"a少なくとも下記の成分を含んでなる核酸分子によってコードされた構築物:nHOMO1PMHOMO2mを含んでなり;Pは成分を含んでなり、Mは成分を含んでなり;式中、PROM1は第1の転写促進配列であり;NEGはネガティブ選択マーカーであり;TERM1は第1の転写終止配列であり;HOMO1は、ヌクレアーゼDNA標的配列に先行するゲノム部分に相同な部分であり;PROM2は第2の転写促進配列であり;POSはポジティブ選択マーカーであり;TERM2は第2の転写終止配列であり;PROM3は第3の転写促進配列であり;MCSは多重クローニング部位であり;TERM3は第3の転写終止配列であり;HOMO2は、前記ヌクレアーゼDNA標的配列に後続するゲノム部分に相同な部分である;b少なくとも下記の成分を含んでなる核酸分子によってコードされた構築物又はを含んでなる群より選択される少なくとも1つの構築物:PROM4NUC1;NUC2;又は、本セットはまた、少なくとも下記の成分を含んでなる単離タンパク質又は組換えタンパク質である配列を含んでなり:NUC3;であり;MEGA2は前記メガヌクレアーゼ、前記TALEN又は前記ZFNのメッセンジャーRNA形態であり;MEGA3は前記メガヌクレアーゼ、前記TALEN又は前記ZFNの単離タンパク質又は組換えタンパク質であり;ここで、構築物若しくは又は配列からの前記メガヌクレアーゼ、前記TALEN又は前記ZFNは、前記ヌクレアーゼDNA標的配列を認識、切断し;構築物若しくは又は配列は、少なくとも1つの標的細胞中に構築物と同時トランスフェクトされるように構成されるを含んでなる遺伝子構築物のセット。構築物の前記成分HOMO1及びHOMO2が、前記ヌクレアーゼDNA標的配列に隣接する標的細胞ゲノムの部分に相同な少なくとも200bpで6000bpより多くない配列を含んでなる、請求項1に記載の構築物セット。構築物の前記成分HOMO1及びHOMO2が、前記ヌクレアーゼDNA標的配列に隣接する標的細胞ゲノムの部分に相同な少なくとも1000bpで2000bpより多くない配列を含んでなる、請求項1又は2に記載の構築物セット。前記成分が群:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子nptl;ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子hph;ピューロマイシンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子pac;ブラスティシジンSデアミナーゼ耐性遺伝子bsr;ブレオマイシン耐性遺伝子shbleから選択される、請求項1、2又は3に記載の構築物セット。前記成分が群:CpGアイランドが欠失した単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子HSVTKDelCpG;CpGアイランドが欠失したウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子にカップリングしているシトシンデアミナーゼCDUPRTDelCpGから選択される、請求項1~4のいずれか1項に記載の構築物セット。前記エレメントPROM1、PROM2、PROM3及びPROM4が、群:サイトメガロウイルス前初期プロモーターpCMV;シミアンウイルス40プロモーターpSV40;ヒト伸長因子1αプロモーターphEF1α;ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターphPGK;マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターpmPGK;ヒトポリユビキチンプロモーターphUbc;ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターpHSVTK;ヒト成長停止特異的5プロモーターphGAS5;テトラサイクリン応答性エレメントpTRE;脳症心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位配列IRESEMCV、口蹄疫ウイルス由来のIRES配列IRESFMDV、SV40から選択される、請求項1~5のいずれか1項に記載の構築物セット。前記エレメントTERM1、TERM2、TERM3及びTERM4が、群:ポリアデニル化シグナルSV40pA、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルBGHpAから選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載の構築物セット。前記エレメントMCSが5又は3末端にインフレームのペプチドタグを含んでなり、該ペプチドタグが、群:FLAG、FLASHREASH、IQ、ヒスチジン、STREP、ストレプトアビジン結合性タンパク質SBP、カルモジュリン結合性タンパク質CBP、ヘマグルチニンHA、cmyc、V5タグ配列、ヌクレオプラスミンからの核局在化シグナル、SV40由来のNLS、NLSコンセンサス、トロンビン切断部位、P2A切断部位、T2A切断部位、E2A切断部位から選択される、請求項1~7のいずれか1項に記載の構築物セット。前記エレメントMCSが、群:ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子LacZ、ヒト分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子hSEAP、マウス分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子mSEAPから選択されるレポーター遺伝子を含んでなる、請求項1~8のいずれか1項に記載の構築物セット。構築物が配列番号45又は配列番号46を含んでなる、請求項1~8のいずれか1項に記載の構築物セット。請求項1~10のいずれか1項に記載の遺伝子構築物のセットと;該遺伝子構築物セットを用いる形質転換細胞の作製のための指示書とを含んでなる、GOIをコードする配列を少なくとも1つの細胞中に導入するためのキット。CHOK1細胞;HEK293細胞;Caco2細胞;U2OS細胞;NIH3T3細胞;NSO細胞;SP2細胞;CHOS細胞;DG44細胞を含んでなる群より選択される少なくとも1つの標的細胞を更に含んでなる請求項11に記載のキット。a興味対象の遺伝子をコードする配列を、請求項1~9のいずれか1項の構築物の位置MCS中にクローニングする工程;b標的細胞を、工程bの前記構築物及び請求項1~9のいずれか1項の構築物、又は配列の少なくとも1つで同時トランスフェクトする工程;c前記標的細胞から、成分の存在及び成分の不存在に基づいて少なくとも1つの細胞を選択する工程を含んでなる、少なくとも1つの細胞を相同組換えにより形質転換する方法。工程cの選択が及びによりコードされている遺伝子産物の活性について逐次に行われる請求項13に記載の方法。工程cの選択が及びによりコードされている遺伝子産物の活性について同時に行われる請求項13に記載の方法。標的細胞又は生物のゲノム中の任意の点への興味対象の配列の導入にHRの能力を利用する方法であって、これまでに可能とされていたものより詳細なゲノム操作を可能にする方法が提供される。本発明者らは、ここに、a少なくとも下記の成分を含んでなる核酸分子によってコードされた構築物:nHOMO1PMHOMO2mを含んでなり;Pは成分を含んでなり、Mは成分を含んでなり;式中、PROM1は第1の転写促進配列であり;NEGはネガティブ選択マーカーであり;TERM1は第1の転写終止配列であり;HOMO1は、ヌクレアーゼDNA標的配列に先行するゲノム部分に相同な部分であり;PROM2は第2の転写促進配列であり;POSはポジティブ選択マーカーであり;TERM2は第2の転写終止配列であり;PROM3は第3の転写促進配列であり;MCSは多重クローニング部位であり、ここには興味対象の遺伝子が挿入されていてもよく;TERM3は第3の転写終止配列であり;HOMO2は、メガヌクレアーゼ、TALEN又はZFNの前記DNA標的配列に後続するゲノム部分に相同な部分である;とb下記の成分の少なくとも1つを含んでなる核酸分子によってコードされた構築物又はを含んでなる群より選択される少なくとも1つの構築物:PROM4NUC1;NUC2、又は、本セットはまた、下記の成分を少なくとも含んでなる単離タンパク質又は組換えタンパク質である配列を含んでなる:NUC3であり;NUC2は前記メガヌクレアーゼ、TALEN又はZFNのメッセンジャーRNA形態であり;NUC3は前記メガヌクレアーゼ、TALEN又はZFNの単離タンパク質又は組換えタンパク質であり;ここで、構築物若しくは又は配列からの前記メガヌクレアーゼ、前記TALEN又は前記ZFNは、前記DNA標的配列を認識、切断し;構築物若しくは又は配列は、少なくとも1つの標的細胞中に構築物と同時トランスフェクトされるように構成されているとを含んでなる新たな遺伝子構築物セットを開発した。より一般的には、ゲノム標的を特異的に切断し、そうしてDSBを誘導することができ、12~45bpの二本鎖DNA標的配列を有する任意のヌクレアーゼを本発明において使用することができる。本発明に包含されるヌクレアーゼの非限定的な例は、メガヌクレアーゼ、TALEN、ZFNであるが、本発明はまた、ゲノム標的を切断し、そうしてDSBを誘導することができ、12~45bpの二本鎖DNA標的配列を有する少なくとも1つのエンドヌクレアーゼを含んでなる任意の融合タンパク質として規定されるキメラエンドヌクレアーゼを用いても機能し得る。特定のゲノム標的でDSBを誘導することができるヌクレアーゼに加えて、本発明はまた、12~45bpの特定ゲノム標的配列で一本鎖破断を誘導することができるヌクレアーゼの使用も包含する。SSBはまたニックとしても知られ、このようなニックを生じるヌクレアーゼは、本発明に明示的に包含される。本発明に従う構築物は、図1に非限定的な様式で説明されている。組込みマトリクス構築物及びヌクレアーゼ発現プラスミド構築物は、細胞中に同時トランスフェクトされる。