単離されたモノクローナル抗ヒト平衡型ヌクレオシドトランスポーター1抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体が、アミノ酸配列GYTFTDYEを含む可変重鎖相補性決定領域1配列アミノ酸配列IDPETGAIまたはアミノ酸配列IDPETGKTを含む可変重鎖相補性決定領域2配列およびアミノ酸配列TREFTYまたはアミノ酸配列TRELTYを含む可変重鎖相補性決定領域3配列を含み、該抗体またはその抗原結合断片が、hENT1または生物学的に活性なその断片に結合する、単離されたモノクローナル抗ヒト平衡型ヌクレオシドトランスポーター1抗体またはその抗原結合断片。前記抗体またはその抗原結合断片が、アミノ酸配列QSLLFSNGKTYを含む可変軽鎖相補性決定領域1配列アミノ酸配列LVSを含む可変軽鎖相補性決定領域2配列およびアミノ酸配列VQGTHFPWTを含む可変軽鎖相補性決定領域3配列をさらに含む、請求項1記載の抗体。前記抗体またはその抗原結合断片が、SEQIDNO2、4、6、8、9、28、30、32、34、36、38、39、51、および53より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変配列を含む、請求項1記載の抗体。前記抗体またはその抗原結合断片が、SEQIDNO14、16、18、20、22、23、43、45、47、および49より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、請求項1記載の抗体。前記抗体がIgGアイソタイプまたはIgGアイソタイプ抗体の抗原結合断片である、請求項1記載の抗体。前記抗体がIgG1アイソタイプまたはIgG1アイソタイプ抗体の抗原結合断片である、請求項5記載の抗体。前記抗体がIgG1κアイソタイプまたはIgG1κアイソタイプ抗体の抗原結合断片である、請求項6記載の抗体。SEQIDNO2、4、6、8、9、28、30、32、34、36、38、39、51、または53のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列およびSEQIDNO14、16、18、20、22、23、43、45、47、または49のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含み、ヒト平衡型ヌクレオシドトランスポーター1または生物学的に活性なその断片に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。前記抗体がIgGアイソタイプまたはIgGアイソタイプ抗体の抗原結合断片である、請求項8記載の抗体。請求項1記載の抗体またはその抗原結合断片および担体を含む、薬学的組成物。請求項8記載の抗体またはその抗原結合断片および担体を含む、薬学的組成物。対象試料または患者試料におけるヒト平衡型ヌクレオシドトランスポーター1の発現または活性のレベルを検出するための、請求項1記載の抗体の使用。前記対象試料または患者試料におけるhENT1の発現または活性の検出されたレベルが、該対象の治療方針を特定するために使用される、請求項12記載の使用。前記治療方針が、ゲムシタビン、ゲムシタビン5エライジン酸エステル、ゲムシタビンN4エライジン酸アミド、シタラビン、シタラビン5エライジン酸エステル、リバビリン5エライジン酸エステル、5アザシチジン5エライジン酸エステル、およびそれらの組合せの投与である、請求項12記載の使用。前記対象試料または患者試料におけるhENT1の発現または活性の検出されたレベルが、hENT1の発現または活性が低い対象試料または患者試料を同定して該対象の治療方針を特定するために使用される、請求項12記載の使用。前記治療方針が、ゲムシタビン5エライジン酸エステル、ゲムシタビンN4エライジン酸アミド、シタラビン、シタラビン5エライジン酸エステル、リバビリン、リバビリン5エライジン酸エステル、または5アザシチジン5エライジン酸エステルの投与である、請求項15記載の使用。制癌剤または抗ウイルス薬のためのコンパニオン診断剤としての、請求項1記載の抗体の使用。前記制癌剤が、ゲムシタビン5エライジン酸エステル、ゲムシタビンN4エライジン酸アミド、シタラビン5エライジン酸エステル、リバビリン5エライジン酸エステル、または5アザシチジン5エライジン酸エステルである、請求項17記載の使用。対象におけるヒト平衡型ヌクレオシドトランスポーター1の異常な発現または活性に関連付けられている臨床適応症の症状を緩和する方法であって、それを必要とする対象に、hENT1の異常な発現または活性に関連付けられている該臨床適応症の該症状を緩和するのに十分な量のhENT1のアンタゴニストを投与する段階を含む、方法。前記対象がヒトである、請求項19記載の方法。前記アンタゴニストがモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項19記載の方法。前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、アミノ酸配列GYTFTDYEを含む可変重鎖相補性決定領域1配列アミノ酸配列IDPETGAIまたはアミノ酸配列IDPETGKTを含む可変重鎖相補性決定領域2配列およびアミノ酸配列TREFTYまたはアミノ酸配列TRELTYを含む可変重鎖相補性決定領域3配列を含み、hENT1または生物学的に活性なその断片に結合する、請求項21記載の方法。前記抗体またはその抗原結合断片が、SEQIDNO2、4、6、8、9、28、30、32、34、36、38、39、51、および53より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変配列を含む、請求項22記載の方法。前記抗体またはその抗原結合断片が、SEQIDNO14、16、18、20、22、23、43、45、47、および49より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む、請求項22記載の方法。前記抗体がIgGアイソタイプまたはIgGアイソタイプ抗体の抗原結合断片である、請求項22記載の方法。前記抗体がIgG1アイソタイプまたはIgG1アイソタイプ抗体の抗原結合断片である、請求項25記載の方法。前記抗体がIgG1κアイソタイプまたはIgG1κアイソタイプ抗体の抗原結合断片である、請求項26記載の方法。詳細な説明本発明は、hENT1に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、1μM以下、例えば、100nM以下、好ましくは10nM以下、およびより好ましくは1nM以下の平衡結合定数でhENT1エピトープに結合する。例えば、本明細書において提供されるhENT1抗体は、約1nM以下~約1pMの間の範囲のKdを示す。ヌクレオシド類似体薬は、それらが効果を発揮する場である細胞に入るためにヌクレオシドトランスポーターに依存する―これらの分子は拡散によって原形質膜を通過するのではなく、効率的な細胞取込みには、これらの特殊な原形質膜ヌクレオシドトランスポータータンパク質の存在が必要である。シタラビンおよびゲムシタビンは、効果をもたらすためにヒト平衡型ヌクレオシドトランスポーター1に依存する2種の抗癌薬である。かなりの比率の癌細胞は、hENT1を低発現する。hENT1の低い発現およびまたは活性は、癌および他の新生物障害、例えば、急性骨髄性白血病または膵癌などに罹患している患者において見出されている。治療の臨床的効果が低いことと、癌細胞中のhENT1が少ないことまたは存在しないこととの相関関係が明らかにされている。621629FarrelletalHumanEquilibrativeNucleosideTransporter1LevelsPredictResponsetoGemcitabineinPatientsWithPancreaticCancerGastroenterology136187195およびGiovannettietalTranscriptionanalysisofhumanequilibrativenucleosidetransporter1predictssurvivalinpancreascancerpatientstreatedwithgemcitabineCancerRes6639283935を参照されたい。研究により、膵癌患者の腫瘍細胞におけるhENT1発現の欠如とヌクレオシド類似体およびゲムシタビンのような他の化学療法薬に対するその患者の不十分な応答との直接的な相互関係が示されている。187195を参照されたい。また、hENT1は、リバビリンの経口摂取にも重要であり、リバビリンによるC型肝炎治療に対する耐性の原因となり得る。458347を参照されたい。したがって、本発明のhENT1抗体は、患者または患者試料中のhENT1レベルを検出する際に有用である。本発明のhENT1抗体は、現行の制癌剤または抗ウイルス薬のためのコンパニオン診断剤として有用である。例えば、hENT1抗体は、シタラビン、アザシチジン、ゲムシタビン、ゲムシタビン5エライジン酸エステル、シタラビン5エライジン酸エステル、5アザシチジン5エライジン酸エステル、およびリバビリン5エライジン酸エステルを含む、ヌクレオシド類似体薬のような化学療法剤と併用した際に有用である。また、hENT1抗体は、プリンヌクレオシド誘導体およびピリミジンヌクレオシド誘導体などの作用物質と組み合わせても有用である。を参照されたい。本発明のhENT1抗体は、治療計画の追加またはそうでなければ治療計画の変更のために、hENT1の発現およびまたは活性が低いかまたはそうでなければ低減している患者の集団を特定するのに有用である。