"苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、それにより対象における閉塞性肺疾患を処置することを含む、対象における閉塞性肺疾患又は状態を処置する方法。閉塞性肺疾患又は状態が、ぜん息、慢性閉塞性肺疾患COPD、気腫又は気管支炎である、請求項1に記載の方法。苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項1に記載の方法。医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項1に記載の方法。対象がヒトである、請求項1に記載の方法。苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、それにより対象におけるぜん息を処置することを含む、対象におけるぜん息を処置する方法。苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項6に記載の方法。医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項6に記載の方法。対象がヒトである、請求項6に記載の方法。苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、それにより対象におけるCOPDを処置することを含む、対象におけるCOPDを処置する方法。苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項10に記載の方法。医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項10に記載の方法。対象がヒトである、請求項10に記載の方法。苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、それにより対象における気管支炎を処置することを含む、対象における気管支炎を処置する方法。苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項14に記載の方法。医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項14に記載の方法。対象がヒトである、請求項14に記載の方法。苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気管支拡張を必要とする対象に投与し、それにより対象における気管支拡張を誘発することを含む、対象における気管支拡張を誘導する方法。苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項18に記載の方法。医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項18に記載の方法。対象がヒトである、請求項18に記載の方法。苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気道平滑筋ASM弛緩を必要とする対象に投与し、それにより対象における気道平滑筋を弛緩させることを含む、対象における気道平滑筋を弛緩させる方法。苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項22に記載の方法。医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項22に記載の方法。対象がヒトである、請求項22に記載の方法。対象における気管支収縮又は気管支痙攣を処置又は予防する方法であって、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、該処置又は予防を必要とする対象に投与し、それにより気管支収縮又は気管支痙攣を処置又は予防することを含む、上記方法。苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項26に記載の方法。医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項26に記載の方法。対象がヒトである、請求項26に記載の方法。気道平滑筋細胞を、苦味物質受容体に結合する試験化合物と接触させる工程、及び試験化合物が気道平滑筋細胞を弛緩させるか否かを決定する工程を含み、ここで平滑筋細胞を弛緩させる化合物は気道平滑筋を弛緩させるための化合物として同定される、気道平滑筋を弛緩させるための化合物を同定する方法。気道平滑筋細胞の弛緩が、気道平滑筋細胞における苦味物質受容体仲介シグナル伝達の増加を検出することにより検出される、請求項30に記載の方法。苦味物質受容体仲介シグナル伝達の増加が、気道平滑筋細胞における細胞内カルシウム放出の増加又は細胞内IP3の増加を検出することにより検出される、請求項31に記載の方法。苦味受容体の調節剤を同定するための方法であって:a苦味受容体を天然で発現する気道細胞を試験化合物と接触させる工程、及びb苦味受容体の活性を測定する工程を含み、ここで苦味受容体の活性を増加させる化合物は苦味受容体のアゴニストであり、そして苦味受容体の活性を減少させる化合物は苦味受容体のアンタゴニストである、上記方法。苦味物質受容体の活性の変化が、試験化合物と接触していない気道平滑筋細胞と比較した、気道平滑筋細胞における細胞内カルシウム放出の変化又は細胞内IP3の変化により検出される、請求項33に記載の方法。苦味受容体のアンタゴニストである化合物を同定する方法であって:a苦味受容体を天然で発現する気道細胞を、試験化合物と、そして苦味物質と接触させる工程、及びb苦味受容体の活性を測定する工程を含み、ここで苦味物質と接触したが試験化合物とは接触していない細胞における苦味受容体の活性と比較して、苦味受容体の活性を阻害する試験化合物を苦味受容体のアンタゴニストと同定する、上記方法。苦味受容体の活性が、細胞内カルシウム放出の変化又は細胞内IP3の変化を測定することにより測定される、請求項35に記載の方法。試験化合物が、苦味物質の前に、後に、又は苦味物質と同時に加えられる、請求項35に記載の方法。気道細胞が気道平滑筋細胞又は非線毛気道上皮細胞である、請求項33又は35に記載の方法。ぜん息及びCOPDのような閉塞性気道疾患の処置におけるさらなる治療選択肢に対する満たされていない必要性が存在する。特定のGq-共役経路を拮抗し、それにより気管支痙攣を減少させる可能性のある薬物の改善においていくらかの進展があったが、β-アゴニストが依然として唯一の実用的な直接的気管支拡張薬である。ぜん息及びCOPDのような閉塞性肺疾患を処置するための新しい手段の発見及び開発が緊急に必要とされている。要旨第一の局面において、対象subjectにおける閉塞性肺疾患又は状態を処置する方法が本明細書において提供され、この方法は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む。特定の局面において、閉塞性肺疾患又は状態は、例えばぜん息、慢性閉塞性肺疾患COPD、気腫又は気管支炎であり得る。第二の局面において、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気管支拡張を必要とする対象に投与することを含む、対象における気管支拡張を誘発する方法が本発明において提供される。第三の局面において、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気道平滑筋ASM弛緩を必要とする対象に投与することを含む、対象における気道平滑筋を弛緩させる方法が本明細書において提供される。第四の局面において、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気管支収縮又は気管支痙攣の処置又は予防を必要とする対象に投与することを含む、気管支収縮又は気管支痙攣を対象における処置又は予防する方法が本明細書において提供される。上記の方法の特定の局面において、苦味物質は、アリストコール酸aristocholicacid、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンのような化合物であり得る。上記の方法のさらに他の局面において、医薬組成物は吸入剤又は他の送達方法、例えば経口送達の形態であり得、そして対象はヒトでも他の動物でもよい。第五の局面において、気道平滑筋細胞を、苦味物質受容体に結合する試験化合物と接触させること、及び試験化合物が気道平滑筋細胞を弛緩させるか否かを決定することを含み、ここで平滑筋細胞を弛緩させる化合物は気道平滑筋を弛緩させるための化合物として同定される、気道平滑筋を弛緩させるための化合物を同定する方法が本明細書において提供される。例えば、気道平滑筋細胞の弛緩は、気道平滑筋細胞における苦味物質受容体仲介シグナル伝達の増加を、例えば気道平滑筋細胞における細胞内カルシウム放出の増加又は細胞内IP3の増加を検出することにより検出され得る。第六の局面において、苦味物質受容体の調節剤を同定するための方法が本明細書において提供され、この方法は、苦味受容体を天然で発現する気道細胞を試験化合物と接触させること、及び苦味受容体の活性を測定することを含み、ここで苦味受容体の活性を増加させる化合物は苦味受容体のアゴニストであり、そして苦味受容体の活性を減少させる化合物は苦味受容体のアンタゴニストである。