"血管または毛細血管の傷害および/または介入に伴うコラーゲン誘発性の血小板凝集を阻害するための医薬の製造のための、単離されたマスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンの使用であって、該ヘパリンプロテオグリカンが流動血液におけるコラーゲンに対する血小板の存続した接着によるコラーゲン誘発性の血小板凝集の阻害をもたらす、使用。前記ヘパリンプロテオグリカンが局所投与可能である、請求項1記載の使用。流動血液におけるコラーゲンに対する血小板の存続した接着によるコラーゲン誘発性の血小板凝集の阻害をもたらす、マスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンの製造方法であって、以下の工程a単離および精製されたマスト細胞を細胞培養培地中で細胞増殖が可能な条件を用いて培養すること;b要すれば活性化および/または溶解によってヘパリンプロテオグリカンを含有する顆粒を遊離させること;c遊離された顆粒を周辺の培養培地に溶解させること;dその培地から溶解したヘパリンプロテオグリカンHEP-PGを収集すること;e要すればその溶解したヘパリンプロテオグリカンから多重HEP-PGHEP-PG分子を分離すること、を含んでなる方法。工程bの活性化が、マスト細胞の脱顆粒化を誘導し、マスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンおよびHEP-PG分子を放出するマスト細胞アゴニストを用いて行う、請求項3記載の方法。アゴニストが塩基性ポリアミンおよびカルシウムイオノフォアからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。血管または毛細血管の傷害および/または介入に関連して局所投与するためのデバイスであって、流動血液におけるコラーゲンに対する血小板の存続した接着によるコラーゲン誘発性の血小板凝集の阻害をもたらす単離されたマスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンで該デバイスがコーティングされている、デバイス。該デバイスがステントを含んでなる、請求項6記載のデバイス。該デバイスが血管移植片を含んでなる、請求項6記載のデバイス。該デバイスが体外循環系を含んでなる、請求項6記載のデバイス。血管または毛細血管の傷害および/または介入に関連する局所投与のための調製物であって、流動血液におけるコラーゲンに対する血小板の存続した接着によるコラーゲン誘発性の血小板凝集の阻害をもたらす単離されたマスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンを、製薬的に許容し且つ適合し得る担体および/または添加剤と組み合わせて含んでなる調製物。本発明は、全身的な抗血小板薬と組み合せることができる、局所的適用形態での抗血小板処置の別の方法を提供する。この組合せは、血管形成術、血管および毛細血管の外科手術および動脈内膜切除と組み合せて使用することができ、血小板接着のための暴露された内皮下血管および毛細血管のコラーゲンを不動態化することができる。最初の研究において、ヘパリンプロテオグリカンHEP-PGで達成された望ましい効果によって、血小板-血小板相互作用の阻害に基づく局所的な血栓形成は有意に減少したけれども、コラーゲン上での粘着は維持されていた。粘着血小板上でのコラーゲン誘発の血小板活性化は、マスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンHEP-PG、多重ヘパリングリコサミノグリカン分子それ自体またはコア分子に結合した多重ヘパリングリコサミノグリカン分子、負に帯電したグリコサミノグリカンの十分なカップリング密度をもたらす空間的に最適な巨大分子の提示または配置をもたらす長球状または球状のコア分子に結合した低分子量ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン、の存在下で完全にブロックされることが示された。上に定義された効果は、ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAGが75±25kDaの分子量を有し、および/または多重の担体コア分子に結合し、スペーサー/リンカーを有し、非分画もしくは分画ヘパリンまたはヘパリン様鎖が最適な空間的位置で提示されたときに得られ、このHEP-GAG分子を含むプロテオグリカンHEP-PG分子は、溶液中として存在するかまたはコラーゲンでコートされた表面上に固定化するかまたは吻合術の際、閉じる血管表面に塗布する。現在の手段を用いた、血栓を阻害するためおよび過剰な創傷修復を制限するためのトロンビンターゲッティングは、処置部位の再狭窄の発生を依然として伴っていた。本発明のHEP-GAG分子およびHEP-PG分子の利点は、正常な止血応答を確保する、維持された全身的血小板機能にあった。生体内での平滑筋細胞増殖に対する、マスト細胞由来のHEP-GAG分子およびHEP-PG分子の局所的阻害効果も、低分子量ヘパリン分子種の効果WangKovanenCirculationRes印刷中と比較して有意に優れていることを示した。これらの予備的な知見に基づき、本発明者らは本発明のヘパリン様化合物、並びにその調製方法およびそれらの使用を開発した。本発明の目的は以下に記載する。本発明の第1の目的は、マスト細胞由来の多重ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAGおよび/またはヘパリンプロテオグリカンHEP-PGの構造と特性を模擬した可溶性のヘパリン様化合物を提供することであり、このHEP-GAG分子およびHEP-PG分子は、血小板-コラーゲン相互作用のほぼ完全な阻害に基づくこれまで報告されなかったメカニズムによって特徴づけられることが示された。このメカニズムは、新たに開発され、合成的、半合成的または生物工学的に修飾されたヘパリン様化合物、並びに血管または毛細血管の傷害、および血管形成術、ステント術および血管移植術などの介入に伴う血栓を阻害するのに有用な局所的に適用可能な調製物の特性をスクリーニングし決定するのに有用であり、便利である。本発明の別の目的は、適合し得る添加剤、担体などと組み合せて本発明のヘパリン様化合物を含有する薬学的に有用な調製物を提供することであった。本発明の第3の目的は、本発明のヘパリン様化合物を投与するための手段および/またはデバイスを、該手段またはデバイスをコーティングすることにより提供することであった。さらに、本発明の目的は、マスト細胞からHEP-GAGおよびHEP-PG分子を製造するための方法を提供し、さらにそのマスト細胞またはHEP-GAGもしくはHEP-PG分子を化学的および/または生物工学的方法により修飾して、請求の範囲で定義された、天然のマスト細胞由来のHEP-PG分子またはそれから得られる多重HEP-GAG分子の空間的配置と特性に類似した最適な空間的配置と特性を有する、新規のヘパリン様化合物を提供することであった。さらに、本発明の目的は、本発明のヘパリン様化合物の、それ自体としてのまたは調製物を製造するための成分としての使用、および血管形成術、ステント術および血管移植術などの血管および毛細血管の外科手術または介入に関連する動脈血栓を含む重篤な血管障害の予防的処置および阻害に有用なデバイスの使用であった。発明の要約血小板-コラーゲン相互作用は、止血および動脈血栓の、本質的な引き金となる事象である。予備研究において、本発明者らは、ヘパリンプロテオグリカンHEP-PGの分子量、つまりそのヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG部分の多重構造または空間的配置または提示に基づくヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAGの特に高い分子量、と血小板-コラーゲン相互作用に対するその阻害効果との間の明確な関連性を見い出した。最良の結果は、多重グリコサミノグリカンHEP-GAG、または血管のマスト細胞が活性化されてそれら細胞の顆粒が外部の体液にエキソサイトーシスにより排出され、そこで顆粒由来のヘパリン分子が可溶化されるような、生体内における状況を模擬するサイズを有する多重グリコサミノグリカン鎖を含むヘパリンプロテオグリカンHEP-PGによって、得られることが示された。この可溶化されたヘパリンプロテオグリカンHEP-PGは、平均して約10個の、それぞれの分子量が75±25kDaであるヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG部分を含む。所望の効果は、いくつかの非分画のまたは分画された、本明細書におけるいわゆる低分子量ヘパリングリコサミノグリカン単位が末端-末端結合または末端-側鎖で組み合わさって多重グリコサミノグリカン自身かまたはコア分子に結合した多重グリコサミノグリカンを形成することによっても得られた。さらに、同様な凝集の阻害は、多重非分画ヘパリン鎖12±10kDaの多重アミノ硫酸基がヘテロな二官能性カップリング試薬、即ち空間的な配置とカップリング密度を有する本発明の最適に帯電したヘパリン様化合物を製造するための最適なコア分子を与えるスペーサーまたはリンカー分子、例えば球状タンパク質であるアルブミンに存在するリジン残基と結合するN-サクシニルイミジル-32-ピリジルチオプロピオネートSPSDなど、とカップリングした場合に見い出された。このように、本発明はヘパリン様化合物であって、多重ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子を含み、高分子量を有し、いくつかの末端-末端および/または末端-側鎖で連結したヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子そのものまたはそれが天然または合成により得られた、鎖状の、好ましくは短いまたは球状のコア分子に連結したものからなる、または球状のコア分子と複合体を形成する低分子量のヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカンからなる、ヘパリン様化合物に関する。好ましくは、コア分子自体よりも多くのヘパリンまたはヘパリン様分子の結合を可能にするスペーサーまたはリンカー分子を使用して、上記ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカンの望ましく十分なカップリング密度を得る。本発明のヘパリン様化合物は、負に帯電したヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子または単位のカップリング密度を有し、それは、本発明のヘパリン様化合物の独特の特異的な特性の原因となるまたはそのような特性と密接に関連していると思われる空間的配置を本発明のヘパリン様化合物にもたらし、その特性は、マスト細胞由来のHEP-GAGおよびHEP-PG分子についてはじめて認識され、その特性は、血管または毛細血管の傷害または介入に伴う動脈血栓の一般的な原因である流動血液におけるコラーゲン上の血小板凝集を実質的に完全に阻害する能力である。本発明のヘパリン様化合物は、好ましくはいくつかの多重の末端-末端でおよび/または末端-側鎖で結合したヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG分子を含む。そのそれぞれは、好ましくは75±25kDaまたは75±25kDaを超える分子量を有する。本発明のヘパリン様化合物において、多重ヘパリンまたはヘパリングリコサミノグリカン分子は、天然または合成のコア分子と、結合、連結または複合体を形成してもよい。コア分子は、好ましくは球状であるかまたは所望の長球状の配置を与えるものであるが、より鎖状に近いコア分子に結合することもできる。低分子量のヘパリンまたはヘパリングリコサミノグリカン分子もコア分子に結合することができる。但し、その場合には、コア分子は長球状または球状の配置を有する。また、スペーサーまたはリンカー分子の使用が望ましく、これはより多くのヘパリンまたはヘパリン様分子または単位の連結を可能にし、したがってより最適な空間的配置とより高いカップリング密度をもたらす。コア分子はタンパク質またはポリペプチドであると有利である。コア分子の有用な例は、球状タンパク質、例えばアルブミン、好ましくはヒト由来の血清アルブミンである。