"ヒト細胞中のMafAの発現を上方制御することができ、19~25ヌクレオチド長の鎖であって、配列AUCUGUACUGGAUGAGCGG配列番号1またはUUUCCCGCAGGAGAUUGAC配列番号2を含む第1の鎖を含む、短いRNA。前記RNAが、19~25ヌクレオチド長の鎖であって、前記第1の鎖とともに二本鎖を形成する第2の鎖を含む、請求項1に記載の短いRNA。前記RNAのそれぞれの鎖が、その3’末端に、対をなさない1~3のヌクレオチドを持ち、オーバーハングを形成している、請求項2に記載の短いRNA。前記3’オーバーハングが1つまたは複数のウラシルヌクレオチドを含む、請求項3に記載の短いRNA。前記3’オーバーハングが1つまたは複数のウラシルヌクレオチドから成る、請求項3に記載の短いRNA。ヒト細胞によるインスリン産生をインビトロで誘導するための、請求項1~5のいずれか1項に定義された短いRNAの使用。配列AUCUGUACUGGAUGAGCGG配列番号1を含む短いRNAと、配列UUUCCCGCAGGAGAUUGAC配列番号2を含む短いRNAとが組み合わされて用いられる、請求項6に記載の使用。ヒト細胞によるインスリン産生を誘導するインビトロの方法であって、前記細胞を、請求項1~5のいずれか1項に定義された短いRNAに接触させることを含む方法。前記インスリン産生がグルコース反応性である、請求項8に記載の方法。配列AUCUGUACUGGAUGAGCGG配列番号1を含む短いRNAと、配列UUUCCCGCAGGAGAUUGAC配列番号2を含む短いRNAとが組み合わされて用いられる、請求項8または9に記載の方法。前記ヒト細胞が幹細胞、肝臓細胞、または膵臓細胞である、請求項8~10のいずれか1項に記載の方法。請求項1~5のいずれか1項に定義された短いRNAを1つまたは複数含む、エクスビボまたはインビトロのヒト細胞。請求項8~11のいずれか1項に定義された方法によって得ることができる、インスリン産生のために誘導されたエクスビボまたはインビトロのヒト細胞。療法での使用のための、請求項12または13に定義された細胞。糖尿病または病的肥満の治療での使用のための、請求項14に記載の細胞。療法での使用のための、請求項1~5のいずれか1項に定義された短いRNA。糖尿病、脂肪肝、または病的肥満の治療での使用のための、請求項1~5のいずれか1項に定義された短いRNA。請求項12または13に定義された細胞および/または請求項1~5のいずれか1項に定義された短いRNAの薬学的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、糖尿病または病的肥満を治療する方法。請求項1~5のいずれか1項に定義された短いRNA、および/または請求項12または13に定義された細胞、ならびに薬学的に許容し得る希釈剤、担体、または賦形剤を含む、医薬組成物。iヒト細胞中のMafAの発現を上方制御することができ、19~25ヌクレオチド長の鎖であって、配列AUCUGUACUGGAUGAGCGG配列番号1を含む第1の鎖を含む、短いRNA、およびiiヒト細胞中のMafAの発現を上方制御することができ、19~25ヌクレオチド長の鎖であって、配列UUUCCCGCAGGAGAUUGAC配列番号2を含む第1の鎖を含む、短いRNAを含む、キット。本発明者は思いがけなく、短いRNA分子を用いてMafAを上方制御することによって細胞のインスリン産生を誘導し得ることを見出した。本発明者は、MafA遺伝子の上方制御を達成してインスリン産生細胞を生み出し、従来技術の方法に付随する問題を克服する新たな短いRNAsaRNAを開発した。特に、本発明の分子は、宿主細胞のゲノムに取り込まれる可能性のある遺伝要素の投与にはつきものの、安全上の懸念を生じさせない。本発明者は、好適なRNA標的転写物を同定し、これらの短いRNA分子を設計するために有利な方法/アルゴリズムを用いた。このため、本発明者は、MafAの発現を調節するために宿主細胞のRNA転写物を標的とする新規の短いRNA分子を提供した。本発明の短いRNAは、従来技術の発現ベクターより小さい分子であり、そのため侵襲性が低い。本発明の分子が宿主自身の制御系を用いて遺伝子を制御することは、遺伝子の追加の複製を宿主に導入することほど侵襲的ではない可能性がある。本発明の短いRNAは、mRNAとMafAのタンパク質レベルとを上方制御することができ、これが下流の標的の上方制御につながる。本発明の短いRNAは、本明細書において特殊化誘導RNAとも呼ばれる。本発明のMafA活性化RNAは、再生医療に用いるインスリン産生細胞を作り出すための有効、非侵襲的、かつ安全な代替手段である。本発明のおもな利点は、これが遺伝子を活性化する小分子RNAの一過性の適用に関するものであり、その影響もまた一過性だということである。このことは、刺激に反応することができ、特にグルコースに反応してインスリンを産生することができる誘導細胞つまり、本明細書が開示する方法を用いて特殊化するように誘導された細胞の作製を可能にする。したがって、本発明の一態様では、細胞のMafAを上方制御することができる短いRNAが提供され、ここで前記短いRNAは、19~25ヌクレオチド長の第1の鎖であって、AUCUGUACUGGAUGAGCGG配列番号1またはUUUCCCGCAGGAGAUUGAC配列番号2の配列を含む第1の鎖を含む。好ましくは、前記RNAは、19~25ヌクレオチド長の第2の鎖であって、前記第1の鎖と共に二本鎖を形成する第2の差を含む。好ましくは、前記RNAのそれぞれの鎖は、その3‘末端に1~3個の対をなさないヌクレオチドを持ち、オーバーハングを形成する。好ましくは、前記3’のオーバーハングは、1つまたは複数のウラシルヌクレオチドを含むか、またはそれから成る。一実施形態では、前記短いRNAは、配列番号1を含むかまたはそれから成る第1の鎖と、配列番号2を含むかまたはそれから成る第2の鎖を含むかまたはそれから成る第2の鎖を含む。別の実施形態では、前記短いRNAは、配列番号3を含むかまたはそれから成る第1の鎖と、配列番号4を含むかまたはそれから成る第2の鎖を含む。さらなる態様では、本発明は、本明細書に定義される短いRNAの、細胞によるインスリン産生を誘導するための使用を提供する。この使用は、インビトロでもインビボでもよい。好ましくは、本明細書に開示される使用および方法では、AUCUGUACUGGAUGAGCGG配列番号1の配列を含む短いRNAと、UUUCCCGCAGGAGAUUGAC配列番号2の配列を含む短いRNAとが組み合わせて用いられる。さらなる態様では、本発明は、細胞によるインスリンの産生を誘導する方法を提供し、前記方法は、本明細書に定義される短いRNAに前記細胞を接触させることを含む。この方法は、インビボでもインビトロでもエクスビボでもよい。好ましくは、本明細書に開示される使用および方法では、前記インスリン産生はグルコース反応性である。さらなる態様では、本発明は、本明細書に定義される短いRNAを1つまたは複数含むエクスビボまたはインビトロの細胞を提供する。さらに、本発明は、本明細書に定義される方法によって得ることのできるインスリンを産生するために誘導されるエクスビボまたはインビトロの細胞を提供する。インスリン産生を誘導することには、分化、すなわち特定の膵臓の細胞系へと細胞を推し進め、細胞の可能性を減少させること、が伴い得る。したがって、多分化能multipotentまたは多能性pluripotent細胞は、特定の細胞系の特殊化した細胞、例えばβ細胞へと分化するために誘導され得る。インスリン産生を誘導することには分化転換が伴い得る、すなわち、特定の細胞系統の細胞が誘導されて、異なる細胞系統に特徴的な特有の機能を身に付け得る。例えば、上皮細胞、肝細胞など肝臓の細胞、または繊維芽細胞などの分化した細胞が誘導されて、インスリンなど別の細胞型の特徴を持つ標的タンパク質を産生することもあり得る。あるいは、インスリン産生の誘導によって、細胞が特殊化した特性を身に付けるように誘導され、その一方で多能性pluripotentまたは多分化能multipotentの表現型を保持することもあり得る。したがって、幹細胞にインスリンの産生を誘導することによって、インスリン産生能のある膵臓β細胞の作製に至る可能性もあるが、また、インスリン産生能のある多能性細胞か、または肝細胞などの非膵臓の体細胞でインスリン産生能のあるものが生じる可能性もある。本明細書に開示された方法で産生される特殊化した、すなわちインスリンを産生する細胞は、インスリンの産生を誘導することによって作られたため、誘導細胞と呼ばれる。本発明の方法では、標的遺伝子MafAの上方制御は間接的にインスリンの産生に影響を及ぼす可能性がある。MafAは、インスリンの産生を直ちにまたは最終的に制御する間接的影響。産生の制御は、とりわけ標的タンパク質インスリンをコードする遺伝子の転写の活性化を伴い得る。またMafAは、この事象の連鎖を調節することによって、標的タンパク質インスリンの産生にも影響を及ぼす可能性があるが、これは下流制御と呼ばれる。下流制御は、標的タンパク質インスリンを制御し得る第2の遺伝子を調節する標的遺伝子MafAの短いRNAを用いることによる上方制御を伴い得るか、または第2の遺伝子が第3の遺伝子を調節し得、そしてこの連鎖が最終的に、標的タンパク質インスリンの産生をもたらす。インスリンの産生に影響間接的影響を及ぼす遺伝子としては、PDX1、ニューロゲニン3Ngn3、Rfx6、MafA、Hlxb9.Hnf6、Ptf1a、NeuroD、ベータセルリンおよびNkx6-1が挙げられる。本発明の方法のいずれかにおいて、2つまたはそれ以上の異なるsaRNA分子を一緒に用いることができる。これらが同じ標的RNA転写物を下方制御するか、またはそれぞれのsaRNA分子が異なるRNA転写物を下方制御し得る。本発明者は、誘導細胞によってインスリンの発現を達成しただけではない。実施例に明らかにされている通り、本発明者の方法はインスリンの分泌ももたらすが、多くの応用ではこれが望ましい。細胞がインスリンのインビトロ産生に向けられたものである場合は、インスリンの分泌が時間のかかるインスリン抽出手順を回避する。細胞が移植のためのものである場合、または方法がインビボで用いられる場合は、誘導細胞がインスリンを分泌できることがきわめて重要である。また本発明の方法は、グルコース反応性の方法でインスリン産生を実現する。実施例に明らかにされている通り、誘導細胞はグルコース存在下の方が、グルコース不在下よりもインスリン産生量が著しく多い。このことは明らかに、インビボの応用にきわめて有利である。我々が知る限り、細胞を誘導してグルコース反応性の方法でインスリンを分泌する方法に関する報告はこれが最初のものである。理論に拘泥するつもりはないが、グルコース反応性の方法によるインスリンの産生および分泌は、saRNA技術の使用、特にMafAを上方制御するためのsaRNA技術の使用によって達成されると考えられている。本発明の方法/使用は、好ましくは、グルコース反応性の方法でインスリンを産生する/産生する能力のある細胞を作り出す。グルコース反応性という表現は当技術分野で周知であり、グルコース反応性とは、グルコース存在下ではインスリンの産生および/または分泌がグルコース不在下よりも多いという意味であることを、当業者は認識している。少なくともインビボの状況では、グルコースの存在とは生理学的に有意なグルコース濃度を意味し、グルコースの不在とは生理学的に有意であるには低すぎるグルコース濃度、ならびにグルコースの完全な不在を意味することを理解しなければならない。好ましくは、グルコース反応性の細胞は、グルコース存在下ではグルコース不在下よりも、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、95、または100多いインスリンを産生する。好ましくは、インスリン産生はグルコース濃度と正に相関する。すなわち、細胞が高いグルコース濃度に暴露された場合は、低いグルコース濃度に暴露された場合よりも多量のインスリンを産生する。好ましくは、細胞外環境でグルコース濃度が上昇すると、同時にインスリン産生の上昇がもたらされる。好ましくは、細胞は、健康な膵臓β細胞のものと類似のグルコース反応性を示す。したがって、好ましくは、細胞はグルコース反応性の方法で誘導されてインスリンを産生する。また好ましくは、細胞は、インスリンの分泌のために誘導される。インスリン産生は、免疫蛍光検査法、ELISAまたはウェスタンブロット法などの標準のプロトコルを用いて分析する。実施例に適切なアッセイを記載した。例えば、サンプルを抗インスリン抗体と接触させ、標識された二次抗体を用いて結合した抗体を検出することもできる。