"エピガロカテキンガレートまたはメチル化エピガロカテキンガレート、またはその医薬的に許容される塩と、ホスホジエステラーゼ阻害剤と、を組み合わせたことを特徴とする薬剤。がん、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症または筋萎縮の治療で使用するための、請求項1に記載の薬剤。67LR陽性の疾患の治療で使用するための、請求項1または請求項2に記載の薬剤。前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がホスホジエステラーゼ3阻害剤またはホスホジエステラーゼ5阻害剤である、請求項1~請求項3のいずれか一項に記載の薬剤。前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がバルデナフィルである、請求項1~請求項3のいずれか一項に記載の薬剤。aエピガロカテキンガレートまたはメチル化エピガロカテキンガレート、またはその医薬的に許容される塩を含有する第一の単位剤形;bホスホジエステラーゼ阻害剤を含有する第二の単位剤形;及びc前記第一の単位剤形及び第二の単位剤形を収容するための容器手段;を含んでなる、がん、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症または筋萎縮の治療で使用するためのキット。本発明によれば、エピガロカテキンガレート又はその医薬的に許容される塩、又はメチル化エピガロカテキンガレート又はその医薬的に許容される塩と、ホスホジエステラーゼ阻害剤とを組み合わせたことを特徴とする、疾患の治療での使用に適した薬剤が提供される。また、本発明によれば、EGCG又はその医薬的に許容される塩、又はメチル化EGCG又はその医薬的に許容される塩と、PDE阻害剤との組み合わせを患者に投与することを含む、疾患の治療方法が提供される。本発明は特に、がん、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症及び筋萎縮等の疾患、又は、67LR陽性の疾患の治療に有用である。本明細書において、組み合わせという用語は、組み合わせの各成分が、同時に、連続的に、または個別に、患者に投与されることを想定している。したがって、本発明のEGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩と、PDE阻害剤とを組み合わせた薬剤は、一つの単位剤形中にその二つの成分が含有されている形態の薬剤であってもよく、または、EGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩を含有する第一の単位剤形と、PDE阻害剤を含有する第二の単位剤形とを組み合わせた形態の薬剤であってもよい。本明細書において、67LR陽性の疾患とは、白血病細胞において67LRが高発現しているというような、その疾患の部位細胞において67LRの発現が異常に亢進している疾患をいう。EGCG--エピガロカテキン-3-O-ガレートは緑茶葉等に含有されるポリフェノール化合物の一種である。メチル化EGCGは、下記の式I:式中、R1~R6はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基又はメトキシ基を表し、且つ、R1~R6の少なくとも一つはメトキシ基を表すの化合物である。例えば、R1~R6の一つがメトキシ基であり、他がヒドロキシル基である化合物、または、R1~R6の二つがメトキシ基であり、他がヒドロキシル基である化合物が挙げられる。具体的には、3-O-メチル-エピガロカテキン-3-ガレート、4-O-メチル-エピガロカテキン-3-ガレート、3,4-O-ジメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、3,5-O-ジメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、4’-O-メチル-エピガロカテキン-3-ガレート、4’,4-O-ジメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、4’,3,4-O-トリメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、4’,3,5-O-トリメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、3’,5’-O-ジメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、3’,5’,4-O-トリメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、3’,5’,3,4-O-テトラメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、3’,5’,3,5-O-テトラメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、3’,4’,5’-O-トリメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、3’,4’,5’,4-O-テトラメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、3’,4’,5’,3,4-O-ペンタメチル-エピガロカテキン-3-ガレート、及び3’,4’,5’,3,5-O-ペンタメチル-エピガロカテキン-3-ガレート等である。メチル化EGCGは、EGCGと同様に、67LRを介してその各種作用を奏する。メチル化EGCGとしては、3-O-メチル-エピガロカテキン-3-ガレート及び4-O-メチル-エピガロカテキン-3-ガレートが好ましい。メチル化EGCGとしては、また、下記の式II:式中、R7及びR8はそれぞれ独立にヒドロキシル基又はメトキシ基を表し、且つ、R7及びR8の少なくとも一つはメトキシ基を表すの化合物が挙げられる。具体的には、7-O-メチル-エピガロカテキン-3-ガレート等である。EGCG及びメチル化EGCGは、例えば、緑茶葉の抽出液から、HPLC、合成吸着剤クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過等の手法により単離することができる。また、EGCG及びメチル化EGCGは公知の方法で合成することもできる。本発明において、EGCG及びメチル化EGCGは、その医薬的に許容される塩として用いることもできる。医薬的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属ナトリウム、カリウム及びリチウム等との塩、及びアルカリ土類金属カルシウム及びマグネシウム等との塩が挙げられる。