"カイコ配列、1つまたは複数のスパイダーシルク弾性モチーフ配列、1つまたは複数のスパイダーシルク強度モチーフ配列、またはその組合せを含むキメラ配列によりコードされることを特徴とする組換えスパイダーシルクタンパク質。請求項1に記載の組換えシルクタンパク質において、前記スパイダーシルク弾性モチーフ配列が、MaSp様モチーフ配列またはMiSp様モチーフ配列であることを特徴とする組換えシルクタンパク質。請求項2に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質において、前記MaSp様モチーフが、MaSp1、MaSp2、またはそれらの組合せであることを特徴とする組換えスパイダーシルクタンパク質。請求項1に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質において、成長促進ペプチドをさらに含むことを特徴とする組換えスパイダーシルクタンパク質。請求項1に記載の組換えシルクタンパク質を含むキメラスパイダーシルク/カイコ繊維であって、前記シルク繊維が天然カイコシルク繊維よりも大きな張力強度を有することを特徴とするキメラスパイダーシルク/カイコ繊維。1つまたは複数のスパイダーシルク弾性モチーフ配列、1つまたは複数のスパイダーシルク強度モチーフ配列、またはそれらの組合せを含む配列を有する組換えキメラ遺伝子を有することを特徴とするトランスジェニックカイコ。請求項6に記載のトランスジェニックカイコにおいて、前記カイコが、天然カイコ繊維よりも2倍大きな張力強度を有するキメラスパイダーシルク/カイコ繊維の製造に適したキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質を産生することができることを特徴とするトランスジェニックカイコ。請求項5に記載のトランスジェニックカイコにおいて、前記トランスジェニックカイコが、トランスジェニックカイコガBombyxmoriカイコであることを特徴とするトランスジェニックカイコ。請求項6に記載のトランスジェニックカイコにおいて、8つのスパイダーシルク弾性モチーフ配列を含むことを特徴とするトランスジェニックカイコ。請求項8に記載のトランスジェニックカイコにおいて、前記スパイダーシルク弾性モチーフ配列が、MaSp様モチーフ配列またはMiSp様モチーフ配列であることを特徴とするトランスジェニックカイコ。フィブロイン重鎖fhc-スパイダーシルクキメラを発現することができるカイコガBombyxmoriシルクフィブロイン重鎖発現カセットを含む遺伝子構築物であって、前記構築物が、スパイダーシルク弾性モチーフ配列、スパイダーシルク強度モチーフ配列、またはその両方をコードするスパイダーシルクタンパク質配列を含み、前記構築物が、カイコガBombyxmorifhcシルクタンパク質のN末端およびC末端断片により挟まれていることを特徴とする遺伝子構築物。請求項11に記載の遺伝子構築物において、前記スパイダーシルクタンパク質配列が、4~8コピーの推定上の鞭毛状シルク弾性モチーフ配列および1~4コピーの推定上の牽引糸シルク強度モチーフ配列を含むことを特徴とする遺伝子構築物。請求項11に記載の遺伝子構築物において、前記弾性モチーフ配列がGPGGAであり、かつ前記強度モチーフ配列がGGPSGPGSA8であることを特徴とする遺伝子構築物。図5に定義されるような遺伝子構築物。図12Aに定義されるようなpiggyBacベクター。図12Bに定義されるようなpiggyBacベクター。キメラスパイダーシルク複合繊維の生産のための製造方法であって、a.キメラスパイダーシルク強度モチーフ配列、スパイダーシルク柔軟性モチーフ配列、またはそれらの組合せをコードする遺伝子を有するpiggyBacベクター系を使用して、トランスジェニックカイコを作製すること;b.前記トランスジェニックカイコに、前記カイコにとって天然の適切な生理学的条件下で繭を産生させること;c.繭を収集してキメラスパイダーシルク繊維を抽出することを含むことを特徴とする製造方法。請求項17に記載の方法において、前記トランスジェニックカイコが、トランスジェニックカイコガBombymoriカイコであることを特徴とする方法。スパイダーシルク複合繊維へのアセンブリに適した、安定なキメラスパイダーシルクタンパク質を安定に発現することができるトランスジェニックカイコガBombyxmoriカイコを作製する方法であって、前記キメラスパイダーシルクタンパク質が、スパイダーシルク柔軟性モチーフ配列、スパイダーシルク強度モチーフ配列、またはそれらの組合せを含む配列によりコードされており、前記方法が、a.スパイダーシルク柔軟性モチーフ配列、スパイダーシルク強度モチーフ配列、またはそれらの組合せを有する組換え遺伝子カセットを含むpiggyBacベクターを、変異カイコガBombyxmoriの卵に挿入して、注入されたカイコガBombyxmori卵を準備すること;b.適切なインキュベーション条件下で前記卵を孵化させて幼虫を準備すること;c.適切なインキュベーション条件下で前記幼虫を成熟させること;およびc.トランスジェニックカイコガBombyxmoriカイコを選択することを含むことを特徴とする方法。請求項19に記載の方法において、組換え遺伝子カセットが、トランスジェニックカイコガBombyxmoriの選択のために緑色蛍光タンパク質GFPを含むことを特徴とする方法。請求項19に記載の方法において、前記piggyBacベクターが、pXLBacII-ECFPNTDCTDmasplX1610,458pbまたはpXLBacII-ECFPNTDCTDmaspX2411,250bpであることを特徴とする方法。安定に組み込まれたスパイダーシルクタンパク質を含む合成複合シルク繊維であって、前記合成複合シルク繊維が、天然カイコシルク繊維の張力強度と比較して、かつ天然スパイダーシルク繊維と比較して、より大きな張力強度を有することを特徴とする合成複合シルク繊維。請求項22に記載の合成複合シルク繊維において、安定に組み込まれた治療用分子をさらに含むことを特徴とする合成複合シルク繊維。本発明で使用されるカイコ染色体に遺伝子を挿入する方法により、その遺伝子が染色体に安定に組み込まれ、発現され、かつ交配により同様に子孫に安定に受け継がれることが可能になる。カイコ卵への微量注入を使用する方法または遺伝子銃を使用する方法が使用できるが、使用される方法は、カイコ染色体への外来遺伝子の挿入のための標的遺伝子含有ベクターおよびトランスポゾン遺伝子NatureBiotechnology18,81-84,2000を含有するヘルパープラスミドを同時にカイコ卵に微量注入することからなることが好ましい。標的遺伝子は、微量注入されたカイコ卵から孵化し成長した組換えカイコの生殖細胞に挿入される。このようにして得られた組換えカイコの子孫は、その染色体中に標的遺伝子を安定に保持することができる。本発明で得られた組換えカイコの遺伝子は、通常のカイコと同じ方法で維持することができる。すなわち、通常条件下で卵を孵化させ、孵化した幼虫を人工飼料に集め、次いで、通常のカイコと同じ条件下でそれらを生育させることにより、第5齢のカイコまで生育させることができる。本発明では得られた組換えカイコは、カイコの発育および成長を最大化するために、通常のカイコと同じ方法で生育させることができ、通常条件下で生育させることにより外来タンパク質を産生することができる。本発明で得られた遺伝子組換えカイコは、通常のカイコと同じように、蛹になり繭を産生することができる。雄と雌は蛹段階で識別され、蛾に変態した後に、雄と雌を交配し、その翌日に卵を収集する。卵は、通常のカイコ卵と同じ方法で保存することができる。本発明の遺伝子組換えカイコは、上記のように、繁殖を繰り返すことによりその後の世代に継続することができ、かつ大量に増加させることができる。本明細書で使用されるプロモーターに関して特に限定はなく、任意の生物に由来するいかなるプロモーターもカイコ細胞内で効果的に作用するならば使用することができるが、カイコシルク腺中でタンパク質を特異的に誘導するように設計されたプロモーターが好ましい。カイコシルク腺タンパク質プロモーターの例としては、フィブロイン重鎖プロモーター、フィブロイン軽鎖プロモーター、p25プロモーター、およびセリシンプロモーターが挙げられる。本発明では、キメラスパイダーシルクタンパク質を発現するための遺伝子カセットは、昆虫細胞に挿入される場合には、キメラタンパク質の合成に必要な1組のDNAを指す。キメラスパイダーシルクタンパク質を発現するこの遺伝子カセットは、キメラスパイダーシルクタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進するプロモーターを含有する。通常、遺伝子カセットは、さらにターミネーターおよびポリA付加領域を含有し、好ましくは、プロモーター、外来タンパク質構造遺伝子、ターミネーター、およびポリA付加領域を含有する。