ヘッジホッグシグナル伝達経路を特徴付けるための研究ツールとしての、次の一般式:式中、Xは、オルト、メタまたはパラ位において、H、OH、NH2、ハロゲン原子、1~10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、アルコキシ基、3~8個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはアリール基を表し;R8は、X基を有する炭素以外の炭素上のオルト、メタまたはパラ位において、NHR1、OR1またはNHR1を表し;Wは、H、OH、NH2またはハロゲン原子を表し;R1、R2およびR3は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して;水素原子;または1~10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基1以上の2重もしくは3重結合で任意に不飽和であり、1以上のヘテロ原子、1以上のハロゲン原子または1以上のアリールもしくはヘテロアリール基で任意に置換される;または3~8個の炭素原子を有するシクロアルキル1~10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基またはアルコキシ基で任意に置換されるを表し;R4、R5、R6およびR7は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して、H、Cl、Br、I、CN、NO2、1~10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、アルコキシ基、または3~8個の炭素原子を有するシクロアルキルから選択され;R3およびR4は、それらを有するキノリン環の隣接する窒素および炭素原子と一緒になって5もしくは6員環を形成するように縮合することができると解釈されるの少なくとも1つの化合物の使用。一般式の化合物が、プロピル4ベンゾエートエチル4ベンゾエートエチル4ベンゾエート4安息香酸ブチル4ベンゾエートtertブチル4ベンゾエートベンジル4ベンゾエートNフェニル1ヘキシル4ヒドロキシ2オキソ12ジヒドロキノリン3カルボキシアミドイソプロピル4ベンゾエートから選択されることを特徴とする、請求項1に記載の使用。次の工程:aSmo一般式の化合物複合体を得るため、Smoothened受容体と一般式の化合物の少なくとも1つとを接触させ;bSmoothened受容体、一般式の前記化合物および試験分子を接触させ;c工程bで回収されたSmoothened受容体をSmo一般式の化合物複合体と比較することによって、前記Smoothened受容体と前記試験分子との相互作用を検出し;そしてdSmoothened受容体との相互作用が測定される前記試験分子を選択するを含む、Smoothened受容体のSmo2結合部位のリガンドをスクリーニングおよび/または特定するための方法。前記工程aが液相で行われ、該工程が次の工程:aSmo一般式の化合物複合体を得るため、Smoothened受容体と一般式の化合物の少なくとも1つとを接触させ;bSmoothened受容体、一般式の前記化合物および試験分子を接触させ;c場合により1以上の試験分子および/または一般式の前記化合物に結合させた、前記Smoothened受容体を回収し;d工程cで回収されたSmoothened受容体をSmo一般式の化合物複合体と比較することによって、前記Smoothened受容体と前記試験分子との相互作用を検出し;そしてe相互作用が測定される前記試験分子を選択するを含むことを特徴とする、請求項3に記載の方法。工程aが固体担体上で行われることを特徴とする、請求項3に記載の方法。前記方法が、Smo2結合部位に結合しないSmoothened受容体リガンドを特定することができる方法であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。その方法が、請求項3~6のいずれか1つに記載の1つの方法の工程と追加の工程:-Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞と前記の選択された分子とを接触させ、そして-前記細胞の前記細胞応答を誘導することができる分子を選択するとを含むことを特徴とする、Smoothened受容体アゴニストを特定するための方法。次の工程:a前記細胞応答を誘導するために、Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞を、請求項1または請求項2で定義された一般式の化合物の少なくとも1つと一緒に培養し;b工程aの最後で得られる細胞を試験分子と接触させ;c前記細胞の前記細胞応答の阻害を誘導する分子を選択するを含む、Smoothened受容体アンタゴニスト分子を特定するための方法。次の工程:a前記細胞応答を誘導するために、Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞を、請求項1で定義された一般式の化合物の少なくとも1つと一緒に培養し;b工程aの最後で得られる細胞を試験分子と接触させ;cSmoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞の細胞応答の増大を誘導する分子を選択するを含む、Smoothened受容体活性化の増強を誘導することができるアンタゴニスト分子を特定するための方法。少なくとも機能的Smoothened受容体と請求項1または請求項2で定義された一般式の化合物の少なくとも1つを含むキット。次の工程:a試験細胞を請求項1または請求項2で定義された一般式の標識された化合物と接触させ;b前記試験細胞の受容体に少しも結合していない、一般式の前記標識された化合物を除くために前記細胞を洗浄し;c標識された細胞を検出するを含む、Smoothened受容体を発現している、腫瘍細胞のような細胞を特定するための方法。本発明者らは、分化を活性化するキノリン誘導体である新規な化合物を発見した;これらの化合物によって誘導される生物活性は、SAG、Smoアゴニストと比較して異なる薬理学的特徴を有するSmoアンタゴニストによって阻害され、それは、これらの化合物がSAGの結合部位とは異なる結合部位に作用することを立証している。