"下記a~dのいずれか1つで表されることを特徴とするタンパク質:a配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質;b配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;c配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質;d配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質。下記a~dのいずれか1つで表されることを特徴とする遺伝子:a配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列からなる遺伝子;b配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子;c配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;d配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。請求項2に記載の遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする請求項1に記載のタンパク質の製造方法。請求項1に記載のタンパク質を用いてN-サクシニル-DL-アミノ酸中のN-サクシニル-D-アミノ酸を加水分解する工程、及びN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてN-サクシニル-L-アミノ酸をラセミ化してN-サクシニル-D-アミノ酸を生成させる工程を含むことを特徴とするD-アミノ酸の製造方法。請求項1に記載のタンパク質を用いてN-サクシニル-DL-アミノ酸中のN-サクシニル-D-アミノ酸を加水分解する工程、およびN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてN-サクシニル-L-アミノ酸をラセミ化してN-サクシニル-D-アミノ酸を生成させる工程が同時に行なわれることを特徴とする請求項4に記載の方法。本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、N-サクシニル-D-アミノ酸の加水分解活性が高く、サクシニルアミノ酸ラセマーゼと組み合わせることにより、工業的な規模、時間においてD-アミノ酸を高収率で製造することができる新規なD-サクシニラーゼを提供することにある。本発明者は、上記目的を達成するために、N-サクシニル-D-アミノ酸加水分解能力を指標として様々な土壌微生物をスクリーニングした結果、N-サクシニル-D-アミノ酸を加水分解する能力に優れる新規な微生物クプリアビダスCupriavidusエスピー.P4-10-Cを見出し、該新規な微生物が新規なD-サクシニラーゼを産生していることを見出した。さらに、該新規なD-サクシニラーゼ遺伝子のクローニングに成功し、DNA組換え法によりD-サクシニラーゼの遺伝子工学的生産にも成功した。また、本発明者らは、前記知見を基に、公的機関に寄託されているこの微生物の近縁種についても鋭意探索を行い、それらの中からもN-サクシニル-D-アミノ酸を加水分解する能力に優れるものを見出し、該寄託微生物が新規なD-サクシニラーゼを産生していることを見出した。さらに、これらの新規なD-サクシニラーゼ遺伝子のクローニングに成功し、DNA組換え法によりD-サクシニラーゼの生産にも成功した。そして、これらの知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成させた。すなわち、本発明によれば、a~dのいずれか1つで表されることを特徴とするタンパク質が提供される:a配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質;b配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;c配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質;d配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質。また、本発明によれば、a~dのいずれか1つで表されることを特徴とする遺伝子が提供される:a配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列からなる遺伝子;b配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子;c配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;d配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。さらに、本発明によれば、上記遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする上記タンパク質の製造方法が提供される。さらに、本発明によれば、上記タンパク質を用いてN-サクシニル-DL-アミノ酸中のN-サクシニル-D-アミノ酸を加水分解する工程、及びN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてN-サクシニル-L-アミノ酸をラセミ化してN-サクシニル-D-アミノ酸を生成させる工程を含むことを特徴とするD-アミノ酸の製造方法が提供される。本発明のD-サクシニラーゼは、従来の酵素に比べてN-サクシニル-D-アミノ酸の加水分解活性が格段に高いため、公知のサクシニルアミノ酸ラセマーゼと組み合わせて使用することにより、N-アシルアミノ酸の効率的なラセミ化と加水分解が可能となる。従って、本発明によれば、医薬品原料などとして有用なD-アミノ酸を、工業的な規模、時間において高収率で得ることが可能となる。本発明のD-サクシニラーゼは、a配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質、またはb配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。配列番号2は、新規な土壌微生物クプリアビダスエスピー.P4-10-C株のD-サクシニラーゼの塩基配列であり、配列番号1は、そのアミノ酸配列である。配列番号4,6,8は、クプリアビダスエスピー.P4-10-C株の近縁種のD-サクシニラーゼの塩基配列である。具体的には、配列番号4は、クプリアビダスメタリデュランスCupriavidusmetalliduransの、配列番号6は、クプリアビダスネケターCupriavidusnecatorの、配列番号8は、ラルストニアピケッティRalstoniapickettiiのD-サクシニラーゼの塩基配列である。配列番号3,5,7はそれぞれ、配列番号4,6,8の塩基配列に対応するアミノ酸配列である。なお、上述のクプリアビダス属の細菌の中には、ラルストニア属の細菌として文献に表記されているものもあるが、クプリアビダス属が正式な属名として一般的に使用され始めている。これらの細菌の学術名は、将来の再分類により、統一又は変更される可能性がある。上記aおよびbのタンパク質は、N-サクシニルアミノ酸のD体とL体のうちD体であるN-サクシニル-D-アミノ酸に対する加水分解活性が高く、D-アミノ酸を効率的に生成させることができるという特徴を有する。上記aおよびbのタンパク質は、N-アセチルアミノ酸よりもN-サクシニルアミノ酸に対して顕著に高い活性を有する。これらのことから、上記aおよびbのタンパク質は、N-サクシニル-D-アミノ酸を効率的に加水分解してD-アミノ酸とコハク酸を生成する反応を触媒する酵素、つまりD-サクシニラーゼであると言える。本発明のD-サクシニラーゼの理化学的性質は、以下のi~viに示す通りである。i作用:N-サクシニル-D-アミノ酸を加水分解して、D-アミノ酸を生じる。iiサブユニット構造:SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が50~70kダルトンと20~30kダルトンを示すサブユニットを含有するヘテロダイマーである。iii基質特異性:下記一般式Iに示す任意のN-サクシニル-D-アミノ酸に対して作用する。一般式I中、Rは、置換基を有してもよい炭素数4~20のアリール基、または置換基を有してもよい炭素数5~20のアラルキル基を示す。