"ダイナミックパスウェイマップDPMの生成方法であって、複数のパスウェイ要素を格納するパスウェイ要素データベースへのアクセスを提供するステップであって、各前記パスウェイ要素は少なくとも1つのパスウェイへのその関与により特徴付けられるステップと、前記パスウェイ要素データベースに結合された修正エンジンへのアクセスを提供するステップと、前記修正エンジンを使用して第1のパスウェイ要素を少なくとも1つの先験的に既知の属性と関連付けるステップと、前記修正エンジンを使用して第2のパスウェイ要素を少なくとも1つの仮の属性と関連付けるステップと、前記修正エンジンを使用して、それぞれ前記既知の属性及び前記仮の属性を用いて、少なくとも1つの前記パスウェイについての前記第1のパスウェイ要素及び前記第2のパスウェイ要素を相互相関させて、少なくとも1つの前記パスウェイについての影響レベルを割り当てることにより、確率的パスウェイモデルを形成するステップと、及び分析エンジンを介して前記確率的パスウェイモデルを用いることにより、患者試料の複数の要素についての複数の計測属性から、特定のパスウェイについての参照パスウェイ活性情報を有するDPMを導き出すステップと、を含む方法。前記パスウェイは調節パスウェイネットワーク内にある、請求項1に記載の方法。前記調節パスウェイネットワークは、加齢パスウェイネットワーク、アポトーシスパスウェイネットワーク、恒常性パスウェイネットワーク、代謝パスウェイネットワーク、複製パスウェイネットワーク、及び免疫応答パスウェイネットワークから成る群より選択される、請求項2に記載の方法。前記パスウェイは、シグナル伝達パスウェイネットワーク内にある、及び個別的パスウェイネットワークのネットワーク内にある、から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。前記シグナル伝達パスウェイネットワークは、カルシウム/カルモジュリン依存性シグナル伝達パスウェイネットワーク、サイトカイン媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、ケモカイン媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、成長因子シグナル伝達パスウェイネットワーク、ホルモンシグナル伝達パスウェイネットワーク、MAPキナーゼシグナル伝達パスウェイネットワーク、ホスファターゼ媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、Rasスーパーファミリー媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、及び転写因子媒介性シグナル伝達パスウェイネットワークから成る群より選択される、請求項4に記載の方法。前記パスウェイ要素はタンパク質である、請求項1に記載の方法。前記タンパク質は、受容体、ホルモン結合タンパク質、キナーゼ、転写因子、メチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、及びヒストンデアセチラーゼから成る群より選択される、請求項6に記載の方法。前記パスウェイ要素は核酸である、請求項1に記載の方法。前記核酸は、タンパク質コード配列、ゲノム調節配列、調節RNA、及びトランス活性化配列から成る群より選択される、請求項8に記載の方法。前記参照パスウェイ活性情報は、正常組織、罹患組織、加齢組織、又は回復組織に関して特定のものである、請求項1に記載の方法。前記既知の属性は、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、及びタンパク質活性から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。前記仮の属性は、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、及びタンパク質活性から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。前記計測属性は、突然変異、示差的遺伝子配列オブジェクト、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、タンパク質活性、及びタンパク質相互作用から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。ダイナミックパスウェイマップDPMの生成方法であって、複数のパスウェイ要素を含む確率的パスウェイモデルを格納するモデルデータベースへのアクセスを提供するステップであって、前記複数のパスウェイ要素の第1の数値を相互相関させ、かつ既知の属性に基づき少なくとも1つのパスウェイについての影響レベルを割り当て、前記複数のパスウェイ要素の第2の数値を相互相関させ、かつ仮の属性に基づき少なくとも1つのパスウェイについての影響レベルを割り当てるステップと、分析エンジンを介して、患者試料の複数の要素についての複数の計測属性を用いることにより、前記確率的パスウェイモデルを修正して前記DPMを得るステップであって、該DPMは特定のパスウェイについての参照パスウェイ活性情報を有するステップと、を含む方法。前記パスウェイは、調節パスウェイネットワーク、シグナル伝達パスウェイネットワーク、又は個別的パスウェイネットワークのネットワーク内にある、請求項14に記載の方法。前記パスウェイ要素は、受容体、ホルモン結合タンパク質、キナーゼ、転写因子、メチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、及びヒストンデアセチラーゼから成る群より選択されるタンパク質であり、又は核酸が、ゲノム調節配列、調節RNA、及びトランス活性化配列から成る群より選択される、請求項14に記載の方法。前記参照パスウェイ活性情報は、正常組織、罹患組織、加齢組織、又は回復組織に関して特定のものである、請求項14に記載の方法。前記既知の属性は、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、及びタンパク質活性から成る群より選択される、請求項14に記載の方法。前記仮の属性は、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、及びタンパク質活性から成る群より選択される、請求項14に記載の方法。前記計測属性は、突然変異、示差的遺伝子配列オブジェクト、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、タンパク質活性、及びタンパク質相互作用から成る群より選択される、請求項14に記載の方法。生物学的に関連性のある情報を分析する方法であって、ダイナミックパスウェイマップDPMを格納するモデルデータベースへのアクセスを提供するステップであって、前記DPMは、第1の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性によって確率的パスウェイモデルを修正することにより生成されるステップと、第2の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性を得るステップと、分析エンジンを介して、前記DPM及び前記第2の細胞又は患者試料の前記複数の要素についての前記複数の計測属性を用いることにより、前記第2の細胞又は患者試料についての予測パスウェイ活性情報を決定するステップと、を含む方法。前記第1の細胞又は患者試料の前記複数の要素についての前記計測属性は、健常な細胞又は組織、細胞又は組織の特定の年齢、細胞又は組織の特定の疾患、罹患した細胞又は組織の特定の病期、特定の性別、特定の民族、特定の職業集団、及び特定の人種に特徴的である、請求項21に記載の方法。前記第2の細胞又は患者試料の前記複数の要素についての前記計測属性は、突然変異、示差的遺伝子配列オブジェクト、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、タンパク質活性、及びタンパク質相互作用から成る群より選択される、請求項21に記載の方法。前記第1の試料及び前記第2の試料は同じ細胞又は患者から得られ、前記第2の細胞又は患者試料の前記複数の要素についての前記複数の計測属性を得る前に前記細胞又は患者に処置を提供するステップを更に含む、請求項21に記載の方法。前記処置は、放射線照射、前記患者への薬剤の投与、及び前記細胞への候補分子の投与から成る群より選択される、請求項24に記載の方法。前記候補分子は、候補分子ライブラリのメンバーである、請求項25に記載の方法。前記予測パスウェイ活性情報は、ある要素を少なくとも1つのパスウェイにおいて階層的に上位の要素として同定する、請求項21に記載の方法。前記予測パスウェイ活性情報は、ある要素を疾患に関連する少なくとも1つのパスウェイにおいて疾患の決定因子である要素として同定する、請求項21に記載の方法。前記予測パスウェイ活性情報のグラフィック表現を生成するステップを更に含む、請求項21に記載の方法。少なくとも一部において前記予測パスウェイ活性情報に基づく推奨処置を生成するステップを更に含む、請求項21に記載の方法。前記予測パスウェイ活性情報を用いて、疾患についての診断、予後診断、又は処置オプションの選択肢、及び食事指導から成る群より選択される推奨を考案するステップを更に含む、請求項21に記載の方法。前記予測パスウェイ活性情報を用いて、後成的要因、ストレス適応、生物体の状態、及び修復又は治癒の状態を特定するステップを更に含む、請求項21に記載の方法。発明の詳細な説明0082本書に開示する実施形態は事例的かつ例示的であり、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の特許請求の範囲から逸脱することなく他の実施形態を利用することができ、構造上の変更を行うことができる。0083本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、文脈上明確に指示されない限り、単数形a、an、及びtheは複数形の参照を含む。従って、例えば、anmiRNAへの参照は、複数の係るmiRNAを含み、医薬担体apharmaceuticalcarrierへの参照は、1個以上の医薬担体及びその均等物への参照である、等となる。0084本明細書で使用されるとき、用語キュレーションされたは、科学的及び/又は臨床的な原理に従い、当技術分野において周知の方法、例えば、分子生物学的技法、生化学的技法、生理学的技法、解剖学的技法、ゲノミクス技法、トランスクリプトミクス技法、プロテオミクス技法、メタボロミクス技法、ADME、及びバイオインフォマティクス技法などを用いて、試験、分析、及び同定される生体分子及び/又は非生体分子の集合間の関係を意味する。この関係は、生化学的パスウェイ、遺伝的パスウェイ、代謝パスウェイ、遺伝子調節パスウェイ、遺伝子転写パスウェイ、遺伝子翻訳パスウェイ、miRNA調節パスウェイ、偽遺伝子調節パスウェイなどの生化学的なものであってよい。0085ハイスループットデータは、癌組織における分子変化の包括的な概観を提供している。新しい技術により、腫瘍試料及び癌細胞株のゲノムコピー数変動、遺伝子発現、DNAメチル化、及びエピジェネティクスの状態の同時ゲノムワイドアッセイが可能である。0086癌ゲノムアトラスTCGA、スタンドアップトゥキャンサーStandUpToCancer:SU2Cなど、及び更に多くの研究が、様々な腫瘍について近い将来に計画されている。現行のデータセットの解析から、患者間で遺伝的変化は異なり得るが、多くの場合に共通のパスウェイが関与することが認められる。従って、癌の進行に関与する関連パスウェイを同定し、それらが異なる患者においてどのように変化するかを検出することが決定的に重要である。0087本発明者らは、複数のパスウェイ要素の複数の属性を確率的パスウェイモデルに統合し、次に患者のデータを使用して修正してダイナミックパスウェイマップを生成するシステム及び方法を開発した。最も重要なのは、パスウェイ内のパスウェイ要素についての属性は、先験的に知られている必要はないことが理解されるべきである。実際に、少なくともいくつかのパスウェイ要素の属性のうちの少なくともいくつかは仮定される。次に、パスウェイ要素を相互相関させ、より多くのパスウェイへの特定の影響レベルを割り当てることにより確率的パスウェイモデルを構築し、これは好ましくは特定の参照状態例えば、健康的又は病的を表す。次に、患者試料の複数の要素についての計測属性を確率的パスウェイモデルと組み合わせて使用することで、1つ以上の特定のパスウェイについての参照パスウェイ活性情報を提供する患者試料特有のダイナミックパスウェイマップを作成する。0088特に、1つ以上のパスウェイ要素についての複数の種類の属性を、1つ以上の他のパスウェイ要素についての合理的に仮定された複数の種類の属性と組み合わせて統合することにより、著しく少ない制限された分析が可能となり、それにより高度な精度及び分解能を有する多因子分析が可能となることが理解されるべきである。実際に、意図されたシステム及び方法により、比較的少数の計測された患者試料属性に基づいて詳細かつ本質的な結果をもたらすことが可能となることに留意すべきである。当然ながら、また、意図されたされるシステム及び方法は、1つ以上のパスウェイ要素についての2種以上の属性の入力を可能とすることで、1つ以上のパスウェイ要素についての2種以上の属性の出力を生成し、入力及び出力された属性及びパスウェイ要素は完全に個別であってもよいことに留意すべきである。例えば、及び別の観点から見て、遺伝子活性、複合体、及び細胞プロセスの状態に関する患者特有のゲノム推論は、所定の確率的パスウェイモデルに基づいて引き出してもよい。0089以下の説明は、コンピュータ/サーバに基づいたパスウェイ解析システムについて描かれているが、様々な代替構成も適していると考えられ、かつ個別的に、又は集合的に動作するサーバ、インターフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、コントローラ、又は他の種類の計算装置を含む様々な計算装置を使用することができることに留意すべきである。計算装置は、有形で、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、RAM、フラッシュ、ROMなどに格納されたソフトウェア命令を実行するように構成されたプロセッサを含むことが理解されるべきである。ソフトウェア命令は、好ましくは、開示された装置に関連して後述するように、役割、責任、又は他の機能を提供するように計算装置を構成する。特に好ましい実施形態では、標準化されたプロトコル又はアルゴリズムを用いた様々なサーバ、システム、データベース、又はインターフェース交換データは、おそらくHTTP、HTTPS、AES、公開鍵‐秘密鍵の交換、ウェブサービスAPI、公知の金融取引プロトコル、又は他の電子情報交換方法に基づくものであった。データ交換は、好ましくは、パケット交換網、インターネット、LAN、WAN、VPN、又は他の種類のパケット交換網上で行われる。0090更に、以下の説明から本発明の主題における多くの例示的な実施形態を提供する。各実施形態は本発明の要素の単一の組合せを表すが、本発明の主題は、開示要素の全ての可能な組み合わせを含むと考えられる。従って、一実施形態が要素A、B及びCを含み、第2の実施形態が要素B及びDを含む場合、次に本発明の主題は、たとえ明示的に開示されていなくてもA、B、C又はDの他の残りの組み合わせも含むものと考えられる。0091本発明者らは、遺伝子間のキュレーションされたパスウェイ相互作用を包含する患者特異的な遺伝的活性を推論するための新規方法を提示する。遺伝子は、因子グラフによって遺伝子及びその産物の発現及び既知の活性を符号化する相互に接続し合う変数の集合としてモデル化され、多種のオミクスデータを証拠として取り込むことが可能になる。0092本方法は、確率的推論を用いて、患者においてパスウェイの活性例えば、内部遺伝子の状態、相互作用、又は高レベル出力が変化する程度を予測する。SPIAと称される競合するパスウェイ活性推論手法と比較して、本発明者らの方法は、限定されるものではないが多形性膠芽腫GBM及び乳癌の両方のデータセットにおいて、より少ない偽陽性で癌関連パスウェイ活性の変化を特定する。0093ゲノムモデルに関するデータ統合を用いたパスウェイ認識アルゴリズムPARADIGMは、遺伝子が分離して考慮される場合に見過ごされるGBM患者のサブセットについて、一貫したパスウェイレベル活性を特定した。更に、このアルゴリズムを用いてGBM患者の有意なパスウェイ摂動に基づきGBM患者をグループ化することで、GBM患者は有意に異なる生存転帰を有する臨床的に関連性のあるサブグループに分けられる。0094これらの知見は、患者群又は個人の共通して摂動を受けるパスウェイにおいて重要な点にある遺伝子を標的とすることのできる治療法が選択され得ることを示唆している。0095本発明者らは、任意の数のゲノム及び機能的ゲノムのデータセットを統合して、患者試料において変化する分子パスウェイを推論することのできる因子グラフKschischang2001、上記に基づいた確率的グラフィカルモデルPGMフレームワークについて記載する。本発明者らは、膠芽腫及び乳癌の両方のデータセットのコピー数変動及び遺伝子発現データを使用してこのモデルを検証した。構造化したパスウェイモデルを用いて推論される活性は、膠芽腫患者を臨床的に関連性のあるサブタイプに層別化することに成功した。この結果から、パスウェイ情報に基づく推論は、遺伝子レベルのデータを分離して使用するより有益な情報を提供することが示唆される。0096より優れた予後診断及び診断を提供することに加えて、統合パスウェイの活性化は、疾患の進行を抑止するために用いることができる可能性のある治療についての重要な手掛かりをもたらす。0097本発明者らは、統合された患者データから遺伝的パスウェイの活性を推論するためのPARADIGMPAthwayRecognitionAlgorithmusingDataIntegrationonGenomicModelsゲノムモデルに関するデータ統合を用いたパスウェイ認識アルゴリズムと称される手法を開発した。図1は、本手法の概要を示す。単一の患者試料に関する複数のゲノムスケールの計測値を組み合わせて、単一の米国国立癌研究所NCIパスウェイの遺伝子、産物、及び抽象的プロセス入出力の活性を推論する。PARADIGMは統合パスウェイ活性IPAの行列Aを生成し、ここでAijは、患者試料jにおけるエンティティiの推論された活性を表す。次に、行列Aを元の構成データセットの代わりに使用して、臨床転帰との関連性を特定することができる。0098本発明者らは、初めに各NCIパスウェイを個別的な確率モデルに変換した。p53アポトーシスパスウェイのごく一部の小例を図2cに示す。NCIのパスウェイ図を、隠れ状態と観測状態との両方を含む因子グラフに変換した図2。因子グラフは、エンティティ間の既知の相互作用を表す構造により、遺伝子関連及び生物学的プロセス関連の状態情報に関する観測を統合する。0099生物学的パスウェイを因子グラフで表現するために、本発明者らは、特定のmRNA又は複合体などの細胞中のエンティティの状態を変数を用いて記述し、かつこれらのエンティティ間の相互作用及び情報フローを因子を用いて表現する。これらの変数は各エンティティの示差的状態を、分子エンティティの直接的な濃度ではなく、対照又は正常レベルとの比較で表現する。この表現により、本研究者らは、多くの場合に遺伝子の示差的状態を直接計測するか、又は直接的な計測値を対応する対照との相対的な計測値に変換するかのいずれかであるDNAマイクロアレイによって検出される遺伝子発現などの、多くのハイスループットデータセットをモデル化することが可能になる。また、遺伝子間の多種の調節関係についても可能になる。例えば、p53のMDM2媒介性ユビキチン依存性分解を表す相互作用は、p53タンパク質レベルを阻害する活性化MDM2としてモデル化することができる。00100一実施形態では、本方法を用いて、様々な診断上及び治療上の適用、例えば、癌組織の検出、癌組織の病期分類、転移性組織の検出など;神経障害、例えば、限定されるものではないが、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症ALS、パーキンソン病、統合失調症、癲癇、及びこれらの合併症;ディジョージ症候群、自閉症などの発達障害、多発性硬化症などの自己免疫障害、糖尿病などの検出;感染症、例えば、限定されるものではないが、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、リーシュマニア、住血吸虫症、マラリア、条虫、象皮病、線虫、ネマチンnematineによる感染症などの治療に使用することができる臨床情報を提供し得る。00101一実施形態では、本方法を用いて、変化した遺伝子発現、mRNAの発現過剰に対する非存在/存在を検出及び定量化し、又は治療介入中のmRNAレベルをモニタするための臨床情報を提供し得る。発現の変化に関連する病態、疾患又は障害としては、後天性免疫不全症候群AIDS、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎dermnatomyositis、真性糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫性疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合型免疫不全症SCID、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症;並びに腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌が挙げられる。この診断アッセイでは、遺伝子発現の変化を検出するために、ハイブリダイゼーション又は増幅技法を用いて患者からの生体試料における遺伝子発現を標準試料と比較し得る。この比較のための定性的又は定量的方法は、当技術分野において周知である。00102一実施形態では、本方法を用いて、変化した遺伝子発現;mRNAの非存在、存在、又は過剰発現を検出及び定量化し;又は治療介入中のmRNAレベルをモニタするための臨床情報を提供し得る。発現の変化に関連する障害としては、静坐不能akathesia、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症ALS、失調、双極性障害、緊張病、脳性麻痺、脳血管疾患クロイツフェルト‐ヤコブ病、認知症、うつ病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジー、ジストニー、癲癇、ハンチントン病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、神経線維腫症、神経障害、パーキンソン病、ピック病、網膜色素変性症、統合失調症、季節性情動障害、老年性認知症、脳卒中、トゥレット症候群並びに腺癌、黒色腫、及び奇形癌を含む癌、特に脳の癌が挙げられる。00103一実施形態では、本方法を用いて、哺乳動物タンパク質の発現又は活性の変化に関連する病態についての臨床情報を提供し得る。このような病態の例としては、限定されるものではないが、後天性免疫不全症候群AIDS、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫性疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合型免疫不全症SCID、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症;並びに腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌、静坐不能akathesia、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、失調、双極性障害、緊張病、脳性麻痺、脳血管疾患クロイツフェルト‐ヤコブ病、認知症、うつ病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジー、ジストニー、癲癇、ハンチントン病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、神経線維腫症、神経障害、パーキンソン病、ピック病、網膜色素変性症、統合失調症、季節性情動障害、老年性認知症、脳卒中、トゥレット症候群並びに腺癌、黒色腫、及び奇形癌を含む癌、特に脳の癌が挙げられる。00104一実施形態では、本明細書にerein開示される方法を用いて、核酸配列の発現又は活性の低下に関連する障害を検出、病期分類、診断、及び/又は治療し得る。このような障害の例としては、限定されるものではないが、癌、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌;免疫障害、例えば、後天性免疫不全症候群AIDS、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、リンパ球毒素性偶発性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症、外傷、ブルトン型X連鎖性無γグロブリン血症X-linkedagammaglobinemiaofBruton、分類不能型免疫不全症CVI、ディジョージ症候群胸腺低形成、胸腺形成異常、IgA単独欠損症、重症複合型免疫不全症SCID、血小板減少症及び湿疹を伴う免疫不全症ウィスコットアルドリッチ症候群、チェディアック東症候群、慢性肉芽腫性疾患、遺伝性血管神経性浮腫、及びクッシング病に関連する免疫不全症;並びに発達障害、例えば、尿細管性アシドーシス、貧血症、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成不全、WAGR症候群ウィルムス腫瘍、無虹彩、泌尿生殖器奇形、及び精神遅滞、スミスマゲニス症候群、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経障害、例えばシャルコーマリートゥース病及び神経線維腫症、甲状腺機能低下症、水頭症、発作性障害、例えばシデナム舞踏病Syndenham’schorea及び脳性麻痺、脊椎披裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴、並びに対象の任意の組織、臓器、又は系、例えば、脳、副腎、腎臓、骨格系又は生殖器系が関与する細胞成長及び分化、胚発生、並びに形態形成に関連する任意の障害が挙げられる。00105一実施形態では、本明細書にerein開示される方法を用いて、核酸配列の発現に関連する障害を検出、病期分類、診断、及び/又は治療し得る。このような障害の例としては、限定されるものではないが、内分泌障害、例えば、性腺機能低下症、シーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンドシュラークリスチャン病、レッテラーシーベ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、及び小人症を含む下垂体機能低下に関連する障害;先端巨大症、巨人症、及び抗利尿ホルモンADH不適合分泌症候群SIADHを含む下垂体機能亢進症;並びに、甲状腺腫、粘液水腫、細菌感染症を伴う急性甲状腺炎、ウイルス感染症を伴う亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎橋本病、及びクレチン病を含む甲状腺機能低下に関連する障害;甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、及びプランマー病を含む甲状腺機能亢進に関連する障害;並びに、コン病慢性高カルシウム血症chronichypercalemiaを含む副甲状腺機能亢進に関連する障害;呼吸器疾患、例えば、アレルギー、喘息、急性及び慢性の炎症性肺疾患、ARDS、気腫、肺うっ血及び肺浮腫、COPD、間質性肺疾患、及び肺癌;癌、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌;及び免疫不全症、例えば、後天性免疫不全症候群AIDS、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、リンパ球毒素性偶発性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症、並びに外傷が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、サザン解析若しくはノーザン解析、ドットブロット、又は他の膜ベースの技法;PCR法;ディップスティックアッセイ、ピンアッセイ、及びELISAアッセイ;並びにマイクロアレイにおいて、患者からの体液又は組織を利用して核酸配列発現の変化を検出するために用いられ得る。