免疫原性組成物であって、a.Nef、Polおよび/またはGagから選択される1種以上の抗原を含んでなる1種以上のポリペプチドであって、該1種以上の抗原は1種以上のクレードの1種以上のHIV-1株から選択されるものと、b.Th1免疫応答の優先的誘導物質であるアジュバントとを含んでなる、該免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる1種以上のクレードのHIV-1株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための、免疫原性組成物。Nefを含んでなる1種以上のポリペプチドを含んでなる、請求項1に記載の免疫原性組成物。Nefが、クレードA、B、C、D、E、F、G、H、J、Kに属するHIV-1株、またはHIV-1組換え型流行株CRF由来である、請求項2に記載の免疫原性組成物。Nefが、クレードBに属するHIV-1株由来である、請求項2または請求項3に記載の免疫原性組成物。Polを含んでなる1種以上のポリペプチドを含んでなる、請求項1~4に記載の免疫原性組成物。PolがRT断片である、請求項5に記載の免疫原性組成物。Polが、クレードA、B、C、D、E、F、G、H、J、Kに属するHIV-1株、またはHIV-1組換え型流行株CRF由来である、請求項5または請求項6に記載の免疫原性組成物。Polが、クレードBに属するHIV-1株由来である、請求項5~7のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。Gagを含んでなる1種以上のポリペプチドを含んでなる、請求項1~8のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。Gagが、クレードA、B、C、D、E、F、G、H、J、Kに属するHIV-1株、またはHIV-1組換え型流行株CRF由来である、請求項9に記載の免疫原性組成物。Gagが、クレードBに属するHIV-1株由来である、請求項9または請求項10に記載の免疫原性組成物。Gagがp17である、請求項9~11のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。p17が、クレードA、B、C、D、E、F、G、H、J、Kに属するHIV-1株、またはHIV-1組換え型流行株CRF由来である、請求項12に記載の免疫原性組成物。p17が、クレードBに属するHIV-1株由来である、請求項12または請求項13に記載の免疫原性組成物。Gagがp24である、請求項9~14のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。p24が、クレードA、B、C、D、E、F、G、H、J、Kに属するHIV-1株、またはHIV-1組換え型流行株CRF由来である、請求項15に記載の免疫原性組成物。p24が、クレードBに属するHIV-1株由来である、請求項15または請求項16に記載の免疫原性組成物。Gagが、p17およびp24の両方を、独立したタンパク質抗原成分としてまたは互いに融合された状態で含んでなる、請求項9~17のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。p17およびp24が互いに融合され、異種アミノ酸配列によって隔てられる、請求項18に記載の免疫原性組成物。部分aの、2種以上のポリペプチドを含んでなる、請求項1~19のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、免疫学的活性サポニン画分および/またはリポ多糖類および/または免疫刺激性オリゴヌクレオチド:から選択される1種以上の成分を含んでなる、請求項1~20のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが免疫学的活性サポニン画分およびリポ多糖類を含んでなる、請求項1~21のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記免疫学的活性サポニン画分がQS21である、請求項20または請求項21に記載の免疫原性組成物。前記リポ多糖類がリピドA誘導体である、請求項20~22のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記リピドA誘導体が3D-MPLである、請求項23に記載の免疫原性組成物。アジュバントがステロールを含んでなる、請求項1~25のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記ステロールがコレステロールである、請求項25に記載の免疫原性組成物。アジュバントがリポソーム担体を含んでなる、請求項1~27のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントがサポニンおよびステロールを含んでなり、サポニン:ステロールの割合が1:1~1:100w/wである、請求項1~27のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。サポニン:ステロールの割合が1:1~1:10w/wである、請求項28に記載の免疫原性組成物。サポニン:ステロールの割合が1:1~1:5w/wである、請求項28または請求項29に記載の免疫原性組成物。アジュバントがサポニンおよびリポ多糖類を含んでなり、サポニン:リポ多糖類の割合が1:1である、請求項1~30のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントがリポ多糖類を含んでなり、該リポ多糖類が投与量当たり1~60μgの量で存在する、請求項1~32のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記リポ多糖類が投与量当たり50μgの量で存在する、請求項33に記載の免疫原性組成物。前記リポ多糖類が投与量当たり25μgの量で存在する、請求項33に記載の免疫原性組成物。アジュバントがサポニンを含んでなり、該サポニンが投与量当たり1~60μgの量で存在する、請求項1~32のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記サポニンが投与量当たり50μgの量で存在する、請求項36に記載の免疫原性組成物。前記サポニンが投与量当たり25μgの量で存在する、請求項36に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、0.5mL投与量当たり0.025~2.5mg、0.05~1.5mg、0.075~0.75mg、0.1~0.3mgまたは0.125~0.25mg例えば、0.2~0.3mg、0.1~0.15mg、0.25mgまたは0.125mgのステロール例えば、コレステロールを含んでなる、請求項1~32のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、0.5mL投与量当たり5~60μg、10~50μgまたは20~30μg例えば、5~15μg、40~50μg、10μg、20μg、30μg、40μgまたは50μgのリピドA誘導体例えば、3D-MPLを含んでなる、請求項1~32のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、0.5mL投与量当たり5~60μg、10~50μgまたは20~30μg例えば、5~15μg、40~50μg、10μg、20μg、30μg、40μgまたは50μgのサポニン例えば、QS21を含んでなる、請求項1~32のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが水中油型エマルションを含んでなる、請求項1~27のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。水中油型エマルションがスクアレンおよび/またはアルファトコフェロールを含んでなる、請求項42に記載の免疫原性組成物。水中油型エマルションが代謝性水中油型エマルションである、請求項41または請求項42に記載の免疫原性組成物。水中油型エマルションがTween80などの乳化剤を含んでなる、請求項42~44のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントがサポニンおよびリポ多糖類を含んでなる、請求項42~45のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、サポニンおよびリポ多糖類を、1:10~10:1w/wという範囲のサポニン:リポ多糖類の割合で含んでなる、請求項46に記載の免疫原性組成物。アジュバントがサポニンおよびステロールを含んでなる、請求項42~46のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、サポニンおよびステロールを、1:1~1:20w/wの範囲のサポニン:ステロールの割合で含んでなる、請求項48に記載の免疫原性組成物。