"海馬の背側CA1野内に、興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含む非ヒト動物であって、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を阻害することができ、前記タンパク質の前記照射が、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす、非ヒト動物。前帯状皮質内に、興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含む非ヒト動物であって、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができ、前記タンパク質の前記照射が、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす、非ヒト動物。扁桃体基底外側部内に、興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含む非ヒト動物であって、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができ、前記タンパク質の前記照射が、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす、非ヒト動物。影響を受ける前記記憶機能が、記憶想起または記憶形成である、請求項1~3のいずれか1項に記載の非ヒト動物。前記記憶が恐怖記憶である、請求項1~4のいずれか1項に記載の非ヒト動物。前記記憶が遠隔記憶である、請求項1~5のいずれか1項に記載の非ヒト動物。前記タンパク質が、NpHR、BR、AR、およびGtR3からなる群から選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載の非ヒト動物。前記タンパク質が、配列番号3に示される配列と少なくとも95同一であるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の非ヒト動物。前記タンパク質が、小胞体ER輸出シグナルおよび/または膜輸送シグナルをさらに含む、請求項8に記載の非ヒト動物。前記アミノ酸配列が、リンカーを通して前記ER輸出シグナルに結合される、請求項8に記載の非ヒト動物。前記ER輸出シグナルが、アミノ酸配列FCYENEVを含む、請求項9に記載の非ヒト動物。前記膜輸送シグナルが、アミノ酸配列KSRITSEGEYIPLDQIDINVを含む、請求項9に記載の非ヒト動物。前記タンパク質が、配列番号5または配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の非ヒト動物。海馬の背側CA1野、扁桃体基底外側部、および前帯状皮質からなる群から選択される脳領域を含む脳組織切片であって、光活性化タンパク質が、前記脳領域の興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができ、前記タンパク質の前記照射が、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす、脳組織切片。個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法であって、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記個体において海馬の背側CA1野に投与することを含み、光活性化タンパク質が、海馬の前記背側CA1野内で、興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができ、それにより前記タンパク質を前記光により活性化することが、前記個体において事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす、方法。個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法であって、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記個体において前帯状皮質に投与することを含み、光活性化タンパク質が、前記前帯状皮質内で、興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができ、それにより前記タンパク質を前記光により活性化することが、前記個体において事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす、方法。個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法であって、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記個体において扁桃体基底外側部に投与することを含み、光活性化タンパク質が、前記扁桃体基底外側部内で、興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができ、それにより前記タンパク質を前記光により活性化することが、前記個体において事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす、方法。前記ポリヌクレオチドが、ベクターである、請求項15~17のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターが、AAVベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、HSVベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項18に記載の方法。記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法であって、個体において事象の記憶想起または記憶形成の間に、海馬の背側CA1野内で、興奮性ニューロンの脱分極を抑制することを含み、光活性化タンパク質が、前記個体の海馬の前記背側CA1野内で、前記興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができる、方法。記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法であって、個体において事象の記憶想起または記憶形成の間に、前帯状皮質内で、興奮性ニューロンの脱分極を抑制することを含み、光活性化タンパク質が、前記個体の前記前帯状皮質内で、前記興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができる、方法。記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための方法であって、個体において事象の記憶想起または記憶形成の間に、扁桃体基底外側部内で、興奮性ニューロンの脱分極を抑制することを含み、光活性化タンパク質が、前記個体の前記扁桃体基底外側部内で、前記興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができる、方法。前記事象が恐怖事象である、請求項15~22のいずれか1項に記載の方法。前記個体がヒトである、請求項15~22のいずれか1項に記載の方法。前記個体が非ヒト動物である、請求項15~22のいずれか1項に記載の方法。個体において心的外傷後ストレス障害を治療するための方法であって、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記個体の海馬の背側CA1野に投与することを含み、光活性化タンパク質が、海馬の前記背側CA1野において、興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができ、それにより前記タンパク質を前記光により活性化することが、前記個体において事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす、方法。個体において心的外傷後ストレス障害を治療するための方法であって、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記個体の前帯状皮質に投与することを含み、光活性化タンパク質が、前記前帯状皮質において、興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができ、それにより前記タンパク質を前記光により活性化することが、前記個体において事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす、方法。前記ポリヌクレオチドが、ベクターである、請求項26または27に記載の方法。前記ベクターが、AAVベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、HSVベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項28に記載の方法。記憶想起または記憶形成に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングする方法であって、a非ヒト動物において事象の記憶想起または記憶形成の間に、海馬の背側CA1野内の興奮性ニューロンを薬剤と接触させることであって、前記非ヒト動物が、前記動物の海馬の前記背側CA1野内で、前記興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含み、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができることと、b事象の記憶想起または記憶形成の間に、前記海馬の前記背側CA1野内で、前記興奮性ニューロンの脱分極を抑制することと、c前記光の存在下または非存在下で、前記薬剤が記憶想起または記憶形成に影響を及ぼすかを決定する、方法。記憶想起または記憶形成に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングする方法であって、a非ヒト動物において事象の記憶想起または記憶形成の間に、前帯状皮質内の興奮性ニューロンを薬剤と接触させることであって、前記非ヒト動物が、前記動物の前記前帯状皮質内で、前記興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含み、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができることと、b事象の記憶想起または記憶形成の間に、前記前帯状皮質内で、前記興奮性ニューロンの脱分極を抑制することと、c前記光の存在下または非存在下で、前記薬剤が記憶想起または記憶形成に影響を及ぼすかを決定する、方法。記憶想起または記憶形成に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングする方法であって、a非ヒト動物において事象の記憶想起または記憶形成の間に、扁桃体基底外側部内の興奮性ニューロンを薬剤と接触させることであって、前記非ヒト動物が、前記動物の前記扁桃体基底外側部内で、前記興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含み、前記タンパク質が光応答性であり、前記ニューロンが前記光で照射されると、前記ニューロンの脱分極を抑制することができることと、b事象の記憶想起または記憶形成の間に、前記扁桃体基底外側部内で、前記興奮性ニューロンの脱分極を抑制することと、c前記光の存在下または非存在下で、前記薬剤が記憶想起または記憶形成に影響を及ぼすかを決定する、方法。前記タンパク質が、NpHR、BR、AR、およびGtR3からなる群から選択される、請求項15~32のいずれか1項に記載の方法。前記NpHRタンパク質が、配列番号3に示される配列と少なくとも95同一であるアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の方法。前記NpHRタンパク質が、小胞体ER輸出シグナルおよび/または膜輸送シグナルをさらに含む、請求項34に記載の方法。配列番号3に示される配列と少なくとも95同一である前記アミノ酸配列が、リンカーを通して前記ER輸出シグナルおよび/または前記膜輸送シグナルに結合される、請求項35に記載の方法。前記ER輸出シグナルが、アミノ酸配列FCYENEVを含む、請求項35に記載の方法。前記膜輸送シグナルが、アミノ酸配列KSRITSEGEYIPLDQIDINVを含む、請求項35に記載の方法。前記NpHRタンパク質が、配列番号5または配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の方法。詳細な説明本開示は、時間ベースで記憶機能を修正するのに有用であると考えられる。本発明の特定の適用は、記憶想起および/または記憶想起に結合される感情応答の妨害を促進する。本明細書に開示される例示の実施形態の多くの態様は、この分野のこれまでの開発に関し、それらを基礎とするため、以下の論考は、そのようなこれまでの開発をまとめて、実装の詳細および修正が描かれ得る基礎および根底をなす教示に関する強固な理解を提供する。この文脈において、以下の論考は、参照することにより本明細書に組み込まれるこれらの参考文献における教示とともに提供される。本発明は、必ずしもそのような適用に限定されないが、発明の様々な態様は、この文脈を使用して様々な実施例の考察を通して理解されてよい。背側CA1海馬回路の時間的妨害は、文脈的恐怖記憶の取得を防止するために有効であることが発見された。それと一致して、一般的な神経ネットワーク理論は、記憶の固定のプロセスが、海馬と皮質との間の接続における短期修飾から開始し、海馬が記憶自体を保存するよりもむしろ、完全な記憶に寄与する関連皮質部位を活性化するのを可能にする。これらの皮質トレースは、繰り返し共活性化され、それらの間の段階的な長期変化は、最終的にこれらの接続が海馬の関与なしに記憶を支持するために十分強力となるまで起こる。意外にも、背側CA1海馬回路の妨害は、皮質再組織化が発生したと考えられた後であっても、恐怖記憶の呼び出しを遮断するのに有効であることが発見された。本開示の様々な実施形態に従って、神経回路の制御に関連する方法、システム、またはデバイスが論じられる。神経回路に対する制御は、抑制または励起を含むことができ、それぞれ調製された発火、および/または外部回路入力に対する修正された感受性を含み得る。例えば、抑制はイオンチャネルおよび/またはイオンポンプ例えば、NpHRおよびNpHR変異型などの光活性化タンパク質を使用して達成され得る。そのようなイオンチャネルは、ニューロンの膜電位をその閾値電圧から離し、活動電位を中断または抑制させる。別の例では、励起は、イオンチャネル例えば、ChR2およびChR2変異型などの光活性化タンパク質を使用して達成され得る。そのようなイオンチャネルは、膜電位を閾値電圧に向かって移動、および/または通過させることができ、それにより活動電位を励起または促進する。様々な実施形態に従って、光活性化タンパク質を使用して、ニューロンの静止電位を時間的に移行させて、外部回路入力に対するその感受性を増減させる。これらの様々なオプションは、組み合わせて使用することもできる。本明細書に提供されるデバイスおよび方法は、記憶機能に可逆的に影響し得る。例えば、以下に記載される方法を使用して、長期および短期記憶、ならびに恐怖記憶またはストレス記憶を含む様々な種類の記憶の基礎となる神経回路を制御および/または特性化してよい。方法は、様々な段階の記憶機能例えば、記憶の取得、固定、および呼び出しにも影響し得る。記憶機能例えば、記憶形成および/または記憶想起に影響を及ぼすためのいくつかの変型例では、記憶機能は、光活性化タンパク質を発現する、海馬の背側CA1領域、扁桃体基底外側部BLA、および/または前帯状皮質ACCのニューロンに光を印加することにより影響される。