"明細書に記載のcDNA。発明の要約内在性ヒトGPCRの非内在性変種およびそれらの用途を本明細書で開示する。本発明は、例えば、以下を提供する:項目1hARE-3F313Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目2項目1記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目3ベクターおよび項目1記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目4項目3記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目5hARE-4V233Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目6項目5記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目7ベクターおよび項目5記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目8項目7記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目9hARE-5A240Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目10項目9記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目11ベクターおよび項目5記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目12項目11記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目13hGPCR14L257Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目14項目13記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目15ベクターおよび項目13記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目16項目15記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目17hGPCR27C283Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目18項目17記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目19ベクターおよび項目17記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目20項目19記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目21hARE-1E232Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目22項目21記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目23ベクターおよび項目21記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目24項目23記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目25hARE-2G285Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目26項目25記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目27ベクターおよび項目25記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目28項目27記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目29hPPR1L239Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目30項目29記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目31ベクターおよび項目29記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目32項目31記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目33hG2AK232Aを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目34項目33記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目35ベクターおよび項目33記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目36項目35記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目37hRUP3L224Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目38項目37記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目39ベクターおよび項目37記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目40項目39記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目41hRUP5A236Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目42項目41記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目43ベクターおよび項目41記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目44項目42記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目45hRUP6N267Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目46項目45記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目47ベクターおよび項目45記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目48項目47記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目49hRUP7A302Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目50項目49記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目51ベクターおよび項目49記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目52項目51記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目53hCHN4V236Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目54項目53記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目55ベクターおよび項目53記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目56項目55記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目57hMC4A244Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目58項目57記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目59ベクターおよび項目57記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目60項目60記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目61hCHN3S284Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目62項目61記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目63ベクターおよび項目61記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目64項目63記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目65hCHN6L352Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目66項目65記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目67ベクターおよび項目65記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目68項目67記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目69hCHN8N235Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目70項目69記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目71ベクターおよび項目69記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目72項目71記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目73hH9F236Kを含んで成る、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型受容体をコードするcDNA。項目74項目73記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目75ベクターおよび項目73記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目76項目74記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。項目77hAT1F239K;hAT1N111A;hAT1AT2K255IC3;およびhAT1A243より成る群から選択される、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGタンパク質共役型AT1受容体をコードするcDNA。項目78項目77記載のcDNAによりコードされる、非内在性の変種ヒトGタンパク質共役型受容体。項目79ベクターおよび項目77記載のcDNAを含んで成るプラスミド。項目80項目79記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。詳細な記述受容体を中核として発展してきた学術文献は、受容体に対する多様な影響を有するリガンドを指す多数の用語を採用している。明瞭化および一貫性のため、本特許明細書を通じて以下の定義を使用するであろう。これらの定義がこれらの用語の他の定義と矛盾する限り、以下の定義が支配する:アゴニストは、それらが受容体に結合する場合に細胞内応答を活性化する、もしくは膜へのGTP結合を高める物質例えばリガンド、候補化合物を意味する。本明細書で使用されるアミノ酸の略語を表Aに示す:部分的アゴニストは、それらが受容体に結合する場合にアゴニストが活性化するより小さい度合/程度まで細胞内応答を活性化する、もしくはアゴニストが高めるより小さい度合/程度まで膜へのGTP結合を高める物質例えばリガンド、候補化合物を意味する。アンタゴニストは、アゴニストと同一の部位で受容体に競争的に結合するがしかし活性型の受容体により開始される細胞内応答を活性化せず、そしてそれによりアゴニストもしくは部分的アゴニストによる細胞内応答を阻害する可能性のある物質例えばリガンド、候補化合物を意味する。アンタゴニストは、アゴニストもしくは部分的アゴニストの非存在下で基線の細胞内応答を減少させない。候補化合物は、スクリーニング技術に基づいて分析できる分子例えば、そして制限でなく化合物を意味する。好ましくは、候補化合物という句は、間接的同定方法により既に決定されたような、受容体に対する反作用薬、アゴニストもしくはアンタゴニストより成る群から選択される化合物であることが公知であった化合物間接的に同定された化合物を包含せず;より好ましくは、最低1種の哺乳動物で治療上の効能を有することが既に決定されている間接的に同定された化合物を包含せず;そして最も好ましくは、ヒトで治療上の有用性を有することが既に決定されている間接的に同定された化合物を包含しない。組成物は最低1種の成分を含んで成る物質を意味し;製薬学的組成物は組成物の一例である。化合物の効能は、受容体結合親和性と対照的に、受容体の機能性を阻害もしくは刺激する化合物の能力の大きさを意味する。化合物の効能の検出の例示的手段を本特許明細書の実施例のセクションに開示する。コドンは、リン酸基に結合されたヌクレオシドアデノシンA、グアノシンG、シチジンC、ウリジンUおよびチミジンTを一般に含んで成りかつ翻訳される場合に1個のアミノ酸をコードするひとそろいの3個のヌクレオチドもしくはヌクレオチドに対する同等物を意味する。