"一般式式中、R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換の炭化水素基、または置換もしくは非置換の複素環基である。で表されるvセレンテラミン化合物の製造方法であって、一般式式中、R1は、前記の通りであり、R4は、保護基である。で表される化合物とメチルトリフェニルホスホニウム塩とを塩基の存在下で反応させることにより一般式で表される化合物を得る工程と、一般式で表される化合物、および一般式で表される化合物のアミノをR5で保護した一般式で表される化合物からなる群から選択されるいずれか1つを閉環メタセシス反応に供し、その後、R4および存在する場合にはR5を脱保護する工程を含む、方法。一般式一般式式中、R1は、前記の通りであり、R4は、保護基である。で表される化合物とメチルトリフェニルホスホニウム塩とを塩基の存在下で反応させることにより一般式で表される化合物を得る工程と、一般式で表される化合物、および一般式で表される化合物のアミノをR5で保護した一般式で表される化合物からなる群から選択されるいずれか1つを閉環メタセシス反応に供し、その後、R4および存在する場合にはR5を脱保護し一般式で表されるvセレンテラミン化合物を得る工程と、一般式で表される化合物と一般式で表される化合物とを反応させて一般式で表される化合物を得る工程を含む、方法。前記工程において、塩基として、n-ブチルリチウム、カリウム-tert-ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、およびリチウムジイソプロピルアミドから選択される少なくとも1つの塩基を用いる、請求項1または2に記載の方法。前記工程において、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、シクロプロピルメチルエーテル、tertブチルメチルエーテル、ジオキサン、およびトルエンから選択される少なくとも1つの溶媒を用いる、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記工程の反応温度および反応時間を、0°C~40°Cで1時間~4時間とする、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記工程の閉環メタセシス反応の触媒として、第二世代HoveydaGrubbs触媒を用いる、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。前記工程の閉環メタセシス反応の溶媒として、ジクロロエタン、ジクロロメタン、クロロホルム、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、およびジメトキシエタンから選択される少なくとも1つの溶媒を用いる、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。前記工程の閉環メタセシス反応の反応温度および反応時間を、25°C~110°Cで1時間~48時間とする、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。前記式中、R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリールアルケニル、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキル、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルケニル、脂肪族環基、複素環基、または脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキニルである、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。前記式中、R2およびR3は、それぞれ独立して、水素、水酸基、ハロゲン、脂肪族環基によって置換されていてもよい炭素数1~4のアルキル、トリフルオロメチル、またはアルコキシルである、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。前記式中、R4は、メチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、4メトキシベンジル、tert-ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、フェニルジメチルシリル、tert-ブチルジフェニルシリル、またはトリイソプロピルシリルである、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。前記式中、R5は、アセチル、ベンゾイル、pトシル、tertブトキシカルボニル、またはベンジルオキシカルボニルである、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。前記式中、R2 ́およびR3 ́の水酸基を保護する保護基は、それぞれ独立して、tert-ブチルジメチルシリル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、トリメチルシリル、フェニルジメチルシリル、トリエチルシリル、フェニルジメチルシリル、tert-ブチルジフェニルシリル、またはトリイソプロピルシリルである、請求項2~12のいずれか1項に記載の方法。前記一般式で表される化合物が、2アミノ35ジブロモ6クロロピラジンと、R1MgX式R1は、前記の通りであり、Xは、ハロゲンである。およびZnCl2とを、パラジウム触媒の存在下で反応させることにより一般式式中、R1は前記の通りである。で表される化合物を得ることと、一般式で表される化合物と、式式中、R4は前記の通りである。で表される化合物とをパラジウム触媒と塩基の存在下で反応させることにより一般式式中、R1およびR4は前記の通りである。で表される化合物を得ることと、一般式で表される化合物と、トリブチルスズとをパラジウム触媒の存在下で反応させること、により得られる、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。上記状況において、vセレンテラジン化合物の簡便な製造方法が求められていた。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、vセレンテラジンの他、多様なvセレンテラジン類縁体の製造にも適用可能な柔軟性が高く簡便な製造方法の開発に成功した。すなわち、本発明は、以下に示す、vセレンテラジン化合物の製造方法などを提供する。1一般式式中、R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換の炭化水素基、または置換もしくは非置換の複素環基である。で表されるvセレンテラミン化合物の製造方法であって、一般式式中、R1は、前記の通りであり、R4は、保護基である。で表される化合物とメチルトリフェニルホスホニウム塩とを塩基の存在下で反応させることにより一般式で表される化合物を得る工程と、一般式で表される化合物、および一般式で表される化合物のアミノをR5で保護した一般式で表される化合物からなる群から選択されるいずれか1つを閉環メタセシス反応に供し、その後、R4および存在する場合にはR5を脱保護する工程を含む、方法。2一般式一般式式中、R1は、前記の通りであり、R4は、保護基である。で表される化合物とメチルトリフェニルホスホニウム塩とを塩基の存在下で反応させることにより一般式で表される化合物を得る工程と、一般式で表される化合物、および一般式で表される化合物のアミノをR5で保護した一般式で表される化合物からなる群から選択されるいずれか1つを閉環メタセシス反応に供し、その後、R4および存在する場合にはR5を脱保護し一般式で表されるvセレンテラミン化合物を得る工程と、一般式で表される化合物と一般式で表される化合物とを反応させて一般式で表される化合物を得る工程を含む、方法。3前記工程において、塩基として、n-ブチルリチウム、カリウム-tert-ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、およびリチウムジイソプロピルアミドから選択される少なくとも1つの塩基を用いる、上記1または2に記載の方法。4前記工程において、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、シクロプロピルメチルエーテル、tertブチルメチルエーテル、ジオキサン、およびトルエンから選択される少なくとも1つの溶媒を用いる、上記1~3のいずれか1項に記載の方法。5前記工程の反応温度および反応時間を、0°C~40°Cで1時間~4時間とする、上記1~4のいずれか1項に記載の方法。6前記工程の閉環メタセシス反応の触媒として、第二世代HoveydaGrubbs触媒を用いる、上記1~5のいずれか1項に記載の方法。7前記工程の閉環メタセシス反応の溶媒として、ジクロロエタン、ジクロロメタン、クロロホルム、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、およびジメトキシエタンから選択される少なくとも1つの溶媒を用いる、上記1~6のいずれか1項に記載の方法。8前記工程の閉環メタセシス反応の反応温度および反応時間を、25°C~110°Cで1時間~48時間とする、上記1~7のいずれか1項に記載の方法。9前記式中、R1は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、置換もしくは非置換のアリールアルケニル、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキル、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルケニル、脂肪族環基、複素環基、または脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキニルである、上記1~8のいずれか1項に記載の方法。10前記式中、R2およびR3は、それぞれ独立して、水素、水酸基、ハロゲン、脂肪族環基によって置換されていてもよい炭素数1~4のアルキル、トリフルオロメチル、またはアルコキシルである、上記1~9のいずれか1項に記載の方法。11前記式中、R4は、メチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、4メトキシベンジル、tert-ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、フェニルジメチルシリル、tert-ブチルジフェニルシリル、またはトリイソプロピルシリルである、上記1~10のいずれか1項に記載の方法。12前記式中、R5は、アセチル、ベンゾイル、pトシル、tertブトキシカルボニル、またはベンジルオキシカルボニルである、上記1~11のいずれか1項に記載の方法。13前記式中、R2 ́およびR3 ́の水酸基を保護する保護基は、それぞれ独立して、tert-ブチルジメチルシリル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、トリメチルシリル、フェニルジメチルシリル、トリエチルシリル、フェニルジメチルシリル、tert-ブチルジフェニルシリル、またはトリイソプロピルシリルである、上記2~12のいずれか1項に記載の方法。14前記一般式で表される化合物が、2アミノ35ジブロモ6クロロピラジンと、R1MgX式R1は、前記の通りであり、Xは、ハロゲンである。