第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドおよび第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドを含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子複合体を形成し、かつ第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物。EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物。多成分核酸酵素、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって:MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイムおよび第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、かつ第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分が会合するように近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、かつ触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ;かつ、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、かつ第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができる、組成物。MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、請求項3記載の組成物。第2の鎖が第1のDFを含む、請求項4記載の組成物。第1の鎖と第2の鎖とがヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、請求項4または請求項5記載の組成物。MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、かつMNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片がヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、請求項3記載の組成物。組織化助長因子が、同定される標的である、請求項3~7のいずれか一項記載の組成物。第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含む組成物であって:SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ;かつEAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、組成物。第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができる、請求項9記載の組成物。第1ヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができる、請求項9記載の組成物。第1のヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項11記載の組成物。第1のヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項9~12のいずれか一項記載の組成物。第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、請求項9~13のいずれか一項記載の組成物。第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、請求項9~13のいずれか一項記載の組成物。第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項1~8のいずれか一項記載の組成物。第2のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項9~15のいずれか一項記載の組成物。前記ニックが、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する、請求項16または請求項17記載の組成物。前記ヌクレアーゼが、MnlI、RsaI、PmeI、Hpy8I、MspI、EarI、およびTspRIからなる群より選択される、請求項16~18のいずれか一項記載の組成物。第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列を完成する、請求項1~19のいずれか一項記載の組成物。第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する、請求項1~19のいずれか一項記載の組成物。第1のDFが前記配列に少なくとも1つの塩基を寄与する、請求項20または請求項21記載の組成物。第1のDFが前記配列に少なくとも2つの塩基を寄与する、請求項20~22のいずれか一項記載の組成物。第1のDFが前記配列に少なくとも3つの塩基を寄与する、請求項20~23のいずれか一項記載の組成物。前記塩基が、EAS1とEAS2との結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ3側にある、請求項22~24のいずれか一項記載の組成物。前記塩基が、EAS1とEAS2との結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ5側にある、請求項22~24のいずれか一項記載の組成物。第1のDFがヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない、請求項1~19のいずれか一項記載の組成物。EAS1およびEAS2が、EAS1およびEAS2の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項1~27のいずれか一項記載の組成物。前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項28記載の組成物。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS1またはEAS2のいずれかから伸長した一本鎖5または3オーバーハング部分を含む、請求項28または請求項29記載の組成物。EAS1またはEAS2の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、請求項1~30のいずれか一項記載の組成物。ヘアピンループ部分の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、請求項28~30のいずれか一項記載の組成物。第1のDFと第2のDFが同一ではない、請求項31または請求項32記載の組成物。第1のDFと第2のDFが同一である、請求項31または請求項32記載の組成物。第2のDFが第1のDFの断片であるか、または第1のDFが第2のDFの断片である、請求項31または請求項32記載の組成物。第2のDF、EAS1、およびEAS2が組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる、請求項34または請求項35記載の組成物。第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドおよび第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドをさらに含み、EAS3の一部がEAS4の一部と相補的であり、かつEAS3の一部が第2のDFの一部と相補的であり、EAS3およびEAS4が、第2のDFと組織化した場合にのみ、付加的なヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、請求項31~33のいずれか一項記載の組成物。EAS3またはEAS4が第3のDFを含む、請求項37記載の組成物。第3のDFが第1のDFと同一である、請求項38記載の組成物。第3のDFが第1のDFと同一ではない、請求項38記載の組成物。付加的なヌクレアーゼが組成物中の別のヌクレアーゼと同一である、請求項37~40のいずれか一項記載の組成物。付加的なヌクレアーゼが組成物中の別のヌクレアーゼと同一ではなく、かつ組成物が該付加的なヌクレアーゼを含む、請求項37~40のいずれか一項記載の組成物。付加的なヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項37~42のいずれか一項記載の組成物。前記ヌクレアーゼが、MnlI、RsaI、PmeI、Hpy8I、MspI、EarI、およびTspRIからなる群より選択される、請求項37~43のいずれか一項記載の組成物。第2のDFのEAS3への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列およびまたはヌクレアーゼ切断配列を完成する、請求項37~44のいずれか一項記載の組成物。第2のDFが、ヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない、請求項37~44のいずれか一項記載の組成物。EAS3およびEAS4が、EAS3およびEAS4の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端とを連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項37~46のいずれか一項記載の組成物。前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項47記載の組成物。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS3またはEAS4のいずれかから伸長した一本鎖5または3オーバーハング部分を含む、請求項47または請求項48記載の組成物。骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3、およびEAS4を含む第1の複合体を含む組成物であって、該骨格オリゴヌクレオチドが:EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS2の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、かつEAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、EAS1を含む第1の部分;EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS3またはEAS4の一部は第1のDFを含み、かつEAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、EAS3を含む第2の部分;ならびに第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分を含む、組成物。骨格オリゴヌクレオチド、第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド、第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド、第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド、および第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドを含む第2の複合体をさらに含み、該骨格オリゴヌクレオチドが:EAS5の一部はEAS6の一部と相補的であり、EAS5の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS5またはEAS6の一部は第1のDFを含み、かつEAS5およびEAS6は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第3のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第3のCESA複合体を形成する、EAS5を含む第1の部分;ならびにEAS7の一部はEAS8の一部と相補的であり、EAS8の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS7またはEAS8の一部は第2のDFを含み、かつEAS7およびEAS8は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第4のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第4のCESA複合体を形成する、EAS7を含む第2の部分;ならびに第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分であって、第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である、第3の部分を含む、請求項50記載の組成物。EAS1がEAS7と同一であり、EAS2がEAS8と同一であり、EAS3がEAS5と同一であり、かつまたはEAS4がEAS6と同一である、請求項51記載の組成物。第1のヌクレアーゼが第3のヌクレアーゼと同一であり、かつまたは第2のヌクレアーゼが第4のヌクレアーゼと同一であり、かつまたは第1、第2、第3、および第4のヌクレアーゼが同一である、請求項51または請求項52記載の組成物。第1の複合体と第2の複合体が、それらそれぞれの相補的な第3の部分を介してハイブリダイズして、第1の二重複合体を形成する、請求項51~53のいずれか一項記載の組成物。第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項54記載の組成物。第1の二重複合体のEAS1~EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1~EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項55記載の組成物。第1の二重複合体のEAS2およびまたはEAS8と第2の二重複合体のEAS2およびまたはEAS8の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項55または請求項56記載の組成物。連結が、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、共有結合、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される、請求項56または請求項57記載の組成物。連結が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される、請求項56または請求項57記載の組成物。第1およびまたは第2のヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項50~59のいずれか一項記載の組成物。第1およびまたは第2のヌクレアーゼが、MnlI、RsaI、PmeI、Hpy8I、MspI、EarI、およびTspRIからなる群より選択される、請求項50~60のいずれか一項記載の組成物。第1のDFのEAS2もしくはEAS8への結合、およびまたは第2のDFのEAS3もしくはEAS5への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列およびまたは部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する、請求項51~61のいずれか一項記載の組成物。第1のDFのEAS2もしくはEAS8への結合、およびまたは第2のDFのEAS3もしくはEAS5への結合が、ヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない、請求項51~61のいずれか一項記載の組成物。EAS1およびEAS2;EAS3およびEAS4;EAS5およびEAS6;ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質が、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項51~63のいずれか一項記載の組成物。前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項64記載の組成物。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが一本鎖5または3オーバーハング部分を含む、請求項64または請求項65記載の組成物。以下のものを含むSIOを含む組成物:標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分であって、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、かつ第2の部分は第1のDFを含む、第1の部分および第2の部分;ならびにEAS1およびEAS2であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼによって消化され得る陥凹3末端を含む第1のCESA複合体を形成することができる、EAS1およびEAS2。SIOが、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである、請求項67記載の組成物。ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項67または請求項68記載の組成物。エキソヌクレアーゼが、一本鎖オリゴヌクレオチド、5個もしくはそれ以上の塩基の3オーバーハングを含む二本鎖オリゴヌクレオチド、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結を消化することができない、請求項69記載の組成物。任意の第1のDFが、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを用いて生成される、請求項1~70のいずれか一項記載の組成物。エキソヌクレアーゼが、ヌクレアーゼBAL31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTからなるより選択される、請求項71記載の組成物。エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIである、請求項71または請求項72記載の組成物。エンドヌクレアーゼが、T7エンドヌクレアーゼI、RNaseH、フラップヌクレアーゼ、またはマングビーンヌクレアーゼである、請求項71記載の組成物。任意のEASが1つまたは複数の検出可能な標識を含む、請求項1~74のいずれか一項記載の組成物。任意のEASがフルオロフォア部分およびまたはクエンチャー部分を含む、請求項1~75のいずれか一項記載の組成物。任意のパートザイム、組織化助長因子、MNAザイム基質、DF、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、またはSIOが、ホスホロチオエート、4アセチルシチジン、5ウリジン、2Oメチルシチジン、5カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2Oメチルプソイドウリジン、βDガラクトシルケオシン、2Oメチルグアノシン、イノシン、N6イソペンテニルアデノシン、1メチルアデノシン、1メチルプソイドウリジン、1メチルグアノシン、1メチルイノシン、22ジメチルグアノシン、2メチルアデノシン、2メチルグアノシン、3メチルシチジン、5メチルシチジン、N6メチルアデノシン、7メチルグアノシン、5メチルアミノメチルウリジン、5メトキシアミノメチル2チオウリジン、βDマンノシルメチルウリジン、5メトキシカルボニルメチルウリジン、5メトキシウリジン、2メチルチオN6イソペンテニルアデノシン、Nカルバモイルスレオニン、NNメチルカルバモイルスレオニン、ウリジン5オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン5オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2チオシチジン、5メチル2チオウリジン、2チオウリジン、4チオウリジン、5メチルウリジン、Nカルバモイルスレオニン、2Oメチル5メチルウリジン、2Oメチルウリジン、ワイブトシン、3ウリジン、βDアラビノシルウリジン、およびβDアラビノシルチミジンからなる群より選択される、少なくとも1つのヌクレオチド置換または付加を含む、請求項1~76のいずれか一項記載の組成物。MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つが、アプタマーまたはその一部をさらに含む、請求項3~8のいずれか一項記載の組成物。アプタマーまたはその一部が、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項78記載の組成物。任意のMNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF、またはヌクレアーゼが、固体支持体に付着している、請求項1~79のいずれか一項記載の組成物。第1のDFが標的の存在下でのみ産生される、請求項1、2、または50のいずれか一項記載の組成物。第1のDFが標的とは異なる、請求項3、9、または50のいずれか一項記載の組成物。組成物が標的を検出するためのものであり、かつ第1のDFが該標的とは異なる、請求項1または請求項2記載の組成物。任意のEASが、別のEASとハイブリダイズして、複数のDFとハイブリダイズし得る部分的酵素シグナル増幅因子複合体を形成することができる、請求項1~83のいずれか一項記載の組成物。標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを含む、請求項3~8のいずれか一項記載の組成物。標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムが、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する、請求項85記載の組成物。異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを含む、請求項3~8のいずれか一項記載の組成物。異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを含む、請求項9または請求項67記載の組成物。異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体を含む、請求項1~3、9、50、または67のいずれか一項記載の組成物。以下の段階を含む、標的を検出するための方法:2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つの多成分核酸基質を提供する段階であって、該パートザイムは標的の存在下で自己組織化して、少なくとも1つのMNAザイムを形成する、段階;MNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で、標的を含むと推定される試料にパートザイムを接触させる段階であって、MNAザイムの触媒活性により、前記少なくとも1つのMNAザイム基質から第1のドライバー断片オリゴヌクレオチドが産生される、段階;第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドおよび第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドを提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階;以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFに接触させる段階:第1の完全酵素シグナル増幅因子複合体を形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2との組織化、ならびに第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成;第1のヌクレアーゼを提供する段階;ならびにヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第1のヌクレアーゼを第1のCESA複合体と接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。第1のヌクレアーゼが、第1のヌクレアーゼの認識部位およびまたは切断部位を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項90記載の方法。第1のDFが、MNAザイム基質の切断によって産生される、請求項90または請求項91記載の方法。第1のDFが、2つまたはそれ以上のMNAザイム基質の核酸連結によって産生される、請求項90または請求項91記載の方法。MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、請求項90~92のいずれか一項記載の方法。第2の鎖が第1のDFを含む、請求項94記載の方法。第1の鎖と第2の鎖がヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、請求項94または請求項95記載の方法。MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、前記MNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片が該ヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、請求項90~92のいずれか一項記載の方法。以下の段階を含む、標的を検出する方法:少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供する段階;SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階;SIOと標的のハイブリダイゼーションによって形成された二重鎖基質を切断し得る第1のヌクレアーゼを提供する段階であって、第1のヌクレアーゼによる二重鎖基質の切断により第1のDFが生成される、段階;EAS1およびEAS2を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階;以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階:第1のCESAを形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成;第2のヌクレアーゼを提供する段階;ならびに第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼを第1のCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成する、請求項98記載の方法。第1のヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成する、請求項98記載の方法。第1のヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項100記載の方法。第1のヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項98~101のいずれか一項記載の方法。第1のCESA複合体の切断によりさらなるDFの放出が可能になり、かつさらなるDFがさらなる酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドと組織化してさらなるCESA複合体を形成し、かつ少なくとも1つのヌクレアーゼを用いてさらなるCESA複合体が切断されて、さらなる検出可能な影響がもたらされ、かつさらなるDFが放出され、それによって検出可能な影響のさらなる増加が促進される、請求項90~102のいずれか一項記載の方法。以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって:第1のDFを産生する段階であって、第1のDFは標的の存在下でのみ産生される、段階;以下のものを提供する段階:EAS1およびEAS2であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含む、EAS1およびEAS2、ならびに、第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドおよび第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドであって、EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である、EAS3およびEAS4;以下のものを接触させる段階:第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2との第1のDF;第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のヌクレアーゼによる切断部位での切断により第2のDFが放出される、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ;以下のものを接触させる段階:第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF;第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断する、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ;ここで、第1のCESA複合体およびまたは第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、方法。第1のCESA複合体および第2のCESA複合体の切断がそれぞれ、検出可能な影響をもたらす、請求項104記載の方法。第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、請求項104および請求項105記載の方法。第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、請求項104および請求項105記載の方法。EAS3またはEAS4の一部が付加的なDFを含み、かつ第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される、請求項104~107のいずれか一項記載の方法。前記付加的なDFの一部が第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの第1の部分と相補的であり、EAS5の第2の部分が第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの一部と相補的であり、かつEAS5およびEAS6が該付加的なDFと組織化して第3のCESA複合体を形成する、請求項108記載の方法。付加的なDFの一部が第1のDFと同一であるか;付加的なDFが第1のDFと同一であるか;または付加的なDFが第1のDFの断片であり;該付加的なDFがEAS1およびEAS2と組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる、請求項108記載の方法。以下の段階を含む、カスケードを用いて複数の異なる標的を検出する方法であって:少なくとも第1のDFおよび第2のDFを産生する段階であって、第1のDFは第1の標的の存在下でのみ産生され、第2のDFは第2の標的の存在下でのみ産生される、段階;以下のものを提供する段階:EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、EAS1およびEAS2、ならびにEAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である、EAS3およびEAS4;以下のものを接触させる段階:第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2との第1のDF;第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のヌクレアーゼは該切断部位で第1のCESA複合体を切断して、第1の検出可能な影響をもたらす、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ;以下のものを接触させる段階:第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF;第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断して、第2の検出可能な影響をもたらす、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ;ここで、第1の検出可能な影響は第2の検出可能な影響とは異なる。第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、請求項111記載の方法。第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、請求項111および請求項112記載の方法。EAS1またはEAS2の一部が付加的なDFを含み、かつ第1のヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される;かつ該付加的なDFが少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第1の検出可能な影響が増加する、請求項111~113のいずれか一項記載の方法。