光の存在下で、これらの光活性化タンパク質は、ニューロンの脱分極化を抑制してよく、それにより記憶の形成および/または想起を妨害する。例示的な方法は、文脈的遠隔および近時恐怖ベースの記憶の取得および呼び出しの文脈において記載されるが、本明細書に開示されるデバイスおよび方法は、記憶機能の他の段階、ならびに他の種類の記憶例えば、キュー記憶に影響するように使用されてよいことを理解されたい。本明細書に記載され、図面に示される様々な実施形態は、一緒におよび/または他の方法で実装されてよい。図面/図に表される項目の1つ以上は、より個別のまたは統合された方法で実装することもでき、または特定の適用に従って有用であるように、ある例では除去され、および/または動作不能にされ得る。例えば、本明細書に論じられるPTSDの治療を伴う実施形態は、時間的に制御された薬物放出を使用して実装され得る。本明細書の記載を参照して、当業者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変化がそこに行われてよいことを認識するであろう。標的細胞における光活性化タンパク質の発現ニューロン例えば、記憶機能に関与するニューロンの活動は、多様な機序を使用して影響されてよい。ニューロン活動に影響する決定論的な方法を使用して、様々な脳機能の基礎となる神経回路を制御および/または特性化してよい。例えば、ニューロン応答は、薬剤例えば、テトロドトキシンTTX、6-シアノ-7-ニトロキノキサリン-2,3-ジオンCNQX、ピクロトキシン、ストリキニーネなどを適用することにより、および/または電気刺激例えば、電極により影響され得る。いくつかの変型例では、ニューロン活動は、ニューロンの膜上である種類のタンパク質を活性化することにより影響される場合があり、細胞膜を過分極化または脱分極化し得る。例えば、ある波長を有する光の存在下で、あるイオン例えば、カチオン、アニオンに透過性となる光活性化タンパク質は、ニューロン内で発現され得る。光活性化タンパク質の例には、以下でさらに説明される、光活性化イオンチャネルおよび/またはポンプが挙げられ得る。いくつかの変型例では、微生物オプシン遺伝子は、神経科学において使用するために適合され得る。これらのオプシンは、正常な哺乳類の脳内で特定細胞型のミリ秒時間スケールの膜電位変化への光パルス列の形質導入を可能にする例えば、チャネルロドプシンChR2、VolvoxチャネルロドプシンVChR1、およびハロロドプシンNpHR。ChR2は、単細胞緑藻クラミドモナスに由来するロドプシンである。本明細書で使用される、用語ロドプシンは、少なくとも2つの構築ブロックである、オプシンタンパク質、および共有結合された共因子、通常レチナールレチンアルデヒドを含むタンパク質である。ロドプシンChR2は、クラミドモナスゲノム内で、本来はクラミオプシン-4Cop4と呼ばれるオプシンチャネルオプシン-2Chop2に由来する。1つの脱分極チャネルロドプシン、ChR2の時間特性は、活性化および非活性化の高速反応速度を含み、正確な時間活動電位列の生成を可能にする。長い時間スケールの活性化を求める適用の場合、チャネルロドプシンの通常高速のオフ反応速度が減速され得ることが発見された。例えば、チャネルロドプシンのある実装は、事実上脱分極化が望ましい時間全体で、1mW/mm2光を適用し、これは望ましいとは言えない。ある波長複数可を有する光に応答して、膜の過分極化を生成するか、または脱分極化を抑制する光活性化タンパク質は、海馬の背側CA1領域CA1、扁桃体基底外側部BLA、および前帯状皮質ACC領域内の、興奮性ニューロン例えば、グルタミン酸作動性ニューロン内で発現されてよい。以下の表1は、ある波長の光の存在下で、脱分極化を抑制するか、またはニューロンを過分極化させるように、興奮性ニューロン内で発現され得る光活性化タンパク質の様々な例を示す。これらおよび他の光活性化タンパク質に関するさらなる説明は、2011年3月17日に出願されたPCT出願第PCT/US11/028893号、表題LIGHTSENSITIVEIONPASSINGMOLECULESにおいて見出され得、参照することによりその全体が組み込まれる。本明細書で使用される、NpHR、BR、AR、およびGtR3は、野生型タンパク質および機能的変異型自然発生する変異型を含むが挙げられる。本発明の実施形態は、自然発生する配列の比較的軽度のアミノ酸変異型を含む。一例では、変異型は、自然発生する配列のタンパク質配列に対して約75を超えて相同性である。他の変異型では、相同性は約80超である。さらに他の変異型は、約85超、90超、またはさらには約93~約95、もしくは約98もの高い相同性を有する。この文脈において相同性は、配列類似性または同一性を意味し、同一性を伴うことが好ましい。この相同性は、配列解析の分野で既知の標準的な技法を使用して決定され得る。本発明の実施形態の組成物は、本明細書に提供されるタンパク質および核酸配列を含み、提供される配列に対して約50を超えて相同、提供される配列に対して約55を超えて相同、提供される配列に対して約60を超えて相同、提供される配列に対して約65を超えて相同、提供される配列に対して約70を超えて相同、提供される配列に対して約75を超えて相同、提供される配列に対して約80を超えて相同、提供される配列に対して約85を超えて相同、提供される配列に対して約90を超えて相同、または提供される配列に対して約95を超えて相同の変異型を含む。本明細書では、非ヒト動物の海馬の背側CA1野、前帯状皮質、および/または扁桃体基底外側部内に興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含む非ヒト動物が提供され、このタンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、このタンパク質の照射は、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、本明細書に記載されるNpHR、BR、AR、およびGtR3からなる群から選択される。例えば、本明細書に記載されるNpHRタンパク質のいずれかは、標的ニューロンの細胞膜上に発現されてよい。また本明細書では、海馬の背側CA1野、扁桃体基底外側部、および前帯状皮質からなる群から選択される脳領域を含む脳組織切片も提供され、光活性化タンパク質は、脳領域の興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、このタンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、このタンパク質の照射は、記憶機能に可逆的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、脳組織切片は、本明細書に記載される非ヒト動物から採取した培養組織切片である。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、本明細書に記載されるNpHR、BR、AR、およびGtR3からなる群から選択される。例えば、本明細書に記載されるNpHRタンパク質のいずれかは、標的ニューロンの細胞膜上に発現されてよい。いくつかの実施形態では、CA1、BLA、および/またはACC領域のニューロンは、ChR2を発現し得る。特に指定のない限り、発明は、多数の類似する変異型を含む。例としては、これらに限定されないが、Chop2、ChR2-310、Chop2-310、およびVolvoxチャネルロドプシンVChR1が挙げられる。VChR1に関するさらなる詳細は、参照することにより本明細書に完全に組み込まれる、Red-shiftedoptogeneticexcitation:atoolforfastneuralcontrolderivedfromVolvoxcarteri,NatNeurosci.June2008,116:631-3.Epub2008Apr.23を参照することができる。他の実装では、同様の修飾を他のオプシンまたは光活性化分子に行うことができる。例えば、修飾/変異をChR2またはVChR1変異型に行うことができる。さらに、修飾された変異型は、光活性化イオンポンプと組み合わせて使用することができる。本明細書で使用される、標的細胞の刺激は、一般に細胞の特性の修正を説明するように使用される。例えば、標的細胞の刺激は、細胞膜の特性の変化をもたらす場合があり、標的細胞の脱分極化または分極化に至り得る。特定の例では、標的細胞はニューロンであり、ニューロンによるインパルス活動電位の生成を促進または抑制することにより、刺激はインパルスの伝送に影響し得る。光活性化タンパク質例えば、オプシンに関するさらなる詳細については、参照することにより本明細書に完全に組み込まれる、DeisserothらのPCT公開第WO2010/056970号、表題OPTICALLY-BASEDSTIMULATIONOFTARGETCELLSANDMODIFICATIONSTHERETOを参照されたい。本開示の実施形態は、標的とされる集団の励起性の双安定変化の実装を対象とする。これには、二重変異ChR2-C128S/D156Aが挙げられるが、必ずしもこれに限定されない。この二重変異ChR2-C128S/D156Aは、培養海馬ニューロン内で十分に耐性があり、青色光の単一短パルスによる急速な段階的活性化、および緑色もしくは黄色光による非活性化の本質的なSFO特性を保存することがわかった。特に、ChR2-C128S/D156Aの活性化スペクトルは、445nmにおいてピークであった。第2の非活性化ピークは、390~400nmにおいて認められ、590nm非活性化ピークと比較して、より高速であるが、不完全な非活性化であった。ChR2-C128S/D156Aを発現する細胞におけるピーク光電流は、ロバストであり、ChR2-D156Aのそれに匹敵することがわかったそれぞれ231.08±31.19s.e.m、n=9細胞および320.96±78.26s.e.m、n=7細胞。個別のトランスフェクトおよびパッチクランプされたニューロンは、次に470nm光の100msパルスで活性化した。電流減衰が細胞減少に起因しないという極めて長期の記録を保証するために、各細胞を別個の間隔で長期の590nm光パルスで非活性化し、各時点で残りのSFO電流の程度を決定する。意外にも、ChR2-C128S/D156Aを発現するニューロンは、いずれかの単一変異体単独を発現する細胞からのものよりも安定した持続性光電流を生じた。単一指数関数減衰曲線を経時的なI非活性化/I活性化の比率に適合させることは、ChR2-C128S/D156Aの29.3分の自然減衰時定数を明らかにし、C128およびD156変異が、相乗的に作用して、ChR2の開放状態の減衰を遅延させることを示す。複雑な哺乳類の行動に対して予期される適用に必要な改善に従って、二重変異SFO電流のかなりの部分は、依然として単一光活性化パルス後20分まで存在した。これらの驚くほど遅い減衰反応速度に基づいて、二重変異体遺伝子は、SSFO安定化ステップ-機能オプシン遺伝子と呼ばれる。SSFOは、活性タンパク質の短縮形としても使用される。いずれの残渣もChR2チャネル閉鎖ゲーティングに関与する可能性があり、いずれの変異もチャネルの開放状態構成を安定化させる可能性がある。理論に拘束されることなく、本開示の態様は、SSFOが光反応サイクルの進行において完全に遮断され得、したがって、光反応サイクル工学で可能な最大安定性を呈し得るという発見に関する。例えば、ChR2C128XおよびChR2-D156Aとは対照的に、SSFO光反応サイクルは、この変異体において到達されなかった後期光反応サイクル段階において、光反応サイクルを分離する可能性がある付加的な非活性脱プロトン化副産物にアクセスするように見られず、そのため、親単一変異よりも、インビボでの繰り返し使用におけるSSFOの信頼性をさらに高める。本開示の実施形態は、光に対するSSFOの感受性を対象とする。例えば、遅い減衰定数を有するチャネルロドプシンは、光子積分器として有効に作用する。これは、光遺伝的回路変調に対する高感受性、低侵襲性のアプローチに特に有用であり得、光パルス長の変調を介して、標的ニューロン集団に対する容易に滴定可能な動作を依然として伴う。異常に低い光強度であっても8μWmm-2まで低い、数百ピコアンペアの全細胞光電流は、SSFOを発現するニューロンから得ることができ、全照射時間の間に、470nmの光に応答して、単一指数関数的反応速度で増加することが発見された。他の態様は、べき乗関係を示す、両対数スケールで活性化光パワーと線形的に相関した活性化時定数の使用に関し、SSFOが純積分器であることを示唆し、光電流の唯一の決定因子として経過時間に対する総光子暴露を用いる。例えば、光電流が所与の最大下活性に到達するために必要とされる膜面積当たりの光子の数τまでの時間は、活性化光パワーに関わらず一定である。本開示の例示的実施形態は、ハイブリッドChRI/VChRIキメラの使用に関し、ChR2配列をまったく含有せず、個別に良好に発現しない2つのオプシン遺伝子に由来し、本明細書ではC1V1と呼ばれる。本開示の実施形態は、Kir2.1チャネルに由来する膜輸送シグナルの付加を通して、VChR1の膜標的の改善にも関する。VChR1-EYFPを発現する培養ニューロンからの共焦点像は、ChR2と比較して細胞内タンパク質の大部分を明らかにし、したがって、VChR1の膜標的を改善し、Kir2.1チャネルに由来する膜輸送シグナルを付加した。このVChR1-ts-EYFPの膜標的は、VChR1-EYFPと比較してわずかに強化されたが、VChR1-ts-EYFPを発現する培養海馬ニューロンから記録された平均光電流は、VChR1-EYFPのそれよりもわずかに大きいだけであった。したがって、本開示の実施形態は、らせんを他のChRからの対応するらせんと交換することにより修飾されるVChR1に関する。例えば、らせん1および2がChR1からの相同セグメントと置き換えられた2つのキメラにおいて、ロバスト改善が認められた。スプライス部位が、らせん2と3との間にChR1残渣Ala145において細胞内ループ内にあるか否か、またはらせん3内にあるか否かChR1残渣Trp163においてに関わらず、得られるキメラは、いずれもロバストに発現され、同様に光電流およびスペクトル特性を強化した。ChR1が弱く発現され、大部分の哺乳類宿主細胞の膜に不良に統合されるに過ぎないため、この結果は望ましくなかった。得られるハイブリッドChR1/VChR1キメラは、本明細書においてC1V1と呼ばれる。本開示の態様は、培養ニューロン例えば、海馬ニューロンにおけるC1V1の発現に関する。実験的試験は、多数の意外で有用な結果を示し、これらは以下でさらに詳述される。C1V1-EYFPは、VChR1-EYFPと比較して、驚くほど改善された平均蛍光を呈する。C1V1を発現するニューロンにおける全細胞光電流は、VChR1-EYFPおよびVChR1-ts-EYFPのそれよりもはるかに大きく、イオン選択性は、ChR2およびVChR1のそれに類似した。C1V1とYFPとの間のKir2.1輸送シグナルの付加は、光電流をさらに41強化した。C1V1-ts-EYFP平均光電流は極めて大きく、野生型WTVChR1のほぼ10倍であった。平均蛍光レベルは、測定された光電流とほぼ一致しVChR1-EYFP、VChR1-ts-EYFP、C1V1-EYFP、およびC1V1-ts-EYFPの平均蛍光はそれぞれ9.3±1、19.6±3.4、19.8±2.8および36.3±3.8、光電流の大きさの増加が、哺乳類ニューロンにおけるこれらのチャネルの発現の改善から主に生じたことを示唆する。総体細胞蛍光統合されたピクセル密度として測定されるは、異なる構成VChR1、VChR1-ts-EYFP、C1V1、C1V1-ts-EYFPにわたって個別の記録/撮像された細胞内の光電流の大きさと線形的に相関した。これは、C1V1の光電流の増加が、ニューロンにおける機能発現の変化に起因することを示唆する理論に制限されない。本開示の様々な実施形態は、高速減衰定数を有するオプシンまたは光活性化タンパク質に関する。この特性は、スパイクに対して正確な制御を提供するため、例えば、内因性コンダクタンスを最小限に干渉し、光パルス当たり単一スパイクをトリガーし、および/または光パルス列の間のプラトー電位を最小化するために特に有用であり得る。