"本願明細書に記載された発明。本発明の要旨本発明にしたがって、樹状細胞に送達されるべきDNAは、マイクロスフェアとして送達される。このような送達アプローチは、マイクロスフェア中の核酸へのヌクレアーゼの接近を防止すると考えられる。AS-オリゴヌクレオチドのマイクロスフェア送達は、特に、NODマウスモデルにおいて、樹状細胞の寛容を誘導するために実行される。マイクロスフェアは、マイクロスフェアがアンチセンスASオリゴヌクレオチドを取り込む、水性条件を使用して製造される。これらのマイクロスフェアは、遺伝子発現を阻害し、そしてインビボおよびインサイチュでのNODマウスにおける自己免疫性糖尿病状態を予防するために使用される。本発明の好ましい局面において、CD40、CD80およびCD86主要転写物に標的化される、3つのAS-オリゴヌクレオチドが合成される。そして、このオリゴヌクレオチド混合物の水溶液が調製され、ポリマー溶液と組み合わされる。加工後、このオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアが提供され、そして、これらはNODマウスに送達される。本発明のこれらの局面および他の局面、目的、特徴ならびに利点種々の組み合わせを含むは、以下の詳細な説明の考察から、明白であり、この考察を通して明確に理解される。例えば、本願発明は以下の項目を提供する。項目11型糖尿病の処置のためのオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアであって、該オリゴヌクレオチドは、該マイクロスフェアの全重量に基づいて、該マイクロスフェアの約30重量と約100重量との間を構成し、該マイクロスフェアは、約50ミクロンを超えない平均粒子サイズを有する、マイクロスフェア。項目2前記オリゴヌクレオチドが、CD40、CD80およびCD86主要転写物ならびにその組み合わせからなる群から選択される主要転写物に結合するように標的化される、項目1に記載のマイクロスフェア。項目3前記オリゴヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2または配列番号3およびその組み合わせからなる群から選択される、項目2に記載のマイクロスフェア。項目41型糖尿病を有する個体へ、マイクロスフェアの形態で核酸を送達するためのプロセスであって、該マイクロスフェアの送達のための投与経路は、静脈内、筋内、皮下、局所、皮内、腹腔内、経口、肺、眼、経鼻または直腸からなる群から選択される、プロセス。項目5項目1に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊から非肥満性糖尿病マウスの膵臓β細胞を防御するためのプロセス。項目6項目2に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊から非肥満性糖尿病マウスの膵臓β細胞を防御するためのプロセス。項目7項目1に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊から個体の膵臓β細胞を防御するためのプロセス。項目8項目2に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊から個体の膵臓β細胞を防御するためのプロセス。項目9項目1に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊からヒトの膵臓β細胞を防御するためのプロセス。項目10項目2に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊からヒトの膵臓β細胞を防御するためのプロセス。項目11項目1に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊および1型糖尿病の発症から個体の膵臓β細胞を防御するためのプロセス。項目12項目2に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊および1型糖尿病の発症から個体の膵臓β細胞を防御するためのプロセス。この説明の過程で、添付の図面への参照がなされる。好ましい実施形態の説明必要とされるように、本発明の詳細な実施形態が、本明細書で開示される;しかしながら開示される実施形態は、本発明の例示であるにすぎず、本発明は種々の形態に具体化され得ることが理解されるべきである。