"ペルオキシレドキシンPeroxiredoxinタンパク質に放射線を照射して、シャペロン活性を増進させる方法。ペルオキシレドキシンタンパク質が、2個または3個のシステイン残基を有する2-システインペルオキシレドキシンであることを特徴とする、請求項1に記載のシャペロン活性を増進させる方法。ペルオキシレドキシンタンパク質が、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項2に記載のシャペロン活性を増進させる方法。放射線が、ガンマ線、電子線ベータ線及び紫外線からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項1に記載のシャペロン活性を増進させる方法。ガンマ線の照射線量が、1~500kGyであることを特徴とする、請求項4に記載のシャペロン活性を増進させる方法。電子線の照射線量が、1~30kGyであることを特徴とする、請求項4に記載のシャペロン活性を増進させる方法。紫外線の照射線量が、5~240Wであることを特徴とする、請求項4に記載のシャペロン活性を増進させる方法。請求項1に記載の方法によって製造された、シャペロン活性が増進したペルオキシレドキシン。請求項8に記載のペルオキシレドキシンを有効成分として含有する環境ストレス抵抗性増進用組成物。環境ストレス抵抗性増進用組成物を製造するための、請求項8に記載のペルオキシレドキシンの使用方法。本発明の目的は、ペルオキシレドキシンPeroxiredoxin,Prxタンパク質のシャペロン活性を増進させる方法を提供することにある。本発明のもう一つの目的は、前記方法によって製造されたシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンタンパク質及びその使用方法を提供することにある。前記目的を達成するために、本発明はペルオキシレドキシンタンパク質に放射線を照射してシャペロン活性を増進させる方法を提供する。また、本発明は放射線の照射によってシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンを提供する。また、本発明はシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンを有効成分として含有する環境ストレス抵抗性増進用組成物を提供する。同時に、本発明は環境ストレス抵抗性増進用組成物を製造するための、放射線の照射によってシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンの使用方法を提供する。本発明のペルオキシレドキシンタンパク質にガンマ線を照射してシャペロン活性を増進させる方法は、ガンマ線の照射によってシャペロンの活性が最適化する条件を確立し、このようなシャペロン活性の増進がペルオキシレドキシンタンパク質の構造変化と関係するものであるということを明らかにし、2-Cysペルオキシレドキシンタンパク質では一般的に知られているαヘリックス構造の減少及びβシート構造の増加が観察された一方、3-Cysペルオキシレドキシンタンパク質では二次構造の変化が観察されないということを明らかにすることにより、シャペロン活性増進に係わるタンパク質の構造変化に対する新しい結果を提示する。本発明によるシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンは環境ストレスに対する耐性を増進させることができるので、農作物を含む多様な生物体の生産性増大及び有用成分の大量生産に寄与することができる。以下、本発明を詳しく説明する。本発明は、ペルオキシレドキシンタンパク質に放射線を照射してシャペロン活性を増進させる方法を提供する。シャペロン活性を増進させる方法において、ペルオキシレドキシンタンパク質は、2-システインペルオキシレドキシンまたは3-システインペルオキシレドキシンであることを特徴とするが、これらに限定されない。2-システインペルオキシレドキシンタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されず、3-システインペルオキシレドキシンタンパク質は配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されない。