構成的に活性化される受容体は構成的受容体活性化にさらされる受容体を意味する。構成的に活性化される受容体は内在性もしくは非内在性であることができる。構成的な受容体の活性化は、その内在性リガンドもしくはその化学的同等物との受容体の結合以外の手段による、活性状態での受容体の安定化を意味する。接触させるもしくは接触することは、インビトロの系であろうとインビボの系であろうと最低2つの部分を一緒にすることを意味する。直接同定するもしくは直接同定されるは、候補化合物という句に関係して、構成的に活性化される受容体、好ましくは構成的に活性化されるオーファン受容体、そして最も好ましくは構成的に活性化されるGタンパク質共役型の細胞表面のオーファン受容体に対する候補化合物のスクリーニング、およびこうした化合物の化合物の効能の評価を意味する。この句は、どの状況下でも、間接的に同定するもしくは間接的に同定されるという句により包含されるもしくはそれを包含すると解釈もしくは理解されるべきでない。内在性は哺乳動物が天然に産生する物質を意味する。例えば、そして制限でなく受容体という用語に関しての内在性は、哺乳動物例えば、そして制限でなくヒトもしくはウイルスにより天然に産生されるものを意味する。対照的に、これに関して非内在性という用語は、哺乳動物例えば、そして制限でなくヒトもしくはウイルスにより天然に産生されないものを意味する。例えば、そして制限でなく、その内在性の形態で構成的に活性でないがしかし操作される場合に構成的に活性になる受容体は、本明細書で非内在性の構成的に活性化される受容体と最も好ましく称される。双方の用語はインビボおよびインビトロ双方の系を記述するのに利用することができる。例えば、そして制限でなく、スクリーニングのアプローチにおいて、内在性もしくは非内在性の受容体はインビトロのスクリーニング系に関してであってよい。さらなる一例として、そして制限としてでなく、非内在性の構成的に活性化される受容体を包含するように哺乳動物のゲノムが操作されている場合には、インビボ系による候補化合物のスクリーニングが実現可能である。Gタンパク質共役型受容体融合タンパク質およびGPCR融合タンパク質は、本明細書に開示される本発明に関して、それぞれ、最低1種のGタンパク質、最も好ましくはこうしたGタンパク質のαサブユニットこれはGTPを結合するサブユニットであるに融合された、内在性の構成的に活性化されるGPCRもしくは非内在性の構成的に活性化されるGPCRを含んで成る非内在性タンパク質を意味し、Gタンパク質は好ましくは内在性のオーファンGPCRと天然に共役するGタンパク質と同一の型のものである。例えば、そして制限でなく、内在性の状態において、Gタンパク質GsαがGPCRと共役する主なGタンパク質である場合、特定のGPCRに基づくGPCR融合タンパク質はGsαに融合されたGPCRを含んで成る非内在性タンパク質であることができ;下に示されるであろうようないくつかの状況では、主なものでないGタンパク質をGPCRに融合することができる。Gタンパク質は構成的に活性なGPCRのC末端に直接融合することができるか、もしくは2者の間にスペーサーが存在してよい。宿主細胞は、その中に組み込まれたプラスミドおよび/もしくはベクターを有することが可能な細胞を意味する。原核生物宿主細胞の場合には、プラスミドは宿主細胞の複製物のような自律的分子として典型的に複製され一般に、プラスミドはその後真核生物宿主細胞への導入のため単離される;真核生物宿主細胞の場合には、真核生物宿主細胞が複製する場合にプラスミドが複製するように、プラスミドが宿主細胞の細胞DNAに組み込まれる。好ましくは、本明細書に開示される本発明の目的上、宿主細胞は真核生物、より好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくは293、293TおよびCOS-7細胞より成る群から選択される。間接的に同定するもしくは間接的に同定されるは、内在性受容体に特異的な内在性リガンドの同定、リガンド-受容体の相互作用を妨害および/もしくはそれと競争するものの決定のための受容体に対する候補化合物のスクリーニング、ならびに活性化された受容体に関連する最低1種のセカンドメッセンジャー経路に影響を及ぼす化合物の効能の評価を必要とする、薬物発見過程への伝統的アプローチを意味する。応答という用語に関係した阻害するもしくは阻害は、化合物の非存在下と対照的に、化合物の存在下で応答が低下もしくは予防されることを意味する。反作用薬は、内在性の形態の受容体もしくは構成的に活性化された形態の受容体のいずれかに結合し、かつ、アゴニストもしくは部分的アゴニストの非存在下で観察される正常の基準レベルの活性より低い、活性の形態の受容体により開始される基線の細胞内応答を阻害するか、もしくは膜へのGTP結合を減少させる物質例えばリガンド、候補化合物を意味する。好ましくは、基線の細胞内応答は、反作用薬の非存在下の基礎の応答に比較して、反作用薬の存在下で最低30、より好ましくは最低50、そして最も好ましくは最低75阻害される。既知の受容体は、その受容体に特異的な内在性リガンドが同定されている内在性受容体を意味する。リガンドは、内在性の天然に存在する受容体に特異的な内在性の天然に存在する分子を意味する。内在性受容体の核酸および/もしくはアミノ酸の配列に関しての突然変異体もしくは突然変異は、突然変異された形態の内在性の構成的に活性化されない受容体が該受容体の構成的活性化を明示するような、こうした内在性の配列に対する指定された1個の変化もしくは複数の変化を意味する。特定の配列に対する同等物に関して、aその後の突然変異された形態のヒト受容体の構成的活性化のレベルが該受容体の第一の突然変異により明示されるものと実質的に同一であり;そしてbその後の突然変異された形態の受容体と該受容体の第一の突然変異との間の配列アミノ酸および/もしくは核酸の相同性のパーセントが最低約80、より好ましくは最低約90、そして最も好ましくは最低95である場合、その後の突然変異された形態のヒト受容体は該ヒト受容体の第一の突然変異に同等であるとみなされる。理想的には、また、構成的活性化を達成するための本明細書に開示される最も好ましいカセットはGPCRの内在性の形態と非内在性の形態との間の単一のアミノ酸および/もしくはコドンの変化を包含するという事実のために、配列の相同性のパーセントは最低98であるべきである。非オーファン受容体は、内在性の天然に存在するリガンドに特異的な内在性の天然に存在する分子を意味し、ここで、受容体へのリガンドの結合が細胞内シグナル伝達経路を活性化する。オーファン受容体は、その受容体に特異的な内在性リガンドが同定されていないかもしくは未知である内在性受容体を意味する。製薬学的組成物は最低1種の有効成分を含んで成る組成物を意味し、それにより該組成物は哺乳動物例えば、そして制限でなくヒトにおける特定の効能のある結果についての検討に基づいて分析できる。当業者は、ある有効成分が当業者のニーズに基づき所望の効能のある結果を有するかどうかを決定するのに適切な技術を理解かつ認識するであろう。プラスミドはベクターおよびcDNAの組み合わせを意味する。一般に、プラスミドは、cDNAの複製および/もしくはそのタンパク質としての発現の目的上、宿主細胞に導入される。応答という用語に関係した刺激するもしくは刺激することは、化合物の非存在下と対照的に化合物の存在下で応答が増大されることを意味する。cDNAに関してのベクターは、最低1個のcDNAを組み込むことが可能かつ宿主細胞への組み込みが可能な環状DNAを意味する。以下のセクションの階層は表象的な効能について示され、また、後に続く開示もしくは請求の範囲に対する制限として意図されず、またそのように解釈されるべきでもない。A.緒言受容体の伝統的な研究は、発見が受容体に影響を及ぼす可能性のあるアンタゴニストおよび他の分子を見出すよう進めることができる前に、内在性リガンドを最初に同定しなければならないという歴史的に基づく演繹的仮定から常に進められてきた。アンタゴニストを最初に知ることができた場合であっても、内在性リガンドを探すように研究が直ちに拡大されてきた。この思考様式は、構成的に活性化される受容体の発見の後でさえ、受容体の研究で持続してきた。これまで認識されていなかったことは、受容体のアゴニスト、部分的アゴニストおよび反作用薬の発見に最も有用であるのは活性状態の受容体であるということである。過度に活性の受容体もしくは過小活性の受容体から生じる疾患に対して、治療薬で望まれるものは、必ずしも内在性リガンドに対するアンタゴニストである薬物でなく、それぞれ、受容体の活性状態を低下させるもしくは受容体の活性を高めるよう作用する化合物である。これは、活性の受容体状態の活性を低下させるもしくは高める化合物は内在性リガンドと同一の部位で結合する必要がないためである。従って、本発明の方法により教示されるとおり、治療的化合物についてのいかなる研究も、リガンドに依存しない活性状態に対して化合物をスクリーニングすることにより開始すべきである。B.ヒトGPCRの同定ヒトゲノムプロジェクトの努力の成果は、ヒトゲノム内に配置されている核酸配列に関する夥しい量の情報の同定につながり;それは、いずれかの特定のゲノム配列がヒトタンパク質を翻訳する読取り枠情報を含有するもしくは含有するかも知れないかどうかに関する理解もしくは認識を伴わずに、遺伝子配列情報が利用可能にされているというこの努力において真実である。ヒトゲノム内の核酸配列のいくつかの同定方法は当業者の範囲内にある。例えば、そして制限でなく、本明細書で開示される多様なヒトGPCRは、ジェンバンク[GenBank]商標データベースを再検討することにより発見された一方、他のGPCRは、既に配列決定されたGPCRの核酸配列を利用してESTデータベースのBLAST商標検索を実施することにより発見された。下の表Bは、GPCRのそれぞれの相同受容体と一緒に、われわれが発見した数種の内在性GPCRを列挙する。受容体の相同性は、人体内での受容体の役割の正しい認識を得ることに関して有用である。本特許明細書が進めるように、われわれは、これらの受容体の非内在性で構成的に活性化される変種を確立するようにこれらの受容体を突然変異するための技術を開示するであろう。本明細書に開示される技術は、本特許明細書が進行するに従って明らかになるであろうように、技術既知の他のヒトのオーファンGPCRにもまた適用されている。C.受容体スクリーニング本明細書に開示される、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトGPCRに対する候補化合物のスクリーニングは、受容体の内在性リガンドの使用を必要とすることなく、この細胞表面受容体で作用する候補化合物の直接の同定を許す。本明細書に開示される内在性の変種ヒトGPCRが発現および/もしくは過剰発現されている身体内の領域を決定することにより、受容体の発現および/もしくは過剰発現を伴う関連疾患/障害状態を決定することが可能であり;こうした一アプローチを本特許明細書で開示する。本明細書に開示されるヒトGPCRの構成的活性化を明示することができる突然変異の創製に関して、GPCRのTM6内に配置されると想定されているプロリン残基からの距離に基づき;このアルゴリズム技術は、引用により本明細書に組み込まれる同時係属中かつ共通に譲渡される特許明細書米国第09/170,496号に開示されている。該アルゴリズム技術は、伝統的な配列の整列ではなく、しかしむしろ前述のTM6のプロリン残基からの指定された距離に基づく。思うに受容体のIC3領域中に配置されるこの残基から16アミノ酸残基に配置されるアミノ酸残基を最も好ましくはリシン残基に突然変異することにより、こうした活性化を得てよい。この目的を達成するためにはこの位置の突然変異で他のアミノ酸残基が有用であるかも知れない。D.疾患/障害の同定および/もしくは選択下により詳細に示されるであろうとおり、最も好ましくは非内在性で、構成的に活性化されるGPCRに対する反作用薬を本発明の方法論により同定することができる。こうした反作用薬は、本受容体に関連する疾患治療のための薬物発見プログラムでのリード化合物として理想的な候補である。GPCRに対する反作用薬を直接同定してそれにより製薬学的組成物の開発を可能にする能力のため、GPCRに関連する疾患および障害の研究が適切である。例えば、GPCRの存在について疾患に罹った組織サンプルおよび正常な組織サンプルの双方を走査することは、今や、学究的修練、もしくは特定のGPCRに対する内在性リガンドを同定する途に沿って追跡することができるもの以上となっている。組織の走査は広範な健康なおよび疾患に罹った組織にわたって実施することができる。こうした組織の走査は、特定の受容体のある疾患および/もしくは障害との関連付けの好ましい第一段階を提供する。例えば、本明細書に開示されるGPCRのいくつかの例示的ドットブロットおよびRT-PCRの結果については、同時係属中の出願処理予定表番号ARE-0050を参照されたい。好ましくは、a組織mRNAに対するドットブロット分析、および/もしくはb組織サンプルでの受容体の発現のRT-PCR同定のためのプローブを作成するのにヒトGPCRのDNA配列を使用する。組織供給源、もしくは疾患に罹った組織中での受容体の存在、または正常組織に比較して疾患に罹った組織中での上昇された濃度での受容体の存在は、限定されるものでないがその疾患に関連する疾患を挙げることができる治療レジメンとの相関を同定するのに好ましく利用することができる。受容体はこの技術により器官の領域に等しく十分に局在化する可能性がある。受容体が局在化されている特定の組織の既知の機能に基づき、受容体の推定の機能上の役割を推定することができる。E.候補化合物のスクリーニング1.包括的GPCRスクリーニングアッセイの技術Gタンパク質受容体が構成的に活性になった場合、それはGタンパク質例えばGq、Gs、Gi、Gz、Goに結合しかつGタンパク質へのGTPの結合を刺激する。その後、Gタンパク質がGTPアーゼとして作用し、そしてGTPをGDPにゆっくりと加水分解し、それにより受容体は正常条件下で失活したようになる。しかしながら、構成的に活性化された受容体はGDPをGTPに交換し続ける。構成的に活性化される受容体を発現する膜への高められた結合をモニターするのに、GTPの加水分解不可能な類似物[35S]GTPγSを使用することができる。[35S]GTPγSはリガンドの非存在下および存在下での膜へのGタンパク質の共役をモニターするのに使用することができることが報告されている。