コア分子のさらなるタイプは、ポリペプチドであるが、これは非常に長いものである必要はなく、例えば、Ser-Gly-Ser-Gly-配列の1またはそれ以上の繰り返しを含む。別法として、他の種類のアミノ酸配列を使用することができる。本発明は、商業的に入手可能なヘパリンおよびタンパク質またはポリペプチドからの一般的な修飾を含む、天然の供給源、合成または半合成または生物工学的方法からヘパリン様化合物を製造するための方法を記載する。天然のヘパリン様化合物は、単離精製した結合組織由来のマスト細胞を適当な培養細胞培地中で、良好な細胞増殖とヘパリンを含有する顆粒の産生とを可能にする条件を用いて増殖させることにより製造する。増殖工程を終了したのち、即ちヘパリンプロテオグリカンの収量が最適になったら、ヘパリンプロテオグリカンを含有する顆粒を、場合により活性化および/または溶解により放出させる。活性化工程は、マスト細胞脱顆粒を誘導し、可溶化された多重HEP-PG分子を放出させるマスト細胞アゴニストにより行うことができる。好ましいアゴニストは、塩基性ポリアミンやカルシウムイオノフォアからなる群から選択する。放出された顆粒を、周囲の培地中で可溶化させ、この可溶化したヘパリンプロテオグリカンHEP-PGを外の培地から集める。その後、所望であれば、天然の多重ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAGを該ヘパリンプロテオグリカンから分離することができ、該ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG分子をさらにお互いに連結させて、高度の分岐および/または多重性を有するヘパリングリコサミノグリカンを得ることができる。合成的または半合成的方法において、いくつかのヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン単位を、末端-末端および/または末端-側鎖で共有結合により連結させることができる。場合により、特に低分子量のヘパリン分子を出発物質として使用する場合、カップリング剤、例えばスペーサーまたはリンカー分子、を使用して、最適な多重性と空間的配置が得られるようにする。上記の本発明はすべて、血管または毛細血管傷害および/または介入に伴う動脈血栓の予防的処置のための方法に関する。この方法は、本発明のヘパリン様化合物の局所的投与によって行なわれる。局所的投与は、調製物の形態で本発明のヘパリン様化合物の有効量を直接、および/または本発明のヘパリン様化合物でコーティングしたデバイス例えばステント、血管移植片または体外循環系などとして間接的に適用することにより行なわれる。本発明のヘパリン様化合物は、薬学的に許容しうる担体および/または添加剤と組み合せて、適用や投与のためのより有用な調製物を得ることができる。本発明はさらに、血管または毛細血管の傷害または介入に関連する本発明のヘパリン様化合物の局所的投与のための調製物、手段および/またはデバイスを記載する。効果的な局所的投与は、例えば本発明のヘパリン様化合物でコーティングされた手段および/またはデバイスにより得られる。本発明はさらに、血管傷害または介入の部位での血小板凝集または詰まりを阻害するための方法に関する。この阻害は、特に本発明のヘパリン様化合物でコーリングされたデバイスの助けにより得られる。局所的投与のための手段および/またはデバイスを製造するための方法はさらに、活性を保持し保存が可能なように、例えばデバイスを本発明のヘパリン様化合物を含む溶液と接触させ、ほぼ滅菌条件下でこのデバイスを処理することを示唆し、そして包含する。デバイスは、例えば凍結乾燥により乾燥することができ、滅菌したバイアル内で使用するまで保存することができる。本発明のヘパリン様化合物でコーティングされたデバイスを処理し保存するための別の方法が当業者に知られている。このように、本発明は、血管または毛細血管の傷害および介入に伴う動脈血栓の原因である、流動している全血におけるコラーゲン上の血小板凝集の実質的に完全な阻害が可能な、医薬品および/またはデバイスを製造するためのヘパリン様化合物の使用に関する。発明の詳細な記載定義本記載では、以下の略語および頭字語を頻繁に使用する。GPは糖タンパク質を意味する。HEP-GAGは、流動している全血におけるコラーゲン誘発性の血小板凝集のほぼ完全な阻害が可能な、長い75kDまたは分岐したまたは多重ヘパリングリコサミノグリカンを意味する。HEP-PGは、上で定義したHEP-GAG分子を含むヘパリンプロテオグリカン天然のまたは合成のまたは半合成の、コア分子に結合した、即ちタンパク-またはペプチドに結合したを意味する。HMWHは、商業的に入手可能な、非分画の高分子量の75~30kDaのヘパリンまたはヘパリングリコサミノグリカン単位を意味する。LMWHは、商業的に入手可能な、低分子量の、75kDa未満のヘパリンまたはヘパリングリコサミノグリカン単位を意味する。この2つのタイプのヘパリンは、本発明においては、いわゆる低分子量ヘパリン分子または単位である。HSAは、ヒト血清アルブミンを意味し、BSAは、ウシ血清アルブミンを意味し、MWは分子量を意味する。PBSは、リン酸緩衝化生理食塩水を意味する。PPACKは、D-フェニルアラニル-1-プロピル-1-アルギニンクロロメチルケトンを意味し、PRPは、血小板豊富血漿を意味し、SDSは、ドデシル硫酸ナトリウムを意味し、TESは、N-トリスヒドロキシ-メチルメチル-2-アミノエタンスルホン酸を意味し、vWfはフォンビルブラント因子を意味する。SPDPは、N-サクシニルイミジル-3-2-ピリジルチオプロピオネートを意味する。本記載においては、使用する用語は、免疫化学、免疫学、生化学などを含め、医学の分野においてそれらが一般的に有する、それらの分野の教科書や論文に記載されている意味と同じ意味を有する。但し、いくつかの用語については、より広い意味で使用し、その用語の一般に使用されている意味とは若干違う意味を有する。これらの用語のうちのいくつかを、以下に定義する。ヘパリン様化合物なる語は、マスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンおよびヘパリングリコサミノグリカンと構造的に類似した化合物を意味し、流動している全血におけるコラーゲン誘発性の血小板凝集をほぼ完全に阻害する能力と、LassilaRLindstedtKKovanenPTArteriosclerosisThrombosisandVascularBiology19971735783587に記載された方法によって測定することができる天然のマスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGまたはそこから得られるヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG分子によって示される独特の特性を付与する、負に帯電したヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン単位のカップリング密度によって特徴付けられる化合物を意味する。本発明のヘパリン様化合物は、可溶性ものもコラーゲン上に固定化されたものも、血管の傷害および介入に伴う動脈血栓の原因である流動している全血におけるコラーゲン上での血小板凝集を阻害する能力、並びに流動している全血とコラーゲンとの相互作用を阻害する能力によって、特に、特徴付けられる。ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子の多重構造または最適なカップリング密度に加え、この特性は本発明のヘパリン様化合物に要求される必要条件である。最も具体的な意味では、ヘパリン様化合物は、マスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGおよびそれから得られるヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAGに限定される。但し、負に帯電したヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子または単位の所望の高いカップリング密度を有する化合物を生じる、独特の、空間的に最適な配置を有するヘパリン様化合物を得るための、直接にまたはスペーサーもしくはリンカー分子の助けによってコア分子に連結した、多重の、非分画または分画ヘパリンまたはヘパリン様鎖もまた含まれる。本発明のヘパリン様化合物の独特の特性を付与する所望の高いカップリング密度は、例えば天然のマスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGまたは多重ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG分子においてはじめて見出されたものであると同時に、本発明のヘパリン様化合物の特性を説明するものであると思われる。本発明においてヘパリンまたはヘパリン様プロテオグリカンなる語は、ヘパリン様化合物の定義において記載した必要条件を満たすヘパリンまたはヘパリン様プロテオグリカンを意味する。好ましくは、プロテオグリカンは、コア分子に結合した、3を越える多重ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子を含む。上記のヘパリンまたはヘパリン様化合物なる語はすべて、組織抽出または好ましくは細胞の培養によって哺乳類の結合組織型マスト細胞から得られる、天然の、水溶性のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGを包含する。これらのヘパリンプロテオグリカンHEP-PGは、通常約10~15の多重ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG分子を含む。合成によって製造されたヘパリンまたはヘパリン様プロテオグリカンは、上で定義した必要条件を満たす限り、任意の数の多重ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子を含むことができる。水溶性または可溶化されたヘパリン様化合物なる語は、マスト細胞由来HEP-PG分子が、マスト細胞の顆粒から,その分子が可溶化する外の媒体へ放出され、その後で細胞の残骸やその他の不溶性成分から分離できることを意味する。本発明の他のヘパリン様化合物は、たとえ、その分子すべての固有の特性が、特定の、特に固体表面に容易に粘着するものであったとしても、上で定義したのと同じタイプの可溶性が付与されるということが観察される。上記の多重ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子なる語はすべて、マスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンから得られ、分子量75±25kDaを有する天然のヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG分子を包含する。この用語はまた、例えば非分画または分画低分子量ヘパリンから得られる、末端-末端および/または末端-側鎖で連結した数個のグリコサミノグリカン単位を有する合成または半合成的に得られるヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカンを包含する。この多重ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子は、ヘパリン様化合物の定義において記載した特性を有する多重の直鎖または分岐鎖の分子を形成する。各ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子は、ヘパリン様化合物の定義に記載した特性を付与するに十分な分子量を有するものである。多重ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子または非分画または分画ヘパリンもしくはヘパリン様鎖は、天然の、合成または半合成コア分子、例えばタンパク質、好ましくは球状タンパク質と複合体を形成して、上で定義した特性を有するヘパリンプロテオグリカンを得ることができる。多重ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン分子なる語は、例えば少なくとも3~4の末端-末端または末端-側鎖で連結した、それぞれ商業的に入手可能な非分画または分画低分子量ヘパリンに相当する分子量を有するヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカン単位を有する分子を包含する。