このような定性的又は定量的な方法は、当技術分野において周知である。本発明の特徴付け及び最良の形態PARADIGM:PARADIGMを使用した多次元癌ゲノミクスデータからの患者特異的パスウェイ活性の推論。00106パスウェイに基づく手法の1つの仮説は、パスウェイデータベースに含まれている遺伝的相互作用は、癌において検出される遺伝子発現変化の間の相関性を解釈するための情報を有するというものである。例えば、癌関連パスウェイが転写活性化因子Aから標的遺伝子Tへのリンクを含む場合、本発明者らはAの発現がTの発現と正の相関E2E相関を有することを予想する。同様に、本発明者らはAのコピー数とTの発現との間に正の相関C2E相関があることを予想する。更に、本発明者らはAにおける増幅は、必ずしもAがより高度に発現することを意味するものでなく、それには次にBの上方制御が必要なため、C2E相関はE2E相関より弱いことを予想する。このように、パスウェイの各リンクはデータに関する予想を提供する;多くの一貫性のあるリンクを含むパスウェイは、更なる考慮事項について関連性を有し得る。本発明者らはこれらの仮定を検証し、NCIパスウェイは、最近のTCGAGBMデータを予測する多くの相互作用を含むことを見出したTheTCGAresearchnetwork2008。00107本発明者らは、統合された患者データから遺伝的パスウェイの活性を推論するPARADIGMPAthwayRecognitionAlgorithmusingDataIntegrationonGenomicModelsと称される手法を開発した。00108PARADIGM法は、既知のシグナル伝達パスウェイによって多様なハイスループットゲノミクス情報を統合し、遺伝子活性、複合体、及び細胞プロセスの状態に関する患者特異的ゲノミック推論を提供する。本方法の核心部は、様々なデータソースを組み合わせるために、因子グラフを用いて推論を利用することである。元のハイスループットデータセットの代わりに、又はそれと併せてこのような推論を使用することで、試料を臨床的に関連性のあるサブタイプに分類する本発明者らの能力が向上する。PARADIGMで統合した活性に基づくGBM患者のクラスタリングにより、種々の生存プロファイルと相関する患者サブタイプが明らかとなった。対照的に、発現データ又はコピー数データのいずれかを用いる試料のクラスタリングでは、データセットにおいて有意なクラスターは何ら明らかとならなかった。00109PARADIGMは、GBM及び乳癌の両方からの腫瘍試料において有意に変化した遺伝子活性のパスウェイ推論を生成する。SPIAと称される競合するパスウェイ活性推論手法と比較して、本発明者らの方法は、癌関連パスウェイにおいて変化した活性をより少ない偽陽性で特定する。計算効率上、PARADIGMは現在、NCIパスウェイをそのまま使用する。00110PARADIGMはEMを用いて隠れ量を推論するが、NCIパスウェイにまだ存在しない新しい相互作用を推論しようと試みるものではない。尤度関数を増加させる新しい相互作用を導入するようにこの手法を拡張することが想像され得る。この問題は概して厄介であるが、構造的EMFriedman1997上記などの発見的手法を使用することにより、計算的な探索戦略を用いて相互作用を特定することができる。00111新たに新規の連結を探索するのでなく、タンパク質間相互作用マップ又は有意な数の発現データセットにおいて相関する遺伝子ペアから得られた相互作用を提案することにより、著しく探索速度を加速することができる。このパスウェイベースの手法の力は、観測される生存差異の根底にある考えられる機構に関して手掛かりを提供し得ることである。有益な情報を提供するIPAは、治療標的を示唆したり、又は臨床試験に最も適した患者を選択したりするのに有用であり得る。例えば、ErbB2増幅は、薬物のトラスツズマブにより治療可能な特定の乳癌型の周知のマーカーである。しかしながら、ErbB2増幅を有する一部の患者は治療抵抗性の腫瘍を有する。CircleMap表示を調査することにより、ErbB2増幅を有するが、PARADIGMにより推論される通りIPAが不活性又は不変のいずれかである患者を特定することができる。ErbB2増幅を有するが、予測される活性を有さない患者には、代替治療が検討され得る。00112将来、より多次元のデータセットが利用可能となるに伴い、このようなパスウェイ推論がコホート間で一般化されるロバストなバイオマーカーを提供するかどうかを検証することは興味深いものになるであろう。乳癌における抗癌化合物に対するサブタイプ及びパスウェイ特異的応答00113現在、ヒト悪性腫瘍の治療に向けて800種を超える小分子阻害薬及び生物製剤の開発が進められているNewMedicinesDatabase|PHRMA.http://newmeds.phrma.org/2010。これらの薬剤の多くは、腫瘍を正常細胞と区別すると考えられる分子構造を標的とし、かつ代謝拮抗薬及びDNA架橋剤、例えばトラスツズマブ及びラパチニブを含めた、癌のサブセットにおいて調節解除される分子イベント及びパスウェイを選択的に標的化する広域特異性の従来の治療薬までの範囲に及ぶ例えば、Slamon,D.J.etal.UseofchemotherapyplusamonoclonalantibodyagainstHER2formetastaticbreastcancerthatoverexpressesHER2.NEnglJMed344,783-7922001;Vogel,C.L.etal.Efficacyandsafetyoftrastuzumabasasingleagentinfirst-linetreatmentofHER2-overexpressingmetastaticbreastcancer.JClinOncol20,719-7262002;Rusnak,D.W.etal.Theeffectsofthenovel,reversibleepidermalgrowthfactorreceptor/ErbB-2tyrosinekinaseinhibitor,GW2016,onthegrowthofhumannormalandtumor-derivedcelllinesinvitroandinvivo.MolCancerTher1,85-942001を参照のこと。Effectsofchemotherapyandhormonaltherapyforearlybreastcanceronrecurrenceand15-yearsurvival:anoverviewoftherandomisedtrials.Lancet365,1687-17172005。00114今日の薬剤開発における一般的な傾向は、従来の薬物と比べて増強した効力及び低い毒性を示す標的化薬剤に向かっているSawyers,C.Targetedcancertherapy.Nature432,294-2972004。ERBB2/EGFR阻害薬のラパチニブなど、高い標的特異性を示す薬物もあれば、SRC阻害薬のダサチニブなど、広範囲のキナーゼを阻害する薬物もあるKaraman,M.W.etal.Aquantitativeanalysisofkinaseinhibitorselectivity.NatBiotechnol26,127-1322008。00115臨床試験は応答の予測因子を含むべきであり、かつ試験に参加する患者を層別化すべきであるという認識が高まっている。多くの分子的に標的化された治療剤は、患者を分類するための明らかな分子構造を提供するが、ほとんどはそうでない。更に、腫瘍間での分子的及び生物学的な違い、標的化されたパスウェイの複雑なクロスカップリング及びフィードバック調節並びに不正確な標的特異性により、基本的機構の予測は多くの場合に複雑となる。分子マーカーに基づく臨床試験の過程では、応答性のサブセットが同定され得るが、この手法は手配が困難かつ高価であり、応答する可能性がもっとも高い選択された分集団において実験的化合物を最初に試験することができない。実際、現在開発中の薬物の大半は今後乳癌で試験されることはないため、乳癌患者の分集団においてのみ極めて有効な化合物が見落とされる確率が高い。有望な手法は、前臨床モデルから得られる応答の予測因子を使用して臨床試験に参加する患者を層別化することであり、それにより開発費用が低減され、患者サブセットで特に有効であり得る薬物が特定され得る。00116細胞株パネルにおける前臨床試験は、初期臨床試験の指針として応答性の分子サブタイプを早期にかつ効率的に同定することを可能にする見込みがある。この手法の有用性についての証拠は、細胞株パネルがaゲフィチニブに応答性を有するものとしてEGFR変異を伴う肺癌を予測しPaez,J.G.etal.EGFRmutationsinlungcancer:correlationwithclinicalresponsetogefitinibtherapy.Science304,1497-15002004、bトラスツズマブ及び/又はラパチニブに応答性を有するものとしてHER2/ERBB2増幅を伴う乳癌を予測しNeve,R.M.etal.Acollectionofbreastcancercelllinesforthestudyoffunctionallydistinctcancersubtypes.CancerCell10,515-5272006;Konecny,G.E.etal.ActivityofthedualkinaseinhibitorlapatinibGW572016againstHER-2-overexpressingandtrastuzumab-treatedbreastcancercells.CancerRes66,1630-16392006、及びcメシル酸イマチニブに耐性を有するものとして変異又は増幅したBCR-ABLを伴う腫瘍を予測するScappini,B.etal.ChangesassociatedwiththedevelopmentofresistancetoimatinibSTI571intwoleukemiacelllinesexpressingp210Bcr/Ablprotein.Cancer100,1459-14712004ことを示す研究によってもたらされる。NCIのディスカバリーセラピューティックプログラムDiscoveryTherapeuticProgramはこの手法を大規模に追求し、約60種の癌細胞株コレクションにおいて分子構造と100,000種超の化合物に対する応答との間の関連性を特定しているWeinstein,J.N.Spotlightonmolecularprofiling:IntegromicanalysisoftheNCI-60cancercelllines.MolCancerTher5,2601-26052006;Bussey,K.J.etal.IntegratingdataonDNAcopynumberwithgeneexpressionlevelsanddrugsensitivitiesintheNCI-60celllinepanel.MolCancerTher5,853-8672006。多様な応答を有する化合物の検出に有用であるものの、NCI60パネルはコレクション内での特定の癌サブタイプの比較的疎である代表性のために、間違いなくサブタイプに特異的な応答の検出力が制限される。例えば、このコレクションには6種類の乳癌細胞株しか含まれず、これは既知の多様性を適切に表現するには不十分である。従って本発明者らは、乳癌におけるインビトロ治療化合物応答と分子サブタイプと活性化したシグナル伝達パスウェイとの間の関連性をより統計的にしっかりと同定するため、約50種の乳癌細胞株のコレクションの使用を図った。ここで本発明者らは、FDA承認薬及び治験化合物の両方を含む77種の化合物について、定量的な成長阻害応答とサブタイプを定義する分子構造と活性化したパスウェイとの間の関連性における評価を報告する。約半数が異常性又はサブタイプ特異性を示す。本発明者らはまた、遺伝子発現及びコピー数データの統合的分析により、観測されるサブタイプ関連応答の一部は特定のパスウェイ活性により説明できることも示している。統合された分子プロファイルはDcisにおけるインターロイキンシグナル伝達の歪み及び浸潤性乳癌における予後診断力の向上を明らかにする00117様々なレベルにおけるハイスループット腫瘍分子プロファイルの蓄積は、世界的に時間及び費用のかかるプロセスとなっている。様々なレベルで遺伝子調節を複合的に分析することにより、複数の上皮癌で調節解除されている特定の生物学的機能及び分子パスウェイが示され、かつ個々に合わせた治療及びモニタリングのための新規な患者サブグループが明らかとなり得る。本発明者らは、約110人の乳癌患者からの、原発腫瘍、対応する血液、かつ既知の微小転移状態を有する新鮮な凍結試料から得られるいくつかの分子レベルでのハイスループットデータを収集した以下、MicMaデータセットと称する。これらの患者は、播種性腫瘍細胞DTCの存在、再発についての長期経過観察及び全生存に関する情報を有する900件を超える乳癌症例コホートの一部である。MicMa集合は、全ゲノムmRNA発現Naume,B.etal.,2007,Presenceofbonemarrowmicrometastasisisassociatedwithdifferentrecurrenceriskwithinmolecularsubtypesofbreastcancer,1:160-17、アレイCGHRussnes,H.G.etal.,2010,Genomicarchitecturecharacterizestumorprogressionpathsandfateinbreastcancerpatients,2:38ra472、DNAメチル化Ronneberg,J.A.etal.,2011,Methylationprofilingwithapanelofcancerrelatedgenes:associationwithestrogenreceptor,TP53mutationstatusandexpressionsubtypesinsporadicbreastcancer,5:61-76、全ゲノムSNP及びSNP-CGHVan,LooP.etal.,2010,Allele-specificcopynumberanalysisoftumors,107:16910-169154、全ゲノムmiRNA発現解析EnerlyE,SteinfeldI,KleiviK,LeivonenS,AureMR,RussnesHG,RonnebergJA,JohnsenH,NavonR,RodlandE,MakelaR,NaumeB,PeralaM,KallioniemiO,KristensenVN,YakhiniZ,Borresen-DaleA.miRNA-mRNAintegratedanalysisrevealsrolesformiRNAsinprimarybreasttumors.PLoSONE2011;62:e16915、TP53mutationstatusdependentpathwaysandhighthroughputpairedendsequencingStephens,P.J.etal.,2009,Complexlandscapesofsomaticrearrangementinhumanbreastcancergenomes,462:1005-1010の並行するパイロット研究において使用されている。これは、単一の研究室によって同じ原発性乳房腫瘍集合に対して行われる包括的なハイスループット分子データ収集である。00118本発明者らは以下にこれらの研究の知見を要約し、研究の各々では、mRNA発現をDNAコピー数、DNAメチル化における調節解除又はmiRNA発現のいずれかと統合することを試みている。過去に本発明者ら及び他の研究者らは複数の分子レベルで乳癌機構を調べているが、mRNA、CNA、miRNA、及びメチル化をパスウェイ文脈でモデル化することによりこれらの観点を統合する試みはごく僅かであった。本論において本発明者らは、乳癌からのこのようなデータを、摂動を受けるパスウェイ及び個別的な表現型特性を有する分子サブタイプの両方の検出と合わせて分析した。00119ここで考察するMicMaデータセットにおいて、本発明者らはメチル化プロファイルに基づき3つの大クラスター及び1つの小クラスターを特定した;大クラスターの1つは主として筋上皮起源の腫瘍からなり、他の2つの大クラスターは主に管腔上皮起源の腫瘍を含むものであった。クラスターは、TP53突然変異及びER、及びErbB2発現状態、並びに悪性度に関して異なっていた。パスウェイ解析により、EGF、NGFR及びTNFなどの遺伝子を含むカノニカルなキュレーションされたパスウェイ、樹状細胞成熟及びNF-κBシグナル伝達パスウェイとの有意な関連性が特定された。DCIS及び浸潤癌からの試料に対する候補遺伝子のパイロシーケンシングから、ABCB1、FOXC1、PPP2R2B及びPTENはDCISにおいてメチル化される新規遺伝子として同定された。どの病変が侵襲性となるリスクを有するかをより良く理解するためには、これらの後成的変化がどのように腫瘍進行の惹起に関与するかを理解することが重要である。00120本発明者らはまた、MicMaデータセットにおけるmiRNA及びmRNA発現間の関係についても、それらの互いの、及び臨床的特徴との相関性の観点で調査した。本発明者らは、増殖、細胞接着及び免疫応答などのいくつかの細胞プロセスが特定のmiRNAと強く関連することを示すことができた。分子固有サブタイプ間、及び異なる増殖レベルの試料間において、統計的に有意なmiRNA発現差異が認められた。本発明者らは、細胞株に対するハイスループットライセートマイクロアレイを用いて、miRNAの増殖調節における役割を検証し、このプロセスの潜在的なドライバーを指摘したEnerlyetal.2001上記。00121この乳癌患者コホートにおいて、10e-6のp値カットオフレベルでTP53突然変異状態によって示差的濃縮を示す40個超のKEGGパスウェイが同定された。パスウェイの示差的濃縮はまた、2つの異なるマイクロアレイプラットフォームに基づく、187個の乳癌試料から成るクロスプラットフォームのデータセットにおいても認められた。示差的に濃縮されたパスウェイは、TP53シグナル伝達及び細胞周期などのいくつかの既知の癌パスウェイ、免疫応答及びサイトカイン活性化を含むシグナル伝達パスウェイ、及び脂肪酸代謝を含む代謝パスウェイJoshietal,2011上記を含むものであった。00122先述の研究の各々は、ハイスループット分子データから対様式でCNA/mRNA、miRNA/mRNA、DNAメチル化/mRNA、TP53/mRNA生物学的相互作用を導き出そうと試みている。本研究では、本発明者らは調節解除されたパスウェイに焦点を合わせ、全ての分子レベルを同時に考慮した統合予後診断指標を開発しようと試みた。本発明者らは、ゲノムモデルに関するデータ統合を用いたパスウェイ認識アルゴリズムPARADIGMを適用することにより、様々な遺伝的パスウェイの相対活性を明らかにし、それらの共同の予後診断潜在力を評価した。次に、クラスター及びPARADIGMにより特定される調節解除されたパスウェイを別のデータセットChin,S.F.etal.,2007,Usingarray-comparativegenomichybridizationtodefinemolecularportraitsofprimarybreastcancers,26:1959-1970で検証し、また、DCIS非浸潤性乳管癌などの、前癌性新生物のデータセットMuggerud,A.A.etal.,2010,MoleculardiversityinductalcarcinomainsituDCISandearlyinvasivebreastcancer,4:357-368で試験した。卵巣漿液性癌において高頻度で変化するパスウェイ00123コピー数及び遺伝子発現の両方の統合分析によって有意に変化するパスウェイを同定するため、本発明者らは最近開発したパスウェイ活性推論法PARADIGMPMID:20529912を適用した。この計算モデルはコピー数変化、遺伝子発現データ、及びパスウェイ構造を組み込み、パスウェイデータベースに存在する全ての遺伝子、複合体、及び遺伝的プロセスについて統合パスウェイ活性IPAを生成する。本発明者らは用語エンティティを、それが遺伝子か、複合体か、又は小分子かを問わず、パスウェイにおける任意の分子を指して使用する。エンティティのIPAは最終活性のみを指す。遺伝子について、IPAはタンパク質の活性状態の推論された活性のみを指し、これは、パスウェイにおける他の遺伝子のコピー数、遺伝子発現、及びシグナル伝達から推論される。本発明者らはPARADIGMを卵巣試料に適用し、米国国立癌研究所のパスウェイ相互作用データベースNCI-PIDに含まれるパスウェイに存在する多くの異なる遺伝子及びプロセスの変化を見出した。本発明者らは1000回のランダムシミュレーションを用いて推論された変化の有意性を評価し、これらのシミュレーションでは、同じ構造を有するパスウェイが使用されるが、パスウェイの種々の点に任意の遺伝子が割り当てられた。換言すれば、所定のパスウェイのあるランダムシミュレーションでは相互作用の集合は固定されたままであり、それ故任意の遺伝子集合はパスウェイ相互作用によって互いに連結された。全試料のIPAの有意性は同じヌル分布に対して評価し、各試料におけるエンティティ毎の有意水準を得た。標準偏差が少なくとも0.1のIPAを、図28にヒートマップとして表示する。00124表3は、PARADIGMにより見出された順列化試料に関して少なくとも3標準偏差だけ変化するパスウェイを示す。FOXM1転写因子ネットワークは、検証した全てのパスウェイの中で最多数の試料において変化した-試料間で平均化したとき67のエンティティが活性の変化を有した。それに対して、卵巣コホートにおいて次に最も高いレベルの活性の変化を有したパスウェイには、PLK1シグナル伝達イベント27、オーロラBシグナル伝達24、及びトロンボキサンA2受容体シグナル伝達20が含まれた。従って、NCI-PIDのパスウェイの中では、卵巣試料に関して、FOXM1ネットワークは他のパスウェイと比べて有意により大きく変化する活性を含む。00125FOXM1転写因子ネットワークは、最も高い割合の患者試料において、正常対照と比較して腫瘍試料において示差的に変化することが分かった図29。FOXM1は、3つの既知の支配的なスプライシング型を有する多機能性転写因子であり、スプライシング型の各々は、細胞増殖及びDNA修復において様々な役割を有する個別的な遺伝子サブセットを調節する。FOXM1cアイソフォームは、AUKB、PLK1、CDC25、及びBIRC5を含めた、細胞増殖において既知の役割を有するいくつかの標的を直接調節するPMID:15671063。他方で、FOXM1bアイソフォームは、DNA修復遺伝子のBRCA2及びXRCC1を含む完全に異なる遺伝子サブセットを調節するPMID:17101782。ATMの間接的制御下にあるCHEK2は、FOXM1発現レベルを直接調節する。00126本発明者らは、FOXM1転写因子自体のIPAは、他の転写因子のIPAよりも高度に変化するかという問いを立てた。本発明者らはFOXM1の活性レベルをNCI-PIDにおける他の203個の転写因子の全てと比較した。NCI集合の他の転写因子と比較しても、FOXM1転写因子は有意に高いレベルの活性を有したp<0.0001;KS検定ことから、それは重要なサインであり得ることが更に示唆される図30。00127FOXM1はまた、上皮起源の多くの異なる正常組織においても発現するため、本発明者らは、PARADIGMにより同定されるサインが、他の組織では正常と見なされ得る上皮サインに起因するかという問いを立てた。これに答えるため、本発明者らは卵管上皮及び卵巣腫瘍組織が顕微解剖されたGEOからの独立したデータセットをダウンロードしGSE10971PMID:18593983、遺伝子発現をアッセイした。本発明者らはFOXM1のレベルは正常試料と比較して腫瘍試料において有意に高いことを見出し、それ故実際に癌性組織においては、FOXM1調節は正常上皮組織に見られるものを超えて亢進することが示唆される図31。00128TCGA卵巣コホート全体が高悪性度の漿液性腫瘍に由来する試料を含んだため、本発明者らは、FOXM1サインは高悪性度漿液性に特異的であるのかという問いを立てた。本発明者らは、低悪性度及び高悪性度の両方の漿液性腫瘍の転写プロファイルが決定されているEtemadmoghadametal.2009のデータセットからEtemadmoghadamD,deFazioA,BeroukhimR,MermelC,GeorgeJ,GetzG,TothillR,OkamotoA,RaederMB,AOCSStudyGroup,HarnettP,LadeS,AkslenLA,TinkerAV,LocandroB,AlsopK,ChiewYE,TraficanteN,FeredayS,JohnsonD,FoxS,SellersW,UrashimaM,SalvesenHB,MeyersonM,BowtellD.IntegratedGenome-WideDNACopyNumberandExpressionAnalysisIdentifiesDistinctMechanismsofPrimaryChemoresistanceinOvarianCarcinomas.ClinicalCancerResearch2009Feb.;154:1417-1427、FOXM1及びその標的のいくつかの対数発現を得た。この独立したデータから、FOXM1及びその標的のいくつかは、低悪性度卵巣癌と比較して漿液性卵巣癌において有意に上方制御されることが確認された図32。FOXM1転写因子ネットワークの25個の遺伝子が、高悪性度疾患において発現がより高い遺伝子の有意な割合を含んていたかどうかを決定するため、本発明者らはEtemadmoghadamのデータを使用してスチューデントのt検定を実施した。ゲノム中723個の遺伝子5.4は、0.05の有意水準で低悪性度癌と比べて高悪性度癌において有意に上方制御されることが分かったベンジャミニホッホバーグBenjamini-Hochbergの方法を用いて複数の試験に対して補正。FOXM1ネットワークは、その遺伝子のうち13個52が示差的に調節されることが分かった。これは、超幾何検定に基づけば有意な割合であるP<3.81012。従ってFOXM1ネットワーク遺伝子の高発現は、ゲノムにおける典型的な遺伝子の発現と比較したとき、高悪性度疾患と確かに特異的に関連するように思われる。00129乳癌及び肺癌を含め、多くの異なる癌におけるFOXM1の役割は十分に実証されているが、卵巣癌におけるその役割はいまだ調査されていない。FOXM1は、3つの既知のスプライシング型を有する多機能性転写因子であり、スプライシング型の各々は、細胞増殖及びDNA修復において様々な役割を有する個別的な遺伝子サブセットを調節する。この分析に関連するFOXM1の相互作用ネットワークの抜粋を図27に示す。FOXM1aアイソフォームは、AUKB、PLK1、CDC25、及びBIRC5を含めた、細胞増殖において既知の役割を有するいくつかの標的を直接調節する。