"ミオスタチンに特異的に結合し、液相アフィニティアッセイにおいて150pMよりも強い親和性を有するヒト化抗原結合タンパク質であって、少なくとも100時間のpKを有するヒト化抗原結合タンパク質。配列番号90のCDRH3又は前記CDRH3の変異体を含む重鎖可変領域を含み、Kabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基Kabatの位置67のアラニン残基Kabatの位置71のバリン残基及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含む、請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。配列番号2のCDRH2又は前記CDRH2の変異体をさらに含む、請求項2に記載のヒト化抗原結合タンパク質。CDRH1又は前記CDRH1の変異体をさらに含む、請求項2又は3に記載のヒト化抗原結合タンパク質。以下のCDR配列配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体及び配列番号109のCDRL3、又は前記CDRL3の変異体のうちの一つ、二つ、又は三つを含む軽鎖可変領域を含み、Kabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。配列番号90のCDRH3又は前記CDRH3の変異体を含む重鎖配列であって、抗原結合タンパク質がKabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基Kabatの位置67のアラニン残基Kabatの位置71のバリン残基及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部並びに必要に応じて、配列番号2のCDRH2、又は前記CDRH2の変異体及び配列番号1のCDRH1、又は前記CDRH1の変異体の一方又は両方をさらに含む前記重鎖配列と、以下のCDR配列配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体及び配列番号109のCDRL3、又は前記CDRL3の変異体のうちの一つ、二つ、又は三つを含む軽鎖配列であって、抗原結合タンパク質がKabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む前記軽鎖配列とを含む、請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。CDRH3変異体が、配列番号3、82~89、91若しくは92のいずれか一つであるか、又は以下のKabat置換V102Y、V102H、V102I、V102D若しくはV102Gのいずれか一つを含有する、請求項2、3、4又は6のいずれか一項に記載のヒト化抗原結合タンパク質。CDRH2変異体が、配列番号93~97、若しくは110のいずれか一つである又は以下のKabat置換N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、N50Q、N50V、N50L、N50K、N50A、I51L、I51V、I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、Y53T、Y53N、N54S、N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、N58T、N58S、N58D、N58R、N58G、N58F若しくはN58Yのいずれか一つを含有する、請求項3、4、5又は7に記載のヒト化抗原結合タンパク質。CDRL3変異体が、配列番号6である又は以下のKabat置換L89Q、L89S、L89G、L89F、Q90N、Q90H、S91N、S91F、S91G、S91R、S91D、S91H、S91T、S91Y、S91V、D92N、D92Y、D92W、D92T、D92S、D92R、D92Q、D92H、D92A、E93N、E93G、E93H、E93T、E93S、E93R、E93A、F94D、F94Y、F94T、F94V、F94L、F94H、F94N、F94I、F94W、F94P、F94S、L96P、L96Y、L96R、L96I、L96W、若しくはL96Fのいずれか一つを含有する、請求項5、6、7又は8に記載のヒト化抗原結合タンパク質。CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号2又は95であり、CDRH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、CDRL3が配列番号109である、請求項6に記載のヒト化抗原結合タンパク質。重鎖の位置2のV、I若しくはG位置4のL若しくはV位置20のL、I、M若しくはV位置22のC位置24のT、A、V、G若しくはS位置26のG位置29のI、F、L若しくはS位置36のW位置47のW若しくはY位置48のI、M、V若しくはL位置69のI、L、F、M若しくはV位置78のA、L、V、Y若しくはF位置80のL若しくはM位置90のY若しくはF位置92のC及び位置94のR、K、G、S、H若しくはNのいずれか一つ又はその組合せ及び又は軽鎖の位置2のI、L若しくはV位置3のV、Q、L若しくはE位置4のM若しくはL位置23のC位置35のW位置36のY、L若しくはF位置46のS、L、R若しくはV位置49のY、H、F若しくはK位置88のC及び位置98のFのいずれか一つ又はその組合せから選択されるKabatのアミノ酸残基のいずれか一つ又はその組合せをさらに含む、請求項6又は10に記載の抗原結合タンパク質。前記抗原結合タンパク質が、配列番号112、113、114、115、119、120若しくは121から選択される重鎖可変領域及び又は配列番号116、117若しくは118から選択される軽鎖可変領域又は前記配列に対して75以上の配列同一性を有する重鎖若しくは軽鎖可変領域変異体を含み、CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号2又は95であり、CDRH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、CDRL3が配列番号109であり、重鎖可変領域がKabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基位置67のアラニン残基Kabatの位置71のバリン残基及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも1個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含み、軽鎖可変領域がKabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域又は配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。重鎖及び軽鎖可変領域を好適なヒト定常領域と組み合わせる、請求項13に記載のヒト化抗原結合タンパク質。前記抗原結合タンパク質が、配列番号123、125、127若しくは138~144から選択される重鎖配列及び又は配列番号145、146、147から選択される軽鎖配列又は前記配列に対して75以上の配列同一性を有する重鎖若しくは軽鎖配列変異体を含み、CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号2又は95であり、CDRH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、CDRL3が配列番号109であり、重鎖がKabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基Kabatの位置67のアラニン残基Kabatの位置71のバリン残基及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含み、軽鎖がKabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、請求項1に記載のヒト化抗原結合タンパク質。重鎖がFc無効化されている、請求項14又は15に記載のヒト化抗原結合タンパク質。請求項1から16のいずれか一項に記載のヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。配列番号122、124、126、128~131、135~137の重鎖DNA配列及び又は配列番号132、133若しくは134から選択される軽鎖DNA配列又は配列番号123、125、127若しくは138~144の重鎖配列及び又は配列番号145、146若しくは147の軽鎖配列をコードする重鎖又は軽鎖DNA配列変異体を含む、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。配列番号122、124若しくは126の重鎖DNA配列及び又は配列番号132、133若しくは134から選択される軽鎖DNA配列又は配列番号145、146若しくは147の軽鎖配列をコードする軽鎖DNA配列変異体を含む、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。請求項17から19のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。請求項20に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。請求項21に記載の宿主細胞を培養する工程と、抗原結合タンパク質を回収する工程とを含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の製造方法。請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質と、製薬上許容し得る担体とを含む医薬組成物。請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項23に記載の組成物を投与する工程を含む、筋肉質量、筋肉強度及び筋肉機能のいずれか一つ又はその組合せを低下させる疾患に罹患した対象を治療する方法。請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項23に記載の組成物を投与する工程を含む、骨格筋減少症、悪液質、筋肉消耗、廃用性筋萎縮、HIV、AIDS、癌、筋骨若しくは神経に対する手術、熱傷、外傷若しくは損傷、肥満、糖尿病、関節炎、慢性腎不全、末期腎不全、鬱血性心不全、慢性閉塞性肺疾患、選択的関節修復、多発性硬化症、脳卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経障害、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、骨粗鬆症、変形性関節症、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸促迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎又は脊柱側弯症に罹患した対象を治療する方法。請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項23に記載の組成物を投与する工程を含む、対象における筋肉質量を増加させる、筋肉強度を増加させる、及び又は筋肉機能を改善する方法。したがって、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能のうちのいずれか1つまたは組合せにおける低減に関連した疾患の治療または予防のためのより有効な療法が依然として必要とされている。本発明は、ミオスタチンと特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能の低減のうちのいずれか1つまたは組合せに関連した疾患を治療するかまたは予防するために用いられ得る。本発明は、ミオスタチンに特異的に結合し、液相アフィニティアッセイにおいて150pMより強い親和性を有するヒト化抗原結合タンパク質を提供する。本発明は、少なくとも100時間のpKを有する、ミオスタチンに特異的に結合する前記抗原結合タンパク質も提供する。本発明は、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、該抗原結合タンパク質が重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が配列番号90のCDRH3又は前記CDRH3の変異体を含み、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基Kabatの位置67のアラニン残基Kabatの位置71のバリン残基及びKabatの位置73のリジン残基の少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質を提供する。本発明は、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、以下のCDR配列配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体及び配列番号109のCDRL3、又は前記CDRL3の変異体のうちの一つ、二つ又は三つを含む軽鎖可変領域を含み、Kabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方、又は両方をさらに含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質を提供する。本発明は、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、配列番号90のCDRH3又は前記CDRH3の変異体を含む重鎖可変領域であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基Kabatの位置67のアラニン残基Kabatの位置71のバリン残基及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部並びに必要に応じて、配列番号2のCDRH2、又は前記CDRH2の変異体及びCDRH1又は前記CDRH1の変異体の一方又は両方をさらに含む前記重鎖可変領域と、以下のCDR配列配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体及び配列番号109のCDRL3、又は前記CDRL3の変異体のうちの一つ、二つ、又は三つを含む軽鎖可変領域であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む前記軽鎖可変領域とを含むヒト化抗原結合タンパク質を提供する。本発明はまた、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、配列番号112、113、114、115、119、120若しくは121から選択される重鎖可変領域及び又は配列番号116、117若しくは118から選択される軽鎖可変領域又は前記配列に対して75以上の配列同一性を有する重鎖若しくは軽鎖可変領域変異体を含み、CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号2又は95であり、CDRH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、CDRL3が配列番号109であり、重鎖可変領域がKabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基Kabatの位置67のアラニン残基Kabatの位置71のバリン残基及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含み、軽鎖可変領域がKabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質も提供する。本発明はまた、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号112の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号113の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号114の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号115の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号119の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域配列番号120の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号116の軽鎖可変領域配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号117の軽鎖可変領域又は配列番号121の重鎖可変領域及び配列番号118の軽鎖可変領域を含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質も提供する。本発明はまた、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、配列番号123、125、127若しくは138~144から選択される重鎖配列及び又は配列番号145、146、147から選択される軽鎖配列又は前記配列に対して75以上の配列同一性を有する重鎖若しくは軽鎖配列変異体を含み、CDRH3が配列番号90であり、CDRH2が配列番号2又は95であり、CDEH1が配列番号1であり、CDRL1が配列番号4であり、CDRL2が配列番号5であり、CDRL3が配列番号109であり、重鎖がKabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基Kabatの位置67のアラニン残基Kabatの位置71のバリン残基及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含み、軽鎖がKabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質も提供する。本発明はまた、配列番号122、124、126、128~131、135~137の重鎖DNA配列及び又は配列番号132、133若しくは134から選択される軽鎖DNA配列又は配列番号123、125、127、若しくは138~144の重鎖配列及び又は配列番号145、146若しくは147の軽鎖配列をコードする重鎖若しくは軽鎖DNA配列変異体を含む、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。本発明はまた、本明細書に定義されたヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、本明細書に定義された核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、本明細書に定義された発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。本発明はまた、本明細書に定義されたヒト化抗原結合タンパク質の製造方法を提供するが、この方法は、上記の宿主細胞を培養する工程および抗原結合タンパク質を回収する工程を含む。本発明はまた、本明細書に定義されたヒト化抗原結合タンパク質および製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明は、筋肉量、筋肉強度および/または筋肉機能を低減する疾患に苦しんでいる被験体の治療方法であって、本明細書中で定義されるようなヒト化抗原結合タンパク質を投与するステップを包含する方法も提供する。本発明は、筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋廃用萎縮、HIV、AIDS、癌、外科手術、熱傷、筋肉骨または神経に対する外傷または損傷、肥満症、糖尿病例えばII型真性糖尿病、関節炎、慢性腎不全CRF、末期腎疾患ESRD、うっ血性心不全CHF、慢性閉塞性肺疾患COPD、待機的関節修復、多発性硬化症MS、卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経疾患、筋萎縮性側索硬化症ALS、パーキンソン病、骨粗鬆症、骨関節炎、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸窮迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎または脊柱側彎症に苦しんでいる被験体の治療方法であって、本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質を投与するステップを包含する方法を提供する。本発明は、被験体における筋肉量を増大し、筋肉強度を増大し、および/または筋肉機能を改善する方法であって、本明細書中で定義されるようなヒト化抗原結合タンパク質を投与するステップを包含する方法を提供する。本発明は、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能のいずれか1つまたはそれらの組合せを低減する疾患に苦しんでいる被験体の治療における使用のための本明細書中で記載されるヒト化抗原結合タンパク質を提供する。本発明は、筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋廃用萎縮、HIV、AIDS、癌、外科手術、熱傷、筋肉骨または神経に対する外傷または損傷、肥満症、糖尿病例えばII型真性糖尿病、関節炎、慢性腎不全CRF、末期腎疾患ESRD、うっ血性心不全CHF、慢性閉塞性肺疾患COPD、待機的関節修復、多発性硬化症MS、卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経疾患、筋萎縮性側索硬化症ALS、パーキンソン病、骨粗鬆症、骨関節炎、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸窮迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎または脊柱側彎症の治療における使用のための本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質を提供する。本発明は、被験体における筋肉量を増大し、筋肉強度を増大し、および/または筋肉機能を改善する方法における使用のための本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質を提供する。本発明は、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能のいずれか1つまたはそれらの組合せを低減する疾患に苦しんでいる被験体の治療における使用のための薬剤の製造における本明細書中で記載されるヒト化抗原結合タンパク質の使用を提供する。本発明は、筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋廃用萎縮、HIV、AIDS、癌、外科手術、熱傷、筋肉骨または神経に対する外傷または損傷、肥満症、糖尿病例えばII型真性糖尿病、関節炎、慢性腎不全CRF、末期腎疾患ESRD、うっ血性心不全CHF、慢性閉塞性肺疾患COPD、待機的関節修復、多発性硬化症MS、卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経疾患、筋萎縮性側索硬化症ALS、パーキンソン病、骨粗鬆症、骨関節炎、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸窮迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎または脊柱側彎症の治療における使用のための薬剤の製造における本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質の使用を提供する。本発明は、被験体における筋肉量を増大し、筋肉強度を増大し、および/または筋肉機能を改善する方法における使用のための薬剤の製造における本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質の使用を提供する。本発明は、ミオスタチン、例えばホモ二量体成熟ミオスタチンと特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、ミオスタチン、例えばヒトミオスタチンと結合し、中和する。抗原結合タンパク質は、抗体、例えばモノクローナル抗体であり得る。ミオスタチンおよびGDF-8はともに、以下のうちのいずれか1つを指す:全長未処理前駆体形態のミオスタチン;潜在型および非潜在活性型での、C末端ドメインの翻訳後切断に起因する成熟ミオスタチン。ミオスタチンという用語は、ミオスタチンに関連した1つ以上の生物学的活性を保持するミオスタチンの任意の断片および変異体も指す。全長未処理前駆体形態のミオスタチンは、プロペプチド、ならびに成熟タンパク質を形成するC末端ドメインを、シグナル配列とともにまたは伴わずに含む。ミオスタチンプロペプチドC末端ドメインは、ポリタンパク質としても知られている。ミオスタチン前駆体は、単量体またはホモ二量体として存在し得る。成熟ミオスタチンは、C末端ドメインとして知られているミオスタチン前駆体タンパク質のC末端から切断されるタンパク質である。成熟ミオスタチンは、単量体、ホモ二量体として、またはミオスタチン潜在型複合体で存在し得る。条件によって、成熟ミオスタチンは、これらの異なる型の組合せ間に平衡を確立し得る。ヒト、ニワトリ、マウスおよびラットミオスタチンの成熟C末端ドメイン配列は、100同一である例えば配列番号104参照。一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号104で示されるホモ二量体成熟ミオスタチンと結合する。ミオスタチンプロペプチドは、シグナル配列の切断後にミオスタチン前駆体のN末端ドメインから切断されるポリペプチドである。プロペプチドは、潜在性関連ペプチドLAPとしても知られている。ミオスタチンプロペプチドは、成熟ミオスタチン上のプロペプチド結合ドメインと非共有的に結合し得る。ヒトプロペプチドミオスタチン配列の一例は、配列番号108で提供される。ミオスタチン潜在型複合体は、成熟ミオスタチンとミオスタチンプロペプチドまたは他のミオスタチン結合タンパク質との間に形成されるタンパク質の複合体である。例えば、2つのミオスタチンプロペプチド分子は、成熟ミオスタチンの2つの分子と会合して、不活性四量体潜在型複合体を形成し得る。ミオスタチン潜在型複合体は、ミオスタチンプロペプチドのうちの一方または両方の変わりに、またはそれに加えて、他のミオスタチン結合タンパク質を含み得る。他のミオスタチン結合タンパク質の例としては、フォリスタチン、フォリスタチン関連遺伝子FLRGならびに増殖および分化因子関連血清タンパク質1GASP-1が挙げられる。ミオスタチン抗原結合タンパク質は、前駆体型、成熟型、単量体型、二量体型、潜在型および活性型のミオスタチンのうちのいずれか1つまたはいずれかの組合せと結合し得る。抗原結合タンパク質は、その単量体および/または二量体形態の成熟ミオスタチンを結合し得る。抗原結合タンパク質は、それがプロペプチドおよび/またはフォリスタチンとの複合体で存在する場合、ミオスタチンを結合することもしないこともある。代替的には、抗原結合タンパク質は、それがフォリスタチン関連遺伝子FLRGおよび/または増殖および分化因子関連血清タンパク質1GASP-1との複合体で存在する場合、ミオスタチンを結合することもしないこともある。例えば、抗原結合タンパク質は、成熟二量体ミオスタチンと結合する。抗原結合タンパク質という用語は、本明細書中で用いる場合、ミオスタチンと結合し得る抗体、抗体断片および他のタンパク質構築物、例えばドメインを指す。