式I:I[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1-6脂肪族またはアリールであり;そして、mは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物の製造方法であって、a第1の有機溶媒中、式IAIA[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、Halはハライドである]の化合物を、式IB:IB式中、RJは、水素またはC1-6脂肪族であるの化合物と反応させ、式IC:IC[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1-6脂肪族またはアリールであり;そして、mは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物を形成させる;および、b第2の有機溶媒中、化合物ICから-CO2RJ基を除去し、式Iの化合物を形成させる、の各段階を含む、方法。環Aが融合したヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールである、請求項1に記載の方法。環Aが、である、請求項1に記載の方法。XがCNである、請求項1に記載の方法。XがCO2Etである、請求項1に記載の方法。RJがC1-6脂肪族である、請求項1ないし請求項5のいずれかに記載の方法。HalがBrである、請求項1ないし請求項6のいずれかに記載の方法。第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項1ないし請求項7のいずれかに記載の方法。第1の有機溶媒がトルエンである、請求項1ないし請求項8のいずれかに記載の方法。段階aがパラジウム触媒の存在下で実施される、請求項1ないし請求項9のいずれかに記載の方法。段階aが、酢酸パラジウムII、PddppfCl2、Pddba2、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム0またはトリスジベンジリデンアセトンジパラジウム0から選択されるパラジウム触媒の存在下で実施される、請求項1ないし請求項10のいずれかに記載の方法。。段階aがPddba2の存在下で実施される、請求項1ないし請求項11のいずれかに記載の方法。段階aが約50°Cないし90°Cで実施される、請求項1ないし請求項12のいずれかに記載の方法。段階aが約70°Cで実施される、請求項1ないし請求項13のいずれかに記載の方法。第2の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項1ないし請求項14のいずれかに記載の方法。第2の有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項1ないし請求項15のいずれかに記載の方法。段階bが無機酸の存在下で実施される、請求項1ないし請求項16のいずれかに記載の方法。段階bが約55°Cないし95°Cで実施される、請求項1ないし請求項17のいずれかに記載の方法。段階bが約75°Cで実施される、請求項1ないし請求項18のいずれかに記載の方法。式II:II[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;Halは、ハライドであり;R1は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、nは、両端を含めて1ないし4の整数である]の化合物の製造方法であって、a第1の有機溶媒中、式IIAIIA[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、Halはハライドである]の化合物を、式IIB:IIB[式中、Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1-6脂肪族またはアリールであり;そして、RJは、水素またはC1-6脂肪族である]の化合物と反応させ、式IIC:IIC[式中、各々独立して:環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1-6脂肪族またはアリールであり;そして、mは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物を形成させる、b第2の有機溶媒中、化合物IICから-CO2RJ基を除去し、式I:I[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1-6脂肪族またはアリールであり;そして、mは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物を形成させる、c塩基の存在下で、式Iの化合物を、式IIDIID[式中、各々独立して、Halはハライドであり;そして、qは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物と反応させ、式IIE:IIE[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1-6脂肪族またはアリールであり;そして、nは、両端を含めて1ないし4の整数である]の化合物を生成させる、d式IIEの化合物を、水酸化物塩基および酸と連続的に反応させ、式IIF:IIF[式中、各々独立して:環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、nは、両端を含めて1ないし4の整数である]の化合物を生成させる、および、e式IIFの化合物を、ハロゲン化剤と、第3の有機溶媒中で反応させ、式IIの化合物を形成させる、の各段階を含む方法。段階aにおいて、第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項20に記載の方法。段階aにおいて、第1の有機溶媒がトルエンである、請求項20または請求項21に記載の方法。段階aにおいて、HalがBrである、請求項20ないし請求項22のいずれかに記載の方法。段階aにおいて、環Aが融合した複素環またはヘテロアリール環である、請求項20ないし請求項23のいずれかに記載の方法。段階aにおいて、環Aがである、請求項20ないし請求項24のいずれかに記載の方法。段階aにおいて、XがCNである、請求項20ないし請求項25のいずれかに記載の方法。段階aにおいて、XがCO2Etである、請求項20ないし請求項26のいずれかに記載の方法。段階aにおいて、RJがEtである、請求項20ないし請求項27のいずれかに記載の方法。式IICにおいて、環Aがであり、mが0であり、XがCNであり、RJがEtである、請求項20ないし請求項28のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、第2の溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項20ないし請求項29のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、第2の溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項20ないし請求項30のいずれかに記載の方法。式I中、環Aがであり、mが0であり、XがCNである、請求項20ないし請求項31のいずれかに記載の方法。段階cにおいて、塩基が無機塩基である、請求項20ないし請求項32のいずれかに記載の方法。式IIDにおいて、一方のHalがClであり、他方のHalがBrである、請求項20ないし請求項33のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、塩基がNaOHである、請求項20ないし請求項34のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、酸がHClである、請求項20ないし請求項35のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、水酸化物塩基との反応を約60°Cないし100°Cで行う、請求項20ないし請求項36のいずれかに記載の方法。式IIEにおいて、環Aがであり、mが0であり、nが1であり、XがCNである、請求項20ないし請求項37のいずれかに記載の方法。段階eにおいて、第3の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項20ないし請求項38のいずれかに記載の方法。段階eにおいて、第3の有機溶媒がトルエンである、請求項20ないし請求項39のいずれかに記載の方法。段階eにおいて、ハロゲン化剤がSOCl2である、請求項20ないし請求項40のいずれかに記載の方法。段階eを約40°Cないし80°Cで行う、請求項20ないし請求項41のいずれかに記載の方法。式IIFにおいて、環Aがであり、mが0であり、nが1である、請求項20ないし請求項42のいずれかに記載の方法。式IIにおいて、環Aがであり、mが0であり、nが1であり、HalがClである請求項20ないし請求項43のいずれかに記載の方法。