これらの化合物は、次の一般式によって定義される:式中、Xは、オルト、メタまたはパラ位において、H、OH、NH2、ハロゲン原子、好ましくは塩素もしくは臭素、1~10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、アルコキシ基、3~8個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはアリール基を表し;R8は、X基を有する炭素以外の炭素上のオルト、メタまたはパラ位において、NHR1、OR1またはNHR1を表し;Wは、H、OH、NH2またはハロゲン原子、好ましくは塩素もしくは臭素を表し;R1、R2およびR3は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して;水素原子;または1~10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基1以上の2重もしくは3重結合で任意に不飽和であり、OおよびSのような1以上のヘテロ原子、1以上のハロゲン原子または1以上のアリールもしくはヘテロアリール基、好ましくはピリジン基で任意に置換される;または3~8個の炭素原子を有するシクロアルキル1~10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基またはアルコキシ基で任意に置換されるを表し;R4、R5、R6およびR7は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して、H、Cl、Br、I、CN、NO2、1~10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、アルコキシ基、または3~8個の炭素原子を有するシクロアルキル、例えばシクロプロピル、シクロペンチルもしくはシクロヘキシルから選択され;R3およびR4は、それらを有するキノリン環の隣接する窒素および炭素原子と一緒になって5もしくは6員環を形成するように縮合することができると解釈される。本発明のために、アルキルの用語は、1~10個の炭素原子、好ましくは3~8個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖状の飽和炭化水素ベースの脂肪族基を意味することが意図される。分枝の用語は、1~6個の炭素原子を有する少なくとも1つのアルキル基、例えばメチルまたはエチルを、直鎖のアルキル鎖が有していることを意味する。好ましくは、一般式の化合物は、R3基が、3~8個の炭素原子を有するアルキル基、例えばヘキシル基であり;R2基が、水素原子または1~3個の炭素原子を有するアルキル基であり;R4、R5、R6およびR7基は、水素原子または1~3個の炭素原子を有するアルキル基を表すようなものである。ハロゲン原子の用語は、臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素原子を意味することが意図され;臭素および塩素の意味が好ましい。アリール基の用語は、少なくとも1つの芳香環から誘導されるいずれかの官能基または置換基を意味することが意図され;フェニル、ベンジルシクロブテン、ペンタレン、ナフタレン、ベンジルフェニルおよびアントラセン基が挙げられうる。ヘテロアリール基の用語は、前で定義された芳香環の少なくとも1つから誘導され、かつP、S、OおよびNから選択されるヘテロ原子を少なくとも1つ含む、いずれかの官能基または置換基を意味することが意図されヘテロアリール基の中で、フラン、ピリジン、ピロール、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、インドール、イソインドール、ベンゾチオフェン、ベンゾcチオフェン、ベンズイミダゾール、インダゾール、ベンズオキサゾール、ベンズイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プリンおよびアクリジン基が挙げられうる。したがって、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達経路を特徴付けるための研究ツールとしての、前で定義された一般式の化合物の使用に関する。一般式の化合物として、非限定的に、次の化合物が特に挙げられうる:プロピル4ベンゾエートエチル4ベンゾエートエチル4ベンゾエート4安息香酸ブチル4ベンゾエートtertブチル4ベンゾエートベンジル4ベンゾエートNフェニル1ヘキシル4ヒドロキシ2オキソ12ジヒドロキノリン3カルボキシアミドイソプロピル4ベンゾエート本発明に基づく一般式の化合物は、図1に示される合成スキームに従って製造される。図1の合成スキームに従って、第1の工程において、アニリンが、キノリノンカルボキシレートを得るためにマイクロウエーブ照射下、トリエチルメタントリカルボキシレートと縮合され;次に、該キノロンが、カルボキシアミドキノリノンエステルを得るためにマイクロウエーブ照射下、4tertブチルアニリンと縮合され;次の工程は、酸を得るためにこれらの化合物のエステル官能基をけん化することからなり、該酸が、実施例に示される種々の変更のための出発点である。以下において、SAGが結合するSmo受容体の部位はSmo1と呼ばれ、一般式の化合物が結合するSmo受容体の部位はSmo2と呼ばれる。さらに、一般式のこれらの化合物は、Hhタンパク質シグナル伝達経路または多能性細胞もしくは全能細胞を維持するかまたは分化させることに関与する他の経路、例えばWnt、Nocht、TGFβまたはBMP経路に作用することができる。それゆえ、これらの化合物は、これらのシグナル伝達経路の新しい調節剤を発見するためおよびSmo受容体または関連受容体の種々の型を検出しこれらの種々の型を調節することができる分子を特定するための両方のツールとして非常に有用であることが判る。ヘッジホッグ経路の調節剤のための種々のスクリーニング方法が知られている:-系列または初代培養の細胞応答:細胞分化、細胞増殖を用いる方法;-標的受容体の膜貫通領域に作用する蛍光化合物との競争を用いる方法-前記経路に関連するレポーター遺伝子を用いる方法;-試験化合物の存在または非存在下、PtcHh相互作用を測定することによりHh活性を検出するアッセイ;-Smoの下流に作用するHh経路の阻害剤を特定するため、Sufuおよびレポーター欠損細胞を用いるアッセイ。