抗体という用語は、免疫グロブリン様ドメインを有する分子を指すよう、最も広い意味で本明細書中で用いられ、例としては、モノクローナル、組換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性およびヘテロ接合抗体;単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合断片、免疫学的に有効な断片、一本鎖Fv、ダイアボディ、Tandabs商標等が挙げられる代替的抗体フォーマットの要約に関しては、HolligerandHudsonNatureBiotechnology2005Vol23No911261136参照。単一可変ドメインという語句は、異なる可変領域またはドメインとは関係なく、抗原またはエピトープを特異的に結合する抗原結合タンパク質可変ドメイン例えば、VH、VHH、VLを指す。ドメイン抗体またはdAbは、抗原と結合し得る単一可変ドメインと同一であるとみなされ得る。単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであり得るが、しかし他の種からの単一抗体可変ドメイン、例えば齧歯類例えば、WO00/29004に開示、テンジクザメおよびラクダ科動物のVHHdAbも含み得る。ラクダ科動物のVHHは、例えばラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコのような種から得られる免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであって、これは、天然では軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する。このようなVHHドメインは、当該技術分野で利用可能な標準技法によりヒト化され、このようなドメインは、ドメイン抗体であると考えられる。本明細書中で用いる場合、VHはラクダ科動物VHHドメインを含む。本明細書中で用いる場合、ドメインという用語は、タンパク質の残りの部分とは関係なく、三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的に、ドメインは、タンパク質の別個の機能的特性に寄与し、多くの場合、タンパク質のおよび/またはドメインの残部の機能を失うことなく、他のタンパク質に付加され、除去されまたは移動され得る。単一可変ドメインは、抗体可変ドメインに特有の配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、それは、完全抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメイン例えばこの場合、1つ以上のループが抗体可変ドメインに特有でない配列に取って代わられている、あるいは切頭化されているかあるいはN-またはC末端伸張を含む抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を包含する。ドメインは、異なる可変領域またはドメインとは関係なく、抗原またはエピトープを結合し得る。抗原結合断片は、ドメインのような非抗体タンパク質足場上の1つ以上のCDRの整列により提供され得る。非抗体タンパク質足場またはドメインは、その天然リガンド以外のリガンドとの結合を得るためにタンパク質工学処理に付されたもの、例えば、CTLA-4エヴィボディ;リポカリン;プロテインA由来分子、例えばプロテインAのZ-ドメインアフィボディ、SpA、A-ドメインアヴィマー、マキシボディ;熱ショックタンパク質、例えばGroE1およびGroES;トランスフェリントランスボディ;アンキリン反復タンパク質DARPin;ペプチドアプタマー;C型レクチンドメインテトラネクチン;ヒトγ-クリスタリンおよびヒトユビキチンアフィリン;PDZドメイン;ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコルピントキシンクニッツ型ドメイン;およびフィブロネクチンアドネクチンその天然リガンド以外のリガンドとの結合を得るためにタンパク質工学処理に付されたから選択される足場の誘導体であるドメインである。CTLA-4細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4は、主にCD4T細胞上に発現されるCD28ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Igひだfoldを有する。抗体のCDRに対応するループは、異なる結合特性を付与するために異種配列で置換され得る。異なる結合特異性を有するよう工学処理されたCTLA-4分子は、エヴィボディとしても知られている。さらなる詳細に関しては、JournalofImmunologicalMethods2483145を参照されたい。リポカリンは、小型疎水性分子、例えばステロイド、ビリン、レチノイドおよび脂質を運搬する細胞外タンパク質の一ファミリーである。それらは、異なる標的抗原と結合するよう工学処理され得る基準構造の開口端に多数のループを伴う剛性βシート二次構造を有する。アンチカリンは、160~180のアミノ酸サイズであり、リポカリンから得られる。さらなる詳細に関しては、BiochimBiophysActa1482337350、US7250297B1およびUS20070224633を参照されたい。アフィボディは、抗原と結合するよう工学処理され得る黄色ブドウ球菌StaphylococcusaureusのプロテインAから得られる足場である。ドメインは、約58アミノ酸の3-らせん束からなる。表面残基の無作為化により、ライブラリーが生成されている。さらなる詳細に関しては、ProteinEngDesSel17455462およびEP1641818A1を参照されたい。アビマーは、Aドメイン足場ファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約35アミノ酸のネイティブドメインは、ジスルフィド結合構造を取る。Aドメインのファミリーにより示される天然変異のシャッフリングにより、多様性が生成される。さらなる詳細に関しては、NatureBiotechnology2315561561およびExpertOpiniononInvestigationalDrugs16909917を参照されたい。トランスフェリンは、単量体血清運搬糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容表面ループ中のペプチド配列、例えば1つ以上のCDRの挿入により、異なる標的抗原を結合するよう工学処理され得る。工学処理化トランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。さらなる詳細に関しては、JBiolChem2742406624073を参照されたい。設計アンキリン反復タンパク質DARPinsは、細胞骨格への内在性膜タンパク質の付着を媒介するタンパク質の一ファミリーであるアンキリンから得られる。単一アンキリン反復は、2つのαらせんおよびβターンからなる33残基モチーフである。それらは:各反復の第一αらせんおよびβターンにおける残基を無作為化すること、;あるいは1つ以上のCDRのようなペプチド配列を挿入することにより、異なる標的抗原を結合するよう工学処理され得る。それらの結合界面は、モジュールの数を増大することにより増大され得るアフィニティー成熟の方法。さらなる詳細に関しては、JMolBiol332489503、PNAS10017001705およびJMolBiol36910151028、ならびにUS20040132028A1を参照されたい。フィブロネクチンは、抗原と結合するよう工学処理され得る足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンIII型FN3の15反復単位の第10ドメインの天然アミノ酸配列の主鎖からなる。βサンドイッチの一端の3つのループは、アドネクチンに当該治療用標識を特異的に認識させるよう工学処理され得る。さらなる詳細に関しては、ProteinEngDesSel18435444、US20080139791、WO2005056764およびUS6818418B1を参照されたい。ペプチドアプタマーは、活性部位で挿入される強制可変ペプチドループを含有する定常足場タンパク質、典型的にはチオレドキシンTrxAからなる組合せ認識分子である。さらなる詳細に関しては、ExpertOpinBiolTher5783797を参照されたい。マイクロボディは、3~4個のシステイン架橋を含有する25~50アミノ酸長の天然マイクロタンパク質から得られる;マイクロタンパク質の例としては、カラタB1およびコノトキシンおよびノッティンが挙げられる。マイクロタンパク質は、マイクロタンパク質の全体的ひだに影響を及ぼさずに、25アミノ酸までを含むよう工学処理され得る。工学処理されたノッティンドメインのさらなる詳細に関しては、WO2008098796を参照されたい。その他の結合ドメインとしては、異なる標的抗原特性を工学処理するための足場として用いられているタンパク質、例えばヒトγ-クリスタリンおよびヒトユビキチンアフィリン、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、Ras結合タンパク質AF-6のPDZドメイン、スコルピン毒素カリブドトキシン、C型レクチンドメインテトラネクチンが挙げられるこれらは、Chapter7NonAntibodyScaffoldsfromHandbookofTherapeuticAntibodiesおよびProteinScience151427で検討されている。本発明の結合ドメインは、これらの代替的タンパク質ドメインのいずれか、ならびにドメイン上にグラフとされる本発明のCDRの任意の組合せから得られる。抗原結合断片または免疫学的に有効な断片は、部分的重および軽鎖可変配列を含み得る。断片は、少なくとも5、6、8または10アミノ酸長である。代替的には、断片は、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも75または少なくとも100アミノ酸長である。特異的に結合するという用語は、抗原結合タンパク質に関連して本明細書中で用いる場合、抗原結合タンパク質がミオスタチンと結合し、他の例えば、無関係なタンパク質とは全く結合しないかまたは有意に結合しない、ということを意味する。しかしながらこの用語は、抗原結合タンパク質が密接に関連する分子例えば、増殖および分化因子-11と交差反応性でもあり得る、という事実を除外しない。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、それらが密接に関連する分子、例えばGDF-11と結合するよりも少なくとも2、5、10、25、50、100または1000倍以上の親和性でミオスタチンと結合し得る。抗原結合タンパク質-ミオスタチン相互作用の結合親和性または平行解離定数KDは、100nM以下、10nM以下、2nM以下、または1nM以下であり得る。代替的には、KDは、5~10nM;または1~2nMであり得る。KDは、500pM~1nM、または1pM~500pM、または1pM~200pM、または1pM~100pMであり得る。抗原結合タンパク質の結合親和性は、会合速度定数kaおよび解離速度定数kdにより決定されるKD=ka/kd。結合親和性は、BIAcore商標により、例えば第一アミンカップリングおよびこの表面での抗体捕捉によりCM5チップ上に結合されるミオスタチンを用いた抗原捕捉により、測定され得る。実施例2.3に記載されるBIAcore商標法は、結合親和性を測定するために用いられ得る。代替的には、結合親和性は、FORTEbioにより、例えば第一アミンカップリングおよびこの表面での抗体捕捉によりCM5針上に結合されるミオスタチンを用いた抗原捕捉により、測定され得る。しかしながら、本発明の抗原結合タンパク質とミオスタチンとの結合の性質のため、結合親和性は等級分け目的のために用いられ得る。ある実施例において、親和性は実施例17に記載のように、溶液相親和性アッセイにより測定されうる。kdは、1×10-3s-1以下、1×10-4s-1以下、または1×10-5s-1以下であり得る。kdは、1×10-5s-1~1×10-4s-1;または1×10-4s-1~1×10-3s-1であり得る。kdが遅いと、抗原結合タンパク質-リガンド複合体の解離は遅くなり、リガンドの中和が改良される。中和するという用語は、本明細書中で用いる場合、invitroまたはinvivoでの、抗原結合タンパク質の非存在下でのミオスタチンの活性と比較して、本明細書中に記載されるような抗原結合タンパク質の存在下ではミオスタチンの生物学的活性が低減される、ということを意味する。中和は、1つ以上の遮断型ミオスタチンがその受容体と結合して、ミオスタチンがその受容体を活性化させないようにし、ミオスタチンまたはその受容体を下方調節し、あるいはエフェクター機能性に影響を及ぼすためであり得る。中和は、遮断型ミオスタチンがその受容体と結合し、したがってミオスタチンがその受容体を活性化させないようにするためであり得る。ミオスタチン活性としては、活性ミオスタチンに関連した増殖、調節および形態形成活性、例えば筋肉量、筋肉強度および筋肉機能を調整することが挙げられる。活性型ミオスタチンに関連したさらなる活性としては、筋繊維数、筋繊維サイズ、筋肉再生、筋繊維症、筋芽細胞の増殖速度、筋原性分化の調整;衛星細胞の活性化、衛星細胞の増殖、衛星細胞の自己複製;筋肉の成長および機能に関与するタンパク質の合成または異化が挙げられる。筋肉は、骨格筋であり得る。生物学的活性の低減または抑制は、部分的または全体的であり得る。中和抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質の非存在下におけるミオスタチン活性に比して、少なくとも20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99または100、ミオスタチンの活性を中和し得る。機能的検定例えば、下記の中和検定において、IC50は、生物学的反応をその最大の50低減する濃度である。中和は、当業者に既知の、または本明細書中に記載されるような1つ以上の検定を用いて、決定されるかまたは測定され得る。例えば、ミオスタチンと結合する抗原結合タンパク質は、サンドイッチELISAで、BIAcore商標、FMAT、FORTEbio商標または同様のinvitro検定、例えば表面プラズモン共鳴により、査定され得る。ELISAベースの受容体結合検定を用いて、抗原結合タンパク質の存在下でプレート上に固定された可溶性ActRIIb受容体と結合するミオスタチンを測定することにより、抗原結合タンパク質の中和活性を決定し得るさらなる詳細に関しては、実施例2.5参照。受容体中和検定は、効力に基づいて1nMより低いIC50を有する分子を識別するために利用可能である高感度法である。しかしながら、それは、結合コンピテントビオチニル化ミオスタチンの精確な濃度に対してそれ自体感受性である。それゆえ、0.1nM~5nM、例えば、0.1nM~3nM、または0.1nM~2nM、または0.1nM~1nMの範囲のIC50値が得られる。代替的には、細胞ベースの受容体結合検定を用いて、受容体結合、下流シグナル伝達および遺伝子活性化の抑制を測定することにより、抗原結合タンパク質の中和活性を決定し得る。例えば、中和している抗原結合タンパク質は、ミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定としても知られているPAI-1特異的プロモーターの制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子をコードする構築物でトランスフェクトされた横紋筋肉腫細胞A204におけるミオスタチン誘導性ルシフェラーゼ活性を抑制するそれらの能力により、同定され得るさらなる詳細に関しては、実施例1.2参照。invivo中和は、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能のうちのいずれか1つまたは組合せにおける変化を実証する動物における多数の異なる検定を用いて、決定され得る。例えば、体重、筋肉量例えば赤身筋肉量、筋肉収縮性例えば強縮力、握力、ぶら下がる動物の能力、および遊泳試験が、単独で、または任意の組合せで用いられて、ミオスタチン抗原結合タンパク質の中和活性を査定し得る。例えば、以下の筋肉の筋肉量が決定され得る:腓腹筋、四頭筋、三頭筋、長指伸筋EDL、前脛骨筋TAおよびヒラメ筋。得られるという用語は、それがその物質に関する物理的起源であるという意味での供給源だけでなく、その物質と構造的に同一であるが、基準供給源に起源を有さない物質も定義するよう意図されるということは、当業者には明らかである。したがって、ドナー抗体に見出される残基は、必ずしも、ドナー抗体から生成されている必要はない。単離されるとは、抗原結合タンパク質のような分子が、それが天然に見出され得る環境から取り出される、ということを意図する。例えば、分子は、それが常態では自然に存在する物質から精製され得る。例えば、抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質を含有する培地に関して、少なくとも95、96、97、98または99またはそれ以上に精製され得る。キメラ抗体は、受容体抗体由来の軽鎖および重鎖定常領域に関連してドナー抗体由来の天然可変領域軽鎖および重鎖を含有する工学処理抗体の一型を指す。ヒト化抗体は、非ヒトドナー免疫グロブリン由来のそのCDRのうちの1つ以上を有し、その分子の残りの免疫グロブリン由来部分が1つ以上のヒト免疫グロブリン単数または複数に由来する工学処理抗体の一型を指す。さらに、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するよう変更され得る例えばQueenetalProNatlAcadSciUSA861002910032、HodgsonetalBioTechnology9421参照。適切なヒト受容体抗体は、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との相同性により、慣用的データベース、例えばKABAT登録商標データベース、ロスアラモスデータベースおよびスイスプロテインデータベースから選択され得る。アミノ酸に基づいたドナー抗体のフレームワーク領域との相同性により特性化されるヒト抗体は、ドナーCDRの挿入のための、重鎖定常領域および/または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適している。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を与え得る適切な受容体抗体は、同様の方法で選択され得る。受容体抗体重鎖および軽鎖は、同一の受容体抗体から生じる必要はない、ということに留意すべきである。従来技術は、このようなヒト化抗体を産生するいくつかの方法を記載している例えばEP-A-0239400およびEP-A-054951参照。ドナー抗体という用語は、その可変領域のアミノ酸配列、1つ以上のCDR、あるいはその他の機能的断片または類似体を第一の免疫グロブリン相手に与える抗体を指す。したがって、ドナーは、変更された免疫グロブリンコード領域を提供して、抗原特異性を有する発現変更抗体を生じ、ドナー抗体に特徴的な活性を中和する。受容体抗体という用語は、ドナー抗体に対して異種である抗体を指し、その重鎖および/または軽鎖フレームワーク領域、および/またはその重鎖および/または軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列の全てまたは任意部分を、第一免疫グロブリン相手に与える。ヒト抗体は、受容体抗体であり得る。VHおよびVLという用語は、抗原結合タンパク質のそれぞれ重鎖可変領域および軽鎖可変領域に言及するために本明細書中で用いられる。CDRは、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列と定義される。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分に、3つの重鎖および3つの軽鎖CDRまたはCDR領域が存在する。したがって、CDRは、本明細書中で用いる場合、全3つの重鎖CDR、全3つの軽鎖CDR、全ての重鎖および軽鎖CDR、または少なくとも2つのCDRを指す。本明細書全体を通して、可変ドメイン配列および全長抗体配列中のアミノ酸残基は、別記しない限り、カバット番号付与法に従って番号付けされる。同様に、実施例で用いられるCDR、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2、CDRH3という用語は、カバット番号付与法に従う。さらなる情報に関しては、Kabatetal配列sofProteinsofImmunologicalInterest4thEdUSDepartmentofHealthandHumanServicesNationalInstitutesofHealthを参照されたい。例えば図20および21は配列HO配列番号12およびLO配列番号15についての、可変重鎖および軽鎖の、それぞれのカバットナンバリングを示す。可変ドメイン配列および全長抗体配列中のアミノ酸残基に関する代替的番号付与法が存在する、ということは当業者には明らかである。CDR配列に関する代替的番号付与法、例えばChothiaetalNature342877883に記述された方法も存在する。抗体の構造およびタンパク質フォールディングは、他の残基がCDR配列の一部とみなされることを意味し得るし、当業者によりそのようであると理解されるべきである。したがって、対応するCDRという用語は、任意の番号付与法、例えば表1に記述される方法を用いてCDR配列を言及するために本明細書中で用いられる。当業者に利用可能なCDR配列に関するその他の番号付与法としては、AbM法バース大学およびコンタクト法ロンドン大学ユニバーシティーカレッジが挙げられる。カバット、コチア、AbMおよびコンタクト法のうちの少なくとも2つを用いて最小重複領域が決定されて、最小結合単位を提供し得る。最小結合単位は、CDRの亜部分であり得る。以下の表1は、各CDRまたは結合単位に関する各番号付与法を用いた一定義を表す。可変ドメインアミノ酸配列を番号付けするために、表1において、カバット番号付与スキームが用いられる。CDR定義のいくつかは、用いられる個々の出版物によって変わり得る、ということに留意すべきである。本明細書中で用いる場合、抗原結合部位という用語は、抗原と特異的に結合し得る抗原結合タンパク質上の部位を指す。これは、単一ドメイン例えばエピトープ結合ドメインまたは一本鎖FvScFvドメインであり得るし、あるいはそれは、標準抗体上で見出され得るような対合VH/VLドメインであり得る。エピトープという用語は、本明細書中で用いる場合、抗原結合タンパク質の特定結合ドメインと接触させる抗原の部分を指す。エピトープは線状であり、抗原からの本質的に線状のアミノ酸配列を含み得る。代替的には、エピトープは、立体配座的または不連続であり得る。例えば、立体配座エピトープは、構造束縛を有する一要素を要するアミノ酸残基を含む。不連続エピトープは、他の配列により分離される、すなわち、抗原の一次配列中で連続配列でないアミノ酸残基を含む。抗原の三次および四次構造の状況では、不連続エピトープの残基は、抗原結合タンパク質により結合されるべき互いにとってほぼ十分である。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関して、同一のまたは配列同一性という用語は、2つの核酸または2つのアミノ酸配列間の、必要により、最適に整列され、適切な挿入または欠失と比較された場合の、同一性の程度を示す。2つの配列間の同一性は、配列により共有される同一部分の数の一関数でありすなわち、同一性=同一位置の数/位置の総数×100、2つの配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップ数および各ギャップの長さを考慮する。2つの配列間の配列の比較および同一性の決定は、下記のように、数学的アルゴリズムを用いて成し遂げられ得る。2つのヌクレオチド配列間の同一性は、NWSgapdna.CMPマトリックス、ギャップ重量40、50、60、70または80、長さ重量1、2、3、4、5または6を用いて、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムを用いて決定され得る。2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性は、PAM120重量残基表、12のギャップ長さペナルティおよび4のギャップペナルティを用いて、ALIGNプログラムバージョン2.0に組み入れられているEMeyersandWMillerを用いても決定され得る。さらに、2つのアミノ酸配列間の同一性は、Blossum62マトリックス、またはPAM250マトリックスのいずれかを用いて、ギャップ重量16、14、12、10、8、6または4、および長さ重量1、2、3、4、5または6で、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム中に組み入れられているNeedlemanandWunschアルゴリズムを用いて決定され得る。一方法において、ポリヌクレオチド配列は、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列例えば配列番号41~55参照と同一であり得る、すなわち、100同一であり、あるいはそれは、参照配列と比較した場合、ある整数までのヌクレオチド変更を含み、例えば、少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、98または99同一である。このような変更は、少なくとも1つのヌクレオチド欠失、置換、例えば転位および転換、または挿入から選択され、この場合、上記の変更は参照ヌクレオチドの5’または3’末端位置で、あるいは、参照配列中または参照配列内の1つ以上の連続基中のヌクレオチド間に独立して点在されるそれらの末端位置の間のどこでも起こり得る。ヌクレオチド変更の数は、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列例えば配列番号41~55参照中のヌクレオチドの総数にそれぞれの同一性100で割ったの数値を掛けた積を、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列例えば配列番号41~55参照中のヌクレオチドの上記総数から差し引くことにより決定され、あるいは:nn≦Xn-XnY式中、nnはヌクレオチド変更の数であり、xnは、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列例えば配列番号41~55参照中のヌクレオチドの総数であり、そしてyは、50に関しては0.50、60に関しては0.60、70に関しては0.70、75に関しては0.75、80に関しては0.80、85に関しては0.85、90に関しては0.90、95に関しては0.95、98に関しては0.98、99に関しては0.99、100に関しては1.00であり、は乗法演算子に関する記号であり、そしてxnとyの任意の非整数積は、xnからそれを差し引く前に、最も近い整数に切捨てられる。同様に、ポリペプチドは、本明細書中に記載されるようなポリペプチド参照配列例えば配列番号7~40、98または99参照と同一であり得る、すなわち、100同一であり、あるいはそれは、参照配列と比較した場合、ある整数までのヌクレオチド変更を含み、例えば、少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、98または99同一である。このような変更は、少なくとも1つのアミノ酸欠失、置換、例えば保存的および非保存的置換、または挿入から選択され、この場合、上記の変更は、参照ポリペプチドのアミノ-またはカルボキシ-末端位置で、あるいは、参照配列中または参照配列内の1つ以上の連続基中のアミノ酸間に独立して点在されるそれらの末端位置の間のどこでも起こり得る。アミノ酸変更の数は、所定の同一性に関して、本明細書中に記載されるようなポリペプチド参照配列例えば配列番号7~40、98または99参照によりコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数にそれぞれの同一性100で割ったの数値を掛けて、次に、その積を、本明細書中に記載されるようなポリペプチド参照配列例えば配列番号7~40、98または99参照中のアミノ酸の上記総数から差し引くことにより決定され、あるいは:na≦Xa-XaY式中、naはアミノ酸変更の数であり、xaは、本明細書中に記載されるようなポリペプチド参照配列例えば配列番号7~40、98または99参照中のアミノ酸の総数であり、そしてyは、50に関しては0.50、60に関しては0.60、70に関しては0.70、75に関しては0.75、80に関しては0.80、85に関しては0.85、90に関しては0.90、95に関しては0.95、98に関しては0.98、99に関しては0.99、100に関しては1.00であり、は乗法演算子に関する記号であり、そしてxaとyの任意の非整数積は、xaからそれを差し引く前に、最も近い整数に切捨てられる。