"二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびRNAを基質とし、かつ、精製後に1mMMgCl2および1mMCaCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5において37°Cで30分間二本鎖DNAに供した際の比活性がベンゾナーゼ登録商標の比活性と同程度またはそれより高い、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼ。分子量が、SDS-PAGE法で17,000~21,000である、請求項1に記載のヌクレアーゼ。二価金属イオンとして、Mg2またはMn2を要求する、請求項1に記載のヌクレアーゼ。ストレプトマイセス属細菌が、Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987である、請求項1に記載のヌクレアーゼ。1配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列、2配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または3配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と90以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ヌクレアーゼ。二本鎖DNAおよび一本鎖DNAを基質とし、かつ、100mMNaの存在下での比活性がNaを添加しない場合の比活性と比べて60以上である、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼ。分子量が、SDS-PAGE法で約66,500である、請求項6に記載のヌクレアーゼ。二価金属イオンとして、Mg2を要求する、請求項6に記載のヌクレアーゼ。ストレプトマイセス属細菌が、Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987である、請求項6に記載のヌクレアーゼ。a配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列、b配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、またはc配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列と85以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ヌクレアーゼ。ヌクレアーゼ活性成分として請求項1~5のいずれか1項に記載のヌクレアーゼおよび/または請求項6~10のいずれか1項に記載のヌクレアーゼを含む粗酵素。Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987を培養して、少なくとも1種の細胞外分泌型ヌクレアーゼを得ることを含む、細胞外分泌型ヌクレアーゼの製造方法。請求項12に記載の製造方法により得られる、細胞外分泌型ヌクレアーゼまたはその粗酵素。Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987。核酸を含む試料に請求項1~5のいずれか1項に記載のヌクレアーゼおよび/または請求項6~10のいずれか1項に記載のヌクレアーゼを供して前記核酸を分解することを含む、核酸を分解する方法。前記核酸がDNAである、請求項15に記載の方法。特許文献1および2に記載のヌクレアーゼならびに非特許文献1に記載のベンゾナーゼは、非病原性微生物を用いて製造せしめるものである。しかし、これらのヌクレアーゼは、遺伝子組換え大腸菌によって生産されるため、由来微生物の生産性と比べて生産性が低い。したがって、工業的規模のヌクレアーゼを得るためには、生産工程の繰返しまたは長期化などが必要となり、作業的、経済的および時間的な負担の増大が問題となる。そこで、ヌクレアーゼの生産方法としては、遺伝子組換え技術を使わず、天然の非病原性微生物を用いて生産するのが望ましい。非特許文献2および3に記載のヌクレアーゼは、非病原性微生物体内に蓄積される、細胞内蓄積型の酵素である。したがって、これらのヌクレアーゼを得るためには、ヌクレアーゼを蓄積させた微生物体を破砕し、次いで得られた微生物破砕物からヌクレアーゼを分離精製しなければならない。そこで、非特許文献2および3に記載のヌクレアーゼを得る工程は複雑であり、かつ、不純物が混入する可能性が高いとの問題がある。それに対して、非特許文献4~7に記載のヌクレアーゼは、非病原性微生物の体外に分泌される細胞外分泌型の酵素であり、上記した特許文献1および2ならびに非特許文献1~3に記載のヌクレアーゼを製造する際に生じる問題は起こらない。しかし、非特許文献4~7に記載のヌクレアーゼは、非常に活性が低いという共通の問題がある。非特許文献4~7に記載のヌクレアーゼの比活性は、非特許文献1に記載の単位に換算すると、それぞれ、3.5×105U/mg-protein、9.7×103U/mg-protein、1.3×104U/mg-proteinおよび3.2×104U/mg-proteinであり、非特許文献1に記載のヌクレアーゼと比較して3~100倍程度活性が低い。また、非特許文献4および5に記載のヌクレアーゼは、NaClによって酵素活性阻害を受け易い。非特許文献4に記載のヌクレアーゼの10mMNaClの存在下での比活性は、非特許文献4に記載の標準活性条件と比べて、32である。非特許文献5に記載のヌクレアーゼの100mMNaClの存在下での比活性は、非特許文献5に記載の標準活性条件と比べて、40~50である。したがって、非特許文献4および5に記載のヌクレアーゼを希釈等する際に、一般的に広く用いられているPBSなどのNaCl含有緩衝液を使用することができない。また、微生物の培養を介する産業的な製造工程では、菌体濁度を上げるために100mM以上の一価金属塩が含まれる高栄養の培地を用いて微生物を培養するのが一般的である。このような培養により得た培養液中の核酸の分解は、塩濃度が高い条件下で実施され得る。非特許文献6および7に記載のヌクレアーゼは、精製酵素としてEDTAによって透析した場合、完全に活性を喪失する。この活性を回復させるにはMn2が要求され、Mg2などの他の二価金属イオンでは代用できない。マンガン塩は非常に高価であり、かつ、残留毒性の危険がある。したがって、非特許文献4~7に記載のヌクレアーゼは、比活性が低い、NaClによって酵素活性阻害を受け易い、酵素活性について要求される二価金属イオンがMn2に限定されるといった問題により、工業的規模での核酸分解に際して利用されていなかった。そこで、天然の非病原性微生物が細胞外に分泌し、かつ、従来のヌクレアーゼよりも比活性が高い、工業的規模での核酸分解に有用なヌクレアーゼを提供することを、本発明が解決しようとする第1の課題とした。また、天然の非病原性微生物が細胞外に分泌し、酵素活性に対するNaClの影響が小さく、かつ、酵素活性についてマンガンよりも安価かつ毒性の小さい二価金属イオンを要求する、工業的規模での核酸分解に有用なヌクレアーゼを提供することを、本発明が解決しようとする第2の課題とした。さらに本発明が解決しようとする別の課題として、上記ヌクレアーゼを製造する方法および該方法に供され得る非病原性微生物を提供することがある。本発明者らは、鋭意研究を積み重ねた結果、培養液中に比活性の高いヌクレアーゼを分泌する微生物を深海から単離することに成功した。次いで該微生物を同定した結果、放線菌の一種である非病原性のストレプトマイセス属細菌であることがわかり、本発明者らはこの微生物をStreptomycessp.MBE174と名付けた。Streptomycessp.MBE174の培養液からヌクレアーゼ活性を示すタンパク質分画を分離および精製したところ、二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびRNAを基質とし、かつ、非特許文献1に記載のベンゾナーゼより比活性が高いヌクレアーゼNucSと、二本鎖DNAおよび一本鎖DNAを基質とし、高濃度のNaの存在下で比活性を維持し、かつ、マンガンよりも安価かつ毒性の小さいマグネシウムを要求し得るヌクレアーゼNucLとの2種類のヌクレアーゼが得られた。上記NucSおよびNucLは、Streptomycessp.MBE174の増殖とともに、ヌクレアーゼ活性を維持して培養液中に分泌されるものであった。したがって、Streptomycessp.MBE174の培養液やこの培養液の乾燥物および簡易に精製したものは、NucSおよびNucLの2種類のヌクレアーゼを含む粗酵素として、工業的規模での核酸分解に供され得る、有用性の高いものである。本発明は、上記知見に基づいて完成された発明である。したがって、本発明によれば、二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびRNAを基質とし、かつ、精製後に1mMMgCl2および1mMCaCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5において37°Cで30分間二本鎖DNAに供した際の比活性がベンゾナーゼ登録商標の比活性と同程度またはそれより高い、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼが本発明の第一の態様のヌクレアーゼとして提供される。好ましくは、分子量が、SDS-PAGE法で17,000~21,000である。好ましくは、二価金属イオンとして、Mg2またはMn2を要求する。好ましくは、ストレプトマイセス属細菌が、Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987である。