"LRRK2に対する試験化合物の影響を細胞系システムにおいて評価するための方法であって、下記の工程:aLRRK2を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、前記LRRK2のSer910および/またはSer935のリン酸化状態に対する影響を評価する工程;ならびに/あるいはbLRRK2を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、14-3-3ポリペプチドへの前記LRRK2の結合に対する影響を評価する工程を含む方法。LRRK2を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、LRRK2の細胞内位置に対する影響を評価する工程を含むか、または、当該工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。化合物を、LRRK2に対する阻害効果を細胞系システムにおいて有すると見なされるとして選択する工程をさらに含み、ただし、前記LRRK2のSer910および/またはSer935のリン酸化が前記暴露の後で低下するならば、かつ/あるいは、14-3-3ポリペプチドへの前記LRRK2の結合が前記暴露の後で低下するならば、かつ/あるいは、細胞質プールにおけるLRRK2の蓄積が前記暴露の後で低下するならば、試験化合物がそのように選択される、請求項1または2に記載の方法。Ser910のリン酸化が、Ser910がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser910がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体を使用して評価される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。Ser935のリン酸化が、Ser935がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser935がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体を使用して評価される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。14-3-3ポリペプチドへの前記LRRK2の結合が、蛍光共鳴エネルギー転移FRETを使用して評価される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。前記細胞系システムがインビトロ細胞システムである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記細胞系システムがエクスビボ細胞システムである、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。前記細胞系システムがインビボシステムである、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。LRRK2を含む前記細胞系システムが試験動物において前記試験化合物にさらされている、請求項9に記載の方法。前記LRRK2のSer910および/またはSer935のリン酸化状態を評価すること、ならびに/あるいは、14-3-3ポリペプチドへの前記LRRK2の結合を評価すること、ならびに/あるいは、細胞質プールにおけるLRRK2の蓄積を評価することが、前記試験動物から得られる細胞に対して行われる、請求項10に記載の方法。前記試験動物から得られる前記細胞が、前記試験動物から血液において得られる細胞である、請求項11に記載の方法。前記細胞系システムが破砕細胞システムである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記細胞系システムがリンパ芽球様細胞系システムである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。Ser910がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser935がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser910がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser935がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体。1Ser910がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser910がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体;2Ser935がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser935がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体;314-3-3ポリペプチド、または、14-3-3ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体;および4蛍光標識されたLRRK2ポリペプチド、または、蛍光標識されたLRRK2をコードするポリヌクレオチドのうちの2つ以上を含む部分品のキット。1Ser910がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser910がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体;2Ser935がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser935がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体;314-3-3ポリペプチド、または、14-3-3ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体;および/あるいは4蛍光標識されたLRRK2ポリペプチド、または、蛍光標識されたLRRK2をコードするポリヌクレオチドの使用であって、LRRK2に対する試験化合物の影響を細胞系システムにおいて評価するための方法における使用。LRRK2ポリペプチドまたはLRRK2ポリヌクレオチド、あるいは、LRRK2に対して特異的に結合する抗体と、14-3-3ポリペプチドまたは14-3-3ポリヌクレオチド、あるいは、14-3-3ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体とを含む精製された調製物または部分品のキット。LRRK2変異体例えば、パーキンソン病の患者において見出されるLRRK2変異体を特徴づける方法であって、下記の工程:a前記LRRK2変異体のSer910および/またはSer935のリン酸化状態を評価する工程;ならびに/あるいはb前記LRRK2変異体の14-3-3ポリペプチドへの結合能を評価する工程を含む方法。細胞系システムにおいて発現されるとき、前記LRRK2変異体の細胞内位置を評価する工程を含むか、または、当該工程をさらに含む、請求項19に記載の方法。本発明の第1の態様は、LRRK2に対する試験化合物の影響を細胞系システムにおいて評価するための方法であって、下記の工程:aLRRK2を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、前記LRRK2のSer910および/またはSer935のリン酸化状態に対する影響を評価する工程;ならびに/あるいはbLRRK2を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、14-3-3ポリペプチドへの前記LRRK2の結合に対する影響を評価する工程を含む方法を提供する。ある実施形態において、本発明の方法は、LRRK2を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、LRRK2の細胞内位置に対する影響を評価する工程を含むか、または、当該工程をさらに含むことができる。本発明の方法は、さらに、化合物を、LRRK2に対する阻害効果を細胞系システムにおいて有すると見なされるとして選択する工程をさらに含むことができ、ただし、前記LRRK2のSer910および/またはSer935のリン酸化が前記暴露の後で低下するならば、かつ/あるいは、14-3-3ポリペプチドへの前記LRRK2の結合が前記暴露の後で低下するならば、かつ/あるいは、細胞質プールにおけるLRRK2の蓄積が前記暴露の後で低下するならば、試験化合物がそのように選択される。試験化合物は典型的には、例えば、インビトロアッセイを使用して、例えば、LRRKitideまたはNictideをLRRK2基質ポリペプチドとして使用するアッセイを使用して、LRRK2の潜在的阻害剤として既に選択されている化合物である場合がある。化合物をLRRK2の潜在的阻害剤として選択するために好適なアッセイの例が、例えば、国際公開WO2008/122789および国際特許出願PCT/GB2009/002047に記載される。典型的には、Ser910のリン酸化が、Ser910がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser910がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体を使用して評価される。典型的には、Ser935のリン酸化が、Ser935がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser935がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体を使用して評価される。Ser910がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体によって、Ser910がリン酸化されるLRRK2には結合するが、Ser910がリン酸化されないLRRK2には結合しない抗体、または、他のリン酸化されたセリン残基には結合しない抗体が意味される。同様に、Ser935がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体は、Ser935がリン酸化されないLRRK2、または、他のリン酸化されたセリン残基には結合しない。リン酸化されたセリン残基に対して広く結合する抗体は、Ser910がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser935がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体ではない。同様に考慮すべき事項が、Ser910がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser935がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体に関連して適用される。Ser910がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体は、Ser910がリン酸化されるLRRK2には結合しない。Ser935がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体は、Ser935がリン酸化されるLRRK2には結合しない。そのような抗体を作製および使用する方法は当業者には明らかであるであろう。そのような抗体の実例、ならびに、そのような抗体を作製および使用する方法の実例が実施例に記載される。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。一例として、ELISA型アッセイが、当業者には広く知られているであろうように、特に有用であり得る。14-3-3ポリペプチドへのLRRK2の結合を、タンパク質:タンパク質の相互作用を評価するための好適な技術であれば、どのような技術によってでも評価することができる。典型的には、FRET蛍光共鳴エネルギー転移技術を、下記でさらに議論されるように、使用することができる。有用であり得る他の技術では、免疫沈殿技術を使用することができる。例えば、免疫沈殿を、当業者には明らかであるであろうように、LRRK2に対して特異的に結合する抗体を用いて行うことができ、または、14-3-3ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を用いて行うことができる。14-3-3ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体は当業者には広く知られているであろうし、また、市販されている。代替では、免疫沈殿を、これもまた当業者には明らかであるであろうように、組換えLRRK2に存在するタグに対して特異的に結合する抗体を用いて、または、組換え14-3-3ポリペプチドに存在するタグに対して特異的に結合する抗体を用いて行うことができる。一例として、14-3-3コプルダウンまたはリン酸化状態に依存しない抗LRRK2抗体のどちらかとカップリングするホスホ/デホスホLRRKの検出を、InvitrogenのAlpha-Elisa技術これは、ハイスループットスクリーニングシステムを達成することにおいて有用であると思われるを使用して行うことができると考えられる。Luminexビーズまたはプレート型エレクトロケミルミネセンスMSD;メソスケール発見検出を使用する多重アッセイもまた使用することができるであろう。タンパク質:タンパク質およびホスホタンパク質検出の両方に対して適用可能であるAlphaスクリーニング技術PerkinElmerMAPK経路、JAK/STAT経路およびAKT経路について開発され、販売されるSureファイヤーキットの詳細が、例えば、httplasperkinelmercoukCatalogCategoryPagehtmCategoryIDAlphaTechMBIOにおいて見出され得る。ホスホタンパク質の検出ならびにタンパク質:タンパク質および総タンパク質の定量化に対して適用可能であるLuminex技術の詳細が、例えば、httpwwwluminexcorpcomapplicationscellularsignalinghtmlにおいて見出され得る。そのような技術の使用の一例が、KhanIH、ZhaoJ.、Ghosh、P.Ziman、M.、SweeneyC、KungHJおよびLuciwPA2010、AssayDrugDevtechnology、8、27~36に関連して記載される。