"野生型パルボウイルスと比較して高い抗腫瘍能力を示すパルボウイルス変異体であって、前記変異体は、aNS-2のLys96位および/またはNS-2のLeu103位でのアミノ酸置換、欠失もしくは付加、またはbNS2タンパク質配列の中央部分およびNS1タンパク質配列のC末端部分の両方に影響を及ぼすパルボウイルスゲノムの左側部分におけるインフレーム欠失を特徴とするパルボウイルス変異体。アミノ酸置換を特徴とする請求項1aまたは請求項1bに記載のパルボウイルス変異体であって、前記欠失は、アミノ酸587~624の欠失を有するNS1タンパク質およびアミノ酸96~133の欠失を有するNS2タンパク質の翻訳を結果として生じさせるヌクレオチド2022~2135であるパルボウイルス変異体。NS-2の96位でのLysは親水性極性アミノ酸によって置換される、および/またはNS-2の103位でのLeuは中性非極性アミノ酸によって置換される、請求項2に記載のパルボウイルス変異体。NS-2のアミノ酸置換Lys96Gluおよび/またはLeu103Proを含む、請求項3に記載のパルボウイルス変異体。以下の置換、aNS2のLys96Glu、または、bNS2のLeu103ProおよびNS1のTyr595Hisを含む、請求項4に記載のパルボウイルス変異体。パルボウイルスH-1H-1PV由来または関連齧歯類パルボウイルス由来である、請求項1~5のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体。前記関連齧歯類パルボウイルスは、LuIII、マウス微小ウイルスMMV、マウスパルボウイルスMPV、マウスの微小ウイルスMVM、ラット微小ウイルスRMV、ラットパルボウイルスRPV、ラットウイルスRVまたはキルハムラットウイルスKRVである、請求項6に記載のパルボウイルス変異体。請求項1~7のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体をコードするDNA。請求項8に記載のDNAを含む発現ベクター。請求項9に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。請求項10に記載の形質転換体を適切な条件下で培養する工程を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体を生成する方法。変異体NS-1またはNS-2タンパク質にのみ結合して野生型NS-1またはNS-2タンパク質には結合しないことをさらに特徴とする、請求項1~7のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体に対する抗体。a請求項1~7のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体、b請求項8に記載のDNA、c請求項12に記載の抗体、および/または場合により、d従来型補助物質、例えば溶媒、緩衝液、担体、マーカーおよびコントロールを含むキットであって、このとき成分a~dの内で、1つ以上の代表的な成分が各々存在してよいキット。a請求項1~7のいずれか一項に記載のパルボウイルス、請求項8に記載のDNA、請求項9に記載の発現ベクター、請求項10に記載の形質転換体または請求項12に記載の抗体およびb薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。癌を治療するための医薬組成物を製造するための請求項1~7のいずれか一項に記載のパルボウイルス、請求項8に記載のDNA、請求項9に記載の発現ベクター、請求項10に記載の形質転換体または請求項12に記載の抗体の使用。癌を治療する方法において使用するための請求項1~7のいずれか一項に記載のパルボウイルス、請求項8に記載のDNA、請求項9に記載の発現ベクター、請求項10に記載の形質転換体または請求項12に記載の抗体。前記癌は、膵臓癌、子宮頸癌、肝臓癌またはリンパ腫である、請求項15または16に記載の使用。このため、本発明の目的は、治療に使用するための改良されたパルボウイルスを提供することである。本発明によると、この課題は、特許請求の範囲に規定した主題によって達成される。本発明は、同時感染した細胞培養中での標準wtH-1PVに取って代わるH-1PV変異体の本出願人による単離に基づいている[13]。本発明は、さらに齧歯類PVの小さな非構造タンパク質およびそれらとウイルス適応のための特定細胞パートナーとの相互作用が果たす極めて重要な役割[14,15]ならびにこれらのウイルスタンパク質内のわずかな修飾によってマウスパルボウイルスの適応度を改良することができる可能性[16]に基づいている。本発明者らは、齧歯類PVの小さな非構造タンパク質の活性を改良することは、さらにウイルス産生およびそれらの抗腫瘍能力におけるこれらのウイルスのより高い有効性の原因となるという前提から出発した。これらの前提は、これらの突然変異をH-1PVゲノム内に導入して、a生殖細胞から回収された子孫ビリオンの量、およびbヒト腫瘍モデルに対する該生殖細胞の腫瘍毒性/腫瘍退縮活性に関して試験することによって確証された。これらの改良されたH-1PVを用いて得られたデータは、実際に子孫ビリオンのより高いバーストおよびウイルスストック内の感染性粒子対完全粒子の上昇した比率、細胞培養内でのより速い増殖および腫瘍異種移植片に対するより優れた抗癌活性を証明した。これらを要約すると、本発明の改良されたPVは、a前臨床アッセイにおいて現在使用されている天然PVと比較して高い抗腫瘍能力を示す、ならびにb製造工程中の時間の短縮およびc前臨床アッセイ中に使用する完全ビリオンの用量の削減をもたらす。したがって、本発明のウイルスは、治療遺伝子の存在および効果的療法のための化学療法薬との併用を必要としない。そこで本発明は、野生型パルボウイルスと比較して高い抗腫瘍能力を示すパルボウイルス変異体であって、前記変異体が、aNS2のLys96位および/またはNS2のLeu103位後者はNS1のTyr595位でのアミノ酸置換も誘導するに対応する位置でのアミノ酸置換、欠失もしくは付加、好ましくは置換、またはbNS2タンパク質配列の中央部分およびNS1タンパク質配列のC末端部分の両方に影響を及ぼすH-1PVゲノムの左側部分におけるインフレーム欠失を特徴とするパルボウイルス変異体を提供する。上記に記載したアミノ酸の位置は参照ポイント点としてのH-1PVと関連しているが、当業者であればNS1/NS2タンパク質のホモロジーに基づいていずれかのパルボウイルス内の対応するアミノ酸位置を容易に決定することができる。好ましくは、この欠失は、少なくとも1個、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも20個および一層より好ましくは少なくとも30個のアミノ酸の長さを有する。好ましくは、前記欠失は、連続アミノ酸の欠失である、および/または野生型に比較したまた別の変異は存在しない。特に好ましいのは、587~624の欠失を有するNS1タンパク質およびアミノ酸96~133の欠失を有するNS2タンパク質例、DelH-1PVを結果として生じさせるヌクレオチド2022~2135のフレーム内欠失である。用語野生型パルボウイルスと比較して高い抗腫瘍能力を示すは、感染1日後のNB-324K細胞の増殖阻害が野生型と比較して少なくとも1.4倍、好ましくは少なくとも1.7倍、より好ましくは少なくとも2倍高いことを意味する。本明細書で使用する用語パルボウイルスは、野生型もしくはそれらの改変された複製能力のある誘導体ならびにそのようなウイルスもしくは誘導体をベースとする関連ウイルスもしくはベクターを含んでいる。適切なパルボウイルス、誘導体等ならびに前記パルボウイルスを生成するために使用可能な細胞は、無用な実験努力をせずに、本明細書の開示に基づけば当業者であれば容易に決定することができる。語句パルボウイルスは、任意のパルボウイルス、特に齧歯類パルボウイルス、例えばマウスの微小ウイルスMVMおよびH-1ウイルスH-1PVを含んでいる。当業者であればNS2のLys96位および/またはNS2のLeu103位でのアミノ酸変化後者の場合にはNS1のTyr595位でのアミノ酸変化とともにまたはNS2タンパク質配列の96~133位およびNS1タンパク質の587から624位の両方での大きな欠失をパルボウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質の公知の核酸配列およびアミノ酸配列、例えばパルボウイルスH-1PVから出発する標準方法にしたがって導入することができる図11および[17]、さらに配列修正については[13]および[18]も参照されたい。当業者であれば、さらに特定の変異体が列挙した所望の生物学的特性を示すか、以下の実施例で説明するアッセイを使用して、例えば哺乳動物細胞、例えばNB-324K細胞の感染性または増殖阻害の野生型に比較した増加を比較することによって容易にアッセイすることができる。好ましいのはアミノ酸置換である上述した部位の1つ以上の部位での点突然変異または上述した部位でのウイルスNS1およびNS2両方のタンパク質配列におけるアミノ酸の大きな欠失のいずれかを有するパルボウイルス変異体である。本発明のより好ましい実施形態では、NS2の96位のLysはまた別の親水性極性アミノ酸例、Arg、Glu、Asp、GinまたはAsnで置換される、および/またはNS2の103位のLeuは天然非極性アミノ酸例、ProまたはGlyによって置換され、後者は天然極性アミノ酸例、Ser、HisまたはThrによるNS1の595位のTyrの置換を誘導する。本発明の一層より好ましい実施形態では、本パルボウイルス変異体は、a以下のアミノ酸置換NS2、Lys96GluまたはNS2、Leu103Pro後者は置換NS1、Tyr595Hisも誘導する、またはb以下のアミノ酸欠失NS2、Δ96~133およびNS1、Δ587~624を含んでいる。特に好ましいのは、以下の修飾、aNS2Lys96Gluの置換PMut2H-1PV変異体、bNS2Leu103ProおよびNS1Tyr595Hisの置換PMut1H-1PV変異体、またはcNS2アミノ酸96~133およびNS1アミノ酸587~624の欠失DelH-1PV変異体を有するパルボウイルス変異体である。好ましくは、本発明のパルボウイルスは、パルボウイルスH-1H-1PV由来または関連齧歯類パルボウイルスに由来する。好ましい関連齧歯類パルボウイルスの例としては、LuIII、マウス微小ウイルスMMV、マウスパルボウイルスMPV、マウスの微小ウイルスMVM、ラット微小ウイルスRMV、ラットパルボウイルスRPV、ラットウイルスRVまたはキルハムラムKilhamラットウイルスKRVが挙げられる。本発明のまた別の主題は、核酸、特に上述のパルボウイルス変異体をコードするDNAに関する。本発明によるDNAは、各々ベクターおよび発現ベクター内に存在する可能性がある。当業者であれば、それらの例に習熟している。E.coli大腸菌のための発現ベクターの場合には、例えばpGEMEX、pUC誘導体、pGEX-2T、pET3b、T7をベースとする発現ベクターおよびpQE-8である。酵母内での発現のためには、例えばpY100およびYcpad1が挙げられ、動物細胞内の発現のためには、例えばpCMV、pCI、pKCR、pEFBOS、cDM8、pMSCNDおよびpCEV4を指定しなければならない。バキュロウイルス発現ベクターpAcSGHisNT-Aは、昆虫細胞内の発現のために特に適合する。好ましい実施形態では、本発明によるDNAを含有するベクターは、ウイルス、例えばアデノウイルス、ワクシニアウイルス、AAVウイルスまたはパルボウイルス、例えばMVMまたはH-1PVであるが、パルボウイルスが好ましい。