塩は、例えば、EGCG又はメチル化EGCGとアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物又は水素化物とを反応させて製造することができる。ホスホジエステラーゼ阻害剤は、cAMP及びcGMP等の環状リン酸ジエステルを加水分解する酵素を阻害する物質であり、非選択的なPDE阻害剤と選択的なPDE阻害剤とが知られている。本発明では、非選択的なPDE阻害剤及び選択的なPDE阻害剤のいずれも用いることができる。非選択的なPDE阻害剤としては、例えば、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、3-イソブチル-1-メチルキサンチンIBMX及びペントキシフィリンpentoxifylline等が挙げられる。選択的なPDE阻害剤としては、例えば、8-メトキシ-3-イソブチル-1-メチルキサンチン等のPDE1阻害剤、エリスロ-9-2-ヒドロキシ-3-ノニルアデニン塩酸塩EHNAhydrochloride等のPDE2阻害剤、シロスタミドcilostamide、ミルリノンmilrinone及びトレキシンtrequisin等のPDE3阻害剤、エタゾラート塩酸塩etazolatehydrochloride及びデンブフィリンdenbufylline等のPDE4阻害剤、及び、バルデナフィルvardenafil、シルデナフィルsildenafil、ザプリナストzaprinast、タダラフィルtadalafil、ジピリダモールdipyridamole、4-{[3’,4’-メチレンジオキシベンジル]アミノ}-6-メトキシキナゾリン、及び1-3-クロロアニリノ-4-フェニルフタラジンMY-5445等のPDE5阻害剤が挙げられる。本発明では、PDE3阻害剤またはPDE5阻害剤が好ましく、そして、EGCG又はその医薬的に許容される塩とPDE5阻害剤との組み合わせ、または、EGCG又はその医薬的に許容される塩とPDE3阻害剤との組み合わせ、が好ましい。本発明は、EGCG又はその医薬的に許容される塩、又はメチル化EGCG又はその医薬的に許容される塩と、PDE阻害剤とを組み合わせることを特徴とする。そして、以下の実施例より理解されるように、これら二つの成分を組み合わせて用いることにより、それぞれ単独で用いた場合に比して、顕著に増強されたがん細胞に対する致死作用が示される。また、EGCGとPDE5阻害剤との併用による抗がん作用は完全に67LR依存的であり、67LR陰性の正常細胞に重大な副作用を及ぼすことなく67LR陽性のがん細胞に対して選択的に抗がん作用を発揮することが判った。したがって、本発明のEGCG又はその医薬的に許容される塩、又はメチル化EGCG又はその医薬的に許容される塩と、PDE阻害剤と、を組み合わせた薬剤はがんの治療に有用である。本発明の薬剤は、EGCGが67LRを介して抗がん作用を発揮するがん例えば、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、前立腺がん、メラノーマ、乳がん、肺がん、子宮頸がん及び結腸がんの治療に特に有用である。また、本発明は、PDE阻害剤を組み合わせることにより、EGCGまたはメチル化EGCGの作用が増強されるということに基づく。そのため、本発明の薬剤は、がんだけではなく、67LR陽性の疾患、または、EGCG又はメチル化EGCGがそれぞれ単独でも治療に有効な作用を奏する疾患、または、EGCG又はメチル化EGCGが67LRを介して治療に有効な作用を奏する疾患、例えば、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症及び筋萎縮等の疾患の治療に有用である。本発明の薬剤は、活性成分EGCGまたはメチル化EGCG、またはその医薬的に許容される塩、またはPDE阻害剤に医薬的に許容できる希釈剤又は担体を適用して製剤化し、投与に適した剤形として提供することができる。希釈剤又は担体としては、医薬的に許容されるものであれば特に制限はなく、例えば、結合剤、崩壊剤、酸味料、発泡剤、人工甘味料、香料、滑沢剤、着色剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び界面活性剤等が挙げられる。剤形には特に制限はなく、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤及び錠剤等の固形製剤、及び、水剤、懸濁剤及び乳剤等の液剤、等の形態で提供することができる。そして、これら製剤は、希釈剤又は担体を使用し、慣用的方法で製造することができる。投与されるEGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩の量、及びPDE阻害剤の量は、対象とする疾患に対して所望の治療効果を奏するに有効な量、例えば所望の抗がん作用を提供するために有効な量、である。EGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩の一日投与量としては、例えば、0.01mg~5000mgであり、または0.1mg~50mgであり、または、0.5mg~20mgであり、または1.0mg~10mgである。PDE阻害剤の一日投与量としては、例えば、0.01mg~2000mgであり、または0.1mg~50mgであり、または、0.5mg~20mgであり、または1.0mg~10mgである。また、PDE阻害剤の一日投与量は、EGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩の一日投与量1質量部について、例えば0.01~100質量部、又は0.1~10質量部、又は0.5~5質量部、とすることができる。本発明のEGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩とPDE阻害剤とを組み合わせた薬剤は、がんの治療のために単独で用いてもよいし、または他の抗がん剤と組み合わせて用いてもよく、また、外科手術又は放射線治療と組み合わせてもよい。以下、実施例および比較例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。[材料及び方法]1EGCGとPDE5阻害剤の組み合わせによる細胞増殖抑制作用及び細胞致死作用の検討ヒト多発性骨髄腫細胞株U266は10ウシ胎児血清添加RPMIRPMI1640培地にて37°C、水蒸気飽和した5CO2条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。ヒト急性骨髄性白血病細胞株HL60は10ウシ胎児血清添加RPMI1640培地にて37°C、水蒸気飽和した5CO2条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。培養に使用したRPMI1640培地は、超純水1LあたりRPMI1640培地104g、HEPES238g、注射用ペニシリンGカリウム20万単位05vial、硫酸ストレプトマイシン注射用1g01vial、NaHCO320gを懸濁した後、フィルター滅菌した。