"ワクチンを調製するためのプロセスであって、i抗原を含む液体組成物における該抗原の濃度を増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、およびii該濃縮された抗原からワクチンを処方するステップを含み、該濃縮された抗原は、ステップiとステップiiとの間、またはステップiおよびステップiiにおいて凍結乾燥されない、プロセス。前記ワクチンが、細菌、ウイルス、真菌、および/または寄生生物によって引き起こされる疾患から防御するためのものである、請求項1に記載のプロセス。前記ワクチンがインフルエンザワクチンである、請求項2に記載のプロセス。請求項3に記載のプロセスであって、該プロセスは、インフルエンザワクチンを調製するためのプロセスであり、iインフルエンザウイルス血球凝集素を含む液体組成物における該血球凝集素の濃度を増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、およびii該濃縮された抗原からインフルエンザワクチンを処方するステップを含む、プロセス。請求項4に記載のプロセスであって、該プロセスは、n個の異なるインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素を含むワクチンを調製するためのプロセスであり、in個の別個の液体組成物であって、それぞれが異なる株由来のインフルエンザウイルス血球凝集素を含む、n個の別個の液体組成物における、血球凝集素の濃度を増加させて、n個の別個の濃縮された抗原を提供するステップ、およびii該n個の別個の濃縮された抗原から多価インフルエンザワクチンを処方するステップを含み、該n個の別個の濃縮された抗原はいずれも、ステップiとステップiiとの間、またはステップiおよびステップiiにおいて凍結乾燥されない、プロセス。前記液体組成物が、外因性糖アルコールおよび/または外因性二糖を実質的に含まない、前述の請求項のいずれか一項に記載のプロセス。抗原濃度が、ステップiにおいて遠心濾過により、限外濾過により、または接線流濾過により増加する、前述の請求項のいずれか一項に記載のプロセス。抗原濃度が、ステップiにおいて接線流濾過により増加する、請求項7に記載のプロセス。ステップiが抗原濃度を少なくとも10倍増加させる、前述の請求項のいずれか一項に記載のプロセス。前記液体組成物が界面活性剤を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載のプロセス。前記界面活性剤がイオン性界面活性剤例えば、CTABまたは非イオン性界面活性剤例えば、ポリソルベート80である、請求項10に記載のプロセス。前記界面活性剤がステップiにおいて濃縮される、請求項10または請求項11に記載のプロセス。前記界面活性剤が、前記抗原が濃縮される程度より低い程度まで濃縮される、請求項12に記載のプロセス。前記界面活性剤がステップiにおいて濃縮されない、請求項10または請求項11に記載のプロセス。ステップiiが固形ワクチン形態を調製する、前述の請求項のいずれか一項に記載のプロセス。ステップiiが蒸発による乾燥を含む、請求項15に記載のプロセス。ステップiiが、前記濃縮された抗原から固形生分解性マイクロニードルを調製する、前述の請求項のいずれか一項に記載のプロセス。ステップiiが、固形マイクロニードルを前記濃縮された抗原でコーティングする、請求項1~16のいずれか一項に記載のプロセス。前記マイクロニードルが金属またはプラスチックである、請求項18に記載のプロセス。ステップiiが、前記濃縮された抗原を1つまたは複数の固形マイクロニードルの表面に適用して、前記ワクチンの注入用のコーティング型マイクロニードルデバイスを提供する、請求項18または請求項19に記載のプロセス。前記マイクロニードルが100~2500μmの長さである、請求項17~20のいずれか一項に記載のプロセス。ステップiiが前記濃縮された抗原から薄型フィルムを調製する、請求項1~16のいずれか一項に記載のプロセス。ステップiiが、前記濃縮された抗原を1つまたは複数の口腔内溶解性ポリマーと混合するステップ、次に、該混合物を用いてフィルムを形成して、前記ワクチンの頬側投与に適した薄型フィルムを提供するステップを含む、請求項22に記載のプロセス。ステップiiが、前記濃縮ワクチン抗原を1つまたは複数の局所溶解性ポリマーと混合するステップ、次に、該混合物を用いてフィルムを形成して、前記ワクチンの経皮投与に適した薄型フィルムを提供するステップを含む、請求項22に記載のプロセス。前記フィルムが10~500μm例えば、75~150μmの厚さである、請求項22~24のいずれか一項に記載のプロセス。前記抗原が前記フィルム内の微粒子の内部へカプセル化される、請求項22~25のいずれか一項に記載のプロセス。i請求項15~26のいずれか一項に記載のプロセスによって固形ワクチンを調製するステップ、次に、ii固形ワクチンを個々の単位用量小袋の中へパッケージングするステップを含む、パッケージングされたワクチンを調製するためのプロセス。前記抗原がインフルエンザ血球凝集素を含み、血球凝集素含有量が、SRIDを用いることによって前記処方ステップの前に測定される、前述の請求項のいずれか一項に記載のプロセス。前記抗原がインフルエンザ血球凝集素を含み、血球凝集素含有量が、SRIDを用いることによって前記処方ステップの後に測定される、前述の請求項のいずれか一項に記載のプロセス。前述の請求項のいずれか一項に記載のプロセスにより調製されるワクチン。被験体において免疫応答を起こす方法であって、請求項30に記載のワクチンを該被験体に投与するステップを含む、方法。インフルエンザウイルス血球凝集素を含む液体ワクチンであって、a該血球凝集素の濃度が少なくとも12mg/mlであり、b該ワクチンがスクロースを実質的に含まない、液体ワクチン。インフルエンザA型ウイルス血球凝集素を含む液体ワクチンであって、a該血球凝集素の濃度が少なくとも2mg/mlであり、b該血球凝集素がH1血球凝集素でもH3血球凝集素でもない、液体ワクチン。インフルエンザB型ウイルス血球凝集素を含む液体ワクチンであって、a該血球凝集素の濃度が少なくとも2mg/mlであり、b該インフルエンザB型ウイルスがB/Yamagata/16/88様株である、液体ワクチン。スクロースを実質的に含まない、請求項33または請求項34に記載の液体ワクチン。少なくとも2株のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素を含む液体ワクチンであって、a該血球凝集素の濃度が少なくとも2mg/ml/株であり、b該ワクチンがスクロースを実質的に含まない、液体ワクチン。マンニトールを実質的に含まない、請求項32、請求項35、または請求項36に記載の液体ワクチン。二糖および糖アルコールを実質的に含まない、請求項32、請求項35、請求項36、または請求項37に記載の液体ワクチン。抗原濃縮を、大きな水性容積の凍結乾燥、その後の、より小さな水性容積における凍結乾燥物の再構成に頼る既存のプロセスとは対照的に、本発明は、バルク抗原の凍結乾燥を、最終処方および/または送達の前に含まない抗原濃縮手順を提供する。本発明者らは、凍結乾燥手順が、所望の濃縮を達成しながら、抗原の保存期間を増強することができるとはいえ、それは抗原を損傷し得、そのため、再構成後に回復する機能性抗原の量は予想より低いことを見出した。さらに、凍結乾燥した抗原は、可溶性抗原を用いて確立された標準アッセイ例えば、血球凝集素定量化についてのSRIDアッセイにおいてうまく機能しない場合が多い。したがって、凍結乾燥を含まない濃縮手順は、最終のワクチン製造物を改善し、標準アッセイの使用を可能にし、最終ワクチンへリオプロテクタントスクロースなどを加える必要性も回避することができる。したがって、本発明は、i抗原を含む液体組成物における抗原の濃度を増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、およびii前記濃縮された抗原からワクチンを処方するステップを含み、前記濃縮された抗原がステップiとステップiiとの間、またはそれらのステップ中に凍結乾燥されない、ワクチンを調製するためのプロセスを提供する。本発明はまた、このプロセスによって調製されたワクチンを提供する。本発明は、固形ワクチン形態を調製するのに特に有用である。本発明はまた、iインフルエンザウイルス血球凝集素を含む液体組成物における血球凝集素の濃度を増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、およびii前記濃縮された抗原からインフルエンザワクチンを処方するステップを含み、前記濃縮された抗原がステップiとステップiiとの間、またはそれらのステップ中に凍結乾燥されない、インフルエンザワクチンを調製するためのプロセスを提供する。本発明はまた、iそれぞれが異なる株由来のインフルエンザウイルス血球凝集素を含むn個の別個の液体組成物における、インフルエンザウイルス血球凝集素の濃度を増加させて、n個の別個の濃縮された抗原を提供するステップ、およびii前記n個の別個の濃縮された抗原から多価インフルエンザワクチンを処方するステップを含み、前記n個の別個の濃縮された抗原のいずれもが、ステップiとステップiiとの間、またはそれらのステップ中に凍結乾燥されない、n個の異なるインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素を含むワクチンを調製するためのプロセスを提供する。nの値は2以上例えば、2、3、4、または5であるが、典型的には、3すなわち、三価インフルエンザワクチンまたは4すなわち、四価インフルエンザワクチンである。本発明はまた、インフルエンザウイルス血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、a前記血球凝集素の濃度が少なくとも12mg/mlであり、b前記ワクチンがスクロースを実質的に含まない、バルク液体ワクチンを提供する。本発明はまた、少なくとも2株のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、a前記血球凝集素の濃度が少なくとも2mg/ml/株であり、b前記ワクチンがスクロースを実質的に含まない、バルク液体ワクチンを提供する。抗原本発明は、様々な供給源由来の抗原を濃縮するのに有用である。抗原は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生生物由来であってもよい。したがって、ワクチンは、細菌、ウイルス、真菌、および/または寄生生物によって引き起こされる疾患から防御し得る。本発明に関して用いられる典型的な細菌には、以下が挙げられるが、それらに限定されない:B.pertussisなどのBordetella。C.tetaniおよびC.botulinumなどのClostridia。C.diphtheriaeなどのCorynebacteria。HaemophilusinfluenzaeなどのPasteurella。M.tuberculossi、M.bovis、および弱毒BacillusCalmetteGuerinなどのMycobacteria。N.meningitidisおよびN.gonorrhoeaeなどのNeisseria。S.typhi、S.paratyphi、S.typhimurium、S.enteritidisなどのSalmonella。S.pneumoniaepneumococcus、S.agalactiae、およびS.pyogenesなどのStreptococci。本発明に関して用いられる典型的なウイルスには、以下が挙げられるが、それらに限定されない。インフルエンザA型、B型、またはC型ウイルスなどのオルトミクソウイルス。