同時トランスフェクションにより、操作されたヌクレアーゼが発現し、内因性の認識部位を認識し、これに結合し、この正確な部位でDNA二本鎖破断を誘導する。細胞はDNA損傷を察知し、相同組換えを誘引し、同時トランスフェクトされた組込みマトリクスをDNA修復マトリクスとして用いて損傷を修復する。なぜならば、組込みマトリクスが、破断したDNAの周囲に相同な領域を含有するからである。ポジティブ選択マーカー及びGOIが、この組換え事象の間にメガヌクレアーゼ認識部位で組み込まれる。よって、安定な標的化細胞クローンを、薬物耐性及び興味対象の組換えタンパク質の発現について選択することができる。本発明に従う構築物において使用することができる遺伝子エレメントのタイプの例を、下記に提供する。これら例は例示に過ぎず、本発明の範囲を如何なる様式でも制限するものではないとみなされるべきである。ポジティブ及びネガティブ選択マーカー遺伝子の一覧を下記の表Iに提供する。表I下記の表IIは、cis活性プロモーター配列の一覧を提供する。各細胞タイプの本来の転写特異性に依存して、種々のプロモーター配列及び又は内部リボソーム侵入部位を、カスタムメガヌクレアーゼオープンリーディングフレーム、選択マーカー遺伝子及び興味対象の遺伝子の発現を駆動するために使用することができる。この表に提供された例に加えて、転写発現レベルを増強するため及び又は感受性の転写サイレンシングを減少させるためすなわち、足場マトリクス付着領域のようなサイレンサーに、追加のcis活性調節配列もまたメガヌクレアーゼ発現プラスミド及び組込みマトリクスに挿入することができる。表II表IIIは、種々のタグエレメントの一覧を提供する。これら種々のタイプのタグ配列は、GOIクローニング後にN末端及びC末端融合物を処分するために、組込みマトリクスの多重クローニング部位に挿入することができる。表III表IVは、最も一般に使用されるレポーター遺伝子の一覧を提供する。種々のタイプのレポーター遺伝子が、ポジティブコントロールを処分するため、組込みマトリクスに導入することができる。表IV本発明において、転写促進配列は、オープンリーディングフレームをコードする第2のヌクレオチド配列と組み合わせて配置されたとき、該オープンリーディングフレームの転写を引き起こすヌクレオチド配列である。加えて、RNA分子の場合、プロモーターは、該RNA分子の翻訳レベルを増大させるように作用する非コーディング配列をいうこともある。本発明において、転写終止配列は、オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列の後に配置されたとき、該オープンリーディングフレームの転写終了を引き起こすヌクレオチド配列である。本発明において、相同部分は、別のヌクレオチド配列と共通してヌクレオチド残基を有するヌクレオチド配列であって、これら配列間に相同組換えを導くヌクレオチド配列であり、より具体的には少なくとも95の同一性、好ましくは97の同一性、より好ましくは99の同一性を有するヌクレオチド配列をいう。構築物の第1及び第2の相同部分は、標的細胞ゲノム中のヌクレアーゼ標的DNA配列に隣接する配列と100同一であることも、示されるような100未満の同一性であることもできる。具体的には、構築物の部分HOMO1及びHOMO2と宿主細胞ゲノムの相同部分との間のオーバーラップは、少なくとも200bpで6000bpを超えず、好ましくはこのオーバーラップは1000bpと2000bpとの間である。したがって、具体的には、構築物の成分HOMO1及びHOMO2は、それぞれ、宿主細胞ゲノムと相同な少なくとも200bpで6000bpを超えない配列を含んでなる。最も具体的には、構築物の成分HOMO1及びHOMO2は、それぞれ、宿主細胞ゲノムと相同な少なくとも1000bpで2000bpを超えない配列を含んでなる。効率的レベルの相同組換えを可能にするに必要なオーバーラップの量は、当該分野において公知である;これら公知レベルから出発して、本発明者らは、本発明に従う構築物セットとの使用のための最も効率的なオーバーラップ範囲を特定した。本発明において、メガヌクレアーゼ標的DNA部位又はメガヌクレアーゼ認識部位は、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼにより認識、切断される22~24bpの二本鎖パリンドローム状、部分的パリンドローム状又は非パリンドローム状ポリヌクレオチド配列を意味するものと意図される。これら用語は、メガヌクレアーゼにより二本鎖破断が引き起こされる独特なDNA位置、好ましくはゲノム位置をいう。メガヌクレアーゼ標的DNA部位は、野生型メガヌクレアーゼにより認識、切断されるDNA配列であり得る。或いは、メガヌクレアーゼDNA標的部位は、異なるDNA標的配列を認識し切断する改変メガヌクレアーゼにより認識され切断されるDNA配列であり得る。N末端IDmoIドメインとICreI単量体との融合による機能的なキメラメガヌクレアーゼの作製もまた記載されている。本発明者等は、メガヌクレアーゼが異なるDNA標的を認識するように操作することができることを示した。ICreI酵素は特に広範に研究され、異なるグループが半合理的アプローチを使用して、ICreI、ISceI、PISceI及びIMsoIの特異性を局所的に変更した。加えて、半合理的アプローチと高スループットスクリーニングとを組み合わせることによって、局所的に変更された特異性を有する何百ものICreI誘導体が操作された:-ICreIの残基Q44、R68及びR70、又はQ44、R68、D75及びI77を変異誘発し、DNA標的の±3~5位で変更された特異性を有する変形体の集団をスクリーニングによって同定した。-ICreIの残基K28、N30及びQ38、又はN30、Y33及びQ38、又はK28、Y33、Q38及びS40を変異誘発し、DNA標的の±8~10位で変更された特異性を有する変形体の集団をスクリーニングによって同定した。2つの異なる変形体が組み合わされて、各々の変形体DNA標的配列の2つの異なる半分の融合から生じるキメラ標的を切断することができる機能的なへテロ二量体エンドヌクレアーゼに組み立てられた。更に、ICreIの残基28~40及び44~77が、ホーミングエンドヌクレアーゼ半部位の別個の部分に結合することができる2つの分離可能な機能的サブドメインを形成することが示された。ICreIの同一単量体内の2つのサブドメインの変異の組合せにより、各サブドメインが結合する±3~5位及び±8~10位のヌクレオチドを含んでなるパリンドローム状の組合せDNA標的配列を切断することができる新規キメラ分子の設計が可能になった。メガヌクレアーゼ変形体を製造する方法及び哺乳動物細胞又は酵母細胞における切断誘導組換えに基づくアッセイは、国際PCT出願WO2004067736;Epinatら,NucleicAcidsRes20033129522962;Chamesら,NucleicAcidsRes200533e178及びArnouldら,JMolBiol2006355443458に記載されている。これらアッセイは、標準的な方法によりモニターすることができる機能的なLacZレポーター遺伝子を生じる。前の2つの工程の組合せにより、4つの異なるサブドメインを含むより大きなコンビナトリアルアプローチが可能になる。この異なるサブドメインは、選択された特異性を有する全体的に再設計されたメガヌクレアーゼ変形体を取得するために、別々に改変されて組み合わされる。第1の工程において、新規なメガヌクレアーゼの二者一組が、切断が望まれる標的に由来するパリンドローム状標的を切断する新たな分子に組み合わされる。その後、この半メガヌクレアーゼを組み合せることで、興味対象の標的を切断するへテロ二量体種が生じ得る。4セットの変異の、モデル標的配列又はヒトRAG1、XPC及びHPRT遺伝子からの配列を切断するへテロ二量体エンドヌクレアーゼへの組立てが、Smithら、Arnouldら及びWO2008059382にそれぞれ記載されている。メガヌクレアーゼの他の例、例えばヒトデュシェーヌ筋ジストロフィー遺伝子中の標的又はヒトカルパイン小サブユニット1遺伝子中の標的を切断するものを本発明で使用することができる。このような変形体メガヌクレアーゼ及びこれらが認識、切断する変形体DNA標的は全て、本特許出願に含まれる。特定のメガヌクレアーゼとその標的の任意の組合せを、標的細胞ゲノム中に存在し且つ構築物のHOMO1及びHOMO2と相同なゲノム部分が隣接しているメガヌクレアーゼ標的配列として使用することができる。同様に、TALEN及びZFNのような他のヌクレアーゼは、特定のDNA標的配列を認識、切断するように操作することができ、本特許出願に含まれる。TALEN及び又はZFNのような特定のヌクレアーゼとその標的の任意の組合せを、標的細胞ゲノム中に存在し且つ構築物のHOMO1及びHOMO2と相同なゲノム部分が隣接しているヌクレアーゼ標的配列として使用することができる。本発明において、マーカー遺伝子は、発現したときに該マーカー遺伝子を発現する細胞又は細胞集団と、該マーカー遺伝子を発現しない細胞又は細胞集団との弁別を可能にする遺伝子産物である。ポジティブ選択マーカーは、該マーカーを含んでなる細胞を、毒素の補充のような選択工程から回復又は救出する性質を与える。ネガティブ選択マーカーは、本来的に毒性であるか、又はプロトキシンの補充のような選択工程後に該マーカーを含んでなる細胞に死をもたらす。ここで、ネガティブマーカーはプロトキシンに作用して毒素を形成する。細胞の生存能を利用する選択に加えて、マーカー遺伝子発現に基づく細胞ソーティングのような他の選択手段も本発明に包含される。本発明において、多重クローニング部位は、該多重クローニング部位を含んでなるプラスミド中への興味対象のフラグメントのサブクローニングを可能にするように、幾つかの制限部位を含有する短いDNAセグメントである。本発明において、メガヌクレアーゼは、12~45bpの二本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼを意味するものと意図される。これは、メガヌクレアーゼ、例えばICreI又はIDmoIの野生型形態であってもよいし、これら酵素の1つの上記のような遺伝子操作形態又は1以上のメガヌクレアーゼの部分を含んでなる融合タンパク質であってもよい。