少なくとも濃度300mMの塩および濃度5~30のグリセロールを含む水溶液においてFVIIIを保存するステップを含む、FVIII濃度が少なくとも1μgmlでありpHが55~85である水溶液においてFVIIIを安定化する方法。前記水溶液が濃度2~20mMの二価陽イオンを含む、請求項1に記載の方法。前記水溶液が濃度005~03gkgの界面活性剤を含む、請求項1または2に記載の方法。前記塩がNaClである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。前記水溶液中の前記塩濃度が300~1000mMである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。FVIIIがBドメイン切断型変異体であり、前記FVIII濃度が少なくとも1μgmlであり、前記塩濃度が約500mMであり、前記グリセロール濃度が10~20であり、前記二価陽イオン濃度が約10mMであり、前記界面活性剤濃度が01~02gkgであり、かつ前記溶液のpHが6~8である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。少なくとも1μgmlのFVIIIを含み、pHが55~85であり、少なくとも濃度300mMの塩および濃度5~30のグリセロールを含む、FVIII水溶液。濃度005~03gkgの界面活性剤をさらに含む、請求項7に記載の溶液。濃度2~20mMの二価陽イオンをさらに含む、請求項7または8に記載の溶液。前記塩がNaClである、請求項7から9のいずれか一項に記載のFVIII溶液。前記水溶液中の前記塩濃度が300~1000mMである、請求項7から10のいずれか一項に記載のFVIII溶液。FVIIIがBドメイン切断型変異体であり、前記FVIII濃度が少なくとも1μgmlであり、前記塩濃度が約500mMであり、前記グリセロール濃度が10~20であり、前記二価陽イオン濃度が約10mMであり、前記界面活性剤濃度が01~02gkgであり、かつ前記溶液のpHが6~8である、請求項7から11のいずれか一項に記載のFVIII溶液。請求項1から6のいずれか一項に記載の方法および請求項7から12のいずれか一項に記載の溶液を用いた分離または精製の間にFVIIIが安定化される、サイズ排除クロマトグラフィーによるFVIIIの分離または精製のための方法。請求項1から6のいずれか一項に記載の方法および請求項7から12のいずれか一項に記載の溶液を用いた修飾工程の間にFVIIIが安定化される、FVIIIの翻訳後修飾のための方法。FVIIIを安定化するための、請求項7から12のいずれか一項に記載の溶液または請求項1から6のいずれか一項に記載の方法の使用。本発明は、少なくとも濃度300mMの塩および濃度5~30のグリセロールを含む水溶液においてFVIIIを保存するステップを含む、FVIII濃度が少なくとも1μgmlでありpHが55~85である水溶液においてFVIIIを安定化する方法に関する。本発明はさらに、このような溶液およびその使用に関する。この成分の組合せによって、比較的高いFVIII濃度という条件下でFVIIIが沈殿する傾向を弱めうることが、本明細書において本発明者らによって示される。本発明の方法および溶液は、例えば、濃度が少なくとも05μgmlまで上昇するFVIIIの濃縮およびまたは精製に関してなど、FVIII濃度が05μgmlより低い状況に関しても有用である。発明の説明FVIII第VIII因子は、肝細胞によって主に産生される大型の複合糖タンパク質である。ヒトFVIIIは、シグナルペプチドを含む2351個のアミノ酸からなり、相同性に基づいて定義されるいくつかの独特なドメインを含む。3つのAドメイン、1つの独特なBドメイン、および2つのCドメインがある。ドメインの順序はNH2A1A2BA3C1C2COOHのように記載することができる。FVIIIは、BA3境界線で隔てられた2本の鎖として血漿中を循環している。これらの鎖は、二価の金属イオン結合によって連結されている。A1A2B鎖は、重鎖と呼ばれ、一方A3C1C2は軽鎖と呼ばれる。本明細書において、FVIIIは、血漿由来のFVIIIもしくは組換えFVIII、野生型FVIII、または例えば発色アッセイにおいてFVIII活性を有する任意のFVIII変異体であると理解される。