MSD技術において、プレート表面での捕獲および抗体検出の原理は、どのようなELISAとも同じであり、しかし、検出様式では、ルテニウムによりタグ標識されたプローブによるエレクトロケミルミネセンスが使用され、そしてまた、この技術は、アレー形式によるウエルでの多重化を可能にする。httpwwwmesoscalecomCatalogSystemWebWebRootliteraturebrochurespdftechBrochurepdf定量的な、細胞培養でのアミノ酸による安定同位体標識化SILACに基づく質量分光法を、LRRK2または14-3-3ポリペプチドの免疫沈殿物と会合するタンパク質を特定および定量するために使用することができる。当業者には広く知られているであろうように、他の免疫沈殿物方法を使用することができる。例えば、ジゴキシゲニン標識された14-3-3ポリペプチドを使用することができる。そのような方法のいくつかの実例が実施例に記載される。上記で記されるように、タンパク質:タンパク質の相互作用を細胞または細胞抽出物において評価するための他の技術もまた使用することができる。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移FRETに基づくシステムを、組換えLRRK2と、組換え14-3-3ポリペプチドとの相互作用が評価されているならば、例えば、LRRK2および14-3-3ポリペプチドの両方がともに蛍光ポリペプチドによりタグ標識されるならば、使用することができる。したがって、LRRK2と、14-3-3タンパク質との間における分子相互作用および、試験化合物の影響を、FRETに基づく方法を使用して、例えば、顕微鏡例えば、多光子顕微鏡などでのFLIM-FRETなどを使用して調べることができるであろう。一例として、Cherryタグ標識された野生型14-3-3イソ型を発現させるための構築物、または、コントロールとしてであるが、ホスホ標的と結合しない、Cherryタグ標識された14-3-3イソ型の不活性変異体例えば、14-3-3ゼータ[E180K]などを発現させるための構築物を、野生型GFP-LRRK2を安定的に発現する細胞株に、または、コントロールとしてであるが、GFP-LRRK2[S910A/S935A]を安定的に発現する細胞株にトランスフェクションすることができる。GFP蛍光団と、mCherry蛍光団とが、LRRK2の14-3-3への結合によって一緒になり、その結果として、それらの蛍光寿命これが検出され得るが影響を受けるであろうとき、FRET蛍光共鳴エネルギー転移が生じ得る。FLIM蛍光寿命画像化顕微鏡法を使用して、本発明者らは、強いタンパク質-タンパク質相互作用したがって、FRETの部位と、相互作用が弱い部位、または、相互作用がない部位とがカラーコード化によって認識され得る細胞の空間分布を作製することができる例えば、Lieresetal.2009QuantitativeanalysisofchromatincompactioninlivingcellsusingFLIM-FRET.JCellBiol.2009Nov16;1874:481-96.を参照のこと。FLIM-FRETは、GFP-LRRK2[S910A/S935A]と、mCherry-14-3-3との間、または、野生型GFP-LRRK2と、不活性14-3-3ポリペプチドとの間では観測されないはずである。一般に使用されるFRET対には、CFPドナーおよびYFPアクセプター、同様にまた、GFPドナーおよびCherryアクセプターが含まれる。ドナー蛍光団およびアクセプター蛍光団がともに、同じ励起光波長により励起される場合、例えば、GFP-YFPのFRET対の場合には、強化アクセプター蛍光EAFと呼ばれる特別な種類のFRETを検出することができる。FRET技術に関するさらなる参考文献の例には、下記が含まれる:WallrabePeriasamy2005CurrentOpinioninBiotechnologyVolume16,Issue1,February2005,Pages19-27;ImagingproteinmoleculesusingFRETandFLIMmicroscopy;Aietal2008NatureMethods5,401-403FluorescentproteinFRETpairsforratiometricimagingofdualbiosensors;Shaneretal.2004NatBiotechnol22:1567-1572Improvedmonomericred,orangeandyellowfluorescentproteinsderivedfromDiscosomasp.redfluorescentprotein.LRRK2を含む細胞系システムを試験化合物に暴露することの、当該LRRK2のSer910および/またはSer935のリン酸化状態に対する影響を評価すること、ならびに/あるいは、LRRK2を含む細胞系システムを試験化合物に暴露することの、当該LRRK2の14-3-3ポリペプチドへの結合に対する影響を評価することを、LRRK2の細胞内局在化を評価することによって行うことができ、または、LRRK2の細胞内局在化を評価することによってさらに評価することができる。Ser910および/またはSer935のリン酸化を低下させること、ならびに/あるいは、LRRK2の14-3-3ポリペプチドへの結合を低下させることは、細胞質全体に拡散的に位置するのとは対照的に、細胞質プールに存在するLRRK2ポリペプチドの量を増大させると考えられる。LRRK2の細胞内位置を、当業者には広く知られている技術を使用して、例えば、免疫組織化学または蛍光顕微鏡観察を使用して、例えば、蛍光タンパク質例えば、GFPタグを有する組換えLRRK2ポリペプチドを使用する免疫組織化学または蛍光顕微鏡観察を使用して評価することができる。そのような技術の実例が実施例に示される。1つの実施形態において、本発明の方法は、LRRK2を含む細胞系システムを試験化合物に暴露することの、LRRK2の細胞内位置に対する影響を評価する工程を含むことができ、または、当該工程をさらに含むことができる。細胞系システムはインビトロ細胞システムである場合がある。例えば、アッセイを細胞株に対して行うことができる。好適な細胞株の例には、Swiss3T3細胞またはHEK-293細胞が含まれると考えられる。他の好適な細胞には、例えば、野生型LRRK2を発現するヒト対象に由来するか、あるいは、LRRK2[G2019S]または、パーキンソン症候群に関連する他のLRRK2変異体についてホモ接合性であるヒト対象に由来するEBV形質転換されたリンパ芽球様細胞が含まれる。ニューロン細胞株もまた使用することができる。好適な細胞株はまた、組換えLRRK2および/または組換え14-3-3ポリペプチドを発現する細胞株である場合がある。そのような発現のための好適な細胞には、実施例に記載されるように、T-Rex細胞が含まれると考えられる。これらの細胞、例えば、T-Rex細胞は、当業者には広く知られているであろうように、組換えLRRK2または組換え14-3-3ポリペプチドを誘導可能な様式で発現することができる。例えば、細胞を、例えば、実施例に記載されるように、ドキシサイクリンを培養培地に含むことによって、所望される組換えポリペプチドを発現させるために誘導することができる。14-3-3ポリペプチドは典型的には、ヒトのベータイソ型、イータイソ型、シータイソ型、ゼータイソ型、ガンマイソ型またはイプシロンイソ型であり得るか、あるいは、ヒトのベータイソ型、イータイソ型、シータイソ型、ゼータイソ型、ガンマイソ型またはイプシロンイソ型を含み得る。14-3-3ポリペプチドはヒトのシグマイソ型でないことだけが好ましい。14-3-3ポリペプチド配列の例が下記に示される。当業者は他の14-3-3ポリペプチド配列をデータベースから容易に特定することができる。例えば、NCBIデータベースのHomologene機能を使用することができる。ヒト1433ベータMTMDKSELVQKAKLAEQAERYDDMAAAMKAVTEQGHELSNEERNLLSVAYKNVVGARRSSWRVISSIEQKTERNEKKQQMGKEYREKIEAELQDICNDVLELLDKYLIPNATQPESKVFYLKMKGDYFRYLSEVASGDNKQTTVSNSQQAYQEAFEISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFYYEILNSPEKACSLAKTAFDEAIAELDTLNEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSENQGDEGDAGEGENマウス1433ベータMTMDKSELVQKAKLAEQAERYDDMAAAMKAVTEQGHELSNEERNLLSVAYKNVVGARRSSWRVISSIEQKTERNEKKQQMGKEYREKIEAELQDICNDVLELLDKYLILNATQAESKVFYLKMKGDYFRYLSEVASGENKQTTVSNSQQAYQEAFEISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFYYEILNSPEKACSLAKTAFDEAIAELDTLNEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSENQGDEGDAGEGENヒト1433イプシロンMDDREDLVYQAKLAEQAERYDEMVESMKKVAGMDVELTVEERNLLSVAYKNVIGARRASWRIISSIEQKEENKGGEDKLKMIREYRQMVETELKLICCDILDVLDKHLIPAANTGESKVFYYKMKGDYHRYLAEFATGNDRKEAAENSLVAYKAASDIAMTELPPTHPIRLGLALNFSVFYYEILNSPDRACRLAKAAFDDAIAELDTLSEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDMQGDGEEQNKEALQDVEDENQマウス1433イプシロンMDDREDLVYQAKLAEQAERYDEMVESMKKVAGMDVELTVEERNLLSVAYKNVIGARRASWRIISSIEQKEENKGGEDKLKMIREYRQMVETELKLICCDILDVQDKHLIPAANTGESKVFYYKMKGDYHRYLAEFATGNDRKEAAENSLVAYKAASDIAMTELPPTHPIRLGLALNFSVFYYEILNSPDRACRLAKAAFDDAIAELDTLSEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDMQGDGEEQNKEALQDVEDENQヒト1433イータMGDREQLLQRARLAEQAERYDDMASAMKAVTELNEPLSNEDRNLLSVAYKNVVGARRSSWRVISSIEQKTMADGNEKKLEKVKAYREKIEKELETVCNDVLSLLDKFLIKNCNDFQYESKVFYLKMKGDYYRYLAEVASGEKKNSVVEASEAAYKEAFEISKEQMQPTHPIRLGLALNFSVFYYEIQNAPEQACLLAKQAFDDAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDQQDEEAGEGNマウス1433イータMGDREQLLQRARLAEQAERYDDMASAMKAVTELNEPLSNEDRNLLSVAYKNVVGARRSSWRVISSIEQKTMADGNEKKLEKVKAYREKIEKELETVCNDVLALLDKFLIKNCNDFQYESKVFYLKMKGDYYRYLAEVASGEKKNSVVEASEAAYKEAFEISKEHMQPTHPIRLGLALNFSVFYYEIQNAPEQACLLAKQAFDDAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDQQDEEAGEGNヒト1433ガンマMVDREQLVQKARLAEQAERYDDMAAAMKNVTELNEPLSNEERNLLSVAYKNVVGARRSSWRVISSIEQKTSADGNEKKIEMVRAYREKIEKELEAVCQDVLSLLDNYLIKNCSETQYESKVFYLKMKGDYYRYLAEVATGEKRATVVESSEKAYSEAHEISKEHMQPTHPIRLGLALNYSVFYYEIQNAPEQACHLAKTAFDDAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDQQDDDGGEGNNマウス1433ガンマMVDREQLVQKARLAEQAERYDDMAAAMKNVTELNEPLSNEERNLLSVAYKNVVGARRSSWRVISSIEQKTSADGNEKKIEMVRAYREKIEKELEAVCQDVLSLLDNYLIKNCSETQYESKVFYLKMKGDYYRYLAEVATGEKRATVVESSEKAYSEAHEISKEHMQPTHPIRLGLALNYSVFYYEIQNAPEQACHLAKTAFDDAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDQQDDDGGEGNNヒト1433シータMEKTELIQKAKLAEQAERYDDMATCMKAVTEQGAELSNEERNLLSVAYKNVVGGRRSAWRVISSIEQKTDTSDKKLQLIKDYREKVESELRSICTTVLELLDKYLIANATNPESKVFYLKMKGDYFRYLAEVACGDDRKQTIDNSQGAYQEAFDISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFYYEILNNPELACTLAKTAFDEAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDSAGEECDAAEGAENマウス1433シータMEKTELIQKAKLAEQAERYDDMATCMKAVTEQGAELSNEERNLLSVAYKNVVGGRRSAWRVISSIEQKTDTSDKKLQLIKDYREKVESELRSICTTVLELLDKYLIANATNPESKVFYLKMKGDYFRYLAEVACGDDRKQTIENSQGAYQEAFDISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFYYEILNNPELACTLAKTAFDEAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDSAGEECDAAEGAENヒト1433ゼータMDKNELVQKAKLAEQAERYDDMAACMKSVTEQGAELSNEERNLLSVAYKNVVGARRSSWRVVSSIEQKTEGAEKKQQMAREYREKIETELRDICNDVLSLLEKFLIPNASQAESKVFYLKMKGDYYRYLAEVAAGDDKKGIVDQSQQAYQEAFEISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFYYEILNSPEKACSLAKTAFDEAIAELDTLSEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDTQGDEAEAGEGGENマウス1433ゼータMDKNELVQKAKLAEQAERYDDMAACMKSVTEQGAELSNEERNLLSVAYKNVVGARRSSWRVVSSIEQKTEGAEKKQQMAREYREKIETELRDICNDVLSLLEKFLIPNASQPESKVFYLKMKGDYYRYLAEVAAGDDKKGIVDQSQQAYQEAFEISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFYYEILNSPEKACSLAKTAFDEAIAELDTLSEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDTQGDEAEAGEGGENヒト1433シグマMERASLIQKAKLAEQAERYEDMAAFMKGAVEKGEELSCEERNLLSVAYKNVVGGQRAAWRVLSSIEQKSNEEGSEEKGPEVREYREKVETELQGVCDTVLGLLDSHLIKEAGDAESRVFYLKMKGDYYRYLAEVATGDDKKRIIDSARSAYQEAMDISKKEMPPTNPIRLGLALNFSVFHYEIANSPEEAISLAKTTFDEAMADLHTLSEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTADNAGEEGGEAPQEPQSマウス1433シグマMERASLIQKAKLAEQAERYEDMAAFMKSAVEKGEELSCEERNLLSVAYKNVVGGQRAAWRVLSSIEQKSNEEGSEEKGPEVKEYREKVETELRGVCDTVLGLLDSHLIKGAGDAESRVFYLKMKGDYYRYLAEVATGDDKKRIIDSARSAYQEAMDISKKEMPPTNPIRLGLALNFSVFHYEIANSPEEAISLAKTTFDEAMADLHTLSEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTADSAGEEGGEAPEEPQS14-3-3ポリペプチドは、当業者には広く知られているであろうように、タグ配列を含むことができる。例えば、FRETシステムにおいて有用であるタグを使用することができる。例えば、蛍光タンパク質タグ例えば、Cherryタグを使用することができる。14-3-3ポリペプチドは、14-3-3ポリペプチドがリン酸化ポリペプチドに結合する場合には一般に当てはまると考えられるように、LRRK2ポリペプチドに結合するとき、ダイマー典型的にはホモダイマーの形態であってもよいと考えられる。典型的には、14-3-3ポリペプチドは全長型14-3-3ポリペプチドである。組換えLRRK2は、例えば、実施例に記載されるように、例えば、蛍光ポリペプチド成分例えば、GST成分または緑色蛍光タンパク質GFP成分またはFLAG成分によりタグ標識されるLRRK2である場合がある。LRRK2ポリペプチドは野生型LRRK2である場合があり、または、LRRK2変異体、例えば、LRRK2[G2019S]である場合がある。典型的には、LRRK2は薬物抵抗性のA2016T変異を有しない。典型的には、LRRK2はキナーゼ不活性変異体ではない。典型的には、LRRK2はセリン残基を910位および935位これは全長の野生型LRRK2の番号表記であるに有する。典型的には、これらのセリン残基の周りの配列もまた、野生型LRRK2から変化していない。具体的には、図3Gにおいて特定される残基が典型的には保持されているすなわち、-3位および-4位における塩基性残基、-2位におけるSer残基、-1位におけるAsn、ならびに、1位における大きい疎水性残基。典型的には、LRRK2は全長型LRRK2である。LRRK2が薬物抵抗性のA2016T変異を有するコントロール細胞が有用である場合がある。LRRK2が変異例えば、アラニンへの変異を910位および935位これは全長の野生型LRRK2の番号表記であるの一方または両方に有するコントロール細胞が有用である場合がある。LRRK2がキナーゼ不活性変異体であるコントロール細胞もまた有用である場合がある。FLAGまたはGSTによりタグ標識されたLRRK2を安定的に発現する細胞株が特に有用である場合がある。FRETを行うために適合性のある蛍光性タグによりタグ標識されるLRRK2および14-3-3ポリペプチドを発現する細胞株が有用である場合がある。FRETのドナー-アクセプター対の例が当業者には広く知られているであろうし、また、いくつかの実例が上記で示される。例えば、LRRK2をGFP成分によりタグ標識することができ、一方、14-3-3ポリペプチドをCherry成分によりタグ標識することができる。ニューロン細胞株または血液細胞株もまた特に有用である場合がある。LRRK2を内因的に発現するどのような細胞株もまた有用である場合がある。LRRK2は典型的にはヒトLRRK2であり、しかし、代替では、別の哺乳動物LRRK2である場合がある例えば、実験室動物のLRRK2、あるいは、LRRK2の潜在的阻害剤を評価することにおいて有用であると考えられる組織アッセイシステムまたは器官アッセイシステムのLRRK2。したがって、LRRK2は実験室用齧歯類のLRRK2例えば、マウス、ウサギまたはラットである場合があり、または、実験室用霊長類のLRRK2例えば、サルLRRK2である場合がある。本発明のアッセイは、例えば、実験室動物例えば、マウスまたはサルの脳組織におけるLRRK2に対する試験化合物の影響を評価することにおいて有用であるかもしれない。LRRK2ポリペプチドは、野生型ヒトLRRK2の天然に存在する変異を有するヒトLRRK2、または、その融合体が可能である。ヒトLRRK2の天然に存在する変異は、パーキンソン病PDに関連する変異であり得る。上記で記されるように、この変異は、野生型ヒトLRRK2の番号表記を使用する場合、G2019Sであり得る。この変異は、Jaleeletal2007supraorinPCT/GB2008/001211,supraにおいてさらに議論されるように、LRRK2のプロテインキナーゼ活性を高めると考えられる。変異は、野生型ヒトLRRK2の番号表記を使用する場合、代替では、R1441C、R1441G、Y1699C、R1914H、I2012T、I2020TまたはG2385Rであり得る。R1441C、R1441G、Y1699CまたはT2361Iの変異を有するLRRK2は、野生型LRRK2と類似するプロテインキナーゼ活性を有すると考えられる。R1914HまたはI2012Tの変異を有するLRRK2は、ほぼ不活性であると考えられる。R1441CまたはY1699Cの変異を有するLRRK2は、野生型LRRK2よりも大きい程度に、細胞質全体に拡散的に存在するよりはむしろ細胞質プールに蓄積すると考えられる。I2012Tの変異を有するLRRK2は、野生型LRRK2と、R1914HまたはI2012Tの変異を有するLRRK2との中間的な活性を有すると考えられる。G2385Rの変異を有するLRRK2もまた、ほぼ不活性であると考えられる。さらなる変異体の活性が国際特許出願PCT/GB2008/001211上掲の図17に示される。化合物を、2つ以上のLRRK2ポリペプチドに対して、例えば、2つ以上の変異体LRRK2ポリペプチドに対して試験することが有用である場合がある。これは、設計および試験するためのさらなる化合物について決定することを助けるかもしれない。本質的ではないが、LRRK2ポリペプチドが、Thr558またはThr526の残基に対する全長型ヒトモエシンのリン酸化に関して、あるいは、そのような残基を含むペプチド基質例えば、RLGRDKYKTLRQIRQまたはRLGRDKYKTLRQIRQGNTKQRまたはRLGWWRFYTLRRARQGNTKQRのリン酸化に関して、全長型ヒトLRRK2の酵素活性の少なくとも30を有することが特に好ましい。LRRK2ポリペプチドが、Thr558またはThr526の残基に対する全長型ヒトモエシンのリン酸化に関して、あるいは、上記で議論されるような、そのような残基を含むペプチド基質のリン酸化、または、RLGWWRFYTLRRARQGNTKQRのリン酸化に関して、全長型ヒトLRRK2の酵素活性の少なくとも50を有するならば、好ましくは少なくとも70を有するならば、より好ましくは少なくとも90を有するならば、より好ましい。NCBIデータベースにおける哺乳動物LRRK2配列についてのアクセション番号には、下記が含まれる:AAV639751humanXP0011684941PantroglodytesXP6157603BosTaurusXP5437342CanisfamiliarisNP0800062MusmusculusXP2355814Rattusnorvegicus哺乳動物LRRK2ポリペプチド配列および非哺乳動物LRRK2ポリペプチド配列の数多くのさらなる例が、当業者には広く知られているであろうように、NCBIMedline商標サービスからアクセス可能な配列データベースにおいてアクセスすることができる。ポリペプチドの変化体によって、本発明者らは、挿入、欠失および置換保存的または非保存的のどちらであろうともを包含する。具体的には、本発明者らは、そのような変化が、適する場合には、プロテインキナーゼ活性、または、リン酸化され得ること、または、LRRK2と、14-3-3ポリペプチドとの間での相互作用を実質的に変化させない、当該ポリペプチドの変化体を包含する。当業者は、例えば、各ポリペプチドの様々な例の配列例えば、異なる種に由来する配列を比較することに基づいて、適切な変化体を容易に設計し、試験することができるであろう。当業者は、挿入または欠失がどこにおいて行われ得るか、あるいは、どの残基が、適する場合には変化されないままであり得るか、または、保存的置換によって置換され得るか、または、非保存的置換によって置換され得るかを容易に決定することができるであろう。変化体ポリペプチドは、例えば、実施例に記載されるように、容易に試験することができる。保存的置換によって、Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;および、Phe、Tyrなどの組合せが意図される。IUPAC-IUB生化学命名法委員会の三文字または一文字のアミノ酸コードが、上記で定義される記号Zaaを除いて、本明細書中では使用される。具体的には、Xaaは任意のアミノ酸を表す。少なくとも、本明細書中で定義されるコンセンサス配列に対応するアミノ酸はL-アミノ酸であることが好ましい。ポリペプチド変化体が、少なくとも65の同一性を関連性があるヒトポリペプチドのアミノ酸配列に関して有するアミノ酸配列より好ましくは少なくとも70、71、72、73または74の同一性、一層より好ましくは少なくとも75の同一性、さらに一層より好ましくは少なくとも80の同一性、さらに好ましくは少なくとも85の同一性、一層さらに好ましくは少なくとも90の同一性、最も好ましくは少なくとも95または97の同一性を関連性があるヒトポリペプチドのアミノ酸配列に関して有するアミノ酸配列を有するならば、特に好ましい。プロテインキナーゼ変化体が、少なくとも65の同一性をヒトポリペプチドの触媒作用ドメインのアミノ酸配列に関して有するアミノ酸配列より好ましくは少なくとも70、71、72、73または74の同一性、一層より好ましくは少なくとも75の同一性、さらに一層より好ましくは少なくとも80の同一性、さらに好ましくは少なくとも83または85の同一性、一層さらに好ましくは少なくとも90の同一性、最も好ましくは少なくとも95または97の同一性を関連性があるヒトアミノ酸配列に関して有するアミノ酸配列を有するならば、一層さらに好ましい。プロテインキナーゼ関連ポリペプチドの触媒作用ドメインが、例えば、下記で記載されるような配列比較を使用して、当業者によって容易に特定され得ることが理解されるであろう。プロテインキナーゼは、Johnsonetal1996Cell,85,149-158andTaylorRadzio-Andzelm1994Structure2,345-355において総説されるように、保存された触媒作用コアを示す。このコアは、逆平行β-シートを主として含む小さいN端側突出部と、ほとんどがα-らせんである大きいC端側突出部とに折り重なる。2つのポリペプチドの間におけるパーセント配列同一性を、好適なコンピュータープログラム例えば、Wisconsin大学GeneticComputingGroupのGAPプログラムを使用して求めることができ、パーセント同一性は、配列が最適にアラインメントされているポリペプチドに関して計算されることが理解されるであろう。アラインメントは代替では、ClustalWプログラムThompsonetal.,1994を使用して行うことができる。使用されるパラメーターは下記の通りであり得る:高速ペアワイズアライメントパラメーター:Kチュープルワードサイズ;1、ウインドウサイズ;5、ギャップペナルティー;3、トップダイアゴナルの数;5、スコア化方法:xパーセント。多重アラインメントパラメーター:ギャップオープンペナルティー;10、ギャップエクステンションペナルティー;0.05。スコア化行列:BLOSUM。アラインメントは代替では、プログラムT-CoffeeまたはプログラムEMBOSSを使用して行うことができる。例えば、全長型ヒトLRRK2のSer910に対応する等価である残基を、ポリペプチドの配列を、配列間の一致を最大とするような方法で全長型ヒトLRRK2の配列に関してアラインメントすることによって特定することができる。アライメントは、目視検査によって、および/または、ポリペプチドのパーセント同一性が計算されることを同様にまた可能にするであろう好適なコンピュータープログラム例えば、Wisconsin大学GeneticComputingGroupのGAPプログラムの使用によって行うことができる。AlignプログラムPearson1994in:MethodsinMolecularBiology,ComputerAnalysisofSequenceData,PartIIGriffin,AMandGriffin,HGedspp365-389,HumanaPress,Clifton。したがって、この様式で特定される残基もまた、対応する残基である。例えばLRRK2の短縮型形態の場合、または、アミノ酸の単純な置換が生じている形態では、対応する残基を特定することは容易であることが理解されるであろう。