"539B1812、539B4702、539B4892、539B3042、および539B4782からなる抗体の群から選択されるアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ酵素AAD12に特異的に結合するモノクローナル抗体。539B1812の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。539B4702の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。539B4982の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。539B3042の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。539B4782の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。PTA10919、PTA10920、PTA10921、PTA10922、およびPTA10923からなる群から選択されるアクセッション番号でアメリカンタイプカルチャーコレクションATCCに寄託されている、請求項1に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。ATCCアクセッション番号PTA10919の下に寄託されている、請求項7に記載のハイブリドーマ。ATCCアクセッション番号PTA10920の下に寄託されている、請求項7に記載のハイブリドーマ。ATCCアクセッション番号PTA10921の下に寄託されている、請求項7に記載のハイブリドーマ。ATCCアクセッション番号PTA10922の下に寄託されている、請求項7に記載のハイブリドーマ。ATCCアクセッション番号PTA10923の下に寄託されている、請求項7に記載のハイブリドーマ。AAD12酵素の存在を同定するための方法であって:a請求項1に記載の第1のモノクローナル抗体をアッセイ表面に固定化し、次いで該アッセイ表面を洗浄する工程、b前記アッセイ表面を、AAD12を含む疑いのある液体と結合を可能にするのに十分な時間接触させた後、該アッセイ表面を洗浄する工程c前記アッセイ表面をレポート基と結合した請求項1に記載の異なる二次抗体と、該第2の結合体化モノクローナル抗体との結合を可能にするのに十分な時間接触させた後、該アッセイ表面を洗浄する工程;およびd前記レポート基の有無を検出する工程を含む、方法。AAD12酵素の定量法であって:aアッセイ表面にAAD12抗血清を固定化する工程b前記アッセイ表面をAAD12を含む疑いのある液体と結合を可能にするのに十分な時間接触させた後、アッセイ表面を洗浄する工程c前記アッセイ表面をレポート基と結合した請求項1に記載の異なる二次抗体と、前記第2の結合体モノクローナル抗体との結合を可能にするのに十分な時間接触させた後、該アッセイ表面を洗浄する工程、d標準曲線と比較することによって、前記レポート基の存在を定量する工程を含む方法。前記結合体モノクローナル抗体が539B4702である、請求項14に記載の方法。詳細な説明本発明は、AAD12と反応する抗体およびmAbを産生するハイブリドーマを包含する。下記の表は、ハイブリドーマ系統の名称とそれに対応するATCC寄託の名称を示している。本発明はまた、AAD12を単離または検出するためにmAbを使用する方法を含み、この方法は、a表面上に該抗体を固定化する工程、b固定化した抗体をAAD12を含有する混合物と接触させる工程、cAAD12に結合した固定化した抗体を混合物から分離する工程、およびd固定化した抗体から抗体が結合したAAD12を除去することによってAAD12を回収する工程を含む。本発明はまた、生物学的サンプル中のAAD12の存在を識別するために本発明の抗体を用いる方法を含み、この方法は以下を含む:aアッセイ表面上に該抗体を固定化する工程、bアッセイ表面をAAD12を含む疑いのある液体と接触させ、適切な溶液でアッセイ表面を洗浄する工程、cアッセイ表面をレポート基で標識した抗AAD12抗体と接触させ、適切な溶液でアッセイ表面を洗浄する工程、dレポート基の存在を検出する工程。本発明はさらに、トランスジェニック植物、特に大豆と綿植物で発現されるAAD12酵素の定量分析法を含む。AAD12タンパク質は、PBSリン酸緩衝生理食塩水溶液で大豆サンプルから抽出される。