シャペロンの活性を増進させるために照射される放射線は、ガンマ線、電子線ベータ線、エックス線及び紫外線からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましく、ガンマ線または紫外線であることがさらに好ましいがそれらに限定されない。シャペロンの活性を増進させるために照射されるガンマ線は、1~500kGyであることが好ましく、さらに2~100kGyであることが好ましく、15~30kGyであることが最も好ましいが、これに限定されない。また、シャペロンの活性を増進させるために照射される電子線は、1~30kGyであることが好ましく、15~30kGyであることがさらに好ましいが、これに限定されない。同時に、シャペロンの活性を増進させるために照射される紫外線は、5~240Wであることが好ましいが、これに限定されない。本発明の実施例において、緑膿菌PAO1及びシュードモナスプチダKT2440からのPP10843-Cys遺伝子及びPA35292-Cys遺伝子を発現ベクターpRSETaにクローニングした後、それを用いてタンパク質を生産して精製した図1ないし図5参照。精製された2種類のPrxタンパク質PP1084、PA3529に0~500kGyのガンマ線を照射して、構造を変化させるガンマ線量を確認した。2種類のPrxタンパク質はともに、100kGy以上を照射した時にその構造がほぼ破壊されることを確認することができた図6及び図7参照。また、本発明の実施例において、前記精製された2種類のPrxタンパク質に対するガンマ線の照射範囲を把握した後、ガンマ線の照射によってシャペロン活性が増加するか否かを確認した結果、30kGyのガンマ線照射量でPP1084タンパク質及びPA3529タンパク質の両方においてシャペロン活性が最も増加することが確認された図8及び図9参照。このように増加したシャペロン活性とPrxタンパク質の構造変化との関係を確認するために、ガンマ線を照射した2種類のPrxタンパク質の構造をFPLCを用いて分析した。その結果、PP10843-Cysタンパク質及びPA35292-Cysタンパク質は、ガンマ線照射後、分子量が大きいタンパク質グループ及び分子量が小さいタンパク質グループを生成して、低分子化されることが確認された図10及び図11参照。また、本発明の実施例において、高線量ガンマ線を照射した後のPrxタンパク質の構造変化を確認するために、照射されたPrxタンパク質を還元環境でSDS-PAGEを用いて分離した。その結果、ガンマ線を照射しないPrxタンパク質では25kDaの分子量が観察されたが、ガンマ線を照射したタンパク質では還元剤によって還元されない新しい共有結合が生成された。生成された共有結合を確認するために、一般的に酸化状態で生成されることが知られているジチロシン結合の生成の有無を、ガンマ線が照射されたPP1084タンパク質について確認した結果、チロシン結合が30kGyと50kGyで増加することが確認された図12ないし図14参照。また、本発明の実施例において、シャペロン活性に影響を及ぼすタンパク質の疎水性変化を確認するために、ガンマ線の照射によるPrxタンパク質の疎水性変化を観察した結果、シャペロン活性を最も多く増進させた30kGyのガンマ線量でPP1084タンパク質及びPA3529タンパク質の疎水性が増加することが確認された図15及び図16参照。また、本発明の実施例において、ガンマ線の照射後のPrxタンパク質の二次構造の変化を観察した。一般的にシャペロン活性が増進した時に観察されるαヘリックスの減少とβシートの増加が、2-CysPA3529タンパク質で観察されたが、3-CysPP1084タンパク質では二次構造の変化は観察されなかった図17及び図18参照。また、本発明の実施例において、紫外線の照射によってシャペロン活性が増加するか否かを確認するため、紫外線の照射後のシャペロン活性及びチオレドキシンペルオキシダーゼ活性を測定した結果、紫外線の照射時間が増加するにつれて分子シャペロン活性が増加した一方、チオレドキシンペルオキシダーゼ活性は減少することが確認された図19及び図20参照。以上より、放射線の照射によってペルオキシレドキシンタンパク質のシャペロン活性が非照射群に比べて顕著に増加することが明らかになった。したがって、本発明により、放射線の照射を用いてペルオキシレドキシンのシャペロン活性を増進できることが判明した。