成長ホルモン受容体をコードする核酸分子を標的とする長さ8~80核酸塩基の化合物であって、成長ホルモン受容体をコードする前記核酸分子SEQIDNO4またはSEQIDNO18と特異的にハイブリダイズし、そして成長ホルモン受容体の発現を阻害する、前記化合物。長さ12~50核酸塩基である、請求項1に記載の化合物。長さ15~30核酸塩基である、請求項1に記載の化合物。オリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の化合物。オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の化合物。オリゴヌクレオチドがDNAオリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の化合物。オリゴヌクレオチドがRNAオリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の化合物。オリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の化合物。短い干渉RNAsiRNA分子である、請求項7に記載の化合物。成長ホルモン受容体をコードする核酸分子SEQIDNO4またはSEQIDNO18と、少なくとも70の相補性を有する、請求項1に記載の化合物。成長ホルモン受容体をコードする核酸分子SEQIDNO4またはSEQIDNO18と、少なくとも80の相補性を有する、請求項1に記載の化合物。成長ホルモン受容体をコードする核酸分子SEQIDNO4またはSEQIDNO18と、少なくとも90の相補性を有する、請求項1に記載の化合物。成長ホルモン受容体をコードする核酸分子SEQIDNO4またはSEQIDNO18と、少なくとも95の相補性を有する、請求項1に記載の化合物。SEQIDNO19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、73、74、75、76、77、78、79、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93または94の少なくとも8核酸塩基部分を含む、請求項1に記載の化合物。オリゴヌクレオチドが、SEQIDNO19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、73、74、75、76、77、78、79、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93および94から選択される、請求項14に記載の化合物。オリゴヌクレオチドが、SEQIDNO30、44および57から選択される、請求項15に記載の化合物。成長ホルモン受容体SEQIDNO4またはSEQIDNO18をコードする領域に特異的にハイブリダイズし、この領域、またはその部分または部位が、翻訳開始コドン、停止コドン、コード領域、5非翻訳領域、3非翻訳領域、イントロン:エクソン結合部、またはエクソン:イントロン結合部を含む、請求項1に記載の化合物。核酸分子の領域、部分または部位が、SEQIDNO161~232から選択される配列の少なくとも8核酸塩基部分を含む、請求項17に記載の化合物。成長ホルモン受容体の発現を少なくとも45阻害する、請求項1に記載の化合物。少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基を有する、請求項1に記載の化合物。少なくとも1つの2Oメトキシエチル糖部分を有する、請求項20に記載の化合物。少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、請求項20に記載の化合物。少なくとも1つの5メチルシトシンを有する、請求項20に記載の化合物。細胞または組織における成長ホルモン受容体の発現を阻害する方法であって、前記細胞または組織を請求項1に記載の化合物と接触させることを含む、前記方法。成長ホルモン受容体のモジュレータをスクリーニングする方法であって、以下の工程:a成長ホルモン受容体をコードする核酸分子の好ましい標的部分を、成長ホルモン受容体の1またはそれ以上の候補モジュレータと接触させる工程;そしてb成長ホルモン受容体の発現をモジュレートする、成長ホルモン受容体発現の1またはそれ以上のモジュレータを同定する工程;を含む、前記方法。成長ホルモン受容体発現のモジュレータが、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、RNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチドRNA二本鎖を形成することができる前記RNAオリゴヌクレオチドの少なくとも部分を有するRNAオリゴヌクレオチド、またはキメラオリゴヌクレオチドを含む、請求項25に記載の方法。成長ホルモン受容体のシグナル伝達、活性、または発現の既知阻害剤、または成長ホルモンインスリン様成長因子軸の既知阻害剤に関連する成長ホルモン受容体の候補モジュレータをベンチマークテストすることをさらに含む、請求項25に記載の方法。成長ホルモン受容体シグナル伝達、活性または発現の既知阻害剤が、ドーパミンアゴニスト、ソマトスタチン類似体または成長ホルモン受容体アンタゴニストである、請求項27に記載の方法。成長ホルモン受容体のシグナル伝達、活性または発現の既知阻害剤が、Trovert、オクトレオチドoctreotide、Sandostatin、メシル酸ブロモクリプチンbromocriptinemesylate、またはカベルゴリンcabergoline、または請求項1の化合物である、請求項28に記載の方法。サンプル中の成長ホルモン受容体の存在を、SEQIDNOs5または6を含む少なくとも1つのプライマー、またはSEQIDNO7を含むプローブを使用して同定することを含む、疾患状態を同定するための診断方法。請求項1の化合物を含む、キットまたはアッセイデバイス。成長ホルモン受容体のシグナル伝達または成長ホルモンインスリン様成長因子軸に関連する疾患または症状を有する動物を治療する方法であって、前記動物に対して、成長ホルモン受容体またはインスリン様成長因子レベルまたは発現をモジュレートすることができる治療的または予防的有効量のオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。オリゴヌクレオチドが、請求項1に記載の化合物である、請求項32に記載の方法。前記疾患または症状疾患または症状が、先端肥大症、巨人症、癌、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、異所性血管新生、異所性血管形成、黄斑変性、リウマチ性関節炎、または短寿命である、請求項32に記載の方法。動物がヒトである、請求項32に記載の方法。細胞または組織におけるインスリン様成長因子1の発現を阻害する方法であって、前記細胞または組織を、請求項1に記載の化合物と接触させ、それにより成長ホルモン受容体の発現およびインスリン様成長因子1の発現を阻害することを含む、前記方法。成長ホルモン受容体のシグナル伝達のモジュレータをスクリーニングする方法であって、以下の工程:a成長ホルモン受容体をコードする核酸分子の好ましい標的部分を、成長ホルモン受容体の1またはそれ以上の候補モジュレータと接触させる工程;そしてb成長ホルモン受容体のシグナル伝達をモジュレートする成長ホルモン受容体発現の1またはそれ以上のモジュレータを同定する工程;を含む、前記方法。成長ホルモン受容体発現のモジュレータが、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、RNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチドRNA二本鎖を形成することができる前記RNAオリゴヌクレオチドの少なくとも部分を有するRNAオリゴヌクレオチド、またはキメラオリゴヌクレオチドを含む、請求項37に記載の方法。成長ホルモン受容体発現のモジュレータが、インスリン様成長因子1発現をモジュレートする、請求項37に記載の方法。成長ホルモン受容体シグナル伝達、活性または発現の既知阻害剤、または成長ホルモンインスリン様成長因子軸の既知阻害剤に関連する成長ホルモン受容体の候補モジュレータをベンチマークテストすることを更に含む、請求項37に記載の方法。成長ホルモン受容体シグナル伝達、活性または発現の既知阻害剤が、ドーパミンアゴニスト、ソマトスタチン類似体または成長ホルモン受容体アンタゴニストである、請求項40に記載の方法。成長ホルモン受容体シグナル伝達、活性または発現の既知阻害剤が、Trovert、オクトレオチド、Sandostatin、メシル酸ブロモクリプチン、またはカベルゴリンもしくは請求項1の化合物である、請求項41に記載の方法。成長ホルモン受容体のシグナル伝達と関連する疾患または症状の治療のための医薬の製造における、成長ホルモン受容体をコードする核酸分子を標的とする化合物の使用。成長ホルモン受容体をコードする核酸分子を標的とする化合物が、成長ホルモンをコードする核酸分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項43に記載の使用。疾患または症状が、先端肥大症、巨人症、癌、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、異所性血管新生、異所性血管形成、黄斑変性、リウマチ性関節炎、または短寿命である、請求項43に記載の使用。実施例1:ヌクレオシドホスホールアミダイトの合成アミダイトおよびそれらの中間体を含む以下の化合物を、US特許6426220に記載されたように、そしてPCTWO0236743において公開されたように調製した;5メチルdCアミダイトのための5Oジメトキシトリチルチミジン中間体、5メチルdCアミダイトのための5Oジメトキシトリチル2デオキシ5メチルシチジン中間体、5メチルdCアミダイトのための5Oジメトキシトリチル2デオキシN4ベンゾイル5メチルシチジンの最後から二番目の中間体、[5O44ジメトキシトリフェニルメチル2デオキシN4ベンゾイル5メチルシチジン3Oイル]2シアノエチルNNジイソプロピルホスホールアミダイト5メチルdCアミダイト、2フルオロデオキシアデノシン、2フルオロデオキシグアノシン、2フルオロウリジン、2フルオロデオキシシチジン、2O2メトキシエチル修飾アミダイト、2O2メトキシエチル5メチルウリジン中間体、5ODMT2O2メトキシエチル5メチルウリジンの最後から二番目の中間体、[5O44ジメトキシトリフェニルメチル2O2メトキシエチル5メチルウリジン3Oイル]2シアノエチルNNジイソプロピルホスホールアミダイトMOETアミダイト、5Oジメトキシトリチル2O2メトキシエチル5メチルシチジン中間体、5Oジメトキシトリチル2O2メトキシエチルN4ベンゾイル5メチルシチジンの最後から二番目の中間体、[5O44ジメトキシトリフェニルメチル2O2メトキシエチルN4ベンゾイル5メチルシチジン3Oイル]2シアノエチルNNジイソプロピルホスホールアミダイトMOE5MeCアミダイト、[5O44ジメトキシトリフェニルメチル2OメトキシエチルN6ベンゾイルアデノシン3Oイル]2シアノエチルNNジイソプロピルホスホールアミダイトMOEAアミダイト、[5O44ジメトキシトリフェニルメチル2O2メトキシエチルN4イソブチリルグアノシン3Oイル2シアノエチルNNジイソプロピルホスホールアミダイトMOEGアミダイト、2Oアミノオキシエチルヌクレオシドアミダイトおよび2Oジメチルアミノオキシエチルヌクレオシドアミダイト、2ジメチルアミノオキシエトキシヌクレオシドアミダイト、5OtertブチルジフェニルシリルO22無水5メチルウリジン、5Otertブチルジフェニルシリル2O2ヒドロキシエチル5メチルウリジン、2O[2フタルイミドキシエチル]5tブチルジフェニルシリル5メチルウリジン、5Otertブチルジフェニルシリル2O[2ホルムアドキシイミノオキシエチル]5メチルウリジン、5Otertブチルジフェニルシリル2O[NNジメチルアミノオキシエチル]5メチルウリジン、2Oジメチルアミノオキシエチル5メチルウリジン、5ODMT2Oジメチルアミノオキシエチル5メチルウリジン、5ODMT2O2NNジメチルアミノオキシエチル5メチルウリジン3[2シアノエチルNNジイソプロピルホスホールアミダイト]、2アミノオキシエトキシヌクレオシドアミダイト、N2イソブチリル6Oジフェニルカルバモイル2O2エチルアセチル5O44ジメトキシトリチルグアノシン3[2シアノエチルNNジイソプロピルホスホールアミダイト]、2ジメチルアミノエトキシエトキシ2DMAEOEヌクレオシドアミダイト、2O[22NNジメチルアミノエトキシエチル]5メチルウリジン、5Oジメトキシトリチル2O[22NNジメチルアミノエトキシエチル]5メチルウリジン、および5Oジメトキシトリチル2O[22NNジメチルアミノエトキシエチル]5メチルウリジン3OシアノエチルNNジイソプロピルホスホールアミダイト。