"ウエストナイルウイルスWNVのエンベロープ蛋白質Eを特異的に認識し、他のフラビウイルスとの交差反応性が低いモノクローナル抗体。ウエストナイルウイルスWNVが、WNVNY99株、WNVKunjin株、WNVg2266株、またはWNVEg101株である、請求項1に記載のモノクローナル抗体。他のフラビウイルスが、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルスMVEV、セントルイス脳炎ウイルスである、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体。ハイブリドーマSHW23H11株FERMBP11308によって産生される、請求項1~3のいずれかに記載のモノクローナル抗体。ウエストナイルウイルスWNVのプレメンブレン蛋白質PrMを特異的に認識し、他のフラビウイルスとの交差反応性が低いモノクローナル抗体。ウエストナイルウイルスWNVが、WNVNY99株、WNVKunjin株、WNVg2266株、またはWNVEg101株である、請求項5に記載のモノクローナル抗体。他のフラビウイルスが、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルスMVEV、セントルイス脳炎ウイルスである、請求項5または6に記載のモノクローナル抗体。ハイブリドーマSHW29C2株FERMBP11309またはハイブリドーマSHW31B2株FERMBP11310によって産生される、請求項5~7のいずれかに記載のモノクローナル抗体。ハイブリドーマSHW23H11株FERMBP11308。ハイブリドーマSHW29C2株FERMBP11309。ハイブリドーマSHW31B2株FERMBP11310。被験血清と請求項1~8のいずれかに記載のモノクローナル抗体とをWNV抗原に競合反応させるステップを少なくとも含む、ウエストナイルウイルスWNV感染の判定方法。ウエストナイルウイルスWNV感染の判定方法であって、以下のステップ:WNV抗原を固相に固定化させるステップ;被験血清と請求項1~8のいずれかに記載のモノクローナル抗体とを前記固相に添加し、固定化したWNV抗原に競合反応させるステップ;前記モノクローナル抗体と反応する酵素標識抗マウスイムノグロブリン抗体を前記固相に添加するステップ;前記標識酵素の基質液を前記固相に添加するステップ;前記基質液の発色の程度によって、被験血清に含まれる抗WNV抗体の有無を判定し、それによって被験血清のWNV感染の有無を判定するステップ;を含む上記方法。発色の程度を吸光度変化により測定する、請求項13に記載の方法。被験血清に含まれる抗WNV抗体によって、前記モノクローナル抗体と固定化したWNV抗原との結合が阻害される割合抗体結合阻害を算出するステップをさらに含む、請求項13または14に記載の方法。抗体結合阻害が下記式:抗体結合阻害100-被験血清の吸光度値陰性血清の吸光度値×100で算出される、請求項15に記載の方法。請求項1~8のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて免疫学的測定法により、試料中のウエストナイルウイルスWNVを検出することを特徴とする、ウエストナイルウイルスWNVの検出方法。請求項1~8のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、ウエストナイルウイルスWNV感染判定用またはウエストナイルウイルスWNV検出用キット。本発明の課題は、WNV感染を迅速かつ高精度に判定できる方法を提供することにある。本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、WNVNY99株を感染させたVero細胞の培養上清を不活化処理し、ショ糖密度勾配遠心法にて精製することによって得られたWNVWNV蛋白質を免疫原として接種したマウスの脾臓細胞やリンパ節細胞とミエローマ細胞を細胞融合したハイブリドーマから、WNVの構造蛋白質であるエンベロープ蛋白質Eまたはプレメンブレン蛋白質PrMを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることに成功した。また、当該ハイブリドーマにより産生されるWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体を用いた競合ELISAは、同じ血清型群ウイルスである、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルスMVEV、セントルイス脳炎ウイルス免疫血清に対して交差反応性が低いことを確認した。本発明はかかる知見により完成されたものである。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。1ウエストナイルウイルスWNVのエンベロープ蛋白質Eを特異的に認識し、他のフラビウイルスとの交差反応性が低いモノクローナル抗体。2ウエストナイルウイルスWNVが、WNVNY99株、WNVKunjin株、WNVg2266株、またはWNVEg101株である、1に記載のモノクローナル抗体。3他のフラビウイルスが、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルスMVEV、セントルイス脳炎ウイルスである、1または2に記載のモノクローナル抗体。