被験者においてアルツハイマー病を診断する方法であって、前記被験者からの組織サンプルまたは体液サンプルにおいて1つ以上の差異的に発現するタンパク質を検出することを含む方法。アルツハイマー病の性質または程度を測定する、請求項1に記載の方法。時間の経過にともなうアルツハイマー病の進行を測定する、請求項2に記載の方法。ヒトまたは動物被験者において、アルツハイマー病の性質または程度を測定する方法であって、以下の工程:a異なるレベルのアルツハイマー病症状を示す被験者由来のまたはそのような被験者を表す関連組織若しくは体液サンプルにおいて、少なくとも1つのタンパク質が差異的に発現するといいうパラダイムを確立する工程;b前記被験者から組織サンプルまたは体液サンプルを入手する工程;c前記サンプル中の、差異的に発現するタンパク質の存在、非存在若しくは発現の程度を測定する工程;並びにdそのような測定と臨床情報の間の事前の相関関係を参考にして、アルツハイマー病の性質または程度と前記測定とを関連づける工程;を含む方法。アルツハイマー病の重篤度を測定する、請求項4に記載の方法。アルツハイマー病の継続期間を測定する、請求項4または5に記載の方法。組織または体液サンプルは、尿、血液、血漿、血清、唾液または脳脊髄液サンプルである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。対照被験者のものと比較して、前記タンパク質の発現の増加を検出する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。対照被験者のものと比較して、前記タンパク質の発現の減少を検出する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。差異的に発現するタンパク質に対する特異的抗体を用いて、サンプル中に前記タンパク質に特異的な自己抗体を検出することにより、またはマススペクトロメトリー法により、前記タンパク質を検出する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。差異的に発現するタンパク質を二次元ゲル電気泳動を使用して検出する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。前記サンプルを固相支持体に固定化する、請求項10に記載の方法。1つより多い差異的に発現するタンパク質を検出することを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。4つ以上の差異的に発現するタンパク質を検出することを含む、請求項13に記載の方法。アルツハイマー病を緩和する最も適切且つ有効な治療を予測するため、及びその治療の成果をモニターするために、アルツハイマー病に罹患した個体の組織サンプルまたは体液サンプル中の差異的に発現するタンパク質のパターンを用いる、請求項13または14に記載の方法。少なくとも1つの前記差異的に発現するタンパク質が、図6、図7、図8または図12に示されるタンパク質である、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。少なくとも1つの前記差異的に発現するタンパク質が、図6に示されるスポット177に見られる、登録番号P01834の免疫グロブリンλ鎖C領域である、請求項5に記載の方法。少なくとも1つの前記差異的に発現するタンパク質が、図6に示されるスポット165に見られる血清アルブミン前駆体アイソフォームである、請求項6に記載の方法。少なくとも1つの前記差異的に発現するタンパク質が、図6、図7、図8または図12に示される以下のタンパク質:アポリポプロテインAIV前駆体、アポリポプロテインCIII前駆体、トランスシレチン、ガレクチン7、補体タンパクC4前駆体、補因子H、S100カルシウム結合タンパク質またはセルロプラスミン、ヒストン2B、免疫グロブリンλ鎖C領域、フィブリノーゲンγ鎖前駆体、インターαトリプシン重鎖H4前駆体、補体タンパクC3前駆体、クラステリン前駆体、γ若しくはβアクチン、ハプトグロビン前駆体の一つ、またはその断片、または図6のスポット番号2、14、15、123、165、176、184に見られる血清アルブミン前駆体アイソフォームである、請求項16に記載の方法。前記断片はアポリポプロテインAIVの270309残基、補体タンパクC4の68014461744残基を含む、または前記断片はSDSPAGEで28kDaの断片として移動するアポリポプロテインAIVのN末断片である、請求項19に記載の方法。少なくとも1つの前記差異的に発現するタンパク質が、図6、図7または図12に示される以下のタンパク質:α2マクログロブリン、免疫グロブリンα1鎖C、アポリポプロテインAIVの一つ、あるいはその断片、あるいは図6のスポット2に見られる補因子Hまたは血清アルブミン前駆体である、請求項19に記載の方法。アルツハイマー病を治療するのに有効な治療を決定することをさらに含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。アルツハイマー病の発症または進行を防ぐことを目的として、アルツハイマー病状態における1つ以上の差異的に発現するタンパク質の発現を、健常状態に見られるものに回復させるであろう薬剤を用いる治療方法。アルツハイマー病を治療するのにおける有効性を判定するための薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程:aスクリーニングされる薬剤で治療を受けたアルツハイマー病症状を示す被験者由来のまたはそのような被験者を表す関連組織若しくは体液サンプルを入手する工程;b治療を受けた被験者由来のまたはそのような被験者を表す関連組織若しくは体液サンプルにおいて、差異的に発現するタンパク質の存在、非存在若しくは発現の程度を測定する工程;並びにc治療を受けたアルツハイマー病症状を示す被験者において、差異的に発現するタンパク質の発現、活性若しくは量を変化させる程度に従って、前記薬剤を選択または拒絶する工程;を含む方法。工程aの前に、アルツハイマー病症状を示す被験者及び健常被験者由来のまたはそのような被験者を表す関連組織若しくは体液サンプルにおいて、少なくとも1つのタンパク質が差異的に発現するというパラダイムを確立する工程をさらに含む、請求項24に記載の方法。前記差異的に発現するタンパク質の発現を、健常被験者のものに移行させる場合、その薬剤を選択する、請求項24または25に記載の方法。前記タンパク質の発現を、健常被験者のものまで移行させる場合、その薬剤を選択する、請求項24または25に記載の方法。アルツハイマー病を治療するのにおける有効性を判定するための薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程:aスクリーニングされる薬剤で治療を受けたアルツハイマー病症状を示す被験者由来のまたはそのような被験者を表す関連組織若しくは体液サンプルを経時的に入手する工程;b前記サンプル中の、差異的に発現するタンパク質の存在、非存在若しくは発現の程度を測定する工程;並びにc前記薬剤が治療を受けたアルツハイマー病症状を示す被験者において、差異的に発現するタンパク質の発現に経時的に変化をもたらすかどうかを測定する工程;を含む方法。工程aの前に、アルツハイマー病症状を示す被験者及び健常被験者由来のまたはそのような被験者を表す関連組織若しくは体液サンプルにおいて、少なくとも1つのタンパク質が差異的に発現するというパラダイムを確立する工程;並びにアルツハイマー病症状を示す被験者及び健常被験者において、前記差異的に発現するタンパク質の発現が経時的に相違するというパラダイムを確立する工程;をさらに含み、前記差異的に発現するタンパク質の発現における変化を経時的に防ぐまたは減速する場合、その薬剤を選択する、請求項28に記載の方法。異なるレベルのタンパク質発現を示す被験者、この被験者は以下のa健常被験者とアルツハイマー病症状を示す被験者;並びにb前記薬剤で治療を受けていないアルツハイマー病症状を示す被験者と前記薬剤の治療を受けたアルツハイマー病症状を示す被験者;を含む、請求項24から29のいずれか一項に記載の方法。