"コアとして磁性酸化鉄粒子、前記磁性酸化鉄粒子上に金シェル、そして前記金シェル上にポリアルキレングリコールコーティングを含む複合粒子であって、前記ポリアルキレングリコールが前記金シェルへ0.05~1.0nm2/ポリアルキレングリコール分子の密度にて結合している、前記複合粒子。前記ポリアルキレングリコールが前記金シェルへ0.125~0.7nm2/ポリアルキレングリコール分子の密度にて結合している、請求項1に記載の複合粒子。前記ポリアルキレングリコールが前記金シェルへ0.2~0.4nm2/ポリアルキレングリコール分子の密度にて結合している、請求項1に記載の複合粒子。平均直径が60nm以下である、請求項1に記載の複合粒子。平均直径が10~50nmである、請求項1に記載の複合粒子。平均直径が15~40nmである、請求項1に記載の複合粒子。前記磁性酸化鉄が、Fe3O4、γ-Fe2O3、MnFe2O3およびフェライトからなる群より選択される一つである、請求項1に記載の複合粒子。前記ポリアルキレングリコールが、ポリメチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールからなる群より選択される一つである、請求項1に記載の複合粒子。前記ポリアルキレングリコール分子が、チオール-金カップリングによって前記金分子に結合している、請求項1に記載の複合粒子。前記ポリアルキレングリコールの平均分子サイズが500~5000ダルトンの範囲である、請求項1に記載の複合粒子。脳腫瘍、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、十二指腸癌、大腸癌、肝臓癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫および皮膚癌からなる群より選択される複数種の癌のネガティブエンハンスメントをもたらす、請求項1に記載の複合粒子。膵臓癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、脳腫瘍および卵巣癌からなる群より選択される複数種の癌を診断する方法に使用するための、請求項1に記載の複合粒子。請求項1に記載の複合粒子を製造する方法であって:金シェルを磁性酸化鉄粒子上へ適用する工程;およびポリアルキレングリコールコーティングを前記金シェル上へ0.05~1.0nm2/ポリアルキレングリコール分子の密度にて適用する工程、を含む、前記方法。前記金シェルの前記磁性酸化鉄粒子上への適用を、前記磁性酸化鉄粒子と、金錯体と、オレイルアミン、オレイン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、オクチルアミン、NaBH4、ドデシルアミンおよびドデカンチオールからなる群より選択される還元剤とを含有する溶液中において前記金錯体を還元することにより行う、請求項13に記載の方法。前記ポリアルキレングリコールコーティングの前記金シェル上への適用を少なくとも1回繰り返す、請求項13に記載の方法。前記ポリアルキレングリコール分子が、チオール-金カップリングによって前記金分子に結合している、請求項13に記載の方法。請求項1~11のいずれか一項に記載の複合粒子を含む、MRI造影剤。前記複合粒子が、NaCl濃度0~1.5Mの溶液中で60nm以下の平均直径を維持する、請求項17に記載のMRI造影剤。癌の診断方法であって:請求項17に記載のMRI造影剤を被験体へ投与する工程;MRIシステムを用いて前記被験体の磁気共鳴画像を取得する工程;および前記磁気共鳴画像から腫瘍組織を検出する工程、を含む、前記方法。前記磁気共鳴画像がT2強調MRIである、請求項19に記載の方法。これらの状況下では、血中循環特性が延長され、膵臓癌組織上にエンハンスメントをもたらすことのできるMRI造影剤の開発が待たれている。本発明者らは既に、ネガティブ造影剤として流体力学的直径が約100nmであるPEGでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を報告しており、皮下大腸腫瘍モデルのMR画像化に成功している[14]。また、本発明者らは、膵臓腫瘍モデルを受動的に標的とするためのナノ粒子系の上限サイズが約50nmであることを最近見出した未発表データ。従って、本発明者らは、酸化鉄系のナノ粒子系のサイズおよび表面特性を適切に制御することで、膵臓腫瘍の生体内検出に有効なT2強調MRI造影剤の開発が可能となるとの仮説を立てた。本発明者らは上述の仮説を実証するため鋭意検討した結果、膵臓腫瘍モデルを画像化するT2強調MRI造影剤として用いるためのPEGでコーティングされた酸化鉄コア/金シェルナノ粒子PEG-AuION系を開発した。本発明者らによって開発された方法では、ナノ粒子の全体的なサイズを酸化鉄ナノ粒子をAuでコーティングすることにより制御したが、Auはメトキシ-PEG-チオールMeO-PEG-SHとの反応後、高次凝集体を形成することなく、強力なAu-S結合によって高密度のPEGコーティングを表面上に形成することが可能である。当該ナノ粒子を用いて得られた結果から、PEG-AuIONは血中循環が長く、正常位の膵臓腫瘍と皮下大腸腫瘍モデルをMR画像化することが明らかとなった。本知見から、酸化鉄コア/金シェルナノ粒子AuIONの流体力学的サイズと有効PEG密度を正確に制御できる上述の方法は、膵臓癌を含む種々の腫瘍型のMRI造影剤の開発にとって有望な方法である可能性が示唆される。従って、本発明は以下のものを提供する:[1]コアとして磁性酸化鉄粒子、前記磁性酸化鉄粒子上に金シェル、そして前記金シェル上にポリアルキレングリコールコーティングを含む複合粒子であって、前記ポリアルキレングリコールが前記金シェルへ0.05~1.0nm2/ポリアルキレングリコール分子の密度にて結合している、前記複合粒子。[2]前記ポリアルキレングリコールが前記金シェルへ0.125~0.7nm2/ポリアルキレングリコール分子の密度にて結合している、[1]に記載の複合粒子。[3]前記ポリアルキレングリコールが前記金シェルへ0.2~0.4nm2/ポリアルキレングリコール分子の密度にて結合している、[1]に記載の複合粒子。[4]平均直径が60nm以下である、[1]に記載の複合粒子。