"ポリマーを分析するためのデバイスであって、該デバイスは、a前記ポリマーが通過することができるトンネルギャップを形成する第1の電極および第2の電極と;b前記第1の電極に結合した第1の試薬および前記第2の電極に結合した第2の試薬を含み、前記第1の試薬および前記第2の試薬は、それぞれ、前記ポリマーのある単位と一時的な結合を生成することが可能であり、前記一時的な結合が生成すると、検出可能な信号が作られる、デバイス。前記試薬、および前記トンネルギャップの幅は、前記第1の試薬および前記第2の試薬が、前記ポリマーの単位と一時的な結合を生成するとき、前記ポリマーのそれぞれのモノマーについて特定の検出可能な信号を作りだすような構成である、請求項1に記載のデバイス。前記第1の電極および/または前記第2の電極が、金、炭素、白金、グラフェンまたは窒化チタンを含む、請求項1に記載のデバイス。作られる前記検出可能な信号が、前記トンネルギャップ中で、前記ポリマーの1個の単位のみの結合によって生じる、請求項1に記載のデバイス。前記トンネルギャップは、幅が約1~約4nmである、請求項1に記載のデバイス。前記第1の試薬と前記第2の試薬が同じである、請求項1に記載のデバイス。前記一時的な結合が水素結合である、請求項1に記載のデバイス。前記第1の試薬および前記第2の試薬が、水溶液中で少なくとも1個の水素結合供与部および少なくとも1個の水素結合受容部を含む、請求項1に記載のデバイス。前記第1の試薬および前記第2の試薬が、独立して、メルカプト安息香酸、4-メルカプトベンズカルバミド、イミダゾール-2-カルボキシド、および4-カルバモイルフェニルジチオカルバメートからなる群から選択される、請求項1に記載のデバイス。前記ポリマーがDNAまたはRNAであり、そして前記単位がヌクレオチドである、請求項1に記載のデバイス。前記単位が、A、C、T、GおよびmCからなる群から選択される、請求項1に記載のデバイス。前記ポリマーがタンパク質であり、そして前記単位がアミノ酸である、請求項1に記載のデバイス。c少なくとも1個のナノ細孔で分離されている、第1の流体容器および第2の流体容器をさらに含み、該ナノ細孔を通って前記ポリマーが流れてもよい、請求項1に記載のデバイス。前記第1の流体容器と前記第2の流体容器との間に電気泳動バイアスをかけるための、第1の駆動電極と第2の駆動電極とをさらに含む、請求項13に記載のデバイス。前記ナノ細孔の上部に配置された上部接触電極をさらに含み、前記ナノ細孔が導電性である、請求項13に記載のデバイス。前記第1の電極および前記第2の電極がカーボンナノチューブである、請求項1に記載のデバイス。ポリマーまたはポリマー単位を分析する方法であって、該方法は、a前記ポリマーのある単位と、第1の試薬で官能基化された第1の電極との間に一時的な結合を生成し、前記ポリマーの該単位と、第2の試薬で官能基化された第2の電極との間に一時的な結合を生成する工程;およびb前記一時的な結合が生成したとき、検出可能な信号を検出する工程を含む、方法。前記第1の試薬と前記第2の試薬が同じであり、ならびにメルカプト安息香酸、4-メルカプトベンズカルバミド、イミダゾール-2-カルボキシド、および4-カルバモイルフェニルジチオカルバメートからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。前記ポリマーがDNAまたはRNAであり、そして前記ポリマー単位がヌクレオチドである、請求項17に記載の方法。ポリマーの配列を決定する方法であって、該方法は、a第1の試薬で官能基化された第1の電極と第2の試薬で官能基化された第2の電極との間に形成されたトンネルギャップに、前記ポリマーのある単位を流す工程;b前記ポリマーのある単位と、前記第1の試薬および前記第2の試薬との間に一時的な結合を生成する工程;c前記一時的な結合が生成したとき、検出可能な信号を検出する工程;ならびにd前記ポリマーのそれぞれの連続した単位について、工程a~cを繰り返す工程を含む、方法。前記一時的な結合が、読み取り分子中の芳香族基と、検体中の芳香族基との間のπスタッキングである、請求項1に記載のデバイス。ナノ細孔の内側に化学結合しており、および前記ナノ細孔をポリマーが通過するにつれて、ポリマーの単位と一時的な結合を形成する分子からなるナノ細孔を、電気泳動によって動かされるポリマーが通過する速度を遅らせるためのデバイス。本発明は、ポリマーおよび/またはポリマー単位を分析するための組成物、デバイス、方法を提供する。ポリマーは、DNA、RNA、多糖類またはペプチドのようなホモポリマーまたはヘテロポリマーであってもよい。デバイスは、ポリマーが通過することができるトンネルギャップを形成する電極を備えている。電極は、電極に結合した試薬で官能基化されており、この試薬は、ポリマー単位と一時的な結合を生成することが可能である。上述の試薬と上述の単位との間に一時的な結合が生成されるとき、検出可能な信号が作られ、これを使用してポリマーを分析する。トンネルギャップの幅は、電極がポリマーの単位に対し一時的な結合を形成したときに作られる信号の選択性を最適化するように構成されるか、または調節される。発明の詳細な説明本発明は、ポリマー単位および/またはポリマーを分析するための組成物、要素、デバイス、方法を提供する。分析することが可能な例示的なポリマー単位およびポリマーとしては、ヘテロポリマーおよび関連する単位が挙げられる。例えば、分析することが可能なポリマーとしては、DNA、RNA、多糖類、ペプチドが挙げられ、ポリマー単位としては、ポリマーのモノマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、アミノ酸、多糖類のモノマーが挙げられる。ある種の実施形態では、エピジェネティックマーク例えば、メチル化されたDNAおよび/またはRNAを分析し、例えば、メチル化されていないDNA/RNA単位と区別してもよい。デバイスは、1つ以上の読み取り分子試薬とも呼ばれるで官能基化された2個以上の電極と、ポリマー単位および/またはポリマーが通過してもよいトンネルギャップとを備えている。電極上にある試薬は、ポリマーの単位と一時的な結合を生成することが可能である。一時的な化学結合または物理的な結合は、その単位がギャップの中にあるときに生成し、第1の電極と第2の電極との間の回路を完成させる。次いで、この生成した一時的な結合が検出可能な信号を導き出し、この信号を使用してポリマーを分析してもよい。電極上述の2個以上の電極は、任意の適切な材料から作られていてもよく、標的ポリマー単位と結合することが可能な試薬で官能基化されていてもよい。例えば、電極は、任意の導電性材料、例えば、金属、金属アロイ、金、白金、金アロイ、白金アロイ、炭素、カーボンナノチューブ、グラフェンまたは窒化チタンから作られてもよい。ある種の実施形態では、電極は、プローブと基材とを含む。電極は、当該技術分野で周知であるように、任意の適切な無機または有機の絶縁性材料、例えば、SixO-1x、窒化ケイ素、金属酸化物を含む無機材料、またはポリエチレン、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルなどのようなポリマーを含む有機材料などの間の表面または内部に作られるか、またはこれらの絶縁性材料で部分的に絶縁されていてもよい。絶縁性材料は、電流が流れるときに電極からバックグラウンドノイズが生じるのを防ぐような構成になっていてもよい。例えば、電極は、小さな先端または頂部以外はHDPEで完全に覆われていてもよい。別の実施形態では、電極は、絶縁層の間に埋め込まれており、ナノ細孔と接触する領域のみが露出していてもよい図60。バイアスが0.5ボルト以下の場合、1平方ミクロン程度の大きさの部分を、無視できるほどのリーク電流で、1モル濃度までの塩溶液に露出させることができる。読み取り試薬は、電極の鋭敏化に重要な役割を果たす。典型的な金電極は、10nm以上のファセットが露出しているナノ結晶性組成物をもつ。したがって、1個の塩基のみと接触させることは不可能であると思われる。しかし、電極を官能基化すれば、容易に1塩基の解像度にすることができる。というのは、特定の分子の接触がここでトンネル電極として役立ち、金属表面上で鋭敏な十分に規定された表面粗さを作り出すからである。試薬電極は、1つ以上の試薬によって官能基化されている。電極は、同じ試薬で官能基化されていてもよく、試薬の組み合わせによって官能基化されていてもよく、または、別個の試薬で個々に官能基化されていてもよい。電極に結合し、標的ポリマー単位と一時的に結合することが可能な任意の適切な試薬を用いてもよい。電極に対する標的ポリマー単位の結合を促進するために、望ましい電極の物質に依存して、標的ポリマー単位に結合することが可能な読み取り分子に種々の官能基を連結してもよい。適切な官能基としては、例えば、-SH、-NH2、-N3、-NHNH2、-ONH2、-COOH、-CHO、アセチレン、ジチオカルバメート、ジチオカルボキシレートを挙げることができる。金属に対するジチオカルバメート結合は、金属のフェルミ準位とより近いレベルで分子レベルで整列させることによって、トンネル電流を大きく増大させるFlorianvonWrochem、DeqingGao、FrankScholz、Heinz-GeorgNothofer、GabrieleNellesおよびJurinaM.Wessels、Efficientelectroniccouplingandimprovedstabilitywithdithiocarbamate-basedmolecularjunctions、NatureNanotechnology、2010年6月20日を参照。ある種の実施形態では、電極は、官能基に連結し、その後読み取り分子に結合することが可能となる。例えば、金属を用いる場合、電極が金ならば、試薬と電極とが共有結合しやすくなるように、チオール官能基をもつ試薬を使用してもよい。ジチオカルバメートを用いて、金、Pt、TiNに結合させてもよい。これらの基によって、金属と試薬との電気的なカップリングを高めることができる。グラフェンの縁は、カルボキシレート、カルボニル、エポキシドを有することが多いため、アミン化学を利用し、グラフェンの孔およびカーボンナノチューブの末端を官能基化してもよい。試薬は、標的ポリマー単位と一時的な結合を生成することが可能でありJ.Heら、Nanotechnology20、0751022009、ヌクレオシドと一時的な結合を生成することが可能であるS.Changら、NatureNanotechnology4、2972009。一時的な結合は、その結合によって、検出可能な電子信号を電極を介して検出することができるものであれば、物理的な結合、化学結合またはイオン結合であってもよいS.Changら、Nanotechnology20、0751022009;M.H.Lee、O.F.Sankey、Phys.Rev.E79、05191112009。好ましい一時的な結合としては、水素結合が挙げられる。この場合、例示的な試薬は、水素供与基または水素受容基を含んでいてもよい。別の実施形態は、水または水系電解液中で一緒に押される芳香族環同士のπスタッキング相互作用である。DNAおよび/またはRNAに結合する例示的な試薬としては、メルカプト安息香酸、4-メルカプトベンズアミド、イミダゾール-2-カルボキシド、ジチオカルバメートイミダゾール-2-カルボキシド4-カルバモイルフェニルジチオカルバメート4-carbamonylphenyldithiocarbamateとも呼ばれるが挙げられる。4-メルカプトベンズアミドには、2個の水素結合供与部位窒素の上と、1個の水素結合受容部位カルボニルが存在する。例えば、4種類のヌクレオチド塩基に対する同様の結合態様を図53に示す。4種類のヌクレオチド塩基に対するイミダゾール-2-カルボキシアミドの同様の結合態様を図61に示す。読み取り部中の芳香族環とDNA塩基中の芳香族環との間のπスタッキングを含むさらなる結合態様もあると考えられる。試薬は、種々の溶媒例えば、有機溶媒、水または電解水溶液中に存在する場合、1個以上の水素結合供与部および/または1個以上の水素結合受容部が存在するように配合されていてもよい。例えば、メルカプト安息香酸は、例えば、トリクロロベンゼンのような有機溶媒中で働き、一方、4-メルカプトベンズアミド4-mercatobenzamide、イミダゾール-2-カルボキシド、ジチオカルバメートイミダゾール-2-カルボキシドは、水系電解液中および水中で働く。これらの設計原理を具体化する多くの分子が読み取り部として機能するであろうことを注記すべきである。例えば、金電極またはTiN電極に連結するためにチオールで官能基化されたグアニンは、認識信号を作り出すだろう。ある種の実施形態では、試薬は、電極と試薬の水素結合部分との間に架橋を生成する可とう性部分を含むような構成であってもよい。この架橋は、置換または非置換のアルキル鎖であってもよく、例えば、-CH2y-であり、yは1~5の整数である。例えば、電極に対して官能基化する場合、イミダゾール-2-カルボキシアミドは、電極に対してアミド部分を接続する-CH2CH2-架橋をもつ。