4ハイブリドーマSHW23H11株FERMBP11308によって産生される、1~3のいずれかに記載のモノクローナル抗体。5ウエストナイルウイルスWNVのプレメンブレン蛋白質PrMを特異的に認識し、他のフラビウイルスとの交差反応性が低いモノクローナル抗体。6ウエストナイルウイルスWNVが、WNVNY99株、WNVKunjin株、WNVg2266株、またはWNVEg101株である、5に記載のモノクローナル抗体。7他のフラビウイルスが、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルスMVEV、セントルイス脳炎ウイルスである、5または6に記載のモノクローナル抗体。8ハイブリドーマSHW29C2株FERMBP11309またはハイブリドーマSHW31B2株FERMBP11310によって産生される、5~7のいずれかに記載のモノクローナル抗体。9ハイブリドーマSHW23H11株FERMBP11308。10ハイブリドーマSHW29C2株FERMBP11309。11ハイブリドーマSHW31B2株FERMBP11310。12被験血清と前記1~8のいずれかに記載のモノクローナル抗体とをWNV抗原に競合反応させるステップを少なくとも含む、ウエストナイルウイルスWNV感染の判定方法。13ウエストナイルウイルスWNV感染の判定方法であって、以下のステップ:WNV抗原を固相に固定化させるステップ;被験血清と前記1~8のいずれかに記載のモノクローナル抗体とを前記固相に添加し、固定化したWNV抗原に競合反応させるステップ;前記モノクローナル抗体と反応する酵素標識抗マウスイムノグロブリン抗体を前記固相に添加するステップ;前記標識酵素の基質液を前記固相に添加するステップ;前記基質液の発色の程度によって、被験血清に含まれる抗WNV抗体の有無を判定し、それによって被験血清のWNV感染の有無を判定するステップ;を含む上記方法。14発色の程度を吸光度変化により測定する、13に記載の方法。15被験血清に含まれる抗WNV抗体によって、前記モノクローナル抗体と固定化したWNV抗原との結合が阻害される割合抗体結合阻害を算出するステップをさらに含む、13または14に記載の方法。16抗体結合阻害が下記式:抗体結合阻害100-被験血清の吸光度値陰性血清の吸光度値×100で算出される、15に記載の方法。17前記1~8のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて免疫学的測定法により、試料中のウエストナイルウイルスWNVを検出することを特徴とする、ウエストナイルウイルスWNVの検出方法。18前記1~8のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、ウエストナイルウイルスWNV感染判定用またはウエストナイルウイルスWNV検出用キット。本発明の新規なウエストナイルウイルスWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体は、WNVと同じ血清型群ウイルスである、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルスMVEV、セントルイス脳炎ウイルス免疫血清に対して交差反応性が低いため、WNV感染を特異的かつ高精度に判定できる。また、当該モノクローナル抗体を用いて構築した競合ELISAによる本発明のWNV感染の判定方法によれば、従来法で3時間要していた被験血清と抗体の保持時間が、1時間に短縮でき、WNV感染の迅速な判定が可能となる。また、従来法では510倍希釈の血清が必要であったが、本発明の方法では、100倍に希釈した血清でも正しく判定することが可能である。よって、少量の血清しか得られない、野鳥におけるサーベイランスに用いることができる。また、本発明の方法におけるターゲット抗原は構造蛋白質であるため、不活化ワクチン接種後の抗体検査等に用いることができる。さらに、競合ELISAでは、検体ごとに種特異的二次抗体を用意する必要がないため、幅広い動物種において適用できる。本発明のモノクロ-ナル抗体はウエストナイルウイルスに対し反応性が高く、他の日本脳炎型群ウイルスへの反応性が低いのでウエストナイルウイルスの免疫学的検出に適用できる。以下、本発明について詳細に説明する。1.WNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体本発明のモノクローナル抗体は、ウエストナイルウイルスWNVの構造蛋白質であるエンベロープ蛋白質Eまたはプレメンブレン蛋白質PrMを特異的に認識し、他のフラビウイルスとの交差反応性が低いモノクローナル抗体以下、これらをWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体と称する場合があるである。ウエストナイルウイルスWNVの種類は、限定はされないが、NY99株、Kunjin株、g2266株、Eg101株が含まれる。これらの株の全てを認識するものでもよく、これらの株のうちの1種のみを認識するものでもあってもよい。従って、本発明のモノクローナル抗体を用いてウエストナイルウイルスWNVの感染判定またはウエストナイルウイルスWNVの検出を行う場合は、目的に応じて適宜好ましい抗体を選択して使用してもよい。例えば、ウエストナイルウイルスWNVの全般的な感染判定または検出を目的とする場合は、上記株の全てを認識できるモノクローナル抗体を用いることが好ましく、また、特定の株の感染判定または特異的検出を目的とする場合は、当該特定の株に特異的なモノクローナル抗体のみを用いることが好ましい。