"幹細胞を、以下の工程1~6に付すことを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造法:1幹細胞を、Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程2前記1で得られた細胞を、GSK3阻害剤を含む培地で培養する工程3前記2で得られた細胞を、GSK3阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程4前記3で得られた細胞から、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程5前記4で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程6前記5で得られた細胞を、培地で培養する工程。工程3におけるアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤がアクチビンである、請求項1記載の製造法。工程1におけるRhoキナーゼ阻害剤が-R-トランス-4-1-アミノエチル-N-4-ピリジルシクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩である、請求項1記載の製造法。工程2および3におけるGSK3阻害剤が、i6-[[2-[[4-2,4-ジクロロフェニル-5-4-メチル-1H-イミダゾール-2-イル-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]ニコチノニトリル、および/またはii2’Z,3’E-6-ブロモインジルビン-3’-オキシムである、請求項1記載の製造法。工程5におけるレチノイン酸受容体アゴニストがレチノイン酸である、請求項1記載の製造法。工程5におけるAMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤がドーソモルフィンである、請求項1記載の製造法。工程5におけるアクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤が4-[4-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル-5-2-ピリジニル-1H-イミダゾール-2-イル-ベンズアミドである、請求項1記載の製造法。工程5における細胞増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子である、請求項1記載の製造法。工程1~6において、フィーダー細胞を実質的に用いない、請求項1記載の製造法。工程1~6における培地が、血清を実質的に含まない、請求項1記載の製造法。幹細胞が、人工多能性幹細胞iPS細胞、胚性幹細胞ES細胞又はヒトの体性幹細胞である請求項1記載の製造法。膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、膵ポリペプチドPP産生細胞、及びグレリン産生細胞からなる群より選択されるいずれかである請求項1記載の製造法。内胚葉細胞を、以下の工程4’および5’に付すことを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造法:4’内胚葉細胞から細胞塊を形成させ、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程5’前記4’で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程。請求項1または13に記載の製造法で得られた膵ホルモン産生細胞を含む、医薬。以下の工程1~6からなる群より選択されるいずれか1種以上の工程によって得られた細胞を用いることを特徴とする、糖尿病治療薬のスクリーニング方法:1幹細胞を、Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程2前記1で得られた細胞を、GSK3阻害剤を含む培地で培養する工程3前記2で得られた細胞を、GSK3阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程4前記3で得られた細胞から、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程5前記4で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程6前記5で得られた細胞を、培地で培養する工程。本発明の目的は、細胞医療の応用により適した膵ホルモン産生細胞の製造法、該製造法により得られた膵ホルモン産生細胞を含む医薬、および該細胞を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法を提供することである。本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、段階的に分化誘導因子の種類やその組合せを変えること、および内胚葉細胞から細胞塊を形成させた後に浮遊状態で培養すること等によって、幹細胞からより膵発生を模倣した形三次元的な構造を維持した形の膵ホルモン産生細胞を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下を提供する。[1]幹細胞を、以下の工程1~6に付すことを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造法:1幹細胞を、Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程2前記1で得られた細胞を、GSK3阻害剤を含む培地で培養する工程3前記2で得られた細胞を、GSK3阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程4前記3で得られた細胞から、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程5前記4で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程6前記5で得られた細胞を、培地で培養する工程;[2]工程3におけるアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤がアクチビンである、上記[1]記載の製造法;[3]工程1におけるRhoキナーゼ阻害剤が-R-トランス-4-1-アミノエチル-N-4-ピリジルシクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩である、上記[1]または[2]記載の製造法;[4]工程2および3におけるGSK3阻害剤が、i6-[[2-[[4-2,4-ジクロロフェニル-5-4-メチル-1H-イミダゾール-2-イル-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]ニコチノニトリル、および/またはii2’Z,3’E-6-ブロモインジルビン-3’-オキシムである、上記[1]ないし[3]のいずれかに記載の製造法;[5]工程5におけるレチノイン酸受容体アゴニストがレチノイン酸である、上記[1]ないし[4]のいずれかに記載の製造法;[6]工程5におけるAMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤がドーソモルフィンである、上記[1]ないし[5]のいずれかに記載の製造法;[7]工程5におけるアクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤が4-[4-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル-5-2-ピリジニル-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミドである、上記[1]ないし[6]のいずれかに記載の製造法;[8]工程5における細胞増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子である、上記[1]ないし[7]のいずれかに記載の製造法;[9]工程1~6において、フィーダー細胞を実質的に用いない、上記[1]ないし[8]のいずれかに記載の製造法;[10]工程1~6における培地が、血清を実質的に含まない、上記[1]ないし[7]のいずれかに記載の製造法;[11]幹細胞が、人工多能性幹細胞iPS細胞、胚性幹細胞ES細胞又はヒトの体性幹細胞である上記[1]ないし[10]のいずれかに記載の製造;[12]膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞、グルカゴン産生細胞、ソマトスタチン産生細胞、膵ポリペプチドPP産生細胞、及びグレリン産生細胞からなる群より選択されるいずれかである上記[1]ないし[11]のいずれかに記載の製造法;[13]内胚葉細胞を、以下の工程4’および5’に付すことを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造法;4’内胚葉細胞から細胞塊を形成させ、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程5’前記4’で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程;[14]上記[1]ないし[13]のいずれかに記載の製造法で得られた膵ホルモン産生細胞を含む、医薬;[15]以下の工程1~6からなる群より選択されるいずれか1種以上の工程によって得られた細胞を用いることを特徴とする、糖尿病治療薬のスクリーニング方法:1幹細胞を、Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程2前記1で得られた細胞を、GSK3阻害剤を含む培地で培養する工程3前記2で得られた細胞を、GSK3阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程4前記3で得られた細胞から、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程5前記4で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程6前記5で得られた細胞を、培地で培養する工程。本発明の製造法によれば、幹細胞からより膵発生を模倣した形の膵ホルモン産生細胞を製造することができる。また、前記工程1~6のいずれか1種以上の工程によって得られた細胞は、糖尿病等の膵ホルモン産生及び/又は分泌異常に起因する疾患の予防及び/又は治療に有用な化合物のスクリーニングに用いることができる。さらに本発明の細胞は、そのような疾患を治療するための細胞医療に用いることができ、三次元的な構造を維持しているので、従来の製造方法により得られる膵ホルモン産生細胞と比較しても、細胞医療への応用により適した細胞である。以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。本発明において膵ホルモン産生細胞とは、膵ホルモンを産生する能力を有する細胞を意味する。該膵ホルモン産生細胞は常に膵ホルモンを産生している必要はなく、膵ホルモンの産生能力を有していればよい。従って、産生される膵ホルモン量は特に限定されない。膵ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド、グレリンが挙げられる。膵ホルモン産生細胞としてはインスリン産生細胞膵β細胞と同義、グルカゴン産生細胞膵α細胞と同義、ソマトスタチン産生細胞膵δ細胞と同義、膵ポリペプチドPP産生細胞、グレリン産生細胞が挙げられる。これらの中でも、インスリン産生細胞が好ましい。本発明において幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する複数系列の細胞に分化しうる細胞をいう。具体的には胚性幹細胞ES細胞、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞EG細胞:ProcNatlAcadSciUSA.1998,95:13726-31、精巣由来の多能性幹細胞GS細胞:Nature.2008,456:344-9、体細胞由来人工多能性幹細胞inducedpluripotentstemcells;iPS細胞、ヒトの体性幹細胞組織幹細胞が挙げられ、好ましくは、iPS細胞、ES細胞またはヒトの体性幹細胞、さらに好ましくはiPS細胞である。