"虚血事象に罹患している対象を治療する方法であって、a前記虚血事象後約24時間以内に抗凝血剤およびタンパク質キナーゼCPKC活性化因子を前記対象に投与することと、bステップaの後に、治療継続期間にわたり少なくとも1種のPKC活性化因子を投与することとを含み、ステップaおよびステップbの前記PKC活性化因子が同一であるかまたは異なる方法。請求項1に記載の方法であって、前記抗凝血剤が、組織プラスミノーゲン活性化因子TPAである方法。請求項1に記載の方法であって、ステップaおよびステップbの前記PKC活性化因子が、それぞれ独立に、PKCの1,2-ジアシルグリセロールDAGおよび1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリンホスファチジル-L-セリン、PS部位のうち少なくとも1つと結合する、またはPKCを間接的に活性化させる方法。請求項1に記載の方法であって、ステップaおよびステップbの前記PKC活性化因子が、それぞれ独立に、大環状ラクトン、ホルボールエステル以外のジアシルグリセロール誘導体、イソプレノイド、ダフナン型ジテルペン、二環式のトリテルペノイド、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、成長因子活性化因子、および脂肪酸、ならびにそれらの誘導体から選ばれる方法。請求項4に記載の方法であって、前記大環状ラクトンが、ブリオスタチン、ブリオログ、およびネリスタチンから選ばれる方法。請求項5に記載の方法であって、前記ブリオスタチンが、ブリオスタチン-1である方法。請求項1に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記PKC活性化因子の前に前記抗凝血剤が投与される方法。請求項7に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記抗凝血剤が、前記虚血事象後24時間以内に投与される方法。請求項8に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記抗凝血剤が、前記虚血事象の約1時間~約12時間後に投与される方法。請求項9に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記抗凝血剤が、前記虚血事象の約2時間~約6時間後に投与される方法。請求項7に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記PKC活性化因子が、前記抗凝血剤の投与後24時間以内に投与される方法。請求項11に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記PKC活性化因子が、前記抗凝血剤の投与の約1時間~約12時間後に投与される方法。請求項12に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記PKC活性化因子が、前記抗凝血剤の約2時間~約6時間後に投与される方法。請求項7に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記抗凝血剤が、前記虚血事象後約6時間以内に投与され、前記PKC活性化因子が、前記抗凝血剤の後、約2時間以内に投与される方法。請求項14に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記抗凝血剤が、前記虚血事象の約3時間後に投与され、前記PKC活性化因子が、前記抗凝血剤の約2時間後に投与される方法。請求項1に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記PKC活性化因子が、前記抗凝血剤の前に投与される方法。請求項16に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記PKC活性化因子が、前記虚血事象後24時間以内に投与される方法。請求項17に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記PKC活性化因子が、前記虚血事象の約1時間~約12時間後に投与される方法。請求項18に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記PKC活性化因子が、前記虚血事象の約2時間~約6時間後に投与される方法。請求項16に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記抗凝血剤が、前記PKC活性化因子の投与後24時間以内に投与される方法。請求項20に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記抗凝血剤が、前記PKC活性化因子の投与の約1時間~約12時間後に投与される方法。請求項21に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記抗凝血剤が、前記PKC活性化因子の投与の約2時間~約6時間後に投与される方法。請求項16に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記PKC活性化因子が、前記虚血事象後約6時間以内に投与され、前記抗凝血剤が、前記PKC活性化因子の投与後約2時間以内に投与される方法。請求項23に記載の方法であって、ステップaにおいて、前記PKC活性化因子が、前記虚血事象の約3時間後に投与され、前記抗凝血剤が、前記PKC活性化因子の約2時間後に投与される方法。請求項1に記載の方法であって、ステップbにおける前記治療が、前記虚血事象の約10時間~約32時間後に開始される方法。請求項25に記載の方法であって、ステップbの前記治療が、前記虚血事象の約24時間後に開始される方法。請求項1に記載の方法であって、ステップbにおいて、前記PKC活性化因子が、1週間当たり1~3回投与される方法。請求項1に記載の方法であって、ステップbにおける前記治療継続期間が約1週間~約10週間の範囲に亘る方法。請求項1に記載の方法であって、ステップbにおいて、前記PKC活性化因子が、静脈内注射により投与される方法。請求項1に記載の方法であって、死亡率が、前記抗凝血剤単独の投与に比して低下する方法。請求項30に記載の方法であって、脳卒中後24時間の死亡率が少なくとも40低下する方法。請求項1に記載の方法であって、出血性変化が、前記抗凝血剤単独の投与と比較して低下する方法。請求項32に記載の方法であって、出血性変化の前記低下が、前記抗凝血剤単独の投与と比較して、前記対象のヘモグロビンレベルを測定することにより決定される方法。請求項33に記載の方法であって、前記ヘモグロビンレベルが約50低下する方法。請求項1に記載の方法であって、血液脳関門の破損が、前記抗凝血剤単独の投与と比較して低下する方法。請求項1に記載の方法であって、前記治療が、脳卒中により誘導される脳障害を回復させる方法。請求項1に記載の方法であって、前記治療が、脳卒中により誘導される記憶障害を回復させる方法。それ必要を必要とする対象における脳卒中を治療する方法であって、a脳卒中に罹患している対象を同定することと、b前記対象に治療有効量のタンパク質キナーゼCPKC活性化因子を投与することと、c前記対象が虚血性脳卒中または出血性脳卒中の何れに罹患したか決定することと、d前記対象が虚血性脳卒中に罹患した場合は、治療有効量の抗凝血剤を投与することと、e少なくとも1種のPKC活性化因子を治療継続期間にわたり投与することとを含み、ステップbおよびステップeの前記PKC活性化因子が同一であるかまたは異なる方法。請求項38に記載の方法であって、ステップcが、コンピューター断層撮影CTスキャンを撮影することを含む方法。本開示の特定の実施態様aspectを、以下に、より詳細に記載する。本出願において使用し本明細書において明確にする用語および定義は、本開示内での意味を表すことを意図している。本明細書において言及する特許および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる用語および/または定義と矛盾する場合は、本明細書中に記載する用語および定義が優先される。文脈により特に規定されない限り、単数形a、an、およびtheには複数形についての言及が含まれる。用語およそおよび約は、言及した数または値とほぼ同じであることを意味し、測定値の性質または精度を考慮すれば、言及した数または値には、測定された量についての許容される程度の誤差が含まれている。本明細書において使用する場合、用語およそおよび約は、一般に、特定した量、頻度、または値の±20を包含すると理解されるべきである。本明細書中で示される数量は、特に指定しない限り近似値であり、このことは、用語約またはおよそは、明示的に指定されない場合には推測できることを意味する。用語~を投与する、投与、または~を投与することは、本明細書において使用する場合、1医療関係者もしくはその権限を与えられた代行者いずれかにより、またはその指示下で、本開示による組成物を提供すること、与えること、投薬すること、および/または処方すること、ならびに2患者または人物自身により、本開示による組成物を取り込むこと、服用すること、または摂取することを指す。本明細書において使用する場合、組成物の投与は、任意の投与経路、たとえば経口、静脈内、皮下、腹腔内、および筋肉内経路を包含する。本明細書において使用する場合、用語対象は、哺乳動物、すなわち、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物を意味する。語句治療有効量は、測定可能な治療応答を結果としてもたらす治療剤の量を指す。治療応答は、使用者たとえば臨床家が当該療法への有効な応答と認めるであろう任意の応答、たとえば、症状および代理臨床マーカーの改善であってもよい。したがって、治療応答は、一般に、疾患または状態、たとえば、脳卒中の1つ以上の症状の向上または阻害であろう。測定可能な治療応答には、症状または疾患が防止されもしくはその発症が遅延している、または、当該治療剤により他の形で軽減されているとの所見も含まれる。したがって、治療有効量は、本明細書において使用する場合、虚血性脳卒中に伴う1つ以上の症状または状態を低減するだけ十分な量を指し、このような症状または状態としては出血性変化、血液脳関門の破損、ヘモグロビンレベルの増加、および死亡率が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用する場合、タンパク質キナーゼC活性化因子またはPKC活性化因子は、タンパク質キナーゼCと結合することによって、タンパク質キナーゼCにより触媒される反応の速度を増加させる物質を意味する。本明細書において使用する場合、大環状ラクトンは、マクロライド環を含む化合物、すなわち、1つ以上のデオキシ糖が結び付いていてもよい大きな大環状ラクトン環を指す。本開示による脂肪酸は、飽和または不飽和、分枝または無分枝、天然に存在するまたは合成のものであってもよい。用語一不飽和脂肪酸MUFAは、単一のC=C二重結合を含み、鎖中の残りの炭素原子が単結合されている脂肪酸を指し、MUFAは、モノエン脂肪酸とも呼ばれる。MUFAの例としては、オレイン酸、ミリストレイン酸、およびパルミトレイン酸が挙げられるが、これらに限定されない。用語cis-MUFAは、C=C二重結合に隣接する水素原子が二重結合の同じ側にあるMUFAを指す。用語多価不飽和脂肪酸PUFAは、2つ以上のC=C二重結合を含む脂肪酸を指し、PUFAは、ポリエン脂肪酸とも呼ばれる。PUFAとしては、限定するものではないが、ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、およびω-9脂肪酸が挙げられ、これらの脂肪酸において、1つ目のC=C二重結合は、鎖の中でカルボン酸基から最も遠い最後の炭素ω炭素として公知であるからそれぞれ3番目、6番目、および9番目の炭素に位置する。省略形X:Yは、X個の炭素原子とY個の二重結合とを含有するアシル基を指す。