同一性は、配列の全長全体またはその任意の断片で決定され、任意の挿入または欠失を伴う場合も伴わない場合もある。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質という用語は、各々、2つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。ペプチドは、単量体または多量体であり得る。あるアミノ酸置換が保存的であるとみなされるということは、当該技術分野で周知である。アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられ、そして抗原結合タンパク質の結合親和性の全てまたは実質的に全てを保持する群内の置換は、保存的置換とみなされる以下の表2参照。本発明は、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質を提供する。本発明はまた、ミオスタチンに特異的に結合し、少なくとも100時間のpKを有するヒト化抗原結合タンパク質も提供する。本発明は、ミオスタチンに結合し、配列番号90のCDRH3又はそのCDRH3変異体を含むヒト化抗原結合タンパク質重鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含む前記配列を提供する。抗原結合タンパク質はまた、ミオスタチン活性を中和することもできる。例えば、本発明は、ミオスタチンに結合し、配列番号90のCDRH3又は前記CDRH3の変異体を含むヒト化抗原結合タンパク質重鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質が、Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、及びKabatの位置69のロイシン残基Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基又はKabatの位置20のイソロイシン残基、Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基をさらに含む、前記配列を提供する。上記のヒト化抗原結合タンパク質重鎖配列は、配列番号2のCDRH2又は前記CDRH2の変異体をさらに含んでもよい。上記のヒト化抗原結合タンパク質重鎖配列は、CDRH1又は前記CDRH1の変異体をさらに含んでもよい。本発明は、ミオスタチンに特異的に結合し、以下のCDR配列配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体及び配列番号109のCDRL3、又は前記CDRL3の変異体のうちの一つ、二つ又は三つを含むヒト化抗原結合タンパク質軽鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基、及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、前記配列を提供する。例えば、本発明は、ミオスタチンに特異的に結合し、配列番号109のCDRL3又は前記CDRL3の変異体を含むヒト化抗原結合タンパク質軽鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質が、Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基Kabatの位置46のトレオニン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基又はKabatの位置46のトレオニン残基、Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基をさらに含む、前記配列を提供する。上記のヒト化抗原結合タンパク質軽鎖配列は、配列番号5のCDRL2又は前記CDRL2の変異体をさらに含んでもよい。上記のヒト化抗原結合タンパク質軽鎖配列は、CDRL1又は前記CDRL1の変異体をさらに含んでもよい。本発明は、ミオスタチンに特異的に結合するヒト化抗原結合タンパク質であって、配列番号90のCDRH3又は前記CDRH3の変異体を含む重鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部及び必要に応じて、配列番号2のCDRH2、若しくは前記CDRH2の変異体及びCDRH1若しくは前記CDRH1の変異体の一方又は両方をさらに含む、前記重鎖配列と、以下のCDR配列配列番号4のCDRL1、又は前記CDRL1の変異体配列番号5のCDRL2、又は前記CDRL2の変異体及び配列番号109のCDRL3、又は前記CDRL3の変異体のうちの一つ、二つ又は三つを含む軽鎖配列であって、前記抗原結合タンパク質がKabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基、及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む、前記軽鎖配列とを含む、前記ヒト化抗原結合タンパク質を提供する。上記のヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3配列に加えて、CDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2、及びCDRL3又はその変異体から選択される任意の組合せの一つ若しくは複数のCDR、又は全部のCDRをさらに含んでもよい。例えば、上記のヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3及びCDRH1、又はその変異体を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3及びCDRH2、又はその変異体を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH1及びCDRH2、及びCDRH3、又はその変異体を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRL1及びCDRL2、又はその変異体を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRL2及びCDRL3、又はその変異体を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRL1、CDRL2及びCDRL3、又はその変異体を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3及びCDRL3、又はその変異体を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3、CDRH2及びCDRL3、又はその変異体を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH3、CDRH2、CDRL2及びCDRL3、又はその変異体を含んでもよい。ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含んでもよい。例えば、ヒト化抗原結合タンパク質は、CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含んでもよい。CDR変異体は、少なくとも一個のアミノ酸により改変されたアミノ酸配列であって、前記改変がアミノ酸配列の化学的又は部分的変化であってもよく、その改変により、変異体が未改変の配列の生物学的特性を保持することができる、前記アミノ酸配列を含む。例えば、変異体はミオスタチンに結合する機能的変異体である。CDRアミノ酸配列の部分的変化は、一個から数個のアミノ酸の欠失若しくは置換、又は一個から数個のアミノ酸の付加若しくは挿入、又はその組合せによるものであってよい。CDR変異体は、アミノ酸配列中に、任意の組合せで、1、2、3、4、5又は6個のアミノ酸置換、付加又は欠失を含んでもよい。CDR変異体は、アミノ酸配列中に、任意の組合せで、一個、二個又は三個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含んでもよい。CDR変異体は、アミノ酸配列中に一個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含んでもよい。アミノ酸残基中の置換は、例えば、一個の疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換するなど、保存的置換であってよい。例えば、ロイシンをバリン又はイソロイシンで置換することができる。CDRL1、L2、L3、H1およびH2は、限定数の主鎖立体配座のうちの1つを構造的に示す傾向がある。CDRの特定の基準構造クラスは、CDRの長さとループパッキングの両方により限定され、CDRおよびフレームワーク領域の両方における重要位置に置かれる残基により決定される構造的決定残基またはSDR。MartinとThornton1996JMolBiol263800815は、重要残基基準鋳型を限定するために、自動式方法を生み出した。クラスター分析を用いて、CDR組に関する基準クラスを限定し、次いで、埋め込まれた疎水性物質、水素結合残基、ならびに保存グリシンおよびプロリンを分析することにより、基準鋳型が同定される。配列を重要残基鋳型と比較して、同一性あんたは類似性マトリックスを用いて各鋳型をスコアリングすることにより、抗体配列のCDRが基準クラスに割り当てられ得る。カバット番号前のアミノ酸が配列番号14または24の元のアミノ酸配列であり、カバット数の末尾のアミノ酸配列が置換アミノ酸であるCDR基準の例としては、以下のものが挙げられる:CDRH1基準:Y32I、Y32H、Y32F,Y32T、Y32N、Y32C、Y32E、Y32D、F33Y、F33A、F33W、F33G、F33T、F33L、F33V、M34I、M34V、M34W、H35E、H35N、H35Q、H35S、H35Y、H35T;CDRH2基準:N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、N50Q、N50V、N50L、N50K、N50A、I51L、I51V、I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、Y53T、Y53N、N54S、N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、N58T、N58S、N58D、N58R、N58G、N58F、N58Y;CDRH3基準:V102Y、V102H、V102I、V102S、V102D、V102G;CDRL1基準:D28N、D28S、D28E、D28T、I29V、N30D、N30L、N30Y、N30V、N30I、N30S、N30F、N30H、N30G、N30T、S31N、S31T、S31K、S31G、Y32F、Y32N、Y32A、Y32H、Y32S、Y32R、L33M、L33V、L33I、L33F、S34A、S34G、S34N、S34H、S34V、S34F;CDRL2基準:A51T、A51G、A51V;CDRL3基準:L89Q、L89S、L89G、L89F、Q90N、Q90H、S91N、S91F、S91G、S91R、S91D、S91H、S91T、S91Y、S91V、D92N、D92Y、D92W、D92T、D92S、D92R、D92Q、D92H、D92A、E93N、E93G、E93H、E93T、E93S、E93R、E93A、F94D、F94Y、F94T、F94V、F94L、F94H、F94N、F94I、F94W、F94P、F94S、L96P、L96Y、L96R、L96I、L96W、L96F。CDR毎に、重鎖または軽鎖可変領域毎に、重鎖または軽鎖毎に、および抗原結合タンパク質毎に、多重変異体CDR基準位置が存在し、したがって、置換の任意の組合せが本発明のヒト化抗原結合タンパク質において存在し得るが、但し、CDRの基準構造は維持される。CDR変異体の他の例としては、以下のものが挙げられるカバット番号付与スキームを使用。この場合、カバット数の前のアミノ酸は配列番号14または24の元のアミノ酸配列であり、そしてカバット番号の末尾のアミノ酸配列は置換アミノ酸である:H2:G55D、G55L、G55S、G55T、G55V;H3:Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、W100E_F、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、V102N、V102S;L3:C91S。例えば、ミオスタチンと結合する本発明のヒト化抗原結合タンパク質は、配列番号90のCDRH3を含み得る。ヒト化抗原結合タンパク質はさらに、配列番号2、93~97のいずれか1つのCDRH2を含み得る。特に、CDRH2は、配列番号95であり得る。ヒト化抗原結合タンパク質は、配列番号109のCDRL3も含み得る。ヒト化抗原結合タンパク質はさらに、CDRH1配列番号1、CDRL1配列番号4およびCDRL2配列番号5のいずれか1つ、またはこれらの組合せ、またはこれら全てを含み得る。ヒト化抗原結合タンパク質はまた、ミオスタチン活性を中和しうる。CDRを含むヒト化抗原結合タンパク質は、10B3または10B3キメラ重鎖:配列番号7または25、軽鎖:配列番号8により実証された効力の10倍以内、または5倍以内の、EC50により実証されるようなミオスタチンとの結合に関する効力を示し得る。ミオスタチンとの結合に関する効力は、EC50により実証されるように、ELISA検定により実行され得る。上記のように、CDRの特定基準構造クラスは、CDRの長さおよびループパッキングの両方により限定され、CDRおよびフレームワーク領域の両方における重要位置に置かれる残基により決定される。したがって、配列番号1~6で列挙されるCDR、配列番号82~97および配列番号109および110で列挙されるCDRのほかに、本発明の抗原結合タンパク質の基準フレームワーク残基は、以下のものを包含し得るカバット番号付与法を使用:重鎖:位置2のV、IまたはG;位置4のLまたはV;位置20のL、I、MまたはV;位置22のC;位置24のT、A、V、GまたはS;位置26のG;位置29のI、F、LまたはS;位置36のW;位置47のWまたはY47;位置48のI、M、VまたはL;位置69のI、L、F、MまたはV;位置78のA、L、V、YまたはF;位置80のLまたはM;位置90のYまたはF;位置92のC;および/または位置94のR、K、G、S、HまたはN;および/または軽鎖:位置2のI、LまたはV;位置3のV、Q、LまたはE;位置4のMまたはL;位置23のC;位置35のW;位置36のY、LまたはF;位置46のS、L、RまたはV;位置49のY、H、FまたはK;位置71のYまたはF;位置88のC;および/または位置98のF。上記のフレームワーク位置のいずれか1つ、任意の組合せまたは全てが、本発明のヒト化抗原結合タンパク質中に存在し得る。重鎖または軽鎖可変領域毎に、重鎖または軽鎖毎に、およびヒト化抗原結合タンパク質毎に、多重変異体フレームワーク基準位置が存在し、したがって、任意の組合せが本発明の抗原結合タンパク質において存在し得るが、但し、フレームワークの基準構造は維持される。例えば、重鎖可変フレームワークは、位置2のV、位置4のL、位置20のV、位置22のC、位置24のA、位置26のG、位置29のF、位置36のW、位置47のW、位置48のM、位置69のM、位置78のA、位置80のM、位置90のY、位置92のC、および位置94のRを含み得る。例えば、軽鎖可変フレームワークは、位置2のI、位置3のQ、位置4のM、位置23のC、位置35のW、位置36のF、位置46のS、位置49のY、位置71のY、位置88のC、および位置98のFを含み得る。ヒト化重鎖可変ドメインは、配列番号10のヒト受容体可変ドメイン配列と、フレームワーク領域において75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、98以上、99以上または100の同一性を有する受容体抗体フレームワーク内の配列番号1~6で列挙されるCDR;上記の配列番号82~97および110のCDRを含み得る。ヒト化軽鎖可変ドメインは、配列番号11のヒト受容体可変ドメイン配列と、フレームワーク領域において75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、98以上、99以上または100の同一性を有する受容体抗体フレームワーク内の配列番号4~6で列挙されるCDRならびに上記の配列番号109で列挙される変異体CDR;対応するCDR;結合単位;またはその変異体を含み得る。配列番号10および配列番号11の両方において、CDRH3/CDRL3の位置は、Xにより示されている。配列番号10および配列番号11における10X残基は、CDRの場所に関するプレースホルダーであり、各CDRにおけるアミノ酸配列の数の測定値ではない。本発明はまた、ミオスタチンに結合し、配列番号112、113、114、115、119、120又は121のいずれか一つから選択される重鎖可変領域を含むヒト化抗原結合タンパク質も提供する。抗原結合タンパク質は、配列番号116、117又は118のいずれか一つから選択される軽鎖可変領域を含んでもよい。任意の重鎖可変領域を、任意の軽鎖可変領域と組み合わせてもよい。抗原結合タンパク質はまた、ミオスタチンを中和することもできる。ヒト化抗原結合タンパク質は、以下の重鎖及び軽鎖可変領域の組合せのいずれか一つを含んでもよいH3L4、H3L5、H3L6、H4L4、H4L5、H4L6、H5L4、H5L5、H5L6、H6L4、H6L5、H6L6、H7L4、H7L5、H7L6、H8L4、H8L5、H8L6、H9L4、H9L5、又はH9L6。抗体重鎖可変領域は、配列番号112、113、114、115、119、120又は121のいずれか一つに対して75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、98以上、99以上又は100の同一性を有してもよく、本明細書で定義されるCDRH1、CDRH2、及びCDRH3、又は変異体が存在し並びに重鎖可変領域はKabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含む。例えば、CDRH3は配列番号90であり、CDRH2は配列番号2又は95であり、CDRH1は配列番号1である。例えば、重鎖可変領域は、Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基Kabatの位置67のアラニン残基、及びKabatの位置69のロイシン残基Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基又はKabatの位置20のイソロイシン残基、Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基をさらに含んでもよい。抗体軽鎖可変領域は、配列番号116、117又は118のいずれか一つに対して75以上、80以上、85以上、90以上又は95以上、98以上、99以上、又は100の同一性を有してもよく、本明細書で定義されたCDRL1、CDRL2、及びCDRL3、又は変異体が存在し並びに軽鎖可変領域はKabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン、及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む。例えば、CDRL1は配列番号4であり、CDRL2は配列番号5であり、CDRL3は配列番号109である。例えば、軽鎖可変領域は、Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基Kabatの位置46のトレオニン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基又はKabatの位置46のトレオニン残基、Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基をさらに含んでもよい。任意の重鎖可変領域を、任意の軽鎖可変領域と組み合わせてもよい。配列番号112~121の配列の同一性は、配列の全長にわたって決定することができる。抗体重鎖可変領域は、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む配列番号112、113、114、115、119、120又は121のいずれか一つの変異体であってよい。抗体軽鎖可変領域は、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む配列番号116、117又は118のいずれか一つの変異体であってもよい。例えば、上記のカノニカルCDR及びカノニカルフレームワーク残基置換は、少なくとも75同一であるか、又は最大30個のアミノ酸置換を含む変異体配列として重鎖又は軽鎖可変領域変異体中に存在してもよい。任意の重鎖可変領域を、好適なヒト定常領域と組み合わせることができる。任意の軽鎖可変領域を、好適な定常領域と組み合わせることができる。本発明はまた、ミオスタチンに結合し、配列番号123、125、127、又は138~144のいずれか一つから選択される重鎖を含むヒト化抗原結合タンパク質も提供する。ヒト化抗原結合タンパク質は、配列番号145、146、又は147のいずれか一つから選択される軽鎖を含んでもよい。任意の重鎖を、任意の軽鎖と組み合わせることができる。抗原結合タンパク質は、ミオスタチンを中和することもできる。ヒト化抗原結合タンパク質は、以下の重鎖及び軽鎖の組合せのいずれか一つを含んでもよいH3L4、H3L5、H3L6、H4L4、H4L5、H4L6、H5L4、H5L5、H5L6、H6L4、H6L5、H6L6、H7L4、H7L5、H7L6、H8L4、H8L5、H8L6、H9L4、H9L5、H9L6、H7無効化L4、H7無効化L5、H7無効化L6、H8無効化L4、H8無効化L5、H8無効化L6、H9無効化L4、H9無効化L5、又はH9無効化L6。抗体重鎖は、配列番号に対して75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、98以上、99以上又は100の同一性を有してもよく、本明細書で定義されたCDRH1、CDRH2及びCDRH1、又は変異体が存在し並びに重鎖はKabatの位置28のセリン残基並びにKabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基のうちの少なくとも一個、又はその組合せ、若しくは全部をさらに含む。例えば、CDRH3は配列番号90であり、CDRH2は配列番号2又は95であり、CDRH1は配列番号1である。例えば、重鎖は、Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基Kabatの位置67のアラニン残基、及びKabatの位置69のロイシン残基Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基又はKabatの位置20のイソロイシン残基、Kabatの位置28のセリン残基、Kabatの位置48のイソロイシン残基、Kabatの位置66のリジン残基、Kabatの位置67のアラニン残基、Kabatの位置69のロイシン残基、Kabatの位置71のバリン残基、及びKabatの位置73のリジン残基をさらに含んでもよい。抗体軽鎖は、配列番号のいずれか一つに対して75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、98以上、99以上又は100の同一性を有してもよく、本明細書で定義されたCDRL1、CDRL2及びCDRL3、又は変異体が存在し並びに軽鎖はKabatの位置71のチロシン残基並びにKabatの位置46のトレオニン残基及びKabatの位置69のグルタミン残基の少なくとも一方又は両方をさらに含む。例えば、CDRL1は配列番号4であり、CDRL2は配列番号5であり、CDRL3は配列番号109である。例えば、軽鎖は、Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基Kabatの位置46のトレオニン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基又はKabatの位置46のトレオニン残基、Kabatの位置69のグルタミン残基、及びKabatの位置71のチロシン残基をさらに含んでもよい。配列番号の配列の同一性は、配列の長さにわたって決定することができる。抗体重鎖は、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む配列番号のいずれか一つの変異体であってもよい。抗体軽鎖は、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む配列番号のいずれか一つの変異体であってもよい。例えば、上記の基準CDRおよび基準フレームワーク残基置換は、少なくとも75同一であるか、または30個までのアミノ酸置換を含有する変異体配列として、変異体重鎖または軽鎖可変領域中にも存在し得る。上記のような抗原結合タンパク質、例えば、1つ以上のアミノ酸の化学的修飾および/または挿入、欠失または置換による配列の部分的変更を有する変異体、あるいは上記の配列のいずれかと75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、98以上、99以上の同一性を有するものは、10B3または10B3キメラ重鎖:配列番号7または25、軽鎖:配列番号8により実証された効力の10倍以内、または5倍以内の、EC50により実証されるようなミオスタチンとの結合に関する効力を示し得る。ミオスタチンとの結合に関する効力は、EC50により実証されるように、ELISA検定により実行され得る。本発明の抗原結合タンパク質は、中和されたFcであり得る。Fc中和を達成する一方法は、重鎖定常領域の位置235および237EUインデックス番号付与法のアラニン残基の置換を包含する。例えば、抗原結合タンパク質は、中和されたFcであり、配列番号123ヒト化重鎖:H7_G55S-F100G_YFc中和;または配列番号125ヒト化重鎖:H8_G55S-F100G_YFc中和または配列番号127ヒト化重鎖H9_G55S-F100G_YFc中和の配列を含み得る。代替的には、抗原結合タンパク質は、中和されたFcであり、位置235および237のアラニン置換を含まない。本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質が結合するミオスタチンのエピトープは、立体配座的または不連続的エピトープであり得る。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質はミオスタチン上の線状エピトープと結合し得ず、例えば、抗原結合タンパク質は、ミオスタチンの還元または変性試料と結合し得ない。立体配座的または不連続的エピトープは、ミオスタチン受容体結合部位と同一であるか、類似するか、または重複し得る。エピトープは、ミオスタチンがその成熟形態であり、別のミオスタチン分子との二量体ホモ二量体の一部として存在する場合、利用可能であり得る。エピトープは、ミオスタチンがその成熟形態であり、そして記載されるような他のミオスタチン結合分子との四量体の一部として存在する場合も、利用可能であり得る。エピトープは、2つのミオスタチンポリペプチドを横断して分布され得る。この型の不連続エピトープは、各ミオスタチン分子からの配列を含み得る。配列は、二量体の三次および四次構造の状況では、エピトープを形成するのに互いに十分に近く、抗原結合タンパク質により結合され得る。立体配座的および/または不連続的エピトープは、既知の方法により、例えばCLIPS商標PepscanSystemsにより同定され得る。Pepscanの足場上化学結合型免疫原性ペプチドCLIPS技法を用いた10B3Cのミオスタチン結合部位のその後の分析は、ミオスタチンのPRGSAGPCCTPTKMSアミノ酸配列がキメラ抗体のための結合部位であり得る、ということを示唆する。Pepscan法は、束縛ペプチドを用いる。