組み換えαマンノシダーゼを含む細胞培養物のフラクションが、マルチモードリガンドを含む樹脂によるクロマトグラフィーに供される、組み換えαマンノシダーゼを細胞培養物から精製するための方法。組み換えαマンノシダーゼを含む細胞培養物のフラクションが、清澄化された未希釈の採取物である、請求項1記載の方法。樹脂に結合されているマルチモードリガンドが、カルボン酸基またはスルホン酸基を有する物質である、請求項1または2記載の方法。樹脂に結合されているマルチモードリガンドが、式I、IIまたはIIIの物質:であり、ここで、式IIおよびIIIの物質のRは式IVの官能基:である、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。マルチモードリガンドを含む樹脂にロードされた細胞培養物のフラクションが、イソプロパノール、好ましくは少なくとも1のイソプロパノール、例えば少なくとも2、3、4、45のイソプロパノール、好ましくは少なくとも5のイソプロパノールを含む溶液を用いる少なくとも1回の洗浄工程に供される、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。組み換えαマンノシダーゼを含む第1の溶出液が、エチレングリコールまたはプロピレングリコールを含む水溶液を用いてマルチモードリガンドを含む樹脂から溶出される、請求項1~5のいずれか一項記載の方法。マルチモードリガンドを含む樹脂から得られるαマンノシダーゼを含む第1の溶出液が、αマンノシダーゼを含むフラクションを疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に適用して、組み換えαマンノシダーゼを含む溶出液を供給する工程、αマンノシダーゼを含むフラクションをミックスモードイオン交換樹脂に通して混入物質を保持させ、組み換えαマンノシダーゼを含むフロースルー液を供給する工程、およびαマンノシダーゼを含むフラクションを陰イオン交換樹脂によるクロマトグラフィーに供して、組み換えαマンノシダーゼを含む溶出液を供給する工程を含む方法にさらに供される、請求項1~6のいずれか一項記載の方法。αマンノシダーゼが、SEQIDNO2で示される配列の配列のアナログまたはの配列の部分配列から選択される配列を有する、請求項1~7のいずれか一項記載の方法。請求項1~8のいずれか一項記載の精製方法により得ることができるαマンノシダーゼを含む組成物。a第0日に、組み換えαマンノシダーゼを産生することができる細胞を、ベース培地を含む生産用リアクターに接種し、細胞培養物を供給する工程、b第1日から少なくとも1度、細胞培養物にフィード培地を添加する工程、c第3日以降または生存細胞密度が21MVCmLを上回ったときのいずれか早い方において、細胞培養物の温度を、最高でも35°C、例えば34°C、33°C、32°C、好ましくは最高でも31°Cに調節する工程を含む、組み換えαマンノシダーゼの半回分生産または連続生産のための方法。d請求項1~8のいずれか一項記載の精製方法をさらに含む、請求項10記載の方法。細胞培養物が、動物由来の任意の補助成分、例えばタラ肝油補助成分を本質的に含まない、請求項10または11記載の方法。少なくとも30L、例えば少なくとも50L、75L、100L、150L、200L、好ましくは少なくとも250Lの容量で実施される、請求項10~12のいずれか一項記載の方法。αマンノシダーゼが、SEQIDNO2で示される配列の配列のアナログまたはの配列の部分配列から選択される配列を有する、請求項10~13のいずれか一項記載の方法。請求項10~14のいずれか一項記載の生産方法により得ることができる、αマンノシダーゼを含む組成物。精製された組み換えαマンノシダーゼを含む組成物であって、該αマンノシダーゼの少なくとも80が130kDa糖タンパク質として存在する、組成物。組み換えαマンノシダーゼが、5°Cで保存される場合は少なくとも4日間、または20°Cで保存される場合は少なくとも24ヶ月間、溶液中で安定性を維持する、請求項16記載の組成物。αマンノシダーゼが、SEQIDNO2で示される配列の配列のアナログまたはの配列の部分配列から選択される配列を有する、請求項16または17記載の組成物。医薬として使用するための、請求項9および15~18のいずれか一項記載の組成物。αマンノシドーシスの処置において使用するための、請求項9および15~18のいずれか一項記載の組成物。αマンノシドーシス処置用の医薬の調製のための、請求項9および15~18のいずれか一項記載の組成物の使用。αマンノシドーシスを処置する、および/または、αマンノシドーシスに関連する症状を低減もしくは軽減する方法であって、請求項9および15~18のいずれか一項記載の精製された組み換えαマンノシダーゼを含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。以下では、本発明をより詳細に説明する。発明の詳細な説明定義本発明についてさらに詳細に考察する前に、まず以下の用語および慣例について定義する。組み換えαマンノシダーゼ本発明の文脈において、組み換えαマンノシダーゼは、その起源または操作により自然界で見い出される野生型αマンノシダーゼのすべてまたは一部と等しくないαマンノシダーゼと定義される。したがって、それは、少なくとも2つの融合されたDNA配列であってその第1の配列は自然界では通常、第2の配列と融合されていない配列を含むハイブリッドDNA配列である組み換えDNA分子に関連する組み換え技術を用いて構築される。組み換えαマンノシダーゼタンパク質は、ヒト起源であっても非ヒト起源であってもよい。特に、それは、組み換えヒトリソソームαマンノシダーゼrhLAMANであり得る。αマンノシダーゼ産物は、単一ポリペプチドまたは単一ポリペプチドおよびそのフラクションの混合物であり得る。また、αマンノシダーゼは、翻訳後修飾に供され、したがって糖タンパク質の形態であり得る。細胞培養細胞培養は、細胞を管理された条件下で成長させる方法である。本発明の文脈においては、細胞培養物中の細胞が関心対象のタンパク質、例えば組み換えαマンノシダーゼを発現するよう特別に設計されている。細胞培養は、化学的条件および物理的条件の管理を実現するよう特別に設計されているバイオリアクターにおいて行われ得る。フラクション本発明の文脈において、フラクションは、細胞培養物のフラクションを意味する。フラクションは、全細胞培養物を構成するものであり得るが、多くの場合は、培養物の処理されたフラクション、例えば清澄化された、ろ過された、濃縮された、希釈された、または部分精製されたフラクションである。