"口腔で許容可能なキャリヤー中に、アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼ、α-グルカナーゼおよびその組合せから選択される第2の酵素と、の組合せの効果的量を含有するオーラルケア組成物。アルカリ性プロテアーゼがセリンプロテアーゼである請求項1記載の組成物。アルカリ性プロテアーゼがスブチリシンsubtilisinである請求項2記載の組成物。第2の酵素がセルラーゼである前述の請求項のいずれかに記載の組成物。第2の酵素がα-グルカナーゼである前述の請求項のいずれかに記載の組成物。0.001-0.1のセルラーゼおよび0.002-0.2のアルカリ性プロテアーゼを含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。0.002-0.2のα-グルカナーゼおよび0.002-0.2のアルカリ性プロテアーゼを含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。アルカリ性プロテアーゼが菌類fungal起源かまたは細菌bacterial起源である前述の請求項のいずれかに記載の組成物。洗口液、歯磨剤、歯ゲル、歯磨き粉、非研磨性ゲル、ムース、フォーム、マウススプレー、トローチ剤、オーラル錠剤、デンタルインプリメント、義歯クリーナーおよびペットオーラルケア用品から選択される形の前述の請求項のいずれかに記載の組成物。組成物が必要に応じて更に水、研磨剤、界面活性剤、起泡剤、ビタミン、ポリマー類、添加酵素、湿潤剤、増粘剤、抗菌剤、防腐剤、香味料、着色料および/またはその組合せを含有する歯磨剤またはマウスウォッシュである前述の請求項のいずれかに記載の組成物。組成物のpHが4.5~6.5である前述の請求項のいずれかに記載の組成物。遊離または酸付加塩の形態で塩基性アミノ酸を更に含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。効果的量のフッ化物イオン源を更に含有する前述の請求項のいずれかに記載の組成物。以下の成分を重量によって含有するマウスウォッシュの形態の前述の請求項のいずれかに記載の組成物:アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα-グルカナーゼから選択される第2の酵素と、を含有する組成物の効果的量を口腔に適用することを包含する、i口腔における微生物バイオフィルム形成を抑制する、iiプラークの蓄積を減少する、iii歯肉炎を減らすか抑制する、iv虫歯の形成を減らすか抑制する、v歯と口腔をきれいにする、および/またはvi全身の健康を促進する方法。オーラルケア組成物の製造における、アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα-グルカナーゼから選択される第2の酵素の使用。アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼおよびα-グルカナーゼから選ばれる第2の酵素とを含有するオーラルケア組成物において使用のための液体酵素プレ濃縮物。実施例1:単一生物バイオフィルムに対する酵素評価以前検討した酵素系は、配合と安定性に関して重大な課題を提起した。従って、我々は、細菌のバッチ醗酵方法を用いて生産された一連の酵素を検討する。これらの酵素は、以下の通り異なったターゲットのために、増加した液体安定性および潜在的なより高い活性を提供する:酵素は単独でおよび2~3-酵素カクテルで、単一および混合種試験管内システムで検討する。また、最も有効で容易に入手できる2つのカクテルを、洗口液に配合し、4日のプラーク治験でテストされる。菌株と培養条件:アクチノミセスビスコサスActinomycesviscosus、ATCC♯31346は、0.6イースト抽出物TSB-YEで補われるトリプチカーゼ大豆ブイヨン中37°C静置培養で増殖する。混合種アッセイのために、細菌の原料は、Aビスコサス、ラクトバシルスカセイATCC♯334、ストレプトコッカスオラリスATCC♯35037、フソバクテリウムヌクレアツムATCC♯10953およびベイロネラパルブラVeilonellaparvula、ATCC♯17745を接種した連続培養ケモスタットである。