ジェミニウイルス科のマステレウイルス属に属するウイルスに対する複製阻害剤であって、該ウイルスのステムループ領域の全長DNA又は該全長DNAから選ばれる1又は2以上の部分DNAに特異的に結合することができるジンクフィンガータンパク質を含み、かつステムループ構造の形成を阻害することができる複製阻害剤。マステレウイルス属に属するウイルスのステムループ領域の全長DNAから選ばれる1個の部分DNAに結合可能な単一のジンクフィンガータンパク質を含む請求項1に記載の複製阻害剤。マステレウイルス属に属するウイルスのステムループ領域の全長DNAから選ばれる1個の部分DNAと、該DNAに結合しフランキング領域から選ばれる1個のDNAとからなる連続したDNAに結合可能な単一のジンクフィンガータンパク質を含む請求項1に記載の複製阻害剤。上記ジンクフィンガータンパク質が9個ないし12個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質である請求項1ないし3のいずれか1項に記載の複製阻害剤。マステレウイルス属に属するウイルスがコムギ萎縮病ウイルスである請求項1ないし4のいずれか1項に記載の複製阻害剤。請求項1ないし5のいずれか1項に記載のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸。請求項6に記載の核酸を含む植物形質転換用の組換えベクター。請求項1ないし5のいずれか1項に記載のジンクフィンガータンパク質又は該ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を有効成分として含む農薬。ジェミニウイルス科のマステレウイルス属に属するウイルスによる植物の感染を予防する方法であって、請求項1ないし5のいずれか1項に記載のジンクフィンガータンパク質又は該ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸の予防有効量を植物に施用する工程を含む方法。ジェミニウイルス科のマステレウイルス属に属するウイルスに対して耐性を有する植物であって、請求項1ないし5のいずれか1項に記載のジンクフィンガータンパク質を発現可能な遺伝子組み換え植物。請求項1ないし5のいずれか1項に記載のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を導入することにより形質転換された植物。ジェミニウイルス科のマステレウイルス属に属するウイルスに対する耐性を植物に獲得させる方法であって、請求項1ないし5のいずれか1項に記載のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を該植物に導入して形質転換する工程を含む方法。請求項1ないし5のいずれか1項に記載のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を含む植物形質転換用ベクター。本発明の課題は、ジェミニウイルスに対する有効な感染防除手段を提供することにある。より具体的には、ジェミニウイルスに包含されるマステレウイルス属に属する植物ウイルスの複製を阻害する薬剤及びマステレウイルス属に属する植物ウイルスに対して耐性を有する植物などを提供することが本発明の課題である。本発明者はこのステムループ部分に着目し、ジェミニウイルスに属する多様なウイルスの複製を共通して阻害することができる手段を提供すべく鋭意研究を行った。その結果、ステムループ部分のDNAにAZPを特異的に結合させることによりウイルスDNAの二重鎖構造を安定化し、ステムループへの構造変化を阻害することによって、一本鎖DNAしか切断できないRepによるウイルスDNAの切断を阻害することができることを見出した。また、本発明者はこのウイルス複製阻害作用が実際に植物体において機能することを確認した。この手法は、例えば、ジェミニウイルスのベゴモウイルス属において特に高度に保存されているステムループ部を利用することによりベゴモウイルス属に属するウイルスに対して汎用のウイルス複製阻害剤を提供するために極めて有用である。さらに本発明者らは研究を進めた結果、ジェミニウイルスのマステレウイルス属に属するウイルスにおいて保存されているステムループ部及びその周辺領域を利用して同様の手法を適用することにより、コムギ萎縮病ウイルスなどを含むマステレウイルス属に属するウイルスに対して汎用のウイルス複製阻害剤を提供することができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明により、ジェミニウイルス科のマステレウイルス属に属するウイルスに対する複製阻害剤であって、該ウイルスのステムループ領域の全長DNA又は該全長DNAから選ばれる1又は2以上の部分DNAに特異的に結合することができるジンクフィンガータンパク質を含み、かつステムループ構造の形成を阻害することができる複製阻害剤が提供される。上記発明の好ましい態様によれば、マステレウイルス属に属するウイルスのステムループ領域の全長DNAから選ばれる1個の部分DNAに結合可能な単一のジンクフィンガータンパク質を含む上記の複製阻害剤;マステレウイルス属に属するウイルスのステムループ領域の全長DNAから選ばれる1個の部分DNAと、該DNAに結合する周辺領域から選ばれる1個のDNAとからなる連続したDNAに結合可能な単一のジンクフィンガータンパク質を含む上記の複製阻害剤;及びステムループ領域及び該ステムループ領域に結合する周辺領域からなるDNAから選ばれる2個以上の部分DNAにそれぞれ結合可能なジンクフィンガータンパク質をリンカーで2個以上結合したジンクフィンガータンパク質を含む上記の複製阻害剤が提供される。さらに好ましい態様によれば、上記ジンクフィンガータンパク質が8個ないし13個、好ましくは9個ないし12個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質である上記の複製阻害剤が提供される。また、本発明により、上記のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸、及びジェミニウイルスに対する複製阻害剤であって、上記のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を含む複製阻害剤も提供される。上記発明の好ましい態様によれば、マステレウイルス属に属するウイルスがコムギ萎縮病ウイルスである上記の複製阻害剤が提供される。別の観点からは、本発明により、上記のジンクフィンガータンパク質又は上記のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を含むマステレウイルス属に属するウイルスに対する抗ウイルス剤;上記のジンクフィンガータンパク質又は上記のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を含むマステレウイルス属に属するウイルスに対する感染予防剤;マステレウイルス属に属するウイルスによる感染に対する防除用の農薬であって、上記のジンクフィンガータンパク質又は上記のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を含む農薬が提供される。さらに別の観点からは、本発明により、植物のマステレウイルス属に属するウイルス感染を予防する方法であって、上記のジンクフィンガータンパク質又は上記のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸の予防有効量を植物に施用する工程を含む方法;マステレウイルス属に属するウイルス感染に対する防除方法であって、上記のジンクフィンガータンパク質又は上記のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸の防除有効量を植物に施用する工程を含む方法が提供される。