"間葉系幹細胞MSCの培養上清を含む腸炎の予防治療剤。MSCの培養上清が、MSCを低酸素濃度下で培養して得られる培養上清である請求項1に記載の腸炎の予防治療剤。間葉系幹細胞MSCが、骨髄間葉系幹細胞BMSCである請求項1又は2に記載の腸炎の予防治療剤。腸炎が、炎症性腸疾患である請求項1~3のいずれかに記載の腸炎の予防治療剤。本発明の課題は、腸炎の優れた予防治療剤を提供することにある。前述の非特許文献1は、MSC投与によって、腸炎からの回復が促進されることを開示している。しかし、かかる効果は、粘膜固有層の間質に時折生着したMSCが再プログラミングされて、周皮細胞、血管平滑筋細胞、筋繊維芽細胞などの筋系細胞に分化することによると考えられた。すなわち、腸炎の回復を促進するためには、MSC自体が必須であると考えられた。しかし、本発明者らは、腸炎の予防や、治療に関して、従来の知見に囚われることなく鋭意研究を進めたところ、意外なことに、MSCの培養上清が腸炎の予防治療効果を有していることを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、1間葉系幹細胞MSCの培養上清を含む腸炎の予防治療剤や、2MSCの培養上清が、MSCを低酸素濃度下で培養して得られる培養上清である上記1に記載の腸炎の予防治療剤や、3間葉系幹細胞MSCが、骨髄間葉系幹細胞BMSCである上記1又は2に記載の腸炎の予防治療剤や、4腸炎が、炎症性腸疾患である上記1~3のいずれかに記載の腸炎の予防治療剤に関する。本発明によると、腸炎の予防、治療や、改善が可能となる。また、本発明によると、MSC自体を用いる非特許文献1のような場合とは違って、薬剤を調製する施設は通常の施設でもよいため、必要な時期に必要な量を確保し易く、また、患者の拒絶反応を考慮する必要がないので、MSC自体を用いる場合と比較して簡便性及び利便性に非常に優れている。本発明の腸炎の予防治療剤以下、単に本発明の予防治療剤とも表示する。としては、間葉系幹細胞MSCの培養上清を含んでいる限り特に制限されず、本発明における腸炎としては、腸炎である限り特に制限されず、具体的には、潰瘍性大腸炎、クローン病、抗がん剤や抗生物質等の薬剤による薬剤性腸炎、放射線による放射線腸炎等を好適に例示することができ、中でも、潰瘍性大腸炎、クローン病を好適に例示することができる。本発明の作用機序の詳細は不明であるが、MSCの培養上清に含まれている、MSC由来の何らかの活性成分が、腸炎に対して予防治療効果を発揮しているものと考えられる。本明細書におけるMSCの培養上清とは、MSCが増殖し得る条件の下、MSCが増殖し得る培養液でMSCを培養して得られた培養液培養後の培養液からMSCを除去したものを意味するが、かかる培養上清から、例えば、残存培地成分培養前の培養液の成分のうち、培養後の培養液中に残存している成分、培養液の水分などの、本発明における腸炎の予防治療効果に寄与しない成分の少なくとも一部をさらに除去したものも、便宜上、本明細書におけるMSCの培養上清に含まれる。なお、簡便性の観点からは、培養後の培養液からMSCを除去したものをそのまま培養上清として用いることが好ましい。前述のMSCが増殖し得る培養液としては、本発明における腸炎の予防治療効果が得られる限り、特に制限されないが、イーグル最小必須培地Eagle’sMinimumEssentialMedium:EMEM、最小必須培地αMinimumEssentialMediumα:MEMα、ダルベッコ改変イーグル培地DulbeccosModifiedEagleMedium:DMEMなどの哺乳動物細胞用の細胞培地を例示することができ、中でも、DMEMを好適に例示することができ、中でも、グルコースを1,000mg/mL、グルタミンを584mg/mL含有するDMEMをより好適に例示することができ、中でも、Invitrogen社製のDMEMをさらに好適に例示することができる。なお、培養液は、ウシ胎児血清FBSなどの血清を添加したものであってもよいが、哺乳動物に投与した際の抗原抗体反応を避ける観点から、無血清の培養液を好適に例示することができる。培養液の原材料は市販されているものを適宜利用することができる。MSCを培養する際の培養条件としては、MSCが増殖し得る培養条件である限り、特に制限されないが、より優れた腸炎の予防治療効果を得る観点から、通常の大気中の酸素濃度20よりも低い酸素濃度下本明細書において、低酸素濃度下とも表示する。