より具体的には、ペルオキシレドキシンタンパク質がガンマ線の照射によって低分子化されて、ジチロシン結合が増加し、2-Cysペルオキシレドキシンタンパク質ではタンパク質二次構造のβシートとランダムコイルが増加して、αヘリックス及びターン構造の減少が観察された一方、3-Cysペルオキシレドキシンタンパク質では二次構造の変化が観察されないということを明らかにすることで、シャペロン活性増進に係わるタンパク質の構造変化に対する新しい結果を提示した。また、このようなペルオキシレドキシンタンパク質の構造変化は、シャペロン活性に関与する疎水性の増加を誘導して、15~30kGyのガンマ線の照射範囲でペルオキシレドキシンタンパク質のシャペロン活性が非照射群に比べて3倍以上増加することから、その活性が最適化されることを確認した。また、2-Cysペルオキシレドキシンタンパク質がガンマ線以外に紫外線の照射によってもシャペロン活性が非照射群に比べて顕著に増加する結果を提示した。したがって、本発明による放射線を照射する方法を、ペルオキシレドキシンのシャペロン活性を増進させる方法として有用に使用することができる。また、本発明は、放射線の照射によってシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンを提供する。本発明において、ペルオキシレドキシンタンパク質は、2-システインペルオキシレドキシンまたは3-システインペルオキシレドキシンであることを特徴とするが、これらに限定されない。2-システインペルオキシレドキシンタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されず、3-システインペルオキシレドキシンタンパク質は配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されない。本発明において、放射線は、ガンマ線、電子線ベータ線、エックス線及び紫外線からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましく、ガンマ線または紫外線であることがさらに好ましいが、それらに限定されない。シャペロンの活性を増進させるために照射するガンマ線は、1~500kGyであることが好ましく、2~100kGyであることがさらに好ましく、最も好ましいのは15~30kGyであるが、これに限定されない。また、シャペロンの活性を増進させるために照射される電子線は、1~30kGyであることが好ましく、15~30kGyであることがさらに好ましいが、これに限定されない。同時に、シャペロンの活性を増進させるために照射される紫外線は、5~240Wであることが好ましいが、これに限定されない。本発明の実施例において、ガンマ線または紫外線などの放射線の照射によってペルオキシレドキシンのシャペロン活性が増進されることが観察され、15~30kGy範囲のガンマ線をペルオキシレドキシンに照射した時、ペルオキシレドキシンの低分子化、ジチロシン結合の増加のような構造変化が観察され、このような構造変化がペルオキシレドキシンタンパク質の疎水性を増加させることによってシャペロンの活性を非照射群に比べて3倍以上増進させるということが明らかとなった。また、2-Cysペルオキシレドキシンタンパク質が、ガンマ線以外に紫外線の照射によってもシャペロン活性が非照射群に比べて顕著に増加する結果を提示した。したがって、本発明による放射線を照射する方法を用いて、シャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンタンパク質を製造することができる。また、本発明は、本発明によるシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンを有効成分として含有する環境ストレス抵抗性増進用組成物を提供する。同時に、本発明は環境ストレス抵抗性増進用組成物を製造するための本発明によるシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンの使用方法を提供する。本発明の実施例において、ガンマ線または紫外線などの放射線の照射によってペルオキシレドキシンのシャペロン活性が増進されることが確認され、15~30kGy範囲のガンマ線をペルオキシレドキシンに照射した時、ペルオキシレドキシンの低分子化、ジチロシン結合の増加のような構造変化が観察され、このような構造変化がペルオキシレドキシンタンパク質の疎水性を増加させることによってシャペロンの活性を非照射群に比べて3倍以上増進させるということを明らかにした。