したがって、本発明は、研究ツールとして、特にSmo2結合部位に結合することによってSmoothenedと相互作用することができる分子を特定するための一般式の化合物の少なくとも1つの使用に関する。特に、本発明は、Smoothened受容体のSmo2結合部位のリガンドをスクリーニングするためおよび/または特定するための方法に関し、その方法は次の工程を含む:aSmo一般式の化合物複合体を得るため、Smoothened受容体と一般式の化合物の少なくとも1つとを接触させ;bSmoothened受容体、一般式の前記化合物および試験分子を接触させ;c工程bで回収されたSmoothened受容体をSmo一般式の化合物複合体と比較することによって、前記Smoothened受容体と前記試験分子との相互作用を検出し;そしてdSmoothened受容体との相互作用が測定される前記試験分子を選択するを含む。工程aは、Smoothened受容体を発現する細胞または機能的Smoothened受容体を含む膜の抽出物、特に、Rivoyreetalによって記載された方法を用いて得ることができる、機能的ヒトSmoothened受容体を有する酵母膜の抽出物を用いて行うことができる。工程aがSmoothened受容体を発現する細胞を用いて行われるとき、前記受容体の発現は、構成的であるか、細胞の形質転換から生じるその他のいずれかであり、それゆえ、それは同種または異種のSmoothened受容体を発現または過剰発現する。このSmoothened受容体は、それに野生型受容体と異なる生化学的または薬理学的性質を付与する変異体を有することもできる。一般式のいずれかの化合物が、本発明の方法を行うために用いられることができる;しかしながら、それは、特にSmoothened受容体に対するその親和性により、当業者によって選択されうる。工程aは、液相中または適当な固体担体上で行われる;当業者は、例えば膜抽出物の形態または精製されたタンパク質の形態でのSmoothened受容体を用いるかどうかによって、実施のこれらの様式を選択して適応させるであろう。工程aが液相中で行われるとき、液相スクリーニング法は次の工程に従って行われる:aSmo一般式の化合物複合体を得るため、Smoothened受容体と一般式の化合物の少なくとも1つとを接触させ;bSmoothened受容体、一般式の前記化合物および試験分子を接触させ;c場合により1以上の試験分子および/または一般式の前記化合物に結合させた、前記Smoothened受容体を回収し;d工程cで回収されたSmoothened受容体をSmo一般式の化合物複合体と比較することによって、前記Smoothened受容体と前記試験分子との相互作用を検出し;そしてe相互作用が測定される前記試験分子を選択する。工程aは、Smoothened受容体を含む膜抽出物を用いて行うことができ、次いでそれを一般式の化合物および試験分子とインキュベートし;次いで該混合物を遠心分離にかけ;遠心分離後得られるペレットを緩衝液中に再懸濁させ、次いで非特異的相互作用を除くために再度遠心分離にかける。次いで、試験分子のSmoothened受容体への結合を、蛍光を測定するかまたは一般式の化合物の標識化による放射活性を測定するかのいずれかにより分析する:-液相スクリーニング法の一つの変形によれば、一般式の前記化合物を予め標識化する。標識化は、先行技術の慣用の方法に従って、3H、11C、14C、32P、35S、125I、99mTc、18F、64Cu、76Br、124I、13N、15Oあるいは123Iのような放射性同位体の組み込みにより放射活性となり得る。一般式の化合物の標識化は、当業者に公知の方法に従って、蛍光体を前記化合物に結合させることからもなりうる;標識は、通常、検出される放射性原子によって選択される放射線画像装置を用いるか、蛍光を測定することにより検出されうる。その場合、Smoothened受容体と1以上の試験分子との間の相互作用を検出する工程dは、工程cで回収されるSmoothened受容体の放射活性によるかまたは蛍光による標識を、Smo一般式の化合物複合体のそれと比較することによって行われる;選択される分子は、工程cで回収されるSmoothened受容体の標識がSmo一般式の化合物複合体のそれより弱いものである。-液相スクリーニング法のもう1つの変形によれば、相互作用の検出は、Smo一般式の化合物複合体の位置を工程cで回収されるSmoothened受容体のそれと比較することによるクロマトグラフィーによって行われる;もし位置が同じであれば、そのときはSmoothened受容体と試験分子との間の相互作用はなく;逆に、位置における差は、相互作用を示す;そのときは、試験分子とSmoothened受容体との間の相互作用が、Smo2結合部位で実際に起きていることを確認することが望ましい。あるいは、本発明によるスクリーニング法の工程aは、適当な固体担体上で行われうる。固体担体の用語は、特に、酵素、抗体、ペプチド、微生物、生物組織、脂質、核酸等のような生物学的単位を含む膜からなる、試験分子との結合を可能にするバイオセンサー、およびリガンドのタンパク質受容体への結合のような生物学的シグナルを測定可能な物理的シグナル、例えば電気化学的、光学的、圧電性または熱量測定のシグナルに変換することを可能にするトランスデューサーを意味することが意図される。本件の場合、膜上に結合された生物学的単位はSmoothened受容体であり;並行して行われる2つの実験において、固体担体上のSmoothened受容体が一般式の化合物および一般式の前記化合物と試験分子との混合物と接触させられ、これらの実験のそれぞれにおいて得られるシグナルが比較され、該シグナルの変更を誘導する分子が選択される。例として、固体担体は、プラズモン共鳴によって結合を検出するためのバイオセンサーであり、その使用は、バイオセンサーの表面での質量の変化により、タンパク質とそのリガンドとの間の相互作用を視覚化し特徴付けることを可能にする。質量のこの変化は、バイオセンサーの表面でのプラズモン共鳴の角度における変化により測定され、放射性標識されたリガンドまたは蛍光リガンドを必要としない。固体担体でのスクリーニング法が、Smoothened受容体を含む膜抽出物と一緒に行われるとき、これらの抽出物は脂溶性バイオセンサー上への注入により結合される。