インフルエンザA型またはB型ウイルスは、パンデミック間期例年/季節性の株であってもよいし、またはパンデミック発生を引き起こす可能性をもつ株由来であってもよいすなわち、現在広まっている株における血球凝集素と比較して新しい血球凝集素を有するインフルエンザ株、またはトリ被験体において病原性であり、かつヒト集団において水平方向に伝染する可能性を有するインフルエンザ株、またはヒトにとって病原性であるインフルエンザ株。特定の季節および株の性質に依存して、インフルエンザA型ウイルスは、1つまたは複数の以下の血球凝集素亜型に由来し得る:H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、またはH16。より詳細には下記に示されている。肺炎ウイルスRSV、パラミクソウイルスPIV、およびモルビリウイルス麻疹などのパラミクソウイルス科ウイルス。肺炎ウイルスまたはメタ肺炎ウイルスmetapneumovirus、例えば、RSウイルスRSV、ウシRSウイルス、マウス肺炎ウイルス、および七面鳥鼻気管炎ウイルス。好ましくは、肺炎ウイルスは、RSVまたはヒトメタ肺炎ウイルスHMPVである。パラインフルエンザウイルスPIV1型、2型、3型、または4型、ムンプス、センダイウイルス、サルウイルス5、ウシパラインフルエンザウイルス、およびニューカッスル病ウイルスなどのパラミクソウイルス属。好ましくは、パラミクソウイルス属はPIVまたはムンプスである。エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルス、およびアフトウイルスなどのピコルナウイルス科。エンテロウイルスには、ポリオウイルス1型、2型、または3型、コクサッキーAウイルス1型~22型、および24型、コクサッキーBウイルス1型~6型、エコーウイルスECHOウイルス1型~9型、11型~27型、および29~34型、ならびにエンテロウイルス68型~71型が挙げられる。好ましくは、エンテロウイルスは、ポリオウイルス、例えば、MahoneyもしくはBrunendersなどの1型株、MEF-1などの2型株、またはSaukettなどの3型株である。ヘパルナウイルスヘパトウイルスとも名付けられているの例はA型肝炎ウイルスである。ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスなどのトガウイルス科。風疹ウイルスなどのルビウイルスが好ましい。不活性化のための有用なアルファウイルスには、サケ膵臓病ウイルスおよび睡眠病ウイルスなどの水生のアルファウイルスが挙げられる。ダニ媒介性脳炎TBE、デング1型、2型、3型、または4型、黄熱病、日本脳炎、ウエストナイル脳炎、セントルイス脳炎、ロシア春夏脳炎、ポワッサン脳炎などのフラビウイルス属。C型肝炎ウイルスHCV。ウシウイルス性下痢症BVDV、ブタコレラCSFV、またはボーダー病BDVなどのペスチウイルス。B型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルス。リッサウイルス例えば、狂犬病ウイルスおよびベシクロウイルスVSVなどのラブドウイルス。ノーウォークウイルス、ならびにハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなどのノーウォーク様ウイルス、ならびにブタ小水疱性発疹ウイルスなどのベシウイルスなどのカリシウイルス科。SARS、ヒト呼吸器コロナウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルスIBV、マウス肝炎ウイルスMHV、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルスTGEVなどのコロナウイルス。オンコウイルス、レンチウイルス、またはスプマウイルスなどのレトロウイルス。オンコウイルスは、HTLV-1、HTLV-2、またはHTLV-3であってもよい。レンチウイルスは、SIV、HIV-1、またはHIV-2であってもよい。オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスなどのレオウイルス属。パルボウイルスB19またはボカウイルスなどのパルボウイルス属。単純ヘルペスウイルスHSV、水痘帯状疱疹ウイルスVZV、エプスタインバーウイルスEBV、サイトメガロウイルスCMV、ヒトヘルペスウイルス6HHV6、ヒトヘルペスウイルス7HHV7、およびヒトヘルペスウイルス8HHV8などのヒトヘルペスウイルス。パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなどのパポバウイルス。パピローマウイルスには、HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63、および65が挙げられる。ヒトアデノウイルスA、B、C、D、E、F、またはGのいずれかを含むアデノウイルス科。本発明は、ウイルス用ワクチン、特に、ワクチン抗原がウイルス表面糖タンパク質であるウイルス用ワクチンを調製するのに理想的である。したがって、本発明は、下でより詳細に記載されているように、インフルエンザワクチンを調製するためにインフルエンザウイルス血球凝集素を濃縮するのに理想的である。濃縮ステップは、>5mg/ml、>10mg/ml、>15mg/ml、>20mg/ml、>25mg/ml、およびさらに>30mg/mlのHA含有量を有するインフルエンザワクチン抗原を提供することができる。液体組成物本発明のプロセスは、液体組成物における抗原の濃度を増加させ、それにより、処方物を目的とした濃縮された抗原を提供する。好ましい液体組成物は、凍結乾燥されたことがないものである。好ましい液体組成物は、リオプロテクタントlyoprotectantを実質的に含まない。したがって、組成物は、外因性糖アルコール特に:ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトールおよび/または外因性二糖特に:スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオースを実質的に含まなくてもよい。したがって、液体組成物におけるソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオースの合わせた濃度は、10mg/ml未満すなわち、1未満であってもよいが、理想的には、1mg/ml未満、例えば、0.1mg/ml未満である。典型的な液体組成物は、例えば、少なくとも500回のワクチンの別個のヒト単位用量についての十分な抗原を含有する、バルクワクチンである。液体組成物は、一価すなわち、1つだけの病原体から防御するためのワクチン抗原を含有するでも、多価すなわち、1つより多い病原体から防御するためのワクチン抗原を含有し、1つより多い様々な非交差防御性病原体例えば、複数の髄膜炎菌血清型または複数のインフルエンザA型ウイルス血球凝集素型が存在する場合を含むでもよい。それは、好ましくは、一価である。本発明は、様々なワクチン抗原濃度を有する液体試料に関して用いることができる。典型的には、液体試料は、ワクチン抗原を少なくとも1μg/mlの濃度で含む。濃縮ステップ本発明のプロセスは、抗原の濃度が増加するステップを含む。この濃縮ステップに様々な技術を用いることができ、それらには、遠心濾過、限外濾過、または接線流濾過交差流濾過としても知られているが挙げられるが、それらに限定されない。凍結乾燥を必要としないのにもかかわらず、良好な濃縮を達成することができるので、好ましい方法は、TFFを用いる。遠心濾過は、液体のフィルターを通しての遠心分離を含む。フィルターは、抗原を保持して濃縮するが、溶媒または小さい溶質を保持しない。濾液の容積が増加するにつれて、保持分retentateにおける抗原の濃度もまた増加する。この技術は、典型的には、固定角ローターを用いる。種々の適切な遠心濾過デバイスが市販されており、例えば、商標Centricon商標、Vivaspin商標、およびSpintek商標として販売されている製品である。フィルターのカットオフは、目的の抗原が保持分中に保持されるように選択される。限外濾過は、液体を半透膜に対して押す静水圧の使用を含む。フィルターは、抗原を保持して濃縮するが、溶媒または小さい溶質を保持しない。静水圧の連続的な適用によって、濾液の容積が増加し、それにしたがって、保持分における抗原の濃度もまた増加する。多くの限界濾過膜が市販されている。限外濾過膜の分子量カットオフMWCOは、どの溶質が膜を通過することができるかすなわち、濾液へ、およびどれが保持されるかすなわち、保持分中を決定する。本発明に関して用いられるフィルターのMWCOは、目的の抗原の実質的に全部が保持分に留まるように選択される。接線流濾過TFFは、液体をフィルター膜にわたって接線方向に通すことを含む。試料側は、典型的には、濾液側に対して陽圧で保たれる。液体がフィルターの上を流れるとき、その中の成分は、膜を通って濾液へと通過することができる。連続流は、濾液の容積を増加させ、それにしたがって、保持分における抗原の濃度は増加する。TFFは、デッドエンド濾過と対照をなし、そのデッドエンド濾過において、試料は、膜に対して接線方向ではなく、膜を貫いて通る。多くのTFFシステムが市販されている。TFF膜のMWCOは、どの溶質が膜を通って通過することができるかすなわち、濾液中、およびどれが保持されるかすなわち、保持分中を決定する。本発明に関して用いられるTFFフィルターのMWCOは、目的の抗原の実質的に全部が保持分に留まるように選択される。これらの3つの濃縮技術は相互排他的ではなく、例えば、本発明は、接線流限外濾過を用いることができる。どの技術が選択されようと、それは、好ましくは、目的の抗原の濃度を少なくともn倍nは5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、またはそれ以上である増加させる。処方ステップ抗原濃縮後、本発明のプロセスは、任意の中間の凍結乾燥なしで、濃縮された抗原をワクチンとして処方する。処方ステップもまた、抗原の凍結乾燥を含まない。理想的には、処方後の凍結乾燥もなく、すなわち、ワクチン抗原は、濃縮の開始から患者投与まで、凍結乾燥を回避する。本発明は、様々なワクチン処方物を調製するために用いることができる。濃縮ステップを用いるということは、本発明が、患者への少量の材料の送達に関わる技術にとって理想的であることを意味する。例えば、本発明は、例えば、皮内注射用の0.1ml以下の単位用量容積を有する液体ワクチン処方物を調製するのに有用である。本発明はまた、固形しかし、凍結乾燥されていないワクチン処方物を調製するのに有用であり、なぜならば、それは、高い抗原濃度を必要とし得るためである。下でより詳細に記載されているように、適切な固形処方物には、固形生分解性マイクロニードル、コーティング型マイクロニードル、および薄型フィルムが挙げられるが、それらに限定されない。したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは、濃縮された抗原から固形ワクチン形態を調製することを含んでもよい。このステップは、乾燥を含んでもよいが、凍結乾燥を含まず、例えば、それは蒸発を含んでもよい[11]。リオプロテクタントは、凍結乾燥には関係のない理由で例えば、コーティングを増強するために、処方物に加えられる場合が多いが、本発明の処方ワクチンは、リオプロテクタントを実質的に含まない場合がある。それゆえに、いくつかの実施形態において、本発明の処方ワクチンは、糖アルコール特に、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトールおよび/または二糖特に、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオースを実質的に含まなくてもよい。