実施例2:オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド合成本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を通じて、便利にそして日常的に調製することができる。そのような合成のための装置は、例えば、AppliedBiosystemsFosterCityCAを含むいくつかの販売者により販売されている。当該技術分野において公知のそのような合成のための手段のいずれかその他のものを、さらにまたは代替的に利用することができる。同様の技術を使用してホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製することは、周知である。オリゴヌクレオチド:未置換及び置換ホスホジエステルPOオリゴヌクレオチドを、自動DNAシンセサイザーAppliedBiosystemsmodel394で、ヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホールアミダイト化学を使用して、合成する。亜リン酸結合の酸化のため、アセトニトリル中10wvの3H12ベンゾジチオール3オン11ジオキシド溶液によりチア化を行ったこと以外は、ホスホロチオエートPSは、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドのためと同様に合成される。チア化反応段階の時間を180秒に増加し、そして、引き続いて通常のキャッピング段階を行った。CPGカラムからの切断、及び、55°Cでの12~16時間濃縮された水酸化アンモニウム中にて脱ブロック化した後、3倍量以上のエタノールで沈殿することにより、オリゴヌクレオチドを1MNH4OAc溶液から回収した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドを、本明細書中で参考文献として援用する、US特許5508270に記載の通り、調製する。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用する、US特許4469863に記載の通り、調製する。3デオキシ3メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用する、US特許5610289または5625050に記載の通り、調製する。ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用する、US特許5256775またはUS特許5366878に記載の通り、調製する。アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用する、公開されたPCT出願PCTUS9400902及びPCTUS9306976それぞれWO9417093及びWO9402499として公開に記載の通り、調製する。3デオキシ3アミノホスホールアミデートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用する、US特許5476925に記載の通り、調製する。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用されるUS特許5023243に記載の通り、調製する。ボランリン酸オリゴヌクレオチドは、共に本明細書中で参考文献として援用される、US特許5130302及び5177198に記載の通り、調製する。オリゴヌクレオシド:MMI結合オリゴヌクレオシドとも特定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとも特定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド3結合オリゴヌクレオシドとも特定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド4結合オリゴヌクレオシドとも特定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、ならびに、例えば、MMIとPOあるいはPS結合とを換えたものを有する混合バックボーン化合物は、そのすべてが本明細書中で参考文献として援用される、US特許5378825、5386023、5489677、5602240および5610289に記載の通り、調製する。ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、US特許5264562および5264564に記載の通り、調製する。エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、US特許5223618に記載の通り、調製する。実施例3:RNA合成一般的には、RNA合成化学は、戦略的な中間反応における様々な保護基の選択的取り込みに基づく。当業者は、有機合成において保護基を使用することを理解しうるが、有用な保護基のクラスには、シリルエーテルが含まれる。特に、大型bulkyシリルエーテルを使用して、2ヒドロキシル上の酸不安定なオルソエステル保護基と組み合わせて、5ヒドロキシルを保護化する。次いで、この組み合わせの保護基は、標準的な固相合成技術と共に使用される。すべてのその他の合成工程の後、酸不安定なオルソエステル保護基を最終的に除去することは、重要なことである。さらに、合成のあいだシリル保護基を初期に使用することは、2ヒドロキシルの所望されない脱保護化なしに、所望したときに容易に除去することを保証する。他と差別的に除去し、そして他と差別的に化学的に不安定である保護基による2ヒドロキシルの保護化と組み合わせて、5ヒドロキシルの連続的な保護化を行うこの方法により、RNAオリゴヌクレオチドを合成した。RNAオリゴヌクレオチドは、段階的な様式で合成する。それぞれのヌクレオチドを、連続的に3から5方向、固相支持体結合オリゴヌクレオチドに対して添加する。鎖の3末端の最初のヌクレオシドは、固相支持体に対して共有結合される。ヌクレオチド前駆体であるリボヌクレオシドホスホールアミダイトおよび活性化物質を添加し、最初のヌクレオシドの5末端に対して2番目の塩基を結合する。支持体を洗浄し、そしてすべての反応しなかった5ヒドロキシル基を無水酢酸によりキャップ化して、5アセチル成分を得る。次いで、結合は、酸化されてより安定になり、そして究極的には所望のPV結合となる。ヌクレオチド付加サイクルの最後に、5シリル基をフルオリドにより切り出す。サイクルを、それぞれの次のヌクレオチドについて繰り返す。合成に続いて、ホスフェート上のメチル保護基を、30分間にわたりDMF中1Mジソジウム2カルバモイル2シアノエチレン11ジチオレート三水和物S2Na2を用いて、切り出す。脱保護化溶液を、水を使用して固相支持体結合オリゴヌクレオチドから洗い流す。次いで、支持体を、水中40メチルアミンを用いて、55°Cにて10分間、処理する。これにより、溶液中のRNAオリゴヌクレオチドが放出され、環外アミンを脱保護化し、そして2基を修飾する。オリゴヌクレオチドを、この段階にて、陰イオン交換HPLCにより解析することができる。2オルソエステル基は、除去すべき最後の保護基である。DharmaconResearchIncLafayetteCOにより開発されたエチレングリコールモノアセテートオルソエステル保護基は、以下の重要な特性を有する有用なオルソエステル保護基の一例である。それは、ヌクレオシドホスホールアミダイト合成およびオリゴヌクレオチド合成の条件に安定である。しかしながら、オリゴヌクレオチド合成の後、オリゴヌクレオチドをメチルアミンにより処理する。メチルアミンは、固相支持体からオリゴヌクレオチドを切り出すだけでなく、オルソエステルからアセチル基を除去する。オルソエステル上の得られた2エチルヒドロキシル置換基は、アセチル化された前駆体と比較して、電子求引性electronwithdrawingが低い。結果として、修飾オルソエステルは、酸で触媒された加水分解に対してより不安定になる。具体的には、切り出しの速度が、アセチル基を除去した後は10倍早い。従って、このオルソエステルは、オリゴヌクレオチド合成に適合性であるために、十分な安定性を保持し、それにもかかわらず、引き続いて修飾される場合、最終的なRNAオリゴヌクレオチド生成物に適合する比較的穏やかな水性条件下において、脱保護化が生じるようにする。さらに、RNA合成の方法は、当該技術分野において周知であるScaringeSAPhDThesisUniversityofColorado1996;ScaringeSAetalJAmChemSoc19981201182011821;MatteucciMDandCaruthersMHJAmChemSoc198110331853191;BeaucageSLandCaruthersMHTetrahedronLett19812218591862;DahlBJetalActaChemScand199044639641;ReddyMPetalTetrahedronLett19942543114314;WincottFetalNucleicAcidRes19952326772684;GriffinBEetalTetrahedron19672323012313;GriffinBEetalTetrahedron19672323152331。本発明のRNAアンチセンス化合物RNAオリゴヌクレオチドは、本明細書中の方法により合成することができ、またはDharmaconResearchIncLafayetteCOから購入することができる。いったん合成すれば、次に相補的RNAアンチセンス化合物を、当該技術分野において公知の方法によりアニーリングして、二本鎖二重鎖アンチセンス化合物を作成することができる。例えば、二重鎖は、30μlのRNAオリゴヌクレオチドの相補鎖のそれぞれ50μMRNAオリゴヌクレオチド溶液と15μlの5×アニーリングバッファー100mM酢酸カリウム、30mMHEPESKOHpH74、2mM酢酸マグネシウムとを組み合わせ、その後90°Cにて1分間加熱し、その後37°Cにて1時間反応させることにより形成することができる。