その後、ウシ胎児血清をRPMI1640培地に添加し、細胞培養に使用した。トリパンブルー法によるEGCGとバルデナフィルの組み合わせによる抗がん作用の検討において用いたトリパンブルーは、1の濃度となるようにPBSに懸濁したものをトリパンブルー染色液とした。用いるPBSは超純水1Lに対し、NaCl80g、KCl02g、Na2HPO4115g、KH2PO02gを溶解し調製しオートクレーブ滅菌した。U266及びHL60を1FCS含有RPMI1640に5x104cellsmL及び1x104cellsmLとなるようそれぞれ調整して24wellplateに播種し、バルデナフィルが終濃度で5μMとなるよう添加した。用いたバルデナフィルは10ジメチルスルホキシド添加超純水にて5mMとなるように調整し、30°Cにて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。バルデナフィルの添加後直ちにインキュベーターに戻し、3時間経過後、EGCGを終濃度で5μMとなるように添加した。用いたEGCGは10ジメチルスルホキシド添加超純水にて5mMとなるように調整し、30°Cにて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。EGCG添加後、直ちにインキュベーターにもどし、96時間培養した。その後、充分に懸濁した細胞培養液に、終濃度が01となるようトリパンブルー染色液を添加し10分経過後、細胞数を血球計算盤により計測した。染色されないものを生細胞とみなし、細胞生存率はトリパンブルー染色を行い、その全細胞数に対する染色されない細胞の割合で求めた。その後顕微鏡による細胞の写真の撮影を行った。実験結果の統計処理にはTukey’stestを用いた。2EGCGとPDE5阻害剤の組み合わせによる細胞増殖抑制作用及び細胞致死作用における67LR関与の検討トリパンブルー法によるEGCGとバルデナフィルの組み合わせによる抗がん作用の検討において用いたトリパンブルーは1の濃度となるようにPBSに懸濁したものをトリパンブルー染色液とした。用いるPBSは超純水1Lに対し、NaCl80g、KCl02g、Na2HPO4115g、KH2PO402gを溶解し調製しオートクレーブ滅菌した。ヒト多発性骨髄腫細胞株U266及びヒト急性骨髄性白血病細胞株HL60を1FCS含有RPMI1640に5x104cellsmL及び1x104cellsmLとなるよう調整して96wellplateに播種し、バルデナフィルが終濃度で5μMとなるよう添加した。その後直ちに、終濃度が20μgmLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouseIgMが終濃度で20μgmLとなるように添加した。用いたバルデナフィルは10ジメチルスルホキシド添加超純水にて5mMとなるように調整し、30°Cにて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。各種抗体の添加後直ちにインキュベーターに戻し、3時間経過後、EGCGを終濃度で5μMとなるように添加した。用いたEGCGは10ジメチルスルホキシド添加超純水にて5mMとなるように調整し、30°Cにて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。EGCG添加後、直ちにインキュベーターにもどし、96時間培養した。その後、充分に懸濁した細胞培養液に終濃度が01となるようトリパンブルー染色液を添加し10分経過後、細胞数を血球計算盤により計測した。染色されないものを生細胞とみなし、細胞生存率はトリパンブルー染色を行い、その全細胞数に対する染色されない細胞の割合で求めた。実験結果の統計処理にはTukey’stestを用いた。3EGCGとPDE5阻害剤バルデナフィルの組み合わせによるアポトーシス誘導作用における67LR関与の検討AnnexinVPI重染色法によるEGCGとバルデナフィルの組み合わせによる抗がん作用の検討において用いたヨウ化プロピジウムPI染色液はPIを50μgmLの濃度となるようにPBSに懸濁したものをPI染色液とした。用いたPBSは超純水1Lに対し、NaCl80g、KCl02g、Na2HPO4115g、KH2PO402gを溶解し調製しオートクレーブ滅菌した。用いたAnnexinVBindingBufferは10mMHEPES140mMNaCl25mMCaCl2pH74となるよう調整しフィルター滅菌に供した。U266及びHL60を1FCS含有RPMI1640に5x104cellsmL及び1x104cellsmLになるよう調整して96wellplateに播種し、バルデナフィルが終濃度で5μMとなるよう添加した。その後直ちに、終濃度が20μgmLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouseIgMの終濃度が20μgmLとなるように添加した。用いたバルデナフィルは10ジメチルスルホキシド添加超純水にて5mMとなるように調整し、30°Cにて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。各種抗体の添加後直ちにインキュベーターに戻し、3時間経過後、EGCGを終濃度で5μMとなるように添加した。用いたEGCGは10ジメチルスルホキシド添加超純水にて5mMとなるように調整し、30°Cにて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。EGCG添加後、直ちにインキュベーターにもどし、96時間培養した。その後、充分に懸濁した細胞培養液を300×g5分にて遠心し、上清を除去した後、AnnexinVBindingBufferにて懸濁し、細胞数を血球計算盤により計測し再び300×g5分にて遠心し、1×106cellsmLとなるようAnnexinVBindingBufferにて懸濁した。この細胞懸濁液100μLに対しAnnexinVAlexaFluor488Conjugateを5μL添加しさらに事前に調製したPI染色液2μLを上から添加し、室温にて15分放置した。その後、AnnexinVBindingBuffer400μLを上から添加し、フローサイトメーターであるFACSCaliberを用いて測定を行った。コンペンセーションをかけたのちAnnexinVAlexaFluor488ConjugateはFL1にて測定し、陽性とみなされた細胞をアポトーシス細胞とした。解析はCellQuestにておこなった。実験結果の統計処理にはTukey’stestを用いた。4ヒト前立腺がんに対するEGCGとPDE5阻害剤の組み合わせによる細胞増殖抑制作用及び細胞致死作用の検討ヒト前立腺がん細胞株PC3は10ウシ胎児血清添加RPMIRPMI1640培地にて37°C、水蒸気飽和した5CO2条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。