またインスリン産生もRNAレベルで、例えば逆転写酵素PCR、好ましくは反定量または定量PCRを用いて分析することもできる。当業者は、インスリン分泌の分析にELISAを用い得ることを承知している。グルコースに暴露された細胞とグルコースに暴露されない細胞のインスリン産生を比較することによって、グルコース反応性を決定することもきる。本発明の方法は、全能細胞、多能性細胞pluripotentcell、多分化能細胞multipotentcellまたは体細胞を用いて実施することができ、すなわち、このような細胞のいずれかを開始細胞として用いることができ、これがインスリン産生に特殊化するよう誘導される。本明細書に開示された方法は、開始細胞から特殊化したインスリン産生細胞を作り出す。このような方法によって作り出される特殊化した細胞は、少なくとも標的タンパク質インスリンの発現において開始細胞とは異なる。好適な開始細胞については、以下にさらに詳細に検討する。全能細胞は、ある生命体に認められるあらゆる細胞型に分化し、その生命体全体を形成する能力を持つ。多能性細胞は、内胚葉胃内部の内層、胃腸管、肺、中胚葉筋肉、骨、血液、尿生殖器、または外胚葉上皮組織および神経系の3種の胚葉のいずれにも分化する能力を持つ細胞である。分化能は、細胞が種類の異なる細胞へと分化し得る範囲である。多能性細胞は、多分化能細胞より大きい分化能を持つ。細胞集団の内部で、個々の細胞は様々な分化能を持ち得る。多分化能細胞の集団は、時間が経つと、体細胞へと分化した一部の細胞と、分化せずに依然として多分化能のままで残る一部の細胞とを含み得る。多能性細胞の集団も同じく、時間が経つと、多分化能細胞と体細胞、そして多能性細胞を含み得る。したがって、本発明の方法は、全能細胞、多能性細胞、多分化能細胞、または体細胞に関して用い得る。細胞は成熟細胞、または、例えば成熟幹細胞、胚幹細胞、または癌由来幹細胞などの胚細胞であり得るが、成熟幹細胞が好ましい。細胞は、好ましくはヒト細胞である。多能性細胞は、人工多能性幹細胞inducedpluripotentstemcelliPSCまたはiPS細胞と略される、即ち、通常は成体の体細胞である非多能性の細胞から、特定の遺伝子の強制的な発現を誘導することによって人工的に誘導される多能性幹細胞、の一種であり得る。国際公開第2005/059113号は、特に有利な種類の多能性幹細胞を開示している。この幹細胞は、骨髄および/もしくは末梢血などの血液から、または臍帯もしくは胎盤から採取された材料から直接単離することが可能であり、外胚葉細胞、中胚葉細胞、および内胚葉細胞へと分化する特有の能力を持つ。そのため、この細胞は、全能ではないとしても明らかに多分化能または多能性である。したがって、WO第2005/059113号に開示された幹細胞は、自己移植自己由来の方法で用い得る組織移植用細胞の有用な供給源を提供する。国際公開第2005/059113号に開示された細胞は、当技術分野ではOmniCyteとして公知である。国際公開第2005/059113号の教示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。OmniCyteは自己再生することができ、造血細胞を含めて、外胚葉、中胚葉、および内胚葉細胞へと分化することが可能なCD34である幹細胞である。上に述べた通り、この細胞は骨髄および/または血液から直接単離することが可能である。さらに、培養中にプラスチック例えば、標準の組織培養器に付着するその能力を特徴とする。好適な培養器は、CorningIncorporated,NewYork,USAによって製造されたものである。OmniCyteはさらに、支持細胞層、つまり幹細胞の成長を支持する細胞通常は、自分でさらに成長または分裂することなく重要なメタボライトを供給するガンマ線照射によって不活化されているを必要とすることを特徴とする。OmniCyteはさらに、aCD34細胞のための組織または血液サンプルを濃縮すること、bサンプルを担体に接触させ、前記担体に付着する細胞を採取すること、によって得られることを特徴とする。好適な組織または血液のサンプルとしては、骨髄、末梢血、臍帯血または組織、胎盤、および脂肪吸引によって得られるサンプルが挙げられる。さらに具体的には、組織または血液サンプル好ましくは、血液または骨髄サンプルのような造血組織を密度勾配分離法にかけ、低密度の細胞をCD34に対する親和性リガンド好ましくは、常磁性粒子に付着しているに暴露し、前記CD34リガンドに付着した細胞を回収し、CD34の分集団を組織培養級のプラスチックに暴露し、かつプラスチックに付着したCD34細胞を回収することによって得ることができる。Omnicyteは、好ましくは成熟しており、それゆえ非胎児性である。2004年9月24日に、OmniCyteのサンプルを、寄託番号04092401の下にPortonDown,Salisbury,SP40JGのECACCに寄託した。寄託は、WillowTreeCottage,SpinningWheelLane,Binfield,BerkshireRG425QH,GreatBritainのMyrtleGordon教授によって行われ、細胞株は幹細胞OmniCyteと名付けられた。本発明の方法は、好ましくは、OmniCyte、造血幹細胞HSC、および間葉系幹細胞MSCから選択された細胞に対して実施され、OmniCyteが特に好ましい。多分化能細胞は、複数ではあるが限られた数の系統から細胞を生じさせる能力を持つ。多分化能細胞の一例は、数種類の血液細胞へと発達することができるが、脳細胞または他の種類の細胞に発達することはできない血液幹細胞である、造血細胞である。間葉幹細胞、またはMSCは、骨芽細胞骨細胞、軟骨細胞軟骨の細胞、および含脂肪細胞脂肪細胞をはじめとする種々の細胞型へと発達することのできる多分化能幹細胞である。体細胞は、生殖系列細胞配偶子、配偶子を生み出す細胞生殖母細胞、多分化能細胞および多能性細胞以外で生命体の体を形成する任意の種類の細胞である。体細胞は任意の動物から誘導することができるが、好ましくは哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。好適な例としては、肝細胞などの肝臓の細胞、β細胞などの膵臓細胞、上皮細胞、および繊維芽細胞が挙げられるが、肝細胞および膵細胞が好ましい。本発明の方法が、本発明の短いRNAと接触する細胞母集団の細胞のすべてには誘導を達成し得ず、また実際達成する必要のないことを、十分理解しなければならない。したがって、本発明の方法に供された、すなわち本発明の短いRNAに接触した細胞母集団の中から、好ましくは、少なくとも10、20、30、35、38、40、42、または45、例えば約25~55、30~50、35~45が、インスリンを産生するよう誘導され得るが、一部の実施形態では、少なくとも50、60、70、80、または90がインスリンを産生するよう誘導される。本明細書で用いる場合、用語RNAは、少なくとも1つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。リボヌクレオチドが意味するのは、β-D-リボ-フラノース部分の2‘位にヒドロキシル基を持つヌクレオチドである。これらの用語には、二本鎖RNA、一本鎖RNA、部分精製されたRNAなどの単離されたRNA、基本的に純粋なRNA,合成RNA、組み換え技術によって作られたRNA、ならびに、1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および/または変更によって天然のRNAとは異なる変更されたRNAが含まれる。このような変更には、RNAの末端や内部、例えばRNAの1つまたは複数のヌクレオチドなど、への非ヌクレオチド材料の付加が含まれ得る。また本発明のRNA分子のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなど、非鎖状のヌクレオチドをも含み得る。このような変更されたRNAは、類似体、または天然RNAの類似体と称される。用語二本鎖RNAまたはdsRNAは、本明細書で用いられる場合、二本鎖リボ核酸を指し、内因性および人工のsiRNA、ショートヘアピンRNAshRNA、およびマイクロRNAmiRNAを含むが、これらに限定はされない。用語短い干渉RNAまたはsiRNAは、本明細書に用いられる場合、1つまたは複数の標的RNA転写物の配列特異的な媒介開裂により、RNAiを介して遺伝子発現を調節することが可能な核酸分子を指す。RNAiの場合は通常、RNA転写物はmRNAであり、そのためこの標的の開裂は遺伝子発現の下方制御をもたらす。しかしながら本発明では、標的遺伝子の上方制御または下方制御は、関心の標的遺伝子に対してそれぞれアンチセンスまたはセンスであるRNA転写物の開裂によって達成される。siRNAは、19~25塩基対長の二本鎖RNA分子であり、いくつかの対をなさない塩基が各3‘末端にあって、3’オーバーハングを形成している。好ましくは、3‘オーバーハングはそれぞれ1~3ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは2である。siRNAは、標的RNA転写物の一領域に対して完全またはほぼ完全に相補性の配列を持つ1つの鎖を含有する。RNA誘導型サイレンシング複合体RISCとして公知のタンパク質が、siRNAのこの鎖ガイド鎖を組込み、標的RNA転写物を認識するためのテンプレートとして用いている。RISCは次に、組み込まれた鎖と完全またはほぼ完全な相補性を持つ標的RNA転写物の開裂に関与する。標的RNA転写物の一領域に対して相補性を持たないsiRNA分子の他方の鎖は、パッセンジャー鎖と名付けられている。一本鎖または二本鎖のRNA分子は、siRNA分子ではないものの、自らと完全またはほぼ完全な相補性を持つ標的RNA転写物をRISC関連の開裂によって下方制御することができ、siRNAに似た活性を有すると言われる。本発明の短いRNA分子は、この活性を有する。相補性および相補的とは、第1の核酸が第2の核酸と、例えば非ワトソン-クリック塩基対形成を介して、水素結合を形成し得ることを意味する。非ワトソン-クリック塩基対形成を介して別の核酸と水素結合を形成することができる核酸も、相補性を持つという定義に該当する。相補性パーセントとは、第2の核酸配列と水素結合例えば、ワトソン-クリック塩基対形成を形成し得る核酸分子中の残基の割合を表す例えば、10中の5、6、7、8、9、10は、50、60、70、80、90、100である。完全に相補的または完全な相補性とは、第1の核酸配列のすべての連続する残基が、第2の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合を形成する状態を意味する。ほぼ完全な相補性とは、第1の核酸配列の基本的にすべての連続する残基が、第2の核酸配列の同じ数の連続する残基と水素結合を形成する状態を意味するが、第1の核酸が、生体分子の使用を伴う転写または分子の生物学的プロセスなどの不完全なプロセスで調製されるという事実により、第1の配列は第2の配列と100相補的ではない可能性も考えられる。しかしながら、第2の配列の対応する残基と水素結合を形成することができない第1の配列の残基の数が十分少ないため、2つの核酸配列は依然として、所望の目的に必要とされる限り、水素結合で結合される。一般的に、ほぼ完全な相補性とは、第1の核酸配列が第2の核酸配列に対して、少なくとも95の相補性を持つことを意味する。同一性、同一のまたは配列同一性とは、第1の核酸の配列が第2の核酸配列と同一であることを意味する。同一性パーセントは、第1の核酸分子の中の第2の核酸配列と同一の残基の割合を表す例えば、10中の5、6、7、8、9、10は、50、60、70、80、90、および100同一である。完全な同一性または完全に同一とは、第1の核酸配列のすべての連続する残基が、第2の核酸配列中の連続する同数の残基と同一であることを意味する。ほぼ完全な同一性とは、第1の核酸配列の基本的にすべての連続する残基が、第2の核酸配列中の連続する同数の残基と同一であることを意味するが、第1の核酸が、生体分子の使用を伴う転写または分子生物学的プロセスなどの不完全なプロセスによって調製されるということから、第1の配列は第2の配列と100同一ではない可能性もある。しかしながら、第2の配列の対応する残基と同一ではない第1の配列の同数の残基の数が十分少ないため、2つの核酸配列は依然として、所定の目的に対して十分に同一である。一般的に、ほぼ完全な同一性とは、第1の核酸配列が第2の核酸配列と、少なくとも95同一であることを意味する。