およびZnCl2とを、パラジウム触媒の存在下で反応させることにより一般式式中、R1は前記の通りである。で表される化合物を得ることと、一般式で表される化合物と、式式中、R4は前記の通りである。で表される化合物とをパラジウム触媒と塩基の存在下で反応させることにより一般式式中、R1およびR4は前記の通りである。で表される化合物を得ることと、一般式で表される化合物と、トリブチルスズとをパラジウム触媒の存在下で反応させること、により得られる、上記1~13のいずれか1項に記載の方法。本発明によれば、vセレンテラジン化合物を簡便に製造する方法が提供される。本発明の好ましい態様によれば、vセレンテラジン化合物を高収率で製造することができる。以下、本発明について詳細に説明する。1vセレンテラジン化合物本発明は、下記一般式で表される化合物を提供する。、水酸基、炭素数1~6個のアルキル、炭素数1~6個のアルコキシル、アミノ、炭素数1~6個のジアルキルアミノなどからなる群から選択される少なくとも1つが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、置換基は水酸基である。置換もしくは非置換のアリールは、具体的には、フェニル、p-ヒドロキシフェニル、p-アミノフェニル、p-ジメチルアミノフェニルなどであり、好ましくは、フェニル、p-ヒドロキシフェニルなどである。本発明のいくつかの態様では、置換もしくは非置換のアリールは、非置換のアリールであり、例えば、フェニルなどである。R1の置換もしくは非置換のアリールアルキルは、例えば1~5個の置換基を有する炭素数7~10個のアリールアルキル、または非置換の炭素数7~10個のアリールアルキルである。置換基としては、例えば、ハロゲン、水酸基、炭素数1~6個のアルキル、炭素数1~6個のアルコキシル、アミノ、炭素数1~6個のジアルキルアミノなどが挙げられる。置換もしくは非置換のアリールアルキルは、例えば、ベンジル、α-ヒドロキシベンジル、フェニルエチル、p-ヒドロキシベンジル、p-ジメチルアミノベンジルなどであり、好ましくは、ベンジル、α-ヒドロキシベンジル、フェニルエチルなどである。本発明のいくつかの態様では、置換もしくは非置換のアリールアルキルは、ベンジルである。R1の置換もしくは非置換のアリールアルケニルは、例えば1~5個の置換基を有する炭素数8~10個のアリールアルケニル、または非置換の炭素数8~10個のアリールアルケニルである。置換基としては、例えば、ハロゲン、水酸基、炭素数1~6個のアルキル、炭素数1~6個のアルコキシル、アミノ、炭素数1~6個のジアルキルアミノなどが挙げられる。置換もしくは非置換のアリールアルケニルは、例えば、フェニルビニル、p-ヒドロキシフェニルビニル、p-ジメチルアミノフェニルビニルなどである。本発明のいくつかの態様では、置換もしくは非置換のアリールアルケニルは、非置換のアリールアルケニルであり、例えば、フェニルビニルなどである。R1の脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキルは、例えば、非置換の直鎖もしくは分枝鎖の炭素数1~4個のアルキル、または例えば1~10個の脂肪族環基によって置換された直鎖もしくは分枝鎖の炭素数1~4個のアルキルである。脂肪族環基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、シクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチルなどである。脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピル、2-メチルプロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、シクロブチルメチル、シクロプロピルメチルなどであり、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、2-メチルプロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチルなどである。本発明のいくつかの態様では、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキルは、脂肪族環基によって置換されていてもよい直鎖のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、プロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチルなどである。R1の脂肪族環基によって置換されていてもよいアルケニルは、非置換の直鎖もしくは分枝鎖の炭素数2~6個のアルケニル、または例えば1~10個の脂肪族環基によって置換された直鎖もしくは分枝鎖の炭素数2~6個のアルケニルである。脂肪族環基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、シクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチルなどである。脂肪族環基によって置換されていてもよいアルケニルは、例えば、ビニル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、2-メチルプロペニルなどであり、好ましくは、2-メチルプロペニルなどである。R1の脂肪族環基は、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、シクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環基は、シクロヘキシルなどである。R1の複素環基は、環を構成する原子として炭素以外にN、O、およびSからなる群から選択される1~3個の原子を含む例えば5~7員環であって炭素を介して結合する基、または2つ以上のそのような環が縮環したものであって炭素を介して結合する基、もしくはそのような環とベンゼン環が縮環したものであって炭素を介して結合する基である。複素環基は、例えば、チオフェン-2-イル、2フラニル、4ピリジルなどである。本発明のいくつかの態様では、複素環基は、硫黄を含む複素環基であり、例えば、チオフェン-2-イルである。R1の脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキニルは、非置換の直鎖もしくは分枝鎖の炭素数2~6個のアルキニル、または例えば1~10個の脂肪族環基によって置換された直鎖もしくは分枝鎖の炭素数2~6個のアルキニルである。脂肪族環基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、シクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチルなどである。脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、2-メチルプロピニルなどであり、好ましくは、2-メチルプロピニルなどである。本発明の好ましい態様によれば、R1は、フェニル、p-ヒドロキシフェニル、ベンジル、α-ヒドロキシベンジル、フェニルエチル、フェニルビニル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、メチル、エチル、プロピル、2-メチルプロピル、2-メチルプロペニル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、またはチオフェン-2-イルである。本発明のさらに好ましい態様によれば、R1は、ベンジルである。R2のハロゲンは、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素である。本発明の好ましい態様によれば、ハロゲンは、フッ素である。R2の脂肪族環基によって置換されていてもよい炭素数1~4のアルキルは、例えば、非置換の直鎖もしくは分枝鎖の炭素数1~4個のアルキル、または例えば1~10個の脂肪族環基によって置換された直鎖もしくは分枝鎖の炭素数1~4個のアルキルである。脂肪族環基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、シクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチルなどである。脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピル、2-メチルプロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、シクロブチルメチル、シクロプロピルメチルなどであり、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、2-メチルプロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチルなどである。本発明のいくつかの態様では、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキルは、脂肪族環基によって置換されていてもよい直鎖のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、プロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチルなどである。R2のアルコキシルは、例えば、炭素数1~6個の直鎖または分枝鎖のアルコキシである。アルコキシは、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、iso-プロポキシ、sec-プロポキシ、n-ブトキシ、iso-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、n-ペンチルオキシ、iso-ペンチルオキシ、sec-ペンチルオキシ、1,1-ジメチルプロピルオキシ、1,2-ジメチルプロポキシ、2,2-ジメチルプロピルオキシ、n-ヘキソキシ、1-エチルプロポキシ、2-エチルプロポキシ、1-メチルブトキシ、2-メチルブトキシ、iso-ヘキソキシ、1-メチル-2-エチルプロポキシ、1-エチル-2-メチルプロポキシ、1,1,2-トリメチルプロポキシ、1,1,2-トリメチルプロポキシ、1-プロピルプロポキシ、1,1-ジメチルブトキシ、1,2-ジメチルブトキシ、2,2-ジメチルブトキシ、2,3-ジメチルブチルオキシ、1,3-ジメチルブチルオキシ、2-エチルブトキシ、1,3-ジメチルブトキシ、2-メチルペントキシ、3-メチルペントキシ、ヘキシルオキシなどである。本発明のいくつかの態様では、アルコキシは、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、iso-プロポキシ、sec-プロポキシ、n-ブトキシ、iso-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシなどであり、好ましくは、メトキシである。本発明の好ましい態様によれば、R2は、水素、水酸基、メチル、エチル、プロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、トリフルオロメチル、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、iso-プロポキシ、sec-プロポキシ、n-ブトキシ、iso-ブトキシ、sec-ブトキシ、またはtert-ブトキシである。本発明のさらに好ましい態様によれば、R2は、水酸基、またはトリフルオロメチルである。