患者の身体の流動体サンプル中のコペプチン、またはコペプチン免疫反応性を示すコペプチンの生理学的に生じるスプライスバリアント、フラグメント、若しくは翻訳後修飾された形態の量の測定、並びにコペプチンの測定された量またはコペプチン免疫反応性と、疾患の存在及びまたは経過及びまたは重度及びまたは予後との関連付けによる、神経下垂体からのバソプレッシンの放出の非生理学的な変化に関連する、または誘導される疾患の診断及びモニタリングのためのinvitro診断方法。前記神経下垂体からのバソプレッシン放出の非生理学的変化に関連する、または誘導される疾患が、循環器疾患、特に慢性若しくはうっ血性心不全、心停止、心臓性ショック、心筋梗塞、急性心筋梗塞、高血圧症、心臓手術;肝硬変;肺疾患、腎多嚢胞病のような腎臓疾患;尿崩症;低ナトリウム症の形態、不適合抗利尿ホルモン分泌症候群の形態;出血、浮腫形成疾患、炎症性疾患、外傷、火傷、それらの感染性合併症及び敗血症、重度な敗血症、及び敗血症ショック;並びに中枢神経系の疾患病気からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。前記コペプチン免疫反応性が、配列番号1に存在するアミノ酸配列を認識する第1の特異的な結合物、並びに配列番号2に存在するアミノ酸配列を認識する第2の特異的な結合物を使用するサンドイッチ免疫アッセイを使用して測定することが可能である免疫反応性である、請求項1または2に記載の方法。前記特異的な結合物がポリクローナル及びまたはモノクローナル抗体である、請求項3に記載の方法。前記免疫アッセイが第1の固定化された特異的な結合物、及び検出可能なラベルを有する、または標識されたマーカー分子との反応によって選択的に標識されることが可能である、第2の可溶化された特異的な結合物を使用するヘテロジーニアス免疫アッセイである、請求項3または4に記載の方法。前記免疫アッセイがホモジーニアス免疫アッセイである、請求項3または4に記載の方法。前記生物学的な流動体が血清、血漿、血液、または脳脊髄液より選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。前記疾患が敗血症、心筋梗塞、慢性心不全、及び動脈の血圧の増大より選択される、請求項2に記載の方法。-配列番号1または配列番号2に存在する第1のアミノ酸配列を認識する、少なくとも1つの第1の抗体;及び-配列番号1または配列番号2に存在する他の第2のアミノ酸配列を認識する、少なくとも1つの第2の抗体、-前記第1または第2の抗体の少なくとも1つは検出可能なラベルを有する、を含む、免疫アッセイのための試薬を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。前記第1または第2の抗体の1つが表面上に固定化される、請求項9に記載のキット。標準物質として使用され、且つ検定目的のためのペプチドを更に含む、請求項9または10に記載のキット。前記ペプチドが配列番号3に係るアミノ酸配列を有する、請求項11に記載のキット。コペプチンは39アミノ酸、その糖鎖部分を含み、約2000Daの分子量を有する1517。糖鎖付加は前駆体VPプロホルモンの131位である。コペプチンの生物学的な機能は不明確なままである。例えば血清または血漿のような身体の流動体における液性の診断マーカーとしてバソプレッシンを直接定量することは、ルーチンの診断にとって適切でない。90より多くのバソプレッシンは血小板に結合することから、測定のために利用できない21。かくして、血漿で認められるフリーなバソプレッシンは血流に放出されたバソプレッシンの真の量を反映しない。血小板に対するバソプレッシンの結合は、血漿を得るために使用される遠心分離に依存して変化する測定に含まれる血小板の量に依存して異なる結果を導く22。さらなる妨害は、血液サンプルを遠心分離前に室温の状態にすると、より多量のバソプレッシンが認められるという事実である。これらの効果及びinvivoにおけるバソプレッシンの短い半減期、及び20°Cで保存した際でもexvivoの血漿サンプルにおける短い半減期は、ルーチンの診断におけるバソプレッシンの使用を妨害している。その短い半減期のため、ルーチンの診断において、バソプレッシンが検出限界に達する前にサンプルの入手、血漿の取得、サンプルの実験室への輸送、及び必要とされる試験を含む実験室における診断の実施をすることが不可能であった。