得られた二重鎖アンチセンス化合物を、標的核酸の役割を調べるためのキット、アッセイ、スクリーニング、またはその他の方法において使用することができる。実施例4:キメラオリゴヌクレオチドの合成本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または、混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型でありうる。これらには、結合ヌクレオシドのギャップセグメントが結合ヌクレオシドの5あるいは3ウィングセグメントの間に位置する第一の型、及び、ギャップセグメントがオリゴマー化合物の3端あるいは5端のどちらかに位置する、第二のオープンエンド型が含まれる。第一の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、ギャップマーあるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、ヘミマーあるいはウィングマーとしても知られる。2OMe2デオキシ2OMeキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド2Oアルキルホスホロチオエートを有するキメラオリゴヌクレオチド及び2デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを、上記の通り、AppliedBiosystems自動DNAシンセサイザーModel394を使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーを用い、及び、DNA部分には2デオキシ5ジメトキシトリチル3Oホスホールアミダイトを、そして、5及び3ウィングには5ジメトキシトリチル2Oメチル3Oホスホールアミダイトを使用して、合成する。標準的な合成サイクルを、5ジメトキシトリチル2Oメチル3Oホスホールアミダイトについての反応時間を増加させたカップリング工程を取り込むことにより修飾する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切り出し、そして、濃縮アンモニアNH4OH中で55°Cにて12~16時間、脱保護化する。次いで、脱保護化したオリゴを、適切な方法沈殿、カラムクロマトグラフィーにより回収し、減圧下にて容量を減少させ、そしてキャピラリー電気泳動により、および、質量分析により、収量について、および、純度について、分光光度的に分析される。2O2メトキシエチル2デオキシ2Oメトキシエチルキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド2O2メトキシエチル2デオキシ2Oメトキシエチルキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2Oメトキシエチルアミダイトを2Oメチルアミダイトに置き換えた2Oメチルキメラオリゴヌクレオチドのための上記の方法に従って、調製した。2O2メトキシエチルホスホジエステル2デオキシホスホロチオエート2O2メトキシエチルホスホジエステルキメラオリゴヌクレオチド2O2メトキシエチルホスホジエステル2デオキシホスホロチオエート2Oメトキシエチルホスホジエステルキメラオリゴヌクレオチドは、2Oメトキシエチルアミダイトを2Oメチルアミダイトに置き換えた、2Oメチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記の方法、キメラ構造のウィング部分中のホスホジエステルヌクレオチド間結合を作るためのヨウ素を用いる酸化、中央ギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を作るための3H12ベンゾジチオール3オン11ジオキシドBeaucageReagentを使用する硫化に従って、調製する。他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5623065に従って合成される。実施例5:成長ホルモン受容体を標的とする二本鎖アンチセンス化合物の設計およびスクリーニング本発明に従って、本発明のアンチセンス化合物およびそれらの相補物を含む一連の核酸二本鎖を、成長ホルモン受容体を標的とするように設計することができる。一態様において、これらの核酸二本鎖は、二本鎖RNA化合物である短い干渉RNAあるいはsiRNA。一般的には、RNaseH依存的アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性部位は、siRNAの活性部位であると予想されるVickersetal2003JBiolChem27871087118。本発明の一態様において、二本鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、少なくとも表1に示されるオリゴヌクレオチド配列の部分を含む。あるいは、成長ホルモン受容体を標的とする一連のdsRNAを合成しそして試験する新規のジーンウォーキングgenewalkを使用することができる。dsRNA鎖の末端を、1またはそれ以上の天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を付加することにより修飾して、オーバーハングを形成することができる。次いで、dsRNAのセンス鎖を、アンチセンス鎖の相補物として設計しそして合成し、そしていずれかの末端に修飾または付加を含有してもよい。例えば、一態様において、dsRNA二本鎖の両方ともの鎖が、中央部核酸塩基にわたり相補的であり、それぞれが一方の末端または両方の末端にオーバーハングを有する。二本鎖は、単分子の二本鎖であってもまたは二分子の二本鎖であってもよい;すなわち、2本の鎖が、直接的またはリンカーにより連結されていてもよく、または別々の分子であってもよい。一例として、配列CGAGAGGCGGACGGGACCGを有しかつデオキシチミジンdTの2核酸塩基オーバーハングを有するアンチセンス鎖を含む二本鎖は、以下の構造を有する場合がある:別の態様においては、同一の配列CGAGAGGCGGACGGGACCGを有するアンチセンス鎖を含む二本鎖を、以下に示す様に、平滑末端一本鎖オーバーハングなしを有する様に調製することができる:二本鎖のRNA鎖を、本明細書中に開示する方法により合成することができ、またはDharmaconResearchIncLafayetteCOから購入することができる。いったん合成すると、相補的鎖がアニーリングされる。一本鎖を分取し、そして50μMの濃度に希釈する。いったん希釈したら、30μLの各鎖を15μLの5×アニーリングバッファー溶液と組み合わせる。前記バッファーの最終濃度は、100mM酢酸カリウム、30mMHEPESKOHpH74、および2mM酢酸マグネシウムである。最終容量は、75μLである。この溶液を、90°Cにて1分間インキュベートし、そしてその後15秒間遠心処理する。チューブを37°Cにて1時間静置させ、その時点でdsRNA二本鎖を実験に使用する。dsRNA二本鎖の最終濃度は20μMである。この溶液は、凍結して保存し20°Cそして5回まで凍結融解することができる。いったん調製したら、二本鎖アンチセンス化合物を、成長ホルモン受容体発現をモジュレートするそれらの能力について評価する。細胞が80コンフルエントに達したら、それらを本発明の二本鎖アンチセンス化合物を用いて処理する。96ウェルプレート中で増殖させた細胞に関して、ウェルを、200μLのOPTIMEM1減少血清培地GibcoBRLを用いて一度洗浄し、そして次いで、12μgmLLIPOFECTINGibcoBRLおよび最終濃度200nMの所望の二本鎖アンチセンス化合物を含有する130μLのOPTIMEM1により処理しする。処理後5時間後に、培地を新鮮な培地に置換する。細胞を処理後16時間後に回収し、その時点でRNAを単離し、そして標的の減少をRTPCRにより測定する。実施例6:オリゴヌクレオチドの単離制御孔ガラスカラム固相支持体から切り出し、そして、濃縮された水酸化アンモニウム中、55°Cにて12~16時間、脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは、1MNH4OAcから>3倍量のエタノールを用いた沈殿により回収する。合成されたオリゴヌクレオチドは、エレクトロスプレー質量分析分子量決定により、そしてキャピラリーゲル電気泳動により分析され、そして、少なくとも70の全長物質であると判断された。合成により得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル結合の相対量は、16amu生成物に対する正確な分子量の比率により決定した3248。いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをChiangらJBiolChem19912661816218171により記載の通り、HPLCで精製した。HPLC精製物質を用いて得られた結果は、非HPLC精製物質から得られたものと同様だった。実施例7:オリゴヌクレオチド合成-96ウェルプレートフォーマットオリゴヌクレオチドを、固相PIIIホスホールアミダイト化学により、96ウェルフォーマットで同時に96配列を構築することができる自動シンセサイザーで合成した。ホスホロジエステルヌクレオチド間結合はヨウ素水溶液を用いる酸化によって得られた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中3H12ベンゾジチオール3オン11ジオキシドBeaucageReagentを使用した硫化により、生成した。標準的な塩基保護βシアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトは、商業販売者例えば、PEAppliedBiosystemsFosterCityCAまたはPharmaciaPiscatawayNJから購入した。非標準ヌクレオシドは、標準的な方法、あるいは、特許の方法の通り、合成する。それらは、塩基保護βシアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトとして使用される。オリゴヌクレオチドを支持体から切り出し、そして、高温度5560°Cにて、12~16時間、濃縮NH4OHにより脱保護し、そして放出された生成物を次に減圧下で乾燥した。乾燥した生成物を次に滅菌水に再懸濁して、マスタープレートを得て、そこからすべての分析用プレート試料及び試験用プレート試料をロボットピペッターを使用して希釈する。実施例8:オリゴヌクレオチド分析-96ウェルプレートフォーマット各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈及びUV吸収分光器により調査した。個々の生成物の全長の完全性を、キャピラリー電気泳動CEにより、96ウェルフォーマットBeckmanPACETMMDQで、あるいは、個々に調製した試料については市販のCE器具例えば、BeckmanPACETM5000、ABI270で、評価した。塩基組成及びバックボーン組成は、エレクトロスプレー質量分光計を使用する化合物の質量分析により、確かめられた。すべてのアッセイ試験プレートは、マスタープレートから、シングルチャネルあるいはマルチチャネルのロボットピペッターを使用して希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも85が、少なくとも85完全長であれば、許容可能であると判断した。