例えば、苦味物質受容体の活性の変化は、試験化合物と接触していない気道平滑筋細胞と比較して、気道平滑筋細胞における細胞内カルシウム放出の変化又は細胞内IP3の変化により検出される。第七の局面において、苦味受容体のアンタゴニストである化合物を同定する方法が本明細書において提供され、この方法は、苦味受容体を天然で発現する気道細胞を、試験化合物と、かつ苦味物質と接触させること、及び苦味受容体の活性を測定することを含み、ここで苦味物質と接触したが試験化合物とは接触していない細胞における苦味受容体の活性と比較して、苦味受容体の活性を阻害する試験化合物を苦味受容体のアンタゴニストと同定する。例えば、苦味受容体の活性は、細胞内カルシウム放出の変化又は細胞内IP3の変化を測定することにより測定される。試験化合物は、苦味物質の前に、後に、又は苦味物質と同時に加えられ得る。本明細書において記載されるスクリーニング方法において、気道細胞は気道平滑筋細胞でも非線毛気道上皮細胞でもよい。詳細な説明例えばぜん息及びCOPDのような閉塞性肺疾患を処置するための、気道拡張を増加させる新規な方法が本明細書において提供される。本発明の処置方法は、苦味受容体が単離されたヒト気道平滑筋ASMにおいて発現されるという予期しない発見に基づく。舌上の苦味の受容体は植物ベースの毒素を回避するために発達したと考えられている910。これらの受容体はGタンパク質共役受容体GPCRであり、少なくとも25の受容体サブタイプからなり、通常は他の苦味受容体と重複するアゴニストのレパートリーをそれぞれが認識して、重複した広く同調した回避及び拒絶のネットワークを作っている91113。ASM上の苦味受容体の発見により、本発明者らは、これらの気道受容体における環境性吸入抗原の作用が痙縮及び気管支収縮をもたらすことにより、特定の気管支痙攣性障害、例えば職業性ぜん息14が引き起こされるのかもしれないという仮説を最初に立てることとなった。この考えは、苦味受容体が舌の分化した味覚細胞における[Ca2]iの増加と対になっており、かつこのシグナルがASM細胞におけるヒスタミン、アセチルコリン及びブラジキニンのような公知の気管支収縮性GPCRでも見られる2という事実に基づくものであった。本明細書に開示される様々なアプローチを使用して、苦味物質がASM細胞において[Ca2]iを増加させることも見出された。しかし逆説的に、本発明者らは、苦味受容体アゴニストが気管支拡張剤であり、いずれの公知の治療剤よりも有意に高い有効性を有するということを発見した。これらの受容体は、ホスホリパーゼCPLCの受容体生成Gβγ活性化、及び細胞表面Kチャネルを開いて膜過分極を生じる分割された一過性[Ca2]i上昇を含む新規な機構によりASMにおける弛緩応答を変換する。以下の実施例において詳細に考察されるこれらの知見は、本明細書において特許請求される本発明の基礎である。本発明の様々な局面において、苦味物質が気道平滑筋の弛緩及び気管支拡張を誘発するということ、並びに苦味物質の対象への投与が気管支収縮に関連する状態及び疾患を処置するために使用され得るという新しい知見に基づく処置方法が提供される。従って、一局面において本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、対象における閉塞性肺疾患又は状態を処置する方法を提供する。第二の局面において、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気管支拡張を必要とする対象に投与することを含む、対象における気管支拡張を誘発する方法を提供する。第三の局面において、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気道平滑筋ASM弛緩を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるASMを弛緩させる方法を提供する。第四の局面において、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気管支収縮又は気管支痙攣の処置又は予防を必要とする対象に投与することを含む、対象における気管支収縮又は気管支痙攣を処置又は予防する方法を提供する。関連する局面において、本発明は、気道平滑筋を弛緩させるための化合物を同定する方法を提供し、この方法は、気道平滑筋細胞を、苦味物質受容体に結合する試験化合物と接触させること、及び試験化合物が気道平滑筋細胞を弛緩させるか否かを決定することを含み、ここで平滑筋細胞を弛緩させる化合物は気道平滑筋を弛緩させるための化合物として同定される。上記の本発明の局面の各々において、苦味物質BTのアイデンティティは方法の成功に決定的ではないが、特定のBTが特定の方法において、かつ特定の状態及び疾患の処置において、他のBTよりも有効だろうということは想定される。非毒性であり、苦味受容体を活性化する多くの公知の合成薬剤がある10。そして好ましい治療プロフィールを有し得る多くの植物由来苦味物質及びそれらの代謝産物が存在する10。苦味受容体、苦味物質受容体及び同類のものは、当該分野で知られているように、かつ/又は例えばChandrashekaretal.,Cell100:703-7112000;Adleretal.,Cell100:693-7022000;Chandrashekaretal.Nature444:288-2942006;若しくはConteaetal.,Cytogenet.GenomeRes.98:45-532002において記載されるように、T2R又はTAS2R受容体を意味する。苦味物質は、合成でも天然に存在するものでも、気道平滑筋細胞の表面上に存在する苦味物質受容体に結合し、そしてそのような結合を介して、気道平滑筋細胞を弛緩させる化合物を意味し;このような化合物はいずれも、本明細書に記載される方法における使用のための苦味物質として考慮される。本発明の医薬組成物及び方法において使用され得る苦味物質の例としては、限定されないが、以下の1つ又はそれ以上が挙げられる:アリストコール酸aristocholicacid、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビン。このような苦味物質は1つ又はそれ以上の苦味受容体のアゴニストであり、そしてこのような上記suchsuchアゴニストのそれらの同族苦味受容体への結合は、本明細書に記載されるような周知の方法により検出され得る。苦味受容体アンタゴニストは、アゴニストの苦味受容体への結合を阻害し、かつ/又はそうでなければ苦味受容体アゴニストのそれらの同族受容体への結合により開始される生化学的シグナル伝達カスケードを阻害する。結合の減少及び/又は苦味受容体シグナル伝達の阻害は部分的でも完全でもよい。従って苦味アンタゴニストは、食料品、医薬品、及び他の経口摂取製品における苦味を部分的に又は完全に減少させ得るか又はマスクし得る。本発明により包含される閉塞性肺疾患及び状態は、急性でも慢性でも、対象の肺中へ、かつ/又は肺からの気流の欠陥を特徴とする呼吸器の状態又は疾患を含む。閉塞性肺疾患及び状態としては、例えばぜん息、慢性閉塞性肺疾患COPD、気腫及び気管支炎に加えて、嚢胞性線維症、気管支拡張症、細気管支炎、及びアレルギー性気管支肺アスペルギルス症が挙げられる。本明細書に記載されるよに苦味物質を投与することにより処置又は予防され得る別のこのような閉塞性肺疾患又は状態としては、例えば喫煙又は腐食性化学物質のような有害化合物の吸入により;呼吸器感染症により;又は敗血症、若しくは食物例えば落花生、薬物例えばペニシリン、昆虫の刺創若しくは咬傷、花粉、カビ、イエダニ、ラテックス若しくは他の物質に対するアレルギー反応により引き起こされるようなアナフィラキシーにより;又は気管支収縮若しくは気管支痙攣の他の要因により引き起こされ得る気管支収縮又は気管支痙攣が挙げられる。例えば苦味物質は、運動又は大気汚染により誘発される気管支痙攣を予防又は処置するために投与され得る。別の例において、苦味物質は呼吸管の配置により誘発される気管支痙攣を予防又は処置するために管の配置前又は配置中に投与され得る。本発明の苦味物質は、例えば低酸素環境例えば海抜数千フィートにおける酸素摂取量を改善するため、又は運動能力を改善するために、気管支拡張を増加させることが望ましいかもしれない状況において、健常個体に投与され得る。本発明の実施態様の各々において、処置を受ける対象はヒト又は非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類、鳥類、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、コンパニオンアニマル、例えばイヌ、ネコ若しくは齧歯類、又は他の哺乳動物である。いくつかの実施態様において、対象はヒトである。苦味物質を含む本発明の医薬組成物は、苦味物質のアイデンティティによって、1つ又はそれ以上の担体、希釈剤及び添加剤例えば、薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は添加剤を含んでいてもよい。薬学的に許容しうるは、生物学的にも他の点でも有害でない物質、すなわち、有害な生物学的影響を引き起こすことも、それが含まれる医薬組成物のいずれの構成要素とも有害な様式で相互作用することもなく、苦味物質とともに個体に投与され得る物質を意味する。