また、2-Cysペルオキシレドキシンタンパク質が紫外線の照射によってもシャペロン活性が非照射群に比べて顕著に増加する結果を提示した。したがって、本発明による放射線の照射によって製造されたシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンは、環境ストレスに対する耐性を増進させることができるので、環境ストレス抵抗性増進用組成物として有用に使用することができる。以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。<実施例1>ペルオキシレドキシンPP1084,PA3529タンパク質の製造<1-1>ペルオキシレドキシンPRX遺伝子のクローニングPRX遺伝子を、緑膿菌PAO1及びシュードモナスプチダKT2440のゲノムDNAからそれぞれポリメラーゼ連鎖反応PCRを用いて得、クローニングベクターであるpGEMT-easyベクターにクローニングし、塩基配列分析を用いて遺伝子を確認した。その後、発現ベクターであるpRSETaベクターの多重クローニング部位の制限酵素位置に遺伝子をサブクローニングした。まず、PP1084遺伝子のクローニングのために下記の条件でPCRを行なった。PCR条件は、緑膿菌PAO1及びシュードモナスプチダKT2440のゲノムDNA10ng、dNTP0.2uM、正方向プライマー20pmol、逆方向プライマー20pmol、Taqポリメラーゼ1ユニット、及び蒸留水を添加して総体積が20μlになるようにした。94°Cで1分間の変性過程を1回経た後、94°Cで30秒間変性、50°Cで30秒間アニーリング、及び72°Cで45秒間延長の過程を35回反復した。その後、72°Cで10分間の最後の延長過程を1回経た後、PCR産物を獲得した。PCRに使用したプライマーは下記のとおりである。緑膿菌PAO1正方向プライマー:5’ccgctcgagatgagcgtactc3’配列番号3、緑膿菌PAO1逆方向プライマー:3’cgagctcttacagcttgccagc5’配列番号4、シュードモナスプチダKT2440正方向プライマー:5’ccgctcgagatgagcgtactcgta3’配列番号5、及びシュードモナスプチダKT2440逆方向プライマー:3’cccaagcttttacagcttgctggc5’配列番号6。緑膿菌PAO1のゲノムDNAでは、XhoI及びScaI制限酵素配列を含む配列番号3及び配列番号4のプライマーを用いてPCR産物を獲得し、シュードモナスプチダKT2440ゲノムDNAでは、XhoIとHindIII制限酵素配列を含む配列番号5及び配列番号6のプライマーを用いてPCR産物を獲得した。獲得した2種類のPRX遺伝子をクローニングベクターであるpGEMT-easyベクターに挿入し、塩基配列分析を用いて二つの遺伝子の塩基配列を確認した。そして、発現ベクターであるpRSETaベクターの多重制限酵素クローニング部位の制限酵素位置にそれぞれの遺伝子をサブクローニングした。その後、発現ベクターpRSETaに挿入されたPP1084遺伝子からのPrxタンパク質の発現及び分離精製のために、大腸菌KRX株;Promega,米国を前記ベクターで形質転換した。pRSETaベクターシステムにおいて、T7プロモーターを用いて挿入されたPrxタンパク質を過発現させ、Prxタンパク質の純粋分離を容易にするためにPrxタンパク質のN-末端に6個のヒスチジンHisを付加してタンパク質を合成した。pRSETaベクターシステムのT7プロモーター作動のために、宿主大腸菌細胞内でT7RNAポリメラーゼを供給した。KRX株は、L-ラムノ-スによってT7RNAポリメラーゼの供給が調節される宿主大腸菌である。Prxタンパク質の分離精製のためにPP1084タンパク質形質転換体クローンを作成し、1~11の番号を付与した図1。また、PA3529タンパク質形質転換体クローンを作成し、1~5の番号を付与した図2。PP1084クローン及びPA3529クローンを5mlのLBLuriaBertani培地が入っている15mlのテストチューブに1:100の比率で接種し、30°C、120rpmで培養した。OD600nmの数値が0.4になるまで培養した後、20L-ラムノ-ス最終0.2を添加して、37°C、120rpmで2時間培養した。