上記Rにおける置換基を有していてもよい炭素数6~20のアリール基としては、フェニル基、4-ヒドロキシフェニル基などが挙げられる。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。また、置換基を有していてもよい炭素数7~20のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、4-フェニルベンジル基、4-ヒドロキシベンジル基等が挙げられる。iv温度安定性:酵素濃度0.2mg/mL、リン酸緩衝溶液pH7.5で60分間熱処理した場合、50°Cで残存活性が90以上である。v至適温度:酵素濃度0.01mg/mL、リン酸緩衝溶液pH7.5で反応させる場合、温度45~50°Cが至適である。なお、至適とは、酵素濃度0.01mg/mL、リン酸緩衝溶液pH7.5において、30°C、40°C、45°C、50°C、60°Cでそれぞれ5分間反応させた場合の活性が最も高かった温度で測定された活性値を100としたときの相対値が80以上である温度範囲を示す。vi至適pH:酵素濃度0.01mg/mL、37°Cで60分間反応させる場合、pH7~8が至適である。なお、至適とは、酵素濃度0.01mg/mL、緩衝溶液にはリン酸緩衝溶液pH5.5-pH7.5、Tris-HClpH7.5-pH8.5、ホウ酸緩衝溶液pH8.5-pH10.0を用い、37°Cで60分間反応させた場合の活性が最も高かったpHで測定された活性値を100としたときの相対値が80以上である温度範囲を示す。本発明は、a配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列からなる遺伝子、およびb配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含する。これらは、上記aおよびbのタンパク質に対応する遺伝子である。本発明のD-サクシニラーゼは、上記aおよびbのものに限定されず、c配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質、またはd配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質も含む。また、本発明の遺伝子は、c配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、またはd配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、D-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含む。これは、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果としてタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。また、本発明のD-サクシニラーゼの遺伝子を、由来生物以外の宿主生物大腸菌などに組込んで本発明のD-サクシニラーゼを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。ここで、1若しくは数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造やD-サクシニラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、1~50個、好ましくは1~30個、より好ましくは1~20個、さらに好ましくは1~10個である。ただし、配列表の配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位を含むアミノ酸配列の場合には、30°C、pH7~8の条件下で配列表の配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の50以上、好ましくは80以上、より好ましくは90以上、さらに好ましくは95以上のD-サクシニラーゼ活性を保持していることが望ましい。また、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80以上、好ましくは85以上、より好ましくは90以上、さらに好ましくは95以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件ここでいう相同性homologyは、比較する配列間において一致する塩基の数が最大となるような並べ方にして演算された値であることが望ましい、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60°C、1×SSC、0.1SDS、好ましくは60°C、0.1×SSC、0.1SDS、さらに好ましくは65°C、0.1×SSC、0.1SDSに相当するに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。ただし、配列表の配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、30°C、pH7~8の条件下で配列表の配列番号1,3,5または7に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の50以上、好ましくは80以上、より好ましくは90以上、さらに好ましくは95以上のD-サクシニラーゼ活性を保持していることが望ましい。上記c及びdのD-サクシニラーゼ活性を有するタンパク質及びその遺伝子は、例えばTransformerMutagenesisKit;Clonetech製、EXOIII/MungBeanDeletionKit;Stratagene製、QuickChangeSiteDirectedMutagenesisKit;Stratagene製、KOD-Plus-MutagenesisKit;東洋紡製などの市販のキットやPCR法を利用して配列番号2,4,6または8に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この形質転換体、この形質転換体の菌体破砕液もしくは精製した酵素タンパク質をN-サクシニル-DL-アミノ酸に添加してD-アミノ酸の生成を実施例に記載の方法で測定することによって確認することができる。次に、本発明のD-サクシニラーゼの製造方法について説明する。本発明のD-サクシニラーゼの製造は、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。ベクターとしては、原核および/または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明のD-サクシニラーゼの遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターDNAを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Taqポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなDNAポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、TAクローニングによるベクターへの接続も可能である。また、宿主細胞としては、従来公知のものが使用可能であり、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物などが挙げられ、より好ましくは微生物が挙げられ、特に好ましくは大腸菌例えば、K12株、B株などが挙げられる。形質転換体の調製は、常法に従って行えばよい。得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子から本発明のD-サクシニラーゼが発現されて、形質転換体中に蓄積する。形質転換体中に蓄積した本発明のD-サクシニラーゼは、未精製のまま用いることができるが、精製したものを使用しても良い。この精製方法としては、従来公知のものが使用可能であり、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこからタンパク質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGE、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEなどの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。