[5]平均直径が10~50nmである、[1]に記載の複合粒子。[6]平均直径が15~40nmである、[1]に記載の複合粒子。[7]前記磁性酸化鉄が、Fe3O4、γ-Fe2O3、MnFe2O3およびフェライトからなる群より選択される一つである、[1]に記載の複合粒子。[8]前記ポリアルキレングリコールが、ポリメチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールからなる群より選択される一つである、[1]に記載の複合粒子。[9]前記ポリアルキレングリコール分子が、チオール-金カップリングによって前記金分子に結合している、[1]に記載の複合粒子。[10]前記ポリアルキレングリコールの平均分子サイズが500~5000ダルトンの範囲である、[1]に記載の複合粒子。[11]脳腫瘍、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、十二指腸癌、大腸癌、肝臓癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫および皮膚癌からなる群より選択される複数種の癌のネガティブエンハンスメントをもたらす、[1]に記載の複合粒子。[12]膵臓癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、脳腫瘍および卵巣癌からなる群より選択される複数種の癌を診断する方法に使用するための、[1]に記載の複合粒子。[13][1]に記載の複合粒子を製造する方法であって:金シェルを磁性酸化鉄粒子上へ適用する工程;およびポリアルキレングリコールコーティングを前記金シェル上へ0.05~1.0nm2/ポリアルキレングリコール分子の密度にて適用する工程、を含む、前記方法。[14]前記金シェルの前記磁性酸化鉄粒子上への適用を、前記磁性酸化鉄粒子と、金錯体と、オレイルアミン、オレイン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、オクチルアミン、NaBH4、ドデシルアミンおよびドデカンチオールからなる群より選択される還元剤とを含有する溶液中において前記金錯体を還元することにより行う、[13]に記載の方法。[15]前記ポリアルキレングリコールコーティングの前記金シェル上への適用を少なくとも1回繰り返す、[13]に記載の方法。[16]前記ポリアルキレングリコール分子が、チオール-金カップリングによって前記金分子に結合している、[13]に記載の方法。[17][1]~[11]のいずれか一項に記載の複合粒子を含む、MRI造影剤。[18]前記複合粒子が、NaCl濃度0~1.5Mの溶液中で60nm以下の平均直径を維持する、[17]に記載のMRI造影剤。[19]癌の診断方法であって:[17]に記載のMRI造影剤を被験体へ投与する工程;MRIシステムを用いて前記被験体の磁気共鳴画像を取得する工程;および前記磁気共鳴画像から腫瘍組織を検出する工程、を含む、前記方法。[20]前記磁気共鳴画像がT2強調MRIである、[19]に記載の方法。50nm以下のサイズに制御され、高密度のPEGブラシでコーティングされた本発明の複合粒子は、腫瘍を標的とする生体分子を結合させなくても、膵臓腫瘍を含む様々な腫瘍のMRI造影剤として使用できる。高いポリアルキレングリコール密度に加えて比較的小さな流体力学的直径のため、本発明の複合粒子は循環が長くなっている。本発明の複合粒子はEPR効果によって膵臓モデルへ蓄積し、その結果膵臓における腫瘍のMR画像のコントラストが増強される。以下、本発明をより詳細に記載する。以下の実施態様は本発明を記載するための例示であって、本発明はこれらの実施態様に限定されるわけではない。本発明は、その趣旨を逸脱しない限り、様々な態様で実施することができる。複合粒子本発明の複合粒子は、少なくとも3種類の材料、即ち、コアとしての磁性酸化鉄粒子、前記コアを包囲するシェルとしての金、そして前記金シェルを包囲する外側コーティング層としてのポリアルキレングリコールを含む図1参照。本発明の複合粒子は、非常に高密度のポリアルキレングリコールコーティングを有し、前記ポリアルキレングリコールは、前記金シェルへ0.05~1.0nm2金シェル表面/ポリアルキレングリコール分子の密度にて結合している。好ましくは、ポリアルキレングリコールは前記金シェルへ0.075~0.9nm2、0.1~0.8nm2、0.125~0.7nm2、0.15~0.6nm2、0.175~0.5nm2、0.2~0.4nm2、0.225~0.3nm2または0.23~0.27nm2金シェル表面/ポリアルキレングリコール分子の密度にて結合している。この高密度ポリアルキレングリコールコーティングを有することで、本発明の粒子は高い生体適合性と被験体の循環系において長期の循環能とを有する。本発明の複合粒子の平均直径は60nm以下であり、好ましい範囲は5~55nm、好ましくは10~50nm、より好ましくは15~40nm、さらに好ましくは15~35nm、15~30nm、20~30nm、20~27.5nmまたは20~25nmである。このような本発明の複合粒子は、先行技術のMRI造影剤の複合粒子例えば、平均直径が234.0nmである中川らの文献に記載のものに比べて驚くほどサイズが小さいため、本発明の複合粒子は処理の難しい腫瘍例えば、膵臓癌へも侵入することができる。本発明の複合粒子の緩和r2は100×103~200×103M1s1、好ましくは125×103~175×103M1s1、より好ましくは140×103~160×103M1s1、そしてさらに好ましくは145×103~155×103M1s1の範囲であり、MR画像に強いコントラストをもたらす。さらに、本発明の複合粒子は、被験体へ投与した際に腫瘍に特異的な生体内分布を示す。複合粒子の生体内分布は、血中および組織中のAu含量を誘導結合プラズマ質量分析ICP-MSを用いて測定することで確認できる。本発明の複合粒子は、塩を含有する溶液中で安定である。本発明の実施例に示すように、本発明の複合粒子は、0~1.5MのNaClを含有するNaCl水溶液中でその粒子径、即ち、直径を維持する。さらに、本発明の複合粒子は生理的条件下で非常に安定であり、そのためMR画像のエンハンスメントが長く続く。本発明の複合粒子はまた、広範囲のpH、例えばpH3~10で安定である。