式IIIIII[式中、各々独立して、R2は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJであり;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;R3は、OH、OP、-O-C1-6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、-O-アリールまたは-O-ヘテロアリールにより置換されていることもあるC1-6脂肪族であり;Pは、保護基であり;そして、oは、0ないし3の整数である]の化合物の製造方法であって、a式IIIA:IIIA[式中、各々独立して、R2は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJであり;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;そして、oは、0ないし3の整数である]の化合物を、ハロゲン化剤と、第1の有機溶媒中で反応させ、式IIIB:IIIB[式中、各々独立して、R2は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJであり;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;oは、0ないし3の整数であり;そして、Halはハライドである]の化合物を形成させる、b式IIIBの化合物を、第2の有機溶媒中、式IIIC:IIIC[式中、Pは保護基である]の化合物と反応させ、続いて、還元および酸処理により、式IIID:IIID[式中、R2は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJであり;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;oは、0ないし3の整数であり;Halはハライドであり;Pは保護基であり;そして、は陰イオンである]の化合物を形成させる、c式IIIDの化合物を、塩基の存在下で中和し、式IIID-a:IIID-a[式中、R2は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJであり;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;oは、0ないし3の整数であり;Halはハライドであり;そして、Pは保護基である]の化合物を形成させる、d式IIID-aの化合物を、第3の溶媒中で、式IIIE:IIIE[式中、各々独立して:R3は、OH、OP、-O-C1-6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、-O-アリールまたは-O-ヘテロアリールにより置換されていることもあるC1-6脂肪族である]の化合物と、触媒の存在下で反応させ、式IIIの化合物を形成させる、の各段階を含む、方法。式IIIAにおいて、oが1であり、R2がFである、請求項45に記載の方法。段階aにおいて、ハロゲン化剤がN-ブロモスクシンイミドである、請求項45または請求項46に記載の方法。段階aにおいて、第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項45ないし請求項47のいずれかに記載の方法。段階aにおいて、第1の有機溶媒が酢酸エチルである、請求項45ないし請求項48のいずれかに記載の方法。段階aを約2°Cないし42°Cで行う、請求項45ないし請求項49のいずれかに記載の方法。式IIIBにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrである、請求項45ないし請求項50のいずれかに記載の方法。式IIICにおいて、Pがベンジルである、請求項45ないし請求項51のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、第2の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項45ないし請求項52のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、第2の有機溶媒がトルエンである、請求項45ないし請求項53のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、式IIICの化合物との反応を約60°Cないし100°Cで行う、請求項45ないし請求項54のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、還元を水素で実施する、請求項45ないし請求項55のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、酸がp-トルエンスルホン酸である、請求項45ないし請求項56のいずれかに記載の方法。式IIIDにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrであり、がTos-であり、Pがベンジルである、請求項45ないし請求項57のいずれかに記載の方法。式IIIEにおいて、R3がCCH32CH2Oベンジルである、請求項45ないし請求項58のいずれかに記載の方法。段階cにおいて、塩基が無機塩基である、請求項45ないし請求項59のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、第3の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項45ないし請求項60のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、第3の有機溶媒がアセトニトリルである、請求項45ないし請求項61のいずれかに記載の方法。段階dを約60°Cないし100°Cで行う、請求項45ないし請求項62のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、触媒がパラジウム触媒である、請求項45ないし請求項63のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、触媒が、酢酸パラジウムII、PddppfCl2、Pddba2、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム0、MeCN2PdCl2またはトリスジベンジリデンアセトンジパラジウム0から選択される、請求項45ないし請求項64のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、触媒が酢酸パラジウムIIである、請求項45ないし請求項65のいずれかに記載の方法。式IVIV[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1およびR2は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;R3は、OH、OP、-O-C1-6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、-O-アリールまたは-O-ヘテロアリールで置換されていることもあるC1-6脂肪族であり;Pは保護基であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;nは、両端を含めて1ないし4の整数であり;そして、oは、両端を含めて1ないし3の整数である]の化合物の製造方法であって、a式IIIA:IIIA[式中、各々独立して、R2は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJであり;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;そして、oは、両端を含めて1ないし3の整数である]の化合物を、ハロゲン化剤と、第1の有機溶媒中で反応させ、式IIIB:IIIB[式中、各々独立して:R2は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJであり;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;oは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、Halはハライドである]の化合物を形成させる、b式IIIBの化合物を、第2の有機溶媒中、式IIIC:IIIC[式中、Pは保護基である]の化合物と反応させ、続いて、還元および酸処理により、式IIID:IIID[式中、R2は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJであり;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;oは、両端を含めて0ないし3の整数であり;Halはハライドであり;Pは保護基であり;そしては陰イオンである]の化合物を形成させる、c式IIIDの化合物を、塩基の存在下で中和し、式IIID-a:IIID-a[式中、R2は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJであり;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;oは、両端を含