スクリーニングにおいて使用されるポリペプチドは、天然に存在する対立遺伝子変化体スプライス変化体を含むを含めて、哺乳動物好ましくはヒト由来であるあるいは、農業において有用な種、または、飼育動物もしくは伴侶動物として有用な種、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシであることが好ましい。スクリーニングにおいて使用されるポリペプチドは、当業者には知られているように、あるいは、上記で述べられるように、または、実施例に記載されるように、GST部分を含むことができ、あるいは、ビオチン化することができ、または、他の場合には、例えば、6His、HA、mycもしくは他のエピトープタグによりタグ標識することができる。これは、ポリペプチドの精製および/または検出において有用である場合がある。化合物の影響を、残基Ser910または残基Ser935のリン酸化、あるいは、14-3-3ポリペプチドの結合、あるいは、LRRK2の細胞内局在化を当該化合物の種々の濃度の存在下で、例えば、当該化合物の非存在下および存在下で、例えば、約100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.1μM、0.01μMおよび/または0.001μMの濃度で比較することによって求めることができる。試験化合物の影響を、LRRK2の阻害剤であると考えられる化合物例えば、H-1152および/またはスニチニブの影響と比較することが有用である場合がある。細胞系システムはエクスビボ細胞システムである場合がある。細胞は組織または器官のサンプルの形態である場合がある。サンプルは、血液、腎臓、脳または脾臓あるいは、LRRK2が非常に発現する他の組織のサンプルである場合がある。細胞系システムはインビボシステムである場合がある。例えば、LRRK2を含む細胞系システムは試験動物において試験化合物に暴露されているかもしれない。試験動物を試験化合物に暴露する好適な方法は当業者には広く知られているであろう。典型的には、化合物は、注射による投与のために、または、経口投与のために配合することができ、しかし、当業者には明らかであるであろうように、他の投与経路を使用することができる。分析のためのサンプルを、侵襲的な技術、最小限に侵襲的な技術または非侵襲的な技術によって試験動物から得ることができる。例えば、血液サンプルこれは最小限に侵襲的であるを分析することができる;または、脳組織のサンプルこれは侵襲的である、これは動物の屠殺を必要とする場合がある。LRRK2のSer910および/またはSer935のリン酸化状態を評価すること、ならびに/あるいは、LRRK2の14-3-3ポリペプチドへの結合を評価すること、ならびに/あるいは、LRRK2の細胞内位置を評価することを、試験動物から得られる細胞に対して行うことができる。例えば、試験動物から得られる細胞は、試験動物から血液において得られる細胞である場合がある。細胞系システムはリンパ芽球様細胞系システムである場合がある。リンパ芽球様細胞は試験動物からの血液サンプルに存在し得る。マクロファージ細胞株例えば、RAW細胞株システムが有用であるかもしれない。ヒト志願者からの血液から得られるマクロファージを使用するシステムもまた有用であるかもしれない。本方法は、LRRK2のプロテインキナーゼ活性あるいは、Ser910および/またはSer935のリン酸化、あるいは、LRRK2と、14-3-3ポリペプチドとの間での相互作用、あるいは、細胞質プールにおけるLRRK2の蓄積を細胞系システムにおいて調節する化合物、例えば、阻害する化合物を特定することにおいて有用であると考えられる。LRRK2のプロテインキナーゼ活性あるいは、Ser910および/またはSer935のリン酸化、あるいは、LRRK2と、14-3-3ポリペプチドとの間での相互作用、あるいは、細胞質プールにおけるLRRK2の蓄積を細胞系システムにおいて調節する化合物、例えば、阻害する化合物は、パーキンソン病例えば、特発性パーキンソン病または遅発型パーキンソン病またはパーキンソン症候群の処置において有用であるかもしれない。LRRK2のプロテインキナーゼ活性あるいは、Ser910および/またはSer935のリン酸化、あるいは、LRRK2と、14-3-3ポリペプチドとの間での相互作用、あるいは、細胞質プールにおけるLRRK2の蓄積を細胞系システムにおいて調節する化合物、例えば、阻害する化合物はまた、他の神経変性状態において有用であるかもしれない。上記化合物は、LRRK2ポリペプチドと、基質ポリペプチドとの間での接触領域またはその近くに結合する化合物であり得るか、あるいは、別の領域に結合し、かつ、例えば、複合体の安定化または不安定化を生じさせる立体配座変化もしくはアロステリック変化を誘導する化合物、または、その形成の促進または阻害を生じさせる化合物であり得る。上記化合物は、LRRK2ポリペプチドのプロテインキナーゼ活性をアロステリック効果によって増大させるようにLRRK2ポリペプチドまたは基質ポリペプチドに結合することができる。このアロステリック効果は、LRRK2ポリペプチドの活性の自然界での調節に関与するアロステリック効果であるかもしれない。本方法において特定される化合物はそれ自体が薬物として有用であるかもしれないか、または、本方法において特定される化合物は、より効力のある化合物を設計および合成するためのリード化合物を表すかもしれない。上記化合物は、化合物を特定する上記方法のそれぞれについて、薬物様化合物、または、薬物様化合物を開発するためのリード化合物であるかもしれない。前記方法は、当業者には広く知られているように、医薬用化合物または薬物の開発におけるスクリーニングアッセイとして有用であるかもしれないことが理解されるであろう。用語薬物様化合物は当業者には広く知られており、また、この化合物を、例えば、医薬品における有効成分として薬剤における使用のために好適にし得る特性を有する化合物の意味を包含する場合がある。したがって、例えば、薬物様化合物は、有機化学の技術によって合成され得る分子、それほど好ましくはないが、分子生物学または生化学の技術によって合成され得る分子である場合があり、好ましくは、小分子これは5000ダルトン未満であり得るである。薬物様化合物はさらに、特定のタンパク質1つまたは複数との選択的相互作用の特徴を示してもよく、また、生物学的利用能および/または細胞膜浸透能を有してもよく、しかし、これらの特徴は必須でないことが理解されるであろう。用語リード化合物は同様に当業者には広く知られており、また、この化合物は、自身は例えば、その意図された標的に対する効力が弱いだけであるために、または、その作用において選択性がないために、または、不安定であるために、または、合成が困難であるために、または、生物学的利用能が不良であるために薬物としての使用について好適ではないが、より望ましい特性を有し得る他の化合物を設計するための出発点を提供し得るという意味を包含する場合がある。プロテインキナーゼの活性をインビボにおいて調節し得る化合物を特定することが望ましいであろうことが理解されるであろう。したがって、本方法において使用される試薬および条件は、例えば、LRRK2ポリペプチドと、基質ポリペプチドとの間における相互作用が、ヒトLRRK2と、内因性のヒト基質ポリペプチドとの間における場合と実質的に同じであるように選ばれ得ることが理解されるであろう。典型的には、本発明の方法は、ヒト組換えポリペプチドを場合により発現するヒト細胞系システムにおいて行うことができる。上記化合物はLRRK2ポリペプチドに結合してもよい、または、基質ポリペプチドに結合してもよいことが理解されるであろう。本発明のスクリーニング方法、または、LRRK2ポリペプチドのプロテインキナーゼ活性を調節する化合物の能力が測定され得る他のアッセイにおいて試験される化合物は、分子モデリング技術を使用して、例えば、コンピューター技術を使用して、選択および/または設計改変を含むが行われている化合物である場合があるしかし、そのような化合物である必要はない。選択または設計された化合物は、既に合成されていないならば合成し、そして、LRRK2ポリペプチドに対するその影響について、例えば、プロテインキナーゼ活性に対するその影響について試験することができる。化合物は本発明のスクリーニング方法で試験することができる。試験される化合物は、プロテインキナーゼの活性を調節することができる可能性があると既に考えられる化合物である場合があり、または、プロテインキナーゼの活性を調節する可能性が高いことに基づいて選択されていない化合物である場合がある。したがって、試験される化合物は、一般的な、選択されていない化合物バンクの少なくとも一部を形成する化合物である場合があり、または、代替では、事前に選択された化合物バンクの少なくとも一部を形成する化合物、例えば、プロテインキナーゼの活性を調節する可能性が高いと考えられることに基づいて事前に選択される化合物のバンクを形成する化合物である場合がある。ハイスループット操作が可能であるスクリーニングアッセイが特に好ましいであろうことが理解されるであろう。当業者には明らかであるであろうように、上記化合物が他のプロテインキナーゼに対してどのような影響を有するかを評価することが望ましい場合がある。例えば、他のプロテインキナーゼの基質、例えば、RockIIの基質のリン酸化に対する化合物の影響を、LRRK2阻害剤と、ROCK阻害剤とを区別するために評価することが望ましい場合がある。例えば、例えば、国際特許出願PCT/GB2008/001211上掲の図20および図22に示されるように、または、それらの説明文において議論されるように、LRRK2およびRock-IIの基質選択性が異なる。一例として、LRRK2はMYPTをリン酸化せず、一方、RockIIはMYPTをリン酸化する。本明細書中に記載されるスクリーニング方法を使用して特定される化合物をさらに試験することが適切であるかもしれないPDモデル、バイオマーカーおよび評価技術に関する情報が、例えば、下記のリンクこれらは当業者に入手可能な情報を表しているにおいて見出され得る。httpwwwnindsnihgovaboutnindsplansnihparkinsonsagendahtmModelshttpwwwsciencedailycomreleases200607060729134653htmhttpwwwsciencedailycomreleases200410041005074846htmhttpenwikipediaorgwikiParkinsonsdiseasePD動物モデルには、6-ヒドロキシドーパミン処理の齧歯類およびMPTP処理の霊長類が含まれる。両者は、ドーパミン作動性脳細胞およびいくつかの他のタイプの毒性破壊に基づいており、これらには通常、若い、他の場合には健康な動物が用いられる。これらのモデルはパーキンソン病のいくつかの重要な特徴を再現するので、それらは、出現した新しい治療法を試験するために有用であると考えられる。化合物はまた、当業者には広く知られているように、他の試験例えば、毒性学試験または代謝試験に供される場合がある。本発明のスクリーニング方法は、選択された化合物の合成、精製および/または配合を行う工程を含むことができる。化合物は、医薬使用のために、例えば、動物またはヒトでのインビボ試験における使用のために配合される場合がある。本発明のさらなる態様は、Ser910がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser935がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser910がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser935がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体を提供することである。本発明のさらなる態様は、1Ser910がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser910がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体;2Ser935がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体、または、Ser935がリン酸化されないLRRK2に対して特異的に結合する抗体;3例えばジゴキシゲニンで、例えば標識された14-3-3ポリペプチド、または、14-3-3ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体;および4蛍光標識されたLRRK2ポリペプチド、または、蛍光標識されたLRRK2をコードするポリヌクレオチドのうちの2つ以上を含む部分品のキットを提供する。本発明のさらなる態様は、1Ser910がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体;2Ser935がリン酸化されるLRRK2に対して特異的に結合する抗体;314-3-3ポリペプチド、または、14-3-3ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体;および/あるいは4蛍光標識されたLRRK2ポリペプチド、または、蛍光標識されたLRRK2をコードするポリヌクレオチドの使用であって、LRRK2に対する試験化合物の影響を細胞系システムにおいて評価するための方法における使用を提供する。本発明のさらなる態様は、LRRK2ポリペプチドまたはLRRK2ポリヌクレオチドすなわち、LRRK2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは、LRRK2に対して特異的に結合する抗体と、14-3-3ポリペプチドまたは14-3-3ポリヌクレオチドすなわち、14-3-3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは、14-3-3ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体とを含む精製された調製物または部分品のキットを提供する。調製物またはキットは、例えば、組換えによるLRRK2ポリヌクレオチドまたはLRRK2ポリペプチドと、組換えによる14-3-3ポリペプチドまたは14-3-3ポリヌクレオチドとを含むことができる。LRRK2および14-3-3は、上記で議論されるように、FRETシステムにおける使用に好適である蛍光性タグを含むことができる。調製物またはキットは、免疫沈殿されたLRRK2ポリペプチドおよび14-3-3ポリペプチドを含むことができる。調製物またはキットは、LRRK2に対して特異的に結合する抗体と、14-3-3ポリペプチドこれは、例えば、標識することができ、例えば、ジゴキシゲニンにより標識することができる、または、14-3-3ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体とを含むことができる。調製物またはキットは本発明のアッセイにおいて有用であり得る。