本明細書で使用される配列の相補性または同一性へのあらゆる言及は、特に別の記載がない限り、本短いRNAの全長を指す。短いRNAは、標的RNA転写物に対して相補性ではないきわめて短い3‘または5’配列を含み得る。好ましくは、このような配列は3‘である。前記配列は、1~5ヌクレオチド長、好ましくは2~3、例えば2または3である。前記配列は、好ましくはウラシルを含むか、またはウラシルから成り、そのため最も好ましくは2または3ウラシルの3’ストレッチである。。この非相補的配列は、テイルと呼ぶこともできる。したがって、短いRNAは、好ましくは、i標的RNAの一領域と95の相補性を持つ配列、およびii好ましくは、ウラシル残基を含むか、またはこの残基から成る1~5ヌクレオチドの3’テイル、から成る。したがって、短いRNAは、一般にその長さ全体にわたり、標的RNA転写物の3‘テイルこれが存在する場合以外の一領域と相補性がある。本明細書に開示される短いRNA配列のいずれもが、任意でこのような3‘テイルを含み得る。したがって、表に開示された配列のいずれもが、任意でこのような3’テイルを含み得る。配列アラインメントおよび同一性パーセントまたは相補性パーセントの計算は、LASARGENEバイオインフォマティクス計算パッケージbioinformaticscomputingsuiteDNASTARInc.,Madison,WIのMegalignプログラム、ClustalVアラインメント法HigginsandSharp1989CABIOS5:151-153、およびBLAST2.0プログラムパッケージ、を含むがこれらに限定はされない当分野で公知の任意の方法またはツールを用いて決定し得る。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、例えば全米バイオテクノロジー情報センターを通じて、公的に入手可能である。当業者は、その所望の目的に適うようにこれらのツールのパラメーターを設定することができよう。一方の配列がDNA配列であり、他方がRNA配列である第1および第2の核酸配列の同一性または相補性を評価するにあたっては、RNA配列がウラシルを含むのに対して、DNA配列はその代わりにチミンを含むことを念頭に置かなければならない。したがって、このような場合に、配列同一性を評価する際にはウラシル残基はチミン残基と同一とみなされ、また相補性を評価する際にはウラシル残基はアデニン残基と相補性である/水素結合を形成する能力がある、とみなされる。遺伝子の阻害または下方制御とは、遺伝子複数可の発現レベルの低下、または遺伝子によってコードされたポリペプチド複数可もしくはその活性のレベルの低下、または、本発明の短いRNA分子の不在下で観察されたものより低い、遺伝子から転写されたRNA分子複数可のレベルの低下を意味する。あるRNA分子が下方制御されているとされる場合は、そのRNA分子のレベルが、本発明の短いRNA分子の不在下で観察されたものより低下することを意味する。遺伝子の活性化もしくは上方制御とは、遺伝子複数可の発現レベル、または遺伝子に制御されるポリペプチド複数可もしくはその活性のレベル、または、本発明の短いRNA分子の不在下で観察されるものより高いレベルであって、遺伝子から転写されたRNA分子複数可のレベル、の上昇を意味する。好ましくは、本発明の方法のすべてがインビトロまたはエクスビボで実施されるが、ほかにインビボの方法も企図されている。したがって、前もって対象から単離されている細胞または組織サンプルに対して実施され得る。好ましくは、上記方法に用いられるこの短いRNA分子は13~30ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは16~25ヌクレオチド長であり、さらに一層好ましくは17~21ヌクレオチド長であり、最も好ましくは19、20、21、22、23ヌクレオチド長である。この短いRNA分子は一本鎖であるか、または好ましくは、二本鎖であり得る。二本鎖の場合は、好ましくは二本鎖のうちの各鎖が少なくとも14、さらに好ましくは少なくとも18、例えば19ヌクレオチド長である。好ましくは、二本鎖は少なくとも12、さらに好ましくは少なくとも15、さらに好ましくは17、さらに一層好ましくは少なくとも19ヌクレオチドの長さにわたってハイブリダイズされる。各鎖はきっちり19ヌクレオチド長、または19ヌクレオチド3‘テイルであり、20、21、22、23、又は25ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、二本鎖の長さは30ヌクレオチド未満であるが、それは、これを超える長さの二本鎖であれば、インターフェロン応答を誘発するリスクが高まり得るからである。二本鎖のdsRNAを形成する鎖は、長さが同等でも不等でもあり得る。最も好ましくは、短いRNA分子は短い干渉RNAsiRNA分子である。任意で、短いRNA分子は、塩基対が安定に形成された2本の鎖から成り、それぞれの鎖の3‘末端には対をなさないヌクレオチドがいくつも付いて3’オーバーハングを形成しているdsRNA分子である。各鎖の3‘オーバーハングを形成しているヌクレオチドの数は、好ましくは1~5ヌクレオチドの範囲であり、さらに好ましくは1~3ヌクレオチド、最も好ましくは2ヌクレオチドである。この3’オーバーハングは、上述の3‘テイルで形成されてもよく、そのため3’テイルが3‘オーバーハングであり得る。短いRNA分子は、標的RNA転写物を有効かつ特異的に下方制御しなければならない。上述のように、これは標的RNA転写物との高度な相補性を持つ短いRNAによって達成することができる。短いRNAは、標的RNA転写物とのミスマッチが5以下、好ましくは4または3以下、さらに好ましくは2以下、さらに一層好ましくは1以下であり、最も好ましくはミスマッチがない。2つまたはそれ以上の配列の相補性の程度の決定は、当分野で公知のいずれかの方法により実施することができる。好ましくは、使用する方法は、Hossbachetal.前掲に提示されたものである。この方法に従ってhttpwwwmpibpcmpgdegroupsluehrmannsiRNAでアクセス可能なPerlスクリプトを用いる。加えて、短いRNA分子の設計および分析のためのさまざまなツールが公知であり、このことは、当業者が標的RNA転写物の有効かつ特異的な下方制御を成し遂げることを可能にする。確立された方法としては、例えばGPboostアルゴリズムおよびReynoldsアルゴリズムPMIDs:15201190、14758366が挙げられる。さらに、標的RNAの有効な下方制御をもたらす短いRNAの能力は、細胞中のRNAまたはタンパク質レベルの測定のための標準技術を用いて評価することができる。例えば、本発明の短いRNAを培養細胞に送達し、ノーザンブロット法もしくはドットブロット法を含むがこれに限定はされない技術を用いて、または定量RT-PCRを用いて、標的RNAのレベルを測定することができる。好ましくは、この短いRNAは、aaaa、cccc、gggg、またはuuuuのうちのいずれのモチーフも保有していない。好ましくは、短いRNAは、少なくとも20、かつ75以下、すなわち20と75との間、好ましくは20~55のGCパーセンテージを持っている。上記方法の短いRNAは、理想的には熱力学的に安定な二本鎖であり、その場合は、それぞれの鎖のGCパーセンテージは少なくとも25、かつ75以下、即ち25~75、好ましくは20~55である。RNAが、aaaa、cccc、gggg、またはuuuuのモチーフを保有しているかどうかを判定するため、および分子/鎖のGC含有率を判定するためのアルゴリズムは、当業者には周知である。そのようなツールには、SaetromandSnove,2004BiochemBiophysResCommun321:247-253andVentetal.,2006BMCBioinformatics7:52017pagesに記載され、参照されるものがある。短いRNAは、RISCタンパク質複合体に組み込まれる短いRNA鎖に対するミスマッチの数が少ない非標的転写物の下方制御を誘導することができる。これは短いRNA分子の効率性を低下させるため、望ましくない。その結果として、意図しない的外れの効果を防止するため、短いRNA分子は、目的とする標的以外の転写物に対して限られた相補性を持つはずである。短いRNAの候補が開裂に基づく的外れの効果をもつ可能性は、非標的RNA配列に対するその相補性の関数であり、当分野の任意の公知の方法で判定することができる。任意で、ungappedSmith-WatermanmethodTFSmithMSWaterman1981Journalofmolecularbiology147:195-197を用いて、短いRNAの候補をEnsemblFlicek,P.,etal.2008Ensembl2008.NucleicAcidsRes36:D707-714ヒトトランスクリトームデータベースSnove,O.,Jr.,etal.2004Biochem.Biophys.ResCommun325:769-733に対してスクリーニングし、短いRNAの潜在的な的外れ転写物を特定することができる。あるいは、短いRNAを、選択されたRNA配列の母集団、例えばヒトのトランスクリプトームのデータベース全体を包含しない選択されたGenBank配列に対して、スクリーニングすることもできる。あるいは、ハミング距離の尺度を用いることもできる。好ましくは、短いRNA分子は、特定された的外れ転写物に対して2つを超えるミスマッチを持つ。あるいは別の視点から見ると、好ましくは、短いRNA分子はすべての潜在的な的外れ転写物に対して、2以上のハミング距離を持つ。短いRNAが二本鎖の場合は、好ましくは両方の鎖がこの要件を満たす。任意で、短いRNA分子は、公知のきわめて有効な標準siRNAと共通の特徴を持つ。好ましくは、短いRNA、または二重鎖であれば短いRNAの一方または両方の鎖は、0.1を超えるGPboostスコアを持つ。GPboostはsiRNAの有効性に対する遺伝子プログラミングによる公知の予測システムであり、siRNA鎖のGPboostスコアの決定に用いられる方法は、PredictingtheefficacyofshortoligonucleotidesinantisenseandRNAiexperimentswithboostedgeneticprogramming,PalSaetrom2004Bioinformatics2017:3055-3063に開示されており、その内容が参照することにより本明細書に組み込まれる。あるいは、または加えて、短いRNA分子は、きわめて有効なsiRNAに付随する特有な配列の特徴を有している。Reynoldsによって記載され、参照によって本明細書に組み込まれるアルゴリズム{Reynoldsetal.2004NatureBiotechnology223:326-330}は、短いRNAがこの種の特徴を十分に持っているかどうかという判定を可能にする。当業者であれば、その特定の目的に対するその閾値を定義し、精緻化することができるであろう。任意で、短いRNA分子は、きわめて有効なsiRNAに付随する位置特異的配列モチーフを含有する。siRNA有効性予測アルゴリズムは当技術分野で周知であり、きわめて有効なsiRNAに付随するモチーフは、参照によって本明細書にその内容が組み込まれるSaetromandSnove,2004BiochemBiophysResCommun321:247-253において検討されている。好ましくは、短いRNA分子は、細胞のRNAi機構に直接入ることができるか、または細胞のRNAi機構に入る前に、Dicerによるプロセシングが可能である。短いRNAが細胞のRNAi機構に入る前に、ダイサーによるプロセシングが可能であるかどうかを判定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Tiemannetal.2010RNA166:1275-1284、およびRoseetal.2005NucleicAcidResearch33:134140-4156に開示されているようなインビトロのダイサーアッセイが挙げられる。短いRNA分子が二本鎖の場合に、分子内の1本の鎖だけが標的RNA転写物を有効かつ特異的に下方制御することができる場合は、好ましくは、その鎖は選択的にRISC内へと取り込まれる。1本の鎖だけが選択的にRISC内へと取り込まれる二本鎖RNA分子の設計は、当業者の能力の範囲内である。