したがって、処方ワクチンにおけるソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオースの合わせた濃度は、10mg/ml未満すなわち、1未満、例えば、1mg/ml未満または0.1mg/ml未満であってもよい。処方ステップは、理想的には、濃縮された抗原が適切な効力を保持することを保証するために、濃縮ステップの4週間以内例えば、2週間以内に実施される。本発明のワクチンは、理想的には、イヌリンを含まない。また、本発明のワクチンは、理想的には、ウイルス抗原をカプセル化する表面活性物質ベシクルを含まない。固形生分解性マイクロニードル本発明を用いて調製することができる一つの有用な固形処方物は、固形生分解性マイクロニードルである。これらは、典型的には、単独で投与されず、むしろ、複数のニードルが同時に、例えば、複数のマイクロニードルを含む皮膚パッチとして、投与される。マイクロニードルは、固形であって、保存中、構造的完全性を保持し、かつパッチが適用される場合、被験体の皮膚に貫入することができるような、固形である。皮膚貫入に必要とされる力学特性は、問題になっている生物体に依存するが、それらは、通常、ヒト皮膚に貫入するのに十分な強度を有する。適切な固形ニードルを形成するための材料は、容易に入手可能であり、これらを、任意の特定のニーズのために、試験して、適当な濃度などを決定することができる。マイクロニードルは生体溶解性biosolubleかつ生分解性である。したがって、固形材料は、参考文献2および3下記参照に用いられたコーティング型マイクロニードルとは対照的に、パッチが適用された後、皮膚において溶解する。溶解して、その後、材料は、代謝されて、無害な最終生成物が生成される。パッチを適用した後の溶解のタイムスケールは様々であり得るが、溶解は、典型的には、パッチを適用した後すぐに例えば、10秒以内に、開始し、例えば、最高1分間、5分間、10分間、20分間、30分間、1時間、5時間、10時間、または24時間、マイクロニードルが完全に溶解するまで、続き得る。適切なインビボ溶解動態をもつ材料は、容易に入手可能であり、これらは様々であり得、任意の所望の溶解プロフィールのために試験して、適当な濃度などを決定することができる。マイクロニードルを形成するための適切なマトリックス材料は、典型的には、生体溶解性かつ生分解性ポリマーであり、これらは、1つまたは複数の炭水化物を含んでもよい。例えば、材料は、セルロース、デキストリン、デキストラン、二糖、キトサン、キチンなど、またはそれらの混合物を含んでもよい。他のGRAS材料もまた用いてもよい。適切なセルロースには、セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられるが、それらに限定されない。適切なデキストリンには、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロデキストリン、イコデキストリン、黄色デキストリン、および白色デキストリンが挙げられるが、それらに限定されない。適切な二糖には、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、およびセロビオースが挙げられるが、それらに限定されない。生体溶解性かつ生分解性マイクロニードルを形成するための一つの適切な材料は、デキストリン/トレハロース混合物である。マイクロニードルは、皮膚に貫入することができる。それらは、表皮に貫入して、真皮へ材料を送達するすなわち、皮内送達のに十分な長さであるべきであるが、理想的には、それらが皮下組織の中へ、またはそれを越えて、貫入することができるほど長くはない。それらは、典型的には、長さが100~2500μm、例えば、長さが1250~1750μm、または約1500μmである。送達時点において、先端は、真皮に貫入していてもよいが、ニードルの基部は、表皮に留まったままであってもよい。マイクロニードルは、様々な形および幾何学的配置をもち得る。それらは、典型的には、皮膚接触skin-facing点で先細になっており、例えば、角錐または円錐としての形をとる。<500μmの最大直径をもつ先細のマイクロニードルが典型的である。単一のパッチは、典型的には、複数のマイクロニードル、例えば、パッチあたり≧10個、≧20個、≧30個、≧40個、≧50個、≧60個、≧70個、≧80個、≧90個、≧100個、≧200個、≧300個、≧400個、≧50個、≧750個、≧1000個、またはそれより多い個数を含む。パッチが複数のマイクロニードルを含む場合、それは、マイクロニードルの全部が付着しているバッキング層を含んでもよい。≧20個の突出したマイクロニードルを有する単一のバッキング層が典型的である。パッチが複数のマイクロニードルを含む場合、これらを、規則的な反復パターンもしくはアレイで配置することができ、または不規則に配置されてもよい。パッチは、典型的には、3cm2以下、例えば、<2cm2または<1cm2の面積を有する。0.5cm~1.5cmの直径を有する円形パッチが有用である。パッチ上のマイクロニードルの密度は、様々であり得るが、≧10個cm-2、≧20個cm-2、≧30個cm-2、≧40個cm-2、≧50個cm-2、≧60個cm-2、≧70個cm-2、≧80個cm-2、またはそれより大きい密度であってもよい。本発明のパッチは、皮膚接触内面および環境接触外面を有する。内面は、被験体の皮膚への接着性を促進するために接着剤を含んでもよい。存在する場合、それは、好ましくは、マイクロニードル自体に存在せず、すなわち、マイクロニードルは接着剤を含まない。内面上に接着剤を有するのではなく、パッチは、例えば、絆創膏またはニコチンパッチに見られるような、パッチを皮膚に接着させるための接着性外側縁を提供する追加のバッキングを有してもよい。上記のようなパッチは、参考文献4~8における技術およびガイダンスに従うことによって作製することができる。例えば、1.5mmの長さのマイクロニードルの空洞を有する型を調製することができる。デキストリンおよびトレハロースのマトリックス材料を、インフルエンザワクチンと混合することができ、この水性材料を、遠心力で型に入れ、固形マイクロニードルのアレイを形成することができる。その後、セルロースゲルを、マトリックス/ワクチン混合物例えば、その混合物はフィルムを形成しているの上に入れ、パッチの上にバッキング層を形成することができる。この層が乾燥したならば、それを取り出し、固形マイクロニードルが突出するパッチが、生み出され得る。したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは以下のステップを含んでもよい:a生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料を濃縮ワクチン抗原と混合するステップ;およびbマイクロニードルを形成するためにステップaからの混合物を、空洞を含有する型に加えるステップ。それはさらに以下のステップを含んでもよい:c前記混合物を型において固化させてset、固形マイクロニードルが形成されるステップ;d任意で、固化マイクロニードルに材料を適用して、バッキング層を提供するステップ;およびeマイクロニードルおよび任意のバッキング層を型から取り出すステップ。パッチを、個々の小袋の中へパッケージングし、例えば、窒素下で密閉し、その後、熱密閉してもよい。それらは、マイクロニードルへの損傷を避けるために注意深く保存されるべきである。コーティング型マイクロニードル本発明を用いて調製することができる別の有用な固形処方物は、コーティング型マイクロニードルである。これらは、典型的には、単独で投与されず、むしろ、複数のニードルが同時に、例えば、複数のマイクロニードルにより、投与される。一つの適切な製造物は、Macroflux商標Zosanoの商標として販売されている。マイクロニードルは、保存中、構造的完全性を保持し、かつ被験体の皮膚に貫入することができるような、固形である。皮膚貫入に必要とされる力学特性は、問題になっている生物体に依存するが、それらは、通常、ヒト皮膚に貫入するのに十分な強度を有する。マイクロニードルは固形であり、患者の皮膚への挿入後、上記で論じられた生分解性マイクロニードルとは対照的に無傷のままである。適切な固形ニードルを形成するための材料は、容易に入手可能であり、これらを、任意の特定のニーズのために、試験し、選択することができ、例えば、金属ステンレススチールなどまたはポリマーポリカーボネートなど、理想的には医療グレードである。金属ニードルは、レーザーカッティングおよび電解研磨を用いて製作することができる[9]。ポリマーニードルは、マイクロ複製microreplicationおよび/またはマイクロ成形micromolding射出成形を含むによって製作することができる。適切なマイクロニードルは、参考文献2、3、および9~13に開示されている。本発明の濃縮された抗原を、マイクロニードル上にコーティングすることができる。このコーティングは、例えば、浸漬ステップ、その後の、例えば、蒸発による乾燥ステップ必要に応じてそれらのステップを繰り返すを含む、浸漬コーティングdip-coatingなどの簡単なプロセスによって達成することができる。他の有用なコーティング技術は、参考文献11に開示されている。したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは、以下のことを含んでもよい:濃縮ワクチン抗原を1つまたは複数の固形マイクロニードルの表面へ適用して、ワクチンの注入用のコーティング型マイクロニードルデバイスを提供すること。ニードルに適用するためのコーティング溶液は、1つまたは複数の生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料を含むことができ、これらは、1つまたは複数の炭水化物を含んでもよい。例えば、材料は、セルロース、デキストリン、デキストラン、二糖、キトサン、キチンなど、またはそれらの混合物を含んでもよい。他のGRAS材料もまた用いてもよい。適切なセルロース、デキストリン、および二糖は上記に列挙されている。したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは以下のステップを含んでもよい:a生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料を濃縮ワクチン抗原と混合するステップ;およびbステップaからの混合物を、1つまたは複数の固形マイクロニードルの表面に適用し、ワクチンの注入用のコーティング型マイクロニードルデバイスを提供するステップ。コーティングを、参考文献11に記載されているように、1つまたは複数の沈着増強成分を用いることによって増強させてもよい。上記で論じられた適用ステップは、適用サブステップ、続く乾燥サブステップを含んでもよく、この対のサブステップは、1回、または1回より多く、例えば、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、またはより多い回数、実施することができる。デバイスにおけるマイクロニードルは、適用された場合、皮膚に貫入することができる。それらは、表皮に貫入して、真皮へ材料を送達するすなわち、皮内送達のに十分な長さであるべきであるが、理想的には、皮下組織の中へ、またはそれを越えて、貫入することができるほど長くはない。それらは、典型的には、長さが100~2500μm、例えば、長さが250~750μm、または約1500μmである。送達時点において、先端は、真皮に貫入していてもよいが、ニードルの基部は、表皮に留まったままであってもよい。ニードルを、患者の皮膚に、30秒間~30分間、適用し、その後、取り除くことができる。マイクロニードルは、様々な形および幾何学的配置をもち得る。