ヒト化抗原結合タンパク質は、ヒトにおいて、またはネズミ動物モデルにおいて、invivoで少なくとも6時間、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも7日または少なくとも9日の半減期を有し得る。ヒト化抗原結合タンパク質が結合するミオスタチンポリペプチドは、組換えポリペプチドであり得る。ミオスタチンは溶液中に存在し得るし、あるいは固体表面に付着され得る。例えばミオスタチンは、ビーズ、例えば磁気ビーズに付着され得る。ミオスタチンは、ビオチニル化され得る。ミオスタチンに接合されるビオチン分子は、固体表面にビオチンストレプトアビジンをカップリングすることにより固体表面にミオスタチンを固定するために用いられ得る。ヒト化抗原結合タンパク質は、ラット、マウス、霊長類例えば、カニクイザル、旧世界ザルまたは大型類人猿またはヒトに由来し得る。抗原結合タンパク質は、ヒト化またはキメラ抗体であり得る。ヒト化抗原結合タンパク質は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのものであり得る定常領域を含み得る。定常領域は、IgGアイソタイプ、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはその変異体のものであり得る。抗原結合タンパク質定常領域は、IgG1であり得る。抗体のFcエフェクター部分に対する突然変異的変化を用いて、FcRnおよび抗体間の相互作用の親和性を変えて、抗体代謝回転を調整し得る。抗体の半減期は、invivoで延長され得る。これは、最大投与量および最大投与頻度が長期間invivoIC50を維持する結果として達成され得る場合、患者集団に有益である。ミオスタチンは可溶性標的であるため、抗体のFcエフェクター機能は、全部または一部、除去され得る。この除去は、安全性プロフィール増大を生じ得る。定常領域を含むヒト化抗原結合タンパク質は、低減されたADCCおよび/または補体活性化またはエフェクター機能性を有し得る。定常ドメインは、IgG2またはIgG4の天然中和定常領域、あるいは突然変異化IgG1定常ドメインを含み得る。適切な修飾の例は、EP0307434に記載されている。Fc中和を達成する一方法は、重鎖定常領域の位置235および237EUインデックス番号付与法でのアラニン残基の置換を含む。抗体が増強されたエフェクター機能/ADCCおよび/または補体活性化を有するよう、ヒト化抗原結合タンパク質は、突然変異化定常ドメインから選択される1つ以上の修飾を含み得る。適切な修飾の例は、ShieldsetalJBiolChem27665916604、LazaretalPNAS10340054010ならびにUS6737056、WO2004063351およびWO2004029207に記載されている。ヒト化抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能/ADCCおよび/または補体活性化を有するよう、抗原結合タンパク質は、変更されたグリコシル化プロフィールを有する定常ドメインを含み得る。変更されたグリコシル化プロフィールを有する抗原結合タンパク質を産生するための適切な方法の例は、WO2003/011878、WO2006/014679およびEP1229125に記載されている。本発明は、本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。核酸分子は、i1つ以上のCDRH、重鎖可変配列または全長重鎖配列;およびii1つ以上のCDRL、軽鎖可変配列、または全長軽鎖配列をコードする配列を含み、同一核酸分子上にiおよびiiを有する。代替的には、本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、a1つ以上のCDRH、重鎖可変領域、または全長重鎖配列;あるいはb1つ以上のCDRL、軽鎖可変配列、または全長軽鎖配列をコードする配列を含み、aおよびbは別個の核酸分子上にある。重鎖をコードする核酸分子は、配列番号122124126128131135137を含み得る。軽鎖をコードする核酸分子は、配列番号132133または134を含み得る。あるいは、重鎖をコードする核酸分子は、配列番号123125127または138144の重鎖アミノ酸配列をコードする可変重鎖DNA配列を含み得る。軽鎖をコードする核酸分子は、配列番号145146または147の軽鎖アミノ酸配列をコードする軽鎖DNA配列を含み得る。抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、次の1以上の重鎖および軽鎖組合せを含みうる:H3L4H3L5H3L6H4L4H4L5H4L6H5L4H5L5H5L6H6L4H6L5H6L6H7L4H7L5H7L6H8L4H8L5H8L6H9L4H9L5H9L6H7非機能化L4H7非機能化L5H7非機能化L6H8非機能化L4H8非機能化L5H8非機能化L6H9非機能化L4H9非機能化L5またはH9非機能化L6。本発明は、本明細書中に記載されるような核酸分子を含む発現ベクターも提供する。本明細書中に記載されるような発現ベクターを含む組換え宿主細胞も提供される。本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、適切な宿主細胞中で産生され得る。本明細書中に記載されるような抗原結合タンパク質の産生方法は、本明細書中に記載されるような宿主細胞を培養するステップ、ならびに抗原結合タンパク質を回収するステップを包含し得る。組換え形質転換、トランスフェクト化または形質導入宿主細胞は、少なくとも1つの発現カセットを含み得る上記発現カセットは、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。代替的には、組換え形質転換、トランスフェクト化または形質導入宿主細胞は、少なくとも1つの発現カセットを含み第一発現カセットは、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、さらに、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第二カセットを含み得る。安定的に形質転換された宿主細胞は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の重鎖および/または軽鎖をコードする1つ以上の発現カセットを含むベクターを含み得る。例えば、このような宿主細胞は、軽鎖をコードする第一ベクター、ならびに重鎖をコードする第二ベクターを含み得る。宿主細胞は、真核生物、例えば哺乳類であり得る。このような細胞株の例としては、CHOまたはNS0が挙げられる。宿主細胞は、非ヒト宿主細胞であり得る。宿主細胞は、非胚性宿主細胞であり得る。宿主細胞は、培地、例えば無血清培地中で培養され得る。抗原結合タンパク質は、宿主細胞により倍地中に分泌され得る。ヒト化抗原結合タンパク質は、ヒト化抗原結合タンパク質を含有する上記培地に関して、少なくとも95以上例えば、98以上に精製され得る。ヒト化抗原結合タンパク質および製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物が、提供され得る。医薬組成物を使用説明書と一緒に含むkitofpartsが提供され得る。便益のために、キットは、予定量の試薬を、使用説明書とともに含み得る。抗体構造無傷抗体ほとんどの脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパおよびラムダと呼ばれる2つの型のうちの1つに割り当てられ得る。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、ヒト抗体は、5つの異なるクラスIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに割り当てられ得る。IgGおよびIgAは、さらに、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4;ならびにIgA1およびIgA2に細分され得る。種変異体は、少なくともIgG2a、IgG2bを有するマウスおよびラットに伴って存在する。可変領域のより多く保存される部分は、フレームワーク領域FRと呼ばれる。無傷重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、3つのCDRにより連結される4つのFRを含む。各鎖中のCDRは、FRにより極く近接して一緒に保持され、他の鎖からのCDRとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、しかし、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害ADCCに参加すること、Fcγ受容体との結合を介した食作用、新生児Fc受容体FcRnによる半減期/清掃率、ならびに補体カスケードのC1q成分による補体依存性細胞傷害を示す。ヒトIgG2定常領域は、古典的経路により補体を活性化するかまたは抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する能力を本質的に欠くことが報告されている。IgG4定常領域は、古典的経路により補体を活性化する能力を欠くことが報告されており、抗体依存性細胞性細胞傷害を弱く媒介するだけである。これらのエフェクター機能を本質的に欠いている抗体は、非溶解性抗体と呼ばれ得る。ヒト抗体ヒト抗体は、当業者に既知の多数の方法により産生され得る。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫またはマウス-ヒトへテロ骨髄腫細胞株を用いて、ハイブリドーマ法により作製され得るKozborJImmunol1333001およびBrodeurMonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications5163参照。代替的方法としては、ファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用これらはともに、ヒト可変領域レパートリーを利用するが挙げられるWinterAnnuRevImmunol12433455;GreenJImmunolMethods2311123参照。そのマウス免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントに置き換えられたトランスジェニックマウスのいくつかの系統が、目下利用可能であるTomizukaPNAS97722727;FishwildNatureBiotechnol14845851;MendezNatureGenetics15146156参照。抗原投与時に、このようなマウスは、当該抗体が選択され得るヒト抗体のレパートリーを産生し得る。ファージ表示技法は、ヒト抗原結合タンパク質およびその断片を産生するために用いられ得る。McCaffertyNature348552553およびGriffithsetalEMBO1332453260を参照されたい。親和性成熟の技法MarksBiotechnol10779783を用いて、結合親和性を改良し得るが、この場合、一次ヒト抗体の親和性は、順次、HおよびL鎖可変領域を天然変異体に取り替えて、改良された結合親和性に基づいて選択することにより改良される。エピトープ刷り込みのようなこの技法の変異体も、目下、利用可能である。WO93/06213;WaterhouseNuclAcidsRes2122652266を参照されたい。キメラおよびヒト化抗体キメラ抗体は、典型的には、組換えDNA法を用いて産生される。慣用的手法を用いて例えば、抗体のHおよびL鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、抗体をコードするDNA例えば、cDNAが単離され、シーケンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの典型的供給源として役立つ。一旦単離されると、DNAは発現ベクター中に入れられ、これは次に、別の状況では抗体の合成を得るために免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば大腸菌、COS細胞、CHO細胞または骨髄腫細胞中にトランスフェクトされる。DNAは、ヒトLおよびH鎖に関するコード配列を対応する非ヒト例えばネズミHおよびL定常領域の代わりに置換することにより修飾され得る例えば、MorrisonPNAS816851参照。免疫原性の大きな減少は、ヒトフレームワーク受容体フレームワークおよび定常領域上に非ヒト例えば、ネズミ抗体ドナー抗体のCDRをグラフトして、ヒト化抗体を生成することによってのみ、達成され得るJonesetalNature321522525およびVerhoeyenetalScience23915341536参照。しかしながら、CDRグラフト化は、それ自体、抗原結合特性の完全保持を生じ得ず、そしてしばしば、有意の抗原結合親和性が回収されるべきものである場合、ドナー抗体のいくつかのフレームワーク残基時として復帰突然変異と呼ばれるは、ヒト化分子中に保存される必要がある、ということが見出されているQueenetalPNAS861002910033;CoetalNature351501502参照。この場合、非ヒトドナー抗体との最大配列相同性を示すヒト可変領域が、ヒトフレームワークFRを提供するために、データベースから選択される。ヒトFRの選択は、ヒトコンセンサスまたは個々のヒト抗体からなされ得る。必要な場合、ドナー抗体からの重要な残基は、ヒト受容体フレームワーク中で置換されて、CDR立体配座を保存し得る。抗体のコンピューターモデル化を用いて、このような構造的に重要な残基を同定する手助けをし得るWO99/48523参照。代替的には、ヒト化は、張り合わせveneeringのプロセスにより達成され得る。独特のヒトおよびネズミ免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域の統計学的分析は、曝露残基の精確なパターンはヒト抗体とネズミ抗体とで異なり、ほとんどの個々の表面位置は、少数の異なる残基に対する強い選択性を有する、ということを明示したPadlanetalMolImmunol28489498およびPedersenetalJMolBiol235959973参照。したがって、ヒト抗体中に通常見出されるものと異なるそのフレームワーク領域中の曝露残基を置き換えることにより、非ヒトFvの免疫原性を低減することが可能である。タンパク質抗原性は表面接触可能性と相関し得るため、表面残基の置き換えは、マウス可変領域をヒト免疫系に対して見えないようにするのに十分であり得るMarketalinHandbookofExperimentalPharmacologyVol113ThepharmacologyofMonoclonalAntibodiesSpringerVerlag105134も参照。抗体の表面のみが変更され、支持残基は妨害されないままであるため、ヒト化のこの手法は張り合わせと呼ばれる。さらなる代替的アプローチとしては、WO04/006955に記述されたもの、ならびに細菌発現系を用いて、配列中のヒト生殖系列に近接した抗体を産生するHumaneerig商標Kalobiosの手法が挙げられるAlfenitoMAdvancingProteinTherapeuticsJanuary2007SanDiegoCalifornia。二重特異性抗原結合タンパク質二重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも2つの異なるエピトープに関する結合特異性を有する抗原結合タンパク質である。このような抗原結合タンパク質の製造方法は、当該技術分野で既知である。伝統的に、二重特異性抗原結合タンパク質の組換え的産生は、2つの免疫グロブリンH鎖-L鎖の同時発現に基づいており、この場合、2つのH鎖は異なる結合特異性を有するMillsteinetalNature305537539WO93/08829;およびTrauneckeretalEMBO1036553659参照。HおよびL鎖の無作為取り合わせのため、10個の異なる抗体構造の考え得る混合物が産生され、このうちの1つだけが所望の結合特異性を有する。代替的アプローチは、所望の結合特異性を有する可変ドメインを、ヒンジ領域、CH2およびCH3領域の少なくとも一部を含む重鎖定常領域と融合することを包含する。軽鎖結合に必要な部位を含有するCH1領域は、縮合物のうちの少なくとも1つに存在し得る。これらの融合物をコードするDNA、ならびに所望により、L鎖は、別個の発現ベクター中に挿入され、次いで、適切な宿主生物体中に同時トランスフェクトされる。しかし、2つまたは3つ全ての鎖に関するコード配列を1つの発現ベクター中に挿入することが可能である。一アプローチでは、二重特異性抗体は、一方の腕における第一結合特異性を有するH鎖、ならびに他方の腕における第二結合特異性を提供するH-L鎖対で構成されるWO94/04690参照。SureshetalMethodsinEnzymology121210も参照されたい。抗原結合断片定常領域を欠く断片は、古典的経路により補体を活性化する能力、または抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する能力を欠く。伝統的に、このような断片は、例えばパパイン消化による無傷抗体のタンパク質分解的消化により産生される例えばWO94/29348参照が、しかし、組換え的に形質転換された宿主細胞から直接産生されることもある。ScFvの産生に関しては、BirdetalScience242423426を参照されたい。さらに、抗原結合断片は、下記のような種々の工学処理技法を用いて産生され得る。Fv断片は、それらの2つの鎖の相互作用エネルギーがFab断片より低いと思われる。VHおよびVLドメインの会合を安定化するために、それらは、ペプチドScience242423426HustonetalPNAS8558795883、ジスルフィド架橋Biochemistry2913621367およびノブインホールknobinhole突然変異ProteinSci6781788と結び付けられてきた。ScFv断片は、当業者に周知の方法により産生され得るWhitlowetalMethodsCompanionMethodsEnzymol297105およびHustonetalIntRevImmunol10195217参照。ScFvは、細菌細胞、例えば大腸菌中で、または真核生物細胞中で産生され得る。ScFvの1つの欠点は生成物の一価性であり、これは、多価結合によるものである結合活性増大ならびにそれらの短い半減期を妨げる。これらの問題を克服するための試みとしては、化学的カップリングCanRes5340264034andMcCartneyetalProteinEng8301314により、あるいは非対合C末端システイン残基を含有するScFvの自発性部位特異的二量体化CellBiophys26187204参照により、付加的C末端システインを含有するScFvから産生される二価ScFv’2が挙げられる。代替的には、ScFvは、ダイアボディを形成するためにペプチドリンカーを3~12残基に短縮することにより、多量体を形成するよう強いられ得るHolligeretalPNAS9064446448参照。さらに、リンカーの縮小は、ScFv三量体ProteinEng10423433参照および四量体FEBSLett453164168参照を生じ得る。二価ScFv分子の構築は、ミニ抗体PacketalBiochemistry3115791584参照およびミニボディCancerRes5630553061参照を形成するためにタンパク質二量体化モチーフを用いた遺伝子融合によっても達成され得る。第三ペプチドリンカーにより2つのScFv単位を連結することにより、ScFv-Sc-Fvタンデムも産生され得るKuruczetalJImmol15445764582参照。二重特異性ダイアボディは、短いリンカーによりもう一つの抗体のVLドメインに連結された一抗体からのVHドメインからなる2つの一本鎖融合生成物の非共有的会合により、産生され得るKipriyanovetalIntJCan77763772参照。このような二重特異性ダイアボディの安定性は、上記のようなジスルフィド架橋またはノブインホール突然変異の導入により、あるいは2つのハイブリッドScFv断片がペプチドリンカーにより連結される一本鎖ダイアボディScDbの形成により、増強され得るKontermannetalJImmunolMethods226179188参照。四価二重特異性分子は、例えば、ScFv断片を、IgG分子のCH3ドメインに、またはヒンジ領域を介してFab断片に融合することにより入手可能であるColomaetalNatureBiotechnol15159163参照。代替的には、四価二重特異性分子は、二重特異性一本鎖ダイアボディの融合により作製されているFEBSLett4549094参照。らせん-ループ-らせんモチーフを含有するリンカーを用いたScFv-ScFvタンデムの二量体化によるより小さな四価二重特異性分子FEBSLett4324549参照、あるいは分子内対合を防止する配向で4つの抗体可変ドメインVHおよびVLを含む一本鎖分子JMolBiol2934156参照も、形成され得る。二重特異性Fab’2断片は、Fab’断片の化学的カップリングにより、またはロイシンジッパーを介したヘテロ二量体化により、作製され得るJExpMed175217225;およびKostelnyetalJImmunol14815471553参照。単離VHおよびVLドメインMO入手可能であるUS6,248,516;US6,291,158;およびUS6,172,197参照。ヘテロ接合抗体ヘテロ接合抗体は、任意の便利な架橋方法を用いて形成される2つの共有的に結び付けられた抗体からなる例えば、US4,676,980参照。その他の修飾本発明の抗原結合タンパク質は、それらのエフェクター機能を増強するかまたは変えるために、他の修飾を含み得る。抗体のFc領域と種々のFc受容体FcγRとの間の相互作用は、抗体依存性細胞性細胞傷害ADCC、補体の固定、食作用ならびに抗体の半減期/クリアランスを包含する抗体のエフェクター機能を媒介する、と考えられる。抗体のFc領域に対する種々の修飾は、所望の特性に依って実行され得る。例えば、別の状況では溶解性である抗体を非溶解性にさせるFc領域における特異的突然変異は、EP0629240およびEP0307434に詳述されており、あるいは、血清半減期を増大するために抗体中にサルベージ受容体結合エピトープを組み入れ得るUS5,739,277参照。ヒトFcγ受容体としては、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaおよび新生児FcRnが挙げられる。ShieldsetalJBiolChem27665916604は、共通組のIgG1残基が全てのFcγRsを結合するのに関与するが、一方、FcγRIIおよびFcγRIIIはこの共通組の範囲外の別個の部位を利用する、ということを実証した。IgG1残基の一群は、アラニン:Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297およびPro-239に変更された場合、全てのFcγRとの結合を低減した。全てがIgGCH2ドメイン中に存在し、CH1およびCH2をつなぐヒンジの近くに群をなす。FcγRIは結合のためにIgG1残基の共通組のみを利用するが、しかしFcγIIおよびFcγRIIIは、共通組のほかに、別個の残基と相互作用する。いくつかの残基の変更は、FcγRII例えばArg-292またはFcγRIII例えば、Glu-293との結合のみを低減した。いくつかの変異体は、FcγIIまたはFcγRIIIとの改良された結合を示したが、しかし、他の受容体との結合に作用しなかった後Ser-267Alaは、FcγIIとの結合を改良したが、しかしFcγRIIIとの結合は作用を受けなかった。他の変異体は、FcγIIまたはFcγRIIIとの改良された結合を示し、他の受容体との結合の低減を伴った例えば、Ser-298AlaはFcγIIIとの結合を改良し、FcγRIIとの結合を低減した。FcγIIIaに関して、最良の結合IgG1変異体は、Ser-298、Glu-333およびLys-334でのアラニン置換を併有した。新生児FcRn受容体は、抗体クリアランスおよび組織全体の経細胞輸送の両方に関与すると考えられるJunghansImmunolRes162957;およびGhetieetalAnnuRevImmunol18739766参照。ヒトFcRnと直接的に相互作用するよう決定されたヒトIgG1残基としては、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434およびHis435が挙げられる。この節に記載された位置のいずれかでの置換は、抗体の血清半減期増大および/またはエフェクター特性変更を可能にし得る。その他の修飾としては、抗体のグリコシル化変異体が挙げられる。それらの定常領域中の保存位置での抗体のグリコシル化は、抗体機能、特に上記のようなエフェクター機能に及ぼす顕著な作用を有することが知られている例えばBoydetalMolImmunol3213111318参照。1つ以上の炭水化物部分が吹かされ、置換され、欠失されまたは修飾される抗体またはその抗原結合断片のグリコシル化変異体が、意図される。アスパラギン-X-セリンまたはアスパラギン-X-トレオニンモチーフの導入は、炭水化物部分の酵素的付着のための潜在的部位を作製し、したがって、抗体のグリコシル化を操作するために用いられ得る。RajuetalBiochemistry4088688876では、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼおよび/またはα,2,3シアリルトランスフェラーゼを用いて、再ガラクトシル化および/または再シアリル化の工程を通して、TNFR-IgGイムノアドヘシンの末端シアリル化が増大された。末端シアリル化の増大は、免疫グロブリンの半減期を増大すると考えられる。抗体は、大半の糖タンパク質と同様に、典型的には糖型の混合物として産生される。この混合物は、抗体が真核生物、特に哺乳類細胞中で産生される場合に、特に明白である。限定された糖型物質を製造するために、種々の方法が開発されてきたZhangetalScience303371;SearsetalScience2912344;WackeretalScience2981790DavisetalChemRev102579HangetalAccChemRes34727参照。抗体は、本明細書中で用いられる場合、限定数の糖型物質を含み得る。抗体は、非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコールPEG、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンとカップリングされ得る。タンパク質とPEGとの共役は、タンパク質の半減期を増大するための、ならびにタンパク質の抗原性および免疫原性を低減するための確立された技法である。異なる分子量およびスタイル線状または分枝鎖を有するPEG化の使用は、無傷抗体ならびにFab’断片を用いて研究されてきたKoumenisetalIntJPharmaceut1988395参照。製造方法抗原結合タンパク質は、トランスジェニック生物、例えばヤギJImmunolMethods231147157参照、ニワトリGenetEngNews20155参照、マウスまたは植物CurrOpinionBiotechnol11199204MaNatMed4601606BaezetalBioPharm135054StogeretalPlantMolBiol42583590参照中で産生され得る。抗原結合タンパク質は、化学合成によっても産生され得る。しかしながら、抗原結合タンパク質は、典型的には、当業者に周知の組換え細胞培養技法を用いて産生される。抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単離され、複製可能ベクター、例えば、さらなるクローニング増幅または発現のためのプラスミド中に挿入される。一発現系は、グルタミン酸合成酵素系例えば、LonzaBiologicsにより販売されているであり、特にこの場合、宿主細胞はCHOまたはNS0である。抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、慣用的手法例えばオリゴヌクレオチドプローブを用いて、容易に単離され、シーケンシングされる。