ES細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。好ましくはヒトに由来する細胞を使用できる。ES細胞の具体例としては、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のES細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したES細胞、及びこれらのES細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したES細胞が挙げられる。各ES細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。マウスのES細胞は、1981年にエバンスらEvansetal.,1981,Nature292:154-6や、マーチンらMartinGR.etal.,1981,ProcNatlAcadSci78:7634-8によって樹立されており、例えば大日本住友製薬株式会社大阪、日本から購入可能である。ヒトのES細胞は、1998年にトムソンらThomsonetal.,Science,1998,282:1145-7によって樹立されており、WiCell研究施設WiCellResearchInstitute、ウェブサイト:http://www.wicell.org/、マジソン、ウイスコンシン州、米国、米国国立衛生研究所NationalInstituteofHealth、京都大学などから入手可能であり、例えばCellartis社ウェブサイト:http://www.cellartis.com/、スウェーデンから購入可能である。iPS細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。好ましくはヒトに由来する細胞を使用できる。iPS細胞の具体例としては、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入して得られる、ES細胞同様の多分化能を獲得した細胞例えば、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、c-Myc遺伝子及びSox2遺伝子を導入することによって得られるiPS細胞、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子及びSox2遺伝子を導入することによって得られるiPS細胞NatBiotechnol2008;26:101-106等が挙げられる。他にも、導入遺伝子をさらに減らした方法Nature.2008Jul31;4547204:646-50、低分子化合物を利用した方法CellStemCell.2009Jan9;41:16-9、CellStemCell.2009Nov6;55:491-503、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法CellStemCell.2009May8;45:381-4など、iPS細胞の作製法については技術的な改良が鋭意行われているが、作製されたiPS細胞の基本的な性質、すなわち多分化能を有するという点は作出方法によらず同等であり、いずれも本発明の製造法に用い得る。体性幹細胞としては、ヒトに由来するものが使用できる。ここで体性幹細胞とは、膵ホルモン産生細胞へと分化し得る細胞であり、例えば骨髄や脂肪由来の間葉系幹細胞や膵臓内に存在する幹細胞が挙げられる。本発明の方法を用いれば、作製方法の異なるヒトiPS細胞株等、種々の幹細胞株からの膵ホルモン産生細胞の製造が可能となる。1.膵ホルモン産生細胞の製造法本発明の製造法は、幹細胞から膵ホルモン産生細胞を製造する方法である。また、本発明の製造法は、より未分化な状態にある細胞幹細胞をより分化した状態膵ホルモン産生細胞へと分化誘導する方法でもある。本発明の製造法は、以下の工程1~6を含む。1幹細胞を、Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程2前記1で得られた細胞を、GSK3阻害剤を含む培地で培養する工程3前記2で得られた細胞を、GSK3阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程4前記3で得られた細胞から、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程5前記4で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程6前記5で得られた細胞を、培地で培養する工程工程1:幹細胞を、Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程本工程は、後述する工程2の幹細胞から膵ホルモン産生細胞へと分化誘導を開始する工程の前段階、すなわち、幹細胞の前培養播種の段階に相当する。本工程における幹細胞は、フィーダー細胞またはフィーダー細胞抽出物と共培養されたものであってもよい。ここでフィーダー細胞とは、共培養によって、他の種類の細胞が増殖できる環境を提供する細胞をいう。本工程における幹細胞としては、分散細胞又は非分散細胞のいずれでもよいが、分散細胞であるのが望ましい。分散細胞としては、単一細胞、及び数個典型的に約2~500、20~200、又は50~100個の細胞からなる細胞塊後述の工程4で説明するように、細胞塊とは、複数個の細胞が相互に接着等することによって一つの塊をなしている状態をいうを形成している細胞が挙げられるが、本工程においては、細胞塊であるのが望ましい。分散細胞の調製は、自体公知の方法により行われ得る。このような方法としては、キレート剤例、EDTA、酵素例、トリプシン、コラゲナーゼ等による処理、機械的な分散例、ピペッティングなどの操作が挙げられる。分散細胞は、浮遊細胞浮遊細胞とは、培養器や基材に接着していない状態の細胞をいう、または接着細胞接着細胞とは、培養器や基材に接着している状態の細胞をいうであり得る。本工程では、上述した幹細胞について、フィーダー細胞またはフィーダー細胞抽出物を除去例えば、遠沈管に移して2~10分間静置し、上清を除くことによって、除去した後に、後述するRhoキナーゼ阻害剤を含む培地で培養するすなわち、播種時からフィーダー細胞を用いることなく、分化誘導を開始するのが望ましい。Rhoキナーゼ阻害剤とは、Rhoキナーゼの活性を阻害する物質をいう。Rhoキナーゼとは、GTPグアノシン三リン酸の分解酵素であるGTPアーゼの範疇に含まれる低分子量GTP結合タンパク質低分子量Gタンパク質の1種で、アミノ末端にセリン/スレオニンキナーゼ領域、中央部にコイルドコイル領域およびカルボキシ末端にRho相互作用領域を有するAmanoetal.,Exp.Cell.Res.,261,44-512000。本工程で用いるRhoキナーゼ阻害剤としては、例えば、1-5-イソキノリンスルホニル-2-メチルピペラジンH-7、1-5-イソキノリンスルホニル-3-メチルピペラジンイソH-7、N-2-メチルアミノエチル-5-イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩H-8、N-2-アミノエチル-5-イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩H-9、N-[2-p-ブロモシンナミルアミノエチル]-5-イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩H-89、N-2-グアニジノエチル-5-イソキノリンスルホンアミド塩酸塩HA-1004、1-5-イソキノリンスルホニルホモピペラジン二塩酸塩Fasudil/HA-1077、S--2-メチル-4-グリシル-1-4-メチルイソキノリニル-5-スルホニルホモピペリジン二塩酸塩H-1152、-R-トランス-4-1-アミノエチル-N-4-ピリジルシクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩Y-27632が挙げられる。これらはいずれも商業的に入手可能例えば、SIGMA社、和光純薬工業社から購入可能であり、なかでも特にY-27632が好ましい。本工程では、1種又は2種以上のRhoキナーゼ阻害剤の組み合わせのいずれも使用可能である。本工程において、幹細胞は、Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地で培養される。Rhoキナーゼ阻害剤の培地中での濃度は、幹細胞の生存率の向上等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常0.01~1000μM、好ましくは0.1~100μM、特に好ましくは1.0~50μMである。Rhoキナーゼ阻害剤としてY-27632を用いる場合、好ましくは約1.0~約30μM、さらに好ましくは約2.0~約20μMの濃度で用いられ得る。Rhoキナーゼ阻害剤としてFasudil/HA1077を用いる場合、Y-27632の上記濃度の約2倍の濃度で用いられ得る。複数種のRhoキナーゼ阻害剤を組み合わせて使用する場合は、各阻害剤を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地での培養時間は、幹細胞の生存率の向上等の所望の効果を達成し得るような長さの時間である限り特に限定されない。例えば、幹細胞がヒトiPS細胞である場合、ヒトiPS細胞を分散させた後に約12時間以上の時間例、12~72時間にわたり、Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地で培養すれば所望の効果を十分に得ることができる。Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地中の幹細胞の密度は、幹細胞の生存率の向上等の所望の効果を達成し得るような密度である限り特に限定されない。好ましくは約1.0×101~1.0×107細胞/ml、より好ましくは約1.0×102~1.0×107細胞/ml、さらにより好ましくは約1.0×103~1.0×107細胞/ml、並びに最も好ましくは約3.0×104~1.0×106細胞/mlである。本工程で用いる培地は、Rhoキナーゼ阻害剤を含有している限り、特に限定されず、通常、幹細胞を培養するのに用いられる培地以下、便宜上、基礎培地とも称するにRhoキナーゼ阻害剤を添加してなるものである。本工程で用いる基礎培地としては、霊長類ES/iPS細胞用培地リプロセル培地、BME培地、BGJb培地、CMRL1066培地、GlasgowMEM培地、ImprovedMEMZincOption培地、IMDM培地、Medium199培地、EagleMEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、RPMI1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの培地から任意に選択した2種以上の培地を混合した培地などが使用できる。ただし、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。本工程では、特に霊長類ES細胞用培地リプロセル培地を用いることが望ましい。これらの培地は、リプロセル社、Invitrogen社、SIGMA社、コスモバイオ社などから購入可能である。本工程で用いる培地としては、血清及び/又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。本明細書中、血清を実質的に含まないとは、血清の含量で、約1容量未満、好ましくは約0.1容量未満、さらに好ましくは約0.01容量未満であることを意味する。無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分例えば、増殖因子が混入している培地は無血清培地に該当する。本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン例えば、脂質リッチアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素例えば亜鉛、セレン、B27サプリメント、N2サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、2-メルカプトエタノール、3’チオールグリセロール、及びこれらの均等物が挙げられる。