用語抗体によって、合成抗体、ならびに、抗原結合部位を保持する、完全な抗体のフラグメントおよび変化体例えば、上記で議論されるようなものが含まれる。抗体はモノクローナル抗体であってもよく、しかし、同様に、ポリクローナル抗体調製物、その一部1つまたは複数例えば、FabフラグメントまたはFab’2フラグメント、あるいは、合成抗体またはその一部であってもよい。Fab、Fv、ScFvおよびdAbの抗体フラグメントはすべて、大腸菌において発現させ、大腸菌から分泌させることができ、したがって、このことは多量の前記フラグメントの容易な製造を可能にする。ScFv分子によって、VHおよびVLのパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して連結される分子が意味される。IgGクラスの抗体が好ましい。選択された抗原に対する好適なモノクローナル抗体を、上記で示されるように改変される公知技術によって、例えば、MonoclonalAntibodies:AmanualoftechniquesH.ZolaCRCPress,1988およびMonoclonalHybridomaAntibodies:techniquesandApplicationsJGRHurrellCRCPress,1982に開示される技術によって調製することができる。二重特異性抗体を、細胞融合によって、一価フラグメントの再結合によって、または、完全な抗体の化学的な架橋によって調製することができる。二重特異性抗体を調製するための方法が、Corvalenetal,1987CancerImmunol.Immunother.24,127-132and133-137and138-143に開示される。それらの特異的な結合部位を保持する様々な抗体フラグメントの合成に関わる技術の一般的な総説が、WinterMilstein1991Nature349,293-299に見出されるはずである。精製されたされるによって、調製物が、調製物が他の成分の存在下で形成されている場合、他の成分例えば、組換え細胞の他の成分から少なくとも部分的に分離されていることが意味される。使用され得る精製方法の実例が実施例に記載される。調製物は実質的に純粋である場合がある。実質的に純粋によって、本発明者らは、前記ポリペプチドが他のタンパク質を実質的に有しないことを意味する。したがって、本発明者らは、重量比でタンパク質含有量の少なくとも2、3、4、5、10、15、20または30を前記ポリペプチドとして含むどのような組成物をも包含する。タンパク質含有量の好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも70、さらにより好ましくは少なくとも90、最も好ましくは少なくとも95が前記ポリペプチドである。したがって、本発明はまた、前記ポリペプチドと、混入物とを含む組成物であって、混入物が、重量比で組成物の96未満、95未満、94未満、90未満、85未満、80未満または70未満、好ましくは組成物の50未満、より好ましくは組成物の30未満、さらにより好ましくは組成物の10未満、最も好ましくは重量比で組成物の5未満を含む組成物を包含する。本発明はまた、エクスビボにおいて他の成分と組み合わされるとき、実質的に純粋な前記ポリペプチドを包含し、ただし、この場合、前記他の成分は、前記ポリペプチドが見出される細胞に見出される成分のすべてではない。本発明のさらなる態様は、LRRK2変異体例えば、パーキンソン病の患者において見出されるLRRK2変異体を特徴づける方法であって、下記の工程:a前記LRRK2変異体のSer910および/またはSer935のリン酸化状態を評価する工程;ならびに/あるいはb前記LRRK2変異体の14-3-3ポリペプチドへの結合能を評価する工程を含む方法を含む。本発明はさらに、細胞系システムにおいて発現されるとき、前記LRRK2変異体の細胞内位置を評価する工程を含むか、または、当該工程をさらに含むことができる。評価工程は、上記で記載される抗体、試薬および細胞系システムを使用して行うことができる。本明細書中で参照されるすべての文書が本明細書により参照によって組み込まれる。疑念を回避するために、Jaleeletal2007BiochemJ4052,307-317,PCT/GB2008/001211andPCT/GB2009/002047が参照により組み込まれる。本明細書における明らかに以前に刊行された文書の列挙または議論は、当該文書が最新技術の一部であること、または、共通する一般的な知識であることを認めるものとして必ずしも解釈されるべきではない。次に、本発明が、下記の限定されない図および実施例を参照することによってより詳しく説明される。キナーゼ活性の阻害はSer910/Ser935におけるLRRK2の脱リン酸化および14-3-3結合の破壊を引き起こす。LRRK2阻害剤を評価するための細胞系アッセイの開発。ロイシンリッチリピートプロテインキナーゼ-2LRRK2は著しい数のパーキンソン病患者において変異している。Gly2019をSerに変化させるありふれた変異はキナーゼ触媒活性を高めるので、小分子のLRRK2阻害剤は、パーキンソン病を処置することにおいて有用であるかもしれない。しかしながら、ロバストな細胞系アッセイを開発するために利用され得るであろうLRRK2の生理学的基質または下流エフェクターが何ら特定されていないので、阻害剤の有効性は評価が困難である。今回、本発明者らは、内因性LRRK2が内因性14-3-3イソ型と相互作用することを明らかにする。この相互作用が、ロイシンリッチリピートドメインの前方に位置する保存されたSer910残基およびSer935残基のリン酸化によって媒介される。驚くべきことに、LRRK2の2つの構造的に無関係な阻害剤H-1152またはスニチニブによるSwiss3T3細胞の処理は、Ser910およびSer935における内因性LRRK2の脱リン酸を誘導し、それにより、14-3-3との相互作用を破壊した。本発明者らは、H-1152およびスニチニブが、LRRK2キナーゼ活性を阻害することによってSer910およびSer935の脱リン酸化を誘導することを示唆する;これらの化合物は、薬物抵抗性LRRK2[A2016T]変異体の有意な脱リン酸化を誘導することができなかった。そのうえ、LRRK2の14-3-3非結合性変異体が、細胞質全体に拡散的に局在化するよりはむしろ、離散的な細胞質プールの中に蓄積するという知見と一致して、H-1152は、LRRK2が細胞質プール内に蓄積することを生じさせる。これらのデータは、Ser910、Ser935の脱リン酸化、または、14-3-3結合の破壊、および/あるいは、LRRK2の細胞質局在化をモニターすることが、LRRK2キナーゼ阻害剤の相対的効力をインビボで評価するためのマーカーとして使用され得ることを示している。これらの知見はLRRK2キナーゼ阻害剤の開発を助けるであろう。これらの知見はまた、Ser910およびSer935のリン酸化がどのようにLRRK2によって制御されるかを理解し、かつ、パーキンソン病の発症に対する何らかの関係を確立するためのさらなる研究を刺激するであろう。材料および方法試薬および一般的方法。組織培養試薬をLifeTechnologiesから得た。グルタチオンSepharose4BをAmershamBiosciencesから得た。[γ-32P]-ATPをPerkinElmerから得た。P81ホスホセルロース紙をWhatmanから得た。Pepceuticalsにより、Nictideが合成された。Flp-inT-RExシステムをInvitrogenから得た。安定な細胞株は、ヒグロマイシンによる選抜によって製造者の説明書に従って作製されたものであり、以前に記載されている[非特許文献8]。制限酵素消化、DNA連結および他の組換えDNA手順を、標準的プロトコルを使用して行った。すべての変異誘発を、Quick-Change部位特異的変異誘発キットStratageneを使用して行った。トランスフェクションのために使用されるDNA構築物を、QiagenまたはInvitrogenのプラスミドMaxiキットを製造者のプロトコルに従って使用して大腸菌DH5αから精製した。すべてのDNA構築物がDNA配列決定によって確認されたDNA配列決定が、DYEnamicETターミネーター化学AmershamBiosciencesをAppliedBiosystems自動DNAシーケンサーで使用して、TheSequencingService、SchoolofLifeSciences、UniversityofDundeeスコットランド、英国によって行われた。H1152をCalbiochemから購入し、スニチニブをLCLaboratoriesから購入した。緩衝液。溶解緩衝液は、50mMTris/HClpH7.5、1mMEGTA、1mMEDTA、1w/v1mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mMβ-グリセロリン酸ナトリウム、50mMNaF、5mMピロリン酸ナトリウム、0.27Mスクロース、1mMベンズアミジンおよび2mMフェニルメタンスルホニルフルオリドPMSFを含有し、かつ、示されるように150mMのNaClとともに、1v/vのTritonX-100または0.5v/vのNP-40のどちらかが補充された。緩衝液Aは、50mMTris/HClpH7.5、50mMNaCl、0.1mMEGTAおよび0.1v/v2-メルカプトエタノール、ならびに、0.27Mスクロースを含有した。λホスファターゼ反応を、1mMMNCl2および2mMDTTが補充される緩衝液Aにおいて行った。細胞培養、処理および細胞溶解。HEK-293細胞およびSwiss3T3細胞を、10FBS、2mMグルタミンおよび1×抗真菌剤/抗生物質溶液が補充されるダルベッコ改変イーグル培地DMEMで培養した。T-REx細胞株を、10FBSおよび2mMグルタミン、1×抗真菌剤/抗生物質[pen/strep]、ならびに、15μg/mlのブラストシジンおよび100μg/mlのヒグロマイシンが補充されるDMEMで培養した。培養物を、1μg/mlのドキシサイクリンを示された時間または24時間培養培地に含むことによって、示されたタンパク質を発現させるために誘導した。細胞トランスフェクションをポリエチレンイミン法[非特許文献12]によって行った。阻害剤が利用される場合、阻害剤をDMSOに溶解し、コントロールとして使用されるDMSOの同等体積とともに、示された濃度で使用した。培養培地におけるDMSOの最終濃度は0.1v/vを決して超えなかった。阻害剤を、溶解前に、示された時間にわたって培養培地に加えた。15cmディッシュあたり、HEK293細胞は、示された界面活性剤が補充される溶解緩衝液の1.0mlにより溶解され、3T3細胞は、示された界面活性剤が補充される溶解緩衝液の0.6mlにより溶解され、16,000×gでの4°Cでの10分間の遠心分離によって清澄化された。誘導および阻害剤処理の後、T-REx-GFP発現細胞を、PBSによる洗浄の後、SDS溶解緩衝液により室温で溶解した。SDS溶解物を煮沸し、超音波処理して粘度を下げた。直ちに使用されないとき、すべての溶解物上清が液体窒素でスナップ凍結され、使用まで-80°Cで貯蔵された。タンパク質濃度を、BSAを標準物とするBradford法を使用して求めた。抗体。抗LRRK2100-500S348CおよびS406Cおよび抗LRRK22948-2514S374Cは、以前に記載されたものであった[非特許文献8]。LRRK2のホスホセリン910に対する抗体S357Cを、KLHコンジュゲート化ホスホペプチドVKKKSNpSISVGEFY式中、pSがホスホセリンであるをヒツジに注射することによって作製し、ホスホペプチドおよびデホスホペプチドに対する正の選抜および負の選抜によってそれぞれアフィニティー精製した。LRRK2のホスホセリン935に対する抗体S814Cを、KLHコンジュゲート化ホスホペプチドNLQRHSNpSLGPIFDH式中、pSがホスホセリンであるをヒツジに注射することによって作製し、ホスホペプチドおよびデホスホペプチドに対する正の選抜および負の選抜によってそれぞれアフィニティー精製した。ヒツジのポリクローナル抗体S662BをMBP-MYPTニワトリアミノ酸714~1004に対して惹起させた。MYPTホスホトレオニン850に対するウサギのポリクローナル抗体をUpstate36-003から得た。抗GFP抗体S268Bを組換えGFPタンパク質に対して惹起させ、抗原に対してアフィニティー精製した。抗FLAGM2抗体およびアフィニティーマトリックスをSigmaA2220から得た。NanotrapGFPバインダーアフィニティーマトリックスをChromoTekから得た。14-3-3を認識するウサギポリクローナル抗体K-19、SC-629、および、コントロールのウサギIgGSC-2027抗体をSantaCruzbiotechnologyから得た。HSP90抗体をCellsignallingtechnology4877から得た。抗MARK3をUpstate05-680から得た。免疫学的手順。細胞溶解物10μg~30μgをSDSポリアクリルアミドゲルまたはNovex4~12グラジエントゲルでの電気泳動によって分離し、ニトロセルロースメンブランに電気ブロットした。メンブランを、50mMTris/HClpH7.5、0.15MNaClおよび0.1v/vTweenTBST緩衝液における5スキムミルクw/vによりブロッキング処理した。ホスホ抗体については、一次抗体を、10μg/mlの脱リン酸化ペプチドを含むTBSTにおける5スキムミルクで希釈されて1μg/mlの濃度で使用した。すべての他の抗体は、TBSTにおける5w/vミルクにおいて1μg/mlで使用された。免疫複合体の検出を、蛍光団コンジュゲート化二次抗体MolecularProbes、その後、OdysseyLICORを使用する可視化、または、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体Pierceおよび増強ケミルミネセンス試薬による可視化のどちらかを使用して行った。免疫沈殿のために、抗体を1μg抗体/μlビーズの比率でプロテインG-Sepharoseに非共有結合によりカップリングしたか、または、抗FLAGM2アガロースを利用した。細胞溶解物をカップリング抗体と1時間インキュベーションした。免疫複合体を、0.3MのNaClが補充される溶解緩衝液により2回洗浄し、そして、緩衝液Aにより2回洗浄した。沈殿物をキナーゼの供給源として使用したか、または、免疫ブロットによって直ちに分析した。オーバーレイファーウエスタン分析で使用されるジゴキシゲニンDIG標識された14-3-3を、[非特許文献13]に記載されるように調製した。LRRK2との14-3-3相互作用を直接に評価するために、免疫沈殿物をニトロセルロースメンブランに電気ブロットし、5スキムミルクにより30分間ブロッキング処理した。TBSTによる洗浄の後、メンブランを、4°Cで一晩、TBSTにおける5BSAで1μg/mlに希釈されるDIG標識された14-3-3とインキュベーションした。