前記薬剤で治療を受けた及び受けていない健常被験者において、異なるレベルのタンパク質発現は観察されない、請求項30に記載の方法。アルツハイマー病症状を示す被験者は、アルツハイマー病に罹患したヒト患者である、請求項24から29のいずれか一項に記載の方法。アルツハイマー病症状を示す被験者は、突然変異型アミロイド前駆体タンパク質APPトランスジェニックマウス、プレセニリン1PS1トランスジェニックマウス、APPPS1ダブルトランスジェニックマウス、及び/またはグリコーゲンシンターゼキナーゼトランスジェニックマウスであり、健常被験者は野生型マウスである、請求項24から29のいずれか一項に記載の方法。組織または体液サンプルは、脳組織サンプルである、請求項33に記載の方法。組織または体液サンプルは、尿、血液、血漿、血清、唾液または脳脊髄液サンプルである、請求項33または34に記載の方法。関連組織またはそのタンパク質含有抽出物について実施する二次元ゲル電気泳動を用いることによりパラダイムを確立する、請求項4、25または29のいずれか一項に記載の方法。関連組織またはそのタンパク質含有抽出物のSELDI分析を用いることによりパラダイムを確立する、請求項4、25または29のいずれか一項に記載の方法。差異的に発現するタンパク質は、図6、図7、図8及び図12に示される1つ以上のタンパク質、またはそのげっ歯類同等物を含む、請求項24から37のいずれか一項に記載の方法。少なくとも1つの前記差異的に発現するタンパク質が、図6、図7、図8または図12に示される以下のタンパク質:アポリポプロテインAIV前駆体、アポリポプロテインCIII前駆体、トランスシレチン、ガレクチン7、補体タンパクC4前駆体、ヒストン2B、免疫グロブリンλ鎖C領域、フィブリノーゲンγ鎖前駆体、補因子H、インターαトリプシン重鎖H4前駆体、補体タンパクC3前駆体、クラステリン前駆体、γ若しくはβアクチン、ハプトグロビン前駆体の一つ、またはその断片、または図6のスポット番号No2、14、15、123、165、176、184に見られる血清アルブミン前駆体アイソフォーム、またはそのげっ歯類同等物である、請求項38に記載の方法。前記断片はアポリポプロテインAIVのアミノ酸270309残基、または補体タンパクC4の14461744残基、またはそのげっ歯類同等物を含む、請求項40に記載の方法。少なくとも1つの前記差異的に発現するタンパク質が、図6、図7または図12に示される以下のタンパク質:α2マクログロブリン、免疫グロブリンα1鎖C、アポリポプロテインAIVの一つ、あるいはその断片、あるいは図6のスポット2に見られる補因子Hまたは血清アルブミン前駆体、あるいはそのげっ歯類同等物である、請求項39に記載の方法。請求項24から41のいずれか一項に記載の方法を用いて薬剤を同定することを含み、その薬剤を製造し、且つ製薬組成物を供給するのに適当な担体でそれを製剤化するさらなる工程を含む、製薬組成物を作製する方法。アルツハイマー病被験者及び健常被験者からの関連組織または体液サンプルにおいて、差異的に発現するタンパク質を同定する方法であって、以下の工程:i組織サンプル若しくは体液サンプル、またはそこからのタンパク質を含む抽出物を、固相支持体に固定化する工程;ii固定化したタンパク質を表面増強レーザー脱離飛行時間質量分析法により分析する工程;iiiアルツハイマー病被験者及び健常被験者間の、タンパク質発現の差を検出するために得られたスペクトルを比較する工程;を含む方法。組織または体液サンプルは、血液、血清または脳脊髄液サンプルである、請求項43に記載の方法。前記方法で同定された差異的に発現するタンパク質を単離する工程をさらに含む、請求項43または44に記載の方法。前記単離されたタンパク質を特徴づけする工程をさらに含む、請求項45に記載の方法。広い意味で本発明は、アルツハイマー病の診断のための方法及び組成物に関する。とくに本発明は、健常状態の発現と比較して、アルツハイマー病状態において差異的に発現するタンパク質を同定し、且つそれを記載する。第一の特徴点として本発明は、被験者におけるアルツハイマー病の診断方法を提供する。この方法は、前記被験者からの組織サンプルまたは体液サンプルにおいて、ここに記載する方法により同定された1つ以上の差異的に発現するタンパク質を検出することを含む。すべての特徴点として本発明の方法は、進行したアルツハイマー病だけでなく軽度認知障害MCI等のアルツハイマー病前段階に関しても使用して良い。もう一つの特徴点として本発明は、ヒトまたは動物被験者における、アルツハイマー病の性質または程度の測定方法を提供する。この方法は、前記被験者からの組織サンプルまたは体液サンプルにおいて、ここに記載する方法により同定された1つ以上の差異的に発現するタンパク質を検出することを含む。従って、本発明の方法は、アルツハイマー病の進行またはMCIからアルツハイマー病への疾患の進行をモニターする方法を含む。また、例えば、MCIからアルツハイマー病への進行について、またはアルツハイマー病の継続期間若しくは重篤度について予測する方法も含む。好ましい実施態様では、この方法は以下の工程:a異なるレベルのアルツハイマー病症状を示す被験者由来のまたはそのような被験者を表す関連組織若しくは体液サンプルにおいて、少なくとも1つのタンパク質が差異的に発現するというパラダイムを確立する工程;b前記被験者から組織サンプルまたは体液サンプルを入手する工程;c前記サンプル中の、差異的に発現するタンパク質の存在、非存在若しくは発現の程度を測定する工程;並びにdそのような測定と臨床情報の間の事前の相関関係を参考にして、アルツハイマー病の性質または程度と前記測定とを関連づける工程;を含む。ある実施態様では、本発明の方法を用いることにより前記疾患の進行を追跡し、疾患の重篤度例えば、全体的な認知症重篤度を判定しても良い。別の実施態様では、本発明の方法を用いることにより、診断時点までの疾患の継続期間を判定できる。例えば、免疫グロブリンλ鎖C領域IglamdachainCregionの発現は図6のスポット177参照、全体的な認知症重篤度と相関している可能性がある。血清アルブミン前駆体serumalbuminprecursorの発現は図6のスポット165参照、疾患の継続期間と負の相関にある可能性がある。この方法により、当該技術分野で入手可能な予防的または治療的処置に対して、患者のアルツハイマー病タイプを種々のタイプと関連させ、それにより治療に対する患者の応答を促すことができる。いくつかの実施態様では、1つ以上のタンパク質が差異的に発現し、アルツハイマー病の性質または程度の複合タンパク質フィンガープリントを提供する。好ましくは、少なくとも4つのタンパク質が差異的に発現する。好ましいことに、本発明の方法に用いられる患者サンプルは、組織サンプルまたは血液、血漿、血清若しくは尿サンプル等の体液サンプルである。被験者からより容易に採取できるので、列挙されたような体液を使用することが好ましい。これは、コスト、簡易性、迅速性及び被験者の健康という点において、明らかに利点がある。血液、血漿等の血液産物、及び尿はとくに好ましい。差異的に発現するタンパク質を検出する工程の前に、下に記載するような、サンプルから最も多く存在するタンパク質を除くための除去工程が先行しても良い。好ましいことに、少なくとも1つの差異的に発現するタンパク質は、図6、図7または図12に示されるタンパク質である。