また、本発明により、マステレウイルス属に属するウイルスに対して耐性を有する植物であって、上記のジンクフィンガータンパク質を発現可能な遺伝子組み換え植物;マステレウイルス属に属するウイルスに対して耐性を有する植物であって、上記のジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換植物;植物にマステレウイルス属に属するウイルスに対する耐性を獲得させる方法であって、上記のジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子で植物を形質転換する工程を含む方法が提供される。さらに本発明により、上記のジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を含む組換えベクター、及び植物をマステレウイルス属に属するウイルスに対して耐性を有する植物に形質転換するために用いる上記の組換えベクターが提供される。ベクターとしては植物用のウイルスベクターなどを用いることができる。本発明の複製阻害剤は、ジェミニウイルス科のマステレウイルス属に属するウイルスにおいて保存されているステムループ領域をターゲットとしていることから、マステレウイルス属に属する多様なウイルスによる感染に対して共通の複製阻害剤として作用することができる。従って、本発明の複製阻害剤は、マステレウイルス属に属するウイルスに属する代表的なウイルスであるWDV感染のみならず、マステレウイルス属に属する他のウイルスに対しても高い有効性を発揮することができるので、マステレウイルス属に属する多様なウイルスに対する防除手段として極めて有用である。本発明の複製阻害剤は、ジェミニウイルス科のマステレウイルス属に属するウイルスに対する複製阻害剤であって、上記ウイルスのステムループ領域の全長DNA又は該全長DNAから選ばれる1又は2以上の部分DNAに特異的に結合することができるジンクフィンガータンパク質を含み、かつステムループ構造の形成を阻害することができることを特徴としている。本明細書において用いられるジェミニウイルスの用語は、植物に感染するDNAウイルスであって、一本鎖の環状DNAを1つ又は2つ有するウイルスを意味するが、この用語の意味は、例えば、化学と生物41pp3113172003などに具体的に説明されている。ジェミニウイルスはゲノム構造、宿主範囲、及び媒介昆虫の種類に応じて以下の4つの属、すなわちマストレウイルス属、クルトウイルス属、トポクウイルス属、及びベゴモウイルス属に分類されるが、本発明の複製阻害剤はこれらのうち特にマストレウイルス属に属する任意のウイルスを標的とすることができる。それぞれの属に属するウイルスのゲノム構成については、上記の刊行物の図2に具体的に示されている。また、ジェミニウイルスに属するウイルス及びその略号については、例えば、国際公開WO2004101798に詳細な表が開示されている。国際公開WO2004101798の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。ジェミニウイルスには、既知のジェミニウイルスのほか、未知のジェミニウイルスや既知のジェミニウイルスが変異した新種ジェミニウイルスなども包含されることは言うまでもない。ジェミニウイルスに包含されるウイルスとしては、例えば、MSV、WDV、BeYDVなどのマストレウイルス属に属するウイルス、BCTVなどのクルトウイルス属に属するウイルス、TPCTVなどのトポクウイルスに属するウイルス、並びにBGMV、ACMV、SLCV、TGMV、及びTYLCVなどのベゴモウイルス属に属するウイルスを挙げることができるが、これらに限定されることはない。本発明の複製阻害剤はMSV、WDV、BeYDVなどのマストレウイルス属に属するウイルスを対象とする複製阻害剤として提供されるが、これらのうちWDVが特に好ましい対象である。ベゴモウイルス属に属するウイルスでは複製阻害剤の結合部位となるステムループ領域が高度に保存されていることが知られている。ベゴモウイルス属に属するウイルスとしては、例えば、TYLCCNV、TYLCGV、TYLCMalV、TYLCSV、TYLCTHV、TYLCV、ACMV、BGMV、CaLCuV、ToCMoV、TGMV、ToGMoV、ToMHV、ToMoTV、ToMoV、ToRMV、ToSLCV、ToSRV、ワタ葉巻、東アフリカキャッサバモザイク、ジャガイモ黄化モザイク、カボチャ葉巻、サツマイモ葉巻、タバコ葉巻、トマト葉巻などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。以下、本発明の複製阻害剤の設計手法及び作用機序などの説明のために参考として特にベゴモウイルス属に属するTYLCVについて言及する場合がある。図3にジェミニウイルスとTYLCV及びWDVとの包含関係を示す。本発明の複製阻害剤は、マストレウイルス属に属するウイルスのステムループ領域の全長DNA又は該全長DNAから選ばれる1又は2以上の部分DNAに特異的に結合することができるジンクフィンガータンパク質を含み、かつステムループ構造の形成を阻害する作用を有している。ジェミニウイルスのステムループ領域の用語について、例えばベゴモウイルス属に属するTYLCVを例にとって説明すると、ステムループ領域は互いに相補的に結合する2つのステム領域と、その間に存在してループを形成するループ領域とからなる33塩基の領域である。TYLCVには多様な株の存在が知られているが、全てのTYLCVにおいてステムループ領域の塩基配列は高度に保存されている。図4にTYLCVのステムループ領域を示す。このステムループ領域はベゴモウイルスに属する他のウイルスにおいても高度に保存されており、例えば、BGMVの両方のDNAのCR上には34塩基からなるステムループ領域が存在しているが、その塩基配列はベゴモウイルスに属する他のウイルスのステムループ領域の塩基配列と極めて相同性が高い。本明細書において、ステムループ領域の塩基配列が高度に保存されているとは、比較すべき塩基配列のホモロジーが80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、さらに好ましくは97以上、特に好ましくは99以上であることを意味する。マストレウイルス属に属するウイルスについても同様であり、一般的にはベゴモウイルス属に属するウイルスに比べてステムループ領域のホモロジーが低い場合もあるが、マストレウイルス属に属するウイルスにおけるステムループ領域の塩基配列も保存されており、ホモロジーは通常は60以上、好ましくは70以上、より好ましくは80以上、さらに好ましくは90以上、特に好ましくは95以上である。さらに、ジェミニウイルスの他の属に属するウイルスについても、ステムループ領域については高度に保存されている。図5にジェミニウイルスに包含される数種のウイルスについてのステムループ領域の相同性を示す。本発明の複製阻害剤は、上記のとおりマストレウイルス属に属するウイルスにおいて保存されているステムループ領域の全長DNA又は該全長DNAから選ばれる1又は2以上の部分DNAに特異的に結合し、この特異的な結合の結果として、ステムループ構造の形成を阻害することができるように設計することができる。本発明の複製阻害剤は、ステムループ領域の全長DNA又は該全長DNAから選ばれる1又は2以上の部分DNAに特異的に結合する性質に加えて、ステムループ領域DNAの上流及び/又は下流に結合するフランキング領域のDNAに特異的に結合するように設計することもでき、このような態様は本発明において好ましい態様である。特に好ましい態様の一つは、マステレウイルス属に属するウイルスのステムループ領域の全長DNAから選ばれる1個の部分DNAと、該DNAに結合しフランキング領域から選ばれる1個のDNAとからなる連続したDNAに結合可能な単一のジンクフィンガータンパク質を含む複製阻害剤である。この特に好ましい態様の複製阻害剤の具体例として、本明細書の実施例1にはAZP11及び12が開示されている。