例えば、特定されたこの患者集団に、hENT1欠損細胞における取込みを可能にするように設計された治療剤、例えば、ゲムシタビン5エライジン酸エステルもしくはゲムシタビンN4エライジン酸アミド、シタラビン5エライジン酸エステル、または5アザシチジン5エライジン酸エステルもしくはリバビリン5エライジン酸エステルなどが投与される。12561264を参照されたい。研究により、ゲムシタビン、シタラビン、およびアザシチジンなどの確立されたヌクレオシド薬とは対照的に、これらの薬物は癌細胞に侵入し、癌細胞中のhENT1発現レベルとは無関係に、癌細胞において活性を保持できることが示されている。comparedtocytarabineinmetastaticandschumantumorxenograftmodelsCancerRes5929442949およびGalmarinietalCP4055andCP4126areactiveinaraCandgemcitabineresistantlymphomacelllinesBrJHaematol144273275を参照されたい。また、hENT1欠損細胞におけるゲムシタビン5エライジン酸エステルおよびシタラビン5エライジン酸エステルの取込みは、インビトロでも確認されており、欠損癌細胞におけるシタラビン5エライジン酸エステルおよびゲムシタビン5エライジン酸エステルの活性な三リン酸代謝産物が多量に形成されることが確認されている。ゲムシタビン5エライジン酸エステルまたはシタラビン5エライジン酸エステルなど脂質を結合された薬物の脂質尾部が細胞内部で切断された後、親薬物が放出される。hENT1トランスポーターの欠如により、薬物は細胞内部に閉じ込められ、高濃度の活性代謝産物が測定されている。を参照されたい。これらの知見から、脂質を結合されたゲムシタビン誘導体およびまたは脂質を結合されたシタラビン誘導体が、hENT1の欠如またはhENT1の低い発現およびもしくは活性が原因でシタラビンおよびゲムシタビンに耐性であるか、またはそうでなければそれらに対する応答性が低い腫瘍を治療する際に有用であることが示唆される。したがって、本発明の抗体は、これらの脂質を結合されたゲムシタビン誘導体およびもしくは脂質を結合されたシタラビン誘導体ならびにまたは脂質を結合された5アザシチジン5エライジン酸エステルとの併用療法において有用である。例えば、hENT1抗体は、hENT1の発現およびまたは活性が低いかまたはそうでなければ低減している患者を検出する際に有用である。例えば、hENT1抗体を用いて、癌および他の新生物障害、例えば、急性骨髄性白血病または膵癌などに罹患している患者をスクリーニングすることができる。したがって、hENT1抗体は、hENT1の発現およびまたは活性のレベルに基づいて、治療するための患者を特定するのに有用である。いくつかの態様において、患者は、1種もしくは複数種のヌクレオシド類似体薬およびまたはヌクレオシド類似体に由来する薬物の投与を含む治療計画を現在受けている。いくつかの態様において、患者は、1種もしくは複数種のヌクレオシド類似体薬およびまたはヌクレオシド類似体に由来する薬物の投与を含む治療計画を現在受けており、これらの患者は、治療に応答するのを止めてしまっているか、またはそうでなければヌクレオシド類似体薬に対する応答性が低い。いくつかの態様において、患者は、1種もしくは複数種のヌクレオシド類似体薬およびまたはヌクレオシド類似体に由来する薬物の投与を含む治療計画を以前受けていた。いくつかの態様において、患者は、1種もしくは複数種のヌクレオシド類似体薬およびまたはヌクレオシド類似体に由来する薬物の投与を含む治療計画を以前受けており、これらの患者は、治療に応答するのを止めてしまっていたか、またはそうでなければヌクレオシド類似体薬に対する応答性が低かった。定義他に規定されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈において特に指示がない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、かつ複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書において説明する、細胞培養および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質化学およびオリゴヌクレオチド化学またはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される学術用語は、当技術分野において周知であり、一般に使用されるものである。標準的技術が、組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換のために使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野において一般に遂行されているように、もしくは本明細書において説明するようにして、実施する。前述の技術および手順は、一般に、当技術分野において周知である従来の方法に従って、かつ本明細書の全体にわたって引用および考察される様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献において説明されているようにして、実施する。例えば、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualを参照されたい。本明細書において説明する分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して使用される学術用語、ならびにそれらの実験室での手順および技術は、当技術分野において周知であり、かつ一般に使用されるものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬品の調製、調剤、および送達、ならびに患者の治療のために使用される。本開示に従って使用される場合、以下の用語は、別段の定めが無い限り以下の意味を有すると理解されるものとする。本明細書において使用される場合、ヒト平衡型ヌクレオシドトランスポーター1およびhENT1という用語は同義であり、交換可能に使用され得る。本明細書において使用される場合、抗体という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。特異的に結合するもしくは免疫反応するまたは標的とするとは、抗体が所望の抗原の1つまたは複数の抗原決定基と反応し、かつ他のポリペプチドとは反応しないか、またはずっと低い親和性で結合することを意味する。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、dAb、単鎖、Fab断片、Fab断片、およびF2断片、scFv、ならびにFab発現ライブラリーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。基本的な抗体構造単位は、テトラマーを構成することが公知である。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の2つの同一のペアから構成され、各ペアは1つの軽鎖および1つの重鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担当する、約100~110またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担当する定常領域の境界を定める。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスIgG、IgM、IgA、IgE、およびIgDのいずれかに関連し、これらは分子中に存在する重鎖の性質が互いに異なる。いくつかのクラスは、IgG1およびIgG2などのサブクラスもさらに有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であり得る。モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体組成物という用語は、本明細書において使用される場合、独特な軽鎖遺伝子産物および独特な重鎖遺伝子産物からなる抗体分子のただ1つの分子種のみを含む抗体分子集団を意味する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域は、この集団の全分子において同一である。MAbは、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができ、それに対する独特な結合親和性を特徴とする、抗原結合部位を含む。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスIgG、IgM、IgA、IgE、およびIgDのいずれかに関連し、これらは分子中に存在する重鎖の性質が互いに異なる。いくつかのクラスは、IgG1およびIgG2などのサブクラスもさらに有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であり得る。抗原結合部位または結合部分という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を意味する。抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のN末端可変領域のアミノ酸残基によって形成されている。超可変領域と呼ばれる、重鎖および軽鎖のV領域内の著しく変化に富む3つのストレッチは、フレームワーク領域またはFRとして公知である保存の度合いが高い隣接するストレッチの間に介在する。したがって、FRという用語は、免疫グロブリン中の超可変領域の間に、かつそれらに隣接して天然に存在するアミノ酸配列を意味する。