このモニタリングの一例、なかんずく当業者に公知かつ利用可能な例は、1995年にトレイノルTraynorとナホルスキNahorskiにより報告された。本アッセイ系の好ましい使用は候補化合物の初期スクリーニングのためである。なぜなら、該系は、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のGタンパク質に関係なく、全部のGタンパク質共役型受容体に包括的に応用可能であるからである。2.特異的GPCRスクリーニングアッセイの技術包括的Gタンパク質共役型受容体アッセイすなわちアゴニスト、部分的アゴニストもしくは反作用薬である化合物を選択するためのアッセイを使用して候補化合物が同定されれば、該化合物が受容体部位で相互作用していることを確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、包括的アッセイにより同定された化合物は受容体に結合しないかも知れないが、しかし代わりに細胞内ドメインからGタンパク質を単に分離するかも知れない。a.Gs、GzおよびGiGsは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方、GiならびにGzおよびGoはこの酵素を阻害する。アデニリルシクラーゼはATPのcAMPへの転化を触媒し;従って、Gsタンパク質を共役する構成的に活性化されたGPCRは、cAMPの増大された細胞レベルと関連する。他方、GiもしくはGz、Goタンパク質を共役する構成的に活性化されたGPCRは、cAMPの低下された細胞レベルと関連する。一般に、IndirectMechanismsofSynapticTransmission,第8章、FromNeuronToBrain第3版ニコルスNichols,J.G.ら編サイナウアアソシエーツインクSinauerAssociates,Inc.1992を参照されたい。従って、cAMPを検出するアッセイを利用して、ある候補化合物が例えば受容体に対する反作用薬すなわちこうした化合物はcAMPのレベルを低下させることができるであるかどうかを決定することができる。cAMPを測定するための当該技術分野で既知の多様なアプローチを利用することができ;最も好ましいアプローチはELISAに基づく形式での抗cAMP抗体の使用に頼る。利用することができる別の型のアッセイは全細胞セカンドメッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子のプロモーターは特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を司る。環状AMPは、cAMP応答性のDNA結合タンパク質もしくは転写因子CREBその後cAMP応答要素と呼ばれる特定の部位でプロモーターに結合しそして遺伝子の発現を司るの結合を促進することにより遺伝子発現を司る。レポーター遺伝子例えばβ-ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼの前に複数のcAMP応答要素を含有するプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。従って、構成的に活性化されたGsに結合された受容体は、cAMPの蓄積を引き起こし、これがその後遺伝子およびレポータータンパク質の発現を活性化する。その後、標準的な生化学的アッセイを使用して、β-ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検出することができるチェンChenら1995。b.GoおよびGqGqおよびGoは酵素ホスホリパーゼCの活性化に関連し、この酵素は順にリン脂質PIP2を加水分解して、2種の細胞内メッセンジャー、すなわちジアシルグリセロールDAGおよびイノシトール1,4,5-三リン酸IP3を放出する。IP3の増大された蓄積はGqおよびGo会合型受容体の活性化と関連する。一般に、IndirectMechanismsofSynapticTransmission,第8章、FromNeuronToBrain第3版ニコルスNichols,J.G.ら編サイナウアアソシエーツインクSinauerAssociates,Inc.1992を参照されたい。IP3の蓄積を検出するアッセイは、候補化合物が例えばGqもしくはGo会合型受容体に対する反作用薬であるすなわちこうした化合物はIP3のレベルを低下させることができるかどうかを決定するのに利用することができる。Gq会合型受容体はAP1レポーターアッセイここでGq依存性のホスホリパーゼCがAP1要素を含有する遺伝子の活性化を引き起こすを使用してもまた検査することができ;従って、活性化されたGq会合型受容体は、こうした遺伝子の発現の増大を明示することができ、それにより、それに対する反作用薬はこうした発現の減少を明示することができ、また、アゴニストはこうした発現の増大を明示することができる。こうした検出のための商業的に入手可能なアッセイが利用可能である。3.GPCR融合タンパク質反作用薬、アゴニストおよび部分的アゴニストの直接の同定のための候補化合物のスクリーニングでの使用のための内在性で、構成的に活性化されるオーファンGPCRもしくは非内在性で、構成的に活性化されるオーファンGPCRの使用は興味深いスクリーニングの挑戦を提供し、ここでは当然、それに結合される内在性リガンドの非存在下でさえ該受容体は活性である。従って、こうした化合物が反作用薬、アゴニスト、部分的アゴニストであることができるかどうか、もしくはこうした受容体に対する影響を有することができるかどうかに関しての理解を許すこうした識別の目的をもって、例えば候補化合物の存在下の非内在性受容体とその化合物の非存在下の非内在性受容体とを識別するために、こうした識別を高める可能性のあるアプローチを利用することが好ましい。好ましい一アプローチはGPCR融合タンパク質の使用である。一般に、非内在性のオーファンGPCRが上で示されたアッセイ技術ならびに他者を使用して構成的に活性化されていることを決定すれば、内在性GPCRと共役する優勢なGタンパク質を決定することが可能である。GPCRへのGタンパク質の共役はシグナル伝達経路を提供し、これは評価することが可能である。哺乳動物発現系の使用によりスクリーニングが行われることが最も好ましいため、こうした系はその中に内在性Gタンパク質を有することが期待されよう。従って、当然、こうした系においては、非内在性の構成的に活性化されたオーファンGPCRが連続的にシグナルを発するであろう。この点に関して、例えば受容体に対する反作用薬の存在下で、とりわけスクリーニングに関してそれが反作用薬と接触される場合にそれが受容体をより容易に識別することが可能であろうことがよりありそうであるように、このシグナルを高めることが好ましい。GPCR融合タンパク質は、非内在性GPCRと共役するGタンパク質の効能を高めることを意図している。GPCR融合タンパク質は非内在性の構成的に活性化されたGPCRを用いるスクリーニングに好ましい。なぜなら、こうしたアプローチは、こうしたスクリーニング技術で最も好ましく利用されるシグナルを増大させるからである。これは大きなS/N比の助長で重要であり;こうした大きな比は本明細書で開示されるような候補化合物のスクリーニングに重要かつ好ましい。GPCR融合タンパク質の発現に有用な構築物の構築は当業者の範囲内にある。商業的に入手可能な発現ベクターおよび系が、研究者の特定のニーズに合う可能性のある多様なアプローチを提供する。こうしたGPCR融合タンパク質構築物に対する重要な基準は、内在性のGPCR配列およびGタンパク質配列の双方が同じ読み枠にある好ましくは内在性GPCRの配列はGタンパク質配列の上流であること、および、GPCRの発現に際してGタンパク質もまた発現することが可能であるようにGPCRの終止コドンを欠失もしくは置き換えなくてはならないことである。GPCRはGタンパク質に直接連結することができるか、もしくは2者の間にスペーサー残基好ましくは約12を越えないが、この数字は当業者により容易に確かめることが可能であるが存在することができる。われわれは、使用されないいくつかの制限部位が発現に際して効果的にスペーサーとなるであろうことに、スペーサーの使用が便宜性に基づくと好ましい。最も好ましくは、GPCR融合タンパク質構築物の創製に先立ち非内在性GPCRに共役するGタンパク質を同定することができる。同定された数種のGタンパク質が存在するにすぎないため、その中の内在性のGPCR配列の挿入にGタンパク質の配列を含んで成る構築物すなわち普遍的Gタンパク質構築物が利用可能であることが好ましく;これは、異なる配列を有する多様な異なった内在性GPCRの大スケールのスクリーニングにおいて効率を提供する。上に示されたとおり、Gi、GzおよびGoに共役する構成的に活性化されるGPCRは、これらの型のGPCRに基づくアッセイを挑戦的にするcAMPの形成を阻害すると期待されるすなわち、cAMPシグナルは活性化に際して減少し、従って例えばこのシグナルをさらに減少させることができる反作用薬の直接の同定を興味深いものとする。本明細書に開示されるであろうとおり、われわれは、実現可能なシクラーゼに基づくアッセイを確立する努力において、これらの型の受容体について内在性のGPCRの内在性のGタンパク質に基づかないGPCR融合タンパク質を創製することが可能であることを確かめた。従って、例えば、H9のようなGz共役型受容体、Gs融合タンパク質を利用するGPCR融合タンパク質を確立することが可能である。われわれは、こうした融合構築物は、発現に際して非内在性のGPCRが例えば天然のGzタンパク質よりもむしろGsと共役することを誘導もしくは強要し、その結果シクラーゼに基づくアッセイを確立することが可能であると考える。従って、Gi、GzおよびGo共役型受容体について、われわれは、GPCR融合タンパク質を使用しかつアッセイがアデニルシクラーゼ活性の検出に基づく場合は、Gsもしくは酵素アデニリルシクラーゼの形成を刺激する同等のGタンパク質を用いて融合構築物を確立することを好む。F.医薬品化学一般にしかし常にでなく、候補化合物の直接の同定はコンビナトリアル化学の技術を介して生成される化合物に関連して好ましく実施され、それにより何千もの化合物がこうした分析のため無作為に調製される。一般に、こうしたスクリーニングの結果は独特のコア構造を有する化合物であることができ;その後、これらの化合物は、その医薬特性をさらに高めるため、好ましいコア構造1種もしくは複数を取り巻く付加的な化学的改変に好ましくかけられる。こうした技術は当業者に既知でありかつ本特許明細書で詳細に取り扱わないであろう。G.製薬学的組成物さらなる開発に選択された候補化合物は、当業者に公知の技術を使用して製薬学的組成物に処方することができる。適する製薬学的に許容できる担体は当業者に利用可能であり;例えば、Remingtons’sPharmaceuticalSciences、第16版、1980、マックパブリッシングカンパニーMackPublishingCo.オスロOsloら編を参照されたい。H.他の利用性本明細書に開示される非内在性の変種ヒトGPCRの好ましい使用は、好ましくは製薬学的作用物質としての使用のための反作用薬、アゴニストもしくは部分的アゴニストとしての候補化合物の直接の同定のためのものであることができるが、これらの変種ヒトGPCRはまた研究の設定でも利用することができる。例えば、GPCRを組み込むインビトロおよびインビボの系は、正常のおよび疾患に罹った双方のヒトの状態でこれらの受容体が演じる役割をさらに解明かつ理解するため、ならびに構成的活性化の役割の理解それがシグナル伝達カスケードの理解に適用されるために利用することができる。非内在性のヒトGPCRの価値は、そのための内在性リガンドが同定される前に人体でのこれらの受容体の役割を理解するのに、それらの独特の特徴のため非内在性のヒトGPCRを使用することができることにおいて、研究ツールとしてのそれらの利用性が高められることである。開示される受容体の他の用途は、とりわけ本特許明細書の検討に基づき当業者に明らかとなるであろう。以下の実施例は本発明の解明の目的上そして制限でなく提示する。本明細書で特定の核酸およびアミノ酸の配列が開示される一方、当業者は、下に報告される同一のもしくは実質的に類似の結果を達成しつつこれらの配列に対する小さな改変を行う能力があると信じられる。1配列から別のものまで例えばラット受容体からヒト受容体まで、もしくはヒト受容体Aからヒト受容体Bまでの配列カセットの応用もしくは理解への伝統的アプローチは、配列整列の技術それにより配列は共通の領域を決定する活動で整列されるに一般に基づく。本明細書に開示される突然変異のアプローチはこのアプローチに頼らないが、しかし、代わりにアルゴリズムのアプローチ、およびヒトGPCRのTM6領域内に配置される保存されたプロリン残基からの位置上の距離に基づく。このアプローチが確実にされれば、当業者は、それに対して小さな変更を行って本明細書に開示される実質的に同一の結果すなわち構成的活性化を達成する能力があると信じられる。こうした改変されたアプローチは本開示の範囲内と考えられる。実施例1内在性のヒトGPCR1.ヒトGPCRの同定ジェンバンク[GenBank]商標データベース情報の再検討に基づき、開示された内在性ヒトGPCRのあるものを同定した。データベースを検索する間に以下のcDNAクローンを下に明示されるとおり同定した表C。他の開示された内在性ヒトGPCRは、以下のESTクローンをクエリ配列として使用するESTデータベースdbestのBLAST商標検索を実施することにより同定した。その後、同定された以下のESTクローンをプローブとして使用して、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした表D。2.完全長のクローニングA.ヒトG2AマウスESTクローン1179426を使用して、3種のアミノ酸G2Aコーディング配列を除く全部を含有するヒトゲノムクローンを得た。このコーディング配列の5’は5’RACEを使用することにより得、また、PCRのための鋳型はクロンテックClontechのヒト脾マラソン-レディ[Marathon-Ready]商標cDNAであった。