このようなFVIII変異体の例としては、Bドメイン切断型欠失型変異体、およびまたは1つもしくは複数の側基に結合したFVIII、ならびにあるいは1つまたは複数のAドメインおよびまたはCドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸修飾を有するFVIII変異体などが挙げられる。このようなFVIII修飾の内の1つまたは複数の結果として、野生型FVIIIと比べて循環半減期が長いFVIII変異体が生じうる。Bドメイン野生型FVIII分子中のBドメインの長さは、約907アミノ酸である。Bドメイン切断型FVIII分子変異体中のBドメインの長さは、約10から約800アミノ酸、例えば、約10アミノ酸から約700アミノ酸などまで様々でありうる。切断されたBドメインは、重鎖およびもしくは軽鎖の断片ならびにまたは野生型FVIII分子には存在しない人工的に導入された配列を含みうる。Bドメイン切断型およびBドメイン欠失型という用語は、本明細書において同義的に使用されてよい。溶液のイオン強度Iは、その溶液におけるイオン濃度の周知の指標である。溶液のイオン強度Iは、その溶液中に存在するすべてのイオンの濃度の関数である。Table1では、本発明に関連して使用されうる様々な塩のモル濃度をイオン強度に変換している。本明細書において、水溶液水性緩衝液とは、水が主な溶媒であり、かつ有機溶媒を全く含まないか、または微々たる量およびもしくは極微量の有機溶媒、例えば1未満の有機溶媒などを含む、溶液であると理解される。本明細書において、塩とは、任意の塩、例えば、table1に記載の塩の内の1つまたは複数であると理解される。本発明の文脈におけるグリセロールとは、グリセロールならびにグリセロールの代わりとなりうる他の化合物、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、13プロパンジオール、ジエタノールアミン、スクロース、デキストロース、トレハロース、グルコースなどの例えば多価アルコールなどを意味する。このタイプの化合物が水溶液におけるFVIIIの安定化に関してグリセロールの代わりとなりうることは、当業者に周知である。本明細書において、界面活性剤表面活性剤とは、任意の界面活性剤表面活性剤、例えば、次の界面活性剤SDS、TritonX100、X114、CHAPS、DOC、NP40、Tween80およびTween20の内の1つまたは複数を含むと意図される。本発明によれば、二価陽イオン、例えばMg2、Cu2、Zn2、Ca2が溶液に添加される。Ca2は、table1に記載した塩の内の1つまたは複数ならびにCa2の形態で添加されうる。サイズ排除クロマトグラフィーSECゲル濾過クロマトグラフィーとは、溶液中の分子がそれらのサイズに基づいて分離されるクロマトグラフィー方法である。有機溶媒が移動相として使用される場合に使用されるゲル浸透クロマトグラフィーという名称に対して、典型的には、カラムを通して試料を輸送するのに水溶液が使用される場合、この技術はゲル濾過クロマトグラフィーとして公知である。SECは、ポリマーに関して優れた分子量の結果をもたらすことができるため、広く使用されているポリマーの特性決定方法である。ゲル濾過クロマトグラフィーの主な用途は、タンパク質および他の水溶性ポリマーの分画であるのに対し、ゲル浸透クロマトグラフィーは、有機可溶性ポリマーの分子量分布を解析するのに使用される。本明細書において、FVIIIの翻訳後修飾とは、例えば、その分子と親水性ポリマー、脂肪酸誘導体、アルブミン、Fcドメインなどとの結合のような、rFVIIIまたは血漿由来FVIIIの任意の修飾であることが意図される。FVIIIの修飾変換は、例えば、化学的アプローチおよびまたは酵素的アプローチを用いて起こすことができる。ペプチドの酵素的翻訳後修飾のための方法の一例は、国際公開第03031464号において開示されている。本明細書において、FVIIIの安定化は、活性FVIIIの損失の減少であると意図される。比較的高いFVIII濃度を伴う条件下でのFVIIIの貯蔵、精製および翻訳後修飾に関して、FVIII収率低下の主な原因は、FVIII分子の凝集沈殿である。したがって、本明細書において、安定化とは、高濃度FVIII溶液におけるFVIII沈殿の減少と考えることができる。実施例において、本発明による溶液およびまたは方法がFVIII収率低下の軽減をどのようにもたらすかが示される。実施形態の一覧実施形態1したがって、第1の態様において、本発明は、少なくとも濃度300mMの塩、濃度5~35のグリセロール、濃度2~20mMの二価陽イオン、および濃度005~03gkgの界面活性剤を含む水溶液においてFVIIIを保存するステップを含む、FVIII濃度が少なくとも1μgmlでありpHが55~85である水溶液においてFVIIIを安定化する方法に関する。