このベクターは、さらにまたレトロウイルス、例えばMoMULV、MoMuLV、HaMuSV、MuMTV、RSVまたはGaLVであってよい。本発明によるDNAを含有する発現ベクターを構築するためには、当分野において公知の一般的方法を使用することができる。これらの方法には、例えば、invitro組換え技術、合成法およびinvivo組換え法が含まれる。さらに、本発明は、上述したベクターを含有する宿主細胞に関する。これらの宿主細胞には、細菌、酵母、昆虫および動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞が含まれる。E.coli菌株HB101、DH1、x1776、JM101、JM109、BL21、XL1Blue、SG13009およびSure登録商標、後者は完全パルボウイルスゲノムをベースとするベクターのために好ましく、酵母菌株サッカロミセスセレビジエSaccharomycescerevisiaeおよび動物細胞L、A9、3T3、FM3A、CHO、COS、Vero、HeLa、293TおよびNB-324K、後者2つはH-1PVベクターのために好ましく、昆虫細胞sf9が好ましい。これらの宿主細胞を形質転換させる方法、形質転換体を表現型に関して選択する方法および上述したベクターを使用することによって本発明によるDNAを発現させる方法は、当分野において公知である。そこで、本発明は、本発明のパルボウイルス変異体を生成する方法であって、本発明の形質転換体を適切な条件下で培養する工程および細胞または培養物からパルボウイルス変異体を収集する工程を含む方法も提供する。さらに、本発明は、上述したパルボウイルス変異体NS1もしくはNS2タンパク質、すなわち野生型に比較して高い抗腫瘍能力の原因となる変異が所在する該パルボウイルス変異体タンパク質の領域、を特異的に認識する抗体に関する。抗体は、モノクローナル、ポリクローナルもしくは合成抗体またはそれらのフラグメント、例えばFab、FvまたはscFVフラグメントであってよい。好ましくは、モノクローナル抗体に関する。産生のためには、動物、特にポリクローナル抗体のためにはウサギもしくはヤギおよびモノクローナル抗体のためにはマウスを上述したパルボウイルス変異体の非構造タンパク質またはそれらのフラグメントで免疫することが好ましい。動物のまた別の追加免疫は、同一パルボウイルス変異体の非構造タンパク質またはそれらのフラグメントを用いて実施することができる。ポリクローナル抗体は、次に動物血清から入手し、さらに精製することができる。モノクローナル抗体は、標準方法にしたがって得られるが、特にKohlerandMilstein[19-Nature256495]およびGalfreandMilstein[20-MethEnzymol733]による方法を参照されたい。この場合には、マウス骨髄腫細胞が免疫された動物に由来する脾臓細胞と融合される。本発明による抗体は、多数の方法で、例えば上述したパルボウイルス変異体から発現した変異体非構造タンパク質を免疫沈降させるため、またはそれらを単離するために使用することができる。これらの抗体は、イムノアッセイにおいて液相内に、または固体担体へ結合させることができる。これに関連して、抗体は、様々な方法で標識することができる。当業者であれば、適切なマーカーおよび標識法に習熟している。イムノアッセイの例として、ELISA、RIAならびに共免疫沈降法、免疫蛍光法およびイムノブロッティング法が挙げられる。そこで、本発明は、治療および診断目的のために適合する生成物を提供する。特に、本発明による発現ベクター、例えばパルボウイルスは、遺伝子治療手段のために使用することができる。さらに、本発明によるパルボウイルス変異体は、例えば腫瘍疾患を治療するための毒素として適当である。このため、本発明の適用のためのキットも提供される。このキットは、以下、a本発明によるパルボウイルス変異体、b本発明によるDNA、例えば発現ベクター、特にパルボウイルス、c本発明による抗体、ならびにd従来型補助物質、例えば溶媒、緩衝液、担体、マーカーおよびコントロールを含んでいる。成分a~dの内で、1つ以上の代表的な成分が各々存在してよい。本発明は、さらに本発明のパルボウイルス変異体、前記パルボウイルス変異体を産生するベクターもしくは細胞パルボ治療薬もしくはパルボ治療用組成物、例えばヒト293T、ヒトNB-324KまたはラットRG2細胞を含有する医薬組成物を提供する。投与するために、本パルボ治療薬は、適切な医薬担体と結合することができる。当分野において周知のタイプおよび市販の容易に入手可能な適切な医薬担体には、リン酸緩衝食塩PBS液、水、エマルジョン、例えば油/水型エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、造影剤例、Visipaque、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、適切な用量で被験者に投与するための従来型調製方法によってパルボ治療薬とともに調製することができる。追加の医薬上適合する担体は、ゲル、生体吸収性マトリックス材料、該治療薬を含有する移植成分または任意の他の適切な媒体vehicle、送達もしくは分注手段もしくは物質を含むことができる。本発明のパルボ治療薬によって治療可能な患者には、ヒトならびに非ヒト動物が含まれる。後者の例には、制限なく、動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコが含まれる。パルボ治療用医薬組成物の患者、例えば脳腫瘍患者への投与は、数多くの適切な方法のいずれか、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、頭蓋内および腫瘍内投与によって実行することができる。投与経路は、当然ながら、疾患の性質および該医薬組成物中に含有された特定の治療薬に左右される。そのようなパルボ治療薬が血液脳関門を通って進入する能力を備える感染性ウイルス粒子を含む場合、治療は、該ウイルス治療薬、例えばH-1PV変異体の静脈内注射によって実施できる、または少なくとも開始できる。長期静脈内治療はウイルス治療薬に対する中和抗体が形成されるために非効率になり易いので、静脈内ウイルス投与の初期投与計画後に様々な投与様式を採用することができる、またはそのような様々な投与技術、例えば頭蓋内もしくは腫瘍内ウイルス投与を、パルボウイルス治療の全経過を通して代替的に使用することができる。また別の特殊な投与技術として、パルボ治療薬ウイルス、ベクターおよび/または細胞剤は、患者に移植された起源から該患者に投与することができる。例えば、シリコーンもしくは他の生体適合性材料製のカテーテルを、それ以上の外科的介入を行わずに様々な時点に該パルボ治療用組成物を局所的に注射することを可能にするために腫瘍除去中もしくは別個の手技によって該患者内に設置された小さな皮下リザーバーRickhamリザーバーに接続することができる。パルボウイルス変異体もしくはパルボウイルス由来ベクターは、定位固定外科技術または神経ナビゲーションターゲティング技術によって例えば腫瘍内に注射することもできる。パルボウイルス剤もしくは組成物の投与は、移植されたカテーテルを通して低流量でウイルス粒子もしくはウイルス粒子を含有する流体の、適切なポンプシステム、例えば蠕動式注入ポンプまたは対流強化送達CEDポンプを使用した連続注入によって実施することもできる。パルボ治療用組成物のさらにまた別の投与方法は、所望の場所、例えば腫瘍へ該パルボ治療薬を分注するために構築および配置された移植器具からである。例えば、パルボ治療用組成物、例えばパルボウイルスH-1変異体が含浸されたウエハーを使用することができるが、このとき該ウエハーを外科的腫瘍切除の終了時に切除腔の辺縁に付着させる。そのような治療的介入において複数のウエハーを使用することができる。パルボ治療薬を能動的に生成する細胞、例えばパルボウイルスH-1PV変異体またはH-1PVベクターは、所望の組織、例えば腫瘍内へ、または腫瘍切除後の腫瘍腔内へ注射することができる。上述した投与様式の2つ以上の組み合わせは、任意の適切な方法、例えば同時に、同時期に、または連続的に使用することができる。パルボ治療薬の投与レジメンは、当分野の技術の範囲内で、患者データ、観察所見および他の臨床因子、例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、性別および投与される特定ウイルス、ベクター、細胞など、投与の時間および経路、疾患のタイプ、例えば腫瘍のタイプおよび特性、患者の一般的健康状態ならびに該患者が受ける他の薬物もしくは療法に基づいて担当医が容易に決定することができる。したがって、本発明は、癌を治療するための医薬組成物を調製するための本発明によるパルボウイルス変異体、前記パルボウイルス変異体を産生する細胞、本発明のDNA、発現ベクターまたは抗体の使用にさらに関する。好ましい癌は、本発明の薬剤を用いた治療に特に影響を受け易いと期待される膵臓癌、子宮頸癌、肝細胞癌およびリンパ腫である。以下の実施例では、本発明をより詳細に説明する。材料および方法A細胞および試薬サルウイルス40-形質転換ヒト新生児腎臓NB-324K細胞[21]は、5ウシ胎仔血清、グルタミンおよび抗生物質100μg/mLのペニシリンおよび100U/mLのストレプトマイシン、Gibco/Invitrogen社、独国カールスルーエを補給したイーグル最小必須培地Sigma-Aldrich社中で増殖させた。ヒトPDAC細胞系Panc-1およびMiaPaCa-2原発腫瘍から樹立は、A.Vecchi氏InstitutoClinicoHumanitas社、イタリア国ロッツァーノの厚意により提供された。ヒトHeLa細胞系は、E.Schwarz氏GermanCancerResearchCenter、独国ハイデルベルクの厚意により提供された。Panc-1、MiaPaCa-2およびHeLa細胞は、10ウシ胎仔血清PAALaboratories社、オーストリア国パッシングおよび2mMのL-グルタミンGibco/Invitrogen社を補給したダルベッコの変法イーグル培地DMEM、Sigma-Aldrich社、独国タウフキルヒェン中で増殖させた。SV40T抗原-、Ad5-形質転換ヒト胚腎臓293T細胞系[28]は、10のFCS、2mMのL-グルタミン、100U/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシンを補給したダルベッコの変法イーグル培地DMEM、Sigma社中で培養した。Bウイルスの注射および産生ウイルス感染は、37°Cで1時間、補給物を含まない細胞培養培地中でプレートを定期的に揺動させながら希釈した精製ウイルスの6cmの細胞培養皿Sarstedt社、独国ニュルンブレヒト1枚当たり400μLの接種菌を用いて実施した。DelH-1PVおよびPMutH-1PV変異体は、最初に適切なプラスミド構築体を使用して、以前に説明された293T細胞のトランスフェクション[18]によって生成した。H-1PV変異体ならびにwtH-1PVは、続いて低い感染多重度MOI、すなわち10-3PFU/細胞でNB-324K細胞の感染によって生成した。感染3日後または細胞変性作用の出現後に細胞を採取し、3回の冷凍-解凍サイクルによってVTE緩衝液50mMのTrispH8.7、0.5mMのEDTA中に溶解させた。細胞破壊片を遠心分離によって除去し、ウイルスストックはイオジキサノールステップ勾配遠心分離によって精製した[22]。子孫ウイルス産生を測定するために、1×105個の細胞を0.5PFU/細胞のMOIでH-1PV変異体もしくはwtH-1PVを用いて感染させた。感染後の様々な時点に培地を採取し、感染した培養を収集し、VTE緩衝液中で3回の冷凍-解凍サイクルにかけた。ウイルス力価は、プラークアッセイによって細胞抽出物および培養培地の両方について決定した。