開示されるヒトG2Aは、以下:5’-CTGTGTACAGCAGTTCGCAGAGTG-3’配列番号41;1回目のPCR5’-GAGTGCCAGGCAGAGCAGGTAGAC-3’配列番号42;2回目のPCRのような配列番号41および配列番号42に示されるような第一回および第二回のPCRのためのG2AのcDNAに特異的なプライマーを使用するPCRにより増幅した。PCRは、94°C30秒間、次いで94°C5秒間および72°C4分間の5周期;ならびに94°5秒間および70°4分間の30周期で、アドバンテージAdvantageGCポリメラーゼキットクロンテックClontech;製造説明書に従うことができるを使用して実施した。およそ1.3kbのPCRフラグメントをアガロースゲルから精製し、HindIIIおよびXbaIで消化し、そして発現ベクターpRC/CMV2インヴィトロジェンInvitrogenにクローン化した。T7シークェナーゼ[Sequenase]商標キットUSBアマーシャムUSBAmersham;製造元の説明書が従われたを使用してクローン化された挿入物を配列決定し、そして提示された配列と配列を比較した。P32標識されたフラグメントを用いてRNAドットブロットクロンテックClontech;製造元の説明書が従われたをプロービングすることによりヒトG2Aの発現を検出した。b.CHN9ESTクローン1541536の配列決定は、CHN9が1個の開始コドンのみを有するすなわち終止コドンは欠けていた部分的cDNAクローンであることを示した。CHN9をデータベースnrに対してBLAST検索するのに使用した場合、CHN9の3’の配列はロイコトリエンB4受容体のcDNAの5’非翻訳領域CHN9のコーディング配列と同じ読み枠に終止コドンを含有したに100相同であった。LTB4RのcDNAの5’非翻訳領域がCHN9の3’配列であったかどうかを決定するために、CHN9に見出される開始コドンに隣接する5’配列およびLTB4Rの5’非翻訳領域に見出される終止コドンを取り巻く3’配列に基づくプライマーを使用してPCRを実施した。利用された5’プライマー配列は以下のとおりであった:5’-CCCGAATTCCTGCTTGCTCCCAGCTTGGCCC-3’配列番号43;センスおよび5’-TGTGGATCCTGCTGTCAAAGGTCCCATTCCGG-3’配列番号44;アンチセンス製造元により供給される緩衝液系、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各4種のヌクレオチドとともに鋳型としての胸腺cDNAおよびrTthポリメラーゼパーキンエルマーPerkinElmerを使用してPCRを実施した。周期条件は、94°C1分間、65°C1分間ならびに72°C1分および10秒間の30周期であった。予測された大きさと一致する1.1kbのフラグメントをPCRから得た。本PCRフラグメントをpCMVにサブクローニングし下を参照されたいそして配列決定した配列番号35を参照されたい。c.RUP4鋳型としてヒト脳cDNAクロンテックClontechを用いるRT-PCRにより完全長のRUP4をクローン化した:5’-TCACAATGCTAGGTGTGGTC-3’配列番号45;センスおよび5’-TGCATAGACAATGGGATTACAG-3’配列番号46;アンチセンス。以下の周期、すなわち94°C2分間;94°C30秒間;55°C30秒間、72°C45秒間および72°C10分間により、タックプラスプレシジョン[TaqPlasPrecision]商標ポリメラーゼストラタジーンStratagene;製造説明書が従われたを使用してPCRを実施した。周期2から4を30回反復した。PCR産物を1アガロースゲルで分離し、そして500bpのPCRフラグメントを単離しかつpCRII-TOPO商標ベクターインヴィトロジェンInvitrogenにクローン化し、そしてT7DNAシークェナーゼ[Sequenase]商標キットアマーシャムAmershamおよびSP6/T7プライマーストラタジーンStratageneを使用して配列決定した。PCRフラグメントから示される配列分析は、実際に、他のGPCRとの類似性をもつ1個の連続的読取り枠を有する、代替スプライシングされた形態のAI307658であった。このPCRフラグメントの完了された配列は以下のとおりであった:上の配列に基づき、2種のセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組:5’-CTGCTTAGAAGAGTGGACCAG-3’配列番号48;オリゴ1、5’-CTGTGCACCAGAAGATCTACAC-3’配列番号49;オリゴ2および2種のアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組:5’-CAAGGATGAAGGTGGTGTAGA-3’配列番号50;オリゴ35’-GTGTAGATCTTCTGGTGCACAGG-3’配列番号51;オリゴ4を、製造元の説明書に従って鋳型としてヒト脳マラソン-レディ[Marathon-Ready]商標cDNAクロンテックClontech、カタログ番号7400-1を用いる3’-および5’-RACEPCRに使用した。RACEPCRにより生成されたDNAフラグメントをpCRII-TOPO商標ベクターインヴィトロジェンInvitrogenにクローン化し、そしてSP6/T7プライマーストラタジーンStratageneおよび数種の内的プライマーを使用して配列決定した。3’RACE産物はポリAテールおよびTAA終止コドンで終了する1個の完了される読取り枠を含有した。5’RACE産物は不完全な5’末端を含有したすなわちATG開始コドンが存在しなかった。新たな5’配列に基づき、オリゴ3および以下のプライマー:5’-GCAATGCAGGTCATAGTGAGC-3’配列番号52;オリゴ5を第2回の5’racePCRに使用し、そしてPCR産物を上のとおり分析した。第3回の5’racePCRは、アンチセンスプライマー:5’-TGGAGCATGGTGACGGGAATGCAGAAG-3’配列番号53;オリゴ6および5’-GTGATGAGCAGGTCACTGAGCGCCAAG-3’配列番号54;オリゴ7を利用して実施した。5’RACEPCRの産物の配列は開始コドンATGの存在を示し、また、さらなる回の5’racePCRはいかなるそれ以上の5’配列も生成しなかった。プライマーとして、センスプライマー5’-GCAATGCAGGCGCTTAACATTAC-3’配列番号55;オリゴ8およびオリゴ4を使用するRT-PCR、ならびにヒト脳および心のcDNA鋳型クロンテックClontech、カタログ番号7404-1から生成された650bpのPCR産物の配列分析により、完了された5’配列を確認した。オリゴ2および以下のアンチセンスプライマー:5’-TTGGGTTACAATCTGAAGGGCA-3’配列番号56;オリゴ9を使用するRT-PCR、ならびにヒト脳および心のcDNA鋳型クロンテックClontech、カタログ番号7404-1から生成された670bpのPCR産物の配列分析により、完了された3’配列を確認した。d.RUP5以下の配列:5’-ACTCCGTGTCCAGCAGGACTCTG-3’配列番号575’-TGCGTGTTCCTGGACCCTCACGTG-3’配列番号58を有した、ATG開始コドンから上流のセンスプライマー配列番号57、および終止コドンとしてTCAを含有するアンチセンスプライマー配列番号58、ならびに鋳型としてヒト末梢白血球cDNAクロンテックClontechを使用するRT-PCRにより完全長のRUP5をクローン化した。段階2から段階4が30回反復された以下の周期、すなわち94°C30秒間;94°C15秒間;69°C40秒間;72°C3分間;および72°C6分間による50μlの反応中での増幅にアドバンテージ[Advantage]商標cDNAポリメラーゼクロンテックClontechを使用した。1.4kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII-TOPO商標ベクターインヴィトロジェンInvitrogenを用いてクローン化し、そしてT7DNAシークェナーゼ[Sequenase]商標キットアマーシャムAmershamを使用して完全に配列決定した。配列番号9を参照されたい。e.RUP6プライマー:5’-CAGGCCTTGGATTTTAATGTCAGGGATGG-3’配列番号59および5’-GGAGAGTCAGCTCTGAAAGAATTCAGG-3’配列番号60ならびに鋳型としてヒト胸腺マラソン-レディ[Marathon-Ready]商標cDNAクロンテックClontechを使用するRT-PCRにより完全長のRUP6をクローン化した。以下の周期、すなわち94°C30秒間;94°C5秒間;66°C40秒間;72°C2.5秒間および72°C7分間による50μl反応中での増幅にアドバンテージAdvantagecDNAポリメラーゼクロンテックClontech、製造元の説明書に従うを使用した。周期2から4を30回反復した。1.3kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII-TOPO[商標]ベクターインヴィトロジェンInvitrogenにクローン化し、そしてABIビッグダイターミネーター[BigDyeTerminator]商標キットP.E.バイオシステムP.E.Biosystemを使用して完全に配列決定した配列番号11を参照されたい。f.RUP7プライマー:5’-TGATGTGATGCCAGATACTAATAGCAC-3’配列番号61;センスおよび5’-CCTGATTCATTTAGGTGAGATTGAGAC-3’配列番号62;アンチセンスならびに鋳型としてヒト末梢白血球cDNAクロンテックClontechを使用するRT-PCRにより完全長のRUP7をクローン化した。段階2ないし段階4が30回反復された以下の周期、すなわち94°C2分間;94°C15秒間;60°C20秒間;72°C2分間;72°C10分間による50μl反応中での増幅にアドバンテージ[Advantage]商標cDNAポリメラーゼクロンテックClontechを使用した。1.25kbのPCRフラグメントを単離し、そしてpCRII-TOPO商標ベクターインヴィトロジェンInvitrogenにクローン化し、そしてABIビッグダイターミネーター[BigDyeTerminator]商標キットP.E.バイオシステムP.E.Biosystemを使用して完全に配列決定した。配列番号13を参照されたい。3.アンジオテンシンIIタイプ1受容体AT1製造元により供給される緩衝液系、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各4種のヌクレオチドとともに鋳型としてのゲノムDNAおよびrTthポリメラーゼパーキンエルマーPerkinElmerを使用するPCRにより、内在性のヒトアンジオテンシンIIタイプ1受容体AT1を得た。周期条件は、94°C1分間、55°C1分間および72°C1.5分間の30周期であった。5’PCRプライマーは、配列:5’-CCCAAGCTTCCCCAGGTGTATTTGAT-3’配列番号63とともにHindIII部位を含有し、そして3’プライマーは以下の配列:5’-GTTGGATCCACATAATGCATTTTCTC-3’配列番号64とともにBamHI部位を含有する。生じる1.3kbのPCRフラグメントをHindIIIおよびBamHIで消化し、そしてpCMV発現ベクターのHindIII-BamHI部位にクローン化した。cDNAクローンを完全に配列決定した。その後、ヒトAT1の核酸配列番号65およびアミノ酸配列番号66の配列を決定しかつ確かめた。4.GPR38GPR38を得るため、製造元により供給される緩衝液系、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各4種のヌクレオチドとともに鋳型としてのヒトゲノムcDNAおよびrTthポリメラーゼパーキンエルマーPerkinElmerを使用して、2種のPCRフラグメントを組み合わせることによりPCRを実施した。各PCR反応の周期条件は94°C1分間、62°C1分間および72°C2分間の30周期であった。第一のフラグメントは、以下の配列:5’-ACCATGGGCAGCCCCTGGAACGGCAGC-3’配列番号67を伴う端部位を含有した5’PCRプライマー、および以下の配列:5’-AGAACCACCACCAGCAGGACGCGGACGGTCTGCCGGTGG-3’配列番号68を有する3’プライマーを用いて増幅した。第二のPCRフラグメントは、以下の配列:5’-GTCCGCGTCCTGCTGGTGGTGGTTCTGGCATTTATAATT-3’配列番号69を有する5’プライマー、ならびにBamHI部位を含有しかつ以下の配列:5’-CCTGGATCCTTATCCCATCGTCTTCACGTTAGC-3’配列番号70を有する3’プライマーを用いて増幅した。配列番号67および配列番号70をプライマーとして使用して上に示された周期条件を使用する、2種のフラグメントを鋳型として使用してGPR38を増幅した。生じる1.44kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、そしてpCMV発現ベクターの平滑BamHI部位にクローン化した。5.MC4MC4を得るため、製造元により供給される緩衝液系、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各4種のヌクレオチドとともに鋳型としてのヒトゲノムcDNAおよびrTthポリメラーゼパーキンエルマーPerkinElmerを使用してPCRを実施した。各PCR反応の周期条件は94°C1分間、54°C1分間および72°C1.5分間の30周期であった。5’PCRは配列:5’-CTGGAATTCTCCTGCCAGCATGGTGA-3’配列番号71とともにEcoRI部位を含有し、そして3’プライマーは配列:5’-GCAGGATCCTATATTGCGTGCTCTGTCCCC-3’配列番号72とともにBamHI部位を含有した。1.0kbのPCRフラグメントをEcoRIおよびBamHIで消化し、そしてpCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位にクローン化した。