したがって、本明細書で開示される特定の詳細は、限定として解釈されるべきではなく、特許請求のための単なる根拠として、そして実質的に任意の適切な様式で本発明を種々に使用するように当業者へ教示するための代表的な根拠として解釈されるべきである。好ましい実施形態は、CD40、CD80およびCD86の主要転写物に標的化する、本明細書に記載のアンチセンスAS-オリゴヌクレオチドのマイクロスフェアを処方および注射することにより、自己免疫性インシュリン依存性糖尿病を予防する。これらのオリゴヌクレオチドは、NODマウスモデルにおいて、インシュリン産生β細胞の破壊を防止することを試みる、免疫寛容を誘導するように設計される。これらのβ細胞の破壊を導く事象は、図1に示される。これは、どのようにして、NODマウスおよびヒトにおいて、膵臓のインシュリン産生β細胞の自己免疫性の破壊により、1型糖尿病が発現するかを示す。臨床的な発症の時点において、ヒトは、10~20の残余のβ細胞集団を有する。この残余の集団を残すことは、グルコースレベルを調節するのに適切である、残存インシュリンレベルをもたらし得る。本発明の微粒子は、図1に示されるβ細胞の自己免疫性の破壊を妨害するために提供される。樹状細胞DCは、あらゆる組織において見られ、そして皮下に高度に濃縮される潜在的な抗原提示細胞となるべく、活性化され得ることが理解される。これらの抗原提示樹状細胞は、特に、リンパ節におけるT細胞の活性化を介する免疫応答のきっかけとして作用する。図2は、NIH3T3線維芽細胞をトランスフェクトするために使用され得る、βガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドベクターの図面である。プラスミドDNAマイクロスフェアによる、NIH3T3線維芽細胞のトランスフェクションについてのインビトロでの証拠が、βガラクトシダーゼx-gal5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-ガラクトピラノシド基質の添加に応答して青色に染色する細胞により、図3において示される。図4は、マイクロスフェアの、溶液中のDNAを防御する能力を示す。これは、概して本明細書に記載されるように生成される、プラスミドDNAのマイクロスフェアにより付与されるヌクレアーゼ防御を示す、アガロース電気泳動ゲルである。プラスミドサンプル1、2および3において、無防備nakedのプラスミドDNAがDNAseに曝された。スメアは、3つのレベルのDNAase処理の各々において、プラスミドDNA分解を示す。粒子1のサンプルおよび粒子2のサンプルにおいて、プラスミドDNAマイクロスフェア処方物がDNAaseに曝された。スメアの欠如は、マイクロスフェア処方物が、プラスミドDNAを分解から保護することを示す。図5は、4つの異なるプラスミドDNA処理におけるβガラクトシダーゼ活性について報告する。無防備のプラスミドDNA処理は、非常に低いレベルを示した。幾分より高いレベルが、送達ビヒクルとしてリポフェクタミン市販の陽イオン性脂質を使用するプラスミドDNA陽イオン性脂質複合体の処理について示される。大幅により高い活性が、図4の粒子1に対応するマイクロスフェア1および図4の粒子2に対応するマイクロスフェア2による、2つのpDNAマイクロスフェアについて示される。マウスにおける糖尿病の自己免疫の処置に使用されるマイクロスフェアの作製において、3種のAS-オリゴヌクレオチドが、水溶液に溶解され、そして水溶性ポリマーとポリカチオンとに組み合わされる。この溶液は、代表的に約60°C~70°Cでインキュベートされ、約23°Cに冷却される。そして過剰なポリマーが除去される。以下の配列を有する3種のAS-オリゴヌクレオチドを含むと考えられるマイクロスフェアが、形成される:ここで星印は、チオエーションthioationを示す。より詳細には、核酸は、代表的に、約30重量と約100重量との間のマイクロスフェアを含み、そして約50ミクロンを超えない平均粒子サイズを有する。代表的に、これらは、以下のように調製される。オリゴヌクレオチド混合物の水溶液は、3つのオリゴヌクレオチド溶液各々の溶液は、これらの3つの型のうちの1つを含むからのアリコートを組み合わせることにより調製される。3つの型のオリゴヌクレオチドを含む溶液が調製される。