EAS3またはEAS4の一部が付加的なDFを含み、かつ第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される;かつ該付加的なDFが少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第2の検出可能な影響が増加する、請求項111~114のいずれか一項記載の方法。以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって:第1のドライバー断片を産生する段階であって、第1のドライバー断片は該標的の存在下でのみ提供される、段階;以下のものを提供する段階:EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、かつEAS1またはEAS2は支持体に連接されている、EAS1およびEAS2、EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS3またはEAS4の一部は第3のDFを含み、かつEAS3またはEAS4は支持体に連接されている、EAS3およびEAS4;以下のものを接触させる段階:第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESAを形成させる条件下における、EAS1およびEAS2との第1のDF;第1のヌクレアーゼと第1のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のものによる該切断部位での切断により第2のDFが放出される、第1のCESAと第1のヌクレアーゼ;以下のものを接触させる段階:第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESAを形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF;第2のヌクレアーゼと第2のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る第3のDFが放出される、第2のCESAと第2のヌクレアーゼ;ここで、第1のCESA複合体およびまたは第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、方法。の第1のDFが、SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および二重鎖構造を前記イニシエーターヌクレアーゼと接触させることによって産生され、前記イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第1のDFが放出される、請求項104~116のいずれか一項記載の方法。の第2のDFが、SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖定義ある種の用語および語句を本明細書で用いており、それらは以下に規定する意味を有するものとする。本出願で用いる場合、単数形の1つのan、1つのanおよびそのtheは、文脈によって明らかに別のことが指定されている場合を除き、複数の言及物も含む。例えば、1つのMNAザイムまたは1つの完全酵素シグナル増幅因子CompleteEnzymeSignalAmplifier複合体または1つの部分的酵素シグナル増幅因子PartialEnzymeSignalAmplifier複合体という用語はそれぞれ、複数のMNAザイムまたは完全部分的酵素シグナル増幅因子複合体または部分的酵素シグナル増幅因子複合体も含む。文脈によって別のことが要求されるか、または逆のことが明記されている場合を除き、本明細書で単数の完全体integer、段階または要素として挙げられた本発明の完全体、段階または要素には、挙げられた完全体、段階または要素の単数形および複数形の両方が明らかに含まれる。含むcomprisingという用語は、を主に含むincludeが、必ずしもそれだけを含むのではないことを意味する。さらに、含むcomprisingという語の変化形、例えば含むcompriseおよび含むcomprisesなどは、相応して変化した意味を有する。したがって、例えば、ある所与の段階を含む方法は、排他的にその段階だけからなってもよく、または1つもしくは複数の別の段階を含んでもよい。完全酵素シグナル増幅因子複合体、CESA複合体およびCESAは、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するCESA複合体とは、酵素例えば、ヌクレアーゼによって認識されて切断されることが可能であり、かつ酵素認識配列/部位および酵素切断配列/部位を含む、多オリゴヌクレオチド複合体のことである。酵素は例えば、ヌクレアーゼ例えば、制限酵素酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼであってよい。酵素切断配列/部位は、酵素認識配列/部位の内側にあっても、外側にあっても、または一部が重なり合ってもよい。本明細書で称するCESA複合体は、少なくとも2つの酵素増幅因子基質EnzymeAmplifierSubstrateEASオリゴヌクレオチド、および少なくとも1つのドライバー断片DriverFragmentDFを含み、それぞれについては以下で定義する。CESA複合体の1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的である。加えて、前記EASオリゴヌクレオチドの1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDFの少なくとも一部分に対しても相補的である。DFが1つまたは複数の塩基を、酵素認識配列/部位および/または酵素切断配列/部位に寄与してもよいが、必ずしもそうである必要はない。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるCESA複合体を、例えば、第1のCESA複合体、第2のCESA複合体、第3のCESA複合体などのように数字で称してもよいことに留意されたい。酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド、酵素増幅因子基質EASオリゴヌクレオチド、EASオリゴヌクレオチド、EASオリゴおよびEASは、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するEASオリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的であり、その結果、適切な条件下でその2つの間のハイブリダイゼーションが起こるようなオリゴヌクレオチドのことである。EASオリゴヌクレオチドが任意で、以下に定義するようなドライバー断片DFの少なくとも一部分に対して相補的な少なくとも1つの部分を含んでもよい。EASオリゴヌクレオチドが、例えば、CESA複合体および部分的酵素シグナル増幅因子PESA複合体以下に定義するようななどの複合体の成分であってもよい。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるEASオリゴヌクレオチドを、例えば、第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドEAS1、第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドEAS2、第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドEAS3などのように数字で称してもよいことに留意されたい。いくつかの態様において、EASオリゴヌクレオチドが、リンカーによってもう1つのEASオリゴヌクレオチドとつなぎ合わされてもよい。例えば、EAS1およびEAS2が同一のオリゴヌクレオチド中に存在し、そこでそれらがヘアピン構造の形成を可能にする連結性核酸配列によってつなぎ合わされてもよい。部分的酵素シグナル増幅因子複合体、部分的酵素シグナル増幅因子PESA複合体、PESA複合体およびPESAは、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するPESA複合体とは、少なくとも2つの酵素増幅因子基質EASオリゴヌクレオチドを含む多オリゴヌクレオチド複合体のことであり、ここで1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的である。加えて、前記EASオリゴヌクレオチドの1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDF以下に定義するようなの少なくとも一部分に対しても相補的である。DFとハイブリダイズする能力を有するにもかかわらず、DFはPESA複合体とハイブリダイズせず、それ故にPESA複合体の成分ではない。PESA複合体は酵素による少なくとも部分的な認識配列/部位および/または少なくとも部分的な切断配列/部位を含み、それが酵素による完全な認識配列/部位および/または完全な切断配列/部位を含有してもよい。酵素は例えば、ヌクレアーゼ例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼであってよい。いくつかの態様において、PESA複合体の2つのEASオリゴヌクレオチドがリンカーによってつなぎ合わされてもよい。例えば、2つのEASオリゴヌクレオチドが同一のオリゴヌクレオチド中に存在し、そこでそれらがヘアピン構造の形態で連結性核酸配列によってつなぎ合わされてもよい。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるPESA複合体を、例えば、第1のPESA複合体、第2のPESA複合体、第3のPESA複合体などのように数字で称してもよいことに留意されたい。ドライバー断片オリゴヌクレオチド、ドライバー断片DFオリゴヌクレオチド、ドライバー断片オリゴ、DFオリゴヌクレオチド、DFオリゴおよびDFは、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するDFオリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、少なくとも1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的であり、その結果、適切な条件下でその2つの間のハイブリダイゼーションが起こるようなオリゴヌクレオチドのことである。DFオリゴヌクレオチドは、本発明の方法によって検出しようとする標的分子例えば、核酸であってもよく、そうでなくともよい。DFオリゴヌクレオチドが、複合体、例えばCESA複合体などの成分であってもよい。そのような場合に、DFオリゴヌクレオチドが、1つまたは複数のヌクレオチドを、複合体の中に存在する可能性のある酵素認識配列/部位および/または酵素切断配列/部位に寄与してもよいが、必ずしもそうである必要はない。酵素は例えば、ヌクレアーゼ例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼであってよい。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるDFオリゴヌクレオチドを、例えば、第1のDF、第2のDF、第3のDFなどのように数字で称してもよいことに留意されたい。合成イニシエーターオリゴSyntheticInitiatorOligoまたはSIOとは、試料中の標的核酸とハイブリダイズして、それにより、ヌクレアーゼによる切断を受けやすい基質を形成することができ、この切断によって、ドライバー断片DFとして機能しうるより短いオリゴが生じるようなオリゴヌクレオチドのことである。SIOは、ヌクレアーゼによるその切断の前には阻害性断片InFとして機能してもよい。SIOは、部分的または完全に二本鎖コンフォメーションにある1つまたは複数のオリゴヌクレオチドで構成されうる。複数のオリゴヌクレオチドを有するSIOを、本明細書ではSIO複合体と称する。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるSIOを、例えば、第1のSIO、第2のSIO、第3のSIOなどのように数字で称してもよいことに留意されたい。酵素阻害性複合体またはEICとは、酵素による切断を受けやすい二重鎖構造の形成を妨害する余分な配列の存在が原因で、酵素による切断を受けにくい二重鎖を形成する、2つまたは3つ以上の相補的核酸断片またはオリゴヌクレオチドによって形成される複合体のことである。1つの態様において、EICはEAS1、EAS2および阻害性断片InFを含む。もう1つの態様において、EICはPESAおよびInFを含む。1つのさらなる態様において、InFは、DFとして有用であるものの、切断を受けやすい二重鎖CESAの形成を妨げる付加的なヌクレオチドも有する配列を含む。さらなる態様において、InFは、標的分析物の存在下でのみ切断されて、DFとして機能してCESAの組織化を完了させることのできる、より小型のオリゴヌクレオチド断片となるオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、InFは、標的の存在下でのみヌクレアーゼによって切断されてDFを生じる合成イニシエーターオリゴまたはSIOであってよい。他の態様において、InFは、標的の存在下でのみMNAザイムによって切断されてDFになることのできるMNAザイム基質であってよい。いくつかの態様において、InFの切断は核酸酵素またはアプタザイムaptazymeに依存する。いくつかの態様において、核酸酵素またはアプタザイムにはMNAザイムが含まれる。他の態様において、切断はタンパク質酵素によって媒介される。いくつかの態様において、酵素はエンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、酵素はエキソヌクレアーゼである。さらに他の態様において、切断は化学的手段によって実現される。EzyampまたはEzyAmp反応は、ヌクレアーゼによるCESAの標的依存的切断によってシグナルの発生および/または増幅が助長され、そのシグナルによって標的の存在が指し示される過程である。EzyAmp反応は、1つまたは複数のPESA複合体およびCESA複合体を含みうる。いくつかの態様において、複数のPESA複合体からの複数のCESAの形成は、第1のPESAに対する第1のDF標的依存性イベントにより生じるの結合によって第1のCESAが形成され、第1のCESAの切断によって第2のDFが放出され、それが第2のPESAと結合して第2のCESAを形成し、第2のCESAの切断によって、第1のPESAと結合しうる第1のDFが放出されて、もう1つの第1のCESAが形成されるという、フィードバックループを形成することができる。続いてこの第1のCESAが切断されて、もう1つの第2のDFが生成され、それがもう1つの第2のPESAと結合してもう1つの第2のCESAを形成することができ、以下も同様である。検出可能なシグナルは、第1および/または第2のCESAの切断のたびごとに発生し、それ故に、単一の標的依存性イベントに由来するシグナルを増幅する手段となる。本明細書で称するEzyAmp反応が、直線的およびフィードバック性のシグナル増幅カスケードの両方を範囲に含むことは理解されるであろう。酵素とは、化学反応を触媒することのできるあらゆる分子のことを指す。触媒性タンパク質、触媒性アミノ酸およびタンパク質酵素は同じ意味を有し、基質を認識して化学修飾を触媒する、アミノ酸の鎖で構成される分子を記述するために、本明細書中で互換的に用いられる。酵素は別の酵素、アプタマー、分子または核酸を認識して、結合を切断すること、付加すること、または修飾することができる。触媒性核酸分子、触媒性核酸、核酸酵素および触媒性核酸配列は同じ意味を有し、DNA分子もしくはDNA含有分子当技術分野においてDNA酵素、デオキシリボザイムまたはDNAザイムとしても公知またはRNAもしくはRNA含有分子当技術分野においてRNA酵素またはリボザイムとしても公知またはMNAザイムを記述するために本明細書中で互換的に用いられ、これらはすべて、基質を認識して基質の化学修飾を触媒する。MNAザイム、アプタMNAザイム、DNAザイム、リボザイム、アプタザイム、EAS、CESA複合体、PESA複合体、SIO、ドライバー断片または阻害性断片におけるヌクレオチド残基には、塩基A、C、G、TおよびU、ならびにそれらの誘導体または類似体が含まれてよく、それらの例は表1に列記されている。MNAザイム、アプタMNAザイム、DNAザイム、リボザイム、アプタザイム、EAS、CESA複合体、PESA複合体、SIO、ドライバー断片または阻害性断片の1つまたは複数の成分を、ビーズ、チップ、アレイ、マイクロキャリア、ナノキャリア、コードされたマイクロキャリア、コードされたナノキャリアを非限定的に含みうる固体支持体に付着させることができる。誘導体という用語は、本発明の核酸またはヌクレオチドに関連して用いられる場合、一体的に産生されるか例えば、組換え手段によってまたは合成後に付加される例えば、化学的手段によって任意の融合分子を含む、任意の機能的に同等な核酸またはヌクレオチドを含む。そのような融合体には、RNAまたはDNAを有する本発明のオリゴヌクレオチドに、ポリペプチド例えば、ピューロマイシンもしくは他のポリペプチド、小分子例えば、ソラレンまたは抗体が付加もしくは結合体化されたものが含まれうる。類似体という用語は、本発明の核酸またはヌクレオチドに関連して用いられる場合、DNAまたはRNAの分子または残基と類縁関係にあって、DNA残基もしくはRNA残基またはそれらの類似体と水素結合を形成できてもよいすなわち、それはDNA残基もしくはRNA残基またはそれらの類似体とアニーリングして塩基対を形成することができる物理的構造を有する化合物を含むが、そのような結合は、前記化合物を類似体という用語の範囲に含めるのにそれほど必要とされない。そのような類似体は、それらが構造的に類縁関係にあるリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基とは異なる化学特性および生物学的特性を有してもよい。メチル化残基、ヨウ化残基、臭素化残基またはビオチン化残基は、類似体の例である。デオキシイノシン、C5イミダゾールデオキシウリジン、37デアザdATP、2OメチルRNA、2Oメチルキャップを含む、ヌクレオチド類似体を含有する活性DNAザイムが記載されている。他の類似体も、DNAザイムおよびMNAザイムの触媒活性との適合性がある可能性がある。触媒活性による核酸の改変、例えば、1つの塩基の別の塩基への置換による、1つの塩基の類似体への置換によるか、または糖成分もしくはホスホジエステル骨格の改変によるものは、当業者にとって簡単である。例えば、改変を合成中に行うこともでき、または合成後に特定塩基の修飾によって行うこともできる。塩基変化または塩基類似体などの改変を組み込んだ触媒性核酸の実験的検討により、改変された配列または特定の類似体が触媒活性に及ぼす影響を評価することが可能になる。塩基A、C、G、TおよびUの類似体は当技術分野において公知であり、サブセットを表1に列挙している。ヌクレアーゼ消化を阻害しうる類似体の例も当技術分野において周知である。そのような類似体は、エキソヌクレアーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼによる切断を防ぐために、オリゴヌクレオチド内部に戦略的に配置することができる。一例として、ホスホロチオエート結合のSp立体異性体は、λエキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII大腸菌Ecoli、エキソヌクレアーゼI大腸菌、エキソヌクレアーゼTおよびRecJを含む多くのヌクレアーゼの切断を大きく阻害することが知られている。複数のホスホロチオエート結合を含めることは、ヌクレアーゼ活性をブロックするのに極めて有効な可能性がある。表1ヌクレオチド類似体の例組織化助長因子assemblyfacilitator分子、組織化助長因子、MNAザイム組織化助長因子分子、MNAザイム組織化助長因子は同じ意味を有し、成分パートザイムの自己組織化を助長して触媒活性のあるMNAザイムを形成させる分子を指して、本明細書中で互換的に用いられる。好ましい態様において、組織化助長因子はMNAザイムの自己組織化のために必要とされる。組織化助長因子分子には、いくつかの態様において、標的、標的分析物または分析物が含まれ、これらはそれぞれ、本明細書で用いる場合、特定のMNAザイムによって存在を検出または測定しようとする分子のことを指す。組織化助長因子分子は、MNAザイムの成分または部分を構成する1つまたは複数のオリゴヌクレオチドパートザイムと対合するかまたは結合する、1つまたは複数の領域を含む。組織化助長因子は、それがMNAザイムの成分パートザイムの少なくとも1つと相互作用するか、対合するか、または結合するのであれば、それぞれの成分パートザイムまたはオリゴヌクレオチドと相互作用したり、対合したり、あるいは結合したりする必要はない。本明細書で用いる場合、MNAザイム組織化助長因子分子は、MNAザイムの自己組織化を助長しうる、最も広範囲にわたる成分を範囲に含むものとする。標的および分析物も、最も広範囲にわたる検出可能な成分を範囲に含むものとし、それらに対しては高感度の検出方法が望ましい。例示的な標的のいくつかには、核酸配列、ウイルス、細菌、プリオン、タンパク質、抗体および小分子が含まれる。他の標的分析物についても、本明細書における使用を想定している。基質、基質分子および化学基質は同じ意味を有し、触媒性分子によって認識されて化学修飾されるあらゆる分子を指して、本明細書中で互換的に用いられる。特定の態様において、基質は酵素によって認識されて修飾され、他の態様において、基質は触媒性核酸分子によって認識されて修飾される。特定の態様において、基質はタンパク質酵素によって認識されて修飾され、他の態様において、基質は核酸酵素によって認識されて修飾される。特定の態様において、基質は一本鎖核酸分子を含んでよく、他の態様において、基質は二本鎖核酸分子を含んでよい。さらなる態様において、基質はヘアピン分子を形成しうる。基質の化学修飾は、反応の生成物の出現もしくは増加によって、または反応の基質の消失もしくは減少によって測定することができる。1つの特定の触媒性分子が1つまたは複数の異なる基質分子を認識することも、各基質分子が触媒性分子による触媒活性にとって認識可能な少なくとも最小限の構造を有するのであれば可能である。本明細書で用いる場合、パートザイムおよび成分パートザイムという用語は同じ意味を有し、その2つまたはそれ以上がMNAザイム組織化助長因子分子の存在下でのみ相伴ってMNAザイムを形成することのできる、DNA含有性またはRNA含有性オリゴヌクレオチドのことを指して、本明細書中で互換的に用いられる。ある好ましい態様において、1つまたは複数の、好ましくは少なくとも2つの成分パートザイムは、3つの領域またはドメインを含む:化学修飾を触媒するMNAザイムの触媒性コアの一部を形作る触媒性ドメイン;標的分析物と会合および/または結合するセンサーアームドメイン;ならびに基質と会合および/または結合する基質アームドメイン。当業者は、パートザイムは必ずMNAザイム構造の一部を形作らなくてはならないものの、それがMNAザイム組織化助長因子分子を特異的に認識する必要も、それと直接結合したり会合したりする必要もないことを理解するであろう。したがって、ある所与のMNAザイムに対する1つまたは複数のパートザイムが、前述のドメインの1つまたは複数またはすべてを全体的または部分的に欠いてもよいことは明らかである。ある態様において、1つまたは複数のパートザイムは他のパートザイムと相互作用するが、組織化助長因子分子とは必ずしも相互作用しない。他の態様において、1つまたは複数の特定のパートザイムは、組織化助長因子分子と間接的にのみ相互作用し、それと直接的に結合することも対合することもない。本明細書で用いるMNAザイムおよび多成分核酸酵素という用語は、MNAザイム組織化助長因子分子例えば、標的分析物の存在下でのみ基質分子を触媒的に修飾することのできる活性核酸酵素を形成する、2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド配列例えば、パートザイムのことを指す。1つの態様において、パートザイムAおよびBはそれぞれ、標的分析物と結合する例えば、核酸標的とのWatsonCrick塩基対合によって。MNAザイムは、パートザイムAおよびBのセンサーアームが標的上で互いに隣接してハイブリダイズした時にのみ形成される。MNAザイムの基質アームは基質と係合し、その切断は、パートザイムAおよびB上の部分的触媒性ドメインの相互作用によって形成されたMNAザイムの触媒性コアによって触媒される。いくつかの態様において、MNAザイムは基質をフルオロフォアとクエンチャー色素の対の間で切断し、それによってシグナルを発生させる。DNA/RNAキメラ基質の切断は、図面に例示されている図5A。他の態様において、MNAザイムが、パートザイムとの結合後に基質分子を核酸連結させてもよい。本明細書で用いるMNAザイムおよび多成分核酸酵素という用語が、PCT特許公報第WO/2007/041774号、第WO/2008/040095号、第WO2008/122084号、ならびに関連する米国特許出願公開第20070231810号、第20100136536号および第20110143338号これらの文書のそれぞれの内容はすべて、相互参照により本明細書に組み入れられるのいずれか1つまたは複数に開示されたものを含め、あらゆる公知のMNAザイムおよび修飾MNAザイムを範囲に含むことは理解されるであろう。MNAザイムおよび多成分核酸酵素という用語の範囲に含まれるMNAザイムおよび修飾MNAザイムの非限定的な例には、切断触媒活性を有するMNAザイム本明細書中で例示するような、1つまたは複数の組織化阻害因子を含む、解体しているかまたは部分的に組織化したMNAザイム、1つまたは複数のアプタマーを含むMNAザイムアプタMNAザイム、1つまたは複数の短縮型センサーアームおよび任意で1つまたは複数の安定化オリゴヌクレオチドを含むMNAザイム、1つまたは複数の活性阻害因子を含むMNAザイム、多成分核酸不活性プロ酵素MNAi、ならびにリガーゼ触媒活性を有するMNAザイムMNAザイムリガーゼが含まれ、これらはそれぞれ、WO/2007/041774号、WO/2008/040095号、WO2008/122084号、US20070231810号、US20100136536号および/またはUS20110143338号の1つまたは複数に詳細に記載されている。本明細書で用いる場合、アプタマーは、その高次構造、例えば3D結合ドメインまたはポケットなどが理由で、1つまたは複数のリガンドを高い親和性および特異性で認識する能力を有する核酸配列またはペプチド配列を含む。アプタマーは、核酸、タンパク質、プリオン、小型有機化合物または生物体全体と結合することができる。本明細書における好ましいアプタマーは、合成核酸の複合的ライブラリーから、吸着、回収および再増幅の反復過程によって単離しうる、短い一本鎖DNAまたはRNAオリゴマーである。アプタマーは、アミノ酸または抗生物質などの小分子から、タンパク質および核酸の構造体までの範囲にわたる、ほとんどあらゆる標的に対して作製することができる。本明細書で用いるオリゴヌクレオチドまたはオリゴは、DNAもしくはDNA含有核酸分子、またはRNAもしくはRNA含有分子のセグメントまたは断片のことを表す。オリゴヌクレオチドの例には、核酸標的;基質、例えば、MNAザイムによって修飾されうるもの;プライマー、例えば、PCRなどの方法によるインビトロ標的増幅のために用いられるもの、およびMNAザイムの成分が含まれる。MNAザイム組織化助長因子は、ある態様において、本明細書で定義されたようなオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で用いるパートザイムには、オリゴヌクレオチドも含まれる。オリゴヌクレオチドの他の例には、EAS、InF、SIOおよびDFが含まれる。本明細書で言及するオリゴヌクレオチドは、別のオリゴヌクレオチドに対して相補的であってよい。第2の核酸分子に対して相補的であると本明細書で称する任意の核酸分子は、適切な条件下で、その第2の核酸分子全体的または部分的にと、WatsonCrick塩基対合を介してハイブリダイズすることができる。本明細書で用いる場合、塩基という用語は、塩基が結びついているリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの全体を範囲に含むことが理解されるであろう。ヘアピンオリゴヌクレオチドまたはヘアピンとは、本明細書で用いる場合、分子内ハイブリダイゼーション結合の形成をもたらす配列相補性をそれ自体の内部に含むオリゴヌクレオチドのことを表す。相補性部分はステムと呼ばれ、一方、ステムを形成するものの間の領域はループと命名されている。ヘアピンは、5末端または3末端のいずれかでステムから伸びる余剰配列を有してもよい。ヘアピンが、別のオリゴヌクレオチド、例えばDFなどに対して相補的な配列を含んでもよい。蛍光標識およびフルオロフォアとは、蛍光を発することができる物質または部分のことを指す。クエンチャーは、フルオロフォアの放出エネルギーを、この2つの部分が近接した時に吸収することができる部分のことである。フルオロフォアはさまざまな波長でエネルギーを吸収および放出することができ、それ故に種々の波長で消光を受ける。フルオロフォアおよびクエンチャーは、近接するように容易に操作することができる。例えば、両者を同一のDNA鎖上に0~20塩基単位以内の間隔で配置してもよく、またはDNA鎖の両端に配置してもよい。この空間配置により、フルオロフォアの発光波長では実質的にシグナルが生じなくなる。物理的分離が、例えば、DNA鎖の酵素的切断の結果として起こると、クエンチャーおよびフルオロフォアは、クエンチャーがフルオロフォアからのエネルギーをうまく吸収するには隔たりが大き過ぎるようになり、その結果、検出可能なシグナルがフルオロフォアの発光波長で生じる。本明細書で用いる場合、カスケードという用語は、各段階の発生が典型的には直前の段階の発生に依存する、連続的段階として起こる任意の一連の過程または動作のことを指す。カスケードにはこのため、酵素的カスケードまたは任意の他のシグナル伝達カスケードが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、カスケードは、ヌクレアーゼの触媒活性に起因するシグナルの増幅を伴いうる。好ましい態様において、そのような増幅カスケードは、第1の分子の、またはそれらによる触媒性修飾によって、第2の分子の、またはそれらによる触媒性修飾のために必要な分子が得られ、それによって今度は、第1の分子の、またはそれらによる触媒性修飾のために必要な分子が得られるという、シグナルの反復的であってそれ故に周期的な増幅を伴いうる。いくつかの態様において、必要な分子には、ドライバー断片、パートザイム、酵素、組織化助長因子、基質、標的、それらの一部分もしくは断片、またはそれらの組み合わせが含まれうる。いくつかの態様において、カスケードはそれ故に、累積作用の産生を伴うことができ、そのようにして、シグナルを検出しうるレベルで発生させることによって、存在量の少ない標的を検出することができる。他の態様において、3つ以上の触媒段階を利用することもできる。カスケードが直線的であってもよい。好ましい態様において、カスケードは指数関数的であってもよい。本明細書で用いる場合、フィードバックカスケードという用語は、後の段階の発生が前の段階の発生に依存し、かつその同一の前の段階の発生が、少なくとも一部には後の段階の発生に依存するという、連続的段階として起こる任意の一連の過程または動作のことを指す。略号本明細書中および本明細書の全体を通じて、以下の略号を用いる:RE:制限エンドヌクレアーゼ、制限酵素CESA:完全酵素シグナル増幅因子複合体PESA:部分的酵素シグナル増幅因子複合体SIO:合成イニシエーターオリゴEIC:酵素阻害性複合体RERS:制限酵素認識部位/配列RER:制限酵素認識EAS:酵素増幅因子基質オリゴEAS1:第1の酵素増幅因子基質オリゴEAS2:第2の酵素増幅因子基質オリゴEAS3:第3の酵素増幅因子基質オリゴEAS4:第4の酵素増幅因子基質オリゴEAS5:第5の酵素増幅因子基質オリゴEAS6:第6の酵素増幅因子基質オリゴEAS7:第7の酵素増幅因子基質オリゴEAS8:第8の酵素増幅因子基質オリゴInF:阻害性断片DF:ドライバー断片MNAザイム:多成分核酸酵素DNAザイム:デオキシリボ核酸酵素;PCR:ポリメラーゼ連鎖反応;dH2O:脱イオン蒸留水;LNA:ロックド核酸;PNA:ペプチド核酸;bDNA:分枝DNAアッセイ;FCS:蛍光相関分光法;TSA:チラミドシグナル増幅因子;An:分析物または標的;F:フルオロフォア色素分子;Q:クエンチャー分子;N=A、C、T、Gまたはそれらの任意の類似体;N=Nに対して相補的な、またはNと塩基対合することができる任意のヌクレオチド;x:Nの任意の数;x:Nの任意の数;n=rNと互換W:AまたはT;K:A、GまたはAA;rN:任意のリボヌクレオチド塩基;x:rNの任意の数;rR:aまたはg;rY:cまたはu;M:AまたはC;H:A、CまたはT;D:G、AまたはT;JOEまたは6JOE:6カルボキシ45ジクロロ27ジメトキシフルオレセイン;FAMまたは6FAM:6カルボキシフルオレセインOligo:オリゴヌクレオチドBHQ=blackholeクエンチャーBHQ1=BlackHoleクエンチャー1BHQ2=BlackHoleクエンチャー2TXR=テキサスレッドまたはスルホローダミンIAbFQまたはIAbkFQ=Iowablack蛍光クエンチャー詳細な説明本明細書において提供される図面および実施例は、本発明およびそのさまざまな態様を例示することを目的としており、限定するためのものではないことが、最初に理解されるべきである。標的の検出、同定および/または定量のための組成物、方法およびキットを提供する。本方法は全体として、完全酵素シグナル増幅因子複合体の中に組み込まれた時に検出可能なシグナルのヌクレアーゼ媒介性増幅を助長する、ドライバー断片DFの標的依存的生成のための成分を含む組成物の使用を含む。ある態様においては、ドライバー断片DFの標的依存的生成によって生じた初期シグナルが、新たな標的分子が提供されるか否かとは関係なく増幅されるすなわち、初期標的認識イベント後のシグナル増幅が標的分子とは独立に起こりうる、フィードバックカスケードを提供する。DFが標的認識イベントによって生じる手段に関しては、何ら特定の限定は存在しないものの、いくつかの態様において、DFは、多成分核酸酵素MNAザイムによる基質の切断によって生じる。MNAザイムは好ましくは、組織化助長因子の存在下で自己組織化して活性核酸酵素を形成する複数の核酸パートザイムによって形成される。好ましい態様において、組織化助長因子は標的であり、それ故にMNAザイムは標的の存在下でのみ形成される。