で培養することが好ましい。前述の低酸素濃度下としては、培養中の培養液に接している気体中の濃度が好ましくは1~19の範囲内、より好ましくは1~15の範囲内、さらに好ましくは1.5~10の範囲内、さらにより好ましくは2~8の範囲内の条件下であることを好適に含む。かかる低酸素濃度下での培養は、例えば、市販の低酸素チャンバー低温O2/CO2インキュベータ9200EX、和研薬株式会社製内で培養することによって、行うことができる。上記の間葉系幹細胞MSCとしては、未分化の間葉系細胞である限り特に制限はされず、哺乳動物の骨髄、骨膜、脂肪組織、末梢血等から常法に従い採取した後、未分化のMSCをプラスチック付着性の有無等により選択することができる。即ち、骨髄等に含まれる細胞の中で付着性を有するものを選択することによりMSCを得ることができる。ここで、MSCとしては、本発明のより優れた効果を得る観点から、骨髄間葉系幹細胞を用いることが好ましい。かかる骨髄間葉系幹細胞は、例えば骨髄間質細胞から分離することができる。また、上記のMSCとしては、本発明の予防治療剤の投与対象と同種の哺乳動物由来のMSCを用いることが好ましく、投与対象以外の同種の哺乳動物由来のMSCや、投与対象自身のMSC自家細胞を用いることができる。なお、培養上清を作製する際の培養に用いるMSCとしては、MSCを70~90コンフルエント好ましくは80コンフルエントまで増殖させて得られた細胞をゼロ継代とし、それをさらに増殖させて3~5継代のMSCを用いることができる。本発明における腸炎の予防治療効果とは、いずれかの腸炎の発症を予防及び/又は治療する効果を意味する。かかる治療効果には、その腸炎を完全に治癒する効果だけでなく、そのいずれかの症状を軽減、改善する効果の他、かかる症状の悪化の速度を低下させる効果も含まれる。本発明の予防治療剤は、本発明における腸炎の予防治療効果が得られる限り、MSCの培養上清以外の腸炎の予防治療剤などの任意成分をさらに含んでいてもよいし、生理食塩水等で希釈されていてもよい。本発明の予防治療剤に含有されるMSCの培養上清は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、腸炎に対する優れた予防治療効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えばMSCの培養上清を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるMSCの培養上清を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。本発明の予防治療剤の投与方法としては特に制限されないが、血管内投与好ましくは静脈内投与、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等を好適に例示することができ、中でも、血管内投与をより好適に例示することができる。本発明の予防治療剤の投与量としては、腸炎の種類や、その症状の度合い、剤型、投与対象の体重等によって変わり得るが、MSCの培養上清非乾燥重量換算で、例えば、1日当たり、0.1μg/kg~10g/kgの範囲を好適に例示することができ、中でも、1μg/kg~1g/kgの範囲をより好適に例示することができる。なお、本発明の予防治療剤の投与は、1日のうち1~複数回に分けて行ってもよい。また、本発明の予防治療剤の投与は継続的に行うことが好ましい。例えば、3日に1回以上の頻度で、2回以上継続して投与することが好ましく、中でも、2日に1回以上の頻度で、3回以上継続して投与することがより好ましく、中でも、1日に1回以上の頻度で4回以上継続して投与することが好ましい。本発明の予防治療剤の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。また、本発明の予防治療剤に含まれるMSCの培養上清におけるMSCの由来である哺乳動物の種類は、本発明の予防治療剤の投与対象となる哺乳動物の種類と一致していることが、腸炎に対するより安定して優れた予防治療効果を得る観点から好ましい。なお、本発明の他の態様として、本発明の腸炎の予防治療剤や改善剤の調製に使用するためのMSCの培養上清の使用や、MSCの培養上清を、上記の腸炎の予防治療や改善に使用する方法や、MSCの培養上清を対象哺乳動物に投与することにより、上記の腸炎を予防治療あるいは改善する方法を挙げることができる。