ノックアウトシーラムリプレースメントはInvitrogen社から購入可能である。その他の血清代替物については、Invitrogen社、SIGMA社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能である。培地中の濃度は、血清代替物がB27サプリメントの場合、0.01~10重量、好ましくは、0.1~2重量である。本工程では、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましい。すなわち、本工程で用いる培地は、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に含まない培地であるのが好ましく、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を全く含まない培地であるのがより好ましい。本明細書中、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に含まないとは、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物の培地中の含量が約5容量未満、好ましくは約1容量未満、さらに好ましくは約0.01容量未満であることをいう。本工程においてフィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、本発明の製造法により製造された膵ホルモン産生細胞には拒絶反応の原因物質例、動物由来の細胞の混入が少ない。本工程での培養は、通常、培養器を用いて行われる。このような培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば、特に限定されないが、接着培養の実施に際しては細胞接着性であるのが望ましく、浮遊培養の実施に際しては細胞非接着性であるのが望ましい。培養器の例としては、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックスECM等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものである。接着培養の際の培養器としては、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、細胞培養シートなどが挙げられる。これらの培養器は細胞との接着性を向上させるために親水性を付与したり、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞支持用基質でコーティングされてもよい。なお、細胞培養シートとは、細胞をシート状に培養することを目的する支持体を指し、例えばOptiCellNunc社が市販されている。本工程における細胞支持用基質は、TypeI-collagen、BDマトリゲル日本ベクトンデッキンソン社、フィブロネクチンInvitrogen社などが好ましく用いられるが、BDマトリゲル、フィブロネクチンを用いるのがより好ましく、フィブロネクチンを用いるのがさらに好ましい。浮遊培養の際の培養器としては、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、チューブ、ローラーボトルなどが挙げられる。これらの培養器は疎水性の材質を用いたものであったり、ハイドロゲルや脂質など、細胞やタンパク質の吸着を防止する素材をコーティングしたものである。細胞の凝集塊を効率的に形成させるためには、U字あるいはV字形状の底面を有する培養器を使用することが望ましい。その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、使用する幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されるものではないが、約30~40°C、好ましくは約37°Cであり得る。CO2濃度は、約1~10、好ましくは約2~5であり得る。酸素分圧は、1~10であり得る。工程2:前記工程1で得られた細胞を、GSK3阻害剤を含む培地で培養する工程本工程は、前記工程1に続いて実施する工程であり、後述する工程3とともに幹細胞から内胚葉細胞への分化を誘導する工程に相当する。セリン/スレオニンプロテインキナーゼであるGSK3グリコーゲンシンターゼキナーゼ3は、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。GSK3には異なる遺伝子にコードされアミノ酸レベルで高い相同性を有するGSK3αとGSK3βのアイソフォームが存在する。また、GSK3がWntシグナルにも関与し、GSK3を阻害することによりWntシグナルが活性化されることが知られている。GSK3阻害剤として、GSK3α阻害剤及びGSK3β阻害剤が挙げられるが、本工程では、GSK3β阻害剤が望ましい。GSK3阻害剤として、具体的にはCHIR980142-[[2-[5-ニトロ-6-アミノピリジン-2-イルアミノ]エチル]アミノ]-4-2,4-ジクロロフェニル-5-1H-イミダゾール-1-イルピリミジン、CHIR99021、ケンパウロン、AR-AO144-18、TDZD-84-ベンジル-2-メチル-1,2,4-チアジアゾリジン-3,5-ジオン、SB2167633-2,4-ジクロロフェニル-4-1-メチル-1H-インドール-3-イル-1H-ピロール-2,5-ジオン、BIO、TWS-1193-[6-3-アミノフェニル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イルオキシ]フェノール及びSB4152862-3-クロロ-4-ヒドロキシフェニルアミノ-3-2-ニトロフェニルマレインイミド[2-[2,5-ジヒドロ-4-[3-クロロ-4-ヒドロキシフェニルアミノ]-2,5-ジオキソ-1H-ピロール-3-イル]フェニル]オキシラトオキソイミニウムが例示される。これらはAxonMedchemBV社、和光純薬工業社、EnzoLifeSciences,Inc.社、MerckBioscience社、TocrisBioscience社、Stemgent社、Sigma社などから購入可能である。また、GSK3のmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA等もGSK3阻害剤として使用することができる。これらはいずれも商業的に入手可能であるか既報に従って合成することができる。幹細胞から内胚葉細胞への分化誘導にWnt-3Aペプチドを用いる方法が知られている非特許文献1、2、5。一方、本工程では、低分子化合物であるGSK3阻害剤を使用することで、優れた操作性、再現性、選択性を提供することができる。GSK3β阻害剤は、好ましくは、CHIR990216-[[2-[[4-2,4-ジクロロフェニル-5-4-メチル-1H-イミダゾール-2-イル-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]ニコチノニトリルまたはBIO2’Z,3’E-6-ブロモインジルビン-3’-オキシムである。本工程では、1種又は2種以上のGSK3阻害剤の組み合わせのいずれも使用可能である。GSK3阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、通常、0.01~100μM、好ましくは0.1~10μMである。CHIR99021の場合、通常0.1~20μM、好ましくは1~5μM、BIOの場合、通常0.01~5μM、好ましくは0.1~2μMである。複数種のGSK3阻害剤を組み合わせて使用する場合は、各阻害剤を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。本工程で用いる培地は、GSK3阻害剤を含有している限り、特に限定されず、通常、幹細胞を培養するのに用いられる培地基礎培地にGSK3阻害剤を添加してなるものである。本工程で用いる基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL1066培地、GlasgowMEM培地、ImprovedMEMZincOption培地、IMDM培地、Medium199培地、EagleMEM培地、αMEM培地、DMEM培地、無血清DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの混合培地が挙げられる。ただし、本工程で用いる基礎培地は、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。これらの培地は、Invitrogen社、SIGMA社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能である。本工程で用いる基礎培地は、好ましくは、無血清DMEM/F12培地、RPMI1640培地、ImprovedMEMZincOption培地、特に好ましくは、無血清DMEM/F12培地である。本工程で用いる培地としては、血清及び/又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。本工程では、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましく、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を全く用いないのがより好ましい。本工程においてフィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、本発明の製造法により製造された膵ホルモン産生細胞には拒絶反応の原因物質例、動物由来の細胞の混入が少ない。本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素例えば亜鉛、セレン、B27サプリメント、N2サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、2-メルカプトエタノール、3’チオールグリセロール、及びこれらの均等物などが挙げられる。本工程で用いる血清代替物としては、B27サプリメントが好ましい。培地中の濃度は、B27サプリメントの場合、0.01~10重量、好ましくは、0.1~2重量である。これらの血清代替物については、Invitrogen社、SIGMA社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能である。本工程における培養温度は、使用する幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されるものではないが、約30~40°C、好ましくは約37°Cである。培養時間は、約37°Cの培養温度で、6~144時間、好ましくは12~72時間である。本工程における培養は、通常、約1~10、好ましくは5のCO2を通気したインキュベーター内にて行われる。工程3:前記工程2で得られた細胞を、GSK3阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程本工程は、前記工程2に続いて実施する工程であり、幹細胞からの内胚葉細胞への分化誘導を完了させる工程に相当する。本工程で使用されるアクチビン受容体様キナーゼALK-4,7の活性化剤は、ALK-4及び/またはALK-7に対し活性化作用を有する物質から選択される。本工程で使用されるアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤の例としては、アクチビン、Nodal、Myostatinが挙げられ、いずれも商業的に入手可能である。なかでも、本工程で使用されるアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤としてはアクチビンが好ましい。上記アクチビンは、TGFβトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する大きさ24kDのペプチド性細胞増殖、分化因子であり、2個のβサブユニットがSS結合を介して2量体を構成しているLing,N.,etal.,1986Nature321,779-782;Vale,W.,etal.,1986Nature321,776-779。本発明においてはアクチビンA、B、C、D、ABのいずれでも、またヒト、マウス等いずれの動物由来のものをも使用でき、これらは商業的に入手可能である。