樹脂本発明の文脈において、樹脂は、クロマトグラフィーシステムにおける固定相の基礎を構成するものであり、該システムには、関心対象の特定の分子またはタンパク質に対する一定量の親和性を提供するよう様々な化学基または物質が付加される。樹脂は、多くの場合、リガンドが共有結合的に付加されたポリマービーズであり、使用される液体移動相に対して不溶性のものである。マルチモードリガンドマルチモードリガンドは、少なくとも2つの様式で関心対象の分子またはタンパク質と相互作用するよう設計された任意のリガンドを意味する。個々の相互作用は、非依存的に、疎水性、親水性、イオン性、ファンデルワールス相互作用、水素結合または任意のその他の分子間の化学的もしくは物理的相互作用であり得る。本発明の文脈において、リガンドは、上記のような樹脂に付加された有機化学物質である。マルチモードリガンドは、移動相に溶解されてクロマトグラフィーカラムを通過する異なる物質に対して異なる親和性を有する。親和性の違いにより、異なる物質のクロマトグラフィーカラムにおける保持時間にばらつきが生じ、それによりそれらの物質の分離が実現する。保持時間はまた、その他の因子、例えば、移動相の構成成分、pHおよび温度にも依存する。マルチモードリガンドを含む樹脂は、ときには、ミックスモード樹脂とも称されるが、本発明の文脈においては、マルチモードリガンドを含む樹脂は、同一樹脂上に数種の異なるリガンドを含み、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂CHTの場合は反対の電荷、例えばOH、CaおよびPO42を有し得る、いわゆるミックスモードイオン交換樹脂と混同されるべきではない。ロード本発明の文脈において、ロードは、採取物、溶出液またはその他の溶液をクロマトグラフィーシステム、例えば、固定相として樹脂を含むクロマトグラフィーカラムに移すことを意味する。バッファーバッファーという用語は、弱酸および/もしくはそれに対応する塩または弱塩基および/もしくはそれに対応する塩のいずれかを含み、pHの変化に抗する溶液の一般的表現として周知である。本発明の文脈において、使用されるバッファーは、クロマトグラフィーシステムにおける使用に適したものであり、そのようなバッファーとして、リン酸バッファー、例えばリン酸二ナトリウムNa2HPO4、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム、酢酸バッファー、例えば酢酸ナトリウムもしくは酢酸カリウム、硫酸バッファー、例えば硫酸ナトリウムもしくは硫酸カリウム、硫酸アンモニウムもしくはHepes、またはその他のバッファー、例えばホウ酸ナトリウムもしくはtrisHClバッファーが含まれるがこれらに限定されない。限外ろ過限外ろ過は、水圧を利用してカットオフサイズまたはカットオフ値としても知られる特定サイズの孔を含む膜の向こう側に分子および溶媒を通過させる分離方法である。膜のカットオフ値よりも小さい分子量を有する分子のみが膜を通過することができ、それよりも大きな分子量を有する分子は膜を通過せずいわゆる非透過液retentateを形成する。したがって、非透過液中に存在する分子は、溶媒が膜を通過して流れ出るため、濃縮され得る。特定の態様において、ポリペプチド、例えばαマンノシダーゼを含む溶液または組成物の濃縮は、タンジェンシャルフローろ過TFFにより実施され得る。この方法は、大規模濃縮に、すなわち、1リットルから数百リットルの容量の溶液の濃縮に特に有用である。したがってこの方法は、産業規模での関心対象のポリペプチドの濃縮溶液の生産に特に有用である。TFF技術は、ろ過したい溶液を半透膜を通じて流し;膜孔より小さい分子のみ膜を通過させて、回収したい大きな物質を保持するろ液非透過液を形成させる特定装置の使用に基づく。TFF法では、2つの異なる圧が適用される;1つは溶液をシステムにポンプ供給しシステム中で循環させるためのものであり流入圧、もう一方の圧は小分子および溶媒に膜を通過させるよう膜をまたいで適用されるものである膜圧。流入圧は、典型的には、1~3バールの範囲、例えば15~2バールの間であり得る。膜間圧TMPは、典型的には、1バール超であり得る。関心対象のポリペプチドの濃縮組成物は、その組成物の濃縮にTFFが使用される場合、非透過液として回収され得る。TFFに有用な膜は、典型的には、再生セルロースまたはポリエーテルスルホンPES製であり得る。ダイアフィルトレーション本発明の文脈において、ダイアフィルトレーションは、関心対象の種を非透過液中に残し、すなわちフィルターを通過させず、その他の成分、例えばバッファーおよび塩はフィルターを通過させるろ過方法である。したがってダイアフィルトレーションは、例えば、あるバッファーを別のバッファーと交換するのに、または関心対象の種、例えば組み換えαマンノシダーゼを含む溶液を濃縮するのに使用され得る。本発明の第1の局面は、組み換えαマンノシダーゼを細胞培養物から精製する方法であって、組み換えαマンノシダーゼを含む細胞培養物のフラクションが、マルチモードリガンドを含む樹脂によるクロマトグラフィーに供される方法、を提供することである。本発明においてマルチモードリガンドを含む樹脂を使用する利点は、これらの樹脂が高い導電レベルを有する溶液中でαマンノシダーゼ種に結合することができる点にある。これは、高い導電レベルを有する未希釈の採取物を使用することができ、採取バッファーの交換が必要とならないという利点を有する。したがって、マルチモードリガンドを含むクロマトグラフィー工程は、好ましくは、細胞培養物からフラクションを単離した後の最初のクロマトグラフィー工程であり得る。マルチモードリガンドを含むクロマトグラフィー工程は、多くの場合、関心対象のタンパク質は当初はカラムに保持されすなわち捕捉されるのに対し、多くの不純物は洗浄工程の間にカラムを通過することから、捕捉工程と称されることがある。タンパク質はその後、特定の溶出バッファーを用いて溶出させる。したがって、本発明の一つの態様では、組み換えαマンノシダーゼを含む細胞培養物のフラクションが清澄化された未希釈の採取物である方法が提供される。本発明の文脈において、清澄化された未希釈の採取物という用語は、非溶解物または固形物を含まない、すなわち、清澄な溶液である、細胞培養の採取物を意味する。この採取物は、それを清澄な溶液に変換するための処理に供されている場合がある。そのような処理には、ろ過および遠心分離が含まれ得るがこれらに限定されない。さらに、この採取物は、クロマトグラフィー工程に供される前に大きくは希釈されていない。したがってこの採取物は、10未満、例えば7未満、5未満、2未満、1未満、05未満、たとえば01未満希釈される。最も好ましい態様において、この採取物は希釈されない。