C感染性ウイルスの滴定ウイルスストックは、NB-324K指標細胞上でプラークアッセイ[23]または感染細胞ハイブリダイゼーションアッセイ[24]によって滴定した。ウイルス力価は、他のどこかで記載された[18,23,25]ウイルス懸濁液1ミリリットルmL当たりのプラーク形成単位PFUまたは複製単位RUとして表示した。D完全ウイルス粒子の滴定ウイルスストック内に存在する完全ウイルス粒子の量は、以前に記載された定量的ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイ[26]によって決定し、ウイルス懸濁液1ミリリットル当たりの完全ウイルス粒子数として表示した。E増殖阻害の測定感染NB-324K細胞の増殖動態は、Casy細胞計数システムCasy社、独国ロイトリンゲンを使用して電子パルス面積分析法によって監視した。Fイムノブロッティング法1.5×105個のNB-324K細胞は、3PFU/細胞のMOIでDelH-1PV、PMut1H-1PV、PMut2H-1PVまたはwtH-1PVを用いて感染させた。細胞は、感染6、8、24および48時間後に収集し、プロテアーゼ阻害剤Roche社、独国を補給したRIPA緩衝液150mMのNaCl、10mMのTrispH7.5、1mMのEDTApH8.0、1のNP-40、0.5のデオキシコール酸ナトリウム、0.1のSDS中に溶解させた。タンパク質の定量Bio-Radタンパク質アッセイ、Bio-RadLaboratories社、独国ミュンヘン後、10μgの全タンパク質をSDS12-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法SDS-PAGEによって分離し、Protranニトロセルロース膜PerkinElmerLifeSciences社、独国イーバーリンゲンへ電気移送した。この膜は、最初にNS1SP8、[27]、NS2α-NS2p、[18]もしくはウイルスカプシドタンパク質α-VPpep、[25]に向けられたウサギポリクローナル抗血清のいずれかと、次に適切な二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体Promega社、独国マンハイムとインキュベートした。免疫反応性タンパク質は、さらに強化化学発光法GEHealthcareEurope社、独国フライブルクによって解明した。G感染培養細胞からの核および細胞質タンパク質分画5×105個のNB-324K細胞は、1PFU/細胞のMOIでDelH-1PV、PMut1H-1PV、PMut2H-1PV、PMut4H-1PVもしくはwtH-1PVを用いて感染させた。感染16、20、24および42時間後に細胞を採取し、核および細胞質タンパク質分画をNE-PER核および細胞質抽出試薬キットThermoFisherScientific社、米国ロックフォードを製造業者の取扱説明書にしたがって使用し実施した。各分画中に存在する感染性粒子の数をプラークアッセイによって決定し、全PFUとして表示した。H細胞クローン形成能の測定NB-324K細胞は、様々なMOIでwtH-1PVまたはDelH-1PVを用いて感染させた。4時間後、感染細胞をトリプシン処理によって採取し、6cm細胞培養皿上に単一細胞として、すなわち培養皿1枚当たり細胞100~200個で再播種した。2.5の抗H-1カプシド血清PV1を含有する完全培地中での培養13~17日後に、細胞を固定し、クリスタルバイオレット溶液100mLの70EtOH中に希釈させた1gのクリスタルバイオレットを用いて染色した。細胞コロニー数を計数し、各MOIについて擬似mock処理細胞と比較した生存細胞のパーセンテージとして表示した。I免疫蛍光法1.5×104個のNB-324K細胞は、カバースリップ診断用顕微鏡スライド、ErieScientific社、米国ポーツマス上で増殖させ、DelH-1PVまたはwtH-1PVを用いて3PFU/細胞のMOIで感染させた。感染の15および21時間後に、細胞を3.7ホルムアルデヒド中で10分間固定し、低温メタノールを用いて5分間、低温アセトンを用いて2分間処理し、10分間0.2のTritonX-100[4-1,1,3,3-テトラメチルブチルフェノール]エトキシレートを用いて透過化した。PBSを用いて洗浄した後、細胞は約30分間10ウシ胎仔血清を含有するブロッキング溶液を用いて処理した。細胞は、連続的に一次抗体としてのマウスモノクローナル抗体3C3F121:100の希釈率C.Dinsart、未公表および二次抗体としてのロバ抗マウスalexafluor488結合抗体1:600の希釈率、SantaCruzBiotechnology社、米国オレゴン州ユージーンとともに各々室温で1時間インキュベートし、続いてリン酸緩衝食塩液により3回洗浄した。全ての溶液および希釈液は、リン酸緩衝食塩液中で調製した。DAPI4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを用いたDNAの高速染色後、カバースリップをエタノールを用いて乾燥させ、ポリビニルアルコールElvanol、Serva社、独国ハイデルベルクの存在下でスライドガラス上に載せた。サンプルをLeicaDMRBE顕微鏡を用いて63倍の倍率で油浸対物レンズを用いて試験し、画像をHamamatsuOrcaデジタルカメラを用いて記録し、Openlab2Improvision社、英国およびAdobePhotoshopCS2ソフトウエアを使用して処理した。所定の表現型のパーセンテージを決定するために、1表現型当たり200個の細胞を試験した。J腫瘍抑制のinvivo測定4×107個のPanC-1細胞は、3RU/細胞のMOIでDelH-1PVまたはwtH-1PVのいずれかを用いてinvitroで感染させた。感染4時間後に、マウス1匹当たり5×106個の細胞をBalb/cヌードマウスの右側腹部へ皮下s.c.注射した。7匹のヌードマウスに擬似mock処理つまり、緩衝液処理細胞を注射し、7匹のヌードマウスにwtH-1PV感染細胞を注射し、他方6匹のヌードマウスにはDelH-1PV感染細胞を注射した。マウス6~7週齢の雌、1ケージ当たり5匹は21~24°C、40~60の湿度に設定した騒音絶縁室内で維持した。腫瘍サイズは、カリパスを用いて約3カ月間の期間にわたり週2~3回測定した。腫瘍容積は、式V=1/2×長さ×幅2にしたがって計算し、総容積mm3の平均値または290mm3超の腫瘍を有する1群のマウスのパーセンテージのいずれかで表示した。2×106個のHeLa細胞をBalb/cヌードマウスの右側腹部へ皮下注射した。移植9日後に、5匹のヌードマウスに各々100μLのPBSを注射し、5匹のヌードマウスに各108PFUのDelH-1PV100μLのPBS中を注射し、5匹のヌードマウスに各々108PFUのwtH-1PV100μLのPBS中を注射した。マウス6~7週齢の雌、1ケージ当たり5匹は21~24°C、40~60の湿度に設定した騒音絶縁室内で維持した。腫瘍サイズは、カリパスを用いて約6週間の期間にわたり週2~3回測定した。腫瘍容積は、式V=1/2×長さ×幅2にしたがって計算し、総容積mm3の平均値または1,000mm3超の腫瘍を有する1群のマウスのパーセンテージのいずれかで表示した。Kパルスチェイス代謝放射標識および細胞抽出物9×105個のNB-324K細胞は、3PFU/細胞のMOIでDelH-1PVもしくはwtH-1PVまたは擬似mock処理すなわち、緩衝液処理のいずれかを用いて感染させた。感染18時間後、培養を30分間に、5透析ウシ胎仔血清、1のL-グルタミンおよび1ゲンタマイシンを補給したMetおよびCys非含有ダルベッコ変法イーグル培地DMEM中の200μCiのTran35S標識1,175Ci/mmol、MPBiomedicals社を用いて代謝標識した。その後、標識培地を吸引し、細胞は血清非含有MEMを用いて1回洗浄した。細胞は続いて溶解させた、または37°Cの未標識完全培地チェイス中で再インキュベートし、その後、標識合成タンパク質の分解を調査するためにインキュベーション後の様々な時点に溶解させた。溶解は、プロテイナーゼ阻害剤の混合物Complete、ロッシュ社、独国マンハイムを補給したRIPA緩衝液150mMのNaCl、10mMのTris[pH7.5]、1mMのEDTA[pH8.0]、1v/vのNonidetP-40、0.5のデオキシコール酸ナトリウム、0.1w/vのドデシル硫酸ナトリウムSDSを使用して実施した。タンパク質は、4°Cにて10分間全速力でエッペンドルフ遠心管中での遠心分離によって細胞破壊片を除去した後に採取した。L細胞およびウイルスタンパク質の共免疫沈降法5×106cpmの標識タンパク質抽出物は、4°Cで1時間連続回転下Reax2、Heidolph社のH-1PVNS1、H-1PVNS2、ヒトCRM1もしくは14-3-3タンパク質のいずれかに向けられた8~10μLのウサギポリクローナル抗血清の存在下でインキュベートし、さらに100μLのプロテインAセファロース6MB、GEHealthcare社を各サンプルに加えた後に4°Cで1時間インキュベートした。サンプルは、5分間5,500rpmおよび4°Cで遠心したSigma2K15。タンパク質-抗体-ビーズ複合体は、次に各1mLのRIPA/-SDS緩衝液を用いて3回洗浄した。サンプルペレットを適切な量の2×SDSローディング色素80~100μL中に再懸濁させ、タンパク質を12w/vポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離した。AmplifyAmersham社を用いた30分間のインキュベーション後、ゲルを乾燥させ、さらにオートラジオグラフィーフィルムBioMaxm、MSFilm、Kodak社に露光させた。Mウイルスの熱変性および定量的リアルタイムPCRによるパッケージ化ウイルスDNAの検出精製DelH-1PVもしくは精製wtH-1PVいずれかの109個の完全ウイルス粒子を含有するDNAse-緩衝液希釈液400mMのTris-HCl[pH8.0]、100mMのMgSO4、10mMのCaCl2、Promega社、独国マンハイムを10分間既定温度PCR装置を用いて発生させた50~70°Cの範囲内の温度へ加熱した。サンプルは、続いて37°Cで1時間DNAseI[0.1U/μL、Promega社、独国マンハイム]を用いて処理した。無傷カプシドの数を決定できるように、ウイルス粒子はアルカリ溶菌によって崩壊させ、パッケージ化ウイルスDNAを他の場所で記載されたように[29]Mastercycler登録商標eprealplexEppendorf社、独国ハンブルクを使用して定量的リアルタイムPCRによって検出した。個々の反応混合物20μLは、1×TaqManUniversalPCRMasterMixTMAppliedBiosystems社、0.28μMの標識NS1-TagManTMプローブ、0.28μMの各フォワードプライマーおよびリバースプライマーならびに2.85μLのテンプレートを含有していた。ウイルス力価は、ウイルス懸濁液1mL当たりのウイルスゲノムvg/mLとして表示し、以下の式にしたがって計算した。ウイルス力価[vg/mL]=IQ[1/mL].35000因数35000=[46.7μL/6.7μL×20μL]×100μL/10μL×1000μLIQはサンプルの定量蛍光強度を意味し、因数35000は1ウエル当たり46.7μL/6.7μL×20μL、アルカリ溶菌1000μL/10μLのために使用されるウイルス懸濁液10μL当たりおよび1mLのウイルスストック液当たりのウイルス力価を表示するための1mL1000μL当たりの量を計算するために必要とされる。