好ましい実施態様では、差異的に発現するタンパク質は、アポリポプロテインAIV前駆体apolipoproteinAIVprecursor、アポリポプロテインCIII前駆体apolipoproteinCIIIprecursor、トランスシレチンtransthyretin、ガレクチン7galectin7、補体タンパクC4前駆体complementC4precursor、α2マクログロブリン前駆体alpha2macroglobulinprecursor、免疫グロブリンα1鎖CIgalpha1chainC、ヒストン2Bhistone2B、免疫グロブリンλ鎖C領域IglamdachainCregion、フィブリノーゲンγ鎖前駆体fibrinogengammachainprecursor、補因子HcomplementfactorH、インターアルファトリプシン重鎖H4前駆体interalphatrypsinheavychainH4precursor、補体タンパクC3前駆体complementC3precursor、クラステリン前駆体clusterinprecursor、γ若しくはβアクチンgamma若しくはbetaactin、ハプトグロビン前駆体haptoglobinprecursor、または図6のスポットID番号2、14、15、123、165、176、184に見られる血清アルブミン前駆体アイソフォームserumalbuminprecursorisoform、またはその断片である。好ましい断片は、アポAIVのC末断片、またはアナフィラトキシンドメインを欠失した補体タンパクC4前駆体のC4α領域である。その断片は、例えば、アポリポプロテインAIVのアミノ酸270309残基、または補体タンパクC4のアミノ酸14461744残基を含む、あるいはSDSPAGEで1016kDaのポリペプチドまたは28kDaのポリペプチドとして移動するアポリポプロテインAIVのN末断片であり、あるいは図7に示した分子量6430、14640、27147、または14646Daのタンパク質のいずれかの断片である。別の好ましい断片は、図9、図10及び図13-19に太字で示した領域を含む。好ましい断片は、アミノ酸の長さが50残基未満、100残基未満、150残基未満、200残基未満、250残基未満、300残基未満、350残基未満、400残基未満、500残基未満、600残基未満、700残基未満、800残基未満、900残基未満、1000残基未満、1100残基未満、1200残基未満、1300残基未満、1400残基未満、1500残基未満、1600残基未満、1700残基未満、1800残基未満、1900残基未満または2000残基未満である。ある差異的に発現するタンパク質の発現は、対照被験者と比較してアルツハイマー病被験者において発現が増加しているかもしれない。別の差異的に発現するタンパク質は、対照被験者と比較してアルツハイマー病被験者において発現が減少しているかもしれない。図6、図8及び図12に、ここで開示された前記タンパク質の発現が、対照被験者に対してアルツハイマー病被験者において増加しているか減少しているかを示す。これらの図から、ここに列挙されたすべてのタンパク質に対して、発現の増加または減少が病状を示していることは従って明らかである。上に列挙した好ましいタンパク質を含む。好ましいことに、差異的に発現するタンパク質は、対照被験者に対してアルツハイマー病患者に見られるレベルの間で、少なくとも15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、3倍、35倍、4倍、5倍、10倍以上の発現の違いを示す。前記差異的に発現するタンパク質は、例えば、ELISAアッセイまたはウエスタンブロッティングでそのタンパク質に対する特異的抗体を用いることにより検出できる。あるいはまた、二次元ゲル電気泳動、またはLSMSMS、MALDITOF若しくはSELDITOFを含むマススペクトロメトリー法により他の中から検出できる。前記サンプルは、分析のために固相支持体に固定化される。ある実施態様では、被験者サンプルから調製された二次元ゲルのスポットパターンに基づいてのみ、診断がなされても良い。アルツハイマー病またはMCI被験者から得られたスポットパターンを、個々のタンパク質を同定する必要なく、対照被験者から得られたパターンと直接比較しても良い。ある実施態様では、1つ以上のバイオマーカーに対して特異的な抗体を加え、固定化した抗体がそのバイオマーカータンパク質を捕獲する、という抗体サンドイッチ法を用いる。前記捕獲されたタンパク質を、その後、シグナルを発する物質酵素、蛍光タグ、放射ラベル等を直接標識した二次抗体、またはさらに増幅させる方法標識された二次抗体、酵素を用いたストレプトアビジン/ビオチンシステム、フルオロフォア、放射ラベル等を用いることにより検出する。他の免疫学的手法としては、患者サンプルを一次元または二次元ゲル電気泳動後、ウエスタンブロッティングのような手法により固体表面に転写、その後、ADのバイオマーカーに対する特異的抗体を用いて検出する方法を含む。代替的な実施態様では、患者からのサンプルまたはADを表す関連組織を用いて前記ウエスタンブロッティング法を行い、その後、AD患者の血中には存在するが対照には存在しないバイオマーカーに対する特異的抗体の存在を検出することにより、バイオマーカーに対する自己抗体を検出する。前記方法は、アルツハイマー病に対する有効な治療を決定することをさらに含む。さらなる特徴点として本発明は、アルツハイマー病の発症または進行を防ぐために、アルツハイマー病状態において差異的に発現する1つ以上のタンパク質の発現を、健常状態に見られるものへ回復させるであろう薬剤を用いる治療法を提供する。好ましくは、前記タンパク質の発現は健常状態まで回復する。さらなる特徴点として本発明は、アルツハイマー病を緩和するための最も適切且つ有効な治療を予測するために、アルツハイマー病に罹患した個体からの組織サンプルまたは体液サンプルまたは尿中に差異的に発現するタンパク質のパターンを用いる方法を提供する。また本発明は、アルツハイマー病治療における有効性を判定するための薬剤のスクリーニング法を提供し、この方法は以下の工程:aスクリーニングされる薬剤で治療を受けたアルツハイマー病症状を示す被験者由来またはそのような被験者を表す関連組織サンプルを入手する工程;b治療を受けた被験者由来またはそのような被験者を表す組織中の、差異的に発現するタンパク質の存在、非存在若しくは発現の程度を測定する工程;並びにc治療を受けたアルツハイマー病症状を示す被験者において、差異的に発現するタンパク質の発現、活性若しくは量を変化させる程度に従って、薬剤を選択または拒絶する工程;を含む。選択的に、前記方法はさらに、前記工程aの前に、アルツハイマー病症状を示す被験者及び健常被験者由来またはそのような被験者を表す関連組織において、少なくとも1つのタンパク質が差異的に発現するというパラダイムを確立する工程を含む。好ましくは、差異的に発現するタンパク質の発現を、健常被験者のものに移行させる場合、その薬剤を選択する。さらに好ましくは、その発現を健常被験者のものまで移行させることができた場合、その薬剤を選択する。また本発明は、アルツハイマー病治療における有効性を判定するための薬剤のスクリーニング法を提供し、この方法は以下の工程:aスクリーニングされる薬剤で治療を受けたアルツハイマー病症状を示す被験者由来、またはそのような被験者を表す関連組織若しくは体液サンプルを経時的に入手する工程;b前記サンプル中の、差異的に発現するタンパク質の存在、非存在若しくは発現の程度を測定する工程;並びにc治療を受けたアルツハイマー病症状を示す被験者において、差異的に発現するタンパク質の発現に経時的に変化をもたらす薬剤かどうかを測定する工程;を含む。選択的に、前記方法はさらに、前記工程aの前に、アルツハイマー病症状を示す被験者及び健常被験者由来またはそのような被験者を表す関連組織若しくは体液において、少なくとも1つのタンパク質が差異的に発現するというパラダイムを確立する工程;及び/またはアルツハイマー病症状を示す被験者及び健常被験者において、前記差異的に発現するタンパク質の発現が経時的に相違するというパラダイムを確立する工程を含む。経時的なサンプルは、隔週、隔月、隔年で採取する。例えば、毎月、2ヶ月おき、3ヶ月おき、4ヶ月おき、6ヶ月おき、8ヶ月おき、または12ヶ月おきにサンプルを採取する。経時的なタンパク質の発現の変化は、その被験者からのサンプル中の初期の発現レベルと比較して、及び/または健常被験者からのサンプル中の発現レベルと比較して、増加または減少しているかもしれない。その発現の変化を経時的に減速または停止させる場合、その薬剤を選択する。