別の態様では、清澄化された未希釈の採取物が10~20mScm、例えば12~17mScm、好ましくは15mScmの導電率を有する方法が提供される。導電率は、採取物をクロマトグラフィーシステムにロードする前に測定される。一つの態様において、クロマトグラフィーは、カルボン酸基またはスルホン酸基を有するマルチモードリガンドを含む樹脂により行われる。これらのリガンドに含まれるカルボン酸および/またはスルホン酸は、クロマトグラフィーシステムの条件により、特に移動相のpHにより、プロトン化形態または脱プロトン化塩形態であり得る。さらに別の態様では、樹脂に結合されているマルチモードリガンドが、式I、IIまたはIII:の物質であって、式IIおよびIIIの物質のRが式IV:の官能基である物質である方法が提供される。式IVの官能基により表されるマルチモードリガンドは、一般にCibraconBlue3Gと呼ばれ、式I、IIおよびIIIの物質により表される市販品の例は、それぞれ、Capto商標MMC、Capto商標BlueおよびBluesepharose商標fastflowである。他の有用なマルチモード型の樹脂には、Capto商標Adhere、MEPHyperCel商標、HEAHyperCel商標およびPPAHyperCel商標が含まれる。本発明の文脈において、そのような樹脂は、組み換えαマンノシダーゼを含む未希釈採取物の初期精製に特に効果的であることが証明されている。本発明のさらなる態様は、マルチモードリガンドを含む樹脂にロードされた細胞培養物のフラクションが、イソプロパノール、好ましくは少なくとも1VVのイソプロパノール、例えば少なくとも2、3、4、45VVのイソプロパノール、好ましくは少なくとも5VVのイソプロパノールを含む溶液を用いる少なくとも1回の洗浄工程に供される方法を提供する。イソプロパノールを含む溶液を用いる利点は、それが望ましくない宿主細胞タンパク質HCPsの十分な除去を提供する点、特に、それが所望の130kDarhLAMAN種のタンパク質分解を担うプロテアーゼの除去を助ける点にある。HCPsは、生産時の細胞培養において使用される宿主細胞に関して内因的であるタンパク質と理解されたい。イソプロパノールが好ましいが、この方法において有用なその他のアルコールには、エタノール、nプロパノールおよびnブタノールが含まれる。さらに別の態様では、洗浄工程で使用される溶液のpHがpH35~65、例えばpH40~60、pH45~55、好ましくはpH47~50の範囲である方法が提供される。別の態様は、洗浄工程で使用される溶液が酢酸バッファー、好ましくは005~16M、例えば01~15M、05~14M、07~13M、08~12M、09~11Mの範囲、好ましくは095Mの濃度の酢酸バッファーを含む方法を提供する。酢酸バッファーは、好ましくは、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸アンモニウムからなる群より選択され得る。さらに別の態様は、組み換えαマンノシダーゼを含む第1の溶出液がエチレングリコールまたはプロピレングリコールを含む水溶液を用いてマルチモードリガンドを含む樹脂から溶出される方法を提供する。溶出バッファーへのエチレングリコールの添加は、溶出させる組み換えαマンノシダーゼの収率を大きく向上させることが見出された。プロピレングリコールも収率を向上させるが、エチレングリコールが好ましい。一つの態様は、水溶液中のエチレングリコールまたはプロピレングリコールの濃度が20~60、20~50、25~50、30~50、35~45、例えば40である方法を提供する。好ましい態様では、エチレングリコールまたはプロピレングリコールを含む水溶液が塩化ナトリウムを含む方法が提供される。この溶液への塩化ナトリウムの添加は、rhLAMAN酵素の溶出を促進することにより収率を大きく向上させることが見出された。別の態様において、エチレングリコールまたはプロピレングリコールを含む水溶液中の塩化ナトリウムの濃度は02~24Mの範囲、例えば04~22M、06~20M、08~19M、10~18M、12~17M、14~16Mの範囲、好ましくは15Mである。あるいは、塩化ナトリウムの濃度は、02~16Mの範囲または14~24Mの範囲であり得る。好ましい態様において、エチレングリコールまたはプロピレングリコールを含む水溶液は、バッファーを含む。バッファーは、好ましくはリン酸バッファー、例えばリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムであり得る。リン酸バッファーが好ましいが、この水溶液に有用なさらなるバッファーには、クエン酸バッファーおよびホウ酸バッファー、Tris、MES、MOPSおよびHepesバッファーが含まれる。別の好ましい態様において、エチレングリコールまたはプロピレングリコールを含む水溶液中のバッファー塩の濃度は、50~350mM、55~300mM、65~280mM、70~250mM、75~200、80~200mM、85~150mM、好ましくは90mMである。さらに別の好ましい態様において、エチレングリコールまたはプロピレングリコールを含む水溶液のpHは、pH70~90、例えばpH71~85、pH72~83、pH75~80、好ましくはpH77である。一つの態様では、マルチモードリガンドを含む樹脂から得られるαマンノシダーゼを含む第1の溶出液がさらに以下の工程を含む方法に供される方法が提供される:αマンノシダーゼを含むフラクションを疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に適用して、組み換えαマンノシダーゼを含む溶出液を供給する工程、αマンノシダーゼを含むフラクションをミックスモードイオン交換樹脂に通して混入物質を保持させ、組み換えαマンノシダーゼを含むフロースルー液を供給する工程、およびαマンノシダーゼを含むフラクションを陰イオン交換樹脂によるクロマトグラフィーに供して、組み換えαマンノシダーゼを含む溶出液を供給する工程。一つの態様では、上記の工程~を含み、工程のフラクションはマルチモードリガンドを含む樹脂による精製に供されたものであり、工程のフラクションは工程の溶出液由来であり、そして工程のフラクションは工程のフロースルー液由来である方法が提供される。換言すると、工程からは列挙されている順に実施される。しかし、工程からの間の中間工程は排除されない。これらは、中間精製工程および/またはウイルス削減もしくは除去工程であり得る。好ましい態様において、工程の疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は、アルキル置換樹脂、好ましくはブチルセファロース樹脂である。