ラクダ科動物VHドメイン、及びラムダ軽鎖クラスVλ又はカッパ軽鎖クラスVκのいずれかのラクダ科動物VLドメインを含み、少なくとも1つのアミノ酸置換が、該VHドメイン及び/又は該VLドメイン中に存在し、該アミノ酸置換複数可が、以下からなる群から選択されることを特徴とする、抗体:a該ラクダ科動物VHドメイン中のアミノ酸置換複数可、ここで、Kabatによる、該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94、及びH108からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVHドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される;並びにb該ラクダ科動物VLドメイン中のアミノ酸置換、ここで、該ラムダ軽鎖クラスVλのラクダ科動物VLドメインについて、Kabatによる、該ラクダ科動物Vλドメインの位置L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、及びL103からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVλドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換され;かつ該カッパ軽鎖クラスVκのラクダ科動物VLドメインについて、Kabatによる、該ラクダ科動物Vκドメインの位置K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104、及びK106からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVκドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される。前記ラクダ科動物VHドメインが、ヒトVH3ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H74、H77、H78、H82b、H83、H84、H86、H89、H93、又はH94のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH3ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項1記載の抗体。前記H74のアミノ酸が交換される、請求項1又は請求項2記載の抗体。前記H74のアミノ酸がS又はA、好ましくはSと交換される、請求項3記載の抗体。前記H83のアミノ酸が交換される、請求項1又は請求項2記載の抗体。前記H83のアミノ酸がR又はK、好ましくはRと交換される、請求項5記載の抗体。前記H84のアミノ酸が交換される、請求項1又は請求項2記載の抗体。前記H84のアミノ酸がA又はT、好ましくはAと交換される、請求項7記載の抗体。前記H94のアミノ酸が交換される、請求項1又は請求項2記載の抗体。前記H94のアミノ酸がRと交換される、請求項9記載の抗体。以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項2記載の抗体:好ましくはQ又はEと交換されたH1;好ましくはQ、R、又はKと交換されたH13;好ましくはPと交換されたH14好ましくはF又はVと交換されたH29;好ましくはS、D、又はGと交換されたH30;好ましくはV、F、又はI、最も好ましくはVと交換されたH37;好ましくはAと交換されたH40;好ましくはT又はSと交換されたH77;好ましくはL又はA、最も好ましくはLと交換されたH78;好ましくはSと交換されたH82b;好ましくはDと交換されたH86;好ましくはV又はL、最も好ましくはVと交換されたH89;好ましくはA又はTと交換されたH93。前記ラクダ科動物VHドメインがヒトVH1ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H7、H11、H12、H13、H69、H71、H78、H80、又はH86のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH1ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項1記載の抗体。前記H11のアミノ酸が、好ましくはVと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。前記H12のアミノ酸が、好ましくはKと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。前記H13のアミノ酸が、好ましくはKと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。前記H69のアミノ酸が、好ましくはI、M、又はS、最も好ましくはMと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。前記H71のアミノ酸が、好ましくはR、A、E、又はT、最も好ましくはRと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。前記H80のアミノ酸が、好ましくはMと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。前記H86のアミノ酸が、好ましくはDと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。前記H78のアミノ酸が、好ましくはV又はAと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。前記H1のアミノ酸が、好ましくはQ又はEと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。前記H7のアミノ酸が、好ましくはSと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。前記ラクダ科動物VHドメインがヒトVH4ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H16、H23、H30、H48、H49、H67、H68、H71、H81、H84、H85、H86のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH4ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項1記載の抗体。前記H16のアミノ酸が、好ましくはEと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H23のアミノ酸が、好ましくはA又はTと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H30のアミノ酸が、好ましくはSと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H48のアミノ酸が、好ましくはIと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H1のアミノ酸が、好ましくはQ又はEと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H67のアミノ酸が、好ましくはVと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H68のアミノ酸が、好ましくはTと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H71のアミノ酸が、好ましくはVと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H81のアミノ酸が、好ましくはKと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H84のアミノ酸が、好ましくはAと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H85のアミノ酸が、好ましくはAと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H86のアミノ酸が、好ましくはDと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。前記H108のアミノ酸が、好ましくはLと交換される、請求項1~35のいずれか一項記載の抗体。前記ラクダ科動物VLドメインが前記ラムダ軽鎖クラスVλに属し、かつKabatによる、該ラクダ科動物Vλドメインの位置L1、L2、L3、L5、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L81、L84、L103、L104、L108のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVラムダドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項1記載の抗体。ラクダ科動物VλドメインがヒトVλ1ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラクダ科動物Vλドメインの位置L11、L14、L18、L19、L38、L69、L74、L76、又はL80のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ1ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項37記載の抗体。以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項38記載の抗体:前記L11のアミノ酸が、好ましくはA又はVと交換される;前記L14のアミノ酸が、好ましくはA又はT、より好ましくはAと交換される;前記L18のアミノ酸が、好ましくはR又はK、より好ましくはRと交換される;前記L19のアミノ酸が、好ましくはVと交換される;前記L38のアミノ酸が、好ましくはQと交換される;前記L69のアミノ酸が、好ましくはTと交換される;前記L74のアミノ酸が、好ましくはA又はGと交換される;前記L76のアミノ酸が、好ましくはS又はTと交換される;前記L80のアミノ酸が、好ましくはS、T、又はAと交換される。前記ラクダ科動物VλドメインがヒトVλ2ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラクダ科動物Vλドメインの位置L3、L8、L14、L15、L17、L18、L39、L42、L47、L58、L59、又はL80のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ2ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項37記載の抗体。以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項40記載の抗体:前記L3のアミノ酸が、好ましくはAと交換される;前記L8のアミノ酸が、好ましくはA、P、又はRと交換される;前記L14のアミノ酸が、好ましくはSと交換される;前記L15のアミノ酸が、好ましくはPと交換される;前記L17のアミノ酸が、好ましくはQと交換される;前記L18のアミノ酸が、好ましくはSと交換される;前記L39のアミノ酸が、好ましくはH又はP、より好ましくはHと交換される;前記L42のアミノ酸が、好ましくはK又はT、より好ましくはKと交換される;前記L47のアミノ酸が、好ましくはMと交換される;前記L58のアミノ酸が、好ましくはVと交換される;前記L59のアミノ酸が、好ましくはP又はSと交換される;前記L80のアミノ酸が、好ましくはAと交換される。前記ラクダ科動物VλドメインがヒトVλ3ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラクダ科動物Vλドメインの位置L1、L2、L3、L5、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L19、L20、L44、L46、L49、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L76、L78、又はL84のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ3ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項37記載の抗体。以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項42記載の抗体:前記L1のアミノ酸が、好ましくはSと交換される;前記L2のアミノ酸が、好ましくはYと交換される;前記L3のアミノ酸が、好ましくはEと交換される;前記L5のアミノ酸が、好ましくはMと交換される;前記L7のアミノ酸が、好ましくはD又はPと交換される;前記L8のアミノ酸が、好ましくはP、S、L、又はH、好ましくはPと交換される;前記L9のアミノ酸が、好ましくはS又はAと交換される;前記L11のアミノ酸が、好ましくはVと交換される;前記L14のアミノ酸が、好ましくはA又はSと交換される;前記L15のアミノ酸が、好ましくはP、L、又はT、好ましくはPと交換される;前記L19のアミノ酸が、好ましくはA又はV、好ましくはAと交換される;前記L20のアミノ酸が、好ましくはR又はS、好ましくはRと交換される;前記L44のアミノ酸が、好ましくはPと交換される;前記L46のアミノ酸が、好ましくはLと交換される;前記L49のアミノ酸が、好ましくはYと交換される;前記L60のアミノ酸が、好ましくはE又はD、より好ましくはEと交換される;前記L66のアミノ酸が、好ましくはS、N、又はTと交換される;前記L67のアミノ酸が、好ましくはS又はPと交換される;前記L69のアミノ酸が、好ましくはT又はNと交換される;前記L70のアミノ酸が、好ましくはT、M、又はI、より好ましくはTと交換される;前記L71のアミノ酸が、好ましくはA、V、又はTと交換される;前記L72のアミノ酸が、好ましくはT又はS、より好ましくはTと交換される;前記L76のアミノ酸が、好ましくはS又はT、より好ましくはSと交換される;前記L78のアミノ酸が、好ましくはV、A、T、又はI、より好ましくはV又はAと交換される;前記L84のアミノ酸が、好ましくはAと交換される。前記ラクダ科動物VλドメインがヒトVλ5ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラクダ科動物Vλドメインの位置L2、L11、L17、L19、L40、L70、L72、又はL80のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ5ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項37記載の抗体。以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項44記載の抗体:前記L2のアミノ酸が、好ましくはPと交換される;前記L11のアミノ酸が、好ましくはL、S、又はHと交換される;前記L17のアミノ酸が、好ましくはA又はE、より好ましくはAと交換される;前記L19のアミノ酸が、好ましくはA又はVと交換される;前記L40のアミノ酸が、好ましくはPと交換される;前記L70のアミノ酸が、好ましくはA又はT、より好ましくはAと交換される;前記L72のアミノ酸が、好ましくはI又はL、より好ましくはIと交換される;前記L80のアミノ酸が、好ましくはS又はP、より好ましくはSと交換される。前記ラクダ科動物VλドメインがヒトVλ8ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラクダ科動物Vλドメインの位置L2、L11、L60、L67、L80、L81、又はL84のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ8ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項37記載の抗体。以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項46記載の抗体:前記L2のアミノ酸が、好ましくはTと交換される;前記L11のアミノ酸が、好ましくはFと交換される;前記L60のアミノ酸が、好ましくはDと交換される;前記L67のアミノ酸が、好ましくはLと交換される;前記L80のアミノ酸が、好ましくはAと交換される;前記L81のアミノ酸が、好ましくはDと交換される;前記L84のアミノ酸が、好ましくはSと交換される。前記L103のアミノ酸が、好ましくはKと交換される、請求項37~47のいずれか一項記載の抗体。前記ラクダ科動物VLドメインが前記カッパ軽鎖クラスVκに属し、かつKabatによる、該ラクダ科動物Vκドメインの位置K1、K2、K3、K4、K11、K12、K13、K14、K15、K42、K43、K70、K77、K79、K80、K83、K7、K9、K14、K18、K36、K46、K63、K19、K39、K45、K58、K68、K78、K100、K103、K104、又はK106のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVカッパドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項1記載の抗体。前記ラクダ科動物VκドメインがヒトVκ1ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラクダ科動物Vκドメインの位置K1、K2、K4、K11、K12、K13、K15、K42、K43、K70、K77、K79、K80、又はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ1ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項49記載の抗体。以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項50記載の抗体:K2のアミノ酸が、好ましくはD、A、又はNと交換される;K4のアミノ酸が、好ましくはM又はLと交換される;K11のアミノ酸が、好ましくはVと交換される;K12のアミノ酸が、好ましくはKと交換される;K13のアミノ酸が、好ましくはKと交換される;K15のアミノ酸が、好ましくはV又はT、最も好ましくはVと交換される;K42のアミノ酸が、好ましくはKと交換される;K43のアミノ酸が、好ましくはA又はV、最も好ましくはAと交換される;K70のアミノ酸が、好ましくはD又はE、最も好ましくはDと交換される;K77のアミノ酸が、好ましくはS又はC、より好ましくはSと交換されるK79のアミノ酸が、好ましくはQと交換される;K80のアミノ酸が、好ましくはP又はS、最も好ましくはPと交換される;K83のアミノ酸が、好ましくはF、I、又はV、最も好ましくはFと交換される。前記ラクダ科動物VκドメインがヒトVκ2ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラクダ科動物Vκドメインの位置K7、K9、K12、K14、K18、K36、K46、K63、K77、K79、又はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ2ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項50記載の抗体。以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項52記載の抗体:K7のアミノ酸が、好ましくはT又はSと交換されているK9のアミノ酸が、好ましくはLと交換される;K12のアミノ酸が、好ましくはPと交換される;K14のアミノ酸が、好ましくはTと交換される;K18のアミノ酸が、好ましくはP又はQ、最も好ましくはPと交換される;K36のアミノ酸が、好ましくはY、F、又はL、最も好ましくはYと交換される;K46のアミノ酸が、好ましくはL又はR、最も好ましくはLと交換される;K63のアミノ酸が、好ましくはSと交換される;K77のアミノ酸が、好ましくはRと交換される;K79のアミノ酸が、好ましくはEと交換される;K83のアミノ酸が、好ましくはV又はF、最も好ましくはVと交換される。前記ラクダ科動物VκドメインがヒトVκ4ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラクダ科動物Vκドメインの位置K9、K11、K12、K13、K15、K18、K19、K39、K43、K45、K58、K68、K78、K80、又はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ4ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項50記載の抗体。以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項54記載の抗体:K9のアミノ酸が、好ましくはDと交換される;K11のアミノ酸が、好ましくはLと交換される;K12のアミノ酸が、好ましくはAと交換される;K13のアミノ酸が、好ましくはVと交換される;K15のアミノ酸が、好ましくはLと交換される;K18のアミノ酸が、好ましくはRと交換される;K19のアミノ酸が、好ましくはAと交換される;K39のアミノ酸が、好ましくはKと交換される;K43のアミノ酸が、好ましくはPと交換される;K45のアミノ酸が、好ましくはKと交換される;K58のアミノ酸が、好ましくはVと交換される;K68のアミノ酸が、好ましくはGと交換される;K78のアミノ酸が、好ましくはLと交換される;K80のアミノ酸が、好ましくはAと交換される;K83のアミノ酸が、好ましくはVと交換される。前記L103のアミノ酸が、好ましくはKと交換される、請求項50~55のいずれか一項記載の抗体。前記L104のアミノ酸が、好ましくはVと交換される、請求項50~55のいずれか一項記載の抗体。前記L106のアミノ酸が、好ましくはIと交換される、請求項50~55のいずれか一項記載の抗体。