用いられ得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体が挙げられ、この中で、典型的にはプラスミドが用いられ得る。一般的に、このようなベクターはさらに、シグナル配列、複製の起点、1つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターおよび転写終結配列発現を促すために抗原結合タンパク質ポリヌクレオチドと操作可能的に連結されるを包含する。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別々のベクター中に挿入され、そして同時にまたは順次、同一宿主中に例えば、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔または形質導入により導入されるか、あるいは所望により、上記の導入前に、重鎖および軽鎖はともに同一ベクター中に挿入され得る。コドン最適化は、宿主細胞により産生されるタンパク質の総レベルが、野生型配列によりトランスフェクトされる場合のレベルと比較して、コドン最適化遺伝子でトランスフェクトされる場合により大きくなるよう意図して、用いられ得る。いくつかの方法が発表されているNakamuraetalNucleicAcidsResearch24214215W098/34640;W097/11086。遺伝暗号の冗長性のために、本明細書中に開示されるもの特に、所定の宿主細胞中での発現のために最適化されたコドンに代わるポリヌクレオチドも、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質をコードし得る。その本発明の抗原結合タンパク質のコドン使用頻度は、転写体および/または生成物収量を増大するために宿主細胞のコドン偏位を受け入れるよう修飾され得る例えば、HoekemaetalMolCellBiol19877291424。コドンの選択は、発現のために用いられる宿主細胞との適切な適合性を基礎にし得る。シグナル配列抗原結合タンパク質は、成熟タンパク質のN末端に特異的切断部位を有する異種シグナル配列との融合タンパク質として産生され得る。シグナル配列は、宿主細胞により認識され、プロセシングされるはずである。原核生物宿主細胞に関して、シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性腸毒素IIリーダーであり得る。酵母分泌に関して、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダーであり得る例えばWO90/13646参照。哺乳類細胞系では、ウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルおよびネイティブ免疫グロブリンシグナル配列が適切であり得る。典型的には、シグナル配列は、リーディングフレーム中で、抗原結合タンパク質をコードするDNAと結紮される。配列番号9で示されるようなシグナル配列が用いられ得る。複製の起点複製の起点は当該技術分野で周知であり、ほとんどのグラム陰性細菌に関してはpBR322、ほとんどの酵母に関しては2μプラスミド、そしてほとんどの哺乳類細胞に関しては種々のウイルス起点、例えばSV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPVが適している。一般的に、複製成分の起点は、哺乳類発現ベクターのためには必要でないが、しかし早期プロモーターを含有するため、SV40が用いられ得る。選択マーカー典型的選択遺伝子は、a抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、あるいはb栄養要求性欠損を補足し、または複合培地中で利用可能でない栄養素を供給する、あるいはc両方の組合せであるタンパク質をコードする。選択スキームは、宿主細胞の増殖を停止することを包含し得る。抗原結合タンパク質をコードする遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、例えば、同時送達された選択マーカーにより付与される薬剤抵抗性のために生き残る。一例は、DHFR選択マーカーであって、この場合、形質転換体はメトトレキサートの存在下で培養される。細胞は、漸増量のメトトレキサートの存在下で培養されて、当該外因性遺伝子のコピー数を増幅し得る。CHO細胞は、DHFR選択のために、特に有用な細胞株である。さらなる一例は、グルタミン酸合成酵素発現系LonzaBiologicsである。酵母に用いるための選択遺伝子の一例は、trp1遺伝子であるStinchcombetalNature28238参照。プロモーター抗原結合タンパク質を発現するための適切なプロモーターは、抗原結合タンパク質をコードするDNA/ポリヌクレオチドと操作可能的に連結される。原核生物宿主のためのプロモーターとしては、phoAプロモーター、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター、例えばTacが挙げられる。酵母細胞における発現に適したプロモーターとしては、3-ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の解糖酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド3ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース6ホスフェートイソメラーゼ、3-ホスホグリセラートムターゼおよびグルコキナーゼが挙げられる。誘導可能な酵素プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸ホスファターゼ、メタロチオネイン、ならびに窒素代謝またはマルトース/ガラクトース利用に関与する酵素が挙げられる。哺乳類細胞系における発現のためのプロモーターとしては、ウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス例えばアデノウイルス2、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス特に、最初期遺伝子プロモーター、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルスRSVプロモーター、ならびに早期または後期シミアンウイルス40が挙げられる。もちろん、プロモーターの選択は、発現のために用いられる宿主細胞との適切な適合性に基づいている。最初のプラスミドは、RSVおよび/またはSV40および/またはCMVプロモーター、軽鎖可変領域VLをコードするDNA、κC領域をネオマイシンおよびアンピシリン耐性選択マーカーと一緒に含み、二番目のプラスミドは、RSVまたはSV40プロモーター、重鎖可変領域VHをコードするDNA、γ1定常領域をコードするDNA、DHFRおよびアンピシリン耐性マーカーを含み得る。エンハンサー要素例えば高等真核生物に関して適切である場合、ベクター中でプロモーター要素に操作可能的に連結されるエンハンサー要素が用いられ得る。哺乳類エンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトタンパク質およびインスリンからのエンハンサー要素が挙げられる。代替的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサー要素、例えばSV40エンハンサーbp100~270で、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはネズミIgG2a遺伝子座を用い得るWO04/009823参照。エンハンサーは、プロモーターに対して蒸留の部位でベクター上に置かれ得る。代替的には、エンハンサーは、他の場所に、例えば非翻訳領域内またはポリアデニル化シグナルの下流に置かれ得る。エンハンサーの選択および位置決めは、発現のために用いられる宿主細胞との適切な適合性を基礎にし得る。ポリアデニル化/終結真核生物系において、ポリアデニル化シグナルは、抗原結合タンパク質をコードするDNA/ポリヌクレオチドと操作可能的に連結される。このようなシグナルは、典型的には、オープンフレームワークの3’に配置される。哺乳類系では、非限定例としては、成長ホルモンに由来するシグナル、伸長因子1αおよびウイルス例えばSV40遺伝子またはレトロウイルス長末端反復が挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化/終結シグナルとしては、ホスホグリセレートキナーゼPGKおよびアルコールデヒドロゲナーゼ1ADH遺伝子に由来するものが挙げられる。原核生物系では、ポリアデニル化シグナルは、典型的には必要とされず、その代わりに、より短く、より限定されたターミネーター配列を用いることが常である。ポリアデニル化/終結配列は、発現のために用いられる宿主細胞との適切な適合性を基礎にし得る。その他の方法/収量を高めるための要素上記のほかに、収量を高めるために用いられ得るその他の特徴としては、クロマチンリモデリング要素、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン修飾が挙げられる。宿主細胞抗原結合タンパク質をコードするクローニングまたは発現ベクターのための適切な宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。適切な原核生物細胞としては、真正細菌、例えば腸内細菌科、例えば大腸菌属、例えば大腸菌例えば、ATCC31,446;31,537;27,325、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌、セラチア族、例えばセラチアマルセセンス、および赤痢菌属、ならびにバスラス属、例えば枯草菌およびバシラスリケニフォルミスDD266710参照、シュードモナス属、例えば緑膿菌、およびストレプトミセス属が挙げられる。酵母宿主細胞のうち、出芽酵母、分裂酵母、クルイベロミセス例えば、ATCC16,045;12,424;24178;56,500、ヤロウイア属EP402,226、メタノール資化酵母EP183070、PengetalJBiotechnol108185192も参照、カンジダ属、トリコデルマリーシアEP244234、ペニシリン、トリポクラジウム属およびアスペルギルス属宿主、例えばアスペルギルスニデュランスおよびクロカビも意図される。高等真核生物宿主細胞としては、哺乳類細胞、例えばCOS-1ATCCNo.CRL1650、COS-7ATCCCRL1651、ヒト胚性腎臓細胞株293、仔ハムスター腎臓細胞BHKATCCCRL.1632、BHK570ATCCNO:CRL10314、293ATCCNO.CRL1573、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO例えば、CHO-K1、ATCCNO:CCL61、DHFR-CHO細胞株、例えばDG44UrlaubetalSomaticCellMolGenet12555556参照、特に、懸濁培養用に適応されたCHO細胞株、マウスセルトリ細胞、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞ATCCCRL-1587、HELA細胞、イヌ腎臓細胞ATCCCCL34、ヒト肺細胞ATCCCCL75、HepG2および骨髄腫またはリンパ腫細胞、例えばNS0US5,807,715参照、Sp2/0、Y0が挙げられる。このような宿主細胞はさらにまた、抗原結合タンパク質の質、機能および/または収量を改変するために、工学処理され、または適応され得る。非限定例としては、特異的改変例えば、グリコシル化酵素およびタンパク質フォールディングシャペロンが挙げられる。細胞培養方法抗原結合タンパク質をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に既知の任意の方法により培養され得る。宿主細胞は、スピナーフラスコ、ローラーボトルまたは中空繊維系中で培養され得るが、しかし、大量生産のためには、撹拌タンク反応器が、特に懸濁培養のために用いられる。撹拌タンクは、例えばスパージャー、そらせ板または低剪断翼を用いて、曝気のために適応され得る。気泡塔およびエアリフト反応器に関しては、空気または酸素気泡による直接曝気が用いられ得る。宿主細胞が無血清培地中で培養される場合、曝気工程の結果としての細胞損傷を防止するのに役立つよう、細胞保護剤、例えばプルロニックF-68を、培地は補足される。宿主細胞特性によって、微小担体が足場依存性細胞株のための増殖基質として用いられ得るか、あるいは細胞は懸濁培養に適応され得るこれが典型的。宿主細胞、特に無脊椎動物宿主細胞の培養は、種々の操作方式、例えばフェドバッチ、反復バッチ処理DrapeauetalCytotechnology15103109参照、延長バッチ法または還流培養を利用し得る。組換え的に形質転換された哺乳類宿主細胞は血清含有培地、例えばウシ胎仔血清FCS中で培養され得るが、しかし、例えばこのような宿主細胞は、KeenetalCytotechnology17153163に開示されているような合成無血清培地、あるいは市販の培地、例えばProCHO-CDMまたはUltraCHO商標CambrexNJUSA中で、必要な場合には、エネルギー源、例えばグルコースおよび合成成長因子、例えば組換えインスリンを補足して、培養される。宿主細胞の無血清培養は、それらの細胞が無血清条件で増殖するよう順応されることを必要とし得る。一順応アプローチは、血清含有培地中でこのような宿主を培養し、そして、宿主細胞が無血清条件で順応することを習得するよう、繰り返し、培地の80を無血清培地に交換することである例えば、ScharfenbergetalinAnimalCellTechnologyDevelopmentstowardsthe21stcenturyJBiotechnol721320andCupitetalLettApplMicrobiol29273277参照。脱アミド化は、アミド官能基が除去される化学反応である。生化学では、その反応は、アミノ酸のアスパラギンおよびグルタミンのアミド含有側鎖を損傷するため、タンパク質の分解において重要である。脱アミド化反応は、タンパク質の有用な寿命を限定し得ると考えられ、それらは、治療用タンパク質の製造中に生じる最も一般的な翻訳後修飾のうちの1つでもある。例えば、invitroまたはinvivoの生物学的活性の低減または損失が組換えヒトDNAアーゼおよび組換え可溶性CD4に関して報告されているが、一方、他の組換えタンパク質は影響を及ぼされないと思われる。ミオスタチンと結合する本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の能力は、脱アミド化を誘導するストレス条件下では影響を及ぼされないと思われる。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の生物学的活性、ならびにそれらの有用な寿命は、脱アミド化により影響されるとは考えられない。医薬組成物疾患、障害および症状という用語は、互換的に用いられる。本明細書中に記載されるようなヒト化抗原結合タンパク質の精製調製物は、本明細書中に記載されるヒト疾患の治療に用いるために医薬組成物中に組み入れられ得る。医薬組成物は、ミオスタチンが疾患に寄与するかまたはミオスタチンの活性の中和が有益である疾患の治療に用いられ得る。治療的有効量の本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質を含む医薬組成物は、ミオスタチン中和に応答する疾患の治療に用いられ得る。薬学的調製物は、ヒト化抗原結合タンパク質を、製薬上許容可能な担体と組合せて含み得る。ヒト化抗原結合タンパク質は、単独で、または医薬組成物の一部として、投与され得る。典型的には、このような組成物は、許容可能な薬学的実行により知られており、求められるような製薬上許容可能な担体を含む例えば、RemingtonsPharmaceuticalSciences16theditionMackPublishingCo参照。このような担体の例としては、滅菌担体、例えば生理食塩水、リンガー溶液またはデキストロース溶液が挙げられ、任意に適切な緩衝液で5~8の範囲内のpHに緩衝される。医薬組成物は、注射または連続注入例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内または門脈内により投与され得る。このような組成物は、適切には、可視的粒状物質を含有しない。医薬組成物は、1mg~10gの抗原結合タンパク質、例えば5mg~1gの抗原結合タンパク質を含み得る。代替的には、組成物は、5mg~500mg、例えば5mg~50mgを含み得る。このような医薬組成物の製造方法は、当業者に周知である。医薬組成物は、単位投薬形態で1mg~10gの抗原結合タンパク質を、任意に使用説明書と一緒に含み得る。医薬組成物は、当業者に周知であるかまたは明らかな方法に従って、投与前に再構成するために凍結乾燥フリーズドライされ得る。抗体がIgG1アイソタイプを有する場合、このアイソタイプの抗体の銅媒介性分解の程度を低減するために、銅のキレート剤、例えばクエン酸塩例えばクエン酸ナトリウムまたはEDTAまたはヒスチジンが医薬組成物に付加され得るEP0612251参照。医薬組成物は、可溶化剤、例えばアルギニン塩基、洗剤/抗凝集剤、例えばポリソルベート80、ならびに不活性ガス、例えばバイアル上部空間の酸素に取って代わるための窒素も含み得る。抗原結合タンパク質を投与するための有効用量および治療レジメンは、一般的には、経験的に決定され、患者の年齢、体重および健康状態、そして治療されるべき疾患または障害といったような因子に左右され得る。このような因子は、主治医の権限内である。適切な用量を選択するに際しての指針は、例えばSmithetalAntibodiesinhumandiagnosisandtherapyRavenPressNewYorkに見出され得る。したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、治療的有効量で投与され得る。被験体に投与される抗原結合タンパク質の投与量は、一般的に、1μg~150mg/被験体の体重1kg、0.1mg/kg~100mg/kg、0.5mg/kg~50mg/kg、1~25mg/kgまたは1~10mg/kgである。例えば、用量は、10mg/kg、30mg/kg、または60mg/kgであり得る。抗原結合タンパク質は、非経口的に、例えば皮下に、静脈内に、または筋肉内に投与され得る。所望により、有効1日用量の治療用組成物が、例えば2、3、4、5、6回またはそれ以上の回数に分けて、適切な間隔で、任意に単位剤形で、投与され得る。例えば、用量は、14または28日毎に1回、各投与日に多数回用量投与形態で、皮下投与され得る。用量の投与は、静脈内注入により、典型的には15分~24時間、例えば2~12時間、または2~6時間の期間に亘ってなされ得る。これは、有毒副作用の低減を生じ得る。用量の投与は、必要に応じて1回以上、例えば1日3回、毎日1回、2日毎に1回、週1回、2週間に1回、月1回、3ヶ月毎に1回、6ヶ月毎に1回、または12ヶ月毎に1回、繰り返され得る。抗原結合タンパク質は、維持療法により、例えば6ヶ月以上の期間の間、週1回、投与され得る。抗原結合タンパク質は、間欠療法により、3~6ヶ月の期間投与され、次に、3~6ヶ月間は用量投与せず、その後、3~6ヶ月間、抗原結合タンパク質を投与するといった周期で用量投与される。投与量は、抗ミオスタチン抗原結合タンパク質を標的にする抗イディオタイプ抗体を用いることにより、生物学的試料中で投与後の循環抗ミオスタチン抗原結合タンパク質の量を測定することにより、決定され、または調整され得る。投与量を決定し、または調整する他の手段、例えば薬理学の生物学的マーカーバイオマーカー、筋肉量および/または機能、安全性、耐容性および治療反応の測定これらに限定されないが利用され得る。抗原結合タンパク質は、被験体におけるミオスタチン活性を下方調節するために有効な量で、有効な期間、投与され得る。抗原結合タンパク質は、特定部位を標的として治療を向けるような方法で、被験体に投与され得る。例えば抗原結合タンパク質は、筋肉、例えば骨格筋中に、局所的に注射され得る。ヒト化抗原結合タンパク質は、本明細書中で記載される疾患の治療に用いられる1つ以上の他の治療的に活性な薬剤、例えばミルタザピン、酢酸メゲストロール、ドロナビノール、オキサンドロロン、テストステロン、組換え成長ホルモン、ニュートロピン、ヒューマトロープ、ゲノトロピン、ノルディトロピン、サイゼンおよびオムニトロープ、シプロヘプタジン、オルニチンオキサグルタレート、メチルフェニデート、ならびにモダフィニル、オルリスタット、シブトラミン、リモナバンと組合せて用いられ得る。このような組合せは、ミオスタチンが疾患に清、またはミオスタチンの活性を中和することが有益である疾患の治療に用いられ得る。ヒト化抗原結合タンパク質が他の治療的に活性な薬剤と組合せて用いられる場合、個々の成分は、一緒に、または別々に、順次または同時に、別個のまたは併合製剤処方物中で、任意の適切な経路により、投与され得る。別々にまたは順次投与される場合、抗原結合タンパク質および治療的に活性な薬剤単数または複数は、任意の順序で投与され得る。上で言及された組合せは、上記のような組合せを、任意に製薬上許容可能な担体または賦形剤と一緒に含む単一製剤処方物の形態で用いるために示され得る。同一処方物中に組合される場合、構成成分は安定であり、互いに、そして処方物の他の構成成分と相溶性であって、投与のために処方され得る、と理解される。別々に処方される場合、それらは、任意の便利な処方物中に、例えば当該技術分野の抗原結合タンパク質に関して既知の方法で、提供され得る。同一疾患に対して活性である第二治療薬と組合せる場合、各構成成分の用量は、抗原結合タンパク質が単独で用いられる場合とは異なり得る。適切な用量は、当業者には容易に理解されるであろう。ヒト化抗原結合タンパク質および治療的に活性な薬剤単数または複数は、相乗的に作用し得る。言い換えれば、抗原結合タンパク質と治療的活性薬剤単数または複数とを組合せて投与すると、各々の単独の作用の合計よりも大きい作用を、本明細書中に記載される疾患、障害または症状に及ぼし得る。医薬組成物は、他の薬剤とともに抗原結合タンパク質からなる構成要素を有し、任意に使用説明書を伴うキットを含み得る。便宜のために、キットは、予定量での試薬を、使用説明書とともに含み得る。個体、被験体および患者という用語は、互換的に本明細書中で用いられる。被験体は、典型的にはヒトである。被験体は、哺乳類、例えばマウス、ラットまたは霊長類例えば、マーモセットまたはサルでもあり得る。被験体は、非ヒト動物であり得る。抗原結合タンパク質は、獣医的用途も有し得る。治療されるべき被験体は、農場動物、例えば雌ウシまたは雄ウシ、ヒツジ、ブタ、去勢雄ウシ、ヤギまたはウマであり、あるいは飼育動物、例えばイヌまたはネコであり得る。動物は、任意の齢、または成熟成体動物であり得る。被験体が実験室動物、例えばマウス、ラットまたは霊長類である場合、動物は、筋肉消耗、筋疾患または筋肉損失に関連した疾患または症状を誘導するよう処置され得る。処置は、治療的、予防的または防止的であり得る。被験体は、それを必要としているものであり得る。処置を必要としているものとしては、将来的に疾患を発症する恐れがあるもののほかに、既に特定の医学的疾患に罹患している個体を含み得る。したがって、本明細書中で記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、予防的または防止的処置のために用いられ得る。この場合、疾患の1つ以上の局面または症候の開始を防止するかまたは遅延するために、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質が投与される。被験体は、無症候性であり得る。被験体は、疾患に対する遺伝的素因を有し得る.このような個体に、予防的有効量の抗原結合タンパク質が投与される。予防的有効量は、本明細書中に記載される1つ以上の局面または症候の開始を防止するかまたは遅延する量である。本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、治療方法にも用いられ得る。治療という用語は、疾患の少なくとも1つ以上の局面または症候の緩和、低減または防止を包含する。例えば、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、本明細書中に記載される疾患の1つ以上の局面または症候を改善し、または低減するために用いられ得る。本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、治療的、予防的または防止的処置のための有効量で用いられる。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の治療的有効量は、疾患の1つ以上の局面または症候を改善するかまたは低減するために有効な量である。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、本明細書中に記載される疾患を処置し、防止し、または治癒するためにも用いられ得る。本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、一般的に、被験体の健康に及ぼす有益な作用を有し、例えばそれは、被験体の想定寿命を増大し得る。本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、完全な治癒に作用する必要はなく、あるいは疾患の全ての症候または症状発現を根絶して、実行可能な治療的処置を施す必要はない。関連分野で認識されているように、治療薬として用いられる薬剤は、所定の疾患状態の重症度を低減し得るが、しかし疾患の全ての症状発現をなくして有用な治療薬としてみなされる必要はない。同様に、予防的に施される処置は、実用可能な予防薬を生じさせるために疾患の開始を防止するに際して完全に有効である必要はない。単に、例えばその症候の数または重症度を低減することにより、あるいは別の処置の有効性を増大することにより、あるいは別の有益な作用を生じさせることにより疾患の衝撃を低減すること、あるいは被験体において疾患が生じるかまたは悪化する見込みを低減することで、十分である。障害、疾患または症状としては、筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋廃用萎縮、HIV、AIDS、癌、外科手術、熱傷、筋肉骨または神経に対する外傷または損傷、肥満症、糖尿病例えばII型真性糖尿病、関節炎、慢性腎不全CRF、末期腎疾患ESRD、うっ血性心不全CHF、慢性閉塞性肺疾患COPD、待機的関節修復、多発性硬化症MS、卒中、筋ジストロフィー、運動ニューロン神経疾患、筋萎縮性側索硬化症ALS、パーキンソン病、骨粗鬆症、骨関節炎、脂肪酸肝疾患、肝硬変、アジソン病、クッシング症候群、急性呼吸窮迫症候群、ステロイド誘導性筋肉消耗、筋炎および脊柱側彎症が挙げられる。加齢性筋消耗筋疾患とも呼ばれるまたは筋肉減少症は、年齢に伴って起こる筋肉量および筋肉強度の進行性損失である。この症状は、筋肉破壊増大のほかに、筋肉の合成および修復低減の結果と考えられる。加齢性筋消耗では、個々の繊維が失われるため、筋繊維の束は縮小し得る。さらに、このような被験体における廃用性筋萎縮のため、筋繊維も小さくなる。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、筋肉減少症を処置するために用いられ得る。加齢性筋消耗は中年に開始し、残りの人生を通して加速する。当該症状に関して最も一般的に用いられる定義は、四肢骨格筋量/身長2kg/m2が若年成体に関する平均値の2標準偏差未満というものである。この障害は、移動性低減、機能的能力障害および独立性の損失を引き起こし得る。廃用性筋萎縮は、多数の異なる症状、疾患または障害、例えば不動化、術後外科学、透析、救命救急診療例えば、熱傷、ICU、筋肉または骨に対する外傷または損傷と関連づけられ得る。廃用性萎縮は、長期間の筋肉廃用をもたらす多数の原因または出来事に起因し得る。筋萎縮は、筋繊維のサイズおよび/または数および/または機能の低減を包含する。悪液質は、体重の損失、筋肉量の損失、筋萎縮、疲労、衰弱、ならびに積極的に体重を落とそうとしていない個体における食欲の損失のいずれか1つまたは組合せに関連した症状である。悪液質は、種々の他の障害、例えば本明細書中に記載される疾患のうちのいずれか1つと関連し得る。例えば、悪液質は、癌、感染症後、HIVまたはAIDSによる、腎不全、自己免疫病、ならびに薬剤またはアルコール中毒と関連し得る。