NヒトNB-324K細胞へのウイルスの結合5×105個のヒトNB-324K細胞は、104vg/細胞のMOIでwtH-1PVまたはDelH-1PVを用いて感染させ、さらに1時間4°Cでインキュベートした。細胞は、氷温1×PBSを用いて洗浄し、500μLの1×PBS中で剥離させ、4°Cで5分間3,500rpmで遠心することによりペレット化したcentrifuge5417R、Eppendorf社。上清は、Eppendorf試験管中に保管した。細胞は次に200μLの氷温1×PBS中に再懸濁させ、DNAは細胞溶解後にDNeasyBloodandTissueキットQiagen社を製造業者の取扱説明書にしたがって使用し精製した。細胞溶解液は、ウイルス粒子を変性させるために85°Cで30分間インキュベートしHBT130、HaepLaborConsult社、遊離したウイルスDNAはHirt抽出によって回収した。上清分画内または細胞に結合した状態いずれかで存在するウイルスゲノムの定量は、他の場所で記載された定量的リアルタイムPCR[28]によって決定した。Oウイルスの取り込み8×104個のNB-324K細胞は、104vg/細胞のMOIでwtH-1PVまたはDelH-1PVのいずれかを用いて感染させ、さらに37°Cでインキュベートした。感染後の時点0.5~3時間に、細胞を1×PBSで洗浄し、膜結合ウイルス粒子をトリプシン/EDTAInvitrogen社処理によって剥離させた。次に細胞を5分間3,500rpmおよび室温での遠心分離によってペレット化したcentrifuge5417R、Eppendorf社。細胞はDNeasyBloodandTissueキットQiagen社を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して溶解させ、内在化ウイルスDNAはHirt抽出によって抽出した。内在化ウイルスゲノムの定量は、他の場所で記載された定量的リアルタイムPCR[28]によって決定した。P哺乳動物細胞からの低分子量ウイルスDNAの抽出Hirt抽出感染もしくはトランスフェクト細胞または細胞上清からの低分子量ウイルスDNAの抽出は、他の場所で記載されたHirt抽出[30]によって、またはDNeasyBloodandTissueキットQiagen社のいずれかによって実施した。QサザンブロッティングウイルスDNA複製型は、1-アガロースゲル電気泳動法によって分離した。各30分間の2回の変性処理およびゲル各々についての15分間の2回の中和処理後、DNA分子を室温で15~20時間ニトロセルロースフィルターProtran、GEHealthcare社上へ10×SSC緩衝液の存在下での毛細管作用によって移した。膜をブロットから取り外し、DNA分子は膜のUV処理によって固定化した。膜はその後、32P放射標識NS特異的プローブとともにハイブリダイズし、さらにオートラジオグラフィーフィルム上、-80°Cで露光させたBioMax、MSFilm、Kodak社。Rトランスフェクション-CaPO4を使用するトランスフェクション6μgのpwtH-1PVおよびpDelH-1PVプラスミドDNAは、HEPES緩衝食塩液と塩化カルシウムCaCl2溶液の混合液中で他の箇所で記載されたように[28]沈降させ、さらに完全培地中の10cm培養皿中の2×106の293T細胞に加え、その後37°Cおよび5のCO2でインキュベートした。-リポフェクタミン2000を使用するトランスフェクショントランスフェクションの30~60分前に、完全細胞培養培地を補給物が補給されていない新鮮培地と交換した。その間に、6μgのpwtH-1PVおよびpDelH-1PVプラスミドDNAをOPTI-MEMInvitrogen社中に希釈させ、リポフェクタミン2000Invitrogen社およびOPTI-MEMの混合液を製造業者の取扱説明書にしたがって調製した。2種の溶液を混合し、室温で25分間インキュベートした後、混合液をサブコンフルエントなNB-324K細胞の細胞培養培地へ滴下した。トランスフェクション4時間後、トランスフェクション培地を新鮮完全細胞培養培地と交換した。パルボウイルス変異体の構築ADelH-1PV変異体H-1PVゲノム内のNS-コーディング配列すなわち、Δ2022~2135ヌクレオチドにおける欠失は、pSR19プラスミド[13]および表1に列挙したプライマーを用いてPCRによって構築した。欠失した領域を含有するApoI-HindIIIフラグメントを変異したDNAから切断し、引き続いてpDelH-1PVプラスミド構築体を生成するために所望のベクター内の同等の野生型ApoI-HindIIIフラグメントと置換した。この構築体は、全置換ApoI-HindIIIフラグメントGATCBiotech社、独国コンスタンスを配列決定することによって確認した。BPMutH-1PV変異体単一および二重点突然変異の感染性H-1PVクローンpSR19内への導入は、特定部位突然変異誘発によって、QuickChange登録商標特定部位突然変異誘発キットStratagene社、オランダ国アムステルダムを製造業者の取扱説明書にしたがって、および表2に記載したプライマーを使用して実施した。全ての構築体は、シーケンシングによって検証したGATCBiotech社、独国コンスタンス。野生型H-1PVに比較してDelH-1PVの増加した感染性、およびDelH-1PVに比較してPMut1H-1PVおよびPMut2H-1PV変異体の類似、もしくは一層良好な感染性ウイルスストックの感染性は、完全ウイルス粒子P対感染性粒子Iの比率、つまりP/I比によって規定される。このため、P/I比が低いほどウイルスストックの感染性は高くなる。図2は、NB-324K細胞内で新規に生成されたウイルスストック由来のwtH-1PVに比較した様々な欠失および点突然変異H-1PV変異体のP/I比粒子対感染性比を示している。各ウイルスストックについて、完全粒子の量はこのストックのゲノム力価にしたがって決定したが、感染性粒子の量は完全粒子がiプラークを形成するプラーク形成単位もしくはPFUで与えられる、およびii参照NB-324K細胞系内のそれらのゲノムを複製する複製単位もしくはRUで与えられる能力にしたがって決定した。2つのP/I比は、さらに完全粒子すなわち、ウイルスゲノムを含有するカプシドの量を、-最初にPFUの量完全ビリオンが細胞溶解を通して培養内に拡散する能力を特徴付ける図2の比1と、-次にRUの量それらのゲノムを増幅させることのできる完全ビリオンを特徴付ける図2の比2と比較することによって決定した。図2に示したように、PMut1H-1PVおよびPMut2H-1PV点突然変異体ならびにDelH-1PV欠失変異体は、完全粒子がそれらのゲノムを増幅させる図2、比2または細胞培養内で増殖する図2、比1いずれかの能力に関してwtH-1PVよりも低いP/I比を示した。実際に、DelH-1PVおよびPMut2H-1PVの両方のP/I比ならびにPMut1H-1PVのP/I比は、wtH-1PVのP/I比と比較して、各々少なくとも5分の1および8分の1である。これは、これらの変異体の感染性がより高いことを示しており、PMut1H-1PVは最高水準を示している。これとは対照的に、PMut3H-1PVおよびPMut4H-1PV点突然変異体は、完全ビリオンがゲノムを増幅させる、および増殖する両方の能力に関して3つの他の変異体DelH-1PV、PMut1H-1PVおよびPMut2H-1PVと比較して高い、このため不良なP/I比を示した。これらの2つの変異体はさらに、少なくとも細胞培養内でそれらが増殖する能力によると、wtH-1PVよりも不良なすなわち、2倍以上高いP/I比を示した。これらのデータは、PMut3H-1PVおよびPMut4H-1PV両方の点突然変異体の減少した感染性を示している。PMut1およびPMut2H-1PV内に導入された点突然変異は単独で該変異体の感染性を増加させたが、他方両方の点突然変異の組み合わせはPMut4H-1PVにおけるのと同様に反対の影響を有すると思われ、感染性完全粒子より多い悲感染性粒子をもたらしたことは注目に値する。要するに、点突然変異体PMut1H-1PVNS2Leu103ProおよびNS1Tyr595Hisの感染性は欠失変異体DelH-1PVΔヌクレオチド2022~2135または点突然変異体PMut2H-1PVNS2Lys96Gluのいずれか1つより一層良好であり、これら2つの後者の感染性は既にwtH-1PVの感染性に比較して有意にすなわち、少なくとも5倍増加した。感染NB-324K細胞内のwtH-1PVと比較したDelH-1PVの増加した、および/またはより高速の増殖欠失変異体DelH-1PVおよび点突然変異体PMut1H-1PV、PMut2H-1PVおよびPMut3H-1PVならびにwtH-1PVのウイルス産生をプラークアッセイによって分析した。力価の決定を可能にする他、この方法は、ウイルスが隣接細胞を感染させ、それにより単層細胞培養内で拡散する能力を意味するプラーク形成能力を示している。プラークアッセイは常に、ウイルスストックが何であれ、おそらく感染している場合は細胞が細胞周期の様々な段階にあるという事実に起因して、小さなプラークおよび大きなプラークの混合物を生じさせるが、パルボウイルス複製周期は細胞周期のS期でしか開始できないことは注目に値する。しかし、プラークが大きく、ウイルスによって産生する大きなプラークの量が多いほど、このウイルスが細胞培養内で増殖する能力は良好である。図3のAは、参照NB-324K細胞系内で様々なH-1PV変異体およびwtH-1PVによって形成されたプラークのサイズを例示している。PMut3H-1PVは、wtH-1PVより小さなプラークを明確に産生したが、これは少なくともヒトNB-324K細胞内でこの変異体の増殖効率が低いことを示唆している。これらのデータはさらに、NB-324K細胞内の上述したこの変異体の低い感染性とも一致している実施例3および図2を参照されたい。これとは対照的に、3つの他の変異体PMut1H-1PV、PMut2H-1PVおよびDelH-1PVによって生成されたプラークは、一般にPMut3H-1PVを用いて得られたプラークより大きかったが、これはこれらの変異体を用いた場合のより良好な増殖効率を示唆している。しかし、PMut2H-1PVおよびPMut1H-1PVは、wtH-1PVを用いて得られたプラークより各々小さい、および大きいプラークを産生すると思われた。これらの2つの点突然変異体によって形成されたプラークの様々なサイズおよびwtH-1PVまたはDelH-1PVを用いて得られたものと比較したそれらの比率を決定するためにはまた別の実験が実施される。図3のAに示したように、欠失変異体DelH-1PVは、wtH-1PVより大きなプラークを産生した。実際に図3のBに示したように、大きな、つまり25mm2超のプラークのより高い比率は、DelH-1PV変異体を用いた感染後に形成されたが、wtH-1PVは、小さな、つまり20mm2までのプラークの高い比率を生成した。さらに、DelH-1PVは、wtH-1PV各々、13mm2および67mm2に比較して高い平均および最高サイズ各々、19mm2および118mm2のプラークを生じさせた。これを言い換えると、DelH-1PV変異体を用いて得られたプラークサイズの平均値は、wtH-1PVを用いて得られたプラークサイズの平均値に比較して1.5倍高く、これはDelH-1PV変異体のより良好な増殖効率および/または高速の感染周期を示唆している。これらのデータはさらに、NB-324K細胞内の上述したこのDelH-1PV変異体の高い感染性とも一致している実施例3および図2を参照されたい。要するに、欠失変異体DelH-1PVΔヌクレオチド2022~2135の増殖は、NB-324K細胞内のwtH-1PVと比較して増加する、および/または高速である。点突然変異体PMut1H-1PVNS2Leu103ProおよびNS1Tyr595HisがwtH-1PVと同様に、またはより良好に増殖するかどうかについては、今後決定される。