この架橋によって、アミド部分は回転することができ、それによって、アデニン、シトシン、グアニン、チミンと異なる検出可能な様式で相互作用する。図61を参照。また、試薬は、ペプチドを分析するために、アミノ酸と一時的な結合を生成するような構成であってもよい。図13は、アミノ酸の水素結合供与部位と水素結合受容部位の例を示す。アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンhistadineおよびアルギニンにある2個以上の隣接する部位Dと書かれている供与部またはAと書かれている受容部が利用可能である。リジン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファンにある単一の部位を、ペプチド骨格に対しても水素結合を生成する試薬を用い、組み合わせて読み取ることができる。芳香族試薬は、πスタッキングによって、芳香族環をもつアミノ酸ヒスチジンhistadine、チロシン、プロリンおよびトリプトファンを認識することができる。したがって、ペプチドを、本明細書に記載のデバイスおよび方法にしたがって分析してもよい。図76は、ペプチド骨格を認識するための例示的な試薬、およびアミノ酸の側鎖を認識するための例示的な試薬を示す。トンネルギャップポリマー単位例えば、DNAのヌクレオシドまたはタンパク質のアミノ酸は、トンネルギャップを通って拡散しつつ検出されるか、または、電気泳動によってトンネルギャップを通って移動する。ギャップの幅は、固定されていてもよく、動的に調節可能であってもよい。ギャップは、好ましくは固定されている。ギャップは、2個の電極の間の空間を含む。ギャップは、それぞれの標的単位がギャップに適合するような大きさに調節される。ギャップは、幅が約0.5~約6nm、例えば、約1~約4nm、約1.5~約3.5nm、約2~約3nm、または約2~約2.5nmであってもよい。ギャップの幅は、使用する試薬、分析される標的ポリマー単位によって変わってもよい。4-メルカプトベンズアミドで官能基化された2個の電極の場合、ギャップは、約2~約2.5nm、例えば、約2.1~約2.2nm、または約2.16nmであってもよいギャップコンダクタンスが20pSである場合、典型的には、DNAの読み取りに用いられる。イミダゾール-2-カルボキシアミドで官能基化された2個の電極の場合、ギャップは、約2.2~約2.6nm、例えば、約2.3~約2.5nm、約2.35~約2.4nm、または約2.37nmであってもよいギャップコンダクタンスが20pSである場合、典型的には、DNAの読み取りに用いられる。ギャップの距離は、以下に記載するように決定されてもよい。図1は、1つの固定されたトンネルギャップ中で、4種類のDNAヌクレオシドそれぞれと作られる独特の水素結合を示す。4-メルカプトベンゼンは、4種類のヌクレオシドそれぞれと水素結合を生成する。水素結合は円で囲まれており、Sは、デオキシリボース糖部分をあらわす。これらの構造は、コンピュータシミュレーションによって作成され、4-メルカプトベンズアミドを有機溶媒中で用いたため、おそらく、実際の構造を非常によくあらわしている。水中で働く読み取り分子の場合、構造をモデル化する試みは、水分子との水素結合や、水が介在し、一緒に押し出してπスタッキング相互作用を生成する芳香族環の相互作用と競争するため複雑化する。信頼性の高い読み取りを得るとき、ギャップの正確な大きさが重要となることがある。大部分の時間または作られる信号の大部分が、ギャップ内にポリマーの1個の単位のみが存在することによって生じるような大きさであるべきである。適切なギャップの幅は、ギャップを動的に調節することが可能なデバイスを用いることによって決定されてもよい。ある種の実施形態では、動的に調節可能なデバイスを用い、標的単位を分析してもよい。いずれの場合でも、ギャップの幅は、以下のように決定されるか、または設定されてもよい。電極は、特定のバイアスで、選択されたトンネル電流が得られるまで、共に近づけられる。例えば、0.5Vのバイアスで6pAの電流は、1,2,4-トリクロロベンゼン中でトンネル現象を起こさせる場合、ギャップ2.5nmに対応する。ギャップは、走査型トンネル顕微鏡法の分野で周知であるように、有効なサーボ制御を適用することによって維持される。ある特定の実施形態では、サーボ制御は、周波数の応答を100Hz以下に制限する。ただし、ギャップが十分に大きい状態に維持されると、バックグラウンドトンネル信号は、図2に示されるように、特徴がない。分子がギャップ内で結合する場合、トンネルギャップ内で一時的な電流スパイクが観察される図4。両方の電極を官能基化すると、それぞれのヌクレオシドに特徴的な電流で、電流ピークの狭い分布が観察される図7B。しかし、電流信号から特定のヌクレオシドを特定することは、その分布の高電流部分がテーリングしていることによって複雑化しており、このテーリングは、1個よりも多い標的分子がギャップ内で同時に結合していることによるものである。主要ピークの電流の2倍にあたる電流分布に第2のピークが生じることがある図6。ギャップを小さくするにつれてベースラインコンダクタンスまたは電流が増加するにつれて、多くの箇所で電極に接触することが可能となり、複数分子が読み取られる相対的な頻度が大きくなる。この2分子読み取り頻度の増加を図7Aに示すこの図は、ギャップが小さくなるにつれて、どのようにピーク電流が上がっていくかも示している。したがって、ギャップを大きくすると、2つの悪い影響がある。第1に、ピーク電流が下がり図7Aに示されているように、第2に、所与の濃度の標的に対する読み取り速度が下がる図8。したがって、ある種の実施形態では、重要な要素は、a読み取りシステムに対し、所定の時間に1個の要素すなわち、所定の時間に、DNAポリマーの1個の塩基が存在するように標的ポリマーの位置を変えることができるようなナノ細孔を有する、可変性で制御可能なトンネルギャップを組み込むことと;bある様式または別の様式ですべての標的に結合する試薬を使用することとを含み、ギャップは、標的のための独特の結合形状がほんの数個しか存在しないような大きさに調節され、それによって、特徴的な信号が作られる。ナノ細孔ある種の実施形態では、デバイスには、1つ以上のナノ細孔が備わっていてもよく、このナノ細孔を通って、ポリマーは、分析のためにトンネルギャップに向けられてもよい。ナノ細孔は、所定の時間に、ポリマーの1個の単位がトンネルギャップに流れることができるような構成であってもよい。したがって、DNAを分析するためのナノ細孔は、ペプチドを分析するためのナノ細孔より小さくてもよい。可変性のギャップを有するトンネル接合部について、このような実施形態を図9に示す。ギャップ自体の詳細は、図10A~Fに示される。固定されたギャップデバイスの詳細は、図60に示される。シークエンシング用ポリマー例えば、DNAは、流体容器1断面で示されているの中に存在する。ポリマーを含有する流体は、ナノ細孔3の配列を通って流れるか、または、場合により、第1の容器1と第2の流体容器2との間に、基準電極4を用いて印加した電気泳動のバイアスVeによってナノ細孔を流される。両方の容器を電解液例えば、1MKClで満たし、それに加え、標的DNAが一本鎖形態に維持されるように、容器1のpHを大きな値pH=11または12に調節してもよい。電気信号からの変換の独立した照合が必要ではない場合、収集容器2中の電解溶液は、好ましくは、電気化学的な漏れが最低限になるように、小さくするmM。ある特定の実施形態では、ナノ細孔は導電性であり、ナノ細孔配列の上部にめっきされている電極5に接続している。この配列は、走査式トランスデューサ7例えば、走査型プローブ顕微鏡の分野で周知のx、y、z走査要素によって所定の位置に保持されている1個以上の第2の電極6によってプローブされてもよい。読み取り装置は、堅枠8を介してナノ細孔の配列に接続していてもよい。トンネル接合部の例示的な図を図10に示す。図10Aは、DNAが電気泳動によってナノ細孔101を移動し、DNA分子がプローブ104とナノ細孔101の上部にある金電極またはTiN電極103の間を通るときに、金プローブが読み取る配置を示す。ナノ細孔101は断面で示されており、ケイ素、窒化ケイ素または二酸化ケイ素の基材102に開けられている。読み取り試薬105および106は、プローブ104および金属電極103に接続している。図10Bの電子顕微鏡写真は、窒化ケイ素基材中のナノ細孔107が、金108の薄い20nm層でコーティングされていることを示している。細孔を開けるという操作によって、金は細孔の周囲で再結晶化し、その結果、原子が規則的に並んだ鋭い棚状の金の突起109がナノ細孔の縁に突き出て、ポリマーの読み取り電極の1つを形成している。図10Cは、カーボンナノチューブ電極204を伴うプローブが、窒化ケイ素基材203に担持されているグラフェン基材202中のナノ細孔201の上に保持されている実施形態を示す。読み取り試薬205および206は、CNT204およびグラフェンナノ細孔201の縁に接続している。図10Dの電子顕微鏡写真は、ナノ細孔207がグラフェン多層208に開けられていることを示す。図10Eおよび10Fは、絶縁体12から突出している金属プローブ13が、薄い金属電極5でコーティングされている誘電性基材11を貫通して突き出ているカーボンナノチューブナノ細孔の配列1個のナノ細孔に10が書かれている、この配列によってカーボンナノチューブが突き出ている、の上に保持されている実施形態を示す。このような配列は、Holtら、FastMassTransportThroughSub-2-NanometerCarbonNanotubes.Science、2006.312、p.1034-1037参考として組み込まれるに記載されているように、ケイ素表面からナノチューブをCVD成長させ、次いで窒化ケイ素を充填し、その下にある担持部をエッチングして取り去ることによって加工されてもよい。例えば、プラズマエッチングによって残ったカーボンナノチューブ突出部を除去する前に、膜の上側には、接合部として作用する蒸発させたAuの層があってもよい厚み10~100nm。DNAを電気泳動によってカーボンナノチューブの中を移動させることは、近年、Liuら、Translocationofsingle-strandedDNAthroughsingle-walledcarbonnanotubes.Science、2010、327、p64-67によって示されており、これも参考として組み込まれる。プローブ6は、Nagaharaら、PreparationandCharacterizationofSTMTipsforElectrochemicalStudies.Rev.Sci.Instrum.、1989.60、p.3128-3130に記載されるように、頂部に少しだけ数平方ミクロン13が露出した状態で、絶縁体12の層で覆われていてもよい。これにより、電解溶液内で電気化学的なリーク電流が生じるのが最低限になる。ある種の実施形態では、上述の要素は、例えば、図60に示されているように、マイクロアレイまたはチップの構造であってもよい。ここで、担持材料302ケイ素、酸化ケイ素または窒化ケイ素は、薄い金属電極303例えば、原子層堆積法によって堆積したTiNでコーティングされ、次いで、使用する読み取り試薬に最適になるように選ばれた厚み308の誘電体層304で覆われている。本明細書に記載するほとんどの試薬の場合、この厚みは、1.5~3nmである。第2の電極305が堆積しており、最終的な誘電層309で覆われている。ナノ細孔301は、デバイス全体を貫通するように開けられており当該技術分野で周知の電子ビームを用いることによって、露出した金属電極表面は、読み取り試薬306および307で官能基化されている。金属電極は、任意の従来からある方法によってナノ細孔の周りに形成されてもよい。例えば、集束イオンビームによる化学蒸着法によって、窒化ケイ素膜に形成されたナノ細孔にPtを堆積させてもよい。金属例えば、TiNも、原子層蒸着法または化学気相成長法によって堆積させ、その後に孔をエッチングするか、孔を作成してもよい。また、まず、膜例えば、SiN、SiまたはSiO2を金属でコーティングし、その後に孔を開けてもよい。また、本質的に導電性の物質であるグラフェンを、ナノ細孔を有する電極として用いてもよい。グラフェンの場合、グラフェンに細孔を開けてもよい。例えば、48kbpまでの長いオリゴマーの場合、グラフェンの細孔の移動を使用してもよい。グラフェンを用いる場合、細孔の縁のみを官能基化することが可能である。ナノ細孔のためにカーボンナノチューブを使用する例示的なトンネルギャップを図11に示す。プローブを基材から取り外してもよく、そのため、基材およびプローブを異なる試薬で官能基化することが可能である。ある特定の実施形態では、プローブ金または白金、または白金アロイは、水溶液中で水素結合供与部と水素結合受容部とが存在する試薬である4-メルカプトベンズカルバミド21で官能基化されている。カーボンナノチューブ10の末端は、好ましくは、当該技術分野で周知のように、アミド結合示されていないを用いてカルバミド部分22で官能基化されていてもよい。Feldman,A.K.