さらに、心臓悪液質は、例えば、心筋梗塞を起こしたことがある患者、またはうっ血性心不全を有する患者において、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質を用いて処置され得る。したがって、癌悪液質を有する患者は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質により処置され得る。慢性閉塞性肺疾患COPD患者は、疾患の軽度、中等度または重殿症候を示し得る。COPDは、気腫および気管支炎を有する患者を包含する。気腫を有する患者は、一般的に、非常に痩せているかまたはひ弱であり、彼等の疾患は一般的に回復不能であると考えられる。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、患者の根底にある肺機能を改善することがより難しいため、気腫を有する患者を処置するために用いられ得る。気管支炎を有する患者は、筋肉を欠くこともあるがしかし、一般的により強健であり、その疾患はある程度の回復可能性を有すると考えられる。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、任意に患者の根底にある肺機能の処置と組合せて、気管支炎を有する患者を処置するために用いられ得る。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質による処置は、気腫または気管支炎を有する患者における呼吸に関与する筋肉の機能を改善することに及ぼす直接的作用を有し得る。癌患者はしばしば筋消耗を示すが、これは、入院、感染、脱水、股関節部骨折、そして最終的には死をもたらし得る。例えば、筋肉量の10損失は、癌患者の劇的に低い予後に関連し得る。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質による処置は、癌患者の全身状態を改善して、例えば、完全化学療法または化学療法のより攻撃的使用を可能にし、そして患者の生活の質を改善し得る。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質を用いて、癌悪液質を処置し得る。癌としては、例えば前立腺、膵臓、肺、頭および首、結腸直腸の癌、およびリンパ腫が挙げられる。例えば、前立腺癌では、被験体は転移性前立腺癌を有し得るし、および/またはアンドロゲン除去療法ADTを受けているかもしれない。癌を有する被験体は、局所進行型または転移性癌、例えば早期転移性癌を有し得る。したがって、前立腺癌後にADTを受けている患者は、本発明の抗原結合タンパク質により処置され得る。慢性腎不全CRFまたは末期腎疾患ESRDを有する患者は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質で処置され得る。例えば、患者は、透析前処置されて、透析の開始を遅延し得る。代替的には、1年以上、2年以上、または3年以上の間透析を続けてきた患者は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質で処置され得る。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の使用は、短期的に、または抗原結合タンパク質の長期使用により長期的に、筋消耗を防止し、処置し得る。筋肉、骨または神経に対する外傷または損傷の例としては、股関節部骨折および急性膝損傷が挙げられる。股関節部骨折を有する患者は、しばしば骨折前に筋萎縮を有し、筋萎縮は、多数の患者において股関節部骨折への重要な誘因である。股関節部骨折後、不使用のために筋肉強度は失われ、そしてしばしば、股関節部骨折患者は歩行移動または機能が骨折前のレベルに戻らない。さらに、多くの股関節部骨折患者は、COPD、ESRDおよび癌といった症状にも悩まされ、これらは有意の筋消耗に関与し、そして股関節部骨折を受け易くする。したがって、患者は、股関節部骨折の恐れがある場合、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質で処置され得る。これらの患者は直ちに手術を受けなければならないため、股関節部骨折に伴ってかなりの治療的緊急性が存在する。したがって、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質による術後処置は、筋肉の量および強度の損失を小さくし、および/または筋肉の量および強度の回復を改善することにより、股関節部骨折患者の回復を手助けし得る。股関節部骨折の恐れがある被験体、または股関節部骨折を有する被験体は、本発明の抗原結合タンパク質で処置され得る。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、手術前に患者の筋肉を構築するために予定手術患者を処置するのに役立ち得る。筋ジストロフィーは、進行性筋衰弱を引き起こす遺伝的、遺伝性筋疾患の一群を指す。筋ジストロフィーは、進行性骨格筋衰弱、筋肉タンパク質の欠陥、ならびに筋肉細胞および組織の死を特徴とする。筋ジストロフィーの例としては、Duchenne型DMD、Becker型、四肢帯型LGMD、先天性、顔面肩甲上腕型FSHD、筋緊張性、眼球咽頭性、およびEmeryDreifuss型が挙げられる。例えば、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、Duchenne型、Becker型または四肢帯型筋ジストロフィーを処置するために用いられ得る。さらにまた、局所性萎縮よりむしろ散在性筋萎縮が、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質により処置され得る。特に、筋緊張性ジストロフィーは、より局部化された筋萎縮/機能不全、ならびに本疾患における骨格/骨および心臓問題の役割のため、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質により処理され得る。肥満は、健康が負の影響を及ぼされ得る程度まで過剰体脂肪が蓄積した症状である。それは一般に、体格指数BMI=体重を身長の二乗で割った値30kg/m2以上、と定義される。これは、肥満と、体重超過BMI=25~29.9kg/m2と定義されるとを区別する。肥満は、種々の疾患、例えば心臓血管性疾患、2型真性糖尿病、閉塞性睡眠時無呼吸、癌および骨関節炎と関連し得る。その結果、肥満は平均余命を低減することが判明している。肥満のための典型的処置としては、食餌療法、身体運動および外科手術が挙げられる。肥満は、筋肉量を壮大氏、その結果、基礎代謝率を増大し得る本明細書中に記載される抗原結合タンパク質により処置され得る。例えば、血清の化学的性質およびインスリン感受性の改善は、このような処置に起因し得る。筋肉量、筋肉強度および筋肉機能における低減の典型的局面または症候としては、全身性衰弱、疲労、身体活動の低減、転倒し易いこと、機能的無能力、自立性の損失、移動性低減のための抑うつ、食欲損失、栄養失調、および異常な体重減少のいずれか1つまたはいずれかの組合せが挙げられる。当該疾患は、高レベルのミオスタチンと関連し得る。本明細書中に記載される抗原結合タンパク質は、ミオスタチンのレベルおよび/またはミオスタチンの活性を調整するために用いられ得る。多重終点を用いて、筋肉量、筋肉強度および筋肉機能の変化を実証し得る。このような終点としては、簡易身体能力バッテリー、レッグプレス、directedqualityoflifesurvey、日常生活動作ADL、機能的自立度評価表FIM、機能検査およびスケール例えば、歩行検査、階段上がり、自転車作業計、強度検査およびスケール例えば、握力検査、徒手筋力検査スケール、生体インピーダンス分析、筋電図、動力計、二重エネルギーX線吸収測定、コンピューター断層撮影検査、磁気共鳴画像法、筋組織学、血液/生化学検査、人体測定学、皮膚厚測定、体格指数査定、ならびに体重モニタリングが挙げられる。筋肉強度は、両側足筋肉、首筋肉または腹筋を用いて査定され得る。簡易身体能力バッテリーSPPBは、起立平衡、歩行速度ならびに椅子から立ち上がる能力の測定により査定される0~4のスケールで等級分けする下肢機能の多成分測定である。歩行検査は、ある距離を患者が歩くのに要する時間としての下肢機能の評価である。レッグプレスは、重量を用いて足の強度を測定し、力を査定する。多重スケールおよびシステムは、患者の生活の質を定性的に評価するために、当該技術分野で用いられる。二重エネルギーX線吸収測定DEXAは、概算骨格筋量の測定である。筋肉量、および筋肉強度および筋肉機能の変化を実証するために、動物における多数の検定も用いられ得る。例えば、握力検査は、握力計を引張る動物の力を測定する。傾斜面試験は、それ自身を保留する動物の能力を測定する。遊泳試験は、代表的活動性、例えば遊泳を通した機能的能力を測定するが、これは人における歩行検査と同様である。後肢発揮力検査HEFTは、尾に刺激を適用後に発揮される最大力を測定する。動物におけるその他の身体能力検査としては、歩行速度および回転かご運動が挙げられる。これランの検査/モデルは、単独で、または任意の組合せで用いられ得る。高脂肪食HFD誘導性インスリン抵抗性マウスモデルは、肥満に関するモデルとして用いられ得る。糖質コルチコイドは、膨大な一連の慢性炎症性疾病、例えば全身性紅斑性狼瘡、サルコイドーシス、関節リウマチおよび気管支喘息の治療に一般に用いられる。しかしながら、高用量の糖質コルチコイドはヒトおよび動物における筋萎縮を引き起こす。同様に、副腎皮質ホルモン過剰症は、クッシング病における筋萎縮に重要な役割を果たす。デキサメタゾンdex誘導性筋萎縮は、筋肉ミオスタチンmRNAおよびタンパク質発現の用量依存性の顕著な誘導に関連するMaKetal2003AmJPhysiolEndocrinolMetab285E363E371。ミオスタチン発現増大は、糖質コルチコイドが重要な役割を果たす固定化および熱傷損傷のような筋萎縮のいくつかのモデルでも報告されているLalaniRetal2000JEndocrinol167417428;KawadaSetal2001JMuscleResCellMotil22627633;およびLangCHetal2001FASEBJ15NIL323NIL338。したがって、糖質コルチコイド誘導性筋消耗のマウスモデルは、本発明の抗原結合タンパク質を試験するために用いられ得る。ヒト廃用性筋萎縮は一般に、整形外科的障害、例えば関節の慢性骨関節炎、または骨折の治療のためのギプス固定化に関連して、ならびにその他の医療的または外科的理由のための長期安静の状況において起こる。廃用性筋萎縮は、筋肉強度の低減および無能力化を生じる。身体のリハビリテーションは、依然として唯一の治療選択肢であり、それはしばしば、長期間を要し、筋肉を正常のサイズまたは強度に常に戻すわけではない。したがって、筋萎縮を誘導するために坐骨神経破砕を用いるマウスモデルは、本発明の抗原結合タンパク質を試験するために用いられ得る。癌患者の有意部分は、脂肪組織の進行性萎縮および筋消耗のために体重損傷に悩まされる。癌死の約20が筋肉損失により引き起こされる、と見積もられる。筋消耗は一般的に、多くの疾患症状における死亡率の良好な予測子である。AIDS、飢餓および癌に関する調査からのデータは、個々の前疾病除脂肪体重の30~40より多い損失は致命的であるということを示すDeWyeWDInClinicsinOncologyEditedbyCalmanKCandfearonKCHLondonSaunders1986Vol5no2p251261;KotterDPetal1990JParentEnteralNutr14454358;およびWigmoreSJetal1997BrJCancer75106109。したがって、筋消耗に関与するシグナル伝達経路の抑制による筋萎縮の考え得る軽減は、非常に魅力的である。したがって、C-26腫瘍保有マウスモデルは、本発明の抗原結合タンパク質を試験するために用いられ得る。診療所では、腱切除は、筋腱間単位における先天性および/または後天性変形のための腱の外科的横切開を指すが、しかし、腱連続性の損失は、外傷または変性筋骨格性疾患中にも起こり得る。腱切除は、静止張力の即時損失、筋節短縮、ならびに筋肉量および力発生能力のその後の減少を生じるJamalietal2000MuscleNerve23851862。したがって、骨格筋萎縮を誘導するマウス腱切除モデルを用いて、本発明の抗原結合タンパク質を試験し得る。記載される抗原結合タンパク質は、短期、長期および/または予防的療法のために用いられ得る。短期療法は、筋力を急速に構築し、患者を適切なレベルの機能的能力にし、次いで、これは、運動または長期療法により維持され得る。長期療法は、経時的に筋肉強度を維持するかまたは徐々に構築するために用いられ得る。予防的療法は、記載された患者集団において典型的には経時的に起こる筋肉の量および強度の減少を防止するために用いられ得る。余り重症でない筋消耗における早期介入は筋肉機能の維持のみを必要とするため、筋肉機能の改善は、上首尾の処置を明示する必要が常にあるわけではない。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉の強度、量および機能を増大するための化粧用途も有し得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、宇宙飛行士に関する宇宙飛行および訓練運動中の用途も有し得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉、例えば骨格筋に及ぼす直接的生物学的作用を有し得る。代替的には、記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉、例えば骨格筋に及ぼす間接的な生物学的作用を有し得る。例えば、該ヒト化抗原結合タンパク質は筋組織学、筋肉量、筋肉繊維数、筋肉繊維サイズ、筋肉再生および筋線維症の1以上に対して影響を有しうる。例えば、筋肉量は、増大され得る。特に、被験体の除脂肪量は増大され得る。以下の筋肉:四頭筋、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋TAおよび長指伸筋EDLのいずれか1つまたは組合せの量は、増大され得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋繊維数および/または筋繊維サイズを増大し得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉再生を増強しおよび/または筋繊維症を低減する。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋芽細胞の増殖速度を増大し、および/または筋原性分化を活性化し得る。例えば、ヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉前駆体細胞の増殖および/または分化を増大し得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、衛星細胞に及ぼす以下の作用の1つまたは組合せを有し得る:増殖を活性化し、増大する、そして自己再生を促進する。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、ミオスタチンレベルを調整し得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、被験体の体重を増大し得る。記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋収縮性を増大し、および/または筋肉機能を改善し得る。ヒト化抗原結合タンパク質は、骨密度を増大し得る。本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、筋肉の増殖、機能および収縮性に関与するタンパク質の合成および/または異化作用を調整し得る。例えば、筋肉関連タンパク質、例えばミオシン、ジストロフィン、ミオゲニンのタンパク質合成は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の使用により上方調節され得る。例えば、筋肉関連タンパク質、例えばミオシン、ジストロフィン、ミオゲニンのタンパク質異化作用は、本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質の使用により下方調節され得る。診断的使用方法本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質は、診断目的のためにinvitroまたはinvivoで生物学的試料中のミオスタチンを検出するために用いられ得る。例えば、抗ミオスタチン抗原結合タンパク質は、培養細胞中、組織中または血清中のミオスタチンを検出するために用いられ得る。組織は、先ず、ヒトまたは動物身体から除去され得た例えば、生検。慣用的イムノアッセイ、例えばELISA、ウエスタンブロット、免疫組織化学、または免疫沈降法が用いられ得る。ミオスタチンの存在またはレベルを疾患と相関させることにより、当業者は関連疾患を診断し得る。さらに、被験体におけるミオスタチンのレベル増大の検出は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質による処置に応答する患者集団を示し得る。ミオスタチンレベルにおける低減の検出は、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質で処置された被験者における筋肉の強度、量および機能の増大の生物学的作用を示し得る。抗原結合タンパク質は、1つ以上の抗原結合タンパク質、検出可能ラベル、ならびにキットの使用のための使用説明書を含む診断キット中に提供され得る。便宜のために、キットは、予定量での試薬を、使用説明書とともに含み得る。本明細書中に記載されるヒト化抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、それを必要とする被験体に投与され得る。核酸分子は、適切な足場またはドメイン、可変ドメインまたは全長抗体中でCDRを発現し得る。核酸分子は、ヒトまたは動物細胞中での発現を可能にするベクター中に含まれ得る。核酸分子またはベクターは、製薬上許容可能な賦形剤および/または上記のような1つ以上の治療的に活性な薬剤とともに投与するために処方され得る。実施例1.組換えタンパク質の生成1.1成熟二量体ミオスタチンの精製HexaHisGB1Tev/D76Aマウスミオスタチンポリタンパク質配列配列番号101を、CHO分泌系中で発現させた。GB1タグ配列番号102はWO2006/127682に記載されており、高レベルでのミオスタチンの発現を可能にすることが判明したが、これは、Fcタグを用いた構築物と比較して、ミオスタチンの適正なフォールディングを可能にした。ヒトおよびマウス成熟ミオスタチンの配列は100同一であるため、マウスポリタンパク質配列配列番号103を用いて、成熟ミオスタチン配列配列番号104を生成した。ミオスタチン任意の潜在的分解を低減するために、マウスポリタンパク質配列を、領域DVQRADSSDにおけるD76A突然変異を用いて工学処理した。0.5MNaClを有する50トリス-HCl緩衝液、pH8.0中で、Ni-NTAアガロースQiagenを用いたCHO培地から、発現されたHexaHisGB1Tev/D76Aマウスミオスタチンポリタンパク質シグナル配列なしを捕捉した。Ni溶出液は、フリン切断緩衝液50mMHEPES、pH7.5、0.1MNaCl、0.1トリトンX-100、1mMCaCl2に交換し、その後、室温で一晩、1:25V/Vのフリン/タンパク質比でフリン配列番号105で示されるフリンの発現社内配列で切断した緩衝液であった。フリンは、プロペプチドと成熟ミオスタチンとの間TPKRSRRとDFGLDCDとの間のポリタンパク質を切断して、プロペプチドおよび成熟ミオスタチンを生成する。フリン切断反応の全混合物を6MGdn-HCl中に入れて、凝集塊を解離した。40分で、15~60緩衝液B勾配で60°Cで、C8RP-HPLCVydac208TP、GraceDeerfieldILUSAを用いて混合物から、成熟ミオスタチンを単離したC8RP-HPLC緩衝液A:H2O中0.1TFA、緩衝液B:100アセトニトリル中0.1TFA。ピークの直ぐ前の分画成熟ミオスタチンを含有するをプールし、その後のinvitro検定に用いた。図1は成熟ミオスタチンに関するLC/MS分析を示し、図2は還元および非還元ミオスタチン試料を用いたNuPAGEゲルを示す。1.2組換えミオスタチンのinvitro生物学的活性ミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定ThiesetalGrowthFactors18251259を用いて、横紋筋肉腫細胞A204におけるミオスタチンのinvitro活性を査定した。204細胞LGCPromochemHTB-82を、DMEM高グルコースフェノールレッドなし、5活性炭処理済みFCSおよび1×グルタマックス中で増殖させた。次に、細胞をトリプシン処理して懸濁液を生成し、Geminiトランスフェクション試薬社内試薬、特許WO2006/053782に記載を用いて、PAI-1プロモーターの12×CAGAボックスの制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するpLG3プラスミドでトランスフェクトした。96ウェルFluoronuncプレートのウェル当たり40,000細胞で細胞を植えつけて、定住させて、一晩増殖させた。翌日、ともに配列番号104で示される配列を有するRDSystemsミオスタチンまたは社内ミオスタチンである組換え成熟ミオスタチンを、連続希釈により各ウェルの培地に付加し、細胞を放置して、さらに6時間インキュベートした後、SteadyLiteを付加して、これを、室温で20分間インキュベートし、SpectraMaxM5読取器で読み取った。ルシフェラーゼ発現を生じる細胞シグナル伝達のミオスタチン活性化を実証する用量応答曲線を、図3Aに示す。RDSystemsおよび社内成熟二量体ミオスタチン種はともにA204細胞を活性化して、用量依存的にルシフェラーゼシグナルを生じる、ということが明白に認められ得る。社内精製ミオスタチンは、検定における選択的により低いバックグラウンドならびにRDSystemsミオスタチンを上回る改善された動的範囲を実証する。代替的方法では、A204細胞LGCPromochemHTB-82を、McCoys培地および10熱不活性化FBS中で増殖させた。次に、細胞を、バーゼン液InvitrogenおよびTrypLEInvitrogenの1:1混合物で引き離して、DMEM高グルコースフェノールレッドなし、5活性炭処理済みFCSおよび2mMグルタマックス検定培地中に再懸濁した。14×106細胞を、懸濁液中で、PAI-1プロモーターの12×CAGAボックスの制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するpLG3プラスミド18.2μgを、1mMのGeminiトランスフェクション試薬社内試薬、特許WO2006/053782に記載182μlと混合することにより、トランスフェクトした。細胞をT175培養フラスコに移して、一晩インキュベートした。翌日、RDSystemsミオスタチンまたは社内ミオスタチンである組換え成熟ミオスタチンを、連続希釈により、あるいは20μlの最終容積中の試験抗体の連続希釈の存在下で一定濃度で、96ウェル黒色FluoroNUNC検定プレートに付加した。ミオスタチン抗体混合物を、30分間、予備インキュベートした。トランスフェクト化細胞を、バーゼン液:TrypLEを用いてフラスコから引き離して、2.2×105細胞/mlで検定培地中に再懸濁し、180μl/ウェルで検定プレート中に分配した。プレートをさらに6時間インキュベートした後、SteadyLite試薬を付加して、これを、室温で20分間インキュベートし、SpectraMaxM5読取器で読み取った。ルシフェラーゼ発現を生じる細胞シグナル伝達の成熟二量体ミオスタチン活性化を実証する用量応答曲線を、図3Bに示す。異なる日に得られたデータにより示されるように異なる試験状況で、社内ミオスタチン種はA204細胞を活性化して、用量依存的に且つ再現可能的に、ルシフェラーゼシグナルを生じる。2.モノクローナル抗体の生成およびマウスモノクローナル抗体10B3の特性化2.1モノクローナル抗体成熟ミオスタチン実施例1に記載したように調製を各々に腹腔内注射することにより、SJL/JマウスJacksonLaboratoriesを免疫化した。免疫化前に、ミオスタチンをクリプトスポリジウムパルブムCparvumと接合させて、マウスを接合体2.5μgのミオスタチンを10μgのクリプトスポリジウムパルブムに接合で、さらに7.5μgの可溶性ミオスタチンで免疫化した。マウスからの脾臓細胞を取り出し、Bリンパ球を、PEG1500Boehringerの存在下で、P3X63BCL2-13細胞社内で生成、Kilpatricketal1997Hybridoma16pages381389参照由来のマウス骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを生成した。限界希釈EHarlowandDLaneに記載された方法を使用により、個々のハイブリドーマ細胞株をクローン化した。単一クローンを含有するウェルを顕微鏡で同定し、活性に関して上清を試験した。最初に、FMATサンドイッチ検定フォーマットで組換えミオスタチンに対する結合活性に関して、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。これらの陽性物の二次スクリーニングを、BIAcore商標法を用いて完了して、組換えミオスタチンRDSystems、788-G8-010/CFおよび社内発現された精製ミオスタチン上記1.1参照との結合を検定した。ミオスタチン結合検定から同定された陽性物を、限界希釈によりサブクローン化して、安定モノクローナル細胞株を生成した。無血清条件下で細胞工場で増殖させたこれらのハイブリドーマからの免疫グロブリンを、固定化プロテインAカラムを用いて精製した。次いで、これらの精製モノクローナル抗体を、ELISAおよびBIAcore商標によりミオスタチン結合に関して再スクリーニングした。モノクローナル抗体10B3を、組換えミオスタチンと結合される潜在的抗体として同定した。2.2モノクローナル抗体10B3のシーケンシングおよび10B3キメラのクローニング総RNAを10B3ハイブリドーマ細胞から抽出して、予定アイソタイプIgG2a/κによりリーダー配列および抗体定常領域に特異的なプライマーを用いた逆転写により、重鎖および軽鎖可変ドメインのcDNAを生成した。可変重鎖および軽鎖ドメインのcDNAを、次に、シーケンシングのためにプラスミド中にクローン化した。10B3VH領域アミノ酸配列は、配列番号7で示される。10B3VL領域アミノ酸配列は、配列番号8で示される。10B3に関するカバットCDR配列を、表3および表4に示す。10B3ネズミモノクローナル抗体からの可変領域VH:配列番号7;VL:配列番号8を取り、これらをヒトIgG1/k野生型定常領域上にグラフトすることにより、キメラ抗体を構築した。単一配列配列番号9で示されるを、これらの構築物の構築に用いた。要するに、クローン化ネズミ可変領域をPCRにより増幅して、哺乳類発現ベクターRld_Ef1およびRln_Ef1中へのクローニングを要する制限部位に導入した。HindIIIおよびSpeI部位を設計して、VHドメインを枠で囲み、ヒトγ1野生型定常領域を含有するベクターRld_Ef1中へのクローニングを可能にした。HindIIIおよびBsiWI部位を設計して、VLドメインを枠で囲み、ヒトκ定常領域を含有するベクターRln_Ef1中へのクローニングを可能にした。正しいVH配列番号25およびVL配列番号8配列を有するクローンを同定し、CHOK1細胞上清中での発現のためにプラスミドを調製した標準分子生物学技法を使用。免疫化プロテインAカラムを用いて細胞上清から抗体を精製し、280nmで吸光度を読み取ることにより定量した。その結果生じたキメラ抗体を、10B3キメラ10B3CまたはHCLCと名づけた。10B3キメラ抗体は、配列番号26で記述されるような重鎖アミノ酸配列を有する。10B3キメラ抗体は、配列番号27で記述されるような軽鎖アミノ酸配列を有する。2.3組換えミオスタチンとの結合サンドイッチELISAにおける10B3および10B3キメラ10B3C結合ミオスタチンRDSystems、788-G8-010/CF。