アルキル置換樹脂には、エチル、ブチルおよびオクチルセファロース樹脂が含まれ得る。さらに、フェニルセファロース樹脂もまた適用可能である。そのような樹脂の例は、ButylSSepharose商標6FastFlow、ButylSepharose商標4FastFlow、OctylSepharose商標4FastFlow、PhenylSepharose商標6FastFlowおよびPhenylSepharose商標6FastFlow、ButylSepharose商標HighPerformance、PhenylSepharose商標HighPerformanceである。疎水性相互作用樹脂、特にブチルセファロース樹脂を用いる精製工程の利点は、rhLAMAN酵素の収率の良さを維持しつつ宿主細胞タンパク質、特にDNA残留物を効率的に除去する点にある。さらに別の態様において、工程は、少なくとも1回の洗浄工程を含み、洗浄に使用される溶液は、リン酸バッファーおよび酢酸バッファー、好ましくはリン酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムを含む。このデュアルバッファー洗浄工程は、宿主細胞タンパク質およびDNA残留物等の不純物の除去に特に効果的であることが証明された。さらに別の態様において、工程のデュアルバッファー洗浄におけるリン酸バッファーの濃度は、5~40mM、例えば10~30mM、15~25mMの範囲、好ましくは20mMであり、酢酸バッファーの濃度は、09~15M、例えば10~14M、11~13Mの範囲であり、好ましくは12Mである。別の態様において、工程は、少なくとも1回の洗浄工程を含み、洗浄に使用される溶液は、1種類のバッファーのみ、好ましくはリン酸バッファー、好ましくはリン酸ナトリウムを含む。別の態様において、1種類のバッファーのみを含む少なくとも1回の洗浄工程の1種類のバッファーは、04~08M、例えば05~07Mの範囲、好ましくは06Mの濃度で存在する。一つの態様では、工程のミックスモードイオン交換樹脂が、セラミックヒドロキシアパタイトまたはフルオロアパタイト樹脂、好ましくはセラミックヒドロキシアパタイトI型CHTI樹脂である方法が提供される。このクロマトグラフィー工程を適用することにより、組み換えαマンノシダーゼ組成物から相当量のDNA不純物が効果的に分離されること、および宿主細胞タンパク質は結合するがrhLAMAN酵素産物はカラムに結合せずに通過することが示された。別の態様において、工程の陰イオン交換樹脂は、強陰イオン交換樹脂、例えば第4級アンモニウム強陰イオン交換樹脂である。そのような樹脂には以下の例が含まれるがこれらに制限されない:Qsepharose商標HP、Qsepharose商標FF、DEAEsepharose商標、Capto商標Q、Uno商標Q、ANXsepharose商標。さらに別の態様では、ウイルス不活性化工程が好ましくは工程と工程の間に行われる方法が提供される。好ましい態様において、ウイルス不活性化工程は、工程のフロースルー液とイソプロパノールの水溶液の少なくとも2時間の混合フロースルー液/イソプロパノール水溶液の11VVを含み、好ましくはその後に限外ろ過による濃縮およびダイアフィルトレーションを用いるイソプロパノールの除去を含む。不活性化中のイソプロパノール水溶液は、10~50のイソプロパノール、例えば20~40、25~35、28~32の範囲、好ましくは30のイソプロパノールであり得る。したがってフロースルー液およびイソプロパノール水溶液の11VV溶液は、15のイソプロパノール終濃度を有する。別の好ましい態様は、ウイルス削減工程が好ましくはクロマトグラフィー工程の後に行われる方法である。一つの態様において、ウイルス削減工程は、フィルター、好ましくはウイルス除去用フィルター、例えばultipor商標VFgradeDV20フィルターまたはplanova商標15Nもしくは20Nフィルターを通じた組み換えαマンノシダーゼを含む溶液、好ましくは工程の溶出液のろ過を含む。好ましくは、Planova商標15Nフィルターが使用される。本発明の精製方法は、大規模で実施され得る点で有利であり、したがって好ましい態様において、この方法は、少なくとも05L、例えば少なくとも10L、20L、50L、10L、好ましくは少なくとも130Lのカラム容量を有するクロマトグラフィーカラム上で実施される。本発明の別の態様では、αマンノシダーゼが、SEQIDNO2で示される配列Aの配列のアナログまたはの配列の部分配列から選択される配列を有する上記の精製方法が提供される。ここで、SEQIDNO2により示される配列は、WO02099092に提供される組み換えヒトリソソームαマンノシダーゼrhLAMANのアミノ酸配列を表す。部分配列は、親配列の50以上、例えば親配列の55、60、65、70、75、80、85、90以上または95以上のサイズを有する親配列のフラグメントを意味する。したがって、関心対象の部分配列は、505~1009連続アミノ酸残基、例えば、525~1009、550~1009、575~1009、600~1009、625~1009650~1009、675~1009、700~1009、725~1009、750~1009、775~1009、800~1009、825~1009850~1009、875~1009、900~1009、925~1009、950~1009、975~1009、980~1009、990~1009または例えば1000~1009連続アミノ酸残基の長さを有し得る。さらに、SEQIDNO2またはそのアナログの関連部分配列は、触媒部位を保持していなければならない。ヒトLAMANの3D構造は知られていないが、ウシLAMANの3D構造は報告されており、そのデータに基づいて、以下のアミノ酸がヒトLAMANにおいても活性部位に関与しているおよび/または活性に必要なZn2原子の配位を担っていると結論付けられている:AA72H、AA74D、AA196D、AA446HUniProtKBSwiss~Protデータベース:O00754MA2B1HUMANHeikinheimoetalJMolBiol327631~6442003。ヒトLAMANにおけるAA72および196の変異は酵素活性をほぼ完全に消失させることが示されているHansenetalBiochemJ381pp537~567。活性を発揮するために、rhLAMANの部分配列は、少なくとも上記の4つのアミノ酸を含む領域を保持しているのがよい。好ましくは、rhLAMANの部分配列はまた、例えば結合部位、βターン、ジスルフィド架橋、停止コドン等を含む1つまたは複数の追加の立体配座部分を含む。