アジュバントがサポニンおよび代謝性オイルを含んでなる、請求項42~49のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、サポニンおよび代謝性オイルを、1:1~250:1w/wの範囲の代謝性オイル:サポニンの割合で含んでなる、請求項50に記載の免疫原性組成物。アジュバントがアルファトコフェロールを含んでなる、請求項42~51のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、0.5mL投与量当たり0.5~15mg、1~13mg、2~11mg、4~8mgまたは5~6mg例えば、2~3mg、5~6mgまたは10~11mgの代謝性オイルスクアレンなどを含んでなる、請求項42~52のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、0.5mL投与量当たり0.1~10mg、0.3~8mg、0.6~6mg、0.9~5mg、1~4mgまたは2~3mg例えば、0.9~1.1mg、2~3mgまたは4~5mgの乳化剤Tween80などを含んでなる、請求項42~52のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、0.5mL投与量当たり0.5~20mg、1~15mg、2~12mg、4~10mg、5~7mg例えば、11~13mg、5~6mgまたは2~3mgのトコールアルファトコフェロールなどを含んでなる、請求項42~52のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、0.5mL投与量当たり5~60μg、10~50μgまたは20~30μg例えば、5~15μg、40~50μg、10μg、20μg、30μg、40μgまたは50μgのリピドA誘導体例えば、3D-MPLを含んでなる、請求項42~52のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、0.5mL投与量当たり0.025~2.5mg、0.05~1.5mg、0.075~0.75mg、0.1~0.3mgまたは0.125~0.25mg例えば、0.2~0.3mg、0.1~0.15mg、0.25mgまたは0.125mgのステロール例えば、コレステロールを含んでなる、請求項42~52のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、0.5mL投与量当たり5~60μg、10~50μgまたは20~30μg例えば、5~15μg、40~50μg、10μg、20μg、30μg、40μgまたは50μgのサポニン例えば、QS21を含んでなる、請求項42~52のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが金属塩およびリピドA誘導体を含んでなる、請求項1~21のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、0.5mL投与量当たり100~750μg、200~500μgまたは300~400μgのAlを、例えば、リン酸アルミニウムとして含んでなる、請求項59に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、0.5mL投与量当たり5~60μg、10~50μgまたは20~30μg例えば、5~15μg、40~50μg、10μg、20μg、30μg、40μgまたは50μgのリピドA誘導体例えば、3D-MPLを含んでなる、請求項59または請求項60に記載の免疫原性組成物。アジュバントが、CpGモチーフを含んでなる免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項1~61のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中に存在する1種以上のクレードのHIV-1株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための、請求項1~62のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードが、クレードA、B、C、D、E、F、G、H、J、K、またはHIV-1組換え型流行株CRFから選択される、請求項63に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中のHIV-1クレードがクレードBである、請求項63または請求項64に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる1種以上のクレードが、クレードA、B、C、D、E、F、G、H、J、K、またはHIV-1組換え型流行株CRFから選択される、請求項1~65のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる1種以上のクレードが、クレードAまたはCから選択される、請求項1~66のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる1種以上のクレードが、クレードAおよびCである、請求項1~67のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株に対する体液性免疫応答の誘導に使用するための、請求項1~68のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の前記1種以上のクレードのHIV-1株に対する体液性免疫応答の誘導に使用するための、請求項69に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株に感染した個体への長期未発症者状態の付与に使用するための、請求項1~70のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の前記1種以上のクレードのHIV-1株に感染した個体への長期未発症者状態の付与に使用するための、請求項71に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株に対する多サイトカイン産生抗ウイルスCD4T細胞の誘導に使用するための、請求項1~72のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の前記1種以上のクレードのHIV-1株に対する多サイトカイン産生抗ウイルスCD4T細胞の誘導に使用するための、請求項73に記載の免疫原性組成物。CD4T細胞が、IL2、IFNγおよびTNFαのうちの2種以上を産生する、請求項73または請求項74に記載の免疫原性組成物。CD4T細胞がIL2およびIFNγを産生する、請求項73~75のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。CD4T細胞がIL2およびTNFαを産生する、請求項73~75のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。CD4T細胞がIFNγおよびTNFαを産生する、請求項73~75のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。CD4T細胞がIL2、IFNγおよびTNFαを産生する、請求項73~75のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。CD4T細胞がCD40Lを発現する、請求項73~79のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株に感染した個体における漸進的CD4T細胞減少の防止に使用するための、請求項1~80のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の前記1種以上のクレードのHIV-1株に感染した個体における漸進的CD4T細胞減少の防止に使用するための、請求項81に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株に感染した個体におけるウイルス保有者の減少または消滅に使用するための、請求項1~82のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の前記1種以上のクレードのHIV-1株に感染した個体におけるウイルス保有者の減少または消滅に使用するための、請求項83に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株に感染した個体における、多数で長期間効果のある数のHIV-1特異的多機能性CD4T細胞の誘発に使用するための、請求項1~84のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の前記1種以上のクレードのHIV-1株に感染した個体における、多数で長期間効果のある数のHIV-1特異的多機能性CD4T細胞の誘発に使用するための、請求項85に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株に感染した個体におけるウイルス血症の制御または減少に使用するための、請求項1~86のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の前記1種以上のクレードのHIV-1株に感染した個体におけるウイルス血症の制御または減少に使用するための、請求項87に記載の免疫原性組成物。