さらに、遺伝子カセットは、プロモーターと外来タンパク質構造遺伝子との間に連結された分泌シグナル遺伝子を含有してもよい。任意の遺伝子配列を、ポリA付加配列と外来タンパク質構造遺伝子との間に連結してもよい。さらに、人工的に設計および合成された遺伝子配列も連結することができる。さらに、キメラスパイダーシルク/カイコ遺伝子を挿入するための遺伝子カセットは、両側に1対のpiggyBacトランスポゾンの逆方向反復配列を有し、piggyBacトランスポゾンの作用を介して昆虫細胞染色体に挿入される1組のDNAからなる、キメラスパイダーシルク/カイコ遺伝子を発現するための遺伝子カセットを指す。本発明におけるベクターは、環状または線状のDNA構造を有するものを指す。大腸菌E.coliにおいて複製することができ、かつ環状DNA構造を有するベクターが特に好ましい。このベクターには、形質転換体の選択を容易にする目的で、抗生物質耐性遺伝子またはクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子などのマーカー遺伝子も組み込むことができる。本発明で使用される昆虫細胞に関して特に限定はないが、それらは、好ましくは鱗翅類細胞、より好ましくはカイコガBombyxmori細胞、さらに一層好ましくはカイコシルク腺細胞またはカイコガBombyxmori卵に含まれる細胞である。シルク腺細胞の場合には、フィブロインタンパク質が活性に合成され、かつその細胞の取り扱いが容易であるので、第5齢カイコ幼虫の後部シルク腺細胞が好ましい。昆虫細胞によるキメラスパイダーシルクタンパク質の発現のための遺伝子カセットを組み込むために使用される方法に関して特に限定はない。遺伝子銃を使用する方法および微量注入を使用する方法は、培養昆虫細胞への組み込みのために使用することができ、カイコシルク腺細胞に組み込む場合には、例えば、遺伝子銃を使用して、第5齢カイコ幼虫の体から取り出された後部シルク腺組織に遺伝子を容易に組み込むことができる。遺伝子銃を使用する後部シルク腺への遺伝子組み込みは、例えば、粒子銃Bio-Rad、モデル番号PDS-1000/Heを1,100~1,800psiのヘリウムガス圧で使用するなどして、外来タンパク質を発現するための遺伝子カセットを含有するベクターでコーティングされた金粒子を寒天プレート上に固定された後部シルク腺に打ち込むことにより実行することができる。カイコガBombyxmoriの卵に含まれる細胞に遺伝子を組み込む場合は、微量注入を使用する方法が好ましい。ここで、卵に微量注入する場合、卵の細胞に直接微量注入することは必要でなく、それどころか、卵に単純に微量注入することにより遺伝子を組み込むことができる。その染色体に本発明のキメラスパイダーシルクタンパク質を発現するための遺伝子カセットを含有する組換えカイコは、キメラスパイダーシルク遺伝子を挿入するためのカセットを有するベクターを、カイコガBombyxmoriの卵に微量注入することにより得ることができる。例えば、第一世代Glカイコは、Tamaraらの方法NatureBiotechnology18,81-84,2000に従って、キメラスパイダーシルク遺伝子を挿入するための遺伝子カセットを有するベクターとpiggyBacトランスポサーゼ遺伝子がカイコアクチンプロモーターの制御下に配置されたプラスミドとを、カイコガBombyxmori卵に同時に微量注入し、その後、孵化した幼虫を生育して、その結果得られた同じ群内の成虫G0と交配することにより得られる。組換えカイコは、このGl世代の中で1~2の頻度で通常出現する。組換えカイコの選択は、Gl世代カイコの組織からDNAを単離した後、外来タンパク質遺伝子配列に基づいて設計されたプライマーを使用して、PCRにより行うことができる。あるいは、組換えカイコは、カイコ細胞で発現されうる、プロモーターの下流に連結された、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、遺伝子を挿入するための遺伝子カセットにあらかじめ挿入し、次いで、第1齢段階のGl世代カイコの中から紫外線下で緑色蛍光を発光する個体を選択することにより容易に選択することができる。さらに、その染色体中に外来タンパク質を発現するための遺伝子カセットを含有する組換えカイコを得る目的で、カイコガBombyxmori卵に、遺伝子を挿入するための遺伝子カセットを有するベクターを微量注入する場合も、組換えカイコは、上記と同じ方法で、piggyBacトランスポサーゼタンパク質を同時に微量注入することにより得ることができる。piggyBacトランスポゾンは、両末端上の13塩基対の逆方向配列と約2.1kの塩基対の内部にあるORFとを有するDNAの転移因子を指す。本発明で使用されるpiggyBacトランスポゾンに関して特に限定はないが、使用可能なものの例としては、イラクサギンウワバTrichoplusiani細胞株TN-368、オートグラファカリフォルニカAutographacalifornicaNPVAcNPV、およびガレリアメロネアGalleriamelloneaNPVGmMNPVに由来するものが挙げられる。好ましくは、遺伝子およびDNA転移活性を有するpiggyBacトランスポゾンは、プラスミドpHA3PIGおよびイラクサギンウワバTrichoplusiani細胞株TN-368NatureBiotechnology18,81-84,2000に由来するpiggyBacの一部を有するpPIGA3GFPを使用して調製することができる。piggyBacに由来するDNA配列の構造は、TTAA配列を含有する1対の逆方向末端配列を有することが必要とされ、それらのDNA配列の間に挿入されたサイトカイン遺伝子などの外来遺伝子を有する。トランスポゾンに由来するDNA配列を使用してカイコ染色体に外来遺伝子を挿入するためにトランスポサーゼを使用することがより好ましい。例えば、遺伝子がカイコ染色体に挿入される頻度は、カイコ細胞内で転写および翻訳されたトランスポサーゼが2対の逆方向末端配列を認識し、それらの間の遺伝子断片を切り取って、カイコ染色体にそれを転移できるように、piggyBacトランスポサーゼを発現することができるDNAを同時に挿入することによりかなり改善することができる。本発明は、以下の説明によりさらに一層完全に認識することができる。生物医学領域におけるキメラシルクタンパク質:キメラスパイダーシルク繊維は、極めて細い繊維を必要とする眼科手術、神経修復、および形成外科などの手技の一部に広く用いられている材料の一部として提供される。さらなる使用としては、骨、靭帯、および腱の再生のためのスキャフォールド材料ならびに薬物送達のための材料が挙げられる。本発明の方法により製造される組換えスパイダーシルク繊維は、血管創傷治癒装置、止血包帯、パッチ、および接着剤を含む創傷閉鎖システム、縫合糸、薬物送達などの種々の医療用途、ならびに例えば、スキャフォールド材料、靭帯人工器官などの組織工学用途、ならびに人体への長期的または生物分解性移植のための製品に使用することができる。好ましい組織工学的スキャフォールドは、本明細書に記載の組換えスパイダーシルク/カイコ繊維を用いて作製された繊維の不織ネットワークである。さらに、本発明の組換えキメラシルク繊維は、これらに限定されないが、脊椎ディスク、頭蓋組織、硬膜、神経組織、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、脾臓、心筋、骨格筋、腱、靭帯、および胸部組織を含む、これらのユニークなスキャフォールドから恩恵を受けうる、器官の修復、置換または再生の戦略に使用することができる。本発明の別の実施形態では、組換えスパイダーシルク繊維材料は治療剤を含有することができる。これらの材料を形成するために、治療剤は、材料形成に先立って繊維の中に組み込んでもよく、形成後に材料に負荷してもよい。本発明の組換えキメラシルク繊維と併せて使用することができる異なる治療剤の種類は莫大である。一般に、本発明の医薬組成物を介して投与することができる治療剤としては、限定はされないが、抗生物質および抗ウイルス剤などの抗感染剤;化学療法剤すなわち制癌剤;抗拒絶剤;鎮痛剤および鎮痛配合剤;抗炎症剤;ステロイドなどのホルモン剤;増殖因子骨形態形成タンパク質すなわちBMP1~7、骨形態形成様タンパク質すなわちGFD-5、GFD-7、およびGFD-8、上皮増殖因子EGF、繊維芽細胞増殖因子すなわちFGF1~9、血小板由来増殖因子PDGF、インシュリン様増殖因子IGF-IおよびIGF-II、形質転換増殖因子すなわちTGF-βI~III、血管内皮細胞増殖因子VEGF;および他の天然由来または遺伝子改変のタンパク質、多糖、糖タンパク質、またはリポタンパク質が挙げられる。これらの増殖因子は、R.G.LandesCompanyが出版したTheCellularandMolecularBasisofBoneFormationandRepairbyVickiRosenandR.ScottThiesに記載されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。