以下に、実施例等を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これら実施例等により限定されるものではない。[細胞培養及び実験動物]ラット骨髄間葉系幹細胞RatMesenchymalstemcells;rMSCを8週齢のLewisラットCharlesRiver研究所の骨髄から採取し、文献に記載の通りに培養したJavazonEHColterDCSchwarzEJProckopDJRatmarrowstromalcellsaremoresensitivetoplatingdensityandexpandmorerapidlyfromsinglecellderivedcoloniesthanhumanmarrowstromalcellsStemCells200119219225。すなわち、大腿骨及び脛骨の骨幹に針を刺して骨髄細胞を採取し、15ウシ胎児血清FBSを含有する完全α改変イーグル培地MEMα、Invitrogen社製CarlsbadCA30mlで洗浄した後、骨髄細胞懸濁液を70μmナイロンフィルターBectonDickinson社製FranklinLakesNJでろ過し、75cm2フラスコにプレートした。完全MEMα15FBS中で、37°C、5CO2条件下で骨髄細胞を増殖させ、3日後に上記培地を新しい完全MEMα培地15FBSに交換し、接着した骨髄細胞を80コンフルエントまで増殖させ、得られた細胞試料をゼロ継代passage0と定義した。3継代~5継代の細胞を実験に用いた。AmericanTypeCultureCollectionATCCManassasVAから入手したラット小腸由来の細胞IEC-6細胞及びヒト結腸癌由来の細胞Caco-2細胞を通常20酸素下でDMEMInvitrogen社製及びMEMInvitrogen社製で各々維持した。札幌医科大学動物実験委員会のガイドラインに従い、Lewisラットを飼養した。札幌医科大学の組換えDNA実験の安全性のための動物実験委員会が、全ての実験プロトコルを検討、承認した。ラットは全て雄で、使用時には8週齢、体重は250g以下であった。[rMSCの免疫表現型、インビトロでの分化、及び蛍光免疫組織染色]rMSCの免疫表現型を、ラット表面抗原CD11b、CD31、CD43、CD44、CD45、及びCD90に対する特異的抗体イムノテック社製を用いてFACSCaliburBDBiosciences社製FranklinLakesNJにより決定したJavazonEHColterDCSchwarzEJProckopDJRatmarrowstromalcellsaremoresensitivetoplatingdensityandexpandmorerapidlyfromsinglecellderivedcoloniesthanhumanmarrowstromalcellsStemCells200119219225。また、かかるrMSCのインビボでの骨細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞への分化能を確認したRomanovYASvintsitskayaVASmirnovVNSearchingforalternativesourcesofpostnatalhumanmesenchymalstemcellscandidateMSCLikecellsfromumbilicalcordStemCells200321105110。[rMSC由来馴化培地MSC-CMの調製]インビボの治療に最適なrMSC由来馴化培地MSC-CMについて検討するために、3種類の馴化培地CM、すなわち、通常酸素下でインキュベートした馴化培地norCM、低酸素下でインキュベートした馴化培地hypoCM、及び、INFγで刺激した馴化培地γCMを調製した。具体的には、以下のような方法で行った。rMSC4×105細胞を150mmの培養皿に適切なスケールで播種し、rMSCがコンフルエントに達するまで完全MEMα15FBSで培養した。かかるrMSCを以下の3種類のCMの調製に用いた。norCMの場合は、前述のrMSCを無血清DMEMで、通常酸素下酸素濃度20、24時間培養した。hypoCMの場合は、前述のrMSCを無血清DMEMで、低酸素下酸素濃度5、24時間培養した。