この溶液は、好ましくは、約10mg/mlのオリゴヌクレオチドを含む。これらは、約1:1から約4:1のポリカチオン:オリゴヌクレオチドの体積比で、ポリカチオン溶液の10mg/mlストック溶液のアリコートと組み合わされる。ポリビニルピロリドンおよび/またはポリエチレングリコールのポリマー溶液が調製され、そして、その他の溶液と組み合わされる。加熱、冷却、遠心分離および複数回の洗浄は、水性の懸濁物を提供し、この懸濁物は、代表的に、凍結および凍結乾燥され、オリゴヌクレオチドとポリカチオンとを含むマイクロスフェアの乾燥粉末を形成する。本発明にしたがうマイクロスフェアは、プラスミドDNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに他の核酸のための実行可能な非ウイルス性の送達手段である。これらは、3T3線維芽細胞における、βガラクトシダーゼプラスミドDNAのインビトロ送達を可能にする。マイクロスフェアは、ヌクレアーゼ活性からプラスミドDNAを保護する。高いレベルのβガラクトシダーゼ活性が、マイクロスフェア処方物によるトランスフェクション後に発現される。目的のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するマイクロスフェアは、膵臓のインシュリン産生β細胞の破壊をもたらす自己免疫反応の活性化において重要であることが公知の、表面細胞抗原CD40、CD80およびCD86をダウンレギュレートさせる。このことは、皮下に位置する樹状細胞への皮下注射により達成され得る。NODマウス研究は、β細胞の自己免疫性の破壊の有効な予防を実証する。DNAおよびオリゴヌクレオチドのマイクロスフェアは、インビトロおよびインビボでの、有効なトランスフェクションビヒクルである。樹状細胞は、オリゴヌクレオチドマイクロスフェアを取り込み、表面細胞抗原CD40、CD80およびCD86の発現を抑制するようである。このアンチセンスanitsenseオリゴヌクレオチドマイクロスフェアは、NODマウスにおいて糖尿病の発症を有効に予防する。以下の実施例は、本発明をさらに示すために、本発明の特定の特徴および利点を示す。これらの実施例は、本発明を限定するとも、他の方法により本発明の限定であるともみなされるべきではない。実施例1CD40、CD80およびCD86主要転写物に標的化される、3つのAS-オリゴヌクレオチドを、UniversityofPittsburghPittsburgh、PAにあるDNA合成設備により合成した。AS-オリゴヌクレオチドの配列は、以下である:オリゴヌクレオチド混合物の水溶液を、3つのオリゴヌクレオチド溶液各々は、1つの型のオリゴヌクレオチドを含んだのアリコートを組み合わせることにより調製し、3つの型のオリゴヌクレオチドの10[mg/ml]溶液を生成した。diH2O中で10[mg/ml]のポリ-L-リジンHBrを調製したBachem、KingofPrussia、PAによるポリ-L-リジンHBr50,000まで。ポリ-L-リジンHBrを、1:1の体積比で、このオリゴヌクレオチド溶液に添加した。この混合物を、穏やかにボルテックスした。pH=5.5でのlM酢酸ナトリウムSpectrum、Gardena、CA中に、12.5のPVPポリビニルピロリドン、40,000ダルトン、SpectrumChemicals、Gardena、CAと12.5のPEGポリエチレングリコール、3,350ダルトン、SpectrumChemicals、Gardena、CAとを含む25ポリマー溶液を作製した。このポリマー溶液を以下:750μ1のAS-オリゴヌクレオチド、0.75mlのポリ-L-リジンHBr、3.0mlのPEG/PVPのように2:1の体積比で添加し、そして4.50mlの全容積にした。このバッチを70°Cで30分インキュベートし、次に23°Cに冷却した。冷却に際して、この溶液が濁り、そして沈殿が生じた。次いで、この懸濁物を遠心分離し、そして過剰なPEG/PVPを除去した。生じたペレットを、脱イオン水でこのペレットを再懸濁することにより洗浄し、次に遠心分離そして上清の除去を行った。この洗浄プロセスを、3回繰り返した。この水性の懸濁物を、凍結および凍結乾燥させて、オリゴヌクレオチドとポリ-L-リジンとを含有するマイクロスフェアの乾燥粉末を形成した。図6は、1:1のポリ-L-リジン:オリゴヌクレオチド比の物質の走査電子顕微鏡写真SEMを示す。