培養に使用したRPMI1640培地は、超純水1LあたりRPMI1640培地104g、HEPES238g、注射用ペニシリンGカリウム20万単位05vial、硫酸ストレプトマイシン注射用1g01vial、NaHCO320gを懸濁した後、フィルター滅菌した。その後、ウシ胎児血清をRPMI1640培地に添加し、細胞培養に使用した。トリパンブルー法によるEGCGとバルデナフィルの組み合わせによる抗がん作用の検討において用いたトリパンブルーは、1の濃度となるようにPBSに懸濁したものをトリパンブルー染色液とした。用いるPBSは超純水1Lに対し、NaCl80g、KCl02g、Na2HPO4115g、KH2PO402gを溶解し調製しオートクレーブ滅菌した。PC3は10FCS含有RPMI1640に1x104cellsmLとなるようそれぞれ調整して24wellplateに播種し、24時間前培養後バルデナフィルが終濃度で5μMとなるよう添加した2FCSRPMIに置換した。用いたバルデナフィルは10ジメチルスルホキシド添加超純水にて5mMとなるように調整し、30°Cにて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。バルデナフィルの添加後直ちにインキュベーターに戻し、2時間経過後、EGCGを終濃度で10μMとなるように添加した。用いたEGCGは10ジメチルスルホキシド添加超純水にて5mMとなるように調整し、30°Cにて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。EGCG添加後、直ちにインキュベーターにもどし、72時間培養した。その後、充分に懸濁した細胞培養液に終濃度が01となるようトリパンブルー染色液を添加し10分経過後、細胞数を血球計算盤により計測した。染色されないものを生細胞とみなし、細胞生存率はトリパンブルー染色を行い、その全細胞数に対する染色されない細胞の割合で求めた。顕微鏡による細胞の写真の撮影を行った。実験結果の統計処理にはTukey’stestを用いた。[結果]1多発性骨髄腫細胞に対するEGCGの細胞致死作用A及び細胞増殖抑制作用BにおけるPDE5阻害剤の組み合わせ効果EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤バルデナフィルによるEGCGの多発性骨髄腫に対する作用の増強について検討を行った。ヒト多発性骨髄腫細胞株U266を24wellplateに5x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、血球計算板を用いてトリパンブルー染色法による細胞生存率測定及び生細胞数測定を実施した。結果を図1に示すn3,Tukey’stest,P0001。図1に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こしたA。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強したB。さらに顕微鏡写真においても同様の結果が得られたC。これらことからPDE5選択的阻害剤であるバルデナフィルは多発性骨髄腫細胞に対するEGCGの作用を顕著に増強することが明らかになった。2急性骨髄腫性白血病細胞に対するEGCGの細胞致死作用A及び細胞増殖抑制作用BにおけるPDE5阻害剤の組み合わせ効果EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤バルデナフィルによるEGCGの急性骨髄性白血病細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト急性骨髄性白血病細胞HL60を24wellplateに1x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、血球計算板を用いてトリパンブルー染色法による細胞生存率測定及び生細胞数測定を実施した。結果を図2に示すn3,Tukey’stest,P0001。図2に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こしたA。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強したB。さらに顕微鏡写真においても同様の結果が得られたC。これらことからPDE5選択的阻害剤であるバルデナフィルは急性骨髄性白血病細胞に対するEGCGの作用を顕著に増強することが明らかになった。3多発性骨髄腫細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤の細胞致死作用A及び細胞増殖抑制作用Bにおける67LR関与の検討EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤バルデナフィルによるEGCGの多発性骨髄腫細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト多発性骨髄腫細胞株U266を96wellplateに5x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、その後直ちに、終濃度が20μgmLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouseIgMが終濃度で20μgmLとなるように添加した。3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、血球計算板を用いてトリパンブルー染色法による細胞生存率測定及び生細胞数測定を実施した。結果を図3に示すn3,Tukey’stest,P0001。図3に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こしたA。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強したB。さらに、EGCGとバルデナフィルの組み合わせによる両作用は抗67LR抗体処理によって完全にキャンセルされたA及びB。以上の結果から、EGCGとバルデナフィルの組み合わせによるがん細胞致死作用は67LR依存的であることが明らかになった。4急性骨髄性白血病細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤の細胞致死作用A及び細胞増殖抑制作用Bにおける67LR関与の検討EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤バルデナフィルによるEGCGの急性骨髄性白血病細胞に対する作用の増強について検討を行った。急性骨髄性白血病細胞株HL60を96wellplateに1x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、その後直ちに、終濃度が20μgmLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouseIgMが終濃度で20μgmLとなるように添加した。