また、特に好ましい他の態様では、ステムループ領域の該全長DNAから選ばれる1個の部分DNAに特異的に結合するジンクフィンガータンパク質を含む複製阻害剤である。この特に好ましい態様の複製阻害剤の具体例として、本明細書の実施例1にはAZP13が開示されている。さらに、ステムループ領域及び該ステムループ領域に結合する周辺領域からなるDNAから選ばれる2個以上の部分DNAにそれぞれ結合可能なジンクフィンガータンパク質をリンカーで2個以上結合したジンクフィンガータンパク質を含む上記の複製阻害剤も好ましい。特異的な結合によりステムループ構造の形成を阻害するためには、ステムループ領域から選ばれるDNAに対して、又はステムループ領域から選ばれるDNAとともに該ステムループ領域の周辺領域であるフランキング領域から選ばれるDNAに対して本発明の阻害剤が結合してウイルスDNAの二重鎖構造を安定化することができればよいが、ステムループ領域及び必要に応じてその周辺領域の塩基配列に基づいて適宜のジンクフィンガードメインを選択することにより、マステレウイルス属に属するウイルスのステムループ構造の形成を阻害するジンクフィンガータンパク質を設計することが可能である。ジンクフィンガータンパク質に含まれるジンクフィンガードメインは、認識コード表を用いて特定の塩基配列を認識することができるように設計することができる。本明細書においてジンクフィンガードメインとはジンクフィンガードメインとはジンクフィンガータンパク質に存在するDNA結合部位を構成するドメインのことを意味しており、単にフィンガーと呼ばれる場合もある。代表的にはジンクフィンガータンパク質は2個、3個、4個、6個、又は10個程度のジンクフィンガードメインを有している。認識コード表及び特定の塩基配列を認識して特異的に結合するジンクフィンガータンパク質の設計手法については、例えば特表2004519211号公報に記載されている。上記特許公報の開示の全てを参照により本明細書の開示に含める。また、Biochemistry41pp707470812002などを参照することもできる。上記のとおり、マストレウイルス属に属するウイルスのゲノムDNAのステムループ領域の塩基配列情報は容易に入手可能であり、当業者は少なくともステムループ領域の全長DNA又は全長DNAから選択される1又は2以上の部分DNAに対して特異的に結合可能なジンクフィンガータンパク質を容易に設計して製造することができる。参考のために、例えばTYLCVのみを標的とした複製阻害剤を設計する手法を実施例の参考例1に示した。TYLCV間でよく保存されているステムループ領域DNAの全長又はほぼ全長を含むDNAに対して結合可能なジンクフィンガータンパク質を設計すればよく、このようなジンクフィンガータンパク質から選ばれる1種類のジンクフィンガータンパク質を本発明の複製阻害剤として用いることにより、全てのTYLCVの複製を阻害することが可能になる。このようなジンクフィンガータンパク質としては、例えば、ジンクフィンガードメインを10個含むジンクフィンガータンパク質を設計することができる。上記の手法をTYLCV以外のジェミニウイルスファミリーを標的とした複製阻害剤の設計に適宜適用できることは当業者に容易に理解されることである。また、参考のために、TYLCVのほかベゴモウイルス属に属するウイルスを含む多様なジェミニウイルスを標的とした複製阻害剤を設計する手法も実施例の参考例2に示した。例えば、ステム領域の全長DNAから標的ジェミニウイルスにおいて共通の配列であ2個以上の部分DNAを選択し、それらの部分DNAに対して結合する単一のジンクフィンガータンパク質を設計するか、又はそれらの部分DNAに対してそれぞれ結合する2個以上のジンクフィンガータンパク質を設計して、これらの2個以上のジンクフィンガータンパク質を適宜のリンカー、例えばペプチドリンカーなどでそれぞれ結合すればよい。リンカーとしては、アミノ酸残基数が1~40個、好ましくは1~20個、さらに好ましくは1~10個程度のペプチドリンカーのほか、例えばアルキレン鎖やポリエチレングリコール鎖などの合成リンカーや糖鎖などを用いてもよい。ステム領域の全長DNAから2以上の部分DNAを選択するにあたっては、標的となるベゴモウイルス属に属するウイルスを含む多様なジェミニウイルスのステム領域において非共通配列となる部分DNAを含まないように選択することが好ましく、一般的には、この非共通配列の上流及び下流に位置する共通配列のDNAを部分DNAとして選択することが望ましい。参考として、TYLCVのみを標的とする複製阻害剤の例、及びベゴモウイルス属に属するウイルスを含む多様なジェミニウイルスを標的とする複製阻害剤の例をそれぞれ図6に示す。図中、上側がTYLCVのみを標的とする場合の例であり、下側がベゴモウイルス属に属するウイルスを含む多様な多様なジェミニウイルスを標的とする場合の例である。例えば、TYLCVのみを標的とする複製阻害剤として配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列を有する複製阻害剤、及びベゴモウイルス属に属するウイルスを含む多様なジェミニウイルスを標的とする複製阻害剤として配列番号2に示すアミノ酸配列を有する複製阻害剤を挙げることができる。また、配列番号1又は2により特定されるアミノ酸配列において1から数個、好ましくは1~5個程度のアミノ酸の欠失、置換、及び/又は付加を有するアミノ酸配列からなる複製阻害剤であって、配列番号1又は2により特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同様の複製阻害作用を有するタンパク質も複製阻害剤として用いることができる。さらに、配列番号1又は2により特定されるアミノ酸配列に対して70、好ましくは80、さらに好ましくは90以上の相同性を有し、配列番号1又は2により特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同様の複製阻害作用を有するタンパク質も複製阻害剤として用いることができる。TYLCVのみを標的とする複製阻害剤の例、及びベゴモウイルス属に属するウイルスを含む多様なジェミニウイルスを標的とする複製阻害剤を調製するために用いる核酸としては、上記のタンパク質をコードするDNAのほか、上記又はのタンパク質をコードするDNAを含む核酸を用いることができる。上記又はで表されるタンパク質をコードするDNAとしては、例えば、配列番号3又は4に示す塩基配列で特定されるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAなどが含まれる。このようなDNAとしては、例えば、DNAをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法において、コロニー又はプラーク由来のDNA又はDNA断片を固定化したフィルターを用いて07~10M程度のNaCl存在下で65°Cでハイブリダイゼーションを行った後、01~2×SSC溶液を用いて65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNAなどを挙げることができる。例えば、プローブとして用いるDNAの塩基配列に対して70以上、好ましくは80以上、さらに好ましくは90以上、特に好ましくは95以上、最も好ましくは98以上の相同性を有するDNAを好ましく用いることができる。本発明により提供されるマストレウイルス属に属するウイルスに対する複製阻害剤の設計は以下のように行うことができる。マストレウイルス属に属するウイルスの代表例としてWDVを挙げることができるが、WDVについては図29に示す変異体が知られているがステムループ領域は高度に保存されており、さらにそれぞれステム領域の下流及び上流に結合する周辺領域も高度に保存されている。