本発明の複合粒子は基本的に、金シェルを磁性酸化鉄粒子上へ適用する工程と、ポリアルキレングリコールコーティングを金シェル上へ適用する工程の2段階で製造可能である。磁性酸化鉄粒子は市販のものであってよく例えば、フェリデックス登録商標、または、適当な鉄錯体から調製してもよい。磁性酸化鉄粒子の調製、金シェルの磁性酸化鉄粒子上への適用、ポリアルキレングリコールコーティングの金シェル上への適用について詳細を以下に記載する。磁性酸化鉄本発明の複合粒子に使用する磁性酸化鉄は、磁気を帯びていて酸化鉄を含有している限り任意の材料であってよい。従って、磁性酸化鉄粒子は市販のものでもよい例えば、フェリデックス登録商標。磁性酸化鉄の例としては、Fe3O4、γ-Fe2O3、MnFe2O3およびフェライトが挙げられる。好ましくは磁性酸化鉄はγ-Fe2O3である。本発明の複合粒子に使用する磁性酸化鉄粒子の平均直径は7.5~15nm、好ましくは8.0~14nm、より好ましくは8.5~13.5nm、さらに好ましくは9.0~11nmである。磁性酸化鉄粒子は、1種以上のキャッピング剤の存在下で鉄錯体、例えばFeCO5、FeCl3およびFeSO4を熱分解することで調製可能である。キャッピング剤の例としては、オレイルアミン、オレイン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、オクチルアミン、1,2-ヘキサデカンジオール、3-メルカプト-1-プロパンスルホン酸、ドデシルアミンおよびドデカンチオールが挙げられる。キャッピング剤の好ましい例はオレイルアミンとオレイン酸であり、5:1=オレイルアミン:オレイン酸の比率で用いるのが有利である。オレイン酸の存在は、均一な形状の磁性酸化鉄粒子特に、γ-Fe2O3粒子を得るのに役立つ。好ましくは好気条件下で鉄錯体の熱分解を行う。磁性酸化鉄粒子の形成は、電子顕微鏡観察によって容易に確認できる。金シェル磁性酸化鉄粒子上の金シェルはAu分子からなり、平均の厚さが0.5~1.8nm、好ましくは0.7~1.5nm、より好ましくは1.0~1.4nm、さらに好ましくは1.2~1.4nmである。金シェルの磁性酸化鉄粒子上への適用は、磁性酸化鉄粒子と、金錯体と、還元剤とを含有する溶液中で金錯体を還元することにより行うことができる。金錯体の例としては、HAuCl4およびAuO2CCH33が挙げられる。金錯体の好ましい例はHAuCl4である。しかしながら、金錯体は、リガンドを提供することでAu分子と錯体を形成し、かつ、適当な溶液中でAuイオンを生成できる限り、上記のものに限定されない。あるいは、Au分子を金の塩形態例えば、硝酸塩、塩化物、酢酸塩、クエン酸塩で提供することもできる。還元剤の例はオレイルアミン、オレイン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、オクチルアミン、NaBH4、ドデシルアミンおよびドデカンチオールからなる群より選択されるが、これらに限定されない。溶液に使用する溶剤としては、水、含水アルコールまたはアルコール例えば、メタノール、エタノール、n-プロパノール、酸例えば、塩酸、硫酸、硝酸、有機溶剤例えば、ベンゼン、フェノール、トルエン、クロロホルム、ジオクチルエーテルが挙げられる。上記で列挙した化合物は、1つ以上のハロゲン基で置換されていてもよい。溶剤の好ましい例は1,2-ジクロロベンゼンである。磁性酸化鉄粒子上での金シェルの形成を促進するために、ガンマ線、電子線または超音波といった刺激を必要に応じて溶液へ与えてもよい。このようにして調製した金シェルを有する磁性酸化鉄粒子は、過剰のリガンド、還元剤または溶剤を除去するために、適当な手段例えば、分散-遠心分離によって洗浄してもよい。金シェルの形成は、X線回折測定によりAu分子の面心立方fcc格子構造からブラッグ回折ピークを検出することで確認できる。あるいは、金シェルの形成は、電子顕微鏡観察により磁性酸化鉄粒子の厚さの増加を測定するか、または、紫外可視分光法によって確認できる。ポリアルキレングリコール本発明の複合粒子に使用するポリアルキレングリコールは、複合粒子に親水性と生体適合性を与えるものである限り任意の材料であってよい。ポリアルキレングリコールの例としては、低級C1-C6アルキレングリコールのポリマー、例えば、ポリメチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。一実施態様では、ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコールPEGである。好ましくは、ポリアルキレングリコールの平均分子サイズは500~5000ダルトン、750~4000ダルトンまたは1000~3000ダルトンの範囲である。ポリアルキレングリコールは1つ以上のSH基を含有していてもよく、金シェルの表面へチオール-金カップリング反応によって結合させることができる。好ましくは、ポリアルキレングリコールは1つのSH基を一方の末端に含む。ポリアルキレングリコールは、必要に応じて、アルコキシ基をもう一方の末端に含む。アルコキシ基の好ましい例としては、C1-C4アルコキシ基、即ち、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基およびブトキシ基が挙げられる。一実施態様では、アルコキシ基はメトキシである。このようにして得られたポリアルキレングリコールでコーティングされた複合粒子は既に水溶性であるが、金シェル表面上のポリアルキレングリコールの密度を増加させるために、コーティング工程を少なくとも1回繰り返してもよく、その結果、水性条件での複合粒子の安定性がさらに強化される。ポリアルキレングリコールのコーティング工程を繰り返す際の溶剤として低級アルコール例えば、メタノール、エタノールまたはプロパノールを用いることにより、本発明の複合粒子のサイズを十分に制御することができる。一方、ポリアルキレングリコールの1回目のコーティングには、任意の溶剤、例えば、有機溶剤フェノールやクロロホルム等または水性溶剤水等を使用してもよい。ポリアルキレングリコールの1回目のコーティングに好ましい溶剤の例はクロロホルムである。