抽出液を遠心分離し、水性の上清を回収し、希釈される。希釈されたサンプルのアリコートを、サンドイッチELISAフォーマットにおいて抗AAD12ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でコーティングされたプレートのウェル中で酵素結合抗AAD12モノクローナル抗体とともにインキュベートする。サンドイッチのペアの両方の抗体がサンプル中のAAD12タンパク質を捕捉する。インキュベーション期間の終了時に、結合されていない試薬はPBSで洗浄することにより、プレートから除去される。AAD12の存在は、酵素基質と酵素複合体をインキュベートし、着色された生成物を生成することにより検出される。AAD12を抗体サンドイッチに結合しているので、発色のレベルは、サンプル中のAAD12の濃度に比例するすなわち、より低いタンパク質濃度はより低い発色をもたらす。450nmの吸光度から基準波長例えば650nmのようなの吸光度を差し引いたものが、プレートリーダーを用いて測定される。標準曲線は二次回帰式を用いて7標準濃度から推定される。このAAD12ELISAは、植物組織サンプル抽出物中のAAD12の定量のために十分特異的かつ高感度である。加えて、本発明の抗体は、標準的なウェスタンブロッティングの手順を使用してAAD12の存在を確認するために用いることができる。目的のタンパク質に対する抗体の調製は、当該分野において周知である。GalfreおよびMilstein、MethodsinEnzymologyVol73AcademicPressNewYork1981JamesWGodingMonoclonalAntibodies:PrinciplesandPracticeAcademicPressOrlandFloridaによって記載されたAAT選択システムが使用され得る。しかし、マウスの細胞と融合パートナーとの互換性からHATヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン選択システムLittlefieldScience145、7091964によって記載されたが好ましい。使用済成長培地は、その後免疫モノクローナル抗体の分泌についてスクリーニングされる。酵素結合免疫吸着検定手順は、この目的に最も適している。しかし、大容量のスクリーニングに適応した放射免疫アッセイでも許容可能である。かなり多数の無関係であまり望まれていない培養物を連続的に削減するように設計されたマルチプルスクリーニングが、小割合の本発明のmAbを単離するために実行される必要がある。AAD12と反応するモノクローナル抗体を分泌する培養が、市販のアッセイを用いてイソタイプされた。求められている抗AAD12モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ培養物は、モノクローン性と安定性を確立するために数回サブクローニングされるべきである。真核生物、非接着細胞培養のサブクローニングのための周知の方法には、限界希釈法、軟寒天、蛍光活性化セルソーティング技術が含まれる。各サブクローニング後、得られた培養物を、安定した抗体を分泌する培養物が確立されたことを確実にするために抗体分泌及びアイソタイプについて再測定しなければならない。本発明の抗AAD12抗体は、抗体結合部位の一部が露出し、AAD12に結合しうるように表面に固定化することができる。固定化抗体のための幅広い種類のスキームが、過去数十年にわたって開発されてきた。固定化は、所望の表面に直接抗体を共有結合させることによって、または表面に抗体を架橋することによって達成することができる。セファロース登録商標ファルマシア、Pistcataway、ニュージャージー州のような多糖類ベースのビーズへの抗体のCNBrおよびカルボジイミド結合は、本発明と整合する直接結合方式の例である。直接結合は一般的に任意の特定の方法で抗体を方向付けることはないが、いくつかの種類の直接結合が抗体を再現可能に固定化物質に方向付けることができる。好ましいカップリング方式は、その抗原結合領域が露出したままであるように抗体を方向付ける。そのようなスキームの一つは、抗体の重鎖に見出される天然糖質を利用している。まず炭水化物部分を対応するアルデヒドに酸化し、次にアルデヒドを表面の第一級アミノ基と反応させることによって、有利な方向に抗体を連結することが可能である。多くの種類の架橋が可能であり、固定化物質に対して抗体を共有結合で結合する小有機リンカーが含まれる。