前記ラクダ科動物VH及び/又はVLドメインが、少なくとも1つの異種CDR、フレームワーク領域、又はそれらの部分を含む、請求項1~58のいずれか一項記載の抗体。前記異種CDR又はフレームワーク領域が、齧歯類、ウサギ目動物、ラクダ科動物、霊長類、又は軟骨魚類から得られる、請求項59記載の抗体。前記ヒトVH又はVLVλもしくはVκドメイン配列が、体細胞突然変異したヒト可変領域又はその部分である、請求項1~60のいずれか一項記載の抗体。前記ヒトVH又はVLVλもしくはVκドメイン配列が、コンセンサス配列又はその部分を含む、請求項1~61のいずれか一項記載の抗体。抗体断片から形成されるFab、Fab、Fab2、二重特異性Fab、Fv断片、ダイアボディ、線状抗体、単鎖可変断片scFv、抗体、又は多重特異性抗体である、請求項1~62のいずれか一項記載の抗体。非ラクダ科動物抗体由来の少なくとも1つのCH1、CH2、又はCH3ドメインをさらに含む、請求項1~63のいずれか一項記載の抗体。前記非ラクダ科動物抗体がヒト抗体である、請求項64記載の抗体。IgG、IgM、IgD、IgE、及びIgAからなる群から選択されるヒト重鎖定常領域を含む、請求項1~65のいずれか一項記載の抗体。ヒトカッパ又はラムダ軽鎖定常領域を含む、請求項1~66のいずれか一項記載の抗体。前記ラクダ科動物VH及び/又はVLドメインが、ラクダ、リャマ、ヒトコブラクダ、ビクーナ、グアナコ、又はアルパカに由来する、請求項1~67のいずれか一項記載の抗体。前記ラクダ科動物VH及び/又はVLドメイン配列が、リャマ又はアルパカに由来する、請求項1~68のいずれか一項記載の抗体。請求項1~69のいずれか一項記載の抗体をコードするポリヌクレオチド分子。宿主細胞又は無細胞発現系での前記抗体の発現を可能にする調節配列に機能的に連結された請求項70記載のポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター。請求項71記載の発現ベクターを含む宿主細胞又は無細胞発現系。前記抗体の発現を可能にする条件下で請求項71記載の宿主細胞又は無細胞発現系を培養し、かつ発現された抗体を回収することを含む、組換え抗体の産生方法。発明の詳細な説明本発明は、ラクダ科ファミリーの種の通常型抗体レパートリーに由来する、所望の標的抗原に対する特異性を有する、ヒト化抗体に関する。したがって、第一の態様では、本発明は、ラクダ科動物VHドメイン、及びラムダ軽鎖クラスVλ又はカッパ軽鎖クラスVκのいずれかのラクダ科動物VLドメインを含み、少なくとも1つのアミノ酸置換が、該VHドメイン及び/又は該VLドメイン中に存在し、該アミノ酸置換複数可が、以下のものから選択されることを特徴とする、抗体、及びより具体的には、ラクダ科動物由来抗体のヒト化変異体を提供する:a該ラクダ科動物VHドメイン中のアミノ酸置換複数可、ここで、Kabatによる、該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94、及びH108からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVHドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される;並びにb該ラクダ科動物VLドメイン中のアミノ酸置換、ここで、該ラムダ軽鎖クラスVλのラクダ科動物VLドメインについて、Kabatによる、該ラクダ科動物Vλドメインの位置L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、及びL103からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVλドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換され;かつ該カッパ軽鎖クラスVκのラクダ科動物VLドメインについて、Kabatによる、該ラクダ科動物Vκドメインの位置K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104、及びK106からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVκドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される。以下の節において、本発明の様々な態様がより詳細に定義されている。矛盾することが明確に示されない限り、そのように定義された各態様を、任意の他の1つの態様又は複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であることが示された任意の特徴を、好ましい又は有利であることが示された任意の他の1つの特徴又は複数の特徴と組み合わせることができる。定義抗体という用語は、標的抗原を特異的に認識する、モノクローナル抗体完全長モノクローナル抗体を含む、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体例えば、二重特異性抗体、抗体断片、イムノアドヘシン、及び抗体イムノアドヘシンキメラを含むように最も広い意味で用いられる。抗体断片の非限定的な例としては、単一の可変ドメインVH、VL、もしくはVκSkerraA及びPluckthunAの文献1988Science240:103841、単鎖抗体例えば、scFvBirdREらの文献1988Science242:42326;HustonJSらの文献1988ProcNatlAcadSciUSA85:587983、Fab、Fab2、又は当業者に周知の他の断片が挙げられる。本発明の抗体中のVLドメインは、Vラムダ型又はVカッパ型であることができる。特に明記しない限り、VLドメインという用語は、本明細書では一般的な意味で用いられ、かつカッパ型の免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインVκとラムダ型の免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインVλの両方を意味する。ラクダ科動物VLドメイン及びラクダ科動物由来VLドメインという用語は、ラクダ科動物種から単離されたVLドメイン又は特に明記しない限り、Vκ型もしくはVλ型のどちらか、及びネイティブなラクダ科動物VLドメインと比べて1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を含む人為操作されたその変異体を意味する。ラクダ科動物VHドメインという用語は、γ、ε、δ、α、又はμアイソタイプを含む、ラクダ科動物の任意の既知の重鎖アイソタイプのVHドメイン、及びネイティブなラクダ科動物VLドメインと比べて1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を含む人為操作されたその変異体を意味する。ラクダ科動物VHドメインという用語は、ラクダ科動物の通常型抗体のVHドメインだけを意味し、ラクダ科動物VHHドメインを包含しない。ラクダ科動物VHドメイン又はラクダ科動物VLドメインという用語は、それぞれ、通常型のラクダ科免疫グロブリン可変領域遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列を含むVH又はVLドメインを意味する。ラクダ科動物VH及び/又はVLドメインラムダ又はカッパ軽鎖をコードする通常型のラクダ科免疫グロブリン遺伝子配列は、天然の免疫グロブリン遺伝子限定するものではないが、ラクダ科動物、例えば、所望の抗原で免疫したラクダ科動物から得られる生殖系列免疫グロブリン遺伝子、再編成された免疫グロブリン遺伝子、もしくは体細胞突然変異した免疫グロブリン遺伝子を含むから、又は天然の通常型のラクダ科免疫グロブリン遺伝子配列限定するものではないが、異種CDRもしくはフレームワーク領域配列を含むように改変されている天然のラクダ科免疫グロブリン遺伝子、もしくはコンセンサス配列を含む非経験的にabinitio生成された免疫グロブリン遺伝子、もしくは天然の通常型のラクダ科免疫グロブリン遺伝子配列のキメラを含むに由来する合成遺伝子から得ることができる。ラクダ科動物VHドメインという用語は、ラクダ科VHHドメインを包含しない。異種CDR又はフレームワーク領域配列という用語は、ラクダ科動物VH又はVLVλ/Vκドメインでなされた任意のCDR又はフレームワーク領域アミノ酸配列改変を包含する。対応する位置という用語は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている、Kabatらの文献、免疫学的関心対象のタンパク質の配列SequencesofProteinsofImmunologicalInterest第5版PublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthBethesdaMD1983に示された付番体系による、ヒトVH又はVLVλもしくはVκドメイン配列中の同じ付番位置のアミノ酸を意味する。ヒトVHドメイン配列という用語は、ヒト生殖系列によってコードされた任意の抗体重鎖可変領域配列、又はその部分に加え、その誘導体を広く包含する。ヒトVHドメイン配列の好適で、非限定的な例としては、ヒト重鎖生殖系列V、D、及び/もしくはJ領域配列、体細胞突然変異したVHドメインを含む成熟ヒトVHドメイン配列、並びにコンセンサスヒト生殖系列もしくは成熟ヒトVHドメイン配列、又はそれらの部分が挙げられる。ヒトVLドメイン配列という用語も同様に定義される。コンセンサス配列の好適で、非限定的な例、及びそれを作製する方法は、US648213号に記載されている。に由来するという用語は、ある生物由来の成熟可変領域アミノ酸配列と同じ生物由来の生殖系列にコードされたV、D、及び/又はJ領域アミノ酸配列との間の相同性の程度を意味する。生殖系列にコードされた特定のV、D、及び/又はJ領域アミノ酸配列に対する高度な相同性を有する可変領域は、その生殖系列配列に由来すると考えられる。生殖系列配列という用語は、生物のゲノムDNAに存在する、再編成されていない免疫グロブリンV、D、及び/もしくはJ領域、又はそれらの部分によってコードされたアミノ酸配列を意味する。特定のファミリーに属するか、又は特定のファミリーメンバーと一致するラクダ科動物VH又はVLVλもしくはVκドメインを本明細書で参照することができる。特に明記しない限り、ラクダ科動物VH及びVLVλ又はVκドメインを、規定のファミリー又は特定のファミリーメンバーのヒトVH又はVLVλもしくはVκドメイン配列に対するアラインメントに基づいて、特定のファミリー又はファミリーメンバーに割り当てる。したがって、VH1、VH2、又はVH4などではなくヒトVH3ファミリーのVHドメインと最も良く整列するラクダ科動物VHドメインを、本明細書ではラクダ科動物VH3ドメインと同定することができる。ヒトVH1ファミリーのVHドメインと最も良く整列するラクダ科動物VHドメインを、本明細書ではラクダ科動物VH1ドメインと呼ぶ。ヒトVH4ファミリーのVHドメインと最も良く整列するラクダ科動物VHドメインを、本明細書ではラクダ科動物VH4ドメインと呼ぶ。同様に、特に明記しない限り、ラクダ科動物VLVλ又はVκドメインを、既知のファミリー又はファミリーメンバーのヒトVLVλ又はVκドメインに対するアラインメントに基づいて、特定のクラスに割り当てる。したがって、カッパクラスのヒトVLドメインと最も良く整列するラクダ科動物VLドメインを、本明細書では、ラクダ科動物VκドメインVκと略記すると呼ぶことができ、一方、ラムダクラスのヒトVLドメインと最も良く整列するラクダ科動物VLドメインを、本明細書では、ラクダ科動物VラムダドメインVλと略記すると呼ぶことができる。Vカッパドメインの分類において、ラクダ科動物Vκドメインを、最も近いヒトサブクラスに対するアラインメントを基にして、特定のサブクラスに割り当てることができる。したがって、ヒトVκ1、Vκ2、及びVκ4と最も良く整列するラクダ科動物Vκドメインを、本明細書では、それぞれ、ラクダ科動物Vκ1、ラクダ科動物Vκ2、及びラクダ科動物Vκ4ドメインと呼ぶことができる。ラクダ科動物VH及びVLVλ又はVκドメインを、最も良く一致するヒト生殖系列配列を基にして分類することもできる。したがって、例として、ヒトVH323生殖系列と最も良く整列するラクダ科動物VHドメインを、本明細書では、ラクダ科動物VH323ドメインと呼ぶことができる、などのようである。同様に、ヒトVκ146生殖系列と最も良く整列するラクダ科動物Vκドメインを、本明細書では、ラクダ科動物Vκ146ドメインと特定することができる。さらに、重鎖又はカッパ/ラムダ軽鎖ドメインのJセグメントによってコードされたFR4領域を、最も良く一致するヒト生殖系列を基にして分類することもできる。したがって、例として、ヒトJH3生殖系列と最も良く整列するラクダ科動物重鎖可変ドメインのFR4を、本明細書では、ラクダ科動物JH3領域と呼ぶことができ、該FR4をコードするC末端部分は、ヒト化又は生殖系列化のために特に関心対象となる。ラクダ科動物種は、古典的又は通常型抗体、さらには重鎖抗体という、2つの異なるタイプの抗体を有することが知られている。本明細書で使用する場合、通常型抗体という用語は、IgA、IgG、IgD、IgE、又はIgMを含む任意のアイソタイプの抗体を意味する。ネイティブな又は天然の通常型ラクダ科動物の抗体は、通常、2本の同一の軽L鎖及び2本の同一の重H鎖から構成される、ヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則的に配置された鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端N末端に可変ドメインVHを有し、それに続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の端N末端にある可変ドメインVLともう一方の端にある定常ドメインCLを有し;軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと並置され、かつ軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並置されている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの境界面を形成すると考えられている。重鎖抗体という用語は、軽鎖を天然に欠いている抗体のような、ラクダ科動物種に天然に生じることが知られている第二のタイプの抗体を意味するHamersCastermanらの文献、Nature1993;363;4468。重鎖抗体HCAbと略されるは、共有ジスルフィド結合によって連結された2本の重鎖から構成される。HCAb中の各重鎖は、一方の端に可変ドメインを有する。HCAbの可変ドメインは、これを通常型ラクダ科動物抗体の重鎖の可変ドメインVHと区別するためにVHHと呼ばれる。VHHドメインとVHドメインは全く別物であり、ラクダ科動物ゲノムの異なる遺伝子セグメントによってコードされている。Vラムダ軽鎖ドメインの第一、第二、及び第三の超可変ループを、本明細書では、L1λ、L2λ、及びL3λと呼び、かつVLドメイン中の残基2434L1λ、5056L2λ、及び8997L3λ残基の付番はKabatによる;CDRの定義はChothiaによる又はPluckthunHoneggerデータベースhttpwwwbiocunizhchantibodySequencesGermlinesなどの、いくつかのタンパク質データベースから同定することができる。ヒト配列をラクダ科VH又はVLドメインのV領域と比較するために、例えば、wwwexpasychtoolsalignのようなウェブサイトを介して利用可能な配列アラインメントアルゴリズムを用いることができるが、限定された配列セットに関しては、手作業によるアラインメントを行なうこともできる。同じカノニカルフォールド組合せを有し、かつ各鎖のフレームワーク領域1、2、及び3との最高水準の相同性を有するファミリーのヒト生殖系列軽鎖及び重鎖配列を選択し、関心対象のラクダ科可変領域と比較することができる;同様に、FR4を、ヒト生殖系列JH及びJK又はJL領域に照らしてチェックする。全体的な配列相同性の割合の計算において、FR1、FR2、及びFR3の残基は、同一のカノニカルフォールド組合せを有するヒト生殖系列ファミリー由来の最も良く一致する配列を用いて評価されることに留意されたい。同じカノニカルフォールド組合せを有する最も良く一致するもの又は同じファミリーの他のメンバーと異なる残基のみがスコア化されるNBプライマーにコードされたFR1中の違いは全て除外する。しかしながら、ヒト化の目的のためには、同じカノニカルフォールド組合せを持たない、他のヒト生殖系列ファミリーのメンバーと同一のフレームワーク領域内の残基に対して、これらは上記のストリンジェントな条件によればネガティブとスコア化されるという事実にもかかわらず、ヒト化を考慮することができる。この考えは、ヒト化のためのミックスアンドマッチmixandmatchアプローチに基づいており、このアプローチでは、Quと同僚Quらの文献、ClinCancerRes5:309531001999及びOnoと同僚Onoらの文献、MolImmunol36:3873951999によって行われたように、FR1、FR2、FR3、及びFR4の各々が、その最も良く一致するヒト生殖系列配列と個別に比較され、そのため、ヒト化分子は、様々なFRの組合せを含む。ヒト化のためのアミノ酸位置のコアリスト成熟ラクダ科動物VH及びVLドメインとコンセンサスヒト生殖系列VH/VL配列との配列アラインメント、及びさらに、最も良く整列するヒト生殖系列配列とのアラインメントに基づいて、ラクダ科動物VHドメイン及びVLドメイン中の以下の残基が置換の候補として同定された:Kabatによって付番された、ラクダ科動物VHドメインのH1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94、又はH108;Kabatによって付番された、ラクダ科動物VラムダドメインのL1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、又はL103。Kabatによって付番された、ラクダ科動物VカッパドメインのK1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104、又はK106。これらのリストは、ヒト化しようとするラクダ科動物VH又はVラムダもしくはVカッパドメインに対して最も良く整列するヒト生殖系列となる特定のヒト生殖系列に対して生殖系列化するときに変化を考慮することができる、ラクダ科動物VHフレームワークアミノ酸位置のコアセット、並びにラクダ科動物Vラムダ及びVカッパフレームワークアミノ酸位置のコアセットとみなされるべきである。各コアセット内のアミノ酸位置は全て、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3、又はFR4に生じる。したがって、本発明は、Kabatによる、位置H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94、又はH108のうちの1つ又は複数の天然アミノ酸が、ラクダ科動物VHドメイン中のその位置に天然に見られるアミノ酸以外のアミノ酸に交換されるラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。特に、H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94、又はH108のうちの1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVHドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸に交換されてもよい。本発明はまた、Kabatによる、位置L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、又はL103のうちの1つ又は複数の天然のアミノ酸が、ラクダ科動物Vラムダドメイン中のその位置に天然に見られるアミノ酸以外のアミノ酸に交換されるラクダ科動物VラムダドメインVλを含む抗体を提供する。特に、L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、又はL103のうちの1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVラムダドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸に交換されてもよい。本発明はまた、Kabatによる、位置K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104、又はK106のうちの1つ又は複数の天然のアミノ酸が、ラクダ科動物Vカッパドメイン中のその位置に天然に見られるアミノ酸以外のアミノ酸に交換されるラクダ科動物VカッパドメインVκを含む抗体を提供する。特に、K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104、又はK106のうちの1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVカッパドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸に交換されてもよい。本発明による抗体は、上に示したコアリスト中のVHアミノ酸位置のいずれか1つ又は複数におけるアミノ酸置換を含むラクダ科動物VHドメインを、上に示したコアリスト中のVラムダ又はVカッパアミノ酸位置のいずれか1つ又は複数におけるアミノ酸置換を含むラクダ科動物Vラムダ又はVカッパドメインと組み合わせて含み得る。該コアリスト中の位置H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94、又はH108の各々において代入されるべきアミノ酸は、a出発ラクダ科動物VHドメイン中のその位置の天然のアミノ酸ではなく、かつb1つ又は複数のヒトVHドメイン配列中の対応する位置に見られる任意のアミノ酸であることができる。同様に、該コアリスト中の位置L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、又はL103の各々において代入されるべきアミノ酸は、a出発ラクダ科動物Vラムダドメイン中のその位置の天然のアミノ酸ではなく、かつb1つ又は複数のヒトVラムダドメイン配列中の対応する位置に見られる任意のアミノ酸であることができる。