脂溶性バイオセンサーが用いられるとき、膜抽出物は、膜受容体とリガンドとの間の相互作用を追跡することができるデキストランに共有結合により結合された脂溶性基に結合するBindinginteractionsofEscherichiacoliwithglobotetraosylceramideusingasurfacePlasmonresonancebiosensorJMicrobiolMeth58313320WikstromAandDeinumJProbingtheinteractionofcoagulationfactorswithphospholipidvesiclesurfaceplasmaresonanceAnalBiochem36298107。したがって、本発明の変形によれば、プラズモン共鳴によって結合を検出するためのバイオセンサーは、その上へのSmoothened受容体を含む膜の調製が注入によって結合されるBiacoreセンサーチップL1疎水性バイオセンサーのような脂溶性バイオセンサーである。固体担体でのスクリーニング法が、精製されたSmoothened受容体と一緒に行われるとき、該受容体は、リガンドが該レセプターに結合するとき、レセプターが結合される接続部分の指標における変化を検出することにある表面プラズモン共鳴を測定するためのバイオセンサーに結合もされる。一つの態様の変形によれば、固体担体でのスクリーニング法は、Smo2結合部位に結合しないSmoothened受容体リガンドを特定することもできる;これらのリガンドの作用の活性化または阻害は、次の方法によって特徴付けられる。本発明は、Smoothened受容体アゴニスト、特にSmo2結合部位に結合するものを特定するための方法にも関し、それはリガンド特定法に対して記載された工程に加えて、Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞と特定されたリガンドを接触させることおよび該細胞の該細胞応答を誘導することができるアゴニスト分子を選択する追加の工程を含む。Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞は、アルカリホスファターゼ活性により測定可能な細胞分化でSmoothened受容体の活性化に応答する間葉細胞;細胞増殖でSmoothened受容体の活性化に応答する小脳の初代顆粒細胞;成体の脳もしくは神経前駆の幹細胞または発達の間もしくは成体中の組織に存在するその他の前駆細胞の系列または初代培養から選択され、例えば、それらに対する細胞応答は、Gliファミリーの転写因子をコードするような遺伝子またはヘッジホッグ経路により活性化される遺伝子であるPatchedもしくはHipをコードするその他の遺伝子のような遺伝子の誘導からなるうる。特に、本発明によるアゴニストを特定するための方法は、細胞応答として、フォルスコリンの存在下、試験化合物によるホスファターゼ活性の誘導を評価することによって行われうる実施例IIのパート2参照、そこで、SAGのように化合物1が骨形成を刺激することができることが示されている;化合物1アゴニストはホスファターゼ活性を誘導するためのポジティブコントロールとして役立つことができる。本発明は、Smoothened受容体アンタゴニスト分子を特定するための方法にも関し、次の工程を含む:a細胞応答を誘導するために、Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞を一般式の化合物の少なくとも1つと一緒に培養し;b工程aの最後で得られる細胞を試験分子と接触させ;c前記細胞の前記細胞応答の阻害を誘導する分子を選択する。この方法の例は、以下の実験の部実施例IIに示される。Smoothened受容体アンタゴニスト活性を試験することが求められる分子は、特に、SmoothenedのSmo2結合部位に結合するリガンドであって、本発明によるリガンドを特定する前記の方法のいずれか1つによって特定される。この同じ方法は、一般式の化合物によって誘導されるSmoothened受容体の活性化の増強を誘導することができる分子を特定するためにも用いることができる;増強の用語は、一般式の化合物によって誘導される活性化の度合いを増加させる分子の能力を意味することが意図される。それゆえ、Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞の細胞応答を増大することを誘導する分子が、選択されるであろう。本発明は、本発明による方法を行うためのキットにも関し、それは、少なくとも機能的Smoothened受容体と少なくとも1つの一般式の化合物を含む。機能的Smoothened受容体は、膜抽出物の形態かあるいはSmoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞のいずれかで存在する。Smoothened受容体と一般式の化合物との間の結合を含む実験は、次のものを特徴付けて特定するためにも用いることができる:-Smo2結合部位が活性である構造でSmoothened受容体を発現している新しい細胞型;または-Smoothened受容体に関連する受容体のような、分化に関与するその他の受容体。次に、本発明は、Smoothened受容体を発現している、腫瘍細胞のような細胞を特定する方法に関し、次の工程を含む:a試験細胞を一般式の標識された化合物と接触させ;b前記試験細胞の受容体に少しも結合していない、一般式の前記標識された化合物を除くために前記細胞を洗浄し;c標識された細胞を検出する。本化合物は、細胞分化、増殖、細胞死、遊走もしくは細胞生存、または細胞がまだ獲得したことがない性質もしくは状態を取得することができるその他のものに関与する新しい受容体もしくは受容体の新しい形態を特定し特徴付けるためにも用いることができる。本発明のもう1つの変形によれば、一般式の化合物は、Smo2結合部位でのSmoothened受容体の活性化の因果関係を研究するための研究ツールとして用いられる。