実施例9:細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理標的核酸の発現に対するアンチセンス化合物の効果は、測定可能なレベルで標的核酸が存在する場合、様々な細胞タイプのいずれにおいても、試験することができる。これは、例えば、PCRあるいはノザンブロット分析を使って日常的に決定することができる。以下の細胞タイプは説明のために提供されるが、選択された細胞タイプ中において標的が発現される場合には、他の細胞タイプを日常的に使用することができる。これは、当該技術分野において日常的な方法、たとえばノザンブロット解析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、あるいはRTPCR、により容易に確認することができる。T24細胞:ヒト移行上皮細胞transitionalcell膀胱癌細胞株T24細胞はAmericanTypeCultureCollectionATCCManassasVAより入手した。T24細胞は、10ウシ胎児血清InvitrogenCorporationCarlsbadCA、100unitmLペニシリン、100μgmLストレプトマイシンInvitrogenCorporationCarlsbadCAを添加した、完全McCoys5A基本培地InvitrogenCorporationCarlsbadCAで、日常的に培養した。細胞は、それが90コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により、日常的に継代した。RTPCR分析において使用するため、細胞を96ウェルプレートFalconPrimaria353872に7000細胞/ウェルの濃度でまいた。ノザンブロットあるいは他の分析のため、細胞を100mmあるいは他の標準的な組織培養プレートにまき、そして、適切な量の培地及びオリゴヌクレオチドを使用して、同様の処理をすることができる。A549細胞:ヒト肺癌細胞株A549は、AmericanTypeCultureCollectionATCCManassasVAより入手した。A549細胞は、10ウシ胎児血清InvitrogenCorporationCarlsbadCA、100unitmLペニシリン、100μgmLストレプトマイシンInvitrogenCorporationCarlsbadCAを加えた、DMEM基本培地InvitrogenCorporationCarlsbadCAで、日常的に培養した。細胞は、それが90コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により、日常的に継代した。NHDF細胞:ヒト新生児皮膚線維芽細胞NHDFは、CloneticsCorporationWalkersvilleMDより入手した。NHDFは、提供者により推奨される通り添加した線維芽細胞成長培地CloneticsCorporationWalkersvilleMDで、日常的に維持した。細胞は提供者により推奨される通り、10継代まで維持した。HEK細胞:ヒト胎児ケラチノサイトHEKはCloneticsCorporationWalkersvilleMDより入手した。HEK細胞は、提供者により推奨される通り処方されたケラチノサイト増殖培地CloneticsCorporationWalkersvilleMDで、日常的に維持した。細胞は、提供者により推奨される通り、10継代まで、日常的に維持した。MCF7細胞:ヒト乳房癌腫細胞株MCF7を、AmericanTypeCulureCollectionManassasVAから入手した。MCF7細胞は、10ウシ胎児血清GibcoLifeTechnologiesGaithersburgMDを添加したDMEM、低グルコースGibcoLifeTechnologiesGaithersburgMD中で、日常的に培養した。細胞が90コンフルエントに達したときに、細胞を、トリプシン処理および希釈により、日常的に継代した。細胞を、RTPCR解析において使用するため、96ウェルプレートFalconPrimaria3872中に、7000細胞ウェルの濃度でまいた。ノザンブロットまたは他の解析のため、細胞を100mm組織培養プレートまたはその他の標準的な組織培養プレートにまき、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理することができる。bEND細胞:マウス脳内皮細胞株、bENDを、MaxPlank研究所BadNauheimGermanyのDrWernerRisauより入手した。bEND細胞は、10ウシ胎児血清GibcoLifeTechnologiesGaithersburgMDを添加したDMEM、高グルコースGibcoLifeTechnologiesGaithersburgMD中で日常的に培養された。細胞が90コンフルエントに達した際に、細胞を、トリプシン処理と希釈により、日常的に継代した。細胞を、RTPCR解析において使用するため、3000細胞ウェルの濃度で96ウェルプレートFalconPrimaria3872中にまいた。ノザンブロットまたは他の解析のため、細胞を100mm組織培養プレートまたはその他の標準的な組織培養プレートにまき、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理することができる。アンチセンス化合物の処理:細胞が65~75コンフルエントに達したとき、オリゴヌクレオチドにより処理した。96ウェルプレートで増殖させた細胞について、ウェルを100μLのOPTIMEMTM1減少血清培地InvitrogenCorporationCarlsbadCAで一度洗浄し、次に375μgmLLIPOFECTINTMInvitrogenCorporationCarlsbadCA及び望ましい濃度のオリゴヌクレオチドを含有する、130μLのOPTIMEMTM1で処理した。細胞を処理し、そしてデータを3回繰り返しで得る。37°Cにて4~7時間処理後、培地をフレッシュな培地に交換した。オリゴヌクレオチド処理後16~24時間後に細胞を回収した。使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに変化させる。特定の細胞株に対する最適オリゴヌクレオチド濃度を決定するため、細胞をある濃度範囲の陽性対照オリゴヌクレオチドにより処理する。ヒト細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトHrasを標的とする、ISIS13920、または、ヒトJunN末端キナーゼ2JNK2を標的とする、ISIS18078、のいずれかから選択される。両方の対照とも、ホスホロチオエートバックボーンを有する2Oメトキシエチルギャップマー2Oメトキシエチルは太字で示したである。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスcrafおよびラットcrafの両方を標的とし、ホスホロチオエートバックボーンを有する2Oメトキシエチルギャップマー2Oメトキシエチルは太字で示したである、ISIS15770、である。cHarasISIS13920mRNA、JNK2ISIS18078mRNA、またはcrafISIS15770mRNAの80の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際に新規オリゴヌクレオチドについてのスクリーニング濃度として利用する。80の阻害が達成されない場合、cHras、JNK2またはcrafmRNAの60の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際にオリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。60の阻害が達成されない場合、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験については適していないものと判断する。本明細書中で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、50nM~300nMである。実施例10:成長ホルモン受容体発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析成長ホルモン受容体発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野において知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、成長ホルモン受容体mRNAレベルは、例えばノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応PCR、あるいは、リアルタイムPCRRTPCRにより、定量することができる。リアルタイム定量PCRが現在のところ好ましい。RNA分析は、全細胞内RNA、あるいは、ポリAmRNAについて行うことができる。本発明のRNA解析の好ましい方法は、本明細書中の他の実施例に記載する様な、全細胞内RNAを使用するものである。RNA単離の方法は、当該技術分野において周知である。ノザンブロット分析もまた、当該技術分野においては、日常的な方法である。リアルタイム定量PCRは、PEAppliedBiosystemsFosterCityCAから入手可能な、市販のABIPRISMTM7600、7700または7900SequenceDetectionSystemを使用することにより、都合よく成し遂げることができ、そして、製造者の指示に従って使用される。成長ホルモン受容体のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析イムノブロット、酵素結合型イムノソルベントアッセイELISA、あるいは、蛍光活性化細胞分取器FACSといった、当該技術分野において周知である様々な手法により定量することができる。成長ホルモン受容体に対する抗体は、MSRSの抗体カタログAerieCorporationBirminghamMIといった様々な供給者から、特定されそして入手することが可能であり、または、当該技術分野において周知の従来からのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体作成方法により調製することができる。成長ホルモン受容体の発現の減少は、血清またはその他の体液、組織または器官中のインスリン様成長因子Iの減少を測定することにより、間接的に測定することもまたできる。実施例11:成長ホルモン受容体阻害剤を使用するための、表現型アッセイおよびinvivo研究の計画表現型アッセイ成長ホルモン受容体阻害剤が、本明細書中に開示される方法によりいったん特定されたら、化合物を1またはそれ以上の表現型アッセイでさらに調べる。それぞれのアッセイは、特定の疾患状態または症状の治療における有効性についての測定可能な最終目標予測を有する。表現型アッセイ、およびそれらに使用するためのキット、および試薬は、当業者に対して周知であり、そして本明細書中では、健康および疾患における成長ホルモン受容体の役割および/または関連性を調べるために使用される。