その後、ヒトMC4の核酸配列番号73およびアミノ酸配列番号74の配列を決定した。6.CCKBCCKBを得るため、製造元により供給される緩衝液系、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各4種のヌクレオチドとともに鋳型としてのヒト胃cDNAおよびrTthポリメラーゼパーキンエルマーPerkinElmerを使用してPCRを実施した。各PCR反応の周期条件は94°C1分間、65°C1分間ならびに72°C1分および30秒間の30周期であった。5’PCRは配列:5’-CCGAAGCTTCGAGCTGAGTAAGGCGGCGGGCT-3’配列番号75とともにHindIII部位を含有し、また、3’プライマーは配列:5’-GTGGAATTCATTTGCCCTGCCTCAACCCCCA-3’配列番号76とともにEcoRI部位を含有した。生じる1.44kbのPCRフラグメントをHindIIIおよびEcoRIで消化し、そしてpCMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位にクローン化した。その後、ヒトCCKBの核酸配列番号77およびアミノ酸配列番号78の配列を決定した。7.TDAG8TDAG8を得るため、製造元により供給される緩衝液系、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各4種のヌクレオチドとともに鋳型としてのゲノムDNAおよびrTthポリメラーゼパーキンエルマーPerkinElmerを使用してPCRを実施した。周期条件は94°C1分間、56°C1分間ならびに72°C1分および20秒間の30周期であった。5’PCRプライマーは以下の配列:5’-TGCAAGCTTAAAAAGGAAAAAATGAACAGC-3’配列番号79とともにHindIII部位を含有し、また、3’プライマーは以下の配列:5’-TAAGGATCCCTTCCCTTCAAAACATCCTTG-3’配列番号80とともにBamHI部位を含有した。生じる1.1kbのPCRフラグメントをHindIIIおよびBamHIで消化し、そしてpCMV発現ベクターのHindIII-BamHI部位にクローン化した。配列決定された3種の生じるクローンは、ProからAlaへのアミノ酸43、LysからAsnへのアミノ酸97、およびIleからPheへのアミノ酸130の変化を伴う3種の潜在的多形を含有した。その後、ヒトTDAG8の核酸配列番号81およびアミノ酸配列番号82の配列を決定した。8.H9H9を得るため、製造元により供給される緩衝液系、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各4種のヌクレオチドとともに鋳型としての下垂体cDNAおよびrTthポリメラーゼパーキンエルマーPerkinElmerを使用してPCRを実施した。周期条件は94°C1分間、62°C1分間および72°C2分間の30周期であった。5’PCRプライマーは以下の配列:5’-GGAAAGCTTAACGATCCCCAGGAGCAACAT-3’配列番号15とともにHindIII部位を含有し、また、3’プライマーは以下の配列:5’-CTGGGATCCTACGAGAGCATTTTTCACACAG-3’配列番号16とともにBamHI部位を含有した。生じる1.9kbのPCRフラグメントをHindIIIおよびBamHIで消化し、そしてpCMV発現ベクターのHindIII-BamHI部位にクローン化した。H9は、アミノ酸P320S、S493Nおよびアミノ酸G448Aの変化を伴う3種の潜在的多形を含有した。その後、ヒトH9の核酸配列番号139およびアミノ酸配列番号140の配列を決定しかつ確かめた。実施例2非内在性の構成的に活性化されるGPCRの調製当業者は、核酸配列の突然変異のための技術を選択する能力があると信じられる。上に開示された非内在性の変種数種のヒトGPCRを創製するのに利用されたアプローチを下に提示する。下に開示される突然変異はアルゴリズムのアプローチに基づき、それによりTM6/IC3の界面近くのGPCRのTM6領域に配置される保存されるプロリン残基からのGPCRのIC3領域に配置される16番目のアミノ酸が、最も好ましくはリシンアミノ酸残基に突然変異される。1.トランスフォーマー部位特異的[TransformerSite-Directed]商標突然変異誘発非内在性のヒトGPCRの調製は、製造元の説明書に従い、トランスフォーマー部位特異的[TransformerSite-Directed]商標突然変異誘発キットクロンテックClontechを使用してヒトGPCRで達成することができる。2種の突然変異誘発プライマー、最も好ましくはリシン突然変異を創製するリシン突然変異誘発オリゴヌクレオチド、および選択マーカーオリゴヌクレオチドを利用する。便宜上、ヒトGPCRに組み込まれるべきコドン突然変異を標準的形態でもまた示す表E:指定される配列プライマーを使用して、上の方法に従い、以下のGPCRを突然変異した表F。その後、非内在性のヒトGPCRを配列決定し、また、形成されかつ確かめられた核酸およびアミノ酸の配列を、下に表Gに要約されるとおり、本特許明細書への付随する配列表付録に列挙する:2.非内在性ヒトGPCRの創製のための代替アプローチa.AT11.F239K突然変異F239突然変異核酸配列について配列番号89、およびアミノ酸配列について配列番号90を参照されたいを創製することにより、非内在性の構成的に活性化されるヒトAT1受容体の調製を達成した。突然変異誘発は、製造元の説明書に従い、トランスフォーマー部位特異的突然変異誘発[TransformerSite-DirectedMutagenesis]商標キットクロンテックClontechを使用して実施した。2種の突然変異誘発プライマー、リシン突然変異誘発オリゴヌクレオチド配列番号91および選択マーカーオリゴヌクレオチド配列番号92を使用した。これらはそれぞれ以下の配列を有した:5’-CCAAGAAATGATGATATTAAAAAGATAATTATGGC-3’配列番号915’-CTCCTTCGGTCCTCCTATCGTTGTCAGAAGT-3’配列番号922.N111A突然変異非内在性のヒトAT1受容体の調製もまた、N111A突然変異核酸配列について配列番号93、およびアミノ酸配列について配列番号94を参照されたいを創製することにより達成した。10DMSO、0.25μMの各プライマー、および0.5mMの各4種のヌクレオチドを補充された、製造元により提供される緩衝液系を用いてpfuポリメラーゼストラタジーンStratageneを使用して、2回のPCR反応を実施した。使用された5’PCRのセンスプライマーは以下の配列:5’-CCCAAGCTTCCCCAGGTGTATTTGAT-3’配列番号95を有し、また、アンチセンスプライマーは以下の配列:5’-CCTGCAGGCGAAACTGACTCTGGCTGAAG-3’配列番号96を有した。生じる400bpのPCRフラグメントをHindIII部位で消化し、そしてpCMVベクターのHindIII-SmaI部位にサブクローニングした5’構築物。使用された3’PCRのセンスプライマーは以下の配列:5’-CTGTACGCTAGTGTGTTTCTACTCACGTGTCTCAGCATTGAT-3’配列番号97を有し、また、アンチセンスプライマーは以下の配列:5’-GTTGGATCCACATAATGCATTTTCTC-3’配列番号98を有した。生じる880bpのPCRフラグメントをBamHIで消化し、そして5’構築物のPstT4ポリメラーゼにより平滑化されたおよびBamHI部位に挿入して完全長のN111A構築物を生成した。周期条件は、94°C1分間、60°C1分間および72°C1分間5’PCRもしくは1.5分間3’PCRの25周期であった。3.AT2K255IC3突然変異AT2K255IC3のドメインスワップ突然変異核酸配列について配列番号99を、およびアミノ酸配列について配列番号100を参照されたいを創製することにより、非内在性の構成的に活性化されるヒトAT1の調製を達成した。AT1のIC3に隣接する制限部位を生成させて、アンジオテンシンIIタイプ2受容体AT2からの対応するIC3でのIC3の置き換えを助長した。これは2回のPCR反応を実施することにより達成した。センスプライマーとして配列番号63を、およびアンチセンスプライマーとして以下の配列:5’-TCCGAATTCCAAAATAACTTGTAAGAATGATCAGAAA-3’配列番号101を利用することにより、5’非翻訳領域からIC3の開始までをコードする5’PCRフラグメントフラグメントAを生成させた。センスプライマーとして以下の配列:5’-AGATCTTAAGAAGATAATTATGGCAATTGTGCT-3’配列番号102およびアンチセンスプライマーとして配列番号64を使用することにより、IC3の終了から3’非翻訳領域までをコードする3’PCRフラグメントフラグメントBを生成させた。PCR条件は、10DMSO、0.25μMの各プライマーおよび0.5mMの各4種のヌクレオチドを補充された、製造元により供給される緩衝液系を用いて、鋳型としての内在性のAT1cDNAクローンおよびpfuポリメラーゼストラタジーンStratageneを使用して、94°C1分間、55°C1分間および72°C1.5分間の30周期であった。フラグメントA720bpをHindIIIおよびEcoRIで消化しそしてサブクローニングした。フラグメントBはBamHIで消化し、そしてクローン化されたPCRフラグメントの5’にEcoRI部位をもつpCMVベクターにサブクローニングした。以下の配列:5’AATTCGAAAACACTTACTGAAGACGAATAGCTATGGGAAGAACAGGATAACCCGTGACCAAG-3’センス;配列番号1035’TTAACTTGGTCACGGGTTATCCTGTTCTTCCCATAGCTATTCGTCTTCAGTAAGTGTTTTCG-3’アンチセンス;配列番号104を有する2種の合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、L255K突然変異を伴いAT2のIC3をコードしそして5’にEcoRI付着端および3’にAfIII付着端を含有するDNAフラグメントフラグメントCを生成させた。フラグメントCを、EcoRIおよびAfIII部位によりフラグメントBの前に挿入した。その後、生じるクローンをEcoRI部位によりフラグメントAと連結して、AT2K255IC3をもつAT1を生成させた。4.A243突然変異A243突然変異核酸配列について配列番号105、およびアミノ酸配列について配列番号106を参照されたいを創製することにより、非内在性のヒトAT1受容体の調製もまた達成した。A243突然変異は以下のPCRに基づく戦略を使用して構築した。すなわち、10DMSO、0.25μMの各プライマーおよび0.5mMの各4種のヌクレオチドを補充された、製造元により提供される緩衝液系とともにpfuポリメラーゼストラタジーンStratageneを使用して2回のPCR反応を実施した。利用された5’PCRのセンスプライマーは以下の配列:5’-CCCAAGCTTCCCCAGGTGTATTTGAT-3’配列番号107を有し、また、アンチセンスプライマーは以下の配列:5’-AAGCACAATTGCTGCATAATTATCTTAAAAATATCATC-3’配列番号108を有した。利用された3’PCRのセンスプライマーは、Ala挿入を含有する以下の配列:5’-AAGATAATTATGGCAGCAATTGTGCTTTTCTTTTTCTTT-3’配列番号109そしてアンチセンスプライマー:5’-GTTGGATCCACATAATGCATTTTCTC-3’配列番号110を有した。周期条件は、94°C1分間、54°C1分間および72°C1.5分間の25周期であった。その後、5’および3’のPCRのアリコートを共鋳型として使用して、5’PCRのセンスプライマーおよび3’PCRのアンチセンスプライマーを使用する二次的PCRを実施した。PCR条件は、伸長時間が2.5分であったことを除き一次PCRと同一であった。生じるPCRフラグメントをHindIIIおよびBamHIで消化し、そしてpCMVベクターにサブクローニングした配列番号105を参照されたい。4.CCKBV322K突然変異核酸配列について配列番号111、およびアミノ酸配列について配列番号112を参照されたいを創製することにより、非内在性の構成的に活性化されるヒトCCKB受容体の調製を達成した。突然変異誘発は、実施例1からの野性型CCKBを使用する増幅を介してPCRにより実施した。配列番号75、およびV322K突然変異を含んで成るアンチセンスプライマー:5’-CAGCAGCATGCGCTTCACGCGCTTCTTAGCCCAG-3’配列番号113を使用することにより第一のPCRフラグメント1kbを増幅した。V322K突然変異を含んで成るセンスプライマー:5’-AGAAGCGCGTGAAGCGCATGCTGCTGGTGATCGTT-3’配列番号114および配列番号76を使用することにより第二のPCRフラグメント0.44kbを増幅した。その後、配列番号75および配列番号76、ならびに上で示された系および条件を使用して、V332Kを含んで成るCCKBを増幅するための鋳型として2種の生じるPCRフラグメントを使用した。V332K突然変異を含有する生じる1.44kbのPCRフラグメントをHindIIIおよびEcoRIで消化し、そしてpCMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位にクローン化した配列番号111を参照されたい。3.クイックチェンジ[QuikChange]商標部位特異的[Site-Directed]商標突然変異誘発クイックチェンジ[QuikChange]商標部位特異的[Site-Directed]商標突然変異誘発キットストラタジーンStratagene、製造元の説明書に従うを使用することにより、非内在性のヒトGPCRの調製もまた達成することができる。内在性GPCRを鋳型として好ましく使用し、また、2種の突然変異誘発プライマー、ならびに最も好ましくはリシン突然変異誘発オリゴヌクレオチドおよび選択マーカーオリゴヌクレオチドキットに包含されるを利用する。