"a出生前診断手順の終了時に羊水細胞の二次採収培養物を採取するか、又は新鮮な羊水からの細胞を適切な培養培地中で培養するステップと、b光学顕微鏡観察によって、弓状又は突起弓状の皮膚紋理に類似の形状を示す少なくとも2つの細胞コロニーを有する接着細胞培養物を選択するステップと、cステップbで選択された細胞培養物を単離し、それらを幹細胞用の培養培地中で培養するステップと、d細胞コロニーを形成する幹細胞の少なくとも90が弓状又は突起弓状の皮膚紋理に類似の形状をした細胞コロニーを得るために、十分な回数の継代培養をinvitroで実施するステップとを含む、又はそれからなる、羊水の異種細胞混合物から多能性幹細胞を単離する方法。弓状、突起弓状の皮膚紋理に似た形状を示す細胞コロニーを形成することを特徴とする、請求項1に記載の方法に従って入手可能な羊水の多能性幹細胞。αMEM-Chang培地中で約10±2時間の複製時間を有することを特徴とする、請求項2に記載の多能性幹細胞。HLAA、B、C、CD10、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、SSEA4、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、cMyc、FGF4、FGF5、Nodal、ALPマーカーを発現し、クラスIIDR、CD11b、CD14、CD34、CD38、CD49d、CD117、SSEA3マーカーを発現しないことを特徴とする、請求項2から3までのいずれか一項に記載の多能性幹細胞。請求項2から4までのいずれか一項に記載の多能性幹細胞を、1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤及び/又はアジュバントと一緒に含む、又はそれからなる医薬組成物。インプラントの形態の、請求項5に記載の医薬組成物。請求項2から4までのいずれか一項に記載の多能性幹細胞に由来するトリプトファン代謝物をさらに含む、請求項5から6までのいずれか一項に記載の医薬組成物。医学及び獣医学の分野において使用するための、それぞれ請求項2から4まで及び5から6までに記載の多能性幹細胞又は医薬組成物。自己免疫疾患の処置又は予防において使用するための、それぞれ請求項2から4まで及び5から6までに記載の多能性幹細胞又は医薬組成物。炎症性自己免疫疾患が糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症からなる群から選択される、請求項9に記載の使用のための多能性幹細胞又は医薬組成物。臓器移植の拒絶の予防において使用するための、それぞれ請求項2から4まで及び5から6までに記載の多能性幹細胞又は医薬組成物。したがって、上記に鑑みて、既知のものの不利点を克服する、幹細胞の新しい単離手順を提供する必要性が明らかである。本発明の著者らは、今回、羊水の異種細胞混合物から幹細胞を単離する手順を開発した。本発明者らは、出発材料、すなわち新鮮な羊水であるか出生前診断の経路の終了時の培養残留物であるかに依存せずに羊水由来幹細胞HA-SCを入手することができる。他の手順とは異なり、出生前診断の終了時にHA-SCの入手が可能なことで、HA-SCを入手する手順を開始する前に羊膜細胞の遺伝子構成を知ることが可能となり、したがって、細胞治療又は幹細胞バンクでの貯蔵に使用不可能な培養物の処理が回避される。さらに、本発明者らによって提案される方法は、既知の手順と比較して、時間及び金銭の両方に関して経済的である。より詳細には、本発明者らは、2つの多能性幹細胞の集団HA-SCを単離することができ、その主な表現型の差異は異なる増殖能力である。一方の集団は約10~18時間の複製時間を示す一方で、他方は同じ培養条件下で約30~36時間を示す。したがって、2つの細胞集団は羊水由来速fast幹細胞fHA-SC及び羊水由来遅slow幹細胞sHA-SCと命名されている。どちらのHA-SCも、細胞治療に使用することを可能にする特徴を示す、すなわち、多能性があり、腫瘍細胞へ形質転換されず、とりわけ、末梢T細胞の増殖及び生存に対して恒常的、局在的且つIDO依存的な制御を発揮することができ、抗原及び臓器に特異的な寛容も促進する。さらに、これらはどちらも、免疫調節機能に重要なTGF-β1サイトカインベータ1トランスフォーミング成長因子を異なった量産生することができる。sHA-SC細胞は、既に記載したAFSCと複製時間を含めて多くの類似性を示す一方で、fHA-SCは、著しい複製時間の差異同じ実験条件下のみが原因で、AFSとは異なる。fHA-SCは、高い複製潜在能が原因で、既知のものとは異なる幹細胞種を表す。高い増殖能力により、多数の細胞を短期間で得ることが可能であるため、fHA-SCが細胞治療で使用するために特に興味深く有用なものとなる。このfHA-SCの独特な特性は、他方では、すべての他の非胚性幹細胞に固有の制限である。本発明によれば、幹細胞は、自由意志で診断的理由のために羊水穿刺に供され、インフォームドコンセントに署名した妊娠第16~17週目の女性からの羊水試料から単離する。幹細胞の単離手順は、特定の形態及びコロニー形状を有する細胞の選択からなる。