本発明の別の側面によれば、1配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列、2配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または3配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と90以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ヌクレアーゼが本発明の第二の態様のヌクレアーゼとして提供される。本発明の別の側面によれば、二本鎖DNAおよび一本鎖DNAを基質とし、かつ、100mMNaの存在下での比活性がNaを添加しない場合の比活性と比べて60以上である、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼが本発明の第三の態様のヌクレアーゼとして提供される。好ましくは、分子量が、SDS-PAGE法で約66,500である。好ましくは、二価金属イオンとして、Mg2を要求する。好ましくは、ストレプトマイセス属細菌が、Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987である。本発明の別の側面によれば、a配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列、b配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、またはc配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列と85以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ヌクレアーゼが本発明の第四の態様のヌクレアーゼとして提供される。本発明の別の側面によれば、ヌクレアーゼ活性成分として本発明の第一または第二の態様のヌクレアーゼおよび/または本発明の第三または第四の態様のヌクレアーゼを含む粗酵素が提供される。本発明の別の側面によれば、Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987を培養して、少なくとも1種の細胞外分泌型ヌクレアーゼを得ることを含む、細胞外分泌型ヌクレアーゼの製造方法が提供される。本発明の別の側面によれば、本発明の製造方法により得られる、細胞外分泌型ヌクレアーゼまたはその粗酵素が提供される。本発明の別の側面によれば、Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987が提供される。本発明の別の側面によれば、核酸を含む試料に本発明の第一または第二の態様のヌクレアーゼおよび/または本発明の第三または第四の態様のヌクレアーゼを供して前記核酸を分解することを含む、核酸を分解する方法が提供される。好ましくは、前記核酸がDNAである。本発明のヌクレアーゼは天然の非病原性微生物であるストレプトマイセス属細菌の一種が細胞外に分泌するものであることから、本発明のヌクレアーゼを生産するストレプトマイセス属細菌の培養液や該培養液の乾燥物や粗精製物を粗酵素として利用することができる。また、本発明のヌクレアーゼは、従来のヌクレアーゼと比べて比活性が高い、または、高塩濃度存在下でも活性を維持しつつ、要求される二価金属イオンがマグネシウムであるとの特徴を有することから、工業的規模での核酸分解に供され得るものである。本発明の2種のヌクレアーゼは、たとえば、塩濃度によって使い分けができる。具体的には、低塩濃度の環境下では、比活性の大きい一方の酵素たとえば、NucSによる迅速なDNAおよびRNAの分解が可能であり、高塩濃度の環境下では他方の酵素たとえば、NucLによるDNA分解およびRNAの蓄積が期待できる。したがって、本発明の2種のヌクレアーゼを含む混合物を用意すれば、塩濃度を変化させることによって、所望の核酸の分解および蓄積が達成できる。また、本発明の高塩濃度の環境下で活性を維持する酵素たとえば、NucLは、RNAを分解せずに、DNAを分解できる。このようなRNAを分解しないという特性を活かして、たとえば本発明の酵素を、RNAを特異的に調製する方法へ使用することが可能である。本発明のヌクレアーゼを用いれば、細胞抽出液中のタンパク質その他の目的物質を単離および精製する場合に、プロセス時間の短縮、目的物質の収量向上、遠心分離法による分画の改善ペレットと上清との分離性、溶液の円滑なろ過特に限外ろ過、クロマトグラフィー工程の効率向上、ウイルスやインクルージョンボディなどの収率向上、ELISA、クロマトグラフィー、2D-PAGEやフットプリント解析などの測定誤差の回避などが期待できる。以下、本発明の詳細について説明する。本発明のヌクレアーゼは、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼに関する。本発明のヌクレアーゼは、その性質、機能および構造により2つの酵素群に分類される。以下では本発明のヌクレアーゼをヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBという名称により説明する。[1]本発明のヌクレアーゼA本発明のヌクレアーゼAは、二本鎖DNA、たとえば、スーパーコイル型およびリラックス型などの二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびRNAを基質とするヌクレアーゼに関する。本発明のヌクレアーゼAは、精製後に1mMMgCl2および1mMCaCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5において37°Cで30分間二本鎖DNAに供した際の比活性がベンゾナーゼ登録商標の比活性と同程度またはそれより高いとの特徴を有する。本明細書におけるベンゾナーゼ登録商標とは、非特許文献1において製品名ベンゾナーゼグレードI99250U/μLforbiotechnologyとして記載されている、市販のヌクレアーゼをいう。後述する実施例により示される1mMMgCl2および1mMCaCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5において37°Cで30分間二本鎖DNAに供した際のベンゾナーゼ登録商標の比活性は、9.4×105U/mg-proteinである。本明細書におけるベンゾナーゼ登録商標の比活性と同程度とは、ベンゾナーゼの比活性に近似する値であれば特に制限されず、たとえば、ベンゾナーゼの比活性の±10以内、好ましくは±5以内、より好ましくは±2以内をいう。本明細書におけるベンゾナーゼ登録商標の比活性より高いとは、ベンゾナーゼの比活性より高ければ特に制限されず、たとえば、ベンゾナーゼの比活性の1.1倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2.0倍以上、さらに好ましくは2.5倍以上、より好ましくは3.0倍以上である。ベンゾナーゼの比活性と比べる際は、本発明のヌクレアーゼAは精製されたものを用いる。本発明のヌクレアーゼAの精製は、陰イオン交換SuperQ、ハイドロキシアパタイト、陽イオン交換CMセファロース、ヘパリンアフィニティーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製される。本発明の好ましい態様である、後述する実施例に記載のNucSは、精製後の比活性が3.6×106U/mg-proteinである。それに対して、ベンゾナーゼ登録商標の比活性は、9.4×105U/mg-proteinである。したがって、精製後の本発明のヌクレアーゼAの比活性は、ベンゾナーゼの比活性の約3.8倍であることが好ましい。本発明のヌクレアーゼAの基質特異性は、二本鎖DNA、一本鎖DNA、RNAなどの種々の核酸を基質として1mMMgCl2および1mMCaCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5において37°Cで30分間供して、これらの基質の分解活性を調べることで測定する。本発明のヌクレアーゼAは、基質および比活性が上記した通りのものであれば特に制限されないが、好ましくは、分子量がSDS-PAGE法で17,000~21,000であり、および/または二価金属イオンとしてMg2またはMn2を要求する。本発明のヌクレアーゼAは、上記した基質への触媒活性および比活性の他、分子量および二価金属要求性などを指標として、ストレプトマイセス属細菌、たとえば、深海水面下200m以下の海に生息するストレプトマイセス属細菌を培養した培養上清中のヌクレアーゼ活性を調べるスクリーニング法により単離することが可能である。深海に生息するストレプトマイセス属細菌として好ましいのは、Streptomycessp.MBE174である。なお、このStreptomycessp.MBE174は、独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センター〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1つくばセンター中央第6に2010年7月27日付けで受託番号FERMP-21987として寄託されている。本発明のヌクレアーゼAの具体的な態様は、1配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列、2配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または3配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と90以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ヌクレアーゼである。