めて0ないし3の整数であり;Halはハライドであり;そして、Pは保護基である]の化合物を形成させる、d式IIIDの化合物を、第3の有機溶媒中、式IIIE:IIIE[式中、各々独立して、R3は、OH、OP、-O-C1-6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、-O-アリールまたは-O-ヘテロアリールで置換されていることもあるC1-6脂肪族である]の化合物と、触媒の存在下で反応させ、式III:III[式中、各々独立して:R2は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJであり;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;R3は、OH、OP、-O-C1-6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、-O-アリールまたは-O-ヘテロアリールで置換されていることもあるC1-6脂肪族であり;Pは保護基であり;そして、oは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物を形成させる、e式IIIの化合物を、第4の有機溶媒中、式II:II[式中、各々独立して:環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;Halはハライドであり;R1は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、nは、両端を含めて1ないし4の整数である]の化合物と反応させ、式IVの化合物を形成させる、の各段階を含む、方法。式IVにおいて、環Aが、である、請求項67に記載の方法。式IVにおいて、oが1であり、R2がFである、請求項67または請求項68に記載の方法。式IVにおいて、Pがベンジルである、請求項67ないし請求項69のいずれかに記載の方法。式IVにおいて、R3がOPにより置換されていることもあるC4脂肪族である、請求項67ないし請求項70のいずれかに記載の方法。式IVにおいて、R3がである、請求項67ないし請求項71のいずれかに記載の方法。式IVにおいて、R3がである、請求項67ないし請求項72のいずれかに記載の方法。式IVにおいて、環Aがであり、mが0であり、nが1であり、oが1であり、R2がFであり、Pがベンジルであり、R3がである、請求項67ないし請求項73のいずれかに記載の方法。段階aにおいて、ハロゲン化剤がN-ブロモスクシンイミドである、請求項67ないし請求項74のいずれかに記載の方法。段階aにおいて、第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項67ないし請求項75のいずれかに記載の方法。段階aにおいて、第1の有機溶媒が酢酸エチルである、請求項67ないし請求項76のいずれかに記載の方法。段階aを、約2°Cないし42°Cで行う、請求項67ないし請求項77のいずれかに記載の方法。式IIIBにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrである、請求項67ないし請求項78のいずれかに記載の方法。式IIICにおいて、Pがベンジルである、請求項67ないし請求項79のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、第2の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項67ないし請求項80のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、第2の有機溶媒がトルエンである、請求項67ないし請求項81のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、式IIICの化合物との反応を約60°Cないし100°Cで行う、請求項67ないし請求項82のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、還元を水素で実施する、請求項67ないし請求項83のいずれかに記載の方法。段階bにおいて、酸がp-トルエンスルホン酸である、請求項67ないし請求項84のいずれかに記載の方法。式IIIDにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrであり、がTos-であり、Pがベンジルである、請求項67ないし請求項85のいずれかに記載の方法。式IIIEにおいて、R3がCCH32CH2Oベンジルである、請求項67ないし請求項86のいずれかに記載の方法。段階cにおいて、塩基が無機塩基である、請求項67ないし請求項87のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、第3の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項67ないし請求項88のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、第3の有機溶媒がアセトニトリルである、請求項67ないし請求項89のいずれかに記載の方法。段階dを約60°Cないし100°Cで行う、請求項67ないし請求項90のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、触媒がパラジウム触媒である、請求項67ないし請求項91のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、触媒が、酢酸パラジウムII、PddppfCl2、Pddba2、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム0、MeCN2PdCl2またはトリスジベンジリデンアセトンジパラジウム0から選択される、請求項67ないし請求項92のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、触媒が酢酸パラジウムIIである、請求項67ないし請求項93のいずれかに記載の方法。段階eにおいて、環Aがであり、mが0であり、nが1であり、HalがClである、請求項67ないし請求項94のいずれかに記載の方法。段階eにおいて、第4の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項67ないし請求項95のいずれかに記載の方法。段階eにおいて、第4の有機溶媒がジクロロメタンである、請求項67ないし請求項96のいずれかに記載の方法。段階eを約-20°Cないし20°Cで行う、請求項67ないし請求項97のいずれかに記載の方法。段階eにおいて、式IIの化合物を、酸前駆物質をハロゲン化することによりインサイチュで製造し、単離せずに式IIIの化合物と反応させる、請求項67ないし請求項98のいずれかに記載の方法。2個の保護基を式IVの化合物から除去し、式IVAIVAの化合物を形成させることをさらに含む、請求項67ないし請求項99のいずれかに記載の方法。保護基を水素化により除去する、請求項100に記載の方法。化合物1:1の製造方法であって、a化合物2:2を、ブロム化剤と反応させ、化合物3:3を形成させる、b化合物3を化合物4:4と反応させ、続いて還元し、化合物5:5を形成させ、続いて、化合物5を塩基で中和し、化合物5a:5aを得る、c化合物5aを化合物6:6と、触媒の存在下で反応させ、化合物7:7を形成させる、d化合物7を、化合物8:8と反応させ、化合物9:9を形成させる、および、e2個のBn保護基を除去し、化合物1を形成させる、の各段階を含む、方法。段階aにおいて、ブロム化剤がN-ブロモスクシンイミドである、請求項102に記載の方法。段階bにおいて、還元を水素で実施する、請求項102または請求項103に記載の方法。段階cにおいて、触媒がパラジウム触媒である、請求項102ないし請求項104のいずれかに記載の方法。段階cにおいて、触媒が、酢酸パラジウムII、PddppfCl2、Pddba2、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム0、MeCN2PdCl2またはトリスジベンジリデンアセトンジパラジウム0から選択される、請求項102ないし請求項105のいずれかに記載の方法。段階cにおいて、触媒が酢酸パラジウムIIである、請求項102ないし請求項106のいずれかに記載の方法。段階dにおいて、酸前駆物質を単離せずにハロゲン化することにより、化合物8をインサイチュで製造する、請求項102ないし請求項107のいずれかに記載の方法。段階eにおいて、Bn保護基を水素化により除去する、請求項102ないし請求項108のいずれかに記載の方法。式23:23[式中、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、-RJ、-ORJ、-NRJ2、-NO2、ハロゲン、-CN、-C1-4ハロアルキル、-C1-4ハロアルコキシ、-CONRJ2、-NRJCORJ、-SORJ、-SO2RJ、-SO2NRJ2、-NRJSO2RJ、-CORJ、-CO2RJ、-NRJSO2NRJ2、-COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1-6脂肪族であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1-6脂肪族またはアリールであり;そして、mは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物。