さらに、バソプレッシンの低いinvivoの安定性、及び血小板への結合及び血小板からの放出に由来して変化する結果のために、バイオマーカーとしての使用は、急速に生じる分解の影響で、最適化されたサンプルの実施条件であっても極端に制限される。本発明の主題は、バソプレッシンの不利な半減期の効果、及び測定において変化する結果を克服すること、並びに循環器疾患及び敗血症の診断のための、バソプレッシンの放出に関連する分子、より具体的にはコペプチンの検出及び定量のための方法、使用、及びキットを開発することである。本発明の主題は、VPプロホルモンの特定のフラグメント、特にコペプチンを、循環器疾患及び敗血症の診断及びモニタリングにおいて、特に身体の流動体におけるバソプレッシンの生理学的な放出の定量のためのツールとして使用できるという驚くべき発見に基づいて達成されるであろう。前記フラグメント、特にコペプチンの産生は、同一の前駆体に由来するために、バソプレッシンの放出と相関する。exvivoにおける前記前駆体タンパク質、フラグメント、及びまたはその組み合わせの安定性は驚くほど高く、前記フラグメント、特にコペプチンをルーチンの目的に完全に適したものとすることが認められた。コペプチンのようなフラグメントと前記前駆体ペプチドの他のフラグメントとの間の結合は、バソプレッシンが関与する全ての疾患のための診断のツールとしてそれらを適切なものとする。そのため、特にコペプチンは、各種の疾患、特に循環器疾患及び全身の炎症、特に敗血症の診断及びモニタリングのための医学的な診断方法において使用されて良い。さらに、1つの実施態様において本発明は、バソプレッシンが関与する上述の疾患ための疾患の診断、経過の調節、及び予後のためのコペプチンの使用に関する。臨床的なデータが、前記疾患の診断を支持するために更に考慮に入れられても良い。本発明に係るコペプチンと少なくとも75の相同性、好ましくは80の相同性、より好ましくは少なくとも90の相同性を示すアミノ酸配列を使用することが可能である。本発明の好ましい実施態様において、以下の実施例よれば、ヒトバソプレッシンニューロフィジン2コペプチン前駆体のアミノ酸配列の2つの領域が特定の抗体によって認識される免疫学的な結合部位として選択された:132147位:CATQLDGPAGALLLRLV149164位:CLAGAPEPFEPAQPDAY。検定のため、及び標準溶液の調製のために、上述の結合部位の双方を含むぺプチドを使用した:132164位:ATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY。特定の抗体に認識される免疫学的な結合部位PATV17及びPLAY17は、131位のコペプチンの推定の糖鎖付加部位を含まないように選択された。そのため、定量されたコペプチンの翻訳後修飾の存在または不在は、その様な抗体を使用するアッセイにおけるコペプチンの認識に対していかなる有意な影響も有するはずがない。そのため、用語コペプチンは裸のコペプチンペプチドと同様に、前記ペプチドの翻訳後修飾形態を含む。上述の各ペプチドが以下の記載にように合成される際に、アミノ末端にシステイン残基を各コペプチンアミノ酸配列に付加し、前記ペプチドを当業者に既知の方法によって可溶性タンパク質として化学的に合成した。それらを精製し、質量分析器及び逆相HPLCによって品質を調整し、分取して凍結乾燥した。本発明に係る合成ペプチドを抗原の生産に使用して、動物に注射し、本発明に係るコペプチンに対する抗体を産生した。当業者に既知の、この主題を達成するための他の方法が使用されて良い。好ましい実施態様では、PierceRockfordILUSAの方法に従って、前記ペプチドPATV17及びPLAY17をMBSを介して担体タンパク質であるスカシ貝ヘモシアニンに接合した。ヒツジで上述のペプチドに対する抗体を生産した。本発明の好ましい実施態様では、上述のペプチドに対するポリクローナル抗体を産生させた。既知の方法に従って抗体を精製した。本発明の好ましい実施態様では、これは、Pierceの方法に従って、PierceのSulfoLinkGelのアミノ末端のシステイン残基を介するペプチドのカップリングによるリガンド特異的なアフィニティークロマトグラフィーによって好適に達成された。好ましい実施態様では、検出可能なマーカーを使用して前記抗体を標識した。使用されるマーカーは好ましくは蛍光マーカーであり、より好ましい実施態様では、前記抗体を化学発光マーカーで標識し、更に好ましい実施態様では、PATV17及びPLAY17に対する抗体を化学発光マーカーで標識した。