次に、本発明のD-サクシニラーゼをサクシニルアミノ酸ラセマーゼと組み合わせて用いてD-アミノ酸を製造する方法について説明する。本発明によれば、D-アミノ酸は、本発明のD-サクシニラーゼを用いてN-サクシニル-DL-アミノ酸ラセミ体中のN-サクシニル-D-アミノ酸D体を効率的に加水分解する工程によって製造される。この工程は、具体的には、適当な溶液中に、本発明のD-サクシニラーゼと原料のN-サクシニル-DL-アミノ酸を溶解させて反応液を調製し、この反応液を適当な条件に設定することによって行うことができる。使用する溶液は、蒸留水でもよいが、必要により、リン酸塩やトリスなどの緩衝剤を使用してもよい。緩衝剤を使用する場合、その濃度は20~200mMであることが好ましく、pHは6~8であることが好ましい。本発明のD-サクシニラーゼは、反応液中1~10000mg/L10~100000U/Lの濃度で使用されることが好ましい。本発明のD-サクシニラーゼと反応させるN-サクシニル-DL-アミノ酸は、種々の公知の方法によって合成することができ、例えばSakaiA.etal.,Biochemistry,2006,4514,4455-62に記載の方法によって合成することができる。原料のDL-アミノ酸の種類は、製造したいD-アミノ酸の種類に応じて適宜選択すればよく、天然に存在する20種のアミノ酸および非天然アミノ酸およびその誘導体であることができる。反応液中のN-サクシニル-DL-アミノ酸の濃度は、特に限定されないが、一般的に1重量~30重量である。本発明のD-アミノ酸の製造方法では、反応を進行させる温度は、本発明のD-サクシニラーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には5~60°Cが好ましく、10~55°Cがより好ましく、30~50°Cがさらに好ましい。また、反応時のpHは、本発明のD-サクシニラーゼが十分作用するpHであれば特に限定されないが、一般的にはpH5~10が好ましく、pH6~9がより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、一般的に1~120時間程度、好ましくは1~72時間程度、さらに好ましくは1~24時間程度である。反応時間は、製造したいD-アミノ酸の種類と所望の収量、収率、使用する酵素や基質の量、量比、反応温度や反応pHなどを考慮し、実験的に適宜選択することができる。なお、本発明のD-アミノ酸の製造方法で使用するD-サクシニラーゼは、精製されたものや未精製のもの粗酵素液などに限定されず、形質転換体中に含まれた状態のものであってもよい。この場合は、形質転換体を反応系に添加して、形質転換体を培養させながら同時に反応を進行させるか、又は予め培養された形質転換体を反応系に添加すればよい。本発明のD-アミノ酸の製造方法は、N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてN-サクシニル-L-アミノ酸をラセミ化してN-サクシニル-D-アミノ酸を生成させる工程をさらに含む。本発明のD-サクシニラーゼは、N-サクシニル-DL-アミノ酸ラセミ体中のN-サクシニル-D-アミノ酸を主に加水分解するため、このままではラセミ体のうち、N-サクシニル-L-アミノ酸の多くが無駄になってしまう。そこで、N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてN-サクシニル-L-アミノ酸をラセミ化してN-サクシニル-D-アミノ酸を生成させてやれば、残ったN-サクシニル-L-アミノ酸もD-アミノ酸に変換することができる。N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、N-サクシニルアミノ酸のL体をD体に変換する反応とD体をL体に変換する反応の両方を触媒してその比率をほぼ等しくラセミ化する酵素である。本発明の製造方法で使用するN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、N-サクシニルアミノ酸をラセミ化することができれば特に限定されず、特開2007-82534号公報に記載されたN-アシルアミノ酸ラセマーゼや特開2008-61642号公報に記載されたN-アシルアミノ酸ラセマーゼなどの従来公知のものを使用することができる。N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてN-サクシニル-D-アミノ酸をラセミ化する反応は、例えば以下の条件でN-サクシニルアミノ酸、N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼおよび緩衝剤を含む反応溶液中で混合することにより行なう。反応温度は、使用するN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には25~70°Cが好ましく、37~60°Cがより好ましい。反応時のpHは、使用するN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼが十分作用するpHであれば特に限定されないが、一般的にはpH5~9が好ましく、pH6~8がより好ましい。N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、反応液中50~15000mg/L5000~1500000U/Lの濃度で使用されることが好ましい。N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、2価の金属イオンを0.1mM~1M好ましくは0.1~1mMの終濃度で添加することにより、活性が著しく向上する。添加する2価の金属イオンとしては、Mn2,Co2,Mg2,Fe2およびNi2が挙げられる。N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼの反応に用いる緩衝剤は、D-サクシニラーゼの反応に用いる緩衝剤と同様のものが使用できる。なお、特開2007-82534号に記載のN-アシルアミノ酸ラセマーゼは、その後の研究により、N-サクシニルアミノ酸をより好適な基質とするN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼであることが判明している。従って、特開2007-82534号に記載のN-アシルアミノ酸ラセマーゼは、本発明のD-サクシニラーゼと組合せて使用することができる。前述のN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼによるラセミ化反応とD-サクシニラーゼによる加水分解反応は、別々に行なうことも可能であるが、同時に行なわれることが好ましい。同時に行われる場合、微視的に見ると、まずN-サクシニル-DL-アミノ酸のうちD体が本発明のD-サクシニラーゼにより加水分解脱サクシニル化され、目的のD-アミノ酸が生成する。基質のD体が消費されるとラセミ状態が解消されるため、N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼはL体をD体に変換する反応をより促進する。N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼにより生成したN-サクシニル-D-アミノ酸は、本発明のD-サクシニラーゼにより順次D-アミノ酸へと分解される。この繰返しにより、理論的にはほぼすべてのN-サクシニル-DL-アミノ酸をD-アミノ酸に変換することができる。ラセミ化反応および加水分解反応を同時に行う場合の反応条件は、N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼおよび本発明のD-サクシニラーゼが活性を発揮する条件の範囲内であれば特に限定しないが、基質濃度0.01重量~30重量、pH5~9、温度40~50°Cで行うことが好ましい。ラセミ化反応および加水分解反応に要する時間は、原料として用いるN-サクシニル-DL-アミノ酸が、所望する量のD-アミノ酸へと変換し得るまでの時間であれば特に制限されず、仕込み量によっても異なるが、一般的に1日~7日程度である。本発明において使用するD-サクシニラーゼのアシラーゼ活性は、例えば以下のD-アミノ酸オキシダーゼ法により測定することができる。<試薬>10mMN-サクシニル-D-バリン1.0U/mLペルオキシダーゼ東洋紡製PEO-3011.0mM4-アミノアンチピリン第一化学薬品製1.0mMTOOS同人化学研究所製6.0U/mLD-アミノ酸オキシダーゼバイオザイム製DOX2を含む25mMリン酸緩衝溶液を反応試薬とする。