このようなスペーサーアームは許容可能であり、好ましくは、ブリッジが形成された後はタンパク質と相互作用するべきではない。上記の説明は、本発明の範囲を限定することを意味することは一切ない。固定化物質に対して抗体を連結させるための多数の他の周知の方式は本発明と整合している。レポート基で標識された抗体が様々な環境において抗原の存在を識別するために使用できることが周知である。放射性同位元素で標識された抗体は、高い精度と感度で、様々な生物学的流体中の抗原の存在を識別するために、放射免疫アッセイで数十年にわたって使用されている。さらに最近では、酵素標識抗体は、一般的なELISAにおける放射性標識された抗体の代替物として使用されてきた。本発明の抗体は、ポリスチレンのウェルまたは粒子のような固定化物質に結合され得、AAD12が試験サンプル中に存在するかどうかを判断するためにイムノアッセイにおいて使用することができる。本発明のこの実施形態では、サンプルは、免疫親和性表面と接触させ、インキュベートする。洗浄工程の後、免疫親和性表面に結合している任意のAAD12が、レポート基で標識された本発明の別の抗体を表面に接触させることによって検出される。本発明の抗体およびアッセイ法とラテラルフローストリップlateralflowstripsまたはイムノクロマトストリップの使用は、本発明と整合性がある。ラテラルフローアッセイは、当該分野で周知である。例えば、米国特許第6485982号を参照。この態様では、ラテラルフロー試験は、AAD12単独で、または他の検体と同時に、定性的または半定量的検出に用いることができる。ラテラルフロー試験は、本明細書に記載された全ての試験の形式を使用する最も簡単な方法であり、植物材料が迅速に溶液中に抽出され、ラテラルフローストリップ上で試験される現場の設定で特に有用である。この態様では、液体サンプル中にラテラルフローストリップを配置するか、またはラテラルフローストリップに液体サンプルを適用し、所定時間後に結果を読み取ることが必要なだけである。全てのラテラルフロー試験は、試験結果を検証するために使用される手続対照ラインまたは試料対照ラインのいずれかを組み込む必要がある。したがって、2つのラインが現れれば、肯定的な結果を示し、一方有効な陰性試験は、対照ラインを生成するのみである。試験ラインのみが表示された場合、またはラインが表示されない場合、それは無効である。典型的なラテラルフロー試験ストリップは、4つの主要コンポーネント、すなわち、試験サンプルが適用されるサンプルパッド、着色粒子典型的に金コロイド粒子、またはラテックスマイクロスフェアに結合した本発明の抗体を含んだコンジュゲートパッド、本発明の異なる抗体が捕捉ゾーンまたは試験ラインとして膜を横切るラインに固定化された疎水性のニトロセルロース又は酢酸セルロース膜などのような反応膜、および毛細管現象により反応膜を横切ってサンプルを吸引するように設計された廃液リザーバで構成される。ラテラルフローストリップのコンポーネントは、通常、不活性バッキング材に固定されており、シンプルなディップスティック形式またはサンプルポートと捕捉および制御ゾーンを示す反応窓が付いているプラスチックケースの中に提示されてもよい。アッセイの実施形態の他の態様では、AAD12を含む疑いのある試験サンプルを表面上で乾燥させ、固定化した試験サンプルを形成する。次いで、本発明の標識抗体を固定化した試験サンプルと接触させ、インキュベートする。サンプルはAAD12が含まれている場合は、標識された抗体は、固定化されたAAD12に結合する。また、この方法は、本発明の非標識抗体、続いて、すでにAAD12に結合した本発明の抗体に結合する標識二次抗体を用いて、行うことができる。洗浄した後、固定化された試験サンプルは、任意のレポート基の存在を検出するために測定される。レポート基は、典型的には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはβDガラクトシダーゼなどの酵素である。適切な基質は、酵素と反応したときに色の変化を生じる。そうすることで、色の強度の測定が、分光光度計を用いて定量化されうる。レポート基が放射性同位体である場合には、適切なガンマまたはベータ線検出機器が、レポート基を定量するために使用されうる。レポート基の強度が、試験サンプルにおけるAAD12の量と直接相関関係がある。