同様に、該コアリスト中の位置K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104、又はK106の各々において代入されるべきアミノ酸は、a出発ラクダ科動物Vカッパドメイン中のその位置の天然のアミノ酸ではなく、かつb1つ又は複数のヒトVカッパドメイン配列中の対応する位置に見られる任意のアミノ酸であることができる。ラクダ科動物VH又はVLの特定のVH又はVLクラス又はサブクラスへの生殖系列化ラクダ科動物VH又はVLドメインを特定のヒト生殖系列クラス又はサブクラスへと生殖系列化するのに特に適切なさらなるアミノ酸残基のセットが同定されている。したがって、特定の実施態様では、本発明は、以下のものを提供する。ヒトVH3ドメインとの相同性を有するラクダ科動物VHドメインを含み、Kabatによる、該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H5、H13、H14、H29、H37、H40、H74、H77、H78、H83、H84、H86、又はH94のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH3ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。ヒトVH1ドメインとの相同性を有するラクダ科動物VHドメインを含み、Kabatによる、該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H7、H11、H12、H13、H69、H71、H78、H80、又はH86のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH1ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。ヒトVH4ドメインとの相同性を有するラクダ科動物VHドメインを含み、Kabatによる、該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H30、H48、H67、H68、H71、H81、H84、H85、又はH86のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH4ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。ヒトVλ1ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vラムダドメインを含み、Kabatによる、該ラクダ科動物Vラムダドメインの位置L11、L14、L18、L19、L69、L74、L76、又はL80のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVL1ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。ヒトVλ2ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vラムダドメインを含み、Kabatによる、該ラクダ科動物Vラムダドメインの位置L8、L14、L15、L17、L18、L39、L42、L47、L58、L59、又はL80のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ2ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。ヒトVλ3ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vラムダドメインを含み、Kabatによる、該ラクダ科動物Vラムダドメインの位置L1、L2、L3、L5、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L19、L20、L60、L66、L69、L70、L71、L72、L76、L78、又はL84のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ3ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。ヒトVλ5ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vラムダドメインを含み、Kabatによる、該ラクダ科動物Vラムダドメインの位置L2、L11、L17、L19、L40、L70、L72、又はL80のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ5ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。ヒトVλ8ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vラムダドメインを含み、Kabatによる、該ラクダ科動物Vラムダドメインの位置L2、L11、L60、L67、L80、L81、又はL84のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ8ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。ヒトVκ1ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vカッパドメインを含み、Kabatによる、ラクダ科動物VHドメインの位置K1、K4、K11、K12、K13、K15、K42、K43、K70、K77、K79、K80、又はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ1ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。ヒトVκ2ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vカッパドメインを含み、Kabatによる、ラクダ科動物VHドメインの位置K7、K9、K12、K14、K18、K36、K46、K63、K77、K79、又はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ2ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。ヒトVκ4ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vカッパドメインを含み、Kabatによる、ラクダ科動物VHドメインの位置K9、K11、K12、K13、K15、K18、K19、K39、K43、K45、K58、K68、K78、K80、又はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ4ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。交換用アミノ酸の選択の論理的根拠交換用に選択されるアミノ酸位置でラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインに対して代入されるべき適切な交換用アミノ酸を選択するために、該ラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインアミノ酸配列と、ヒトVH又はVλもしくはVκドメインのアミノ酸配列、典型的にはヒト生殖系列VH又はVλもしくはVκ配列、及び生殖系列JH又はJλもしくはJκ配列、或いは特定のVH又はVλもしくはVκファミリーもしくはそのファミリーメンバーについてのコンセンサス配列とのアラインメントを再び参照することができる。いくつかの異なるアプローチを取って、ヒト残基を選択し、本明細書で同定された1つ又は複数の位置にある天然のラクダ科動物アミノ酸残基を交換することができる。第一に、最も良く一致/整列するヒト生殖系列VH又はVλもしくはVκドメイン、或いは出発ラクダ科動物VH又はVλもしくはVκと極めて良く一致する少なくともヒト生殖系列これは、最も良く一致するヒト生殖系列配列と同じファミリー又はそのファミリーメンバーのメンバーであることが好ましい中の対応する位置に見られる交換用ヒトアミノ酸残基を選択することができる。任意の所与のラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインに対して最も良く一致するヒト生殖系列配列を選択するためのアルゴリズムは、上に示されている。第二に、ラクダ科動物VH/Vλ/Vκドメインが割り当てられるVHもしくはVλもしくはVκファミリー又はファミリーメンバーのために、最もよく用いられるヒト生殖系列由来の交換用ヒト残基を選択することができる。例えば、ラクダ科動物VHドメインがVH3ファミリーに属することが確認されているならば、最もよく用いられるヒトVH3生殖系列ファミリーメンバーであるV323を交換用アミノ酸残基の源として用いることができる。配列アラインメントを用いて、ラクダ科動物VH/Vλ/Vκドメイン配列中で交換されるべきアミノ酸残基と等価なヒト残基を同定する。下記の表1~3には、特定のファミリー又はファミリーメンバーに属するラクダ科動物VH/Vλ/Vκドメインのための交換用ヒトアミノ酸残基の源としての好ましいヒトVH、Vラムダ、及びVカッパ生殖系列が記載されている。最後に、第三のアプローチでは、別の生殖系列ファミリー由来のVH又はVλもしくはVκドメインを含む、任意の他のヒト生殖系列VH又はVλもしくはVκドメイン配列由来の置換ヒトアミノ酸残基を選択することができる。この場合、出発ラクダ科動物VHドメインと選択されたヒトVH生殖系列の間の全体的な配列相同性はあまり考慮されなくてもよく;置換残基が、ことによると類似した局所的配列状況にある、ヒト生殖系列に見られる残基であることだけで十分な場合がある。上記のアプローチの組合せを単一のラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインにおいて用いることができ;2以上の異なるヒト生殖系列から取得した交換用残基を混合して組み合わせることができる。任意の所与のラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインについて、本明細書で同定された位置、特に、コアリストに載っているアミノ酸位置ラクダ科動物VHドメインのH1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94、又はH108;ラクダ科動物VラムダドメインのL1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、又はL103;ラクダ科動物VκドメインのK1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104、又はK106のうちの1つ又は複数にあるネイティブなラクダ科動物残基を交換するかしないかの決定は、ケースバイケースで判断してもよい。第一段階として、所与のVH又はVλもしくはVκドメインをヒト化する場合、典型的には、ラクダ科動物配列と基準ヒト配列これは、特定の生殖系列配列又はコンセンサス配列であってもよいとのアラインメントによって変化させるべき候補残基を同定する。コアリスト適宜、VH又はVλもしくはVκについてのものに載っていることが確認された位置にミスマッチがあるすなわち、ヒト配列と整列しないラクダ科動物残基を、上に示した基準に従って選択された対応するヒト残基との交換用に選択することができる。ある場合には、ミスマッチがある全てのラクダ科動物残基を対応するヒト残基と交換する決定を下してもよい。別の場合には、例えば、抗体の構造例えば、抗原結合部位の立体構造にとってのその重要性のために、特定の位置にある1つ又は複数の残基を変化させない決定を下してもよい。その他の残基を、それが他のヒト生殖系列において同じ配列状況で見られVH/Vλ/Vκドメイン全体にわたって、必ずしも最も良く一致するものではない、したがって、それをヒトのものと考えることができるという理由で除外してもよいすなわち、変化させなくてもよい。さらに、ミスマッチ残基の位置を考慮に入れてもよい。すなわち、FR1、FR2、及びFR3中のミスマッチ残基を変化させることが一般に好ましいが、CDR中のミスマッチは大きく容認されてもよい。また、ミスマッチ残基複数可が溶媒に曝されるかどうかを考慮してもよい。内部にあって、溶媒に曝されないミスマッチ残基は、溶媒に曝される残基よりも大きく容認されてもよい。本明細書に記載の生殖系列化アプローチの他に、折り畳まれた分子の表面で溶媒に曝されるミスマッチ残基のみに交換が考慮されるベニアリングによってヒト化を達成することもできる。VL残基1、2、3、5、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22、37、39、40、41、42、43、45、4649、57、59、60、63、65、66、67、68、69、70、72、74、76、77、79、80、81、83、85、99、100、101、103、105、及び106は露出しているか、大部分露出しているか、又は一部埋没しており、ヒト化における成熟を考慮することができるアステリスクは、2つの異なるVLについての不一致を示す。VH残基1、3、5、7、8、10、11、13、14、15、16、17、19、21、23、25、26、28、30、40、41、42、43、44、46、66、68、70、72、73、74、75、76、77、79、81、82a、82b、83、84、85、87、88、89、104、105、108、110、112、及び113は露出しているか、大部分露出しているか、又は一部埋没しており、同様に、ヒト化において突然変異させることができるPadlanの文献、MolImmunol31:1692171994。これらのリストを用いて、溶媒に曝されるラクダ科動物VL及びVH候補残基を突然変異誘発のためにコアリストから選択し、それにより、ベニアリングのプロセスへと進むことができる。以下に説明するように、ヒト化プロセスを反復して実行することもできるし、又はライブラリーアプローチを求めることもできる。例えば、様々な組合せのアミノ酸残基が置換されている所与の出発ラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインの1セットのヒト化変異体を調製してもよい。その後、これらの変異体を、標的抗原に対する結合親和性、及びヒト宿主における潜在的なまたは実際の免疫原性を含む、機能に関するその他のパラメータ/指標について試験してもよい。[出発ラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメイン中で]変化させることが選択された位置の各々における可能な交換用残基のプールからの特定の交換用ヒト残基の選択は、局所的な配列状況によって、又はラクダ科動物VHドメイン配列内のヒトT細胞エピトープの存在を最小化する必要性によって影響を受ける場合がある。したがって、所与のラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインのヒト化のための適切な残基を選択する場合、まず、最も良く一致するヒト生殖系列、すなわち、CDR中の適当なカノニカルフォールド構造との最も高い配列相同性を調べることができるが、一致しないカノニカルフォールド例えば、長さの異なるCDRとの高い配列相同性を示す生殖系列も、必ずしも最も良く一致するものではない同じファミリー内の他のヒト生殖系列ファミリーメンバーも調べ、また、異なるファミリーのヒト生殖系列すらも調べることができる。好ましい置換VH上に示した基準を考慮して、表4に記載のアミノ酸置換は、ラクダ科動物VHドメインのヒト化に好適であることが確認されている。したがって、本発明の対象には、表4に記載のアミノ酸置換の1つもしくは複数、又は任意の組合せを含むラクダ科動物VHドメインを含む抗体が含まれるが、これらに限定されない。各々の場合において、左側の列に特定されている位置にあるラクダ科動物VH配列によってコードされるアミノ酸は、右側の列に記載されている、その位置についての好ましいヒト残基のうちの1つに交換することができる。表4は、特定のヒトVHファミリー又はファミリーメンバーにとって、どの変化が最も重要と考えられるかを示すものでもあるが、これは、限定と解釈されるべきではない。ラクダ科動物生殖系列において、逸脱する残基が高い頻度で出現することから結論されるヒト生殖系列から逸脱する残基が表4に記載されており、好ましい変化は、ラクダ科動物残基を、CDR1及びCDR2についての同一のカノニカルフォールド組合せを有する最良のヒト生殖系列中に存在する残基に変換する変化である。これらの結論は、図36、37、及び38から得られた。これらの図は、最も良く一致するヒト生殖系列ファミリーメンバーから逸脱する体細胞突然変異したラマグラマVH中の残基、及び全ヒト生殖系列ファミリーに存在する残基を示している。また、言及した図は、ヒト生殖系列残基が体細胞突然変異したVH領域にかなり多く見られるものの、頻度が低いことを示しており、そのため、ヒト生殖系列中に存在する残基への復帰突然変異が実現可能であるはずであるという確信が得られる。さらに、図40、41、及び42は、タイプは同じであるが、ラマパコスの生殖系列VHについての解析を示している。特定の実施態様では、本発明は、表4に記載のアミノ酸変化のうちの少なくとも1つを含むラクダ科動物VHドメインを含むヒト化抗体を包含し、ここで、該ラクダ科動物VHドメインは、リャマラマグラマ又はアルパカラマパコスに由来する。本発明によるヒト化抗体は、表4に記載の特定のアミノ酸置換のうちの2つ以上の任意の組合せを含むラクダ科動物VHドメインも含み得る。この場合も、該ラクダ科動物VHドメインは、リャマラマグラマ又はアルパカラマパコスに由来し得る。特定のヒトVH配列への生殖系列化成熟した機能的抗原結合性ラクダ科動物VH及びVL又はVκドメイン配列と、その最も良く整列するヒト生殖系列とのアラインメントに基づいて、所与のラクダ科動物VH及びVL又はVκドメインを特定のヒト生殖系列配列へと生殖系列化するときに特に有用なアミノ酸置換のセットが得られた。このヒト配列は、ヒト化のために選択された特定のラクダ科動物配列に対して最も良く一致するヒト生殖系列であり得るしかし、必ずしもそうではない。特定のヒト生殖系列VHサブクラスへとヒト化するための好ましい置換のセットは、次の通りである各々の場合において、記載された位置複数可にあるラクダ科動物にコードされた天然の残基を、以下に示す特定のアミノ酸と交換することができる:HuVH321:H1E、H13K、H77S、H83R、H84A特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH321配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマまたはラマパコスに由来するラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。HuVH348:H1E、H77S、H83R、H84A特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH348配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマまたはラマパコスに由来するラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。HuVH323:H1E、H74S、H83R、H84A特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH323配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマまたはラマパコスに由来するヒト化ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。HuVH366:H1E、H29V、H37V、H40A、H74S、H83R、H84A、H94R特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH366配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマまたはラマパコスに由来するヒト化ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。HuVH311:H1Q、H13K、H14P、H37I、H77S、H78L、H83R、H84A、H94R特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH311配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマまたはラマパコスに由来するヒト化ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。HuVH366:H1E、H29V、H37V、H40A、H74S、H78L、H83R、H84A、H86D、H94R特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH366配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマまたはラマパコスに由来するラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。HuVH348:H1E、H77S、H83R、H84A、H86D特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH348配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマまたはラマパコスに由来するラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。HuVH146:H1Q、H11V、H12K、H13K、H69M、H71R、H78V、H80M特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH146配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。