これらのコロニーは、新鮮な羊水のアリコート、又は出生前診断の終了時に残る細胞培養物、すなわち、出生前診断のストックとして使用され、分析結果又は報告書の送達後に廃棄される羊水の細胞培養物を使用した培養によって得ることができる。新鮮な羊水のアリコートを使用する場合は3~5ml、試料を遠心分離し、細胞を収集し、適切な培地中で6~7日間培養する。適切な培養培地の例は、1CHANG、2MSCGM商標LONZA、3αMEMChang:18のChangB、2のChangC、15の幹細胞用ウシ胎仔血清HYCLONE、1のペニシリン-ストレプトマイシン、1のグルタミンを添加したαMEM、4DMEM:10の幹細胞用ウシ胎仔血清HYCLONE、1のペニシリン-ストレプトマイシン、1のグルタミンを添加したDMEM、5αMEM:幹細胞用ウシ胎仔血清HYCLONE、1のペニシリン-ストレプトマイシン、1のグルタミンを添加した10のαMEMである。前記培養期間後、羊水中に存在する細胞の一部のみがamniodish登録商標Eurocloneに接着し、形態的に異なるコロニーの起源となる図1。本発明の方法によれば、特定の形態を示しているコロニーのみを選択し、幹細胞特異的培地中で培養する。目的のコロニーの起源となる細胞は、新鮮な羊水だけではなく、出生前診断の残留培養物中にも見つけることができる。出生前診断手順に従って、羊水約15~20mlを遠心分離し、4mlのChang培地中に再懸濁させ、amniodish登録商標上で4つの初代培養物に分割する。6日間の培養後、amniodish登録商標の表面に接着している細胞を出生前分析に使用する一方で、羊水由来の一部の懸濁細胞を含有する培養培地を収集し、25cm2の細胞培養用ファルコンフラスコ中に入れ、これに1mlの新鮮なChang培地を加え、診断の完了時までCO2インキュベーター内に保つ。二次採収培養物と命名されたこの培養物は、診断の完了時までさらに6~9日間CO2インキュベーター内に残す。この診断完了期間中に、既に接着していない細胞は接着し、複製によって、形態的に異なるコロニーの起源となることができる図1。上述のように、本発明による方法は、新鮮な羊水だけでなく、予備診断の終了時に廃棄される回収二次培養物も使用することができる。以下に、出生前診断方法の説明的なスキーム並びに本発明及び当分野の既知の方法に従って幹細胞の単離に使用した出発材料を報告する。本発明による方法は、弓状又は突起弓状の皮膚紋理に似た図2aに報告したものに類似している必要がある、線維芽細胞様及びコロニー形状でなければならないという、倒立光学顕微鏡を用いた細胞形態の検査に基づく選択を含む。fHA-SCを得るためには、図2aに報告された特定の形状を有する2つのコロニーの培養物のみを使用し、他方で、上記の前記コロニーを示さないすべての他の細胞培養物はsHA-SCの起源となる。必ずしも十分な数のコロニーが存在するわけではないため、すべての培養物をfHA-SCの単離に使用することはできない。同種fHA-SC細胞系を得ることができる培養物の数は非常に少なく、著者の観察によれば羊水の約1である1000個を超える試料。出生前診断手順の終了時に二次採収培養物から選択された培養物において、Chang培養培地を、αMEMChang、αMEM、DMEM、MSCGM商標などの幹細胞特異的培地で交換する。fHA-SCは非常に速く増殖し、上皮又はsHA-SC細胞などのすべての他の培養細胞種より高度にコンピテントであり、最大3回のinvitro継代培養後にfHA-SCが培養細胞の95より多くを表し図3、事実上同種細胞系となる。sHA-SCは、幹細胞特異的培地中で増殖するが、均一性に達することはない。1つの羊水試料からは1種類の独立した細胞集団を単離することが可能であり、両方は可能でない。上記報告した単離手順は、新鮮な羊水又は出生前診断経路の残留培養物を使用して同じ結果を与えるが、選択の前に材料を培養する期間は異なる前者及び後者の場合で6~8及び18~20日間。このことは、HA-SCを単離する可能性にも、同じ試料から様々な時点で様々なHA-SC種を入手する機会にも影響を与えない。本発明による細胞単離手順は、既知の技法と比較して複数の利点、特に以下を提供する:1HA-SCは、新鮮な羊水から及び出生前診断の終了時の両方において選択することが可能である。出生前診断の終了時の二次採収培養物の使用が、以下の理由により好ましい:a選択材料は、それが廃棄されるにもかかわらず出生前診断の終了時に回収されるため、通常の診断手順を妨げない、bさらなる量の羊水を羊水穿刺によって引き抜き採取することを必要としない、c出生前診断の終了時の物質の使用により、染色体又は遺伝子の病態を有さない対象からの幹細胞のみを含めることが可能となる。したがって、病態を含まない出発材料を使用することが可能である。さらに、細胞治療に使用不可能な潜在能を有する培養物の単離が回避されるため、さらなるコスト削減がもたらされる。さらに、ルーチンな遺伝子調査中に検出された病態を研究実験モデルのベースにすることも可能である、d出発試料中に存在する幹細胞のパーセンテージを増加させる。3~5mlの新鮮な羊水の代わりに15~20mlの羊水を起源とする回収培養物が使用可能であることにより、出発試料中に存在する幹細胞の数が増加する。