この混合培養は、特定複合培地で連続培養ケモスタット中に37°Cで保持される。ヒドロキシアパタイトディスクの唾液コーティング:成長阻害および混合種バイオフィルム抑制のアッセイは、表面の基質としてヒドロキシアパタイトHAPディスクを使って行われる。パラフィン刺激された唾液は単一ドナーから回収され、破片をペレット化するために遠心分離される。続いて、唾液をインキュベーションによって紫外線の下で45分間殺菌する。処理および殺菌された唾液は、HAPディスクを含んでいる無菌24穴培養プレートの穴に植え付けられる。プレートを、一晩中4°Cで培養して薄膜を形成する。単一種バイオフィルムの破壊:Aビスコサスの単一種バイオフィルムは、96または384穴ポリスチレン培養プレート中で形成される。細菌をTSB-YE20mlの凍結株から新しく37°Cで一晩増殖する。一晩の培養菌を、2分の1の濃度0.5xTSBに薄められたトリプチカーゼ大豆ブイヨンで、610nm光学濃度OD610~0.2に希釈する。この希釈した培養菌の100μlを適切な無菌培養プレートの各々の井戸に加えて、プレートを一晩37°Cで培養する。一晩の培養の後、上澄を移し、各井戸の底には強固なバイオフィルムが残る。試験液を各々の井戸の最初のカラムに加え、2倍の連続希釈を0.5xTSBで全てのプレート全体で行う。特に明記しない限り、プレートは37°C1時間で培養される。処理の後、上澄を移して、処理液と除去したバイオフィルムも取り除く。0.3グラムクリスタルバイオレットの50μlを、各々の井戸に加えて、15分間染色する。染色液を移し、井戸を10mMトリスおよび1mMEDTAの緩衝液を用いてpH8.0で洗浄し、その後乾燥する。染色されたプレートを、パーキンエルマーエンビジョンEnVisionマイクロプレートリーダの上で、吸光度590nmについて検出する。吸光度はメディアだけで処理された井戸の吸光度と比較され、結果をメディアコントロールと比較してバイオフィルム形成における減少パーセントとして報告する。単一種バイオフィルム破壊アッセイは、単一酵素溶液をいくつかの特性について選別するのに用いられる。全8つのテスト酵素は1のグリセロール中3-4の溶液として受領し、すべてを口腔に初期に増殖したAビスコサスによって形成される単一種バイオフィルムを崩壊させる能力についてテストする。潜在的有効性のために酵素を選別するのに役立つことに加えて、このスクリーンは各酵素単独での投与量反応曲線を決定するのに用いられる。この情報は混合種アッセイおよびカクテル中の酵素の組み合わせの両方について濃度の選択を導くのに用いられる。我々はバイオフィルム消去濃度BiofilmEradicationConcentration;BEC50をバイオフィルムの50以上が崩壊する最も低い濃度と定義する。これは、個々のテストされる酵素の有効性の数値的測定を可能にする。これらの値は、表2に示す。バイオフィルムの<50の破壊が、テストされた酵素の最も高い濃度10000ppmでさえ、観察される。中性およびアルカリ性プロテアーゼは、テストされる酵素で、口腔の早期増殖で形成されたバイオフィルムを崩壊させることに最も効果的である。単一酵素でも細菌性バイオフィルムの破壊に非常に効果的でありえるが、より包括的なアプローチは酵素の複数の異なる種類のカクテルを使うことである。カクテルアプローチの長所は、バイオフィルムマトリックスの複数の成分が目標とされるということである。マトリックスの複数の成分の分解は、バイオフィルムのより完全な破壊を確実にする。従って、我々は2または3種の酵素カクテルのいくつかを評価する。2つの最も効果的酵素がプロテアーゼであるので、我々はより高いBEC50値を有するいくつかの酵素をカクテル中に含める。我々は、タンパク質をターゲットとする二つの酵素中性プロテアーゼとアルカリ性プロテアーゼ、炭水化物をターゲットとする二つセルロースとα-グルカナーゼおよび脂質をターゲットとする一つクチナーゼを選んだ。2種または3種の酵素の10個のカクテルはこれらの5種の酵素を表3に示す濃度および組合せで使用して配合される。