"対応するmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチドの単離されたRNA。末端3’ヒドロキシル基を含有してなる請求項1記載の単離されたRNA。化学合成されたRNA、または天然に存在するRNAのアナログである、請求項1記載の単離されたRNA。1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換または変化により請求項1記載のRNAとは異なるものである、請求項1記載の単離されたRNAのアナログ。転写サイレンシングにより対応する遺伝子を不活化する約21~約23ヌクレオチドの単離されたRNA。RNA干渉を媒介する可溶性抽出物。抽出物がショウジョウバエ胚に由来するものである、請求項6記載の可溶性抽出物。抽出物が、合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚に由来するものである、請求項7記載の可溶性抽出物。a二本鎖RNAとRNA干渉を媒介する可溶性抽出物とを組み合わせる工程、それにより組み合わせを生じる;およびb二本鎖RNAが約21~約23ヌクレオチド長のRNAにプロセスされる条件下でaの組み合わせを維持する工程を含む、約21~約23ヌクレオチド長のRNAの作製方法。可溶性抽出物が合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚に由来するものである、請求項9記載の方法。組み合わせから約21~約23ヌクレオチドのRNAを単離する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。請求項9記載の方法により作製された約21~約23ヌクレオチドのRNA。a分解対象の遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAとRNA干渉を媒介する可溶性抽出物とを組み合わせる工程、それにより組み合わせを生じる;およびb二本鎖RNAが分解対象の遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセスされる条件下でaの組み合わせを維持する工程、それによりmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチドのRNAを作製する、を含む、分解対象の遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチド長のRNAの作製方法。可溶性抽出物が合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚に由来するものである、請求項13記載の方法。組み合わせから約21~約23ヌクレオチドのRNAを単離する工程をさらに含む、請求項13記載の方法。請求項15記載の方法により作製された約21~約23ヌクレオチドの単離されたRNA。a分解対象の遺伝子のmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAを細胞または生物に導入する工程;bmRNAの分解が起こる条件下でaで作製された細胞または生物を維持する工程、それにより細胞または生物において遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する、を含む、細胞または生物において遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する方法。aのRNAが化学合成されたRNAまたは天然に存在するRNAのアナログである、請求項17記載の方法。前記遺伝子が細胞性mRNAまたはウイルスmRNAをコードする、請求項17記載の方法。a遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAとRNA干渉を媒介する可溶性抽出物とを組み合わせる工程、それにより組み合わせを生じる;b二本鎖RNAが約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセスされる条件下でaで作製された組み合わせを維持する工程、それにより約21~約23ヌクレオチドのRNAを作製する;cbで作製された約21~約23ヌクレオチドのRNAを単離する工程;d細胞または生物にc単離されたRNAを導入する工程;およびe遺伝子のmRNAの分解が生じる条件下でdで作製された細胞または生物を維持する工程、それにより、細胞または生物において遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する、を含む、RNA干渉が生じる細胞または生物において遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する方法。可溶性抽出物が、合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚に由来するものである、請求項20記載の方法。RNAがゲル電気泳動を用いて単離される、請求項20記載の方法。a遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチドのRNAを細胞または生物に導入する工程、それにより該RNAを含む細胞または生物を作製する、およびbRNA干渉が生じる条件下に、該RNAを含む細胞または生物を維持する工程、それにより該細胞または生物中の遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する、を含む、RNA干渉が生じる細胞または生物において遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する方法。約21~約23ヌクレオチドのRNAが、RNA干渉を媒介する化学合成されたRNAまたはRNAのアナログである、請求項23記載の方法。遺伝子が細胞性mRNAまたはウイルスmRNAをコードするものである、請求項23記載の方法。請求項23記載の方法により生じたノックダウン細胞または生物。細胞または生物が疾患を模倣するものである、請求項26記載のノックダウン細胞または生物。a分解対象の遺伝子のmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAを細胞または生物に導入する工程、それにより試験細胞または試験生物を作製する;b遺伝子のmRNAの分解が生じる条件下で試験細胞または試験生物を維持する工程、それにより遺伝子のmRNAが分解する試験細胞または試験生物を作製する;およびcbにおいて作製された試験細胞または試験生物の表現型を観察する工程、および任意に観察された表現型と適切な対照細胞または対照生物の表現型とを比較する工程、それにより遺伝子の機能に関する情報を提供する、を含む、細胞または生物における遺伝子の機能の調査方法。aで導入されるRNAが、化学合成されているか、またはRNA干渉を媒介するRNAのアナログである、請求項28記載の方法。a遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAとRNA干渉を媒介する可溶性抽出物とを組み合わせる工程、それにより組み合わせを生じる;b二本鎖RNAが約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセシングされる条件下でaで生じた組み合わせを維持する工程、それにより約21~約23ヌクレオチドのRNAが作製される;cbで作製された約21~約23ヌクレオチドのRNAを単離する工程;d細胞または生物にcで単離されたRNAを導入する工程、それにより試験細胞または試験生物を作製する;e遺伝子のmRNAの分解が生じる条件下で試験細胞または試験生物を維持する工程、それにより該遺伝子のmRNAが分解される試験細胞または試験生物を作製する;およびfeにおいて作製される試験細胞または試験生物の表現型を観察する工程、および任意に観察された表現型と適切な対照の表現型とを比較する工程、それにより遺伝子の機能に関する情報を提供する、を含む、細胞または生物における遺伝子の機能の調査方法。RNAが末端3’ヒドロキシル基を含有してなるものである、請求項30記載の方法。可溶性抽出物が合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚に由来するものである、請求項30記載の方法。RNAがゲル電気泳動を用いて単離される、請求項30記載の方法。dsRNAを約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセスするショウジョウバエ細胞の生化学成分および適切なキャリアを含有してなる組成物。約21~約23ヌクレオチドのRNAにより分解対象の遺伝子のmRNAを標的化する細胞の生化学成分を含有してなる組成物。分解対象のタンパク質のmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAを個体に投与することを含む、個体におけるタンパク質の存在に関する疾患または状態を治療する方法。約21~約23ヌクレオチドのRNAが、化学合成されているか、またはRNA干渉を媒介するRNAのアナログである、請求項36記載の方法。a分解対象の遺伝子のmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAを細胞または生物に導入する工程;bmRNAの分解が生じる条件下でaの細胞または生物を維持する工程、cbの細胞または生物に薬剤を導入する工程;およびd該薬剤が細胞または生物において効果を有するかどうかを決定する工程、ここで該薬剤が細胞または生物において効果を有さない場合、該薬剤が遺伝子産物または遺伝子産物を含む生物学的経路において作用するを含む、薬剤が遺伝子産物に作用するかどうかを評価する方法。約21~約23ヌクレオチドのRNAが、化学合成されているか、またはRNA干渉を媒介するRNAのアナログである、請求項38記載の方法。a分解対象の遺伝子のmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAを細胞または生物に導入する工程;bmRNAの分解が生じる条件下でaの細胞または生物を維持する工程、それにより該遺伝子の発現の減少を生じる;およびc細胞または生物において遺伝子の減少した発現の効果を決定する工程、ここで減少した発現が効果を有する場合、遺伝子産物が薬物発見の標的であるを含む、遺伝子産物が薬物発見に適した標的であるかどうかを評価する方法。約21~約23ヌクレオチドのRNAが、合成RNAまたはRNA干渉を媒介するRNAのアナログである、請求項40記載の方法。RNA干渉を媒介する内因性21~23ヌクレオチドRNA分子の配列決定により同定される遺伝子。RNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチドのRNAおよび適切なキャリアを含有してなる医薬組成物。遺伝子がノックダウンされるべき細胞に、該遺伝子に対応するmRNAを標的化する約21~約23ntのRNAを導入する工程および得られた細胞をRNAiが生じる条件下で維持する工程を含み、該遺伝子のmRNAの分解を生じ、それによりノックダウン細胞を作製する、ノックダウン細胞の作製方法。約21~約23ヌクレオチドのRNAが、RNA干渉を媒介する合成RNAまたはRNAのアナログである、請求項44記載の方法。分解対象の遺伝子の配列に対応するdsRNA、該遺伝子に対応する標識mRNAおよびRNA干渉を媒介する可溶性抽出物を組み合わせる工程、それにより組み合わせを生じる;dsRNAが分解される条件下で組み合わせを維持する工程および効率的に切断されるmRNA中の部位を同定する工程を含む、RNAiプロセスにより効率的に切断されるmRNA内の標的部位を同定する方法。請求項46記載の方法によりmRNA内に同定される標的部位にわたる、RNAiを効率的に媒介する21~23ntRNAを同定する方法。ゲル電気泳動を用いて単離された請求項16記載のRNA。非変性法を用いて単離された請求項16記載のRNA。非変性カラムクロマトグラフィーを用いて単離された請求項16記載のRNA。本発明の課題は、RNA干渉のRNA配列特異的メディエータを提供することである。即ち、本発明の要旨は、1対応するmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチドの単離されたRNA、2末端3’ヒドロキシル基を含有してなる1記載の単離されたRNA、3化学合成されたRNA、または天然に存在するRNAのアナログである、1記載の単離されたRNA、41つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換または変化により1記載のRNAとは異なるものである、1記載の単離されたRNAのアナログ、5転写サイレンシングにより対応する遺伝子を不活化する約21~約23ヌクレオチドの単離されたRNA、6RNA干渉を媒介する可溶性抽出物、7抽出物がショウジョウバエ胚に由来するものである、6記載の可溶性抽出物、8抽出物が、合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚に由来するものである、7記載の可溶性抽出物、9a二本鎖RNAとRNA干渉を媒介する可溶性抽出物とを組み合わせる工程、それにより組み合わせを生じる;およびb二本鎖RNAが約21~約23ヌクレオチド長のRNAにプロセスされる条件下でaの組み合わせを維持する工程を含む、約21~約23ヌクレオチド長のRNAの作製方法、10可溶性抽出物が合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚に由来するものである、9記載の方法、11組み合わせから約21~約23ヌクレオチドのRNAを単離する工程をさらに含む、9記載の方法、129記載の方法により作製された約21~約23ヌクレオチドのRNA、13a分解対象の遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAとRNA干渉を媒介する可溶性抽出物とを組み合わせる工程、それにより組み合わせを生じる;およびb二本鎖RNAが分解対象の遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセスされる条件下でaの組み合わせを維持する工程、それによりmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチドのRNAを作製する、を含む、分解対象の遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチド長のRNAの作製方法、14可溶性抽出物が合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚に由来するものである、13記載の方法、15組み合わせから約21~約23ヌクレオチドのRNAを単離する工程をさらに含む、13記載の方法、1615記載の方法により作製された約21~約23ヌクレオチドの単離されたRNA、17a分解対象の遺伝子のmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAを細胞または生物に導入する工程;bmRNAの分解が起こる条件下でaで作製された細胞または生物を維持する工程、それにより細胞または生物において遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する、を含む、細胞または生物において遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する方法、18aのRNAが化学合成されたRNAまたは天然に存在するRNAのアナログである、17記載の方法、19前記遺伝子が細胞性mRNAまたはウイルスmRNAをコードする、17記載の方法、20a遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAとRNA干渉を媒介する可溶性抽出物とを組み合わせる工程、それにより組み合わせを生じる;b二本鎖RNAが約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセスされる条件下でaで作製された組み合わせを維持する工程、それにより約21~約23ヌクレオチドのRNAを作製する;cbで作製された約21~約23ヌクレオチドのRNAを単離する工程;d細胞または生物にc単離されたRNAを導入する工程;およびe遺伝子のmRNAの分解が生じる条件下でdで作製された細胞または生物を維持する工程、それにより、細胞または生物において遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する、を含む、RNA干渉が生じる細胞または生物において遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する方法、21可溶性抽出物が、合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚に由来するものである、20記載の方法、22RNAがゲル電気泳動を用いて単離される、20記載の方法、23a遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチドのRNAを細胞または生物に導入する工程、それにより該RNAを含む細胞または生物を作製する、およびbRNA干渉が生じる条件下に、該RNAを含む細胞または生物を維持する工程、それにより該細胞または生物中の遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する、を含む、RNA干渉が生じる細胞または生物において遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する方法、24約21~約23ヌクレオチドのRNAが、RNA干渉を媒介する化学合成されたRNAまたはRNAのアナログである、23記載の方法、25遺伝子が細胞性mRNAまたはウイルスmRNAをコードするものである、23記載の方法、2623記載の方法により生じたノックダウン細胞または生物、27細胞または生物が疾患を模倣するものである、26記載のノックダウン細胞または生物、28a分解対象の遺伝子のmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAを細胞または生物に導入する工程、それにより試験細胞または試験生物を作製する;b遺伝子のmRNAの分解が生じる条件下で試験細胞または試験生物を維持する工程、それにより遺伝子のmRNAが分解する試験細胞または試験生物を作製する;およびcbにおいて作製された試験細胞または試験生物の表現型を観察する工程、および任意に観察された表現型と適切な対照細胞または対照生物の表現型とを比較する工程、それにより遺伝子の機能に関する情報を提供する、を含む、細胞または生物における遺伝子の機能の調査方法、29aで導入されるRNAが、化学合成されているか、またはRNA干渉を媒介するRNAのアナログである、28記載の方法、30a遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAとRNA干渉を媒介する可溶性抽出物とを組み合わせる工程、それにより組み合わせを生じる;b二本鎖RNAが約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセシングされる条件下でaで生じた組み合わせを維持する工程、それにより約21~約23ヌクレオチドのRNAが作製される;cbで作製された約21~約23ヌクレオチドのRNAを単離する工程;d細胞または生物にcで単離されたRNAを導入する工程、それにより試験細胞または試験生物を作製する;e遺伝子のmRNAの分解が生じる条件下で試験細胞または試験生物を維持する工程、それにより該遺伝子のmRNAが分解される試験細胞または試験生物を作製する;およびfeにおいて作製される試験細胞または試験生物の表現型を観察する工程、および任意に観察された表現型と適切な対照の表現型とを比較する工程、それにより遺伝子の機能に関する情報を提供する、を含む、細胞または生物における遺伝子の機能の調査方法、31RNAが末端3’ヒドロキシル基を含有してなるものである、30記載の方法、32可溶性抽出物が合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚に由来するものである、30記載の方法、33RNAがゲル電気泳動を用いて単離される、30記載の方法、34dsRNAを約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセスするショウジョウバエ細胞の生化学成分および適切なキャリアを含有してなる組成物、35約21~約23ヌクレオチドのRNAにより分解対象の遺伝子のmRNAを標的化する細胞の生化学成分を含有してなる組成物、36分解対象のタンパク質のmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAを個体に投与することを含む、個体におけるタンパク質の存在に関する疾患または状態を治療する方法、37約21~約23ヌクレオチドのRNAが、化学合成されているか、またはRNA干渉を媒介するRNAのアナログである、36記載の方法、38a分解対象の遺伝子のmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAを細胞または生物に導入する工程;bmRNAの分解が生じる条件下でaの細胞または生物を維持する工程、cbの細胞または生物に薬剤を導入する工程;およびd該薬剤が細胞または生物において効果を有するかどうかを決定する工程、ここで該薬剤が細胞または生物において効果を有さない場合、該薬剤が遺伝子産物または遺伝子産物を含む生物学的経路において作用するを含む、薬剤が遺伝子産物に作用するかどうかを評価する方法、39約21~約23ヌクレオチドのRNAが、化学合成されているか、またはRNA干渉を媒介するRNAのアナログである、38記載の方法、40a分解対象の遺伝子のmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAを細胞または生物に導入する工程;bmRNAの分解が生じる条件下でaの細胞または生物を維持する工程、それにより該遺伝子の発現の減少を生じる;およびc細胞または生物において遺伝子の減少した発現の効果を決定する工程、ここで減少した発現が効果を有する場合、遺伝子産物が薬物発見の標的であるを含む、遺伝子産物が薬物発見に適した標的であるかどうかを評価する方法、41約21~約23ヌクレオチドのRNAが、合成RNAまたはRNA干渉を媒介するRNAのアナログである、40記載の方法、42RNA干渉を媒介する内因性21~23ヌクレオチドRNA分子の配列決定により同定される遺伝子、43RNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチドのRNAおよび適切なキャリアを含有してなる医薬組成物、44遺伝子がノックダウンされるべき細胞に、該遺伝子に対応するmRNAを標的化する約21~約23ntのRNAを導入する工程および得られた細胞をRNAiが生じる条件下で維持する工程を含み、該遺伝子のmRNAの分解を生じ、それによりノックダウン細胞を作製する、ノックダウン細胞の作製方法、45約21~約23ヌクレオチドのRNAが、RNA干渉を媒介する合成RNAまたはRNAのアナログである、44記載の方法、46分解対象の遺伝子の配列に対応するdsRNA、該遺伝子に対応する標識mRNAおよびRNA干渉を媒介する可溶性抽出物を組み合わせる工程、それにより組み合わせを生じる;dsRNAが分解される条件下で組み合わせを維持する工程および効率的に切断されるmRNA中の部位を同定する工程を含む、RNAiプロセスにより効率的に切断されるmRNA内の標的部位を同定する方法、4746記載の方法によりmRNA内に同定される標的部位にわたる、RNAiを効率的に媒介する21~23ntRNAを同定する方法、48ゲル電気泳動を用いて単離された16記載のRNA、49非変性法を用いて単離された16記載のRNA、50非変性カラムクロマトグラフィーを用いて単離された16記載のRNAに関する。本発明により、RNA干渉のRNA配列特異的メディエータが提供される。発明の要旨合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚に由来する無細胞系における遺伝子特異的、dsRNA媒介性干渉が本明細書中に記載される。インビトロ系は、RNAiの分子基礎を分析するための遺伝的アプローチを補完する。本明細書中に記載されるように、RNAiの根底にある分子機構はショウジョウバエインビトロ系を用いて調査された。結果は、RNAiがATP依存性であるが、mRNA転写からは切り離されていることを示した。これは、タンパク質合成がインビトロではRNAiには必要でないことを示した。RNAi反応において、dsRNAの両方の鎖センスおよびアンチセンスが約21~約23ヌクレオチドnt長の小さなRNA断片またはセグメントにプロセシングされる21~23nt長のマーカーに相当する配列決定ゲルにおける移動度を有するRNA、任意に21~23ntRNAと呼ばれる。小RNA断片へのdsRNAのプロセシングは、標的化mRNAを必要とはせず、このことは小RNA種がdsRNAのプロセシングによって生じ、dsRNA標的化mRNA分解の産物ではないことを示す。mRNAは、dsRNAを用いた同一性の領域内でのみ切断される。切断は、21~23ヌクレオチド離れた部位で起こり、同じ間隔がdsRNA自体について観察されており、dsRNA由来の21~23ヌクレオチド断片がmRNA切断をガイドしていることを示唆する。この精製された21~23ntのRNAは、RNAiを媒介し、これらの断片がmRNA切断をガイドすることを確認する。従って、本発明は、RNAiを媒介する約21~約23ヌクレオチドの単離されたRNA分子二本鎖;一本鎖に関する。すなわち、本発明の単離されたRNAは、mRNAが対応する遺伝子のmRNAの分解を媒介する遺伝子、これはまた標的遺伝子と呼ばれる、の転写産物であるmRNAの分解を媒介する。便宜上、かかるmRNAはまた本明細書中では分解対象のmRNAとも呼ばれる。本明細書中で使用される用語、RNA、RNA分子単数または複数、RNAセグメント単数または複数およびRNA断片単数または複数は、RNA干渉を媒介するRNAに言及するために交換可能に使用される。これらの用語には、二本鎖RNA、一本鎖RNA、単離されたRNA部分的に精製されたRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換え産生RNA、ならびに1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および/または変化により天然に存在するRNAとは異なる改変RNAが含まれる。かかる変化は、21~23ntのRNAの末端または内部RNAの1つ以上のヌクレオチドで等への非ヌクレオチド物質の付加を含みうる。本発明のRNA分子中のヌクレオチドはまた、天然には存在しないヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準ヌクレオチドを含みうる。集合的に、かかる変化したRNAの全ては、アナログまたは天然に存在するRNAのアナログと呼ばれる。本発明の21~23ヌクレオチドのRNAは、それがRNAiを媒介する能力を有するのに十分なようにだけ天然のRNAに類似している必要がある。本明細書で使用する語句RNAiを媒介するは、どのRNAがRNAi機構またはプロセスによって分解されるかを識別する能力をいう示す。RNAiを媒介するRNAは、それがRNAi機構に特定のmRNAを分解させるようにRNAi機構と相互作用する。1つの態様では、本発明は、それらの配列が対応する特定のmRNAの切断を行う約21~約23ヌクレオチドのRNA分子に関する。配列の完全な一致が存在する必要はないが、RNAが標的化mRNAのRNAi切断を行うことが可能であるように十分に一致していなければならない。特定の態様では、本発明の21~23ntのRNA分子は、3’ヒドロキシル基を含む。本発明はまた、RNAi切断を媒介する能力を有する約21~約23ヌクレオチドのRNA分子を生産する方法に関する。ある態様では、ショウジョウバエがインビトロ系で使用される。この態様では、dsRNAは、ショウジョウバエ胚に由来する可溶性抽出物と組み合わされ、それにより組み合わせを生じる。組み合わせは、dsRNAが約21~約23ヌクレオチドのRNA分子にプロセシングされる条件下で維持される。別の態様では、ショウジョウバエは、インビトロ系で使用されて、特定の遺伝子例えば、オンコジーン、ウイルス遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチドのRNA配列が得られる。