1mlのL-ラムノ-スによって誘導された細胞を4°C、6000rpmで10分間遠心分離して得、100μlの1×ゲルローディングバッファーを添加して再び懸濁し、100°Cで5分間沸騰させた。用意したそれぞれの試料をSDS-PAGEに7μlずつローディングして電気泳動し、PP1084タンパク質及びPA3529タンパク質の過発現を確認した図3及び図4。<1-2>PRXタンパク質の精製pRSETa発現ベクターにクローニングされた2種類のPRX遺伝子PP1084及びPA3529を大量生産するために、実施例<1-1>で製造したそれぞれの遺伝子を大腸菌E.coliシステムを用いて過発現させた後、PP1084クローン及びPA3529クローンを400mlのLBLuriaBertani培地が入っている2l三角フラスコに1:100の比率で接種し、30°C、120rpmで培養した。OD600nmの数値が0.4になるまで培養した。その後、20L-ラムノ-ス最終0.2を添加して、30°C、120rpmで培養した。L-ラムノ-スによって誘導された細胞を4°C、6000rpmで10分間遠心分離して得て、0.02トリトンX-100が添加されたバインディングバッファー[20mMTris-HClpH7.5、0.5MNaCl、5mMイミダゾール]を用いて懸濁した後、冷凍保管した。バインディングバッファーは、400mlLBに対して30mlの割合で添加した。超音波粉砕機Sonicatorを用いて細胞を溶解させた後、溶解物を4°C、15000rpmで40分間遠心分離して上澄み液のみを分離した。あらかじめ平衡させたNTA-キレートレジンpeptron韓国大田市に前記細胞溶解物を添加した後、4°Cで1時間以上ローテーティングホイールRotatingwheelで撹拌してレジンに結合させた。撹拌が終わった後、4°C、1000rpmで5分間遠心分離してレジンと上澄み液とを分離した。分離したレジンに、レジンの量に対して約5倍程度の洗浄バッファー[20mMTris-HClpH7.5、0.5MNaCl、50mMイミダゾール]を添加して、4°Cで1時間以上ローテーティングホイールで撹拌して上澄み液を除去する過程を5回反復した。レジンに対して0.5~1倍程度の溶出バッファー[20mMTris-HClpH7.5、0.5MNaCl、200~400mMイミダゾール]を洗浄したレジンに添加して、1時間以上4°Cでローテーティングホイールで撹拌した後、上澄み液を得た。溶出バッファーを添加して上澄み液を得る過程を3回反復した後、得られた上澄み液を溶出画分1、2、及び3に分離して保管した。前記得られた溶出画分をメンブレンチューブに移した後、1lの50mMヘペスpH8.0を用いて3回透析し、バッファーを交換した。その後、セントリコンCentriconを用いて濃縮し、実験に用いるまで-80°Cで冷凍保管した。<1-3>SDS-PAGEを用いた精製されたPrxタンパク質の確認セントリコンを用いて濃縮したタンパク質を確認するために、SDS-PAGEを用いて濃縮されたPrxタンパク質の純度及び濃度を確認した図5。溶出分画物1、2、3のタンパク質をウエスタンブロットを用いて確認した結果、図5に示すように、25kDaサイズのPrxタンパク質が検出された図5。<実施例2>Prxタンパク質2-Cys、3-Cysの構造変化及びシャペロン活性増進のためのガンマ線線量探索<実施例1>で分離、精製した二種類のPrxタンパク質を1mg/mlの濃度に調整した後、それぞれ1mlずつエッペンドルフチューブに分注し、0~500kGy範囲の高線量ガンマ線を照射した。高線量ガンマ線の照射のために、韓国原子力研究院放射線科学研究所の60Coガンマ線照射装置60Co,ca.150TBqキャパシティ;Atomicenergyofcanadalimited,カナダを用いた。ガンマ線は、0、2、5、15、30、50、100、200、300、400、500kGyでそれぞれ照射した。ガンマ線を照射した後、タンパク質の構造変化を確認するためにポリアクリルアミドゲル分析法を用いてタンパク質を分析した。非還元PAGE分析法とネイティブPAGENativePAGE分析法を用いたが、非還元PAGE分析法は、非還元状態のタンパク質構造の分析法であり、ジスルフィド結合によって維持される構造のみを確認することができる。ネイティブPAGE分析法は、タンパク質の構造を構成する共有結合及び非共有結合によるタンパク質構造を分析することができる。