抗原のうちの2種、3種、4種以上が、融合タンパク質を形成するように融合される、請求項1~88のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。融合タンパク質が、Polと融合されたGagまたはGagと融合されたPolを含んでなる、請求項89に記載の免疫原性組成物。融合タンパク質が、Nefと融合されたPolまたはPolと融合されたNefを含んでなる、請求項89または請求項90に記載の免疫原性組成物。融合タンパク質が、Gagと融合されたNefまたはNefと融合されたGagを含んでなる、請求項89~91のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。Gagがp17および/またはp24である、請求項90または請求項92に記載の免疫原性組成物。PolがRTである、請求項90または請求項91に記載の免疫原性組成物。抗原が、Nef、RT、p17およびp24を任意の順序で含んでなる融合タンパク質を形成するように融合される、請求項1~94のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。抗原が、p24-RT-Nef-p17を含んでなる融合タンパク質を形成するように融合される、請求項1~95のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。融合タンパク質中の抗原が、2種、3種または4種の異なるHIV-1クレードのHIV-1株由来である、請求項89~96のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。融合タンパク質中の抗原の総てが、同じHIV-1クレードのHIV-1株または株群由来である、請求項89~96のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。抗原を含んでなる1種以上の非融合ポリペプチドをさらに含んでなる、請求項89~98のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。非融合ポリペプチド中の抗原が、融合タンパク質中の抗原の少なくとも1種と同じクレードのHIV-1株由来である、請求項99に記載の免疫原性組成物。非融合ポリペプチド中の抗原が、融合タンパク質中の1種以上のクレードとは異なるHIV-1株由来である、請求項99に記載の免疫原性組成物。非融合ポリペプチドがEnvを含んでなる、請求項99~101のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。非融合ポリペプチドが、gp120、gp140またはgp160のうちの1種以上を含んでなる、請求項99~102のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上の抗原のうちの1種が、クレードBのHIV-1株由来である、請求項1~103のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中に2種の抗原が存在する場合、両方の抗原がクレードBのHIV-1株由来である、請求項1~104のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中に3種の抗原が存在する場合、3種の抗原総てがクレードBのHIV-1株由来である、請求項1~105のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中に4種の抗原が存在する場合、4種の抗原総てがクレードBのHIV-1株由来である、請求項1~106のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物の1回投与量における各抗原の総量が、0.5~25μg、2~20μg、5~15μgまたはおよそ10μgである、請求項1~107のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物の1回投与量における融合タンパク質の総量が10μgである、請求項95~98に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物の1回投与量における非融合ポリペプチドの総量が20μgである、請求項99~103に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物の1回投与量における全抗原の総量が、0.5~50μg、2~40μg、5~30μg、7~20μgまたはおよそ30μg、およそ20μgまたはおよそ10μgである、請求項1~110のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株に対する抗ウイルス免疫応答の長期記憶の誘導に使用するための、請求項1~111のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の前記1種以上のクレードのHIV-1株に対する抗ウイルス免疫応答の長期記憶の誘導に使用するための、請求項112に記載の免疫原性組成物。持続性抗ウイルスCD4T細胞の誘導に使用するための、請求項1~113のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。CD4T細胞が少なくとも6ヶ月間存続する、請求項114に記載の免疫原性組成物。CD4T細胞が、6~24ヶ月間または9~18ヶ月間、例えば、12ヶ月間存続する、請求項114~115のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための請求項1~116のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、該組成物が対象に2回または3回投与として最初に投与され、ここで、該投与は、2週間~3ヶ月、好ましくは1ヶ月の期間の間隔がおかれる、免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための請求項1~117のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、該組成物が対象に例えば、追加免疫として6~24ヶ月または9~18ヶ月おきに、例えば、年1回投与される、免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための請求項1~117に記載の免疫原性組成物であって、該組成物が対象に例えば、追加免疫として6ヶ月または1年の間隔で投与される、免疫原性組成物。請求項118または請求項119に記載の免疫原性組成物であって、前記対象への該組成物の後の投与が同じ対象への該組成物の先行投与の免疫応答を高める、免疫原性組成物。免疫原性組成物中の1種以上のHIV-1クレードとは異なる前記1種以上のクレードのHIV-1株による疾患または感染症の治療または予防に使用するための請求項1~120のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、該組成物がプライムブースト治療計画の一環として使用される、免疫原性組成物。初回免疫量である、請求項121に記載の免疫原性組成物。追加免疫量である、請求項121に記載の免疫原性組成物。2回以上の初回免疫量および/または追加免疫量が投与される、請求項121~123に記載の免疫原性組成物。ワクチン組成物である、請求項1~124のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。請求項1~125に記載のHIV-1株による疾患または感染症の治療または予防のための医薬の製造における、請求項1~124に記載の免疫原性組成物または請求項125に記載のワクチンの使用。請求項1~125に記載のHIV-1疾患または感染症を治療または予防する方法であって、請求項1~124に記載の免疫原性組成物または請求項125に記載のワクチンを対象に投与する工程を含む、方法。以下の実施例およびデータによって本発明を説明するが、それらは本発明を限定するものではない。1.アジュバント調製物有機溶媒中の脂質卵黄由来または合成のホスファチジルコリンなどおよびコレステロールおよび3D-MPLの混合物を真空下あるいは不活性ガス流下で乾燥させた。