それらは、典型的には、皮膚接触点で先細になっており、例えば、角錐または円錐としての形をとる。<500μmの最大直径をもつ先細のマイクロニードルが典型的である。マイクロニードルデバイスは、典型的には、複数のマイクロニードル、例えば、デバイスあたり≧10個、≧20個、≧30個、≧40個、≧50個、≧60個、≧70個、≧80個、≧90個、≧100個、≧200個、≧300個、≧400個、≧50個、≧750個、≧1000個、≧1500個、≧2000個、またはそれより多い個数を含む例えば、デバイスあたり300~1500個。デバイスが複数のマイクロニードルを含む場合、これらは全て、典型的には、単一のバッキング層に付着している。デバイスが複数のマイクロニードルを含む場合、これらを、規則的な反復パターンもしくはアレイで配置することができ、または不規則に配置されてもよい。マイクロニードルデバイスは、典型的には、3cm2以下、例えば、<2cm2または<1cm2の面積を有する。0.5cm~1.5cmの直径を有する円形デバイスが有用である。マイクロニードルの密度は、様々であり得るが、≧10個cm-2、≧20個cm-2、≧30個cm-2、≧40個cm-2、≧50個cm-2、≧60個cm-2、≧70個cm-2、≧80個cm-2、またはそれより大きい密度であってもよい。各マイクロニードル間が2mmで、14個のマイクロニードル/cm2の密度をもつデバイスが有用である。マイクロニードルデバイスは、皮膚接触内面および環境接触外面を有する。内面は、被験体の皮膚への接着性を促進するために接着剤を含んでもよい。存在する場合、それは、好ましくは、マイクロニードル自体に存在せず、すなわち、マイクロニードルは接着剤を含まない。内面上に接着剤を有するのではなく、デバイスは、デバイスを皮膚に接着させるための接着性外側縁を提供する追加のバッキングを有してもよい。マイクロニードルデバイスを、個々の小袋の中へパッケージングし、例えば、窒素下で密閉し、その後、熱密閉してもよい。それらは、マイクロニードルへの損傷を避けるために注意深く保存されるべきである。薄型フィルム本発明を用いて調製することができる別の有用な固形処方物は、薄型経口フィルムなどの薄型フィルムである。これらのフィルムは、唾液および頬組織との接触で、湿り、迅速に溶解し、それゆえに、口の中でワクチン抗原を放出する。これらの薄型フィルムの主要な成分は、典型的には、1つまたは複数の親水性ポリマー複数可であり、そのポリマーは、良好な粘膜接着特性を有し得、完全に溶解するまで頬組織への強い接着を与える。同じようなフィルムは、非経口送達、例えば、参考文献14に開示されているような経皮投与に用いることができる。適切な薄型フィルムは、典型的には、最初に適用される場合、厚さが10~500μm、例えば、厚さ75~150μmである。患者の口に、例えば、ヒト成人の口に、またはヒト幼児の口に適合するそれらの他の寸法が適し得る。一つの適切な型のフィルムは、参考文献15に開示されている。このフィルムは、i粘膜接着性層としてNoveonおよびEudragitS-100、およびii不透過性バッキング層として医薬品ワックスを有する粘膜接着性二層フィルムを含む。これらのフィルムのさらなる詳細は参考文献16にある。別の適切な型のフィルムは参考文献17に開示されている。このフィルムは以下を含む:a1つまたは複数の水溶性ポリマー;b1つまたは複数の粘膜接着性ポリマー;c微粒子内にカプセル化されたワクチン抗原。適切な水溶性ポリマーには、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、キサンタンガム、トラガカントゴム、グアーガム、アカシアゴム、アラビアゴム、ポリアクリル酸、メタクリル酸メチルコポリマー、カルボキシビニルポリマー、アミラーゼamylase、高アミラーゼスターチ、ヒドロキシプロピル化高アミラーゼスターチ、デキストリン、ペクチン、キチン、レバン、エルシナン、コラーゲン、ゼラチン、ゼイン、グルテン、大豆タンパク質分離物、乳漿タンパク質分離物、およびカゼインが挙げられるが、それらに限定されない。適切な粘膜接着性ポリマーには、キトサン、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリL-リシン、ポリエチレンイミン、ポリエチレンオキシド、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、およびそれらの誘導体またはコポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。有用な微粒子は、口の中でなお存在しているが、カプセル化された粒子の内容物すなわち、ワクチン抗原を放出する材料でできている。参考文献14におけるフィルムは、経皮送達のために、陽イオン性ポリβ-アミノエステルを含む。本発明に関して有用な経口フィルムは、ワクチンを、投与中、より美味にさせる矯味矯臭薬を含んでもよい。薄型フィルムは、様々なプロセスによって作製することができ、そのプロセスには、溶媒キャスティングsolventcasting;ホットメルト押し出し成形;固形分散押し出し成形;および圧延が挙げられるが、それらに限定されない。本発明のプロセスにおける処方ステップは、以下のステップを含んでもよい:a濃縮ワクチン抗原を1つまたは複数の口腔内溶解性ポリマーと混合するステップ;およびbステップaからの混合物を用いてフィルムを形成して、ワクチンの頬側投与に適した薄型フィルムを提供するステップ。本発明のプロセスにおける処方ステップは、以下のステップを含んでもよい:a濃縮ワクチン抗原をポリβ-アミノエステルなどの1つまたは複数の局所溶解性ポリマーと混合するステップ;およびbステップaからの混合物を用いてフィルムを形成して、ワクチンの経皮投与に適した薄型フィルムを提供するステップ。これらのフィルムを、個々の単位用量の小袋の中へパッケージングし、例えば、窒素下で密閉し、その後、熱密閉してもよい。小袋は、保存中、フィルムを乾燥状態に保つために防水であるべきである。処置およびワクチンの投与の方法本発明の処方ワクチンを、被験体に、例えば、皮膚を通して、頬組織を通して、送達することができる。したがって、本発明は、本発明の処方ワクチンを被験体に投与するステップを含む、被験体において免疫応答を起こす方法を提供する。これは、例えば、マイクロニードルが被験体の真皮に貫入するように、マイクロニードルパッチまたはデバイスを被験体の皮膚に適用すること、または薄型フィルムを被験体の頬組織もしくは舌に適用することを含んでもよい。本発明はまた、被験体にワクチン接種する方法に用いる濃縮された非凍結乾燥抗原を提供する。本発明はまた、被験体において免疫応答を起こすための薬物の製造における濃縮された非凍結乾燥抗原の使用を提供する。ワクチン製造物は、ヒトまたは非ヒト動物の被験体にワクチンを投与するのに適している。これらの方法および使用によって起こされた免疫応答は、一般的に、抗体応答、好ましくは、防御抗体応答を含む。マイクロニードルパッチまたはデバイスは、例えば、絆創膏または公知の皮膚パッチについてのように簡単な手による適用により皮膚に適用されてもよいし、バネ駆動式注入器を用いて適用されてもよい。本発明により調製されるワクチンは、小児と成人のどちらも処置するのに用いることができる。処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールによることができる。複数回投与は、一次免疫スケジュールおよび/または追加免疫スケジュールにおいて用いられてもよい。複数回投与は、典型的には、少なくとも1週間例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など離して、投与される。インフルエンザワクチン接種本発明のプロセスは、インフルエンザワクチンを調製するのに理想的である。様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンが現在利用可能であり例えば、参考文献18の17章および18章を参照、現在のワクチンは、不活性化ウイルスかまたは弱毒化生ウイルスかのいずれかに基づいている。不活性化ワクチン全ウイルス、スプリットビリオン、または表面抗原は、筋肉内または皮内注射によって投与されるが、生ワクチンは鼻腔内に投与される。本発明は、これらのワクチン形態の全部に関して用いることができる。本発明のいくつかの実施形態は、表面抗原インフルエンザワクチン不活性化型を用いる。そのようなワクチンは、スプリットビリオンワクチンまたは全ビリオンワクチンより少ないウイルス成分を含有する。それらは、表面抗原血球凝集素、および典型的には、ノイラミニダーゼも含む。これらのタンパク質をインフルエンザウイルスから精製された形態で調製するためのプロセスは、当技術分野においてよく知られている。FLUVIRIN商標、AGRIPPAL商標、およびINFLUVAC商標製品は、表面抗原インフルエンザワクチンの例である。本発明が表面抗原インフルエンザワクチンを用いる場合、このウイルスは、卵内で成長していてもよいし、または細胞培養で成長していてもよい下記参照。ワクチン用のインフルエンザウイルス成長のための現在の標準方法は、孵化SPF鶏卵を用い、ウイルスは、卵内容物尿膜腔液から精製される。卵に基づいたウイルス成長が用いられる場合には、1つまたは複数のアミノ酸が卵の尿膜腔液へウイルスと共に導入されてもよい[24]。ウイルスはまず、卵内で成長する。その後、それは感染した卵から採取される。ビリオンは、尿膜腔液から様々な方法によって採取することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊する界面活性剤を含む線形スクロース勾配溶液を用いるゾーン遠心分離を含んでもよい。その後、抗原は、任意の希釈後、ダイアフィルトレーションによって精製されてもよい。ウイルスを不活性化するための化学的手段には、有効量の1つまたは複数の以下の作用物質での処理を含む:界面活性剤、ホルムアルデヒド、β-プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレンC60、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはそれらの組み合わせ。ウイルス不活性化の非化学的方法は、例えば、UV光またはγ線照射など、当技術分野において知られている。本発明のいくつかの実施形態は、全ウイルス、スプリットウイルス、ビロソーム、弱毒化生ウイルス、または組換え血球凝集素を用いることができる。これらのワクチンは、それらの抗原を、例えば、余分のインフルエンザウイルスタンパク質の存在について、試験することによって、表面抗原ワクチンと容易に区別することができる。不活性化全ウイルスは、例えば、卵または培地から得られたウイルス含有液からビリオンを採取し、その後、上記のようにそれらを処理することによって、得ることができる。スプリットビリオンは、精製されたビリオンを界面活性剤例えば、エチルエーテル、ポリソルベート80、デオキシコレート、トリ-N-ブチルリン酸、TritonX-100、TritonN101、臭化セチルトリメチルアンモニウム、TergitolNP9などで処理し、サブビリオン調製物を生じることによって得られる例えば、Tween-エーテルスプリッティングプロセス。例えばインフルエンザウイルスを、スプリットする方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、参考文献19~24などを参照されたい。ウイルスのスプリッティングは、典型的には、感染性か非感染性かにかかわらず、全ウイルスを破壊濃度のスプリッティング剤で破壊または断片化することによって行われる。