R3のハロゲンは、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素である。本発明の好ましい態様によれば、ハロゲンは、フッ素である。R3の脂肪族環基によって置換されていてもよい炭素数1~4のアルキルは、例えば、非置換の直鎖もしくは分枝鎖の炭素数1~4個のアルキル、または例えば1~10個の脂肪族環基によって置換された直鎖もしくは分枝鎖の炭素数1~4個のアルキルである。脂肪族環基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、シクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチルなどである。脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピル、2-メチルプロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、シクロブチルメチル、またはシクロプロピルメチルなどであり、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、2-メチルプロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチルなどである。本発明のいくつかの態様では、脂肪族環基によって置換されていてもよいアルキルは、脂肪族環基によって置換されていてもよい直鎖のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、プロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチルなどである。R3のアルコキシルは、例えば、炭素数1~6個の直鎖または分枝鎖のアルコキシであるアルコキシは、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、iso-プロポキシ、sec-プロポキシ、n-ブトキシ、iso-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、n-ペンチルオキシ、iso-ペンチルオキシ、sec-ペンチルオキシ、1,1-ジメチルプロピルオキシ、1,2-ジメチルプロポキシ、2,2-ジメチルプロピルオキシ、n-ヘキソキシ、1-エチルプロポキシ、2-エチルプロポキシ、1-メチルブトキシ、2-メチルブトキシ、iso-ヘキソキシ、1-メチル-2-エチルプロポキシ、1-エチル-2-メチルプロポキシ、1,1,2-トリメチルプロポキシ、1,1,2-トリメチルプロポキシ、1-プロピルプロポキシ、1,1-ジメチルブトキシ、1,2-ジメチルブトキシ、2,2-ジメチルブトキシ、2,3-ジメチルブチルオキシ、1,3-ジメチルブチルオキシ、2-エチルブトキシ、1,3-ジメチルブトキシ、2-メチルペントキシ、3-メチルペントキシ、ヘキシルオキシなどである。本発明のいくつかの態様では、アルコキシは、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、iso-プロポキシ、sec-プロポキシ、n-ブトキシ、iso-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシなどであり、好ましくは、メトキシである。本発明の好ましい態様によれば、R3は、水素、水酸基、フッ素、メチル、エチル、プロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、トリフルオロメチル、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、iso-プロポキシ、sec-プロポキシ、n-ブトキシ、iso-ブトキシ、sec-ブトキシ、またはtert-ブトキシである。本発明のさらに好ましい態様によれば、R3は、水素である。本発明のいくつかの態様によれば、一般式において、R1は、ベンジルであり、R2は、水酸基、またはトリフルオロメチルであり、R3は、水素である。本発明のある態様によれば、一般式で表される化合物は、下記式で表される化合物である。本発明の別の態様によれば、一般式で表される化合物は、下記式で表される化合物である。さらに、本発明は、下記一般式で表される化合物を提供する。式中、R1は、上記一般式で説明した通りである。本発明のある態様によれば、一般式で表される化合物は、下記式で表される化合物である2本発明のvセレンテラミン化合物またはvセレンテラジン化合物の製造方法一般式で表される化合物の製造方法、および一般式で表される化合物の製造方法について説明する。以下の製造方法の説明において、R1~R3は、前記の通りである。R2 ́およびR3 ́は、それぞれ独立して、水素、水酸基、アルコキシル、ハロゲン、置換もしくは非置換の炭化水素基、または保護された水酸基である。R2 ́およびR3 ́の保護基によって保護された水酸基における保護基は、例えば、tert-ブチルジメチルシリル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、フェニルジメチルシリル、tert-ブチルジフェニルシリル、またはトリイソプロピルシリルであり、好ましくは、tert-ブチルジメチルシリルである。R2 ́およびR3 ́のアルコキシル、ハロゲン、および置換もしくは非置換の炭化水素基は、R2およびR3 ́でそれぞれ説明した通りである。R2 ́は、好ましくは、tert-ブチルジメチルシリルオキシである。R3 ́は、好ましくは、水素である。R4は、保護基であり、例えば、メチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、4メトキシベンジル、tert-ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、フェニルジメチルシリル、tert-ブチルジフェニルシリル、またはトリイソプロピルシリルであり、好ましくは、メチルである。R5は、保護基であり、例えば、アセチル、ベンゾイル、pトシル、tertブトキシカルボニル、またはベンジルオキシカルボニルであり、好ましくは、R5は、アセチルである。Xはハロゲンであり、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素である。Xは、好ましくは、臭素である。21一般式で表される化合物の製造方法一般式で表される化合物は、一般式で表される化合物から、次のようにして製造することができる。最初の工程では、Wittig反応によって、一般式で表される化合物のホルミルをメチレン化する。すなわち、一般式で表される化合物とメチルトリフェニルホスホニウム塩とを塩基の存在下で反応させることにより一般式で表される化合物を得る。メチルトリフェニルホスホニウム塩は、好ましくは、メチルトリフェニルホスホニウムブロミドである。Wittig反応で用いられる塩基の具体例としては、n-ブチルリチウム、カリウム-tert-ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、リチウムジイソプロピルアミドなどが挙げられる。また、反応で用いられる溶媒の具体例としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、シクロプロピルメチルエーテル、tertブチルメチルエーテル、ジオキサン、トルエンなどが挙げられる。これらの溶媒は適宜選択でき、単独で用いてもよく、混合溶媒として用いてもよい。反応温度および反応時間は、特に限定されないが、例えば、0°C~40°Cで1時間~4時間、好ましくは、10°C~30°Cで1時間~3時間、特に好ましくは、10°C~20°Cで1時間~2時間である。次の工程では、一般式で表される化合物、および一般式で表される化合物のアミノをR5で保護した一般式で表される化合物からなる群から選択されるいずれか1つを閉環メタセシス反応に供し、その後R4および存在する場合にはR5を脱保護する。これにより、一般式で表される化合物を得る。一般式で表される化合物を次の閉環メタセシス反応に供する場合には、先ず、一般式で表される化合物中のアミノをR5で保護し、一般式で表される化合物を得る。アミノのR5による保護は、具体的には、次のように行う。トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、4ジメチルアミノピリジンなどの塩基存在下、一般式で表される化合物を、塩化アセチル、無水酢酸、塩化ベンゾイル、二炭酸ジtブチル、クロロギ酸ベンジルなどと反応させることで行う。より具体的には、R5がアセチルである化合物は、後述の合成例に記載の方法を用いて得ることができる。反応で用いられる溶媒の具体例としては、ピリジン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、トルエンなどが挙げられる。これらの溶媒は適宜選択でき、単独で用いてもよく、混合溶媒として用いてもよい。反応温度および反応時間は、特に限定されないが、例えば、0°C~100°Cで1時間~24時間、好ましくは、20°C~70°Cで1時間~12時間、特に好ましくは、50°C~60°Cで1時間~2時間である。次に、一般式で表される化合物、および一般式で表される化合物からなる群から選択されるいずれか1つについて閉環メタセシス反応を行うことにより三環式芳香族化合物を得る。すなわち、一般式で表される化合物または一般式で表される化合物の閉環メタセシス反応を、Grubbs触媒またはHoveydaGrubbs触媒の存在下で行い、一般式で表される化合物または一般式で表される化合物を得る。本発明の好ましい態様では、閉環メタセシスに供する化合物として、一般式で表される化合物を用いる。一般式で表される化合物を用いることで、より収率よく、一般式で表される化合物を得ることができる。閉環メタセシス反応で用いられるGrubbs触媒またはHoveydaGrubbs触媒としては、第一世代Grubbs触媒、第二世代Grubbs触媒、第一世代HoveydaGrubbs触媒、第二世代HoveydaGrubbs触媒などが挙げられ、好ましくは、第二世代HoveydaGrubbs触媒が挙げられる。反応で用いられる溶媒の具体例としては、ジクロロエタン、ジクロロメタン、クロロホルム、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジメトキシエタンなどが挙げられる。これらの溶媒は適宜選択でき、単独で用いてもよく、混合溶媒として用いてもよい。反応温度および反応時間は、特に限定されないが、例えば、25°C~110°Cで1時間~48時間、好ましくは、50°C~110°Cで1時間~24時間、特に好ましくは、90°C~100°Cで12時間~18時間である。そして、上記にて一般式で表される化合物が得られた場合には、一般式で表される化合物のR4を脱保護して一般式で表される化合物を得る。R4の脱保護は、具体的には、次のように行う。ルイス酸もしくはブレンステッド酸を作用させることで行う。より具体的には、R4がメチルである場合の脱保護は、後述の合成例に記載の方法を用いて行うことができる。反応で用いられる溶媒の具体例としては、ピリジン、テトラヒドロフラン、トルエン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、水などが挙げられる。これらの溶媒は適宜選択でき、単独で用いてもよく、混合溶媒として用いてもよく、溶媒を用いなくてもよい。反応温度および反応時間は、特に限定されないが、例えば、0°C~300°Cで01時間~60時間、好ましくは、30°C~250°Cで05時間~12時間、特に好ましくは、180°C~220°Cで05時間~1時間である。