生理活性物質を含有するスパイダーシルク/カイコ繊維は、1つまたは複数の治療剤をこの材料を作製するために使用される繊維と混合することにより製剤化することができる。あるいは、治療剤は、好ましくは医薬として許容される担体を用いて繊維上にコーティングすることができる。繊維を溶解しない任意の医薬担体を使用することができる。治療剤は、液体、微粉固体、または他のいかなる適切な物理的形態として存在してもよい。治療剤の量は、使用される特定の薬物および治療されている病状に依存することになる。典型的には、薬物量は、材料重量の約0.001パーセント~約70パーセント、より典型的には約0.001パーセント~約50パーセント、最も典型的には約0.001パーセント~約20パーセントを占める。体液または組織と接触すると、例えば、薬物は放出されることになる。組換えスパイダーシルク/カイコ繊維で作製された組織工学スキャフォールドは、作製後にさらに改変することができる。例えば、スキャフォールドは、所望の細胞集団のための受容体または化学誘引物質として機能する生理活性物質でコーティングすることができる。このコーティングは、吸収または化学結合を介して施すことができる。本発明による使用に適した添加物は、生物学的または医薬的に活性な化合物を含む。生物学的に活性な化合物の例としては、細胞接着に影響を及ぼすことが知られているRGDインテグリン結合配列のバリエーションを含有するペプチドなどの細胞接着メディエーター、生物学的に活性なリガンド、および特定の種類の細胞または組織の内殖を促進または排除する物質が挙げられる。そのような物質としては、例えば、骨形態形成タンパク質BMPなどの骨形成誘導物質、上皮増殖因子EGF、繊維芽細胞増殖因子FGF、血小板由来増殖因子PDGF、血管内皮細胞増殖因子VEGF、インシュリン様増殖因子IGF-IおよびII、TGF-、YIGSRペプチド、グリコサミノグリカンGAG、ヒアルロン酸HA、インテグリン、セレクチン、およびカドヘリンが挙げられる。スキャフォールドは、再建手術を含む、組織工学的および組織先導的再生用途に向けた用品に形成される。スキャフォールドの構造は、細胞内殖を可能にし、細胞の前播種の必要性を除去する。スキャフォールドはまた、成型して、外部支持器官を形成する細胞のインビトロ培養の支持体のための外部スキャフォールド材料を形成することができる。スキャフォールドは、体内の細胞外マトリックスECMを模倣するように機能する。スキャフォールドは、インビトロ培養およびその後の移植期間中の、単離細胞ための物理的支持体および接着基質の両方として役立つ。移植された細胞集団が増殖して、細胞が正常に機能するにつれて、細胞はそれ自体のECM支持体を分泌し始める。軟骨および骨のような構造組織の再建では、組織形状が機能するのに不可欠であり、種々の厚さおよび形状の用品にスキャフォールドを成形する必要がある。3次元構造に所望されるいかなる凹部、開口部、または精密部分も、はさみ、メス、レーザービーム、または他の切断器具でマトリックスの一部を除去することにより作製することができる。スキャフォールドの用途としては、神経、筋骨格、軟骨、腱、肝臓、膵臓、眼、外皮、動静脈、泌尿器、または任意の他の組織形成固体または中空器官などの組織の再生が挙げられる。スキャフォールドはまた、3次元の組織または器官を形成させるために、分離細胞、例えば軟骨細胞または肝細胞のためのマトリックスとして移植で使用することができる。任意のタイプの細胞を、培養および可能な移植のためのスキャフォールドに加えることができ、これらの細胞には、筋肉および骨格系の細胞、例えば軟骨細胞、線維芽細胞、筋細胞、および骨細胞、実質細胞、例えば肝細胞、膵細胞膵島細胞を含む、腸起源の細胞、および他の細胞、例えば神経細胞、骨髄細胞、皮膚細胞、多能性細胞、および幹細胞、ならびにそれらの組合せが含まれ、これらは、ドナー由来、樹立された株化細胞由来、または遺伝子操作の前もしくは後のものであってもよい。組織の断片も使用することができ、同じ構造の中にいくつかの異なる細胞タイプを用意することができる。細胞は、適切なドナーまたはその細胞が移植されることになる患者から入手して、標準的手法を使用して分離し、スキャフォールドの上および中に播種する。インビトロでの培養を、場合によっては移植前に実行してもよい。あるいは、スキャフォールドを移植して血管新生させ、次いで、細胞をスキャフォールドに注入する。インビトロでの細胞培養および組織スキャフォールドの移植のための方法および試薬は、当業者には公知である。本意図の組換えスパイダーシルク/カイコ繊維は、放射線滅菌すなわちガンマ線、化学滅菌エチレンオキシド、または他の適切な手段等の従来の滅菌方法を使用して滅菌することができる。好ましくは、滅菌工程は52~55°Cの間の温度で8時間以下の時間エチレンオキシドを用いてなされる。滅菌後、生体材料は、輸送ならびに病院および他の医療施設での使用のために、適切な滅菌耐湿性パッケージの中に詰められる。本発明のキメラシルク繊維はまた、運動用衣類および防弾チョッキの製造/製作など、種々の形態の運動用および防護用衣服の製造において要請を受ける可能性がある。本明細書で開示のキメラスパイダーシルク繊維はまた、改善されたエアバッグの製作など、自動車産業で使用することができる。開示のキメラシルク繊維を使用するエアバッグは、クモの巣の餌食になる、飛んでいる昆虫のエネルギーをクモの巣が吸収するときよりも、自動車事故でのより大きな衝撃エネルギーに備える。定義本明細書で使用される場合、生体適合性は、シルク繊維またはそれから作製される材料が、無毒で、突然変異性がなく、最小から中程度の炎症反応を誘発することを意味する。本発明で使用される好ましい生体適合性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレンオキシドPEO、ポリエチレングリコールPEG、コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、ポリアスパラギン酸、ポリリシン、アルギネート、キトサン、キチン、ヒアルロン酸、ペクチン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシアルカノエート、デキストラン、およびポリ酸無水物が挙げられる。本発明によると、2つ以上の生体適合性ポリマーを水溶液に加えることができる。本明細書で使用される場合、柔軟性および/または弾性モチーフおよび/またはドメイン配列は、シルク繊維などの材料に弾性および/または柔軟性の特性を付与することに関連するスパイダーシルクをコードする遺伝子またはタンパク質の断片の同定可能な遺伝子配列として定義される。例として、柔軟性および/または弾性モチーフおよび/またはドメインはGPGGAである。本明細書で使用される場合、強度モチーフは、シルク繊維の張力強度を増加および/または向上させるなど、材料に強度特性を付与することに関連するスパイダーシルクをコードする遺伝子またはタンパク質の断片の同定可能な遺伝子配列として定義される。例として、これらのスパイダー強度モチーフの一部は、GGPSGPGSA8Aはポリアデニン配列であるである。本発明は、本発明の代表例となるように意図する、以下の実施例によりさらに特徴づけられるであろう。実施例1-材料および方法本実施例は、トランスジェニックカイコの作製に使用する材料および方法/手法、使用する遺伝子構築物の作製に使用する基本手順、ならびにトランスジェニックスパイダーシルク繊維の張力強度の評価に使用する参照表を説明するために提供する。1.使用する遺伝子配列。使用する遺伝子は、本明細書に提示の図13~16に示す。保存的置換を有する、例えば実質的に同じキメラスパイダーシルクタンパク質特性を有する、これらの配列のより短いおよび/またはより長いバージョンを使用することが可能であると考えられるので、これらのバリエーションは本発明の一部として構想される。2.キメラシルクタンパク質およびこれらのキメラスパイダーシルクタンパク質を用いて得られる繊維は、張力強度のために評価される。表1に、キメラスパイダーシルク繊維の評価に対する一般的な基準を示す。本発明のキメラスパイダーシルク繊維は、天然スパイダーシルクに類似の張力および他の機械的強度特性を有することが見出された。実施例2-個々の形質転換されたカイコシルクの張力強度特性の分析トランスジェニックカイコシルクについて、スパイダーシルク特異抗体を使用して、カイコシルク腺タンパク質含有物およびトランスジェニックカイコ繭からのシルク繊維の両方のウエスタンブロッティングによりスパイダーシルクキメラタンパク質の存在を分析した。両方の場合に、トランスジェニックカイコがキメラタンパク質を産生すると確認され、微分抽出試験から、これらのタンパク質がそれらの繭のトランスジェニックシルク繊維の不可欠な成分であることがわかった。