破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的可溶化を生じ、ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリッティング剤は、非イオン性およびイオン性例えば、陽イオン性表面活性物質、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレン-アルキルエーテル、N,N-ジアルキル-グルカミド、Hecameg、アルキルフェノキシ-ポリエトキシエタノール、NP9、四級アンモニウム化合物、サルコシル、CTAB臭化セチルトリメチルアンモニウム、トリ-N-ブチルリン酸、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびDOT-MA、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール例えば、TritonX-100またはTritonN101などのTriton表面活性物質、ポリオキシエチレンソルビタンエステルTween表面活性物質、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。一つの有用なスプリッティング手順は、デオキシコール酸ナトリウムとホルムアルデヒドの連続効果を用い、スプリッティングは、最初のビリオン精製中に例えば、スクロース密度勾配溶液中で起こり得る。したがって、スプリッティングプロセスは、非ビリオン材料を除去するためのビリオン含有材料の清澄、例えば、CaHPO4吸着などの吸着方法を用いる採取されたビリオンの濃縮、全ビリオンの非ビリオン材料からの分離、例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどのスプリッティング剤を含有するスクロース勾配を用いる密度勾配遠心分離ステップにおけるスプリッティング剤を用いるビリオンのスプリッティング、およびその後の、望ましくない材料を除去するための濾過例えば、限外濾過を含み得る。スプリットビリオンは、有用には、リン酸ナトリウム緩衝等張塩化ナトリウム溶液中に再懸濁することができる。スプリットワクチンの例は、BEGRIVAC商標、IΝΤΑΝΖΑ商標、FLUARIX商標、FLUZONE商標、およびFLUSHIELD商標製品である。ビロソームは、核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子である[25]。それらは、ウイルスの界面活性剤での可溶化、続いて、ヌクレオカプシドの除去、およびウイルス糖タンパク質を含有する膜の再構成によって調製することができる。ビロソームを調製するための代替方法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に加えて、膜内にウイルスタンパク質を有するリポソームを生じさせることを含む。弱毒化生ウイルスは、卵内または細胞培養で成長したウイルスから得られるが、ウイルスは不活性化されていない。そうではなく、ウイルスは、例えば、ヒトインフルエンザ感染のフェレットモデルにおいてインフルエンザ様病気を生じさせないように、弱毒化attされている。それはまた低温に適応したca株であってもよく、すなわち、それは、25°C多数の野生型インフルエンザウイルスの複製について制限的である温度で効率的に複製することができる。それはまた、温度感受性tsであってもよく、すなわち、それの複製は、多くの野生型インフルエンザウイルスが効率的に成長する温度37~39°Cにおいて制限される。ca、ts、およびatt表現型の累積的効果は、以下である:弱毒化ワクチンにおけるウイルスは、鼻咽頭で複製して、典型的なヒト患者において防御免疫を誘導することができるが、それは疾患を引き起こさない。すなわち、それは標的ヒト集団への一般的な投与について安全であるということである。これらのウイルスは、ビリオン含有液からビリオンを精製すること、例えば、その液体の遠心分離による清澄後、例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含有する緩衝液での安定化によって調製することができる。生ワクチンは、FLUMIST商標製品を含む。生ワクチンは本発明に関して用いることができるが、非生ワクチンを用いることが好ましい。ビリオンから得られた抗原を用いることの代替として、血球凝集素を組換え宿主例えば、バキュロウイルスベクターを用いる、Sf9などの昆虫細胞系において発現させ、精製された形態で[26~28]、またはウイルス様粒子VLP;例えば、参考文献29および30を参照の形態で用いることができる。本発明のいくつかの実施形態は、卵内ではなく、細胞培養で成長したウイルスから調製されたインフルエンザワクチンを用いる。細胞培養が用いられる場合、ウイルス成長培養基は、典型的には、哺乳動物起源の細胞系である。適切な起源の哺乳動物細胞には、ハムスター細胞、ウシ細胞、ヒトおよびサルを含む霊長類細胞、およびイヌ細胞が挙げられるが、それらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などの様々な細胞型を用いてもよい。適切なハムスター細胞の例は、BHK21またはHKCCという名前を有する細胞系である。適切なサル細胞は、例えば、Vero細胞系のように、腎細胞などのアフリカミドリザル細胞である。適切なイヌ細胞は、例えば、MDCK細胞系のように腎細胞である。したがって、適切な細胞系には、MDCK;CHO;293T;BHK;Vero;MRC-5;PER.C6;WI-38などが挙げられるが、それらに限定されない。インフルエンザウイルスを成長させるための好ましい哺乳動物細胞系には、メイディンダービーイヌ腎臓由来のMDCK細胞[31~34];アフリカミドリザルCercopithecusaethiops腎臓由来のVero細胞[35~37];ヒト胚性網膜芽細胞由来のPER.C6細胞[38]が挙げられる。これらの細胞系は、広く入手可能であり、例えば、AmericanTypeCellCultureATCCコレクションから、CoriellCellRepositoriesから、またはEuropeanCollectionofCellCulturesECACCから入手可能である。例えば、ATCCは、カタログ番号CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586、およびCRL-1587により様々な異なるVero細胞を供給し、カタログ番号CCL-34によりMDCK細胞を供給する。PER.C6は、ECACCから寄託番号96022940により入手可能である。哺乳動物細胞系のあまり好ましくない代替物として、ウイルスは、トリ細胞系で成長することができ[例えば、参考文献39~41]、それには、アヒル例えば、アヒル網膜またはニワトリ由来の細胞系が挙げられる。トリ細胞系の例には、トリ胚性幹細胞[39、42]およびアヒル網膜細胞[40]が挙げられる。適切なトリ胚性幹細胞には、ニワトリ胚性幹細胞由来のEBx細胞系、EB45、EB14、およびEB14-074が挙げられる[43]。ニワトリ胚性線維芽細胞CEFもまた用いてもよい。インフルエンザウイルスを成長させるための最も好ましい細胞系はMDCK細胞系である。もともとのMDCK細胞系は、ATCCからCCL-34として入手可能であるが、この細胞系の誘導体もまた用いてもよい。例えば、参考文献31は、懸濁培養での成長に適応したMDCK細胞系を開示するDSMACC2219として寄託されたMDCK33016。同様に、参考文献44は、無血清培養において懸濁状態で成長するMDCK由来細胞系を開示するFERMBP-7449として寄託されたB-702。参考文献45は、非腫瘍原性MDCK細胞を開示し、それらには、MDCK-SATCCPTA-6500、MDCK-SF101ATCCPTA-6501、MDCK-SF102ATCCPTA-6502、およびMDCK-SF103PTA-6503が挙げられる。参考文献46は、感染に対する高い感受性を有するMDCK細胞系を開示し、それらには、MDCK.5F1細胞ATCCCRL-12042が挙げられる。これらのMDCK細胞系のいずれもを用いることができる。ウイルスが哺乳動物細胞系で成長している場合、本発明の製造物は、有利なことには、卵タンパク質例えば、オボアルブミンおよびオボムコイドおよびニワトリDNAを含まず、それにより、潜在的なアレルゲン性を低下させる。本発明の細胞由来製造物における血球凝集素は、卵由来ウイルスに見られるパターンとは異なるグリコシル化パターンを有し得る。したがって、そのHAおよび他の糖タンパク質は、ニワトリ卵に見られないグリコフォームを含む可能性がある。有用なHAには、イヌグリコフォームが挙げられる。卵由来材料およびニワトリグリコフォームが存在しないことにより、細胞培養で成長したウイルスから調製されたワクチンを卵由来製造物と区別することができる方法が提供される。ウイルスが細胞系で成長している場合、成長のための培養物、およびまた、培養を開始するために用いられるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、RSウイルス、パラインフルエンザウイルス3、SARSコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および/またはパルボウイルスを含まないすなわち、それらによる汚染について試験し、陰性の結果が示されている[47]。単純ヘルペスウイルスの非存在は特に好ましい。MDCK細胞などの細胞系での成長について、ウイルスは、懸濁状態の細胞において成長してもよいし[31、48、49]、接着培養の細胞で成長してもよい。懸濁培養のための一つの適切なMDCK細胞系は、DSMACC2219として寄託されたMDCK33016である。代替として、マイクロキャリア培養を用いることができる。インフルエンザウイルス複製を支援する細胞系は、好ましくは、無血清培養培地および/または無タンパク質培地中で成長する。ヒトまたは動物起源の血清由来の添加物が存在しない培地は、本発明との関連において、無血清培地と呼ばれる。無タンパク質とは、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除しているが、任意で、トリプシンまたはウイルス成長に必要とされる場合がある他のプロテアーゼなどのタンパク質を含むことができる、細胞の増倍が起こる培地を意味すると理解される。そのような培地で成長した細胞は、当然ながら、それ自体のタンパク質を含有する。インフルエンザウイルス複製を支援する細胞系は、好ましくは、ウイルス複製中37°C未満[50]、例えば、30~36°C、31~35°C、または33±1°Cで成長する。培養細胞においてウイルスを増殖させるための方法は一般的に、培養細胞に、培養される株を接種するステップ、例えば、ウイルス力価または抗原発現により決定されるようなウイルス増殖にとって望ましい時間の間接種後24~168時間、感染した細胞を培養するステップ、および増殖したウイルスを収集するステップを含む。培養細胞は、1:500~1:1、好ましくは、1:100~1:5、より好ましくは1:50~1:10のPFUまたはTCID50により測定されるウイルス対細胞比で接種される。ウイルスは細胞の懸濁液に加えられるか、または細胞の単層に適用され、ウイルスは、細胞に、25°C~40°C、好ましくは28°C~37°Cで、少なくとも60分間、ただし通常には、300分間未満、好ましくは90~240分間、吸着させられる。感染した細胞培養物例えば、単層は、採取される培養上清のウイルス含有率を増加させるために凍結融解によるかまたは酵素作用によるかのいずれかで除去されてもよい。その後、採取された液体は不活性化されるか凍結保存されるかのいずれかである。培養細胞を、約0.0001~10、好ましくは0.002~5、より好ましくは0.001~2の感染多重度m.o.i.