抗体分子において、軽鎖の3つの超可変領域および重鎖の3つの超可変領域は、三次元空間に互いに関連して配置して、抗原結合表面を形成している。抗原結合表面は、結合される抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの3つの超可変領域は相補性決定領域またはCDRと呼ばれる。各ドメインに対するアミノ酸の割付は、KabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterest、またはChothiaLeskJMolBiol196901917、ChothiaetalNature342878883の定義に従っている。本明細書において使用される場合、エピトープという用語は、免疫グロブリンもしくはその断片、またはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープという用語は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖の側鎖など分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特殊な三次元構造特性、ならびに特殊な電荷特性を有する。解離定数が1μM以下、例えば100nM以下、好ましくは10nM以下、およびより好ましくは1nM以下である場合、抗体は抗原に特異的に結合すると述べられる。本明細書において使用される場合、特異的結合、免疫学的結合、および免疫学的結合特性という用語は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である対象の抗原との間で起こるタイプの非共有結合的相互作用を意味する。免疫学的結合相互作用の強さまたは親和力は、相互作用の解離定数の観点から表現することができ、Kdが小さいほど親和力が大きいことを表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を用いて定量することができる。1つのこのような方法は、抗原結合部位抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを伴い、これらの速度は、複合体の相手の濃度、相互作用の親和力、および両方の方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメーターに依存する。したがって、結合速度定数および解離速度定数の両方とも、濃度ならびに実際の結合速度および解離速度を計算することによって決定することができる。を参照されたい。KoffKonの比は、親和力に関係していないあらゆるパラメーターを取り消すことを可能にし、解離定数Kdと等しい。AnnualRevBiochem59439473を参照されたい。本発明の抗体は、放射性リガンド結合アッセイ法または当業者に公知である同様のアッセイ法などのアッセイ法によって測定した際に平衡結合定数が1μM以下、好ましくは100nM以下、より好ましくは10nM以下、および最も好ましくは100pM~約1pM以下である場合、hENT1に特異的に結合すると述べられる。生物試料という用語は、対象から単離された組織、細胞、および生物学的液体、ならびに対象内に存在する組織、細胞、および液体を含むと意図される。したがって、血液および血液の画分または成分は、生物試料という用語の用法の範囲内に含まれる。本明細書において使用される単離されたポリヌクレオチドという用語は、ゲノム起源、cDNA起源、もしくは合成起源のポリヌクレオチド、またはその何らかの組合せを意味し、この起源が理由で、この単離されたポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドが天然にはその中に存在するポリヌクレオチドの全体とも一部分とも結合していないか、天然には結合していないポリヌクレオチドに機能的に連結されているか、またはより大型の配列の一部分として、天然には存在しない。本発明によるポリヌクレオチドには、SEQIDNO1、3、5、7、27、29、31、33、35、および37に示す、重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、ならびにSEQIDNO13、15、17、21、42、44、46、および48に示す、軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子が含まれる。hENT1抗体本発明のモノクローナル抗体はhENT1に結合する。これらのモノクローナル抗体は、hENT1の発現およびまたは活性を阻害する能力を有する。阻害は、例えば、様々な標準的アッセイ法のいずれかを用いて測定される。本発明のhENT1抗体のための例示的な可変重鎖配列には、VH312可変重鎖、VH59可変重鎖、VH512可変重鎖、VH513可変重鎖、VH53可変重鎖、VH511可変重鎖、または本明細書において提供され、コンセンサス可変重鎖領域配列1と呼ばれるコンセンサス可変重鎖が含まれる。また、本発明のhENT1抗体のための例示的な可変重鎖配列には、VH11可変重鎖、VH14可変重鎖、VH16可変重鎖、VH42可変重鎖、VH43可変重鎖、VH44可変重鎖、または本明細書において提供され、コンセンサス可変重鎖領域配列2と呼ばれるコンセンサス可変重鎖も含まれる。各重鎖配列の可変ドメインを以下の配列においてボールド体で示す。好ましくは、本発明のhENT1抗体の可変重鎖は、アミノ酸配列GYTFTDYEを含む可変重鎖相補性決定領域1配列、アミノ酸配列IDPETGAIまたはアミノ酸配列IDPETGKTを含む可変重鎖相補性決定領域2配列、およびアミノ酸配列TREFTYまたはアミノ酸配列TRELTYを含む可変重鎖相補性決定領域3配列を含む。これらのCDRは、IMGTアルゴリズムを用いて同定した。BrochetetalIMGTVQUESTthehighlycustomizedandintegratedsystemforIGandTRstandardizedVJandVDJsequenceanalysisNuclAcidsResvol36W503508。VH312重鎖可変領域は、SEQIDNO1に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO2に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO2に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH312核酸配列VH312アミノ酸配列VH59重鎖可変領域は、SEQIDNO3に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO4に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO4に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH59核酸配列VH59アミノ酸配列VH512重鎖可変領域は、SEQIDNO5に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO6に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO6に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH512核酸配列VH512アミノ酸配列VH513重鎖可変領域は、SEQIDNO7に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO8に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO8に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH513核酸配列VH513アミノ酸配列VH53重鎖可変領域は、SEQIDNO50に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO51に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO51に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH53核酸配列VH53アミノ酸配列VH511重鎖可変領域は、SEQIDNO52に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO53に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO53に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH511核酸配列VH511アミノ酸配列コンセンサス重鎖可変領域配列1のアミノ酸配列は、SEQIDNO9に示す。可変ドメインは、SEQIDNO9に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO9に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。コンセンサスVHアミノ酸配列1これらの可変重鎖配列のアライメントを下記に示す。