一方、上記にて一般式で表される化合物が得られた場合には、一般式で表される化合物のR4を脱保護して一般式で表される化合物を得る。R4の脱保護は、具体的には、次のように行う。ルイス酸もしくはブレンステッド酸を作用させることで行う。より具体的には、R4がメチルである場合の脱保護は、後述の合成例に記載の方法を用いて行うことができる。反応で用いられる溶媒の具体例としては、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン、メタノールなどが挙げられる。これらの溶媒は適宜選択でき、単独で用いてもよく、混合溶媒として用いてもよい。反応温度および反応時間は、特に限定されないが、例えば、0°C~50°Cで1時間~24時間、好ましくは、0°C~30°Cで2時間~6時間、特に好ましくは、0°C~20°Cで2時間~4時間である。さらに、一般式で表される化合物のR6を脱保護して一般式で表される化合物を得る。R5の脱保護は、具体的には、次のように行う。炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウムなどの塩基存在下、溶媒中で加熱することで行う。より具体的には、R5がアセチルである場合の脱保護は、後述の合成例に記載の方法を用いて行うことができる。反応で用いられる溶媒の具体例としては、メタノール、エタノール、nブタノール、tブタノール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、水などが挙げられる。これらの溶媒は適宜選択でき、単独で用いてもよく、混合溶媒として用いてもよい。反応温度および反応時間は、特に限定されないが、例えば、40°C~100°Cで1時間~24時間、好ましくは、50°C~80°Cで2時間~24時間、特に好ましくは、60°C~70°Cで12時間~16時間である。22一般式で表される化合物の製造方法一般式で表される化合物は、一般式で表される化合物から、次のようにして製造することができる。一般式で表される化合物の製造方法は、前記の通りである。そして、一般式で表される化合物と一般式で表される化合物とを反応させて一般式で表される化合物を得る。一般式で表される化合物は公知の方法で製造することができる。具体的には、AdamczykMetalSynthCommun3231993205、またはBaganzHMayHJChemBer9937663770およびBaganzHMayHJAngewChemIntEdEng5420に記載の方法、あるいは、それらに準ずる方法で製造することができる。より具体的には、置換ベンジルGrignard反応剤をジエトキシ酢酸エチルと低温で反応させるか、またはエタノール中でαジアゾα’置換フェニルケトンに次亜塩素酸tertブチルを作用させることで、一般式で表わされる化合物を製造することができる。一般式で表される化合物を得るための反応において使用される溶媒は、特に限定されず、種々のものを使用できる。例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エーテル、メタノール、エタノール、水などであり、これらは単独でまたは混合して使用することができる。また、反応温度および反応時間は、特に限定されないが、例えば、0°C~200°Cで1時間~96時間、室温~150°Cで3時間~72時間、または60°C~120°Cで6時間~24時間である。23一般式で表される化合物の製造方法前記一般式で表される化合物は、例えば、式で表される化合物から次のように製造することができる。最初の工程では、式で表される化合物に対して、有機亜鉛化合物との根岸カップリングを行う。具体的には、式で表される化合物と、R1MgXおよびZnCl2とを、パラジウム触媒の存在下で反応させることにより一般式で表される化合物を得る。式で表される化合物は、WO2003059893号に記載されている化合物であり、例えば、後述の合成例に記載の方法により合成することができる。R1MgClは、公知の合成法により合成したものを用いてもよいし、市販のものを用いてもよい。根岸カップリングで用いられるパラジウム触媒の具体例は、Pd4、PdCl22、Pd2、トリス二パラジウム、トリス二パラジウムクロロホルム錯体、ビス二パラジウム、ビスパラジウム、フェロセンジクロロパラジウムなどである。さらに、この反応で用いられる溶媒の具体例は、ベンゼン、トルエン、キシレン、N,N-ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジエチルエ-テル、t-ブチルメチルエ-テル、1,4-ジオキサンなどである。これらの溶媒は適宜選択でき、単独で用いてもよく、混合溶媒として用いてもよい。反応温度および反応時間は、特に限定されないが、例えば、0°C~50°Cで1時間~24時間、好ましくは、10°C~40°Cで2時間~24時間、特に好ましくは、20°C~30°Cで6時間~16時間である。次の工程では、ボロン酸との鈴木宮浦カップリングにより、5位選択的に一般式で表される化合物をアリール化する。具体的には、一般式で表される化合物と、式で表される化合物とをパラジウム触媒と塩基の存在下で反応させることにより一般式で表される化合物を得る。一般式で表される化合物は、市販のものを使用してもよいし、公知の合成法により合成したものを使用してもよい。鈴木宮浦カップリングで用いられるパラジウム触媒の具体例は、アリルパラジウムクロリド、Pd4、PdCl22、Pd2、トリス二パラジウム、トリス二パラジウムクロロホルム錯体、ビス二パラジウムなどである。反応を促進するため、場合によりこれらのパラジウム触媒にホスフィン化合物を加えてもよい。そのホスフィン化合物の具体例は、2--1-フェニルインドール、トリホスフィン、トリシクロヘキシルホスフィン、1--2-フェロセン、1--2-フェロセン、1--2-フェロセン、1,1’-ビスフェロセン、2,2’-ビス-1,1’-ビナフチル、2-メトキシ-2’--1,1’-ビナフチル、2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2’,6’-ジメトキシビフェニルなどである。この反応で用いられる塩基の具体例は、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、ナトリウムエトキシド、ナトリウムt-ブトキシド、酢酸ナトリウム、リン酸三カリウム、フッ化カリウムなどである。さらに、この反応で用いられる溶媒の具体例は、ベンゼン、トルエン、キシレン、N,N-ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジエチルエ-テル、t-ブチルメチルエ-テル、1,4-ジオキサン、メタノ-ル、エタノール、イソプロピルアルコ-ル、水などである。これらの溶媒は適宜選択でき、単独で用いてもよく、混合溶媒として用いてもよい。反応温度および反応時間は、特に限定されないが、例えば、0°C~50°Cで1時間~24時間、好ましくは、10°C~40°Cで2時間~24時間、特に好ましくは、20°C~30°Cで6時間~16時間である。次の工程では、ビニル化合物とのStilleカップリングによって、一般式で表される化合物のピラジン環の6位をビニル化する。具体的には、一般式で表される化合物と、トリブチルスズとをパラジウム触媒の存在下で反応させることにより一般式で表される化合物を得る。トリブチルスズは、市販のものを使用してもよいし、公知の方法により合成したものを使用してもよい。Stilleカップリングに用いられるパラジウム触媒の具体例は、Pd4、PdCl22、Pd2、トリス二パラジウム、トリス二パラジウムクロロホルム錯体、ビス二パラジウムなどである。反応を促進するため、場合により、これらのパラジウム触媒に、テトラnブチルアンモニウムクロリド、テトラnブチルアンモニウムブロミド、テトラnブチルアンモニウムヨージドなどを加えてもよく、また、副生成物の生成を抑制するため、2、6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノールBHTなどの重合禁止剤を加えてもよい。さらに、この反応で用いられる溶媒の具体例は、ベンゼン、トルエン、キシレン、N,N-ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジエチルエ-テル、t-ブチルメチルエ-テル、1,4-ジオキサンなどである。これらの溶媒は適宜選択でき、単独で用いてもよく、混合溶媒として用いてもよい。反応温度および反応時間は、特に限定されないが、例えば、60°C~120°Cで1時間~24時間、好ましくは、80°C~110°Cで1時間~12時間、特に好ましくは、100°C~110°Cで1時間~2時間である。3カルシウム結合型発光蛋白質の製造方法本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、一般式で表わされる化合物と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを接触させて、カルシウム結合型発光蛋白質を得ることにより、製造または再生することができる。ここで、接触とは、vセレンテラジン化合物とカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、vセレンテラジン化合物を収容した容器にカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を添加すること、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を収容した容器にvセレンテラジン化合物を添加すること、またはvセレンテラジン化合物とカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを混合すること、などが含まれる。本発明の1つの態様によれば、接触は、還元剤および酸素の存在下、低温で行う。より具体的には、本発明の発光蛋白質は、例えば、ShimomuraOetalBiochemJ251405410、およびShimomuraOetalBiochemJ261913920などに記載の方法によって製造または再生することができる。本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、酸素存在下において、vセレンテラジン化合物と分子状酸素から生成するvセレンテラジン化合物のペルオキシドと、アポ蛋白質とが複合体を形成した状態で存在する。前記複合体にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、vセレンテラジン化合物の酸化物であるvセレンテラミド化合物と二酸化炭素を生成する。前記複合体を本発明の発光蛋白質と称することがある。本発明の発光蛋白質を製造するのに用いるアポ蛋白質は、例えば、アポイクオリン、アポクライティン-I、アポクライティン-II、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン、またはアポベルボインなどである。本発明のいくつかの態様では、アポ蛋白質は、アポイクオリン、アポオベリン、アポクライティン-I、アポクライティン-II、またはマイトロコミンなどであり、例えば、アポイクオリンである。アポ蛋白質は、天然から採取したものであっても、遺伝子工学的に製造したものであってよい。さらに、アポ蛋白質は、カルシウム結合型発光蛋白質を製造できるものであれば、そのアミノ酸配列を天然のものから遺伝子組換え技術によって変異させたものであってもよい。