それらの分子量は、一般に20kDa未満、主に15kDa未満であるが、12kDa未満の分子量を有するヘパリングリコサミノグリカンも使用することができる。そのような場合は、単に、ヘパリン様化合物に関して定義した特性を付与するに十分に高い分子量またはカップリング密度を有するHEP-GAG分子を得るためにそれら分子をさらに多く結合させねばならないというだけである。天然マスト細胞由来の自然の多重ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG分子は、一般に、約75±25kDaの分子量を有する。そのような天然の多重ヘパリングリコサミノグリカン分子もまた末端-末端および/または末端-側鎖で連結させて、より大きな分子を得ることもでき、これもまた本発明の範囲に属する。このように、本発明の多重ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAGは、それらの任意の多重を含めて、少なくとも75±25kDaの分子量を有する。請求の範囲に定義したヘパリン様化合物の特徴を他に有していれば、ヘパリン様グリコサミノグリカンが定義された分子量を有していなければならないという必要性はない。高い分子量のほかに、十分なカップリング密度を得るための別の方法は、非分画または分画グリコサミノグリカン、例えばヘパリン、を球状のコア分子へ連結することである。所望の密度は、特に、より多くの所望のヘパリンまたはヘパリングリコサミノグリカン単位の結合を可能にする特異的なスペーサーまたはリンカー分子を用いることにより得られる。たとえ、天然のマスト細胞由来のHEP-GAG分子およびHEP-PG分子が血漿において実質的に低いアンチトロンビン結合活性を有することにより特徴づけられたとしても、本発明のヘパリン様化合物すべてがそうではない。しかしながら、血管または毛細血管の傷害および介入に伴う動脈血栓の原因であるコラーゲン誘発性の血小板凝集を実質的に完全に阻害する可能性は、本発明のすべてのヘパリン様化合物にあるものであるが、その化合物のうちのいくつかにおいては、その特性が強力なアンチトロンビンIII促進活性と結びつく。この組合せ効果はさらに有利な特性を、その製品、即ち本発明の化合物、調製物およびデバイスに付与する。このように、本発明におけるヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカンおよびヘパリンまたはヘパリン様プロテオグリカンなる語は、マスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGまたはヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAGだけでなく、合成、半合成のまたは組換えDNA技術を用いて製造されたヘパリン様グリサミノグリカンおよびヘパリン様プロテオグリカンも意味する。最も広い態様では、ヘパリン様化合物なる語は、直鎖状のまたは分岐したヘパリン様グリコサミノグリカン、即ちアミノ基を含み天然または合成または半合成のコア分子に連結または共有結合した、数百の単糖類からなる化合物を意味する。そのようなヘパリン様化合物は、上で記載した要件および必要条件を満たし、天然のマスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGおよびヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAGの特徴を有する分子を得るために、例えばコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、へパラン硫酸および/またはヒアルロン酸など、天然に存在するグリコサミノグリカン分子種そのものまたは化学的または組換えDNA技術を含む生物工学的手段により修飾されたものから得られる。ヘパリン様グリコサミノグリカン分子は天然物から単離する必要はない。それら分子を合成することもでき、または天然に存在する分子種のフラグメントを互いに、特にヘパリンフラグメントを連結させて新たな改変体を得ることもでき、その特性は当業者に知られている方法によって容易に試験することができる。マスト細胞なる語は、哺乳類またはヒト由来の血管または漿膜のマスト細胞のような、結合組織に関連するマスト細胞を意味し、それぞれの組織から単離することができ、その細胞を培地中で、その細胞の増殖と、マスト細胞の溶解および/または活性化による本発明のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGの分泌とを可能にする条件下で培養することができる。ヒトのマスト細胞を含め哺乳類のマスト細胞は、入手可能であり、文献に記載されているButterfieldJHWeilerDDewaldGGleichGJLeukRes19881234555NilssonGBlomTKuscheGullbergMKjellenLButterfieldJHSundstomGNilssonKHellmanLScandJImmunol19943948998。マスト細胞は一般に、慣用の突然変異誘発または組換えDNA技術により修飾することができる。カップリング密度なる語は、負に帯電したヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカンが、本発明のヘパリン様化合物の特徴が得られるような方式で空間的に互いに集まることを意味する。これは、多重ヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカンを調製することにより、または短い分子をお互いに、負電荷の十分な密度と最適な提示を可能にするような空間的配置に集めることにより、達成される。スペーサー/リンカー分子なる語は、所望の化合物または分子の、コア分子への結合を可能にする多様な基を有する重合化合物を意味する。SPSDが一つの例であるが、例えばタンパク質化学およびコンビナトリアルケミストリーcombinatorialchemistryの分野の当業者は、同等の有用性を有する多様な他のスペーサー/リンカー分子を見い出すことができる。流動全血におけるコラーゲン上での血小板凝集を実質的に完全に阻害する能力なる語は、LassilaRLindstedtKKovanenPTArteriosclerosisThrombosisandVascularBiology19971735783587に記載の方法によって測定したときに、血小板とコラーゲンとの間の相互作用を阻止することができるということを意味する。局所的投与または局所的使用なる語は、本発明のヘパリン様化合物を血管の傷害領域に、そのものとしてまたはinsituもしくはオンプレイスonplaceの形態で、即ち局所的locallyまたは局所的topicallyに適用可能な調製物もしくは組成物および/または手段もしくはデバイスとして投与することを意味する。局所的投与は、例えば、露出した血管組織を溶液でフラッシングflushingすることによって行なう。本発明のヘパリン様化合物は、デバイスをコーティングするのに使用することができ、それを傷害した血管に接触させて設置することができる。このようなデバイスは、例えばコーティングされたステント、即ち血管を開いたまま維持するために血管内に設置する小さなデバイス、または弱くなった血管組織を置き換えるために使用する血管移植片である。コーティングすることができるデバイスのその他の例には、例えば体外循環系があり、その内壁を本発明のヘパリン様化合物でコーティングすることができる。予防的処置なる語は、局所的localまたは局所的topically適用、例えば本発明のヘパリン様化合物をそれ自体としてまたは適当な調製物としてまたは該ヘパリン様化合物でコーティングされたデバイスの形態で、露出した血管組織をフラッシングすることにより、血管または毛細血管の傷害および介入による血栓を阻止することを意味する。ヘパリン様化合物の局所的投与は、それ自体としてまたは慣用の調製物の全身的投与と組み合せて使用することができる。動脈血栓なる語は、アテローム血栓症およびその他脈管構造の止血状態、血管傷害および医原性の血管形成術およびその他の介入を含む、内因的な状態に関連する動脈内の血栓を意味する。調製物なる語は、患者に投与するための調製物、手段および/またはデバイス中の適合し得る薬学的に許容し得る添加物、担体と組み合せて使用する本発明のヘパリン様化合物を意味する。発明の一般的記載本発明の第一の目的は、生体内での血小板-コラーゲン相互作用について、本発明のHEP-GAG分子またはHEP-PG分子の効果と、標準的なヘパリン平均分子量15および5kDaの効果とを比較することであった。標準的なヘパリンとは対照的に、マスト細胞由来のHEP-PGおよびHEP-GAG分子は、血小板豊富血漿におけるコラーゲン誘発性の血小板凝集とセロトニン放出を完全に阻害することが示された。本発明のマスト細胞由来のHEP-GAGおよび/またはHEP-PG分子によって引き起こされるこの阻害は、それらの巨大分子構造に依存していることが示された。流動血液では、マスト細胞由来のHEP-GAGおよびHEP-PG分子はまた、コラーゲンでコーティングされた表面上での血小板の沈着を、低いせん断速度および高いせん断速度shearrateの両方で阻害した。マスト細胞由来のHEP-GAGおよびHEP-PG分子は糖タンパクGPIa/IIa介在の血小板粘着を阻害しなかったが、その後の血小板の活性化と凝集、並びにコラーゲン刺激後の血小板へのフィブリノーゲン結合を減弱化した。マスト細胞由来のHEP-GAGおよびHEP-PG分子は血小板に結合しなかったが、フォンビルブラント因子vWfに強固に結合し、コラーゲンへの結合を増強した。高いせん断速度での血小板粘着とリストセチン刺激後のGPIbに対するvWf結合は、顕著に影響しなかったが、本発明のHEP-GAGおよびHEP-PG分子は、トロンビン誘発性の凝集とGPIIb/IIIaへのvWf結合を減少させた。これらの知見は、HEP-PGの分泌を確保することによる血管マスト細胞の活性化が、マトリックスコラーゲンの血栓形成性を、その血小板活性化能力を阻害することにより局所的に減弱化し得ることを暗示している。トロンビン活性を阻害するマスト細胞由来HEP-PGの能力を調べることが、この研究の最初の目的であった。具体的には、非常に高い分子量のヘパリン分子種の阻害効果を、標準的なヘパリンの、アンチトロンビンIII活性の増強に本質的によるところの、よく知られている抗凝固機能NaderHBDietrichCPinLaneDAandLindahlUHeparinChemicalandBiologicalPropertiesClinicalApplicationErwardArnoldLondon1989pp8196と比較した。トロンビンを阻害するHEP-PG、HMWH、およびLMWHの異なる能力に焦点を当てたこの分析図1は、血漿タンパク質の非存在下では、HEP-PGのほうがHMWHよりもアンチトロンビンIIIを直接増強する機能的な能力が優れているが、血漿の存在下ではHEP-PGはHMWHよりも効力が低かったことが示された。これらのデータから、HEP-PGが、HMWHと比較して、ヘパリンに対する結合についてアンチトロンビンIIIと拮抗すると考えられているvWfなどの血漿タンパク質とより効果的に結合するかどうかについて理解することができた。分子量が大きいヘパリンほど、血漿タンパク質に対する親和性が高いということは示されているBaruchDAjzenbergNDenisCLegendreJCLormeauJCMeyerDThrombHeamost199467639643。総括すると、HMWHおよびLMWHと比較した、観察された血小板-コラーゲン相互作用に対するHEP-PGの阻害能力以下実施例15~16を参照は、アンチトロンビンIIIに依存するトロンビン阻害によるものではないと結論づけられた。本研究の主な知見は、iコラーゲン誘発性の血小板凝集図2、iiそれに続く密な顆粒の放出セロトニン、およびiii低いおよび高いせん断速度条件下両方での、流動全血における固定化されたコラーゲン上の血小板沈着図3のHEP-PGによる全体的な阻害であった。以前に、HMWH濃度>6μg/mLは、脱陽イオン化PRPにおいて低用量コラーゲンにより誘発される血小板凝集を減少させることは示されていたFernandezFNguyenPvanRynJOfosuFAHirshJBuchananMRThrombRes198643491495。