そのような研究は、例えば、一般式の化合物と接触させることによる活性化の前および後の細胞によってメッセンジャーRNAおよび/またはタンパク質の発現プロファイルを比較することにある;該研究は、さらに、1つから誘導されかつ同じ細胞型の2つのグループの細胞、1つのグループの細胞は一般式の化合物で、他方はSmo1以外の結合部位に結合することが知られているSmoアゴニストで活性化された細胞のメッセンジャーRNAおよび/またはタンパク質の発現プロファイルを比較することからなる。mRNA定量化法は、遺伝子のファミリーまたは細胞によって発現されたその他の全ての遺伝子の発現パターンを解析することができる方法でありえ;ミクロRNA転写の調節も解析されうる。細胞のこの生化学的または分子的特徴付けが、一般式の化合物に感受性な腫瘍細胞を特定するために用いられ、それに続く段階で、一般式の化合物に感受性な腫瘍の診断方法を開発するために用いられる。一般式の化合物は、Smo受容体の変異体の生物学的機能を特徴付けるためにも用いられる;この特徴付けは、Smo変異体の発現のためのベクターで細胞を形質変換し、Smo変異体を発現する前記細胞への一般式の化合物の効果を観察することによって行うことができる。前記の取り決めに加えて、本発明は、以下の記載から現れるであろうその他の取り決めも含み、それは、本発明による一般式の化合物の薬理学的性質を示す実施例および次の添付の図にも言及する:実施例1:一般式の種々の化合物の合成エチル1ヘキシル4ヒドロキシ2オキソ12ジヒドロキノリン3カルボキシレートの製造コンデンサーを備えた丸底フラスコ中、メタントリカルボン酸トリエチルエステルの溶液に、Nヘキシルアニリンを加える。得られる反応混合物をCEMDiscoveryマイクロウエーブオーブン中に入れ、開放した丸底フラスコ中で照射し、次いで生成されるエタノールを溜去するパラメータは次のとおりである:出力250W、温度225°C、実行時間5分、保持時間15分。マイクロウエーブ加熱後、粗反応混合物を、41で石油エーテル:酢酸エチルを用いるクロマトグラフィーカラムで精製する。得られる結晶の生成物を乾燥し、本化合物:収量430mgを得る。1HNMRδ816764727719448418172086IAtertブチル4ベンゾエートエチル1ヘキシル4ヒドロキシ2オキソ12ジヒドロキノリン3カルボキシレートおよびtertブチル4アミノベンゾエートを無水トルエン中に懸濁し、開放の容器を用いてマイクロウエーブ加熱したパラメータは次のとおりである:出力200W、温度120°C、実行時間7分、保持時間10分。反応の最後で、溶媒の23をコンデンサーなしで蒸発させる。粗反応混合物を41の石油エーテル:酢酸エチルを用いるクロマトグラフィーカラムにより精製する。得られる結晶の生成物を乾燥し、標記の化合物:収量195mgを得る。1HNMRδ816790775738425160152139128084IB4安息香酸0°Cに冷却したトリフルオロ酢酸の溶液に、tertブチル4ベンゾエートを少しずつ加え、該混合物を3時間反応させる。得られる粗生成物を、白色の結晶固体が生じるまでエチルエーテルで洗浄する。生成物を乾燥し、収量61mgを得る。1HNMRδ816797765738427159139128084ICベンジル4ベンゾエート4安息香酸のTHF溶液を0°Cに冷却し、ベンジルアルコールをEDCIおよびジメチルアミノピリジンと一緒に加える。反応混合物を終夜撹拌する。有機層を水で洗浄し、減圧下に蒸発させる。粗生成物を41石油エーテル:酢酸エチルを用いるカラムクロマトグラフィーで精製し、収量30mgを得る。1HNMRδ816804783768746725738530428159141115084実施例II-SAG化合物が作用する部位とは異なる特定の結合部位に一般式の化合物が結合することの実証本発明による一般式の化合物の分化の刺激に対する効果を、インビトロで多能性線維芽細胞株C3H10T12を分析することにより測定した。この活性化は、Hh経路アンタゴニストとして前に記載された化合物、より具体的にはSmo受容体アンタゴニストにより阻害される。さらに、これらの薬剤は、Hh経路アゴニストであるSAGによって用いられるものとは区別されるシグナル伝達様式を有する。1材料と方法一般式の化合物による分化の活性化試験された一般式の化合物は、化合物1および6:であり、それらはジメチルスルホキシド中、25mMの濃度に溶解され、次いで、用いられるまで20°Cの温度で保存された。多能性線維芽細胞株C3H10T12は、ATCCによって推奨される条件下で培養された。これらの細胞の分化の刺激は、ChenらおよびFrankKamenetskyらによって記載された方法に従って、化合物の増大濃度を用いて行った。一般式の化合物による活性化は、細胞株の分化を引き起こし、該細胞株がアルカリホスファターゼを発現することを可能にする。したがって、アルカリホスファターゼ活性の測定によって化合物の活性を測定することができた。比較として、SAG化合物、Smo活性剤の活性を、一般式の化合物を試験するために用いられたのと同じ条件下で試験した。C3H10T12細胞を、ウエル当たり5×103細胞の密度で96ウエルプレートに播種し、24時間後、10のウシ胎仔血清が追加されたDMEM培地中、10nM~10μMの範囲の濃度で試験化合物を添加した。試験は4反復で行った。次いで、プレートを5CO2の雰囲気下、37°Cの温度で56日間インキュベートした。次いで細胞を冷たいリン酸緩衝液中で洗浄し、次いで、09のNaClおよび02のTritonX100を含む50μlの溶液中、4°Cでの超音波処理により溶解した。次いで、得られた溶解物中のアルカリホスファターゼを、Pepinskyらによって記載された方法に従って測定した。100μmの反応緩衝液と50μlの基質の溶液を添加後、該溶解物を37°Cで3060分間インキュベートし、次いで光学密度を415nmの波長で読み取った。ヘッジホッグ経路アンタゴニストによる分化の阻害阻害実験のため、Cur61414、シクロパミン、GDC0449、それから分子MRT14MRT79MRT80およびMRT81のような前記のSmo阻害剤の増大濃度の存在下、分化を刺激するため、化合物1、化合物6またはSAGを用いた。これらの化合物は、100エタノールまたはジメチルスルホキシドに溶解し、次いで20°Cで保存した。フォルスコリンおよびIWR1の活性フォルスコリンの存在下の実験のため、フォルスコリンの増大濃度の存在下、分化を刺激するため、化合物1およびSAGを用いた。