感染NB-324K細胞内のウイルスタンパク質の蓄積ウイルスタンパク質の蓄積は、DelH-1PV、PMut1H-1PV、PMut2H-1PVまたはwtH-1PVを用いて感染させたNB-324K細胞内での免疫ブロッティングアッセイによって決定した。図4は、感染6時間、8時間、24時間および48時間後の非構造的NS1およびNS2タンパク質ならびにカプシドVPタンパク質の蓄積を示している。試験したウイルス全部が非構造タンパク質およびカプシドタンパク質を発現することができた。しかし、これらのタンパク質の蓄積パターンは、ウイルス毎に相違していた。全感染NB-324K細胞では、カプシドタンパク質VP1およびVP2は、感染24時間および48時間後に検出可能であったが、より早期の6時間および8時間後には検出できなかった。感染24時間後、欠失および点突然変異体で感染させた細胞は、wtH-1PV感染細胞と比較して高い量のVPタンパク質を示した図4、黒色矢印。感染24時間~48時間後には、DelH-1PVは、VPタンパク質蓄積における強度の増加をもたらしたが、PMut1H-1PVおよびPMut2H-1PV変異体またはwtH-1PVを用いた場合はVPタンパク質の増加は全く、またはわずかしか観察されなかった。wtH-1PVおよびDelH-1PV感染とは対照的に、非構造タンパク質NS1は、PMut1H-1PVまたはPMut2H1-PVのいずれかによる感染8時間後に既に検出可能であった図4、赤色の矢印。さらに、これら2つの点突然変異体はさらに感染24時間および/または48時間後に観察されたようにwtH-1PVまたはDelH-1PVを用いて得られたものに比較してNS1の高い蓄積レベルをもたらしたが、後者は少なくとも感染後の分析した期間内にNS1の最低蓄積レベルを生じさせると思われた。全ての場合に感染早期、つまり感染6時間後または8時間後にはNS2タンパク質を検出することができなかったが、NS2の蓄積パターンは感染後期には全4種のウイルス間で際だって相違していた図4、黒色の囲み枠。感染8時間~24時間後、NS2は、DelH-1PVを除く全ウイルスを用いて検出可能なレベルに蓄積した。感染の24時間および48時間後の時点に、NS2蓄積のレベルはwtH-1PVを用いて感染させた細胞内で類似であったが、各々PMut1H-1PVまたはPMut2H-1PVを用いた感染後有意に増加または減少した。DelH-1PVを用いて感染させた細胞内では、NS2は、分析した最後の時点、つまり感染48時間後にはほとんど検出不能であった。要するに、点突然変異体PMut1H-1PVNS2Leu103ProおよびNS1Tyr595HisおよびPMut2H-1PVNS2Lys96Gluは、どちらも高度に細胞毒性であると思われ実施例6および図5を参照されたい、非構造タンパク質NS1のより早期および高度の蓄積を生じさせたが、欠失変異体DelH-1PVΔヌクレオチド2022~2135は、より高速で増殖すると思われ実施例4および図3を参照されたい、また、少なくとも参照ヒトNB-324K細胞系内および分析した期間内にカプシドタンパク質VP1およびVP2のより高速の蓄積ならびに非構造タンパク質NS2の最低蓄積を生じさせた。PMut1H-1PVおよびPMut2H-1PV変異体を用いた増加した細胞培養増殖阻害および増加した感染性子孫ビリオンの産生点突然変異体PMut1H-1PVおよびPMut2H-1PVの細胞毒性および生殖特性を感染ヒトNB-324K内の欠失変異体DelH-1PVおよびwtH-1PVの細胞毒性および生殖特性と比較した。このため細胞培養増殖および感染性子孫ビリオンの産生をどちらも4日間追跡した。他方、生細胞および死細胞の量を、Casy細胞計数システムを用いて測定し、図5Aは、擬似mock処理細胞内で得られた生細胞の平均値に基づいた生細胞の平均パーセンテージを示している。他方、プラークを形成可能な新規に作製されたビリオンの量はプラークアッセイによって決定し、図5Bは、感染1、2、3および4日後に得られた全プラーク形成単位の量を示している。図5Aに示したように、全ウイルスは細胞培養増殖を阻害することができ、欠失変異体DelH-1PVおよびwtH-1PVは、少なくとも感染後第1日に類似レベルの細胞増殖阻害を示した。しかしはるかに高い細胞毒性作用、つまり約1.5および2倍の細胞集団増殖のより強力な阻害は、少なくとも感染後第1日のDelH-1PVまたはwtH-1PV感染細胞と比較した場合に点突然変異体PMut1H-1PVおよびPMut2H-1各々を用いたNB-324K細胞の感染後に明白に観察された。図5Bに示したように、全ウイルスは、ヒトNB-324K細胞内で感染性子孫ビリオンを産生することができた。しかし、点突然変異体PMut1H-1PVおよびPMut2H-1PVの両方ならびに欠失変異体DelH-1PVはwtH-1PVに比較して高い感染性子孫ビリオンの産生を生じさせ、これは少なくとも感染1日後に全プラーク形成単位の量における各々約12倍、7.5倍および5倍の増加を示した。要するに、点突然変異体PMut1H-1PVNS2Leu103ProおよびNS1Tyr595HisおよびPMut2H-1PVNS2Lys96Gluは、欠失変異体DelH-1PVΔヌクレオチド2022~2135およびwtH-1PVに比較して一層強度にNB-324K細胞集団の増殖を阻害する。全3種の変異体、つまりPMut1H-1PV、PMut2H-1PVおよびDelH-1PVはさらに、wtH-1PVが少なくともヒトNB-324K細胞において生じさせたより高度の感染性子孫ビリオンの産生を生じさせた。感染ヒトNB-324K細胞の核および細胞質内のPFU分布図6は、wtH-1PVまたは変異体DelH-1PV、PMut1H-1PVもしくはPMut2H-1PVのいずれかを用いて感染させたNB-324K細胞内の二次感染の非存在下での感染性子孫ビリオンの産生および細胞内分布を示している。細胞の核および細胞質分画内に存在する感染性子孫ビリオンをプラークアッセイによって感染16時間、20時間、24時間および42時間後に定量し、プラーク形成単位すなわち、プラーク形成粒子もしくはビリオンとして表示した。図6のaに示したように、NB-324K細胞の核分画から回収したプラーク形成性、つまり感染性子孫ビリオンの量は、試験した全時点でDelH-1PVまたはwtH-1PVのいずれかによる感染後に同等であり、経過時間に伴って同様に増加した。これとは対照的に、そして図6のbに示したように、wtH-1PV感染NB-324K細胞と比較してDelH-1PV内の感染24時間および48時間後の細胞質分画から有意に高い量のプラーク形成ビリオンが回収された。これらのデータは、wtH-1PV感染細胞と比較してDelH-1PVによる感染後のNB-324K細胞の核から細胞質への新規に作製された感染性ビリオンのより早期および/または増加した輸送とともに一次感染の結果としての子孫ビリオンの増加した産生を明らかに示した。PMut1H-1PV、PMut2H-1PVまたはPMut4H-1PVを用いて感染させたNB-324K細胞の核分画内でのプラーク形成子孫ビリオンの蓄積パターンは、wtH-1PVまたはDelH-1PVのいずれかによる感染後に得られた蓄積パターンとは相違していた。図6のcに示したように、二重点突然変異体PMut4H-1PVは、試験した全ての他のウイルスと比較して、NB-324K細胞の核分画内ではるかに高い量のプラーク形成粒子、すなわち感染20時間後の7倍および感染24時間後の5倍の増加を生じさせた。感染24時間後、PMut1H-1PVはさらに、PMut2H-1PV、DelH-1PVおよびwtH-1PVと比較してNB-324K細胞の核分画内で有意に高い量のプラーク形成粒子を生じさせた。なおPMut1H-1PV、PMut2H-1PVもしくはPMut3H-1PVを用いた感染後に核内で見いだされた核形成粒子の量が、感染24時間~42時間後の時点に欠失変異体DelH-1PVもしくはwtH-1PVとは対照的に低下したことは興味深い。細胞質分画内では、および図6のdに示したように、二重点突然変異体PMut4H-1PVは、感染の少なくとも42時間後にDelH-1PVを用いて得られた量にほぼ近似した野生型に比較して感染20時間、24時間および42時間後のプラーク形成粒子の量の明白な増加を示した。単一点突然変異体PMut1H-1PVはwtH-1PVと比較して、さらに少なくとも感染の24時間および48時間後と比較して高い量のプラーク形成子孫ビリオンを生じさせたが、DelH-1PVを用いて得られた量ほど高くはなかった。他の変異体とは対照的に、PMut2H-1PVを用いて感染させたNB-324K細胞の細胞系質内で見いだされたプラーク形成粒子の量は、試験した全時点において実質的に一定のままであり、したがってwtH-1PVを用いて感染させたサンプル内で見いだされた量より低いままであった。後者のデータは、子孫ビリオンの増加した細胞質蓄積を可能にする感染周期の一部の過程は他の変異体とは対照的にPMut2H-1PVを用いると損傷される可能性があることを示唆している。これらをまとめると、欠失変異体DelH-1PVΔヌクレオチド2022~2135および二重点突然変異体PMut4H-1PVNS2Lys96Glu、Leu103ProおよびNS1Tyr595Hisは野生型と比較して子孫ビリオンの明白に増加した産生を示したが、PMut4H-1PVは核内の早期の蓄積もまた示し、DelH-1PVは野生型と比較して新規に作製された感染性ビリオンの早期の核輸送を示している。単一点突然変異体PMut1H-1PVNS2Leu103ProおよびNS1Tyr595Hisは、だが少なくとも試験した時点にはより少ない量のプラーク形成粒子を備える二重点突然変異体PMut4H-1PVと同様に挙動すると思われるが、他方単一点突然変異体PMut2H-1PVNS2Lys96Gluは、感染細胞の細胞系質内で感染性子孫ビリオンを蓄積するその能力が損傷していると思われる。DelH-1PVの生活環の一部の過程は野生型H-1PVの生活環の一部の過程より高速である図7は、感染15時間および21時間後の免疫蛍光アッセイによって検出されたように感染NB-324K内の単細胞レベルでのウイルス粒子の蓄積および細胞内局在を示している。この実験では、ヒトNB-324K細胞をハイブリッドh欠失変異体DelhH-1PVまたはH-1PVゲノムの左側の部分が等価の領域によって、つまり密接に関連するパルボウイルスMVMppdB-MVp構築体から回収された、[25]由来のゲノムのヌクレオチド1~ヌクレオチド990と置換されたハイブリッド野生型hH-1PVのいずれかを用いて感染させた。これは、ウイルスプロモーターP34ならびにそれらのアミノ末端でのNS1の最初の244アミノ酸およびNS2の85アミノ酸はMVMp起源であり、他方NS1およびNS2タンパク質の両方のカルボキシ末端ならびにウイルスプロモーターP38および完全VPタンパク質はH-1PV起源であることを意味している。DelH-1PVにより感染させた細胞集団間では、wtH-1PVにより感染させた集団と比較して、核内で新規に集合した粒子を示すより多数の細胞が15時間および21時間後の時点に観察された。さらに、核から細胞質へ既に遊離された子孫ビリオンを示している多数の細胞はまた感染21時間後にwtH-1PVにより感染させた集団と比較してDelH-1PVにより感染させた細胞集団間でも観察された図7、白い矢印。これらのデータはハイブリッドDelhH-1PVおよびハイブリッド野生型hH-1PVを用いて得られたが、これらのデータは、wtH-1PVを用いて感染させたものに比較してDelH-1PVにより感染させたNB-324K細胞の細胞質分画内での感染性子孫ビリオンの、上述したより高速の蓄積と一致している実施例7および図6を参照されたい。