上記1配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼは、分子量がSDS-PAGE法で17,000~21,000である酵素群であり、共通配列としてALPTPVSAATAR配列表の配列番号27を有する。配列表の配列番号1は、共通アミノ酸配列ALPTPVSAATARをN末端の起点として17kDaと算出される共通アミノ酸配列157アミノ酸を指す。本発明のヌクレアーゼAのより具体的な態様は、後述する実施例に記載のNucSであり、214アミノ酸配列表の配列番号3からなるヌクレアーゼである。上記2のアミノ酸配列の1から数個のアミノ酸の欠失、置換または付加における1から数個の範囲は、上記2のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼの精製後の比活性が、1mMMgCl2および1mMCaCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5において37°Cで30分間二本鎖DNAに供する条件下で、ベンゾナーゼ登録商標の比活性と同程度またはそれより高くなる範囲であれば特に限定されないが、たとえば、1から20個、好ましくは1から10個、より好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個程度を意味する。また、アミノ酸の欠失とは配列中のアミノ酸残基の欠落もしくは消失を意味し、アミノ酸の置換は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていること、およびアミノ酸の付加とは配列中に新たなアミノ酸残基が付け加えられていることをそれぞれ意味する。1から数個のアミノ酸の欠失、置換または付加の具体的な態様としては、1から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えらた態様がある。たとえば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。上記3のアミノ酸配列における相同性は、上記3のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼの精製後の比活性が、1mMMgCl2および1mMCaCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5において37°Cで30分間二本鎖DNAに供する条件下で、ベンゾナーゼ登録商標の比活性と同程度またはそれより高くなる範囲である90以上であり、好ましくは93以上であり、より好ましくは95以上であり、さらに好ましくは97以上、なおさらに好ましくは99以上である。本発明のヌクレアーゼAを取得する方法は制限されるものではなく、上記したスクリーニング法以外にも、たとえば、配列表の配列番号1および3の記載を参照して、物理化学的に合成してもよいし、遺伝子工学的に配列表の配列番号1および3に記載のアミノ酸配列をコードする核酸から作成してもよい。[2]本発明のヌクレアーゼB本発明のヌクレアーゼBは、二本鎖DNA、たとえば、スーパーコイル型およびリラックス型などの二本鎖DNAおよび一本鎖DNAを基質とし、かつ、RNAを実質的に基質としないヌクレアーゼに関する。本発明のヌクレアーゼBは、100mMNaの存在下での比活性がNaを添加しない場合の比活性と比べて60以上、好ましくは70以上、より好ましくは80以上、さらに好ましくは90以上であるとの特徴を有する。本発明のヌクレアーゼBの比活性に対するNaの影響は、1mMMgCl2と0~100mMNaClを含む10mMTris/HCl、pH8.5中で、Deoxyribonucleicacidsodiumsaltfromsalmontestes0.4mg/mLシグマアルドリッチ社製、Catno.D1626-1Gを基質として、各NaCl濃度の核酸分解活性を25°Cで測定することにより調べることができる。本発明のヌクレアーゼBの基質特異性は、本発明のヌクレアーゼAの基質特異性と同様にして調べることができる。本発明のヌクレアーゼBは、基質およびNaに対する安定性が上記した通りのものであれば特に制限されないが、好ましくは、分子量がSDS-PAGE法で約66,500であり、および/または二価金属イオンとしてMg2を要求する。本発明のヌクレアーゼBは、上記した基質への触媒活性およびNaに対する安定性の他、分子量および二価金属要求性などを指標として、ストレプトマイセス属細菌、たとえば、深海水面下200m以下の海に生息するストレプトマイセス属細菌を培養した培養上清中のヌクレアーゼ活性を調べるスクリーニング法により単離することが可能である。深海に生息するストレプトマイセス属細菌として好ましいのは、Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987である。本発明のヌクレアーゼBの具体的な態様は、a配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列、b配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、またはc配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列と85以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ヌクレアーゼである。上記a配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼは、分子量がSDS-PAGE法で66,500であり、N末端部にシグナルペプチドを含まない成熟タンパク575アミノ酸である。本発明のヌクレアーゼBのより具体的な態様は、後述する実施例に記載のNucLであり、607アミノ酸配列表の配列番号4からなり、N末端にシグナルペプチドを含む。上記bのアミノ酸配列の1から数個のアミノ酸の欠失、置換または付加における1から数個の範囲は、上記bのアミノ酸配列を含むヌクレアーゼの100mMNaの存在下での比活性がNaを添加しない場合の比活性と比べて60以上である範囲であれば特に限定されないが、たとえば、1から20個、好ましくは1から10個、より好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個程度を意味する。また、上記bのアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、アミノ酸の置換およびアミノ酸の付加の意味ならびに1から数個のアミノ酸の欠失、置換または付加の具体的な態様は、本発明のヌクレアーゼAの具体的態様である2のアミノ酸配列で説明したのと同様である。上記cのアミノ酸配列における相同性は、上記cのアミノ酸配列を含むヌクレアーゼの100mMNaの存在下での比活性がNaを添加しない場合の比活性と比べて60以上である範囲である85以上であり、好ましくは88以上であり、より好ましくは90以上であり、さらに好ましくは95以上、なおさらに好ましくは99以上である。本発明のヌクレアーゼBを取得する方法は制限されるものではなく、上記したスクリーニング法以外にも、たとえば、配列表の配列番号2および4の記載を参照して、物理化学的に合成してもよいし、遺伝子工学的に配列表の配列番号2および4に記載のアミノ酸配列をコードする核酸から作成してもよい。[3]本発明の粗酵素本発明の粗酵素は、ヌクレアーゼ活性成分として本発明のヌクレアーゼA、本発明のヌクレアーゼBまたはこれら2種のヌクレアーゼを含む。本発明の粗酵素において、本発明のヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBの存在比は特に制限されず、基質となる核酸の種類や濃度、これらのヌクレアーゼの活性に影響を与える物質の種類や濃度などに応じて適宜選択できる。本発明の粗酵素は、含有する本発明のヌクレアーゼAおよび/またはヌクレアーゼBの性質を示す。本発明の粗酵素によれば、たとえば、低塩濃度の環境下では、比活性の大きい本発明のヌクレアーゼAによる迅速なDNAおよびRNAの分解が期待でき、高塩濃度の環境下では本発明のヌクレアーゼBによるDNA分解およびRNAの蓄積が期待できる。したがって、本発明の粗酵素によれば、塩濃度を変化させることによって、所望の核酸の分解および蓄積が達成できる。本発明の粗酵素は、本発明のヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBを生産するストレプトマイセス属細菌、好ましくはStreptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987を培養して得られる培養物として製造可能である。[4]本発明の製造方法本発明の製造方法は、Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987を培養して、少なくとも1種の細胞外分泌型ヌクレアーゼを得ることを含む、細胞外分泌型ヌクレアーゼの製造方法である。具体的には、Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987を常法にしたがって適当な培地に接種して適切な条件下で培養し、得られた培養物から細胞外分泌型ヌクレアーゼを採取してなる、細胞外分泌型ヌクレアーゼの製造方法である。細胞外分泌型ヌクレアーゼとして好ましいのは、本発明のヌクレアーゼAおよび/または本発明のヌクレアーゼBである。