例えば、標的RNA転写物を標的とする短いRNA分子の当該鎖の5’末端を、他方の鎖の5’末端ほど熱力学的に安定ではないように作製または選択することができる。好ましくは、二本鎖の熱力学的な末端安定性には大きな差があるため、標的RNA転写物を標的とする短いRNA分子の鎖の5‘末端は他方の鎖の5’末端ほど熱力学的に安定ではない。二本鎖の熱力学的な末端安定性ΔΔGの絶対値の差は、当分野で標準の任意の方法に従って計算することができる。任意で、二本鎖の熱力学的な末端安定性の差の絶対値は、RNAfoldHofackeretal.,2003NucleicAcidsResearchVol.31,No.13,pp3429-3431を用いて、二本鎖の末端の5つの終結ヌクレオチドを検討することによって計算することができる。好ましくは、RNAfoldで計算された二本鎖の熱力学的な末端安定性の差の絶対値は、0kcal/mol超、さらに好ましくは1kcal/mol超、さらに好ましくは3kcal/mol超である。例えば上に記載されたもののような短いRNAの設計に向けた多くの標準的なツールが、分子のこの特性を評価する手段を提供する。例えば、二本鎖分子の熱力学的な性質が一方の鎖のRNAi機構への組み込みを他方の鎖の組み込みより好むようであれば、二本鎖分子を選択することができる。あるいは、一方の鎖の選択的な取り込みは、1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および/または変更によって天然RNAとは異なるものとなったRNAを含有するdsRNAを用いることにより、達成することができる。このような修飾は当業者には周知であり、以下に詳細に論ずる。ダイサーはリボヌクレアーゼタンパク質であり、外因性のdsRNAを開裂して、19~25塩基対から成り、各3‘末端では対をなさないいくつかの塩基が3’オーバーハングを形成する二本鎖の断片にする。上記の方法に用いられる短いRNAは、ダイサー基質siRNAD-siRNAであってよい。ダイサー基質として設計されたsiRNAは、標準の長さのsiRNAおよびshRNAより高い効力を持つことができる。D-siRNAは、左右非対称の二本鎖siRNAであり、その鎖は22~30ヌクレオチド長である。一般に、一方の鎖パッセンジャー鎖は22~28ヌクレオチド長、好ましくは25ヌクレオチド長であり、かつ他方の鎖ガイド鎖は24~30ヌクレオチド長、好ましくは27ヌクレオチド長であり、パッセンジャー鎖の3‘末端の二本鎖は平滑末端であり、ガイド鎖の3’末端にはオーバーハングが付いている。オーバーハングは1~3ヌクレオチド長、好ましくは2ヌクレオチドである。パッセンジャー鎖もまた5‘リン酸塩を含有する。D-siRNAでは一般に、パッセンジャー鎖の3’末端の2つのヌクレオチドがリボ核酸RNAではなく、むしろデオキシリボ核酸DNAである。DNAおよび平滑末端二本鎖によって、酵素ダイサーが二本鎖をプロセシングし、元のD-siRNAのパッセンジャー鎖とガイド鎖の5‘および3’末端のそれぞれ21ヌクレオチドから成る21マー二本鎖にすることが確保される。オーバーハングは、1~3ヌクレオチド長、好ましくは2ヌクレオチドである。またパッセンジャー鎖は5‘リン酸塩も含有し得る。D-siRNAでは一般に、パッセンジャー鎖の3’末端の2つのヌクレオチドがリボ核酸RNAではなく、むしろデオキシリボ核酸DNAである。DNAおよび平滑末端二本鎖によって、酵素ダイマーが二本鎖をプロセシングし、元のD-siRNAのパッセンジャー鎖およびガイド鎖の5‘および3’末端のそれぞれ21ヌクレオチドから成る21マー二本鎖にすることが確保される。標準の19マーsiRNA分子をD-siRNAへと拡張する方法は当技術分野で周知であり、例えば、Hefneretal.2008J.Biomol.Tech.194:2231-237に記載されている。27マー/25マーのD-siRNAに拡張されると、多くのsiRNA分子は、パッセンジャー鎖の3’末端の対をなさない塩基の予測された数がガイド鎖の5’末端の対をなさない塩基の予測された数より少ないか、または同等である末端構造を持つようになる。公知のmiRNAの構造およびダイサーPAZドメインの結合要件に基づけば、この構造はダイサーのプロセシングにとって最適以下となる可能性がきわめて高く、そのため、このような二本鎖はsiRNAとしては有用でも、ダイサー基質siRNA分子に拡張されるとそれほど有用ではなくなる。したがって、好ましくは、本発明の短いRNAはそのような構造を有さず、それよりむしろ、パッセンジャー鎖の3’末端の対をなさない塩基の予測された数が、ガイド鎖の5’末端の対をなさない塩基の予測された数より多い。任意で、上記の方法に用いられる短いRNA分子は、修飾、すなわち、1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および/または変更によって、天然のRNAとは異なるものとなったRNAを含み得る。例えば、短いRNAが二本鎖である場合、dsRNA分子の二本の鎖は化学結合基などの結合成分またはオリゴヌクレオチドのリンカーによって結合され得、その結果生じるdsRNAの構造はヘアピン構造となる。結合成分は、dsRNAの活性に対し、例えばRISC複合体への鎖の取り込みまたはダイサーとの会合をブロックすることによってなど、ブロックまたはその他の方法で負の影響を与えてはならない。多くの好適な化学結合基が、当技術分野で公知である。オリゴヌクレオチドのリンカーを用いる場合は、dsRNAの完全な機能性が維持される限り、任意の配列または長さであってよい。好ましくは、リンカー配列は、他のヌクレオチド塩基より多い量のウリジンおよびグアニンを含有し、かつ約4~9、さらに好ましくは8~9残基の好ましい長さを持つ。短いRNAには修飾を含めることができるが、RNA組成物がダイサーのための基質の役目を果たすことを妨げない場合に限られる。一層有効なRNAiの生成をもたらし、細胞に送達されるdsRNAの各分子ごとに効果が高まり、かつ/または治療環境でのdsRNAの安定性を確保するために役立つような、dsRNAのダイサープロセシングを強化する1つまたは複数の修飾を行うことができる。修飾は、3‘末端領域、5’末端領域、3’末端および5’末端領域の両方、または、場合によっては配列内のさまざまな位置に組み込むことができる。上記で言及した制約を念頭に置きつつ、任意の数および組み合わせの修飾をRNAに組み込むことができる。多数の修飾が存在する場合、それらは同一でも異なってもよい。基質、糖成分、リン酸骨格、およびその組み合わせに対する修飾が予期される。いずれの5‘末端もリン酸化することができる。ダイサーのプロセシングのために、パッセンジャー鎖の3’末端に位置する好適な修飾因子で短いdsRNA分子を修飾することができる、つまり、dsRNAは、ダイサーの結合およびプロセシングを方向付けるように設計される。好適な修飾因子としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、ならびに蛍光分子などの立体障害型分子が挙げられる。アシクロヌクレオチドは、dNMPに通常存在する2‘-デオキシリボフラノシル糖を2‐ヒドロキシエトキシメチル基で置換する。他のヌクレオチド修飾因子としては、3’-デオキシアデノシンコルジセピン、3’-アジド-3‘-デオキシチミジンAZT、2’,3‘-ジデオキシイノシンddI、2’,3‘-ジデオキシ-3’-チアシチジン3TC、2‘,3’-ジデヒドロ-2‘,3’-ジデオキシイノシンd4T、ならびに3’-アジド-3’-デオキシチミジンAZT、2‘,3’-ジデオキシ-3‘-チアシチジン3TC、および2’,3‘-ジデヒドロ-2’,3‘-ジデオキシチミジンd4Tのヌクレオチド一リン酸、が挙げられる。デオキシヌクレオチドは修飾因子として用いることができる。ヌクレオチド修飾因子を用いる場合は、1~3のヌクレオチド修飾因子をパッセンジャー鎖の3’末端のリボヌクレオチドを2つのヌクレオチド修飾因子で置換する。立体障害分子を用いる場合は、パッセンジャー鎖の3‘末端のリボヌクレオチドに結合させる。したがって、鎖の長さは修飾因子の組み込みによって変化しない。任意で、dsRNA中で2つのDNA塩基を置き換えて、ダイサープロセシングを方向付ける。任意で、ガイド鎖の5’末端およびパッセンジャー鎖の3’末端の二本鎖の平滑末端を形成する2つのリボヌクレオチドに代えて、2つのDNA末端塩基をパッセンジャー鎖の3’末端に置き、2ヌクレオチドのRNAオーバーハングをガイド鎖の3’末端に置く。これは、DNAが平滑末端にあり、RNA塩基がオーバーハングの末端にある非対象の構成である。リン酸骨格に企図される修飾の例としては、メチルホスホネートをはじめとするホスホネート、ホスホロチオネート、およびアルキルホスホトリエステルのようなホスホトリエステル修飾などが挙げられる。糖成分に企図される修飾の例としては、2‘-O-メチル、2’-フルオロ、アミノ、およびデオキシなどの2‘-アルキルピリミジン修飾などが挙げられる例えば、Amarzguiouietal.,2003を参照されたい。基礎群に企図される修飾の例としては、脱塩基糖、2-O-アルキル修飾ピリミジンalkylmodifiedpyrimidine、4-チオウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヨードウラシル、および5-などが挙げられる。また、LNAlockednucleicacidも組み込むことができるであろう。ほかにも多くの修飾が公知であり、上記の基準を満たす限り用いることができる。本発明の短いRNAは、このほか部分精製されたRNA、実質的に純粋なRNA、対称RNA、または組み換え技術によって作られたRNAも含むことができる。短いRNAに対して考えられる他の変更としては、短いRNAの末端複数可または短いRNAの1つまたは複数の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド材料の付加、短いRNAをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾例えば、2’-置換リボヌクレオチドの使用、または糖リン酸骨格に対する修飾、またはデオキシリボヌクレオチドによる短いRNA中の1つまたは複数のヌクレオチドの置換が挙げられる。短いRNAが二本鎖の場合は、好ましくは両方の鎖とも、上記に定義したように標的RNA転写物を有効かつ特異的に下方制御することができる。このような多機能性siRNA分子の設計方法は、Hossbachetal.,2006RNABiology32:82-89に開示されており、参照することによって本明細書に組み込まれる。短いRNAが二本鎖であり、かついずれの鎖も上記に定義した標的RNA転写物を有効かつ特異的に下方制御することができる場合は、好ましくは、二本鎖の熱力学的末端安定性に大きい差はない。二本鎖の熱力学的末端安定性ΔΔGの差の絶対値は、当技術分野で標準の任意の方法で計算することができる。光学的には、二本鎖の熱力学的末端安定性の絶対値は、RNAfoldHofackeretal.,2003NucleicAcidsResearchVol.31,No.13,pp3429-3431を用いて、二本鎖の末端の5つの終結ヌクレオチドを検討することによって計算する。好ましくは、RNAfoldによって計算される二本鎖の熱力学的末端安定性は、3kcal/mol未満、さらに好ましくは1kcal/未満である。本発明の方法では、インスリン産生の誘導は、標的の特殊化誘導遺伝子MafAを上方制御、すなわち活性化することによって達成される。上方制御はシス上方制御である。このような文脈において、シス上方制御とは、標的RNA転写物が、標的遺伝子MafAの遺伝子座と関連する遺伝子座から転写されることを意味する。標的RNA転写物は、標的遺伝子の転写開始部位から500ヌクレオチド上流または500ヌクレオチド下流までの遺伝子座から転写される。用語{特定の遺伝子座}から転写されるとは、本発明の標的RNA転写物の文脈では、標的RNA転写物の転写開始部位が{当該特定の遺伝子座に}見出されることを意味する。標的RNA転写物の転写開始部位は、標的RNA転写物のこれ以外の本質的な特徴が存在する限り、標的遺伝子を含有する染色体のいずれかの鎖に見出され得る。標的RNA転写物は、標的遺伝子の転写開始部位の500、250、または100ヌクレオチド上流から、標的遺伝子の転写終止部位の500、250、または100ヌクレオチド下流までの間に位置するゲノム配列に対して、アンチセンスの配列を含む。任意で、標的RNA転写物は、標的遺伝子のコード領域を含むゲノム配列に対してアンチセンスの配列を含む。