他の態様において、DFは、合成イニシエーターオリゴヌクレオチドSIOと標的配列とのハイブリダイゼーションによって形成される二重鎖の標的依存的ヌクレアーゼ切断によって生じる。1組成物およびキット本明細書では、本発明の方法を実施するための組成物およびキットを提供する。あくまでも非限定的な例に過ぎないが、組成物およびキットは、酵素増幅因子基質EASオリゴヌクレオチド、ドライバー断片DF、部分的酵素シグナル増幅因子PESA複合体、完全酵素シグナル増幅因子CESA複合体、酵素阻害性複合体EIC、阻害性断片InF、合成イニシエーターオリゴSIO、触媒性核酸、MNAザイム、MNAザイム成分、パートザイム、組織化助長因子、MNAザイム基質、酵素、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、基質、アプタマー、および/またはヘアピンオリゴヌクレオチドのうち任意の1つまたは複数を含みうる。11MNAザイム本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数のMNAザイムを含みうる。MNAザイムとは、2つまたは3つ以上のオリゴヌクレオチド成分から自己組織化しうる触媒活性のある核酸酵素のことであり、本明細書中ではパートザイムとも称される。パートザイムオリゴヌクレオチドは、MNAザイム自己組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する。いくつかの態様において、MNAザイムの存在を検出することができ、そしてそれは標的の存在を指し示すが、これはMNAザイムが、組織化助長因子を含む標的である標的の存在下でのみ形成されるためである。MNAザイムは当技術分野において周知であり、PCT特許公報第WO/2007/041774号、第WO/2008/040095号、第WO2008/122084号、ならびに関連した米国特許出願公開第20070231810号、第20100136536号および第20110143338号のうち任意の1つまたは複数に、さらに詳細に記載されているこれらの文書のそれぞれの内容はすべて、相互参照により本明細書に組み入れられる。好ましい態様において、MNAザイム構造は、1つまたは複数のDNAザイムおよび/またはリボザイムに基づく。特定のDNAザイム構造に基づくMNAザイム構造がより好ましい。現時点で好ましい構造は、10:23および8:17DNAザイムを含むDNAザイムである。さまざまな態様において、MNAザイムはリボヌクレオチド塩基およびデオキシリボヌクレオチド塩基の一方または両方を含む。より好ましい態様において、MNAザイム構造は、少なくとも一部にはDNAザイムの構造に基づく。他の好ましい態様において、MNAザイムは、少なくともいくつかのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。より好ましい態様において、MNAザイムの触媒性コアは、1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。さらにより好ましい態様において、1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、基質の触媒作用に関与する。他の態様において、触媒性コアの中の少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、触媒活性を向上させる。さらに他の態様において、MNAザイムの触媒性コアの中の少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体については、デオキシリボヌクレオチド塩基が存在しない同等なMNAザイムのものに比して、触媒作用が測定可能な速度で起こるという厳密な必要条件が存在する。MNAザイムは、当業者に周知の1つまたは複数の置換、例えば、類似体、誘導体、修飾もしくは改変された塩基、リボヌクレオチド、糖もしくはリン酸骨格の改変、さまざまな欠失、挿入、置換、重複もしくは他の修飾、またはこれらの任意の組み合わせなどを含みうる。そのような修飾、置換、欠失、挿入などを、分子が触媒活性を保つように、センサーおよび/もしくは基質アームに、ならびに/または触媒性コア部分に加えることができる。基質または組織化助長因子と結合するアームの、置換および修飾に対する忍容性は十分であり、このため種々の基質/組織化助長因子に向けての分子の個別適合化tailoringが可能になる。例えば、センサーアームの修飾により、種々の組織化助長因子に向けての個別適合化が可能になり、一方、基質アームの修飾により、種々の基質に向けての個別適合化が可能になる。パートザイムのセンサーアームのみを改変し、基質アームは変化させずにおくことにより、そのすべてがユニバーサルMNAザイム基質を検出のために利用する、多数の標的のそれぞれに対して特異的な多種多様なMNAザイムを設計することができる。当業者は、このことが、各標的に対して個別化されるかまたは一意的な基質の必要性をなくすという利点を理解するであろう。それぞれの新たな標的に必要なのは、パートザイムのセンサーアーム部分のうち1つまたは複数における1つまたは複数の変化のみである;基質アーム部分および触媒コア部分は不変のままであってよい。したがって、単一のMNAザイム基質を、MNAザイムを用いる単一の標的に対して、および、改変されたMNAザイムを用いる一連のアッセイにおいて複数の標的に対して用いることができる。多数のレポーター基質により、各標的ごとに1つずつの複数のMNAザイムを用いる単一のアッセイにおいて複数の標的を検出するという多重化が可能になる。MNAザイムを用いるそのような多重化された方法は、溶液中で、または支持系への付着により、容易に実現することができる。多重化アッセイをこのように、基質またはMNAザイムパートザイムまたは組織化助長因子または追加の酵素活性のうち1つまたは複数を、本明細書に記載したように支持体に付着させることによって実現しうることを、本明細書では想定している。当業者は、MNAザイムがデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはその両方を含むことを理解するであろう。少なくとも1つの、より好ましくはすべてのデオキシリボヌクレオチド成分オリゴヌクレオチドを含むMNAザイムが現時点では好ましい。また、MNAザイムの触媒性コアの内部に少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含むMNAザイムも好ましい。そのような塩基が触媒活性のために必要である態様が、さらにより好ましい。いくつかの態様において、パートザイム、組織化助長因子または基質のうち少なくとも1つが、標的と結合しうるアプタマーを含有すること/含むこともできる。好ましいアプタマーには、合成核酸またはペプチドの複合的ライブラリーから、吸着、回収および再増幅の反復過程によって単離しうる、短い一本鎖DNAもしくはRNAオリゴマー、またはペプチドが含まれうる。アプタマーはこのように、アミノ酸または抗生物質などの小分子から、タンパク質および核酸の構造体までの範囲にわたる、ほとんどあらゆる標的に対して作製することができる。好ましい態様において、アプタマーには、例えば、好ましくは進化および選択の手法によって生成される核酸結合分子が含まれる。好ましくは、アプタマーは、例えば、上記の表1のようなヌクレオチド類似体を非限定的に含む、DNAもしくはRNA分子またはその両方の組み合わせを含みうる。アプタマーの使用とMNAザイムを組み合わせるための戦略は、当技術分野において公知である。例えば、MNAザイムの少なくとも1つのパートザイムにアプタマーを組み込んでもよくアプタパートザイム、さらに、ヘアピンを形成することができ、それ故にMNAザイム組織化を阻害しうる相補的配列を組み込んでもよい。検出しようとする分析物または標的はアプタパートザイムと結合し、その結果、活性MNAザイムの組織化が可能になる。標的分析物の非存在下では、アプタパートザイムは、活性MNAザイムの組織化を阻害するヘアピン構造をとる。標的分析物の存在下では、標的分析物はアプタパートザイムのアプタマードメインと結合し、その結果、ヘアピン構造を妨害して、アプタパートザイムが活性MNAザイムの組織化に加わることが可能になる。続いて、活性MNAザイムがMNAザイム基質を修飾して、ドライバー断片を生成させることができる。他の態様において、アプタマーが、アプタマーならびにヘアピン構造を形成しうる相補的阻害因子配列を組み込んだ組織化助長因子の一部として存在してもよい。標的分析物の非存在下では、組織化助長因子は、この成分が活性MNAザイムの組織化を導く能力を阻害するヘアピン構造をとる。標的分析物の存在下では、標的分析物は組織化助長因子のアプタマードメインと結合し、その結果、ヘアピン構造が妨害されて、成分が活性MNAザイムの組織化を導くことを可能にする。続いて活性MNAザイムがMNAザイム基質を修飾して、ドライバー断片を生成させることができる。当業者は、アプタマーを組織化助長因子分子のいずれかの末端に組み込みうることを理解するであろう。さらに、複数のアプタマーを、パートザイムオリゴヌクレオチド成分のうち1つまたは複数に組み込むこともできると考えられることも理解されるであろう。1つのさらなる態様において、アプタマー配列を、活性MNAザイムが標的分析物の存在下でのみ形成されるような立体配置で、パートザイムの末端に組み込むこともできるアプタパートザイム。この場合、MNAザイム検出戦略のために必要なオリゴヌクレオチド成分には以下のものが含まれる;標準的なパートザイム;末端の一方にアプタマーが組み込まれたパートザイムであるアプタパートザイム;標的の存在下でアプタパートザイムおよびパートザイムの両方と結合して活性MNAザイムの組織化を可能にする組織化助長因子;基質;ならびに、アプタパートザイムと、パートザイム配列の少なくともアプタマー配列の一部および基質結合アームの一部にわたる領域内で結合する組織化阻害因子。標的の非存在下では、組織化阻害因子はアプタパートザイムと結合し、その結果、MNAザイム基質の結合および切断をブロックする。標的の存在下では、標的はアプタパートザイムのアプタマー配列と結合し、組織化阻害因子の結合を妨げて、MNAザイム基質の結合および切断を可能にする。そのため、活性MNAザイムは標的の存在下でのみ形成され、MNAザイム基質を修飾して切断断片、例えばドライバー断片を生成することができる。さらに、組織化阻害因子が別個の分子であってもよく、またはMNAザイム複合体に加わる成分の1つの中に組み込まれてもよいことは、当業者には理解されるであろう。また、1つまたは複数のアプタマーを、パートザイム、組織化助長因子またはMNAザイム基質を含むオリゴヌクレオチド成分のいずれかの中に組み込むこともできると考えられることも、当業者には理解されるであろう。さらに、アプタマーを、これらのオリゴヌクレオチドのいずれか1つの一方の末端に組み込むこともできると考えられる。12MNAザイム基質本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数のMNAザイム基質を含みうる。基質は、ある所与のMNAザイムに対して特異的であってもよく、または異なる標的特異性を有する複数のMNAザイムによる修飾が可能なユニバーサル/ジェネリック基質であってもよい。MNAザイムは、ある態様において、ユニバーサルまたはジェネリックな基質を利用しうるという有利な特性を有する。ユニバーサルMNAザイム基質は、複数の異なる標的を認識する新たなMNAザイムを作り出すための設計変更を容易にすることによって、迅速アッセイの開発を可能にする。パートザイムの基質アーム部分および触媒性コア部分を不変のままにして、新たな標的に対して必要な、1つまたは複数のパートザイムのセンサーアーム部分のみを変化させてもよい。ユニバーサル基質配列は提供されており、このため、同一の基質を、多くの異なる標的に関するアッセイに組み入れることができる。さらに、同一の基質を、基質が溶液中に遊離しているか、または支持体に連接されるかもしくは付着されているアッセイを含む、本明細書中のさまざまな態様における方法に組み入れることもできる。一連のユニバーサル基質を、複数の標的の同時検出を可能にする多重的反応に用いることができる。ユニバーサル基質を用いるMNAザイム戦略には、新たな各標的に対して特異的なプローブの設計および使用を必要とする、TaqMan登録商標または分子ビーコンMolecularBeaconsまたはハイブリダイゼーションプローブなどの検出技術を上回る、大きな利点がある。ある態様において、MNAザイム基質は、部分的酵素基質増幅因子複合体PESAと結合して、ヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼによる切断に対する感受性のない酵素阻害性複合体EICを形成する阻害性断片として作用しうる。MNAザイムによるMNAザイム基質の修飾により、本発明の方法例えば、EzyAmp反応に用いるための1つまたは複数の成分を得ることができる。修飾は例えば、MNAザイム基質の切断または複数のMNAザイム基質の核酸連結であってよい。いくつかの態様においては、MNAザイム基質の切断によって、ドライバー断片として機能し、PESAと組織化して、制限酵素または他のヌクレアーゼによる切断を受けやすいCESAを形成する、より小さな断片が生成されうる。MNAザイム基質はユニバーサルであって任意の標的に対して有用でありうるため、ユニバーサルMNAザイム基質の切断はユニバーサルドライバー断片の生成をもたらしうる。その結果、ユニバーサルDFはユニバーサルPESAと結合して、任意の標的の存在下で切断されてシグナルの増幅を可能にするユニバーサルCESAをもたらすことができる。他の態様においては、複数のMNAザイム基質の核酸連結によって、ドライバー断片として機能し、PESAと組織化して、制限酵素または他のヌクレアーゼによる切断を受けやすいCESAを形成する、より大きな断片が生成されうる。MNAザイム基質はユニバーサルであって任意の標的に対して有用でありうるため、ユニバーサルMNAザイム基質の核酸連結は、ユニバーサルドライバー断片の生成をもたらしうる。その結果、ユニバーサルDFはユニバーサルPESAと結合して、任意の標的の存在下で切断されてシグナルの増幅を可能にするユニバーサルCESAをもたらすことができる。13ドライバー断片本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数のドライバー断片DFを含みうる。追加的または代替的に、本発明の方法による組成物およびキットの使用中にDFを生成させることもできる。ある態様において、ドライバー断片を、オリゴヌクレオチドの成分として提供することもできる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドであっても二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、酵素増幅因子基質EASオリゴヌクレオチド、合成イニシエーターオリゴヌクレオチド、MNAザイム基質オリゴヌクレオチド、ヘアピンオリゴヌクレオチド例えば、複数のEAS、好ましくは2つのEASを含むヘアピンオリゴヌクレオチド、連接されたオリゴヌクレオチド、または一方の鎖に内部ループ部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであってよい。二本鎖および/またはヘアピンオリゴヌクレオチドは、一方の鎖がその相補的鎖よりもさらに伸びている突出部分例えば、5または3突出部を含みうる。オリゴヌクレオチドを、複合体例えば、PESAまたはCESAの中の他の成分と複合体化させてもよい。ある態様において、ドライバー断片はEASオリゴヌクレオチドの成分として提供され、このEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は別の異なるEASオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、この異なるEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分はドライバー断片の少なくとも一部分に対して相補的である。ドライバー断片は、本明細書に開示されたシグナル増幅方法例えば、EzyAmp反応を惹起させるために用いることができる。例えば、標的検出時にのみ利用可能になるドライバー断片を、PESA複合体の中のEASに対する結合後にシグナル増幅カスケードを惹起させるために用いることができる。そのような態様において、カスケードはドライバー断片の非存在下では始まらず、それ故にそれはイニシエータードライバー断片とも称されるが、この用語は暗示的であるに過ぎず、そのようなドライバー断片を記述する上での必要条件ではないことは理解されるであろう。例えば、ドライバー断片が、標的配列の存在下でのみ組織化されるMNAザイム基質によるMNAザイムの切断によって生成されてもよい。また、ドライバー断片が、標的の存在下でのみ組織化する、リガーゼ活性を有するMNAザイムによる複数の基質の核酸連結によって生成されうることも想定している。ドライバー断片が、タンパク質、脂質、小分子、ウイルス、またはアプタマーを組み込んだこれらの種類の触媒性核酸によって検出可能な他のリガンドを含む標的リガンドの存在下でのみMNAザイム基質を切断する、アプタMNAザイムまたはアプタザイムDNA、RNAまたはキメラの触媒活性によって生成されてもよい。ある態様において、ドライバー断片は、例えば、図19および24ならびに実施例9および14に記載されたような標的依存性MNAザイムを用いて生成されうる。これらの態様は、基質としてとの、ならびにDFと結合してそれ故にそれをブロックするためとの両方の役割を果たし、それ故に本明細書中で基質ブロッカーsubstrateblockerオリゴヌクレオチドと称される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体からのドライバー断片の生成を説明している。非限定的な例に過ぎないが、MNAザイム基質が第1および第2の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の成分であって、ここで第1の鎖が、MNAザイムの触媒活性によって修飾例えば、切断されうる内部ループ部分を含んでもよい。いくつかの態様において、第1および第2の鎖はヘアピンループ部分によって連結されており、ここで一方の鎖の5末端はもう一方の鎖の3末端と連結されていてもよい。内部ループ部分の内部の塩基は、第2の鎖の塩基とハイブリダイズしていない。オリゴヌクレオチド複合体は、ループ部分の外側にあって、対向鎖の一部分とハイブリダイズしている、少なくとも1つのドライバー断片を含む。例えば、ドライバー断片が複合体の第2の鎖の成分であってもよい。標的の存在下では、MNAザイムが組織化して、ループ部分を切断し、それにより、別の実体例えば、EASとハイブリダイズしうる一本鎖ドライバー断片を放出する様式で複合体を修飾することができる。例えば、ループの切断によって、ループの一部分が複合体から除去され、それにより、ドライバー断片とあらかじめハイブリダイズした二本鎖複合体の一部分が除去されうる。標的依存的な様式で生成されたこのドライバー断片が、増幅カスケードを誘発させることができる。または、MNAザイム基質が、第1および第2の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の成分であって、ここで第1および第2の鎖が、一方の鎖の5末端をもう一方の鎖の3末端と接続するヘアピンループ部分によって連結されていてもよい。ヘアピンループ部分は、組織化標的の存在下で組織化が起こると、MNAザイムの触媒活性によって修飾例えば、切断されうる。オリゴヌクレオチド複合体は、ヘアピン部分の外側にあって、対向鎖の一部分とハイブリダイズしている少なくとも1つのドライバー断片を含む。標的の存在下では、MNAザイムが組織化し、ヘアピンループ部分を切断して、それにより、別の実体例えば、EASとハイブリダイズしうる一本鎖ドライバー断片をもたらす様式で複合体を修飾することができる。例えば、ヘアピンループの切断によって、ループの一部分が複合体から放出され、それにより、ドライバー断片とあらかじめハイブリダイズした二本鎖複合体の一部分が除去されうる。標的依存的な様式で生成されたこのドライバー断片が、増幅カスケードを誘発することができる。また、制限酵素切断によってドライバー断片を生成させることが可能であることも想定している。例えば、二本鎖ゲノムDNAテンプレートの一方または両方の鎖の切断により、解離し、続いて、PESAと結合してCESAを形成し、その結果、ひとたび惹起されるとゲノムDNA由来の惹起性ドライバー断片の存在のみに依拠するのではなく、CESAの切断によって生成される新たなドライバー断片に依存すると考えられる、EzyAmpカスケード反応を惹起しうると考えられる、惹起性ドライバー断片として機能しうる特異的断片が生成されうると考えられる。標的DNA中のシトシン残基をメチル化するには、メチル化感受性REを用いうると考えられる。他の態様においては、ミスマッチ性ヘテロ二重鎖配列またはDNA/RNA二重鎖配列のいずれかを認識して切断する酵素または化学物質を用いて、ドライバー断片を生成させうることを想定している。ミスマッチは、調査している配列に関係する天然のミスマッチであってよいと考えられ、例えば、後天性突然変異または遺伝性SNPであってよいと考えられる。惹起性ドライバー断片を、例えば、不溶性支持体に連接されたSIOを含む、標的と複合体化された合成イニシエーターオリゴヌクレオチドSIOの切断によって生成させることもできる。本発明の組成物およびキットに含められるドライバー断片を、CESA複合体のヌクレアーゼ消化によって生成させることもできる。ヌクレアーゼは、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼであってよい。任意の適した制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いることができる。ある態様において、ヌクレアーゼは制限酵素である。制限酵素は、少なくとも1つのニックを含む二重鎖オリゴヌクレオチドを認識して切断することが可能であってよい。ニックは、制限酵素の認識部位の内側にあってもよく、または外側にあってもよい。ニックは、制限酵素の切断部位の内側にあってもよく、または外側にあってもよい。あらゆる制限酵素を用いうる可能性があるものの、適した制限酵素の非限定的な例には、MnlI、RsaI、PmeI、Hpy8I、MspI、EarIおよびTspRI、ならびに、表2および表3に示された制限酵素のうち任意の1つまたは複数が含まれる。ある態様において、ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼである。いかなる種類のエンドヌクレアーゼにも限定されないが、適した例には、T7エンドヌクレアーゼI、マングビーンヌクレアーゼ、RNaseH、Flapヌクレアーゼ、およびMNAザイムが含まれる。ある態様において、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼであり、その非限定的な例には、ヌクレアーゼBAL31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼTが含まれる。14合成イニシエーターオリゴSIO本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数の合成イニシエーターオリゴSIOを含みうる。SIOとは、SIOと試料中に存在する標的核酸との間での二重鎖の形成を誘導するために試料に添加されるオリゴヌクレオチドのことである。ヌクレアーゼによるSIO/標的二重鎖の対形成領域または非対形成領域のいずれかの切断を利用して、ドライバー断片として機能する核酸断片を生成させることができる。いくつかの態様においては、ミスマッチ性ヘテロ二重鎖配列またはDNA/RNA二重鎖配列のいずれかを認識して切断する酵素または化学物質を用いて、ドライバー断片を生成させうることを想定している。この態様には、SIOは必要ないと考えられる。ミスマッチは、調査している配列に関係する天然のミスマッチであってよいと考えられ、例えば、後天性突然変異または遺伝性SNPであってよいと考えられる。突然変異またはSNPが起こる箇所以外の箇所で配列を切断することを望むならば、生物試料中に存在する核酸の特定部位での切断を誘導するために、合成イニシエーターオリゴSIOを添加することが可能と考えられる。SIOは、標的生体テンプレートと比較して1つまたは複数のミスマッチを含有しうると考えられる。または、SIOが、例えば、DNA配列と結合して、その結果、そのようなハイブリッド配列を認識する酵素を用いる切断のための部位を提供する短いRNA/DNA二重鎖が形成されるような、RNA/DNAキメラオリゴであってもよいと考えられる。そのような追加的な態様においては、生物検体をSIOおよびエキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とともにインキュベートして、その結果、酵素がより大きな断片を消化してドライバー断片を生み出すようにすることによって、ドライバー断片を生成させうると考えられる。このようにして利用しうると考えられる酵素の非限定的な例は、表2以下に列記されている。2段階プロトコールを必要とする酵素もあるが、1段階反応に適用しうるものもある。当業者は、多くの他の酵素を、DNAおよび/またはRNAで構成される、マッチするSIOまたはミスマッチのあるSIO、ならびにエキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性のいずれかを有する酵素を用いてドライバー断片を生成させるために利用しうると考えられることを認識しているであろう。例示的なエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの使用の機序は、図8~11を参照することによって、さらによく理解されるであろう。図8は、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼIによる3→5エキソヌクレアーゼ活性を利用してドライバー断片を生成させるための2つの機序を図示している。この酵素は、DNA二重鎖からの3一本鎖突出部を加水分解する。標的DNAを含有する試料に合成イニシエーターオリゴSIOを添加して、ドライバー断片の生成を助長する。右のパネルでは、DFはSIOの切断に由来し、部分標的断片はインタクトのまま残り、再利用されて、より多くのDFを生成させる。左のパネルでは、DFは標的の切断に由来する。エキソヌクレアーゼIによるこの複合体の切断を防ぐために、ホスホロチオエート塩基をPESA複合体の3突出伸長部に組み込むことができる。ひとたびDFが生成されると、それはPESAとハイブリダイズして、その結果、それをCESA複合体に変換させる。図9は、マングビーンヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用してDFを生成させるための2つの機序を図示している。このエンドヌクレアーゼは、DNA二重鎖からの一本鎖突出部を3方向または5方向のいずれかに分解して、平滑末端を残す。ドライバー断片の生成を助長するために、DNAを含有する標的試料に合成イニシエーターオリゴSIOを添加する。右のパネルでは、DFはSIOに由来し、一方、左のパネルではドライバー断片は標的に由来する。PESAまたはCESAのヌクレアーゼ消化を防ぐために、左Lまたは右Rに示された反応を2段階1および2で行うことができる。これは物理的分離によって実現しうると考えられる。ひとたびDFが生成されれば、それはPESAとハイブリダイズし、その結果、それをCESA複合体に変換させる。図10は、エキソヌクレアーゼIIIのエキソヌクレアーゼ活性を利用してDFを生成させるための機序を図示している。この酵素は、DNA二重鎖の3末端からヌクレオチドを除去する。この酵素は平滑または陥凹3末端に対しては活性があるが、一本鎖DNAに対する活性はなく、それ故に3突出末端を切断しないと考えられる。この酵素はまた、二重鎖DNA中のニックから加水分解を開始して、一本鎖ギャップを生じさせる。成分オリゴヌクレオチド上のホスホロチオエートヌクレオチドの存在によって、このエキソヌクレアーゼ活性がブロックされる。DFの生成を助長するために、標的DNAを含有する試料にSIOを添加する。SIOに組み込まれたホスホロチオエートは、DF断片がPESAまたはCESAとハイブリダイズした時に生み出されるニックでの切断を防ぐ。DFはSIOに由来し、標的は再利用されて、より多くのDFを生成させる。この態様において、SIOは、標的と二重鎖を形成する標的特異的領域、およびユニバーサルな標的非結合領域を含みうると考えられる。エキソヌクレアーゼIIIによる標的特異的領域の切断により、ユニバーサルPESAと結合して、その結果、ユニバーサルCESAを形成させうると考えられる、ユニバーサルドライバー断片の生成SIOの標的非結合領域に対応をもたらしうると考えられる。図11は、T7エキソヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用してDFを生成させるための機序を図示している。この酵素は、DNA二重鎖またはDNA/RNA二重鎖から、特にリン酸化された5末端から、5方向にヌクレオチドを除去する。リン酸化された基質の存在下では、5リン酸を有しない他の5末端に対する活性は大きく低下する。DFの生成を助長するために、標的DNAまたはRNAを含有する試料にSIOを添加する。DFは合成イニシエーターオリゴSIOに由来し、RNAまたはDNA標的は再びサイクルに利用されて、より多くのDFを生成させうる。PESAはDNAで構成されるが、T7エキソヌクレアーゼによる分解を防ぐために、ある程度の二重鎖RNAを二重鎖の5末端に有してもよい点線ボックス。この態様において、SIOは、標的と二重鎖を形成する標的特異的領域、およびユニバーサルな非結合領域を含みうると考えられる。T7エキソヌクレアーゼによる標的特異的領域の切断は、ユニバーサルPESAと結合し、その結果、ユニバーサルCESAを形成させうると考えられるユニバーサルドライバー断片SIOの標的非結合領域に対応の生成をもたらしうると考えられる。さらに、SIOが、代替的または追加的に、標識された核酸、ナノ粒子、微粒子、タンパク質、抗体、RNA、DNA、核酸類似体、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックド核酸、ペプチド核酸キメラ、アプタマー、またはそれらの任意の組み合わせなどの実体を組み込んでもよい。例えば、ナノ粒子は金ナノ粒子であってよい。ある態様において、本発明の組成物およびキットは、不溶性支持体に連接されたSIOを含む。ある態様において、SIOはヘアピンコンフォメーションとして提供されてよい。非限定的な例として、SIOは、分子内結合を形成させるオリゴの一部分と、内部の塩基が相補的でない、ステムの一方の端にあるヘアピンループ部分との間の配列相補性のために生じる二本鎖ステム部分を含みうる。ヘアピンSIOは、5または3末端のいずれかでステムから伸びて、それにより、一本鎖配列の5または3突出部を形成する余分な配列を有しうる。ヘアピン状SOIが、別のオリゴヌクレオチド、例えばDFなどに対して相補的な配列を含んでもよい。図23は、ヘアピンSIOの非限定的な例を提示している。15完全酵素シグナル増幅因子CESA複合体および部分的酵素シグナル増幅因子PESA複合体本発明の組成物およびキットは、1つもしくは複数の完全酵素シグナル増幅因子CESA複合体および/または1つもしくは複数の部分的酵素シグナル増幅因子PESA複合体を含みうる。完全酵素シグナル増幅因子CESA複合体は、典型的には、2つの酵素増幅因子基質EASオリゴヌクレオチド例えば、第1の酵素増幅因子基質EAS1オリゴおよび第2の酵素増幅因子基質EAS2オリゴならびにドライバー断片を含む。EAS1は典型的には二重鎖の一方の鎖を含み、これは二本鎖になった時に、ヌクレアーゼによる認識配列および切断配列を組み込む。ヌクレアーゼは例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼであってよい。好ましい態様において、EAS1は二重鎖の一方の鎖を含み、これは二本鎖になった時に、一方の鎖に制限酵素認識配列および切断部位を組み込む。例示的なCESA複合体は図14および15に提示されている。CESA複合体の1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的であり、前記EASオリゴヌクレオチドのうち1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDFの少なくとも一部分に対しても相補的である。上述したように、CESA複合体は、ヌクレアーゼによる認識配列および切断配列を含む。DFは、認識配列および/またはヌクレアーゼ切断配列について1つまたは複数のヌクレオチドを寄与しうるが、必ずしもそうである必要はない。2つのEASオリゴによって形成される部分認識配列および/または部分的酵素切断配列への、DFによる1つまたは複数のヌクレオチドの寄与は、DFがPESA複合体と結合してCESA複合体を形成した際に、ヌクレアーゼ媒介性切断の誘因となる。DFが認識配列および/または切断配列について1つまたは複数のヌクレオチドを寄与する態様において、DFは任意の数のヌクレオチド、例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ以上のヌクレオチドを寄与しうる。または、DFが5つ未満、4つ未満または3つ未満のヌクレオチドを寄与してもよい。DFによって寄与されるヌクレオチドは、例えば、2つのEASオリゴによって形成される部分ヌクレアーゼ認識配列または部分ヌクレアーゼ切断配列のすぐ5側またはすぐ3側にあってよい。または、DFによって寄与されるヌクレオチドが、2つのEASオリゴによって形成される完全ヌクレアーゼ認識配列または完全ヌクレアーゼ切断配列から5側または3側に1、2、3、4、5または6ヌクレオチドの位置にあってもよい。代替的な態様において、DFは、CESA複合体のヌクレアーゼ認識配列および/またはヌクレアーゼ切断配列について、ヌクレオチドを全く寄与しない。にもかかわらず、本明細書の実施例5に提示した実験データによって確かめられたように、完全ヌクレアーゼ認識および切断配列を既に含むPESAに対するDFの結合により、CESA複合体の切断に際して生成されるシグナルは増強されうる。CESA複合体の切断は、典型的には、特定イベントを指し示す検出可能なシグナルを発生させるために用いられる。図3および5を参照すると、第1の酵素増幅因子基質オリゴEAS1は、検出可能な部分Fおよびクエンチャー部分Qの両方を含む。第2の酵素増幅因子基質オリゴEAS2もクエンチャー部分Qを含む。