次いで、水溶液リン酸緩衝生理食塩水などを加え、脂質が総て懸濁状態になるまで容器を攪拌した。次いで、この懸濁液を、リポソームサイズが約100nmに減少するまでマイクロ流動化し、その後、0.2μmフィルターで滅菌濾過した。この工程の代わりに押し出しまたは超音波処理を行ってもよい。典型的には、コレステロール:ホスファチジルコリン比は1:4w/wであり、水溶液を加え、10mg/mlの最終コレステロール濃度を得た。リポソームはおよそ100nmのサイズを有し、SUV小さな一枚膜リポソームと呼ぶ。リポソームはそれら自体が長期にわたって安定しており、融合能力を有していない。滅菌した多量のSUVをPBSに加えた。PBS組成は、Na2HPO4:9mM;KH2PO4:48mM;NaCl:100mMpH6.1であった。QS21水溶液をSUVに加えた。3D-MPLおよびQS21の終濃度は、それぞれ、100μg/mlであった。成分の各添加の間に、中間生成物を5分間攪拌した。pHを確認し、必要に応じてNaOHまたはHClを用いて6.1/-0.1に調整した。2.HIV-1抗原の調製2.1HIV-1p24-RT-Nef-p17融合物F4およびF4のコドン最適化型coF4coの構築および発現。2.1.1F4の非コドン最適化型HIV-1gagp24キャプシドタンパク質およびp17基質タンパク質、逆転写酵素およびNefタンパク質を、バクテリオファージT7プロモーターpET発現系の制御下で、大腸菌B834株B834DE3は、BL21DE3のメチオニン要求性親株であるにおいて発現させた。それらを、4種のタンパク質の完全配列を含有する単一融合タンパク質として発現させた。成熟p24コード配列はHIV-1BH10分子クローンに由来し、成熟p17配列およびRT遺伝子はHXB2に由来し、Nef遺伝子はBRU分離株に由来する。誘導後、組換え細胞は、総タンパク質の10になる著しいレベルのp24-RT-Nef-p17融合物を発現した。細胞を22°Cで増殖させ誘導した場合、p24-RT-Nef-p17融合タンパク質は主として細菌溶解物の可溶性画分凍結/融解後でもに限定され。30°Cで増殖させた場合、およそ30の組換えタンパク質が不溶性画分に存在した。融合タンパク質p24-RT-Nef-p17は、1136個のアミノ酸で構成されており、およそ129kDaの分子量を有する。全長タンパク質はSDSゲル上で約130kDaに移動する。このタンパク質は、そのアミノ酸配列に基づいて理論等電点pI7.96を有し、これは2D-ゲル電気泳動によって確認される。組換えプラスミドの詳細:名称:pRIT15436または研究室における名称pET28b/p24-RT-Nef-p17宿主ベクター:pET28bレプリコン:colE1選択:カナマイシンプロモーター:T7インサート:p24-RT-Nef-p17融合遺伝子。組換えタンパク質の詳細:p24-RT-Nef-p17融合タンパク質:1136個のアミノ酸。N末端-p24:232a.a.-ヒンジ:2a.a.-RT:562a.a.-ヒンジ:2a.a.-Nef:206a.a.-P17:132a.a.-C末端ヌクレオチドおよびアミノ酸配列:ヌクレオチド配列[配列番号7]p24配列を太字で示しているNef配列には下線を施している囲み:遺伝子構築によって導入されたヌクレオチドアミノ酸配列[配列番号8]P24配列:アミノ酸1-232太字RT配列:アミノ酸235-795Nef配列:アミノ酸798-1002P17配列:アミノ酸1005-1136囲み:遺伝子構築によって導入されたアミノ酸Kリジン:トリプトファンWの代わり。酵素活性をなくすために導入された突然変異。組換えタンパク質の発現:pETプラスミドにおいて、標的遺伝子p24-RT-Nef-p17は強いバクテリオファージT7プロモーターの制御下にある。このプロモーターは、大腸菌RNAポリメラーゼによって認識されず、宿主細胞におけるT7RNAポリメラーゼの起源に依存する。B834DE3宿主細胞はlacUV5の制御下にあるT7RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含み、その発現は細菌培養物へのIPTGの添加によって誘導される。前培養物を、振盪フラスコ中、37°Cで対数増殖期中期A620:0.6まで増殖させ、その後4°Cで一晩保存した定常期培養物を避けるため。培養物を、1グルコースおよび50μg/mlカナマイシンを補給したLBT培地で増殖させた。増殖培地へのグルコースの添加は、基礎組換えタンパク質発現を減少させる利点を有するcAMP媒介性lacUV5プロモーター抑制を回避する。4°Cで一晩保存した培養物10mlを用いて、カナマイシン含有LBT培地グルコース不含200mlに接種した。培養物を30°Cおよび22°Cで増殖させ、O.D.620が0.6に達したときに、IPTGを添加した最終濃度1mM。培養物をさらに3時間、5時間および18時間一晩インキュベートした。誘導前および誘導から3時間後、5時間後および18時間後にサンプルを採取した。抽出物の調製は以下の通りであった:細胞ペレットを破砕バッファー中に理論O.D.10に懸濁し、フレンチプレスに20.000psiまたは1250バールbarsで4回通すことによって破壊した。粗抽出物Tを20.000gで30分間遠心分離機にかけ、可溶性S画分と不溶性P画分を分離した。破砕バッファー:50mMTris-HCLpH8.0、1mMEDTA、1mMDTTプロテアーゼ阻害剤カクテル一式/Boerhinger。SDS-PAGEおよびウエスタンブロット解析:不溶性ペレットP、上清Sおよび粗抽出物Tに対応する画分を10還元SDS-PAGEにおいて泳動した。p24-RT-Nef-p17組換えタンパク質をクーマシーブルー染色およびウエスタンブロットWBにより検出した。クーマシー染色:p24-RT-Nef-p17タンパク質は以下のように現れる:±130kDa付近に1つのバンド算出MWと一致しているMW理論値:128.970ダルトンMW見かけ値:130kDaウエスタンブロット解析:試薬=-RTp66/p51に対するモノクローナル抗体ABIから購入希釈度:1/5000-アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート抗マウス抗体希釈度:1/7500発現レベル:22°Cで20時間誘導後に総タンパク質の最大10を示す図9Aを参照のこと非常に強いp24-RT-Nef-p17特異的バンド。組換えタンパク質溶解性:新鮮な細胞抽出物T画分、S画分、P画分:22°C/20時間の増殖/誘導を行った場合、ほぼ総てのp24-RT-Nef-p17融合タンパク質が細胞抽出物の可溶性画分において回収される図9A。30°C/20時間の増殖/誘導を行った場合、およそ30のp24-RT-Nef-p17タンパク質が不溶性画分に存在する図9A。凍結/融解S2画分、P2画分:可溶性S1画分22°Cで20時間の誘導を-20°Cで保存した。融解し、20.000g/30分間で遠心分離機にかけた:S2およびP21/10容量に再懸濁したDTTを含む破砕バッファー:ほぼ総てのp24-RT-Nef-p17融合タンパク質は依然として可溶性であった1~5のみ沈降した図9Bを参照のことDTTを含まない破砕バッファー:85~90のp24-RT-Nef-p17は依然として可溶性であった図9BF4タンパク質を、下記で確認される精製方法を用いて精製した。2.1.2F4のコドン最適化型以下のポリヌクレオチド配列は、そのコドン使用頻度が、大腸菌において高度に発現される遺伝子におけるコドン使用頻度と類似するようにコドン最適化されている。そのアミノ酸配列は、F4の非コドン最適化型について上に示したものと同一である。F4coのヌクレオチド配列:[配列番号9]p24配列を太字で示しているNef配列には下線を施している囲み:遺伝子構築によって導入されたヌクレオチドF4の非コドン最適化型に関して用いた手法をコドン最適化配列に適用した。組換えプラスミドの詳細:名称:pRIT15513研究室における名称:pET28b/p24-RT-Nef-p17宿主ベクター:pET28bレプリコン:colE1選択:カナマイシンプロモーター:T7インサート:p24-RT-Nef-p17融合遺伝子、コドン最適化型F4のコドン最適化型遺伝子を、B834DE3株のrecA-誘導体である大腸菌BLRDE3細胞において発現させた。RecA突然変異は推定されるλファージ生産を防止する。前培養物を、振盪フラスコ中、37°Cで対数増殖期中期A620:0.6まで増殖させ、その後4°Cで一晩保存した定常期培養物を避けるため。培養物を、1グルコースおよび50μg/mlカナマイシンを補給したLBT培地で増殖させた。増殖培地へのグルコースの添加は、基礎組換えタンパク質発現を減少させる利点を有するcAMP媒介性lacUV5プロモーター抑制を回避する。4°Cで一晩保存した培養物10mlを用いて、カナマイシン含有LBT培地グルコース不含200mlに接種した。培養物を37°Cで増殖させ、O.D.620が0.6に達したときに、IPTGを添加した最終濃度1mM。培養物をさらに19時間一晩、22°Cでインキュベートした。