、M.L.Steigerwald、X.GuoおよびC.Nuckolls、MolecularElectronicDevicesBasedonSingle-WalledCarbonNanotubeElectrodes.Acc.Chem.Res.、2008.41:p.1731-1741を参照。移動速度の制御読み取り試薬で官能基化された読み取りギャップを使用することのさらなる利点は、実施例13に記載されるように、ギャップ内に塩基が結合している時間が本質的に長いことである。ナノ細孔がかかえる主な問題は、熱揺らぎに打ち勝つほど十分に大きいバイアスを細孔にかけると、DNAが高速で移動してしまうことである。DNAは、数百万塩基/秒の速度で移動し、この速度は、実用的なproactical読み出しスキームにとって速すぎる。この問題は、Brantonら、NatureBiotechnologyvolume28、pp1146-1153、2008に記載されている。DNA塩基と結合する分子で電極が官能基化されている場合、1個の塩基を、数秒間までの間捕捉されたままにすることができる。図59に示されている原子間力顕微鏡データの詳細な分析Huangら、NatureNanotechnology、vol5、pp868-873、2010は、読み取り試薬で官能基化されたナノ細孔を通るDNAの速度を上げるには、わずかな力を加えるだけでよいことを示している。例えば、図59のデータを使用し、ナノ細孔に80mVのバイアスをかけると、DNAが、10塩基/秒の速度で移動することが示され、この速度は、120mVでは100塩基/秒を超える値まで増える。ポリマーの分析本発明の化合物、要素、デバイス、方法を用いて、ポリマーを分析してもよい。ある特定の操作方法では、図9の電源Vtを用いることによって、例えば、約0.1~1V、例えば、約0.3~0.7V、または約0.5VVtのバイアスを電極に印加してもよい。プローブとナノ細孔の間のギャップは、望ましい設定電流に達するまで、トランスデューサ図9の7によって調節される。望ましい設定電流は、約1~10pA、例えば、約3~6pAであってもよい。例えば、移動バイアスVeを印加し、カーボンナノチューブを通るDNAの移動を作り出してもよい。Veの好ましい値は、0.1~1Vである。ある種の実施形態では、トランスデューサ7の横方向の走査動作を用いて、片方の電極例えば、プローブを、表面の上を移動させ、DNAを首尾良く移動させるナノ細孔の位置決めをし、トンネル信号の識別が最大限になるようにギャップを調節してもよい。好ましい初期値例えば、0.5Vで6pAの電流になるようにギャップを設定し、4種類のヌクレオシドからの信号の分離が最適になるようにバックグラウンドトンネル電流を少し調節してもよい。ポリマーを分析するときに好ましいさらなる要素は、a速いデータのスパイクを除くこと持続時間40μs未満;bデータの0.3秒ブロックでノイズレベルより1~2上の標準偏差に閾値を設定し、自動的にピークを検出;c周波数応答が35Hzより速くならないように、バックグラウンド電流信号を維持するサーボゲインの調節;dデータを獲得しているときはサーボをオフにする手段である。ギャップの平均的な大きさを制御するサーボをデータ獲得中に残しておくと、望ましい配列決定信号に応答して、サーボがギャップを調節してしまうので、データがゆがめられてしまう。例えば、サーボをオンにした状態で図68、73、74のトレースを得たすぐ上に記載した通り、応答時間をゆっくりにした状態。ギャップを固定してサーボ制御を行わず図70、71および72のトレースを得た。信号はかなり解釈しやすくなる。ギャップを変えることが可能な装置では、最適な配置は、DNAが存在しない状態でバックグラウンド信号によってサンプルを整列させ、サーボを用いてギャップを安定化させ、次いで、サーボをオフにしてデータを獲得することであり、ギャップを再設定すると、DNA信号が止まる。ある特定の実施形態では、電流信号は、信号の持続時間に基づいて選択され、バックグラウンドの上にあるピークを認識するためのベースラインを確立するために、0.5秒以下の間隔でバックグラウンド電流の数値を合わせる。本発明のさらなる利点は、必要な場合、標的群からの信号を最適化するためにギャップを調節し、小さな距離10個分の炭素-炭素結合までの距離離れた、水素結合供与部および/または水素結合受容部および/または、πスタッキングが可能な芳香族環が存在する任意の標的をこのスキームで読み取ることができることであると理解されるだろう。両電極を作成するカーボンナノチューブ他の実施形態では、カーボンナノチューブを用い、図12に示されるような両電極を作成してもよい。ポリマーの配列を決定するための電極としてのカーボンナノチューブは、第61/083,993号CarbonNanotubeBasedDeviceforSequencingPolymersに記載されており、本明細書に参考として組み込まれる。Liuら、Translocationofsingle-strandedDNAthroughsingle-walledcarbonnanotubes.Science、2010、327、p64-67、さらに、第61/083,993号CarbonNanotubeBasedDeviceforSequencingPolymersに記載されているように、DNAは、ケイ素ウエハの表面に構築されたデバイスを用いて、カーボンナノチューブ30の中の小さなギャップを通って移動する図12を参照。酸素プラズマエッチングに対するレジストバリア35の開口部分を短時間露出させた後、トランスデューサ36を用いて、ギャップの上にある固定された点37に対して薄膜34を押し上げてデバイスを曲げることによって、CNTに非常に小さな切れ目を作成し、その片側に移動させてもよい。切れ目のついたカーボンナノチューブを曲げると、それが破壊され、管が存在する基材がさらに曲がっていくと、ギャップの程度は大きくなる。開口したギャップの大きさは、片方の電極31aから別の電極31bまで流れるトンネル電流を用いることによって測定される。望ましいギャップの大きさ2~2.5nmが得られたら、CNTの末端を上述の様なカルバミド基32で官能基化する。ある特定の方法では、DNAがギャップ30を移動し、トランスデューサ36は、塩基からのトンネル電流信号の分離を最適化するように調節され、電極31aおよび31bにカルバミド基を結合することによってギャップが広がる。実施例1.材料の合成および特性決定1.1材料および方法プロトンNMR1HスペクトルをVarian500MHz分光計で記録した。クロロホルム中の1H化学シフトは、溶媒ピークδH=7.26ppmをリファレンスとした。高解像度質量スペクトルHRMSを、大気圧化学イオン化APCI技術を用いて記録した。UV吸収を、VarianCary300UV分光光度計で記録した。フラッシュクロマトグラフィーを、自動化フラッシュクロマトグラフィーTeledyneIsco,Inc.CombiFlashRfを用いて実施した。全ての化学試薬は、商業的な供給業者から購入し、他の記述がされていない場合には、受領したままの状態で使用した。2’-デオキシアデノシンおよび2’-デオキシグアノシンは、TCIAmericaから購入し、チミジンはAlfaAesarから、2’-デオキシシチジンはSigma-Aldrichから購入した。Sure/SealTM瓶に入った無水N,N-ジメチルホルムアミドDMFは、Sigma-Aldrichから購入した。1,2,4-トリクロロベンゼンTCB、99、Aldrichは、窒素下、モレキュラーシーブ4Åで乾燥させ、次いで、濾過した後に減圧状態で蒸留した。それ以外の全ての溶媒は、受領したままの状態で使用した。1.2ヌクレオシドのビスtert-ブチルジメチルシリルTBDMS誘導体図14を参照を調製する一般的な手順D.A.Barawkar、R.K.Kumar、K.N.Ganesh、TetrahedronLetters48、85051992;W.Zhang、R.Rieger、C.Iden、F.Johnson、Chem.Res.Toxicol.8、1481996;P.Potier、A.Abdennaji、J.P.Behr、Chem.Eur.J.6、41882000を参照。乾燥ヌクレオシド1.0mmol、ジメチルアミノピリジンdimethylaminopridineDMAP、0.15mmolおよびイミダゾール6mmolの無水DMF10mL溶液に、tert-ブチルジメチルシリルクロリドTBDMSCl、2.5mmolを加えた。反応混合物を窒素下、室温で一晩撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせて濃縮し、CH2Cl2-CH3OHの勾配が100:0~100:5の溶出液を用いて、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで残渣を精製した。3’,5’-ビス-O-tert-ブチルジメチルシリル-デオキシアデノシン1:収率80。1HNMR500MHz,CDCl3:δ8.29s,1H,2-H,8.09s,1H,8-H,6.65brs,2H,NH2,6.41t,1H,1’-H,4.56dd,1H,3’-H,3.96d,1H,4’-H,3.82dd,1H,5’-H,3.72dd,1H,5’’-H,2.59m,1H,2’-H,2.39m,1H,2’’-H,0.86s,18H,CH33CSi,0.05s,6H,CH3SiO,0.03s,6H,CH3SiO.HRMSAPCI:C22H41N5O3Si2Hとして計算値480.2826;実測値480.2818。3’,5’-ビス-O-tert-ブチルジメチルシリル-デオキシシチジン2:収率17。1HNMR500MHz,CDCl3δ8.07d,1H,6-H,7.14brs,2H,NH2,6.24t,1H,1’-H,5.84d,1H,5-H,4.38m,1H,3’-H,3.92m,2H,5’-H,3.77m,1H,4’-H,2.42m,1H,2’-H,2.08m,1H,2’’-H,0.92s,9H,CH33CSi,0.88s,9H,CH33CSi,0.11s,3H,CH3SiO0.10s,3H,CH3SiO,0.07s,3H,CH3SiO0.06s,3H,CH3SiO.HRMSAPCI:C21H41N3O4Si2Hとして計算値456.2714;実測値456.2722。3’,5’-ビス-O-tert-ブチルジメチルシリル-デオキシグアノシン3:クロマトグラフィーから得た粗生成物をエタノール95中で再結晶させることによってさらに精製した。収率21。1HNMR500MHz,CDCl3δ13.10brs,1H,NH,7.89s,1H,8-H,7.11brs,2H,NH2,6.26t,1H,1’-H,4.57t,1H,3’-H,3.97t,1H,4’-H,3.81m,1H,5’-H,3.77m,1H,5’’-H,2.51m,1H,2’-H,2.37m,1H,2’’-H,0.91s,9H,CH33CSi,0.90s,9H,CH33CSi,0.10s,6H,CH3SiO0.07s,6H,CH3SiO.HRMS:APCIC22H41N5O4Si2Hとして計算値496.2775;実測値496.2767。3’,5’-ビス-O-tert-ブチルジメチルシリル-チミジン4:収率83。1HNMR500MHz,CDCl3δ9.78brs,1H,NH,7.40s,1H,6-H,6.27t,1H,1’-H,4.33t,1H,3’-H,3.85t,1H,4’-H,3.80dd,1H,5’-H,3.69dd,1H,5’’-H,2.18m,1H,2’-H,1.93m,1H,2’’-H,1.84s,3H,5-CH3,0.85s,9H,CH33CSi,0.82s,9H,CH33CSi,0.04s,6H,CH3SiO0.00s,6H,CH3SiO.HRMS:APCIC22H42N2O5Si2Hとして計算値471.2711;実測値471.2712。1.3ストック溶液の調製tert-ブチルジメチルシリルtert-butyldimethylsiyl基によって保護されたヒドロキシル基をもつヌクレオシドdA、dG、dT、dCの飽和溶液1.0mgを、新しく蒸留した1,2,4-トリクロロベンゼン20mlに加え、超音波浴で10分間超音波処理した。この溶液を濾紙1番、Whatmanで濾過し、グローブボックス水分は0.5ppm未満、酸素は0.5ppm未満内で保存した。このストック溶液をTCBで希釈することによって作業用溶液を調製した。1.4ストック溶液の濃度TCBのUV吸収はヌクレオシドのUV吸収と重なってしまうため、溶媒を交換することによってストック溶液の濃度を決定した。一定分量のストック溶液1mlから、80°C、真空下でTCBを除去し、残渣を同じ容積のクロロホルムに再び溶解し、UV吸収を測定して濃度を決定した。クロロホルム中での全ヌクレオシド誘導体のUV吸光係数は、それぞれ一連のdA、dG、dT、dC希釈物を用いて、最大吸収波長で決定した。希釈ファクターは、3.5から200までさまざまであった。曲線の当てはめは、Origin8で行った。得られたストック溶液の濃度を以下の表に列挙している。表1.TCBストック溶液中のヌクレオシド飽和濃度。