミドを用いて正規化することと、d前記サンプル中の前記哺乳動物細胞の特定の型及び/又は状態を前記比較に基づいて推定することと、を含む、哺乳動物から得られたサンプル中の哺乳動物細胞の特定の型及び/又は状態を同定する方法。前記同定が、前記比較に基づく前記特定の細胞の型及び/又は状態の相対定量を更に含む、請求項1に記載の方法。工程aの前に、既知の特定の細胞型及び/又は細胞状態を有する細胞のゲノム内の接近可能クロマチンの相対量を測定することを含む、特定の細胞型及び/又は細胞状態を決定する工程を更に含む、請求項1又は2に記載の方法。既知の特定の細胞型及び/又は細胞状態を有する細胞のゲノム内の接近可能クロマチンの相対量に関する情報を含む知識ベースを生成することを更に含む、請求項3に記載の方法。分析がDNAseI消化、ChIPChip商標、クロマチン免疫沈降マイクロアレイ、バイサルファイト変換に基づく若しくはバイサルファイト変換に基づかない定量PCR分析、選択的沈降、及び/又はバイサルファイトによるシトシンの変換を含むアッセイによって接近可能クロマチンの相対量を測定することを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。前記細胞のゲノム内の細胞型及び/又は細胞状態に特異的な前記領域が、FOXP3、GNLY、CD3、血小板糖タンパク質IXGP9;低親和性免疫グロブリンεFc受容体FCER2;タンパク質S100-PS100カルシウム結合タンパク質P;ホメオドメイン相互作用プロテインキナーゼ3HIPK3;膜貫通4L6ファミリーメンバー19TM4SF19;CD160抗原前駆体ナチュラルキラー細胞受容体BY55CD160;及びLIMドメイン結合タンパク質2LDB2から選択される遺伝子を含む領域から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。細胞型及び/又は細胞状態に非特異的な前記領域が、GAPDH等のハウスキーピング遺伝子を含む領域から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。前記細胞型がCD19B細胞、CD3CD8細胞傷害性T細胞、CD15顆粒球、CD14単球、CD56ナチュラルキラー細胞、CD4ヘルパーT細胞等の免疫細胞;腎細胞;骨細胞;神経細胞;血液細胞;肺細胞;結腸細胞及びヒト胚性幹細胞を除くこれらのいずれかの前駆体から選択される、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。前記同定に基づく疾患の素因又は疾患の診断を更に含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。疾患が免疫疾患又は免疫状態、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、白血病/リンパ腫、肺がん、前立腺がん、子宮がん、乳がん、皮膚がん、内分泌がん、膀胱がん、膵臓がん、他の消化管がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭部がん、頸部がん、及び腺腫等のがん、出生異常、精神遅滞、肥満、神経疾患、糖尿病、並びに妊娠性糖尿病からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。哺乳動物から得られたサンプル中の哺乳動物細胞の特定の型及び/又は状態の相対量に対する薬物の効果をモニタリングする方法であって、前記薬物で治療した哺乳動物において請求項1~8のいずれか一項に記載の方法を行うことと、前記哺乳動物細胞の前記特定の型及び/又は状態の相対量を非治療サンプルのものと比較することとを含む、哺乳動物から得られたサンプル中の哺乳動物細胞の特定の型及び/又は状態の相対量に対する薬物の効果をモニタリングする方法。生体サンプルが血液又はその画分、唾液、口腔細胞、涙液、精液、尿、汗、糞便物質、皮膚、及び毛髪からなる群から選択される、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。前記細胞型がCD19B細胞、CD3CD8細胞傷害性T細胞、CD15顆粒球、CD14単球、CD56ナチュラルキラー細胞、CD4ヘルパーT細胞等の免疫細胞;腎細胞;骨細胞;神経細胞;血液細胞;及びヒト胚性幹細胞を除くこれらのいずれかの前駆体から選択される、請求項11又は12に記載の方法。