DIG14-3-3を、HRP標識された抗DIGFabフラグメントRocheにより検出した。SILAC培地。SILACDMEM培地NaHCO3、L-グルタミン、アルギニン、リシンおよびメチオニンを含まない高グルコース、BioseraA0347を、10の透析FBSHycloneを用いて調製し、これに、メチオニン、グルタミン、NaHCO3、標識された、または標識されないアルギニンおよびリシンを補充した。GFPタグ標識されたタンパク質を有する細胞を、下記の同位体標識化とともに1:10の比率での3回の継代培養のために、SILACDMEMにおいて培養した。GFP対野生型LRRK2については、L-アルギニン84μg/ml;Sigma-AldrichおよびL-リシン146μg/mlリシン;Sigma-AldrichをGFPlight培地に加え、一方、L-アルギニン13CおよびL-リシン13CCambridgeIsotopeLaboratoryを同じ濃度でGFP-LRRK2野生型heavy培地に加えた。GFP対LRRK2G2019Sの実験については、L-アルギニンおよびL-リシンをGFPlight培地に加え、L-アルギニン13C/15NおよびL-リシン13C/15NCambridgeIsotopeLaboratoryをGFP-LRRK2G2019Sheavy培地に加えた。アミノ酸濃度は通常のDMEMInvitrogenのための処方に基づく。調製されると、SILAC培地をよく混合し、0.22μmのフィルターMilliporeでろ過した。代謝標識された細胞を、ドキシサイクリンを培養培地に含むことによって24時間、GFPまたはGFP-LRRK2融合タンパク質を発現させるために誘導した。SILAC質量分析。代謝標識され、かつ、GFPまたはLRRK2野生型またはG2019Sのどれかを発現させるために誘導される細胞を、10cmディッシュあたり0.5mlで、1のTritonX-100が補充される溶解緩衝液において溶解した。それぞれの条件について個々に、9mgの細胞溶解物を、4°Cで1時間、20μlのベッド体積のGFPバインダーアガロースビーズによる個々の免疫沈殿に供した。ビーズを、1のTritonX-100および300mMのNaClが補充される溶解緩衝液の5mlにより1回洗浄し、その後、この溶解緩衝液の10mlにより洗浄した。その後、ビーズを5mlの貯蔵緩衝液により1回洗浄し、その後、10mlの貯蔵緩衝液により1回洗浄した。ビーズと会合したタンパク質を、70°Cで10分間、1×LDSサンプル緩衝液により溶出し、その後、0.22μmのスピン-Xカラムに通した。コントロールGFPの溶出液を、等量での野生型LRRK2またはLRRK2G2019Sのどちらかの溶出液と一緒にし、上記のように還元し、アルキル化した。サンプルをゲルの半分のみについて12のNovexゲルで分離した。ゲルをコロイダルブルーにより一晩染色して、3時間脱染色した。レーン全体を以前の記載[非特許文献30]のように、合計で9つのバンドで切り出し、トリプシンにより消化した。ペプチドの質量分析法による分析。消化物を、溶媒A2アセトニトリル/0.1ギ酸/98水および溶媒B90アセトニトリル/10水/0.09ギ酸を用いて、ProxeonEasy-LCナノフローLCシステムProxeon、デンマークに装着されるPepMapC18ナノカラム75μm×15cm、DionexCorporationに接続されるBiosphereC18トラップカラム0.1mm内径×2mm、Nanoseparations、オランダで分離した。10μlのサンプル合計で2μgのタンパク質を溶媒Aにおいてトラップカラムに7μl/分の一定流速により負荷し、同じ流速で3分間洗浄した。トラップでの濃縮の後、ペプチドを、300nl/分の一定流速による90分間にわたる5~50の溶媒Bの直線グラジェントにより溶出した。HPLCシステムは、5cmのPicotipFS360-20-10エミッターが装着されるナノエレクトロスプレーイオン源ProxeonBiosystemsを介してリニアイオントラップ-オービトラップハイブリッド質量分析計LTQ-OrbitrapXL、ThermoFisherScientificIncに接続された。スプレー電圧が1.2kVに設定され、加熱キャピラーの温度が200°Cに設定された。プロフィルモードでのフルスキャンMSサーベイスペクトルm/z350~1800を、500,000個のイオンの蓄積の後、60,000の分解能によりOrbitrapにおいて取得した。Orbitrapにおけるプレビュースキャンからの5つ最も強いペプチドイオンを、10,000個のイオンの蓄積の後、LTQにおいて衝突誘導解離正規化衝突エネルギー、35;活性化Q、0.250;および活性化時間、30msによってフラグメント化した。最大フィリング時間がフルスキャンについては1,000msであり、MS/MSスキャンについては150msであった。前駆体イオンの電荷状態スクリーニングが可能となり、すべての帰属されない電荷状態、ならびに、一価の化学種が棄却された。ロック質量オプションが、質量の正確性を改善するためにサーベイスキャンについて可能となった。データを、Xcaliburソフトウエアを使用して取得した。質量分析法データのMaxQuant分析。それぞれの実験について得られる生の質量分析データファイルを、MaxQuantバージョン1.0.13.13http://www.maxquant.orgおよびMascot検索エンジンMatrixScience、バージョン2.2.2ソフトウエアを使用して1つの定量化されたデータセットにまとめた。酵素特異性をトリプシンの酵素特異性に設定したこれは、プロリン残基のN端側での切断、および、アスパラギン酸残基と、プロリン残基との間における切断について考慮する。ソフトウエア内で使用される他のパラメーター:変更可能な修飾-メチオニンの酸化;データベース-標的おとりのヒトMaxQuantipi.HUMAN.v3.52.decoyこれは148,380個のデータベース入力を含有する;標識-R6K4[GFP対野生型LRRK2について]またはR10K8[GFP対LRRK2G2019Sについて];MS/MS許容誤差-0.5Da;e100Daあたりの最高MS/MSピーク-5;最大見逃し切断-2;標識アミノ酸の最大値:3;誤発見率FDR:1。LRRK2免疫沈殿キナーゼアッセイ。ペプチドキナーゼアッセイを、30μMのNictideペプチド基質の存在下、50mMTrispH7.5、0.1mMEGTA、10mMMgCl2および0.1mM[γ-32P]ATP約500~1000cpm/pmolにおいて、免疫沈殿LRRK2をキナーゼの供給源として用いて50μlの総体積で組み立てた。反応を、反応混合物の30μlをP81ホスホセルロース紙に加え、50mMリン酸に浸すことによって停止させた。徹底した洗浄の後、反応生成物をチェレンコフ計数によって定量化した。残る反応液の半分を、OdysseyLICORシステムを使用する免疫ブロット分析に供した。比活性がcpm/LICORに依存しない密度値として表される。500μgのトランスフェクション細胞溶解物を、5μlのベッド体積の抗FLAGアガロースによる免疫沈殿に1時間供した。ビーズを、300mMNaClが補充される溶解緩衝液により2回、その後、緩衝液Aにより2回洗浄した。ペプチドキナーゼアッセイを、200μMの長い変化体のLRRKtideペプチド基質RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR[非特許文献9、10]またはNictideペプチド基質RLGWWRFYTLRRARQGNTKQR[非特許文献10]の存在下、50mMTrispH7.5、0.1mMEGTA、10mMMgCl2および0.1mM[λ-32P]ATP約300~500cpm/pmolにおいて、免疫沈殿LRRK2を用いて50μlの総体積で組み立てた。反応を、反応混合物の30μlをP81ホスホセルロース紙に加え、50mMリン酸に浸すことによって停止させた。徹底した洗浄の後、反応生成物をチェレンコフ計数によって定量化した。残る反応液の半分を、OdysseyLICORシステムを使用する免疫ブロット分析に供した。比活性がcpm/LICORに依存しない密度値として表される。質量分析法によるリン酸化部位の特定。内因性LRRK2および組換えLRRK2を、抗LRRK2100-500アガロースまたは抗FLAGアガロースを使用して、Swiss3T3溶解物、または、FLAG-LRRK2を発現させるために誘導されるT-Rex細胞の細胞溶解物の50mgからそれぞれ免疫沈殿させた。免疫沈殿物を、2×LDSサンプル緩衝液または200μg/mlFLAGペプチドを使用してアフィニティーマトリックスから溶出させ、10mMジチオスレイトールによる還元および50mMヨードアセトアミドによるアルキル化の前に0.2μmのSpin-XカラムCorningでろ過した。サンプルを70°Cで10分間加熱し、コロイダルブルーInvitrogenによる染色に先立って4~12のNovexゲルで分離した。LRRK2に対応するバンドを切り出し、以前の記載[非特許文献30]のようにトリプシンにより消化した。サンプルを、上位5つのイオンが、親イオンからのリン酸の中性喪失z=2、3および4について、中性喪失質量=49、32.33および24.5の多段階活性化を使用するリニアイオントラップでフラグメント化されたことを除いて、上記のように、LTQOrbitrapXL質量分析計Thermoで分析した。Mascot包括的ファイルを、raw2msmM.Mannからの譲渡を使用して生ファイルから作製し、InternationalProteinIndexIPIマウスデータベースを内因性LRRK2について使用するか、または、IPIヒトデータベースを組換えLRRK2について使用するローカルMascotサーバーmatrixscience.comに対して検索した。蛍光顕微鏡観察。HEK-293Flp-inT-RExをInvitrogenから購入し、LRRK2のGFPタグ標識された野生型および変異体形態を有する安定な細胞を、標準的プロトコルを使用して作製した。細胞を4ウエルのガラス製底部のCC2被覆チャンバースライドNuncに置床した。置床後1日目に、細胞を0.1μg/mlのドキシサイクリンにより誘導し、24時間後、細胞を、リン酸塩緩衝化生理的食塩水で緩衝化される4パラホルムアルデヒドUSBから購入、19943において固定処理した。細胞をProLongGoldInvitrogenに載せ、αPlan-Apochromatの100倍対物レンズを使用するZeissLSM700共焦点顕微鏡でそれぞれの変異体について同じ設定のもとで画像化した。結果LRRK2の14-3-3との会合。本発明者らは、HEK-293細胞に由来する安定的に発現された全長型GFP-LRRK2図1Aおよび図1B、同様にまた、GFP-LRRK2[G2019S]変異体図1Cおよび図1Dの免疫沈殿物と会合するタンパク質を特定するために、定量的な、細胞培養でのアミノ酸による安定同位体標識化SILACに基づく質量分析を用いた。最上位のヒットこれは、GFP単独と比較して、GFP-LRRK2またはGFP-LRRK2[G2019S]に関して10倍~30倍より大きいレベルで濃縮されたものであるは、野生型LRRK2については14-3-3のべータイソ型、イータイソ型、シータイソ型、ゼータイソ型およびイプシロンイソ型を含み図1B、LRRK2[G2019S]についてはべータイソ型、シータイソ型、ゼータイソ型、ガンマイソ型およびイプシロンイソ型を含んでいた図1D。観測された2つの他の大きな相互作用は、それらのキナーゼ特異的な標的化CDC37サブユニットとシャペロン会合する熱ショックタンパク質-90Hsp90の2つのイソ型を含んでいた5倍~15倍濃縮された。Hsp90およびCDC37は、野生型LRRK2と、同様にまた、LRRK2[G2019S]変異型との両方と会合した。Hsp90およびCDC37は、LRRK2と相互作用することが以前に報告されている[非特許文献14]。LRRK2の他の有意な相互作用因子が本発明者らの相互作用因子スクリーニングでは何ら認められなかった。本発明者らは、Hsp90と同様に、内因性14-3-3がSwiss3T3細胞から内因性LRRK2と一緒に共免疫沈殿したことを見出した図2A。本発明者らはまた、内因性LRRK2が、Swiss3T3細胞から、内因性14-3-3イソ型を認識する抗体と一緒に共免疫沈殿したことを認めた図2B。ヒト14-3-3の7つすべてのイソ型の発現のためにコードするプラスミドを、全長型FLAG-LRRK2を安定的に発現する以前に作製されたHEK-293細胞[非特許文献8]にトランスフェクションした。アフィニティー精製の後、変則的なシグマイソ型は別として、14-3-3の他のすべての形態がFLAG-LRRK2と相互作用した図1C。本発明者らはまた、全長型LRRK2が293細胞における内因性14-3-3と会合したが、並行実験では、試験されたLRRK2の様々な単離されたドメインは14-3-3と結合することができなかったことを認めた図1D。この観察結果が、14-3-3オーバーレイ-ファーウエスタン結合アッセイを用いて確認され、このアッセイでは、単離されたドメインではなく、全長型LRRK2がジゴキシゲニン標識の14-3-3に結合した図1D-下段パネル。14-3-3のイソ型はほとんどが、それらの結合パートナー上における特定のリン酸化された残基と相互作用する[非特許文献11、15]。14-3-3のLRRK2との会合がリン酸化に依存したどうかを確認するために、本発明者らは内因性LRRK2図2Eまたは過剰発現させたFLAG-LRRK2図2Fをラムダホスファターゼの存在下または非存在下でインキュベーションした。ラムダホスファターゼによる内因性LRRK2または過剰発現LRRK2の処理は、オーバーレイアッセイを使用して評価される14-3-3の相互作用を著しく低下させた。EDTAがアッセイに含まれる場合EDTAがアッセイに含まれることにより、ラムダホスファターゼが阻害される、ラムダホスファターゼがLRRK2への14-3-3結合を抑制することが妨げられた図2Eおよび図2F。ラムダホスファターゼ処理の後におけるLRRK2への14-3-3の残存結合は恐らくは、LRRK2の不完全な脱リン酸化に起因するものと思われる。内因性LRRK2における主要なリン酸化部位のマッピング。どのリン酸化された残基が14-3-3への結合を媒介するかを明らかにするために、本発明者らは、マウスSwiss3T3細胞から免疫沈殿された内因性LRRK2の詳細なホスホペプチドorbitrap質量分析法分析を行った図3A。これにより、3つの明瞭なリン酸化部位、すなわち、Ser860、Ser910およびSer935が明らかにされた図3B。これらの残基は、ロイシンリッチリピートの直前であるLRRK2のN端側の非触媒作用領域に位置する図3C。