以下の実施例は、本発明を実施する方法を記述するための助けになり、本発明の抗AAD12抗体およびアッセイの特徴を説明する。実施例1免疫原の調製添加安定剤を含むPBSTリン酸緩衝生理食塩水005Tween20を含む,pH74ベースの緩衝液中で、トランスジェニック大豆から取り出した凍結乾燥葉組織からAAD12タンパク質を抽出し、可溶性タンパク質を遠心分離後の上清中に回収した。上清を濾過し、可溶性タンパク質をフェニルセファローズPhenylSepharose登録商標PSビーズGEヘルスケアに結合させた。1時間のインキュベーション後、PSビーズをPBSTで洗浄し、結合したタンパク質をMilliQTM水で溶出した。塩化ナトリウムを導電性を高めるために添加し、PS精製タンパク質をシュードモナスフルオレッセンスで産生された組換えAAD12に対して惹起された抗AAD12特異的ポリクローナル抗体に結合された抗AAD12イムノアフィニティーカラムにロードした。非結合タンパク質をカラムから収集し、カラムをあらかじめ冷却したPBSリン酸緩衝生理食塩水、pH74で十分に洗浄した。結合したタンパク質を、35MのNaSCN、50mMトリス登録商標、pH80の緩衝液でカラムから溶出した。微生物由来AAD12及び大豆由来AAD12を、SDSPAGEおよびウェスタンブロット法で調べた。微生物由来AAD12では、主要なタンパク質のバンドは、クマシー染色したSDSPAGEゲル上で可視化したところ、約32kDaであった。予想通りに、対応する植物由来AAD12タンパク質のサイズは微生物由来のタンパク質と同一であった。予想通りに、植物精製した画分は、AAD12タンパク質に加えて、非免疫反応性不純物を少量含んでいた。共精製されたタンパク質は、おそらくカラムマトリックスとの弱い相互作用によってカラムに保持されていた。微生物由来AAD12および植物由来の抽出物は、抗AAD12ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット上で予想された大きさの陽性のシグナルを示した。AAD12ウェスタンブロット解析では、免疫反応性タンパク質は陰性対照ネイティブ大豆抽出物には全く観察されず、代替の大きさのタンパク質凝集や分解産物はトランスジェニック植物由来のサンプルで見られなかった。実施例2ハイブリドーマの調製マウスを精製AAD12で免疫化し、標準的な融合技術を使用して、抗AAD12モノクローナル抗体を発現する一群のハイブリドーマを調製した。消費した組織培養培地のサンプルをハイブリドーマ培養を含む各ウェルから無菌的に取り出して、次の抗体捕捉ELISA法を用いてAAD12反応性についてアッセイした。マイクロタイターウェルを精製AAD12の1~10gmLの溶液でコーティングした。ウェルを洗浄し、使用済みの組織培養培地のサンプルをウェル内に配置し、インキュベートした。ウェルを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗血清を添加し、インキュベートした。プレートを洗浄した後、呈色反応を発生させるために基質を添加し、プレートのOD光学密度を読んだ。高いOD値を有するウェルを、ハイブリドーマを含む培養ウェルにマップした。培養を拡大するにつれ増殖安定性及び抗体産生を確保するために、AAD12抗体陽性培養を抗体産生について継続的にスクリーニングした。限界希釈クローニングのいくつかのラウンドを、各培養物の真のモノクローン性を確立するために行った。抗体陽性クローンについてのさらなるアッセイを実施して、植物材料とともに現場使用するための本発明の定量的検出方法に使用するために各抗体の適合性を判断した。実施例3定量ELISAこの実施例は、本発明の抗体および方法を用いる、ダイズ組織におけるAAD12を定量的に測定するための方法である。キャリブレーション標準曲線定量範囲は、緩衝液中025ngmlから10ngmLである。R3段階での大豆の種子、葉V5とV10、根、および飼料におけるAAD12タンパク質レベルは、10ngmgの定量限界LOQおよび05ngmgの検出限界LODを用いて測定することができる。試験物質は、AAD12タンパク質および様々なマーベリックのMaverick非トランスジェニック対照大豆を発現するように遺伝的に改変された代表的な大豆の組織サンプルであった。以下にリストされている組織は、温室から収集された。