天然から採取した発光蛋白質のアポ蛋白質の塩基配列およびアミノ酸配列は、次の通りである。すなわち、天然型アポイクオリンの塩基配列を配列番号:1に、アミノ酸配列を配列番号:2に示す。天然型アポクライティン-Iの塩基配列を配列番号:3に、アミノ酸配列を配列番号:4に示す。天然型アポクライティン-IIの塩基配列を配列番号:5に、アミノ酸配列を配列番号:6に示す。天然型アポマイトロコミンの塩基配列を配列番号:7に、アミノ酸配列を配列番号:8に示す。天然型アポオベリンの塩基配列を配列番号:9に、アミノ酸配列を配列番号:10に示す。天然型アポベルボインの塩基配列を配列番号:11に、アミノ酸配列を配列番号:12に示す。組換え技術によって変異させたアポ蛋白質は、例えば、以下の~からなる群から選択される蛋白質である。天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列において1~複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性もしくは機能を有する蛋白質、天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列に対して90以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性もしくは機能を有する蛋白質、および天然型アポ蛋白質の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性もしくは機能を有する蛋白質。上記天然型アポ蛋白質は、例えば、アポイクオリン、アポクライティン-I、アポクライティン-II、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン、またはアポベルボインなどである。本発明のある態様では、アポ蛋白質は、アポオベリン、アポクライティン-I、アポクライティン-II、またはマイトロコミンなどであり、好ましくは、アポイクオリンである。これらの天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列または塩基配列は、前記の通りである。上記カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性もしくは機能とは、例えば、アポ蛋白質がvセレンテラジン化合物のペルオキシドと結合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成する活性または機能を意味する。蛋白質がvセレンテラジン化合物のペルオキシドと結合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成するとは、具体的には、蛋白質が、vセレンテラジン化合物のペルオキシドと結合して発光蛋白質を形成すること、だけではなく蛋白質が、酸素存在下に、vセレンテラジン化合物と接触することにより、蛋白質とvセレンテラジン化合物のペルオキシドとを含有する発光蛋白質を形成すること、をも意味する。ここで、接触とは、蛋白質とvセレンテラジン化合物とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、vセレンテラジン化合物を収容した容器に蛋白質を添加すること、蛋白質を収容した容器にvセレンテラジン化合物を添加すること、または蛋白質とvセレンテラジン化合物とを混合すること、などが含まれる。また、vセレンテラジン化合物は、vセレンテラジン、および、vセレンテラジンと同様に、アポ蛋白質として、イクオリンなどのカルシウム結合型発光蛋白質を構成しうる化合物を指す。具体的には、cf3vセレンテラジンなどである。上記1~複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列における1~複数個の範囲は、例えば、1~20個、1~15個、1~10個、1~9個、1~8個、1~7個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、1個である。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、SambrookJetalMolecularCloningALaboratoryManualThirdEditionColdSpringHarborLaboratoryPress、AusbelFMetalCurrentProtocolsinMolecularBiologySupplement1~38JohnWileyandSons、NucAcidsRes106487、ProcNatlAcadSciUSA796409、Gene34315、NucAcidsRes134431、またはProcNatlAcadSciUSA82488などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。また、上記90以上の同一性を有するアミノ酸配列における90以上の範囲は、例えば、90以上、91以上、92以上、93以上、94以上、95以上、96以上、97以上、98以上、99以上、99.1以上、99.2以上、99.3以上、99.4以上、99.5以上、99.6以上、99.7以上、99.8以上、または99.9以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、BLAST、など参照などの解析プログラムを用いて決定できる。BLASTを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。また、上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、天然型アポ蛋白質の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。具体的には、コロニー或いはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、0.7~1.0mol/LのNaCl存在下、65°Cでハイブリダイゼーションを行った後、0.1~2倍濃度のSSC溶液を用い、65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、SambrookJetalMolecularCloningALaboratoryManualThirdEditionColdSpringHarborLaboratoryPress、AusbelFMetalCurrentProtocolsinMolecularBiologySupplement1~38JohnWileyandSons、またはGloverDMandHamesBDDNACloning1CoreTechniquesApracticalApproachSecondEditionOxfordUniversityPressなどの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで言うストリンジェントな条件は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、および高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。低ストリンジェントな条件は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、05SDS、50ホルムアミド、32°Cの条件である。また、中ストリンジェントな条件は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、05SDS、50ホルムアミド、42°Cの条件である。高ストリンジェントな条件は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、05SDS、50ホルムアミド、50°Cの条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphosDirectLabellingReagentsを用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55°Cの条件下で01SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、BLASTなどの解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、アポ蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60以上、65以上、70以上、75以上、80以上、85以上、88以上、90以上、92以上、95以上、97以上、98以上、99以上、993以上、995以上、997以上、998以上、999以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。本発明で使用することができる組換えアポ蛋白質として、例えば、ShimomuraOandInouyeSProteinExpressPurif169195に記載の組換えイクオリン、InouyeSandSaharaYProteinExpressPurif53384389に記載の組換えクライティンI、またはInouyeSJBiochem143711717に記載の組換えクライティンIIなどを挙げることができる。このようにして得たカルシウム結合型発光蛋白質は、さらに精製に供してもよい。カルシウム結合型発光蛋白質の精製は、通常の分離精製方法に従って行うことができる。分離精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。4.本発明のvセレンテラジン化合物または本発明の発光蛋白質の利用発光基質としての利用本発明のいくつかの態様のvセレンテラジン化合物は、発光触媒酵素の作用により発光するので、発光基質として利用できる。そこで、本発明は、本発明のvセレンテラジン化合物に、発光触媒酵素を接触させることを含む、発光方法を提供する。ここで、接触とは、本発明のvセレンテラジン化合物と発光触媒酵素とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、vセレンテラジン化合物を収容した容器に発光触媒酵素を添加すること、発光触媒酵素を収容した容器にvセレンテラジン化合物を添加すること、またはvセレンテラジン化合物と発光触媒酵素とを混合すること、などが含まれる。本発明の発光方法に用いる発光触媒酵素は、例えば、エビ由来のルシフェラーゼ、ガウシア由来のルシフェラーゼ、レニラ由来のルシフェラーゼ、Pleuromammasp由来のルシフェラーゼ、またはMetridialonga由来のルシフェラーゼである。また、本発明の発光方法に用いる発光触媒酵素は、これらのルシフェラーゼの変異体でもよい。変異体としては、例えば、、LoeningetalProteinEngDesSel19391400記載のレニラルシフェラーゼの変異体LoeningetalNaturemethods4641643記載のレニラルシフェラーゼの変異体WooetalProteinSci17725735記載のレニラルシフェラーゼの変異体などが挙げられる。これらの発光触媒酵素は、例えば、ShimomuraetalBiochemJ251405410、ShimomuraetalBiochemJ261913920、またはShimomuraetalBiochemJ270309312に記載の方法またはそれに準ずる方法で製造することができる。或いは、チッソ株式会社、和光純薬社およびプロメガ社などから各種市販されているので、これらの市販のものを、本発明の発光方法に用いてもよい。