クエンチャー部分は、CESAが制限酵素または他のヌクレアーゼによって切断されるまで、第1のEAS1の検出可能な部分からの検出可能なシグナルを減じさせるか、または消失させるように適合化されている。例えば、クエンチャー部分が、BlackHoleクエンチャー1BHQ1またはBlackHoleクエンチャー2BHQ2を含んでもよい。当業者は、任意の適したフルオロフォアクエンチャー色素のペアをそのようなプロトコールに用いうることを理解しているであろう。さらに、CESA複合体例えば、EAS1の1つまたは複数のEASオリゴが、代替的または追加的に、標識された核酸、ナノ粒子、微粒子、タンパク質、抗体、RNA、DNA、核酸類似体、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックド核酸、ペプチド核酸キメラ、アプタマーまたはそれらの任意の組み合わせなどの実体を組み込んでもよい。例えば、ナノ粒子は金ナノ粒子であってよい。ヌクレアーゼによるCESAの切断の結果として、検出可能な影響が生じ、その効果の大きさおよび/または速さは、それ故に試料中の標的の数量を指し示しうる。検出可能な影響は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円偏光二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電気光学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、種々の方法によって検出することができる。いくつかの態様において、CESA複合体の1つのEASオリゴは、制限酵素認識配列の一部分および/または制限酵素切断配列の一部分を含む、二重鎖の一方の鎖を含む。図1、2および3を参照すると、第1および第2の酵素増幅因子基質オリゴEAS1およびEAS2はそれらの全長の少なくとも一部分にわたって相補的であり、その結果、第1および第2のEASオリゴの相補性部分はハイブリダイズして、部分的に二本鎖の制限酵素認識配列および/または制限酵素切断配列を形成する。図4および5を参照すると、第2のEASEAS2は、EAS1との結合に際して、EAS1上に位置する検出可能な部分を消光させうるクエンチャー部分を含みうる。または、EAS2は、EAS1上に位置するクエンチャー部分によって蛍光が消光される検出可能な部分を含みうる。EAS1とEAS2とのハイブリダイゼーションによって形成される複合体は、部分的酵素シグナル増幅因子PESA複合体と称される。PESA複合体は、少なくとも2つの酵素増幅因子基質EASオリゴヌクレオチドを含む多オリゴヌクレオチド複合体であり、ここで1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的である。加えて、前記EASオリゴヌクレオチドのうち1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDFの少なくとも一部分に対しても相補的である。DFとハイブリダイズする能力を有するものの、このDFはハイブリダイズしておらず、それ故、PESA複合体の成分ではない。PESA複合体は、酵素の少なくとも部分的な認識配列/部位および/または少なくとも部分的な切断配列/部位を含み、酵素の完全な認識配列/部位および/または完全な切断配列/部位を含んでもよい。例示的なPESAは、図1C、3C、4、5B、7A、7B、8左および右のパネルの両方、14C、17A、18A、19A、20および22に図示されている。MNAザイムによるMNAザイム基質の切断によって、またはタンパク質エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む他のヌクレアーゼによるSIO/標的二重鎖の切断によって生じるドライバー断片DFは、完全制限酵素認識配列図2に破線ボックスで表示に必要であってもよく、および/または、それが制限酵素による切断のために必要な制限酵素認識配列に隣接する付加的な配列であってもよい。図2を参照すると、切断部位が黒の縦向き実線矢印によって表示されている。ドライバー断片の少なくとも一部分は、第1の酵素増幅因子基質オリゴEAS1の少なくとも一部分に対して相補的である。図1、2および3を参照すると、ドライバー断片および第1のEAS1はそれらの全長の少なくとも一部分にわたって相補的であり、その結果、ドライバー断片および第1の酵素増幅因子基質オリゴの相補的部分が、例えばハイブリダイゼーションによって組織化して、完全または部分的な制限酵素認識部を含む二本鎖配列を形成することができる。CESA中に組み込まれる完全または部分二本鎖制限酵素切断配列を、このようにして形成させてもよい。EAS1、EAS2およびDFのハイブリダイゼーションによって組織化されたCESAは、REによる認識および切断の両方のために必要な配列すべてを含む。1つの態様において、適切なREによるCESAの切断は、第1の酵素増幅因子基質オリゴEAS1の検出可能な部分とクエンチャー部分との間での切断をもたらし、この2つの部分が分離して、それにより、クエンチャー部分が検出可能な部分の局所環境から隔てられるかまたは事実上除去されるのに伴って、検出可能なシグナルが出現するかまたは増加することを可能にする。他の態様において、CESAの切断は、さらなるPESAとハイブリダイズしてさらなるCESAを形成させる新たなドライバー断片の生成をもたらしうる例えば、図7、17A、18A、19A、20および22。このさらなるCESAは、同じREまたは異なるREによる切断を受けやすいと考えられる。図2および15を参照すると、いくつかの態様において、完全に組織化したCESAは、異なるデザインを有しうる。DF中央が白い黒線は、制限酵素の完全認識配列に必要なこともあれば、および/または、それが制限酵素による切断のために必要な制限酵素認識部位に隣接して付加的な配列を与えることもある。制限酵素による切断は5突出部、3突出部のいずれかをもたらすこともあれば、またはそれが平滑末端を生成させせることもある。制限酵素は、EAS1、EAS2およびDFの二本鎖組織化複合体の一方または両方の鎖を切断しうる。EAS2とDFが隣接する位置は、連続した二本鎖二重鎖をREが正常に切断する位置であってもよく、またはそれが、制限酵素による認識および切断のために必要な配列のある別の場所であってもよい。EAS2と隣接するDFの末端は、前の段階でより長い分子の切断の結果として生じたものでなければならない。例えば、ドライバー断片が、MNAザイムによるMNAザイム基質の5および3断片への切断によって生成されるのであれば、隣接する末端は、切断されたMNAザイム基質の3断片の5末端、または5断片の3末端でなければならない。もう1つの例として、ドライバー断片がエキソヌクレアーゼIIIによるSIOの切断によって生成され、それ故に5断片が生み出されるのであれば図10、隣接する末端はこの5断片の3末端でなければならない。図1Bを参照すると、酵素阻害性複合体またはEICとは、EAS1、EAS2および阻害性断片InFを含みうる複数のオリゴヌクレオチドによって形成される複合体のことである。EICは、複数のオリゴ上に存在する酵素認識部位および切断部位の配列を含むだけでなく、制限酵素による切断または他のヌクレアーゼの阻害を引き起こす付加的な配列も含む。EICがPESAおよびInFを含む態様において、そのCESAへの変換のためには阻害性断片InFの切断によってドライバー断片DFとして機能してCESAを完成させるより小型の断片が生成されることが必要である。InFの切断はいくつかの手段によって実現しうる。InFが、標的分析物の存在下で組織化し、InF/MNAザイム基質を切断してDFを生成させるMNAザイムの基質であってもよい。または、InFが、標的配列とハイブリダイズして、タンパク質エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識される二重鎖を形成させる合成イニシエーターオリゴヌクレオチドSIOであり、その結果、InF/標的複合体の対形成した塩基または対形成しない塩基が切断されて、CESAを完成させるDFが生成されてもよい。ある態様において、PESA複合体およびCESA複合体はヘアピン構造の形態で提供される。非限定的な例として、PESA複合体は、複合体の中の各EASオリゴの少なくとも一部分と、その内部のループ塩基が相補的でない、ステムの一方の端にあるヘアピンループ部分との間の配列相補性のために生じる二本鎖ステム部分を含みうる。ヘアピンPESA複合体は、5または3末端のいずれかでステムから伸びて、それにより、一本鎖配列の5または3突出部を形成する余分な配列を有しうる。ヘアピンPESA複合体が、別のオリゴヌクレオチド、例えばDFなどに対して相補的な配列を含んでもよい。ヘアピンCESA複合体は、ヘアピンPESA複合体にDFが結合すると形成されうる。図18は、ヘアピンPESA複合体およびヘアピンCESA複合体の非限定的な例を提示している。ドライバー断片などの成分を複数の複合体の間に局在させるため、およびその移行を向上させるために、CESA複合体を形成する潜在能力のあるPESA複合体を複合的構造体に組み込んでもよい。図22は、PESA複合体を分枝構造に組み込むことによってEzyAmp成分を局在されるための例示的な方法を図示している。骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3およびEAS4を含む第1の複合体を用意する。骨格オリゴヌクレオチドは、EAS1、EAS3、およびEAS1とEAS3を隔てる介在部分を含む。EAS1の一部分は、それがハイブリダイズするEAS2の一部分に対して相補的であり、EAS2の一部分は第1のDFの一部分に対して相補的であり、かつ、EAS1またはEAS2の一部分は第2のDFを含む。EAS3の一部分は、それがハイブリダイズするEAS4の一部分に対して相補的であり、EAS3の一部分は第2のDFの一部分に対して相補的であり、かつ、EAS3またはEAS4の一部分は第2のDFを含む。第1の複合体はC形状をとり、EAS1およびEAS3を隔てる介在部分は、相補的配列を含む第2の複合体の対応する部分とのハイブリダイゼーションに向けた位置にある。図22のパネルBに示されているように、これにより、4つの別個のPESA複合体を有する二重複合体の形成が可能になる。図22Dに図示されているように、単一複合体または二重複合体のそれぞれの1つまたは複数のアームを、任意の適した試薬例えば、ビオチン/アビジン、化学試薬、抗体、ペプチドリンカーなどを用いて、別の単一複合体または二重複合体の1つまたは複数のアームと連結させることができる。さまざまなPESA複合体を互いに近接させることにより、CESA複合体の形成および切断に際して、さまざまなPESA複合体間でのドライバー断片の効率的な移行が可能になる。16オリゴヌクレオチドドライバー断片、阻害因子断片、合成イニシエーターオリゴヌクレオチドおよび酵素増幅因子基質はオリゴヌクレオチドであり、当業者に周知である、類似体例えば、表1に列記されたもの、誘導体、修飾もしくは改変された塩基、リボヌクレオチド、糖骨格もしくはリン酸骨格の改変さまざまな欠失、挿入、置換、重複もしくは他の修飾、またはこれらの任意の組み合わせといったといった1つまたは複数の置換を含みうる。そのような修飾、置換、欠失、挿入などは、それがその機能を実質的に保つ限り、オリゴヌクレオチド中の任意の位置に加えることができる。オリゴヌクレオチドに対する置換および修飾は十分な忍容性があってよく、ある特定の条件下で機能するように、または完全酵素シグナル増幅因子複合体を伴う反応の効率の向上のために、分子を個別適合化することを可能にする。例えば、1つまたは複数のヌクレオチド類似体を含めることによる酵素増幅因子基質またはドライバー断片の修飾によって、より不安定な完全酵素シグナル増幅因子複合体の組織化が助長され、それにより、例えば、ヌクレアーゼによる完全酵素シグナル増幅因子複合体の切断の効率が向上する可能性がある。当業者は、本発明のオリゴヌクレオチド、例えば、ドライバー断片、合成イニシエーターオリゴヌクレオチド、阻害性断片、基質、アプタマーおよび酵素増幅因子基質オリゴなどが、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの一方、またはその両方を含みうることを理解するであろう。ある態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドを含む。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは主としてデオキシリボヌクレオチドを含み、さらにより好ましくは、デオキシリボヌクレオチドのみを含む。17制限酵素本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数の制限酵素、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたはそれらの組み合わせを含みうる。本発明の組成物、方法およびキットにおいて有用な制限酵素は、I型、II型、III型またはIV型制限酵素でありうる。制限酵素は一般に、サブユニット組成、切断位置、配列特異性および補助因子要求性に基づいて、これらの型に分類される表2参照。表2制限酵素の型表2に列記された制限酵素は、例示のみを目的として提示されており、本発明の範囲をいかなる形でも制限するものではない。当業者は、広範囲にわたる制限酵素がCESAおよびEzyAmp反応の開発に適合すると考えられることを理解するであろう。例えば、制限酵素データベースREBASEhttprebasenebcomrebaserebasehtmlにリスト化されている多くの制限酵素が、CESAおよびEzyAmp反応の開発に適合すると考えられる。以下の表3は、本発明における多様な特異性および特性を有する制限酵素の例を提示している。表3制限酵素の例これらの群は相互排他的ではないこれも一例として挙げるに過ぎないが、MnlIは、EzyAmp反応に用いるのに特に有用な酵素である。MnlIは4つのヌクレオチド二本鎖認識配列を必要とする。切断部位はRERSから一定の距離の場所にあり、この酵素は介在空間に何ら特異的な配列を必要としない。DNAの各鎖は部分認識配列を与え、それは完全な二本鎖認識配列をもたらすためにその相補物とハイブリダイズしなければならない。認識配列、介在配列および切断部位は以下のように描写することができるここでNは任意のデオキシリボヌクレオチドであってよく、/は切断部位を指し示す:二本鎖配列の一方の鎖が非連続的である場合すなわち、隣接するデオキシリボヌクレオチドがホスホジエステル結合で連結していない、DNA二重鎖はニックを含むと言う。MnlIの標準の認識配列は、ニックを全く含まない連続した二本鎖DNAで構成される。RERS内部の種々の位置にニックを有するさまざまな二重鎖構造、ならびにミスマッチ性ヌクレオチド、チオ基およびリボヌクレオチドを含む構造をMnlIが切断する能力を特徴づけるために広範な研究が着手された。これらの研究の目的は、部分的MnlI認識部位を含む一定範囲にわたるPESAおよびDFの設計を可能にする柔軟性のレベルを判定することであった表4。他のREに対して行われたそのような広範な特性決定からも、EzyAmp反応に他のREを用いることに関する情報が得られると考えられる。表4MnlIによって切断される能力に関して試験した構造:‐CCTCまたはGGAGはMnlI認識部位を形作る部分配列である。‐Nは任意のヌクレオチドであり、NはNに対して相補的である‐rNはリボヌクレオチドである‐↓↑はREによる切断である‐はニックを指し示す18エキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素本発明の組成物およびキットは、エキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を含みうる。制限酵素および触媒性核酸酵素に加えて、核酸配列を切断する能力を有する他のタンパク質酵素も、本明細書に記載の組成物、方法およびキットにおいて有用である。これらの酵素のいくつかは、一本鎖または二本鎖核酸の末端からのヌクレオチドの除去をもたらすエキソヌクレアーゼ活性を有する。また別の酵素はエンドヌクレアーゼ活性を有し、配列を内部結合で切断して、より小型の断片を生じさせる。適したエキソヌクレアーゼの非限定的な例には、ヌクレアーゼBAL31、エキソヌクレアーゼI大腸菌、エキソヌクレアーゼIII大腸菌、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼT、およびヌクレアーゼBAL31が含まれる。適したエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、T7エンドヌクレアーゼI、RNaseH、Flapヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼおよびMNAザイムが含まれる。適したヌクレアーゼのサブセットの特性を表5に列記している。表5ヌクレアーゼの特性19アプタマー本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数のアプタマーを含みうる。アプタマーとは、それらの比較的高次の構造、例えば、3D結合ドメインまたはポケットが原因で、1つまたは複数のリガンドを高い親和性および特異性で認識する能力を有する核酸配列またはペプチド配列である。例えば、アプタマーは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生物体全体、小分子、重合体、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせ、または他の任意の実体と結合してよい。いくつかの態様において、アプタマーは、1つまたは複数のリガンドを認識する能力を有する、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはそれらの組み合わせを含みうる。本明細書における好ましいアプタマーには、短い一本鎖DNA、RNAオリゴマー、またはペプチドが含まれる。これらは、吸着、回収および再増幅の反復過程によって合成核酸の複合ライブラリーから単離することができる。アプタマーは、アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造までの範囲にわたるほぼあらゆる標的に対して作製することができる。好ましくは、アプタマーは、例えば、上記の表1の通りのヌクレオチド類似体を非限定的に含む、DNA分子またはRNA分子またはその両方の組み合わせを含みうる。当業者は、アプタマーを、本発明の方法に用いられる他の任意の成分例えば、MNAザイム成分に組み込みうることを理解するであろう。110キット本発明はまた、本明細書に開示された方法を遂行するためのキットも提供する。典型的には、本発明の方法を実施するためのキットは、本方法を実施するために必要な試薬のすべてを含む。キットは、本発明の任意の1つもしくは複数の組成物、および/または本発明の組成物の任意の1つもしくは複数の成分を含みうる。例えば、1つの態様において、キットは、MNAザイム成分の入った第1の容器、MNAザイム基質の入った第2の容器、およびPESA成分の入った第3の容器、および制限酵素の入った第4の容器を含みうる。MNAザイムの自己組織化は、被験試料中に存在する組織化助長因子または標的の会合を必要とする。このため、そのような態様においては、キットの成分を配合すると、被験試料中に存在する組織化助長因子または標的の存在下でMNAザイムが組織化して、基質を切断してDFを生じさせる。続いてDFがPESA成分と会合して、制限酵素による認識部位および切断部位を含むCESAをもたらす。他の態様において、キットが、SIOの入った第1の容器、PESA成分の入った第2の容器、およびSIOと標的との間で二重鎖が形成された時に切断することができるヌクレアーゼの入った第3の容器、および制限酵素を含む第4の容器を含んでもよい。使用中に、被験試料中に存在するSIOと標的との会合によって二重鎖が形成される。したがって、そのような態様においては、キットの成分を配合すると、被験試料中に存在する標的の存在下でSIOが二重鎖を形成し、二重鎖が形成された場合にはヌクレアーゼが切断してDFを形成させる。続いてDFがPESA成分と会合して、制限酵素による認識部位および切断部位を含むCESAをもたらす。典型的には、本発明のキットは、例えば、洗浄用試薬、および/または本発明の方法の遂行に必要とされる他の試薬を含む、1つまたは複数の他の容器も含むと考えられる。本発明に関連して、キットは試薬が別々の容器に収容されている任意のキットを含むことができ、それは小型ガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチックもしくは紙の小片を含むことができる。そのような容器は、試料および試薬の交差汚染を回避しながらの1つの区画から別の区画への試薬の効率的な移行、ならびに1つの区画から別の区画への各容器の薬剤または溶液の定量的様式での添加を可能にすることができる。そのようなキットはまた、被験試料を収容するであろう容器、アッセイに用いられる試薬を収めた容器、洗浄試薬を収めた容器、および検出試薬を収めた容器も含みうる。典型的には、本発明のキットは、キット成分を用いて適切な方法を実行するための使用説明書も含むと考えられる。本発明のキットおよび方法は、例えばリアルタイムPCR装置を非限定的に含む、自動分析機器およびシステムとともに用いうる。複数の異なる標的の検出、同定または定量への適用のために、本発明の単一のキットを適用しうることもあれば、または代替的に、例えば各標的に対して特異的な試薬を含む複数の異なるキットが必要なこともある。本発明の方法およびキットは、任意の実体を検出、同定または定量することが望ましいあらゆる状況において用途がある。2検出およびシグナル増幅本発明は、少なくとも1つの標的の検出、同定および/または定量のためのさまざまな方法を提供する。さらに、本発明は、標的の検出によって生じたシグナルの増幅のためのさまざまな方法も提供する。本方法は、本発明の組成物およびキット、ならびに、上記のセクション1に記載されたものを含む、それらの成分を用いて行うことができる。21イニシエータードライバー断片本発明の方法による標的の検出、定量および/または増幅は、典型的には、1つまたは複数のドライバー断片DFの使用に依拠する。特に、本方法は、典型的には、標的分子の検出に際して生じる初期DF本明細書ではイニシエーターDFとも称するの生成に依拠する。ひとたび生成されると、イニシエーターDFは、例えば、PESA複合体とハイブリダイズして、酵素による認識および修飾が可能なCESA複合体を形成させることによって、シグナルの発生を惹起することができる。酵素例えば、ヌクレアーゼによるCESA複合体の修飾例えば、切断は検出可能な影響をもたらすほか、別のPESA複合体と結合して、それによってシグナル増幅を助長することのできるさらなるDFを放出させることもできる。好ましい態様において、イニシエーターDFは標的とは明確に異なるものの、いくつかの態様において、イニシエーターDFは標的の一部分を含んでもよく、かつ他の態様において、イニシエーターDFが標的であってもよい。好ましい態様において、イニシエーターDFの生成は制限酵素による標的の酵素的切断を伴わないが、この可能性は必ずしも除外されない。イニシエーターDFが標的特異的イベントによって生成され、これが本発明のシグナル検出経路およびシグナル増幅経路を活性化するための誘因としての役を果たしてもよい。一般に、イニシエーターDFの生成は、本発明のオリゴヌクレオチド例えば、SIO、MNAザイムまたはPESA複合体に対する標的分子の結合によって、ヌクレアーゼなどの酵素による修飾を受けることのできる複合体を形成することを伴う。例えば、オリゴヌクレオチドに対する標的の結合により、部分的酵素認識部位および/または切断部位が完成してもよい。いくつかの態様において、標的が結合するオリゴヌクレオチドはDFを含み、そのようにして形成された複合体の酵素的修飾は、オリゴヌクレオチドからイニシエーターDFを放出させるのに役立つ例えば、図8B、9B、10、11および23を参照。他の態様において、オリゴヌクレオチドに対する標的の結合は、標的の酵素的修飾による、標的からのイニシエーターDFの直接的な生成を助長する例えば、図8Aおよび9Aを参照。さらに他の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的と結合すると触媒的に活性となり、1つまたは複数の基質を修飾してDFを形成させる例えば、図5、13、19および24を参照。非限定的な例に過ぎないが、イニシエーターDFは、サブセクション13で上述したように、MNAザイムによる基質の切断または核酸連結によって生成させることができる。基質は基質ブロッカーオリゴヌクレオチドであってよいサブセクション13、図19および24B、24C、24D、ならびに実施例9および14を参照。他の態様において、イニシエーターDFを、標的例えば、ゲノムDNAの制限酵素切断、標的と複合体化した合成イニシエーターオリゴヌクレオチドSIOの切断例えば、上記のサブセクション14、図8~11および図23によって、またはミスマッチ性ヘテロ二重鎖配列もしくはDNA/RNA二重鎖配列のいずれかを認識して切断する酵素もしくは化学物質によって生成させることもできる。ミスマッチは、調査している配列に関係する天然のミスマッチであってよいと考えられ、例えば、後天性突然変異または遺伝性SNPであってよいと考えられる。当業者は、上記に言及したイニシエータードライバー断片を生成させるための方法が例示のみを目的としていること、および他の適した方法も利用しうることを認識しているであろう。22標的の検出本発明の方法は、標的の存在を指し示すシグナルを得るために用いることができる。ある態様においては、イニシエーターDFの生成により、検出可能な影響を得ることができる。上記のサブセクション21で述べたように、イニシエーターDFは、本発明のオリゴヌクレオチドに対する標的の結合によって形成される複合体の酵素的修飾例えば、切断によって生成させることができる。例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー部分で標識されたSIOに対する標的の結合により、部分が分離され、それ故に、イニシエーターDFの放出時に検出可能な影響が得られる様式で、SIOの酵素的修飾を助長させることができる例えば、図23を参照。追加的または代替的に、標的の存在を、オリゴヌクレオチド/標的複合体の酵素的修飾によって生じた生成物のサイズおよび配列などの特性に基づいて検出し、さらに可能性としては定量することもできると考えられる。221直線的カスケード好ましい態様において、標的認識イベントに際して生成されたイニシエーターDFは、PESA複合体の完成を介してシグナルを発生させてCESA複合体を形成させるために用いられる。CESA複合体の酵素的切断を利用して、検出可能な影響を生成させること、ならびに/または、別のPESA複合体と結合して、酵素的切断およびシグナル生成を行えるさらなるCESA複合体を形成することができ、このようにして直線的カスケードをもたらすことのできる、1つもしくは複数の追加的なDFを得ることもできる。この過程は図4に図示されており、ここでは、前の段階で生成されたドライバー断片例えば、イニシエーターDFが、第1の酵素増幅因子基質EAS1オリゴおよび第2の酵素増幅因子基質EAS2オリゴを含むPESA複合体と組織化する。DFがPESA複合体と組織化すると、制限エンドヌクレアーゼ認識部位図4中の破線ボックスおよび制限エンドヌクレアーゼ切断部位図4中の塗りつぶされた縦向き矢印を含むCESAが生み出される。1つの態様において、第1のEAS1はクエンチャーQで標識されており、第2のEAS2はフルオロフォアFで標識されている。組織化したCESAの切断の後に引き続いて成分の解離が起こる結果、フルオロフォアとクエンチャーの分離が起こり、それに随伴して蛍光性シグナルの発生およびインタクトDFの放出が起こる図4。続いてDFは別のPESAと会合して別のCESAを形成することができ、それはさらに制限エンドヌクレアーゼ切断および蛍光の増加を招く。この過程はこのようにして続き、図4に図示されているように、制限酵素で媒介されるさらなるEAS1の切断によって蛍光性シグナルが生じるシグナル増幅をもたらす。さらに他の態様において、CESAを切断する酵素は、制限エンドヌクレアーゼではないヌクレアーゼである。図5に図示されているもう1つの態様において、第1および第2のパートザイムは、組織化助長因子を含有する試料と接触すると自己組織化して、触媒活性のあるMNAザイムとなる。MNAザイムはMNAザイム基質と結合してMNAザイム基質の修飾を助長し、前記修飾はそれにより、組織化助長因子の存在を指し示し、ここで組織化助長因子は標的である図5A。アプタマーを伴うもののような他の態様において、組織化助長因子は標的でなくてもよく、それ故にMNAザイムの自己組織化のために必要な要素のみを含んでもよい。触媒活性のあるMNAザイムによるMNAザイム基質の切断図5A、段階1によって、PESAと組織化しうるドライバー断片DFが生じ図5B図5、段階2、それは第1のEASEAS1および第2のEASEAS2、ならびに制限酵素認識部位破線ボックスおよび制限酵素切断部位黒の縦向き矢印を形成するDFを含むCESA図5Cを生み出す。1つの態様において、第1の酵素増幅因子基質オリゴはフルオロフォアFおよびクエンチャーQで標識され、EAS2はクエンチャーQで標識される。制限酵素によるこの組織化した構造の切断図5、段階3および引き続いての成分の解離図5、段階4により、蛍光性シグナルの発生およびDFの放出がもたらされる。続いてDFは別のPESAと会合して別のCESAを形成させることができ図5、段階5、それがさらに制限酵素切断を招く図5、段階6、段階3と同様。この過程はこのようにして続き、図5の段階4、5および6に示されているように、制限酵素で媒介されるさらなるEAS1の切断によって蛍光性シグナルが生じるシグナル増幅をもたらす。MNAザイムの性質、およびREを含むヌクレアーゼの特性の多様性が理由で、広範囲にわたる温度で反応を行いうるため、課せられるのは、MNAザイムの組織化、MNAザイム基質の触媒性修飾例えば、切断のための必要条件、ならびにPESAおよびDFからのCESAの組織化およびヌクレアーゼの活性のための必要条件のみである。本方法の各段階は異なる温度で行うことができ、例えばMNAザイムの形成を標的の存在下で行い、引き続いてのMNAザイム基質の切断をある温度で実現して、DFを含むCESAの形成およびシグナル増幅を生じさせる引き続いての制限酵素による切断を異なる温度で起こさせることができる。または、MNAザイムおよび制限酵素を含むヌクレアーゼの両方の触媒活性を支える環境で、すべての段階を単一の温度で行うこともできる。タンパク質エキソヌクレアーゼexoncleaseまたはエンドヌクレアーゼを用いる標的指向性切断によってドライバー断片が生成される他の態様においては、EzyAmpのために必要なすべてのタンパク質酵素と適合性のある反応条件が、当業者によって容易に決定されうる。本明細書においてさらに提示するように、制限酵素を含むヌクレアーゼを単独で、またはMNAザイムと組み合わせて使用する、標的検出のためのいくつかの方法は、標的の熱サイクリングおよび/または変性を必要としない。等温法は熱サイクリングを必要とする方法よりも融通が利き、一本鎖核酸および二本鎖核酸を含む標的間の区別も可能にする。さらに、熱サイクリングの必要がないことにより、そのような方法は、より容易でかつより安価になりうる。本明細書における方法に従って提供されるのは、試料中の合成性でも天然性でもよい関心対象の標的を検出する、簡単で、迅速で、費用効率が良く、等温で、かつ手順に融通性がある方法である。222フィードバックカスケード本発明の好ましい態様において、標的認識イベントに際して生成されるイニシエーターDFは、複数のPESAおよびCESA複合体を伴うフィードバックカスケードにおいてシグナルを生じさせるために用いられる。非限定的な例に過ぎないが、図17Aおよび18Aを参照すると、イニシエーターDFDFaは第1のPESA複合体PESAAと結合して、それにより、ヌクレアーゼによる認識部位および切断部位を有する第1のCESA複合体CESAAを形成させることができる。PESAAは第1および第2のEASオリゴEAS1およびEAS2を含んでよく、ここでEAS1の一部分はEAS2に対して相補的であり、かつEAS1の一部分はDFaに対して相補的である。また、EAS1を、EAS1がインタクトのままでシグナルが生成されることを防ぐかまたは実質的に防ぐのに十分なほど近傍に配置されたフルオロフォアおよびクエンチャー部分で標識することもできる。EAS2は、DFaとは明確に異なる第2のDFDFbを含みうる。ヌクレアーゼによるPESAAの切断によってEAS1が切断され、それにより、フルオロフォアおよびクエンチャー部分が分離されて検出可能なシグナルが得られ、同じくEAS2を切断してDFbが放出され、その結果、それはPESABと複合体化してCESABを形成する。CESABは第3のおよび第4のEASオリゴEAS3およびEAS4を含んでよく、ここでEAS3の一部分はEAS4に対して相補的であり、かつEAS3の一部分はDFbに対して相補的である。また、EAS3を、EAS3がインタクトのままでシグナルが生じるのを防ぐかまたは実質的に防ぐのに十分なほど近傍に配置されたフルオロフォアおよびクエンチャー部分で標識することもできる。EAS4はDFaを含みうる。ヌクレアーゼによるPESABの切断によってEAS3が切断され、それにより、フルオロフォアおよびクエンチャー部分が分離されて検出可能なシグナルが得られ、同じくEAS4を切断してDFaが放出され、その結果、それは新たなPESAAと複合体化してCESAAを形成することができ、その結果、フィードバック性シグナル増幅ループが得られる。新たなDFaおよびDFbの連続的生成によって補給されるCESAAおよびCESABの以後の切断ラウンドは、PESAAに対するイニシエーターDFDFaの初期結合から生成されるシグナルを増幅する役割を果たし、追加的な標的分子の存在とは関係なくそれを行う。にもかかわらず、新たなイニシエーターDFオリゴすなわち、DFaも、追加的な標的分子の認識に際して、系に入る可能性がある。したがって、本方法は、最小数の標的分子から生じたシグナルを増幅して、存在する標的分子の量の検出および定量の両方を行う手段として役立てるために用いることができる。ある態様において、PESAAおよび/またはPESABはヘアピンオリゴヌクレオチドである図18Aを参照。図19は、MNAザイムを伴うフィードバックシグナル増幅カスケードのもう1つの例を提示している。この例では、惹起性DF配列はMNAザイム基質配列の一部ではない。オリゴヌクレオチドパートザイムは基質ブロッカーDFaオリゴヌクレオチドのループ部分の内部に存在する標的を認識すると組織化して、ループを切断することのできるMNAザイムを形成する。