VH11重鎖可変領域は、SEQIDNO27に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO28に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO28に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH11核酸配列VH11アミノ酸配列VH14重鎖可変領域は、SEQIDNO29に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO30に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO30に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH14核酸配列VH14アミノ酸配列VH16重鎖可変領域は、SEQIDNO31に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO32に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO32に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH16核酸配列VH16アミノ酸配列VH42重鎖可変領域は、SEQIDNO33に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO34に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO34に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH42核酸配列VH42アミノ酸配列VH43重鎖可変領域は、SEQIDNO35に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO36に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO36に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH43核酸配列VH43アミノ酸配列VH44重鎖可変領域は、SEQIDNO37に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO38に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO38に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VH44核酸配列VH44アミノ酸配列コンセンサス重鎖可変領域配列2のアミノ酸配列は、SEQIDNO39に示す。可変ドメインは、SEQIDNO39に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO39に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。コンセンサスVHアミノ酸配列2これらの可変重鎖配列のアライメントを下記に示す。本発明のhENT1抗体のための例示的な可変軽鎖配列には、VL2可変軽鎖、VL10可変軽鎖、VL11可変軽鎖、VL20可変軽鎖、VL21可変軽鎖、または本明細書において提供され、コンセンサス可変軽鎖領域配列1と呼ばれるコンセンサス可変軽鎖が含まれる。また、本発明のhENT1抗体のための例示的な可変軽鎖配列には、VL22可変軽鎖、VL23可変軽鎖、VL27可変軽鎖、VL210可変軽鎖、VL212可変軽鎖、VL216可変軽鎖、または本明細書において提供され、コンセンサス可変軽鎖領域配列2と呼ばれるコンセンサス可変軽鎖も含まれる。好ましくは、本発明のhENT1抗体の可変軽鎖は、アミノ酸配列QSLLFSNGKTYを含む可変軽鎖相補性決定領域1配列、アミノ酸配列LVSを含む可変軽鎖相補性決定領域2配列、およびアミノ酸配列VQGTHFPWTを含む可変軽鎖相補性決定領域3配列を含む。これらのCDRは、IMGTアルゴリズムを用いて同定した。BrochetetalIMGTVQUESTthehighlycustomizedandintegratedsystemforIGandTRstandardizedVJandVDJsequenceanalysisNuclAcidsResvol36W503508。VL2軽鎖可変領域は、SEQIDNO13に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO14に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO14に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VL2核酸配列VL2アミノ酸配列VL10軽鎖可変領域は、SEQIDNO15に示す核酸配列にコードされる。CDR領域は、SEQIDNO16に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VL10核酸配列VL10アミノ酸配列VL11軽鎖可変領域は、SEQIDNO17に示す核酸配列にコードされる。CDR領域は、SEQIDNO18に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VL11核酸配列VL11アミノ酸配列VL20軽鎖可変領域は、SEQIDNO19に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO20に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO20に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VL20核酸配列VL20アミノ酸配列VL21軽鎖可変領域は、SEQIDNO21に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO22に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO21に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VL21核酸配列VL21アミノ酸配列コンセンサス軽鎖可変領域配列1は、SEQIDNO23に示す核酸配列にコードされる。CDR領域は、SEQIDNO23に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。コンセンサスVLアミノ酸配列1これらの可変軽鎖配列のアライメントを下記に示す。VL22軽鎖可変領域は、SEQIDNO42に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO43に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO43に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VL22核酸配列VL22アミノ酸配列VL23軽鎖可変領域は、SEQIDNO44に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO45に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO45に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VL23核酸配列VL23アミノ酸配列VL27軽鎖可変領域は、SEQIDNO44に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO45に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO45に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VL27核酸配列VL27アミノ酸配列VL210軽鎖可変領域は、SEQIDNO46に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO47に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO47に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VL210核酸配列VL210アミノ酸配列VL212軽鎖可変領域は、SEQIDNO48に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO43に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO43に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VL212核酸配列VL212アミノ酸配列VL216軽鎖可変領域は、SEQIDNO44に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO45に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO45に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。VL216核酸配列VL216アミノ酸配列コンセンサス軽鎖可変領域配列2は、SEQIDNO49に示す核酸配列にコードされる。可変ドメインは、SEQIDNO49に示すアミノ酸配列においてボールド体で示している。CDR領域は、SEQIDNO49に示すアミノ酸配列において四角で囲んでいる。コンセンサスVLアミノ酸配列2これらの可変軽鎖配列のアライメントを下記に示す。