ここで、レニラルシフェラーゼのうち、Renillareniformis由来のルシフェラーゼの塩基配列を配列番号:13に、アミノ酸配列を配列番号:14に示す。また、エビルシフェラーゼのうち、Oplophorusgracilorostris由来のルシフェラーゼの塩基配列を配列番号:15に、アミノ酸配列を配列番号:16に示す。さらに、ガウシアルシフェラーゼのうち、Gaussiaprinceps由来のルシフェラーゼの塩基配列を配列番号:17に、アミノ酸配列を配列番号:18に示す。また、InouyeShimomuraBiochemBiophysResCommun233349353記載のレニラルシフェラーゼ変異体の塩基配列を配列番号19に、アミノ酸配列を配列番号20に示す。本発明の一つの態様では、発光触媒酵素として、Renillareniformis由来のルシフェラーゼ、例えば、配列番号:14のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む蛋白質を用いる。本発明の別の態様では、発光触媒酵素として、レニラルシフェラーゼの変異体、例えば、配列番号:20のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む蛋白質を用いる。本発明のいくつかの態様では、発光触媒酵素としてレニラルシフェラーゼの変異体を用いることで、最大発光波長を、Renillareniformis由来のルシフェラーゼに対して、長波長側にシフトさせることができる。これらの発光触媒酵素を本発明のいくつかの態様のvセレンテラジン化合物に接触させることで、発光が生じる。通常発光時間は、001~1時間であるが、条件の選択により、発光時間を更に長時間とすることも、または発光時間を更に短時間とすることも可能である。カルシウムイオンの検出または定量上記のようにして得た本発明の発光蛋白質は、アポ蛋白質と、vセレンテラジン化合物および分子状酸素より生成するvセレンテラジン化合物のペルオキシドとが非共有的な結合を形成したものであり、且つカルシウムイオンの作用によって発光する発光蛋白質である。よって、本発明の発光蛋白質は、カルシウムイオンの検出または定量に使用することができる。カルシウムイオンの検出または定量は、検体溶液を直接発光蛋白質溶液に添加し、発生する発光を測定することにより行うことができる。或いは、検体溶液に発光蛋白質溶液を添加し、発生する発光を測定することにより、カルシウムイオンを検出または定量することもできる。また、前記発光蛋白質は、カルシウムイオンの検出または定量を行う測定系に添加する前に、予めアポ蛋白質の水溶液と本発明のvセレンテラジン化合物とを接触させて生成させたものを用いてもよい。また、測定系中で、アポ蛋白質とvセレンテラジン化合物とを接触させることにより、アポ蛋白質とvセレンテラジン化合物のペルオキシドとからなる発光蛋白質を生成させてもよい。生成した発光蛋白質は、アポ蛋白質と本発明のvセレンテラジン化合物のペルオキシドとの複合体であり、前記複合体はカルシウムイオン濃度依存的に発光する。カルシウムイオンの検出または定量は、カルシウムイオンによる本発明の発光蛋白質の発光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、CentroLB960などを使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、発光蛋白質を用いて、既知のカルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。本発明のvセレンテラジン化合物は、アポ蛋白質とvセレンテラジン化合物のペルオキシドとからなる発光蛋白質を作製し、前記発光蛋白質をマイクロインジェクション法などの手法により細胞内に直接導入することによって、生理的条件下の細胞内カルシウムイオン濃度変化の検出に利用することもできる。本発明のvセレンテラジン化合物は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、アポ蛋白質遺伝子を細胞内で発現させることによって、細胞内で生成させ、さらに、生成したアポ蛋白質に細胞外より本発明のvセレンテラジン化合物を付与することにより、発光蛋白質を生成させるのに用いてもよい。このようにして細胞内に導入した、または細胞内で生成した本発明の発光蛋白質を用いて、外部刺激に対する細胞内のカルシウムイオン濃度の変化を測定することもできる。発光によるレポーター蛋白質などとしての利用本発明の発光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明のvセレンテラジン化合物を接触させ、本発明の発光蛋白質に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。ここで、接触とは、宿主細胞とvセレンテラジン化合物とを同一の培養系反応系に存在させることを意味し、例えば、宿主細胞の培養容器にvセレンテラジン化合物を添加すること、宿主細胞とvセレンテラジン化合物とを混合すること、宿主細胞をvセレンテラジン化合物の存在下で培養することなどが含まれる。本発明のvセレンテラジン化合物は、プロモーターなどの転写活性の測定のために利用することができる。例えば、発光触媒酵素をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明のvセレンテラジン化合物を接触させ、本発明のvセレンテラジン化合物に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。ここで、接触とは、宿主細胞と本発明のvセレンテラジン化合物とを同一の培養系反応系に存在させることを意味し、例えば、宿主細胞の培養容器にvセレンテラジン化合物を添加すること、宿主細胞とvセレンテラジン化合物とを混合すること、宿主細胞をvセレンテラジン化合物の存在下で培養することなどが含まれる。また、発光触媒酵素は、前述のものであり、例えば、レニラルシフェラーゼ、エビルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、およびこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも1つのルシフェラーゼ、好ましくは、レニラルシフェラーゼ変異体である。さらに、本発明は、プロモーターなどの転写活性の測定に使用するためのキットを提供する。本発明のいくつかの態様のキットは、本発明のvセレンテラジン化合物と、発光触媒酵素とを含む。本発明の別の態様のキットは、本発明の発光蛋白質と、セレンテラジン化合物とを含む。セレンテラジン化合物、或いは発光触媒酵素などの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などからなる群から選択される少なくとも1つを用いることができる。本キットは、さらに必要に応じて、専用容器、その他必要なアクセサリー、および説明書などからなる群から選ばれる少なくとも1つを含んでもよい。発光による検出マーカなどとしての利用本発明の発光蛋白質は、発光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、例えば、イムノアッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明の発光蛋白質を化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。また、本発明の検出マーカは、例えば、アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに、本発明のvセレンテラジン化合物を接触させることによって、本発明の発光蛋白質を生成させて、前記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。ここで、接触とは、細胞と本発明のvセレンテラジン化合物などとを同一の培養系反応系に存在させることを意味し、例えば、細胞の培養容器に本発明のvセレンテラジン化合物などを添加すること、細胞と本発明のvセレンテラジン化合物などとを混合すること、宿主細胞を本発明のvセレンテラジン化合物などの存在下で培養することなどが含まれる。また、本発明は、vセレンテラジン化合物と、発光触媒酵素とを用いることを含む、イムノアッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出方法を提供する。この場合、発光触媒酵素を化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。また、検出マーカは、例えば、発光触媒酵素と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに、本発明のvセレンテラジン化合物を接触させることによって、前記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。ここで、接触とは、細胞と本発明のvセレンテラジン化合物とを同一の培養系反応系に存在させることを意味し、例えば、細胞の培養容器に本発明のvセレンテラジン化合物を添加すること、細胞と本発明のvセレンテラジン化合物とを混合すること、宿主細胞を本発明のvセレンテラジン化合物の存在下で培養することなどが含まれる。また、発光触媒酵素は、前述のものであり、例えば、レニラルシフェラーゼ、エビルシフェラーゼ、およびガウシアルシフェラーゼからなる群から選択される少なくとも1つのルシフェラーゼである。このような目的物質などの分布の測定は、発光イメージングなどの検出法などを利用して行うこともできる。なお、アポ蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。さらに、本発明は、イムノアッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に使用するためのキットを提供する。本発明のいくつかの態様のキットは、本発明の発光蛋白質と、セレンテラジン化合物とを含む。本発明の別の態様のキットは、本発明のvセレンテラジン化合物と、発光触媒酵素とを含む。セレンテラジン化合物、或いは発光触媒酵素などの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などからなる群から選択される少なくとも1つを用いることができる。本キットは、さらに必要に応じて、専用容器、その他必要なアクセサリー、および説明書などからなる群から選ばれる少なくとも1つを含んでもよい。アミューズメント用品の材料アポ蛋白質と本発明のvセレンテラジン化合物のペルオキシドとからなる複合体は、微量のカルシウムイオンと結合するだけで発光する。よって、本発明の発光蛋白質は、アミューズメント用品の材料の発光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具などがあげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。生物発光共鳴エネルギー移動法本発明のいくつかの態様のvセレンテラジン化合物は、前記のように、発光触媒酵素の作用により発光するので、生物発光共鳴エネルギー移動法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の解析などの分析方法に利用することができる。また、本発明の発光蛋白質も、生物発光共鳴エネルギー移動法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定などの分析方法に利用することができる。