前記スクリーニング法では、異なるレベルのタンパク質発現を示す以下の被験者:a健常被験者とアルツハイマー病症状を示す被験者;並びにb前記薬剤で治療を受けていないアルツハイマー病症状を示す被験者と薬剤治療を受けたアルツハイマー病症状を示す被験者;を含む。代替的な実施態様では、タンパク質の発現レベルが異なる以下の被験者:a前記薬剤で治療を受けた及び受けていない健常被験者;並びに以下の一方または両方b前記薬剤で治療を受けた及び受けていない軽度認知障害被験者;並びにc前記薬剤で治療を受けた及びを受けていないアルツハイマー病症状を示す被験者;を含む。好ましくは、前記薬剤で治療を受けた及び受けていない健常被験者において、異なるレベルのタンパク質発現は見られない。アルツハイマー病症状を示す被験者は、好ましくはアルツハイマー病に罹患したヒト患者である。あるいはまた、アルツハイマー病症状を示す被験者は、突然変異型アミロイド前駆体タンパク質APPトランスジェニックマウス、プレセニリン1PS1トランスジェニックマウス、及び/またはAPPPS1ダブルトランスジェニックマウス等のモデル動物かもしれない。組織または体液サンプルは、例えば、脳組織、血液、血漿、血清、唾液または脳脊髄液サンプルである。ある実施態様では、前記関連組織またはそのタンパク質含有抽出物について実施する二次元ゲル電気泳動を用いることによりパラダイムを確立する。別の実施態様では、前記関連組織またはそのタンパク質含有抽出物についてのSELDI分析を用いることによりパラダイムを確立する。好ましくは、前記組織または抽出物は固相支持体、例えばチップに固定化される。好ましいことに、サンプルから最も多く存在するタンパク質を除き、バックグラウンドを下げるために、二次元ゲル電気泳動またはSELDI分析の前に、除去工程が先行しても良い。この方法は、前記方法により同定された差異的に発現するタンパク質を単離する工程、及び選択的に、その単離されたタンパク質を特徴づけする工程をさらに含む。好ましくは、少なくとも1つの差異的に発現するタンパク質は、図6、図7、図8若しくは図12に示されたタンパク質、またはそのげっ歯類同等物である。好ましい実施態様では、差異的に発現するタンパク質は、アポリポプロテインAIV前駆体、アポリポプロテインCIII前駆体、トランスシレチン、ガレクチン7、補体タンパクC4前駆体、補因子H、S100カルシウム結合タンパク質S100calciumbindingproteinまたはセルロプラスミンceruloplasmin、インターαトリプシン重鎖H4前駆体、補体タンパクC3前駆体、クラステリン前駆体、γ若しくはβアクチン、ハプトグロビン前駆体、またはその断片である。好ましい断片は、アポAIVのC末断片、またはアナフィラトキシンドメインを欠失した補体タンパクC4前駆体のC4α領域である。例えば、その断片はアポリポプロテインAIVのアミノ酸270309残基、または補体タンパクC4のアミノ酸14461744残基を含む。好ましい断片は、図9、図10及び図13-19に強調した1つ以上の配列を含むであろう。さらなる特徴点として本発明は、前記方法を用いて薬剤を同定することを含み、その薬剤を製造し、且つ製薬組成物を供給するのに適当な担体でそれを製剤化するさらなる工程を含む、製薬組成物を作製する方法を提供する。さらなる特徴点として本発明は、軽度認知障害被験者及び/またはアルツハイマー病被験者及び健常被験者からの組織または体液サンプルにおいて、差異的に発現するタンパク質を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程:i組織サンプル若しくは体液サンプル、またはそのタンパク質含有抽出物を、固相支持体に固定化する工程;ii固定化したタンパク質を表面増強レーザー脱離飛行時間質量分析法を用いて分析する工程;iiiアルツハイマー病被験者及び健常被験者間の、タンパク質発現の差を検出するために得られたスペクトルを比較する工程;を含む。また、異なるレベルのアルツハイマー病症状を示す被験者由来またはそのような被験者を表す関連組織において、差異的に発現し、且つここに記載する方法または前記組織若しくはそのタンパク質含有抽出物について二次元ゲル電気泳動を実施することにより得ることができるそのようなタンパク質を提供する。この方法は、以下の工程:a3mm×180mmのアクリルアミドポリマーの非直線状固定化pH勾配IPGゲルを準備する工程;b前記IPGゲルを、尿素8M、3ジメチルアンモニオ1プロパンスルホナートCHAPS、2wv、05IPGファルマライト、及び微量のブロモフェノールブルーの水溶液25mlを含むカセット中で再水和する工程;c前記カセットから液体を除き、湿った電極芯、電極、及びサンプルカップを備えた電気泳動トレーに前記ゲルを移し、ゲルとカップを低粘度のパラフィン油で覆う工程;d前記IPGゲルの陰極末端で、尿素8M、CHAPS4wv、Tris40mM、05IPGファルマライト、及び微量のBromophenolBlue中の関連生体組織を乾燥粉末にした材料の水溶液200μgをサンプルカップにアプライする工程;e前記ゲルについて、3時間500Vの定電圧で、その後1時間500Vから1000Vの直線的増加の勾配電圧で、その後2時間1000Vの定電圧で、その後2時間1000Vから8000Vの直線的増加の勾配電圧で、その後、タンパク質がゲル中でpI依存的な最終地点へ移動するのに十分な時間8000V定電圧で、等電点電気泳動を実施する工程;f前記ゲルを、TrisHCl50mMpH68、尿素6M、グリセロール30vv、SDS2wv及びDTT10mgmlを含む水溶液100mlの入ったトレー内で平衡化する工程;gこの溶液を、TrisHCl50mMpH88、尿素6M、グリセロール30vv、SDS2wv、ヨードアセタミド25mgml、及び微量のBromophenolBlueを含む水溶液100mlで置換し、20分間インキュベートする工程;hリーディングバッファーとしてのTrisHCl0375MpH88中で、TEMED05wv、過硫酸アンモニウム01wv、及びチオ硫酸ナトリウム5mMを添加して重合させる、アクリルアミド/ピペラジン-ジアクリリル架橋剤916T26Cの縦勾配スラブゲル160×200×15mmを準備する工程;i前記ゲルをsecブタノールで約2時間浸し、その後ブタノールを除去し、水で置換する工程;j前記IPGゲル断片を二次元電気泳動に適したサイズに切断し、陽極末端から6mm及び陰極末端から14mmを除去する工程;k前記スラブゲルを、70°Cに加熱したアガロース05wv及びリーディングバッファーとしてのTrisグリシンSDS25mM198mM01wvの水溶液で浸し、この浸した溶液を介してスラブゲル上に前記IPGゲルをのせる工程;l812°C、5時間40mAの定電流で、二次元電気泳動を実施する工程;並びにmゲルを洗浄する工程;を含む。本発明は部分的に、二次元電気泳動による高感度タンパク質検出に関わる体系的な探索手法に基づく。差異的に発現するタンパク質の特徴づけを助けるために、GenomicSolutions社から入手可能であるようなタンパク質の標準マーカーセットを、余分なレーンにのせて二次元電気泳動を実施しても良い。後に挙げる例は、アルツハイマー病関連の標的タンパク質を同定するために、本発明の実験的パラダイムが効果的に使用されることを証明する。<定義>ここで使用される差異的な発現は、組織または体液タンパク質発現における、少なくとも1つの認識可能な差異を表す。それは、組織タンパク質発現における量的に測定可能な差異、半量的に見積もり可能な差異、または質的に検出可能な差異であっても良い。従って、差異的に発現するタンパク質ここではDEPと称するは、健常状態の組織において強く発現し、アルツハイマー病状態の組織においてあまり強く発現していない、あるいは全く発現していないものでも良い。逆に、それはアルツハイマー病状態の組織において強く発現し、健常状態においてあまり強く発現していない、または全く発現していないものでも良い。さらに、健常状態と疾患状態の間の比較で、タンパク質がいずれかの認識可能な変化を受けている場合は、その発現は差異的とみなされて良い。用語パラダイムは、見本例、試験モデルまたは標準を意味する。