また、他のフラビウイルスとの交差反応性が低いとは、本発明のモノクローナル抗体と他のフラビウイルスである日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルスMVEV、セントルイス脳炎ウイルスとの反応性交差反応性が、ウエストナイルウイルスWNVとの反応性を基準として、約30以下、好ましくは約20以下、より好ましくは約10以下であることをいう。本発明のWNVのエンベロープ蛋白質Eを特異的に認識する抗体としては、好ましくはハイブリドーマSHW23H11株によって産生されるモノクローナル抗体、WNVのプレメンブレン蛋白質PrMを特異的に認識する抗体としては、好ましくはハイブリドーマSHW29C2株またはハイブリドーマSHW31B2株によって産生されるモノクローナル抗体が例示できる。ここで、他のフラビウイルスには、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルスMVEV、セントルイス脳炎ウイルスが含まれる。また、上記モノクローナル抗体には、目的の抗原を特異的に認識する限り、その抗体断片、例えば、Fab、F2、Fab、Fvを含む意である。本発明のWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体を産生する好適なハイブリドーマとして、上記ハイブリドーマSHW23H11株、ハイブリドーマSHW29C2株、ハイブリドーマSHW31B2株は、平成22年10月22日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター茨城県つくば市東1-1-1中央第6にそれぞれ受託番号FERMBP11308、FERMBP11309、FERMBP11310としてそれぞれプタベスト条約の規定下で国際寄託された。以下、ハイブリドーマSHW23H11株、ハイブリドーマSHW29C2株、ハイブリドーマSHW31B2株から産生されるモノクローナル抗体をそれぞれSHW23H11、SHW29C2、SHW31B2と称する場合がある。2.WNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体の作製本発明のWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体は、WNV抗原の調製、免疫及び抗体産生細胞の採取、細胞融合、ハイブリドーマの選択及びクローニング、モノクローナル抗体の採取の各工程を含む一般的な手法により作製できる。WNV抗原の調製WNV抗原は、WNV株、好ましくは、WNVNY99株を株化細胞に感染させ、該ウイルス感染細胞を培養した後、培養上清を不活化処理し、一般的なウイルス精製法として使用されているショ糖密度勾配遠心法にて精製することによって調製する。ここで、株化細胞としては、例えば、Vero細胞、MDCK細胞、BHK21細胞、GL37細胞、HmLu1細胞などの動物由来の細胞や昆虫由来細胞を用いることができる。ウイルスの不活化処理は、β-プロピオラクトンやホルマリン処理、加熱、紫外線照射などの通常の方法で行えばよいが、β-プロピオラクトン処理が好ましい。免疫及び抗体産生細胞の採取上記のようにして得られたWNV抗原を免疫原として、アジュバンドとともに、あるいはアジュバンドなしに哺乳類、鳥類等に投与する。ここで、アジュバンドとしては、通常用いられるアジュバント、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、BCG、ハンターズ、タイターマック、ゲルブアジュバント、百日咳毒素、リン酸アルミニウムゲル、水酸化アルミニウムゲル等が挙げられ、これらを単独で使用してもよいし、これらの2種以上を混合して使用してもよい。哺乳類としては、マウス、ラット、ウサギ等を使用することができ、鳥類としては、ハト、ニワトリ等を使用することができるが、マウスを使用するのが好ましく、BALBcマウスを使用することがより好ましい。抗原の1回の投与量は、マウスの場合1匹当たり通常1~100μgである。投与部位は、主として腹腔内、皮下、静脈内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2~3週間間隔で、最低2~3回行う。そして、最終免疫後、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞およびリンパ節細胞が好ましい。細胞融合次に、ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウスなどの動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株は、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。一般的には、8-アザグアニン耐性株を使用できる。この細胞株は、ヒポキサンチン-グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼを欠損し、HAT培地で生育できない。