本発明の製造方法は、大別すると、aStreptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987を培養して、細胞外分泌型ヌクレアーゼ含有培養物を得る工程、及びb該培養物から細胞外分泌型ヌクレアーゼを得る工程の二つの工程を含む。Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987の培養に用いる栄養培地としては、ストレプトマイセス属細菌用の培地として知られているものを広く使用でき、たとえば、YMAYeastextract-MaltextractAgar培地イーストエキス4.0g/l、モルトエキス10.0g/l、グルコース4.0g/l、寒天18.0g/l;pH7.3やアルブミン培地エッグアルブミン0.25g/l、グルコース1.0g/l、K2HPO40.5g/l、MgSO47H2O0.2g/l、Fe2SO431溶液1ml、寒天18.0g/l;pH6.8-7.0などの合成培地の他に天然培地も使用でき、好ましくはイーストエキス4.0g/l、モルトエキス10.0g/l、グルコース30.0g/l、ポリペプトンS50.0g/l、炭酸カルシウム6.0g/l;pH無調整を使用できる。ただし、培養物をそのまま粗酵素として用いる場合、培地調製において、pHや一価塩、二価金属塩、リン酸塩、その他酵素活性に影響する化合物の濃度には注意を要する。所望のヌクレアーゼ活性に応じて、これらの濃度を増減させることが好ましい。培養法としては液体培養法振とう培養法もしくは通気攪拌培養法が好ましく、工業的には通気攪拌培養法が好ましい。Streptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987の培養は、通常、温度20~45°C、好ましくは25~40°C、pH5~9、好ましくは6~8から選ばれる条件で好気的に実施する。培養時間はStreptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987が増殖し始める時間以上の時間であればよく、好ましくは8~120時間であり、さらに好ましくは所望のヌクレアーゼ活性が最大値に達成する時間までである。菌体増殖を確認する方法は特に制限はないが、たとえば、培養物を採取して顕微鏡で観察してもよいし、吸光度で観察してもよい。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、0.5~20ppmが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したりすればよい。培養方式は、回分培養、流加培養、連続培養または灌流培養のいずれでもよい。上記のようにして培養して得られた培養物から、細胞外分泌型ヌクレアーゼを採取する。細胞外分泌型ヌクレアーゼの採取法は、一般の酵素の採取の手段に準じて行うことができる。たとえば、固液分離などの通常知られる手段によって細胞を除いた後に培養上清を粗酵素として用いることができる。固液分離には、通常知られる方法を制限なく利用することができ、例えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する方法、培養物に濾過助剤を加えることや濾過助剤をプレコートしたプレコートフィルターなどにより濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する方法などが採用される。粗酵素は、そのままで使用することもできるが、精製して使用することもできる。例えば、ここに挙げるものに限定されるものではないが、得られた粗酵素を、熱処理などの耐熱性の差を利用する方法;透析、限外ろ過、レジンカラム、ゲルろ過、ゲルろ過クロマトグラフィーおよびSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分子量の差を利用する方法;塩沈澱、硫安沈殿、アルコール沈殿およびその他の溶媒沈澱などの溶解性の差を利用する方法;DEAE-トヨパール樹脂などを用いるイオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法;アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法;ブチルトヨパール樹脂などを用いる疎水クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法;吸着クロマトグラフィーなどの物理化学的な吸着性の差を利用する方法;等電点電気泳動および等電点クロマトグラフィーなどの等電点の差を利用する方法といった通常知られる方法を単独または組み合わせて供することにより、工業用途の精製酵素を調製できる。粗酵素及び精製酵素は、固定化することもできる。たとえば、イオン交換体への結合法、樹脂および膜などとの共有結合吸着法、高分子物質を用いた包括法などを採用することができる。本発明の製造方法によって得られる細胞外分泌型ヌクレアーゼまたはその粗酵素は、本発明の別の態様として提供される。また、本発明の製造方法に用いられるストレプトマイセス属細菌であるStreptomycessp.MBE174受託番号:FERMP-21987もまた、本発明の別の態様として提供される。本発明の製造方法の別の態様としては、本発明のヌクレアーゼAをコードするDNAの塩基配列、たとえば、配列表の配列番号5に記載の塩基配列や本発明のヌクレアーゼBをコードするDNAの塩基配列、たとえば、配列表の配列番号6に記載の塩基配列を参照して、本発明のヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBをコードするDNA断片を物理化学的または遺伝子工学的に合成し、次いで合成したDNA断片をベクターに組み込み、次いでDNA断片を組み込んだ組換えベクターを宿主細胞に挿入して形質転換体を作製し、この形質転換体を培養することにより細胞外分泌型ヌクレアーゼを得ることを含む、細胞外分泌型ヌクレアーゼを製造する方法が提供される。[5]本発明の方法本発明の方法は、核酸を含む試料に本発明のヌクレアーゼA、本発明のヌクレアーゼBまたはこれら両方を供して前記核酸を分解することを含む、核酸を分解する方法に関する。本発明のヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBは、固体状または液体状の粗酵素および精製酵素として利用することができる。本発明のヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBは、通常知られる方法で固定化させた固定化酵素として使用することもできる。核酸を含む試料における水性媒体としては、核酸分解反応を妨げるものでなければ特に制限されないが、たとえば、水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液としては、たとえば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが採用されるが、本発明のヌクレアーゼAはリン酸イオンやナトリウムイオンにより活性阻害が生じる可能性があるため、これらを含まないトリス塩酸緩衝液などが好ましい。本発明のヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBの使用量は特に制限はないが、核酸分解の効率および経済性の観点から、たとえば、本発明のヌクレアーゼAの使用量は核酸10μgに対して1×10-6から50U単位であり、好ましくは1×10-5から10Uであり、より好ましくは1×10-4から1Uであり、さらに好ましくは1×10-3から1×10-1Uであり;本発明のヌクレアーゼBの使用量は核酸10μgに対して1×10-4から50Uであり、好ましくは1×10-3から20Uであり、より好ましくは1×10-2から10Uであり、さらに好ましくは1×10-1から1Uである。核酸の濃度は、溶液に溶解し得る範囲であれば特に限定されない。核酸分解反応は本発明のヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBが活性を有し、安定に維持される温度付近、たとえば、25~35°Cで実施することが好ましい。pHは本発明のヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBが活性を有し、安定に維持される条件下で行うことが好ましく、たとえば、7.5~9.5で行うのが適当である。上記条件で十分な核酸分解が見られた時点で反応を終了するが、反応は通常1~100時間で終了する。核酸分解反応終了後、核酸を含む試料中に標的物質が含まれている場合は、標的物質を分離精製し、本発明のヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBは別途回収する。標的物質や核酸を含む試料の性質に応じて、反応液を60~135°C、好ましくは65~100°Cに加熱して酵素を失活させるか、またはpHの低下塩酸等の酸の添加などの適当な手段によって酵素を失活させて反応を停止してもよい。核酸を含む試料としては、二本鎖DNA、一本鎖DNA、RNAなどを含む試料が想定されるが、本発明のヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBのいずれの酵素の基質となり得る二本鎖DNAおよび一本鎖DNAなどのDNAを含む試料であることが好ましい。以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。1.培養上清中に存在する核酸分解酵素の活性染色による検出プラスミドDNAに対する核酸分解活性を指標としたスクリーニングにより、培養上清中に核酸分解酵素を分泌高生産する深海由来Streptomycessp.MBE174以下、MBE174ともよぶを単離した。