0、2、5、15、30、50、100、200、300、400、500kGyのガンマ線を照射した後、同量のタンパク質を電気泳動し、タンパク質をクマシーブリリアントブルーR-250で染色してタンパク質構造変化を分析した。その結果、図6に示されるように、PP1084タンパク質は、非還元PAGE分析及びネイティブPAGE分析を通じて、ガンマ線を照射しない1番レーンに比べて、5kGyを照射した時には観察されるバンドの濃さが増加し、100kGyからはタンパク質バンドが観察されないという結果を示した。これは照射されたガンマ線によってタンパク質の構造が破壊されて低分子化されたことを示す。また、図7に示されるように、PA3529もガンマ線を照射しない1番レーンに比べて、5~50kGyの強さではバンドが濃くなってから減少する傾向を示し、100kGyからはPP1084タンパク質と同様に、照射されたガンマ線によってタンパク質の構造が破壊されてタンパク質バンドが観察されないという結果を示した図6及び図7。<実施例3>Prxタンパク質2-Cys、3-Cysのシャペロン活性測定一般的な例として、タンパク質がストレス酸化的ストレス、熱ストレスに露出すると変性してフォールディングされていた3次構造の一部が解け、疎水性のアミノ酸残基が露出する。このような過程がひどくなるにつれて変性したタンパク質が不規則的な凝集体に変化し、タンパク質分解酵素によって分解されてなくなる。ここで、シャペロンタンパク質例えば、sHSPs、DnaJは、ストレスによって部分的に解けたタンパク質の疎水性アミノ酸に結合して凝集体に進行することを防止し、元の3次元構造に戻ることができる環境を作り出す機能を有する。分子シャペロン活性は、ホルダーゼHoldase活性及とフォールダーゼFoldase活性とに区別され、本実験ではシャペロン機能の中でもホルダーゼの機能を分析した。熱ストレスに敏感なリンゴ酸脱水素酵素MDHを43°Cに加熱すると、MDHは変性し始めて凝集体に変化し、OD650nmはMDHの変性によって加熱時間に比例して増加する。しかし、シャペロン活性を有するタンパク質とMDHが共存する状態で43°Cに加熱すると、MDHの変性は抑制され、したがって吸光度が増加しない。ホルダーゼの機能分析は、この現象を利用するものである。具体的には、MDHタンパク質のみが存在する状態で43°Cに加熱しながら、OD650nmの増加率を測定した。また、MDHタンパク質に対するそれぞれの割合でペルオキシレドキシンタンパク質を添加して43°Cに加熱しながら、OD650nmの増加率を測定した。測定は、下記の表1及び表2に示す条件で行った。図8及び図9に示されるように、3-Cysを有するPP1084タンパク質と2-Cysを有するPA3529タンパク質に、0、5、15、30、50、100、300、500kGyのガンマ線を照射した後にOD値を測定した結果、30kGyで最も低い吸光度を示し、シャペロン活性が最も高くなる結果となった図8及び図9。<実施例4>高線量ガンマ線によるPrxタンパク質の構造変化分析高線量のガンマ線を照射したPrxPP1084及びPA3529タンパク質の変化したタンパク質構造を分析するために、FPLCAKTA;AmershamBiosciencesを用いて一定速度で0.5ml/分流速度Prxタンパク質及び50mMヘペスpH8.0バッファーをスーパーデックスsuperdex200HR10/30カラムに通過させて、OD280nmで測定されたタンパク質の量ピークを基にクロマトグラムを描いた。結果的に、二種類のPrxPP1084及びPA3529タンパク質は、二つのタンパク質グループを形成しており、15~20分にカラムを通過した分子量が大きいタンパク質グループF-1と、20~25分にカラムを通過した分子量が小さいタンパク質グループF-2とに分類された。また、高線量のガンマ線の照射後にシャペロン活性は増加するが、二種類のPrxPP1084及びPA3529タンパク質の分子構造は、ガンマ線によって低分子化されることが確認された図10及び図11。<実施例5>高線量ガンマ線によるPrxタンパク質の新しい共有結合の生成<実施例1>で分離、精製した二種類のPrxタンパク質を1mg/mlの濃度に調整した後、それぞれ1mlずつエッペンドルフチューブに分注し、0~500kGy範囲の高線量ガンマ線を照射した。