実験結果は、C1V1-ts-EYFPにおいて記録された光誘発光電流が、VChR1のそれに類似する時定数により減衰されたことを示唆する。したがって、本開示の態様は、低非活性化、考えられるさらなる赤色寄りの吸収、および/または、光反応サイクルの反応速度を改善するための発色団領域における修飾を対象とする。一実施形態は、対応するChETA変異E162Tを対象とし、この実験は、加速した光反応サイクル例えば、約3倍を提供することを示唆する参照することにより本明細書に組み込まれる、Gunaydin,etal.,Ultrafastoptogeneticcontrol,NatNeurosci,2010を参照することができる。意外にも、この変異は、作用スペクトルを530nmまで浅色に偏移することが示されたが、ChR2または他の微生物ロドプシンにおける類似変異は、赤色寄りの偏移をもたらした。別の実施形態は、グルタミン酸塩-122のトレオニンへの変異を対象とするC1V1-E122T。実験的試験は、C1V1-E122Tが、ChR2の46不活性化と比較して、わずか26だけ不活性化したこと、加えてスペクトルが546nmまでさらに赤色寄りに偏移したことを示した。本開示の別の実施形態は、E122TおよびE162T変異の両方を含む、C1V1の二重変異を対象とする。実験的試験は、電流の不活性化がE122T変異の場合より低く、光反応サイクルがE162Tと比較して速いことを示した。これは、個別の変異の複数の有用な特性が、二重変異体内で一緒に保存されたことを示唆する。光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド本明細書に記載される光活性化タンパク質またはオプシンは、当該技術分野において既知の方法により、例えば、タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドによりニューロンに送達されてよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクターであり、例えば、AAVベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、HSVベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである。例えば、ニューロンは、細胞特異的プロモータに動作可能に結合された光活性化タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと接触されてよく、該ニューロンは、細胞膜上に光活性化タンパク質を発現する。いくつかの変型例では、細胞特異的プロモータは、カルシウム/カルモデュリン依存性タンパク質キナーゼHaCaMKIIaプロモータである。いくつかの変型例では、光活性化可能なeNpHR3.1またはeNpHR3.0をコードする核酸配列は、ベクター内のCaMKIIaプロモータに動作可能に結合される。いくつかの変型例では、光活性化タンパク質は、CA1領域、BLAおよび/またはACCにおいて、興奮性グルタミン酸作動性ニューロン内で発現される。遺伝子送達に使用され得る任意のベクターが使用されてよい。いくつかの変型例では、ウイルスベクター例えば、AAV、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、ベクターは、組み換えAAVベクターである。AAVベクターは、それらが感染する細胞のゲノム内に安定した部位特異的な様式で組み込むことができる、比較的小さい寸法のDNAウイルスである。これらは、細胞の成長、形態、または分化に対するいずれの影響も誘発することなく幅広い細胞に感染することができ、またこれらはヒトの病理には関与していないと考えられる。AAVゲノムは、クローニングされ、シークエンシングされ、特徴付けられてきた。該ゲノムは、約4700塩基を包含し、ウイルスの複製開始点としての役割を果たす約145塩基の末端逆位配列ITR領域を各末端に含む。ゲノムの残りの部分は、キャプシド形成の機能を担う2つの必須領域に分割される:ウイルスの複製およびウイルス遺伝子の発現に関与するrep遺伝子を含む、ゲノムの左側部分、ならびにウイルスのキャプシドタンパク質をコードするcap遺伝子を含む、ゲノムの右側部分。AAVベクターは、当該技術分野における標準的な方法を使用して調製されてもよい。いずれの血清型のアデノ随伴ウイルスも好適である例えば、Blacklow,ParvovirusesandHumanDiseaseJ.R.Pattison,ed.1988pp.165-174、Rose,ComprehensiveVirology3:1,1974、P.TattersallTheEvolutionofParvovirusTaxonomyInParvovirusesJRKerr,SFCotmore.MEBloom,RMLinden,CRParrish,Eds.p5-14,HudderArnold,London,UK2006、およびDEBowles,JERabinowitz,RJSamulskiTheGenusDependovirusJRKerr,SFCotmore.MEBloom,RMLinden,CRParrish,Eds.p15-23,HudderArnold,London,UK2006を参照されたく、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ベクターを精製するための方法は、例えば、米国特許第6566118号、第6989264号、および第6995006号、ならびにWO/1999/011764号標題MethodsforGeneratingHighTiterHelper-freePreparationofRecombinantAAVVectorsに見出すことができ、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、PCT出願第PCT/US2005/027091号に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。インビトロおよびインビボで遺伝子を移動させるためのAAVに由来するベクターの使用が記載されている例えば、国際特許出願公開第91/18088号およびWO93/09239号、米国特許第4,797,368号、同第6,596,535号、および同第5,139,941号、ならびに欧州特許第0488528号を参照されたく、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、repおよび/またはcap遺伝子が欠失し、対象となる遺伝子によって置換された種々のAAV由来構築物、ならびにインビトロ培養細胞内またはインビボで生物内で直接的に対象となる遺伝子を移動させるためのこれらの構築物の使用について記載している。本発明による複製欠損組み換えAAVは、2つのAAV末端逆位配列ITR領域によって隣接された対象となる核酸配列を含むプラスミドと、AAVキャプシド形成遺伝子repおよびcap遺伝子を持つプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス例えばアデノウイルスに感染させた細胞株内にコトランスフェクトすることによって調製することができる。生成されたAAV組み換え体は、次いで、標準的な技術によって精製される。いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用するためのベクター複数を含むは、ウイルス粒子例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5,AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、およびAAV16を含むがこれらに限定されないAAVウイルス粒子中にキャプシド形成される。したがって、本発明は、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む組み換えウイルス粒子組み換えポリヌクレオチドを含むため、組み換え体であるを含む。このような粒子を生成する方法は、当該技術分野で既知であり、米国特許第6,596,535号に記載されている。本明細書に記載の動物細胞について、1つ以上のベクターを、神経細胞、心臓細胞、または幹細胞に投与することができることを理解されたい。1つ以上のベクターが使用される場合、それらは、同時または異なる時点で、動物細胞に投与することができることを理解されたい。例えば、いくつかの変型例では、ニューロン内のC1V1オプシン遺伝子は、C1V1-ts-EYFPをコードするレンチウイルスベクターおよび本明細書で論じられる様々な点変異の組み合わせを生成することにより実行された。次いでオプシンは、培養された海馬ニューロン内で発現され、同一の刺激条件下2msパルス、542nm光、5.5mW/mm2、全細胞光電流を記録した。C1V1、C1V1-E162T、およびC1V1-E122T/E162Tを発現する細胞内の光電流は、すべてロバストであり、ChR2-H134Rの光電流よりも大きく流れた。実験は、C1V1-E122T/E162Tを発現する細胞から、およびChR2-H134Rを発現する細胞からの統合体細胞YFP蛍光および光電流の比較も含んだ。意外にもC1V1-E122T/E162T細胞は、等しい蛍光レベルでChR2-H134R細胞よりも強い光電流を示した。これは、C1V1が、ChR2-H134Rと比較して、より高い単位コンダクタンスを有し得ることを示唆する。試験結果は、C1V1-E122Tの反応速度が、C1V1-E122T/E162Tのそれよりも遅かったこと、およびC1V1-E122Tを発現する細胞が、二重変異体を発現する細胞よりも強く赤色光630nmに応答したことを示唆する。これは、赤色光に応答して、光遺伝的スパイクを生成するために特に有用であり得る。本開示の様々な実施形態と一致して、同一のマイクロ回路内に常駐する抑制性および/または興奮性ニューロンは、様々な光活性化タンパク質例えば、オプシンの導入に際して標的とされる。実験的試験は、培養された海馬ニューロン内のCaMKIIaプロモータ下で、別個に発現されたC1V1-E122T/E162TおよびChR2-H134Rにより行われた。C1V1-E122T/E162Tを発現する細胞は、2ms緑色光パルス560nmに応答してスパイクしたが、紫色光パルス405nmにはスパイクしなかった。対照的に、ChR2-H134Rを発現する細胞は、2ms405nm光パルスに応答してスパイクしたが、2ms561nm光パルスにはスパイクしなかった。本開示の様々な実施形態は、生きている脳切片内の2つのニューロン集団の独立した活性化に関する。実験的な試験は、20PV::CreマウスのmPFC内でCaMKIIa-C1V1-E122T/E162Tts-eYFPおよびEFla-DIO-ChR2-H134R-EYFPにより行った。非発現PYR細胞では、405nm光パルスは、PV細胞の直接活性化に起因して、ロバストかつ高速な抑制性シナプス後電流IPSCをトリガーしたが、561nm光パルスは、局所抑制性ニューロンのC1V1-発現錐体細胞から生じる予期される長潜時多シナプスIPSCのみをトリガーした。ニューロン内で発現したタンパク質の光活性化ニューロン内で発現した光活性化タンパク質を活性化する波長を有する光を適用することができる任意のデバイスを使用して、ニューロンを脱分極化および/または過分極化してよい。例えば、図1に表される1つ以上のニューロンの膜電圧に影響を及ぼすイオンチャネルおよび/またはイオンポンプを活性化するための光送達デバイス100が使用されてもよい。そこに示されるように、光送達デバイス100は、光刺激を脳の標的領域に提供するように構成される。光送達デバイス100は、基部102、基部に取り付けられるカニューレガイド104、およびカニューレガイドを介して基部に取り付けられた1つ以上の光学導管106を含んでよい。基部102は、光学導管106から標的組織領域101、例えば、CA1領域103に光を送達するように位置付けられた1つ以上の光送達ポート108を含む。光学導管106は、ファイバーの近位端が、光学光源図示せずに取り付けられ、遠位端が、光送達ポート108と連通している光ファイバーであってよい。光学光源は、連続光および/またはパルス光を提供することができ、既定のパルス配列で光を提供するようにプログラム可能であってよい。光送達デバイス100は、任意の数の光学導管106を有してよく、望ましくは、例えば、1、2、3、4、5、10、15、20などであってよい。光学導管106は、それぞれ同一または異なる波長の光を運んでよい。送達された光は、450nm~600nmの間の波長、例えば、黄色光または緑色光を有してよい。光送達デバイス100は、任意の数の光送達ポート108を有してよく、望ましくは、例えば、1、2、3、4、5、10、15、20などであってよい。いくつかの変型例では、光学導管と同数の光送達ポートであってよいが、他の変型例では、異なる数の光学導管および光送達ポートであり得る。例えば、2つ以上の光送達ポートに光を運ぶ単一の光学導管であってもよい。代替または付加的に、単一の光学導管は、単一の光送達ポートに接続してよい。カニューレガイド104は、光学導管106を光送達ポート108に固定および整列するのを助けるように構成されてよい。いくつかの実施形態では、光送達デバイス100は、記憶の形成および想起に影響を及ぼすように、両側光をCA1領域103に送達するように構成される。光送達デバイスは、ニューロン活性を測定するために構成され得る、1つ以上の測定電極を含んでもよい。例えば、測定電極は、ニューロンが刺激に応答するとき、1つ以上のニューロンの膜全体の膜電位例えば、活動電位および/または電流の変化を記録し得る。いくつかの変型例では、測定電極は、光学刺激に対する1つ以上のニューロンの電気応答を測定し得る。測定電極は、細胞外または細胞内電極であり得る。記憶機能に影響を及ぼす方法本明細書に記載されるように、標的組織領域101は、光に応答して細胞の膜電圧を修正するように設計された光活性化タンパク質を有する細胞を持つ神経組織を含んでよい。いくつかの変型例では、光活性化タンパク質を使用して、脳のCA1、BLA、およびACC領域におけるニューロンの脱分極化を抑制することにより記憶の形成および/または想起を妨害してよい。本開示の実施形態は、記憶の取得、呼び出し、および/または記憶と感情的な反応、例えば恐怖との関連付けを妨害することを対象とする。特定の実施形態では、記憶に関与する神経回路の機能は、光活性化イオンチャネル例えば、NpHR、BR、ARなどおよび/またはポンプ例えば、プロトンポンプGtR3の活性化により妨害される。ある実装では、この妨害は、記憶形成の間に実装され得る。他の実装では、この妨害は、記憶想起前またはその間に実装され得る。これは、記憶の呼び出しを伴う精神疾患または神経疾患、例えばPTSDに特に有用であり得る。ある実施形態と一致して、妨害は、その妨害に対して提示される、および/または制御される記憶トリガー事象または他の外部刺激に応答してトリガーされ得る。例えば、妨害は、トリガーに応答するように条件付けられた個体に対して、記憶のトリガーに応答して提供され得る。別の例では、個体は、妨害を活発にトリガーし得る。例えば、個体は、PTSDと関連付けられた記憶を経験するとき、妨害をトリガーし得る。本開示の他の実施形態は、記憶の取得、呼び出し、および/または記憶と感情的な反応との関連付けを促進することを対象とする。本明細書に記載される方法は、記憶機能におけるニューロン複数可および/または神経回路の役割を確認するように、および/または記憶障害と関連付けられる疾患を治療するように使用され得る。