2本発明の方法は、培養物の顕微鏡選択に基づいて一貫した結果が得られる可能性を提供する。3細胞形態及びコロニー形状の顕微鏡観察による前選択は、fHA-SCの起源となる確率がより高い培養物の経済的且つ素早い同定システムである。4羊水穿刺による出生前診断は幅広く使用されている手順であるため、羊水は容易に入手可能である。5本発明の方法は、治療的又は研究使用のための胚の破壊に関する倫理的懸念を克服する。本発明の方法に従って単離されるどちらのHA-SC細胞型sHA-SC、fHA-SCも、表現型:成長プロット、複製時間、膜マーカー、多能性マーカー、免疫学的特性が特徴づけられている。HA-SCの複製能力は、様々な培養培地及び様々な細胞量を使用して評価されている。図4は前記2つの細胞種の複製時間を示し、時間値は2つの細胞集団で非常に異なっており、sHA-SCでは30~36時間であり図4A、fHA-SCでは10~18時間である図4B。前記図中から見ることができるように、MSCGM及びαMEM-Chang培地を使用した細胞の成長プロットは、複製能力に対する培養培地の効果を指摘しているが、それでも集団の差異は依然として残る。逆に、異なる細胞量を使用した場合には、有意な差異は検出されなかった。他の非胚性幹細胞と比較したfHA-SC種の細胞の高い増殖能力により、これが任意の実験手順及び細胞治療において特に適したものとなる。HA-SC細胞は以下の特徴を有する:a以下のマーカーを発現する:HLAA、B、C、SSEA4、CD10、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、OCT4。逆に、これは、SSEA3、クラスIIDR、CD11b、CD14、CD34、CD38、CD49d図5A~Bについて陰性である。bCD117c-kitのメッセンジャーを発現するが、対応するタンパク質を決定することは必ずしも可能ではない。この最後のものは、一部のsHA-SC細胞系中でのみ検出されている。CD117を発現するsHA-SC細胞系は、細胞の22でそうであった図5C。c主な多能性関連転写因子、すなわち、OCT4、NANOG、SOX2、FGF5、FGF4、cMYC、KLF4、アルカリホスファターゼALP、Nodalを発現するため、多能性細胞である。多能性因子は、KLF4がfHA-SCによってより高いレベルで、すなわちsHA-SCの約400倍で発現される以外は、2つの集団によって有意な差異なしに発現される。d胚性及び成体の幹細胞と比較して中間の特性を示す。einvitro培養の通常の手順の結果として細胞生存度の変化をまったく示さない。いずれにしても前記2つの細胞集団は互いに異なり、fHA-SCは150世代を超えて連続的に培養することができる一方で、sHA-SCは20世代を超えない。f長期間、すなわち2年を超える凍結解凍サイクルの後にも表現型の改変を受けない。g通常のinvitro培養手順及び凍結解凍サイクル後に染色体安定性を示す。h胚性幹細胞とは対照的に腫瘍原性を示さない。i低レベルのクラスIMHC複合抗原及びクラスIIMHC複合抗原の発現の非存在の結果として、低い免疫原性プロフィールを有する。l樹状細胞及びマクロファージなどの造血細胞系と比較して、特に炎症誘発性刺激との接触後に、高レベルのIDO酵素を発現する。fHA-SCの独特な特徴は、IDO酵素の2つの形態IDO1及びIDO2の構成的発現である図6。IDOが存在するおかげで、HA-SCは、糖尿病などの自己免疫病態の処置において、寛容原性応答の強力なエフェクターの役割を果たす。局在的トリプトファン欠乏とアポトーシス促進性代謝物キヌレニンの放出との組合せにより、HA-SCは、末梢T細胞の増殖及び生存に対して更新された恒常的、局在的且つIDO依存的な制御を発揮することができ、抗原及び臓器に特異的な寛容も促進する。m特に炎症誘発性刺激との接触後に、高レベルのTGFβ1を発現する。著者らは、HA-SCをスフィンゴシン-1-リン酸シグナル分子によって刺激して、IDO及びTGFβ1を産生させることができることを最初に実証した。nINFγアポトーシス促進性サイトカインを用いた刺激後、HA-SCはアポトーシス細胞のパーセンテージの減少を示し図7、特に、fHA-SCに関して、複製細胞のパーセンテージの増加及びKLF4発現の増加が注目される。本発明による幹細胞を一義的に同定及び分類することを可能にするために、文献中に記載のように、HA-SCの複数の表現型的及び機能的特徴をAFS及びAFMSCと比較した。特に、比較は、同じ実験条件下で、細胞形態、複製時間、表面又は細胞内タンパク質抗原、多能性分子マーカーmRNA、免疫調節における機能的役割に関して実施した。比較実験は例4に記載されており、表1に概要が示されている。得られた結果は、sHA-SCは既に文献に記載されている細胞とより類似している一方で、fHA-SCはユニークな特徴を示し、新しい種類の羊水由来幹細胞を表すことを示唆している。文献に記載されているようにHA-SCと他の幹細胞種とを比較することで、1表面マーカー、2得られた細胞培養物の均一性、3分子マーカー、4複製時間、5免疫学的特性に関する一部の差異が示される。