その結果、本発明の複合粒子は1粒子当たり平均で500~5000個のポリアルキレングリコール分子を有し、好ましくは1粒子当たり平均で1000~4000、1500~3000、2000~2750または2250~2600個のポリアルキレングリコール分子を有する。1粒子当たりのポリアルキレングリコール分子の数は、N2雰囲気下での複合粒子の熱重量分析TGAにより算出できる。ポリアルキレングリコールコーティングの平均の厚さは3~10nm、好ましくは4~8nm、より好ましくは5~7nmであると考えられる。金シェル上でのポリアルキレングリコールコーティングの形成は、リンタングステン酸染色を用いた電子顕微鏡観察によって確認できる。複合粒子の適用上述したように、本発明の複合粒子は、高密度のポリアルキレングリコールコーティングを金シェル上に有する点を特徴とする。高密度のポリアルキレングリコールコーティングのおかげで本発明の複合粒子は優れた生体適合性と長期の血中循環能を有し、そのためMR画像のエンハンスメントが長く続く。さらに、本発明の複合粒子は、被験体へ投与した際に腫瘍に特異的な生体内分布を示す。さらに、本発明の複合粒子は粒子径が小さいため50nm未満、従来の方法で使用されているMRI造影剤では処理の難しい腫瘍組織へ侵入でき、前記腫瘍組織の画像に明らかなエンハンスメントをもたらすことができる。これらの特性を有するため、本発明の複合粒子はMR画像造影剤として、特に被験体の腫瘍を診断するために有利に用いることができる。本発明の複合粒子は、プロトン緩和を促進してより長いエコー時間でMRIシグナルを減少させる磁性酸化鉄粒子をコアとして含むため、T2強調MRI造影剤として有利に用いることができる。複合粒子を用いて診断される被験体としては、哺乳動物例えば、ヒト、サル、ヒト以外の霊長類、家畜動物例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ペット動物例えば、イヌ、ネコ、実験モデル動物例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の複合粒子によって可視化される腫瘍の例としては、良性または悪性のいずれでもよい。悪性腫瘍の例としては、脳腫瘍、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、十二指腸癌、大腸癌、肝臓癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫および皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない。これらの癌は原発性または転移性のいずれでもよい。一実施態様では、診断対象の癌は膵臓癌である。別の実施態様では、診断対象の癌は大腸癌である。複合粒子は、経口または非経口経路のいずれで被験体へ投与してもよい。経口投与の場合には、本発明の複合粒子を錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤またはシロップ剤として製剤化すればよい。非経口投与の場合には、本発明の複合体を注射剤、坐剤、点眼剤、経肺投与用の製剤例えば、ネブライザーを用いて投与するもの、経鼻投与用の製剤、経皮投与用の製剤例えば、クリーム剤や軟膏剤として製剤化すればよい。注射剤の形態では、本発明の複合粒子は、全身投与してもよく、あるいは、静脈内注射輸液を含む、筋肉内注射、腹腔内注射または皮下注射などの局所投与で投与してもよい。本発明の複合粒子は、1種以上の薬学的に許容される添加剤例えば、賦形剤、滑沢剤、分解剤、安定化剤、結合剤、矯味矯臭剤、希釈剤と共に製剤化することもできる。賦形剤の例としては、デンプン例えば、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、ラクトース、結晶性セルロース、リン酸水素カルシウムが挙げられる。滑沢剤の例としては、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバ蝋、パラフィンが挙げられる。結合剤の例としては、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、そして賦形剤の例として挙げた化合物が挙げられる。分解剤の例としては、賦形剤の例として挙げた化合物、化学変性デンプンまたはセルロース例えば、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ポリビニルピロリドンが挙げられる。安定化剤の例としては、p-ヒドロキシ安息香酸のエステル例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、アルコール類例えば、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、フェノール類例えば、フェノール、クレゾール、チメロサール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸が挙げられる。矯味矯臭剤の例としては、日常的に使用されている甘味剤、酸味剤および着香剤が挙げられる。本発明の複合粒子の液体製剤を調製する際には、溶剤、例えば、エタノール、フェノール、クロロホルム、クロロクレゾール、精製水および蒸留水を使用できる。あるいは、本発明の複合粒子をリン酸生理食塩緩衝液またはトリス-HCl緩衝液へ溶解してもよい。液体製剤には、界面活性剤および/または乳剤、例えば、ポリソルベート80、ステアリン酸ポリオキシル40およびラウロマクロゴールが含まれていてもよい。上述の添加剤は、本発明の複合粒子の製剤に応じて、単独または組み合わせて使用することができる。被験体へ投与される本発明の複合体の用量は、被験体の年齢、性別および状態、投与の経路や頻度、本発明の複合粒子の製剤の種類に応じて変わる。投与スケジュールは、内科医、外科医、獣医師、生体医用工学の研究者、そして特に放射線専門医といった当業者であれば適切に決めることができる。本発明の複合粒子の有効用量は、被験体の体重1kg当たり1~500mgの範囲、好ましくは被験体の体重1kg当たり1~20mgの範囲であるが、これに限定されない。本発明の複合粒子を被験体へ投与すると、ネガティブエンハンスメントによって即ち、暗い画像として腫瘍組織が可視化される。