ミエローマ細胞の好適な具体例としては、P3X63Ag8U1、P3X63Ag8、P3NS11Ag41、P3X63Ag8653、Sp2OAg14、Sp2OFO2などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI1640培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを151~251の割合で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤存在下、あるいは電気パルス処理により融合反応を行う。4ハイブリドーマの選択、スクリーニング及びクローニング細胞融合後、ハイブリドーマを選択する。ハイブリドーマの選択方法は、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。ハイブリドーマの選択は、例えば、ハイブリドーマを選択培地例えばHAT培地で培養することにより行なうことができる。この際の培養は、常法に従えばよく、特に限定されない。通常は、30~37°Cで7~10日間培養すればよい。目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法モノクローナル抗体の採取取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等を用いることができる。細胞培養法においては、例えば、ハイブリドーマを仔ウシ血清含有RPMI1640培地、MEM培地等の動物細胞培地中で、通常の培養条件で3~10日間培養し、その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を取得できる。また、高密度培養法により高濃度のモノクロ-ナル抗体を含む培養上清を得、目的とするモノクロ-ナル抗体を取得することもできる。腹水形成法においては、例えば、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にプリスタン等の鉱物油を投与し、その後、ハイブリドーマ1×106~1×107個、好ましくは1×106個を腹腔内に投与する。投与した哺乳動物を1~2週間以上飼育し、腹腔に貯留した腹水又は血清を採取することにより目的とするモノクローナル抗体を取得できる。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらの方法を組み合わせることにより精製することができる。3.ウエストナイルウイルスWNV感染の判定方法本発明のウエストナイルウイルスWNV感染の判定方法は、被験血清と1.のWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体本発明のモノクローナル抗体とをWNV抗原に競合反応させるステップを少なくとも含む。競合反応は、必ずしも固相を必要としない液相法が、固相を用いた方が、測定操作が簡便になるため好ましい。例えば、固相法により競合反応を行う場合は、WNV抗原を適当な担体に固定化し、次いで、WNV感染の判定が望まれる被験血清と本発明のモノクローナル抗体とを、固定化したWNV抗原と接触させて、本発明のモノクローナル抗体‐WNV抗原の免疫複合体および被験血清中の抗WNV抗体WNV抗原免疫複合体を競合的に生成させる。生成した本発明のモノクローナル抗体‐WNV抗原の免疫複合体の検出を行い、その結果から、被験血清中の抗WNV抗体の有無、すなわちWNV感染の有無の判定を行うことができる。上記免疫複合体の検出には、本発明のモノクローナル抗体と結合可能な標識抗体二次抗体を用いて行う。標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体のいずれであってもよい。本発明のウエストナイルウイルスWNV感染の判定方法の好ましい態様は、以下のステップ~を包含する競合ELISAによる。WNV抗原を固相に固定化させるステップ;被験血清と1.のWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体とを前記固相に添加し、固定化したWNV抗原に競合反応させるステップ;前記モノクローナル抗体と反応する酵素標識抗マウスイムノグロブリン抗体を前記固相に添加するステップ;前記標識酵素の基質液を前記固相に添加するステップ;前記基質液の発色の程度によって、被験血清に含まれる抗WNV抗体の有無を判定し、それによって被験血清のWNV感染の有無を判定するステップ。以下、各ステップについて説明する。ステップ:ステップは、WNV抗原を固相に固定する工程である。ここで用いるWNV抗原はWNVの抗原性を有する限り、いかなる蛋白質またはペプチドであってもよい。WNVの抗原性とは、抗WNV抗体と反応することができる能力、すなわち、抗体結合部分エプトープを有することをいう。また、WNV抗原は、天然から回収されたもの、組換え遺伝子工学的手法により作製されたもの、又は化学合成されたもののいずれであってもよい。よって、WNV抗原は、例えば、前項21のように、WNVを感染させた株化細胞を培養して、培養物から単離精製することにより作製してもよいし、WNV構造蛋白質またはその部分ペプチドのアミノ酸配列情報に基づいて公知のペプチド合成法で化学合成してもよいし、WNV構造蛋白質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子を含有する形質転換体を培養して組換え体として作製することもできる。WNV抗原を固定化する固相は、該抗原を固定化し得る限り、いかなるものであってもよい。例えば、プラスチックポリスチレン、ポリビニル、ポリカーボネート等、ニトロセルロース膜、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、デキストラン、ガラス等を固相として使用することができる。