本発明の複製阻害剤の設計において考慮すべき周辺領域の塩基数は、例えばステム領域の末端から200以下、好ましくは100以下、さらに好ましくは50以下、特に好ましくは30以下程度である。さらにこれらの領域はマストレウイルス属に属する他のウイルスにおいても保存されており、この領域のホモロジーは通常は60以上、好ましくは70以上、より好ましくは80以上、さらに好ましくは90以上、特に好ましくは95以上である。従って、WDVの複製を阻害するためには、WDVのステムループ領域に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質を用いるか、あるいはWDVのステムループ領域の一部に結合するとともにWDVのステム領域の上流及び/又は下流に結合しているDNAに対して特異的に結合するジンクフィンガータンパク質を用いることができる。一例として、図30にWDVを含むマストレウイルス属に属するウイルスに対する本発明の複製阻害剤の標的サイトを示す。WDVの複製を阻害するためにセンス鎖に対して特異的に結合するジンクフィンガータンパク質のほか、アンチセンス鎖に対して特異的に結合するジンクフィンガータンパク質を用いてもよい。本明細書の実施例1にはセンス鎖を認識するジンクフィンガータンパク質としてAZP11及びAZP13が具体的に開示されており、アンチセンス鎖側の配列に基づいて設計されたジンクフィンガータンパク質としてAZP12が具体的に開示されている。また、AZP11、AZP12、及びAZP13の設計方法をそれぞれ図31、図32、図及び33に示し、AZP11、AZP12、及びAZP13のアミノ酸配列を配列表の配列番号5、6、及び7にそれぞれ示した。本発明の複製阻害剤として、配列番号5、6、又は7により特定されるアミノ酸配列において1から数個、好ましくは1~5個程度のアミノ酸の欠失、置換、及び/又は付加を有するアミノ酸配列からなる複製阻害剤であって、マストレウイルス属に属するウイルスに対して配列番号5、6、又は7により特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同様の複製阻害作用を有するタンパク質を用いることもできる。さらに、配列番号5、6、又は7により特定されるアミノ酸配列に対して70、好ましくは80、さらに好ましくは90以上の相同性を有し、配列番号5、6、又は7により特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同様の複製阻害作用を有するタンパク質も本発明の複製阻害剤として用いることができる。マストレウイルス属に属するウイルスに対する複製阻害剤を調製するために用いる核酸としては、例えば、上記AZP11、AZP12、及びAZP13をコードするDNAのほか、上記又はのタンパク質をコードするDNAを含む核酸を用いることができる。上記又はで表されるタンパク質をコードするDNAとしては、例えば、配列番号8、9、及び10に示す塩基配列で特定されるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAなどが含まれる。このようなDNAとしては、例えば、DNAをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法において、コロニー又はプラーク由来のDNA又はDNA断片を固定化したフィルターを用いて07~10M程度のNaCl存在下で65°Cでハイブリダイゼーションを行った後、01~2×SSC溶液を用いて65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNAなどを挙げることができる。例えば、プローブとして用いるDNAの塩基配列に対して70以上、好ましくは80以上、さらに好ましくは90以上、特に好ましくは95以上、最も好ましくは98以上の相同性を有するDNAを好ましく用いることができる。本発明の複製阻害剤は上記のジンクフィンガータンパク質又は該ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸の形態で提供されるが、本発明の複製阻害剤をそのまま農薬として植物に施用することにより、マストレウイルス属に属するウイルスに対する感染防除を行うことができる。本発明の複製阻害剤の施用方法は特に限定されないが、例えば、当業界で周知の製剤用添加物を用いて、農薬用組成物として調製することができる。有効成分としてタンパク質又は核酸を含む農薬用組成物が当業界で知られており、適宜の手段を用いて農薬用組成物を調製することができる。例えば、上記の核酸を組み込んだプラスミドなどのベクターを用いて植物細胞内に上記核酸を導入して一過性に植物を形質転換する方法や、ベクターを用いて植物ゲノムに上記核酸を組み込む方法などが挙げられるが、この方法に限定されるわけではない。本発明の方法において利用可能なベクターには、植物に感染するウイルスベクターも含まれる。農薬用組成物の形態は特に限定されず、当業界で利用可能な形態であればいかなる形態を採用してもよい。例えば、乳剤、液剤、油剤、水溶剤、水和剤、フロアブル、粉剤、微粒剤、粒剤、エアゾール、くん蒸剤、又はペースト剤などの形態の組成物を用いることができる。農薬用組成物の製造方法も特に限定されず、当業者に利用可能な方法を適宜採用することができる。また、他の抗ウイルス剤、殺虫剤、殺菌剤、殺虫殺菌剤、除草剤などの他の農薬の有効成分を農薬用組成物に配合することもできる。本発明により、上記の複製阻害剤を発現可能な形質転換植物が提供される。本発明において形質転換の対象となる植物は特に限定されず、植物体全体のほか、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞のいずれであってもよい。植物の種類は特に限定されず、任意の植物を対象とすることができるが、マストレウイルス属に属するウイルスの感染が成立する植物種を対象とすることが好ましい。より具体的には、植物種として、例えばアオイ科、アカザ科、アブラナ科、アヤメ科、イソマツ科、イネ科、イワタバコ科、ウコギ科、ウリ科、カキノキ科、キク科、クルミ科、クワ科、ケシ科、ゴマノハグサ科、サクラソウ科、サトイモ科、サボテン科、シソ科、シュウカイドウ科、ショウガ科、スイレン科、スミレ科、セリ科、センリョウ科、ツツジ科、ツバキ科、トウダイグサ科、ナス科、ナデシコ科、バラ科、ヒルガオ科、フウロソウ科、ブドウ科、ブナ科、ボタン科、マタタビ科、マメ科、ミカン科、ヤマノイモ科、ユキノシタ科、ユリ科、ラン科、リュウゼツラン科、リンドウ科、イネ科に属する植物を挙げることができるが、これらに限定されることはない。好ましくは、例えば、トマト、コショウ、タバコ、カボチャ、マニオック、サツマイモ、ワタ、メロン、ジャガイモ、ダイズ、ワイン、トウモロコシ、コムギ、イネ、サトウキビ、マメ、ビート、スイカ、オクラ、キャッサバなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。さらに好ましい植物はコムギ又はイネなどであり、特に好ましい植物はコムギである。形質転換すべき植物源としては、プロトプラスト、種子、芽生え、苗、カルス、培養細胞、植物体などが挙げられるが特に限定されることはない。対象植物の種類に応じて、当業者は適宜の部位を選択して形質転換を行うことが可能である。形質転換に用いるためのベクターの種類は特に限定されないが、ベクターには上記のジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーター及び/又はエンハンサー配列を含むことが好ましい。プロモーター及びエンハンサー配列としては、植物細胞において上記遺伝子を発現しうるものであればその種類は特に限定されず、任意のプロモーター及びエンハンサー配列を使用することができる。例えば、アグロバクテリウム又はリゾビウムのような植物細胞内で発現する遺伝子を含め、植物体、植物ウイルス、又は細菌由来のプロモーターなどを用いることができる。