"乳癌患者が、原発性腫瘍の外科的除去後に乳癌を再発することなく長期生存する可能性を予測する方法であって、前記患者から得られた乳癌組織サンプルにおけるCCNB1のRNA転写物の発現レベルであって、RNA転写物の参照セットに対して正規化された発現レベルを決定する工程を含み、前記CCNB1の過剰発現が、乳癌を再発せずに長期生存する可能性の低下を示す方法。前記方法が、前記患者から得られた乳癌組織サンプルにおける1又は2以上の予後RNA転写物またはその発現産物の発現レベルであって、前記乳癌組織サンプルにおける全RNA転写物またはその全産物の発現レベル、あるいはRNA転写物またはその産物の参照セットの発現レベルに対して正規化された発現レベルを決定する工程を更に含み、前記1又は2以上の予後RNA転写物が、以下:Bcl2、FOXM1、PRAME、STK15、CEGP1、Ki-67、GSTM1、CA9、PR、BBC3、NME1、SURV、GATA3、TFRC、YB-1、DPYD、GSTM3、RPS6KB1、Src、Chkl、ID1、EstRl、p27、XIAP、Chk2、CDC25B、IGF1R、AK055699、P13KC2A、TGFB3、BAGI1、CYP3A4、EpCAM、VEGFC、pS2、hENTl、WISP1、HNF3A、NFKBp65、BRCA2、EGFR、TK1、VDR、pENTl、EPHX1、IF1A、DIABLO、CDH1、HIFlα、IGFBP3、CTSBおよびHer2からなる群から選択される1又は2以上の遺伝子の転写物であり、FOXM1、PRAME、STK15、Ki-67、CA9、NME1、SURV、TFRC、YB-1、RPS6KB1、Src、Chkl、Chk2、CDC25B、CYP3A4、EpCAM、VEGFC、hENT1、BRCA2、EGFR、TK1、VDR、EPHX1、IF1A、CDH1、HIFlα、IGFBP3、CTSB、Her2およびpENT1の1又は2以上の過剰発現が、乳癌を再発せずに長期生存する可能性の低下を示し、Bcl2,CEGP1、GSTM1、PR、BBC3、GATA3、DPYD、GSTM3,ID1、EstRl、p27、XIAP,IGF1R、AK055699、P13KC2A、TGFB3、BAGI1,pS2、WISP1、HNF3A、NFKBp65およびDIABLOの1又は2以上の過剰発現が、乳癌を再発せずに長期生存する可能性の向上を示し、少なくとも2、好ましくは少なくとも5、より好ましくは少なくとも10、最も好ましくは少なくとも15の予後RNA転写物またはその発現産物の発現レベルが決定される、請求項1に記載の方法前記方法が、以下:PRAME、VEGFC、HIF1A、hENT1、GCLC、TIMP2、ID1、p27及びupaの遺伝子のRNA転写物又はその発現産物の発現レベルを決定する工程を更に含み、乳癌がエストロゲンレセプターER陽性乳癌である、請求項1に記載の方法。前記RNAが、前記患者の固定された、パラフィン包埋された乳癌組織検体から単離される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。前記RNA転写物の発現レベルが、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRにより定量化される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。前記RNA転写物の発現レベルが、アレイにより定量化される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。1つの局面において、本発明は、癌と診断された患者の臨床結果を予測するための方法に関する。この方法は、患者から得られた癌組織における1つ以上の遺伝子の発現レベルの決定、もしくはそれらの発現産物の発現レベルの決定を含む。その遺伝子は、p53BP2、カテプシンBまたはカテプシンL、Ki67/MiB1、およびチミジンキナーゼから成る群から選択される。その発現レベルは、コントロールの遺伝子単数または複数に対して正規化され、参照となる癌組織セットにおいて検出される量と比較され、ここで、ap53BP2の発現レベルが、下位10の百分位数である場合;またはbカテプシンBまたはカテプシンLのいずれかの発現レベルが、上位10の百分位数である場合;またはcKi67/MiB1またはチミジンキナーゼのいずれかの発現レベルが、上位10の百分位数である場合、不良な結果が予想される。不良な臨床結果は、例えば、生存期間の短縮または癌再発の危険性の増加の点で測定され得る例えば、癌の外科的手術での除去の後。別の実施形態において、本発明者は、癌患者における処置後の癌再発の可能性を予想する方法を考慮している。この方法は、癌患者から得られた癌細胞におけるp27の発現レベルの決定またはその発現産物の発現レベルの決定を含み、この発現レベルは、コントロール遺伝子単数または複数に対して正規化され、参照される癌組織セットにおいて見られる量と比較され、ここで上位10の百分位数の発現レベルは、処置後の再発の危険性の低下を示す。別の局面において、本発明は,Bcl2、肝細胞核因子3、ER、ErbB2およびGrb7、またはそれらの発現産物からなる群から選択した2種類以上の遺伝子の癌組織での発現レベルの決定を含む癌分類の方法に関する。癌組織でのこれら遺伝子の発現レベルは、コントロール遺伝子単数または複数に対して正規化されており、参照癌組織セットで見られる量と比べられ、ここで、iBcl2,肝細胞核因子3、およびER、またはそれらの発現産物のうち少なくとも1種類を発現している腫瘍で、参照癌組織セットでの平均発現レベルより上のものは、処置後の疾患がない、全体的な患者の生存に対して、良好な予後を持つと分類される;およびii高いレベルのErbB2およびGrb7またはそれらの発現産物を発現している腫瘍が、参照癌組織セットでの平均発現レベルより10倍以上のものは、処置後の疾患がない全体的な患者の生存に対して、不良な予後を持つと分類される。全てのタイプの癌例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、腺癌、黒色腫、および脳腫瘍が挙げられる。前記の方法は、乳癌の予後診断/分類に特に適切である。これまでの全ての局面において、特定の実施形態で、発現レベルは、ホルマリン固定された、パラフィン包埋組織サンプルから入手したRNAの使用により決定される。遺伝子発現プロファイリングの全ての技術とプロテオミクスの技術は共に、本発明の前記した局面の実行における使用に適切である。一方、遺伝子発現レベルは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRにより、しばしば決定される。組織源が、ホルマリン固定された、パラフィン包埋組織サンプルである場合、RNAはしばしばフラグメント化されている。発現データはさらに、多変量の分析例えば、CoxProportionalHazardsモデルを用いるにかけられ得る。さらなる局面において、本発明は固定された、蝋包埋標本から核酸を調製するための方法に関する。この方法は以下を含む:a固定された、蝋包埋組織標本の切片を、事前の脱蝋なしで、タンパク質分解酵素存在下、溶解緩衝液中約56°C~70°Cの温度でインキュベートし、溶解溶液を形成する工程;b溶解溶液を蝋が凝固する温度まで冷却する工程;およびc溶解溶液から核酸を単離する工程。溶解緩衝液は、尿素例えば、4M尿素を含み得る。特定の実施形態において、前記した方法の工程aにおけるインキュベーションは、約65°Cで実行される。別の特定の実施形態において、前記方法において使用されるタンパク質分解酵素は、タンパク質分解酵素Kである。別の実施形態において、工程bにおける冷却は、室温で実行される。さらなる実施形態において、タンパク質除去後に核酸は2.5MNH4OAcで単離される。例えば、核酸は、固定された蝋包埋組織標本中に存在する核酸の総量であり得る。さらなる別の実施形態において、総核酸は、タンパク質除去の後、2.5MNH4OAcで溶解溶液から沈殿することによって単離される。例えば、沈殿は、イソプロパノールで実行され得る。以上で記述した方法は、総核酸からDNAを除く工程例えば、DNAase処理によってをさらに含み得る。例えば、組織標本は、腫瘍から入手され得る。さらに、RNAは、腫瘍が濃縮され組織標本の顕微鏡解剖された部分から入手され得る。全てのタイプの癌例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺がん、腎臓癌、腺癌、黒色腫、および脳腫瘍、特に乳癌が制限なしに挙げられる。以上で記述した方法は、RNAを遺伝子発現プロファイルに供する工程をさらに含み得る。従って、表1に列挙した遺伝子の少なくとも2つを含む遺伝子セットについて、遺伝子発現プロファイルが、完了され得る。遺伝子発現プロファイリングの全ての方法が意図されるが、特定の実施形態において、遺伝子発現プロファイリングは、増幅工程が先に行われ得る、RT-PCRにより実行される。別の局面において、本発明は、遺伝子発現分析のためのフラグメント化されたRNAを調製するための方法に関する。この方法は以下の工程を含む:a少なくとも1つの遺伝子特異的な一本鎖DNAの足場に対してRNAのフラグメントが相補的なそのDNAの足場とハイブリダイズする条件で、RNAと混合する工程;bハイブリダイズしたRNAフラグメントを、DNAポリメラーゼにより伸長してDNA-DNA二重鎖を形成する工程;およびc二重鎖からDNAの足場を除去する工程。特定の実施形態において、この方法の工程bで、RNAは、目的の遺伝子それぞれに特異的な一本鎖テンプレートDNAの混合物と混ぜられ得る。本方法は、熱変性および二重鎖DNAのDNAの足場さらなる足場の重複があってもよいし、なくてもよいへの再アニールの工程をさらに含み得る。本方法はまた、過程cにおける足場の除去の工程の前に、DNAポリメラーゼで二重鎖のセンス鎖をさらに伸長する工程を含み得る。DNAテンプレートは、目的遺伝子に対して完全に相補的であり得るが、そうである必要はない。特定の実施形態において、少なくとも1つのDNAテンプレートは、目的の遺伝子の特定の区域に対して相補的である。他の実施形態において、DNAテンプレートは、同じ遺伝子の多形性改変体に対し相補的な配列を含んでいる。テンプレートDNAは、1つ以上のdUTPまたはrNTP部位を含み得る。この件において、工程cでは、工程bで形成されたDNA-DNA二重鎖中に存在するDNAテンプレートをdUTPまたはrNTP部位で断片化することによりDNAテンプレートは除去され得る。重要な実施形態において、RNAは、固定された蝋包埋組織標本から抽出され、酵素アッセイでの基質として働くのに十分な程度に精製される。RNA精製には、オリゴdTに基づく工程がふくまれ得るが、含む必要はない。さらなる局面では、本発明は、目的遺伝子の少なくとも1つを代表しているフラグメント化されたRNAを含むサンプルにおけるRNAフラグメント増幅の方法に関する。この方法は、以下の工程を含む:a5’末端にRNAポリメラーゼプロモーターを含む1本鎖DNAの足場と相補的なRNAフラグメントがこのDNAの足場とハイブリダイズする条件下でDNAの足場のプールとサンプルを接触させる工程;bDNAの足場に沿って、DNAポリメラーゼで、ハイブリダイズしたRNAフラグメントを伸長し、DNA-DNA二重鎖形成する工程;cインビトロ転写によって目的の遺伝子単数または複数を増幅する工程;およびd二重鎖からDNAの足場を除去する工程。代表的なプロモーターは、T7RNAポリメラーゼプロモーターであり、代表的なDNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼIである。工程dにおいて、DNAの足場は、例えば、DNaseIでの処理によって除去され得る。さらなる実施形態において、一本鎖DNAの足場のプールは、部分的なまたは完全な目的遺伝子の配列例えば、cDNAクローンのライブラリを含む。特定の実施形態において、サンプルは、全ゲノムまたはそれらの一部分を代表する。好ましい実施形態において、ゲノムは、ヒトゲノムである。別の局面において、本発明は、患者のための個人化したゲノム化学のプロファイル調整の方法に関する。この方法は、以下の工程を含む:a患者から得られた組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程;bこのような組織における、表1で列挙した遺伝子セットから選択した少なくとも2つの遺伝子の発現レベルを決定する工程であって、この発現レベルは、コントロール遺伝子単数または複数に対して正規化され、癌組織の参照セットで観察される量と比較される、工程。;cならびに、遺伝子発現分析により得たデータを要約するレポートを作成する工程。患者から得られた組織は、癌細胞を含み得るが、含まなくても良い。以前と同じように、癌は、例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、腺癌、黒色腫、または脳腫瘍であり得る。特に、乳癌が好まれる。特定の実施形態において、RNAは、癌細胞を濃縮された乳癌組織の顕微鏡解剖された一部分から入手される。コントロール遺伝子セットは、例えば、S-アクチンおよびリボソームタンパク質LPOを含み得る。患者の利用または患者の医師の利用のために準備されるレポートは、患者の治療において潜在的に有益な、少なくとも1種類の薬剤の同定を含み得る。前述の方法の工程bは、薬物に対する細胞の感受性に特異的に影響する遺伝子の発現レベル決定の工程を含み得る。例えば、遺伝子は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A3、アンフィリレグリンamphiliregulin、ARG、BRK、BCRP、CD9、CD31、CD82/KAI-1、COX2、c-abl、c-kit、c-kitL、CYP1B1、CYP2C9、DHFR、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ、EGF,エピレグリン、ER-α、ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、ER-β、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、γ-GCSグルタミルシステインシンターゼ、GATA3、グラニルグラニルピロリン酸シンターゼ、Grb7、GST-α、GST-π、HB-EGF、hsp27、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン/CGA、IGF-1,IGF-2,IGF1R、KDR、LIV1、肺耐性タンパク質/MVP、Lot1、MDR-1、ミクロソームエポキシド加水分解酵素、MMP9、MRP1、MRP2、MRP3、MRP4、PAI1、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-c、PDGF-D、PDGFR-α、PDGFR-β、PLAGa多形腺腫1、PREPプロリルエンドペプチダーゼ、プロゲステロンレセプター、pS2/トレフォイルtrefoil因子、PTEN、PTB1b、RAR-α、RAR-β2、還元型葉酸塩キャリア、SXR、TGF-α、チミジンホスホリラーゼ、チミジンシンターゼ、トポイソメラーゼII-α、トポイソメラーゼII-β、VEGF、XIST、およびYB-1からなる群より選択され得る。別の実施形態において、前記のプロセスの工程bは、多種薬剤耐性因子例えば、γグルタミルシステインシンターゼGCS,GST-α、GST-π、MDR-1、MRP1-4、乳癌耐性タンパク質BCRP、肺癌耐性タンパク質MVP、SXRまたはYB-1の発現レベルを決定する工程を含む。別の実施形態において、前記プロセスの工程bは、真核生物の翻訳開始因子4EEIF4Eの発現レベルの決定を含む。なお別の実施形態において、前記プロセスの工程bは、DNA修復酵素の発現レベル決定を含む。さらなる実施形態において、前記プロセスの工程bは、細胞周期調節因子例えば、c-MYC、c-Src、サイクリンD1、Ha-Ras、mdm2、p14ARF、p21WAF1/CI、p16INK4a/p14、p23、p27、p53、P13K、PKC-ε、またはPKC-δの発現レベル決定を含む。またさらなる実施形態において、前記プロセスの工程bは、腫瘍サプレッサまたは関連タンパク質例えば、APCまたはE-カドヘリンの発現レベル決定を含む。別の実施形態において、前記方法の工程bは、アポトーシスを調節する遺伝子例えば、p53、BC12、Bcl-x1、Bak、Bax、および関連因子、NFκ-B、CIAP1、CIAP2、survivin、および関連因子、p53BP1/ASPP1またはp53BP2/ASPP2の発現レベル決定を含む。さらなる別の実施形態において、前記プロセスの過程bは、細胞侵襲または血管形成を制御する因子例えば、uPA、PAI1、カテプシンB、カテプシンC、およびカテプシンL、散乱因子HGF、c-met、KDR、VEGF、またはCD31の発現レベル決定を含む。異なる実施形態において、前記方法の工程bは、免疫細胞もしくは免疫プロセスまたは炎症細胞もしくは炎症プロセスに対するマーカー例えば、Ig軽鎖λ、CD18、CD3、CD68、FasCD95、Fasリガンドの発現レベル決定を含む。さらなる実施形態において、前記プロセスの工程bは、細胞増殖マーカー例えば、Ki67/MiB1、PCNA、Pin1、またはチミジンキナーゼの発現レベル決定を含む。なおさらなる実施形態において、上記プロセスの工程bは、増殖因子例えば、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGF1R、FGF2、CSF-1、CSF-lR/fms、SCF-1、IL6またはIL8のようなまたは増殖因子レセプターの発現レベルの決定を包含する。別の実施形態において、上記プロセスの工程bは、乳癌のサブクラスを規定する遺伝子マーカーの発現レベルの決定を包含し、ここでこの遺伝子マーカーは、例えば、GRO1オンコジーンα、Grb7、サイトケラチン5およびサイトケラチン17、レチノール結合タンパク質4、肝細胞核因子3、インテグリンサブユニットα7、またはリポプロテインリパーゼであり得る。なおさらなる局面において、本発明は、乳癌と診断された患者の、5-フルオロウラシル5-FUまたはそのアナログに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程;bチミジル酸シンターゼmRNAの、組織における発現レベルを決定する工程であって、ここで発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程、およびcこの正規化したチミジル酸シンターゼmRNAレベルに基づいて患者の応答を予測する工程。上記方法の工程dは、さらに、ジヒドロピリミジンホスホリラーゼの発現レベルを決定する工程を包含し得る。別の実施形態において、本方法の工程bはさらに、チミジンホスホリラーゼの発現レベルを決定する工程を包含し得る。さらに別の実施形態において、以下の場合に5-FUまたはそのアナログに対する正の応答が予測される:i工程bにおいて決定された正規化されたチミジル酸シンターゼmRNAレベルが、15百分位数を下回る場合;またはii工程bにおいて決定されたチミジル酸シンターゼの正規化した発現レベルおよびジヒドロピリミジンホスホリラーゼの発現レベルの合計が、25百分位数を下回る場合、またはiii工程bにおいて決定されたチミジンシンターゼの正規化された発現レベル、ジヒドロピリミジンホスホリラーゼの発現レベル、およびチミジンホスホリラーゼの発現レベルの合計が、20百分位数を下回る場合。