支持細胞又はならし培地を必要としない基質上でヒト多分化能幹細胞を未分化状態で培養するための方法であって、塩、ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子ベータと、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸及びリチウムの少なくとも2つとを、複数回の連続する培養継代中に該ヒト多分化能幹細胞を未分化状態で保持するのに十分な量で含む培地において、該ヒト多分化能幹細胞を培養する工程であって、前記培地が10~1000ngmLの濃度で繊維芽細胞成長因子を含む工程を含む、前記方法。培地が、少なくとも40ngmLの濃度で線維芽細胞成長因子を含む、請求項1記載の方法。培地が、トランスフェリン又はトランスフェリン代用物及びインスリン又はインスリン代用物も含む、請求項1又は2記載の方法。前記ヒト多分化能幹細胞の少なくとも90が、複数回の連続する培養継代中に転写因子Oct4に対して陽性である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記ヒト多分化能幹細胞が、シアル酸残渣Neu5Gcを示さない、請求項4に記載の方法。前記ヒト多分化能幹細胞が、ヒト胚幹細胞である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。生体外細胞培養物であって、ヒト多分化能幹細胞幹細胞が成長することのできる基質及び塩、ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子ベータと、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸及びリチウムの少なくとも2つとを、複数回の培養継代中に該ヒト幹細胞を未分化状態で保持するのに十分な量で含む培養培地であって、支持細胞を含まず、且つ支持細胞に決して露出されない培地を培養容器内に含み、前記培地が10~1000ngmLの濃度で繊維芽細胞成長因子を含む、前記生体外細胞培養物。培地が、少なくとも40ngmLの濃度で線維芽細胞成長因子を含む、請求項7記載の細胞培養物。培地が、少なくとも100ngmLの濃度で線維芽細胞成長因子を含む、請求項7記載の細胞培養物。前記培地が、アルブミン、インスリン又はインスリン代用物及びトランスフェリン又はトランスフェリン代用物をさらに含む、請求項7~9のいずれか1項に記載の細胞培養物。インスリン及びトランスフェリンが組み換え型蛋白質である、請求項10記載の細胞培養物。前記ヒト多分化能幹細胞が、複数回の連続する培養継代中に転写因子Oct4に対して少なくとも90陽性である、請求項7~11のいずれか1項に記載の細胞培養物。前記ヒト多分化能幹細胞が、シアル酸残渣Neu5Gcを示さない、請求項12に記載の細胞培養物。前記ヒト多分化能幹細胞が、ヒト胚幹細胞である、請求項7~13のいずれか1項に記載の細胞培養物。ヒト多分化能幹細胞を培養するための培地であって、塩、ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子ベータと、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸及びリチウムの少なくとも2つとを、複数回の培養継代中に該培地において未分化状態で成長した幹細胞を保持するのに十分な量で含み、10~1000ngmLの濃度で繊維芽細胞成長因子を含む、前記培地。アルブミン、インスリン又はインスリン代用物及びトランスフェリン又はトランスフェリン代用物をさらに含む、請求項15記載の培地。非ヒト動物からの生成物を含まない、請求項15又は16に記載の培地。ヒト多分化能幹細胞が、ヒト胚幹細胞である、請求項15~17のいずれか1項に記載の培地。いくつかの培地処方は、ヒトES細胞を多少の時間未分化のままにすることができるが、この状態はしばしばそれ自体を保持することができない。特に、培養容器における最初の種培養物から同一の培養容器における集密までのヒトES細胞の成長を継代としての定義する。激しい分化をしない1回又は2回の継代のためのヒトES細胞の培養を可能にするが、続いて該細胞がその後の継代で迅速に分化するいくつかの培地処方を見出した。ならし培地又は線維芽細胞支持細胞を用いずに、分化させることなくヒトES細胞の無限増殖を正確に支持する培地のためには、該培地が少なくとも5回の継代のために実質的に均一且つ未分化状態でヒトES細胞の培養を支持することを実証しなければならないと考えるようになった。該培養物が、培養期間中に比較的均一且つ未分化のままであり、及びヒトES細胞の重要な特徴の全てを保持することも重要である。幹細胞培養物の分化状態は、該細胞の形態学的特徴を判断することによって非常に容易に評価することができる。