たとえば、リノール酸であれば、18:2と省略されよう。PUFAの例としては以下が挙げられるがこれらに限定されない:リノール酸9,12-オクタデカジエン酸、γ-リノレン酸GLA;6,9,12-オクタデカトリエン酸、α-リノレン酸9,12,15-オクタデカトリエン酸、アラキドン酸5,8,11,14-エイコサテトラエン酸、エイコサペンタン酸eicosapentanoicacidEPA;5,8,11,14,17-エイコサペンタン酸、ドコサペンタエン酸DPA;7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸DHA;4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサン酸docosahexanoicacid、およびステアリドン酸6,9,12,15-オクタデカテトラエン酸。PUFA源としては、海産魚、および、油糧種子作物に由来する植物油が挙げられる。商業的に開発された植物油中のPUFAは、たとえばリノール酸および/またはリノレン酸を含んでいてもよい。用語cis-PUFAは、C=C二重結合に隣接する炭素原子が二重結合の同じ側にあるPUFAを指す。用語メチレン中断型ポリエンは、単一のメチレン-CH2-基により互いに隔てられている2つ以上のcis型C=C二重結合を含むPUFAを指す。用語非メチレン中断型ポリエンおよびポリメチレン中断型脂肪酸は、2つ以上のメチレン基により隔てられた2つ以上のcis型C=C二重結合を有するPUFAを指す。共役脂肪酸、たとえば共役リノール酸9-cis,11-trans-オクタデカジエン酸、all-cis-9,12-オクタデカジエン酸の異性体は、共役ジエン、すなわち、隣接する炭素上のC=C二重結合を有する。いくつかの証拠から、共役リノール酸は抗腫瘍活性を有する場合があることが示唆される。用語シクロプロピル基は、連結されて三員環-CHCH2CH-を形成する炭素原子3個のシクロアルカン基を指す。用語エポキシルepoxyl基は、連結されて三員環-CHOCH-を形成する、2個の炭素原子と酸素原子とを含む複素環基を指す。用語PUFA誘導体は、PUFAまたはそのアルコールもしくはエステルを指し、この誘導体において、C=C二重結合のうち少なくとも1つはシクロプロパン化またはエポキシ化されている。用語MUFA誘導体は、MUFAまたはそのアルコールもしくはエステルを指し、この誘導体において、C=C二重結合はシクロプロパン化またはエポキシ化されている。本明細書において使用する場合、選択的な活性化は、1つのPKCアイソザイム、たとえばPKCεが、任意の他のPKCアイソザイムより検出しやすい規模まで活性化されることを意味する。用語神経変性は、ニューロンの構造または機能が進行性に喪失することを指し、ニューロン死も含まれる。用語薬学的に許容されるは、生理学的に忍容性があり、対象に投与した際、典型的には不都合な反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。本開示は、全般にはrTPAの使用について記載するが、脳卒中の治療に適した他の抗凝血剤および抗凝血療法も企図される。さらに、本開示は、特定の人工型のTPAたとえばrTPAに限定されず、TPAを全般に包含することは理解される。本開示は、全般に、脳卒中を治療する方法であって、抗凝血剤たとえばrTPAおよびPKC活性化因子を投与する初期治療、それに続く、PKC活性化因子を投与する後続治療を含む方法に関する。いくつかの態様では、PKC活性化因子の初期投与により、脳卒中後たとえば虚血事象後にrTPAを投与でき有効性も保持され続ける時間が拡大されると考えられる。PKC活性化因子の後続投与は、保護、防止、および/または再生に関する付加的利益、たとえば、抗アポトーシス、抗シナプス喪失、および/またはシナプス形成をもたらすと考えられる。本明細書において開示する方法は、たとえば、死亡率を低下させ、出血性変化を低下させ、血液脳関門BBBの破損を低下させ、および/または、ヘモグロビン分析値レベルを低下させると考えられ、この場合、ヘモグロビン値上昇は、脳卒中に起因する、再灌流の減少、梗塞サイズの増大、および/または死亡のリスク因子である。さらに、本明細書において開示する方法は、脳卒中発症後の認知能力、学習、および/または記憶力を改善すると考えられ、脳卒中により誘導される脳障害および/または脳卒中により誘導される記憶障害を回復させると考えられる。変動的時間域slidingtemporalwindow本明細書において開示する方法では、PKC活性化因子は、初期治療用のrTPAの前、後、および/またはそれと同時に、投与してもよい。本開示のいくつかの態様では、rTPAとPKC活性化因子とを同時に投与する。したがって、本開示は、対象へのPKC活性化因子およびrTPAの投与についての変動的時間域を企図する。用語変動的時間域は、脳卒中に罹患している対象に、PKC活性化因子およびrTPAを、任意の順序で、互いに対して任意の時点で、および、脳卒中が発生した時期に対して任意の時点で、投与できるという概念を指す。以下のとおり、少なくとも4つのシナリオが企図される。シナリオ1:本開示のいくつかの態様では、脳卒中に罹患した後、所与の期間内にPKC活性化因子を、続いて、さらに期間を置いた後でrTPAを、対象に投与してもよい。PKC活性化因子は、脳卒中発生後の任意の時点で、一般には約24時間以内に、投与してもよい。たとえば、PKC活性化因子は、脳卒中の約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間後に、対象に投与してもよい。次いで、rTPAを、PKC活性化因子の約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間後に、対象に投与してもよい。たとえば、いくつかの態様では、PKC活性化因子は、虚血事象後24時間以内、たとえば、虚血事象の約1時間~約12時間後、または約2時間~約6時間後に投与する。次いで、rTPAを、PKC活性化因子の投与後24時間以内、たとえば、PKC活性化因子の投与の約1時間~約12時間後、または約2時間~約6時間後に投与する。一態様において、PKC活性化因子は、虚血事象後約6時間以内に投与し、rTPAは、PKC活性化因子の投与後約2時間以内に投与する。別の態様では、PKC活性化因子は、虚血事象の約3時間後に投与し、rTPAは、PKC活性化因子の約2時間後に投与する。シナリオ2:いくつかの態様では、脳卒中に罹患した後、所与の期間内にrTPAを対象に投与し、続いて、さらに期間を置いた後でPKC活性化因子を投与してもよい。rTPAは、脳卒中発生後の任意の時点で、一般には約24時間以内に、投与してもよい。たとえば、rTPAは、脳卒中の約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間後に、対象に投与してもよい。次いで、PKC活性化因子を、rTPAの投与の約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間後に、対象に投与してもよい。たとえば、いくつかの態様では、rTPAは、虚血事象後24時間以内、たとえば、虚血事象の約1時間~約12時間後、または約2時間~約6時間後に投与する。次いで、PKC活性化因子を、rTPAの投与後の24時間以内、たとえば、rTPAの約1時間~約12時間後、または約2時間~約6時間後に投与する。一態様において、rTPAは、虚血事象後約6時間以内に投与し、PKC活性化因子は、rTPAの後、約2時間以内に投与する。別の態様では、rTPAは、虚血事象の約3時間後に投与し、PKC活性化因子は、rTPAの約2時間後に投与する。シナリオ3:本開示の他の態様では、脳卒中に罹患した後、所与の期間内にPKC活性化因子を対象に投与し、続いて、さらに期間を置いた後でrTPAを1回以上、さらに続いて、一定の期間後にPKC活性化因子を1回以上、投与してもよい。たとえば、PKC活性化因子は、脳卒中の約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間後に、対象に投与してもよい。次いで、rTPAを、PKC活性化因子の投与の約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間後に、対象に投与してもよい。その後、別のPKC活性化因子を、rTPAの投与の約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間後に投与してもよい。rTPAの前および後に投与するPKC活性化因子は、同じであっても異なっていてもよい。同様に、脳卒中に罹患した後、所与の期間内にrTPAを1回以上対象に投与し、続いて、さらに期間を置いた後でPKC活性化因子を1回以上、さらに続いて、一定の期間後に同じまたは異なるPKC活性化因子を1回以上、投与してもよい。シナリオ4:また他の態様では、PKC活性化因子およびrTPAは、脳卒中に罹患した後の対象に同時に投与してもよい。この投与は、PKC活性化因子とrTPAとを含む組成物を直接投与すること、または、PKC活性化因子を含む組成物とrTPAを含む別個の組成物とを、順序は問わないがすなわち、PKC活性化因子を含む組成物を最初に投与してもrTPAを含む組成物を最初に投与してもよい次々に素早く連続して投与することにより行なってもよい。いくつかの態様では、本開示は、rTPAで虚血性脳卒中を治療するための治療可能域を拡大する方法であって、rTPAの前、後、またはそれと同時にPKC活性化因子を投与することを含む方法を提供する。rTPAたとえばActivase登録商標を投与するための推奨期間は、約3時間である。本開示の一態様において、たとえば、PKC活性化因子を脳卒中の約2時間後に対象に投与し、続いて、rTPAを約6時間後すなわち、脳卒中の約8時間後に投与する。別の態様では、rTPAを脳卒中の約6時間後に対象に投与し、続いて、PKC活性化因子を約2時間後すなわち、脳卒中の約8時間後に投与する。本開示の少なくとも1つの態様は、脳卒中に罹患している対象の治療法であって、該対象が虚血性脳卒中または出血性脳卒中のいずれに罹患したかが判明する前の治療法を提供する。たとえば、本開示は、脳卒中に罹患している対象を同定し、治療有効量のPKC活性化因子を投与し、該対象が虚血性脳卒中または出血性脳卒中の何れに罹患したか決定する方法を提供する。罹患した脳卒中の型についての決定は、医療分野において公知の任意の適当な手段、たとえば、コンピューター断層撮影CTスキャンにより、行なってもよい。対象が虚血性脳卒中に罹患した場合は、治療有効量のrTPAを投与してもよい。しかし、対象が出血性脳卒中に罹患した場合は、rTPAは投与しない。したがって、本開示のいくつかの態様では、rTPAで脳卒中を治療するための治療可能時間域を拡大することにより、対象が虚血性脳卒中または出血性脳卒中のいずれに罹患したかの決定が可能になる。本明細書において開示する方法において、rTPAおよびPKC活性化因子から成る初期治療たとえば、シナリオ1~4に記載してあるに続いて、PKC活性化因子から成る後続治療を行う。PKC活性化因子から成る後続治療は、たとえば、虚血事象の約10時間~約32時間後、たとえば虚血事象の約24時間後に開始してもよい。初期治療および後続治療において投与するPKC活性化因子は、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの態様では、PKC活性化因子は、1週間当たり1~3回投与する。いくつかの態様では、治療継続期間は約1週間~約10週間、たとえば約1週間~約6週間の範囲、たとえば約1週間、約2週間、約3週間、約4週間、約5週間、または約6週間である。PKC活性化因子本開示のいくつかの態様では、PKC活性化因子は、PKCεを他のPKCアイソザイムの少なくとも1倍、2倍または5倍たとえば、本明細書に記載のPKC活性化アッセイによって測定する場合、活性化してもよい。活性化されると、PKC酵素は、RACK活性化Cキナーゼ受容体タンパク質により原形質膜に移動させられるが、RACKタンパク質は、活性化PKCの膜結合型受容体である。