また、本明細書において説明する抗体と同じエピトープに結合する抗体も、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体はhENT1に特異的に結合し、その際、この抗体は、ヒトhENT1上の1つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。当業者は、あるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかを、後者がhENT1に結合するのを前者が妨げるかどうかを確認することによって過度に実験することなく判定することが可能であることを認識するであろう。本発明のモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、試験されるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合する場合、これら2種のモノクローナル抗体は同じエピトープまたは密接に関連したエピトープに結合する。あるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうか判定するための代替の方法は、本発明のモノクローナル抗体を可溶性hENT1タンパク質とプレインキュベートし、次いで、試験されるモノクローナル抗体を添加して、試験されるそのモノクローナル抗体のhENT1結合能力が阻害されているか判定するものである。試験されるモノクローナル抗体が阻害されている場合、十中八九、それは、本発明のモノクローナル抗体と同じまたは機能的に等価なエピトープ特異性を有する。また、本発明のモノクローナル抗体のスクリーニングは、例えば、試験モノクローナル抗体がhENT1の発現およびまたは活性を調節、妨害、阻害、低減、拮抗、無効化、またはそうでなければ干渉することができるかどうかを測定および判定することによって実施することもできる。当技術分野の範囲内で公知である様々な手順が、hENT1を対象とするか、またはその誘導体、断片、類似体、ホモログ、もしくはオルソログを対象とするモノクローナル抗体の作製のために使用され得る。。完全ヒト抗体は、CDRを含む軽鎖および重鎖の両方の配列全体がヒト遺伝子から生じている抗体分子である。このような抗体は、本明細書においてヒト抗体または完全ヒト抗体と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トリオーマ技術ヒトB細胞ハイブリドーマ技術およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBVハイブリドーマ技術を用いることによって調製される。ヒトモノクローナル抗体は、使用されてよく、ヒトハイブリドーマを用いることによってまたはインビトロでエプスタインバーウイルスを用いてヒトB細胞を形質転換することによって、作製されてよい。モノクローナル抗体は、例えば、KohlerandMilsteinNature256495によって説明されているもののようなハイブリドーマ法を用いて調製される。ハイブリドーマ法では、典型的には、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を免疫化剤で免疫化して、その免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、インビトロでリンパ球を免疫化してもよい。本発明の抗体はモノクローナル抗体である。例えば、動物をhENT1、例えば、マウスhENT1、ラットhENT1、もしくはヒトhENT1、またはそれらの免疫原性断片、誘導体、もしくは変異体などで免疫化することによって、hENT1の発現およびまたは活性を調節、妨害、阻害、低減、拮抗、無効化、またはそうでなければ干渉するモノクローナル抗体が作製される。あるいは、動物は、hENT1をコードする核酸分子を含むベクターをトランスフェクトされた細胞で免疫化され、その結果、hENT1が、トランスフェクトされた細胞の表面で発現され、結合している。あるいは、これらの抗体は、抗体または抗原結合ドメイン配列を含むライブラリーをhENT1結合についてスクリーニングすることによっても得られる。このライブラリーは、例えば、組み立てられたファージ粒子の表面で発現されるバクテリオファージコートタンパク質へのタンパク質融合物またはペプチド融合物として、バクテリオファージにおいて調製され、コードされるDNA配列はファージ粒子内に含まれる。次いで、骨髄腫B細胞融合の結果として生じるハイブリドーマを、hENT1に対する反応性についてスクリーニングする。本発明のモノクローナル抗体には、完全ヒト抗体またはヒト化抗体が含まれる。これらの抗体は、投与される免疫グロブリンに対するヒトの免疫応答を引き起こすことなくヒトに投与するのに適している。いくつかの方法において、hENT1抗体は、例えば、ヒト配列のみを含む抗体を用いたファージディスプレイ法によって作り上げられる。このようなアプローチは、当技術分野において、例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO9201047および米国特許第6521404号において周知である。、HanesandPluckthunPNASUSA9449374942、ParmleyandSmithGene73305318、ScottTIBSvol17241245、CwirlaetalPNASUSA8763786382、RusseletalNuclAcidsResearch2110811085、HoganboometalImmunolReviews1304368、ChiswellandMcCaffertyTIBTECH10808A、および米国特許第5733743号も参照されたい。ヒト抗マウス抗体応答により、当技術分野におけるキメラ抗体またはそれ以外のヒト化抗体の調製がもたらされてきた。キメラ抗体はヒト定常領域および免疫可変領域を有するが、特に抗体を長期的にまたは多数回利用する際には、ある種のヒト抗キメラ抗体応答が観察されることが予想されている。したがって、HAMA応答またはHACA応答の懸念およびまたは影響を無くすか、またはそうでなければ軽減するためには、hENT1に対する完全ヒト抗体を提供することが望ましい。免疫原性が低減した抗体の作製は、ヒト化、キメラ化、および適切なライブラリーを用いたディスプレイ技術によっても遂行される。マウス抗体または他種由来の抗体は、当技術分野において周知の技術を用いてヒト化または霊長類化できることが認識される。例えば、WinterandHarrisImmunolToday144346およびWrightetalCritReviewsinImmunol12125168を参照されたい。関心対象の抗体を組換えDNA技術によって操作して、CH1、CH2、CH3、ヒンジドメイン、およびまたはフレームワークドメインを対応するヒト配列で置換することができる。また、キメラ免疫グロブリン遺伝子を構築するためのIgcDNAの使用も当技術分野において公知であるおよびJImmunol1393521。mRNAが、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から単離され、cDNAを作製するために使用される。関心対象のcDNAは、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができる。あるいは、ライブラリーを作製し、スクリーニングして、関心対象の配列を単離する。次いで、抗体の可変領域をコードするDNA配列をヒト定常領域配列に融合させる。ヒト定常領域遺伝子の配列は、KabatetalSequencesofProteinsofimmunologicalInterestNIHpublicationno913242において見出すことができる。ヒトC領域遺伝子は、公知のクローンから容易に入手できる。アイソタイプの選択は、補体結合または抗体依存性細胞障害における活性などの所望のエフェクター機能に基づいて導かれる。好ましいアイソタイプは、IgG1、IgG3、およびIgG4である。κまたはλのヒト軽鎖定常領域のいずれかが使用され得る。次いで、キメラヒト化抗体は、従来の方法によって発現される。本発明はまた、抗hENT1断片Fv、Fab、Fab、およびF2、単鎖抗hENT1抗体、二重特異性抗hENT1抗体、ならびにヘテロ結合体抗hENT1抗体も含む。Fv、F2、およびFabなどの抗体断片は、例えばプロテアーゼまたは化学的切断による、完全なタンパク質の切断によって調製され得る。あるいは、切断型遺伝子が設計される。例えば、F2断片の一部分をコードするキメラ遺伝子は、H鎖のCH1ドメインおよびヒンジ領域、続いて、切断型分子をもたらすための翻訳停止コドンをコードするDNA配列を含むと思われる。例えば、hENT1の異常な発現およびまたは活性に関連付けられている疾患および障害を治療する際の抗体の有効性を高めるために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが望ましい場合があり得る。例えば、システイン残基をFc領域中に導入し、それによって、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させることができる。このようにして作製されたホモ二量体抗体は、内在化能力の改善、ならびにまたは補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞障害の増大を示し得る。およびShopesJImmunol14829182922を参照されたい。あるいは、2個のFc領域を有し、それによって、強化された補体溶解およびADCC能力を有し得る抗体を人工的に設計することもできる。を参照されたい。本発明はまた、毒素のような細胞障害性物質または放射性同位元素に結合された抗体を含む免疫複合体にも関連する。