このなかでも特にアクチビンAが好適に用いられる。使用する幹細胞の由来する動物種と同じ動物種由来のアクチビンを用いるのが好ましく、例えばヒト由来の幹細胞を出発原料とする場合、ヒトアクチビンAを用いるのが好ましい。本工程における培地中のアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤の濃度は、用いるアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤の種類によって適宜設定されるが、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤としてアクチビンを使用する場合の培地中の濃度は通常0.1~200ng/ml、好ましくは5~150ng/ml、特に好ましくは10~100ng/mlである。本工程では、1種又は2種以上のアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤の組み合わせのいずれも使用可能であり、複数種の活性化剤を組み合わせて使用する場合は、各活性化剤を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。また、本工程では、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤とともにGSK3阻害剤を培地中に含めることを特徴とする。アクチビン及びGSK3阻害剤との存在下に幹細胞を培養すれば、より好適に内胚葉細胞へと分化させることができる。本工程で使用するGSK3阻害剤として、GSK3α阻害剤及びGSK3β阻害剤が挙げられる。本工程で使用するGSK3阻害剤としては、GSK3β阻害剤が好ましい。本工程で使用するGSK3阻害剤として、具体的には、前記工程2で例示したGSK3阻害剤と同様のものが列挙されるが、本工程においても、GSK3β阻害剤であるCHIR99021またはBIOが好ましく用いられる。GSK3阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、CHIR99021の場合、通常0.1~20μM、好ましくは1~5μM、BIOの場合、通常0.01~5μM、好ましくは0.1~2μMである。本工程では、1種又は2種以上のGSK3阻害剤の組み合わせのいずれも使用可能であり、複数種の阻害剤を組み合わせて使用する場合は、各阻害剤を上記した濃度範囲に基づいて適宜増減して使用する。本工程において、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤とGSK3阻害剤とは、培地中に同時に添加されてもよく、また、幹細胞の内胚葉細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤とGSK3阻害剤とは、培地中に同時に添加されることが簡便であり、また好ましい。本工程で用いる培地は、前記工程2で例示した基礎培地に、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤及びGSK3阻害剤を添加することにより作製される。本工程で用いる培地は、前記工程2で用いたものと同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよいが、同種の基礎培地例、無血清DMEM/F12培地を用いて作製されたものであることが好ましい。本工程で用いる基礎培地は、好ましくは、無血清DMEM/F12培地、RPMI1640培地、ImprovedMEMZincOption培地、特に好ましくは、無血清DMEM/F12培地である。本工程では、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましく、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を全く用いないのがより好ましい。本工程で用いる培地としては、血清及び/又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。本工程においてフィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、本発明の製造法により製造された膵ホルモン産生細胞には拒絶反応の原因物質例、動物由来の細胞の混入が少ない。本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素例えば亜鉛、セレン、B27サプリメント、N2サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、2-メルカプトエタノール、3’チオールグリセロール、及びこれらの均等物などが挙げられるが、B27サプリメントが望ましい。培地中の濃度は、B27サプリメントの場合、0.01~10重量、好ましくは、0.1~2重量である。本工程における培養温度は、使用する細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されるものではないが、約30~40°C、好ましくは約37°Cである。培養時間は、約37°Cの培養温度で、6~288時間、好ましくは12~124時間である。本工程における培養は、通常、約1~10、好ましくは5のCO2を通気したインキュベーター内にて行われる。本工程において、幹細胞が内胚葉細胞に分化誘導されたことの確認は、内胚葉マーカーを用いて行われる。具体的には、内胚葉細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子内胚葉マーカーの発現の有無を評価することによって行うことができる。タンパク質の発現は抗原抗体反応を利用した方法等によって、遺伝子の発現はRT-PCRを利用した方法等によって評価することができる。該マーカーとしては、SOX17性決定領域Y、SexdeterminingregionY、Goosecoidgoosecoidhomeobox、CXCR4chemokineC-X-Cmotifreceptor4、FOXA2forkheadboxA2等が挙げられる。工程4:前記工程3で得られた細胞から、細胞塊sphereを形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程本工程は、前記工程3で得られた、内胚葉細胞に分化した状態にある細胞、すなわち、内胚葉細胞について、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程再播種する工程である。本明細書中、細胞塊とは、複数個の細胞が相互に接着等することによって、一つの塊をなしている状態例えば、10個以上の細胞が相互に接着した状態をいい、単離細胞及びみなし単離細胞に相対する概念である。単離細胞とは、他の細胞と接着せずに独立した状態にある一つの細胞をいう。みなし単離細胞とは、1,2個の他の細胞と接着している、或いは接着力が弱く簡単に離れてしまう程度に集合している状態の数個の細胞の群をいう。本工程において、細胞塊とは、前記工程3で得られた、複数個例えば10個以上の細胞内胚葉細胞が、細胞間で相互に接着等することによって、一つの塊をなしている状態をいう。細胞塊と単離細胞及びみなし単離細胞とは、集合している細胞数例えば3個以上の細胞が集合していれば、細胞塊によって区別されてもよいが、細胞懸濁液を光学顕微鏡などで拡大して観察した平面像において、細胞として一つのまとまりをなす領域の面積によって区別されてもよい。例えば、細胞の大きさ半径が10μm程度の場合、その断面積は約300μm2となる。従って、例えば、細胞として一つのまとまりをなす領域の面積が300μm2未満であれば単離細胞及びみなし単離細胞とし、900μm2すなわち細胞3個分より広ければ細胞塊としてもよい。10個以上の細胞が相互に接着した細胞塊を形成したとすれば、その断面積は3000μm2以上になると想定される。本明細書中、浮遊状態で培養するとは、培地中において、非接着性の条件下で培養することをいう。非接着性の条件下での培養とは、培養器や基材に接着させない状態例えば、非接着性のマルチウェルプレートを利用での培養をいう。非接着性の条件下での培養は、自体公知の方法により行われ得る。このような方法としては、例えば、培養器の表面にポリヒドロキシエチルメタアクリレート等の親水性の物質プロテオグリカンをコートし、細胞の基材への接着を阻害する方法CellStructFunct,13,1791988や、冷却することにより培養液に溶解する合成高分子化合物を培養器の表面に塗布し、細胞を接着させた後、培養器を冷却して合成高分子化合物を溶解し、細胞のシートを作る方法BioTechnology,8,8541990があり、これらの方法は必要に応じて改良することができる。例えば、培養液交換時の細胞の損失を防ぐため、一旦、培養器に遠心操作を施し、細胞塊を培養器表面に強制的に付着させた後、培養液を交換することや、細胞ごと培養液を遠沈管に移し、遠心操作で細胞を落とした後、上清の培養液を交換することができる。本工程では、細胞塊の形成前に、前記工程3で得られた細胞内胚葉細胞に、タンパク質消化酵素を添加して、細胞同士を分離させ、単一細胞の状態にしてもよい。タンパク質消化酵素としては、トリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ディスパーゼ、アキュターゼInvitrogen商品名等を用いることができるが、これらに限定されない。これらのタンパク質消化酵素は、典型的には、消化酵素の作用の阻害剤であるCa2やMg2をキレートするためにEDTAを加えて、トリプシン-EDTA溶液例:0.25トリプシン-1mMEDTAの様な形態で用いられる。本工程において、前記工程3で得られた細胞から、細胞塊は、例えば、以下のようにして調製することができる。すなわち、前記工程3で得られた細胞を、適当な媒体中、培養器上で浮遊培養する。例えば、低接着性の培養器として96ウェルの丸底ディッシュを用いた場合には、1ウェルあたり2~40万細胞を播種し、形成した凝集体を低接着性の6cmディッシュ等に移したりしながら、37°Cで、約6時間~約10日間、好ましくは約6時間~約2日間、さらに好ましくは1日間、適当な培地中で培養する。低接着性の培養器としては、通常、当技術分野で用いられている培養器に低接着性となるような処理を施したものが例示される。培養器としては、培養ディッシュ、培養フラスコ、回転培養用器具スピナーフラスコ等等が挙げられ、具体的にはスフェロイドプレートが挙げられる。低接着性となるような処理としては、ハイドロゲルを共有結合させることコーティングによって蛋白質や細胞の接着を抑制するような処理が用いられる。具体的には、本工程は、前記工程3で得られた細胞を、例えば、96穴のスフェロイドプレートに1穴あたり2×104個の密度で播種し、37°C、5CO2の条件下で、1のB27サプリメントが添加されたImprovedMEMZincOption培地で1日間培養する。本工程において、上記のようにして得られた細胞塊を、培地中において浮遊状態で培養する。浮遊状態での培養とは、上述のとおり、非接着性の条件下での培養、すなわち、培養器や基材に接着させない状態例、非接着性のマルチウェルプレートでの培養をいう。本工程で用いる培地すなわち、再播種時の培地としては、前記工程2で例示した基礎培地が挙げられる。本工程で用いる培地は、上記工程2~3と同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよいが、膵ホルモン産生細胞への分化誘導がより効率的に行えるという点で、ImprovedMEMZincOption培地Invitrogen社が、本工程での基礎培地として好適に用いられる。該培地は公知文献RichterA.etal.,NationalCancer197249,1705に従って調製することも可能である。本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素例えば亜鉛、セレン、B27サプリメント、N2サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、2-メルカプトエタノール、3’チオールグリセロール、及びこれらの均等物などが挙げられる。本工程で用いる血清代替物としてはB27サプリメントが好ましい。本工程では、特に、B27サプリメントが添加されたImprovedMEMZincOption培地Invitrogen社が好適に用いられる。