このような組成物を対象に投与するための適切な製剤又は組成物を提供するために従来の薬務が使用され得る。これらの用語は、細胞培地を具体的に除外する。適切な希釈剤乾燥及び液状の医薬製剤の両方については当業者に周知であり、そしてこれらとしては、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース例えば水中5デキストロース、水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ポリソルベート80Tween-80TM、ポリエチレングリコール300及び400PEG300及び400、PEG化ヒマシ油例えば、CremophorEL、ポロキサマー407及び188、シクロデキストリン又はシクロデキストリン誘導体HPCD2-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリン及び2-ヒドロキシエチル-シクロデキストリンを含む;例えば米国特許出願公開20060194717号を参照のことが挙げられる。担体は、医薬製剤の文脈において、活性成分の対象への送達を改善及び/又び延長する化合物及び物質である。担体は、制御放出技術を使用して、薬物のインビボでの活性を延長させるか又は対象における薬物の放出を遅らせるために役立ち得る。担体はまた、対象における薬物代謝を減少させ得、かつ/又は薬物の毒性を低減し得る。担体はまた、薬物の送達が対象における特定の細胞又は組織を対象にするために使用され得る。一般的な担体親水性担体及び疎水性担体の両方としては、脂肪エマルジョン、脂質、PEG化リン脂質phospholids、リポソーム及びリポスフェアlipospheres、ミクロスフェア生分解性ポリマー又はアルブミンで作られているものを含む、ポリマーマトリックス、生体適合性ポリマー、タンパク質-DNA複合体、タンパク質複合体、赤血球、小胞及び粒子が挙げられる。医薬組成物に含められる添加剤は、例えば薬物の性質、及び投与様式によって異なる目的を有する。一般的に使用される添加剤の例としては、限定することなく、以下が挙げられる:安定化剤、可溶化剤、及び界面活性剤、緩衝剤及び保存料、等張化剤、増量剤、滑沢剤例えばタルク又はシリカ、及び脂肪、例えば植物ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、又はステアリン酸、乳化剤、懸濁化剤又は粘性剤、不活性希釈剤、フィラー例えばセルロース、第二リン酸カルシウム、植物脂肪及び油脂、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、及びステアリン酸マグネシウム、崩壊剤例えば架橋ポリビニルピロリドン、グリコール酸ナトリウムデンプン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、結合剤例えば、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース又は変性セルロース、例えば微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、糖類、例えばスクロース及びラクトース、又は糖アルコール、例えばキシリトール、ソルビトール若しくはマルチトール、ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコール、湿潤剤、抗菌剤、キレート剤、コーティング例えばセルロースフィルムコーティング、合成ポリマー、シェラック、トウモロコシタンパク質ゼイン又は他の多糖類、及びゼラチン、保存料ビタミンA、ビタミンE、ビタミンC、レチニルパルミテート、及びセレン、システイン、メチオニン、クエン酸及びクエン酸ナトリウム、並びにメチルパラベン及びプロピルパラベンを含む合成保存料、甘味料、芳香剤、矯味矯臭剤、着色剤、投与補助剤、並びにそれらの組み合わせ。本発明の医薬組成物は、鼻腔吸入でも頬側吸入でも、肺投与のために製剤化され得る。医薬組成物の単位投薬量は、加圧パック若しくはネブライザからのエアロゾルスプレーの形態で、又は気化器を介して都合よく送達され得る。医薬組成物は製剤化散剤として送達されてもよく、そして散剤組成物はガス注入粉末吸入器デバイスを用いて吸入され得る。吸入のための送達システムの一例は定量吸入MDIエアロゾルであり、これは本発明の医薬組成物の、適切な噴霧剤例えばHFA-134a1,1,1,2-テトラフルオロエタンを含むフルオロカーボン又は炭化水素中の乾燥懸濁剤又は湿性液剤として製剤化され得る。噴霧剤は、1つ又はそれ以上の安定化添加剤、例えばエタノール及びオレイン酸も含み得る。さらに、いずれの他の適切な投与経路も使用され得、例えば、限定されないが、静脈内、非経口、口腔粘膜経由transbuccal、経皮transdermal、経皮transcutaneous、皮下、鼻腔内、エアロゾル、又は経口投与である。治療用製剤はは液状の液剤形態でも懸濁剤形態でもよく;例えば、経口投与については、製剤は錠剤又はカプセル剤の形態であり得;鼻腔内製剤については、散剤、点鼻薬、又はエアロゾルの形態;経皮製剤については、クリーム剤、又は皮膚に適用するためのパッチ上に広げられた形態でであり得る。医薬製剤中の苦味物質の有効量は、使用される苦味物質及び並びに処置される状態又は疾患、さらには対象の年齢及び他に摂取される薬剤のような因子によって変わる。有効投薬量は、典型的には当該分野で周知であるように担当医によって設定されるだろう。しかし単位用量で対象に送達される苦味物質の濃度は、一般的には約0.05mgから約100mgの範囲に及び、又はこの範囲内の値である。苦味物質は組み合わせて例えば2つ又はそれ以上の苦味物質、かつ/又は1つ若しくはそれ以上の苦味物質でない化合物例えば、限定されないがアルブテロールのようなベータ-アゴニストと組み合わせて投与され得る。本明細書において提供される1つの非限定的な例において、イソプロテレノール及びクロロキンに対する気道弛緩応答は相加的であり;したがって、いくつかの状況下では、この組み合わせをそれを必要とする対象に投与することが適切であり得る。本明細書で使用される用語用量、投薬量、単位用量、単位投薬量、有効用量及び関連する用語は、所望の治療効果例えば、気管支拡張又は気道の弛緩を生じるように計算された活性成分苦味物質の所定の量を含有する物理的に別個の単位を指す。これらの用語は治療有効量及び本明細書において開示される方法の示された目的を達成するために十分な量と同義である。本明細書で使用される用語処置する、処置すること、及び処置はそれらの通常及び慣例の意味を有し、そして対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状を寛解させること、対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状の再発を遮断すること又は寛解させること、対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状の重症度及び/又は頻度を減少させることの1つ又はそれ以上を含む。本明細書において使用される処置は、患者又は対象がより容易に呼吸できるように、少なくとも部分的に、かつ少なくとも一時的に、気管支収縮又は気管支痙攣を軽減すること又は気管支拡張を増加させることを含む。処置は、医薬組成物が投与されていない対象に対して、約1~約100だけ寛解させること、遮断すること、低減すること、減少させること又は阻害することを意味する。好ましくは、寛解させること、遮断すること、低減すること、減少させること又は阻害することは、医薬組成物が投与されていない対象に対して約100、99、98、97、96、95、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、又は1である。本明細書で使用される用語予防する、予防すること、及び予防はそれらの通常及び慣例の意味を有し、そして対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状を予防すること、対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状の再発を阻止すること、及び対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状の頻度を減少させることの1つ又は以上を含む。本明細書で使用される予防は、患者又は対象における呼吸が阻害されないように、少なくとも部分的に、かつ少なくとも一時的に、気管支収縮又は気管支痙攣を阻止することを含む。予防は、医薬組成物が投与されていない対象に対して、対象における約100、99、98、97、96、95、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5又は1の保護であり得る。予防は、医薬組成物の投与の後、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、若しくは24時間、又はそれ以上持続する。平滑筋細胞の表面上の苦味物質受容体を活性化し、それにより気道平滑筋を弛緩させることにより気道平滑筋を弛緩させる方法が本明細書において提供される。