実施形態2実施形態のいずれかに記載の方法のFVIII濃度は、少なくとも約05、06、07、08、09、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、または25000μgmlであってよい。実施形態3本発明による任意の実施形態のFVIII濃度は、例えば、1~25000μgml、例えば、1~20000μgml、1~15000μgml、1~10000μgml、1~5000μgml、1~4000μgml、1~3000μgml、1~2000μgml、1~1000μgml、1~900μgml、1~800μgml、1~700μgml、1~600μgml、1~500μgml、1~400μgml、1~300μgml、1~200μgml、1~100μgml、5~5000μgml、5~4000μgml、5~3000μgml、5~2000μgml、5~1000μgml、5~900μgml、5~800μgml、5~700μgml、5~600μgml、5~500μgml、5~400μgml、5~300μgml、5~200μgml、5~100μgml、10~25000μgml、10~20000μgml、10~15000μgml、10~10000μgml、10~5000μgml、10~4000μgml、10~3000μgml、10~2000μgml、10~1000μgml、10~900μgml、10~800μgml、10~700μgml、10~600μgml、10~500μgml、10~400μgml、10~300μgml、10~200μgml、10~100μgml、15~25000μgml、15~20000μgml、15~10000μgml、15~5000μgml、15~4000μgml、15~3000μgml、15~2000μgml、15~1000μgml、15~900μgml、15~800μgml、15~700μgml、15~600μgml、15~500μgml、15~400μgml、15~300μgml、15~200μgml、15~100μgml、20~5000μgml、20~4000μgml、20~3000μgml、20~2000μgml20~1000μgml、20~900μgml、20~800μgml、20~700μgml、20~600μgml、20~500μgml、20~400μgml、20~300μgml、20~200μgml、または20~100μgmlなどの範囲であってよい。実施形態4塩が、1つもしくは複数のナトリウム塩およびまたは1つもしくは複数のアンモニウム塩からなる群から選択される一価の塩である、本発明の実施形態のいずれかに記載の方法。このような塩の例はtable1に記載されている。実施形態5塩がNaClである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。実施形態6水溶液中の塩濃度が275~1500mM、例えば、275~1400mM、275~1300mM、275~1200mM、275~1100mM、275~100mM、275~1000mM、275~900mM、275~800mM、275~700mM、275~600mM、275~500mM、275~400mM300~1500mM、300~1400mM、300~1300mM、300~1200mM、300~1100mM、300~1000mM、300~900mM、300~800mM、300~700mM、300~600mM~300~500mM、300~400mM、325~1500mM、325~1400mM、325~1300mM、325~1200mM、325~1100mM、325~1000mM、325~900mM、325~800mM、325~700mM、325~600mM、325~500mM、325~400mM、350~1500mM、350~1400mM、350~1300mM、350~1200mM、350~1100mM、350~1000mM、350~900mM350~800mM、350~700mM、350~600mM、350~500mM、350~400mM、400~1500mM、400~1400mM、400~1300mM、400~1200mM、400~1100mM、400~1000mM、400~900mM、400~800mM、400~700mM、400~600mM、400~500mM、450~1500mM、450~1400mM、450~1300mM、450~1200mM、450~1100mM、450~1000mM、450~900mM、450~800mM、450~700mM、450~600mM、500~1500mM、500~1400mM、500~1300mM、500~1200mM、500~1100mM、500~1000mM、500~900mM、500~800mM、500~700mM、または500~600mMなどである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。