誘導前および誘導から19時間後にサンプルを採取した。抽出物の調製は以下の通りであった:細胞ペレットを、サンプルバッファー中に理論O.D.10に再懸濁し、煮沸し、SDS-PAGEに直接ロードした。SDS-PAGEおよびウエスタンブロット解析:粗抽出物サンプルを10還元SDS-PAGEにおいて泳動した。p24-RT-Nef-p17組換えタンパク質をクーマシーブルー染色図10およびウエスタンブロットにより検出する。クーマシー染色:p24-RT-Nef-p17タンパク質は以下のように現れる:±130kDa付近に1つのバンド算出MWと一致しているMW理論値:128.967ダルトンMW見かけ値:130kDaウエスタンブロット解析:試薬=-ウサギポリクローナル抗RTウサギPO3L16希釈度:1/10.000-ウサギポリクローナル抗Nef-Tatウサギ388希釈度1/10.000-アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体希釈度:1/750022°Cで19時間かけての誘導後に、組換えBLRDE3細胞は、総タンパク質の10~15に及ぶ非常に高いレベルでF4融合物を発現した。天然遺伝子由来のF4と比較して、コドン最適化遺伝子のF4組換え産物プロフィールは少し単純化されている。60kDaの主要なF4関連バンドだけでなく、それより小さい弱いバンドも消失した図10を参照のこと。2.2F4coGMPロットの調製前培養物を、大腸菌株B1977の凍結種培養物を用いて調製した。この株は、F4をコードするコドン最適化配列F4coを含有するpET28b誘導体で形質転換したBLRDE3株である。種培養能はおよそ1E10コロニー形成単位/mlと決定された。種培養物を室温に融解し、500μlを用いて、50μg/mlカナマイシンを補給した前培養培地400mlが入った2リットルエルレンマイヤーフラスコバッフルなしに接種した出典、Zabriskieetalから、この文献は引用することにより本明細書の一部とされる。次いで、接種したフラスコを37°C±1°Cおよび200rpmでインキュベートしたNewBrunswickScientific社製Innova4430、ストローク1インチを使用。650nmでの光学濃度OD650nmが2に達したときこれはおよそ5時間30分のインキュベーションに相当するに前培養を停止させた。停止直後に前培養物を接種に用いた。大型発酵槽への接種が必要である場合、複数のバッチの前培養物を合わせてもよい。2.3F4cop24-RT-Nef-p17の精製-大腸菌株B19772.3.1概要融合構築物F4coを精製するために、2つのクロマトグラフィー工程ならびに最終バッファー交換およびタンパク質リフォールディングのためのダイアフィルトレーションを含む精製プロセスを使用することができる。そのような方法は以下の主要工程を含む:OD90での細胞ペーストホモジナイゼーションおよび8M尿素の添加CMhyperZでの陽イオン交換クロマトグラフィーポジティブモードQAE550Cでの陰イオン交換クロマトグラフィーポジティブモードタンジェンシャルフローフィルトレーション滅菌濾過1.5lホモジネートOD90の最終開発規模で3つの再現性バッチを生産することに成功した。3つの異なる細胞培養収穫物から得られた一貫した結果によって精製プロセスのロバスト性robustnessが立証された。3つのロットによって1.3~1.6gの間のF4coが生産された。全長産物の純度は、産物の不均一性から約93~94であったクーマシーブルー染色したSDSゲルの密度スキャン。下に、3つの再現性バッチを用いて得られた結果を示す。3.3.2解析方法ローリー法を用いて総タンパク質濃度を決定した。SDS-PAGEについては、還元または非還元SDS-PAGE用サンプルバッファー/-β‐メルカプトエタノールでサンプルを調製し、95°Cで5分間加熱した。1mm厚の、プレキャストNuPageゲルまたはCriterionXTゲルのいずれかを用い、4~12SDS-ポリアクリルアミドゲル上で150Vで90分間、タンパク質を分離した。クーマシーブルーR250を用いてタンパク質を可視化した。抗F4ウエスタンブロットについては、染色していないSDSゲルからタンパク質をニトロセルロース膜に4°Cで70Vで2時間または30Vで一晩、転写した。抗F4抗体を用いてF4を検出した。アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体を一次抗体に結合させ、タンパク質バンドを、基質としてBCIPおよびNBTを用いて可視化した。抗大腸菌ウエスタンブロットについては、上記のように、SDS-PAGEによってタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に転写した。残りの宿主細胞タンパク質を、ポリクローナル抗大腸菌抗体を用いて検出した。上記のように、アルカリ性ホスファターゼ反応を用いてタンパク質バンドを可視化した。サンプルを、無菌状態のエッペンドルフカップ中で異なる温度通常、-20°C、4°C、RT、30°Cにおいて安定性試験に付した。サンプルを指定時間インキュベートし、その後、F4分解を検出するために還元性条件においてまたは凝集体を検出するために非還元性条件において、SDS-PAGEにより解析した。分析的SECについては、分析用Superdex200HR10/30カラムにおいて10mMTrisバッファーpH8.5-0.4Mアルギニン-10mM亜硫酸ナトリウム-1mMEDTAにより流速0.5ml/分でタンパク質を分離した。タンパク質の溶出を280nmにおいてオンラインでモニタリングした。LAL試験を採用し、BioWhittaker社製のキットを用いて精製バルク中のエンドトキシンを測定した。大腸菌055:B5エンドトキシンを標準として用いた。96ウェル分光光度計Spectramax250、MolecularDevicesにより37°Cで反応曲線を記録し、それらのデータを、SoftmaxProを使用して解析した。Roche社製の尿素/アンモニア試験キットを用いて残留尿素を測定した。分光光度計UltraspecII、Pharmaciaを使用して、NADHの吸光度を340nmにおいてモニタリングした。3.3.3精製プロセス2.3.4再現性ロットの結果追跡調査典型的な例としてロット1の精製追跡調査を図11に示す。F4co陽性画分だけをこのSDS-PAGEおよびそれに対応する抗F4ウエスタンブロットにおいて解析した。図3Aのゲルでは、タンパク質の純度が高まるにつれて約130kDaに位置する全長F4coバンドの増加が見られる。レーン2はホモジネートにおけるF4coの割合を示している。F4coはCM溶出液中に回収され、多くのHCPは消滅したレーン3。最終産物純度は第2の精製工程後にQAE溶出液においてすでに得られたレーン4。F4coは限外濾過後に保持液において変化しておらずレーン5、レーン6は精製産物を表している。産物の不均一性からSDSゲルにおいていくつかの低分子量バンドが目に見える;これらのバンドは図3Bの抗F4coウエスタンブロットにおいても検出された。純度産物の一貫性を確認するために、3つの精製バルクを、CB染色したSDSゲルおよび抗F4ウエスタンブロットにおいて比較し、それらを図12Aおよび図12Bに示している。加えて、各タンパク質に対して向けられる抗体を用いてウエスタンブロットを行った図13A~図13Dの抗p24、抗RT、抗Nef-Tatおよび抗p17-His。SEC分析分析用Superdex200カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーSEC分析により3つの精製バルクをさらに比較した。3つのクロマトグラムは下記図14において比較している。図12AのSDSゲルならびに図12Bおよび図13A~図13Dのウエスタンブロットにおいて明らかなF4coのタンパク質パターンの類似性だけでなく、図14のSECカラムからのほぼ同一の溶出プロフィールからも、非常に良好なロット間一貫性が示される。全長F4coバンドおよび低分子量LMWバンドはSDSゲルおよびウエスタンブロットにおいて同じような強度で現れる。ゲルにおいて目に見えるLMWバンドは明らかに産物に関連するものである:それらは、抗F4抗体および/または各タンパク質に対して向けられる抗体によって認識されるが、下記図15の抗大腸菌ウエスタンブロットでは検出されなかった。抗大腸菌ウエスタンブロットは、各精製バルクのレーンにつき10μgのタンパク質を用いて行った。可視バンドの不在は産物の純粋性のさらなる指標であり、それによってSDSゲルにおける可視バンドは産物に関連するものであることが示される。標準0.1~1μgホモジネートとの比較によって、3つの精製バルク総てにおいて残留HCP混入は一貫して1未満であったことが示される。まとめると、これらの総てのデータによって、産物の純粋性および不純物の不在だけでなく、F4coの不均一性もまた示される。重要なことは、それらのデータが異なる発酵バッチからの精製材料の優れたロット間一貫性を示しているということである。