3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、血球計算板を用いてトリパンブルー染色法による細胞生存率測定及び生細胞数測定を実施した。結果を図4に示すn3,Tukey’stest,P0001。図4に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こしたA。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強したB。さらに、EGCGとバルデナフィルの組み合わせによる両作用は抗67LR抗体処理によって完全にキャンセルされたA及びB。以上の結果から、EGCGとバルデナフィルの組み合わせによるがん細胞致死作用は67LR依存的であることが明らかになった。5多発性骨髄腫細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤のアポトーシス誘導活性における67LR関与の検討EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤バルデナフィルによるEGCGの多発性骨髄腫細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト多発性骨髄腫細胞株U266を96wellplateに5x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、その後直ちに、終濃度が20μgmLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouseIgMが終濃度で20μgmLとなるように添加した。3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、AnnexinVPI重染色法によるアポトーシス細胞率測定を実施した。結果を図5に示すn3,Tukey’stest,P0001。図5に示されるように、バルデナフィル単独では細胞に対して何ら毒性を示さないものの、EGCGは単独でアポトーシスを誘導した。さらに、EGCGのアポトーシス誘導作用はバルデナフィルと併用することで顕著に増強された。また、EGCG単独、およびEGCGとバルデナフィルの組み合わせ、によるアポーシス誘導作用は抗67LR抗体処理によって完全に消失した。以上の結果から、バルデナフィルは67LRを介したEGCGのがん細胞に対するアポトーシス誘導作用を顕著に増強することが明らかになった。6急性骨髄性白血病細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤のアポトーシス誘導活性における67LR関与の検討EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤バルデナフィルによるEGCGの急性骨髄性白血病細胞に対する作用の増強について検討を行った。急性骨髄性白血病細胞株HL60を96wellplateに1x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、その後直ちに、終濃度が20μgmLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouseIgMが終濃度で20μgmLとなるように添加した。3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、AnnexinVPI重染色法によるアポトーシス細胞率測定を実施した。結果を図6に示すn3,Tukey’stest,P0001,P001。図6に示されるように、バルデナフィル単独では細胞に対して何ら毒性を示さないものの、EGCGは単独でアポトーシスを誘導した。さらに、EGCGのアポトーシス誘導作用はバルデナフィルと併用することで顕著に増強された。また、EGCG単独、およびEGCGとバルデナフィルの組み合わせ、によるアポーシス誘導作用は抗67LR抗体処理によって完全に消失した。以上の結果から、バルデナフィルは67LRを介したEGCGのがん細胞に対するアポトーシス誘導作用を顕著に増強することが明らかになった。7ヒト前立腺がん細胞株PC3に対するEGCGの細胞致死作用A及び細胞増殖抑制作用BにおけるPDE5阻害剤の組み合わせ効果EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤バルデナフィルによるEGCGの前立腺がんに対する作用の増強について検討を行った。ヒト前立腺がん細胞株PC3を24wellplateに1x104cellsmLとなるように播種し、24時間前培養後、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルが添加された培地に置換し、2時間経過後、EGCGを終濃度が10μMとなるよう添加した。96時間後、血球計算板を用いてトリパンブルー染色法による細胞生存率測定及び生細胞数測定を実施した。結果を図7に示すn3,Tukey’stest,P0001。図7に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こしたA。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強したB。さらに顕微鏡写真においても同様の結果が得られたC。これらことからPDE5選択的阻害剤であるバルデナフィルは前立腺がんに対するEGCGの作用を顕著に増強することが明らかになった。8ヒト多発性骨髄腫細胞株RPMI8226に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果バルデナフィルによるEGCGの多発性骨髄腫細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト多発性骨髄腫細胞株RPMI8226を24wellplateに5x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率A及び生細胞数Bを測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図8に示すn3,Tukey’stest,P005,P0001。図8に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こしたA。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強したB。9患者由来多発性骨髄腫に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果バルデナフィルによるEGCGの患者由来多発性骨髄腫細胞に対する作用の増強について検討を行った。