苦味物質受容体は、受容体を苦味物質と接触させることにより活性化され得る。活性化され得る苦味物質受容体としては、例えば、T2R10;T2R14;T2R44;T2R5;T2R4;T2R48;T2R3;T2R49;T2R45;T2R50;T2R47;T2R9;T2R13;TAS2R55;TAS2R46;TAS2R1;TAS2R8が挙げられる。本明細書において提供される方法のいずれかにおいて、上述の苦味物質受容体の1つ又はそれ以上が活性化され得る。苦味物質は、様々な刺激により引き起こされるか若しくは疾患若しくは状態の原因となっている気管支痙攣若しくは気管支収縮を予防若しくは処置するため;気管支拡張を増加させるため;かつ/又は気道平滑筋を弛緩させることが望ましいであろう様々な疾患及び状態を処置するために使用され得る。例えば、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるぜん息を処置する方法を提供する。別の例において、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるCOPDを処置する方法を提供する。さらに別の例において、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、対象における気管支炎を処置する方法を提供する。これらの局面の各々において、医薬組成物は吸入剤の形態であり得、又はいずれかの周知の方法例えば、限定されないが、経口、静脈内、頬側、経皮などにより全身投与され得る。これらの局面の各々において、医薬組成物は好ましくは吸入剤の形態である。気道平滑筋細胞を、苦味物質受容体に結合する試験化合物と接触させること、及び試験化合物が気道平滑筋細胞を弛緩させるか否かを決定することを含み、ここで平滑筋細胞を弛緩させる化合物は気道平滑筋を弛緩させるための化合物として同定される、気道平滑筋を弛緩させるための化合物を同定する方法もまた本明細書において提供される。試験化合物が結合し得る苦味物質受容体としては、例えば、T2R10;T2R14;T2R44;T2R5;T2R4;T2R48;T2R3;T2R49;T2R45;T2R50;T2R47;T2R9;T2R13;TAS2R55;TAS2R46;TAS2R1;TAS2R8が挙げられ得る表2のとおりの命名法;代替の命名については表3を参照のこと。本明細書において提供される方法のいずれかにおいて、苦味物質は上述の苦味物質受容体の1つ又はそれ以上に結合し得る。苦味受容体アゴニストである化合物を同定する方法も本明細書において提供される。苦味受容体アンタゴニストである化合物を同定する方法も本明細書において提供される。苦味受容体アゴニスト及びアンタゴニストの同定苦味受容体が気道細胞例えば、気道平滑筋細胞及び非線毛気道上皮細胞の表面上で発現されるという本発明者らの発見は、苦味受容体アゴニスト及びアンタゴニストとして役立つ化合物を同定するための新しいスクリーニングアプローチを提供する。苦味受容体アゴニストは、本明細書に記載されるように、例えば気道平滑筋を弛緩させるため、及び苦味受容体を活性化させることが望ましいであろういずれかの他の用途のために使用され得る。苦味受容体アンタゴニストは多くの用途を見出し、例えば食物及び飲料;薬物、栄養補助食品、及び栄養補給剤;口腔ケア製品などにおける苦味を減少させるかマスクするための成分として含まれる。本明細書に記載される方法により同定された候補苦味受容体アンタゴニストを、周知の方法により、例えば候補苦味受容体アンタゴニストを消耗品又は他の経口摂取される製品と混合し、そしてそれらの製品を苦味の知覚に敏感な人々による味覚試験にかけることにより、さらに評価され得る。試験化合物はいずれかの合成又は天然に存在する分子であり得る。化合物は、化合物のライブラリ、例えば、限定されないが、当該分野で周知であるような、コンビナトリアル化合物ライブラリ又は天然に存在する化合物例えば、限定されないが、ペプチド、タンパク質、糖類、炭水化物、ヌクレオチド、核酸、脂質及び/又はそれらの誘導体若しくは混合物のライブラリから同定され得る。試験化合物には、苦味受容体アゴニスト又はアンタゴニストとの構造類似性が既知である化合物が含まれ得る。当業者は、合成及び天然の化学化合物ライブラリーの多くの商業的供給源があることを理解するだろう例えば、限定されないが:TimTecUSA,PrincetonBioMolecularResearch,AuroraFineChemicalsなど。コンビナトリアルライブラリー及び他の化合物ライブラリーを製造及びスクリーニングするための多数の方法が当該分野で周知である。例えば、米国特許第7,393,65号;米国特許公開第2010/0129833号;及び米国特許公開第2010/0113548号これはそれぞれその全体が参照により本明細書に加入されるを参照のこと。苦味受容体の試験化合物すなわち可能性のあるアゴニスト又はアンタゴニストの結合はいずれかの適切なアプローチにより検出され得る。例えば、苦味物質の苦味受容体への結合は、ホスファチジルイノシトールPIのホスホリパーゼC媒介加水分解を介するイノシトール酸リン酸IP3の増加のような細胞内事象を開始する。次いでIP3は細胞内カルシウム貯蔵の放出を刺激する。従って、このような変化を検出するための周知の方法を使用して、細胞質カルシウム濃度の変化又は第二メッセンジャーレベルの変化が、苦味受容体アゴニスト又はアンタゴニストを同定するために使用され得る。本明細書において記載される方法に加えて、このような有用な方法の例については例えば米国特許第7,393,654号;米国特許公開第2010/0129833号;及び米国特許公開第2010/0113548号これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に加入されるを参照のこと。苦味受容体の活性を測定することは、苦味受容体により達成される生化学的シグナル伝達の変化例えば、細胞内カルシウム放出、IP3レベル、又は他のシグナル伝達分子レベルの変化を測定すること、又は苦味物質受容体への苦味物質の結合の量を測定することを意味する。例えば、苦味受容体に対するアンタゴニストは、既知の苦味物質のその同族受容体への結合を阻害する能力、又は例えば細胞内カルシウム放出、IP3生成などにより証明されるような生化学的シグナル伝達における苦味物質が媒介する増加を阻害する能力により同定され得る。反対に、苦味物質受容体アゴニストは、苦味物質受容体に結合するその能力、及び/又は本明細書に記載され、そして当該分野で周知であるような苦味物質が媒介する生化学的シグナル伝達を刺激するその能力により同定される。苦味物質アゴニスト及びアンタゴニストを検出するためのこのような周知のアッセイの例については、例えば、米国特許第7,393,65号;米国特許公開第2010/0129833号;及び米国特許公開第2010/0113548号を参照のこと。さらに、本明細書に記載されるように、苦味受容体アゴニスト及びアンタゴニストは、気道平滑筋細胞を弛緩させるそれらの能力苦味受容体アゴニストの場合、又はこのような弛緩を阻害するそれらの能力苦味受容体アンタゴニストの場合により同定され得る。苦味受容体媒介活性の少なくとも10の増加は苦味受容体アゴニストを同定する。アゴニスト媒介苦味受容体活性の少なくとも10の減少は苦味受容体アンタゴニストを同定する。このような変化は、例えば少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、10などの変化であり得る。一例において、細胞をマルチウェルディッシュで増殖させ、蛍光ベースのカルシウム指示薬色素をロードし、そして試験化合物を添加し、続いて細胞内カルシウム[Ca2]i放出の変化を示す蛍光の変化をモニタリングする。試験化合物には、既知の苦味受容体アゴニスト又はアンタゴニストに対して構造的類似性を有するものが含まれ得る。苦味受容体アゴニストとして役立つ化合物で細胞を処理した場合、[Ca2]iの用量依存性上昇が観察される。用量-応答曲線から、効力最大応答の50が生じる場合の有効濃度;EC50としても知られる及び有効性最大[Ca2]i応答がその化合物について確認され得る。苦味受容体のアンタゴニストは、これらの細胞における[Ca2]iのアゴニスト活性化を遮断するそれらの能力によりそれ自体特異的に同定される。従って、苦味受容体へのアンタゴニストの結合は単独で調べた場合は[Ca2]iの変化を生じないか、又は減少をもたらすだろう。苦味受容体アンタゴニストを同定するための実験は、提案されているアンタゴニスト及び苦味受容体の既知のアゴニストで細胞を処理することにより行われる。既知のアゴニストからの[Ca2]iシグナルと提案されているアンタゴニスト化合物の存在下でのそのアゴニストからのシグナルとを比較することにより、アゴニストの受容体へのアクセスを遮断するように作用しているという証拠が得られ、これはアンタゴニストであることを示す。様々な用量の提案されているアンタゴニストを使用することにより、効力上で定義される及び有効性ここではアゴニストシグナルの最大阻害と定義されるが明らかにされる。具体例は、苦味受容体アゴニストアセスルファームKを800マイクロモル濃度の固定濃度で、多様な濃度の味覚受容体アンタゴニストGIV3727TAS2R31でアンタゴニストであることが知られていると共に使用し、そしてGIV3727の濃度を増加させながら[Ca2]iシグナルの大きさの減少を観察することである。