本発明の複合粒子と共に、TGF-β阻害剤等の追加の薬剤を必要に応じて被験体へ同時投与してもよい。追加の薬剤の同時投与は、本発明の複合粒子の投与前または投与後に行うことができる。追加の薬剤は、本発明の複合粒子を被験体へ投与しながら、同時投与してもよい。以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に記載するが、下記の実施例は発明の範囲を限定するものではない。1.材料および方法材料ペンタカルボニル鉄FeCO5およびテトラクロロ金III酸水素四水和物HAuCl4は関東化学株式会社東京、日本から購入した。1,2-ジクロロベンゼンODCBはシグマ-アルドリッチ社セントルイス、ミズーリ州、米国から購入した。オレイルアミン、オレイン酸、エタノール、メタノールおよびクロロホルムは和光純薬工業株式会社大阪、日本から購入した。メトキシ-PEG-チオールMeO-PEG-SH;Mw=2,000は日油株式会社東京、日本から購入した。酸化鉄コア/金シェルナノ粒子AuIONの合成典型的な合成では、4mmolのFeCO50.53mlを3mlの脱酸素化されていないODCBに溶解し、次いで15mlのODCBと、8mmolのオレイルアミン2.63mlと、1.6mmolのオレイン酸0.5mlとを含有する温かい溶液中へ速やかに注入した。得られた混合物をゆっくりと180°Cまで好気条件下で加熱した。溶液の最初のオレンジ色はプロセス中に徐々に黒へと変わった。9時間後、得られた黒い溶液を室温まで冷却し、エタノールを添加してナノ粒子を沈殿させた。得られた黒い凝集塊を8,000rpmにて10分間遠心分離することにより単離し、γ-Fe2O3ペレットをODCB中へ再分散させた。Auシェルをγ-Fe2O3ナノ粒子の表面上に調製するため、最初にHAuCl42.5mmolを5mlのODCB中に含む溶液を1mmolのオレイルアミンの存在下に調製し、次いでこの溶液を数分間撹拌してHAuCl4をODCB中に完全に溶解させた。次に、この溶液を、50mgのγ-Fe2O3ナノ粒子と2mmolのオレイルアミンとを10mlのODCB中に含む溶液へゆっくりと添加した。得られた混合物を室温で1時間撹拌し、次いで140°Cで2時間撹拌した。溶液の色が黒から薄いピンク色へと変わった。混合物を室温へ冷却し、8,000rpmにて5分間遠心分離し、得られた少量の沈殿物を廃棄した。エタノールを残りの溶液へ添加し、次いで遠心分離を14,000rpmにて15分間行った。ナノ粒子を分散-遠心分離を数回繰り返して洗浄し、過剰のオレイルアミンをナノ粒子の表面から除去した。最終的に、ナノ粒子を10mlのクロロホルム中に分散させた。AuION上へのPEGコーティング周知のチオール-金化学を用いてPEGをナノ粒子の表面へ結合させた。AuIONをクロロホルムへ分散させた溶液へ、100mgのMeO-PEG-SHを添加し、混合物を24時間室温で振盪撹拌し、次いで真空下でクロロホルムを除去した。PEGでコーティングされたAuIONは水性媒体中に可溶化することができた。しかしながら、150mMのNaClをナノ粒子溶液へ添加した12時間後には、ナノ粒子の一部に塩による凝塊形成が観察された。表面上のPEG密度を上げるため、ナノ粒子に2回目のPEG化プロセスを行った。PEGでコーティングされたAuIONを真空乾燥したものクロロホルム蒸発後をメタノール中に分散させ、50mgのMeO-PEG-SHを添加した。溶液を24時間振盪混合した。一晩透析分画分子量10,000してメタノールを水と交換した。ナノ粒子は水性媒体中に容易に分散し、数ヶ月経っても沈殿物は観察されなかった。未結合のMeO-PEG-SHは限外濾過MWCO200000;ポリスルホン膜、東洋濾紙株式会社、東京、日本により除去した。PEG化されたγ-Fe2O3コア/Auシェルナノ粒子PEG-AuIONの物理化学的特性決定紫外可視スペクトルは、石英キュベットを用いて紫外-可視-近赤外分光計V-570、日本分光株式会社、八王子、東京、日本にて記録した。ナノ粒子の形態およびサイズ分布は、透過型電子顕微鏡観察H-7000、日立製作所、東京、日本により加速電圧100kVにて記録した。TEMサンプルは、異なる溶剤中のナノ粒子を1滴10μl炭素コーティングされた400メッシュCuグリッド上へ載せ、空気中で乾燥させることにより調製した。X線回折パターンは、MACScienceM18XHF回折計を用い、293KにてCu-Kα照射λ=1.54056Åを行い記録した。AuION中のAuおよびFeの含量は、イオン結合プラズマ質量分析ICP-MS、4500、ヒューレットパッカード社、パロアルト、カリフォルニア州、米国により求めた。動的光散乱およびζ電位の測定は、25°Cにてマルバーン4700システム上でDTS5001セルを備えたゼータサイザーナノZS機器を用いて行った。ポリマーのAuIONへの吸着量は、熱重量分析TGAEXSTAR6200TG/DTA、セイコーインスツル社、千葉、日本によって、窒素雰囲気下、加熱速度10°C/分にて25~600°Cの温度範囲において測定した。ナノ粒子水溶液のプロトン緩和r2は、CarrPurcellMeiboomGillCPMG配列により25°Cで25MHzのパルスNMRJNMMU25A、日本電子株式会社、昭島、日本を用いて評価した。癌細胞株および動物動物実験プロトコルは全て、東京大学動物実験委員会の方針に従って行った。マウス大腸腺癌由来のC26細胞株は、松村医師国立がん研究センター東病院柏、日本より提供を受けた。MiaPaCa-2ヒト膵臓腺癌細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション米国培養細胞系統保存機関;マナッサス、ヴァージニア州より入手した。C26およびMiaPaCa-2細胞は、細口フラスコ中で、10FBSを添加したDMEM中、37°C、5CO2中にて培養した。BALB/cヌードマウス5~6週齢は、日本チャールスリバー株式会社東京、日本より入手した。BALB/cヌードマウスメスの皮下にC26細胞1×106細胞、50μL体積を接種した。異種移植片は接種後12日目に使用した。