分泌シグナルペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド配列、発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を挿入するためのクローニング部位、およびグリコフォリンの膜貫通ドメインをコードする配列を含むポリヌクレオチド配列を順に含む、タンパク質の細胞表面発現のための核酸発現ベクター。グリコフォリンの膜貫通ドメインがグリコフォリンAの膜貫通ドメインである、請求項1記載の核酸ベクター。グリコフォリンAの膜貫通ドメインがマウスグリコフォリンA膜貫通ドメインまたはアルメニアンハムスターグリコフォリンAドメインである、請求項1または2記載の核酸ベクター。マウスグリコフォリンAドメインが、配列番号1に開示するアミノ酸を含み、かつアルメニアンハムスターグリコフォリンAドメインが、配列番号12に開示するアミノ酸配列を含む、請求項3記載の核酸ベクター。分泌シグナルペプチドがハチ毒メリチンの分泌シグナルペプチドである、請求項1~4のいずれか一項記載の核酸ベクター。ハチ毒メリチンの分泌シグナルペプチドが、配列番号2に開示するアミノ酸配列を含む、請求項5記載の核酸ベクター。発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を挿入するためのクローニング部位の下流3に、配列番号3のアミノ酸配列を含むFLAGタグをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1~6のいずれか一項記載の核酸ベクター。グリコフォリンの膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列の下流3に、Hisタグ、好ましくは配列番号4に開示するアミノ酸配列を含むHisタグをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項記載の核酸ベクター。クローニング部位が、NheI、KpnI、BamHI、EcoRI、EcoRV、およびNotIの制限酵素切断部位を含む、請求項1~8のいずれか一項記載の核酸ベクター。配列番号5、配列番号13、配列番号14、または配列番号15からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項1~9のいずれか一項記載の核酸ベクター。発現させるタンパク質が膜結合型タンパク質である、請求項1~10のいずれか一項記載の核酸ベクター。請求項1~11のいずれか一項記載のベクターを含む、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはHEK細胞。抗体作製に適したタンパク質の発現のための、請求項12記載の細胞の使用。抗体作製に向けた、好ましくはモノクローナル抗体作製に向けた、非ヒト動物の免疫化のための、請求項12記載の細胞の使用。特定のタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製するための方法であって、a請求項1~11のいずれか一項記載のベクターを用いることで該特定のタンパク質を細胞表面に発現する細胞によって、非ヒト動物を免疫化する工程b工程aの非ヒト動物の脾臓細胞を単離する工程cB細胞ハイブリドーマを作製するために、工程bの脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合する工程およびd該特定のタンパク質に対する抗体を発現するB細胞ハイブリドーマを同定する工程を含む、前記方法。非ヒト動物がマウスまたはハムスターである、請求項15記載の方法。上述の発明。哺乳動物細胞の細胞表面における発現タンパク質熱帯熱マラリア原虫ORFPFF0620c、ヒトABCA1細胞外ドメイン、およびラットTMEM27細胞外ドメインを、それぞれ発現プラスミドpANITA2PFF0620C、pANITA2ABCA1、またはpANITA2TMEM27を使って、HEK細胞の細胞表面に発現させた。細胞表面での高レベルな発現を保証するために、遺伝子をいくつかの方法で改変した図1i内在性配列のコドンを哺乳動物細胞における発現に関して最適化し、予測細胞外ドメインだけを使用したii内在性分泌シグナル配列を、ハチ毒メリチンの分泌シグナル配列で置き換えたiii膜アンカリングのために、予測GPI付着シグナル配列または予測膜貫通ドメインの代わりに、マウスグリコフォリンAの膜貫通ドメインコード配列を使用したiv発現分析を可能にするために、FLAGタグを膜貫通ドメインのN末端に挿入し、6×HisタグをC末端に置いた。これら2つのタグは、組換えにより発現された抗原の細胞外局在の立証を容易にするために、膜貫通ドメインの直前と直後に配置した。