環Aが、融合したヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールである、請求項110に記載の化合物。環Aが、である、請求項110または請求項111に記載の化合物。XがCNである、請求項110ないし請求項112のいずれかに記載の化合物。XがCO2Etである、請求項110ないし請求項113のいずれかに記載の化合物。RJがC1-6脂肪族である、請求項110ないし請求項114のいずれかに記載の化合物。化合物。化合物。実施例方法と材料ビトリドVitride登録商標ナトリウムビス2-メトキシエトキシアルミニウムヒドリド[またはNaAlH2OCH2CH2OCH32]、65wgt溶液、トルエン中は、AldrichChemicalsから購入した。3-フルオロ-4-ニトロアニリンはCapotChemicalsから購入した。5-ブロモ-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソールは、AlfaAesarから購入した。22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-カルボン酸は、SaltigoLanxessCorporationの提携会社から購入した。本願中のどこでも、化合物の名称が化合物の構造を正しく記載していない場合、構造が名称に取って代わり、基準となる。化合物1の合成酸部分22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-1-酢酸エチル-アセトニトリルの合成リアクターを窒素でパージし、トルエン900mLを入れた。溶媒を16時間以上窒素で拡散して脱気した。次いで、リアクターにNa3PO41557g、9495mmolを入れ、続いてビスジベンジリデンアセトンパラジウム0728g、1266mmolを入れた。ヘキサン中のtert-ブチルホスフィンの10w/w溶液5123g、2532mmolを、窒素パージした滴下漏斗から10分間かけて23°Cで加えた。混合物を50分間撹拌し、そのとき、5-ブロモ-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール75g、3165mmolを1分間かけて添加した。さらに50分間撹拌した後、混合物にエチルシアノアセテート716g、6330mmolを5分間かけて加え、水45mLを一度に加えた。混合物を40分間かけて70°Cに加熱し、反応体から生成物への変換割合をHPLCで1-2時間毎に分析した。完全な変換が観察された後典型的には、5-8時間後に完全な変換、混合物を20-25°Cに冷却し、セライトパッドで濾過した。セライトパッドをトルエン2X450mLですすぎ、併せた有機物を、減圧下、60-65°Cで300mLに濃縮した。濃縮物にDMSO225mLを加え、減圧下、70-80°Cで、溶媒の活発な蒸留が終わるまで濃縮した。溶液を20-25°Cに冷却し、段階2に備えてDMSOで900mLに希釈した。1HNMRδ71671070346341912322-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-アセトニトリルの合成上記からの22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-1-酢酸エチル-アセトニトリルのDMSO溶液に、3NHCl6173mL、185molを、20分間かけて加え、その間に内部温度を<40°Cに維持した。次いで、混合物を75°Cに1時間かけて加熱し、HPLCにより1-2時間毎に変換を分析した。>99の変換が観察されたとき典型的には、5-6時間後、反応を20-25°Cに冷却し、MTBE2X525mLで抽出し、抽出中に完全な相分離が可能になるように十分な時間をかけた。合わせた有機抽出物を5NaCl2X375mLで洗浄した。次いで、冷却したレシーバーフラスコを備えた、15-25Torrの真空蒸留に適する設備に溶液を移した。溶液を真空下、<60°Cで濃縮し、溶媒を除去した。次いで、得られた油状物から22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-アセトニトリルを、125-130°Cオーブン温度および15-20Torrで蒸留した。22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-アセトニトリルを澄んだ油状物として、5-ブロモ-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール2段階から収率66で、HPLC純度915AUC95のw/wアッセイに相当するで単離した。1HNMRδ74474372240722-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボニトリルの合成50w/wNaOHの原液を、窒素で拡散して16時間以上脱気した。適量のMTBEを同様に数時間脱気した。窒素でパージしたリアクターに、脱気したMTBE143mLを入れ、続いて22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-アセトニトリル4095g、2077mmolおよびテトラブチルアンモニウムブロミド225g、1038mmolを入れた。混合物の体積を記録し、混合物を窒素で拡散して30分間脱気した。十分に脱気したMTBEを加え、混合物を脱気前の元の体積に戻した。230°Cで撹拌中の混合物に、脱気した50w/wNaOH143mLを10分間かけて加え、続いて1-ブロモ-2-クロロエタン447g、3116mmolを30分間かけて加えた。反応をHPLCで1時間間隔で変換について分析した。試料を採取する前に、撹拌を止め、相を分離させた。上部の有機相を分析用に試料採取した。>99の変換が観察されたとき典型的には25-3時間後、反応混合物を10°Cに冷却し、温度を<-25°Cに維持する速度で水461mLを加えた。温度を20-25°Cに調節し、相を分離した。注釈:完全な相分離のために十分な時間が許されるべきである。水相をMTBE123mLで抽出し、合わせた有機相を1NHCl163mLおよび5NaCl163mLで洗浄した。MTBE中の22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボニトリルの溶液を真空下、40-50°Cで164mLに濃縮した。溶液にエタノール256mLを加え、真空下、50-60°Cで再度164mLに濃縮した。エタノール256mLを加え、混合物を真空下、50-60°Cで164mLに濃縮した。得られた混合物を20-25°Cに冷却し、次の段階に備えてエタノールで266mLに希釈した。1HNMRδ7437407301751531-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボン酸の合成先の段階からのエタノール中の22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボニトリルの溶液に、6NNaOH277mLを20分間かけて加え、77-78°Cの内部温度に45分間かけて加熱した。反応の進行をHPLCにより16時間後に監視した。注釈:22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボニトリルおよび22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボニトリルの部分的加水分解に由来する第一級アミドの両方の消費が監視された。>99の変換が観察されたとき典型的には、16時間後に100の変換、反応混合物を25°Cに冷却し、エタノール41mLおよびDCM164mLを加えた。溶液を10°Cに冷却し、6NHCl290mLを<25°Cの温度を維持する速度で加えた。20-25°Cに温めた後、相を分離させた。下部の有機相を回収し、上部の水相をDCM164mLで逆抽出した。注釈:水相は高濃度の無機塩のために抽出の前後にいくらか濁った。有機物を合わせ、真空下で164mLに濃縮した。トルエン328mLを加え、混合物を164mLに70-75°Cで濃縮した。混合物を45°Cに冷却し、MTBE364mLを加え、60°Cで20分間撹拌した。溶液を25°Cに冷却し、仕上げpolish濾過し、残存する無機塩を除去した。MTBE123mLを使用してリアクターをすすぎ、固体を回収した。次の段階に備えて、合わせた有機物をきれいなリアクターに移した。1-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボン酸の単離先の段階からの1-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボン酸の溶液を、真空下で164mLに濃縮し、トルエン328mLを加え、70-75°Cで164mLに濃縮した。次いで、混合物を100-105°Cに加熱し、均一な溶液を得た。この温度で30分間撹拌した後、2時間かけて溶液を5°Cに冷却し、5°Cで3時間維持した。