いくつかの実施形態では、個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための本明細書に提供される方法は、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、個体の海馬の背側CA1野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部に投与することを含み、光活性化タンパク質は、海馬の背側CA1野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、それによりそのタンパク質を光によって活性化することが、個体における事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、個体において記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼすための本明細書に提供される方法は、個体における事象の記憶想起または記憶形成の間に、海馬の背側CA1野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの脱分極化を抑制することを含み、光活性化タンパク質は、個体の海馬の背側CA1野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができる。いくつかの実施形態では、事象は恐怖事象である。本明細書では、個体において心的外傷後ストレス障害を治療するための方法が提供され、光活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、個体の海馬の背側CA1野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部に投与することを含み、光活性化タンパク質は、個体の海馬の背側CA1野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現され、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制することができ、それによりそのタンパク質を光によって活性化することが、個体における事象の記憶想起または記憶形成に可逆的に影響を及ぼす。本明細書では、記憶想起または記憶形成に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングする方法が提供され、a非ヒト動物における事象の記憶想起または記憶形成の間に、海馬の背側CA1野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンを薬剤と接触させることであって、非ヒト動物は、該非ヒト動物の海馬の背側CA1野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの細胞膜上に発現された光活性化タンパク質を含み、タンパク質は光応答性であり、ニューロンが光で照射されると、ニューロンの脱分極を抑制できることと、b事象の記憶想起または記憶形成の間に、海馬の背側CA1野、前帯状皮質、または扁桃体基底外側部内で興奮性ニューロンの脱分極を抑制することと、cその薬剤が、光の存在下または非存在下で記憶想起または記憶形成に影響を及ぼすか否かを決定することと、を含む。本明細書において使用される個体は、ヒトを含む哺乳類である。哺乳類には、これらに限定されないが、農場動物、スポーツ動物、ペット、霊長類、マウス、およびラットが挙げられる。個体には、コンパニオン動物も挙げられ、これらに限定されないが、イヌおよびネコが挙げられる。一態様では、個体はヒトである。別の態様では、個体は非ヒト動物である。本明細書において使用される非ヒト動物には、非ヒト哺乳類が挙げられる。本開示の実施形態に従って記憶機能を制御または修正するための方法の一例は、図2に表される。時間トリガー事象202は、記憶機能に対して制御を実装するための基準点を提供する。本明細書で論じられるところの、制御の時間性質は特に有用であり得る。それに制限されないが、記憶トリガー事象202は、訓練事象に結合され得る。例えば、個体例えば、非ヒト動物、哺乳類、ヒトは、特定の刺激に応答するように個体を訓練するために設計された刺激を導入される。記憶トリガー事象202は、個体に対する特定刺激の導入であり得る。別の例では、記憶トリガー事象は、個体の反応または動作に応答し得る例えば、個体がPTSD事象を経験しているという表示。制御命令204は、刺激源206がどのように刺激208を細胞集団210に適用するかを決定する。これらの制御命令は、所望の標的の機能として決定および適用され得る。所望の標的は、例えば、時間属性、空間位置、および/または細胞型の1つ以上により定義され得る。刺激208は、記憶機能212の修正をもたらす。次いで刺激の効果は、モニター、観察、および/または評価され得る214。モニタリングを使用して、制御命令204を調整することができ216、それにより意図された結果に対する刺激を微調整することができる。本明細書で論じられる様々な実施形態は、記憶機能の基礎となる神経回路を制御および特性化するためのそのようなプロセスと関連してまたは加えて使用され得るさらなる例を提供する。CA1およびACCのニューロンを抑制することにより記憶想起に影響を及ぼす記憶想起を妨害するための方法の一変型例は、CA1領域の興奮性ニューロンを抑制することを含んでよい例えば、膜脱分極化を遮断または低減することにより、および/または膜過分極を促進することにより。光活性化イオンチャネル、例えば、eNpHR3.1またはNpHR3.0は、チャネルタンパク質をコードするポリヌクレオチドを領域に投与することにより個体のCA1領域内に位置するニューロン上に発現されてよい。eNpHR3.1またはNpHR3.0イオンチャネルは、黄色光の存在下で活性化される例えば、約591nmの波長を有する。個体には、上述される光送達デバイス100などの光送達デバイスが提供されてよい。光送達デバイスは、黄色光がCA1ニューロンに送達され得るように個体上に位置付けられてよい。記憶例えば、恐怖記憶またはストレス記憶などの任意の望ましくない記憶の想起後または想起中に、光送達デバイスは、黄色光をCA1ニューロンに送達するように活性化されてよく、それによりそれらの脱分極化を抑制し、記憶の呼び出しを妨害する。記憶の呼び出しが十分に妨害されると、光送達デバイスは非活性化され得る。光送達デバイスの非活性化時に、個体は、妨害なしに記憶を想起する能力を再取得し得る。この方法を使用して、近時記憶例えば、過去1日未満に起こった事象の記憶の呼び出しおよび遠隔記憶例えば、過去1日、過去1週間、過去2週間、過去4週間を超えて、過去8週間以前に起こった事象の記憶の呼び出しを妨害してよい。いくつかの変型例では、ACCの興奮性ニューロンは、同様の光活性化タンパク質を発現してよく、遠隔記憶の想起を妨害するように同様に抑制されてよい。CA1領域のニューロンを抑制することを含む記憶想起を妨害するための方法は、マウスなどの非ヒト動物において使用されてよい。例えば、CA1領域のニューロンにおいてeNpHR3.1またはNpHR3.0を発現するマウスは、カスタマイズされたFCチャンバ内で訓練され、それらのマウスは文脈Aに導入された後、音に続いて足衝撃を2回提示された。試験セッションにおいて、eNpHR3.1またはNpHR3.0CA1ニューロンに送達された緑色光は、硬直例えば、文脈的硬直の低減により測定されるように、マウスが記憶すなわち、恐怖記憶またはストレス記憶を呼び出す能力と干渉した。eNpHR3.1またはNpHR3.0CA1ニューロンが光に暴露されない別個の試験において、マウスは、正常な硬直率により測定されるように、訓練セッション中に形成された恐怖記憶を呼び出すことができる。いくつかの変型例では、試験セッションは、訓練セッション後1日以内に起こり得るが、他の変型例では、試験セッションは、訓練セッションから4週間以上後に起こり得る。緑色光をマウスのeNpHR3.1CA1ニューロンに適用することは、ニューロンの脱分極化を可逆的に抑制し、それにより近時および/または遠隔の文脈的恐怖記憶の呼び出しを妨害する。eNpHR3.1またはNpHR3.0CA1ニューロンから緑色光を除去することは、マウスが近時および/または遠隔の文脈的恐怖記憶を呼び出す能力を回復させる。遠隔記憶の呼び出しまたは想起を可逆的に妨害するための方法は、記憶が繰り返し呼び出されて強固になった後に使用されてもよい。例えば、eNpHR3.1またはNpHR3.0を発現するCA1ニューロンを有するマウスは、上述のように訓練され得る。訓練セッションから5週間後の試験セッションでは、マウスは、訓練中に形成された記憶を呼び出すことができたが、eNpHR3.1またはNpHR3.0CA1ニューロンが緑色光に暴露されると、それらはもはや記憶を呼び出すことができなかった。eNpHR3.1またはNpHR3.0CA1ニューロンの緑色光への後次暴露は、恐怖記憶の想起を妨害した。いくつかの方法では、記憶呼び出しの開始時および/または記憶呼び出しの間にeNpHR3.1またはNpHR3.0CA1ニューロンを光に暴露することにより妨害され得る。例えば、呼び出し開始と同時に例えば、試験セッションの開始時に緑色光をeNpHR3.1またはNpHR3.0CA1ニューロンに適用することは、記憶の呼び出しを妨害する。記憶呼び出しの間に緑色光がeNpHR3.1またはNpHR3.0CA1ニューロンに適用されるとき例えば、試験セッションが開始されてからいくらか経過した後で光を適用するとき、例えば、試験セッションの中間、マウスは最初に恐怖記憶を呼び出して応答したが硬直により、次いで光が適用された後、速やかに恐怖応答を呈しなくなった。これらの方法は、eNpHR3.1を発現するCA1ニューロンを有するPTSDのある個体において使用されてよく、恐怖記憶の呼び出しを可逆的に妨害および/または中断するために、恐怖記憶の想起と同時および/またはその間に、光送達デバイスは活性化されてよい。光送達デバイスの後次非活性化は、個体がこの記憶および他の記憶を呼び出す能力を回復し得る。ACC領域のニューロンを抑制することを含む記憶想起を妨害するための方法は、マウスなどの非ヒトにおいて使用されてよい。例えば、ACCのニューロンにおいてeNpHR3.1を発現するマウスは、上述のように訓練されてよい。訓練セッションから4週間後の試験セッションにおいて、eNpHR3.1ACCニューロンに送達される緑色光は、マウスが訓練中に形成された記憶を呼び出す能力を干渉した。緑色光をeNpHR3.1CA1ニューロンから除去することは、遠隔恐怖記憶に対するマウスの能力を回復させる。CA1海馬を抑制することにより記憶形成に影響を及ぼすCA1領域における興奮性ニューロンの脱分極化を抑制することおよび場合によってはこれらのニューロンを過分極化することは、記憶想起を抑制し得るが、そのような抑制は、記憶形成も妨害し得る。記憶形成を妨害するための方法の一変型例は、文脈的記憶などの記憶の形成中にCA1領域のニューロンを抑制することを含んでよい。光活性化イオンチャネル、例えば、eNpHR3.1は、前述される個体のCA1領域内に位置するニューロン上に発現されてよい。個体には、本明細書に記載される光送達デバイス100などの光送達デバイスが提供されてよい。記憶例えば、恐怖記憶またはストレス記憶の形成の間に、光送達デバイスは活性化されて、緑色光をCA1ニューロンに送達し、それによりそれらの脱分極化を抑制し、記憶の形成を妨害し得る。記憶形成が十分に妨害されると、光送達デバイスは、非活性化され得る。光送達デバイスの非活性化時に、個体は、妨害なしに記憶を形成する能力を再取得する場合がある。CA1領域のニューロンを抑制することを含む記憶形成を妨害するための方法は、マウスなどの非ヒト動物において使用されてよい。例えば、CA1領域のニューロン内でeNpHR3.1を発現するマウスは、緑色光をeNpHR3.1CA1ニューロンに送達しながら、カスタマイズされたFCチャンバ内で訓練された。訓練の間に、マウスは、第1の文脈に導入された後、音に続いて足衝撃に暴露された。光の適用のない後次試験セッションでは、マウスは、文脈的硬直の低減により測定されるように、訓練の記憶を呈しなかった。同一のマウスは、eNpHR3.1CA1ニューロンが光に暴露されない別個の訓練セッションを受けた。次いでマウスは、後次試験セッションにおいて記憶を呼び出すことができた。いくつかの変型例では、試験セッションは、訓練セッション後1日以内に起こり得るが、他の変型例では、試験セッションは、訓練セッションから4週間後に起こり得る。緑色光をマウスのeNpHR3.1CA1ニューロンに適用することは、ニューロンの脱分極化を可逆的に抑制し、それにより近時および/または遠隔記憶の形成を妨害した。緑色光をeNpHR3.1CA1ニューロンから除去することは、マウスが恐怖記憶を形成する能力を回復させた。扁桃体基底外側部を抑制することにより記憶形成に影響を及ぼす記憶形成を妨害するための方法のいくつかの変型例は、記憶形成の間にBLA内でeNpHR3.1を発現するニューロンに光を送達することを含んでよい。eNpHR3.1などの光活性化イオンチャネルは、個体のBLA内に位置するニューロン上に発現されてよい。個体には、上述される光送達デバイス100などの光送達デバイスが提供されてよい。光送達デバイスは、緑色光がBLAニューロンに送達され得るように、個体上に位置付けられてよい。記憶例えば、恐怖記憶またはストレス記憶の形成後またはその間に、光送達デバイスは活性化されて、緑色光をBLAニューロンに送達し、それによりそれらの脱分極化を抑制し、記憶の形成を妨害し得る。記憶形成が十分に妨害されると、光送達デバイスは非活性化され得る。光送達デバイスの非活性化時に、個体は、妨害なしに記憶を取得する能力を再取得する場合がある。BLA領域のニューロンを抑制することを含む、記憶取得を妨害するための方法は、マウスなどの非ヒト動物において使用されてよい。例えば、緑色光は、上述される恐怖条件付け訓練セッションの間に、BLAのニューロン内でeNpHR3.1を発現するマウスに送達され得る。次いでマウスは、訓練セッションの恐怖記憶を取得したか否かを決定するように試験され得る。訓練セッションの間にBLAに送達される緑色光は、マウスが恐怖またはストレス記憶を取得する能力を妨害し得る。記憶形成または想起を修復する薬物をスクリーニングする記憶機能の基礎となる神経回路を制御することは、記憶想起に対する薬剤の効果を評価するためのツールを提供し得る。例えば、CA1領域および/またはACCおよび/またはBLAのeNpHR3.1を発現するニューロンの抑制を使用して、記憶の呼び出しを回復させるための様々な薬剤の効果を評価してよい。A1領域および/またはACCおよび/またはBLA内で非ヒト動物興奮性ニューロンの脱分極化または励起を活性化する薬剤を識別するための方法の一例は、図3Aに表される。方法300は、光活性化タンパク質を脳302のCA1領域および/またはACCおよび/またはBLAに送達すること、ならびにCA1および/またはACC領域303の興奮性ニューロンの脱分極化を抑制することを含んでよい。上述されるように、脱分極化を抑制することは、活動電位の生成を防止するために、選択された波長例えば、黄色または緑色を有する光をCA1および/またはACC領域のニューロン上に発現されたeNpHR3.1イオンチャネルに適用することを含んでよい。他の型の光活性化チャネルは、NpHR、BR、ARの変異型などのこれらの興奮性細胞およびGtR3などのプロトンポンプの脱分極化を抑制するように発現されてもよい。eNpHR3.1イオンチャネルの活性化を抑制する効果は、遊離細胞または全細胞パッチクランプ法304を使用することにより電気的に測定され得る。いくつかの変異型では、CA1および/またはACC領域の興奮性細胞の電気活動は、単一電極および/または多電極配列を使用して測定されてよい。CA1および/またはACC領域の抑制されたニューロンは、次に試験薬剤306と接触されてよい。ニューロンの電気活動は、同様に測定されてよい308。試験薬剤と接触させる前および後のCA1領域および/またはACCおよび/またはBLAの興奮性ニューロンの電気測定値を比較して、試験薬剤が、ニューロンの脱分極化を活性化および/または回復したか否かを決定してよい310。この方法300は、必要に応じて繰り返し使用し、任意の数または様々な薬剤をスクリーニングしてよい。非ヒト動物における記憶の形成または想起を回復するために有効であり得る薬剤を識別するための方法の一例は、図3Bに表される。