実施形態7FVIIIがBドメイン切断型変異体である、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。実施形態8グリセロール濃度が5~35、例えば、5~30、5~25、5~20、5~15、5~10、125~35、125~30、125~25、125~20、125~15、15~35、15~30または15~20などである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。実施形態9二価陽イオン濃度が2~20mM、例えば、2~15mM、2~10mM、2~5mM、5~20mM、5~15mM、5~10mM、10~20mMまたは10~15mMなどである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。二価陽イオンは、例えば、table1に記載したカルシウム塩の形態で添加されてよい。実施形態10界面活性剤濃度が005~05gkg、例えば、005~04gkg、005~03gkg、005~02gkg、005~01gkg、01~05gkg、01~04gkg、01~03gkgまたは01~02gkgなどである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。本発明に関連して使用するのに適した界面活性剤の例としては、SDS、TritonX100、X114、CHAPS、DOC、NP40、Tween80およびTween20が挙げられる。実施形態11溶液のpHが55~85、例えば、55~80、55~75、55~70、55~65、55~60、60~85、60~80、60~75、60~70、60~65、65~85、65~80、65~75、65~70、70~85、70~80、70~75、75~85、75~80、または80~85などである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。実施形態12FVIII分子がBドメイン切断型変異体であり、FVIII濃度が少なくとも1μgmlであり、塩濃度が約500mMであり、グリセロール濃度が10~20であり、二価陽イオン濃度が約10mMであり、Tween濃度が01~02gkgであり、かつ溶液のpHが6~8である、本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法。実施形態13少なくとも1μgmlのFVIIIを含み、pHが55~85であり、少なくとも濃度300mMの塩、濃度5~30のグリセロール、濃度2~20mMの二価陽イオンおよび濃度005~03gkgの界面活性剤を含む、FVIII水溶液。界面活性剤は、好ましくはTween20である。実施形態14塩が、ナトリウム塩またはアンモニウム塩からなる群から選択される一価の塩である、本発明による実施形態のいずれか1つに記載のFVIII溶液。実施形態15塩がNaClである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載のFVIII溶液。実施形態16水溶液中の塩濃度が300~1000mMである、本発明による実施形態のいずれか1つに記載のFVIII溶液。好ましくは、塩はNaClである。実施形態17FVIII分子がBドメイン切断型変異体であり、FVIII濃度が少なくとも1μgmlであり、塩濃度が約500mMであり、グリセロール濃度が10~20であり、Ca2濃度が約10mMであり、Tween濃度が01~02gkgであり、かつ溶液のpHが6~8である、本発明による実施形態のいずれか1つに記載のFVIII溶液。