最終行には、トンネル現象の測定で使用した最終濃度を列挙している各ヌクレオシドについて、ほぼ等しい読み取り速度が得られる濃度実施例2:プローブおよび表面の調製および特性決定金S.Changら、Nanotechnology20、0751022009AlfaAesar、直径0.25mm、純度99.999およびPtIr20L.A.Nagahara、T.Thundat、S.M.Lindsay、Rev.Sci.Instrum.60、31281989のプローブをエッチングし、表面を調製しJ.A.DeRose、T.Thundat、L.A.Nagahara、S.M.Lindsay、Surf.Sci.2561021991、水素炎でアニーリングした。安息香酸0.3mgを、アルゴンで脱気したN,N-ジメチルホルムアミドSigma-Aldrich、純度>99.992mLに溶解した。基材をこの溶液に2時間浸した後、すぐに水素炎でアニーリングし、次いで、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトン、1,2,4-トリクロロベンゼン1,2,4-trichlrobenzeneですすぎ、使用前にN2を流して乾燥させた。修飾する前に、プローブをpiranhaH2SO4/30H2O23:1-熱および酸素を発するので、注意深く処理せよで洗浄した。次いで、プローブを1mM安息香酸溶液に一晩浸し、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトン、1,2,4-トリクロロベンゼン1,2,4-trichlrobenzeneで洗浄し、使用前に風をあてて乾燥させた。全ての測定は、新しく調製した純粋な溶媒中またはヌクレオシド溶液中で行った。偏光解析法STMA.H.Schaefer、C.Seidel、L.Chi、H.Fuchs、Adv.Mat.10、8391998およびFTIRS.E.Creager、C.M.Steiger、Langmuir11、18521995によって表面の特性を決定した。FTIRスペクトルは、明らかに、安息香酸部分が露出しており、中性形態であることを示している。バックグラウンドトンネル信号を測定し、図2に示した。2.1分極電流および電気化学的な漏れピーク電流の絶対値は、以下のように、電気化学的な漏れによって影響を受ける。表面から遠く離れたプローブを用いて測定したバックグラウンドリーク電流を引いた後に、トンネル電流を設定する。この値がかなりの値数十pA~数百pAである場合、プローブが絶縁されていなくてもその結果、表面全体で漏れが発生する、プローブを表面に近づけたとき、プローブの頂部周囲で拡散速度が変わるため、漏れがさらに変化することがあり得るpAレベルで。したがって、表面から遠く離れたプローブを用いた漏れを適用して補正すると、表面に近いプローブを用いた漏れを過剰に補正してしまうことがあり得る。その結果、見かけのトンネル電流は過大評価されてしまい、あるヌクレオシド溶液と、別のヌクレオシド溶液とで漏れが異なる場合、ヌクレオシドごとの実際の設定点が変わってしまう。この影響は、飽和濃度でのdCおよびdGのピークの見かけの桁数を変えてしまう程大きい表1。表1に示される作業濃度まで希釈すると、バイアス0.5Vでのリーク電流は、1.0~2pAdA、0.0~1.0pAdT、0.3~1pAdGであった。dC0.8μMの場合、初期は15pAの電流が観察されたが、上の溶液に1時間さらした後、電流は数pAまで下がった。これらのバックグラウンドを、本明細書で報告するベースライントンネル電流から引いた。単一のヌクレオシドのデータと、混合物のデータとの間の類似性によって明らかなように、顕著な誤差は生じないと思われる。dT、dG、dCの生データの例は、図15に見い出すことができる。2.2STMサーボゲインサーボの周波数応答は、サーボを適用していない場合図16Aと、適用している場合図16Bの1/fノイズプロットを比較することによって決定された。電流のトレースをフーリエ変換し、以下にしたがってスペクトル密度として示した式中、nは、周波数チャネル番号であるΔt=20μs、N=50000。図16Aの実線は、1/fに当てはめたものである。閉じたサーボループを用いると図16B、ノイズデータは、28msの応答時間に対応し、35Hz未満に抑えられる。この時間は、全てのパルスをゆがめるには十分ではないが、最も長いパルスをゆがめるのには十分に長い図15の図内挿入図の長いパルスは、測定したサーボ応答と一致して、ピーク電流のレベルを少し減らしていることが示されている。2.3自動的なピーク検出高速化し、操作者による偏りをなくすために、データの分析を自動化した。ある操作者がこのプロセスに入力するのは、極端にノイズの多いバックグラウンドコンタミネーションの特徴がみられた場合、プローブを基材のもっと静かな領域に移動させることであった。この原理の課題は、サーボによって完全には補正されなかったバックグラウンド電流で、低い周波数での不安定さである。ピークを許容するための閾値を小さい値に固定して使用すると、この閾値よりも上の非常に小さいベースライン変動でさえ、大量の偽の計測数を生じてしまった。この問題を以下のように克服した。電流-時間データ50kHzで得たを0.3sのブロックに分けた。ブロック内の振幅をビニングし、データの下側半分をGaussianに当てはめ、Gaussianの平均値が望ましいベースライン電流と等しいことをプログラムで確認した。GaussianのHWHHを用いて、ベースラインノイズのSD、σを決定した。閾値をデータ操作0.3s以内のノイズの2σ上に設定することによって、ここに示したデータを分析した。ノイズレベルは操作継続時間によって変わるため、この可変性閾値は、結果として可変性のカットオフ値となり、データを集めたときに、最も低い電流の読み取りでは分布の形状が変わってしまうことがあるすなわち、dTの場合で、片方の電極が官能基化されていないものを用いて得たデータ。操作時間30sすなわち、100個の0.3sセグメントでのデータのカットオフ値dT、4.3μM、Gbl=12pSV=0.5Vの3つの選択の影響を図17に示す。非常に短いパルス装置の解像限界にあるは、データを支配することがあるが、ヌクレオシドの属性には感受性ではないようである。したがって、たった1個のスパイク20μsまたは2個のデータ点の継続40μsの全てのスパイクを除外した。スパイクの持続期間の分布は、図27~図29に与えられている。2.4未官能基化電極を用いて得られたデータ未官能基化電極を用いて得られたデータを図18および19に示す。図18および19は、分布が非対称であることを示す。本願発明者らは、分子形状がランダムに分布しており、トンネル電流は、所定の位置での変化に対し、指数関数的に感受性であると想定している。したがって、本願発明者らは、電流の対数値にGaussian分布を使用した。式IIに示される式は、図18および19に曲線で示されるように、データとよく一致している。データの適合の質は、図20に示されるように、図19Aから得たデータのlog-logプロットを用いて示される。曲線は放物線である。表2:ピーク電流Ip、分布の高電流側の幅I0.5、未官能基化金電極を通る4種類のヌクレオシドの読み取り速度RRを、コンダクタンス20pSおよび40pSバイアス=0.5Vで設定する。Gaussianへの当てはめと、Gaussianlogへの当てはめの差は、官能基化されたプローブを用いて測定した狭い分布ではそれほど顕著ではなかったが、Gaussianlog関数に当てはめた方が、Gaussianに当てはめるよりも明らかに良かった。ほとんどのデータを2種類のGaussianの合計に当てはめ、第2のピークを、第1の電流ピークの2倍の位置を中心とした。より分布が狭い場合、HWHHは、によって概算値が与えられる。2.5ヌクレオシド混合溶液のデータヌクレオシド混合溶液のデータを図21に与えている。混合した膜を用いた読み取りはある程度不均一であり、このことは、表面が相分離していることを示していた。6箇所の異なる点で表面をサンプリングし、データを加えることによって、図3Fおよび図3H、図5Cおよび図21に示されている分布を得た。dA:dGのバルク濃度比が0.24である場合表1、測定したピーク面積の比率は0.6であり、dAがdGよりも高い親和性で表面に結合していることを示唆している。バルク濃度比をdA/dG=0.12に変えると、ピーク面積の比率はたった0.4まで下がり、この混合物の吸着等温線が複雑であることを示している。dT:dCのバルク濃度比が0.19である場合表1、それぞれのピークの面積比は、表面濃度比が1.1であることを示しており、dCは、この表面にきわめて大きな親和性を有することを示唆している。濃度比を0.09:1に変えると図21、積分ピーク面積は、表面濃度比がdT/dC=0.2に変わったことを示している。したがって、dC/dT混合層の場合、dA/dG混合物の場合よりもバルク濃度を所定量変化させて生じる相対表面濃度の変化がかなり大きくなり、これはおそらく、異なる溶媒親和性、異なる表面親和性、表面上にあるヌクレオシド間の相互作用と競争する結果であろう。それでも、減らした要素に関連するピークは、同じように下がっており、純粋なヌクレオシド溶液に対する現行の測定法に基づく本願発明者らのピーク割り当ては有効である。2.6水素結合した複合体のコンダクタンスの計算印加したバイアスに起因する電流の評価は、弾道輸送理論を用いて決定される。金の電子状態は、分子から飛び出し、トンネル電流を生じる。透過中に電子が非弾性散乱することは考慮しない。電子の流れは、金属のフェルミ準位にある電子が分子を通過する透過関数によって決定される。非常に小さなバイアスのみを考慮する/-0.1V。この領域で、I-V特性は全て線形であり、そのため、結果は、単純に導電性によって特徴づけられる。導電性は、コンダクタンスの量と、フェルミ準位での透過関数の積となる。透過関数の計算は、散乱理論から得られる標準的な結果によって与えられJ.K.Tomfohr、O.F.Sankey、J.Chem.Phys.120、15422004、式中、Eは、エネルギー金の接点のフェルミ準位であり、は、左側および右側の金属の接点の状態のスペクトル密度であり、GMは、グリーン関数の分子伝搬関数である。関数は、金属状態の全ての情報を含有し、分子にいかにカップリングするかの情報を含み、GMは、分子内の電子状態に関するあらゆる情報を含む。グリーン関数の伝搬関数は、金属同士の接点の経路に沿った距離で、ほぼ指数関数的に減衰していくだろう。状態のスペクトル密度およびグリーン関数を計算するために、電子状態のモデルおよび半無限の金属線をモデリングする方法が必要である。本願発明者らは、先端および基材、半無限的に平坦な金平面111の表面の両方をモデリングした。Au中空部位の上で、分子の末端に硫黄原子が接続している。スーパーセルスラブ形状を使用する。このことは、系は間に特定の構造で分子が挟まれたAuスラブの周期的な配列初期は薄いであることを意味する。連続的なスーパーセル構造は、ブロッホの定理を使用して、系全体の電子状態を決定することができる構造である。スーパーセル全体の電子構造は、密度汎関数理論の範囲内で自己無撞着に決定される。スラブがAuの5~7層であるという事実を補正するために、塊状の金をあらわす中心の層を選択することによって帰納法によりスラブが無限に拡張する。電子構造は、ファイアボール模型の局所的な原子軌道を用いて決定されるO.F.Sankey、D.J.Niklewski、Phys.Rev.B40、39791989。この局所的な軌道は、有限の半径をもち、したがって、基底状態から非常にわずかに励起されている。SIESTAコードP.Ordejon、E.Artacho、J.M.Soler、Phys.Rev.B53、104411996を密度汎関数理論の範囲内で使用する。全てのコア状態を除去する疑似ポテンシャルを用いて、全ての原子を記述する。使用するバイアスの設定は、全原子についてdoublezetapluspolarizationDZPであるが、但し、Auは、singlezetapluspolarizationSZPを使用する。2個の読み取り部と標的塩基との間の結合の多くの異なる形状を調べた。全ての場合で、読み取り部および塩基の緩和DFT形状を使用した。制限された一連の計算を分子系全体に緩和した。表3に報告した結果を緩和した個々の分子の形状に使用し、次いで、個々の分子を、図1A~1Dの組み立てられた構造に厳密に翻訳する。重要な変数は、水素結合の長さ例えば、実験およびDFTM.H.Lee、O.F.Sankey、Phys.Rev.E79、05191112009から、このような水素結合した分子について予想される値に設定された、および金属線間の距離であった。概算される金属線の距離は、トンネル現象の減衰定数および溶媒を通るthoughバックグラウンドトンネル電流から概算した値に設定された。理論と実験の量的な不一致表3は、特にdTの場合に大きいようである。しかし、溶媒が介在するトンネル現象を無視すると、おそらく、1個だけが官能基化され、上部の接触が溶媒を介している電極を用いて検出されるものと同等の重要なさらなる電流を無視することになる。この電流は、ここで計算される結合を介する値にバックグラウンドとして加えるべき、かなりの量の電流である。