第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10速く分解し、かつ第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、単離された細胞を含む、組成物。第2のハイドロゲルが第1のハイドロゲルの周りに架橋されているか、または第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルの中に物理的に捕捉されている、請求項1記載の組成物。血管内皮増殖因子VEGF、酸性繊維芽細胞増殖因子aFGF、塩基性繊維芽細胞増殖因子bFGF、胎盤増殖因子PIGF、血小板由来増殖因子PDGF、レプチン、造血増殖因子HGF、VEGF受容体1VEGFR1、VEGFR2、骨形成タンパク質BMPファミリーのメンバー、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF、FMS様チロシンキナーゼ3リガンドFlt3リガンド、肝細胞増殖因子、ストロマ由来因子1SDF1、インスリン様増殖因子IGF、抗VEGF抗体、抗aFGF抗体、抗bFGF抗体、抗PIGF抗体、抗レプチン抗体、抗HGF抗体、抗VEGFR1抗体、抗VEGFR2抗体、抗PDGF抗体、抗BMP抗体、抗Flt3リガンド、抗IGF抗体からなる群より選択される生理活性因子をさらに含む、請求項1記載の組成物。前記細胞が、間葉系幹細胞、筋芽細胞、血管前駆細胞、胚性幹細胞もしくは誘導多能性幹細胞に由来する分化細胞、誘導多能性細胞、または繊維芽細胞から分化状態へ直接再プログラムされた細胞である、請求項1記載の組成物。第1のハイドロゲルがポロゲンを含む、請求項1記載の組成物。第1のハイドロゲルが20kPa~60kPaの弾性率を含む、請求項1記載の組成物。第2のハイドロゲルが、PHSRN、DGEA、またはRGDであるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項1記載の組成物。第2のハイドロゲルが、アルギン酸重合体鎖1本当たり2~10ペプチドの密度のRGDペプチドを含む、請求項1記載の組成物。第2のハイドロゲルが少なくとも40kPaの初期弾性率を含む、請求項1記載の組成物。第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物を対象へ投与する工程を含む、足場から哺乳動物対象の組織へ細胞を配備する方法であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10速く分解し、かつ該組成物が、投与の時点では孔を欠いており、対象への滞留後に孔を含むようになり、かつ第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、単離された細胞を含む、方法。第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物を対象へ投与する工程を含む、インビボで足場へ細胞を動員する方法であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10速く分解し、かつ該組成物が、投与の時点では孔を欠いており、対象への滞留後に孔を含むようになる、方法。第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10速く分解し、かつ第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、骨または軟骨の修復、再生、または形成の促進において使用するための生理活性因子を含む、組成物。生理活性因子が、BMP2、BMP4、またはRunXを含む、請求項12記載の組成物。第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、および骨前駆細胞からなる群より選択される単離された骨細胞を含む、請求項12記載の組成物。第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、単離された軟骨細胞を含み、単離された軟骨細胞が、軟骨芽細胞を含む、請求項12記載の組成物。