次いで、混合物を濾過し、リアクターおよび回収した固体を冷1:1トルエン/n-ヘプタン2X123mLで洗浄した。物質を真空下、55°Cで17時間乾燥させ、1-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボン酸をオフホワイト色結晶性固体として提供した。1-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボン酸を、22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-アセトニトリル単離を含む3段階からの収率79、HPLC純度990AUCで単離した。ESIMSmz計算値24204実測値241581HNMRδ1240740730717146117酸部分の代替的合成22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-メタノールの合成購入できる22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-カルボン酸10当量を、トルエン10体積中でスラリー化する。ビトリド登録商標2当量を、滴下漏斗で、温度を15-25°Cに維持する速度で添加する。添加の終了時に、温度を40°Cに2時間高め、次いで10w/waqNaOH40当量を、温度を40-50°Cに維持しながら、添加漏斗で注意深く添加する。さらに30分間撹拌した後、層を40°Cで分離させる。有機相を20°Cに冷却し、次いで水2x15体積で洗浄し、乾燥させNa2SO4、濾過し、濃縮し、粗製22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-メタノールを得、それを次の段階で直接使用する。5-クロロメチル-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソールの合成22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-メタノール10当量を、MTBE5体積に溶解する。触媒量のDMAP1molを添加し、SOCl212当量を滴下漏斗で添加する。リアクターの温度を15-25°Cに維持する速度でSOCl2を添加する。温度を30°Cに1時間高め、次いで20°Cに冷却し、次いで水4体積を滴下漏斗で添加し、温度を30°C未満に維持する。さらに30分間撹拌した後、層を分離させる。有機層を撹拌し、10w/vaqNaOH44体積を添加する。15ないし20分間撹拌した後、層を分離させる。次いで、有機相を乾燥させNa2SO4、濾過し、濃縮し、粗製5-クロロメチル-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソールを得、それを次の段階で直接使用する。22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-アセトニトリルの合成DMSO125体積中の5-クロロメチル-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール1当量の溶液を、DMSO3体積中のNaCN14当量のスラリーに、温度を30-40°Cに維持しながら添加する。混合物を1時間撹拌し、次いで水6体積を添加し、続いてMTBE4体積を添加する。30分間撹拌した後、層を分離する。水層をMTBE18体積で抽出する。合わせた有機層を水18体積で洗浄し、乾燥させNa2SO4、濾過し、濃縮し、粗製22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-アセトニトリル95を得、それを次の段階で直接使用する。残りの段階は、酸部分の合成について上記したのと同じである。アミン部分2-ブロモ-5-フルオロ-4-ニトロアニリンの合成フラスコに3-フルオロ-4-ニトロアニリン10当量を入れ、続いて酢酸エチル10体積を入れ、撹拌し、全ての固体を溶解した。N-ブロモスクシンイミド10当量を、22°Cの内部温度を維持するように少しずつ添加した。反応終了時に、反応混合物をロータリーエバポレーターで、真空で濃縮した。残渣を蒸留水5体積でスラリー化し、スクシンイミドを溶解し除去した。スクシンイミドは、水での後処理によっても除去できる。水をデカンタし、固体を2-プロパノール5体積中で終夜スラリー化した。得られたスラリーを濾過し、湿ったケーキを2-プロパノールで洗浄し、真空オーブン中、50°Cで、終夜、N2流で、一定重量に達するまで乾燥させた。黄色がかった褐色の固体を単離した50収率、975AUC。他の不純物は、ブロモ-位置異性体14AUCおよびジ-ブロモ付加体11AUCであった。1HNMRδ819706664R-1-4-アミノ-2-ブロモ-5-フルオロフェニルアミノ-3-ベンジルオキシプロパン-2-オールのp-トルエンスルホン酸塩の合成徹底的に乾燥させたフラスコに、N2下で、以下のものを入れた:活性化粉末状4Aモレキュラーシーブ2-ブロモ-5-フルオロ-4-ニトロアニリンを基準として50wt、2-ブロモ-5-フルオロ-4-ニトロアニリン10当量、過塩素酸亜鉛二水和物20molおよびトルエン8体積。混合物を室温で30分間以下で撹拌した。最後に、トルエン2体積中のR-ベンジルグリシジルエーテル20当量を、定常流で添加した。反応を80°C内部温度に加熱し、約7時間、または、2-ブロモ-5-フルオロ-4-ニトロアニリンが<5AUCになるまで撹拌した。反応を室温に冷却し、セライト50wtを添加し、続いて酢酸エチル10体積を添加した。得られた混合物を濾過し、セライトおよび篩を除去し、酢酸エチル2体積で洗浄した。濾液を塩化アンモニウム溶液4体積、20w/vで洗浄した。有機層を重炭酸ナトリウム溶液4体積x25w/vで洗浄した。有機層を真空で、ロータリーエバポレーターで濃縮した。得られたスラリーをイソプロピルアセテート10体積に溶解し、この溶液をBuchiの水素化反応器hydrogenatorに移した。水素化反応器に5wtPtS/C15molを入れ、混合物をN2下、30°C内部温度で撹拌した。反応にN2を、続いて水素を流した。水素化反応器の圧力を水素1Barに合わせ、混合物を迅速に>1200rpm撹拌した。反応終了時に、触媒をセライトのパッドで濾過し、ジクロロメタン10体積で洗浄した。濾液を真空で濃縮した。残っているイソプロピルアセテートをジクロロメタン2体積で追い出し、ロータリーエバポレーターで乾燥するまで濃縮した。得られた残渣をジクロロメタン10体積に溶解した。p-トルエンスルホン酸一水和物12当量を添加し、終夜撹拌した。生成物を濾過し、ジクロロメタン2体積で洗浄し、吸引乾燥させた。湿ったケーキを乾燥トレーに移し、真空オーブンに入れ、45°Cで、N2流で、一定重量に達するまで乾燥させた。R-1-4-アミノ-2-ブロモ-5-フルオロフェニルアミノ-3-ベンジルオキシプロパン-2-オールのp-トルエンスルホン酸塩をオフホワイト色固体として単離した。キラル純度は、>97eeと測定された。3-クロロ-3-メチルブト-1-イニルトリメチルシランの合成プロパルギルアルコール10当量を容器に入れた。水性塩酸37、375体積を添加し、撹拌を始めた。固体アルコールの溶解中に、穏やかな吸熱5-6°Cが観察される。得られた混合物を終夜16時間撹拌すると、ゆっくりと暗赤色になった。30Lのジャケット付き容器に水5体積を入れ、次いでそれを10°Cに冷却した。反応混合物をゆっくりと吸引により水に移し、混合物の内部温度を25°Cより低く維持した。ヘキサン3体積を添加し、得られた混合物を05時間撹拌した。相を分離させ、水相pH<1を流し出し、廃棄した。ロータリーエバポレーターを使用して有機相を真空で濃縮し、生成物を赤色油状物としてもたらした。4-ベンジルオキシ-33-ジメチルブト-1-イニルトリメチルシランの合成方法Aこの部分のすべての当量と体積の記述は、250gの反応を基準とする。削り屑状マグネシウム695g、286mol、20当量を、3Lの4口リアクターに入れ、磁気スターラーで、窒素下、05時間撹拌した。リアクターを氷水浴に浸した。THF18L、72体積中の塩化プロパルギル250g、143mol、10当量の溶液を、内部発熱約10°Cが観察されるまで、ゆっくりと撹拌しながらリアクターに添加した。グリニャール試薬形成を、1H-NMR分光法を使用するIPCにより確認した。一旦発熱が鎮まったら、残りの溶液をゆっくりと添加し、<15°Cのバッチ温度を維持した。添加は約35時間を要した。得られた暗緑色の混合物を、2Lの蓋付きビンにデカンタした。この部分のすべての当量と体積の記述は、500gの反応を基準とする。22Lのリアクターに、THF15L、3体積中のベンジルクロロメチルエーテル95、375g、231mol、08当量の溶液を入れた。リアクターを氷水浴で冷却した。上記の通りに製造した2つのグリニャール試薬のバッチを合わせ、次いで、ベンジルクロロメチルエーテル溶液にゆっくりと滴下漏斗で添加し、バッチ温度を25°Cより低く維持した。添加は15時間を要した。反応混合物を終夜16時間撹拌した。この部分のすべての当量と体積の記述は、1kgの反応を基準とする。15塩化アンモニウム溶液を、30Lジャケット付きリアクターで準備した水85kg中15kg、10体積。溶液を5°Cに冷却した。上記の通りに製造した2個のグリニャール反応混合物を合わせ、次いで、ヘッダー容器を介して塩化アンモニウム溶液に移した。