第2の誤差の原因は、おそらく、トンネルギャップに対する本願発明者らの概算によるものである。少し過剰に概算したことで2.5のうち0.1nm、伸長した水素結合の電子減衰定数が非常に大きいため、計算されるトンネル電流が顕著に低くなるだろう。M.H.Lee,O.F.Sankey、Phys.Rev.E79、05191112009。実施例3:トンネル現象の測定本願発明者らは、デジタルオシロスコープを取り付けたPicoSPM走査型プローブ顕微鏡Agilent、Chandlerでトンネル現象の測定を行った。プローブおよび金111基材の両方を4-メルカプト安息香酸で官能基化すると、TCB中のトンネルバックグラウンド信号は、バイアス0.5VでIblが10pAまで、コンダクタンス20pSの設定点電流で比較的ノイズがなかった図2。ヌクレオシド溶液を液体セルに入れ、その後、分極電流は、小さな値まで低下した。本願発明者らは、以前ノイズが少ないバックグラウンド信号を与えたトンネル電流レベルでプローブを再びつないだ。トンネル信号の中で、電流スパイクは、すぐに明らかであった図15。ヌクレオシドの表面濃度も、ギャップ内の分子捕捉効率もあらかじめわかっていなかったため、本願発明者らは、トンネルギャップ内でほぼ等しいスパイク比率を得るように、ヌクレオシド溶液の濃度を調節した表3。表3:Ibl=6pA、V=0.5Vで、官能基化されたトンネル接合部で測定されたコンダクタンスおよび計算されたコンダクタンス。測定された値は、3回の独立した試行の平均である誤差は±lsd。計算されたコンダクタンスは、図1A~1Dで示される構造に関する。読み取り速度は、0.8~4.3μMのヌクレオシド濃度で180秒間に得られた計測数に基づく。理論値と実験値の範囲の不一致は、ある電極に結合した分子内での溶媒が介在するトンネル現象によるバックグラウンドへの寄与を無視したことを反映していると思われる。絶対値は、ギャップの大きさの概算値が不正確であることによって影響を受けているだろう。スパイクの多くは、1個の分子がギャップ内に結合している場合および結合していない場合の2種類のレベルのテレグラフノイズの特徴を示していたS.Changら、Nanotechnology20、0751022009図内挿入図、図15。STMサーボゲインは、最も長い持続時間をもつスパイクのみが、電流制御サーボの作用によって影響を受けるように設定された図16。本願発明者らは、スパイクの高さを分析するためのカスタムプログラムを用いて、ピーク電流の分布を作成した。このプログラムは、ベースラインのノイズよりも上にある2種類の標準偏差の信号を捕捉し、さらに、所定時間内で1点または2点だけのデータを除外したすなわち、持続時間が40μsまで。測定した分布のフィルタリングパラメータを選択する効果を図17および図27~28に示す。図3は、これらの測定した分布が、電極の官能基化によってどのように影響を受けるかを示す。未官能基化電極を用いて記録した分布を図3Aおよび図3Cに示す。未官能基化電極を用いた信号を記録するために、本願発明者らは、20pSのコンダクタンスで操作することによって、トンネルギャップを少し減らさなければならなかった。この小さなギャップでさえ、未官能基化電極を用いたピリミジンヌクレオシドの読み取りは、プリンヌクレオシドの読み取りよりもかなり少なかった図18、表2。測定された電流分布は、図18~20に示されるように、電流の対数値のGaussian分布に非常によく当てはまった実線。当てはめられたピーク電流は、これら2種類のヌクレオシドで異なっていたdAの場合、15.9±0.4PA、dGの場合、18.7±0.2PAが、その差2.8pAは、高電流側での分布幅約15pAよりも小さい。官能基化された基材および未官能基化金プローブを用いて、ギャップを大きくして12pSに対応測定を繰り返すと、測定した電流の分布は、1桁狭くなる図3B-dA図3D-dGが、ピーク電流に有意な差はない。スパイクの継続時間の分布は、未官能基化電極と、片方が官能基化された電極とでよく似ている図29。したがって、未官能基化電極を用いて観察されたスパイクは、ヌクレオシドが一時的に結合した状態にも対応しているようである。この場合、官能基化された電極を用いて観察される分布が狭いことは、トンネルギャップ内で結合状態をもつ種類の数が減った結果に相違ない。プローブおよび基材の両方が官能基化されている場合図3E-dA、図3G-dG、dAのピーク電流は、明らかにdGのピーク電流よりも大きい。このような明確に区別される信号は、両電極が官能基化されているときに作られ得るが、この信号は単一のヌクレオシドに由来するものであろうかテレグラフノイズ信号は、1個の分子の読み取りに特徴的であり、小さなピークは、2分子の読み取りに割り当てられ図3B、図3D、図3E、図3Gの2、所定の時間に1個よりも多い分子の読み取りが頻繁ではないことを示唆している。しかし、電気化学的なリーク電流によって、ヌクレオシドに依存する電流誤差が入り込んでしまい、そのため、測定される電流は、1個の分子の電流のみから作られるものではない場合があり得る。トンネル現象の読み取りの忠実度のよりよい試験は、電気化学的バックグラウンドに起因する任意の誤差が両信号群に存在するような2種類のヌクレオシド混合物を用いて行うことができる。図3Fは、dAおよびdGの混合物を用いて得られる電流分布を示す。高い方の電流ピークが、本質的にdA単独のときに記録される電流と同じであるため、この混合物のdA分子を計測しているはずである。この割り当ては、溶液中のdAの濃度を半分にすることによって確認される図3H。表面濃度は、あらかじめわかっておらず、表面結合部位に対するヌクレオシド間の競争、溶液中に戻る異なる解離速度に依存しているため、絶対的な信号の比率は、定量的な濃度の観点で解釈することはできない。このパネルのデータのほとんどは、読み取りの5のみを用いた1分子の読み取りが、ギャップ内のdAおよびdGを同時に読み取った場合と一致すると想定するとよく当てはまるdAdG、図3F。dCおよびdTの場合にも、同じ種類の特徴が観察される図5および図29が、未官能基化ギャップおよび未官能基化基材のデータは、小さなピリミジンヌクレオシドについて有意な数の読み取り数を得るためには、もっと大きなトンネル電流20pA、40pSに対応するで集めなければならなかった図19。また、dCとdTは、官能基化されたプローブを用いて読み取る場合、混合サンプル中で明確に分離される図5Cおよび図21。所与のバイアスで、ピーク電流の絶対値は、ギャップのベースラインコンダクタンスに正比例し図7A、すなわち、大きなトンネルギャップの中にある他の水素結合した系で報告されているのと同様に、ギャップが小さくなるにつれて、指数関数的に増加するS.Changら、Nanotechnology20、0751022009。本願発明者らは、ピーク電流が、ギャップの大きさが固定された状態で、バイアスすなわち、ギャップコンダクタンスに依存するという興味深い証拠を発見し図22、このことは、電流-電圧が、両電極に結合した分子に非線形に依存する可能性を示している。また、ギャップが狭くなるにつれて読み取りの頻度も増えた図24。一方、多分子の読み取りの割合は、ギャップを小さくするとすばやく増加し図7Aおよび図25、そのため、0.5Vのバイアスでベースラインコンダクタンスは12pSが最適値であると思われる。Ibl=6pA、V=0.5Vで測定したピーク電流の値を図7Bの斜線付のバーによってまとめている。これらは、4種類それぞれのヌクレオシドについて、3回の異なる試行の結果であるひとつは、サンプル調製からデータ分析まで異なるチームによって行った。それぞれのヌクレオシドのピークを、分布幅に匹敵する量によって分離し、2箇所の良好な接点を用いての1分子の読み取りである割合から、p≧0.6で塩基を特定することができる図26。また、本願発明者らは、官能基化された基材と、未官能基化Auを用いたプローブのデータ濃い陰影のバー、または未官能基化Ptを用いたプローブのデータ淡い陰影のバーを記録した。ピーク電流は、ヌクレオシドごとにほとんど変わらず、未官能基化接点に関連する抵抗Rcについて予想された結果であったX.D.Cuiら、Science294、5712001が、選択性がないことは、接点の抵抗だけでは説明することができない。本願発明者らは、2個の官能基化されたプローブを用いた読み取りが、1個の分子に関する抵抗Rmを決定づけると推定する場合、片方が未官能基化電極である接合部の抵抗は、Rj=RcRmによって与えられるはずである。図7Bは、片方に未官能基化金電極を用いた信号は、分子の抵抗に対し感受性がないことを示しており、一方、未官能基化Pt電極は、単純な直列抵抗モデルで予想される感受性の約半分であり、おそらく、電極に対する結合様式が、分子状態の位置に影響を及ぼしていることを反映しているV.Meunier、P.S.Krstic、J.Chem.Phys.128、0411032008。12pSのコンダクタンスで、本願発明者らは、G=G0exp-βx式中、G0は、コンダクタンスの量であり77μS、β=6.4nm-1であるを用いて、ギャップが約2.5nmであると概算するJ.He、L.Lin、P.Zhang、S.M.Lindsay、NanoLetters7、38542007。図1A~Dは、両電極が官能基化されているギャップ内で4種類のヌクレオシドについてもっとも可能性が高い水素結合であると考える構造エネルギーが一番低いものを示している。本願発明者らは、これら4種類の分子の接合部のコンダクダンスおよび予想されるコンダクタンスの密度機能関数計算を行い、以下の表3に、測定値を列挙している。コンダクタンスの予想される桁数は、実験値と一致しているが、絶対値はかなり小さく、これはもしかすると、トンネルギャップの大きさを大きく概算してしまっているためかもしれない。dTの持続時間のデータ図29は、両電極が官能基化されている場合でもほとんど変化を示さず、そのため、dTのスパイクは、ある電極での溶媒が介在するトンネル現象を表しているだろう。溶媒分子はシミュレーションには含まれていないため、このさらなるトンネル現象への寄与は、予想には存在しない。したがって、それぞれの予想された電流に、一定のバックグラウンドを加えるべきであり、予想された電流と測定された電流の範囲の食い違いが減るだろう。実施例4:4-メルカプトベンズアミドの合成以下のスキームにしたがって、4-メルカプトベンズアミドの合成をおこなった。4.1材料および方法プロトンNMR1HスペクトルをVarian400MHz分光計で400MHzで記録するか、またはVarian500MHz分光計で500MHzで記録し、炭素NMR13Cスペクトルを、Varian400MHz分光計で100MHzで記録するか、または、Varian500MHz分光計で125MHzで記録した。HRMSスペクトルを、大気圧化学イオン化APCI技術を用いて得た。フラッシュクロマトグラフィーは、CombiFlashRfTeledyneIsco,Inc.で実施した。全ての試薬は、他の記述がされていない場合には、Aldrichから購入した。4.2工程1:4-トリチルメルカプト安息香酸4-メルカプト安息香酸1.54g、10mmolおよび塩化トリチル2.79g、10mmolをDMF25mLに溶解し、周囲温度で36時間撹拌した。減圧下で溶媒を除去した。残渣をクロロホルム50mLに溶解し、水で洗浄した25mL×3回。有機層をMgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮した。化合物1を白色固体として得た3.20g、81。1HNMR500MHz,CDCl3:7.67d,2H,7.21‐7.39m,15H,6.99d,2H.4.3工程2:4-トリチルメルカプトベンズアミド化合物1198mg、0.5mmol、1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾールHOBt68mg、0.5mmol、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミドDCC103mg、0.5mmolのTHF5mL溶液に、0°Cでアンモニアジオキサン中0.5M、1mmolを滴加した。得られた混合物を室温まで加温し、24時間撹拌した。濾過した後、濾液を飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィーシリカゲル、ジクロロメタン:メタノールの勾配が100:0から100:3で精製し、化合物2を白色固体として得た154mg、78。1HNMR400MHz,CDCl3:6.98‐7.43m,19H,5.95brs,1H,5.75brs,1H;HRMSAPCI:実測値396.1442;C26H22NOSHとして計算値396.1422。4.4工程3:4-メルカプトベンズアミド化合物260mg、0.15mmolを、トリフルオロ酢酸TFA2mLとトリエチルシランTES2mLの混合物に溶解し、室温で2時間撹拌した。この溶液を減圧下、ロータリーエバポレーターで乾燥するまで蒸発させた。残渣をヘキサンとジクロロメタンの混合物v:v=1:1から結晶化させ、化合物3を白色固体として得た12mg、52。