単離された骨細胞が、自己または同種の細胞である、請求項14記載の組成物。第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10速く分解し、かつ第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、筋肉の修復、再生、または形成において使用するための生理活性因子を含む、組成物。生理活性因子がMyoDを含む、請求項17記載の組成物。第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および筋前駆細胞からなる群より選択される単離された筋細胞を含む、請求項17記載の組成物。単離された筋細胞が、自己または同種の細胞である、請求項19記載の組成物。第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10速く分解し、かつ第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、皮膚の修復、再生、または形成において使用するための生理活性因子を含む、組成物。生理活性因子がFGFを含む、請求項21記載の組成物。第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、繊維芽細胞、皮膚細胞、上皮細胞、または皮膚前駆細胞からなる群より選択される単離された皮膚細胞を含む、請求項21記載の組成物。単離された皮膚細胞が、自己細胞または同種細胞である、請求項23記載の組成物。ポロゲンの密度が、前記組成物の全体積の少なくとも50である、請求項5記載の組成物。発明の詳細な説明最近の数十年にわたり、生体適合性重合体は、細胞移植のための担体として機能する足場を形成するため、またはデバイスへ宿主細胞集団を動員するため、使用されてきた。一般に、乳酸グリコール酸共重合体PLGAなどのスポンジ、またはアルギン酸などの合成ハイドロゲルが、使用されている。しかしながら、いずれの材料のセットも、短所を有する。例えば、スポンジは、典型的には、血清タンパク質を吸収するため、材料からの接着タンパク質または接着ペプチド例えば、RGDの提示を制御することが困難である。また、スポンジ材料は、典型的には、注射に適用できず、埋め込みのために侵襲性の手術を必要とし、また、移植された細胞または宿主細胞を、初期には対立的である可能性のある例えば、炎症時に存在する好中球は幹細胞を攻撃する可能性がある宿主環境へ曝す。他方、合成ハイドロゲルは、典型的には、注射可能であり、最小限に侵襲性の送達を可能にし、タンパク質と相互作用しない。しかしながら、本明細書に記載された本発明以前には、ハイドロゲル中の孔サイズが、典型的には、真核細胞の直径よりはるかに小さかったため、移植された細胞集団を拡張させ、傷害組織を修復させるために移植された細胞を放出すること、またはデバイスへ宿主細胞を動員することは困難であった。本発明は、ハイドロゲル注射後にハイドロゲル内にインサイチューで孔を形成するための方法を含む。周囲ハイドロゲル内に封入された犠牲ポロゲンの分解を介して、インサイチューで孔が形成される。孔形成の動力学および開始は、ポロゲンを形成するために使用される材料を操作することにより制御され、細胞が、ポロゲン自体またはその周囲のハイドロゲルのいずれかへ封入される。実施例は、インビトロの幹細胞の配備、増殖、および分化を証明し、インビボの幹細胞の配備およびケモカインにより媒介される細胞動員も証明する。系は、このマトリックスにおける孔の形成を介して、重合体マトリックスからの細胞の配備、または重合体マトリックスへの局所的な細胞の動員の制御を媒介する。孔のサイズ、分布、および形成の動力学は、使用者によりあらかじめ定められ、孔の周囲のマトリックスの完全性は、このマトリックスの内部の細胞または生物学的因子と共に、不変である。従って、1注射可能であり;2使用者が、不溶性の合図insolublecueを使用して、細胞の運命を制御することを可能にし;かつ3細胞を配備するかまたは動員するため、時間経過とともに孔を形成する、材料を生成するための、ハイドロゲルの接着リガンド提示および/または弾性率即ち、堅さなどの不溶性の合図の使用が、本明細書に記載される。