さらに、蛍光実体顕微鏡を使用する、シルク腺またはシルク繊維の直接検査により、キメラ緑色蛍光タンパク質融合物のそれぞれの発現がシルク腺および繊維の両方において明らかになった。ほとんどの場合において、繊維中の蛍光タンパク質の量は、通常の照明下で、繭を緑色により視覚化するのに十分高いものであった。表2に、個々のトランスジェニックカイコから産生されたトランスジェニックシルクの分析を示す。これらの分析から、スパイダー4またはスパイダー6構築物を用いて形質転換されたトランスジェニック系は、形質転換されていないカイコからのシルク繊維と比較すると強度が改善したキメラスパイダーシルク/カイコ繊維を産生することが明確にわかる。これらの繊維が、ある場合には天然シルクのほぼ2倍の強度があることは意義がある。カイコ/スパイダーシルクキメラ繊維の強度における2倍の改善は、カイコシルクをスパイダーシルクと同様の強度および柔軟性にするのに必要と考えられる改善にほぼ近い。したがって、これらの結果から、カイコを遺伝子操作して、スパイダーシルクの特定の強度および/または柔軟性ドメインをコードするpiggyBacベクターを使用してBombyx/スパイダーシルクキメラタンパク質を構築することにより、天然スパイダーシルクと有利に競争することができるキメラスパイダーシルク/カイコ繊維を産生させることができることが判明する。実施例3-トランスジェニックカイコにおけるキメラスパイダーシルク/カイコタンパク質発現のためのカイコキメラ遺伝子発現カセットおよびpiggyBacベクター本実施例は、種類が莫大なカイコキメラスパイダーシルク遺伝子発現カセットを用意する際の本発明の有用性および範囲を実証するために提供する。本実施例はまた、カイコの形質転換が成功することが示されたpiggyBacベクターの完成、および生産において商業的に有用な長さの繊維の製造に適している、商業的に有用なキメラスパイダーシルクタンパク質の製造の成功を実証する。発現カセット。以下に示す基本的な発現カセットに関していくつかのバリエーションを構築した。これらの構築物は、フィブロイン重鎖fhc-スパイダーシルクキメラを発現するように設計された構築物のアセンブリを表しており、合成スパイダーシルクタンパク質配列が、B.morifhcタンパク質のN末端およびC末端の断片により挟まれている。この点に関し、図5に示す基本的なカイコガBombyxmoriシルクフィブロイン重鎖発現カセットに関するいくつかのバリエーションを構築した。この設計には、フィブロイン重鎖fhc-スパイダーシルクキメラを発現するように設計された構築物のアセンブリが含まれており、合成スパイダーシルクタンパク質配列が、B.morifhcタンパク質のN末端およびC末端の断片により挟まれている。各発現カセット内の機能的に関連する遺伝エレメントには、左から右にかけて次のものが含まれる:B.morifhc遺伝子に由来する主要プロモーター、上流エンハンサーエレメントUEE、基本プロモーター、およびN末端ドメインNTD、その後に、NTDの上流に位置する翻訳開始部位とインフレームで位置する種々の合成スパイダーシルクタンパク質配列以下を参照、その後に、翻訳終結部位およびRNAポリアデニル化部位を含むfhcのC末端ドメインCTD。8つの異なるバージョンの発現カセットが図5に図示されており、これらは、NTDとスパイダーシルクとの間にインフレームでのEGFPの挿入があるまたはない4つの異なる合成スパイダーシルク/カイコタンパク質をコードする。これらの配列を、スパイダー2、スパイダー4、スパイダー6、およびスパイダー8と名付け、以下のように定義する。aスパイダー2:A4S824からなる7,104bp。A1は、推定上の鞭毛状シルク弾性モチーフGPGGAの4コピーを示す;したがって、A4は、この同じ配列の16コピーを示す。S8は、推定上の牽引糸シルク強度モチーフ[GGPSGPGSA8]を示し、リンカー-ポリアラニン配列としても記載される。GFP緑色蛍光タンパク質融合タンパク質のおよその大きさは161.950.4=212.3Kdである。bスパイダー4:A2S842からなる7,386bp。A2は、推定上の鞭毛状シルク弾性モチーフGPGGAの8コピーを示す;S8は、上記のように、推定上の牽引糸シルク強度モチーフ[GGPSGPGSA8]を示す。GFP融合タンパク質のおよその大きさは169.450.4=219.8Kdである。cスパイダー6:A2S814からなる2,462bp。上記のように、A2は弾性モチーフGPGGAの8コピーを示し、S8は強度モチーフ[GGPSGPGSA8]を示す。GFP融合タンパク質のおよその大きさは56.450.4=106.8Kdである。dスパイダー8:A2S828からなる4,924bp。上記のように、A2は弾性モチーフGPGGAの8コピーを示し、S8は強度モチーフ[GGPSGPGSA8]を示す。GFP融合タンパク質のおよその大きさは112.850.4=163.2Kdである。NTDエキソンIおよびIIの大きさ162515161;eGFP27135;CTD6470=50,391Kd。実施例4-piggyBacへの発現カセットのサブクローニング図5に図示したそして実施例3に記載した8つの異なるバージョンの発現カセットのそれぞれを、AscIおよびFseIを使用して親プラスミドから切除し、pBAC[3xP3-DSRedaf]の対応する部位にサブクローニングした。このpiggyBacベクターのマップを図6に示す。EGFPを有するおよびEGFPを有さない、上記のすべてのpiggyBacベクターを、個々の成分に関してPCRにより試験すると、予測された大きさの生成物が示された。EGFPに融合したスパイダーシルクタンパク質をコードするpiggyBacベクターのそれぞれは、B.moriシルク腺においてEGFP発現を誘導するそれらの能力をアッセイすることにより機能的に評価した。手短に言えば、シルク腺をカイコから取り出し、粒子銃を使用して、piggyBacDNAまたは対照でコーティングされたタングステン粒子をこの腺に打ち込んだ。次いで、打ち込まれた組織を、培養皿のグレース培地中で培養し、2日および3日後に、共同研究者の研究室で利用可能なEGFP蛍光のための装備がある実体顕微鏡を使用して、EGFP発現についてシルク腺を検査した。各ベクターはEGFP蛍光を誘導することが示された。EGFP挿入があるおよび挿入がないスパイダー4および6をコードする4つのpiggyBacベクターのセットを使用して、トランスジェニックカイコを作製した。実施例5-トランスジェニックカイコの単離。一般に、カイコの形質転換は、piggyBacベクターとpiggyBacトランスポサーゼをコードするヘルパープラスミドとの混合物を、カイコの卵に微量注入することにより前胚盤葉胚に導入することを含む。卵が産まれた後4時間の間は、胚盤葉形成は起こらない。したがって、胚の収集および注入は、比較的長時間にわたって室温で行うことができる。微量注入の技術的なハードルは、硬い障壁となる卵殻を突破する必要があることである。Tamuraおよび共同研究者は、鋭利なタングステン針を用いて卵殻を貫通し、次いで、得られた穴にガラス毛細管注射針を正確に挿入することによりカイコの微量注入手法を完成した。これは現在では比較的ルーチン的な手技になっており、卵殻に穴をあけ、タングステン針を除去し、ガラス毛細管を挿入し、そしてDNA溶液を注入するように調整されたエッペンドルフのロボット注射針マニピュレーターを用いて実行される。次いで、Krazy接着剤を小滴使用して卵を再密封し、幼虫に孵化するまで28°Cおよび湿度70の通常の生育条件下で維持した。次いで、生存する注入された昆虫は、交配してFl世代の胚を生成し、その後続いてDS-Red眼マーカーの発現に基づいて推定上の形質転換体を同定する。次いで、この方法により同定された推定上の雄性および雌性形質転換体を交配して、ホモ接合型の血統を作製し、さらに詳細な遺伝子分析を行う。具体的には、本プロジェクトに関するカイコの形質転換は、piggyBacベクターとヘルパープラスミドDNAの混合物を、透明な表皮のカイコ変異体であるカイコガBombyxmoripnd-wlの卵に注入することを含む。この変異体カイコについては、Tamura,etal.2000に記載されており、この文献は、参照によって具体的に本明細書に組み込まれる。この変異体には、蛍光遺伝子を使用するスクリーニングを極めて容易にするメラニン沈着欠乏症がある。いったん赤目の推定上のFl形質転換体を同定すると、ホモ接合型の血統を確立して、本物の形質転換体をシルク腺タンパク質のウエスタンブロッティングを使用して確認し、繭シルクを採取した。実施例6-トランスジェニックカイコによるキメラスパイダーシルク/カイコ産生の分析トランスジェニックカイコシルクについて、スパイダーシルク特異抗体を使用して、カイコシルク腺タンパク質含有物およびトランスジェニックカイコ繭からのシルク繊維の両方のウエスタンブロッティングによりスパイダーシルクキメラタンパク質の存在を分析した。