さらなる実施形態において、上記方法の工程bにおいて、c-mycおよび野生型p53の発現レベルが決定される。この場合において、5-FUまたはそのアナログに対する正の応答は、野生型p53の正規化された発現レベルに対するc-mycの正規化された発現レベルが15百分位数を上回る場合に予測される。なおさらなる実施形態において、上記方法の工程bにおいて、NFκBおよびcIAP2の発現レベルが決定される。特定の実施形態において、5-FUまたはそのアナログに対する抵抗性は、代表的に、NFκBおよびcIAP2の正規化された発現レベルが10百分位数以上である場合に予測される。別の局面において、本発明は、乳癌と診断された患者のメトトレキサートまたはそのアナログに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにb以下の場合に、メトトレキサートもしくはそのアナログに対する患者の感受性の減少を予測する工程:iDHFRレベルが、コントロール遺伝子セットにおけるDHFRの平均発現レベルよりも10倍以上高い場合、またはii還元葉酸キャリアRFCファミリーのメンバーの正規化された発現レベルが、10百分位数を下回る場合。なお別の局面において、本発明は、乳癌と診断された患者のアントラサイクリンまたはそのアナログに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにb以下の場合に、アントラサイクリンもしくはそのアナログに対する患者の抵抗性もしくは減少した感受性を予測する工程:iトポイソメラーゼIIαの正規化された発現レベルが、10百分位数を下回る場合、またはiiトポイソメラーゼIIβの正規化された発現レベルが、10百分位数を下回る場合、またはiiiトポイソメラーゼIIαもしくはトポイソメラーゼIIβの、組み合わせた正規化された発現レベルが、10百分位数を下回る場合。異なる局面において、本発明は、乳癌と診断された患者のドセタキソールdocetaxolに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにbCYP1B1の正規化された発現レベルが、10百分位数を上回る場合、ドセタキソールに対する減少した感受性を予測する、工程。本発明は、さらに、乳癌と診断された患者のシクロホスファミドまたはそのアナログに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにbアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1および1A3の発現レベルの合計が、参照組織セットにおけるそれらの組み合わせた発現レベルの平均より10倍高い場合に、シクロホスファミドもしくはそのアナログに対する患者の減少した感受性を予測する、工程。さらなる局面において、本発明は、乳癌と診断された患者の抗エストロゲン治療に対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットエストロゲンレセプターαERαおよびプロゲステロンレセプターαPRαに対して陰性および陽性の両方の標本を含むにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにbERαもしくはPRαの正規化された発現レベル、およびミクロソームエポキシドヒドロラーゼ、pS2/トレフォイル因子1、GATA3およびヒト絨毛性ゴナドトロピンの少なくとも1つの正規化された発現レベルに基づいて患者の応答を予測する、工程。特定の実施形態において、以下の場合に、患者から得られた乳癌組織におけるERαまたはPRαの発現レベルに関係なく、応答の欠如または感応性の減少が予測される:iミクロソームエポキシドヒドロラーゼの正規化された発現レベルが10百分位数を上回る場合;あるいはiipS2/トレフォイル因子1、またはGATA3もしくはヒト絨毛性ゴナドトロピンの正規化された発現レベルが、上記乳癌組織セットにおける対応する平均発現レベルを下回る場合。別の局面において、本発明は、乳癌と診断された患者のタキサンに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにb以下の場合に、タキサンに対する減少した感受性を予測する工程:iXISTの発現が、全く検出されないか、もしくはわずかに検出される場合、またはiiGST-πもしくはプロピルエンドペプチダーゼPREPの正規化された発現レベルが、10百分位数を上回る場合;またはiiiPLAG1の正規化された発現レベルが、10百分位数を上回る場合。本発明はまた、乳癌と診断された患者のシスプラチンまたはそのアナログに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにbERCC1の正規化された発現レベルが、10百分位数を上回る場合、抵抗性または感受性の減少を予測する、工程。本発明はさらに、乳癌と診断された患者のErbB2またはEGFRアンタゴニストに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにbGrb7、IGF1R、IGF1およびIGF2の少なくとも1つの正規化された発現レベルに基づいて患者の応答を予測する、工程。特定の実施形態において、正の応答は、Grb7の正規化された発現レベルが10百分位数を上回り、かつIGF1R、IGF1およびIGF2の発現レベルが90百分位数より高く上昇していない場合に予測される。さらに特定の実施形態において、減少した応答性は、IGF1R、IGF1およびIGF2のうちの少なくとも1つの発現レベルが上昇する場合に予測される。別の局面において、本発明は、ビスホスホネート薬物に対する、乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにb患者から得られた乳癌組織が変異体Ha-Rasを発現し、さらに、90百分位数以上の正規化された発現レベルでファルネシルピロホスフェートシンターゼまたはゲラニルピロホスフォンシンターゼを発現する場合に、正の応答を予測する工程。さらに別の局面において、本発明は、シクロオキシゲナーゼ2インヒビターによる処置に対する、乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにb患者から得られた乳癌組織におけるCOX2の正規化された発現レベルが90百分位数以上である場合に正の応答を予測する工程。本発明はさらに、EGFレセプターEGFRアンタゴニストに対する、乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにb以下の場合にEGFRアンタゴニストに対する正の応答を予測する工程:iEGFRの正規化された発現レベルが10百分位数以上である場合で、かつiiエピレグリン、TGF-α、アンフィレグリン、ErbB3、BRK、CD9、MMP9、CD82、およびLot1のうちの少なくとも1つの正規化された発現レベルが90百分位数より高い場合。別の局面において、本発明は、EGFRアンタゴニストによる処置に対する、乳癌と診断された患者の応答をモニタリングするための方法に関し、この方法は、処置の間に、患者におけるエピレグリン、TGF-α、アンフィレグリン、ErbB3、BRK、CD9、MMP9、CD82、およびLot1からなる群より選択される遺伝子の発現レベルをモニタリングする工程を包含し、ここで、発現レベルの減少は、このような処置に対する正の応答を示す。さらに別の局面において、本発明は、abl、c-kit、PDGFR-α、PDGFR-βおよびARGからなる群より選択される薬物標的化チロシンキナーゼに対する、乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;babl、c-kit、PDGFR-α、PDGFR-βおよびARG、ならびにチロシンキナーゼの同族リガンドからなる群より選択されるチロシンキナーゼの正規化された発現レベルを決定する工程、ならびにチロシンキナーゼの正規化された発現レベルが、10百分位数を上回る場合に、cチロシンキナーゼの配列が任意の変異を含むか否かを決定する工程、を包含し、ここで、以下の場合に正の応答が予測される:iチロシンキナーゼの正規化された発現レベルが10百分位数を上回る場合、iiチロシンキナーゼの配列が活性化変異を含む場合、またはiiiチロシンキナーゼの正規化された発現レベルが正常であり、かつリガンドの発現レベルが10百分位数を上回る場合。本発明の別の局面は、抗血管形成薬による処置に対する、乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法であり、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにb以下の場合に正の応答を予測する工程:iVEGFの正規化された発現レベルが10百分位数を上回り、かつiiKDRまたはCD31の正規化された発現レベルが20百分位数を上回る場合。本発明のさらなる局面は、乳癌と診断された患者が、多重薬物抵抗性タンパク質P-糖タンパク質をコードするMRP-1遺伝子と相互作用する薬物に対する抵抗性を発生する可能性を予測するための方法であり、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供して、PTP1bの発現レベルを決定する工程であって、ここで、発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにbMRP-1遺伝子の正規化された発現レベルが90百分位数より高い場合に、患者が上記薬物に対する抵抗性を生じる可能性があると結論付ける工程。本発明はさらに、乳癌と診断された患者が、癌処置において使用される化学療法剤または毒素に対する抵抗性を生じる可能性を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにb以下の遺伝子:MDR1、SGTα、GSTπ、SXR、BCRPYB-1、およびLRP/MVPのうちの少なくとも1つの正規化された発現レベルを決定する工程であって、ここで、4百分位数を上回る正規化された発現レベルの知見は、患者が薬物に対する抵抗性を生じる可能性があることを示す、工程。乳癌組織サンプルにおけるVEGFmRNAの翻訳効率を測定する方法もまた、本明細書中に含まれ、この方法は、サンプルにおけるVEGFおよびEIF4EmRNAの発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、同じVEGF発現レベルに対してより高い正規化されたEIF4E発現レベルは、VEGFに対する比較的により高い翻訳効率の指標である。別の局面において、本発明は、VEGFアンタゴニストに対して乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法を提供し、この方法は、コントロール遺伝子に対して正規化された、VEGFおよびEIF4EmRNAの発現レベルを決定して、参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、90百分位数より高いVEGF発現レベルおよび50百分位数より高いEIF4E発現レベルは、患者の応答の良好な予測因子である。本発明はさらに、乳癌と診断された患者における乳癌の再発率を予測するための方法を提供し、この方法は、患者から得られた乳癌組織における、p53mRNA発現:p21mRNA発現の比またはp53mRNA発現:mdm2mRNA発現の比を決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、上記正常比は、再発の危険性がより高いことを示す。代表的に、より高い再発の危険性は、この比が10百分位数を上回る場合に示される。さらに別の局面において、本発明は、外科手術後に、乳癌患者における乳癌の再発率を予測するための方法を提供し、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるサイクリンD1の発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、10百分位数を上回る発現レベルは、外科手術後に再発の危険性が増加したことを示す。この方法の特定の実施形態において、発現レベルが10百分位数を上回る場合に、患者はアジュバント化学療法に供される。本発明の別の局面は、外科手術後に、乳癌患者における乳癌の再発率を予測するための方法であり、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるAPCまたはE-カドヘリンの発現レベルを決定、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、5百分位数を上回る発現レベルは、外科手術後に再発の危険性が増加し、高まった危険性は、生存期間が短くなることを示す。本発明のさらなる局面は、乳癌と診断された患者の応答を予測して、アポトーシス促進性薬物により処置するための方法であり、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるBCl2およびc-MYCの発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、ic-MYCの発現レベルが上昇していない、10百分位数を上回るBCl2発現レベルは、良好な応答を示し、そしてii良好な応答は、BCl2の発現レベルにも関わらず、c-MYCの発現レベルが上昇した場合には、示されない。本発明のなおさらなる局面は、乳癌と診断された患者についての処置結果を予測するための方法であり、この方法は、以下の工程:a患者から得られた乳癌組織から抽出したRNAを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程;ならびにbNFκB、ならびにcIAP1、cIAP2、XIAP、およびSurvivinからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の正規化された発現レベルを決定する工程、を包含し、ここで、予後不良は、NFκB、ならびにcIAP1、cIAP2、XIAP、およびSurvivinからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子についての発現レベルが5百分位数を上回る場合に示される。本発明はさらに、乳癌と診断された患者に対する処置結果を予測するための方法に関し、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるp53BP1およびp53BP2の発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、予後不良は、p53BP1またはp53BP2の発現レベルが10百分位数を下回る場合に予測される。本発明はさらに、乳癌と診断された患者に対する処置結果を予測するための方法に関し、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるuPAおよびPAI1の発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、i不良の結果は、uPAおよびPAI1の発現レベルが20百分位数を上回る場合に予測され、そしてii再発の危険性の減少は、uPAおよびPAI1の発現レベルが乳癌参照セットにおいて観察された平均より高く上昇しない場合に予測される。特定の実施形態において、不良の結果は、外科手術後の短い生存期間または癌再発の危険性の増加の観点で測定される。別の特定の実施形態において、uPAおよびPAI1は、正常なレベルで発現され、そして患者は、外科手術後にアジュバント化学療法に供される。本発明の別の局面は、乳癌と診断された患者における処置結果を予測するための方法であり、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるカテプシンBおよびカテプシンLの発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、不良の結果は、カテプシンBまたはカテプシンLのいずれかの発現レベルが10百分位数を上回る場合に予測される。直前にあるように、不良な処置結果は、例えば、短い生存期間または癌再発の危険性の増加の観点で測定され得る。本発明のさらなる局面は、乳癌と診断された患者の処置を考察するための方法であり、この方法は、以下の工程を包含する:a患者から得られた乳癌組織における散乱因子およびc-metの発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程、およびb散乱因子およびc-met、または両方の組み合わせの発現レベルが90百分位数より高い場合に、正確で積極的な化学療法処置を示唆する工程。本発明のなおさらなる局面は、乳癌と診断された患者についての処置の結果を予測する方法であって、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるVEGF、CD31およびKDRの発現レベルを決定する工程を包含し、この発現レベルは、対照遺伝子に対して規格化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較され、ここで、VEGF、CD31およびKDRのいずれかの発現レベルが上位10の百分位数である場合、不良な処置結果が予測される。本発明のなお別の局面は、乳癌と診断された患者についての処置の結果を予測する方法であって、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるKi67/MiB1、PCNA、Pin1およびチミジンキナーゼの発現レベルを決定する工程を包含し、この発現レベルは、対照遺伝子に対して規格化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較され、ここで、Ki67/MiB1、PCNA、Pin1およびチミジンキナーゼのいずれかの発現レベルが上位10の百分位数である場合、不良な処置結果が予測される。本発明はさらに、乳癌と診断された患者についての処置の結果を予測する方法に関し、この方法は、患者から得られた乳癌組織における可溶性CD95および全長CD95の発現レベルを決定し、対照遺伝子に対して規格化し、そして、参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、可溶性CD95の存在は、不良な患者の生存に相関する。本発明はまた、乳癌と診断された患者についての処置の結果を予測する方法に関し、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるIGF1、IGF1RおよびIGFBP3の発現レベルを決定する工程を包含し、この発現レベルは、対照遺伝子に対して規格化され、そして、参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較され、ここで、IGF1、IGF1RおよびIGFBP3の発現レベルの合計が上位10の百分位数である場合、不良な処置結果が予測される。