高線量ガンマ線の照射のために韓国原子力研究院放射線科学研究所の60Coガンマ線照射装置60Co,ca.150TBqキャパシティ;AtomicEnergyofCanadaLimited,カナダを用いた。ガンマ線は、0~500kGyの範囲で照射した。高線量ガンマ線を照射したタンパク質の構造変化分析のために、完全な還元環境下でSDS-PAGE分析法により二種類のタンパク質を電気泳動した。同量のタンパク質を電気泳動してタンパク質をクマシーブリリアントブルーR-250で染色し、タンパク質構造変化を分析した。その結果、高線量ガンマ線を照射しない二つの対照群タンパク質は、還元状態のSDS-PAGEでともに単量体の分子量である25kDa程度の分子量を示した。しかし、ガンマ線を照射したタンパク質の場合、還元剤によって還元されない新しい共有結合が生成されることを確認した。一般的に、強力な酸化的ストレスや極端な酸化状態において、チロシン同士の共有結合であるジチロシン結合が生成されることが報告されている。そこで、本発明者らはこの新たに生成された共有結合がジチロシン結合であると推測して、これを確認することにした。<実施例6>高線量ガンマ線によるジチロシン結合の増加<実施例1>で分離、精製した二種類のPrxタンパク質を1mg/mlの濃度に調整した後、それぞれ1mlずつエッペンドルフチューブに分注し、0~500kGy範囲の高線量ガンマ線を照射した。高線量ガンマ線の照射のために韓国原子力研究院放射線科学研究所の60Coガンマ線照射装置60Co,ca.150TBqキャパシティ;AtomicEnergyofCanadaLimited,カナダを用いた。ガンマ線は、0~500kGyの範囲で照射した。高線量ガンマ線によって生成されたジチロシン結合の増加を確認するために、完全な還元環境下でSDS-PAGEを行なった。アンチジチロシン抗体を用いて、SDS-PAGEを通じて分離したタンパク質中のジチロシン結合のみを選択的にイメージ化した。PP1084タンパク質にそれぞれの線量で高準位ガンマ線を照射した後、SDS-PAGEで電気泳動した。SDS-PAGEでそれぞれの分子量別に分離したPP1084タンパク質をNC膜ニトロセルロース膜;Bio-rad,米国に転写した。5スキムミルクで1時間ブロッキングし、T-TBSバッファー[10mMTris-HClpH7.5、150mMNaCl、0.05ツイーン-20]で10分間、1回洗浄した。アンチジチロシン抗体をT-TBSバッファーに5000:1で添加して1時間反応させた後、T-TBSバッファー中で20分間強く振とうする洗浄を5回反復した。HRP検出キットを用いてアンチジチロシン抗体の付着したジチロシン結合を形成したPP1084タンパク質のみを選択的に検出した。その結果、図12及び図13に示されるように、PP1084タンパク質及びPA3529タンパク質は、還元状態で25kDaの単量体サイズを示した図12及び図13の1:0kGy。高線量ガンマ線によって二つのPrxタンパク質の部分的構造変化が起き、具体的には、ガンマ線非照射群に比べて2~50kGyのガンマ線を照射した二つのPrxタンパク質では、50kDaにおける構造変化が著しいことが確認された図12及び図13。このようなPrxタンパク質の構造的変化がジチロシン結合によるものか否かを確認するために、アンチジチロシン抗体を用いてジチロシン結合の増減を確認した。30~50kGyを照射したPP1084タンパク質のジチロシン結合が、ガンマ線非処理群に比べて著しく増加することが50kDaサイズで観察された図14。<実施例7>高線量ガンマ線によるPrxタンパク質の疎水性変化分析Prxタンパク質では、親水性ドメインがタンパク質外部に、疎水性ドメインがタンパク質内部に位置し、水溶性の性質を維持する。しかしながら、シャペロンタンパク質では、比較的高い割合の疎水性のドメインが外部に露出していることが知られている。実施例2ないし6において、本発明者らは、二つのPrxタンパク質に高線量ガンマ線15~30kGyを照射すると、シャペロン活性が増加することを確認した。そこで、高線量ガンマ線が二つのPrxタンパク質の疎水性ドメインの露出を増加させてシャペロン活性を増加させたと仮定し、それを検証した。シャペロン活性を増加させた原因を確認するため、下記の表3及び表4のような構成でbis-ANS結合実験を行ない、疎水性の変化がシャペロン活性にどのような影響を及ぼすのかを調べた。