培地中、B27サプリメントの濃度は、0.01~10重量、好ましくは0.1~2重量である。本工程では、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましく、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を全く用いないのがより好ましい。本工程においてフィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、拒絶反応の原因物質例、動物由来の細胞の混入が少ない。本工程で用いる培地としては、血清及び/又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。培養温度は、使用する細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されるものではないが、約30~40°C、好ましくは約37°Cである。培養時間は、6~360時間、好ましくは約1日間~約12日間、さらに好ましくは約8日間である。浮遊状態で細胞塊を形成させた場合には、細胞塊を形成させた後、細胞塊を浮遊培養に付すことなく、工程5に付すこともできる。この場合、工程5に移る前に形成された細胞塊を、0~48時間、好ましくは0~24時間浮遊状態で培養してもよい。本工程における培養は、通常、約1~10、好ましくは5のCO2を通気したインキュベーター内にて行われる。具体的には、本工程は、前記工程3で得られた細胞を、例えば、96穴のスフェロイドプレートに1穴あたり2×104個の密度で播種し、37°C、5CO2の条件下で、1のB27サプリメントが添加されたImprovedMEMZincOption培地で1日間培養する。本工程4は、前記工程1~3を経て得られた内胚葉細胞以外の内胚葉細胞を出発材料としても、膵ホルモン産生細胞を製造することができる。従って、本発明は、本工程4により、内胚葉細胞を出発材料とする膵ホルモン産生細胞の製造法、すなわち、内胚葉細胞から細胞塊を形成させ、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養することを特徴とする、膵ホルモン産生細胞の製造法本明細書中、本発明の製造法2と略記する場合があるも提供する。なお、上記工程1~3を経て得られた内胚葉細胞以外の内胚葉細胞を出発材料とした膵ホルモン産生細胞の製造法も、前記した工程3で得られた細胞を出発材料とした膵ホルモン産生細胞の製造法における工程4と同様に行うことができる。具体的には、本発明の製造法2は、内胚葉細胞を、以下の工程4’および5’に付すことを特徴とする。4’内胚葉細胞から細胞塊を形成させ、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程5’前記4’で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程工程4’は上記工程4と、工程5’は上記工程5とそれぞれ同様にして行うことができる。本工程、より好ましくは、前記工程1~3の後、本工程4を経ることによって、より膵発生を模倣した形の膵ホルモン産生細胞を製造することができる。該細胞は三次元細胞塊の構造を有するので、単層培養細胞に比べ、生体内における状態に近く、より機能的であると考えられる。さらに該細胞は三次元的な構造により、従来の製造方法により得られる膵ホルモン産生細胞と比較しても、細胞医療への応用により適した細胞であると考えられる。工程5:前記工程4で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程本工程は、前記工程4を経て得られた細胞、すなわち、浮遊状態で培養された内胚葉細胞から膵ホルモン産生前駆細胞への分化を誘導する工程に相当する。本工程で用いるレチノイン酸受容体RARアゴニストは、天然のレチノイドであっても、合成のレチノイド、レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニストや同等の活性を有する天然物であってもよい。天然のレチノイドの例は、レチノイン酸立体異性体の全トランス-レチノイン酸全トランスRAと9-シス-レチノイン酸9-シスRAが知られているである。合成のレチノイドは当技術分野で公知である米国特許第5,234,926号、米国特許第4,326,055号等。レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニストとしては、Am80、TTNPB、AC-55649などが挙げられる。天然物の例としては、ホノキオール、マグノロールなどが挙げられる生物機能開発研究所紀要9:55-61、2009年。本工程で用いるRARアゴニストは、好ましくはレチノイン酸である。RARアゴニストの培地中の濃度は、用いるアゴニストの種類によって適宜設定されるが、レチノイン酸の場合、通常0.1~100μM、好ましくは0.5~10μMである。本工程で用いるAMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤は、AMP活性化プロテインキナーゼAMPK阻害活性を有する化合物、アクチビン受容体様キナーゼALK-2,3,6阻害活性を有する化合物、及びAMP活性化プロテインキナーゼ阻害活性とアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6阻害活性とを併せ持つ化合物からなる群より選択される。AMPK阻害活性を有する化合物としては、ドーソモルフィンDorsomorphin:6-[4-2-ピペリジン-1-イルエトキシフェニル]-3-ピリジン-4-イルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン、araAアデニン-9-β-d-アラビノフラノシド、C75等が挙げられる。アクチビン受容体様キナーゼALKは幾つかに分類されておりALK-2,3,6はBMPタイプI受容体型のキナーゼとして、後述するALK-4,5,7はTGF-βスーパーファミリータイプIの受容体型キナーゼとして、それぞれ知られている。ALK-2,3,6阻害活性を有する化合物としては、ドーソモルフィン、LDN-1931896-4-ピペラジノフェニル-3-キノリン-4-イルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン等が挙げられる。ドーソモルフィンは、AMPK阻害活性及びALK-2,3,6阻害活性の両方の活性を有する。本工程で用いるAMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤としては、ドーソモルフィンが好ましい。これらの化合物はSIGMA社、Tocrisbioscience社、Stemgent社、MerckBioscience社などから購入可能である。また、AMP活性化プロテインキナーゼおよびALK-2,3,6のmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA等もAMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはALK-2,3,6の阻害剤として使用することができる。また、本工程中において培養中の細胞から培地中にBMPファミリーに属する分化因子の増殖、あるいは当該分化因子の分泌が確認された場合には、当該分化因子の活性を中和する抗体、あるいはBMPに結合してその作用を阻害することが知られているNoggin、Chordin、Cerberus、Gremlin等もAMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはALK-2,3,6の阻害剤として使用することができる。また、本工程において培養中の細胞から培地中に上記工程3でアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤として例示したアクチビンの増加、あるいは分泌が確認された場合には、アクチビンの活性を中和する抗体、あるいはアクチビンに結合してその作用を阻害することが知られているホリスタチンもAMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはALK-2,3,6の阻害剤として使用することができる。AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ドーソモルフィンの場合、通常0.1~20μM、好ましくは0.2~5μMである。本工程で用いるアクチビン受容体様キナーゼALK-4,5,7の阻害剤としては、SB-431542、SB-5051242-5-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-イル-2-tert-ブチル-3H-イミダゾール-4-イル-6-メチルピリジンヒドロクロリド、SB-5253346-[2-tert-ブチル-5-6-メチル-ピリジン-2-イル-1H-イミダゾール-4-イル]-キノキサリン、A-83-013-6-メチル-2-ピリジル-N-フェニル-4-4-キノリニル-1H-ピラゾール-1-チオカルボキサミド、GW6604、LY-5802762-6-メチル-2-ピリジニル-3-4-フルオロフェニル-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール及びSD-2082-5-クロロ-2-フルオロフェニル-N-ピリジン-4-イルピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン等が挙げられる。これらはSIGMA社、Tocrisbioscience社、和光純薬工業社などから購入可能である。また、ALK-4,5,7のmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA等もALK-4,5,7の阻害剤として使用することができる。本工程で用いるALK-4,5,7の阻害剤としては、SB-4315424-[4-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル-5-2-ピリジニル-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミド又はその水和物が好ましい。アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、SB-431542の場合、通常、0.1~50μM、好ましくは1~20μMである。本工程で用いる細胞増殖因子として、血管内皮細胞増殖因子VEGF、肝細胞増殖因子HGF、幹細胞増殖因子SCF、上皮細胞増殖因子EGF、各種の線維芽細胞増殖因子a/bFGF等が挙げられるが、なかでも特に塩基性線維芽細胞増殖因子bFGFが好ましい。細胞増殖因子の培地中の濃度は、用いる因子の種類によって適宜設定されるが、bFGFの場合、通常、1~200ng/ml、好ましくは20~100ng/mlである。本工程は、上記したレチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、及び細胞増殖因子の4種類全ての成分を含む培地中で実施される。本工程において、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、及び細胞増殖因子は培地中に同時に添加されてもよく、また、膵ホルモン産生前駆細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼ及び/又はアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、及び細胞増殖因子は、培地中に同時に添加されることが簡便であり、また好ましい。本工程で用いる培地は、前記工程2で例示した基礎培地に、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、及び細胞増殖因子を添加することにより作製される。本工程で用いる培地は、前記工程4と同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよい。膵ホルモン産生前駆細胞への分化誘導がより効率的に行えるという点で、ImprovedMEMZincOption培地Invitrogen社が、本工程での基礎培地として好適に用いられる。