市販のELISAプレート例えば、96ウェルELISAプレートを使用すると便利である。WNV抗原の固相への固定化は、物理的吸着、共有結合、架橋等などの常法により行うことができる。例えば、96ウェルELISAプレートを使用する場合、WNV抗原を界面活性剤例えば、TritonX100で可溶化し、炭酸緩衝液等で至適な倍率に希釈し、例えば4°Cで1晩静置することにより固相に固定化できる。固相化されなかった余剰の抗原は洗浄液で数回例えば3回洗浄する。次いで、固相中のWNV抗原が固定化されていない部分を適当なブロッキング剤でブロッキングすることが好ましい。ブロッキング剤としては、仔ウシ血清、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、スキムミルク等のブロッキング剤を使用することができる。反応後、余剰のブロッキング剤を除去するために固相を洗浄する。固相の洗浄には、例えば、洗浄液を使用できる。固相の洗浄は十分に行うのが好ましく、通常3~5回洗浄する。ステップ:ステップは、被験血清と、1.のWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体とを前記固相に添加し、固定化したWNV抗原に競合反応させるステップである。このステップにおいては、固定化したWNV抗原のエピトープ部分に対し、被験血清中の抗WNV抗体とWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体が競合反応する。被験血清を採取した動物がWNVに感染している場合は、被験血清中に抗WNV抗体が含まれており、固定化したWNV抗原へのWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体の結合が阻害される。一方、被験血清を採取した動物がWNVに感染していない場合は、被験血清中に抗WNV抗体が含まれておらず、固定化したWNV抗原へのWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体の結合が阻害されない。上記の競合反応は、例えば、37°Cで1~2時間インキュベーションすることにより行う。反応後、未反応の被験血清中の抗WNV抗体およびWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体を除去するために固相を洗浄する。固相の洗浄には、洗浄液を使用できる。固相の洗浄は十分に行うのが好ましく、通常3~5回洗浄する。被験血清は、ウエストナイルウイルスに感染するヒトを含む哺乳類、鳥類など動物の血清であれば特に限定はされない。例えば、ヒト、ウマ、ニワトリ、ブタ、ウシなどが挙げられる。被験血清は、常法に従って調製することができる。例えば、採血後、血液が十分に凝固した後室温で3000rpm、15分程度遠心し、その上清を分離し、血清とする。ステップ:ステップは、前記WNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体と反応する酵素標識抗マウスイムノグロブリン抗体を前記固相に添加するステップである。酵素標識としては、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等が挙げられる。なお、ステップにおいて酵素標識したモノクローナル抗体を用いた場合、このステップは省かれる。また、モノクロ-ナル抗体をビオチン化することにより、アビジン-ビオチン系を用いることも可能である。ステップ:ステップは、前記標識酵素の基質液を前記固相に添加するステップである。本ステップにおいては、酵素標識抗マウスイムノグロブリン抗体によるWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体の検出が可能となる。検出は、標識酵素と基質との反応産物による発色に基づいて行う。ステップ:ステップは、前記基質液の発色の程度によって、被験血清に含まれる抗WNV抗体の有無を判定し、それによって被験血清のWNV感染の有無を判定するステップである。被験血清が陽性血清の場合、被験血清中の抗WNV抗体が固相に固定化されたWNV抗原と反応し、WNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体の該WNV抗原への結合が阻害されるために、呈色反応が弱い。一方、被験血清が陰性血清の場合、WNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体が該WNV抗原に結合し、該WNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体に酵素標識抗マウスイムノグロブリン抗体が結合するため、酵素による呈色反応が強い。よって、発色が弱い場合は、被験血清が陽性血清であると判定でき、発色が強い場合は、被験血清が陰性血清であると判定できる。また、発色の程度を定量的に測定するために、被験血清に含まれる抗WNV抗体によって、WNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体と固定化したWNV抗原との結合が阻害される割合抗体結合阻害を算出するステップをさらに含めてもよい。抗体結合阻害は、下記式:抗体結合阻害100-被験血清の吸光度値陰性血清の吸光度値×100で算出することができる。