一方、1μMでの化合物1または01μMでのSAGによる活性化に対して、IWR1化合物を10μMで用いた。アルカリホスファターゼ活性は前記のように測定された。2結果21化合物1および6による分化の活性化化合物1および6が、C3H10T12多能性細胞において骨形成を刺激する能力を有することが実証された。この分化は、分化6日後のアルカリホスファターゼの誘導に関連する。図2は、C3H10T12細胞の刺激に対して、化合物1および並列して作成されたSAGの用量作用曲線を表す。化合物1は、同様の親和性でSmoアゴニストSAGのそれよりも大きい最大刺激を得ることを可能にする。22Smoothenedアンタゴニストによる化合物1および6の活性の阻害化合物1の活性は、Smo受容体アンタゴニストによって阻害される。それは、シクロパミン、Cur61414、GDC0449または化合物MRT14およびMRT81のような公知のアンタゴニストの増大濃度の存在下、化合物1によって誘導されるアルカリホスファターゼ活性の段階的阻害に反映される。化合物6も、Smoアンタゴニストによって阻害されうる特性を有する。2つの化合物1および6において、試験されたアンタゴニストの活性を比較するとき、これら2つの骨形成刺激剤に対する大きな薬理学的類似が注目される。このことは、これらの化合物に関して作用が同一の様式であることを提示している。2つの化合物1および6に対する、Smoアンタゴニストの親和性が測定され、表Iに示される。それらは、アゴニスト化合物によって誘導される生物学的応答の50を阻害することができる濃度に相当するIC50として表される。化合物MRT14およびMRT81は、2つの化合物に対して非常に近い値を有して、その応答に対して良好な親和性を示す。化合物1および6に対して、MRT14の親和性は、それぞれ032および04μMであり、一方、両化合物に対するMRT81のそれは006μMである。逆に、シクロパミン、Cur61414およびGDC0449は、これらの化合物に対してほとんど親和性を有しない。表I:Smo2部位に対するヘッジホッグ経路アンタゴニストの親和性C3H10T12細胞の分化は、化合物1および6で誘導されるアルカリホスファターゼによって測定される。IC50値は、図3および4に示される阻害曲線から誘導される。4反復での2~6での平均。SAG化合物は、Smo1と呼ばれる結合部位に作用する。これら2つの化合物に対するアンタゴニストの薬理学の比較が表IIに示される。SAGまたは化合物1による刺激に対するSmoアンタゴニストの活性が比較されるとき、得られる最大阻害およびその親和性の両方の観点で重要な差異が存在する。第1の注目すべき差異は、化合物1に対して10μMで観察されたシクロパミン、Cur61414およびGDC0449によるより弱い阻害であるのにに対して、これらの化合物はSAGの存在での完全な阻害を可能にする。表II:Smo1およびSmo2部位に対するヘッジホッグ経路アンタゴニストの活性の比較化合物1およびSAG化合物によってC3H10T12細胞に誘導される間葉系幹細胞の細胞分化を測定する応答は、化合物1およびSAG化合物によって誘導されるアルカリホスファターゼ活性によって測定される。IC50値は、図3および5に示される阻害曲線から誘導される。SAG化合物および化合物1は、Smo1およびSmo2結合部位にそれぞれ結合する。それらの結合は、ヘッジホッグ経路アンタゴニストによりブロックされる。化合物MRT14およびMRT81それと化合物SANT1は、類似の値で、Smo1部位およびSmo2部位に対して同程度の親和性を示す。一方、その他のヘッジホッグ経路アンタゴニストは、Smo2部位よりSmo1部位に対してずっと選択的である。逆に、化合物MRT81およびMRT79は、Smo1部位よりSmo2部位に対してより選択的である。このことは、SAGおよび化合物1で得られる化合物のIC50値の間の比が計算されると明らかにされる。表III:Smo1およびSmo2部位に対するヘッジホッグ経路アンタゴニストの選択性Smo1部位およびSmo2部位に対するアンタゴニストのIC50値が、表IおよびIIにおけるように評価された。Smo2部位と比較してSmo1部位に対して、300倍以上の選択性がGDC0449で、17倍の選択性がCur61414で観察されるのに対して、SANT1はSmo1およびSmo2部位に対して類似の活性を保持する。逆に、化合物MRT81、MRT55およびMRT79は、Smo2部位に対して、それぞれ13、25および125倍より選択的である。前記化合物のこの特異性は、意義深いことであり、Smo1およびSmo2結合部位のレベルでの重要な薬理学的な差異を立証している。24Smo1とSmo2部位は異なる活性化のメカニズムを示すフォルスコリンによる化合物1およびSAGの活性の調節一般式の化合物およびSAGは、別個の経路により作用する。実際、フォルスコロンは、間葉系幹細胞におけるHh経路によって誘導される骨形成の阻害剤であることが知られている。以下の試験の目的は、この特性が一般式の化合物にも適用できるかどうかを決めることである。C3HT10T12細胞の分化は、フォルスコリンの存在下、化合物1によって刺激された。図6、パネルに示されるようよう、フォルスコリンが化合物1への応答において増強効果を有することを明示しているのに対して、フォルスコリンはSAG化合物の活性を阻害することを明示している。それゆえ、これら2つの骨形成刺激剤は、別個の経路により作用する。フォルスコリンののこの効果は、一般式のその他の化合物に対しても見られた。IWR1化合物、Wnt経路アンタゴニストによる、化合物1およびSAGの活性の調節化合物1およびSAGにおけるフォルスコリンの活性の差は、一般式の化合物の活性に関与する他の細胞内経路への探求に導いた。Hh経路に加えて、C3H10T12細胞の分化は、例えば、Wnt、Nocht、TGFβまたはBMP経路のようなシグナル伝達経路によって刺激される。Wnt経路に関して、カノニカル経路の活性化は、TCFLEF遺伝子の転写の活性に関与するβカテニンの活性化を誘導する。Wntリガンドの非存在下、βカテニンはリン酸化され、次いで分解される。最近、axin2を安定化し、βカテニンの破壊をもたらす分子IWR1が発見された。axin2および/またはβカテニンが、化合物1によって誘導されるシグナルの変換に関与することができるかどうかを決定するためにこの阻害剤が用いられた。