実施形態18本発明による実施形態のいずれか1つに記載のFVIII溶液は、実施形態2に関して説明したFVIII濃度、実施形態6において説明した塩濃度、実施形態8において説明したグリセロール濃度、実施形態9において説明した二価陽イオン濃度、実施形態10において説明した界面活性剤濃度、および実施形態11において説明したpHをさらに備えていてもよい。具体的な塩は、本明細書において提案する選択肢のいずれかから選択することができる。二価陽イオンの具体的な供給源も、本明細書において提案する選択肢のいずれかから同様に選択することができる。界面活性剤の具体的な供給源も、本明細書において提案する選択肢のいずれかから同様に選択することができる。実施形態19本発明の実施形態のいずれか1つに記載の方法およびまたは本発明の実施形態のいずれか1つに記載の溶液を用いた分離または精製の間にFVIIIが安定化される、サイズ排除クロマトグラフィーによるFVIIIの分離または精製のための方法。実施形態20本発明による実施形態のいずれか1つに記載の方法およびまたは本発明の実施形態のいずれか1つに記載の溶液を用いた修飾工程の間にFVIIIが安定化される、FVIIIの翻訳後修飾のための方法。実施形態21FVIIIを安定化するための、本発明の実施形態のいずれか1つに記載の溶液およびまたは本発明の実施形態のいずれか1つに記載の方法の使用。実施形態22少なくとも濃度300mMの塩および濃度5~30のグリセロールを含む水溶液においてFVIIIを保存するステップを含む、FVIII濃度が少なくとも1μgmlでありpHが55~85である水溶液においてFVIIIを安定化する方法。実施形態23水溶液が濃度2~20mMの二価陽イオンを含む、本発明の実施形態のいずれかに記載の方法。実施形態24二価陽イオンがMgCl2である、本発明の実施形態のいずれかに記載の方法。実施形態25二価陽イオンがCaCl2である、本発明の実施形態のいずれかに記載の方法。実施形態26水溶液が濃度005~03gkgの界面活性剤を含む、本発明の実施形態のいずれか1つに記載の方法。界面活性剤は、好ましくはTweenである。実施形態27少なくとも1μgmlのFVIIIを含み、pHが55~85であり、少なくとも濃度300mMの塩、および濃度5~30のグリセロールを含む、FVIII水溶液。実施形態28濃度005~03gkgの界面活性剤をさらに含む、本発明の実施形態のいずれかに記載の溶液。界面活性剤は、好ましくはTweenである。実施形態29濃度2~20mMの二価陽イオンをさらに含む、本発明の実施形態のいずれか1つに記載の溶液。実施形態30二価陽イオンがMgCl2である、本発明の実施形態のいずれかに記載の溶液。実施形態31二価陽イオンがCaCl2である、本発明の実施形態のいずれかに記載の溶液。FVIII溶液を10mMHEPES、05MNaCl、20グリセロール、2mMCaCl2、002tween80、pH75にバッファー交換し、約30mgmlまで濃縮した。以下のパターンの緩衝液を用いて、タンパク質結晶化のための96ウェルマイクロタイタープレートを準備した横列A50mM酢酸Na、pH50、B50mMHis、pH55、C50mMHis、pH60、D50mMイミダゾール、pH65、E50mMイミダゾール、pH70F50mMHEPES、pH75G50mMHEPES、pH80H50mMGlygly、pH90縦列1および70MNaCl2および8008MNaCl3および902MNaCl4および10033MNaCl5および11053MNaCl6および1208MNaClウェルはすべて、20グリセロール、002tween80を含有した。縦列1~6は2mMCaCl2を含有し、縦列7~12は16mMCaCl2を含有した。FVIII溶液200nl緩衝液400nlを液滴として混合し、透明なフィルムでプレートを密封し、24時間インキュベートし、顕微鏡下で検査した。次の尺度に基づいて、液滴の沈殿を採点したなし清澄、低度わずかな沈殿物、高度多量の沈殿物。これらの結果を下記の表に示す。033M以上のNaCl濃度が、特に最低pH値において沈殿を回避するのに最も好都合であることが認められる。第VIII因子溶液を10mMHEPES、05MNaCl、20グリセロール、10mMCaCl2、002tween80、pH75にバッファー交換し、アミコンスピンフィルターを用いて19mgmlまで濃縮した。以下のパターンを用いて、384ウェルのマイクロタイタープレートを準備した横列A50mMHis、pH55、B50mMHis、pH60、C50mMイミダゾール、pH65D50mMイミダゾール、pH70E50mMHEPES、pH75F50mMHEPES、pH80縦列10MNaCl2017MNaCl3023MNaCl403MNaCl504MNaCl605MNaClウェルはすべて、20グリセロール、002tween80および10mMCaCl2を含有した。