で感染させてもよい。さらにより好ましくは、細胞を約0.01のm.o.i.で感染させる。感染した細胞は、感染から30~60時間後、採取することができる。好ましくは、細胞は、感染から34~48時間後、採取される。さらにより好ましくは、細胞は、感染から38~40時間後、採取される。プロテアーゼ典型的にはトリプシンは、一般的に、ウイルス放出を可能にするために細胞培養中に加えられ、プロテアーゼは培養中の任意の適切な段階で加えることができる。細胞培養から調製されたワクチンを含むワクチン製造物は、好ましくは、用量あたり10ng未満好ましくは1ng未満、より好ましくは100pg未満の残留宿主細胞DNAを含有し、痕跡量の宿主細胞DNAが存在してもよい。任意の残留宿主細胞DNAの平均の長さは、500bp未満、例えば、400bp未満、300bp未満、200bp未満、100bp未満などであることが好ましい。汚染DNAは、標準精製手順、例えば、クロマトグラフィーなどを用いてワクチン調製中に除去することができる。残留宿主細胞DNAの除去は、ヌクレアーゼ処理、例えば、DNアーゼを用いることにより、増強させることができる。宿主細胞DNA汚染を低下させるための便利な方法は、参考文献51および52に開示されており、それは、最初にDNアーゼ例えば、Benzonaseウイルス成長中に用いることができるを用いること、およびその後、陽イオン性界面活性剤例えば、CTABビリオン破壊中に用いることができるを用いることの2ステップ処理を含む。β-プロピオラクトンなどのアルキル化剤での処理も宿主細胞DNAを除去するために用いることができ、有利なことには、ビリオンを不活性化するためにも用いてもよい[53]。本発明のいくつかの実施形態は、一価インフルエンザワクチンすなわち、それは単一のインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素抗原を含むを用いるが、いくつかの実施形態において、それは、二価ワクチン、三価ワクチン、四価ワクチン、または>4価ワクチンすなわち、4つより多い異なるインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素を含むなどの多価ワクチンであってもよい。一価ワクチンと多価ワクチンとは、複数のHA型についてアミノ酸シーケンシングなどにより試験することによって容易に区別される。一価ワクチンは、パンデミック状況中かまたはパンデミック前の状況のいずれかにおいて、パンデミック株またはパンデミックの可能性がある株に対して免疫化するのに特に有用である。これらの株の特性は以下である:aそれらは、現在広まっているヒト株における血球凝集素と比較して新しい血球凝集素を含有する。すなわち、10年超の間、ヒト集団において明らかではなかった株例えば、H2、またはこれまでに、ヒト集団において全く見られることがなかった株例えば、一般的に鳥集団においてのみ見出されているH5、H6、またはH9であり、それゆえに、ヒト集団はその株の血球凝集素に対して免疫学的にナイーブである;bそれらは、ヒト集団において水平に伝染する能力がある;およびcそれらはヒトに対して病原性である。これらの株は、インフルエンザA型HA亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、またはH16のいずれかを有してもよい。H5血球凝集素型を有するウイルスは、パンデミックインフルエンザに対して免疫化するために好ましく、またはH2、H7、もしくはH9亜型も好ましい。本発明は、1つまたは複数のインフルエンザA型ウイルスNA亜型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、またはN9から防御し得る。したがって、可能な株には、H5N1、H5N3、H9N2、H2N2、H7N1、およびH7N7、ならびに任意の他の新たなパンデミックの可能性のある株が挙げられる。多価ワクチンは、季節的設定においてより典型的であり、例えば、三価ワクチンが典型的であり、H1N1インフルエンザA型株、H3N2インフルエンザA型ウイルス株、およびインフルエンザB型ウイルス株由来などの2つのインフルエンザA型ウイルスおよび1つのインフルエンザB型ウイルス株由来の血球凝集素を含む。四価ワクチンもまた有用であり[54]、例えば、2つのインフルエンザA型ウイルス株と2つのインフルエンザB型ウイルス株、または3つのインフルエンザA型ウイルス株と1つのインフルエンザB型ウイルス株由来の抗原を含む。したがって、ワクチンは、二価、三価、四価などであってもよい。一価ワクチンを除いて、インフルエンザA型ウイルス株とインフルエンザB型ウイルス株の両方由来の血球凝集素を含むことが通例である。2つのインフルエンザA型ウイルス株だけを含むワクチンにおいて、これらは、通常、1つのH1株例えば、H1N1株と1つのH3株例えば、H3N2株である。しかしながら、いくつかの実施形態において、1つのパンデミックインフルエンザA型ウイルス株と1つのH1株、または1つのパンデミックインフルエンザA型ウイルス株と1つのH3株であってもよい。ワクチンが1つより多いインフルエンザ株を含む場合、その異なる株は、典型的には、別々に成長し、ウイルスが採取されかつ抗原が調製された後で混合される。したがって、本発明のプロセスは、1つより多いインフルエンザ株由来の抗原を混合するステップを含んでもよい。参考文献54に記載されているように、例示的な四価ワクチンは、2つのインフルエンザA型ウイルス株と2つのインフルエンザB型ウイルス株由来A-A-B-B、または3つのインフルエンザA型ウイルス株と1つのインフルエンザB型ウイルス株由来A-A-A-Bの血球凝集素を含むことができる。インフルエンザB型ウイルスは現在、異なるHA亜型を提示していないが、インフルエンザB型ウイルス株は、2つの別個の系列に分類される。これらの系列は1980年代後半に出現し、お互いに抗原的におよび/または遺伝的に区別することができるHAを有する[55]。現在のインフルエンザB型ウイルス株は、B/Victoria/2/87様かまたはB/Yamagata/16/88様のいずれかである。本発明のワクチンが2つのインフルエンザB型株を含む場合、これは通常、1つのB/Victoria/2/87様株と1つのB/Yamagata/16/88様株である。これらの株は、通常、抗原的に区別されるが、アミノ酸配列の違いもまた、その2つの系列を区別するために記載されており、例えば、B/Yamagata/16/88様株は、アミノ酸残基164Lee40HA配列に対して番号付けられたにおいて欠失をもつHAタンパク質を有する場合が常にではないが多い[56]。好ましいA-A-B-Bワクチンは、iH1N1株;iiH3N2株;iiiB/Victoria/2/87様株;およびivB/Yamagata/16/88様株由来の血球凝集素を含む。3つのインフルエンザA型ウイルス株を含むワクチンにおいて、これらは通常、1つのH1株例えば、H1N1株と2つのH3株例えば、2つのH3N2株である。2つのH3株は、抗原的に別個のHAタンパク質、例えば、A/Moscow/10/99と交差反応する1つのH3N2株と、A/Fujian/411/2002と交差反応する1つのH3N2株を有する。2つのH3株は、異なるクレイド由来であってもよいH3N2株のクレイドA、BおよびCは参考文献57に開示されている。しかしながら、いくつかの実施形態において、これらの株の1つすなわち、H1株、または2つのH3株のうちの1つは、パンデミック株に置き換えられてもよい。したがって、一つの好ましいA-A-A-Bワクチンは、iH1N1株;iiA/Moscow/10/99様H3N2株;iiiA/Fujian/411/2002様H3N2株;およびivB/Victoria/2/87様またはB/Yamagata/16/88様であり得るインフルエンザB型ウイルス株由来の血球凝集素を含む。別の好ましいA-A-A-Bワクチンは、iH1N1株、iiH3N2株、iiiH5株例えば、H5N1株、およびivインフルエンザB型株由来の血球凝集素を含む。別の好ましいA-A-A-Bワクチンは、i2つの異なるH1株、iiH3N2株、およびiiiインフルエンザB型株由来の血球凝集素を含む。2つ以上のインフルエンザB型ウイルス株由来の抗原が存在する場合、インフルエンザB型ウイルス株の少なくとも2つは、別個の血球凝集素を有し得るが、関連したノイラミニダーゼを有してもよい。例えば、それらは、両方ともB/Victoria/2/87様ノイラミニダーゼを有してもよく[58]、または両方ともB/Yamagata/16/88様ノイラミニダーゼを有してもよい。例えば、2つのB/Victoria/2/87様ノイラミニダーゼは両方とも、1つまたは複数の以下の配列特性を有してもよい:1残基27においてはセリンではなく、好ましくはロイシンである;2残基44においてはグルタミン酸ではなく、好ましくはリシンである;3残基46においてはスレオニンではなく、好ましくはイソロイシンである;4残基51においてはプロリンではなく、好ましくはセリンである;5残基65においてはアルギニンではなく、好ましくはヒスチジンである;6残基70においてはグリシンではなく、好ましくはグルタミン酸である;7残基73においてはロイシンではなく、好ましくはフェニルアラニンである;および/または8残基88においてはプロリンではなく、好ましくはグルタミンである。同様に、いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼは、残基43に欠失を有してもよく、またはそれはスレオニンを有してもよい;NA遺伝子におけるトリヌクレオチド欠失に起因する残基43における欠失は、B/Victoria/2/87様株の特性として報告されているが、最近の株はThr-43を取り戻している[58]。逆に、当然ながら、その反対の特性は、2つのB/Yamagata/16/88様ノイラミニダーゼによって共有される可能性がある例えば、S27、E44、T46、P51、R65、G70、L73、および/またはP88。これらのアミノ酸は、Lee40ノイラミニダーゼ配列に対して番号付けられている[59]。したがって、本発明のA-A-B-Bワクチンは、HAについて抗原的に別個であるが1つのB/Yamagata/16/88様、1つのB/Victoria/2/87様、NAについては関連している両方ともB/Yamagata/16/88様、または両方ともB/Victoria/2/87様2つのB株を用いてもよい。いくつかの実施形態において、本発明は、A/NewCaledonia/20/99H1N1株、A/Wyoming/03/2003H3N2株、およびB/Jiangsu/10/2003株のそれぞれ由来の血球凝集素を含有する三価スプリットワクチンを包含しない。抗原を組成物に有用に含めることができる株には、抵抗性パンデミック株[61]を含む、抗ウイルス治療に抵抗性例えば、オセルタミビル[60]および/またはザナミビルに対して抵抗性である株が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、ワクチンは、少量のチオメルサールまたはメルチオレートなどの水銀に基づいた保存剤を含んでもよい。存在する場合、そのような保存剤は、典型的には、5μg/ml未満の水銀を供給し、より低いレベル、例えば、<1μg/ml、<0.5μg/mlが可能である。好ましいワクチンは、チオメルサールを含まず、より好ましくは、水銀を含まない[23、62]。そのようなワクチンは、非水銀性保存剤を含むことができる。チオメルサールの非水銀性代替物には、2-フェノキシエタノールまたはコハク酸α-トコフェロールが挙げられる[23]。最も好ましくは、ワクチンは保存剤を含まない。いくつかの実施形態において、ワクチンは、安定化量のゼラチンを、例えば、0.1未満で含んでもよい。