この方法320は、光活性化タンパク質を脳のCA1領域および/またはACCおよび/またはBLAに送達すること322および活動電位の生成を防止するために、選択された波長例えば、黄色または緑色を有する光をCA1および/またはACCおよび/またはBLA領域のニューロン上に発現されたeNpHR3.1イオンチャネルに適用すること323を含んでよい。他の型の光活性化チャネルは、NpHR、BR、ARの変異型などのこれらの興奮性細胞およびGtR3などのプロトンポンプの脱分極化を抑制するように発現されてもよい。記憶形成または想起の間に、光の存在下で、非ヒト動物の応答が測定されてよい324。いくつかの変型例では、記憶は、個体が文脈Aに導入され、足衝撃を伴う音に暴露される訓練セッションの間に形成される場合があり、記憶想起に対する応答は、文脈Aに導入されるとき、および/または音が再生されるときに硬直し得る。CA1および/またはACC領域の抑制されたニューロンは、次に試験薬剤と接触されてよい326。非ヒト動物の応答は、同様に測定されてよい328。試験薬剤と接触する前および後の非ヒト動物の応答を評価して、試験薬剤が光の存在下で記憶形成または記憶想起に影響を及ぼすか否かを決定し得る330。いくつかの変型例では、方法320を記憶形成例えば、訓練セッションの間に使用して、記憶形成に対する薬剤の効果を評価してよい。また方法320を記憶想起例えば、訓練セッションからいくらか経過した後の試験セッションの間に使用して、記憶想起に対する薬剤の効果を評価してもよい。方法320は、必要に応じて繰り返し使用し、任意の数または様々な薬剤をスクリーニングしてよい。すべての上記方法に適用し得る時間精度の変動上述される方法のいくつかの変型例では、光活性化タンパク質例えば、eNpHR3.1またはeNpHR3.0を発現するニューロンの抑制は、正確な時点で適用され得る。例えば、CA1領域内でeNpHR3.1を発現するニューロンは、試験セッションの間だけ光を照射されてよい。eNpHR3.1を発現するニューロンの時間精度抑制は、記憶の呼び出しを妨害し得る。試験セッションの間にマウスのCA1領域内でeNpHR3.1を発現するニューロンに光を正確に適用することは、動物において遠隔および/または近時恐怖記憶想起を抑制し得る。上述される方法の他の変型例では、eNpHR3.1を発現するニューロンの抑制は、長期間にわたって適用されてよい。例えば、CA1領域内でeNpHR3.1を発現するニューロンは、試験セッション前例えば、試験セッションの30分以上前に光が照射されてよい。海馬のCA1領域内でeNpHR3.1を発現するニューロンの長期抑制は、CA1ニューロンの正確な抑制とは異なって記憶の想起に影響し得る。例えば、CA1ニューロンに対する長期の光適用すなわち、長期抑制は、近時の文脈的恐怖呼び出しに影響し得るが、遠隔の文脈的記憶の呼び出しには影響しなかった。PTSDを治療する方法上述される方法の1つ以上を使用してPTSDのある個体を治療してよい。本開示の態様を使用して、PTSD患者を治療することができ、再強化前後の実時間、または記憶が既に想起された後の実時間に、遠隔恐怖記憶を可逆的にシャットダウンすることにより、再発する妨害記憶が現れると、それが停止され得る。いくつかの変型例では、PTSDを治療するための方法は、光活性化タンパク質をコードするウイルスベクターを個体に投与することを含んでよい。光活性化タンパク質は、特定波長を有する光の存在下で、ニューロンの脱分極を抑制するように構成され得る。そのような光活性化タンパク質の例には、NpHR、BR、AR、およびGrR3が挙げられ得る。前述のように、ウイルスベクターは、任意のニューロン集団または型に送達され得る例えば、CA1、ACC、およびBLA脳領域の興奮性ニューロン。望ましくない記憶例えば、恐怖またはストレス記憶を呼び出す間に、光活性化タンパク質を発現するニューロン複数可は、脱分極化から抑制され、それにより望ましくない記憶の想起を妨害し得る。いくつかの変型例では、ニューロン複数可の脱分極化を抑制することは、特定波長の光を光活性化タンパク質を発現するニューロンに適用することを含んでよい。続いて例えば、望ましくない記憶の呼び出しが妨害された後、光は除去されてよい。これは、記憶が妨害なしに呼び出され得るように、記憶機能を回復させ得る。これらのステップは、PTSD治療の経過において所望され得るだけ反復されてよい。本開示の別の実施形態に従って、薬物の乱用に関連する記憶を抑制して、薬物探索行動を低減することができる。他の実施形態は、記憶プロセスにおける特定のニューロン集団の役割を研究するために、異なる脳領域の変調により認知に直ちに影響を及ぼす能力を対象とする。ある光活性化タンパク質によるニューロンの抑制および他の光活性化タンパク質による活性化は、様々な脳機能および行動の基礎となる神経回路の精密な時間的、遺伝的、および空間的解析を可能にし得る。本明細書において、記憶の呼び出しを妨害する方法が提供され、この方法は、遠隔記憶想起の効果を妨害するのに十分な抑制の時間精度を用いて、背側CA1海馬回路の機能を抑制することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、記憶トリガー事象に応答性である。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側CA1海馬回路の細胞内で発現された光応答性オプシンを活性化することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側CA1海馬回路付近に位置付けられた1つ以上の電極を通して電気パルスを印加することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側CA1海馬回路に近位の位置で薬物を放出することを含む。いくつかの実施形態では、遠隔記憶想起の効果は、遠隔記憶に対する感情的な応答を含む。また本明細書では、記憶の形成を妨害する方法を提供する。この方法は、遠隔記憶の形成を妨害するのに十分な抑制の時間精度を用いて、背側CA1海馬回路の機能を抑制することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、記憶トリガー事象に応答性である。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側CA1海馬回路の細胞内で発現される光応答性オプシンを活性化することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側CA1海馬回路付近に位置付けられた1つ以上の電極を通して電気パルスを印加することを含む。いくつかの実施形態では、抑制の工程は、背側CA1海馬回路に近位の位置で薬物を放出することを含む。いくつかの実施形態では、遠隔記憶想起の効果は、遠隔記憶に対する感情的応答を含む。また本明細書では、記憶機能を促進する方法も提供され、この方法は、背側CA1海馬回路の機能を励起して、遠隔記憶の形成または遠隔記憶の呼び出しを促進することを含む。また本明細書では、遠隔記憶の呼び出しと関連付けられる神経疾患の治療の方法が提供され、この方法は、遠隔記憶の想起に応答して、遠隔記憶の想起の効果を妨害するのに十分な抑制の時間精度を用いて、背側CA1海馬回路の機能を抑制することを含む。本明細書の開示による様々な実験および実施例が以下に提供される。光遺伝的方法を使用して、遠隔記憶に対する定義された細胞型の寄与を探求する際に以前の方法よりもオンセットおよびオフセットが桁違いに速い、文脈的条件付けから何週間も経過した後であっても遠隔段階に及ぶ、文脈的恐怖記憶の呼び出しが、海馬のCA1領域内の興奮性ニューロンの光遺伝的抑制により排除されることがわかったが、以前の研究では、海馬の検出可能な影響は認められなかった。この干渉の効果は、運動、不安、またはキューによる記憶形成に関して認められず、顕著に遠隔文脈的記憶は、自由に移動する行動セッションの途中であっても、CA1抑制により直ちに抑制され得る。しかしながら、以下に記載される実験は、以前の観察が、典型的な薬理学的時間スケールに一致するように海馬の光遺伝的抑制を延長するにつれて、遠隔海馬依存性から遠隔海馬非依存性に変換したことを確認し、光遺伝的方法もまた、前帯状皮質ACCの遠隔時間スケールの重要性を確認し、海馬が遠隔呼び出しのためのACCの採用に関与することを示した。これらの見解は、薬物および病変データの解釈に対して広範な意味を有し、臨床海馬文献の不可解な側面に焦点を当て、記憶想起における顕著なダイナミズムを明らかにし、基礎となる神経回路は、通常、遠隔時点であっても海馬に応じて記憶に関与するデフォルト構造を適応的に移行させるが、数分の時間スケールで代替機序に柔軟に移動させる。様々な型の光活性化タンパク質は、記憶機能の基礎となる神経回路を制御および特性化するように使用されてよい。例えば、NpHRの変異型は、ニューロンの脱分極化および/または過分極化を抑制してよい。第3世代のeNpHRは、遺伝子と蛍光色素分子との間に輸送シグナルを有し、改善した膜標的および増加した光誘起された過分極化を示した。この第3世代eNpHRを使用して、近時および遠隔記憶取得および呼び出しの両方におけるそれらの役割を決定するように、海馬のCA1領域におけるニューロンを動揺させた。強化された黄色蛍光タンパク質eNpHR3.1-EYFPにインフレーム融合されたeNpHR3.1をコードするレンチウイルスベクターは、海馬内の興奮性グルタミン酸作動性ニューロンに選択的なカルシウム/カルモデュリン依存性タンパク質キナーゼIIαCaMKIIαプロモータの制御下で使用した。eNpHR3.1は、ニューロンに誘導された光電流および過分極化の両方において、eNpHR3.0に類似する内因性N末端シグナルペプチドの欠失を伴うeNpHR3.0の切断バージョンである。実験手順対象。6~8週齢のC57BL6マウスは、CharlesRiverから入手した。マウスは、逆12時間明/暗サイクルで維持され、食餌および水が自由に与えられるコロニー内にケージ当たり4~5匹収容した。実験プロトコルは、スタンフォード大学IACUCにより承認され、国立衛生研究所実験動物の管理と使用に関する指針のガイドラインに適合する。ウイルス製造。インビボ注入のためのCaMKIIα-eNpHR3.1-EYFPレンチウイルスは、前述のように製造したGradinaruetal.,2010、Zhangetal.,2007。アデノ関連ウイルスAAVCaMKIIα-eNpHR3.0-EYFPプラスミドは、BamHIおよびEcoRI制限部位を使用して、CaMKIIαプロモータを運ぶAAV骨格にeNpHR3.0-EYFPをクローン化することにより構成した。組み換えAAVベクターは、AAV5コートタンパク質で血清型化され、ノースカロライナ大学のVectorCoreによりパッケージ化され、滴定は2×1012粒子/mLであった。AAVCaMKIIα::eNpHR3.0およびレンチCaMKIIα::eNpHR3.1のマップは、www.optogenetics.orgでオンライン入手できる。定位ウイルス注入、カニューレ/パッチコード移植、および光送達。マウスをイソフルランで麻酔をかけ、頭部を定位装置内に配置したKopfInstruments,Tujunga,CA、Leica実体顕微鏡。眼の乾燥を防止するために眼軟膏を適用した。正中線頭皮切開を行った後、小開頭術を行い、10μLシリンジおよび薄い34ゲージ金属針を使用してウイルスを送達したWorldPrecisionInstruments,Sarasota,FL。注入容積および流速0.1μL/分で1μLを注入ポンプWPIにより制御した。注入後、針をさらに5分間留置し、次いでゆっくり引き抜いた。CA1光遺伝的抑制の場合、2μLのCaMKIIα::eNpHR3.1-EYFPを担持する濃縮レンチウイルスを、左および右成人海馬の両方のCA1内の2つの部位1μL/部位に顕微注入した。部位1:前後APブレグマから-1.5mm、中外側ML±1mm、背腹DV-1.5、部位2:AP-2.5mm、ML±2mm、DV-1.5mm。次に両側ガイドカニューレ中心から中心まで2.5mm、PlasticsOne,Roanoke,VAをCA1の0.5mm上に置きAP-1.94mm、ML±1.25mm、DV-1mm、および歯科セメントを使用して頭蓋骨に固定したCBメタボンド、Parkell,Edgwood,NY。皮膚は、Vetbond組織接着剤を用いて糊付けした。動物は、麻酔から回復するまで加熱パッド上に維持した。外科処置の開始時に、ブプレノルフィン0.03mg/kgを皮下的に付与して、不快感を最小化した。ニューロン活性を抑制するために、緑色光561nm、記述レーザなどは、0.5mm突出部を有するガイドカニューレを通して挿入された2つの300μm厚光ファイバーThorlabs,Newton,NJを通して両側に送達した。対照マウスは、eNpHR3.1に非感染であるが、CA1に光を送達するカニューレがさらに埋め込まれるか、またはeNpHR3.1に感染し、埋め込まれるが、脳の表面で光送達を終結させたダミーファイバーに接続された。したがって対照マウスは、レーザー光送達と関連付けられる実験マウスと同一の視覚キューおよび文脈的情報を経験した。扁桃体基底外側部BLA光遺伝的抑制の場合、1.5μLのAAV5CaMKIIα::eNpHR3.0-EYFPを左および右BLAの両方に顕微注入したAP-1.5mm、ML±3.47mm、DV-5mm。次にパッチコード金属フェルール、直径2.5mm、厚さ200μm、長さ5mm、切断された裸の光ファイバー、DoriclensesInc.,Quebec,Canadaを各BLAAP-1.5mm、ML±3.47mm、DV-4.8mm内に配置し、歯科セメントを使用して頭蓋骨に固定した。緑色光は、接続するプラスチックスリーブを使用してパッチコードに取り付けられた2つの200μm厚の光ファイバーDoriclensesを通して両側送達した。前帯状皮質ACC光遺伝的抑制の場合、1.0μLのAAV5CaMKIIα::eNpHR3.0-EYFPを左および右ACCの両方に顕微注入したAP1mm、ML±0.35mm、DV-2.2mm。次にパッチコードDoriclensesInc.を1つのACC上に正中線にできる限り近く片側配置しAP1mm、ML±0.2mm、DV-1.25mm、歯科セメントを使用して頭蓋骨に固定した。緑色光は、パッチコードに取り付けられた200μm厚の光ファイバーDoriclensesを通して送達された。嗅球OB光遺伝的抑制の場合、1.0μLのAAV5CaMKIIα::eNpHR3.0-EYFPを、左および右OBの両方に顕微注入したAP4.5mm、ML±0.75mm、DV-3.25および-2mm。次にパッチコードDoriclensesInc.を1つのOB上に正中線にできる限り近く片側配置しAP4.5mm、ML±0.15mm、DV-1.4mm、歯科セメントを使用して頭蓋骨に固定した。緑色光は、パッチコードに取り付けられた200μm厚の光ファイバーDoriclensesを通して送達された。免疫組織化学。CaMKIIα陽性ニューロン内のeNpHR-EYFP発現の拡散を測定し、特異性を決定するために、マウスをケタミン/キシラジンで麻酔にかけ、冷たいPBSに続いて、リン酸緩衝生理食塩水PBS、pH7.4に溶解された4パラホルムアルデヒドPFAを用いて経心臓的に還流させた。脳を除去し、PBS中4PFAにおいて4°Cで3時間後置した後、PBS中30スクロースにおいて平衡させた。40μm厚の冠状断面は、凍結ミクロトームLeica上で切断され、免疫組織化学のために処理されるまで抗凍結剤中25グリセロール、30エチレングリコール、PBS中4°Cで保管した。浮遊する断片をPBS中で洗浄した後、30分間0.2TritonX-100Tx100および2正常ロバ血清NDS中で培養した。切片は、2NDS中で一次抗体とともに一晩培養したマウス抗CaMKIIα1:500、Abcam,Cambridge,MA、ウサギ抗GABA1:500、Millipore,Billerica,MA、ウサギ抗c-Fos1:500、EMDDarmstadt,Germany。次に切片をPBSで洗浄し、室温で2時間、二次抗体を用いて培養したCy3に共役されたロバ抗マウス、Cy3またはCy5のいずれかに共役されたロバ抗ウサギ、すべて1:1000、JacksonLaboratories,Westgrove,PA。