HuVH146:H1Q、H7S、H11V、H12K、H69M、H71R、H78V、H80M、H86D特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH146配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマパコスに由来するラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。HuVH4304:H1Q、H30S、H48I、H67V、H68T、H71V、H81K、H84A、H85A特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH4304配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。HuVH4304:H1Q、H30S、H48I、H67V、H68T、H71V、H81K、H84A、H85A、H86D特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH4304配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマパコスに由来するラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。上記の実施態様の各々は、位置108にアミノ酸Lをさらに含んでいてもよい。好ましい置換VカッパVκ及びVラムダVλ表5に記載のアミノ酸置換は、ラクダ科動物VLドメインのヒト化に好適であることが確認されている。したがって、本発明の対象には、表5に記載のアミノ酸置換の1つもしくは複数、又は任意の組合せを含むラクダ科動物VLドメインを含む抗体が含まれるが、これらに限定されない。各々の場合において、左側の列に特定されている位置にあるラクダ科動物VL配列によってコードされるアミノ酸は、表5の右側の列に記載されている、その位置についての好ましいヒト残基のうちの1つに交換することができる。ラクダ科動物生殖系列において、逸脱する残基が高い頻度で出現することから結論されるヒト生殖系列から逸脱する残基が表5に記載されており、好ましい変化は、ラクダ科動物残基を、CDR1及びCDR2についての同一のカノニカルフォールド組合せを有する最良のヒト生殖系列中に存在する残基に変換する変化である。これらの結論は、Vカッパについては図30から、及びVラムダについては図31~35から得られた。これらの図は、最も良く一致するヒト生殖系列ファミリーメンバーから逸脱する体細胞突然変異したリャマVκ/Vλ中の残基、及び全ヒト生殖系列ファミリーに存在する残基を示している。また、言及した表は、ヒト生殖系列残基が体細胞突然変異したVカッパ/Vラムダ領域にかなり多く見られるものの、頻度が低いことを示しており、そのため、ヒト生殖系列中に存在する残基への復帰突然変異が許容されることを示している。特定の実施態様では、本発明は、表5に記載のアミノ酸変化のうちの少なくとも1つを含むラクダ科動物Vκ又はVλドメインを含むヒト化抗体を包含し、ここで、該ラクダ科動物Vκ又はVλドメインは、リャマラマグラマ又はアルパカラマパコスに由来する。本発明によるヒト化抗体はまた、表5に記載の特定のアミノ酸置換のうちの2つ以上の任意の組合せを含むラクダ科動物Vκ又はVλドメインを含んでいてもよく、ここでも、該ラクダ科動物Vκ又はVλドメインは、リャマラマグラマ又はアルパカラマパコスに由来する。特定のヒトVκ又はVλ配列への生殖系列化成熟した機能的抗原結合性ラクダ科動物Vκ又はVλドメイン配列と、その最も良く整列するヒト生殖系列とのアラインメントに基づいて、所与のラクダ科動物VLドメインを特定のヒト生殖系列配列へと生殖系列化するときに特に有用なアミノ酸置換のセットが得られた。このヒト配列は、ヒト化のために選択された特定のラクダ科動物配列に対して最も良く一致するヒト生殖系列であり得るしかし、必ずしもそうではない。特定のヒト生殖系列Vラムダファミリーメンバーへとヒト化するための好ましい置換のセットは、次の通りである各々の場合において、記載された位置複数可にあるラクダ科動物にコードされた天然の残基を、以下に示す特定のアミノ酸と交換することができる:Vλ144:L11A、L14T、L18R、L19V、L38Q、L69T、L74A、L76S、L80S特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ144配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。Vλ211:L8R、L17Q、L18S、L39H、L42K、L47M、L58V、L59P、L80A特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ211配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。Vλ218:L3A、L14S、L15P、L17Q、L18S、L39H、L47M、L58V、L80A特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ218配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。Vλ319:L1S、L3E、L7D、L8P、L11V、L14A、L19V、L20R、L60D、L69N、L70T、L72S、L76T、L84A特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ319配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。Vλ325:L1S、L2Y、L3E、L5M、L8P、L9S、L15P、L66S、L69T、L71V、L78V特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ325配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。Vλ537:L2P、L11S、L17E、L19A、L40P、L70T、L72I、L80S特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ537配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。Vλ861:L2T、L11F、L60D、L67L、L80A、L81D、L84S特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ861配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。特定のヒト生殖系列Vカッパファミリーメンバーへとヒト化するための好ましい置換のセットは、次の通りである各々の場合、記載された位置複数可にあるラクダ科動物にコードされた天然の残基を、以下に示す特定のアミノ酸と交換することができる:Vκ113:K11V、K12K、K13K、K15V、K42K、K43A、K70D、K77S、K79Q、K80P、K83F特定の実施態様では、本発明は、ヒトVκ113配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物Vカッパドメインを含む抗体を提供する。Vκ228:K7S、K9L、K12P、K14T、K18P、K36Y、K46L、K63S、K77R、K79E、K83V特定の実施態様では、本発明は、ヒトVκ228配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物Vカッパドメインを含む抗体を提供する。Vκ41:K9D、K11L、K12A、K13V、K15L、K18R、K19A、K39K、K43P、K45K、K58V、K68G、K78L、K80A、K83V特定の実施態様では、本発明は、ヒトVκ41配列に対して整列し、かつ記述された位置複数可に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、好ましくはラマグラマに由来するラクダ科動物Vカッパドメインを含む抗体を提供する。上記の実施態様の各々は、FR4の残基103にアミノ酸置換を含むこともでき、VカッパとVラムダの両方について、この位置にKを有することが好ましい。さらに、Vカッパにおけるアミノ酸置換を、FR4の残基100に導入して、この位置にQを有することが好ましいか、又はFR4の残基104に導入して、Vを有することが好ましい。本発明の抗体中のラクダ科動物VH及び/又はVλ及び/又はVκドメインは、本明細書で提供されたコアVH、Vλ、及びVκリスト上で特定される1つ又は複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換の他に、天然のラクダ科動物VH、VL、又はVκドメイン例えば、標的抗原によるラクダ科の能動免疫によって得られる通常型ラクダ科動物抗体のVH、Vλ、又はVκドメインと比較して、さらなるアミノ酸配列変化を含むように人為操作することができる。特定の実施態様では、該抗体のVH、Vλ、及びVκドメインは、VHドメインとVλ/Vκドメインのどちらか一方又は両方のフレームワーク領域FR1、FR2、FR3、及びFR4にわたって、最大10個、また場合により、さらに多くのアミノ酸置換を導入するように独立に人為操作されていてもよい。ヒト化目的で、ラクダ科動物生殖系列JセグメントによってコードされたFR4残基中で行なわれ得るアミノ酸置換のリストを以下に提供する:JセグメントによってコードされたFR4残基中のアミノ酸置換さらなる実施態様では、本発明は、ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供し、ここで、Kabatによる、該ラクダ科動物VHドメインの位置H108の、FR4にコードされたアミノ酸は、ヒトVHドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される。H108の交換用残基は、上で論じたラクダ科動物VHドメインのヒト化の一般原則に従って選択することができる。特に、交換用ヒト残基は、最も近いヒト生殖系列配列との、もしくはヒトコンセンサス配列とのアラインメントを基にして、又は最も良く整列するヒト生殖系列と同じクラスもしくはサブクラスのヒト生殖系列配列から、もしくは異なるクラスもしくはサブクラスのヒト生殖系列からさえも選択することができる。一実施態様では、H108のアミノ酸は、好ましくはL、又はあまり好ましくないが、Mと交換される。Jカッパ又はJラムダのアミノ酸変化を同様の原則に従って選択することができる。したがって、本発明は、ラクダ科動物Vλ又はVκドメインを含む抗体を提供し、ここで、Kabatによる、該ラクダ科動物Vλ又はVκドメインのうちの1つ又は複数の位置のアミノ酸は、ヒトVλ又はVκドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される。一実施態様では、Vラムダドメインは、ヒトVラムダドメインとの相同性を有し、L103のアミノ酸は、好ましくはK、又はあまり好ましくないが、E又はQと交換される。一実施態様では、Vカッパドメインは、ヒトVカッパドメインとの相同性を有し、K103のアミノ酸は、好ましくはK、又はあまり好ましくないが、Rと交換される。一実施態様では、Vカッパドメインは、ヒトVカッパドメインとの相同性を有し、K104のアミノ酸は、好ましくはVと交換される。一実施態様では、Vカッパドメインは、ヒトVカッパドメインとの相同性を有し、K104のアミノ酸は、好ましくはLと交換される。CDR中のアミノ酸変化ヒト化をもたらすアミノ酸置換に加えて、出発ラクダ科VH、Vλ、又はVκドメイン中のミスマッチのあるアミノ酸残基を、ヒトVH、Vλ、又はVκドメインに見られる等価な残基と交換することにより、ヒト化目的のためにも、該ラクダ科動物由来のVH、Vλ、及びVκドメインの超可変ループCDRに、特にCDR1及び/又はCDR2に、さらにCDR3にも、アミノ酸置換を独立に行なうことも可能である。FRとの境界に位置する残基が関心対象となるが、それは、これらが、FR及びCDRにコードされた残基からなるT細胞エピトープを決定し得るからである。以下の表は、ラクダ科動物由来CDRのヒト化のための可能なアミノ酸置換をまとめたものである。したがって、本発明の範囲は、CDR1及び/又はCDR2及び/又はCDR3中のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVHドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換されるラクダ科動物VHドメインを含む抗体にまで及ぶ。許容されるアミノ酸置換は、表6にまとめたものを含み、このうちの1つ又は複数が、任意の組合せで存在し得る。本発明は、CDR1及び/又はCDR2及び/又はCDR3中のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ又はVκドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換されるラクダ科動物Vλ又はVκドメインを含む抗体も包含する。許容されるアミノ酸置換は、表6にまとめたものを含み、このうちの1つ又は複数が、任意の組合せで存在し得る。任意の所与のヒト化ラクダ科動物VH、Vλ、又はVκドメインについて、CDR中のアミノ酸置換を、フレームワーク領域中のアミノ酸置換とともに、又はフレームワーク領域中のアミノ酸置換なしで含めることができる。フレームワークアミノ酸置換も存在する場合、好ましい変化には、表4VH並びに表5Vλ及びVκにまとめたもの全てが含まれる。ラクダ科動物VH、Vλ、及びVκドメインのCDR内でヒト化するとき、フレームワーク領域について上で概説した生殖系列化アプローチの一般原則に従うことができる。したがって、同じファミリーもしくはファミリーメンバーの特定のヒト生殖系列配列これは、出発ラクダ科動物VH/Vλ/Vκドメインに対して最も良く整列するヒト生殖系列であってもよいし、そうでなくてもよいへと生殖系列化することを選ぶことができるし、又は異なるファミリーもしくはファミリーメンバーのヒト生殖系列配列へと生殖系列化することを選ぶことができる。ファミリーを越えた生殖系列化成熟ラクダ科動物VH及びVλ/Vκ配列並びにそれに由来するコンセンサス配列と、該ラクダ科動物VHVλ/Vκドメインが最も良く整列するヒトVH又はVλ/Vκドメイン配列と同じファミリー又はファミリーメンバーではないヒトVH及びVλ/Vκドメインのコンセンサス配列とのアラインメントにより、ラクダ科動物VH又はVλ/Vκドメインの、異なる生殖系列ファミリー又はファミリーメンバーのヒトVH又はVλ/Vκドメイン配列へのヒト化を可能にし得るアミノ酸置換のセットを得ることが可能になった。これらのアミノ酸置換のセットは、添付の図に記載されている。図6~11は、ファミリーVH1、3、及び4のヒト生殖系列配列と最も良く整列するラクダ科動物VH配列を、ファミリー1、3、4、5、6、及び7のヒト生殖系列又は成熟VH配列へと生殖系列化する全順列を示す。図12~26は、Vλファミリー1、3、5、及び8のヒト生殖系列配列と最も良く整列するラクダ科動物Vλ配列VLと表記するを、ヒトVλファミリー1、3、4、5、6、7、8、9、及び10のヒト生殖系列又は成熟Vλ配列へと生殖系列化する全順列を示し、図27~29は、Vκファミリー1、及び4のヒト生殖系列配列と最も良く整列するラクダ科動物Vκ配列を、ヒトVκファミリー1、3、4、及び5のヒト生殖系列又は成熟Vκ配列へと生殖系列化する全順列を示す。ヒト化を可能にするために交換が考慮され得るアミノ酸位置は、ラクダ科動物VH、Vλ、又はVκファミリーの出発コンセンサス配列を複数の異なるヒト生殖系列ファミリーのコンセンサス配列と比較しているそれぞれの表で強調されている。したがって、これらの表を用いて、どのヒト生殖系列ファミリー又はサブファミリーを生殖系列化するかをまず選択し、次に、ヒト化プロセスで考慮される適切なアミノ酸置換を選択することができる。本明細書中の別所で概説されているように、ヒト化を、反復プロセスとして、又は複数の交換、もしくは交換の組合せを同時に試験することを可能にするライブラリーアプローチを用いて実施することができる。以下の表7には、ヒトVH1ファミリーと最も良く整列するラクダ科動物配列をヒトVH3のファミリーメンバーへと生殖系列化することが考慮され得る、図6~11に示すアラインメントから得られたアミノ酸置換が記載されている。好ましいヒトアミノ酸は、生殖系列化に使用され得るファミリーに最も良く見られるアミノ酸である。しかしながら、特定の位置では、特定のファミリーメンバーに存在するアミノ酸が、それぞれのヒト生殖系列ファミリーのコンセンサス配列に見られるアミノ酸から逸脱している場合がある。上記の交換は全て、ラクダ科動物VH1からヒトVH3への生殖系列化を可能にするのに有用であり得るが、それは、いずれか1つの特定の成熟ラクダ科動物VH1ドメインをヒトVH3へと生殖系列化するときに、これらの交換の全てが行なわれなければならないか、又はこれらの交換の全てが実際に行なわれることを必ずしも意味するものではない。それどころか、熟練した読者であれば、本明細書中の別所で概説されている、生殖系列化アプローチの一般原則に従って、この表から適切な交換を選択することができるであろう。以下の実施例には、ヒトVκ1ファミリーと最も良く整列するラクダ科動物配列をヒトVκ3のファミリーメンバーへと生殖系列化することが考慮され得る、図27~29から得られたアミノ酸置換が記載されている。好ましいヒトアミノ酸は、生殖系列化に使用され得るファミリーに最もよく見られるアミノ酸である。しかしながら、特定の位置では、特定のファミリーメンバーに存在するアミノ酸が、それぞれのヒト生殖系列ファミリーのコンセンサス配列に見られるアミノ酸から逸脱している場合がある。以下の実施例には、ヒトVλ8ファミリーと最も良く整列するラクダ科動物配列をヒトVλ2のファミリーメンバーへと生殖系列化することが考慮され得る、図24~26から得られたアミノ酸置換が記載されている。好ましいヒトアミノ酸は、生殖系列化に使用され得るファミリーに最もよく見られるアミノ酸である。しかしながら、特定の位置では、特定のファミリーメンバーに存在するアミノ酸が、それぞれのヒト生殖系列ファミリーのコンセンサス配列に見られるアミノ酸から逸脱している場合がある。VH1をVH3へと、Vκ1をVκ3へと、及びVλ8をVλ2へと生殖系列化するための上記の例は、ある特定のファミリーの成熟ラクダ科動物VH又はVLドメインの、異なるファミリー又はサブファミリーのヒト生殖系列への生殖系列化を可能にするために、図6~29に提示された配列アラインメント情報をいかに利用することができるかということを示すために記載されている。この文脈において、異なるファミリー又はサブファミリーという用語は、ヒト化することを望む成熟ラクダ科動物VH又はVLに対して最も良く整列するヒト生殖系列が属するファミリー又はサブファミリーではない任意のファミリー又はサブファミリーを意味する。本発明はまた、免疫原性のリスクを回避するために、ヒト免疫系で最も支配的に用いられている、VH及びVλ/Vκを含む抗体となるよう、ファミリーを越えて生殖系列化する能力を提供する。VH3ファミリーとファミリーメンバーDP47又は323、Vκ3ファミリーとファミリーメンバーDPK22又はA27、及びVλ2ファミリーとファミリーメンバーDPL11もしくは2a2又はVλ1ファミリーとファミリーメンバーDPL5、又はVλ3ファミリーとファミリーメンバーDPL23が好ましい。US2003190317号においてGenentechにより開示されている技術、及びMorphosysKnappikらの文献、JMolBiol296:57862000を利用することができる。熟練した読者であれば、図6~29に提示された配列アラインメント情報によって、ラクダ科動物VH、Vラムダ、及びVカッパドメインのファミリー又はサブファミリーを越えた多数の生殖系列化の可能性が可能になることを理解するであろう。任意の所与の成熟ラクダ科動物VH又はVLドメインについて、FR1、FR2、FR3、及びFR4の各々を、同じ又は異なるヒト生殖系列へと生殖系列化することができるミックスアンドマッチアプローチが使用可能であると考えられる場合、可能性の数はまたさらに増大する。図6~29に提示された配列アラインメント情報によって可能になる生殖系列化の可能性の全てが本発明の対象の一部を形成することが意図される。したがって、本発明の範囲は、図6~29にまとめたアミノ酸置換の1つ又は複数を含むラクダ科動物VHドメイン及び/又はラクダ科動物VLドメインを含む任意のヒト化ラクダ科動物抗体にまで及ぶ。本発明の範囲表4に記載のVH置換と類似したアミノ酸置換を含むヒト化VHHドメインは、本発明の範囲内に包含されないことが好ましい。一実施態様では、本発明の抗体の全VHドメイン及び/又は全Vλ/Vκドメインは、ラクダ科ファミリーの種から得ることができる。その後、ラクダ科VHドメイン及び/又はラクダ科Vλ/Vκドメインを、本明細書で特定されている1つ又は複数の特定の位置で、アミノ酸置換をラクダ科配列に導入するタンパク質操作に供する。特定の実施態様では、ラクダ科超可変ループ又はCDRは、所望の標的抗原によるラクダ科ファミリーの種の能動免疫によって得ることができる。本明細書で詳細に考察及び例証されているように、標的抗原によるラクダ科ネイティブな動物又はラクダ科動物種の免疫グロブリンレパートリーを発現するように人為操作されたトランスジェニック動物のいずれかの免疫後、所望の抗原に対する特異性を有するB細胞産生通常型ラクダ科抗体を同定することができ、そのような抗体のVH及びVλ/Vκドメインをコードするポリヌクレオチドを公知の技術を用いて単離することができる。能動免疫により得られた単離されたラクダ科VH及びVλ/Vκドメインは、本発明によるヒト化抗体を人為操作するための基礎として用いることができる。無傷のラクダ科VH及びVλ/Vκドメインから出発して、本明細書で特定された特定のアミノ酸位置での置換を含む、出発ラクダ科配列から逸脱するVHドメイン及び/又はVλ/Vκドメインのフレームワーク領域中の1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を人為操作することが可能である。一次アミノ酸配列におけるそのような変化の目的は、おそらく好ましくない特性例えば、ヒト宿主における免疫原性、生成物の潜在的な不均一性及び/もしくは不安定性の部位グリコシル化、脱アミド化、異性体化などを減少させるか、又は分子のいくつかの他の好ましい特性例えば、溶解度、安定性、バイオアベイラビリティなどを増強することであり得る。