本菌株が培養上清中に生産する核酸分解酵素は、SDS-PAGEおよびDeoxyribonucleicacidsodiumsaltfromsalmontestesシグマアルドリッチ社製、Catno.D1626-1Gを基質とした活性染色により、分子量約66.5kDaおよび17~21kDaの低分子領域に分布を持つ複数個のタンパクであることが分かった。2.MBE174の分類学的位置MBE174の16SrRNA遺伝子配列1483塩基対を解析したところ、StreptomycesakiyoshiensisNBRC12434TAB184095、S.viridochromogenesNBRC3113TAB184728、S.paradoxusNBRC14887TAB184628、S.collinusNBRC12759TAB184123、S.griseoflavusLMG19344TAJ781322に99一致した。これより、本菌株はストレプトマイセス属細菌であると判断される。種レベルでの同定には更なる分類学的解析を要する。3.低分子核酸分解酵素NucleaseSの精製分子量約17~21kDaの低分子核酸分解酵素NucleaseSと命名、以下NucSと省略するを、陰イオン交換SuperQ、ハイドロキシアパタイト、陽イオン交換CMセファロース、ヘパリンアフィニティー図1を参照、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。精製の概要を表1に示した。NucSについて、1mMMgCl2、1mMCaCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5中で37°Cにおける比活性を測定したところ以下、この条件の測定法を標準比活性測定法ともよぶ、3.6×106U/mg-proteinであり、非常に高い比活性を示した。ここで1Uは、サケ精子DNA1mg/mLインビトロジェン社製、Catno.15632-011を基質とし、酵素を作用させた場合に、30分間に260nmの吸光度を1上昇させる酵素量を示している。参考として、NucSについて、最も比活性が高いとカタログに記載されている市販の核酸分解酵素であるベンゾナーゼBenzonase登録商標の比活性をカタログ記載の条件37°Cで、同基質を用いて、測定したところ、9.4×105U/mg-proteinであった。この結果から、NucSはベンゾナーゼの約3.8倍高い比活性を有することが分かった。SuperdexG75GEヘルスケア社製を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量を測定したところ、分子量約16kDaの溶出位置をピークトップとしてカラムより溶出された。この値は、SDS-PAGE上で産出された酵素の分子量約17~21kDaとよく一致したことから、NucSはモノマーとして存在していると判断される。Novex登録商標IEFpH3-10gelインビトロジェン社製を用いて等電点を測定したところ、pIは10であった。SDS-PAGE後の酵素タンパク質を分子量ごとに切り出し、トリプシン消化後、LC-MS/MS分析に供したところ、切り出したすべてのタンパク質において共通のアミノ酸配列を持つペプチドALPTPVSAATAR配列表の配列番号27を検出した。NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、BLASTPprograms2.2.24引用文献:StephenF.Altschul,ThomasL.Madden,AlejandroA.Schaffer,JinghuiZhang,ZhengZhang,WebbMiller,andDavidJ.Lipman1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402を参照、本文献の記載はここに特に開示として援用されるを用いて、Non-redundantproteindatabaseに対して相同性検索を行なった。その結果、このアミノ酸配列は、データベース上に登録されている分泌型タンパク質secretedprotein分子量23kDaS.scabiei87.22由来、S.griseoflavusTu4000由来他の一部に一致した。また、これまで生化学的性質が発表されているS.rimosus由来核酸分解酵素のN末端配列APPTPPDTATARにも相同性8/12アミノ酸を示した。これらの結果より、MBE174の生産する17~21kDaの低分子量の核酸分解酵素群は同一遺伝子から転写翻訳された後に、酵素タンパク質C末端部分においてプロテアーゼ等により低分子化を受けた産物であると判断された。本アミノ酸配列を用いた、上記のBLASTPprograms2.2.24による相同性検索の結果、上述のsecretedprotein[StreptomycesgriseoflavusTu4000由来]アクセッション番号ZP_05541504に加えて、secretedprotein、[StreptomycesavermitilisMA-4680由来]アクセッション番号NP_827004、secretedprotein[StreptomycescoelicolorA32由来]アクセッション番号NP_626595.1などの一部に含まれるアミノ酸配列に完全に一致した。続いて、これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその1000bp上流、1000bp下流の塩基配列をNCBIデータベースより取得し、GENETYX登録商標-MACVersion12.1.0ソフトウエアを用いて、アライメントした。本アライメント塩基配列に基づき、フォワードとリバースプライマーからなるプライマーセットA配列表の配列番号7および8およびB配列表の配列番号9および10を設計した。プライマーセットAのフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれprimersetAF、およびprimersetARとも表記し、後述のいずれのプライマーセットに用いられたプライマーもこれらに準じて表記した。MBE174の総DNAを鋳型として、プライマーセットAを用いたPCRにより約0.3kbの増幅DNA断片、プライマーセットBを用いたPCRにより約0.5kb増幅DNA断片を得た。PCR反応は、TaKaRaLATaq登録商標ポリメラーゼタカラバイオ社製および製品に添付のバッファーを使用し、熱変性97°Cにて20秒、アニーリング55-63°Cにて1分、伸長反応72°C1.5分からなるサイクルを30回繰り返す方法を用いた。続いてこの増幅断片の塩基配列の解析を行なった。得られた塩基配列に基づき、プライマーセットC配列表の配列番号11および12を作成した。MBE174の総DNAを鋳型として、プライマーセットCを用いたPCRにより約0.3kbの増幅DNA断片を取得し、本断片の塩基配列を解析した。上記アライメント塩基配列とNucSの塩基配列解析により得られた塩基配列に基づき、プライマーセットD配列表の配列番号13および14を作成した。MBE174の総DNAを鋳型として、プライマーセットDを用いたPCRにより約0.3kbの増幅DNA断片を取得し、本断片の塩基配列を解析しnucS遺伝子5’末端配列を得た。一方で、MBE174の総DNAを制限酵素PstIで消化し、TaKaRaLAPCRinvitroCloningKitタカラバイオ社製、Catno.RR015に含まれるPstIカセットを連結した。このDNA混合物を鋳型として、プライマーセットE配列表の配列番号15および16を用いてPCR反応を行なった。得られたPCR反応物を鋳型として、さらにプライマーセットF配列表の配列番号17および18を用いて、約1.2kbの増幅断片を取得し、nucS遺伝子の3’末端塩基配列を解析した。上記プライマーセットA~Fを用いたPCRにより得られたDNA増幅断片の全塩基配列をアセンブルし、nucS遺伝子全長の塩基配列配列表の配列番号5を明らかにした。本酵素の遺伝子配列は、最も近いもので、S.coelicolorA32ゲノム配列上のputativesecretedproteinをコードする領域に88552/626塩基、S.avermitilisMA-4680ゲノム配列上のputativesecretedproteinをコードする領域に85533/623塩基、S.scabiei87.22ゲノム配列上のputativesecretedproteinをコードする領域に85533/624塩基一致した。また、本遺伝子がコードするアミノ酸配列配列表の配列番号3は、最も近いもので、S.coelicolorA32のsecretedproteinに83178/214アミノ酸、S.viridochromogenesDSM40736およびS.griseoflavusTu4000のsecretedproteinに82177/214アミノ酸一致した。データベースに登録されているすべての遺伝子やタンパク質を対象とした検索により、本遺伝子とそのアミノ酸配列に相同性を示す塩基配列は検出されるものの、単離精製機能的、酵素化学的解析がなされた報告例のあるタンパクは皆無である。したがって、NucSタンパク質およびnucS遺伝子は、これまでに報告のない新規なものと推察される。分子量が約17~21kDaであるNucSはSDS-PAGE後のその分子領域に含まれる全てのタンパク質を分子量ごとに切り出し、トリプシン消化後、LC-MS/MS分析に供した結果、上記のように、全てのタンパク質において共通のアミノ酸配列を持つペプチドALPTPVSAATARがあった。NucSの分子量は、SDS-PAGE法により最も分子量が小さい場合が約17kDaであることより、NucSのアミノ酸配列214アミノ酸のうち、共通アミノ酸配列ALPTPVSAATARをN末端の起点として17kDaと算出される共通アミノ酸配列157アミノ酸を、NucSのコア配列配列表の配列番号1とした。