一般には、活性化されると、PKC酵素は、RACKタンパク質により原形質膜に移動させられる。PKC活性化の他の徴候としては、ホスファチジルイノシトール三リン酸依存性キナーゼPDK1による特定のC末端セリン/トレオニン残基でのリン酸化が挙げられ、PKCファミリーの各酵素中のよく保存された配列が、少なくとも2つの追加的なリン酸化および/または自己リン酸化を起こしている。PKCの活性化は、たとえば、Sunら、RecentPatentsCNSDrugDiscov.、2006、第1巻、147~56ページに記載されている。本明細書において開示する方法、組成物およびキットに適したPKC活性化因子としては、例として、大環状ラクトン、たとえばブリオスタチンおよびネリスタチンneristatinクラスが挙げられ、これらは、PKCを刺激するように作用する。ブリオスタチンクラスの化合物のうち、ブリオスタチン-1は、PKCを活性化しても腫瘍を促進しないことが示されている。ブリオスタチン-1は、PKC活性化因子としてとりわけ有用と考えられるが、その理由は、用量応答曲線が二相性であり、ブリオスタチン-1は、PKCアイソザイム、たとえばPKCα、PKCδ、およびPKCεの分化調節を行うことが実証されているからである。ブリオスタチン-1については、動物およびヒトにおける毒性および安全性試験が行われており、抗癌剤として積極的に調査されている。大環状ラクトンは、一般に、14、15または16員のラクトン環を含む。マクロライドは、ポリケチドクラスの天然生成物に属する。大環状ラクトンおよびその誘導体は、たとえば、米国特許第6,187,568号、同第6,043,270号、同第5,393,897号、同第5,072,004号、同第5,196,447号、同第4,833,257号、および同第4,611,066号、および第4,560,774号に記載されており、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの特許には、大環状ラクトンについての多様な化合物および多様な使用抗炎症剤または抗腫瘍剤としての使用を含むが記載されている。Szallasiら、J.Biol.Chem.、1994、第269巻、2118~2124ページ;Zhangら、CancerRes.、1996、第56巻、802~808ページ;Henningsら、Carcinogenesis、1987、第8巻、1343~1346ページ;Varterasianら、Clin.CancerRes.、2000、第6巻、825~828ページ;Mutterら、BioorganicMed.Chem.、2000、第8巻、1841~1860ページ、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ブリオスタチンおよびネリスタチン化合物は、初めは、海洋性のコケムシBugulaneritinaLから単離された。一態様において、例としては、PKC活性化因子は、大環状ラクトン、たとえばブリオスタチンまたはネリスタチンである。ブリオスタチンとしては、たとえば以下が挙げられる:ブリオスタチン-1、ブリオスタチン-2、ブリオスタチン-3、ブリオスタチン-4、ブリオスタチン-5、ブリオスタチン-6、ブリオスタチン-7、ブリオスタチン-8、ブリオスタチン-9、ブリオスタチン-10、ブリオスタチン-11、ブリオスタチン-12、ブリオスタチン-13、ブリオスタチン-14、ブリオスタチン-15、ブリオスタチン-16、ブリオスタチン-17、およびブリオスタチン-18。少なくとも1つの態様では、ブリオスタチンは、ブリオスタチン-1である。本開示に適したネリスタチンとしては、たとえばネリスタチン-1が挙げられる。ブリオスタチンの類似体は、一般にブリオログbryologと称され、本開示における使用に適した特定の1クラスのPKC活性化因子である。表1は、いくつかのブリオログの構造的特徴をまとめたものであり、PKC親和性にばらつきがあることが実証されている範囲は0.25nM~10μM。構造的には、ブリオログはすべて類似している。ブリオスタチン-1は2つのピラン環と1つの6員環アセタールとを有するが、大半のブリオログにおいては、ブリオスタチン-1のピランのうち1つは、第2の6員アセタール環で置きかえられている。この修飾により、ブリオログの安定性はブリオスタチン-1に比して、たとえば強酸中でも塩基中でも低下するが、生理学的なpHではそれほどでもない。ブリオログは、ブリオスタチン-1988と比較して分子量も小さく範囲は約600g/mol~755g/mol、その特性が、血液脳関門を越える輸送を容易にする。類似体1は、最も高いPKC親和性を呈する。Wenderら、Curr.DrugDiscov.Technol.、2004、第1巻、1~11ページ;Wenderら、Proc.Natl.Acad.Sci.、1998、第95巻、6624~6629ページ;Wenderら、J.Am.Chem.Soc.、2002、第124巻、13648~13649ページ、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。唯一、類似体1は、ブリオスタチンより高いPKC親和性を呈する。類似体2は、ブリオスタチン-1のA環を欠くが、高いPKC親和性を維持する最も単純な類似体である。活性のあるブリオログに加え、類似体7dは、26位でアセチル化されているが、実質的にPKC親和性がない。本開示において、B環ブリオログを使用してもよい。これらの合成ブリオログは、低ナノモル範囲で親和性を有する。Wenderら、OrgLett.、2006、第8巻、5299~5302ページ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。B環ブリオログは、完全に合成のものである利点を有し、天然源から精製する必要がない。第3のクラスの適当なブリオスタチン類似体は、A環ブリオログである。これらのブリオログは、ブリオスタチン-1と比較してPKC親和性がわずかに低くブリオログ3、4、および5についてそれぞれ、6.5nM、2.3nM、および1.9nM、分子量が小さい。ブリオスタチン類似体は、米国特許第6,624,189号および同第7,256,286号に記載されている。ジアシルグリセロールDAGのいくつかの誘導体は、PKCと結合し、これを活性化させる。Niedelら、Proc.Natl.Acad.Sci.、1983、第80巻、36~40ページ;Moriら、J.Biochem.、1982、第91巻、427~431ページ;Kaibuchiら、J.Biol.Chem.、1983、第258巻、6701~6704ページ。しかし、DAGおよびDAG誘導体は、薬物としての価値は限定されている。ジアシルグリセロールによるPKCの活性化は一過性のものであるが、その理由は、ジアシルグリセロールは、ジアシルグリセロールキナーゼおよびリパーゼにより速やかに代謝されるからである。Bishopら、J.Biol.Chem.、1986、第261巻、6993~7000ページ;Chuangら、Am.J.Physiol.、1993、第265巻、C927~C933ページ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。脂肪酸の置換により、活性化の強度が決定される。不飽和脂肪酸を有するジアシルグリセロールは、最も活性が高い。立体異性配置は重要であり、1,2-sn配置を有する脂肪酸は活性があるが、2,3-sn-ジアシルグリセロールおよび1,3-ジアシルグリセロールはPKCと結合しない。cis-不飽和脂肪酸は、ジアシルグリセロールと相乗性を有する場合がある。少なくとも1つの態様では、用語PKC活性化因子は、DAGまたはDAG誘導体を明示的に除外する。イソプレノイドも、本開示に適したPKC活性化因子である。たとえば、ファルネシルチオトリアゾールは合成イソプレノイドであり、Kd値2.5μMでPKCを活性化する。たとえば、ファルネシルチオトリアゾールは、ジオレオイルグリセロールと等効力であるが、脂肪酸の加水分解性エステルを有さない。Gilbertら、Biochemistry、1995、第34巻、3916~3920ページ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファルネシルチオトリアゾールおよび関連化合物は、安定で難分解性のPKC活性化因子を代表する。低分子量305.5g/molであり荷電基が不在であることから、ファルネシルチオトリアゾールであれば、血液脳関門を容易に通過すると期待される。オクチルインドラクタムVは、テレオシジンと関連する非ホルボールタンパク質キナーゼC活性化因子である。オクチルインドラクタムV具体的には--エナンチオマーの利点としては、より大きな代謝安定性、より高い効力EC50=29nM、および低分子量これにより、血液脳関門を越える輸送が容易になるが挙げられる。Fujikiら、Adv.CancerRes.、1987、第49巻、223~264ページ;Collinsら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、1982、第104巻、1159~4166ページ、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。グニジマクリンは、ダフナン型ジテルペンであり、0.1nM~1nMの濃度で、ネズミ科動物の白血病および充実性腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示す。グニジマクリンは、K562細胞において濃度0.3nMでPKC活性化因子として作用し、Cdc25Aの抑制、および、続いて起こるサイクリン依存性キナーゼ2Cdk2の阻害5ng/mlで100の阻害が達成されるを通して、G1/S期の細胞周期進行を調節する。グニジマクリンは、ブリオスタチンに類似した複素環の天然の生成物であるが、いくらかそれより小さい分子量=774.9g/mol。イリパリダルIripallidalは、イリスパリダIrispallidaから単離された二環式のトリテルペノイドである。イリパリダルは、NCI60細胞株スクリーンにおいて抗増殖活性を示し、GI50成長を50阻害するために必要な濃度値はマイクロモル~ナノモルの範囲である。イリパリダルは、高い親和性Ki=75.6nMでPKCαと結合する。イリパリダルは、RasGRP3依存的に、Erk1/2のリン酸化を誘導する。その分子量は、486.7g/molである。イリパリダルは、ブリオスタチンの約半分のサイズであり、荷電基を欠く。インゲノールは、ホルボールに関連するジテルペノイドであるが、より毒性は低い。インゲノールは、白い乳液を分泌する植物であるチャボタイゲキEuphorbiapeplusから誘導される。たとえば、インゲノール3,20-ジベンゾエートは、PKCとの結合について[3H]ホルボールジブチレートと競合するKi=240nM。Winklerら、J.Org.Chem.、1995、第60巻、1381~1390ページ、参照により本明細書に組み込まれる。インゲノール-3-アンゲレートは、局所使用すると、扁平上皮癌およびメラノーマに対して抗腫瘍活性を呈する。Ogbourneら、AnticancerDrugs、2007、第18巻、357~362ページ、参照により本明細書に組み込まれる。ナプタレンスルホンアミドnapthalenesulfonamide、たとえばN-n-ヘプチル-5-クロロ-1-ナフタレンスルホンアミドSC-10およびN-6-フェニルヘキシル-5-クロロ-1-ナフタレンスルホンアミドは、別クラスのPKC活性化因子に属する。SC-10は、ホスファチジルセリンの機序と類似の機序を用いて、カルシウム依存的にPKCを活性化する。Itoら、Biochemistry、1986、第25巻、4179~4184ページ、参照により本明細書に組み込まれる。ナフタレンスルホンアミドは、ブリオスタチンとは異なる機序により作用し、ブリオスタチン、または、別のクラスのPKC活性化因子に属する物質と相乗効果を示す場合がある。