本発明者らはまた、HEK-293細胞において発現される過剰発現させた全長型ヒトFLAG-LRRK2のリン酸化を分析し、これにより、Ser860、Ser910およびSer935がリン酸化の主要な部位であることが確認された図3Aおよび図3B。加えて、本発明者らは、過剰発現させたヒトFLAG-LRRK2の調製物における3つの他のリン酸化部位、すなわち、Ser955、Ser973およびSer976を見出した図3Bおよび図3C。Ser955、Ser973およびSer976を含むホスホペプチドもまた、内因性LRRK2の本発明者らの分析では検出されたが、これらのペプチドは存在量がより少なかったために、本発明者らはその正確なリン酸化部位を定めることができなかったデータは示されず。Ser910およびSer935のリン酸化は14-3-3結合を媒介するが、キナーゼ活性を制御しない。本発明者らは、Ser860、Ser955、Ser973、Ser976、または、Ser973976の両方のリン酸化部位のAlaへの変異は、全長型FLAG-LRRK2への14-3-3の結合に影響を及ぼさなかったことを認めた図3D。しかしながら、驚くべきことに、Ser910および/またはSer935のAlaへの変異は相互作用を失わせた。このことは、これらの残基のリン酸化が14-3-3イソ型へのLRRK2の結合を媒介することを示している図3D。特定されたリン酸化部位の変異は、Nictide基質ペプチドに対して測定されるとき、LRRK2のプロテインキナーゼ活性に影響を及ぼさなかった図3D。次に、本発明者らは、Ser910またはSer935がリン酸化されるLRRK2を認識するリン特異的抗体を作製した。これらの抗体は特異的であった。これは、Ser910のAlaへの変異はホスホ-Ser910抗体によるLRRK2の認識を失わせ、同様に、Ser935の変異はホスホ-Ser935抗体による認識を失わせたからである図3E。本発明者らは、Ser910のAlaへの変異が、LICORによって定量化されたとき、Ser935のリン酸化をおよそ半減させ、また、逆も同様に、Ser935の変異がSer910のリン酸化をおよそ半減させたことを一貫して認めた図3E。これらの抗体を利用して、本発明者らは、マウスの脳、腎臓および脾臓から免疫沈殿される内因性LRRK2がSer910ならびにSer935においてリン酸化されたこと、また、この内因性LRRK2もまた、14-3-3と結合したことを明らかにする図3F。配列アライメントにより、Ser910およびSer935の部位、同様にまた、それらを取り囲む残基が、哺乳動物種では高度に保存されていることが示される図3G。Ser910およびSer935を含むこの領域は、線虫またはキイロショウジョウバエのLRK-1には存在せず、また、実際、哺乳動物のLRRK1には存在しない。Ser910およびSer935の周りの残基を比較することにより、いくつかの驚くべき類似性が示される図3H、すなわち、-3位および-4位における塩基性残基、-2位におけるSer残基、-1位におけるAsn、および、1位における大きい疎水性残基。LRRK2阻害剤はSer910/Ser935の脱リン酸化を誘導し、14-3-3結合を破壊した。Swiss3T3細胞をLRRK2阻害剤のH-1152図4Aまたはスニチニブ図4Cの増大する量とインキュベーションすることにより、Ser910およびSer935における内因性LRRK2の用量依存的な脱リン酸化が生じ、これには、14-3-3結合が同時に減少することが付随した。10μM~30μMのH-1152または3μM~10μMのスニチニブはSer910およびSer935のほとんど完全な脱リン酸化を誘導し、その結果、14-3-3結合の喪失を生じさせた。内因性LRRK2-Ser910/Ser935リン酸化および14-3-3結合に対するH-1152の阻害効果図4Bおよびスニチニブの阻害効果図4Dが30分以内に認められ、少なくとも2時間にわたって持続した。LRRK2キナーゼ活性はSer910およびSer935のリン酸化ならびに14-3-3結合を制御するという証拠。LRRK2のリン酸化および14-3-3の結合に対するH1152およびスニチニブの影響がLRRK2プロテインキナーゼ活性の阻害から生じたことを明らかにするために、本発明者らは、LRRK2[G2019S]変異体またはH1152/スニチニブ抵抗性LRRK2[A2016TG2019S]変異体を過剰発現するHEK-293をLRRK2阻害剤により処理した。内因性LRRK2に関して認められるように、本発明者らは、H-1152およびスニチニブが、Ser910およびSer935におけるパーキンソン病LRRK2[G2019S]変異体の用量依存的な脱リン酸化、ならびに、14-3-3への結合を破壊することを誘導したことを見出した図5A-上段パネル。しかしながら、非常に重要なことに、H-1152またはスニチニブのどちらも、Ser910またはSer935のリン酸化、あるいは、薬物抵抗性LRRK2[A2016TG2019S]変異体への14-3-3結合を有意に阻害しなかった図5A-下段パネル。このことは、H1152およびスニチニブがSer910ならびにSer935の脱リン酸化を誘導し得ること、したがって、14-3-3結合を破壊し得ることが、これらの化合物がLRRK2プロテインキナーゼ活性を阻害し得ることに依存していることを強く示唆する。H-1152およびスニチニブが変異体LRRK2[G2019S]を野生型LRRK2よりも2倍~4倍強く阻害することを明らかにする薬理学的データ[非特許文献8]と一致して、本発明者らは、H1152およびスニチニブが、脱リン酸化を誘導することにおいて、また、14-3-3のLRRK2[G2019S]への結合を損なうことにおいて、野生型LRRK2よりも強力であったことを見出した図5Aおよび図5B-上段パネルを比較せよ。野生型FLAG-LRRK2の脱リン酸化を293細胞において誘導することにおけるH-1152およびスニチニブの効力は、Swiss3T3細胞において内因性LRRK2について認められるこれらの薬物の影響と類似していた図4および図5Bを比較せよ。LRRK2がSer910およびSer935を自己リン酸化しないという証拠。LRRK2は、セリン残基よりもトレオニン残基をリン酸化する著しい優先傾向を有しており[非特許文献8]、このことは、Ser910およびSer935のリン酸化が自己リン酸化によって媒介されないかもしれないことを示唆する。このことと一致して、LRRK2自己リン酸化部位を調べる他の研究では、多数のホスホトレオニン自己リン酸化部位がマッピングされているが、LRRK2がSer910またはSer935においてリン酸化することは報告されていない[非特許文献16~18]。内因性LRRK2がSer910およびSer935において自身をリン酸化し得るかどうかをさらに調べるために、本発明者らは、Swiss3T3細胞を、非薬物下で、または、Ser910およびSer935の脱リン酸化を誘導するために30μMのH-1152でのどちらかで処理した図6。内因性LRRK2を免疫沈殿させ、洗浄して薬物を除き、免疫沈殿物をマグネシウム-ATPの非存在下または存在下でインキュベーションした。30分後、LRRK2キナーゼ活性、ならびに、Ser910およびSer935のリン酸化を定量化した。これらの研究では、H-1152処理された細胞から単離されるLRRK2は脱リン酸化され、そして、薬物が除かれていたことを示す処理されていない細胞から単離されるLRRK2と同じ活性を有したことが明らかにされた図6。重要なことではあるが、本発明者らは、H1152処理された細胞から得られるLRRK2をマグネシウム-ATPとインキュベーションした後におけるSer910またはSer935のリン酸化における増大を何ら認めなかった。薬物非処理の細胞から単離されるLRRK2の、Ser910およびSer935でのリン酸化の量もまた、自己リン酸化反応では増大しなかった。Ser910/Ser935のリン酸化に対する多数のシグナル伝達阻害剤の影響。Ser910およびSer935の脱リン酸化の特異性へのさらなる洞察を得るために、GFP-LRRK2を安定的に発現するHEK293細胞を、PI3-キナーゼ、mTOR、ERK、p38、JNKを含む細胞における主要なシグナル伝達経路、および、生来的な免疫シグナル伝達経路を抑制する阻害剤を含めて、33個のキナーゼ阻害剤の一群により処理した図16。すべての阻害剤を、文献で日常的に用いられる濃度の上限、および、シグナル伝達経路を抑制することが知られている本発明者らの単位で利用した。予想されるように、10μMのスニチニブはSer910およびSer935の著しい脱リン酸化を誘導し、一方で、試験された阻害剤のうちの32個はSer910/Ser935の脱リン酸化に有意な影響を及ぼさなかった。Ser910およびSer935のある程度の脱リン酸化が、15μMの濃度で使用され、多くのプロテインキナーゼをJNKよりも強く阻害することが知られている比較的非特異的なJNK阻害剤SP600125[非特許文献34]に関して認められた。より強力なJNK阻害剤AS601245はこれらの部位の脱リン酸化を誘導しなかったことには留意しなければならない。さらなる研究が、Ser910およびSer935のリン酸化を直接に媒介するプロテインキナーゼを明確化するために必要であろう。14-3-3結合の破壊はLRRK2の細胞局在化を変化させる。14-3-3タンパク質の一般的な役割は、14-3-3タンパク質が結合するタンパク質の細胞内局在化に影響を与えることである。したがって、本発明者らは、14-3-3結合がLRRK2の細胞局在化に影響を及ぼし得るかどうかを調べた。低レベル、かつ、できる限り均一な発現を保証するために、本発明者らは、全長型GFP-LRRK2の野生型形態および14-3-3非結合性Ser910/Ser935変異体形態を安定的に発現するFlp-inT-REx293細胞を作製した。免疫ブロット分析により、野生型GFP-LRRK2形態および変異体GFP-LRRK2形態が類似するレベルで発現されたことが明らかにされた図8A。次に、本発明者らは、共焦点顕微鏡観察を使用して細胞内局在化を調べ、以前の報告[非特許文献18]と一致して、野生型LRRK2が細胞質ゾル全体に一様に分布し、核から排除されたことを見出した図8B。対照的に、LRRK2[S910A]、LRRK2[S935A]およびLRRK2[S910AS935A]の14-3-3非結合性変異体が細胞質ゾルプール内に蓄積した図8B。41個のLRRK2疾患関連変異体の14-3-3結合の特徴づけ。次に、本発明者らは、LRRK2の41個のパーキンソン病形態型のSer910/Ser935リン酸化および14-3-3結合特性を調べることに決めた。分析されたLRRK2における種々の変異の場所が図9の挿入図に示される。本発明者らは、N端のFlagエピトープタグを有するLRRK2の全長の野生型形態および変異体形態を293細胞において発現させた。LRRK2を免疫沈殿させ、タンパク質のレベルを定量的LICOR-免疫ブロッティング分析によって求めた。類似するレベルのLRRK2形態物を免疫ブロット分析に供した。免疫ブロット分析では、変異体のほとんどが、野生型酵素と類似する程度にSer910およびSer935においてリン酸化され、14-3-3と相互作用したことが明らかにされた図9、下段パネル。しかしながら、Ser910/Ser935のリン酸化、したがって、14-3-3結合が、4つの変異体R1441G、Y1699C、E1874stopおよびI2020Tにおいて失われた図9、下段パネル。Ser910/Ser935のリン酸化および14-3-3結合が、6つの他の変異体M712V、R1441H、R1441C、A1442P、L1795FおよびG2385Rにおいて有意に低下した図9、下段パネル。本発明者らはまた、LRRKtideペプチド基質を用いてLRRK2の41個の変異体形態の相対的なプロテインキナーゼの比活性を比較した[非特許文献9]図5。以前の研究[非特許文献7~9]と一致して、LRRK2[G2019S]変異体は野生型LRRK2よりも約3倍大きい比活性を有した。2つの他の変異体、すなわち、LRRK2[R1728H]およびLRRK2[T2031S]もまた、野生型LRRK2よりも2倍および4倍増大した活性をそれぞれ示した。キナーゼドメインを有さず、したがって、不活性であるR1874stop変異は別として、試験されたすべての他の変異体が野生型LRRK2と類似する活性を有した。14-3-3の内因性LRRK2との会合がLRRK2[R1441C]ノックインマウスでは損なわれる。LRRK2[R1441C]のパーキンソン病変異が14-3-3結合を破壊するというさらなる証拠を得るために、本発明者らは、以前に報告された同腹子野生型マウスおよびホモ接合性LRRK2[R1441C]ノックインマウスに由来する内因性LRRK2と会合する14-3-3のレベルを比較した[非特許文献19]。LRRK2を、それぞれの遺伝子型の3匹の別個のマウスから得られる脾臓、腎臓および脳から免疫沈殿させた。免疫ブロッティングおよび14-3-3オーバーレイ分析により、LRRK2発現のレベルが野生型マウスおよびノックインマウスにおいて類似しており、しかしながら、Ser910/Ser935のリン酸化および会合した14-3-3のレベルが、野生型と比較されるLRRK2[R1441C]ノックインマウスに由来する組織において著しく低下したことが明らかにされた図10。変異の最大の影響が腎臓において認められた。LRRK2の41個の変異体形態の細胞局在化。全長型GFP-LRRK2の野生型形態および変異体形態の低レベル、かつ、できる限り均一な発現を保証するために、本発明者らは、GFP-LRRK2の野生型形態および変異体形態を安定的に発現するFlp-inT-REx293細胞を作製した。免疫ブロット分析により、様々なGFP-LRRK2形態が比較的類似するレベルで発現されたことが明らかにされた図11A。調べられた野生型、キナーゼデッド変異体および多くの他のLRRK2変異体の局在化が細胞質ゾル全体に一様に分布し、かつ、核から排除され、細胞質プール内における蓄積が認められなかった図11B、または、より大きい画像を見るための図13を参照のこと。驚くべきことに、低下したSer910/Ser935のリン酸化および14-3-3への結合を示したほとんどの変異体が細胞質ゾルプール内に蓄積したR1441C、R1141G、R1441H、A1442P、Y1699C、L1795F、I2020T。短縮されたE1874stop変異体これは拡散的な細胞質局在化を示したを除いて、2つの他の変異体M712VおよびG2385Rだけが、低下したSer910/Ser935のリン酸化および14-3-3結合を示し図9、しかし、細胞質プールに蓄積しなかった図11Bまたは図13。1つだけの変異体R1067Qが、14-3-3と相互作用し、かつ、細胞質プール内に蓄積することが見出された図11Bまたは図13。14-3-3結合の破壊はLRRK2の細胞局在化を変化させる。細胞質全体に拡散的に局在化するよりはむしろ、14-3-3と相互作用しないLRRK2の変異体は、本実施例において示されるように、細胞質凝集物の中に蓄積する。