患者由来多発性骨髄腫細胞を24wellplateに5x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率A及び生細胞数Bを測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図9に示すn3,Tukey’stest,P0001。図9に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することで多発性骨髄腫患者由来リンパ球に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。10ヒト形質細胞腫ARH77に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果バルデナフィルによるEGCGの形質細胞腫に対する作用の増強について検討を行った。ヒト形質細胞腫ARH77を24wellplateに5x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率A及び生細胞数Bを測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図10に示すn3,Tukey’stest,P001,P0001。図10に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでヒト形質細胞腫細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。11慢性骨髄性白血病細胞株K562に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果バルデナフィルによるEGCGの慢性骨髄性白血病細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562を24wellplateに5x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率A及び生細胞数Bを測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図11に示すn3,Tukey’stest,P001,P0001。図11に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでヒト慢性骨髄性白血病細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。12ヒト乳がん細胞株MCF7に対するEGCGの細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果バルデナフィルによるEGCGの乳がん細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト乳がん細胞株MCF7を24wellplateに1x104cellsmLとなるように播種し24時間前培養した。その後、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図12に示すn3,Tukey’stest,P0001。図12に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでヒト乳がん細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。13ヒト胃がん細胞株MKN45に対するEGCGの細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果バルデナフィルによるEGCGの胃がん細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト胃がん細胞株MKN45を24wellplateに1x104cellsmLとなるように播種し24時間前培養した。その後、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図13に示すn3,Tukey’stest,P0001。図13に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでヒト胃がん細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。14ヒト膵臓がん細胞株PANC1に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果バルデナフィルによるEGCGの膵臓がん細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト膵臓がん細胞株PANC1を24wellplateに1x104cellsmLとなるように播種し24時間前培養した。その後、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率A及び生細胞数Bを測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図14に示すn3,Tukey’stest,P001,P0001。図14に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでヒト膵臓がん細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。15ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECの生存率および細胞増殖に対するEGCGとPDE5阻害剤の併用効果バルデナフィルによるEGCGの臍帯静脈内皮細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECを24wellplateで5FCS含有EGM2培地に2x104cellsmLにて播種し、24時間前培養後した。その後各濃度0~5μMのバルデナフィルを添加したSOD、Catalase含有1FCSRPMI1640培地に置換し、3時間処理した。その後、EGCGを終濃度5μMとなるように添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率A及び生細胞数Bを測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図15に示すn3,Tukey’stest。図15に示されるように、EGCGとバルデナフィルの併用は正常細胞HUVECに対して毒性を示さなかった。16健常者由来末梢血リンパ球の生存率および細胞増殖に対するEGCGとPDE5阻害剤の併用効果バルデナフィルによるEGCGの健常者由来末梢血リンパ球に対する作用の増強について検討を行った。