本発明者らは、この系が多くのGOIに関して多くの多様なモデル哺乳動物細胞株で作用できることを示した。本発明の更なる観点によれば、成分は、群:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子nptl;ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子hph;ピューロマイシンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子pac;ブラスティシジンSデアミナーゼ耐性遺伝子bsr;ブレオマイシン耐性遺伝子shbleから選択される。好ましくは、成分は、群:CpGアイランドが欠失した単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子HSVTKDelCpG;CpGアイランドが欠失したウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子にカップリングしたシトシンデアミナーゼCDUPRTDelCpGから選択される。組込みマトリクスのランダムな細胞内線状化は、宿主ゲノム中への該構築物のランダムな組込みを導くことがある。線状化がネガティブマーカー内で生じ、そうしてその機能を不活化する場合には、これらランダム組込み事象は、細胞のプロドラッグ処理で消去されない。したがって、本発明の更なる観点に従えば、少なくとも2つの成分を含んでなる形態の構築物が提供される。組込みマトリクス上の2つのネガティブ選択発現カセットの存在はこの問題を克服する。好ましくは、エレメントPROM1、PROM2、PROM3及びPROM4は、群:サイトメガロウイルス前初期プロモーターpCMV;シミアンウイルス40プロモーターpSV40;ヒト伸長因子1αプロモーターphEF1α;ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターphPGK;マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターpmPGK;ヒトポリユビキチンプロモーターphUbc;ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターpHSVTK;ヒト成長停止特異的5プロモーターphGAS5;テトラサイクリン応答性エレメントpTRE;脳症心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位配列IRESEMCV、口蹄疫ウイルス由来のIRES配列IRESFMDV、SV40から選択される。好ましくは、エレメントTERM1、TERM2、TERM3及びTERM4は群:ポリアデニル化シグナルSV40pA、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルBGHpAから選択される。好ましくは、エレメントMCSは、5又は3末端にインフレームのペプチドタグを含んでなる。ここで、前記ペプチドタグは、群:FLAG、FLASHREASH、IQ、ヒスチジン、STREP、ストレプトアビジン結合性タンパク質SBP、カルモジュリン結合性タンパク質CBP、ヘマグルチニンHA、cmyc、V5タグ配列、ヌクレオプラスミンからの核局在化シグナル、SV40由来のNLS、NLSコンセンサス、トロンビン切断部位、P2A切断部位、T2A切断部位、E2A切断部位から選択される。検出可能なペプチドタグ、核局在化シグナル及び精製タグに加えて、MCSはまた、他の有用な追加の配列、例えば細胞透過性ペプチド、検出可能な化合物をキレートするペプチドを含むことができる。本発明の更なる特定の観点に従えば、MSCは、群:ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子LacZ、ヒト分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子hSEAP、マウス分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子mSEAPから選択されるレポーター遺伝子を含んでなり得る。このような形態の構築物は、本発明に従う構築物セットを用いるHRによる、このようなレポーター遺伝子の挿入から生じる遺伝子発現のレベルを決定するためのポジティブコントロールとして使用することができる。具体的には、構築物は配列番号45又は配列番号46を含んでなる。本発明の第2の観点に従えば、GOIをコードする配列を少なくとも1つの細胞中に導入するためのキットが提供される。該キットは、本発明の第1の観点に従う遺伝子構築物セットと、該遺伝子構築物セットを用いる形質転換細胞の作製のための指示書とを含んでなる。具体的には、前記キットは、CHOK1細胞;HEK293細胞;Caco2細胞;U2OS細胞;NIH3T3細胞;NSO細胞;SP2細胞;CHOS細胞;DG44細胞;K562細胞、U937細胞;MRC5細胞;IMR90細胞;Jurkat細胞;HepG2細胞;HeLa細胞;HT1080細胞;HCT116細胞;Huh7細胞;Huvec細胞;Molt4細胞を含んでなる群より選択される少なくとも1つの標的細胞を更に含んでなる。本発明の第3の観点に従えば、少なくとも1つの細胞を相同組換えにより形質転換する方法が提供される。該方法は以下の工程を含んでなる:a興味対象の遺伝子をコードする配列を、構築物のMCS位置中にクローニングする工程;b標的細胞を、工程aの前記構築物と上記で規定される構築物、又はの少なくとも1つとで同時トランスフェクトする工程;c前記標的細胞から少なくとも1つの細胞を成分の存在及び成分の不存在に基づいて選択する工程。具体的には、工程cの選択は、及びによってコードされている遺伝子産物の活性について逐次に行われる。或いは、工程cの選択は、及びによってコードされている遺伝子産物の活性について同時に行われる。定義-ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書中では一文字コードに従って指称される。一文字コードでは、例えば、QはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。-ヌクレオチドは下記のとおり指称される:一文字コードはヌクレオシドの塩基を指称するために使用される:aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドに関しては、rはg又はaを表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はcを表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。-メガヌクレアーゼにより、12~45bpの二本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼが意図される。例としては、ISceI、IChuI、ICreI、ICsmI、PISceI、PITliI、PIMtuI、ICeuI、ISceII、ISceIII、HO、PICivI、PICtrI、PIAaeI、PIBsuI、PIDhaI、PIDraI、PIMavI、PIMchI、PIMfuI、PIMflI、PIMgaI、PIMgoI、PIMinI、PIMkaI、PIMleI、PIMmaI、PIMshI、PIMsmI、PIMthI、PIMtuI、PIMxeI、PINpuI、PIPfuI、PIRmaI、PISpbI、PISspI、PIFacI、PIMjaI、PIPhoI、PITagI、PIThyI、PITkoI、PITspI、IMsoIが挙げられる。-ホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼにより、単一のLAGLIDADGモチーフを有し、パリンドローム状DNA標的配列を切断する野生型ホモ二量体LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばICreI若しくはIMsoI又はそれらの機能的変形体が意図される。-LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変形体又はZFN変形体又はTALEN変形体又は変形体により、それぞれLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ配列又はTALEN配列又はZFN配列の少なくとも1つのアミノ酸を異なるアミノ酸で置換して得られるタンパク質が意図される。-機能的変形体により、DNA標的、好ましくは野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はTALEN又はZFN変形体によっては切断されない新たなDNA標的を切断することができるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変形体又はTALEN変形体又はZFN変形体が意図される。例えば、このような変形体は、DNA標的配列と接触するか又は該DNA標的と直接若しくは間接に相互作用する位置でアミノ酸変化を有する。-新規な特異性を有するヌクレアーゼ変形体により、親ヌクレアーゼのものとは異なる切断標的パターンを有する変形体が意図される。変形体は、親ヌクレアーゼより少ない標的を切断してもよいし、多い標的を切断してもよい。好ましくは、変形体は、親ヌクレアーゼにより切断されない少なくとも1つの標的を切断することができる。用語新規な特異性、改変された特異性、新規な切断特異性、新規な基質特異性は、DNA標的配列のヌクレオチドに対する変形体の特異性をいう。-ICreIにより、SWISSPROTP05725又はpdbアクセッションコード1g9yの配列を有する野生型ICreIが意図される。-ドメイン又はコアドメインにより、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼに特徴的なαββαββαフォールドである、約100アミノ酸残基の配列に相当するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが意図される。