対照的にFOXM1bアイソフォームは、DNA修復遺伝子のBRCA2及びXRCC1を含む完全に異なる遺伝子サブセットを調節する。ATMの間接的な制御下にあるCHEK2は、FOXM1の発現レベルを直接調節する。卵巣患者のほとんどにおけるFOXM1の発現増加に加えて、小さいサブセットはまた、CBSにより検出されるコピー数増幅の増加も有する19が、計測したゲノムにおける全遺伝子の上位5分位内のコピー数増加を伴う。従って、FOXM1の選択的スプライシング調節はDNA修復と細胞増殖との間の制御スイッチに関与し得る。しかしながら、個別のアイソフォーム活性を区別することは、アイソフォームを区別するエクソン構造及びエクソンアレイプローブの位置によって困難なため、現時点ではこの主張を裏付けるデータは不十分である。これらの試料のmRNAの将来のハイスループットシーケンシングは、FOXM1アイソフォームの示差的レベルの決定を促進し得る。PARADIGMがこの転写因子に集中した最高レベルの活性変化を検出したという観測から、FOXM1は細胞において重要な調節ポイントにあることが示唆される。診断00130本明細書に記載の方法を用いて、変化した遺伝子発現、mRNAの発現過剰に対する非存在/存在を検出及び定量化し、又は治療介入中のmRNAレベルをモニタし得る。発現の変化に関連する病態、疾患又は障害としては、特発性肺動脈高血圧症、二次性肺高血圧症、細胞増殖性障害、特に退形成乏突起膠腫、星状細胞腫、乏突起星細胞腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経節神経腫、神経細胞腫瘍、多発性硬化症、ハンチントン病、乳腺腺癌、前立腺腺癌、胃腺癌、転移性神経内分泌癌、非増殖性線維嚢胞性及び増殖性線維嚢胞性の乳腺疾患、胆嚢炎及び胆石症、変形性関節症、並びに関節リウマチ;後天性免疫不全症候群AIDS、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫性疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合型免疫不全症SCID、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、血液透析、体外循環、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症;プロラクチン産生障害、不妊症、例えば、卵管疾患、排卵異常、及び子宮内膜症、性周期の乱れ、月経周期の乱れ、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍又は卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫障害、子宮外妊娠、及び催奇形性;乳癌、乳腺線維嚢胞症、及び乳汁漏出症;精子形成の乱れ、精子の生理異常、良性前立腺肥大症、前立腺炎、ペイロニー病、インポテンス、女性化乳房;日光角化症、動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合結合組織病MCTD、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性赤血球増加症、原発性血小板血症、癌の合併症、癌、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌が挙げられる。別の態様において、本発明の核酸。00131本明細書に記載の方法を用いて、変化した遺伝子発現;mRNAの非存在、存在、又は過剰発現を検出及び定量化し;又は治療介入中のmRNAレベルをモニタし得る。発現の変化に関連する障害としては、静坐不能akathesia、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、失調、双極性障害、緊張病、脳性麻痺、脳血管疾患クロイツフェルト‐ヤコブ病、認知症、うつ病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジー、ジストニー、癲癇、ハンチントン病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、神経線維腫症、神経障害、パーキンソン病、ピック病、網膜色素変性症、統合失調症、季節性情動障害、老年性認知症、脳卒中、トゥレット症候群並びに腺癌、黒色腫、及び奇形癌を含む癌、特に脳の癌が挙げられる。00132遺伝子発現に関連する病態、疾患又は障害の診断のための基礎を提供するため、正常な又は標準の発現プロファイルを確立した。これは、正常な対象動物又はヒトのいずれかから採取した生体試料を、ハイブリダイゼーション条件又は増幅条件下でプローブと組み合わせることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な対象を用いて得られた値を、既知量の実質的に精製された標的配列が用いられる実験値と比較することにより定量化され得る。このようにして得られた標準値は、特定の病態、疾患、又は障害の症状を示す患者の試料から得られた値と比較され得る。標準の値から特定の病態に関連する値の方への偏差を使用して、当該病態を診断する。00133また、このようなアッセイを用いて、動物試験及び臨床試験において特定の治療的処置レジメンの効力を評価し、又は個別の患者の治療をモニタし得る。病態の存在が確定し、かつ治療プロトコルが開始されると、診断アッセイは定期的に繰り返され、患者における発現レベルが正常な対象で観測されるレベルに近付き始めるかどうかが決定され得る。継続的なアッセイから得られる結果を使用して、数日から数ヶ月の範囲の期間にわたる治療効力が示され得る。モデル系00134動物モデルは、ヒトと同様の毒性応答を示し、かつ曝露条件がヒト曝露に適切である場合に、バイオアッセイとして用いることができる。哺乳動物は最も一般的なモデルであり、低コスト、利用し易さ、及び豊富な毒性学の参考文献のために、ほとんどの毒性試験がラット又はマウスなどのげっ歯類で行われている。近交系げっ歯類は、対象遺伝子の過小発現又は過剰発現の生理学的影響の研究、及び疾患の診断及び治療方法の開発に好都合なモデルを提供する。特定の遺伝子例えば、乳中に分泌されるものを過剰発現するように同系交配した哺乳動物もまた、当該遺伝子により発現する好都合なタンパク質供給源として機能し得る。毒性学00135毒性学は、薬剤の生物系に及ぼす影響の研究である。毒性試験の大半はラット又はマウスで行われ、これらの薬剤がヒトの健康に及ぼす影響を予測するのに役立つ。生理機能、行動、恒常作用、及び致死性における定性的及び定量的な変化の観測を用いて毒性プロファイルを生成し、薬剤への曝露後のヒトの健康に及ぼす影響を評価する。00136遺伝毒性学では、遺伝子突然変異を生じさせる薬剤の能力が同定及び分析される。遺伝毒性薬剤は、通常、核酸との相互作用を促進する共通の化学的又は物理的な特性を有し、かつ染色体異常が子孫に伝わるとき最も有害である。毒性学的研究では、受胎前の親、妊娠中の母親、又は発育中の生物体のいずれかに投与される場合に、子孫における構造的又は機能的な異常の頻度を増加させる薬剤が同定され得る。マウス及びラットは、統計学的要件を満たすのに必要な生物体数を産生するそれらの生殖周期が短いため、これらの試験において最も高頻度で使用される。00137急性毒性試験は、薬剤を対象に単回投与して、その薬剤の症候学又は致死性を決定することに基づくものである。3つの実験が行われる:a初回用量範囲を判断する実験、b有効用量の範囲を絞り込む実験、及びc用量反応曲線を確立するための最終実験。00138長期毒性試験は、薬剤の反復投与に基づくものである。これらの試験にはラット及びイヌが一般的に用いられ、異なるファミリーの種からのデータが提供される。発癌を除いて、薬剤を高用量濃度で3~4ヶ月間にわたり連日投与すると、成体動物におけるほとんどの毒性形態が明らかになるという多数の証拠がある。001391年以上の継続期間を伴う慢性毒性試験は、薬剤の毒性の欠如又は発癌可能性のいずれかを実証するために用いられる。試験がラットで行われる場合、最低3つの試験群1つの対照群が用いられ、動物は、開始時及び実験中所定間隔で検査及び観察される。トランスジェニック動物モデル00140対象遺伝子を過剰発現又は過小発現するトランスジェニックげっ歯類を同系交配し、ヒト疾患をモデル化又は治療剤若しくは毒物を試験するために用い得る。参照により本明細書に援用される米国特許第4,736,866号明細書;同第5,175,383号明細書;及び同第5,767,337号明細書を参照のこと。ある場合には、導入された遺伝子は、胎児発育中又は出生後に特定の時点で特定の組織型において活性化され得る。実験的薬物治療の投与前、投与中、及び投与後のトランスジェニック動物における表現型又は組織特異的mRNA発現を分析することにより、導入遺伝子の発現が観察される。胚性幹細胞00141げっ歯類の胚から単離された胚性幹細胞ESは、胚を形成する能力を保持している。ES細胞を担体の胚内に置くと、それらの細胞は正常な発生を再開し、生産動物の全ての組織に寄与する。ES細胞は、実験的ノックアウト及びノックインげっ歯類株の作製に使用される好ましい細胞である。マウス129/SvJ細胞株などのマウスES細胞は初期マウス胚に由来し、当技術分野において周知の培養条件下で成長させる。ノックアウト株用のベクターは、生体内で転写及び/又は翻訳を妨害するマーカー遺伝子を含むように修飾された疾患遺伝子候補を含む。ベクターは、当技術分野において周知の電気穿孔法、リポソーム送達、顕微注入法などの形質転換法によってES細胞に導入される。内因性げっ歯類遺伝子は、細胞分裂中に相同組換え及び組込みによって破壊疾患遺伝子に置き換えられる。形質転換ES細胞が同定され、かつ好ましくはC57BL/6マウス株由来のものなどのマウス細胞胚盤胞に顕微注入される。胚盤胞は偽妊娠の雌親に外科的に移植され、得られたキメラの子孫の遺伝子型を決定し、繁殖させてヘテロ接合又はホモ接合の株が産生される。00142ES細胞はまた、神経細胞、造血系、及び心筋細胞などのインビトロで様々な細胞型及び組織の分化の研究にも用いられるBainetal.1995Dev.Biol.168:342-357;WilesandKeller1991Development111:259-267;及びKlugetal.1996J.Clin.Invest.98:216-224。最近の進展では、ヒト胚盤胞に由来するES細胞もまた、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉ectodermnalの細胞型を含む8つの別個の細胞系統に分化するようインビトロで操作し得ることが実証されているThomson1998Science282:1145-1147。ノックアウト解析00143遺伝子ノックアウト解析では、ヒト疾患遺伝子候補の領域は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子neo;例えば、Capecchi1989Science244:1288-1292を参照のことなどの非哺乳動物遺伝子を含むように酵素的に修飾される。挿入されたコード配列は標的化遺伝子の転写及び翻訳を妨害し、疾患候補タンパク質の生化学合成を妨げる。修飾された遺伝子は、培養胚性幹細胞上記に記載されるに形質転換され、形質転換細胞はげっ歯類胞胚に注入され、かつ胞胚は偽妊娠の雌親に移植される。トランスジェニック子孫を異種交配させると、ホモ接合近交系が得られる。ノックイン解析00144胚発生初期に存在する全能性ES細胞を使用して、ノックインヒト化動物ブタ又はヒト疾患のトランスジェニック動物モデルマウス又はラットを作製することができる。ノックイン技術によってヒト遺伝子のある領域は動物ES細胞に注入され、ヒト配列は組換えによって動物細胞ゲノムに組み込まれる。組み込まれたヒト遺伝子を含む全能性ES細胞は、上記に記載したとおり操作される。近交系動物は試験及び処置され、類似のヒト病態に関する情報が得られる。このような方法は、いくつかのヒト疾患のモデル化に用いられている。例えば、Leeetal.1998Proc.Natl.Acad.Sci.95:11371-11376;Baudoinetal.1998GenesDev.12:1202-1216;及びZhuangetal.1998Mol.CellBiol.18:3340-3349を参照のこと。非ヒト霊長類モデル00145動物試験の分野では、生理学、遺伝学、化学、薬理学及び統計学などの基礎科学からのデータ及び方法論を取り扱う。このようなデータは、非ヒト霊長類に対する治療剤の効果の評価において、それがヒトの健康に関係し得るために最も重要である。サルは、ワクチン及び薬物の評価においてヒトの代理として使用され、その応答は同様の条件下でのヒト曝露に関係する。カニクイザルマカカファシキュラリスMacacafascicularis、マカカムラタMacacamulata及びコモンマーモセットカリトリクスヤックスCallithrixjacchusが、これらの研究で使用される最も一般的な非ヒト霊長類NHPである。NHPコロニーの育成及び維持は巨費を伴うため、通常、初期研究及び毒性学的試験はげっ歯類モデルで行われる。薬物中毒などの行動測定を用いる試験では、NHPは第一選択肢の試験動物である。加えて、NHP及びヒト個体は、多くの薬物及び毒素に対して示差的感受性を示し、これらの薬剤の高代謝群及び低代謝群として分類することができる。本発明の例示的使用00146オーダーメイド医療は、利益を受ける可能性が最も高い患者に特異的な治療を送達するのに有望である。本発明者らは、治療化合物の約半数は、臨床的に関連する転写上又はゲノム上の乳癌サブタイプの1つ以上において選択的に有効であることを示した。これらの知見は、乳癌治療において応答に関連する分子サブタイプを定義することの重要性を支持している。本発明者らはまた、細胞株に関する転写及びゲノムのデータのパスウェイ統合は、観測されるサブタイプ特異的応答についての機構的説明を提供するサブネットワークを明らかにすることも示す。細胞株と腫瘍との間のサブネット活性の比較分析により、サブタイプ特異的サブネットワークの大部分が細胞株と腫瘍との間で保存されていることが示される。これらの分析から、十分に特徴付けられた細胞株パネルにおける実験的化合物の前臨床スクリーニングにより、初期段階の臨床試験における感受性濃縮に使用し得る応答に関連する分子サイン候補を同定できるという着想が裏付けられる。本発明者らは、このインビトロ評価手法が、化合物の臨床開発開始前に応答性の腫瘍サブタイプが同定される可能性を高め、それにより費用が低減され、最終的にFDA承認される確率が高まり、場合によっては応答する可能性が低い患者の治療に伴う毒性が回避されることを示唆する。この研究において、本発明者らは、転写サブタイプを定義する分子サインのみを評価し、反復されるゲノムCNAを選択した。本発明者らは、遺伝子突然変異、メチル化及び選択的スプライシングなどの更なる分子構造を解析に含めると、本手法の検出力及び精度が増加すると期待する。同様に、細胞株パネルのサイズが大きくなるほど、パネル内であまり一般的ではない分子パターンを評価する検出力が増加し、かつヒト乳癌に存在する多様性のより完全な範囲を表現する確率が高まる。00147乳癌の発生は、自然免疫細胞と適応免疫細胞との両方の存在の有意な増加により特徴付けられ、B細胞、T細胞、及びマクロファージは腫瘍性間質に存在する最も豊富な白血球に相当するDeNardoDG,CoussensLM.Inflammationandbreastcancer.Balancingimmuneresponse:crosstalkbetweenadaptiveandinnateimmunecellsduringbreastcancerprogression.BreastCancerRes.2007;94:212。腫瘍間質及び血清における高い免疫グロブリンIg値、及び過剰な濾胞性B細胞、調節性T細胞の存在量の増加、及び原発性腫瘍又はリンパ節におけるCD4/CD8又はTH2/TH1Tリンパ球の高い比は、腫瘍悪性度、病期、及び全患者生存と相関することが示されているBates,G.J.etal.,2006,QuantificationofregulatoryTcellsenablestheidentificationofhigh-riskbreastcancerpatientsandthoseatriskoflaterelapse,24:5373-5380;細胞傷害性Tリンパ球CTL及びナチュラルキラーNK細胞を含め、白血球によっては抗腫瘍活性を呈し34Dunn,G.P.,Koebel,C.M.,andSchreiber,R.D.,2006,Interferons,immunityandcancerimmunoediting,6:836-848、肥満細胞、B細胞、樹状細胞、顆粒球、及びマクロファージなどの他の白血球は、腫瘍進行を妨げるか、又は増強するその能力を通して、より二極化した役割を呈する35deVisser,K.E.andCoussens,L.M.,2006,Theinflammatorytumormicroenvironmentanditsimpactoncancerdevelopment,13:118-137。これらの研究における最も傑出した知見は、免疫応答TCR及びインターロイキンシグナル伝達、IL4、IL6、IL12及びIL23シグナル伝達における摂動の同定であり、これは予後診断値によるサブクラスの分類をもたらすものであった。ここで本発明者らは、これらのイベントがハイスループット分子データにおいて反映され、乳房腫瘍の分子的な細分類に強く干渉するという証拠を提供する。00148本開示はまた、HGS-OvCaにおける異常についての初めての大規模な統合的見解も提供する。概して、突然変異スペクトルは驚くほど単純なものであった。TP53における突然変異は優勢であり、HGS-OvCaの少なくとも96において起こった一方、BRCA1/2は、生殖細胞突然変異と体細胞突然変異とを組み合わせたことにより、腫瘍の22で変異した。7つの他の有意に変異した遺伝子が同定されたが、HGS-OvCaのわずか2-6であった。対照的に、HGS-OvCaは著しい度合いのゲノム配列の乱れdisarrayを実証する。高頻度のSCNAは、膠芽腫による先のTCGAの知見46と顕著な対照をなし、TCGAの知見では、反復的に変異する遺伝子がより多く、染色体腕レベル又は限局的なSCNAははるかに少なかった図37A。HR成分を含む推定DNA修復遺伝子における突然変異及びプロモーターのメチル化の高率発生は、SCNAの高率発生を説明し得る。突然変異スペクトルは、HGS-OvCaを他のOvCa組織学的サブタイプとは完全に異なるものとして特徴付ける。例えば、明細胞OvCaはTP53突然変異が少ないが、反復されるARID1A及びPIK3CAの突然変異を有し47~49;類内膜OvCaは高頻度のCTTNB1、ARID1A、及びPIK3CAの突然変異及びより低率のTP53を有する48、49一方、粘液性OvCaではKRAS突然変異がよく見られる50。卵巣癌サブタイプ間のこれらの差異は、病因学的効果と系統効果との組み合わせを反映していると思われ、サブタイプ別のケアによって卵巣癌転帰を改善する機会を表している。00149新規治療手法の特定は、TCGAの主目的である。HR欠損を含むHGS-OvCaの約50はPARP阻害薬によって利益を受け得る。更に、共通に調節解除されたパスウェイ、RB、RAS/PI3K、FOXM1、及びNOTCHは、治療的攻撃の機会を提供する。最後に、反復性の増幅領域における22個の遺伝子に対する阻害薬は既に存在し実施例XIII以下を参照のこと、標的遺伝子が増幅される場合のHGS-OvCaにおける評価を正当化する。総じてこれらの発見は、異常な遺伝子又はネットワークを検出し、かつこれらの特定の異常に有効となるよう選択される治療によって標的化されるHGS-OvCaの治療手法の土台を作るものである。00150図40では、パスウェイ解析エコシステム100の例示的な概要を提示する。エコシステム100は、好ましくは複数のパスウェイ要素125A~125N総じてパスウェイ要素125と称するを格納するパスウェイ要素データベース120を含むことができる。パスウェイ要素125の各々は、1つ以上のパスウェイへのその関与によって特徴付けることができる。要素125は、要素の特徴を表す1つ以上の特性又は値を含む別々に管理可能なデータオブジェクトと見なすことができる。いくつかの実施形態では、要素125は、特性又は値のnタプルとみなすことができ、要素125タプルの各特性メンバーは、他の要素タプルの他の特性メンバーに対して比較、分析、対比するか、そうでなければ評価され得る。00151修正エンジン110は、場合によりネットワークリンク例えば、LAN、WAN、インターネット、VPNなどを通じてパスウェイ要素データベース120と通信可能に連結する。いくつかの実施形態では、パスウェイ要素データベース120は、修正エンジン110の近傍にあってもよく、一方で他の実施形態では、パスウェイ要素データベース120は修正エンジン110から遠隔にあってもよい。例えば、パスウェイ要素データベース120は、NationalLambdaRailURLwww.nlr.netを参照のことやインターネットを介してアクセス可能である。更に、修正エンジン110、又はこのことに関してエコシステム100は、ネットワークを通じて、場合によっては手数料と引き換えにユーザーがアクセスすることができる。00152修正エンジン110は、分析のためにパスウェイ要素データベース120から1つ以上の要素125を取得する。好ましくは、修正エンジン110は、要素125の少なくとも1つ例えば、要素125Aを、少なくとも1つの先験的に既知の属性133と関連付ける。更に、修正エンジン110はまた別の要素、例えば要素125Nを仮の属性137と関連付ける。いくつかの実施形態では、修正エンジン110は、推論規則、プログラムによる命令、又は他の技術に基づいて、自動的に関連付けを行うことができる。例えば、既知の属性133は、公知の研究から得ることができ、一方で仮の属性137は、修正エンジン110が直列又は並列に仮の属性スペース間を通る属性パラメータ化スペースによって綿密に計画され得る。他の実施形態では、ユーザーは、場合によりHTTPサーバ又は他の適切なインターフェース技術により動作する1つ以上のユーザーインターフェース図示しないを介して、所望通りに属性133又は属性137を手動で関連付けることができる。00153修正エンジン110は、更に既知の属性133及び仮の属性137を用いて、1つ以上のパスウェイについてのパスウェイ要素125を相互相関させる。更に、修正エンジン110は、要素125に1つ以上の影響レベル145を割り当てる。相互相関及び影響レベル145の割り当てによって、修正エンジン110はパスウェイが仮の属性137又は他の因子によってどのように影響され得るかを概説する確率的パスウェイモデル140を構築する。00154いくつかの実施形態では、確率的パスウェイモデル140は、示唆されるように記録保管の目的で、又は分析のために、パスウェイモデルデータベース150内に格納され得る。要素125のように、確率的パスウェイモデル140はまた、場合によりnタプルとして、モデルの特徴を表す特性又は値を有する個別的に管理可能なデータオブジェクトとして格納され得る。モデル145、又更には要素125も、任意の所望のスキーマによって格納され得る。要素データベース120又はモデルデータベース150を構築するために使用可能な例示的な適したデータベースとしては、MySQL、PostgreSQL、Oracle、又は他の適切なデータベースが挙げられる。いくつかの実施形態では、データオブジェクト例えば、要素125、確率的パスウェイモデル140などには、簡単に検索や読み出しを可能にする方法で、その特性又は値により複数のインデックスを設けることができる。00155エコシステム100は、好ましくは、実際のデータに関連して確率的パスウェイモデル140を更に分析するよう構成された分析エンジン160を含む。示される例では、分析エンジン160は、場合によりユーザー又は研究者の指示の下で確率的パスウェイモデル140を取得し、ダイナミックパスウェイモデル165を導き出す。好ましくは、ダイナミックパスウェイモデル165は、患者試料からの1つ以上の計測属性173を確率的パスウェイモデル140と関連する属性と比較することによって導き出される。従って、分析エンジン160は、ダイナミックパスウェイモデル165を形成するために、確率的パスウェイモデル140を修正、更新、訂正するか、そうでなければ検証しようとする。完了すると、ダイナミックパスウェイモデル165は、モデルデータベース内に格納され得る。より好ましい実施形態では、分析エンジン160は、1つ以上の出力装置例えば、ディスプレイ、プリンタ、ウェブサーバなどを設定することで、ダイナミックパスウェイモデル165を提示することができる。分析00156従って、本発明の主題に係るシステムの使用は、一般的にパスウェイ要素データベースを含むものである。既に上述したように、データベースは物理的に単一のコンピュータに配置され得るが、分散型データベースも本明細書における使用に適していると考えられることが理解されるべきである。更に、このようなデータベースが複数のパスウェイ要素を格納及び検索できる限り、かつ各パスウェイ要素は少なくとも1つのパスウェイへのその関与により特徴付けられる限り、データベースの特定の形式は、本発明の主題に限定されるものではないことが理解されるべきである。00157意図されるパスウェイ要素に関して、パスウェイの一部である全ての要素は本明細書に含まれることに留意されたい。従って、適切なパスウェイ要素としては、単独、又は他の細胞成分との複合体化する1種以上のタンパク質例えば、グリコシル化、ミリストイル化などにより修飾されても又は修飾されなくてもよい、天然の核酸又は組換え核酸であり得る様々な核酸ゲノムDNA、染色体外DNA、hnRNA、siRNA、mRNA、rRNAなど、脂質、ホルモン、セカンドメッセンジャー、及び治療剤又は予防剤として提供される薬学的に活性な薬剤が挙げられる。従って、及び別の観点から見て、意図されるパスウェイ要素は様々な機能を有し得、特に好ましい機能には種々の酵素機能がある。例えば、適切な機能は、キナーゼ/ホスファターゼ、ポリメラーゼ/ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、ヒドロラーゼ特にGTPアーゼ、ヒドロキシラーゼ、メチルトランスフェラーゼメチラーゼなどである。00158従って、パスウェイ要素がタンパク質である場合、適切なパスウェイ要素としては、様々な受容体、ホルモン結合タンパク質、キナーゼ、転写因子、開始因子、メチラーゼ及びメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、及びにヒストンデアセチラーゼが挙げられる。同様に、パスウェイ要素が核酸である場合、意図されるパスウェイ要素としては、タンパク質配列、1つ以上のゲノム調節配列、調節RNA、及びトランス活性化配列をコードする核酸が挙げられる。00159従って、特定のパスウェイ要素に応じて、パスウェイの性質はかなり変化し得、かつ全ての既知のパスウェイは本明細書における使用に適していると考えられることが理解されるべきである。例えば、意図されるパスウェイは、シグナル伝達、細胞周期、細胞増殖及び又は代謝、修復機構特にDNA修復及び神経シグナル伝達に関与し得る。