この態様では、標的対象の遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAは、ショウジョウバエ胚に由来する可溶性抽出物と組み合わされ、それによって組み合わせを生じる。組み合わせは、二本鎖RNAが約21~約23ヌクレオチド長のRNAにプロセシングされる条件下で維持される。本明細書中に示されるように、21~23ntのRNAは標的遺伝子そのmRNAが分解対象である遺伝子のmRNAのRNAiを媒介する。ショウジョウバエをインビトロ系で使用して21~23ntのRNAを得る方法は、組み合わせからRNA配列を単離することをさらに含みうる。本発明はまた、本発明の方法により生産される21~23ntのRNA、ならびに他の方法、例えば、化学合成または組換えDNA技術により生産された、RNAiを媒介する天然に存在するRNAと同一かまたは実質的に同一の配列を有する21~23ntのRNA、例えば、本発明の方法により生産されるものに関する。これらの全ては、RNA干渉を媒介する21~23ntのRNAと呼ばれる。本明細書中で使用される用語、単離されたRNAは、本明細書中に記載されるdsRNAのプロセシングまたは切断;化学合成法による生産;および組換えDNA技術による生産を含む、任意の手段によって得られるRNAを含む。本発明はさらに、治療的または予防的処置および21~23ntのRNAおよび適切なキャリア例えば、緩衝液または水を含有する医薬組成物等のRNAiを媒介する21~23ntのRNAを含有する組成物等のための21~23ntのRNAの使用に関する。本発明はまた、細胞または生物例えば、マウスまたはヒトなどの哺乳動物における遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する方法に関する。ある態様では、分解対象のmRNAを標的化する約21~約23ntのRNAが、細胞または生物に導入される。細胞または生物は、mRNAの分解が生じる条件下で維持され、それにより細胞または生物における遺伝子のmRNAのRNA干渉が媒介される。細胞または生物は、細胞または生物が得られるとRNAiが生じるものであるか、または細胞もしくは生物はRNAiが生じる例えば、RNAiを媒介する細胞もしくは細胞抽出物から得られる成分の添加または内因性成分の活性化によるように修飾されたものでありうる。本明細書中で使用される用語RNAiが生じる細胞または生物は、細胞または生物が得られるとRNAiが生じる細胞または生物、またはRNAiが生じるように修飾された細胞または生物の両方が含まれる。別の態様では、細胞における遺伝子のRNA干渉を媒介する方法は、ショウジョウバエ胚に由来する可溶性抽出物と遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAとを組み合わせることを含み、それにより組み合わせが生じる。組み合わせは、二本鎖RNAが、約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセシングされる条件下で維持される。次いで、21~23ntのRNAは単離されて、細胞または生物に導入される。細胞または生物は、遺伝子のmRNAの分解が生じるような条件下で維持され、それにより細胞または生物における遺伝子のRNA干渉を媒介する。前の態様に記載されたように、細胞または生物は、RNAiが自然に生じる得られると細胞または生物においてものまたはRNAiが生じるように修飾されているものである。21~23ntのRNAはまた、化学合成法または組換えDNA技術等の他の方法により作製されうる。本発明はまた、dsRNAを約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセスprocessする細胞、例えば、ショウジョウバエ細胞の生化学的成分に関する。さらに、約21~約23ヌクレオチドのRNAによるmRNAの標的化に関与する細胞の生化学的成分は、本発明の主題である。両方の態様において、生化学的成分は、それらが生じる細胞から得られうるか、または化学合成または組換えDNA法等の他の方法により作製されうる。本明細書中で使用される用語単離されたは、それらが生じる供給源から得られた物質例えば、生化学成分、RNAおよび化学合成または組換え核酸DNA、RNA法等の方法によって生産された物質を含む。本発明はまた、標的遺伝子をノックダウン部分的にまたは完全にする方法に関し、従って、遺伝子単数または複数をノックダウンまたはノックアウトする現在利用可能な方法の代替法を提供する。この遺伝子発現をノックダウンする方法は、治療的に、または研究のために使用することができる例えば、疾患状態のモデルを生じるため、遺伝子の機能を調べるため、薬剤agentが遺伝子に対して作用するかどうかを評価するため、薬物送達の標的を確証するために。遺伝子機能が除去される場合、得られる細胞または生物はノックアウトとも呼ばれる。ノックダウン細胞および生物を作製する方法の一つの態様は、遺伝子標的遺伝子ともいうがノックダウンされるべき細胞または生物に、該遺伝子を標的化する約21~約23ntのRNAを導入し、得られた細胞または生物を維持し、標的遺伝子のmRNAの分解を起こし、それによってノックダウン細胞または生物をRNAiが生じる条件下で生産する。本方法により生産されるノックダウン細胞または生物はまた、本発明の主題である。本発明はまた、細胞または生物において遺伝子の機能を調査または評価する方法に関する。一つの態様では、分解対象の遺伝子のmRNAを標的化する約21~約23ntのRNAは、RNAiが起こる細胞または生物に導入される。細胞または生物は、試験細胞または生物とも呼ばれる。試験細胞または生物は、遺伝子のmRNAの分解が起こる条件下で維持される。次いで、試験細胞または生物の表現型が観察され、適切な対照細胞または生物例えば、標的特異的細胞が標的化されていない以外は同じ様式で処理される対応細胞または生物のそれと比較される。分解対象のmRNAを標的化しない21~23ntのRNAは、試験細胞または生物に導入されるRNAの代わりに、対照細胞または生物に導入されうるが、必ずしもそうする必要はない。試験細胞または生物と対照細胞または生物との表現型の差異は、分解されたmRNAの機能に関する情報を提供する。別の態様では、遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAは、二本鎖RNAが約21~約23ヌクレオチドのRNAを生じるようにプロセスされる条件下で、本明細書中に記載されるショウジョウバエ胚由来の可溶性抽出物等のRNAiを媒介する可溶性抽出物と組み合わされる。約21~約23ヌクレオチドのRNAが単離され、次いでRNAiが起こる細胞または生物試験細胞または試験生物に導入される。試験細胞または試験生物は、mRNAの分解が起こる条件下で維持される。次いで、試験細胞または生物の表現型が観察され、適切な対照例えば、標的遺伝子を標的しない以外は試験細胞または生物と同一の様式で処理される対応する細胞または生物のそれと比較される。試験細胞または生物と対照細胞または生物との間の表現型の差異は、標的化遺伝子の機能に関する情報を提供する。提供される情報は、遺伝子の機能を同定規定するのに充分であり得るか、またはそうするための他のアッセイまたは解析から得られた情報と組み合わされて使用されうる。また、本発明の主題は、薬剤が遺伝子に作用するかどうかを確認する方法である。この方法では、分解対象のmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAが、RNAiが起こる細胞または生物に導入される。細胞または生物導入されたRNAを含むは、mRNAの分解が生じる条件下で維持され、薬剤は細胞または生物に導入される。薬剤が、細胞または生物において効果を有するかどうかを決定する;薬剤が細胞または生物において効果を有さない場合、薬剤は遺伝子に作用する。本発明はまた、遺伝子産物が薬物の発見または開発のための標的であるかどうかを確証する方法に関する。分解対象の遺伝子に対応するmRNAを標的化する約21~約23ヌクレオチドのRNAが細胞または生物に導入される。細胞または生物は、mRNAの分解が起こる条件下で維持され、遺伝子の発現の減少を生じる。遺伝子の発現の減少が細胞または生物において効果を有するかどうかが決定され、ここで、遺伝子の発現の減少が効果を有する場合、遺伝子産物は、薬物の発見または開発のための標的である。本発明はまた、分解対象のタンパク質のmRNAタンパク質をコードするmRNAを標的化する約21~約23のヌクレオチドのRNAを個体に投与することを含む、個体におけるタンパク質の存在に関連する疾患または状態の治療方法を包含する。結果として、前記タンパク質は産生されないか、または治療が非存在でありうる程度まで産生されない。本発明によりさらに、RNA干渉を媒介する内因性の21~23ヌクレオチドRNA分子の配列決定により同定される遺伝子が包含される。本発明によりさらに、RNAiに特に適切なmRNA内の標的部位を同定する方法ならびに21~23ntのRNAがRNAiを媒介する能力を評価する方法が包含される。本発明のファイルは、カラーで作製された少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面を有する本発明のコピーは、請求し、必要な料金を支払うことにより米国特許庁により提供される。発明の詳細な説明二本鎖dsRNAは、RNA干渉RNAiとして知られるプロセスを介してmRNAの配列特異的分解を行う。プロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物の胚を含む、広範な生物において起こることが知られている。本明細書中に記載されるインビトロ系でショウジョウバエを用いて、dsRNAが21~23ヌクレオチドnt長のRNAセグメントにプロセスされ、さらに、これらの21~23ntフラグメントが精製され、ショウジョウバエ抽出物に戻された場合、それらはより長いdsRNAの非存在下でRNA干渉を媒介する。従って、これらの21~23ntフラグメントは、RNA分解の配列特異的メディエータである。特定の長さのフラグメントでありうる分子シグナルは、RNAiに関与する細胞因子を漸加するためにこれらの21~23ntフラグメントに存在するはずである。本発明は、これらの21~23ntフラグメントおよび遺伝子機能を特異的に不活化するためのそれらの使用を包含する。これらのフラグメントまたは同一もしくは類似した特性の組換え産生または化学合成のオリゴヌクレオチドは、哺乳動物細胞における分解のために特定のmRNAの標的化を可能にする。RNAiを誘発するための哺乳動物細胞における長鎖dsRNAの使用は、おそらく、インターフェロン応答の有害な効果のために、通常実用的ではない。本発明の21~23ntのフラグメントを用いて可能である、特定の遺伝子機能の特定の標的化は、機能的ゲノム適用および治療的適用に有用である。特に、本発明は、RNAiを媒介する約21~約23ヌクレオチドのRNA分子に関する。1つの態様では、本発明は、それらが対応する特定のmRNAの切断を行う約21~約23ヌクレオチドのRNA分子に関する。本発明の21~23ntのRNA分子はまた、3’ヒドロキシル基を含む。21~23ntのRNA分子は、一本鎖または二本鎖2つの21~23ntのRNAとしてであり得る;かかる分子は、平滑末端でありうるか、または突出末端を含みうる例えば、5’、3’。特定の態様では、RNA分子は二本鎖であり、平滑末端であるか、または突出末端を含む2つの21~23ntのRNAとして。1つの態様では、RNA分子の少なくとも1つの鎖は、約1~約6ヌクレオチド例えば、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオチド長の3’突出部を有する。他の態様では、3’突出部は、約1~約5ヌクレオチド長、約1~約3ヌクレオチド長および約2~約4ヌクレオチド長である。1つの態様では、RNA分子は二本鎖であり、一方の鎖は3’突出部を有し、他方の鎖は平滑末端であるかまたは突出部を有しうる。RNA分子が二重鎖であり、両方の鎖が突出部を含む態様では、突出部の長さは互いに同一であっても異なっていてもよい。特定の態様では、本発明のRNAは、対となり、RNAの両方の3’末端に約1~約3、特に約2ヌクレオチドの突出部を有する21ヌクレオチド鎖を含む。本発明のRNAの安定性をさらに増大するために、3’突出部を分解に対して安定化しうる。1つの態様では、RNAは、プリンヌクレオチド、例えば、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドを含ませることにより安定化される。あるいは、修飾アナログによるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、2’デオキシチミジンによるウリジン2ヌクレオチド3’突出部の置換は許容され、RNAiの効率に影響しない。2’ヒドロキシルが存在しないことは、組織培養培地において突出部のヌクレアーゼ抵抗性を有意に増強する。本発明の21~23ntのRNA分子は、当業者に公知の多数の技術を用いて得られうる。例えば、RNAは、当該分野で公知の方法を用いて化学合成されるか、または組み換え産生されうる。21~23ntのRNAはまた、本明細書中に記載されるインビトロ系でショウジョウバエを用いて得られうる。インビトロ系でのショウジョウバエの使用は、dsRNAとショウジョウバエ胚に由来する可溶性抽出物とを組み合わせることを要し、それにより組み合わせを生じる。組み合わせは、dsRNAが約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセスされる条件下で維持される。ショウジョウバエインビトロ系はまた、特定の遺伝子例えば、オンコジーン、ウイルス遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する約21~約23ヌクレオチド長のRNAを得るために使用されうる。本態様では、前記遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAは、ショウジョウバエ胚に由来する可溶性抽出物と組み合わされ、それにより組み合わせを生じる。組み合わせは、二本鎖RNAが約21~約23ヌクレオチドのRNAにプロセスされる条件下で維持される。本明細書中に示されるように、21~23ntのRNAは、分解対象のmRNAのRNAiを媒介する。本発明はまた、本明細書中に記載される方法により作製される21~23ntのRNA分子に関する。