正常位の膵臓腫瘍は、MiaPaCa-2細胞1×107細胞、50μL体積をヌードマウスの膵臓へ正常位で接種することにより作製し、増殖期に到達するまで2~3週間生育した。肝転移腫瘍モデルは、MiaPaCa-2癌細胞1×107細胞、50μL体積を腸間膜静脈へ注射することにより開発した。腫瘍を3週間生育し、適切な転移形成を肉眼で検出した。磁気共鳴画像法には、20mm3を超える転移節を有するマウスを選択した。生体内分布の検討C26細胞をBALB/cヌードマウスメス、6週齢、n=5、日本チャールスリバー株式会社の腹部へ移植して担腫瘍マウスを作製した。腫瘍体積が100mm3に達したら、PEG-AuIONを0.8mgAu/kgの用量にて静脈内注射した。ナノ粒子を注射後、腫瘍および主要な器官腎臓、肝臓、筋肉、脾臓を0.25、0.5、1、2、4、8および24時間目に採取した。血液は下大静脈より採取し、ヘパリンを添加して遠心分離し、血漿を得た。血漿および全ての器官を王水中で分解し、蒸発させ、1M塩酸溶液中に再溶解してICP-MS測定用サンプルを調製した。血漿および組織中のAu濃度について曲線下面積AUCを24時間まで台形法則に基づいて算出した。生体内MRI4.7TスキャナーINOVA200、バリアン社、パロアルト、カリフォルニア州、米国を用いて腫瘍のMR画像化を行った。生きているマウスのT2強調MR画像の場合には、以下のパラメータを採用した:点分解能=234×234μm、切片の厚さ=2.0mm、TE=60ms、TR=3000ms、取得回数=5。磁性ナノ粒子PEG-AuIONおよびフェリデックス登録商標、Feとして450μgを担腫瘍マウスへ静脈内投与した後、腫瘍領域のT2強調MR画像を異なる時点例えば、注射前、注射後約5分、注射後4時間まで15分おきで撮影した。組織学切除したサンプルを一晩4パラホルムアルデヒド中で固定し、次いでパラフィン包埋してヘマトキシリンエオジンHE染色用に調製した。脱蝋して貼り付けた切片へ、鏡検用銀増感キットキルケガードペリーラボラトリーズ社、ゲイザースバーグ、メリーランド州、米国を用いて切片の銀染色を行った。サンプルをオリンパス東京、日本AX80顕微鏡を用いて観察した。2.結果および考察酸化鉄コア/金シェルナノ粒子AuIONの合成図1に、本検討におけるPEG-AuIONの調製についての模式図を示す。ナノ粒子の合成は、有機溶剤中高温にて2工程連続で行い、その結果、サイズ、結晶性および磁気特性が制御された高度に単分散のナノ粒子が形成された。まず、平均直径が10.5±1.6nmのほぼ単分散のγ-Fe2O3ナノ粒子を合成するが、キャッピング剤であるオレイルアミンおよびオレイン酸5:1の存在下、好気条件下にて、既報の方法[20]を若干改変してFeCO5を熱分解することにより合成した。形状の異なるγ-Fe2O3ナノ粒子が形成するのを避けるため、少量のオレイン酸を反応混合物へ添加した。γ-Fe2O3ナノ粒子の結晶構造を、図2に示すように、X線回折測定により確認した。次の工程では、オレイルアミンが還元剤かつ安定化剤として機能する有機溶剤中で140°CにてHAuCl4をオレイルアミンで還元することにより、γ-Fe2O3ナノ粒子の表面上へAuをコーティングした[18]。このようにして合成したオレイルアミンでコーティグされたAuIONは、さらなる修飾を行うための有機溶剤中に分散可能であった。γ-Fe2O3表面上でのAuシェルの形成は、異なる媒体中におけるナノ粒子の紫外可視分光法により確認した。図3に示すように、AuIONは長鎖アルキルリガンドで保護されているため、AuIONは有機媒体中では特徴的なプラズモン共鳴は何ら示さなかった。しかしながら、AuIONを水性媒体中へ移した場合には、515nmに吸収を有するプラズモン共鳴バンドが現れ、おそらく水中では比誘電率が変化するためと思われる。γ-Fe2O3ナノ粒子上でのAuシェルの形成は、図2に示すように、X線回折測定でも確認した。AuIONのX線回折スペクトルからは、Auのfcc格子構造からのブラッグ回折ピークの出現が明らかに見て取れる。デバイ-シェラーの式を用い、γ-Fe2O3表面上のAuの厚さを1.3nmと算出した。TEMによる検討図4A、Bからは、Auシェルをγ-Fe2O3ナノ粒子上へ沈着後に平均粒子径が1.5±0.6nm増加したことが明らかであり、これはX線回折ピークから算出されたAuの厚さと同程度である。クロロホルム中でPEG修飾を行った後真空下で蒸発させるサイクルを1回行ったところ、PEG-AuIONは水性媒体中に容易に溶解した。しかしながら、ナノ粒子を12時間150mMのNaCl溶液中でインキュベートした場合には凝塊形成が生じたことから、ナノ粒子表面上のMeO-PEG-SHのコーティングが不完全であることが示唆されたデータ未掲載。従って、ナノ粒子を2回PEGコーティングし、高密度のPEGコーティングを達成した。透析によって水性媒体中へ移した後も、塩によるPEG-AuIONの凝塊形成は観察されなかったことから、AuIONの表面周囲に明らかに高密度のPEG層が形成されたことが示唆された。0.03ウシ血清アルブミンを含む10mMのトリス-HCl緩衝液中で保存したPEG-AuIONは、顕著な凝集を示すことなく数ヶ月安定であった。MeO-PEG-SHで表面修飾した後水へ移したPEG-AuIONのTEM画像図4Cからは、明らかな凝塊形成は認められなかった。さらにまた、1リンタングステン酸でネガティブ染色したところ、AuIONコアの周囲にPEGコーティングが観察された。最終的に、PEG層の厚さはTEMより6.5±1.2nmと求められた。PEGでコーティングされた酸化鉄コア/金シェルナノ粒子PEG-AuIONの合成と特性決定PEG-AuIONは、図5の点線に示すように、10mMのトリス-HCl緩衝生理食塩水中で動的光散乱DLS測定により測定したところ、42nmのZ-平均流体力学的直径を示した。その結果、生理的環境下ではPEG-AuIONは凝集しないことが判明し、一方で、クロロホルム中に分散させたAuION図5の実線、Z-平均サイズが13nm、PDI0.071と比較して流体力学的直径が29nm増加したことが観察された。この増加は、酸化鉄コアを包囲するPEGシェルの寄与と考えられる。DLSによる検討から求めたPEG層の厚さは、TEMによる検討図4で観察された厚さと比べて高い値である。これらの結果から、水中では一部のAuIONが凝集している可能性が判明した。