熱帯熱マラリア原虫PFF0620c、ヒトABCA1細胞外ドメイン、およびラットTMEM27細胞外ドメインを発現するHEK由来細胞株を、安定トランスフェクションによって樹立した。高発現細胞株を得るために、抗FLAG抗体による表面染色後に、トランスフェクタントを蛍光活性化細胞選別によって高発現細胞プールに分離した。高発現細胞プールへと選別するためにゲーティングした細胞の平均蛍光強度は、全トランスフェクタントのそれより21~43倍高かった。ヒトABCA1発現細胞株およびラットTMEM27発現細胞株を、ウェスタンブロット分析によって発現について調べたところ、予期される分子量を持つタンパク質の高レベルな発現が示された図2。熱帯熱マラリア原虫PFF0620cタンパク質の細胞表面発現は抗FLAG抗体による免疫蛍光分析によって示され、生細胞に強いシグナルがもたらされた図3。これに対して、抗6×His抗体による染色は、メタノール固定細胞にのみ強いシグナルをもたらし、生細胞にはシグナルをもたらさなかった図3B。これらの結果は、PFF0620cが、発現し、かつFLAGタグを細胞外に置きHisタグを細胞内に置いた状態で細胞壁にアンカリングされることを立証した。トランスフェクトHEK細胞で免疫化したマウスにおけるマラリア抗原特異的抗体の発達PFF0620cHEKの高発現細胞プールを使ってNMRIマウスを免疫化した。マウスに、106個の細胞の静脈内注射を3日間連続して行い、2週間後にもう一度、3回の連日注射を行った。トランスフェクタントの免疫染色を非トランスフェクトHEK細胞の免疫染色と比較するフローサイトメトリーによって、血清抗体価の発達を分析した。トランスフェクタントで観察された蛍光強度は、非トランスフェクト対照HEK細胞で観察されたものより4倍高かった。これは、トランスフェクトHEK細胞の表面に発現したマラリア抗原に対する抗体応答を、マウスが開始していたことを示した。トランスフェクトHEK細胞で免疫化したマウスの脾臓細胞をPAI骨髄腫細胞と融合して、B細胞ハイブリドーマを作製した。融合細胞をマイクロタイター培養プレートのウェルに分配した。PFF0620c特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定するために、精製組換えタンパク質を全く必要としない2段階スクリーニング手法を使用した。まず最初に、全ての培養ウェルを、ELISAにより、IgG産生について試験した。試験したウェルの18~29が陽性だった。第2段階では、IgG産生に関して陽性である全てのウェルを、トランスフェクト細胞に結合する抗体について、IFAによってスクリーニングした。マルチウェルスライドガラス上にスポットしたトランスフェクトHEK細胞と非トランスフェクトHEK細胞を、個々のハイブリドーマ上清で染色し、蛍光顕微鏡法で分析した図4。非トランスフェクトHEK細胞を各試料の陰性対照とした。トランスフェクト細胞上で陽性である数多くのクローンが、非トランスフェクト細胞でも陽性だった。しかし融合は、トランスフェクタントとは強く反応するが非トランスフェクトHEK細胞とは反応しない抗体を含有するウェルも数多くもたらした。他の抗体は全て、免疫化に使用したトランスフェクト細胞に特異的であり、対照トランスフェクタントを染色しなかった。PFF0620c融合物からの再クローニングにより、このカテゴリーのウェルから、17個のハイブリドーマクローンを得た。モノクローナル抗体の特異性をウェスタンブロット分析でさらに確認した図5。mAbのうち16個は、免疫化に使用したトランスフェクタントの溶解物中の対応する組換えタンパク質を染色したが、対照トランスフェクトHEK細胞または非トランスフェクトHEK細胞の溶解物中のタンパク質は染色しなかった。PFD1130w特異的モノクローナル抗体はインビボで寄生虫の成長を阻害する本発明者らは、熱帯熱マラリア原虫SCIDマウスモデルにおける抗PFD1130wmAbのインビボ寄生虫阻害活性を評価した。熱帯熱マラリア原虫PFF0620cに対するmAbの作製に使用したものと同じ方法およびベクターを使って、抗PFD1130wmAbを製造した下記の方法の項を参照されたい。このモデルでは、熱帯熱マラリア原虫の成長が可能になるように、ヒト赤血球を移植した非骨髄枯渇NODscidIL2Rnullマウスを使用する。058±014の寄生虫血を有するマウス3匹ずつの各群に、それぞれマウス1匹あたり25mgの抗PFD1130wc12mAb、05mgの抗PFD1130wc12mAb、または25mgのアイソタイプサブクラス対照mAbを、1回注射した。続く6日間にわたって全てのマウスの寄生虫血を監視した。PBSのみまたは対照mAbを受けたマウスにおける寄生虫血は増加し続けて6日後には113±08に達したのに対し、05mgの抗PFD1130wc12mAbを受けたマウスでは寄生虫血の増加の程度がはるかに低く、6日後に56±13に達した。