γCMの場合は、ラットINFγ100ng/ml、BioLegend社製を含む無血清DMEMで、前述のrMSCを通常酸素下酸素濃度20、24時間培養した後、PBSで洗浄し、さらに無血清DMEMで、通常酸素下酸素濃度20、24時間培養した。3種類それぞれの場合のCMを収集し、300×gで5分間遠心し、最後に0.22μmのシリンジフィルターを用いてろ過し、使用時まで-80°Cで保存した。製造元の説明書に従い、カットオフ値が10kDaの遠心ろ過ユニットUltracel10KMillipore社製を用いて、限外ろ過により上記CMnorCM、hypoCM、又は、γCMをさらに濃縮最終濃度1μg/μlしてインビボ実験用とした。なお、通常酸素下の培養は、標準的インキュベータ内において5CO2及び20O2含有空気下で行い、低酸素下での培養は、製造元の説明書に従って最終酸素濃度5の低酸素条件をセットした、低酸素チャンバー低温O2/CO2インキュベータ9200EX、和研薬株式会社製内において行った。[MTTアッセイ]細胞生存率を、MTT[3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド]発色還元アッセイにより測定したSladowskiDSteerSJClothierRHBallsMAnimprovedMTTassayImmunolMethods1993157203207。すなわち、細胞を96ウェルプレートに播種し、CellCountingKit8同仁化学研究所製のアリコート10μlを上記96ウェルマイクロプレートの各ウェルに添加し、37°Cで1~4時間インキュベートして反応させた。生細胞におけるMTT還元物質の発色の程度の指標となる吸光度に基づいて、MTTの発色が阻害される割合を導き、かかる割合を基に細胞生存率を算出した。MTT還元物質の発色レベルは、波長450nmの吸光度として測定した。[細胞周期及びアポトーシスの解析]フローサイトメトリー用として、IEC-6単細胞懸濁液Singlecellsuspensionを90低温エタノールで固定し、RNaseAで処理し、ヨウ化プロピジウムで染色した。フローサイトメトリーで測定されるサブG1のピークを、アポトーシス細胞分画とした。DeadEndColorimetricTUNELシステムPromega社製を用いて、末端デオキシヌクレオチド転移酵素媒介dUTPニック末端標識TUNEL反応を行った。製造元の説明書に従って、Ki67免疫組織化学法Abcam社製を行った。少なくとも5つの異なる試料においてKi67陽性核及びTUNEL陽性核をカウントし、Ki67標識指標及びアポトーシス指標を百分率で表した。[スクラッチアッセイ]IEC-6細胞のインビトロの遊走を、単層培養細胞創傷アッセイ、即ちスクラッチアッセイにより測定した。p200ピペットの先端で、35mm皿上のIEC-6単層に直線の傷を十字状につけてスクラッチを作り、よく洗浄して、削られた細胞を除去した後、各々1.5mlのMSC-CMを加えた。画像を取得する際に位相差顕微鏡下で同一の区域を得ることができるように、上記スクラッチの近傍に、基準点として利用できる印をつけた。一定時間ごと0、6、12、及び24時間に観察するため、上記の皿を37°Cのインキュベータから取り出すことが可能であり、各々の時間枠経過後の画像を取得した後に戻して、インキュベートを再開した。各々の画像について、TScratchprogramソフトウェアhttpwwwcselabethzchsoftwarehtmlから無料で入手を用いて各時間枠の、開放創openwoundの区域面積を定量的に測定した。各実験は少なくとも3回繰り返したGebackTSchulzMMPKoumoutsakosPDetmarMAnovelandsimplesoftwaretoolforautomatedanalysisofmonolayerwoundhealingassaysBioTechniques200946265274。[残存シグナルのウエスタンブロット解析]各々のコンフルエント細胞を、20mMのTris-HCl、pH7.4、150mMの塩化ナトリウム、1mMのEDTA、pH8.0、0.1w/vのドデシル硫酸ナトリウムSDS、0.1のデオキシコール酸ナトリウム、及び1のTritonX100、並びにプロテアーゼインヒビターカクテル錠CompleteMini商標RocheDiagnostics社製及びホスファターゼインヒビターカクテル錠PhosSTOPRocheDiagnostics社製を1錠ずつ含む放射線免疫沈降法RIPAバッファーに溶解した。