それ故、特に好ましいパスウェイとしては、カルシウム/カルモジュリン依存性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、サイトカイン媒介性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、ケモカイン媒介性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、成長因子シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、ホルモンシグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、MAPキナーゼシグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、ホスファターゼ媒介性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、Rasスーパーファミリー媒介性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、並びに転写因子媒介性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワークが挙げられる。従って、パスウェイは個々のパスウェイ、及びパスウェイネットワーク内のパスウェイ、更には個別的なパスウェイネットワークのネットワーク内のパスウェイであり得ることが理解されるべきである。例えば、本明細書において意図されるパスウェイは調節パスウェイネットワーク内にあってもよい。例えば、意図されるパスウェイネットワークには、加齢パスウェイネットワーク、アポトーシスパスウェイネットワーク、恒常性パスウェイネットワーク、代謝パスウェイネットワーク、複製パスウェイネットワーク、及び免疫応答パスウェイネットワークがある。00160従って、パスウェイ要素の属性の種類及び数値は大幅に変化し得、かつ特定のパスウェイ要素は大部分において属性の種類及び数値を決定することは容易に明らかとなるはずである。例えば、パスウェイ要素が核酸である場合、属性は、コピー数、特定のハプロタイプ又は突然変異、調節要素の強度例えば、プロモータ、リプレッサなど、転写レベル又は翻訳レベルであり得る。更に、意図される属性はまた、クラス属性例えば、遺伝子は、特定の転写因子によって活性化可能である、又は特定のホルモン応答要素に感受性がある、等を含み、又は化合物属性例えば、少なくとも2つの異なる属性を表すであってもよい。同様に、パスウェイ要素がタンパク質である場合、属性は翻訳量、タンパク質活性、補因子の要件、活性をもたらすための多タンパク質複合体形成の要件などであり得る。00161上記から容易に明らかであるように、パスウェイ要素の少なくともいくつかについての属性の少なくともいくつかは、先の研究及び刊行物から知られており、そのため、特定のパスウェイ要素についての先験的に既知の属性として意図されるシステム及び方法に使用することができる。一方で、数々の属性は、先験的に知られていないが、多種多様なこのような未知の属性は、合理的に良好な精度を期待して仮定できることが理解されるべきである。例えば、パスウェイ要素が受容体のゲノム配列であり、その配列はトランス活性化因子結合配列要素が先行する場合、パスウェイ要素の1つの属性はトランス活性化因子結合の要件であると合理的に仮定することができる。更に、トランス活性化の強度が同様の制御配列で知られている場合、パスウェイ要素の転写レベルは合理的に推論することができる。00162従って、仮の属性は任意に仮定された値ではないが、仮定は少なくとも部分的に既知の情報に基づいていることに留意すべきである。更に、仮の属性の種類及び値はまた参照パスウェイの関数であることに留意すべきである。例えば、最も一般的には、参照パスウェイは健常な細胞のパスウェイである。このように、属性の数値範囲及び種類は、一般的に正常な細胞のそれを反映する。しかしながら、非正常細胞も参照パスウェイを確立するために使用され得ることを認識すべきである。00163パスウェイ要素の属性は、多くの場合、少なくとも1つ以上の他のパスウェイ要素の1つ以上の属性に依存するので、現在多次元パスウェイマップは、各属性の量的範囲を必要とすることなく、概念的に単純かつ効果的な方法で構築することができることを特に認識すべきである。実際、数値線形値だけでなく、機能情報及び相互依存性も表現する属性を有するために、現在、複雑なパスウェイパターンを優れた分解能及び精度で確立することができる。00164このようなパスウェイパターンは、一般的にはパスウェイ要素データベースに結合された修正エンジンを用いて生成され、修正エンジンを用いて1第1のパスウェイ要素を少なくとも1つの先験的に既知の属性と関連付け、2第2パスウェイ要素を少なくとも1つの仮の属性と関連付け、かつ3それぞれ既知の属性及び仮の属性を用いて、少なくとも1つのパスウェイについての第1パスウェイ要素及び第2パスウェイ要素を相互相関させて、少なくとも1つのパスウェイについての影響レベルを割り当てることにより、最終的に確率的パスウェイモデルを形成する。例えば、第1のパスウェイ要素と少なくとも1つの先験的に既知の属性との関連付けは、多数の方法で行うことができる。しかしながら、属性はパスウェイ要素と直接関連付けられる属性のnタプルの1つとして表現されることが特に好ましい。最も一般的には、既知の属性は論文審査された刊行物に由来する。しかしながら、2次情報源例えば、SWISSPROT、EMBL、OMIM、NCI-PID、Reactome、Biocarta、KEGGなどの様々なデータベースで編集されて公的に入手可能な情報も適していると考えられる。同様に、仮の属性は手動で、より好ましくは少なくとも半自動化された方法でパスウェイ要素と関連付けられる。00165相互相関は多数の技術によって達成することができる。いくつかの実施形態では、パスウェイ要素は手動で相互相関され得る。しかしながら、より好ましい実施形態では、要素は1つ以上の自動化技術により相互相関され得る。例えば、多数の要素は、可能な相関を見出そうとする修正エンジンを介してその特性に関して分析され得る。修正エンジンは、多変量解析、遺伝的アルゴリズム、推論論法、又は他の技術を介して、このような相関を見出すように構成することができる。推論論法の例としては、演繹的論理、仮説論理、帰納論理、又は他の形態の論理を含む様々な形態の論理の適用が挙げられる。種々の形態の論理、特に仮説論理又は帰納論理を適用することにより、意図されるエンジンは可能性のある相関を発見することができ、それは別の方法では研究者は見落とすであろう。推論論法の別の例としては、確率伝搬、ループ確率伝搬、ジャンクションツリー、変数消去、又は他の推論方法などの確率モデルに推論を使用する適用が挙げられる。00166影響レベルは、仮の属性が既知の属性を有する要素を含むパスウェイにおいて有する定量値を表すものである。影響レベルは、単一の値又は複数の値を含むことができる。単一の値の例は、場合により評価段階にあるパスウェイシステム内の他の既知の影響に対する絶対値、又は正規化値として、重み係数を含むことができる。例示的な多値の影響レベルは、可能な分布幅を有する値の範囲を含むことができる。更に、影響レベルの初期値は手動設定を含む様々な技術により確立することができる。より好ましい実施形態では、初期値は修正エンジンによって作成される手動の推定により確立することができる。例えば、1つ以上の要素又はパスウェイの特性による相対的な距離は、影響レベルを重み付けするために使用することができる。距離は、正確な距離であってもよく、又は距離の二乗であってもよい。別の例では、影響レベルは、パスウェイシステム内の他の全ての値の間の影響レベルにおける尤度を最大化することで決定することができる。00167次に、相互相関及び影響の割り当ては、パスウェイ要素についての取得された属性及び仮の属性に基づいて確立される。更に、パスウェイ要素が既に既知のパスウェイ要素であるとき、要素のそれぞれのパスウェイへの関連性は先験的に確立されていることに留意されたい。しかしながら、また公知のシステム及び方法とは対照的に、そのように確立された確率的パスウェイモデルは、相互相関及び影響の割り当てを使用して、所定のパスウェイ内で各要素についての機能的相互関係及び重み付け効果を予測することを可能とする。当然ながら、確率的パスウェイモデルは、健常な細胞及び組織に対して、並びに老化、攻撃された、又はそうでなければ罹患した細胞又は組織に対して確立可能であることが理解されるべきである。00168最も好ましくは、次に分析エンジンは確率的パスウェイモデルを使用して、患者試料の複数の要素についての複数の計測属性からダイナミックパスウェイマップを導き出す。例えば、患者試料は、生体液、生検又は外科的検体に由来してもよく、一般的には、当技術分野で周知の方法を用いて分析される。従って、及び他の適切な属性の中で、計測属性には、突然変異、示差的遺伝子配列オブジェクト、1種以上の特定の遺伝子についての遺伝子コピー数、1種以上の特定の遺伝子についての転写レベル、1種以上の特定のタンパク質についての翻訳レベル、タンパク質活性、タンパク質相互作用、分析物例えば代謝産物の存在及び/又は量、又は疾患のマーカーなどがある。00169特に好ましい態様では、計測属性は確率的パスウェイモデルに供給され、確率的パスウェイモデルからの逸脱を示すことができるダイナミックパスウェイマップに到達する。従って、ダイナミックパスウェイマップは、特定のパスウェイ正常組織、罹患組織、加齢組織、又は組織回復などに対して特異的であり得るについての参照パスウェイ活性情報をユーザーに提供することが理解されるべきである。従って、及び別の観点から見て、ダイナミックパスウェイマップは、比較的限られた数の計測属性に基づいて、患者試料中の1つ以上のパスウェイに関連する情報をユーザーが容易に識別することを可能にする。00170従って、本発明者らはまた、ダイナミックパスウェイマップの生成方法も検討し、この方法は、複数のパスウェイ要素を含む確率的パスウェイモデルを格納するモデルデータベースへのアクセスをユーザーに提供する。当然ながら、特定のアクセスプロトコルが少なくとも部分的に特定の用途に基づいて決定されるように、このようなアクセスは様々な方法で制御することができる。しかしながら、アクセスは使用回数に応じて課金するアクセス又は事前に許可されたアクセスであることが一般に好ましい。あるいは、モデルデータベースはまた、公的にアクセス可能なネットワークを介してアクセス可能であってもよい。既に上記に記載したように、少なくともいくつかの複数のパスウェイ要素を相互相関させ、既知の属性に基づき少なくとも1つのパスウェイについての影響レベルを割り当て、かつ別の数の複数のパスウェイ要素を相互相関させ、かつ仮の属性に基づき少なくとも1つのパスウェイについての影響レベルを割り当て、及び分析エンジンは、患者試料の複数の要素についての複数の計測属性により確率的パスウェイモデルを修正することでダイナミックパスウェイマップを取得し、ダイナミックパスウェイマップは特定のパスウェイについての最も好ましい参照パスウェイ活性を含むことが一般に好ましい。00171当然ながら、意図されるシステム及び方法は、標準パスウェイモデル例えば健康なドナーを表すに対する第1の試料の分析に適しているだけでなく、このようなシステム及び方法は、健常組織に対する罹患組織の患者内分析も可能とし、組織についてのパスウェイ活性情報を予測することが理解されるべきである。従って、同じ患者からの2つの試料すなわち罹患組織及び非罹患組織からを使用して、特定の薬剤に対する罹患組織の感受性を予測することができる。それ故、本発明者らはまた、生物学的に関連する情報を分析する方法を検討し、この方法では、ダイナミックパスウェイマップを格納するモデルデータベースへのアクセスが提供され、DPMは、第1の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性によって確率的パスウェイモデルを修正することにより作成される。続いて、複数の計測属性は第2の細胞又は患者試料の複数の要素に対して取得され、次にダイナミックパスウェイマップ及び第2の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性は分析エンジンによって使用されて、第2の細胞又は患者試料についての予測パスウェイ活性情報を決定する。00172それ故、第1の細胞又は患者試料の複数の要素についての計測属性は、健常な細胞又は組織、細胞又は組織の特定の年齢、細胞又は組織の特定の疾患、罹患した細胞又は組織の特定の病期、特定の性別、特定の民族、特定の職業集団、更には特定の人種に特徴的であり得る。このように計算された情報は、職業、薬品治療、疾患の素因などに関した実際の又は可能性が高いパスウェイの差異についての貴重な情報を提供し得る。従って、第1の試料及び第2の試料は、同時に同じ細胞又は患者から得られ、又は異なる時間最も一般的には治療が開始された後に得られる。本明細書に提示されるシステム及び方法の多くの用途が検討される一方で、特に好ましい用途には、DPM及び創薬に基づいて1種以上の薬物に対する罹患細胞の感受性について患者を試験する用途がある。このような用途においては、患者又は患者試料は、処置一般的には、手術、放射線照射及び薬剤の投与が施された後に、潜在的な治療的価値の第2の薬剤を投与され得る。00173このようなシステム及び方法を用いて、予測パスウェイ活性情報は、パスウェイ要素を少なくとも1つのパスウェイにおいて階層的に上位の要素として同定可能であり、及び/又はパスウェイ要素を疾患に関連する少なくとも1つのパスウェイにおいて疾患の決定因子である要素として同定可能であることが認識されるべきである。従って、高い可能性で所望の転帰を達成する標的様式において薬学的介入を使用することができる。予測パスウェイ活性情報が医師に提供される場合、予測パスウェイ活性情報のグラフィック表現を生成して、その情報を施術者のニーズにより適したものとすることが一般的に好ましい。更に、予測パスウェイ活性情報は、疾患についての診断、予後診断、又は推奨例えば処置オプションの選択肢又は食事指導を考案するために、システム及び又はユーザーによって使用され得ることが意図される。或いは、又は更に、予測パスウェイ活性情報はまた、後成的要因、ストレス適応、生物体の状態、及び/又は修復若しくは治癒の状態を特定するために使用することができる。00174既に説明したもの以外のさらに多くの変更が本明細書における本発明の概念から逸脱することなく可能であることは、当業者に明らかなはずである。従って、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されるものではない。更に、明細書及び特許請求の範囲の両方の解釈において、全ての用語は、文脈と一致して最も広い可能な様態で解釈されるべきである。特に、用語含むcomprisesandcomrisingは、非排他的態様で要素、成分、又はステップを指すものとして解釈されるべきであり、言及される要素、成分、又はステップは、明示的に言及されていない他の要素、成分、又はステップと存在、又は利用、又は組み合わせ可能であることを示唆する。明細書及び特許請求の範囲において、A、B、C、....及びNから成る群より選択される何かの少なくとも1つを指す場合、文章は、AN又はBNなどではなく、群から1つの要素のみが必要とされるものとして解釈されるべきである。00175更なる実施形態では、まだ開発されていない任意の分子生物学的技術において、そうした新しい技術が、限定されるものではないがトリプレット遺伝子コード及び特異的な塩基対相互作用などの特性を含む、現在公知の核酸分子の特性に頼るものであるならば、ポリヌクレオチド核酸が用いられ得る。00176本発明は、以下の例を参照することにより、更に容易に理解されるであろう。これらの例は、本発明の特定の態様及び実施形態を単に例示する目的で含まれており、限定として含まれるものではない。実施例I:データソース00177Chin2007上記の乳癌コピー数データを、NCBIGeneExpressionOmnibusGEOから受託番号GPL5737に基づき、GSE8757からの関連するアレイプラットフォームアノテーションと共に入手した。00178プローブアノテーションをBED15フォーマットに変換し、UCSC癌ゲノミクスブラウザUCSCCancerGenomicsBrowserZhu:2009、上記に表示して、続いて分析した。アレイデータをプローブIDによってプローブアノテーションにマッピングした。Naderi2007、上記からの適合する発現データを、EBI社のMIAMIExpressから受託番号E-UCon-1を使用して入手した。Human1AV2についてのプラットフォームアノテーション情報を、Agilent社のウェブサイトから入手した。発現データをプローブレベル中央値で正規化し、プローブIDによってHUGO遺伝子名にマッピングした。00179全てのデータを、全ての試料-プローブ値を含む順位付け手順を用いてノンパラメトリックに正規化し、順位に基づき各遺伝子-試料ペアに符号付きp値を与えた。0.05の最大p値を使用して、有意に変化した遺伝子-試料ペアを決定した。00180TCGAからの膠芽腫データを、AffymetrixU133Aプラットフォームにおいて230個の患者試料及び10個の隣接する正常組織についての遺伝子発現を提供するTCGADataPortalから入手した。患者試料のプローブを、各プローブの正常中央値を減じて正常組織に対して正規化した。加えて、同じ患者集合についてのCBSでセグメント化Olshen:2004上記1618頁されたコピー数データを入手した。両方のデータセットを、乳癌データと同じ手順を用いてノンパラメトリックに正規化した。実施例II:パスウェイ概論00181本発明者らは、米国国立癌研究所パスウェイ相互作用データベースNCIPIDから利用可能なキュレーションされたパスウェイの集合を集めたSchaefer:2009上記。各パスウェイは、内因性及び外因性の細胞以下レベル、細胞レベル、組織レベル、又は生物体レベルのイベント及び表現型を表す高次の生体分子過程の周辺で論理的にグループ化された相互作用の集合を表す。BioPAXレベル2フォーマットのパスウェイをダウンロードした。全てのエンティティ及び相互作用を、RasqalRDFエンジンを使用してSPARQLクエリで抽出した。00182本発明者らは、3つの物理的実態タンパク質コード遺伝子、小分子、及び複合体、遺伝子ファミリー、及び抽象的プロセスを含む5つの異なる種類の生物学的実体エンティティを抽出した。BioPAXタンパク質についての相互参照が異なる遺伝子からのタンパク質を挙げるときは常に、遺伝子ファミリーを作成した。遺伝子ファミリーは、いずれの単一の遺伝子も特定の機能を果たすのに十分である遺伝子の集まりを表す。例えば、冗長な役割を有する相同体、及び互いを機能的に補うことが認められる遺伝子は、ファミリーに組み入れられる。00183抽出により、種々のタイプを説明するアノテーション付きのパスウェイで使用されるあらゆるエンティティ及び相互作用のリストが作られた。本発明者らはまた、アポトーシスなどの、NCIコレクションに存在し得る一般的なプロセスを指す抽象的プロセスも抽出した。例えば、p53腫瘍抑制遺伝子が関与する相互作用を詳述するパスウェイはアポトーシス及び老化へのリンクを含み、それは機械学習による分類のための特徴として利用することができる。00184予想どおり、C2E相関は中程度であったが、活性化相互作用間で、偶然で予想されるものと比べて正の相関に対して顕著な濃縮を有した図3。E2E相関は更に強く、同様に濃縮した。従って、特徴付けしにくい癌のこの例であっても、パスウェイ相互作用の有意なサブセットはゲノム変化を遺伝子発現における調節と連結し、パスウェイレベルの手法が追及するに値するという着想が裏付けられる。実施例III:生物学的パスウェイのモデル化及び予測00185本発明者らは、初めに各NCIパスウェイを個別の確率モデルに変換した。p53アポトーシスパスウェイのごく一部の小例を図2に示す。NCIのパスウェイ図を、隠れ状態及び観測状態の両方を含む因子グラフに変換した。因子グラフは、エンティティ間の既知の相互作用を表す構造により、遺伝子関連及び生物学的プロセス関連の状態情報に関する観測を統合する。00186生物学的パスウェイを因子グラフで表現するために、本発明者らは、特定のmRNA又は複合体などの細胞中のエンティティの状態を変数を用いて記述し、かつこれらのエンティティ間の相互作用及び情報フローを因子を用いて表現する。これらの変数は各エンティティの示差的状態\textit{differential}を、分子エンティティの直接的な濃度ではなく、対照又は正常レベルとの比較で表現する。この表現により、本発明者らは、多くの場合に遺伝子の示差的状態を直接計測するか、又は直接的な計測値を対応する対照との相対的な計測値に変換するかのいずれかであるDNAマイクロアレイによって検出される遺伝子発現などの、多くのハイスループットデータセットをモデル化することが可能になる。また、遺伝子間の多種の調節関係についても可能になる。例えば、p53のMDM2媒介性ユビキチン依存性分解を表す相互作用は、p53タンパク質レベルを阻害する活性化MDM2としてモデル化することができる。00187因子グラフは、各エンティティのランダム変数X={xi,xi,....,xn}と、エンティティを制約して互いの関数として生物学的に意味のある値をとらせるm個の非負関数、すなわち因子の集合とを使用して細胞の状態を符号化する。j番目の因子φjは、エンティティに関する部分集合Xj⊂Xの確率分布を定義する。00188エンティティ及び因子のグラフ全体は、以下のとおりに全エンティティに関する同時確率分布を符号化する:式中、Z=ΠjΣsxjφjSは正規化定数であり、SXは、SがXにおける変数のセッティングであることを表す。00189各エンティティは、対照レベル例えば、正常組織で計測されるとおりのと比べて活性化、基準どおり、又は不活性化に対応する3つの状態のうちの1つをとることができ、それぞれ1、0、又は-1として符号化され得る。状態は、エンティティの種類例えば、遺伝子、タンパク質等に応じて様々に解釈され得る。例えば、活性化されたmRNAエンティティは過剰発現を表す一方、活性化されたゲノムコピーエンティティはゲノムに3コピー以上が存在することを表す。00190図2は、単一のタンパク質コード遺伝子についての因子グラフの概念モデルを示している。パスウェイ中の各タンパク質コード遺伝子Gについて、エンティティを導入することによりゲノムのコピー数GDNA、mRNA発現GmRNA、タンパク質レベルGprotein、及びタンパク質活性Gprotein図2でDNA、mRNA、タンパク質、及び活性と表示された楕円を表現する。パスウェイの全ての化合物、タンパク質複合体、遺伝子ファミリー、及び抽象的プロセスに、本発明者らは分子タイプが活性の単一変数を含める。00191図2の例は1つのプロセスアポトーシスのみを示すが、実際には多くのパスウェイは、遺伝子活性の出力例えば、アポトーシス及び老化から入力例えば、DNA損傷に至る全てを表現するこのような複数のプロセスを有する。00192因子の構成を単純にするため、本発明者らは初めにパスウェイを有向グラフに変換し、そのグラフの各エッジに正又は負のいずれかの影響のラベルを付与する。第一に、本発明者らは全てのタンパク質コード遺伝子Gについて、GDNAからGmRNAに、GmRNAからGproteinに、及びGproteinからGproteinにラベル正を有するエッジを加え、そのコピー数からその活性化形態のタンパク質産物の存在に至る遺伝子の発現を反映する。パスウェイ中の全ての相互作用は、有向グラフの単一のエッジに変換される。00193この有向グラフを使用して、次に本発明者らは、因子グラフを特定する因子のリストを作成する。全ての変数xiについて、本発明者らは単一の因子φXiを加え、式中、Xi={xi}∪{Parents}xi}、及びParentsxiは有向グラフにおけるxiの全ての親を指す。全ての値のセッティングに対する因子の値は、xiがParentsxiのセッティングによるその期待値に一致するかどうかに依存する。00194この研究について、期待値は親変数の過半数の票に設定される。親が正のエッジにより連結される場合、それは、因子の値に対してそれ自体の状態の1倍の票に寄与する。逆に、親が負のエッジにより連結される場合、その変数はそれ自体の状態の-1倍を投票する。最小のラベルが付されたエッジによってxiに連結される変数は、単一の票を獲得し、その票の値はこれらの変数の最小値であり、AND状の連結をもたらす。同様に、最大のラベルが付されたエッジによってxiに連結される変数は、単一の票を獲得し、その票の値はこれらの変数の最大値であり、OR状の連結をもたらす。ゼロの票は棄権票として取り扱う。投票がない場合、期待される状態はゼロである。そうでない場合、過半数の票が期待される状態であり、かつ1と-1とが同点であると、抑制因子及び欠失により重点が置かれて-1の期待される状態となる。期待される状態のこの定義を考慮して、φixi,Parentsxiは以下のとおり特定される:00195ここに示す結果について、εは0.001に設定したが、イプシロンの選択における桁の差異は結果に有意な影響を及ぼさなかった。最後に、本発明者らは因子グラフに観測変数及び因子を加えて、パスウェイ及び多次元機能的ゲノミクスデータの統合を完了する図2。離散化した機能的ゲノミクスデータセットの各々は、タンパク質コード遺伝子の分子タイプの1つに関連付けられる。00196コピー数変化のアレイCGH/SNP推定はゲノム型に関連付けられる。遺伝子発現データはmRNA型に関連付けられる。ここでの結果に提示しないが、将来の拡張には、mRNA型のDNAメチル化データ、並びにタンパク質型及び活性型のプロテオミクス及び遺伝子リシーケンシングのデータが含まれる。各観測変数はまた3つ組の値である。次に記載するとおり、各観測データ型に関連付けられる因子は全エンティティ間で共有され、データから学習される。実施例IV:推論及びパラメータ推定00197割り当ての集合D={x1=s1,x2=s2,x2,....,xk=sk}は、添え字1~kが付与された観測変数に関する患者のデータの完全集合を表すとする。{SDX}は、Dにおける割り当てと一致する変数Xの集合のあらゆる可能な割り当ての集合を表すとする;すなわち隠れ変数は変化し得るが、任意の観測変数x1はDにおけるその割り当てに固定される。00198患者データを考慮して、本発明者らは、特定の隠れエンティティx1が状態aであり得るかどうか、例えば、どの程度TP53のタンパク質活性が-1不活性化であり得るか、又はアポトーシスが1活性化であり得るかを推定しようとする。これを行うには、本発明者らは患者のデータを観測する前にイベントの事前確率を計算しなければならない。Aiaが単集合の割り当て集合{x1=a}を表し、かつφが完全に規定された因子グラフである場合、この事前確率は:であり、式中、Zは方程式1に導入された正規化定数である。同様に、患者の全ての観測と共にx1が状態aである確率は:である。00199本発明者らは、パスウェイの大部分にHUGIN最新版によるジャンクションツリー推論アルゴリズムを使用した。患者当たりの推論が3秒間より長くかかるパスウェイについては、本発明者らは、逐次更新、収束許容値109、及び最大反復10,000回で信念伝搬法を使用する。全ての推論は、対数領域に対するものとしての実領域で実施し、libDAIMooij:2009上記で実施した。00200観測因子のパラメータの学習に、本発明者らは期待値最大化EMアルゴリズムDempster1977上記を用いる。簡潔に言えば、EMは、隠れ変数の確率を推論することと、隠れ変数の確率を所与とする尤度を最大化するようにパラメータを変更することとを反復して行うことにより、隠れ変数を含むモデルのパラメータを学習する。本発明者らはコードを書いてlibDAIに提供し、EMを実行した。各パスウェイについて、本発明者らは患者毎の因子グラフを作成し、患者データを適用し、かつ尤度の変化が0.1未満になるまでEMを実行した。本発明者らは各パスウェイから学習したパラメータを平均化し、次にこれらのパラメータを使用して、各変数についての最終的な事後信念を計算した。00201推論後、本発明者らは活性分子タイプを有する各変数について統合パスウェイ活性を出力した。本発明者らは方程式2及び3からの数量を使用して、エンティティiの活性が上昇uo又は低下するという本発明者らの信念が患者データによって増加する程度を反映する対数尤度比を計算した:00202次に、本発明者らは、として、対数尤度比に基づき遺伝子iについての単一の統合パスウェイ活性IPAを計算した。