算出された抗体結合阻害により、被験血清のWNV感染の有無を判定できる。例えば、抗体結合阻害が約80~90である場合は、被験血清がWNVNY99株に感染している可能性が高いと判定でき、抗体結合阻害が約75~85である場合は被験血清がWNVKunjin株感染に感染している可能性が高いと判定でき、抗体結合阻害が約50~60である場合はただし、WNVg2266株感染についてはSHW31B2抗体を用いた場合の阻害、被験血清がWNVEg101株またはWNVg2266株に感染している可能性が高いと判定できる。また、予め、抗体結合阻害とWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体との相対関係を示す検量線を作成しておくことにより、抗体結合阻害から被験血清中の抗WNV抗体の量を求めることも可能である。4.ウエストナイルウイルスWNV検出方法本発明のウエストナイルウイルスWNV検出方法は、前記1.のWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体本発明のモノクローナル抗体を用いて免疫学的測定法により、試料中のウエストナイルウイルスWNVを検出することを特徴とする。免疫学的測定法イムノアッセイとしては、本発明のモノクローナル抗体とウエストナイルウイルスWNVとの免疫複合体の形成の有無を検出できるものであればいかなる方法でもよく、例えば、酵素免疫測定法、酵素イムノメトリックアッセイ法、蛍光免疫測定法、放射線免疫測定法、発光免疫測定法、イムノブロット法、ウェスタンブロット法等などを挙げることができる。これらの免疫測定方法自体は公知であり、本発明のモノクローナル抗体を使用する以外は、常法に従って行うことができる。試料としては、ウエストナイルウイルスWNVが含まれる可能性のある生体試料であれば特に限定はされないが、例えば、血液、血清、血漿、リンパ球培養上清、細胞などが挙げられる。また、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫測定法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法により行うこともでき、サンドイッチ法の場合には固相化抗体及び標識抗体のうち少なくとも1種が本発明のモノクローナル抗体であればよい。標識物質としては、例えば、酵素例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ等、蛍光物質例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンイソチオシアネート等、放射性同位体125Iや3H等などを使用することができる。5.ウエストナイルウイルスWNV感染判定用またはウエストナイルウイルスWNV検出用キット本発明のWNV感染判定用またはウエストナイルウイルスWNV検出用キットは、前記1.のWNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体を少なくとも含むものであればよく、当該キットには、前述の方法で調製したWNV抗原、固相、WNV構造蛋白質特異的モノクローナル抗体と反応する酵素標識抗マウスイムノグロブリン抗体、酵素基質液を含めてもよい。さらに、当該キットには、上記の試薬や材料のほかに、陽性陰性の参照試料、緩衝液、溶解液、洗浄液、反応停止液、使用説明書などが含まれていてもよい。上記各試薬のうち、懸濁液、溶液、または凍結乾燥品の形態とすることができる。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例11.材料および方法ウイルスウエストナイルウイルスWNVNY99株Kunjin株,g2266株Eg101株、日本脳炎ウイルスJEVNakayama株JaNAr0102株、マレーバレー脳炎ウイルスMVEVMVEV151株、セントルイス脳炎ウイルスを用いた。これらのウイルスの培養上清をVero細胞を用いて調製した。ウイルス抗原は、βプロピオラクトンで不活化した培養上清をショ糖密度勾配精製法によって調製し、抗血清作製、免疫化、競合ELISA、間接ELISA、およびウェスタンブロットの抗原として用いた。モノクローナル抗体モノクローナル抗体の調製は、CurrentProtocolsinImmunologyに記載の方法に若干の改良を加えて行ったYokoyamaWMProductionofMonoclonalAntibodiesInColiganJEKruisbeekAMMarguliesDHShevachEMStroberWEdsCurrentProtocolsinImmunologyNewYorkJohnWileyandSons1991Unit25251。11週齢のメスBALBcを、水酸化アルミニウムゲルと混合した前記不活化および精製したWNV20μgにて腹腔内注射で2~3回免疫した。最終免疫は、前記不活化および精製したWNV20μgにて静脈内注射で行った。最終免疫から3日後にマウスを麻酔し、放血した。マウスの脾臓細胞をP3X63Ag8U1ミエローマ細胞と50ポリエチレングリコールを用いて融合した。ハイブリドーマ細胞をHAT選択培地中に希釈し、CO2インキュベータ内で7~10日間インキュベートした。ハイブリドーマ細胞の一次スクリーニングアッセイを抗原として前記不活化精製WNV抗原を用いて間接ELISAにて行った。二次スクリーニングはWNVNY99株免疫ニワトリ血清を用いて競合ELISAにて行った。