PEG-AuIONの水中でのζ電位は0.49±0.12mVとニュートラルであり、ナノ粒子表面がPEG層によって完全に表面処理されていることが明らかとなった。12.9nmのAuIONの表面上に存在するPEG分子分子量=2kDaの数は、N2雰囲気下でのサンプルのTGA分析より約2500と算出された。この表面被覆率は、PEG1分子当たり0.25nm2の占有面積に相当し、Auナノ粒子表面上に結合したMeO-PEG-SHについて従来報告されている値2.42nm2[21~22]よりも有意に低い。溶液中のNaCl濃度の上昇に対するPEG-AuIONの分散安定性を、DLSを用いて評価した。PEG-AuIONの流体力学的直径は、1.5MのNaCl濃度までは著しい変化は見られなかった図6。生理的条件下におけるPEG化ナノ粒子の安定性を調べるため、PEG化ナノ粒子を10ウシ胎仔血清を含む10mMのトリス-HCl緩衝液中でpH7.4、37°Cにて12時間インキュベートし、次いで流体力学的直径を測定した図7。12時間の間に流体力学的体積に変化は見られず、優れた粒子安定性が判明した。ナノ粒子は3~10のpH範囲でも安定であった。PEG-AuIONをT2MRI造影剤として用いる可能性について調べるため、PEG-AuIONの緩和r2を評価したところ、その値は149.32mM1s1図8と求められ、市販のT2造影剤であるフェリデックス登録商標デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子と同程度であった。AuION上のMeO-PEG-SHコーティングは2段階で行い、確実にナノ粒子表面上に高密度のPEG層が形成するようにした。PEGの吸着を繰り返し行うプロセスが金表面上のPEG表面密度の増加に有意に寄与することは、既に報告されている[23]。AuIONのAu表面上にPEGコーティングを繰り返すこのプロセスを本検討に採用した。異なる溶剤最初はクロロホルム、次いでメタノール中でPEGをAuIONへ繰り返し添加することにより、非常に高密度のPEG層がナノ粒子表面上に形成された。PEGコーティングの2回目のサイクルにメタノールを溶剤として用いる点は、PEG化ナノ粒子の粒子径と分散度を制御する上でも非常に重要であることが判明した。AuIONの2回目のPEGコーティングを水中で行うと、流体力学的直径が大きく[66.4±12.2nm]、多分散度指数も高い低品質の粒子が得られた。一方、2回目のPEGコーティングをメタノール中で行った後ナノ粒子を透析によって水性媒体中へ移すと、ナノ粒子系の流体力学的サイズ約40nmを狭いサイズ分布で適切に制御できた。PEG化されたFe2O3コア/Auシェルナノ粒子の生体内分布図9は、PEG-AuIONを静脈内投与した後の血漿中の金濃度を経時的に示したものである。血漿中の金濃度の測定からは、PEG-AuIONが静脈内投与後に安定して血漿区画中を循環し、24時間経っても注射した用量の8が観察されることが明らかである。PEG-AuIONの血中循環が長くなったことに伴って、37°Cの生理的条件でのPEG-AuIONの安定性も当然高くなった図7。PEG-AuIONの固形腫瘍および正常組織肝臓、腎臓、脾臓および筋肉中への蓄積も図9に示す。注目すべきことに、PEG-AuIONは時間と共に固形腫瘍へ連続的に蓄積する一方、正常組織への蓄積はある程度制限されていた。固形腫瘍への選択性を評価するため、注射後24時間におけるAu濃度-時間曲線の曲線下面積AUCと、腫瘍対正常組織のAUC比とを求めた表1。PEG-AuIONは脾臓、腎臓および腎臓については1.0を超えるAUCtumor/AUCorgan比を示し、腫瘍に対する選択性が判明した脾臓、腎臓および筋肉に対するAUCtumor/AUCorganの測定値はそれぞれ2.84、1.21および67.27。これらのAUCtumor/AUCorgan比は、ステルス性の薬物担体[24]の場合に観察される値と同程度である。しかしながら、AUCtumor/AUCliver比は0.95であり、腫瘍への選択性は認められないことが分かる。PEG-AuIONの肝臓における生体内分布には、血液中を循環しているPEG-AuIONが一部含まれていた。肝臓は、体内の血液量の約5分の1を有する。これらのAUCtumor/AUCorgan比は、ステルス性の薬物担体[24]生体適合性ポリマーで修飾された無機ナノ粒子としては当該文献中では依然として稀であるの場合に観察される値と同程度である。これらの結果から、PEG-AuIONは明らかに、肝臓や脾臓といった器官に存在するRESへの取り込みが少ないことが示唆される。生体内での腫瘍の画像化動的生体内MRIに対するPEG-AuIONの効力について検討するため、腫瘍組織の画像化を行い、市販のMRI造影剤であるフェリデックス登録商標デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子と比較した。まず、マウス大腸腺癌C26細胞を皮下に接種されたヌードマウスに生体内MRIを行った図10a、b。T2強調腫瘍部位におけるネガティブエンハンスメントはPEG-AuIONの注射の5分後から徐々に増加し、66の最大ネガティブエンハンスメントが注射後4時間で観察された図10aおよび図11a、表2。これに対し、フェリデックス登録商標は、4時間経っても腫瘍にネガティブエンハンスメントは見られなかったが図10bおよび図11a、表2、これはおそらくRESでの非特異的な蓄積が高かったためと考えられる。次に、膵臓癌の正常位モデルにおけるPEG-AuION系の効力を、ヒト膵臓癌由来のMiaPaCa-2細胞株を用いて試験した。腫瘍領域のT2強調MR画像を経時的に図10c、dに示す。ナノ粒子の投与後わずか5分で顕著なネガティブエンハンスメント約25が観察され、投与後4時間経っても持続していたことから図10cおよび図11b、表3、腫瘍へ効率的にナノ粒子が蓄積することが実証された。対照実験では、同一の腫瘍モデルにおける経時的なMR画像化に対するフェリデックス登録商標の効果を検討した。図10dおよび表3に示すように、フェリデックス登録商標は、投与後4時間経っても腫瘍のネガティブエンハンスメントは見られず、腫瘍への粒子の蓄積が乏しいことが判った。