本研究では、マスト細胞由来のHEP-PGが、HMWHとは対照的に、コラーゲン誘発性血小板凝集およびセロトニン放出を、コラーゲン濃度に関係なく全体的に阻害することがわかった。興味深いことに、HEP-PG分子は、血小板豊富血漿PRPにコラーゲンの10秒後に加えた場合でさえ、血小板に対するコラーゲンの作用を阻害できることが示された。マスト細胞由来のHEP-PG分子は、PPACK-PRPよりもクエン酸塩PRPにおいて、コラーゲンによる血小板凝集を効果的に阻害することを示し、HEP-PG分子が、コラーゲン刺激に対する陽イオン依存の血小板機能をブロックするのに最も強力であることを示した図2、3、4。血小板GPIa/IIaの異質性は、人によって様々な血小板応答をもたらしたが、このことは、恐らく、ゲルろ化された血小板の凝集に対するHEP-PGの阻害効果がアル程度変動していることに反映している。この結果は、ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG分子の多重構造に関連することを示した。使用した条件下では、HEP-PG分子はコラーゲンまたは静止している血小板とは直接には結合しなかったようであることから、HEP-PG分子は他のメカニズムにより血小板-コラーゲン相互作用を妨害した。HEP-PGがMg2-依存性の血小板粘着を阻害せずに、その後で血小板凝集を減少させた図4および5という知見は、GPIa/IIaからGPIIb/IIIaへの活性化シグナルの伝達の減弱を暗示した。このように、フィリノーゲン結合の検出された減少は、コラーゲン誘発性血小板活性化の妨害にとって二次的なものであった。HEP-PGがGPIIb/IIIaに直接作用しなかったという示唆は、HEP-PGの存在下での正常なADPおよびエピネフリン誘発性の凝集とフィブリノーゲン結合によってさらに裏付けられた。本発明のHEP-GAG分子についても同様の結果が得られた。この知見は、コラーゲン上での血小板粘着後の活性化の減少図3、4、5を暗示し、これは、低いせん断速度および高いせん断速度両方での流動血液における血小板動員の阻害を導くものである。HEP-PGによってMg2依存の血小板粘着は減少しなかったので、根底にあるメカニズムとしてのGPIa/IIaの直接の阻害は排除される。コラーゲン誘発性の凝集だけでなくトロンビン誘発性の凝集をも阻害する、強い負電荷を有する巨大分子であるHEP-PG分子は、アゴニストによる活性化の間の負に帯電した血小板膜リン脂質の外への移動を遮断したBeversEMComfuriusPZwaalRFABloodRev19915146154。GPIa/IIa介在のコラーゲンに対する粘着の後の、血小板機能の低下は、GPIIb/IIIaに対するリガンド結合の減少によって媒介されたであろう。実際、HEP-PGはコラーゲンにより刺激された血小板へのフィブリノーゲン結合を減少し、HEP-GAGも同様に減少させることを示した。流動条件下では、コラーゲンへの血小板動員は、vWfと、血小板GPIbおよびIIb/IIIa並びにコラーゲンに対するその結合に大きく依存している。GPIIb/IIIaはトロンビンのvWfへの結合が引き金となり、ヒルジンを使用した条件下では、血小板を加えた60秒後にトロンビンのタンパク質加水分解作用を阻止した。HEP-PGはまた、vWfの血小板への結合を減少させた以下の表IIを参照。以上をまとめると、コラーゲンに対する血小板粘着の後、HEP-PGは血小板活性化をブロックし、同時にvWfに強固に結合することにより、GPIIb/IIIaに対するそのアベイラビリティーを減少させた。マスト細胞由来のHEP-GAG分子およびHEP-PG分子はvWfに結合することにより、vWfの、GPIIb/IIIaとの相互作用だけでなく、GPIbとの相互作用の破壊をももたらした。したがって、リストセチン誘発性の血小板凝集がHEP-PGにより顕著に減少した以下の表I参照。100倍過剰のHMWHはvWf結合を阻害したが、使用したHEP-PGの濃度では、リストセチンにより刺激された血小板に対するvWfの結合静止条件は影響を受けなかった。HEP-PGが血小板-コラーゲン相互作用を阻害する高いせん断速度での流動血液においては、これらの巨大分子は、静止結合分析における効果と比較して、vWf-依存の血小板活性化に対する効果が確かに強かった。実際、試験管内および生体内の両方で、HMWHはvWf依存の血小板機能をかなり妨害することが既に報告されているSobelMMcNeillPMCarlsonPLKermodeJCAdelmanBConroyRMarquesDJClinInvest19918717871793。しかし、HEP-PGは、GPIbおよびヘパリン結合領域が存在するA1ドメイン以外のvWf分子の他のドメインによっても媒介されるvWfのコラーゲンへの結合を阻害するどころかむしろ増強した。vWfのコラーゲンへの結合の増加は、コラーゲンの血小板活性化ドメインを封じると考えられる。本発明のヘパリン様分子の供給源の1つであるマスト細胞は、血管壁の外膜層および小静脈の血管周囲に多く存在するGalliSJNEnglJMed1993328257265。それらは、アテローム発生の部位である動脈内膜にも存在し、活性化されたマスト細胞は、最も一般的な破裂部位である、冠アテロームの炎症領域の肩の部分inflammatoryshoulderregionへ浸潤することが分かっているKovanenPTKaartinenMPaavonenTCirculation19959210841088。活性化されると、炎症において起こるように、マスト細胞は脱顆粒し一連の血管作用因子をエキソサイトーシスによって排出する。なかでも短命ロイコトリエンおよびプロスタグランジン、血小板活性化因子およびヒスタミンは血小板を刺激することが知られている。ヒスタミンは、内皮のフォンビルブラント因子vWfおよびP-セレクチンを放出し、2つの因子は血小板および白血球に対する重要な粘着シグナルであるWagnerDDThrombHaemost199370105110。さらに、マスト細胞は、そこから臨床的に使用されるヘパリンが得られるグリコサミノグリカンを分泌するのに対しNaderHBDietrichCPinLineDAandLindahlUHeparinChemicalandBiologicalPropertiesClinicalApplicationEdwardArnoldLondon1989pp8196、活性化された血小板は、血小板第4因子、ヘパリン中和因子、およびヘパリン開裂エンドグリコシダーゼであるヘパリチナーゼを分泌する。このように、これら2つのタイプの細胞間での相互作用が、それらが活性化された後に存在するようであるが、これまで十分に特徴付られてはこなかった。止血においてマスト細胞活性化が関与するかどうかを、マスト細胞が過剰に活性化された状態になる2つの臨床的状態である、アナフィラキシー状態の間および肥満細胞症において調べることができる。これらの状態でも、血管内皮における変化、つまりその非血栓形成特性のダウンレギュレーション、粘着分子の誘導、透過性の増加および内皮下構造の露出WagnerDDThrombHaemost199370105110、を引き起こす血小板アゴニストや強力な炎症メディエーターの放出にもかかわらず、血栓はあまりみられなかった。したがって、活性化されたマスト細胞はそれ自身の血栓形成性を中和することが可能であった。以前、その抗凝固能力に加え、臨床的に有用な高分子量のヘパリングリコサミノグリカンHMWH;平均分子量15kDaが、低用量のコラーゲンによって誘発される血小板凝集を阻害することを示したFernandezFNguyenPvanRynJOfosuFAHirshJBuchananMRThrombRes198643491495;興味深いことに、ヘパリンの阻害効果は使用したヘパリンの分子量に直接関係することが分かった。本発明を導いた研究では、HEP-GAGおよびHEP-PG分子は、マスト細胞顆粒からエキソサイトーシスの後に放出された。可溶性のHEP-PGの放出の後に顆粒の不溶性のマトリックスを形成する残ったプロテオグリカン顆粒残遺物;直径05~10μmは、ヘパリングリコサミノグリカン鎖のみから構成されていたLindstedtKKokkonenJOKovanenPTJLipidRes1992336574。一方、顆粒から細胞外の液体に放出された可溶性のプロテオグリカンは、ヘパリンを含み、程度は低いがコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン鎖も含んでいたLindstedtKKokkonenJOKovanenPTJLipidRes1992336574。可溶性HEP-PGに対するヘパリナーゼおよびコンドロイチナーゼの異なる効果、つまり前者はその阻害活性を減少させるが後者はそうでないということから、血小板-コラーゲン相互作用に対する阻害効果がHEP-PGのヘパリングリコサミノグリカンコンポーネントに起因しているということが分かった。可溶性HEP-PGの構造的解析では、二糖単位の組成はヘパリンに典型的なものであるJpLiPKovanenULindahlunpublishedresults。したがって、HEP-PGと市販のヘパリンとの間の観察された機能の違いは、グリコサミノグリカン鎖の組成以外の他の要因によるものであると結論できた。このように、血小板機能を阻害するインタクトなHEP-PG分子量750kDaの能力は、上に既に述べたようにHMWH分子量15kDaまたはLMWH分子量5kDa図2よりも大きかった、HEP-PGから放出されるヘパリングリコサミノグリカン鎖分子量75kDaの能力よりも高かった。これらをまとめると、上記の知見は、本発明の高い分子量のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGをもたらす、大きいサイズのヘパリン鎖と、そのコアタンパク質への結合の両方が、観察された阻害に寄与する最も重要な因子であることを示した。ヘパリナーゼでヘパリン鎖の部分を破壊すると阻害能力が減少するので、マスト細胞由来のHEP-PGの阻害能力は、ヘパリン鎖にのみ関連していた。HEP-PGを高塩濃度で処理し、イオン介在のプロテアーゼ、即ちグリコサミノグリカン鎖に結合したチマーゼ、トリプターゼ、およびカルボキシペプチダーゼA、の結合を切断した後でもコラーゲン誘発性の血小板凝集に対する記載した阻害能力が存在していた。等モル濃度で標準的なヘパリンの負の電荷を中和することが知られている硫酸プロタミンは、100倍モル過剰でHEP-PGの効果のみを阻害した。このことは、ヘパリンの天然のアントゴニストであり血小板凝集の間に放出される血小板由来の第4因子が、HEP-PGを中和するための非常に高い局所的濃度に必要であろうということを示した。分子量500,000を有するポリリジンの血小板凝集濃度においてさえ、HEP-PGは阻害能力を保持した。これらの証拠はすべて、ヘパリンの強い負電荷がHEP-PGの活性に決定的なものであることを示した。血管傷害によって露出したコラーゲンにより相互作用を受ける血小板は、止血とアテローム血栓症の両方において非常に重要な役割を果たしていると考えられている。血小板-血管壁相互作用における血管コラーゲンの重要性は、コラーゲンに対する糖タンパク質受容体の血小板の欠陥またはGPIa/IIaに対するmabs、およびコラーゲン合成が最適化されたときに平滑筋細胞マトリックスの血栓形成性が増大することによる、コラーゲン合成の欠陥を有する出血障害の患者においては明らかである。マスト細胞由来のHEP-PGは、マスト細胞が存在し様々な刺激によって活性化され得る、内皮下および外膜へ局所的に分泌され得るKolodgieFDVirmariRCornhillJFHerderickEESmialekJJAmCollCardiol19911715531560。コラーゲンに対する血小板反応性に対するHEP-PGの有意の阻害能力は、血管壁における血栓を制限する新たなマスト細胞依存の生理学的メカニズムを暗示した。このメカニズムは、ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG分子の多重構造に依存していると考えられた。この最初の知見は、後になって確認され、他のヘパリン様化合物においてもみられた。本研究の別の目的は、血小板-コラーゲン相互作用に対するマスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGの効果を調べることであった。モデルとしてラット漿膜マスト細胞を使用した。