本発明はさらに、乳癌を分類する方法に関し、この方法は、乳癌組織における、Bcl12、肝細胞核因子3、LIV1、ER、リポタンパク質リパーゼ、レチノール結合タンパク質4、インテグリンα7、サイトケラチン5、サイトケラチン17、GROオンコジーンoncogen、ErbB2およびGrb7からなる群から選択される2つ以上の遺伝子の発現レベルを決定する工程を包含し、この発現レベルは、対照遺伝子に対して規格化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較され、ここで、i参照組織セットにおける平均発現レベルよりも上のBcl1、肝細胞核因子3、LIV1およびERのうちの少なくとも1つを発現している腫瘍は、外科的切除の後に、疾患を有さず、全般的な患者の生存についての良好な予後を有していると分類され;ii参照組織セットと比較して、リポタンパク質リパーゼ、レチノール結合タンパク質4、インテグリンα7のうちの少なくとも1つの発現の上昇によって特徴付けられる腫瘍は、外科的切除の後に、疾患を有さず、そして、全般的な患者の生存の中程度の予後を有していると分類され;そして、iii参照組織セットにおける平均発現レベルよりも4倍以上のレベルのサイトケラチン5および17ならびにGROオンコジーン、または、参照組織セットにおける平均発現レベルよりも10倍以上のレベルのErbBおよびGrb7のレベルの上昇を示す腫瘍は、外科的切除の後に、疾患を有さず、全般的な患者の生存の不良な予後を有していると分類される。本発明の別の局面は、表2に列挙される順方向プライマーおよび逆方向プライマーからなる群から選択される2つ以上の遺伝子特異的なプライマーのパネルである。本発明のなお別の局面は、PT-PCR増幅における断片化されたRNA集団の逆転写のための方法であり、この方法は、増幅反応において、逆方向プライマーとして複数の遺伝子特異的なプライマーを使用する工程を包含する。特定の実施形態において、この方法は、同じ増幅反応中に2~約40,000個の遺伝子特異的プライマーを用いる。別の実施形態において、遺伝子特異的プライマーは、約18~24塩基例えば、約20塩基長である。別の実施形態において、プライマーのTmは約58~60°Cである。このプライマーは、例えば、表2に列挙される順方向プライマーおよび逆方向プライマーからなる群から選択され得る。本発明はまた、逆転写酵素駆動式の第1鎖cDNA合成の方法に関し、この方法は、約18~24塩基長で、約58°C~約60°Cの最適Tmを有する遺伝子特異的プライマーを用いる工程を包含する。特定の実施形態において、第1鎖cDNA合成の後にPCRDNA増幅が行われ、そして、プライマーは、PCR増幅を駆動する逆方向プライマーとして機能する。別の実施形態において、この方法は、同じ第1鎖cDNA合成反応混合物中に複数の遺伝子特異的プライマーを用いる。遺伝子特異的プライマーの数は、例えば、2~約40,000の間であり得る。異なる局面において、本発明は、原発性腫瘍の外科的切除の後に、乳癌を再発することがない、乳癌患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、この方法は、上記患者から得られた乳癌組織サンプルにおける1つ以上の診断的RNA転写物またはその生成物の発現レベルを決定する工程を包含し、この発現レベルは、上記乳癌組織サンプルにおける全てのRNA転写物もしくはその生成物、またはRNA転写物もしくはその生成物の参照セットの発現レベルに対して規格化され、ここで、診断的転写物は、以下からなる群から選択される1つ以上の遺伝子の転写物であり:ここで、のうちの1つ以上の過剰発現は、乳癌を再発することがない長期生存の減少した可能性を示し、のうちの1つ以上の過剰発現は、乳癌を再発することがない長期生存の増加した可能性を示す。本発明の方法の特定の実施形態において、少なくとも2、好ましくは少なくとも5、より好ましくは少なくとも10、最も好ましくは少なくとも15の診断的転写物またはその発現生成物の発現レベルが決定される。乳癌が侵襲性乳癌エストロゲンレセプターER過剰発現ER陽性腫瘍およびER陰性腫瘍の両方を含むである場合、分析は、以下の遺伝子のうちの少なくとも2つの転写物、またはその発現生成物の発現レベルの決定を含む:乳癌がER陽性侵襲性乳癌である場合、分析は、以下の遺伝子のうちの少なくとも2つの転写物またはその発現生成物の発現レベルの決定を含む:前と全く同じように、少なくとも5、より好ましくは少なくとも10、最も好ましくは少なくとも15の遺伝子またはそのそれぞれの発現生成物の発現レベルを決定することが好ましい。特定の実施形態において、少なくとも1つ以上の診断的RNA転写物の発現レベルが決定され、ここで、RNAは、例えば、患者の固定化され、蝋で包埋した乳癌組織検体から得られ得る。RNAの単離は、例えば、上記もしくは本願を通じて記載される手順のいずれかに従って、または当該分野で公知の任意の他の方法によって実行され得る。なお別の局面において、本発明は、固相表面上に固定化された以下の遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイに関する:特定の実施形態において、アレイは、以下の遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む:さらなる局面において、本発明は、原発性腫瘍の外科的切除の後に、乳癌を再発することがない、侵襲性乳癌と診断された患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:1以下からなる群から選択される遺伝子セットの遺伝子のRNA転写物または発現生成物の、上記患者から得られた乳癌組織サンプルにおける発現レベルを決定する工程であって:この発現レベルは、上記乳癌組織サンプルにおける全てのRNA転写物もしくはその生成物の発現レベル、または、RNA転写物もしくはその生成物の参照セットに対して規格化される、工程;2工程aで得られたデータを統計分析にかける工程;そして3上記長期間の生存の可能性が増加したかまたは減少したかを決定する工程。なおさらなる局面において、本発明は、原発性腫瘍の外科的切除の後に、乳癌を再発することがない、エストロゲンレセプターER陽性の侵襲性乳癌と診断された患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:1以下からなる群から選択される遺伝子セットの遺伝子のRNA転写物または発現生成物の発現レベルを決定する工程:2工程1で得られたデータを統計分析にかける工程;そして3上記長期生存の可能性が増加したかまたは減少したかを決定する工程。異なる局面において、本発明は、固相表面上に固定化された、以下からなる群から選択される遺伝子セットにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイに関する:さらなる局面において、本発明は、固相表面上に固定化された、以下からなる群から選択される遺伝子セットにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイに関する:全ての局面において、ポリヌクレオチドは、代表的に約500~5000塩基長のcDNAcDNAアレイであり得るが、より短いかまたはより長いcDNAもまた使用され得、そして本発明の範囲内である。あるいは、ポリヌクレオチドは、代表的に約20~80塩基長のオリゴヌクレオチドDANマイクロアレイであり得るが、より短いオリゴヌクレオチドおよびより長いオリゴヌクレオチドもまた適切であり、そして本発明の範囲内である。固体表面は、例えば、ガラスまたはナイロン、あるいはマイクロアレイのようなアレイを調製する際に代表的に使用される任意の他の固体表面であり得、そして代表的に、ガラスである。表1は、乳癌遺伝子の列挙を示す。表2は、断片化mRNAの増幅のために使用されるアンプリコン配列およびプライマー配列を示す。表3は、試験した乳癌遺伝子の受託番号および配列番号を示す。好ましい実施形態の詳細な説明A.定義他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。Singletonら、DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology第2版、J.WileySonsNewYork,NY1994およびMarch,AdvancedOrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure第4版JohnWileySonsNewYork,NY1992は、当業者に、本発明において使用される用語の多くの一般的案内を提供する。当業者は、本明細書中に開示される方法および材料と類似または等価な、多くの方法および材料を認識し、これらは、本発明の実施において使用され得る。実際に、本発明は、記載される方法および材料に、いかなる様式でも限定されない。本発明の目的で、以下の用語が以下に定義される。用語マイクロアレイとは、基板上の、ハイブリダイズ可能なアレイエレメント好ましくは、ポリヌクレオチドプローブの順序立った配置をいう。用語ポリヌクレオチドとは、単数形または複数形で使用される場合、一般に、改変されていないRNAまたはDNA、あるいは改変されたRNAまたはDNAであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。従って、例えば、本明細書中で定義されるポリヌクレオチドとしては、一本鎖DNAおよび二本鎖DNA、一本鎖領域および二本鎖領域を含むDNA、一本鎖RNAおよび二本鎖RNA、ならびに一本領域および二本鎖領域を含むRNA、DNAおよびRNAこれらは、一本鎖であっても、より代表的には二本鎖であってもよく、あるいは一本鎖領域および二本鎖領域を含み得るを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、用語ポリヌクレオチドとは、本明細書中において使用される場合、RNAまたはDNA、あるいはRNAとDNAとの両方を含む、三重鎖領域をいう。このような領域における鎖は、同じ分子を形成しても異なる分子を形成してもよい。領域は、1つ以上の分子の全てを含み得るが、より代表的には、いくつかの分子の領域のみを含む。三重螺旋領域の分子の1つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。用語ポリヌクレオチドとしては、具体的に、1つ以上の改変された塩基を含むDNAおよびRNAが挙げられる。従って、安定性または他の理由で改変された骨格を有するDNAまたはRNAは、この用語が本明細書中で意図されるようなポリヌクレオチドである。さらに、通常でない塩基例えば、イノシンまたは修飾塩基例えば、トリチウム化塩基を含むDNAまたはRNAは、本明細書中で定義される場合の用語ポリヌクレオチドに含まれる。一般に、用語ポリヌクレオチドは、改変されていないポリヌクレオチドの全ての化学的改変形態、酵素的改変形態、および/または代謝的改変形態、ならびにウイルスおよび細胞単純な細胞および複雑な細胞を含むに特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。用語オリゴヌクレオチドとは、比較的短いポリヌクレオチドをいい、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖リボヌクレオチドまたは二本鎖リボヌクレオチド、RNA:DNAハイブリッド、ならびに二本鎖DNAが挙げられるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチド例えば、一本鎖DNAプローブオリゴヌクレオチドは、しばしば、化学的方法によって、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して合成される。しかし、オリゴヌクレオチドは、種々の他の方法によって作製され得、この方法としては、インビトロ組換えDNA媒介技術、ならびに細胞および生物内でのDNAの発現が挙げられる。用語差示的に発現される遺伝子、差示的遺伝子発現およびこれらの同義語これらは、交換可能に使用されるとは、正常またはコントロール被験体における発現と比較して、疾患特に、乳癌のような癌を罹患する被験体において発現がより高レベルまたはより低レベルに活性化される遺伝子をいう。この用語はまた、同じ疾患の異なる段階において、発現がより高レベルまたはより低レベルに活性化される遺伝子を包含する。差示的に発現される遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルにおいて、活性化されるかまたは阻害されるかのいずれかでありうるか、あるいは選択的スプライシングに供されて異なるポリペプチド産物を生じ得ることもまた、理解される。このような差異は、例えば、mRNAレベル、表面発現、分泌またはポリペプチドの他の関与の変化によって、証拠付けられ得る。差示的遺伝子発現は、2つ以上の遺伝子の間での発現の比較、または2つ以上の遺伝子の間での発現の比の比較、またはさらに、同じ遺伝子の差示的にプロセスされた2つの産物の比較を包含し得、これらは、正常な被験体と疾患特に、癌に罹患する被験体との間で異なるか、または同じ疾患の種々の段階の間で異なる。差示的発現としては、遺伝子、または例えば、正常細胞と疾患細胞との間、または異なる疾患事象もしくは疾患段階を受けた細胞の間でのその遺伝子の発現産物における、一時的発現パターンまたは細胞発現パターンの、定量的差異と定性的差異との両方を含む。本発明の目的で、差示的遺伝子発現は、少なくとも約2倍、好ましくは少なくとも約4倍、より好ましくは少なくとも約6倍、最も好ましくは少なくとも約10倍の差異が、正常な被験体および疾患被験体における所定の遺伝子の発現の間、または疾患被験体における様々な段階の疾患発達において存在する場合に、存在するとみなされる。語句遺伝子増幅とは、遺伝子または遺伝子フラグメントの複数のコピーが、特定の細胞または細胞株において形成されるプロセスをいう。複製された領域増幅されたDNAの伸長は、しばしば、アンプリコンと称される。通常、産生されるメッセンジャーRNAmRNAの量すなわち、遺伝子発現のレベルはまた、発現される特定の遺伝子から作製されるコピーの数に比例して増加する。用語予後とは、本明細書中で、癌に起因する死または進行新生物疾患例えば、乳癌の再発、転移拡散、および薬物耐性が挙げられるの可能性の予測をいうように使用される。用語予測とは、本明細書中で、患者が薬物または薬物のセットに対して、好ましくかまたは好ましくなくかのいずれかで応答する可能性、およびこれらの応答の程度をいうように使用される。本発明の予測方法を臨床的に使用して、任意の特定の患者に対して最も適切な処置形態を選択することによって、処置の決定をなし得る。もし患者が治療法例えば、外科的処置、所定の薬剤および薬剤の組み合わせでの化学療法、および/または放射線療法に対して好意的に反応する可能性がある場合、本発明の予測方法は、予測において価値ある手段である。特定の薬剤または治療の選択肢に対する用語耐性上昇increasedresistanceは、本発明に従って使用された場合、標準的な薬剤の投与量または標準的な処置プロトコルに対する反応の減少を意味する。特定の薬剤または治療の選択肢に対する用語感受性の減少、本発明に従って使用された場合、標準的な薬剤の投与量または標準的な処置プロトコルに対する反応の減少を意味する。一方、反応の減少は、薬剤の用量または治療の強度を高めることによって補われ得る少なくとも一部。患者の反応は、患者に対する利点を示す任意の指標を使用して評価され得る。その最終段階には、1ある程度の腫瘍の成長の抑制遅延および完全な成長の停止を含む;2腫瘍細胞の数の減少;3腫瘍の大きさの減少;4腫瘍細胞の隣接する周辺器官および/または組織への浸潤の抑制すなわち、減少、遅延または完全な停止;5転移の抑制すなわち、減少、遅延または完全な停止;6腫瘍の退行または腫瘍の拒絶に帰ししかし必ずしもそうではない抗腫瘍免疫応答の増強;7腫瘍に関した1つ以上の症状のある程度の除去;8処置後の生存の長さの上昇;および/または9処置後の所定の時点での死亡率の減少が挙げられるが、これらに限定されない。用語処置は治療的処置および予防的なprophylacticまたは予防的なpreventative測定の両方を意味し、ここでの対象は、標的となる病理学的状態または障害を予防または遅らせる減らす事である。治療を必要とするものは、既に障害を持つもの、および障害を持つ傾向があるものまたは障害が予防されるべきものとの両方を含む。腫瘍例えば癌の処置において、処置因子は腫瘍細胞の病理を直接減少させ得るかまたは腫瘍細胞を他の治療因子例えば、放射線および/または化学療法による処置に対してより感受性になるようにし得る。本明細書中で使用される用語腫瘍は、すべての新生物形成の細胞成長および細胞増殖を指す。腫瘍は悪性または両性であり得るし、全ての前癌性細胞および組織ならびに癌性細胞および組織であり得る。用語癌および癌性は、制御されていない細胞成長によって代表的に特徴付けられる哺乳動物における生理学的な状態を指すかまたは記載する。癌の例としては、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、腺癌、黒色腫、および脳腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。癌の病理学は患者の健康を損なう全ての現象を含む。これには、異常なまたは制御不可能な細胞の成長、転移、近隣細胞の通常の機能への干渉、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症応答または免疫学的応答の抑制または悪化、腫瘍形成、前癌状態、腺癌、周囲のまたは離れた組織または器官例えばリンパ節などへの浸潤が挙げられるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者によって容易に決定されて、一般的にプローブの長さ、洗いの温度、および塩濃度に依存する経験的訂算である。一般的に、長いプローブは、適切なアニーリングのために高い温度を必要とし、一方短いプローブは、低い温度を必要とする。相補的な鎖がそれらの融解温度以下の環境において存在する場合、ハイブリダイゼーションは一般的に、変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーションし得る配列との間の所望する相同性の程度が高いほど、使用される相対的な温度も高くなる。結果として、相対的により高い温度は、反応状態をより厳密にする傾向があり、より低い温度は厳密性を低めるということになる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性のさらなる詳細の説明には、Ausubelら、CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,1995を参照のこと。本明細書中で定義されるような、ストリンジェントな状態または高度にストリンジェントな状態は代表的に:1低いイオン強度および洗浄のための高い温度例えば、50°Cで0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1ドデシル硫酸ナトリウムを使用する;2ハイブリダイゼーションの間に変性因子ホルムアミド例えば、42°Cにて、0.1ウシ血清アルブミン/0.1Ficoll/0.1ポリビニルピロリドン/pH6.5で750mM塩化ナトリウム50mMリン酸ナトリウム緩衝液を有する50v/vホルムアミド、75mMクエン酸ナトリウムを使用する;または342°Cで50ホルムアミド、5×SSC0.75MNaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウムpH6.8、0.1ピロリン酸ナトリウム、5×Denhardtの溶液、超音波処理した鮭精子DNA50μg/ml、0.1SDS、および10硫酸デキストランを使用し、42°Cで0.2×SSC塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムそして55°Cで50ホルムアミドにおいて洗い、続いて55°Cにて、EDTAを含む0.1×SSCよりなる高度のストリンジェンシーで洗う。