発熱がこのクエンチにおいて観察され、それを、内部温度を25°Cより低く維持するように実施した。一度移動が完了したら、容器のジャケットの温度を25°Cに設定した。ヘキサン8L、8体積を添加し、混合物を05時間撹拌した。相分離後、水相pH9を流し出し、廃棄した。残っている有機相を水2L、2体積で洗浄した。22Lロータリーエバポレーターを使用して有機相を真空で濃縮し、粗生成物を橙色油状物として提供した。方法B削り屑状マグネシウム106g、435mol、10当量を22Lリアクターに入れ、次いで、THF760mL、1体積に懸濁した。バッチ温度が2°Cに達するように、容器を氷水浴中で冷却した。THF45L6体積中の塩化プロパルギル760g、435mol、10当量の溶液をゆっくりとリアクターに添加した。100mLを添加した後、添加を止め、グリニャール試薬の開始を示す13°Cの発熱が観察されるまで混合物を撹拌した。一旦発熱が鎮まったら、さらに500mLの塩化プロパルギル溶液をゆっくりと添加し、バッチ温度を<20°Cに維持した。グリニャール試薬形成をIPCにより1H-NMR分光法を使用して確認した。残りの塩化プロパルギル溶液をゆっくりと添加し、バッチ温度を<20°Cに維持した。添加は約15時間を要した。得られた暗緑色の溶液を05時間撹拌した。グリニャール試薬形成をIPCにより1H-NMR分光法を使用して確認した。未希釈のベンジルクロロメチルエーテルをリアクターの滴下漏斗に入れ、次いで、滴下してリアクターに添加し、バッチ温度を25°Cより低く維持した。添加は10時間を要した。反応混合物を終夜撹拌した。方法Aと同じ手順および相対的な量の物質を使用して水性の後処理および濃縮を実施し、生成物を橙色油状物として得た。4-ベンジルオキシ-33-ジメチルブト-1-インの製造30Lのジャケット付きリアクターにメタノール6体積を入れ、次いで5°Cに冷却した。水酸化カリウム85、13当量をリアクターに添加した。水酸化カリウムが溶解する際に、15-20°Cの発熱が観察された。ジャケットの温度を25°Cに設定した。メタノール2体積中の4-ベンジルオキシ-33-ジメチル-1-トリメチルシリルブト-1-イン10当量の溶液を添加し、得られた混合物を、HPLCで監視して反応が完了するまで撹拌した。25°Cでの典型的な反応時間は3-4時間である。反応混合物を水8体積で希釈し、次いで05時間撹拌した。ヘキサン6体積を添加し、得られた混合物を05時間撹拌した。相を分離させ、次いで水相pH10-11を流しだし、廃棄した。有機相を水8体積中のKOH85、04当量の溶液で、続いて水8体積で洗浄した。次いで、ロータリーエバポレーターを使用して有機相を濃縮し、表題物質を黄色-橙色の油状物として得た。この物質の典型的な純度は80の範囲であり、主として単一の不純物が存在した。1HNMRδ728718710435324191125N-ベンジルグリコール化-5-アミノ-2-2-ベンジルオキシ-11-ジメチルエチル-6-フルオロインドールの合成方法AR-1-4-アミノ-2-4-ベンジルオキシ-33-ジメチルブト-1-イン-1-イル-5-フルオロフェニルアミノ-3-ベンジルオキシプロパン-2-オールの合成R-1-4-アミノ-2-ブロモ-5-フルオロフェニルアミノ-3-ベンジルオキシプロパン-2-オールのp-トルエンスルホン酸塩を、固体をジクロロメタン5体積および飽和NaHCO3溶液5体積中で澄んだ有機層が得られるまで撹拌することにより、遊離塩基化した。得られた層を分離し、有機層を飽和NaHCO3溶液5体積で、続いて塩水で洗浄し、真空で濃縮し、R-1-4-アミノ-2-ブロモ-5-フルオロフェニルアミノ-3-ベンジルオキシプロパン-2-オール遊離塩基を油状物として得た。酢酸パラジウム001当量、dppb0015当量、CuI0015当量および炭酸カリウム3当量をアセトニトリル12体積に懸濁した。15分間撹拌した後、アセトニトリル02体積中の4-ベンジルオキシ-33-ジメチルブト-1-イン11当量の溶液を添加する。混合物に窒素ガスを1時間拡散させ、次いでアセトニトリル41体積中のR-1-4-アミノ-2-ブロモ-5-フルオロフェニルアミノ-3-ベンジルオキシプロパン-2-オール遊離塩基1当量の溶液を添加する。混合物に窒素ガスをさらに1時間拡散させ、次いで80°Cに加熱する。反応の進行をHPLCにより監視し、反応は通常3-5時間で完了する。混合物を室温に冷却し、次いでセライトで濾過する。ケーキをアセトニトリル4体積で洗浄する。合わせた濾液を乾燥するまで共沸させ、次いで混合物を次のリアクターに仕上げ濾過する。かくして得られたR-1-4-アミノ-2-4-ベンジルオキシ-33-ジメチルブト-1-イン-1-イル-5-フルオロフェニルアミノ-3-ベンジルオキシプロパン-2-オールのアセトニトリル溶液を、さらに加工せずに次の手順環状化に直接使用する。N-ベンジルグリコール化-5-アミノ-2-2-ベンジルオキシ-11-ジメチルエチル-6-フルオロインドールの合成ビス-アセトニトリルジクロロパラジウム01当量およびCuI01当量をリアクターに入れ、次いでアセトニトリル全部で95体積中の上記で得られるR-1-4-アミノ-2-4-ベンジルオキシ-33-ジメチルブト-1-イン-1-イル-5-フルオロフェニルアミノ-3-ベンジルオキシプロパン-2-オール1当量の溶液に懸濁する。混合物を窒素ガスで1時間拡散させ、次いで80°Cに加熱する。反応の進行をHPLCにより監視し、反応は、典型的には1-3時間で完了した。混合物をセライトで濾過し、ケーキをアセトニトリルで洗浄する。酢酸エチル75体積への溶媒交換を実施する。酢酸エチル溶液をNH3-NH4Cl水溶液2x25体積で、続いて10塩水25体積で洗浄する。次いで、酢酸エチル溶液をシリカゲル18wt当量およびSi-TMT01wt当量と6時間撹拌する。濾過後、得られる溶液を濃縮する。残った油状物をDCM/ヘプタン4体積に溶解し、次いでカラムクロマトグラフィーにより精製する。次いで、かくして得られる油状物を25EtOAc/ヘプタン4体積から結晶化する。結晶性R-1-5-アミノ-2-1-ベンジルオキシ-2-メチルプロパン-2-イル-6-フルオロ-1H-インドール-1-イル-3-ベンジルオキシプロパン-2-オールは、典型的には収率27-38で得られる。1HNMRδ738734732723721677606513454446445433409404363356349343140N-ベンジルグリコール化-5-アミノ-2-2-ベンジルオキシ-11-ジメチルエチル-6-フルオロインドールの合成方法B酢酸パラジウム33g、004当量、dppb94g、006当量および炭酸カリウム15kg、30当量をリアクターに入れる。遊離塩基の油状物ベンジルグリコール化4-アンモニウム-2-ブロモ-5-フルオロアニリン15kg、10当量をアセトニトリル82L、41体積に溶解し、次いでリアクターに添加した。混合物を窒素ガスで1時間以上拡散した。アセトニトリル中の4-ベンジルオキシ-33-ジメチルブト-1-イン70、11kg、105当量の溶液を混合物に添加し、次いで、それを窒素ガスで1時間以上拡散させた。混合物を80°Cに加熱し、次いで終夜撹拌した。HPLCによるIPCを実施し、反応は16時間後に完了すると判定された。混合物を環境温度に冷却し、次いでセライトパッド228gで濾過した。リアクターおよびセライトパッドをアセトニトリル2x2L、2体積で洗浄した。合わせた相を溶媒8Lが回収されるまで22Lロータリーエバポレーターで濃縮し、アセトニトリル7L35体積中に粗生成物を残す。ビス-アセトニトリルジクロロパラジウム144g、015当量をリアクターに入れた。粗製の溶液をリアクターに戻し、ロータリーエバポレーターのバルブをアセトニトリル4L、2体積で洗浄した。合わせた溶液を窒素ガスで1時間以上拡散させた。反応混合物を16時間以上80°Cに加熱した。HPLCによる工程制御は、出発物質の完全な消費を示す。反応混合物をセライト300gで濾過した。リアクターおよびフィルターケーキをアセトニトリル3L、15体積で洗浄した。合わせた濾液を回転蒸発により油状物に濃縮した。油状物を酢酸エチル88L、44体積に溶解した。溶液を20塩化アンモニウム5L、25体積で、続いて5塩水5L、25体積で洗浄した。シリカゲル35kg、18wteqを有機相に添加し、それを終夜撹拌した。DeloxanTHPII金属捕捉剤358gおよびヘプタン176Lを添加し、得られた混合物を3時間以上撹拌した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過した。フィルターケーキをヘプタン25L中の30酢酸エチルで洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮し、N-ベンジルグリコール化-5-アミノ-2-2-ベンジルオキシ-11-ジメチルエチル-6-フルオロインドールを茶色のペーストとして得た14kg。化合物1の合成ベンジル保護化合物1の合成1-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボン酸13当量をトルエン25体積、1-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボン酸を基準としてでスラリー化した。塩化チオニルSOCl2、17当量を滴下漏斗で添加し、混合物を60°Cに加熱した。