Prxタンパク質を25°Cでbis-ANS[1,1’-ビ4-アニリノナフタレン-5,5’-ジスルホン酸]と30分間反応させ、分光光度計[SFM25分光蛍光計Kontronドイツ]で380~600nmまで蛍光分析を行なってタンパク質の疎水性ドメインの露出程度を確認した。その結果、図15に示したように、3-CysPP1084タンパク質では、ガンマ線非照射群に比べて、5kGyのガンマ線を照射した群で疎水性が増加したことが確認された。5kGyよりも高い15、30、及び300kGyの線量では、ガンマ線を照射しない比較群と同程度かむしろ低い数値を示した。一方、2-CysPA3529タンパク質では、図16に示されるように、非照射群に比べてガンマ線を照射した群全てで疎水性が増加し、30kGyで最も疎水性が増加し、50、15、5、300kGyの順に疎水性が増加したことが確認された図15及び図16。<実施例8>高線量ガンマ線によるPrxタンパク質の二次構造変化分析<実施例7>のように、高線量ガンマ線がPrxタンパク質の2次元構造にどのような影響を及ぼし、そのような変化がPrxタンパク質のシャペロン機能と構造にどのような影響を及ぼすのかを確認するため、円偏光二色性分光分析CircularDichroismSpectroscopyを行なった。タンパク質の2次元構造のうち、αヘリックス、βシート、ターン、及びランダムコイル構造を観察した。より良い結果を得るために、Prxタンパク質のバッファーを10mMTrispH8.0バッファーに交換して、分光光度計[JascoJ715分光偏光計JascoGreatDunmow,英国]を用いて190~250nmまでのFarUV-CDスペクトルを分析することでPrxタンパク質の2次元構造を分析した。その結果、3-CysPP1084タンパク質の2次元αヘリックス、βシート、ターン、及びランダムコイルでは、ガンマ線の照射線量による変化が観察されなかった。しかしながら、2-CysPA3529タンパク質の場合、αヘリックス構造は56から0に減少し、βシート構造は0から55に増加し、ターン構造は23.3から0に減少し、そしてランダムコイル構造は19から49.6に増加する変化が観察された。すなわち、2-CysPA3529タンパク質では、一般的にシャペロン活性の増加を示すβシートの増加及びαヘリックス構造の減少を観察することができ、3-CysPP1084タンパク質ではガンマ線によってシャペロン活性が増進したものの、タンパク質の二次構造の変化は観察されなかった図17及び図18。<実施例9>紫外線の照射によるPrxタンパク質2-Cysのシャペロン及びPOD活性測定紫外線UVを照射したPaPrx緑膿菌3529,PA3529タンパク質の生理活性変化を確認するため、暗室内で温度を4°C一定に維持し、15ワット中波mediumwaveUVランプSpectroline,米国を用いて5Wの紫外線をPA3529タンパク質に一定に照射した。ここで、紫外線の強度はUVデジタルラジオメーターDRC-100XSpectroline,米国を用いて測定し、それぞれPaPrxタンパク質に紫外線を0h~5hまで差を与えながら照射した。<9-1>シャペロン活性の測定リンゴ酸脱水素酵素MDHを基質に使用して、紫外線を照射されたPaPrxタンパク質とともに43°Cの熱ストレスを与え、340nmの吸光度を15分間測定することにより、MDHが凝集する程度から分子シャペロン活性を測定した。ここで、PaPrxタンパク質とMDHタンパク質との割合を1:1で反応させて、吸光度測定時にはDU800分光光度計Beckmann,米国を用いた。その結果、紫外線の照射時間が増加するにつれて分子シャペロン活性が増加することが確認された図19。<9-2>チオレドキシンペルオキシダーゼ活性の測定紫外線照射されたPaPrxタンパク質のチオレドキシンペルオキシダーゼ活性をTrxシステム[10mMNADPHニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、1uM酵母Trx酵母チオレドキシン、5uMTRチオレドキシンレダクターゼ、1uMPaPrxタンパク質、50mMHepes]を用いて測定した。ここでは、NADPHが10μlのH2O2によって酸化される程度を、340nmの吸光度により10分間測定した。吸光度測定はDU800分光光度計Beckmann,米国を用いた。その結果、紫外線の照射時間が増加するにつれてチオレドキシンペルオキシダーゼ活性が減少することが確認された図20。"