さらなる好ましい実施態様では、本発明は、身体の流動体のサンプル中の本発明に係るコペプチンの検出のために産生された抗体の使用、並びに特定量のその様な抗体または本発明に係る分子の検出に特異的な多量の抗体を含むキットに関する。各種の標識を使用する手動の、自動の、若しくは治療の時点の様式の競争的またはサンドイッチ免疫アッセイを含む、当業者に既知のもののような、異なるアッセイが前記分子の検出に使用されて良い。個々の分子に対する抗体の結合の検出方法も当業者に既知である。その様な既知のアッセイのいかなる様式がコペプチンの定量との関連で使用されても良い。例えば、いわゆるPOC試験として免疫クロマトグラフィータイプのような即時試験の装置を用いてコペプチンを定量することは本発明の範囲の内である。コペプチンの定量は、いわゆるTRACE技術を使用する、いわゆるKRYPTORタイプのホモジーニアスアッセイで実施されても良い。本発明の好ましい実施態様は、特にサンドイッチタイプの2つの部位の免疫アッセイのための、上述のペプチド0413pAK及び0417pAKに対して産生された抗体の使用を開示する。本発明の他の好ましい実施態様は、各種の身体の流動体及び他の生体物質中の本発明の分子、特にコペプチンの濃度の検出及び定量のためのこれらの抗体の使用を開示する。好ましい実施態様では、コペプチンは身体の流動体で50pgmlを超える濃度で検出されて良い。1つの好ましい実施態様では、本発明は、血清及び血漿におけるexvivoのコペプチンの長期の安定性の発見に基づき、それを使用する。血漿及び血清におけるコペプチンのレベルは、驚くべきことに、室温で2日間貯蔵した後でさえ安定であった。かくして、コペプチンは、バソプレッシンよりもはるかに診断の目的に適する。本発明の好ましい実施態様は、健康な個体、敗血症患者、心筋梗塞患者、及び動脈の血圧の増大した患者におけるコペプチンの検出のための、並びに慢性またはうっ血性心不全の重度の決定のためのPLAY17及びPATV17に対して産生された抗体の使用を開示する。本発明は、身体の流動体中の本発明の分子、特にコペプチンの存在及び安定性の決定、並びに健康な対照と上述の各種の患者を含む各種の疾患の患者とのペプチド濃度の差の測定を可能にする。健康な対照個体の中央値は約13pgmlである。本発明は、更に、上述のものを含む疾患の状態における、身体の流動体中の液性のバイオマーカーであるコペプチンの濃度の優位な変化を開示する。本発明の好ましい実施態様は非常に有意な変化、すなわち敗血症患者及び心筋梗塞の患者におけるコペプチンの濃度の約10倍の増大、並びに動脈の血圧が増大した患者における約35倍の増大という驚くべき発見に基づく。CHF患者では、コペプチンの測定レベルは、NewYorkHeartAssociation機能分類システムを使用して一般的に評価される病気の重度と良く相関する。NYHAクラスIからIVは以下の典型的な機能と一致する:NYHAクラスI-無症候;NYHAクラスII-中程度の運動に伴う症状;NYHAクラスIII-最小限の運動に伴う症状;NYHAクラスIV-休息時の症状。全部で348のCHF患者の血漿サンプル中のコペプチンレベルを定量した試験において、異なるクラスの中央値は明らかに傾向を示した。本発明は、特にコペプチンの1つ以上の抗体を使用する、上述の疾患のための診断方法、キット、及びアッセイも提供する。物質、方法、及び測定実施例1ペプチド合成当業者に既知の標準的な方法に従って、ペプチドを合成し、それらの品質を質量分析器及び逆相HPLCによって調整して、分取して凍結乾燥した。前記ペプチドのアミノ酸配列を以下に示すに相当する位置を意味する:PATV17CATQLDGPAGALLLRLV配列番号1PLAY17CLAGAPEPFEPAQPDAY配列番号2標準ペプチドPAY33ATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY配列番号3。実施例2接合及び免疫PIERCERockfordILUSAによるNHSエステルマレイミド架橋剤のプロトコルに従って、MBSによって、配列番号1から2のペプチドを担体タンパク質KLHに接合した。100μgの接合体を受けさせ、続いて4週間ごとに50μgの接合体を受けさせてヒツジを免疫した。4週間毎の免疫後4ヶ月から、700mlの血液を全ての羊より回収し、遠心分離によって抗血清を得た。接合、免疫、及び抗血清の生産はMicroPharmCarmerthenshireUKによって実施された。