要するに、欠失変異体DelhH-1PVΔヌクレオチド2022~2135を産生する細胞内で野生型hH-1PVを産生する細胞に比較して子孫ウイルス粒子のより早期の核退出が発生するが、これはDelhH-1PV感染周期の一部の過程が少なくとも参照ヒトNB-324K細胞系においてはwtH-1PV感染周期の一部の過程よりも高速で進行することを示唆している。欠失変異体DelH-1PVは、野生型H-1PVより低い細胞毒性を示す欠失変異体DelH-1PVの細胞毒性は、クローン形成性アッセイとその後のクリスタルバイオレット染色を使用してNB-324K細胞上のwtH-1PVの細胞毒性と比較した。図8のAに示したように、コロニーを形成可能な、つまり欠失変異体H-1PVによる感染後に増殖可能な細胞の量は、wtH-1PVによる感染後に検出された細胞コロニーの量よりある程度多い。図8のBに示したように、この作用は特に、細胞を低度または中等度の感染多重度すなわち、0.5PFU/細胞または2.5PFU/細胞で感染させた場合に観察される。これらのデータは全部で、wtH-1PVの毒性と比較して欠失変異体DelH-1PVの減少した毒性を示している。これらは予備試験データである。しかし、欠失変異体DelH-1PVの減少した毒性は、少なくともヒトNB-324K細胞内での子孫ビリオンのより良好な産生と相関付けることができる。実際に、これらのデータは、本発明者らの研究所で以前に得られた子孫ビリオンの優れた生産者である細胞系は感染過程中にはあまり迅速には死滅しないという観察所見と一致する。要するに、欠失変異体DelH-1PVΔヌクレオチド2022~2135は、ウイルス産生の増加に好都合であると思われるwtH-1PVと比較して低い毒性を示す。様々な膵臓癌細胞系およびHeLa細胞内でのDelH-1PVの増加したウイルス産生上述したように、標準wtH-1PVに比した欠失変異体DelH-1PVの有意な利点は、参照ヒトNB-324K細胞系における感染性および産生率に関して観察された。DelH-1PV変異体のこの作用は、様々なヒト腫瘍細胞系で確証された。図9は、感染後の様々な時点でのプラークアッセイによって決定されたように、ヒトNB-324K、ヒト膵臓癌Panc-1およびMiaPaCa-2ならびにヒト子宮頸癌HeLa細胞系においてwtH-1PVを用いて得られた感染性粒子の量と比較した欠失変異体DelH-1PVによって産生した感染性粒子の量を示している。図9に示したように、試験した全ヒト細胞系におけるwtH-1PVと比較してDelH-1PVによる感染後に感染性子孫ビリオンの増加した産生が観察された。要するに、欠失変異体DelH-1PVΔヌクレオチド2022~2135は、ヒト参照細胞系NB-324Kだけではなくヒト腫瘍由来の異なる膵臓癌または子宮頸癌細胞においても産生率に関してwtH-1PVに比して有意な利点を示す。欠失変異体DelH-1PVは腫瘍増殖抑制において野生型H-1PVよりも優れた効率を示す上述したinvitro実験に加えて、欠失変異体DelH-1PVが腫瘍増殖に及ぼす作用をinvivoアッセイにおいても調査した。図10のAは、実施されたinvivoアッセイの略図を示している。ヒト膵臓癌Panc-1細胞を緩衝液で処理した擬似mock処理細胞、またはDelH-1PVもしくはwtH-1PVを用いて1RU/細胞の感染多重度で感染させたRU、すなわち、複製単位は、そのウイルスゲノムを宿主細胞内へ送達して増幅させることのできる完全ウイルス粒子に対応する。擬似mock処理Panc-1細胞もしくはパルボウイルス感染Panc-1細胞を、さらに以下のようにBalb/cヌードマウスに皮下注射した。7匹のヌードマウスは擬似mock処理Panc-1細胞を受容し、7匹のヌードマウスはwtH-1PVより感染させたPanc-1細胞を受容し、6匹のヌードマウスはDelH-1PV変異体により感染させたPanc-1細胞を受容した。腫瘍増殖を感染後83日の期間追跡し図10、290mm3超のサイズの腫瘍のパーセンテージについても決定した図10のC。データは、擬似mock処理腫瘍と比較してパルボウイルス感染Panc-1腫瘍の出現および増殖における強度の遅延を示した。さらに、明白に減少した腫瘍増殖は、wtH-1PVにより感染させたPanc-1腫瘍細胞が注射されたヌードマウスに比較してDelH-1PV感染Panc-1腫瘍細胞を受容したヌードマウスにおいても観察された。実際、290mm3超のサイズを有するヒトPanc-1腫瘍は、Panc-1細胞がwtH-1PVを受容した場合に比較してDelH-1PVを受容した場合は約10日後に検出され、移植83日後、290mm3超のサイズを有するヒトPanc-1腫瘍は55超のwtH-1PVと比較してDelH-1PVにより感染させた場合は20未満であった図10のC。要するに、欠失変異体DelH-1PVΔヌクレオチド2022~2135は、動物におけるヒト腫瘍増殖抑制においてwtH-1PVより強度の効率を示す。DelH-1PVの腫瘍内注射は野生型H-1PVに比較してHeLa細胞由来腫瘍の増殖抑制においてより効率的であるin-vivoアッセイでは、2×106個のHeLa細胞をBalb/cヌードマウスの右側腹部へ皮下注射した。マウスがHeLa細胞由来腫瘍を発現した9日後に、マウス1匹当たり108PFU100μLの容積のPBS中のDelH-1PVまたはwtH-1PVを腫瘍増殖部位の近く、すなわち腫瘍内へ注射した。腫瘍増殖は、移植42時間後まで監視した。図12は、欠失変異体DelH-1PVが腫瘍内に注射された場合にHeLa細胞由来子宮頸癌腫瘍の増殖に及ぼす作用を示している。加速された腫瘍増殖は、おそらくはウイルスの腫瘍内注射による腫瘍細胞質量の崩壊に起因するこれらの条件下で観察された。接種材料の液圧が腫瘍細胞の拡散に寄与し、それにより強度に加速された腫瘍増殖に関与した可能性が最も高かった。しかし、wtH-1PVと比較してDelH-1PVを用いるとこれらの条件下で一層改良された腫瘍抑制を観察することができた。図12のAに示したように、1,000mm3超の腫瘍を発現するマウスの数は、DelH-1PVの注射後にはmock処理緩衝液マウスまたはwtH-1PV注射マウスと比較して遅延した。実際、wtH-1PVが腫瘍内注射された場合は60のマウスつまり5匹中3匹のマウスが注射6日後に既に1,000mm3超の腫瘍を発現したが、DelH-1PVが腫瘍内注射された場合は注射25日後にしか発現しなかったつまり、ほぼ20日遅い。図12のBは、各群における1,000mm3未満の腫瘍を有するこれにより動物の犠死を防止するマウスのパーセンテージで提示したマウスの生存率を示している。DelH-1PVにより処理されたマウスの80つまり5匹中4匹は注射35日後まで生存したが、wtH-1PVで処理されたマウスは既に注射17日後から40つまり5匹中2匹しか生存していなかった。要するに、欠失変異体DelH-1PVΔヌクレオチド2022~2135は、invivoでのHeLa細胞由来ヒト腫瘍の増殖抑制においてwtH-1PVより強力な能力を示している。野生型NS2Pタンパク質と比較したDelNS2Pタンパク質の増加した新規合成および不安定性ウイルス非構造タンパク質の新規合成および安定性をDelH-1PVまたはwtH-1PVにより感染させたNB-324K細胞からパルスチェイス標識および免疫沈降アッセイによって決定した。図13は、30分の標識期間後の新規合成された非構造NS1およびNS2Pタンパク質の量ならびにそれらの合成の240分後までの時間内のこれらのウイルスタンパク質の残留量を示している。新規合成された野生型NS1に比較して、より高い量の新規合成されたDelNS1が検出された図13、上方パネル、チェイス0分間。しかし、切断形のNS1DelNS1は、少なくとも60分のチェイス期間までは野生型形と同様に安定性であるように見えた。野生型NS1の場合、追加のより緩徐に移動するバンドがチェイス期間の開始時0分~20分の時点にわずかに検出できたが、少なくとも40分~240分のチェイス期間には明白に見られるようになり、その量は時間の経過に伴って増加し、NS1のより高速で移動する形態は漸進的に減少した。これは、進行性および/または一時的に発生すると思われる野生型NS1の一部の翻訳後修飾の出現を表示している。野生型NS1ほど明白には見られないが、DelNS1もまた少なくとも120分のチェイス期間まではダブレットとして移動すると思われたが、240分のチェイス期間後にはDelNS1のより緩徐に移動する形態しか検出されず、これは野生型NS1と比較してDelNS1タンパク質の翻訳後修飾が相違する、および/またはより高速に発生することを示唆している。図13に示したように下方のパネル、DelNS2Pタンパク質の合成および分解はどちらも、野生型NS2Pの合成および分解と比較して衝撃的に促進された。実際、新規合成されたDelNS2Pタンパク質の量は標識期間後チェイス0分の時点に野生型タンパク質の1つよりはるかに高かったが、大多数のDelNS2Pは60分のチェイス期間後既に消失し、240分のチェイス期間後には新規合成されたDelNS2Pはもはや検出されなかったが、新規合成された野生型NS2Pは依然検出可能であった。要するに、DelNS2Pの合成および代謝回転は、野生型NS2Pと比較して明白に強化される。NS1の翻訳後修飾は、さらにタンパク質の野生型形と比較して切断形Delにおいて変化させられる可能性がある。まとめると、これらのデータは、114-ヌクレオチド長の、DelH-1PVゲノム内のインフレーム欠失および/または結果として生じる非構造DelNS1およびDelNS2タンパク質における37アミノ酸の切断がこれらのウイルスタンパク質の一部の調節機構に影響を及ぼすことを強力に示唆している。これらの変化がDelH-1PV子孫ビリオンの観察された、より高度の感染性および/またはより早期の核退出において重要な問題となるかは、今後調査する。DelNS2Pは核外輸送因子Crmlおよび14-3-3タンパク質ファミリーメンバーと依然として相互作用することができるウイルスタンパク質が特定の細胞タンパク質と相互作用する能力は、DelH-1PVまたはwtH-1PVにより感染させたNB-324K細胞の代謝的に35S標識したタンパク質抽出物をもちいた共免疫沈降アッセイによって決定した。図14のAに示したように、等価量の細胞タンパク質Crm1左のパネルおよび14-3-3右のパネルは、適切な抗体を用いた免疫沈降後に全試験サンプル中で検出された。さらに、等価量の野生型NS2およびDelNS2タンパク質が、SDSの非存在下で調製されたサンプル中ではCrm1または14-3-3のいずれかと共沈降することが見いだされた各々、図14のA、レーン3および5ならびにレーン7および9。Crm1および14-3-3両方とのウイルスDelNS2および野生型NS2タンパク質の共沈降は、DelNS2または野生型NS2がmock処理細胞由来のサンプル中図14のA、レーン1および10またはタンパク質-タンパク質相互作用を中断させるSDSの存在下で調製されたサンプル中図14のA、レーン2および4ならびにレーン6および8で検出されなかったため特異的であった。図14のBは、類似量のDelNS2および野生型NS2タンパク質をNS2P特異的抗血清を使用した場合に感染したサンプルから免疫沈降させたことを示す。これらのデータは、サンプル中に存在するDelNS2または野生型NS2タンパク質の全量の一分画だけがCrm1または14-3-3のいずれかと相互反応できたことも指示している。要するに、ウイルスDelNS2タンパク質はCrm1および14-3-3細胞生成物両方と野生型NS2と同様に効率的に相互作用するが、これはH-1PVNS2タンパク質配列中の37アミノ酸の欠失がウイルスタンパク質とその細胞パートナーとの結合特性を無効にしないこと、そしてH-1PVNS2の一部の立体配座構造が切断Del形において依然として維持されたことを示唆している。