なお、N-サクシニル-D-バリンの合成は、例えば以下のようにして行うことができる。D-バリンナカライテスク製、4.7gと無水コハク酸ナカライテスク製、4.0gを40mLの酢酸ナカライテスク製に溶解させる。次に、溶液を50~60°Cに加熱し、溶媒を揮発させて結晶化させる。次に、結晶化した白い沈殿を集めて、酢酸エチル20mLとメタノール20mLの混合液中で再結晶化させる。そして、沈殿を乳鉢で破砕し、乾燥させ、N-サクシニル-D-バリンを得る。詳細は非特許文献1に記載されている。<測定条件>反応試薬2.7mLを37°Cで5分間予備加温する。酵素溶液0.3mLを添加しゆるやかに混和後、水を対照に37°Cに制御された分光光度計で、555nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化ΔODTESTを測定する。盲検は酵素溶液の代わりに酵素を溶解する溶液を試薬混液に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化ΔODBLANKを測定する。これらの値から次の式に従ってD-サクシニラーゼ活性を求める。ここでD-サクシニラーゼ活性における1単位Uとは、上記条件下で1分間に1マイクロモルのD-アミノ酸を生成する酵素量として定義する。数1活性U/mL={ΔODTEST-ΔODBLANK×3.0×希釈倍率}/{31.0×0.3×1/2×1.0}なお、式中の3.0は反応試薬酵素溶液の液量mL、31.0は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数cm2/マイクロモル、1/2は酵素反応で生成したH2O2の1分子から形成するQuinoneimine色素が1/2分子であることによる係数、0.3は酵素溶液の液量mL、1.0はセルの光路長cmを示す。以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。[実施例1]D-サクシニラーゼのスクリーニング本発明菌株は、以下の方法により土壌中よりスクリーニングを行い単離した。培地として、硝酸アンモニウム0.2、リン酸二水素カリウム0.2、リン酸水素二ナトリウム0.3、硫酸マグネシウム7水塩0.05、酵母エキス0.01、ポリペプトン0.01、誘導物質N-サクシニル-D-フェニルアラニン0.2を含むpH7.5の培地に少量の土壌を加え、35°Cで試験管振盪培養することで、土壌より集積培養を数回実施した。同様の培地で寒天2を含むシャーレ培地を作成し、集積培養を行った培養液をプレートアウトし、単離コロニーとした。単離されたコロニーを、再度上記培地で試験管振盪培養し、以下の方法でD-サクシニラーゼ活性を持った菌株をセレクトした。HPLC分析による産生菌の選抜:コロニー単離された菌株培養液中の、N-サクシニル-D-フェニルアラニンに対して強い活性を示す菌株をセレクトするため、下記のHPLCによる分析を行った。カラム:InertsilODS-25μm、4.6mmφ×150mmGLSciencesInc.、移動相:pH2.3リン酸水溶液:アセトニトリル=80:20、温度:40°C、流速:1.0mL/min、検出:210nmの条件で、培養後遠心分離した培養上清液中のN-サクシニル-D-フェニルアラニンの分解とD-フェニルアラニンの生成を、N-サクシニル-D-フェニルアラニン、及びD-フェニルアラニンが溶出される時間のピーク面積より分析した。このような方法を経て得られた菌株は、下記の菌学的性質を有するものであった。この菌株をクプリアビダスエスピー.P4-10-CCupriavidussp.P4-10-Cと命名した。細菌学試験I1.細胞形態:桿菌0.7-0.8×1.2-2.0μm2.グラム染色性:陰性3.胞子の有無:陰性4.運動性:あり5.コロニー状態培地:Nutrientagar培養時間:24Hr直径:2.0-3.0mm色調:淡黄色形:円形隆起状態:レンズ状周縁:全縁表面の形状:スムーズ透明度:不透明粘調度:バター状6.生育温度試験:37°C生育45°C生育7.カタラーゼ反応:陽性8.オキシダーゼ反応:陽性9.グルコースからの酸/ガス生産酸生産/ガス生産:陰性/陰性10.O/Fテスト酸化/発酵:陰性/陰性細菌学試験III1.クエン酸の利用Simmons法:陽性2.でんぷんの加水分解:陰性3.リパーゼ活性Tween20:陰性4.D-リボースからの酸産生:陰性5.イノシトールからの酸産生:陰性6.マンニトールからの酸産生:陰性7.L-アラビノースからの酸産生:陰性以上の生化学的、菌学的諸性質の結果、運動性を有するグラム陰性桿菌で、グルコースを酸化せずカタラーゼ及びオキシダーゼが陽性を示し、Cupriavidusの一般性状と一致する。API試験の結果、C.gilardiiの性状と類似する点も多いが、クエン酸の利用、イノシトールを酸化しない点は異なる。さらに、BLASTをもちいたアポロンDB-BA4.0に対する相同性検索上位株の16SrDNAによる簡易分子系統の結果、C.gilardiiの16SrDNAとクラスターを形成し近縁である事を示した。しかし、配列間に21塩基の相違点があり、C.gilardiiに近縁なCupriavidussp.とする事が妥当であった。この事から、自然界より新たに発見した微生物はクプリアビダスCupriavidus属に属する細菌に分類された。なお、本発明で発見した菌株は、クプリアビダスエスピー.P4-10-CCupriavidussp.P4-10-Cとして、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERMBP-11387として国際寄託されている国際寄託日:2011年6月28日。[実施例2]クプリアビダスエスピー.P4-10-C株の生産するD-サクシニラーゼの精製クプリアビダスエスピー.P4-10-C株を、普通ブイヨン栄研1.8、粉末酵母エキスD-30.2和光純薬工業株製、Code:390-00531、カザミノ酸ダイゴ0.1和光純薬工業株製、Code:392-00655、リン酸水素二カリウム0.3、グルコース0.2を添加したpH7.5の培地で、500mLフラスコに200mL培地を加えオートクレーブ滅菌した培地27本を用い35°C、150r/min、回転攪拌で2日間培養した。培養終了時の濁度ABS660nmは2.7で、pH8.6であった。培養後、冷却遠心分離機日立工機株製を用い、8000r/minで30分間遠心分離を行い集菌した。集菌した菌体を、20mmol/LHEPES-NaOHpH7.5緩衝液で洗浄した後、再度遠心分離し、菌体36gを得た。取得菌体量の約3倍の20mMHEPES-NaOHpH7.5緩衝液100mLで懸濁後、氷冷下の超音波細胞破砕装置BD-1東湘電気株製を用い、5分サイクルで10回超音波破砕を行った。破砕後、高速冷却遠心機日立工機株製で8000r/min、4°C、60分間遠心分離し、上清液178mLを得た。これを粗酵素液とした。なお、本菌株は培養時にN-サクシニル-D-フェニルアラニンを添加しなくともD-サクシニラーゼを産生した。粗酵素液を透析チューブに詰め、20mMHEPES-NaOHpH7.51.2M硫酸アンモニウム含有緩衝液中に投入し、低温室内4°Cで攪拌を行いながら、数回緩衝液を交換し一昼夜透析を行った。透析終了後、高速冷却遠心機日立工機株製で4000r/min、4°C、30分間遠心分離し、上清液100mLを得た。この上清液を、予め20mMHEPES-NaOHpH7.51.2M硫酸アンモニウム含有緩衝液で平衡化したButyl-TOYOPEARL650Mカラム東ソー株製3.2cmφ×20cmに供して目的酵素を吸着させ、20mMHEPES-NaOHpH7.51.2M硫酸アンモニウム含有緩衝液と20mMHEPES-NaOHpH7.5緩衝液を総量2000mL用い、直線濃度勾配法で酵素を溶出し、D-サクシニラーゼ活性のある画分を回収した。Butyl-TOYOPEARLで得られた活性画分を70硫酸アンモニウム飽和にて濃縮し、遠心分離10,000r/min、4°C、60分間にて沈殿を回収した。回収した沈殿を、5mMリン酸緩衝液pH7.2で透析した。この透析した酵素液33mLを、予め5mMリン酸緩衝液pH7.2で平衡化したMacro-PrepCHTTypeIBIO-RAD社製ハイドロキシアパタイトカラム1.6cmφ×20cmに吸着させた。次に、5mMリン酸緩衝液pH7.2と300mmol/Lリン酸緩衝液pH7.2を総量150mL用いて直線濃度勾配法で酵素を溶出し、D-サクシニラーゼ活性のある画分を回収した。Macro-PrepCHTTypeIにより得られた活性画分130mLを、ビバスピン20ザルトリウス株製分画分子量10000の限外ろ過膜を用いて、20mLに濃縮した。