しかしながら、他の実施形態において、ワクチンはゼラチンを含まない。ゼラチンの非存在により、ワクチンは、ゼラチン感受性である少ない割合の患者において安全であることが保証され得る[63、64]。いくつかの実施形態において、ワクチンは、1つまたは複数の抗生物質、例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンBを含んでもよい。しかし、好ましい実施形態においては、ワクチンは抗生物質を含まない。いくつかの実施形態において、ワクチンはホルムアルデヒドを含んでもよい。しかし、好ましい実施形態においては、ワクチンはホルムアルデヒドを含まない。上記で言及されているように、いくつかの実施形態において、ワクチンは卵成分例えば、オボアルブミンおよびオボムコイドを含んでもよいが、好ましい実施形態は卵成分を含まない。特定の成分および添加物を使用せずにワクチンを調製することは、参考文献65に開示されており、それにより、これらの材料が残留量でさえも存在しないことを保証する。血球凝集素HAは、現在の不活性化インフルエンザワクチンにおいて主要な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にはSRIDによって測定される、HAレベルへの参照により標準化される。現行のワクチンは、典型的には、1株あたり約15μgのHAを含有するが、より低い用量が、例えば、小児用に、またはパンデミック状況において、またはアジュバントを用いる場合、用いることができる。より高い用量例えば、3×または9×用量[66、67]と同様に、1/2すなわち、1株あたり7.5μgのHA、1/4、および1/8などの分割量も用いられている。これらのワクチンは、0.5mlの用量容積、すなわち、30μg/ml/株の典型的なHA濃度を有する。三価INTANZA商標製品は、0.1mlの容積中、1株あたり9μgのHA、すなわち、90μg/ml/株のHA濃度を含有し、270μg/mlの総HA濃度を示す。本発明の製造物は、用量あたりインフルエンザ1株あたり0.1~50μg、好ましくは0.1~50μg、例えば、1~20μgのHAを含むことができる。理想的には、製造物は、1株あたり≦16μgの血球凝集素、例えば、1~15μg、1~10μg、1~7.5μg、1~5μgなどを有する。1株あたりの特定のHA用量は、例えば、約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約1.9、約1.5などを含む。表面抗原ワクチンにおいて、HAは、組成物において総タンパク質の50重量より多く、例えば、免疫原性組成物における総インフルエンザタンパク質の60~100、60~90、または60~80を占めることができる。生ワクチンについて、投薬量は、HA含有量ではなく、50組織培養感染量mediantissuecultureinfectiousdoseTCID50によって測定され、例えば、用量あたり1株あたり106~108好ましくは106.5~107.5のTCID50である。本発明に関して用いられるインフルエンザ株は、野生型ウイルスに見出されるような天然HA、または改変型HAを有してもよい。例えば、ウイルスをトリ種において高病原性にさせる決定因子例えば、HA1/HA2切断部位の周りの超塩基性領域を除去するようにHAを改変することが知られている。逆遺伝学の使用は、そのような改変を促進する。本発明のワクチン製造物は、インフルエンザワクチン抗原に加えて構成要素を含むことができる。上記で論じられているように、例えば、それらは、生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料、または経口フィルムポリマーを含むことができる。ワクチン製造物は、界面活性剤を含んでもよい。界面活性剤のレベルは、幅広く様々であり得、例えば、1μgのHAあたり0.01~50μgの界面活性剤μg/μg、または0.05~50μgである。低レベルの、例えば、0.05~1μg/μg、もしくは0.1~1μg/μgの界面活性剤を用いることができ、または高レベル、例えば、5~30μg/μgも用いることができる。界面活性剤は単一の界面活性剤例えば、ポリソルベート80またはCTABでもよいし、混合物例えば、ポリソルベート80とCTABの両方でもよい。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート80Tween80またはオクチルフェノールエトキシレートTritonX100などの非イオン性である。ポリソルベート80は、1μgのHAあたり0.05~50μgのポリソルベート80、例えば、0.05~0.75μg/μg、0.1~1μg/μg、0.1~0.8μg/μg、0.1~0.5μg/μg、5~40μg/μg、5~30μg/μg、または8~25μg/μgで存在してもよい。CTABは、低量、例えば、0.1μg/μg未満、0.05μg/μg未満で存在してもよい。上記で言及されているように、いくつかのワクチン製造物は、チオメルサールまたは2-フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでもよいが、好ましいワクチンは水銀も保存剤も含まない。ワクチン製造物は、ナトリウム塩などの生理的塩を含んでもよい。塩化ナトリウムNaClが好ましく、それは、1~20mg/mlで存在してもよい。存在してもよい他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。ワクチン製造物は、1つまたは複数の緩衝液を含んでもよい。典型的な緩衝液には、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液特に、水酸化アルミニウムアジュバントと共に、またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には、5~20mMの範囲で含まれる。ワクチン製造物は、好ましくは、無菌である。ワクチン製造物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、用量あたり<1EU内毒素単位、標準的尺度、および好ましくは用量あたり<0.1EUを含有する。ワクチン製造物は好ましくは、グルテンを含まない。ワクチン製造物は、免疫賦活分子を含むことができる。これらは、パッチを調製する前に抗原と混合することができる。免疫賦活分子の適切なクラスには、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト、TLR9アゴニスト、およびCD1dアゴニストが挙げられるが、それらに限定されない。適切な免疫賦活分子には、イミキモドR-837[68、69]およびレシキモドR-848[70]などのイミダゾキノリン、またはそれらの塩例えば、塩酸塩;RC-529[71、72]などのアミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体;α-ガラクトシルセラミドなどのα-グリコシルセラミド;参考文献73からのER804057;E5564[74、75]などが挙げられるが、それらに限定されない。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能、および防御を評価するための方法は当技術分野においてよく知られている。ヒトインフルエンザウイルスの血球凝集素に対する抗体力価は、防御と相関していることが、ヒト研究から示されている約30~40の血清試料血球凝集阻害力価は、同種ウイルスによる感染から約50の防御を示す[76]。抗体応答は、典型的には、血球凝集阻害により、マイクロ中和試験により、一元放射状免疫拡散法SRIDにより、および/または一元放射状溶血反応SRHにより測定される。これらのアッセイ技術は、当技術分野においてよく知られている。好ましいワクチンは、効力についてのCPMP評価基準の1、2、または3を満たす。成人18~60歳において、これらの評価基準は以下である:1≧70のセロプロテクション;2≧40のセロコンバージョン;および/または3≧2.5倍のGMT増加。高齢者>60歳において、これらの評価基準は以下である:1≧60のセロプロテクション;2≧30のセロコンバージョン;および/または3≧2倍のGMT増加。これらの評価基準は、少なくとも50人の患者についての非盲検研究に基づいている。インフルエンザワクチンは、現在、生後6ヶ月から小児および成人の免疫化に用いることが推奨されている。したがって、ヒト被験体は、1歳未満、1~5歳、5~15歳、15~55歳、または少なくとも55歳であってもよい。そのワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢者例えば、≧50歳、≧60歳、好ましくは≧65歳、幼若者例えば、≦5歳、入院中の被験体、医療従事者、軍部関係者および軍人、妊婦、慢性病の免疫不全の被験体、ワクチンを受ける前の7日以内に抗ウイルス化合物例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物;下記参照を服用した被験体、卵アレルギーをもつ人々、および海外旅行をする人々である。しかしながら、ワクチンは、これらの群にのみ適しているわけではなく、集団においてより一般的に用いられてもよい。パンデミック株について、全年齢群への投与が好ましい。1用量より多い投与典型的には2用量は、免疫学的にナイーブな患者において、例えば、以前にインフルエンザワクチンを受けたことがない人々にとって、または新しいHA亜型に対するワクチン接種をするためにパンデミック発生においてのように、特に有用である。バルク液体ワクチン上記で述べられているように、本発明は、インフルエンザウイルス血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、a前記血球凝集素の濃度が少なくとも12mg/mlであり、b前記ワクチンがスクロースを実質的に含まない、バルク液体ワクチンを提供する。これらのバルクワクチンは、筋肉内ではないnon-intramuscular経路による送達用のワクチンの製造の間の有用な中間体であり得る。HA濃度は、12mg/ml超、例えば、≧15mg/ml、≧20mg/ml、≧25mg/ml、≧30mg/ml、≧35mg/ml、≧40mg/ml、≧45mg/ml、≧50mg/mlであってもよい。本発明はまた、インフルエンザA型ウイルス血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、a前記血球凝集素の濃度が少なくとも2mg/mlであり、b前記血球凝集素がH1血球凝集素でもH3血球凝集素でもない、バルク液体ワクチンを提供する。好ましくは、ワクチンは、cスクロースを実質的に含まない。H1とH3の両方のインフルエンザA型ウイルス血球凝集素複数可を含まないこれらのバルクワクチンは、筋肉内ではない経路による送達用のワクチンの製造の間の有用な中間体であり得る。HA濃度は、2mg/ml超、例えば、≧3mg/ml、≧4mg/ml、≧5mg/ml、≧6mg/ml、≧7mg/ml、≧8mg/ml、≧9mg/ml、≧10mg/ml、≧12mg/ml、≧14mg/ml、≧15mg/ml、≧16mg/ml、≧18mg/ml、≧20mg/ml、≧25mg/ml、≧30mg/ml、≧35mg/ml、≧40mg/ml、≧45mg/ml、≧50mg/mlであってもよい。血球凝集素はH5であってもよい。本発明はまた、インフルエンザB型ウイルス血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、a前記血球凝集素の濃度が少なくとも2mg/mlであり、b前記血球凝集素が、B/Shandong/7/97血球凝集素ではない、バルク液体ワクチンを提供する。