具体的には、本明細書に記載された方法は、孔形成相以後ポロゲンと呼ぶまたは非分解性もしくは緩徐分解性の相以後バルクと呼ぶのいずれかへ細胞が封入されることを可能にする過程を使用して、孔形成性ハイドロゲルを作出する。本発明は、細胞封入を可能にする孔形成性ハイドロゲルを作出するための一般化されたアプローチのための方法、および細胞のハイドロゲルからの配備またはハイドロゲルへの動員の動力学を制御するための手段を提供する。ハイドロゲルミクロビーズポロゲンが形成され、次に、第2のバルクハイドロゲルへ封入される。ポロゲンおよびバルクハイドロゲルを形成するために使用される重合体の組成は、変動し得る;しかしながら、ポロゲンは、バルクハイドロゲルより例えば、10、20、50、2倍、5倍、10倍、20倍、またはそれ以上急速に分解しなければならない。細胞または生理活性因子例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF、血管内皮増殖因子VEGFなどの増殖因子、凝縮オリゴヌクレオチド、例えば、CpG、またはプラスミドDNAは、ポロゲン相、バルクハイドロゲル相のいずれか、または両方の相へ任意で封入される。ポロゲンは、使用者によりあらかじめ定められた時間の経過とともにインサイチューで分解し、その時点で、細胞が放出されるか、または材料へ遊走してもよい。しかしながら、孔形成性ハイドロゲルは、初期には孔を欠くため、形成直後に機械的な支持を提供するのに有用である図1。細胞の放出または動員は、ポロゲン分解の動力学を制御することにより操作される。例えば、アルギン酸重合体はアルギン酸ジアルデヒドを生成するため酸化され、酸化度が増加するにつれ、放出される細胞の総数が増加する図2、図3。あるいは、ポロゲンを架橋するために使用される条件が、有意なポロゲン分解および細胞放出が起こり始める時点を操作するために改変される図2。さらに、宿主タンパク質との相互作用を容易にするかまたは阻害するため、ポロゲン化学を変化させることができる図5。細胞の放出および細胞の運命は、バルクハイドロゲルの生物物理学的特性および生化学的特性例えば、弾性率およびRGDなどのインテグリン結合接着ペプチドの密度を操作することにより制御される。例えば、孔形成、バルクハイドロゲルのRGD密度、およびバルクハイドロゲルの弾性は、全て、これらの材料における細胞増殖に影響する図2、図6。相互に分離したポロゲンおよびバルクの直交の加工orthogonalprocessingは、細胞の放出および細胞の運命を操作するために系を調整する能力を増強する。例えば、幹細胞系統拘束は、孔形成の動力学とは独立して、弾性率またはRGD密度を変動させることによりモジュレートされる。対照的に、マクロ多孔性材料を形成するために使用される他の技術例えば、溶媒に基づくポロゲンの抽出は、細胞封入と適合性でなく、典型的には、ポロゲン相およびバルク相の両方の物理的特性に影響する。急速分解性バルクハイドロゲル材料の物理的特性および生化学的特性は、分解の過程で連続的に変化する。これらのパラメーターは、細胞の運命を調節するため、バルク相を設計するために利用される。ハイドロゲル組成物ハイドロゲルは、親水性である重合体鎖のネットワークを含む。アクアゲルとも呼ばれるハイドロゲルは、時には、水が分散媒であるコロイドゲルとして見出される。ハイドロゲルは、高度に吸収性の999超の水を含有し得る天然または合成の重合体である。ハイドロゲルはまた、その高い含水量ゆえに、天然組織に極めて類似した柔軟性の程度を有する。ハイドロゲルは、架橋された重合体から構成される。例示的なハイドロゲルは、アルギン酸、ポリエチレングリコールPEG、PEGアクリレート、アガロース、および合成タンパク質、例えば、コラーゲンまたは改変タンパク質即ち、自己集合ペプチドに基づくハイドロゲルなどの、細胞封入と適合性の材料から構成される。例えば、市販のハイドロゲルには、細胞培養のための規定された三次元3D微小環境を作出するために使用される合成マトリックスである、BD商標PuraMatrix商標PeptideHydrogelが含まれる。例えば、ハイドロゲルは、完全にまたは部分的に生分解性である生体適合性重合体マトリックスである。