得られた混合物を2時間撹拌した。トルエンおよび過剰のSOCl2をロータリーエバポレーターで留去した。さらなるトルエン25体積、1-22-ジフルオロ-13-ベンゾジオキソール-5-イル-シクロプロパンカルボン酸を基準としてを添加し、混合物を1体積のトルエンまで蒸留した。DCM4体積中のR-1-5-アミノ-2-1-ベンジルオキシ-2-メチルプロパン-2-イル-6-フルオロ-1H-インドール-1-イル-3-ベンジルオキシプロパン-2-オール1当量およびトリエチルアミン3当量の溶液を0°Cに冷却した。トルエン1体積中の酸塩化物溶液を、バッチ温度を10°Cより低く維持しながら添加する。反応の進行をHPLCにより監視し、反応は、通常数分で完了する。25°Cに温めた後、反応混合物を5NaHCO335体積、1MNaOH35体積および1MHCl5体積で洗浄する。メタノール2体積への溶媒交換を実施し、得られるメタノール中のR-N-1-3-ベンジルオキシ-2-ヒドロキシプロピル-2-1-ベンジルオキシ-2-メチルプロパン-2-イル-6-フルオロ-1H-インドール-5-イル-1-22-ジフルオロベンゾ[d][13]ジオキソール-5-イルシクロプロパンカルボキサミドの溶液を、さらに加工せずに次の段階水素化分解に使用する。化合物1の合成5パラジウム/チャコール約50乾重量、001当量を、適切な水素化容器に入れる。上記で得られるメタノール2体積中のR-N-1-3-ベンジルオキシ-2-ヒドロキシプロピル-2-1-ベンジルオキシ-2-メチルプロパン-2-イル-6-フルオロ-1H-インドール-5-イル-1-22-ジフルオロベンゾ[d][13]ジオキソール-5-イルシクロプロパンカルボキサミド溶液を注意深く添加し、続いてメタノール中の3MHCl溶液を添加する。容器を窒素ガスで、次いで水素ガスでパージする。HPCL分析で測定して反応が完了するまで、混合物を激しく撹拌する。典型的な反応時間は3-5時間である。反応混合物をセライトで濾過し、ケーキをメタノール2体積で洗浄する。イソプロパノール3体積への溶媒交換を実施する。粗製のVX-661を75IPA-ヘプタン4体積、即ち、1体積のヘプタンを3体積のIPAに添加するで結晶化し、得られる結晶を50IPA-ヘプタン即ち、2体積のヘプタンを混合物に添加するで成熟させる。2段階のアシル化/水素化分解手順からの典型的な化合物4の収率は、68ないし84の範囲である。直前に記載したのと同じ手順に従って、化合物4をIPA-ヘプタンから再結晶できる。化合物1は、出典明示により本明細書の一部とする米国公開特許出願US20090131492に記載のいくつかの合成経路の1つによっても製造し得る。下記の表10は、化合物1の分析データを記載する。表10アッセイ化合物のΔF508-CFTR矯正correction特性を検出および測定するためのアッセイ化合物のΔF508-CFTR調節特性をアッセイするための光学的膜電位方法光学的膜電位アッセイは、蛍光変化の測定装置、例えば電位差/イオンプローブリーダーVIPRGonzalezJEKOadesetalCell-basedassaysandinstrumentationforscreeningion-channeltargetsDrugDiscovToday4431-439を参照のことと組み合わせて、GonzalezおよびTsienに記載の膜電位感受性FRETセンサーを利用したGonzalezJEandRYTsienVoltagesensingbyfluorescenceresonanceenergytransferinsinglecellsBiophysJ69127280、およびGonzalezJEandRYTsienImprovedindicatorsofcellmembranepotentialthatusefluorescenceresonanceenergytransferChemBiol426977を参照のこと。これらの電位感受性アッセイは、膜可溶性の電位感受性色素であるDiSBAC23と、蛍光リン脂質であるCC2-DMPEそれは、原形質膜の外側膜に結合して、FRET供与体として作用するの間の、蛍光共鳴エネルギー転移FRETにおける変化に基づく。膜電位Vmの変化は、負電荷のDiSBAC23が原形質膜を通過して再分布するのを誘発し、それによってCC2-DMPEからのエネルギー伝達量が変化する。蛍光放射の変化を、96または384ウェルマイクロタイタープレートにおいて細胞をベースとするスクリーニングを行うよう設計された、統合された液体処理システムhandlerおよび蛍光検出器であるVIPR登録商標IIを使用して監視した。1.矯正化合物の同定ΔF508-CFTRと関係する輸送障害を矯正する小分子を同定するために、単一付加single-additionHTSアッセイフォーマットを開発した。細胞を、試験化合物の存在または非存在ネガティブコントロール下、37°Cで16時間、血清不含有培地中でインキュベートした。ポジティブコントロールとして、384ウェルプレートに播いた細胞を、27°Cで16時間インキュベートし、温度-矯正ΔF508-CFTRとした。その後、細胞をクレブスリンゲル溶液で3回すすぎ、電位感受性色素を添加した。ΔF508-CFTRを活性化するために、10μMフォルスコリンおよびCFTR増強剤、ゲニステイン20μMを、各ウェルにCl-不含有媒体と共に添加した。Cl-不含有媒体の添加は、ΔF508-CFTR活性化に応答してCl-排出を促進し、その結果の膜脱分極を、FRETをベースとする電位感受性色素を使用して光学的に監視した。2.増強化合物の同定ΔF508-CFTRの増強剤を同定するために、二重付加double-additionHTSアッセイフォーマットを開発した。最初の添加中、試験化合物を含むか、または含まないCl-不含有培地を各ウェルに添加した。22秒後、2-10μMフォルスコリンを含むCl-不含有培地の2回目の添加を行い、ΔF508-CFTRを活性化した。両方の添加後の細胞外Cl-濃度は28mMであって、それは、ΔF508-CFTR活性化に応答してCl-排出を促進し、結果としての膜脱分極を、FRETをベースとする電位感受性色素を使用して光学的に監視した。3.溶液浴溶液1:NaCl160mM、KCl45mM、CaCl22mM、MgCl21mM、HEPES10mM、NaOHでpH74。塩化物不含有浴溶液:浴溶液1中の塩化物塩を、グルコン酸塩で置き換える。CC2-DMPE:DMSO中、10mM原液として製造し、-20°Cで貯蔵した。DiSBAC23:DMSO中、10mM原液として製造し、-20°Cで貯蔵した。4.細胞培養ΔF508-CFTRを安定に発現するNIH3T3マウス線維芽細胞を、膜電位の光学的測定に使用する。細胞を、175cm2培養フラスコ中、2mMグルタミン、10ウシ胎仔血清、1×NEAA、β-ME、1×pen/strep、および25mMHEPESを添加したダルベッコの改変イーグルス培地中で、37°C、5CO2中、湿度90で維持する。全ての光学的アッセイのために、細胞を、384ウェルのマトリゲル被覆プレート中、30000/ウェルで播種し、37°Cで2時間培養し、その後、増強剤アッセイのために27°Cで24時間培養した。矯正アッセイのために、細胞を16-24時間、化合物有りおよび無しで、27°Cまたは37°Cで培養する。化合物のΔF508-CFTR調節特性をアッセイするための電気生理的アッセイ1.ウッシングUssingチャンバーアッセイウッシングチャンバー実験を、ΔF508-CFTRを発現する分極上皮細胞で行い、光学的アッセイで同定したΔF508-CFTRモジュレーターをさらに特徴解析した。CostarSnapwell細胞培養インサート上に増殖したFRTΔF508-CFTR上皮細胞を、ウッシングチャンバーPhysiologicInstrumentsIncSanDiegoCAにマウントし、単層を、電位固定システムDepartmentofBioengineeringUniversityofIowaIAおよびPhysiologicInstrumentsIncSanDiegoCAを用いて継続的に短絡させた。2mVパルスを適用して経上皮電気抵抗を測定した。これらの条件下で、FRT上皮細胞は、4KΩ/cm2またはそれ以上の抵抗を示した。溶液を27°Cに維持し、空気をバブリングさせた。電極オフセット電位および流体抵抗を、無細胞インサートを使用して矯正した。これらの条件下で、電流は、頂端膜で発現されるΔF508-CFTRを介したCl-の流動を反映する。MP100A-CEインターフェースおよびAcqKnowledgeソフトウェアv326BIOPACSystemsSantaBarbaraCAを使用して、ISCをデジタル方式で得た。2.矯正化合物の同定典型的なプロトコールは、基底側から頂端膜へのCl-濃度勾配を利用した。この勾配を設定するため、通常のリンゲル溶液を基底側膜に使用し、一方、頂端NaClを、等モルのグルコン酸ナトリウムで置き換えNaOHを用いてpH74に滴定、上皮を横切る大きなCl-濃度勾配を得た。全ての実験を、無傷の単層で行った。ΔF508-CFTRを完全に活性化するために、フォルスコリン10μM、PDE阻害剤、IBMX100μMを添加し、次いでCFTR増強剤、ゲニステイン50μMを添加した。他の細胞タイプで観察されるように、△F508-CFTRを安定に発現するFRT細胞の低温でのインキュベートは、細胞膜でのCFTRの機能的密度を増大する。