IWR1は、1μMの濃度で用いられた化合物1の活性を60減ずることができるのに対して、SAGのそれは変えなかった。IWR1化合物を用いた化合物1の用量作用曲線は、アルカリホスファターゼ阻害に対して、IC5025μMを推定することを可能にした。この値は、Wnt形態形成経路の阻害を測定する試験により決定されたIWR1の親和性に一致する。この実験は、一般式の化合物の作用がaxin2タンパク質を含むことを示している。βカテニンの活性の制御におけるaxin2タンパク質の役割が、これらの化合物によって誘導される生物活性は、βカテニン経路を含みうることを提示している。この経路は、例えば結腸直腸癌のような多重病態と関連する。さらに一般的には、それは、胚および成体の組織中の幹細胞の維持に関与し、それは神経新生を調節し、遺伝病に関与する。それゆえ、Smo2結合部位をブロックすることができる選択的化合物の特定は、非常に興味がある。結論これらの実験は、Smo1もしくはSmo2部位の一方または他方、あるいは両方の部位に作用する特定の構造を示す細胞分化アンタゴニストを特定および選択するために、一般式の化合物を用いることができることを実証している。式の化合物によって誘導されるその他の生物学的応答増殖、遊走、アポトーシス、遺伝子誘導等の特定が、これらのSmo2結合部位を調節する化合物を特定するための試験の開発を可能にするであろう。これらの新規な化合物は、健康な個体または病状に罹患している個体におけるこれらの種々の応答を調節することを可能にするであろう。参考文献AhnSandALJoynerInvivoanalysisofquiescentadultneuralstemcellsrespondingtoSonichedgehogNature4378947AngotEKLoulieretalChemoattractiveactivityofsonichedgehogintheadultsubventricularzonemodulatesthenumberofneuralprecursorsreachingtheolfactorybulbStemCells26231120BeachyPASSKarhadkaretalTissuerepairandstemcellrenewalincarcinogenesisNature43232431BermanDMSSKarhadkaretalMedulloblastomagrowthinhibitionbyhedgehogpathwayblockadeScience297155961BruntonSAJHStibbardetalPotentagonistsoftheHedgehogsignalingpathwayBioorgMedChemLett19430811CharytoniukDETraiffortetalIntrastriatalsonichedgehoginjectionincreasePatchedtranscriptlevelsintheadultratsubventricularzoneEurJNeurosci1623517ChenBMEDodgeetalSmallmoleculemediateddisruptionofWntdependentsignalingintissueregenerationandcancerNatChemBiol51007ChenJKJTaipaleetalSmallmoleculemodulationofSmoothenedactivityProcNatlAcadSciUSA99140716CorcoranRBandMPScottOxysterolsstimulateSonichedgehogsignaltransductionandproliferationofmedulloblastomacellsProcNatlAcadSciUSA103840813CoulombeJETraiffortetalHedgehoginteractingproteininthematurebrainmembraneassociatedandsolubleformsMolCellNeurosci2532333FrankKamenetskyMXMZhangetalSmallmoleculemodulatorsofHedgehogsignalingidentificationandcharacterizationofSmoothenedagonistsandantagonistsJBiol110FreeseJLDPinoetalWntsignalingindevelopmentanddiseaseNeurobiolDis3814853HoKSandMPScottSonichedgehoginthenervoussystemfunctionsmodificationsandmechanismsCurrOpinNeurobiol125763IncardonaJPWGaffieldetalTheteratogenicVeratrumalkaloidcyclopamineinhibitssonichedgehogsignaltransductionDevelopment125355362InghamPWandAPMcMahonHedgehogsignalinginanimaldevelopmentparadigmsandprinciplesGenesDev15305987LaiKBKKasparetalSonichedgehogregulatesadultneuralprogenitorproliferationinvitroandinvivoNatNeurosci6217LoulierKMRuatetalIncreaseofproliferatingoligodendroglialprogenitorsintheadultmousebrainuponSonichedgehogdeliveryinthelateralventricleJNeurochem9853042LumLandPABeachyTheHedgehogresponsenetworksensorsswitchesandroutersScience30417559MaGYXiaoetalRecentprogressinthestudyofHedgehogsignalingJGenetGenomics3512937MaYAErkneretalHedgehogmediatedpatterningofthemammalianembryorequirestransporterlikefunctionofdispatchedCell1116375MartiEandPBovolentaSonichedgehoginCNSdevelopmentonesignalmultipleoutputsTrendsNeurosci258996McMahonAPPWInghametalDevelopmentrolesandclinicalsignificanceofhedgehogsignalingCurrTopDevBiol531114PepinskyRBRIShapiroetalLongactingformsofSonichedgehogwithimprovedpharmacokineticandpharmacodynamicpropertiesareefficaciousinanerveinjurymodelJPharmSci9137187PepinskyRBCZengetalIdentificationofapalmiticacidmodifiedformofhumanSonichedgehogJBiolChem2731403745RohatgiRLMilenkovicetalHedgehogsignaltransductionbySmoothenedpharmacologicevidencefora2stepactivationprocessProcNatlAcadSciUSA1063196201RohatgiRLMilenkovicetalPatched1regulateshedgehogsignalingattheprimaryciliumScience3173726RomerJTHKimuraetalSuppressionoftheShhpathwayusingasmallmoleculeinhibitoreliminatesmedulloblastomainPtc1p53miceCancerCell622940RomingerCMWLBeeetalEvidenceforallostericinteractionsofantagonistbindingtotheSmoothenedreceptorJPharmacolExpTher3299951005ScalesSJandFJdeSauvageMechanismsofHedgehogpathwayactivationincancerandimplicationsfortherapyTrendsPharmacolSci3030312SinhaSandJKChenPurmorphamineactivatestheHedgehogpathwaybytargetingSmoothenedNatChemBiol22930SteccaBandARuiziAltabaAGLI1p53inhibitoryloopcontrolsneuralstemcellandtumourcellnumbersEmboJ2866376TaipaleJJKChenetalEffectsofoncogenicmutationsinSmoothenedandPatchedcanbereversedbycyclopamineNature40610059TaipaleJMKCooperetalPatchedactscatalyticallytosuppresstheactivityofSmoothenedNature4188927TraiffortEDCharytoniuketalDiscretelocalizationsofhedgehogsignallingcomponentsinthedevelopingandadultratnervoussystemEurJNeurosci113199214TraiffortECDubourgetalFunctionalcharacterizationofsonichedgehogmutationsassociatedwithholoprosencephalyJBiolChem2794288997TraiffortEKLMoyaetalHighexpressionandanterogradeaxonaltransportofaminoterminalsonichedgehogintheadulthamsterbrainEurJNeurosci1483950TsuboiKandCWShultsIntrastriatalinjectionofsonichedgehogreducesbehavioralimpairmentinaratmodelofParkinsonsdiseaseExpNeurol17395104VarjosaloMandJTaipaleHedgehogfunctionsandmechanismsGenesDev22245472WangYZZhouetalSelectivetranslocationofintracellularSmoothenedtotheprimaryciliuminresponsetoHedgehogpathwaymodulationProcNatlAcadSciUSA10626238WechslerReyaRandMPScottThedevelopmentalbiologyofbraintumorsAnnuRevNeurosci24385428WilsonCWMHChenetalSmoothenedadoptsmultipleactiveandinactiveconformationscapableoftraffickingtotheprimaryciliumPLoSOne4e5182WuXJWalkeretalPurmorphamineinducesosteogenesisbyactivationofthehedgehogsignalingpathwayChemBiol11122938YangHJXiangetalConverseconformationalcontrolofSmoothenedactivitybystructurallyrelatedsmallmoleculesJBiolChem2842087684ZhaoYCTongetalHedgehogregulatesSmoothenedactivitybyinducingaconformationalswitchNature4502528