1表面マーカー。Orciani-DiPrimioらOrcianiら、2008、Int.J.Immunopathol.Pharmacol.、21:595~602及びTsaiらHum.Reprod.2004、19:1450~1456による単離手順を使用してCD105陰性AFMSCが得られ、CD105とは、MSCの細胞治療の国際学会InternationalSocietyofCellularTherapyinMSCsの指針によれば、対象細胞について95より高く陽性でなければならない膜抗原であるDominiciM.ら、2006、Cytotherapy、8:315~317。さらに、Tsaiらによって得られた幹細胞は、2つの基礎的な抗原、すなわちCD90及びCD117について弱く陽性である。また、SessaregoらHaematolgica、2008、93:339~346によって記載されているように、低レベルのCD44及びCD105が、AFMSCによっても発現される。DeCoppiに従って得られたAFSとは対照的に、一部のsHA-SC培養物を除いては、HA-SCはCD117タンパク質を発現しない。2細胞培養物の均一性。SassaregoらHaematolgica、2008、93:339~346は、その手順による細胞系は、寸法及び形態に関して異なる様々な細胞部分集団を含有すると主張している。同様の結果が本発明者らによってsHA-SCに関して得られている一方で、fHA-SCは95均一であることが証明されている図5D。3分子マーカー。TsaiらHum.Reprod.、2004、19:1450~1456は、その手順に従って単離したAFMSCはOCT4のmRNAを発現するが、部分集団中でのみタンパク質を検出することが可能である一方で、本発明によるすべての得られたHA-SCは常にOCT4タンパク質を99のパーセンテージで発現すると主張している図5b。4複製時間。HA-SC、AFS及びAFMSCの同じ実験条件下での複製時間が評価されている。その比較によれば、任意の実験条件下で、sHA-SCは、AFS及びAFMSCについて既に記載されているものに類似の30~36時間の平均複製時間を有する一方でRoubelakisM.G.ら、2007、StemCellsDev.、16:931~952;CananziM.ら、2009、ReprodBiomedOnline.、補遺18、1:17~27、fHA-SCは、他の細胞よりも著しく短い10~18時間の複製時間を有すると推論することが可能である。5免疫学的特性。AFSCは、MSCに匹敵し、したがってしばしば免疫抑制性である特徴を有するがRoelenD.L.ら、2009、Hum.Immunol.、70:16~23、免疫調節性特性は記載されていない。本発明によるHA-SCの革新的態様は、Tリンパ球特異的集団の分化に関連する免疫調節能力からなる。RoelenらHum.Immunol.、2009、70:16~23は、IDOを産生するが、mRNAのみが検出可能でタンパク質は検出されない非常に低いレベルで産生する、AFMSCの能力を記載している。逆に、HA-SCは、注目に値する基底レベルのIDO酵素IDO1又はIDO2を産生し、INFγの誘導後、発現レベルは樹状細胞又は胎盤由来細胞などの造血細胞系よりも高い値に達する。結論として、sHA-SCは既知の技術に記載されている細胞に類似の特徴を有する一方で、fHA-SCは新しい種類の細胞である。fHA-SCの新規性は、その高い複製能力並びに免疫抑制性及び免疫調節性の特性によるものである。自己免疫起源の病態、すなわちI型糖尿病にもfHA-SCが治療効果を発揮するかどうかを検証するために、これらのデータに基づいて、NODマウス肥満でない糖尿病性の実験モデル、I型糖尿病に関する1セットの研究を実施した。実際、fHA-SCは拒絶に対する自己保護能力を有するが、それは免疫適格マウスでは異種移植を表し、したがって宿主の免疫抑制を必要としないことに注目するのは興味深い。他方では、NODマウスでは、同系の間葉細胞すなわちマウス由来が保護活性を発揮するという証拠が存在する。結果がこの仮説を裏付けており、実際、NODマウスに接種したHA-SCは、5カ月後に、拒絶も新生物の成長も誘発していなかった。HA-SCは膵臓中で検出されておりリンパ節又は脾臓中ではない、これらはホーミングプロセス後に局在化される。自己免疫炎症の標的臓器である膵臓では、これらの細胞は炎症プロセスの低下を誘導する。したがって、NODマウスで得られた実験データは、標的部位でのみ免疫及び炎症反応を阻害し、炎症領域内のサイトカイン勾配に従った遊走ホーミングプロセスを介した損傷組織の修復を促進する能力からもたらされる、fHA-SCの治療潜在能を実証する。したがって、本発明によるfHA-SCは局所的免疫抑制を誘導するために適している。局所的免疫抑制は、患者にとって全身性のものよりもはるかに有利であるとみなされ、これは、後者は感染症の危険性を増加させる可能性があるためである。さらに、fHA-SCによる免疫応答の局所的調節は組織再生を促進し、内在性幹細胞を損傷部位に動員し、成体細胞中の局所幹細胞の分化を誘導することができる。通常の細胞治療では、細胞拒絶及び標的臓器中での局在化の問題が存在する。