と共に使用する。適度にストリンジェントな状態はSambrookら,MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress,1989によって記載されるように同定され得、上で記載したものより低いストリンジェントの洗浄の溶液およびハイブリダイゼーションの条件例えば、温度、イオン強度、およびSDSの使用を含む。適当にストリンジェントな状態の1つの例は、溶液中20ホルムアミド、5×SSC150mMNaCl,15mMクエン酸3ナトリウム、50mMリン酸ナトリウムpH7.6、5×Denhardtの溶液、10硫酸デキストラン、および20mg/ml変性剪断鮭精子DNAを含む37°Cで一晩インキュベートし、続いて約37~50°Cでの1×SSCにおいてフィルターを洗う。当業者は、どのように温度、イオン強度などをプローブの長さなどのような適応因子の必要に応じて調節するかを認識する。本発明に関して、ある特定の遺伝子セット中に列挙されている遺伝子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも5つの言及は、列挙された遺伝子の任意の1つ、または任意の組み合わせおよび全ての組み合わせを意味する。用語スプライシングおよびRNAスプライシングは交換可能に使用され、真核細胞の細胞質へと移動することをコードする連続したコード配列を持つ成熟mRNAを産生するためにイントロンを除去しエキソンを繋ぐRNAプロセッシングを指す。理論上は、用語エキソンは、成熟RNA産物中において表現されている中断された遺伝子の任意の断片を指すB.Lewin.GenesIVCellPress,CambridgeMass.1990。仮説では、用語イントロンは、転写されるが転写産物からスプライシングにより除去され、そのいずれかの端にエキソンがあるDNAの任意の断片を指す。操作的に、エキソン配列は、Ref.配列番号により定義されている遺伝子のmRNA配列内で生じる。操作的に、イントロン配列は、遺伝子のゲノムDNA内の介在する配列であり、エキソン配列によってひとまとめにくくられており、GTおよびAGスプライスコンセンサス配列を5および3境界に持つ。B.詳細な説明本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学組換え技術を含む、微生物学、細胞生物学、および生化学の当該技術分野の範囲内である従来の技術を使用する。このような技術は、文献内で完全に説明されている。例えば、MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版Sambrookら,1989;OligonucleotideSynthesisM.J.Gait,編,1984;AnimalCellCultureR.I.Freshney,編,1987;MethodsinEnzymologyAcademicPress,Inc.;HandbookofExperimentalImmunology,第4版D.M.WeirC.C.Blackwell,編,BlackwellScienceInc.,1987;GeneTransferVectorsforMammalianCellsJ.M.MillerおよびM.P.Calos,編,1987;CurrentProtocolsinMolecularBiologyF.M.Ausubelら,eds.,1987;およびPCR:ThePolymeraseChainReaction,Mullisら,編,1994。1.遺伝子発現プロファイリング一般的に、遺伝子発現プロファイリングの方法は以下の2つの大きな群に分類し得る:ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、およびポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法。当該分野で公知であるサンプル中のmRNA発現を定量化するための最も一般的に使用されている方法は、ノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーションParkerおよびBarnes,MethodsinMolecularBiology106:247-2831999;RNAse保護アッセイHod,Biotechniques13:852-8541992;および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRWeisら,TrendsinGenetics8:263-2641992を含む。代わりに、特定の2重鎖例えば、DNA2重鎖、RNA2重鎖、およびDNA-RNAハイブリッド2重鎖またはDNA-タンパク質2重鎖を認識し得る抗体が使用され得る。配列決定に基づく遺伝子発現分析の代表的な方法としては、遺伝子発現の連続分析SerialAnalysisofGeneExpressionSAGEおよび大量並列痕跡配列決定massivelyparallelsignaturesequencingMPSSによる遺伝子発現分析が挙げられる。2.逆転写酵素PCRRT-PCR上で列挙した技術で、最も感受性で最も適応性のある定量方法はRT-PCRである。このRT-PCRは、異なるサンプル集団、通常の組織および腫瘍組織、薬剤処置するまたは薬剤処置なし、でのmRNAのレベルを比較するために使用されて、遺伝子発現のパターンを特徴づけ得、密接に関連するmRNA間を区別し得、そしてRNA構造を分析し得る。最初の工程は標的サンプルからのmRNAの単離である。出発物質は、代表的に、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、およびそれぞれ対応する通常の組織または細胞株から単離された総RNAである。このように、RNAは種々原発腫瘍例えば、乳、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮など、腫瘍、または腫瘍細胞株から、健康的なドナーからのプールされたDNAと共に単離され得る。mRNAの源が原発腫瘍である場合、例えば、mRNAは、凍結または保存された、パラフィン包埋された、かつ固定された例えば、ホルマリン固定された組織サンプルから抽出され得る。mRNA抽出のための一般的な方法は、当該分野で周知であり、分子生物学の標準的な参考書例えば、Ausubelら,CurrentProtocolsofMolecularBiology,JohnWileyandSons1997.に開示されている。パラフィン包埋された組織からのRNA抽出の方法は、例えば、RuppおよびLocker,LabInvest.56:A671987,およびDeAndresら,BioTechniques18:420441995において開示されている。特に、RNAの単離は、営業的製造業者から例えば、Qiagenの精製キット、緩衝液のセットおよびタンパク質分解酵素を使用し,製造業者の指示に従って実行され得る。例えば、培養中の細胞からの総RNAはQiagenRNeasyミニカラムを使用して単離され得る。他の市販されているRNA単離キットとしては、MasterPureTM完全DNAおよびRNA精製キットEPICENTRE登録商標,Madison,WIおよびパラフィンブロックRNA単離キットAmbion,Inc.が挙げられる。組織サンプルからの総RNAは、RNAStat-60Tel-Testを使用して単離され得る。腫瘍から調製されたRNAは、例えば、塩化セシウム濃度勾配遠心によって単離され得る。PCRでRNAはテンプレートとして働かないので、RT-PCRによる遺伝子発現プロファイリングでの最初の工程は、RNAテンプレートのcDNAへの逆転写であり、続いてPCR反応におけるその指数関数的増幅が起こる。最も一般的に使用される2つの逆転写酵素は、アビロavilo骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素AMV-RTおよびMoloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素MMLV-RTである。逆転写酵素の工程は代表的に、状況および発現プロファイリングの目的に依存して特異的なプライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴdTプライマーを使用して準備される。例えば、抽出されたRNAは、GeneAmpRNAPCRキットPerkinElmer,CA,USAを使用し、製造業者の指示に従って逆転写され得る。誘導されたcDNAはそれに続くPCR反応におけるテンプレートとして使用され得る。PCRの工程で種々の耐熱性のDNA依存性DNAポリメラーゼを使用し得るが、代表的に5’-3’ヌクレアーゼ活性を有するが、3’-5’校正エンドヌクレアーゼ活性を欠いているTaqDNAポリメラーゼが使用される。従って、TaqMan登録商標PCRは、代表的に、標的のアプリコンに結合しているハイブリダイゼーションプローブを加水分解するためにTaqまたはTthポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性を使用するが、同様の5’ヌクレアーゼ活性を持つ任意の酵素が使用され得る。2つのオリゴヌクレオチドプライマーが、PCR反応独特のアプリコンを産生するのに使用される。3番目のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、2つのPCRプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計されている。プローブは、TaqDNAポリメラーゼ酵素により伸長されず、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識されている。2つの色素がプローブ上にあるように近くに共に位置する場合、レポーター色素からの任意のレーザー誘発発光は、クエンチャー蛍光染色により消光される。増幅反応の間、TaqDNAポリメラーゼ酵素はテンプレート依存性の様式でプローブを切断する。結果として生じるプローブフラグメントは、溶液中に解離し、放出されたレポーター色素からの信号は、第2の発蛍光団の消光効果から影響を受けない。レポーター色素の1分子が合成された新しい分子それぞれに対して遊離し、消光されないレポーター色素の検出は、データの定量的な解釈のための基礎を提供する。TaqMan登録商標は、市販されている道具例えば、ABIPRISM7700TMSequenceDetectionSystemTMPerkin-Elmer-AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA、またはLightcyclerRocheMolecularBiochemicals,Mannheim,Germanyを使用して実施され得る。好ましい実施形態において、5’ヌクレアーゼの手順は、同時定量的PCR装置例えば、ABIPRISM7700TMSequenceDetectionSystemTMで行われる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子CCDカメラおよびコンピュータからなる。このシステムは、サーモサイクラー上で96-ウェルフォーマットでサンプルを増幅する。増幅の間、レーザー誘導の蛍光信号は、すべての96ウェルに対して光ファイバーケーブルを介して同時に収集され、CCDで検出される。このシステムは、装置を動かし、かつデータを分析するためのソフトウェアを含む。5’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にCtまたは閾値サイクルとして表現される。上で議論されるように、蛍光値は、サイクル毎に記録され、増幅反応におけるその点に増幅される産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録される点が、閾値サイクルCtである。誤差およびサンプル間の変動の影響を最小にするために、通常、RT-PCRを、内部標準を使用して実施する。理想的な内部標準は、異なる組織間で一定レベルで発現され、そして実験処理によって影響しない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるRNAは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-ホスフェート-デヒドロゲナーゼGAPDHおよびβ-アクチンに対するmRNAである。RT-PCR技術のより最近の変化は、実時間定量的PCRであり、これは、2重標識蛍光発生fluorigenicプローブすなわち、TaqMan登録商標プローブによりPCR産物蓄積を測定する。実時間PCRは、定量的競合的PCR各標的配列に対して内部の競合物が正規化のために使用されるおよびサンプル中に含まれる正規化遺伝子またはRT-PCRのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較PCRの両方に匹敵する。さらなる詳細について、例えば、Heldら、GenomeResearch6:986-9941996を参照のこと。3.マイクロアレイ差示的遺伝子発現が、マイクロアレイ技術を使用して、同定され得るかまたは確認され得る。従って、乳癌関連遺伝子の発現プロフィールを、マイクロアレイ技術を使用して、新鮮な腫瘍組織またはパラフィンに埋め込んだ腫瘍組織のいずれかで測定し得る。この方法において、目的のポリヌクレオチド配列を、マイクロチップ基板上に、プレートするかまたはアレイする。次いで、アレイされた配列を、目的の細胞または組織由来の特異的DNAプローブとハイブリダイズする。RT-PCR法と同様に、mRNAの供給源は、代表的に、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する製造組織または細胞株から単離された全RNAである。従って、RNAは、種々の原発腫瘍または腫瘍細胞株から単離され得る。mRNAの供給源が原発腫瘍である場合、mRNAは、例えば、凍結またはアーカイブされたパラフィン包埋および固定例えば、ホルマリン固定組織サンプルから抽出され得、これは、毎日、臨床的な実施において慣用的に調製および保存される。マイクロアレイ技術の特定の実施形態において、cDNAクローンのPCR増幅挿入物を、密なアレイで基板に適用する。好ましくは、少なくとも10,000個のヌクレオチド配列が基板に適用される。マイクロアレイ化遺伝子各々10,000エレメントでマイクロチップ上に固定されるは、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適切である。蛍光標識されたcDNAプローブを、目的の組織から抽出したRNAの逆転写によって、蛍光ヌクレオチドの組み込みによって作製し得る。チップに適用された標識cDNAプローブは、アレイ上のDNAの各スポットに特異的にハイブリダイズする。非特異的な結合プローブを除去するためのストリンジェントな洗浄後、チップを共焦点レーザーマイクロスコピーによってまたは別の検出方法例えば、CCDカメラによって走査する。各アレイ化エレメントのハイブリダイゼーションの定量によって、対応するmRNAの存在量の評価が可能である。二重色蛍光を用いて、RNAの2つの供給源から作製した別々に標識されたcDNAプローブを、アレイに対でハイブリダイズする。従って、各特定された遺伝子に対応する2つの供給源由来の転写物の相対的存在量は、同時に決定される。ハイブリダイゼーションの小型スケールは、多数の遺伝子についての発現パターンの簡便で迅速な評価を与える。このような方法は、まれな転写物細胞当たり数コピーで発現されるを検出するため、および発現レベルで少なくとも約2倍の差異を再現可能に検出するために必要とされる感度を有することが示されているSchenaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA932:106-1491996。マイクロアレイ分析を、市販の機器によって、製造業者のプロトコルに従って例えば、AffymetrixGenChip技術、またはIncyteのマイクロアレイ技術を使用することによって、実施し得る。遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ方法の開発によって、癌分類および種々の腫瘍型における結果の予測の分子マーカーを体系的に調査することが可能になる。4.遺伝子発現の連続分析SAGE遺伝子発現の連続分析SAGEは、各転写物についての個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なしに、多数の遺伝子転写物の同時かつ定量的な分析を可能にする方法である。最初に、転写物をただ一つ同定するのに十分な情報を含む短い配列タグ約10~14bpを作製するが、但し、このタグは、各転写物内の独特の位置から得られている。次いで、多くの転写物を一緒に連結して、長い一連の分子を形成し、これは、配列決定され得、複数のタグの同一性を同時に明らかにする。転写物の任意の集団の発現パターンは、個々のタグの存在量を決定し、そして各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価され得る。さらなる詳細について、例えば、Velculescuら,Science270:484-4871995;およびVelculescuら,Cell88:243-511997を参照のこと。5.大規模並列サイン配列決定MassivelyParallelSignatureSequencingMPSSによる遺伝子発現分析この方法Brennerら,NatureBiotechnology18:630-6342000によって記載されるは、非ゲルベースのサイン配列決定と、別々の5μm直径マイクロビーズ上での数百万のテンプレートのインビトロクローニングとを組み合わせる配列決定アプローチである。最初に、DNAテンプレートのマイクロビーズライブラリーを、インビトロクローニングによって構築する。これに続いて、高い密度代表的に、3×106マイクロビーズ/cm2でフローセルにおいて、テンプレート含有マイクロビーズの平面アレイのアセンブリがなされる。各マイクロビーズ上のクローン化テンプレートの自由末端が、DNAフラグメント分離を必要としない蛍光ベースのサイン配列決定法を使用して、同時に分析される。この方法は、酵母cDNAライブラリーから数十万の遺伝子サイン配列を単一操作で同時にかつ正確に提供することが示されている。6.本発明のmRNA単離方法、精製方法および増幅方法の一般的説明本発明の代表的なプロトコルの工程mRNA単離、精製、プライマー伸長および増幅を含むを、図1に示す。図1に示されるように、この代表的なプロセスは、パラフィン包埋腫瘍組織サンプルの約10μmの厚みの切片を切断することで開始する。次いで、以下に記載される本発明の方法に従って、RNAを抽出し、そしてタンパク質およびDNAを取り出す。RNA濃度の分析の後、RNA修復および/または増幅工程が、必要な場合、含まれ得、そしてRNAが、遺伝子特異的プロモーターを使用して逆転写され、続いてRT-PCRが行われる。最後に、調べられた腫瘍サンプル中で同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて、患者に利用可能な最良の処置選択肢を同定するためにデータが分析される。