抗体の精製ヒツジ由来のポリクローナル抗体をリガンド特異的なアフィニティー精製を使用して精製した。この工程のために、ペプチドPATV17及びPLAY17をPierce社製のSulfoLinkGelに結合させた。Pierce社のプロトコルに従って前記結合を生じさせた。5mgのペプチドを5mlのゲルに添加した。まとめると、カラムを10mlの溶出バッファー及び結合バッファーを使用して3回洗浄した。100mlのヒツジ抗血清を02μmのフィルターを使用して濾過し、カラムから10mlの結合バッファーの入ったビーカーに移されたカラム物質に添加した。前記物質を穏やかに回転させて室温で一晩インキュベートした。前記物質を空のカラムに移した。溶出液を廃棄した。続いて、前記カラムを250mlのタンパク質を含まない結合バッファーで洗浄した。洗浄したカラムに溶出バッファーを添加して、1mlのフラクションを回収した。各フラクションのタンパク質量をBCA法によって測定した。タンパク質量が08mgmlより大きいフラクションを溜めた。タンパク質量の測定後、39mgの抗PATV17抗体0413pAk及び103mgの抗PLAY17抗体0417pAkを得た。実施例4標識以下の様に、抗PLAY17抗体0417pAkを処理した:Pharmacia社のプロトコルに従い、NAP5ゲル濾過カラムを介して、500μlのアフィニティー精製した産生された抗体を1mlの100mMリン酸カリウムバッファー中で再緩衝化した。抗体溶液のタンパク質濃度は15mgmlであった。化学発光マーカーを使用する標識のために、10μlのMA70AkridiniumNHSエステルを67μlの抗体溶液に添加して、室温で15分間インキュベートした。次いで、423μlの1Mグリシンを添加して、10分間インキュベートした。Pharmacia社のプロトコルに従い、NAP5ゲル濾過カラムを使用して、前記溶液を1mlの溶媒A中で再緩衝化した。未結合のラベルの最終的な除外のために、ゲル濾過HPLCを実施した。前記サンプルを添加して、溶媒A、1ml分の流速でクロマトグラフィーを実施した。クロマトグラフィーの流れを、標識の程度を測定するために280nm及び368nmの波長でUVメーターにおいて連続的にモニターした。標識化抗体の吸収比368280nmは01であった。モノマー状の抗体を含有するフラクションを回収し、3mlのに固定化した。その方法のために、前記抗体溶液を、50mMTris、100mMNaCl、pH78で66μgmlのタンパク質濃度に希釈した。管毎に300μlの希釈タンパク質溶液をピペットで移した。これらを22°Cで20時間インキュベートして、溶液を除去した。次いで、42mlの10mMリン酸ナトリウム、2KarionFP、03ウシ血清アルブミン、pH65の溶液を各管に添加した。20時間後に前記溶液を除去して、前記管を真空乾燥器で乾燥させた。実施例6免疫アッセイ以下のアッセイバッファーを使用した:100mMリン酸ナトリウム、150mMNaCl、5ウシ血清アルブミン、01非特異的ヒツジIgG、01アジ化ナトリウム、pH74。健康な個体と各種の疾患上述の疾患の患者、特に心臓疾患及び循環の疾患のEDTA血漿のコペプチン濃度を定量した。標準的な物質として、バソプレッシンニューロフィジン2コペプチン前駆体の132164位に相当する、化学的に合成されたペプチドを使用した。前記標準物質を正常なウマの血清に希釈した。試験管中に、100μlの標準物質またはサンプル、並びに100μlのアッセイバッファーをピペットで移した。前記管を穏やかに回転させて、22°Cで2時間インキュベートした。1mlの洗浄バッファーを使用して4回洗浄した後に、上清を廃棄した。次いで、100万RLUのMA70で標識された抗体を含有する200μlのアッセイバッファーを添加して、22°Cで穏やかに回転させて更に2時間インキュベートした。1mlの洗浄バッファーを使用して4回洗浄した後に、管に結合した化学発光物質をルミノメーターで定量した。ソフトウェアMultiCalcを使用して、サンプルの濃度を測定した。実施例7コペプチン濃度の測定コペプチン免疫反応性という用語は、開発されたサンドイッチ免疫アッセイによって検出される基質の量を意味する。前記サンドイッチ免疫アッセイは、基質の検出のために、バソプレッシンニューロフィジン2コペプチン前駆体の132147位及び149164位に対して産生された抗体を使用する。開発されたアッセイの典型的な標準曲線を図1に記載する。前記アッセイを使用して、50pgmlを超える血漿または血清中のコペプチンの免疫反応性が定量的に測定されて良い。