次に切片を洗浄し、DAPI1:50,000で20分間培養して、再洗浄し、PVA-DabcoSigmaとともにスライド上に載置した。共焦点蛍光画像は、5Xもしくは10X空気対物レンズ、または40X油浸対物レンズを使用して走査レーザー顕微鏡上で取得した。ウイルス変換率を決定するため、eNpHR-EYFP陽性でもある40倍野当たりのCaMKIIα免疫活性ニューロンの割合を計算した。インビボオプトロード記録。CA1における同時光学刺激および電気記録は、光ファイバー核直径200μm、0.2N.A.できつく結束され、ファイバー端を超えて約0.4mmわずかに突出する電極の先端を有する細胞外タングステン電極1MΩ、約125μmからなるオプトロードを使用して、前述のとおり実行しGradinaruら、2007、記録されたニューロンの照明を保証する。記録は、CA1AP-1.94mm、ML1.4mm、DV-1.1の境界に最初に配置され、徐々に0.1mm増分で低下するオプトロードを用いて行った。光ファイバーは、200μmファイバーからの約20mW出力とともに473nm固体レーザーダイオードに結合した。単一ユニット記録は、PBS中に希釈したケタミン/キシラジン混合物で麻酔をかけたマウスにおいて行ったケタミン80mg/kg、キシラジン15~20mg/kg。シグナルを記録し、1800微小電極AC増幅器を使用して、300Hz低/5kHz高で帯域通過ろ過した。恐怖条件付けパラダイムにおける学習および記憶の測定。恐怖条件付け装置は、平方条件付けケージ18x18x30cmで構成され、衝撃生成器および周波数帯変換器にワイヤ接続されたグリッドフロアを有し、聴覚チャンバに取り囲まれたCoulbourninstruments,PA,USA。装置は、訓練および/または試験の間に光の送達を可能にするように修正した。恐怖条件付けを導入するために、マウスを120秒間ケージに入れ、純音2.9kHzを20秒間鳴らした後、2秒間の足衝撃を与えた短期記憶の場合は0.5mA、長期記憶の場合は1mA。次にこの手順を繰り返し、2回目の衝撃の送達から30秒後、マウスをホームケージに戻した。恐怖条件付けは、硬直完全な不動性の連続測定、優勢行動恐怖応答により評価したFanselow,2000。硬直は、治療群に左右されない経験を積んだ実験者により試験を通して連続的に測定した。文脈的恐怖条件付けを試験するために、マウスを基の条件付けケージに入れ、硬直を5分間測定した。聴覚キューによる恐怖条件付けを試験するために、マウスを異なる文脈-平坦な床の錐体形状のケージに入れた。新規環境の影響の対照として、この新しいケージ内で硬直を2.5分間測定した後、2.9kHzの音を2.5分間鳴らし、その間に条件付けされた硬直を測定した。この基本パラダイムを異なる実験の可変条件下で適用した。第1の実験では図5、マウスを以下のように訓練および試験した。1日目-連続561nm光投与により訓練する光オン。2日目-光投与なしに文脈的試験およびキュー試験を行う2時間間隔光オフ。3日目-訓練、光オフ。4日目-試験、光オフ。5日目-文脈的試験およびキュー試験、光オン。第1の遠隔記憶実験では図6A:1日目-訓練、光オフ。29日目-文脈的およびキュー試験、光オン。30日目-試験、光オフ。第2の遠隔記憶実験では図6C:1日目-訓練、光オフ。64日目-文脈的試験、光オン。第3の実験では図8:1日目-訓練、光オフ。36日目-試験、光オフ。37日目-試験、光オン。38日目-試験、3分間光オフ、続いて3分間光オン。BLA実験では図5H~I、マウスを1日目に光オンで訓練し、2日目に光オフで文脈的恐怖およびキューによる恐怖について試験した。ACC図10A-BおよびOB実験では、マウスを1日目に光オフで訓練し、2日目に光オンで試験した後、29日目に光オンで試験した。長期の光暴露の場合図7A、B、10C、光ファイバーを、条件付けケージを通して寝床を有する通常のハウジングケージの中に通し、光をこのケージ内に30分間送達した。次に光の送達を妨害なしに継続しながら、マウスを5分間の試験の間条件付けケージに入れた。文脈的およびキューによる条件付け試験の結果は、Studentのt検定または2方向ANOVAにより解析し、続いて必要に応じて事後試験を行った。薬物送達。薬理学実験図6D-Eの場合、マウスのCA1上に二重カニューレを埋め込んだ。カニューレ、外科処置および位置は、光送達実験と同一であった。Kitamuraらにより説明されるようにKitamuraetal.,2009、TTXSigma,20μMおよびCNQXTocrisBioscience,Ellisville,MO。3mMまたは生理食塩水は、ガイドカニューレよりも0.5mm長い28ゲージステンレス鋼内部カニューレPlasticsOneを通して1μLの容積で注入した。内部カニューレは、PE20管によりマイクロシリンジポンプHarvardApparatus,Holliston,MAに接続した。溶液は、200nL/分の定速で投与し、ガイドカニューレからの漏出を避けるために、注入の終了から2分後に注入カニューレを除去した。オープンフィールド試験。オープンフィールド試験は、オープンプラスチックアリーナ内で行った長さ50cm×幅50cm×深さ40cm。チャンバの中央にマウスを個別に配置し、3分間自由に探索させた。野の中央および周縁の両方における活動は、自動ビデオ追跡システムBiobserve,Bonn,Germanyを使用して測定した。中央の時間の割合は、オープンフィールドの中央35×35cmの領域で費やした合計時間の割合として定義される。eNpHR3.1により誘発されたスパイクの連続抑制の電気生理学的測定。長期光暴露実験からの4匹のマウスに上述のとおり注射し、行動試験を行った後、絶命させて生理学実験のために切片化した。26NaHCO3、2.5KCl、1.25NaH2PO4、10MgSO4H14O7、.5CaCl2H4O2、11グルコースおよび234スクロースをmMで含有する氷冷スクロース溶液を経心臓的に還流させ、続いて同一の氷冷スクロース溶液中で300ミクロン切片を切断することにより、背側CA1を含有する冠状切片を調製した。電気生理学的記録は、126NaCl、26NaHCO3、2.5KCl、1.25NaH2PO4、1MgCl2、2CaCl、および10グルコースをmMで含有するaCSFの一定還流下で行った。すべての記録は、32°Cで行った。パッチ電極先端抵抗=2~6MΩは、mMで130K-グルコン酸塩、10KCl、10Hepes、10EGTA、および2MgClpHはKOHで7.3に調整で充填した。直列抵抗は、通常10~20MΩであり、実験は、30MΩを超えると中断した。膜電位は、7mVの測定液間電位に対して訂正した。活動電位の導入は、10hzで200pAからの範囲の電流を注入することにより行った。eNpHR3.1の活性化のための光は、531±20nmフィルターを通るX-Cite120Wハロゲン光源および40x/0.8NA水対物レンズを7mW/mm2で使用して送達した。培養ニューロンにおけるeNpHR3.1とeNpHR3.0との間の電気生理学的比較。海馬培養:一次培養海馬ニューロンは、P0Sprague-Dawley子ラットから調製した。CA1およびCA3領域を単離し、0.4mg/mLパパインで消化しWorthington,Lakewood,NJ、1:30マトリゲルBecktonDickinsonLabware,Bedford,MAでプレコーティングしたガラスカバースリップの上に65,000/cm2の密度で配置した。培養物は、1.25FBSHyclone,Logan,UT、4B-27補助剤GIBCO,GrandIsland,NY、2mMGlutamaxGIBCO、およびFUDR2mg/ml,Sigmaを含有するNeurobasal-A培地InvitrogenCarlsbad,CAとともに、5CO2加湿培養器内で維持した。リン酸カルシウムトランスフェクション。6~10区分の海馬ニューロンを、24ウェルプレートにおいて65,000細胞/ウェルで増殖させた。各ウェルのDNA/CaCl2混合物は、15μLの総H20中1.5~3μgDNAQIAGENエンドトキシンを含まない調製物1.875μL2MCaCl2最終Ca2濃度250mM。DNA/CaCl2に15μLの2XHEPES緩衝生理食塩水pH7.05を添加し、最終容積をピペットにより十分に混合した。室温で20分後、30μLのDNA/CaCl2/HBS混合液を各ウェルに滴下しそこから成長培地が一時的に除去され、400μLの温かいMEMと置き換えられた、37°Cで45~60分間トランスフェクションを進行させた。次に各ウェルを3X1mLの温かいMEMで洗浄し、成長培地を置き換えた。オプシン発現は、一般に20~24時間以内に観察された。電気生理学。全細胞パッチクランプ記録は、前述のとおり行った細胞内溶液:129mMK-グルコン酸塩、10mMHEPES、10mMKCl、4mMMgATP、0.3mMNa3GTP、pH7.2に滴定;細胞外タイロード:125mMNaCl、2mMKCl、3mMCaCl2、1mMMgCl2、30mMグルコース、および25mMHEPES、pH7.3に滴定。電圧固定記録の場合、細胞は-70mVで保持した。光は、300WDG-4ランプSutterInstruments,Novato,CAから593/40nmフィルターSemrock,Rochester,NYおよびLeica40X/0.8NA水対物レンズを通して送達し、試料における光パワーは、3mW/mm2であった。全細胞パッチクランプデータは、レンチウイルスeNpHR3.0およびeNpHR3.1にトランスフェクションした、または形質導入されたかのいずれかであり、1週間発現させた培養海馬ニューロンから得た。発現は、ヒトCaMKIIαプロモータにより駆動され、EYFPに対する融合により可視化した。cFos染色によるニューロン活性化撮像。YFP対照およびeNpHR3.1マウスは、条件付けの間に光投与で訓練され音の提示なし、文脈の恐怖のみが導入されるようにする、90分後に絶命させた、c-Fosレベルを試験した上記免疫組織化学のセクションにおいて詳述される。訓練されていない対照およびeNpHR3.1マウスの2つの他の群を、それらのホームケージから絶命させた。遠隔記憶の場合、YFP対照およびeNpHR3.1マウスは、光なしで恐怖条件付けされ、28日後に光を用いる条件付け文脈に暴露され、90分後に絶命させてcFosレベルを試験した。この時点で対照群は、対照およびeNpHR3.1マウスであり、訓練された後、条件付け文脈に再度暴露されることなく、28日後にホームケージから絶命させた。結果背側CA1における興奮性ニューロンの特異的光遺伝的抑制はニューロン活性を低減する。CaMKIIα::eNpHR3.1ベクターの定位送達は、CA1特異的発現をもたらすことがわかった図4A。eNpHR3.1は、膜電位に対して同等の効果を有する内因性N末端シグナルペプチドの欠失を伴うeNpHR3.0の切断バージョンである。eNpHR3.1は、ニューロン膜を標的とし、体細胞の周囲、ならびにCA1ニューロンの先端および基底樹状突起内で発現される図4B。トランスフェクションした領域内で、CaMKIIα細胞の94458/486細胞、3匹のマウスからがeNpHR3.1を発現し、プロモータは完全な特異性を提供した。すべてのeNpHR3.1-EYFP細胞は、CaMKIIα陽性でもあった図4C。eNpHR3.1タンパク質は、CA1内で発現されたが、これらの発現条件下で、単海馬部分体内、注入部位の上の頭頂葉皮質内、視床内、または手綱内では発現しなかった。カニューレ追跡はブレグマ-1.94、発現部位の上で見ることができた。感染の容積は、背側CA1のかなりの割合を占めた0.875±0.05mm3、N=12マウス。CA1ニューロン活性に対するeNpHR3.1の生理学的効果を検証するために、麻酔を受けたマウスにおいて、CA1ニューロンのオプトロード記録光ファイバーケーブルに結合された細胞外電極を使用する同時光学刺激および電気記録を行い図4D左、実験は、興奮性CA1ニューロンの連続した561nmの照明が、スパイク振幅に影響することなく、時間的に正確かつ可逆的な方法で、インビボでスパイクを強力に抑制したことを確認した図4D。これらのマウスにおけるCA1ニューロンの561nm照明は、平均スパイク振幅に影響することなく33.55±4.94μV、29.20±4.4μV、および33.32±5.45μV、光投与前、間、および後スパイク頻度の可逆的かつ顕著な低減をもたらした4.93±1.6Hz、1.31±0.15Hz、および6.45±2.4Hz、それぞれ光投与前、間、および後、2匹のマウスから15トレース、P<0.02。代表的なオプトロード記録トレース、ならびに平均頻度および振幅が示される平均±SEM。CA1光遺伝的抑制は文脈的恐怖の取得および想起を遮断する。文脈的恐怖条件付けにおける海馬の関与は、この構造に対する身体的、薬理学的、および遺伝的病変に基づき、病変と試験との間の間隔は、数十分から数週間に及ぶAnagnostarasetal.,1999、KimandFanselow,1992、Kitamuraetal.,2009、Shimizuetal.,2000、Wiltgenetal.,2010、関連神経回路内の適合および補償を可能にし得る。第1の試験に対して、CA1の実時間光遺伝的抑制が記憶形成を変調し得る場合、二重カニューレシステムを通して挿入された2つの光ファイバーを介して両側連続緑色561nm光は、カスタマイズされたFCチャンバ内で自由に移動するマウスにおいて、標的とする背側CA1図5Aに送達された。光は、すべてのマウスに送達され、eNpHR3.1においてCA1抑制を伴ったが、対照マウス感染しなかったがカニューレとともに埋め込まれ、CA1の中に光を受信したマウス、または感染し、脳の中に伸長しなかったが、ダミーファイバーに接続されて埋め込まれたマウスのいずれかでは伴わなかった。恐怖条件付け訓練の間、マウスは、両側連続561nm光送達下で、文脈Aに導入された後、音に続いて足衝撃を2回提示され、光なしで24時間後の記憶についてマウスを試験した。次に光学抑制の非存在下で、翌日に恐怖記憶を評価した。訓練の間の背側CA1光遺伝的抑制は、対照n=4と比較して、eNpHR3.1マウスn=5において文脈的恐怖取得を完全に防止した39±5.4対7.6±4.3硬直、平均±SEM、P<0.005図5B、左。光遺伝的抑制の効果が可逆的か否かを試験するために、次にすべてのマウスを光投与なしに同一文脈において再訓練し、翌日に再試験した。実際にeNpHR3.1マウスは、訓練中に光が投与されなかったとき、正常な文脈的記憶を呈した64.6±6.6対49.7±11.7硬直、P>0.5図5B、中間。翌日に、背側CA1光遺伝的抑制が記憶の呼び出しも干渉し得たか否かを試験した。そのため、同一のマウスを試験し、今回は呼び出しの間に光送達を用いたところ、前日に提示された記憶は、照明下での呼び出しが不可能になったことがわかった図5B、右、42.6±10.1対5.94±4.1硬直、P<0.01。これらの実験は、これらのプロセスにおいてCA1興奮性細胞の実時間重要性を直接示すことにより、近時文脈的恐怖記憶の取得および呼び出しに海馬が必要とされるという以前の理解を支持する。これらの効果が一般に文脈的恐怖記憶に特異的であり、恐怖取得および恐怖発現機序に特異的でないことを検証するために、同一のマウスをそれらの音の記憶について異なる文脈で試験した。eNpHR3.1マウスn=5は、対照n=4と比較して、訓練中のCA1光抑制に続く正常な聴覚キューによる恐怖記憶の取得図5C、左、ならびに試験中の照明を用いた正常なキューによる恐怖の呼び出しを示した図5C、右。これらの見解は、海馬依存性タスクのみに影響を及ぼすことにおいて、光遺伝的操作の機能特異性を示す。光遺伝的システムをさらに有効化するために、多数の付加的制御実験を行った。空間探索は文脈的恐怖取得に重要であるためMcHughandTonegawa,2007、光刺激下で訓練中に、条件付けチャンバ内の探索時間を測定したところ、eNpHR3.1発現動物n=5と対照動物n=5、図5Dとの間に差異は認められなかった。CA1光遺伝的抑制は、新規環境の探索にも影響がなかった。