プロモーターとしては、例えば、AgrobacteriumtumefaciensのTDNA由来のプロモーター、Smasプロモーター、桂皮アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、NOSプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼプロモーター、GRP18プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモーター、植物由来のアクチンやヒストン等のプロモーター/エンハンサーなどを用いることができるが、これらに限定されることはない。ベクターには選択マーカー遺伝子として種々の抗生物質耐性遺伝子や他のマーカー遺伝子をコードする配列を含めることができる。マーカー遺伝子の例としては、例えば、抗スペクチノマイシン遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アセト乳酸合成酵素を阻害する除草剤に対する耐性遺伝子、グルタミン合成酵素を阻害する除草剤に対する耐性遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を挙げることができるが、これらに限定されることはない。遺伝子発現効率を高めるために、例えば、遺伝子のコード領域のポリヌクレオチドコーディング領域の3末端にポリ配列を包含させることも好ましい場合がある。ポリ配列としては種々の植物遺伝子又はTDNA由来のものを用いることができるが、これらに限定されることはない。遺伝子を高レベルに発現させるために有用な他の配列、例えば特定の遺伝子のイントロン配列、5不翻訳領域の配列などをベクターに導入しておいてもよい。また、核内への移行を促進するために核局在化シグナルなどを組み込んでおくことも好ましい。高等植物の遺伝子発現に有用なベクターは当分野において周知であり、任意のベクターを使用することができる。例えば、ベクターを植物細胞に導入した際にベクターDNAの一部を宿主植物のゲノムに組み込むことができるベクターとしてAgrobacteriumtumefaciensのTiプラスミド由来のベクターのほか、Tiプバスミド由来のKYLX6、pKYLX7、pBI101、pBH2113、pBI121などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。発現ベクターは外来性遺伝子を植物細胞に導入するための公知の方法、例えばパーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション、リポフェクション法、及びアグロバクテリウム法などの微生物媒介トランスフェクション法などを用いて所望の植物細胞に導入することができる。これらのうち、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、及びアグロバクテリウム法などが好ましいが、アグロバクテリウム法を特に好ましく用いることができる。2成分ベクター法を用いることにより、効率的に遺伝子組み換えを行うことができる場合もある。なお、発現ベクターの構築方法及び植物の形質転換方法については、本明細書の実施例にさらに具体的に説明されているので、当業者は上記の一般的な説明及び実施例の具体的な説明を参照しつつ、ベクターの種類やベクターに導入すべき配列、形質転換法などを適宜修飾ないし改変することにより、本発明の複製阻害剤を発現するように所望の植物を形質転換することができる。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。参考例11材料と方法AZPのデザイン以下の2種類のDNA領域をそれぞれ認識するジンクフィンガータンパク質を特表2004519211号公報に記載された認識コード表に基づいてデザインした。aTYLCVで保存されているステムループ領域bジェミニウイルスで保存されているステムループ領域図6の上段に示したAZPでは10個のジンクフィンガードメインを連続的に結合した。図6の下段に示すAZPではステムループ領域内でジェミニウイルスに保存されている2つの領域を認識する2種のAZPを短いペプチドで連結した。AZP発現プラスミドの作製TYLCV専用AZPを図7に示すスキームで作製した。まず3個ずつジンクフィンガーを連結した遺伝子をPCRにより合成し、それぞれの遺伝子を大腸菌発現ベクターのpET21aのBamHIHindIIIサイトにクローニングした後、得られたプラスミドの塩基配列を確認することにより、pETTYLCV3、pETTYLCV4、及びpETTYLCV5を得た。次にpETTYLCV3及びpETTYLCV4内の3フィンガーAZPの遺伝子をPCRにより増幅して連結し、最終的にpETTYLCV34を得た。5TATA3を認識するジンクフィンガー遺伝子を作製し、上述した方法でpETTYLCV5内の3フィンガーAZP遺伝子と連結することによりpETTYLCV6を作製した。最後に、pETYLCV34及びpETTYLCV6からそれぞれ6フィンガーAZP遺伝子及び4フィンガーAZP遺伝子をPCRにより増幅して連結することにより、ステムループ領域の配列を形成する33塩基のうち31塩基を認識するAZP2発現用プラスミドを作製した。ジェミニウイルス汎用AZP以下、AZP3と呼ぶを図8に示すスキームで作製した。まずステムループ領域内でジェミニウイルスにおいて保存されている2つの領域を認識する2種のAZP遺伝子とリンカーペプチド遺伝子を組み込むため、まずプリカーサープラスミドを作製した。ジェミニウイルスで保存されている長いほうの領域を認識する6フィンガーAZP遺伝子をpETTYLCV34からPCRで増幅し、pETMCSにクローニングすることによりpETTYLCV3/4MCSを作製した。次にジェミニウイルスで保存されている短いほうの領域を認識する3フィンガーAZP遺伝子をpETTYLCV5からPCRで増幅し、pETTYLCV34MCSにクローニングすることにより、リンカーペプチドとして6アミノ酸を有するAZP3を発現するプラスミドを作製した。AZPの発現AZP発現プラスミドで大腸菌BL21を形質転換し、得られた形質転換体をアンピリシリンを含むLB培地で37°Cで培養し、OD600が0607になったときにIPTGを最終濃度1mMになるように添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。さらに3時間培養した後、遠心分離により大腸菌を回収し、タンパク質精製まで80°Cに保存した。AZPの精製各AZPは基本的に同じ方法で精製した。80°Cで保存した大腸菌にlysisbuffer100mMTrsHCl、100mMNaCl、01mMZnCl2、5mMDTT、pH8010mlを加え、凍結及び融解を3回繰り返して大腸菌の細胞壁を壊れやすくした。次に超音波破砕機にかけて大腸菌を破砕した後、遠心分離することにより目的タンパク質を含む上清を回収した。この上清を陽イオン交換樹脂のBiorex70BioRad社にアプライして目的タンパク質を樹脂に吸着させた後、washbuffer50mMTrsHCl、50mMNaCl、01mMZnCl2、02mMDTT、pH80で十分洗浄した。次に、elutionbuffer50mMTrsHCl、300mMNaCl、01mMZnCl2、02mMDTT、pH80で目的タンパク質を溶出させた。目的タンパク質を含むフラクションのみを集め、限外ろ過膜で濃縮後、等量のグリセロールを加えて撹拌した後、80°Cにて保存した。AZP純度はSDSPAGE上のクマシーブルー染色のバンドの量で判断した。各タンパク質の濃度は、ProteinAssayESLRoche社を用いて決定した。RepN発現プラスミドの作製RepNはウイルス複製タンパク質RepのN末領域部191アミノ酸残基でDNA結合能を有している。AZPによるRepのdirectrepeatsへの結合の阻害実験に用いるためにRepNを以下の方法で調製した。