構造的には、ナフタレンスルホンアミドはカルモジュリンCaM拮抗剤W-7と類似しているが、CaMキナーゼには効果を及ぼさないことが報告されている。ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤も、PKCを間接的に活性化することにより、本開示におけるPKC活性化因子として適当と考えられる。ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない:6-2-4-[4-フルオロフェニルフェニルメチレン]-1-ピペリジニルエチル-7-メチル-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-5-オンR59022および[3-[2-[4-ビス-4-フルオロフェニルメチレン]ピペリジン-1-イルエチル]-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-41H-キナゾリノンR59949。さまざまな成長因子、たとえば線維芽細胞成長因子18FGF-18およびインスリン成長因子は、PKC経路を通して機能する。FGF-18発現は学習に際して上方調節され、インスリン成長因子受容体は学習に関与している。これらのまたは他の成長因子によるPKCシグナル伝達経路の活性化は、PKC活性化の追加的な手段となる可能性がある。成長因子たとえばNGFおよびBDNFの合成および/または活性化を刺激する成長因子活性化因子4-メチルカテコール誘導体、たとえば4-メチルカテコール酢酸MCBAなどは、PKC、ならびに、シナプス形成および/または神経突起の枝分かれに関与する収束型経路も活性化する。本開示によるPKC活性化因子としては、脂肪酸、たとえば不飽和脂肪酸MUFAおよび/またはPUFAなど、ならびに、少なくとも1つのC=C二重結合がシクロプロピル基に置きかえられているすなわちシクロプロパン化された二重結合またはエポキシル基に置きかえられているすなわちエポキシ化された二重結合その誘導体が挙げられる。いくつかの態様では、不飽和脂肪酸のC=C二重結合はすべて、シクロプロピル基および/またはエポキシル基に置きかえられている。いくつかの態様では、脂肪酸誘導体は、シクロプロピル基とエポキシル基の両方を含んでいてもよい。本開示のいくつかの態様では、PKC活性化因子は、脳卒中を治療するための脂肪酸誘導体を含む。いくつかの態様では、たとえば、脂肪酸誘導体PUFAおよび/またはMUFA誘導体などは、低いたとえばナノモルの濃度でPKCεを活性化すると考えられる。脂肪酸誘導体の末端官能基は、例としては、遊離カルボン酸-CO2、アルコール-CHOH、またはエステル-CO2R、たとえばモノエステルもしくはポリエステルであってもよい。エステルのアルキル基Rは、直鎖または分枝状のもの、たとえば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、およびテトラデシル基などであってもよい。エステルは、脂肪アルコールにエステル連結の形で連結している脂肪酸から形成してもよい。企図される他のアルキルエステルとしては、脂肪族アルコールエステルおよび芳香族アルコールエステルが挙げられる。一態様において、たとえば、アルコールエステルは、プロピレングリコールエステルである。別の態様では、アルコールエステルは、グリセロールエステルである。脂肪酸のグリセロールエステルとしては、たとえば以下が挙げられる:グリセロール脂肪酸エステル、グリセロール酢酸脂肪酸エステル、グリセロール乳酸脂肪酸エステル、グリセロールクエン酸脂肪酸エステル、グリセロールコハク酸脂肪酸エステル、グリセロールジアセチル酒石酸脂肪酸エステル、グリセロール酢酸エステル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、およびポリグリセロール縮合リシノール酸エステル。グリセロール誘導体は生物学的に重要であるが、その理由は、脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジン酸の形態でグリセロールにコンジュゲートされると考えられるからである。たとえば、トリアシルグリセロールまたはトリグリセリドは、3つの脂肪酸のカルボキシル基が、グリセロールの3個の炭素すべてのヒドロキシル基にエステル連結している化合物である。カルボン酸をエステル化すると、負電荷が除去されることにより、血液脳関門を越える輸送が容易になるが、アルコール基も、血液脳関門を越える輸送を容易にする。本開示の脂肪酸誘導体の基礎となることができるMUFAとしては、限定するものではないが、次の構造:CH3CH2xCH=CHCH2yCOOH式中、xおよびyはそれぞれ、互いに独立性に、3~11の奇数の整数であるを有する脂肪酸が挙げられる。例としては、cis-およびtrans-MUFA、たとえばオレイン酸、エライジン酸、オブツシル酸、カプロレイン酸、ラウロレイン酸、リンデル酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、およびペトロセリン酸が挙げられる。MUFAアルコールの例としては、たとえば、エライジンアルコールelaidicalcohol、オレイルアルコール、および1-モノリノレイルrac-グリセロールが挙げられる。シクロプロパン化およびエポキシ化MUFA誘導体の具体例としては、エリアジンeliadicアルコールシクロプロパンBR-106、エリアジン酸シクロプロパンBR-107、オレイルアルコールシクロプロパンBR-108、およびエポキシステアリン酸BR-116が挙げられる。図5を参照のこと。本明細書において開示する方法のために企図される、天然にシクロプロパン化またはエポキシ化されたMUFASまたはそのエステルまたはアルコール誘導体としては、マルベン酸malvenicacid、ベルノル酸、およびステルクリン酸が挙げられる。例示的な化合物は、ベルノル酸メチルエステルBR-117である。本開示の脂肪酸誘導体の基礎となることができるPUFAとしては、限定するものではないが、次の構造:CH3CH24CH=CHCH2xCH2yCOOH式中、xおよびyは、それぞれ独立に、2~6の範囲の整数であるを有する脂肪酸が挙げられ、メチレン中断型および/またはポリメチレン中断型ポリエンを包含する。これがω-6PUFAである。例としては、限定するものではないがリノール酸、γ-リノール酸、アラキドン酸、およびアドレン酸が挙げられ、その構造は次のとおりである:リノール酸CH3CH24CH=CHCH22CH26COOHγ-リノレン酸CH3CH24CH=CHCH23CH23COOHアラキドン酸CH3CH24CH=CHCH24CH22COOHアドレン酸CH3CH24CH=CHCH24CH24COOHリノール酸誘導体DCP-LA2-[2-ペンチルシクロプロピルメチル]シクロプロパンオクタン酸BR-101は、公知のPKCの、あまり知られていないアイソフォーム特異的な活性化因子の1つである。図5を参照のこと。DCP-LAは、PKCεを選択的に活性化し、100nMで最大の効果を有するKannoら、J.LipidRes.、2006、第47巻、1146~1156ページ。SC-10と同様、DCP-LAは、ジアシルグリセロール結合部位ではなく、PKCのホスファチジルセリン結合部位と相互作用する。本開示の脂肪酸誘導体の基礎となることができるPUFAのさらなる例としては、次の構造:CH3CH2CH=CHCH2xCH2yCOOH式中、xおよびyは、それぞれ独立に、2~6の範囲の整数であるが挙げられ、メチレン中断型および/またはポリメチレン中断型ポリエンを包含する。これがω-3PUFAである。例としては、限定するものではないがα-リノール酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、およびエイコサテトラエン酸が挙げられ、その構造は次のとおりである:α-リノレン酸CH3CH2CH=CHCH23CH26COOHエイコサテトラエン酸CH3CH2CH=CHCH24CH25COOHエイコサペンタエン酸CH3CH2CH=CHCH25CH22COOHドコサヘキサエン酸CH3CH2CH=CHCH26CH22COOHPUFA誘導体としては、C=C二重結合のうち少なくとも1つがシクロプロパン化またはエポキシ化されているPUFAカルボン酸、アルコール、またはエステル末端基が挙げられる。cis-PUFAエステルの例としては、次の構造:CH3CH24CH=CHCH2xCH2yCOORCH3CH2CH=CHCH2xCH2yCOOR式中、xおよびyは、それぞれ独立に、2~6の範囲の整数であり、Rはアルキル基であるが挙げられる。いくつかの態様では、Rは、アルコール、たとえば一価または多価アルコールのアルキル基である。アルコールの例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、グリセロール、マンニトール、およびソルビトールが挙げられるが、これらに限定されない。このような場合、アルコールは、分枝または無分枝のアルキル鎖を含んでいてもよく、または、芳香族アルキルを含んでいてもよいたとえばフェノールアルコール。PUFA誘導体の例としては、リノール酸アルコールジシクロプロパンBR-105、リノレン酸アルコールトリシクロプロパンBR-104、およびベルノル酸メチルエステルシクロプロパンBR-109が挙げられるが、これらに限定されない。図5を参照のこと。いくつかの態様では、PUFA誘導体は、C=C二重結合のうち少なくとも1つがシクロプロパン化cyclpropanatedまたはエポキシ化されているPUFAまたはそのエステルもしくはアルコールである。いくつかの態様では、たとえば、PUFA誘導体は、2~6個のシクロプロパン化またはエポキシ化された二重結合を有するPUFAまたはそのエステルもしくはアルコールを含む。少なくとも1つの態様では、PUFA誘導体は、3つのシクロプロパン化またはエポキシ化された二重結合を有するPUFAまたはそのアルコールもしくはエステルを含む。本開示のPUFA誘導体は、シクロプロピル基とエポキシル基の両方を含んでいてもよい。いくつかの態様では、PUFA誘導体は、エポキシ化cis-PUFAアルコール、たとえばリノール酸アルコールジシクロプロパンまたはリノレン酸アルコールトリシクロプロパンを含んでいてもよい。本開示によるシクロプロパン化および/またはエポキシ化脂肪酸の基礎を形成してもよいPUFAとしては、アラキドン酸AA、ドコサヘキサエン酸DHA、およびエイコサペンタエン酸EPAが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なPUFA誘導体としては、ドカヘキサノン酸docahexaenonicacidメチルエステルヘキサシクロプロパンBR-111、エイコサペンタエン酸メチルエステルペンタシクロプロパンBR-114、およびアラキドン酸メチルエステルテトラシクロプロパンBR-115が挙げられる。図5を参照のこと。一態様において、PKC活性化因子は、次の構造:式中、Rは、Hまたはアルキル基であるを有する、DHAのシクロプロパン化PUFA誘導体を含む。一態様において、Rは、メチルBR-111またはDHA-CB6メチルエステル、またはメチル-3-2-2-2-2-2-2-エチルシクロプロピルメチルシクロプロピルメチルシクロプロピルメチル-シクロプロピルメチルシクロプロピルメチルシクロプロピルプロパノエートである。別の態様では、PKC活性化因子は、次の構造:を有するPUFA誘導体を含む。この化合物は、BR-114EPA-CP5またはメチル4-22-2-2-エチルシクロプロピルメチルシクロプロピルメチルシクロプロピルメチルシクロプロピルメチル-シクロプロピルブタノエートメチルエステルである。さらなる別の態様では、PKC活性化因子は、次の構造:を有するPUFA誘導体を含む。この化合物は、BR-115AA-CP4またはメチル4-2-2-2--ペンチルシクロプロピルメチルシクロプロピルメチルシクロプロピルメチルシクロプロピルブタノエートメチルエステルである。別の態様では、PKC活性化因子は、次の構造:を有するPUFA誘導体erivativeを含む。