前記ドメインは、逆平行βシートに折りたたまれた4つのβ鎖を含んでなる。このドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと組み合わせて、前記DNA標的を切断することができる機能的エンドヌクレアーゼを形成することができる。例えば、二量体ホーミングエンドヌクレアーゼICreIの場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは残基6~94に相当する。単量体ホーミングエンドヌクレアーゼの場合、2つのこのようなドメインがエンドヌクレアーゼの配列中に見出される;例えば、IDmoIでは、第1のドメイン及び第2のドメインが短いリンカーで隔てられている。-サブドメインにより、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的半部位の別個の部分と相互作用する、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域が意図される。2つの異なるサブドメインは独立して又は部分的に独立して挙動し、一方のサブドメイン中の変異は、他方のサブドメインの結合及び切断特性を変更しないか、又は多くの場合で該特性を変更しない。したがって、2つのサブドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的半部位の別個の部分に結合する。-βヘアピンにより、ループ又はターンにより接続されている、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆平行βシートの2つの連続したβ鎖が意図される。-単鎖メガヌクレアーゼ、単鎖キメラメガヌクレアーゼ、単鎖メガヌクレアーゼ誘導体、単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体又は単鎖誘導体により、ペプチド性スペーサーにより連結された2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメイン又はコアドメインを含んでなるメガヌクレアーゼが意図される。単鎖メガヌクレアーゼは、各々の親メガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分を含んでなるキメラDNA標的配列を切断することができる。-切断活性により、本発明の変形体の切断活性は、PCT出願WO2004067736;Epinatら,NucleicAcidsRes20033129522962;Chamesら,NucleicAcidsRes200533e178及びArnouldら,JMolBiol2006355443458に記載されるように、レポーターベクターを用いる酵母又は哺乳動物細胞における直接反復組換えアッセイにより測定され得る。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた、レポーター遺伝子の2つの短縮型非機能的コピーとその介在配列内にキメラDNA標的配列とを含んでなる。DNA標的配列は、親ホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位から、少なくとも1つのヌクレオチドの異なるヌクレオチドによる置換によって誘導される。好ましくは、DNA切断部位の1以上の位置での4塩基の異なる組合せであるパリンドローム状又は非パリンドローム状DNA標的のパネルが試験される。変形体の発現は、DNA標的配列を切断することができる機能的エンドヌクレアーゼを生じる。この切断は直接反復間の相同組換えを誘導して機能的レポーター遺伝子を生じ、この発現は適切なアッセイによりモニターすることができる。-DNA標的、DNA標的配列、標的配列、標的部位、標的、部位;認識部位、認識配列、ホーミング認識部位、ホーミング部位、切断部位により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼによって認識、切断される、22~24bpの二本鎖パリンドローム状、部分的パリンドローム状又は非パリンドローム状ポリヌクレオチド配列が意図される。これら用語は、エンドヌクレアーゼによって二本鎖破断が誘導されるべき独特なDNA位置、好ましくはゲノム位置をいう。DNA標的は、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5→3配列によって規定される。或いは、DNA標的、DNA標的配列、標的配列、標的部位、標的、部位;認識部位、認識配列、ホーミング認識部位、ホーミング部位、切断部位は、ヌクレアーゼによって認識、切断される二本鎖パリンドローム状、部分的パリンドローム状又は非パリンドローム状ポリヌクレオチド配列を意図する。-DNA標的半部位、半切断部位又は半部位により、各ヌクレアーゼドメイン又は各TAL若しくは各ジンクフィンガードメインが結合するDNA標的の部分が意図される。-キメラDNA標的又はハイブリッドDNA標的により、2つの親ヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合体が意図される。加えて、前記標的の少なくとも一方の半分は、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ標的の場合、隔てられているサブドメインによって結合されるヌクレオチドの組合せを含んでなり得る。-変異により、核酸アミノ酸配列中の1以上のヌクレオチドアミノ酸の置換、欠失及び又は付加が意図される。-ヌクレアーゼにより、特定のゲノムDNA標的を切断し、そうしてDSB又はSSBを誘導することができ、12~45bpの二本鎖DNA標的配列を有する、任意の天然に存在するか又は人工的な酵素、分子又は他の手段を意味するものと意図される。-相同により、別の配列と配列間の相同組換えを導くに十分な同一性、より具体的には少なくとも95の同一性、好ましくは97の同一性、より好ましくは99の同一性を有する配列が意図される。-同一性は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基で占められているとき、その位置で該分子同士は同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列によって共有される位置における同一の又は匹敵するヌクレオチド数の関数である。FASTA又はBLASTの一部分として入手可能であるを含む種々のアラインメントアルゴリズム及び又はプログラムを、2つの配列間の同一性を計算するために使用してもよく、例えばデフォルト設定で使用することができる。-個体は、哺乳動物及び他の脊椎動物を含む。用語哺乳動物は、本明細書中で使用する場合、子に授乳し、子を出産するか又は産卵する任意の脊椎動物を含むをいう。哺乳動物種の例としては、ヒトその他の霊長類、げっ歯類及び反芻動物が挙げられる。-興味対象の遺伝子又はGOIは、既知又は推定の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列をいう。-遺伝子疾患は、1又は幾つかの遺伝子の異常に、部分的又は完全に、直接的又は間接的に起因する任意の疾患をいう。前記異常は変異、挿入又は欠失であり得る。前記変異は点状変異であり得る。前記異常は、遺伝子のコーディング配列又はその調節配列に影響することがある。前記異常は、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造若しくは安定性に影響することがある。この遺伝子疾患は劣性でも優性でもあり得る。このような遺伝子疾患は、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝臓代謝障害、レッシュ‐ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、色素性網膜炎、毛細管拡張性運動失調、ブルーム症候群、網膜芽腫、デュシェーヌ筋ジストロフィー及びテイ‐サックス病であり得るが、これらに限定されない。-ベクター:本発明において、例えば上記で規定する構築物又はとして使用することができるベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター又は線状若しくは環状DNA若しくはRNA分子を含むがこれらに限定されない。好適なベクターは、自律複製及び又は連結されている核酸の発現が可能なものである。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、商業的に入手可能である。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルス及びアルファウイルス、及び二本鎖DNAウイルス、及びポックスウイルスを含むが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例には、トリ白血症肉腫、哺乳動物Cタイプ、Bタイプウイルス、Dタイプウイルス、HTLVBLV群、レンチウイルス、スプマウイルスが挙げられる。用語ベクターは、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。好適なベクターの1つのタイプはエピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。好適なベクターは、自律複製及び又は連結されている核酸の発現が可能なものである。作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができるベクターは、本明細書中で発現ベクターと呼ぶ。本発明に従うベクターは、YAC、BAC、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター又は線状若しくは環状DNA若しくはRNA分子を含むがこれらに限定されない。一般に、組換えDNA技術に利用される発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。