両方の場合において、トランスジェニックカイコはキメラタンパク質を産生することが確認され、微分抽出実験から、これらのタンパク質は、それらの繭のトランスジェニックシルク繊維の不可欠な成分であることがわかった。さらに、蛍光実体顕微鏡を使用する、シルク腺またはシルク繊維の直接検査により、キメラ緑色蛍光タンパク質融合物のそれぞれの発現がシルク腺および繊維の両方において明らかになった図7。ほとんどの場合において、繊維中の蛍光タンパク質の量は、通常の照明下で、繭を緑色により視覚化するのに十分高いものであった。実施例7-piggyBacベクターの設計piggyBacは、効率的にカイコを形質転換するために使用することができるので、本プロジェクトのために選択したベクターになった4,11,43。本プロジェクトで使用した特定のpiggyBacベクターは、いくつかの重要な特徴を備えた遺伝子を保有するように設計した。図17に強調表示されているように、これらには、外来スパイダーシルクタンパク質の発現を後部シルク腺でさせるであろうB.moriフィブロイン重鎖fhcプロモーター91,92、ならびに外来シルクタンパク質の発現レベルおよび繊維へのそのアセンブリを促進するであろうfhcエンハンサー93が含まれた。piggyBacベクターはまた、弾性GPGGA8および強度リンカー-アラニン8の両モチーフを有する比較的大きな合成スパイダーシルクタンパク質であるA2S814をコードした図17A。合成スパイダーシルクタンパク質配列は、カイコガBombyxmorifhcタンパク質のN末端およびC末端ドメインをコードする配列の内側に埋め込んだ図17B~17C。このキメラカイコ/スパイダーシルクの設計は、外来タンパク質をB.moriシルク腺における新生内因性シルク繊維に組み込むように仕向けて、複合シルク繊維を産生するために使用されてきた91、92。本研究で構築されたpiggyBacベクターの1つでは、キメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質が単独でコードされたが図17B、別のベクターでは、N末端高感度緑色蛍光タンパク質EGFPタグを有するこの同じタンパク質がコードされた図17C。本明細書で記載のように、後者の構築物は、形質転換した子孫により産生されるシルク繊維の分析を容易にし、さらに、シルク腺におけるキメラスパイダーシルクタンパク質の発現を検討ための予備的な生体外シルク腺打ち込みアッセイのために使用された。方法:いくつかの遺伝子断片を、カイコガBombyxmori株P50/Daizoのシルク腺から単離されたゲノムDNAと図17に示す遺伝子特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応PCRにより単離した。これらの断片には、fhcの主要プロモーターおよび上流エンハンサーエレメントMP-UEE、異なる5’-および3’-フランキング制限部位を有する、2バージョンのfhcの基本プロモーターBPおよびN末端ドメインNTD;エキソン1/イントロン1/エキソン2、fhcのC末端ドメインCTD;3’コード配列およびポリAシグナル、ならびにEGFPが含まれる。それぞれの場合において、増幅産物をゲル精製し、予測された大きさのDNA断片を切除して回収した。続いて、fhcのMP-UEE、fhcのCTD、およびEGFP断片をpSLfall80fapSLY.Miaoにクローニングし、2つの異なるNTD断片をpCR4-TOPOInvitrogenCorporation,Carlsbad,CAにクローニングし、そして適切な増幅産物を含有する大腸菌E.coli形質転換体を制限酵素マッピングにより同定し、配列決定により確認した。次いで、以下のように、これらの断片を使用して、本研究で使用するpiggyBacベクターを組み立てた。合成A2S814スパイダーシルク配列を、BamHIおよびBspEIを用いて、pBluescriptSKIIプラスミド前駆体F.TeuleandR.V.Lewisから切除し、ゲル精製して回収し、上記のpSL中間プラスミドにおいてCTD上流の対応する部位にサブクローニングした。このステップにより、pSL-スパイダー6-CTDと名付けたプラスミドを得た。次いで、Not1BamHI断片を上記のpCR4-TOPO-NTD中間プラスミドの1つから切除し、ゲル精製して回収し、そしてpSLスパイダー6-CTDにおいてスパイダー6-CTD配列上流の対応する部位にサブクローニングして、pSL-NTD-スパイダー6-CTDを作製した。並行して、Not1/Xbal断片を上記のpCR4-TOPO-NTD中間プラスミドから切除し、ゲル精製して回収し、上記のpSL-EGFP中間プラスミドにおいてEGFPアンプライマー上流の対応する部位にサブクローニングした。これにより、NTD-EGFP断片を含有するプラスミドが得られ、この断片をNotlおよびBamHIを用いて切除し、pSL-スパイダー6-CTDにおいてスパイダー6-CTD配列上流の対応する部位にサブクローニングした。次いで、MP-UEE断片を上記のpSL中間プラスミドからSfiIおよびNot1を用いて切除し、ゲル精製して回収し、上記の2つの異なる中間pSLプラスミドにおいてNTD-スパイダー6-CTDおよびNTD-EGFP-スパイダー6-CTD配列の上流の対応する部位にサブクローニングした。最後に、完全に組み立てられたMP-UEE-NTD-A2S814-CTDまたはMP-UEE-NTD-EGFPA2S814-CTDカセットを、それぞれの最終的なpSLプラスミドからAscIおよびFseIを用いて切除し、pBAC[3xP3-DSRedaf]98の対応する部位にサブクローニングした。この最後のサブクローニングステップにより、EGFPマーカーの有無を示すためにスパイダー6およびスパイダー6-EGFPと名付けられた、2つの別々のpiggyBacベクターが得られた。下記に記載のように、これらのベクターは、生体外シルク腺打ち込みアッセイおよびカイコ遺伝子組換えのために使用した。結果:生体外アッセイの結果は、GFPタグ付きキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質をコードするpiggyBacベクターが後部シルク腺領域で緑色蛍光を誘導することを示した。GFP特異抗体を用いる免疫ブロッティングアッセイはさらに、打ち込まれたシルク腺が、約116kDaの見かけの分子量Mrを有する免疫反応性タンパク質を含有することを実証した。予測106kDaよりわずかに大きいが、これらの結果は、本piggyBacベクターの基本設計の検証となり、これらの構築物を使用する、トランスジェニックカイコの単離を促した。実施例8-トランスジェニックカイコの単離各piggyBacベクターを、piggyBacトランスポサーゼをコードするプラスミドと混合し、その混合物をカイコガBombyxmoripnd-wl43から単離した卵に独立に微量注入した。形質転換体におけるEGFPタグ付きキメラカイコ-スパイダーシルクタンパク質の検出を容易にする、透明な表皮表現型を生じるメラニン沈着欠乏症を有するので、このカイコ株を使用した。推定上のFl形質転換体は、各piggyBacベクター図17Dに含まれる神経特異的3XP3プロモーター27の制御下にあるDS-Redの発現に起因する赤眼表現型により最初に同定した。方法に記載のように、これらの動物は、いくつかのホモ接合型トランスジェニックカイコの血統を樹立するために使用し、それらの形質転換に使用したpiggyBacベクターを表して、スパイダー6およびスパイダー6-GFPと名付けた。方法:生体外シルク腺打ち込みアッセイ第5齢の3日目に入っている、生きているカイコガBombyxmori株pnd-wlカイコを、70エタノールに数秒間液浸して滅菌し、0.7w/vのNaCI中に置いた。次いで、シルク腺全体を各動物から無菌的に切り離し、抗生物質添加のグレース培地を含有するペトリ皿に移し、DNA打ち込み工程までそこに保持した。並行して、タングステンミクロ粒子1.7μmM-25マイクロキャリヤー;Bio-RadLaboratories,Hercules,CAを、以下のように、打ち込み用にDNAでコーティングした。ミクロ粒子を、製造業者の説明書に従って前処理し、3mg/50μlアリコートで50グリセロール中に-20°Cで保存した。各打ち込み実験の直前に、製造業者の説明書に従って、ミクロ粒子アリコート3mgを最大容量5μl中で適切なpiggyBacDNA5μgでコーティングした。ミクロ粒子アリコートの一部を、DNA陰性対照として使用するために蒸留水でコーティングした。各打ち込み実験を6回反復し、個々の打ち込みにはそれぞれ1対のインタクトシルク腺が含まれた。