これらの問題は、本発明による幹細胞の独特な特徴のおかげで克服されている。実際、低い免疫学的プロフィールを有するそれは、外来であると認識されないため宿主によって拒絶されず免疫障壁を克服、ホーミングプロセスを実施する能力のおかげで、標的臓器中に独立して局在することができる。これらは、自己免疫疾患を治療するためのその使用を可能にする基礎的な特徴である。現在、自己免疫病態の決定的な処置は利用可能でない一方で、異常な免疫患者の応答は、対象の組織及び重要臓器を慢性的且つ不可逆的に損傷させる。ヒト羊水由来の幹細胞は、1セットの特異的細胞前駆体多能性幹細胞を供給することによって失われた組織財産を再構成すると同時に、患者において免疫学的欠損の根底にある自己免疫を補正するという、二重の意図を有する。本発明の著者らによって得られたデータは、特定の単離方法によって得られた細胞を単に投与するだけで、糖尿病性動物において免疫応答の生理的な再バランス化がもたらされることを示唆している。したがって、本発明の特定の目的は、a出生前診断手順の終了時に羊水由来細胞の二次採収培養物を採取するか、又は新鮮な羊水からの細胞を適切な培養培地中で培養するステップと、b光学顕微鏡観察によって、弓状又は突起弓状の皮膚紋理に類似の形状を示す少なくとも2つの細胞コロニーを有する接着細胞培養物を選択するステップと、cステップbで選択された細胞培養物を単離し、幹細胞用の培養培地中で培養するステップと、d細胞コロニーを形成する幹細胞の少なくとも90が弓状又は突起弓状の皮膚紋理に類似の形状をした細胞コロニーを得るために、十分な回数の継代培養をinvitroで実施するステップを含む、又はそれからなる、羊水の異種細胞混合物から多能性幹細胞を単離する方法である。一般に、同種培養物を得るためには2回又は3回の継代培養が十分である。上記に列挙した理由により、ヒト細胞の調製には、ステップaで、出生前診断手順の終了時の羊水由来細胞の二次採収培養物を使用することが好ましい。多能性幹細胞を動物から調製する場合は、新鮮な羊水を使用することができる。羊水由来幹細胞に適した培養培地は、たとえば以下のとおりである:-ChangChang培地組成Chang培地:塩7900mg/l、デキストロース1400mg/l、アミノ酸781mg/l、L-グルタミン219mg/l、ポリペプチド66mg/l、ビタミン22mg/l、デオキシリボヌクレオシド21mg/l、リボヌクレオシド20mg/l、ピルビン酸ナトリウム110mg/l、他の構成成分8mg/l、ホルモン及び微量元素0.00025mg/l、ステロイドホルモン0.0013mg/l、新生ウシ血清6v/v、ウシ胎仔血清6v/v。前記培地はキットとして市販されており、凍結乾燥した添加剤C及び基本培地Bの2つの構成成分からなり、これらを合わせる、-MSCGM商標LONZA、-αMEMChangαMEM-Chang培地組成:18のChangB、2のChangC、15の幹細胞用ウシ胎仔血清HYCLONE、1のペニシリン-ストレプトマイシン、1のグルタミンを添加したαMEMアール塩、25mMのHEPES、L-グルタミンなし、-DMEM4500mg/LのD-グルコース、ピルビン酸ナトリウムを含み、L-グルタミンなしのDMEM:10の幹細胞用ウシ胎仔血清HYCLONE、1のペニシリン-ストレプトマイシン、1のグルタミンを添加したDMEM、-αMEMαMEM培地組成:10の幹細胞用ウシ胎仔血清HYCLONE、1のペニシリン-ストレプトマイシン、1のグルタミンを添加したαMEM。幹細胞には、MSCGM商標LONZA、αMEMChang、DMEMDMEM、αMEMが好ましくは使用される。上記定義した方法に従って入手可能な羊水由来多能性幹細胞は本発明のさらなる目的を表し、前記細胞は、弓状又は突起弓状の皮膚紋理に似た形状を有する細胞コロニーを形成することを特徴とする。本発明による多能性幹細胞は、アルファ-MEM-Chang培地中で約10±2時間の複製時間を有することを特徴とする。さらに、前記細胞は、HLAA、B、C、CD10、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、SSEA4、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、cMyc、FGF4、FGF5、Nodal、ALPマーカーを発現し、クラスIIDR、CD11b、CD14、CD34、CD38、CD49d、CD117、SSEA3マーカーを発現しないことを特徴とする。本発明は、上記定義した多能性幹細胞を、1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤及び/又はアジュバントと一緒に含む、又はそれからなる医薬組成物にさらに関する。医薬組成物は、インプラントの形態で、たとえばアルギネート錠として調製することができる。さらに、組成物は、上記定義した多能性幹細胞に由来するトリプトファン代謝物をさらに含むことができる。本発明による多能性幹細胞又は医薬組成物は、医学及び獣医学の分野において、特に、糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症などの自己免疫炎症性疾患を処置又は予防するために使用することができる。