ハイドロゲルを形成し得る材料の例には、アルギン酸およびアルギン酸誘導体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸グリコール酸共重合体PLGA、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、天然および合成の多糖、ポリペプチド、具体的には、ポリなどのポリアミノ酸、ポリヒドロキシブチレートおよびポリεカプロラクトンなどのポリエステル、ポリ無水物;ポリホスファジン、ポリ、ポリ、具体的には、ポリ、ポリPAM、ポリ、ポリなどの修飾スチレン重合体、プルロニックポリオール、ポリオキサマー、ポリ、ポリ結合したβDマンヌロン酸単量体M単位およびαLグルロン酸単量体G単位から構成され、それらの割合および重合体鎖上の連続的な分布は変動し得る。アルギン酸多糖は、二価カチオン例えば、Ca2、Mg2、Ba2に対する強力な親和性を有し、これらの分子に曝された時に安定したハイドロゲルを形成する高分子電解質系である。合成ハイドロゲルは、典型的には、注射可能であり、最小限に侵襲性の送達を可能にし、タンパク質と相互作用しない。従って、接着タンパク質または接着ペプチドの提示が正確に制御される。さらに、合成ハイドロゲルは、典型的には、細胞よりはるかに小さい孔メッシュサイズを有し<10nm、細胞は>10um、そのことは、宿主細胞が移植された細胞を攻撃するのを防止する。しかしながら、この小さな孔サイズは、移植された細胞が材料内に広範に増殖することも防止し、それが最終的に放出されて、様々な機能例えば、機能的な組織の再生または疾患組織の破壊に影響することも妨害する。ハイドロゲルおよびスポンジの望ましい特色を組み合わせるため、いくつかの技術が導入されている。例えば、硬いマイクロスフェアがハイドロゲルへ封入され、次いで、マクロ多孔性ハイドロゲルを残すため、それが溶媒例えば、アセトンで抽出されたり、凍結乾燥がマクロ多孔性ハイドロゲルを生成するために適用されたりしている。ハイドロゲルは、インビボで急速に分解して、宿主細胞を放出するよう修飾され得る。しかしながら、本明細書に記載された本発明以前には、非分解性または緩徐分解性材料成分の細胞封入との組み合わせを可能にするアプローチは存在しなかった。ハイドロゲル材料の機械的特性および生化学的組成は、細胞の運命に強く影響し、分解自体が細胞の運命を本質的に調節することができる。孔形成性組成物ハイドロゲルミクロビーズポロゲンが形成される。次に、ポロゲンは、非分解性であるかまたはポロゲンと比較して遅い速度で分解するバルクハイドロゲルへ封入される。細胞は、ポロゲンまたはバルクコンパートメントのいずれかへ任意で封入される。ハイドロゲル形成またはインビボの所望の部位への注射の直後には、複合材料は、孔を欠き、外科的充填剤として機能する。その後、ポロゲン分解により、インサイチューで孔が形成され、封入された細胞が、複合材料から離れて、周囲の組織または体内の遠隔の組織、例えば、リンパ節へ配備される。孔のサイズおよび分布は、ポロゲン形成、およびバルクハイドロゲルを形成する重合体との混合の間、制御される。あるいは、ハイドロゲルは、細胞を封入されずに注射され、孔形成は、バルク成分もしくはポロゲン成分のいずれかから放出されるケモカインと組み合わせて、またはそれとは独立して、宿主細胞を動員する手段として使用される。ポロゲンは、バルクハイドロゲルを形成するために使用される材料より急速に分解し、初期には、バルクハイドロゲル相を形成する重合体との混合に耐えるために十分に機械的に安定している限り、任意の生体適合性重合体から構成される。バルクは、任意のハイドロゲル形成性重合体から構成される。アルギン酸組成物組成物および方法において利用される重合体は、天然に存在するものであってもよいし、または合成により作成されたものであってもよい。一例において、ポロゲンおよびバルクハイドロゲルの両方が、アルギン酸から形成される。アルギン酸という用語は、本明細書において使用されるように、アルギン酸の多数の誘導体例えば、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、またはアルギン酸プロピレングリコールをさす。例えば、参照により本明細書に組み入れられるPCTUS9716890を参照のこと。