多数の適切なベクターが当業者に公知である。ベクターは、選択マーカー、例えば:真核細胞培養用には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ;Scerevisiae用にはTRP1;Ecoliではテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性を含んでなり得る。これら選択マーカーはまた、本発明に従う構築物及びの一部分として使用することもできる。好ましくは、前記ベクターは、本発明のポリペプチドをコードする配列が適切な転写及び翻訳制御エレメントの制御下に配置されており、前記タンパク質の産生又は合成を可能にする発現ベクターである。したがって、前記ポリヌクレオチドは発現カセットに含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、前記コーディングポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、リボソーム部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位及び転写終止部位を含んでなる。これはまた、エンハンサー又はサイレンサーエレメントを含んでなり得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。本発明をより良く理解するため、及び本発明を実施する方法を示すために、ここで、添付の図面を参照して、本発明に従う具体的な実施形態、方法及びプロセスを示すが、これらは例示にすぎない。ここで、本発明者らが企図した具体的な態様を例として記載する。下記の説明では、十分な理解のための多くの具体的詳細が記載される。しかし、本発明がこれら具体的詳細に制限されることなく実施され得ることは、当業者に明らかである。説明が不必要にぼやかされないように、周知の方法及び構造は記載していない。実施例1:メガヌクレアーゼをコードするプラスミドの設計本発明者らを含む幾つかのグループは、特に興味対象たる天然ゲノムDNA配列を標的化するためにメガヌクレアーゼの認識能力を改変した。これら新たに開発された酵素は、天然に存在するメガヌクレアーゼに応じて設計された;本出願人らは、それらを、所与の適用のために十分に規定されたDNA配列を標的化するために使用した。本出願人らは、メガヌクレアーゼ用の高スループットスクリーニングプラットフォームを開発して、DNA鋏の膨大なコレクションを創出し、それらを改変特異性技術と組み合わせた。改変された認識特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼに関して、本発明で挙げられる例は、ICreIの元々の骨格からのタンパク質改変体に関する。しかし、本発明は、任意の他のメガヌクレアーゼ骨格、例えばISceI、ICreI、IMsoI、PISceI、IAniI、PIPfuI、IDmoI、ICeuI、ITsp0611、又は機能的ハイブリッドタンパク質に適用することができる。ほとんどのメガヌクレアーゼタンパク質は、実際には単量体であるにもかかわらず、二重内部対称性を保存しており、各々が標的DNAの半分と相互作用する2つのDNA結合性半部位を有する。このことは、2つの隔てられたサブユニットから構成され、したがって各サブユニットが認識遺伝子座の半部位を認識するへテロ二量体組成物を形成している、ICreI由来の操作されたメガヌクレアーゼには当てはまらない。本出願人らは、機能的切断活性を維持しながら両単量体を融合することが、それらを短いペプチド配列で連結することによって可能であることを既に示した。この最初の理論的枠組みから、そして図2に示されるように、ICreI由来の操作されたメガヌクレアーゼの発現は、下記を使用して行うことができる:-各単量体成分を発現する、2つの別々のDNAプラスミド同じプラスミド中の2つの別々の配列により;-両単量体成分の融合体から構成される単鎖形態を用いることにより同じプラスミドから。他の発現カセットを含有する組込みマトリクスについての場合のように、メガヌクレアーゼのオープンリーディングフレームの転写を駆動するcis活性DNAエレメントは、標的細胞株及びその中の遺伝子エレメントの相対的性質に依存して変更することができる。実施例2:組込みマトリクスの設計任意の細胞タイプにおけるメガヌクレアーゼ駆動HRを可能にするために、汎用プラスミド骨格を設計し、構築した。組込みマトリクスにクローニングされる或る種の遺伝子エレメントは必須である。相同性アームは、特異的な遺伝子標的化を達成するために必要である。これらは、iメガヌクレアーゼ標的部位の上流のゲノム領域及びiiメガヌクレアーゼ標的部位の下流のゲノム領域に特異的なプライマーを用いるPCR増幅により作製される。相同性アームの長さは、500bpと2kbの間、通常15kbである。ポジティブ選択カセットは、プロモーター領域及びターミネーター配列によって制御される耐性遺伝子から構成される。このことはまた、対抗選択カセットについても当てはまる。汎用組込みマトリクスに挿入されるこれらタイプの遺伝子エレメントについてのプラスミドマップの例pIMUniversalTKNeo、pIMUniversalCDUPRTHygroを図4に示す。図4には、ポジティブ及びネガティブ選択マーカー遺伝子が示されている。ポジティブ及び対抗選択に関与する遺伝子の一覧を表Iに示す。そのような遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子nptl、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子hph、ピューロマイシンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子pac、ブラスティシジンSデアミナーゼ耐性遺伝子bsr、ブレオマイシン耐性遺伝子shble、CpGアイランドが欠失した単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子HSVTKDelCpG、CpGアイランドが欠失したウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子にカップリングしたシトシンデアミナーゼCDUPRTDelCpGが挙げられる。発現カセットは、多重クローニング部位から構成され、MCSに、GOIが古典的な分子生物学技法を用いてクローニングされる。MCSには、プロモーター及びターミネーター配列が隣接する。このような遺伝子エレメントの一覧を表IIに示す。そのような遺伝子エレメントとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーターpCMV、シミアンウイルス40プロモーターpSV40、ヒト伸長因子1αプロモーターphEF1α、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターphPGK、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターpmPGK、ヒトポリユビキチンプロモーターphUbc、ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターpHSVTK、ヒト成長停止特異的5プロモーターphGAS5、テトラサイクリン応答性エレメントpTRE、脳症心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位配列IRESEMCV、口蹄疫ウイルス由来のIRES配列IRESFMDV、SV40ポリアデニル化シグナルSV40pA、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルBGHpAが挙げられる。この基本足場から、多くの組込みマトリクスを誘導できる。例えば、IRES配列で隔てられた二重MCSを導入して、2つのGOIを発現させることができる。MCSは、GOIのタグ化を可能にするインフレームの短い配列を備えることができる。この場合、付着させるタグのタイプに応じて多くの応用を考案することができる。表IIIは、組込みベクターに導入することができる任意付加の遺伝子エレメントの概要を示す。そのような遺伝子エレメントとしては、FLAG、FLASHREASH、IQ、ヒスチジン、STREP、ストレプトアビジン結合性タンパク質SBP、カルモジュリン結合性タンパク質CBP、ヘマグルチニンHA、cmyc、V5タグ配列、ヌクレオプラスミンからの核局在化シグナル、SV40からのNLS、NLSコンセンサス、トロンビン切断部位、P2A切断部位、T2A切断部位、E2A切断部位が挙げられる。加えて、レポーター遺伝子もまた、MCS中にクローニングすることができ、想定された染色体遺伝子座での標的化された組込み後の発現レベルを評価するためのポジティブコントロールとして役立てることができる。これらには、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子LacZ、ヒト分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子hSEAP、マウス分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子mSEAPが含まれる。最後に、メガヌクレアーゼ誘導標的化組込みは、時に、望まない事象を伴うことがある。通常、この現象には、プラスミド骨格の配列を含む組込みマトリクスの完全な挿入が関係する。この現象を少なくとも部分的に回避するために、対抗選択マーカーが、例えばKhanahmadら,2006及びJinら,2003に記載されるように、プラスミドの骨格部分に存在する。メガヌクレアーゼ駆動標的化組込みに関するこのタイプの自殺遺伝子発現系の使用は、潜在的なランダム挿入を伴う標的化細胞クローンの除去に特に関連する。組込みマトリクスの細胞内線状化もまた、宿主ゲノムにおけるランダム組込みを導くことがある。