DelH-1PVビリオンは、熱変性に対して野生型H-1PVビリオンよりも感受性である感染細胞内のウイルスゲノムの脱カプシド過程は、invitroでは熱変性アッセイによって模倣することができる。H-1PV粒子の熱変性への感受性は、完全ビリオンを様々な温度へ曝露させ、DNase処理してその後にアルカリ溶菌を行った後に残留する無傷ビリオンの定量的リアルタイムPCRによって該サンプル中に依然として存在するウイルスゲノムの量を決定することによってinvitroで分析した。図15に示したように、DelH-1PVおよびwtH-1PVビリオンの安定性は、精製完全粒子を各10分間50°C~70°CのPCR装置内で生成される温度に曝露させることによって調査した。図15は、熱変性後に回収されたDelH-1PVゲノム総量ので表示は、野生型ゲノムの1つと比較した場合に、試験した全温度で低かった。完全粒子の50の変性をもたらした温度は、DelH-1PVおよびwtH-1PV間の2.42°Cの差を生じさせ、前者の場合は59.11°Cであり、後者の場合は61.53°Cであった。要するに、DelH-1PV粒子は、熱変性に対してwtH-1PV粒子よりも感受性であった。これは、DelH-1PVウイルスゲノムが、wtH-1PVゲノムより効率的に脱カプシド化することができ、これはさらに前者の増加した感染性に好都合でもあろうことを示唆している。DelH-1PVを用いた改良された細胞結合および取り込み完全粒子の細胞表面への結合は、ウイルス内在化を防止するために4°Cで1時間のインキュベーション後に感染NB-324K細胞から回収されたウイルスゲノムの量を定量的リアルタイムPCRによって測定し決定した。完全粒子の取り込みは、ウイルス侵入を可能にするために事前に37°Cでインキュベートし、血漿膜結合ウイルス粒子を取り除くためにトリプシン/EDTAにより処理した感染細胞から感染後の様々な時点0.5時間~3時間の内在化ウイルスゲノムの量を定量的リアルタイムPCRによって測定し調査した。図16のAは細胞膜結合完全粒子のパーセンテージを示しているが、図16のBはDelH-1PVまたはwtH-1PVいずれかによるNB-324K細胞の感染後の両方の内在化ウイルスゲノムの量を示している。図16のAに示したように、細胞膜に結合した完全粒子のパーセンテージは野生型H-1Vと比較してDelH-1PVによる感染後には9.7倍高かったが、これはDelH-1PVがwtH-1PVビリオンに比較して感染細胞の血漿膜で結合することにより感受性であることを指示している。図16のBに示したように、試験した全細胞溶解物中で、つまり試験した全インキュベーション時間で、wtH-1PVと比較して有意に高い量のウイルスゲノムがDelH-1PVによる感染後に回収された。既に感染30分後に、ほぼ9倍の増加が観察された。これらのデータは、wtH-1PVと比較してDelH-1PVビリオンの上述した、より良好な結合効率と相関している。要するに、DelH-1PVの血漿膜での結合、および可能性のある結果として感染細胞の内側でのその取り込みは、野生型ウイルスに比較して有意に改善される。熱変性に対する上述したより高い感受性とともに増強された結合/取り込み実施例15、図15およびこの欠失変異体DelH-1PVΔヌクレオチド2022~2135の感染性子孫ビリオンのより早期/高速の核退出実施例7、図6および実施例8、図7をDelH-1PVウイルス粒子の一部の微細な修飾に帰せることができるかは、今後調査する。DelH-1PVゲノムの早期の複製および感染NB-324K細胞内の一本鎖DNAの高度の蓄積ウイルス複製型の蓄積は、DelH-1PVまたはwtH-1PVにより感染させたNB-324K細胞由来の細胞抽出物を使用してサザンブロッティングアッセイによって分析した。図17のAは、細胞の感染がアッセイ中の二次感染を防止するために中和抗体の存在下で実施されたため、感染3時間、9時間、12時間、16時間および24時間後の一次感染の結果としてのウイルス単量体複製型mRF、二量体複製型dRFの蓄積を示している。これらのウイルスDNA形各々のシグナル強度はPhosphoImager分析によって定量し、図17のBは、感染後の指示時点でのこれらの形態各々のシグナル強度のDelH-1PV対野生型の比率を示している。どちらのウイルスも全ウイルス複製型を蓄積することができた。しかし、これらの複製型の蓄積パターンは、DelH-1PVと比較してwtH-1PVによる感染後に幾らか遅延した。全感染NB-324K細胞内では、より早期の3時間後の時点にウイルス複製型は検出できなかった。感染9時間後、mRFおよびdRFはどちらも明白に視認することができ、wtH-1PVに比較してDelH-1PVによる感染後にはより高い強度を伴った図17のA。実際、DelH-1PVmRFおよびdRFの蓄積におけるwtH-1PVに比較した各々7倍および11倍の増加は、感染9時間後に測定された図17のB。感染12時間後、DelH-1PVmRFおよびdRFはwtH-1PVmRFおよびdRFと比較してどちらも依然として高量で、しかしより低い程度5倍未満で存在したが、dRF分子のNS1-依存性開裂の生成物であるssDNAの蓄積は、wtH-1PVssDNAの蓄積と比較して19倍の増加に達するDelH-1PV感染サンプル中で有意に検出可能になった。これらのデータは、感染9時間後のDelH-1PV感染細胞中でのwtH-1PV感染細胞に比較して少なくとも感染12時間後まで持続する強度の大きい複製活性を示している。感染後の後期の時点には、全3種の複製型は、両方の感染サンプル図17のA中で明白に見ることができ、野生型に比較してDelH-1PV複製型の4倍未満感染16時間後および2倍未満感染20時間後の上昇した蓄積を伴った。これらのデータは、wtH-1PV感染サンプル中の複製活性が感染12時間~16時間後により強度になったが、それでも感染後の早期の時点に観察された強度に比較して、DelH-1PVサンプル中ほど高くなかった。要するに、欠失変異体DelH-1PVゲノムΔヌクレオチド2022~2135の複製は、NB-324K細胞内のwtH-1PVゲノム複製と比較してより早期に発生する。これらのデータは、wtH-1PVと比較したDelH-1PVビリオンの上述した、より良好な結合、およびNB-324K細胞内に進入するより良好な効率実施例16および図16ならびにDelH-1PVビリオンの熱変性に対する高い感受性実施例15、図15と一致している。DelH-1PVまたは野生型H-1PVのいずれかを用いたNB-324K細胞のトランスフェクション後の複製型の蓄積に差は見られないDelH-1PVおよびwtH-1PV複製型の蓄積は、中和抗体の存在下でプラスミド構築体pDelH-1PVもしくはpwtH-1PVを用いたヒトNB-324K細胞のトランスフェクション後に評価し、その後にサザンブロッティングアッセイによるトランスフェクトサンプルの分析を実施した。この実験は、パルボウイルス生活環のいずれかの早期の過程の非存在下でのDelH-1PVおよびwtH-1PVゲノムの複製活性を比較するために設計されたが、これは上述したように、特定細胞結合取り込みにおいてwtH-1PVと比較してDelH-1PVを用いると強化されることが明らかになった実施例16および図16。図18は、トランスフェクション12時間、16時間および24時間後のウイルス単量体複製型mRFおよび二量体複製型dRFの蓄積を示している。図18に示したように、ウイルスmRFおよびdRF分子の外観および蓄積における有意差は、pwtH-1PVと比較したプラスミド構築体pDelH-1PVを用いたトランスフェクション後の早期の時点に観察された。ウイルスmRFおよびdRF複製型はいずれもトランスフェクション12時間後に検出できなかった。DelH-1PVおよびwtH-1PVゲノム両方からのmRFおよびdRFはトランスフェクション16時間後に可視できるようになり、それら両方の量はトランスフェクション24時間後に有意に増加した。要するに、DelH-1PVゲノム自体の複製は早期には発生しない、および/またはwtH-1PVゲノム複製に比較してトランスフェクトNB-324K細胞内では強化されない。野生型H-1PV完全ビリオンの遊離に比較したトランスフェクトNB-324K細胞の培地中でのDelH-1PV完全ビリオンの増加した、および/またはより迅速な遊離子孫ビリオンの遊離は、中和抗体の存在下PV1または非存在下-PV1においてpDelH-1PVまたはpwtH-1PVのいずれかを用いたNB-324K細胞のトランスフェクション10時間、17時間および72時間後に収集した細胞培養上清から観察した。ウイルスssDNA分子は、Hirt抽出によって上清サンプルから回収し、サザンブロッティング分析によって検出した。トランスフェクション72時間後の上清サンプル中に存在した完全および感染粒子は、定量的リアルタイムPCRによってウイルスゲノムvgの量およびプラークアッセイによってプラーク形成単位PFUの量を各々測定し定量した。図19は、トランスフェクション10時間および17時間後に上清サンプル中でsssDNAは検出可能ではなかったことを示している。トランスフェクション72時間後、ssDNAの検出可能な量は全試験上清サンプルから二次感染の発生を許容する中和抗体の非存在下で実施されたものに比較して二次感染を防止する中和抗体の存在下で実施されたトランスフェクションサンプルからはるかに低い程度で回収された。それでも両方の場合に、トランスフェクト293T細胞の上清から得られたDelH-1PV子孫ssDNAのシグナル強度は、wtH-1PV子孫ssDNAのシグナル強度に比較して高かった。これらのデータは、DelH-1PV子孫ビリオンの遊離がwtH-1PVと比較して改良されることを示しており、これはウイルス生活環の早期の過程細胞表面へのウイルス結合および内在化、ウイルスゲノムの脱カプシド化および転換の非存在下でさえ生じる。さらに図19に示したように、トランスフェクション72時間後の上清中に存在するDelH-1PV子孫ビリオンは、wtH-1PVに比較した場合により低いP/I比を示した。実際、中和抗体の存在下で生成されたDelH-1PV子孫ビリオンのP/I比は、wtH-1PVと比較して21分の1まで減少した。要するに、DelH-1PV子孫ビリオンは、wtH-1PV子孫ビリオンと比較してトランスフェクト細胞の細胞培養培地中でより早期に、および/またはより優れた効率で遊離される。さらに、それらがトランスフェクションによって生成された場合でさえ、欠失変異体DelH-1PVΔヌクレオチド2022~2135の子孫ビリオンは、wtH-1PVと比較して増強された感染性を示した。野生型H-1PVおよび野生型hH-1PVに比較したヒト293T細胞のトランスフェクションによって生成されるDelH-1PVおよびDelhH-1PVの増加した感染性DelH-1PV、DelhH-1PV、wtH-1PV、野生型hH-1PVの粒子対感染性P/I比は、適切なプラスミド構築体によるヒト293T細胞のトランスフェクション後に生成し、トランスフェクション3日後に細胞ペレットから回収されたウイルスストックから決定した。各ウイルスストックについて、完全粒子の量は、ウイルス粒子含有ゲノムの数1mL当たりのウイルスゲノムvgで与えられるを決定するために、ストックのDNAse処理およびアルカリ溶菌後に実施した定量的リアルタイムPCRによって測定した。各ウイルスストックについて、感染粒子の量は、参照NB-324K細胞系内で完全粒子がプラークを形成する能力1mL当たりのプラーク形成単位PFUで与えられるを決定するために、プラークアッセイによって測定した。図20に示したように、DelH-1PVおよびDelhH-1PVは、wtH-1PVおよび野生型hH-1PVよりも4.5分の1および5.8分の1のP/I比を示した。