1つの態様では、本明細書中に記載の方法は、RNA分解の配列特異的メディエータとして有用である、従って、疾患または所望しない状態に関連するか、またはその原因となる産物をコードするヒトmRNA等のmRNAを阻害するための21~23ntのRNA分子を同定または得るために使用される。例えば、オンコプロテインまたはウイルスタンパク質の産生は、疾患または状態が起こることを妨げるために、それが起こる程度を限定するために、またはそれを逆転するために、ヒトにおいて阻害されうる。ヒトにおける標的対象の遺伝子の配列が公知である場合、21~23ntのRNAが作製されて、ヒトまたは他の霊長類の細胞等の細胞においてRNAiを媒介する能力について試験されうる。RNAiを媒介することが示された21~23ntのヒトRNA分子は試験され得、所望であれば、適切な動物モデルにおいてそれらのインビボ有効性がさらに評価されうる。RNAiを媒介することが示された21~23ntのRNAのさらなるコピーが本明細書中に記載の方法により作製されうる。インビトロ系でショウジョウバエを用いて21~23ntのRNA配列を得る方法は、組み合わせからRNA配列を単離することをさらに含みうる。21~23ntのRNA分子は、当業者に公知の多数の技術を用いて単離されうる。例えば、ゲル電気泳動は、組み合わせから21~23ntのRNAを分離するために使用さ得、RNA配列を含むゲルスライスが取り出され得、ゲルスライスからRNAが溶出されうる。あるいは、非変性カラムクロマトグラフィー等の非変性方法が、作製されたRNAを単離するために使用されうる。また、クロマトグラフィー例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、グリセロール勾配遠心分離、抗体を用いるアフィニティー精製が21~23ntのRNAを単離するために使用されうる。インビトロ系においてショウジョウバエから単離されるRNAタンパク質複合体はまた、本明細書中に記載される方法例えば、遺伝子のmRNAのRNAiを媒介する方法において直接使用されうる。RNAiを媒介または行うショウジョウバエ胚に由来する適切な抽出物は本発明に包含される。可溶性ショウジョウバエ抽出物は、種々の方法で得られうる。例えば、可溶性抽出物は、実施例1、2および3に記載のように合胞体胚盤葉ショウジョウバエ胚から得られうる。可溶性抽出物は、RNAiが生じる他の細胞に由来しうる。あるいは、可溶性抽出物は、RNAiを行わない細胞から得られうる。この場合、RNAiを媒介するのに必要な因子は、かかる細胞に導入され得、次いで可溶性抽出物が得られる。抽出物の成分はまた、当該分野で公知の方法を用いて化学的に合成され、および/または組み合わされうる。任意のdsRNAは、それが、RNAiを媒介するのに十分な相同性を標的遺伝子に対して有する場合、本発明の方法に使用されうる。本発明の方法に使用するためのdsRNAの配列が知られている必要はない。あるいは、本発明に使用するためのdsRNAは、全体の遺伝子1つまたはそれ以上またはその一部の配列等の既知の配列に相当しうる。使用されうるdsRNAの長さに上限はない。例えば、dsRNAは、遺伝子の約21塩基対bpから遺伝子の全長またはそれ以上の範囲である。1つの態様では、本発明の方法に使用されるdsRNAは約1000bp長である。別の態様では、dsRNAは約500bp長である。さらに別の態様では、dsRNAは約22bp長である。本明細書に記載の21~23ntRNAは、様々な方法で使用しうる。例えば、21~23ntRNA分子は、細胞または生物内の遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介するために使用しうる。具体的な態様では、疾患または望ましくない状態を予防または処置するなど、ヒト細胞またはヒトにおけるRNA干渉を媒介するために、21~23ntRNAを該細胞または該個体の細胞に導入する。本方法では、疾患または望ましくない状態を引き起こすか、またはこれらに寄与する遺伝子または複数の遺伝子を標的化し、RNAiにより対応するmRNA標的化された遺伝子の転写産物を分解する。本態様では、分解のために対応するmRNA標的化された遺伝子のmRNAを標的化する約21個から約23個のヌクレオチドのRNAを、細胞または生物内に導入する。細胞または生物は、該対応するmRNAの分解が起こる条件下に維持し、それにより該細胞または生物内の遺伝子のmRNAのRNA干渉を媒介する。特定の態様では、細胞内の遺伝子のRNA干渉の媒介方法は、該遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAをショウジョウバエ胚由来の可溶性抽出物と合わせ、それにより組み合せを作製する工程を含む。該組み合せを、該二本鎖RNAが約21個から約23個のヌクレオチドのRNAにプロセッシングされる条件下に維持する。次いで、21~23ntRNAを単離し、細胞または生物内に導入する。細胞または生物を、該遺伝子のmRNAの分解が起こる条件下に維持し、それにより該細胞または生物内の遺伝子のRNA干渉を媒介する。通常RNAiが起こらない細胞内に21~23ntRNAを導入する場合、RNAiを媒介するのに必要な因子をかかる細胞内に導入するか、または必要な因子の発現をかかる細胞内で誘導する。あるいはまた、RNAiを媒介することが知られた21~23ntRNAと同じか、または充分に類似した組成を有するように、他の方法例えば、化学合成、組換えDNA作製により作製した21~23ntRNAを、RNAiを媒介するために同様に使用しうる。かかる21~23ntRNAは、1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換または修飾により改変しうる、および/または非ヌクレオチド物質を含有し得る。本発明のさらなる態様は、白血病またはAIDSなどの疾患または望ましくない状態を引き起こすか、またはこれらに関連する1つまたは複数の遺伝子を破壊するための個体由来の細胞のエキソビボ処置法である。この態様では、処置対象の細胞を公知の方法例えば、静脈切開または骨髄の採取を用いて個体から得、対応する1または複数のmRNAの分解を媒介する21~23ntRNAを該細胞内に導入し、次いで、これを個体に再導入する。必要であれば、RNAiが起こるのに必要な生化学的成分もまた該細胞内に導入することができる。本明細書に記載のmRNAの干渉媒介法を用い、分解のために任意の遺伝子のmRNAを標的化しうる。例えば、任意の細胞mRNAまたはウイルスmRNAを標的化することができ、その結果、コードされたタンパク質例えば、発癌タンパク質、ウイルスタンパク質、発現が減衰される。また、本明細書に記載の方法を用い、疾患または望ましくない状態に関連するおよび/またはこれらの原因となる任意のタンパク質のmRNAを分解するために標的化することができる。本発明はまた、細胞または生物内の遺伝子の機能を調べる方法に関する。一態様において、分解のために遺伝子のmRNAを標的化する約21個~約23個のヌクレオチドのRNA配列を細胞または生物内に導入する。該細胞または生物を、該遺伝子のmRNAの分解が起こる条件下に維持する。次いで、細胞または生物の表現型を観察し、適切な対照と比較し、それにより該遺伝子の機能に関する情報を提供する。別の態様では、該遺伝子の配列に対応する二本鎖RNAを、ショウジョウバエ胚由来の可溶性抽出物と、該二本鎖RNAがプロセッシングされて約21個から約23個のヌクレオチドのRNAが生じる条件下で合わせる。約21個~約23のヌクレオチドのRNAを単離し、次いで該細胞または生物内に導入する。該細胞または生物を、該遺伝子のmRNAの分解が起こる条件下に維持する。次いで、該細胞または生物の表現型を観察し、適切な対照と比較し、それにより該遺伝子の機能を同定する。本発明のさらなる局面は、21~23ntRNAのRNAiを媒介する能力を評価する方法、特に、どの1つまたは複数の21~23ntRNAが最もRNAiを効率的に媒介するかを調べる方法である。該方法の一態様において、分解対象のmRNAの配列に対応するdsRNAを、検出可能に標識例えば、放射標識などの末端標識したmRNAおよび本発明の可溶性抽出物と合わせ、それにより組み合せを作製する。該組み合せを、該二本鎖RNAがプロセッシングされ、かつ該mRNAが分解される条件下に維持する。標識されたmRNAの切断物の移動を既知長のマーカーと比較することにより最も効果的に切断される部位をマッピングする。次いで、これらの部位に広がる21量体を設計し、そのRNAi媒介における効率について試験する。あるいはまた、他の領域よりも効率的にRNAiによって標的化され、したがって特に有用な標的部位でありうる、遺伝子に対応するmRNAの特定のセグメントまたは特定の複数のセグメントがあるか否かを調べるために本発明の抽出物を使用することができる。一態様において、破壊対象の遺伝子の配列に対応するdsRNA、該遺伝子の標識されたmRNAを、RNAiを媒介する可溶性抽出物とあわせ、それにより組み合せを作製する。得られた組み合せをdsRNAが分解される条件下に維持し、最も効率的に切断されるmRNA上の部位を、シークエンシングゲル上での既知サイズの標準物との比較などの公知の方法を用いて同定する。実施例の概要実施例1に記載の遺伝子発現のdsRNA依存性サイレンシングを反復するインビトロショウジョウバエ胚溶解物の開発により、RNAiの生化学的解析が可能となった。インビトロ系では、センスまたはasRNAはそうではないが、dsRNAは、分解のために対応するmRNAを標的化するが、非関連対照mRNAの安定性には影響しない。さらに、溶解物中でのdsRNAのプレインキュベーションは、その標的mRNA分解のための活性を増強し、これは、dsRNAが、抽出物内のタンパク質と結合することにより、または二重結合性修飾により活性形態に変換されるにちがいないことを示唆する。RNAiの特徴の多くを反復する合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚由来の無細胞系の開発を本明細書に記載する。この反応において観察される干渉は、配列特異的であり、dsRNAにより促進されるが一本鎖RNAによっては促進されず、特異的mRNA分解により機能し、最小限の長さのdsRNAしか必要とせず、長鎖dsRNAで最も効率的である。さらに、dsRNAのプレインキュベーションはその活性を増強する。これらの結果は、可溶性反応物においてRNAiが配列特異的プロセスにより媒介されることを示す。実施例2に記載するように、RNAiの必要条件を解析するため、ならびにdsRNAおよびmRNAの運命を調べるためにインビトロ系を使用した。RNAiは、インビトロでATPを必要とするが、mRNA翻訳または標的化mRNAの7-メチル-グアノシンキャップの認識のどちらも必要としない。dsRNAはインビトロで21~23nt種の集団にプロセッシングされるが、一本鎖RNAはされない。dsRNA内のアデノシン脱アミノは、21~23ntRNAの形成に必要でないようである。本明細書に記載のように、mRNAは、dsRNAの配列に対応する領域のみで切断され、mRNAが21~23nt間隔で切断され、これは、dsRNA由来の21~23nt断片が該mRNAの切断を標的化していることを強く示すものである。さらにまた、実施例3および4に記載のように、21~23nt断片を精製して可溶性抽出物に添加して戻すと、RNAを媒介する。本発明を、なんら限定することを意図しない以下の実施例により示す。実施例1二本鎖RNAによるインビトロでの標的化mRNAの分解材料および方法RNARr-LucmRNAは、pSP64プラスミドポリリンカー由来の25ntの5’非翻訳配列と、pSP64プラスミドポリリンカー配列の19ntおよび続く6ntのSacI部位からなる25ntの3’非翻訳配列とに隣接する926ntRrルシフェラーゼコード配列から構成された。Pp-LucmRNAは、Ppルシフェラーゼ停止コドンの直前にKpnI部位が導入された1653ntのPpルシフェラーゼコード配列を含有した。Ppコード配列は、21ntのpSP64プラスミドポリリンカーおよび続くショウジョウバエハンチバックmRNA由来の512ntの5’非翻訳領域UTRからなる5’非翻訳配列と、562ntハンチバック3’UTRおよび続く6ntのSacI部位からなる3’非翻訳配列とに隣接した。使用したハンチバック3’UTR配列は、インビボおよびインビトロでナノス応答エレメントの機能を破壊するG-U変異を6個含んだ。25ntポリAテイルで終わる両方のレポーターmRNAは、転写されたプラスミド内にコードされた。Rr-LucmRNAおよびPp-LucmRNAの両方について、25ntのコードされたポリAテイルが直後に続くNsiI部位で切断されるプラスミド鋳型からのランオフ転写により転写物を作製した。転写物がポリAテイルで終わることを確実にするため、NsiI切断転写物鋳型をdNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼで切断した。SP6mMessagemMachineキットAmbionをインビトロ転写に使用した。このキットを用い、得られた転写物の約80を7-メチルグアノシンでキャップする。転写反応物にα-32P-UTPを含めることにより32P放射標識を行った。Pp-Lucではss、asおよびdsRNAを翻訳開始点に対して93~597位に対応させ、505bpのdsRNAを作製した。Rr-Lucではss、asおよびdsRNAを翻訳開始点に対して118~618位に対応させ、501bpのdsRNAを作製した。ショウジョウバエナノス競合dsRNAを翻訳開始点に対して122~629位に対応させ、508bpのdsRNAを作製した。ssRNA、asRNAおよびdsRNA図1に概略を示すを、ポリメラーゼ連鎖反応により、T7RNAポリメラーゼを用いて作製した鋳型からインビトロで転写した。T7RNA転写物のゲル精製後、RQ1DNアーゼPromegaを用いて処理することにより残留するDNA鋳型を除去した。次いで、RNAをフェノールおよびクロロホルムで抽出した後、沈殿させ、水に溶解した。RNAのアニーリングおよびネイティブゲル電気泳動20mMNaClを含む、ssRNAおよびasRNA0.5μMの10mMTris-HClpH7.5を1分間95°Cまで加熱した後、冷却し、室温で12~16時間アニーリングした。RNAを沈殿させ、溶解バッファー下記に再懸濁した。