便宜上、ヒトGPCRに組み込まれたコドンの突然変異およびそれぞれのオリゴヌクレオチドを標準的形態で示す表H:実施例3受容体の発現タンパク質の発現のために多様な細胞が当該技術に使用可能であるが、哺乳動物細胞を利用することが最も好ましい。これの主要な理由は実地的なことに基づく。すなわち、例えばGPCRの発現のための酵母細胞の利用が可能な一方で、受容体共役型の遺伝子的機構を包含しなくてもよい事実、酵母の場合は包含しない非哺乳動物細胞および哺乳動物の系について発展した分泌経路をプロトコルに導入し、従って、非哺乳動物細胞で得られる結果は、潜在的に有用な一方で哺乳動物細胞から得られるものと同じくらい好ましくはない。哺乳動物細胞のうち、COS-7、293および293T細胞がとりわけ好ましいが、利用される特定の哺乳動物細胞は当業者の特定のニーズに基づくことが可能である。第1日に、150mmプレートあたり1×107個の293T細胞をプレート培養した。第2日に2本の反応チューブを準備した各チューブについて後に続く比率はプレート1枚あたりである。すなわち、チューブAは、1.2mlの血清を含まないDMEMアーヴィンサイエンティフィックIrvineScientific、カリフォルニア州アーヴィン中に20μgのDNA例えばpCMVベクター;受容体cDNAを含むpCMVベクター、などを混合することにより準備し;チューブBは1.2mlの血清を含まないDMEM中に120μlのリポフェクタミンギブコGibcoBRLを混合することにより準備した。チューブAおよびBは反転数回により混合し、次いで室温で30~45分間インキュベートした。混合状態をトランスフェクション混合物と称する。プレート培養された293T細胞を1×PBSで洗浄し、次いで10mlの血清を含まないDMEMを添加した。細胞に2.4mlのトランスフェクション混合物を添加し、次いで37°C/5CO2で4時間インキュベートした。トランスフェクション混合物を吸引により除去し、次いで25mlのDMEM/10ウシ胎児血清を添加した。細胞を37°C/5CO2でインキュベートした。72時間のインキュベーション後に細胞を収穫し、そして分析に利用した。実施例4非内在性GPCRの構成的活性の測定のためのアッセイ非内在性のヒトGPCRの構成的活性の評価には多様なアプローチが利用可能である。以下は具体的説明であり;当業者は、当業者のニーズに優先的に利益をもたらす技術を決定する能力があると信じられる。1.膜結合アッセイ:[35S]GTPγSアッセイGタンパク質共役型受容体がリガンド結合もしくは構成的活性化のいずれかの結果としてその活性状態にある場合、受容体はGタンパク質に共役しそしてGDPの放出およびGTPのGタンパク質へのその後の結合を刺激する。Gタンパク質-受容体複合体のαサブユニットがGTPアーゼとして作用し、そしてGTPをGDPにゆっくりと加水分解し、この点で受容体が通常非活性化される。構成的に活性化された受容体はGDPをGTPと交換し続ける。構成的に活性化される受容体を発現する膜への[35S]GTPγSの高められた結合を立証するのに、加水分解不可能なGTP類似物[35S]GTPγSを利用することができる。構成的活性化を測定するための[35S]GTPγS結合の使用の利点は:aそれが全部のGタンパク質共役型受容体に包括的に応用可能である;bそれは膜表面の近接であり、細胞内カスケードに影響を及ぼす分子を拾い上げることをより少なくありそうにすることである。該アッセイは、直接的に関連する受容体を発現する膜への[35S]GTPγSの結合を刺激するGタンパク質共役型受容体の能力を利用する。従って、該アッセイは、既知の、オーファンのおよび構成的に活性化されるGタンパク質共役型受容体に対する候補化合物をスクリーニングするための直接同定法で使用することができる。該アッセイは包括的であり、また、全部のGタンパク質共役型受容体での薬物発見に対する応用性を有する。[35S]GTPγSアッセイは、20mMHEPES、および1mMと約20mMとの間のMgCl2この量は結果の至適化のため調節することができるが、20mMが好ましいpH7.4、約0.3nMと約1.2nMとの間の[35S]GTPγSこの量は結果の至適化のため調節することができるが、1.2が好ましいおよび12.5ないし75μgの膜タンパク質例えば受容体を発現するCOS-7細胞;この量は至適化のため調節することができるが、75μgが好ましいおよび1μMGDPこの量は至適化のため変更することができるを含む結合緩衝液中で1時間インキュベートすることが可能である。その後、コムギ胚芽アグルチニンビーズ25μl;アマーシャムAmershamを添加し、そして混合物を室温で別の30分間インキュベートする。その後、チューブを1500×gで室温で5分間遠心分離し、そしてその後シンチレーション計数器で計数する。より少なく高価なしかし同等に応用可能な代替物が同定されており、これはまた大スケールのスクリーニングのニーズにも合致する。フラッシュプレート[Flashplate]商標およびワラック[Wallac]商標シンチストリップを利用して、高スループットの[35S]GTPγS結合アッセイの全体構成を定めることができる。さらに、この技術を使用すれば、[35S]GTPγS結合を介して効力をモニターするのと同一時点で受容体へのトリチウム化されたリガンドの結合を同時にモニターするために、該アッセイを既知のGPCRに利用することができる。トリチウム標識プローブおよび35S標識プローブの双方を見るようにワラックWallacベータ計数器がエネルギーウィンドウを切り替えることができるために、これが可能である。このアッセイはまた、受容体の活性化をもたらす他の型の膜活性化事象を検出するのにも使用してよい。例えば、該アッセイは多様な受容体Gタンパク質共役型受容体およびチロシンキナーゼ受容体の双方の32Pホスホリル化をモニターするのに使用してよい。膜がウェルの底部に遠心分離されている場合、結合された[35S]GTPγSもしくは32P-ホスホリル化された受容体が、ウェルの被覆されているシンチラントを活性化することができる。この原理を立証するのにシンチ[Scinti]商標ストリップワラックWallacが使用されている。加えて、該アッセイはまた、放射活性に標識されたリガンドを使用して受容体へのリガンド結合を測定するための有用性も有する。類似の様式で、放射標識された結合されたリガンドがウェルの底部に遠心分離されている場合、シンチストリップの標識は放射標識されたリガンドに接近して活性化および検出をもたらす。2.アデニリルシクラーゼ細胞に基づくアッセイのため設計されたフラッシュプレート[FlashPlate]商標アデニリルシクラーゼキットニューイングランドニュークリアNewEnglandNuclear;カタログ番号SMP004Aを、粗原形質膜との使用のため改変することができる。フラッシュプレートFlashPlateのウェルはシンチラントのコーティングを含有し、このコーティングはcAMPを認識する特異的抗体もまた含有する。cAMP抗体への放射活性のcAMPトレーサーの結合についての直接の競争により、ウェル中で生成されたcAMPを定量した。以下は、受容体を発現する膜中のcAMPレベルの変化の測定のための簡潔なプロトコルとしてはたらく。トランスフェクションされた細胞をトランスフェクションのおよそ3日後に収穫する。20mMHEPES、pH7.4および10mMMgCl2を含有する緩衝液に懸濁された細胞の均質化により膜を調製した。均質化は、ブリンクマンBrinkmanポリトロン[Polytron]商標を使用し氷上でおよそ10秒間実施する。生じるホモジェネートを4°Cで49,000×gで15分間遠心分離する。その後、生じるペレットを20mMHEPES、pH7.4および0.1mMEDTAを含有する緩衝液に再懸濁し、10秒間均質化し、次いで49,000×gで4°Cで15分間遠心分離する。生じるペレットは利用されるまで-80°Cで保存することができる。測定の日に膜ペレットを室温でゆっくりと融解させ、20mMHEPES、pH7.4および10mMMgCl2これらの量は至適化することができるが、本明細書に列挙される値が好ましいを含有する緩衝液に再懸濁して0.60mg/mlの最終タンパク質濃度を生じる再懸濁された膜は使用まで氷上に置いた。cAMP標準および検出緩衝液11mlの検出緩衝液に対し2μCiのトレーサー[125I]cAMP100μlを含んで成るを調製し、そして製造元の説明書に従って維持する。アッセイ緩衝液はスクリーニングのため新たに調製し、そして20mMHEPES、pH7.4、10mMMgCl2、20mMシグマSigma、0.1単位/mlのクレアチンホスホキナーゼシグマSigma、50μMGTPシグマSigmaおよび0.2mMATPシグマSigmaを含有し;アッセイ緩衝液は利用されるまで氷上で保存することができる。NENフラッシュプレートFlashPlateへの50μlのアッセイ緩衝液の添加、次いで50μlの膜懸濁液の添加によりアッセイを開始する。結果として生じるアッセイ混合物を室温で60分間インキュベートし、次いで100μlの検出緩衝液を添加する。その後、プレートを追加の2~4時間インキュベートし、次いでワラックWallacマイクロベータ[MicroBeta]商標シンチレーション計数器で計数する。各アッセイプレート内に含有される標準cAMP曲線からウェルあたりのcAMPの値を外挿する。C.レポーターに基づくアッセイ1.CREBレポーターアッセイGs会合型受容体Gs刺激を検出する方法はcAMP依存性の様式で活性化される転写因子CREBの既知の特性に依存する。293もしくは293T細胞中でのGs共役型の活性についてアッセイするのに、パスディテクト[PathDetect]商標CREBトランスレポーティングCREBtrans-Reporting系ストラタジーンStratagene、カタログ番号219010を利用することができる。細胞は、哺乳動物トランスフェクションキットストラタジーンStratagene、カタログ番号200285を製造元の説明書に従って使用して、この上の系のプラスミド成分、および内在性もしくは突然変異体の受容体をコードする指定された発現プラスミドでトランスフェクションする。簡潔には、400ngのpFR-LucGal4認識配列を含有するルシフェラーゼレポータープラスミド、40ngのFA2-CREBGal4のDNA結合ドメインを含有するGal4-CREB融合タンパク質、80ngのpCMV-受容体発現プラスミド受容体を含んで成るおよび20ngのCMV-SEAP分泌型アルカリホスファターゼ発現プラスミド;トランスフェクションされた細胞の培地中でアルカリホスファターゼ活性を測定して、サンプル間のトランスフェクション効率の変動について制御するを、キットの説明書に従ってリン酸カルシウム沈殿中に組み合わせる。沈殿物の半分を96穴プレートの3個のウェルに同等に配分し、細胞上で一夜保ち、そして翌朝に新鮮培地で置き換える。トランスフェクションの開始48時間後に細胞を処理し、そして例えばルシフェラーゼ活性についてアッセイする。2.AP1レポーターアッセイGq会合型受容体Gq刺激を検出する方法は、それらのプロモーター中にAP1要素を含有する遺伝子の活性化を引き起こすGq依存性ホスホリパーゼCの既知の特性に依存する。リン酸カルシウム沈殿物の成分が410ngのpAP1-Luc、80ngのpCMV-受容体発現プラスミドおよび20ngのCMV-SEAPであったことを除いて、CREBレポーターアッセイに関して上に示されたプロトコルに従い、パスディテクト[Pathdetect]商標AP-1シスレポーティングAP-1cis-Reporting系ストラタジーンStratagene、カタログ番号219073を利用することができる。3.CRE-Lucレポーターアッセイ293および293T細胞をウェルあたり細胞2×104個の密度で96穴プレート上でプレート培養し、そして翌日、製造元の説明書に従ってリポフェクタミン試薬BRLを使用してトランスフェクションした。DNA/脂質混合物を以下のとおり各6個のウェルのトランスフェクションのため調製する。すなわち、100μlのDMEM中の260ngのプラスミドDNAを、100μlのDMEM中2μlの脂質と穏やかに混合した260ngのプラスミドDNAは、200ngの8xCRE-Lucレポータープラスミドプラスミドの一部分の表示については下および図1を参照されたい、50ngの内在性受容体もしくは非内在性受容体を含んで成るpCMVまたはpCMV単独、ならびに10ngのGPRS発現プラスミドpcDNA3インヴィトロジェンInvitrogen中のGPRSより成った。8XCRE-Lucレポータープラスミドは以下のとおり調製した。すなわち、pβgal-基本ベクターBasicVectorクロンテックClontechのBglV-HindIII部位にラットソマトスタチンプロモーター-71/51をクローン化することにより、ベクターSRIF-β-galを得た。アデノウイルス鋳型AdpCF126CCRE87HumanGeneTherapy18831996を参照されたいからのPCRにより、8コピーのcAMP応答要素を得、そしてKpn-BglV部位でSRIF-β-galベクターにクローン化して8xCRE-β-galレポーターベクターをもたらした。8xCRE-Lucレポータープラスミドは、8xCRE-β-galレポーターベクター中のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を、HindIII-BamHI部位でpGL3-基本ベクタープロメガPromegaから得られたルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることにより生成した。室温で30分のインキュベーション後に、400μlのDMEMでDNA/脂質混合物を希釈し、そして100μlの希釈された混合物を各ウェルに添加した。細胞培養インキュベーター中での4時間のインキュベーション後に、10FCSを含む100μlのDMEMを各ウェルに添加した。翌日、トランスフェクションされた細胞を、10FCSを含むウェルあたり200μlのDMEMで変更した。8時間後、PBSでの1回の洗浄後に、ウェルをウェルあたり100μlのフェノールレッドを含まないDMEMに変更した。