差異的に発現するタンパク質をスクリーニング方法に用いる場合はどこでも、前記タンパク質の差異的な発現性を事前に測定したというパラダイムを確立する予備工程を、過去のある時点で実施していなければならない。一度パラダイムを確立すると、スクリーニング方法を実施するすべての場合で再確立する必要はない。用語パラダイムを確立するは、それに応じて解釈されなければならない。関連組織は、脳機能に関わるいずれかの組織、とくにアルツハイマー病に関わる組織を意味する。患者の組織/体液、...を表す...は、前述の生物学的変化を研究目的のために模擬実験できるいずれかの組織または体液を意味し、例えば一次細胞培養、または関連組織から究極的に由来する細胞系を含む。用語被験者は、ヒト及び動物の被験対象物を含む。前記の治療は、1つ以上の薬剤または食物の投与、及び/または食餌若しくは運動等の他の因子を含むことができる。差異的に発現するタンパク質DEPは、フィンガープリントタンパク質、標的タンパク質またはパスウェイタンパク質を含む。ここで使用される用語フィンガープリントタンパク質は、DEPを意味し、その発現は単独または他のDEPと組み合わせて、アルツハイマー病罹患の疑いのある患者の状態をモニターまたは評価するために用いることができる。これらのタンパク質は、通常組み合わせて、とくに4つ以上の組み合わせで用いられるため、便宜上フィンガープリントタンパク質と称される。ただし場合により、この目的のために、単独で、または他の1つのみとともに若しくは他の2つのタンパク質とともに用いられる可能性に対しては偏見をもたない。そのようなフィンガープリントタンパク質は、例えばアルツハイマー病の特定のタイプを診断するために用いることができ、従って、そのタイプに対する特異的な治療を提案するために用いることができる。ここで使用される用語診断は、患者における前記疾患の存在、非存在または可能性に関するいずれかの情報の提供を含む。それはさらに、それと関係するまたは経験的に関係する疾患若しくは症状のタイプまたは分類に関する情報の提供を含む。これは、例えば、前記疾患の重篤度を診断することを含むかもしれない。それは、前記疾患の医学的過程について、例えばその継続期間や重篤度、MCIからアルツハイマー病への進行過程について診断することを含む。現在、発症から今現在までの継続期間継続期間が長いほどより重篤な疾患に相当すると臨床診断とにより、病状を診断する。これらの診断測定は、記憶及び他の認知に対する臨床テスト、機能日常生活を送る能力に対する臨床テスト、及び全体的な認知症重篤度の臨床診断を含む。ADに対して有望な治療の試行は、現在、これらの測定により評価されている。米国食品医薬品局FDAと他の医療承認機関は、認知機能及び全機能の両方についてのこれらの診断測定を重要な部分として要求している。世界的な認知症評価尺度GlobalDementiaScaleは、全機能についてのそのような測定の一つである。それは、標準化された一連の重篤度基準の代わりに、認知及び機能を含む重篤度について評価者により診断される。ここで使用される用語標的タンパク質はDEPを意味し、そのレベルまたは活性はアルツハイマー病を緩和するための治療により調節できる。患者における標的タンパク質のレベルまたは活性は、例えば標的タンパク質、それと相互作用する別のタンパク質または遺伝子を投与することにより、あるいはそれと相互作用するまたは低下させる薬剤、例えば前記タンパク質に対する抗体、前記タンパク質の競合的阻害剤、または相当する遺伝子の転写若しくは翻訳のプロセスに作用する薬剤を投与することにより調節を果たすことができる。ここで使用されるアルツハイマー病に関連した用語緩和は、1つ以上の非所望の症状またはその影響を低減するいずれかの形態を意味する。患者のアルツハイマー病症状のいずれかの改善は、用語緩和の範囲内にある。改善はまた、疾患の進行を減速させることも含む。あるいは、またはさらに、前記DEPは、脳機能の調節に関与する少なくとも1つの他のタンパク質または遺伝子と相互作用しうる。そのような他のタンパク質は、ここではパスウェイタンパク質PPと称する。パスウェイタンパク質は別のDEPでありうるが、この用語PPは、DEPと相互作用するタンパク質に適用され、DEP自体には適用されない。例として、本発明の実施態様は、添付する図面を参考にしてより詳細に記載されるであろう。《被験者》実験集団は、長期的に調査された、ADに罹患した人NINCDSADRDAprobable、他の認知症患者、及び健常年配者の大きな群集に基づく集団から抽出される。詳細な臨床診断を有する1000を超える被験者について、サンプルが入手可能である。臨床検査データは、体系的な診断、認知検査、及び行動検査を含む。およそ50mlBD社の採血管vacutainerK3Eの15の4×10ml、及びexetainerに1×10mlの血液が各被験者から採血される。被験者は、採血の2時間より前から飲食をしない。1本のBD社vacutainerK3E血漿及びextainer血清がプロテオミクス研究に用いられる。プロテオミクスのために回収された前記血清/血漿サンプルを、回収から2時間以内に8分間3000回転で遠心する。《分析》8M尿素、2wvCHAPS、05IPGファルマライトpH310AmershamBiotech社UKからなる2D用溶解バッファー中で、血清/血漿サンプルを溶解及び再水和した。その後、溶解したサンプルを18cm310NLImmobilinepH勾配ゲルpH310のポリアクリルアミドゲルを用いた等電点電気泳動にかけた。再水和したゲルのIPG等電点電気泳動は、IPGphor泳動装置で、以下のプロトコール:ステップ1:1時間500Vstepnholdsh:すなわち、ゲルにかける電流を表示された時間特定の設定でステップの泳動時間中、徐々に増やしていく;ステップ2:2時間500Vshステップ3:1時間500から1000Vの直線的増加の勾配電圧Gステップ4:2時間1000Vshステップ5:2時間1000から8000VGステップ6:8時間8000Vshを用いて16時間実施した。その後、等電点電気泳動したIPGゲルは、10mgmlジチオトレイトールDTTを加えたSDS平衡化バッファー50mMTrisHClpH88、6M尿素、30vvグリセロール、2SDS、及び微量のブロモフェノールブルーで20分間平衡化した。その後、20分間の25mgmlヨードアセタミドのステップが続く。その後、平衡化したゲルは、EttanDaltIIシステムを用いて10アクリルアミド二次元等電点電気泳動ゲルで分離した。電気泳動後、前記ゲルを別々の染色ボックスに入れ、室温で1時間40エタノール/10酢酸を用いて固定し、Hochstrasseプロトコールに従って染色した表1。ゲルの分析はMelanie3ソフトウェア及びMannWhitney順位和検定を用いて行い、被験者グループの比較には偽発見率FalseDiscoveryRate統計分析を行った。表1:Hochstrasse染色プロトコール《サンプルの準備》ゲル内での還元、アルキル化及び消化トリプシンを用いたを、マススペクトロメトリーによる分析の前に行った。システイン残基は、DTTで還元され、ヨードアセタミド処理により誘導体化され、安定的なカルバミドメチルCAM誘導体を形成した。トリプシン消化は、37°Cで1時間行った後、室温/オーバーナイトで行った。《MALDITOFマススペクトロメトリー》消化したサンプル3μlを脱塩し、ZipTipC18Millipore社を用いて濃縮した。4μlの50アセトニトリル/01トリフルオロ酢酸にペプチドを溶出した。その後、05μlをマトリックスαシアノ4ヒドロキシケイ皮酸05μlを備えた目的のプレート上へのせた。VoyagerDePro、MALDITOFマススペクトロメーターAppliedBiosystems社を用いてペプチドマスフィンガープリントを得た。マススペクトルを、遅延引出しdelayedextractionを備えたリフレクトロンモードreflectronmodeで得た。その後、得られたマススペクトルを固定し、30ppm以上の正確性を達成するために、質量21630569Daの自己消化によるトリプシンペプチドを用いた。《LCMSMS》一連のアセトニトリルと水溶液の洗浄により、ゲル断片からペプチドを抽出した。