用語センスは、本発明の文脈で核酸配列を説明するために用いる場合、当該配列が標的遺伝子のコード鎖上の配列に対して同一性を持つことを意味する。用語アンチセンスは、本発明の文脈で核酸配列を説明するために用いる場合、当該配列が標的遺伝子のコード鎖上の配列に対して相補性であることを意味する。遺伝子のコード鎖とは、当該遺伝子のmRNAに対するコード配列を含有する鎖のことである。遺伝子のテンプレート鎖とは、当該遺伝子のmRNAに対するコード配列を含有しない鎖のことである。用語相補性のおよび相補性は、上に定義した通りである。好ましくは、標的RNA転写物は、標的遺伝子のコード鎖上の配列に対し、全長にわたって少なくとも75、好ましくは少なくとも85、さらに好ましくは少なくとも90、さらに一層好ましくは少なくとも95相補性の配列を含む。好ましくは、標的RNA遺伝子は、標的遺伝子のコード鎖上の配列に対し、全長にわたって完全またはほぼ完全な相補性を持つ配列を含む。あるいは、標的RNA転写物は、標的遺伝子のコード鎖上の配列に対して完全またはほぼ完全な相補性を持つungapped配列を、1つまたは複数、通常はいくつか例えば、少なくとも3つ、または少なくとも6つ含み、前記ungapped配列は、少なくとも16ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも25ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも50ヌクレオチド長、さらに一層好ましくは少なくとも75ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも100ヌクレオチド長である。RNA転写物複数可と上述のゲノム配列複数可との同一性/相補性を評価する場合に、コード/テンプレート鎖は、遺伝子の転写領域の上流および下流に伸びると考えられており、つまり、用語コード鎖およびテンプレート鎖は実際の鎖のラベルに過ぎず、長さの制約を示すものではない。標的RNA転写物は、コードRNA分子、つまりアミノ酸配列をコードするRNA分子であるか、または非コードRNA分子、つまりアミノ酸配列をコードしないRNA分子であるかのいずれかである。好ましくは、標的RNA転写物は非コードRNAである。標的RNA転写物は、好ましくは少なくとも16ヌクレオチド長である。しかし、好ましくは、標的RNA転写物は少なくとも100、さらに好ましくは少なくとも200ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも1000ヌクレオチド長、可能性としては少なくとも4000ヌクレオチド長である。標的RNA転写物は、標的遺伝子のコード鎖上のゲノム配列に対して相補的な配列を含む。任意で、標的RNA転写物がアンチセンスであるゲノム配列は、標的遺伝子のプロモーター領域の一部を含む。この特徴を言い表す別の方法は、アンチセンスの標的RNA転写物が標的遺伝子のプロモーター領域と重なるということである。遺伝子は複数のプロモーター領域を有する可能性があり、その場合に標的RNA転写物は、プロモーター領域のうちの1つ、2つ、又はそれ以上と重なる可能性がある。注釈つきの遺伝子座のオンラインデータベースを用いて、遺伝子のプロモーター領域を特定してもよい。いずれのプロモーター領域でも、プロモーター領域全体が重なる必要はなく、プロモーター領域内の部分配列に標的RNA転写物が重なれば十分であり、つまり、重なりは部分的な重なりであり得る。同じく、標的RNA転写物全体がプロモーター領域内の当該配列に対してアンチセンスである必要はなく、標的RNA転写物がプロモーター領域にアンチセンスである配列を含んでいることだけが必要である。標的RNA転写物と標的遺伝子のプロモーター領域との間の重なりの領域は、単一ヌクレオチド長まで短くてもよいが、好ましくは少なくとも15ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも25ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも50ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも75ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも100ヌクレオチド長である。以下の具体的な取り決めのひとつひとつが、用語重なるの範囲内に入ることが意図されている。a標的RNA転写物と標的遺伝子のプロモーター領域の長さが同一であり、その長さ全体にわたって重なるつまり、相補的である。b標的RNA転写物は標的遺伝子のプロモーター領域より短く、かつその長さ全体にわたって標的遺伝子のプロモーター領域と重なるすなわち、その長さ全体にわたって標的遺伝子のプロモーター領域内の配列と相補的である。。c標的RNA転写物は標的遺伝子のプロモーター領域より長く、標的遺伝子のプロモーター領域はそれによって完全に重複している、すなわち、標的遺伝子のプロモーター領域はその長さ全体にわたって、標的RNA転写物内の配列と相補的である。d標的RNA転写物および標的遺伝子のプロモーター領域は、同じまたは異なる長さであり、重なる領域は、標的RNA転写物の長さおよび標的遺伝子のプロモーター領域の長さのいずれよりも短い。上記の定義重なりは、本明細書全体を通じて、他の重なる配列の説明に準用される。明らかに、アンチセンスRNA転写物が標的遺伝子のプロモーター領域以外の領域と重なりあう場合は、転写物の配列は、プロモーター領域内よりもむしろその領域内の配列に対して相補的である。好ましくは、RNA転写物は、標的遺伝子の転写開始部位を含むゲノム配列に対してアンチセンスの配列を含む。言い換えれば、好ましくは、標的RNA転写物は標的遺伝子の転写開始部位と重なる配列を含む。理論に拘泥するつもりはないが、本発明の短いRNAは、標的遺伝子MafAの一領域に対してアンチセンスである標的RNA転写物のsiRNA様の開裂を誘導することによって、標的遺伝子MafAの修飾を成し遂げ得る。本発明の短いRNAはこのほか、アルゴノートタンパク質との複合体となって、制御クロマチン修飾タンパク質のアンカーとしても作用することができるのではないかと考えられる。正確な機構は未知であるが、効果が観察されるように標的RNA転写物が細胞中に存在することは明らかである。細胞中に存在する標的RNA転写物を判定する方法は、当技術分野で周知である。しかしながら、本発明の目的に関しては、標的遺伝子に対してアンチセンスのいかなるRNA転写物の確実な確認も実際に求められてはいない。したがって、前記非コードRNA転写物すなわち、下方制御するべき標的転写物の存在を判定する必要はない。本発明者は、遺伝子の転写開始部位を囲む領域にある遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列が得られれば、つまり配列決定によって判定するかデータベース上に見出せば、その領域に対する逆相補的RNA配列を判定すれば、この後者の配列に対して相補的な短いRNA分子を用いて標的遺伝子を上方制御することができることを見出した。相補性の要件については、本明細書の別の箇所で考察する。遺伝子の転写開始部位を囲む領域は、転写開始部位の100、200、300、400、500、800、1000、または2000ヌクレオチド上流と下流との間に位置する領域である。理論に拘泥するつもりはないが、saRNAの作用機序は、例えばポリコームグループを介したクロマチンのリモデリングを伴う可能性があると考えられている。ポリコームグループタンパク質は、プロモーターに関連したRNAをはじめとするncRNAと直接相互作用し、それによってプロモーターへと補充されてサイレンシングを生じさせることができるように思われる。したがって、saRNAはそのようなポリコームを補充するncRNAに干渉することによって、プロモーターでのポリコームレベルを低下させ、Trithoraxグループタンパク質のようなポジティブなクロマチンリモデリング複合体がポジティブなヒストンマークを確立することを可能にすることができる。標的遺伝子または関心の遺伝子とは、その発現の修飾が望まれる遺伝子のことであり、本明細書で標的遺伝子への言及が行われる場合、好ましくはMafAのことであると理解するべきである。上に詳しく述べた通り、標的遺伝子は、インスリンである標的タンパク質をコードする遺伝子とは異なる。したがって、標的タンパク質へのいかなる言及も、好ましくはインスリンを意味すると理解するべきである。標的遺伝子を含有する細胞は、好ましくはヒト細胞である。標的mRNA配列は、標的遺伝子に由来するmRNA配列である。特殊化誘導遺伝子は、上方制御されると細胞の特殊化を誘導する遺伝子である。本明細書における特殊化遺伝子への言及は、好ましくはMafAへの言及である。上に考察した方法は、標的遺伝子MafA、すなわち少なくとも1つの標的の特殊化を誘導する遺伝子、を上方制御するための短いRNAの使用を必要とする。したがって、このような方法は、さらなる短いRNAの使用または当技術分野で公知の他の手段による、さらなる特殊化インスリン産生誘導遺伝子の活性化を可能にする。好ましくは、上記の方法は、PDX1、ニューロゲニン3Ngn3、Rfx6、MafA、Hlxb9、Hnf6、Ptf1a、NeuroD、Nkx6-1、およびプロインスリンから成る群から選択される2、3、4、5、6、7、または8個の標的遺伝子、より好ましくはPDX1、Ngn3、Rfx6、およびMafAである標的遺伝子に対する短いRNAを用いた上方制御を含み、前記短いRNAは好ましくは本明細書に述べた原則に適合する。この一連の標的遺伝子のあらゆる組み合わせが企図されている。本発明の方法は、細胞を適切な因子と接触させることを含み得る。適切な因子は、好ましくはグルコース、アクチビン、エキセンジン好ましくはエキセンジン4、ノギン、FGF、ニコチンアミド、トルブタミド、IGF-II、HGF、および/またはEGFから選択され得る。一実施形態では、細胞を、グルコース、好ましくは約2.5mMまたは2.5nM、および/またはアクチビンA、好ましくは約10ngと、少なくとも1日、好ましくは2~4日間、例えば3日間接触させる。一実施形態では、細胞をグルコース、好ましくは約11mMまたは11nM、エキセンジン、好ましくは約5ng、ノギン、好ましくは50ng、FGF、好ましくは5ng、および/またはEGF、好ましくは5ngと、約6日間、例えば4~8日間接触させる。前記の接触は、適切な間隔で、例えば3日おきに繰り返すこともできる。一実施形態では、細胞を、まずグルコースおよびアクチビンAと3日間接触させ、次に3日目および6日目に、グルコース、エキセンジン、ノギン、FGF、およびEGFと接触させる。一実施形態では、細胞を、好ましくは9日目に、ニコチンアミド、好ましくは約10mM、IGF-II、好ましくは約50ng、HGF、好ましくは約10ng、エキセンジン4、好ましくは約25ng、およびアクチビンA、好ましくは約10ngと接触させる。好ましくは、これらのステップの実施中には、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミンが、存在しない。典型的なワークフローを図7および9に示す。これらの図に示されたワークフローの各ステップは、別々の実施形態を表す。本発明の方法では、細胞または細胞集団を、本発明の短いRNA分子と接触させる。短いRNA分子は、本発明の短いRNAとともに任意の好適な送達試薬を用いることによって、インビトロまたはインビボで前記細胞に投与することができる。このような好適な送達試薬としては、MirusTransitTKO脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン例えばポリリジン、ウイルス性の粒子、エレクトロポレーション、もしくはリポソームが挙げられる。リポソームの調製には様々な方法が公知であるが、例えばSzokaetal.1980、AnnRev.Biophys.Bioeng.9:467、ならびに米国特許第4,235,871号および同第5,019,369号に記載されており、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。細胞をsaRNAと接触させるステップは、トランスフェクションと称することもできる。特に好ましくは、本発明の短いRNAを封入するリポソームは、例えばオプソニン化阻害部分を構造体の表面に結合させることによって、単核細胞マクロファージおよび細網内皮系によるクリアランスを回避するように修飾される。