打ち込みの場合、グレース培地中での保持状態から1w/vの滅菌寒天を含有する90mmペトリ皿上にこれらの腺を移し、ペトリ皿を、Bio-RadBiolistic登録商標PDS-1000/HeParticleDeliverySystemチャンバーの中に置いた。以前に記載されているように26、チャンバーを20~22Hgに排気し、シルク腺に、1,100psiのヘリウム圧力を使用して、粒子源から標的組織まで6cmの距離で、前コーティングしたタングステンミクロ粒子を打ち込んだ。打ち込み後、シルク腺を、2×抗生物質添加のグレース培地を含有する新たなペトリ皿に置き、28°Cでインキュベートした。スパイダー6-GFPのpiggyBacベクターにおけるEGFPマーカーの一過性発現を、打ち込み後48および72時間に蛍光顕微鏡で評価した。画像を、倍率4.2倍、位相1/120秒、緑色蛍光1/110秒捕捉でオリンパスFSX100顕微鏡を用いて取得した。さらに、下記に記載されるように、EGFPタグ付きおよびタグなしキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質の一過性発現を、打ち込まれたシルク腺抽出物をEGFP-またはスパイダーシルク-特異抗血清を用いて免疫ブロッティングすることにより評価した。カイコの形質転換pnd-wlガによる産卵1時間後に卵を集め、スライドガラス上に並べた。ベクターおよびヘルパープラスミドをそれぞれ、0.2μg/ulの最終濃度で注入緩衝液0.1mMリン酸ナトリウム、5mMKC1、pH6.8中に再懸濁し、1~5nlを、WorldPrecisionInstrumentsPV820圧力調節器米国、SurugaSeikiM331マイクロマニピュレーター日本、およびNarishigeHD-21ダブルピペットホルダー日本からなる注入システムを使用して、各前胚盤葉カイコ胚に注入した。穴をあけられた卵は、HelpingHandSuperGlueゲルTheFaucetQueens,Inc.,USAを用いて密封し、次いで、胚発生のために25°Cおよび湿度70の成長チャンバーの中に置いた。孵化後、幼虫を人工飼料日本農産工業株式会社、日本で飼育し、同じ系内の同胞を交配することによりその後の世代を得た。トランスジェニック子孫は、550~700nmの間のフィルターを備えたオリンパスSXZ12顕微鏡東京、日本を使用して、DsRedの蛍光眼マーカーの存在により試験的に同定した。結果:特別にEGFPを励起せずに白色光の下で目視検査を行っても、EGFPの発現は、スパイダー6-GFP形質転換体により産生される繭で観察された図18A。さらに、これらの動物に由来するシルク腺図18B~18Cおよび繭図18Dを蛍光顕微鏡下で検査すると、EGFPの強い発現が観察された。繭は、EGFPシグナルと融合したシルク繊維を少なくとも一部含むように見えた。スパイダー6-GFPのシルク腺および繭におけるEGFPタグ付きキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質の発現は、EGFPおよびスパイダーシルクタンパク質に対する特異抗血清を用いて、シルク腺および繭の抽出物を免疫ブロッティングすることにより確認した図19。スパイダー6のシルク腺および繭の抽出物に関しても同様の結果が、スパイダーシルクタンパク質特異抗血清を用いる免疫ブロッティングにより得られた図19。これらの結果は、我々が、EGFPタグ付きまたはタグなし形態のキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質をコードするトランスジェニックカイコの単離に成功したこと、およびこれらのタンパク質が、それらのトランスジェニック動物により産生されるシルク繊維に結合していることを示した。実施例9-複合シルク繊維の分析連続タンパク質抽出法を使用して、キメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質とトランスジェニックカイコから産生される複合シルク繊維との関連を分析した。緩く結合したセリシン層を除去した後、方法に記載のように、この練りシルク繊維を、苛酷さを増していく一連の抽出に付した。方法:カイコ繭タンパク質の連続抽出親カイコおよびトランスジェニックカイコから産生された繭を採取し、セリシン層を、0.05w/vのNa2CO3中で、材料:溶媒比を1:50w/vにして、85°Cにて15分間繭を穏やかに撹拌することにより除去した40。この練りシルクを、槽から取り出し、同じ材料:溶媒比で、熱水50~60°Cを用いて注意深く撹拌しながら2回洗浄した。次いで、練りシルク繊維を凍結乾燥して秤量し、セリシン層除去の効率を評価した。この練り繊維を使用して、確実に一定の撹拌を行う混合ホイール上での回転による連続タンパク質抽出プロトコールを、以下のように行った。練りシルク繊維30mgを、リン酸緩衝生理食塩水PBS;137mMNaCl、2.7mMKC1、10mMNa2P04、1.8mMKH2P04中で、4°Cにて16時間処理した。この材料を遠心分離により不溶性分画と可溶性分画に分離し、上清を取り出し、PBS可溶性分画として-20°Cに保存し、ペレットを次の抽出に付した。このペレットを2w/vSDS1mlに再懸濁し、室温で16時間インキュベートした。再び、材料を遠心分離により不溶性画分と可溶性分画に分離し、上清を取り出し、SDS可溶性分画として-20°Cに保存し、ペレットを次の抽出に付した。このペレットを、2v/vβ-メルカプトエタノールを含有する9MLiSCN1mlに再懸濁し、室温で16~48時間インキュベートした。遠心分離後、上清を9MLiSCN/BME可溶性分画として-20°Cに保存した。このステップで得られた最終ペレットを、5v/vBMEを含有する16MLiSCN1mlに再懸濁し、室温で約1時間インキュベートした。これにより完全に溶解し、最終抽出物が得られ、この抽出物は、16MLiSCN可溶性分画として、免疫ブロッティングアッセイを実施するまで-20°Cに保存した。シルクタンパク質の分析生体外打ち込みアッセイに由来するシルク腺およびさらに未処置の親カイコおよびトランスジェニックカイコに由来するシルク腺を、1w/vSDSおよび5M尿素を含有するリン酸ナトリウム緩衝液30mMNa2P04、pH7.4中で、氷上ホモジナイズし、次いで、4°Cの微量遠心機で、13,500rpmにて5分間、澄明化した。上清をシルク腺抽出物として収集し、これらの抽出物および上記の連続繭抽出物を、10mMTris-HCl/2SDS/5BME緩衝液で4倍に希釈し、約90μgの総タンパク質を含有する試料をSDS-PAGE負荷緩衝液と1:1で混合し、95°Cで5分間煮沸し、4~20グラジエントゲルPierceProteinProducts;Rockford,IL上に負荷した。分離後、製造業者の説明書に従い、Bio-Rad転写セルを使用して、タンパク質をゲルからPVDF膜Immobilon商標;Millipore,Billerica,MAに転写した。ジョロウグモNephilaclavipesの鞭毛状シルク様A2ペプチドに対して産生された、スパイダーシルクタンパク質特異ポリクローナルウサギ抗血清GenScriptCorporation,Piscataway,NJまたは商用EGFP特異マウスモノクローナル抗体LivingColors登録商標GFP,ClontechLaboratories,MountainView,CAを一次抗体として使用して、免疫検出を実施した。二次抗体はそれぞれ、ヤギ抗ウサギIgG-HRPPromegaCorporation,Madison,WIまたはヤギ抗マウスIgGHLHRPコンジュゲートEMDChemicals,Gibbstown,NJとした。抗体はすべて、標準ブロッキング緩衝液l×PBST/0.05脱脂粉乳中で、1:10,000希釈で使用し、抗体抗原反応を、商用キットECL商標WesternBlottingDetectionReagents;GEhealthcareを使用して化学発光により可視化した。結果:この手順の各ステップの後に、可溶性分画と不溶性分画を遠心分離により分離し、可溶性分画は免疫ブロッティングのために保存し、不溶性分画は次の抽出のために使用した。最終抽出溶媒は残存するシルク繊維を完全に溶解した。免疫ブロッティングの対照から、スパイダーシルクタンパク質特異抗血清は、pnd-wlシルク繊維中のいずれのタンパク質も認識しないが図19B、レーン3~6、大腸菌E.coliで産生されたキメラカイコ/A2S814スパイダーシルクタンパク質を認識する図19B、レーン2ことが確認された。生理食塩水図19B、レーン8および13、SDS図19B、レーン9および14、および8MLiSCN/2β-メルカプトエタノール図19B、レーン10および15を使用して、トランスジェニック動物由来の練り繭を連続抽出しても、いかなる検出可能な免疫反応性のタンパク質も放出されなかった。