いくつかの商業的供給元のいずれか一つから購入することができる代表的な表現型アッセイには、細胞生存率、細胞傷害性、増殖または細胞生存を測定するためのものMolecularProbesEugeneOR;PerkinElmerBostonMA、酵素的アッセイを含むタンパク質ベースのアッセイPanveraLLCMadisonWI;BDBiosciencesFranklinLakesNJ;OncogeneResearchProductsSanDiegoCA、細胞制御、シグナル伝達、炎症、酸化プロセス、およびアポトーシスに関するものAssayDesignsIncAnnArborMI、トリグリセリド蓄積に関するものSigmaAldrichStLouisMO、血管形成アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイおよび代謝アッセイに関するものChemiconInternationalIncTemeculaCA;AmershamBiosciencesPiscatawayNJが含まれる。一つの限定的ではない事例において、特定の表現型アッセイについて適切であると判断された細胞すなわち、乳癌の研究について選択されるMCF7細胞;肥満の研究について脂肪細胞を、invitro研究から特定された成長ホルモン受容体阻害剤ならびに対照化合物により、上述した方法により決定される最適濃度にて、処理する。処理期間の最後に、処理された細胞および未処理の細胞を、表現型の結論および表現型の最終目標を決定するためのアッセイについて特異的な1またはそれ以上の方法により解析する。表現型の最終目標には、時間または処理用量に対する細胞形態の変化、ならびにタンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類、または金属などの細胞構成成分のレベルの変化が含まれる。pH、細胞周期のステージ、細胞による生物学的指標の取り込みまたは排出を含む細胞状態の測定値もまた、目的とする最終目標である。処置後の細胞の遺伝子型の解析1またはそれ以上の細胞遺伝子の発現の測定値もまた、成長ホルモン受容体阻害剤の効率または潜在力の指標として使用される。特徴的な遺伝子、または特定の疾患状態、症状、または表現型に関連することが疑われる遺伝子を、処理細胞および未処理細胞の両方ともで測定する。Invivo研究本明細書中に記載するinvivo研究の個々の被験体は、ヒトを含む温血の脊椎動物である。臨床試験は、個体が不必要にリスクに曝されず、そして個体が完全に研究におけるそれらの役割について情報を与えられることを保証する様に、厳しいコントロールのもとにおかれる。治療を受けるという心理的な作用について明らかにするため、ボランティアには、プラセボまたは成長ホルモン受容体阻害剤を無作為に与える。さらに、医師が治療においてバイアスを受けることを防止するため、医師には、彼らが投与している医薬が成長ホルモン受容体阻害剤であるかまたはプラセボであるかについての情報を与えていない。この無作為化アプローチを使用して、各ボランティアは、新しい治療法またはプラセボのいずれかを与えられることについて同一の機会を有している。ボランティアは、示される疾患状態または症状に関連する生物学的パラメータを、最初いずれかの治療前のベースライン測定値および最後最後の治療後に、そして研究期間中定期的に測定しながら、成長ホルモン受容体阻害剤またはプラセボのいずれかを、8週間の期間にわたり与えられる。そのような測定値には、前処置レベルと比較した、体液、組織または器官中の成長ホルモン受容体をコードする核酸分子レベルまたは成長ホルモン受容体タンパク質レベルが含まれる。その他の測定値には、治療される疾患状態または症状の指標、体重の指標、血圧の指標、疾患または毒性の薬理学的指標の血清力価の指標、ならびにADME吸収、分布、代謝および排出absorptiondistributionmetabolismandexcretion測定値の指標が含まれるが、これらには限定されない。それぞれの患者について記録された情報には、年齢歳、性別、身長cm、疾患状態または症状の家族歴yesno、動機付け評価motivationratingいくらか中程度高、および示された疾患または症状に関する以前の治療処置の回数および種類が含まれる。この研究に参加したボランティアは、健康な成人年齢18歳~65歳であり、およびほぼ同数の男性および女性が本研究に参加する。特定の特徴を有するボランティアを、プラセボ処置および成長ホルモン受容体阻害剤処置に均等に分配する。一般的には、プラセボで処置されるボランティアは、処置に対してほとんど反応しないかまたは全く反応せず、一方成長ホルモン受容体阻害剤で処置されるボランティアは、本研究の結論において、それらの疾患状態または症状の指標において肯定的な傾向を示す。実施例12:RNA単離ポリAmRNA単離ポリAmRNAは、MiuraらClinChem19964217581764に従って、単離された。ポリAmRNA単離のための他の方法は、当該技術分野において日常的なものである。簡潔には、96ウェルプレート上で増殖させた細胞について、細胞から増殖培地を除き、そして、各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。60μL溶解バッファー10mMTrisHCl、pH76、1mMEDTA、05MNaCl、05NP40、20mMバナジルリボヌクレオシド複合体を各ウェルに加え、プレートをゆっくり揺り動かし、そして次に、室温で5分間インキュベートした。溶解物55μLをオリゴdTをコートした96ウェルプレートAGCTIncIrvineCAに移した。プレートを、室温にて60分間インキュベートし、洗浄バッファー10mMTrisHClpH76、1mMEDTA、03MNaCl200μLで3回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオルに当てて、余分な洗浄バッファーを取り除き、そしてその後、5分間風乾した。70°Cに前もって熱した、溶出バッファー5mMTrisHClpH7660μLを、各ウェルに加え、プレートを90°Cホットプレートで5分間インキュベートし、そして、次に溶出物を新しい96ウェルプレートに移した。100mmあるいは他の標準的なプレート上で増殖させた細胞は、適切な容量のすべての溶液を用いて、同様に処理し得る。全RNA単離全RNAは、QiagenIncValenciaCAより購入したRNEASY96TMキット及びバッファーを用い、製造者の推奨する方法に従って単離した。簡潔には、96ウェルプレート上で増殖させた細胞について、増殖培地を細胞から除き、そして、各ウェルを200μL冷PBSで洗浄した。150μLのバッファーRLTを各ウェルに加え、そして、プレートを20秒間激しく揺り動かした。70エタノール150μLを次に各ウェルに加え、内容物を3回上下にピペッティングして混ぜた。次に試料を排水回収トレイを備えたQIAVACTMマニホルドに取り付け、そして減圧装置に取り付けた、RNEASY96TMウェルプレートに移した。減圧は1分間行われた。500μLのバッファーRW1をRNEASY96TMプレートの各ウェルに加え、15分間インキュベートし、そして、再び減圧を1分間行った。その後、500μLのバッファーRW1をRNEASY96TMプレートの各ウェルの添加し、そして減圧を2分間行った。その後、1mLのバッファーRPEをRNEASY96TMプレートの各ウェルの添加し、そして減圧を90秒間行った。次に、バッファーRPE洗浄を繰り返し、さらに3分間減圧を行った。プレートをQIAVACTMマニホルドから取り外し、そしてペーパータオルにあてて乾燥させた。次に、プレートを、12mL回収チューブを含む、回収チューブラックを備えたQIAVACTMマニホルドにもう一度取り付けた。RNAを次に各ウェル中の140μLのRNAseフリー水をピペッティングすることにより溶出し、1分間インキュベートし、そして次に、3分間減圧を行った。繰り返しのピペッティング及び溶出段階を、QIAGENBioRobot9604QiagenIncValenciaCAを用いて、自動化することができる。本質的には、培養プレート上で細胞を溶解した後、プレートをロボットデッキに移し、そこで、ピペッティング、DNase処理、及び、溶出段階が実行される。実施例13:成長ホルモン受容体mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析成長ホルモン受容体mRNAレベルの定量は、ABIPRISMTM7600、7700、または7900SequenceDetectionSystemPEAppliedBiosystemsFosterCityCAを製造者の指示に従って使用して、リアルタイム定量PCRにより決定された。これは、閉じられたチューブで、ゲルに基づかず、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応PCR産物のハイスループット定量ができる蛍光検出システムである。PCRが終了した後に、増幅産物が定量される標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量PCRにおける産物はそれが蓄積するに従って定量される。これは、フォワードPCRプライマー及びリバースPCRプライマーの間に特異的にアニールし、そして2つの蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドをPCR反応物中に含むことにより達せられる。レポーター色素例えば、PEAppliedBiosystemsFosterCityCA、OperonTechnologiesIncAlamedaCAまたはIntegratedDNATechnologiesIncCoralvilleIAのいずれかから入手可能なFAMあるいはJOEを、プローブの5端に結合させ、そして、クエンチャー色素例えば、PEAppliedBiosystemsFosterCityCA、OperonTechnologiesIncAlamedaCAまたはIntegratedDNATechnologiesIncCoralvilleIAのいずれかから入手可能なTAMRAを、プローブの3端に結合させる。プローブ及び色素が無傷なとき、レポーター色素の発光は3クエンチャー色素の近接により消光される。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングはTaqポリメラーゼの5エキソヌクレアーゼ活性により切断されうる基質を作り出す。PCR増幅サイクルの伸長相の間、Taqポリメラーゼによるプローブの切り出しは、プローブの残りからそしてつまりクエンチャー成分からレポーター色素を遊離し、そして、配列特異的な蛍光シグナルが生み出される。各サイクルで、さらなるレポーター色素分子はその対応するプローブから切り出され、そして、蛍光強度は、ABIPRISMTMSequenceDetectionSystemに組み込まれるレーザー光学系により、一定の間隔でモニターされる。各アッセイにおいて、未処理の対照試料由来mRNAの希釈系列を含有する一連の並行反応は、試験試料の、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パーセントを定量するのに用いられる、標準曲線を生み出す。定量的PCR解析の前に、測定される標的遺伝子に対して特異的なプライマープローブセットを、GAPDH増幅反応とともに多重化することができる能力について評価する。多重化において、標的遺伝子および内部標準遺伝子GAPDHの両方を、単一サンプル中で同時に増幅する。この解析において、非処理細胞から単離されるmRNAは、階段希釈される。