1HNMR500MHz,CDCl3:7.68d,2H,7.31d,2H,6.50brs,1H,6.29brs,1H,3.61s,1H;13CNMR125MHz,CDCl3:169.9,138.0,129.4,128.5,128.2.4HRMSAPCI:実測値154.0326;C7H7NOSHとして計算値154.0326。実施例5:電極の製造、官能基化、特性決定5.1電極の製造HClおよびエタノールの混合物体積比1:1を用い、金のワイヤAesar純度99.999から電気化学的に金の先端をエッチングした。絶縁プロセスのために、鋭い先端のみを選択した倍率300倍の光学顕微鏡で判断。高密度ポリエチレンHDPEを絶縁体として用いた。絶縁の前に、金の先端をpiranha過酸化酸素と硫酸の混合物、体積比が1対3-注意-この物質は、有機物質と反応して爆発することがあるで1分間洗浄し、有機汚染物質を除去し、2回蒸留した蒸留水、エタノールですすぎ、圧縮窒素ガスを吹きかけて乾燥させた。絶縁の間、自家製の先端コーティング装置で、HDPEを250°Cで溶融させた。溶融したHDPEを通って浸透し、絶縁性材料を含む先端のほとんどの領域を覆い、頂部のみを絶縁しないままにしておいた。絶縁した先端の露出した表面領域を、フェリシアン化カリウム中、サイクリックボルタンメトリーで特性決定した。絶縁した先端および絶縁していない先端をサイクリックボルタンメトリーで試験した。絶縁した先端は、整合性が高く、規則的な電極を与えた。図30および図31は、これらの結果を示す。図30は、50mMのフェリシアン化カリウム中、未官能基化金のワイヤのサイクリックボルタンメトリーを示す電位対Agワイヤ。図31は、HDPEでコーティングされたSTM先端のサイクリックボルタンメトリーを示す。半球状に露出した先端形状であると推定し、式Imax=2πRnFCDを用いると、コーティングされた走査プローブの典型的な露出表面積は、10~2μm程度である。5.2官能基化金の基材を水素炎でアニーリングし、汚染物質を除去し、十分に規則的なAu表面を作成した。実施例4にしたがって調製した4-メルカプトベンズアミドをメタノールに溶解し1mM、チオールの酸化を防ぐためにアルゴンを用いて脱気した。絶縁された先端が処理された基材をこの溶液に2時間より長い時間浸した。その結果、表面にベンズアミドの単層が生成された。官能基化の時間を長くすると、プローブの上の絶縁体が分解するので、プローブの処理は2時間までに制限した。金基材の官能基化は、20時間までにわたって行った。堆積させた後の分子SAMの厚みを、偏光解析法Gaertner、Skokie、ILを用い、波長632.8nmで、入射角を70°にして測定した。新しく水素炎で熱した未官能基化金基材マイカの上に厚み200nmの光学定数は、分子を堆積させる前に測定し、n=0.2およびk=-3.53を得た。SAMの光学定数をnf=1.45およびkf=0に設定した。4-メルカプトベンズアミド単層の厚みは、0.70±0.17nmであると測定された。ThermoNicolet6700FTIRThermoFisherScientific,MAにSmartAperturedGrazingAngle部品を取り付け、SAMの赤外線吸収スペクトルを記録した。粉末サンプルのスペクトルを、SmartOrbitdiamondsingle-bounceATR部品を用いて得た。図32は、4-メルカプトベンズアミド単層のFTIRスペクトル下側の線および粉末のFTIRスペクトル上側の線を示す。単層のIRで、3487cm-1、1610cm-1、1404cm-1の吸収ピークは、それぞれ、解離性のNH2水素結合していないのN-H伸縮振動、アミドバンドI、アミドバンドIIであると帰属される。偏光解析データは、ほとんど完全に単層で覆われていることを示唆しているが、STM画像図33は、途切れ途切れに覆われていることを示していた。この紙で記録される読み取り速度は、官能基化されている断片の上に位置しているプローブを用いて行われる読み取りである。図33で、STM画像は、Au111表面の上にメルカプトベンズアミドの島があることを示している1mMPBバッファ中、金の先端を含む画像、10pAの設定点で先端に0.5ボルトのバイアス。5.3電極の撮像光学顕微鏡画像および透過型電子顕微鏡TEM画像によって電極の特性を決定した。図34a~cは、未官能基化電極を示しており、図34d~fは、ポリエチレンでコーティングされた先端を示す。図34aは、典型的な良好な先端の光学顕微鏡画像を示す。この先端を、図34b~cに示されるように、透過型電子顕微鏡TEMでさらに特性決定した。この場合、先端の半径は約16nmである図34c。TEM撮像中に、炭素層金の先端を覆う白色の層を堆積させた。点線の円弧は、半径が16nmである。測定された半径は、典型的には、5~20nmの範囲にわたっていた。先端の表面は、通常は滑らかであるが、時には、隆起高さが1~2nmが観察される。一見したところでは、このような丸いプローブから1分子解像度を得ることができることは驚くべきことであるが、表面への分子の吸着によって、1分子解像度を可能にする局所的に高い点が作られるAFMプローブで官能基化された分子内構造の解像度によって示されるよりも良好である。典型的な絶縁された先端の光学顕微鏡画像を図34dに示す。この先端は、リーク電流を示さず約1pAの測定限界未満、実験では約8pAピーク/ピーク値、すなわち、ベースラインから4pA上の120Hzノイズを示した。同じ先端のTEM画像を図34d~fに示す。図34e~fの矢印は、露出した金を示しているコーティングが帯電するため、高解像度の撮像は可能ではない。実施例6:トンネルギャップの特性決定6.1水およびバッファ実施例5に記載したような電極を含むトンネルギャップを、2回蒸留した水および0.1mMリン酸バッファPB-pH=7.4を用いて特性決定した。未官能基化電極を用い、バッファ単独で小さな信号を観察したが、両電極が官能基化されており、トンネルギャップのコンダクタンスを20pS以下に設定した場合には、小さな信号はかなり少なくなった。図55を参照。トンネル現象の減衰は、官能基化された両電極を用いると、水単独の場合減衰定数βは約6.1±0.7nm-1よりもきわめて速かったβ=14.2±3.2nm-1。以下の実施例6.2を参照。i=10pAおよびV=0.5Vでのトンネルギャップは、2個のベンズアミド分子の長さよりも少し長いと概算される。すなわち、2nmよりも少し大きい。6.2水のバックグラウンド信号0.5Vでギャップの大きさを20pSにし、2回蒸留した水の中で、官能基化された基材の上に未官能基化電極を備えるコントロール実験を行い、小さな振幅のバックグラウンドテレグラフノイズ信号を得るバイアス0.5Vでほぼ6pA-図35。しかし、官能基化された基材の上に官能基化された先端を備えている場合、一般的にこのような信号は観察されない偶発的な信号の観察は、先端または基材の表面が4-メルカプトベンズアミドで完全に覆われていないことに由来するだろう。これらのバックグラウンド信号は、大きさが小さく、DNA信号よりも頻度が少ないため、データ分析中に閾値によって除外することができる。6.3トンネル現象の減衰曲線2回蒸留した水の中で、官能基化された電極および官能基化されていない電極を組み合わせ、減衰曲線を測定した。LnI対距離のプロット図36を線形に割り当てた傾きから減衰定数βを算出した。図36は、純粋なH2O中トンネル電流の減衰曲線を示すそれぞれの場合に、複数の曲線がプロットされている。図36aは、未官能基化金電極を示す。図36bは、両方ともが官能基化された電極を示す。図36cは、一方が未官能基化電極であり、他方が官能基化された電極を示す。官能基化された電極について、大きな距離でβの有意な増加が検出され、このことは、ギャップ組成の変化を示しており、本願発明者らは、ベンズアミドが相互作用する領域から、ベンズアミドが相互作用しない領域への遷移であると考える。βの測定値の分布を図37に示す。図37は、a未官能基化金電極;b両方ともがメルカプトベンズアミドで官能基化された電極;c片方の電極が官能基化されており、他方が官能基化されていない電極について、純水中のβのヒストグラムを示す。Gaussianへの当てはめ平均±SDによって、a6.11±0.68nm-1、b14.16±3.20nm-1、c6.84±0.92nm-1が得られた。実施例7:トンネルギャップ内のDNAヌクレオチドを分析DNAヌクレオチドPB中、10μMを、水系電解溶液中、実施例5に記載した電極を用いて作成したトンネルギャップに入れた。これらのヌクレオチドからは、図56c~fに示すように特徴的なノイズのスパイクがみられた。信号計測率図57に定義されているは、25計測数/s5-メチル-デオキシシチジン5’-モノホスフェート、dmCMPから、1c/s未満デオキシシチジン5’-モノホスフェート、dCMPまでかなり変動していた。チミジン5’-モノホスフェートdTMPを用いた場合は、信号は全く記録されず、その信号は、コントロールと非常によく似ていた図55。STM画像は、このヌクレオチドが表面多分プローブに非常に強く結合しており、1個の分子が接合部に広がり、相互作用を遮断していることを示唆している。電流はいきなりスパイクしもっと長い信号はその後に示され、スパイクの高さの分布は、図56g~jに示されるように、対数値の2種類のGaussian分布に非常によく当てはまった当てはめパラメータは、以下の実施例8に記載されている。これらのヒストグラムは、局所的なノイズバックグラウンドのSDの1.5倍を超えるパルスのみすなわち、典型的には、6pAより大きいパルスを計測することによって作成されたこの分析手順の完全な記載は、Changらによって与えられている。dCMPは、最も高い信号を発生し、最も計測率が低く、一方、デオキシアデノシン5’-モノホスフェートdAMPおよびdmCMPは、最も小さな信号を生成し、計測率が最も高かった。以下の実施例9に記載されているように、有機溶剤中のシチジンと5-メチルシチジンには、ほとんど違いがなかった。パルスの高さ分布が狭い3種類の塩基dAMP、dmCMP、GMPは、2つのレベル間を変動する供給源の特徴であるテレグラフノイズの急激な発生を示すことが多い特に、dAMPの場合に顕著。このような2レベルの分布は、トンネル信号が、トンネル接合部に捕捉された1個の分子によって作られていることを強く示す。ヌクレオチドから生じるトンネル現象のノイズの特徴を表4にまとめている。表4:ヌクレオチドトンネル現象のノイズの特徴。パラメータは図57に定義されている。指数関数的な分布に合わせたときの誤差。§標準誤差スパイクの振幅およびその信号の時間分布において、dAMP信号は、dCMP信号とよく分離しており、dmCMP信号は、dCMP信号とよく分離している表4および以下に記載。この理由のために、A、CおよびmC塩基で構成されるDNAオリゴマーを以下の実施例11でさらに観察した。実施例8:電流分布に対するGaussianの当てはめ実施例7のデータから作成したピークを、トンネル電流の対数値でGaussian分布に当てはめ、トンネル形状のランダムな分布を推定するモデルを対数的にサンプリングする。水中のこのデータについて、2つのピークが必要であり、これは2つの結合形状を暗示している。式S1当てはめパラメータを表S1に列挙している。表S1.強度分布の当てはめパラメータ実施例9:有機溶媒中のシチジンおよび5メチルシチジンの電流分布実施例4~5にしたがい、電極と4-メルカプトベンズアミド読み取り部を用い、有機溶媒中で測定したmCのデータが本実施例に含まれており、2種類の塩基からの信号が有機溶媒中で大きく重なっていることが示され、これは、この作業で、CおよびmeCから異なる信号を作るときに水分子が所定の役割を果たすことを示す。図40は、トリクロロベンゼン溶媒中、安息香酸読み取り部を用い、シチジンについて測定した電流分布黒色および5meシチジンについて測定した電流分布斜線を示す。実施例10:ヘテロポリマー内の1個の塩基を分析10.1ヘテロポリマー内の1個の塩基を読み取る2個の電極、プローブ、上の実施例4~5に記載されているような4-メルカプトベンズアミドで両方ともが官能基化されている基材を用い、dCCACCオリゴマーを分析した。電流の特徴的なバーストが観察され、その例を図54bに示すが書かれているスパイクは、非特異的であり、分析から外されている。バックグラウンドトンネル電流は10pAであり、バイアスは0.5Vである。以下に示されるように、頻度が低く、振幅の大きなパルスはCで示し、一方、頻度が高く、振幅が小さいパルスはAで示している。図54cは、スパイクの振幅の移動平均を示す0.25sのウインドウ、0.125sのステップ。直線より下にある値は、明らかにA塩基を特定している。図54dは、パルス周波数の移動平均を示しスパイクの隣接するそれぞれの対に対して定義されるような、それぞれの末端の周波数が低い領域は、これらの領域をC塩基に帰属することができるという信頼性を高めている。C塩基は、0.015nAより小さい無視できる数のスパイクを作成する赤色の線。AまたはCに帰属する確率を図54eに示す。