前記治療が免疫疾患又は免疫状態、がん、出生異常、精神遅滞、肥満、神経疾患、糖尿病、及び妊娠性糖尿病からなる群から選択される疾患又は状態に対するものである、請求項11~13のいずれか一項に記載の方法。請求項1~14のいずれか一項に記載の方法を行うための材料を含む診断キット。材料及び方法略語:Amp、アンプリコン;CD3D、T細胞表面糖タンパク質CD3δ鎖;CD3G、T細胞表面糖タンパク質CD3γ鎖;FOXP3、フォークヘッドボックスタンパク質P3;GAPDH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ;GNLY、グラニュライシン。細胞及び組織サンプルホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織サンプルについては、ベルリン大学附属シャリテ病院ChariteUniversitaetsmedizinBerlinのベンジャミンフランクリンキャンパスCampusBenjaminFranklinの病理学研究所のアーカイブから検索した。腫瘍及び正常組織の代表的なパラフィンブロックを選択し、対応する正常実質を含む結腸直腸癌又は気管支癌の標本の組織マイクロアレイTMAを、直径1mmのコアを用いて構築した。新鮮凍結卵巣組織サンプル及び血液については、ベルリン大学附属シャリテ病院のウィルヒョーキャンパスCampusVirchowの卵巣がん腫瘍バンクから検索した。ゲノムDNAの単離ヒトの血液、組織からのゲノムDNAの精製については、DNeasyBloodandTissueKitQiagen,Hilden,Germanyを使用した。腹水の場合、本発明者らは培養細胞からの全DNAの単離のためのプロトコルに従った。ホルマリン固定し、パラフィン包埋したFFPE組織のサンプルからのゲノムDNAは、QIAampDNAFFPETissueKitQiagen,Hilden,Germanyを用いて単離した。パラフィンブロックをトリミングして余分なパラフィンを除去し、組織切片の厚さを10umに調整した。各々の反応は10個の組織切片を用いて行った。ゲノムDNAの亜硫酸水素ナトリウム変換亜硫酸水素ナトリウム媒介変換をEpiTectBisulfiteKitQiagen,Hilden,Germanyを適用することによって行い、反応を0.5ug~1ugの精製ゲノムDNAを用いて行った。簡潔に述べると、高バイサルファイト塩濃度及び低pH下でのゲノムDNAの熱サイクリングによって、非メチル化シトシン残基のウラシル続くPCRにおいてチミンとして複製されるへの変換をもたらす。これらの条件下ではメチル化シトシンCpGジヌクレオチドのコンテキスト内に見られるは変化しないままであるため、この処理はエピジェネティック標識を配列情報に変換するものである。オリゴヌクレオチドこの研究において使用される増幅プライマー及び加水分解プローブ等のオリゴヌクレオチドは、ヒトゲノムGRCh37eEnsemblerelease56;2009年9月のアセンブリに対するそれらの染色体位置によって表される。定量的バイサルファイトシークエンシングのためのオリゴヌクレオチド:a遺伝子間CD3GENSG00000160654/CD3DENSG00000167286領域:アンプリコン番号1、フォワードプライマー:11:118213200-118213221:1、リバースプライマー:11:118213616-118213637:1;アンプリコン番号2、フォワードプライマー:11:118214271-118214292:1、リバースプライマー:11:118214685-118214705:1;アンプリコン番号3、フォワードプライマー:11:118214702-118214723:1、リバースプライマー:11:118215151-118215173:1;bGNLYENSG00000115523遺伝子領域:アンプリコン番号1、フォワードプライマー:2:85921382-85921404:1、リバースプライマー:2:85921742-85921763:1;アンプリコン番号2、フォワードプライマー:2:85921807-85921828:1、リバースプライマー:2:85922259-85922279:1;アンプリコン番号3、フォワードプライマー:2:85922895-85922916:1、リバースプライマー:2:85923327-85923348:1;cGAPDHENSG00000111640CpG島:アンプリコン番号1、フォワードプライマー:12:6644119-6644135:1、リバースプライマー:12:6644635-6644656:1;アンプリコン番号2、フォワードプライマー:12:6643586-6643604:1、リバースプライマー:12:6643990-6644011:1。