データベースに登録されている配列との比較により、NucSのコア配列はStreptomycesgriseoflavusTu4000のsecretedproteinあるいはS-layerdomain-containingproteinに86136/157アミノ酸、StreptomycescoelicolorA32のsecretedproteinとStreptomyceslividansTK24のsecretedprotein等に85135/157アミノ酸一致した。4.66.5kDaの核酸分解酵素NucleaseLの精製分子量約66.5kDaの核酸分解酵素NucleaseLと命名、以下NucLと省略するを疎水性ブチルトヨパールおよびフェニルセファロース、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一バンドになるまで精製した図2を参照。精製の概要を表2に示した。NucLについて、1mMMgCl2、1mMCaCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5中、37°Cにおける比活性は5.6×104U/mg-proteinであった。Novex登録商標IEFpH3-10gelインビトロジェン社製を用いて、等電点を測定したところ、pIは7.0であった。次に、精製酵素のN末端アミノ酸配列を決定したところ、DSVRIHDIQGTTRであることが分かった。この配列は、Streptomycesscabiei87.22のゲノムにコードされる推定タンパク質putativesecretedhydrolase、S.avermitilisMA-4680のゲノム上にコードされる推定タンパク質largesecretedproteinにそれぞれ12/13アミノ酸、一致した。さらに精製酵素をSDS-PAGE後にトリプシン消化し、LC-MS/MS分析に供したところ、StreptomycesavermitilisMA-4680、StreptomycesgriseoflavusTu4000のゲノム配列にコードされる2つの推定タンパク質largesecretedprotein[StreptomycesgriseoflavusTu4000由来]アクセッション番号ZP_05541988、largesecretedprotein[StreptomycesavermitilisMA-4680由来]アクセッション番号NP_827523のアミノ酸配列と一致する、短いアミノ酸配列6-21アミノ酸が計8カ所検出された。続いて、largesecretedprotein[StreptomycesavermitilisMA-4680由来]アクセッション番号NP_827523のアミノ酸配列を用いて、BLASTPprogramsによる相同性検索を行なったところ、largesecretedprotein[StreptomycessviceusATCC29083]アクセッション番号ZP_06916237、largesecretedprotein[StreptomycesviridochromogenesDSM40736由来]アクセッション番号ZP_05530648、putativehydrolase[Streptomycesscabiei87.22由来]アクセッション番号YP_003492557largesecretedprotein[StreptomycescoelicolorA32由来]アクセッション番号NP_626174、largesecretedprotein[StreptomycesghanaensisATCC14672由来]アクセッション番号ZP_04688952、largesecretedprotein[StreptomycesgriseoflavusTu4000由来]アクセッション番号ZP_05541988に約80の相同性を示した。これらのタンパクのアミノ酸配列をNCBIデータベースより取得し、GENETYX登録商標-MACVersion12.1.0ソフトウエアを用いて、アライメントした。本アライメントアミノ酸配列に基づき、保存性の高い領域を選択し、プライマーセットG配列表の配列番号19および20を作成した。MBE174の総DNAを鋳型として、プライマーセットGを用いたPCRにより約1.6kbの増幅DNA断片配列を取得し、塩基配列の解析を行なった。得られた塩基配列を基に、primersetHR配列表の配列番号21を設計した。また一方で、largesecretedprotein[StreptomycesgriseoflavusTu4000由来]アクセッション番号ZP_05541988をコードする塩基配列の上流に存在する塩基配列1000bpおよびlargesecretedprotein[StreptomycescoelicolorA32由来]アクセッション番号NP_626174をコードするを塩基配列の上流に存在する塩基配列1000bpをNCBIデータベースより取得し、これらに保存された配列に基づき、primersetHF配列表の配列番号22を作成した。MBE174の総DNAを鋳型として、primersetHR、primersetHFの組み合わせからなるプライマーセットHを用いたPCRにより約0.5kbの増幅DNA断片を取得し、塩基配列の解析を行ない、nucL遺伝子5’末端配列を得た。またMBE174の総DNAを制限酵素PstIで消化し、TaKaRaLAPCRinvitroCloningKitタカラバイオ社製、Catno.RR015に含まれるPstIカセットを連結しDNA混合物を鋳型として、プライマーセットI配列表の配列番号23および24を用いてPCR反応を行なった。得られたPCR反応物を鋳型として、さらにプライマーセットJ配列表の配列番号25および26を用いて、約1.3kbの増幅断片を取得し、nucL遺伝子の3’末端塩基配列を解析した。上記プライマーセットG~Jを用いたPCRにより得られたDNA増幅断片の全塩基配列をアセンブルし、nucL遺伝子全長の塩基配列配列表の配列番号6を明らかにした。本酵素の遺伝子配列は、最も近縁なもので、S.coelicolorA32のゲノム配列のputativelargesecretedproteinをコードする領域に841587/1872塩基、S.avermitilisMA-4680ゲノム上のputativelargesecretedproteinをコードする領域に811508/1859塩基一致した。また、本遺伝子がコードするアミノ酸配列配列表の配列番号4は、最も近縁なもので、S.coelicolorA32のゲノム上にコードされるputativelargesecretedproteinに80491/613アミノ酸、S.ghanaensisATCC14672のゲノム上にコードされるlargesecretedproteinに80488/609アミノ酸一致した。データベースに登録されているすべての遺伝子やタンパクを対象とした検索により、本遺伝子に相同性を示す塩基配列は検出されるものの、単離精製機能的、酵素化学的解析がなされた報告例のあるタンパクは皆無である。したがって、NucLタンパク質およびnucL遺伝子は、これまでに報告のない新規なものと推察される。nucLがコードする全アミノ酸配列607アミノ酸のうち、N末端のシグナルペプチドを切断した配列をNucL成熟タンパク575アミノ酸とした配列表の配列番号2。このNucL成熟タンパクは、NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、BLASTPprograms2.2.24を用いて、Non-redundantproteindatabaseに対する相同性検索の結果、StreptomycescoelicolorA32、StreptomyceslividansTK24のputativelargesecretedproteinと81465/574アミノ酸、StreptomycesghanaensisATCC14672のlargesecretedproteinに80467/577アミノ酸一致した。5.NucSとNucLの生化学的性質NucSとNucLの生化学的性質の試験結果を以下に示す。1酵素活性に対するpHの影響各pHにおける核酸分解活性は、1mMMgCl2、1mMCaCl2を含む20mM2-モルホリノエタンスルホン酸,一水和物/NaOHMES,pH5.5~7.0、3-モルホリノプロパンスルホン酸/NaOHMOPS,pH7~8、N-トリスヒドロキシメチルメチル-3-アミノプロパンスルホン酸/NaOHTAPS,pH8~9、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸/NaOHCHES,pH9~9.5、またはN-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸/NaOHCAPS,9.5~10中で、Deoxyribonucleicacidsodiumsaltfromsalmontestes0.4mg/mLシグマアルドリッチ社製、Catno.D1626-1Gを基質として、25°Cで15分間測定した。NucSはpH8.5、NucLはpH8.8付近が最適反応pHであることが分かった図3および図4を参照。2酵素活性に対する温度の影響1mMMgCl2、1mMCaCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5中で15分間、各温度条件における核酸分解活性を測定したところ、NucSは55°C、NucLは45°C付近が最適反応温度であることが分かった図5を参照。3熱安定性試験1mMMgCl2、1mMCaCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5中で、各温度で30分熱処理後の残存活性を測定した図6を参照。氷浴中に保存しておいた酵素の活性を100とした。