式中、Rは、Hまたはアルキルエステルである。一態様において、Rは、メチルである。合成方法脂肪酸ならびにそのエステルおよびアルコールは、天然源、たとえば魚油、亜麻仁油、大豆、菜種油、もしくは藻類を精製することにより得るもしくは生成させる、または、微生物の酵素的合成と化学合成との組合せを用いて合成することができる。一例として、脂肪酸メチルエステルは、メタノールおよび均一系アルカリ触媒を使用して、精製された/食用タイプの油のトリグリセリドをエステル交換することにより生成させることができる。炭化水素中の二重結合のシクロプロパン化の方法は、当技術分野において公知である。たとえば、改変型のシモンズ-スミス反応は、二重結合をシクロプロパンに変換するための標準的な方法である。TanakaおよびNishizaki、Bioorg.Med.Chem.Lett.、2003、第13巻、1037~1040ページ;KawabataおよびNishimura、J.Tetrahedron、1967、第24巻、53~58ページ;DenmarkおよびEdwards、J.Org.Chem.、1991、第56巻、6974~6981ページ。この反応においては、アルケンを金属カルベノイド、たとえばヨウ化メチレンおよびジエチル亜鉛で処理すると、結果として、アルケンがシクロプロパン化される。ltoら、OrganicSyntheses、1988、第6巻、327ページも参照のこと。メチルエステルのシクロプロパン化も、触媒としてのパラジウムIIアセテートの存在下でジアゾメタンを使用して達成された。Gangadharら、J.Am.OilChem.Soc.、1988、第65巻、601~606ページ。エポキシ化の方法も当技術分野において公知であり、典型的には、有機溶媒中での脂肪酸ジオキシランの反応が含まれる。Sonnetら、J.Am.OilChem.Soc.、1995、第72巻、199~204ページ。一例として、PUFA二重結合のエポキシ化は、ジメチルジオキシランOMDをエポキシ化剤として用いて達成できる。Grabovskiyら、HelveticaChimicaActa、2006、第89巻、2243~22453ページ。本開示は、脳卒中に伴う神経障害および/または疾患の治療を企図する。いかなる特定の機序にも限定されるものではないが、PKCεを選択的に活性化させると、結果として、α-セクレターゼ、たとえば腫瘍壊死因子-α変換酵素TACEの活性化が促進されると共に、Aβの産生が減少すると考えられる。しかし、このことは、非神経細胞、たとえば線維芽細胞中で主に起こるようである。PKCεを活性化させると、さらに、シナプス形成が誘導され、または、脳卒中発症後またはアルツハイマー病におけるアポトーシスが防止されると考えられる。PKCεを活性化させると、さらに、GSK-3βの阻害を通したAβ媒介性の神経毒性からニューロンが保護されると考えられる。本明細書において開示する方法は、脳卒中後24時間の死亡率を低下させると考えられる。たとえば、24時間後の死亡率を、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、または少なくとも50低下させると考えられる。少なくとも1つの態様では、PKC活性化因子およびrTPAを初期投与し、続いてPKC活性化因子を後続投与することにより、脳卒中後24時間の死亡率が少なくとも40低下する。いくつかの態様では、本明細書において開示する治療の方法は、脳卒中後の血液脳関門の破損を減少させると考えられ、および/または、出血性変化を減少させると考えられる。いくつかの態様では、たとえば、脳卒中後にPKC活性化因子およびrTPAを投与し、続いてPKC活性化因子を後続投与することにより、ヘモグロビンレベルが低下すると考えられ、この場合のヘモグロビンの低下は、出血性変化の低下および/または血液脳関門の破損の低下の指標となる。いくつかの態様では、ヘモグロビンhemoglovinレベルは、約30、約35、約40、約45、約50、約55、または約60低下する。少なくとも1つの態様では、たとえば、ヘモグロビンレベルは、約50低下する。血液脳関門の破損の低下は、アルブミンの血管外遊出を測定することにより評価してもよい。DiNapoliら、NeurobiologyofAging、2008、第29巻、753~764ページ。さらに、本開示のいくつかの態様では、脳卒中に起因する梗塞たとえば、虚血事象が原因で生じる組織損傷のサイズを、限定および/または低下させると考えられる。製剤および投与本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学分野において公知の任意の適当な方法により調製してもよい。一般には、そのような調製方法には、活性成分を担体または1つ以上の他の副成分と会合させ、次いで、必要または所望により、製品を所望の単回または複数回投与用の単位に成形または包装することが含まれる。本明細書において提供される医薬組成物の記載は、主として、ヒトへの医療用としての投与に適した医薬組成物に向けたものであるが、そのような組成物は、一般に、あらゆる種類の動物への投与に適していることは、当業者には理解されよう。多様な動物への投与に適した組成物にするために、ヒトへの投与に適した医薬組成物を改変することは十分理解され、通常の技能を有する獣医薬理学者は、そのような修飾を、あったとしても通常の実験作業のみを用いて設計および実施できる。本発明の医薬組成物の投与が企図される対象としては、ヒトおよび他の霊長動物、および他の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、PKC活性化因子と抗凝血剤、たとえばrTPAとは、一緒に製剤化される。他の態様では、PKC活性化因子とrTPAとは、別々に製剤化される。本明細書において開示する組成物は、任意の適当な経路、たとえば経口、非経口、経粘膜、鼻腔内、吸入、または経皮経路により、投与してもよい。非経口経路としては、静脈内、細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、くも膜下腔内、および頭蓋内投与が挙げられる。血液脳関門を通過させるための適当な投与経路を選んでもよい。Rapoportら、J.LipidRes.、2001、第42巻、678~685ページ。本明細書において開示する組成物は、従来の方法により製剤化してもよく、任意の薬学的に許容される添加物、たとえば賦形剤、滑沢剤、希釈剤、香味料flavorant、着色料、緩衝剤、および崩壊剤を含んでいてもよい。たとえば、Remington’sPharmaceuticalSciences、第20版、MackPublishingCo.、2000を参照のこと。いくつかの態様では、PKC活性化因子は、固体の経口用剤形で製剤化する。経口投与用には、本組成物は、薬学的に許容される賦形剤を用いた従来の手段により調製された錠剤またはカプセルの形態をとっていてもよく、そのような賦形剤は、たとえば、結合剤たとえばアルファー化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース;フィラーたとえば乳糖、結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム;滑沢剤たとえばステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ;崩壊剤たとえばバレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム;または湿潤剤たとえばラウリル硫酸ナトリウムである。錠剤は、当技術分野で一般に公知の方法によりコーティングされていてもよい。経口投与用の液体調製物は、たとえば、溶液剤、シロップ剤、もしくは懸濁剤の形態をとっていてもよく、または、使用前に水または他の適当なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として提供してもよい。そのような液体調製物は、薬学的に許容される添加物を用いた従来の手段により調製してもよく、そのような添加物は、たとえば、懸濁化剤たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂;乳化剤たとえばレシチンまたはアラビアゴム;非水性ビヒクルたとえばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分留された植物油;および保存剤たとえばメチルまたはプロピル-フィドロキシベンゾエートphydroxybenzoateまたはソルビン酸である。本調製物は、必要に応じ、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含んでいてもよい。本開示の他の態様では、PKC活性化因子は、非経口投与、たとえばボーラス注射または持続注入用に製剤化してもよい。注射用製剤は、単位剤形で、たとえば、アンプル、または、保存剤が添加された複数回投与用容器の形態で、提供してもよい。本組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、分散系、またはエマルションなどの形態をとっていてもよく、製剤化剤formulatoryagent、たとえば懸濁化剤、安定化剤、および/または分散剤を含有していてもよい。いくつかの態様では、PKC活性化因子は、投与のための薬学的に許容される担体を用いて製剤化してもよい。薬学的に許容される担体としては次のうち1つ以上が挙げられるが、これらに限定されない:賦形剤;表面活性剤;分散剤;不活性な希釈剤;造粒および崩壊剤;結合剤;滑沢剤;甘味剤;香味剤;着色剤;保存剤;生理的分解性の組成物たとえばゼラチン;水性のビヒクルおよび溶媒;油性のビヒクルおよび溶媒;懸濁化剤;分散または湿潤剤;乳化剤、粘滑剤;緩衝剤;塩;増粘剤;フィラー;乳化剤;酸化防止剤;抗生物質;抗真菌剤;安定化剤;および薬学的に許容されるポリマー性または疎水性材料。本発明の医薬組成物中に含まれていてもよい他の添加成分は、当技術分野で一般に公知であり、たとえば、Remington’sPharmaceuticalSciences、Genaro編、MackPublishingCo.、Easton、Pa.、1985参照により本明細書に組み込まれるに記載されている場合がある。いくつかの態様では、PKC活性化因子は、投与のための疎水性担体を用いて製剤化してもよい。疎水性担体としては、包接錯体、分散系たとえばミセル、マイクロエマルション、およびエマルション、ならびにリポソームが挙げられる。例示的な疎水性担体としては、包接錯体、ミセル、およびリポソームが挙げられる。たとえば、Remington’s:TheScienceandPracticeofPharmacy、第20版、Gennaro編、Lippincott、Philadelphia、PA、2003を参照のこと。本明細書において開示するPKC活性化因子は、疎水性担体中に、たとえば、担体全体の少なくとも1、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、または少なくとも90重量比として組み込んでもよい。加えて、たとえば製剤を安定化させるために、他の化合物を疎水性担体または溶液のいずれかに含ませてもよい。いくつかの態様では、PKC活性化因子は、デポ調製物として製剤化してもよい。そのような長時間作用製剤は、埋込みたとえば皮下もしくは筋肉内により、または筋肉内注射により、投与してもよい。したがって、たとえば、PKC活性化因子は、適当なポリマー性もしくは疎水性材料たとえば、許容される油中のエマルションとしてまたはイオン交換樹脂を用いて、あるいは、やや溶けにくい誘導体として、たとえばやや溶けにくい塩として、製剤化してもよい。別の態様では、PKC活性化因子は、ベシクル、たとえばミセル、リポソーム、または人工の低密度リポタンパク質LDL粒子の形態で送達してもよい。たとえば、米国特許第7,682,627号を参照のこと。投与する用量は、適切には、1日当たり約1mg~約10g、たとえば約10mg~約1g、またはたとえば約250mg~約500mgのPKC活性化因子を送達するように調製してもよい。