本工程では、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましく、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を全く用いないのがより好ましい。本工程においてフィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、拒絶反応の原因物質例、動物由来の細胞の混入が少ない。本工程で用いる培地としては、血清及び/又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素例えば亜鉛、セレン、B27サプリメント、N2サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、2-メルカプトエタノール、3’チオールグリセロール及びこれらの均等物などが挙げられる。本工程で用いる血清代替物としてはB27サプリメントが望ましい。血清代替物の培地中における濃度は、B27サプリメントの場合、0.01~10重量、好ましくは、0.1~2重量である。本工程は、使用する内胚葉細胞の培養に適した培養温度、通常30~40°C、好ましくは37°C程度で72~288時間、好ましくは120~216時間、1~10、好ましくは5の二酸化炭素を通気したCO2インキュベーター内にて培養することによって実施される。本工程において、内胚葉細胞が膵ホルモン産生前駆細胞に分化誘導されたことの確認は、膵ホルモン産生前駆細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子膵ホルモン産生前駆細胞マーカーの発現の有無を評価することによって行うことができる。タンパク質の発現は抗原抗体反応を利用した方法等によって、遺伝子の発現はRT-PCRを利用した方法等によって評価することができる。該マーカーとしては、NGN3、HNF6hepatocytenuclearfactor6、別名:onecuthomeobox1、PDX1pancreaticandduodenalhomeobox1等が挙げられる。工程6:前記工程5で得られた細胞を、培地で培養する工程本工程は、膵ホルモン産生前駆細胞から膵ホルモン産生細胞への分化を誘導する工程に相当する。本工程で用いる基礎培地としては、前記工程2で例示した基礎培地が挙げられる。本工程で用いる培地は、前記工程5と同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよい。膵ホルモン産生細胞への分化誘導がより効率的に行えるという点で、ImprovedMEMZincOption培地Invitrogen社が、本工程での基礎培地として好適に用いられる。本工程では、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いないのが好ましく、フィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を全く用いないのがより好ましい。本工程においてフィーダー細胞及び/又はフィーダー細胞抽出物を実質的に用いない場合、拒絶反応の原因物質例、動物由来の細胞の混入が少ない。本工程で用いる培地としては、血清及び/又は血清抽出物を実質的に含まない培地が好ましく、無血清培地がより好ましい。本工程で用いる培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、アルブミン例えば、脂質リッチアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素例えば亜鉛、セレン、B27サプリメント、N2サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などが挙げられる。なかでも、B27サプリメントが好ましい。特に、B27サプリメントが添加されたImprovedMEMZincOption培地Invitrogen社が好適に用いられる。培地中、B27サプリメントの濃度は、0.01~10重量、好ましくは0.1~2重量である。また、ImprovedMEMZincOption培地へは、細胞の生存率を向上させる添加剤を添加してもよい。そのような添加物として、例えば、ノックアウトシーラムリプレースメント、N2サプリメント等の血清代替物等が挙げられる。培地中の前記添加剤の濃度は、0.01~10重量、好ましくは0.1~2重量である。好ましくは、本工程で用いる培地には、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、及び細胞増殖因子は含まれない。従って、工程5と工程6との間に培地交換を行うことが好ましい。本工程は、使用する膵ホルモン産生前駆細胞の培養に適した培養温度、通常30~40°C、好ましくは37°C程度で24~240時間、好ましくは72~192時間、1~10、好ましくは5の二酸化炭素を通気したCO2インキュベーター内にて培養することによって実施される。本工程において膵ホルモン産生前駆細胞が膵ホルモン産生細胞に分化誘導されたことの確認は、膵ホルモン産生細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子膵ホルモン産生細胞マーカーの発現、あるいは培地中に分泌される膵ホルモンの量を測定することによって行うことができる。該マーカーとしては、インスリン、グルカゴン、パンクレアティンクポリペプチド、ソマトスタチン、グレリン、PCSK1proproteinconvertasesubtilisin/kexintype1、SUR1sulfonylureareceptor1、別名:ATP-bindingcassette,sub-familyCCFTR/MRP,member8、NKX6.1NK6homeobox1、PAX6pairedbox6、NEURODneurogenicdifferentiation1、ARXaristalessrelatedhomeobox等が挙げられる。上記した通り、本発明は、幹細胞から膵ホルモン産生細胞を製造する方法を提供するが、同様の方法、すなわちより未分化な状態にある細胞をより分化した状態へと分化誘導する方法によって、幹細胞から、多様な分化状態にある細胞内胚葉細胞、膵管細胞、膵内分泌細胞、膵外分泌細胞やそれらに共通する前駆細胞等へと分化誘導することができる。誘導された分化の程度は各細胞に特異的に発現しているタンパク質や遺伝子の発現の有無を確認することによって知ることができる。本発明の製造法では、幹細胞を膵ホルモン産生細胞へ効率的に分化誘導することにより、高い膵ホルモン分泌能を有する膵ホルモン産生細胞を大量に供給できる。この膵ホルモン産生細胞は、医薬特に細胞医療の為の医薬や、糖尿病治療薬を開発するためのツールとして利用することができる。2.本発明の細胞を含む医薬本発明は、上記した本発明の製造法又は本発明の製造法2により製造された膵ホルモン産生細胞本発明の細胞を含む、医薬を提供する。さらに、本発明は、上記した本発明の製造法好ましくは工程1~5又は本発明の製造法2により製造された膵ホルモン産生前駆細胞を含む医薬本明細書中、本発明の医薬と略記する場合がある。を提供する。本発明の医薬において、膵ホルモン産生細胞又は膵ホルモン産生前駆細胞はそのまま、もしくはフィルター濾過などにより濃縮したペレットなどの細胞塊などとして用いられる。さらに、該医薬は、DMSOジメチルスルホキシドなどの保護剤を加え、凍結保存することもできる。該医薬は、医薬として、より安全に利用するために、加熱処理、放射線処理など、膵ホルモン産生細胞としての機能又は膵ホルモン産生前駆細胞としての機能を残しつつ、病原体のタンパク質が変性する程度の条件下での処理に付してもよい。また、膵ホルモン産生細胞又は膵ホルモン産生前駆細胞が必要量以上に増殖することを防止するために、上記処理と組み合わせて、マイトマイシンC前処理等による増殖の抑制や、哺乳類が自然には持っていない代謝酵素の遺伝子を当該細胞に導入して、その後、必要に応じて未活性型の薬を投与し、哺乳類が自然には持っていない代謝酵素の遺伝子を導入した細胞の中だけでその薬を毒物に変化させて細胞を死滅させる方法自殺遺伝子療法等の処理に付してもよい。本発明の医薬は、安全で低毒性であり、哺乳動物例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ブタ、サル等、好ましくは、ヒトに投与移植することができる。本発明の医薬の投与量移植量は、例えば、1×105~1×1010細胞/個体、好ましくは、5×107~1×1010細胞/個体、さらに好ましくは、1×109~1×1010細胞/個体である。本発明の医薬において、患者本人の細胞あるいは組織適合型が許容範囲のドナーの細胞を用いて作成された膵ホルモン産生細胞を用いることが好ましいが、年齢や体質などの理由から充分な細胞が得られない場合には、ポリエチレングリコールやシリコンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。そのような場合には、腹腔内や皮下への移植も可能である。また、本発明の医薬の投与量移植量は、投与される患者の年齢、体重、症状などによって適宜変更することができる。本発明の医薬のうち、膵ホルモン産生細胞を含む医薬は、それ自体の投与移植により、患者の体内で膵ホルモンの産生分泌が可能となり、膵ホルモンの産生分泌の低下に起因する疾患の治療に有用である。例えばインスリン産生細胞を含む医薬は、糖尿病I型およびII型、好ましくはI型またはインスリン産生量が低下したII型、特に好ましくはI型の治療に有用である。一方、本発明の医薬のうち、膵ホルモン産生前駆細胞を含む医薬は、患者に投与移植された後、適当な条件下で膵ホルモン産生細胞に分化誘導されることによって、膵ホルモンが産生分泌される。3.スクリーニング方法本発明は、以下の工程1~6からなる群より選択されるいずれか1種以上の工程によって得られた細胞を用いることを特徴とする、医薬好ましくは糖尿病治療薬のスクリーニング方法本明細書中、本発明のスクリーニング方法と略記する場合があるを提供する。1幹細胞を、Rhoキナーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程2前記1で得られた細胞を、GSK3阻害剤を含む培地で培養する工程3前記2で得られた細胞を、GSK3阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程4前記3で得られた細胞から、細胞塊を形成させた後に、該細胞塊を培地中において浮遊状態で培養する工程5前記4で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、AMP活性化プロテインキナーゼおよび/またはアクチビン受容体様キナーゼ-2,3,6の阻害剤、アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7の阻害剤、および細胞増殖因子を含む培地で培養する工程6前記5で得られた細胞を、培地で培養する工程上記工程1~6は、上記した本発明の膵ホルモン産生細胞の製造法における工程1~6と同様にして実施され得る。本スクリーニングに用いられる細胞としては、上記工程1~6を経て得られる膵ホルモン産生細胞;上記工程1~5を経て得られる膵ホルモン産生前駆細胞;上記工程1~4または上記工程1~3を経て得られる内胚葉細胞;上記工程1~2を経て得られる細胞;上記工程1を経て得られる細胞が挙げられる。本発明のスクリーニング方法は、具体的には以下のようにして実施される態様1。a試験化合物存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合と、b試験化合物非存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合における、該細胞内の膵ホルモン発現量又は該細胞外への膵ホルモン分泌量をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる。膵ホルモンの発現量としては、膵ホルモンタンパク質の発現量、膵ホルモンタンパク質をコードするポリヌクレオチド例、mRNAの発現量などが挙げられる。膵ホルモンの発現量及び分泌量の測定は、公知の方法、例えば、膵ホルモンを認識する抗体を用いて、細胞抽出液中や培地中などに存在する前記膵ホルモンを、ウエスタンブロッティング解析、ELISA法などの方法又はそれに準じる方法に従って行われる。mRNA量の測定は、公知の方法、例えば、ノザンハイブリダイゼーション、S1マッピング法、PCR法、DNAチップあるいはアレイ法又はそれに準じる方法に従って行われる。