翌日、製造元の説明書に従って、ルックライト[LucLite]商標レポーター遺伝子アッセイキットパッカードPackardを使用してルシフェラーゼ活性を測定し、そして1450マイクロベータ[MicroBeta]商標シンチレーションおよび発光計数器ワラックWallacで読み取った。4.SRF-LucレポーターアッセイGq刺激を検出するための一方法は、それらのプロモーター中に血清応答因子を含有する遺伝子の活性化を引き起こすGq依存性のホスホリパーゼCの既知の特性に依存する。例えばCOS7細胞でのGq共役型の活性についてアッセイするのに、パスディテクト[Pathdetect]商標SRF-Lucレポーティング系ストラタジーンStratageneを利用することができる。製造元の説明書に従って哺乳動物トランスフェクション[MammalianTransfection]商標キットストラタジーンStratagene、カタログ番号200285を使用して、系のプラスミド成分および内在性もしくは非内在性のGPCRをコードする指定された発現プラスミドで細胞をトランスフェクションする。簡潔には、410ngのSRF-Luc、80ngのpCMV受容体発現プラスミドおよび20ngのCMV-SEAP分泌型アルカリホスファターゼ発現プラスミド;トランスフェクションされた細胞の培地中でアルカリホスファターゼ活性を測定して、サンプル間のトランスフェクションの効率の変動について制御するを、製造元の説明書に従ってリン酸カルシウム沈殿物中で組み合わせる。沈殿物の半分を96穴プレートの3個のウェルに同等に配分し、血清を含まない培地中で細胞上で24時間保つ。指定された場合は、最後の5時間、細胞を1μMのアンジオテンシンとともにインキュベートする。その後細胞を溶解し、そして、製造元の説明書に従ってルックライト[Luclite]商標キットパッカードPackard、カタログ番号6016911およびトライルックスTrilux1450マイクロベータMicroBeta液体シンチレーションおよび発光計数器ワラックWallacを使用してルシフェラーゼ活性についてアッセイする。データはグラフパッドプリズム[GraphPadPrism]商標2.0aグラフパッドソフトウェアインクGraphPadSoftwareInc.を使用して解析することができる。5.細胞内IP3蓄積アッセイ第1日に、受容体内在性および/もしくは非内在性を含んで成る細胞を24穴プレート上でプレート培養することができる通常、ウェルあたり細胞1×105個、とは言えこの数字は至適化することができる。第2日に、ウェルあたり50μlの血清を含まないDMEM中の0.25μgのDNAおよびウェルあたり50μlの血清を含まないDMEM中の2μlのリポフェクタミンを最初に混合することにより、細胞をトランスフェクションすることができる。溶液は穏やかに混合し、そして室温で15~30分間インキュベートする。0.5mlのPBSで細胞を洗浄し、そして400μlの血清を含まない培地をトランスフェクション培地と混合しかつ細胞に添加する。その後、細胞を37°C/5CO2で3~4時間インキュベートし、そしてその後、トランスフェクション培地を除去しかつウェルあたり1mlの通常の成長培地で置き換える。第3日に、細胞を3H-ミオイノシトールで標識する。簡潔には、培地を除去し、そして細胞を0.5mlのPBSで洗浄する。その後、0.5mlのイノシトールを含まない/血清を含まない培地ギブコGIBCOBRLを、ウェルあたり0.25μCiの3H-ミオイノシトールとともにウェルあたりに添加し、そして細胞を37°C/5CO2で16~18時間一夜インキュベートする。第4日に、細胞を0.5mlのPBSで洗浄し、そして、イノシトールを含まない/血清を含まない培地、10μMパージリン、10mM塩化リチウムを含有する0.45mlのアッセイ培地、もしくは0.4mlのアッセイ培地および10μMの最終濃度までの50μlの10×ケタンセリンketを添加する。その後細胞を37°Cで30分間インキュベートする。その後細胞を0.5mlのPBSで洗浄し、そしてウェルあたり200μlの新鮮/氷冷停止溶液1MKOH;18mMホウ酸ナトリウム;3.8mMEDTAを添加する。溶液を5~10分間もしくは細胞が溶解されるまで氷上で保ち、そしてその後、200μlの新鮮/氷冷中和溶液7.5HClにより中和する。その後、ライセートを1.5mlのエッペンドルフチューブに移し、そしてチューブあたり1mlのクロロホルム/メタノール1:2を添加する。溶液を15秒間ボルテックス攪拌し、そして上層をバイオラッドBioRadAG1-X8商標陰イオン交換樹脂100~200メッシュに適用する。最初に樹脂を1:1.25W/Vの水で洗浄し、そして0.9mlの上層をカラムに負荷する。カラムを10mlの5mMミオイノシトールおよび10mlの5mMホウ酸ナトリウム/60mMギ酸ナトリウムで洗浄する。2mlの0.1Mギ酸/1Mギ酸アンモニウムを用い、10mlのシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアル中にイノシトールトリスリン酸を溶出する。10mlの0.1Mギ酸/3Mギ酸アンモニウムで洗浄することによりカラムを再生し、そしてddH2Oで2回すすぎ、そして水中で4°Cで保存する。例示的結果を下の表Iに提示する:C.細胞に基づく検出アッセイ例-TDAG8293細胞をプレートあたり細胞1.3×107個の密度で150mmプレート上でプレート培養し、そしてプレートあたり12μgのそれぞれのDNAおよび60μlのリポフェクタミン試薬BRLを使用してトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクション後24時間に実施されるアッセイのため血清を含有する培地中で成長させた。トランスフェクション後48時間に実施される検出アッセイ血清および血清を含まない培地を比較するアッセイ;図3を参照されたいのため、初期培地を血清もしくは血清を含まない培地のいずれかに変更した。血清を含まない培地は、単にダルベッコの改変イーグルDME高グルコース培地アーヴィンサイエンティフィックIrvineScientific9024から構成された。上のDME培地に加えて、血清を含む培地は以下、すなわち10ウシ胎児血清ハイクロンHycloneSH30071.03、1の100mMピルビン酸ナトリウムアーヴィンサイエンティフィックIrvineScientific9334、1の20mML-グルタミンアーヴィンサイエンティフィックIrvineScientific9317および1のペニシリン-ストレプトマイシン溶液アーヴィンサイエンティフィックIrvineScientific9366を含有した。96穴のアデニリルシクラーゼ活性化フラッシュプレート[Flashplate]商標を使用したNEN:SMP004A。最初に、アッセイのための標準50μlを、ウェルあたり50pmolから0pmolまでのcAMP濃度の範囲にわたるプレート二重に添加した。標準cAMPNEN:SMP004Aを水で再構成し、そして1×PBSアーヴィンサイエンティフィックIrvineScientific9240を使用して連続的希釈物を作成した。次に、50μlの刺激緩衝液NEN:SMP004Aを全部のウェルに添加した。cAMPの活性化もしくは不活性化を測定するのに化合物を使用する場合は、水で希釈された各化合物10μlを三重でそのそれぞれのウェルに添加した。使用された多様な最終濃度は1μMから1mMまでの範囲にわたる。アデノシン5’-三リン酸、ATPリサーチバイオケミカルズインターナショナルResearchBiochemicalsInternational:A-141およびアデノシン5’-二リン酸、ADPシグマSigma:A2754をアッセイで使用した。次に、それぞれのcDNACMVもしくはTDAG8でトランスフェクションされた293細胞を、トランスフェクション後24血清培地中でのアッセイの検出もしくは48血清および血清を含まない培地を比較するアッセイの検出時間で収穫した。培地を吸引し、そして細胞を1×PBSで1回洗浄した。その後、5mlの1×PBSを3mlの細胞解離緩衝液シグマSigma:C-1544とともに細胞に添加した。解離された細胞を遠心分離チューブに移し、そして室温で5分間遠心分離した。上清を除去し、そして、1ミリリットルあたり細胞2×106個の最終濃度を得るように、細胞ペレットを適切な量の1×PBSに再懸濁した。化合物を含有するウェルに、1×PBS中の細胞50μlウェルあたり細胞1×105個を添加した。プレートを室温で15分間振とう機でインキュベートした。トレーサーcAMPを含有する検出緩衝液を調製した。11mlの検出緩衝液NEN:SMP004A中で50μl1μCiに等しいの[125I]cAMPNEN:SMP004Aを添加した。インキュベーション後に、トレーサーcAMPを含有するこの検出緩衝液50μlを各ウェルに添加した。プレートを振とう機に設置し、そして室温で2時間インキュベートした。最後に、プレートのウェルからの溶液を吸引し、そしてワラックWallacマイクロベータ[MicroBeta]商標シンチレーション計数器を使用してフラッシュプレートを計数した。図2Aにおいて、ATPおよびADPは内在性のTDAG8に結合し、それぞれ約59および約55のcAMPの増大をもたらす。図2Bは、内在性のTDAG8へのATPおよびADPの結合を明示し、ここでは内在性TDAG8がトランスフェクションされ、そして血清および血清を含まない培地中で成長された。血清培地中で成長された内在性のTDAG8へのATPの結合は、化合物を伴わない内在性のTDAG8に比較して、約65のcAMPの増大を明示し;血清を含まない培地中では約68の増大が存在した。血清中の内在性TDAG8へのADPの結合は約61の増大を明示する一方、血清を含まない培地中ではADP結合が約62増大の増大を明示する。ATPおよびADPは、それぞれ139.8μMおよび120.5μMのEC50値で内在性のTDAG8に結合するデータは示されない。図2Bに提示される結果は、血清および血清を含まない培地を比較した場合に実質的に同一の結果を示すが、われわれの選択は血清に基づく培地を使用することである。とは言え血清を含まない培地もまた利用することが可能である。実施例6GPCR融合タンパク質の調製構成的に活性化されるGPCR-Gタンパク質融合構築物の設計を以下のとおり達成した。すなわち、ラットGタンパク質Gsα長形態;伊藤Itoh,H.ら、83PNAS37761986の5’および3’双方の端をそれにHindIII5’-AAGCTT-3’配列を包含するように工作した。正しい配列隣接するHindIII配列を包含するの確認後に、そのベクターのHindIII制限部位を使用してサブクローニングすることにより、配列全体をpcDNA3.1-インヴィトロジェンInvitrogen、カタログ番号V795-20にsnuttleした。pcDNA3.1-へのサブクローニング後にGsαの配列について正しい向きを決定した。HindIII配列でラットGsα遺伝子を含有する改変されたpcDNA3.1-をその後確認し;このベクターは今や普遍的Gsαタンパク質ベクターとして利用可能となった。pcDNA3.1-ベクターは、HindIII部位の上流に多様な公知の制限部位を含有し、従ってGsタンパク質の上流に内在性の構成的に活性なGPCRのコーディング配列を挿入する能力を有益に提供する。他の普遍的Gタンパク質ベクターを創製するのにこの同一のアプローチを利用することができ、そして、もちろん、当業者に既知の他の商業的に入手可能なもしくは占有のベクターを利用することができる。重要な基準は、GPCRの配列がGタンパク質の配列の上流にかつ同じ読み枠で存在することである。TDAG8はGsを介して共役する一方、H9はGzを介して共役する。以下の例示的GPCR融合タンパク質についてGsαへの融合を達成した。TDAG8I225K-Gsα融合タンパク質構築物は以下のとおり作成した。すなわち、プライマーを以下のとおり設計した:5’-gatcTCTAGAATGAACAGCACATGTATTGAAG-3’配列番号125;センス5’-ctagGGTACCCGCTCAAGGACCTCTAATTCCATAG-3’配列番号126;アンチセンス。小文字のヌクレオチドはGタンパク質とTDAG8との間の制限部位中のスペーサーとして包含される。該センスおよびアンチセンスプライマーはそれぞれXbaIおよびKpnIの制限部位を包含した。その後、それぞれについて以下のプロトコルを使用し、PCRを利用して、上に開示されたGsα普遍的ベクター内の融合についてそれぞれの受容体配列を保証した。すなわち、2μlの各プライマーセンスおよびアンチセンス、3μLの10mMdNTP、10μLの10×タックプラス[TaqPlus]商標プレシジョンPrecision緩衝液、1μLのタックプラス[TaqPlus]商標プレシジョンPrecisionポリメラーゼストラタジーンStratagene:600211ならびに80μLの水を含有する別個のチューブに、100ngのTDAG8のcDNAを添加した。TDAG8についての反応温度および周期時間は以下のとおりであった。すなわち、最初の変性段階はそれを94°Cで5分間、そして、94°C30秒間;55°C30秒間;72°C2分間の周期を行った。最後の伸長時間は72°Cで10分間行った。順向きのPCR産物を1アガロースゲル上で泳動し、そしてその後精製したデータは示されない。精製された産物をXbaIおよびKpnIニューイングランドバイオラブスNewEnglandBiolabsで消化し、そして所望の挿入物を精製しかつそれぞれの制限部位でGs普遍的ベクターに連結した。形質転換後に陽性のクローンを単離し、そして制限酵素消化により決定し;293細胞を使用する発現は下に示されるプロトコルに従って達成した。TDAG8:Gs融合タンパク質についてのそれぞれの陽性のクローンを配列決定して正しさを確かめた。非内在性の構成的に活性化されるTDAG8I225Kを含んで成るGPCR融合タンパク質を上のとおり分析し、そして構成的活性化について確かめた。H9F236K-Gsα融合タンパク質構築物は以下のとおり作成した。すなわち、プライマーを以下のとおり設計した:5’-TTAgatatcGGGGCCCACCCTAGCGGT-3’配列番号145;センス5’-ggtaccCCCACAGCCATTTCATCAGGATC-3’配列番号146;アンチセンス。小文字のヌクレオチドはGタンパク質とH9との間の制限部位中のスペーサーとして包含される。