回収した濃縮液を、20mMHEPES-NaOHpH7.5酸緩衝液で透析した。この透析液を、予め20mMHEPES-NaOHpH7.5緩衝液で平衡化したHiTrapQF.F.カラム5mLGEヘルスケアバイオサイエンス社製に供し、続いて20mMHEPES-NaOHpH7.5と20mMHEPES-NaOHpH7.50.3M塩化ナトリウム酸緩衝液を総量200mL用いて直線濃度勾配法で酵素を溶出し、D-アミノアシラーゼ活性のある画分を回収した。D-サクシニラーゼ活性が確認された画分の少量を定法のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGE分析に供し、不純蛋白質が混在しない画分を回収し、新規D-サクシニラーゼを得た。精製後の電気泳動結果を図1に示す。[実施例3]クプリアビダスエスピー.P4-10-C株の生産するD-サクシニラーゼの酵素学的性質実施例2で得られたD-サクシニラーゼの酵素学的性質を、以下の方法で測定した。1.分子量定法のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法SuperSepAce10-20和光純薬社製で測定を行った。タンパク質分子量マーカー積水メディカル株製、タンパク質分子量マーカー第一IIIこのマーカーは、フォスフォリラーゼb97,400ダルトン、ウシ血清アルブミン66,267ダルトン、アルドラーゼ42,400ダルトン、カルボニックアンヒドラーゼ30,000ダルトン、トリプシンインヒビター20,100ダルトン、及びリゾチーム14,400ダルトンを含むの移動度より分子量を求めた。分子量は50~70kダルトンと20~30kダルトンのサブユニットを含有するヘテロダイマーであった図1。2.基質特異性前記したD-アミノ酸オキシダーゼ法ただし、N-サクシニル-D-トリプトファン、N-サクシニル-D-フェニルアラニン、N-サクシニル-D-セリンに対する活性値を測定する場合は、反応基質として10mMN-サクシニル-D-バリンではなく、10mMN-サクシニル-D-トリプトファン、10mMN-サクシニル-D-フェニルアラニン、10mMN-サクシニル-D-セリンを使用し、それぞれ測定する。並びに以下に記載のHPLC分析法に則り、以下のN-サクシニル-D-アミノ酸を反応させて確認を行った。アミノ酸オキシダーゼが作用しにくいN-サクシニル-D-アスパラギン酸、N-サクシニル-D-アスパラギン、N-サクシニル-D-グルタミン酸に対しては、HPLC測定によりカラム:InertsilODS-25μm、4.6mmφ×150mmGLSciencesInc.、移動相:pH2.3リン酸水溶液:アセトニトリル=90:10、温度:40°C、流速:0.5mL/min、検出:210nmの条件で、D-アミノ酸の検量線を作成し、反応液を分析し、D-アミノ酸濃度を測定した。基質側鎖のタイプによる活性の差異を検討するため、カルボキシ基を持ったN-サクシニル-D-グルタミン酸、N-サクシニル-D-アスパラギン酸、カルボキシ基がアミド化されているN-サクシニル-D-アスパラギン、疎水性の芳香環を有するN-サクシニル-D-フェニルアラニン、N-サクシニル-D-トリプトファン、疎水性の脂肪族炭化水素基を有するN-サクシニル-D-バリン、親水性のヒドロキシ基を有するN-サクシニル-D-セリンについて実験を行なった。その結果を表4に示す。表4から明らかなように、側鎖による差異はあるものの、実施例2で得られたD-サクシニラーゼは、様々なタイプのアミノ酸に対し酵素活性を示すことが確認された。さらに、10mMの各種N-サクシニル-D-アミノ酸をD-アミノ酸へ加水分解する能力について、実施例2で得られたD-サクシニラーゼと公知D-アミノアシラーゼアマノ和光純薬工業株式会社コード:329-61063、特開2001-000185、アルカリゲネスキシロースオキシダンスサブスピーシーズキシロースオキシダンスA-6株由来を比較した。その結果を表5に示す。表5から明らかなように、実施例2で得られたD-サクシニラーゼは、基質により異なるが、公知のD-アミノアシラーゼアマノより約1000倍以上優れていた。測定方法は、実施例2で得られたD-サクシニラーゼについては、上述のD-アミノ酸オキシダーゼ並びにHPLC分析法に則って行った。また、公知D-アミノアシラーゼアマノについては、0.1mMの塩化コバルトを含む溶液中で反応させ、すべてHPLC分析法に則って行った。実施例2で得られたD-サクシニラーゼのN-サクシニル-D-アミノ酸からD-アミノ酸への加水分解活性は12U/mg以上である。3.温度安定性及び至適温度実施例2で得られたD-サクシニラーゼ酵素液を用いて、D-アミノ酸オキシダーゼ法で温度安定性と至適温度を調べた。温度安定性は酵素液0.2mg/mLをpH7.5のリン酸緩衝溶液中で4°C、40°C、50°C、55°C、60°C、65°C、又は70°Cで60分間処理し、その酵素活性を求めた。至適温度は、酵素液0.01mg/mLをpH7.5のリン酸緩衝溶液中で反応温度を30°Cから60°Cまで変化させ、その酵素活性を求めた。温度安定性の評価は4°Cで処理した場合を100とした残存相対活性で示した。また、至適温度の評価は50°Cにおける酵素活性を100とした相対活性で示した。結果を図2温度安定性及び図3至適温度に示す。図2から明らかなように、本酵素は、50°Cの熱処理によってもその酵素活性は、4°Cで処理したときの90以上の活性を維持することが分かった。また、図3から明らかなように、本酵素の至適温度は45°Cから50°C付近である。なお、至適温度とは、酵素濃度0.01mg/mL、リン酸緩衝溶液pH7.5において、30°C、40°C、45°C、50°C、60°Cでそれぞれ5分間反応させた場合の活性が、最も高かった温度を100としたときの相対値で80以上である温度範囲を示す。4.至適pH実施例2で得られたD-サクシニラーゼ酵素液0.01mg/mLを用いて、上記記載のHPLC分析法で至適pHを調べた。緩衝溶液にはリン酸緩衝溶液pH5.5-pH7.5、Tris-HClpH7.5-pH8.5、ホウ酸緩衝溶液pH8.5-pH10.0を用い、それぞれのpHで37°C、60分間反応させた後、その酵素活性を求めた。pH安定性の評価は、pH=7.45の場合を100とした相対活性で示した。結果は図4に示す。図4から明らかなように、本酵素は、pH=6.99~8.40で、pH=7.45で処理したときの80以上の活性を示した。5.金属イオンの影響実施例2で得られたD-サクシニラーゼ酵素液0.01mg/mLを用いて、以下の表6に示す様々な2価の金属イオンをそれぞれ終濃度1mM存在下で37°C、60分間反応させ、D-サクシニラーゼ活性を上記記載のHPLC分析法で測定し、無添加の酵素活性を100とした相対活性で示した。結果を表6に示す。表6から明らかなように、本酵素活性は、金属イオンによる顕著な影響を受けなかった。[実施例4]クプリアビダスエスピー.P4-10-C株由来のD-サクシニラーゼ遺伝子の単離1.部分配列の取得SDS-PAGE後に該酵素に相当するバンドをアクリルアミドゲル上からPVDF膜Bio-Rad:シーケーブロットPVDFメンブレンに転写し、N末端アミノ酸配列分析、内部アミノ酸配列分析を行い、約60kDaのバンドから内部アミノ酸配列;SNNWVIAGSRTSTGR、約23kDaのバンドからN末端アミノ酸配列;APPTDRYAAPGLEKPと内部アミノ酸配列;MARDFGPAYVDGDRRを得た。これらの同定したアミノ酸配列をもとに縮重プライマーを合成し表8の配列番号9、10、クプリアビダスエスピーP4-10-Cより公知の方法で抽出したゲノムDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼKOD-Plus東洋紡製を用いて推奨する条件のもとでPCRを行った。該PCRで増幅されたPCR産物をクローニングキットTargetClone-Plus東洋紡製を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターpBluescriptにクローニングし、エシェリヒアコリーEscherichiacoliDH5α株コンピテントセル東洋紡製に形質転換し、形質転換体を取得した。該形質転換体をLB培地で培養し、プラスミドを抽出し、BigDye商標登録Terminatorv3.1CycleSequencingKitAppliedBiosystemsにより遺伝子配列を確認し、部分配列575bpを取得した。2.