その結果、NucSは45°Cまで安定であり、NucLは35°Cまで安定であった。4酵素活性に対する一価塩の影響NucSおよびNucLについて一価塩の影響を調べた。1mMMgCl2と0~1000mMNaClを含む10mMTris/HCl、pH8.5中で、Deoxyribonucleicacidsodiumsaltfromsalmontestes0.4mg/mLシグマアルドリッチ社製、Catno.D1626-1Gを基質として、各NaCl濃度の核酸分解活性を25°Cで15分間測定した。NucS活性はNaCl濃度が低い場合に高く、NucLは1000mMまでのNaCl濃度存在条件でも活性を維持することが分かった図7を参照。KClを用いた場合にもほぼ同様の結果が得られた図8を参照。5酵素活性に対する二価金属塩の影響NucSおよびNucLについて二価金属塩の影響を調べた。1mMCaCl2と、0~20mMMgCl2あるいはMnCl2を含む20mMTris/HCl、pH8.5中に、基質としてDeoxyribonucleicacidsodiumsaltfromsalmontestes0.4mg/mLシグマアルドリッチ社製、Catno.D1626-1Gを加えた反応液に、NucSあるいはNucLを添加、氷中で30分間インキュベートした後、核酸分解活性を25°Cで15分間測定した。NucS、NucLは活性に二価の金属塩を要求した。NucS、NucLは0.25~5mMMgCl2存在下で高い活性を示した図9を参照。またNucSは1~2mMMnCl2存在下でMgCl2存在下とほぼ同等の活性を示した図10を参照。なお、本試験では酵素安定性を高めるために、すべての反応液に1mMCaCl2を添加した。6酵素活性に対するリン酸塩の影響NucSおよびNucLについてリン酸塩の影響を調べた。1mMMgCl2、1mMCaCl2を含む0~40mMリン酸カリウム緩衝液、pH8.5中で、Deoxyribonucleicacidsodiumsaltfromsalmontestes0.4mg/mLシグマアルドリッチ社製、Catno.D1626-1Gを基質として、核酸分解活性を25°Cで15分間測定した。NucSはリン酸塩に強く阻害され、0.5mM以上のリン酸塩により活性を失った。一方、NucLはNucSと比較して、リン酸塩に対して優れた耐性を示し、10mMのリン酸カリウム存在下でも50の活性を保持することができた。図11を参照7酵素活性に対する各種化学物質の影響氷浴上で表3中の化合物と1時間接触させたのち、標準比活性測定方法で酵素活性を測定した表3を参照。表3に示すように、NucSとNucLはZnCl2、CuCl2、EDTAによって強く阻害された。また、NucSはジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミドに高い耐性を示し、NucLはSDSに高い耐性を示した。なお、水に難溶の化合物はジメチルスルホキシドに溶解した後、酵素液に添加した。添加後のジメチルスルホキシドの終濃度は5とし、5ジメチルスルホキシド存在下での活性を100とした。6.NucSとNucLによる核酸分解のパターンと基質特異性1NucSおよびNucLの環状プラスミドDNAに対する分解様式の解析プラスミド精製キットHiSpeed登録商標PlasmidMidiKit;キアゲン社製、Catno.12643を用いて精製した環状プラスミドDNApUC18を基質として、NucSおよびNucLそれぞれの核酸分解様式を解析した。標準比活性測定方法による、プラスミド溶液約2~10μgに対して、下の表にある異なる酵素量の酵素液をそれぞれ添加して、25°Cで15分間核酸分解反応を行なった。分解後の反応液を1アガロースゲル電気泳動に供し、その分解されたDNAの分解様式を解析した。酵素濃度を変化させて分解したときの様子25°Cの反応を図12に示した。参考として、ベンゾナーゼ同ユニット数を用いた場合の試験結果も合わせて図12に示した。なお、各レーンの説明は表4に示した。続いて、NucLの酵素量を0.5Uに上げ、プラスミドが完全に分解できるか試験した図13を参照。これらの結果より、NucSおよびNucLは、環状プラスミドDNAを、スーパーコイル型、リラックス型の形状に関わらず、単独酵素でプラスミドを完全に分解することが可能であることが分かった。2NucSおよびNucLの環状DNAに対する分解反応初期における反応様式の解析標準比活性測定方法による、NucSおよびNucLの環状DNApUC18プラスミドに対する分解反応初期における反応様式を解析した図14および図15を参照。本結果より、NucSはエンド型様式の分解活性を持つと推察される。また、NucLは、DesaiandShankarEurJBiochem267512351352000を参照、本文献の記載はここに特に開示として援用されるによって報告例のある一本鎖特異的なエンド型核酸分解酵素に類似した反応パターンを示した。一本鎖特異的核酸分解酵素による環状プラスミドDNAの分解は、一本鎖のエンド型切断の蓄積による低分子化によって進むと考えられている。3二本鎖直鎖DNAの分解パターン標準比活性測定方法による、環状DNApUC18プラスミドを制限ヌクレアーゼBamHI5’-突出末端を生じる、SacI3’-突出末端を生じる、SmaI平滑末端を生じるを用いて直鎖状にした基質を用いて、NucSおよびNucLを用いた分解反応を行なった図16および図17を参照。なお、各レーンの説明は表5に示した。本結果により、NucSおよびNucLは、DNA鎖末端の構造に関わらず直鎖状二本鎖DNAを単独酵素で分解することが可能であることが分かった。また、図12と図16および図17との比較により、NucSは、環状DNAと直鎖状二本鎖DNAを同様の効率で分解することが分かった。一方、NucLは環状DNAに比べて、直鎖状二本鎖DNAをより効率良く分解した。また、反応途中で観察される分解の進んでいないDNAの最大サイズがNucSでは反応開始から一定であるのに対し図16のレーン5~8の主なバンド、NucLではサイズの低下が起きている図17のレーン3とレーン4~8の主なバンドを比較。これはNucLによるDNA分解が、ランダムな位置というよりもむしろ末端部分でより効率良く起きていること、すなわちエキソ型分解反応が進んでいること示唆する。以上の結果から、NucLはエンドエキソ型と呼ばれる反応様式を有すると推定される。4一本鎖DNAと二本鎖DNA、RNAに対する反応性試験15分間の標準比活性測定方法による、低温で溶解したサケDNA二本鎖DNAと95°C、10分間の熱変性後の同DNA一本鎖DNAに対する各酵素の反応性を試験した。その結果、NucSは未変性DNAと熱変性DNAを同程度の効率で分解するが、NucLは未変性DNAに比べて熱変性後DNAを、約5倍の高い効率で分解することが分かった。すなわち、NucLは一本鎖DNAに効率良く作用する酵素であると言える。また、RNA酵母由来mRNAに対する分解活性を測定した結果、NucSはRNA分解活性を示したが、NucLはRNA分解活性を示さなかった。5ホスホジエステラーゼ、ホスファターゼ活性試験ビスp-ニトロフェニルリン酸、p-ニトロフェニルリン酸を基質として、TomoyedaらArchivesofbiochemistryandbiophysics1311912021969を参照、本文献の記載はここに特に開示として援用されるの方法に従い、1mMMgCl2、1mMCaCl2および1グリセロールを含む100mMTris/HCl、pH8.5中で、0.2上記基質とする反応液を用いて、両方酵素のホスホジエステラーゼ活性、ホスファターゼ活性を25°Cで測定した。その結果、NucSはホスホジエステラーゼおよびホスファターゼ活性をどちらも持たないが、NucLはホスホジエステラーゼおよびホスファターゼの両活性を有することが分かった。7.まとめNucSは、市販核酸分解酵素に比べて格段に高い比活性を持ち、低塩濃度条件下で種々の核酸一本鎖と二本鎖の直鎖および環状DNA、RNAを効率良くエンド型に分解する。NucLは広い塩濃度条件下でDNA一本鎖と二本鎖の直鎖および環状DNAをエンドエキソ型に分解する。したがってNucSおよびNucLを併用することにより、広範な条件において優れた核酸分解活性が期待される。また両酵素は、Mn2の添加を必要とせず、低濃度1mMのMg2およびCa2存在下で高い活性を示すこと、また本酵素の生産菌は培養が容易で、安全性が高いと考えられるストレプトマイセス属細菌であることから、食品や医薬品製造時の核酸分解工業用酵素として有望と考えられる。核酸分解酵素高生産放線菌Streptomycessp.MBE174を培養することによって、また本酵素をコードする新規遺伝子を用いて、核酸分解酵素を安価に提供することが可能であると考えられる。