回収および収率各精製工程後のF4coの回収率は、CB染色したSDSゲルおよび総タンパク質の回収ローリー試験によって測定されたタンパク質濃度に基づいて評価した。図16では、例としてロット3の生産中に採取された全画分を示している。ゲル上に置くサンプル容量は、各採取画分の容量と同じにし、図16のレーン2ホモジネート容量と直接関係する。従って、全長F4coバンドの密度の目視検査によって回収率の評価が可能である。SDSゲルでは、レーン2のホモジネートおよび初期F4co含量を示す。CMカラムは、非清澄化ホモジネートから総てのF4coを捕捉したが、一方、膨大な量のHCPは、pH7.0ではその樹脂と相互作用せず、FTでは消滅したレーン3。前溶出液ではわずかな損失が観察され、それによって産物パターンは単純化され、HCPの除去は向上した。全長F4coは、350mMNaClを含むCM溶出液においてほとんど定量的に回収されたレーン5。F4coについての損失がほとんどないことが以下の工程で検出された。QAEカラムのFTおよび前溶出液ではさらなるHCPバンドおよびLMWF4coバンドの除去が見られるレーン7およびレーン8。QAE溶出液では高いF4co回収率および最終産物純度が得られたレーン9。限外濾過工程後に多少の産物損失があることに気づく。この損失は約10~15と評価され、濾液レーン11およびレーン12では著しい量のタンパク質が認められなかったことからこれはUF膜上へのタンパク質吸着によって説明することができた。これらのSDSゲルに基づいて、全体的なF4co回収率は3つのロット総てにおいて50より高いようであった。3.ヒト被験者におけるF4の免疫原性3.1方法論本実施例では、HIV-1ワクチン候補は、投与量当たり10μg、30μgまたは90μgのF4組換えタンパク質を有効成分として含み、それにAS01Bをアジュバントとして添加するかまたは注射水WFIを用いて再構成した。ワクチン抗原は、スクロース、EDTA、アルギニン、ポリソルベート80および亜硫酸ナトリウムを含むリン酸バッファー中にF4抗原を含有する凍結乾燥させたペレットとして調製した。AS01Bリポソームに基づくアジュバント系は50μgMPLおよび50μgQS21を含み、上記実施例1に従って調製した。F4抗原を含有する凍結乾燥画分ならびにAS01Bアジュバント系またはWFIを含有する液体画分は、いずれも単回投与用3mlガラスバイアルで与え、注射直前にワクチン投与者が再構成した。バイアル内容物の溶解後に、再構成されたワクチン溶液0.5mlを筋肉内投与用シリンジに吸引した。参加者は、別のHIV-1ワクチン研究にこれまでに参加したことがなく、またはMPLを受けたことがない、HIV-1感染症のリスクが低い18~40歳の健常な成人男女であった。被験者は、初回ワクチン接種前8週間以内の血清スクリーニング総ての検査はAbbottAxSYMでにおいてHBVHBc、C型肝炎ウイルスHCV、HIV-1およびHIV-2のコア抗原に対する抗体に対して血清反応陰性であり、かつHBV表面抗原HBsAgおよびHIV-1p24抗原に対して陰性であることが必要であった。ClinicalTrials.govの登録事項に詳述されているとおり、本研究への登録には標準的な適格基準を用いた。180名の被験者をアジュバント添加群とアジュバント非添加群との間で5:1に無作為に割り付けた。各群50名の被験者からなる3つの群は、AS01B中10μg、30μgまたは90μgのF4からなる漸増用量を受け、各群10名の被験者からなる3つの群は、注射水WFI中F4の漸増用量を受けた。本研究はアジュバンテーションについては観察者盲検としたが、抗原含量についてはオープンとした。各被験者は、利き腕でない方の腕の三角筋内への注射によって、0ヶ月時に初回ワクチン投与を受け、第1ヶ月目に第2回目の投与を受けた。安全性および免疫応答の評価のために、ワクチン投与前第0日目、第2回目のワクチン投与から2週間後第44日目および1ヶ月後第60日目、ならびに第6ヶ月目第180日目および第12ヶ月目第360日目に血液サンプルを得た。研究参加者の平均±SD年齢は22.3±4.62歳範囲:18~40歳であり、63.3は女性であり、その割合は大部分が白人96.7であった。6つの研究群間ではベースライン統計に差異はなかった。被験者は総て、研究ワクチンの2回投与を受け、180名の被験者のうちの176名は本研究を完遂した。第12ヶ月目のプロトコール免疫原性コホートには150名の被験者83.3が含まれた。解析からの除外理由を下に要約する。3.2安全性各ワクチン投与後7日間、予測される局所症状注射部位の痛み、発赤、腫脹、全身症状発熱、疲労、頭痛、発汗、筋肉痛および消化管症状悪心、嘔吐、下痢、腹痛をダイアリーカードに記録した。症状の重篤度を1~3の段階で格付けし、段階3の症状は、発赤または腫脹が直径50mmを超えている場合、または発熱が39.0°Cより高い場合、その他の症状については通常の日常生活に支障をきたす場合と定義される。予測されない症状は各ワクチン投与後30日間記録し、一方、重篤な有害事象SAEは本研究を通して記録した。全ワクチン接種コホートにおいて反応原性および安全性の解析を行った。予測される局所症状および全身症状ならびに/または予測されない局所症状および全身症状を報告している被験者の数および割合を、厳密な95信頼区間CIを用いて算出した。安全性データについての正式な統計比較は行わなかった。各ワクチン投与後、ワクチン接種後の7日の間にF4/AS01B群において、F4/WFI群と比べて著しく高い反応原性が観察された図17。ワクチン接種後の7日の間での予測される症状および予測されない症状の全発生率は、F4/AS01B群での投与の99.0~100.0であるのに対し、F4/WFI群では45.0~75.0であった。さらに、全身症状の発生率は、第2回目のワクチン投与後にF4/AS01B群においてより高かった。F4/AS01B群では、投与全体のおよそ3分の1に段階3の症状が結果として生じた。これに対して、F4/WFI群では、ワクチン接種に関連して、予測されるまたは予測されない段階3の症状は報告されなかった。F4/AS01B群では抗原用量レベルの間で反応原性に差異は観察されなかった。最も多く見られる予測される局所症状は注射部位における痛みであった。それは、F4/AS01B群での投与の96.0~98.0で起こったのに対し、F4/WFI群での投与の10.0~30.0であった。段階3の重篤度の注射部位における痛みは、F4/AS01B群での投与の≦10.1で起こった。発赤および腫脹はF4/AS01B群でのみ報告され、それぞれ、投与の19.0~35.0および20.0~25.0で起こった。最も多く見られる予測される全身症状は、F4/AS01B群およびF4/WFI群において、それぞれ、疲労投与の66~77、30~45および頭痛投与の58~62、20~25であった。段階3の予測される全身症状の投与当たり発生率全体は、F4/AS01B群では≦12.1であった。ワクチン接種後の30日の間に、F4/WFI群の被験者の50.0~70.0が予測されない症状を報告したのに対し、F4/AS01B群では被験者の60.0~84.0であった。F4/AS01B群の被験者の30.0~44.0では症状は原因としてワクチン接種が関係していると考えられ最も頻繁には、悪寒および注射部位の反応、段階3の重篤度のものは少数であった。症状は、全体的に見て、一過性であり、一般的には2日または3日以内に後遺症なく消えた。本研究期間を通して、F4/AS01B群において6種のSAEが報告された。総ては、ワクチン接種と無関係であると考えられ、後遺症なく消えた。本研究期間中に死亡は認められず、有害事象を理由に本研究から離脱した被験者はいなかった。3.3T細胞応答CD4T細胞応答を、p17、p24、RTおよびNefペプチドプールを用いた刺激後の細胞内サイトカイン染色ICSにより評価し、インターロイキン2IL-2、インターフェロンガンマIFN-γ、腫瘍壊死因子アルファTNF-αおよびCD40-リガンドCD40Lの発現を評価した。実施したICSは、これまでに記載されている方法論[MaeckerHTMainoVCPickerLJImmunofluorescenceanalysisofTcellresponsesinhealthanddiseaseJClinImmunol20391399およびMaeckerHTDunnHSSuniMAKhatamzasEPitcherCJetalUseofoverlappingpeptidemixturesasantigensforcytokineflowcytometryJImmunolMethods2552740を参照のこと、各々の文献は引用することにより本明細書の一部とされる]を適合させたものであり、採血後6時間以内での標準的なFicoll-Isopaque密度勾配遠心分離によって全血細胞から単離されさらなる解析まで液体窒素中で低温保存された末梢血単核細胞PBMCを用いた。簡潔には、融解したPBMCを、抗CD28抗体および抗CD49d抗体の存在下で、クレードBのp17、p24、RTまたはNef適合抗原の配列を包含する、11個のアミノ酸の重複を有する15merペプチドのプールを用いてinvitroで刺激した。