この具体例において、アッセイは例えば、初代ヒト気道平滑筋細胞又はH292細胞両方ともTAS2R31を発現するのでを用いて行われ得る。一般に、苦味受容体のアゴニスト及びアンタゴニストについてのアッセイは、1つ又はそれ以上の苦味受容体を発現する気道細胞例えば、気道平滑筋細胞又は非線毛気道上皮細胞のいずれかの供給源を用いて行われ得る。例えば、初代ヒト気道平滑筋細胞は、SAGreenetal.Influenceofbeta2-adrenergicreceptorgenotypesonsignaltransductioninhumanairwaysmoothmusclecells.Am.J.Respir.CellMol.Biol.13:25-33,1995その全体が参照により本明細書に加入されるにおいて記載されるようにヒト組織から得られ得る。本明細書において記載されるスクリーニング方法において使用され得る初代平滑筋細胞の別の供給源は、LonzaResearchSolutionsからのカタログ番号CC-2576及び他のものである。さらに、当業者には当然のことながら、Lonzaは正常及び疾患の気道上皮細胞並びに気道平滑筋細胞の供給元である。Lonzaはまた正常及び疾患の気道線維芽細胞を提供し、これもまた、選択された細胞型が1つ又はそれ以上の興味のある苦味受容体を発現する限り、本発明のスクリーニング方法において使用され得る。本明細書に記載される方法において有用である別の細胞株は、不死化ヒト気管支上皮細胞株BEAS-2Bアメリカ培養細胞系統保存機関AmericanTypeCultureCollectionカタログ番号CRL-9609である。H292NCI-H292としても知られる;アメリカ培養細胞系統保存機関カタログ番号CRL-1848は、多数の型の苦味受容体を発現するヒト肺粘液性類表皮癌由来の誘導された細胞である例えば表1を参照のこと。適切な場合、気道細胞はまた、本明細書に記載され、かつ当該分野で周知であるように、気管軟骨内でそれらを使用して試験され得る。さらに、必要に応じて、いずれかの非ヒト細胞、例えばマウス又はラット初代気道細胞が使用され得、初代細胞分離株、樹立細胞株、又は気管軟骨として使用され得る。いずれかの他の動物種も必要に応じて使用され得る限定されないが、イヌ、ウシ、ブタ、霊長類などが挙げられる。当業者は、本明細書に記載される方法における使用のために適切な細胞供給源を同定する方法を理解するだろう。方法[Ca2]i、cAMP及び膜電位の測定。初代ヒトASM細胞を商業的供給源Cloneticsから入手し、そして3~8継代で細胞を使用して実験しながら記載されるように維持した31。これらの細胞は以前に確認されたように31、>95の気道平滑筋からなるものであった。[Ca2]iの変化を検出するために、96ウェルプレートに付着した細胞80,000細胞/ウェルに、プロベネシドと共にFluo-4AMBDBiosciencesを1時間37°Cでロードした。受容体アゴニストを示された濃度で37°Cにて自動化ピペット操作システムにより三連で加え、そしてFlexStationIIMolecularDevicesを使用して485nmでの励起により525nmのシグナルが生じた。データを1.5秒ごとに60秒間取得した。別の記載がなければ、研究は1.5mMカルシウムを含有する培地で行った。いくつかの研究において、ASMを、4x106細胞及びsiRNA4μgを使用してエレクトロポレーションNucleofector,Lonzaにより、T2R10siRNAInvitrogen又はスクランブル配列siRNAコントロールでトランスフェクトした。24に時間後に細胞を[Ca2]iアッセイのために96ウェルプレートに移した。cAMP測定のために、ヒトASM細胞を24ウェルディッシュにプレーティングし、アゴニストを示された時間、37°Cで三連で加え、そして溶解緩衝液を加えて急速凍結させることにより反応を停止させた。サンプルをアセチル化し、そしてcAMPを、以前に記載されたように32、高感度125I-cAMPベースのラジオイムノアッセイにより測定した。VASPリン酸化状態を、非リン酸化形態及びリン酸化形態に特異的な抗体AlexisBiochemicalsを使用して全細胞溶解物のウェスタンブロットにより確認した。ASM細胞全体の膜電位に対する苦味物質の効果を、膜電位感受性蛍光色素MolecularDevicesを使用して、記載されるように1996ウェルプレート形式で50,000細胞/ウェルを用いて測定した。励起は530nmであり、そして発光は565nmで得られた。データをリアルタイムで300秒間集め、相対的蛍光単位として示す。エクスビボでのインタクトな気道の生理学。全てのマウス研究は動物実験委員会AnimalCareandUseCommitteeにより認可されており、そしてヒト組織研究は、メリーランド大学Baltimoreの治験審査委員会InstitutionalReviewBoardにより認可された。約60日齢のFVB/Nマウスから、気管の5mm切片を切除し、そして以前に記載されたように33、等長性isometricミオグラフシステムRadnotiにおいて調べた。手短には、固定ワイヤと変換器連結ワイヤとの間に取り付けた気管軟骨を、Krebs緩衝液中に37°Cで95O2、5CO2から通気して維持した。5mNの静止張力を各軟骨輪について確立し、これはGPCRアゴニストからの収縮及び弛緩を調べるための長さ-張力の最適な関係をもたらすということを本発明者らは示した34。示された範囲の用量又は単一濃度を使用して実験を行った。適切な場合は、Krebs緩衝液を用いて3回25ml交換することにより薬物の洗い流しを達成した。弛緩研究のために、軟骨輪を、固定濃度を使用してアセチルコリンのような薬剤を用いて収縮させ、これを複数の用量のイソプロテレノール又は苦味物質を加える間維持した。外科標本から新たに得られたヒト組織からの第四次気管支を、肉眼で病理のない領域から切開し、軟骨輪を上記の方法と類似した方法で調製し試験した。磁気ツイスティングサイトメトリーMagnetictwistingcytometry。ベースライン細胞剛性の動的変化を、以前に詳細に記載されるように15、磁気ツイスティングサイトメトリーを使用して単離されたヒトASM細胞の収縮及び弛緩の指標として測定した。手短には、接着性ヒトASM細胞に結合されたArg-Gly-Asp被覆強磁性マイクロビーズを水平方向に磁化し、次いで時間内に正弦波的に変動している垂直方向に整列された均一な磁場で回転させる。正弦波的に回転するtwisting磁場は、ビーズの回転rotation及び旋回変位の両方を引き起こし:次いでこのような強制的なビーズの運動は、細胞により生じる内部応力により妨げられる。生じた振動トルクに対応したビーズの側方変位を、約5nmの空間分解能で検出し、そしてビーズ変位に対する固有トルクの比を計算し、そして細胞剛性としてパスカル/nmPa/nmの単位で表した。それぞれ個々のASM細胞について、ベースライン剛性を最初の60秒間測定し、そして薬物添加後に、次の540秒間連続的に剛性を測定した。いくつかの実験において、GPCRアゴニストを加える前に、細胞をビヒクル又は阻害剤に10分間予め曝露したイベリオトキシン10nM、カリブドトキシン10nM、H89100nM、又はU731221μM。各細胞について、アゴニスト刺激の前に剛性をそのベースライン剛性に対して正規化した。領域的かつ局所的[Ca2]iシグナルの共焦点像。領域的かつ局所的[Ca2]iシグナルを、膜透過性[Ca2]i感受性蛍光色素Fluo-3アセトキシメチルエステルFluo-3AMを使用して以前に記載されたように3536可視化した。培養ヒトASMに5μMFluo-3AM20プルロニック酸pluronicacidを含むDMSOに溶解したを30~45分間、室温で約22°Cロードした。細胞をmMで137NaCl、5.4KCl、2CaCl2、1MgCl2、10HEPES、及び10グルコースを含有するTyrode液pH7.4NaOHで調整で洗浄して細胞外Fluo-3AMを除去し、そして15~30分間細胞チャンバーに置いて細胞質の色素の脱エステル化を完了させた。Fluo-3AMを488nmで励起し、そして蛍光を>505nmで測定した。2次元画像を0.22μm/ピクセル、512ピクセル/ライン、256ライン/画像で0.5秒ごとに1回スキャンした。ラインスキャン画像を0.075μm/ピクセル、512ピクセル/ラインで2ms間隔で10,000ライン/画像を収集した。画像をIDLソフトウェアパッケージを使用したアルゴリズムで処理した。各共焦点像の蛍光シグナルFから最初にバックグラウンドを差し引いて、F/F0に関して正規化したここでF0は薬物適用前のベースライン蛍光である。[Ca2]iシグナルの大きさを、擬比率pseudo-ratio法37により絶対[Ca2]iに対してさらに較正した。典型的な画像フィールドは2~4個の細胞を含み、そして各実験について10フィールドを調べた。T2R発現。全RNAをヒトASM細胞から抽出し、そして2μgRNA、オリゴdTプライマー、及びモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を使用して逆転写を行った。リアルタイムPCRを、以前に詳細に記載された方法38を使用して、25のT2Rに特異的なプライマーAppliedBiosystems、示された他のGPCR、及びGAPDHを用いて、AppliedBiosystems7300リアルタイムPCRシステムを使用して行った。