感染したトマトから回収したTYLCVゲノムを用いてRepN遺伝子をPCRによりTYLCVゲノムから増幅し、AZPの場合と同様に、pET21aのBamHIHindIIIサイトにクローニングした。得られたプラスミドの塩基配列を確認することによりRepN発現用のプラスミドを作製した。RepNタンパク質の発現及び精製RepNの発現はAZP発現の場合と同様に行い十分量の発現を得た。得られた大腸菌は、タンパク質精製まで80AZP及びRepNの複製起点への結合能の評価各タンパク質の標的DNA配列への結合能の評価はゲルシフトアッセイにより行った。標的DNA配列を含むDNAオリゴマーを作成し、5末端を32Pで標識した。次に標識DNAを含むbindingbufferに所定量のタンパク質を添加し、氷上で1時間反応させた。この反応物を6非変性アクリルアミドゲルにアプライし、4°Cで2時間電気泳動した。泳動後、ゲルをクロマト紙に載せて乾燥させた。十分乾燥した後にX線フィルムに感光させ、標識DNAのバンドを検出した。遊離DNAとタンパク質とのDNA複合体の量比が11になるときのタンパク質濃度が標的DNA配列との解離定数に相当する。そのタンパク質濃度に基づいてAZP及びRepNの結合能の比較を行った。AZPによるウイルス複製タンパク質の切断阻害能の評価Rep発現プラスミドの作製1切断阻害能の評価には切断活性を有するfulllengthのRepが必要となるので、Rep発現プラスミドの作製を行った。RepN発現プラスミドの作製と同様に、Rep遺伝子はPCRによりTYLCVゲノムから増幅し、pET21aのBamHIHindIIIサイトにクローニングした。得られたプラスミドの塩基配列を確認することによりRep発現用のプラスミドを作製した。Rep発現プラスミドの作製2Rep単独では、大腸菌破砕後に可溶化の状態で検出できない場合があることから、溶けにくいタンパク質の可溶化を促進し、かつ精製が簡便なglutachioneStransferaseGSTとの融合体としてRepを作製した。T7プロモーター及びGST遺伝子を含むDNA領域をGST融合タンパク質発現用のプラスミドを作製した。GSTRep融合タンパク質の発現3種類の大腸菌、BL21、Rosetta2pLysS、及びBL21CodonPlusRILをそれぞれpETGSTRepで形質転換し、得られた各クローンをRepNタンパク質発現時と同様に37°C、1mMIPTGで発現誘導した。それぞれの大腸菌で発現量は同じであったが、大腸菌破砕後のGSTRepの可溶化量はBL21において最も高かった。そこでBL21形質転換体を用いて30°Cでのタンパク質発現を行った。GSTRepタンパク質の精製大腸菌ペレットをLysisBuffer3mLに懸濁し、ソニケーションを行った。GSTRepタンパク質の可溶化をSDSPAGEで確認後、遠心分離して上清のみを取り出した。20倍量の1xGSTBindWashBufferであらかじめ洗浄したGST結合レジンを15mLコニカルに移し、さらに1xGSTBindWashBuffer5mLで洗浄し、400×g、25°C、5分間遠心して上清を丁寧に取り除いた。この前処理したレジンにソニケーション後のGSTRepタンパク質を含む上清を045μmメンブレンフィルターでろ過したものを添加した。4°Cで一晩振盪して、レジンにGSTAZPタンパク質を吸着させた。このレジンをカラムに流し、WashingBufferで洗浄後、ElutionBufferで溶出した。溶出した各フラクションをSDSPAGEで確認し、GSTRepタンパク質を含むフラクションを集め、限外ろ過膜で全量が300μLになるまで濃縮した。タンパク質濃度は市販のキットで決定した。GSTAZP融合タンパク質の発現AZPをglutachioneStransferaseGSTとの融合体とし、そのGSTAZP遺伝子をT7プロモーターの下流においた、発現ベクターを大腸菌に導入した。この大腸菌をLBAmp液体培地120mLでOD600が065~075になるまで培養した。培養後最終濃度が1mMとなるようにIPTGを添加し、さらに3時間培養することにより、GSTAZPタンパク質を誘導発現させた。誘導後の大腸菌を遠心して回収して-80°Cに保存した。GSTAZPタンパク質の精製はGSTRepタンパク質の精製と同じ方法で行った。AZPによるウイルス複製タンパク質の切断阻害能の評価Repの結合サイトを含む200塩基対からなる標識DNA5nMを含む反応溶液25mMTrisHClpH7575mMNaCl25mMDTTにGSTAZP又は性能比較実験のためにGSTRepN若しくはコントロール実験のためGSTを添加して混合し、氷上に30分間静置した。その後、最終濃度が2μM及び5mMとなるようにGSTRep及びMgCl2をそれぞれ添加した後、25°Cで反応させた。30分後、05MEDTAを2μLを添加して反応を終了させ、フェノール処理及びエタノール沈殿を行った。LoadingBuffer3μLで溶解して作製したサンプルを8変性アクリルアミドゲルにおいて電気泳動した。2結果AZPの標的DNA配列への結合能の評価精製したAZP及びRepNの標的DNA配列への結合能をゲルシフトアッセイにより評価した。この実験においては、32PでラベルしたDNAに各種濃度でタンパク質を添加し結合反応を行わせた後、遊離DNAとタンパク質とのDNA複合体を非変性ゲル上で分離する。遊離DNAとタンパク質とのDNA複合体のバンドの比が11になるタンパク質濃度解離定数に相当を求めたところ、TYLCV専用のAZP2の解離定数は03~1nM、ジェミニウイルス汎用のAZP3の解離定数は10nMであることがわかった。一方、RepNの解離定数は30nMであった。この実験により、デザインしたAZP2及びAZP3の標的DNA配列に対する結合力はいずれもRepNより強いことが確認された。AZPによるウイルス複製タンパク質の切断阻害能の評価精製したTYLCV専用のGSTAZPは図12のレーン4~7に示されているようにRepによる複製起点の切断を効果的に阻害できた。その阻害効果はAZP濃度に依存しており、20μMで完全な阻害が認められた。一方、Repのドミナントネガティブ体であるRepNでは全く切断阻害が認められなかったについても同様にして切断阻害能を評価した。その結果を図13に示す。参考例21材料と方法AZP形質転換トマトの作製AZPの植物用安定的発現ベクターの作製AFP2をコードする遺伝子の植物ゲノムへの挿入はアグロバクテリア法により行った。プロトプラスト実験用にpUC35SOTYLCV346をpUC35SOMCSから図14の方法で調製し、このプラスミドから35Sプロモーター‐AZP遺伝子‐NOSターミネーターを含む領域をEcoRI及びHindIIIで切り出した。断片をアガロースゲル上で精製した後、バイナリープラスミドpBI121のEcoRI/HindIIIサイトにクローニングしてpBIOTYLCV346を得た。シークエンシングにより塩基配列が正しいことを確認した。AZP3についても同様の操作を行った。MicroTomの育種72穴のプラスチックトレイに栽培土をつめ、如雨露で軽く土を湿らせた後、MicroTomの種をひとつずつ蒔き、その上に湿らせた土を軽くかぶせ、全体をサランラップ登録商標で覆った。このトレイを人工気象室で培養した。発芽が認められた時点でサランラップ登録商標をはずし、培養を同一条件下で培養を継続した。播種後約2週間経過後に苗を直径12cmのプラスチックポットに移し、種を回収するまで培養した。MicroTomの種の調製赤く熟したMicroTomの実を回収し、赤道線上でナイフで2つに分割し、スパチュラですべての種を50mlプラスチックチューブに回収した。水で軽く洗った後、1塩酸水で10分間洗浄し、種の周囲のゼラチン層を溶解させた。次に流水で10分間種を洗浄し、余分な水分をペッパータオルで吸い取った後、室温で2日間風乾させた。乾燥した種は4°Cで保存した。