37°Cでの2時間のインキュベーション後に、細胞内遮断薬であるブレフェルジンAを添加して、さらなる一晩のインキュベーション中のサイトカイン分泌を阻害した。その後、細胞を収穫し、表面マーカーであるCD4およびCD8について染色し、次いで固定したCytofix/Cytopermキット、BDBiosciences。次いで、固定した細胞を細胞膜浸透化処理し、IL-2、IFN-γ、TNF-αおよびCD40Lに対する標識抗体を用いて染色し、洗浄し、胎児仔ウシ血清含有リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁し、FACSCantoフローサイトメーターおよびFACSDivaソフトウェアまたはFlowJoソフトウェアを用いたフローサイトメトリーによって解析した。ワクチン誘導CD4T細胞のクレード間交差反応性を評価するために、第0日目および第44日目に採取したPBMCを、クレードAおよびクレードCHIV-1株のコンセンサス配列のペプチドプールを用いてCD40Lの発現ならびにIL-2、IFN-γおよびTNF-αの産生についてICSにより解析した。p24およびp17に用いたクレードA配列は、天然分離株TZA173タンザニアに由来し、RTおよびNefに用いたクレードA配列は、天然分離株KEMSA4070ケニアに由来する。全抗原のクレードC配列はZM651株由来のものであった。この予備調査は上記のように行い、F410μg/AS01B群の被験者由来のサンプルでのみ行った。ICSの結果は、p17抗原、p24抗原、RT抗原またはNef抗原を用いた刺激に応答して免疫マーカーであるIL-2、IFN-γ、TNF-αおよび/またはCD40Lをそれぞれ発現する、CD4T細胞およびCD8T細胞全体の頻度単位パーセントとして表した。抗原特異的CD4応答がカットオフ値以上であるならば、被験者はレスポンダーと考えられた。0.03二重陽性抗原特異的CD4T細胞すなわち、IL-2、IFN-γ、TNF-αおよびCD40Lから少なくとも2種のマーカーを発現する細胞のカットオフ値は、異なる抗原に対して、95パーセンタイルの二重陽性抗原特異的CD4T細胞全体の中での最大値百未満切り上げに基づいて選択した。免疫原性の解析は、プロトコール遵守した免疫原性ATPコホートにおいて行った。各単独抗原によるinvitro刺激後および少なくとも1種、2種、3種および4種総ての抗原によるinvitro刺激後のIL-2および少なくとも1種の他のマーカーを発現するCD4T細胞の頻度ならびにレスポンダーの割合を各時点において決定した。F4特異的CD4T細胞応答は、各単独抗原に応答した特異的CD4T細胞頻度の合計として定義した。第2回目のワクチン投与の2週間後にアジュバントを添加したまたは添加しないF4の3回投与を比較するために、IL-2および少なくとも1種の他のマーカーを発現するCD4T細胞の頻度について二元配置ANOVA統計検定を行った。ANOVAモデルには固定効果として用量10μg、30μgおよび90μgおよびアジュバントAS01BおよびWFIを含めた。正規分布した応答を得るために、CD4T細胞のlog10頻度で解析を行った。分散の一様性の基準は、アジュバント添加群およびアジュバント非添加群の間では満たされなかった。用量とアジュバントとの間の相互作用は大部分の抗原p17を除くによるinvitro刺激について有意でありp≦0.05、AS01BとWFIとの間の差異は明らかに大きかったことから、第2回目の投与の2週間後第44日目にAS01Bを添加したF4の3回投与を比較するために、IL-2および少なくとも1種の他のマーカーを発現するCD4T細胞のlog10頻度について一元配置ANOVAを行った。一元配置ANOVAモデルには固定効果として用量10μg、30μgおよび90μgを含めた。分散の一様性の基準は3つのAS01B群の間で満たされた。F4抗原およびその成分各々に対するCD4T細胞応答についてANOVA解析を実施した。多重比較テューキークレーマー法を行い、用量とCD4T細胞応答との関係も評価した。幾何平均GM比およびそれらのCIを表にした。解析は、F4抗原およびその成分各々に対するCD4T細胞応答について行った。3.4同種抗原に対するCD4T細胞応答総てのアジュバント非添加ワクチン群において、IL-2をはじめとする少なくとも2種の免疫マーカーを発現する抗原特異的CD4T細胞の頻度は、ほとんどの場合、カットオフ値より低いかまたはその値に近かった図18を参照のこと。これに対して、総てのF4/AS01B群において非常に高いレスポンダー率が観察された図19。第2回目のワクチン投与の2週間後第44日目に10μgF4/AS01B群において最大の割合のレスポンダーが見られた、総てのワクチン接種被験者が少なくとも3種の抗原に対して応答し、4種の抗原総てに対しては80.4が応答した。各抗原でのCD4T細胞レスポンダー率を調査したときに図20、F4/AS01B群における応答は非常に幅広く、4種のワクチン抗原総てに対して向けられるが、RT抗原を用いた刺激後に頻度がより高いことが明らかになった。10μgF4/AS01B群の被験者の97.7は、第360日目でも2種の抗原に対して応答し続けており、3種および4種の抗原に対してはそれぞれ、84.1および59.1が応答し続けていた図19ことから、ワクチン誘導CD4T細胞応答は長く続いた。F4融合タンパク質に対する全体応答は、F410μg/AS01B群においてより大きくかつより持続的であった第44日目においてp<0.0001図21。この群では、IL-2および少なくとも1種の他のマーカーを産生するF4特異的CD4T細胞の幾何平均頻度は、第44日目に1.2近くでピークに達した。F4/AS01Bワクチンは、10μgF4/AS01B群におけるそれらのサイトカイン共発現プロフィールによって示されるとおり、多機能性F4特異的CD4T細胞を誘導した図22。特異的CD4T細胞の大部分は、CD40Lを発現し、IL-2を単独でまたはTNF-αおよび/もしくはIFN-γとともに産生した。F4特異的CD4T細胞のおよそ50は少なくとも2種のサイトカインを分泌し、このサイトカイン共発現プロフィールは第12ヶ月目まで維持された図23。単独抗原の総てで類似のプロフィールが観察された図24および図25を参照のこと。3.5CD8T細胞応答ICS方法に基づいて、ワクチン誘導CD8T細胞はまだ検出されていない。3.6異種抗原に対するCD4T細胞応答クレード間交差反応性第44日目の10μgF4/AS01B群におけるワクチン誘導CD4T細胞応答についてのHIV-1非クレードB抗原との交差反応性を評価するために、クレードAおよびクレードCの抗原、ならびにクレードB抗原対照として含めたを用いたinvitro刺激後に応答を解析した。p17、p24、RTおよびNefペプチドプールを用いたICSおよびフローサイトメトリー解析によって、クレードAおよびクレードCに属する4種の抗原総てに対して幅広い交差反応性を示すCD4T細胞応答が明らかになった図26。興味深いことに、10μgF4co投与を受けたどのボランティアも同種クレードBのRTおよびp24に対する応答を起こし、クレードAおよびクレードCの対応抗原両方に対する応答も示した図27。異なるクレード全体にわたるこれらの抗原でのエピトープ保存レベルが比較的低いことと比べると、そのような高いレベルの交差反応性が観察されることは驚くべきである。3.7体液性免疫応答p17、p24、RT、NefおよびF4に対する免疫グロブリンGIgG抗体応答についての血清における有無を、酵素結合免疫吸着測定法ELISAを用いて解析した。各試験サンプルの相対濃度を評価するために、陽性対照およびキャリブレータを各プレートで実施し、特異性を確認するために陰性対照も実施した。VersaMaxプレートリーダーにおいて450nmでプレート読み取り、SoftMaxPro3.1.1.ソフトウェアを用いて解析した。血清反応陽性は、アッセイカットオフ値以上p17については≧187mEU/ml、p24については≧119mEU/ml、RTについては≧125mEU/ml、Nefについては≧232mEU/ml、F4については≧42mEU/mlの抗体濃度として定義した。カットオフ値は、総ての被験者のワクチン接種前の応答に基づいて選択した。Nefについてはワクチン接種前の時点での95パーセンタイルに基づいて、F4co、p17、p24およびRTについてはワクチン接種前の時点での99パーセンタイルに基づいて選択を行った。各単独抗原および融合タンパク質についての血清反応陽性率および幾何平均抗体濃度GMCを95CIで算出した。血清反応陽性率については、二項変数の厳密法を用いて95CIをコンピュータ計算した。GMCについての95CIは、平均log10変換抗体濃度の95CIの真数を求めることによって算出した。アッセイのカットオフより低い抗体濃度については、GMC算出のためにカットオフの半分の任意の値を与えた。体液性免疫応答では、AS01B群においてF4融合タンパク質に対する抗体濃度が強かった図28。アジュバント添加群総てにおいてF4に対する100血清変換率が認められ、用量レベル総てについて類似のIgG力価を有し、これは第12ヶ月目まで存続した。