BioRadタンパク質アッセイBioRad社製によりタンパク質量を算出した各々の溶解液40μgを、12変性ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、二フッ化ポリビニリデンPVDF膜に転写した。5脱脂粉乳を含むTBST溶液中でブロッキング処理した後、pan-Akt、phospho-Akt、Erk5、phospho-Erk5、及びJNK1/3に対する一次抗体SantaCruz社製、phospho-SAPK/JNK、p38、及びphospho-p38に対する一次抗体CellSignalingTechnology社製、並びにβアクチンに対する一次抗体SigmaAldrich社製と共に上記膜をインキュベートし、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体SantaCruz社製と共にインキュベートした。enhancedchemiluminescencekitAmershamBiosciences社製を用いて免疫反応を進行させた。[実験腸炎モデル及び腸炎の重症度の評価]5DSSを含む飲水を7日間0日目~6日目不断給餌することによりDSS腸炎を誘発させた。6日目に上記DSS溶液を水に交換し、体重、文献CooperHSMurthySNSShahRSSedergranDJClinicopathologicstudyofdextransulfatesodiumexperimentalmurinecolitisLabInvest199369238249に記載のDiseaseactivityindexscoreDAIスコア、及び組織学的スコアによる評価を行うまで、ラットに毎日普通の水を飲ませた。上記のDAIスコアは、便性状硬便=0;軟便=1;水様便=2、血便なし=0;少付着程度=1;多流出=2、体重減少基準から2未満の減少=0;基準から2以上5未満の減少=1;基準から5以上10未満の減少=2;基準から10以上の減少=3と規定した上で、便性状×2血便×2体重減少=DAIスコア、という式に基づいて算出した。また上記の組織学的スコアは、次の通りである:炎症重症度、なし=0;軽度=1;中程度=2;炎症性細胞浸潤を伴う重度=3。炎症の範囲、なし=0;粘膜のみ=1;粘膜及び粘膜下層=2;貫壁性浸潤=3。陰窩の損傷、損傷なし=0、基底の1/3が損傷=1、基底の2/3が損傷=2、陰窩が消失しているが表層上皮が存在する場合=3、陰窩及び表層上皮の両方が消失している場合=3WilliamsKLetalEnhancedsurvivalandmucosalrepairafterdextransodiumsulfateinducedcolitisintransgenicmicethatoverexpressgrowthhormoneGastroenterology2001120925937。上記グループ分けについて知らされていない病理医が、腸炎実験の最も炎症の重い病変、及び対照である腸管の対応する解剖学的切片について、代表的断面をヘマトキシリン及びエオシンで染色して、組織学的スコアを独立に判定した。各ラットn=10由来の3つの全周断面全部で90断面を解析した。Ki67に対するウサギモノクローナル抗体mAbをAbcam社から購入した。[MSC-CMに放出されたサイトカイン及びケモカインの検出]製造元の説明書にしたがい、複数タンパク質ELISAキット、MultiAnalyteELISArray商標キットSABioscience社製を用いてラット炎症性サイトカインについてMSC-CMを分析した。簡潔に述べれば、各々のMSC-CMを、キットに付属するサンプル希釈用バッファーで十分に希釈した。このキットを用いてIL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17A,IFN-γ、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、MIP-1α、及びMIP-1βの濃度を分析した。