未分化幹細胞は特徴的な形態、すなわち、明確に画定された細胞境界線を有する小さく且つ緻密な細胞を有し、顕微鏡下での幹細胞培養物の検査によって容易に判断することのできる形態である。それに反し、分化した細胞はより大きく且つより散在して見え、不明瞭な境界線を有する。ある種の未分化細胞は未分化細胞のコロニーの縁で見ることができ、及び通常は見え、最適な幹細胞培養物は、分化しているように見える該培養物の周辺において、培養容器中で最小数のみの細胞で増殖するものである。経験とともに、ヒトES細胞培養物の分化及び健康の状態を視覚的に良好な精度で判断することができる。未分化のES細胞の状態を追跡するのに用いられる生化学的マーカーは、転写調節因子Oct4の存在であり、これはES細胞の未分化状態の最も信頼できるマーカーとしてみなされており、且つ未分化細胞が分化し始めると消失する重要なマーカーの一つである。発明の開示本発明は、支持細胞又はならし培地を必要としないヒト胚幹細胞を培養するための、塩、ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム及び形質転換成長因子ベータを、全てが複数の培養継代中に該幹細胞を未分化状態に保持するのに十分な量で含む培地でヒト胚幹細胞を培養する工程を含む方法として要約される。本発明は、幹細胞を線維芽細胞支持細胞又はならし培地を必要とせずに無制限に未分化状態で培養することのできる、高濃度の線維芽細胞成長因子、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム及び形質転換成長因子ベータを含む培地で培養されるヒト胚幹細胞の生体内細胞における培養も意図している。本発明の目的は、支持細胞からの又は幹細胞が培養されているならし培地のための、動物細胞及び動物性蛋白質の使用又はそれらへの露出を回避するヒト胚幹細胞のための長期培養条件を定義することである。本発明の別の目的は、培養液中の最大割合の細胞をできる限り未分化状態でできる限り保持する上記のヒト胚幹細胞のための培養条件を定義することである。本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の明細書から明らかとなる。発明の詳細な説明未分化状態且つさらに支持細胞及びならし培地の不存在下でのヒト胚幹細胞の無限培養及び活気のある増殖を可能にする複数の培養条件及び培地を確認した。これらの培地及び培養条件の開発が、任意の種類の動物細胞に直接的又は間接的に露出されることなく、定義され且つ制御された条件でのヒトES細胞系の誘導及び保持を可能にする。これらの培地は、未分化ES細胞の増殖を、これらの培地がそのような培養を無制限に支持することが確実に明らかである少なくとも5回の複数の継代中に支持することが証明された。ヒトES細胞の培養及び増殖のために定義され且つヒト化された培地は、典型的には塩、ビタミン、グルコース源、ミネラル及びアミノ酸を含む。培地条件及び供給条件を補完して細胞成長を支持するために、最初の幹細胞は一つの供給源又は別の供給源からの血清を含んだ。以前にも、線維芽細胞成長因子及び血清置換添加剤の添加が、血清無しでヒトES細胞の増殖を可能にすることが報告された。血清置換剤は、そのために販売されている市場で入手可能な製品であり得るか、又は蛋白質、例えば血清アルブミン、ビタミン、塩、ミネラル、トランスフェリン又はトランスフェリン代用物、及びインスリン又はインスリン代用物の調合混合物であり得る。この血清置換成分はセレンで補完されてもよい。ここで好ましくは、定義された血清置換剤が、ヒトES細胞を培養する際に任意の供給源からの血清の代わりに用いられ、血清成分における変化の問題を回避し、且つできる限り上記の培地を使用する。我々は、十分な培地、及び以下に記載される表1で開示されここで教示される培地の成分の全てを定義し、該表は我々のTeSR1と命名する培地の全ての成分と該成分の濃度を列挙する。TeSR1培地は、ヒト血清アルブミンで補完されるDMEMDF12塩基、ビタミン、抗酸化剤、微量のミネラル、特定の脂質、及びクローン成長因子からなる。以前はヒトES細胞を未分化状態に保持するのに必要であると考えられていた線維芽細胞支持細胞層の必要性を回避するために、より高い濃度のFGFの使用と、GABA、ピペコリン酸、リチウム及び形質転換成長因子ベータの使用の組み合わせが、培地が未分化幹細胞成長を支持することを可能にすることをここで報告する。これらの添加剤の組み合わせは、支持細胞又はならし培地への露出無く、ヒトES細胞の培養を未分化状態で保持するのに十分であることが見出された。これらの添加剤は明らかに十分である。しかし、それらの全ては全ての培地処方に必要とはなり得ない。