データをΔΔCT法を使用してADRB2を参照として使用して解析した39。T2R10、14、44、5、4及び48に対するプライマーから誘導されたPCR産物を配列解析して、示されたヒトT2Rであることを確認した。免疫細胞学を、記載されるように31固定化細胞を使用して行った。抗血清力価は:T2RThermoScientific1:300、ガストデューシンSantaCruz1:500及びBKCaSigma1:100であった。オボアルブミン感作及び肺機能試験。6週齢BALB/cマウスの感作を、200μlミョウバン中100μgオボアルブミン、又はミョウバンのみコントロールの腹腔内注射により0日目及び14日目に行った。次いで19、21及び24日目に、マウスを1.0エアロゾル化オボアルブミンに曝露した。最後の曝露の24時間後にマウスを鎮静させ、挿管し、そして以前に記載されるように40flexiVentシステムSCIREQを換気及び気道抵抗の測定のために利用した。換気は、一回換気量240μl及び呼気終末陽圧2.5cmH2Oで150呼吸/分であった。安定化した後、持続気道抵抗がベースラインより約5倍高くなるまでマウスをエアロゾル化メタコリンの用量ネブライザで2.0、4.0、8.0及び16mg/mlに曝露した。最後のアセチルコリン吸入の3分後に、苦味物質キニーネ150μg若しくはデナトニウム200μg、又はβ-アゴニストアルブテロール3.0μgをエアロゾルにより10秒間かけて投与した。抵抗測定Raw、cmH2O/ml/秒を実験の間中、30秒ごとに行った。統計分析。[Ca2]i及びエクスビボ気管軟骨研究についての用量応答曲線を、反復非線形シグモイド最小二乗フィッティングにより解析した。全ての研究からの結果を、対応のある又は非対応の二元配置t検定pairedorunpairedtwo-wayt-tests試験設計に依存するを使用して、P<0.05を有意とみなして比較した。多重比較が求められる場合、事後post-hoct検定を用いるANOVAを、多重比較についての補正と共に利用した。データを平均値±標準誤差として示す。結果ヒトASMは[Ca2]iと共役した苦味受容体を発現する。初期の研究は、いくつかの公知の苦味受容体アゴニスト例えばクロロキン、サッカリン、及びデナトニウムが培養ヒトASM細胞において増加した[Ca2]iを惹起することを見出した図1a、b、c。これらの苦味物質に対するASM細胞における[Ca2]i応答は、ヒスタミン及びブラジキニンのような公知の気管支収縮性GPCRアゴニストと大きさが類似していることが見出された図1c。これらの結果は、全ての25の公知のT2R遺伝子に対するプライマーを用いた定量的RT-PCR研究を促し、ここで本発明者らは、多数の苦味受容体転写物がヒトASMにおいて発現したことを確認した。発現を、β2-アドレナリン作用性受容体β2ARASM緊張の調節との認識された生理学的及び薬理学的関連性を有する受容体についての遺伝子レベルと比較した表2-W.Meyerhofetal.,ChemSenses35:157-1702010に記載される命名法。ヒト気道平滑筋細胞ASM上でそれぞれ高レベル及び低レベルで発現されることが公知の2つの他のGPCRADORA1及びLTB4Rの発現も示す。表3は表2に示されるmRNA発現レベルを示すが、当該分野で周知である苦味受容体についての代替の命名法を代わりに使用する。2つの命名法の差異は表2と3とを比較することにより理解され得る。多数のTAS2R転写物がヒトASMにおいて発現されることが見出され、T2R10,T2R14及びT2R44サブタイプは最も高度に発現された。2つの甘味受容体についての転写物は、最初にアレイにより確認され6T1R1及びT1R2、RT-PCRにより確認されなかった表2。さらなる苦味物質のさらなる選別により、[Ca2]iがアリストコール酸、ストリキニーネ、キニーネ、コルヒチン及びヨヒンビンに応答することが明らかになった図1c。重大なことには、2つの甘味受容体アゴニストのスクラロース及びSC45647に対する応答は見られなかった図1c。そして、本発明者らは、T2R4を活性化するコルヒチンに対するASMにおける比較的低い応答RT-PCRにより中間レベルのASM発現剤expressor及び排他的にT2R16を発現する10サリシンに対して応答しないことこれはRT-PCRによりASMにおいて検出されないに気付いた。ストリキニーネT2R10及び-46を活性化するに対する強い応答はまた、ASMにおける高い発現を有するT2R10と一致していた。従って、ASMにおいて、苦味物質に対する[Ca2]i応答は、アゴニスト特異性及びこれらの細胞におけるT2Rサブタイプ発現に基づく順位と一致しており、甘味受容体アゴニストに対する[Ca2]i応答はない。2つの高度に発現する受容体T2R10及びT2R44及びRT-PCRにより検出されなかった受容体T2R7に対して特異的なポリクローナル抗血清を使用したヒトASM細胞の免疫細胞学は、前者の2つの受容体の細胞表面発現を明らかにしたが、後者については明らかにならなかった図2。これらの研究はまた、これらの細胞におけるガストデューシンのαサブユニットの発現を明らかにした図2。T2R10特異的siRNAを用いたASM細胞のトランスフェクションは、T2R10mRNAをスクランブルsiRNAコントロールと比較して36±1.8減少させ、これはストリキニーネ促進[Ca2]iの262.0の減少を伴っていたコントロールに対してP<0.05。さらなる研究において、ASM細胞を培地のみで、又はT2R10、T2R7に特異的なポリクローナル抗血清、若しくはアイソタイプ特異的IgGと共にインキュベートし、次いでストリキニーネ促進[Ca2]iを決定した。T2R10抗血清はストリキニーネ促進[Ca2]i応答を用量依存性の様式で減少させ約77の最大阻害、図3、このT2Rの発現を示すRT-PCR及び免疫細胞学の結果と一致していた。非特異的効果についてのコントロールとして、T2R7これはASMにおいて発現されないに対する抗血清は、同じ力価で[Ca2]i刺激に対して有意な効果を有しておらず、IgGも有意な効果を有していなかった。総合すれば、上記の研究は、ASM細胞でのT2Rの発現を裏付け、そして発現を苦味物質媒介[Ca2]iシグナル伝達と関連付ける。サッカリンにより誘発されるヒトASM細胞における[Ca2]iの増加は、細胞外Ca2の存在に依存せず、そして応答はGβγ阻害剤ガレイン、PLCβ阻害剤U73122により除去され、そしてイノシトール-3-リン酸IP3受容体アンタゴニスト2APBにより部分的に阻害された図1d。ASM細胞におけるこれらの結果は舌の特殊化味覚細胞における苦味受容体についてのシグナル伝達と一致し、ここでGgust-関連βγはPLCβを活性化してIP3生成を生じ、これが筋小胞体sarcoendoplasmicreticulum上のIP3受容体を活性化し、この細胞内貯蔵からCa2が放出される9。苦味受容体は気道弛緩を惹起する。ヒトASMにおいて苦味物質のいくつかにより促進される[Ca2]iの増加が、気管支収縮性GPCRに対して作用するリガンドの大きさと類似した大きさであったことを考えると、本発明者らは、苦味受容体がASM収縮を惹起すると最初に仮定した。しかし、単離されたインタクトなマウス気道において、クロロキン、デナトニウム及びキニーネは用量依存性弛緩を生じ、最大応答はアセチルコリンにより惹起された活性収縮を>90減少させた図4a。これらの同じ実験条件下での完全β2ARアゴニストイソプロテレノールに対する最大弛緩応答は、活動張力の30±9.2の減少であった図4a。クロロキン及びキニーネもまた、異なるGq-受容体アゴニストセロトニン、図4bにより収縮された気道を用いて調べ、そして顕著な弛緩も観察された。クロロキン弛緩についてのEC5093±4.3μM及び110±32μMは、収縮がそれぞれアセチルコリンによって刺激されたかセロトニンによって刺激されたかに関わらずほとんど同じであった。さらに、本発明者らは、苦味物質がベースライン気管軟骨張力を約30弛緩させることを見出した図5。ヒト肺組織の非疾患部分から得られた第四次気管支における限られた数の研究において、本発明者らはまた、アセチルコリン収縮軟骨輪でのクロロキン又はサッカリンからの50~80の弛緩を観察した図6。苦味物質媒介気道弛緩は、シクロオキシゲナーゼ阻害剤インドメタシンによっても一酸化窒素シンターゼ阻害剤L-NAMEによっても変更されず、このことは、気道上皮細胞から生じる気管支活性bronchoactiveリガンドから生じる二次的応答よりもむしろASM受容体の直接活性化を示唆した。β-アゴニストを用いて観察される気道弛緩は、その後のPKA活性化を伴うcAMPの増加と共役するβ2ARに起因する2。しかし、それぞれ高感度ラジオイムノアッセイにより又は血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質VASPのPKA媒介リン酸化により評価して、cAMPにおけるクロロキン促進増加についてもインタクトな培養ASM細胞におけるPKA活性化についても証拠は見出されなかった図4c。インタクトな気道を用いた一連の連続した投薬及び休薬の実験において、準最大用量のクロロキンはアセチルコリン媒介収縮の約67弛緩を生じ、これは、休薬及びアセチルコリンへの再曝露により完全に逆戻りした図4d。