プレートを10ng/ウェルでミオスタチンで被覆し、遮断溶液PBS、0.1Tweenおよび1BSAで遮断した。洗浄PBS、0.1Tween後、抗体を、37°Cで2時間、希釈シリーズ全体で、インキュベートし、プレートを再び洗浄した後、抗マウスHRPまたは抗ヒトHRPそれぞれ、Dako、P0161およびSigma、A-8400とともに37°Cで1時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、呈色反応が起こるまでOPD基質Sigma、P9187を付加し、反応を、H2SO4の付加により停止させた。プレートを490nmの吸光度で読み取り、EC50を確定した表5参照。組換えミオスタチンに対する10B3マウス親および10B3Cの親和性を、BIAcore商標表面プラズモン共鳴分析により査定した。捕捉表面の使用により、分析を実行した;10B3マウス親に第一級アミンをカップリングさせることにより、抗マウスIgGをC1チップとカップリングさせた;そして、10B3キメラに対する第一級アミン結合により、プロテインA表面をC1上に作製した。捕捉後、64nM、16nM、4nM、1nM、0.25nMおよび0.0625nMで表面全体に組換えミオスタチンを通して、緩衝液注射すなわち0nMを二重参照のために用いた。各分析物注射の間に再生ステップを置き、この後、新しい抗体捕捉事象を生じた後、次のミオスタチン注射を実行した。1:1モデルおよび二価モデルT100機械分析ソフトウェアに固有の両方を用いて、データを分析した表6参照。両捕捉表面は、100mMリン酸を用いて再生され得る。運転緩衝液としてHBS-EPを用いて、分析温度として25°Cを用いて、作業を実行した。10B3の結合能力をさらに分析するために、ELISAベースの検定を実行して、結合が純成熟ミオスタチンに特異的であるか、あるいは、ミオスタチンプロペプチドのArg75およびAsp76間のBMP-1切断後に、潜在型複合体、ならびに潜在性複合体から放出される成熟ミオスタチンを含めた他のミオスタチン抗原を用いて結合が既に起きているか否かを確定したWolfmanetalPNAS100pages1584215846。HexaHisGB1Tev/ヒトミオスタチンプロペプチド配列配列番号106を用いて、ヒトミオスタチンプロペプチドの精製を実行した。この配列を、CHO分泌系で発現させて、発現タンパク質を、CHO培地からのNi-NTAGEHealthcareNJにより捕捉した。HexaHisGB1タグを、Tevプロテアーゼ社内で発現、配列番号107で示される配列により切断した。Tevプロテアーゼは、配列番号106のタグおよびプロペプチド間ENLYFQおよびENSEQK間を切断して、配列番号108の配列を生じる。非通過画分中のタグ切断ヒトミオスタチンポリタンパク質を用いて、6MグアニジンHClの存在下で、Ni-NTA上に、切断タグおよび非切断hexaHisGB1Tev/ヒトミオスタチンポリタンパク質を補足した。通過画分を、1×PBS緩衝液中のSuperdex200カラム上に適用し、凝集二量体および単量体形態をカラム上で分離した。ヒトミオスタチンプロペプチド配列番号108二量体型を、潜在型複合体形成に用いた。室温で2時間、3:1w/w比での6MグアニジンHCl中の精製ヒトミオスタチンプロペプチド配列番号108および成熟ミオスタチン配列番号104の混合物により、ミオスタチン潜在型複合体を調製し、その後、4°Cで一晩、1×PBS中に透析して、1×PBS緩衝液中のSuperdex200カラム上に載せた。ミオスタチンプロペプチドおよび成熟ミオスタチンの両方を含有するピークでの分画を、プールした。LC/MSおよびSDS-PAGEにより、潜在型複合体を確証したデータは示されていない。BMP-1消化のために、150μlのヒトミオスタチン潜在型複合体1.5mg/mlを、225μlのBMP-10.217mg/ml、75μlの25mMHEPESpH7.5および150μlの:20mMCaCl2、4μMZnCl2および0.04Brij35とともにインキュベートした。反応物を、30°Cで一晩インキュベートした。BMP-1タンパク質を、CHO分泌系を用いて、社内発現させた配列番号111で示される配列。PBS中で4°Cで一晩、100ng/ウェルで、EIA/RIAプレートCostarのウェル上に、ミオスタチン抗原を被覆した後、室温で30分間、遮断PBS、3BSAした。プレートを洗浄しPBS、1BSAおよび0.1Tween20、その後、洗浄緩衝液中の10B3の希釈シリーズを付加し、室温で2時間、インキュベートした。プレートを再び洗浄後、洗浄緩衝液中で1:10,000希釈したペルオキシダーゼ接合AffinipureFab’2断片ロバ抗マウスIgGを付加し、室温で1時間、インキュベートした。最終洗浄ステップ後に、TMB基質を付加し、生じた比色測定的変化を、硫酸で停止させて、プレートを450nmで読み取った。図4は、10B3が成熟二量体ミオスタチン、潜在型複合体四量体、ならびにBMP-1節団子に潜在型複合体から放出されるミオスタチンを結合し得る、ということを示す。10B3はプロペプチド二量体と結合しない、ということも判明したデータは示されていない。2.4ミオスタチン上の10B3結合エピトープの粗製地図作成10アミノ酸重複するオフセット4アミノ酸ビオチニル化14merペプチドを、ミオスタチンアミノ酸配列を基礎にして合成して、10B3供給:MimotopesAustraliaにより認識される結合エピトープの位置をマッピングした。SRUBIND読取機SRUBiosystemsで、作業を実行した。ストレプトアビジンバイオセンサープレートを洗浄し、基線を読み取り、ストレプトアビジン被覆バイオセンサープレート上にビオチニル化ペプチドを捕捉した。プレートを再び洗浄し、新たに基線読み取りを行なって、次に、抗体を付加し、結合をモニタリングした。10アミノ酸重複するオフセット4アミノ酸14mer特注人工ペプチド配列の詳細を、表7に示す。14merペプチド結合データの分析は、10B3がミオスタチン内の任意の線状エピトープを結合し得ない、ということを実証した。しかしながら、対照抗ミオスタチン抗体は、ペプチド組内のエピトープを結合することが示されたデータは示されていない。Pepscanの足場上での化学的連結免疫原ペプチドCLIPS技法を用いた10B3Cのミオスタチン結合部位のその後の分析は、ミオスタチンのPRGSAGPCCTPTKMSアミノ酸配列がキメラ抗体に関する結合部位であり得る、ということを示唆するデータは示されていない。2.5ミオスタチンActRIIb受容体結合の無能力化非機能化炭酸塩緩衝液中で、4°Cで一晩、1μg/mlで、ELISAプレートのウェル中に組換え可溶性ActRIIbRDSystems339-RBBを被覆した。標準ELISAプロトコールに従って、プレートを遮断し2.3に上記した遮断溶液を参照、洗浄した。平行して、2nMビオチニル化ミオスタチン社内、1.1に記載。ビオチニル化物質を、10B3、10B3Cおよび陰性対照IgG1アイソタイプ対照からなる抗体希釈シリーズとともに、37°Cで2時間、予備インキュベートした。次に、ビオチニル化ミオスタチン:抗体反応物を、37°Cで1時間、ActRIIb被覆プレートに付加した。標準洗浄手順を実行後、1:1000希釈ストレプトアビジン-HRP接合体DakoP0397を付加して、さらに37°Cで1時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、OPD基質Sigmaおよび酸停止溶液処置後、490nmの吸光度で検定した。ミオスタチン活性の抑制に関する抑制曲線およびIC50値を、それぞれ、図5および表8に示す。受容体無能力化検定は、効力に基づいて1nMより低いIC50を有する分子を識別するために利用可能な最高感度方法である。しかしながら、それは、結合コンピテントビオチニル化ミオスタチンの精確な濃度に対してそれ自体感受性である。それゆえ、異なる場合に、同一方法を用いて、10B3に関して、他のIC50値、例えば0.13nM、0.108nM、0.109nMまたは0.384nMが確定された表8の値に留意、132ng/ml=0.88nM。2.6invitroでのミオスタチンの生物学的活性の抑制1.2で上記したミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定を用いて、ミオスタチンの活性に及ぼす抗ミオスタチン抗体のinvitro作用を査定した。2.8nM細胞活性化検定におけるED70と等価の濃度でのミオスタチンを、種々の濃度の10B3または10B3C抗体0.1~20nMとともに37°Cで予備インキュベート氏、その後、トランスフェクト化A204細胞に付加するよう、検定を修正した。ルシフェラーゼ値を読み取り、これから、図6に示した抑制曲線を作成した。表9は、当該検定およびANOVA分析を3回反復した後に抗体に関して確定したIC50値を示す。データは、明らかに、A204筋肉細胞株のミオスタチン活性化の用量依存的抑制を実証するが、一方、対照抗体は、ミオスタチン活性の抑制を示さなかった。2.710B3のinvivo効力親10B3の効力を実証するために、8週齢雌CB17SCIDマウスにおける35日試験を5週間実行した。3、10または30mg/kgで腹腔内注射により、1、4、8、15、22および29日目に、処置群10匹/群に用量投与したが、一方、対照群には、PBSまたはアイソタイプ対照抗体IgG2aを投与した。試験完了時に、動物の総体重Aおよび総除脂肪筋肉量Bを、それぞれ、動物を計量することおよびQMRI分析により決定した図7。動物の選択時35日目に、個々の筋肉腓腹筋A、四頭筋Bおよび長指伸筋EDLCを、筋肉量決定のために動物から切り出した図8。筋肉機能に及ぼす作用を確定するために、exvivo収縮性試験をいいDL筋で実施した図9が、この場合、筋肉の強直力図9Aおよび筋肉量1mg当たりの強直力図9Bを確定した。30mg/kg用量を用いた処置軍において、10B3に対する明らかな用量依存的応答が観察されたが、これは、35日試験後の体重および除脂肪筋肉量における最も有意の改善を表すそれぞれ、8および8.5。筋肉量の分析は、腓腹筋、四頭筋およびEDLで同じ傾向を実証し、これらは全て、筋肉量の用量依存的増大を示し、さらにまた、30mg/kg用量投与群は最大有意を示した。さらにまた、試験記載せずは、握力の有意の改善が35日といった早期時点では観察され得ない、ということを実証した。しかしながら、exvivo収縮性試験は、EDLの強直力測定において有意の改善が実証され得る、ということを実証する。さらに、改善は、筋肉量と関係がないことが実証された。したがって、10B3は、存在する筋肉量の機能を改善する能力を示す。3.10B3のヒト化3.1配列解析10B3可変領域の配列と、他のネズミおよびヒトの免疫グロブリン配列との間で比核を行なった。これは、FASTAおよびBLASTプログラムを用いて、ならびに視覚的検査により実行した。10B3VHに関する適切なヒト受容体フレームワークを同定したIGHV1_18およびJH3ヒトJセグメント配列:配列番号10。10B3VLに関する適切なヒト受容体フレームワークを同定したIGKV1_16およびJK2ヒトJセグメント配列:配列番号11。配列番号10では、受容体フレームワークのCDRH1およびCDRH2が存在し、CDRH3はXXXXXXXXXXにより表される。配列番号11では、受容体フレームワークのCDRL1およびCDRL2が存在し、CDRL3はXXXXXXXXXXにより表される10X残基は、CDRの場所に関するプレースホルダーであり、各CDRにおけるアミノ酸配列の数の測定値ではない。CDRグラフト化において、満足すべき結合を得るために、受容体フレームワーク中のオーソログの代わりに含まれあるべきドナー抗体からの1つ以上のフレームワーク残基を要することは、典型的である。10B3中の以下のネズミフレームワーク残基は、CDRグラフト化ヒト化バージョンの抗体の設計において潜在的に重要であると、確認された位置は、カバット等の番号付与法に従う:異なる復帰突然変異を有する3つのヒト化VH構築物を設計して、満足すべき活性を有するヒト化抗体を得た。これらに、H0~H2の番号を付す。H0配列番号12は、CDRのカバット定義を用いて特定される受容体配列中への10B3VHCDRのCDRグラフトからなる。H1配列番号13はH0と同一であるが、しかし、位置105のアミノ酸がグルタミンの代わりにトレオニンである復帰突然変異を有する。H2配列番号14はH0と同一であるが、しかし位置28のアミノ酸がトレオニンの代わりにセリンである復帰突然変異を有する。全てのヒト化VH領域および対応する重鎖に関して、フレームワーク4の配列WGQGTMVTVSSが修飾され、それによりメチオニンアミノ酸残基カバット位置108がロイシンアミノ酸に代わって置換された、ということに留意されたい。これはヒト化VH領域をコードするDNA配列中のSpe1クローニング部位の含入に起因する。異なる復帰突然変異を有する4つのヒト化VL構築物を設計して、満足すべき活性を有するヒト化抗体を得た。これらに、L0~L3の番号を付す。L0配列番号15は、CDRのカバット定義を用いて特定される受容体配列中への10B3VLCDRのCDRグラフトからなる。L1配列番号16はL0と同一であるが、しかし、位置16のアミノ酸がグリシンの代わりにアルギニンである復帰突然変異を有する。L2配列番号17はL0と同一であるが、しかし位置71のアミノ酸がフェニルアラニンの代わりにチロシンである復帰突然変異を有する。L3配列番号18はL0と同一であるが、しかし位置100のアミノ酸がグルタミンの代わりにアラニンである。様々な復帰突然変異を有する五つのさらなるヒト化VH構築物を設計して、満足な活性を有するヒト化抗体を取得した。これらのものはH0及びH3~H6と番号付けられる。H0は、CDRのKabatの定義を用いる、特定のアクセプター配列中への10B3VHCDRのCDR移植からなる。H3はH0と同一であるが、以下の復帰突然変異を有する位置28のアミノ酸がトレオニンの代わりにセリンであり、位置48のアミノ酸がメチオニンの代わりにイソロイシンであり、位置67のアミノ酸がバリンの代わりにアラニンであり、及び位置69のアミノ酸がメチオニンの代わりにロイシンである。H4はH0と同一であるが、以下の復帰突然変異を有する位置28のアミノ酸がトレオニンの代わりにセリンであり、位置71のアミノ酸がトレオニンの代わりにバリンであり、及び位置73のアミノ酸がトレオニンの代わりにリジンである。H5はH3及びH4の復帰突然変異を組み合わせたものである。H6はH5と同一であるが、以下の復帰突然変異を付加したものである位置20のアミノ酸がバリンの代わりにイソロイシンであり、及び位置66のアミノ酸がアルギニンの代わりにリジンである。さらに、H3~H6VH構築物は、位置100Gのアミノ酸がフェニルアラニンの代わりにチロシンであるCDRH3中に単一の点突然変異を提供する。全てのヒト化VH領域について、フレームワーク4の配列が改変されており、それによってメチオニンアミノ酸残基はロイシンアミノ酸残基に置換されていることに留意されたい。これは、ヒト化VH領域をコードするDNA配列中へのSpe1クローニング部位の含有の結果生じるものである。様々な復帰突然変異を有する三つのさらなるヒト化VL構築物を設計して、満足な活性を有するヒト化抗体を取得した。これらのものはL0及びL4~L6と番号付けられる。L0は、CDRのKabatの定義を用いる、特定のアクセプター配列中への10B3VLCDRのCDR移植からなる。L4はL0と同一であるが、位置69のアミノ酸がトレオニンの代わりにグルタミンであり、及び位置71のアミノ酸がフェニルアラニンの代わりにチロシンである復帰突然変異を有する。L5はL0と同一であるが、位置71のアミノ酸がフェニルアラニンの代わりにチロシンであり、及び位置46のアミノ酸がセリンの代わりにトレオニンである復帰突然変異を有する。L6はL4及びL5の復帰突然変異を組み合わせたものである。さらに、L4~L6は、位置91のアミノ酸がシステインの代わりにセリンであるCDRL3中に単一の点突然変異を提供する。10B3の軽鎖は、CDRL3中のKabatの位置91にシステイン残基を有する。対形成していないシステインは化学的に反応し、抗体プロセスの発達中に改変を誘導し、生成物の異種性の可能性及び親和性の変動の可能性をもたらし得る。さらに、この残基は、免疫グロブリンの折畳みを作るのに必須である可変領域中の他のシステインとの誤った対形成に起因する誤った折畳み又は凝集を促進し得る。かくして、C91を有するヒト化抗体を、セリンに置換した。H0~H2及びL0~L3ヒト化VH及びVL構築物を、RldEf1及びRlnEf1哺乳動物発現ベクター中へのクローニングのための制限部位並びにシグナル配列を含む重複オリゴヌクレオチドのdenovo構築により調製した。ヒトIgG1野生型定常領域を含有するRldEf1中へのクローニングのためのシグナル配列を含有するVHドメインを構成するために、HindIII及びSpeI制限部位を導入した。ヒトκ定常領域を含有するRlnEf1中へのクローニングのためのシグナル配列を含有するVLドメインを構成するために、HindIII及びBsiWI制限部位を導入した。これは本質的にWO2004014953に記載の通りである。H3~H6及びL4~L6ヒト化VH及びVL構築物を、部位特異的突然変異誘発及びpTT発現ベクターを有する中へのクローニングのための制限部位並びにシグナル配列を含む重複オリゴヌクレオチドのdenovoでの構築により調製した。ヒトIgG1野生型定常領域を含有するpTT中へのクローニングのためのシグナル配列を含有するVHドメインを構成するために、HindIII及びSpeI制限部位を導入した。ヒトκ定常領域を含有するpTT中へのクローニングのためのシグナル配列を含有するVLドメインを構成するために、HindIII及びBsiWI制限部位を導入した。10B3キメラの重鎖及び軽鎖とヒト化抗体の両方における潜在的な脱アミド化部位のためのinsilicoでの分析により、重鎖CDRH2中のKabatの位置54のアスパラギンが脱アミド化のための高い能力を有するものと同定された。この残基をさらに特性評価するために、本発明者らは、N54がアスパラギン酸又はグルタミンアミノ酸残基に置換された10B3キメラ抗体及びヒト化H2L2抗体を作製した。10B3キメラの軽鎖及びヒト化抗体は、CDRL3中のKabatの位置91にシステイン残基を有する。対形成していないシステインは化学的に反応し、抗体プロセスの発達中に改変を誘導し、生成物の異種性の可能性及び親和性の変動の可能性をもたらし得る。さらに、この残基は、免疫グロブリンの折畳みを作るのに必須である可変領域中の他のシステインとの誤った対形成に起因する誤った折畳み又は凝集を促進し得る。この残基をさらに特性評価するために、本発明者らは、C91がセリンアミノ酸残基に置換された10B3キメラ抗体及びヒト化H2L2抗体を作製した。さらに、本発明者らはまた、重鎖CDRH2中で行われた脱アミド化置換と、軽鎖CDRL3中の位置91での置換とを組み合わせた。これらの分析の一部として作製された抗体を、表10に例示する。5CDRH3変異体ヒト化抗体5.1CDRH3変異体ヒト化抗体の構築代替的アミノ酸残基への各残基のCDRH3配列番号3の部位特異的突然変異誘発を、基本分子として抗体H2L2-C91S可変配列:それぞれ配列番号14および24;全長配列:それぞれ配列番号30および40を用いて実行した。全長DNA発現構築物、例えばH2およびL2-C91S塩基配列それぞれ配列番号45および55に関するヒト定常領域を、pTTベクターNationalResearchCouncilCanada、修飾化多クローニング部位MCSを有するを用いて産生した。約300のCDRH3変異体を生成し、約200の変異体をその後の分析で試験した5.2および5.3参照。5.2HEK2936E細胞におけるCDRH3変異体発現約200のCDRH3変異体のそれぞれ重鎖および軽鎖をコードするpTTプラスミドを、一時的にHEK2936E細胞中に同時トランスフェクトし、小規模で発現させて、抗体を産生した。重鎖は、変異体CDRH3配列を伴うH2の塩基配列を有し、軽鎖は、上記と同様に、L2-C91Sの塩基配列を有する。抗体を、組織培養上清から直接査定した。5.3組織培養上清に関する初期スキャン-ProteOnXPR36CDRH3スクリーニングに関する初期動態分析を、ProteOnXPR36BioradLaboratoriesで実行した。残基R95~P100_Bに関して、プロテインA/G捕捉表面Pierce21186を用いて分析を実行し、残基A100_C~V102に関しては抗ヒトIgG表面を用いたBIAcore/GEHealthcareBR-1008-39。GLMチップBioRadLaboratories176-5012上に捕捉分子を固定するために第一アミンカップリングを用いて、両捕捉表面を同様に調製した。当該特定変異体を発現する一次的トランスフェクションからの組織培養上清からのプロテインA/G抗ヒトIgG表面突然変異化される残基によって上に、CDRH3変異体を直接捕捉した。捕捉後、社内組換えヒトミオスタチン上記1.1参照を、256nM、32nM、4nM、0.5nMおよび0.0625nMで、分析物として用い、緩衝液注射単独すなわち0nMは、結合曲線を二重参照するために用いた。ミオスタチン結合事象後、捕捉表面を再生した:プロテインA/G捕捉表面に関しては、100mMリン酸を用いて捕捉表面を再生した;抗ヒトIgG表面に関しては、3MMgCl2を用いて捕捉表面を再生した;再生は、別の周期の捕捉および結合分析のために準備された予備捕捉抗体を除去した。次に、ProteOn分析ソフトウェアに固有の1:1モデル質量運搬に、データを適合させた。HBS-EPBIAcore/GE-HealthcareBR-1006-69を用いて作業を実行し、分析温度は25°Cであった。相互作用の性質のため結果を解釈することは難しかったが、これは、1:1モデルが相互作用を適切に説明するとは考えらないが、しかしながらセンサーグラムを判定することにより、基本分子を上回る親和性改善を示し得る構築物を選択することは可能であった。基本分子より良好な動態プロフィールを有すると思われる同定された11のCDRH3を有するために、スクリーニングを判定した。11のCDRH3変異体の重鎖を、以下の表11に記載するカバット番号付与法を使用。変異体の全てが、軽鎖L2-C91Sを有した可変配列:配列番号24;全長配列:配列番号40、全長DNA配列:配列番号55。基本分子より良好な動態プロフィールを有することが確認されたさらなるCDRH3変異体は、F100G_S配列番号110であったが、しかしこれはさらに分析されなかった。コードすなわちH2L2-C91S_Y96Lによる抗体への言及は、適切な細胞株中で、軽鎖および重鎖をコードする第一および第二プラスミド、例えばpTT5_H2_Y96L配列を含有するプラスミド、ならびにpTT5_L2-C91S配列を含有するプラスミドの同時トランスフェクトおよび発現により生成される抗体を意味する。5.4CDRH3変異体の選択パネルの発現表11に記述された11のCDRH3変異体の重鎖および軽鎖を、HEK2936E細胞中で発現させて5.2に記載、固定化プロテインAカラムGEHealthcareを用いてアフィニティー精製して、280nmでの吸光度を読み取ることにより定量した。5.5BIAcore商標による組換えミオスタチンとの結合ProteOnXPR36上での初期スクリーニングからの構築物の選択が上首尾であったか否かを判断するために、オフ速度等級分け実験を精製組換え抗体に関して実施した。用いられる抗体の濃度で、ぞれぞれ約60共鳴単位RU、250RUおよび1000RUの最大結合シグナルを生じる異なる密度低、中、高でカップリングする第一アミンにより、ミオスタチン組換え社内、上記1.1参照を、CM5チップBiacoreGEHealthcareBR-1000-14上に共有的に固定した。抗体の単一濃度、256nMを緩衝液注射で用いて、結合相互作用を二重参照した。ミオスタチン表面の各密度に対する抗体全ての相互作用に関して、BIAcore300機に固有のソフトウエアを用いて、解離の初期速度オフ速度を算定した。再生は、100mMリン酸を用いることによるものであり、25°CでHBS-EP緩衝液を用いて、検定を実行した。試験した全ての構築物は、オフ速度がH2L2C91Sより遅いという点で、基本分子H2L2C91Sより良好なオフ速度解離速度定数を示す、ということが判明した。高密度表面では、上位5つの構築物は、10B3キメラを除いて、H2L2-C91S_P100B_I、H2L2-C91S_W100E_F、H2L2-C91S_F100G_Y、H2L2-C91S_G99S、およびH2L2-C91S_P100B_Fであった。5.6BIAcore商標による組換えミオスタチンとの結合の完全動態分析ミオスタチン組換え社内、上記1.1参照を、それぞれ約15RU、37RUおよび500RUの最大結合シグナルを出す表面を生じる低、中および高密度で、SeriesSCM5チップ上に固定した。CDRH3変異体を、256nM、64nM、16nM、4nM、1nMで全3つの表面全体に通して、緩衝液注射すなわち0nMを二重参照のために用い、再生は100mMリン酸を用いた。T100BIAcore機に固有の二価モデルにデータを適合させて、HBS-EPを用いて、25°Cで作業を実行した。概して、基本H2L2-C91Sに対する適合は、全3つの密度表面でCDRに比して不十分であった。したがって、精確な基線値は得るのが難しかった。3つの表面のうち、最高密度表面は、基本抗体およびCDR変異体間に最良の分離を生じたが、しかしこれもまた、基本H2L2-C91S分子に対する適合は不十分であった。しかしながら、この表面は、構築物間にほとんどの分離を生じ、ならびに結合活性結合および再結合事象がより高頻度で、それゆえ親和性における小さな差を拡大し得るため、真の二価結合のための最良の表面を間違いなく提供する表面であると予測される。概して、主に、特に高密度表面での優れたすなわち、より遅いオフ速度のため、CDR変異体は全て、基本H2L2-C91Sより良好であると思われた。この検定に関与する方法のため、バイオセンサーチップ表面との標的抗原の共有的カップリングでは、得られる実際の親和性は、invivoで観察され得る神話性を反映し得ない。しかしながら、このデータは、等級分け目的のために有用である。この検定の高密度表面からのデータを用いて、全体的親和性に基づいた上位5つの構築物は、キメラ10B3を除いて、F100G_Y、P100B_I、P100B_F、F100G_NおよびW100E_Fであった。しかしながら他の構築物親和性はすべて、F100G_Yの2倍以内であった。5.7ミオスタチン捕捉ELISA11のアフィニティー精製CDRH3を、ミオスタチン捕捉ELISAにおける結合活性に関しても分析した。ミオスタチンに対する2.5μg/mlのポリクローナル抗体RDSystemsAF788を用いて、4°Cで一晩、96ウェルELISAプレートを被覆した。次いで、このプレートを洗浄緩衝液PBS、0.1Tween20中で3回洗浄し、室温で1時間、遮断溶液PBS、0.1Tween201ウシ血清アルブミン[BSA]で遮断した。次に、ミオスタチンを1時間の間に遮断緩衝液中に1μg/mlで付加した後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。次に、抗体を適切な濃度範囲約10~0.01μg/mlに滴定して、プレートに付加し、室温で1時間、インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。抗ヒトκ軽鎖HRP接合抗体SigmaA7164、メーカーの仕様説明書に従って用いたを用いて、10B3キメラHcLcまたはH0L0のようなヒト化またはキメラ抗体の結合を検出した。次に、プレートを洗浄緩衝液中で3回洗浄し、OPD基質メーカーの使用説明書に従って用いたとともに展開させて、プレート読取機で490nmで読み取った。H2L2-C91S、H0L0、HcLc10B3キメラおよび陰性対照モノクローナル抗体を対照抗体として用いた実験を、図10に示す。全11のCDRH3変異体抗体が、このELISAにおいて組換えミオスタチンと結合した。H2L2-C91S_P100B_I、H2L2-C91S_V102N、H2L2-C91S_G100A_K、H2L2-C91S_P100B_FおよびH2L2-C91S_F100G_Yは、基本H2L2-C91SおよびH0L0より良好なミオスタチンに関する結合活性を有する傾向があった。5.8ミオスタチン競合ELISA3つの異なるミオスタチン競合ELISAにおいて、CDRH3変異体をさらに調べた。10B3ネズミmAbと競合する能力に関して、精製抗体を分析した。5.8.1捕捉方法としてのポリクローナルAbの使用5.7に記述されたプロトコールを用いて、各ウェルに10B3最終濃度0.3μg/mlを付加し、適切な濃度範囲約10~0.01μg/mlに滴定された抗体と混合した。