さらに、本発明による多能性幹細胞又は医薬組成物は、臓器移植の拒絶に対する予防移植片対宿主病GVHDにおいて使用することができる。以下に、本発明を、その好ましい実施形態に従って、例示的であるが限定的でない方法によって記載し、同封した図面を詳細に参照する。例1羊水由来幹細胞の単離方法幹細胞の単離方法は、新鮮な羊水の一部を使用した、又は出生前診断手順の終了時に残る細胞培養物を使用した培養物を起源とする、コロニーの特定の形態及び形状を有する細胞の選択に基づく。出生前診断の手順羊水約15~20mlを遠心分離し、4mlのChang培地中に再懸濁させ、amniodish登録商標上で4つの初代培養物に分割する。6日間の培養後、amniodish登録商標の表面に接着している細胞を出生前分析に使用する一方で、残りの羊水の一部の懸濁細胞を依然として含有する上清を回収し、25cm2の細胞培養フラスコ中に入れ、1mlの新鮮なChangC培地を加え、診断手順が完了するまでCO2インキュベーター内に保つ。回収培養物と命名されたこの培養物は、診断が完了する間、さらに6~9日間CO2インキュベーター内に静置する。この期間中に、依然として接着していない細胞は接着し、複製によって、異なる形態を有するコロニーの起源となることができる図1。本発明による多能性幹細胞の単離方法本発明による方法は、基礎的なステップとして、出生前診断手順の終了時の二次採収培養物からの、光学倒立顕微鏡を使用した観察による、図2aに例示した形状を示すコロニーの選択を含む。図2aに示すように、選択するコロニーは、似た形状のフィンガープリント皮膚紋理学を有するものである。特に、コロニーの形態は弓状arc皮膚紋理又はデルタ及び突起弓状tentedarc又はモノデルタ皮膚紋理に類似している。弓状arc又はデルタ線は互いに隣り合って波状となる一方で、突起弓状tentedarc又はモノデルタ線は弓状arcに類似であるが、その間に突起increasingstickが存在する2b。さらに、前記コロニーの細胞形態はフィブロプラストfibroplastに類似している。fHA-SCを得るためには、上記前記形状を示す2つのコロニーを含む培養物のみを選択して使用する。上記の前記コロニーのいずれも示さないすべての他の細胞培養物はsHA-SCの起源となる。選択した培養物中のChang培養培地を幹細胞特異的培地MSCGM、Lonza株式会社で交換し、いずれの場合でも上述したαMEM-Chang、DMEM、αMEMなどの他の幹細胞特異的培地も使用することができる。特異的培地中の上述したコロニーの細胞は、3回のinvitro継代培養のみの後で既に、培養物中に存在する細胞の95より多くに達する図3。選択した培養物は、invitroで、インキュベーター内、37°C、5のCO2中で、3日ごとに培地を交換して、さらに培養する。細胞凍結は、50の胎児血清Hyclone、幹細胞に特異的、10のジメチルスルホキシドを添加した培養培地を含有する混合物を使用して実施する。最初に細胞を-80°Cで3日間保存し、その後、液体窒素容器中に移す。例2例1の単離方法から得られた細胞の特徴づけ。複製時間の決定図4複製時間TDは方程式TD=t×log2/logNt/N0を使用して計算し、式中、N0は播種した細胞数を表し、NTは、時間tに回収された細胞数であるYouQ.ら、2009.J.Int.Med.Res.、37:105~112。複製時間は、以下の培養培地:Chang、DMEM、αMEM-Chang、MSCGM、αMEMを使用して、2つの異なる細胞量:1000、2000、5000及び10000個を用いて評価した。Chang、DMEM、αMEM、αMEM-Changを使用して得られた複製時間は非常に類似している一方で、MSCGM培地では異なる値が得られた。したがって、続いて例示したデータは、αMEM-Chang及びMSCGMを使用して得られた複製時間を指す。sHA-SCは、αMEM-Chang中では30±3時間、MSCGM中では36±4時間の複製時間を有しており、他方で、fHA-SCは、αMEM-Chang中では10±2時間、MSCGM中では14±3時間の複製時間を有している。異なる細胞量を使用した場合に有意な差異はなかった。FACSを使用した表現型の特徴づけ図5FACSを使用した表現型の特徴づけでは、細胞をモノクローナル抗体で標識し、EPICS細胞蛍光測定計及びEXPO32ADCソフトウェアBeckmanCoulterを使用して蛍光の読み取りを実施した。3×105個の細胞を、フルオレセインイソチオシアネートFITC又はフィコエリスリンPEとコンジュゲートしたモノクローナル抗体で標識した30分間、4°Cでインキュベーション。以下の抗体を使用した:HLAA、B、C、クラスIIDR、CD10、CD11b、CD14、CD29、CD34、CD38、CD44、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD117、OCT4、SSEA3、SSEA4。OCT4は核タンパク質であり、したがって、0.2のTritonX100を細胞透過処理に使用した。