これらの細胞は、それぞれモノマーを含み、分子量75kDa50~100kDaの範囲のヘパリングリコサミノグリカン鎖を平均で10個含む、分子量750kDa750~1000kDaの範囲のHEP-PGからなる細胞質分泌性顆粒で満たされている。活性化されると、マスト細胞はそれら顆粒のうちのいくつかを、細胞外液に放出し、そこで顆粒HEP-PGのフラクションが可溶化するLindstedtKKokkonenJOKovanenPTJLipidRes1992336574。これらの可溶性HEP-PGは、コラーゲン誘発性の血小板凝集と固定されたコラーゲンとの血小板の相互作用を強力に阻害することが分かった。この知見は、多重ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAGまたはHEP-GAG分子を含むヘパリンプロテオグリカンHEP-PG自体が血管の細胞外マトリックスに対する反応性を減弱し、それによりマスト細胞の他の潜在的な血栓形成効果を中和することを暗示している。HEP-GAG分子構造の多重の特徴は、所望の効果を達成するのに非常に重要であることが示され、本発明において、マスト細胞由来のHEP-GAG分子の活性は、他のヘパリン様化合物の活性と同様、負に帯電したヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカンの分子の複雑さおよびまたは高いカップリング密度に基づいているということが示された。本発明のヘパリン様化合物、特にマスト細胞由来のHEP-GAGおよびHEP-PG分子によって得られた改良は、血小板豊富血漿においてコラーゲン誘発性の血小板凝集およびセロトニン放出を完全に阻害するという事実に基づいていることが示された。さらに、本発明のヘパリン様化合物は、流動している全血においてコラーゲンでコーティングされた表面における血小板沈着を、低いおよび高いせん断速度の両方で好ましく阻害する。マスト細胞由来のHEP-GAGおよびHEP-PG分子と同じように、本発明のヘパリン様化合物は、血小板の活性化および凝集、並びに血小板へのフィブリノーゲンの結合をコラーゲン刺激の後に、同時に、フォンビルブラント因子vWfを強固に結合し、そのコラーゲンへの結合を促進することにより、同様に、いくつかの決定的なコラーゲンの血小板活性化領域を遮蔽することにより、好ましく減弱化する。また、ヘパリン様化合物はトロンビン誘発性の凝集と、その後のフォンビルブラント因子の糖タンパク質GPIIb/IIIa複合体への結合を好ましく減少させる。流動している全血における血小板懸濁液中でのコラーゲン誘発性の血小板凝集および血小板と固定されたコラーゲンとの相互作用の阻害は、それらの最も傑出した特性である。アレルゲン誘発性のマスト細胞活性化が出血時間を有意に長引かせ、提供者の出血時の血液中でのトロンビン生成を減少させたという事実KauhanenPKovanenPTReunalaTLassilaRThrombHaemostThrombHaemost1998798437は、マスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGおよび多重ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAGの特性としての血管の細胞外マトリックスに対する血小板の反応性の減少により、皮膚のマスト細胞活性化で誘発された出血時間の延長を説明するものであると考えられる。マスト細胞由来のHEP-PGは、10分間続く急性モデルおよび72時間の追跡モデルにおいて、吻合の間のラットの大腿動脈における血栓形成を破壊することが示した。これは本発明のヘパリン様化合物の所望の特性である。HEP-GAG分子およびHEP-PG分子で得られた改善は、定義した技術的特徴を有する本発明の他のヘパリン様化合物によっても得られ、その結果として、血管または毛細血管の傷害または例えば血栓によって引き起こされた血管系における他の重篤な障害に関連する血小板凝集の阻害を含む改良が、本発明の他のヘパリン様化合物によって得ることができた。マスト細胞由来のHEP-GAGおよびHEP-PG分子を含め、本発明のヘパリン様化合物は、例えば手術後の治癒で望ましくないまたは過剰な血液凝固を生じる分画されていないヘパリンと比較すると、より効果的な障害の局所的予防的処置および阻害をもたらすことが示された。多重ヘパリングリコサミノグリカンHEP-GAG部分を含むマスト細胞由来のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGと同様に、本発明のヘパリン様化合物は、血管細胞外マトリックスに対する血小板の反応性を減弱させる効果に関与することが示された。マスト細胞由来のHEP-PG分子のHEP-GAG部分の多重構造または負に帯電したグリコサミノグリカン単位の高いカップリング密度が、その化合物に独特の特性を付与する本発明のヘパリン様化合物をもたらすことを示した。このように、長球状、瓶ブラシ状の空間的提示または配置が、所望の効果を得るために特に重要であるということ、その結果、多重の末端-末端および/または末端-側鎖で連結したグリコサミノグリカン単位を有する合成または半合成で得られたHEP-GAG分子が、それ自身で特に有用であり、マスト細胞由来のHEP-GAGおよびHEP-PG分子と同じかまたは改良された特性によって特徴づけられることが示された。本発明の他のヘパリン様化合物は、グリコサミノグリカン単位、好ましくはヘパリングリコサミノグリカン単位を末端-末端または末端-側鎖で連結させて十分に大きなグリコサミノグリカン分子を形成することにより製造することができ、この多重の直鎖または分岐したグリコサミノグリカン分子は、それ自体で、または天然の、合成または半合成によって得られたコア分子、例えば球状タンパク質またはポリペプチド鎖など、好ましくは短いポリペプチド鎖との複合体として使用することができ、それらの特性は容易にスクリーニングおよび試験することができるものである。本発明のヘパリン様化合物は、活性であると分かれば、血管または毛細血管傷害や介入に伴う動脈血栓の予防的処置において使用することができる。本発明のヘパリン様化合物は、局所的使用のための調製物を製造するのに、およびステント、移植片および/または体外循環系などのデバイスをコーティングするのに有用である。この調製物、手段およびデバイスは、血管の傷害および介入に伴う動脈血栓の予防的処置および流動している全血のコラーゲンとの相互作用の阻害に順次に使用することができる。即ち、本発明のヘパリン様化合物は、改善された、即ち、改善された効力による、アテローム血栓症や血管の傷害および血管内皮のその他の変化を含む他の止血状態を含む血栓のより効果的な局所的処置のための、医薬調製物または医薬を製造するために使用することができる。上記のすべての本発明のヘパリン様化合物は、血管または毛細血管の傷害または介入に伴う動脈血栓の予防的処置に使用し、それ自身としてまたは適当な、適合する添加物、担体などと組み合せて、または本発明のヘパリン様化合物でコーティングされたステント、移植片などのデバイスとして、局所的に適用または投与する。様々な種類のデバイス、例えばステントは、その使用およびそのコーティングについて詳細に記載されており、例えばその内容が本明細書の一部を構成する以下の特許公報に記載されている:WO98/22162、EP832618、US5718862、US5603722、US5583213、US5571166、US5554182、US5618298、US5342621、US5409696。デバイスはまた、種々の適用に応じた、多くの種々の形態で商業的に入手可能である。そのような製品は、例えば、AVEArterialVascularEngineeringSantaRosaCA95403USA製のMicrostentII商標、SciMedBostonScientificCorporationFrance製のNIR商標およびNIROYAL商標ステントである。デバイスは、剛体の、半剛体の、弾力性の、らせん形をした、一般にプラスティック、シリコン、金属、ハイドロキシアパタイトでできたものである。ステントの調製の材料として特に好ましいのは、ポリアクリル酸であるが、本発明のHEP-GAGおよび/またはHEP-PG分子でコーティング可能な、所望なフレキシブルな、弾力性のある、半剛体のまたは剛体の、堅さを有するその他のものは、本発明の範囲から何ら除外されることはない。本発明は、他の血管または毛細血管の手術を含む、血管形成術、ステントおよび/または移植片の適用などの血管の傷害に伴う血栓を含む血栓症の予防的処置および/または阻害において使用するための、薬学的または医学的活性を有する調製物に関する。本発明の、水溶性の、ヘパリン様化合物を得るために使用する方法および材料、並びにそれを含む調製物およびデバイスおよびそれらの使用を以下の実施例においてさらに詳細に記載する。実施例は、単なる説明であって発明の範囲の限定と解釈されるべきではない。当業者は、本発明を応用するためのさらなる可能性をすぐに認識するであろう。実施例1AヘパリンプロテオグリカンHEP-PGの製法刺激されたマスト細胞によってエキソサイトーシスされたヘパリンプロテオグリカンHEP-PGマスト細胞はラットの腹膜腔および胸膜腔から報告YurtRW;WesleyLeid,Jr.R;AustenKF著、J.Biol.Chem.、1977年、252巻:518~521頁に従って分離した。標準的な検定においては、マスト細胞10~13×106個を、HSARedCrossTransfusionService社、ヘルシンキ、フィンランド0.1mg/mLおよび5.6mMグルコースを含有するPBS緩衝液1mL中でインキュベーションした。プレインキュベーション15分間、37°C後、細胞を特異的マスト細胞アゴニストである化合物48/80SigmaChemical社5μg/mLとともに15分間インキュベーションして脱顆粒を誘導した。対照実験では、化合物48/80が血小板凝集を誘導しないことが示された。脱顆粒したマスト細胞を150×gで10分間遠心して沈降させ、上清液をさらに12000gで15分間遠心してエキソサイテーションした顆粒を沈降させ、顆粒不含上清液をアルシアンブルーFlka社反応性物質の量について分析したLindstedtK;KokkonenJO;KovanenPT著、J.LipidRes.、1992年、33巻:65~74頁。血漿の非存在下で行った実験では、大豆トリプシン阻害剤Sigma社を加えてマスト細胞由来天然セリンプロテアーゼを不活化した。実験を通じ、HEP-PGは300倍濃度までの市販ブタ非分画高分子量ヘパリンHMWHLeiras、フィンランド平均MW15kDa、1<7.5kDa、1mg=100IUUSPおよび分画低分子量ヘパリンLMWHFragmin,KabiPharmacia社MW5kDa、25>7.5kDa、1mg=152抗Xa単位と比較した。HEP-PGは、緩衝液または血漿中のイオン化したカルシウムまたはマグンシウムの量を変化させなかったMicrolyte6、KoneInstruments社、フィンランドBoinkTBTJ;BuckelyBM;ChristiansenTF,CovingtonAK;Muller-PlatheD;SachsCh;Siggaard-AndersonO著、Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem、1991年、29巻:767~772頁。マスト細胞を35S-硫酸ナトリウムAmershamInternationalと報告LindstedtK;KokkonenJOKovanenPT著J.LipidRes.1992年33巻:65~74頁のようにインキュベーションすることによってHEP-PGを放射能標識した。実験によっては、HEP-PGをコンドロイチナーゼABCおよびヘパリナーゼ共に生化学工業社で処理した。実施例1BヘパリンプロテオグリカンHEP-PGの製法天然ヘパリンプロテオグリカンHEP-PG結合組織型マスト細胞、例えば哺乳類起源の皮膚マスト細胞および漿膜マスト細胞などは、実施例1Aに記載した方法または若干の修正を加えた方法を用いて、ラットのみならず例えばウシ、ブタ、ヒツジ等の他の哺乳類種からも単離することができる。ウシまたはブタの屠殺の際に腹膜腔および胸膜腔をリン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄する。液を集め、100×gで5分間1回遠心し、沈降した細胞をPBSに再懸濁する。マスト細胞の単離をファイコル中で勾配遠心により行い、マスト細胞は30および40ファイコル層の中間層に濃縮される。