この態様において、惹起性DFDFaは基質ブロッカーオリゴの対向鎖上に存在するループを基準として。MNAザイムによるループの切断は、DFaに対して相補的である基質ブロッカーオリゴの一部分の解離をもたらし、それにより、DFaがPESAAとハイブリダイズしてCESAAを形成することを可能にする。CESAAの引き続いての切断により、検出可能なシグナルが生じて例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー部分の分離により、DFbが放出される。放出されたDFbはPESABと会合して、CESABを形成させ、それはREによって切断されうる。CESABの切断により、検出可能なシグナルが生じて例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー部分の分離により、DFaとして機能しうるオリゴの放出がもたらされる。このようにして、CESAAおよびCESABが連続的に形成され、切断されて、より多くのDFaおよびDFbを放出し、より多くのCESAAおよびCESABの形成をもたらすというフィードバックカスケードが形成される。より複雑な反応では、一意的なMNAザイムによって放出されるように設計された一意的な惹起性DFをそれぞれが含む複数の二本鎖オリゴ複合体が存在してもよい。フィードバックシグナル増幅カスケードのさらに非限定的な例は、図22に提示されている。上記の図22のさまざまな説明において詳述したようにサブセクション15および図面の簡単な説明を参照、PESA複合体を分枝構造に組み込むことによってEzyAmp成分を局在させることによって、フィードバックカスケードシステムの効率を向上させることができる。これらの構造は複数のPESA複合体を互いに近接させて、CESA複合体の形成および切断に際してさまざまなPESA複合体間でのドライバー断片のより効率的な移行を可能にする。例えば、図22Aに示された態様で示されているように、単一分枝構造は少なくとも2つのPESA複合体PESAAおよびPESABを含んでよく、各複合体は別個のDFDFaまたはDFbと結合するとヌクレアーゼ切断を行うことができる。PESAAに対してDFaが結合すると形成されるCESA複合体CESAAのヌクレアーゼ切断は、検出可能な影響をもたらしてDFbを放出させることができる。DFbはPESABと結合してCESABを形成させることができ、それはヌクレアーゼによって切断されて、さらなる検出可能な影響をもたらして、さらなるPESAAと結合しうるさらなるDFaを放出させることができ、このようにしてフィードバックループが形成される。図22Bに示された態様に示されているように、単一分枝構造はそれらの各々の骨格部分を介してハイブリダイズして二重分枝構造を形成し、そのようにして、構造内部に存在するPESAAおよびPESAB複合体の数を効果的に倍加させることができる。単一分枝構造および二重分枝構造を、1つまたは複数の連結試薬を用いて他の単一分枝構造および/または他の二重分枝構造と連結させて、分枝構造のネットワークを形成させることができる。例えば、図22Dに示された態様で示されているように、任意の適した試薬例えば、ビオチン/アビジン、化学試薬、抗体、ペプチドリンカーなどを用いて、単一分枝構造および/または二重分枝構造の1つまたは複数のアームを、他の単一分枝構造および/または二重分枝構造の1つまたは複数のアームと連結させることができる。図23は、単一のPESA構造およびSIOを用いてフィードバックカスケードが生成されるもう1つの態様を図示している。この例では、エキソヌクレアーゼIIIExoIIIなどの適したエキソヌクレアーゼによってシグナル増幅を惹起させて媒介させる。ExoIIIは、末端が平滑または陥凹であればDNA二重鎖の3ヒドロキシル末端からのヌクレオチドを除去するが、少なくとも5ヌクレオチドの3突出部を有する二重鎖を含め、一本鎖オリゴは消化しない。ホスホロチオエートヌクレオチドもエキソヌクレアーゼ活性をブロックすることが知られている。フルオロフォアFおよびクエンチャーQで標識しうると考えられるSIOは、突出3末端を有するヘアピンコンフォメーションで表される。SIOは5ヌクレオチドを上回る3突出部を有するため、ExoIIIは標的結合前のSIOを消化することができない。SIO中のホスホロチオエートヌクレオチドは、SIO中のその箇所を越える加水分解を防ぎ、そうすることでDFをインタクトのままにする。SIOは、ExoIIIによってホスホロチオエート塩基まで加水分解されうるSIO中の陥凹3末端を形成する標的の相補的領域と結合して、そうすることでインタクトDFを遊離させて、蛍光の増加を引き起こすことができる。この例では、DFは、標的に対して相補的ではないSIOの5部分すなわち、ホスホロチオエートヌクレオチドに対して5側の配列に対応する。SIOとはもはや結合していない標的は、続いて再利用されて別のSIOと結合することができ、そうすることで別のDFを生成させる。そのようにして生成されたDFは、PESAのEAS1と結合して、EAS1の3末端が陥凹しているCESAを形成する。ExoIIIは続いてCESAのEAS1鎖を加水分解して、蛍光の増加およびDFの放出を引き起こし、このDFは再利用されてより多くのPESAをCESAに変換することができる。223多重化本発明の方法は、複数の標的を単一のEzyAmp反応で検出するために用いることができ、別個の標的の検出によって生じた個々のシグナルは同時に増幅することができる。一般に、本明細書に記載の方法を用いる複数の異なる標的の多重的な検出/シグナル増幅は、それぞれが特定の標的に由来する一連の異なるイニシエータードライバー断片を生成させることによって実現することができる。対応するPESA複合体は、特定の各種類のイニシエーターDFに関して用意することができ、各PESA複合体は、他のPESA複合体のものと区別しうる別個の検出可能な要素例えば、一意的なフルオロフォアを含む。そのような反応のためのイニシエータードライバー断片は、上記のサブセクション21で言及した方法のうちいずれか1つまたは複数を含む、任意の適した様式で生成させることができる。ある態様においては、それぞれが複数の異なる標的に由来する複数の別個のイニシエータードライバー断片を、複数の異なる標的特異性を有し、かつ別個のドライバー断片を含む、2つもしくはそれ以上の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド、別個の標的特異性を有し、かつ1つもしくは複数のMNAザイム基質の触媒性修飾によって別個のドライバー断片を生じうる2つもしくはそれ以上のMNAザイム、または、それぞれが複数の異なる標的特異性を有し、かつそれぞれが別個のDFを生じうる、1つもしくは複数の合成イニシエーターオリゴヌクレオチドと1つもしくは複数のMNAザイムとの組み合わせを用いて生成させることができる。当業者はこのため、本明細書で提供された組成物および方法を、反応当たり単一の標的を検出するため、または複数の標的を単一の反応で検出するために用いうることを認識しているであろう。複数の標的を検出する場合には、そのアッセイおよび検出しようとするものに応じて、1つまたは複数のMNAザイムを用いることができる。例えば、類縁関係にある複数の構造、例えば、例えば決定的な配列MNAザイムによって認識されるを共有し、かつ例えば、決定的な配列の外側での長さまたは配列のみに違いのある一群の配列を検出する場合には、単一のMNAザイムで十分と考えられる。決定的な配列を有するあらゆる配列を検出しうると考えられる。複数のMNAザイムは、単一ヌクレオチド程度のわずかしか違いのない類縁関係にある配列を検出する場合、またはさらには大きく異なる標的を検出しようとする場合、およびそれぞれの有無を把握することが望ましい場合に、有用であると想定している。同様に、いくつかの態様においては、単一のMNAザイム基質で十分と考えられるが、一方、他においては、いくつかの標的のそれぞれの検出を可能にする、一意的なDFを形成させるために一意的なMNAザイム基質が必要である。場合によっては、方法の多重化は、方法の設計を助長すると考えられる別個または一意的なMNAザイムの形成を必要とする。別個または一意的なDFは、基質を支持体に対して固定する場合には必要でないと考えられ、支持体上のそれぞれの局在によって区別することができる。これらの設計の特徴は、当業者によって容易に理解されるであろう。いくつかの態様において、本方法は、1つの反応で種々の異なるタイプの標的、例えば核酸標的およびタンパク質の検出を可能にする。同様に、複数の標的に向かう複数のSIOを用いる反応により、複数の標的を同時に分析する複数のアッセイを開発することが可能になると考えられる。このスキームまたは他のものでは、CESAを制限酵素または別のヌクレアーゼによって切断させて、シグナル増幅を助長することができる。非限定的な例に過ぎないが、複数の標的を、一連のユニバーサル基質を修飾する複数のMNAザイムを用いて検出することができ、各基質の修飾は、別個のPESAと組織化して別個の制限酵素に対するCESAを生成する別個のDFをもたらし、それにより、別個に検出可能なシグナル例えば、異なる蛍光がもたらされると考えられる。多重EzyAmp系に関する例示的な戦略は図13に示されており、そこではさまざまな別個のイニシエータードライバー断片が、標的特異性が異なる一連の3種のMNAザイムを用いて、標的特異的な様式で生成されている。生成された異なる各DFは別個のPESA複合体と結合し、別個のPESA複合体はそれぞれ別個のフルオロフォアを含む。そのようにして形成された3つのCESA複合体はヌクレアーゼによって切断され、それぞれのケースで、3種の異なるフルオロフォアによって別個のシグナルが生成される。図25は、2つのEzyAmp反応が単一のチューブ内で同時に起こり、このようにして独立にモニターされる、多重分析の結果を示している。上記のような複数の異なる標的の認識によって生じた別個のシグナルを、同時または実質的に同時な様式で独立に増幅しうることは理解されるであろう。例えば、別個の標的の検出によって生じ、別個のイニシエータードライバー断片とともに形成されたCESA複合体は、例えば、上記のサブセクション222および/または223に記載した方法を用いて、それぞれ別々の直線的および/またはフィードバックカスケードに組み込まれ、それぞれ別個のシグナルを増幅すると考えられる。直線的および/またはフィードバックカスケードは合わせて進行して、異なるシグナルを独立に増幅すると考えられる。また、単一の標的の内部の複数の領域を、本発明の方法を用いて同時にまたは実質的に同時に検出することもできる。そのようなケースでは、一連の別個または同一な惹起性ドライバー断片を、所与の標的の内部の異なる領域に基づいて、一連の標的認識イベントによって生成させる。例えば、標的内部の異なる領域に対する特異性を有する複数の異なるMNAザイムを、この目的に利用しうる。MNAザイムは単一のユニバーサル基質を利用して、それぞれが単一の種類のPESAと結合して一連の同一のCESAを形成させて同一な検出可能な影響を生じさせる、単一の種類のDFの複数のコピーを生成させることができる。または、MNAザイムが一連の異なるユニバーサル基質を触媒的に修飾し、各基質の修飾が、別個のPESAと組織化して、別個の検出可能なシグナルを生じる別個のCESAを生成させる、別個のDFをもたらしてもよい。224不溶性および固体支持体を用いる方法また、一般に、本発明の方法は、多重化されているか否かにかかわらず、溶液状態で、または例えば、MNAザイム基質、パートザイム、PESA、CESA、EAS、DF、EIC、InF、SIO、制限酵素、ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、アプタマー、ヘアピンオリゴヌクレオチド、MNAザイム組織化助長因子および/または標的を含む1つもしくは複数のアッセイ成分が結合された、付着された、または連接された不溶性支持体または固体支持体と組み合わせて、適用可能であることも理解されるべきである。そのような系の特徴は、本明細書で考察した方法および変法の提供を受けた当業者には一般に理解されるであろう。したがって、本発明は、本明細書における文字通りの教示に限定されるとみなされるべきではなく、本明細書において提供する教示の原理および範囲ならびに当技術分野における知識に矛盾することなく修正および変更することができる。好ましくは、支持体は、基質を保持し、それが反応混合物の大部分の中に自由に移動することを許さない不溶性材料またはマトリックスである。核酸オリゴヌクレオチドを含む基質の固定化および局在化のためのそのような支持体は、当技術分野において公知である。当業者は、支持体を、マイクロアッセイにおける使用に好都合なビーズ、ならびに反応条件との適合性がある他の材料を含む、種々の形態にある多種多様なマトリックス、重合体などから選択しうることを理解するであろう。ある好ましい態様において、支持体は、プラスチックビーズもしくはウェーハなどのプラスチック材料、または特定のアッセイを内部で実施するウェルもしくはチューブのプラスチック材料であってよい。ある態様において、支持体はマイクロキャリアまたはナノキャリアである。ある態様において、支持体はコード化されていてもよい。例えば、支持体に係留されたMNAザイム、MNAザイム基質、CESAおよび/またはPESAを用いて標的を検出するための方法を想定している。好ましい態様においては、PESAを好ましくは支持体と付着させる。もう1つの好ましい態様において、SIOを支持体と付着させる。支持体に対するPESAまたはそれらの成分の結びつけは、ドライバー断片のPESAとの組織化、ならびに引き続いての、フルオロフォアFおよびクエンチャーQで標識されたCESAの制限酵素による切断が起こると、フルオロフォアが、支持体に連結されたまま残るクエンチャーから離れて、反応混合物の大部分の中に放出される。このように、検出可能なシグナルは、クエンチャー部分と検出可能な部分が切断によって隔てられると大きく増加する。1つの代替的な態様において、フルオロフォアを含有する検出可能な部分が切断後に結びついたまま残ってもよい。これにより、支持体上でのシグナルの局在が可能になる。ある場合には、フルオロフォアを溶液中に遊離させることも想定している。ある態様において、反応は、溶液中で起こるように設定されてもよく、および/または固体支持体に付着された成分を含んでもよい。図20に示された反応は、連接された成分を用いるアッセイに関する例示的なシェーマを示している。この図において、ステーション1は連接されたオリゴヌクレオチドを有するものとして描写されており、このオリゴヌクレオチドは標的依存的な様式で切断されると段階1、第1のDFを放出すると考えられる斜線入りの線。続いてこのDFはステーション2に連接されたPESAAへと移動して、それとハイブリダイズしてCESAAを形成する段階2。CESAAの切断段階3により、第2のドライバー断片黒の実線が放出され、それはステーション3のPESABへと移動すると考えられる。第2のDFがPESABとハイブリダイズすると、CESABが形成されうると考えられる段階4。CESABの切断は、第1のDFと同等な配列の放出をもたらす斜線入りの線。この第1のDFは続いてステーション2に移動して段階5、より多くのCESAAを形成させ、それが切断されてより多くの第2のDFを放出させうると考えられる。このようにしてカスケード反応が惹起され、そうすることでCESAの連続的な形成および切断が可能になると考えられる段階3、4および5。各PESAがフルオロフォアFおよびクエンチャーQで標識されるアッセイでは、これらの部分間の切断により、蛍光性シグナルが生成されると考えられる。このシグナルは固体表面2もしくは3に保持させてもよく図示された通り、またはフルオロフォアおよびクエンチャーの位置が逆であるならば、溶液中に放出させることもできると考えられる。ステーションは別々のチャンバーであってもよく、またはそれらが例えば、チップまたはマイクロキャリアなどの別々の固体表面であってもよい。この戦略は、EzyAmpカスケードを開発する上で有用な制限酵素の数を増加させると考えられる。この筋書きでは、唯一の必要条件は、標的依存性切断によって生成されるドライバー断片が、REによる認識および切断のために必要な配列を完成させることのみと考えられる。この筋書きには、もはや、REが、その標的依存的な切断の前に、ドライバー断片を含む完全長オリゴヌクレオチドによって阻害されるという必要条件はないと考えられる。この場合には、切断されていない長い断片がPESAと物理的に隔てられ、標的依存的な様式での切断後に初めてPESAと接触しうると考えられる。したがって、PESA断片と標的特異的断片との接合部に追加的な配列が存在しても阻害されないREをEzyAmpアッセイに用いて、カスケード反応を作り出すことができる。225アプタマー当業者は、本明細書に記載の方法をアプタマーとともに用いることができ、前記アプタマーが核酸以外の標的を含む標的の検出、同定および/または定量を助長することを容易に理解するであろう。本発明の方法に用いるのに適したアプタマーの非限定的な例には、上記のサブセクション18に記載されたものが含まれる。例えば、核酸以外の実体を含む標的を検出するために、MNAザイムおよび制限酵素を用いる方法を想定している。当業者は、アプタマーをMNAザイム成分の任意のものに組み込みうることを理解するであろう。さらに、複数のアプタマーを、パートザイムオリゴヌクレオチド成分の1つまたは複数に組み込みうると考えられることも理解されるであろう。MNAザイムの組織化のために標的が必要とされない態様においては、アプタマーを組織化助長因子に組み込むことができる。アプタマー配列を、活性MNAザイムが標的の存在下でのみ形成される立体配置で、パートザイムの末端に組み込むアプタパートザイムという関連した戦略も考えている。そのような検出戦略のために必要なオリゴヌクレオチド成分には、以下が含まれる;標準的なパートザイム;その末端の一方にアプタマーが組み込まれているパートザイムであるアプタパートザイム;標的の存在下でアプタパートザイムおよびパートザイムの両方と結合して活性MNAザイムの組織化を可能にするオリゴヌクレオチドである組織化助長因子;MNAザイム基質;ならびに、アプタパートザイムと、パートザイム配列の少なくともアプタマー配列の一部および基質結合アームの一部にわたる領域でハイブリダイズする組織化阻害因子。標的の非存在下では、組織化阻害因子はアプタパートザイムと結合し、その結果、MNAザイム基質の結合および切断をブロックする。標的の存在下では、標的はアプタパートザイムのアプタマー配列と結合し、組織化阻害因子の結合を妨げて、MNAザイム基質の結合および切断を可能にする。そのため、活性MNAザイムは標的の存在下でのみ形成されて、蛍光シグナル生成を生じさせることができる。上記の戦略において、阻害因子配列が別個の分子であってもよく、またはMNAザイム複合体に加わる成分の1つの中に組み込まれてもよいことは、当業者には理解されるであろう。また、1つまたは複数のアプタマーを、パートザイム、組織化助長因子または基質を含む、いずれかのオリゴヌクレオチド成分の中に組み込みうると考えられることも理解されるであろう。さらに、アプタマーを、これらのオリゴヌクレオチドのいずれか1つの一方の末端に組み込むことも可能と考えられる。226方法の最適化当業者は、本明細書に記載の方法を、標的の検出、同定および/または定量を最適化する目的で、種々の実験パラメーターを用いて最適化しうることを容易に理解するであろう。最適化される具体的な実験パラメーター、およびそのような最適化のレベルは、使用する具体的な方法、ならびに検出、同定および/または定量しようとする具体的な標的に依存すると考えられる。そのようなパラメーターには、時間、温度、pH、塩の濃度、オリゴヌクレオチドの濃度、緩衝液の類類および濃度、制限酵素補助因子、界面活性剤、陽イオンおよびジメチルスルホキシドDMSO、EDTA、ATP、グリセロールを非限定的に含む他の試薬の濃度、相補性の長さ、GC含量、ならびにMNAザイムおよび/またはCESAの核酸成分の融解点Tmが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、例えば、特定の核酸配列の検出を伴う方法では、その方法を行う温度を好ましくは含む実験パラメーターを、配列の変異を含む標的核酸と含まない標的核酸に対するMNAザイム成分の結合を区別しうるように最適化することができる。そのような方法を行う温度は、約20°C~約96°C、約20°C~約75°C、約20°C~約60°C、または約20°C~約55°Cの範囲内にあってよい。1つの好ましい態様においては、本明細書に記載の方法を実施するために最適化された反応を提供する。そのような最適化された反応では、検出されたシグナルを、最適化されていない反応よりも最大で10、20または30増加させる。より好ましい反応条件は、検出されるシグナルを、少なくとも35または40、好ましくは最大50またはそれ以上向上させる。さらにより好ましい態様において、最適化された反応は、触媒活性の50を上回る、さらに最大で66、75、またはさらには100を上回る増加を有する。さらにより好ましい態様において、完全に最適化された反応方法は、シグナル検出の100、200またはさらには300またはそれ以上の増加を与えると考えられる。他の好ましい反応条件は、最適化されていない反応条件を用いて実施した方法よりも、触媒活性を最大で1000またはそれ以上向上させることができる。本明細書で提供される方法を最適化するための非常に好ましい反応条件は、ある種の二価陽イオンを含めることである。ほとんどの核酸酵素およびタンパク質酵素の触媒活性は、二価陽イオンの濃度により、濃度依存的な様式で影響される。好ましい最適化された反応は、Ba2、Sr2、Mg2、Ca2、Ni2、Co2、Mn2、Zn2およびPb2のうち1つまたは複数に関して最適化される。227方法の適用当業者は、MNAザイム、CESAおよび制限酵素を、広範囲にわたる応用分野で、標的の検出、同定または定量のための戦略に用いうることを認識しているするであろう。これらの分野には、医学、獣医学、農業、食品工学、品質管理、環境試験、生命科学研究、法医学、同定試験、画像化およびバイオテロリズム向けの用途が非限定的に含まれる。医学的用途の非限定的な例には、特定の疾患もしくは病状、またはそのような疾患もしくは病状を発症するリスクの診断、および/または疾患もしくは病状に関して予後予測を行うことがある。生物学的用途に関しては、可能性を否定するのではないものの、生きている動物またはヒトの身体に対して本発明の方法を実施することに関して何ら特定の必要条件はないこと、および本方法をインビトロ/エクスビボで行ってもよいことは、理解されるであろう。例えば、本方法は、生物試料例えば、血液試料または組織試料に対して、そのような細胞および核酸の凍結試料、パラフィン包埋試料を含む、対象から前もって単離された細胞または核酸に対して、ならびに培養細胞に対して実施することができる。本明細書に記載の方法を用いて、溶液中の標的を検出、同定および/または定量しうることも直ちに明らかであろう。例えば、単一の基質を用いて単一の標的を検出、同定および/または定量することを伴う戦略を、そのような検出のために適用することができる。いくつかの態様において、これはユニバーサル基質の使用を伴いうる。本発明をこれから、以下の具体的な例を参照しながらさらに詳細に説明するが、これらの例は、本発明の範囲を限定するものとはまったく見なされるべきではない。実施例1以下の実施例は、ヌクレアーゼによって切断可能または切断不可能である種々の二重鎖構造体を形成する、オリゴヌクレオチドの能力を実証する。ヌクレアーゼによって切断可能である構造体は、CESA複合体等の二重鎖構造体であり、本実施例におけるヌクレアーゼは制限酵素REである。11オリゴヌクレオチド以下の反応について、オリゴヌクレオチド断片を組み合わせて、切断可能な二重鎖基質を形成し得るそれらの能力について試験した。例示的な構造体を図3において図解する。本実施例において、二重鎖には、酵素MnlIに対する二本鎖の制限酵素認識部位RERSのうちの一方の鎖を形成するのに必要とされるすべてのヌクレオチドを含む1種の鎖が含有されている。REの切断活性を、二重標識したDNA複合体の切断によって観測した。本実施例において、酵素増幅因子基質オリゴ1EAS1を、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端において6フルオレセイン6FAM部分で末端標識し、EAS15BFと命名した。EAS25Bと命名された、第2の酵素増幅因子基質オリゴEAS2も、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で末端標識されており、EAS15BFとアニールしてPESAを産生する。完全酵素シグナル増幅因子CESA複合体と称される十分に組織化した切断可能な二重鎖基質のREによる切断を、485nmFAM励起波長における励起を用いて530nmFAM発光波長において観測した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、太字でかつ下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。この酵素に対する認識配列に寄与する塩基は、下線が引かれており、上段の鎖5NNCCTCN7/3および下段の鎖3NNGGAGN6/5であり、/は切断部位を示す。阻害性断片Sub1TRB2およびDFに共通している領域は、イタリック体でかつ下線が引かれている。大文字はDNAを示し、小文字はRNAを示す。14反応成分図3において図解したオリゴヌクレオチドおよび構造体に関して、反応A、B、C、およびDを、表6に列挙した以下のオリゴヌクレオチド断片を含有するように準備した。表6切断可能および切断不可能な構造体のための成分EAS1、EAS2、およびDFによるCESAの形成を、蛍光標識したEAS1EAS15BFのRE10UMnlIによる切断によって生じる蛍光シグナルの増大によって測定した。反応A、B、C、およびDのすべてをSmartCycler登録商標SystemサーモサイクラーCepheidにおいて37°Cで行い、すべての反応の総容量は25μLであった。各反応に対する蛍光を、36秒おきに合計60分間読み取った。すべての反応は、1×BSANewEnglandBiolabs中に100nMのEAS15BF、125×NEBuffer4NewEnglandBiolabs、および10単位のMnlIを含有していた。加えて、反応Aは100nMのEAS25Bおよび100nMDF1を含有しており、反応Bは100nMのEAS25Bおよび100nMSub1TRB2を含有しており、反応Cは100nMのEAS25Bを含有しており、一方で、反応DはEAS1のみを含有していた。15結果:REによる切断の検出反応Aにおいて、EAS1EAS15BF、EAS25B、およびDF1の添加は、経時的なFAM蛍光の増大によって示されるように図14A;RE、REMnlIに対する切断可能なCESA二重鎖基質の形成をもたらした。この観察結果は、REによる認識および切断に必要とされる領域内の2本の鎖のうちの少なくとも一方に断裂またはニックを含有している二本鎖複合体を認識および切断し得る制限酵素の能力と一致する。言い換えれば、切断可能な二重鎖基質は、2本の断裂していない連続した相補鎖から必ずしも形成されるのではなく、むしろ相補的二重鎖を形成する複数のオリゴから作製され得る。対照的に、DF1断片を欠いているがSub1TRB2を含む反応Bでは、Sub1TRB2がInFとして作用するため、形成した二重鎖は切断されず、ゆえに蛍光は経時的に増大しなかった図14B;RE。これは、Sub1TRB2がDF1の配列全体を含むという事実にもかかわらず起こった。、InfSub1TRB2中に存在する配列は、DF中にも存在するその特異的配列に付加的であるが、切断可能な二重鎖基質の形成を阻害した。実際、付加的配列は、酵素阻害性複合体EICと称される切断不可能な複合体の形成をもたらした。EAS15BFおよびEAS25Bのみを含有しており、DF1およびSub1TRB2の両方を欠いている反応Cにおいて、蛍光の増大は観察されず、これら2種のオリゴEAS1およびEAS2だけでは、REによる二重鎖の認識および切断に不充分であることを示した図14C;RE。オリゴEAS1およびEAS2はハイブリダイズして部分的酵素シグナル増幅因子PESA複合体を形成するが、しかしながら、切断不可能なPESAを切断可能なCESAに変換するためには、付加的オリゴ、すなわちDFが必要とされる。最後に、EAS1のみを含有している対照反応Dにおいて、経時的な蛍光の増大は観察されず、この構造体がMnlIに対する認識配列の一方の鎖を含有しているという事実にもかかわらず、この構造体は切断を受けにくいことを示した。EAS1を組み入れている切断可能な二重鎖を形成するためには相補的配列が必要とされるため、切断は起こり得ない。実施例2以下の実施例は、ヌクレアーゼ制限酵素を介したシグナル増幅につながる、蛍光標識したオリゴの切断をもたらす、CESAにおいて制限酵素認識部位を生成するための複数種のオリゴヌクレオチド断片の使用に基づいた。ヌクレアーゼ切断がシグナル増幅をもたらす反応を、EzyAmp反応と称する。21EzyAmpオリゴヌクレオチドこのEzyAmp反応に対して、制限酵素認識部位を形成するために、ドライバー断片と組み合わせた2種のオリゴヌクレオチドEAS1およびEAS2が必要とされる。本実施例において、EzyAmpシステム1を用いて、酵素MnlIに対する制限酵素認識部位RERSを形成する。EzyAmpシステム1EzyAmp1は、酵素増幅因子基質オリゴ1EAS11JB、酵素増幅因子基質オリゴ2EAS21、およびMNAザイム基質Sub1Sub1FBの切断によって生成されるドライバー断片1DF1から構成される。ストラテジーは、図5において図解されるとおりである。EzyAmp活性を、二重標識した断片の切断によって観測する。本実施例において、EAS1EAS11JBを、5末端においてJOE部分で、3末端においてBlackHoleクエンチャー1BHQ1部分で末端標識した。EAS2EAS21は、EAS11JBとアニールする。十分に組織化したCESAのRE切断を、520nmJOE励起波長における励起を用いて548nmJOE発光波長において観測した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列の少なくとも一部を形成する上段の鎖5NNCCTCN7/3および下段の鎖3NNGGAGN6/5。22パートザイムオリゴヌクレオチドおよび組織化助長因子ドライバー断片1DF1を生成するために、MNAザイム基質Sub1FBを、合成標的、すなわち組織化助長因子AFPD1の存在下で形成する触媒活性MNAザイムによって切断する。組織化助長因子、ならびにパートザイムAおよびBの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的組織化助長因子とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。23MNAザイム基質MNAザイム活性を、二重標識した核酸レポーターMNAザイム基質Sub1FBの切断によって観測する。MNAザイム基質配列は、より長いバージョンが817DNAザイム基質として以前に用いられているLietal2000、RNAおよびDNA塩基の両方を含有しているキメラ配列である。本実施例において、レポーターMNAザイム基質をSub1FBと命名し、5末端において6カルボキシフルオレセイン6FAM部分で、3末端においてBlackHoleクエンチャー1BHQ1部分で末端標識した。MNAザイムによるSub1FBの切断を、485nmFAM励起波長における励起を用いて530nmFAM発光波長において観測した。Sub1FBの標識配列は、5から3に以下のとおりである。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。イタリック体の塩基は、切断後にDFとして作用する部分protionに相当する。24反応成分EAS1、EAS2、およびドライバー断片によるCESAの形成を、蛍光標識したEAS11JBのRE20UMnlI;NewEnglandBiolabsによる切断によって生じる蛍光シグナルの増大によって測定した。試験反応を20nMの標的組織化助長因子AFPD1の添加によって開始し、対照反応をH2Oの添加によって開始した。すべての反応をSmartCycler登録商標SystemサーモサイクラーCepheidにおいて35°Cで行い、すべての反応の総容量は25μLであった。各反応に対する蛍光を、チャンネル1FAMおよびチャンネル2Cy3において72秒おきに合計120分間読み取って、それぞれFAMおよびJOEを観測した。すべての反応は、50mMMgCl2Ambion中に50nMのパートザイムAPD1A21、50nMパートザイムBPD1B31、50nMSub1FB、100nMEAS11JB、および100nMEAS21のバルク混合物、1×BSANewEnglandBiolabs、ならびに1×NEBuffer4NewEnglandBiolabsを含有していた。25結果:EAS1の切断の検出試験反応への標的組織化助長因子の添加によって、パートザイムAおよびBは、iドライバー断片DF1DF1:GGAAGAGATの生成、およびiiSub1FBのMNAザイム切断を示す、経時的に増大しかつFAMチャンネルにおいてリアルタイムで観測され得る検出可能なシグナルをもたらす、レポーターMNAザイム基質Sub1FBを切断する触媒活性MNAザイムに組織化した図6i標的AFPD1。DFは、次いでPESA複合体EAS1およびEAS2によって形成されるに結合して、MnlIによって切断される二重鎖基質として機能するCESA複合体を形成し得た。これは、今度は標的AFPD1の存在の指標である、CESA複合体中に存在するEAS1のRE切断を示す、JOEにおいて経時的に増大する検出可能なシグナルをもたらした図6iii標的AFPD1。混合物に標的組織化助長因子を添加しない対照反応において、触媒活性MNAザイムは形成せず、ゆえにレポーターMNAザイム基質Sub1FBは切断されず、DFは生成されず、かつCESAは生成されなかった。したがって、FAMまたはJOEシグナルのいずれにおいても、経時的に増大するシグナルはなかった図6iiおよびiv標的なしの対照。このことは、CESAの形成のためのDFを供給するために、MNAザイムによるSub1FBの切断が必要とされることを示している。対照的に、これらの標的なしの反応において、PESAとSub1FBとの間のハイブリダイゼーションによって、その切断されていない状態でInFとして機能するEICが形成された。実施例3本実施例は、完全酵素シグナル増幅因子CESA複合体および関連するオリゴヌクレオチドの設計のためのストラテジーを提供する。例として、817DNAザイムに基づくMNAザイムによる切断に適したMNAザイム基質は、以下の配列:大文字はDNAを示し、小文字はRNAを示すを有してよい。