それぞれの希釈物は、GAPDHのみに特異的なプライマープローブセットの存在下または標的遺伝子のみに特異的なプライマープローブセットの存在下単一反応性singleplexing、もしくは両方に特異的なプライマープローブセットの存在下多重反応性において増幅させる。PCR増幅の後、GAPDHおよび標的mRNAシグナルの標準曲線を、希釈の関数として、単一反応性サンプルおよび多重反応性サンプルの両方から作成する。多重反応性サンプルから作成されたGAPDHシグナルおよび標的シグナルの傾きおよび相関係数の両方が、単一反応性サンプルから作成されたそれらの対応する値の10以内に収まる場合には、その標的に対して特異的なプライマープローブセットは、多重化可能であるとみなされる。PCRの他の手法もまた、当該技術分野において、既知である。PCR試薬はInvitrogenCorporationCarlsbadCAより入手した。RTPCR反応は、30μL全RNA溶液20~200ngを含有する96ウェルプレートに、20μLのPCRカクテルMgCl2を含まない25×PCRバッファー、66mMMgCl2、375μMの各dATP、dCTP、dCTPおよびdGTP、375nMの各フォワードプライマーおよびリバースプライマー、125nMのプローブ、4単位のRNAseインヒビター、125単位のPLATINUM商標Taq、5単位のMuLV逆転写酵素、および25×ROX色素を加えることにより実行した。RT反応は48°Cで30分のインキュベーションにより実行された。95°Cにて10分間インキュベーションしてPLATINUM商標Taqを活性化した後、40サイクルの2ステップPCRプロトコル:95°Cにて15秒間変性その後60°Cにて15分間アニーリング/伸長を行った。リアルタイムRTPCRにより得られた遺伝子標的量は、発現が一定であるGAPDH遺伝子の発現レベルを用いて、またはRiboGreenTMMolecularProbesIncEugeneORを使用して全RNAを定量することにより、正規化する。GAPDH発現は、標的と同時に、多重化により、もしくは別々に実行することにより、リアルタイムRTPCRにより定量される。全RNAは、RiboGreenTMRNA定量試薬MolecularProbesIncEugeneORを使用して定量する。RiboGreenTMによるRNAの定量方法は、JonesLJらAnalyticalBiochemistry1998265368374の中で教示されている。このアッセイにおいて、170μLのRiboGreenTM標準試薬10mMTrisHCl、1mMEDTA、pH75中で1:350に希釈したRiboGreenTM試薬を、30μLの精製細胞RNAを含有する96ウェルプレート中にピペットで注入する。プレートを、485nmでの励起および530nmでの放射を用いて、CytoFluor4000PEAppliedBiosystems中で読み取る。刊行物に記載された配列情報本明細書中でSEQIDNO4として援用されるGenBankアクセッション番号NM0001631を使用して、ヒト成長ホルモン受容体に対するプローブおよびプライマーを、ヒト成長ホルモン受容体配列にハイブリダイズするように設計した。ヒト成長ホルモン受容体について、PCRプライマーは:フォワードプライマー:GATGTCCCAATGTGACATGCASEQIDNO5、リバースプライマー:AAGTAGGCATTGTCCATAAGGAAGTTSEQIDNO6、およびPCRプローブ:FAMCCGGAAATGGTCTCACTCTGCCAAGATAMRASEQIDNO7、であり、ここでFAMは蛍光色素であり、そして、TAMRAはクエンチャー色素である。ヒトGAPDH用のPCRプライマーは:フォワードプライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTCSEQIDNO8、リバースプライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTCSEQIDNO9であり、及びPCRプローブは:5JOECAAGCTTCCCGTTCTCAGCCTAMRA3SEQIDNO10、であり、JOEは蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRAはクエンチャー色素である。刊行物に記載された配列情報本明細書中でSEQIDNO11として援用されるGenBankアクセッション番号NM0102841を使用して、マウス成長ホルモン受容体に対するプローブおよびプライマーを、マウス成長ホルモン受容体配列にハイブリダイズするように設計した。マウス成長ホルモン受容体について、PCRプライマーは:フォワードプライマー:TTGACGAAATAGTGCAACCTGATCSEQIDNO12、リバースプライマー:CGAATCCCGGTCAAACTAATGSEQIDNO13、およびPCRプローブ:FAMCATTGGCCTCAACTGGACTTTACTAATAMRASEQIDNO14、であり、ここでFAMは蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRAはクエンチャー色素である。マウスGAPDHについてPCRプライマーは:フォワードプライマー:GGCAAATTCAACGGCACAGTSEQIDNO15、リバースプライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGATSEQIDNO16であり、及びPCRプローブは:5JOEAAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATCTAMRA3SEQIDNO17であり、JOEは蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRAはクエンチャー色素である。実施例14:成長ホルモン受容体mRNAレベルのノザンブロット分析アンチセンス処理の18時間後、単層の細胞を冷PBSで2回洗浄し、そして、1mLRNAZOLTMTELTESTBIncFriendswoodTX中で溶解した。全RNAは製造者が推奨するプロトコルに従って調製した。MOPSバッファーシステムAMRESCOIncSolonOHを用い、11ホルムアルデヒドを含有する12アガロースゲルによる電気泳動により、20μgの全RNAを分離した。NorthernSouthernTransferバッファーシステムTELTESTBIncFriendswoodTXを使用して、一晩キャピラリートランスファーすることによって、RNAをゲルからHYBONDTMNナイロンメンブレンAmershamPharmaciaBiotechPiscatawayNJに移した。RNAのトランスファーは、UV可視化により確認した。メンブレンをSTRATALINKERTMUVCrosslinker2400StratageneIncLaJollaCAを使用して、UV架橋により固定し、そしてその後QUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液StratageneLaJollaCAを使用して、ストリンジェントな条件についての製造者の推奨を用いて、プローブ化した。ヒト成長ホルモン受容体を検出するため、ヒト成長ホルモン受容体特異的プローブを、フォワードプライマーGATGTCCCAATGTGACATGCASEQIDNO5およびリバースプライマーAAGTAGGCATTGTCCATAAGGAAGTTSEQIDNO6を使用したPCRにより調製した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、ヒトグリセルアルデヒド3ホスフェートデヒドロゲナーゼGAPDHRNAClontechPaloAltoCAについてプローブ化した。マウス成長ホルモン受容体を検出するため、マウス成長ホルモン受容体特異的プローブを、フォワードプライマーTTGACGAAATAGTGCAACCTGATCSEQIDNO12およびリバースプライマーCGAATCCCGGTCAAACTAATGSEQIDNO13を使用したPCRにより調製した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、マウスグリセルアルデヒド3ホスフェートデヒドロゲナーゼGAPDHRNAClontechPaloAltoCAについてプローブ化した。PHOSPHORIMAGERTMおよびIMAGEQUANTTMSoftwareV33MolecularDynamicsSunnyvaleCAを用いて、ハイブリダイズしたメンブレンを可視化し、そして、定量した。データは未処理対照におけるGAPDHレベルに標準化した。実施例15:2MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、ヒト成長ホルモン受容体発現のアンチセンス阻害本発明に従って、刊行物に記載された配列本明細書中でSEQIDNO4として援用されるGenBankアクセッション番号NM0001631、および本明細書中でSEQIDNO18として援用されるGenBankアクセッション番号NT0067028の配列の位置468085~502183の相補鎖を用いて、一連のオリゴヌクレオチドを、ヒト成長ホルモン受容体RNAの異なる領域を標的とするように設計した。化合物は表1に示す。標的部位は、化合物が結合する特定の標的配列上の最初の最も5側のヌクレオチドを示す。表1中のすべての化合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーであり、両方の端5及び3方向を5ヌクレオチドのウィングによって挟まれた、10個の2デオキシヌクレオチドからなる中央ギャップ領域から構成される。ウィングは、2メトキシエチル2MOEヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間バックボーン結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエートPSである。全てのシチジン残基は5メチルシチジンである。化合物を、ヒト成長ホルモン受容体mRNAレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に記載の通り、定量的リアルタイムPCRにより分析した。データは、MCF7細胞を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理した3回の実験からの平均である。それぞれのデータ点についての陽性対照は、SEQIDNOにより表中に特定する。存在する場合、NDはデータなしを示す。表1に示されるように、SEQIDNO19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、73、74、75、76、77、78、79、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、および94は、このアッセイにおいてヒト成長ホルモン受容体発現の少なくとも45の阻害を示し、そして従って、好ましい。SEQIDNO30、44および57がより好ましい。ISIS272322SEQIDNO57は、すべての成長ホルモン受容体転写物中に出現する領域であるエクソン10を標的とする。従って、エクソン10を標的とする化合物は、本発明の好ましい態様である。1または複数のヒト転写物中で選択的スプライシングされることが報告されているエクソン3もまた、好ましい標的領域でありうる。