ポロゲン形成に適したアルギン酸重合体は、5000~500000Daのダルトン分子量を有する。重合体は、急速分解を容易にするため、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム参照により本明細書に組み入れるBouhadiretal2001BiotechProg17945950による酸化により任意でさらに修飾される。下記実施例においては、ハイドロゲルミクロビーズを形成するため、二価カチオン例えば、Ca2またはBa2の槽への同軸気流による噴霧器を通した押し出しにより、重合体を架橋した。気流速度が高いほど、ポロゲン直径は小さくなる。ポロゲンを形成するために使用される二価イオンの濃度は、5~500mMで変動し得、重合体の濃度は、1重量~5重量で変動し得る。しかしながら、バルク相より有意に小さいポロゲンを作製する任意の方法が適切である。宿主タンパク質および細胞とのある程度の相互作用を有するポロゲンを作製するため例えば、糖残基の>5の程度に酸化されたアルギン酸は、宿主細胞と有意に相互作用する、図5、またはこの相互作用を阻害するため例えば、NaBH4により還元された酸化型アルギン酸は、タンパク質もしくは宿主細胞との最小限の相互作用を示す、図5、ポロゲン化学をさらに操作することができる。バルクハイドロゲルの形成に適したアルギン酸重合体は、5000~500000Daのダルトン分子量を有する。バルクハイドロゲルがポロゲンより緩徐に分解する限り、分解を容易にするため、重合体を例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化によりさらに修飾してもよい。細胞応答を制御するための生物学的な合図例えば、RGDなどのインテグリン結合接着ペプチドを提示するよう、重合体を修飾することもできる。細胞応答をさらに制御するため、オリゴヌクレオチド、増殖因子、または薬物などの生理活性因子を、ポロゲンまたはバルクハイドロゲルのいずれかへ封入することもできる。バルクハイドロゲルを形成するために使用される二価イオンの濃度は、5~500mMで変動し得、重合体の濃度は、1重量~5重量で変動し得る。バルク重合体の弾性率は、例えば、封入された細胞の運命を制御するため、調整される。実施例1:ハイドロゲル内でのインサイチューの孔形成画像化および機械的特性試験を介して証明される、ハイドロゲル内のインサイチュー孔形成が、図1に示される。図1Aに示されるように、急速分解性ハイドロゲル赤色の球から構成されたミクロビーズを、第2のハイドロゲル形成性重合体材料と混合し、それをビーズの周りに架橋させた。インサイチューのミクロビーズの分解の後、完全なハイドロゲルネットワーク桃色が、孔のネットワークと共に残った。標準ハイドロゲル左バーまたは孔形成性ハイドロゲル右バーの弾性率測定を決定した図1D。0日目には、孔が形成されていなかったため、孔形成性複合物と標準ハイドロゲルとの間に全体的な硬度の統計的有意差は存在しなかった;しかしながら、4日後、複合物の率は、孔形成のゆえに、実質的に下落する。本明細書に記載されたハイドロゲルの生成に関連した付加的な方法は、以下の通りである。BouhadiretalPolymer199940357584参照により本明細書に組み入れられるは、過ヨウ素酸ナトリウムによるアルギン酸の酸化を記載し、反応を特徴決定している。BouhadiretalBiotechnolProg20011794550参照により本明細書に組み入れられるは、アルギン酸ジアルデヒドアルギン酸ジアルデヒドは、アルギン酸内の糖のあるパーセント例えば、5がアルデヒドを形成するよう酸化されている高MWアルギン酸であるを形成するための高分子量アルギン酸の酸化、およびハイドロゲルを急速に分解させるための適用を記載している。KongetalPolymer200243623946参照により本明細書に組み入れられるは、グルロン酸GA含量を実質的に低下させることなく、グルロン酸GAリッチアルギン酸の重量平均分子量MWを低下させるための、ガンマ照射の使用を記載している例えば、ガンマ照射は、アルギン酸のマンヌロン酸、MAブロックを選択的に攻撃する。アルギン酸は、GAブロックおよびMAブロックから構成され、アルギン酸にその硬度弾性率を与えるのはGAブロックである。