抗マウスHRP接合抗体DAKOP0260、メーカーの仕様説明書に従って用いたを用いて、10B3抗体の結合を検出した。ELISAデータから得られた等級分けを、表12に示す。5.8.2捕捉方法としてのビオチニル化ミオスタチンの使用5.7に記述されたプロトコールを用いて、しかし、プレートを最初に、4°Cで一晩、5μgl/mlのストレプトアビジンで被覆した。ビオチニル化ミオスタチンを0.3μg/ml遮断緩衝液で1時間の間、付加し、その後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。10B3最終濃度0.2μg/mlを各ウェルに付加し、適切な濃度範囲約10~0.01μg/mlに滴定された抗体と混合した。抗マウスHRP接合抗体DAKOP0260、メーカーの仕様説明書に従って用いたを用いて、10B3抗体の結合を検出した。ELISAデータから得られた等級分けを、表12に示す。5.8.3捕捉方法としてのミオスタチンの使用直接捕捉6.7に記述されたプロトコールを用いて、しかし、プレートを最初に、4°Cで一晩、0.2μgl/mlのミオスタチン組換え社内、上記1.1参照で被覆した。10B3最終濃度0.3μg/mlを各ウェルに付加し、適切な濃度範囲約10~0.01μg/mlに滴定された抗体と混合した。抗マウスHRP接合抗体DAKOP0260、メーカーの仕様説明書に従って用いたを用いて、10B3抗体の結合を検出した。ELISAデータから得られた等級分けを、表12に示す。CDRH3変異体はすべて、10B3に対して競合し得る。異なる競合ELISAの各々からの5つの最も強力な分子を、表12に列挙する。この節における分析、ならびに5.6および5.7節における前のBIAcoreデータに基づいて、変異体H2L2-C91S_P100B_F、H2L2-C91S_P100B_I、H2L2-C91S_F100G_Y、H2L2-C91S_V102NおよびH2L2-C91S_V102Sを、さらなる分析のために選択した。5.9invitroでのミオスタチンの生物学的活性の抑制5.8の5つの選択CDRH3変異体を、ミオスタチン応答性レポーター遺伝子検定上記1.2参照で試験して、invitro効力を査定した。5nMの濃度でのミオスタチンを、種々の濃度の抗体とともに37°Cで予備インキュベートした後、トランスフェクト化A204細胞に付加した。細胞を37°Cでさらに6時間インキュベートした後、相対ルシフェラーゼ発現を、冷光により確定した。その結果生じたIC50を、表13に示す。データは、試験した全ての抗体が10B3キメラと同様の効力でミオスタチンを無能力化し、H2L2-C91S_F100G_Yが最高の効力を有したが、しかしこの検定においてはそれほど有意にではなかった、ということを実証する。6.Fc無能力化定常領域変異体の構築および発現invivoでの抗ミオスタチンの作用様式はミオスタチンの単純結合および無能力化であるので、ADCCおよびCDC応答を発揮するために分子がそのFc機能を保有するということは必要でない。さらに、Fc機能の無能力化は、注入関連免疫反応への可能性に対して軽減する手助けをし得る。Fc機能を無能力かする突然変異は、以下の置換EU番号付与系を使用を包含する:Leu235Ala;およびGly237Ala。標準分子生物学技法を用いて、CDRH3変異体H2_F100G_Yの可変重鎖領域に関する配列をコードする遺伝子を、現存する構築物から、hIgG1Fc無能力化定常領域を含有する発現ベクターに移した。重鎖配列番号98、H2_F100G_Y_Fc無能力化および軽鎖中で3回洗浄した。ウェルをブロック溶液で室温で1時間ブロッキングした後、洗浄バッファーで3回洗浄した。次に抗体を適当な濃度範囲まで滴定しきり約10~001μl、プレートに加え、室温で1時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄バッファーで3回洗浄した。抗ヒトカッパ軽鎖HPRコンジュゲート化抗体を用いて、ヒト化またはキメラ抗体、例えば10B3キメラまたはH0L0の結合を検出した。次いでプレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、OPD基質Sigma社より。製造業者の指示書に従い使用したで発色させ、プレートリーダーで490nmで読み取った。図11は、H2L2C91SF100GYH2L2C91SHcLc、および陰性対照mAb;ならびに全5つのCDRH2変異体抗体に関する結果を示す。CDRH2変異体は、H2L2C91SF100GYの場合より良好なまたは同様のミオスタチンに対する結合活性を有した。7.4CDRH2変異体BIAcore分析BIAcoreによりミオスタチン結合親和性における任意の変化を確定するためにも、CDRH2変異体を試験した。プロテインAを、C1BIAcoreバイオセンサーチップ上に固定し、精製抗体を低密度で捕捉し、したがって、ミオスタチンの最大結合は30共鳴単位未満を生じた。256nMのみの濃度で捕捉抗体表面全体にミオスタチンを通した;緩衝液注射すなわち0nMを、結合データを二重参照するために用いた。プロテインA表面の再生は、100mMリン酸を用いた。T100BIAcore分析ソフトウェアにともに固有の二価モデルおよび2状態モデルにデータを適合させた。しかしながら、ミオスタチンは二量体であるため、二価モデルデータにより重きを置いた。HBS-EPを用いて、25°Cで作業を実行した。用いたモデルは、invivoでの真の結合を反映せず、モデルそれ自体は相互作用を精確に反映せず、したがって、算定値は等級分けのみに関してであった。データは、H2L2-C91S_F100G_Yと比較して、CDRH2変異体は親和性に非常に有意に影響を及ぼすわけではなく、二価モデルによる最悪の構築物H2L2C91S_G55LF100G_Yは全体的親和性の6.8倍の悪化を示す、ということを示唆する。7.5invitroでのミオスタチンの生物学的活性の抑制invitro無能力化検定に及ぼすCDRH2変異体の作用も、A204ルシフェラーゼ検定を用いて調べた節1.2に記載。抑制曲線のIC50値を、表17に示す。データは、全てのCDRH2変異体抗体が、この検定において、H2L2-C91S_F100G_Yと同様の効力で、A204細胞のミオスタチン誘導性活性化を抑制する、ということを示す。7.6Fc無能力化CDRH2変異体A204検定において最高の見掛けの効力を有する開発可能性増強分子であるH2L2C91S_G55SF100G_Yを、配列番号99で例示されるように、EU番号付与系を用いて、以下の置換を作ることによって:Leu235Ala;およびGly237AlaFc無能力化した。受容体結合検定実施例2.5を用いて、この新規の分子H2L2C91S_G55SF100G_Y-Fc無能力化が、H2L2C91S_G55SF100G_Yに比して、わずかに改善された効力を有する、ということを実証した表18参照。8.10B3処置はC26腫瘍保有マウスにおける筋消耗を減じた最新の研究において、体重変化、筋肉の量および機能に及ぼす10B3処置の作用を、癌悪液質試験のために広範に用いられる前臨床モデルである結腸-26腫瘍保有マウスで試験した。38匹の8週齢雄CD2F1マウスを、無作為に4群に分けた:mIgG2an=9、10B3n=9、mIgG2aC-26n=10および10B3C-26n=10。結腸-26C-26腫瘍細胞を、1×106細胞/マウスで20匹のマウスに皮下移植した。数時間後、動物に抗体注射を開始した。マウスに、マウスIgG2a対照抗体または10B3を、30mg/kgの用量で、0、3、7、14、21日目に腹腔内注射した。実験全体を通して、体重および脂肪量をモニタリングした。25日目の屠殺直前に、中大腿部の坐骨神経の電気刺激時の収縮力を測定することにより、下肢筋肉強度を査定した。腫瘍重量、ならびに個々の筋肉量および精巣上体脂肪パッド量を、実験終了時に確定した。図12は、0日目から25日目までのC-26腫瘍保有マウスにおける体重に及ぼす抗体処置の作用を示す。腫瘍保有マウスは、腫瘍移植後21日目に劇的に体重を失い始める。10B3による処置は、腫瘍保有マウスにおける体重損失を有効に軽減した。10B3で処置した腫瘍保有マウスの平均体重は、mIgG2a対照抗体で処置した腫瘍保有マウスより8高かった。10B3処置群とmIgG2a対照処置群との間に腫瘍サイズの有意差は認められなかったIgG2a:2.2g対10B3:1.9g。図13は、C-26腫瘍保有マウスにおける総体脂肪A、精巣上体脂肪パッドBおよび除脂肪筋肉量Cに及ぼす抗体処置の作用を示す。腫瘍保有マウスは、有意に低い総体脂肪を有した図13A。精巣上体脂肪パッドは、10B3およびmIgG2a対照処置腫瘍保有マウスの両方において、ほぼ完全に消失した図13Bが、これは、10B3が体脂肪損失に対して腫瘍保有動物を防御しない、ということを示唆する。図13Cに示したように、10B3処置は、正常動物ならびに腫瘍保有マウスの両方において、除脂肪筋肉量の有意のp<0.01増大を生じる。対照IgG2aで処置した腫瘍保有マウスは、腫瘍除去後、有意に低い除脂肪筋肉量を有した。これに対比して、10B3で処置した腫瘍保有マウスは、IgG2a処置腫瘍保有マウスより有意にp<0.01高い除脂肪筋肉量を有した。実際、10B3処置腫瘍保有マウスと正常動物との間の除脂肪筋肉量に有意差は認められなかった。表19は、筋肉量に及ぼす抗体処置の作用を示す。予測どおり、腫瘍保有マウスは、TA、EDL、四頭筋、ヒラメ筋および腓腹筋の有意の損失を有した表19。10B3処置は、正常動物において筋肉損失を減じた。10B3で処置した腫瘍保有マウスでは、TA、EDL、四頭筋、ヒラメ筋および腓腹筋の重量は、IgG2aで処置した腫瘍保有マウスの場合より、それぞれ、17.8、11.3、16.9、13.4および14.6多かった。表19:10B3処置は、腫瘍を保有するマウスにおける筋喪失を緩和した。データは、平均筋肉量mgSEMである。上付のおよび記号は、それぞれ、IgG2a群からおよびC26IgG2a群からのスチューデントT検定による有意差p005、従って、非有意である。図17は、デキサメタゾンにより誘導される体脂肪蓄積に対する10B3又は対照抗体を用いる予備治療の効果を示す。対照抗体で予備治療された動物は、体脂肪蓄積の有意な増加を示した。しかしながら、10B3で予備治療された動物においてはデキサメタゾン治療後に体脂肪率の有意な増加はなかった。これらの結果は、10B3又はそのヒト化抗体を、糖質コルチコイドにより誘導される筋肉消耗の治療に用いることができることを示唆している。例えば、糖質コルチコイド療法を行っている患者における筋肉消耗の予防的治療が有利であり得る。ヒト廃用性筋萎縮は一般に、骨折の治療のため、並びに他の医学的又は外科的理由のためのベッドでの長期療養の状況における関節の慢性変形性関節症又はギプス固定などの整形外科障害と関連して生じる。廃用性筋萎縮は、筋肉強度の低下及び身体障害をもたらす。身体リハビリテーションが依然として唯一の治療選択肢であり、それには長い期間を要することが多く、常に筋肉を正常なサイズ又は強度に回復させるわけではない。ここで、本発明者らは、マウスにおける廃用性萎縮の予防における10B3の有効性を評価するための神経損傷モデルを用いた。39匹の8週齢のオスのC57BLマウスを4群に無作為に分割したmIgG2a偽、10B3偽、mIgG2a坐骨神経圧壊及び10B3坐骨神経圧壊。0、3、7、14、21及び28日目に、30mgkgのmIgG2a対照又は10B3抗体をマウスに腹腔内投与した。抗体治療の三週間後、マウスをイソフルランで麻酔し、大腿中央部の右坐骨神経を露出させ、無傷のままにするか又は止血鉗子を用いて10秒間圧壊することにより損傷させた。手術の一週間後、マウスは最後の抗体注射を受けた。神経圧壊手術の10日後にマウスを安楽死させ、後肢の筋肉質量を評価した。図18は、対照抗体で治療した群における筋肉質量に対する坐骨神経圧壊の効果を示す圧壊。坐骨神経圧壊損傷は、長指伸筋、前脛骨筋、腓腹筋及びヒラメ筋の質量の偽対照と比較してそれぞれ22、37、41及び29の有意な減少をもたらした。坐骨神経損傷は大腿四頭筋質量に影響しなかった。図19Aは、偽手術した脚における骨格筋質量に対する10B3及び対照抗体治療の効果を示す。偽手術群においては、10B3治療はTA、EDL、腓腹筋及び大腿四頭筋の質量を、IgG2a対照群と比較した場合、それぞれ7、10、12及び13有意に増加させた。しかしながら、10B3治療は、ヒラメ筋における有意な質量変化を引き起こさなかった。図19Bは、坐骨神経を圧壊した脚における骨格筋質量に対する10B3及び対照抗体治療の効果を示す。10B3で治療された動物は、IgG2a対照治療動物よりも有意に多い筋肉を保持した。10B3で治療された神経損傷された動物のTA、EDL、腓腹筋及びヒラメ筋は全て、IgG2a対照群のものよりも多い質量を示した。10B3治療はまた、偽手術した動物及び神経圧壊した動物の両方において総体重を増加させた。これらの結果は、10B3又はそのヒト化抗体がヒト廃用性筋萎縮の予防及び又は治療のための能力を有し得ることを証明している。7~8週齢のオスのSCIDマウスにおける筋肉増殖に対する、完全に機能するWTFcドメイン又はFc無効化突然変異を有するH2L2抗ミオスタチン変異体の効果を、3、10及び30mgkgの用量を用いて比較した。マウス親分子10B3を陽性対照として使用し、また、3、10及び30mgkgで投与し、無関係のマウスIgG2aアイソタイプ対照を30mgkgで投与した。投与群あたり10匹の動物が存在した。0、3、7、14及び21日目に腹腔内注射により分子を投与した。試験の28日目に、動物を屠殺し、解剖し、以下の筋肉の重量を測定した前脛骨筋、大腿四頭筋、長指伸筋及び腓腹筋。10B3陽性対照群は対照動物と比較して筋肉質量の10を超える増加を示した一方、二つのH2L2変異体は測定された筋肉組織に対して顕著により低い効果を示したが、増加した筋肉質量に対する用量依存的傾向が観察されたが、いくつかの筋肉群においてはいくらかの統計的に有意な効果が観察されたことがわかった。ヒト化VH構築物並びにヒト化VL構築物を、pTT哺乳動物発現ベクター中で調製した。これらの分析の一部として生成された抗体を表21に例示する。表20中の抗体をコードする重鎖及び軽鎖発現プラスミドを、293fectinを用いてHEK2936E細胞中に同時トランスフェクトした。24時間後、トリプトン供給液をそれぞれの細胞培養液に添加し、48~72時間後に細胞を収穫した。結合アッセイにおいて試験する前にプロテインAカラムを用いて抗体を精製した。ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の両方における潜在的な脱アミド化部位に関するinsilicoでの分析により、重鎖CDRH2中のKabatの位置54のアスパラギンが脱アミド化のための高い能力を有するものと同定された。この潜在的な危険性を軽減するために、Kabatの位置55のアミノ酸を部位特異的突然変異誘発によりセリンに置換した。三つのヒト化VH構築物を作製した。これらのものはH7、H8及びH9と番号付けられる。H7、H8及びH9はそれぞれH4、H5及びH6と同一であるが、位置55のアミノ酸がグリシンの代わりにセリンである点突然変異を有する。組換え可溶性ActRIIbを、炭酸バッファー中、1μgmlでELISAプレートのウェル中で4°Cで一晩被覆した。01tween20及び01BSAを含有するPBSでプレートをブロックし、標準的なELISAプロトコルに従って洗浄した。同時に、2nMのビオチン化ミオスタチンを、表21及び22の抗体の連続希釈液と共に37°Cで30分間予備インキュベートした。次いで、ビオチン化ミオスタチン抗体反応液を、ActRIIb被覆プレートに37°Cで1時間添加した。標準的な洗浄手順を行った後、ウェルあたり50μlの1200希釈されたストレプトアビジンHRPコンジュゲートを添加し、次いで、37°Cでさらに1時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、490nmの吸光度で以下の基質でアッセイし、酸停止溶液処理を行った。結果を、少なくとも3回の反復のIC50平均値で示し、それと共に信頼区間を以下の表23に示す。これらのデータは、ActRIIbFcタンパク質へのミオスタチンの結合の中和に関するIC50の範囲を示す。効力は重鎖によって大きく決定され、H7、H8及びH9が最も低いIC50値を与える。ミオスタチン応答性リポーター遺伝子アッセイGrowthFactors18251~259を用いて、横紋筋肉腫細胞中でのミオスタチンのinvitroでの活性を評価した。A204細胞を、10ウシ胎仔血清を含有するRPMI1640培地中で増殖させた。細胞をトリプシン処理して、懸濁液を作製し、FuGene6を用いてPAI1プロモーターの12xCAGAボックスの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するpLG3プラスミドでトランスフェクトした。24時間後、細胞を収穫し、洗浄し、20DMSO、80ウシ胎仔血清中に2x107細胞mlで再懸濁し、分注し、80°Cで凍結した。A204細胞の凍結バイアルを解凍し、50mlの温めた培地中に懸濁した。細胞を沈降させ、13x106細胞mlで30nMミオスタチンを含有する10mlの培地中に再懸濁した。細胞を96穴プレートに、ウェルあたり50μl添加した。表21及び22に記載の抗体を、1ウシ胎仔血清及び2nMミオスタチンを含有するDMEM高グルコース培地中で連続希釈し、100μlの試験サンプルをアッセイプレートに移した。アッセイプレートを37°Cで5時間インキュベートした。次いで、100μlのSteadyGlo試薬を各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした後、Viewluxプレートリーダーを用いて発光測定を行った。結果を表24に示す。これらのデータは、上記で試験した抗ミオスタチンヒト化抗体は全部、リポーター遺伝子でトランスフェクトされたA204細胞中でルシフェラーゼ応答を刺激するその能力に関してミオスタチンを中和することができることを示している。ELISAを行って、H8L5が任意の他の増殖因子及び特に、提唱されたエピトープ配列の周囲でいくらかの相同性を共有することが知られるTGFファミリーの他のメンバーに結合することができるかどうかを決定した。ELISAプレートを05μgmlの様々な増殖因子で被覆し、標準的なELISA条件下でH8L5中で滴定することにより、H8L5が結合することができる試験された唯一の他の因子がGDF11であり、50の結合を得るのに必要とされる濃度はミオスタチンよりも3倍低いと結論付けられた。SPRデータは、H8L5が、より弱い親和性にも拘らず、アクチビンBに結合することを示唆していた。PAI1プロモーターの12xCAGAボックスの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含むpLG3プラスミドでA204細胞をトランスフェクトし、一晩インキュベートした。様々な濃度のH8L5及び40nMのアクチビンBを含有する溶液を調製し、30分間予備インキュベートした。次いで、20μlのこれらの試験溶液をアッセイプレート中に入れ、180μlのトランスフェクトされた細胞をアッセイ培地中に222x105mlで添加した。細胞を37°Cで6時間インキュベートした。次いで、50μlのSteadyLite試薬を添加した。プレートをrtで20分間、振とうしながらインキュベートし、発光モードでTecanUltraプレートリーダー上で読み取った。H8L5はIC5015μMを有するアクチビンBの非常に弱い阻害剤であることが示された。Kinexa液相アフィニティを用いて、様々な抗ミオスタチン分子に対する全体の親和性を決定した。吸着又はアミンカップリングにより、ミオスタチンビーズを調製した。試験した様々な抗ミオスタチン分子は、様々な濃度のミオスタチンで被覆したビーズの作製を必要とした。アッセイの液相部分については、固定された濃度の抗体を、広範囲のミオスタチン濃度と共にインキュベートし、分析を進行させる前に少なくとも2h、rtでインキュベートすることにより平衡に到達させた。次いで、ミオスタチンビーズを用いて、ミオスタチンビーズマトリックスに結合している遊離抗体により液相サンプル中に存在する遊離抗体の量を決定した後、蛍光染料で標識された好適な二次抗体を用いて検出した。結合曲線を、装置に固有のKinexaPro分析ソフトウェアを用いて適合させた。次いで、様々な出発濃度の抗体を用いる複数回の実行をコンパイルし、n曲線分析ソフトウェアを用いて分析して、親和性のより正確な決定を得た。invivoでの抗ミオスタチンの作用様式はミオスタチンの単純な結合及び中和であるので、分子がADCC及びCDC応答を惹起するためにそのFc機能を保持することは必須ではない。さらに、無効化Fc機能は、注入関連免疫反応の可能性を軽減するのに役立ち得る。無効化Fc機能への突然変異は、EU番号付け系を用いる以下の置換Leu235Ala及びGly237Alaを含む。標準的な分子生物学技術を用いて、ヒト化VH構築物H7、H8及びH9の可変重鎖領域の配列をコードする遺伝子を、存在する構築物から、hIgG1Fc無効化定常領域を含有する発現ベクターに移した。これらの分析の一部として作製された抗体を表26に例示する。任意の無効化重鎖を、任意の軽鎖と対形成させることができる。FcR及びC1qに対する結合分析を、ProteOnXPR36を用いて実行した。試験抗体を、一次アミンカップリングによりGLCバイオセンサーチップ上に固定した。FcRは2048nM、512nM、128nM、32nM及び8nMで用いたが、C1qは512nM、128nM、32nM、8nM及び2nMで用いた。バッファー注入を用いて、結合センサーグラムを二重参照した。相互作用の性質に起因して、再生は必要なく、結合センサーグラムは20minの解離時間及びその後のバッファー注入の使用により基準線に戻った。各受容体群及びC1q結合のための全体的なRmaxを用いて、ProteOnの分析ソフトウェアに固有の平衡化モデルにデータを適合させた。表27に提示されたこれらのデータは、Fc無効化突然変異が、無効化突然変異を含まない同じ抗体と比較して、Fc受容体及びC1qへの無効化抗体の結合を効率的に弱めることを説明することを示していた。C1qに対する親和性のこの変化の補体を固定する抗体の能力への影響を調査するために、CH50EqEIAキットを用いた。これらの実験により、H8L5が濃度依存的様式でヒト血清に曝露された場合、終末補体複合体を産生することができることが示された。それは見たところ、組換えミオスタチンに結合した場合により多くのTCCを生成し、Fc無効化等価物よりもさらに多くのTCCを生成することができる。図24Aは、15のヒト血清を用いて得られた結果を示し、図24Bは25のヒト血清を用いて得られた結果を示す。これから、免疫複合体クリアランスの補体媒介性機構が必要であり、H8L5はそのFc無効化等価物よりも好ましいものであるべきであると結論付けられた。約24gの重さの11週齢のオスのCB17SCIDマウスに、0、3、7、14及び21日目に、以下の抗体30mgkgのhIgG1対照抗体、30mgkgの10B3、3、10、30及び60mgkgの10B3H8L5又は10B3H8L5Fc無効化抗体を腹腔内投与した。数匹のマウスには30mgkgのhIgG1、又は1、3、10及び30mgkgのAMG745を4週間にわたって週に2回腹腔内投与した。AMG745は、WO2007067616A2に公開された配列を用いて調製した。28日目に、個々の骨格筋を切断し、その重量を記録した。図28は、試験した筋肉の質量に対する治療の効果を示す。10B3を用いる治療は、TA、大腿四頭筋、EDLにおいて有意な質量増加を引き起こし、腓腹筋においては有意な増加を引き起こさなかった。いずれかのヒト化抗体を用いる治療は、いくつかの用量群において有意な増加で個々の筋肉質量に対する効果をもたらした。AMG745治療は、1mgkgの最少用量以外の全ての用量レベルで大腿四頭筋、腓腹筋における有意な質量増加をもたらした。図28を参照されたい。この試験は、3群の動物、すなわち、二つの10B3治療群、並びにアイソタイプ一致対照群からなっていた。最初の3週間にわたって5回、動物に投与し、ウシ筋肉容量のMRI決定を0日目に実施し、その後12週間にわたって毎週実施した。アイソタイプ対照群と比較して、30mgkgの10B3で治療された動物のウシ筋肉容量及び体重の両方の有意な増加が、投与期間中に観察された30mgkg及び3mgkg投与群と対照群とのウシ筋肉容量の差異率は、それぞれ、約15及び5未満であった。しかしながら、重要なことに、高用量群と対照群との筋肉容量の有意な差異は9週間の洗い出し期間を通じて維持されたが、投与の中止後4週間では、二つの群の体重間に統計的な差異はなかった。また、第3週及び第4週で、対照群と比較して、3mgkgの10B3群においてウシ筋肉容量の有意な増加が観察されたが、その後は観察されなかった。注目すべきことに、試験の経過を通じて、低用量の10B3で治療された動物と対照動物との間で体重の有意な差異はなかった。H8L5の効力を、用量応答を規定するために様々な範囲の用量で8週齢のSCIDマウスにおいて評価した。30mgkgの10B3又は01、03、10、30若しくは100mgkgのH8L5を、0、3、7、14及び21日目に動物に腹腔内注射により投与した。動物を28日目に屠殺した。筋肉及び他の組織を切り出し、重量を計測した。低用量では、H8L5は副睾丸脂肪パッド質量を有意に増加させた。1mgkgを超える用量レベルでは、H8L5は個々の骨格筋質量の有意な増加を引き起こした。後肢坐骨神経の電気刺激によりinsituで測定されたピーク筋収縮力は、1~10mgkgの用量レベルのH8L5で治療された群における対照と比較して、19~24増加した。この試験は、H8L5がこのモデルにおける強力な同化剤であることを確認するものである。最少有効用量は、重量計測した全ての筋肉の質量及び血清中の遊離ミオスタチンの中和の有意な増加に基づいて、1mgkgである。重要なことに、筋肉質量の増加は、invivoでの収縮性測定による最大力生成の有意な増加をもたらし、1mgkgの用量で対照動物に対して有意な改善が観察された。H8L5の薬物動態挙動を、01、1及び10mgkgの単回腹腔内注射後にメスのCB17SCIDマウスにおいて決定した。以下の採取スケジュール2、6、12、24、48、72、192、336、504及び672時間に従って採取時間点あたり3匹の動物からの代替スパースサンプリング設計に従って血清サンプルを採取した。Gyrolabplatformビオチン化ミオスタチン捕捉試薬及びDylightAlexa標識ヤギ抗ヒトIgG検出抗体を用いてサンプルをH8L5について分析した。WinNonLin、Enterpriseversion41を用いる非コンパートメント薬物動態分析により、PK分析を実施した。01、10及び10mgkgの標的用量でのSCIDマウスへの腹腔内投与後のH8L5に関する血清濃度時間データから誘導された薬物動態パラメータの概要を下記表29に提示する。配列表配列番号1GYFMH配列番号2NIYPYNGVSNYNQRFKA配列番号3RYYYGTGPADWYFDV配列番号4KASQDINSYLS配列番号5RANRLVD配列番号6LQCDEFPLT配列番号7EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYNGVSNYNQRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTTVTVSS配列番号8DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQCDEFPLTFGAGTKLELK配列番号9MGWSCIILFLVATATGVHS配列番号10QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARXXXXXXXXXXWGQGTMVTVSS配列番号11DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCXXXXXXXXXXFGQGTKLEIK配列番号12QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTLVTVSS配列番号13QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSNYNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTVSS配列番号14QVQLVQSG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