一実施形態では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分とリガンドの両方を含む。短いRNAを発現する組み換えプラスミドは、そのままで、またはMirusTransitLT1脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン例えば、ポリリジン、又はリポソームをはじめとする好適な送達試薬と併せて投与することができる。短いRNAを発現する組み換えウイルスベクター、およびそのようなベクターを細胞に送達する方法は、当技術分野内では公知である。好ましくは、前記接触させるステップを2回以上、好ましくは3日おきに実施するが、毎日、または2、4、もしくは5日おきであってもよい。接触は、好ましくは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15日間実施するが、6または9日間が好ましい。上記の方法において、複数の標的遺伝子を上方制御する場合は、この多様な標的遺伝子を上方制御するために用いる短いRNAは、多様な頻度で、多様な期間にわたって投与することができる。用いる特定の投与計画は、当業者がその所望の目的、特定の開始細胞の種類、および送達方法に合わせて容易に決定することができる。一例としては、本発明の短いRNA分子のピコモル濃度を用いてもよい。本発明の短いRNAは、単独で、または考察中の特定の方法で有効であることが公知の他の活性薬剤複数可との併用で提供することができる。その他の活性薬剤複数可は、本発明の短いRNAと同時に、別々に、または逐次的に投与することができる。したがって、本発明の短いRNAを1つだけ用いることも、本発明の短いRNAを2つ以上組み合わせて用いることも、または、妥当であれば、前記の短いRNA複数可と他の活性物質複数可とを組み合わせて用いることも可能である。本発明のすべての態様の重要な特徴は、本発明の短いRNAを用いてアンチセンスRNA転写物を標的とすることが、標的遺伝子の上方制御をもたらすという点である。本発明の短いRNA分子は、任意の好適な方法で、例えば合成により、または細胞での発現によって、当業者には周知の分子生物学の技術を用いて、作製することができる。例えば、短いRNAは、Tuschletal.の米国公開出願第2002/0086356号に記載のショウジョウバエインビトロ系、またはVermaandEckstein1998AnnuRevBiochem67:99-134に記載のRNA分子の合成方法など参照によって本明細書に全体として組み込まれる、当技術分野で公知の方法を用いて、化学合成または組み換え技術によって作製することができる。本発明の短いRNAは、適切に保護されたリボヌクレオシドのホスホラミダイトと従来のDNA/RNA合成装置とを用いて、化学的に合成することもできる。短いRNAが二本鎖RNAである場合は、2つの別個の相補的RNA分子としても、または2つの相補的領域を持つ単一のRNA分子としても合成することができる。合成RNAまたは合成試薬の供給業者としては、ProligoHamburg,Germany、DharmaconResearchLafayette,Colo,USA、PierceChemicalPerbioScience,Rockford,Ill.,USAの一部、GlenResearchSterling,Va.,USA、ChemGenesAshland,Mass.USA、およびCruachemGlasgow,UKが挙げられる。また短いRNAは、任意の好適なプロモーターを用いて、組み換え型の環状または線状DNAから発現させることもできる。本発明の短いRNAを発現させるための好適なプロモーターとしては、例えば、U6またはH1のRNAのポルIIIのプロモーター配列、およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターの選択は、当業者の技術の範囲内である。本発明の組み換えプラスミドは、短いRNAを特定の組織または特定の細胞内環境に発現させるための誘導可能または制御可能なプロモーターも含み得る。組み換えプラスミドから発現された短いRNAは、標準技術を用いて培養細胞発現系から単離することができる。本発明の二本鎖の短いRNAは、2つの別個の相補的RNA分子として、または2つの相補的領域を持つ単一RNAとして、組み換えプラスミドから発現させることができる。短いRNAの発現に好適なプラスミドの選択、プラスミドに短いRNAを発現させるための核酸配列を挿入する方法、および関心の細胞に組み換えプラスミドを送達する方法は、当業者の技術の範囲内である。例えば、Tuschl,T.2002,Nat.Biotechnol.20:446-448、およびBrummelkampTRetal.,2002,Science296:550-553参照によって本明細書に組み込まれるを参照されたい。本発明の短いRNAは、インビボで、組み換えウイルスベクターから細胞内に発現させることもできる。本発明の組み換えウイルスベクターは、本発明の短いRNAをコードする配列と、短いRNA配列を発現するための任意の好適なプロモーターとをふくむ。好適なプロモーターとしては、例えばU6またはH1のRNAのポルIIIのプロモーター配列、およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターの選択は、当業者の技術の範囲である。本発明の二本鎖の短いRNAは組み換えウイルスベクターから、2つの別個の相補的なRNA分子として、または2つの相補的な領域を持つ単一のRNA分子として発現させることができる。例えばアデノウイルスAV由来のベクター、アデノ関連ウイルスAAV、レトロウイルス例えば、レンチウイルスLV、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス、ヘルペスウイルスなど、dsRNA分子複数可のコード配列を受け入れることのできる任意のウイルスベクターを用いることができる。ウイルスベクターの向性は、必要に応じて、他のウイルスに由来する外膜タンパク質または他の表面抗原でベクターを偽型化することによって、または異なるウイルスカプシドタンパク質を代入することによって、修飾することができる。本発明での使用に好適な組み換えウイルスベクターの選択、短いRNAを発現させるための核酸配列をベクター内に挿入する方法、および関心の細胞にウイルスベクターを送達する方法は、当技術分野の技術の範囲内である。例えば、DornburgR1995,GeneTherap.2:301-310参照によって本明細書に組み込まれるを参照されたい。実施例で考察するように、本発明者は、本明細書に開示される方法を用いて、数多くの特殊化遺伝子の活性を有効に修飾する特定の短いRNA分子を設計した。好ましい特殊化遺伝子については上に考察した。したがって、さらなる態様では、本発明は、表1~6に示す固有の配列を持つ一本鎖でも二本鎖でもよい短いRNA分子を提供する。任意で、これらの配列のいずれもが、3’テイルを含み得る。本発明はまた、上記の個々の鎖の配列を含む、またはこれらの配列から成る一本鎖または二本鎖のRNA分子も提供する。本発明はまた、上述したRNA分子と同等のDNA分子も提供する。本発明の短いRNA分子は、再生法または修復法をはじめとする治療法にそのまま用いることができる。さらなる態様において、本発明は、治療に用いるための本発明の短いRNAを提供する。好ましくは、本明細書に開示する2つの特異的な短いRNAであって、MafAを上方制御する短いRNAは、組み合わせて用いられる。さらなる態様において、本発明は、本発明の短いRNAを、それを必要とする患者に投与することを含む遺伝子治療の方法を提供する。本発明は、患者の特殊化した細胞、好ましくはインスリン産生細胞の欠乏による疾患の治療に使用するための本発明の短いRNAを提供する。さらなる態様において、本発明は、本発明の短いRNAを含む細胞または細胞株を提供する。さらなる態様において、本発明は、本発明の方法のいずれか1つによって調製される、特殊化した細胞を提供する。実施例に詳述するように、本発明の方法は、インスリン分泌能のある細胞の創出を可能にする。したがって、さらなる態様において、本明細書に開示の方法を用いて得ることのできる、インスリン産生能のある細胞が提供される。好ましくは、細胞は、OmniCyteなどのCD34幹細胞の特殊化を誘導することによって得られる。細胞は、好ましくはエクスビボであり、すなわち生命体の一部ではない。任意で、細胞をインビトロまたは単離されたと称することもできる。このような細胞の治療への使用が、本発明のさらなる態様である。任意で、本発明の特殊化した細胞および本発明の短いRNAは、本明細書に開示の治療的適応において、組み合わせて用いることができる。組み合わせてには、単独投与、同時投与、または逐次的投与が含まれる。別の観点から見ると、本発明は、上に定義した特殊化した細胞および/または短いRNAの薬学的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法を提供する。治療的適応は、本発明の特殊化した細胞および/または短いRNA分子の投与から恩恵を受ける任意の状態、損傷、または障害の治療であり得る。これは、特殊化した細胞の欠乏に伴う、またはこれを特徴とする状態であり得る。好ましくは、治療的適応は、再生又は修復である。任意で、再生または修復は、損傷した臓器、好ましくは膵臓または肝臓に対するものでる。あるいは、再生または修復は、損傷それ自体ではないが正常な発達を遂げていない臓器に対するものであり得る。したがって再生は、臓器の成長または改善のあらゆる方法を含むものと広く解釈されるべきである。糖尿病、I型またはII型の真性糖尿病の治療は好ましい。治療し得る他の疾患は、肥満、特に病的肥満、脂肪肝、特に脂質およびグリコーゲンの沈着と関連する場合、ならびにグルコースおよび/またはインスリンの摂取および/または利用の不良を特徴とする、またはこれに起因するあらゆる状態である。このような障害は、異常なインスリンの産生、摂取、または利用に起因する状態と呼ぶことができる。任意で、本発明は、本発明の短いRNAおよび/または本発明の特殊化した細胞を、膵臓細胞、特にβ細胞が不足した患者の膵臓の少なくとも一部の再生に使用するために提供する。膵臓がインスリンを十分に産生しない、または実際には全く産生しない患者はいずれも、このような治療から恩恵を受ける可能性がある。インスリンの産生不足には、正常な健康な対象より低いレベルのインスリン産生が含まれるが、正常な健康な対象に匹敵するレベルのインスリンを産生するが、例えばインスリン耐性、過剰な食物消費、病的肥満などの理由からさらに高いインスリンレベルを必要とする対象も含まれる。本発明の短いRNAおよび/または細胞は、膵臓を標的とする代わりに、またはそれに加えて肝臓を標的とし、肝細胞、または肝臓を占める本発明の細胞が、インスリンを産生するようにするために用いることもできる。短いRNA分子または細胞は、注射によって、例えば静脈内、皮下、筋肉内、または標的臓器内に投与することができる。したがって、注射は全身、または例えば標的臓器、好ましくは膵臓または肝臓などの標的部位に、または標的部位内に対するものであってよい。あるいは、投与は経口またはpr経直腸であってもよい。細胞を膵臓に注射するのが好ましい。本発明の短いRNAおよび/または細胞は、それを必要とする患者に対し、当技術分野で公知の任意の手段または送達ビヒクルによって、例えばナノ粒子、陽イオン性脂質、コレステロールもしくはα-トコフェロール、リポソーム、例えば陽性に荷電した陽イオン性リポソーム、ポリエチレンイミンなどのポリマー、デンドリマー、アプタマーを介して、または抗体複合体として、投与することができる。また短いRNAは、ウイルスベクターによって発現したshRNAまたはmiRNA擬態として投与することもできる。好ましくは、saRNAまたは細胞は、saRNAまたは細胞を特定の組織または細胞型、例えば膵臓細胞または肝臓細胞、例えば肝細胞もしくはβ細胞へと方向付ける部分と関連するか、錯体を形成するか、連鎖するか、またはその内部に含有されている。前記部分は、上に述べた手段/送達ビヒクルのひとつであり得る。アプタマーは、選択性、親和性、および安定性の高いオリゴヌクレオチドまたはペプチドである。特有の安定した形状を帯び、それによって標的分子にきわめて特異的な強力結合を与えている。