このプロトコルの個々の工程を、以下にさらに詳細に考察する。7.アーカイブされた組織試料からの核酸の単離のための改善された方法上に考察されるように、本発明の方法の最初の工程において、全RNAを、目的の供給源材料固定されたパラフィン包埋組織試料を含むから抽出し、そして酵素アッセイにおいて基質として作用するように十分に精製する。市販の産物の入手可能性および組織からの核酸例えば、RNAの単離に関して入手可能な広範囲な知識にもかかわらず、固定されたパラフィン包埋組織試料FPETからの核酸RNAの単離は、困難が無いわけではない。1つの局面において、本発明は、アーカイブされた例えば、FPET組織試料からの核酸の単離のための改善された方法に関する。mRNA種の測定レベルは、細胞および組織の生理学的状態または病理学的状態を規定するために有用である。RT-PCR上で考察されるは、この遺伝子発現プロファイリングについて、最も感度が高く再現可能な定量的方法の1つである。パラフィン包埋、ホルマリン固定組織は、このような研究について最も幅広く入手可能な材料である。いくつかの研究所が、RT-PCRについてのRNA供給源として固定パラフィン包埋組織FPETを首尾良く使用することが可能であることを実証したStantaら,Biotechniques11:304-3081991;Stantaら,MethodsMol.Biol.86:23-261998;Jacksonら,Lancet1:13911989;Jacksonら,J.Clin.Pathol.43:499-5041999;Finkeら,Biotechniques14:448-4531993;Goldsworthyら,Mol.Carcinog.25:86-911999;StantaandBonin,Biotechniques24:271-2761998;Godfreyら,J.Mol.Diagnostics2:842000;Spechtら,J.Mol.Med.78:B272000;Spechtら,Am.J.Pathol.158:419-4292001。これによって、遺伝子発現プロファイリングを、ヒト生検試料の最も通常に入手可能な供給源で実施し得、従って、潜在的に新たな価値のある診断情報および治療情報を作成し得る。最も幅広く使用されるプロトコルは、有害な有機溶媒例えば、キシレン、またはオクタンFinkeら、上出を利用して、核酸RNAおよび/またはDNA抽出の前に、パラフィンブロック中の組織を脱蝋する。必須の有機溶媒除去例えば、エタノールを用いるおよび再水和工程これは、複数の操作を必要とするが続き、プロトコルに実質的な合計時間を追加し、これは、数日かかり得る。FPETからのRNA抽出のための市販のキットおよびプロトコル[MasterPureTTMCompleteDNAandRNAPurificationKitEPICENTRE登録商標,Madison,WI;ParaffinBlockRNAIsolationKitAmbion,Inc.およびRNeasyTMMinikitQiagen,Chatsworth,CA]は、代表的に、複数の遠心分離およびエタノール緩衝液交換、およびキシレンでのインキュベーション後のインキュベーションを必要とする手順で、脱パラフィン化のためのキシレンを使用する。本発明は、遺伝子発現測定のための十分にインタクトな核酸特にRNAを産生する、改善された核酸抽出プロトコルを提供する。本明細書中における核酸抽出プロトコルにおける重要な工程は、いずれの有機溶媒も使用しない脱蝋の性能であり、これによって、有機溶媒の除去に関連する複数の手順の必要性を排除し、そしてプロトコルに対する合計の時間を実質的に減少する。本発明に従って、蝋例えば、パラフィンを、溶解緩衝液中で65~75°Cでのインキュベーションによって蝋に埋め込まれた組織サンプルから除去され、この溶解緩衝液は、組織を可溶化し、そして蝋を凝固させるために冷却することに続いて、タンパク質を加水分解する。図2は、蝋を除去するためのキシレンを使用する、代表的な商業的方法と比較した、本発明のRNA抽出プロトコルのフローチャートを示す。プロセスの個々の工程および全体のプロセスについて必要とされる時間を、チャートに示す。示されるように、商業的プロセスは、本発明のプロセスよりも約50多い時間を必要とする。溶解緩衝液は、細胞溶解物について公知の任意の緩衝液であり得る。しかし、mRNA分子のバルクが、フラグメント化することが予期され、従って、インタクトなポリアデニル化テールを有さず、引き続く分析アッセイについて回収されず利用可能でもないので、本発明のためのRNAを単離するために、ポリアデニル化mRNAを選択的に精製するオリゴ-dT-ベースの方法は、使用されないことが好ましい。そうでなければ、多くの標準的な核酸精製スキームが使用され得る。これらとしては、カオトロープchaotropeおよび有機溶媒抽出、ガラスビーズまたはフィルターを使用する抽出、塩析および沈殿ベースの方法、または生物学的供給源から全RNAまたは全核酸を回収するための当該分野で公知の精製方法のいずれかが挙げられる。溶解緩衝液は、例えば、Qiagen,Epicentre,またはAmbionから市販される。溶解緩衝液の好ましい群としては、代表的に、尿素、およびプロテインキナーゼKまたは他のプロテアーゼが挙げられる。プロテアーゼKは、大部分の哺乳動物DNaseおよびRNaseが、特に0.5~1ドデシル硫酸ナトリウムSDSの存在下で迅速に不活化されるので、高い品質の非損傷DNAまたはRNAの単離に非常に有用である。これは、RNAの場合に特に重要であり、RNAは、DNAよりも分解に対してより感受性である。DNaseが活性のために金属イオンを必要とし、従って、キレート剤例えば、EDTAによって容易に不活化され得るものの、RNaseについて類似の補因子要件がない。蝋の冷却および得られる凝固によって、核酸全体からの蝋の容易な分離が可能になり、この核酸全体は、例えば、イソプロパノールによって簡便に沈殿され得る。さらなる処理は、意図される目的に依存する。RNA分析の提案される方法が抽出物中の混入するDNAによる偏りbiasに供される場合、RNA抽出物は、例えば、DNaseRNAを保存しながらDNAを特異的に除去するための後精製によってさらに処理され得る。例えば、引き続くRT-PCR増幅のために高い品質のRNAを単離することが目的である場合、核酸沈殿に続いて、通常、DNase処理によって、DNAが除去される。しかし、DNAは、DNaseまたは当該分野で周知の他の技術によって種々の段階の核酸単離で除去され得る。本発明の核酸抽出プロトコルの利点は、アーカイブされたパラフィン包埋組織サンプルからのRNAの単離のために最も明らかであるものの、本発明の蝋除去工程これは、有機溶媒の使用を包含しないもまた、核酸全体RNAおよびDNAまたはDNAのみの抽出のための任意の従来のプロトコルに包含され得る。これらの局面全てが、特に、本発明の範囲内である。パラフィンを除去するための加熱、引き続く冷却を使用することによって、本発明のプロセスは、貴重な処理時間を省き、一連の操作を排除し、それによって、核酸の収率を潜在的に増加させる。実際、以下の実施例に提示される実験的証拠は、本発明の方法がRNA収率を損なわないことを実証する。8.逆転写の5’多重化遺伝子特異的プライミングRT-PCRは、最初の工程として試験RNA集団の逆転写を必要とする。逆転写のために最も一般的に使用されるプライマーは、オリゴ-dTであり、これは、RNAがインタクトである場合、良好に働く。しかし、このプライマーは、FPE組織における場合のように、RNAが高度にフラグメント化する場合、有効ではない。本発明は、遺伝子特異的プライマーの使用を含み、このプライマーは、約58°Cと60°Cとの間で最適なTmを有する長さのおよそ20塩基である。これらのプライマーはまた、PCRDNA増幅を駆動する逆プライマーとして役立つ。本発明の別の局面は、同じ反応混合物中の多重遺伝子特異的プライマーを含むことである。このような異なるプライマーの数は、非常に変動し得、2個という少なさおよび40,000以上という多さであり得る。表2は、本発明の方法を実施する際に首尾良く使用され得る逆プライマーの例を示す。図9は、この多重化遺伝子特異的プライミングストラテジーを使用して得られた発現データを示す。詳細には、図9は、70個のFPE乳癌試料にわたる92個の遺伝子の発現の表示である表1に列挙される遺伝子のサブセット。y軸は、サイクル閾値時間として発現を示す。代替的アプローチは、cDNA合成のためのプライマーとしてランダムへキサマーの使用に基づく。しかし、本発明者らは、遺伝子特異的プライマーの多重度を使用する方法が、ランダムへキサマーを使用する公知のアプローチよりも優れることを実験的に実証している。9.発現プロファイリングアッセイのためのフラグメント化mRNAの調製生物学的サンプル中の特異的mRNA種の存在量を分析することが目的である。なぜなら、この発現プロフィールが、そのサンプルの生理学的状態の指数を提供するからである。mRNAは、抽出し、そのネイティブな状態を維持することが困難であることがよく知られており、結果として、生物学的供給源から回収されたmRNAは、しばしば、フラグメント化されるかまたは少し分解される。これは、特に、化学的に固定され、長期間保存されたヒト組織試料において当てはまる。1つの局面において、本発明は、相対的な存在量が保存され、そして目的のmRNAが首尾良く測定され得る方式で、発現をプロファイリングするために、種々の供給源アーカイブされた組織試料を含むから抽出されるmRNAを調製する手段を提供する。この方法は、レポータープローブTaqMan登録商標型アレイの5’エキソヌクレアーゼと連結されたRT-PCR上で考察される、フラップエンドヌクレアーゼアッセイCleavase登録商標およびInvader登録商標型アッセイ、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ、cDNAハイブリダイゼーションアレイ、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、3’単一ヌクレオチド発現アッセイおよび生物学的サンプル中の特定のmRNA配列の存在量を評価するために設計された他のアッセイを含む、公知の発現プロファイリング方法のいずれかによる分析のためのmRNAを調製する手段として有用である。本発明の方法に従って、RNA全体が、供給源材料から抽出され、酵素アッセイにおける基質として作用するように十分に精製される。抽出手順組織サンプルを埋め込むために使用される蝋例えば、パラフィンを除去する新規で改善された方法を含むが、上で考察されている。mRNAのバルクがフラグメント化されることが予期され、ポリアデニル化されず、従って、回収されず、オリゴ-dTに基づく方法が使用される場合、引き続く分析アッセイに利用可能であるので、ポリアデニル化mRNAを選択的に精製するオリゴ-dTに基づく方法が、本発明のためのRNAを単離するために使用されないことが好ましいことも注目された。フラグメント化RNAを修復するための改善された方法の図を、図3に示す。組織サンプルから精製されたフラグメント化RNAを、目的の各々のmRNA種に対して、ユニバーサルまたは遺伝子特異的一本鎖DNAと混合する。これらのテンプレートは、クローン化遺伝子供給源由来のmRNAの全長DNAコピーであり得、これらは、アッセイされる遺伝子のセグメントのみを表す遺伝子のフラグメントであり得、これらは、目的の全長遺伝子または特定のセグメントのいずれかを表す一連の長さのオリゴヌクレオチドであり得る。テンプレートは、単一のコンセンサス配列を表し得るか、またはその遺伝子の多型改変体の混合物であり得るかのいずれかである。このDNAテンプレートまたは足場scaffoldは、好ましくは、その長さに1つ以上のdUTPまたはrNTPを含む。これは、後の分析アッセイにおいて基質または標的として作用することをさけるために、引き続く分析工程を実施する前にテンプレートを除去する手段を提供する。この除去は、サンプルをウラシル-DNAグリコシラーゼUDGで処理し、それを加熱して、UDGが無塩基abasic部位を生成する場所で鎖を切断することによって、達成される。rNTPの場合、サンプルは、塩基性緩衝液pH約10の存在下で加熱されて、rNTPがテンプレートに配置される場所で鎖の切断を誘導し得る。一本鎖DNAテンプレートを、生成RNAと混合し、この混合物を変性し、DNAテンプレートに相補的なRNAフラグメントが効果的に一本鎖DNAテンプレートに沿って伸長され得るプライマーとなるようにアニーリングする。DNAポリメラーゼIは、伸長のためのプライマーを必要とするが、DNAプライマーまたはRNAプライマーのいずれかを効果的に使用する。従って、DNAポリメラーゼIおよびdNTPの存在下で、フラグメント化RNAは、相補的なDNAテンプレートに沿って伸長され得る。伸長の効率を増大させるために、この反応は、熱サイクルされ得、フラグメント化RNAの集団全体がRNAフラグメントプライマーから抽出される二本鎖DNAとして表されるまで、重複するテンプレートおよび伸長産物がハイブリダイズし得そして伸長し得る。この修復されたRNAの作製に続いて、サンプルは、DNAテンプレート足場をフラグメント化し、そして引き続く分析反応で沈殿することを妨げるために、UDGで処理されるか、または中程度に塩基性の溶液で熱処理される。次いで、この酵素伸長から得られる産物は、酵素に基づくアッセイからの蛍光、化学発光、比色または他の共通読みだしのような増幅および検出可能なシグナル生成を含む標準的な酵素プロファイリングアッセイでテンプレートとして使用され得る。例えば、TaqMan登録商標型アッセイについて、この二本鎖DNA産物は、標準的なアッセイでテンプレートとして添加され;そしてアレイハイブリダイゼーションについて、この産物は、アレイハイブリダイゼーションのための一本鎖標識RNAを作製するために代表的に使用されるcRNA標識反応のためのcDNAテンプレートとして作用する。テンプレートを調製するこの方法は、短すぎて標準的なcDNA生成スキームでテンプレートとして有効に作用しないmRNAフラグメントから情報を回収する利点を有する。さらに、この方法は、特異的な分析アッセイによって標的化されるmRNA配列で特定の位置を保存するように作用する。例えば、TaqMan登録商標アッセイは、標識化されたレポータープローブによって標的化されるPCR増幅テンプレートとして作用するように、mRNAのcDNAコピーで単一の連続配列に依存する。mRNA鎖切断がこの配列で起こる場合、アッセイは、そのテンプレートを検出せず、元のサンプル中のそのmRNAの量を過小評価する。この標的調製方法は、RNAフラグメント化からのその効果を最小化する。RNAプライマー伸長アッセイで形成される伸長産物は、一本鎖DNAテンプレートの入力量を制御し、そして伸長反応の制限サイクリングを行うことによって、制御され得る。これは、分析のために標的化されるmRNA配列の相対的存在量を保存する際に重要である。この方法は、容易に多重化されるので、各標的配列について並行調製を必要としないさらなる利点を有する。標的化遺伝子特異的分析よりも、発現されたゲノム分析全体に対して、サンプル抽出物中のmRNA配列の集団全体を伸長するために、ランダム配列長オリゴヌクレオチドの大プールまたはクローン化配列の全ライブラリーを使用することもまた可能である。10.RT-PCRの前のmRNA種の増幅FPETから単離され得るmRNAの制限された量および乏しい量に起因して、目的のmRNAを正確に増幅し得る新規な手順が、特に、遺伝子発現のリアルタイム定量TaqMan登録商標に、特に定量的に多くの数>50の遺伝子>50~10,000に非常に有用である。現在のプロトコル例えば、Eberwine,Biotechniques20:584-911996は、主に、マイクロアレイ分析のために少量の全RNAまたはポリARNAからのmRNA増幅のために最適化される。本発明は、図4に示されるように、プライマーとして遺伝子特異的配列を使用して、少量のフラグメント化された全RNA平均サイズ約60~150bpの増幅のために最適化されるプロトコルを提供する。本発明の増幅手順は、1回の逆転写の実施において非常に多くの数代表的に100~190,000もの多さの遺伝子特異的プライマーGSPを使用する。各々のGSPは、続くRNA増幅についての5’末端でのRNAポリメラーゼプロモーター例えば、T7DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターを含む。GSPは、このRNAの小さなサイズのためにプライマーとして好ましい。現在のプロトコルは、dTプライマーを使用し、このプライマーは、FPETRNAの小さなサイズに起因するmRNAの全ての逆転写を適切には表さない。GSPは、長さ、Tmなどのような通例のパラメーターを最適化することにより、設計され得る。例えば、GSPは、PrimerExpress登録商標AppliedBiosystemsまたはPrimer3MITソフトウェアプログラムを使用して設計され得る。代表的には、遺伝子当たり少なくとも3つのセットが設計され、そしてFPETRNA上で最も低いCtを与えるセット最良の実験品が、選択される。第2鎖cDNA合成が、標準的手段図4、方法1を参照のこと、またはPCR条件例えば、95°C、10分Taq活性化続いて60°C、45秒下のGSPfプライマーおよびTaqpolにより実施される。後者の方法の利点は、第2の遺伝子特異的プライマー、SGFfは、より多くの開始DNAがT7RNAポリメラーゼによるRNA増幅のために必要な場合、さらなる特異性および潜在的により効率的な第2鎖の合成ならびにいくつかのPCRサイクルを実施する選択肢を与えることである。次いで、RNA増幅は、標準的条件下で実施され、多数のcRNAの複製を産生し、この複製は続いて、標準的TaqMan登録商標反応において使用される。このプロセスは、T7に基づくRNA増幅を使用することにより例示されるが、当業者は、T3またはSp6のようなプライマーを必要としない他のRNAポリメラーゼプロモーターがまた使用され得、本発明の範囲内にあることを理解する。11.フラグメント化したRNAの伸長および続く増幅の方法上記セクション9および10に記載される本発明を組み合わせ、そして改変する本方法は、図5に例示される。この手順は、フラグメント化したmRNAの伸長で始まる。この手順は、骨格DNAが、5’末端にてT7RNAポリメラーゼプロモーター配列でタグ化され、RNAフラグメントから伸長される二本鎖DNAを誘導することを除いて、上記のように生じる。このテンプレート配列は、インビトロでの転写の後で除去される必要がある。これらのテンプレートは、dUTPまたはrNTPヌクレオチドを含み得、セクション9に記載されるようなテンプレートの酵素的除去を可能にし、またはこれらのテンプレートは、DNaseI処理により除去され得る。テンプレートDNAは、任意の数の異なるmRNAを表す集団であり得る。DNAテンレート骨格の高度な配列複雑性源が、種々の細胞または組織からRNAをプールすることにより作製され得る。1つの実施形態において、これらのRNAが、二本鎖DNAに変換され、ファージミドにクローニングされる。次いで、一本鎖DNAは、ファージミド増殖および精製ファージミドからの一本鎖DNA単離により回収される。本発明は、本発明が遺伝子発現プロファイルシグナルを、以下による2つの異なる方法において増大させるので有用である:試験mRNAポリヌクレオチド配列長を増大させることおよびインビトロにおける転写増大の両方。さらなる利点は、本発明がT7RNAポリメラーゼプロモーター配列でタグ化された遺伝子特異的プライマーで逆転写最適化を実行する必要を除外し、従って、比較的早く、経済的であることである。