局所投与または非経口投与用に調製する際は、本製剤は、最終的な製剤の約0.01重量~約60重量、たとえば約0.1重量~約30重量、たとえば約1重量~約10重量を含有する調合物の形態で作製してもよい。適当な用量は、当技術分野において公知の方法により、および、臨床的に意義のある因子、たとえば患者の年齢により、決定できる。少なくとも1つの態様では、PKC活性化因子は、静脈内投与用に製剤化する。PKC活性化因子は、約5μg/m2~約50μg/m2、たとえば約10μg/m2~約30μg/m2、または約25μg/m2~約50μg/m2の範囲の用量で投与してもよい。いくつかの態様では、たとえば、PKC活性化因子の初期投与は、約25μg/m2~約50μg/m2の範囲である。いくつかの態様では、PKC活性化因子の後続投与は、約5μg/m2~約30μg/m2の範囲、たとえば約10μg/m2、約15μg/m2、または約20μg/m2である。いくつかの態様では、PKC活性化因子およびrTPAは、両方とも静脈内投与用に製剤化する。rTPAは、約0.9mg/kgの用量の静脈内投与用に製剤化してもよい。PKCおよびrTPAは、静脈内投与用に一緒に製剤化してもよく、または、静脈内投与用に別々に製剤化してもよい。キット本開示は、さらに、本明細書において開示する抗凝血剤たとえばrTPAとPKC活性化因子の医薬組成物を調製し、それを必要とする対象に投与するために利用し得るキットに関する。キットは、さらに、本明細書に記載の医薬組成物を投与するための器具、たとえば注射器を含んでいてもよい。いくつかの態様では、キットは、本明細書において開示するrTPAとPKC活性化因子の組成物を保存および/または続いて混合するための1つ以上のバイアル、注射器、針、アンプル、カートリッジ、瓶、または他の当該容器を含んでいてもよい。一定の態様では、本明細書において開示するrTPAとPKC活性化因子の組成物を保存および/または続いて混合するための器具、注射器、アンプル、カートリッジ、瓶または他の当該容器は、2つ以上の室を有するか否かを問わない。またさらなる態様では、本明細書において開示するrTPAとPKC活性化因子の組成物は、1つ以上の目盛り付き容器たとえば、体積の測定に有用な1つ以上の注射器または他の器具中で保存してもよい。一定の態様では、キットは、同じまたは別々のアンプル、バイアル、注射器、カートリッジ、瓶、または他の当該容器内に保存されるrTPAとPKC活性化因子の医薬組成物を含んでいてもよい。本キットは、さらに、1つ以上の麻酔剤、好ましくは局所麻酔剤を含んでいてもよい。一定の態様では、麻酔剤は、即時使用可能な製剤、たとえば、注射可能な製剤予め製剤を充填してある1つ以上の注射器の形態であってもよい、または、本明細書において開示するrTPAとPKC活性化因子の組成物を投与しようとする領域に局所施用してもよい製剤の形態である。麻酔剤の局所用製剤は、パッド、スワブ、ウェットティッシュ、使い捨てのナプキン、布、パッチ、包帯、ガーゼ、綿ボール、Q-tip商標に塗布される麻酔剤;軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、液剤、または任意の他の局所施用される製剤の形態であってもよい。本発明と共に使用するための麻酔剤としては、たとえばリドカイン、マーカイン、コカイン、およびキシロカインを挙げてもよいが、これらに限定されない。本キットは、さらに、rTPAとPKC活性化因子の医薬組成物の使用、およびrTPAとPKC活性化因子の製剤を混合、希釈、または合わせるための手順に関する取扱説明書を含有していてもよい。取扱説明書は、さらに、混合後であるが投与に先立ち、rTPAおよび/またはPKC活性化因子の製剤を正しく希釈して所望のpHまたはpH範囲および/または所望の特定の活性および/またはタンパク質濃度を得るための指示書を含有していてもよい。取扱説明書は、さらに、用法用量に関する情報を含有していてもよい。取扱説明書は、さらに、本明細書において開示するrTPAとPKC活性化因子の医薬組成物での治療の対象を選別する方法を指示してある材料を含有していてもよい。キットは、さらに、追加的な緩衝剤、注射器、針、無針注射器具、滅菌済のパッドまたはスワブを含んでいてもよい。本開示のいくつかの態様では、キットは、rTPAを含む組成物と、PKC活性化因子を含む1つ以上の組成物、たとえば、それぞれがPKC活性化因子を含む少なくとも2つの組成物を含む。該2つ以上の組成物は、同じまたは異なるPKC活性化因子を含んでいてもよく、同じ用量または異なる用量のPKC活性化因子用に製剤化してもよい。次の例は、本開示を例証することを意図しているが、決して限定的なものではない。当業者であれば、本明細書中に示す開示内容と一致する追加的な態様を想起するであろうということは理解される。[実施例]例1脳卒中の局所脳虚血モデルこの実験には、一過性の局所脳虚血の動物モデルを使用した。結紮により、麻酔をかけたラットにおいて中大脳動脈MCAを外科的に切断し閉塞させ、続いて、規定期間約2時間後に再灌流させた。MCAの閉塞MCAOによる一過性虚血の動物モデルは周知であり、たとえば、SicardおよびFisher、Exp.Transl.StrokeMed.、2009、第1巻、1~7ページに記載されている。例2薬物投与第1の実験においては、虚血事象の6時間後にrTPAを静脈内投与し約0.9mg/kg、続いて2時間後にブリオスタチン-1を約25μg/m2~50μg/m2の用量範囲で単回静脈内投与した。第2の実験においては、虚血事象の2時間後にブリオスタチン-1を静脈内投与し約25μg/m2~50μg/m2、続いて約6時間後にrTPA約0.9mg/kgを静脈内投与した。第3の実験においては、虚血事象の2時間後にrTPAを静脈内投与し約0.9mg/kg、続いて約6時間後にブリオスタチン-1を約25μg/m2~50μg/m2の用量範囲で静脈内投与した。例3結果1.死亡率。脳卒中の6時間後にrTPAを、続いて2時間後にブリオスタチン-1を投与すると、24時間後の死亡率は0となったN=9匹。これに対し、脳卒中の6時間後にrTPAを投与し、ブリオスタチンでの後続治療を行わなかった場合、44の死亡率が認められたN=6匹。2.出血、浮腫、および血液脳関門破損。脳卒中の2時間後にブリオスタチン-1を、続いて6時間後にrTPAを投与すると、結果として、皮質および線条体におけるヘモグロビン分析値は、脳卒中の6時間後にrTPAを投与したが事前にブリオスタチン-1での治療を行わなかった場合と比較して50低下した図1。脳浮腫も、このrTPAとブリオスタチン-1との組合せを用いた場合には、顕著に減少した図2。BBB透過性は、局所虚血発症後に浮腫の出現に先立ち典型的に上昇することから、浮腫を用いて、虚血病変部位によるBBB破損の程度を測定することができる。加えて、出血過程は、BBB破損および浮腫に関与している。1つの実験では、エバンスブルー染料の取込みを用いてBBB透過性、すなわち、脳卒中の虚血動物モデルにおける破損、および出血を測定した。図3は、ブリオスタチンと本開示の方法による投与との組合せが、同側および対側皮質においてエバンスブルー染料の取込み量を顕著に減少させたことを示している。最後に、BBBを越えるナトリウム輸送量の増加は、虚血性脳卒中における脳浮腫形成を助長する。図4は、同側および対側皮質におけるNaFの取込み量も、本開示によるブリオスタチン-1およびrTPAの投与法で減少することを示している。前述の結果は、虚血性脳卒中発症後のブリオスタチン-1とrTPAとの組合せが、虚血性脳卒中発症後の死亡率および脳障害を予想外および顕著に低下させることを実証するものである。例4脂肪酸メチルエステルの合成シクロプロパン化脂肪酸メチルエステルシクロプロパン化脂肪酸の合成。クロロヨードメタンおよびジエチル亜鉛を使用する、改変型のシモンズ-スミス反応を用いて、PUFAのメチルエステルをシクロプロパン化した。Tanakaら、Bioorg.Med.Chem.Lett.、2003、第13巻、1037~1040ページ;Furukawaら、Tetrahedron、1968、第24巻、53~58ページ;Denmarkら、J.Org.Chem.、1991、第56巻、6974~6981ページ。すべての装置を60°Cで1時間熱し、乾燥窒素と共に炎を用いて乾燥させた。撹拌子および温度プローブを備えた100mlの三つ首丸底フラスコに、氷-ドライアイス混合物を巻き、25mlのジクロロメタン中の1.25g4.24mmolのリノール酸メチルエステルまたはドコサヘキサエン酸メチルエステルを充填し、N2を通気させた。長さ24インチの20ゲージ針を用いて、ジエチル亜鉛の1M溶液51ml、54.94mmolにヘキサンを嫌気的に加え、この溶液を-5°Cに冷却した。ジヨードメタン8.2ml、101.88mmolまたはクロロヨードメタンClCH2Iを、絶えず撹拌しながら、1秒当たり1滴、滴加した。添加速度を必要に応じ減少させて、反応混合物を2°C未満に維持した。反応混合物は反応中に曇った状態になり、不溶性の白色の亜鉛生成物が遊離した。フラスコを密封し混合物を1時間反応させ、次いで、2時間かけて徐々に室温に戻した。フード内での爆発性残留物の形成を防止するために、ジエチル亜鉛を蒸発させて除去することはしなかった。混合物を100mlの水の中に撹拌下でゆっくり注いで、一切の過剰なジエチル亜鉛を分解させた。エタンを放出させた。混合物をガラス遠心管中にて5000rpmで遠心分離し、上部の水層を捨てた。白色の沈殿物をCH2Cl2で抽出し、有機相と合わせた。有機相を水で洗浄し、遠心分離した。ヘキサン1酢酸エチルを使用したシリカゲルGTLCにより生成物を分析し、n-ヘキサン中の漸増濃度の1~10酢酸エチルを使用したシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、窒素下で蒸発させると、メチルエステルが無色の油として残った。シモンズ-スミス反応は、出発物質の立体化学を維持する。Furukawaら、Tetrahedron、1968、第24巻、53~58ページ。ドコサヘキサエン酸メチルエステルを90~95の収率でDHA-CP6に変換させた。生成物は無色の油であり、シングルビームでの吸光度はエタノール中では202nmで最大であり、I2とは反応しなかった。IRスペクトルは、3070cm-1および1450cm-1でのシクロプロパン環の吸収を示した。同じ条件下で、エイコサペンタエン酸メチルエステルをEPA-CP5に変換させ、アラキドン酸メチルエステルをAA-CP4に変換させた。リノール酸メチルエステルをDCP-LAメチルエステルに変換させたところ、公知の試料と同一であった。メチルエステルの加水分解。メチルエステル0.15gを1mlの1NLiOHおよび1mlのジオキサンに溶解した。ジオキサンおよびメタノールを加えると、やがて均質になり、この溶液を60°Cで一晩撹拌した。生成物をCH2Cl2中で抽出し、遠心分離した。水層および白色の界面を水で再抽出し、白色の層がそれ以上形成されなくなるまで洗浄した。生成物をN2下で蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物である無色の油を、n-ヘキサン中の20EtOAcで溶出した。その純度を、10EtOAc/ヘキサンでのTLCにより、および、205nmでのUV検出を用いたC18RP-HPLCにより、確認した。エポキシド基は、従来の手段により、たとえば、適切なアルケンをm-クロロ過安息香酸またはt-ブチルヒドロペルオキシドで酸化することにより、導入できる。合成した他の化合物としては、図5に示すものが挙げられるBR-101~BR-118。例5ドコサヘキサン酸Docosahexanoicacidを使用した精製PKCεの活性化PKCアッセイ。組換えPKC1ngのPKCαまたはPKCεアイソフォームをBR-101DCP-LAと、以下の存在下で混合した:10マイクロモルのヒストン、5mMのCaCl2、1.2μg/μlのホスファチジル-L-セリン、0.18μg/μlの1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロールDAG、10mMのMgCl2、20mMのHEPESpH7.4、0.8mMのEDTA、4mMのEGTA、4グリセロール、8μg/mlのアプロチニン、8μg/mlのロイペプチン、および2mMのベンズアミジン。