抽出物を最初の上清で浸し、凍結乾燥した。その後、各サンプルを6μlの50mM炭酸水素アンモニウムに再懸濁し、LCMSMSにより分析した。UltimateLCシステムDionex社UKを用いて、クロマトグラフィー分離を行った。75μmC18PepMapカラムを用いた逆相クロマトグラフィーによりペプチドを分解した。200nlmlの流速で前記ペプチドを溶出するために、005ギ酸の中にアセトニトリルを勾配により供給した。QTOFmicroWatersCorporationに適合させたZスプレー源Zspraysourceを用いたエレクトロスプレーのイオン化により、前記ペプチドをイオン化した。前記機器を自動切換えモードで稼動するように設定し、衝突により誘起する断片化により配列順序を決定するために、前駆体イオンをその強度に基づいて選択した。MSMS分析は、ペプチドの質量電荷比mzと荷電状態に基づいて選択される衝突エネルギープロファイルを用いることにより行った。結果対照グループn50及び患者グループn50すべてについての二次元ゲル画像を統計解析にかけた。計16個のタンパク質スポットが重要な結果を示すp005図6参照。図6に示す結果は、複数のMSMSスペクトルの正確な一致に基づいているように、明らかに一致している。得られたペプチド範囲をもつ選ばれたタンパク質の配列を図8から図10に示す。《ペプチドフィンガープリンティングを用いた分類予測》二次元電気泳動におけるペプチドスポットのパターンにより、臨床的に判断されるような事例性を予測できるかどうかを判断するために、分類予測を行った。データのトレーニングセットに基づくグループに設定された分類を予測するためのアルゴリズムを記憶している管制機器、SupportVectorMachinesSVMを用いた。SVMは、マイクロアレイ解析に最も一般的に用いられる。しかしながら、その統計上の課題はプロテオミクスに類似しており、様々なプロテオミクス研究の分類予測モデルとして、SVMがあらかじめ用いられている。GeneSpringSiliconGenetics社を用いて、オリジナルの25の患者及び25の対照をトレーニングセットとして指定し、その後、その複製の25の患者及び25の対照をテストセットとして指定した。同定されたすべてのタンパク質を可能性のある識別分子として用い、パラメーターPolynomialDotProductOrder1及びDiagonalScalingFactor1を用いて、テストサンプル50中の34が、患者または対照として正確に同定された。二次元電気泳動のデータについてSVM解析のみを用いた感度は56、特異性は80であった。《患者と対照間で差異のあるペプチドの同定》患者と対照の初めのセット、及びその複製セットにおける標準化したスポットの吸光度を比較した。各スポットの患者と対照間の平均差を、Wilcoxen順位和検定MannWhitneyを用いて比較した。平均差のないゼロ仮定に対するp値を保存し、増加する値により分類し順位づけした。棄却された仮説のうち誤って棄却された真の帰無仮説の割合FDRインデックスを、順位番号と理論上の確率との割合スポット総数で割った順位番号として算出した。15スポットが、05以下のFDRを示すことが同定された。その後、これらはLCMSMSを用いて同定される。《臨床的指標とペプチドスポットの相関関係》患者と対照は同程度の年齢であるが、観察されたペプチドまたはスポットの差異が年齢、性別またはAPOE遺伝子型に起因している可能性があった。従って、年齢、性別及びAPOE遺伝子型を有する100の被験者すべてにおいて、患者と対照間で差異のある15スポットに対する相関解析を行った。まず、変数を比較するための基準を定めるために、データをユニット分散に応じて増減したすなわち、各値を特定変数に対するすべての値の標準偏差で割った。その後、Pearsonの相関係数を算出した。どのスポットも、年齢、性別またはAPOE遺伝子型との強い相関関係は見られなかった。2つのスポットが年齢と、2つのスポットが性別と、また1つのスポットがAPOE遺伝子型と弱い相関関係を示した。理想的なバイオマーカーとは、患者と対照間で差異があるだけでなく、疾患の進行のマーカーとなるものであろう。従って、50すべての症例のうち、患者対照間で差異を示す15のスポットは、MMSEMiniMentalStateExamination:認知機能検査及びGDSGlobalDementiaRatingScale:総合的知的機能低下評価尺度により判定されたように、認知症の継続期間及び程度と相関した。2つのスポットが、疾患の進行及び全体的な認知症重篤度の評価スポット177に関してr2029、及び疾患の継続期間スポット166に関してr2029と僅かに且つ有意に相関した。従って、1つのペプチド-免疫グロブリンλ鎖C領域スポット177は全体的な認知症重篤度と相関している。検討された疾患の進行及び継続期間に対するもう一つのマーカーは、アルブミンスポット165と負の相関を示す。《プレ除去分析》この実験において、二次元ゲル電気泳動の工程の前に、6つの最も大量に存在するタンパク質を除くために、ヒト血漿サンプルを除去した。方法Agilent社の除去カラムを用いて、60のヒト血漿サンプル30の対照被験者及び30の疾患被験者を除去した。前記サンプルを二次元電気泳動で分離したpH310、10SDS、75μgのタンパク質をのせた。ゲルを銀染色し、スキャンし8bit、200dpi、Progenesisソフトウェアを用いて定量的に分析した。分離ゲルからゲル断片を取り上げるために、いくつかの対照サンプルを混合し、3つのゲルに処理した2つのゲルには205μgのタンパク質をのせ、1つのゲルには350μgのタンパク質をのせた。分離ゲルを流すために、疾患サンプルについても同じ方法を実施した。その後、タンパク質のスポットを脱色し、トリプシン処理し、及びポリペプチドをSpotハンドリングワークステーションGEAmershamBiosciences社を備えたMALDIターゲットプレート上にのせた。作製されたペプチドプロファイルを、SwissProtデータベースと組み合わせたMsFitプログラムを用いて分析した。結果対照及び疾患サンプルから抽出したタンパク質のゲル画像をProgenesisv2005で分析した。各グループ対照及び疾患は29枚の分析ゲルに基づいた。スポットの検出、一致判定をProgenesisで行い、その後、スポットデータをExcelに移行し、イン-ハウスinhouseで展開したマクロを変動係数CV、t検定及びRegulationfactoorchangeを算出するために用いた。11スポットを、以下の選択基準:少なくとも60以上のゲルに検出され、2倍の増減及びp0005、に基づいた分析に選択した。図11に、参照用ゲルにおけるこの11スポットの位置を示す。この画像は、対照サンプルから抽出したタンパク質の二次元プロファイルと一致する。ゲルに検出される11スポットの標準化した値を分析し、図12に示す。すべてのタンパク質スポットを3から6枚の異なる分離ゲルから取り出し、MS分析にかけた。すべてのタンパク質について、図12に示すように同定することができた。減少したスポットについては、α2マクログロブリン前駆体174178の2スポット、インターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体232の1スポット、図12に灰色で示すようにクラステリン前駆体712と補体タンパクC3前駆体713とが混合した1スポットを認めた。増加したスポットについては、補体タンパクC4前駆体652832の2スポット、アクチン675の1スポット、及びハプトグロビン前駆体702703706の3スポットを認めた。同定されたタンパク質の範囲を推定し、異なる鎖またはアイソフォームを区別するために、各スポットに対し、ペプチドマスの共通のリストを確立した。このリストにより、3から6枚の分離ゲルから取り出した同一スポットに一致するすべてのペプチドマスを再分類する。一致したペプチドに属するアミノ酸を、図13から図19に下線を引いて示す考察分析した前記11スポットは、対照及び疾患サンプル間で増減する7つのタンパク質、つまり、α2マクログロブリン、インターαトリプシンインヒビター重鎖H4、補体タンパクC3、補体タンパクC4、アクチン及びハプトグロビンであると確認した。