25mgの抗PFD1130wc12mAbを受けたマウスの寄生虫血は、実験の終了時まで低いままだった6日目に14±03。陰性対照群と比較した6日後の寄生虫血の相違は著しく有意だった両側t検定P<00001図6。抗PFD1130wmAbがインビボでの寄生虫成長を阻害するという事実は、内在性タンパク質にその天然の状況下で結合するmAbを作製するという、ここに記載するもっぱら細胞に基づく技術の能力を示している。方法プラスミドの構築および形質転換ハチ毒メリチンの分泌シグナル配列をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを、NheI消化pcDNA31Invitrogenにライゲーションすることにより、シグナル配列の3に1つのNheI部位を保っているプラスミドpcDNA31BVMを得た。骨髄から抽出したRNAをテンプレートとして使用し、rtPCRInvitrogenSuperScriptIIIFirstStrandSynthesisキットおよびRocheExpandHighFidelityPCRSystemによって、マウスグリコフォリンの細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインcDNAを得た。その結果得られたPCRアンプリコンをpCR21クローニングベクター中にクローニングした。マウスグリコフォリンに対するプライマーは5NotI部位と3ヒスチジンタグを含有し、その後ろに停止コドンとEagI部位が続いた。グリコフォリン6HisフラグメントをEagIで切り出し、NotI消化pcDNA31BVMにライゲーションすることにより、グリコフォリン配列の5端にpcDNA31NotI部位が保存されているプラスミドpcDNA31BVMGPを得た。発現ベクターの完成品pANITA2を作出するために、短いリンカー配列で挟まれたFlagタグをコードしていてFlagタグの5側にユニークNotI部位をもたらす二本鎖オリゴヌクレオチドを、NotI消化pcDNA31BVMGP中にライゲーションした。ラットTMEM27細胞外ドメイン配列番号9のaa15~130、熱帯熱マラリア原虫遺伝子PFF0620Cの予測細胞外ドメイン配列番号11のaa21~353、およびヒトABCA1のN末端細胞外ドメイン配列番号7のaa43~640の各cDNA配列を、哺乳動物細胞培養において高い発現が得られるようにコドン使用頻度を最適化して、合成した。それらの遺伝子を、pANITA2ベクターのユニークNbeI部位およびユニークNotI部位にライゲーションし、ベクターの配列を、DNA配列決定によって確認した。その結果得られたプラスミドを、以下、それぞれpANITA2TMEM27、pANITA2PFF0620C、またはpANITA2ABCA1という。pANITA31およびpANITA33では、元からあるpcDNA31XbaIおよびXhoI部位も、部位特異的変異誘発によって除去した。マルチクローニング部位および融合タンパク質コード配列の特徴を、挿入物の先頭から数えた番号と共に、下記の表1に示す。プライマー設計の指針としてチャイニーズハムスターグリコフォリン配列を使用し、かつアルメニアンハムスター骨髄RNA調製物から作製したcDNAを使用して、PCRクローニングおよびヌクレオチド配列決定を行うことによって、アルメニアンハムスターグリコフォリン配列を決定した。次に挙げる配列を表1に示すコザック配列を持つpANITA2=配列番号15、pANITA31=配列番号13、およびpANITA33=配列番号14。表1発現ベクターの比較PFF0620C、TMEM27、またはABCA1ドメインを安定に発現するHEK293細胞株の樹立JetPEI商標PolyPlusトランスフェクション試薬を製造者のプロトコールに従って使用することにより、293HEK細胞に、pANITA2TMEM27、pANITA2PFF0620C、またはpANITA2ABCA1をトランスフェクトした。抗生物質選択をトランスフェクションの48時間後に開始した。500μgmlのジェネティシンGibcoを含有する選択培地を3~4日毎に交換した。非抗生物質耐性細胞が死滅し、耐性細胞が正常に増殖し始めた後、FACSによって高発現プールを作製した。細胞を酵素不含解離緩衝液細胞解離緩衝液、酵素不含、ハンクス平衡塩、Gibcoで解離し、ブロッキング緩衝液3BSAを含有するPBSで洗浄した。次に細胞を、ブロッキング緩衝液で希釈した200μlの100μgml抗FLAGmAb=FLAG27と共に、氷上で15分間インキュベートした。次に細胞をブロッキング緩衝液で洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した200μlの100μgmlFITC結合ヤギ抗マウスIgG抗体RAMIgGFITC、NordicImmunologicalLaboratoriesと共に、氷上で15分間インキュベートした。