アニーリングをモニターするため、2のアガロースゲルを含むTBEバッファー中でRNAを電気泳動させ、臭化エチジウムで染色したSambrookら、MolecularCloningColdSpringHarborLaboratoryPressPlainviewNY。溶解物の調製オレゴンRハエの0~2時間目の胚を25°Cの発光糖蜜寒天上に集めた。胚を4~5分間50vv漂白剤中で絨毛膜除去し、水洗し、ブロット乾燥し、低温Potter-Elvehjem組織摩砕器Kontesに移した。湿った胚1gあたり、5mMジチオトレイトールDTTおよび1mg/mlPefablocSCBoehringer-Mannheimを含む溶解バッファー100mM酢酸カリウム、30mMHEPES-KOH、pH7.4、2mM酢酸マグネシウム1ml中で胚を4°Cで溶解させた。溶解物を、25分間、14500×gで4°Cで遠心分離し、上清みを分割して液体窒素中で即座に凍結し、-80°Cで保存した。反応条件溶解物の調製および反応条件は、HussainおよびLeibowitzにより記載されたものから誘導した。反応物は、50v/v溶解物、mRNA10~50pMの最終濃度、およびssRNA、asRNAまたはdsRNA10nM最終濃度を含む10v/v溶解バッファーを含んだ。各反応物はまた、10mMクレアチンリン酸、10μg/mlクレアチンホスホキナーゼ、100μMGTP、100μMUTP、100μMCTP、500μMATP、5μMDTT、0.1U/mLRNasinPromega、および100μMの各アミノ酸を含んだ。酢酸カリウムの最終濃度を100mMに調整した。標準的な条件のため、mRNAを添加する前に、反応物を氷上に集め、次いで25°Cで10分間予備インキュベートした。mRNAを添加した後、さらに60分間インキュベーションを続けた。10分間のプレインキュベーション工程は、図3A~3Cおよび5A~5Cの実験では省略した。4容量の1.25×PassiveLysisBufferPromegaで反応を停止させた。PpおよびRrルシフェラーゼ活性を、Dual-LuciferaseReporterAssaySystemPromegaを用い、Monolight2010Luminometerで検出した。RNAの安定性32P-放射標識したmRNAを含む反応物を、40容量の2×PKバッファー200mMTris-HCl、pH7.5、25mMEDTA、300mMNaCl、2w/vドデシル硫酸ナトリウムの添加により消光させた。プロテイナーゼKを最終濃度465μg/mlまで添加した。次いで、反応物を15分間65°Cでインキュベートし、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール25:24:1で抽出し、等容量のイソプロパノールで沈殿させた。ホルムアルデヒド/アガロース0.8w/vゲルSambrookら、MolecularCloningColdSpringHarborLaboratoryPressPlainviewNYでの電気泳動により反応物を解析した。アガロースゲルNytranPlus膜上に真空下で乾燥を画像用プレートFujixに曝露することにより放射能を検出し、FujixBas2000およびImageGauge3.0Fujixソフトウェアを用いて定量した。市販溶解物未処置ウサギ網状赤血球溶解物Ambionおよび小麦麦芽抽出物Ambionの反応物を製造業者の指示書に従って構築した。mRNAの添加の前に、溶解物中でdsRNAを27°C小麦麦芽または30°C網状赤血球溶解物で10分間インキュベートした。結果および考察dsRNAがインビトロで遺伝子発現を特異的にブロックしうるか否かを評価するため、配列においてもルシフェリン基質特異性においても関連しない2つの異なるルシフェラーゼ遺伝子由来のレポーターmRNAを使用した:RenillareniformisウミシイタケルシフェラーゼRr-LucおよびPhoturispennsylvanicaホタルルシフェラーゼPp-Luc。一方の遺伝子から作製したdsRNAを該ルシフェラーゼmRNAを標的化するために使用し、他方のルシフェラーゼmRNAを、同じ反応で同時翻訳される内部対照とした。Rr-LucおよびPp-Luc遺伝子由来のポリメラーゼ連鎖反応産物の転写により約500bpのdsRNAを調製した。各dsRNAは翻訳開始点の約100bp下流から始まった図1。センスssおよびアンチセンスasRNAをインビトロで転写し、互いにアニーリングさせてdsRNAを作製した。RrdsRNAおよびPpdsRNAを形成するために使用した個々のRr501およびPp505ntのasRNAおよびssRNAのネイティブゲル電気泳動を行った。ssRNA、asRNAおよびdsRNAをそれぞれ、そのコグネイトmRNAの発現を特異的にブロックするが、非関連内部対照mRNAの発現は特異的にブロックしない能力について試験した。ssRNA、asRNAまたはdsRNAを、ショウジョウバエ胚溶解物を含有する反応物中で10分間インキュベートした後、Pp-LucmRNAおよびRr-LucmRNAの両方を加え、さらに60分間インキュベーションを続けた。ショウジョウバエ胚溶解物は、外因的に転写されたmRNAを、使用した条件下で効率的に翻訳する。Pp-Luc酵素活性およびRr-Luc酵素活性の量を測定し、Pp-Luc/Rr-Luc図2AまたはRr-Luc/Pp-Luc図2Bのいずれかの比を計算するために使用した。異なる実験の比較を容易にするため、各実験での比を、ssRNA、asRNAまたはdsRNAの代わりにバッファーを反応物に加えた対照で観察された比に対して標準化した。図2Aは、Pp-Luc遺伝子の配列の部分と同一の505bpdsRNAが10nM濃度でPp-LucmRNAの発現を特異的に阻害したが、Rr-Luc内部対照の発現には影響しなかったことを示す。ssRNAとasRNAのいずれも、Pp-LucまたはRr-Luc内部対照の発現に影響しなかった。したがって、Pp-Luc発現は、そのコグネイトdsRNAにより特異的に阻害された。逆に、Rr-LucmRNAに対する501bpのdsRNAは、10nM濃度で、Rr-Luc発現を特異的に阻害したが、Pp-Luc内部対照の発現は特異的に阻害しなかった図2B。また、同等レベルのssRNAまたはasRNAは、いずれのレポーターmRNAの発現に対しても効果はほとんどないか、全くなかった。平均して、dsRNAは、1時間のインキュベーション後にルシフェラーゼ活性測定したこれらの実験において特異的ルシフェラーゼ発現を70減少させた。新たな溶解物および反応成分の添加により反応物の翻訳能力が補充された他の実験では、内部対照に対して標的化ルシフェラーゼ活性のさらなる減少が観察された。asRNAでなく、dsRNAがこれらの溶解物で遺伝子発現を阻害する能力は、一本鎖RNA半減期約10分に対してdsRNA半減期約2時間の安定性が大きいためだけではない。7-メチルグアノシンキャップを伴って転写されたssRNAおよびasRNAは、非キャップdsRNAと同じくらい溶解物中で安定であったが、遺伝子発現を阻害しない。対照的に、キャップされたssRNAおよびasRNAから形成されたdsRNAは標的化mRNAの発現を特異的にブロックする。ショウジョウバエでの効果的なRNAiは、合胞体胞胚葉胚内への約0.2fmolのdsRNAの注入を必要とするCarthewwww1pittedu~carthewmanualRNAi_Protocolhtml。ショウジョウバエ胚の平均容積は約7.3nlであるため、これは、約25nMの細胞内濃度に相当するMazurら、Cryobiology25543544。ショウジョウバエ溶解物での遺伝子発現は、同等濃度のdsRNA10nMにより阻害されたが、dsRNA濃度の低下は特異的干渉の量を10倍減少させた。10ナノモルのdsRNAは、溶解物に添加される標的mRNAに対して200倍過剰のdsRNAに相当する。この過剰のdsRNAが、インプットdsRNAが変換されて遺伝子特異的干渉のための活性形態が形成される時間依存性および/または濃度依存性ステップを反映しうるか否かを試験するため、コグネイトmRNAの発現を阻害する能力に対するdsRNAのプレインキュベーションの効果を調べた。25°Cで30分間のインキュベーション後、溶解物の翻訳能力が有意に減少するため公表されていない観察、RNAiに必要なすべての因子が、プレインキュベーション期間中、活性なままであることを確実にすることが望ましかった。したがって、30分毎に、dsRNAおよび溶解物を含有する反応物を、インキュベートしていない溶解物を含有する新たな反応物と混合した図3A。3時間にわたるプレインキュベーションでの6回の連続的段階的移し変えの後、オリジナル濃度に対して64倍に希釈されたdsRNAを、溶解物および50pMの標的mRNAとともに60分間インキュベートした。最後に、Pp-Luc酵素レベルおよびRr-Luc酵素レベルを測定した。比較のため、インプット量10nMのdsRNAをバッファー中で32倍に希釈し、任意のプレインキュベーションステップの非存在下での遺伝子特異的dsRNA干渉を生じる能力を評価した。溶解物中でのdsRNAのプレインキュベーションは、その特異的遺伝子発現を阻害する能力を有意に増強した。一方、32倍に希釈したdsRNAは効果を示さず、予備インキュベートしたdsRNAは、64倍に希釈されているにもかかわらず、実験誤差の範囲内で、非希釈dsRNAと同じくらい強力であった。プレインキュベーションによるdsRNAの増強は、Pp-LucmRNA図3BおよびRr-LucmRNA図3Cの両方を標的化するdsRNAについて観察された。64倍希釈を考慮すると、プレインキュベーションにより与えられた活性化は、156pM濃度のdsRNAが50pM標的mRNAを阻害することを可能にした。さらに、活性化されたdsRNAの希釈は、効果的でありうるが、試験しなかった。我々は、試験した両方のdsRNAはプレインキュベーション手順により活性化されたが、それぞれが、相同であるmRNAのみの発現を干渉するという特異性を充分に保持したことに注目する。反応物のさらなる研究により、dsRNA増強の機序を同定するための方法が提供されうる。dsRNAをプレインキュベーションすると、これらの溶解物中での該遺伝子発現を阻害する能力が向上するという観察の1つの可能性のある説明は、特定の因子が該dsRNAを修飾する、および/または該dsRNAと会合するかのいずれかである。したがって、dsRNAを、量を増加しながら反応物に添加することは、かかる因子を滴定し得、非関連配列の第2のdsRNAにより引き起こされる遺伝子特異的干渉の量を減少させうる。Pp-LucmRNAおよびRr-LucmRNAについて、非関連ショウジョウバエナノスdsRNAを、濃度を増加しながら反応物に添加することは、レポーターmRNAを標的化するdsRNAにより引き起こされる遺伝子特異的干渉の量を減少させた図4。試験した濃度のナノスdsRNAは、いずれも非標的化mRNAの翻訳レベルに影響せず、これは、ナノスdsRNAが、遺伝子特異的干渉に関与する因子を特異的に滴定するが、翻訳機構の成分は特異的に滴定しないことを示す。特異的干渉を生じるために使用した5nMのdsRNAに対して200倍過剰の約1000nMdsRNAを添加することにより1つまたは複数の制限因子を滴定した。インビトロ干渉は、mRNA翻訳の特異的阻害、または特定のmRNAの標的化破壊のいずれかを反映しうる。これらの2つの可能性を区別するため、32P-放射標識した基質を用いてPp-LucmRNAおよびRr-LucmRNAの運命を直接調べた。10nMのPp-LucmRNAまたはRr-LucmRNAの安定性を、バッファーまたは505bpPp-dsRNA10nMのいずれかとともに溶解物中でインキュベートした。指示された時間後、試料を除タンパクし、次いで、変性ゲル電気泳動により32P-放射標識されたmRNAを分離した。dsRNA非存在下では、Pp-LucmRNAおよびRr-LucmRNAは、ともに溶解物中で安定であり、インプットmRNAの約75がインキュベーションの3時間後に残留した。インプットmRNAの約25は、反応物中で速やかに分解され、インビトロ転写プロセスにより生じた非キャップmRNAを提示するようである。Pp-LucmRNAを標的化するdsRNA10nM、505bpの存在下では、3時間後、15未満のPp-LucmRNAが残存した図5A。予期した通り、Rr-LucmRNAは、Pp-LucmRNAを標的化するdsRNAの存在下で安定なままであった。逆に、Rr-LucmRNAを標的化するdsRNA10nM、501bpは、Rr-LucmRNAの破壊を引き起こしたが、Pp-LucmRNAの安定性に対しては影響を与えなかった図5B。したがって、dsRNAは、非関連対照mRNAの安定性に影響を与えない相同なmRNAの崩壊促進を特異的に引き起こした。この所見は、少なくともショウジョウバエにおいて、インビボで、dsRNAの効果は、例えば核内での特異的保持を引き起こすことによって、細胞下局在化を変えずに標的mRNAを直接不安定化し、非特異的分解をもたらすことであることを示す。これらの結果は、RNAiがインビボで、インサイチューハイブリダイゼーションおよびノーザンブロットにより測定される細胞質mRNAレベルの減少をもたらすという観察と一致する。トリパノソーマ類およびヒドラ属におけるノーザンブロット解析は、dsRNAが典型的にはmRNAレベルを90未満だけ減少させることを示すLohmannら、DevBiol214211214。ここに示されたデータは、3時間のインキュベーション後、インビトロmRNAレベルが65~85に減少することを示し、インビボ観察と同等の効果である。それらは、C.elegansにおけるRNAiが翻訳後のものであるという所見とも一致する。タンパク質合成に対する特異的効果の最も簡単な説明は、それが、RNA崩壊速度の加速を反映するということである。しかしながら、結果は、翻訳および安定性に対する、独立しているが特異的な効果を排除しない。インビボでは、RNAiは最小限の長さのdsRNAを必要とするようである。長さ49bp、149bp、505bpおよび997bp図1に概略図のRNA二重鎖のPp-LucmRNAのインビトロ分解を標的化する能力を評価した。インビボ観察とかなり一致して、49bpのdsRNAはインビトロで効果的ではなかったが、149bpのdsRNAはmRNA崩壊をわずかだが増強し、505bpおよび997bpのdsRNAは両方とも強いmRNA分解を引き起こした図5C。該mRNAの他の部分を標的化する50bpのdsRNAは、500bpのdsRNAで見られるものほど強くないが、検出可能なmRNA分解を引き起こす。したがって、短いdsRNAの中にはRNAiを媒介しないものもあるが、ほぼ同じ長さであるが組成の異なるものの中にはRNAiを媒介できるものがある。