例えば、本発明のいくつかの態様のvセレンテラジン化合物と発光触媒酵素とをドナー蛋白質として使用し、有機化合物または蛍光蛋白質をアクセプター蛋白質として使用して、両者の間で生物発光共鳴エネルギー移動を起こすことにより蛋白質間の相互作用を検出することができる。ここで、発光触媒酵素は、前述のものであり、例えば、レニラルシフェラーゼ、エビルシフェラーゼ、およびガウシアルシフェラーゼからなる群から選択される少なくとも1つのルシフェラーゼである。或いは本発明の発光蛋白質をドナー蛋白質として使用し、有機化合物または蛍光蛋白質をアクセプター蛋白質として使用して、両者の間で生物発光共鳴エネルギー移動を起こすことにより蛋白質間の相互作用を検出することができる。本発明のある態様では、アクセプター蛋白質として使用する有機化合物は、Hoechist3342、Indo1またはDAP1などである。本発明の別の態様では、アクセプター蛋白質として使用する蛍光蛋白質は、緑色蛍光蛋白質、青色蛍光蛋白質、変異GFP蛍光蛋白質またはフィコビリンなどである。本発明の好ましい態様において、解析する生理機能は、オーファン受容体、アポトーシス、または遺伝子発現による転写調節などである。また、本発明の好ましい態様において、分析する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼまたはリン酸化酵素などである。BRET法による生理機能の解析は、公知の方法で行うことができ、例えば、BiochemJ2005385625637、またはExpertOpinTherTarets200711541556などに記載の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことができ、例えば、NatMethods20063165174、またはBiotechnolJ20083311324などに記載の方法に準じて行うことができる。さらに、本発明は、上記分析方法に使用するためのキットを提供する。キットは、本発明のvセレンテラジン化合物と、発光触媒酵素と、有機化合物および/または蛍光蛋白質とを含む。vセレンテラジン化合物、発光触媒酵素、並びに有機化合物および蛍光蛋白質などの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などからなる群から選択される少なくとも1つを用いることができる。本キットは、さらに必要に応じて、専用容器、その他必要なアクセサリー、および説明書などからなる群から選ばれる少なくとも1つを含んでもよい。なお、本明細書に記載した全ての文献および刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。また、本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態および具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。以下、合成例および実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの合成例および実施例に限定されるものではない。合成例概要本合成例に例示するvセレンテラジン化合物の製造方法は、多様なvセレンテラジン類縁体の製造に適用可能な柔軟性の高い高効率製造方法である。すなわち、本合成例では、まず、市販の2クロロ6アミノピラジン3のジブロモ化により合成した既知化合物4に対して、ベンジル亜鉛試薬との根岸カップリングを行ったところ、化合物4にベンジル基を導入し、化合物5を得ることができた。次に、化合物5とボロン酸6との鈴木宮浦カップリングにより5位選択的に化合物5をアリール化して化合物7を得た後、ビニルスズとのStilleカップリングによって化合物7の6位をビニル化することにより、化合物8を得ることに成功した。これら3種類のカップリング反応において、無保護のアミノ基の効果により高い位置選択性でそれぞれの置換基を導入できたと考えられる。さらに、得られた化合物8のホルミル基をWittig反応によってメチレン化し化合物9を得た。化合物9のアミノ基をアセチル基で保護した後、第二世代HoveydaGrubbs触媒を用いる閉環メタセシス反応を行うことにより、三環式芳香族化合物11を収率よく得ることができた。この際、アミノ基を保護していない化合物9からも閉環メタセシス反応は低収率ながら進行し、対応する環化体12を得ることができたが、アシル基保護を導入した方が効率よく閉環反応が進行することが分かった。つづいて、化合物11のメチル基を三臭化ホウ素により除去して化合物13とし、これを少量の炭酸水素ナトリウム存在下、メタノール中で加熱することによりアセチル基を脱保護してvセレンテラミン14を得た。尚、アミノ基がアセチル基で保護されていない化合物12のメチル基の除去には三臭化ホウ素を用いることができなかったが、ピリジン塩酸塩と加熱することで低収率ながらvセレンテラミン14を得ることができた。最後に、vセレンテラミン14とケトアセタール15との縮合環化反応を行うことで、vCTZを合成することができた。本合成経路は、市販の化合物から8~10段階と短工程であり、最後に用いるケトアセタールのベンゼン環上の置換基を変えることで安定性の向上が期待されるものをはじめ、多様なvCTZ類縁体を簡便に合成することができる。今後、本合成法を利用して、近赤外発光イメージングをはじめとする多様な用途に適したvCTZ化合物が創出されると期待される。材料および方法クロマトグラフィー分析用薄層クロマトグラフィーは、あらかじめシリカゲルが塗布されたガラスプレートを用いて行った。スポット検出は、紫外線ランプ、ヨウ素吸着、アニスアルデヒド水溶液に浸した後、ホットプレートで焼くことで行った。分取用フラッシュカラムクロマトグラフィーには、シリカゲル、粒径4550μmまたは関東化学3756585、silicagel60N、粒径63210μmを用いた。ただし、CTZ類縁体の精製の際には、シリカゲル粒径4050μmまたは関東化学3755879silicagel60N粒径100210μmを用いた。核磁気共鳴スペクトル1H核磁気共鳴スペクトルは、Bruker社製、AVANCE400またはAVANCE500核磁気共鳴装置を用いて測定した。化学シフトは、tetramethylsilane4Siまたは測定溶媒の非重水素化体由来のピークを内部標準として相対的値として表した。シグナル分裂線様式の略語s、d、mはそれぞれ単重線、二重線、多重線を表す。13C核磁気共鳴スペクトルは、Bruker社製、AVANCE400核磁気共鳴装置を用いて測定した。化学シフトは、測定溶媒の炭素由来のピークを内部標準として相対的値として表した。赤外線吸収スペクトルIRスペクトルは、DRS8000を装着した島津製作所社製、SHIMAZUIRPrestige21spectrophotometerを用い、拡散反射法により測定した。質量分析高分解能質量分析スペクトルは、Bruker社製BrukermicrOTOFを用い、エレクトロスプレーイオン化法により測定した。化学薬品すべての試薬は特に記さない限り、市販のものをそのまま使用した。反応、抽出、クロマトグラフィー用の溶媒には、アセトニトリル、酢酸エチル、nヘキサン、脱水テトラヒドロフラン、トルエン、脱水ピリジン、12ジクロロエタン、脱水ジクロロメタン、メタノール、エタノールの市販品をそのまま用いた。なお、断りが無い場合は、使用した混合溶媒における混合比率はv/vである。反応試薬は、以下に挙げる物を使用した。MatrixScientific社からは2amino6chloropyrazineを、和光純薬工業株式会社からはNbromosuccinimide、2formyl4methoxyphenylboronicacid、フッ化カリウム、tetranbutylammoniumchloride、methyltriphenylphosphoniumbromide、4pyridine、塩化アセチル、濃塩酸、pyridiniumhydrochlorideを、Aldrich社からは塩化亜鉛、ベンジルマグネシウムクロリド、dichlorobispalladium、21phenylindole、tributyltin、第二世代HoveydaGrubbs触媒、三臭化ホウ素を、東京化成工業株式会社からはallylpalladiumchloridedimer、関東化学株式会社からはnbutyllithiumを購入し、そのまま反応に用いた。合成例12Amino35dibromo6chloropyrazine2Amino6chloropyrazineのアセトニトリル溶液に、0°CにてNbromosuccinimideをゆっくりと加え、室温まで昇温後、一晩撹拌した。これに水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製し、2amino35dibromo6chloropyrazineを黄色固体として得たTLCRf0311HNMRδ51413CNMRδ1207122014611510合成例22Amino3benzyl5bromo6chloropyrazineアルゴン雰囲気下、塩化亜鉛を脱水THFに加え、これに室温にてベンジルマグネシウムクロリドを加えた。室温で30分撹拌した後、dichlorobispalladiumおよび、2amino35dibromo6chloropyrazineを室温にて順次加え、そのまま室温で一晩撹拌した。これに水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製し、2amino3benzyl5bromo6chloropyrazineを黄色固体として得たTLCRf0251HNMRδ40845071972472773713CNMRδ40112381275128412931353139514491513合成例325methoxybenzaldehydeアルゴン雰囲気下、allylpalladiumchloridedimerを脱水THFに溶解し、これに室温にて21phenylindoleを加え、そのまま室温で10分撹拌した後に、2amino3benzyl5bromo6chloropyrazine、2formyl4methoxyphenylboronicacid、フッ化カリウム、水を室温にて順次加え、そのまま室温で一晩撹拌した。これに水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製し、25methoxybenzaldehydeを赤茶色固体として得たTLCRf0271HNMRδ39241346672172572773173273775175599213CNMRδ404557111212071274128412921325132713571358137813911441151516001910合成例425methoxybenzaldehydeアルゴン雰囲気下、25methoxybenzaldehydeを脱気したトルエンに溶解し、これに室温にてdichlorobispalladium、tributyltin、tetranbutylammoniumchlorideを順次加え、15時間加熱還流した。室温まで冷却後、これに水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製し、25methoxybenzaldehydeを赤茶色油状物質として得たTLCRf0271HNMRδ39241545053963365772072873073674175598813CNMRδ41055711061205121012721285129113231329134413611365138714021452151515981915合成例5:2Amino3benzyl56vinylpyrazineアルゴン雰囲気下、methyltriphenylphosphoniumbromideを脱水THFに懸濁し、これに0°Cにてnbutyllithiumをゆっくり滴下し、そのまま0°Cにて15分撹拌した。