リアルタイムPCRベースアッセイのためのオリゴヌクレオチド:aFOXP3ENSG00000049768TSDR:メチル化特異的PCR:フォワードプライマー:X:49117219-49117246:1、リバースプライマー:X:49117283-49117307:1、プローブ:X:49117256-49117273:1;脱メチル化特異的PCR:フォワードプライマー:X:49117219-49117246:1、リバースプライマー:X:49117283-49117307:1、プローブ:X:49117256-49117278:1。bCD3:メチル化特異的PCR:フォワードプライマー:11:118213633-118213653:1、リバースプライマー:11:118213686-118213707:1、プローブ:11:118213670-118213687:1;脱メチル化特異的PCR:フォワードプライマー:11:118213632-118213653:1、リバースプライマー:11:118213686-118213709:1、プローブ:11:118213664-118213690:1。cGNLY:メチル化特異的PCR:フォワードプライマー:2:85921878-85921895:1、リバースプライマー:2:85921964-85921992:1、プローブ:2:85921918-85921943:1;脱メチル化特異的PCR:フォワードプライマー:2:85921877-85921895:1、リバースプライマー:2:85921964-85921992:1、プローブ:2:85921911-85921939:1。dGAPDH:脱メチル化特異的PCR:フォワードプライマー:12:6644378-6644399:1、リバースプライマー:12:6644456-6644476:1、プローブ:12:6644429-6644457:1。バイサルファイト変換されたDNAに特異的な使用されるプライマーの配列は、以下のとおりである例えば図5を参照されたい。定量的バイサルファイトシークエンシングバイサルファイト変換に特異的なプライマーを用いて、7ngの亜硫酸水素ナトリウム変換されたゲノムDNAから標的領域をプレ増幅した。PCRを1×PCRバッファー、1UのTaqDNAポリメラーゼQiagen,Hilden,Germany、200μMdNTP、各々12.5pmolのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含有する25μlの最終容量で行った。熱サイクリングを95°Cで15分間、続いて95°Cで1分間、55°Cで45秒間及び72°Cで1分間を40サイクル、72°Cで10分間の最終伸長工程で行った。PCR産物をExoSAP-ITUSBCorpを用いて精製し、増幅プライマー及びABIBigDyeTerminatorv1.1chemistryAppliedBiosystemsを適用して直接シークエンシングした。産物をエタノール沈殿によって精製し、1Mベタインbetaineに溶解させ、ABI3100遺伝子分析装置でのキャピラリー電気泳動に供した。AB1ファイルを、配列トレースを正規化し、不完全なバイサルファイト変換を補正し、CpG部位でのメチル化シグナルの定量を可能にするESMEを用いて解釈した。リアルタイムPCRリアルタイムPCRを、RocheLightCycler480ProbesMasterchemistryRocheDiagnosticsを用いて、各々30pmolのメチル化特異的又は脱メチル化特異的フォワードプライマー及びリバースプライマー、5pmolの加水分解プローブ、50ngの□-ファージDNANewEnglandBiolabs、及び60ngのバイサルファイト変換されたゲノムDNAの鋳型、又はそれぞれの量のプラスミド標準を含有する20μlの最終反応容量で行った。各々のサンプルを、LightCycler480SystemRocheを用いて三連で分析した。全てのアッセイシステムについて、サイクリング条件は95°Cで10分間の予熱工程、続いて50サイクルの95°Cで15秒間及び61°Cで1分間の工程を含んでいた。