ショウジョウバエ溶解物で観察された遺伝子特異的干渉が無細胞翻訳系の一般的な性質であるか否かを調べた。dsRNAのPp-LucmRNAおよびRr-LucmRNAの発現に対する効果を、市販の小麦麦芽抽出物およびウサギ網状赤血球溶解物において調べた。10nMのssRNA、asRNAまたはdsRNAのいずれかの添加は、小麦麦芽抽出物においていずれのmRNAレポーターの発現に対しても効果はなかった。対照的に、ウサギ網状赤血球溶解物への10nMのdsRNAの添加は、mRNA安定性の顕著で迅速な非特異的減少を引き起こした。例えば、Rr-LucdsRNAの添加は、15分以内にRr-LucmRNAおよびPp-LucmRNAの両方の分解を引き起こした。同じ非特異的効果が、Pp-LucdsRNAの添加時に観察された。ウサギ網状赤血球溶解物へのdsRNAの添加により誘導されるmRNAの非特異的破壊は、おそらく、先に観察されたdsRNAによるRNアーゼLの活性化を反映するWilliamsら、NucleicAcidsRes613351350Zhouら、Cell72753765Matthewsウイルスとタンパク質合成のための細胞機構との相互作用。TranslationalControl、505548頁、ColdSpringHarborLaboratoryPressPlainviewNY。dsRNAを欠くマウス細胞株誘導性抗ウイルス経路が最近記載され、哺乳動物RNAiのための研究において有用でありうる。RNAiはある種の哺乳動物細胞に存在することが知られているが、その存在は、多くの哺乳動物細胞型において、dsRNAによる非特異的抗ウイルス応答の迅速な誘導により不明瞭になっているようである。特定のmRNAのdsRNA標的化破壊はRNAiに特徴的であり、これは、ショウジョウバエを含む多くの生物においてインビボで観察されている。上記の系は、インビトロ反応において、RNAiの多くの局面を反復する。標的化されたmRNAは特異的に分解されるが、同じ溶液中に存在する非関連対照mRNAは影響を受けない。このプロセスは、長さ150bpを超えるdsRNAで最も効率的である。インビトロdsRNA特異的分解反応は、2つの非関連遺伝子を用いて観察されたため、すべてではないにせよ、多くのmRNAに一般的であろう。本明細書に記載した、mRNA安定性に対するインビトロ効果の大きさは、インビボで報告されたものLohmannら、DevBiol214211214と同等である。しかしながら、インビトロ反応はmRNAに対して過剰のdsRNAを必要とする。対照的に、インビボでは、1つの細胞あたり数個のdsRNA分子が遺伝子発現を阻害しうるKennerdellおよびCarthewCell9510171026。インビボとインビトロ間での標的mRNAに対するdsRNAの理論量の差は、インビトロ反応のほとんどがその対応するインビボプロセスよりも効率的でないという点で驚くべきことではない。興味深いことに、溶解物中でのdsRNAのインキュベーションは、そのRNAiに対する活性を大きく増強し、これは、他の因子を修飾するか、または会合するかのいずれかであるか、あるいはその両方であることを示す。おそらく、注入されたdsRNAは、本明細書でショウジョウバエ溶解物でのRNAiについて報告したものと類似のプロセスにより活性化されたため、標的化されたmRNAをインビボで阻害する際に少数の分子が効果的である。実施例2二本鎖RNAは、21~23個のヌクレオチド間隔でmRNAのATP依存性切断を指向する方法および材料インビトロRNAiインビトロRNAi反応物および溶解物の調製は、反応物が、0.03g/mlクレアチンキナーゼ、25μMクレアチンリン酸Flukaおよび1mMATPを含んだこと以外は、実施例1に記載の通りとした。各実験で、クレアチンリン酸を新たに500mMで水に溶解した。図2および3を除き、GTPを反応物から除外した。RNA合成Pp-lucmRNAおよびRr-lucmRNAならびにPp-dsRNAおよびRr-dsRNA図6のdsRNABを含むを、先に先に記載のようにしてインビトロ転写により合成した。dsRNACの転写鋳型を作製するため、5’センスRNAプライマーを、gcgtaatacgactcactataGAACAAAGGAAACGGATGATとし、3’センスRNAプライマーをGAAGAAGTTATTCTCCAAAA配列番号:3とし;5’asRNAプライマーをgcgtaatacgactcactataGAAGAAGTTATTCTCCAAAA配列番号:4とし、3’asRNAプライマーをGAACAAAGGAAACGGATGAT配列番号:5とした。dsRNAAのためには、5’センスRNAプライマーを、gcgtaatacgactcactataGTAGCGCGGTGTATTATACCとし、3’センスRNAプライマーをGTACAACGTCAGGTTTACCA配列番号:7とし;5’asRNAプライマーをgcgtaatacgactcactataGTACAACGTCAGGTTTACCA配列番号:8とし、3’asRNAプライマーをGTAGCGCGGTGTATTATACC配列番号:9とした小文字はT7プロモーター配列。mRNAを、グアニリルトランスフェラーゼGibco/BRL、S-アデノシルメチオニンSigmaおよびα-32P-GTP3000Ci/mmol;NewEnglandNuclearを用い、製造業者の指示書に従って5’末端標識した。放射標識されたRNAを、PolyATractIIIキットPromegaを用いるポリA選択により精製した。非放射活性7-メチル-グアノシンキャップRNAおよびアデノシンキャップRNAを、GTPに対して5倍過剰の7-メチル-G5’ppp5’GまたはA5’ppp5’Gでのインビトロ転写反応において合成した。キャップアナログをNewEnglandBiolabsから購入した。ATP枯渇およびタンパク質合成阻害溶解物を10分間25°Cで2mMグルコースおよび0.1U/mlヘキソキナーゼSigmaとともにインキュベートすることによりATPを枯渇させた。タンパク質合成インヒビターを、Sigma社から購入し、250倍濃縮原液として無水エタノールに溶解した。反応物におけるインヒビターの最終濃度は、アニソマイシン53mg/ml;シクロヘキシミド100mg/ml;クロラムフェニコール100mg/mlとした。相対タンパク質合成を、RNAi反応においてRr-lucmRNAの翻訳により産生されたRrルシフェラーゼタンパク質の活性を1時間後に先に記載のようにして測定することにより測定した。dsRNAプロセッシングの解析内部α-32P-ATP標識したdsRNA505bpPp-lucまたは501bpRr-lucまたは7-メチル-グアノシンキャップRr-lucアンチセンスRNA501ntを5nMの最終濃度で、標準的な条件下、2時間、ショウジョウバエ溶解物中で非標識mRNAの存在下または非存在下でインキュベートした。2×プロテイナーゼKバッファーの添加により反応を停止させ、先に記載のようにして除タンパクした。15または18ポリアクリルアミドシークエンシングゲル内での電気泳動により生成物を解析した。α-32P-ATP標識した501ntRr-lucセンスRNAおよびasRNAの完全RNアーゼT1消化により長さ標準品を作製した。mRNA切断の解析のため、5’-32P-放射標識したmRNA上記を、上述のdsRNAとともにインキュベートし、5図5Bおよび6図6Cのポリアクリルアミドシークエンシングゲル内での電気泳動により解析した。長さ標準品は、上述のようにしてグアニリルトランスフェラーゼで放射標識した市販のRNAサイズ標準品FMCBioproducts、部分塩基加水分解、および5’-放射標識したmRNAから作製したRNアーゼT1ラダーを含んだ。脱アミノアッセイ内部α-32P-ATP標識したdsRNA5nMを、標準的な条件で2時間、ショウジョウバエ溶解物中でインキュベートした。除タンパクした後、試料を12シークエンシングゲル上に供し、完全長のdsRNAを21~23nt産物から分離した。0.3MNaCl中で一晩、ゲル切片からRNAを溶出し、エタノール沈殿させ、遠心分離により回収し、29μlの水中に再溶解した。RNAを、ヌクレアーゼP1水中8μlRNAを含有する10μl反応物、30mMKOAc、pH5.3、10mMZnSO4、10μgまたは3単位のヌクレアーゼP1、3時間、50°Cでヌクレオシド5-リン酸塩に加水分解した。試料1mlを非放射活性5-モノヌクレオチド[0.05O.D.単位A260のpA、pC、pG、pIおよびpU]とともにセルロースHPTLCプレートEMMerck上で同時スポットし、一次元においてイソ酪酸/25アンモニア/水66/1/33、v/v/vおよび二次元において0.1Mリン酸ナトリウム、pH6.8/硫酸アンモニウム/1-プロパノール100/60/2,v/w/v;Silberklangら、1979で分離した。非放射活性内部標準の移動をUVシャドウイングにより測定した。結果および考察RNAiはATPを必要とする実施例1において記載したように、ショウジョウバエ胚溶解物は、RNAiを忠実に反復する。あらかじめ、標的化mRNAからのルシフェラーゼタンパク質の合成を測定することによりdsRNA媒介性遺伝子スプライシングをモニターした。したがって、これらのRNAi反応は、mRNAの効率的な翻訳に必要なATP再生系を含んだ。ATPが実際にRNAiに必要であるか否かを試験するため、ATPをADPに変換させるヘキソキナーゼおよびグルコースで処理することにより溶解物からATPを枯渇させ、32P-放射標識したウミシイタケルシフェラーゼRr-lucmRNAの運命を追跡することにより直接RNAiをモニターした図6。ヘキソキナーゼおよびグルコースでの処理により、溶解物中の内在ATPレベルが250μMから10μM未満に低下した。ATP再生は、外来クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼの両方を必要とし、高エネルギーリン酸塩をクレアチンリン酸からADPに移動させるために作用する。ATP枯渇抽出物にクレアチンリン酸またはクレアチンキナーゼのいずれかを別個に補充すると、RNAiは観察されなかった。したがって、RNAiはインビトロでATPを必要とする。ATP枯渇溶解物を含有する反応物にATP、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼをすべて一緒に添加した場合、Rr-lucmRNAのdsRNA依存性分解が回復した図6。クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼの両方が存在するならば、外来ATPの添加は該枯渇溶解物での効率的なRNAiには必要でなく、これは、アデノシンヌクレオチドの内在濃度250mMがRNAiを補助するのに充分であることを示す。ホタルルシフェラーゼPp-lucmRNAを伴うRNAiもまた、ATP依存性である。RrdsRNAの不在下におけるRrlucmRNAの安定性は、エネルギー再生系が伴われた場合に観察されるものと比較してATP枯渇溶解物において減少した。しかし、これらの条件下でのmRNAの減衰は、インビトロでのRNAiに特徴的である迅速な減衰速度論を示さなかった。また、それはdsRNA指向性RNAiに特徴的である安定なmRNA切断生成物を生じなかった。これらの実験は、RNAiに対するATPの必要条件が、直接的にRNAi機構における1つ以上のステップでATPに影響を与えるかどうか、または間接的に溶解物中の他のヌクレオシド三リン酸の高濃度の維持におけるATPの役割を反映するのかどうかを確立していない。インビトロでのRNAiに翻訳は必要でないATPに対する必要条件は、RNAiがmRNA翻訳の高エネルギー依存プロセスに連結しうることを示唆する。この可能性を試験するために、タンパク質合成インヒビターの有りおよび無しの標準RNAi反応物中で示した時間のインキュベーション後、532P放射能標識PplucmRNAの変性アガロースゲル解析を調製することにより、タンパク質合成の様々なインヒビターを反応物に添加した。真核生物翻訳インヒビターのアニソマイシン、最初のペプチド結合形成のインヒビター、シクロヘキシミド、ペプチド鎖伸長のインヒビター、およびピューロマイシン、翻訳のプレ成熟終結を生じるtRNA模倣物pp402547を試験した。これらのインヒビターの各々は、ショウジョウバエ溶解物において1900倍より多くタンパク質合成を減少させた図7A。対照的に、クロラムフェニコール、ショウジョウバエミトコンドリアタンパク質合成のインヒビターは、溶解物において翻訳に対して効果を持たなかった図7A。アニソマイシン、シクロヘキシミド、またはクロラムフェニコールの存在にかかわらず、RNAiは通常の効率で行なわれた。ピューロマイシンはまた、効率的なRNAiを乱さなかった。したがって、タンパク質合成はインビトロでのRNAiに必要でない。翻訳開始は、mRNAの7メチルグアノシンキャップの認識を伴うATP依存プロセスであるMerrickおよびHersheyThePathwayandMechanismofEukaryoticProteinSynthesisTranslationalControlJHersheyMMathewsおよびNSonenberg編pp3169。インビトロでRNAiを支持するのに使用されるショウジョウバエの溶解物はまた、翻訳のキャップ依存性を再利用する;7メチルグアノシンキャップを有するPplucmRNAは、ApppGキャップを有する同じmRNAより10倍より大きい効率で翻訳された図7B。ショウジョウバエ溶解物において両方のRNAは等しく安定であり、効率におけるこの差異が、単にアデノシンキャップを有するmRNAの迅速な減衰により説明されうるわけではないことを示しているも参照。翻訳機構は、7メチルグアノシンキャップを有するPplucmRNAとアデノシンキャップを有するPplucmRNAとの間で区別しうるが、2つのmRNAは、PpdsRNAの存在下でRNAiに対して等しい感受性であった図7C。これらの結果は、キャップ認識におけるステップがRNAiを関連しないことを示す。dsRNAは、21~23nt種にプロセスされる25nt長のRNAは、植物において転写後遺伝子サイレンシングを受ける遺伝子のセンスおよびアンチセンス鎖から生じる。均一に32P放射能標識したdsRNAの2時間のインキュベーションにおいて変性アクリルアミドゲル解析産物を形成させ、標的mRNAの存在または非存在下で標準RNAi条件下で溶解物中でasRNAをキャップした。dsRNAがまた、小RNA断片にプロセスされることが見出された。