他の実施態様では、一次アミノ酸配列の変化を、能動免疫により得られたラクダ科VH及び/又はVλ/Vκドメインの1つ又は複数の超可変ループ又はCDR中で人為操作することができる。そのような変化は、抗原結合親和性及び/もしくは特異性を増強するために、又はおそらく好ましくない特性、例えば、ヒト宿主における免疫原性いわゆるヒト化、生成物の潜在的な不均一性及び/もしくは不安定性の部位、グリコシル化、脱アミド化、異性体化などを減少させるために、又は分子のいくつかの他の好ましい特性、例えば、溶解度、安定性、バイオアベイラビリティなどを増強するために導入することができる。標的抗原又は標的抗原もしくはそれをコードするポリヌクレオチドを含む組成物による能動免疫の代わりとして、所望の抗原結合特性を有するヒト化抗体の成分として用いることができるVH及び/又はVλ/Vκドメインの供給源として、罹患したラクダ科動物における免疫応答又はラクダ科種内で自然に起こる免疫応答を利用することも可能である。そのようなVH/Vλ/Vκドメインは、能動免疫により得られるVH/Vλ/Vκドメインと類似した方法でヒト化抗体を人為操作するための出発点として用いることもできる。本発明はまたさらに、非免疫ライブラリー、及びそれから得られる/それに由来するヒト化抗体の使用を包含している。他の実施態様では、本発明は、ラクダ科由来のヒト化VH及びVλ/Vκドメインと、非ラクダ科動物抗体由来の1つ又は複数の定常ドメイン、例えば、ヒトにコードされた定常ドメイン又は人為操作されたその変異体とを含むキメラ抗体分子を包含する。本発明は、VH又はVλ/Vκドメインのうちの一方がラクダ科動物にコードされているが、本発明によってヒト化されたものであり、もう一方の可変ドメインが非ラクダ科動物例えば、ヒト、齧歯類、ウサギ目動物、非ヒト霊長類、又は軟骨魚類由来のものであるキメラ抗原結合ポリペプチド例えば、抗体分子にも及ぶ。そのような実施態様では、VHドメインとVλ/Vκドメインは両方とも、ラクダ科動物の同じ種から得られることが好ましく、例えば、VHとVλ/Vκは両方とも、ラマグラマ由来であってもよいし、又はVHとVλ/Vκは両方とも、ラマパコス由来であってもよい人為操作されたアミノ酸配列変異の導入前。そのような実施態様では、VHドメインとVλ/Vκドメインは両方とも、単一の動物、特に、能動免疫された単一の動物に由来するものであってもよい。ヒト化抗体の構造非限定的な実施態様では、本発明によるヒト化抗体は、そのアミノ酸配列が完全に又は実質的にヒトのものであるCH1ドメイン及び/又はCLドメインを含むことができる。本発明の抗体が、ヒト治療用途を対象とした抗体である場合、該抗体の定常領域全体、又は少なくともその一部が完全に又は実質的にヒトアミノ酸配列を有することが典型的である。したがって、本発明の抗体のCH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、及びCLドメイン並びに存在するならばCH4ドメインの1つ又は複数又は任意の組合せは、そのアミノ酸配列に関して完全に又は実質的にヒトのものであることができる。有利なことに、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、及びCLドメイン並びに存在するならばCH4ドメインは全て、完全に又は実質的にヒトのアミノ酸配列を有することができる。ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、又は抗体断片の定常領域の文脈において、実質的にヒトという用語は、ヒト定常領域との少なくとも90、又は少なくとも95、又は少なくとも97、又は少なくとも99のアミノ酸配列同一性を意味する。この文脈におけるヒトアミノ酸配列という用語は、生殖系列遺伝子、再編成された遺伝子、及び体細胞突然変異した遺伝子を含む、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列を意味する。本発明は、ヒト配列に関して1つ又は複数のアミノ酸付加、欠失、又は置換によって改変されているヒト配列の定常ドメインを含む抗体も企図している。本明細書中の別所で論じられているように、1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、又は欠失が、重鎖及び/又は軽鎖の定常領域内、特にFc領域内で行なわれることが企図されている。アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の、異なる天然アミノ酸との、又は非天然もしくは修飾されたアミノ酸との交換を生じさせることができる。例えば、グリコシル化パターンの変化例えば、N又はO結合型グリコシル化部位の付加又は欠失によるものなどの、他の構造的修飾も許容される。抗体の意図された用途に応じて、Fc受容体へのその結合特性に関して、本発明の抗体を修飾すること、例えば、エフェクター機能を調節することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基複数可をFc領域に導入し、それにより、この領域内での鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。こうして生成されたホモ二量体型抗体は、改善された内在化能、並びに/又は増大した補体媒介性細胞傷害性及び抗体依存性細胞傷害性ADCCを有する。Caronらの文献、JExpMed176:119111951992及びShopesの文献、BJImmunol148:291829221992を参照されたい。或いは、抗体を、2つのFc領域を有し、その結果、増強された補体溶解能及びADCC能を有し得るように人為操作することができる。Stevensonらの文献、AntiCancerDrugDesign3:2192301989を参照されたい。本発明は、化学療法剤、毒素例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性のある毒素、もしくはその断片、又は放射性同位体すなわち、放射性コンジュゲートなどの、細胞毒性物質に結合した、本明細書に記載されたような抗体を含む免疫抱合体も企図している。Fc領域は、半減期を延長するように人為操作することもできる。本発明は、ある実施態様では、ラクダ科/ヒトキメラ抗体、及び特にVH及びVλ/Vκドメインが完全にラクダ科動物配列例えば、リャマ又はアルパカのものであり、かつその抗体の残りの部分が完全にヒト配列のものであるキメラ抗体を包含する。好ましい実施態様では、本発明は、ヒト化された又は生殖系列化されたラクダ科抗体、並びにVH及びVλ/Vκドメインが、能動免疫により得られたラクダ科VH及びVλ/Vκドメインと比べて、フレームワーク領域内に1つ又は複数のアミノ酸置換を含む、ラクダ科/ヒトキメラ抗体も包含する。そのようなヒト化は、出発ラクダ科VH又はVλ/Vκドメイン中のミスマッチのあるアミノ酸残基を、ヒト生殖系列にコードされたVH又はVλ/Vκドメイン中に見られる等価な残基と交換することによって、ヒト生殖系列VH又はVλ/Vκドメインとの配列同一性を増大させる。本発明はまたさらに、ラクダ科動物以外の種例えば、齧歯類、霊長類、ウサギ目動物、もしくは軟骨魚類、又は異なるラクダ科動物種から得ることができる、異種抗体に由来するCDR又は超可変ループが、ヒト化されたラクダ科動物VH及びVλ/Vκフレームワーク上に移植されており、該抗体の残りの部分も完全にヒト起源のものである、CDR移植抗体を包含する。本発明は、VH又はVλ/Vκドメインのどちらか一方が、本明細書で特定される特定の位置の1つ又は複数におけるアミノ酸置換を含む、ヒト化されたラクダ科動物VH又はVλ/Vκドメインであり、かつもう一方の可変ドメインが、非ラクダ科動物、例えば、ヒトのアミノ酸配列を有する、抗原結合ポリペプチドも包含する。したがって、ヒト化されたラクダ科動物VHドメインをヒトVλ/Vκドメインと対合させるか、又はヒトVHドメインをヒト化されたラクダ科動物Vλ/Vκドメインと対合させることが企図されている。そのような対合は、そこから所望の抗原結合特性を有する高親和性のバインダーを選択する、利用可能な抗原結合レパートリーを増大させることができる。本発明はまたさらに、VHドメイン及び/又はVλ/Vκドメインの超可変ループ複数可又はCDR複数可が、ラクダ科から得られるが、該ラクダ科動物由来の超可変ループ又はCDRの少なくとも1つは、ラクダ科動物にコードされた配列と比べて1つ又は複数のアミノ酸置換、付加、又は欠失を含むように人為操作されている、抗原結合ポリペプチドに及ぶ。そのような変化は、超可変ループ/CDRのヒト化を含む。このように人為操作されているラクダ科動物由来のHV/CDRは、ラクダ科動物にコードされたHV/CDRのアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を依然として示すことができる。この文脈において、実質的同一性は、ラクダ科動物にコードされたHV/CDRとの、1個以下、又は2個以下のアミノ酸配列ミスマッチを許容することができる。本発明による抗体は、任意のアイソタイプであることができる。ヒト治療用途を対象とする抗体は、典型的には、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型、多くの場合、IgG型であり、その場合、抗体は、4つのサブクラスIgG1、IgG2a及びIgG2b、IgG3、又はIgG4のいずれかに属することができる。これらのサブクラスの各々において、例えば、Fc依存的機能性を増強もしくは軽減するために、Fc部分内に1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を生じさせるか、又は他の構造的修飾を生じさせることが許容される。本発明によるヒト化抗体は、研究と、疾患の診断及び/又は治療の両方における、広範な用途で有用であり得るが、特にモノクローナル抗体の形態での、ヒト治療剤としての特定の有用性を見出すであろう。本発明は、広範な抗原に対するヒト化抗体、及び具体的にはモノクローナル抗体の産生のためのプラットフォームを提供し、かつその最も広い態様において、本発明は、標的抗原の厳密な中身に関しても、実際に標的抗原に対する結合の特異性又は親和性に関しても、限定されることを意図するものではない。しかしながら、特定の非限定的な実施態様では、標的抗原は、非ラクダ科動物抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、又はヒト抗原であることができる。好ましい実施態様では、標的抗原は、治療上特に重要な抗原であることができる。治療上重要な標的という用語は、ヒトもしくは動物の疾患の、又はそれぞれの疾患に関連した作用の、形成、発症、進行、媒介に関与する標的を意味する。この定義に含まれるのは、標的の発現レベル及び/又は活性が、抗体結合によって調節される標的例えば、その活性がアゴニスト又はアンタゴニスト抗体の結合によって調節され得る受容体、並びに標的の活性及び/又は発現が、疾患に対する直接的又は間接的な影響を有する標的である。例として、ヒト抗原は、受容体、受容体リガンド、細胞シグナル伝達分子、ホルモン、サイトカイン又はサイトカイン受容体、神経伝達物質などとして機能する天然のヒトポリペプチドタンパク質を含むことができる。天然のとは、ポリペプチドがその発達のいずれかの段階においてヒト体内で発現されることを意味し、疾患の経過中にヒトの体によって発現されるポリペプチドを含む。ポリヌクレオチド、ベクター、及び組換え発現本発明はまた、本発明のヒト化抗体をコードするポリヌクレオチド分子、宿主細胞又は無細胞発現系で該抗体の発現を可能にする調節配列に機能的に連結された本発明のヒト化抗体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、及びこの発現ベクターを含む宿主細胞又は無細胞発現系を提供する。本発明のヒト化抗体をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、組換えDNA分子を含む。核酸、ポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチド分子という用語は、本明細書では互換的に用いられ、かつ一本鎖又は二本鎖のいずれかの任意のDNA又はRNA分子、及び一本鎖の場合、その相補配列の分子を意味する。核酸分子を論じる際、特定の核酸分子の配列又は構造は、該配列を5から3の方向で提供する通常の慣習に従って、本明細書に記載することができる。本発明のいくつかの実施態様では、核酸又はポリヌクレオチドは、単離されている。この用語は、核酸分子に適用される場合、それが起源とする生物の天然のゲノム内でそれがすぐに接している配列から分離されている核酸分子を意味する。例えば、単離された核酸は、プラスミドベクターもしくはウイルスベクターなどのベクターに挿入されたDNA分子、又は原核細胞もしくは真核細胞もしくは非ヒト宿主生物のゲノムDNAに組み込まれたDNA分子を含むことができる。RNAに適用される場合、単離されたポリヌクレオチドという用語は、上で定義した単離されたDNA分子によってコードされるRNA分子を主に意味する。或いは、この用語は、その自然の状態ですなわち、細胞又は組織内でそれが関連している他の核酸から精製/分離されているRNA分子を意味することができる。単離されたポリヌクレオチドDNA又はRNAのいずれかはさらに、生物学的手段又は合成手段によって直接的に産生され、かつその産生時に存在する他の成分から分離された分子を表すことができる。本発明によるヒト化抗体の組換え産生のために、それをコードする組換えポリヌクレオチドを標準的な分子生物学的技術を用いて調製し、かつ選ばれた宿主細胞、又は無細胞発現系で発現させるための複製可能なベクターに挿入することができる。好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、又は高等真核細胞、具体的には哺乳動物細胞であることができる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株COS7、ATCCCRL1651;ヒト胎児腎臓株293細胞又は懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた293細胞、Grahamらの文献、JGenVirol36:591977;ベビーハムスター腎臓細胞BHK、ATCCCCL10;チャイニーズハムスター卵巣細胞/DHFRCHO、Urlaubらの文献、ProcNatlAcadSciUSA77:42161980;マウスセルトリ細胞TM4、Matherの文献、BiolReprod23:2432511980;マウス骨髄腫細胞SP2/0AG14ATCCCRL1581;ATCCCRL8287、又はNSOHPAカルチャーコレクション番号85110503;サル腎臓細胞CV1、ATCCCCL70;アフリカミドリザル腎臓細胞VERO76、ATCCCRL1587;ヒト子宮頸癌細胞HELA、ATCCCCL2;イヌ腎臓細胞MDCK、ATCCCCL34;バッファロー系ラット肝臓細胞BRL3A、ATCCCRL1442;ヒト肺細胞W138、ATCCCCL75;ヒト肝臓細胞HepG2、HB8065;マウス乳癌MMT060562、ATCCCCL51;TRI細胞Matherらの文献、AnnalsNYAcadSci383:44681982;MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝細胞癌株HepG2、並びにDSMのPERC6細胞株である。これらの宿主細胞の各々における使用に好適な発現ベクターもまた、当技術分野では一般に公知である。宿主細胞という用語は通常、培養された細胞株を意味することに留意すべきである。本発明による抗原結合ポリペプチドをコードする発現ベクターが導入されているヒト全体は、本発明の範囲から明確に除外される。重要な態様では、本発明はまた、組換え抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド例えば、発現ベクターを含む宿主細胞又は無細胞発現系を、該抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養し、かつ発現された抗体を回収することを含む、組換えヒト化抗体を産生する方法を提供する。この組換え発現プロセスは、ヒト治療用途を対象とするモノクローナル抗体を含む、本発明による抗体の大規模生産に用いることができる。インビボ治療用途に好適な組換え抗体の大規模製造のための好適なベクター、細胞株、生産プロセスは、通常、当技術分野で利用可能であり、かつ当業者に周知である。本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を含む、診断キットなどを含む、試験キット、及びさらに本発明による抗体を含む医薬製剤に関する。ヒト化抗体が診断用途を意図したものである場合、例えば、該抗体が病状又は疾患感受性のバイオマーカーとなる抗原に特異的である場合、抗原結合ポリペプチドを試験キットの構成要素として供給することが好都合であることがある。診断試験は、通常、例えば、ELISA、ラジオイムノアッセイ、Elispotなどの、標準的なイムノアッセイの形を取る。そのような試験キットの構成要素は、本発明の抗原結合ポリペプチドを用いて実施することが意図される試験又はアッセイの性質に応じて様々に異なり得るが、通常、本発明の抗原結合ポリペプチドを用いてイムノアッセイを実施するために必要とされるさらなる試薬を含む。診断試薬として用いられる、抗体、又はその抗原結合断片は、例えば、蛍光部分、酵素標識、又は放射性標識などの顕在化標識revealinglabelを有することができる。インビボ治療用途を対象とするヒト化抗体は、通常、1つ又は複数の医薬として許容し得る希釈剤、担体、又は賦形剤と一緒に、医薬剤形へと製剤化されるレミントン薬科学RemingtonsPharmaceuticalSciences、第16版、OsolA編、1980。本発明による抗体は、通常、それを必要とする哺乳動物対象、通常ヒト患者に、静脈内投与されるか、又は筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、腫瘍内、経口、腫瘍周辺、皮下、滑液嚢内、髄腔内、局所、舌下もしくは吸入経路で投与されるべき、滅菌水溶液として製剤化される。疾患の予防又は治療のために、抗体の適切な投薬量は、治療されるべき疾患の種類、該疾患の重症度及び臨床経過に加え、患者の年齢、体重、及び既往歴によって決まり、かつ担当医の判断によって決定される。ヒト化抗体の産生のためのプロセス本発明によるヒト化抗体の産生のためのプロセスは、まず、所望の抗原結合特性を有する通常型ラクダ科動物抗体を単離し、次に、本明細書に記載したように、VHドメイン又はVLドメインのいずれかにおいて1つ又は複数のアミノ酸置換を人為操作することによって、該抗体をヒト化に供することを含むことができる。該プロセスの第一の工程は、標的抗原に対する免疫応答を誘発するためのラクダ科ファミリーの種の能動免疫、それにより、該標的抗原と免疫反応性のあるラクダ科動物の通常型抗体を生成させること含むことができる。ラクダ科動物の免疫のためのプロトコルは、付随する実施例に記載されている。免疫に用いられる抗原調製物は、精製された形の標的抗原、例えば、組換えにより発現されたポリペプチド、又はその免疫原性断片であることができる。しかしながら、例えば、該標的抗原を発現もしくはコードする単離された細胞もしくは組織調製物、細胞ライセート、細胞上清もしくは細胞膜などの画分などのような抗原の粗調製物で免疫するか、又は該標的抗原をコードするポリヌクレオチドで免疫するDNA免疫ことも可能である。このプロセスは、通常、ラクダ科種の動物リャマ及びアルパカを含むが、これらに限定されないの免疫を含み、かつ有利なことに、これらの動物は非近交系集団に属する。しかしながら、ラクダ科動物の通常型Ig遺伝子座、又は少なくともその一部を含むトランスジェニック動物例えば、トランスジェニックマウスを用いることも企図される。関心が高まっている話題は、インビボ及びインビトロで生成された抗体の相補性決定領域CDR間の差異であるように思われる。インビボ選択が、得られる抗体の免疫原性、機能性、安定性、及びその結果として改善された製造可能性に対して望ましい影響を有する一方、インビトロで生成されかつ選択された合成CDRは、この観点から言えば、不利であり得ると推測される。所与の治療抗体は、患者からのいわゆる抗イディオタイプ抗体応答によって中和されるリスクがあるので、このことは重要であるLonbergの文献、NatureBiotechnology23:111711252005。ラクダ科動物の能動免疫に基づくプロセスの重要な利点は、個々の動物が異なる遺伝的背景を有する巨大な非近交系集団にラクダ科の全ての種を保つことができるという事実に端を発する。したがって、能動免疫を用いて、潜在的な抗原結合分子の多様なプールを得ることができる関心対象の抗原に対する強力かつ多様な免疫応答を誘発することが可能である。付随する実施例で例証されているように、ラクダ科動物の能動免疫によって、高度の免疫多様性を有する標的抗原に結合するFab断片を生成させることができることが認められている。理論によって束縛されることを望むものではないが、ヒトとラクダ科動物の間の系統学的距離は、所与の標的抗原に対する多様な免疫応答の生成に重要であり得ると推測される。対照的に、非ヒト霊長類は、系統学的にヒトに近く、したがって、非ヒト霊長類とヒトの間で高い相同性を有する標的は、非ヒト霊長類において強度及び多様性の点で限定された免疫応答しか誘発することができない。ヒトから系統学的に離れている非近交系集団で能動免疫を用いることができることは、仮に、そのように産生された抗体が、治療的潜在能力を有する候補抗体を作製するために大幅なタンパク質操作を必要とするようなヒト抗体との低い配列相同性及び構造相同性を示すのであれば、特に有利なことではないであろう。したがって、ラクダ科生殖系列及び体細胞突然変異配列が、ヒトVH及びVLドメインとの非常に高度の配列相同性及び構造相同性を有するVHドメインとVLドメインの両方をコードすることが示されたことは極めて重要である。巨大な非近交系集団の利用可能性と組み合わせた、この高度の相同性により、ヒト治療薬として使用されるモノクローナル抗体の開発のための非常に強力なプラットフォームが得られる。