線状化は、ネガティブマーカー内で起きれば、その機能を不活化し、ランダム組込み事象は、細胞のプロドラッグ処理では除去されない。この欠点を迂回するために、本発明者らは、組込みマトリクス上に2つのネガティブ選択発現カセットが存在する組込みマトリクスを提案する;例えば、1つはHOMO1領域の上流、1つはHOMO2領域の下流。本発明者らは、少なくとも1つのネガティブ選択発現カセットの使用により多コピー標的化組込みが防止されることを示した。以前には、対抗ネガティブ選択マーカーの使用は、ランダム組込みの防止について記載されていた。本発明者らは、ここで、これらマーカーはまた多コピー標的化組込みの防止も可能にすることを示した。プラスミド骨格中、組換え誘発性エレメントの外に自殺遺伝子発現カセットを含有する組込みマトリクスにより、想定した染色体遺伝子座での組込み事象に富んだ標的化細胞クローンの選択が可能になる。幾つかの標的化細胞クローンでの自殺遺伝子発現カセットの維持は、望まない組込み事象である。なぜならば、正確な標的化プロセスは、通常、組換え誘発性エレメントの外側に位置するプラスミドベース配列の組込みを排斥するからである。したがって、細胞クローンを、自殺遺伝子系に関連する毒性プロドラッグで処理することで、このようなタイプの組込み体を含有するものを殺傷することができる。或る染色体遺伝子座での標的化組込みのための本発明は、古典的なプラスミドベース系以外のタイプのDNA起源からの組込みマトリクスを用いても得ることができる。これらには、DNA中間体が生成される任意のタイプのウイルスベクター、例えば、1LTR及び2LTRを利用する非組込みレトロウイルス及びレンチウイルス、環状プロウイルス、エピソームDNAウイルスベクター、並びにエピソーム複製状態を有する他のタイプのDNAウイルスが含まれる。実施例3:トランスフェクション及び選択本実施例では、我々は、RAG1ヒト遺伝子に位置する標的に特異的なメガヌクレアーゼを用いる、GOIの標的化された組込みの同定を導く技術的プロセスを提示する。下記の立証に使用されたRAG1特異的組込みマトリクスに関するプラスミドマップpIMRAG1MCS、pIMRAG1Lucを図6に示す。この操作されたメガヌクレアーゼはヒトRAG1遺伝子内を認識、切断することができるので、標的化組込みを実質的に全てのヒト細胞系統で得ることができる。プラスチックに接着する細胞の能力に依存して、トランスフェクション及び選択手順は異なるが、共に標的化細胞クローンの効率的な同定を導く。組込みマトリクス及びメガヌクレアーゼ発現ベクターを、細胞中に公知の技法を用いてトランスフェクトする。外来DNAを真核細胞中に導入する種々の方法が存在し、多くの材料がトランスフェクションのキャリアとして使用されている。トランスフェクション用キャリアは3種類に分類することができる:ポリマー、リポソーム及びナノ粒子。他のトランスフェクション法としては、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、熱ショック、マグネトフェクション及び専売のトランスフェクション試薬が挙げられる。31接着性HEK293細胞のトランスフェクション及び選択ここでは、例として、Lipofectamineを用いるHEK293のトランスフェクションに使用する手順を記載する。材料及び方法トランスフェクションの1日前に、HEK293細胞を10cm組織培養皿に播種する。トランスフェクション当日に、ヒトRAG1メガヌクレアーゼ発現プラスミド及び組込みマトリクス及びそれから誘導したGOI含有プラスミド又はポジティブコントロールとしてのpIMRAG1Lucを300μlの血清フリー培地に希釈する。他方で、10μlのLipofectamine試薬を290μlの血清フリー培地に希釈する。両方のミックスを5分間室温でインキュベートする。その後、希釈DNAを希釈Lipofectamine試薬に加える。このミックスをチューブの倒置により穏やかにホモジナイズし、20分間室温でインキュベートする。次いで、このトランスフェクションミックスをプレーティングした細胞上に分注し、トランスフェクト細胞を37°C、5CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。翌日、トランスフェクション培地を新鮮な完全培地と交換する。トランスフェクションの3日後、細胞を採集し、計数する。次いで、細胞を、10cm組織培養皿中、200細胞mlの密度で総容量10mlの完全培地に播種する。10cm組織培養皿を37°C、5CO2で計7日間インキュベートする。7日間の終時に、単一細胞コロニーが見られる。トランスフェクションの10日後、培養培地を、選択剤を補充した新鮮培地と交換する。本実施例では、組込みマトリクスは、全長のネオマイシン耐性遺伝子を含有する。したがって、クローンの選択は、G418スルフェートを04mgmlの濃度で用いて行う。培地の交換は2日毎又は3日毎に計7日間行う。この選択期の終時に、耐性細胞を、96ウェルプレートに単離することも、対抗選択のために10cm培養皿に維持するか又は新たな96ウェルプレートに再配置することもできる。HSVTK対抗選択マーカーが組込みマトリクスに存在するので、耐性細胞又はコロニーを10μMのガンシクロビルの存在下で培養して、ランダム挿入及び多コピー標的化組込みのような望まない組込み事象を除去することができる。GCVの存在下での5日間の培養後、更なる特徴付けのために二重耐性細胞コロニーを単離することができる。この選択期の終時に、PCRによる分子スクリーニングのために耐性細胞コロニーを単離することができる。32接着性U2OS細胞のトランスフェクション及び選択ここでは、例として、AmaxaCellLineNucleofectorKitV試薬を用いるU2OSのトランスフェクションに使用する手順を記載する。材料及び方法トランスフェクション当日に、細胞は80コンフルーエントを超えていてはならない。細胞をサブクローニング容器からトリプシン処理によって採集し、15mlコニカルチューブに集める。採集した細胞を計数する。トランスフェクションポイントあたり106細胞が必要である。細胞を300gで5分間遠心分離し、CellLineNucleofectorSolutionVに106細胞100μlの濃度で再懸濁する。Amaxaエレクトロポレーションキュベットを、i興味対象の遺伝子を含有するhsRAG1組込みマトリクスCMVNeo又はhsRAG1組込みマトリクスCMVNeoLucとhsRAG1メガヌクレアーゼプラスミド、ii100μlの細胞懸濁物を加えることにより調製する。細胞及びDNAを穏やかに混合し、AmaxaプログラムX001を用いてエレクトロポレートする。エレクトロポレーションの直後、予め加温した完全培地を細胞に加え、細胞懸濁物を、5mlの37°Cに予熱した完全培地を含む2つの10cm培養皿に分割する。次いで、10cm培養皿を37°C、5CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。トランスフェクションの2日後、完全培養培地を、04mgmlのG418を補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を2日毎又は3日毎に計7日間繰り返す。D9で、04mgmlG418を補充した完全培養培地を、04mgmlのG418及び50μMガンシクロビルを補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を2日毎又は3日毎に計5日間繰り返す。D14で、G418及びGCV耐性クローンを96ウェルプレートに採取する。この工程で、細胞を04mgmlのG418のみを補充した完全培地で維持する。この選択期の終時に、PCRによる分子スクリーニングのために耐性細胞コロニーを単離することができる。33接着性HCT116細胞のトランスフェクション及び選択ここでは、例として、FuGENEHDを用いるHCT116のトランスフェクションに使用する手順を記載する。材料及び方法トランスフェクションの1日前に、HCT116細胞を10cmの組織培養皿に播種する。トランスフェクション当日に、ヒトRAG1メガヌクレアーゼ発現プラスミド及び組込みマトリクス及びそれから誘導したGOI含有プラスミド又はポジティブコントロールとしてのpIMRAG1Lucを500μlの血清フリー培地に希釈する。次いで、15μlのFuGENEHD試薬をこのDNAミックスに希釈する。このミックスをチューブの倒置により穏やかにホモジナイズし、15分間室温でインキュベートする。次いで、このトランスフェクションミックスをプレーティングした細胞上に分注し、トランスフェクト細胞を37°C、5CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。トランスフェクションの翌日、完全培養培地を、04mgmlのG418を補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を2日毎又は3日毎に計7日間繰り返す。D9で、04mgmlG418を補充した完全培養培地を、04mgmlのG418及び50μMガンシクロビルを補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を2日毎又は3日毎に計5日間繰り返す。D14で、G418及びGCV耐性クローンを96ウェルプレートに採取する。この工程で、細胞を04mgmlのG418のみを補充した完全培地で維持する。この選択期の終時に、PCRによる分子スクリーニングのために耐性細胞コロニーを単離することができる。34接着性HepG2細胞のトランスフェクション及び選択ここでは、例として、FuGENEHDを用いるHepG2のトランスフェクションに使用する手順を記載する。材料及び方法トランスフェクションの1日前に、HCT116細胞を10cm組織培養皿に播種する。トランスフェクション当日に、ヒトRAG1メガヌクレアーゼ発現プラスミド及び組込みマトリクス及びそれから誘導したGOI含有プラスミド又はポジティブコントロールとしてのpIMRAG1Lucを500μlの血清フリー培地に希釈する。次いで、15μlのFuGENEHD試薬をこのDNAミックスに希釈する。