さらに、各単独F4抗原成分に対してもIgG抗体が誘発された。アジュバント非添加群では、非常に低い応答が誘導された図29を参照のこと。3.8結論これらの結果は、F4/AS01Bアジュバント添加HIV-1ワクチンの反応原性プロフィールは、安全性への懸念なく、許容できたことを示している。加えて、免疫原性結果によって、F4/AS01Bアジュバント添加HIV-1ワクチン候補が多数で長期間効果のある数のHIV-1特異的多機能性CD4T細胞を誘発することも分かった。特に重要なのは、アジュバント添加ワクチン群におけるレスポンダー率が全体的に高かったことであり、ワクチン抗原総てに対して応答が誘発された。興味深いことに、最高レスポンダー率は最低抗原用量群10μgF4/AS01において観察され、3種のHIV-1抗原に対しては参加者の100が応答し、4種のHIV-1抗原総てに対しては80が応答した。アジュバント添加ワクチン群は、F4特異的CD4T細胞の頻度が非常に高いことが特徴であり、これは第12ヶ月目まで存続した。多サイトカイン産生抗ウイルスCD4T細胞は単一サイトカイン産生細胞よりも機能的に優れていると考えられることから、ワクチン誘導CD4T細胞がCD40Lを発現し、IL-2を単独でまたはTNF-αおよび/またはIFN-γとともに産生したという発見は重要で有望な報告である。さらに、この研究の結果は、クレードB抗原単独で構成されるF4/AS01Bアジュバント添加HIV-1ワクチンによって、クレードAおよびクレードCの4種の抗原総てに対しても幅広い交差反応性を示すCD4T細胞応答を誘発することができたことを示している。世界でのHIV-1ウイルスの多様性を考えれば、幅広い交差反応性を示し長期間効果のある免疫応答の誘導は、HIV-1ワクチンの開発における考慮すべき重要な事柄である。結論として、この研究の結果は、F4/AS01Bアジュバント添加HIV-1ワクチン候補の安全性および免疫原性を立証している。AS01アジュバントを添加した、10μgのF4タンパク質を含有するワクチン2回投与により、幅広い反応性を示し持続する強い多機能性CD4T細胞応答が誘導された。この免疫応答の特性によって、このワクチンは、予防状況においてだけでなく疾患修飾性治療ワクチンとしても有望なエイズワクチン候補となる。4.異なるクレード由来のF4coの免疫原性本実施例では、クレードBおよびクレードC由来のコドン最適化F4によって誘発されるT細胞応答を、クレードA、クレードBおよびクレードC由来のペプチドに対する交差反応性について試験した。4.1方法論免疫処置に用いるクレードBF4coタンパク質は、実施例2に記載のとおり調製し、同じ配列を有する。免疫処置に用いるクレードCF4coは、以下の配列を有するコンセンサスクレードC配列を用いて調製した:F4coクレードCコンセンサス抗原のアミノ酸配列[配列番号10]クレードCF4coをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列:配列番号11各免疫処置では、F4coタンパク質に、AS01Bを用いてアジュバント添加した。6~8週齢の雌CB6F1C57Bl/6マウスとBalb/Cマウスのハイブリッドに、AS01Bアジュバント系において処方した50μlのF4coクレードBまたはF4coクレードC3μgまたは9μgを用いて、第0日目、第14日目および第28日目に3回筋肉内に免疫した。マウスを4群に割り当てた各群動物40匹:第1群:9μgF4coクレードB/AS01B第2群:3μgF4coクレードB/AS01B第3群:9μgF4coクレードC/AS01B第4群:3μgF4coクレードC/AS01B第2回目および第3回目の免疫処置の7日後それぞれ、7dpIIおよび7dpIIIに、試験実施のために血液サンプルを採取した。第2回目および第3回目の投与の7日後に、IFN-γおよび/またはIL-2および/またはTNFαを分泌するF4co特異的CD4T細胞およびCD8T細胞の頻度を決定した。簡潔には、40匹のマウス/群の末梢血リンパ球PBLを採取し、プールした10匹のマウス/群のもの4プール。赤血球溶解を行った後、それらの細胞を丸型96-ウェルプレートに1ウェル当たり100万細胞でプレーティングした。次いで、それらの細胞を、抗CD28および抗CD49dの存在下で、F4coクレードB配列、F4coクレードC配列またはF4coクレードA配列を包含する重複15mersペプチド1μg/ml/ペプチドのプールを用いてinvitroで、37°Cで6時間再刺激した。p24およびp17に関するクレードAペプチド配列は、天然分離株TZA173タンザニア由来のものであり、RTおよびNefに関するクレードAペプチド配列は、天然分離株KEMSA4070ケニアに由来する。クレードCペプチド配列は、ZM651株由来のものであるp24、p17、NefおよびRTに関する。クレードBペプチドは、F4coクレードB抗原の配列p24およびp17はBH10株由来のもの、RTはHXB2株由来のものおよびNefはBru-Lai株由来のものを包含する。バックグラウンド応答のため、培地ペプチド刺激を行わない中に残っている細胞を陰性対照として用いた。ペプチドプールとの共培養から2時間後に、ブレフェルジンAをウェルに添加しサイトカイン分泌を阻害するため、それらの細胞を4時間さらにインキュベートし、一晩°Cで移動させた。その後、それらの細胞を以下のマーカー:CD4、CD8、IL-2、IFN-γおよびTNF-αについて染色し、LSRIIおよびFlowJoソフトウェアを用いたフローサイトメトリーによって解析した。4.2CD4T細胞応答F4coクレードB抗原またはF4coクレードC抗原によって誘導される特異的CD4T細胞応答の交差反応性を、マウスにおいて、クレードAペプチド、クレードBペプチドおよびクレードCペプチドに対するHIV特異的CD4T細胞応答の大きさを測定することによって評価した。全体として、F4co特異的CD4T細胞応答は、F4coクレードB抗原およびF4coクレードC抗原の双方によって誘導され、総てのクレードのペプチドに対して変動する強度で観察された。HIV特異的CD4T細胞の頻度は、クレードBF4co抗原およびクレードCF4co抗原の双方で第3回目の投与後に増加した。F4coクレードB抗原が、クレードBペプチドに対する最大レベルのCD4T細胞応答を誘導したことは、恐らく、該ペプチドが、免疫処置に用いたF4coクレードB抗原と全く同じ配列を有するという事実に起因すると思われる。F4coクレードB誘導CD4T細胞応答の交差反応性は、クレードAペプチドおよびクレードCペプチドに対して観察された。クレードAペプチドおよびクレードCペプチドに対する特異的CD4T細胞応答の強度は、クレードBペプチドで観察された強度のおよそ半分であった図30~図32および図36。F4coクレードC抗原およびF4coクレードB抗原の双方によって誘発されたクレードC特異的CD4T細胞応答の大きさは同等であった図32。興味深いことに、交差反応性HIV特異的CD4T細胞応答は、F4coクレードC抗原によって誘導されたが、クレードAペプチドおよびクレードBペプチドに対するCD4T細胞応答の強度は、クレードCペプチドで得られた強度の半分を超えていた図30~図32および図36。予想どおり、応答するCD4T細胞の割合は、免疫処置に用いた抗原に関係なく、クレードAペプチドに対して最も低く図30および図36、これは、F4coタンパク質に用いたクレードB配列およびクレードC配列とのこれらのペプチドの同一性パーセントが最も低いためである図8。加えて、第2回目および第3回目の免疫処置後に単離されたF4co特異的CD4T細胞は多機能性であることが見出され、各集団の半分を超えるものがIL2ならびにIFNγおよび/またはTNFαを発現したデータは示していない。4.3CD8T細胞応答クレードB抗原およびクレードC抗原双方によって誘導されたF4co特異的CD8T細胞のレベルは、CD4T細胞応答で観察されたレベルよりも全体的に低くかったが、動物のいくつかのプールではそれでも検出できた。CD4T細胞データと同様に、最大のCD8T細胞応答はF4coクレードB抗原によって誘導され、クレードBペプチドに対して特異的であった。クレードCペプチドおよびクレードAペプチドに対する交差反応性は非常に低かった図33~図35および図36。F4coクレードC抗原は、クレードCに対して特異的な、非常に低いCD8T細胞応答を誘発したが、クレードBペプチドおよびクレードAペプチドに対する交差反応性も低い強度ではあるが検出できた。多機能性については、レスポンダーCD8T細胞の割合が低いことから、確実に解析できなかった。4.4結論この前臨床研究からのクレード間交差結果を図36に要約している。クレードA、クレードBおよびクレードCに対する強い交差反応性F4co特異的CD4T細胞応答は、F4coクレードB抗原およびF4coクレードC抗原の双方によって誘導され、それらの応答は多機能性であった。F4co特異的CD8T細胞の頻度は強くなかったが、クレード間交差応答は試験した3種のクレード総てにわたって検出できた。