センスおよびアンチセンスプライマーはそれぞれEcoRVおよびKpnIの制限部位を包含し、その結果、スペーサー制限部位に帰されるがGタンパク質とH9との間に存在する。その後、それぞれについて以下のプロトコルを使用し、PCRを利用して、上に開示されたGsα普遍的ベクター内の融合についてそれぞれの受容体配列を保証した。すなわち、100ngの各プライマーセンスおよびアンチセンスならびに45μLのPCRスーパーミックス[Supermix]商標ギブコGibco-Brl、ライフテックLifeTechを含有する別個のチューブに、80ngのH9のcDNAを添加した50μLの総反応体積。H9についての反応温度および周期時間は以下のとおりであった。すなわち、最初の変性段階はそれを94°Cで1、そして、94°C30秒間;55°C30秒間、72°C2分間の周期を行った。最後の伸長時間は72°Cで7分間行った。順向きのPCR産物を1アガロースゲル上で泳動し、そしてその後精製したデータは示されない。精製された産物をpCRII-TOPO商標系にクローン化し、次いで陽性のクローンを同定した。陽性のクローンを単離し、EcoRVおよびKpnIニューイングランドバイオラブスNewEnglandBiolabsで消化し、そして所望の挿入物を単離し、精製しかつそれぞれの制限部位でGs普遍的ベクターに連結した。形質転換後に陽性のクローンを単離し、そして制限酵素消化により決定し;293細胞を使用する発現は下に示されたプロトコルに従って達成した。H9F236K:Gs融合タンパク質についての各陽性のクローンを配列決定して正しさを確かめた。膜は利用されるまで凍結-80°Cした。H9はGzと共役するのであるがGsタンパク質により媒介されるcAMP応答を測定する能力を確かめるため、NENアデニルシクラーゼ活性化フラッシュプレート[Flashplate]商標アッセイキット96穴の形式に基づき、以下のcAMP膜アッセイを利用した。結合緩衝液は10mMHEPES、100mMNaClmおよび10mMMgClpH7.4より成った。再生緩衝液は結合緩衝液中で調製し、そして20mMホスホクレアチン、20Uのクレアチンホスホキナーゼ、20μMGTP、0.2mMATPおよび0.6mMIBMXより成った。cAMP標準は以下のとおり結合緩衝液中で調製した:凍結された膜対照としてのpCMVおよび非内在性のH-Gs融合タンパク質の双方を溶液中まで室温で氷上で融解した。膜を懸濁液中までポリトロンで均質化した2×15秒。ブラッドフォードBradfordアッセイプロトコル下を参照されたいを使用して膜タンパク質濃度を測定した。再生緩衝液中で膜の濃度を0.5mg/mlに希釈した最終アッセイ濃度-ウェルあたり25μg。その後、50μlの結合緩衝液を各ウェルに添加した。対照には、ウェルあたり50μlのcAMP標準をウェル11および12A-Gに、結合緩衝液単独を12Hに添加した96穴の形式で。その後、ウェルあたり50μlのタンパク質をウェルに添加し、そして室温で振とう機上で60分間インキュベートした。検出緩衝液下を参照されたい中100μlの[125I]cAMPを各ウェルに添加した最終-11mlの検出緩衝液中に50μlの[125I]cAMP。これらを室温で2時間インキュベートした。プレートを8チャンネルのマニホールドで吸引し、そしてプレートの蓋で封止した。結果結合されたcAMPのpmolをプロット15でワラック[Wallac]商標1450で読み取った。結果を図3に提示する。図3に提示される結果は、Gs共役型融合がシクラーゼ反応を駆動することが可能であり、その結果H9F236Kの構成的活性化の測定が実現可能であったことを示す。これらの結果に基づけば、反作用薬、アゴニストおよび部分的アゴニストである候補化合物の直接同定がシクラーゼに基づくアッセイを使用して可能である。実施例6プロトコル:[35S]GTPγSを使用する反作用薬およびアゴニストの直接同定われわれは、全く理解されていない理由上、例えば反作用薬のような候補化合物の直接同定に内在性の構成的に活性のGPCRを利用したが、アッセイ間の変動が悪化されたようになる可能性がある。その場合、好ましくは、上に開示されたようなGPCR融合タンパク質を非内在性の構成的に活性化されるGPCRとともにもまた利用する。われわれは、こうしたタンパク質を使用する場合にアッセイ間の変動が実質的に安定化されるようであり、それにより有効なS/N比が得られることを決定した。これは候補化合物のより確固たる同定を見込むという有益な結果を有する。従って、直接同定のためにはGPCR融合タンパク質を使用すること、また、利用される場合は以下のアッセイプロトコルを利用することが好ましい。膜の調製目的の、および反作用薬、アゴニストもしくは部分的アゴニストとしての候補化合物の直接同定での使用のための非内在性の構成的に活性のオーファンGPCR融合タンパク質を含んで成る膜は、以下のように好ましく調製する:a.材料膜掻き取り緩衝液は20mMHEPESおよび10mMEDTA、pH7.4より構成され;膜洗浄緩衝液は20mMHEPESおよび0.1mMEDTA、pH7.4から構成され;結合緩衝液は20mMHEPES、100mMNaClおよび10mMMgCl2、pH7.4から構成される。b.手順全部の材料は処置の間中氷上に保つ。最初に、細胞のコンフルエントな単層から培地を吸引し、次いで10mlの冷PBSですすぎ、次いで吸引する。その後、5mlの膜掻き取り緩衝液を添加して細胞を掻き取り;これに次いで細胞抽出物を50ml遠心管に移す20,000rpmで4°Cで17分間遠心分離される。その後、上清を吸引し、そしてペレットを30mlの膜洗浄緩衝液に再懸濁し、次いで20,000rpmで4°Cで17分間遠心分離する。上清をその後吸引し、そしてペレットを結合緩衝液に再懸濁する。その後、ブリンクマンBrinkmanポリトロン[polytron]商標ホモジェナイザーを使用してこれを均質化する全部の物質が懸濁液中にあるまで15~20秒破裂させる。これを本明細書で膜タンパク質と称する。ブラッドフォードBradfordタンパク質アッセイ均質化の後に、ブラッドフォードBradfordタンパク質アッセイを使用して膜のタンパク質濃度を測定するタンパク質を約1.5mg/mlに希釈し、等分し、そして後の使用のため凍結する-80°Cことができ;凍結される場合、使用のためのプロトコルは以下のとおりである。すなわち、アッセイの日に、凍結された膜タンパク質を室温で融解し、次いでボルテックス攪拌し、そしてその後、約5~10秒間約12×1,000rpmでポリトロンで均質化し;複数の調製のためには、異なる調製物の均質化の間にホモジェナイザーを徹底的に洗浄すべきであることが言及される。a.材料結合緩衝液上に従う;ブラッドフォードBradford色素試薬;ブラッドフォードBradfordタンパク質標準を製造元の説明書に従ってバイオラッドBioRadカタログ番号500-0006利用する。b.手順二重のチューブを準備する1本は膜を包含し、そして1本は対照のブランクとして。それぞれは800μlの結合緩衝液を含有した。その後、10μlのブラッドフォードBradfordタンパク質標準1mg/mlを各チューブに添加し、そしてその後10μlの膜タンパク質を1本のチューブにだけ添加するブランクでない。その後、200μlのブラッドフォードBradford色素試薬を各チューブに添加し、次いでそれぞれをボルテックス攪拌する。5分後にチューブを再度ボルテックス攪拌し、そして、その中の物質をキュベットに移す。その後、波長595でCECIL3041分光光度計を使用してキュベットを読み取る。直接同定アッセイa.材料GDP緩衝液は37.5mlの結合緩衝液および2mgのGDPシグマSigma、カタログ番号G-7127より成り、次いで0.2μMGDPを得るため結合緩衝液で一連の希釈を行い各ウェル中でのGDPの最終濃度は0.1μMGDPであった;候補化合物を含んで成る各ウェルは、100μlのGDP緩衝液最終濃度、0.1μMGDP、50μlの結合緩衝液中の膜タンパク質、および50μlの結合緩衝液中の[35S]GTPγS0.6nM10mlの結合緩衝液あたり2.5μlの[35S]GTPγSより成る200μlの最終体積を有する。b.手順候補化合物は96穴プレートの形式これらは-80°Cで凍結させることができるを使用して好ましくスクリーニングする。膜タンパク質もしくは、対照として、GPCR融合タンパク質を除外する発現ベクターを含む膜を懸濁液中まで短く均質化する。その後、上に示されたブラッドフォードBradfordタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を測定する。その後、膜タンパク質および対照を結合緩衝液で0.25mg/mlに希釈する最終アッセイ濃度、ウェルあたり12.5μg。その後、100μlのGDP緩衝液をワラックWallacシンチストリップ[Scintistrip]商標ワラックWallacの各ウェルに添加する。その後、5μlのピンツールを使用して、こうしたウェルに5μlの候補化合物を移すすなわち、200μlの総アッセイ体積中の5μlは1:40の比であり、その結果候補化合物の最終スクリーニング濃度は10μMである。再度、汚染を回避するため、各移送段階の後にはピンツールを水1×、エタノール1×および水2×を含んで成る3個の水槽ですすぐべきであり、過剰の液体は各すすぎの後にツールから振りそして紙およびキムワイプでぬぐって乾かすべきである。その後、50μlの膜タンパク質を各ウェルに添加しGPCR融合タンパク質を含まない膜を含んで成る対照ウェルもまた利用する、そして室温で5~10分間前インキュベートする。その後、50μlの結合緩衝液中の[35S]GTPγS0.6nMを各ウェルに添加し、次いで室温で振とう機で60分間インキュベートする再度、この実施例において、プレートをホイルで覆った。その後、22°Cで4000RPMで15分間のプレートの回転によりアッセイを停止する。その後、プレートを8チャンネルのマニホールドで吸引し、そしてプレートの蓋で封止する。その後、製造元の説明書に従ってProt.37の設定を使用してワラックWallacc1450でプレートを読み取る。実施例7プロトコル:確認アッセイ上に示されたような直接同定された候補化合物の確認を提供するための独立のアッセイのアプローチを使用して、その後確認アッセイを利用することが好ましい。この場合、好ましい確認アッセイはシクラーゼに基づくアッセイである。改変されたフラッシュプレート[FlashPlate]商標アデニリルシクラーゼキットニューイングランドニュークリアNewEnglandNuclear;カタログ番号SMP004Aを、以下のプロトコルに従って、非内在性の構成的に活性化されるオーファンGPCRに対する反作用薬およびアゴニストとして直接同定された候補化合物の確認に、好ましく利用する。トランスフェクションされた細胞をトランスフェクション後およそ3日に収穫する。20mMHEPES、pH7.4および10mMMgCl2を含有する緩衝液中に懸濁された細胞の均質化により膜を調製する。均質化は、ブリンクマンBrinkmanポリトロン[Polytron]商標を使用して氷上でおよそ10秒間実施する。生じるホモジェネートは49,000×gで4°Cで15分間遠心分離する。その後、生じるペレットを、20mMHEPES、pH7.4および0.1mMEDTAを含有する緩衝液に再懸濁し、10秒間均質化し、次いで49,000×gで4°Cで15分間遠心分離する。生じるペレットは利用されるまで-80°Cで保存することができる。直接同定スクリーニングの日に、膜ペレットを室温でゆっくりと融解し、20mMHEPES、pH7.4および10mMMgCl2を含有する緩衝液に再懸濁して、0.60mg/mlの最終タンパク質濃度を生じる再懸濁された膜は使用まで氷上に置く。cAMP標準および検出緩衝液11mlの検出緩衝液に対して2μCiのトレーサー[125I]cAMP100μlを含んで成るは、製造元の説明書に従って調製しかつ維持する。アッセイ緩衝液はスクリーニングのために新たに調製し、そして20mMHEPES、pH7.4、10mMMgCl2、20mMホスホクレアチンシグマSigma、0.1単位/mlのクレアチンホスホキナーゼシグマSigma、50μMGTPシグマSigmaおよび0.2mMATPシグマSigmaを含有し;アッセイ緩衝液は利用されるまで氷上で保存することができる。上に従って同定された候補化合物凍結されている場合は室温で融解させるを、40μMの膜タンパク質ウェルあたり30μgおよび50μlのアッセイ緩衝液と一緒に、好ましくは96穴プレートのウェルに添加するウェルあたり3μl;12μMの最終アッセイ濃度。その後、この混合状態を穏やかに振とうしながら室温で30分間インキュベートする。インキュベーション後に、各ウェルに100μlの検出緩衝液を添加し、次いで2~24時間インキュベートする。その後、プレートを、製造元の説明書に従いProt.31を使用してワラックWallacマイクロベータ[MicroBeta]商標プレートリーダーで計数する。本特許文書で挙げられる特許、出願および印刷された刊行物のそれぞれはこれによりそっくりそのまま引用により組み込まれることが意図される。当業者は、多数の変更および改変を、本発明の技術思想から離れることなく本発明の好ましい態様に対し行ってよいことを認識するであろう。全部のこうした変形物は本発明の範囲内にあることが意図される。多様な発現ベクターが当業者に利用可能であるが、内在性および非内在性双方のヒトGPCRに対する利用の目的上、利用されるベクターはpCMVであることが最も好ましい。このベクターは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約theBudapestTreatyfortheInternationalRecognitionoftheDepositofMicroorganismsforthePurposeofPatentProcedureの規定の下に、1998年10月13日にアメリカンタイプカルチャーコレクションAmericanTypeCultureCollectionATCC10801UniversityBlvd.,米国バージニア州マナサス20110-2209に寄託された。該DNAはATCCにより試験され、そしてそうであることが決定された。ATCCはpCMVに対し以下の寄託番号:ATCC203351を割り当てている。配列表"