このことは、本発明者らに、H-1152処理が、離散的な細胞質プールへのGFP-LRRK2またはGFP-LRRK2[G2019S]の細胞質での再局在化を誘導するかどうかを調べることを促した図14。本発明者らは、GFP-LRRK2またはGFP-LRRK2[G2019S]の薬物感受性形態または薬物抵抗性A2016T変異体形態を低レベルで発現する安定な誘導可能なT-REx細胞株を用いた。非処理の細胞では、GFP-LRRK2およびGFP-LRRK2[G2019S]が細胞質全体に拡散的に局在化し、核には認められなかった図14A。しかしながら、H-1152処理はLRRK2の細胞質プール内における著しい蓄積を誘導した図14A。H-1152のこの影響がLRRK2キナーゼ活性の阻害を介して媒介されることに合致して、細胞質プールにおける蓄積が、薬物抵抗性のLRRK2[A2016T]またはLRRK2[A2016TG2019S]を発現する細胞をH-1152により処理したときには何ら認められなかった図4A。さらなるコントロールとして、本発明者らは、14-3-3と結合せず、細胞質プール内に蓄積することが以前に示されたGFP-LRRK2[R1441C]およびGFP-LRRK2[Y1699C]の局在化を調べた[本実施例;33]。本発明者らは、これらの変異体が、H-1152による処理の後でGFP-LRRK2およびGFP-LRRK2[G2019S]について認められる細胞質プール様構造体と類似する細胞質プール様構造体の中に蓄積したことを確認した図14Aおよび図14Bを比較せよ。考察本論文における重要な知見が、LRRK2のキナーゼ活性により、Ser910/Ser935のリン酸化、したがって、14-3-3結合、同様にまた、LRRK2の細胞質局在化が間接的に制御されることである。本発明者らが調べている細胞株Swiss3T3図4およびHEK-293図5では、Ser910およびSer935におけるLRRK2のリン酸化、したがって、14-3-3への結合が、構造的に異なったLRRK2阻害剤のH-1152およびスニチニブによる処理によって取り消された。本発明者らはまた、H-1152が、14-3-3と結合しないLRRK2変異体について認められる離散的な細胞質プールと類似する離散的な細胞質プールの中に蓄積するようにLRRK2を誘導することを見出している図14B。本発明者らは、LRRK2阻害剤が、薬物抵抗性LRRK2[A2016T]変異体の脱リン酸化または再局在化を誘導することにおいて効果的ではないので図5、脱リン酸化および細胞質での再局在化がLRRK2キナーゼ活性の阻害から生じると結論する。H-1152およびスニチニブが、LRRK2[G2019S]のSer910/Ser935の脱リン酸化を誘導することにおいて野生型LRRK2よりも強力である図5という知見はまた、これらの薬物がLRRK2[G2019S]を野生型LRRK2よりも2倍~4倍強く阻害すること[非特許文献8]と一致している。本発明者らは、14-3-3のイソ型が内因性LRRK2と相互作用し、これがSer910およびSer935のリン酸化によって媒介されることを明らかにする。14-3-3タンパク質が、多くの細胞内タンパク質これらは、異なった細胞プロセスに対する広範囲に及ぶ影響を発揮すると動的に相互作用する。それらは、標的タンパク質上における特定のリン酸化された残基に結合することによって働く。LRRK2が14-3-3のイソ型と相互作用するという知見は、一次配列の分析によって予測され得ないと考えられる。これは、910および935のリン酸化部位の周りの残基は、14-3-3相互作用の一般的モードのための最適なモード1およびモード2のコンセンサス結合モチーフにこだわらないからである[非特許文献11、15]。しかしながら、14-3-3と相互作用する多くのタンパク質は、異なった予測できない変則的な結合モチーフを介して相互作用する。これは恐らくは、他の構造的特徴が相互作用に寄与すると考えられるからである[非特許文献11]。本発明者らが調べているすべての細胞株Swiss3T3図4およびHEK-293図5では、Ser910およびSer935におけるLRRK2のリン酸化、したがって、14-3-3への結合が、細胞を構造的に異なったLRRK2阻害剤のH-1152およびスニチニブにより処理することによって取り消された。本発明者らは、H-1152ならびにスニチニブが、薬物抵抗性LRRK2[T2016A]変異体の脱リン酸化を誘導することにおいて効果的ではないので図5、脱リン酸化がLRRK2キナーゼ活性の阻害から生じると結論する。さらに、H-1152およびスニチニブは、LRRK2[G2019S]の脱リン酸化を誘導することにおいて野生型LRRK2よりも強力であり図5、このことは、これらの薬物がLRRK2[G2019S]を野生型LRRK2よりも2倍~4倍強く阻害することと一致している。重要な疑問が、LRRK2がSer910およびSer935のリン酸化を制御する機構に関する。1つの可能性が、Ser910およびSer935が直接のLRRK2自己リン酸化部位を構成することである。しかしながら、本発明者らのデータは、H-1152またはスニチニブにより処理された細胞から単離される脱リン酸化されたLRRK2はマグネシウム-ATPとのインキュベーションの後でSer910/Ser935において自身をリン酸化することができないことを示唆する図6。このことは、最適なペプチド基質におけるリン酸化Thr残基をSer残基に置換することにより、LRRK2によるリン酸化が失われたという本発明者らの知見[非特許文献8]によって明らかにされるように、LRRK2が、セリン残基よりもトレオニン残基をリン酸化する著しい優先傾向を有することを一致している。さらには、LRRK2自己リン酸化部位をマッピングすることを目指した数多くの研究では、Ser910またはSer935が特定されていない[非特許文献16~18]。メラノーマ腫瘍の包括的ホスホプロテオミック研究では、Ser935におけるLRRK2のリン酸化が、2250のタンパク質に関して分類される5600のリン酸化部位の1つとして特定されたが、これはさらには調べられなかった[非特許文献19]。ただ1つだけのプロテインキナーゼがこれらの残基の両方をリン酸化するかもしれないことを示唆する、Ser910およびSer935の周りの配列における有意な類似性が存在する図3G。本発明者らの知見が意味することは、Ser910/Ser935キナーゼがLRRK2によって刺激されるかもしれないこと、および/または、これらの残基に作用するプロテインホスファターゼ1つまたは複数がLRRK2によって阻害されることである。今後の研究では、Ser910およびSer935に作用するキナーゼ1つまたは複数および/またはプロテインホスファターゼ1つまたは複数を特定すること、ならびに、それらがLRRK2によって制御されるかどうかを明らかにすることが重要であろう。本発明者らのデータは、Ser910またはSer935のどちらかの変異により、相互作用14-3-3相互作用が失われるので、Ser910およびSer935の両方のリン酸化が、結合するとしてLRRK2との14-3-3の安定な相互作用のために必要であることを示唆する。14-3-3分子は、リン酸化された残基と相互作用する能力をそれぞれのモノマーが有するダイマーを形成する[非特許文献15]。したがって、14-3-3ダイマーは、2つのリン酸化された残基と相互作用する能力を有する。14-3-3の1つのダイマーが、リン酸化されたSer910およびリン酸化されたSer935の両方と相互作用することが可能である。本発明者らはまた、Ser910またはSer935のどちらかをAla残基に変異させることにより、他方の残基の有意な脱リン酸化が誘導されたことを認めた図3E。14-3-3が結合することにより、LRRK2が、プロテインホスファターゼによって脱リン酸化されることから保護されるならば、このことは説明され得ると思われる。したがって、14-3-3の結合をSer910またはSer935のどちらかの変異によって失わせることにより、他方の部位の脱リン酸化が促進されると思われる。他の標的例えば、ホスファチジルイノシトール4-キナーゼIIIベータ[非特許文献20]またはCdc25C[非特許文献21]などへの14-3-3結合は、リン酸化された残基をプロテインホスファターゼから立体的に遮蔽することによってであると恐らくは考えられるが、これらの酵素を脱リン酸化から保護することが示されている。14-3-3タンパク質は最初、脳において非常に発現される酸性タンパク質として42年以上前に特定された[非特許文献31]。それ以降、様々な14-3-3タンパク質が、パーキンソン病を含めて、数多くの神経学的障害の調節に関係しているとされている[非特許文献26、27]。例えば、14-3-3イータは、パーキン、すなわち、常染色体劣性若年性パーキンソニズムにおいて変異するタンパク質に結合し、そのE3リガーゼ活性を負に調節する[非特許文献22]。様々な14-3-3タンパク質がアルファ-シヌクレインと相互作用し[非特許文献23]、パーキンソン病患者の脳におけるレビー小体に見出されている[非特許文献24]。加えて、14-3-3シータ、14-3-3イプシロンおよび14-3-3ガンマは近年、神経毒性の細胞系モデルにおいてアルファ-シヌクレインの過剰発現の毒性影響を抑制することが示された[非特許文献25]。本発明者らのデータは、LRRK2への14-3-3結合が、パーキンソン病と関連があるかもしれないことを示唆する。これは、驚くべきことに、調べられた41個の変異のうちの10個がSer910/Ser935の低下したリン酸化および14-3-3イソ型への低下した結合を示したからである図12。本発明者らのデータは、Ser910および/またはSer935の変異により、LRRK2の触媒活性は影響を受けないので図3D、14-3-3相互作用はLRRK2プロテインキナーゼ活性を制御していないことを示唆する。そのうえ、H-1152またはスニチニブによる細胞の処理では、Ser910およびSer935の脱リン酸化、同様にまた、14-3-3結合を破壊することが誘導され、しかし、内因性LRRK2キナーゼ活性は影響を受けなかった図6。LRRK2への14-3-3結合は基質または他の調節因子とのその相互作用に影響を与えるかもしれないか、あるいは、LRRK2の安定性または細胞局在化に影響するかもしれない。本発明者らの実験は、Ser910/Ser935の変異による14-3-3結合の破壊が、LRRK2が細胞質プール内に蓄積することを生じさせたので、14-3-3結合がLRRK2の細胞質局在化に影響することを示している。以前の研究では、LRRK2[R1441C]およびLRRK2[Y1699C]を含めて、様々なLRRK2変異体が、細胞において発現されたとき、細胞質プール内に蓄積することが明らかにされており[非特許文献33、35、36]、このことは、本発明者らが本研究において確認することができた知見である図11Bまたは図13。これらの細胞質プールは、誤って折り畳まれた不安定なLRRK2タンパク質の凝集物を含むことが示唆された[非特許文献35]。このことが当てはまるならば、14-3-3は、LRRK2を安定化することにおいて役割を果たしていることが示唆されるかもしれない。重要なことに、本発明者らは、細胞質プール内に蓄積した8個の変異体のうちの7個が、分析された野生型LRRK2およびほとんどの他のLRRK2変異体が14-3-3と結合し、かつ、細胞質ゾルプール内に蓄積しなかった条件のもとで、低下したSer910/Ser935のリン酸化および14-3-3への結合を示した図11B。本発明者らはまた、Ser910/Ser935のリン酸化および14-3-3結合が、損なわれたドーパミン作動性神経伝達を示すホモ接合性のR1441Cノックインマウスに由来する3つのマウス組織において著しく低下することを明らかにすることによってこれらの知見の妥当性を確認している[非特許文献37]。図12において、本発明者らは、本発明者らが分析している41個のLRRK2変異を、本研究で分析される変異がプロテインキナーゼ活性、Ser910/Ser935のリン酸化および14-3-3結合、ならびに、細胞局在化に対して有する影響に基づいて6つのグループに分けている。分析された41個の変異のうちの3つだけが、LRRK2プロテインキナーゼを2倍~4倍著しく高めた。驚くべきことに、LRRK2[T2031S]変異はLRRK2[G2019S]変異体よりも活性であり、野生型LRRK2よりもほぼ4倍大きい活性を示した。LRRK2[T2031S]変異は、PDの家族歴を有するただ1人のスペイン人患者において報告されているだけである[非特許文献38]。興味深いことに、Thr2031が、LRRK2キナーゼドメインのTループの中に、すなわち、多くのキナーゼがリン酸化によって活性化される領域の中に位置する。近年の研究では、昆虫細胞において発現されるLRRK2の触媒活性フラグメントが、Thr2031を含めて、いくつかの残基において自己リン酸化されることが示唆されている[非特許文献16]。だが、本発明者らは、この部位のリン酸化を内因性LRRK2または過剰発現LRRK2においてこれまで一度も認めることができないでいる。本発明者らは、Thr2031をAlaに変化させて、リン酸化を防止することにより、T2031S変異と類似する、活性における増大RJN、データは示されずがもたらされたこと、および、Gluに変異させて、リン酸化を模倣することにより、LRRK2が不活性化されることND、データは示されずを見出している。さらなる研究が、Thr2031の役割、および、Serへのその変異および/またはリン酸化または他の共有結合修飾がどのようにLRRK2の触媒活性に影響を与えるかを理解するために必要である。LRRK2[R1728H]変異はキナーゼ活性における2倍の増大を示し、PDの家族歴を有するただ1人の患者において特定された[非特許文献39]。Arg1728残基がCORドメインにおけるキナーゼドメインの外側に位置する図9。図7において、本発明者らは、Ser910およびSer935のリン酸化がLRRK2活性に依存し、かつ、14-3-3イソ型への結合を媒介するモデルを示す。Ser910およびSer935におけるLRRK2のリン酸化、または、14-3-3結合は、開発途中にあるLRRK2阻害剤の相対的効力を評価するために、細胞に基づく読み出しとして展開することができる。このアッセイは、LRRK2阻害剤により処置される動物またはヒトの細胞株または組織において展開することができる。LRRK2阻害剤が臨床試験で投与されるヒト患者については、血液におけるSer910およびSer935でのLRRK2のリン酸化状態をLRRK2阻害剤の効力のバイオマーカーとして用いることができるであろうこれは、LRRK2が血液細胞において強く発現されるからである。本発明者らは、これが、LRRK2プロテインキナーゼ阻害剤の効力を、内因性LRRK2標的のリン酸化を測定することに基づいて評価するために使用することができる最初の簡便な細胞系システムであると信じている。"