00203直感的には、IPAスコアは、対数尤度比Lの符号付きの類似形を反映する。00204遺伝子が活性化される可能性が高い場合、IPAはLに設定される。或いは、遺伝子が不活性化される可能性が高い場合、IPAは対数尤度比の負値に設定される。遺伝子が変わらない可能性が最も高い場合、IPAはゼロに設定される。各パスウェイは、他のパスウェイとは独立して分析される。従って遺伝子は、1つの遺伝子がそれが現れる各パスウェイへと、複数の推論に関連付けられることができる。同じ遺伝子についての推論が異なることは、遺伝子のパスウェイ文脈に応じた代替的なデータ解釈と見ることができる。実施例V:有意性評価00205本発明者らは、データの2つの異なる順列によりIPAスコアの有意性を評価する。within順列について、初めにランダムな実サンプルを選択し、次に同じパスウェイ内からランダムな遺伝子を選択することによって、新しいデータタプルすなわち対応した遺伝子発現及び遺伝子コピー数の選択を、パスウェイの各遺伝子についてタプルが選択されるまで行うことにより、順列化したデータサンプルを作成する。any順列も手順は同じであるが、ランダムな遺伝子を選択するステップは、ゲノムのどこからでも遺伝子を選択し得る。両方の順列タイプについて、1,000個の順列サンプルが作成され、順列化サンプル毎に摂動スコアが計算される。順列化サンプルからの摂動スコアの分布をヌル分布として用いて、真の試料の有意性を推定する。実施例VI:シグナル伝達パスウェイ影響解析SPIA00206Tarca2009,上記によるシグナル伝達パスウェイ影響解析SPIAをCで実行して実行時間を低減し、本発明者らの解析環境に適合するものとした。本発明者らはまた、より詳細な出力を提供する能力も追加して、SPIA出力とPARADIGM出力とを直接比較できるようにした。本発明者らのSPIAバージョンは、パスウェイのエンティティ毎に累積摂動及び摂動係数を出力することができる。このコードは要求に応じて利用可能である。実施例VII:デコイパスウェイ00207各癌データセットについてデコイパスウェイ集合を作成した。各NCIパスウェイを使用してデコイパスウェイを作成し、これは同じ構造から成るが、パスウェイのあらゆる遺伝子はRefGene社のランダム遺伝子に置換した。全ての複合体及び抽象的プロセスは同じままとし、PARADIGM及びSPIAの両方についての有意性分析を実パスウェイ及びデコイパスウェイの両方を含むパスウェイの集合に対して実行した。パスウェイは各方法内で順位付けし、全パスウェイに対する実パスウェイの割合を計算して視覚化した。実施例VIII:クラスタリング及びカプランマイヤー分析00208重心連結による非中心化相関階層的クラスタリングを、Eisen1998上記1621頁の方法を用いて膠芽腫データに対して実行した。75例の患者試料間で少なくとも0.25のシグナルを有するIPAのみをクラスタリングに使用した。目視検査により4つの明らかなクラスターが現れ、それをカプランマイヤー分析に使用した。Rを使用してカプランマイヤー曲線を計算し、ログランク統計によってp値を求めた。実施例IX:PARADIGMの検証00209EM訓練手順の質を評価するため、本発明者らは遺伝子発現とコピー数とのタプルE,Cが遺伝子及び患者にわたって順列化されているヌルデータセットと比べた実際の患者データを使用して、EMの収束を比較した。予想どおり、PARADIGMは、真のデータセットではヌルデータセットと比べてはるかに急速に収束した。例として、本発明者らは遺伝子AKT1についてのIPAをEM反復の関数としてプロットした図4。活性が最初の数回の反復で急速に収束することが分かる。EMは実際の患者データで訓練したとき活性化レベルに急速に収束したが、一方、ランダムデータを入れたときは活性不変に収束した。この収束により、パスウェイ構造及び推論は、統合された患者データにおける活性パターンを成功裏に特定可能であることが示唆される。00210本発明者らは次に、乳癌及びGBMの両方のコホートに対してPARADIGMを実行した。本発明者らは統計的シミュレーション手順を開発し、負の分布から予想され得るものと比べてどのIPAが有意に異なるかを決定した。本発明者らは負の分布をパスウェイにおける全ての患者間及び遺伝子間で順列化することにより作成した。経験的に、本発明者らは、各遺伝子がネットワークにより決定される異なるトポロジー的文脈を有するという事実の補正を促進するには、パスウェイの遺伝子間のみでの順列化が必要であることが分かった。乳癌データセットでは、56,172個のIPA全体の7が、対応する陰性対照と比べて有意に高い又は低いことが分かった。平均して、NCIパスウェイは患者当たり497個の有意なエンティティを有し、127個中103個のパスウェイは20以上の患者で変化した少なくとも1つのエンティティを有した。GBMデータセットでは、141,682個のIPA全体の9が、対応する陰性対照と比べて有意に高い又は低いことが分かった。平均して、NCIパスウェイは患者当たり616個の有意なエンティティを有し、127個中110個のパスウェイは20以上の患者で変化した少なくとも1つのエンティティを有した。00211別のコントロールとして、本発明者らは、NCIパスウェイの遺伝子と同じように連結される任意の遺伝子から統合活性を得ることができるかという問いを立てた。これを行うため、本発明者らは偽発見率を推定し、それをSPIATarca:2009上記と比較した。多くの遺伝的ネットワークが癌に関係していることが分かっているため、本発明者らは陰性対照集合として模擬デコイパスウェイを使用することを選択した。各NCIパスウェイについて、本発明者らはNCIパスウェイと同じネットワーク構造を使用してゲノム中のランダム遺伝子を互いに連結することにより、デコイパスウェイを作成した。00212次に本発明者らはPARADIGM及びSPIAを実行して、NCIパスウェイ及びデコイパスウェイの両方のIPAを導き出した。PARADIGMについては、本発明者らはパスウェイサイズで正規化した後に患者間で有意であることが分かったIPAの数により、各パスウェイを順位付けした。SPIAについては、パスウェイは、それらの計算された影響係数に従い順位付けした。本発明者らは、PARADIGMはSPIAと比べて最上位の活性化パスウェイからより多くのデコイパスウェイを除外することを見出した図5。例えば乳癌では、PARADIGMは、上位10に1個、上位30に2個、及び上位50に4個のデコイを順位付けする。それに対してSPIAは、上位10に3個、上位30に12個、及び上位50に22個のデコイを順位付けする。NCIIPAの順位の全体的な分布は、順位の累積分布をプロットすることで観察すると、SPIAよりもPARADIGMの方が高いP<0.009、K-S検定。実施例X:乳癌及びGBMにおける上位PARADIGMパスウェイ00213本発明者らは、NCIパスウェイを本発明者らの順列解析により検出されたエンティティ当たりのその有意なIPAの平均数に従い並べ替え、乳癌表1及びGBM表2における上位15を計算した。00214上位15のうちのいくつかのパスウェイは、既にそのそれぞれの癌に関連付けられている。乳癌では、SPIA及びPARADIGMの両方が、エストロゲン関連パスウェイ及びErbB2関連パスウェイを検出することができた。最近の主なメタ分析研究ではWirapatiP,SotiriouC,KunkelS,FarmerP,PradervandS,Haibe-KainsB,DesmedtC,IgnatiadisM,SengstagT,SchutzF,GoldsteinDR,PiccartM,DelorenziM.Meta-analysisofgeneexpressionprofilesinbreastcancer:towardaunifiedunderstandingofbreastcancersubtypingandprognosissignatures.BreastCancerRes.2008;104:R65、Wirapetiらは、エストロゲン受容体及びErbB2の状態が、乳癌における僅か3つの主要な予後診断サインのうちの2つであることを見出した。PARADIGMはまた、AKT1関連PI3Kシグナル伝達パスウェイを、いくつかの試料において有意なIPAを有する最上位のパスウェイとして特定することができた図6を参照のこと。00215抗アポトーシスAKT1セリン-スレオニンキナーゼは乳癌に関与することが知られており、ERBB2パスウェイと相互作用するJuX,KatiyarS,WangC,LiuM,JiaoX,LiS,ZhouJ,TurnerJ,LisantiMP,RussellRG,MuellerSC,OjeifoJ,ChenWS,HayN,PestellRG.Akt1governsbreastcancerprogressioninvivo.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2007May;10418:7438-7443。GBMでは、FOXM1及びHIF-1-αの両方の転写因子ネットワークが広範に研究されており、高悪性度の膠芽腫においては悪性度の低い神経膠腫と比べて過剰発現することが示されているLiuM,DaiB,KangS,BanK,HuangF,LangFF,AldapeKD,XieT,PelloskiCE,XieK,SawayaR,HuangS.FoxM1Bisoverexpressedinhumanglioblastomasandcriticallyregulatesthetumorigenicityofgliomacells.CancerRes.2006Apr.;667:3593-3602;SemenzaGL.HIF-1andhumandisease:onehighlyinvolvedfactor.GenesDev.2000Aug.;1416:1983-1991。実施例XI:データセットの視覚化00216PARADIGM推論の結果を視覚化するため、本発明者らは、パスウェイにおける各遺伝子周りを中心として複数のデータセットを表示するためのCircleMap視覚化を開発した図7。この表示では、遺伝子周りに同心円状の輪をプロットすることにより、各遺伝子がコホート間のその全てのデータと関連付けられ、各輪は、単一の種類の計測値又は計算推論に対応する。輪の中の各度数刻みは単一の患者試料に対応し、一方で色は活性化レベル赤色、不活性化レベル青色、又は不変化レベル白色の活性に対応する。本発明者らはErbB2パスウェイのサブセットについてCircleMapをプロットし、乳癌コホートからのER状態、IPA、発現、及びコピー数データを含めた。00217遺伝子発現データは、様々な癌の分子サブタイプを定義することに成功している。癌サブタイプは、薬物感受性及び全生存などの種々の臨床転帰と相関することが分かっている。本発明者らは、GBMについて、生の発現データではなくPARADIGMIPAを使用して有益な情報を提供するサブタイプを同定できるかという問いを立てた。IPAを使用することの利点は、IPAが、コピー数、発現、及び遺伝子間の既知の相互作用における要約を提供し、従って意味のある患者サブグループを明らかにするためのよりロバストなサインを提供し得ることである。本発明者らは、初めに、GBM試料間で少なくとも中程度に繰り返し活性化した全てのIPAを決定し、1,755個のエンティティが229例中少なくとも75例の試料で0.25のIPAを有したことを見出した。本発明者らはこれらのエンティティの全てのIPAを活性行列に集めた。次に試料及びエンティティを、非中心化ピアソン相関及び重心連結による階層的クラスタリングを用いてクラスター化した図8。00218目視検査から、IPAに基づき4つの明らかなサブタイプが明らかとなり、第4のサブタイプは最初の3つと明らかに異なった。第4のクラスターは、明らかなHIF-1-α転写因子ネットワークの下方制御並びにE2F転写因子ネットワークの過剰発現を示す。HIF-1-αは、低酸素状態への応答の調節に関与する主転写因子である。対照的に、最初の3つのクラスターのうちの2つは、EGFRサインが高く、かつGATAインターロイキン転写カスケードを含む不活性MAPキナーゼカスケードを有する。興味深いことに、EGFRの突然変異及び増幅は高悪性度の神経膠腫並びに膠芽腫と関連付けられているKuanCT,WikstrandCJ,BignerDD.EGFmutantreceptorvIIIasamoleculartargetincancertherapy.Endocr.Relat.Cancer2001Jun.;82:83-96。増幅及び特定の突然変異により、二量体の自己刺激又はリガンド非依存性の活性化のいずれかを介して構成的に活性なEGFRが生じ得る。EGFRが構成的に活性化すると、腫瘍形成及び固形腫瘍の進行が促進され得る。EGFRを標的化することが公知の分子であるゲフィチニブは、現在、他のEGFR駆動の癌におけるその効力について調査されている。従って、定性的にはクラスターは患者を層別化し得る生物学的に有意義な論題に焦点を合わせているように思われる。00219これらの観測を定量化するため、本発明者らは、PARADIGMにより同定される種々のGBMサブタイプが種々の生存プロファイルと一致するかという問いを立てた。本発明者らは、4つのクラスターの各々について、初回診断後の月数に対して生存患者の割合をプロットすることにより、カプランマイヤー曲線を計算した。本発明者らは4つのクラスターの各々についてカプランマイヤー生存曲線をプロットし、個別的なIPAサインと関連付けられる任意のクラスターが生存転帰を予測するかどうかを確かめた図9。第4のクラスターは他のクラスターと大きく異なるP<2.11×105;コックス比例ハザード検定。最初の3つのクラスターの患者の半数は18ヶ月を超えて生存する;クラスター4の患者について生存は有意に増加し、半数が30ヶ月超生存する。加えて、20~40ヶ月の範囲にわたり、クラスター4の患者は他のクラスターの患者の2倍生存する可能性が高い。実施例XII:クラスターについてのカプランマイヤー生存プロット00220生存分析から、クラスター4の患者は有意により良好な生存プロファイルを有することが明らかとなった。クラスター4は、網膜芽細胞腫抑制因子と共に作用するE2Fの上方制御を有することが分かった。従ってE2Fの上方制御は、クラスター4の患者からの腫瘍試料における細胞周期進行の能動的抑制と整合する。加えて、クラスター4はHIF-1-α転写因子の不活性と関連付けられた。第4のクラスターにおける不活性は、腫瘍がより酸素化されていて、それらがより小さい、又はより新しい腫瘍であり得ることを示唆するマーカーとなり得る。従って、PARADIGMIPAは、顕著に異なる生存転帰を有するサブタイプを描出するのに意味のあるプロファイル集合を提供する。00221比較のため、本発明者らはまた、発現データ又はCNAデータのみを用いた患者のクラスタリングにより、患者サブタイプを導き出すことを試みた。これらのデータソースのいずれを用いたクラスタリングからも明らかな群は見出されず、このデータセットの元のTCGA解析における知見と一致したTCGA:2008図14を参照のこと。これは、遺伝子間の相互作用及び結果的に生じる個々の遺伝子発現の組み合わせ出力は、患者転帰としてのこのような複雑な表現型のより優れた予測因子を提供し得ることを示唆している。実施例XIII:卵巣癌の統合ゲノム解析:試料及び臨床データ。00222この報告では、489個の臨床的にアノテートされたステージII-IVのHGS-OvCa及び対応する正常なDNAの解析を取り上げている。患者は、HGS-OvCaと診断された個体の診断時の年齢、病期、腫瘍悪性度、及び手術転帰を反映した。臨床データは2010年8月25日現在のものであった。HGS-OvCa標本は全身的治療の前に外科的に切除され、但し全ての患者は白金剤の投与を受け、及び94がタキサンの投与を受けた。このコホートの無進行生存及び全生存の中央値は、既に公表されている治験11、12と同様である。患者の25は無病のままであり、及び45は最終経過観察時に生存していた一方、31は白金ベース療法の完了後6ヶ月以内に進行した。中央値の追跡は30ヶ月であった範囲0~179。TCGA解析用の試料は、70超の腫瘍細胞核、かつ20未満の壊死を有するよう選択した。00223独立した部位に複数の分子アッセイを用いる協調分子解析を、表4に記載のとおりデータはhttp://tcga.cancer.gov/dataportalで入手可能二階層で実施した。階層1のデータセットは公開されているが、階層2のデータセットは個人を特定し得る臨床情報又はゲノム情報を含むため、http://tcga.cancer.gov/dataportal/data/access/closed/に記載されるとおり資格を必要とする。実施例XIV:突然変異解析。00224316個のHGS-OvCa試料から単離したDNA及び各個体に対応する正常試料に対し、エキソームキャプチャー及びシーケンシングを実施した。キャプチャー試薬は、合計約33メガベースの非冗長配列の約18,500個の遺伝子から約180,000個のエクソンを標的化した。Illumina社のGAIIxプラットフォーム236試料ペア又はABI社のSOLiD3プラットフォーム80試料ペアでの超並列シーケンシングにより、試料当たり約14ギガベース合計約9×109塩基が得られた。平均して、コード塩基の76が腫瘍及び対応する正常試料の両方において十分な深さで網羅され、確信的な突然変異検出が可能となった。19,356個の体細胞突然変異腫瘍当たり約61個をアノテートし、表4に分類した。HGSOvCa病態生理学において重要であり得る突然変異を、aバックグラウンドと比べて有意に増加した頻度で存在する非同義変異又はスプライス部位変異を探し出し、bこの研究の突然変異をCOSMIC及びOMIMの突然変異と比較し、かつcタンパク質機能に対する影響を予測することにより、同定した。002252つの異なるアルゴリズムにより、非同義変異又はスプライス部位変異の数が突然変異分布モデルに基づき予想される数を有意に上回った9個の遺伝子が同定された表5。公表されている結果13と一致して、TP53は316個中303個の試料において突然変異し283個は自動化された方法により、かつ20個は手動検査後、BRCA1及びBRCA2は、それぞれ9及び8のケースで生殖細胞系列突然変異を有し、両方とも更に3のケースで体細胞突然変異を示した。6つの他の統計的に繰り返し突然変異した遺伝子が同定された;RB1、NF1、FAT3、CSMD3、GABRA6、及びCDK12。CDK12はRNAスプライシング調節に関与するもので14、これまでに肺及び大腸の腫瘍に関係付けられた15、16。9個のCDK12突然変異のうちの5個はナンセンス又はインデルのいずれかであったことから、潜在的な機能喪失が示唆され、一方4個のミスセンス突然変異R882L、Y901C、K975E、及びL996Fはそのプロテインキナーゼドメインにおいてクラスター化された。GABRA6及びFAT3は、両方とも有意に突然変異したと見られたが、HGS-OvCa又は卵管組織では発現しないようであったため、これらの遺伝子の突然変異がHGS-OvCaにおいて有意な役割を果たす可能性は低い。00226本研究による突然変異をCOSMIC17及びOMIM18のデータベースの突然変異と比較して、一般的にそれほど突然変異しない更なるHGS-OvCa遺伝子を同定した。これにより、BRAFN581S、PIK3CAE545K及びH1047R、KRASG12D、及びNRASQ61Rにおける突然変異を含め、それぞれ477個及び211個のマッチが得られた。これらの突然変異は形質転換活性を呈することが示されているため、本発明者らは、これらの突然変異はまれであるものの、HGS-OvCaにおける重要なドライバーであると考える。00227本発明者らは、タンパク質ファミリー及び全脊椎動物ゲノムの配列アラインメントからの進化情報と、予測される局所的なタンパク質構造と、選択されるヒトSwissProtタンパク質特徴とを組み合わせることにより、既知の癌遺伝子及び腫瘍抑制因子における突然変異に関する訓練後に、CHASMを使用して推定ドライバー突然変異を同定した19、20。CHASMにより、腫瘍形成性を有すると予測される122個のミスセンス突然変異が同定された。タンパク質機能における突然変異により駆動される変化を、MutationAssessorを使用してタンパク質ファミリー配列アラインメント及び既知の又は相同性に基づく三次元タンパク質構造における残基配置を比較することによって、全ての確認済みの体細胞ミスセンス突然変異についての進化情報から推測した。ミスセンス突然変異の27パーセントはタンパク質機能に影響を与えると予測された。実施例XV:コピー数解析。00228489個のHGS-OvCaゲノムに存在する体細胞性コピー数変化SCNAを同定し、図37Aにおいて多形膠芽腫glioblastomemultiformeデータと比較した。SCNAは、広範な染色体領域に影響を及ぼす領域性異常と、より小さい限局性異常とに分けた。領域性異常の統計的解析により8個の繰り返し起こる獲得及び22個の喪失が同定され、その全てが既に報告されている22図37B。獲得のうち5個及び喪失のうち18個は、50超の腫瘍で起こった。00229GISTICを使用して、繰り返し起こる限局性SCNAを同定した。これにより、8個以下の遺伝子をコードする26領域を含む63領域の限局性増幅図37Cが得られた。最も一般的な限局性増幅はCCNE1、MYC、及びMECOMをコードし図37C、各々20超の腫瘍で高度に増幅された。HGS-OvCaにおける新たな極めて限局化された増幅ピークは、活性化Cキナーゼ受容体のZMYND8;p53標的遺伝子のIRF2BP2;DNA結合タンパク質阻害薬のID4;胚発生遺伝子のPAX8;及びテロメラーゼ触媒サブユニットのTERTをコードした。3つのデータソース:http://www.ingenuity.com/、http://clinicaltrials.gov及びhttp://www.drugbank.caを使用して、増幅された過剰発現遺伝子の潜在的治療阻害因子を同定した。この調査により、少なくとも10のケースで増幅されたMECOM、MAPK1、CCNE1及びKRASを含め、治療標的である22個の遺伝子が同定された。00230GISTICにより50個の限局的な欠失も同定された。腫瘍の少なくとも2において、既知の腫瘍抑制遺伝子であるPTEN、RB1、及びNF1はホモ接合性欠失領域にあった。重要なことには、RB1及びNF1はまた有意に変異した遺伝子の中にもあった。1つの欠失は、5個の非同義変異及び2個のフレームシフト突然変異を有する必須細胞周期制御遺伝子のCREBBPを含め、3つの遺伝子のみを含んだ。実施例XVI:mRNA及びmiRNAの発現並びにDNAメチル化解析。002313つの異なるプラットフォームAgilent社、Affymetrix社のHuEx、Affymetrix社のU133Aからの11,864個の遺伝子についての発現計測値を、サブタイプを同定かつ転帰を予測するために組み合わせた。個々のプラットフォーム計測値は、限定的な、しかし統計的に有意なバッチ効果を受けたが、一方、組み合わせたデータセットはそれを受けなかった。組み合わせたデータセットの解析から約1,500個の本質的に変化し易い遺伝子が同定され、それらをNMFコンセンサスクラスタリングに使用した。この解析により4つのクラスターが得られた図38a。同じ解析手法をTothillらの公的に利用可能なデータセットに適用し、同様に4つのクラスターを得た。TothillのクラスターとTCGAクラスターとの比較により、明らかな相関が示された。従って本発明者らは、HGS-OvCaには少なくとも4つのロバストな発現サブタイプが存在すると結論付ける。00232本発明者らは、その4つのHGS-OvCaサブタイプを、クラスターに含まれる遺伝子及び先行する観測25に基づき、免疫反応型、分化型、増殖型及び間葉型と名付けた。T細胞ケモカインリガンドのCXCL11及びCXCL10、並びに受容体のCXCR3は、免疫反応型サブタイプを特徴付けた。HMGA2及びSOX11などの転写因子の高発現、卵巣腫瘍マーカーMUC1、MUC16の低発現並びにMCM2及びPCNAなどの増殖マーカーの高発現は、増殖型サブタイプを定義した。分化型サブタイプはMUC16及びMUC1の高発現並びに分泌性卵管マーカーのSLPIの発現と関連付けられ、より成熟した発達段階が示唆された。HOX遺伝子の高発現並びに筋線維芽細胞FAP及び微小血管周皮細胞ANGPTL2、ANGPTL1などの間質成分の増加を示唆するマーカーが、間葉型サブタイプを特徴付けた。00233DNAメチル化の上昇及び腫瘍発現の低下により、168個の遺伝子は、卵管対照と比較してHGS-OvCaにおいて後成的にサイレンシングされたものとして関係付けられた26。DNAメチル化は全試料にわたり遺伝子発現の低下と相関した。AMT、CCL21及びSPARCL1は、大多数の腫瘍でプロモーター過剰メチル化を示したため、注目に値した。奇妙にも、卵巣癌で増幅及び過剰発現することが以前に報告されているRAB25もまた、腫瘍のサブセットにおいて後成的にサイレンシングされるようであった。BRCA1プロモーターは、既に報告されているとおり、489個中56個11.5の腫瘍で過剰メチル化及びサイレンシングされた。腫瘍間での様々なDNAメチル化のコンセンサスクラスタリングにより、年齢、BRCA不活性化イベント、及び生存における差異と有意に関連付けられた4つのサブタイプが同定された。しかしながら、これらのクラスターは中程度の安定性しか示さなかった。00234TCGAデータセットにおける転写サブタイプについて、生存期間に有意な差異はなかった。増殖型群はMYC増幅及びRB1欠失の速度低下を示したのに対し、免疫反応型サブタイプは3q26.2MECOM増幅頻度の増加を示した。DNAメチル化クラスターと遺伝子発現サブタイプとの間の中程度の、しかし有意な重複が指摘されたp<2.21016、カイ二乗検定、調整ランド指数=0.07。00235215個の試料からの統合した発現データセットを用いて、全生存を予測し得る193個の遺伝子の転写サインを定義した。一変量コックス回帰分析の後、108個の遺伝子は不良な生存率と相関し、かつ85個は良好な生存率と相関した0.01のp値カットオフ。独立した255個のTCGA試料の集合並びに3個の独立した発現データセットにおいて予測力を検証した25、29、30。検証試料の各々に、その発現プロファイルと予後診断遺伝子サインとの間の類似性を反映して、予後診断遺伝子スコアを割り当てた31図38c。このサインのカプランマイヤー生存分析から、全ての検証データセットにおいて生存率との統計的に有意な関連性が示された図38d。00236miRNA発現データのNMFコンセンサスクラスタリングにより、3つのサブタイプが同定された。興味深いことに、miRNAサブタイプ1はmRNA増殖型サブタイプと重複し、かつmiRNAサブタイプ2はmRNA間葉性サブタイプと重複した図38d。生存期間はiRNAサブタイプ間で有意に異なり、miRNAサブタイプ1腫瘍の患者の生存は有意に長かった図38e。実施例XVII:疾患に影響するパスウェイ。00237いくつかの分析により、316例の完全に解析されたケースからのデータが統合され、HGS-OvCaに寄与する生物学が特定された。既知の癌関連パスウェイが1つ以上の突然変異、コピー数変化、又は遺伝子発現変化を含む頻度の解析から、RB1パスウェイ及びPI3K/RASパスウェイがそれぞれ67及び45のケースで調節解除されたことが示された図39A。HotNet33を使用して大規模タンパク質間相互作用ネットワーク32において変化したサブネットワークを調べることで、HGS-OvCa試料の23で変化したNotchシグナル伝達パスウェイを含め、いくつかの既知のパスウェイが同定された図39B。00238公表された研究では、突然変異した若しくはメチル化したBRCA1又は突然変異したBRCA2を含む細胞は相同組換えHR欠陥を有し、PARP阻害薬に高度な応答性を有することが示されている35~37。