溶解物中でインキュベートした場合、501bpRrdsRNAおよび505bpPpdsRNAの両方の約15の投入放射能が21~23ntRNA断片に見られた。dsRNAは、500bp長より長いため、断片の15の収率は、多数の21~23ntRNAが各全長dsRNA分子から作製されることを意味する。他の安定な産物は検出されなかった。両方の鎖を均等に32P放射能標識したdsRNAから、小さいRNA種を作製した。dsRNA由来の21~23ntRNAの形成が、対応するmRNAの存在を必要としなかったことは、小さいRNA種が、dsRNA標的化mRNA分解の産物としてよりむしろdsRNAのプロセシングにより生じることを証明している。22ヌクレオチドは、A型RNARNAヘリックスの2つのターンに対応することが注目された。センスまたはアンチセンス鎖のどちらかで放射能標識したdsRNAを標準RNAi反応において溶解物と共にインキュベートした場合、類似する効率で21~23ntRNAを生じた。これらのデータは、21~23ntRNAがdsRNAの対称プロセシングにより生じるという考えを支持する。種々のデータは、21~23ntRNAが、dsRNAからのみ効率よく生じ、一本鎖RNAとdsRNAとの間の相互作用の結果でないという考えを支持する。第1に、32P放射能標識505ntPplucセンスRNAまたはasRNAは、5nMの非放射性505bpPpdsRNAとインキュベートした場合、効率よく21~23nt産物に変換されなかった。第2に、mRNAの不在下で、501ntの7メチルグアノシンキャップ化RrasRNAは、検出可能な量の21~23ntRNAをわずかに作製するのみであり、これはおそらくアンチセンス調製物に混入している少量のdsRNAのためである。しかしながら、32P放射能標識キャップ化RrasRNAを有する反応物にRrlucmRNAが含まれる場合、少量の21~23nt産物が生じ、それは等モル量のRrdsRNAから作製された21~23ntRNAの4の量に相当する。この結果は、RrasRNA調製物におけるdsRNAの混入の存在を反映していないようである。なぜなら、RrlucmRNAの存在下では、その不在下より、有意に多い産物がasRNAから生じたからである。その代わり、データは、asRNAが相補的なmRNA配列と相互作用して反応においてdsRNAを形成し得、生じるdsRNAが続いて小さいRNA種にプロセスされることを示唆する。RrasRNAは、インビトロでの低レベルの真のRNAiを支持し得下記参照、この説明と一致する。次に、dsRNA由来の21~23ntRNAの作製は、ATPを必要とするかどうかを求めた。ヘキソキナーゼおよびグルコースで処理することによりATPを枯渇した溶解物中で505bpPpdsRNAをインキュベートした場合、21~23ntRNAが作製されたが、それはクレアチンキナーゼおよびリン酸クレアチンを含むことにより枯渇した溶解物中でATPが再生された場合よりも6倍遅かった。したがって、ATPは、21~23ntRNA種の作製に必要とはされず、その代わり、単にその形成を高めうる。代替的には、ATPは、dsRNAのプロセシングに必要とされうるが、ヘキソキナーゼ処理後に残っているものより低い濃度でありうる。ATP枯渇溶解物中で生じる小さいRNAフラグメントのより遅い移動性に対する分子基礎は、理解されていない。WagnerおよびSunおよびSharpは、RNAiによる遺伝子サイレンシングにdsRNAが必要であることが、プロセスにおけるdsRNA特異的アデノシンデアミナーゼの関与を反映していると推測した。dsRNAアデノシンデアミナーゼは、ウラシルと塩基対を形成しないイノシンへアデノシンを変換することにより、dsRNAをほどく。dsRNAアデノシンデアミナーゼは、mRNAの転写後編集において機能する概説は、BassTrendsBiochemSci2215762参照。RNAiにおけるdsRNAアデノシンデアミナーゼの関与について試験するために、標準インビトロRNAi反応におけるショウジョウバエ胚溶解物とのインキュベーション後の501bpRrlucおよび505bpPplucdsRNAにおけるアデノシンのイノシンへの変換の程度を調査した。全長dsRNAおよび21~23ntRNA種におけるアデノシン脱アミノ化を、2次元薄層クロマトグラフィーにより評価した。商業的に入手可能なヌクレアーゼP1を混入するホスファターゼによる単一核酸塩の分解により無機リン酸を作製した。21~23nt種におけるアデノシン脱アミノ化の程度をまた測定した。32Pアデノシンで放射能標識した全長dsRNAを溶解物中でインキュベートし、全長dsRNAおよび21~23ntRNA産物の両方を変性アクリルアミドゲルから精製し、ヌクレアーゼP1を用いてモノヌクレオチドに切断し、2次元薄層クロマトグラフィーにより解析した。全長dsRNAにおけるアデノシンの有意な画分を、2時間後、イノシンに変換した。対照的に、21~23nt種においてアデノシンの04または07のみが脱アミノ化された。これらのデータは、21~23ntRNA種の27分子中の1未満がイノシンを含むことを暗示する。したがって、21~23nt種内のdsRNA依存アデノシン脱アミノ化は、その作製に必要ないようである。asRNAは、インビトロで少量のRNAiを生じるmRNAを57メチルグアノシンキャップ内で32P放射能標識した場合、安定な5崩壊産物がRNAi反応の間に蓄積した。かかる安定な5崩壊産物が、PplucおよびRrlucmRNAの両方に対して、それらのコグネイトdsRNAとともにインキュベートされた場合に観察された。以前、asRNAがdsRNAの代わりに使用される場合、有効なRNAiが生じないことが報告された。にもかかわらず、バッファーとよりasRNAとインキュベートした場合に、mRNAはあまり安定でなかった図8Aおよび8B。これは、RrlucmRNAに対して特に明らかであった:溶解物中での3時間のインキュベーション後、約90のRNAが完全なままであったが、asRNAを添加した場合約50のみであった。dsRNAを添加した場合、5未満が残った。興味深いことに、asRNAにより生じたmRNA安定性における減少は、dsRNAを用いるRNAi反応に特徴的な少量の安定な5崩壊産物の形成により伴われた。この知見は、mRNAとインキュベートした場合に上記参照、少量の21~23nt産物がasRNAから形成されるという観察に匹敵し、asRNAは効率が悪いにもかかわらず、RNAi経路に入りうるという考えに説得力を与える。mRNA切断部位は、dsRNAの配列により決定されるmRNA切断部位を、約100ntのRrluc配列から移した3つの異なるdsRNA、A、BおよびCを用いて試験した。3つのdsRNA、ABおよびCのそれぞれとの、またはバッファーΦとの所定時間のRrlucmRNAのインキュベーションを行なった後に生じた安定な5切断産物の変性アクリルアミドゲル解析を行なった。RrlucmRNA配列と比べたこれらの位置を図9に示す。5キャップ内で32P放射能標識したRrlucmRNAを有する標準RNAi反応物中で3つのdsRNAの各々をインキュベートした。dsRNAの不在下において、溶解物中の3時間のインキュベーション後でさえ、mRNAとして安定な5切断産物は検出されなかった。対照的に、20分のインキュベーション後、3つのdsRNAの各々は、特定のdsRNAに特徴的なmRNA切断産物のセットに対応するはしご状のバンドを作製する。各dsRNAに対して安定な5mRNA切断産物は、dsRNAに対応したRrlucmRNAの領域に限定された。dsRNAのAに対して、5切断産物の長さは、236~約750nt未満の範囲であった;dsRNAのAは、RrlucmRNAのヌクレオチド233~729にわたる。dsRNAのBとのmRNAのインキュベーションは、150~約600ntの長さの範囲のmRNA5切断産物を生じた;dsRNAのBは、mRNAのヌクレオチド143~644にわたる。最後に、dsRNAのCは、66~約500ntの長さのmRNA切断産物を生じた。このdsRNAは、RrlucmRNAのヌクレオチド50~569にわたる。したがって、dsRNAは、全細胞mRNAプールからどのmRNAが分解されるかを選択するRNAi反応に対して特異性を与えるだけでなく、mRNA配列の切断の正確な位置もまた決定する。mRNAは21~23ヌクレオチド間隔で切断されるRNAiの機構においてさらなる洞察を得るために、3つのdsRNAの各々に対するいくつかのmRNA切断部位の位置をマップした図10。上記5切断産物のサブセットの高分解能変性アクリルアミドゲル解析を行なった。注目すべきことに、ほとんどの切断は、21~23ntの間隔で生じた図10。dsRNAが、21~23ntRNA種にプロセスされるという本発明者らの観察、ならびに25ntRNAが植物における転写後遺伝子サイレンスと関係づけられるというHamiltonおよびBaulcombeの知見を考慮すれば、この間隔は、特に著しい。本発明者らが位置決定をした16個の切断部位のなかでGrishokら、Science28724947Kettingら、Cell9913341Tabaraら、Cell9912332、どのようにdsRNAがmRNAを破壊のために標的化するのかに関するモデルを示唆する図11。このモデルでは、Cエレガンス遺伝子座rde1およびrde4などの遺伝子に関与するようなプロセスにおいて、dsRNAは最初に21~23nt長の断片に切断される。得られた断片おそらくRNAi特異的タンパク質に結合した短いasRNAは、次にmRNAと対を形成し、mRNAを切断するヌクレアーゼを漸加するであろう。代替的には、鎖交換は、mRNAに類似する21~23ntのdsRNA断片を一時的に有するタンパク質RNA複合体で生じ得る。断片化に続くdsRNAの二本鎖の分離は、ATP依存性RNAヘリカーゼにより援助され得、観察された21~23ntRNA作製のATP増加を説明する。各小さいRNA断片は、おそらく21~23nt断片の5または3末端で、mRNAにおいて1つまたは多くて2つの切断を生じるようである。小さいRNAは、Cエレガンスにおけるego1遺伝子またはアカパンカビ属におけるqde1遺伝子によりコードされるようなRNA指向性RNAポリメラーゼにより増幅され得、dsRNAの不在下に長く続く転写後遺伝子サイレンシングを行ない、RNAi効果を開始した。Cエレガンスにおける遺伝性のRNAiは、開始のためにrde1およびrde4遺伝子を必要とするが、続く生成を持続するためでない。Cエレガンスにおけるrde2、rde3およびmut7遺伝子はRNAiが生じる組織で必要とされるが、遺伝性のRNAiの開始に必要でない。これらのエフェクター遺伝子は、mRNA標的の実際の選択およびそれらの続く切断において機能するタンパク質をコードするようである。dsRNA上での複合体形成、dsRNA切断中またはその後の鎖解離、21~23ntRNAの標的mRNAとの対形成、mRNA切断、および標的化複合体の再生利用を含むRNAiの間の多数の工程のいくつかにおいて、ATPが必要とされうる。インビトロでのRNAi系を用いてこれらの考えを試験することは、今後重要な挑戦であろう。RNAiに関与するいくつかの遺伝子はまた、トランスポゾンサイレンシングおよび同時抑制に重要である。同時抑制は、植物、昆虫およびおそらくヒトにわたる広範な生物学的現象である。ショウジョウバエメラノガスターにおいて最もおこりうる機構は、転写サイレンシングである。したがって、21~23nt断片は、転写制御、ならびに転写後制御に関与するようである。実施例3単離された21~23マーは、新規RNAi反応物に添加した場合、配列特異的干渉を生じた溶解物中の500bpdsRNAのインキュベーション反応からの21~23nt断片の単離二本鎖RNAをショウジョウバエ胚溶解物中10nMの濃度で本明細書に記載の標準条件下に3時間25°Cにてインキュベートした。試料の除タンパク後、21~23ntの反応産物を未プロセスdsRNAから変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。非放射能標識21~23nt断片の検出のために、放射能標識dsRNAとのインキュベーション反応を同じゲルの別のレーンに負荷した。非放射活性21~23nt断片を含むゲルスライスを切り出し、ゲルスライスから21~23nt断片を04mlの03MNaClで4°Cで一晩かけて溶出した。エタノール沈殿および遠心分離により、RNAを上清から回収した。10μlの溶解バッファーにRNAペレットを溶解させた。対照として、21~23ntバンドよりわずかに高いゲルスライスおよび低いゲルスライスもまた切り出し、同じ溶出および沈殿手順に供した。インキュベートしていないdsRNAもまた15ゲル上に負荷し、21~23nt断片に対応するゲルスライスを切り出して、溶出した。対照実験由来の全部のペレットを10μlの溶解バッファーに溶解させた。溶出によるゲルスライス由来の回収の間のRNAの損失は、約50である。翻訳に基づくRNAiアッセイにおける精製21~23nt断片のインキュベーション溶出21~23マーまたは対照RNA溶液の1μlを、標準10μlRNAiインキュベーション反応に使用した上記。標的および対照mRNAの添加の前に、21~23マーを反応混合物を含む溶解物中で10分または30分間プレインキュベートした。これらのRNA上の特異的なシグナルの存在のために、プレインキュベートの間に、RNA干渉を伴うタンパク質は21~23マーと再会合しうる。インキュベートをさらに1時間続け、標的および対照mRNAの翻訳を可能にした。受動溶解バッファーPromegaの添加により反応をクエンチさせ、ルシフェラーゼ活性を測定した。RNAを含まないバッファー対照により標準化された対照ルシフェラーゼ活性に対する標的の比として、RNA干渉が表される。標的遺伝子の特異的な抑制を10分または30分のいずれかのプレインキュベーションを用いて観察した。この抑制は再現性があり、対照に対する標的の相対比は2~3倍低下した。対照として単離されたRNA断片は、特異的な干渉を示さなかった。対照的に、5nMの500bpdsRNAのインキュベーション10分のプレインキュベーションは、標的遺伝子に対する対照の相対比が約30倍の傾向がある。新規溶解物のインキュベーション反応における単離された21~23nt断片の安定性精製21~23ntRNA断片により媒介されるRNAiの観察に一致して、投入21~23ntRNAの35がかかるインキュベーション反応において3時間より多く維持することを見出した。このことは、細胞性因子が除タンパクした21~23nt断片に会合し、機能的なmRNA分解分子を再構築することを示唆している。