特定の分子標的のいずれに対しても、核酸の組み合わせライブラリーから、例えば指数関数的富化によるリガンドの系統的進化SELEX法と呼ばれる技術によって、核酸アプタマーを特定することができる例えば、TuerkCandGoldL:Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment:RNAligandstobacteriophageT4DNApolymerase.Science1990,249:505-510を参照されたい。したがって、当業者は、肝臓細胞または膵臓細胞などの標的細胞、例えばβ細胞に、saRNAまたは本発明の細胞を送達するために好適なアプタマーを設計することができる。ペプチドアプタマーは、例えばイースト2ハイブリッド法を用いて特定することができる。膵臓特異的アプタマーを用いた本発明の短いRNAの膵臓投与が、特に好ましい。DNAアプタマー、RNAアプタマーおよび膵臓特異的アプタマーが企図される。このほか提供されるのは、アプタマーと本発明の短いRNAとの結合体である。結合体は、直接化学結合の形成、ストレプトアビジンなどのリンカーを介した連結法など、2つの部分を連結するための任意の公知の方法を用いて形成してよい。標的細胞の表面受容体に対する抗体を作り出す方法は周知である。本発明のsaRNAを、例えばRNA担体タンパク質を用いてそのような抗体に結合させてもよい。次に、結果として生じる複合体を対象に投与し、受容体媒介エンドサイト―シスを介して標的細胞に取り込ませてもよい。本発明の細胞は、公知の手段を用いてそのような抗体に連結させてもよい。saRNAまたは細胞は、当技術分野で公知の方法を用いてリポソーム内に封入してもよい。リポソームは、任意で、抗体またはペプチドなどの標的細胞特異的な部分と結合させてもよい。本開示全体を通じて、例えば刊行物および特許などの様々な文書が列挙されている。そのような文書はすべて、関係のある部分が参照によって本明細書に組み込まれる。いずれの文書の引用も、本発明に先行する技術であることの承認と解釈されてはならない。本文書の中のある用語の意味または定義が、参照によって組み込まれる文書の中のその用語の定義と食い違う限りにおいて、本文書中で当該用語に割り当てられた意味または定義が支配する。本明細書で参照するのは、本発明に利用される各種の含有物ingredientをはじめとする成分の商標である。本明細書において、本発明者は、特定の商標の下にある材料によって制限されることを意図しない。本明細書の記述では、商標によって参照されるものと等価の材料例えば、異なる供給源から異なる名称または参照番号の下に得られるものを代用し、利用してもよい。明確に意図されているのは、上に開示した本発明の任意で好ましい特徴および実施形態は、単独で実施しても、任意の数と任意の組み合わせで一緒に実施してもよいということであるが、ただし、特徴および実施形態が互いに矛盾する場合、そのような実施が不可能な場合、またはそのような実施が本発明の目的に反する場合は別である。以下の実施例は、本発明を例示し、当業者に本発明の作製および使用を教示することを意図したものである。これらの実施例は、決して本発明を制限するためのものではない。以下の実施例、ならびに表および図の中で、本発明をさらに説明する。ここで、表1は、PDX1の発現を活性化するために設計された短いRNA分子を示す。右側にアンチセンスガイド配列が示され、左側にセンスパッセンジャー配列が示されている。RNA配列にはチミンTの代わりにウラシルUが含有され、この2つの残基は表に提供された配列では等価である。表2は、ニューロゲニンの発現を活性化するために設計された短いRNA分子を示す。右側にアンチセンスガイド配列が示され、左側にセンスパッセンジャー配列が示されている。表3は、Rfx6の発現を活性化するために設計された短いRNA分子を示す。右側にアンチセンスガイド配列が示され、左側にセンスパッセンジャー配列が示されている。表4は、MafAの発現を活性化するために設計された短いRNA分子を示す。右側にアンチセンスガイド配列が示され、左側にセンスパッセンジャー配列が示されている。表5は、インスリンの発現を活性化するために設計された短いRNA分子を示す。右側にアンチセンスガイド配列が示され、左側にセンスパッセンジャー配列が示されている。表6は、インスリンの発現を活性化するために設計された短いRNA分子である。これらの表は、短いRNA配列を示す。短いRNAが一本鎖である場合は、好ましくはアンチセンスカラムに掲載された配列を含むか、またはその配列から成る。二本鎖の短いRNAは、センスカラムに示された配列を含むかまたはその配列から成る鎖と、それと対をなす同じ行のアンチセンスカラムに示された配列を含むかまたはその配列から成る鎖とで形成される。言い換えれば、これらの表の各行は、二本鎖の形成にはどの配列を対にし得るかを示している。したがって、二本鎖の短いRNAには、配列番号1と配列番号2、または配列番号3と配列番号4、などが含まれ得る。実施例1PDX1の発現を活性化するための短いRNAの設計上述の方法を用いてsaRNAの設計を実施した。さらに具体的な詳細を以下に示す。PDX1は、染色体13図1参照のバンドq12.2上に位置する。PDX1の正式な遺伝子名は、ホモサピエンス膵臓十二指腸ホメオボックス1である。mRNAの寄託番号は、NM_000209である。PDX1の参照配列のmRNANM_000209は2つのエキソンを持ち、プラス鎖から転写した。PDX1の遺伝子座から潜在的なアンチセンス転写物を特定するため、PDX1を取り囲むゲノム領域の適切な鎖マイナス鎖に位置するスプライスされた発現配列タグESTを探索した。ESTの転写の方向を判定するのは一般に難しいが、スプライスされたESTのスプライス部位サインを用いることによって判定することができる。ESTCR593175を、標的候補として選択した。アンチセンスRNAはTSSを囲む領域に見出されることが多いことを、最近の深いシークエンシング実験が明らかにしているため、PDX1のプロモーター領域から潜在的なアンチセンス転写物を標的とする短い活性化RNAを設計することを決定した。さらに具体的に言えば、PDX1のTSSから500nts上流および下流のアンチセンス配列PDX1_AS_TSS/-500と略すを、第2の標的候補として用いた。目的は、2つの候補配列を下方制御するための短いRNAを設計することであった。候補の短いRNAは、標的配列を有効に阻害しなければならず、かつ理想的には、潜在的な的外れ効果が最小となるように、できる限り特異的でなければならなかった。そのため、GPboostのsiRNA設計アルゴリズムを用いて、2つの候補配列を下方制御するための潜在的な短いRNAを特定した。予測されたsiRNA候補のリストから、ESTCR593175のエキソン1および2にある最も有望な2つの非オーバーラップsiRNA標的部位、およびプロモーター配列内にあるPDX1のTSSのそれぞれの側にある最も有望なsiRNA標的部位PDX1_AS_TSS/-500を選択した。これらのsiRNA候補を、GPboostによる予測有効性スコア配列モチーフaaaa、cccc、gggg、およびuuuuの不在、20~55の中程度のGC含量、およびすべての潜在的的外れ転写物に対して少なくとも2のハミング距離に基づいて選択した。表1は、結果として生じたPDX1発現活性化のための候補の短いRNAを示す。この表は一本鎖の配列を示すが、活性化RNAは二本鎖分子として投与してもよい。実施例2ニューロゲニン3の発現を活性化させるための短いRNAの設計設計は、実施例1のように実施したが、以下の相違があった。ニューロゲニンは染色体10図2参照、バンドq21.3上に位置する。ニューロゲニン3遺伝子の正式名称は、ホモサピエンスニューロゲニン3である。mRNA寄託番号は、NM_020999である。ニューロゲニン3参照配列mRNANM_020999は2つのエキソンを持ち、マイナス鎖から転写される。ESTA1744512が標的候補として選ばれた。NEUROG3_AS_TSS/-500が第2の標的候補として用いられた。表2に、結果として生じたニューロゲニン3の発現を活性化するための短いRNAの候補を示す。この表は一本鎖の配列を示すが、活性化RNAは二本鎖の分子として投与されてもよい。実施例3Rfx6の発現を活性化するための短いRNAの設計設計は、実施例1のように実施したが、以下の相違があった。Rfx6は、染色体6図3参照、バンドq22.2上に位置する。Rfx6遺伝子の正式名称は、ホモサピエンス制御因子X,6である。mRNA寄託番号は、NM_173560である。Rfx6参照配列mRNANM_173560は19のエキソンを持ち、プラス鎖から転写される。ESTNM_148963が標的候補として選択された。RFX6_AS_TSS/-500が第2の標的候補として用いられた。表3に、結果として生じたRfx6の発現を活性化するための短いRNAの候補を示す。この表は一本鎖の配列を示すが、活性化RNAは二本鎖分子として投与されてもよい。実施例4MafAの発現を活性化するための短いRNAの設計設計は、実施例1のように実施したが、以下の相違があった。MafAは、染色体8図4q24.3上に位置する。MAFA遺伝子の正式名称は、ホモサピエンスV-maf筋腱膜繊維肉腫オンコジーン相同体Aavianである。mRNA寄託番号は、NM_201589である。MafA参照配列mRNANM_201589は、1つのエキソンを持ち、マイナス鎖から転写される。MAFA_ASTSS/-500が標的候補として用いられた。表4に、結果として生じたMafAの発現を活性化するための短いRNAを示す。この表は一本鎖の配列を示すが、活性化RNAは二本鎖の分子として投与されてもよい。実施例5特殊化の誘導―インスリン産生細胞の作製材料および方法以下のようにして多能性細胞omnicytesを得た:顆粒球コロニー刺激因子G-CSFに動員された末梢血液細胞を、StemCellLaboratory,HammersmithHospitalによって処理された白血球除去輸血から、臨床的必要量を超えて得た。すべてのケースについて、インフォームドコンセントおよび地元の研究倫理委員会の承認を得た。CD34細胞をハンクス緩衝食塩水HBSS;Gibco,Paisley,U.Kで、1:4に希釈してから、LymphoprepAxis-Shield,Kimbolton,Cambridgeshire,UK密度勾配にわたる1800rpmでの遠心分離に30分間かけて単核細胞MNCを分離したHeraeus、Hanau、Germany。MNC部分を回収し、まずHBSS中で、次に、0.5のヒト血清アルブミンおよび5mMのEDTA、pH7.2を補充したMACS磁気細胞選別緩衝液リン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄した。CD34陽性細胞選択キットLargeMacs;MiltenylBiotec,BergischGlasbachGermanyを用いて,MNCからCD34細胞を単離した。単離したCD34細胞を、24ウェル培養皿Corning,USA上.1ウェルにつき500μlのα-最小必須培地α-MEMを入れて、25x105細胞の密度で平板培養し、37°Cおよび5CO2で30分間インキュベートした。このインキュベーションの後、プレートをPBSで4回洗浄することにより、この非接着性の細胞集団を除去した。特殊化の誘導を、図7の通りに実施した。omnicyteCD34、接着性を、2.5mMのグルコースおよび10ngのアクチビンAを補充した無血清拡大培養基OmnicyteLimited中、3日間培養した。3日目および6日目には、細胞がsaRNA分子でトランスフェクトされていた。対になったsaRNAオリゴヌクレオチドを、50mMのトリス塩酸pH8.0、100mMのNaCl、および5mMのEDTAを用いてアニールした。90°Cでの変性ステップの後、室温に至るまでの段階的なアニールステップが続いた。NanofectaminPAAをメーカーのプロトコルに従って用いて、アニールされたsaRNAオリゴヌクレオチド0.15μg/ウェルのトランスフェクションを実施した。11mMグルコースの3日目および6日目に、5ngエキセンジン、50ngヒトノギン、5ngFGF、5ngEGFを添加した。RNA分析RNA分析用に、9日目に細胞を採取し、遠心分離により粒状化した。RNAqueous-MicroキットAmbionをメーカーの指示に従って用いて、全RNAを回収した。RNAを、Nanodrop1000マイクロサンプル定量装置を用いて定量した。QiagenのOneStepRT-PCRキットをメーカー推奨に従って用いて、各サンプルから1μgの全RNAを逆転写した。