3つのハイブリドーマ株を選択し、限界希釈法にてクローン化した。クローン化したハイブリドーマ株の全部をプリスタン処理したBALBcマウスに腹腔内に接種し、腹水を採取した。腹水を硫酸アンモニウム沈殿法およびDEAEイオン交換法にて精製した。ウェスタンブロット解析WNV抗原を12BisTris勾配ゲル上で、非還元条件下で電気泳動し、その後、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロッティングした。膜を20ブロックエースを含有するTBSで洗浄し、HRP結合抗マウスIgGと共にインキュベートした。TBSTで洗浄後、該ストリップを3,3-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド溶液に浸した。抗E抗体HB112及び抗PrM抗体ab25888を参照抗体として用いた。間接ELISA間接ELISAを文献HirotaJNishiHMatsudaHTsunemitsuHShimizSCrossreactivityofJapaneseencephalitisvirusvaccinatedhorseserainserodiagnosisofWestNilevirusJVetMedSci2010Mar7236972に記載の方法に若干の改変を加えて実施した。各ウイルス抗原はタンパク質濃度100ngウェルで用いた。各ウイルス抗原と上記3つのハイブリドーマ株から産生される各モノクローナル抗体との交差反応性を間接ELISAによって評価した。HRP結合抗マウスIgGを二次抗体として用いてモノクローナル抗体の検出を行い、また、HRP結合抗ニワトリIgG二次抗体を用いてニワトリIgGの検出を行った。WNV感染ニワトリ血清9羽の5週齢のSPFニワトリにWNVを注射により接種した。ニワトリ一羽につき103104105106107プラーク形成ユニットPFUを胸筋に筋肉内注射した。それらのニワトリについて、Vero細胞を用いたプラークアッセイによってウイルス接種後48時間にWNVウイルス血症を調べた。それらのすべてがウイルス血症を示し、平均PFUは7540pfumlであった。ニワトリをWNV接種後、1週、10日、2週、3週、4週、5週、および6週で放血させた。血液サンプルを室温で4~6時間凝固させ、その後、4°Cにて一晩保持し、2500gで20分間遠心分離して血清を分離し、使用するまで80°Cにて凍結保存した。なお、感染性を有すると考えられる試料はすべて、P3施設内で取り扱った。JEVMVEVSLEVおよびWNV免疫ニワトリ血清SPFの5週齢のニワトリを用いた。水酸化アルミニウムゲルと混合したウイルス抗原25μgニワトリを用いて筋肉内注射で隔週3回免疫した。すべてのニワトリを最終免疫後2週間で放血し、全採血した。血液サンプルを室温で4~6時間凝固させ、4°Cにて一晩保持し、2500gで20分遠心分離し、血清を分離し、使用するまで80°Cにて凍結保存した。これらの血清のすべては、プラーク減少中和試験PRNTにおいて免疫ウイルスの相同ウイルスに対して中和能を有していた。中和試験におけるプラーク減少プラーク減少中和試験PRNTをVero細胞を塗布した6ウェルプレートを用いてWNVのOIEManualに記載された通り行ったOfficeInternationaldesepizooties2004WestNilevirusInManualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimalsmammalsbirdsandbees5thedpp10641071OIEParis。被験血清を希釈し、10テンジクネズミ血清を含む最小必須培地中で等量のウイルス調製物と混合し、37°Cで1時間保持した。混合物のアリコート100μlをVero細胞単層の各ウェルに接種し、ときどき攪拌しながらCO2インキュベータ内で37°Cにて1時間保持した。インキュベーション後、トラガカントガムを含む栄養分を添加し、細胞をCO2インキュベータ内で3~5日間放置し、続いて、該細胞をホルマリンで固定してクリスタルバイオレットで染色した。プラーク減少が70または90を示した最大血清希釈率をタイターエンドポイントとした。競合ELISA96ウェルプレートに、炭酸塩-重炭酸塩緩衝生理食塩水に希釈したWNV抗原を1ウェルあたり150または75ng被覆し、該プレートを4°Cにて12時間インキュベートした。プレートを002Tween20を含む350μlのPBSで3回洗浄した。以降の各ステップにおいて、被験試料およびモノクローナル抗体のウェルへの添加後のインキュベーション条件は37°Cで1時間、洗浄は350μlのPBSTを用いて3回行った。プレートをPBST中で20ブロックエースを含むPBSTに希釈した各ウイルス免疫血清100μlを添加した。プレートを基質溶液50mMクエン酸ナトリウム中に10mM22アジノビス、4mMH2O2含有、pH40100μlで満たした。各ウェルの吸光度は37°Cにて1時間インキュベーション後に405nmにて測定した。結果は、式:阻害100-実験動物管理実験開始前に動物を用いる全ての実験は動物衛生研究所の動物実験倫理委員会による承認を得た。2.結果モノクローナル抗体の特徴抗WNVモノクローナル抗体を分泌する3つのハイブリドーマを得た。モノクローナル抗体のイムノグロブリンクラスはIgG1kであった。ウェスタンブロット解析では、SHW23H11はWNVエンベロープ蛋白質Eと反応し、SHW29C2およびSHW31B2はWNVプレメンブレン蛋白質PrMと反応することが示された図1。