MicroTom子葉への遺伝子導入MicroTomの種子10~20粒を10希釈したハイターで殺菌した後、滅菌水を用いて4回洗浄した。この種子を播種用培地1×MurashigeSkoog培地、15gLsucrose、3gLgelriteを固めたプラントボックスに播種し、6日間、25°C、16時間日長の条件で生育させた。本葉が数ミリ程度になった個体を形質転換に用いた。アグロバクテリア感染の前日にpBIOTYLCV346で形質転換したアグロバクテリアC58C1RifRのグリセロールストック20μLを、2mLのLB培地に植菌し、30°Cで24時間培養した。感染当日、アグロバクテリウム菌液1mLをエッペンドルフチューブに取り、5000rpm、5分間の遠心分離により集菌した。この菌体を100μMのアセトシリンゴン、10μMのメルカプトエタノールを含むMS培地40mLに懸濁させた。MicroTomの子葉をカミソリを用いて切り取り、先端から半分の付近で2つに切断した。これら子葉切片を上述のアグロバクテリウム懸濁液に浸け、10分間静置し、感染させた。滅菌したキムタオルにのせて余分な懸濁液を吸い取り、共存培地1×MS培地、30gLsucrose、3gLgelrite、15mgLtzeatin、40μMアセトシリンゴン、01MES、pH57に葉を置いた。フタをサージカルテープでシールし、アルミホイルで遮光して25°Cで培養した。3~4日後、感染させた子葉切片をカルス誘導培地に移した。約2週間で感染させた一部の子葉切片からカルスが形成され、シュートを形成するものも見られた。2週間ごとに新しいカルス誘導培地に植え継いだ。カルスから葉が3~4枚形成された個体の子葉切片部分を切り落としてシュート誘導培地に移し、シュートの成長を促進させた。シュートが1~2cmの長さに伸びた時点でシュートの最下端でカルスから切り離し、発根培地RIM培地12xMS培地3gLGelriteKan50mgLAugmentin375mgL、01MESpH57に植え継いだ。発根培地で2週間以内に発根した個体の根を切り落としてプラントボックス内に固化させた発根培地に植え継ぎ、発根の二次選抜を行った。プラントボックスで発根した個体を以下の順化のステップに移した。最初の発根培地で2週間以内に発根しなかった個体は、切り口を薄く切り落として新しい発根培地へ植え継ぎ、再び発根を誘導した。プラントボックスの発根培地で発根が見られた個体は、結実させて種子を得るために土植えにした。この際、湿度環境等の変化で植物が枯死しないように、湿度緩やかに下げて順化させた。具体的には、プラントボックスに湿らせた土を入れ、その中に発根個体を植えて、最初は高湿度の状態にし、徐々にフタを緩めて湿度を下げた。プラントボックス内で約1ヶ月かけて十分に順化させた植物を鉢に植えて生育させた。2回目の発根選抜以降の植物について目的の遺伝子が導入されているかどうかをPCRによって確認した。約5mmの本葉1枚を切り取り、CTAB法によってゲノムDNAを抽出した。最終的に300μLのTEに懸濁したゲノムDNA溶液のうち1μLを用いてPCR法により遺伝子導入をチェックした。プライマーとしては、カナマイシン耐性遺伝子NPT2遺伝子が増幅されるプライマーセットと人工転写遺伝子とNOSterminatorを含む領域が増幅されるプライマーセットを設計して用いた。形質転換体からのタンパク質の抽出形質転換植物の1~2cmの葉をマイクロチューブに採取した。これに液体窒素を加えて凍結させ、ホモジナイズペッスルを用いて細かく砕いた。液体窒素が気化した後、200μLのSDSサンプルバッファー4SDS20glycerol001BPB102MEを加え、さらにすりつぶした。95°Cで10分間保温したあと、遠心後に上清を新しいマイクロチューブに移した。これを植物抽出タンパク質のサンプルとした。ウエスタンブロット抽出したタンパク質のうち1μLを12SDSポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。分子量マーカーとしてPerfectProteinWesternMarkerを同時に泳動した。タンパク質をアクリルアミドゲルからPVDFメンブレンに転写したあと、ポンソーSを用いてタンパク質を確認した。メンブレンをブロッキング液5スキムミルク、005tween20PBSで振盪したのち、ペルオキシダーゼ標識抗HA抗体を反応させた。分子量マーカーに対する抗体としてSproteinHRPも同時に反応させた。ECL化学発光システムを用いてX線フィルムを感光させ、シグナルを検出した。このシグナルのサイズとシグナル強度から、形質転換植物内でAZPが発現しているかどうかを検証した。ウイルス感染実験ウイルス感染用プラスミドの作製ウイルス感染はアグロバクテリアの感染力を利用して行った。複製起点を2つ有するウイルスゲノムコピーをバイナリープラスミドに導入するために、TYLCV及びTYLCVmildの2種類について、目的プラスミドの作製を以下に示す2段階で行った。TYLCVmildはTYLCVとはRepの結合するdirectrepeats配列が異なり、ジェミニウイルスに対する汎用性を調べる目的で用いた。TYLCVのウイルスゲノムDNAから複製起点を含む05コピー分のDNAフラグメントをPCRにより増幅し、バイナリープラスミドpBI121のEcoRIHindIIIサイトにクローニングし、pBITYLCVを得た。シークエンシングにより塩基配列が正しいことを確認した。TYLCVの1コピー分のDNAフラグメントを導入する際、PCRで増幅したDNAをクローニングする場合には、作製したプラスミドの塩基配列を確認する必要があるが、目的プラスミドはウイルスゲノムを15コピー含むので必ず重複するDNA領域があり、シークエンシングにより塩基配列が正しいことを確認することができない。そこで、一度クローニングプラスミドpBluescriptIIKSにウイルスゲノム1コピー分を組み込んで、全塩基配列を確認した後にPCRを行わずに制限酵素で切り出したDNAフラグメントをpBITYLCVに導入することにした。TYLCVのウイルスゲノムDNAから複製起点を含む1コピー分のDNAフラグメントをPCRにより増幅し、pBluescriptIIKSのPstI/HindIIIサイトにクローニングしてpBSTYLCVを得た。シークエンシングにより全塩基配列が正しいことを確認した。次にpBSTYLCVからBsrGI及びHindIIIでウイルスゲノム1コピー分のDNAフラグメントを切り出し、アガロースゲル上で精製後、pBITYLCVのBsrGI/HindIIIサイトにクローニングし、最終的に目的プラスミドのpBITYLCVを得た。TYLCVmildについても、同様の操作を行い、最終的に目的プラスミドのpBITYLCVmildを得ることができた。ウイルス感染用プラスミドの感染能の確認アグロバクテリアC58C1RifRのコンピテントセルを作製した。このコンピテントセルに、作製したTYLCVゲノムあるいはTYLCVmildゲノムを15コピー有するバイナリーベクターを導入し、アグロイノキュレーション用のアグロバクテリアのグリセロールストックを作成し、-80°Cに保存した。野生型トマトに感染する前日に、このグリセロールストックを6mLのLB培地に植菌し、30°Cで一昼夜培養した。次にアグロバクテリアを集菌し、バッファー1mLに懸濁させた。この懸濁液を播種後約10日の苗の子葉に注入して、感染させた。感染後定期的に植物個体の観察及び葉の中のウイルスDNAの検出を行った。そのためのDNAサンプルの作製は上述したように行い、それぞれのTYLCVに特異的なプライマーセットを用いて行って得たPCR生成物の解析により、ウイルス感染を分子レベルで評価した。TYLCV感染耐性の評価形質転換体T3からの苗にウイルスバイナリーベクターを保持するアグロバクテリアの懸濁液を注入し、感染症状を経時的に肉眼で確認した。また、感染させたトマトの葉からDNAを抽出し、植物体内でウイルスが増殖しているかどうかを、前項の方法に従ってPCRで検証した。