膵ホルモン産生細胞の培養は、膵ホルモンが発現および/または分泌される条件下であれば特に限定されず公知の方法に従って行えばよい。培地としては、例えば、約1~20の牛胎児血清を含むMEM培地Science,122巻,5011952等、DMEM培地Virology,8巻,3961959、RPMI1640培地TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation199巻,5191967、199培地ProceedingoftheSocietyfortheBiologicalMedicine,73巻,11950が用いられる。培地のpHは約6~8であるのが好ましい。培養は通常約30°C~40°Cで約15時間~5日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿が挙げられる。ここで試験化合物は塩を形成していてもよい。該塩としては、生理学的に許容される酸や塩基例、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アルミニウム塩などとの塩が用いられ、この様な塩としては、例えば、無機酸例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸との塩、有機酸例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸との塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アルミニウム塩が用いられる。例えば、上記aの場合における膵ホルモンの発現量又は分泌量を、上記bの場合に比べて、約20以上、好ましくは約30以上、より好ましくは約50以上抑制阻害する試験化合物を、膵ホルモン産生細胞における膵ホルモン発現を抑制阻害する化合物として選択することができる。上記aの場合における膵ホルモンの発現量又は分泌量を、上記bの場合に比べて、約20以上、好ましくは約30以上、より好ましくは約50以上促進する試験化合物を、膵ホルモン産生細胞における膵ホルモンの発現又は分泌を促進する化合物として選択することができる。膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、インスリン発現を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。膵ホルモン産生細胞がグルカゴン産生細胞である場合、グルカゴン発現を抑制阻害する化合物は糖尿病治療薬として有用である。本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、a試験化合物存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合と、b試験化合物非存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合における、該細胞の増殖能をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる態様2。使用する試験化合物としては、上記態様1で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様1と同様にして行うことができる。細胞の増殖能を測定する方法としては、通常、当技術分野で実施されている方法が用いられ、例えば細胞数を計測する方法や3H、5-bromo-2’-deoxy-uridineBrdU等の取り込み、ATP量、テトラゾリウム化合物からホルマザン産物への変換量を評価する方法が挙げられる。例えば、膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、有意にインスリン産生細胞の増殖を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。膵ホルモン産生細胞がグルカゴン産生細胞である場合、有意にグルカゴン産生細胞の増殖を抑制阻害する化合物は糖尿病治療薬として有用である。本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、a試験化合物存在下で膵ホルモン産生前駆細胞を培養した場合と、b試験化合物非存在下で膵ホルモン産生前駆細胞を培養した場合における、該細胞の分化の程度をそれぞれ調べ、比較する方法が挙げられる態様3。使用する試験化合物としては、上記態様1で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様1と同様にして行うことができる。膵ホルモン産生前駆細胞の分化の程度は、例えば膵ホルモン産生前駆細胞及び/又は膵ホルモン産生細胞の特異マーカーの発現の有無によって調べられる。膵ホルモン産生前駆細胞の特異マーカーとしては、NGN3neurogenin3、PAX4pairedbox4が、膵ホルモン産生細胞の特異マーカーとしてはインスリン、グルカゴン、パンクレアティックポリペプチド、ソマトスタチン、グレリン、PCSK1proproteinconvertasesubtilisin/kexintype1、SUR1sulfonylureareceptor1、別名ATP-bindingcassette,sub-familyCCFTR/MRP,member8、グルコキナーゼ、MAFAv-mafmusculoaponeuroticfibrosarcomaoncogenehomologA、IAPPisletamyloidpolypeptide等がそれぞれ例示される。例えば、膵ホルモン産生前駆細胞がインスリン産生前駆細胞である場合、有意にインスリン産生前駆細胞の分化を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。膵ホルモン産生前駆細胞がグルカゴン産生前駆細胞である場合、有意にグルカゴン産生前駆細胞の分化を抑制阻害する化合物は糖尿病治療薬として有用である。本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、a試験化合物存在下で内胚葉細胞を培養した場合と、b試験化合物非存在下で内胚葉細胞を培養した場合における、該細胞の増殖あるいは分化能をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる態様4。使用する試験化合物としては、上記態様1で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様1と同様にして行うことができる。細胞の増殖能を測定する方法としては、通常、当技術分野で実施されている方法が用いられ、例えば細胞数を計測する方法や3H、5-bromo-2’-deoxy-uridineBrdU等の取り込み、ATP量、テトラゾリウム化合物からホルマザン産物への変換量を評価する方法が挙げられる。内胚葉細胞の分化能は、例えば内胚葉系細胞の特異マーカーの発現の有無によって調べられる。内胚葉系細胞の特異マーカーとしては、アルファフェトプロテイン、アルブミン、ペプシン、肺サーファクタントプロテインなどが挙げられる。一般に内胚葉系細胞の分化誘導や培養は中胚葉あるいは外胚葉系細胞に比べて技術的に困難であり、当該スクリーニング系によって得られた化合物を利用して作製した細胞自体及び/又は内胚葉の分化誘導系は、新たな医薬のスクリーニング系に利用し得る。膵ホルモン産生細胞の機能を保護する維持する医薬等も本発明のスクリーニング方法に準じた方法で得ることができる。本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、a試験化合物存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合と、b試験化合物非存在下で膵ホルモン産生細胞を培養した場合における、該細胞の生存数あるいは機能をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる態様5。使用する試験化合物としては、上記態様1で用いられるものと同様のものが挙げられる。また、本態様における細胞の培養は、上記態様1と同様にして行うことができる。細胞の生存数を測定する方法としては、通常、当技術分野で実施されている方法が用いられ、例えば細胞数を計測する方法や3H、5-bromo-2’-deoxy-uridineBrdU等の取り込み、ATP量、テトラゾリウム化合物からホルマザン産物への変換量を評価する方法が挙げられる。また、アポトーシスが誘発された細胞の数は、形態的な特徴クロマチンの凝縮、核の断片化、細胞の収縮などを呈する細胞の計数の他に、TUNNELTdT-mediateddUTPnickendlabeling法による断片化DNAの検出や活性カスパーゼの有無の検出、7-AAD7-amino-actinomycinDなど生細胞不透過性色素による核染色、ホスファチジルセリンの細胞表面への露出やミトコンドリアメンブレンの脱分極化、特定の細胞内タンパク質の切断や分解などの測定によって定量化し得る。また、細胞の機能を測定する方法としては、グルコース濃度に応じたインスリンあるいはCペプチドの分泌量や細胞膜電位の変動を測定する方法などが挙げられる。本態様では、膵ホルモン産生細胞に対して障害を与えることが知られている因子例えば、炎症性サイトカインや活性酸素およびその産生誘導物質、高濃度の脂肪酸やグルコースを細胞の培養時に添加し、該細胞の生存数あるいは機能を測定し、比較する方法が挙げられる。膵ホルモン産生細胞がインスリン産生細胞である場合、膵ホルモン産生細胞に対して障害を与えることが知られている因子に対して有意にインスリン産生細胞の生存あるいは機能維持を促進する化合物は糖尿病治療薬として有用である。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる医薬は、常套手段に従って、生理学的に許容し得る添加剤例、担体、香味剤、賦形剤、防腐剤、安定剤、結合剤を用いて製剤化することができる。このようにして得られる製剤の剤形としては、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などの経口剤;注射剤などの非経口剤が挙げられる。これら製剤における有効成分の含量は例えば、0.1~90重量である。前記添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムなどの結合剤;結晶性セルロースなどの賦形剤;コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などの膨化剤;ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤;ショ糖、乳糖、サッカリンなどの甘味剤;ペパーミント、アカモノ油、チェリーなどの香味剤;油脂、注射用水、植物油例えば、ゴマ油、ヤシ油、大豆油、緩衝剤例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液などの液状担体;溶解補助剤例えば、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール;非イオン性界面活性剤例えば、ポリソルベート80TM、HCO-50;溶解補助剤例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール;無痛化剤例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン;安定剤例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール;保存剤例えば、ベンジルアルコール、フェノール;酸化防止剤が挙げられる。前記注射用水としては、例えば、生理食塩水;ブドウ糖、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなどを含む等張液が挙げられる。本発明のスクリーニング方法によって得られる医薬好ましくは糖尿病治療薬は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーに対して経口的または非経口的に投与することができる。該医薬の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより適宜設定される。以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。