実施例8健康な個体及び疾患状態のコペプチン免疫反応性の濃度健康な個体の血清及び血漿、並びに敗血症、心筋梗塞、及び動脈の血圧の増大を含む各種の疾患に罹っている患者の血清及び血漿を分析した。コペプチン免疫反応性を測定した。健康な個体と比較すると、コペプチン免疫反応性は疾患状態で驚くほど増大した。健康な個体は約13pgmlの中央値を示し、敗血症患者は約150pgmlの中央値、心筋梗塞の患者では約129pgmlの中央値、動脈の血圧の増大の患者では459pgmlの中央値であった。実施例9NYHAクラスIからIVの慢性的心不全患者におけるコペプチン免疫反応性の濃度全部で348のCHF患者の血清及び血漿サンプルにおいて、上述のアッセイを使用してコペプチンレベルを測定した。結果を図4に図示する。認められ得るように、異なるクラスのpgmlにおけるコペプチン濃度の中央値は明らかな増大の傾向を示した。NYHAクラスIの患者の中央値は2030pgml、クラスIIは3325pgml、クラスIIIは4960pgml、及びクラスIVは8580pgmlであると認められた。血漿中のコペプチンレベルとCHFの重度との密接な相関関係が存在するという発見は、コペプチンを、CHFの診断、CHFの経過及び進展のモニタリング、並びにCHF治療のモニタリング及び調節における使用のためのバイオマーカーの候補にする。更に、心不全の治療においてバソプレッシンレセプターアンタゴニストの有用性を評価する現在の試みに鑑みて27、心不全の患者の血清または血漿サンプル中のコペプチンの定量は、とりわけバソプレッシンレセプターアンタゴニストを使用する治療が有用であり得る患者を同定することが可能である。実施例10コペプチン免疫反応性の安定性コペプチン免疫反応性は血漿及び血清中において驚くほど安定であることを発見した。表2は、敗血症患者の血清及び血漿中の外来性の免疫反応性コペプチンのexvivoにおける安定性を示す。室温で2日間の貯蔵でさえ、免疫反応性における減少は検出されないであろう。かくして、コペプチン免疫反応性のexvivoにおける安定性はバソプレッシンと比較して驚くほど顕著に増大した。1SinghRangerGThephysiologyandemergingrolesofantidiuretichormoneIntJClinPract5677778220022LandryDWOliverJAThepathogenesisofvasodilatoryshockNEnglJMed3455885953CoatesLCBirchNPDifferentialcleavageofprovasopressinbythemajormolecularformsofSPC3JNeurochem701670167819984WilsonMFBrackettDJTompkinsPBenjaminBArcherLTHinshawLBElevatedplasmavasopressinconcentrationsduringendotoxinandEcolishockAdvShockRes6152619815LandryDWLevinHRGallantEMAshtonRCJrSeoSD’AlessandroDOzMCOliverJAVasopressindeficiencycontributestothevasodilationofsepticshockCritCareMed304975006SharsharTCarlierRBlanchardAPaillardMRaphaelJCGajdosPAnnaneDDepletionofneurohypophysealcontentofvasopressininsepticshockCritCareMed3049750020027SharsharTBlanchardAPaillardMRaphaelJCGajdosPAnnaneDCirculatingvasopressinlevelsinsepticshockCritCareMed311752175820038ForrestPVasopressinandshockAnaesthIntensiveCare2946347220019VincentJLEndocrinesupportinthecriticallyillCritCareMed30702703200210HolmesCLLandryDWGrantonJTScienceReviewVasopressinandthecardiovascularsystempart2clinicalphysiologyCritCare81523200411LindnerKHStrohmengerHUEnsingerHHetzelWDAhnefeldFWGeorgieffMStresshormoneresponseduringandaftercardiopulmonaryresuscitationAnaesthiology77662668199212WenzelVKrismerACArntzHRSitterHStadlbauerKHLindnerKHAcomparisonofvasopressinandepinephrineforoutofhospitalcardiopulmonaryresuscitationNEnglJMed350105113200413NorthWGGeneregulationofvasopressinandvasopressinreceptorsincancerExpPhysiol85SpecNo27S40S200014BaumannGDingmannJFDistributionbloodtransportanddegradationofantidiuretichormoneinmanJClinInvest5711091116197615SmythDGMasseyDEAnewglycopeptideinpigoxandsheeppituitaryBiochemBiophysResCommun8710061010197916deBreeFMBurbachJPStructurefunctionrelationshipsofthevasopressinprohormonedomainsCellMolNeurobiol18173191199817HolwerdaDAAglycopeptidefromtheposteriorlobeofpituitariesIIsolationandcharacterizationEurJBiochem28334339197218NagyGMulchaheyJJSmythDGNeillJDTheglycopeptidemoietyofvasopressinneurophysinprecursorisneurohypophysialprolactinreleasingfactorBiochemBiophysPesCommun151524529198819HydeJFNorthWGBenJonathanNThevasopressinassociatedglycopeptideisnotaprolactinreleasingfactorstudieswithlactatingBrattlebororatsEndocrinology1243540198920NorthWGBiosynthesisofvasopressinandneurophysinsinDGashandGBoerVasopressinPrinciplesandPropertiespp175209NewYorkPlenumPress198721ChesneyetalJLabClinMed1985S106abrufbarunterwwwncbinihgov22KlugeetalClinicalChemistry1999S9810023RobertsonetalJournalofClinicalInvestigationVol521973S2340235224NorthWGetalImmunohistochemicalEvaluationofVasopressinExpressioninBreastFibrocysticDiseaseandDuctalCarcinomaInSituEndocrinePathology2003Vol14No32003pages25726225NorthWGetalVasopressingenerelatedproductsaremarkersofhumanbreastcancerBreastCancerResearchandTreatmentVol341995pages22923526NorthWGNeuropeptideProductionbySmallCellCarcinomaVasopressinandOxytocinasPlasmaMarkersofDiseaseJClinEndocrinolMetabVol731991No6pages1316132027ThibonnierMVasopressinreceptorantagonistsinheartfailureCurrentOpinioninPharmacology20033683687