LAMANのヒト形態にはいくつかの疾患誘発変異が存在し、これが特定のアミノ酸、例えばAA53、72、77、188、200、355、356、359、402、453、461、518、563、639、714、750、760、801、809、916SEQIDNO1で示される核酸配列、および上記のSEQIDNO2で示される配列の部分配列またはアナログをコードする核酸配列、からなる群より選択される核酸配列を含み得る。細胞は、好ましくは、WO02099092に記載されるような、組み換え酵素を生産する目的のために特別に構築されたrLAMANチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞系であり得る。この細胞系の培養物DSMACC2549は、2002年6月6日に、ブタペスト条約に基づく特許寄託の目的で、DSMZGmbHMaschroderweg1bD38124BraunschweigGermanyに寄託されている。この細胞は、SEQIDNO1で示される配列を有する発現プラスミドpLamanExp1を用いて得ることもできる。工程a~cの方法はさらに、以下の工程、d細胞培養物から組み換えαマンノシダーゼを精製する方法であって、組み換えαマンノシダーゼを含む細胞培養物のフラクションを上記のカルボン酸基またはスルホン酸基を有するマルチモードリガンドを含む樹脂によるクロマトグラフィーに供する、方法、を含み得る。さらに別の態様において、生産方法において使用される細胞培養物は、動物由来の任意の補助成分、例えばタラ肝油補助成分を本質的に含まない。そのような補助成分の使用を回避することで、最終酵素生産物へのウイルスの混入の危険性が低下する。生産方法の一つの好ましい態様において、半回分生産または連続生産の未希釈採取物は、少なくとも01gL、例えば少なくとも02gL、03gL、04gL、好ましくは少なくとも05gLのαマンノシダーゼ濃度を有する。別の態様において、半回分生産または連続生産の未希釈採取物は、3~35UmL、例えば5~35UmL、7~35UmLの範囲、好ましくは10~35UmLの範囲の酵素活性を有する。さらなる方法の最適化により、採取物の酵素活性は35UmLよりもさらに高くなり得ることを理解されたい。この生産方法は、大規模に実施され得る点で有利である。したがって一つの態様において、半回分生産または連続生産のための方法は、少なくとも30L、例えば少なくとも50L、75L、100L、150L、200L、好ましくは少なくとも250Lの容量で実施される。本発明の別の態様では、αマンノシダーゼが、SEQIDNO2で示される配列Aの配列のアナログまたはの配列の部分配列から選択される配列を有する上記の生産方法が提供される。本発明の別の態様は、上記の生産方法により得ることができるαマンノシダーゼを含む組成物である。そのような組成物は、好ましい態様において、追加の有効生産物成分activeproductingredientsAPI、アジュバントおよび/または賦形剤を含み得る。本発明の第3の局面では、精製された組み換えαマンノシダーゼを含む組成物であって、αマンノシダーゼの少なくとも80が130kDa糖タンパク質として存在する組成物が提供される。好ましい態様では、精製された組み換えαマンノシダーゼを含む組成物であって、組み換えαマンノシダーゼが、5°Cで保存される場合は少なくとも4日間、または20°Cで保存される場合は少なくとも24ヶ月間、溶液中で安定性を維持する、組成物が提供される。rhLAMAN酵素生産物用の処方バッファー溶液に関する本発明の好ましい組成が以下に記載され、それにより達成される安定性も列挙されている。Na2HPO4350mM二塩基リン酸ナトリウムNaH2PO4017mM一塩基リン酸ナトリウムグリシン27mMマンニトール250mMpH770、290mOsmkg等張液使用時安全性:安定溶液5°C4日20°C6時間20°C24ヶ月凍結乾燥5°C24ヶ月本発明の別の態様では、αマンノシダーゼが、SEQIDNO2で示される配列Aの配列のアナログまたはの配列の部分配列から選択される配列を有する上記の組成物が提供される。別の好ましい態様は、医薬として使用するための、上記の精製された組み換えαマンノシダーゼを含む組成物である。さらなる態様において、上記の精製された組み換えαマンノシダーゼを含む組成物は、αマンノシドーシスの処置において使用するためのものである。さらに別の態様は、αマンノシドーシス処置用の医薬の調製のための、上記の精製された組み換えαマンノシダーゼを含む組成物の使用である。別の態様は、αマンノシドーシスを処置するおよび/またはαマンノシドーシスに関連する症状を低減もしくは軽減する方法であって、上記の精製された組み換えαマンノシダーゼを含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法である。本発明の局面の一つの文脈において記載される態様および特徴は、本発明の他の局面にも適用されることに留意されたい。本願において引用されているすべての特許文献および非特許文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。ここからは、以下の非限定的な実施例により本発明をさらに詳細に記載する。使用される略語:CIP:定置洗浄CleanInPlaceCV:カラム容量Cv:生存細胞密度DF:ダイアフィルトレーションDO:溶存酸素IPA:イソプロパノールMVCmL:106生存細胞mLNaPi:リン酸ナトリウムNaAc:酢酸ナトリウムOD:光学密度EG:エチレングリコールTFF:タンジェンシャルフローろ過TMP:膜間圧UF:限外ろ過実施例1本発明の好ましい精製手順全般αマンノシダーゼを最適な収率および純度で得るための本発明の精製手順を以下に記載する。個々の樹脂について定められた標準的な樹脂再生クリーニング条件を使用する実施例2~5を参照。使用する樹脂は、GEhealthcarelifesciencesおよびBioRadから入手できる。αマンノシダーゼの生産物から採取物のフラクションを供給し、このフラクションを大きく希釈せずに清澄化する。好ましくは希釈を全く行わない。上記のフラクションについて、マルチモードリガンドを含む樹脂によるカラムクロマトグラフィーを含む捕捉工程を実施する。これらの樹脂は、Capto商標MMC、Capto商標Adhere、PlasmidSelect商標Xtra、Capto商標Blue、BlueSepharose商標FastFlow樹脂、MEPHyperCel商標、HEAHyperCel商標およびPPAHyperCel商標からなる群より選択する。