矯正化合物の活性を決定するために、細胞を10μMの試験化合物と共に24時間37°Cでインキュベートし、その後、3回洗浄して、記録した。化合物処理した細胞におけるcAMPおよびゲニステインに媒介されるISCを、27°Cおよび37°Cの対照に対して標準化し、活性として表した。細胞と矯正化合物のプレインキュベーションは、37°C対照と比較して、cAMPおよびゲニステインに媒介されるISCを顕著に増大させた。3.増強化合物の同定典型的なプロトコールは、基底側から頂端膜へのCl-濃度勾配を利用した。この勾配を設定するために、通常のリンゲル溶液を基底側膜に使用し、ナイスタチン360μg/mlで透過性にし、一方、頂端側NaClを等モルのNaOHでpH74に滴定されたグルコン酸ナトリウムで置き換え、上皮を横切る大きなCl-濃度勾配を得た。全ての実験をナイスタチン透過処理の30分後に行った。フォルスコリン10μMおよび全ての試験化合物を、細胞培養インサートの両側に添加した。推定上のΔF508-CFTR増強剤の有効性を、公知の増強剤ゲニステインのそれと比較した。4.溶液側底溶液mM:NaCl135、CaCl212、MgCl212、K2HPO424、KHPO406、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸HEPES10、およびデキストロース10。NaOHを使用して溶液をpH74に滴定した。頂端溶液mM:側底溶液と同じ。ただし、NaClをグルコン酸Na135で置き換えた。5.細胞培養ΔF508-CFTRを発現するFisherラット上皮FRT細胞FRTΔF508-CFTRを、我々の光学的アッセイから同定された推定ΔF508-CFTRモジュレーターのウッシングチャンバー実験に使用した。細胞をCostarSnapwell細胞培養インサート上で培養し、5ウシ胎仔血清、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを添加したCoonの改変HamF-12培地中で37°Cおよび5CO2で5日間培養した。化合物の増強剤活性を特徴解析するのに使用する前に、細胞を27°Cで16~48時間インキュベートし、ΔF508-CFTRを矯正した。矯正化合物の活性を決定するために、細胞を、27°Cまたは37°Cで化合物の有無下、24時間インキュベートした。6.全細胞Whole-cell記録ΔF508-CFTRを安定に発現する、温度および試験化合物で矯正されたNIH3T3細胞における巨視的ΔF508-CFTR電流IΔF508を、穿孔パッチホールセル記録を使用して監視した。簡潔に述べると、IΔF508の電位固定記録を、Axopatch200Bパッチクランプ増幅器AxonInstrumentsIncFosterCityCAを使用して室温で実施した。全ての記録をサンプリング周波数10kHzで取得し、1kHzの低域フィルターにかけた。ピペットは、細胞内液で満たすと5~6MΩの抵抗を有した。これらの記録条件下で、室温でのCl-の計算逆転電位EClは-28mVであった。すべての記録は、シール抵抗>20GΩおよび直列抵抗<15MΩであった。パルス発生、データ取得および分析を、Clampex8に接続されたDigidata1320ADインターフェースを備えたPCAxonInstrumentsIncを使用して行った。浴は、食塩水<250μlを含み、重力駆動の潅流システムを使用して速度2ml/分で連続的に洗い流した。7.矯正化合物の同定細胞膜中の機能的ΔF508-CFTRの密度を増加させる矯正化合物の活性を求めるために、我々は、上記の穿孔パッチ記録技術を使用して、矯正化合物で24時間処理した後の電流密度を測定した。ΔF508-CFTRを十分に活性化するために、10μMフォルスコリンおよび20μMゲニステインを細胞に添加した。我々の記録条件下では、27°Cで24時間インキュベートした後の電流密度は、37°Cで24時間インキュベートした後に観察された電流密度より高かった。これらの結果は、細胞膜中のΔF508-CFTRの密度に対する低温インキュベーションの公知の効果と一致する。CFTR電流密度に対する矯正化合物の効果を決定するために、細胞を10μM試験化合物と共に37°Cで24時間インキュベートし、電流密度を27°Cおよび37°Cの対照と比較した活性。記録前に、細胞を細胞外記録培地で3回洗浄して、残留試験化合物を除去した。10μM矯正化合物と共にプレインキュベートすると、cAMPおよびゲニステインに依存した電流が37°Cの対照に比べて有意に増加した。8.増強剤化合物の特定ΔF508-CFTRを安定に発現するNIH3T3細胞において巨視的ΔF508-CFTRCl-電流IΔF508を増加させるΔF508-CFTR増強剤の能力もまた、穿孔パッチ記録技術を使用して調べた。光学的アッセイから特定された増強剤は、光学的アッセイにおいて観察された類似の作用強度および効力でIΔF508の用量依存的増加を惹起した。試験したすべての細胞において、増強剤の適用前および適用中の逆転電位は、約-30mVであった。約-30mVは、計算したECl-28mVである。9.溶液細胞内液mM:アスパラギン酸Cs90、CsCl50、MgCl21、HEPES10及び240μg/mlアンホテリシンBCsOHを用いてpH735に調節した。細胞外液mM:N-メチル-D-グルカミンNMDG-Cl150、MgCl22、CaCl22、HEPES10HClを用いてpH735に調節した。10.細胞培養ΔF508-CFTRを安定に発現するNIH3T3マウス線維芽細胞を全細胞記録に使用する。細胞を、175cm2培養フラスコ中の2mMグルタミン、10ウシ胎仔血清、1×NEAA、β-ME、1×pen/strepおよび25mMHEPESを補充したダルベッコの改変イーグル培地中で37°C、5CO2および湿度90で維持する。全細胞記録の場合、2500~5000細胞をポリ-L-リジンコートしたカバーガラス上に播き、27°Cで24~48時間培養した後、増強剤の活性を試験するのに使用した。さらに、矯正化合物の活性を測定するために、矯正化合物の有無下、37°Cでインキュベートした。11.単一チャネル記録NIH3T3細胞中で安定に発現された温度-矯正ΔF508-CFTRの単一チャネル活性、および増強剤化合物の活性を、切り出したインサイドアウト膜パッチを使用して観察した。簡潔に述べると、単一チャネル活性の電位固定記録を、Axopatch200Bパッチクランプ増幅器AxonInstrumentsIncを用いて室温で行った。全ての記録をサンプリング周波数10kHzで取得し、400Hzの低域フィルターにかけた。パッチピペットは、CorningKovarSealing7052ガラスWorldPrecisionInstrumentsIncSarasotaFLから作製され、細胞外液で満たすと5~8MΩの抵抗を有した。切り出し後に1mMMg-ATPおよび75nMcAMP依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットPKA;PromegaCorpMadisonWIを添加することによってΔF508-CFTRを活性化した。チャネル活性が安定化された後、重力駆動微小潅流システムを使用してパッチを洗い流した。流入液をパッチに隣接して置き、1~2秒以内に溶液を完全に交換した。急速な洗い流し中にΔF508-CFTR活性を維持するために、非特異的ホスファターゼ阻害剤F-10mMNaFを浴溶液に添加した。これらの記録条件下で、チャネル活性は、パッチ記録の期間最高60分間を通して一定のままであった。細胞内液から細胞外液に移動する陽電荷反対方向に移動する陰イオンによって生成される電流を正電流として示す。ピペット電位Vpを80mVで維持した。2個以下の活性チャネルを含む膜パッチからチャネル活性を分析した。最高同時開口数によって、実験過程中の活性チャネル数を決定した。単一チャネルの電流振幅を測定するために、120秒のΔF508-CFTR活性から記録されたデータを100Hzでオフラインでフィルターし、次いでそれを使用して、BioPatchAnalysisソフトウェアBio-LogicCompFranceを用いてマルチガウシアン関数に当てはめた全点振幅all-pointamplitudeヒストグラムを構築した。合計の微小電流および開口率Poを、120秒のチャネル活性から決定した。BioPatchソフトウェアを使用して、または、関係式Po=I/iN式中、I=平均電流、i=単一チャネル電流振幅、およびN=パッチ中の活性チャネル数から、Poを決定した。12.溶液細胞外液mM:NMDG150、アスパラギン酸150、CaCl25、MgCl22およびHEPES10Tris塩基を用いてpH735に調節した。細胞内液mM:NMDG-Cl150、MgCl22、EGTA5、TES10およびTris塩基14HClを用いてpH735に調節した。13.細胞培養ΔF508-CFTRを安定に発現するNIH3T3マウス線維芽細胞を、切り出された膜のパッチクランプ記録に使用する。175cm2培養フラスコ中の2mMグルタミン、10ウシ胎仔血清、1×NEAA、β-ME、1×pen/strepおよび25mMHEPESを補充したダルベッコの改変イーグル培地中で37°C、5CO2および湿度90で細胞を維持する。単一チャネル記録の場合、2500~5000細胞をポリ-L-リシンコートしたカバーガラス上に播き、使用前に27°Cで24~48時間培養した。上記の方法を使用して、化合物1の活性、すなわちEC50を測定した。それを表11に示す。