これらの添加剤の選択的な除外により、1種以上のこれらの成分を除外して、培養液中の未分化状態の純度を失いながら依然として成長するヒトES細胞培養物を得ることができる。該培養物は、多数の継代中で安定でも安定でなくてもよい。しかし、該組み合わせは、種々の培地が支持細胞又はならし培地を用いない無限回の継代中に、未分化ヒトES細胞の長期間培養及び増殖を支持することを可能にするのに十分であることは明らかである。ヒトES細胞によって発現する受容体のために選択されるこれらの個々の成長因子の我々の最初の主観的なスクリーニングは、未分化増殖において陽性の効果を有するようないくつかの因子を確認した。もちろん、bFGF、LiCl、γアミノ酪酸、ピペコリン酸、及びTGFβが、結局はTeSR1に含まれた。試験された各四種の細胞系では、増殖率及び特徴的なヒトES細胞マーカーの発現を保持する細胞の割合は、TeSR1におけるよりも、線維芽細胞ならし培地で培養された制御細胞の方が高く、及びこれらの5種の因子の任意の1種の除去は、培養効率を減少させる。これらのデータの一部は図1に説明されており、該図は省かれたこれらの成分の任意の1種を有する培地で成長した培養物が、これらの培地成分の全ての4種が含まれる培養物と比較して未分化状態のままでいる細胞がより少ない割合を示したことを示している。Oct4、SSEAI、SSEA4、Tral60及びTral80は全て、幹細胞の分化状態を探知するのに用いられる細胞表面マーカー又は転写調節因子であることを意味する。図4は、複数回の継代に渡って培養物の成長率が最も高かったときは、全てのこれらの成分が共に培養培地にあったときであることを説明する同様の試みを説明している。ヒトES細胞の培養条件において、培養容器に生物学的基質を含むことも有用である。用いた1種の該物質はMatrigelTMであり、これはネズミ細胞由来の人工的基底膜であり、ネズミ細胞を含まない市販の製品として供給される。現在同様の目的を果たすことも知られているヒト由来の別の物質は、その不溶性形態で用いられて繊維基質を作成し、さらにES細胞培養のための基底膜としての役割も果たすヒト型糖蛋白質であるフィブロネクチンである。我々が考えるに、フィブロネクチンの基質単独では十分でない。しかし、ここでヒト型基質物質がヒト型基質蛋白質コラーゲンIV、フィブロネクチン、ラミニン、及びビトロネクチンの組み合わせから製造できることも見出され、及びこの基質はTeSR1培地においてヒトES細胞を無制限に未分化状態に支持するのに十分である。上記培地添加剤の到達に続き、80種以上の個々の成長因子の方法論的な試験をした。一部の添加剤が、少なくともいくつかの継代で、培養中のヒトES細胞の成長を支持するように見える一方、多くがその後の継代において該ES細胞を未分化状態に保持することができなかった。以下の実施例に記載される培地添加剤の結果を与えたこれらの因子の他の組み合わせを確認していない。これは、該成分をいくつかの変化に付さないと言うわけではない。例えば、LiClを培地に用いるのは、wnt経路を刺激するからである。この経路のwnts自体又は他の刺激物、例えばアクチビンは、LiClがおそらくこの目的のために最も経済的な試薬であるとしても、当量のLiClと置き換えることができる。同様に、GABAはGABA受容体と相互作用すると考えられ、及び科学文献は、同一の受容体の作用薬であり、且つ培地におけるGABAの同等物として置き換えられ得るいくつかの分子の同定を含む。PAは、GABA受容体とも相互作用すると考えられている。PA及びGABAの両方がここで用いられる濃度で培地に有用であることが見出され、1種以上の他のこれらの成分が濃度で劇的に上昇し、他の必要性を取り除くことも考えられる。より高い濃度の線維芽細胞成長因子は、支持細胞の必要性を除外するように見える。好ましいFGFは、bFGF及びFGF2とも呼ばれる塩基性FGFであるが、少なくともFGF4、FGF9、FGF17及びFGFl8を含む他のFGFsは、この目的のために同様に十分である。他のFGFsは、より高い濃度でも作用し得る。線維芽細胞支持細胞の存在下又はならし培地において培養されるときに、ヒト胚幹細胞培養物を予め未分化状態のみで保持するという知見は、線維芽細胞がES細胞の分化を阻害するように作用する因子を該培地に放出するという推測を導いた。しかし、培地に対する線維芽細胞支持細胞によって媒介される効果が何であれ、以下に記載される培地が該効果の代わりとなることは明らかである。以下に定義される3種の培地を明確にし、動物性細胞を含まず、及び未分化状態での未分化ヒトES細胞の長期培養を可能にする。実施例は、ヒト化培地にするために培地における蛋白質が全てヒト型である培地、及び動物由来の細胞下生成物に関する全ての起こり得る問題を回避する培養条件も示す。実施例特に明記しない限り、ここに記載される全ての培養液に用いたTeSR1培地の成分を、以下の表1に述べる。