適当な組織化助長因子の存在下においてMNAザイムによって切断されると、このMNAザイム基質は2種の断片、すなわち:を産生する。CESA複合体を産生するための、ドライバー断片としての3オリゴヌクレオチド断片:の使用法の例を、以下の表に明示する。以下の例において、Nは任意のヌクレオチドであり、Nはその相補体である。EAS1およびSub1の3切断断片の配列以下を参照をわずかに修正して、異なる認識配列を有する様々な異なる制限酵素とともに用いられるように設計された、多くの異なるPESAおよびそれに続くCESAを提供することができる。オリゴヌクレオチドEAS1は、制限酵素に対する制限認識部位が、例えば上記に示したユニバーサルまたはジェネリックなESA1配列に従った種々の位置で始まる配列を含有してよい。例として、RE部位が6の位置で始まる場合、BsaW1に対する認識配列TCCGGAを、RER部位に下線が引かれている以下に例証されるように、EAS1、EAS2、およびドライバー断片内に組み入れることができる。あるいは、RE部位が7の位置で始まる場合、Mnl1に対する認識配列CCTCを、RER部位に下線が引かれている以下に例証されるように、EAS1、EAS2、およびドライバー断片内に組み入れることができる。さらなる例において、RE部位が8の位置で始まる場合、Ear1に対する認識配列CTCTTCを、RER部位に下線が引かれている以下に例証されるように、EAS1、EAS2、およびドライバー断片内に組み入れることができる。この一般的ストラテジーを用いると、このDFとともに使用するRE候補には、その5末端にCまたはCCまたはTCCのいずれかを有する認識配列を有するREが含まれるであろう。以下の表におけるRE等他の多くのものに加えてを、このドライバー断片との使用について試験することができる。例証される他の例では、上記のそれらの例と反対向きでの同じドライバー断片の使用が示されている。これらの場合、RE候補は、GまたはGGまたはGGAで終わるRERSを有してよい。そのようなシステムにおける使用のためのEAS1、EAS2、およびDFのジェネリック配列は、以下のとおりである。例として、RE部位が4の位置で始まる場合、BstU1に対するRERSCGCGを、該部位に下線が引かれている以下に例証されるように、EAS1、EAS2、およびドライバー断片内に組み入れることができる。任意の特定のDFとともに使用し得る有用な制限酵素の範囲は、切断を可能にするために存在する、認識配列の5または3のいずれかの付加的配列に対するいくつかのREによる必要条件を上手く活用することによって拡張され得る。実施例4以下の実施例は、ヌクレアーゼ制限酵素を介したシグナル増幅につながる、蛍光標識したオリゴの切断をもたらす、CESAにおいて制限酵素認識部位を生成するための複数種のオリゴヌクレオチド断片の使用に基づいた。ヌクレアーゼ切断がシグナル増幅をもたらす反応を、EzyAmp反応と称する。41EzyAmpオリゴヌクレオチドこのEzyAmp反応に対して、制限酵素認識部位を形成するために、ドライバー断片と組み合わせた2種のオリゴヌクレオチドEAS1およびEAS2が必要とされる。本実施例において、EzyAmpシステム1を用いて、酵素MnlIに対する制限酵素認識部位RERSを形成する。EzyAmpシステム1EzyAmp1は、酵素増幅因子基質オリゴ1EAS11、酵素増幅因子基質オリゴ2EAS21、およびMNAザイム基質Sub1の切断によって生成されるドライバー断片1DF1から構成される。ストラテジーは、図5において図解されるとおりである。EzyAmp活性を、二重標識した断片の切断によって観測する。本実施例において、EAS1EAS11BJを、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端においてJOE部分で末端標識した。EAS2EAS21は、IowaBlackFQIAbFQで末端標識され、EAS11BJとアニールする。十分に組織化したCESAのRE切断を、520nmJOE励起波長における励起を用いて548nmJOE発光波長において観測した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列CCTCの少なくとも一部を形成する。42パートザイムオリゴヌクレオチドおよび組織化助長因子ドライバー断片1DF1を生成するために、MNAザイム基質Sub1TRB2を、合成標的、すなわち組織化助長因子AFPD1の存在下で形成する触媒活性MNAザイムによって切断する。組織化助長因子、ならびにパートザイムAおよびBの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。43MNAザイム基質MNAザイム活性を、二重標識した核酸レポーターMNAザイム基質Sub1TRB2の切断によって観測する。MNAザイム基質配列は、より長いバージョンが817DNAザイム基質として以前に用いられているLietal2000、RNAおよびDNA塩基の両方を含有しているキメラ配列である。本実施例において、レポーターMNAザイム基質をSub1TRB2と命名し、5末端においてスルホローダミンTXR部分で、3末端においてBlackHoleクエンチャー2BHQ2部分で末端標識した。MNAザイムによるSub1TRB2の切断を、598nmTXR励起波長における励起を用いて617nmTXR発光波長において観測した。Sub1TRB2の標識配列は、5から3に以下のとおりである。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。イタリック体の塩基は、DFとして作用し得る部分に相当する。44反応成分EAS1、EAS2、およびドライバー断片によるCESAの形成を、蛍光標識したEAS11BJのREMnlIによる切断によって生じる蛍光シグナルの増大によって測定した。反応を10UMnlINewEnglandBiolabsの添加によって開始した。すべての反応をSmartCycler登録商標SystemサーモサイクラーCepheidにおいて35°Cで行い、すべての反応の総容量は25μLであった。各反応に対する蛍光を、72秒おきに合計120分間読み取った。すべての反応は、50mMMgCl2Ambion中に50nMパートザイムAPD1A21、50nMパートザイムBPD1B31、100nMのSub1TRB2、100nMEAS11BJ、および100nMEAS21Bのバルク混合物、1×BSANewEnglandBiolabs、ならびに12×NEBuffer4NewEnglandBiolabsを含有していた。加えて、試験反応は20nMの標的組織化助長因子AFPD1を含有しており、対照反応はH2Oを含有していた。45結果:EAS1の切断の検出試験反応への標的組織化助長因子の添加によって、パートザイムAおよびBは、iドライバー断片DF1DF1:GGAAGAGATの生成、およびiiSub1TRB2のMNAザイム切断を示す、経時的に増大しかつTXRチャンネルにおいてリアルタイムで観測され得る検出可能なシグナルをもたらす、レポーターMNAザイム基質Sub1TRB2を切断する触媒活性MNAザイムに組織化した。DFは、次いでPESA複合体EAS1およびEAS2によって形成されるに結合して、MnlIによって切断される二重鎖基質として機能するCESA複合体を形成し得た。これは、今度は標的AFPD1の存在の指標である、CESA複合体中に存在するEAS1のRE切断を示す、JOEチャンネルにおいて経時的に増大する検出可能なシグナルをもたらした図12。混合物に標的組織化助長因子を添加しない対照反応において、触媒活性MNAザイムは形成せず、ゆえにレポーターMNAザイム基質Sub1TRB2は切断されず、DFは生成されず、かつCESAは生成されなかった。したがって、TXRまたはJOEチャンネルのいずれにおいても、経時的なシグナルの増大はなかった図12。このことは、CESAの形成のためのDFを供給するために、MNAザイムによるSub1TRB2の切断が必要とされることを示している。対照的に、この反応において、PESAとSub1TRB2との間のハイブリダイゼーションによって、その切断されていない状態でInFとして機能するEICが形成された。実施例5以下の実施例は、i認識配列の特定の塩基に隣接したおよびその範囲内の種々の位置におけるニックを許容し得る、ii認識配列における特定の塩基に隣接した非相補的塩基を許容し得る、iii認識配列と切断部位との間の非相補的塩基を許容し得る、ならびにiv認識配列に隣接したまたはその範囲内のリボヌクレオチドの存在を許容し得る、MnlIの能力を実証する。51オリゴヌクレオチド511反応1:DF結合はRERSGAGGの3末端にすぐ隣接したニックをもたらす。以下の反応において、PESAを、EAS1EAS1102およびEAS2EAS2112から構成した。EAS1は、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端において6フルオレセイン6FAM部分で標識され、かつ5CCTC3という部分的MnlI認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1とアニールするように設計し、かつ5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で標識した。EAS2は、その3末端において5GAGG3という部分的MnlI認識配列を含有していた。DFDF1を、EAS2における部分的MnlI認識配列5GAGG3の直前の3配列として、EAS1にハイブリダイズするように設計した表4B。DFは、MnlI認識配列のいかなる部分も含有していなかった。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。MnlIに対する認識配列に寄与する塩基は、:であり、/は切断部位を示す。512反応2:DF結合は部分的RERSGAGGの3末端から1塩基内側にニックをもたらす。以下の反応において、PESAを、EAS1EAS1102およびEAS2EAS2112から構成した。EAS1は、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端において6フルオレセイン6FAM部分で標識され、かつ5CCTC3という部分的MnlI認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1とアニールするように設計し、かつ5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で標識した。EAS2は、その3末端において5GAGG3という部分的MnlI認識配列の断片5GAG3を含有していた。DFDF1を、EAS2に隣接させて、EAS1にハイブリダイズするように設計した。DFは、5GAGG3という部分的MnlI認識配列の断片3Gを含有しており、EAS2からなくなっている1塩基を付加することによってそれを完成させた表4C。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。MnlIに対する認識配列に寄与する塩基は、:であり、/は切断部位を示す。513反応3:DF結合は部分的RERSGAGGの3末端から2塩基内側にニックをもたらす。以下の反応において、PESAを、EAS1EAS110およびEAS2EAS211から構成した。EAS1は、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端において6フルオレセイン6FAM部分で標識され、かつ5CCTC3という部分的MnlI認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1とアニールするように設計し、かつ5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で標識した。EAS2の3末端は、5GAGG3という部分的MnlI認識配列の断片5GA3を含有していた。DFDF1は、EAS2に隣接させて、EAS1にハイブリダイズするように設計され、かつ5GAGG3という部分的MnlI認識配列の断片5GG3を含有しており、EAS2からなくなっている2塩基GGを付加することによってそれを完成させた表4D。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。MnlIに対する認識配列に寄与する塩基は、:であり、/は切断部位を示す。514反応4:DF結合は部分的RERSGAGGへ2塩基内側にニックおよび1塩基のリボヌクレオチド塩基をもたらす。以下の反応において、PESAを、EAS1Re1F1BJおよびEAS2Re1S15Bから構成した。EAS1は、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端においてJoeNJOE部分で標識され、かつ5CCTC3という部分的MnlI認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1とアニールするように設計し、かつ5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で標識した。EAS2は、5GAGG3という部分的MnlI認識配列の断片5GA3を含有していた。DFrRe1S13を、EAS2に隣接させて、EAS1とアニールするように設計した。DFの5末端は、5GAGG3という部分的MnlI認識配列の断片5GG3を含有しており、EAS2からなくなっている2塩基を付加することによってそれを完成させた。DFは、認識配列内にリボヌクレオチドを導入するために、リボヌクレオチドGgも含有していた表4E。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列の少なくとも一部を形成し、かつリボヌクレオチド塩基は小文字gとして示される。MnlIに対する認識配列に寄与する塩基は、:であり、/は切断部位を示す。515反応5:DF結合は部分的RERSGAGGの3末端から3塩基内側にニックをもたらす。以下の反応において、PESAを、EAS1EAS1102およびEAS2EAS2112から構成した。EAS1は、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端において6フルオレセイン6FAM部分で標識され、かつ5CCTC3という部分的MnlI認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1とアニールするように設計し、かつ5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で標識した。EAS2は、その3末端において5GAGG3という部分的MnlI認識配列の断片5G3を含有していた。DFDF1を、EAS2に隣接させて、EAS1にハイブリダイズするように設計した。DFの5末端は、5GAGG3という部分的MnlI認識配列の断片5GGA3を含有しており、EAS2からなくなっている3塩基を付加することによってそれを完成させた表4F。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。MnlIに対する認識配列に寄与する塩基は、:であり、/は切断部位を示す。516反応6:DF結合はRERSGAGGの5末端にすぐ隣接したニックをもたらす。DFは、認識配列および切断配列の一部を形成する。以下の反応において、PESAを、EAS1MnlIDFSF1BFおよびEAS2MnlIDFSF2から構成する。EAS1は、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端において6フルオレセイン6FAM部分で標識され、かつ5CCTC3という部分的MnlI認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1にハイブリダイズするように設計した。EAS2の5末端は、5GAGG3という部分的MnlI認識配列を含有していた。DFMnlIDFSDFを、EAS2におけるMnlI認識部位5GAGG3のすぐ上流にある5配列として、EAS1とアニールするように設計した。DFは、MnlI認識配列のいかなる部分も含有していなかったが、切断部位を含有していた表4G。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。MnlIに対する認識配列に寄与する塩基は、:であり、/は切断部位を示す。517反応7:DF結合は部分的RERSGAGGの5末端から2塩基上流にニックをもたらす。DFは切断部位の一部を形成する。以下の反応において、PESAを、EAS1MnlIDFSF1BFおよびEAS2MnlIDFSF2から構成した。EAS1は、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端において6フルオレセイン6FAM部分で標識され、かつ5CCTC3という部分的MnlI認識配列を含有していた。EAS2は、EAS1にハイブリダイズするように設計され、かつ5GAGG3という部分的MnlI認識配列、さらにこの配列に対して5に追加の2塩基を含有していた。DFMnlIDFSDFを、EAS2の5末端から2塩基上流に、EAS1にハイブリダイズするように設計した。このDFは、MnlI認識配列のいかなる部分も含有していなかったが、切断部位を含有していた表4H。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。MnlIに対する認識配列に寄与する塩基は、:であり、/は切断部位を示す。518反応8:DF結合は部分的RERSCCTCの5末端から2塩基内側にニックをもたらす。以下の反応において、PESAを、EAS1EAS128およびEAS2EAS227から構成した。EAS1は、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で標識され、かつ5GAGG3という部分的MnlI認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1にハイブリダイズするように設計し、かつ3末端において6フルオレセイン6FAM部分で標識した。EAS2は、5CCTC3という部分的MnlI認識配列の断片5TC3を含有していた。EAS2を、認識配列と切断部位との間で非相補的な1塩基対を生成するように設計した。DFDF3EAS226は、EAS1にハイブリダイズするように設計され、かつ5CCTC3という部分的MnlI認識配列の断片5CC3を含有しており、EAS2からなくなっている2塩基を付加することによってそれを完成させた表4I。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIの認識配列の少なくとも一部を形成する。MnlIに対する認識配列に寄与する塩基は、:であり、/は切断部位を示す。52反応成分EAS1、EAS2、およびDFから構成されるCESA候補のREMnlIによる切断を、フルオロフォアとクエンチャー部分の分離に応答して産生される蛍光シグナルの変化を測定することによって観測した。試験反応を100nmのDFの添加によって開始し、対照反応を水の添加によって開始した対照反応はいかなるDFも含有していなかった。反応をCFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて実施し、反応の総容量は25μLであった。反応を二つ組で実施した。すべてのオリゴヌクレオチドをIntegratedDNATechnologiesIDTから購入した。反応はそれぞれ、100nMのEAS1、100mMのEAS2、1×BSANewEnglandBiolabs、1×NEBuffer4NewEnglandBiolabs、およびヌクレアーゼを含まない水Ambionを含有していた。各反応間の変動を表7に列挙する。表7実施例5における実験の反応条件の変動53結果:CESAの切断の検出試験反応へのDFの添加によって、DFはPESA複合体EAS1およびEAS2によって形成されるに結合した。このことによって、REMnlIに対する完全認識部位を含有しているCESA複合体が形成された。蛍光シグナルの増大は、CESA複合体候補の切断の指標であった。531:DF結合はRERSGAGGの3末端にすぐ隣接したニックをもたらす。反応1へのDFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした図151i。このことは、DFが結合して、5GAGG3というMnlIRERSの3末端にすぐ隣接したニックを形成した場合に、MnlIによって切断可能であるCESAが形成され得ることを示している。本実施例において、PESAは、RERS全体ならびに切断部位を含有しており、ゆえにより低効率ではあるがMnlIによって切断もされる。そのため、DFの非存在下において、蛍光は依然として増大したが、DFを含有している反応よりも遅い速度であった図151ii。532:DF結合は部分的RERSGAGGの3末端内にあら1塩基内側にニックをもたらす。反応2へのDFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした図152i。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナルの増大は観察されなかった図152ii。このことは、DFが、PESA内に部分的MnlI認識配列5GAGG3の3の最後の塩基Gを供給することによってこの配列を完成させた場合に、MnlIによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。533:DF結合は部分的RERSGAGGの3末端から2塩基内側にニックをもたらす。反応3へのDFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした図153i。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナルの増大は観察されなかった図153ii。このことは、DFが、PESA内に部分的MnlI認識配列5GAGG3の3の最後の2塩基GGを供給することによってこの配列を完成させた場合に、MnlIによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。534:DF結合は部分的RERSGAGGへ2塩基内側にニックおよび1塩基のリボヌクレオチド塩基をもたらす。反応4へのDFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした図154i。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナルの増大は観察されなかった図154ii。このことは、DFが、PESA内に部分的MnlI認識配列5GAGG3の3の最後の2塩基GGを供給することによってこの配列を完成させた場合に、たとえ2番目の塩基がリボヌクレオチドGgである場合でさえ、MnlIによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。535:DF結合は部分的RERSGAGGの3末端から3塩基内側にニックをもたらす。反応5へのDFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした図155i。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナルの増大は観察されなかった図155ii。このことは、DFが、PESA内に部分的MnlI認識配列5GAGG3の3の最後の3塩基GGAを供給することによってこの配列を完成させた場合に、MnlIによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。536:DF結合はRERSGAGGの5末端にすぐ隣接したニックをもたらす。DFは、認識配列および切断配列の一部を形成する。DFの存在下図156iまたは非存在下図156iiにおいて経時的な蛍光の増大はなく、DFが、5GAGG3という部分的MnlI認識配列からすぐ上流にあるEAS1の3末端に結合した場合に、切断可能なCESAは形成されないことを示した。DFの添加は、おそらくEAS1へのDFのハイブリダイゼーションによってより柔軟性が低くかつより消光される構造が誘導されるために、PESAに対する消光効果を有すると思われる。537:DF結合はRERSGAGGの5末端から2塩基上流にニックをもたらす。DFは、認識配列および切断配列の一部を形成する。反応7において、DFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした図157i。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナル増大は観察されなかった図157ii。このことは、DFが、PESA内の部分的MnlI認識配列5GAGG3の2塩基上流にある配列に結合し、かつ切断部位の一方を提供した場合に、MnlIによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。538:DF結合は部分的RERSCCTCの5末端内に2塩基のニックをもたらす。反応8において、DFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした図158i。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナルの増大は観察されなかった図158ii。このことは、DFが、5末端由来の2塩基CCによって5CCTC3という部分的MnlI認識配列を完成させた場合に、MnlIによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。反応1~8の全般的結果は、PESAおよび相当するDFが切断可能なCESA構造体を産生するように、当業者がどのようにそれらを設計し得るかということにおいてかなりの柔軟性があることを実証している。特に留意すべきは、PESAをCESAに変換し得る、DFにリボヌクレオチドを含み得る能力である図154i。リボヌクレオチドを含有しているDFを使用し得る能力は、EzyAmp反応を開始する多様なMNAザイムを使用し得る能力を拡張させる。1023DNAザイムに由来するMNAザイムを用いて標的特異的な様式で基質を切断して、DFを直接生成する形式において、切断された両方の断片は、両方ともその切断された末端においてリボヌクレオチドを含有すると考えられる。これらの切断された断片は、リボヌクレオチドがRERS内で許容され得るため、EzyAmp反応におけるDFとして有用であろう。実施例6以下の実施例は、特定の酵素によって切断可能または切断不可能である種々の二重鎖構造体を形成する、オリゴヌクレオチドの能力を実証する。ヌクレアーゼによって切断可能な構造体は、CESA複合体等の二重鎖構造体であり、本実施例におけるヌクレアーゼは制限酵素REである。61オリゴヌクレオチド以下の反応について、オリゴヌクレオチド断片を組み合わせて、二重鎖基質を切断し得る種々のREの能力を試験するための基質として用いた。CESA、PESA、およびEICの例示的な構造体を図1において図解する。本実施例において、種々の二重鎖には、スクリーニングされる特定のREに対するRERSのうちの一方の鎖を形成するのに必要とされるすべての塩基を含む1種のオリゴヌクレオチドが含有されていた。REの切断活性を、フルオロフォアとクエンチャーとの間の物理的分離によって検出可能なシグナルが産生されるようにフルオロフォアおよびクエンチャーが複合体上に位置している、標識した複合体の切断によって観測した。本実施例において、EAS1と命名された酵素増幅因子基質オリゴ1は、フルオロフォアおよびクエンチャーで標識され、加えて、各REに対するRERSの一方の鎖を形成するのに必要とされる塩基のすべてに相当する配列を含有していた。RE1F1JBを、5末端上でJOEで、3末端上でBHQで標識した。EAS71FBを、5末端上で6FAMで、3末端上でIaBFQで標識した。REF4F1F1Bを、4の位置においてフルオレセインで、15の位置においてIaBFQで内部標識した。EAS14BFを、5末端上でIaBFQで、3末端上で6FAMで標識した。EAS51BFを、5末端上でIaBFQで、3末端上で6FAMで標識した。EAS31BFを、5末端上でIaBFQで、3末端上で6FAMで標識した。EAS2と命名された第2の酵素増幅因子基質オリゴは、部分的RERSを含有しており、EAS1とアニールし、いくつかの例ではクエンチャー部分で標識されており、例えばEAS61Bは5末端上でIaBFQで標識された。EAS1およびEAS2は、PESA複合体の構造的同等物を一緒に形成する図1C。ドライバー断片DFの構造的同等物に相当する第3の断片のハイブリダイゼーションは、完全酵素シグナル増幅因子CESA複合体と構造において同等であるが、機能においては必ずしも同等でない二重鎖構造体の形成をもたらす図1A。あるいは、阻害性断片InFの構造的同等物に相当する第3の断片のハイブリダイゼーションは、酵素阻害性複合体EICと構造において同等であるが、機能においては必ずしも同等でない二重鎖構造体の形成をもたらす図1B。いくつかの例において、InFをフルオロフォアおよび/またはクエンチャー部分で標識した。Sub1TRB2を、5末端上でTexasredフルオロフォアで、3末端上でBHQ2で標識し、RE1S15Bを、5末端上でIaBFQで標識した。最後に、EAS1の十分に相補的なRE認識配列のすべてを含有しているアンチセンス対照鎖ASCを、無傷二重鎖のRE切断に対する陽性対照として含んだ。いくつかの例において、ASCをクエンチャー部分で標識し、例えばASCEAS61Bを、5末端上でIaBFQで標識した。上記の十分に組織化した二重鎖構造体を切断し得る種々のREの能力またはその欠如を、EAS1上に存在するフルオロフォアに対する適当なチャンネルにおいて観測した。各反応内に存在するこれらのオリゴヌクレオチドの名前を、以下の表8において5から3に列挙する。REの認識配列に寄与する塩基を表9に提供しており、/は切断部位を示す。表8EzyAmp用のREのスクリーニングに用いられたREおよびオリゴ表8におけるオリゴのそれぞれに対する配列を表9に提供する。表962反応成分反応A、B、C、D、E、およびFを、表10に列挙した以下のオリゴヌクレオチド断片を含有するように準備した。表10反応A~Fのオリゴヌクレオチド成分すべての反応は、1×NEBバッファー表11中に100nMのEAS1および特定の単位数のRE表11を含有していた。加えて、反応Aはそれぞれ100nMのEAS2およびDFを含有しており、反応Bはそれぞれ100nMのEAS2およびInFを含有しており、反応Cは100nMのEAS2を含有しており、反応DはEAS1のみを含有しており、一方で、反応EおよびFは100nMのASCを含有していた。オリゴヌクレオチドをIDTから購入した。いくつかの反応には、その特別なREに対する使用に関するメーカー推奨によって指示されたとおり、1×BSANewEnglandBiolabsの添加も含まれた。反応A~Eに対する具体的な反応条件を表11に示す。各反応Fは、混合物にREを添加しないという点を除いて、反応Eと同一であった。種々のオリゴ構造体の切断またはその欠如を、蛍光標識したEAS1のREによる切断によるその改変に伴う蛍光シグナルの変化を観測することによって測定した。すべての反応A、B、C、D、E、およびFをCFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて特定の温度で行い、すべての反応の総容量は25μLであった。各反応に対する蛍光を、1秒おきに合計100サイクル読み取るようにプログラムした。すべての反応を二つ組で実施した。表11各特定のREに対する反応条件6フルオレセインFAM部分または6JOEJOE部分を含有している反応に対する蛍光の増大を、CFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadのFAMまたはJOEチャンネルチャンネル1または2においてそれぞれ検出した。FAMSybrのスキャンモードを用いた反応において、実行時間は17分間であり、全チャンネルのスキャンモードを用いた反応において、反応時間は24分間であった。Fermentasによって供給されている残りのREおよびバッファーはNewEnglandBiolabsによって供給されている。濃度が供給元によって開示されておらず、したがって、これらの反応は1反応あたりのμLに基づいて実施された。63結果:切断の検出反応A~Fに対して、フルオロフォアとクエンチャーの分離を示す蛍光の増大が検出された場合、これを表12において切断として記録した。蛍光の増大が検出されなかった場合、これはフルオロフォアとクエンチャーの分離がなかったことを示し、これを表12において切断なしとして記録した。表12結果EAS1とその十分な相補鎖ASCを含有している陽性対照の反応Eのすべてにおいて、経時的な蛍光シグナルの増大が観察され、この構造体が切断を受けやすいことを示した。REのそれぞれは二本鎖の複合体を認識かつ切断し得るため、切断が起こり得る。反対に、EAS1とその十分な相補鎖ASCを含有しているが、いかなるREも欠いている陰性対照の反応Fに対して、予測されたとおり、蛍光シグナルの増大は観察されなかった。種々の完全なおよび部分的な二重鎖構造体の切断に関して、種々のREによって切断されるオリゴ構造体に依存して、REは4つの基本的パターンI~IVのうちの1つに分類された。各パターンに従って挙動した酵素の一例を、図16において例証する。表12において提示された上記の結果の意義を、表13において要約する。表13しかしながら、各REの挙動は、イオン強度、pH、Mg濃度、およびRE濃度を含む多くの要素に大きく依存し、そのため、これらのグループ化およびパターンは、これらの反応条件下でのみこれらのREに付属し得るにすぎないことに留意すべきである。それでも、これらの実験は、ヌクレアーゼがそのようなパターンで二重鎖構造体を切断するような適切な反応条件を用いてヌクレアーゼの組み合わせを見出すためのスクリーニングアッセイが設定され得るプロセスを示すものであって、それによって、それらはEzyAmp反応を進めるために活用されるのに適したものとなる。実施例7以下の実施例は、2種の異なるCESA複合体CESAAおよびCESABが、それらそれぞれのDFのいずれかによる開始に応答したこれらのCESA複合体の完成後に、1本の反応チューブ内で単一の制限酵素によって切断される能力を実証する。この反応ためのストラテジーを図17Aにおいて図解する。本実施例におけるCESAを、各CESAの切断によって他方のCESAに対する新たなDFが生成されるように設計した。本実施例において、CESAAおよびCESABを、各CESAの切断によって生成される蛍光シグナルを独立して観測し得るように、異なるフルオロフォアで標識した。