SHW23H11は、プラーク減少中和試験PRNTにおいて弱い中和活性を示した。他の2抗体は、PRNTにおいてプラーク数減少能はなかった。なお、上記モノクロナール抗体を産生するハイブリドーマSHW23H11株は受託番号FERMBP11308として、ハイブリドーマSHW29C2株は受託番号FERMBP11309として、ハイブリドーマSHW31B2株は受託番号FERMBP11310として、平成22年10月22日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター茨城県つくば市東1-1-1中央第6にそれぞれ寄託されている。間接ELISAによって、上記3種のモノクローナル抗体と日本脳炎ウイルス血清型群フラビウイルスとの交差反応性について調べた。SHW23H11はJEV、SLEV、およびMVEVとも反応した。SHW29C2はWNVNY99株及びKunjin株に高度に特異的であった。SHW31B2はWNVNY99株に高度に特異的であり、一方、JEVNakayama株とも反応したが、そのレベルはWNVNY99株のOD値と比べて5分の1であった図2。競合ELISAにおける交差反応性競合ELISAを、上記3種のモノクローナル抗体を用いて構築した。競合ELISAでは、一連のフラビウイルス免疫ニワトリ血清を用いて当該モノクローナル抗体の特異性を調べた。免疫ウイルスに対する中和抗体価と各フラビウイルス免疫ニワトリ血清の競合ELISAにおける阻害を表1に示す。表中の中和抗体価は、免疫ウイルスの相同ウイルスに対するPRNT価を示す。上記3種のモノクローナル抗体をベースとする全ての競合ELISAにおいて、抗WNVNY99株抗体および抗WNVKunjin株抗体を検出することができた。WNVNY99株免疫血清は全ての競合ELISAにおいて、約80~90の阻害を示した。また、全ての競合ELISAにおいて、WNVg2266株免疫血清とWNVEg101株免疫血清はWNVNY99株免疫血清よりも低い阻害を示す傾向にあった。しかしながら、SHW31B2をベースとする競合ELISAでは、他のモノクローナル抗体をベースとする競合ELISAに比べてWNVg2266株免疫血清とWNVEg101株免疫血清に比較的感受性であった。JEV、SLEV、及びMVEV免疫血清はSHW29C2およびSHW31B2をベースとする競合ELISAにおいて、約20阻害を示した。SHW23H11は、他のモノクローナル抗体をベースとする競合ELISAよりも比較的MVEV免疫血清との交差反応性が高かった図3。カットオフ値および算出式:異種フラビウイルス免疫血清の平均阻害3×標準偏差で設定した表2。SHW23H11はMVEV免疫ニワトリ血清に高度に交差反応性であった。競合ELISAの感受性WNV感染ニワトリから経時的に採取した血清を用いて、上記3種のモノクローナル抗体を用いて構築した競合ELISAにおいて阻害の上昇時期について調べた。WNV感染ニワトリはウイルス接種後2日目にウイルス血症を示し、平均ウイルス血症力価は8372PFUmlであった。各ニワトリの中和抗体価の経時変化を図4に示す。プラーク減少中和試験PRNTにおける抗体価の上昇時期はニワトリ毎に異なっていた。例えば、No49は感染後7日で上昇を開始したが、No44は感染後35日まで上昇しなかった。SHW23H11及びSHW29C2をベースとする競合ELISAはほとんど同じ阻害曲線を示した。すべてのWNV感染ニワトリ血清は両競合ELISAにおいて感染3週間後にほとんど50阻害を示した図5。SHW23H11、SHW29C2をベースとする競合ELISAにおいてはWNV感染後3週間後における平均阻害は、それぞれ558、616であった。一方、WNV感染ニワトリ血清はSHW31B2をベースとする競合ELISAではわずかに早く阻害の上昇を示した。SHW31B2をベースとする競合ELISAにおいてはWNV感染後3週間後における平均阻害は、718であった。表2に示したMVEVに対するカットオフ値を用いると、4羽のニワトリ血清が感染後2週間で陽性に転じた。そして、SLEVおよびJEVに対するカットオフ値を用いると、すべての感染ニワトリ血清が、感染後2週間で陽性に転じた。また、SHW31B2をベースとする競合ELISAにおいて、100倍希釈した被験血清を用いる以外は、上記と同様にして、該抗体の日本脳炎ウイルスJEV血清型群ウイルス免疫血清との交差反応性を調べた。該抗体のJEV、マレーバレー脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス免疫血清による阻害は48以下であるのに対し、WNVの各株毎の阻害はWNVg2266の免疫血清では242、WNVEg101の免疫血清では414、WNVKunjinの免疫血清では587、WNVNY99の免疫血清では843であり、WNVの各株、特にWNVNY99によって特異的に阻害された図6。また、図7に示すように、WNV競合ELISA阻害と間接ELISAOD値との相関性競合ELISA阻害と間接ELISAOD値との相関性をWNV感染ニワトリから経時的に採取した血清を用いて調べた。上記3種のモノクローナル抗体をベースとする全ての競合ELISAにおける阻害と間接ELISAOD値との間に高い相関性が見られた図8。SHW23H11、SHW29C2、およびSHW31B2の近似直線のγ2値はそれぞれ09615、09661、および09244であった。"