図39Cは、HGS-OvCaの20がBRCA1/2に生殖細胞系列突然変異又は体細胞突然変異を有し、11がDNA過剰メチル化によってBRCA1発現を失っており、かつBRCA1の後成的サイレンシングはBRCA1/2突然変異と相互排他的であるP=4.4×104、フィッシャーの直接確率検定ことを示している。BRCA状態の一変量生存分析から図39C、BRCA突然変異ケースはBRCA野生型ケースと比べて全生存OSがより良好であることが示された。興味深いことに、後成的にサイレンシングしたBRCA1ケースは、BRCA1/2WTHGS-OvCaと同様の生存を示したOS中央値41.5ヶ月対41.9ヶ月、P=0.69、ログランク検定。これは、BRCA1が相互排他的なゲノム機構及びエピゲノム機構により不活性化されること、及び患者生存が不活性化機構に依存することを示唆している。この研究で見出された、細胞をPARP阻害薬に対して感受性にし得る他のHR遺伝子におけるゲノム変化としては、EMSYの増幅又は突然変異8、PTENの限局的な欠失又は突然変異7;RAD51Cの過剰メチル化3、ATM/ATRの突然変異2、及びファンコニ貧血遺伝子の突然変異5が挙げられる。概して、HR欠陥はHGS-OvCaの約半数に存在し得るもので、腫瘍これらのHR関連異常を標的化するPARP阻害薬の臨床試験に対する理論的根拠を提供する。00239BRCA不活性化イベントの完全集合を全ての繰り返し変化したコピー数ピークと比較することにより、BRCA不活性化のケースにおいて予想外に低いCCNE1の増幅頻度が明らかとなったBRCA野生型ケースの26と比べて、BRCAが変化したケースの8はCCNE1増幅を有した、FDR調整P=0.0048。既に報告されているとおり39、全生存はCCNE1増幅を有する患者について、他の全てのケースと比較して短くなる傾向があったP=0.072、ログランク検定。しかしながら、BRCA野生型のケースのみを調べたとき、CCNE1が増幅したケースについての生存上の不利は見られなかったためP=0.24、ログランク検定、既に報告されているCCNE1の生存の差異は、BRCAが突然変異したケースのより良好な生存により説明され得ることが示唆される。00240最後に、確率的グラフィカルモデルPARADIGM40により、NCIパスウェイ相互作用データベースにおける変化したパスウェイを調べ、FOXM1転写因子ネットワーク図39Dを87のケースで有意に変化したものとして同定した。FOXM1及びその増殖関連標的遺伝子;AURB、CCNB1、BIRC5、CDC25、及びPLK1は、一貫して過剰発現したが、転写調節の指標となるDNAコピー数変化によっては変化しなかった。TP53はDNA損傷後にFOXM1を抑制することから42、HGS-OvCaにおける高率のTP53突然変異はFOXM1の過剰発現に寄与することが示唆される。他のデータセットにおいて、FOXM1パスウェイは隣接上皮組織と比べて腫瘍で有意に活性化され、HGS-OvCaと関連付けられる。実施例XVIII:卵巣漿液性癌において高頻度で変化したパスウェイ00241コピー数及び遺伝子発現の両方の統合解析によって有意に変化したパスウェイを同定するため、本発明者らはPARADIGMを適用した。この計算モデルはコピー数変化、遺伝子発現データ、及びパスウェイ構造を組み込み、パスウェイデータベースに存在する全ての遺伝子、複合体、及び遺伝的プロセスについて統合パスウェイ活性IPAを生成する。本発明者らは用語エンティティを、それが遺伝子か、複合体か、又は小分子かを問わず、パスウェイにおける任意の分子を指して使用する。エンティティのIPAは、最終活性のみを指す。遺伝子について、IPAはタンパク質の活性状態の推論された活性のみを指し、これは、パスウェイにおける他の遺伝子のコピー数、遺伝子発現、及びシグナル伝達から推論される。本発明者らはPARADIGMを卵巣試料に適用し、米国国立癌研究所のパスウェイ相互作用データベースNCI-PIDに含まれるパスウェイに存在する多くの異なる遺伝子及びプロセスの変化を見出した。本発明者らは1000回のランダムシミュレーションを用いて推論された変化の有意性を評価し、これらのシミュレーションでは、同じ構造を有するパスウェイが使用されるが、パスウェイの種々の点に任意の遺伝子が割り当てられた。換言すれば、所定のパスウェイのあるランダムシミュレーションでは、相互作用の集合は固定されたままであり、それ故任意の遺伝子集合はパスウェイ相互作用によって互いに連結された。全試料のIPAの有意性は同じヌル分布に対して評価し、各試料におけるエンティティ毎の有意水準を得た。IPA及びそれらが有意である試料の割合及び標準偏差が少なくとも0.1のIPAを、図28にヒートマップとして表示する。00242表3は、PARADIGMにより見出された順列化試料に関して少なくとも3標準偏差だけ変化するパスウェイを示す。FOXM1転写因子ネットワークは、検証した全てのパスウェイの中で最多数の試料において変化した-試料間で平均化したとき67のエンティティが活性の変化を有した。それに対して、卵巣コホートにおいて次に最も高いレベルの活性の変化を有したパスウェイには、PLK1シグナル伝達イベント27、オーロラBシグナル伝達24、及びトロンボキサンA2受容体シグナル伝達20が含まれた。従って、NCI-PIDのパスウェイの中では、卵巣試料に関して、FOXM1ネットワークは他のパスウェイと比べて有意により大きく変化する活性を含む。00243FOXM1転写因子ネットワークは、最も高い割合の患者試料において、正常対照と比較して腫瘍試料において示差的に変化することが分かった図29。FOXM1は、3つの既知の支配的なスプライシング型を有する多機能性転写因子であり、スプライシング型の各々は、細胞増殖及びDNA修復において様々な役割を有する個別的な遺伝子サブセットを調節する。FOXM1cアイソフォームは、AUKB、PLK1、CDC25、及びBIRC5を含めた、細胞増殖において既知の役割を有するいくつかの標的を直接調節する。他方で、FOXM1bアイソフォームは、DNA修復遺伝子BRCA2及びXRCC1を含む完全に異なる遺伝子サブセットを調節する。ATMの間接的制御下にあるCHEK2は、FOXM1発現レベルを直接調節する。00244本発明者らは、FOXM1転写因子自体のIPAは、他の転写因子のIPAよりも高度に変化するかという問いを立てた。本発明者らはFOXM1の活性レベルをNCI-PIDにおける他の203個の転写因子の全てと比較した。NCI集合の他の転写因子と比較しても、FOXM1転写因子は有意に高いレベルの活性を有したp<0.0001;KS検定ことから、それは重要なサインであり得ることが更に示唆される図30。00245FOXM1はまた、上皮起源の多くの異なる正常組織においても発現するため、本発明者らは、PARADIGMにより同定されるサインが、他の組織では正常と見なされ得る上皮サインに起因するかという問いを立てた。これに答えるため、本発明者らは卵管上皮及び卵巣腫瘍組織が顕微解剖されたGEOからの独立したデータセットをダウンロードしGSE10971、遺伝子発現をアッセイした。本発明者らはFOXM1のレベルは正常試料と比較して腫瘍試料において有意に高いことを見出し、それ故実際に癌性組織においては、FOXM1調節は正常上皮組織に見られるものを超えて亢進することが示唆される図31。00247乳癌及び肺癌を含め、多くの異なる癌におけるFOXM1の役割は十分に実証されているが、卵巣癌におけるその役割はいまだ調査されていない。FOXM1は、3つの既知のスプライシング変異型を有する多機能性転写因子であり、スプライシング変異型の各々は、細胞増殖及びDNA修復において様々な役割を有する個別的な遺伝子サブセットを調節する。この分析に関連するFOXM1の相互作用ネットワークの抜粋を図27に示す。FOXM1aアイソフォームは、AUKB、PLK1、CDC25、及びBIRC5を含めた、細胞増殖において既知の役割を有するいくつかの標的を直接調節する。対照的にFOXM1bアイソフォームは、DNA修復遺伝子のBRCA2及びXRCC1を含む完全に異なる遺伝子サブセットを調節する。ATMの間接的な制御下にあるCHEK2は、FOXM1の発現レベルを直接調節する。卵巣患者のほとんどにおけるFOXM1の発現増加に加え、小さいサブセットはまた、CBSにより検出されるコピー数増幅の増加も有する19が、計測したゲノムにおける全遺伝子の上位5分位内のコピー数増加を伴う。従って、FOXM1の選択的スプライシング調節はDNA修復と細胞増殖との間の制御スイッチに関与し得る。しかしながら、個別のアイソフォーム活性を区別することは、アイソフォームを区別するエクソン構造及びエクソンアレイプローブの位置によって困難なため、現時点ではこの主張を裏付けるデータは不十分である。これらの試料のmRNAの将来のハイスループットシーケンシングは、FOXM1アイソフォームの示差的レベルの決定を促進し得る。PARADIGMがこの転写因子に集中した最高レベルの活性変化を検出したという観測から、FOXM1は細胞において重要な調節ポイントにあることが示唆される。実施例XIX:データセット及びパスウェイ相互作用00248コピー数及び発現データの両方をPARADIGM推論に組み込んだ。8個の正常組織対照の集合が発現データにおける解析に利用可能であったため、患者の遺伝子値の各々を、正常な卵管対照で観察される遺伝子の中央値レベルを減じることにより正規化した。コピー数データは、腫瘍で検出された遺伝子レベルと、それに対する血液正常レベルとの間のコピー数の差異を反映するように正規化した。PARADIGMへの入力のために、発現データは、サブタイプ解析に使用したものと同じ統合データセットから取り、コピー数は、MSKCCAgilent社の1Mコピー数データのセグメント化コールから取った。00249131個のパスウェイ、11,563個の相互作用、及び7,204個のエンティティを含むNCI-PIDからパスウェイの集合体を入手した。エンティティは、PARADIGMのグラフィカルモデルにおいてノードとして表現される分子、複合体、小分子、又は抽象概念である。抽象概念は、一般的な細胞プロセスアポトーシス又は光の吸収など、及びシグナルトランスデューサーのRASファミリーなどの機能的活性を共有する遺伝子ファミリーに対応する。本発明者らは、タンパク質間相互作用、転写調節相互作用、リン酸化及びユビキチン化などのタンパク質修飾相互作用を含む相互作用を収集した。実施例XX:パスウェイ文脈における統合分子活性の推論。00250本発明者らは、コピー数、遺伝子発現、及び各エンティティのパスウェイ文脈を反映する統合パスウェイ活性IPAを割り当てるPARADIGMを使用した。00251データの遺伝子特異的及び患者特異的な断面の順列を使用して、IPAの有意性を評価した。ゲノム中の各遺伝子についての遺伝子発現とコピー数とのペアの値を無作為に選択することにより、1000個のヌル患者のデータを作成した。PARADIGMIPAの有意性を評価するため、本発明者らはパスウェイ構造を維持しながらパスウェイにランダム遺伝子を割り当てることにより、ヌル分布を作成した。実施例XXI:FOXM1パスウェイの同定00252FOXM1ネットワーク内の全ての遺伝子を使用してランダムシミュレーションの間に統計的有意性を評価したが、FOXM1パスウェイの視覚化を可能とするため、図29により有意に変化したIPAを有するFOXM1に直接連結されたエンティティを、図27に含めるために選択した。これらのうち、DNA修復及び細胞周期制御において役割を有する遺伝子であって、FOXM1との相互作用について文献の裏付けがあると認められたものを表示した。元のNCI-PIDパスウェイに見出されなかったBRCC複合体メンバーを、NCI-PIDによればFOXM1の標的であるBRCA2と共にプロットに含めた。上流DNA修復標的を、他のNCIパスウェイにおけるCHEK2の上流調節因子を見つけることにより同定した例えば、PLK3シグナル伝達パスウェイにおいてATMからの間接的リンクが見出された。実施例XXII:クラスタリング00253活性及び非活性の確率の変化を直接的に表す推論活性の使用により、様々な種類のエンティティをまとめて1つのヒートマップにクラスター化することが可能となる。PARADIGM推論の結果を包括的に視覚化するため、EisenCluster3.0を使用して特徴フィルタリング及びクラスタリングを実施した。0.1の標準偏差フィルタリングにより7204個中1598個のパスウェイエンティティが残り、エンティティ及び試料の両方に対して平均連結法、非中心化相関階層的クラスターを実施した。実施例XXIII:細胞株は多くの重要な腫瘍のサブタイプ及び特徴をモデル化する。00254臨床的に関連する分子的応答予測因子の同定に対する細胞株の有用性は、腫瘍における応答を決定する多様な分子機構が細胞株内でどの程度機能するかに依存する。本発明者らは、転写物及びゲノムコピー数の両方のレベルでの細胞株モデルと原発腫瘍との間の類似性に関して以前に報告しており9、本発明者らはここでこの比較を、より高分解能のプラットフォーム及び解析技法を用いて改良する。具体的には、本発明者らは遺伝子発現プロファイルの階層的コンセンサスクラスタリングHCCを使用して、50個の乳癌細胞株及び5個の非悪性乳房細胞株を3つの転写サブタイプ:ルミナル、基底細胞及び新しく記載するクローディン低に分類した図14A。これらのサブタイプは先述したものの改良版であり、基底細胞及びクローディン低caludin-lowは、それぞれ先に指定した基底細胞A及び基底細胞Bのサブタイプに対応する、表7。改良版高分解能SNPコピー数解析図14Bにより、細胞株パネルは、8q24MYC、11q13CCND1、17q12ERBB2、20q13STK15/AURKAの繰り返し生じる増幅領域、及び原発腫瘍に見られる9p21CDKN2Aのホモ接合性欠失をモデル化することが確認される。トラスツズマブ及びラパチニブ療法により決定されるとおりのERBB2腫瘍サブタイプの臨床的関連性を考慮すると、本発明者らは、ERBB2AMPと指定される特別なサブタイプとして、ERBB2のDNA増幅を伴う細胞株を調べた。概して、ルミナル型、基底細胞型、クローディン低型及びERBB2AMP型の細胞株における本発明者らの同定は、臨床生物学と一致している。実施例XIV:細胞株はほとんどの治療化合物に示差的感受性を示す。00255本発明者らは、77種の治療化合物に対する本発明者らの細胞株パネルの感受性を調べた。本発明者らは細胞成長アッセイを用い、定量的終点は9つの濃度の各薬剤に3日間連続的に曝露した後に計測した。試験した抗癌化合物には、従来の細胞傷害剤例えば、タキサン、プラチノール、アントラサイクリンanthracylineと標的化薬剤例えば、SERM及びキナーゼ阻害薬との混合物が含まれた。多くの場合、いくつかの薬剤は同じタンパク質又は分子的作用機構を標的化した。本発明者らは、各化合物についての応答の定量的尺度を、50だけ成長を阻害するのに必要な濃度GI50と称するとして決定した。基礎となる成長データは高品質であるものの、50阻害が達成されなかった場合、本発明者らはGI50を試験した最高濃度に設定した。GI50値は全ての化合物について表8に提供する。本発明者らは、3つの化合物PS1145、セツキシマブ及びバイカレインは細胞株応答の変動が最小限であったため更なる解析から除外した。00256SigmaAKT1-2阻害薬に対する応答の変動を、関連する転写サブタイプと共に示す代表的なウォーターフォールプロットを図10Aに示す。この化合物に対する感受性はルミナル型及びERBB2AMP型の乳癌細胞株で最も高く、基底細胞型及びクローディン低型の乳癌細胞株ではより低かった。全ての化合物についての細胞株間のGI50値の分布を示すウォーターフォールプロットを表示する。本発明者らは、3回又は4回の反復による229個の化合物/細胞株の組み合わせについてのGI50値の絶対偏差中央値を計算することにより、データセット全体の再現性を確立した。これらの反復にわたる平均偏差中央値は0.15であった図15。本発明者らは、GI50値の集合間の対ピアソン相関を計算することにより、8種の化合物に対する応答の一致を評価した図15B.同様の作用機構を有する薬物のペアに対する感受性は高度に相関したことから、同様の作用機構が示唆される。実施例XV:多くの化合物は細胞株のサブセットにおいて選択的に有効である。00257本研究の主な前提は、細胞株における予測性のある分子構造がヒト腫瘍に反映される場合に、前臨床細胞株分析で認められる応答と分子サブタイプとの間の関連性が診療室で繰り返し起こり得ることである。本発明者らは、ノンパラメトリックANOVAを用いて応答-サブタイプの関連性を確立し、転写サブタイプ及びゲノミクスサブタイプ間のGI50値を比較した。00258概して、試験した74個中33個の化合物は、転写サブタイプ特異的な応答を示したFDRp<0.2、表7及び表9。図10Cは、ルミナル、基底細胞、クローディン低及びERBB2AMPのサブタイプの1つ以上と有意な関連性を有する34個の薬剤の階層的クラスタリングを示している。サブタイプと最も強い関連性を有する11個の薬剤は、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達及びヒストンデアセチラーゼの阻害薬であり、ルミナル型及び/又はERBB2AMP型の細胞株において最も高い効力を有した。次に最も高い3つのサブタイプ特異的薬剤-エトポシド、シスプラチン、及びドセタキセル-は、臨床的に観察されるとおり、基底細胞型及び/又はクローディン低型の細胞株において選択的活性を示す。イクサベピロン、GSK461364ポロキナーゼ阻害薬及びGSK1070916オーロラキナーゼ阻害薬を含む分裂装置を標的化する薬剤もまた、基底細胞型及びクローディン低型の細胞株に対して活性がより高かった。EGFR及び/又はERBB2を標的化するAG1478、BIBW2992及びゲフィチニブの全ては、ERBB2増幅と正の関連性を有した。HSP90の阻害薬であるゲルダナマイシンもまた、ERBB2増幅と正の関連性を有した。興味深いことに、VX-680オーロラキナーゼ阻害薬及びCGC-11144ポリアミン類似体は、両方ともERBB2増幅と負の関連性を有したことから、これらはERBB2AMP型腫瘍には比較的不適当な治療法であることが示される。00259本発明者らは、応答と、繰り返し起こる限局的な高レベルのコピー数異常CNA;標本のt検定、FDRp<0.2、表10との間に、7つの関連性6つの固有の化合物を同定した。図10Dは以下を示す:a9p21CDKN2A及びCDKN2Bにおけるホモ接合性欠失は、ビノレルビン、イクサベピロン及びファスカプリシンfascalypsinに対する応答と関連性を有した。ファスカプリシンfascalypsinはCDK4を阻害し、この特異性は、CDK4の阻害におけるCDKN2Aのp16INK4A産物における役割と一致する20。b20q13AURKAをコードするにおける増幅は、AURKB及びAURKCを標的化するGSK1070916及びVX-680に対する感受性よりむしろ、耐性と関連性を有した23。これは、AURKAの増幅がAURKB及びAURKC阻害薬に対する迂回機構を提供することを示唆する。c11q13CCND1における増幅は、カルボプラチン及びAURKB/C阻害薬のGSK1070916に対する感受性と関連性を有した。実施例XVI:サブタイプ特異性は成長速度効果を支配する。00260概して、本発明者らは、ルミナル型サブタイプの細胞株は基底細胞型又はクローディン低型の細胞より成長が遅くクラスカルワリス検定p=0.006、図16A及び表7、倍加時間の範囲が広かった18~300時間ことを見出した。これにより、最も感受性が高い細胞株は最も速く成長する細胞株である可能性が提起された。そうであるならば、次に観測されたサブタイプとの関連性は共変量との関連性を表し得る。本発明者らは、この仮説を共分散分析ANCOVAを用いてサブタイプ及び倍加時間の効果を同時に評価することにより検証し、33個中22個のサブタイプ特異的化合物は、倍加時間よりサブタイプとより良好な関連性を有したことが分かったp値の平均対数比=0.92、標準偏差1.11。これは、サブタイプの構成員は成長速度よりも良好な応答予測因子であるという着想を支持するものである。更に、33個中15個のサブタイプ特異的化合物は、よりゆっくりと成長するルミナル型細胞株において有効性がより高かった表7。1つの薬剤、5-フルオロウラシル5-florouracilは、サブタイプの検証単独では有意ではなかったが、ANCOVAモデルではクラス及び倍加時間の両方に対して強い有意性を示した。5-フルオロウラシル5-florouracilに対する応答は、ルミナル型細胞株及び基底細胞型細胞株の両方で倍加時間が増加するにつれて低下した図16B。本発明者らは、ほとんどの場合に、3日間の成長阻害アッセイは、成長速度によって強い影響を受けない分子サイン特異的応答を検出していると結論付ける。実施例XVII:コピー数及び転写計測値の統合により、サブタイプ特異的応答のパスウェイが同定される。00261本発明者らは、ネットワーク解析ツールのPARADIGM24を使用して、細胞株パネルのサブタイプ間におけるパスウェイ活性の差異を同定した。この解析は、キュレーションされたパスウェイが部分的に重複するという事実によって複雑化する。例えばEGFR、PI3キナーゼ及びMEKは、実際にはそれらが単一のより大きいパスウェイの構成要素であるときに、別個のパスウェイとしてキュレーションされることが多い。この問題に対処するため、PARADIGMは約1400個のキュレーションされたシグナル伝達パスウェイ、転写パスウェイ及び代謝パスウェイを単一の重畳パスウェイSuperPathwayにまとめ合わせ、このような冗長性を排除する。特定の細胞株についてのコピー数データ及び遺伝子発現データの両方を用いて、PARADIGMはパスウェイ相互作用を使用することにより、全ての遺伝子、複合体、及び細胞プロセスについての統合パスウェイレベルIPLを推論する。00262本発明者らは、PARADIGMIPLを用いて、細胞株を原発性乳房腫瘍とそれらのパスウェイ活性化によって比較した。細胞株-腫瘍比較データは、癌ゲノムアトラスTCGAプロジェクトhttp://cancergenome.nih.govにより生成されたデータを使用して行われた。図11は、階層的クラスタリング後の腫瘍及び細胞株の各々についてのパスウェイ活性を示している。各サブタイプについて上位5つのパスウェイ特徴を表11に記載する。概して、腫瘍及び細胞株サブタイプは同様のパスウェイ活性を示し、かつ調節解除されたパスウェイは、元のサブタイプよりも転写サブタイプと良好な関連性を有した図13。しかしながら、クローディン低型細胞株サブタイプと関連付けられるパスウェイは腫瘍では十分に表現されていない-おそらく、クローディン低サブタイプが細胞株コレクションにおいて大きな比率を占め、かつルミナルAサブタイプが欠けているためである図12。実施例XVIII:サブタイプ特異的パスウェイマーカーの同定。00263本発明者らは、サブタイプ間の差異の根底に固有のパスウェイ活性があるかという問いを立てた。そのため、本発明者らは、あるサブタイプの細胞株で他と比較して示差的に上方制御又は下方制御される遺伝子活性を含むSuperPathwayのサブネットワークを同定した。基底細胞型細胞株とコレクション内の他の全てとの間のパスウェイ活性の比較により、941本のエッジにより連結された965個のノードから構成されるネットワークを同定した。ここで、ノードはタンパク質、タンパク質複合体、又は細胞プロセスを表し、エッジはタンパク質リン酸化などの、これらの要素間の相互作用を表す図18~図22を参照のこと。図35Aは、増殖、血管新生、及び腫瘍形成に関連するMYC/MAXサブネットワークの上方制御;及び細胞周期、接着、浸潤、及びマクロファージ活性化を制御するERK1/2サブネットワークの上方制御を示している。FOXM1及びDNA損傷サブネットワークもまた、基底細胞型細胞株において顕著に上方制御された。クローディン低サブタイプを他の全てと比較することにより、基底細胞型細胞株におけるものと同じサブネットワークの多くの上方制御が示され、但し、基底細胞型と比較したときのクローディン低型細胞株におけるβ-カテニンCTNNB1ネットワークの上方制御を含めて例外はあった図35B。β-カテニンは腫瘍発生に関与しているとされ、不良な予後と関連付けられる。ルミナル型細胞株を他の全てと比較することにより、黒色腫における腫瘍形成能を阻害するATF2ネットワークの下方制御、及びER調節遺伝子の転写を制御し、かつ良好な予後のルミナル型乳癌に関与するとされるFOXA1/FOXA2ネットワークの上方制御が示された図35C。ERBB2AMP型細胞株を他の全てと比較することにより、ルミナル型細胞と共通する多くのネットワーク特徴が示された-ほとんどのERBB2AMP型細胞はまたルミナル型細胞として分類されるため、これは意外ではない。しかしながら図35Dでは、ERBB2AMP型細胞株におけるRPS6KBP1を中心とする下方制御が示されている。00264IPLを使用した細胞株間における示差的な薬物応答の比較分析から、応答機構に関する情報を提供するパスウェイ活性が明らかとなった。例えば、基底細胞型細胞株は、DNA損傷剤のシスプラチンに対して選択的な感受性を有し、また、シスプラチンに対する応答に関連する中心的存在であるATM、CHEK1及びBRCA1を含むDNA損傷応答サブネットワークの上方制御も示した34図36A。同様に、ERBB2AMP型細胞株はHSP90の阻害薬であるゲルダナマイシンに対して感受性を有し、またERBB2-HSP90サブネットワークにおける上方制御を示した図36B。この観測はゲルダナマイシンの作用機構と一致する:ゲルダナマイシンはERBB2に結合して、その分解degredationをもたらす。本発明者らは、ERBB2AMP型細胞株はオーロラキナーゼ阻害薬のVX-680に耐性を示し図36C、上、更に、この化合物に対する感受性は20q13AURKAにおける増幅と関連性を有しなかったことを見出した。これにより、この耐性が、FOXM1によりAURKBと同時制御されるCCNB1によって媒介され得る可能性が生じる。4つのサブタイプのうちERBB2AMPは、CCNB1の実質的な下方制御を示す唯一のものである図36C及び図22。この提案される機構は、原発腫瘍においてCCNB1遺伝子発現がAURKB遺伝子発現と有意に相関するという観察により裏付けられる。実施例XVIX:細胞成長阻害アッセイ及び成長速度00265本発明者らは、77種の化合物の効力を本発明者らの55個の乳癌細胞株パネルにおいて評価した。このアッセイは既に記載されているとおり実施したKuo,W.L.etal.AsystemsanalysisofthechemosensitivityofbreastcancercellstothepolyamineanaloguePG-11047.BMCMed7,77,doi:1741-7015-7-77[pii]10.1186/1741-7015-7-772009。簡潔に言えば、細胞を1:5の段階希釈serialdillutionで一組の9用量の各化合物を用いて72時間処理した。CellTiterGloアッセイを用いて細胞生存率を決定した。未処理のウェルについての0hに対する72hの比から、倍加時間DTを推定した。00266本発明者らは、非線形最小二乗法を使用して、以下のパラメータを用いゴンペルツ曲線にデータをフィットした:上側及び下側の漸近線、傾き及び変曲点。フィットした曲線を、NCI/NIHDTPHumanTumorCellLineScreenProcessにより記載され、かつ以前に記載された方法を用いて、GI曲線に変換したScreeningServices-NCI-60DTPHumanTumorCellLineScreen.http://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html.;Monks,A.etal.Feasibilityofahigh-fluxanticancerdrugscreenusingadiversepanelofculturedhumantumorcelllines.JNatlCancerInst83,757-7661991。