健常者由来末梢血リンパ球PBMCを24wellplateに5x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率A及び生細胞数Bを測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図16に示すn3,Tukey’stest。図16に示されるように、EGCGとバルデナフィルの併用は正常細胞末梢血リンパ球に対して毒性を示さなかった。17Balbcマウスに移植したマウス形質細胞腫細胞株MPC11の腫瘍形成に対するEGCGとPDE5阻害剤の併用効果バルデナフィルによるEGCGの形質細胞腫に対する作用の増強について検討を行った。マウス形質細胞腫細胞株MPC11を24wellplateに5x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図17Aに示すn3,Tukey’stest,P001。図17Aに示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでマウス形質細胞腫細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。また、5週齢メスbalbcマウスを1週間予備飼育したのち、マウス多発性骨髄腫細胞株MPC11を5X107cellsmLとなるようにRPMI培地に懸濁した懸濁物100mLを、右背部に皮下注射移植した。移植4日後、EGCG及びバルデナフィルの投与を二日に一回実施し、ノギスにて腫瘍体積の測定を実施した。結果を図17Bに示す。図中、EGCG及びVDNはそれぞれ、EGCG及びバルデナフィルの単独投与を、EGCGVardenafilはEGCGとバルデナフィルとの併用を示す。図17Bに示されるように、EGCG及びバルデナフィルをそれぞれ単独に投与した群ではマウス形質細胞腫細胞株の腫瘍形成に対する阻害作用は全く観察されなかったが、EGCGとバルデナフィルを併用した群では顕著な抗腫瘍作用が観察された。18ヒト多発性骨髄腫細胞株U266に対するメチル化EGCGとPDE5阻害剤の併用効果ヒト多発性骨髄腫細胞株U266を24wellplateに5x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間後、EGCG3メチルまたはEGCG7メチルを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。未添加群をコントロールとし、100とした。EGCG3メチル、EGCG7メチル、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図18に示すn3,Tukey’stest,P0001。図18に示されるように、EGCG3メチル及びEGCG7メチルはいずれも、バルデナフィルと併用することで多発性骨髄腫細胞に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。19前立腺がん細胞株PC3および膵臓がん細胞株PANC1に対するメチル化EGCGとPDE5阻害剤の併用効果ヒト前立腺がん細胞株PC3またはヒト膵臓がん細胞株PANC1を24wellplateに1x104cellsmLとなるように播種し、24時間前培養した。その後、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCG7メチルを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図19に示すn3,Tukey’stest,P001,P0001。図19に示されるように、EGCG7メチルはバルデナフィルと併用することで前立腺がん細胞株および膵臓がん細胞株の細胞増殖を顕著に抑制した。20慢性骨髄性白血病細胞株K562に対するEGCGの細胞増殖抑制作用におけるPDE3阻害剤の併用効果PhosphodiesteraseIIIに対する選択的阻害薬であるトレキシンによるEGCGの慢性骨髄性白血病細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562を24wellplateに5x104cellsmLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようトレキシンを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。EGCG、トレキシン未添加群をコントロールとし、100とした。結果を図20に示すn3,Tukey’stest,P0001。図20に示されるように、EGCGはトレキシンと併用することで慢性骨髄性白血病細胞株の細胞増殖を顕著に抑制した。21バルデナフィルとの併用によるEGCGの抗炎症作用Tolllikereceptor2及びTLR4発現低下作用の増強マウスマクロファージ細胞株RAW2647を5mLdishに1×105cellsmLとなるように播種し、1FCSDMEMにて24時間前培養を行った。次にバルデナフィルを5μMとなるように添加し、さらにその3時間後、EGCGをそれぞれ0μM及び10μMとなるように添加した。24時間後に細胞を回収し、Tolllikereceptor2及びTLR4発現をウエスタンブロット法を用いて測定した。結果を表1に示す。EGCGはバルデナフィルと併用することでTLR2及びTLR4の発現量を顕著に低下させた。[考察]以上の結果から、PDE3阻害剤及びPDE5阻害剤がEGCGの抗がん作用の増強剤として有効で有ることが判明した。また、EGCGとPDE5阻害剤の併用が67LR陽性がんに対する分子標的薬として極めて有効であることが示された。また、EGCGとPDE5阻害剤の併用が正常細胞に対して毒性を示さないことが判明した。参考文献KhanNAfaqFSaleemMAhmadNMukhtarHetalTargetingmultiplesignalingpathwaysbygreenteapolyphenolepigallocatechin3gallateCancerres20066625002505ShanafeltTDCallTGandZentCSetalPhaseItrialofdailyoralPolyphenonEinpatientswithasymptomaticRaistage0toIIchroniclymphocyticleukemiaJClinOncol20092738083814TachibanaHKogaKFujimuraYYamadaKAreceptorforgreenteapolyphenolEGCGNatStructMolBiol200411380381UmedaDTachibanaHYamadaKEpigallocatechin3Ogallatedisruptsstressfibersandthecontractileringbyreducingmyosinregulatorylightchainphosphorylatiomediatedthroughthetargetmolecule67kDalamininreceptorBiochemBiophysResCommun2005333628635UmedaDYanoSYamadaKTachibanaHInvolvementof67kDalamininreceptormediatedmyosinphosphataseactivationinantiproliferativeeffectofepigallocatechin3OgallateataphysiologicalconcentrationonCaco2coloncancercellsBiochemBiophysResCommun2008371172176UmedaDYanoSYamadaKTachibanaHGreenteapolyphenolepigallocatechin3gallatesignalingpathwaythrough67kDalamininreceptorJBiolChem200828330503058NelsonJMcFerranNVPivatoGetalThe67kDalamininreceptorstructurefunctionandroleindiseaseBiosciRep2008283348CioceVCastronovoVandShmooklerBMetalIncreasedexpressionofthelamininreceptorinhumancoloncancerJNatlCancerInst1991832936MenardSCastronovoVTagliabueESobelMENewinsightsintothemetastasisassociated67kDlamininreceptorJCellBiochem199767155165MenardSTaqliabueEColnaghiMIThe67kDalamininreceptorasaprognosticfactorinhumancancerBreastCancerResTreat199852137145VaccaARibattiDandRoncaliLetalMelanocytetumorprogressionisassociatedwithchangesinangiogenesisandexpressionofthe67kilodaltonlamininreceptorCancer199372455461SanjuanXFernandezPLandMiqueletalOverexpressionofthe67kDlamininreceptorcorrelateswithtumourprogressioninhumancolorectalcarcinomaJPathol1996179376380ChenFXQianYRDuanYHetalDownregulationof67LRreducesthemigratoryactivityofhumangliomacellsinvitroBrainResBull200979402408FontaniniGVignatiSandChineSetal67KilodaltonlamininreceptorexpressioncorrelateswithworseprognosticindicatorsinnonsmallcelllungcarcinomasClinCancerRes19973227231BasoloFPollinaLandPaciniFetalExpressionoftheMr67000lamininreceptorisanadverseprognosticindicatorinhumanthyroidcanceranimmunohistochemicalstudyClinCancerRes1996217771780BritschgiASimonHUToblerAFeyMFTschanMPEpigallocatechin3gallateinducescelldeathinacutemyeloidleukaemiacellsandsupportsalltransretinoicacidinducedneutrophildifferentiationviadeathassociatedproteinkinase2BrJHaematol20101495564ShammasMANeriPKoleyHetalSpecifickillingofmultiplemyelomacellsbyepigallocatechin3gallateexractedfromgreenteaactivityandtherapeuticimplicationsBlood200610828042810弘津圭祐etal緑茶カテキン受容体67LRを介したEGCGのアポトーシス誘導機構第6回日本カテキン学会抄録集、p41RiveroVilchesFJdeFrutosSSauraMRodriguezPuyolDRodriguezPuyolMetalDifferentialrelaxingresponsestoparticulateorsolubleguanylylcyclaseactivationonendothelialcellsamechanismdependentonPKGIalphaactivationbyNOcGMPAmJPhysiolCellPhysiol2003285C891898RavipatiGMcClungJAAronowWSPetersonSJFrishmanWHType5phosphodiesteraseinhibitorsinthetreatmentoferectiledysfunctionandcardiovasculardiseaseCardiolRev2007157686ValiquetteLMontorsiFAuerbachSVardenafildemonstratesfirstdosesuccessandreliabilityofpenetrationandmaintenanceoferectioninmenwitherectiledysfunctionRELYIICanUrolAssocJ20082187195BoolellMAllenMJBallardSAGepiAtteeSMuirheadGJNaylorAMOsterlohIHGingellCetalSildenafilanorallyactivetype5cyclicGMPspecificphosphodiesteraseinhibitorforthetreatmentofpenileerectiledysfunctionIntJImpotRes199684752仲原正明etal悪性腫瘍肝転移における5’NucleotidephosphodiesteraseVの腫瘍markerとしての意義:他の腫瘍markerとの比較検討日本消化器外科学会学会誌第23回日本消化器外科学会総会日消外会誌17巻2号p196"