各々の酵素のための濃度は、BEC50に基づいて決定される。Xは所定の酵素がカクテルに存在することを示す。これらのカクテルは上記単一酵素のために行われたのと同様、最初に単一種バイオフィルム破壊アッセイで検討される。このアッセイの結果に基づいて、カクテル2、3、7、8、9及び10を潜在的有効性の更なる分析のために選択する。この時点までのすべての実験は、培地中で実行される。しかしながら、唾液はタンパク質、塩類と他の栄養分並びに消化酵素プロテアーゼを含むの複雑な混合である。この複雑混合物の成分の一つ以上が、酵素がプラークを破壊する前にそれらを効果的に不活性化し得ることも可能である。これらの酵素が口腔環境においてまだ効果的であることを確認するために、我々は、以前にされたように培地で1セットのサンプルを希釈し、全部の人間の唾液で1セットを希釈する平行したバイオフィルム破壊アッセイを行った。このアッセイのために、上で特定される6種のカクテルを、それらのカクテルを作っている5つの個々の酵素に加えてテストする。全6種のカクテルはそれらが培地または唾液で薄められるかどうかにかかわらずほとんど理想的に機能を果たす。これは酵素がバイオフィルムを崩壊させるのに十分長く唾液中で安定なことを示す。この時点までのすべての分析は、1時間の処理時間で実行される。しかしながら、標準的なオーラルケア規格は、長さ30秒~2分である。従って、酵素がこのより短い時間スケールの範囲内でバイオフィルムを崩壊させることができるかどうか決定することは重要である。単一種バイオフィルム分析を30秒と同じくらい短い処理時間で実施する。全ての場合において、1時間で確認されたのと同様の崩壊が、インキュベーション期間がより短くても観察される。実施例2:混合種バイオフィルムの破壊単一種アッセイがいくつかのオプションの迅速なスクリーニングによいが、実際の口腔環境は700種以上の細菌のすみかである。口内で潜在的有効性のより完全な状態を得るために、細菌の混合集団に対する活性効果を研究することが重要である。我々は、異種間相互の影響のモデルとして、細菌の5種集合体を使う。この細菌の混合は、オーラルバイオフィルムの主成分に密接に関連がある5種の細菌を含む。5つの種は、グラム陽性およびグラム陰性、嫌気性および好気性、並びに早い増殖菌および遅い増殖菌の混合を含む。このモデルで使われる細菌は、Aビスコサス、Lカセイ、Sオラリス、FヌクレアツムおよびVパルブラである。このモデルは単一種スクリーンより多様な集団で特定の処理の有効性の表示を提供する。最も重要なのは、この場合より多様な強いバイオフィルムを提供することである。混合種バイオフィルムは、唾液被覆HAPディスクscHAPの上で予め形成される。唾液コーティングの後、ディスクは、0.5xTSBにおいて~0.2のOD610に希釈された実施例1に記載の連続培養菌からの1mlの混合種培養菌で植え付けられる。プレートを、37°Cで24時間培養してバイオフィルムを形成する。予め形成されたバイオフィルムを含んでいるディスクを新しい24穴培養プレートへ移し、0.5mlの試験液を各々のディスクに添加する。プレートは、37°C1時間で緩やかな撹拌下に培養される。処理の後、ディスクを、新しい0.5xTSBを含んでいるプレートに移動して、処理溶液および離れたバイオフィルムをすすぎ落とす。次にディスクを、0.25のトリプシン溶液の1mlを含んでいる15mlのポリスチレンチューブに移す。ディスクを、37°Cで45分間振盪して培養する。チューブは短くボルテックスして細菌を再懸濁し、上澄を新しい24穴プレートへ移す。プレートは2分の間超音波で破壊して残りのHAPをペレット化し、上澄を新しいプレートへ移して吸光度が610nmで確認できた。すべてのサンプルは、3回テストし、3回の井戸の平均を決定する。結果は、単独で培地で扱われるディスクと比較してバイオフィルム形成の軽減パーセントとして報告される。細菌のこの5種混合を使っている前の研究は、バイオフィルムの形成を妨げる化合物の能力に集中した。適応は既存のバイオフィルムの破壊を見るようにしなければならなかった。混合種バイオフィルムは、唾液に覆われたヒドロキシアパタイトディスクの上で48時間予め形成される。