pH45~85で数回の洗浄を行い、その洗浄バッファーを、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、MES、MOPS、Hepes、ホウ酸ナトリウム、trisHCl、クエン酸バッファーまたはそれらの組み合わせ以下、バッファーグループAからなる群より選択する。しかし、少なくとも1回の洗浄において、洗浄溶液はイソプロパノールを含み、pHはpH4~6の間とする。溶出バッファーはバッファーグループAから選択され、溶出溶液はエチレングリコールを含む。溶出pHをpH70~85に維持する。αマンノシダーゼを含む組成物について、疎水性相互作用樹脂によるカラムクロマトグラフィーを含む能動中間工程を実施する。これらの樹脂は、ButylSSepharose商標6FastFlow、ButylSepharose商標4FastFlow、OctylSepharose商標4FastFlow、PhenylSepharose商標6FastFlowおよびPhenylSepharose商標6FastFlow、ButylSepharose商標HighPerformance、PhenylSepharose商標HighPerformanceからなる群より選択する。pH7~8で数回の洗浄を行う。洗浄バッファーを、バッファーグループAから選択する。溶出バッファーもバッファーグループAから選択し、溶出pHはpH7~8の間とする。αマンノシダーゼを含む組成物について、ミックスモードイオン交換樹脂によるカラムクロマトグラフィーを含む受動中間工程を実施し、フロースルー液を供給する。これらの樹脂は、セラミックヒドロキシアパタイトI型もしくはII型好ましくはI型樹脂またはフルオロアパタイトからなる群より選択する。pH7~8で1回の洗浄を行い、フロースルー液を供給する。洗浄バッファーを、バッファーグループAから選択する。αマンノシダーゼを含む組成物について、陰イオン交換樹脂によるカラムクロマトグラフィーを含む洗練polishing工程を実施する。これらの樹脂は、Qsepharose商標HP、Qsepharose商標FF、DEAEsepharose商標、Capto商標Q、Uno商標Q、ANXsepharose商標からなる群より選択する。pH7~8で数回の洗浄を行う。洗浄バッファーを、バッファーグループAおよびTRISHClバッファーから選択する。溶出バッファーもバッファーグループAから選択し、溶出pHはpH7~8の間で維持する。αマンノシダーゼの溶液をイソプロパノールと接触させることによって、ウイルス不活性化工程を実施する。ナノろ過を用いてウイルス除去工程を実施する。本発明にしたがうαマンノシダーゼを含む精製組成物の収率および生産物の成分比を、従来法との比較と共に、以下の表1に示す。同表において:方法1は、本発明にしたがう好ましい方法である。方法2は、方法1と同様であるが洗練工程がない。同法は、捕捉工程についてのイソプロパノールを含む洗浄工程もなく、能動中間工程において数回の洗浄が行われ、そして最後にウイルス不活性化/除去工程がない。方法3は、WO02099092に記載されているものであるマルチモードリガンドを使用しない。表1従来および本発明の精製手順により得られる収率および純度実施例10および図7も参照のこと。実施例2マルチモードリガンドを用いるクロマトグラフィー捕捉工程αマンノシダーゼを含む清澄化された未希釈の採取物は、ミックスモードの相互作用により、マルチモードリガンド型の樹脂、例えばこの実施例で使用するCapto商標MMCに結合する。塩を増やしエチレングリコールを添加することにより生産物が溶出する。Capto商標MMCのキャパシティは、260Uml樹脂であった。捕捉段階は、以下の工程を用いて実施した。1~2カラム容量CVの3MNaCl、pH10~12を300cmhrで用いてカラムを再生する。5CVの50mMリン酸ナトリウムバッファーNaPi、015MNaClpH75を300cmhrで用いて平衡化する。清澄化された未希釈の採取物導電率は約15mScmを300cmhrでロードする。洗浄1:4CVの平衡化バッファー。洗浄2:3CVの095MNaAc、5イソプロパノール、pH49を300cmhr。洗浄3:4CVの平衡化バッファー安定なベースラインまで、すなわち5mmフローセルについて約006Auまでを300cmhr。6CVの15MNaCl、40エチレングリコールを含有する90mMNaPi、pH77を用いて最大120cmhrで生産物を溶出させる。吸光度が上昇新しいベースラインからおよそ10mAuしたら回収を開始する。約4CV回収する。上記のように、3CV、下降流方向、最大120cmhrにてカラムを再生する。好ましくは上昇流方向にて、3CVのH2O、3CVの1MNaOH約60分の接触時間、2~3CVのリン酸バッファー、pH約7、3CVの20mMリン酸ナトリウム20エタノールを用いて定置洗浄CIPおよび浄化処理を行う。20mMリン酸ナトリウム20エタノール中で保存する。表2は、精製スキームの例を示す。表3は、その工程の概要である。図2は、この工程におけるクロマトグラムの例を示す。表2捕捉段階の精製スキーム:135x2ml27mlXK16カラムにCapto商標MMCを充填次ページに続く表3Capto商標MMC捕捉段階における条件の概要実施例3疎水性相互作用を使用するクロマトグラフィー中間能動工程αマンノシダーゼを含む捕捉段階由来の生産物は、硫酸ナトリウムの添加後に、疎水性相互作用により、疎水性相互作用型の樹脂、例えばこの実施例で使用するButylSepharose商標4FFに結合する。塩濃度を下げると生産物が溶出する。そのキャパシティは195Uml樹脂であった。中間能動段階では以下の工程を用いた。1CVの20mMリン酸ナトリウムNaPiバッファー、pH75を用いて100cmhrでカラムを再生する。5CVの05MNa2SO4、20mMNaPi、pH75を用いて150cmhrでカラムを平衡化する。工程1由来の生産物のプールを同容量の20mMNaPi、08MNa2SO4、pH75と混合し、それを70cmhrでカラムにロードする。混合はインラインでまたはロード開始の最大3時間前に実施することができる。11容量:容量vvの混合物は、およそ1111重量:重量wwに相当する溶出液:硫酸ナトリウムバッファー。必要な場合、調整済のロード液を、ロードの前に045μmフィルター親水性PESまたはPVDFを通してろ過してもよい。3CVの平衡化バッファーを用いて70cmhrでカラムを洗浄し、前の工程由来の宿主細胞タンパク質と共にエチレングリコールを除去する。35CVの20mMNaPi、12MNaAc、pH75を用いて100cmhrで洗浄する。35CVの06MNaPi、pH70を用いて150cmhrで洗浄する。