α2マクログロブリンタンパク質は、固有のトラッピング機構により、プロテアーゼの4つのクラスすべてを阻害することができる。ペプチドマスフィンガープリンティングPMF分析により一致した、ゲルスポットの分子量100kDa、図11、スポット174178は、そのタンパク質の主にN末を網羅している図14。従って、前記同定されたタンパク質は、α2マクログロブリンの全長配列の断片に相当するかもしれない。α2マクログロブリンとして同定されたスポットが同一連鎖スポットに属するように図11、この2つのスポット間の差異は翻訳後修飾に起因する可能性がある。インターαトリプシンインヒビター重鎖H4には、2つのアイソフォームがある。アイソフォーム1は930アミノ酸を有し、アイソフォーム2は914アミノ酸を有する。このタンパク質は、プラズマカリクレインにより切断され、100kDaと35kDaの断片を生じる。生じた100kDaの断片は、さらに70kDaへ変換される。PMF分析により一致したマスは、688アミノ酸までの配列を網羅する。この配列は、アイソフォーム1に相当し、70kDaの断片と短い潜在的活性ペプチドを含むかもしれない。この場合、理論分子量及び理論等電点それぞれ74kDa及びpI604は、ゲルスポットからの分子量及び等電点とよく一致する図11、スポット232参照。補体タンパクC3前駆体は、補体システムの活性化に中心的な役割を果たしている。このタンパク質は、2つの鎖α及びβを含む。補体タンパクC3のα鎖に一致する、714アミノ酸から1360アミノ酸の配列図15を網羅するペプチドマスが同定された。α鎖の理論分子量及び理論等電点それぞれ115kDa及びpI555は、ゲルスポットからの分子量及び等電点と一致しない図11、スポット712、713参照。α鎖は、異なる断片に処理される。補体システムの活性化の間に一時的なペプチドが生じるようだ。補体タンパクC3として同定されたスポットが同一連鎖スポットに属するように図11、その差異は翻訳後修飾に起因する可能性がある。補体タンパクC4は、補体システムの古典的経路の活性化に中心的な役割を果たしている。このタンパク質は、3つの鎖α、β及びγを含む。スポット832に対してα及びβ鎖を、スポット652に対しα鎖のみを網羅するペプチドマスを同定した図17。これらの鎖の理論分子量及び理論等電点は、ゲルスポットからの分子量及び等電点と異なる図11、スポット652、832参照。補体タンパクC3と同様に、クラステリン前駆体は2つの鎖α及びβを含む。α及びβ鎖を網羅するペプチドマスを同定した図16。Clusterinの理論分子量及び理論等電点それぞれ50kDa及びpI589は、ゲルスポットからの分子量及び等電点と一致する図11、スポット712参照。全長タンパク質が同定されたようだ。《表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法SELDITOFMS》アルツハイマー病被験者及び対照被験者間で差異のあるタンパク質ピークを同定するために、SELDITOFMS及びProteinChip技術を組み合わせ、その後、物質のさらなる特徴づけ及び存在する成分の同定を進めるために、チップから物質を抽出した。方法:SELDI分析SELDI分析はAD患者サンプル及び対照サンプルの比較を含み、データはプールされたサンプルだけでなく、個体群のサンプルの両方に対して得られている。それぞれの場合において、対照及びAD患者からの血清のスペクトルプロファイルを比較した。A.個体群の分析個体からの対照及びADの血清をQ10SAX2chipsにかけた。:n4対照n4AD血清サンプルは、血清20μlをSELDI用溶解バッファー30μlで希釈することにより新鮮に調製された。サンプル5μlを必要に応じて各スポットにのせた。前記チップを以下のプロトコールを用いて処理した。チップの準備PAPペンを用いて各スポットの周りに疎水性の円を描く。このPAPは、チップをSELDI機器に25分間放置すると完全に乾く。サンプルの準備血清を4060の比血清40μl溶解バッファー60μlでSELDI用溶解バッファーに希釈する。典型的に、この希釈によりサンプルは20mgmlから30mgmlの濃度になるであろう。従って、溶解バッファーの5μlを用いると、100μgから150μg間のタンパク質を各スポットへのせることが可能であろう。サンプルを混合し、使用直前まで氷上でインキュベートし、使用直前に短時間遠心する30秒、14000回転。チップの平衡化チップをFalconチューブに入れ、100mMTrisバッファー室温pH9を1015ml加え、回転式ミキサーで5分間混合する。この操作を2回繰り返す。サンプルのアプライ最後の平衡化工程の後、チップを取り出し、柔らかいティッシュで慎重に乾かす。サンプル5μlを各スポットに滴下し、チップを密封式湿度室に入れ、30分間振とう機に置く。チップの洗浄インキュベーション後、各スポットから慎重にサンプルを除去し、チップをFalconチューブに入れる。100mMTrisバッファーpH9を1015ml加え、Falconチューブを回転式ミキサーで5分間混合する。この操作を4回以上繰返し、チップを滅菌蒸留水DDWで2回洗浄する。チップの乾燥最後の洗浄工程の後、チップを取り出し、柔らかいティッシュで慎重に乾かし、25分間室温で風乾する。SPAのアプライ飽和したSPAマトリックス新しく調製したもの2×06μlを各スポットにピペットで滴下する。最初のアプライは、二度目の06μlをアプライする前に乾くことになる。SPAを乾燥させるために、SELDI機器に10分間放置する。その後、前記チップをSELDI機器で読む。データの分析に、以下の基準:クラスター分析の基準:5sn;100スペクトル;03マス;2sn;addestピーク標準化:総イオン数3000から30000Da間のみを適用した。結果同一サンプルのスポット間の再現性は非常に高かった。高い相関関係を達成した。対照と認知症グループにおける患者間のばらつきが見られた。これは、特異体質性の差異だけでなく、タンパク質量の差異に起因するかもしれない。非常に厳密なクラスター分析を用いると、3つのピークが統計的に有意p005であることが分かり、その信頼性を確かめるためにこれらを視覚的に確認した。関心のあるこの3つのピーク図1-3参照は以下のとおりである。分子量6430Da、162倍ADにおいて存在量多、p0027分子量14640Da、229倍ADにおいて存在量多、p0036分子量27147Da、282倍ADにおいて存在量多、p0004574B.プールされたサンプルの分析プールされたサンプルの分析を、上の記載と全く同じ方法及び基準を用いて分析した。しかしながら、ここでは、3つのプールされた対照に対し、3つのプールされたADサンプルを分析した。この各プールは、少なくとも25の個体からの血清を含む。この方法では、ADに罹患した75以上の個体からのサンプルを網羅し、それらを75の個体数を示す対照集団に対して比較した。プールされたグループを、それぞれ25、25、25の独自の個体からなるADプール1、2及び3のように記載する。結果非常に厳密なクラスター分析を用いると、1つのピークが統計的に有意p005であることが分かり、その信頼性を確かめるためにこれを視覚的に確認した。関心のあるこのピーク図4参照は以下のとおりである。分子量14646Da、172倍ADにおいて存在量多、p0037SELDIピークの同定方法SELDI分析により同定された差異的に発現するタンパク質を、さらにSDSPAGEにより分析した。差異的に発現するタンパク質の分子量に相当するバンドを、マススペクトロメトリー分析のために切り出した。ChipQ10の854及び855個体サンプルから、Laemmliバッファー中で10分間ボイルすることにより物質を抽出し、対照及び疾患スポットを別々のエッペンドルフチューブにまとめた。抽出した物質をSDSPAGE18、Trisglycine、Novex社を用いて分離し、コロイド状クマシーブルーCCBで染色したが、バンドは可視化されなかった。