FACSを使用して得られた結果図5により、単離した細胞は、間葉系幹細胞マーカー及び一部の胚性マーカーについて陽性である一方で、造血起源の幹細胞の主なマーカーについて陰性であることが示されている。特に、細胞は、HLAA、B、C、CD10、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、SSEA4、OCT4について陽性である一方で、クラスIIDR、CD11b、CD14、CD34、CD38、CD49d、CD117、SSEA3について陰性である。未分化胚細胞中で多能性が発現されていることに特異的な一部の分子マーカーの決定は、逆転写酵素反応、続いてPCRRT-PCRによって実施する。約1×106個の細胞から、細胞蛍光測定計分析に使用したものと同じ回数の継代培養で、TRIZOLInvitrogenを使用した全RNAを抽出し、続いて、AppliedBiosystemのプロトコルに従って、OCT4、NANOG、SOX2、FGF5、FGF4、cMYC、KLF4、アルカリホスファターゼALP、Nodal及びβ-アクチン陽性対照のプライマーを使用して、RT-PCRを実施する。表1はRT-PCRに使用したプライマーの配列を示す。本発明者らが単離するすべての細胞系は、以下の表2の結果によって示される多能性マーカーを発現する。リアルタイムRT-PCRRT-PCR分析はMx3000P装置Stratagene、米国カリフォルニア州LaJollaを使用して実施する。反応は、SYBRGreenQPCRMasterMix2xStratageneを用いて、提案されたプロトコルに従って行う。すべての試料は、そのハウスキーピング遺伝子β-アクチンに基づいて標準化する。OCT4、NANOG、SOX2、KLF4遺伝子からのmRNAの相対的定量をsHA-SC及びfHA-SCについて実施する。主にfHA-SCによってsHA-SCよりも400倍高いレベルで発現されるKLF4を例外として、多能性遺伝子は細胞系中で同等に発現される。IDOの決定HA-SC1×106個の細胞を10μMのINFγ又は1μMのS1Pで終夜前処理する。IDOの決定を、定量的PCR図6d及びヒトモノクローナル抗体Milliporeを用いた免疫ブロッティングを使用して、mRNAについて実施する。結果はβ-チューブリンSigma-Aldrichの発現の決定によって標準化する。INFγ又はS1Pで誘導したIDOの機能的能力は、invitroで、トリプトファン加水分解の結果として酵素によって産生されるl-キヌレニンの濃度を測定dosingすることによって評価した。l-キヌレニン代謝物の濃度は、HPLCによって、Fallarinoらによって記載されているプロトコルに従って決定するFallarino,F.ら、2003、Nat.Immunol.、4:1206~1212。IDO1及びIDO2の決定は、以下のプライマーを使用して、RT-PCRによって評価する。図6Aは、IDO陽性対照及びβ-チューブリンと比較した、HA-SC中でのIDO発現の結果を示す。図6Bは胎盤及び絨毛幹細胞中のIDO発現の結果を示しており、図6CはIDO1及びIDO2を参照したRT-PCRを示し、図6Dはβ-アクチンによる正規化後のS1PIDO誘導を示す。1×106個の細胞から6時間の間に産生されたl-キヌレニンの平均量は0.2±0,00169μMである。TGFβ1の産生は、特異的ELISAキットAbnovaCorporationを使用して評価する。24時間かけてINFγで刺激したHA-SCは細胞増殖の増加を示す。ヨウ化プロピジウム試験を使用し、アポトーシス又は様々な段階の細胞サイクルに供された細胞のパーセンテージの評価を可能にして、以下が指摘されている:isHA-SCでは、アポトーシス細胞のパーセンテージは36から10へと減少した、iifHA-SCでは、アポトーシス細胞の基底パーセンテージは非常に低い、すなわち3であり、INFγで刺激した後、対照と比較して細胞のさらに5が分裂している。図7。24時間かけてS1Pで刺激したsHA-SCは、IDO発現を非処理細胞よりも15倍増加させる一方で、fHA-SCはより制限されたmRNAの増加を示す。例3NODマウスにおける幹細胞接種の効果に関する研究NODマウス自己免疫性糖尿病は、NOD/Mrk雌マウスの80において24週齢で起こる。血糖値<200mg/dl糖尿なし及び糖尿の存在下における350~400mg/dlに等しい血糖値少なくとも1週間安定してにより、前糖尿病性5~6及び糖尿病性>15週間状態が定義される。10日間を超えて血糖値を350~400mg/dlに維持したNODマウスは、一度も外因性インスリンで処置しなかった様々な実験中に体重が有意な様式で変化する。NODマウスを、経皮接種によってそれぞれ2×106又は5×106個のfHA-SCを用いて処置する。血中グルコース濃度を、上記報告したように週に1回処置したマウスにおいて監視した。HA-SC及び膵臓リンパ球浸潤の両方による典型的なマーカーの発現を、例2に記載のように細胞蛍光測定を使用して分析する。特に、膵臓試料を、膵臓レベルで特異的且つ十分に特徴づけられた白血球細胞浸潤を示す前糖尿病性の8~9週齢のNOD雌マウスから引き抜き採取する。