表2の好ましいアンチセンス配列が相補的な標的領域は、本明細書中で好ましい標的部分と呼ばれ、そして従って本発明の化合物により標的化するために好ましい。これらの好ましい標的部分は、表3に示される。配列は、表1に示される好ましいアンチセンス化合物の逆相補鎖を示す。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸の最初の最も5末端側ヌクレオチド番号を示す。それぞれの好ましい標的部分が見いだされた種もまた、表3中に示される。実施例16:2MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、マウス成長ホルモン受容体発現のアンチセンス阻害本発明に従って、2番目の一連のアンチセンス化合物を、刊行物に記載された配列本明細書中でSEQIDNO11として援用されるGenBankアクセッション番号NM0102841、本明細書中でSEQIDNO97として援用される、エクソン1B:エクソン2に由来する選択的スプライシング部位を有するGenBankアクセッション番号AF1204802の変異体、本明細書中でSEQIDNO98として援用される、エクソン1C:エクソン2に由来する選択的スプライシング部位を有するGenBankアクセッション番号AF1204802の変異体、本明細書中でSEQIDNO99として援用される、エクソン1D:エクソン2に由来する選択的スプライシング部位を有するGenBankアクセッション番号AF1204802の変異体、および本明細書中でSEQIDNO100として援用されるゲノム配列に示されるGenBankアクセッション番号AF1204802およびGenBankアクセッション番号AC0737531由来の配列を用いて、マウス成長ホルモン受容体RNAの異なる領域を標的とするように設計した。化合物は表2に示す。標的部位は、化合物が結合する特定の標的核酸上の最初の最も5側のヌクレオチド番号を示す。表2中のすべての化合物は、長さが20ヌクレオチドの、キメラオリゴヌクレオチドギャップマーであり、両方の側5及び3方向を5ヌクレオチドのウィングによって挟まれた、10個の2デオキシヌクレオチドからなる中央ギャップ領域から構成される。ウィングは、2メトキシエチル2MOEヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間バックボーン結合はオリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエートPSである。全てのシチジン残基は5メチルシチジンである。化合物を、マウス成長ホルモン受容体mRNAレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に記載の通り、定量的リアルタイムPCRにより分析した。データは、bEND細胞を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処置した3回の実験からの平均である。それぞれのデータ点についての陽性対照は、SEQIDNOにより表中に特定する。存在する場合、NDはデータなしを示す。表2において示される様に、SEQIDNO102、103、104、105、106、107、108、110、112、113、114、115、117、120、121、123、124、126、127、129、130、131、135、137、138、140、141、146、147、148、149、150、151、156、および157は、この実験においてマウス成長ホルモン受容体発現の少なくとも50の阻害を示し、そして従って、好ましい。SEQIDNO104、147、および149がより好ましい。ISIS227446、227507および227509SEQIDNO104、147および149を、用量反応性の研究に供した。3種の化合物すべてが、それぞれ約25nM、125nMおよび125nMのIC50を有する良好な用量反応性を示した。表2の好ましいアンチセンス配列が相補的な標的領域は、本明細書中で好ましい標的部分と呼ばれ、そして従って本発明の化合物により標的化するために好ましい。これらの好ましい標的部分は、表3に示される。配列は、表2に示される好ましいアンチセンス化合物の逆相補鎖を示す。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸の最初の最も5末端側ヌクレオチド番号を示す。それぞれの好ましい標的部分が見いだされた種もまた、表3中に示される。これらの好ましい標的部分は、本発明のアンチセンス化合物によるハイブリダイゼーションに開かれており、そして利用可能であることが実験により見いだされたことから、当業者は、たかだか通常の実験を使用して、これらの好ましい標的部分に特異的にハイブリダイズし、そして結果的に成長ホルモン受容体の発現を阻害するその他の化合物を包含する本発明のさらなる態様を認識しうるかまたは確認することができる。本発明に従って、アンチセンス化合物には、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列EGSオリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも部分にハイブリダイズするその他の短いオリゴマー化合物が含まれる。実施例17:成長ホルモン受容体タンパク質レベルのウエスタンブロット分析ウエスタンブロット分析イムノブロット分析は標準的な方法を用いて行われる。細胞をオリゴヌクレオチド処理の16~20時間後に回収し、PBSで1回洗浄し、Laemmliバッファー100μlwellに懸濁し、5分間煮沸し、そして、16SDSPAGEゲルにロードする。ゲルを15時間、150Vで泳動し、そして、ウエスタンブロットのために、メンブレンにトランスファーする。成長ホルモン受容体に対する適切な一次抗体を、一次抗体の種に対する放射標識した、あるいは、蛍光標識した二次抗体とともに使用する。バンドをPHOSPHORIMAGERTMMolecularDynamicsSunnyvaleCAを使用して、可視化する。実施例18:成長ホルモン受容体に対するアンチセンスを用いて処理した後の動物における血清IGFIの減少~1週間の試験的研究体重が9~lOgの40匹のオスBalbCaマウスを、4匹/ケージでケージの中に入れ、そして1週間の研究の開始までの約1週間Day7、新しい同腹子をそれらの環境中に順応させた。この齢のマウスは、成長率が最高であった。それらのマウスの体重は、この期間中2日ごとに測定しそして記録した。マウスが11gとなったときday2、血液サンプルを以下に記載する様に麻酔下にて回収し、そして血清IGFIアッセイを行い、前処置値を決定し、そして動物の変動性を減少させるためにマウスを処置群に割り当てる際の補助とした。血液サンプルを得るため、動物をペントバルビタール50mgkg腹腔内を用いて麻酔し、そして非空腹時血液サンプルを、正確に5分後に、軽いエーテル麻酔下にてヘパリン化毛細管を介して眼球後部血管叢から回収した。40匹の動物を5群に分類し、試験のために各群は同様の体重平均および同様のIGFI平均濃度を有する様にした。動物n8/群を、以下の5種の処置群:対照塩類溶液2日ごとに1回、ASO成長ホルモン受容体に対するアンチセンスISIS227446SEQIDNO1042日ごとに1回、3および30mgkg、ミスマッチ陰性対照オリゴヌクレオチドISIS261303SEQIDNO267、ISIS227446に対して8塩基ミスマッチ2日ごとに1回、30mgkg、オクトレオチドOctreotide25pgkg1日2回、に指定した。塩類溶液、アンチセンス、ミスマッチ対照およびオクトレオチドサンプルを調製し、そしてブラインドのためにコード化した。動物に対して、塩類溶液を2日ごとに皮下投与で与え、そしてミスマッチ対照またはアンチセンスをday0、day2、day4、day6に投与により与えた。動物に対して、毎日2回、25μgのオクトレオチドを与えた。動物を、1週間の期間、4匹/ケージで収容した。マウスは、事前に決められた量の標準的なマウス飼料および水に実験を通じて常に利用できた。マウスは、実験の全体にわたって、静かで、温度および湿度を維持した環境下で、収容した。day0におよび毎日または2日目の処置前に、動物の体重を測定し、そして食料摂取を測定し、正確な用量の薬剤を投与することを可能にする。動物を、毛並み、皮膚、目、歩行、またはその他の行動の変化について、念入りにモニターした。問題は観察されなかった。day7~day7までの隔日に、体重および食料摂取を測定した。アンチセンスの最終投与の後1日のday7および/またはオクトレオチド投与の後1日のday7に、動物をペントバルビタール50mgkg腹腔投与で麻酔し、そして非空腹時血液サンプルを、正確に5分後に軽いエーテル麻酔下にてヘパリン化毛細管を介して眼球後部血管叢から回収したday7およびday0。day2およびday7に、血清IGFI測定を、ラジオイムノアッセイにより行った。結果を表4に示す。血清IGFIレベルは、ヒトの治療において、成長ホルモンの生物学的活性の最も幅広く使用される測定値である。過剰な成長ホルモンに対する細胞の反応性を妨害するTrovert、および下垂体からの成長ホルモン分泌を妨害するドーパミンアゴニスト薬物およびオクトレオチドソマトスタチンアンタゴニスト薬物の様に、それを使用して、成長ホルモンアンタゴニスト治療の効率を測定する。表4に示す様に、成長ホルモン受容体アンチセンス化合物、ISIS227446SEQIDNO104、1週間の間1日おきに30mgkgで皮下に投与したは、統計的有意性を生成し、そして対照塩類溶液群の55まで血清IGFIを特異的に減少させた。t検定により、アンチセンス30mgkgは、塩類溶液対照p<0005、そしてミスマッチ対照p<001とは有意に異なった。ミスマッチ対照は、塩類溶液対照p>005とは有意には異ならなかった。3mgkgでは、効果がなかった。30mgkgのアンチセンスを1日おきに使用する本研究において血清IGFIレベルが45の減少したことは、毎日10mgkgのTrovertを使用して得られた結果と匹敵するVanNecketalJEndocrinol2000167295303。陰性対照の8ヌクレオチドミスマッチオリゴヌクレオチドISIS261303SEQIDNO267は、対照塩類溶液群と比較して血清IGFIを21減少させた。しかしながら、この減少は、統計的に有意なものではなかったp>005を有する。オクトレオチドをそれぞれ25μg、1日2回投与した場合、day7に血清IGFIレベルに対して何の効果も無かった。オクトレオチドを用いて得られた効果なしは、糖尿病マウスにおいて、day7にこの用量およびこの用量の2回投与を使用するGroenbaekらJEndocrinol2002172637643により報告されたデータと一致している。糖尿病動物においては、50μgのオクトレオチドを1日2回、2週間投与することが、sIGFIレベルを減少させるために必要とされる。このように、成長ホルモン受容体のアンチセンス阻害剤は、ここで、対照と比較して血清インスリン様成長因子Iレベルを45、特異的に減少させることが示された。オクトレオチドまたはTrovertを使用して同様のレベルまで血清インスリン様成長因子Iを減少させることは、臨床的には、先端肥大症、巨人症、年齢に関連する黄斑変性、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病、および成長ホルモン依存性腫瘍、および上述したIGFI依存性腫瘍を含む疾患の治療することに関連する。