可溶性プロテオグリカンを得るためにマスト細胞を塩基性ポリアミンである化合物48/80またはカルシウムイオノフォアA23187で刺激してマスト細胞顆粒のエキソサイトーシスを誘導する。エンドグリコシダーゼによって分解される常法通りに分離されたウシまたはブタ由来ヘパリングリコサミノグリカンとは対照的に、培養された精製マスト細胞は遊離の実質的に分解されていないポリサッカライド鎖を蓄積するが、これはエンドグリコシド分解を受けないNaderHBDietrichCPLaneDAandLindahlUHeparinChemicalandBiologicalPropertiesClinicalApplicationEdwardArnoldLondon19898196。リンパ節由来マスト細胞は、ヒト細胞系統であるHMC-1と同様に培養できる。これらの培養された細胞は遺伝子操作により処理して、HEP-PGの産生を増大させることができる。マウス骨髄由来マスト細胞とフィブロブラストとの共培養によって、コンドロイチン硫酸に関連するヘパリンの生合成が増大することが報告されている。共培養の使用は後にHEP-PG分子を放出する細胞の増殖を改善するために推奨される。このようなヘパリンプロテオグリカンHEP-PGは、典型的にはタンパク質加水分解に対する抵抗性がより高いことが知られており、これはペプチドコアが炭水化物で高度に置換されてことによるものと考えられる。このことは、活性の持続に関する能力並びに安定性および保存性または保存期間の増大によって、HEP-PG分子の潜在的用途を拡大する。実施例1Cヒトのマスト細胞からヒト由来天然ヘパリンプロテオグリカンHEP-PGを製造する方法ヒト起源のたとえば皮膚マスト細胞および漿膜マスト細胞のような結合組織型マスト細胞は、実施例1Aに記載した方法または若干の修正を加えた方法を用いて、単離することができる。通常に行われる生検走査で患者から採取できる程度の少量の試料があればよいとみられる。その後、ヒト由来マスト細胞を通常の細胞培養培地でこのマスト細胞を好適に増殖させる条件下で培養する。マスト細胞はリン酸緩衝生理食塩水で収集し、実施例1Aおよび1Bに記載したように処理する。培養した細胞培養物は、それ自体を既知の方法によって貯蔵し保存することができ、さらなる細胞を産生するための無制限なソースを提供する。実施例1DヘパリンプロテオグリカンHEP-PGの製法合成高分子量ヘパリン鎖およびHEP-PGHEP-GAG分子およびHEP-PG分子の多重構造は血小板-コラーゲン相互作用に対する阻止作用に必須である。しかしながら、低分子量のものとは対照的に、75±25kDa以上の非常に長いグリコサミノグリカンHEP-GAG鎖は阻止性能を保持している。そこで、合成鎖は、分子量が少なくとも12kDa、好ましくは15~20kDaのグリコサミノグリカン単位を少なくとも3個~10個を含み、これが末端-末端または末端-側鎖で相互に結合して直線状または分枝状ヘパリングリコサミノグリカン鎖分子を形成する。さらに在来型に近い構築物を得るためには、これら個々の長鎖ヘパリンHEP-GAG鎖を米国特許第5529958号に記載されているようなポリマーリンカー分子に結合することもできる。有用なポリマーコア分子は、例えば反復Ser-Gly-配列を含む鎖状ペプチドまたはアルブミンHSA等の球状タンパク質であり、これを、SPDP、N-サクシニルイミジル-3-2-ピリジルチオプロピオネートのようなリンカー分子を介してヘパリンに結合することができる。リンカー量に対して過剰量のヘパリンを使用する。しかし、その比率は、もちろん合成ヘパリン様化合物の所望の構造に応じて変動する。これら選択肢、即ち単鎖HEP-GAG分子と合成HEP-PG構築物、はいずれも、天然のヘパリンプロテオグリカンHEP-PGにあるタンパク質の潜在的な抗原性部分が存在しないために、抗原性の少ない改善された調製物を調製する可能性をもたらす。このほか、最適ヘパリン密度を持つ高分子量多重HEP-GAG分子は、ヘテロ二官能性カップリング試薬であるSPSDを用いて、標準的な非分画ヘパリン12kDa鎖をアルブミンのような球状コア分子に結合することによって得ることができる。実施例1Eウシ血清アルブミンBSAに対するヘパリンの架橋結合ヘパリンLovens、MW15kDa2mgをPBSで希釈し、メタノール中でヘテロ二官能性カップリング試薬SPDPN-サクシンイミジル-3-2-ピリジルチオプロピオネート、FlukaChemieAG、スイス1mgとカップリングさせた。ヘパリンを結合させたこの試薬の溶液200μLをDTTジチオスレイトール、SigmaChemicals10mg/mL800μLによって活性化し、DTTの効果を343nmにて分光計でモニターした。試料1mLをPD-10カラムPharmaciaBiotechPharmaciaBiotechAB、ウプサラ、スウェーデンを用いて溶離し、10フラクション各1mLを採取した。各フラクションの吸光度を分光計で343nmにて分析し、遊離DTTを含まない4フラクションをまとめてプールした。BSA0.250mg100μLおよびSPDP0.5mg50μLを22°Cで20分間撹拌し、塩化ナトリウム0.9850μLを加えた。この試料をPD-10カラムを用いて溶離し、各1mLのフラクションを採取した。各フラクションから非結合SPDPを排除するために各フラクション100μLをDTT900μLで処理して吸光度を343nmで測定した。遊離SPDPを含まない5フラクションをプールした。ヘパリン-SPDPおよびBSA-SPDP双方のプールしたフラクションの塩化ナトリウム濃度を3Mまで上昇させ、これら2つのプール液を一緒に4°Cで一夜インキュベーションしてカップリングを誘導した。ヘパリン-BSA結合サンプルを0.9NaClでSephacrylS-300ゲルPharmaciaBiotechカラム高30cmまたはPD-10から溶離した。それぞれ、第1~第45フラクション、第1~第25フラクション各フラクション0.5mLを回収し、BSA-含量即ち280nmの吸光度、に基づいて第24~36フラクション、第16~21フラクションをそれぞれ回収した。フラクションを濃縮し、VSWPO2500フィルムMillipore、ブレッドフォード、MAを用いて水に対して30分間透析するかまたは水に対して30分間微量透析SpectrapormolecularporousmembraneMWCO:12~14.000,SpectrumMedicalIndustries社、ラグナヒルズ、CAし、再度水に対して2時間行った。続いてフラクションをグリコサミノグリカン量について分析しBlyscanBiocolorLtd、ベルファスト、北アイルランド、血小板凝集計で検査した図10参照。一例としてPD-10で分離したフラクション21ヘパリン0.74μg/mLの凝集曲線を示す。フラクション18~21はいずれもコラーゲン誘導血小板凝集に対する阻止性能を示した詳細については実施例22を参照。実施例2トロンビンの阻害プールしたクエン酸化血漿におけるトロンビン時間によっておよびトロンビン基質S2238ChromogenixKabiPharmaciaLarsenMLAbildgaardUTeienANGjesdalKThrombRes1978Vol13285288を用いるクロモゲン検定によってHEP-PG、HMWHおよびLMWHの相対的力価を測定した。後者の検定において、トロンビンDadeBaxterHealthcareFL1U/mL110U/mgは、用いたグリコサミノグリカン濃度の効果を滴定した後に選択した量であった。外因性トロンビン活性は、抗トロンビンIIIKabiPharmacia単独および血漿希釈液トリス-NaCl、HSA、pH8.2中、1:5および1:40の存在下をコントロールとして、血漿タンパクに対するグリコサミノグリカンの競合的結合について評価した。血漿1:40希釈の不在下および存在下で、外因性抗トロンビンIIIを2段階の濃度、7.5および10MU/mLで使用した。試薬を氷上にて96ウェルマイクロタイタープレートFalcon3072BectonDickinsonに入れ、37°Cで10分間インキュベーションした。S2238を添加し、反応を20酢酸で停止し、残留するトロンビン活性を分光光度計で評価した405nmLabsystemsMultiscanMCCLabsystemsフィンランド。実施例3血小板調製研究に用いた血液は医薬を投与されていない健康ボランティアによって提供された。9体積の自由流動血液を、PTFEカニューレViggoスフェーデンを用いて、1体積のD-フェニアラニル-1-プロピル-1-アルギニンクロロメチルケトンPPACKCalbiochem200~400μMまたは酸性クエン酸デキストロース抗凝固剤ACD[凝固にはpH4.9pH7.3、PRP中およびゲル濾過にはpH4.5]に採取した。血小板豊富血漿PRPを遠心分離180×g、12分、22°Cにより分離し、血小板凝集試験および接着検定に使用した。セロトニン陽性血小板の沈着と放出反応を検出するためにPRP中の血小板を14C-セロトニン比放射能8μCi/mL、最終セロトニン濃度40nMAmershamまたは3H-セロトニン比放射能15μCi/mL、最終セロトニン濃度10nMAmershamで37°Cにて15分間標識した。血液潅流試験では、標識PRPを残留血液に加えた。セロトニン標識による血小板検出法は、沈着したプロテインの測定と電子顕微鏡術によって検証されているMustonenPLassilaRThrombHaemost199675175181。ゲル濾過した血小板は、PRPからPGE125ng/mLおよびアピラーゼ1U/mL双方ともSigma存在下で洗浄操作を1回行った後、血小板懸濁液をセファロースCL-2BカラムPharmaciaLKBに通し、調製した。ゲル濾過の後、リストセチン1.0mg/mLSigmaは血小板反応を誘導せず、このことはvWfの不在を示しており、またこの細胞懸濁液は交差免疫電気泳動が証明するように抗トロンビンIII活性を示さなかったLaneDABoisclairMDThompsonJMBloodCoagulationandHaemostasisAPracticalGuideChurchillLivingstone19914570。ゲル濾過血小板は、凝集実験、コラーゲンへのMg2依存血小板接着実験、および血小板-血小板相互作用を媒介するリガンドフィブリノーゲンおよびvWf結合の実験のために使用した。溶離緩衝液は、1mMMg2添加HEPESであったTimmonsSHawigerJHawigerJPlateletsReceptorsAdhesionSecretionMethodsinEnzymologyAcademicPressSanDiegoCA19891691122。通常、2mMCa2をゲル濾過血小板懸濁液に添加したが、Mg依存の接着2mMの検定にはCa2は省略したSantoroSACell198646913920。流動する血漿因子不含再構成血液中で血小板-コラーゲン相互作用を試験する場合は、2mMCa2および1mMMg2添加HSA4溶液を用いたSakariassenKJMuggliRBaumgartnerHRHawigerJPlateletsReceptorsAdhesionSecretionMethodsinEnzymologyAcademicPressSanDiegoCA19891693770。遠心分離および再構成の後、検定の前に最終血小板懸濁液を30分間安定させた。実施例4血小板凝集PRP中およびゲル濾過血小板懸濁液中での凝集は、Payton血小板凝集計PaytonAssCanadaを用いて実験した。ペプシン抽出コラーゲンSigma血小板凝集キットおよびウシI型原繊維コラーゲンMillerEJRhodesRKMethodsinEnzymology1982823364、コラーゲン試薬HormNycomedHormonChemieGermany、トロンビン、リストセチン、ADPSigmaおよびエピネフリンBioanalyticalSystemsINをアゴニストとして使用し、血小板懸濁液270μLに対して各々30μL容を添加した。HEP-PG、HMWHおよびLMWHの効果は、それらを1分間のプレインキュベーションの間にまたはアゴニストコラーゲンと同時に添加することによって実験した。場合によってはHEP-PGをコラーゲンの10秒後または20秒後に添加した。応答は一次凝集速度、1/分の勾配および最大凝集率として評価した。実施例5分離原繊維コラーゲンの固定化原繊維コラーゲンはウシアキレス腱から酢酸抽出およびペプシン不含塩沈殿によって抽出したMillerEJRhodesRKMethodsinEnzymology1982823364。