2結果AZP形質転換トマトの作製MicroTomトマトにAZP遺伝子をそれぞれアグロバクテリアを介して導入した。図15に示す各AZP発現カセットを有するバイナリーベクターで形質転換されたアグロバクテリアを子葉切片に感染させて遺伝子を導入した。次にカナマイシンを含む培地を用いてカルスを誘導させ、シュート、次に根を誘導させた。発根が深く寒天培地に伸びている個体を選ぶことにより発根誘導時に形質転換体をさらに選別し、順化後、土に植替えることにより形質転換体を得た。これら形質転換体T1がAZP遺伝子を有することをPCR法により確認した。カナマイシン耐性遺伝子及びAZP遺伝子を検出するため、図16に示すPCRプライマーセットを用いてT2及びT3植物の作製及び各ラインの解析得られたT1植物におけるAZP遺伝子のコピー数は、T2植物のAZP遺伝子挿入個体の割合を調べ、カイ2乗検定により同定した。すなわち、各T1ラインからT2種子を回収し、それらを播種して得られた各T2個体でのAZP遺伝子の有無をPCRにより同定した。AZP2を導入して得られたT2植物のうち、各々ひとつのラインを例として図19に示した。図19を例に取ると、PCR法により特定のT1ラインから得られた18個体のT2植物中、13個体がAZP遺伝子を有しており、分離比は13対5となる。もし、このT1ラインがAZP遺伝子1コピーを有しているのであれば、その分離比は3対1となるはずである。そこでカイ2乗検定により1コピーと仮定するとカイの2乗値は0074であり、P001の臨界値は663であることから、この帰無仮説は棄却されない。他方、2コピー挿入と仮定すると、カイの2乗値は142となり、臨界値より大きくなり、この帰無仮説は棄却される。以上の検証結果から、このT1ラインは1コピー挿入体であることがわかる。そのほかのT1個体についても同様にして1コピー挿入体の選別を行った。さらに各アプローチの形質転換体でのAZP発現をウェスタンブロットで確認した。各々のアプローチ用のAZP発現カセットには、あらかじめHAエピトープタグをつけて、形質転換体におけるAZPタンパク質の発現を抗HA抗体を用いてたウェスタンブロット法により検証できるようにしておいた。図21に示すように、AFP2を導入したT2植物についてもAZPタンパク質が強く発現されていることが確認できた。AZP遺伝子の1コピー挿入が確認されたT1植物から得られた各T2ラインがホモ又はヘテロのいずれであるかは、それぞれのT2植物からのT3苗のPCR解析により決定した。各T2ラインからのT3苗の葉から抽出したDNAサンプルのPCR解析により、すべての苗でAZP遺伝子の保持が確認されれば、その親であるT2ラインをホモであると断定することができる。統計処理によりホモであることも確認した。また、T3植物においてAZPが発現していることもウェスタンブロットにより確認した。AFP3を用いて形質転換した植物についても、それぞれのT2植物からのT3苗について同様の操作を行ない、同様の結果を得た。注ホモのT2を有するT1ラインは、得られた1コピー挿入T1について解析して得られた結果を示す。TYLCVバイナリープラスミドの作製及び感染能の確認アグロイノキュレーション法によりMicroTomトマトを感染させることが可能かどうかを検証した。複数の野生型MicroTomにTYLCVゲノムを有するアグロバクテリアを注入し、TYLCVの感染を試みた。複数回の試験を行った結果、各回とも高効率で感染させることができた。感染後約10日には若い葉においてTYLCV感染の特徴的な葉の縮退が観察された。さらに成長させた個体ではTYLCV感染の特徴的症状である葉のカーリングや黄色化が明確に観察された。感染した個体では明白な成長の阻害が認められ、開花は多いものの、結実する確率は著しく低かった。アグロイノキュレーション法によるTYLCVの感染を分子レベルでも確認した。感染成立後、各ステージでの葉を回収し、すべての感染した葉でTYLCVゲノムDNAをPCR法により検出することができた。また、TYLCVmildについても同様の実験を行ったが、TYLCVとは異なり、その感染症状はマイルドであった。特に感染初期の症状が葉の周辺の色が薄くなるという程度であり、表現系からの感染の判断は難しい場合がある。従って、表現系による判定だけでなく、PCR法により感染個体でのTYLCVmildで複製されていることを分子レベルで同定することで正確な判定が可能になる。AZP発現によるTYLCV感染耐性の獲得AZP2を導入して作製したT1植物のうちの3個体からそれぞれ得られたホモのT2ラインWDVをターゲットとするAZPのデザイン以下の2種類のDNA領域をそれぞれ認識するジンクフィンガータンパク質を特表2004519211号公報に記載された認識コード表に基づいてデザインした。a上流側のステム領域とそのフランキング領域bステムループ領域c下流側のステム領域とそのフランキング領域AZP11は10個のジンクフィンガードメインを連続的に結合し、図30に示した31塩基対を認識できるようデザインした。AZP12では12個のジンクフィンガードメインを連続的に結合し、図30に示した37塩基対を認識できるようデザインした。AZP13では9個のジンクフィンガードメインを連続的に結合し、図30に示した28塩基対を認識できるようデザインした。AZP発現プラスミドの作製AZP11を図31に示すスキームで作製した。まず3個ずつジンクフィンガーを連結した遺伝子をPCRにより合成し、それぞれの遺伝子を大腸菌発現ベクターのpET21aのBamHIHindIIIサイトにクローニングした後、得られたプラスミドの塩基配列を確認することにより、pETWDV31、pETWDV32、及びpETWDV33を得た。次にpETWDV32及びpETWDV33内の3フィンガーAZPの遺伝子をPCRにより増幅して連結し、最終的にpETWDV6を得た。5GGGT3を認識するジンクフィンガー遺伝子を作製し、上述した方法でpETWDV31内の3フィンガーAZP遺伝子と連結することによりpETWDV4を作製した。最後に、pETWDV4及びpETWDV6からそれぞれ6フィンガーAZP遺伝子及び4フィンガーAZP遺伝子をPCRにより増幅して連結することにより、上流側のステム領域とそのフランキング領域を含む連続した31塩基を認識するAZP11をコードするプラスミドを作製した。AZP12を図32に示すスキームで作製した。まず3個ずつジンクフィンガーを連結した遺伝子をPCRにより合成し、それぞれの遺伝子を大腸菌発現ベクターのpET21aのBamHIHindIIIサイトにクローニングした後、得られたプラスミドの塩基配列を確認することにより、pETWDV34、pETWDV35、pETWDV36、及びpETWDV37を得た。次にpETWDV34及びpETWDV35内の3フィンガーAZPの遺伝子をPCRにより増幅して連結し、最終的にpETWDV62を得た。また、pETWDV36及びpETWDV37内の3フィンガーAZPの遺伝子をPCRにより増幅して連結し、最終的にpETWDV63を得た。最後に、pEWDV62及びpETWDV63からそれぞれ6フィンガーAZP遺伝子をPCRにより増幅して連結することにより、下流側のステム領域とそのフランキング領域を含む連続した37塩基を認識するAZP12をコードするプラスミドを作製した。AZP13を図33に示すスキームで作製した。まず3個ずつジンクフィンガーを連結した遺伝子をPCRにより合成し、それぞれの遺伝子を大腸菌発現ベクターのpET21aのBamHIHindIIIサイトにクローニングした後、得られたプラスミドの塩基配列を確認することにより、pETWDV38、pETWDV39、及びpETWDV310を得た。次にpETWDV39及びpETWDV310内の3フィンガーAZPの遺伝子をPCRにより増幅して連結し、最終的にpETWDV64を得た。最後に、pEWDV64から6フィンガーAZP遺伝子をPCRにより増幅して連結することにより、ステムループ領域28塩基を認識するAZP13をコードするプラスミドを作製した。