肝転移モデルを用いた生体内MRIフェリデックス登録商標と比較したPEG-AuION系の効力を、MiaPaCa-2細胞株を用いた肝臓への転移巣を示すモデルで試験した。腫瘍領域のT2強調MR画像を経時的に図12A、Bに示す。ナノ粒子の投与後わずか5分で顕著なネガティブエンハンスメント約25が観察され、投与後4時間経っても持続していたことから図12A、腫瘍へ効率的にナノ粒子が蓄積することが実証された。一方、フェリデックス登録商標は、投与後4時間経っても腫瘍のネガティブエンハンスメントは見られず、腫瘍への粒子の蓄積が乏しいことが判った。肝臓内の転移巣でのPEG-AuIONの蓄積をさらに検証するため、肝臓内の転移巣のHE染色と銀染色を行って金褐色に染まるを検出した。図13AおよびBには、肝臓内の転移巣のHE染色を示した。図13Cに示すように、PEG-AuIONを投与した場合、肝臓内の転移巣が金に対してポジティブ染色されたことが明らかである図13Bに示したHE染色と同一の切片。金の存在はMRIの結果と一致した。血管周囲に金が観察された。3.結論本検討では、50nm以下のサイズに制御され、高密度のPEGブラシでコーティングされたAuIONが、腫瘍を標的とする生体分子を結合させなくても、膵臓腫瘍を含む様々な腫瘍のMRI造影剤として使用できることが実証された。高いPEG密度に加えて比較的小さな流体力学的直径のため、PEG-AuIONは循環が長くなった。MR画像からは、PEG-AuIONがEPR効果によって膵臓モデルへ蓄積することが明らかとなった。これらの結果から、ナノ粒子の構造および表面特性を適切に制御することで、細胞を標的とするリガンドを結合させなくても、処理の難しい腫瘍例えば、膵臓癌を診断するのに有効なMRI造影剤を開発することが可能であると考えられる。磁性ナノ粒子上にAuシェルが存在することで、バイオマーカーを標的としたイメージング用に各種生体分子での表面修飾が可能となるだけでなく、X線断層撮影[25~26]CTや表面増強ラマン散乱SERS[27]といった各種技術による別の検出様式も提供される。ナノ粒子の医学研究の最終目標は、生物学的事象例えば、癌転移を検出治療するための、そして生物学的事象を細胞分子レベルでリアルタイムに可視化するための、高性能ナノ粒子系を開発することであり、担腫瘍患者の予後をより良好にすることに繋がる。参考文献1AJemalRSiegelEWardYPHaoJQXuMJThunCAACancerJournalForClinicians2009592252MJMacKenzieLancetOncology200455413RWeisslederAMooreUMahmoodRBhoradeHBenvenisteEAChioccaJPBasilionNatMed200063514HBNaICSongTHyeonAdvancedMaterials20092115YWJunJHLeeJCheonAngewChemIntEd20084751226SLaurentDForgeMPortARochCRobicLVElstRNMullerChemRev200810820647YMatsumuraHMaedaCancerResearch19864663878HMaedaJFangTInutsukaYKitamotoIntImmunopharmacol200333199DMMcDonaldPBalukCancerRes200262538110JMHarrisRBChessNatRevDrugDiscov2003221411KKataokaAHaradaYNagasakiAdvDrugDeliveryRev20014711312CKhemtongCWKessingerJMRenEABeySGYangJSGuthiDABoothmanADSherryJMGaoCancerRes200969165113JFBerretNFSchonbeckFGazeauDElKharratOSandreAVacherMAiriauJAmChemSoc2006128175514MKumagaiYImaiMTNakamuraYYamasakiMSekinoSUenoKHanaokaKKikuchiTNaganoEKanekoKShimokadoKKataokaColloidsandSurfacesBBiointerfaces20075617415MKumagaiMRKanoYMorishitaMOtaYImaiNNishiyamaMSekinoSUenoKMiyazonoKKazunoriJControlRelease200914030616JLLyonDAFlemingMBStonePSchifferMEWilliamsNanoLett2004471917LYWangJLuoQFanMSuzukiISSuzukiMHEngelhardYHLinNKimJQWangCJZhongJPhysChemB20051092159318ZXuYHouSSunJAmChemSoc2007129869819DKimJWKimYYJeongSJonBullKoreanChemSoc200930185520JWCheonNJKangSMLeeJHLeeJHYoonSJOhJAmChemSoc2004126195021STakaeYAkiyamaHOtsukaTNakamuraYNagasakiKKataokaBiomacromolecules2005681822WPWuelfingSMGrossDTMilesRWMurrayJAmChemSoc19981201269623KUchidaHOtsukaMKanekoKKataokaYNagasakiAnalChem200577107524HCabralNNishiyamaKKataokaJControlRelease200712114625QYCaiSHKimKSChoiSYKimSJByunKWKimSHParkSKJuhngKHYoonInvestigativeRadiology20074279726DKimSParkJHLeeYYJeongSJonJAmChemSoc2007129766127XQianXHPengDOAnsariQYinGoenGZChenDMShinLYangANYoungMDWangSMNieNatBiotechnol2008268328特開2008-266214号公報"