標的抗原による能動免疫後、末梢血リンパ球、又はリンパ節もしくは脾臓生検標本などの生検標本を、免疫動物から単離し、該標的抗原に対する通常型ラクダ科動物抗体の産生についてスクリーニングすることができる。本実施例で例示するように、パニング又はFACS選別を用いた濃縮などの技術をこの段階で用いて、スクリーニングされるべきB細胞レパートリーの複雑度を低下させることができる。次に、抗原特異的B細胞を選択して、トータルRNA抽出及びその後のcDNA合成に用いる。標的抗原に特異的なネイティブなラクダ科動物VH及びVLドメインをコードする核酸をPCRで単離することができる。関心対象の標的と免疫反応性があるラクダ科動物の通常型抗体を同定するために能動免疫を用いることは必須ではない。ラクダ科動物自身の免疫応答、この動物か、又は例えば、罹患した動物もしくは例えば、通常の感染経路で特定の病原体に自然に曝されている動物かのいずれかに天然に存在する免疫多様性を利用することも可能である場合がある。これに関して、非免疫ラクダ科動物ライブラリーを利用することができる。ラクダ科動物における自然免疫応答が関心対象の標的抗原に結合する抗体を既に生じていれば、そのような抗体を産生するB細胞を培養及び単離するために、又はそのような抗体のモノクローナル培養物を産生するために、並びに/又はそのような抗体のVH及び/もしくはVLドメインをコードするラクダ科動物遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を決定するために、本明細書に記載の遺伝子操作技術、及び当技術分野で公知の他の標準的技術を利用することが可能である。この配列情報を持っていれば、ラクダ科動物由来のVH及び/もしくはVL、又はそれらの超可変ループもしくはCDRを具現化する抗体をコードする組換えDNAコンストラクトを人為操作することが可能である。能動免疫によって得られたものであれ、他の手段によって得られたものであれラクダ科動物VH及びVLドメインをコードする核酸は、本発明による抗原結合ポリペプチドを産生するための発現ベクターに直接クローニングすることができる。特に、これらの配列は、キメラ抗体を産生するために、ヒト抗体定常領域、又はその一部もコードする発現ベクターにクローニングすることができる。しかしながら、ヒト定常領域配列のクローニング及び発現の前に、単離されたラクダ科動物VH及びVL配列に対してさらなる操作を行なうことが典型的である。第一の工程として、候補ラクダ科動物VH及びVL配列能動免疫後に単離された配列を含むを用いて、ラクダ科動物ライブラリー例えば、付随する実施例に記載されているような、Fabライブラリーを調製することができる。次に、このライブラリーを例えば、ファージディスプレイを用いて標的抗原への結合についてスクリーニングすることができる。有望なリード候補は、例えば、Biacore又は好適なバイオアッセイを用いて、標的抗原結合についてさらに試験することができる。最後に、最も有望なリードのVH及びVLドメインをコードする配列を、ヒト抗体定常領域をコードする配列とのインフレーム融合体としてクローニングすることができる。VH/VLドメイン中のラクダ科動物由来配列、又はそのヒト化変異体をコードするために用いられるポリヌクレオチド配列の変化をコドン最適化の目的で導入し、かつコードされるアミノ酸配列を改変しない、クローニング及び/又は発現に関連するポリヌクレオチド配列の他の変化をもたらすことが可能である。特定のプロセスでは、関心対象の抗原に結合することが知られている特定の可変ドメインを、反対のタイプの可変ドメインのセットの各々と対合させるすなわち、VHをVLライブラリーと対合させる、またはその逆を行なう鎖シャッフリングを行なって、ライブラリーを作製し、得られる雑多なVH/VLの組合せを抗原結合の親和性及び/又は特異性について試験することができる。或いは、VHドメインのライブラリーを、無作為か又は階層的な様式かのいずれかで、VLドメインのライブラリーと対合させ、得られた組合せを試験することができるClacksonらの文献、NatureVol352pp6246381991を参照されたい。このプロセスでは、これらのライブラリーは、関心対象の抗原に対する免疫を提示するラクダ科動物能動免疫動物を含む由来の再編成されたVH及びVLVκ又はVλのライブラリーであることができる。この鎖シャッフリングプロセスは、免疫多様性を増大させ、かつ顕著に増強された親和性を有する対合物を生じさせることができる。有用な抗原結合特性を有するラクダ科動物VH/VLドメイン対合物は、関心対象の抗原に結合する非ラクダ科動物好ましくはヒトにコードされたVH/VLドメイン組合せから始める、逆鎖シャッフリングプロセスを用いて単離することもできる。これは、例えば、バリデーション済みの疾患標的に対する完全ヒト治療抗体であることができる。このVH/VL組合せから出発して、VHドメインをラクダ科動物にコードされたVLドメインのライブラリーとシャッフルしまたはその逆を行ない、対合物を抗原結合について試験する第一ラウンドの選択を実施することが可能である。次に、選択された非ラクダ科動物例えば、ヒトVH/ラクダ科動物VL対合物は、ラクダ科動物にコードされたVLをラクダ科動物にコードされたVHのライブラリーに対してシャッフルし、得られた対合物を抗原結合について試験する第二ラウンドの選択に供される。結果として、出発VH/VL組合せのエピトープ跡epitopeimprintを有するラクダ科動物VH/ラクダ科動物VLの組合せを生じさせることが可能となり得る。このラクダ科動物VH/VL組合せを、本明細書に記載のプロセスのいずれかを用いて、さらに人為操作/修飾し、必要に応じて、ヒトにコードされた定常ドメインと組み合わせることができる。その後、ラクダ科動物由来VHドメイン及び/又はラクダ科動物VLドメインをコードするクローニングされたポリヌクレオチド配列を人為操作して、本明細書に開示された特定のアミノ酸位置の1つ又は複数にアミノ酸置換を導入する。好ましい置換としては、本明細書に開示されたJセグメント置換のいずれか及び/又は本明細書に開示されたCDR置換のいずれかと任意に組み合わせた、VHについて表4に記載された置換、及びVLについて表5に記載された置換が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト化の全般的目的は、ヒト対象に導入したときに、VH及びVLドメインが最小限の免疫原性を示す一方で、ラクダ科によってコードされたもとのVH及びVLドメイン例えば、能動免疫によって得られたラクダ科動物VH/VLにより形成された抗原結合部位の特異性及び親和性を保持する分子を産生することである。ヒト化プロトコルは、ラクダ科動物からヒトへのアミノ酸変化を順次導入し、親和性の顕著な低下例えば、5~10倍が認められるまで各段階で試験する反復プロセスとして実施することができる。複数のアミノ酸変化を同時に試験するために、ライブラリーアプローチを用いることも可能である。ライブラリー構築方法ラクダ科動物の通常型抗体のVH及び/又はVLドメインをコードする発現ベクターのライブラリーを作製する方法は、以下の工程を含むことができる:aラクダ科動物の通常型抗体のVH及び/又はVLドメインをコードする核酸分子の領域を増幅して、各遺伝子セグメントがラクダ科動物の通常型抗体のVHドメインをコードするヌクレオチド配列又はVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、増幅された遺伝子セグメントを得る工程、並びにb各発現ベクターが、VHドメインをコードする遺伝子セグメント及び/又はVLドメインをコードする遺伝子セグメントを少なくとも含むように、工程aで得られた遺伝子セグメントを発現ベクターにクローニングし、それにより、発現ベクターのライブラリーを得る工程。工程aで増幅された核酸は、ラクダ科動物のリンパ系組織から調製されたcDNA又はゲノムDNAを含むことができ、該リンパ系組織は、1つ又は複数のB細胞、リンパ節、脾臓細胞、骨髄細胞、又はそれらの組合せを含む。循環B細胞が特に好ましい。驚くべきことに、末梢血リンパ球PBLを、通常型ラクダ科動物抗体のVH及びVLドメインをコードする核酸の供給源として用いることができる、すなわち、直接増幅を可能にするほど十分な量の抗体を発現する形質細胞がPBL試料中に存在することが分かった。これは、動物ラクダ科動物から採取された全血試料からPBLを調製することができるので有利である。これは、侵襲的手順を用いて例えば、脾臓又はリンパ節から組織生検標本を得る必要を避け、試料採取手順を必要なだけ何度も繰り返し、動物に対する影響を最小限に抑えることを意味する。例えば、ラクダ科動物を能動免疫し、該動物から第一の血液試料を採取して、PBLを調製し、次に、同じ動物に追加免疫用量の同じ抗原か、又は異なる抗原かいずれかを用いて2回目の免疫を行ない、その後、第二の血液試料を採取し、PBLを調製することが可能である。リンパ系組織例えば、循環B細胞は、能動免疫したラクダ科動物から得ることができる。非免疫ライブラリー及び罹患したラクダ科動物のリンパ系組織に由来するライブラリーを調製することも企図される。好都合なことに、トータルRNA又はmRNAをリンパ系組織試料例えば、末梢血細胞又は組織生検標本から調製し、標準的な技術によってcDNAに変換することができる。出発材料としてゲノムDNAを用いることも可能である。多様なライブラリーアプローチか、又は該ライブラリーの構築のためのB細胞選択アプローチかのいずれかを用いることができる。多様なライブラリーアプローチでは、VH及びVLをコードする遺伝子セグメントのレパートリーを、いかなる事前のB細胞選択もなくリンパ系組織から調製された核酸から増幅することができる。B細胞選択アプローチでは、所望の抗原結合特性を有する抗体を提示しているB細胞を選択した後、核酸を抽出し、かつVH及びVLをコードする遺伝子セグメントを増幅することができる。様々な従来法を用いて、所望の抗原結合特性を有する抗体を発現するラクダ科動物のB細胞を選択することができる。例えば、B細胞を、通常型IgGの細胞表面提示について、蛍光標識したモノクローナル抗体リャマ又は他のラクダ科動物由来の通常型抗体を特異的に認識する、mAbと、別の蛍光色素で標識した標的抗原とで染色することができる。次に、個々の二重陽性B細胞をFACSで単離し、トータルRNA又はゲノムDNAを個々の細胞から抽出することができる。或いは、細胞をインビトロ増殖に供することができ、分泌されたIgGを含む培養上清をスクリーニングして、トータルRNA又はゲノムDNAを陽性細胞から抽出することができる。またさらなるアプローチでは、個々のB細胞を特定の遺伝子で形質転換させるか、又は腫瘍細胞株と融合させて、自由自在に増殖することができる細胞株を作製し、その後、これらの細胞からトータルRNA又はゲノムDNAを調製することができる。FACSによる選別の代わりに、通常型IgGを発現する標的特異的B細胞をラクダ科動物の通常型抗体に対する固定化したモノクローナル抗体上で、その後、固定化した標的抗原上でパニングすることができる。RNA又はゲノムDNAを抗原特異的B細胞のプールから抽出することができるか、又はこれらのプールを形質転換し、個々の細胞を限定希釈又はFACSによって徹底的にクローニングすることができる。B細胞選択法は、陽性選択又は陰性選択を含むことができる。いかなるB細胞選択も伴わない多様なライブラリーアプローチを用いるのであれ、B細胞選択アプローチを用いるのであれ、リンパ系組織から調製された核酸cDNA又はゲノムDNAは、個々のVHドメイン又はVLドメインをコードする遺伝子セグメントを増幅するために増幅工程に供される。リンパ系組織例えば、末梢B細胞又は組織生検標本から抽出されたトータルRNAを、ランダムプライムcDNAに変換することができるか、又はオリゴdTプライマーをcDNA合成に用いることができるか、或いはIg特異的オリゴヌクレオチドプライマーをcDNA合成に適用することができるか、又はmRNAすなわち、ポリARNAを、オリゴdTセルロースを用いてトータルRNAから精製した後にcDNAを合成することができる。B細胞から単離されたゲノムDNAは、PCRに用いることができる。少なくともVH又はVLをコードする重鎖並びに軽鎖カッパ及びラムダ遺伝子セグメントのPCR増幅は、CH1又はCカッパ/Cラムダ領域の3末端にアニールするプライマーと組み合わせて、可変領域の5末端にアニールするFR1プライマーを用いて実施することができ、これらの定常領域プライマーに関して、各々のタイプに1つのプライマーしか必要ないという利点がある。このアプローチによって、ラクダ科動物Fabをクローニングすることが可能になる。或いは、可変領域の3末端にアニールするFR4プライマーのセットをベクターにコードされた定常領域に融合されたFabとして、又はscFv重鎖可変領域と軽鎖可変領域が柔軟なリンカー配列を介して連結されている、単鎖Fvとして、クローニングするために再度用いることができるか;或いは、可変領域を、哺乳動物細胞表面に提示される完全長IgG分子の産生を可能にする発現ベクターにクローニングすることができる。一般に、増幅は、2工程で行なわれる;第一の工程では、多様性を維持するために大量のcDNAを用いてタグなしプライマーで、及び第二の工程では、アンプリコンをタグ付きプライマーで数サイクルだけ再増幅する。このタグ付きプライマーは、クローニングのために制限部位が5に導入されている延長されたプライマーである。余分なプライマーを除去するために、第一の増幅工程タグなしプライマーで産生されたアンプリコンを、第二の増幅工程の前に、ゲル精製することができる。或いは、プロモーター配列を導入することができ、これにより、リボソーム提示されるRNAへの転写が可能になる。制限部位の代わりに、適当なベクターへの部位特異的挿入を可能にする、CreLox部位又はTOPO部位のような、組換え部位を導入することができる。その後、ラクダ科動物の通常型VH及びVLドメインをコードする増幅された遺伝子セグメントを、機能的抗原結合ポリペプチドとしてVH/VL組合せの発現に好適なベクターにクローニングすることができる。例として、B細胞又はいかなるB細胞選択にも供されていない他のリンパ系組織のプール由来の増幅されたVHCH1/VκCκ/VλCλ遺伝子セグメントをまず、個々のライブラリー一次ライブラリーとして個別にクローニングすることができ、次に、第二の工程では、軽鎖断片を切り出し、これらを重鎖断片をコードするベクターに連結することによって、Fab又はscFVライブラリーを構築することができる。制限酵素による消化が最適でないためにPCR産物のクローニングは比較的非効率的であるので、この2工程手順は、大きいライブラリーの作製を後押しする。scFvをコードするDNA断片は、アンプリコン内の配列のわずかな重複に基づくスプライシングバイオーバーラップエクステンションsplicingbyoverlapextensionPCRSOEによって生成させることができ;PCRにおいて、VH及びVLコードするアンプリコンを、リンカーをコードする小さいDNA断片と混合することにより、重複する配列が原因となって単一のDNA断片が形成される。VH及びVLをコードする遺伝子セグメントを含むアンプリコンをファージベクター又はファージミドベクターにクローニングし、ファージディスプレイをベースにした選択方法を用いることによって、標的特異的抗体断片の選択を可能にすることができる。或いは、アンプリコンを、酵母細胞Fab、scFv、もしくは完全長IgGとして又は哺乳動物細胞IgGとして上での提示を可能にする発現ベクターにクローニングすることができる。他の実施態様では、T7又は他のプロモーター配列及びリボソーム結合部位が増幅用プライマーに含められているリボソームディスプレイ用のアンプリコンを用いることにより、クローニングを回避することができる。標的抗原への結合についての選択後に、プールをクローニングし、個々のクローンを解析する。理論上、このアプローチを用いると、ファージディスプレイライブラリーアプローチとは対照的に、より大きい免疫レパートリーを試料採取することができるが、それは、ファージを用いるライブラリーのクローニング及び選択が、1010~1012クローンに制限されるからである。B細胞選別を適用する場合、個々の標的特異的B細胞のVH又はVLをコードする遺伝子セグメントを含むアンプリコンを、抗体断片scFVもしくはFab、又はさらには完全長IgGの産生のための細菌又は哺乳動物発現ベクターに直接クローニングすることができる。標的抗原と免疫反応性のあるクローンのスクリーニング及び選択スクリーニング/選択は、通常、ライブラリー中のクローンによってコードされる発現産物すなわち、抗原結合ポリペプチドの形態のVH/VL対合物、例えば、Fab、scFV、又は抗体を標的抗原と接触させ、かつ所望の抗原結合特性を示すVH/VL対合物をコードする1つ又は複数のクローンを選択することを含む。ファージディスプレイライブラリーを、固定化した標的抗原に基づいて、又は可溶性の多くの場合、ビオチン化されている標的抗原に基づいて選択することができる。Fabフォーマットは、その単量体の外観及びファージ上でのその一価ディスプレイのために親和性による選択を可能にするが、これは、scFv凝集及びファージ上での多価ディスプレイの結果として並びにIgG二価フォーマットについては不可能である。標的特異的バインダーの十分な濃縮を得るためには、2~3ラウンドの選択が通常必要とされる。その後の選択ラウンドで標的抗原の量を減少させることによって親和性による選択を行なうことができるのに対し、ビオチン化されていない標的による長時間の洗浄によって、極めて良好な親和性を有するバインダーの同定が可能になる。この選択手順が、使用者に特定のエピトープに的を絞らせるのに対し;固定化した標的からファージクローンを溶出する古典的な方法は、抗体断片及び/又は標的を変性させるpHショックに基づくものであり、標的抗原又は可溶性受容体又はサイトカインに対する参照mAbとの競合によって、該標的の関連エピトープに結合する抗体断片を提示するファージの溶出がもたらされる当然ながら、これは、B細胞選択法を含む、他のディスプレイ系にも同様に適用可能である。選択のアウトプットから得られた個々のクローンを、細胞、又は細胞から断片が漏出する培養上清から調製されたペリプラズム画分を用いて、抗原結合ポリペプチド例えば、抗体断片の小規模生産に用いることができる。発現は、誘導性プロモーター例えば、lacプロモーターによって促進することができ、誘導物質IPTGの添加によって該断片の産生が開始されることを意味する。リーダー配列は、該断片のペリプラズムへの輸送を確実なものにする。ペリプラズムでは、該断片が適切にフォールディングされ、分子内ジスルフィド架橋が形成される。得られた粗タンパク質画分を、ELISAなどの標的結合アッセイで用いることができる。結合試験のために、個々のクローンから調製されたファージを用いて、概して非常に低い結合シグナルを生む、Fabの低い発現収量を避けることができる。これらのタンパク質画分は、拮抗抗体を同定するためのインビトロ受容体リガンド結合アッセイを用いてスクリーニングすることもでき;ELISAベースの受容体リガンド結合アッセイを用いることができ、また、Alphascreenのようなハイスループットアッセイも可能である。スクリーニングは、受容体を過剰発現する細胞株の膜画分が固定化されている、放射性標識リガンド結合アッセイで実施することができ;後者のアッセイは、ピコモル量の放射性サイトカインしか必要ないので極めて感度が良く、これは、粗タンパク質画分中に存在する微量の拮抗性Fabによって、正の読み出しが得られることを意味する。或いは、蛍光標識したサイトカインの、細胞表面に発現したその受容体への結合を阻害する抗体についてスクリーニングするためにFACSを適用することができる一方、FMATは、このハイスループット型の変形である。ペリプラズム画分中に存在するFab、又はそのヘキサヒスチジンタグでIMACによってもしくはFabのCH1ドメインに結合することが知られているプロテインGによって部分的に精製されたFabを、細菌夾雑物に対して感度が高くない、細胞を用いるバイオアッセイで直接用いることができ;或いは、個々の大腸菌Ecoli細胞由来のFabを、Fab又はIgGの発現用の哺乳動物系で再クローニングし、その後、バイオアッセイでスクリーニングすることができる。陽性発現ベクタークローン、すなわち、所望の標的抗原に結合する機能性VH/VL組合せをコードするクローンの同定後、可変領域のヌクレオチド配列を決定し、それによって、コードされたVH及びVLドメインのアミノ酸配列を推定することは日常的な手順である。望ましい場合、Fab又はscFVコード領域を、別の発現プラットフォーム、例えば、細菌発現ベクターファージミドベクターと同一であるが、ファージ上でのディスプレイに必要なgene3を含まないに再クローニングすることができ、これにより、より大量のコード断片を産生及び精製することが可能になる。標的結合の親和性を、表面プラズモン共鳴例えば、Biacoreによるか、又は他の方法を介して、精製Fab又はscFVについて決定することができ、その中和効力を、インビトロ受容体リガンド結合アッセイ及び細胞ベースのアッセイを用いて試験することができる。抗原結合性で、かつ特に拮抗性のFab又はscFVのファミリーは、主にVH、特に、VHドメインのCDR3の長さ及びアミノ酸配列の配列解析を基にして同定することができる。効力最適化望ましい場合、所望の標的抗原に対する親和性を有するVH/VL組合せをコードことがスクリーニング/選択によって同定されたクローンを、親和性及び/又は中和効力を最適化する下流の工程に供することができる。各VHファミリーの優良bestperformingメンバーの効力最適化を、軽鎖シャッフリング、重鎖シャッフリング、又はそれらの組合せによって達成し、それにより、動物に天然に生じる親和性変異体を選択することができる。これは、もとのラクダ科動物VH/VLドメインが、能動免疫したラクダ科動物から選択された実施態様では特に有利であるが、それは、同じ免疫動物から調製されたもとのライブラリーを用いて、鎖シャッフリングを行ない、それにより同じ免疫動物で生じる親和性変異体をスクリーニングすることが可能であるからである。軽鎖シャッフリングのために、望ましい抗原結合特性を有するVH/VL対合物例えば、拮抗性FabのVH領域又はVHCH1をコードする遺伝子セグメントを用いて、ライブラリーを構築することができる。このライブラリーでは、この単一のVHをコードする遺伝子セグメントは、クローンがそもそも選択されたライブラリーの軽鎖レパートリーと組み合わされている。例えば、VHをコードするセグメントが、標的抗原に対する免疫応答を誘発するために能動免疫されたラクダ科動物から調製されたライブラリー例えば、Fabライブラリーから選択されたものであるならば、このVHをコードするセグメントを同じ免疫ラクダ科動物の軽鎖VLレパートリーと組み合わせることによって、鎖シャッフリングライブラリーを構築することができる。