その後、同じゲルを改変版MSに適合する銀染色で再染色した図5。11から20kDaの間に、6本のバンドが可視化され、これらを前述のLCMSMSによる分析のために、第1対照レーンから切り出した。同定されたタンパク質を図7に示す。《同定されたタンパク質のさらなる分析》アポリポプロテインAIVQ10SAX2SELDIチップで単離された146kDaのバンドについて、アポリポプロテインAIVP06727に対して得られたシークエンス範囲を図9に示す。SELDIプロファイリング実験中に観察された関心のあるバイオマーカーの分子量は、14640±6Daと決定した。完全長タンパク質がより高い分子量45kDaに観察されるという事実、及びLCMSMS分析で観察されるペプチドが前記タンパク質のC末領域だけを示しているという事実に基づいて、この146kDaの分子はApoAIVの断片であると考えられる。観察される分子量は、SwissProtデータベース内のエントリーP06727のアポリポプロテインAIVに定義されるシークエンス270396残基に対して推定される平均分子量14636Daとよく一致する。従って、270396残基を含む全長アポリポプロテインAIV及びアポリポプロテインAIVのC末断片の両方とも、アルツハイマー病の血清バイオマーカーとなるかもしれない。補体タンパクC4前駆体二次元電気泳動のスポット164について、補体タンパクC4前駆体P01028に対して得られたシークエンス範囲を図10に示す。下線太字で示したいくつかのペプチドに基づいてスポット164を同定し、スポット164中のタンパク質を14661744に及ぶC末断片と確定した。《定量的タンパク質配列タグqPST分析》10の疾患サンプル及び10の対照サンプルを、6つの最も大量に存在するタンパク質に対して、それぞれ免疫除去した。疾患サンプルまたは対照サンプルのどちらかからなる2つのプールを作製し、qPST手順へ適用したCNBrによるプレ切断、ジメチルグリシンによる標識、トリプシン処理、及び強陽イオン交換による分画化。得られたSCX画分を、標準的な手法に従ったQTOFII機器を用いるLCMS及びLCMSMSにより分析した異なる3つのデータ収集法によるLCMS及びLCMSMS。結果タンパク質の同定前述のように、3つの異なるMSMS収集方法:1.できる限り多くのペプチドIDを得るための分析に依存したデータ収集2.増減する対、すなわち、疾患サンプル及び対照サンプル間でシグナル強度が異なるペプチドを含む包含リストによるデータ収集増減基準:≧2/≦053.対をなさないMSシグナルを含む包含リストによるデータ収集を実施した。これら3つの手法から得られた結果を考慮し、重複部分を補正し、88のタンパク質IDが得られた。包含リスト増減≧20/≦05を示す対MSMS法による増減するタンパク質に対する直接的検索及び交差試験8つのペプチドを、増減に対し交差試験できると認定した。これら8つのペプチドは5つのタンパク質を表すタンパク質IDを得るために、ProteinProphetアルゴリズムを用いてペプチドを分類した。これら5つのタンパク質のIDを図8に示す。タンパク質1を示す2つのペプチドは、免疫グロブリンα1鎖C領域にも見られることから、タンパク質ID1と2は、実際は一つのID免疫グロブリンα1鎖C領域を表す。仮定タンパク質DKFZP686C02220は、固有のタンパク質である実際上、一つのペプチドが固有であり、もう一つのペプチドはいくつかのタンパク質において見られる。このタンパク質は、免疫グロブリンの典型的な特性を備えInterProエントリーに関して、もう一つのペプチドは免疫グロブリンα2鎖C領域にも見られる。タンパク質4及び5は、両ペプチドともにハプトグロビン前駆体に見られるので、一つのタンパク質IDハプトグロビン前駆体を表すが、使用したアルゴリズムによると相当するペプチドは別々のタンパク質として分類された。《ウエスタンブロッティングを用いたアポAIVの確認》前記146kDaの分子がアポAIVの断片であることを確認するために、ウエスタンブロッティングを行った。血漿サンプルをDDWで110に希釈し、Bradford色素結合法を用いて分析した希釈したサンプルは適量に分注して扱うことができる。16アクリルアミドゲル、15mm厚、10ウェルNOVEX社に、1レーンあたり20μgのサンプルを用いてサンプルが変性させた一次抗体または二次抗体の場合は、1レーンあたり2μg、1時間80V;1時間30分125VでSDSPAGEを行った。これに続き、ニトロセルロース膜に1時間30分50Vでウエスタンブロッティングを行った。ブロットを以下の抗体:抗ApoAIV抗体N末特異的、SantaCruzBiotechnology社抗ApoAIV抗体C末特異的、SantaCruzBiotechnology社を用いてプローブした。両抗体ともに、ヒト由来のアポAIVのアミノ末端N末またはカルボキシル末端C末付近に位置するペプチドに対して作製された、アフィニティー精製されたヤギ由来のポリクローナル抗体である。N末及びC末に対してプローブすることにより、アポAIVタンパク質及び/またはアポAIV断片を検出する可能性が増すであろうため、これらの抗体を選択した。いくつかのバンドについて、アポAIV特異的、且つADに特異的な可能性があることが分かった。これらのバンドは、対照サンプルまたはADサンプルに対する二次抗体のみの対照ブロットでは検出されない。1016kDa領域に見られるバンド3-6は、ADのバンド3-6に特異的であるが、変性させた抗アポAIV抗体のレーンに見られるバンドと同じ位置にあるようにも見える。バンド3-6は、抗アポAIVN末特異的抗体を用いたブロットでより強く検出されていることも分かる。他に2つの重要なバンドが検出された。バンド1はおよそ45kDaの位置に検出され、全長の成熟型アポAIVタンパク質に相当していると考えられる。バンド2はおよそ28kDaの位置に検出され、アポAIVのN末断片であると考えられる。《補因子Hの確認》方法:サンプルの希釈血漿サンプルをリン酸緩衝食塩水PBSで18に希釈した。等量の2×Laemmliサンプルバッファーを加え、使用まで10分間ボイルした。ウエスタンブロッティングSDS電気泳動は、FisherScientific社の36ウェル、15mm厚のゲルを用いて行ったすべての溶液はNationalDiagnostics社から購入した。サンプルは4濃縮ゲルを有する10分離ゲルで分離したすべての溶液はNationalDiagnostics社から購入した。サンプル20μlは、初めに30分間110Vで、その後、60分間150Vで色素の先端が泳動用バッファーにちょうど入り始めるまで分離した。セミドライ式転写機BioRad社を用いて、45分間15VでゲルをPVDF膜AmershamBiosciences社へ転写した。その後、膜をPBSTweenで調製された5ミルクでブロッキングし、4°C/オーバーナイトで補因子Hの一次抗体Abcam社、UKを用いてプローブした。バンドを化学発光ウエスタン検出キットECLAmershamBiosciences社で検出し、膜をStorm蛍光スキャナーAmershamBiosciences社でスキャンした。免疫反応を示したバンドが139kDaCFH:補因子Hに検出され、その光学密度をImageQuantソフトウェアAmershamBiosciences社を用いて定量した。統計解析ツールSPSSパッケージを用い、分布を利用しないnonparametricMannWhitney検定で解析した。結果NINCDSADRDAprobableADの128人、及び健常年配者対照の78人からの血漿サンプルから、ウエスタンブロッティングの結果を得た。ADに罹患した患者では、CFHに32の増加があったMannWhitney;表2。表2男性に対し、女性全体で相対的に高いCFH値を示すという性別差が見られたp005。しかしながら、性別を分けて考慮したとしても、AD患者は対照と比較して高いCFHを示したp001;表3。表3受信者動作曲線ROC分析により、CFHは偶然ではない良い診断テストであることが示された。ここで言及される参考文献は、すべて明白に参考文献に含まれる。参考文献