このミックスをチューブの倒置により穏やかにホモジナイズし、15分間室温でインキュベートする。次いで、このトランスフェクションミックスをプレーティングした細胞上に分注し、トランスフェクト細胞を37°C、5CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。トランスフェクションの3日後、トランスフェクト細胞をトリプシン処理により採集し、2つの10cm培養皿に分割する。完全培養培地を、08mgmlのG418を補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を3日毎に計10日間繰り返す。D13で、08mgmlG418を補充した完全培養培地を、08mgmlのG418及び50μMガンシクロビルを補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を2日毎又は3日毎に計5日間繰り返す。D18で、細胞を、08mgmlのG418を補充した新鮮な完全培地で培養する。D24で、G418及びGCV耐性クローンを96ウェルプレートに採取する。この工程で、細胞を08mgmlのG418のみを補充した完全培地で維持する。この選択期の終時に、PCRによる分子スクリーニングのために耐性細胞コロニーを単離することができる。35接着性MRC5細胞のトランスフェクション及び選択ここでは、例として、PolyFectを用いるMRC5のトランスフェクションに使用する手順を記載する。材料及び方法トランスフェクションの1日前に、MRC5細胞を10cm組織培養皿に播種する。トランスフェクション当日に、ヒトRAG1メガヌクレアーゼ発現プラスミド及び組込みマトリクス及びそれから誘導したGOI含有プラスミド又はポジティブコントロールとしてのpIMRAG1Lucを275μlの血清フリー培地に希釈する。次いで、50μlのPolyFectHD試薬をこのDNAミックスに希釈する。このミックスをチューブの倒置により穏やかにホモジナイズし、10分間室温でインキュベートする。700μlの完全培地をこのトランスフェクションミックスに加え、その後、最終ミックスをプレーティングした細胞上に分注し、トランスフェクト細胞を37°C、5CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。トランスフェクションの3日後、細胞を採集し、計数する。次いで、細胞を10cm組織培養皿中、1000細胞mlの密度で総容量10mlの完全培地に播種する。10cm組織培養皿を37°C、5CO2で計7日間インキュベートする。7日間の終時に、単一細胞コロニーが見られる。トランスフェクションの10日後、培養培地を、G418スルフェートを04mgmlの濃度で補充した新鮮培地と交換する。培地の交換は2日毎又は3日毎に計7日間行う。D13で、04mgmlG418を補充した完全培養培地を、04mgmlのG418及び50μMガンシクロビルを補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を2日毎又は3日毎に計5日間繰り返す。この選択期の終時に、PCRによる分子スクリーニングのために耐性細胞コロニーを単離することができる。36懸濁Jurkat細胞のトランスフェクション及び選択ここでは、例として、AmaxaCellLineNucleofectorKitVを用いるJurkat細胞のトランスフェクションに使用する手順を記載する。材料及び方法トランスフェクション当日に、Jurkat細胞を15mlコニカルチューブに採集し、計数する。トランスフェクションポイントあたり2×106細胞が必要である。細胞を300gで5分間遠心分離し、CellLineNucleofectorSolutionVに2×106細胞100μlの濃度で再懸濁する。Amaxaエレクトロポレーションキュベットを、i興味対象の遺伝子を含有するhsRAG1組込みマトリクスCMVNeo又はhsRAG1組込みマトリクスCMVNeoLucとhsRAG1メガヌクレアーゼプラスミド、ii100μlの細胞懸濁物を加えることにより調製する。細胞及びDNAを穏やかに混合し、AmaxaプログラムX001を用いてエレクトロポレートする。エレクトロポレーションの直後、予め加温した完全培地を細胞に加え、細胞懸濁物を、24mlの予め加温した完全培地を含む6ウェルプレートのウェル中に移す。次いで、6ウェルプレートを37°C、5CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。トランスフェクションの3日後、完全培養培地を、07mgmlのG418を補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を2日毎又は3日毎に計17日間繰り返す。この選択期の後、耐性細胞を、丸底96ウェルプレート中、10細胞ウェルの密度で07mgmlのG418を補充した完全培地に採集し、クローニングする。十分な増殖後、PCRによる分子スクリーニングのために耐性細胞クローンを単離することができる。Jurkat細胞の場合、対抗選択プロセスは適用しない。なぜならば、Jurkat細胞株は、非常に低濃度でさえこの薬物に極端に感受性であるからである。37懸濁K562細胞のトランスフェクション及び選択ここでは、例として、AmaxaCellLineNucleofectorKitVを用いるK562細胞のトランスフェクションに使用する手順を記載する。材料及び方法トランスフェクション当日に、K562細胞を15mlコニカルチューブに採集し、計数する。トランスフェクションポイントあたり106細胞が必要である。細胞を300gで5分間遠心分離し、CellLineNucleofectorSolutionVに106細胞100μlの濃度で再懸濁する。Amaxaエレクトロポレーションキュベットを、i興味対象の遺伝子を含有するhsRAG1組込みマトリクスCMVNeo又はhsRAG1組込みマトリクスCMVNeoLucとhsRAG1メガヌクレアーゼプラスミド、ii100μlの細胞懸濁物を加えることにより調製する。細胞及びDNAを穏やかに混合し、AmaxaプログラムX001を用いてエレクトロポレートする。エレクトロポレーションの直後、予め加温した完全培地を細胞に加え、細胞懸濁物を、24mlの予め加温した完全培地を含む6ウェルプレートのウェル中に移す。次いで、6ウェルプレートを37°C、5CO2湿潤インキュベーター中でインキュベートする。トランスフェクションの3日後、完全培養培地を、05mgmlのG418を補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を2日毎又は3日毎に計7日間繰り返す。D10で、04mgmlG418を補充した完全培養培地を、05mgmlのG418及び50μMガンシクロビルを補充した新鮮な完全培地と交換する。この工程を2日毎又は3日毎に計5日間繰り返す。この選択期の後、耐性細胞を、丸底96ウェルプレート中、10細胞ウェルの密度で05mgmlのG418を補充した完全培地に採集し、クローニングする。十分な増殖後、PCRによる分子スクリーニングのために耐性細胞クローンを単離することができる。38PCRスクリーニング一旦、選択及び任意の対抗選択が達成されると、96ウェルプレートに再配置した耐性コロニー又はクローンは、96ウェル形式で維持する。耐性細胞からのゲノムDNAを作製するために、プレートの複製をする。次いで、PCRを実行して、標的化組込みを同定する。材料及び方法ゲノムDNAの調製:二重耐性細胞クローンからのゲノムDNAを、ZR96GenomicDNAKitを製造業者の推奨に従って用いて調製する。PCRプライマーの設計:本実施例では、PCRプライマーを以下のルールに従い、図8のパネルAに示されたとおりに選択する。フォワードプライマーは、異種配列に位置する。例えば、フォワードPCRプライマーは、GOIの転写を終止させるBGHpolyA配列中に位置する。リバースPCRプライマーはRAG1遺伝子座内であるが右相同性アーム外に位置する。したがって、PCR増幅は、特定の標的化組込みが生じるときにのみ、可能である。更に、この組合せのプライマーは、組み込まれるべきGOIとは独立に、標的化された事象のスクリーニングに使用することができる。FHS1PCRsc:GGAGGATTGGGAAGACAATAGCRHS1PCRSC:CTTTCACAGTCCTGTACATCTTGTPCR条件:PCR反応は、最終容量25μl中5μlのgDNAについて、025μMの各プライマー、10μMのdNTP及び05μlのHerculaseIIFusionDNApolymeraseを用いて行う。結果ヒトRAG1系における標的化された事象についてのPCRスクリーニングプロセスの例を図8に示す。パネルAには、標的化された組込み後のRAG1遺伝子座の概略図を、スクリーニングPCRプライマーの位置及び予測されるバンドサイズと共に示す。パネルB及びCには、上記のプロセスにより取得したG418RGCVR標的化細胞クローンからのgDNAについてのPCRスクリーニングの結果を示す。二重耐性クローンは96ウェルプレートに再配置されている。数日の培養後、96ウェルプレートを複製し、複製の一方はgDNA調製に使用し、他方の対応する96ウェルプレートは培養で維持する。gDNAをPCR増幅に供し、10μlのPCR反応物を08アガロースゲルにロードし、電気泳動に供する。泳動後、PCRポジティブクローンを同定するために、ゲルを臭化エチジウムで染色し、UV光に露光させる。パネルBで、我々は、96のうち、特異的なDNAバンドが現れる8クローンを同定した。このことは、成功率が83であることを表す。パネルCでは、96のうち20クローンが同定される。成功率は208である。PCRによるこの分子スクリーニングに従って、種々のヒト細胞株のhsRAG1遺伝子座中への標的化された組込みの結果を表Vに要約する。特異的な標的化組込みのレベルは、7~44であり、cGPSカスタム系の有効性が証明される。このことは、本発明が任意の種類の細胞株に適用し得ることを示している。表V:種々の細胞株における標的化組込みの要約これらポジティブクローンを更に特徴付けるために、培養で維持される対応するウェルからの細胞を、個々に、96ウェルプレート形式から10cm培養皿形式に拡張させる。