コラーゲン0.36mg/mL濃度は、0.5M-酢酸中に保存し、フィブリル形成は60mM-TES緩衝液1:1で中和し、35°Cにて90分間湿潤雰囲気中でインキュベーションすることによって誘導したHolmesDFCapaldiMJChapmanJAIntJBiolMacromol19868161166WilliamsBRGelmanRAPoppkeDCPiezKAJBiolChem197825365786585。接着実験には、この原繊維コラーゲン溶液をエタノール洗浄円形Thermanoxカバースリップ直径1.5mm上に5回スプレーした。コラーゲン懸濁液は液滴が乾燥する直前に継続的にスプレーした。走査電子顕微鏡術JEOLJSEM820、日本によって確認したとおり、コラーゲンは直径と間隔がいずれも50~200μmの範囲の原繊維含有液滴の均一層として定着した。このカバースリップは、同日に使用する前に湿潤雰囲気に保存した。潅流実験には、コラーゲンを固定化し、天然型の原繊維を、TESを添加し、栓付のチューブを35°Cにて90分間インキュベーションすることによってPTFEチューブOptinova、フィンランド内でinsituで形成させた。インキュベーションした後、チューブをPBSでリンスした。実施例6PRP中またはMg2-緩衝液中における血小板とコラーゲンとの相互作用固定化コラーゲンへの血小板の接着を2mM-Mg2を添加したHEPES中でPRPPPACKおよびゲル濾過血小板の両方について試験したSantoroSACell198646913920。コラーゲンを被覆したThermanoxカバースリップを24ウェルプレートNUNC2HSAでプレ被覆の底に配置し、14C-セロトニン標識PRPまたはゲル濾過血小板ThrombocounterCCoulterElectronicsを、血小板数を100または300×106/mLに調整して1mL添加した。検定前に、血小板懸濁液中の14C-シンチレーション放射能および血漿中へのセロトニンの放出を、氷上にてイミプラミン-ホルムアルデヒドを用いチューブ中で測定したHolmsenHDangelmaierCAMeasurementofsecretionofserotoninHawigerJPlateletsReceptorsAdhesionSecretionMethodsinEnzymologyAcademicPressSanDiegoCA1989169205210。回転なしに22°Cにて30分間血小板100×106個/mLの接着を試験するためまたは100rpmで回転しつつ37°Cにて30分間PRP由来血小板300×106個/mLの接着後の凝集を試験するためインキュベーションした後、カバースリップを取り、緩衝液で3回洗浄し、シンチレーション計数に付した。コラーゲンを被覆したカバースリップに沈着した血小板の数を添加した血小板の数と比放射能から算出した。血小板から血漿へのセロトニン放出は前記の通りに測定したが、常に5以下であった。これら条件下でのGPIIb/GPIIIaの役割を評価するために、接着検定CollerBSPeerschkeEIScudderLESullivanCAJClinInvest198372325338を行う前に、PRPをGPIIb/GPIIIaに対するmAbm7E3、BarryColler博士から恵与とともにプレインキュベーションした。実施例7流動全血中または再構成血液中における血小板とコラーゲンとの相互作用プレインキュベーションした14C-セロトニン標識血小板を含有するPPACK-抗凝固血液30mLにおいて血小板とコラーゲンとの相互作用を試験するため、血液を潅流ポンプColeParmerILに連結したコラーゲン被覆チューブを通して5分間再循環した。流速10mL/分で様々なせん断速度200、700および1700/秒を誘導するために様々な直径1.1、1.5および1.9mmのチューブを使用した。血液を潅流する前に、コラーゲン表面を、PBSを潅流37°Cで15秒間することによって安定化した。潅流後、接着しなかった血小板をPBSを30秒間潅流させることによって洗い流した。接着した血小板は2SDS中で30分間2回インキュベーションすることによって脱着させ、溶解物をシンチレーション計数に付した。場合によっては、潅流後の表面の走査電子顕微鏡像を得た。接着検定の項に記載したように血小板数、血液のバックグラウンド放射能、およびセロトニン放出を測定した。血漿タンパク質非存在下での血小板-コラーゲン相互作用の試験のために、洗浄した赤血球、軟膜およびゲル濾過14C-セロトニン標識血小板をHSA溶液中に含む再構成血液を用いたSakariassenKLMuggliRBaumgartnerHRHawigerJPlateletsReceptorsAdhesionSecretionMethodsinEnzymologyAcademicPressSanDiegoCA19891693770。また、標準ヘパリン10mg/mLおよびHEP-PG10μg/mLを原繊維コラーゲンHormまたはHEP-PGを溶液中で使用した前の潅流実験で記載した天然酢酸抽出I型コラーゲンからペプシンを用いて製造したモノマー単量体コラーゲンに固定化した。実施例8血小板とHEP-PGとの間の相互作用休止期の血小板へのHEP-PGの結合を35S-標識HEP-PGとPRPとともにまたはゲル濾過血小板とともに37°Cにて15分間インキュベーションすることによって評価した。次いで、35S-シンチレーション活性を、沈降またはゲル濾過を用いて血漿フラクションおよび血小板中に回収した。さらに、30分間インキュベーションすることによってThermanoxカバースリップ上にHEP-PGを固定化した。結合したHEP-PG量は35S-結合から算出し、56±6ng/cm2平均値±標準偏差、n=4の値を得た。次いで、血小板とHEP-PGとの相互作用を前記の血小板接着検定を用いて測定した。実施例9活性化血小板へのvWfおよびフィブリノーゲンの結合vWf比活性200U/mg蛋白質CRTS、フランスBurnoufRadosevichMBurnoufTVoxSang199262111およびフィブリノーゲンをBoltonとHunterの方法BoltonAEHunterWMBiochemJ1973133529539によってI125Amershamを用いて放射性ヨード化した。vWfおよびフィブリノーゲンの構造的安定性は勾配4~21SDSゲル電気泳動を用いて分析することによって確認した。放射能標識vWfの機能は、ゲル濾過血小板のリストセチン誘導性凝集およびトロンビン誘導凝固による放射能標識フィブリノーゲンの凝集によって確認した。ゲル濾過血小板を、リストセチン1mg/mLまたはトロンビン0.1U/mLで3分間刺激した。あるチューブはトロンビンを添加60秒後にヒルジン3U/mLで阻害した。次に125I-vWf15μg/mLを加え、血小板1×108を37°Cで撹拌することなくインキュベーションした。血小板フリーの放射能と血小板が結合した放射能とを分離するため、血小板懸濁液を1.35HSA添加0.3Mショ糖の上部に重層し、950×gで5分間遠心して血小板を沈降させた。上清液を集め、上端を取り除いて、フラクションの放射能を計数した。125I-フィブリノーゲン100μg/mLのADP-刺激およびコラーゲン刺激撹拌血小板への結合を同じようにして試験した。データをスカッチャード分析に付した。実施例10コラーゲンおよびヘパリンプロテオグリカンHEP-PGへのvWfの結合vWfのコラーゲンへの結合に及ぼすHEP-PG、HMWHおよびLMWHの影響をLawrieetalLawrieASHarrisonPArmstrongALWilbournBRDaltonRGSavidgeGFBrJHaematol198973100104に従って評価した。この目的のため、96ウェルのマイクロタイターウェルMaxisorb、NUNCをペプシン化I型コラーゲン67mMリン酸、pH7.2に対して透析50μg/mLで37°Cにて2時間被覆した後、洗浄し、3BSAでブロックした。次に、vWf0.1μg/mLをプレートに加え、様々な濃度のHEP-PG、HMWHおよびLMWHの存在下に2時間インキュベーションした。次いで、結合したvWfをペルオキシダーゼ-結合ポリクローナル抗体DakoASを使用して定量した。さらに、vWf1μgをHEP-PG0.5μgと共に22°Cにて10分間インキュベーションし、酢酸セルロースプレートHelenaLabTXにアプライした。このプレートを、2mMCa2および2mMMg2を含有する5mMHEPESpH7.4中、180Vで30分間電気泳動し、アルシアンブルーで染色してHEP-PGを可視化し、またはポンカウレッドで染色してvWfを可視化した。実施例11統計学的分析結果を平均値±標準偏差で示す。数値のセット間の差異の統計学的有意性は、示すとおりに、対になった数値についてのスチューデントのt-検定またはFactorialANOVAによって算出した。実施例12ラット大腿動脈の顕微手術における吻合および血栓症モデル2種この研究で行った操作はすべて適切な学会の指針によって承認されたものであって、また動物実験に対する政府の指針に従ったものである。処置の前にラットを麻酔したHypnorm商標10mL、Dormicum商標3mL、水を加えて10mL、腹腔内。吻合を行う前に大腿動脈を露出し、クランプ2個を設置し、血管を切断した後、生理食塩水、標準ヘパリンMW15kDa、1mg/mL、100ATU/mLまたはHEP-PG10μg/mLのいずれか100μLでフラッシングした。操作の後約15分に血管を10-0顕微手術糸で8~10ステッチ縫合して閉じた。10分後に循環を再開し、この後にラットに過剰用量の麻酔剤を投与して実験を終了した。それぞれの処置モードをラット5匹で試験した。吻合部位を切開して、走査型電子顕微鏡によって盲検の状態で評価を行った。各試料から75倍および500倍の異なる倍率2種を採用した。顕微鏡像を格付システム:0~3で解析した。最初の血栓症モデルDavidssonSFetalPlastRecSurg865795821990では、血管を2分間ブルドッグクランプで押し潰し、次に血管を部分的に開いて内壁を針で10回掻いてから、生理食塩水、ヘパリンまたはHEP-PGのいずれかを流し、血管を閉じた。循環を10分間再開した。これ以外の実験操作は吻合モデルに記載する実験計画に従って行った。一方の血栓症モデルAndersenDMetalMicrosurgery154134201994では、血管を吻合モデルと同様に処理したが、縫合する際に血管を血流に向けて裏返して血管の全ての層、外膜、中膜および内膜が血流に露出するようにした。これ以外の実験操作は吻合モデルに記載する実験計画に従って行った。結果を証明する実施例実施例13トロンビンの阻害血漿希釈1:3で実験した時には1.0μg/mLの濃度のマスト細胞由来の可溶性HEP-PGは有意にトロンビン時間を延長した図1。しかしながら、HEP-PGによるトロンビンの阻害効果は、HMWHまたはLMWHよりもトロンビンと比べて有意に低かった。また発色検定で測定すると、HEP-PGは1:5血漿希釈の存在下ではトロンビンの阻害効果がHMWHよりも低かった。この相違は使用した様々なトロンビン濃度で観察できた0.5~3U/mLデータ未記載。外因的なアンチトロンビンIIIまたはヘパリンコファクターIIの作用を増強するHEP-PGの能力に血漿蛋白質が影響を及ぼすかどうかを試験するため、血漿の存在または不在下で、残留トロンビン活性に対する様々な濃度のHEP-PGおよびHMWHの効果を測定した。血漿希釈1:40では、HEP-PGとHMWHとの相違はなかった図2。しかしながら血漿不在下ではHEP-PGはHMWHよりも強力にアンチトロンビンIII活性を強化した。従って、HEP-PGはアンチトロンビンIIIの作用を強化できるが、この性能は血漿蛋白質の存在によって妨害される。実施例14血小板豊富な血漿中での血小板凝集およびセロトニン放出マスト細胞誘導HEP-PGは試験した2種類のPRP中において強力にコラーゲン誘導血小板凝集を阻害した。クエン酸塩-抗凝固PRP中で実験した時には、HEP-PGは1.0μg/mLと低濃度で阻害を示した図2。この濃度でHMWHおよびLMWHは凝集を阻害せず、これらヘパリンは300倍過剰300μg/mLを用いても効果がなかった。次に我々は、HEP-PGをアルカリで処理して蛋白質成分を溶解することによって単離されたグリコサミノグリカン鎖を得た。平均MW75kDaのHEP-GAGのこのグリコサミノグリカン鎖の阻害作用は、天然のHEP-PGよりも有意に弱かったが、HMWHおよびLMWHよりも有意に強かった。HEP-PGとは対照的に、HMWHはコラーゲン誘導凝集をクエン酸添加PRP中で低いコラーゲン濃度<2.0μg/mLの場合でのみ阻害した。