これは、より感染性の粒子が、ウイルスがそれらのゲノムのNS-コーディング配列中での114ヌクレオチド長の欠失を含有する場合にヒト293T細胞のトランスフェクション後に生成されたウイルスストックによって生成されたことを示している。要するに、欠失変異体DelH-1PVおよびDelhH-1PVΔヌクレオチド2022~2135はどちらも、wtH-1PVおよびhH-1PVと比較してトランスフェクションによって生成された場合さえより優れた感染性を示す。参照文献1RommelaereJGeletnekyKAngelovaALDaefflerLDinsartCKiprianovaISchlehoferJRRaykovZOncolyticparvovirusesascancertherapeuticsCytokineGrowthFactorRev2010211851952CornelisJJSalomeNDinsartCRommelaereJVectorsbasedonautonomousparvovirusesnoveltoolstotreatcancerJGeneMed20046S1932023BhatRDempeSDinsartCandRommelaereJEnhancementofNKcellantitumourresponsesusinganoncolyticparvovirusInternationalJournalofCancer2010inpressEPubaheadofprint4RaykovZGrekovaSGalabovASBalboniGKochUAprahamianMRommelaereJCombinedoncolyticandvaccinationactivitiesofparvovirusH1inametastatictumormodelOncolRep200717149314995RaykovZGrekovaSLeuchsBAprahamianMRommelaereJArmingparvoviruseswithCpGmotifstoimprovetheironcosuppressivecapacityIntJCancer2008122288028846RommelaereJGieseNCziepluchCCornelisJJParvovirusesasanticanceragentsInSinkovicsJGHorvathJCedsViraltherapyofhumancancersNewYorkMarcelDekker2005627p7RommelaereJCornelisJJAntineoplasticactivityofparvovirusesJVirolMethods1991332332518CornelisJJLangSIStrohDegeAYBalboniGDinsartCRommelaereJCancergenetherapythroughautonomousparvovirusmediatedgenetransferCurrGeneTher200442492619WetzelKStruyfSVanDammeJKayserTVecchiASozzaniSRommelaereJCornelisJJDinsartCMCP3deliveredbyparvovirusMVMpreducestumorigenicityofmousemelanomacellsthroughactivationofTlymphocytesandNKcellsIntJCancer20071201364137110EnderlinMKleinmannEVStruyfSBurrachiCVecchiAKinscherfRKiesslingFPaschekSSozzaniSRommelaereJCornelisJJVanDammeJDinsartCTNFalphaandIFNgammainducibleprotein10deliveredbyparvoviralvectorsactinsynergytoinduceantitumoreffectsinmouseglioblastomaCancerGeneTher20091614916011AngelovaAAprahamianMGrekovaSHajriALeuchsBGieseNHerrmannADinsartCBalboniGRommelaereJRaykovZImprovementofgemcitabinebasedtherapyofpancreaticcarcinomabymeansofoncolyticparvovirusH1PVClinicalCancerResearch20091551151912DaefflerLHoerleinRRommelaereJNueeschJPModulationofminutevirusofmicecytotoxicactivitiesthroughsitedirectedmutagenesiswithintheNScodingregionJVirol200377124661247813FaisstSFaisstSRDupressoirTPlazaSPujolAJauniauxJCRhodeSLRommelaereJIsolationofafullyinfectiousvariantofparvovirusH1supplantingthestandardstraininhumancellsJVirol1995694538454314EngelsmaDValleNFishASalomeNAlmendralJMFornerodMAsupraphysiologicalnuclearexportsignalisrequiredforparvovirusnuclearexportMolBiolCell2008192544255215EichwaldVDaefflerLKleinMRommelaereJSalomeNTheNS2proteinsofparvovirusminutevirusofmicearerequiredforefficientnuclearegressofprogenyvirionsinmousecellsJVirol200276103071031916LopezBuenoAValleNGallegoJMPerezJAlmendralJMEnhancedcytoplasmicsequestrationofthenuclearexportreceptorCrmlbyNS2mutationsdevelopedinthehostregulatesparvovirusfitnessJVirol200478106741068417RhodeSL3rdParadisoPRParvovirusgenomenucleotidesequenceofH1andmappingofitsgenesbyhybridarrestedtranslationJVirol19834517318418WrzesinskiCTesfayLSalomeNJauniauxJCRommelaereJCornelisJDinsartCChimericandpseudotypedparvovirusesminimizethecontaminationofrecombinantstockswithreplicationcompetentvirusesandidentifyaDNAsequencethatrestrictsparvovirusH1inmousecellsJVirol2003773851385819KoehlerGMilsteinCContinuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificityNature197525649549720GalfreGMilsteinCPreparationofmonoclonalantibodiesstrategiesandproceduresMethodsEnzymol19817334621TattersallPBrattonJReciprocalproductiveandrestrictiveviruscellinteractionsofimmunosuppressiveandprototypestrainsofminutevirusofmiceJVirol4694495522ZolotukhinSByrneBJMasonEZolotukhinIPotterMChesnutKSummerfordCSmulskiRJMuzyczkaNRecombinantadenoassociatedviruspurificationusingnovelmethodsimprovesinfectioustiterandyieldGeneTher1999697398523CornelisJJSpruytNSpegelaerePGuettaEDarawshiTCotmoreSFTalJRommelaereJSensitizationoftransformedratfibroblaststokillingbyparvovirusminutevirusofmicecorrelateswithanincreaseinviralgeneexpressionJVirol1988623438344424HaagAMentenPVanDammeJDinsartCRommelaereJCornelisJJHighlyefficienttransductionandexpressionofcytokinegenesinhumantumorcellsbymeansofautonomousparvovirusvectorsgenerationofantitumorresponsesinrecipientmiceHumGeneTher20001159760925KestlerJNeebBStruyfSVanDammeJCotmoreSFDAbramoATattersallPRommelaereJDinsartCCornelisJJCisrequirementsfortheefficientproductionofrecombinantDNAvectorsbasedonautonomousparvovirusesHumGeneTher1999101619163226LangSIBoelzSStrohDegeAYRommelaereJDinsartCCornelisJJTheinfectivityandlyticactivityofminutevirusofmicewildtypeandderivedvectorparticlesarestrikinglydifferentJVirol20057928929827BrockhausKPlazaSPintelDJRommelaereJSalomeNNonstructuralproteinsNS2ofminutevirusofmiceassociateinvivowith1433proteinfamilymembersJVirol1996707527753428GrahamFLVanDerEbAJTransformationofratcellsbyDNAofhumanadenovirus5Virology19735453653929LacroixJLeuchsBLiJHristovGDeubzerHEKulozikAERommelaereJSchlehoferJRWittOParvovirusH1selectivelyinducescytotoxiceffectsonhumanneuroblastomacellsInternationalJournalofCancer20101271230123930AradUModifiedHirtProcedureforRapidPurificationofExtrachromosomalDNAfromMammalianCellsBioTechniques199824760762"