CPクロッシングポイントcrossingpoint値を、LC480分析ソフトウェアを適用して二次導関数最大値secondderivativemaximum法によってコンピュータで計算し、鋳型コピー数を線形回帰による適切なプラスミドベース標準の段階希釈を用いた検量線から算出した。プラスミド標準様々なリアルタイムPCRベースアッセイのためのバイサルファイト変換されたメチル化標的領域及びバイサルファイト変換された脱メチル化標的領域をコンピュータ内で設計し、合成しGenscriptInc、断片をプラスミドpUC57に挿入した。組み換えプラスミドを線状化し、10ng/μlの□-ファージDNANewEnglandBiolabs中で段階希釈して、リアルタイムPCRベースアッセイのための標準を、1回の反応当たりの鋳型コピー数が12500、2500、500、100、20及び4という最終濃度で得た。主要末梢血白血球集団の細胞選別末梢血サンプルを、地方倫理委員会の承認に従うインフォームドコンセントの後に健常ドナーから得た。顆粒球CD15、単球CD14、CD4T細胞CD3CD4、TregCD4CD25highCD45RA-、B細胞CD19、NK細胞CD56、CD56bright、CD56dim、ナイーブCD8T細胞CD3CD8CD45RACD127、及び記憶CD8T細胞CD3CD8CD45RA-CD127/-等の異なる白血球集団への血液サンプルの分画を、以前に記載されるように行ったBaronetalEurJImmunol。選別した細胞の純度はフローサイトメトリーによって求められるように97超であり、生存度は常に99超であった。統計分析メチル化CpG変異体及び非メチル化TpG変異体DNAの量を、二次導関数最大値法からのクロッシングポイントでの線形回帰による検量線から推定した。中央値を使用して試験サンプルの三連の測定値を統合した。遺伝子特異的DNAの割合を、遺伝子特異的specificTpG変異体DNAと、この同じ遺伝子のTpG変異体とCpG変異体との合計、又はGAPDHTpG変異体コピーの数との比率としてコンピュータで計算した。累積生存率はSPSSを用いたカプランマイヤー法によって算出した。群間の単変量比較については、統計的有意性をコックスマンテル検定を用いて評価した。相関分析については、ピアソンの積率係数又はスピアマンの順位相関及びt検定統計量を使用した。全てのP値は両側とした。結果本明細書中で言及される或る特定の特異的遺伝子を分析したが、これは本発明者らによってバイサルファイトにより完全に変換されていると同定され、したがって接近可能クロマチン構造が示唆された図1~図4を参照されたい。特定のRT-PCR設定を用いて、本発明者らはDNAの増幅が、完全にバイサルファイト変換された領域が存在する場合にのみ起こることを示すことができた。変換されていない領域の場合、増幅産物は観察されない。図面中のデータは、確立したPCRシステムが、完全に変換されたDNA種又は完全に変換されていないDNA種のいずれかを排他的に増幅することを示す。2つの種間の交差汚染は観察されなかった。逆の特異性を試験するために、図3に示すようなバイサルファイト変換を模倣するプラスミド制御系を設計した。このプラスミド系は、この特定の設定において分析される完全にバイサルファイト変換されたCD3、FOXP3、GNLY及びGAPDH遺伝子領域のコピー量を定量するのに必要とされる全ての構成要素を含有していた。プラスミドは、配列gcggccgcCCTAAACACTACCACATCTCAAAACCCCTTAAAAAAAACCATCAACCCCATAACACAAACCATAACAACTAAATTTCTgatcGTTTTTGATTTGTTTAGATTTTTTTGTTATTGATGTTATGGTGGTTGGATGTGTTGGGTTTTATTGATATTATGGAGGAAGAGAAGAGGctcgacCCAAACCCCTACCTCCACATCTACATAATAAAAACCATTAACCCTCATCAATAAATCTACATTTCCTCAAACCTACACTATCTAAAATTATACAAAACTAATAAAAAAACAAAATCTCTTCTATATTCagtcGGAATAGAGGAGAAGAGAGAGTTTCATTTTTTTGGTTTTTTAGAAGGAACATGAGAATACATGTTTGTGTTGAGAGTGGGTTAGAGCAGTTTTAGGGTAAAGTATGTGGATAagtcGGTTTTTGGTATTGTAGGTTTTGGGATGTTAGTGTGTAGTGGGTGTATTTTTGTTTGGATGTTGTGTTTGTGGTAGAGTGGTTGTTATGTTGTAATTGGagtcGTTTTTTTTAAAGAGTGTTTTTGATAGGGATTGTTTTAGGAATTAGGTAGGAGAGAAGGGAGTGTGAGAGGTGAAAGTTATTATTATTctcgag配列番号1を、NotI-XhoI制限部位を用いてpUC57プラスミドバックグラウンドに導入することによって構築した。星印は潜在的なメチル化部位を指し、小文字は構築物NotI-CD3-FOXP3-NKII-NKIII-GAPDH-CFF-XhoIの一般構造の境界を示す。リアルタイムPCRアッセイの定量は、ナノドロップ、又はUVette分析若しくはQuibitシステムInvitrogen等の代替方法における吸収測定によって定量される標準化プラスミドを準備し、光学密度を決定することによって達成される。この測定に基づき、プラスミドの濃度を決定し、標準測定系列を測定されたプラスミドの段階希釈を適用することによって作成する。このようにして、プラスミド上の全ての遺伝子について全く等モル濃度の標準を調製し、決定する提供する。この絶対等モル濃度は好ましい実施形態であるが、本発明者らはこの標準化系を全てのサンプルに使用することを提案し、異なるプラスミド上に存在し得るか、又は更にはプラスミド標準若しくはDNA標準からなるものではない様々な異なる標準を採用する場合に、同様の系を用いた分析も想定される。次いで、プラスミド系においてCD3、FOXP3、GLNY、及びGAPDHの完全にバイサルファイト変換された画分を最初に検出した後、生体サンプルを分析した。生細胞は、いわゆるハウスキーピング遺伝子の活性によって規定されるため、これらの遺伝子は定義からして全ての細胞において活性でなくてはならない。様々な実験において、全ての細胞が完全にバイサルファイト接近可能なGAPDH遺伝子座を有するすなわち活性であることが示された。これに関し、本発明者らは顆粒球細胞、単球細胞、NK細胞、CD4ナイーブ細胞、CD8細胞、並びに肺、子宮、乳房、及び結腸の組織を分析し、これらの細胞内の遺伝子座が全てバイサルファイト変換について完全に接近可能であることを示した。接近可能クロマチンを有していた細胞について試験するために、本発明者らは完全にバイサルファイト変換されたDNAのみを認識する上記のPCRプラスミド系を分析した。バイサルファイト変換にとっての接近が限られた細胞が残らないことを示すために、本発明者らは、これらの細胞を完全には変換されていないDNAに特異的な系を用いて増幅することを試みたが、いずれのサンプルにおいてもいかなるシグナルも検出することができなかった。ほとんど全ての考え得るDNAシグナルが、完全に変換されたDNA又は完全に変換されていないDNAのいずれかに由来するため、完全に接近可能なGAPDHを測定することによって非アポトーシス性、非壊死性細胞の総数を確実に決定することができる。次に、特定の細胞においてのみ転写活性を有するDNA断片を分析した。この場合も、本発明者らは、これらの領域で完全に接近可能なDNAを分析した後、これらを試験プラスミド構築物中の接近可能なGAPDHの量と関連付けた。データの精度を確認するために、本発明者らは2つの以下の分析を互いに比較した:SCT1=コピーFBCSPG/コピーFBCGAPDHその測定/算出の結果に対して、SCT2=コピーFBCSPG/コピーFBCSPGコピーNBCSPGここでSCT1は、第1の方法によって決定される特定の細胞型の量であり、SCT2は、第2の方法によって決定される特定の細胞型の量である。コピーFBCSPGは、特定の遺伝子の完全にバイサルファイト変換されたDNAのコピー数であり、コピーFBCGAPDHは、GAPDHの完全にバイサルファイト変換されたDNAのコピー数であり、コピーNBCSPGは、特定の遺伝子のバイサルファイト変換されていないDNAのコピー数である。分析を全血サンプルについて繰り返し、以下のデータを得た:完全なバイサルファイト変換の影響を受けやすい細胞型特異的遺伝子領域の確立及びqPCRアッセイ設計CD3D及びCD3Gchr.11q23.3遺伝子、グラニュライシン遺伝子領域Chr.2p11.2、及びGAPDH遺伝子内のCpG島Chr.12p13.31の遺伝子間制御領域におけるCpGジヌクレオチドのバイサルファイト変換接近可能性を、バイサルファイトシークエンシングを用いて試験した。