これに0°Cにて、25methoxybenzaldehydeを加えた後、室温に昇温して15時間撹拌した。これに水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製し、2amino3benzyl56vinylpyrazineを白色固体として得たTLCRf0371HNMRδ38841643951853056762564765069072072672973513CNMRδ412556110511381154119312721287129212981321133013511370138314031419144815141598合成例6N6vinylpyrazin2ylacetamideアルゴン雰囲気下、2amino3benzyl56vinylpyrazineを脱水ピリジンに溶解し、これに室温にて、4pyridineおよび、塩化アセチルを順次加えた後、60°Cに加熱して1時間撹拌した。室温まで冷却後、これに水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製し、N6vinylpyrazin2ylacetamideを黄色固体として得たTLCRf0171HNMRδ233389428519539566630645652694719724727732合成例7Nacetamideアルゴン雰囲気下、第二世代HoveydaGrubbs触媒を12ジクロロエタンに溶解し、これに室温にてN6vinylpyrazin2ylacetamideを加えた後、90°Cに加熱して一晩撹拌した。室温まで冷却後、これを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製し、Nacetamideを白色固体として得たTLCRf0271HNMRδ233400450724734738742790793901合成例8Nacetamideアルゴン雰囲気下、Nacetamideを脱水ジクロロメタンに懸濁し、これに0°Cにて三臭化ホウ素を加えた後、室温に昇温して3時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、Nacetamideを黄色固体の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いたTLCRf0361HNMRδ217450720732778796944合成例93Amino2benzylbenzofquinoxalin8ol上記で得られたNacetamideの粗生成物をメタノールに溶解し、65°Cに加熱して一晩撹拌した。室温まで冷却後、これを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製し、3amino2benzylbenzofquinoxalin8olを黄土色固体として得たTLCRf0341HNMRδ433716720721726730738750776877合成例103Amino2benzyl8methoxybenzofquinoxalineアルゴン雰囲気下、第二世代HoveydaGrubbs触媒を12ジクロロエタンに溶解し、これに室温にて2amino3benzyl56vinylpyrazineを加えた後、90°Cに加熱して一晩撹拌した。室温まで冷却後、これを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製し、3amino2benzyl8methoxybenzofquinoxalineを白色固体として得たTLCRf0641HNMRδ39843946372173876378590013CNMRδ4185541075118112491255125812721287129113011327134613661389143115121585合成例113Amino2benzylbenzofquinoxalin8ol3Amino2benzyl8methoxybenzofquinoxalineおよびpyridiniumhydrochlorideの混合物を、190°Cで30分撹拌した後、さらに210°Cで30分撹拌した。室温まで冷却後、これに水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製し、3amino2benzylbenzofquinoxalin8olを黄土色固体として得た。合成例12vCoelenterazineアルゴン雰囲気下、3phenyl11diethoxypropan2oneをエタノールおよび水に溶解し、これに3amino2benzylbenzofquinoxalin8olを加え、0°Cに冷却した後、さらに濃塩酸を加え、80°Cに加熱して一晩攪拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をアルゴン気流下でシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し、vcoelenterazineを黄土色粉末として得たTLCRf0501HNMRδ408451669672717724729743763840926合成例13cf3vcoelenterazineアルゴン雰囲気下、3phenylpropan11diethoxy2oneをエタノールおよび水に溶解し、これに3amino2benzylbenzofquinoxalin8olを加え、0°Cに冷却した後、さらに濃塩酸を加え、80°Cに加熱して一晩攪拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をアルゴン気流下でシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し、cf3vcoelenterazineを黄色粉末として得たTLCRf0241HNMRδ426451718725728733740744754766829917実施例1:発現ベクターの構築1レニラルシフェラーゼ発現ベクターpColdRLの構築新規発現ベクターpColdRLは、以下の手順で構築した。InouyeaShimomuraBiochemBiophysResCommun233349353記載のレニラルシフェラーゼを有するベクターpHisRLを鋳型として2種のPCRプライマーRL17NSacIおよびRL18CXhoIを用いて、PCRキットにてPCRを行った。得られた断片をPCR精製キットで精製し、制限酵素SacI/XhoIで消化した後、ベクターpColdIIの制限酵素SacI/XhoI部位に挿入する事によってレニラルシフェラーゼ発現ベクターpColdRLを作製した。なお、インサートDNAの塩基配列は、DNAシークエンサーにて確認した。2長波長に発光をシフトする変異レニラルシフェラーゼ547発現ベクターpColdhRL547の構築変異レニラルシフェラーゼ547遺伝子を有する新規発現ベクターpColdhRL547は、以下の手順で構築した。化学合成法とPCR法により作製した変異レニラルシフェラーゼ547遺伝子を有するベクターpCR21hRL547プラスミドを構築した。変異レニラルシフェラーゼ547遺伝子は、NatureMethods4641643記載のRLuc86547を元に設計し、常法の化学合成法とPCR法の組合せにより合成し、pCR21のAsp718/EcoRI制限酵素サイトにクローン化することによりpCR21hRL547を構築した。次いで、pColdhRL547ベクターを構築するため、pCR21hRL547を制限酵素Asp718/EcoRIで消化した後、ベクターpColdIIの制限酵素Asp718/EcoRI部位に挿入してレニラルシフェラーゼ547発現ベクターpColdhRL547を作製した。なお、インサートDNAの塩基配列は、DNAシークエンサーにて確認した。hRL547をコードするDNAの塩基配列を、配列番号:19に示す。また、hRL547のアミノ酸配列を配列番号20に示す。実施例2組換え蛋白質の精製法1組換え蛋白質の大腸菌での発現大腸菌において組換え蛋白質を発現させるために、レニラルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターpColdRL、レニラルシフェラーゼ547遺伝子発現ベクターpColdhRL547を用いた。常法により大腸菌BL21に導入し、得られた形質転換株をアンピシリンを含有する10mLのLB液体培地に植菌し、37°Cで16時間培養を行った。その培養物を新たなLB液体培地400mLx5本に添加して37°Cで45時間培養を行い、1時間氷冷後、02mMのIPTGを加えて15°Cで17時間培養を行った。培養後、菌体を遠心回収し、蛋白質抽出の出発材料とした。2培養菌体からの組換え蛋白質の抽出およびニッケルキレートゲルカラムクロマトグラフ法集菌した培養菌体を200mLの50mMTrisHClで懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理を3分間、3回行い、その菌体破砕液を10000rpmで4°C、20分間遠心した。得られた可溶画分を、ニッケルキレートカラムに供し、組換え蛋白質を吸着させた。500mLの50mMTrisHClで洗浄後、01Mイミダゾールを含む50mMTrisHClにより目的の組換え蛋白質を溶出した。蛋白質濃度は、Bradford法のもとづく市販のキットを用い、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いて決定した。精製過程における収率を表1へ示した。表1は、レニラルシフェラーゼおよびレニラルシフェラーゼ547の精製収率を示す。実施例3発光活性の測定法レニラルシフェラーゼまたはレニラルシフェラーゼ547を96穴マイクロプレートのウェルに10μL分注した後、発光プレートリーダーCentroLB960を用いて、基質セレンテラジンまたはvセレンテラジン005μgを含む30mMTrisHCl10mMEDTAを01mL注入することにより発光反応を開始させ、発光量を測定した。発光強度は01秒間隔で60秒間、3回測定し、最大発光強度および60秒間の積算値の平均値を相対活性で示した。表2は、レニラルシフェラーゼおよびレニラルシフェラーゼ547の発光活性を示す。実施例4発光スペクトルの測定法発光反応は、エタノールに溶解した基質セレンテラジンまたはvセレンテラジン5μgを含む1mLの50mMTrisHCl10mMEDTAに、各々ルシフェラーゼを加えることにより開始させた。使用したルシフェラーゼの蛋白量は、基質セレンテラジンではレニラルシフェラーゼ15μg、レニラルシフェラーゼ54772μgである。一方、基質vセレンテラジンではレニラルシフェラーゼ147μg、レニラルシフェラーゼ547358μgである。発光スペクトルは、蛍光発光測定装置FP6500にて、励起光源をオフにして、バンド幅20nm、感度Medium、スキャン速度2000nm分、22~25°Cの条件下、光路長10mmの石英セルを用いて測定した。測定したスペクトルから、発光極大値と半値幅を求め、表3に示した。表3は、レニラルシフェラーゼおよびレニラルシフェラーゼ547のスペクトル分析の結果を示す。以上の実施例に示したように、vセレンテラジンを発光基質として用いたものでは、セレンテラジンと比較して、最大発光波長が長波長側にシフトした。さらに、cf3vセレンテラジンを発光基質として用いたものでは、vセレンテラジンと比較しても、最大発光波長が長波長側にシフトしていた。"