CA1光遺伝的抑制が抗不安作用を有しなかったことを検証するために、光投与の間のオープンフィールド探索についてマウスを試験したところ、eNpHR3.1発現n=6と対照マウスn=4、図5G、23.8±2.76対20.46±5.97、P>0.5との間に、路長図5E、564±9および618±114cm、それぞれeNpHR3.1および対照、速度図5F、3.3±0.1対3.43±0.6cm/秒、それぞれeNpHR3.1および対照、または野の中央で費やした時間の割合不安関連行動のサインとしての役割を果たすに差異は認められなかった。最後に、マウスの海馬の代わりに、扁桃体基底外側部BLA、図5Hに両側注入し、恐怖自体の取得および近時および遠隔恐怖の発現が扁桃体に依存するという以前の見解から予測されるように、対照n=9と比較して、eNpHR3.0n=4マウスにおいて文脈的図5I、65.5±7.2対9.6±5.5硬直、P<0.001および聴覚キューによるFC取得図5I、69.5±9.6対24.5±13硬直、P<0.05の両方を光遺伝的に抑制することが可能であることがわかったHanetal.,2009、Johansenetal.,2010、Killcrossetal.,1997、LeDoux,2000、Leeetal.,2006、MarenandQuirk,2004。この様々な見解はともに、実時間、高速、細胞型特異的、可逆的光遺伝的システムの有効性を確認し、取得および呼び出しにおける海馬の実時間の役割を直接示すことにより、記憶文献における以前の一連の主な見解を支持する。CA1光遺伝的抑制は遠隔恐怖記憶の呼び出しを可逆的に干渉する。遠隔記憶の呼び出しにおける海馬の役割を探索した。前述のように文脈的FCを有するマウス群を訓練し、被検体を、海馬の関与が予測されない遠隔段階に及ぶ4週間後に試験した図6A。意外にも、呼び出しの間のCA1抑制は、遠隔恐怖記憶を完全に遮断したことがわかったP<0.0001、対照n=14、69.8±5.3硬直eNpHR3.1n=6、14±6.4硬直。この呼び出しの干渉は可逆的であり、同一のマウスを照明なしに翌日再試験したところ、恐怖記憶は対照と同様に完全に発現された図6A、52.45±6.0対45.18±11.5硬直、P>0.5。さらに、eNpHR3.1マウスは、キューによる試験の間に、照明を用いた場合、正常な遠隔聴覚キューによる恐怖記憶の呼び出しを示し図6B、新しい文脈において、対照n=14、22.3±6.8、eNpHR3.1n=6、11.8±3.5硬直;および音に対して72.4±8.4対58.77±7.9硬直;P>0.5、恐怖発現機序は正常のままであったことをさらに示す。はるかに長い時間間隔においても文脈的恐怖の呼び出しに海馬が依然として関与するか否かを試験するために、別のマウス集団を訓練し、この集団を文脈的FCから9週間後に試験した。呼び出しの間のCA1抑制は、この非常に長い間隔後も遠隔恐怖記憶を遮断し、事前に引き起こされることはなかったことがわかった図6C、P<0.005、対照n=9、31.8±3.8硬直、eNpHR3.1n=6、11.3±3.6硬直。これらの結果は、遠隔文脈的恐怖記憶における海馬の継続的な関与を指摘し、正常な海馬は依然として記憶トレースのデフォルト活性化因子であることを示唆する。それらは、海馬に対する洗練された先駆的な身体的、薬理学的、または遺伝的病変に基づく一般的な理論に対照的であり、病変と呼び出し試験との間の間隔は、数十分から数週間に及ぶAnagnostarasetal.,1999、KimandFanselow,1992、Kitamuraetal.,2009、Shimizuetal.,2000、Wiltgenetal.,2010。実際に、実験は、以前に報告されたようにKitamuraetal.,2009、TTXおよびCNQXを使用して、海馬の薬理的抑制が、FCプロトコルを使用するとき、近時図6D、生理食塩水n=5、56.86±1.9硬直、TTXCNQXn=4、26.05±10.23硬直、P<0.05恐怖呼び出しだけを妨害し、遠隔図6E、生理食塩水n=8、93.93±2.54硬直、TTXCNQXn=9、83.8±4.4硬直、P>0.05恐怖呼び出しを妨害しなかったことを示し、以前の結果を確認した。したがって、代わりに光遺伝の速度および特異性は、行動する動物において用いられると、補償機序の発現を可能にしないことにより、細胞および回路の因果的役割の試験を可能にし得る。この仮説は次に明示的に試験した。精密であるが長期でないCA1光遺伝的抑制は遠隔文脈的恐怖呼び出しを遮断する。時間精度が光遺伝的見解と薬理学的見解との間の相違を説明する重要な要因であるという仮説を検証するために、遠隔光遺伝的実験は、前述のように試験の期間に限定された照明図7A正確または低速介入を模倣し、推定補償機序が関与する時間を許すように、試験前30分間および試験中の長期照明図7A長期のいずれかを用いて反復した。正確な光遺伝的抑制は、遠隔記憶を著しく抑制したが、長期抑制は、遠隔記憶想起に対して検出可能な効果を有しなかった図7A。さらに、長期群からのマウスを、正確な光投与試験のみの間を用いて翌日に再試験したとき、同一のマウスは、抑制された恐怖の呼び出しを示した図7A右。つまり、CA1光遺伝的抑制は、光が試験の間正確に投与されたときにのみ正確群、対照n=4、72.65±11.5硬直、eNpHR3.1n=8、26.9±10.4硬直、P<0.01、28日前に取得された記憶の遠隔恐怖呼び出しを防止するが、試験前ならびに試験の間に光が30分間連続的にオンであったときは防止しなかった長期群、中間、対照n=3、70.13±12.2硬直、eNpHR3.1n=4、67.7±5.6硬直、P>0.05。長期群のマウスを試験の間だけ光を用いて翌日に再試験したとき、それらの呼び出しは妨害された長期群、左、55.5±8.5対27.6±8.6硬直、P<0.05。これらの結果を有効化するために、行動的および生理学的対照の両方を行った。第1に、遠隔記憶に対して影響がない長期eNpHR3.1媒介性CA1抑制が、近時記憶を依然として遮断し得ることを確認した。つまり、新しいマウスの群を訓練し、翌日の試験前30分間、次に試験中に長期照明を用いて試験した。長期光遺伝的抑制は、薬理学的効果図6Dと同様に、近時恐怖記憶の呼び出しを著しく抑制したことがわかった図7B、対照n=7、32.2±10.6硬直、eNpHR3.1n=3、4±2.6硬直、P<0.05。第2に、全細胞パッチクランプ記録図4Aの長期群から調製された切片においてを行ったところ、eNpHR3.1がスパイクを抑制する能力は、予測されるとおり、30分の記録期間を通して安定しGradinaruら、2010、完全に可逆的であった図7C。セクション1抑制開始、2連続的な抑制の間、および3抑制の最後および回復の詳細なトレースは、左下に提示される。光投与前、光投与中光オンの5分後および30分後の良好に誘発されたスパイクの平均割合、ならびに光オフ後の回復が提示される右下、n=4マウス、10細胞。CA1光遺伝的抑制は継続的な恐怖の呼び出しを干渉する。別のマウス集団を訓練し、その集団を、遠隔光オンおよび光オフ呼び出しプローブ順序を逆にして、文脈的FCから5週間後に試験し、最初に記憶トレースの持続性を実証した試験中に光なし、予測のとおり、eNpHR3.1群および対照群の両方で同様のパフォーマンスを観察する、図8左、対照n=8、79.0±8.9硬直、eNpHR3.1n=6、67.8±12.1硬直、P>0.5。翌日、同一マウスを照明下で試験したところ、eNpHR3.1群は、文脈的記憶の呼び出しに失敗した図8左、77.2±4.3対12.8±4.4硬直、P<0.0001。この効果は、完全に可逆的であり、翌日と同様に、光送達なしに試験したとき、eNpHR3.1マウスは、正常な文脈的記憶を示した図8右、61.5±6.7対58.3±3.5硬直、P>0.5。最も重要なことに、このセッション内で光が再度CA1に送達されるとすぐに、マウスが既に嫌悪文脈を呼び出し、恐怖を表現した後、eNpHR3.1において恐怖応答は即時に停止したが図8右、65.2±6.9対15.9±5.2硬直、P<0.001、対照動物では停止しなかった。これらのデータはともに、ある異種の見解を統合することができ、遠隔記憶トレースが海馬のみに保管されないことを明らかにすることにより以前の研究を支持するが海馬の非活性化を補償するのに十分な時間が与えられると、記憶トレースは、以前の報告と一致して、他の構造により依然として想起され得る、同時に正常な海馬が、遠隔記憶トレースのデフォルト活性化因子であってよく、呼び出しセッションを通してその維持に積極的に関与するという意外な見解を明らかにする。遠隔呼び出しの間に海馬により活発に制御される回路の脳全体のマッピング。前初期遺伝子生成物の発現例えば、zif268およびc-Fosおよびニューロン活性の他の広範囲の対策に関する以前の研究は、近時記憶から遠隔記憶への移行が、海馬活性の減少および新皮質活性の増加を伴い得ることを示したACCおよび前頭前皮質内、Bontempietal.,1999、Franklandetal.,2004、Halletal.,2001、Mavieletal.,2004。この活性マッピングアプローチをCA1光遺伝的制御の設定に拡張するために、eNpHR3.1媒介性の抑制を、訓練または遠隔呼び出しの間に送達し、脳全体にわたる前初期遺伝子生成物c-Fosの導入を評価した。マウスは、光送達下で恐怖条件付けし、訓練の90分後に脳を採取した図9A。脳切片は、c-FosおよびDAPIについて染色した図9B。YFP対照およびeNpHR3.1の発現が示される。これらの画像が撮影されたCA1領域は、図9Cにおいて白い正方形でマークされる。訓練後、eNpHR3.1発現マウスは、訓練された対照動物と比較して、CA1内で特異的なc-Fos発現の顕著な低減を示したが図9C~D、n=2~4マウス、6~15切片/群、P<0.01、訓練された対照に等しいBLA活性を示し図9C~D、p<0.0001、訓練中の恐怖回路の予測される海馬非依存性の関与を明らかにした。900により参照される図9D、9G、および9Hの棒および線は、対照-なし群のデータであり、902は、NpHR-なし群のデータであり、904は対照-恐怖群のデータであり、906はNpHR-恐怖群のデータであることに留意されたい。ACC活性レベルの著しい変化は、この時点で認められなかった。CA1、ACC、およびBLAの代表的な画像が示される。生体構造は、DAPI核染色により示され、扁桃体の辺縁部は破線でマークされる。白いスケールバー:150μm。別のマウス群を条件付けした後、CA1光遺伝的抑制の存在下または非存在下で、条件付けから28日後に文脈に再度暴露させたところ、前述のように、eNpHR3.1発現マウスは、遠隔呼び出しの障害を示した。90分後、脳を採取し、c-Fosを染色して図9E、この時点で海馬の制御下の推定記憶関連の脳全体活性パターンを捕捉した。興味深いことに、CA1c-Fosのわずかだが重要な増加は、遠隔呼び出し後に対照において認められたが、eNpHR3.1マウスでは認められなかった図9F~G、P<0.005。遠隔記憶後の代表的なCA1、ACC、およびBLA画像が示される。白いスケールバー:150μm。対照動物において認められたこの遠隔時点でのACC活性の増加P<0.0001は、eNpHR3.1/CA1抑制マウスにおいて低減したためP<0.0001、このCA1細胞の集団は、脳全体の遠隔記憶関連活性の採用に因果的に関与すると考えられた。さらにより驚くことには、BLA内の活性化細胞集団P<0.0001は、対照マウスにおいて認められたが文脈的かつ表現された恐怖を認識した、CA1抑制されたeNpHR3.1マウスでは認められなかったさらに文脈を記憶することができないことがわかった、図9F~G、P<0.0001、図9Gに表されるように、条件付けから28日後の遠隔呼び出しは、対照マウスにおいてCA1c-Fos発現のわずかだが重要な増加をもたらし、ACCおよびBLAにおいて非常に高い活性レベルをもたらした。文脈に対する暴露の間の光抑制は、対照と比較して、CA1活性を完全に遮断しP<0.05、ACCおよびBLA活性を著しく低減した。付加的観察は、遠隔時点でのこのCA1採用集団の特異性を指摘する。eNpHR3.1発現マウスは、対照のそれに等しい前頭前皮質活動の上昇を示し、頭頂葉皮質活動レベルの著しい変化は、いずれの群においても認められなかった。対照的に、上記のとおり、ACCにおける活動レベルは、遠隔記憶のみにおいて著しく採用され、それよりも低い程度でeNpHR3.1媒介性CA1抑制図9H中間の設定に採用され、また以前の報告と一致したBontempietal.,1999、Franklandetal.,2004、Halletal.,2001、Mavieletal.,2004。図9Hは、条件付け0日目と遠隔呼び出し28日目との間の脳活動の全体パターンを表す。CA1の活動レベルは、対照P<0.005マウスにおいて、0日目~28日目まで著しく減少した。ACCの活動レベルは、対照P<0.0001およびeNpHR3.1P<0.001マウスの両方において、0日目~28日目まで著しく増加した。BLAの活動レベルは、eNpHR3.1マウスではなく、対照P<0.001マウスにおいて著しく増加した。これらのデータはともに、遠隔文脈的記憶と関連付けられた脳全体の活動パターンを組織化することにおけるCA1ニューロンのこの小集団の役割を指摘する。ACCの光遺伝的抑制は近時ではなく遠隔文脈的記憶を抑制する。遠隔文脈的記憶の間に活性なCA1ニューロンの集団は、上で示されるように、ACCニューロン活性を完全に組織化することにおいて因果的に関与することがわかったため、また以前の研究は、遠隔恐怖記憶の保存においてACCを関与させるためBontempietal.,1999、Fischeretal.,2007、Franklandetal.,2004、Mavieletal.,2004、記憶の光遺伝的抑制は、文脈的FCから1日後または1ヶ月後のいずれかにACCを直接標的とすることにより探索した。図10Aは、前帯状皮質ACC内のeNpHR3.0発現を表す。以前の研究と完全に一致してFranklandetal.,2004、ACCの光遺伝的抑制は、近時記憶に影響がなかったが75.9±5.4対76±2.9硬直、遠隔記憶を著しく障害した図10B、対照n=5、81.6±4.9硬直、eNpHR3.0n=5、53.8±11硬直、P<0.05。同一の実験を新しいマウス群において繰り返したが、今回は、試験前30分間、次に試験の間に長期照射を送達した。ここでもACCの光遺伝的抑制は、遠隔記憶を著しく障害したが対照n=3、78.0±6.2硬直、eNpHR3.0n=8、45.0±5.2硬直、P<0.05、近時記憶には影響がなかった図10C、78.5±12.7対74.3±4.3硬直。対照的に、別の主要な皮質入力領域が対照目的で標的とされるとき、近時および遠隔恐怖呼び出しの両方の間に、嗅球OB、および光遺伝的抑制の効果を試験したところ、いずれの時点においても呼び出しに影響がなかったことがわかった。この結果は、同時に、皮質へのシナプス入力の主要な源の突然の低下が非特異的に呼び出しに影響しないことを示し、また遠隔記憶におけるACCの特異性を指摘する以前の研究と一致する。これらの見解はともに、新皮質の遠隔重要性を支持し、皮質の再組織化後であっても、遠隔記憶トレースを呼び出すことにおける海馬のデフォルト要件が存在する。遠隔記憶の不可逆的消去は、近年、PKW投与による海馬および皮質においてMiguesetal、Pastalkovaetal2006、Shemaetal2009、Shemaetal2007、およびタグ付け前ニューロンの選択的切除により扁桃体において示されたHanetal2009。一方、ニューロンの損傷に起因して喪失されると推定される遠隔記憶トレースは、環境強化およびクロマチン修飾後の呼び出しに使用可能になったFischeretal2007。一方、光遺伝は、永久的な記憶の消去なしに、可逆的呼び出しの防止を可能にする。海馬が、依然として文脈的恐怖記憶呼び出しのデフォルト活性化因子であるという見解は、CA1内の多くの場所細胞Moseretal2008が、恐怖条件付けに応答してリマップするという事実に起因する場合がありMoitaetal2004、文脈のより高速な認識に寄与し得る。実際に、海馬の損傷は、空間記憶の逆行性健忘を誘導することが繰り返し示されたBroadbentetal2006、Martinetal2005。