本研究で用いた以下の基準物質は、校正標準としておよびELISA分析における強化材料fortificationmaterialとして使用された精製AAD12タンパク質、精製AAD12タンパク質、ならびに交差反応試験するために使用された精製AAD12タンパク質であった。全ての試験物質および基準物質は温度監視冷凍庫に格納され、サンプル調製及び分析のためにのみ取り出された。簡単に言えば、AAD12タンパク質を、075卵白アルブミンOVAを含むPBSTTween登録商標20005を含むリン酸緩衝生理食塩水緩衝液PBSTOVAを用いて、大豆サンプルV5、V10、飼料、および根から抽出した。AAD12タンパク質を、005Tween登録商標20PBSTおよび01トリトンX100TMを含むPBS溶液で大豆の種子から抽出した。抽出液を遠心分離し、水性上清を回収し、希釈して、特定のAAD12ELISAを用いてアッセイした。希釈されたサンプルのアリコートを、サンドイッチELISAフォーマットで、抗AAD12ポリクローナル抗体をコーティングしたプレートのウェル中で酵素標識抗AAD12モノクローナル539B4702抗体と共にインキュベートした。サンドイッチのペアの両方の抗体がサンプル中にAAD12を捕獲した。インキュベーション期間の終了時に、結合していない試薬をPBSTで洗浄することにより、プレートから除去した。AAD12の存在は、抗体に結合した酵素複合体を酵素基質とともにインキュベートし、着色された生成物を生成することにより検出された。AAD12は抗体サンドイッチにバインドされているので、発色のレベルは、サンプル中のAAD12の濃度に比例していたすなわち、より低いタンパク質濃度はより低い発色を生じる。発色反応を、酸性溶液を加えて停止させ、プレートリーダーを用いて450nmの吸光度から650nmの吸光度を差し引いたものを測定した。標準曲線は、0990の決定係数とともに二次回帰式を用いて7つの標準濃度から推定した。このAAD12ELISAは、AAD12タンパク質の定量に対して高度に特異的であった。実施例4アッセイの妥当性検証方法のための予備的定量範囲を、方法の開発と事前検証試験中に独立して確立した。標準濃度が所定の濃度点についての最低平均パーセント誤差を提供した。各組織におけるAAD12測定のための検出限界LODおよび定量限界LOQは、標準曲線を構成するアッセイパラメータ吸光度、バックグランド、および直線範囲、マトリックス干渉、およびまたは投与量に基づいて経験的に定義された。それらはまた、キースらKeithetalの方法KeithLHCrummettW、DeeganJJrLibbyRATaylorJKWentlerG1983PrinciplesofEnvironmentalanalysisAnalChem5522102218に従った統計的アプローチによって、および5ngmL05ngmgのAAD12タンパク質で強化したfortified各対照サンプルを試験することによって支持されていた。このAAD12ELISAの非標的タンパク質であるCry1F、Cry1Ac、Cry34Ab1、Cry35Ab1、PAT、およびAAD1に対する交差反応性をこの研究で試験した。これらのタンパク質は、PBSTOVA中、1μgmLおよび10μgmLの濃度で調製した。同じプレート上で、AAD12標準曲線を基準として生成した。非標的タンパク質のOD応答をAAD12標準曲線から補間し、パーセント交差反応性を以下の式、交差反応性100×AAD12STD曲線による測定濃度標的タンパク質の理論濃度を用いて算出した。陰性対照の各ダイズ組織1×、5×および10×希釈用のサンプル抽出物マトリックスは、異なる濃度でスパイクし、標準曲線を作成した。マトリックススパイク標準曲線を同じプレート上で実行する非スパイク標準曲線から補間した。各標準濃度レベルについて観測平均値マトリックススパイク標準濃度を補間するために使用される非スパイク標準曲線と理論平均値マトリックススパイク標準曲線の濃度との間に15以上の差があれば、潜在的なマトリックス効果を表すと考えられた。一連の5回の抽出を、AAD12を発現することが知られている遺伝子組換え大豆の組織で行った。簡単に説明すると、緩衝液15mLを組織サンプル15mgに加えて、上記のように抽出した。抽出及び遠心分離後、抽出液をピペットで除去した。最初の抽出後は、緩衝液200μLのアリコートを添加し、サンプルを混合し、遠心分離し、上清を除去し、最初の抽出液に加えた。緩衝液の別の15mLを組織に加え、抽出プロセスを繰り返した。この手順を、5つの連続した抽出を得るためにさらに3回繰り返した。