しかしながら、残留シルク繊維を16MLiSCN/5β-メルカプトエタノールによりその後抽出すると、残留スパイダー6から分子量約106kDaの免疫反応性タンパク質図19、レーン11、そして残留スパイダー6-GFP繊維から分子量約130および約110kDaの免疫反応性タンパク質図19、レーン16が放出された。これらのタンパク質はすべて、予測されたものスパイダー6およびスパイダー6-GFPについてそれぞれ、78kDaおよび106kDaより大きかった。これらの差異についての可能な説明としては、高度に反復性のスパイダーシルク配列による転写/翻訳のスタッタリングstuttering、SDS-PAGE上でのタンパク質産物の異常な泳動、および/またはキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質の翻訳後修飾が挙げられる。免疫ブロッティングの陽性対照である、大腸菌E.coliで産生されたキメラカイコ/A2S814スパイダーシルクタンパク質もまた、分子量が予測されたもの60kDaよりも大きかった約75kDa。両トランスジェニックカイコ系の練り繭に由来する16MLiSCN/5β-メルカプトエタノール抽出物はまた、分子量が約40~約75kDaの免疫反応性スメアを含んでおり、これはキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質の分解および/または翻訳の早期終結をおそらく反映している。導入遺伝子産物の大きさまたはその出現の理由にもかかわらず、連続抽出結果により、ここに記載のように提供されたトランスジェニックカイコは、複合シルク繊維に極めて安定に組み込まれたキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質を発現することが明確に実証された。実施例10-複合シルク繊維の機械的性質トランスジェニックカイコにより産生された複合シルク繊維の練り天然および複合シルク繊維の機械的性質をここに記載する。試験のための複合シルク繊維の調製方法および試験の実施方法を以下の方法に示す。方法:機械的性質の試験に使用する練りカイコシルク繊維は、初期長L0が19mmであった。単繊維試験は、MTS標準50Nセルおよび特注品の10g荷重セルTransducerTechniques,TemeculaCAの両方が装着されたSynergie100システムMTSSystemsCorporation,EdenPrairieMNを使用して、周囲条件20~22°Cおよび湿度19~22で実施した。機械的性質データ荷重および伸長は、歪み速度5mm/分および周波数250MHzで、TestWorks登録商標4.05ソフトウェアMTSSystemsCorporation,EdenPrairie,MNを用いて両方の荷重セルで記録し、これにより応力値および歪み値を計算した。各繊維について収集したデータセットから応力/歪み曲線を、MATLABバージョン7.1を使用してプロットし、靭性または切断エネルギー、ヤング率初期剛性、最大応力、および最大伸張=最大歪みを決定した。結果:これらの結果から、EGFPタグ付きまたはタグなしのいずれかのキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質を含有する練り複合繊維は、pnd-wlカイコ由来の天然繊維よりも顕著に大きな伸長性および幾分改善した強度および剛性を有することが実証された表3および図20。表3:親カイコおよびトランスジェニックカイコにより産生された12~15シルク繊維の機械的性質を、正確に調整した温度、湿度、および試験速度の条件下で測定し、その平均値および標準偏差を表に示す。同じ条件下で並行して決定されたスパイダージョロウグモNephilaclavipes牽引糸シルク繊維の平均の機械的性質を比較のために含む。したがって、これらの複合繊維は天然カイコシルク繊維よりも靱性が高い。トランスジェニック動物により産生された複合シルクの機械的性質は、親株により産生された天然繊維のものより変動しやすかった。さらに、2つの異なるスパイダー6-GFP系により産生された複合繊維は同様の伸長性を示したが、張力強度は異なっていた。個々のトランスジェニック系内の複合シルク繊維の機械的性質について観察された変動および系間の変動は、複合繊維における不均一性を表わしている可能性があり、この不均一性は、キメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質比および/または繊維に沿ったこれらのタンパク質の局在化の差による可能性がある。図18Dにおいて、複合繊維に不均一性がある証拠を見ることができる。トランスジェニックカイコ由来の複合繊維、親カイコ由来の天然繊維、および代表的な牽引糸スパイダーシルク繊維について観察された最良の機械的性能の比較を図20に示す。この結果から、複合繊維はすべて、pnd-wlカイコ由来の天然シルク繊維よりも靱性が高いことがわかる。また、トランスジェニックスパイダー6-GFP系4カイコ由来の複合繊維は、同じ条件下で試験された天然スパイダー牽引糸シルク繊維よりもさらに靱性が高かった。これらの結果は、キメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質の組み込みにより、トランスジェニックカイコプラットフォームを使用して産生される複合シルク繊維の機械的性質が顕著に改善されうることを実証する。天然カイコpnd-wlおよびスパイダージョロウグモN.clavipes牽引糸シルク繊維について測定された最良の機械的性能を、トランスジェニックカイコにより産生された複合シルク繊維で得られたものと比較する。繊維はすべて、同じ条件下で試験した。最大靱性値は次のとおりである:カイコpnd-wl青線、43.9MJ/m3;スパイダー6系7オレンジ線、86.3MJ/m3;スパイダー6-GFP系1濃緑線、98.2MJ/m3、スパイダー6-GFP系4淡緑線、167.2MJ/m3;およびジョロウグモN.clavipes牽引糸赤線、138.7MJ/m3。表3を参照のこと。実施例11-安定に組み込まれたキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質を含有する複合繊維スパイダーシルクには、多くの異なる用途に向けた生体材料として非常に多くの使用法がある。これまで、クモ飼育に対する深刻な障害が天然生産活動等を損なっていた。スパイダーシルク繊維産生にとって有効な生物工学的手法を開発する必要性が、本開示で提供されたプラットフォームで示される。組換えスパイダーシルクタンパク質の産生に使用するための他のプラットフォームが記載されてきたが、これらのタンパク質を有用な繊維に効率的に加工することは困難であった。単なるタンパク質ではなく繊維を製造する必要性のため、この特定の生物工学的用途に適任のプラットフォームとしてカイコが位置づけられる。スパイダーシルクタンパク質を産生するために遺伝子操作されたトランスジェニックカイコは、カイコガBombyxmoriセリシンSerlプロモーターの転写制御下にある、天然ジョロウグモNephilaclavipesの大瓶状スピドロイン-1シルクタンパク質をコードするpiggyBacベクターを使用して単離された。スピドロイン配列はC末端fhcペプチドをコードする下流配列と融合された。このpiggyBac構築物を使用して単離されたトランスジェニックカイコは、キメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質を含有する繭を産生したが、このタンパク質は緩く結合したセリシン層でのみ見出された。これに対して、本開示のトランスジェニックカイコにより産生されたキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質は、複合繊維の不可欠な成分であった。他の研究者により設計されたキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質の比較的緩い結合は、とりわけN末端カイコfhcドメインの欠如を反映している可能性がある。あるいは、piggyBacベクターにおけるSer1プロモーターの使用は、このプロモーターが中部シルク腺で転写活性であるため、適切な繊維アセンブリととりわけ調和しない可能性があるが、一方、fhc、フィブロイン軽鎖、およびヘキサメリンタンパク質の発現を制御するfhc、flc、およびfhxのプロモーターはそれぞれ、後部シルク腺において活性である。カイコシルクタンパク質の繊維へのアセンブリは、シルク遺伝子発現の厳格な空間的および時間的調節により部分的に制御される。したがって、本開示のベクターは、キメラタンパク質が新たにアセンブリされた複合シルク繊維に安定して組み込まれることを促進するために、天然シルクタンパク質と同じ場所および同じ時間にキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質の蓄積を促すようにfhcプロモーターで巧妙に仕組まれている。