実施例11:ヒトiPS細胞から内胚葉細胞への分化誘導工程1~3ヒトiPS細胞から内胚葉細胞への分化誘導は次の方法で行った。まず、細胞塊の状態でフィーダー細胞とともに培養維持していたヒトiPS細胞Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子及びSox2遺伝子を導入することによって得られるiPS細胞:NatBiotechnol2008;26:101-106参照を、霊長類ES細胞用細胞剥離液リプロセル社を用いて細胞塊の状態で剥離させ、15ml遠沈管に移して5分間静置し、上清を除くことによってフィーダー細胞を除去した。次に、遠沈管に沈んだヒトiPS細胞に0.25トリプシン-1mMEDTA溶液GIBCO社を添加し、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させたヒトiPS細胞を、BDマトリゲル日本ベクトンデッキンソン社をコートした100mmディッシュ1枚あたり15×104個の密度で播種し、37°C、5CO2下で1日間培養した。100mmディッシュは、BDマトリゲルを無血清のDMEM/F12培地Invitrogen社を用いて40倍希釈し、室温で3時間以上コートしたものを用いた。また、分散時および播種時の培地としては、10μMのY-27632和光純薬を添加した霊長類ES細胞用培地リプロセル社を使用した。播種1日後に、GSK3β阻害剤であるCHIR990213μMと2B27サプリメントGIBCO社を含むDMEM/F12培地に培地交換して2日間培養した。続いて、アクチビンA50ng/mlとCHIR990211μMを含むDMEM/F12培地に培地交換して2日間培養した。ヒトiPS細胞培養時の内胚葉分化マーカーの発現変動を調べるため、分化誘導した細胞を経時的に回収し、RNeasy96Qiagen社を用いて全RNA画分を精製した。PrimeScriptRTreagentkitタカラバイオ社を用いてcDNAを合成した後、定量RT-PCRを実施して、原始線条マーカーであるBrachyury、内胚葉マーカーであるSOX17の遺伝子発現量を測定した。発現解析の結果を図1に示す。培養3日目においてBrachyuryの発現量が一過的に上昇し、4日目にはSOX17の発現量が顕著に増加した。これにより、原始線条への分化を経由して内胚葉マーカーが効率的に発現誘導されたことが明らかとなった。次に、SOX17タンパク質の発現を調べるため、抗SOX17抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。100mmディッシュを用いて内胚葉細胞へと分化誘導した細胞を、アキュターゼInvitrogen社商品名を用いて単一細胞へと解離させ、フィブロネクチンコートした96穴プレートに4×104個の密度で播種し、37°C、5CO2下で1日間培養した。フィブロネクチンコートは、DMEM/F12を用いてフィブロネクチンBDを20倍希釈し、室温で3時間静置することによって行った。播種時の培養液としては、1B27サプリメントを含むImprovedMEMZincOption培地Invitrogen社を使用した。培養後、4パラホルムアルデヒドを添加して室温で30分間インキュベートし、細胞の固定を行った。培養後の細胞を、1次抗体として抗ヒトSOX17抗体AF1924、RD社と反応させ、さらに2次抗体としてAlexa488標識2次抗体Invitrogen社と順次反応させた後、細胞の核をヘキスト33342を用いて染色し、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図2に示す。結果として、大部分の細胞がSOX17タンパクを発現している様子が観察された。以上の検討により、CHIR99021とB27サプリメントを添加したDMEM/F12培地で2日間、さらにアクチビンAとCHIR99021を添加したDMEM/F12培地で2日間培養することによって、フィーダー細胞や血清を使用せず、効率的に内胚葉細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。実施例12:工程2におけるCHIR99021以外のGSK3阻害剤BIOによる内胚葉誘導について検討した。ヒトiPS細胞の播種1日後に、CHIR990213μMと2B27サプリメントGIBCO社を含むDMEM/F12培地に交換して2日間培養した。次に、一方は、GSK3阻害剤としてCHIR990213μMとアクチビンA100ng/mlおよび2B27サプリメントGIBCO社を含むDMEM/F12培地に交換し、培養を継続した図3ではActivinACHIR99021と標記。もう一方は、GSK3阻害剤としてBIO0.5μMとアクチビンA100ng/mlおよび2B27サプリメントGIBCO社を含むDMEM/F12培地に交換し、培養を継続した図3ではActivinABIOと標記。ヒトiPS細胞培養時のSOX17の遺伝子発現量を経時的に測定した。発現解析の結果を図3に示す。CHIR99021またはBIOのどちらを用いても、培養4日目からSOX17の発現量が顕著に増加し、同様の発現パターンを示した。この結果から、CHIR99021以外のGSK3阻害剤を用いても内胚葉を誘導できることが明らかとなった。実施例2:内胚葉細胞から膵ホルモン産生細胞への分化誘導工程4~6内胚葉細胞へ分化させた細胞から細胞塊を形成させ、その後さらに膵ホルモン産生前駆細胞、続いて膵ホルモン産生細胞へと分化誘導させた。100mmディッシュを用いて分化誘導した内胚葉細胞をアキュターゼInvitrogen商品名を用いて、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させた内胚葉細胞を96穴スフェロイドプレート住友ベークライトに1穴あたり2×104個の密度で播種し、37°C、5CO2下で1日間培養して細胞塊を形成させた。分散時および播種時の培地としては、1B27サプリメントを含むImprovedMEMZincOption培地を使用した。内胚葉細胞を播種して1日後に、ドーソモルフィン1μM、レチノイン酸2μM、SB43154210μM及びbFGF50ng/mlを加えた1B27サプリメントを含むImprovedMEMZincOption培地に培地交換し、37°C、5CO2の条件下で8日間培養した。培地交換は4日目の時点で一度行った。8日間培養後、1B27サプリメントを含むImprovedMEMZincOption培地に培地交換してさらに培養を行った。その後の培地交換は3日~4日ごとに行った。内胚葉を播種して1日後にドーソモルフィン、レチノイン酸、SB431542及びbFGFの組み合わせで8日間培養後、1B27サプリメントを含むImprovedMEMZincOption培地に交換してさらに培養を継続したときのインスリンの発現解析の結果を図4に示す。1B27サプリメントを含むImprovedMEMZincOption培地に交換した培養13日目の時点では、インスリンの発現はほとんど認められなかったが、培養15日目以降から急激に増加した。比較例として、内胚葉細胞を播種して1日後にドーソモルフィン、レチノイン酸、SB431542の組み合わせを用いて8日間培養した後、さらに1B27サプリメントを含むImprovedMEMZincOption培地に培地交換してさらに培養を行った。培養19日目の発現解析の結果を図5に示す。ドーソモルフィン、レチノイン酸、SB431542の組み合わせで培養した場合よりも、ドーソモルフィン、レチノイン酸、SB431542及びbFGFの組み合わせで培養することで、培養19日目においてインスリンの発現は高い値を示した。次に、インスリンとグルカゴンのタンパク質の発現について調べるため、抗インスリン抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。内胚葉細胞を播種して1日後にドーソモルフィン、レチノイン酸、SB431542及びbFGFを添加して8日間培養した後、さらに1B27サプリメントを含むImprovedMEMZincOption培地に培地交換して8日間培養した。培養後、4パラホルムアルデヒドを用いて4°Cで3時間固定を行い、OCTコンパウンドTissue-tekに、培養後の細胞を包埋後、厚さ10μmの凍結切片を作製した。その後、1次抗体として抗インスリン抗体A0564、DAKO社又は抗グルカゴン抗体G2654、SIGMA社と反応させ、さらに2次抗体としてAlexa568標識2次抗体Invitrogen社又はAlexa488標識2次抗体Invitrogen社と順次反応させた後、細胞の核をヘキスト33342を用いて染色し、蛍光顕微鏡で観察した。免疫蛍光染色の結果を図6に示す。インスリンを発現している細胞がsphere内部に数多く認められ、グルカゴンを発現している細胞も一部認められた。実施例3:ヒトiPS細胞から膵ホルモン産生細胞への分化誘導工程1~6;BDマトリゲルまたはフィブロネクチンを使用した内胚葉細胞への分化誘導と、膵ホルモン産生細胞への分化誘導ヒトiPS細胞から内胚葉細胞への分化誘導は次の方法で行った。まず、細胞塊の状態で維持していたヒトiPS細胞を実施例1と同様の方法で、単一細胞になるまで解離させた。次に、一方は、培地に分散させたヒトiPS細胞を、フィブロネクチンInvitrogen社をコートした100mmディッシュ1枚あたり60×104個の密度で播種し、37°C、5CO2下で1日間培養した。100mmディッシュは、フィブロネクチンを無血清のDMEM/F12培地Invitrogen社を用いて40倍希釈し、室温で3時間以上コートしたものを用いた。図7ではフィブロネクチンと標記もう一方は、培地に分散させたヒトiPS細胞を、BDマトリゲル日本ベクトンデッキンソン社をコートした100mmディッシュ1枚あたり15×104個の密度で播種し、37°C、5CO2下で1日間培養した。100mmディッシュは、BDマトリゲルを無血清のDMEM/F12培地Invitrogen社を用いて40倍希釈し、室温で3時間以上コートしたものを用いた。図7ではマトリゲルと標記また、分散時および播種時の培地としては、10μMのY-27632和光純薬を添加した霊長類ES細胞用培地リプロセル社を使用した。播種1日後に、GSK3β阻害剤であるCHIR990213μMと2B27サプリメントGIBCO社を含むDMEM/F12培地に培地交換して2日間培養した。続いて、アクチビンA50ng/mlとCHIR990211μMを含むDMEM/F12培地に培地交換して2日間培養した。内胚葉細胞へ分化させた細胞から実施例2と同様に細胞塊を形成させ、その後さらに膵ホルモン産生前駆細胞、続いて膵ホルモン産生細胞へと分化誘導させた。実施例2と同様に、内胚葉細胞を播種して1日後にドーソモルフィン、レチノイン酸、SB431542及びbFGFの組み合わせで8日間培養後、1B27を含むImprovedMEMZincOption培地に培地交換して分化誘導させ、各種分化マーカーの経時的な発現解析を行った。発現解析の結果を図7に示す。内胚葉マーカーであるSOX17の発現は分化に伴い顕著に減少し、膵前駆細胞マーカーPDX1と膵ホルモン産生前駆細胞マーカーNGN3の発現は培養17日目まで徐々に増加した。インスリンの発現は培養17日目から急激に増加した。これら各種分化マーカーの経時的な発現変動は、BDマトリゲルまたはフィブロネクチンを基質として誘導した内胚葉細胞を用いた場合でほとんど同様であった。BDマトリゲルは、Engelbreth-Holm-SwarmEHSマウス肉腫細胞から抽出した基底膜調製品である。一方、本実施例で使用したフィブロネクチンはヒト血漿からアフィニティークロマトグラフィーによって抽出したものである。このことから、フィブロネクチンを使用した場合であっても、BDマトリゲル実施例1および2の場合と同様、膵ホルモン産生細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。以上の実施例1~3の検討により、内胚葉細胞を用いてsphereを形成させ、ドーソモルフィン、レチノイン酸、SB431542及びbFGFを添加した1B27サプリメントを含むImprovedMEMZincOption培地で8日間培養し、その後、1B27サプリメントを含むImprovedMEMZincOption培地に交換して培養する図8に示した膵臓分化誘導系を用いることで、膵ホルモン産生細胞への分化を誘導できることが明らかとなった。本発明の方法により製造された膵ホルモン産生細胞は、他の方法で製造された膵ホルモン産生細胞よりもインスリン産生量に優れている。"