4CVの60mMNaPi、pH75を用いて150cmhrで生産物を溶出する。吸光度の最初の上昇からベースラインに到達するまでの約2CVのピークを回収する。2CVの20mMNaPi、pH75、続いて3CVのH2Oを用いて150cmhrでカラムを再生する。3CVの1MNaOH60分の接触時間、1CVのH2O、1~3CVのリン酸バッファー、および2CVの20mMリン酸ナトリウム20エタノールを用いて、クリーニングおよび浄化処理を行う。20mMリン酸ナトリウム20エタノール中で保存する。表4は、精製スキームの例を示す。表5は、その工程の概要である。図3は、この工程におけるクロマトグラムの例を示す。表4135cmx2cm227mlXK16カラムに充填したButylSepharose商標4FFを用いる中間能動精製スキーム次ページに続く表5ButylSepharose商標4FF工程における条件の概要実施例4ミックスモードイオン交換を使用するクロマトグラフィー中間受動工程中間能動工程由来のαマンノシダーゼを含む2つの溶出液をプールし、水と11重量:重量で混合して導電率を低下させ、これをミックスモードイオン交換樹脂、例えばこの実施例においてはセラミックヒドロキシアパタイトICHTI樹脂にロードした。生産物は結合せずに通過し、宿主細胞タンパク質はカラムに結合する。生産物を含むフロースルー液を回収した。そのキャパシティは550Uml樹脂であった。この中間受動段階の実施例においては以下の工程を用いた。2CVの06MNaPi、pH70を用いて300cmhrでカラムを再生する。5CVの60mMNaPi、pH75を用いて300cmhrでカラムを平衡化する。工程2由来の調整済の溶出液を300cmhrでロードし、生産物を含むフロースルー液を回収する。ロード液の導電率およびpHは、それぞれ約10mScmおよび73であろう。ODが20mAuに上昇してからODが20mAuに戻るまでの、おおよそロード液容量分および2CV洗浄分の生産物を含むフロースルー液を回収する。工程の最後に生産物プールを045μm親水性PESまたはPVDFフィルターでろ過する。4CVの平衡化バッファーを用いて300cmhrでカラムを洗浄する。3CVの06MNaPi、pH70を用いて300cmhrで再生する。3CVの1MNaOH60分の接触時間、1CVの60mMNaPi、pH75および2CVの20mMリン酸ナトリウム20エタノールを用いてクリーニングおよび浄化処理を行う。20mMリン酸ナトリウム20エタノール中で保存する。表6は、精製スキームの例を示す。表7は、その工程の概要である。図4は、この工程におけるクロマトグラムの例を示す。表610cmx2cm2XK16カラムに充填したCHTIを用いる中間受動段階の精製スキーム表7CHTI工程における条件の概要次ページに続く実施例5ウイルス不活性化工程ウイルスの不活性化は、この方法の異なる段階で実施され得る。この実施例では、ウイルスの不活性化を、中間受動工程後かつ洗練工程前に実施した。αマンノシダーゼを含む中間受動プールのウイルス不活性化は、21±5°Cで15イソプロパノール30イソプロパノール水溶液との11混合物を用いる135±15分間のインキュベーションにより行う。タンクを4°Cの冷却ジャケットにより冷却し、プロセスを21±5°Cで維持した。100kDaポリエーテルスルホン膜ScreenAMilliporeまたはSartorius製を用いるタンジェンシャルフローろ過TFFを用いてイソプロパノールを除去し、リン酸ナトリウムバッファーに交換した。この実施例においては、以下の工程をウイルスの不活性化に用いた。中間受動工程由来の生産物フロースルー液を、30イソプロパノールを1094ww相当の11vvで含有する60mMリン酸ナトリウムと混合する。例えば、再循環ポンプ供給により混合する。生産物のタンパク質濃度は、約03~1mgmlとなろう。溶媒/生産物プールを室温で135±15分間インキュベートする。TFF膜を60mMリン酸ナトリウムバッファーで平衡化する。膜間圧TMP11バール、21±5°C、流入圧約14~15バールおよび流出圧約07~08バールの限外ろ過によりこのプールを目標濃度2mgml05~3mgmlまで濃縮する。60mMリン酸ナトリウムバッファーに対するダイアフィルトレーションにより約6容量分を交換する。TMP1バール流入14バール/流出06バールで開始する。1容量分が交換された後、TMPを11に上げることができる。非透過液を回収する。膜を2~3システム容量の希釈バッファーでリンスし、緩やかに結合している生産物を取り除く。このリンス液を非透過液と共に回収する。最終目標タンパク質濃度は、2mgml05~3mgmlである。膜をH2O、続いて05MNaOH60分間の接触時間でクリーニングする。01MNaOH中で保存する。表10は、ウイルス不活性化/TFF工程における条件を示す。表10ウイルス不活性化/TFF工程における条件の概要NaPi60mMリン酸ナトリウム、pH75実施例6陰イオン交換を用いるクロマトグラフィー洗練工程陰イオン交換樹脂、例えばこの実施例では第4級アンモニウム高性能強陰イオン交換樹脂QSepharose商標HP樹脂に対してイオン性相互作用により結合させるため、中間受動工程由来のαマンノシダーゼを含む非透過液の導電率を、調整バッファー20mMTrisHCl、10mMNaCl、75mMマンニトール、0005tween商標80、pH75による6倍希釈により低下させた。非透過液は、ロードする前に直接希釈するかまたはインライン希釈した。生産物は、塩化ナトリウムの添加により、予め1CVの溶出バッファーで満たしておいた容器に溶出させた。そのキャパシティは400Uml樹脂である。この実施例における洗練段階では以下の工程を用いた。1CVの50mMNaPi、1M塩化ナトリウム、pH75を用いて、120cmhrでカラムを再生する。5CVの20mMTrisHCl、10mM塩化ナトリウム、pH75を用いて、120cmhrでカラムを平衡化する。工程4由来の希釈した非透過液を、120cmhrでロードする。5CVの平衡化バッファーおよび1CVの20mMリン酸ナトリウム、pH75を用いて、120cmhrでカラムを洗浄する。1CVの溶出バッファーで予め満たしておいた容器に、4CVの50mMリン酸ナトリウム、02M塩化ナトリウム、pH75を用いて120cmhrで生産物を溶出する。吸光度の最初の上昇10~20mAuで回収開始から30~50mAu2mmフローセルまでのピーク、05~15CV分を回収する。3CVの50mMNaPi、1M塩化ナトリウム、pH75を用いて120cmhrでカラムを再生する。3CVの1MNaOH60分間の接触時間および3CVの10mMNaOHを用いてクリーニングおよび浄化処理を行う。