好ましくは、ワクチンは、cスクロースを実質的に含まない。H1とH3の両方のインフルエンザA型ウイルス血球凝集素複数可を含まないこれらのバルクワクチンは、筋肉内ではない経路による送達用のワクチンの製造の間の有用な中間体であり得る。HA濃度は、2mg/ml超、例えば、≧3mg/ml、≧4mg/ml、≧5mg/ml、≧6mg/ml、≧7mg/ml、≧8mg/ml、≧9mg/ml、≧10mg/ml、≧12mg/ml、≧14mg/ml、≧15mg/ml、≧16mg/ml、≧18mg/ml、≧20mg/ml、≧25mg/ml、≧30mg/ml、≧35mg/ml、≧40mg/ml、≧45mg/ml、≧50mg/mlであってもよい。本発明はまた、インフルエンザB型ウイルス血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、a血球凝集素の濃度が少なくとも2mg/mlであり、bインフルエンザB型ウイルスがB/Yamagata/16/88様株である、バルク液体ワクチンを提供する。好ましくは、ワクチンは、cスクロースを実質的に含まない。H1とH3の両方のインフルエンザA型ウイルス血球凝集素複数可を含まない、これらのバルクワクチンは、筋肉内ではない経路による送達用のワクチンの製造の間の有用な中間体であり得る。HA濃度は、2mg/ml超、例えば、≧3mg/ml、≧4mg/ml、≧5mg/ml、≧6mg/ml、≧7mg/ml、≧8mg/ml、≧9mg/ml、≧10mg/ml、≧12mg/ml、≧14mg/ml、≧15mg/ml、≧16mg/ml、≧18mg/ml、≧20mg/ml、≧25mg/ml、≧30mg/ml、≧35mg/ml、≧40mg/ml、≧45mg/ml、≧50mg/mlであってもよい。本発明はまた、少なくとも2株のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、a前記血球凝集素の濃度が少なくとも2mg/ml/株であり、b前記ワクチンがスクロースを実質的に含まない、バルク液体ワクチンを提供する。HA濃度は、2mg/ml/株超、例えば、≧3mg/ml/株、≧4mg/ml/株、≧5mg/ml/株、≧6mg/ml/株、≧7mg/ml/株、≧8mg/ml/株、≧9mg/ml/株、≧10mg/ml/株、≧12mg/ml/株、≧14mg/ml/株、≧15mg/ml/株、≧16mg/ml/株、≧18mg/ml/株、≧20mg/ml/株、≧25mg/ml/株、≧30mg/ml/株、≧35mg/ml/株、≧40mg/ml/株、≧45mg/ml/株、≧50mg/ml/株であってもよい。このスクロースを含まないバルク多価ワクチンは、理想的には、二価、三価、または四価である。したがって、三価ワクチンにおいて、総HA濃度は、少なくとも6mg/mlである。これらのバルク液体ワクチンにおけるHA濃度は、好ましくは、例えば、規制認可された標準試薬を用いるSRIDにより測定される場合の、HA濃度である。SRIDは、バルクワクチンに、処方前に例えば、コーティング前に、またはフィルム形成前に実施することができるが、いくつかの実施形態において、それは、すでに処方された製造物から回収された材料に例えば、コーティングニードルから抗原を回収した後に実施される。SRIDの利点は、単一の試料において異なるHA間を区別できることであり、例えば、三価ワクチンにおける各HAを、並行して分析することができる。したがって、組成物が特定のHAを含む場合、その含有量を、他のHAの存在下でさえもアッセイすることができる。スクロースを実質的に含まないことに加えて、これらのバルクは、マンニトールを実質的に含まない場合がある。バルクはさらに、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオース、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、およびキシリトールを実質的に含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、バルクは二糖および糖アルコールを実質的に含まない。一般用語含むことcomprisingは、包含することincludingおよびからなることconsistingを網羅し、例えば、Xを含むcomprising組成物は、排他的にXからなってもよいし、または追加の何かを包含してもよく、例えば、XYであってもよい。語実質的にとは、完全にを排除せず、例えば、Yを実質的に含まない組成物は、Yを全く含まなくてもよい。必要に応じて、語実質的には、本発明の定義から省略される場合がある。数値xに関する用語約は、任意であり、例えば、x±5を意味する。特に記述がない限り、2つ以上の成分を混合するステップを含むプロセスは、混合のいかなる特定の順序も必要としない。したがって、成分は任意の順序で混合することができる。3つの成分がある場合には、2つの成分をお互いに組み合わせ、その後、その組み合わせに第3の成分を組み合わせてもよいなど。動物性特に、ウシの材料が細胞の培養に用いられる場合、それらは、伝達性海綿状脳症TSEを含まない、特に、ウシ海綿状脳症BSEを含まない供給源から獲得されるべきである。概して、動物由来材料の完全な非存在下で、細胞を培養することが好ましい。本発明は、凍結乾燥を含まない濃縮手順を提供する。これは、本発明が、凍結乾燥されることなく濃縮および処方される抗原を用いることを意味する。保護の範囲は、ワクチン抗原の少なくとも一部が凍結乾燥されることなく濃縮および処方されるのであれば、凍結乾燥抗原がワクチンに加えられる状況を排除することを意図しない。したがって、本発明の凍結乾燥を含まない濃縮手順を実施すると同時に凍結乾燥も用いることは、保護全体の意図された範囲から外れるものではない。化合物が組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代替として、適切なプロドラッグに置き換えられてもよい。インフルエンザウイルス血球凝集素への凍結乾燥の影響一価インフルエンザウイルスバルク抗原を、サイズ排除クロマトグラフィーSECによって分析し、その後、凍結乾燥および再構成後、再び分析した。以下の2つの異なる凍結乾燥手順を試験した:リオプロテクタントとしてスクロースのみを用いる手順およびスクロースとマンニトールの両方を用いる手順。図1における結果は、5分における顕著なピーク図1Aが再構成された材料において消失している図1Bおよび1Cことを示す。したがって、この処理は、ワクチン抗原を明らかに変化させるので、抗原濃縮は凍結乾燥を避けるべきである。抗原濃縮技術の比較出発HA濃度は、一価インフルエンザウイルスバルクにおいて約0.5mg/mlであった。様々なバルクの濃縮について、以下の3つの異なる方法を用いた:遠心濾過;限外濾過;およびTFF。遠心濾過については、10kDaのカットオフを有するMillipore商標デバイスを用いて、5000rpmで45分間行った。限外濾過については、再生セルロースでできている10kDaカットオフの膜を有するAmicon商標撹拌細胞濃縮器を用いて、加圧窒素下で1時間行った。TFFについては、30kDaカットオフを有する改変ポリエーテルスルホン中空繊維フィルターを用いて、45mlの出発容積を1.5mlまで濃縮するように行った。達成することができる濃度を増加させるために、遠心分離方法および限外濾過方法をまた、凍結乾燥と組み合わせた。遠心濾過は、それ単独で約10倍の濃縮を達成した。続いて凍結乾燥した場合には、追加のSECピークが出現し、再構成された試料は、目に見える凝集物を含有した。限外濾過、続いて凍結乾燥、その後、出発容積へと戻す再構成により、出発材料に匹敵するHA濃度SRIDによって測定された場合のを有する材料が得られ、機能性抗原の損失がないことを示した。再構成された材料は>2週間、安定であった。これらの2つの方法は高濃度例えば、30倍を達成するために凍結乾燥を必要としたが、これは、TFFを用いる場合、単一のステップで達成することができた。さらに、濃縮材料は>2週間、安定であった。したがって、凍結乾燥を必要とすることなく、高い抗原濃度を達成するために、TFFは好ましい技術である。TFFおよび凍結乾燥インフルエンザA型およびB型ウイルスの卵内で成長した3株の一価バルクを以下によって処理した:iスクロースの添加;iiスクロースの存在下において凍結乾燥し、最初の容積に再構成する;iiiiiと同様に凍結乾燥するが、最初の容積の半分に再構成する;ivTFFによる濃縮;またはvvのようなTFFによる濃縮、続いてiiのような凍結乾燥および再構成。それぞれの場合において、HA含有量は、SRIDによって評価され、絶対値として、さらに、それぞれの出発バルク311~437μg/mlの範囲のHA濃度を有したに対する濃縮率concentrationfactorとして下記に示されている。iまたはiiにおける濃縮率が1未満である場合には、リオプロテクタントおよび/または凍結乾燥は、HA結合に干渉している;同じことは、iiiにおける率が2未満である場合、またはvにおける率がivより小さい場合に当てはまる。1組の実験からの結果は以下のとおりであった:したがって、全ての場合において、処理i~iiiは、検出可能なHAにおける低下をもたらしたが、株2の処理iの影響は非常に小さかった。さらに、リオプロテクタントの添加のみは、HAにおける低下をもたらしたが、再構成後の低下はさらにより大きく、すなわち、HAレベルにおける低下は、常に、処理i後より処理ii後に大きかった。したがって、凍結乾燥は検出可能なHAにおいて大きな下落をもたらす。株2を例外として、同様の効果は、TFF後に見られ、すなわち、凍結乾燥はSRID検出可能なHA含有量を低下させた。処理ivおよびvのみを用いる別の組の実験からの結果は以下のとおりであった:したがって、TFFのみは>50倍の濃縮を達成することができる。しかしながら、上記からわかるように、凍結乾燥の追加のステップは常に、SRID測定されたHA含有量における低下をもたらした。免疫原性研究2008年/2009年の季節性由来のインフルエンザ一価バルクをTFFによって濃縮した。濃縮インフルエンザ抗原を、インビボでそれらの免疫原性について評価し、最初の一価バルク材料に対して比較した。抗原を、Balb/C雌性マウスに、3週間隔てた2回の免疫化を用いて筋肉内に投与した。抗原を、一価ワクチン0.3μgのHAとして、三価ワクチン0.3μgのHAとして、またはアジュバント添加された三価ワクチンMF59水中油型エマルジョンアジュバントと共に0.3μgのHAとして、投与した。陰性対照としてPBSを用いた。機能性抗インフルエンザ抗体力価を、血球凝集阻害HIによって評価した。インフルエンザ一価バルクを、TFFによって29mg/ml、28mg/ml、および20mg/mlのHAまで濃縮した。全ての3つの濃度は、0.6~0.81μgのタンパク質あたりのHAのμgの範囲での総タンパク質に対するHAの比率を有した。Tween80ポリソルベート80を抗原と共に濃縮し、8~14mg/mlと見積もった。濃縮された抗原についてのHAに対するTween80の比率は、1μgのHAあたり0.1~0.2μgであり、それは、典型的な一価バルクにおいてと同じである。Tween80とは対照的に、CTABはそのプロセス中に濃縮されず、未処理の一価バルクに存在するレベルをはるかに下回った1μgのHAあたり<0.01μgの界面活性剤。濃縮された抗原は、4°Cで溶液中、SRIDにより3~4週間、安定であった。2回目の免疫化から2週間後のHI力価は、図2に示されている。全ての3つの株H1N1Brisbane;H3N2Brisbane;BFloridaについて、濃縮された抗原の免疫原性は、非濃縮一価バルクに匹敵した。本発明は、例としてのみ記載されているのであって、本発明の範囲および精神の内に留まりながら、改変され得ることは理解されているであろう。"