クプリアビダスエスピー.P4-10-C株からのゲノムDNAの取得培養液50mLの菌体を遠心分離操作に供し、菌体をゲノム抽出キット東洋紡:GenomicDNApurificationKitにて、そのプロトコールに従ってゲノム精製を行った。しかし、本キットで精製したゲノムDNAでは全長配列のクローニングのためのPCR反応において、長鎖のDNA断片を増幅させることが出来なかった。PCR条件を検討しても改善は見られなかったため、これはゲノムDNAの純度に問題があると考え、currentprotocolsinmolucularbiologyに記載されている公知の方法に基づいて、再びゲノムDNAの抽出を行った。まず、50mLの培地で培養し、集菌した菌体をTE50mMTris-HClpH8.0、20mMEDTAに懸濁して洗浄し、遠心分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を11.3mLのTEに懸濁した。さらに、この懸濁液に0.06mLの20mg/mLプロテイナーゼKナカライテスク製、及び0.6mLの10SDS溶液を加えた後、37°Cで1時間インキュベートした。インキュベート後、2mLの5MNaCl溶液を加え十分に攪拌した。その後、1.6mLのCTAB/NaCl溶液10CTAB/0.7MNaClを混合し、65°Cで10分間インキュベートした。インキュベート後、等量の25:24:1フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液で除タンパクを行った。通常の細菌であれば、この工程で水層に濁りは見られないが、本菌の場合、濁りが残っていた。そこで、もう一度、等量の25:24:1フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液で除タンパクを行った。これにより、濁りが完全に除去されたので、続いて、分離した水層に対して等量の24:1クロロホルム/イソアミルアルコールを加えて混合し、水層を回収した。これと等量のイソプロパノールを水層に加えてDNAを沈殿させ、回収した。沈殿したDNAを0.5mLのTEに溶解した後、5μlの10mg/mLRNaseを加えて、37°Cで一晩反応させた。反応後、等量の25:24:1フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液で除タンパクを行い、24:1クロロホルム/イソアミルアルコールを加えて攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに2回行った後に得られた水層に終濃度0.4Mとなるように3M酢酸ナトリウム溶液pH5.2を加え、さらに2倍容のエタノールを加えた。沈殿となって生じたDNAを回収し、70エタノールで洗浄、乾燥させ、1mLのTEに溶解させた。3.全長配列の取得次に上記のようにして得られたゲノムDNAを用いて全長配列を取得するために以下の操作を行った。TAKARALAPCRInVitroCloningKitタカラバイオを用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、既知配列からC末端方向へのDNA断片を増幅させることに成功し、開始コドンを含むN末端から既知の部分遺伝子配列までの塩基配列を決定した。しかしながら、上記キットではC末端側の塩基配列を決定することができなかったため、既知の塩基配列に基づき、遺伝子の外側方向に向けた2種類のプライマー表8の配列番号11、12を新たに設計した。このプライマーを用い、先に得たDNAを鋳型にInversePCR法を行った。これにより、既に取得した部分遺伝子より外側の遺伝子部分を含むDNA断片を取得し、C末端配列を決定した。続いて、酵素のN末端より上流と推定される部分にNdeIの切断部位を結合させた配列を有するDNAプライマー表8の配列番号34とC末端より下流と推定される部分にEcoRIの切断部位を結合させた配列を有するDNAプライマー表8の配列番号35を用いて、この配列の間のDNAを、先に得たDNAを鋳型にしたPCRにより増幅することで、D-サクシニラーゼ遺伝子の全長を含むDNA断片を取得した。得られたDNA断片の塩基配列を解析し、D-サクシニラーゼ遺伝子の全長が含まれていることを確認し、そのアミノ酸配列を推定した。本発明で得られたクプリアビダスエスピー.P4-10-C株由来D-サクシニラーゼ遺伝子をNCBI-BLASThttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにより検索すると、CupriavidusmelalliduransCH34のpeptidaseS45,penicillinamidaseACCESSIONNo.YP_587763として登録されている遺伝子と76の相同性を示した。このpenicillinamidaseが属しているpenicillinacylaseファミリーは、ペニシリンGやセファロスポリンC等を加水分解する酵素であり、このような酵素がN-サクシニル-D-アミノ酸を加水分解することを推定することは困難であり、機能から予測してホモロジー検索により本遺伝子を取得することは不可能に近い。また、これまでN-サクシニル-D-アミノ酸を加水分解する酵素は知られておらず、本発明におけるD-サクシニラーゼは、新規な酵素であるといえる。また、本発明においてクローニング及びN-サクシニル-D-アミノ酸の加水分解能の確認を行った同属のクプリアビダスメタリデュランス、クプリアビダスネケタ-及び、近縁属のラルストニアピケッティにおけるアミノ酸相同性比較においても約50から約80と、近縁属種においてもアミノ酸配列が大きく異なることが分かった表7。[実施例5]クプリアビダスメタリデュランス由来のD-サクシニラーゼの遺伝子の単離独立行政法人製品評価技術基盤機構よりクプリアビダスメタリデュランスNBRC番号101272の菌株を取得し、液体培地で培養した。培養して得た菌体から、ゲノム抽出キット東洋紡:GenomicDNApurificationKitによりゲノムを抽出した。遺伝子特異的プライマーを合成し表8の配列番号13、14、得られたゲノムを鋳型にDNAポリメラーゼKOD-Plus東洋紡製を用いたPCRによって遺伝子を取得した。クローニングキットTargetClone-Plus東洋紡製を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターpBluescriptにクローニングし、組換え発現プラスミドpDSACmを取得した。pDSACmをエシェリヒアコリEscherichiacoliDH5α株コンピテントセル東洋紡製に形質転換し、形質転換体を取得した。該形質転換体をLB培地で培養し、プラスミドを抽出し、BigDye商標登録Terminatorv3.1CycleSequencingKitAppliedBiosystemsにより遺伝子配列を確認し、アミノ酸配列を推定した。シークエンスに用いたプライマーを表8に示す表8の配列番号19,20,21,22,23,24。[実施例6]クプリアビダスネケタ-由来のD-サクシニラーゼ遺伝子の単離独立行政法人製品評価技術基盤機構よりクプリアビダスネケターNBRC番号102504の菌株を取得し、液体培地で培養した。培養して得た菌体から、ゲノム抽出キット東洋紡:GenomicDNApurificationKitによりゲノムを抽出し、遺伝子特異的プライマーを合成し表8の配列番号15、16、以下、実施例5に記載の方法と同様にして、遺伝子配列全長を取得し、アミノ酸配列を推定した。シークエンスに用いたプライマーを表8に示す表8の配列番号25,26,27,28,29。[実施例7]ラルストニアピケッティ由来のD-サクシニラーゼ遺伝子の単離独立行政法人製品評価技術基盤機構よりラルストニアピケッティNBRC番号102503の菌株を取得し、液体培地で培養した。培養して得た菌体から、ゲノム抽出キット東洋紡:GenomicDNApurificationKitによりゲノムを抽出し、遺伝子特異的プライマーを合成し表8の配列番号17、18、以下、実施例5に記載の方法と同様にして、遺伝子配列全長を取得し、アミノ酸配列を推定した。シークエンスに用いたプライマーを表8に示す表8の配列番号30,31,32,33。[実施例8]各種D-サクシニラーゼ遺伝子を発現する組換えプラスミドの作成1.クプリアビダスエスピー.P4-10-C株由来のD-サクシニラーゼ遺伝子の組換えプラスミド実施例4で得られたD-サクシニラーゼ遺伝子のN末端及びC末端部分にそれぞれ制限酵素NdeI及びEcoRIの切断部位を結合させた配列を有するプライマー表8の配列番号34、35を用いて、この間のDNAを、実施例4で得たゲノムDNAを鋳型にしたPCRにより増幅することで、オープンリーディングフレームを含むDNA断片を取得した。このDNA断片を制限酵素NdeIとEcoRIで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドpBSKと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬東洋紡製ライゲーションハイを加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてD-サクシニラーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドpBSKDSAP4-10-Cを取得した。2.クプリアビダスメタリデュランス由来のD-サクシニラーゼ遺伝子の組換えプラスミド実施例5で得られたpDSACmを制限酵素NdeI及びBamHIで処理し、DSA遺伝子を切り出し、同酵素で切断したベクタープラスミドpBSKと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬東洋紡製ライゲーションハイを加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてD-サクシニラーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドpBSKDSACmを取得した。3.クプリアビダスネケター由来のD-サクシニラーゼ遺伝子の組換えプラスミド実施例6で得られたpDSACnを制限酵素NdeI及びPstIで処理し、DSA遺伝子を切り出し、同酵素で切断したベクタープラスミドpBSKと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬東洋紡製ライゲーションハイを加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてD-サクシニラーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドpBSKDSACnを取得した。4.ラルストニアピケッティ由来のD-サクシニラーゼ遺伝子の組換えプラスミド実施例7で得られたpDSARpを制限酵素NdeI及びBamHIで処理し、DSA遺伝子を切り出し、同酵素で切断したベクタープラスミドpBSKと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬東洋紡製ライゲーションハイを加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてD-サクシニラーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドpBSKDSARpを取得した。[実施例9]各種D-サクシニラーゼ遺伝子のE.coliにおける発現実施例8で構築したプラスミド:pBSKDSAP4-10-C、pBSKDSACmpBSKDSACn、及びpBSKDSARpをそれぞれ、エシェリヒアコリDH5α株コンピテントセル東洋紡績製コンピテントハイDH5αに当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した5mLのLB液体培地アンピシリン50μg/mLを含むに植菌後、37°Cで20時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、25mMリン酸緩衝溶液pH7.5に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、各種由来の形質転換体におけるD-サクシニラーゼ粗酵素液を取得した。これらの粗酵素液100μlに150mMN-サクシニル-D-アミノ酸100μlと25mMリン酸緩衝液pH7.5800μlを加えて、37°Cで16時間反応させた。その反応液の一部をTLCプレートメルク社製に供し、ブタノール:酢酸:水3:1:1、v/vからなる展開溶媒で展開し、ニンヒドリンスプレーにより、各種D-アミノ酸を検出した。結果を図5に示す。図5中のTrp、Phe、Val、Ser、Asp、Asn、Gluはそれぞれ、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸を示す。また、色は、ニンヒドリンスプレーで発色した時の色を示す。その結果、クプリアビダスエスピーP4-10-C及びクプリアビダスメタリデュランス由来のD-サクシニラーゼについて強いD-サクシニラーゼ活性を確認することができ、クプリアビダスネケター及びラルストニアピケッティ由来のD-サクシニラーゼについても一定のD-サクシニラーゼ活性を確認することができた。[実施例10]形質転換体からのクプリアビダスエスピーP4-10-C由来のD-サクシニラーゼの調製実施例9で得られたpBSKP4-10-Cを形質転換した形質転換体のコロニーを、500mLの坂口フラスコに入った60mLのLB培地アンピシリン50μg/mLを含むに植菌し、振とう数180rpmで30°C、16時間培養し、種培養液とした。この種培養液を10L容ジャーファーメンターに入った6LのLB培地アンピシリン50μg/mLを含むに接種し、振とう数420rpm、30°Cで21時間培養した。培養終了時の濁度Abs660nmは32.7であった。このようにして得られた菌体を遠心分離で集菌し、25mMリン酸緩衝溶液pH7.5に懸濁し、フレンチプレス破砕機を用いて破砕した。得られた粗酵素液の硫安分画処理を行った後、HiTrapOctylFFカラム5mLGEヘルスケアバイオサイエンス社製、HiTrapCMFFカラム5mLGEヘルスケアバイオサイエンス社製により分離精製した。本方法により得られたD-サクシニラーゼをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGE分析に供したところ、ほとんど不純蛋白質が存在しないことが確認できたので、これを用いて、以下の実施例における酵素特性の評価及びD-アミノ酸製造を行った。[実施例11]形質転換体の生産するD-サクシニラーゼの酵素学的性質1.形質転換体の生産するD-サクシニラーゼの至適温度及び熱安定性実施例10で得られた形質転換体の生産するD-サクシニラーゼ酵素液を用いて、D-アミノ酸オキシダーゼ法で温度安定性と至適温度を調べた。温度安定性は、酵素液を所定の温度で3時間加熱させた後、氷冷し、残存する活性を求めた。至適温度は、反応温度を30°Cか65°Cまで変化させ、その酵素活性を求めた。温度安定性の評価は、4°Cで処理した場合を100とした残存相対活性で示した。また、至適温度の評価は、50°Cにおける酵素活性を100とした相対活性で評価した。結果は図6温度安定性及び図7至適温度に示した。図6及び7から明らかなように、本酵素は、50°Cで処理しても4°Cで処理したときの100の活性を維持し、反応至適温度は45°Cから50°Cを示した。2.形質転換体の生産するD-サクシニラーゼの至適pH及びpH安定性実施例10で得られた形質転換体の生産するD-サクシニラーゼ酵素液を用いて、D-アミノ酸オキシダーゼ法及びHPLC分析法でpH安定性と至適pHを調べた。緩衝溶液には酢酸緩衝溶液pH4.5~pH5.5、リン酸緩衝溶液pH5.5~pH7.5、Tris-HClpH7.5~pH8.5、又はホウ酸緩衝溶液pH8.5~pH10.0を用い、pH安定性は、25°Cで20時間処理した後の酵素活性を求め、至適pHは、それぞれのpHで60分間反応させた後の酵素活性を求めた。酵素活性は、pH7.5pH安定性、pH7.0至適pHの場合をそれぞれ100とした相対活性で示した。結果は、図8pH安定性及び図9至適pHに示した。図8及び9から明らかなように、本酵素は、pH6~8で高い活性を示し、pH4~pH10の範囲においてリン酸緩衝溶液pH7.5で処理したときの80以上の活性を示し、広い範囲のpHで極めて安定であった。4.形質転換体の生産するD-サクシニラーゼの金属イオンの影響実施例10で得られた形質転換体の生産するD-サクシニラーゼ酵素液を用いて、以下の表9に示す様々な2価の金属イオンをそれぞれ終濃度1mM存在下で37°C、60分間反応させ、D-サクシニラーゼ活性をHPLC分析法で測定し、無添加の酵素活性を100とした相対活性で示した。結果を表9に示す。表9から明らかなように、本酵素活性は、金属イオンによる顕著な影響を受けなかった。5.形質転換体の生産するD-サクシニラーゼの阻害剤の影響実施例10で得られた形質転換体の生産するD-サクシニラーゼ酵素液を用いて、以下の表10に示す様々な阻害剤をそれぞれ終濃度1mM存在下で37°C、60分間反応させ、D-サクシニラーゼ活性をHPLC分析法で測定し、無添加の酵素活性を100とした相対活性で示した。