当業者は、多種多様な考え得る部分を、結果として生じる本発明の抗体に結合できることを認識するであろう。CargerPressNewYorkを参照されたい。結合は、抗体および他方の部分が個々の活性を保持する限り、これら2つの分子を結合する任意の化学反応によって遂行してよい。この連結は、多くの化学的メカニズム、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、および錯化を含み得る。しかしながら、好ましい結合は、共有結合である。抗体は、免疫血清のIgG画分を主に与えるプロテインAまたはプロテインGを用いたアフィニティークロマトグラフィーのような周知の技術によって精製される。続いて、またはその代わりに、捜し求められる免疫グロブリンの標的である特異的抗原またはそのエピトープをカラム上に固定して、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製してもよい。免疫グロブリンの精製は、例えば、DWilkinsonpp2528によって考察されている。hENT1に対する抗体の使用本発明に従う治療的実体の投与は、適切な薬学的に許容される担体、賦形剤、ならびに移動、送達、および耐性などの改善を実現するために製剤中に組み込まれる他の作用物質と共に行われることが認識される。多数の適切な製剤を、あらゆる薬剤師に公知の処方集RemingtonsPharmaceuticalSciences、特にその中のBlaugSeymourによるChapter87において見出すことができる。これらの製剤には、例えば、散剤、パスタ剤、軟膏剤、ゼリー剤、ワックス、油、脂質、脂質含有小胞、DNA結合体、無水吸収パスタ剤、水中油型乳剤および油中水型乳剤、乳濁液カーボワックス、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。本明細書において使用される場合、薬学的に許容される担体という用語は、薬学的投与に適合性である任意およびすべての溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張化剤および吸収遅延剤などを含むと意図される。適切な担体または希釈剤には、水、生理食塩水、生理的食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および5ヒト血清アルブミンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。リポソームおよび不揮発性油のような非水系ビヒクルもまた、使用され得る。製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されないこと、および製剤が投与経路に生理学的に適合性かつ耐容性であることを条件として、前述の混合物のいずれも、本発明に従う治療および治療法において適切であり得る。本発明の薬学的組成物は、所期の投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経皮投与、経粘膜投与、および直腸投与が含まれる。薬学的組成物は、投与用の取扱い説明書と一緒に容器、パック、またはディスペンサー中に含まれてよい。通常、本発明の抗体の治療的有効量は、治療目標を達成するのに必要とされる量に関する。投与されるべき必要量は、特異的抗原に対する抗体の結合親和性に依存し、また、投与された抗体が、それが投与された対象の自由体積から枯渇する速度にも依存する。本発明の抗体または抗体断片の治療的に有効な投薬の一般的範囲は、非限定的な例として、約01mgkg体重~約50mgkg体重であり得る。一般的な投薬頻度は、例えば、毎日2回~1週間に1回の範囲でよい。治療の有効性は、個々の癌または新生物障害を診断または治療するための任意の公知の方法と連携して判定される。癌または新生物障害の1種または複数種の症状が軽減される場合、抗体は臨床的有益性を与えることが示される。別の態様において、hENT1に対する抗体は、、hENT1の位置確認およびまたは定量に関する当技術分野の範囲内で公知の方法において使用され得る。さらに別の態様において、本発明による抗体は、試料中のhENT1の存在を検出するための作用物質として使用され得る。別の態様において、hENT1に特異的な抗体は、イムノアフィニティー、クロマトグラフィー、または免疫沈降法などの標準的技術によってhENT1ポリペプチドを単離するのに使用され得る。検出可能な物質に抗体を結合させることによって、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光性材料、生物発光材料、ならびに放射性材料が含まれる。診断用製剤および予防用製剤本発明のhENT1モノクローナル抗体は、診断用製剤および予防用製剤において使用される。1つの態様において、hENT1抗体は、hENT1の発現およびまたは活性が低いかまたはそうでなければ低減している患者または患者試料を同定するのに使用される。1つの態様において、本発明のhENT1抗体は、検出されたhENT1の発現レベルおよびまたは活性レベルに基づいて癌または他の新生物障害の治療に成功する可能性がより高い患者を同定するのに使用される。1つの態様において、本発明のhENT1抗体は、hENT1の異常な発現およびまたは活性に関連付けられている障害を発症するリスクがある患者を同定するのに使用される。1つの態様において、本発明のhENT1抗体は、hENT1の異常な発現およびまたは活性に関連付けられている障害を発症するリスクがある患者に投与される。これらの1種または複数種の障害に対する患者または器官の素因は、遺伝子型マーカー、血清学的マーカー、または生化学的マーカー、例えば、hENT1の発現レベルおよびまたは活性レベルなどを用いて判定することができる。本発明の抗体はまた、患者試料中のhENT1を検出する際に有用であり、したがって、診断用物質として有用である。例えば、本発明のhENT1抗体は、患者試料中のhENT1レベルを検出するためのインビトロアッセイ法、例えばELISAにおいて使用される。1つの態様において、本発明のhENT1抗体は、固体支持体上に固定される。固定された抗体は、試験試料中に存在し得る任意のhENT1に対する捕捉抗体として働く。検出可能な標識のレベルを測定し、標準試料から作成した検量線と比較することによって、試験試料中のhENT1抗原の濃度を決定する。本明細書に引用されるすべての刊行物および特許文献は、あたかもそのような刊行物または文献のそれぞれが参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み入れられる。刊行物および特許文献の引用は、いずれかが関連する先行技術であることを認めるものとして意図されるのでもなく、それらの内容または日付に関するいかなる承認となるものでもない。書面による説明によって本発明を今まで説明してきたが、当業者は、本発明が様々な態様において実施され得ること、ならびに前述の説明および下記の実施例が、例示のためであって、添付の特許請求の範囲を限定するためではないことを認識するであろう。実施された実験および達成された結果を含めて、以下の実施例は、例証するためだけに提供され、本発明に対する限定として解釈されるべきではない。実施例1抗hENT1抗体の作製および配列決定その内容全体が参照により本明細書に組み入れられるJenningsetalDistinctregionaldistributionofhumanequilibrativenucleosidetransporterproteins1and2inthecentralnervoussystemNeuropharmacologyvol40722731において説明されているようにして、抗体を作製した。簡単に説明すると、hENT1の膜貫通セグメント6と7の間の予測される細胞内ループのアミノ酸254~271に対応し、キーホールリンペットヘモシアニンに結合された合成ペプチドでマウスを免疫化することによって、hENT1タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生させた。均一性が95を超えるまで精製されたこの合成ペプチドKLH結合体は、AlbertaPeptideInstituteから入手した。モノクローナル抗体の作製は、HarlowandLaneの手順に従った。ハイブリドーマは、脾細胞をマウス骨髄腫非分泌細胞株PCNSI1AG41と融合させることによって作製し、100μMヒポキサンチン、16μMアミノプテリン、および04μMチミジンの存在下で増殖する能力に基づいて選択し、20熱失活ウシ胎児血清を添加したRPMI1640からなる増殖培地中で維持した。ハイブリドーマ培養物から得た上清を、ウシ血清アルブミンに結合させた合成ペプチドを用いた酵素結合免疫吸着アッセイ法によって免疫反応性についてスクリーニングした。3回の個別のアッセイにおいてELISAで強い陽性の結果を示したハイブリドーマ培養物を限界希釈に供して、クローン集団を得た。hENT1タンパク質に対して高い特異性および結合活性を有するモノクローナル抗体を産生したハイブリドーマ培養物に由来する上清を採取し、1000gで10分間遠心分離して任意の細胞片を除去し、使用するまで20°Cで保存した。ハイブリドーマ細胞沈殿物からmRNAを抽出し、全RNAを沈殿物から抽出した。抽出したRNAに対してRTPCRを実施した。簡単に説明すると、オリゴプライマーを用いて逆転写することによって、RNAからcDNAを作製した。モノクローナル抗体DNAのVH領域およびVL領域の両方を増幅するための可変ドメインプライマーを用いたPCR反応。VHバンドおよびVLバンドを単離し、VLバンドをゲル精製した。VLPCR生成物およびVHPCR生成物の両方をInvitrogen配列決定ベクターpCR21中にクローニングし、陽性の形質転換体を得るためにTOP10大腸菌細胞に形質転換した。