本発明は、種々の異なる方法例えば、RT-PCRまたは種々のDNAアレイ方法で使用されて、遺伝子発現をプロファイリングし得る。以前のプロトコルと全く同じように、このアプローチは、T7プロモーターを使用することにより例示されるが、本発明はそれに限定されない。しかし、当業者は、T3またはSp6のような他のRNAポリメラーゼプロモーターがまた、使用され得ることを理解する。12.乳癌遺伝子セット、アッセイされた遺伝子部分配列および遺伝子配列データの臨床的適用本発明の重要な局面は、乳癌組織による特定の遺伝子の測定された発現を使用して、患者を最良の薬物および薬物の組み合わせに適合させ、かつ予後情報を提供することである。この目的のために、アッセイされるRNAの量および使用されるRNAの質における変動における両方の差を、補正する除いて正規化することが必要である。従って、このアッセイは特定の正規化遺伝子の発現を測定かつ組み込み、この遺伝子としては、GAPDHおよびCyp1のような、周知のハウスキーピング遺伝子が挙げられる。あるいは、正規化は、全てのアッセイされる遺伝子またはその大きなサブセットの平均または中間シグナルCtに基づき得る全体的正規化アプローチ。遺伝子ごとの基準に基づいて、患者腫瘍mRNAの測定された正規化量は、乳癌組織参照セットに見出される量と比較される。この参照セットにおいて、乳癌組織の数Nは、異なる参照セットが全体として本質的に同様に作用することが確実なほど十分に多いべきである。この条件が適合する場合、特定のセットにおいて存在する個々の乳癌組織の同定は、アッセイされる遺伝子の相対量に有意な影響を与えない。通常、乳癌組織参照セットは、少なくとも約30、好ましくは少なくとも約40の異なるFPE乳癌組織試料からなる。他に特筆されることがなければ、各々のmRNA/試験される腫瘍/患者についての正規化発現レベルが、参照セットにおいて測定される発現レベルのパーセンテージとして表される。より詳細には、十分に高い数例えば、40の腫瘍の参照セットは、各々のmRNA種の正規化レベルの分布を生じる。分析されるべき特定の腫瘍サンプルにおいて測定されるレベルは、この範囲内のあるパーセンタイルまで減少し、このパーセンタイルは、当該分野で周知の方法により決定され得る。以下、他に特筆されることがなければ、遺伝子の発現レベルに対する参照は、参照セットに対する正規化した発現とみなされるが、これは常に明確に述べられるわけではない。乳癌遺伝子セットが、表1に示される。遺伝子受託番号ならびに順方向のプライマー、逆方向プライマーおよび遺伝子増幅のために使用され得るアンプリコン配列についての配列番号が、表2に列挙される。マーカーの封入のための基板および参照セットに対するmRNAレベル変動の臨床的意義が、以下に示される。遺伝子は、その発現レベルにより適応される臨床的重要性の型に基づいて、以下のサブセット中に分類される:A.乳癌処置に使用される薬物または他の適応について認可され、かつ乳癌の処置においてオフラベルで使用され得る薬物に対する患者の応答の予測。B.生存についての予後または癌の再発。C.治療薬物に対する患者応答の予測1.薬物に対する細胞感受性に特異的に影響する分子表1は、有力な薬物これもまた列挙されるに対する細胞感受性に特異的に影響する74個の遺伝子イタリック体で示されるを列挙する。示される薬物のほとんどは、乳癌を処置するために認可され、かつ既に使用されている例えば、アントラサイクリン;シクロホスファミド;メトトレキサート;5-FUおよびアナログ。いくつかの薬物が、オフラベルで乳癌を処置するために使用され、または臨床的開発段階にある例えば、ビスホスホネ-トおよび抗VEGFmAb。いくつかの薬物は、乳癌を処置するほど広範に使用されていないが、適応される標的が発現される他の癌において使用される例えば、Celebrexは、家族性結腸癌を処置するために使用される;シスプラチンは、卵巣癌および他の癌を処置するために使用される。正規化チミジレートシンターゼmRNA量が、15パーセンタイル順位以下であるか、またはチミジレートシンターゼに加えてジヒドロピリミジンホスホリラーゼの発現の総量が、25パーセンタイル順位以下であるか、またはこれらのmRNAに加えてチミジンホスホリラーゼの発現の総量が20パーセンタイル順位以下である場合、5FUに対する患者の応答が、適応される。5パーセンタイル順位以下のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼは、5FU、またはXelodaのようなアナログに対する有害応答の危険がある。チミジレートシンターゼおよびジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼのレベルが、先行する段落に規定されるような、受容可能な範囲内である場合、野生型p53以下に規定されるようなのバックグラウンドに対する上位15におけるc-mycmRNAの増幅は、5FUに対する有益な応答を予測するD.Arangoら、CancerRes.61:4910-49152001。チミジレートシンターゼおよびジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの標準レベルの存在下で、上位10におけるNFκBおよびcIAP2のレベルは、化学療法薬物5FUに対する乳腫瘍の抵抗性を示す。トポイソメラーゼIIαの正規化mRNAのレベルが10パーセンタイル順位未満である場合、またはトポイソメラーゼIIβの正規化mRNAのレベルが10パーセンタイル順位未満である場合、または組み合わせられた正規化トポイソメラーゼIIαシグナルおよび正規化トポイソメラーゼIIβシグナルが10パーセンタイル順位未満である場合、アントラサイクリンに対する患者の耐性が、示される。DHFRレベルがこのmRNA種についての平均参照セットレベルよりも十倍以上高い場合、または減少した葉酸キャリヤレベルが10パーセンタイル未満である場合、メトトレキサートに対する患者の感受性が、弱められる。腫瘍が上位10においてCYP1B1を発現する患者が、ドセタキソールに反応する可能性を減少している。アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1および1A3に対するシグナルの合計が、参照セット平均の10倍以上である場合、シクロホスファミドに対する応答の減少した可能性を示す。現在、免疫組織化学により測定されるようなエストロゲンレセプター発現およびプロゲステロンレセプター発現を使用して、抗エストロゲン療法についての患者を選択する。発明者らは、高い程度の一致で、標準的臨床的診断試験により決定されるような、これらのタンパク質のレベルを予測するエストロゲンおよびプロゲステロンレセプターmRNAレベルについてのRT-PCRアッセイを示した図6および7。腫瘍が上位70においてERαまたはPRmRNAを発現する患者が、タモキシフェンまたは他の抗エストロゲンに応答する可能性がある従って、操作上、これより低いレベルのERαは、ERα-ネガティブを規定すべきである。しかし、ミクロソームのエポキシドヒドラーゼについてのシグナルが上位10にあるか、またはpS2/三葉型因子、GATA3もしくはヒト絨毛膜性腺刺激ホルモンについてのmRNAが、ERα-ネガティブ腫瘍において見出される平均レベル以下である場合、抗エストロゲン療法は、有益ではない。XISTシグナルの欠失は、上位10におけるGST-πまたはプロリルエンドペプチダーゼ[PREP]シグナルの増加も弱めるので、タキサンに対する応答の可能性を弱める。上位10におけるPLAG1の増加は、タキサンに対する感受性を減少する。上位10におけるERCC1mRNAの発現は、シスプラチンまたはアナログに対する耐性の有意な危険を示す。Her2mRNA発現のRT-PCRアッセイは、高い程度の一致を有する、標準的診断試験により測定されるようにHer2過剰発現を予測するデータは示さず。腫瘍が上位10においてHer2cyp.1に対して正規化されるを発現する患者が、Hercepinまたは他のErbB2アンタゴニストでの処置に対する有益な応答の増大した可能性を有する。Grb7mRNAの発現の測定は、HER2遺伝子増幅についての試験として役立つ。なぜなら、Grb7遺伝子が、Her2に密接に関連しているためである。Her2の発現がこの段落において上で規定されるように高いならば、同様に増加したGrb7は、Her2遺伝子増幅を指示する。IGF1Rおよび/またはIGF1もしくはIGF2の過剰発現がHerceptinに対する、およびまたEGFRアンタゴニストに対する有益な応答の可能性を減少させる。腫瘍が変異体Ha-Rasおよびまた10パーセンタイル順位を超えるレベルにてファルネシルピロリン酸シンセターゼmRNAまたはゲラニルピロホスホン酸シンセターゼmRNAを発現する患者は、ビス-ホスホネート薬物に対する有益な応答を特に示す可能性のある群を含む。Cox2は、プロスタグランジンの合成における重要な制御酵素である。これは、乳癌を含む癌の種々の型のサブセットにおいて増加したレベルでしばしば発現される。この遺伝子の発現は、転写レベルにて制御され、その結果RT-PCRは、細胞酵素活性の有効なインジケーターとして働く。非臨床的研究が、cox2が腫瘍脈管形成を促進することを示し、これはこの酵素が固形腫瘍における見込みのある薬物標的であることを示唆する。いくつかのCox2アンタゴニストは、抗炎症性状態における使用のために市販される産物である。cox2抑制因子Celebrexを有する家族性腺腫性ポリポーシス患者の処置は、腫瘍性ポリープの数および大きさを有意に減少させた。cox2抑制因子は、乳癌の処置のためにまだ認可されていないが、一般にこのクラスの薬物は、安全でかつcox2が過剰増幅である乳癌においてオフラベルで処方され得る。上位10パーセンタイル単位におけるレベルにてCOX2を発現する腫瘍は、Celebrexまたは他のシクロオキシゲナーゼ2抑制因子の有益な応答の増加した機会を有する。チロシンキナーゼErbB1[EGFR]、ErbB3[Her3]およびErbB4[Her4];またリガンドTGFα、アンフィレグリン、ヘパリン結合EGF様成長因子、およびエピレグリン;またBRK、非レセプターキナーゼ。臨床的開発におけるいくつかの薬物は、EGFレセプターを阻害する。ErbB2-4、指示されるリガンドおよびBRKはまた、EGFR経路の活性を増大する。腫瘍が高いレベルのEGFRまたはEGFRおよびEGFR経路の異常に高いレベルの他に指示される活性化因子を発現する乳癌患者は、EGFRアンタゴニストを用いる処置のための可能性のある候補である。腫瘍が参照パネルで観察される平均レベルの10未満のEGFRmRNAを発現する患者は、EGFRアンタゴニストに応答する可能性が比較的低い[例えば、Iressa、またはImClone225]。EGFRがこの低い範囲を超える場合、90パーセンタイル順位を超えるレベルでのエピレグリン、TGFα、アンフィレグリン、もしくはErbB3、もしくはBRK、CD9、MMP9またはLot1のさらなる存在が、EGFRアンタゴニストに応答する素因となる。エピレグリン遺伝子発現は、特に、EGFR活性化のための良好な代理マーカーであり、EGFRアンタゴニストへの応答を予測するだけではなく、EGFRアンタゴニストへの応答をもモニタリングするために使用し得る[細い針生検を使用して処置の間の腫瘍組織を提供する]。90パーセンタイル順位を超えるCD82のレベルは、EGFRアンタゴニストからのより低い効力を示唆する。チロシンキナーゼabl、c-kit、PDGFRα、PDGFβ、およびARG;また、シグナル伝達リガンドc-kitリガンド、PDGFA、B、CおよびD。この列挙されるチロシンキナーゼは、薬物GleevecTMイマチニブメシレート、Novartisの全ての標的であり、そして列挙されるリガンドは、列挙されるチロシンキナーゼの1つ以上を刺激する。GleevecTMが認可されている2つの適用において、チロシンキナーゼ標的bcr-ablおよびckitは過剰発現され、また活性化変異を含む。GleeveTM標的チロシンキナーゼ標的の1つが乳癌組織中で発現されることの発見が、遺伝子が配列決定されて変異されるか否かを決定する分析の第2段階を促す。変異が見出されることは、当該分野で公知の方法により例えば、対応する野生型のキナーゼに対する、特定のキナーゼのキナーゼ酵素活性を測定することによりまたはリン酸化状態を測定することにより立証され得る活性化変異である。腫瘍がGleeveTM標的チロシンキナーゼをコードする高レベルのmRNA特に、上位10パーセンタイル順位において、または平均的範囲でGleeveTM標的チロシンキナーゼについてのmRNA、および上位10パーセンタイル順位における同族成長刺激リガンドについてのmRNAを発現する、乳癌患者が、GleeveTMでの処置のための特に良好な候補である。VEGFは、有効かつ病理学的に重要な脈管形成因子である。以下の予後指標を参照のこと。VEGFmRNAレベルが、上位10パーセンタイル順位内にある場合、強度の処置が正当化される。このようなレベルは特に、抗脈管形成薬物での処置の重要性を示唆し、この薬物としては、抗VEGF抗体のような、VEGFアンタゴニストが挙げられる。さらに、上位20パーセンタイル順位におけるKDRまたはCD31mRNAレベルは、VEGFアンタゴニストからの利益の可能性をさらに増大する。ファルネシルピロホスファターゼシンテターゼおよびゲラニルゲラニルピロホスファターゼシンテターゼ。これらの酵素は、市販されるビスホスホネート薬物の標的であり、この薬物は、骨粗しょう症の処置のために元々開発されたが、最近乳癌においてオフラベルで患者に処方され始めている。90パーセンタイル順位以上で、乳癌組織においてこれらの酵素をコードする増加したレベルのmRNAが、処置の選択肢としてビスホスホネートの使用を示唆する。2.多剤耐性因子これらの因子は、以下の10個の遺伝子を含む:γグルタミルシステインシンテターゼ[GCS];GST-α;GST-π;MDR-1;MRP1-4;乳癌耐性タンパク質[BCRP];肺耐性タンパク質[MVP];SXR;YB-1。GCSならびにGST-αおよびGST-πの両方は、グルタチオンレベルを制御し、これは化学療法薬物および減少誘導によるほかの毒に対する細胞性感受性を減少させる。グルタチオンは、多剤耐性ポンプ、MDR-1およびMRPについての必要な補因子である。MDR1およびMRPは、乳癌において使用されるいくつかの重要な化学療法薬物を細胞外に能動的に輸送するように機能する。GST、MDR-1、およびMRP-1は、ヒトの癌における予後的意義または予測的意義を有する可能性を決定するために、広範囲に研究されてきた。しかし、大きな不一致が、この質問に関する文献中に存在している。最近、MRPファミリーの新しいメンバーが同定された:MRP-2、MRP-3、MRP-4、BCRP、および肺耐性タンパク質[主要円蓋タンパク質majorvaultprotein]。これらは、MDR-1およびMRP-1の基質特異性と共通する基質特異性を有する。これら全ての関連のあるABCファミリーメンバーおよびグルタチオン合成酵素の本発明への組み込みは、単一のまたは二重の被検体アッセイが不可能である方法において、薬物耐性に対するこのファミリーの寄与を獲得する。MRP-1、多剤耐性タンパク質についての遺伝子コーディングP-糖タンパク質は、転写レベルにおいて主に調節されない。しかし、p-糖タンパク質は、PTP1bの転写を刺激する。本発明の実施形態は、MRP-1/p-糖タンパク質活性の代理測定としてのホスファターゼPTP1bについてのmRNAのレベルの使用である。遺伝子SXRはまた、これが特定の多剤耐性因子の転写を刺激するために、多剤耐性の活性化因子である。乳癌において使用される化学療法剤に関する多剤耐性因子の重要性は、以下の様である。MDR1、GSTα、GSTπ、SXR、BCRPYB-1、またはLRP/MVPのいずれかのmRNAレベルが、上位4パーセンタイル順位である場合、ドキソルビシンに対する有益な応答は、弱められる。任意のMRP1、MRP2、MRP3、もしくはMRP4またはγ-グルタミルシステインシンテターゼのmRNAレベルが上位4パーセンタイル順位である場合、メトトレキサートに対する有益な応答は、阻害される。3.真核生物翻訳開始因子4E[EIF4E]EIF4EmRNAレベルは、タンパク質発現の証拠を提供し、その結果RT-PCRの能力を大きくして遺伝子発現におけるバリエーションを指示する。従って、本発明の1つの特許請求の範囲が、特定の遺伝子[例えば、サイクリンD1、mdm2、VEGF、およびその他]の遺伝子発現の付加されたインジケーターとしてのEIF4Eの使用である。例えば、同量の正規化されたVEGFmRNAを含む2つの組織検体において、より高い正規化レベルのEIF4Eを含む組織が、より高いレベルのVEGF遺伝子発現を示す可能性がある。バックグラウンドは、以下のようである。mRNA翻訳の調節における重要な点は、43Sリボソームサブユニットへ結合するEIF4G複合体によるmRNAの選択である。タンパク質EIF4E[m7GCAP結合タンパク質]は、EIF4Eコピーよりも多いmRNAが細胞中に存在しているために、制限的である。高度に構築化された5’UTRまたは高度にGCリッチなmRNAは、非効率的に翻訳され、これらはしばしば癌に関連する機能を実行する遺伝子[例えば、サイクリンD1、mdm2、およびVEGF]をコードする。EIF4Eは、転写/mRNAレベルにおいてそれ自体調節される。従って、EIF4Eの発現は、タンパク質の数の増加した活性の付加された適応を提供する。EIF4Eの過剰発現が培養された細胞を形質転換し、従ってオンコジーンであることがまた、注目すべきである。EIF4Eの過剰発現は、いくつかの異なる型の癌において起こるが、乳癌において特に重要である。EIF4Eは代表的に、通常の胸の組織において非常に低いレベルで発現される。D.予後指標1.DNA修復酵素変異を介するBRCA1およびBRCA2の欠失は、家族性乳癌のほとんどの一般的な型において重要なオンコジーン段階を示す。これらの重要な酵素のmRNAのレベルは、散発性乳癌のサブセットにおいて同様に異常である。いずれかからのシグナルの欠失[10パーセンタイル順位以下まで]は、短い生存の危険を高める。2.細胞周期調節因子細胞周期調節因子は、以下の14個の遺伝子を含む:c-MYC;c-Src;サイクリンD1;Ha-Ras;mdm2;p14ARF;p21WAF1/CIP;p16INK4a/p14;p23;p27;p53;PI3K;PKC-ε;PKC-δ。p53[TP53]についての遺伝子は、乳癌の大きなフラクションにおいて変異される。頻繁にp53レベルは、機能変異の欠失が起こる場合に高められる。変異がドミナントネガティブである場合、変異は、増殖が促進され、アポトーシスが阻害されるので、癌細胞に対する生存価値survivalvalueを作り出す。何千もの異なるp53変異が、ヒト癌の中で見出され、その多くの機能的結果は、明らかになっていない。学術的な文献の大きな集まりは、変異したp53の予後的意義および予測的意義に取り組み、その結果は非常に対立している。本発明は、以下のようなp53活性の機能的ゲノム測定を提供する。活性化された野生型p53分子は、細胞周期抑制因子p21の転写を誘発する。従って、p21に対するp53の割合は、p53が野生型であり活性化される場合、低いはずである。p53が検出可能であり、p21に対するp53の割合が正常な胸に対して腫瘍において高められる場合、このp53は、非機能的またはドミナントネガティブのp53である。癌の文献は、貧弱な予後によって証明されるような、これについての証拠を提供する。mdm2は、重要なp53調節因子である。活性化された野生型p53は、mdm2の転写を刺激する。