上記キットにより供給される陰性及び陽性対照も測定したSandKLRolinKJAlFalahiYMaghazachiAAModulationofnaturalkillercellcytotoxicityandcytokinereleasebythedrugglatirameracetateCellMolLifeSci20096614461456。[統計学的分析]2つのグループを比較するため、独立t検定及びマン-ホイットニーU検定を用いて、パラメトリック分析及びノンパラメトリック分析を各々行った。カイ二乗検定、ピアソンの統計に基づく実際のP値、又はモンテカルロ法を用いて分類に基づく変数categoricalvariablesを比較した。多重比較のため、特に経時的評価においてANOVAを採用して、2要因反復測定対象間―対象内混合mixedbetweenwithinsubjectANOVAを行い、続いてボンフェローニ検定を適用したTabachnickBGFidellLSedsUsingmultivariatestatisticsNewYorkHarperCollins2001。全ての両側検定twotailedtestにおいてP<0.05の場合に有意性があるとみなした。全ての統計的検定に、SPSSStatisticsソフトウェア170ChicagoILを用いた。[結果][インビトロの細胞生存性、細胞周期、アポトーシス、遊走、及び生存シグナル活性化に対するMSC-CMの効果]インビトロでのIEC-6細胞株の増殖に対する3種類低酸素前処理hypoCM、IFN-γ刺激処理γCM、及び通常酸素前処理norCMのrMSC由来馴化培地MSC-CMの効果や培地濃度による効果を調べるため、MTTアッセイを行い、細胞生存率図1及び細胞周期図2~6を解析した。その結果、IEC-6細胞の細胞生存率は、低酸素による前処理hypoCM群で最も高く、特に処理後87時間において顕著な差が認められた図1。また、フローサイトメトリーにより細胞周期を解析したところ、血清枯渇前のIEC-6細胞図2や血清存在下で培養したIEC-6細胞図3と比較して、血清枯渇により48時間培養したIEC-6細胞は、サブG1のピークが上昇した図4。一方、IEC-6細胞を48時間血清飢餓状態に置いても、norCM図5、又はhypoCM図6のいずれかを用いた場合において、かかるサブG1のピークの上昇は抑制された。これらの結果は、norCM及びhypoCMで培養を行うことにより、血清枯渇によるアポトーシスの誘導が阻害されたことを示唆している。そこで、TUNELによりIEC-6細胞におけるアポトーシスを解析したところ、48時間IFN-γ刺激処理IFNγ48した場合と比較して、通常酸素前処理norCMP=0.023及び低酸素前処理hypoCMP=9.1E-7によりアポトーシスは有意に抑制されていることが示された図7。さらにhypoCM処理によるアポトーシスの抑制効果は、norCM処理によるそれよりも有意に大きかったP=0.012、図7。次に、インビトロのIEC-6細胞遊走を、単層培養細胞創傷アッセイ、すなわちスクラッチアッセイにより測定した図8。その結果、hypoCMによる処理は、DMEM培地P=0.02445及びγCM処理P=0.02267と比較して傷の治癒を促進することが示された図8。さらに、IEC-6におけるAkt及びJNK1/3シグナル活性を解析したところ、血清飢餓処理DMEMFBS-と比較して、MSC-CMnorCM及びhypoCM処理によりIEC-6細胞におけるリン酸化されたAktPhospho-Akt及びJNK1/3レベルが上昇した図9。これらの結果は、MSC-CMnorCM及びhypoCM処理によりAkt及びJNK1/3シグナルが活性化された結果、細胞遊走が促進されたことを示している。[腸炎に対するMSC-CMインビボ投与の治療効果]5DSSで誘発させた急性腸炎DSS腸炎ラットの尾静脈に、インビボ実験用に調製した馴化培地norCMを静脈注射し、MSC-CMにより治療効果があるかどうかを、体重図10及び疾患活動性指標DAIスコア図11を指標に調べた。その結果、DSSに曝露させた期間の腸炎急性期0日目~6日目では、有意な治療効果は見られなかったが、DSS曝露を止めてDSSを含まない飲水に代えた回復期間では、MSC-CM投与により体重が有意に回復することが示された図10。特に投与後12日目~14日目回復期間の5日目~7日目における急性腸炎ラットの体重変化から、MSC-CM投与量依存的な治療効果があることを示された。