0.5マイクロCiの[γ32P]ATPを加えた。インキュベーション混合物を、総体積10マイクロリットルで37度にて15分間インキュベートした。反応は、1×2cm片のリン酸セルロース紙WhatmanP81上に反応混合物を付け、直ちに0.5H3PO4中で1時間ずつ2回洗浄することにより停止させた。リン酸セルロース片をシンチレーションカウンターで計数した。いくつかの実験では、ホスファチジルセリン、ジアシルグリセロール、および/またはカルシウムを除去した。DHAメチルエステルをCaymanChemicalAnnArbor、MEから購入した。PKCアイソザイムはCalbiochemSanDiego、CA製であった。精製PKCεをCalbiochemから購入した。結果精製PKCεを使用したPKC測定から、テストした最低濃度10nMでは、化合物BR-101はPKCεを2.75倍活性化させることが示された図6。PKCαは影響を受けなかったデータは示していない。化合物BR-102も、活性化されていないPKCεの約1.75倍まで、PKCεの活性化を選択的に導いた。PKCεの活性化における低濃度での有効性から、これらの化合物は良好な治療薬候補であろうということが示唆される。例6他のPKC活性化因子を使用した、精製PKCεまたは細胞PKCεの活性化材料。培養培地を、K-DMedicalColumbia、MDまたはInvitrogenCarlsbad、CAから入手した。Aβ1-42をAnaspecSanJose、CAから購入した。多価不飽和脂肪酸メチルエステルをCaymanChemicals、AnnArbor、MIから入手した。他の化学薬品はSigma-AldrichChemicalCo.St.Louis、MOから入手した。PKCアイソザイムはCalbiochemSanDiego、CA製であった。精製PKCεをCalbiochemから購入した。細胞培養。ラット海馬のH19-7/IGF-IR細胞ATCC、Manassas、VAをポリ-L-リジンコーティングしたプレート上に蒔き、DMEM/10FCS中で35°Cにて数日間育てると、やがて約50の被覆率が得られた。次いで、細胞を、ニューロン表現型に分化するように誘導したが、この際の手段は、培地を、基礎となる線維芽細胞成長因子10ng/mlを含有する39°CのN2培地5mlに置きかえ、37°CのT-75フラスコ中で育てることによった。ヒトSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞ATCCは、45F12K/45MEM/10FCS中で培養した。マウスN2A神経芽細胞腫細胞は、DMEM/10FCSグルタミン酸を加えていない中で培養した。生後18日のSpragueDawleyラット胎仔の脳に由来するラット海馬ニューロンを、0.5mMのグルタミンと25μMのグルタミン酸とを含有するB-27neurobasal培地Invitrogen、Carlsbad、CA中に、ポリ-D-リジンSigma-Aldrich、St.Louis、MOでコーティングした12または96ウェルプレート上で蒔いてから、グルタミン酸を加えていない培地で3日間培養した。ニューロン細胞をインキュベーター中で5CO2下で育て、37°Cで14日間維持した。培養細胞に対する実験はすべて、特に指定しない限り3回ずつ実施した。すべてのデータ点は、平均値±SEとして示す。BR-101DCP-LAは、すべての実験においてその遊離酸として使用したが、BR-111DHA-CP6、BR-114EPA-CP5、およびBR-116AA-CP4は、そのメチルエステルとして使用した。タンパク質キナーゼCアッセイ。ラット海馬細胞を培養し、0.2mlのホモジナイゼーション緩衝液20mMのトリス-HCl、pH7.4、50mMのNaF、1μg/mlのロイペプチン、および0.1mMのPMSF中でこすり取り、Marsonixマイクロプローブ超音波処理器を用いた超音波処理5秒、10Wによりホモジナイズした。PKCを測定するために、10μlの細胞ホモジネートまたは精製PKCアイソザイムCalbiochemから購入を37°Cで15分間、以下の存在下でインキュベートした:10μMのヒストン、4.89mMのCaCl2、1.2μg/μlのホスファチジル-L-セリン、0.18μg/μlの1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロール、10mMのMgCl2、20mMのHEPESpH7.4、0.8mMのEDTA、4mMのEGTA、4グリセロール、8μg/mlのアプロチニン、8μg/mlのロイペプチン、および2mMのベンズアミジン。0.5Ciの[γ32P]ATPを加え、先に記載のとおりホスホセルロース上に吸着させることにより、32P-リンタンパク質の形成を測定した。NelsonおよびAlkon、J.Neurochemistry、1995、第65巻、2350~2357ページ。BR-101DCP-LAおよび類似の化合物による活性化の測定については、PKC活性はジアシルグリセロールおよびホスファチジルセリンの不在下で測定し、PKCδ、ε、η、およびμは、KannoらJ.LipidRes.、2006、第47巻、1146~1150ページによる記載のとおり、EGTAおよびCaCl2を加えずに測定した。低濃度のCa2を使用するが、その理由は、高濃度のCa2はPKCホスファチジルセリン結合部位と相互作用し、活性化を妨げるからである。ブリオスタチン活性化の測定については、特に指定しない限り、1,2-ジアシルグリセロールを除いた。結果および考察脂肪酸誘導体のPKCアイソザイム特異性を決定するために、精製PKCで脂肪酸誘導体を5分間プレインキュベートし、放射線測定法によりPKC活性を測定した。先に例5に示したように、BR-101DCP-LAは、10μMでPKCεの有効な活性化因子であったが、他のPKCアイソフォームに及ぼす効果は比較的小さかったデータは示していない。より高い濃度では、BR-101DCP-LAは、部分的にPKCδ約1~100μMおよび活性化PKCγ50~100μMを阻害したデータは示していない。BR-111DHA-CP6、BR-114EPA-CP5、およびBR-115AA-CP4、すなわち、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、およびアラキドン酸のシクロプロパン化誘導体は、それぞれ同程度まで、精製PKCεを活性化した図7。PKCを活性化するために必要な濃度は、BR-101DCP-LAの場合よりおよそ100倍低く、より高い親和性が示唆された。シクロプロパン化リノレニルおよびリノレイルアルコールBR-104およびBR-105、エポキシステアリン酸BR-116、およびベモル酸vemolicacidメチルエステルBR-117は、PKCにはほとんどまたは全く効果を及ぼさなかった図8。シクロプロパン化ベモル酸メチルエステルBR-109は、前述の濃度1μMでPKCεを阻害した図8。ジアシルグリセロール結合部位と結合するPKC活性化因子、たとえばブリオスタチン、グニジマクリンおよびホルボールエステルは、PKC活性の一過性の活性化、続いて、長時間に及ぶ下方調節をもたらす。Nelsonら、TrendsinBiochem.Sci.、2009、第34巻、136~145ページ。このことは、培養したラット海馬細胞において確認された。ラットH19-7/IGF-IR細胞を0.04nMおよび0.2nMのブリオスタチンでインキュベートすると、30分続く2倍の活性化、続いて、24時間のうちにベースラインに戻る20の下方調節がもたらされたデータは示していない。これに対し、DCP-LAに曝露させたPKCは、少なくとも4時間にわたり高値のままであった図9。この活性化の持続は、一次ニューロンにおいてのみ観察された。ブリオスタチンはホルボール12-ミリステート13-アセテートPMAよりPKC親和性が高いとはいえEC50=1.35nM対10nM、ブリオスタチンは、PKCの下方調節という点では、PMAよりはるかに有効性は低かった。PKC活性は、8時間時点ではホルボールエステルにより強く下方調節されるが、ブリオスタチンで処理した細胞中のPKCは、ベースラインまたはその付近であるデータは示していない。この差は、daCruzeSilvaら、J.Neurochem.、2009、第108巻、319~330ページにより報告された、PdBuによりもたらされるAβの増加を説明し得る。この研究者らは、1μMのPdBuを培養COS細胞に8時間接触させて、Aβの増加を観察した。この増加は、ホルボールエステルによりPKCが下方調節されたことに起因したものであったが、そのことは、今回の結果と一致している。下方調節は、DCP-LAおよび関連化合物については測定できなかった。例7PKC活性化因子がAβの産生および分解に及ぼす効果細胞培養。細胞培養を、例6に記載したとおりに実施した。Aβ測定および細胞生存アッセイ。Aβ1-42ヒト蛍光測定ELISAキットInvitrogenをメーカーの取扱説明書に従って使用して、Aβを測定した。結果は、メーカーの取扱説明書に従い、BiotekSynergyHTマイクロプレートリーダー、AlamarBlueおよびCyQuantNFInvitrogenで測定した。結果および考察PKCε活性化がAβ産生に及ぼす効果を測定するために、ヒトAPPSwe/PSIDを形質移入した、大量のAβを産生するマウスneuro2aN2a神経芽細胞腫細胞を使用した。Petanceskaら、JNeurochem.、1996、第74巻、1878~1884ページ。この細胞を多様な濃度のPKC活性化因子ブリオスタチン、BR-101DCP-LA、およびBR-111DHA-CP6で24時間インキュベートすると、細胞内Aβ図11aと分泌されたAβ図11bの両方のレベルが著しく低下した。ブリオスタチンジアシルグリセロール結合部位と結合することによりPKCを活性化するを用いると、阻害は二相性であり、20nM以上の濃度では正味の効果をもたらさなかった。このことは、このクラスのPKC活性化因子は、高濃度で使用するとPKCを下方調節することができるということにより説明し得る。これに対し、BR-101DCP-LAおよびBR-111DHA-CP6は、PKCのホスファチジルセリン部位と結合し、最大10μM~100μMの濃度で単調に増加する阻害を示したが、より高い濃度で下方調節する証拠はなかった。PKC活性化因子によりもたらされたAβのレベル低下が、Aβ合成の阻害またはAβ分解の活性化のいずれに起因するものであったかを決定するために、BR-111DHA-CP60.01μM~10μMおよび低濃度100nMの外因性のモノマーとしてのAβ-42を、培養したSH-SY5Y細胞に接触させた。Aβのこの濃度は非常に低いことから、測定可能な毒性または細胞死を生じさせることはない。SH-SY5Y細胞は微量のAβのみを産生するので、この実験は、PKC活性化因子がAβ分解を増進する能力の有効なテストであった。24時間のうちにAβの大半は細胞により取り込まれており、培養培地中のAβの濃度は検出できなかった。0.01μM~10μMのDHA-CP6を細胞に加えると、Aβの細胞レベルは45~63低下し、このことから、PKCε活性化因子は外因性のAβの分解速度を増加させたことが示された図12。DHA-CP6、ブリオスタチン、およびDCP-LAは、alamarBlueおよびCyQuant染色により測定したとおり図15aおよび図15b細胞生存にも増殖にも効果を及ぼさなかったが、このことから、Aβ産生量の減少は、細胞増殖、または、細胞生存の変化の結果生じたものではないことが示された。例8PKC活性化因子がTACE活性に及ぼす効果TACEアッセイ。TACEは、5μlの細胞ホモジネート、3μlの緩衝液50mMのトリス-HCl7.425mMのNaCl4グリセロール、および1μlの100μMTACE基質Aβz-LAQAVRSSSR-DPaCalbiochemを、1.5mlポリプロピレン遠心管中で37°Cにて20分間インキュベートすることにより測定した。