平均粒子サイズ約2.5μmを有するマイクロスフェア0.5~4μmのサイズを作製した。未知物質の沈殿も観察された。HPLCによるさらなる研究は、この沈殿が残余のPEG/PVP、大部分はPVPからなることを決定した。実施例2CD40、CD80およびCD86主要転写物に標的化される、AS-オリゴヌクレオチドは、実施例1のAS-オリゴヌクレオチド配列であった。このオリゴヌクレオチド混合物の水溶液を、3つのオリゴヌクレオチド溶液各々は、1つの型のオリゴヌクレオチドを含んだのアリコートを組み合わせることにより調製し、3つの型のオリゴヌクレオチドの10[mg/ml]溶液を生成した。オリゴヌクレオチド混合物の溶液を調製した。diH2O中で5[mg/ml]のポリ-L-オルニチンHBrを調製したSigmaによるポリ-L-オルニチンHBr11,900vis。ポリ-L-オルニチンHBrを、このオリゴヌクレオチド溶液に添加した。この混合物を、穏やかにボルテックスした。pH=5.5での0.1M酢酸ナトリウムSpectrumChemicals、Gardena、CA中に、12.5のPVP40,000ダルトン、SpectrumChemicals、Gardena、CAと12.5のPEG3,350ダルトン、SpectrumChemicals、Gardena、CAとを含む25ポリマー溶液を作製した。このポリマー溶液を添加した。実施例1に記載されるように、インキュベーションとリンスが続いた。1.5mlのAS-オリゴヌクレオチド、1.5mlのポリ-L-オルニチンHBr、3.0mlのPEG/PVP、そして全容積、6.0mlを調製した。図7は、この1:1のポリ-L-オルニチン:オリゴヌクレオチド比の物質のSEMを示す。平均粒子サイズ約2μmを有するマイクロスフェア0.2~8μmのサイズを作製した。未知物質の沈殿も観察された。さらなるHPLC研究は、この沈殿が残余のPEG/PVP、大部分はPVPからなることを証明し得た。実施例3インビボ研究を、1型真性糖尿病のNODマウスモデルを使用して実行した。1型糖尿病は、図1に示されるように、膵臓のインシュリン産生β細胞の自己免疫性の破壊により発現する。AS-オリゴヌクレオチドを、β細胞の自己免疫性の破壊を妨害する試みにおいて、3つの適用により使用した。この目標は、T細胞の活性化に必要とされる樹状細胞dendritriccell表面タンパク質をコードするCD40、CD80およびCD86主要転写物を標的化することにより、樹状細胞の機能を妨害することである。低レベルのCD40、CD80およびCD86を有する樹状細胞は、インビボにおいて、抑制性の免疫細胞ネットワークを促進することが公知である。これらのカスケードは、インビボにおいて、β細胞に対するT細胞の反応低下をもたらし得る。試験動物の第一群において、樹状細胞を、NODマウスの骨髄の前駆体から、生体外で増殖させた。CD40、CD80およびCD86主要転写物を標的化する3つのAS-オリゴヌクレオチドの組み合わせを、組織培養内の細胞に添加した。インキュベーション後、AS-オリゴヌクレオチドをトランスフェクトさせた樹状細胞を、5~8週齢の同系syngeneticの受容者まだ糖尿病ではないへ注射した。これは、公知の生体外送達アプローチである。平行して、AS-オリゴヌクレオチドのマイクロスフェアを、同一齢の他のNODマウスへ直接注射した。単回の注射を、このように処置した各マウスに対し実行した。別の群のこれらのNODマウスは、処置せず、コントロールとして扱った。図8は、コントロール、未処置のNODマウスが全て、23週齢までに糖尿病を発症したことを示す。生体外でAS-オリゴヌクレオチドをトランスフェクトされ、そして再注入された樹状細胞の群AS-ODNDCは、糖尿病の発症の遅延を示し、うち20が、グルコースレベルが非糖尿病の範囲内に維持されることを示した糖尿病を有さないままであった。マイクロスフェアをインビボ注射されたNODマウスのうち、71が、43週において糖尿病を有さないままであった。記載された本発明の実施形態は、本発明の原理のいくつかの応用の例であることが理解されるべきである。多くの改変が、本発明の真の意図および範囲から逸脱することなく、当業者によりなされ得る。本明細書に記載される種々の特徴は、任意の組み合わせにおいて使用され得、そして本明細書で具体的に概説される詳細な組み合わせに限定されない。"