結果を表10に示す。表10から明らかなように、本酵素はDTTやEDTA、N-エチルマレイミドでは阻害されず、PCMBやヨードアセトアミド、ヨード酢酸などのシステイン修飾剤で阻害されることから、システイン残基が酵素活性や酵素の安定性等に関与していることがわかった。[実施例12]N-サクシニル-DL-フェニルアラニン、N-サクシニル-DL-トリプトファン及びN-サクシニル-DL-ビフェニルアラニンの合成DL-フェニルアラニン10g和光純薬社製、Code:168-01312と水酸化ナトリウム7.3g和光純薬社製、Code:198-13765を150mLの水に溶解させ、これに無水コハク酸18.7g和光純薬社製、Code:198-04355と水酸化ナトリウム7.3gを添加しながら50°C以下で反応させた。これを減圧濃縮し塩酸和光純薬社製、Code:087-01076でpH2以下に中和し、粗結晶を得た。次に、粗結晶をn-ヘキサン和光純薬社製、Code:085-00416で再結晶させ、沈殿をろ取し、沈殿を粉砕乾燥させN-サクシニル-DL-フェニルアラニン45gを得た。DL-フェニルアラニンをDL-トリプトファン又はDL-ビフェニルアラニンに変更した以外は同様の手順で、N-サクシニル-DL-トリプトファン及びN-サクシニル-DL-ビフェニルアラニンを得た。[実施例13]D-サクシニラーゼを用いた、N-サクシニル-DL-フェニルアラニンからのD-フェニルアラニンの合成5重量N-サクシニル-DL-フェニルアラニン水溶液pH7.510mLを基質として用い、形質転換体のD-サクシニラーゼ酵素液0.05mgを添加し、45°Cで3日間反応させたときのN-サクシニル-DL-フェニルアラニンからのフェニルアラニンの加水分解率と光学活性を、以下のHPLC測定法により算出した。酵素での加水分解によるフェニルアラニンの生成率は、カラム:InertsilODS-25μm、4.6mmφ×150mmGLSciencesInc.、移動相:pH2.3リン酸水溶液:アセトニトリル=80:20、温度:40°C、流速:1.0mL/min、検出:210nmの条件でフェニルアラニンのピーク面積値で測定した。生成したフェニルアラニンの光学活性体比率は、カラム:CROWNPAKCR5μm、4.0mmφ×150mmダイセル化学工業株、移動相:過塩素酸水溶液pH2.0、温度:15°C、流速:1.0mL/min、検出:210nmの条件で測定した。結果を図10に示す。図10から明らかなように、形質転換体のD-サクシニラーゼをN-サクシニル-DL-フェニルアラニン水溶液に添加する反応系で、反応3日目で反応液中のN-サクシニル-DL-フェニルアラニンの50以上が加水分解され、さらに、D-フェニルアラニンのうち90、L-フェニルアラニンのうち10が加水分解された。このことから、本D-サクシニラーゼは、L-フェニルアラニンにも作用するが、D-フェニルアラニンにより強く作用することが明らかである。[実施例14]D-サクシニラーゼ及びサクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いた、N-サクシニル-DL-フェニルアラニンからのD-フェニルアラニンの合成5重量N-サクシニル-DL-フェニルアラニン水溶液pH7.510mLを基質として用い、形質転換体のD-サクシニラーゼ酵素液0.05mgとクロロフレクサスオーランティアカス由来のサクシニルアミノ酸ラセマーゼ配列番号36溶液50mgを添加し、45°Cで4日間反応させたときのN-サクシニル-DL-フェニルアラニンからのD-フェニルアラニンの加水分解生成率、並びに光学活性体比率を、以下のHPLC測定法により算出した。加水分解生成率は、カラム:InertsilODS-25μm、4.6mmφ×150mmGLSciencesInc.、移動相:pH2.3リン酸水溶液:アセトニトリル=80:20、温度:40°C、流速:1.0mL/min、検出:210nmの条件で測定した。光学活性体比率は、カラム:CROWNPAKCR5μm、4.0mmφ×150mmダイセル化学工業株、移動相:過塩素酸水溶液pH2.0、温度:15°C、流速:1.0mL/min、検出:210nmの条件で測定した。酵素反応前と反応後の、基質のピーク面積値より加水分解率を算出した。さらに、生成したフェニルアラニンの光学活性体比率を算出した。結果を図11に示す。図11から明らかなように、本酵素D-サクシニラーゼとサクシニルアミノ酸ラセマーゼを、N-サクシニル-DL-フェニルアラニン水溶液に添加する反応系で、反応4日目で反応液中のN-サクシニル-DL-フェニルアラニンの80以上がD-フェニルアラニンへ変換された。また、サクシニルアミノ酸ラセマーゼを反応系に共存させたことで、大量に残存するN-サクシニル-L-フェニルアラニンのN-サクシニル-DL-フェニルアラニンへの変換、さらにD-フェニルアラニンへの加水分解反応が優先的に進み、L-フェニルアラニンの生成を抑制することに成功した。反応4日目の光学純度は93.6eeであった。[実施例15]D-サクシニラーゼ及びサクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いた、N-サクシニル-DL-トリプトファンからのD-トリプトファンの合成5重量N-サクシニル-DL-トリプトファン水溶液pH7.510mLを基質として用い、形質転換体のD-サクシニラーゼ酵素液0.05mgとクロロフレクサスオーランティアカス由来のサクシニルアミノ酸ラセマーゼ配列番号36溶液50mgを添加し、45°Cで4日間反応させたとき、N-サクシニル-DL-トリプトファンからD-トリプトファンの加水分解生成率、並びに光学活性体比率を、以下のHPLC測定法により算出した。加水分解生成率は、カラム:InertsilODS-25μm、4.6mmφ×150mmGLSciencesInc.、移動相:pH2.3リン酸水溶液:アセトニトリル=80:20、温度:40°C、流速:1.0mL/min、検出:210nmの条件で測定した。光学活性体比率は、カラム:CROWNPAKCR5μm、4.0mmφ×150mmダイセル化学工業株、移動相:過塩素酸水溶液pH2.0/メタノール=90/10、温度:15°C、流速:0.7mL/min、検出:210nmの条件で測定した。酵素反応前と反応後の、基質のピーク面積値より加水分解率を算出した。さらに、生成したトリプトファンの光学活性体比率を算出した。結果を図12に示す。図12から明らかなように、本酵素D-サクシニラーゼとサクシニルアミノ酸ラセマーゼを、N-サクシニル-DL-トリプトファン水溶液に添加する反応系で、反応4日目で反応液中のN-サクシニル-DL-トリプトファンの80以上が加水分解された。反応4日目の光学純度は96.1eeであった。[実施例16]D-サクシニラーゼ及びサクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いた、N-サクシニル-DL-ビフェニルアラニンからのD-ビフェニルアラニンの合成5重量N-サクシニル-DL-ビフェニルアラニン水溶液pH7.510mLを基質として用い、形質転換体のD-サクシニラーゼ酵素液0.05mgとクロロフレクサスオーランティアカス由来のサクシニルアミノ酸ラセマーゼ配列番号36溶液50mgを添加し、45°Cで3日間反応させたとき、N-サクシニル-DL-ビフェニルアラニンからD-ビフェニルアラニンの加水分解生成率、並びに光学活性体比率を、以下のHPLC測定法により算出した。加水分解生成率は、カラム:InertsilODS-25μm、4.6mmφ×150mmGLSciencesInc.、移動相:pH2.3リン酸水溶液:アセトニトリル=80:20、温度:50°C、流速:1.5mL/min、検出:210nmの条件で測定した。光学活性体比率は、カラム:CROWNPAKCR5μm、4.0mmφ×150mmダイセル化学工業株、移動相:過塩素酸水溶液pH2.0/メタノール=85/15、温度:50°C、流速:1.5mL/min、検出:210nmの条件で測定した。酵素反応前と反応後の、基質のピーク面積値より加水分解率を算出した。さらに、生成したビフェニルアラニンの光学活性体比率を算出した。結果を図13に示す。図13から明らかなように、本酵素D-サクシニラーゼとサクシニルアミノ酸ラセマーゼを、N-サクシニル-DL-ビフェニルアラニン水溶液に添加する反応系で、反応3日目で反応液中のN-サクシニル-DL-ビフェニルアラニンの99以上が加水分解された。反応4日目の光学純度は88.3eeであった。"