00267本発明者らは、化合物の50成長を阻害するのに必要な濃度GI50、成長を完全に阻害するのに必要な濃度全成長阻害、TGI及び50集団を減少させるのに必要な濃度50致死濃度、LC50を含め、様々な応答尺度を評価した。基礎をなす成長データの質は高いが終点応答GI50、TGI、LC50に達しなかった場合、値を試験した最高濃度に設定した。GI50は最初に達する閾値を表し、従って最も正確な計測値集合を含む。00268薬物応答データを、以下の基準を満たすようフィルタリングした:19つの三つ組のデータ点間における標準偏差中央値<0.20;2特定の細胞株について、DT±2SDのDT中央値;3フィットした曲線の傾き>0.25;4明らかな応答がないデータセットについて、最高濃度での成長阻害<50。薬物プレートの約80が全てのフィルタリング要件を満たした。本発明者らは、ロバストな形の標準偏差である絶対偏差中央値MADを使用して、本発明者らのGI50の反復計測の信頼性を評価した。曲線の当てはめ及びフィルタリングは、特別に書かれたRパッケージで実施した。実施例XX:薬物スクリーニング00269統計的解析に含まれた各薬物は、データの質についての以下のスクリーニング基準を満たした:1欠測値:細胞株の集合全体でGI50値の40以下が欠測していてもよい;2ばらつき:少なくとも3つの細胞株について、GI50>1.5.mGI50又はGI50<0.5.mGI50のいずれか、式中mGI50は所定の薬物についてのGI50中央値である。これらの基準を満たさない化合物は解析から除外した。実施例XXI:SNPArray及びDNAコピー数解析00270Affymetrix社のGenome-WideHumanSNPArray6.0を使用して、DNAコピー数データを計測した。アレイ品質及びデータ処理は、R統計フレームワークhttp://www.r-project.orgを使用してaroma.affymetrixに基づき実行した。乳癌細胞株SNPアレイを、記載のとおり20個の正常試料アレイを使用して正規化したBengtsson,H.,Irizarry,R.,Carvalho,B.Speed,T.P.Estimationandassessmentofrawcopynumbersatthesinglelocuslevel.BioinformaticsOxford,England24,759-7672008。データを、bioconductor社のパッケージのDNAcopyからサーキュラーバイナリセグメンテーションCBSを用いてセグメント化したOlshen,A.B.,Venkatraman,E.S.,Lucito,R.Wigler,M.Circularbinarysegmentationfortheanalysisofarray-basedDNAcopynumberdata.BiostatisticsOxford,England5,557-5722004。MATLABベースの癌における有意な標的のゲノム同定GenomicIdentificationofSignificantTargetsinCancer:GISTICを使用して、有意なDNAコピー数変化を分析したBeroukhim,R.etal.Assessingthesignificanceofchromosomalaberrationsincancer:methodologyandapplicationtoglioma.ProcNatlAcadSciUSA104,20007-200122007。生データはEuropeanGenotypeArchiveEGA社において受託番号EGAS00000000059により利用可能である。00271コピー数の有意な変化を検出する確率が確実に最大となるようにするため、本発明者らは非悪性細胞株をGISTIC解析から除いた。各同質遺伝子細胞株ペアの一方のメンバーについてのGISTICスコアを使用して、他方のゲノム変化を推論した:AU565はSKBR3から推論した;HCC1500はHCC1806から推論した;LY2はMCF7から推論した;ZR75BはZR751から推論した。実施例XXII:エクソンアレイ解析00272細胞株の遺伝子発現データは、Affymetrix社のGeneChipHumanGene1.0STエクソンアレイから得た。発現の遺伝子レベルの要約を、aroma.affymetrixRパッケージを使用して、HuEx-1_0-st-v2,coreチップタイプに基づく分位点正規化及び対数相加プローブレベルモデルPLMにより計算した。転写物識別子を、BioMartRパッケージを使用してEnsemblデータベースに問い合わせることによりHGNC遺伝子記号に変換した。続いて得られた発現プロファイルをフィルタリングし、全細胞株においてlog2スケールで1.0より大きい標準偏差を表す遺伝子のみを捕捉した。生データはArrayExpressE-MTAB-181において利用可能である。実施例XXIII:コンセンサスクラスタリング00273階層的コンセンサスクラスタリングを用いて細胞株サブタイプを同定したMonti,S.,Tamayo,P.,Mesirov,J.P.Golub,T.A.ConsensusClustering:AResampling-BasedMethodforClassDiscoveryandVisualizationofGeneExpressionMicroarrayData.MachineLearning52,91-1182003。コンセンサスは、細胞株の500サンプリング、試料当たり細胞株の80、凝集型階層的クラスタリング、ユークリッド距離計量及び平均連結法を用いて計算した。00274実施例XXIV:臨床的に関連するサブタイプと治療剤に対する応答との関連性00275本発明者らは、3つのスキームを使用してGI50を比較した:1ルミナル型対基底細胞型対クローディン低型;2ルミナル型対基底細胞型クローディン低型;及び3ERBB2-AMP型対非ERBB2-AMP型。GI50群間の差異を、順位尺度で、必要に応じてノンパラメトリックANOVA又はt検定により比較した。本発明者らは、3組の検定のp値を組み合わせ、かつ偽発見率FDRを使用して複数の検定を補正した。3標本検定について、本発明者らは各群を他の全てと比較して、どの群が最も感度が高いかを決定することにより、有意なクラス効果を有する化合物に対して事後解析を実施した。事後検定のp値を合わせてFDR補正した。全ての場合において、FDRp<0.20を有意と見なした。スキーム2で基底細胞型クローディン低型の群が有意であると分かったが、スキーム1ではそれらの群のうち1つのみが有意であったケースであった場合、本発明者らはクラス特異度を割り当てる際にその3標本ケースに優先度を与えた。解析はRで実施した。実施例XXV:ゲノム変化と治療剤に対する応答との関連性00276本発明者らはt検定を用いて、繰り返し起こるコピー数変化8q24MYC、11q13CCND1、20q13STK15/AURKAにおけるものと薬物感受性との間の関連性を評価した。本発明者らは、増幅が低い、又はない細胞株を単一の群に組み合わせ、それを増幅が高い細胞株と比較した。欠失領域について同等の解析を行った。GI50が試験した最大濃度と等しかった細胞株は、解析から除外した。本発明者らは任意の群が5未満の試料数を有する場合、化合物を除外した。実施例XXVI:成長速度と治療剤に対する応答との関連性00277細胞株クラス及び成長速度の薬物感受性に対する効果を評価するため、本発明者らは、上記に記載される3つの細胞株分類スキームの各々につき1つの、一組の二元配置共分散分析ANCOVA検定を実施した。これにより6組のp値が得られた2つの主効果×3分類スキーム;本発明者らは1回のFDR補正により有意性を評価し、FDRp値<0.20が対象となることを宣言した。本発明者らはこれらの分析をRにおいて関数lm及びANOVAで実施した。これらの関数はcarパッケージの一部として利用可能である。実施例XXVII:統合パスウェイ解析00278PARADIGMソフトウェアを使用して、コピー数、遺伝子発現、及びパスウェイ相互作用データの統合を実施した。簡潔に言えば、この手順は、単一の細胞株又は患者試料から、パスウェイ相互作用並びにゲノムデータ及び機能的ゲノムデータを使用して、遺伝子、複合体、及びプロセスについての統合パスウェイレベルIPLを推論する。詳細は実施例XXXVを参照のこと。実施例XXVIII:TCGA及び細胞株クラスタリング00279本発明者らは、細胞株について推論された活性が、TCGA腫瘍試料におけるそのそれぞれのサブタイプでクラスター化されるかという問いを立てた。高度に連結されたハブ遺伝子及び高度に相関した活性によって生じるバイアスを回避するため、相関分析により決定された2351個の非冗長的活性の集合を使用して、細胞株及び腫瘍試料をクラスター化した。細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料とクラスター化される程度を、コルモゴルフスミルノフ検定を用いて計算し、同じサブタイプの細胞株と腫瘍試料とのペア間の相関から計算されたt統計量の分布を、異なるサブタイプの細胞株ペアから計算された分布と比較した。詳細は実施例XXXVIを参照のこと。実施例XXIX:サブタイプパスウェイマーカーの同定00280本発明者らは、まとめて特定のサブタイプに関する示差的活性を示す相互に連結された遺伝子を探索した。各サブタイプは、細胞株を2つの群に二分化するものとして扱った:一方の群は、そのサブタイプに属する細胞株を含み、第2の群は残りの細胞株を含んだ。本発明者らは、2クラスマイクロアレイ有意性解析SAMアルゴリズムのRインプリメンテーションを使用してTusher,V.G.,Tibshirani,R.Chu,G.Significanceanalysisofmicroarraysappliedtotheionizingradiationresponse.ProcNatlAcadSciUSA98,5116-5121,doi:10.1073/pnas.091062498[pii]2001、SuperPathwayの概念毎に示差的活性DAスコアを計算した。サブタイプについては、正のDAは、そのサブタイプでの他の細胞株と比較したより高い活性に対応する。00281SuperPathwayにおける密接に関係する遺伝子の協調的な上方制御及び下方制御は、PARADIGMにより推論される活性を補強する。隣接遺伝子の活性もまた特定の表現型と相関する場合、本発明者らは高いDAスコアのサブネットワーク全体が見出されることを予想する。本発明者らは、2つの概念を連結するリンクであって、両方の概念が平均DA絶対値より高いDAスコアを有したリンクのみを保持することにより、高いDA絶対値の概念が相互連結されたSuperPathwayにおける領域を同定した。実施例XXX:統合パスウェイ解析00282PARADIGMソフトウェアを使用して、コピー数、遺伝子発現、及びパスウェイ相互作用データの統合を実施した24。簡潔に言えば、この手順は、単一の細胞株又は患者試料から、パスウェイ相互作用並びにゲノムデータ及び機能的ゲノムデータを使用して、遺伝子、複合体、及びプロセスについての統合パスウェイレベルIPLを推論する。TCGABRCAデータは、2010年11月7日付けのTCGADCCから入手した。TCGA及び細胞株遺伝子発現データは、個別に、各データセット内で中心となるプローブ中央値とした。データセット全体細胞株又はTCGA腫瘍試料のいずれかの値を全て順位変換し、-log10順位比に変換してからPARADIGMに投入した。パスウェイは、http://pid.nci.nih.gov/からBioPaxレベル2フォーマットで得られ、NCI-PID、Reactome、及びBioCartaデータベースを含んだ。相互作用を組み合わせて、結合重畳パスウェイSuperPathwayとした。遺伝子、複合体、及び抽象的プロセス例えば細胞周期をパスウェイ概念として保持した。遺伝子概念を結合する前に、全ての遺伝子識別子をHUGO命名法に変換した。全ての相互作用が含まれ、矛盾する影響を解決することは試みなかった。P53最も多く連結された構成要素を始端とする幅優先無向探査を実行し、1つの単一構成要素を構築した。得られた結合パスウェイ構造は、3491個のタンパク質、4757個の複合体、及び520個のプロセスを表す合計8768個の概念を含むものであった。PARADIGM用の期待値最大化パラメータを細胞株データで訓練し、次にTCGA試料に適用した。次に細胞株及び腫瘍試料からのデータを組み合わせて単一のデータ行列とした。細胞株又は腫瘍試料のいずれのデータにおいても、0.5IPLを上回る少なくとも1つの値を有さないエントリーは全て、続く解析から除外した。実施例XXXI:TCGA及び細胞株クラスタリング00283PARADIGMIPLを使用して細胞株をTCGA腫瘍試料と共にクラスター化し、細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料と類似しているかどうかを決定した。SuperPathwayの十分に調べられた範囲は、多数の相互作用を有する遺伝子ハブと、直接的なデータは利用できない多数の中間的な複合体及び抽象的プロセスの大きなシグナル伝達鎖とを含む。ハブへのバイアスを回避するため、クラスタリング前に、細胞株及び腫瘍試料の両方に高度に相関するベクトルピアソン相関係数>0.9を含むパスウェイ概念を、単一のベクトルに統一した。この統一により、元の8939個のパスウェイ概念から2351個の非冗長性ベクトルがもたらされた。00284得られた非冗長性概念の集合を使用して、試料をクラスター化した。47個の細胞株及び183個のTCGA腫瘍試料の両方についての推論されたパスウェイ活性の行列を、Eisen社のClusterソフトウェアパッケージバージョン3.0に実装される完全連結階層的凝集型クラスタリングを用いてクラスター化した。非中心化ピアソン相関をパスウェイ概念の計量として使用し、試料計量にユークリッド距離を使用した。00285細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料とクラスター化される程度を定量化するため、本発明者らは、ピアソン相関から導き出されるt統計量の2つの分布を比較した。Csをサブタイプsの細胞株の集合とする。同様に、TsをサブタイプsのTCGA腫瘍試料の集合とする。例えば、Cbasal及びTbasalは、それぞれ、全ての基底細胞型細胞株及び基底細胞型腫瘍試料の集合である。第1の分布は、同じサブタイプの細胞株及び腫瘍試料を含むあらゆる可能なペア間のピアソン相関から導き出されたt統計量から構成された;すなわち全てのサブタイプsについて、a∈Cs及びb∈Ts’であるようなペアa,b間のあらゆる対相関t統計量を計算した。第2の分布は異なるサブタイプの細胞株間の相関t統計量から構成された;すなわち、a∈Cs及びb∈Cs及びs≠s’であるようなペアa,bに関して計算した。本発明者らはコルモゴルフスミルノフ検定を実施して分布を比較した。実施例XXXII:統合パスウェイ解析00286PARADIGMソフトウェアを使用して、コピー数、遺伝子発現、及びパスウェイ相互作用データの統合を実施した24。簡潔に言えば、この手順は、単一の細胞株又は患者試料から、パスウェイ相互作用並びにゲノムデータ及び機能的ゲノムデータを使用して、遺伝子、複合体、及びプロセスについての統合パスウェイレベルIPLを推論する。TCGABRCAデータは、2010年11月7日付けのTCGADCCから入手した。TCGA及び細胞株遺伝子発現データは、個別に、各データセット内で中心となるプローブ中央値とした。データセット全体細胞株又はTCGA腫瘍試料のいずれかの値を全て順位変換し、-log10順位比に変換してからPARADIGMに投入した。パスウェイは、http://pid.nci.nih.gov/から2010年10月13日付けのBioPaxレベル2フォーマットで得られ、NCI-PID、Reactome、及びBioCartaデータベースを含んだ。相互作用を組み合わせて、結合重畳パスウェイSuperPathwayとした。遺伝子、複合体、及び抽象的プロセス例えば細胞周期をパスウェイ概念として保持した。遺伝子概念を結合する前に、全ての遺伝子識別子をHUGO命名法に変換した。全ての相互作用が含まれ、矛盾する影響を解決することは試みなかった。P53最も多く連結された構成要素を始端とする幅優先無向探査を実行し、1つの単一構成要素を構築した。得られた結合パスウェイ構造は、3491個のタンパク質、4757個の複合体、及び520個のプロセスを表す合計8768個の概念を含むものであった。PARADIGM用の期待値最大化パラメータを細胞株データで訓練し、次にTCGA試料に適用した。次に細胞株及び腫瘍試料からのデータを組み合わせて単一のデータ行列とした。細胞株又は腫瘍試料のいずれのデータにおいても、0.5IPLを上回る少なくとも1つの値を有さないエントリーは全て、続く解析から除外した。実施例XXXIII:TCGA及び細胞株クラスタリング00287PARADIGMIPLを使用して細胞株をTCGA腫瘍試料と共にクラスター化し、細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料と類似しているかどうかを決定した。SuperPathwayの十分に調べられた範囲は、多数の相互作用を有する遺伝子ハブと、直接的なデータは利用できない多数の中間的な複合体及び抽象的プロセスの大きなシグナル伝達鎖とを含む。ハブへのバイアスを回避するため、クラスタリング前に、細胞株及び腫瘍試料の両方に高度に相関するベクトルピアソン相関係数>0.9を含むパスウェイ概念を、単一のベクトルに統一した。この統一により、元の8939個のパスウェイ概念から2351個の非冗長性のベクトルがもたらされた。得られた非冗長性概念の集合を使用して、試料をクラスター化した。47個の細胞株及び183個のTCGA腫瘍試料の両方についての推論されたパスウェイ活性の行列を、Eisen社のClusterソフトウェアパッケージバージョン3.0に実装される完全連結階層的凝集型クラスタリングを用いてクラスター化した45。非中心化ピアソン相関をパスウェイ概念の計量として使用し、試料計量にユークリッド距離を使用した。00288細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料とクラスター化される程度を定量化するため、本発明者らは、ピアソン相関から導き出されるt統計量の2つの分布を比較した。Csをサブタイプsの細胞株の集合とする。同様に、TsをサブタイプsのTCGA腫瘍試料の集合とする。例えば、Cbasal及びTbasalは、それぞれ、全ての基底細胞型細胞株及び基底細胞型腫瘍試料の集合である。第1の分布は、同じサブタイプの細胞株及び腫瘍試料を含むあらゆる可能なペア間のピアソン相関から導き出されたt統計量から構成された;すなわち全てのサブタイプsについて、a∈Cs及びb∈Ts’であるようなペアa,b間のあらゆる対相関t統計量を計算した。第2の分布は異なるサブタイプの細胞株間の相関t統計量から構成された;すなわち、a∈Cs及びb∈Cs’及びs≠s’であるようなペアa,bに関して計算した。本発明者らはコルモゴルフスミルノフ検定を実施して分布を比較した。実施例XXXIV:様々な遺伝子の分子レベルにおける腫瘍の分子サブタイプ00289乳房腫瘍に関して行われる全ゲノム遺伝子発現解析の先駆的研究から、最も顕著にエストロゲン受容体ER陰性基底細胞様サブグループ及びER陽性ルミナルサブグループに属する種々のサブクラスが同定されておりPerou,C.M.etal.,2000,Molecularportraitsofhumanbreasttumours,406:747-752、その臨床転帰には違いがある14Sorlie,T.etal.,2001,Geneexpressionpatternsofbreastcarcinomasdistinguishtumorsubclasseswithclinicalimplications,98:10869-10874。いくつかの分子サブタイプの存在はまた、DNAコピー数解析2Russnesetal.2007上記、DNAメチル化Ronnebergetal.2011上記及びmiRNA発現解析Enerlyetal.2011上記によっても観察されている。しかしながら、問題は、分子解析によって様々な新しい分子レベルで得られたこれらの新しいプロファイルが、mRNA発現により当初見出されたサブクラスをどの範囲まで再現するか、及び臨床上重要な新規患者サブグループを同定するこれらの新しい分類の潜在力はどのようなものかである。これらの問いに取り組むため、本発明者らは初めにMicMaデータセットの乳癌患者を、偏りのない教師なし方法を用いて、調査される各分子レベルによりクラスター化した図23。分子レベル毎の患者のクラスタリングのヒストグラムを個別に、及び患者サブグループ毎の生存KMプロットを、図23に示す。興味深いことに、このクラスタリング手順により、Pam50分類から導き出されるクラスターと高度に相関した7つのmRNA発現クラスターの同定がもたらされる。これはPam50と一致するが、ルミナルAクラスターはexp1-4mRNAクラスターの間に、基底細胞及びERBB2は最後の3つexp5-7のクラスターの間に分かれた。miRNAレベルでは、Enerlyetal.2011上記に既に記載されるとおり、3つの異なるクラスターが得られた;メチル化レベルでは、記載されるとおりの3つの主クラスターと、はるかに小さい1つが認められ、第4のクラスターはRonnebergetal.2011,上記でも観察されたが、それ以上は考察されていない。CNAレベルでは6つの異なるクラスターが出現した。明らかに、あらゆるレベルで個別的な患者クラスターが特定の生存パターンと関連付けられた図23。次に、同じ患者が異なる分子レベルで対応するクラスターを形成したかどうかを評価した。実際、異なるレベルのクラスタリング間に、最も顕著にはDNAメチル化及びmRNA発現及びDNAコピー数の間に、良好な一致が大いにあった表12。しかしながら、試料によってはいかなるレベルでも常に共にクラスター化される一方で、他の試料は研究における特定の各分子終点に応じて異なる群にクラスター化される。002901つの分子レベルに由来する1つのサブクラスを、もう1つによるクラスタリングにより一貫して分けることで、重要な生物学的意義が明らかとなり得る。例えば、3で考察されるとおり、メチル化とmRNA発現との間の良好な相関に基づく分類が認められたがp=2.29106、ルミナル-AクラスmRNA発現によるは更に2つの異なるメチル化クラスターの間に分けられた。同じことが基底細胞様腫瘍にも該当したことから、mRNA発現クラスターとの強い一致にもかかわらず、DNAメチル化によるクラスタリングによって更なる情報が提供されたことが示唆される。異なるDNAメチル化プロファイルを有するルミナルA試料は、生存が異なるRonneberg,J.A.etal.,2011,Methylationprofilingwithapanelofcancerrelatedgenes:associationwithestrogenreceptor,TP53mutationstatusandexpressionsubtypesinsporadicbreastcancer,5:61-76。本発明者ら及び他の研究者の両方からの新しいデータセットの数が増えることで、将来、これらのクラスターがいくつかの最も高頻度及び多数の低頻度の組み合わせに収束するかどうかが明らかとなるであろう。00291異なる分子レベルでの再分類は、異なるレベルに影響を受ける新たな興味深い生物学的パスウェイが指示され得るため、更なる研究の価値があるが、このクラス間でのサンプルを水平に入れ替える中での情報量は限定的であり得る。パスウェイ毎にこれらのクラスター内で示差的に発現/変化する遺伝子を調べることは、先験的知識及び既知の相互作用の選択に依存し、新規のパスウェイを同定することは不可能である。更に、これらの手法は異なるデータセットにおける遺伝子及び計測値を独立変数として扱い、パスウェイにおける遺伝子の位置、又はその相互作用するパートナーの数すなわちパスウェイのトポロジーは考慮せず、遺伝子集合中の1つ又は少数の遺伝子の発現における大きい変動に対して脆弱であり得る。一般に、癌における多くの腫瘍で特定のパスウェイが調節解除され得るが、特定の遺伝子及び調節解除の方法は種々の腫瘍で変化することが観察されているCancerGenomeAtlasResearchNetwork.Comprehensivegenomiccharacterizationdefineshumanglioblastomagenesandcorepathways.Nature2008Oct.;4557216:1061-1068。従って、次に本発明者らは、パスウェイ及び関連する臨床データの文脈における腫瘍内での各遺伝子の活性レベルを特徴付けるため、単一の遺伝子に関する異なるデータ型の計測値間の相互作用並びに既知の遺伝子間相互作用をモデル化するパスウェイベースのモデリング法を適用した。本発明者らは各遺伝子の統合パスウェイレベルIPLを用いて患者を直接同定し、これらの調節解除されたパスウェイに従い分子データ型間で分類して、次に様々な分子レベルにおける新しいクラスターと先述のクラスとの関係を調査した。実施例XXXV:予後的意義により浸潤癌を分類するためのPARADIGM00292腫瘍表現型を説明し、かつ腫瘍を標的化治療され易いものにし得る個別の生物学的機能を、ゲノム変化がどのように妨害するかを理解するために、本発明者らはパスウェイレベルの摂動を理解する必要がある。PARADIGMは、遺伝子を単一のレベルで調べた場合には区別できない患者サブセットにおいて、一貫した活性パスウェイを同定する。この方法は、既知のパスウェイ構造に対して、確率的グラフィカルモデルPGMから統合機能ゲノミクスデータに至るまでの技術を用いる。これは既に、TCGA膠芽腫及び卵巣のデータセットからのコピー数及びmRNA発現のデータ解析に適用されている。PARADIGM解析はまた、DNAメチル化又はコピー数、mRNA及びmiRNA発現などの、複数のレベルでゲノム変化を関係付けるためにも用いることができ、従って個々の各試料における任意の数のオミクスデータ層を統合することができる。DNAメチル化及びmiRNA発現は、ここで観察された調節解除パスウェイに寄与し、かつMicMaコホートにおいて各々それ自体で乳癌の予後診断及び分子プロファイルに明確な寄与を有するように思われるが図23、本発明者らは、これらの2つの分子プロファイルタイプを追加することによるPARADIGMクラスターの予後診断値の向上は見出さなかった。これについての1つの説明は、miRNA及びDNAメチル化解析の予後診断値が、それらの高い相関からmRNA発現によって再現されるというものである。しかしながら、このように結論付けるには、例えば、解析プラットフォームの選択メチル化についての限られたIllumina社の1505CpG癌パネル及び真のmiRNA標的についての本発明者らの限られた知識が、総合的に計測し、かつmiRNA及びDNAメチル化情報を有効にモデル化する本発明者らの能力を制限する要因となり得るかどうかに関して、更なる分析を要する。00293MicMaコホートのmRNA発現及びコピー数変化に基づくPARADIGM解析により、5つの異なるクラスターの存在が同定され図24A、かつmRNA発現とDNAコピー数とを組み合わせると、個別に研究される分子レベルのいずれと比べても、予後に関して患者のより優れた判別につながることが示された図24B及び図23。その摂動がこの分類に最も強く寄与したパスウェイは、アンジオポエチンAngiopoientin受容体Tie2媒介性シグナル伝達のもの、及び最も顕著には、免疫応答TCR及びインターロイキンシグナル伝達のものであり、ここではパスウェイにおけるほぼ全ての遺伝子又は複合体は正常値から外れた図25A。最も著明に認められたのは、IL4、IL6、IL12及びIL23シグナル伝達であった。