これらの21~23nt断片に結合するシグナル、またはそれらの起こり得る二本鎖の性質または特異的な長さは、この観察の原因であるようである。過ヨウ素酸塩処理およびβ脱離に続く配列決定ゲル上での変化した移動度により証明されるように、21~23nt断片は末端3ヒドロキシル基を有する。実施例4非変性法により精製した21~23マーは、新しいRNAi反応物に添加した場合、配列特異的干渉を生じた50ナノモルの二本鎖RNAまたは部分的に切断した長いdsRNAを含む画分と、十分プロセスされた21~23ntsiRNA画分4150を含む画分の両方が、インビトロでの効率的なRNA干渉を媒介することを示す図13B。標的mRNA発現の抑制は、特異的であった:PplucmRNA対照の効果がほとんどまたは全くないことが観察された図13C。これらのデータは、初期の実施例と共に、21~23ntsiRNAが、RNAi経路おいて真の中間体であること、およびインビトロでのRNA干渉の効果的なメディエータであることを証明する。実施例521ヌクレオチドsiRNA二重鎖は、ヒト組織培養においてRNA干渉を媒介する方法RNA調製ExpediteRNAホスホロアミダイトおよびチミジンホスホロアミダイトを用いて、21ntRNAを化学的に合成した。合成オリゴヌクレオチドを脱タンパクし、ゲル精製し、次いでSepPakC18カートリッジ精製を行なった。GL2およびGL3ルシフェラーゼを標的化するsiRNA配列は、開始コドンの最初のヌクレオチドに関連するコード領域153173に対応し、RLを標的化するsiRNAは、開始コドン後の領域119129に対応した。PCR産物由来のT7RNAポリメラーゼを用いてより長いRNAを転写し、次いでゲルおよびSepPak精製を行なった。49および484bpのGL2またはGL3dsRNAは、翻訳開始に関連する113161位および113596位にそれぞれ対応した;50および501bpのRLdsRNAは、118167位および118618位にそれぞれ対応した。ヒト化GFPを標的化するdsRNA合成に対するPCRテンプレートをpAD3から増幅し、それにより50および501bphGdsRNAは、開始コドンに対して118167位および118618位にそれぞれ対応した。siRNAのアニーリングに対して、20μMの一本鎖をアニーリングバッファー中で90°Cで1時間、次いで37°Cで1分間インキュベートした。50および500bpのdsRNAに対しては37°Cでのインキュベーション工程を一晩延長し、これらのアニーリング反応をそれぞれ84μMおよび084μMの標準濃度で行なった。細胞培養10FBS、100ユニットmlのペニシリン、および100μgmlのストレプトマイシンを補充したSchneiderのショウジョウバエ培地中で、S2細胞を25°Cで増殖させた。10FBS、100ユニットmlのペニシリン、および100μgmlのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中で37°Cで293、NIH3T3、HeLaS3、COS7細胞を増殖させた。指数増殖を維持するために、細胞を定期的に継代した。約80コンフルエンシーでのトランスフェクションの24時間前に、哺乳動物細胞をトリプシン処理し、抗生物質を含まない新しい培地を用いて15に希釈し、24ウェルプレートに移した。S2細胞は、分裂前にトリプシン処理しなかった。リポフェクトアミン2000試薬を用いて、接着細胞株に対して製造業者により記載されたようにトランスフェクションを行なった。ウェル当たり、10μgのpGL2ControlまたはpGL3Control、1μgのpRLTK、および028μgのsiRNA二重鎖またはdsRNAをリポソームに配合したものを適用した;最終容量は、ウェル当たり600μlであった。トランスフェクション後20時間細胞をインキュベートし、その後健康であるように見えた。次にルシフェラーゼ発現を、二重ルシフェラーゼアッセイを用いてモニターした。11μgのhGFPコードpAD322および028μgのinvGL2siRNAの共トランスフェクション後、哺乳動物細胞株に対して蛍光顕微鏡によりトランスフェクション効率を測定し、70~90であった。レポータープラスミドをXL1Blue中で増幅し、QiagenEndoFreeMaxiPlasmidKitを用いて精製した。結果RNA干渉は、サイレンス遺伝子に対する配列において二本鎖RNA相同により開始される、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングプロセスであるSharpPAZamorePDScience28724312433SijenTKooterJMBioessays22520531BassBLCell101235238HammondSMら、NatRevGenet2110119。配列特異的mRNA分解のメディエータは、より長いdsRNA610由来のRNaseIII切断により生じた21および22ntの小さい干渉RNAであるHammondSMら、Nature404293296ZamorePDら、Cell1012533BernsteinEら、Naature409363366ElbashirSMら、GenesDev15188200。本明細書に示されるように、21ntsiRNA二重鎖は、ヒト胎児腎臓およびHeLa細胞を含む多数の哺乳動物組織培養物においてレポーター遺伝子発現を特異的に抑制しうる。50または500bpdsRNAと対照的に、siRNAはインターフェロン応答を活性化しない。これらの結果は、siRNA二重鎖が哺乳動物細胞における遺伝子機能の配列特異的不活性化のための一般的なツールであることを示している。突出3末端を有する塩基対形成した21および22ntsiRNAは、Dmelanogaster胚から調製した溶解物中で、効率のよい配列特異的なmRNA分解を媒介する。siRNAがまた組織培養物においてRNAiを媒介しうるかどうかを試験するために、ウミシイタケをコードするレポーター遺伝子に対する対称2nt3突出部を有する21ntsiRNA二重鎖およびホタルの2つの配列バリアントルシフェラーゼ図14Aおよび14Bを構築した。カチオン化リポソームを用いてDmelanogasterSchneiderS2細胞または哺乳動物細胞に、レポータープラスミド組み合わせpGL2pRLまたはpGL3pRLを用いてsiRNA二重鎖を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの20時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。試験した全ての細胞株において、コグネイトsiRNA二重鎖の存在下でレポーター遺伝子の発現の特異的な低減を観察した図15A~15J。注目すべきことに、絶対的ルシフェラーゼ発現レベルは、非-コグネイトsiRNAにより影響せず、21ntRNA二重鎖による有害な副作用がないことを示している例えば、HeLa細胞に対して図16A~16D。DmelanogasterS2細胞において、ルシフェラーゼの特異的な阻害は完全であり、より長いdsRNAに対して以前得られた結果に類似していたCaplenNJら、Gene25295105ClemensMWilliamsBCell13565572UiTeiKら、FEBSLetters4797982。哺乳動物細胞において、レポーター遺伝子が50~100倍強く発現した場合に、特異的な抑制はあまり完全ではなかった図15C~15J。コグネイトsiRNAに応じてGL2発現は3~12倍低下し、GL3発現は9~25倍低下し、RL発現は1~3倍低下した。293細胞に対して、RLsiRNAによるRLルシフェラーゼの標的化は効率的でなかったが、GL2およびGL3標的は特異的に応じた図15I、図15J。293細胞におけるRL発現の低減の欠如は、試験した他のいずれもの哺乳動物細胞株と比較して5~20倍高いその発現および/またはRNA2次構造または会合したタンパク質のため標的配列の限定された利用性のためであるようである。にもかかわらず、コグネイトsiRNA二重鎖によるGL2およびGL3ルシフェラーゼの特異的な標的化は、RNAiがまた293細胞において機能することを示した。uGL2を除く全siRNA二重鎖における2nt3突出部は、チミジンから構成された。3突出部におけるチミジンによるウリジンの置換は、インビトロ系のDmelanogasterにおいて十分耐性があり、突出部の配列は標的認識に重要でなかった。組織培養培地中およびトランスフェクト細胞内でsiRNAのヌクレアーゼ耐性を増強することが示唆されるために、チミジン突出部を選択した。実際、チミジン改変GL2siRNAは、試験した全細胞株において非改変uGL2siRNAよりもわずかに強力であった。3突出部ヌクレオチドのさらなる改変は、siRNA二重鎖の送達および安定性にさらなる利益を提供しうることが考えられる。共トランスフェクション実験において、組織培養培地の最終容量に関しては25nMsiRNA二重鎖を使用した。100nMへのsiRNA濃度の増加は、特異的サイレンシング効果を増加しなかったが、プラスミドDNAとsiRNAとの間のリポソームカプセル化に対する競合のために、トランスフェクション効率に影響を及ぼし始めた。たとえ、siRNAがDNAプラスミドより2~20倍のみ高い濃度であっても、siRNA濃度を15nMに減少することにより、特異的サイレンス効果は減少しなかった。このことは、siRNAが遺伝子サイレンシングを媒介するための非常に強力な試薬であり、siRNAが通常のアンチセンスまたはリボザイム遺伝子標的化実験において適用される濃度より数桁低い濃度で有効であることを示している。哺乳動物細胞上でより長いdsRNAの効果をモニターするために、レポーター遺伝子に対して50および500bpのdsRNAコグネイトを調製した。非特異的対照として、ヒト化GFP由来のdsRNAKehlenbachRHら、JCellBiol141863874を使用した。siRNA二重鎖に一致した量濃度ではないでdsRNAを同時トランスフェクトした場合、レポーター遺伝子発現は、強力にかつ非特異的に減少した。この効果を、代表例としてHela細胞に関して説明する図16A~16D。絶対的ルシフェラーゼ活性は、50bpdsRNA共トランスフェクションにより10~20倍、500bpdsRNA共トランスフェクションにより20~200倍、それぞれ非特異的に減少した。類似した非特異的効果をCOS7およびNIH3T3細胞に対して観察した。293細胞に対して、500bpdsRNAに対してのみ10~20倍の非特異的減少を観察した。dsRNA>30bpによるレポーター遺伝子発現における非特異的減少が、インターフェロン応答の一部として予期されたMatthewsMTranslationalControlにおけるタンパク質合成のためのウイルスと細胞機構の間の相互作用HersheyJ、MatthewsMSonenbergN編505548ColdSpringHarborLaboratoryPressPlainviewNY1996;KumarMCarmichaelGCMicrobiolMolBiolRev62141514341998StarkGRら、AnnuRevBiochem67227264。驚くべきことに、レポーター遺伝子発現における強い非特異的減少にもかかわらず、さらなる配列特異的dsRNA媒介サイレンシングが再現性よく検出された。しかしながら、相対的レポーター遺伝子活性をhGdsRNA対照に対して標準化した場合に、特異的サイレンシング効果が明白であったのみであった図16E、16F。コグネイトdsRNAに応答する2~10倍の特異的減少がまた、試験した他の3つの哺乳動物細胞株においても観察された。dsRNA。また、CHOK1細胞は、インターフェロン応答に不十分であるようにみえる。他の報告では、ルシフェラーゼLacZレポーターの組み合せ、および829bpの特異的LacZまたは717bpの非特異的GFPdsRNAを用いて、293、NIE3T3、およびBHK21細胞をRNAiに対して試験したCaplenNJら、Gene25295105。この場合のRNAiの検出の失敗は、感度に劣るルシフェラーゼLacZレポーターアッセイならびに標的および対照dsRNAの長さの差異のためであるように思われる。あわせると、本明細書に記載された結果は、RNAiは哺乳動物細胞において活性であるが、サイレンシング効果は、インターフェロン系がdsRNA>30bpにより活性化される場合検出するのが困難であることを示している。哺乳動物細胞において21ntsiRNA媒介干渉プロセスの機構は網羅されていないままであり、サイレンシングは転写後および/または転写を生じるようである。Dmelanogaster溶解物において、siRNA二重鎖はsiRNAタンパク質複合体siRNPの再構築により転写後遺伝子サイレンシングを媒介し、それはmRNA認識および標的化切断を導くHammondSMら、Nature404293296;ZamorePDら、Cell1012533ElbashirSMら、GenesDev15188200。植物において、dsRNA媒介転写後サイレンシングはまたRNA指向性DNAメチル化にリンクされ、それは21ntsiRNAによりまた指向されうるWasseneggerMPlantMolBiol43:203220FinneganEJら、CurrBiol11R99R102。プロモーター領域のメチル化は、転写サイレンシングを導きうるがMetterMFら、EMBOJ1951945201、コード配列におけるメチル化は導くことができないWangMBRNA71628。哺乳動物におけるDNAメチル化および転写サイレンシングは、十分考証されたプロセスであるがKassSUら、TrendsGenet13:444449RazinAEMBOJ1749054908、まだ転写後サイレンシングに結びつけられていない。哺乳動物におけるメチル化は、CpG残基に対して優勢である。RLsiRNAにおいてCpGがないために、哺乳動物組織培養物においてRLsiRNAは特異的サイレンシングを媒介するが、DNAメチル化は本発明者らが観察したサイレンシングプロセスには重要でないようである。要約すると、本明細書に記載されているのは、哺乳動物細胞におけるsiRNA媒介遺伝子サイレンシングである。21ntsiRNAの使用は、ヒト組織培養において遺伝子機能の相互作用および遺伝子特異的療法の開発に対して大きな見込みを有する。本発明をその好ましい態様に関して詳細に示し、説明したが、添付した請求の範囲に包含される本発明の精神から逸脱することなく、当業者は形態および詳細について種々の変更を行なうことができることを理解されたい。"