39分子特徴付け二重耐性クローンにおける正確な標的化挿入は、サザンブロット分析により分子レベルで容易に同定することができる。材料及び方法標的化クローンからのgDNAを、107細胞からBloodandCellcultureDNAmidikitを用いて精製した。5~10μgのgDNAを、10倍過剰の制限酵素で、一晩のインキュベーションにより消化する。消化したgDNAを08アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン上に移す。次いで、ナイロンメンブレンを、ネオマイシン遺伝子又は3相同性アームの外側に位置するRAG1特異的配列に特異的な32PDNAプローブを用いて探索する。適切な洗浄後、オートラジオグラフィーによりプローブの特異的ハイブリダイゼーションを明らかにする。結果ここに提示した実施例で、我々は、異なる表現型を有するG418Rクローンのハイブリダイゼーションパターンを比較した。G418RPCR細胞クローンからの10のGCVR及び6つのGCVS標的化細胞クローンを分析し、G418RPCR表現型からの4つのG418R細胞クローンもサザンブロッティングで特徴付けた。これらクローンからのgDNAをHindIII制限酵素又はEcoRVで消化し、RAG1ゲノムプローブ又はネオマイシンプローブとハイブリダイズさせた。RAG1標的化遺伝子座の概略図及び制限酵素消化に応じた予想バンドサイズ及び及び使用したプローブをパネルDに示す。全てのG418RGCVRPCRクローンは、アイソジェニック組込みという当初の予測に一致する分子遺伝学的パターンを示す。パネルAでは、RAG1ゲノムプローブを使用したので、標的化されていないRAG1対立遺伝子の1つに対応する52kbに別のバンドが現れた。このバンドはまた、ネガティブコントロール並びにG418RGCVSPCRポジティブ及びネガティブクローンにも存在する。これら結果は、全てのG418RGCVRPCRクローンについて、ヒトRAG1遺伝子座の1つの対立遺伝子がメガヌクレアーゼ誘導相同組換えにより標的化されたことを証明している。対照的に、G418RGCVSPCRクローンは、標的化された事象を示唆する特異的なバンドを示さない。ネオマイシンプローブで特異的バンドは得られるが、そのサイズは予想サイズと一致しない。これらクローンは、宿主ゲノムへの組込みマトリクスのランダム組込みに起因する。HSVTKのような対抗選択マーカーとそのGCV活性プロドラッグとの使用により、このような望まない事象の排除が可能になる。加えて、G418RGCVSPCRクローンは、G418RGCVRPCRポジティブクローンとは僅かに異なる遺伝子パターンを示す。事実、G418RGCVSPCRポジティブクローンは、パネルEに示された多コピー標的化組込みと矛盾しないパターンを示す。多コピー標的化組込みは、HSVTK遺伝子の組込みが関与し、したがって細胞をGCVに対して感受性にする。本実施例で提示した全てのデータによって、頑強な選択プロセスと組み合わせたカスタムメガヌクレアーゼ誘導遺伝子標的化技術の使用が、標的化された事象の効率的な同定を導くことが証明される。このような標的化された事象は、開発された頑強な対抗選択プロセスを介して弁別することができる単コピー又は多コピー標的化組込みのいずれかであり得る。類似する様式で、この対抗選択プロセスはまた、染色体にランダム関連組込みを有する細胞クローンの排斥を可能にする。実施例4:GOI発現及び安定性41ルシフェラーゼ発現本実施例では、本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子を発現する4つの標的化クローンの発現レベルをモニターした。ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をpIMRAG1MCSにクローニングした。得られるベクターを、実施例3に記載のプロトコルに従ってHEK293細胞にトランスフェクトした。実施例3に記載された選択及び対抗選択プロセスを生き残る標的化細胞クローンを、37章及び38章に従って単離し、特徴付ける。4つのHEK293ルシフェラーゼ標的化クローンを20継代にわたって培養で維持した。各クローンを選択薬の存在下で培養した。更に、本発明者らは、レポーター遺伝子の発現を同じクローンについて選択薬なしで20継代に相当する期間にわたって評価した。材料及び方法ルシフェラーゼ発現:標的化クローンからの細胞をPBS中で2回洗浄し、その後5mlのトリプシンEDTA溶液とインキュベートする。37°Cにて5分間のインキュベーション後、細胞を15mlコニカルチューブに採集し、計数する。次いで、細胞を完全DMEM培地中に50000細胞mlの密度で再懸濁する。100μlを白色96ウェルプレートに3連で小分けする。ウェルあたり100μlのOneGlo試薬を加え、短いインキュベーションの後、プレートをマイクロプレートルミノメータで読み取ることができる。結果データを図10に示す。パネルA及びBには、4つのルシフェラーゼ標的化クローンについての平均ルシフェラーゼ発現レベルを、選択剤の存在下又は不在下のそれぞれで時間の関数として示す。これらデータは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現が、長期間の培養後でさえ顕著に安定であることを示す。更に、選択剤の存在は、導入遺伝子の長期持続性発現の確保に必須ではない。なぜならば、レポーター発現の安定性は、標的化クローンが選択剤なしで培養されたときも変わらないからである。42GFP発現及び安定性本実施例では、本発明者らは、Aequoreamacrodactyla由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子を発現する標的化クローンの発現レベルをモニターした。TagGFP2レポーター遺伝子を、pIMRAG1MCS、pIMRAG1EFIaMCS及びpIMRAG1GAS5MCSにクローニングした。得られるベクターを、実施例31に記載のプロトコルに従ってHEK293細胞にトランスフェクトした。実施例3に記載の選択及び対抗選択プロセスを生き残った標的化細胞クローンを、37章及び38章に従って単離し、特徴付ける。3つの構築物の各々からの1つのHEK293TagGFP2標的化クローンを20継代にわたって培養で維持した。選択圧は発現維持に必須ではないことが示されたので、各クローンを選択薬の不在下で培養した。材料及び方法Tag2GFP発現:標的化クローンからの細胞をPBS中で2回洗浄し、その後5mlのトリプシンEDTA溶液とインキュベートする。37°Cにて5分間のインキュベーション後、細胞を15mlコニカルチューブに採集し、計数する。次いで、細胞を完全DMEM培地中に50000細胞mlの密度で再懸濁する。次いで、細胞サンプルを、MACSQuantデバイスを用いるフローサイトメトリにより分析する。蛍光を緑色チャンネルを用いて集光し、平均蛍光単位として表す。結果データを図11に示す。3つの異なるTagGFP2標的化クローンについてのTagGFP発現の平均蛍光レベルを時間の関数として示す。これらデータは、3つの異なるプロモーターの制御下でのTagGFP2レポーター遺伝子の発現が、選択剤の不在下でさえ、長期間の培養後にも顕著に安定であることを示す。プロモーター配列に応じて、平均蛍光レベルは変動する。EF1aプロモーターは最も強いTagGFP2発現をもたらす一方、GAS5プロモーターはより弱い発現をもたらす。この結果は、TagGFP2発現が、異なるプロモーターの使用によって変調され得ることを示す。43融合タンパク質発現実施例5:標的化された組込みによる遺伝子不活化本実施例では、本発明者らは、RAG1遺伝子座が、iネオマイシン耐性遺伝子を有するRAG1組込みマトリクス及びiiハイグロマイシン耐性遺伝子を有するRAG1組込みマトリクスの逐次のhsRAG1メガヌクレアーゼ駆動標的化組込みにより崩壊した証拠を示す。材料及び方法HCT116細胞を33章に記載のプロトコルに従ってトランスフェクトした。NeoRGCVR耐性クローンを38章に記載したPCRによりスクリーニングした。NeoRGCVRPCRクローンをサザンブロットにより分析した。RAG1対立遺伝子の1つについて同定した標的化クローンのうち、1つのクローンを選択し、拡大させた。このクローンについて、第2の標的化実験を、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有するRAG1組込みマトリクスを使用したことを除いて33章に記載されたように行った。結果として、クローンの選択は、ネオマイシンの代わりにハイグロマイシンに基づいた。38章及び39章に記載のように、HygroRクローンをPCRによりスクリーニングし、PCRポジティブクローンをサザンブロットにより分析した。結果図12の左パネルに、第1の標的化実験後に得られたneoRGCVRPCRクローンのハイブリダイゼーションパターンを示す。ハイブリダイゼーションは、ゲノムDNAのHindIII消化後に、ゲノムプローブで行う。コントロールレーンに示されるように、非標的化RAG1遺伝子座は52kbバンドで同定される。このバンドは、全ての標的化クローンに、第2のバンドに加えて存在する。このことにより、RAG1遺伝子の一方の対立遺伝子は標的化されているが、他方の対立遺伝子は野生型であることが示される。これらクローンの1つを、第2のRAG1対立遺伝子の標的化を目的とする第2の実験に使用した。ハイブリダイゼーションパターンを図12の右パネルに示す。再び、ハイブリダイゼーションは、ゲノムDNAのHindIII消化後に、ゲノムプローブで行う。全ての標的化クローンで、52kbWTバンドはもはや見えない。事実、組込みマトリクスに存在する異種配列の標的化された組込みに特異的な96kbの独特なバンドは、2つを除いて全てのクローンで観察される。これら結果は、RAG1対立遺伝子が共に崩壊してRAG1遺伝子の完全な不活化が導かれたことを証明する。遺伝子不活化のためのこの逐次アプローチは、他のメガヌクレアーゼを用いて他の遺伝子座に適用することも可能である。参考文献"