選択されたコロニー、すなわちVH312、VH59、VH512、VH513、VH11、VH14、VH16、VH42、VH43、VH44、VL2、VL10、VL11、VL20、VL21、VL22、VL23、VL27、VL210、VL212、およびVL216を採取し、配列決定によって解析した。これらのVH配列およびVL配列は前述した。本明細書において説明するアッセイ法を用いて、抗体の結合活性および機能的活性を試験した。簡単に説明すると、サンドイッチELISAを用いて抗体の発現の特性を明らかにし、定量化する。マウスSigmaIgG1κを用いて、較正用標準物質を確立する。吸光度を波長450nMで測定し、マウスIgG1κの量を決定する。次いで、2回目のELISAを用いて、ウシ血清アルブミンに結合させたhENT1ポリペプチドアミノ酸254~271に対するhENT1抗体の親和性を明らかにする。二次抗体を使用し、ELISAプレートを450nMで読み取る。実施例2抗hENT1抗体の発現本明細書において説明する研究により、CHO細胞のトランスフェクションによって産生される抗hENT1IgG1抗体の発現が実証される。最初の研究において、以下の重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を合成し、図1に示す抗体発現プラスミド中にクローニングした。上記の抗体軽鎖および抗体重鎖をコードするDNAは、Geneartによって合成され、CHO細胞における発現用に最適化された。このDNAをDHFR発現ベクター中に挿入した。このベクターはまた、ネオマイシンG418抗生物質およびまたはメトトレキサートを用いた選択によって、安定な細胞株の開発にも使用され得る。重鎖アミノ酸配列軽鎖アミノ酸配列重鎖および軽鎖の可変ドメインは、SEQIDNO54およびSEQIDNO55においてボールド体で示している。相補性決定領域は、SEQIDNO54およびSEQIDNO55において四角で囲んで示している。CDR配列は、本明細書において説明するようにIMGTアルゴリズムを用いて同定した。トランスフェクション効率を最適化するために、様々な条件下で抗体発現プラスミドに対して数回のトランスフェクションを実施した。一過性トランスフェクションを次のようにして実施したPROCHO4CDM培地中でCHOS細胞を培養したトランスフェクション実施日に、細胞を200gで5分間遠心分離し、新鮮なUltraCHOPROCHO5CDM培地中に2×106細胞mlの細胞濃度で再懸濁した150mMNaCl中で希釈した、培養物1mlにつき25μgのDNAおよび41または61いずれかのPEI対DNA比率を用いて、スピナーフラスコにおいて培養物のトランスフェクションを実施した5時間後、トランスフェクトされた培養物を新鮮なUltraCHOProCHO5培地500mlで希釈し、88rpmで撹拌しながら6CO2中、37°Cでインキュベートしトランスフェクション後7~12日目に上清を採取した。以下のさらなる一過性トランスフェクションも実行した。PEI比率41を用いた一過性トランスフェクションスピナーフラスコにおいて、体積規模600mlのUltraCHO培地中でトランスフェクションを実施した。濃度1mgmlのDNAプラスミド調製物を使用した。8日後に、精製するために上清を採取した。PEI比率41を用いた一過性トランスフェクションスピナーフラスコにおいて、体積規模932mlのUltraCHO培地を用いてトランスフェクションを繰り返した。前述したのと同じプラスミド調製物を使用した。8日後に、精製するために上清を採取した。PEI比率41を用いた一過性トランスフェクション濃度2470μgmlおよび純度17の新鮮なMaxiprepを用いてUltraCHO培地700ml中でトランスフェクションを実施した。11日後に、さらに精製するために上清を採取し、凍結した。PEI比率41を用いた一過性トランスフェクションUltraCHO培地1000ml中で、上記で使用したのと同じMaxiprepを用いてトランスフェクションを繰り返した。7日後に、精製するために上清を採取した。PEI比率61を用いた一過性トランスフェクションPEIとDNAの比率を修正し、比率を41から61に変更し、UltraCHO培地と共にProCHO5培地を使用して発現を比較した。プラスミド調製物の濃度は1770μgmlであり純度は17であった。スピナーフラスコにおいて、体積700mlのUltraCHOおよび500mlのProCHO5中でトランスフェクションを実施した。7日後に、精製するために上清を採取した。PEI比率61を用いた一過性トランスフェクション3つの別々のエルレンマイヤーフラスコ中、ProCHO5培地480mlにおいてトランスフェクションを実施した。プラスミド調製物の濃度は1135μgmlであり純度は161であった。数日後に上清を採取した。PEI比率61を用いた一過性トランスフェクションエルレンマイヤーフラスコ中、ProCHO5培地200mlにおいてトランスフェクションを実施した。プラスミド調製物の濃度は370μgmlであり純度は15であった。PEI比率61を用いた一過性トランスフェクショントランスフェクション体積は、エルレンマイヤーフラスコに入れたProCHO5培地において500mlであった。プラスミド調製物の濃度は3645μgmlであり純度は17であった。発現された抗体を培地において検出し、発現された抗体が抗hENT1であることをELISAによって確認した。IgG結合緩衝液を用いて、2つのバッチの細胞培養上清から抗hENT1抗体を精製した。ウェスタンブロットによって示されたように、精製によって抗hENT1抗体を得ることに成功した。しかしながら、精製された試料中には、約100kDaのタンパク質バンドも存在した。前述の数回のトランスフェクションに由来する上清を、陽性対照のマウスIgGと共に、定量的ELISAによって試験した。試験した上清は、本明細書において上清1、上清2、および上清3と呼ばれる。4°Cで一晩、濃度100ngウェルのヤギ抗マウスIgG抗体でELISAプレートをコーティングした。次いで、150rpmで振盪しながら室温で2時間、3乳でプレートをブロットした。10ngウェル~0ngウェルのマウスIgGを段階希釈によって調製し、検量線としてプレートに1試料あたり3個ずつ添加した。上清試料100μlをプレートに1試料あたり3個ずつ添加した。このプレートを150rpmで振盪しながら室温で2時間インキュベートし、PBS01Tweenで6回洗浄した。抗マウスIgG抗体HRP結合体を150rpmで振盪しながら1時間添加し、次いでPBS01Tweenで6回洗浄し、PBSで1回洗浄した後、TMBを用いて顕色させた。この定量的ELISAの結果を図2に示す。次いで、非還元ウェスタンブロット方法論を用いて、3種の上清すべてを試験した。SDSを含まない12アクリルアミドを用いて非還元ゲルを調製し、各上清試料30μlをそれぞれ希釈率51で処理用緩衝液と混合した。1ウェル当たり30μlの試料混合物を添加した。レーン1のマーカーは、SeeBluePlus2着色済みスタンダードである。次いで、ゲルを180Vで85分間泳動させ、ウェスタンブロット膜に20Vで25分間、移した。振盪しながら室温で2時間、3乳で膜をブロックし、70rpmで振盪しながら4°Cで一晩、抗マウスIgG抗体HRP結合体を用いてプローブした。翌日、PBS01TweenおよびPBSでブロットを徹底的に洗浄した後、ECL溶液を1~5分間用いて顕色させた。図3に示したように、上清2において、148kDa~250kDaのバンドの間、かつ陽性対照のマウスIgGの場合と同じサイズにバンドを認識することができた。マウスIgG対照が飽和したため、マウスIgG無しでウェスタンブロットを再び顕色させた。上清2および上清3の両方においてバンドを認識することができる。上清2試料のバンドは、過度に現像した後に最も強いように見えた。上清3試料では弱いバンドを認識することができた。これは、図2の定量的ELISAによって決定された濃度と相関関係があった。どちらの試料バンドも、陽性対照マウスIgGのバンドと同じサイズで、未濃縮上清において現れた。非還元ウェスタンブロットにおける上清バンドの強度は、定量的ELISAにおいて示された濃度に対応している。上清2試料が最も高濃度のIgGを含み、ウェスタンブロットにおいて最も強いバンドを示した。上清3は、IgG含有量が少なく、ブロットにおいて弱いバンドを示した。上清1は、最も低濃度のIgGを含み、バンドを全く示さなかった。これらの上清の差は、トランスフェクション効率およびIgG発現が原因であり得る。上清試料2および3は、同じDNA調製物でトランスフェクトされており、このことは、比較的高い発現レベルの説明となり得る。非還元ウェスタンブロットにより、上清2試料および上清3試料10において、陽性対照のマウスIgGの場合と同じサイズにバンドを認識することができた。完全な組換えマウスIgGが、一過性トランスフェクションにより、CHO細胞において最大濃度466μgLで産生されていた。発現された組換え抗hENT1抗体のアイソタイプは、BioAssayWorksラテラルフローMouseIsoGold試験キットを用いて決定した。簡単に説明すると、2つの異なるバッチに由来する抗体試料5μlを、細胞培養物上清液体を試験するための製造業者の取扱い説明書に従って試料希釈剤05mlに添加した次いで、希釈した試料150μlを3つのラテラルフローカートリッジに添加し、5分の時点でこれらの結果を読み取った。両方の試料において、10D7G2ハイブリドーマの産生物を再現する正しいアイソタイプであるκ軽鎖含有マウスIgG1について、低い抗体濃度を示す色の薄い結果が得られた。混在するアイソフォームは観察されなかった。サンドイッチELISAを用いて、マウスIgG1抗hENT1抗体の発現を実証した。