同様に、MSC-CM投与によりDAIスコアが回復し、特に500μg/日のMSC-CMを投与した群では、対照PBS投与と比べ優れた有意差を有していた図11。さらにDAIスコアを詳細に解析したところ、MSC-CM投与により下痢症状が軽減した図12。[DSS腸炎に対する最適なMSC-CMの療法の検討]次に、MSC-CMの投与方法により腸炎治療効果に違いがあるかどうかを調べた。すなわち、インビボ実験用に調製した馴化培地norCMを、3種類の投与経路腹腔内[IP]、腸管内[IC、即ち注腸]又は静脈内[IV]により急性腸炎ラットへ投与し、体重図13及びDAIスコア図14を指標に調べた。その結果、いずれの経路によるMSC-CMの投与においても、対照PBSと比べ体重の回復効果が認められたが、3種類の経路による投与方法の間で違いは認められなかった図13。また、注腸ICに投与した場合、投与後12日目~14日目回復期間の5日目~7日目における体重は、対照PBS投与と比べ有意差が認められた図13。同様に、DAIスコアについても、3種類の経路によるMSC-CMの投与により、対照PBSと比べ回復していることが示された図14。また、腹腔内投与IPと腸管内IC投与とを比較した場合、11日目P=0.011及び12日目P=0.021で有意差が認められた図14。また、静脈内投与IVでも、腸管内IC投与と比較して好適な結果が得られた。次に、インビトロでの実験において、norCM処理よりもhypoCM処理の方が効果的であったことから、インビボでの腸炎の治療においてもhypoCM処理が効果的であるどうかについて調べた。その結果、MSC-CMを投与した場合と比べ、hypoCMを投与した場合の方が、体重の回復図15、上段及びDAIスコアの回復図15、下段レベルがともに高かった。また、hypoCMを投与した場合のDAIスコアの回復効果は、対照DMEMを投与した場合と比べ、投与後8~11及び13日目に有意差が認められた図15、下段。[腸炎の急性期及び回復期の病理組織学的評価]さらに、MSC-CM療法効果を病理組織学的解析により詳細に解析した。すなわち、インビボ実験用に調製した馴化培地norCMを、DSS腸炎ラットへ投与し、大腸上皮の損傷レベルを、組織学的スコアを指標に解析し図16、また大腸細胞数を、Ki-67陽性細胞を指標に解析した図17。その結果、腸炎の急性期Inductivephase及び回復期Recoveryphaseにおいて、MSC-CMで治療したラットの上皮傷害レベルは著しく抑制され図16、またKi-67陽性細胞数は増加していることが示された図17。特に、腸炎急性期Inductivephaseにおいて、MSC-CMを投与した場合の上皮傷害レベルP=7/98E-5及びKi-67陽性細胞数P=1.43E-4は、対照培養培地投与と比べ、統計的有意性を示していた。また、MSC-CM投与により、腸炎の急性期Inductivephaseでは、Ki-67陽性細胞が陰窩の上方に顕著に増加していたが、回復期Recoveryphaseではこの傾向は認められなかった。なお、MSC-CM投与により、claudin2cldn-2タンパク質は、アップレギュレーションされて急性期Inductivephaseでは主に陰窩の基底部位に再分布したが、回復期Recoveryphaseにはダウンレギュレーションされることも確認した。対照的に、DSS腸炎ラット対照群における急性期Inductivephaseには、cldn-2はダウンレギュレーションされ、また回復期Recoveryphaseにはアップレギュレーションされることも確認した。これらの結果から、MSC-CMは、腸炎急性期に上皮の細胞回転を著明に亢進させ、その傷害を低減することが示された。また、その際に、cldn-2タンパクの誘導、再分布が認められたことから、MSC-CMは、上皮バリア機能回復にも寄与する可能性が認められた。[MSC-CMの含有物の測定]DSS腸炎に対するhypoCM治療作用機構を調べるため、MSC-CM中に含まれるラット炎症性サイトカインのタンパク質量をMultiAnalyteELISArrayにより解析した図18。34種類の代表的なサイトカイン、ケモカイン及び増殖因子のアレイを選択し、norCM処理及びhypoCM処理した場合の培地に含まれる上記34種類のタンパク質の発現量を比較した図18。その結果、VEGFとMCP-1の発現量は、norCM処理した場合と比べ、hypoCM処理した方が高く、有意差が認められた図18。"