最終洗浄後に、標識された細胞を分析し、FACSDivaソフトウェアを実行するBDFACSAriaを使って選別した。分析は全て、細胞片および凝集物を除外するために適切な散乱ゲートを使って行った。高度に標識された細胞が集められるように、ゲーティング設定を設定した。選別後、20FCSを含む培養培地に細胞を集め、35mmウェルにプレーティングした。HEK生細胞の免疫蛍光染色HEK生細胞の免疫蛍光染色には、チャンバースライド4ウェルチャンバースライド、LabTek商標、Nunc商標を使用した。ウェルを、H2O中の100mglポリDリジンで、湿潤箱中、室温にて、終夜コーティングした。ウェルを滅菌H2Oで3回洗浄した後、1ウェルにつき40000個の細胞を播種した。3日後に、ウェルを、無血清培養培地で希釈した500μlの適切なmAbと共に、氷上で30分間インキュベートすることによって、免疫染色を行った。無血清培養培地で2回洗浄した後、無血清培養培地で希釈した500μlの100μgmlFITC結合ヤギ抗マウスIgG抗体RAMIgGFITC、NordicImmunologicalLaboratoriesをウェルに加え、氷上で30分間インキュベートした。最後に、ウェルを無血清培養培地で2回、DPBSカルシウムを含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、Gibcoで1回、すすいだ。DAPIを含有する封入溶液DAPIを含むProLong登録商標Gold褪色防止試薬、Invitrogenでスライドを封入し、カバーガラスで覆った。染色を上述の通りに評価した。マウスの免疫化106個の安定トランスフェクトHEK細胞の静脈内注射によってNMRIマウスを免疫化した。細胞を解凍し、洗浄し、09NaClに再懸濁した。注射は、3日間連続して行い、2週間後に、再び3日間連続して行った。追加免疫後に、血液を採取し、安定トランスフェクト293HEK細胞を用いるIFAにより、血清を抗PFF0620C抗体の存在について調べた。発現細胞と強く反応する血清を持つ動物を融合用に選択した。融合の2日前と1日前に、これらに、106個の細胞の最後の注射を行った。マウスを屠殺し、脾臓を摘出した。滅菌条件下で摩砕することによって脾臓細胞を収集し、ポリエチレングリコール1500RocheDiagnosticsを使って骨髄細胞パートナーPAIマウス骨髄細胞、P3X63Ag8由来と融合させた。融合混合物をマルチウェルプレートにプレーティングし、マウスマクロファージP388の培養上清を補充したHAT培地中で増殖させることによってハイブリドーマを選択した。融合後2~3週の間に、後述のようにELISAおよびIFAによって、ウェルを特異的IgG産生についてスクリーニングした。初期スクリーニングにおいて陽性であったウェルからの細胞を限界希釈法でクローニングすることにより、モノクローナル集団を得た。IgGELISAスクリーニングMaxisorp商標プレートNuncを、PBSに希釈した100μlの5μgmlヤギ抗マウスIgGγ鎖特異的mAbSigmaで、湿潤箱中、4°Cにて、終夜コーティングした。005Tween20を含有するPBSで2回洗浄した後、ウェルを、ブロッキング緩衝液50mMトリス、140mMNaCl、5mMEDTA、005NONidetP40、025ゼラチン、1BSAで、37°Cにて1時間ブロッキングし、その後、2回洗浄した。50μlのハイブリドーマ上清をウェルに加え、37°Cで1時間インキュベートした。4回洗浄した後、プレートを、ブロッキング緩衝液で11000希釈した50μlのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgGγ鎖特異的Sigmaと共に、湿潤箱中、暗所、室温にて、1時間インキュベートした。4回洗浄した後、TMBペルオキシダーゼ基質溶液を加え、色の変化を監視した。抗体の産生と特徴づけ抗体アイソタイプの同定は、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットISO2、Sigmaを使って行った。大規模mAb産生のために、ハイブリドーマ細胞株を500mlのローラーボトルCorningで培養した。プロテインAまたはプロテインGセファロースを使ったアフィニティクロマトグラフィーによってmAbを精製した。DNA配列およびタンパク質配列明確に理解されるように、図表および例を挙げて上記の発明を説明したが、これらの説明および例が本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。本明細書において言及した全ての特許および科学文献の開示は、特に、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。