mdm2タンパク質は、p53に結合し、タンパク質分解による破壊を促進する。従って、通常のレベルのp53または高いレベルのp53の存在において、mdm2の異常に低いレベルは、p53が変異され、不活性化されることを指示する。本発明の1つの局面は、p53状態の姿を提供するmRNAレベルの比p53:p21およびp53:mdm2の使用である。p53のドミナントネガティブの変異についての証拠高いp53:p21および/または高いp53:mdm2mRNA比によって指示されるように、特に上位10パーセンタイル順位においては、乳癌における再発のより高い危険を予測し、従って、乳癌手術後の負の結節における化学療法を使用する決定に対して、重点を置く。別の重要な細胞周期調節因子はp27であり、これは、活性化された形態で、cdk4のレベルで細胞周期進行をブロックする。このタンパク質は、転写レベルにおけるよりもむしろ、主にリン酸化/脱リン酸化を経由して調節される。しかし、p27mRNAのレベルは、まさに変動する。従って、上位10の百分位数におけるp27mRNAのレベルは、手術後の乳癌の再発の低下したリスクを示す。サイクリンD1は、細胞周期のS期に入る主要なポジティブ調節因子である。サイクリンD1の遺伝子は、約20の乳癌患者で増幅されており、そしてそれ故、これらの事例における腫瘍増殖を促進している。本発明の1つの局面は、乳癌患者における診断目的のためのサイクリンD1mRNAレベルの使用である。上位10の百分位数におけるサイクリンD1mRNAのレベルの使用は、手術後の乳癌における再発の高リスクを示唆し、そしてアジュバント化学療法の特定の利益を示唆している。3.その他の腫瘍サプレッサおよび関連タンパク質これらは、APCおよびE-カドヘリンを含む。腫瘍サプレッサAPCは、結腸癌の約50中で失われ、重要な細胞接着分子および成長サプレッサであるE-カドヘリンの同時転写アップレギュレーションをともなうことが長く知られている。最近、このAPC遺伝子が、15~40の乳癌中でサイレンス化されていることが見出された。同様に、E-カドヘリン遺伝子は、約30の乳癌でサイレンス化CpGアイランドメチル化を経由してされている。下位5の百分位数におけるAPCおよび/またはE-カドヘリンの異常に低いレベルは、手術後の乳癌の再発の高リスク、および強調された短縮化生存のリスクを示唆する。4.アポトーシスの調節因子これらは、BCl/BAXファミリーメンバーBCl2、Bcl-xl、Bak、Baxおよび関連因子、NFκ-Bおよび関連因子、ならびにまた、p53BP1/ASPP1およびp53BP2/ASPP2を含む。BaxおよびBakはプロ-アポトーシス、そしてBCl2およびBcl-xlはアンチ-アポトーシスである。従って、これら因子の比率は、細胞傷害性プロ-アポトーシス性薬物への細胞の抵抗性または感受性に影響する。乳癌においては、その他の癌とは異なり、BCl2の増加したレベル上位10の百分位数におけるは、良好な成果と相関している。これは、BCl2が成長阻害活性およびアンチ-アポトーシス活性を有し、そして乳癌においては、前者の活性の重要性が後者の重要性に勝るという事実を反映している。次に、BCl2の影響は、成長刺激転写因子c-MYCの状況に依存する。c-MYCの遺伝子は、乳癌で20増幅されている。c-MYCメッセージレベルがBCl2に対して異常に高められるときこの比が上位10の百分位数にあるように、そのときは、BCl2mRNAの高められたレベルはもはやボジティブな指標ではない。NFκ-Bは、別の重要なアンチ-アポトーシス因子である。当初は、炎症誘発性転写因子として認識され、今や、それは、いくつかの細胞外毒性因子[腫瘍壊死因子のような]に応答してプログラムされた細胞死を防ぐことが明確である。この転写因子の活性は、主に、リン酸化/脱リン酸化事象を経由して調節される。しかし、NFκ-Bのレベルは、細胞によりまさに変動し、そして高められたレベルは、アポトーシスに対する増加した抵抗性と相関し得る。重要なことは、現在の目的には、NFκ-Bは、タンパク質のIAP[アポトーシスのインヒビター]ファミリーの特定のメンバー、詳細には、cIAP1、cIAP2、XIAP、およびSurvivinをコードするmRNAの転写のその刺激を通じてアンチ-アポトーシス活性を多いに奏する。従って、[上位5の百分位数のいずれかにおける]これらのIAPおよびNFκ-BのmRNAレベルの異常に増加したレベルは、NFκ-Bアンチ-アポトーシス経路の活性化を意味する。これは、化学療法後の乳癌の再発の高リスク、そしてそれ故、不良な予後を示唆する。本発明の1つの実施形態は、乳癌における予後のための、上記のアポトーシス調節因子の遺伝子セット、ならびに上記で概説した組み合わせの使用およびそれらのmRNAのレベルの比の包含である。タンパク質p53BP1および2はp53に結合し、そしてプロ-アポトーシス性遺伝子の転写活性化を促進する。p53BP1および2のレベルは、乳癌の有意なフラクションで抑制され、不良な予後と相関する。いずれかが1/10より低い百分位数で発現されるとき、不良な予後が示される。5.細胞侵襲および血管形成を制御する因子これらは、uPA、PAI1、カテプシンB、GおよびL、散乱因子[HGF]、c-met、KDR、VEGF、およびCD31を含む。プラスミノゲンアクチベータuPAおよびそのセルピン調節因子PAI1は、細胞外マトリックスの破壊および腫瘍細胞侵襲を促進する。悪性乳癌における両者のmRNAの異常に高められたレベル上位20の百分位数におけるは、短縮化した生存の増加したリスク、手術後の乳癌における増加した再発、およびアジュバント化学療法を受ける増加した重要性を意味する。その一方、それらの腫瘍が、増加したレベルのこれらのmRNA種を発現しないノードネガティブの患者は、この癌の再発を有する可能性がより少なく、そして標準的な化学療法の利益が、ともなう毒性を正当化するか否かをより重篤に考慮し得る。カテプシンBまたはLは、上位10の百分位数で発現されるとき、不良な疾患フリーおよび全体の生存を予見する。特に、カテプシンLは、ノードポジティブ患者における短い生存を予見する。散乱因子およびその同族レセプターc-metは、細胞運動性および侵襲、細胞成長、および血管形成を促進する。乳癌において、これら因子をコードするmRNAの高められたレベルは、いずれか、またはその組み合わせの発現が、第90百分位数の上であるとき、積極的な化学療法薬物による処置を促進すべきである。VEGFは、血管形成の中心的なポジティブ調節因子であり、そして固形腫瘍における高められたレベルは、短い生存を予見する[多くの文献が、VEGFの高められたレベルが短い生存を予見することを示していることに注目のこと]。VEGFのインヒビターは、それ故、動物およびヒトにおける固形腫瘍の成長を遅延する。VEGF活性は、転写レベルで制御される。上位10の百分位数におけるVEGFmRNAレベルは、平均予後よりも有意に不良であることを示す。血管形成のその他のマーカーは、CD31[PECAM]であり、そしてKDRは、腫瘍における高い血管密度を、しかも腫瘍が特に悪性かつ攻撃的であり、そしてそれ故、積極的な治療戦略が召還されることを示す。6.免疫および炎症性細胞およびプロセスのためのマーカーこれらのマーカーは、免疫グロブリン軽鎖λ、CD18、CD3、CD68、Fas[CD95]、およびFasリガンドを含む。いくつかの系統の証拠は、乳癌で用いられる特定薬物の作用の機構は、宿主免疫/炎症応答の活性化をもたらすことであることを示唆している例えば、Herceptin登録商標。本発明の1つの局面は、炎症性および免疫細胞のためのマーカーの遺伝子セット、および免疫監視に対する腫瘍抵抗性を予見するマーカーにおける包含である。免疫グロブリン軽鎖λは、免疫グロブリン産生細胞のマーカーである。CD18はすべての白血球細胞のマーカーである。CD3はT細胞のマーカーである。CD68はマクロファージのマーカーである。CD95およびFasリガンドは、細胞傷害性T細胞およびNK細胞が標的細胞を殺傷する2つの主要経路の1つを媒介するレセプター:リガンドペアである。CD95の減少した発現、およびFasリガンドの増加した発現は、乳癌における不良な予後を示す。CD95およびFasリガンドもの両方は、膜貫通タンパク質であり、そして細胞死の引き金となるために膜に係留される必要がある。特定の腫瘍細胞は、CD95mRNAの代替スプライシングの結果として作製される、CD95の短縮化可溶性改変体を産生する。これは、腫瘍細胞のNK細胞および細胞傷害性T細胞Fasリガンド媒介殺傷をブロックする。可溶性CD95の存在は、乳癌における不良な生存と相関している。この遺伝子セットは、CD95の可溶性および完全長改変体を含む。7.細胞増殖マーカーこの遺伝子セットは、細胞増殖マーカーKi67/MiB1、PCNA、Pin1、およびチミジンキナーゼを含む。増殖マーカーの高レベル発現は、高組織学グレード、および短い生存をともなう。上位10の百分位数における高レベルのチミジンキナーゼは、短い生存の増加したリスクを示唆する。Pin1は、一部サイクリンD1遺伝子の転写活性化による細胞成長を刺激するプロピルイソメラーゼであり、そして上位10の百分位数におけるレベルは、ネガティブ予後プロフィールに寄与する。8.その他の成長因子およびレセプターこの遺伝子セットは、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGF1R、FGF2、FGFR1、CSF-1R/fms、CSF-1、IL6およびIL8を含む。これらタンパク質のすべては乳癌で発現される。大部分は腫瘍増殖を刺激する。しかし、成長因子FGF2の発現は、良好な結果と相関する。いくつかはアンチ-アポトーシス活性を有する。IGF1は有望である。増加したIGF-1、IGF1R、またはIGFBP3上位10の百分位数におけるこれらシグナルの合計により示されるようにを経由するIGF1の活性化は、腫瘍細胞死を阻害し、そして不良な予後プロフィールに強く寄与する。9.乳癌のサブクラスを規定する遺伝子発現マーカーこれらは:GRO1発癌遺伝子α、Grb7、サイトケラチン5および17、網膜結合タンパク質4、肝細胞核因子3、インテグリンα7、およびリポタンパク質リパーゼを含む。これらのマーカーは、乳癌を、遺伝子発現のレベルで表現型が異なる細胞タイプのサブセットに分ける。Bcl2、肝細胞核因子3、LIV1およびERの平均を超える腫瘍発現シグナルは、疾患フリーの最良の予後、および癌の外科的除去後の全体の生存を有する。リポタンパク質リパーゼ、網膜結合タンパク質4、およびインテグリンα7の上昇した発現により特徴付けられる乳癌腫瘍タイプの別のカテゴリーは、中間の予後を保持する。平均を超えて4倍以上のレベルのサイトケラチン5および17、GRO発癌遺伝子、または平均を超えて10倍以上のErbB2およびGrb7のいずれかの上昇したレベルを発現する腫瘍は、最も不良な予後を有する。以下の実施例を含む、本明細書を通じて、遺伝発現研究を参照して本発明の種々の局面が説明されるが、本発明は、類似の様式で実施され得、そして類似の結果が、当該分野で周知のプロテオミクス技法を適用することにより到達され得る。プロテオームは、特定の時点におけるサンプル中に存在するタンパク質の全体である例えば、組織、生物または細胞培養。プロテオミクスは、とりわけ、サンプル中のタンパク質発現の全体の変化の研究である発現プロテオミクスとも称される。プロテオミクスは、代表的には、以下の工程:12-Dゲル電気泳動2-DPAGEによるサンプル中の個々のタンパク質の分離;2ゲルから回収された個々のタンパク質の同定、例えば、my質量スペクトル分析法および/またはN末端配列決定、および3バイオインフォーマティクスを用いるデータの分析を含む。プロテオミクス法は、遺伝子発現プロファイリングのその他の方法の価値ある補足であり、そして単独または本発明のその他の方法と組合せて用いられ得、本発明の遺伝子マーカーの産物を検出する。本発明のさらなる詳細は、以下の非制限的な実施例に記載される。実施例1ホルマリン固定、パラフィン包埋FPET組織標本からのRNAの単離A.プロトコルI.EPICENTRE登録商標キシレンプロトコールRNA単離1清澄なミクロトームブレードを用いてサンプルあたり1~6の切片各10μm厚さのパラフィン包埋組織を切断し、そして1.5mlのエッペンドルフチューブ中に配置する。2パラフィンを抽出し、そして1mlのキシレンを添加し、そしてチューブを10分間、旋回装置上で振動することにより転置する。3切片を、エッペンドルフ微量遠心分離機中、14,000×gで10分間の遠心分離によりペレット化する。4ペレットが取れるのを避けるために底にいくらかを残し、キシレンを除去する。5ステップ2~4を繰り返す。61mlの100エタノールを添加し、そして3分間、旋回装置上で振動することによって転置する。7残渣を、エッペンドルフ微量遠心分離機中、14,000×gで10分間の遠心分離によりペレット化する。8ペレットが取れるのを避けるために底にいくらかを残してエタノールを除去する。9ステップ6~8を2回繰り返す。10残りのエタノールのすべてを除去する。11各サンプルについて、2μlの50μg/μlプロテイナーゼKを300μlの組織および細胞溶解溶液に添加する。12各サンプルに、300μlの、プロテイナーゼKを含む組織および細胞溶解溶液を添加し、十分に混合する。1365°Cで90分間インキュベートする5分毎にボルテックス混合。残りの組織フラグメントを肉眼によりモニターする。30分後に見えるのであれば、さらなる2μlの50μg/μlプロテイナーゼKを添加し、そしてフラグメントが溶解するまでインキュベートすることを継続する。14サンプルを氷上に3~5分置き、そしてタンパク質除去、および総核酸沈殿を進行する。タンパク質除去および総核酸の沈殿1各溶解サンプルに150μlのMPCタンパク質沈殿試薬を添加し、そして10秒間激しくボルテックスする。2残渣を、エッペンドルフ微量遠心分離機中、14,000×gで10分間の遠心分離によりペレット化する。3上清液を清澄なエッペンドルフチューブ中に移し、そしてペレットを捨てる。4回収された上清液中に500μlのイソプロパノールを添加し、そしてチューブを3分間、旋回装置上で振動することにより完全に混合する。5エッペンドルフ微量遠心分離機中、14,000×gで10分間4°Cの遠心分離によりRNA/DNAをペレット化する。6ペレットを取り除かないように注意して、ピペットでイソプロパノールのすべてを除去する。RNA調整物からの汚染DNAの除去1195μlの1×DNase緩衝液に、5μlのRNaseフリーのDNaseI1U/μlを添加することにより、各サンプルについて200μlのDNaseI溶液を調製する。2200μlのDNaseI溶液中で、ボルテックスすることにより、ペレット化したRNAを完全に再懸濁する。3サンプルを37°Cで60分間インキュベートする。4各サンプルに200μlの2×TおよびC溶解溶液を添加し、そして5秒間ボルテックスする。5200μlのMPCタンパク質沈殿試薬を添加し、10秒間ボルテックスすることにより混合し、そして氷上に3~5分間置く。6エッペンドルフ微量遠心分離機中、14,000×gで10分間の遠心分離により残渣をペレット化する。7RNAを含む上清液を清澄なエッペンドルフチューブに移し、そしてペレットを棄てる。ペレットが移ることを避けるように注意のこと8各上清液に500μlのイソプロパノールを添加し、そして旋回装置上でサンプルを3分間振動する。9エッペンドルフ微量遠心分離機中、14,000×gで4°C10分間の遠心分離によりRNAをペレット化する。10ペレットが取れるのを避けるために底にいくらかを残してイソプロパノールを除去する。111mlの75エタノールで2回すすぐ。RNAペレットがとれる場合、少し遠心分離する。12エタノールを注意深く除去する。13残存エタノールを除去するために約3分間ヒュームフード下にセットする。14このRNAを、30μlのTE緩衝液中に再懸濁し、そして-30°Cに貯蔵する。II.本発明の熱蝋/尿素プロトコルRNA単離1清澄なミクロトームブレードを用いて3つの切片各10μm厚さのパラフィン包埋組織を切断し、そして1.5mlのエッペンドルフチューブ中に配置する。2330μg/mlのプロテイナーゼK50μg/μlのストック溶液から新たに添加されるを含む、300μlの溶解緩衝液10mMTris7.5、0.5サルコシンラウロイルナトリウム、0.1mMEDTApH7.5、4M尿素を添加し、そして簡単にボルテックスする。365°Cで90分間インキュベートする5分毎にボルテックス混合。組織フラグメントを肉眼によりモニターする。30分後になお見えるのであれば、さらなる2μlの50μg/μlプロテイナーゼKを添加し、そしてフラグメントが溶解するまで65°Cでインキュベートすることを継続する。414,000×gで5分間遠心分離し、そして上部水相を、パラフィンシールを乱さないように注意して新たなチューブに移す。5サンプルを氷上に3~5分置き、そしてタンパク質除去、および総核酸沈殿を進行する。タンパク質除去および総核酸の沈殿1各溶解サンプルに150μlの7.5MNH4OAcを添加し、そして10秒間激しくボルテックスする。2残渣を、エッペンドルフ微量遠心分離機中、14,000×gで10分間の遠心分離によりペレット化する。3上清液を清澄なエッペンドルフチューブ中に移し、そしてペレットを捨てる。4回収された上清液中に500μlのイソプロパノールを添加し、そしてチューブを3分間、旋回装置上で振動することにより完全に混合する。5エッペンドルフ微量遠心分離機中、14,000×gで10分間4°Cでの遠心分離によりRNA/DNAをペレット化する。6ペレットを取り除かないように注意して、ピペットでイソプロパノールのすべてを除去する。RNA調製物からの汚染DNAの除去1各サンプルに、45μlの1×DNaseI緩衝液10mMTris-Cl、pH7.5、2.5mMMgCl2、0.1mMCaCl2および5μlのRNaseフリーDNaseI2U/μl、Ambionを添加する。2サンプルを37°Cで60分間インキュベートする。70°Cで5分間加熱することにより、DNaseIを不活性化する。B.結果実験による証拠は、本発明の熱RNA抽出プロトコルがRNA収率を損なわないことを示す。19のFPE乳癌標本を用い、同じ標本中の3つの隣接する切片からRNAを抽出し、RNA収率を、蛍光検出AgilentBioanalyzerを用いるキャピラリー電気泳動により測定した。本発明の方法および市販方法のナノグラムでの平均RNA収率および標準偏差は、それぞれ:139/-21対141/-34であった。また、本発明の尿素含有溶解緩衝液は、EPICENTRE登録商標TC溶解緩衝液を置換し得、そして本発明に従ってタンパク質沈殿のために用いられる7.5MNH4OAc試薬は、EPICENTRE登録商標MPCタンパク質沈殿溶液を置換し得、RNA収率もTaqMan登録商標効率のいずれをも損なわないことが見出された。実施例2RT-PCRの前のmRNA種の増幅上記のセクション10に記載の方法を、固定され、パラフィン包埋された乳癌組織から単離されたRNAとともに用いた。TaqMan登録商標分析は、T7-GSPプライマー非増幅T7-GSPr、T7増幅RNA増幅T7-GSPrで生成された第1鎖cDNAで実施された。RNAは、図4のステップ2に従って増幅した。コントロールとして、TaqMan登録商標をまた、非改変GsPr増幅GsPrで生成したcDNAで実施した。等価な量の初期テンプレート1ng/ウェルを各TaqMan登録商標反応で用いた。結果を図8に示す。インビトロ転写は、RT-PCRシグナル強度を10倍より多く、そして特定の遺伝子では、コントロールに対して100倍を超えて増加し、ここで、RT-PCRプライマーは、インビトロ転写のために二本鎖DNAの生成に用いた方法2で用いたのと同じプライマーであったGSP-T7rおよびGSPr。