我々の予備実験は、未分化ヒトES細胞増殖が72のpH、350mOsMolのモル浸透圧濃度、及び10CO25O2の気圧で最適であることを示した。これらの条件を、ここで記載される全てのその後の培養液に用いた。ヒトES細胞系Hl、H7、H9、及びH14細胞は、それぞれ11、7、25、及び17回の継代の間にTeSRlにおいて全て強く増殖された。核型は、7回の継代後の細胞系H14、及び8回及び21回の継代後のH9で正常であることを確認した。奇形腫形成は11回及び20回の継代後にH1及びH9で確認した。先のES細胞培養物が最適に満たないのはヒトが製造できないシアル酸であるNeu5Gcの存在のためであることが示された。ヒト型基質成分のコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン及びビトロネクチンがヒトES細胞のためのTeSR1培養条件から最終動物性生成物を除去したため、Neu5Gcがこの培地における培養中に現存するヒトES細胞系から除去されたか否かを試験した。線維芽細胞ならし培地において培養されたヒトES細胞でNeu5Gcの存在を確認し、減少したが検出可能な量でTeSR1上で培養された細胞でMatrigelを検出し、及び4種のヒト型基質成分を用いてTeSR1において培養されるES細胞上には全くNeu5Gcは検出できなかった。これらのデータを図2に説明する。従って、TeSR1及びヒト型蛋白質の基質で培養されたヒトES細胞は、ネズミ支持細胞上で培養される細胞で見出される非ヒト型シアル酸残渣を示さない。ヒトES細胞培養液の長期間維持のためのES細胞コロニーの条件及び培養液の安定性を試験するために、TeSR1培地を、我々の考えるならし培地を使用する最も優れた従来の培地条件と比較した。TeSR1培地が、ヒトES細胞を、90以上の細胞が長期間の培養後でもOct4に対して陽性を検定し続けるような未分化状態で保持できたことを見出した。この試験の結果を図3のグラフに示す。これは、いかなる支持細胞及びいかなるならし培地も含まない培地が、ヒトES細胞の未分化成長の濃度を、培養液中の90以上の細胞が全ての段階で未分化のままでいる程度に保持したことが分かる最も重要な事例を示している。3回の継代で培養されたH1の成長曲線及びFACS分析を、TeSR1培地、及び以下の各成分TGFβ、PA、LiCl、GABA及びbFGFを省いたTeSR1培地で測定した。培養を始めるために、各細胞系から3×105個の細胞を継代1の0日目に蒔いた。細胞数は3種のウェルからカウントし、付着物及び継代における最終細胞数を評価した。最初のプレーティング密度及びサンプリング時間を、5回の継代中に出来る限り繰り返した。細胞は継代3の6日目にFACSによって細胞表面マーカーSSEAl、SSEA4、Tra160及びTra181、及び転写因子Oct4に対して分析した。このデータを図1にグラフ式で示す。これらのデータは、ヒトES細胞が、培養液中の細胞のある種の望ましくない分化の損害のためにこれらの各成分の無い培地で培養できること、及び最も高い濃度の未分化培養物のみがこれらの成分の全てを用いることによって達成され得ることを示している。同様の結果が、他の細胞系でも同じように得られた。TeSR1培地において保持したヒトES細胞系の多分化能を試験した。Matrigel基質上で11回及び20回の継代中にTeSR1培地で培養された新規潜在性細胞系WAOl及びWA09の細胞を、それぞれSCIDベージュマウスに注入した。複雑な分化を示す奇形腫が、接種後6~8週間のネズミにおいて発生した。表1TeSRl培地の完全な処方無機塩mM塩化カルシウム08232HEPES1176塩化マグネシウム02352硫酸マグネシウム0319088塩化カリウム326144重炭酸ナトリウム112112塩化ナトリウム9455824リン酸ナトリウム、二塩基0392リン酸ナトリウム、モノ0355152微量ミネラルmM硝酸鉄39H2O000009408硫酸鉄0001176硫酸銅40768E06硫酸亜鉛0001176メタバナジン酸アンモニウムNH4VO30000056硫酸マンガンMnSO4H2O100592E05モリブデン酸アンモニウム100404E05NiSO46H2O494861E06メタケイ酸ナトリウムNa2SiO39H2O0004926108SnCl2532544E05CdCl2621931E05CrCl3941176E06AgNO3500293E06AlCl36H2O24855E05Ba2499217E05CoCl26H2O50021E05GeO225337E05KBr504202E06KI512048E06NaF0000500119アミノ酸mMLアラニン01392Lアルギニンヒドロクロライド05488LアスパラギンH2O01392Lアスパラギン酸01392LシステインHClH2O00