他の研究者が、いくつかのトランスジェニックカイコにより産生された繭に由来する繊維の弾性および張力強度が少し増加することを記載している。しかしながら、セリシン層は機械的性質試験の前に除去されておらず、このデガミングステップは、商業シルク繊維生産のための繭の処理において不可欠である。したがって、繭が従来の様式で処理された場合、組換えスパイダーシルク/カイコタンパク質は除去され、得られるシルク繊維には、機械的性質の改善が期待されないであろう。スパイダーシルクタンパク質を産生するトランスジェニックカイコは、ヘキサフルオロ溶媒に溶解するシルクタンパク質から繊維を再生することに焦点を当てた他の研究の比較的微量な構成要素として報告された。それにもかかわらず、この研究では、ジョロウグモNephilaclavipesの大瓶状スピドロイン-1または鞭毛状シルクタンパク質に由来する極端に短い合成シルク様配列をコードするpiggyBacベクターを用いて生成された2つのトランスジェニックカイコが記載されていた。両方のシルク様ペプチドは、N末端およびC末端fhcドメインの内側に埋め込まれていた。機械的性質試験から、これらのトランスジェニック動物により産生されたシルク繊維は、幾分大きな張力強度41~73MPaを有し、かつ弾性には変化がないことがわかった。これらの研究者はまた、それらの複合繊維の機械的性質において観察された比較的小さな変化は、組換えタンパク質の組み込みが低レベルであることを反映していると報告している。また、それらの構築物に使用された特定のスパイダーシルク様ペプチド配列および/またはそれらの大きさが小さいことによって、それらのトランスジェニックカイコにより産生された複合繊維の機械的性質の比較的小さな変化が少なくとも部分的に説明されうる可能性もある。本トランスジェニックカイコおよび複合繊維は最初のものであり、それらの機械的性質を顕著に改善する、安定に組み込まれたキメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質を含有する複合シルク繊維を産生するトランスジェニックカイコ系が得られた。本トランスジェニックカイコ系により産生される複合スパイダーシルク/カイコ繊維は、天然牽引糸スパイダーシルク繊維よりも靱性が一層高かった。これは、他の要因の中でも、少なくとも部分的には、反復鞭毛状様GPGGA4弾性モチーフおよび大瓶状スピドロイン-2[リンカー-アラニン8]結晶モチーフをコードする、2.4kbpのA2S814合成スパイダーシルク配列の使用による可能性がある。この比較的大きな合成スパイダーシルクタンパク質は、大腸菌E.coliで産生された後、押出しにより繊維に紡ぐことができ、このタンパク質が繊維にアセンブルする天然の能力を保持していることが示される。しかしながら、このタンパク質は、シルク繊維に組み込まれるために、一斉に発現され、内因性のカイコfhc、flc、およびfhxタンパク質と相互作用しなければならないであろう。したがって、A2S814スパイダーシルク配列は、アセンブリ過程を指向して、N末端およびC末端fhcドメインの内側に埋め込まれた。fhcプロモーターが内因性カイコシルクタンパク質に空間的および時間的に接近してそれらの発現を駆動する能力と共に、これらの特徴は、キメラカイコ/スパイダーシルクタンパク質が複合シルク繊維のアセンブリに参加し、その機械的性質に顕著に寄与する能力を少なくとも部分的に説明することができる。実施例12-piggyBacベクター構築物およびpiggyBacベクターの構成要素のPCR増幅いくつかの遺伝子断片を、カイコガBombyxmori株P50/Daizoのシルク腺から単離したゲノムDNAおよび表4に示す遺伝子特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により単離した。これらの断片には、fhcの主要プロモーターおよび上流エンハンサーエレメントMP-UEE、異なる5’-および3’-フランキング制限部位を有する、2バージョンのfhcの基本プロモーターBPおよびN末端ドメインNTD;エキソン1/イントロン1/エキソン2、fhcのC末端ドメインCTD;3’コード配列およびポリAシグナル、ならびにEGFPが含まれる。それぞれの場合において、増幅産物をゲル精製し、予測された大きさのDNA断片を切除して回収した。続いて、fhcのMP-UEE、fhcのCTD、およびEGFP断片をpSLfall80faにクローニングし、2つの異なるNTD断片をpCR4-TOPOInvitrogenCorporation,Carlsbad,CAにクローニングし、そして適切な増幅産物を含有する大腸菌E.coli形質転換体を制限酵素マッピングにより同定し、配列決定により確認した。次いで、以下のように、これらの断片を使用して、この研究で使用するpiggyBacベクターを組み立てた。合成A2S814スパイダーシルク配列を、BamHIおよびBspELを用いて、pBluescriptSKIIプラスミド前駆体から切除し、ゲル精製して回収し、上記のpSL中間プラスミドにおいてCTD上流の対応する部位にサブクローニングした。このステップにより、pSL-スパイダー6-CTDと名付けたプラスミドを得た。次いで、Not1/BamHI断片を上記のpCR4-TOPO-NTD中間プラスミドの1つから切除し、ゲル精製して回収し、そしてpSL-スパイダー6-CTDにおいてスパイダー6-CTD配列上流の対応する部位にサブクローニングして、pSL-NTD-スパイダー6-CTDを作製した。並行して、Not1/Xbal断片を上記のpCR4-TOPO-NTD中間プラスミドから切除し、ゲル精製して回収し、上記のpSL-EGFP中間プラスミドにおいてEGFPアンプライマー上流の対応する部位にサブクローニングした。これにより、NTD-EGFP断片を含有するプラスミドが得られ、この断片をNotlおよびBamHIを用いて切除し、pSL-スパイダー6-CTDにおいてスパイダー6-CTD配列上流の対応する部位にサブクローニングした。次いで、MP-UEE断片を上記のpSL中間プラスミドからSfi1およびNot1を用いて切除し、ゲル精製して回収し、上記の2つの異なる中間pSLプラスミドにおいてNTD-スパイダー6-CTDおよびNTD-EGFP-スパイダー6-CTD配列の上流の対応する部位にサブクローニングした。最後に、完全に組み立てられたMP-UEE-NTD-A2S814-CTDまたはMP-UEE-NTD-EGFPA2S814-CTDカセットを、それぞれの最終的なpSLプラスミドからASc1およびFse1を用いて切除し、pBAC[3xP3-DSRedaf]の対応する部位にサブクローニングしたHorn,etal.2002,InsectBiochem.Mol.Biol.,32:1221-1235。この最後のサブクローニングステップにより、EGFPマーカーの有無を示すためにスパイダー6およびスパイダー6-EGFPと名付けられた、2つの別々のpiggyBacベクターが得られた。以下の表に、使用されたpiggyBacベクターの重要な構成要素の一部を収戴する。実施例13-maspクローニング本実施例は、プラスミド、具体的にはpXLBacIIECFPプラスミドの内部にNTD領域を含有する遺伝子構築物を提供することにより本発明の有用性を実証する。pXLBacIIECFPプラスミドに加えてNTD領域を含有する潜在的に陽性のクローンは、PCRによるコロニースクリーニングにより示される。pXLBacII-ECFPNTDCTDmaspX1610,458bp図12AおよびpXLBacII-ECFPNTDCTDmaspX2411,250bp図12Bの遺伝子構築物maspを作製した。当業者にとって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の修正および変更をなすことができることは明らかであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその等価形態の範囲に入るならば、本発明の修正および変更を包含することが意図される。参考文献以下の参考文献は、参照によって具体的に本明細書に組み込まれる。1.Berghammer,A.,Bucher,G.,Maderspacher,F.,andKlingler,M.1999,Dev.GenesEvol.,209:382-389.2.Birnboim,H.C,andDoly,J.1979,Nucl.AcidsRes.,7:1513-1523.3.Brooks,A.E.,Creager,M.,andLewis,R.V.2005,AlteringtheMechanicsofSpiderSilkThroughMethanolPost-spinDraw.InBiomedica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