Jinら、Anal.Biochem.、2002、第302巻、269~275ページ。4°Cに冷却することにより反応を停止させた。試料を1mlに希釈し、SpexFluorolog2分光蛍光光度計で蛍光を速やかに測定したex=320nm、em=420nm。結果および考察先行研究者らは、PKC活性化因子、たとえばホルボール12-ミリステート13-アセテートはTACE活性を大きく増加させ、その増加はsAPPαの増加およびAβの減少と相関し、このことから、TACEとBACE1とはAPP基質の利用能について競合すること、および、PKC活性化因子はこの競合をTACEに有利に転じさせることが示唆されると報告した。Buxbaumら、JBiol.Chem.、1998、第273巻、27765~27767ページ;Etcheberrigarayら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、2006、第103巻、8215~8220ページ。しかし、これらの先行試験のうち多くは、線維芽細胞、およびニューロン以外の他の細胞型において実施されたものであり、こうした細胞型は、ニューロンとは異なる形でPKC活性化因子に応答するようである。たとえば、Etcheberrigarayらは、10pM~100pMのブリオスタチンによりヒト線維芽細胞においてPKCを活性化させると、α-セクレターゼ活性の初速度がそれぞれ16倍および132倍増加することを見出した。しかし、ヒトSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞、N2aマウス神経芽細胞腫細胞図13a、およびラット海馬由来の一次ニューロン図13bおよび図13cにおいては、PKC活性化因子ブリオスタチン、BR-101DCP-LA、および/またはBR-111DHA-CP6のみが、活性をわずかに増加させた。このことから、PKC活性化因子によるニューロンにおけるAβレベルの低下は、TACEの活性化以外に何らかの他の機序が原因で生じるに違いないということが示唆される。例9PKC活性化因子がエンドセリン変換酵素ECE活性に及ぼす効果ECEアッセイ。SH-S757神経芽細胞腫細胞をブリオスタチン0.27nM、BR-101DCP-LA1μM、およびBR-111DHA-CP61μMでインキュベートした。エンドセリン変換酵素ECEを、JohnsonおよびAhnAnal.Biochem.、2000、第286巻、112~118ページの方法を用いた蛍光測定法により測定した。細胞ホモジネート20μlの試料を50mMのMES-KOH、pH6.0、0.01C12E10ポリオキシエチレン-10-ラウリルエーテル、および15μMのMcaBK27-メトキシクマリン-4-アセチル[Ala7-2,4-ジニトロフェニルLys9]-ブラジキニントリフルオロ酢酸塩Sigma-Aldrich中でインキュベートした。37°Cで60分後、0.5までトリフルオロ酢酸を加えることにより反応をクエンチした。試料を水で1.4mlに希釈し、蛍光をex=334nm、em=398nmで測定した。結果および考察いくつかの酵素、たとえばインスリン分解酵素インスリシン、ネプリリシン、およびECEにより、Aβをinvivoで分解できる。PKCεの過剰発現は、ECEを活性化すると報告されている。Choiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、2006、第103巻、8215~8220ページ。そこで、脂肪酸誘導体PKC活性化因子がECEに及ぼす効果を調べた。ブリオスタチン、BR-101DCP-LA、およびBR-111DHA-CP6は、すべて、ECE活性の持続的な増加をもたらした図14。ECEはジアシルグリセロール結合C1ドメインを有さないので、このことから、ブリオスタチンによる活性化は、ECEの直接活性化に起因するのではなく、PKCによるECEまたはいくつかのECE活性化中間体のリン酸化の結果生じたに違いないことが示唆される。この結果から、PKC活性化因子による間接的なECEの活性化は、患者のAβのレベルを低下させる有用な手段である可能性があることも示唆される。PKCεを特異的に活性化する化合物の利点は、そのような化合物は、ホルボールエステルおよび類似の1,2-ジアシルグリセロールDAG類似体ほどには下方調節をもたらさないと考えられることである。DAGベースの活性化因子に対するPKCの二相性の応答は、PKC活性化因子が、ある時点ではAβレベルを低下させ、別の時点では上昇させる場合もあることを意味する。DaCruzeSilvaら、J.Neurochem.、2009、第108巻、319~330ページ。意図した効果と逆の効果を回避するには、慎重な投与と患者のモニターとが必要であろう。化合物がPKCたとえば、本明細書において開示する脂肪酸誘導体を下方調節する能力は相対的にないことから、そのような意図しない効果が回避される。例10脳卒中の全虚血モデルラットオス、Wistar、200~225gをランダムに6群各8匹に分け、1週間飼育した後で実験を行った。脳血流および酸素供給を一過性または永続性に制限すると、結果として虚血性脳卒中となる。血管性の記憶障害を誘導するために用いる全虚血モデルは、2本の血管の閉塞と短期間の全身低酸素状態とを組み合わせたものであった。両側総頸動脈の結紮を麻酔下ペントバルビタール、60mg/kg、腹腔内で実施した。外科手術から1週間の回復期間の後、ラットを14分間の低酸素状態に曝露させた5酸素、ガラス瓶中。対照ラット偽手術対照およびビヒクル対照に同じ切開術を施して両方の総頸動脈を切り離し、14分間大気にさらしたガラス瓶中。体温は、外科的処置の間、また、動物が完全に回復するまで、加熱光源を用いて37~37.5°Cに保った。例11ブリオスタチンおよびMCDA治療ブリオスタチン-1を20μg/m2で投与した尾静脈内、2回投与/週で10回投与が、開始は、低酸素事象の終了の24時間後とした。4-メチルカテコール二酢酸MCDA、潜在的なNGFおよびBDNFブースターを、別々のラット群において1.0mg/kgで投与した腹腔内、同じ5週間にわたり毎日。最後のブリオスタチン-1、MCDA、またはビヒクル投与の1週間後、ラットに、水迷路の空間学習課題1日当たり2回の訓練試行を4日間、続いてプローブテストの訓練を行った。プローブテスト後に、視認可能プラットフォームテストvisibleplatformtestを行った。結果を図16に示す。全体的に見ると、6群間で有意な学習差があった図16、F5,383=27.480、p<0.001、ANOVA。詳細な分析から、虚血群は空間迷路課題を学習しないことが明らかになったが、その理由は以下のとおりである:試行を通じて逃避潜時に有意差はなくF7,63=0.102、P>0.05、対照ラットと比較して学習が有意に障害された群間差:F1,127=79.751、p<0.001が、他の5群のラットはすべて、課題を学習した試行を通じて、MCDA治療を行った虚血ラット:p<0.05、他の4群:p<0.001。ブリオスタチン-1療法は、成績を大幅に改善し虚血群ブリオスタチン-1治療あり対虚血ラット:F1,127=72.782、p<0.001、対照ラットと統計的に差がない成績レベルとなった虚血群ブリオスタチン-1治療あり対対照ラット:F1,127=0.001、p>0.05。MCDA治療も、虚血ラットの学習を改善した虚血ラットNCDA治療あり対虚血ラット:F1,127=15.584、p<0.001が、虚血ラットMCDA治療ありと対照ラットとの間の差は、5週間の治療後も有意なままであった虚血ラットNCDA治療あり対対照ラット:F1,127=16.618、p<0.001。対照群とブリオスタチン-1のみの群との間ブリオスタチン-1対対照:F1,127=0.010、p>0.05、および、対照群とMCDAのみの群との間MCDA対対照:F1,127=0.272、p>0.05には、差がなかった。虚血群のラットは、プローブテストにおいて標的嗜好性targetpreferenceを示さなかったF3,31=0.096、p>0.05が、他の5群のラットはすべて、プローブテストにおいて標的象限嗜好性targetquadrantpreferenceを示したすべてp<0.005。標的象限率標的象限の距離を、プローブテスト中の非標的象限の距離の平均値で割る。図17を用いてデータを分析した。標的象限率には群間で有意差があったF5,47=5.081、p<0.001。詳細な分析から、対照と虚血ラットとの間F1,15=9.451、p<0.01、虚血ラットと虚血ラットブリオスタチン-1治療ありとの間F1,15=10.328、p<0.01、および、虚血ラットMCDA治療ありと虚血ラットとの間F1,15=5.623、p<0.05では群間差が明らかになったが、対照と虚血ラットブリオスタチン-1治療ありとの間F1,15=0.013、p>0.05、虚血群MCDA治療ありと対照群との間F1,15=2.997、p>0.05、対照とブリオスタチン-1のみのラットとの間F1,15=0.064、p>0.05、および、対照とMCDAのみのラットとの間F1,15=0.0392、p>0.05では差がなかった。プローブテスト後に決定された視認可能プラットフォームテストでは、群間に有意差はないF5,47=0.115、p>0.05ことが明らかになり、このことから、ラットの感覚運動に有意な群間差はないことが示された。例12ブリオスタチン治療オスのWistarラット225~250gにおいて全脳虚血/低酸素症を誘導したが、その際の手段は、両側総頸動脈を永続的に閉塞させることと、約14分間の低酸素状態約5とを組み合わせることによった。ブリオスタチン-1を15μg/m2で投与した尾静脈経由、2回投与/週で10回投与が、開始は、虚血/低酸素事象の終了の24時間後とした。空間学習2試行/日を4日間および記憶1分のプローブテスト、最終試行後24時間課題を、最終投与の9日後に実施した。全体として、群間F3,255=31.856、p<0.001および群×試行間F21,255=1.648、p<0.05で有意差があった。全脳虚血は、空間学習を障害した虚血群対偽手術群:F1,127=79.751、p>0.001。学習障害はブリオスタチン-1治療により回復したブリオスタチン-1虚血群対虚血群:F1,127=50.233、p<0.001が、ブリオスタチン-1単独は、学習に影響しなかったブリオスタチン-1群対偽手術群:F1,127=2.258、p>0.05、最終投与の9日後。記憶保持テストにおいて、偽手術を受けたラットは、標的象限嗜好性を示した。そのような良好な記憶保持は虚血ラットにおいては観察されず、このことから、空間記憶の障害が示される。ブリオスタチン-1療法は、虚血後の記憶保持を、偽手術を受けたラットのレベルまで有効に回復させた。ブリオスタチン-1単独では、標的象限嗜好性において、偽手術を受けた対照ラットの結果と比較して有意な効果がなかった。象限率では群間で有意差があった標的象限遊泳距離targetquadrantswimdistanceを非標的象限における平均遊泳距離で割ることにより算出。F3,31=6.181、p<0.005。詳細な分析から、虚血ラットと偽手術を受けた対照ラットとの間F1,15=9.451、p<0.001、虚血ラットと虚血ラットブリオスタチン-1治療ありとの間F1,15=10.328、p<0.001の有意差が明らかになったが、虚血ラットブリオスタチン-1治療ありと偽手術を受けた対照との間F1,15=0.0131、p>0.05、および、偽手術を受けた対照ラットとブリオスタチン-1単独ラットとの間F1,15=0.161、p>0.05に有意差はなかった。これらの結果から、脳虚血/低酸素症が空間学習および記憶の障害をもたらしたことが実証される虚血事象の約7週間後にテスト。この障害は、時間域の間に適切な介入が行われなければ継続し、回復不可能であったが、長期的なブリオスタチン-1治療により、治療を虚血事象後24時間という広い治療可能時間域で開始した場合であっても回復した。"