71オリゴヌクレオチド以下の反応において、CESAAをPESAAおよびDFaDF1から構成し、一方で、CESABをPESABおよびDFbDF3EAS111から構成する。今度は、PESAAをEAS1AEAS110およびEAS2AEAS211から構成し、PESABをEAS1BEAS112およびEAS2BEAS213から構成する。PESAAのEAS2Aは、DFbの配列と同等である領域をその中に含有しており、PESABのEAS2Bは、DFaの配列と同等である領域をその中に含有している。そのため、反応の開始時にDFaまたはDFbのいずれかを添加し得、次いで、反応の間にCESABまたはCESAAの切断によって各DFがそれぞれ生成され得るように、本実験を設計した。プロセスの概略図を図17Aにおいて図解する。RE活性を、フルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光の変化によって観測した。本実施例において、EAS1Aを、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端においてJOE部分で末端標識した。EAS2Aも、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分によって標識されており、EAS1Aとアニールする。EAS1Bを、5末端において6フルオレセイン6FAM部分で末端標識した。EAS2Bは、3末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分によって標識されており、EAS1Bとアニールする。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列CCTCまたはGAGGの少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFと同等であるものを表す。72反応条件オリゴヌクレオチドをIntegratedDNATechnologiesIDTから購入した。すべての反応は、それぞれ100nMのEAS110、EAS211、EAS112、EAS213、および10mMMgCl2Ambionのバルク混合物、1×BSANewEnglandBiolabs、1×NEBuffer4NewEnglandBiolabs、ヌクレアーゼを含まない水Ambion、ならびに075UMnlINewEnglandBiolabsを含有していた。反応Aを100nMDF1Iまたは等量の水IIの添加によって開始し、反応Bを100nMDF3ESA111IIIまたは等量の水IVの添加によって開始した。すべての反応は、25μLの総反応容量を有した。チャンネル1FAMおよびチャンネル2HEXの両方において蛍光シグナルを同時に測定して、FAMおよびJOEをそれぞれ観測した。反応をCFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて35°Cで行った。各サンプルに対する蛍光を、1秒後おきに150サイクル読み取るようにプログラムしたスキャンモード:全チャンネル。総実行時間は40分間であった。すべての反応を二つ組で実施した。73結果:CESAAおよびCESABの切断の検出各反応における蛍光の変化を、時間に対してプロットし、図17Bに示した。反応Aにおいて、DFaの添加は、経時的なJOE蛍光の増大によって示されるように反応AiiJOE:CESAADFa、REMnlIに対する切断可能なCESAA二重鎖基質の形成をもたらした。それと同時に、同じREMnlIに対する切断可能なCESAB二重鎖基質を形成する、CESAA切断からのDFbの産生の指標である、経時的なFAM蛍光の増大もこの反応において観察された反応AiFAM:CESABDFa。対照的に、DFaを添加しない対照反応において、JOEまたはFAM蛍光の増大は観察されず反応AIIDFaなしの対照、開始DFaの非存在下において、CESAAまたはCESABのどちらも形成されなかったことを示した。反応Bにおいて、DFbの添加は、経時的なFAM蛍光の増大によって示されるように反応BvFAM:CESABDFb、REMnlIに対する切断可能なCESAB二重鎖基質の形成をもたらした。それと同時に、同じREMnlIに対する切断可能なCESAB二重鎖基質を形成する、CESAB切断からのDFaの産生の指標である、経時的なJOE蛍光の増大もこの反応において観察された反応BviJOE:CESAADFb。対照的に、DFbを添加しない対照反応において、JOEまたはFAM蛍光の増大は観察されず反応BIVDFbなしの対照、開始DFbの非存在下において、CESAAまたはCESABのどちらも形成されなかったことを示した。PESAAEAS1AおよびEAS2AとEAS2Bこの状況ではInFとして作用するとの間のハイブリダイゼーション、および/またはPESABEAS1BおよびEAS2BとEAS2Aこの状況ではInFとして作用するとの間のハイブリダイゼーションによって、さらなる切断不可能なEIC複合体が形成されることも期待されている。全般的に、DFaの添加は、MnlIによるその切断をもたらすCESAAを形成し得、それはaJOE蛍光の増大、およびbMnlIによるその切断をもたらす今度はCESABを形成し得る、EAS2Aオリゴヌクレオチドの切断によるDFb断片の生成、および付随するcFAM蛍光の増大、ならびにdEAS2Bオリゴヌクレオチドの切断によるDFa断片の生成をさらに引き起こすことが実験によって実証されている。さらに、反応BへのDFbの添加は、MnlIによるその切断をもたらすCESABを形成し得、それはaFAM蛍光の増大、およびbMnlIによるその切断をもたらす今度はCESAAを形成し得る、EAS2Bオリゴヌクレオチドの切断によるDFa断片の生成、および付随するcJOE蛍光の増大、ならびにdEAS1Bオリゴヌクレオチドの切断によるDFb断片の生成をさらに引き起こすことが実験によって実証されている。そのため、CESAAおよびCESABの両方とも、それらそれぞれのドライバー断片の添加によって形成され得、かつ各CESAの切断によって、他方のPESAを完成させ得るドライバー断片が生成され得る。実施例8以下の実施例は、2種の異なるヘアピン型のCESA複合体CESAAおよびCESABが、それらそれぞれのDFのいずれかによるこれらの複合体の完成後に、1本の反応チューブ内で単一の制限酵素によって切断される能力を実証する。本実施例において、PESAAおよびPESABを、5から3にEAS1、連結配列、およびEAS2を含有している単一のオリゴヌクレオチドから構成する。PESAAおよびPESABは、分子内ヘアピンを形成し得る。ストラテジーを図18のパネルAにおいて図解する。さらに、本実施例におけるヘアピン型のCESAを、各CESAの切断によって他方のCESAに対する新たなDFが生成されるように設計した。本実施例において、PESAAおよびPESABの両方は同じフルオロフォアで標識されており、そのため、結果として得られるCESAの切断によって生成される蛍光シグナルは相加的であると考えられる。81オリゴヌクレオチド以下の反応において、CESAAをPESAAPESA35およびDFaD1F3Sub1から構成し、CESABをPESABPESA36およびDFbDF3PESA35から構成する。PESAAPESA35はヘアピンを形成し得、かつそれは、DFbの配列と同等である領域をその中に含有している。PESABPESA36もヘアピンを形成し得、かつそれは、DFaの配列と同等である領域をその中に含有している。そのため、DFaまたはDFbのいずれかを添加して反応を開始し得、次いで、フィードバックカスケード反応の反応の間にCESAAまたはCESABの切断によって両方のDFがそれぞれ生成され得るように、本実験を設計した。本実施例において、RE活性を、二重標識した各PESAの切断に伴う蛍光の変化によって観測した。本実施例において、PESAAPESA35を、IowaBlackFQIAbFQ部分で末端標識し、フルオレセイン部分で22の位置におけるTの塩基上で内部標識し、PESABPESA36を、IowaBlackFQIAbFQ部分で5末端標識し、フルオレセイン部分で21の位置におけるTの塩基上で内部標識した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列CCTCまたはGAGGの少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFと同等であるものを表す。内部フルオレセインの位置を太字で示す。5末端の枠で囲まれた塩基はEAS1を示し、3側の枠で囲まれた塩基はEAS2を示す。82反応成分オリゴヌクレオチドをintegratedDNAtechnologiesから購入した。すべての反応は、ヌクレアーゼを含まない水Ambion、1×NEBuffer4、1×BSA、および075UMnlIすべてNewEnglandBiolabsのバルク混合物を含有していた。反応を25μLの最終容量に作製し、二つ組で実施した。反応iは、100nMPESA35および10nMDF1を含有しており;反応iiは、100nMPESA35を含有しており;反応iiiは、100nMPESA36および10nMDF3PESA35を含有しており;反応ivは、100nMPESA36を含有しており;反応vは、100nMPESA35、100nMPESA36、および10nMDF1を含有しており;反応viは、100nMPESA35、100nMPESA36、および10nMDF3PESA35を含有しており;反応viiは、100nMPESA35および100nMPESA36を含有しており;反応viiiは、100nMPESA35、100nMPESA36、100nMDF1、および100nMDF3PESA35を含有していた。反応をCFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて33°Cで実施した。各反応に対する蛍光を、5秒後おきに60サイクルスキャンモードFAMSYBR;チャンネル1FAM、次いで25秒後おきに100サイクルスキャンモードFAMSYBR;チャンネル1FAM読み取った。総実行時間は65分間であった。同じ数、種類、および濃度のPESAを含有しているが開始DFを欠いている、それぞれの相当する反応のサイクル1に対して蛍光を正規化した。83結果:PESA35およびPESA36の切断の検出反応iにおいて、ヘアピンPESAAと一緒のDFaの添加は、経時的な蛍光の増大によって示されるように図18B;反応i、REMnlIに対する切断可能なCESAA二重鎖基質の形成をもたらした。対照的に、PESAAとともにはDFaを添加しない反応iiにおいて、経時的な蛍光の増大の欠如によって示されるように図18B;反応ii、切断可能なCESAA二重鎖基質は形成されなかった。反応iiiにおいて、ヘアピンPESABと一緒のDFbの添加は、経時的な蛍光の増大によって示されるように図18B;反応iii、REMnlIに対する切断可能なCESAB二重鎖基質の形成をもたらした。対照的に、PESABとともにはDFbを添加しない反応ivにおいて、経時的な蛍光の増大の欠如によって示されるように図18B;反応iv、切断可能なCESAB二重鎖基質は形成されなかった。反応vにおいて、PESAAおよびPESABの両方を含有している混合物へのDFaの添加は、反応iと比較して、経時的な蛍光の増大のほぼ倍増をもたらした図18B;反応v。これはCESAA切断後のDFbの放出の指標であり、次いでそれはPESABにハイブリダイズして、今度は切断されてより多くのDFaの放出をもたらし得るCESABを形成する。反応viにおいて、PESAAおよびPESABの両方を含有している混合物へのDFbの添加も、反応iiiと比較して、経時的な蛍光の増大のほぼ倍増をもたらした図18B;反応vi。これはCESABの切断後のDFaの放出の指標であり、次いでそれはPESAAにハイブリダイズして、今度は切断されてより多くのDFbの放出をもたらし得るCESAAを形成する。どちらのDFの添加もなく、PESAAおよびPESABの混合物を含有している対照の反応viiは、経時的な蛍光の増大を示さなかった図18B;反応vii。このことは、いかなるDFも存在していない下では、PESAAとPESABとの間に切断可能なCESA構造体は形成され得ないことを示している。最後に、両方のPESAのすべてが利用可能なDFを有するように、DFa、DFb、PESAA、およびPESABが等濃度それぞれ100nMで混合されている陽性対照として、反応viii図18Bを設計した。そのため、すべてのPESAは、CESAを形成しかつ切断されて、このシステムにおいて獲得され得る最大の蛍光の変化を産生するはずである。反応viiiは、反応vおよびviiと比較して、より速い反応速度を呈したが、最終的な蛍光は、反応vおよびviiにおいて観察されたものと同程度であった。このことは、10nMのDFa反応vまたはDFb反応viiのいずれかが、CESABが切断された場合にはより多くのDFaの生成によって、CESAAが切断された場合にはより多くのDFbの生成によって推進される、それぞれ100nMのCESAAおよびCESABの切断を究極的にもたらすカスケード反応を開始し得るという付加的証拠を提供している。このことは、PESAAおよびPESABとともにDFaまたはDFbのいずれかを含むことで反応を開始させることは、反応が観察された時間枠内でPESAAおよびPESABオリゴヌクレオチドの両方の十分な切断をもたらすことを示している。要約すると、実験によって、以下のことが実証されている:aDFDFaまたはDFbのその適合するヘアピンPESAそれぞれ、PESAAまたはPESABへの添加は、REMnlIに対する切断可能なCESAAまたはCESAB二重鎖基質を形成し得、蛍光の増大をもたらす。bPESAAおよびPESABの混合物へのDFaの添加は、CESAAの形成およびそれに続く切断をもたらし、それは、PESABとハイブリダイズして、今度は、切断されかつDFaを放出するCESABを形成し得るDFbを生成する。同様に、PESAAおよびPESABの混合物へのDFbの添加は、CESABの形成およびそれに続く切断をもたらし、それは、PESAAとハイブリダイズして、今度は、切断されかつDFbを放出するCESAAを形成し得るDFaを生成する。このフィードバックは、PESAAおよびPESABのすべてが切断されるまで起こり続ける。この増幅カスケードを用いてシグナルを増幅することができ、標的特異的な様式でDFが生成され得るという条件で、任意の標的の検出が可能となる。ヘアピンPESAの特定の配列を変更して、本実施例におけるDFの1種、または新たなPESAに相補的である異なるDFによって活性化され得るさらなるPESAを生成することができる。実施例9以下の実施例は、DF配列がMNAザイム基質配列の一部でないストラテジーを用いた、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応を実証する。本実施例において実証されるストラテジーを図19Aにおいて図解する。本実施例において、基質配列の側面には、DFに相補的な配列およびDF伸長に相補的な配列が位置した。基質自体の配列はこれらのいかなる領域とも相補的でなく、そのため、オリゴを含有している基質がDFに結合した場合に、一本鎖の基質ループが生成された。十分な基質の結合によって、DFはブロックされ、それはPESAとハイブリダイズできなくなった。特異的標的の存在下で形成されるMNAザイムによってループ型基質が切断された場合に、DFのみがこの複合体から放出されるようにシステムを設計した。基質ループのMNAザイム切断によって、DFが放出され、EzyAmpシグナル増幅反応が開始する。91EzyAmpオリゴヌクレオチドこのEzyAmp反応に対して、2種の異なるPESA複合体PESAAおよびPESABが1つの反応内に存在した。PESAAとDFaDF3EAS211とのハイブリダイゼーションはCESAAの形成をもたらし、一方で、PESABとDFbとのハイブリダイゼーションはCESABの形成をもたらす。PESAAをEAS1AEAS112およびEAS2AEAS213から構成し、PESABをEAS1BEAS110およびEAS2BEAS211から構成する。PESAAのEAS2Aは、DFbの配列と同等である領域をその中に含有している。PESABのEAS2Bは、DFaの配列と同等である領域をその中に含有している。そのため、反応の間に、基質-ブロッカーの切断によって、またはCESABもしくはCESAAの切断によって、DFaまたはDFbのいずれかがそれぞれ生成され得るように、本実験を設計した。プロセスの概略図を図19のパネルAにおいて図解する。RE活性を、オリゴが切断された際のフルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光の変化によって観測した。本実施例において、EAS1Aを5末端において6フルオレセイン6FAM部分で末端標識し、EAS2Aを3末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で末端標識した。EAS1AおよびEAS2Aは、互いにアニールしてPESAAを形成した。EAS1Bを、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端において6フルオレセイン6FAM部分で末端標識した。EAS2Bを3末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で標識した。EAS1BおよびEAS2Bは、互いにアニールしてPESABを形成した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列CCTCまたはGAGGの少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の太字の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFまたはそのより短いバーションと同等であるものを表す。92パートザイムオリゴヌクレオチドおよび組織化助長因子合成標的、すなわち組織化助長因子AFRO5の存在下で触媒活性MNAザイムが形成されるように、パートザイムを設計した。組織化助長因子、パートザイムARO5A43、およびパートザイムBRO5B53の配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。93MNAザイム基質-ブロッカーMNAザイム基質配列は、1023DNAザイムに由来するMNAザイムに対する基質として以前に用いられている配列の伸長をなすオリゴ内に、RNAおよびDNA塩基の両方を含有しているキメラ配列であった。本実施例において、レポーターMNAザイム基質をSub3と命名し、その側面には、DFaに相補的な配列およびDF伸長に相補的な配列が位置した。MNAザイム基質自体の配列はこれらのいかなる領域とも相補的でなく、そのため、それがDFに結合した場合に、一本鎖の基質ループが生成された。基質-ブロッカーの配列は、5から3方向に以下のとおりである。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表し、太字の塩基はパートザイムとハイブリダイズし、かつ下線が引かれている塩基はDFaに結合する。94反応成分標的の存在下における切断可能なCESAの形成を、蛍光の増大を検出することによって測定した。試験反応を100nMの標的組織化助長因子AFRO5の添加によって開始し、対照反応をH2Oの添加によって開始した。25μLの総反応容量を有するすべての反応を、CFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて35°Cで行った。各サンプルに対する蛍光を、チャンネル1FAMにおいて1分後おきに100サイクル読み取るようにプログラムしたスキャンモード:FAMSYBRのみ。総実行時間は115分間であった。すべての反応は、15mMMgCl2Ambion中に200nMパートザイムARO5A43、200nMパートザイムBRO5B53、200nMの基質-ブロッカー14Sub316Inh;それぞれ100nMのDF3ESA111、EAS110、EAS211、EAS112、およびEAS213のバルク混合物、1×BSANewEnglandBiolabs、1×NEBuffer4NewEnglandBiolabs、ヌクレアーゼを含まない水Ambion、ならびに075UMnlINewEnglandBiolabsを含有していた。すべての反応を二つ組で実施した。すべてのオリゴヌクレオチドをIntegratedDNATechnologiesIDTから購入した。95結果:CESAAおよびCESABの切断の検出標的が存在する試験反応において、蛍光の指数関数的な増大が観察された図19のパネルB;標的。このことは、標的組織化助長因子によって、パートザイムAおよびBが、MNAザイム基質を切断する触媒活性MNAザイムに組織化したことを示している。基質の切断は、DFaに接着した断片の解離につながり、ゆえにDFaが、それに続くEzyAmpカスケード反応PESAAおよびPESABから構成されるを開始するのを可能にする。この反応は、放出されたDFaがPESAAEAS1AおよびEAS1Bによって形成されるに結合して、MnlIによって次いで切断されるCESAAを形成した場合に始動した。これは、今度はDFbを放出し、フルオロフォアとクエンチャー部分の分離に相当する、付随した蛍光の増大も生成した。DFbは、次いでPESABEAS1BおよびEAS2Bによって形成されるに結合して、MnlIによるその切断を可能にするCESABを形成する。これは、より多くのDFaを放出して他のCESAAとCESABとの間のフィードバックカスケードを完成させ、かつフルオロフォアとクエンチャー部分の分離に相当する、付随した蛍光の増大も生成した。標的組織化助長因子を添加しない標的なしの対照反応において、80分後に、FAMシグナルの指数関数的な増大は観察されず、低レベルの蛍光のドリフトのみが観察された図19のパネルB;標的なしの対照。このことは、基質のMNAザイム切断を開始してDFaを放出し、それに続くEzyAmp反応を開始するためには、標的の存在が必要とされることを示している。結果は、EzyAmp反応を、DFの配列がMNAザイム基質配列の一部である必要はない標的依存的MNAザイム切断工程によって開始されるように設計することができることを実証している。この反応において、PESAAとEAS2Bとの間のハイブリダイゼーション、およびPESABとEAS1Aとの間のハイブリダイゼーションによって、その切断されていない状態でInFとして機能するEIC複合体が形成されることも期待されている。実施例10以下の実施例は、完全制限部位を含有している2種の部分的相補的オリゴヌクレオチドを切断し得る、制限酵素の能力を実証する。101オリゴヌクレオチド以下の反応において、オリゴヌクレオチド1EAS11およびオリゴヌクレオチド2ASCRE5F2FBは2つの向きで潜在的にハイブリダイズし得、その両方が、MnlIに対する完全認識部位を含有している部分的相補的二重鎖をもたらすと考えられるが、しかしながら、両方の二重鎖は認識部位と切断部位との間にいくつかの不対塩基を有すると考えられる。REMnlIが部分的に相補的でない二重鎖を切断する潜在力を、二重標識した断片の切断後のフルオロフォアとクエンチャー部分の分離による蛍光の変化を観測することによって検討した。オリゴヌクレオチド1を、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、その3末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で末端標識した。オリゴヌクレオチド2を、5末端において6フルオレセイン6FAM部分で、3末端においてBlackHoleクエンチャーBHQ1部分で末端標識した。オリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列CCTCまたはGAGGの一方の鎖を形成する。102反応成分すべての反応は二つ組で実施され、i100nMのオリゴヌクレオチド1またはiiH2Oの添加とともに、ヌクレアーゼを含まない水Ambion中に100nMのオリゴヌクレオチド2および2UのMnlI、1×BSANewEnglandBiolabs、ならびに1×NEBuffer4NewEnglandBiolabsを含有していた。蛍光シグナルをチャンネル1FAMにおいて測定した。25μLの総反応容量を有する反応を、CFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて35°Cで行った。各サンプルに対する蛍光を、8秒後おきに100サイクル読み取るようにプログラムしたスキャンモード:FAMSYBRのみ。総実行時間は40分間であった。103結果:オリゴヌクレオチド1および2の切断の検出反応iにおいて、オリゴヌクレオチド1および2の両方の存在は、オリゴヌクレオチド2におけるクエンチャーからフルオロフォアを分離するMnlI切断の指標である蛍光の増大をもたらした。対照的に、オリゴヌクレオチド1の非存在下において反応ii、増大する蛍光は観察されず、オリゴヌクレオチド2の切断はオリゴヌクレオチド1との部分的二重鎖の形成に依存していること、およびMnlIの存在下におけるシグナルは一本鎖のオリゴヌクレオチド2の切断によるものではないことを示した。結果は、MnlI等のあるREは、完全な二本鎖の認識配列を含有し得るが、認識部位および切断部位を網羅する領域全体にわたって十分に相補的ではない、部分的相補的二重鎖を切断することができることを実証している。この観察結果によって、認識部位と切断部位との間の介在配列にミスマッチを含む1種または複数種のオリゴヌクレオチドからなるPESA複合体を設計するための新たな手段が提供され、ゆえにDFとして機能し得る切断断片の解離の温度および速度の操作が可能となる。実施例11以下の実施例は、1つの反応内で並行して起こる以下の工程:工程iMNAザイムが標的の存在下で形成され、MNAザイム基質を切断して第1のDFを生成する;工程iiこのDFがPESAにハイブリダイズしてCESAを生成し、それがREによって切断された場合に別のDFを生成し、かつフルオロフォアとクエンチャーの分離を付随して引き起こし、蛍光シグナルの生成をもたらす;工程iv第1のCESAの切断によって生成されたDFが、第2のPESAにハイブリダイズして第2のCESAを生成し、それがREによって切断された場合に蛍光シグナルを生成し、かつ第1のDFと同じ機能を果たし得るDFを放出する;工程v工程ivおよびvが繰り返されるフィードバックループが生成される;を用いた、種々の濃度における特異的標的の検出および定量化を例証する。ヌクレアーゼ切断がシグナル増幅をもたらす反応を、EzyAmp反応と称する。本実施例において、EzyAmp反応を、1本の反応チューブ内で単一のREによって切断される2種の異なるCESA複合体CESAAおよびCESABから構成する。本実施例において、両方のPESA複合体は同じフルオロフォアで標識され、そのため、結果として得られるCESAAおよびCESABの切断によって生成されるシグナルは相加的である。111EzyAmpオリゴヌクレオチドこのEzyAmp反応に対して、2種の異なるCESA複合体CESAAおよびCESABが1つの反応内に存在する。CESAAをPESAAおよびDFaから構成し、一方で、CESABをPESABおよびDFbから構成する。今度は、PESAAをEAS1AEAS110およびEAS2AEAS211から構成し、PESABをEAS1BEAS112およびEAS2BEAS213から構成する。PESAAのEAS2Aは、DFbの配列と機能的に同等である領域をその中に含有している。PESABのEAS2Bは、DFaの配列と機能的に同等である領域をその中に含有している。そのため、標的の存在下において反応の開始時にDFaが生成され得、次いで、反応の間にCESABまたはCESAAの切断によって各DFがそれぞれ生成され得るように、本実験を設計した。フィードバックし得るCESA複合体のプロセスの例示的な概略図を図17A、図18A、図19A、および図27Aにおいて図解する。RE活性を、フルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光の変化によって観測した。本実施例において、EAS1Aを、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端において6フルオレセイン6FAM部分で末端標識した。EAS2Aも、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分によって標識されており、EAS1Aとアニールする。EAS1Bは、5末端において6フルオレセイン6FAM部分で末端標識されており、一方で、EAS2Bは、3末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分によって標識されており、EAS1Aとアニールする。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列CCTCまたはGAGGの少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFと同等であるものを表す。112パートザイムオリゴヌクレオチドおよび標的組織化助長因子DFaを生成するために、合成標的、すなわち標的組織化助長因子AFTL5の存在下で形成する触媒活性MNAザイムによって切断されるように、基質Sub1iFIBを設計した。標的組織化助長因子、パートザイムATL5A21、およびパートザイムBTL5B51の配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。113MNAザイム基質MNAザイム活性を、二重標識したレポーターMNAザイム基質の切断によって観測する。MNAザイム基質配列は、817DNAザイム基質として以前に用いられているLietal2000、RNAおよびDNA塩基の両方を含有しているキメラ配列である。本実施例において、レポーターMNAザイム基質をSub1iFIBと命名し、3末端において内部フルオレセインdTiFluorT部分およびIowaBlackFQIAbFQ部分で標識した。Sub1iFIBの標識配列は、5から3に以下のとおりであり、小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。イタリック体の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFとして作用するものを表す。基質、Sub1iFIB;114反応成分触媒活性MNAザイムによるMNAザイム基質の切断を、蛍光の増大によって測定したMNAザイム基質切断およびCESA切断の両方は、同じチャンネルにおいて検出されるフルオロフォアを放出するため、この蛍光をEASオリゴの切断によって生成される蛍光と区別することはできなかったが。CESAAがEAS110、EAS211、およびDF1aのハイブリダイゼーションによって形成され、CESABがEAS12、EAS213、およびDFbによって形成されるように、オリゴを設計した。蛍光標識したCESA成分であるEAS110およびEAS112の切断も、蛍光の増大によって測定した。二重試験反応を、i1nM、ii800pM、iii600pM、iv400pM、v200nM、vi100nM、またはvii50nMの濃度の標的組織化助長因子AFTL5の添加によって開始した。標的なしの対照NTC二重反応を、H2Oの添加によって開始した。25μLの総反応容量を有するすべての反応を、CFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて35°Cで行った。各サンプルに対する蛍光を、チャンネル1FAMにおいて1分後おきに110サイクル読み取るようにプログラムしたスキャンモード:FAMSYBRのみ。総実行時間は120分間であった。すべての反応は、10mMMgCl2Ambion中に075UMnlIとともに300nMパートザイムATL5A21、150nMパートザイムBTL5B31、および30nMSub1iFIB;それぞれ100nMのEAS110、EAS211、EAS112、およびEAS213のバルク混合物、1×BSANewEnglandBiolabs、ヌクレアーゼを含まない水Ambion、ならびにKOHを用いてpH83に調整されている1×NEBuffer1NewEnglandBiolabsを含有していた。すべてのオリゴヌクレオチドをIntegratedDNATechnologiesIDTから購入した。標的濃度の対数値に対して、反応に添加された標的の濃度のCt値から検量線をプロットした。Ct値とは、所定量の標的が閾値蛍光に相当するシグナルを生成するのにかかる時間の量である1サイクルは、およそ1分間に等しい。蛍光の増大の対数期の始動時に閾値を設定した。115結果:標的核酸の検出および定量化図21Aおよび21Bは、試験反応i~viiに添加された標的の量に相当する種々の時点において始動する、増大する蛍光シグナル対数および線形プロットを示している。標的の量によって、EzyAmp反応においてシグナルを生成するのに必要とされる時間が決定した。存在する標的が少ないほど、EzyAmpフィードバック反応を始動するDFaを産生するのに時間がより長くかかっており、ゆえに閾値蛍光に到達するのにかかる時間がより長くなる。標的を添加しない対照反応ではviiiNTC、増大するシグナルは120分後に観察されず、DF産生およびそれに続くEzyAmpシグナル増幅には、触媒活性MNAザイムの標的依存的形成が必要とされることを示唆している。さらなるより低濃度の標的も解析しておりデータ示さず、鋳型なしの対照のシグナルを上回って、わずか1pMを検出可能であった。これは、25μLの反応物において、およそ25aモルまたは107コピーの標的核酸配列に相当する。図21Cは、試験された標的濃度の範囲内で線形の検量線を産生することができるという観察結果による、アッセイの定量能を示している。DF産生は制限酵素切断事象ごとに倍増し、経時的なシグナルの指数関数的な増大をもたらす。この指数関数的な増大によって、PCR指数関数的サイクル閾値法144反応成分において記載されるを用いて、099の回帰値を有する線形曲線においてCtと標的濃度との間の関係を示すことが可能となる。これらの結果は、標的配列の高感度かつ定量的な検出を可能にするEzyAmpの能力を実証している。実施例12本実施例は、仮説に基づくものであり、シグナル増幅カスケードを開始および仲介し得るエキソヌクレーゼIIIExoIIIのヌクレアーゼ能を利用したストラテジーを提供する図23。この酵素は、DNA二重鎖の3末端からヌクレオチドを除去する。それは、平滑のまたは陥凹した3末端上で活性を有するが、5個またはそれより多いヌクレオチドを含む一本鎖DNA上では活性を有さず、ゆえに少なくとも5個のヌクレオチドまたはそれより長いヌクレオチドを有する3突出末端を切断しない。