クエン酸添加-およびPPACK-抗凝固PRPにおけるコラーゲン誘導凝集に対するHEP-PGの用量依存的効果は、HEP-PGの阻害効果が150μg/mLまでのコラーゲン濃度で非依存的であること、およびカチオン枯渇血漿中ではPPACK-PRP中よりもさらに強力であり、この場合には全阻害効果は3μg/mLの濃度でさえ達成されることを示した。HEP-PGおよびコラーゲンを同時に添加するか、HEP-PGをコラーゲンの10秒後に添加するかに関係なく阻害は完全であった。HEP-PGは、試験した最高コラーゲン濃度150μg/mLでさえ、血小板セロトニン放出をPRP中では50からバックグラウンドレベル10まで低下させた。さらなる実験で、我々はHEP-PGをヘパリナーゼまたはコンドロイチナーゼABCで処理した。我々は、ヘパリナーゼを用いた処理が、コラーゲン誘導血小板凝集を阻害するHEP-PGの性能を完全に破壊するが、一方で、コンドロイチナーゼABCによる処理がHEP-PGの阻害能力を減少させないことを発見したデータ示さず。顆粒レムナントを形成する巨大凝集HEP-PG複合体すなわち、エキソサイトーシスした顆粒から可溶性プロテオグリカンの放出後に残る残留物KovanenPTEurHeartJ141992105117LindstedtKKokkonenJOKovanenPTJLipidRes1992336574は同量の可溶性HEP-PGと比較するとコラーゲン誘導血小板凝集に対して効果がなかった。しかしながら、顆粒レムナントを、2M-NaClで処理してHEP-PG単量体に分解した後に血小板に添加すると阻害作用は可溶性HEP-PGで観察されたものと等しかった。血小板のコラーゲン誘導応答を完全に失ったHEP-PGの濃度3μg/mLをコラーゲン以外のアゴニストが誘導する血小板凝集に対するHEP-PGの効果を試験するために選択した。表Iに示す通り、HEP-PGはリストセチンが誘導する血小板の凝集を阻害し、その阻害はリストセチン濃度0.60mg/mLで完全であった。また、阻害は2段階のリストセチン濃度0.75および1.0mg/mLでかなりの値に達した。HMWHおよびLMWHはリストセチン誘導の凝集をHEP-PGと同程度には阻害しなかった。さらに、HEP-PGは、ADPまたはエピネフリン10μMに応答する血小板凝集がを顕著に変更することはなかったデータ示さず。実施例15ゲル濾過血小板の凝集HEP-PGをゲル濾過血小板の懸濁液に加える時、コラーゲン誘導血小板凝集は不完全にしか阻害されない。コラーゲン25μg/mLを用いるとHEP-PG3μg/mLの阻害効果は25と60との範囲である。我々はさらにゲル濾過血小板のトロンビン誘導0.1および0.25IU/mL凝集を試験した。再度、血小板凝集は、HMWHまたはLMWH全て3.0μg/mLによりもHEP-PGによって効果的に阻害されたデータ示さず。HMWHは100倍の濃度300μg/mLで用いた場合、使用した2種類のトロンビン濃度で完全な阻害をもたらした。実施例16ゲル濾過血小板の凝集以下のように、我々は、血小板と固定化コラーゲンの間の相互作用を評価した。血小板100×106個/mLを22°Cで静置、Mg2-依存的条件下で試験したとき、HEP-PG3μg/mLは接着血小板の単層形成に影響を与えなかった図3。対照的に、血小板300×106個/mLを37°Cで回転させた場合には、HEP-PGは後に続く血小板-血小板相互作用を有意に阻害した。しかしながら、PPACK-PRP中ではHEP-PGはこの相互作用を有意に減少しなかった。対応する条件下では、GPIIb/IIIaに対するmAbm7E3、10μg/mLはコラーゲン誘導血小板沈着をそれぞれ20、75および80阻害した。実施例17A流動血液中での血小板とコラーゲンとの間の相互作用に及ぼす可溶性HEP-PGの効果PPACKで抗凝固処理された全血を、コラーゲン被覆チューブに様々な剪断速度で潅流した時に、HEP-PG3μg/mLは血小板の沈着を有意に阻害したが、コラーゲンへの接着は阻害しなかった。阻害は低剪断速度2001/秒および高剪断速度700および17001/秒の両方で明らかであった。血漿不含の再構成した血液を用いて同じ実験700および17001/秒を繰り返した場合には、血小板はHEP-PGの存否とは無関係に同程度がコラーゲンに接着したデータ示さず。全血を17001/秒で潅流後に撮影したコラーゲン被覆表面を被う血小板の走査電子顕微鏡像は、HEP-PGの存在時に凝集物が全く存在しないことを証明した。この剪断速度では、血小板接着はHEP-PGの存在下で有意の減少を示さなかった。表面被覆率はHEP-PG不在では22±4、HEP-PG存在では17±5であったn=3。実施例17B流動全血中での単量体コラーゲン被覆表面への血小板沈着阻害に及ぼす固定化HEP-PGの効果コラーゲンとHMWHおよびHEP-PGの共固定化ではBlyscan検定北アイルランド、ベルファストによって示されるコラーゲン接着は減少しなかった。HEP-PG10μg/mLをI型コラーゲンペプシン処理またはウシの腱からペプシンで分離したものに固定化し、緩衝液または非分画ヘパリンHMWH分子量=15kDa、ヘパリン、レイラス、フィンランド10μg/mLと比較した時に、HEP-PGは血小板動員を10分の1以下まで減少させ、一方、HMWHは4分の1まで減少させた。実施例7Aに示す通り溶液中で有効であるのに加えて、コラーゲン表面に固定化したHEP-PGは、流動する血液中での血小板-血小板相互作用を同様に非常に効果的な阻害を示した。結果を以下の図6に示す。実施例17C流動全血中での原繊維コラーゲン被覆表面への血小板沈着を阻害する固定化HEP-PGの効果コラーゲンHorm試薬と10g/mLとの共固定化を非分画ヘパリン10μg/mLと比較した。非分画ヘパリンとは対照的に、HEP-PGは有意に表面への血小板の沈着を50減少させた。このように単量体コラーゲンに固定化したHEP-PGの効果はまたより天然型のコラーゲン繊維についても得られた。この結果を下記の図5に示す。実施例18血小板へのフィブリノーゲンおよびvWfの結合HEP-PGはフィブリノーゲンのコラーゲン刺激血小板への結合を減少させる傾向がある2.4±1.2から1.5±0.7ピコモル/血小板108個n=4、p=0.06、バックグラウンドは0.8±0.4ピコモル/血小板108個が、ADP誘導の結合には影響を与えなかったデータ示さず。しかしながら、HEP-PG3μg/mLはトロンビン刺激血小板へのvWfの結合を40阻害した234対349ng/血小板108個表II。同じ濃度ではHMWHは有意の効果がなかったが100倍過剰300μg/mLでは血小板へのvWfの阻害を完全にブロックした。HEP-PGはリストセチン刺激血小板へのvWfの結合を阻害しなかった。同様な結果はHMWHでも得られた。再び100倍過剰300μg/mLのHMWHはリストセチン刺激血小板へのvWfの結合を明確に阻止した。実施例19血小板とヘパリンプロテオグリカンHEP-PGとの間の相互作用コラーゲンの代わりにHEP-PGを固定化し、PPACK-PRP中の血小板を接触させた場合には、血小板沈着のレベルは血小板0.36±0.17×106個/cm2n=4であって、このレベルは固定化アルブミン、HSA0.50±0.31×106個/cm2n=4で得られる値と変わらなかった。血小板がHEP-PGに結合しないという知見は、35S-標識HEP-PG3~10μg/mLをPRP中でインキュベーションしたのち血小板を沈降させて35S-シンチレーションの放射能を計数する実験によって確認した。沈降物には35S-シンチレーション放射能は存在せず、HEP-PGは血小板と共沈降しなかったことを示した。その上、洗浄した血小板を35S-HEP-PGとともにインキュベーションした後、ゲル濾過に付すと35S-HEP-PGは血小板集団の後から別れて溶出された。実施例20ヘパリンプロテオグリカンHEP-PGへのおよびコラーゲンへのvWfの結合vWfおよびHEP-PGを単独でまたは一緒に酢酸セルロース板上で電気泳動させ、プレートを両蛋白質およびグリコサミノグリカンについて染色して個々の成分を可視化した。HEP-PGへのvWfの添加は陽極から陰極への移動度を逆転し、vWfとHEP-PGとの間の会合を示唆した。HEP-PGは高剪断速度で血小板-コラーゲン相互作用を阻害し、また他のvWf-媒介血小板機能とも相互作用した表Iので、我々は、ELISA検定を用いて、HEP-PGがvWfのコラーゲンへの結合に影響を及ぼすか否かを試験した。コラーゲンへのvWf結合は阻止されず、反対に顕著に強化された。この結果はHMWHおよびLMWHについて得られた結果とは全く異なっていた。HEP-PGと比較すると、10倍過剰の濃度30μg/mLでさえHMWHは僅かにvWfのコラーゲンへの結合を僅かに増加し、LMWHはいかなる効果も示さなかった。実施例21ヘパリンプロテオグリカンHEP-PGとコラーゲンとの間の相互作用我々は、さらに、HEP-PGが血小板-コラーゲン相互作用を阻害する条件を模擬する条件同様のHEP-PGおよびコラーゲンの濃度および同様のインキュベーション時間でHEP-PGのコラーゲンへの結合も試験した。コラーゲンペプシン化または原繊維を固定化した場合、HEP-PGとは相互作用しなかった。この結果は、35S-HEP-PGを用いるかまたはグリコサミノグリカンをアルシアンブルーで検出して得られた。さらに、コラーゲンとHEP-PGとをインキュベーションした後、ショ糖クッションを通して遠心分離して得られたペレットはアルシアンブルー活性を示さなかった。実施例22コラーゲンは、ウシ血清アルブミンBSAと架橋結合した非分画化ヘパリンの存在下で血小板凝集を誘導した実施例1Eに記載したようにウシ血清アルブミンと架橋結合させた非分画化ヘパリン12kDaを血小板凝集計で分析した図10参照。一例としてヘパリン0.74μg/mLを有するPD-10分離フラクション21について凝集曲線を提供する。フラクション18~21はいずれもコラーゲン誘導血小板凝集に対して阻害効果を示した。そこで、図10Aは緩衝液30μLとプレインキュベーションしたクエン酸添加PRP中での血小板凝集を示す。示した反応は最終濃度25μg/mLでコラーゲンSigmaaggregationkitcollagen30μLに対するものである。図10Bでは、PRPを3μg/mLの最終濃度で30μLのHEP-PGとともに1分間プレインキュベーションした。コラーゲン25mg/mLに対する反応は得られなかった。図10CではPRPを0.74μg/mLBlyscanの濃度で30μLのフラクション21アルブミン結合ヘパリンとともに1分間プレインキュベーションした。コラーゲン25mg/mLに対する反応は得られなかった。実施例23生体内動脈血栓症モデルおよび顕微吻合手術モデルで得られた結果我々は、血管の表面層を針での掻き傷を与えるか与えずに、および動脈の深層、すなわち内膜、中膜および外膜の血液接触を形成する不適切な配置を有するかまたは有しないの大腿動脈吻合の際にHEP-PGを局所的に適用した場合のラットの生体内データを得た。これらの試験は、血栓症の併発によってしばしば中止される、血管手術および顕微手術の間に起きる動脈血栓症のモデルを提供する。目視的観察では、血栓症は対照実験生理食塩水投与の処置したほとんど全ての動物にみられ、開存度は14/22であり、10μg/mLのHEP-PGを容積100μLを吻合部を閉じている時間約10分に局所投与し、次に非抗凝固血液をその損傷部位に10分間流通させた後に屠殺したラットでは21/22血管が開存性であった。我々は、10分間血流を解放する際にインジウム標識ラット血小板300~500×106個/mL0.5mLを点滴することによる吻合モデルを試験した。次いで、ラットを屠殺し、血液および吻合サンプルを採取した。ガンマ線カウンターで血液中の血小板および吻合部位の放射能を計数したところ、HEP-PGについて有意の効果がみられた111-インジウム標識血小板:NaCl14.2±7.2n=7対HEP-PG7.5±2.9×106。平均値±SDn=7/吻合部位。p=0.025、ANOVA。走査電子顕微鏡分析では、さらなる血栓誘発掻き傷または不適正吻合のない吻合モデルでのHEP-PG群では有意に少ない血栓症応答が検出できた。血栓症的反応は壁在性で主に血小板接着層からなり、凝集物は散在的または不在であった図8。走査電子顕微鏡像の比較盲検分析から次のスコアを得た最小1最大4:NaCl3.2n=5;HMWH2.8n=5;HEP-PG1.8n=5;p=0.03。吻合モデルでのHEP-PGvs生理食塩水;ANOVA、反復測定。吻合後72時間に分析した時にも同様な結果を得た。"