これらの確率の計算は、本明細書に記載されているようなヌクレオチド、ホモポリマー、ヘテロポリマーの研究に基づく。この実施例は、明らかに、無傷のDNA分子中でC塩基によってフランキングされた場合、1個のA塩基を高い信頼性で特定することができることを示す。10.2ヌクレオチドについてバーストを示す電流トレース、およびdCCACCについて長時間のトレース図38は、dCCACCで覆われた表面をプローブが動くにつれて、10秒間に生成したトンネルノイズのサンプルを示す。図39は、それぞれのヌクレオチドからの信号の典型的なバーストを示す。図38で、dCCACCについて典型的な10秒間の時間トレースを示す。A信号が優勢であることを注記しておく。電流スパイクの分布図内挿入図は、ほとんど完全にA信号が優勢であり、この当てはめでのC要素小さな箱の曲線を参照は、7以下である。このことは、プローブは、少量のA塩基に結合した状態で多くの時間を過ごしていることを示す。図39には、データの典型的なバーストを示すヌクレオチドの長時間トレースが存在する。これらの例は、それぞれ、電流がスパイクしない領域で囲まれている。実施例11:4-メルカプトベンズアミドで官能基化された電極を用いたDNAオリゴマーの分析図58a、c、eは、dA5、dC5、dmC5について、代表的なトンネルノイズトレースを示し、図58b、dおよびfには、対応する電流ピーク分布が示されている。図58bdA5と図56gdAMP、図58ddC5と図56hdCMP、図58fdmC5と図56idmCMPを比較し、驚くべきことに、トンネル接合部でのほとんどのポリマー結合事象は、単一のヌクレオチドによって作られた信号に似た信号を作ることが示されている。この知見から、1単一の塩基が読み取られており、2ポリマー骨格に起因する立体障害は、塩基結合事象が信号を抑えることを抑制しないことが示される。ヌクレオチドの信号とオリゴマーの信号にはある程度の小さな違いがあり、違いは以下である。1ピークの位置、幅、相対強度がある程度変化する。2ヌクレオチドによって作られるほぼ全ての信号は、0.5Vのバイアスで0.1nA未満である表4。対照的に、dA5およびdmC5によって作られる合計信号の20は、このバイアスで0.1nAより大きい表5以下に記載される、このことは、0.1nAまでしか分布がプロットされていない図56G~Jからは明らかではない。dA5およびdC5のこれらの高電流>0.1nAの特徴が連続的に分布しており、そのため、所定の時間に1個よりも多い塩基が並行して読み込まれていることをあらわさない電流は、1個の分子の値の多くの値に分布しているだろう。むしろ、この特徴は、トンネルギャップ内にポリマー構造が存在することと関連する新しい特徴である。このような非特異的で振幅の大きなスパイクは、図54bではアステリスクで示されている。I>0.1nAでの特徴は、混合配列のオリゴマーではあまり頻繁に起こらないようであり、このことは、ホモポリマーの塩基のスタッキングに関連するものであることを示唆している。図58hは、dACACAの電流分布を示し、事象の95が0.1nA未満である。図58jは、dCmCCmCCの電流分布を示し、事象の99が0.1nA未満である。赤い実線は、スケールは別として、たった1個の当てはめパラメータをもつ構成要素に対応するホモポリマーを測定した分布の合計である。このパラメータは、比率rfitであり、A/Cの比率rfit=0.48またはmC/Cの比率rfit=0.66が寄与している。これらの値は、既知の組成物の比率とは異なっているがACACAの場合0.6、CmCCmCCの場合0.4、驚くべきことに、dCMP単独の場合のスパイクの比率は非常に小さく、Cは、混合配列のオリゴマーデータで非常に十分にあらわされていると考えられる。このことは、Aに囲まれているCは、頻繁に読み取られることを示唆しており、ひょっとすると、これはCを含有するオリゴマーが、単離されたdCMPよりも基材に良好に結合するからであろう。重要なことに、混合したオリゴマーは、個々の塩基信号の合計として記載されているよりも大きい信号を作り出すある中間電流の読み取りには、図58hおよび58jで1と書かれており、さらなる少数の電流が高い特徴は2と書かれており、配列の内容が果たす役割は小さいことを示している。これらの実験では、プローブはサンプルの上をランダムに動き回るため、配列は、決定論的に読み取られるのではない。それにもかかわらず、信号がAのような信号とCのような信号とが交互にあらわれるトレース図58gと、mCのような信号とCのような信号とが交互にあらわれるトレース図58iは簡単に発見されるだろう。これらの信号のバーストの持続時間実施例11の図57を参照は、長いACACAで0.14±0.02s、CmCCmCCで0.15±0.02s。同様のバーストがホモポリマー表5およびヌクレオチド表4でもみられる。表5:オリゴマーのトンネルノイズの特徴。パラメータは図57に定義される。指数関数的な分布に合わせたときの誤差。§標準誤差これにより、別の予想外の知見が導かれる。つまり、トンネルギャップ内で結合した複合体の寿命は、ノイズスパイクms間の間隔または溶液中の結合状態の寿命非常に短いと比較して、非常に長い第2のフラクションことである。実施例12:実施例11のtonおよびtoffの分布継続時間が0.1ms未満の電流スパイクは、電流-電圧変換器のゆっくりとした10kHz応答によってゆがみ、一方、継続期間が数msよりも長いパルスは、トンネルギャップを維持するために用いられたフィードバックによって影響を受ける。tonの分布は、モノマーについて図41に示し、オリゴマーについて図42に示す。toffの分布は、モノマーについて図43に示し、オリゴマーについて図44に示す。実線は、指数関数的な減衰に当てはまり、τonおよびτoffの値は、表4および表5に列挙されている。図41は、dGMP、dCMP、dAMP、dmCMPについて、オン時間の分布を示す。実線は、指数関数的に当てはめられている上側から、1番目の線はGMPであり、2番目の線はCMPであり、3番目の線はAMPであり、4番目の線は5meCである。図42は、dC5、dA5、dmC5について、オン時間の分布を示す。実線は、指数関数的に当てはめられている上側から、1番目の線はCCCCであり、2番目の線はAAAであり、3番目の線は5mCCCである。モノマーと比べ、分布はあまりよく分離されない。図43は、dGMP、dCMP、dAMP、dmCMPについて、オフ時間の分布を示す。実線は、指数関数的に当てはめられている上側から、1番目の線はCMPであり、2番目の線はGMPであり、3番目の線は5meCであり、4番目の線はAMPである。図44は、dC5、dA5、dmCMP5について、オフ時間の分布を示す。実線は、指数関数的に当てはめられている上側から、1番目の線はAAAAAであり、2番目の線は5mCCCCであり、3番目の線はCCCである。この場合も、モノマーと比べ、分布はあまりよく分離されない。実施例13:複合体の長い寿命を試験実施例4~5にしたがって調製されたナノスケールのギャップに限定された4-メルカプトベンズアミド-塩基base-4-メルカプトベンズアミド複合体の予想外の長い寿命について、動的分子間力分光法を独立した試験として用いた。これらの測定では図59a、認識分子のひとつが、34nmの長いポリエチレングリコールPEGリンカーを介してAFMプローブに結合し、一方、もう片方の認識分子は、Au111基材の上に単層を作成した。dAMPを標的検体として用い、ギャップを架橋した。dAMPが存在しない状態で、プローブと基材との接着はきわめて小さく、これはおそらく、ベンズアミド認識分子の上にある水素結合部位に、水分子が安定に結合しているからであった。少量のdAMPが存在する状態で接着特性を観察し、dAMPの濃度が上がるにつれて接着特性は低下したプローブおよび基材の両方のdAMPが結合した。PEG連結部が延びると、特徴的な信号が作られ、複数の結合事象図59biを1分子の事象図59biiと分離することができ、その結果、1分子の結合破壊事象のみを分析した。引張速度の関数として1分子の結合破壊力を図59cにまとめており実線は、異種結合モデルに対し、最大限あり得そうな当てはめであり、結合破壊力の関数として、結合が生き残る確率を図59dに示す。実線は、同じ異種結合モデルに対する当てはめである。これにより、力がゼロの状態でのオフ速度が得られる。したがって、この複合体の本来の力がゼロの寿命は、数秒程度の桁数であり、数ミリ秒程度の桁数ではない。この分析によって、解離させるための遷移状態に対する距離α=0.78nmおよびその変数分散であるσ=0.19nmも得られる。kHzの速度でトンネル信号を作り出しつつ、かなりの第2のフラクションのためのトンネル接合部にそれぞれの塩基が存在すると結論づけられた。したがって、1回のバーストバーストの継続時間は表4および表5に列挙されているで生じる信号の完全な集合体を用い、塩基を特性決定してもよい。電子署名において迅速に変動することに伴う長時間の結合状態の寿命は、STM画像で以前に報告されており、カーボンナノチューブ中の移動に対する1分子反応の影響が報告されている。このノイズの由来はよくわかっておらず、非常に温度感受性が高いと思われる場合を除き、ノイズを生じる運動に対する小さなエネルギー障壁の指標である。オン時間およびオフ時間の分布を分析した図57を参照。限定された時間範囲で、片方の末端で増幅器の応答によって決定され、他端でサーボ応答時間によって決定され、これらの分布は、指数関数的でありポアソンの由来について予想されるとおり、l/e時間τonおよびτoffを表4および表5に列挙している。これらはそれほど異なってはおらず、オン状態とオフ状態の間のエネルギー差ΔGを算出し、表4および表5に列挙される値を得る熱エネルギーの単位では、300KでkBT。これらの値はすべてkBTの一部である。したがって、スイッチングは、かなりの量の障壁を超える熱による活性化をあらわすことができない2つのレベルのノイズの通常の供給源。ある可能な説明は、指数関数的に感受性であるマトリックス要素によってサンプリングされた結合状態におけるブラウン運動である。オンおよびオフの時間は、非常に広範囲に分布するため、塩基信号を特定するのにそれほど有用ではない。しかし、バーストに入る頻度表4および表5のfSは、かなり単純なパラメータである。図49および図50は、3種類のホモポリマーの電流分布および周波数分布を示し、それぞれの曲線の下にある領域がひとまとまりになるように正規化する。dmC5の周波数分布は二峰性であり、mCMP単独の場合、Cの周波数範囲に多くの読み取りが存在し、非常に速い速度での数約1300Hzが観察された図でfmCMPと書かれている。このことは、mCの結合態様が、ポリマーの状況において顕著に変わることを示唆しておりヌクレオチド信号と比較した場合、ポリマー信号が大きくシフトすることと一致する、図58f、そのため、本願発明者らは、AおよびC、特に、以前分析されたdCCACC配列を含むオリゴマーを分析することを選択した。バーストのときに平均電流および周波数が与えられると、図52a~bに示される分布は、塩基がAまたはCである確率を独立して決める。dCCACCの電流分布図38の図内挿入図は、ほぼ完全にAのスパイクの方が優位であるこの当てはめのC分布の要素は、7以下である。これは驚くべき結果であるが、配列中のCが多いほど、Cスパイクの数が少なくなる。しかし、塩基がAによって切断されるとき、Cの読み取り頻度は高くなるという本願発明者らの仮説と一致している例えば、dCMP対dAMPの計測速度と比較して、dACACAでのCの読み取りが増加。バースト信号に対する本願発明者らの分析を用い、混合信号の定量的な帰属を行ってもよいこれは、図58gおよび58iでは目で行った。dC5は、0.015nAより小さな信号を作らず、そのため、このレベルより低いしかし、ノイズよりも高い電流のバーストは、明らかにAに帰属することができる。もっと振幅の大きな信号の場合、周波数および振幅のデータを両方とも使用した。結果は、図54eに示される曲線の対である。このアプローチを用いてDNAの配列を決定するには、いくつかのさらなる開発が必要である。第1に、ポリマーは、特に、読み取られるべきホモポリマーを移動させる場合、速度を制御した状態でトンネルの接合部を通って引っ張られなければならない。DNAは、官能基化されていないナノ細孔を非常に素早く通るので読み取ることができないため、官能基化されたトンネル接合部に塩基が長い時間滞留することが有用である。現時点で、ある部位から別の部位への移動は、制御されていない機械的な流れによって行われ、読み取り複合体に対し、未知の力が生じる。本願発明者らの力分光法データを用い、所与の読み取り速度を得るのに必要であろう引っ張る力を粗く概算することができる全塩基の代表例であるdAMPの測定されたオフ速度を推定する。Bell式は、力Fでのオフ速度を与え、式中、=0.28s-1であり、α=0.78nm、19pNであり、1秒あたり10塩基が通過するだろう。10塩基s-1の速度は、Cの読み取りについて、合理的な信頼レベルで帰属を行うのに十分な、平均で約30のデータスパイクを与える。