他の著明なパスウェイは、エンドセリン、同様に卵巣及び膠芽腫TCGAデータセットで調節解除されるFOXM1転写、並びに同様に乳癌及び卵巣癌で調節解除されることが既に分かっている及びERBB4であった。この解析に基づき、本発明者らは、有意に異なる予後診断を有する以下の患者群を同定した。これらの群は、おおまかに以下のとおり特徴付けることができる:pdgm.1=高FOXM1、高免疫シグナル伝達、pdgm.2=高FOXM1、低免疫シグナル伝達、マクロファージ優勢、pdgm.3=低FOXM1、低免疫シグナル伝達、pdgm.4=高ERBB4、低アンギオポエチンシグナル伝達、pdgm.5=高FOXM1、低マクロファージサイン。002942つの既に発表されているデータセットにおいてParadigmクラスターの同定を検証した。1つはChinetal2007Chin,S.F.etal.,2007,Usingarray-comparativegenomichybridizationtodefinemolecularportraitsofprimarybreastcancers,26:1959-1970によるもので、これはMicMaデータセットと比較して、ER及び高悪性度腫瘍の頻度がより高かったとともに、更に一層興味深いことに、別の集合では非悪性DCIS非浸潤性乳管癌が濃縮された12Muggerud,A.A.etal.,2010,MoleculardiversityinductalcarcinomainsituDCISandearlyinvasivebreastcancer,4:357-368図25B、図25C。純粋なDCIS腫瘍のヒートマップを図25Dに示す27。00295MicMaにおいて最も不良な予後のクラスターpdgm.2では、IL4シグナル伝達はSTAT6と共に強く下方制御され、STAT6はヒト乳癌細胞において成長阻害を妨げることが示されている16Gooch,J.L.,Christy,B.,andYee,D.,2002,STAT6mediatesinterleukin-4growthinhibitioninhumanbreastcancercells,4:324-331。IL4シグナル伝達の下方制御はまた、より高い腫瘍成長を支持し得るマスト細胞の活性化も促進している17deVisser,K.E.,Eichten,A.,andCoussens,L.M.,2006,Paradoxicalrolesoftheimmunesystemduringcancerdevelopment,6:24-37。逆にpdgm.5では、IL23シグナル伝達により、マクロファージ活性化が低下し、ナチュラルキラー細胞活性が増加する。一方の側面でTh-2細胞及びB細胞の動員に、他方でTh-1の増殖に対する免疫応答において癌依存的分極化が考察されている1Ursini-Siegel,J.etal.,2010,Receptortyrosinekinasesignalingfavorsaprotumorigenicstateinbreastcancercellsbyinhibitingtheadaptiveimmuneresponse,70:7776-7787。一定の条件下でTh1/CTL免疫応答は、マウスにおける過形成の腺腫への移行を妨げ得る一方、Th2応答は、癌腫への移行を促進する慢性炎症状態を付与することにより得るという仮説が立てられている。IL4はTh-2由来のサイトカインであり、B細胞分化及び癌細胞での慢性炎症を刺激する。更にTh-2細胞は、これらの癌における免疫抑制を媒介するIL10を分泌する。この免疫抑制は、主に基底細胞癌及びERBB2癌で起こることが示されている。この裏付けとして、最近、腫瘍促進性微小環境で抗腫瘍性獲得免疫プログラムが奪われ、代わりに、上皮細胞挙動の調節に機能的に関与する先天性免疫系の細胞成分が関わることにより悪性腫瘍が促進され得ることが示されているDeNardo,D.G.etal.,2009,CD4Tcellsregulatepulmonarymetastasisofmammarycarcinomasbyenhancingprotumorpropertiesofmacrophages,16:91-102。00296ここに提案されるこの免疫分類と、十分に確立されたmRNA発現による分類ルミナルA、B、基底細胞、ERBB2、正常様との間には、相当の一致があった図24。基底細胞及びERBB2のクラスターに属する試料は、主に、prgm1より不良な予後、ルミナルA-prgm3最も良好な予後のものであった。しかしながら、Paradigmクラスタリングは、ルミナルAprgm3とルミナルBprgm4とのクラスター間についてのかなり有意な区別、並びに予後が極めて不良な基底細胞型腫瘍サブセットprgm2の同定を提供する。実施例XXXVI:パスウェイの摂動がPARADIGMクラスタリングに特異的に影響を与える同定された該パスウェイFOXM1転写00297FOXM1は、細胞周期進行の主要調節因子であり、その内因性FOXM1発現は細胞周期の相に従い振動する。ヒト癌原遺伝子として確認されたFOXM1は、肝癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸癌、膵癌、脳癌並びに最も一般的なヒト癌の基底細胞癌を含め、ヒト固形癌の大多数で上方制御されることが分かっている。FOXM1は、細胞周期及び染色体/ゲノム維持におけるその複数の役割によって腫瘍形成を促進すると考えられているWonsey,D.R.andFollettie,M.T.,2005,LossoftheforkheadtranscriptionfactorFoxM1causescentrosomeamplificationandmitoticcatastrophe,65:5181-5189。初代ヒト皮膚角化細胞におけるFOXM1の異常な上方制御は、ヘテロ接合性の喪失LOH及びコピー数異常の形でのゲノム不安定性を直接誘導し得る。TehM,GemenetzidisE,ChaplinT,YoungBD,PhilpottMP.UpregulationofFOXM1inducesgenomicinstabilityinhumanepidermalkeratinocytes.Mol.Cancer2010;9:45。最近の報告では、成人ヒト上皮幹細胞におけるFOXM1の異常な上方制御は、3D器官型組織再生系において前癌表現型-ヒト過形成と同様の状態-を誘導することが示されたGemenetzidis,E.etal.,2010,Inductionofhumanepithelialstem/progenitorexpansionbyFOXM1,70:9515-952。この著者らは、FOXM1の過剰発現は、分化経路に干渉し、それにより前駆細胞コンパートメントを拡大することによって幹細胞の固有の自己再生増殖能を利用することを示した。従って、FOXM1は幹細胞/前駆細胞の増殖によって癌の発生を誘導するという仮説が立てられた。本発明者らは、主にインターロイキンシグナル伝達活性に従い分けられた、このパスウェイの高い活性及び低い活性を有する2つの乳癌患者群を明らかに認めている。図26は、クラスターpdgm3最良の予後についての、このパスウェイの逆の活性化の仕方を示し活性化されたとき赤色、対して不活性化されたとき青色、これはより不良な生存及びそれに寄与する分子レベル図の形に従いmRNA、CNA、miRNA又はDNAメチル化を伴うその他のクラスターとは対照的である。pdgm3におけるMMP2の下方制御はDNAメチル化による一方、その他の腫瘍ではDNA欠失によることが分かる。miRNAの中で、has-let7-bはpgm3において上方制御され、その他では下方制御され、その標的のAURKBと相補的であった。DNA増幅及びmRNA発現の両方は発現の調節解除の原因と見られた。アンギオポエチン受容体tie2媒介性シグナル伝達00298Angファミリーは、ヒト癌の発症及び成長の間の血管新生において重要な役割を果たす。Ang2の血管新生における役割は、概してAng1の拮抗体であって、血管成熟及び安定化に重要な、Ang1促進性のTie2シグナル伝達を阻害すると考えられる23。Ang2は、別の重要な血管新生因子である血管内皮増殖因子AVEGFAと共に、協働的に血管新生を調整するHashizume,H.etal.,2010,Complementaryactionsofinhibitorsofangiopoietin-2andVEGFontumorangiogenesisandgrowth,70:2213-2223。新しいデータは、ヒト癌が進行する間の浸潤性表現型の癌細胞の血管新生におけるAng2のより複雑な役割を示唆する。特定のアンギオポエチンAngファミリーメンバーはTie1を活性化することができ、例えばAng1は内皮細胞においてTie1リン酸化を誘導する2Yuan,H.T.etal.,2007,ActivationoftheorphanendothelialreceptorTie1modifiesTie2-mediatedintracellularsignalingandcellsurvival,21:3171-3183。しかしながら、Tie2が内皮細胞において下方制御されるとき、Ang1はTie1リン酸化を誘導できず、及びAng1が存在しない場合に、Tie1リン酸化は構成的に活性な形態のTie2又はTie2作動性抗体のいずれかにより誘導されるため、Tie1リン酸化はTie2依存性である25Yuanetal.2007上記。Ang1媒介性AKT及び42/44MAPKリン酸化は主にTie2媒介性であり、Tie1はこのパスウェイを下方制御する。従ってTie1の主な役割は、Tie2駆動性のシグナル伝達を下方制御するその能力及び内皮生存により、血管形態形成を調整することである。両方のTie2媒介性シグナル伝達並びにVEGFR1及び2媒介性シグナル伝達及び特異的シグナルが、このデータセットにおいて観察された。ERBB400299ERBB4は、乳房形態形成における増殖及び細胞運動並びにErbb4を発現する乳房原始上皮の方向性のある細胞運動に寄与する一方で、乳房細胞運命を促進する。Nrg3/Erbb4シグナル伝達の候補エフェクターは同定されており、ここでは初期の乳腺発生及び癌に関連する他のシグナル伝達パスウェイと相互作用することが示されている。ErbB4の生体内での主要な機能の1つは、妊娠及び泌乳誘導中の乳腺の成熟にある。妊娠及び長期の泌乳期間は乳癌リスクの低下と関連付けられており、従って腫瘍抑制におけるErbB4の役割は、泌乳におけるその役割と結び付けられ得る。ほとんどの報告は、思春期に他のErbBファミリーメンバーにより引き起こされる成長刺激を反転させることにおけるErbB4の役割と一致するが、しかしながらERBB4発現との生存の有意な関連性は確認されていないSundvall,M.etal.,2008,RoleofErbB4inbreastcancer,13:259-268。実施例XXXVII:非浸潤性乳管癌DCISにおける分類のためのPARADIGM00300マウスモデルでの前癌性過形成腺における免疫応答の関与を考慮してUrsini-Siegel,J.etal.,2010,Receptortyrosinekinasesignalingfavorsaprotumorigenicstateinbreastcancercellsbyinhibitingtheadaptiveimmuneresponse,70:7776-7787、本発明者らは、DCISケースから構成される既に発表されたデータセットを分析し、浸潤性腫瘍で観察される強い免疫応答及びインターロイキンシグナル伝達が前癌期においても同様に存在するかどうかを見出した。非浸潤性乳管癌DCISは非浸潤型の乳癌であり、一部の病変は急激に浸潤性乳管癌IDCに移行する一方、他の病変は変化しないままであると考えられている。本発明者らは、以前に、31例の純粋なDCIS、36例の純粋な浸潤癌及び42症例の混合診断浸潤癌で非浸潤性要素を伴うものの遺伝子発現パターンを研究しMuggerudetal.2010上記、組織学的悪性度が高いDCIS間でのトランスクリプトームの多様性を観測して、進行性腫瘍により類似した遺伝子発現特徴を有する個別的なDCISサブグループを同定している。このコホート全体IDC及びILCを含むについてのPARADIGM結果のヒートマップは図25C、及び純粋なDCIS試料についてのヒートマップは図25D。いずれの純粋なDCIS腫瘍も、高マクロファージ活性に典型的なシグナル伝達によって特徴付けられるprgm2型ではなかった図25。それと一致して、実験的研究から、原発性乳腺腺癌におけるマクロファージは、その血管新生促進特性の結果として後期発癌を調節するとともにLin,E.Y.andPollard,J.W.,2007,Tumor-associatedmacrophagespresstheangiogenicswitchinbreastcancer,67:5064-5066;Lin,E.Y.etal.,2007,Vascularendothelialgrowthfactorrestoresdelayedtumorprogressionintumorsdepletedofmacrophages,1:288-302、悪性乳房上皮細胞に上皮成長因子EGFを提供することにより肺転移を助長することが実証されている。ここでも、DCISにおいてPARDIGM解析により同定された上位の調節解除パスウェイには、IL2、4、6、12、23、及び23シグナル伝達に関与するものがあった。00301両方のデータセットDCIS、MicMaにおいて、ナイーブCD8T細胞におけるTCRシグナル伝達は、CD8T細胞を動員することが知られる多数のケモカインと共にリストの上位にあった。1つはIL-12であり、これは、NK細胞及びT細胞からのIFN-γ産生を刺激することが示された抗原提示細胞により産生される。IFN-γパスウェイは、調節解除されたパスウェイの1つで、DCISにおけるリストのより上位であった。IFNγはTh1細胞及びNK細胞から産生され、抗腫瘍免疫応答を惹起することが示された。第I相臨床試験において、トラスツズマブハーセプチンの臨床効果は、HER2過剰発現腫瘍を有する患者にIL-12を同時投与することで増強されることが示されており、この効果はNK細胞におけるIFNγ産生の刺激により媒介される29。DCISでは、他の最も強力な寄与体表8は84_NOX4であった。酸素検知性NAPHDオキシダーゼのNOX4、及び食細胞型Aオキシダーゼは、好中性顆粒球における多量の活性酸素種ROSの産生、一次免疫応答に関与するものと同様である。また、FN1フィブロネクチン、及び血小板由来成長因子受容体であるPDGFRBも、COL1A2、IL12/IL12R/TYK2/JAK2/SPHK2、ESR1及びKRT14と共に、DCISにおいて合わせて特異的に繰り返し現れた。00302これらの遺伝子/パスウェイは全て、細胞外マトリックスにおける機能、細胞間相互作用、並びに線維症及び角質化に寄与しているように見える。例えば、フィブロネクチン-1、FN1は、細胞表面上、細胞外液、結合組織、及び基底膜に存在する高分子量糖タンパク質ファミリーに属する。フィブロネクチンは他の細胞外マトリックスタンパク質及び細胞リガンド、例えば、コラーゲン、フィブリン、及びインテグリンと相互作用する。フィブロネクチンは細胞の接着及び遊走プロセスに関与する。血小板由来成長因子受容体のPDGFRは、上皮成長因子EGFと共に、重要な受容体チロシンキナーゼRTKであるEGF及びPDGFの受容体を介してシグナルを伝達する。重要なことに、ここで特定のDCISにおいて過剰発現することが分かったPDGFRは、スニチニブの標的でありFratto,M.E.etal.,2010,Newperspectives:roleofsunitinibinbreastcancer,161:475-482、及びメシル酸イマチニブグリベックの二次標的であるWeigel,M.T.etal.,2010,Invitroeffectsofimatinibmesylateonradiosensitivityandchemosensitivityofbreastcancercells,10:412。INFγ産生を増加させることにより媒介される上記のトラスツズマブハーセプチンの免疫賦活の役割とは逆に、イマチニブはTCR活性化CD4T細胞によるインターフェロン-γ産生を阻害することが示された。これらの観察は、DCIS及び悪性細胞の表面に提示される成長因子受容体間の相互作用並びに免疫構成を明らかにする点で、本発明者らの議論にとって興味深い。PDGFRに対する刺激性自己抗体は、I型コラーゲンの発現増加をもたらすRas、ERK1/ERK2、及び活性酸素種ROSを含む細胞内ループを引き起こすと見られることが示された。これは、本発明者らの研究で同様にDCISにおいて調節解除されるとして観察されたCOL1A2発現と一致する。実施例XXXVIII:材料及び方法00303本解析は、約110例の乳癌から収集したデータに適用し、mRNA発現はAgilent社の全ヒトゲノム4×44K1色法オリゴアレイにより解析した。コピー数変化CNAは、Illumina社のHuman-1109KBeadChipを使用して解析した。このSNPアレイは遺伝子中心的であり、平均物理距離が30kbのゲノム全体を網羅するマーカーを含み、かつ15,969個の固有の遺伝子を表す2004年5月構築、hg17、NCBIBuild35。各試料を全ゲノム増幅に供した。BeadStudiov.2.0、Illumina社を使用して、dbSNPbuild125の順方向の対立遺伝子の向きを参照して遺伝子型レポート及びlogR値を抽出し、CNAについてlogR値を調整した。00304AgilentTechnologies社のHumanmiRNAMicroarrayKitV2を使用して、製造者のプロトコルに従い全RNAからのmiRNAプロファイリングを実施した。Agilent社のScannerG2565Aでのスキャニング及びFeatureExtractionFEv9.5を使用してシグナルを抽出した。重複ハイブリダイゼーションを用いて99試料、種々のアレイ及び時間点で実験を行った。2つの試料は1回のみプロファイル決定した。複製プローブのmiRNAシグナル強度をプラットフォームで平均化し、log2変換して、75パーセンタイルに正規化した。FEv9.5の初期設定により、miRNA発現状態を各試料中における各遺伝子の存在又は非存在としてスコア化した。00305DNAメチル化。EpiTect96重亜硫酸キットBisulfiteKitQiagenGmbH社、独国を使用して、1マイクログラムのDNAを重亜硫酸処理した。500ngの重亜硫酸処理したDNAを、807個の癌関連遺伝子における1505ヶ所のCpG部位を同時に解析するGoldenGateメチル化癌パネルIMethylationCancerPanelIIllumina社、CA、米国を使用して解析した。遺伝子当たり少なくとも2つのCpG部位が解析され、ここで1つのCpG部位はプロモーター領域にあり、1つのCpG部位は最初のエクソンにあり、メチル化データの初期処理にはBeadstudioソフトウェアを、製造者のプロトコルに従い使用した。各CpG部位の検出p値を使用して試料パフォーマンスを検証し、検出p値に基づきデータセットをフィルタリングし、ここで検出p値>0.05のCpG部位を以降の解析から除外した。00306データ前処理及びParadigmパラメータ。コピー数をCBSを用いてセグメント化し、次に、hg18のRefSeq遺伝子座標にわたる全てのセグメントの中央値を取ることにより、遺伝子レベルの計測値にマッピングした。mRNA発現について、計測値は、各プローブについて発現値中央値を減じることにより、第1のプローブで正規化した。各プローブの製造者のゲノム位置を、UCSC社のliftOverツールを使用してhg17からhg18に変換した。次に、RefSeq遺伝子に重なる全てのプローブの中央値を取ることにより、遺伝子毎の計測値を得た。製造者の説明を用いてメチル化プローブを遺伝子と対応させた。各データセットを個別に分位点変換することにより、先のとおりParadigmを実行し10、しかしデータは、5及び95の分位点においてではなく、等しいサイズのビンに離散化した。パスウェイファイルは、先に解析したとおりPID36からであった。図26は、各データ型における上のビン又は下のビンのいずれかの観測割合をカウントし、次に任意のデータ型において観測割合が最大のビンで各ノードをラベル化することによる、離散化した入力データの及びIPL値ではない要約を示す。HOPACH教師なしクラスタリング00307Rバージョン2.12上で動くHOPACHRインプリメンテーションバージョン2.1037を使用して、クラスターを導き出した。全てのデータ型で相関距離計量を使用し、但しParadigmIPLは例外で、非正規分布、かつゼロ値が見られたため、cosangleを使用した。5サンプル未満を含む任意のサンプルクラスターについては、各サンプルを、より大きいクラスター中の最も類似するサンプルと同じクラスターにマッピングした。MicMaデータセットのParadigmクラスターは、MicMaデータセットにおける各クラスターのメドイドmediod中央値関数を使用を決定し、次に別のデータセットの各サンプルを、cosangle距離により最も近かったいずれかのクラスターメドイドmediodに割り当てることにより、他のデータ型にマッピングした。00308カプランマイヤーKaplain-Meier、クラスター濃縮。Rバージョン2.12を使用して、カプランマイヤー統計、プロット、及びクラスター濃縮を決定した。coxph比例ハザードモデルからワルド検定を使用してコックスp値を決定し、及びsurvdiff関数からカイ二乗検定によりログランクp値を決定した。クラスタリングについての遺伝子の値又はパスウェイメンバーの値の全体的な濃縮をANOVAにより決定し、かつ特定のクラスターラベルについての遺伝子の濃縮を、特定のクラスターにおける遺伝子の値と、他の全てのクラスターにおける遺伝子の値とのT検定により決定した。p値調整のベンジャミニとホッホバーグBenjaminiHochbergの方法を用いてFDRを決定した。実施例XXXIX:データセット及びパスウェイ相互作用00309コピー数及び発現データの両方をPARADIGM推論に組み込んだ。8個の正常組織対照の集合が発現データにおける解析に利用可能であったため、患者の遺伝子値の各々を、正常な卵管対照で観察される遺伝子の中央値レベルを減じることにより正規化した。コピー数データは、腫瘍で検出された遺伝子レベルと、それに対する血液正常レベルとの間のコピー数の差異を反映するように正規化した。PARADIGMへの入力のために、発現データは、サブタイプ解析に使用したものと同じ統合データセットから取り、コピー数は、MSKCCAgilent社の1Mコピー数データのセグメント化コールから取った。00310131個のパスウェイ、11,563個の相互作用、及び7,204個のエンティティを含むNCI-PIDからパスウェイの集合体を入手した。エンティティは、PARADIGMのグラフィカルモデルにおいてノードとして表現される分子、複合体、小分子、又は抽象概念である。抽象概念は、一般的な細胞プロセスアポトーシス又は光の吸収など、及びシグナルトランスデューサーのRASファミリーなどの機能的活性を共有する遺伝子のファミリーに対応する。本発明者らは、タンパク質間相互作用、転写調節相互作用、リン酸化及びユビキチン化などのタンパク質修飾相互作用を含む相互作用を収集した。実施例XL:パスウェイ文脈における統合分子活性の推論00311本発明者らは、コピー数、遺伝子発現、及び各エンティティのパスウェイ文脈を反映する統合パスウェイ活性IPAを割り当てるPARADIGMを使用した。00312データの遺伝子特異的及び患者特異的な断面の順列を使用して、IPAの有意性を評価した。ゲノム中の各遺伝子についての遺伝子発現とコピー数とのペアの値を無作為に選択することにより、1000個のヌル患者のデータを作成した。PARADIGMIPAの有意性を評価するため、本発明者らはパスウェイ構造を維持しながらパスウェイにランダム遺伝子を割り当てることにより、ヌル分布を作成した。実施例XLI:FOXM1パスウェイの同定00313FOXM1ネットワーク内の全ての遺伝子を使用してランダムシミュレーションの間に統計的有意性を評価したが、FOXM1パスウェイの視覚化を可能とするため、図29により有意に変化したIPAを有するFOXM1に直接連結されたエンティティを、図27に含めるために選択した。これらのうち、DNA修復及び細胞周期制御において役割を有する遺伝子であって、FOXM1との相互作用について文献の裏付けがあると認められたものを表示した。元のNCI-PIDパスウェイに見出されなかったBRCC複合体メンバーを、NCI-PIDによればFOXM1の標的であるBRCA2と共にプロットに含めた。上流DNA修復標的を、他のNCIパスウェイにおけるCHEK2の上流直接因子を見つけることにより同定した例えば、PLK3シグナル伝達パスウェイにおいてATMからの間接的リンクが見出された。実施例XLII:クラスタリング00314活性及び非活性の確率の変化を直接的に表す推論活性の使用により、様々な種類のエンティティをまとめて1つのヒートマップにクラスター化することが可能となる。PARADIGM推論の結果を包括的に視覚化するため、EisenCluster3.0を使用して特徴フィルタリング及びクラスタリングを実施した。0.1の標準偏差フィルタリングにより7204個中1598個のパスウェイエンティティが残り、エンティティ及び試料の両方に対して平均連結法、非中心化相関階層的クラスターを実施した。実施例XLIIIゲノムDNAの単離00315血液試料2-3mlを患者から採取し、使用時まで、EDTAを含有する試験管に-80°Cで保存する。この血液試料から、DNA単離キットPUREGENE,GentraSystems社、ミネソタ州ミネアポリスを使用して製造者の指示に従いゲノムDNAを抽出する。DNA純度は、ベックマン分光光度計で計測した260nm及び280nmにおける吸光度の比1cm光路;A260/A280として計測される。実施例XLIV:SNPの同定00316患者のDNA試料からの遺伝子領域は、PCRにより、その領域用に特別に設計されたプライマーを使用して増幅する。PCR産物は、上記に開示されるとおりの当業者に周知の方法を用いて配列決定する。配列トレースで同定されるSNPを、Phred/Phrap/Consedソフトウェアを使用して検証し、NCBISNPデータバンクに寄託されている既知のSNPと比較する。実施例XLV:統計的解析00317値は平均値±SDとして表現される。χ2分析WebChiSquareCalculator,GeorgetownLinguistics,GeorgetownUniversity,ワシントンD.C.を使用して、正常な対象と障害を有する患者とにおける遺伝子型頻度間の差異を評価する。事後解析を伴う一元配置ANOVAを示されるとおり実施して、異なる患者群間の血行動態を比較する。00318当業者は、上述の実施形態の様々な適応例及び改良例を本発明の範囲及び精神から逸脱することなく構成し得ることを理解するであろう。当該技術分野において公知の他の好適な技術及び方法は、当業者によって数多くの具体的な様式で、かつ本明細書に記載される本発明の説明に照らして適用され得る。従って、本発明は本明細書に具体的に記載される以外でも実施され得ることが理解されるべきである。上記の説明は例示的であり、限定的であることを意図するものではない。上記の説明を検討することで、当業者には多数の他の実施形態が明らかであろう。従って本発明の範囲は、特許請求の範囲に認められる均等物の全範囲と共に、添付の係る特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。検証済みの突然変異は、独立したアッセイで確認されたものである。その多くは、同じ腫瘍由来の第2の独立したWGA試料を使用して検証される。未検証の突然変異では、独立した確認はまだ行われていないが、真の突然変異である尤度が高い。手計算により、TP53において更なる25個の突然変異が認められた。"