その後、得られたライブラリーを標的抗原の選択に供することができるが、最良の親和性変異体の単離を確実なものとするために、ストリンジェントな条件低い標的濃度、ビオチン化されていない標的による溶液中での徹底的な洗浄下で行なわれる。ペリプラズム画分のオフレートoffrateスクリーニングも、改善されたクローンの同定を助けることができる。配列解析及び細菌性産生ベクターへの再クローニング後、精製され、選択されたFabを、親和性例えば、表面プラズモン共鳴による及び効力例えば、バイオアッセイによるについて試験することができる。重鎖シャッフリングは、軽鎖シャッフリング後に選択されたクローンの軽鎖VLをコードする遺伝子セグメントをVH/VLをコードするもとのクローンが選択された同じ動物由来のもとの重鎖ライブラリーにクローニングし直すことによって行なうことができる。或いは、CDR3特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、拮抗性Fabの軽鎖と組み合わせたレパートリーとしてクローニングし得るVH領域のファミリーの増幅に用いることができる。その後、親和性による選択及びオフレートスクリーニングによって、そのファミリー内の優良VHの同定が可能になる。実際には、軽鎖シャッフリング工程と重鎖シャッフリング工程を、どちらかの順番で行なうことができる、すなわち、まず軽鎖シャッフリングを行なって、次に重鎖シャッフリングを行なうことができるか、又はまず重鎖シャッフリングを行なって、次に軽鎖シャッフリングを行なうことができることが理解されるであろう。両方の可能性が本発明の範囲内に包含される。改善された親和性及び効力を有するVH/VL対合物例えば、Fabの軽鎖又は重鎖から、特に、CDRの配列を用いて、個々のFabの突然変異が組み合わされている人為操作された変異体を作製することができる。突然変異は、多くの場合、相加的なものであり得ることが知られており、これは、これらの突然変異を組み合わせることによって、さらにより増大した親和性がもたらされることを意味する。ヒト治療用途のための生殖系列化及びフォーマット化望ましい抗原結合特性を示すVH/VL対合物をコードする選択された発現クローン例えば、scFV又はFabをコードするファージクローンのVH及びVLをコードする遺伝子セグメントを下流のプロセッシング工程に供し、ヒト治療用途に好適な抗原結合ポリペプチドフォーマット例えば、完全ヒト定常ドメインを有する完全長抗体をコードするベクターなどの、別の発現プラットフォームに再クローニングすることができる。有望なリードの選択されたクローンは、VHドメイン及び/又はVLドメインをコードするヌクレオチド配列中に、1つ又は複数の変化を導入するように人為操作することができ、この変化は、VHドメイン及び/又はVLドメインのコードされたアミノ酸配列を改変してもよいし、改変しなくてもよい。VH又はVLドメインの配列のそのような変化は、本明細書で同定された特定のVH及びVLアミノ酸残基の置換を含む。特に、ラクダ科動物VHドメインを人為操作して、表4に記載の特定のアミノ酸置換の1つ又は複数を導入することができる一方、ラクダ科動物VLドメインを操作して、表5に記載の特定のアミノ酸置換の1つ又は複数を導入することができる。ヒトVH3ファミリーのメンバーと相同なアミノ酸配列を有するVHドメインの生殖系列化は、公知のラマグラマ、ラマパコス、又はカメルスドロメダリウス由来の生殖系列配列中で既に逸脱している、いくつかの残基の交換/置換を伴うことが多い。ラマグラマ、ラマパコス、又はカメルスドロメダリウス、特に、ラマグラマのVH3ドメインの生殖系列化/ヒト化のための許容されるアミノ酸置換は、フレームワーク領域内の位置74、83、及び84kabat付番を使用のいずれか1つ又はいずれかの組合せにおけるアミノ酸交換を含むが、これらに限定されない。そのような交換複数可は、これらの位置にあるラクダ科動物にコードされた残基複数可と異なるアミノ酸との置換を伴い、この異なるアミノ酸は、天然又は非天然のアミノ酸であることができ、かつヒトにコードされたVH3ドメイン中の対応する位置に生じることが知られているアミノ酸であることが好ましい。例えば、位置74のアラニンがセリンと交換されてもよく、又はアラニンがこの位置で保持されてもよく、位置83のリジンがアルギニンと交換され、また、位置84のプロリンがアラニンと交換されてもよい。したがって、本発明の抗原結合ポリペプチドの特定の非限定的な実施態様は、ヒトVH3ドメインとの配列相同性を示すラクダ科動物及びより具体的には、リャマ、アルパカ、又はヒトコブラクダのVHドメインを含む変異体を含み、このVHドメインは、位置74、83、及び84kabat付番を使用のうちの1つ又は複数又は全てにおけるラクダ科動物にコードされた配列に対するアミノ酸置換を含む。特に、以下の置換の1つ又は複数又は任意の組合せを有する変異体が許容される:位置74でSに変化したA、位置83でRに変化したK、又は位置84でAに変化したP。ひとたび必要に応じて、効力最適化の後にリードVH及びVLドメインのアミノ酸配列が分かれば、ヒト生殖系列から逸脱している残基が、好ましいヒト残基最も良く一致するヒト生殖系列由来のもの、又は他のヒト生殖系列に生じる残基、もしくはさらにはラクダ科動物野生型残基を有するものと交換されているVH及びVLの合成遺伝子を設計することができる。この段階で、可変ドメインをコードする遺伝子セグメントを、遺伝子合成時に、又は好適なディスプレイベクターへのクローニングによって、発現ベクターに再クローニングすることができる。この発現ベクターの中で、該遺伝子セグメントはFabのヒト定常領域に融合される。得られたVH及びVL合成遺伝子を組み換えてFabライブラリーにすることができるか、又は生殖系列化されたVHを野生型VLと組み換えることができる逆もまた同様であり、ハイブリッドライブラリーと呼ばれる。親和性による選択によって、優良な生殖系列化バージョンの単離が可能になり、ハイブリッドライブラリーの場合、生殖系列化された優良なVHを生殖系列化された優良なVLと組み換えることができる。生殖系列化されたFabに関するアミノ酸及びヌクレオチド配列情報を用いて、好ましいアイソタイプの完全長ヒトIgGADCC及びCDCについてはIgG1、限定されたエフェクター機能についてはIgG2、IgG2と同様であるが、一価の結合が必要とされる場合にはIgG4の産生のためのコドン最適化された合成遺伝子を生成させることができる。非慢性的適用及び急性適応のために、細菌又は哺乳動物細胞で産生されるヒトFabも産生することができる。本発明は、以下の非限定的な実験的実施例を参照して、さらに理解されるであろう。実施例1~9は、リャマの免疫から始めて、サイトカインxと表された抗原例に対する抗体を作製するプロセスを例示している。同じ一般プロトコルを、任意のラクダ科動物種の任意の標的抗原に適応することができ、したがって、サイトカインxの厳密な中身は重要ではない。本プロセスは、IL1βに結合するFabの調製についても例証されている。様々な刊行物が、前述の記載において及び以下の実施例の全体を通じて引用されており、その各々は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。一般プロトコル実施例1リャマの免疫リャマラマグラマの免疫及び末梢血リンパ球の採取、並びにその後のRNA抽出及び抗体遺伝子断片の増幅を、DeHaardと同僚によって記載されているように実施したDeHaardらの文献、JBact187:453145412005。1頭のリャマを、フロイント完全アジュバント又は動物に優しい適切なアジュバントStimune商標CediDiagnosticsBV社、オランダ用いて、組換えヒトサイトカインxで筋肉内に免疫した。サイトカインx人為操作したヒト細胞株で組換えにより発現されたものは購入した。免疫の前に、凍結乾燥されたサイトカインxを、PBSDulbecco社中、250μg/mlの濃度で再構成した。リャマは、隔週で6回の注射を受け、最初の2回の注射は、注射1回当たりサイトカイン100μg、最後の4回の注射は、各追加免疫1回につき50μgとした。最後の免疫から4日後、150mlの血液試料PBL1を該動物から回収し、血清を調製した。最後の免疫から10日後、150mlの第二の血液試料PBL2を回収し、血清を調製した。この血液試料から、FicollPaque商標勾配AmershamBiosciences社を用いて、リャマ免疫グロブリンの遺伝子供給源としての末梢血リンパ球PBLを単離し、1~5×108個のPBLを得た。抗体の最大多様性は、試料採取されたBリンパ球の数と等しいと予想され、その数は、PBLの数1~5×107の約1092~232DeGenstらの文献、DevCompImmunol30:187982006である。リャマ血清中の通常型抗体の画分は、全免疫グロブリンの量の最大80であり、これを、通常型抗体を産生するBリンパ球の同様の画分に対して外挿することができる。したがって、150mlの血液試料中の通常型抗体の最大多様性は、08~4×107個の異なる分子と計算される。トータルRNAは、Chomczynskiらの方法AnalBiochem162:1561591987に従って、PBLから単離した。実施例2パニング又はFACS選別による抗原反応性B細胞の濃縮任意試料採取されたB細胞レパートリーの複雑性を低下させて、組換えFabファージディスプレイライブラリーの効率的なクローニングを可能にするために、抗原反応性B細胞を、蛍光標識抗原とB細胞マーカーとしてのラクダ科動物の通常型抗体を特異的に認識するmAbとを用いるFACS選別Weitkampらの文献、JImmunolMeth275:2232372003によるか、又は固定化した抗原に対するパニング手順Lightwoodらの文献、JImmunolMeth316:1331432006によって濃縮した。免疫動物由来のPBLを、上記のようなFicollPaque上での密度遠心分離によって単離した。任意に同時精製した赤血球細胞は、PBLペレットを室温で20mlの溶解緩衝液829g/LNH4Cl、109g/LKHCO3、及び37mg/LEDTAに再懸濁し、その後、200×gで10分間遠心分離することにより溶解させた。単球をT150培養フラスコのプラスチック表面に付着させることによる単球の除去も任意とした。これを実現するために、細胞を、10胎仔ウシ血清、Glutamax、25mMHepes、ペニシリンストレプトマイシンInvitrogen社、及び038クエン酸ナトリウムが補充された70mlのRPMIInvitrogen社に再懸濁し、フラスコ内で37°C及び5CO2で2時間インキュベートした。選択されたBを含む上清画分を回収し、細胞をカウントした。標的特異的な通常型抗体を提示する生きたB細胞のFACSにおけるバルク選別を、ラクダ科動物の通常型抗体を特異的に認識する蛍光標識mAbと、また別の蛍光色素で標識された標的抗原とによる同時染色により行なった。1000~100000個の抗原特異的細胞を選別し、Goughと同僚Goughの文献、AnalBiochem173:93951988のプロトコルを適用することによるか、又はTRIzol商標キットInvitrogen社を用いることによって、RNA抽出に用いた。トータルRNAを、抗体重鎖及び軽鎖の可変遺伝子の増幅用の鋳型としてのランダムプライムcDNAに変換した実施例3以降を参照されたい。実施例3可変領域遺伝子の増幅及びクローニングランダムプライムcDNAは、RTPCR用のSuperscriptIII商標ファーストストランド合成システムInvitrogen社を用いて、80μgのPBLRNAから調製した。RNAを、20μlの反応液の8つの独立した反応において、25μMのランダムヘキサヌクレオチドプライマー及び500μMのdNTPの存在下にて65°Cで5分間熱変性させた。その後、供給業者の指示に従って、8×40μlの総最終容量中に、緩衝液及びジチオスレイトール、並びに640ユニットのRNaseOUT40ユニット/μl、Invitrogen社、及び3200ユニットのSuperscriptIII逆転写酵素200ユニット/μl;Invitrogen社を添加した。50°Cで50分間、85°Cで5分間、及び1°Cで1分間の後、RNAseHを添加し約4ユニット、37°Cで20分間インキュベートした。プールしたcDNAを、供給業者の推奨に従ってQIAquick商標PCR精製キットを用いて浄化し、PCRに用いた。CH1の3末端並びにVHの5及び3末端にアニールするプライマーを、リャマ及びヒトコブラクダの生殖系列配列を基にして設計した。これらの配列に関しては、その寄託配列を、DeGenstと同僚DeGenstらの文献、DevCompImmunol30:1871982006からの引用に従って、IMGT及び他のデータベースから検索することができた。軽鎖を増幅するためのオリゴヌクレオチドの設計のために、学位論文ILegssyer、ブリュッセル自由大学に公表されている、再編成されたヒトコブラクダ配列及び体細胞突然変異したヒトコブラクダ配列を用いた。最大多様性を維持するために、鋳型としての比較的大量のランダムプライムcDNA最大25μl、6μgのトータルRNAに相当に対して、可変領域の5末端にアニールする個別のBACKプライマーを用いて、CH1の3末端にアニールするFORプライマーと組み合わせて、全ての一次PCRを実施した。重鎖由来のアンプリコンを、VHの3末端にアニールし、かつ天然のBstEII部位を含むJHFORプライマーとVH遺伝子の5末端にアニールするSfiIタグ付きVHBACKプライマーの組合せを用いて再増幅し、その後、VH断片としてクローニングすることができる。軽鎖V遺伝子を、定常ドメインの3末端にアニールするCKFOR又はCLFORプライマーとV領域の5末端でプライミングするBACKプライマーのセットを用いるPCRで得た。最初のPCR反応からのアンプリコンを、伸長型のCH1FORプライマーNotI部位を含む又はCKFOR及びCLFORプライマーAscI部位を含むを用いて再増幅し、その後、リャマFab断片としてクローニングした。或いは、DNAセグメントを、制限部位をタグ付けしたプライマーAscI部位を含むFORプライマー及びXhoI部位を含むFR4ベースのBACKプライマーを用いて再増幅し、VL断片としてクローニングし、それにより、ヒトC領域と組み合わされたリャマ由来V領域を含むキメラFabを作製することができる。PCRを、Phusion商標ポリメラーゼFinnzymes社及び500pMの各プライマーを用いて、容量50μlの反応液中で、28サイクル96°Cで1分間、60°Cで1分間、及び72°Cで1分間実施した。全ての産物を、QIAexII抽出キットQiagen社を用いて、アガロースゲルから精製した。制限部位を導入するための再増幅用のインプットとして、100~200ngの精製DNA断片を100μlの反応容量で鋳型として用いた。大量のインプットは、多様性の維持を保証するが、これについて、4μlの未増幅のPCR混合物をアガロースゲル上で解析することによりチェックした。実施例4一次及び二次ラクダ科動物Fabレパートリーの構築一次重鎖レパートリー及び2つの一次軽鎖レパートリーの構築のために、制限部位が付加されたPCR産物をゲル精製し、その後、消化し、様々なVH、Vκ、及びVλファミリーを組み合わせて3つのグループにした。VHCH1断片をSfiI及びNotIで消化し、VκCκ及びVλCλ断片をApaLI及びAscIで消化し、ファージミドベクターpCB3適合したマルチクローニングサイトを有するベクターpCES1に類似しているにクローニングした。消化した断片1~2μgを、消化及び精製したpCB32~4μgに、T4DNAリガーゼFermentas社を用いて、室温で数時間、その後、37°Cで1~2時間連結させた。軽鎖又は重鎖プールの脱塩したライゲーション混合液を、大腸菌株TG1のエレクトロポレーションに用いて、1つの鎖のライブラリーを作製した。或いは、合計15μgのVH断片をSfiI及びBstEIIVH中に存在するで消化し、100~200μlの反応混合液中、室温で、9ユニットのT4DNAリガーゼを用いて、4μgのゲル精製したベクターpCB4ベクターpCB3に類似しているが、pIII遺伝子を欠失しているに連結させることができる。さらに、VH遺伝子セグメントをSfiI及びBstEIIを介して、並びにVκ/Vλ遺伝子セグメントをApaLI及びXhoIを介してクローニングし、キメラFd及びVκCκ及びVλCλを得ることができる。Fabライブラリーは、軽鎖レパートリーから調製されたプラスミドDNAから消化された軽鎖断片を重鎖レパートリーを含むプラスミドコレクションにクローニングすることにより得られた。VLライブラリーの少なくとも3×109個の細菌から単離されたプラスミドDNAドナーベクターをApaLI及びAscIで消化し、ゲル精製したDNA断片を、重鎖ライブラリーを既に含むアクセプターベクターにクローニングし、それにより、1~10×109クローンのサイズの、カッパ軽鎖を有する個別のFabライブラリーと、ラムダ軽鎖を有するFabからなる別のライブラリーとを作製した。同様に、単鎖ライブラリー由来のVλCλ又はVκCκをApaLI/AscIを用いてアガロースゲルから抽出し、同じ制限部位を用いて、VHCHライブラリーベクターにクローニングすることができる。実施例5ライブラリーの選択出発接種菌中に各クローン由来の少なくとも10個の細菌が確実に存在するように、ライブラリー由来の代表的な数の細菌を接種に用いて、ヘルパーファージM13KO7又はVCSM13によるファージミド粒子のレスキューを2Lスケールで実施した。選択のために、1013個のコロニー形成単位を、イムノチューブMaxisorp商標チューブ、Nunc社もしくは96ウェルマイクロタイタープレートMaxisorp商標、Nunc社中に固定化した抗原とともに、又は可溶性ビオチン化抗原とともに用いた。固定化した抗原の量は、第1ラウンド1の10μg/mlから始めて、その後の選択ラウンドの間に10~100倍減少させた。抗原を、供給業者の推奨に従って、抗原1分子当たりNHSビオチンPierce社3~10分子の比でビオチン化し、その生体活性についてバイオアッセイで試験した。特に明記しない限り、該抗原を、第1ラウンドの間は1~10nMの濃度で、その後のラウンドの間は10pM~1nMの濃度で選択に用いた。実施例6拮抗性サイトカインx特異的Fabのスクリーニング可溶性Fabは、Marksらの文献Marksらの文献、JMolBiol222:5815971991に記載されているように個々のクローンから、しかし、好ましくは感度を高めるためにモノクローナルファージLeeらの文献、Blood、108:310331112006として産生した。可溶性Fab又はFab提示ファージを含む培養上清を、直接コーティングされた抗原を用いるELISAで試験したか、又は固定化したストレプトアビジンを介して捕捉した。組換えヒトサイトカインx及びストレプトアビジンを、01MNaHCO3pH96中10μg/mlで、4°Cで16時間コーティングした。PBS、01v/vTween20で3回洗浄した後、ビオチン化抗原を、05μg/mlの濃度で、室温で30~60分間添加した。プレートを、PBS中の2w/v半脱脂粉乳Marvel又はPBS中の1カゼイン溶液を用いて、室温で30分間ブロッキングした。培養上清を、2w/vMarvel/PBS中で1倍又は5倍希釈し、2時間インキュベートし;結合したFabを、重Fd鎖のカルボキシル末端にあるmycペプチドタグを認識する抗myc抗体9E105μg/ml、及びウサギ抗マウスHRPコンジュゲートDako社で検出した。最後のインキュベーションの後、染色を、テトラメチルベンジジン及びH2O2を基質として用いて行ない、05容量の1MH2SO4を添加して停止させ;光学密度を450nmで測定した。ELISAで陽性シグナルバックグラウンドの2倍を上回るものを生じるクローンを、オリゴヌクレオチドプライマーのM13リバース及びgeneIIIフォワード4を用いる増幅で得られたPCR産物の、又は個別のFd及びVκCκ又はVλCλアンプリコンのBstNI又はHinfIフィンガープリントによって解析した。サイトカインxのその受容体への結合を妨害するFabの能力のスクリーニングを適当な受容体リガンド結合ELISAにおいて実施した。このために、少量のビオチン化サイトカインxを、サイトカインx受容体をコーティングしたプレート上で培養上清中のFabとともにインキュベートし、その後、結合したサイトカインxを、ストレプトアビジンHRPコンジュゲートで検出した。陽性ヒットの配列を決定し、インビトロ受容体リガンドアッセイでその効力IC50を決定するために、及び固定化したサイトカインxに対するBIAcoreでその親和性を評価するために、Fabを精製した。個々のクローンからの可溶性Fab断片の大規模誘導を、100μg/mlカルベニシリン及び2グルコースを含む2×TY中で、50ml又は250mlスケールで行なった。OD600が09になるまで37°Cで増殖させた後、細胞をペレットにし2934×gで10分間、カルベニシリン及び1mMイソプロピル1チオDガラクトピラノシドIPTGを含む2×TYに再懸濁した。別のDeBellis手順DeBellis及びSchwartzの文献、NAR1990185:1311を、2ではなく、02のグルコースを用いて進め、それにより、対数増殖期後期の細胞の培地へのIPTGの直接添加を可能にした。30°Cで35時間増殖させた後、前述のような遠心分離によって細菌を回収し;細胞ペレットを1mlの氷冷PBSに再懸濁することによって、ペリプラズム画分を調製した。4°Cで2~16時間、縦にheadoverhead回転させた後、2回の遠心分離工程によって、スフェロプラストを除去し;3400×gで10分間スピンさせた後、エッペンドルフ遠心機にて13000×gで10分間の追加の遠心分離工程により、上清を透明化した。得られたペリプラズム画分を、様々な機能アッセイ標的結合ELISA、インビトロ受容体リガンド結合アッセイ、及びBiacoreで直接用いた。配列決定のために、プラスミドDNAを、QiagenミニキットQiagen社を用いて、100μg/mlカルベニシリン及び2グルコースを含むLB培地中、30°Cで増殖させた5ml培養物から、又はFabインサートの境界でアニールするベクタープライマーのM13リバース及びgeneIIIフォワードを用いてアンプリコンを基にして調製した。実施例7リードFabの大規模産生及び精製3~6個の異なるリード由来のFabインサートを、Fdのカルボキシ末端に融合したヘキサヒスチジンタグ及びCMYCタグを含むが、バクテリオファージM13gene3を欠くpCB3と同一の発現ベクターpCB5と符号化にApaLINotIを介して再クローニングした。