各抽出におけるAAD12の濃度をAAD12ELISA法を用いて決定した。少なくとも5回の反復を、各組織サンプルについて検討した。組織の抽出プロセスの見かけの効率を5つ全ての抽出物中での総AAD12タンパク質に対する最初の抽出物中のAAD12タンパク質の比較によって決定した。本方法の精度を、低レベル05ngmgのDW、中間レベル14ngmgでDW、および高レベル8ngmgのDWのAAD12タンパク質でスパイクした陰性対照マトリックスからのAAD12タンパク質の回収率を測定することにより決定した。各濃度について最低でも5反復を分析した。アッセイの精度を回収パーセントとして示した。67から120パーセントの間の回収率を許容可能と考えた。本方法の精度を、複数の日に2人のアナリストが分析した強化された大豆の対照サンプルの結果を用いて決定した。対照サンプル抽出物をAAD12標準の3つのレベル025ngmg、05ngmg、4ngmg、および8ngmgで強化した。強化された抽出物の各レベルは、各ELISAプレートに三連で実行された。平均回収濃度、標準偏差STDEV、及び偏差の係数CVを、サンプルのそれぞれについて計算した。陽性サンプルV5の葉および飼料植物全体も同様に精度について試験した。平均予測濃度、標準偏差STDEV、及び偏差のパーセント係数CVを、各サンプルについて計算した。日内及び日間精度を計算した。この実験の目的は、AAD12タンパク質標準および植物抽出物中のAAD12タンパク質が、ELISAにおいて同様の全体的反応を示すことを確認することだった。これは、標準曲線の定量範囲から補間されたシングル抽出物の希釈からの結果が一致するかどうかを評価することによって、全てのトランスジェニック組織について行われた。全ての定量希釈からの補間結果の変動係数を、各組織の種類について計算した。種子、葉、飼料植物全体および根の組織を、偽陽性と偽陰性の発生について試験した。強化していない15個の対照サンプルと025ngmgで強化した15個のサンプルを、偽陽性と偽陰性率を決定するために、各組織について分析した。分析対象成分を含まないことが知られているサンプルで、確立されたLODまたはLODより上の残留物が発見された場合、偽陽性の結果が発生する。残渣がLODで強化したサンプル中に検出されない場合に偽陰性が発生する。ELISAの測定値はSOFTmaxPROソフトウェアプログラムを使用して分子動力マイクロプレートリーダーMolecularDynamicsMicroplateReaderで記録した。濃度のデータは、平均、パーセント誤差、統計的平均値、標準偏差、およびCVの計算のためにSAS、JMPまたはMicrosoftExcelに移した。イムノアッセイの検出制限LODが、ゼロ検体サンプルの応答からの統計的に有意な差を有する応答を与える検体濃度として定義されている。定量限界LOQ、またはアッセイの動作範囲は、許容可能な精度で一般的に決定することができる最高値と最低濃度として定義されている。本研究では、各組織におけるAAD12の決定のための標的LODおよびLOQは、アッセイパラメータ例えば、吸光度、バックグランド、信号対ノイズ比、および直線性の範囲など、マトリックス干渉、および標準曲線の濃度に基づいて、経験的に定義された。LODおよびLOQはまた、標準的な統計的アプローチにより決定した。確立されたガイドラインに従って、LODおよびLOQを05ngmgの回収の結果から標準偏差を用いて計算した。LOQを標準偏差の10倍10Sとして計算し、LODをマトリックスあたり5個のサンプルの最小の分析結果の標準偏差の3倍3Sとして算出した。各組織の計算結果ならびに標的LODおよびLOQを以下の表にまとめる。標的LODは全て大豆マトリックスについて05ngmgである。標的LOQは全ての大豆マトリックスについて10ngmgである。Cry1F、Cry1Ac、Cry34Ab1、Cry35Ab1、PAT、およびAAD1のようないくつかの関連タンパク質を、交差反応性について試験した。交差反応性は、これらのタンパク質について試験された濃度10000ngmLでは観察されなかった。マトリックス試験の結果を次の表にまとめる。はいは、全7個の標準濃度レベルの観測値と理論値との平均誤差率が15より大きいとき、標準曲線がマトリックスの影響を受けていることを表す。いいえは、マトリックス効果がないか、または全7個の標準濃度レベルの観測値と理論値との平均誤差率が15未満であることを表す。