ナイーブCD4及びCD8Tリンパ球においてCD3近接領域の全てのシトシンが完全に変換され図1B、TpG変異体のみが生じることを見出した。顆粒球、単球、Bリンパ球、及びNK細胞を含む他の試験した細胞型において同じ領域はバイサルファイト変換されず、CpG変異体が生じる。グラニュライシンについては、分析した遺伝子領域がナイーブCD4及びCD8Tリンパ球、単球、顆粒球、並びにB細胞においてCpG変異体中に排他的に存在することが見出されたが、これはナチュラルキラー細胞においてはTpG変異体中に存在するようである図1B。本発明者らは、試験した全ての細胞型において分析したGAPDH領域中にTpG変異体を排他的に見出した図1A。これらのデータに基づいて、CD3領域、GNLY領域、及びGAPDH領域の分析した遺伝子座に対するPCRアンプリコンを設計した。各々の領域について、各々のアッセイについて変異体特異的な蛍光標識検出プローブを含む、TpG変異体鋳型を排他的に認識する1つのPCRシステムと、CpG変異体鋳型に特異的な1つのPCRシステムとを設計した図2。また、TpG変異体及びCpG変異体に対応する3つの遺伝子座の各々に対するプラスミド系を構築した。本発明者らは数桁にわたる増幅の高い線形性を示した増幅効率は1.95~2の範囲であった。また、非生理的に高い濃度で試験した場合であっても、互いに反対の鋳型を用いる各々のTpG変異体及びCpG変異体に特異的なPCRシステムとの交差反応性が検出されたため、高い特異性が示されたコピー数はプラスミドDNA20コピー~12500コピーの範囲であった図2。CD3、GLNY、及びGAPDHに対するqPCRアッセイによる主要血液細胞画分の特性評価CD3、GNLY、及びGAPDHに対するPCRシステムを、最近公表された分離スキームBaronUetalDNAdemethylationinthehumanFOXP3locusdiscriminatesregulatoryTcellsfromactivatedFOXP3conventionalTcellsEurJImmunol200737p237889に従って精製した血液細胞画分について試験した。標準と同等のバイサルファイト変換されたゲノムDNA領域を含有する精製プラスミドの段階希釈物を用いて、TpG変異体からなるDNAコピーの数を決定した。対照として、CpG鋳型変異体を別個の反応で測定した。各々の遺伝子領域についての両方の画分のコピーの比率を算出した。これを表1に示す。結果から、CD8及びCD4Tリンパ球がCD3位置について99を超えるTpG変異体を含有するが、CD19B細胞、CD15顆粒球、CD14単球、及びCD3-CD56ナチュラルキラー細胞が1未満のTpG変異体しか含有せず、排他的にCpG変異体からなることが示された。同等の分析をGNLY領域で行ったところ、95を超えるTpG変異体がCD3-CD56NK細胞及びCD3CD56NKT細胞の両方について観察された。CD19B細胞、CD15顆粒球、CD14単球は排他的にCpG変異体からなる。2.6のCD4細胞及び20.6のCD8記憶T細胞がGNLY遺伝子座についてTpG変異体として検出された。最後に、GAPDH遺伝子領域を指定の全ての細胞型におけるバイサルファイト変換接近可能性について試験した。ここで、CpG変異体の特異的増幅は全ての組織及び細胞型において完全に起こらなかった。これは、バイサルファイトシークエンシングデータ及びこの領域が常に完全に転写活性を有するはずであるという見解と一致する。データは、精製した細胞型におけるGAPDHについてのTpGDNA変異体の効率的な増幅を示した表1。本発明者らはしたがって、この遺伝子が任意の所与のサンプルにおける全細胞カウントの決定に最適であり、細胞数を制御するために生物学的に必要とされる完全に未修飾のDNAストレッチが測定されると推測する。これらのデータに基づいて、本発明者らは様々なqPCRシステムの技術的精度を更に証明しようとした。そのために、そのバイサルファイト変換されたDNAがCD3遺伝子座において99.9のTpG変異体からなることが示される、FACS精製した調節T細胞を選択した。顆粒球はバイサルファイト変換にとって完全に接近不能であることが示され、CD3分析において99.7のCpG変異体からなっていた。次いで、40、20、10、5、3、2、及び1のCD3陽性調節T細胞を顆粒球のバックグラウンドにスパイクしspiked、CpG変異体のバックグラウンドにおけるCD3遺伝子座でのTpG変異体の割合を決定した。表2に示されるように、スパイクしたサンプルとCD3PCR測定との間に厳密な相関ピアソンr=0.998が見られ、比較対照として使用したFOXP3PCRについて観察された厳密な相関ピアソンr=0.998と一致した。スパイキング実験は、精製したCD3-CD56NK細胞をTpG変異体として、及び顆粒球をCpG変異体として使用したGNLYアッセイを用いて行った。CD3アッセイと同様、TpG変異体の比率は、スパイキング実験から予測された比率とよく一致していたピアソンr=0.98表2。次に、CD3、FOXP3、GNLY、及びGAPDH中の領域のTpGバージョンに相当する配列を含有するプラスミドを設計した図3。この構築物は等モル化学量論stoichiometryで全ての標的領域を有するため、定量についての究極的標準とみなされる。このプラスミドを正規化に用いて、GAPDHTpG変異体によって決定された総細胞カウントと比較したCD3、FOXP3及びGNLYTpG変異体の相対量表2を再定量した。結果が内部標準及び元の希釈率の細胞による定量と非常に良好に合致することが示された。エピジェネティックqPCRを適用した全血サンプルにおけるTreg、全身性Tリンパ球、及びNK細胞の分析この方法の適用性を試験するために、本発明者らは、カツマキソマブ治験に参加した卵巣がん患者に由来する全血サンプルを試験し、その結果を、フローサイトメトリー分析から得られたデータと比較した。FACS分析によって決定されたCD3細胞の割合及びCD3qPCRによって決定されたTpG変異体の割合について、本発明者らは、スピアマンの順位相関及び高い統計的有意性R=0.80;p=7.25E-5を示した表2。同様に、FACS測定から得られたCD4CD25Cd127-細胞の割合とFoxp3遺伝子座に見られるTpGDNAの割合との比較によって、強い統計的に高度に有意な相関R=0.84、p=2.13E-5が示された。FACS又はエピジェネティック分析のいずれかによって測定されたFoxp3とCD3細胞との比率は、同様に強く相関したR=0.7、p=0.00098。本発明者らはしたがって、フローサイトメトリーにより測定されたCD3-CD56及びCD3CD56NK及びNKT細胞と、グラニュライシン遺伝子座に見られるTpG変異体の比率との間のより低いが強固な相関を見出したR=0.59、p=0.006。固形腫瘍におけるFoxp3TSDR、CD3、及びグラニュライシンのqPCR分析健常組織及び腫瘍内微小環境における組織浸潤Foxp3Treg、CD3Tリンパ球、及びグラニュライシンに陽性な細胞傷害性細胞の完全に定量的な評価をもたらすために、新鮮凍結卵巣がんサンプルn=86を、独立したドナーに由来する健常卵巣組織及び良性嚢胞n=15と比較した。健常対照0.12と比較して、腫瘍におけるFoxp3細胞の統計的に有意なp=2.34E-11増大中央値:1.28が観察された。さらに、本発明者らは、腫瘍において健常組織4.27、n=15よりも多量のCD3T細胞中央値:7.76、n=84を観察した。この増大はp=2.56E-7により統計的に有意であった。Foxp3Tregと総Tリンパ球カウントとの間の比率について、本発明者らは、健常組織n=15における総T細胞カウントの3.38のTregから腫瘍組織n=84におけるおよそ19.7までという中央値の変化を観察したp=8.06E-07。グラニュライシン発現細胞については重要な変化は観察されなかった。気管支癌BCについては、本発明者らは、ホルマリン固定し、パラフィン包埋したFFPE患者に適合した健常サンプル及び腫瘍サンプルを比較することが可能であった。本発明者らは、健常組織平均:2.0と比較した腫瘍におけるTregの強い増大中央値:4.2を観察した。この増大は、ペアワイズn=52、p=2.76E-2及び非ペアワイズn健常=52、n腫瘍=91、p=9.14E-3比較の両方について統計的に高度に有意であった。ここで、本発明者らは、正常組織中央値:29.6と比較した腫瘍におけるCD3Tリンパ球の顕著な減少中央値:22.3を観察した。この変化は、ペアワイズn=76、p=3.36E-3及び非ペアワイズn腫瘍=87、n健常=76、p=3.4E-3分析の両方について統計的に有意であった。