10mMNaOH中で保存する。表8は、精製スキームの例を示す。表9は、その工程の概要である。図5は、クロマトグラムの例を示す。表8QSepharose商標HP樹脂19cmx2cm238mlを用いる洗練工程の精製スキームの例次ページに続く表9QSepharose商標HP工程における条件の概要次ページに続く実施例7ウイルス削減工程ウイルスの削減は、この方法の異なる段階で実施され得る。この実施例では、ウイルスの削減を、洗練工程の後で実施した。洗練工程由来の溶出液を、01μmの事前ろ過の後に、Planova商標15Nフィルターを通じてナノろ過する。以下の工程を用いた。洗練工程由来の溶出液を01μmフィルターを通じて事前ろ過する。このフィルターを少量の50mMリン酸ナトリウム、02M塩化ナトリウム、pH75でリンスし、緩やかに結合している生産物を取り除く。溶出液を、08バール圧、室温でろ過する。このろ過の後に、50mMリン酸ナトリウム、02M塩化ナトリウム、pH75を用いてPlanova15システムのおよそ3容量分の事後洗浄を行う。実施例8処方および保存100kDa、ScreenA、ポリエーテルスルホン膜Sartorius商標またはMillipore商標を用いるタンジェンシャルフローろ過TFFによりバッファーを処方バッファーに交換する。タンクを4°Cの冷却ジャケットにより冷却することで、方法を21±5°Cで維持することができる。概算キャパシティは100lm2である。以下の工程を処方および保存に使用した。膜を35mMNa2HPO4、017mMNaHPO4、250mMマンニトール、27mMグリシン、pH77処方バッファーにより平衡化する。αマンノシダーゼを含む精製生産物を、およそ1容量の処方バッファーを用いて目標濃度2~3mgmlに希釈する。生産物中のタンパク質濃度が低い場合は、処方バッファーによる希釈前の容量を減らし、4~6mgmlに濃縮することが可能であるしかしそれは必須ではない。TMP08および21±5°Cでの限外ろ過により目標濃度6mgmlまで約2倍濃縮する。TMP08、21±5°Cでの処方バッファーに対するダイアフィルトレーションにより、6容量分交換する。限外ろ過により約15倍濃縮し、非透過液を回収する。膜を1システム容量の処方バッファーでリンスし、緩やかに結合している生産物を取り除く。このリンス液を非透過液と共に回収する。代替法は、リンス液をOD280で測定し、それが生産物を含む場合のみプールすることである。最終目標タンパク質濃度は、7±2mgmlである。膜をH2O、その後に05MNaOH60分の接触時間によりクリーニングする。01MNaOH中で保存する。表11処方用TFF工程における条件の概要次ページに続く生産物を5mgmlに希釈し、無菌ろ過した。ろ過した原体でボトルを充填し、凍結する。実施例9αマンノシダーゼ用の半回分培養方法細胞を解凍した後、その細胞を震盪フラスコ、10Lシードバイオリアクターおよび50Lシードバイオリアクター中で増殖させ、その後にそれらを生産用バイオリアクター250Lに移した。生産用バイオリアクターの接種日における、50Lシードバイオリアクター中の細胞密度は2から25MVCmLの間であった。細胞は、接種完了時の細胞懸濁物の容量が100Lとなるように、05MVCmLの細胞密度でシードバイオリアクターから生産用リアクターに接種した。接種日を第0日と呼び、その次の日を第1日と呼び、以下同様とする。第1日から実験最終日まで、既定の割合でブースト中、毎日、フィード培地を添加した以下参照。第1日から実験最終日まで、既定の割合およびルールでブースト中、毎日、グルタミンおよびグルコースを添加した以下参照。生存細胞密度が≧22MVCmLになる日または第3日のいずれか早い方において、温度を生産温度に下げた。表12実際の温度および実験条件第0日から第2日の間、pH制御のためにCO2のみを自動添加した。アルカリは、pHが660になるまで添加しなかった。ベース培地2mMグルタミンが補充された、111mM2gLグルコースを含むACF培地ExCell302、SAFC。最大3日間、すなわちバイオリアクターの無菌試験の間、グルタミンを含まないベース培地を生産用バイオリアクターに移して365°Cで保存することができる。それ以外の場合は、培地を4°Cで保存する。フィード培地フィード培地E35は、グルタミンを含まず111mMグルコースを含むACF培地で希釈した35CHOCDEfficientFeedBInVitrogenカタログ番号SKUA1024001フィード濃縮物とした。フィード培地は、4°Cの暗所で保存した。フィード培地は、培養中室温で最大96時間、すなわち4日間、暗所で維持できる。表131日あたりの添加したフィード培地の容量添加物a2500mMグルコースのストック溶液。b200mMグルタミンのストック溶液。cアルカリ05MNa2CO3。フィード培地、グルコースおよびグルタミンの送達ブースト中、フィード培地は毎日ポンプ供給した。ブースト中、グルコースおよびグルタミンは、グルコースおよびグルタミンのストック溶液を以下の量で毎日添加し、それらの濃度を所定の目標範囲内で維持した。グルタミン添加ルール:第1日から第3日:バイオリアクター中のグルタミン濃度が2mMとなる容量のグルタミンストック溶液を添加する。第4日以降:バイオリアクター中のグルタミン濃度が1mMとなる容量のグルタミンストック溶液を添加する。グルコース添加ルール:第0日から第8日:グルコースストック溶液を添加しない。第9日以降:生産用バイオリアクター中のグルコース濃度が≦8mMとなった場合、バイオリアクター中のグルコース濃度が8mMとなる容量のグルコースストック溶液を添加する。方法の全体像:表15培養方法の日単位の全体像実施例10αマンノシダーゼを含む精製生産物の特徴付け以下の表16は、本発明の精製スキームが、130kDa糖タンパク質種の比率がそれぞれ75および55kDaの分解産物と比較して高い割合でαマンノシダーゼを提供したことを示している。同表はまた、マルチモードリガンドを含む捕捉工程および中間能動工程の両方における改良された洗浄工程ならびにQsepharoseHP洗練工程を含む4工程精製方法を用いる250L方法が、収率、全体純度および130kDa種の収率のすべてに関して3工程方法を用いる30L方法よりも良い結果をもたらしたことを示している。表16精製生産物におけるαマンノシダーゼ種の収率種の分布は、3つの方法についての図7のHPLCダイヤグラムで確認され、上表はそれぞれ4工程方法および3工程方法を表している。示されている2工程方法は、マルチモードリガンド工程を用いないものである。左側から見て最初のピークは55kDa種であり、続いて、それぞれ130kDa種および75kDa種である。参考文献