7個の標準濃度レベルのいずれかの観測値と理論平均値との間の15より大きい差がマトリックス効果を示すと考えられた。マトリックス効果は、1×スパイクマトリクスレベルで根では認められなかった。マトリックス効果は、V5葉、V10葉、飼料植物全体のスパイクマトリクスレベルの5倍のレベルにおいて見出されなかった。しかし、マトリックス効果は5倍のレベルで種において見出された。ダイズ組織におけるAAD12の定量のためには、少なくとも2倍希釈液が根について推奨され、少なくとも5倍希釈液がV5葉、V10葉および飼料用に推奨され、少なくとも10倍希釈液が種について推奨される。サンプル中の総AAD12タンパク質レベルの決定は、抽出効率を調べるために重要である。陽性サンプルを抽出緩衝液で5回連続して抽出し、各抽出物中のAAD12タンパク質濃度をELISA法で測定した。見かけの抽出効率は全て5つの抽出においてAAD12の合計量に対する最初の抽出におけるAAD12タンパク質の量に基づいていた。大豆組織からのAAD12タンパク質の抽出効率を下表に示す。飼料植物全体、根、種子、V5の葉、およびV10葉の抽出効率は、858~972であった。標準曲線のLOQ、中、高ポイントに等しいレベルで強化した場合の全ての組織からのAAD12の平均回収レベルを以下の表に示す。LOQレベルまたはそれ以上でスパイクした場合、V5葉、V10葉、および種子は、平均回収が67~120仕様の範囲内で67~100、および16あるいはそれ以下の分散のパーセント係数CVであった。アッセイの精度と耐久性を、AAD12タンパク質の4つのレベルが含まれているV5葉および飼料植物全体抽出物を用いて調べた。レベルは8ngmg、4ngmg、05ngmg、および025ngmgであった。アッセイの日内精度は、8、4、005、および025ngmgで強化されたV5葉抽出についてそれぞれ、63、108、96、および150より小さいか、それと同等であった。アッセイの日内精度は、8、4、05、および025ngmgで強化された飼料植物全体抽出物についてそれぞれ、35、131、101、および109より小さいか、それと同等であった。陽性V5葉および飼料のサンプルを、アッセイの堅牢性についても試験した。アッセイの日内精度は、V5葉および植物全体についてそれぞれ、97および197より小さいか、それと同等であった。全ての日およびアナリストにわたるアッセイ間精度は、8、4、05、および025ngmgで強化されたV5葉抽出物についてそれぞれ、46、101、64、および129であった。全ての日およびアナリストにわたるアッセイ間精度は、8、4、05、および025ngmgで強化された飼料抽出物についてそれぞれ、60、105、64、および101であった。全ての日およびアナリストにわたるアッセイ間耐久性は、陽性V5葉および飼料についてそれぞれ、113、および141であった。AAD12ELISAでの標準および試験物質の応答の等価性は、AAD12陽性の組織からの抽出物の8連続希釈までを使用して実証した。各組織抽出物について、希釈液の5つ以上が標準曲線の定量範囲内に入り、定量結果のCVは20未満であった。強化されていない対照サンプルマトリックスブランクおよび025ngmgで強化したサンプルLOD05ngmgを、偽陽性および偽陰性率を決定するために分析した。本研究で分析した強化されていない対照サンプルからの偽陽性およびLODで強化されたサンプルから報告された偽陰性はなかった。要約すると、本方法は10~80ngmgの乾燥重量DWの濃度範囲にわたって検証され、10ngmgDWの全て大豆組織において有効定量限界LOQ、および05ngmgDWの全ての大豆組織中において検出限界LODを有していた。AAD12タンパク質は、全ての組織から許容可能なレベルで回収された。以前の研究で試験された非標的タンパク質と比較した場合、有効アッセイは、AAD12タンパク質に特異的である。ダイズ組織におけるAAD12タンパク質の定量のために、2倍以上の希釈が根について推奨され、5倍以上の希釈がV5葉、V10葉、および飼料用に推奨され、10倍以上の希釈液が種について推奨される。さらに、AAD12タンパク質が効率的に全ての大豆組織から抽出された。アッセイは許容可能な精度accuracyと精密度precisionを有することが示され、偽陽性や偽陰性の結果は標的LOD未満では見られなかった。このAAD12ELISA法は、大豆組織におけるAAD12タンパク質の定量的な測定に適していることが実証された。"