"Klothoタンパク質遺伝子、配列番号1,2のKlothoタンパク質遺伝子増幅用プライマー、配列番号3のプローブ及び皮膚細胞から構成され、前記皮膚細胞でKlothoタンパク質の発現量を増加させる物質をスクリーニングすることにより、皮膚活性物質を探索する探索キット。前記皮膚活性物質は、保湿物質、抗老化物質又は美白物質であることを特徴とする請求項1に記載の探索キット。前記皮膚細胞は、ヒト角質形成細胞、線維芽細胞又はメラニン形成細胞であることを特徴とする請求項1に記載の探索キット。請求項1ないし3のいずれか一項に記載の探索キットを利用して、皮膚細胞に候補物質を処理した後、Klothoタンパク質の発現有無を確認するステップと、Klothoタンパク質の発現を増加させる物質を分離及び精製するステップと、を経て皮膚活性物質を探索する方法。これにより、本発明者は、皮膚細胞でKlothoタンパク質の発現を増加させることができるキットを製作し、これを利用して角質形成細胞、線維芽細胞及びメラニン形成細胞などの皮膚細胞でKlothoタンパク質の発現を確認することにより、抗老化物質及び美白物質などの皮膚活性物質を探索することができることを見つけて、本発明を完成するに至った。したがって、本発明の目的は、皮膚細胞でKlotho遺伝子発現の有無により、皮膚活性物質をスクリーニングするための探索キット及びこれを利用して皮膚活性物質を探索する方法を提供することである。上記した目的を達成するために、本発明では、Klothoタンパク質遺伝子、配列番号1,2のKlothoタンパク質遺伝子増幅用プライマー、配列番号3のプローブ及び皮膚細胞から構成され、前記皮膚細胞でKlothoタンパク質の発現量を増加させる物質をスクリーニングすることにより、皮膚活性物質を探索する探索キットを提供する。また、本発明では、前記探索キットを利用して皮膚活性物質を探索する方法を提供する。本発明による皮膚活性物質探索キットは、皮膚細胞でKlotho遺伝子の発現有無により、抗老化物質、美白物質、及び保湿物質のような皮膚活性物質を迅速で且つ簡便にスクリーニングすることができる。本発明は、皮膚細胞でKlothoタンパク質の発現量を探索することができる方法に関し、これを通じて皮膚細胞で長寿遺伝子であるKlothoタンパク質の発現を誘導することができる物質をスクリーニングすることにより、皮膚活性物質を探索することができる。前記皮膚活性物質は、皮膚シワや弾力を改善させるか又は荒れた皮膚を改善させる抗老化物質、皮膚の色を明るくするか、しみ、そばかす、皮膚のくすみ及び太陽光線による皮膚の日焼けなどの皮膚色素沈着の現象を改善させる美白物質並びに保湿物質を含んでもよい。皮膚細胞でKlothoタンパク質の発現量を探索することができる本発明の探索キットは、Klothoタンパク質遺伝子、配列番号1,2のKlothoタンパク質増幅用プライマー、配列番号3のプローブ表1を参照及び皮膚細胞から構成され、前記皮膚細胞でKlothoタンパク質の発現量を増加させる物質をスクリーニングすることにより、抗老化物質を探索することができる。本発明の一実施例で前記皮膚細胞は、ヒト角質形成細胞NHK:normalhumankeratinocytes、線維芽細胞NHF:normalhumanfibroblasts、またはメラニン形成細胞NHM:normalhumanmelanocyteであってもよいが、これに限定されるものではない。また、本発明は、前記探索キットを利用して、皮膚細胞に候補物質を処理した後、Klothoタンパク質の発現有無を確認するステップと、Klothoタンパク質の発現を増加させる物質を分離及び精製するステップとを経て、皮膚活性物質を探索する方法に関する。本発明の一実施例では、前記探索キットを利用して抗老化物質として知られているレチノイン酸とレチノールがKlothoタンパク質の発現を増加させることを確認し、本発明による探索方法が、未だ知られていない抗老化物質及び皮膚活性物質のスクリーニングに適したものであることを確認した。以下、本発明の内容を実施例及び試験例を通じてさらに具体的に説明する。これらの実施例は、本発明の内容を理解するために提示されたものに過ぎず、本発明の権利範囲がこれらの実施例及び試験例に限定されるものではなく、当業界で通常的に周知された変形、置き換え及び挿入などを遂行することができ、これに関するものも本発明の範囲に含まれる。[試験例1]皮膚細胞でKlothoの発現有無皮膚細胞でKlothoタンパク質が発現されるか否かを調べるために、Klotho遺伝子NCBI寄託番号:NM_004795を増幅させることができる配列番号1,2プライマーを製作した後、前記プライマー対と配列番号3のプローブTaqManTMfluorogenicprobeを利用して角質形成細胞NHK、線維芽細胞NHF、NHM-promoblack{NormalHumanEpidermalMelanocytesNHEMjuvenileforeskin、黒人由来のメラニン形成細胞、Promocell}、NHM-DPNHM-darkpigment;黒人由来のメラニン形成細胞、Invitrogen及びNHM-MPNHM-moderatepigment;東洋人由来のメラニン形成細胞、InvitrogenのcDNAでKlothomRNAを検出することができるか否かをRT-PCRで観察した。