19pNの力は、ナノ細孔17にちょうど80mVのバイアスをかけることによって作りだすことができ、そのため、トンネル接合部あたり、1秒あたり10塩基の読み取り速度は実行可能であるようだ。実施例14:電流分布の高電流側のテーリング図45は、dA5について、4-メルカプトベンズアミドで官能基化された電極の0.1nA未満のスパイクの計測数の分布を示す。これらは、合計の約20であり、dNTPまたはdC5では観察されない。図46は、dmC5について、0.1nA未満のスパイクの計測数の分布を示す。これらは、合計の約20であり、dNTPまたはdC5では観察されない。実施例15:金基材の上でのヌクレオシドモノホスフェートと4-メルカプトベンズアミドの相互作用および溶液中の結合状態の寿命のSPR概算BI-2000SPRシステムBiosensingInstrument、Tempe、AZに、ポリアリールエーテルエーテルケトンPEEKセルブロックとポリジメチルシロキサンPDMSガスケットとからなる2チャンネルフローセルを取り付け、表面プラズモン共鳴SPRセンサーグラムを記録した。入射光の波長は635nmである。それぞれの実験の前に、エタノールと2回蒸留した水でフローセルを洗浄した。厚みが2nmのクロム膜と、厚みが47nmの金膜でBK7ガラスカバースライドVWR48366067をスパッターコーターQuorumEmitechCorporation、K675XD型で連続してコーティングすることによって、SPRセンサーチップを製造した。金基材を脱イオン水、無水エタノールで洗浄し、窒素を吹き、次いで、使用前に水素炎でアニーリングした。1-メルカプトベンズアミドのエタノール溶液を、SPR装置の上に置かれた金の小片にシリアルチャネルモードを用いてオンライン注入することによってベンズアミドの単層を作成した。金表面に分子が結合すると、SPRの信号が増大し、最終的には、定常応答に達し、このことは、単層で最大限覆われたことを示す。4種類の天然に存在するヌクレオシド-5’-モノホスフェートと、ベンズアミド表面との相互作用は、SPR装置のシングルチャネルモードを用いて測定した。注入バルブを介して注入されたサンプル溶液は、ある経路を経由して流れ、PBSバッファpH7.4、10mMホスフェート、150mMNaClは他の経路を経由して流れた。流速60μLmin-1、PBSバッファ中、ヌクレオシドモノホスフェートの濃度が1mMの状態で測定を行った。業者から提供されるソフトウェアでデータ分析を行った。全てのデータセットを単純な1:1相互作用モデルに合わせた。このデータからはKoffが決まらないが、KDの値が非常に大きいこと数mMは、オフ速度が速いことを暗示している。例えば、Kon=106M-1s-1の小さい値であると推定すると、結合状態の寿命は、1mMのKDから、Koff=KDKon=103またはmsのタイムスケールが得られる。図47は、ベンズアミド表面R:2-デオキシリボース5-ホスフェートナトリウム塩、DNA塩基を含まないと相互作用するヌクレオシド-5’-モノホスフェートA、C、G、T、RのSPRセンサーグラムを示す。赤い線は、1:1の結合事象を記述するようにモデリングされ、割り当てられた曲線である。表6は、1:1結合速度論分析から誘導される速度定数および解離定数を示す。表6実施例16:力分光法で結合破壊を読み取る頻度バッファが単独で存在する状態での相互作用を試験した後図48a-1024回の引っ張りのうち、検出された接着事象のみを示す、1μMdAMPを、4-メルカプトベンズアミドで官能基化された電極とともに構成される液体セルに加え、次いで、基材および先端を0.1mMPBで洗浄した数の関数として力曲線をひいた。データは、過剰なdAMPが除去されるにつれて最初は増加し、その後、すすぎを続けるにつれて減少していく図48b~e。特定的には、図48は、adAMPが存在しない状態でひいたコントロール曲線は、ベンズアミド分子との間に接着事象がほとんど示されず、これはおそらく、水によって遮断されているからであろう。dAMPを加えると、多くの接着事象が起こり、過剰量のdAMPが系から洗い流されるにつれて、増大していきb,c、すすぎを続けるにつれて、低下していくd,eことを示している。実施例17:ノイズモデルこの実施例の目的は、塩基を特定するために用いられる信号の可能な起源について概略を説明することである。実施例13に示されるように、トンネル接合部の中で結合した複合体の元々の寿命は長く、数秒間程度である。そのため、電極またはプローブが、1秒あたり数塩基を読み取るように翻訳される場合、塩基は、一般的に、官能基化されている電極に隣接するすべての時間、結合している。msタイムスケールで繰り返される電流スパイクは何に由来するのか。実施例12で与えられるオン時間とオフ時間の分布を用い、オン状態とオフ状態のエネルギーの差を計算してもよい。この値を表5にΔGとして列挙している。これは、300Kで熱エネルギーの一部である単位は300KでkTである。したがって、スパイクは、分子が、別個の熱的に安定な一連の状態の間を飛び跳ねる結果であるはずはない。ここで、本願発明者らは、指数関数的な様式でサンプリングした場合、連続的なブラウン運動が急激であり得る可能性すなわち、指数関数的に距離に感受性である、トンネル現象によってを観察する。このモデルは、電流の対数値の指数関数的な分布の選択が基礎となっていることを注記しておく実施例8の式S1。ブラウン運動は、Gaussianのすなわち、熱的なノイズによって動く1次元のランダムな動きでシュミレーションした。ある位置でのトンネル電流の読み出しの効果シュミレーションするために、この移動を累積した。以下のMatLabプログラムを使用した。可変性の相関関係は、ある工程の所定位置のどれだけ多くが次の工程に保持されるかを記述する。図49~51で、種々の値のパラメータ相関関係のプロットを示す。観察されるノイズに似たノイズスパイクを得るために、1に近い値が必要であった。強度分布は、電流の対数値でGaussianと十分に当てはまりすなわち、式S1、スパイクの間の時間間隔は、指数関数的に割り振られた。図49~51は、相関関係、Cの3つの値について、時間-工程に対し、シュミレーションした移動上側の読み取り、電流下側の読み取りを示している。実施例18:確率の計算図52は、4-メルカプトベンズアミドで官能基化された電極を含むデバイス中、ホモポリマーから得られる信号の正規化された分布を示す。図52Aは、正規化された電流分布に当てはまる左から右へ、1番目のピーク=mC、2番目のピーク=A、3番目のピーク=C。図52Bは、信号のバーストにおいて、測定され、多項式に当てはめられ、正規化されたスパイクの頻度fS-図57を参照を示す線は、約0.2=Aで始まっており、線は約0.65=Cで始まっており、線は約0.4=mCで始まる。分布に対する当てはめを利用し、特定のノイズのバーストがAまたはCに由来する確率を割り当てた平均的な電流および頻度が、交差点よりも上または下にある場合、IACおよびfACと書かれている。CおよびmCの電流分布を分離したクロスオーバー=ImCが、頻度の分布は重なっている。の値を図52aから得た。0.015nA未満では、Cの場合、電流スパイクは本質的に存在しないため、0.015nAよりも小さな平均強度のバーストは、Aの読み取りであると帰属することができる。強度が0.015nAより大きいバーストの場合、本願発明者らは、図52bの正規化された分布から得たの値を使用し、以下の式からAの読み取りの確率を算出し、以下の式から、Cの読み取りの確率を算出する。実施例19:イミダゾール-2-カルボキサミドの合成イミダゾール-2-カルボキサミドを電極に結合させるるのに、ω官能基化された短いアルキルが必要である。種々の45-アルキル化イミダゾールが文献で報告されているか、または市販されているため、イミダゾール環上でアミド化することによってイミダゾール-2-カルボキサミドを合成する一般的な方法が開発された。以下のスキームに描かれているように、45-2-ベンジルチオエチルイミダゾール1aおよびN-[2-4-イミダゾリルエチル]フタルイミド1bをそれぞれアミド化することによって、45-2-チオエチルイミダゾール-2-カルボキサミド5aおよび45-2-アミノエチルイミダゾール-2-カルボキサミド5bを合成した。チオールおよびアミンは、この分子を金属および/または炭素電極に結合させるための固定基として機能する。同じ様式で、45-tert-ブチルジメチルシリルオキシメチルイミダゾール-2-カルボキサミド5cを45-tert-ブチルジメチルシリルオキシメチルイミダゾール1cから合成し、有機溶媒中のNMR研究に用いた以下参照。これらのイミダゾール-2-カルボキサミドを合成する2種類の経路が探求された。イミダゾールの2位をギ酸エステル15またはシアノ基16で置換してもよく、これらは両方とも簡単にアミドに変換することができる。シアノ経路が本願発明者らに最もよい結果を与えることがわかった。第1に、化合物1a、1c、1bを、臭化ベンジルと反応させることによって、1H窒素保護された生成物2a、2b、2cに良好な収率で変換した。NMRによって、生成物はそれぞれ2種類の異性体の混合物であることを確認する。2a、2b、2cを1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムブロミドCAPで処理することによって、2a、2b、2cのイミダゾール環の2位にシアノ基を導入した。CPAは、ジメチルホルムアミドDMF中、0°Cで等量の臭化シアンと4-ジメチルアミノピリジンとを混合することによって、系中で作成した。2.5倍のCAPを用いると最も良い収率が得られた。硫酸20体積およびトリフルオロ酢酸18体積中、加水分解することによって、3a、3b、3cのシアノ基をアミド4a、4b、4cにかなりの収率で変換した。本願発明者らは、過酸化水素存在下、塩基性条件で試験したが、望ましい生成物を得ることはできなかった。液体アンモニア中、ナトリウムを用いて保護基をはずすことによって、最終生成物である5a、5b、5cを得た。tert-ブチルジメチルシリルオキシメチル基が脱保護条件で安定であったことは、特に意味はない。望ましい化合物5cを良好な収率で分離した。実施例20:イミダゾール-2-カルボキシアミドで官能基化された電極を用いてDNAを分析電極を調製し、イミダゾール-2-カルボキシアミドで官能基化した。トンネルギャップを固定した構成にし、6pA、0.5Vのベースライントンネル条件でデオキシ-ヌクレオチドを分析した。コントロール群には、ほぼ信号がみられなかった。図62Aおよび62Bは、mC、A、T、C、Gの電流分布を示す。明らかなように、それぞれのヌクレオチドの電流の特徴は独特であり、したがって、イミダゾール-2-カルボキシアミドの試薬としての有効性を示している。実施例21:イミダゾール-2-カルボキシアミドで官能基化された電極を用いてDNAオリゴマーを分析実施例20の電極を用い、いくつかのホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマーを分析した。片方の電極は、図63に示されるようなギャップが一定の状態で電極表面の上で翻訳するような構成であった。典型的な翻訳速度は、約8.6nm/sであり、DNAが例えばナノ細孔を通って引っ張り出されるようにシュミレーションした。図64は、dCCCCC図64AおよびdAAAAA図64Bの例示的な電流分布を示す。ホモポリマーの連続した読み取り結果を図65~68にまとめておりAAAAA-図65;CCCCC-図66;dmC5-図67;dCCCCC図68、時間sによって電流nAをプロットする。この読み取りは、ホモポリマーについて一貫した信号を示す。ヘテロポリマーの連続した読み取り結果を図70~75にまとめておりACACA-図70;CCACC-図71;CmCCmCC-図72;dACACA-図73;dCmCCmCC-図74;dGTCGTCGTC-図75、時間sによって電流nAをプロットする。この読み取りは、ヘテロポリマーについて一貫した信号を示す。したがって、上の試験は、イミダゾール-2-カルボキシアミドが、オリゴマーを分析するのに有効な試薬であることを確認する。実施例22:4-カルバモイルフェニルジチオカルバメートの合成4-アミノベンズアミド2mmol、272mgのDMF1mL溶液に、NaH鉱物油中60、1.2eq、9.6mgおよびCS21.5eq、181.3uLを以下に示すように0°Cで連続して加えた。0°Cで30分間後、反応混合物を室温まで加温し、84時間撹拌し、次いで、60°Cまで加熱し、4時間撹拌した。室温まで冷却した後、反応混合物をエーテル20mLで希釈し、濾過し、エーテルで洗浄し、黄色がかった粉末183mgを得た収率39。種々の上に開示した特徴および機能または代替物、および他の特徴および機能または代替物は、多くの他の異なるシステムまたは用途に望ましく組み込まれてもよいことが理解されるだろう。さらに、種々の現時点でわかっていないか、または予想されていない代替物、改変、変形または改良は、当業者によって後でなされてもよく、これらも以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。"