第VIII因子の最終濃度が5mgmlになるように、緩衝液および第VIII因子を混合した。各ウェルの光散乱の強度をWyattDynaProプレートリーダーによって測定した。強度が高いほど、自己会合が多いことが示される。これらの結果を下記の表に示す。自己会合の低度が低いことを示す最低の強度は、NaClが高濃度の場合に見出されることが認められる。本発明のいくつかの特徴を本明細書において示し説明してきたが、当業者は多くの改良、代用、変更および均等物に想到するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神の範囲内であるこのような改良および変更すべてを包含することを意図することを理解すべきである。UFDFN8を含む溶液2150gのpHおよびCaCl2をそれぞれ613および合計10mmolkgに調整した。続いて、N8を含む溶液を限外濾過によって約4mgmlまで濃縮し、次いで、5倍体積量の緩衝液を用いたダイアフィルトレーションによってバッファー交換した。次いで、N8を含む溶液を954mgmlまでさらに濃縮した。収率は、分析方法によって97~98の範囲であった。濃縮完了後に測定した全HMWPのレベルを下記の表に示す。結論として、これにより、高濃度NaClという条件下では、FVIII濃度は有意に上昇するもののHMWP形成はないことが実証される。FVIIIのPEG化出発原料は、結果としてpH61となる、05M塩化ナトリウム、10mM塩化カルシウム、20グリセロール、20mMヒスチジンおよび9mM塩酸中に75mgmlのFVIIIを含有する溶液であった。この溶液210mlにシアリダーゼ13mg、ST3Gal142mgおよび40KPEG17gを添加し、周囲の室温で177時間、反応させた。反応の最後の時点で、濁りの徴候も沈殿の徴候もなかった。FVIII分子のフロースルーモードでの疎水性相互作用クロマトグラフィーこのステップの目的は、40Kポリエチレングリコール基によって共有結合的に修飾されたFVIII分子のシアル酸付加のために使用された酵素およびHMWPを、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて除去することであった。直径05cmのカラムをTSKフェニル5PW樹脂でベッド高105cmまで充填して、ベッド容積21mlとした。450mM塩化ナトリウム、10mM塩化カルシウム、10グリセロール、002ポリソルベート80、20mMヒスチジンおよび9mM塩酸からなる5カラム容量の緩衝液でカラムを平衡化して、pH61および約35mScmの導電率を得た。濃度105mgmlのFVIII分子および0025mgmlのST3Gal3を含むロード試料に塩化ナトリウムを添加して、平衡緩衝液と同じ導電率に到達させ、かつヒスチジンおよび塩酸を加えてpH61に調整した。ロード試料、続いて平衡緩衝液をカラムに通過させた。精製されたFVIII産物は、カラムに結合せず、通過画分中に回収され、濃度085mgmlで411mlが得られた。収率は887であった。高分子量タンパク質の含有量は15から10に減少した。ST3Gal3は約24000ppmから1328ppmに減少し、これは約18分の1への減少に相当した。SEC実施例40KPEGに共有結合されているrFVIIIaならびにその反応物質の双方を含有する反応混合物に対して、GEHealthcareから入手したAKTAエクスプローラーおよびSuperdex20018Lを充填したBPG10カラムを用いて、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。流速は08CV時であり、温度は22°Cであり、ランニング緩衝液は以下からなった添加する前に、1CVの水酸化ナトリウムを用いてカラムを清掃し、UVを自動ゼロ設定する前に12CVの緩衝液で平衡化した。濃度105mgmlの反応混合物92mlをカラムに添加した。UV吸光度のシグナルが015AUcmを超えた場合、プールを採取した。濃度046mgmlのプール体積202mlが得られ、収率は98となった。説明したサイズ排除クロマトグラフィーのステップは、加工酵素ならびに他の混在物を減少させるために使用される。加工酵素ST3Gal3は、SECステップによって330分の1に減少した。