Tregと総CD3細胞との比は、健常サンプル中央値:7.6と比較して腫瘍において増大した中央値:18.3。この変化は、ペアワイズ比較n=48、p=6.35E-11及び非ペアワイズ比較n腫瘍=86、n健常=48、p=1.59E-14において統計的に有意であった。本発明者らはグラニュライシン陽性細胞も試験し、健常組織中央値:4.8と比較した腫瘍におけるこれらの細胞の顕著な減少中央値:1.9を見出した。この相違は、ペアワイズ比較n腫瘍=89、n正常=46、p=1.59E-14及び非ペア比較n=46、p=9.77E-9の両方において統計的に有意である。最後に、本発明者らは、結腸直腸がんCRCサンプル及びそれらの隣接する健常対照組織において同じエピジェネティックパラメータを分析した。本発明者らは、健常組織中央値:1.78と対比した腫瘍におけるTregカウントの統計的に高度に有意な増大中央値:4.2を観察したペアワイズ比較:n=49、p=6.29E-4;非ペア比較:n腫瘍=49、n健常=52、p=5.9E-4。本発明者らは、総Tリンパ球カウントの中央値の統計的に有意な低下も見出したが、これは腫瘍において24.9及び健常組織において32.3であったペアワイズ比較:n=61、p=2.59E-2;非ペア比較:n腫瘍=61、n健常=69、p=2.75E-2。総Tリンパ球に対するTregの中央値の増大は高度に有意であったペアワイズ比較:n=49、p=4.75E-7;非ペア比較:n腫瘍=52、n健常=49、p=5.1E-7。健常組織ではTリンパ球におけるTreg数の中央値の値は7.8であり、CRC組織ではこの比率は21.8に跳ね上がる。本発明者らは細胞傷害性免疫細胞のマーカーとしてもグラニュライシンを試験し、本発明者らは、健常組織における3.0と対比して腫瘍におけるGNLY細胞が2.31という中央値である、グラニュライシン陽性細胞の傾向的な減少を観察した。しかしながら、この傾向は統計的に有意ではなかったペアワイズ比較:n=50、p=8.43E-2;非ペア比較:n腫瘍=50、n健常=58、p=8.04E-2。TregはCD3陽性でもあるため、本発明者らは、血液並びに健常組織及び腫瘍組織においてFoxp3とCD3細胞との間に相関があるか否かを知ろうとした。十分な健常卵巣組織がこの分析に利用可能でないため、本発明者らは、Foxp3とCD3TpGとの間に、健常な血液、肺及び結腸直腸組織のそれぞれについて0.47p=0.000、N=124、0.68p=0.000、N=48、及び0.55p=0.000、N=49に等しいスピアマンの順位相関ρを見出している表3。同様に、本発明者らは、気管支がん、結腸直腸がん、及び卵巣がんについてρ=0.48p=0.000、N=86、0.325p=0.325、p=0.019、及び0.76p=0.000、N=107という相関を観察している。本発明者らの発見によると、接近可能なグラニュライシン遺伝子座を有する細胞の数は患者の予後と有意に相関しない。本発明者らはしたがって、腫瘍内微小環境における調節T細胞の量は総CD3細胞数に依存すると結論付ける。疾患予後と腫瘍内免疫細胞カウントとの関連付け結腸直腸がん患者及び卵巣がん患者について、追跡調査データが利用可能であった。したがって、本発明者らは、診断及び手術時に腫瘍内微小環境内で測定された免疫細胞カウントが患者の予後と相関するか否かについて試験した。Gallonetalによって示されたデータと合致して、本発明者らは、結腸直腸がん患者における低いCD3カウントと比較して高いCD3カウントを有する患者について統計的に有意な生存優位性を観察した。この分析について、本発明者らは、一方が23.9のCD3細胞という中央値未満のCD3カウントを有する患者を含有し、他方が中央値を超えるCD3カウントを有する患者を含有する2つの群に患者を分けた。95信頼区間における50ヶ月~73ヶ月と比較して75ヶ月~99ヶ月という平均生存時間及び0.58というハザード率が観察された。卵巣がん患者についての生存分析から、より低いCD3カウントを有する群7.76未満と対比して、高いCD3カウントを有する群7.76超内の患者についてのより良好な生存への強いが統計的に有意でない傾向が得られた。本発明者らのデータは、Treg数の増大と生存率の改善との統計的に有意でない関連性を示す。それどころか、本発明者らは、Treg数と総CD3細胞カウントとの間の直接的な線形相関を示す。"