784Lシスチン2HCl00784Lグルタミン酸01392Lグルタミン296グリシン0296LヒスチジンHClH2O01176Lイソロイシン0326144Lロイシン0353584Lリシンヒドロクロライド0391216Lメチオニン0090944Lフェニルアラニン016856Lプロリン02176Lセリン0296Lトレオニン0352016Lトリプトファン00346528Lチロシン2Na2H2O0167776Lバリン0354368ビタミンmMアスコルビン酸0375ビオチン112112E05塩化コリン00502544Dカルシウムパントテナート00036064葉酸0004704iイノシトール005488ナイアシンアミド0012936ピリドキシンヒドロクロライド00076048RbCl500414E05ZrOCl28H2O903834E05リボフラビン00004704チアミンヒドロクロライド002460217ビタミンB120000392成長因子mMGABA0979ピペコリン酸0000984bFGF580E06LiCl0979TGFベータ1235E08脂質mMリノール酸00070976リポ酸000039984アラキドン酸0001312コレステロール00113798DLアルファトコフェロールアセテート002962リノレン酸0007184ミリスチン酸0008758オレイン酸000708パルミトレイン酸0007862ステアリン酸000703エネルギー基質mMDグルコース1372784ピルビン酸ナトリウム0392蛋白質mMヒトインスリン00034438ヒトホロトランスフェリン014ヒト血清アルブミン1997他の成分mMグルタチオン000592996ヒポキサンチンNa001176フェノールレッド00159936プトレッシン2HCl0000394352チミジン00011762メルカプトエタノール01セレン0000177304PluronicF680238Tween8003358本発明の好ましい態様は、例えば以下の通りである。1支持細胞又はならし培地を必要としない基質上でヒト幹細胞を未分化状態で培養するための、塩、ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム及び形質転換成長因子ベータを、複数回の連続する培養継代中に該ヒト幹細胞を未分化状態で保持するのに十分な量で含む培地において、該ヒト幹細胞を培養する工程を含む、方法。2培地が、少なくとも40ngmLの濃度で線維芽細胞成長因子を含む、1記載の方法。3培地が、トランスフェリン及びインスリンも含む、1記載の方法。4ヒト幹細胞が胚幹細胞である、1記載の方法。5基質上でヒト胚幹細胞を培養する方法において、及び塩、ビタミン、アミノ酸、及び線維芽細胞成長因子を含む培地において、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム及び形質転換成長因子ベータを、複数回の連続する培養継代中に該細胞を未分化状態で保持するのに十分な量で該培地に加えることを含む、方法。6ヒト幹細胞幹細胞が成長することのできる基質及び塩、ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム及び形質転換成長因子ベータを、複数回の培養継代中に該ヒト幹細胞を未分化状態で保持するのに十分な量で含む培養培地であって、支持細胞を含まず、且つ支持細胞に決して露出されない培地を培養容器内に含む、生体外細胞培養。7培地が、少なくとも40ngmLの濃度で線維芽細胞成長因子を含む、6記載の細胞培養。8培地が、少なくとも100ngmLの濃度で線維芽細胞成長因子を含む、6記載の細胞培養。9培地が、アルブミン、インスリン及びトランスフェリンからなる群から選択される蛋白質をさらに含む、6記載の細胞培養。10蛋白質がヒト型である、6記載の細胞培養。11インスリン及びトランスフェリンが組み換え型蛋白質である、10記載の細胞培養。12幹細胞がヒト胚幹細胞である、6記載の細胞培養。13未分化ヒト幹細胞、基質及び培養培地を含むヒト胚幹細胞の培養であって、該培養は支持細胞又は支持細胞に露出された培地を含まず、該培地は非ヒト型動物からの生成物も含まず、該ヒト胚幹細胞は未分化状態で増殖し、且つ長期培養中に転写因子Oct4に対して少なくとも90陽性である、培養。14細胞がシアル酸残渣Neu5Gcを示さない、13記載のヒト胚幹細胞の培養。15幹細胞を培養するための培地であって、塩、ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム及び形質転換成長因子ベータを、複数回の培養継代中に該培地において未分化状態で成長した幹細胞を保持するのに十分な量で含む、培地。16培地が、アルブミン、インスリン及びトランスフェリンからなる群から選択される蛋白質をさらに含む、15記載の培地。