このとき、PCR反応条件は、94°Cで30秒間変性、55°Cで30秒間アニーリング、及び72°Cで60秒間拡張するサイクルを35回繰り返して遂行した。陽性対照群として既存にKlotho遺伝子が発現されると知られているヒト胚芽腎臓細胞であるHEK293humanembryonickidney細胞のcDNAを利用して、その結果を図1a及び図1bに示した。図1a及び図1bの結果において、本発明で使用した角質形成細胞、線維芽細胞及びメラニン形成細胞でKlotho遺伝子が発現されることを確認した。また、KlothomRNAが各細胞で発現された量をquantitativereal-timePCRで確認した結果を図2に示した。[試験例2]レチノイン酸RA及びレチノールROLが処理された角質形成細胞でKlothomRNAの発現量の調査抗老化物質としてよく知られているレチノイン酸とレチノールが角質形成細胞でKlothoの発現に及ぼす影響を調べるために、前記試験例1と同一条件でquantitativerealtimePCRを遂行し、前記レチノイン酸0.1μM及び1μMと、レチノール1μM及び10μMとをそれぞれ処理した後、2日目及び8日目にKlothoタンパク質の発現量を調査し、その結果を図3に示した。図3の結果において、レチノイン酸とレチノールを処理した8日目にKlothoタンパク質の発現量が格段に増加することを確認した。[試験例3]ヒト新生児の上皮角質形成細胞HEKでKlotho遺伝子ノックダウンknockdownヒト新生児の上皮角質形成細胞HEK;Lonza社、NHEK-Neo-NeonatalNormalHumanEpidermalKeratinocytes、Pooledを6-wellに培地KBM-gold、Lonza社に1×105ずつ分注して、37°Cで24時間の間に培養して培地を捨て、OPTI-MEM培地GIBCO社に交換した後、Klotho遺伝子に相補的配列を有するsiRNAsmallinterferingRNA;Dharmacon社、ON-TARGETplus100nMと、トランスフェクション試薬RNAiMAX、invitrogen社10μlとを混合して、OPTI-MEM培地GIBCO社で20分間37°Cで培養したことを添加し、37°Cで6時間培養し、DMEM培地で37°Cに4日間維持させた。対照群としては、何もターゲッティングしないsiRNAを処理したHEK細胞図4のscと、siRNAを入れずにトランスフェクション試薬RNAiMAXのみを処理したHEK細胞図4のVCとを使用した。Klotho遺伝子ノックダウンの有無を確認するために、前記試験例1と同一条件でquantitativerealtimePCRを遂行した結果を図4に示した。図4の結果において、siRNAとトランスフェクション試薬を添加した場合に、Klotho遺伝子発現が顕著に減少することを確認することができる。[試験例4]Klotho遺伝子をノックダウンknockdownさせたヒト新生児の上皮角質形成細胞HEKでMMP-9の発現量増加コラーゲンを分解して老化を起こす因子として知られているMMP-9にKlothoタンパク質が及ぼす影響を調べるために、Klotho遺伝子をノックダウンさせたヒト新生児の上皮角質形成細胞Humanneonatalepidermalkeratinocyte、HEKでMMP-9の発現量の変化をRT-PCRで観察した。ヒト新生児の上皮角質形成細胞HEK;Lonza社のNHEK-Neo-NeonatalNormalHumanEpidermalKeratinocytes、Pooledを6-wellに培地KBM-gold、Lonza社に1×105ずつ分注して、37°Cで24時間の間に培養して培地を捨て、OPTI-MEM培地GIBCO社に交換した後、Klotho遺伝子に相補的配列を有するsiRNAsmallinterferingRNA;Dharmacon社、ON-TARGETplus100nMと、トランスフェクション試薬RNAiMAX、invitrogen社10μlとを混合して、OPTI-MEM培地GIBCO社で20分間37°Cで培養したことを添加し、37°Cで6時間培養してDMEM培地で37°Cに4日間維持させた。対照群としては、何もターゲッティングしないsiRNAを処理したHEK細胞図5のHEKnscと、siRNAを入れずにトランスフェクション試薬RNAiMAXのみを処理したHEK細胞図5のHEKnVCとを使用した。培養されたHEK細胞からRNeasyminikitqiagen社を利用してRNAを抽出し、SuperscriptIIIkitinvitrogen社でRT-PCRを遂行してcDNAを合成した。MMP-9に対するプローブ{TaqMan登録商標GeneExpressionAssays}を使用してquantitiativereal-timePCRを遂行し、MMP-9mRNAの発現様相を観察して、結果を図5に示した。図5の結果において、Klothoの発現量を下げたHEKでMMP-9の発現量が増加することが分かり、これによって下げられたKlothoの発現量がMMP-9の活性を増加させて皮膚老化を促進させることが分かる。