次いでこれらの気道を最大濃度のイソプロテレノールに曝露して、クロロキンへの前曝露なしに得られた値と同様の値である29±4.3弛緩を達成した図4a。さらに、クロロキン及びイソプロテレノールの両方への曝露は、いずれかの化合物単独を用いて見られた弛緩よりも高い弛緩を生じた図4d。これらのデータは、ASM機能的収縮及び弛緩がクロロキンへの前曝露により損なわれないのでクロロキン促進は細胞傷害に起因しないということ、並びに弛緩はβ-アゴニストの弛緩に対して相加的であり、弛緩の異なる機構を示唆しているということを示す。苦味受容体は、局在的Ca2放出からBKCaチャネルを開くことによりASMを弛緩する。総合すれば、これらの逆説的な結果は、苦味受容体アゴニストがASMにおける[Ca2]iの増加を惹起するにもかかわらず、それらが気管支拡張剤として作用することを示し、実際に、本発明者らがこれまでに発見した最も有効な気管支拡張剤である。本発明者らは、この細胞型におけるこれらの受容体の[Ca2]iに対するシグナル伝達の機構を特徴付けしたが、インタクトな気道における協調した気道応答は予期された気管支収縮と一致しなかった。苦味受容体がASM弛緩を惹起する機構をさらに解明するために、本発明者らは、単離されたヒトASM細胞の剛性の動的変化を測定するために磁気ツイスティングサイトメトリー15を使用し図7、従ってインタクトな組織に存在する未確認の機構からの潜在的な交絡因子を除去した。これらの実験において、ペプチドリンカーにより細胞に結合された磁気粒子は、それぞれベースラインからの予期される弛緩及び収縮を生じるイソプロテレノール曝露及びヒスタミン曝露を用いて、単細胞剛性の高度に定量的な測定をもたらす図7a。クロロキン及びサッカリン曝露図7aは、この単細胞レベルでASM弛緩を生じ、これらの苦味物質が平滑筋細胞に対して直接作用することを裏付け、そしてこのことはインタクトな気道の協調した弛緩応答における我々の知見と一致する図4a及び図5。サッカリンに対する弛緩応答はPKA阻害剤H89により遮断されず図7b、cAMP及びVASPリン酸化測定からの結果を裏付けた図4c。U73122によるPLCの阻害は、単離されたASMのサッカリン促進弛緩を除去した図7b。[Ca2]iの苦味物質促進増加に対するPLC阻害βγ阻害剤及びIP3受容体アンタゴニストと同様図1dに伴う本発明者らの知見を考慮すると、これらの結果は、ASMにおけるこれらの受容体の弛緩応答が細胞内Ca2放出により引き起こされるか又は細胞内Ca2放出を必要とするということを示した。この考えと一致して、培養ASM細胞における[Ca2]i放出についてのクロロキンのEC50値70±10μM、図1a、及びインタクトな気道の弛緩におけるクロロキンのEC50値93±4.3μM、図4aは事実上同じである。弛緩がSRCa2放出に依存することは、SRCa2再取り込み阻害剤タプシガルジンSR[Ca2]iを枯渇させるを用いた研究の結果によりさらに支持された。タプシガルジンプレインキュベーションはASM細胞におけるクロロキン及び他の苦味物質が媒介する[Ca2]i刺激を遮断し図8、そしてまたインタクトな気道軟骨のクロロキン媒介弛緩も遮断した図9。ASMにおけるCa2媒介弛緩についての可能性のある機構は、大コンダクタンスCa2活性化KチャネルBKCaの刺激に起因する過分極を介するものである。これらのチャネルはヒトASMで発現されることが知られており16本発明者らが確認した;図2、そして気道緊張を調節すると報告されている17。観察された弛緩が、苦味物質の引き起こしたBKCaのCa2活性化に起因するか否かを調べるために、ヒトASM細胞を担体、Ca2依存性Kチャネルアンタゴニストカリブドトキシン、又は特異的BKCaチャネルアンタゴニストイベリオトキシンで前処理した。図7bに示されるように、単離された細胞で評価して、両方の前処理がサッカリン媒介ASM弛緩を除去した。同様の結果がクロロキンで見られた。そして最後に、イベリオトキシンでの前処理もまた単離されたマウス気道におけるクロロキン促進弛緩を減衰させた図7c。BKCa活性化からのASMの弛緩は、膜過分極に由来すると期待されるだろう18。ASM細胞に膜電位感受性蛍光色素19をロードし、そして図10aに示されるように、KCl及びヒスタミンへの曝露は、期待された膜脱分極を生じた。苦味物質のクロロキン及びサッカリンへの曝露で膜過分極が容易に観察された。さらに、苦味物質促進膜過分極はイベリオトキシンにより完全に阻害された図10b。従って、ASM苦味受容体からの高度に効果的な気管支拡張応答は、BKCaの[Ca2]i依存性活性化に起因すると思われ、これは収縮を引き起こす[Ca2]iのヒスタミン促進増加とは異なる。このことは、ヒスタミン及び苦味物質に対するCa2応答の細胞内分布が異なることを示唆し、そして実際に、高濃度の局在化[Ca2]iがBKCa活性化と関連するということが証明されている20。ASM細胞におけるサッカリン促進[Ca2]i増加の特徴を明確にするために、リアルタイム共焦点画像化をFluo-3をロードした細胞で行った図11。示されるように、局在化した[Ca2]iシグナルがASMの細長い端部及び筋細胞膜領域において検出された。この応答は急速であり例えば、断面の調査では2.5秒以内に観察される、図11a、そして強度は筋細胞の中心領域よりも高かった図11b。ASM細胞の細胞膜に対して1μm以内の平行な領域においてラインスキャンモードを使用した場合、空間的かつ時間的に識別できる[Ca2]i事象が、その後の[Ca2]iの持続的な局在化した上昇の前に、サッカリンの適用後のごく初期に検出された図11e。これらの結果は、サッカリンがASM細胞における局在化[Ca2]iシグナルを促進するとい考えを裏付けた。対照的に、ASM細胞におけるヒスタミンに対する応答は、サッカリンで観察された局在化した特徴を伴わず、細胞全体にわたる[Ca2]iの急速な上昇を生じた図11c。苦味物質はぜん息のマウスモデルにおいて気管支収縮に対抗する。集合的に、上記の結果は全て、ぜん息のような可逆性の閉塞性肺疾患を処置するために利用されるかもしれない新規なASM弛緩経路を指し示す。この可能性を評価するために、苦味物質をアレルギー性気道炎症及び気管支過敏症のマウスモデルの状況において吸入により投与した。マウスをオボアルブミンに対して感作させ、次いで吸入オボアルブミンに繰り返し曝露し、これは急性気道炎症を生じた図12a、b。気道抵抗を、これらのインタクトな鎮静して挿管したマウスにおいて、気管支収縮剤メタコリンの吸入への応答後にベースラインで測定し、次いで気管支収縮期中の苦味物質の吸入後に測定した。これらの研究のためのポジティブコントロールには、アルブテロールぜん息治療において最も一般的に利用される気管支拡張剤であるβ-アゴニストを吸入させた。オボアルブミン感作マウスにおいて、ベースライン気道抵抗を5倍増加させるために必要な吸入メタコリンの濃度は8mg/mlであり、非感作マウスについての≧16mg/mlと比較すると、気道過敏表現型を裏付けた。吸入されたエアロゾル化キニーネは、正常マウス及び感作マウスにおいて気道抵抗をそれぞれ53±2.96及び50±8だけ減少させ、閉塞性気道疾患の病態生理学的に関連するモデルにおける有効性を示した図12c、d。気管支拡張性効果はデナトニウムでも見られ、正常マウスにおいて44±6、そして感作マウスにおいて57±4に達した。ASM上で発現されるGPCRは、気道の緊張及び口径を調節するシグナル伝達受容体の主要なファミリーを代表するものである。ぜん息における気道環境内では、多数の局所的に生成されたリガンドが最終的にこれらの受容体に作用して気管支収縮をもたらす。気管支収縮促進性pro-bronchoconstrictiveGPCRはG2BillingtonCKPennRBSignalingandregulationofGproteincoupledreceptorsinairwaysmoothmuscleRespirRes42243GreenSALiggettSBTheGeneticsofAsthma67904DrazenJMSilvermanEKLeeTHHeterogeneityoftherapeuticresponsesinasthmaBrMedBull56105410705MalmstromKetalOralmontelukastinhaledbeclomethasoneandplaceboforchronicasthmaArandomizedcontrolledtrialMontelukastBeclomethasoneStudyGroupAnnInternMed1304874956EinsteinRetalAlternativesplicingoftheGproteincoupledreceptorsuperfamilyinhumanairwaysmoothmusclediversifiesthecomplementofreceptorsProcNatlAcadSci105523052357MisiorAMetalGlucocorticoidandproteinkinaseAdependenttranscriptomeregulationinairwaysmoothmuscleAmJRespirCellMolBiol4124398BosseYMaghniKHudsonTJ1alpha25dihydroxyvitaminD3stimulationofbronchialsmoothmusclecellsinducesautocrinecontractilityandremodelingprocessesPhysiolGenomics291611689MeyerhofWElucidationofmammalianbittertasteRevPhysiolBiochemPharmacol154377210MeyerhofWetalThemolecularreceptiverangesofhumanTAS2RbittertastereceptorsChemSenses3515717011ChandrashekarJetalT2RsfunctionasbittertastereceptorsCell10070371112AdlerEetalAnovelfamilyofmammaliantastereceptorsCell10069370213ChandrashekarJHoonMARybaNJZukerCSThereceptorsandcellsformammaliantasteNature44428829414LombardoLJBalmesJROccupationalasthmaareviewEnvironHealthPerspect108Suppl469770415AnSSFabryBTrepatXWangNFredbergJJDobiophysicalpropertiesoftheairwaysmoothmuscleinculturepredictairwayhyperresponsivenessAmJRespirCellMolBiol35556416MartinGetalInterleukin4activateslargeconductancecalciumactivatedpotassiumchannelsinhumanairwaysmoothmusclecellsExpPhysiol9390891817MorinCSiroisMEchaveVGomesMMRousseauEFunctionaleffectsof20HETEonhumanbronchihyperpolarizationandrelaxationduetoBKCachannelactivationAmJPhysiolLungCellMolPhysiol293L1037L104418KotlikoffMIKammKEMolecularmechanismsofβadrenergicrelaxationofairwaysmoothmuscleAnnuRevPhysiol5811514119BaxterDFetalAnovelmembranepotentialsensitivefluorescentdyeimprovescellbasedassaysforionchannelsJBiomolScreen7798520FaklerBAdelmanJPControlofKchannelsbycalciumnanomicrodomainsNeuron5987388121ShahASBenShaharYMoningerTOKlineJNWelshMJMotileciliaofhumanairwayepitheliaarechemosensoryScience3251131113422FingerTEetalSolitarychemoreceptorcellsinthenasalcavityserveassentinelsofrespirationProcNatlAcadSciUSA1008981898623WuSVetalExpressionofbittertastereceptorsoftheT2RfamilyinthegastrointestinaltractandenteroendocrineSTC1cellsProcNatlAcadSciUSA992392239724BrockhoffABehrensMMassarottiAAppendinoGMeyerhofWBroadtuningofthehumanbittertastereceptorhTAS2R46tovarioussesquiterpenelactonesclerodaneandlabdanediterpenoidsstrychnineanddenatoniumJAgricFoodChem556236624325SbarbatiAetalAcylhomoserinelactonesinduceearlyresponseintheairwayAnatRec29243944826NakagawaYetalSweettastereceptorexpressedinpancreaticbetacellsactivatesthecalciumandcyclicAMPsignalingsystemsandstimulatesinsulinsecretionPLoSONE4e510627FelbelJTrockurBEckerTLandgrafWHofmannFRegulationofcytosoliccalciumbycAMPandcGMPinfreshlyisolatedsmoothmusclecellsfrombovinetracheaJBiolChem263167641677128YamaguchiHKajitaJMadisonJMIsoproterenolincreasesperipheralCa2ianddecreasesinnerCa2iinsingleairwaysmoothmusclecellsAmJPhysiolCellPhysiol268C771C77929YanWetalBittertastetransducedbyPLCbetadependentriseinIPandalphagustducindependentfallincyclicnucleotidesAmJPhysiolCellPhysiol280C742C75130LiggettSBGreenSABeta2AgonistsinAsthmaTreatment193431PanebraASchwarbMRGlinkaCBLiggettSBHeterogeneityoftranscriptionfactorexpressionandregulationinhumanairwayepithelialandsmoothmusclecellsAmJPhysiolLung293L453L46232LiggettSBetalAlteredpatternsofagoniststimulatedcAMPaccumulationincellsexpressingmutantβ2adrenergicreceptorslackingphosphorylationsitesMolPharmacol3664164633McGrawDWetalairwaysmoothmuscleprostaglandinEP1receptorsdirectlymodulatebeta2adrenergicreceptorswithinauniqueheterodimericcomplexJClinInvest1161400140934McGrawDWAlmoosaKFPaulRJKobilkaBKLiggettSBAntitheticregulationbyβadrenergicreceptorsofGqreceptorsignalingviaphospholipaseCunderliestheairwayβagonistparadoxJClinInvest11261962635YangXRetalMultipleryanodinereceptorsubtypesandheterogeneousryanodinereceptorgatedCa2storesinpulmonaryarterialsmoothmusclecellsAmJPhysiolLungCellMolPhysiol289L338L34836ZhangWMetalET1activatesCa2sparksinPASMClocalCa2signalingbetweeninositoltrisphosphateandryanodinereceptorsAmJPhysiolLungCellMolPhysiol285L680L69037ChengHLedererWJCannellMBCalciumsparkselementaryeventsunderlyingexcitationcontractioncouplinginheartmuscleScience26274074438SmallKMetalPolymorphismsofthecardiacpresynapticα2CadrenergicreceptorsdiverseintragenicvariabilitywithhaplotypespecificfunctionaleffectsProcNatlAcadSci101130201302539LivakKJSchmittgenTDAnalysisofrelativegeneexpressiondatausingrealtimequantitativePCRandthe2MethodMethods2540240840McGrawDWetalCrosstalkbetweenGiandGqGspathwaysinairwaysmoothmuscleregulatesbronchialcontractilityandrelaxationJClinInvest11713911398"