担体のみで処置した群で示されるように図8、興味深いことに、HA-SCで処置したマウスは、CD4及びCD8T細胞の両方の浸潤の有意な低下を示した。また、同様の興味深い様式で、マウスではなくヒト幹細胞に特異的な抗体で染色することによって、炎症の起源となっている臓器レベルでの細胞の存在を証明することも可能である。接種した細胞は、一方ではベータ細胞の再生に寄与することができ、他方では、IDO及びTGF-β1などのサイトカインのように抗炎症経路の発現を介して、同じ部位で、やはり抗原特異的な様式で免疫応答を調節することができることを考慮すると、そのようなデータは非常に重要である。HA-SCのホーミングプロセスを実証するために、接種する細胞電気穿孔を、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを使用して形質移入するpGL4.51luc2/CMV/Neoベクター。24時間後に、そのように形質移入した細胞をマウスの尾側領域に接種し、ルシフェラーゼのみによって分解可能な適切な基質vivoglow、Promegaを動物に直接投与することによって監視する。続いて、蛍光シグナルを放射する陽性細胞をxenogenによって検出する。図9。例4比較実験sHA-SC及びfHA-SCを以下の論文中に報告されている実験条件下に供することによって、上述した著者らによって得られた表現型の特徴づけデータを、AFS及びAFMSCに関する文献データと比較する。-DeCoppiら、-KimらCellProlif、2007、40:75~90。-Sessaregoら、-Orcianiら-Tsaiらマーカーの発現に関する結果は表3及び4に報告されている。表3は、細胞蛍光測定によって評価した一部のマーカーの発現結果を比較する。H:高、L:低、ND:検出されず。パーセンテージの値は、集団中のマーカーを発現する細胞のパーセンテージを示す。表4は多能性分子マーカーの発現結果を比較する。1表面マーカー。DiPrimio及びTsaiによる単離手順を使用して、CD105陰性AFMSCが得られる。さらに、そのような細胞はCD90及びCD117に弱く陽性である。また、SassaregoらHaematolgica、93:339~346、2008によって記載されているように、低レベルのCD44及びCD105がAFMSCからも発現される。DeCoppiによって単離されたAFSとは対照的に、sHA-SCの一部の培養物を除いては、HA-SCはCD117タンパク質を発現しない。2細胞培養物の均一性。SassaregoらHaematolgica、93:339~346、2008は、その研究において単離した細胞系は、大きさ及び形態に関して異なる細胞部分集団を含有すると主張している。同様の結果が本発明者らによってsHA-SCに関して得られている一方で、fHA-SCは95均一であることが示されている。3分子マーカー。TsaiらHum.Reprod.、19:1450~1456、2004は、その研究において単離したAFSMCはOCT4のmRNAを発現するが、彼らは1つの部分集団中でのみタンパク質を検出することができる一方で、本発明者らは、OCT4タンパク質をすべてのHA-SC中で99のパーセンテージで検出することができると主張している図5b。4複製時間。HA-SC及びAFS及びAFMSCの同じ実験条件下での複製時間が評価されており、その比較によれば、すべての実験条件下で、sHA-SCはAFS及びAFMSCについて既に記載されているものに類似の30~36時間の平均複製時間を有する一方で、fHA-SCは、10~18時間の、すなわち他のものよりも著しく短い複製時間を有することが論じられている。Chang、DMEM、αMEMTsaiによって使用、αMEM-ChangDeCoppi及び多くの他の著者らによって使用培地を使用して得られた複製時間は非常に類似している一方で、MSCGM培地Orciani-DiPrimioによって使用では異なる結果が得られる。続いて例示したデータはαMEM-Chang及びMSCGMを使用して得られた複製時間を指す。sHA-SCは、αMEM-Chang中では30±3時間、MSCGM中では36±4時間の複製時間を有しており、他方で、fHA-SCは、αMEM-Chang中では10±2時間、MSCGM中では14±3時間の複製時間を有している。一部の著者は、複製時間は細胞濃度に応じて可変性であると主張しているSassaregoN.ら、2009、Haematologica、93:339~346。著者らは、2つの異なる細胞濃度を使用して成長時間を評価し、有意な差異はなかった。5免疫学的特性。HA-SCの革新的態様は、リンパ球特異的集団の分化に関連する免疫調節能力からなる。T.RoelenらHum.Immunol.2009、70:16~23は、IDOを産生するが、mRNAのみが検出可能でタンパク質は検出されないように非常に低いレベルで産生する、AFMSCの能力を記載している。逆に、HA-SCは、注目に値する基底レベルのIDO酵素IDO1又はIDO2を産生し、INFγの誘導後、発現レベルは樹状細胞又は胎盤由来細胞などの造血細胞系よりも高い値に達する。"