図8にまた示されるのは、標準的な最適化RT-PCRプライマーすなわち、T7テイルを欠いているが用いられたとき生成されたRT-PCRである。示されるように、このコントロールと比較して、新たな方法は、RT-PCRシグナルにおいて実質的な増加を生じたこの実験では4~64倍。新たな方法は、各T7-GSP配列が、RT-PCRシグナルにおける増加が、標準的な最適化RT-PCR非T7テールプライマーに対して各遺伝子について同じであるように最適化されることを要求する。実施例3前癌状態および悪性乳癌における遺伝子発現の研究遺伝子発現研究は、侵襲性乳腺管癌のパラフィン包埋された固定組織サンプル中の遺伝子発現を分子的に特徴付け、およびこのような分子プロフィールと疾患フリーの生存との間の相関を探る主要目的で設計および実施された。本研究のさらなる目的は、侵襲性乳癌の組織サンプルにおける分子プロフィールを、インサイチュinsituの乳腺管癌で得られた分子プロフィールと比較することであった。この研究はさらに、インサイチュの小葉癌腫中、および侵襲性小葉癌腫のパラフィン包埋固定組織サンプル中の分子プロフィールに関するデータを得るために設計された。分子アッセイを、乳癌と診断された202人の個々の患者から得られた、パラフィンに包埋しホルマリン固定した原発胸部腫瘍組織に対して実施した。全ての患者は、胸部の侵襲性腺管癌、原位置純粋腺管癌pureductalcarcinomainsituDCIS、胸部の小葉癌、または原位置純粋小葉癌LCISの診断に伴い手術を受けていた。患者は、材料および方法の節で記載したとおりに実行された組織病理学的評価が適切な量の腫瘍組織および均一な病理を示した場合にのみ研究に含めた。この研究に参加する個体を、以下のグループに分けた:グループ1:原位置純粋腺管癌DCIS;n=18グループ2:侵襲性腺管癌n=130グループ3:原位置純粋小葉癌LCIS;n=7グループ4:侵襲性小葉癌n=16。材料および方法それぞれの代表的な腫瘍塊を、診断用の標準的組織病理学、腫瘍の量の半定量的評価、および腫瘍等級により特徴付けした。合計6つの切片それぞれ厚さ10ミクロンを調製し、そして2つのCostarBrand微量遠心管ポリプロピレン、1.7mL管、透明;各管に3つの切片に入れた。その腫瘍が全標本面積の30未満を構成する場合、そのサンプルは、肉眼顕微解剖を使用して、その腫瘍組織を直接Costar管に押しつけて、病理学者により、粗く切開されていてもよい。1つより多くの腫瘍塊が外科手順の一部として得られた場合、全ての腫瘍塊を、上記のように同じ特徴付けに供し、そしてその病理に最も代表的な塊を分析に使用した。遺伝子発現分析mRNAを抽出し、そして固定したパラフィン埋包組織サンプルから精製し、そして上記の7~11章に記載されるような遺伝子発現分析のために調製した。定量的遺伝子発現の分子アッセイを、ABIPRISM7900TMSequenceDetectionSystemPerkin-Elmer-AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USAを使用して、RT-PCRにより実行した。ABIPRISM7900TMは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子CCD、カメラおよびコンピュータから構成される。このシステムは、サーモサイクラー上の384ウェル形式でサンプルを増幅する。増幅の間、レーザー誘導蛍光シグナルを、384個のウェル全てについて光ファイバーケーブルを通して実時間で収集し、そしてCCDで検出する。このシステムは、この機器を作動させ、そしてデータを分析するためのソフトウェアを含む。分析および結果腫瘍組織を、185の癌関連遺伝子および7つの参照遺伝子について分析した。各患者についての閾値サイクルCT値を、その特定の患者についての全ての遺伝子の中央値に基づいて正規化した。臨床的結果データは、登録データおよび選択された患者のチャートの検討から全ての患者について利用可能であった。結果を以下のように分類した:0乳癌に起因するかもしくは未知の原因に起因して死亡したか、または乳癌の再発を伴って生存している;1乳癌の再発なしで生存しているか、または乳癌以外の原因に起因して死亡した。分析を、以下により実施した:1.正規化した遺伝子発現と0もしくは1の二元結果との間の関係の分析。2.正規化した遺伝子発現と、乳癌の再発なしで生存している患者または乳癌以外の原因に起因して死亡した患者を検閲した場合の結果までの時間上で定義した0または1との間の関係の分析。このアプローチを、個々の遺伝子および複数の遺伝子のセットの予後の影響を評価するために使用した。侵襲性乳癌を有する147人の患者の二元アプローチによる分析第1の二元アプローチにおいて、侵襲性乳癌を有する146人の全ての患者に対して分析を行った。t検定を、0または1に分類される患者のグループに対して行い、そして各遺伝子についてグループ間の差異についてのp値を計算した。以下の表4は、45の遺伝子を列挙しており、グループ間の差異についてのp値は<0.05であった。前述の表4において、より低いネガティブt値は、より良好な結果を伴うより高い発現またはより低いCTを示し、そして反対に、より高いポジティブt値は、より不良な結果を伴うより高い発現より低いCTを示す。従って、例えば、FOXM1遺伝子の上昇した発現t値=3.92、CT平均値生存>CT平均値死亡は、無疾患生存の減少した傾向を示す。同様に、CEGP1遺伝子の上昇した発現t値=-3.39;CT平均値生存<CT平均値死亡は、無疾患生存の増加した傾向を示す。表4に示されるデータに基づいて、乳癌における以下の遺伝子のいずれかの過剰発現は、術後の癌再発のない生存の減少した傾向を示す:FOXM1;PRAME;SKT15,Ki-67;CA9;NME1;SURV;TFRC;YB-1;RPS6KB1;Src;Chkl;CCNB1;Chk2;CDC25B;CYP3A4;EpCAM;VEGFC;hENT1;BRCA2;EGFR;TK1;VDR。表4に示されるデータに基づいて、乳癌における以下の遺伝子のいずれかの過剰発現は、術後の癌再発のない生存のより良好な予後を示す:Blc12;CEGP1;GSTM1;PR;BBC3;GATA3;DPYD;GSTM3;ID1;EstR1;p27;XIAP;IGF1R;AK055699;P13KC2A;TGFB3;BAGI1;pS2;WISP1;HNF3A;NFKBp65。108人のERポジティブ患者の二元アプローチによる分析エストロゲンレセプターERについての正規化されたCTが<25.2を有する108人の患者すなわち、ERポジティブ患者を、別々の分析に供した。t検定を、0または1に分類される患者のグループに対して実行し、そして各々の遺伝子についてのグループ間の差異のp値を計算した。以下の表5は、グループ間の差異のp値が<0.05である場合の12の遺伝子を列挙する。各遺伝子について、分類アルゴリズムを利用して、臨床的結果を推定する際に各遺伝子単独を使用するために最良な閾値CTを同定した。表5に示されるデータに基づいて、ERポジティブ癌における以下の遺伝子の過剰発現は、術後の癌再発のない生存の減少した傾向の指標である:PRAME;FOXM1;EPHX1;HIF1A;VEGFC;Ki-67;VDR;NME1。これらの遺伝子のいくつかPRAME;FOXM1;VEGFC;Ki-67;VDR;およびNME1はまた、ERポジティブ乳癌に限らず、以前の分析における不良な予後の指標として同定された。残りの遺伝子EPHX1およびHIF1Aの過剰発現は、ERポジティブ乳癌のみにおける無疾患生存のネガティブな指標であるようである。表5に示されるデータに基づいて、ERポジティブ癌における以下の遺伝子の過剰発現は、術後の癌再発のない生存についてのより良好な予後の指標である:Bcl-2;DIABLO;IGF1R;GSTM3。後者の遺伝子のうち、Bcl-2;IGFR1;およびGSTM3はまた、ERポジティブ乳癌に限らず、以前の分析における良好な予後の指標として同定された。DIABLOの過剰発現は、ERポジティブ癌のみにおける無疾患生存のポジティブな指標であるようである。複数の遺伝子および結果の指標の分析2つのアプローチを、複数の遺伝子を使用することが、結果間のより良好な弁別を提供するか否かを決定するために採用した。第1に、弁別分析を、変数増加ステップワイズforwardstepwiseアプローチを使用して実行した。任意の単一の遺伝子のみで得られるモデルよりも、より大きな弁別で結果を分類したモデルを作成した。第2のアプローチ事象発生までの時間time-to-eventのアプローチに従って、各遺伝子について、Cox比例ハザードモデル例えば、Cox,D.R.およびOakes,D.1984,AnalsisofSurvivalData,ChapmanandHall,London,NewYorkを参照のことを、従属変数として再発または死亡までの時間、および独立変数として遺伝子の発現レベルで定義した。Coxモデルにおいて<0.05のp値を有する遺伝子を同定した。各遺伝子について、Coxモデルは、その遺伝子の発現における単位変化について再発または死亡の相対的危険性RRを提供する。測定された発現CTスケールの任意の閾値において患者をサブグループに分割するように選択する事ができ、ここで閾値より上の発現値を有する全ての患者は、より高い危険性を有し、そして閾値より下の発現値を有する全ての患者は、より低い危険性を有するか、あるいはその逆もまた同様であり、その遺伝子が良好なRR>1.01予後もしくは不良なRR<1.01予後のどちらの指標であるかに依存する。従って、任意の閾値は、それぞれ増加した危険性または減少した危険性を有する患者のサブグループを規定する。結果を以下の表6および7にまとめる。バイナリー時間対事象time-to-event分析は、わずかな例外を伴って、予後マーカーと同じ遺伝子を同定した。例えば、表4と表6の比較により、1つの遺伝子を除いて、2つの分析が上位15のマーカーの同じリストを作製したことが示される最小のp値によって定義される。さらに、両方の分析は、同じ遺伝子を同定し、これらは、生存期間/再発との相関の方向プラス徴候またはマイナス徴候について一致した。全体として、これらの結果は、これらの同定されたマーカーが有意な予後値を有するという結論を強める。2つより多い遺伝子を有するCoxモデル多変量モデルについて、各個の遺伝子がこのモデルに段階的に組み込まれ、ここで組み込まれた第1の遺伝子は、有意な単変量p値を有する遺伝子の中から予め選択され、そして各次の工程におけるモデルへの組み込みのために選択された遺伝子は、このモデルのデータへのフィッティングを最も良く改善する遺伝子である。この分析は、任意の総数の遺伝子を用いて実施され得る。以下に結果が示されるこの分析において、段階的組み込みを、10個までの遺伝子について実施した。多変量分析を、以下の式を用いて実施する:RR=exp[係数遺伝子A×Ct遺伝子A係数遺伝子B×Ct遺伝子B係数遺伝子C×Ct遺伝子C.....]。この式において、有益な結果の予測指数である遺伝子の係数は、正の数であり、不良な結果の予測指数である遺伝子の係数は、負の数である。この式中のCt値は、ΔCtである。すなわち、集団の正規化された平均Ct値と、研究中の患者について測定された正規化Ctとの間の差異を示す。現在の分析で用いられる規約は、集団平均より下のΔCTは、正の符号を有し、集団平均より上のΔCtは、負の符号を有するということであるより多いかまたはより少ないmRNA存在量を示す。この式を解くことにより算出される相対危険度RRは、患者が癌を再発することなく長期生存する可能性が高いか低いかを示す。侵襲性乳癌を有する147人の患者の多変量遺伝子分析aCoxProportionalHazardsModelを使用する多変量段階的分析を、侵襲性乳癌を有する147人全ての患者について得られた遺伝子発現データを用いて実施した。遺伝子CEGP1、FOXM1、STK15およびPRAMEを、この分析から除外した。以下の10遺伝子セットを、この分析によって、原発性腫瘍の外科的除去後に癌を再発することなく患者が生存する特に強い推定値を有するとして同定した。1.Bcl2、サイクリンGl、NFKBp65、NME1、EPHX1、TOP2B、DR5、TERC、Src、DIABLO;2.Ki67、XIAP、hENTl、TS、CD9、p27、サイクリンG1、pS2、NFKBp65、CYP3A4;3.GSTM1、XIAP、Ki67、TS、サイクリンG1、p27、CYP3A4、pS2、NFKBp65、ErbB3;4.PR、NME1、XIAP、upa、サイクリンGl、Contig51037、TERC、EPHX1、ALDH1A3、CTSL;5.CA9、NME1、TERC、サイクリンG1、EPHX1、DPYD、Src、TOP2B、NFKBp65、VEGFC;6.TFRC、XIAP、Ki67、TS、サイクリンG1、p27、CYP3A4、pS2、ErbB3、NFKBp65。bCoxProportionalHazardsModelを使用する多変量段階的分析を、侵襲性乳癌を有する147人全ての患者について得られた遺伝子発現データを用い、少数の遺伝子を含むインテロゲーションセットを使用して実施した。以下の10遺伝子セットを、この分析によって、原発性腫瘍の外科的除去後に癌を再発することなく患者が生存する特に強い推定値を有するとして同定した。1.Bcl2、PRAME、サイクリンG1、FOXM1、NFKBp65、TS、XIAP、Ki67、CYP3A4、p27;2.FOXM1、サイクリンG1、XIAP、Contig51037、PRAME、TS、Ki67、PDGFRa、p27、NFKBp65;3.PRAME、FOXM1、サイクリンGI、XIAP、Contig51037、TS、Ki6、PDGFRa、p27、NFKBp65;4.Ki67、XIAP、PRAME、hENTI、contig51037、TS、CD9、p27、ErbB3、サイクリンGl;5.STK15、XIAP、PRAME、PLAUR、p27、CTSL、CD18、PREP、p53、RPS6KB1;6.GSTM1、XIAP、PRAME、p27、Contig51037、ErbB3、GSTp、EREG、ID1、PLAUR;7.PR、PRAME、NME1、XIAP、PLAUR、サイクリンGI、Contig51037、TERC、EPHX1、DR5;8.CA9、FOXM1、サイクリンG1、XIAP、TS、Ki67、NFKBp65、CYP3A4、GSTM3、p27;9.TFRC、XIAP、PRAME、p27、Contig51037、ErbB3、DPYD、TERC、NME1、VEGFC;10.CEGP1、PRAME、hENTl、XIAP、Contig51037、ErbB3、DPYD、NFKBp65、ID1、TS。ER陽性侵襲性乳癌を有する患者の多変量分析CoxProportionalHazardsModelを使用する多変量段階的分析を、ER陽性侵襲性乳癌を有する患者について得られた遺伝子発現データを用いて実施した。以下の10遺伝子セットを、この分析によって、原発性腫瘍の外科的除去後に癌を再発することなく患者が生存する特に強い推定値を有するとして同定した。1.PRAME、p27、IGFBP2、HIF1A、TIMP2、ILT2、CYP3A4、ID1、EstRl、DIABLO;2.Contig51037、EPHX1、Ki67、TIMP2、サイクリンGl、DPYD、CYP3A4、TP、AIB1、CYP2C8;3.Bcl2、hENT1、FOXM1、Contig51037、サイクリンGl、Contig46653、PTEN、CYP3A4、TIMP2、AREG;4.HIF1A、PRAME、p27、IGFBP2、TIMP2、ILT2、CYP3A4、ID1、EstRl、DIABLO;5.IGF1R、PRAME、EPHX1、Contig51037、サイクリンGl、Bcl2、NME1、PTEN、TBP、TIMP2;6.FOXM1、Contig51037、VEGFC、TBP、HIF1A、DPYD、RAD51C、DCR3、サイクリンG1、BAG1;7.EPHX1、Contig51037、Ki67、TIMP2、サイクリンGl、DPYD、CYP3A4、TP、AIB1、CYP2C8;8.Ki67、VEGFC、VDR、GSTM3、p27、upa、ITGA7、rhoC、TERC、Pinl;9.CDC25B、Contig51037、hENTl、Bcl2、HLAG、TERC、NME1、upa、ID1、CYP;10.VEGFC、Ki67、VDR、GSTM3、p27、upa、ITGA7、rhoC、TERC、Pinl;11.CTSB、PRAME、p27、IGFBP2、EPHX1、CTSL、BAD、DR5、DCR3、XIAP;12.DIABLO、Ki67、hENT1、TIMP2、IDl、p27、KRT19、IGFBP2、TS、PDGFB;13.p27、PRAME、IGFBP2、HIF1A、TIMP2、ILT2、CYP3A4、ID1、EstRl、DIABLO;14.CDH1;FRAME、VEGFC;HIF1A;DPYD、TIMP2、CYP3A4、EstRl、RBP4、p27;15.IGFBP3、PRAME、p27、Bcl2、XIAP、EstRl、Ki67、TS、Src、VEGF;16.GSTM3、PRAME、p27、IGFBP3、XIAP、FGF2、hENTl、PTEN、EstRl、APC;17.hENTl、Bcl2、FOXM1、Contig51037、サイクリンGI、Contig46653、PTEN、CYP3A4、TIMP2、AREG;18.STK15、VEGFC、PRAME、p27、GCLC、hENTI、ID1、TIMP2、EstRl、MCP1;19.NME1、PRAM、p27、IGFBP3、XIAP、PTEN、hENT1、Bcl2、CYP3A4、HLAG;20.VDR、Bcl2、p27、hENT1、p53、PI3KC2A、EIF4E、TFRC、MCM3、ID1;21.EIF4E、Contig51037、EPHX1、サイクリンGl、Bcl2、DR5、TBP、PTEN、NME1、HER2;22.CCNB1、PRAME、VEGFC、HIF1A、hENT1、GCLC、TIMP2、ID1、p27、upa;23.ID1、PRAME、DIABLO、hENT1、p27、PDGFRa、NME1、BIN1、BRCA1、TP;24.FBXO5、PRAME、IGFBP3、p27、GSTM3、hENT1、XIAP、FGF2、TS、PTEN;25.GUS、HIA1A、VEGFC、GSTM3、DPYD、hENTl、FBXO5、CA9、CYP、KRT18;26.Bclx、Bcl2、hENTl、Contig51037、HLAG、CD9、ID1、BRCA1、BIN1、HBEGF。上記の遺伝子セットの多くは、上で考察された標準条件下で予後マーカーとみなすのに十分な予測値を単独では有さないが、他の遺伝子と組み合わされた場合、その存在が、癌の再発を伴わない患者の長期生存の可能性についての価値ある情報を提供する遺伝子を含む。本開示全体にわたって引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として明確に援用される。本発明は、特定の実施形態とみなされるものに関して記載されてきたが、本発明はこのような実施形態に限定されないことが理解されるべきである。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の改変物および等価物を網羅することを意図する。例えば、本開示は、種々の乳癌関連遺伝子および遺伝子セットの同定、ならびに乳癌の診断および処置に焦点を合わせているが、特に、他のタイプの癌についての類似の遺伝子、遺伝子セットおよび方法が、本明細書の範囲に含まれる。"