[試験例5]再組合Klothoタンパク質を処理したヒト新生児の上皮角質形成細胞HEKでMMP-9の活性減少ヒト新生児の上皮角質形成細胞HEK;Lonza、NHEK-Neo-NeonatalNormalHumanEpidermalKeratinocytes、Pooledを6-wellに培地KBM-goldに5×104ずつ分注して、37°Cで24時間の間に培養した後、再組合Klothoタンパク質RDsystems、RecombinantHumanKlotho1μg/mlを処理して8日間培養した。対照群は、Klothoタンパク質を処理しないHEKを使用した。培養されたHEK培養液をゼラチンゲルにローディングし、zymographyを通じて結果を図6に示した。図6の結果において、再組合Klothoタンパク質を供給したHEKで対照群に比べてMMP-9の活性が減少したことを確認することができる。これを通じてKlothoタンパク質が供給され、MMP-9の活性が減少することによってゼラチン分解が減少され、基底膜の維持效果を有することが分かる。[試験例6]再組合Klothoタンパク質を処理したヒト新生児の上皮角質形成細胞HEKでHAS2mRNAの発現増加皮膚保湿因子として知られているヒアルロン酸の合成酵素であるヒアルロン酸合成酵素hyaluronicacidsynthase2、HAS2の発現に対するKlothoタンパク質の影響を調べるために、ヒト新生児の上皮角質形成細胞Lonza、NHEK-Neo-NeonatalNormalHumanEpidermalKeratinocytes、Pooledに再組合Klothoタンパク質を処理して、HASmRNAの発現様相を観察した。ヒト新生児の角質形成細胞HEKLonza、NHEK-Neo-NeonatalNormalHumanEpidermalKeratinocytes、Pooledを6-well培地KBM-goldに2×105ずつ3well、5×104ずつ3wellで分注して、37°Cで24時間の間に培養した後、再組合Klothoタンパク質を表2のようにそれぞれ1μg/ml、0.5μg/ml濃度で処理し、2日間、8日間37°Cで培養した。培養されたHEKからRNeasyminikitqiagen社を利用してRNAを抽出し、SuperscriptIIIkitinvitrogen社でRT-PCRを遂行してcDNAを合成した。HAS2に対するプローブ{TaqMan登録商標GeneExpressionAssays}を使用してquantitiativereal-timePCRを遂行し、HAS2mRNAの発現様相を観察し、結果を図7に示した。図7の結果において、2日目の無処理対照群である参考例1よりも8日目の無処理対照群である参考例4の場合に、HAS2mRNAの発現が減少され、8日目の再組合Klothoタンパク質処理群である参考例5で、2日目の無処理対照群である参考例1よりもHAS2mRNAの発現が顕著に増加したことを確認することができる。これを通じて参考例4が参考例1よりもHAS2mRNAの発現が減少されることは、HEKが分化されて角質化される過程で起こる現象であると思われ、再組合Klothoタンパク質処理によって8日目に減少されたHAS2を回復させることから見て、Klothoタンパク質は、表皮層の保湿力を回復させる役目をすることが分かる。[試験例7]Klotho遺伝子をノックダウンknockdownさせたヒト新生児の真皮線維芽細胞HDFでp21の発現量増加老化が進行されるほど発現量が増加されると知られているp21にKlothoタンパク質が及ぼす影響を調べるために、Klotho遺伝子をノックダウンさせたヒト新生児の真皮線維芽細胞Humanneonataldermalfibroblast、HDFでp21の発現量の変化をRT-PCRで観察した。ヒト新生児の真皮線維芽細胞Lonza社、NHDF-Neo-NeonatalHumanDermalFibroblastsを60mmディッシュに培地DMEMを利用して2×105ずつ分注し、37°Cで24時間の間に培養して培地を捨て、OPTI-MEM培地GIBCO社に移した後、Klotho遺伝子に相補的配列を有するsiRNAsmallinterferingRNA;Dharmacon社、ON-TARGETplus100nMと、トランスフェクション試薬RNAiMAX、invitrogen社10μlとを混合して、OPTI-MEM培地GIBCO社で20分間37°Cで培養したことを添加し、37°Cで6時間培養し、DMEM培地で37°Cに4日間維持させた。対照群としては、何もターゲッティングしないsiRNAを処理したHDF細胞図8のHDFnscと、siRNAを入れずにトランスフェクション試薬RNAiMAXのみを処理したHDF細胞図8のHEKnVCとを使用した。培養されたHDFからRNeasyminikitqiagen社を利用してRNAを抽出し、SuperscriptIIIkitinvitrogen社でRT-PCRを遂行してcDNAを合成した。老化マーカーであるp21に対するプローブ{TaqMan登録商標GeneExpressionAssays}を使用してquantitiativereal-timePCRを遂行し、p21mRNAの発現様相を観察し、結果を図8に示した。図8の結果において、対照群に比べてKlotho遺伝子をノックダウンさせた場合に、p21の発現量が増加することを確認した。これを通じてKlothoが皮膚真皮線維芽細胞の老化を抑制する役目を遂行することが分かる。"