それは、二重鎖DNAにおけるニックからの加水分解を始動して、一本鎖のギャップを産生することもできる。オリゴ内のホスホロチオエートヌクレオチドの存在によって、エキソヌクレアーゼ活性はブロックされる。この方法には、1つのまたは分離した反応チャンバー内に存在し得るが同じヌクレアーゼExoIIIを利用する、開始工程およびシグナル増幅工程が含まれる。121開始工程:標的依存的な様式でのドライバー断片の生成合成イニシエーターオリゴSIOのみが標的核酸の存在下で加水分解される、ExoIIIに対する基質として、SIOを設計することができる図23。SIOは、特異的標的の検出を可能にする、標的に相補的である約20個のヌクレオチドをその3末端において有してよい。SIOは、標的に相補的でないDFの配列を5末端において含有していてもよい。最後に、SIOは、標的結合部分とDF部分との接合部において1個または複数個のホスホロチオエート化phosphorothiolatedヌクレオチドを含有していてよく、それはフルオロフォアおよびクエンチャーで二重標識されてよい。いくつかの態様において、SIOはヘアピン構造を有し得る。反応における工程を図23において図解する。SIOが標的に結合すると工程1、SIOのDF部分は一本鎖の5突出を形成し、一方で、SIOの標的結合領域は、SIOが、ExoIIIに対する適切な基質として働き得る3陥凹末端を有する二重鎖を形成する。ExoIIIは、次いでホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置に対して後部にあるSIOを加水分解し得、ゆえにSIOのDF部分を放出する工程2。付随して、加水分解はフルオロフォアとクエンチャーの分離をもたらし、それは蛍光の増大を引き起こす。標的は、無傷のままであり、かつ遊離して再利用されてさらなるSIOに結合する工程3。122シグナル増幅工程:CESA複合体の形成および切断シグナル増幅工程は、EzyAmp反応の他の変形型にあるような類似した断片、すなわち相補的オリゴヌクレオチドEAS1およびEAS2を含有している。EAS1を、フルオロフォアおよびクエンチャーで標識することができる。互いに結合すると、EAS1およびEAS2は、各末端に少なくとも5個のヌクレオチドの3突出を有するPESAを形成して、DFの非存在下においてExoIII分解を阻止することができる。EAS1は、DFに対する結合部位として働き得るより長い突出を有してよい。DFの5末端における配列は、EAS1に相補的であるものを超えて伸長し得、そのため、DF結合によって、EAS1上に3陥凹末端を有するCESA複合体が生成される。開始工程において、標的の存在下においてDFがSIOから放出された場合、それは、次いで遊離してPESAに結合し、かつExoIIIに対する基質として働き得るCESAを生成する。DFの3末端におけるホスホロチオエート化塩基の存在によって、DFがPESAに結合した場合に生成されるニックからのヌクレアーゼ分解が阻止される。しかしながら、CESAのEAS1鎖の3陥凹末端はExoIIIによって加水分解され工程5、これはフルオロフォアとクエンチャーの分離による蛍光の増大をもたらす。加えて、DFは、無傷で放出され、かつ遊離して再利用され工程6、別のPESAに結合して別のCESAを生成する。このストラテジーにおいて、開始工程および増幅工程の両方は、感度を増大させるためのシグナル増幅を、標的およびDFの再利用に頼る。上記スキームの多くの変異型が、当業者によって考案され得る。上述のように、PESAは、分離したEAS1およびEAS2オリゴから形成されてよく、またはEAS1およびEAS2をリンカー配列によって接続して、ヘアピン構造を有するPESAを生成してよい。各工程を、1つのチャンバー内または分離したチャンバー内で行ってよい。さらに、フルオロフォアおよびクエンチャー標識の位置については柔軟性がある。それでも、この提案されたストラテジーは、EzyAmp反応の基本的工程、すなわちi標的依存的な様式で、オリゴヌクレオチド例えば、SIOをDFに変換する工程;iiそれ自体はヌクレアーゼに対する基質でないPESAを提供する工程;iiiDFをPESAにハイブリダイズさせて、CESAを生成する工程;およびivCESAをヌクレアーゼで加水分解して検出可能なシグナルを生成し、加えてDFを放出し、それによって、それはより多くのPESAをCESA複合体に変換し得る工程、に従う。実施例13以下の実施例は、2種の異なるDFの存在下において2種の独立したCESAの形成を同時に観測し得るような、EzyAmpシステムを多重化する能力を実証する。本実施例において、2種の異なるPESA複合体PESAAおよびPESABを2種の異なるフルオロフォアで標識し、それによって、それらを独立して観測することができた。PESAAは、DFaの存在下でのみCESAAを形成し、PESABは、DFbの存在下でのみCESABを形成する。十分に組織化したCESAAおよびCESAB複合体の形成は、REMnlIに対するRERSの完成につながる。131オリゴヌクレオチド以下の反応において、CESAAをPESAAおよびDFaから構成し、一方で、CESABをPESABおよびDFbから構成する。今度は、PESAAをEAS1AおよびEAS2Aから構成し、PESABをEAS1BおよびEAS2Bから構成する。DFaのみがPESAAに結合してCESAAを形成し得、かつDFbのみがPESABに結合してCESAAを形成し得るように、本実験を設計した。RE活性を、フルオロフォアとクエンチャー部分の分離に相当する蛍光の変化によって観測する。本実施例において、EAS1ARE1F1BJを、5末端においてIowaBlackFQIAbFQで、3末端においてJOEで末端標識した。EAS1AとアニールするEAS2ARE1S15Bも、5末端においてIowaBlackFQIAbFQで標識した。EAS2BESA33を、5末端において6フルオレセインFAMで末端標識し、EAS2BとアニールするEAS1BESA342を、3末端においてIowaBlackFQIAbFQで標識した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列CCTCまたはGAGGの少なくとも一部を形成する。132反応条件オリゴヌクレオチドをIntegratedDNATechnologiesIDTから購入した。すべての反応は、15mMMgCl2Ambion中にそれぞれ100nMのEAS1ARE1F1BJ、EAS2ARE1F1BJ、EAS1BESA342、およびEAS2BESA33のバルク混合物、1×BSANewEnglandBiolabs、ヌクレアーゼを含まない水Ambion、1×NEBuffer4NewEnglandBiolabs、ならびに2UMnlIを含有していた。25μLの総反応容量で、反応をDFaDF1および/またはDFbD2F3ESA31の添加によって開始し、一方で、対照反応を水の添加によって開始した。各反応に用いられたDFaおよび/またはDFbの濃度を表14に提供する。チャンネル1FAMを観測するおよびチャンネル2JOEを観測するの両方において、蛍光シグナルを同時に測定した。反応をCFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて35°Cで行った。各サンプルに対する蛍光を、1秒後おきに100サイクル読み取るようにプログラムしたスキャンモード:全チャンネル。総実行時間は29分間であった。表14133結果:切断の検出図25において、各反応に対するJOEおよびFAMの両方に対する蛍光シグナルを、時間に対してプロットしている。DFaの添加は、経時的なJOE蛍光の増大をもたらした。増大するJOEシグナルは、DFaがPESAAを完成させてCESAAになり、次いでそれがMnlIによって切断されたことの指標である。今度は、切断されたEAS1AおよびEAS2Aのオリゴ断片の解離は、JOEフルオロフォアとクエンチャーの分離につながる。反応i~vにおいて観察されるように図25、JOE蛍光シグナルの増大の速度は、各反応内に存在するDFaの割合が低下するにつれて減少した。DFbの添加は、経時的なFAM蛍光の増大をもたらした。増大するFAMシグナルは、DFbがPESABを完成させてCESABになることの指標である。MnlIによるCESABの切断は、切断されたEAS1BおよびEAS2Bのオリゴ断片の解離を引き起こし、FAMフルオロフォアとそのクエンチャーの分離につながった。反応i~vにおいて観察されるように図25、蛍光FAMシグナルの増大の速度は、各反応に添加されたDFbの割合が低下するにつれて減少した。DFaまたはDFbのどちらも添加しない対照反応において、FAMまたはJOE蛍光のどちらの増大も観察されず、二重化EzyAmp反応が1種または複数種のDFの存在に特異的であることを実証した。DFaのみが存在する反応iにおいて、蛍光の増大は、JOEに対してのみ観察され、FAMに対しては観察されず、DFaがCESAAの形成に特異的であることを示した。同様に、DFbのみが存在する反応vにおいて、蛍光の増大は、FAMに対してのみ観察され、JOEに対しては観察されず、DFbがCESABの形成に特異的であることを示した。DFaプラスDFbの総量中に存在するDFaの割合がi100からii90に、iii50に、v10に変化するにつれて、相当するJOE蛍光の減少が観察された図25。同様に、DFaプラスDFbの総量中に存在するDFbの割合がv100からiv90に、iii50に、ii10に変化するにつれて、相当するJOE蛍光の減少が観察された。多重化EzyAmpシステムのための例示的なストラテジーを図13において図解する。本実験は、1つの多重化EzyAmp反応において1種より多くの標的を多重検出する潜在力を実証している。例えば、DFaは、標的Aの存在下でのみ標的特異的な様式で生成され得第1のMNAザイムによる第1のMNAザイム基質の切断によって、DFbは、標的Bの存在下でのみ標的特異的な様式で生成され得る第2のMNAザイムによる第2のMNAザイム基質の切断によって。本実施例において実証されたEzyAmpシステムを用いてDFaおよび/またはDFbの存在が検出された場合、JOEの増大は標的Aの存在を示し、FAMの増大は標的Bの存在を示す。JOEまたはFAMのどちらも増大しないことは、どちらの標的も存在しないことを示し、JOEおよびFAMの増大は、両方の標的の存在を示す。実施例14以下の実施例は、DF配列がMNAザイムによって基質として認識される配列の一部でないが、それでもそれが同じ分子内に含有されているストラテジーを用いた、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応を実証する図24D。本実施例において、基質およびDFは、基質-ブロッカー-DFオリゴと称される長いヘアピン型分子の一部である。ヘアピン内の一本鎖ループは、MNAザイムによって基質として認識される配列を含有している。このヘアピンのステムは、相補的なブロッカー配列にハイブリダイズし得るDFaの配列を含有している。この立体構造において、DFはPESAとハイブリダイゼーションすることができない。標的の存在下で形成されるMNAザイムによってMNAザイム基質ループが切断された場合に、DFのみが放出されるようにシステムを設計した。MNAザイムによって開始されるDFの放出によって、EzyAmpシグナル増幅反応が開始する。141EzyAmpオリゴヌクレオチドこのEzyAmp反応に対して、2種の異なるPESA複合体PESAAおよびPESABが1つの反応内に存在した。PESAAとDFaとのハイブリダイゼーションはCESAAの形成をもたらし、一方で、PESABとDFbとのハイブリダイゼーションはCESABの形成をもたらす。PESAAをEAS1AEAS112およびEAS2AEAS213から構成し、PESABをEAS1BEAS110およびEAS2BEAS211から構成する。PESAAのEAS2Aは、DFbの配列と同等である領域をその中に含有している。PESABのEAS2Bは、DFaの配列と同等である領域をその中に含有している。そのため、基質-ブロッカー-DFヘアピンオリゴのMNAザイム切断によって、開始DFaが標的依存的な様式で生成され得るように、本実験を設計した。その後、EzyAmpカスケード反応の間に、DFaおよびDFbは、CESABまたはCESAAの切断によってそれぞれ生成され得る。類似した例示的なカスケード反応が図19Aにおいて図解されているが、開始工程は図24Dにおいて図解されている図19Aにおける開始構造体に類似している、図24Cにおいて図解される工程と対立するものとして。RE活性を、オリゴが切断された際のフルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光の変化によって観測した。本実施例において、EAS1Aを5末端において6フルオレセイン6FAM部分で末端標識し、EAS2Aを3末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で末端標識した。EAS1AおよびEAS2Aは、互いにアニールしてPESAAを形成した。EAS1Bを、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端において6フルオレセイン6FAM部分で末端標識した。EAS2Bを3末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で標識した。EAS1BおよびEAS2Bは、互いにアニールしてPESABを形成した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列CCTCまたはGAGGの少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の太字の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFまたはそのより短いバーションと同等であるものを表す。142パートザイムオリゴヌクレオチドおよび標的組織化助長因子合成標的、すなわち組織化助長因子AFRO5の存在下で触媒活性MNAザイムが形成するように、パートザイムを設計した。組織化助長因子、パートザイムARO5A43、およびパートザイムBRO5B53の配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。143MNAザイム基質-ブロッカー-DFMNAザイム基質配列は、1023DNAザイムに由来するMNAザイムに対する基質として以前に用いられている配列の伸長をなすオリゴ内に、RNAおよびDNA塩基の両方を含有しているキメラ配列である。基質は、配列がオリゴの配列のいかなる部分とも相補的でないため、ヘアピン型の基質-ブロッカー-DF分子のステムから外側にループを作る。ステムは、DFaの配列も含有している。このヘアピン分子の中央にある基質でないループは、相補的でないdT塩基の伸張から構成される。ヘアピン型の基質-ブロッカー-DFオリゴの配列は、5から3方向に以下に付されている。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表し、太字の塩基はパートザイムとハイブリダイズし、下線が引かれている塩基は、DFaの配列太字のイタリック体も含むステムを形成し、かつイタリック体の塩基Tの伸張はヘアピンの中央ループを形成する。144反応成分標的の存在下における切断可能なCESAの形成を、蛍光を観測することによって測定した。試験反応を100nMの標的組織化助長因子AFRO5の添加によって開始し、対照反応をH2Oの添加によって開始した。25μLの総反応容量を有するすべての反応を、CFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて35°Cで行った。各サンプルに対する蛍光を、チャンネル1FAMにおいて1分後おきに100サイクル読み取るようにプログラムしたスキャンモード:FAMSYBRのみ。総実行時間は115分間であった。すべての反応は、15mMMgCl2Ambion中に200nMパートザイムARO5A43、200nMパートザイムBRO5B53、70nMHp5Inh、それぞれ100nMのEAS110、EAS211、EAS112、およびEAS213のバルク混合物、1×BSANewEnglandBiolabs、1×NEBuffer4NewEnglandBiolabs、ヌクレアーゼを含まない水Ambion、ならびに075UMnlINewEnglandBiolabsを含有していた。すべての反応を二つ組で実施した。すべてのオリゴヌクレオチドをIntegratedDNATechnologiesIDTから購入した。145結果:CESAAおよびCESABの切断の検出標的が存在する試験反応において、蛍光の増大が観察された。このことは、標的組織化助長因子によって、パートザイムAおよびBが、基質-ブロッカー-DFヘアピンオリゴのMNAザイム基質部分を切断する触媒活性MNAザイムに組織化したことを示した。基質の切断は、DFaに結合している断片の解離につながり、ゆえにDFaが、それに続くEzyAmp反応PESAAおよびPESABを含むを開始するのを可能にした。このEzyAmpカスケードは、放出されたDFaがPESAAEAS1AおよびEAS1Bによって形成されるに結合してCESAAを形成した場合に始動した。CESAAがMnlIによって切断された場合に、DFbは放出された。加えて、CESAA上に存在するフルオロフォアとクエンチャー部分の分離に相当する、付随した蛍光の増大もあった。次に、DFbは、MnlIによって切断されるCESABを形成するPESABEAS1BおよびEAS2Bによって形成されるに結合した。これは、より多くのDFaを放出して他のCESAAとCESABとの間のフィードバックカスケードを完成させ、かつCESAB上に存在するフルオロフォアとクエンチャー部分の分離に相当する、付随した蛍光の増大も生成した。標的組織化助長因子を添加しない標的なしの対照反応において、FAMシグナルの指数関数的な増大は観察されなかった。このことは、ヘアピン型の基質-ブロッカー-DFオリゴ内の基質部分のMNAザイム切断を開始してDFaを放出し、かつそれに続くEzyAmp反応を開始するためには、標的の存在が必要とされることを示している。結果は、先行するMNAザイム工程の付加によって、標的依存的であるようにEzyAmp反応を設計することができること、および開始DFの配列がMNAザイムによってその基質として認識される配列の一部である必要はないことを実証している。実施例15以下の実施例は、1つの反応内で並行して起こる以下の工程:工程iMNAザイムが標的cDNAの存在下で形成され、MNAザイムレポーター基質を切断して第1のDFDFaを生成する;工程iiこのDFaがPESAAにハイブリダイズしてCESAAを生成し、それがREによって切断された場合に別のDFDFbを生成し、かつフルオロフォアとクエンチャーの分離を付随して引き起こし、検出可能な蛍光シグナルの生成をもたらす;工程ivDFbが第2のPESAPESABにハイブリダイズしてCESABを生成し、それが切断された場合に検出可能な蛍光シグナルを生成し、かつDFaと同じ機能を果たし得るDFを放出する;工程v工程ivおよびvが繰り返されるフィードバックループが生成される;を用いた、2つの濃度におけるcDNARNAから逆転写されるの検出を例証する。ヌクレアーゼ切断がシグナル増幅をもたらす反応を、EzyAmp反応と称する。151EzyAmpオリゴヌクレオチドこのEzyAmp反応に対して、2種の異なるCESA複合体CESAAおよびCESABが1つの反応内に存在する。CESAAをPESAAおよびDFaMNAザイム基質の切断によってまたはCESABの切断によって生成されるから構成し、一方で、CESABをPESABおよびDFbEAS2AEAS211の切断によって生成されるから構成する。今度は、PESAAをEAS1AEAS110およびEAS2AEAS211から構成し、PESABをEAS1BEAS112およびEAS2BEAS113から構成する。PESAAのEAS2Aは、DFbの配列と機能的に同等である領域をその中に含有しており、PESABのEAS2Bは、DFaの配列と機能的に同等である領域をその中に含有している。そのため、反応の間にCESABまたはCESAAの切断によって各DFがそれぞれ生成され得る。RE活性を、フルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光を測定することによって観測した。本実施例において、EAS1Aを、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で、3末端において6フルオレセイン6FAM部分で末端標識した。EAS2Aも、5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で標識されており、EAS1Aとアニールする。EAS1Bは、5末端において6フルオレセイン6FAM部分で末端標識されており、一方で、EAS2Bは、3末端においてBlackHoleFQBHQ1部分で標識されており、EAS1Aとアニールする。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列CCTCまたはGAGGの少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFと同等であるものを表す。152パートザイムオリゴヌクレオチドおよび標的標的であるPPIAのcDNAの存在下で触媒活性MNAザイムが形成されるように、パートザイムを設計した。パートザイムAPPIAA21およびパートザイムBPPIAB31の配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。遺伝子特異的3プライマー3PPIAを用いて、PPIAcDNA標的を生成した。プライマーの配列を、以下に5から3に列挙する。153MNAザイム基質MNAザイム活性を、二重標識した核酸レポーターMNAザイム基質の切断によって観測した。MNAザイム基質配列は、817DNAザイム基質として以前に用いられているLietal2000、RNAおよびDNAヌクレオチドの両方を含有しているキメラ配列である。本実施例において、レポーターMNAザイム基質をSub1iFIBと命名し、3末端において内部フルオレセインdTiFluorT部分およびIowaBlackFQIAbFQ部分で標識した。Sub1iFIBの標識配列は、5から3に以下のとおりである。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。イタリック体の塩基はDFaを形成し、かつ下線が引かれている塩基はREMnlIに対する認識配列の一部を形成すると考えられる。基質、Sub1iFIB;154cDNA標的の生成標的cDNAを、K562細胞株Promegaに由来する全RNAの逆転写によって生成した。200nMの遺伝子特異的3プライマー3PPIAを用いてPPIAcDNAを生成したという点を除いて、メーカーの使用説明書に従って、TetrocDNAsynthesiskitBioline、Austを用いて逆転写を実施した。155EzyAmp反応成分および反応条件触媒活性MNAザイムによるMNAザイム基質の切断、ならびに蛍光標識したCESA成分であるEAS110およびEAS112のREMnlIによる切断を、蛍光の増大によって測定した。試験反応を標的の添加によって開始しPPIAcDNA;反応i115pg、反応ii23pg、標的なしの対照反応反応iiiをH2Oの添加によって開始した。すべての反応を、25μLの総反応容量で、CFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて35°Cで二つ組で行った。各反応に対する蛍光シグナルを、チャンネル1FAMにおいて1分後おきに150サイクル読み取ったスキャンモード:FAMSYBRのみ。すべての反応は、10mMMgCl2Ambion中に075UMnlIとともに300nMパートザイムAPPIAA21、150nMパートザイムBPPIAB31、および30nMSub1iFIB;それぞれ100nMのEAS110、EAS211、EAS112、およびEAS213のバルク混合物、1×BSANewEnglandBiolabs、ヌクレアーゼを含まない水Ambion、ならびに1×NEBuffer1NewEnglandBiolabs;KOHでpH85に調整されているを含有していた。すべてのオリゴヌクレオチドをIntegratedDNATechnologiesIDTから購入した。156結果:標的cDNAの存在の検出図26は、115pgのcDNAを含有している反応i、および23pgのcDNAを含有している反応iiに対する蛍光の増大を示している。標的の量によって、EzyAmp反応において蛍光シグナルを生成するのに必要とされる時間が決定する。存在する標的分子が少ないほど、検出可能な蛍光シグナルを産生するのに時間がより長くかかった。標的なしの対照反応反応iiiの最初のおよそ110分間、シグナルの増大は観察されなかったこの時間の後、蛍光のいくらかのドリフトは観察されたが。このことは、DF産生およびそれに続くEzyAmpシグナル増幅には、触媒活性MNAザイムの形成が必要とされ、かつこれは適切な標的本実施例ではPPIAcDNAの存在下でのみ開始されたことを示している。実施例16以下の実施例は、TspRIとして知られる熱安定性REによって切断可能または切断不可能である種々の二重鎖構造体を形成する、オリゴヌクレオチドの能力を実証する。161オリゴヌクレオチド以下の反応について、オリゴヌクレオチド断片を組み合わせて二重鎖を形成し、それらをRETspRIに対する基質として挙動し得るそれらの能力について試験した。CESA、PESA、およびEICの例示的な構造体を図1において図解する。本実施例において、種々の二重鎖には、それぞれ、TspRIに対する二本鎖RERSのうちの一方の鎖を形成するのに必要とされるすべての塩基を含む1種のオリゴヌクレオチドが含有されていた。RE切断活性を、TspRIによるCESA複合体の切断後のフルオロフォアとクエンチャー部分の分離による蛍光の変化を観察することによって観測した。本実施例において、EAS1は、その5末端においてIowaBlackFQIAbFQ部分で末端標識され、RETspRIに対するRERSの一方の鎖を形成するのに必要とされる塩基のすべてに相当する配列を含有していた。EAS2は、その3末端において6フルオレセインFAM部分で末端標識され、RERSの第2の鎖を形成するのに必要とされる塩基のいくつかを含有していた。EAS2およびEAS1を、アニールしてPESA複合体を形成するように設計した図1C。PESAとDF1デオキシリボヌクレオチドのみから構成されるまたはDF2デオキシリボヌクレオチドおよび1個のリボヌクレオチドから構成されるのいずれかとのハイブリダイゼーションを、すべてがDNAヌクレオチドであるRERSまたは1個のRNAヌクレオチドを有するRERSを含有するCESAを形成するようにそれぞれ設計した図1A。あるいは、阻害性断片InFのハイブリダイゼーションを、酵素阻害性複合体EICを形成するように設計した図1B。InFを、14の位置におけるTの塩基上でフルオレセイン部分で内部標識し、IaBFQ部分で3末端標識した。最後に、十分に連続したRERSを含有しているアンチセンス対照鎖ASCを、陽性対照として含んだ。各反応内に存在するオリゴヌクレオチドを、以下の表15において5から3に列挙する。TspRIの認識部位および切断部位に寄与する塩基は、:であり、Nは任意の塩基であってよく、SはCまたはGであってよく、かつ/は切断部位を示す。表15TspRIに対する反応A~Fのオリゴヌクレオチド成分表15におけるオリゴのそれぞれに対する配列を表16に提供する。大文字はDNAを示し、小文字はRNAを示す。TspRIの認識部位および切断部位に潜在的に寄与し得る塩基は、太字で書かれている。表16162反応成分反応A、B、C、D、E、およびFを、表15に列挙したオリゴヌクレオチドを含有するように準備した。すべての反応は、ヌクレアーゼを含まない水Ambion、1×BSANewEnglandBiolabs、20mMMgCl2Ambion、および20mMTrisHClpH85SigmaAldrich中に100nMのEAS1、50mMの酢酸カリウムSigmaAldrich、1mMDTTSigmaAldrich、ならびに10mMの酢酸マグネシウムSigmaAldrichを含有していた。反応A~Eは2UTspRINewEnglandBiolabsを含有しており、一方で、反応Fは含有していなかった。加えて、反応Aはそれぞれ100nMのEAS2およびDF1を含有しており、反応Bはそれぞれ100nMのEAS2およびDF2を含有しており、反応Cはそれぞれ100nMのEAS2およびInFを含有しており、反応Dは100nMのEAS2を含有しており、かつ反応EおよびFは100nMのASCを含有していた。オリゴヌクレオチドをIDTから購入した。反応を、25μLの総容量で、CFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて47°Cで行った。各サンプルに対する蛍光を、チャンネル1FAM;スキャンモード:SYBRFAMのみにおいて1秒後おきに合計100サイクル読み取るようにプログラムした総反応時間はおよそ17分間であった。163結果:切断の検出EAS1およびその十分な相補鎖ASCを含有している反応Eにおいて、経時的な蛍光シグナルの増大が観察され、この構造体がTspRIによる切断を受けやすいことを示した。EAS1およびその十分な相補鎖ASCを含有しているが、TspRIを欠いている反応Fに対して、蛍光の増大は観察されなかった。反応Aにおいて、経時的な蛍光の増大が観察され、DF1DNAのみから構成されるがPESAに結合し、RERを完成させ、かつREによって切断されるCESAを形成し得ることを示した。このことは、TspRIが、その制限部位内にニックを含有している二重鎖を切断し得ることを実証している。RERSを完成させる配列の一部としてリボヌクレオチドを有するDF2を含有している反応Bにおいても、蛍光の増大が観察された。このことは、CESAが形成され、かつTspRIが、その認識配列および切断配列内にニックおよびリボヌクレオチドを含有している二重鎖を切断し得ることを示している。対照的に、PESAおよびInFを含有している反応Cにおいて、蛍光の増大は見られず、これらのオリゴがEICを形成していたことを示した。同様に、PESAのみを含有している反応Dにおいて、蛍光の増大は見られず、REが切断するには十分なRERSが必要とされることを示した。そのため、TspRIは、実施例6の表13において詳述されるパターンIIを呈する酵素に類似している。TspRIは、二重鎖基質の構造を変化させることによってその活性を操作し得るため、EzyAmpにおける使用のための理想的なRE候補であると結論づけることができる。この酵素は、高度に熱安定性でもあり、したがって、過熱による変性に抵抗性がある。そのため、この酵素は、ゲノムDNA等の鋳型と混合し得、かつ二重らせんの2本の鎖を分離するために加熱し得、ゆえにタンパク質酵素または核酸酵素を用いた切断に適した一本鎖鋳型を提供する。例えば、一本鎖DNA鋳型は、MNAザイムに対する組織化助長因子として機能し得、ゆえにEzyAmp反応を開始するために使用され得る。TspRIと同様に、MNAザイムは、それはPCR反応における有用性を実証しているように、加熱変性工程による影響を受けないと考えられる。あるいは、一本鎖DNAは、図8~11において図解されているものに類似したストラテジーにおいて、熱安定性タンパク質ヌクレアーゼによって次いで切断され得る合成オリゴイニシエーターSIOによる結合に利用可能であると考えられる。実施例17以下の実施例は、CESAが、その適合するDFの存在下におけるその形成後に、REによって切断される能力を実証する。このストラテジーにおいて、CESAの切断によって生成される断片の1つは、元のDFの短縮バージョンに相当する。そのため、この切断断片は、図27Aにおいて図解される別のPESAに対するDFとして機能し、自己フィードバックシグナル増幅をもたらす潜在力を有する。171オリゴヌクレオチド以下の反応において、CESAをPESAおよびDFDF1から構成する。今度は、PESAをEAS1EAS11およびEAS2EAS22から構成する。PESAのEAS2は、DFの短縮配列と同等である領域をその中に含有している。RE活性を、フルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光の変化によって観測した。本実施例において、EAS1を、5末端においてIowaBlackFQIAbFQで、3末端においてBlackHoleクエンチャー1BHQ1で末端標識した。EAS2は、5末端において6フルオレセイン6FAMで標識されており、EAS1とアニールする。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5から3に列挙されており、下線が引かれている塩基は、MnlIに対する認識配列CCTCまたはGAGGの少なくとも一部を形成する。イタリック体の太字の塩基は、EAS2の状況で存在するDF1の短縮バージョンと同等であるものを表す。172反応条件オリゴヌクレオチドをIntegratedDNATechnologiesIDTから購入した。すべての反応は、10mMMgCl2Ambion中にそれぞれ100nMのEAS11およびEAS22のバルク混合物、1×BSANewEnglandBiolabs、1×NEBuffer4NewEnglandBiolabs、ヌクレアーゼを含まない水Ambion、ならびに075UMnlINewEnglandBiolabsを含有していた。総反応容量は25μLであった。試験反応iを100nMDFの添加によって開始し、対照反応iiをH2Oの添加によって開始した。反応をCFX96商標RealTimePCRDetectionSystemBioRadにおいて35°Cで二つ組で実行した。各サンプルに対する蛍光を、30秒後おきに200サイクル読み取るようにプログラムしたスキャンモード:FAMSBYRのみ。総実行時間は125分間であった。173結果:CESA切断の検出それぞれ二つ組の反応に対する平均蛍光読み取り値を、時間に対してプロットしており、図27Bに示す。反応iにおいて、DFの添加は、経時的な蛍光の増大をもたらしたi。対照的に、DFの非存在下において、経時的な蛍光の増大は観察されなかったii。結果は、CESAの形成にはDFの添加が必要とされることを実証している。今度は、MnlIによるCESAの切断は、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を含有しているものを含む断片の解離をもたらす蛍光の増大によって示される。加えて、切断断片の1つは、元のDF配列の短縮バージョンに相当する。この新たなDFは、別のPESAに結合することによって、開始DFと同じ機能を潜在的に実施し得る。