ディスクを新しい培地に移し、1時間試験液の1mlで穏やかな撹拌の下で処理する。この撹拌は、HAPディスクから酵素処理で剥がれるバイオフィルムの機械的除去を可能にする。処理後、残りのバイオフィルムをトリプシンでの処理によりディスクから取り除き、定量化する。結果は、培地で単独で培養されるコントロールと比較してバイオフィルムの減少パーセントとして提供される。カクテル2、7および9並びに関連する単一酵素は、単一酵素と2種の酵素カクテルによって予めつくられた混合種バイオフィルムの破壊を見つけるため検査される。結果は、培地で単独で培養されるディスクと比較してバイオフィルムの減少パーセントとして与えられる。先行研究が効果的であるとするpH5~7で最適活性を有するグルコアミラーゼ0.044およびパパイン0.226の組合せが正のコントロールとして使われる。カクテル7100ppmのアルカリ性プロテアーゼと200ppmのセルラーゼを含むは、グルコアミラーゼとパパインとの正のコントロールを包含する単一酵素またはカクテルのどれよりも大いに上回る。実施例3:配合歯磨剤配合の相対的な複雑さは、酵素の活性と安定性に干渉する可能性がある多数の成分が存在することを意味する。このことは、酵素が単純な液体溶液で安定であるということすでに知られているという事実と組合せて、我々にマウスウォッシュに酵素を調合する試みをもたせる。アルカリ性プロテアーゼセルラーゼカクテルがテストされる他のカクテルを大いに上回ったが、セルラーゼの使用に対する懸念は更なる研究のために代わりの酵素リンスの配合を調査することを促した。セルラーゼは、セルロース分子中の1,4-β-D-グリコシド結合を加水分解する酵素である。セルロースガムは、歯磨剤配合およびしばしばマウスウォッシュの中の増粘剤として一般的に用いられる。歯磨剤作成器材の近くのセルラーゼの微量の存在は、歯磨剤の重度の希薄化または液化さえもたらした。従って、我々は所望によりセルロースガムを含んでいる配合への最終的な混入にふさわしい第2のカクテルを評価のために選んだ。前の試験管内の研究と実用的な考慮の組合せに基づいて、我々は正のコントロールとして、以下の3種の酵素マウスウォッシュ、0.1のセルロース0.2のアルカリ性プロテアーゼ;0.2のα-グルカナーゼ0.2のアルカリ性プロテアーゼ;および0.044のグルコアミラーゼ0.226のパパインを製造することを選択した。配合後、第一段階は酵素が配合中において安定でバイオフィルム崩壊活性を保持することを確認しなければならない。マウスウォッシュベース中の成分は、酵素の添加が無くても、バイオフィルム除去にかなりの影響を及ぼす。従って、プラセボコントロールとしての酵素フリーの配合も同様に試験される。全3つの洗口液は、プラセボについて観測されたものと比較して高度なバイオフィルム除去を示す。このことは、酵素カクテルがマウスウォッシュ処方のマトリックスの中で非常に活性であることを示した。アルカリ性プロテアーゼ/α-グルカナーゼ酵素カクテルが単一種バイオフィルム除去で効果的であることを確認することもできる。このアッセイは、最高3ヵ月の室温でのインキュベーションの後、洗口液処方で繰り返される。同様のバイオフィルム破壊的な活性はこの期間の間保持され、それは酵素がこのマウスウォッシュ処方で比較的安定なことを示す。これらのマウスウォッシュが混合種バイオフィルムに対する活性あることを証明することも重要である。酵素マウスウォッシュベース配合の高い粘性のために、単独でのプラセボマウスウォッシュのためにバイオフィルム除去の非常に高い程度が存在する。したがって、プラセボと比較してバイオフィルムの減少は非配合の酵素カクテルより、かなり低い。しかしながら、同じ性能の傾向は上記実験で見られるように観察される。これらの試験管内の研究は両方のプロトタイプ酵素マウスウォッシュが基準のグルコアミラーゼ-パパイン酵素カクテルのレベルと同一またはそれ以上作用し、酵素フリーのコントロールマウスウォッシュより非常によいことを証明する。いくつかの前の研究はグルコアミラーゼ-パパイン歯磨剤の良い臨床有効性を示したので、この正のコントロールと比較して優れた性能がみられる。"