PDX1、Rfx6、MafA、およびインスリンの発現を、半定量的に測定した。ローディング対照としてアクチンを用いた。免疫蛍光4パラホルムアルデヒドで細胞を20分間、1cmのガラス製カバースリップ上に固定し、続いて0.2トリトンX100で20分間透過化処理をした。カバースリップを3回洗浄し、続いて10ウサギ血清で45分間ブロックした。ウサギで育てた抗ヒトインスリン1:200シグマを10血清中の細胞に1時間添加した。PBSで細胞を3回洗浄し、続いてさらに15分間10血清を添加した後、Alexa-488抱合抗ウサギ二次抗体1:600CellSignalingTechnologyとともに1時間インキュベートした。PBS中で5回洗浄した後、カバースリップを4’6’-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPIVectorlabsを含有するVectashieldとともにガラススライド上に載せた。スライドをLeicaDM4000上で60倍の倍率で視覚化した。平均で5つの画像を撮影し、二次抱合抗体単独での染色と比較して、自己蛍光が存在しないことを確認した。プロインスリンELISA9日目に、10mMのニコチンアミド、50ngのIGF-II、10ngのHGF、25ngのエキセンジン4、および10ngのアクチビンAを補充した前条件付けのα-MEM培地に細胞を移した付属書類E。37°Cおよび5のCO2で16時間、細胞をインキュベートした後、グルコース勾配を添加した。2.8mMのグルコースを3時間添加し、続いて20mMのグルコースをさらに3時間添加した。培地を単離し、メーカー指示に従って全ヒトプロインスリンELISAMillipore用に処理した。キットが供給する陽性対照は、7.9pMのインスリンを含有する。結果omnicyteは、膵臓β細胞の特殊化に必要な因子を発現する。プラスチック付着性の骨髄由来幹細胞の初期の性質は、GordonMYetal.,1987およびGordonMY19948,9によってすでに証明されている。われわれは、単離されたばかりのomnicyteからNeuroD、PDX1、およびRfx6をはじめとする膵臓β細胞への特殊化に必要な転写因子の存在を確認した。これらの因子の発現は、当然、培養3日のうちに下方制御された図5A。アニールされたsaRNAオリゴヌクレオチドのトランスフェクションは、標的遺伝子を上方制御する。インスリン産生細胞へと特殊化するためのこれらの必要な転写因子の発現を維持し、または増加させるために、材料および方法で述べたバイオインフォマティクスおよびソフトウェアアルゴリズムを用いて、小型の活性化RNAsaRNAオリゴヌクレオチドを作成した。このオリゴヌクレオチドを3日目および6日目にアニールし、トランスフェクトしてから、9日目に細胞採取した。mRNA分析では、膵島の形成とインスリンの発現に必要な下流の転写因子Rfx6の順次活性化を促進するために、PDX1図1の上方制御が十分であることが示された21図5B。9日目にPDX1でトランスフェクトされた細胞の形態は、免疫蛍光染色によってインスリンの発現が示された膵島細胞の集合形成の特徴を示すものであった図5C。しかしながら、これらの細胞は、グルコース勾配への暴露後にインスリンを分泌していないことから、未成熟の膵島細胞であることが示唆される。成熟β細胞の特殊化に必要な転写因子の上方制御成熟β細胞の特殊化に必要な遺伝子一式を補完するために、ニューロゲニン3図2、Rfx6図3、MafA図4を標的とするsaRNAを細胞にトランスフェクトした。mRNA分析は、細胞培養9日目までにはプレプロインスリンおよびプロインスリンの発現が有意に上方制御されたことを明らかにしている図6A。PDX1を標的とするsaRNAとβ細胞の特殊化のための後期トランスクリプション因子との組み合わせsaRNAオリゴヌクレオチドのトランスフェクションに続くmRNA分析によってPDX1、Rfx6、ニューロゲニン3Ngn3、およびMafAの標的上方制御が確認されたため、われわれはこれらのオリゴヌクレオチドの組み合わせをomnicytesに添加して、この細胞が一層成熟したインスリン分泌性β細胞へと発達する兆候が示されるかどうかを評価した。3日目および6日目にトランスフェクトされたRfx6、Ngn3、およびMafA単独の組み合わせ、またはPDX1Rfx6、PDX1Ngn3、もしくはPDX1MafAに続いて、9日目のグルコース反応テストのために材料および方法に記載したように細胞を準備し、続いて全プロインスリン分泌のためのELISAを実施した。示された数値は、ELISAキットMilliporeが提供する7.9pMインスリンの陽性対照に対する割合であり、24ウェルプレートの単一ウェル中で培養された細胞を表す図6B。考察この10年間にわたって幹細胞の理解と操作に関して得られた進歩は、研究者が再生医療にこのような細胞を用いることを可能にした。胚細胞は催腫瘍性のリスクを抱えていることから、その臨床応用への使用に対する倫理的な制約は、成体前駆細胞の使用に多くの焦点が当たることを意味した。この分野の研究は、臨床的使用に移すことのできない遺伝子組み換え成分に依存することから、かつては制限されてきた。しかしながら、omnicytesは、治療で補充用幹細胞として使用するために必要な安全基準をすべて満たすものである22。自己細胞から単離することが可能であり、無血清環境で力強い拡大能力があり、かつ肝細胞、膵細胞、心血管細胞、および神経細胞をはじめとする様々な系統への拘束に必要な転写因子をすでに発現していることから優れた発生的柔軟性を示す22。本明細書に示すデータは、新規の小型活性化RNA分子の使用により、omnicytesをインスリン分泌細胞中に誘導し得ることを明らかにしている。このような分子は疑いなく、ウイルス性のバックボーンを持つベクターに依存する標準技術を用いるよりも安全なアプローチを可能にする。インスリン産生の誘導に必要な下流の遺伝子を制御するカスケード効果を生じさせるには、標的転写因子を2つ3つだけ活性化すれば十分だということは、すでに明らかにした。実施例6プロインスリンの発現を活性化させるための短いRNAの設計実施例1のように設計を行ったが、以下の相違があった。プロインスリンは、染色体11図8参照、バンドp15.5上に位置する。このインスリン遺伝子の正式名称は、ホモサピエンスインスリンである。mRNA寄託番号は、NM_000207である。プロインスリン参照配列mRNANM_000207は、3つのエキソンを持ち、マイナス鎖から転写される。標的候補としてINSNM001185098_AS_TSS/-500を用いた。表5および6に、結果として生じたプロインスリンの発現を活性化するための短いRNAの候補を示す。実施例7MafAを上方制御するためのsaRNAを用いたインスリン産生の誘導aCD34細胞をインスリン分泌表現型へと誘導するための最適化プロトコル誘導プロトコルは、0日目に72時間、付着性のCD34細胞集団Omnicytesを10ng/mlのアクチビンASigma、UKおよび2.5nMのグルコースSigma、USAとともに、0.5ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質中にStemCellFactorInvitrogen、USA、250ng/mlのインターロイキン3およびインターロイキン6を含有する無血清CellGro培地CellGenix、UKに補充することで開始された。細胞を80の密集度に拡大させてから、11nMのグルコース、5ngのエキセンジン4Sigma、USA、50ngのノギンSigma、USA、5ngのbFGFSigma、USA、および5ngのEGFSigma、USAを72時間おきに添加し、それとともに、α-MEM培地を伴うNanofectaminePAA、UK抗生物質なしをメーカー指示に従って用いて、MafAを上方制御するために設計された150ngの二本鎖saRNAのトランスフェクションを実施した。このプロセスを、2/3日目、5/6日目、および8/9日目に3回繰り返した適切な細胞密度の確立に依存。最大のトランスフェクション効率を達成するため、24時間ごとに細胞をピペットでそっと取ることにより、細胞のクラスター形成を防いだ。最適化プロトコルのワークフローを図9に示す。MafAを上方制御することのできる2つの特異的saRNAを組み合わせて用いた。これらはPr-1およびPr-2に指定されている。このようなsaRNAで処理された細胞を、本実施例においてトランスフェクトされた細胞と呼ぶ。bアクチンおよびインスリンのウェスタンブロット未分化CD34細胞対照からの全タンパク質抽出物10μgおよびトランスフェクトしたCD34細胞上記プロトコルに従って調製を、SDS-PAGEInvitrogenからの4~12TrisGlycine変性アクリルアミドゲル上で分離した。ニトロセルロース膜上に移した後、ブロットを抗アクチンSigma1:8000および抗インスリンAbcam、続いてHRP抱合二次抗体1:10000Dakoとともにインキュベートした。インスリンは、小さいαサブユニットとそれより大きいβサブユニットを含み、分子重量が約6kDaキロダルトンの小型ペプチドである。結果を図10に示す。cβ細胞の発達に関与する重要な転写因子の定量PCRqPCRトランスフェクトしたCD34細胞上記プロトコルに従って調製との比較による分化したトランスフェクトしていないCD34細胞対照からの転写物の相対量RQおよび全ヒト正常膵臓RNAを評価した。結果を図11に示す。PDX1は、転写因子膵臓十二指腸ホメオボックス1である。インスリンの発現に関与する様々な遺伝子の下流活性化にとって重要なものである。このような因子としては、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、およびGLUT2が挙げられる。NGN3が基本的なヘリックス-ループ-へリックス転写因子ニューロゲニン3であり、これがNEURODニューロゲニン分化因子と一緒にインスリンの発現を制御する。NKX6.1が、β細胞の発達に必要なNK6ホメオボックス1転写因子である。GCKは、グルコース代謝の最初のステップでグルコースをリン酸化するヘキソキナーゼ酵素である。ABBC8ATP結合カセットサブファミリーC、第8員は、ATP結合カセットトランスポーターのスーパーファミリーの一員である。ABBC8は、インスリン放出のためのATP感受性カリウムチャンネル内で機能する。GLP1は、グルカゴン様ペプチド1であり、インスリン分泌を制御する。MAFAv-maf筋腱膜繊維肉腫腫瘍遺伝子相同体Aは、β細胞特異的な転写因子であり、β細胞のRIPE3b―β細胞の成熟期間にインスリン遺伝子INSの発現を制御する保存されたエンハンサーエレメント―に結合する。標的遺伝子のためのプライマーは、Qiagenの有効なQuantitectPrimersである。dA未分化であるか、またはBトランスフェクトされているかのいずれかであるCD34細胞に対し、電子顕微鏡分析を実施した。トランスフェクト細胞Bは、上記のプロトコルに従って調製した。結果を図12に示す。細胞がPDX1への分化とインスリンの発現に向かって分化を始めたBでは、Aに比べて顆粒小胞がはっきりと見られるqPCRデータ参照。明白でクラスター化した小胞は、トランスフェクト細胞中で細胞膜に向かって極性化するのが認められる。eインスリンおよびC-ペプチドの酵素免疫測定ELISA未分化CD34細胞およびトランスフェクト細胞からの培地を、低グルコース2.8nMパルス、およびそれに続く高グルコース16nMパルスに細胞を暴露した後に、回収した。次に、この培地を、メーカーの指示に従って、ヒトインスリンおよびヒトC-ペプチドMilliporeに対して特異的な免疫吸収ELISAプレート上に移した。図13に示すデータは、トランスフェクト細胞がインスリンを分泌することによってグルコース勾配に反応することができたことを示している。実施例8本発明の短いRNAを用いたMafAの上方制御は、肝細胞に関しても達成された。肝上皮細胞を、Pr-1およびPr-2と表わされるsaRNAでトランスフェクトした表4参照、そして表7は、Pr-1が配列番号49と対になった配列番号5であり、かつPr-2が配列番号50と対になった配列番号6であり、それぞれが任意で3‘UUテイルを持つことを示す。結果は、それぞれのsaRNAが単独でMafAの発現を上方制御することができ、かつ両方のsRNAの組み合わせの方が、各saRNAの単独よりも大幅な上方制御を達成したことを示している。図14を参照されたい。表表中、Locは位置を、Eはエキソンを表す。"