製造業者の処方に従い、Fluka炭酸重炭酸緩衝液タブレットを用いて、炭酸重炭酸コーティング緩衝液を調製した。ヤギ抗マウスIgG抗体100μlをpH96のコーティング緩衝液10mlで希釈した。Greiner製の96ウェル中結合能ELISAプレートを、1ウェル当たり100μlの抗マウスIgGプレートコーティング抗体溶液でコーティングした。このプレートをパラフィルムに包み、2~8°Cで一晩置いた。翌日、炭酸コーティング緩衝液中で15wvのSigmaゼラチンを調製することによって、ブロッキング溶液を作製した。96ウェルプレートを冷蔵庫から取り出し、1ウェル当たり200μlの15wvブロッキング溶液を添加することによって、プレートウェルの残存する結合部位をブロックした。このプレートを37°Cで約60分間、置いておいた。精製水500mlにFlukaリン酸緩衝化生理食塩水タブレット1個を溶解することによって、ELISA洗浄溶液を調製した。PBST中に10wvのSigmaゼラチンを溶解することによって、較正物質試料希釈液を調製した。申告されている濃度が10mgmlのSigmaIgG1κを用いて、較正曲線を作成した。1mgmlストックIgG1の16667希釈物を調製して、150ngmlの最高値の較正用標準物質を得た。この標準物質を、アッセイ用希釈液を用いて11で段階的に希釈して、較正用の系列を作製した。精製した抗体試料のタンパク質濃度に基づき、試験のためにこれらの試料を15000希釈した。ブロッキング溶液をプレートから除去し、250μlウェルのアッセイ用希釈液でウェルを一度洗浄した。較正用標準物質および培地試験試料を1試料あたり3個ずつ、100μlウェルでプレートにアプライした。プレートをパラフィルムでカバーし、設定610のプレートシェーカー上に120分間置いた。試料インキュベーション期間の最後に、標準物質および試料を除去し、250μlウェルのアッセイ用希釈液で3回、プレートを洗浄した。アッセイ用希釈液中で1100000に希釈して、二次抗体を調製した。洗浄液を除去し、二次抗体を100μlウェルでプレートに添加した。プレートをパラフィルムでカバーし、速度610のプレートシェーカー上に戻してさらに90分間置いた。結合体インキュベーションの最後に、二次抗体溶液を除去し、250μlウェルのPBST緩衝液で3回、プレートを洗浄し、次いで、精製水で1回すすいだ。テトラメチルベンジジン基質を、プレートのウェルに100μlウェルで添加した。新しい1枚のパラフィルムを用いてプレートをカバーし、実験室周囲温度において10分間、静止状態でこれをインキュベートした。100μlウェルの1Mリン酸を添加することによって、酵素基質反応を終結させた。プレートを450nMで読み取った。両方の試料のA450600は、ベースラインを上回り、やっと検出することができたが、9375ngmlの較正用標準物質の結果をかなり下回っていた。マウスIgG1κELISAは、アイソタイプの結果と相関関係があり、どちらの試料も抗体のこのアイソフォームを非常に低い濃度で含む。発現された抗hENT1抗体の親和性をELISAによって実証した。hENT1タンパク質の合成ペプチド配列を用いて、10D7G2モノクローナル抗体を作製した。第2のELISAを実施して、この合成ペプチド配列AcSKGEEPRAGKEESGVSCアミドに対する精製組換え抗体の親和性を試験した。炭酸重炭酸コーティング緩衝液を上記のIgGELISAに関して説明したようにして調製した。BSAに結合させた合成ペプチド、MW1977、Mgs025のバイアルを、炭酸重炭酸コーティング緩衝液250μlを用いて復元して、理論上の濃度が1mgmlになるようにした。炭酸重炭酸プレートコーティング緩衝液中でこれをさらに1500希釈して、2μgmlのコーティング溶液12mlを得た。Greiner製の96ウェル中結合能ELISAプレートを、1ウェル当たり100μlの2μgmlBSAペプチド溶液を用いてコーティングした。このプレートをパラフィルムに包み、2~8°Cで一晩置いた。翌日、炭酸コーティング緩衝液中で15wvのSigmaゼラチンを調製することによって、ブロッキング溶液を作製した。96ウェルプレートを冷蔵庫から取り出し、1ウェル当たり200μlの15wvブロッキング溶液を添加することによって、プレートウェルの残存する結合部位をブロックした。このプレートを37°Cで約60分間、置いておいた。PBST洗浄緩衝液およびアッセイ用希釈液を、上記のIgGELISAに関して説明したようにして調製した。精製したIgG試料1および2の15000希釈物を、前述のIgGサンドイッチELISAの場合のように調製した。ブロッキング溶液をプレートのウェルから除去し、250μlウェルのアッセイ用希釈液でプレートを一度洗浄した。試験試料を1試料あたり3個ずつ、100μlウェルでプレートのウェルにアプライした。プレートをパラフィルムでカバーし、周囲温度で120分間、610で振盪しながらプレートシェーカー上に置いた。試料インキュベーションの最後に、試料をウェルから除去し、250μlウェルのアッセイ用希釈液で3回、プレートを洗浄した。アッセイ用希釈液中で1100000に希釈して、二次抗体を調製した。洗浄液を除去し、二次抗体を100μlウェルでプレートに添加した。プレートをパラフィルムでカバーし、速度610のプレートシェーカー上に戻してさらに90分間置いた。結合体インキュベーションの最後に、二次抗体溶液を除去し、250μlウェルのPBST緩衝液で3回、プレートを洗浄し、次いで、精製水で1回すすいだ。テトラメチルベンジジン基質を、プレートのウェルに100μlウェルで添加した。プレートを新しい1枚のパラフィルムでカバーし、実験室周囲温度において10分間、静止状態でこれをインキュベートした。100μlウェルの1Mリン酸を添加することによって、酵素基質反応を終結させた。プレートを450nMで読み取った。一過性CHO培養物による機能的抗ペプチドIgGの発現を実証するのに使用できるのは、ペプチドELISAの結果である。ペプチドELISAの特異性を実証するために、150ngmlのSigmaIgG1κ標準物質をウェルD10~12に添加した。この試料の結果は、アッセイ用希釈液のみをいれた6個のウェルについて記録された値とほんのわずかしか違わない。陰性対照の濃度は試験試料の濃度より5000倍高い150ngmlであったが、これが偽陰性をもたらすリスクはなく、150ngmlは、同じプレートタイプ、試料希釈剤、結合体洗浄溶液、および基質を使用するマウスIgG1サンドイッチELISAのために使用される最高値の標準物質である。したがって、試験試料によって生じる任意のシグナルは、ペプチド配列のみに対する結合の結果であり、マウスIgG1と96ウェルプレートのいかなる非特異的相互作用の結果でもないと結論付けられる。2種の試験試料によって生じるシグナルは比較的小さかったが、マウスIgG1κ対照よりは十分に大きく、両方の試料が、合成ペプチド配列AcSKGEEPRAGKEESGVSCアミドに対する特異的親和性を有する組換え抗体を含むと結論付けられた。ペプチドELISAによってより説得力がある陽性結果を得るために、一過性培養物に由来する馴化培地150mlを使用した。YM10限外ろ過ディスクを取り付けたAmicon撹拌セルモデル8400を用いて、150mlの体積を約15mlまで減少させた。次いで、濃縮した試料を110~1640の希釈率でペプチドELISAを用いて試験した。プレートリーダーの結果から、この一過性培養の間に合成ペプチド配列に対して発現された組換え抗体の完全な機能性が実証された。試験によって、10D7G2ハイブリドーマ細胞に由来する可変領域の配列が、正確に決定され、プラスミド構築物に移入され、CHO宿主細胞株内で一過性に発現されたことが実証された。したがって、本明細書において説明する配列は、合成ペプチド配列AcSKGEEPRAGKEESGVSCアミドに対する特異的親和性を有することが実証された。第二の研究において、3A7C8ハイブリドーマ細胞に由来する以下の重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を合成し、図5に示す抗体発現プラスミド中にクローニングした。上記の抗体軽鎖および抗体重鎖をコードするDNAは、Geneartによって合成され、CHO細胞における発現用に最適化された。軽鎖に対してはBamHIおよびAvrII、重鎖に対してはBglIIおよびNheIの制限部位を介して、DHFR発現ベクター中にDNAを挿入した。このベクターはまた、ネオマイシンG418抗生物質およびまたはメトトレキサートを用いた選択によって、安定な細胞株の開発にも使用され得る。重鎖アミノ酸配列軽鎖アミノ酸配列重鎖および軽鎖の可変ドメインは、SEQIDNO57およびSEQIDNO55においてボールド体で示している。相補性決定領域は、SEQIDNO54およびSEQIDNO55において四角で囲んで示している。CDR配列は、本明細書において説明するようにIMGTアルゴリズムを用いて同定した。トランスフェクション効率を最適化するために、様々な条件下で抗体発現プラスミドに対して数回のトランスフェクションが実施される。例えば、前述の一過性トランスフェクション方法を用いて、このプラスミドが試験される。試験は、3A7C8ハイブリドーマ細胞に由来する抗体が正確に決定されたことを確認するために実施され、さらなる試験、例えば、10D7G2ハイブリドーマ細胞に由来する可変領域の配列に関連して前述した試験により、図5に示す抗体発現プラスミドがCHO宿主細胞株内で首尾よく一過性に発現されたことが実証される。書面による説明および例によって本発明を今まで説明してきたが、当業者は、本発明が様々な態様において実施され得ること、ならびに前述の説明および実施例が、例示のためであって、添付の特許請求の範囲を限定するためではないことを認識するであろう。