遠隔記憶が想起されると、それらは再強化に使用可能になり、崩壊の影響を受け易くなるが、トレースを強化し得るDudai2006、Morrisetal2006、NaderandHardt2009、TronsonandTaylor2007、WangandMorris。遠隔恐怖記憶を実時間で、再強化前後に、さらにはそれが既に想起された後であっても遠隔恐怖記憶を可逆的にシャットダウンする能力は、PTSD患者にとって胸躍る治療手段を提供し得、再発する妨害記憶が現れると、他の記憶に永久に影響することなくその妨害記憶が停止され得る。付加的に、薬物乱用に関連する記憶を抑制して、薬物探索行動を低減することができるEverittetal2001、Leeetal2005、Robbinsetal2008。異なる脳領域の光遺伝的変調により認知に即時に影響を及ぼす能力は、記憶プロセスにおける特定のニューロン集団の役割を再試験する、今後の研究の基礎としての役割を果たし、それらの基礎となる神経回路のより微細な時間的、遺伝的、および空間的解析を可能にし得る。前述の発明は、理解を明確にする目的で、図および実施例によりある程度詳細に説明されたが、この説明および実施例は、発明の範囲を限定するものと見なされてはならない。参考文献AdamantidisARZhangFAravanisAMDeisserothKanddeLeceaLNeuralsubstratesofawakeningprobedwithoptogeneticcontrolofhypocretinneuronsNature450420424AnagnostarasSGMarenSandFanselowMSTemporallygradedretrogradeamnesiaofcontextualfearafterhippocampaldamageinratswithinsubjectsexaminationJNeurosci1911061114AravanisAMWangLPZhangFMeltzerLAMogriMZSchneiderMBandDeisserothKAnopticalneuralinterfaceinvivocontrolofrodentmotorcortexwithintegratedfiberopticandoptogenetictechnologyJNeuralEng4S143156BolhuisJJStewartCAandForrestEMRetrogradeamnesiaandmemoryreactivationinratswithibotenatelesionstothehippocampusorsubiculumQJExpPsycholB47129150BontempiBLaurentDemirCDestradeCandJaffardRTimedependentreorganizationofbraincircuitryunderlyinglongtermmemorystorageNature400671675BoydenESZhangFBambergENagelGandDeisserothKMillisecondtimescalegeneticallytargetedopticalcontrolofneuralactivityNatNeurosci812631268BroadbentNJSquireLRandClarkREReversiblehippocampallesionsdisruptwatermazeperformanceduringbothrecentandremotememorytestsLearnMem13187191CipolottiLandBirdCMAmnesiaandthehippocampusCurrOpinNeurol19593598DebiecJLeDouxJEandNaderKCellularandsystemsreconsolidationinthehippocampusNeuron36527538DeisserothKFengGMajewskaAKMiesenbockGTingAandSchnitzerMJNextgenerationopticaltechnologiesforilluminatinggeneticallytargetedbraincircuitsJNeurosci261038010386DudaiYReconsolidationtheadvantageofbeingrefocusedCurrOpinNeurobiol16174178EverittBJDickinsonAandRobbinsTWTheneuropsychologicalbasisofaddictivebehaviourBrainResBrainResRev36129138FanselowMSContextualfeargestaltmemoriesandthehippocampusBehavBrainRes1107381FischerASananbenesiFWangXDobbinMandTsaiLHRecoveryoflearningandmemoryisassociatedwithchromatinremodellingNature447178182FranklandPWandBontempiBTheorganizationofrecentandremotememoriesNatRevNeurosci6119130FranklandPWBontempiBTaltonLEKaczmarekLandSilvaAJTheinvolvementoftheanteriorcingulatecortexinremotecontextualfearmemoryScience304881883GradinaruVThompsonKRZhangFMogriMKayKSchneiderMBandDeisserothKTargetingandreadoutstrategiesforfastopticalneuralcontrolinvitroandinvivoJNeurosci271423114238GradinaruVZhangFRamakrishnanCMattisJPrakashRDiester1Goshen1ThompsonKRandDeisserothKMolecularandcellularapproachesfordiversifyingandextendingoptogeneticsCell141154165HallJThomasKLandEverittBJCellularimagingofzif268expressioninthehippocampusandamygdaladuringcontextualandcuedfearmemoryretrievalselectiveactivationofhippocampalCA1neuronsduringtherecallofcontextualmemoriesJNeurosci2121862193HanJHKushnerSAYiuAPHsiangHLBuchTWaismanABontempiBNeveRLFranklandPWandJosselynSASelectiveerasureofafearmemoryScience32314921496JohansenJPHamanakaHMonfilsMHBehniaRDeisserothKBlairHTandLeDouxJEOpticalactivationoflateralamygdalapyramidalcellsinstructsassociativefearlearningProcNatlAcadSciUSA1071269212697KillcrossSRobbinsTWandEverittBJDifferenttypesoffearconditionedbehaviourmediatedbyseparatenucleiwithinamygdalaNature388377380KimJJandFanselowMSModalityspecificretrogradeamnesiaoffearScience256675677KitamuraTSaitohYTakashimaNMurayamaANiiboriYAgetaHSekiguchiMSugiyamaHandInokuchiKAdultneurogenesismodulatesthehippocampusdependentperiodofassociativefearmemoryCell139814827LeDouxJEEmotioncircuitsinthebrainAnnuRevNeurosci23155184LeeJLDiCianoPThomasKLandEverittBJDisruptingreconsolidationofdrugmemoriesreducescocaineseekingbehaviorNeuron47795801LeeJLMiltonALandEverittBJReconsolidationandextinctionofconditionedfearinhibitionandpotentiationJNeurosci261005110056MarenSNeurobiologyofPavlovianfearconditioningAnnuRevNeurosci24897931MarenSAharonovGandFanselowMSNeurotoxiclesionsofthedorsalhippocampusandPavlovianfearconditioninginratsBehavBrainRes88261274MarenSandQuirkGJNeuronalsignallingoffearmemoryNatRevNeurosci5844852MartinSJdeHozLandMorrisRGRetrogradeamnesianeitherpartialnorcompletehippocampallesionsinratsresultinpreferentialsparingofremotespatialmemoryevenafterremindingNeuropsychologia43609624MavielTDurkinTPMenzaghiFandBontempiBSitesofneocorticalreorganizationcriticalforremotespatialmemoryScience3059699McHughTJJonesMWQuinnJJBalthasarNCoppariRElmquistJKLowellBBFanselowMSWilsonMAandTonegawaSDentategyrusNMDAreceptorsmediaterapidpatternseparationinthehippocampalnetworkScience3179499McHughTJandTonegawaSSpatialexplorationisrequiredfortheformationofcontextualfearmemoryBehavNeurosci121335339MoitaMARosisSZhouYLeDouxJEandBlairHTPuttingfearinitsplaceremappingofhippocampalplacecellsduringfearconditioningJNeurosci2470157023MorrisRGInglisJAingeJAOlvermanHJTullochJDudaiYandKellyPAMemoryreconsolidationsensitivityofspatialmemorytoinhibitionofproteinsynthesisindorsalhippocampusduringencodingandretrievalNeuron50479489MoscovitchMNadelLWinocurGGilboaAandRosenbaumRSThecognitiveneuroscienceofremoteepisodicsemanticandspatialmemoryCurrOpinNeurobiol16179190MoserElKropffEandMoserMBPlacecellsgridcellsandthebrainsspatialrepresentationsystemAnnuRevNeurosci316989NadelLandMoscovitchMMemoryconsolidationretrogradeamnesiaandthehippocampalcomplexCurrOpinNeurobiol7217227NaderKandHardtOAsinglestandardformemorythecaseforreconsolidationNatRevNeurosci10224234NakashibaTYoungJZMcHughTJBuhlDLandTonegawaSTransgenicinhibitionofsynaptictransmissionrevealsroleofCA3outputinhippocampallearningScience31912601264PhelpsEAandLeDouxJEContributionsoftheamygdalatoemotionprocessingfromanimalmodelstohumanbehaviorNeuron48175187RiedelGMicheauJLamAGRoloffELMartinSJBridgeHdeHozLPoeschelBMcCullochJandMorrisRGReversibleneuralinactivationrevealshippocampalparticipationinseveralmemoryprocessesNatNeurosci2898905RobbinsTWErscheKDandEverittBJDrugaddictionandthememorysystemsofthebrainAnnNYAcadSci1141121ShimizuETangYPRamponCandTsienJZNMDAreceptordependentsynapticreinforcementasacrucialprocessformemoryconsolidationScience29011701174SquireLRandAlvarezPRetrogradeamnesiaandmemoryconsolidationaneurobiologicalperspectiveCurrOpinNeurobiol5169177SquireLRandBayleyPJTheneuroscienceofremotememoryCurrOpinNeurobiol17185196SutherlandRJOBrienJandLehmannHAbsenceofsystemsconsolidationoffearmemoriesafterdorsalventralorcompletehippocampaldamageHippocampus18710718SutherlandRJSparksFTandLehmannHHippocampusandretrogradeamnesiaintheratmodelamodestproposalforthesituationofsystemsconsolidationNeuropsychologia4823572369TronsonNCandTaylorJRMolecularmechanismsofmemoryreconsolidationNatRevNeurosci8262275WangHShimizuETangYPChoMKyinMZuoWRobinsonDAAlaimoPJZhangCMorimotoHetalInducibleproteinknockoutrevealstemporalrequirementofCaMKIIreactivationformemoryconsolidationinthebrainProcNatlAcadSciUSA10042874292WangSHandMorrisRGHippocampalneocorticalinteractionsinmemoryformationconsolidationandreconsolidationAnnuRevPsyc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