同時に、V領域を、適切な組合せの制限酵素を用いて再クローニングし、その後、ヒトCH1及びCκ又はCλを含む、キメラFab発現用のgene3欠失ベクターにクローニングした。フィンガープリント解析後、再クローニング後に得られた個々のクローンを、50ml又は250mlスケールで増殖させ、ペリプラズム画分を上記のように調製した。Fab断片をIMACで精製し、正しく形成されたFabを、Superdex商標75HRカラムAmershamPharmaciaBiotech社を用いるサイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製した。細胞ベースのアッセイによっては、1MNaOH中で一晩増感させ、その後、DPBS中で平衡化する陰イオン交換カラムSource30Q、GEHealthcare社に通すことによって、エンドトキシンを除去した。Fabのモル吸光係数13を用いて280nmで光学密度を測定することにより、収量を決定した。精製したFabを、インビトロ受容体リガンド結合アッセイ及びBiacoreで試験して、gene3を含むpCB3ベクターによって産生されたFab断片で得られた観察結果を確認した。最後に、Fabの効力をバイオアッセイで決定した。実施例8本実施例では、親和性ベースの選択引用により本明細書中に組み込まれている、US2003/0190317A1号によって高親和性フレームワーク配列を同定するために、わずかなフレームワーク残基のセットを標的とするソフトランダム化手順を用いて、及び得られたFabライブラリーの繊維状ファージ表面での一価ディスプレイによって、サイトカインxに対するリャマ由来のリードFabをヒト化した。例えば、ヒトコブラクダ由来の生殖系列VHIGHV1S20の場合、野生型残基の70を維持して、位置5Val、Leu、55Gly、Ala、83Ala、Ser、95Lys、Arg、96Ser、Ala、及び101Met、Valについて、小さいライブラリーを作製したIMGT付番。超可変ループ中のアミノ酸について同様に対処することができた。PCRエラーを補正するための、又はさらなる特異的単一コドン変化を導入するための部位特異的突然変異誘発を、本質的にKunkelらの文献CurrProtocMolBiolCH8U812001に記載されているように実施したか、或いはこれらの変異体をコードする合成遺伝子をGeneArtに発注した。部位特異的実験のための鋳型は、ヒト化Fabクローン由来の一本鎖DNAとした。部位特異的突然変異誘発は、野生型Fab又はヒト化FabをコードするDNA中で、ヒト化又は修飾の目的で、限定された数のアミノ酸コドンを直接変化させるためにも用いた。選択後、個々のリードを親和性及び効力について試験し、最も優れたリードをヒトFab/IgGへの再フォーマット化のために選んだ。実施例9ヒトFab断片及びヒトモノクローナル抗体の発現ヒト化VH及びVL領域から出発して、ヒト化Fabの発現を、Rauchenbergerらの文献JBiolChem278:381942042003に記載されているように実施した。ヒトモノクローナル抗体の発現のために、1つは軽鎖コンストラクト用、1つは重鎖コンストラクト用の2つの個別の発現ベクターを、pcDNA31ベクターを基にして構築した。軽鎖用の発現ベクターは、CMVプロモーターの下流にあるヒトCカッパ又はヒトCラムダのいずれかの配列、及び該CMVプロモーターの下流にあり、かつ軽鎖定常ドメインとインフレームになったKPN1BsmB1断片としての軽鎖コンストラクトのクローニングを可能にする制限部位を含んでいた。次に、重鎖用の発現ベクターは、CMVプロモーターの下流にあるヒトCH1ヒンジCH2CH3配列、及び該CMVプロモーターの下流にあり、かつ重鎖定常ドメインとインフレームになったKPN1BsmB1断片としてのVHコンストラクトのクローニングを可能にする制限部位を含んでいた。これらのVL及びVH断片を、コザック配列と、それに続くそれぞれのVL又はVH配列とインフレームになったマウスIgGカッパリーダー配列とを含むKPN1BsmB1断片として、適当な発現ベクターにクローニングした。これらの配列は遺伝子合成により得られ、哺乳動物細胞内での発現のために最適化されたGeneart社。完全長IgG産生のために、VH及びVL発現ベクターコンストラクトを、哺乳動物細胞HEK293一過性又はCHO安定に共トランスフェクトした。一過性にトランスフェクトした細胞又は安定にトランスフェクトした細胞由来の上清をプロテインAクロマトグラフィーにより精製した。モノクローナル抗体又はFabを受容体結合アッセイ及びバイオアッセイで試験し、最も優れたリードをさらなる開発のために選択した。実施例10-IL1βに対するFabの作製特に指示しない限り、以下の試験で用いる材料及びプロトコルは、実施例1~9で用いたものと類似していた。リャマをIL1βで免疫するのに成功した2頭のリャマラマグラマを実施例1に記載したような標準的なプロトコルに従って、ヒトIL1βで免疫した。両方のリャマ由来の血清を、免疫前0日目及び免疫後28日目のELISAでIL1βに対する抗体の存在について試験した。図1に示すように、IL1βに対する特異的シグナルは、免疫後のELISAで認められ、血清を10000倍希釈した後でも認められた。この高い抗体力価は、特異的かつ適切な免疫応答を示している。良好な多様性を有するFabライブラリーを構築した両方の免疫リャマから単離されたPBLを、Haardらの文献JBC1999に記載されている戦略を用いて、RNA抽出、RTPCR、及びファージミドへのFabのPCRクローニングに用いて、良好な多様性を有する多様なライブラリー2~5×108を得た。以下のプライマーを用いた:独立したVλCλ及びVκCκライブラリーを、単一のタグ付きPCR工程30サイクルを用いて構築し、より大きいクローン多様性を保存した。同時に、VHCH1ライブラリーを、2工程PCRタグなしプライマーで25サイクル工程1、その後、タグ付きプライマーで10サイクル工程2を用いて構築した。次に、VλCλ及びVκCκライブラリー由来の軽鎖を、VHCH1発現ベクターに個別に再クローニングして、それぞれ、ラムダ及びカッパリャマFabライブラリー各々の免疫リャマにつき2つを作製した。これらのライブラリーの品質管理を、PCRを用いて通常通りに行なった。無作為に試験したクローンの最大93が完全長Fab配列を含み、これらのライブラリーの高い品質を示した。ヒトIL1β特異的Fabを選択したファージディスプレイを用いて、ビオチン化IL1βに結合する非常に多様なリャマFabを同定した。タンパク質の活性のある立体構造を保存するために、ビオチン化IL1βを捕捉用に用いた。2ラウンドの選択の後、対照と比べて良好な濃縮が認められた。ファージELISAにより、サイトカイン特異的Fabを発現するクローンの存在が明らかになったデータは示さない。ビオチン化IL1βに結合するファージをpHショックにより溶出させた。溶出物outputの連続希釈物101~105を用いて、新鮮な大腸菌TG1細胞に感染させた。得られたコロニー数は、この選択時に結合したファージの数を示す。上記の例では、100nM及び10nMのbiotIL1βを用いて選択を行なったときに、5μlの溶出物から、約105個のファージが得られた。非特異的結合により得られた102個のファージと比べると、これは、1000倍の濃縮を生じさせている。94個の単一クローンを増殖させ、それを用いてモノクローナルファージを産生した。これらのファージをファージELISAで用いた。多くのファージは、ビオチン化IL1βに対する2ラウンドの選択の後に、biotIL1βに対する良好な結合を示した。ヒトIL1β特異的Fabはヒト生殖系列との高い出発相同性を有する標的特異的VH及びVλドメインを、同一のCDR1及びCDR2長、並びに対応するカノニカルフォールドを示すよく見られるヒト生殖系列と一致させた。その後、最も近いヒト生殖系列を、そのフレームワーク領域における配列相同性に基づいて選択した。一致しないアミノ酸残基を、関連する他のヒト生殖系列におけるその存在についてチェックした。一致するものが存在しない場合、これらの残基を外来のものforeignとカウントした。考察及び結論:合計14種の標的特異的VHファミリー、9種の標的特異的Vλファミリー、及び3種のVκファミリーを、このまさに最初の選択に基づいて同定した。14種の抗IL1βWTVHと12種の抗IL1βWTVLのこの最初のパネルは、ヒト生殖系列との顕著に高い配列相同性を示している。これらのVHドメインの33はヒト状況との95以上の出発相同性を有し、かつVLドメインの約44はヒト状況との95以上の出発相同性を有しており、さらなるヒト化の必要がなくなっている。VHドメイン2D8はVH1C2のヒト化バージョンであるが、その理由は、これが最も近いヒト生殖系列と比べて逸脱するアミノ酸残基が1つ少ないことによる。その対応するVLドメインVL2D8は、最も近いヒト生殖系列との95の出発相同性を有しており、これはさらに、1つの復帰突然変異VL2G7によって96に増大した。上記の方法を用いて評価したとき、VH及びVLドメインは全て、1つの例外もなく、ヒト3D結合部位構造すなわち、一致するヒト生殖系列セグメントに生じるのと同一のCDR1及びCDR2についてのカノニカルフォールド組合せを示したデータは示さない。Fab1E2及び1F2のヒト化1E2及び1F2と符号化した2つのIL1β特異的Fabに対してヒト化を行なった。最も近いヒト生殖系列に対するアラインメントに基づいて、そのVH及びVλフレームワーク領域における突然変異が提案された図2。ヒトVH3ファミリーと一致するVHの生殖系列化は、多くの場合、公知のラマグラマ、ラマパコス、又はカメルスドロメダリウス由来の生殖系列配列において既に逸脱している、いくつかの残基を含む。例えば、位置71のアラニン付番はKabatによる及び83のリジン及び84のプロリンは、それぞれ、セリンしかし、特定のヒト生殖系列VH3メンバーでは、アラニンが存在する、アルギニンしかし、いくつかのヒトVH3生殖系列によってリジンが用いられている、及びアラニンに変化させることができる。軽鎖可変配列については、ラクダ科動物に利用可能な生殖系列配列はないが、大部分のリード抗体で変化させられることになる、FRにおけるヒト生殖系列からのいくつかの逸脱が存在する可能性は極めて高い。完全ヒト化hum及び野生型wtV領域の他に、3つの野生型残基しか残存していない安全変異体safeも提案された。Fab1E2を段階的アプローチでフォーマット化し、それにより、ヒト定常ドメインに融合したVλの様々なバージョンwt、safe、及び完全にヒト化したものを、ヒト定常CH1ドメインに融合したVHの様々なバージョンと組み合わせて、表12に示すFabを作製した:これらのFab遺伝子を、GeneArt社ドイツに合成遺伝子として注文し、その後、大腸菌で産生し、精製し、biotIL1βに結合するその能力について試験した。このために、抗mycコーティングしたMaxisorpプレート上でFabを捕捉した。ビオチン化ヒトIL1βを添加し、結合したサイトカインを、HRPコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて検出した。このアッセイの読み出しを、下記の図3に示す。野生型定常ドメインCH1及びCλをそのヒト対応物に置き換えても、結合能に影響はなかった。1E2のVHドメインの部分ヒト化wtVλ/safeVH及び完全ヒト化wtVλ/humVHによって、機能的Fabが生成された。クローン1F2のヒト化変異体を、gene3Fab融合体を発現するファージを用いて試験した図4。ファージは、各コンストラクトにつき4つの独立したクローンから産生した。wt1F2及びwt1E2リャマVλ及びVHをヒトCλ及びCH1に融合したものsafe変異体1F2及びsafe変異体1E2部分ヒト化VλをヒトCλ及びCH1に融合したものhum1F2及びhum1E2完全ヒト化Vλ及びVHをヒトCλ及びCH1に融合したもの細菌増殖、ファージ産生効率、及び毒性などによるクローンのばらつきをなくすために、各Fabにつき4つのクローンを試験した。ニュートラビジンをコーティングしたMaxisorpプレート上でビオチン化IL1βを捕捉し、その後、粗ファージ抽出物すなわち、細菌培地をインキュベートすることにより、ファージELISAを行なった。徹底的な洗浄の後、結合したファージを抗M13HRPモノクローナル抗体で検出した。ニュートラビジンでコーティングしたウェルビオチン化IL1βを含まない上で試験したときの同じファージ調製物からは、シグナルが得られなかったデータは示さない。1F2VL及びVHドメインのフレームワーク領域中での最も近いヒト生殖系列への復帰突然変異によって、抗原特異性を維持する、部分ヒト化safe及び完全ヒト化hum変異体を得ることに成功した。ヒト定常ドメインを用いたラクダ科動物可変ドメインの良好なフォーマット化IL1β特異的クローン1E2のVL及びVH可変ドメインをヒトCλ及びCH1定常ドメインに融合させることに成功し、産生及び精製されるキメラFabを生じさせた。このキメラ1E2Fabは、37°Cで4時間o/d又は28°Cで16時間o/nの誘導を行なうことによって、pCB5ファージミドΔgene3から産生した。野生型リャマ1E2Fabは、30°Cで16時間の誘導を行なうことによって、pCB3gene3含むファージミドから産生した。精製後、これらのFabを、DTTあり還元型又はDTTなし非還元型のSDSPAGEにローディングした。クマシー染色を行ない、これらのFab又はそれらを構成する軽鎖及び重鎖の存在が、予想された分子量バンド図示せずに見事に示された。上記の精製リャマ及びキメラ1E2Fabを、抗mycコーティングしたMaxisorpプレート上で捕捉した。ビオチン化ヒトIL1βとともにインキュベートし、徹底的に洗浄した後、Fabに結合したビオチン化IL1βを、HRPコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて検出した。精製リャマ1E2Fabとキメラ1E2Fabは両方とも、機能的標的結合を示した図5。この知見は、ラクダ科動物由来の可変ドメインとヒトIgGの定常ドメインとの会合の実現可能性を示している。Fabのサブセットは標的の機能阻害を示した下記の表は、以下のELISA実験から得られたOD値を示している。ウェルを、IL1βとその受容体との結合を阻害することが知られているマウスモノクローナル抗体DiacloneSAS社により提供されたものでコーティングした。ビオチン化IL1βを、ビオチン化IL1βに対する2ラウンドの選択の後に同定されたFabのペリプラズム抽出物とともにウェルに添加した。結合したビオチン化IL1βの検出は、HRP標識ストレプトアビジンによってもたらされた。シグナルの低下は、特異的Fabとブロッキングマウスモノクローナル抗体との競合を示し、拮抗作用を示唆した。大量の競合するマウスモノクローナルに中に添加することにより、陽性対照をウェルG12に含めた表13のウェル12G。ブロッキングマウスモノクローナル抗体と良好に競合する多くのFab表13において影付きのセルで示したものを同定した。競合するクローンの配列解析により、スクリーニングした48クローン中に存在する、異なるVHを有する3つのFabの存在が明らかになった表13で6Aと符号化されたプレートの部分。拮抗性Fab1A1表13の競合アッセイで0205のシグナルを生じるもの、1B30444のシグナル、及び関連クローン1G10498のシグナル、並びに最後に1C30386のシグナルのVHの最も近いヒト生殖系列に対する配列アラインメント及び構造相同性解析を以下に示す。3つとも、一致するヒト生殖系列との非常に高度な配列相同性を有し、かつヒト生殖系列に見られるのと同一のカノニカルフォールド組合せを有する。これは、3つの拮抗性リードのラムダ軽鎖についても認められたデータは示さない。Fab1A1は、拮抗性参照モノクローナル抗体と強く競合するELISAベースの競合アッセイで12μg/mlのIC50のに対し、Fab1C3は、競合をほとんど示さない50μg/mlを超える濃度でのみ。しかしながら、バイオアッセイでは、1C3は、1A110μg/mlのIC50よりも強力3μg/mlのIC50であり、これにより、異なるエピトープ認識が示唆される。異なる拮抗性Fabの高い頻度スクリーニングした48クローン中の3つの異なる抗体及びこれらのうちの2つに見られるエピトープ認識の違いは、リャマの非近交系の性質の結果としての抗体の高い多様性を例証している。強力な抗体の高い多様性及び広範なエピトープ範囲と組み合わされた、ヒト生殖系列V領域との高度な配列相同性により、免疫ラクダ科動物由来の治療抗体のパネルの同定が可能になる。実施例11以下の実施例は、確立されたマウスモノクローナル抗体アプローチと比較して、ラクダ科動物の免疫により達成し得る機能的多様性を示している。10匹のBALB/cマウスを、組換えで産生された分子量の小さいサイトカインで免疫した。この免疫プロトコルの終了後、動物を屠殺し、その脾臓細胞を不死化することによって、ハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマの上清を、サイトカイン結合ELISAで、その後、好適なバイオアッセイで試験した。1つの非常に強力なアンタゴニストと1つの弱いアンタゴニストを同定することができた。また、4頭のリャマを、本明細書に記載の一般プロトコルを用いて、組換えで産生した同じサイトカインで免疫した。この免疫プロトコルの終了後、末梢Bリンパ球を採取し、そのRNAを抽出し、精製した。リャマ特異的プライマーのセットを用い、ファージディスプレイ技術を用いて、Fabライブラリーを作製した。これらのFabを、サイトカイン/サイトカイン受容体結合ELISAで試験した。5種の異なるVHファミリーを最初の2頭のリャマから同定し、さらに6種の異なるVHファミリーを次の2頭のリャマから同定することができた。これらのVHファミリーは、高い効力でサイトカイン/受容体相互作用を阻止し、このことは、これらのVHドメインが、長さとアミノ酸配列の両方において独自に異なるCDRを含んでいたことを意味する。したがって、より大きい機能的多様性を、より多数の近交系BALB/cマウスではなく、少数の非近交系リャマから達成することができる。リャマの能動免疫によって得られたVHファミリーは全て、最も近いヒト生殖系列と比較して並外れた配列相同性を示し、かつ一致するヒト生殖系列と同じCDR1及びCDR2のカノニカルフォールド組合せを有していた。実施例12以下の表は、アルパカラマパコスの生殖系列VHドメインと、最も良く一致するヒト生殖系列VHドメインの間のアミノ酸配列相同性比較の結果をまとめたものである。相同性は、ラマグラマについて本明細書で記載したのと同じアルゴリズムを用いて算出した。ラマパコスについての生のVH配列データは示していない:実施例13ヒト化のためのアミノ酸置換の導出成熟ラクダ科動物VHドメインをコードする複数のcDNA配列をクローニングし、完全に配列決定した。さらに、ラクダ科動物Vλ/Vκドメインをコードする複数のラクダ科動物生殖系列断片の配列を得た。次に、この大量の生の配列情報図示せずをバイオインフォマティックス的に処理した。これらの生のラクダ科動物配列の各々について、最も良く一致するヒト生殖系列配列は、本明細書中の別所に記載されているアプローチに従って得られた。次に、これは、異なるファミリー又はサブファミリーに属するラクダ科動物VH及びVλ/Vκドメインのコンセンサス配列の導出を可能にし、かつ各ファミリー又はサブファミリーのメンバーとその最も良く一致するヒト生殖系列との直接的な比較も可能にした。次に、各ラクダ科動物ファミリー又はサブファミリーのコンセンサス配列を整列させ、複数の異なるヒト生殖系列ファミリー又はサブファミリーのコンセンサス配列と比較した。これらの配列アラインメントを添付の図に示す。合計で、163個の成熟VH配列、78個のVκ配列、及び148個のVλ配列を解析した。Vκについては、78個の配列のうち75個が、体細胞突然変異したヒトVκの大部分に認められる9個のAAを有するCDR3を含み、これら全てが位置95にプロリンを有し、これら75個のうち73個が位置90にグルタミンを有していた。この位置90のグルタミンは、ヒトVκにも典型的なカノニカルフォールドタイプ1と関連しているKnappikらの文献、JMolBiol296:57862000。2個のVκのみが8残基のCDR3を有し、1個のVκは10残基のCDR3を有していた。ラクダ科動物Vλのコレクションについて、解析した148個の配列のうち80個が10アミノ酸残基のCDR3を有し、23個が9残基のCDR3長を有し、2個が8残基を有し、30個が11残基を有し、8個が12残基を有し、4個が13残基を有し、1個が14残基を有していた。これらの観察結果はヒトのシステムと相関している。ヒトのシステムでは、VλにCDR3の長さの大きなばらつきが認められ、体細胞突然変異したヒトVλの92は9~11残基のCDR3長を有するリャマ免疫系で認められるのは90。上で概説した配列比較に基づいて、1ヒトVH及びVλ/Vκ配列との不一致をよく示すラクダ科動物VH及びVλ/Vκドメイン内の位置を同定し、それにより、交換が考慮されるべき候補残基を同定すること、並びに2ヒトVH及びVλ/Vκドメイン配列中のこれらの位置の各々での異なるアミノ酸の利用を算出し、それにより、各位置での好適な交換用残基を同定することが可能であった。この利用データを図30~42にまとめる。等価物前述の記載を考慮して、本発明の多くの修正及び別の実施態様が当業者には明らかであろう。したがって、本記載は、単に例示的なものであるとみなされるべきであって、当業者に本発明を実施する最良の形態を教示する目的のためのものである。構造の詳細は、本発明の精神から逸脱することなく、大幅に変更することができ、添付の特許請求の範囲の範囲内に入る全ての修正の排他的使用が留保される。本発明は、添付の特許請求の範囲及び適用可能な法規により必要とされる範囲にのみ限定されることが意図される。特許、特許出願、論文article、書籍、論文treatise、論文dissertation、ウェブページ、図、表、別表、及び/又は添付書類を含む、本出願に引用された文献及び同様の資料は全て、そのような文献及び同様の資料の形式を問わず、その全体が引用により本明細書中に明示的に組み入れられる。組み入れられた文献及び同様の資料のうちの1つ又は複数が、定義された用語、用語の用法、記載された技術などを含む、本出願と異なるか、又は矛盾する場合、本出願が優先される。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。