このように、アンチセンス治療は、成長ホルモン/インスリン様成長因子I軸に関連する症状を治療するために、療法的に有用であると考えられる。インスリン様成長因子1アッセイの後の残った血清を分離し、そして80°Cにて保存した。全肝臓を急いで取り出し、秤量して液体窒素中に浸漬することにより、表示を付けたアルミニウム容器中で急速凍結させた。腎臓および脾臓もまた、液体窒素中で急速凍結させ、冷凍庫の中で80°Cで保存した。屠体を秤量し、そしてその後手頃なプラスチック袋の中に入れ、ドライアイス上で急速冷凍させ、そして80°Cで保存した。30mgkgのアンチセンスでの血清インスリン様成長因子Iの減少は、この期間にわたって体重または器官重量に影響を与える程に十分ではなかった。このことから、他の研究者の刊行物に記載された結果が確認されるVanNecketalJEndocrinol2000167295303。この研究を全体的に見ると、研究期間中の体長の増加は、75~10の範囲であった。尾の長さの増加は、全体の長さの増加に比例していた。食料摂取は、治療群間で有意には相違しなかった。成長体長および体重は、いずれの処置によっても影響を受けなかった。体重は、2種類の方法:重量増生きている動物および最終的な屠体重量で測定した。オクトレオチド群について肝臓重量g全体重がわずかに増加した以外は、絶対的な肝臓重量は変化しなかった。その他の器官の重量は、影響を受けなかった。これらの知見は、成長ホルモン受容体アンチセンスによって見いだされた様に肝臓重量がTrovertにより影響を受けなかった点を除き、vanNeckらにより報告されたTrovertを用いた知見と類似していた。本発明者らのここでの研究由来の組織サンプルにおける成長ホルモン受容体mRNAレベルは、RNaseHベースのアンチセンス作用機構について試験するため、肝臓および腎臓からアッセイされる。本発明者らのここでの研究由来の組織サンプル中でのウェスタンアッセイまたは結合アッセイによる成長ホルモン受容体タンパク質レベルは、追加的なアンチセンス作用機構および/または代替的なアンチセンス作用機構について試験するため、肝臓および/または腎臓からアッセイされる。SjogrenらProcNatlAcadSciUSA19999670887092の成長ホルモン受容体ノックアウト動物において示されるように、肝臓は、血清インスリン様成長因子Iレベルの75に寄与する。ウェスタンブロットおよびノザンブロット全RNA解析または定量的PCRによる肝臓および腎臓のインスリン様成長因子Iのサンプル解析もまた、当業者により理解されるように行われる。実施例19:成長ホルモン受容体に対するアンチセンスを用いた処置後の動物における成長ホルモン受容体活性の減少特異的結合アッセイを、ヨウ化ヒト成長ホルモン[125I]hGHを使用して肝臓組織を用いて行った。ミクロソーム膜調製物を、以下の様にして得た。400mgの組織粉末を、冷ホモジナイズバッファー50mMTrisHCl、250mMスクロース、pH74中でホモジナイズした。これを、3°Cにて10分間、2000rpmで遠心分離にかけ、そして上清を保存した。これを20分間、15000rpmで再び遠心分離にかけた。ペレットを、05mlの阻害剤を含むRRAバッファー50mMTris、20mMMgCl2、pH74中に再懸濁した。ミクロソーム調製物サンプルを特異的結合アッセイまで、80°Cで保存した。[125I]hGH特異的結合アッセイを、以下の様にして行った。4本のガラスチューブを各サンプルについて設定し、2本は用、2本は用であった。異なるサンプルおよび溶液を、それぞれのチューブに以下の様に添加した:i02mlRRAバッファー50mMTris、20mMMgCl2、01BSA、pH74;ii01ml膜12または14希釈;iiiチューブにつき01mlbGH10μgmlまたはチューブにつき01mlRRAバッファー;およびiv01ml[125I]hGHトレーサー。サンプルを、4°Cにて一晩、震盪させながらインキュベートした。反応を25mlの冷RRAを用いて停止させ、そしてサンプルを4°Cにて25分間、2800rpmで遠心分離にかけた。上清を吸引し、そしてペレットをγカウンターを使用して計数した。特異的結合能力を、CPM-CPMとして計算した。ミクロソームサンプルのタンパク質含量は、BCAタンパク質アッセイにより決定した。表5において示されるように、成長ホルモン受容体アンチセンス化合物、ISIS227446SEQIDNO104、1週間の間1日おきに30mgkgで皮下に投与したは、統計的有意性を生成しp<005、そしてそして対照塩類溶液群の61まで成長ホルモン受容体レベル成長ホルモン結合活性により測定の特異的減少を引き起こした。陰性対照の8ヌクレオチドミスマッチオリゴヌクレオチドISIS261303SEQIDNO267は、対照塩類溶液群と比較して作用を何も有さなかった。成長ホルモン受容体のアンチセンス阻害剤は、統計的有意性を生成しp<001、そして12希釈実験において対照ミスマッチ群の59まで成長ホルモン受容体レベルの特異的減少を引き起こした。成長ホルモン受容体レベルの特異的減少は、両方の希釈で、塩類溶液対照およびミスマッチ対照の両方ともと異なり、有意であったt検定によりp<005。アンチセンス処理後のこれらの成長ホルモン受容体レベル測定値は、30mgkgのアンチセンスを1日おきに使用する本発明者らの研究において、対照塩類溶液と比較して、血清インスリン様成長因子Iレベルを45減少させることと一致している。実施例20:成長ホルモン受容体に対するアンチセンスを用いた処理後の動物における成長ホルモン受容体mRNAレベルおよび血清IGFIの減少~さらに1週間の研究オスBalbCaマウスを調製し、そして上述の実施例18における様に、解析のためにグループ分けした。動物n10群を、以下の5種の処置群:対照塩類溶液2日ごとに1回ASO成長ホルモン受容体に対するアンチセンスISIS227446SEQIDNO1042日ごとに1回、30および50mgkg無関係な陰性対照オリゴヌクレオチドISIS260120TTACCGTATGGTTCCTCACT;SEQIDNO268、2日ごとに1回、50mgkg、に指定した。上述の実施例18の様に、動物を処置し、そして血清IGFIレベルを測定した。簡単に書くと、1週間の研究のあいだ、マウスに対して、塩類溶液を皮下投与により2日ごとに与え、そしてday0、day2、day4、day6に投与によりミスマッチ対照またはアンチセンスを与えた。day7に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして非空腹時血清サンプルを正確に5分後に軽いエーテル麻酔下にてヘパリン化毛細管を介して眼球後部血管叢から回収した。血清IGFI測定を、day7にラジオイムノアッセイにより行った。1週間の研究において、成長ホルモン受容体アンチセンス阻害剤ISIS227446は、50mgkg用量で、塩類溶液対照と比較して33p<0001、そして無関係対照と比較して20p<0068、血清IGFIを減少させた。50mgkg用量の無関係対照は、塩類溶液と比較して血清IGFIを17減少させたp>005。この1週間の研究において処置マウスおよび非処置マウス由来の肝臓組織サンプル中の成長ホルモン受容体mRNAレベルを、アッセイした。成長ホルモン受容体アンチセンス阻害剤ISIS227446は、1週間の研究の後、肝臓中の成長ホルモン受容体mRNAレベルを、50mgkg用量で、塩類溶液対照と比較して72減少させたp<00001。30mgkg用量のISIS227446は、成長ホルモン受容体mRNAの50の減少を生じたp<00001。無関係対照オリゴヌクレオチドISIS26012050mgkgは、成長ホルモン受容体mRNAレベルを、約15減少させたp>005。実施例21:成長ホルモン受容体に対するアンチセンスを用いた処置後の動物における成長ホルモン受容体mRNAレベルおよび血清IGFIの減少~2週間の研究2週間の研究を、実施例18における1週間の研究と同様の方法で、今回はISIS227446を、3、5、10、20および30mgkgの用量で使用して、行った。ミスマッチ対照を同一用量で与えた。マウスを、14日間、1日おきに、アンチセンス化合物または塩類溶液で処置した。表6は、14日間処置したマウスにおける血清IGFIレベルを示す。P値は、t検定により決定された。14日目の血清IGFIの減少は、3mgkgと比較して、>10mgkgで得られたレベルの39~43の減少を伴う用量に依存した。3mgkgの用量のISIS227446は、血清IGFIレベルに対して何の効果も有さず、そして塩類溶液未処置対照別の実験において示されると同等であった。ミスマッチ対照では、血清IGFIレベルの減少が低かった。これらの結果は、表7中に示される。2週間の時点にミスマッチオリゴヌクレオチドで観察された30mgkgの作用は、無関係の陰性対照オリゴヌクレオチドISIS260120;SEQIDNO268では観察されなかった。この2週間の研究での処置マウスおよび未処置マウス由来の肝臓組織サンプル中での成長ホルモン受容体mRNAレベルをアッセイした。成長ホルモン受容体アンチセンス阻害剤ISIS227446は、20mgkg用量で、塩類溶液対照と比較して、2週間の研究の後、肝臓における成長ホルモン受容体mRNAレベルを50減少させたp<0001。30mgkg用量のISIS227446は、成長ホルモン受容体mRNAの53の減少を生じたp<00001。ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドISIS261303SEQIDNO267は、30mgkgで、成長ホルモン受容体mRNAレベルを約3減少させた。実施例22:網膜症に対する成長ホルモン受容体のアンチセンス阻害の作用未熟児の網膜症は、極低出生児体重の新生児において失明を引き起こす可能性がある血管新生障害である。網膜症異常血管形成は、例えば、保育器の中で見られる様な相対的に高い酸素レベルにより引き起こされる。網膜症網膜における異常血管形成のマウスモデルを使用して、血管新生の程度に対する薬物の作用を研究する。7日齢のマウスを、出生後day7~day12のあいだ、75酸素中に授乳中の母親と一緒に保育器に入れ、文献Smithetal1994InvestOphthalmolVisSci35101111;RobinsonetalProcNatlAcadSciUSA1996May149348516に記載される様に、酸素により引き起こされる網膜症を引き起こす。動物を酸素下におくあいだ、酸素濃度を少なくとも毎日測定する。出生後day12に、動物を通常大気に戻す。動物を、最大の血管新生が観察される出生後day17に犠死させる。出生後day12、day13、day14、day15、およびday16またはday7、day8、day9、day11、day13、day15およびday17に、マウスにアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。オリゴヌクレオチドを、腹腔内に、5、10、20および30mgkgの濃度で投与する。ミスマッチ対照ISIS261303および/または無関係な陰性アンチセンス対照ISIS260120もまた、与える。実施例23:追加のモデル以下の病理学的動物モデルにおいてそしてヒトにおいて、当業者により理解される様に、成長ホルモン受容体のアンチセンス阻害剤を使用する研究もまた行われる:I型およびII型糖尿病性腎症モデル、癌モデル、関節炎モデル、および化学療法により引き起こされる下痢モデル。