配列表に記載の配列は以下の通りである:No.1NucSのコア配列ALPTPVSAATARGYLASLKVAPENRTGYKRDLFPHWITQSGTCNTRETVLKRDGTNVVTDAACAATSGSWYSPFDGATWTAASDVDIDHLVPLAEAWDSGASAWTTAQRQAFANDLTRPQLLAVTDTVNQSKGDKDPAEWMPPRAAYHCTYVRAWVQ;No.2NucL成熟タンパクDSVRIHDIQGTTRISPYAGRQVADVPGVVTGVRDHGSSRGFWFQDPRPDDDPATSEGVFVFTGSAPGVEAGDAVTVSGTVSEFVPGGTASGNQSLTEITRPTVTVVSRGNPVPDPVVVSARSVPHAYAPAGDAAANGSVNALPLRPDRYALDYYESLEGMNVQVADARVVGATDPYTELWVTVKPGENASPRGGTVYGSRDAQNTGRLQIQTLGVPAGFPAADVGDTLAGATTGPLDYNQFGGYTLVARSLGTLTAGGLARETTREQHRDELSVATYNVENLDPSDGTFAAHAEAIVRNLRSPDIVSLEEIQDDNGATDDGTVTAGVTVGKLIDAVVAAGGPRYDWRSVDPVDKADGGQPGGNIRQVFLFDPRRVSFADRPGGDAVTATGVVKVRGKAALTHSPGRVDPANPAWLNSRKPLAGEFSFRGRTVFVIANHFASKGGDQGLTSQYQPPARSSETQRHLQATAVNTFVKQILAVQKNADVIALGDINDFEFSGTTERLEAGGALWSAVRSLPPGERYSYVYQGNSQVLDQILVSPSIRRGHLSYDSVHINAEFHDQISDHDPQVLRYRP;No.3NucSMPKLYARRRFAVLAALTGLIASAGLFHGPAASAALPTPVSAATARGYLASLKVAPENRTGYKRDLFPHWITQSGTCNTRETVLKRDGTNVVTDAACAATSGSWYSPFDGATWTAASDVDIDHLVPLAEAWDSGASAWTTAQRQAFANDLTRPQLLAVTDTVNQSKGDKDPAEWMPPRAAYHCTYVRAWVQVKYYYGLSVDTAEKTALTNRLAGC;No.4NucLMASQSVTRLAALTVAATCSAASVVVLGPPAHADSVRIHDIQGTTRISPYAGRQVADVPGVVTGVRDHGSSRGFWFQDPRPDDDPATSEGVFVFTGSAPGVEAGDAVTVSGTVSEFVPGGTASGNQSLTEITRPTVTVVSRGNPVPDPVVVSARSVPHAYAPAGDAAANGSVNALPLRPDRYALDYYESLEGMNVQVADARVVGATDPYTELWVTVKPGENASPRGGTVYGSRDAQNTGRLQIQTLGVPAGFPAADVGDTLAGATTGPLDYNQFGGYTLVARSLGTLTAGGLARETTREQHRDELSVATYNVENLDPSDGTFAAHAEAIVRNLRSPDIVSLEEIQDDNGATDDGTVTAGVTVGKLIDAVVAAGGPRYDWRSVDPVDKADGGQPGGNIRQVFLFDPRRVSFADRPGGDAVTATGVVKVRGKAALTHSPGRVDPANPAWLNSRKPLAGEFSFRGRTVFVIANHFASKGGDQGLTSQYQPPARSSETQRHLQATAVNTFVKQILAVQKNADVIALGDINDFEFSGTTERLEAGGALWSAVRSLPPGERYSYVYQGNSQVLDQILVSPSIRRGHLSYDSVHINAEFHDQISDHDPQVLRYRP;No.5nucS遺伝子ATGCCGAAGCTCTACGCGCGTCGACGGTTCGCCGTCCTCGCCGCGCTCACCGGACTCATAGCCTCCGCCGGGCTCTTCCACGGTCCGGCCGCCTCCGCCGCCCTCCCCACGCCGGTCAGCGCCGCCACCGCCCGCGGCTACCTCGCCTCCCTGAAGGTGGCCCCCGAGAACCGCACCGGCTACAAGCGCGACCTCTTCCCCCACTGGATCACGCAGTCCGGCACCTGCAACACCCGCGAGACCGTCCTCAAACGCGACGGCACCAACGTCGTCACCGACGCCGCCTGCGCCGCCACCAGCGGCAGTTGGTACTCGCCCTTCGACGGGGCCACCTGGACCGCCGCCTCCGACGTCGACATCGACCACCTCGTCCCGCTGGCCGAGGCGTGGGACTCCGGCGCGAGCGCCTGGACCACGGCCCAGCGCCAGGCGTTCGCCAACGACCTGACACGTCCTCAGCTCCTCGCCGTCACCGACACCGTGAACCAGTCCAAGGGCGACAAGGACCCGGCCGAGTGGATGCCGCCCCGGGCCGCCTACCACTGCACCTACGTACGCGCCTGGGTGCAGGTGAAGTACTACTACGGCCTCTCGGTCGACACCGCCGAGAAGACGGCGCTCACGAACCGGCTCGCCGGCTGCTGA;No.6nucL遺伝子TTGGCCAGCCAGTCCGTCACGCGCCTCGCCGCGCTCACCGTCGCCGCCACCTGTTCGGCGGCGTCCGTCGTCGTCCTCGGTCCGCCCGCGCACGCCGACTCCGTGCGCATCCACGACATCCAGGGCACCACCAGGATCTCCCCGTACGCCGGCCGCCAGGTCGCCGACGTGCCCGGCGTCGTCACCGGAGTCCGCGACCACGGCTCCTCCCGGGGCTTCTGGTTCCAGGACCCGCGGCCCGACGACGACCCCGCCACCAGCGAGGGAGTGTTCGTCTTCACCGGCTCGGCCCCCGGGGTCGAGGCCGGCGACGCGGTCACCGTCTCCGGCACGGTCTCGGAGTTCGTGCCCGGCGGGACCGCCTCCGGCAACCAGTCGCTCACCGAGATCACCCGGCCCACGGTCACCGTGGTCTCCCGCGGCAACCCGGTGCCGGACCCGGTCGTCGTCTCGGCCCGCTCCGTGCCGCACGCCTACGCCCCGGCGGGCGACGCCGCCGCGAACGGCTCCGTCAACGCCCTGCCCCTGCGGCCCGACCGCTACGCCCTGGACTACTACGAGTCCCTGGAGGGCATGAACGTCCAGGTGGCCGACGCCCGCGTGGTCGGCGCGACCGACCCGTACACCGAGCTGTGGGTGACGGTGAAGCCCGGCGAGAACGCGAGCCCCCGGGGCGGCACCGTCTACGGCTCCCGCGACGCGCAGAACACCGGGCGGCTGCAGATCCAGACCCTGGGCGTACCAGCCGGCTTCCCCGCCGCCGACGTGGGCGACACCCTCGCGGGCGCCACCACCGGCCCGCTCGACTACAACCAGTTCGGCGGCTACACCCTGGTCGCCCGTAGTCTCGGCACGCTCACCGCCGGCGGGCTCGCCCGCGAGACGACCCGGGAGCAGCACCGCGACGAGCTGTCGGTGGCCACGTACAACGTCGAGAACCTCGACCCCTCCGACGGCACCTTCGCCGCGCACGCGGAGGCGATCGTCCGGAACCTGCGCTCACCGGACATCGTGTCCCTGGAGGAGATCCAGGACGACAACGGCGCCACGGACGACGGCACGGTGACCGCCGGCGTGACGGTGGGCAAGCTGATCGACGCCGTCGTCGCGGCCGGCGGCCCGCGCTACGACTGGCGCTCGGTGGACCCCGTCGACAAGGCGGACGGCGGGCAGCCGGGCGGCAACATCCGCCAGGTGTTCCTCTTCGACCCGCGGCGGGTCTCCTTCGCCGACCGTCCCGGCGGGGACGCGGTCACCGCGACCGGGGTGGTGAAGGTGCGCGGCAAGGCGGCGCTGACCCACTCCCCCGGCCGGGTCGACCCCGCGAACCCCGCCTGGCTGAACAGCCGCAAGCCGCTGGCCGGCGAGTTCTCGTTCCGCGGGCGGACGGTCTTCGTGATCGCCAACCACTTCGCGTCCAAGGGCGGCGACCAGGGGCTGACCTCCCAGTACCAGCCGCCGGCGCGGAGTTCGGAGACCCAGCGCCACCTCCAGGCGACGGCGGTGAACACCTTCGTCAAGCAGATCCTGGCGGTCCAGAAGAACGCGGACGTCATCGCCCTCGGCGACATCAACGACTTCGAGTTCTCCGGCACGACGGAACGCCTGGAGGCCGGCGGCGCGCTCTGGTCGGCGGTCAGGTCGCTGCCGCCGGGCGAGCGCTACTCGTACGTCTACCAGGGCAACAGCCAGGTGCTCGACCAGATCCTGGTGAGCCCGTCGATCCGGCGCGGGCACCTGTCCTACGACAGCGTGCACATCAACGCCGAGTTCCACGACCAGATCAGCGACCACGACCCGCAGGTGCTGCGGTACCGCCCCTGA;No.7primersetAFCGCATGCAAGTCTACG;No.8primersetARACTGCCGCTGGTGG;No.9primersetBFAGCGGCAGTGGTACTC;No.10primersetBRACCCGCGATCTGGAAGG;No.11primersetCFGCTACAAGCGCGACCTCTTC;No.12primersetCRTGGACTGGTTCACGGTGTC;No.13primersetDFAACTGCCGCTGGTGG;No.14primersetDRCTGAGCAGTATGTCGACGGTC;No.15primersetEFGCTACAAGCGCGACCTCTTC;No.16primersetERGTTAGAACGCGTAATACGAC;No.17primersetFFCTGGGTGCAGGTGAAGTACTAC;No.18primersetFRGTAATACGACTCACTATAGG;No.19primersetGFGGCTTCTGGATCAGGACCC;No.20primersetGRCTGCGGGTCGTGGTCG;No.21primersetHRCGGTGAGCGACTGGTTG;No.22primersetHFCAGTACATGGCGAAACCTTGAC;No.23primersetIFCGAGTTCTCGTTCCGCG;No.24primersetIRGTTAGAACGCGTAATACGAC;No.25primersetJFATCGCCAACCACTTCGC;No.26primersetJRGTAATACGACTCACTATAGG;No.27NucSの共通配列ALPTPVSAATAR。"