KongetalPolymer200243623946参照により本明細書に組み入れられるは、高MWGAリッチアルギン酸と、照射された低MW高GAアルギン酸との二成分組み合わせが、カルシウムにより架橋されて硬いハイドロゲルを形成するが、同一の全体重量濃度の高MWGAリッチアルギン酸のみから作成されたハイドロゲルより、急速に分解し、低い溶液粘性も有することを示している。AlsbergetalJDentRes2003829038参照により本明細書に組み入れられるは、照射された低MWGAリッチアルギン酸から作成されたハイドロゲルの分解プロファイルを、骨組織工学への適用と共に記載している。KongetalAdvMater200416191721参照により本明細書に組み入れられるは、ガンマ照射手法を酸化反応と組み合わせることによる、ハイドロゲル分解プロファイルの制御、および軟骨工学への適用を記載している。水素バイオマテリアルの分解を制御するための技術は、当技術分野において周知である。例えば、LutolfMPetalNatBiotechnol2003215138参照により本明細書に組み入れられるは、哺乳動物酵素MMPを介して分解するよう操作された、ポリに基づく材料を記載している。BryantSJetalBiomaterials200728297886US7192693B2;参照により本明細書に組み入れられるは、マクロスケールの孔を有するハイドロゲルを作製するための方法を記載している。孔鋳型例えば、ポリメタクリル酸メチルビーズをバルクハイドロゲル内に封入し、次いで、バルクハイドロゲルを完全なまま残して、ポロゲンを抽出するため、アセトンおよびメタノールを使用する。SilvaetalProcNatlAcadSciUSA20081051434752参照により本明細書に組み入れられる;US20080044900は、アルギン酸スポンジからの内皮前駆細胞の配備を記載している。スポンジは、アルギン酸ハイドロゲルを形成し、次いで、それを凍結乾燥することにより作成される氷晶が孔を形成する。これらの材料は、単独で送達された細胞と比較して細胞の治療効果を改善するが、これらの材料は、外科的に植え込まれなければならず即ち、注射不可能であり、細胞封入を適用できず細胞は凍結乾燥時に死滅するであろう、この方法は、弾性率を制御することにより細胞の運命を制御することを困難にする。AlietalNatMater2009参照により本明細書に組み入れられるは、樹状細胞を動員し、抗腫瘍応答を誘発するようプログラムするための、多孔性足場の使用を記載している。HuebschetalNatMater2010951826参照により本明細書に組み入れられるは、封入された間葉系幹細胞の分化を制御するための、ハイドロゲルの弾性率の使用を記載している。1注射可能であり;2使用者が不溶性の合図を使用して細胞の運命を制御することを可能にし;かつ3細胞を配備するかまたは動員するための孔を時間経過とともに形成する、材料を生成するための、ハイドロゲルの接着リガンド提示および/または弾性率即ち、堅さなどの不溶性の合図の使用が、本明細書に記載される。具体的には、本明細書に記載された方法は、孔形成相以後ポロゲンと呼ぶまたは非分解性もしくは緩徐分解性の相以後バルクと呼ぶのいずれかへ細胞が封入されることを可能にする過程を使用して、孔形成性ハイドロゲルを作出する。本明細書に記載された方法において、ポロゲンは、溶媒ではなく加水分解により分解する。このことは、細胞がポロゲンまたはその周りのバルクゲルのいずれかへ封入され、ゲルへ封入されたタンパク質またはその他の生理活性化合物が変性する確率は極めて低いことを意味する。以下に詳細に記載されるように、ポロゲンは、封入の間には完全性を保つが、急速に分解して、走査型電子顕微鏡検により可視である空隙を生じ、複合材料の弾性率および破壊靱性の損失をもたらした。具体的には、走査型電子顕微鏡写真SEMは、形成直後0日目の孔形成性ハイドロゲルは、ほぼ完全なネットワークを保有しているが;製作の10日後までに、有意な孔形成が観察されることを示した図1E。複合材料50ポロゲン体積分率の弾性率は、標準ハイドロゲルポロゲンなしの弾性率と実質的に異なっていなかった;しかしながら、空隙が形成されるにつれ、複合物の率は実質的に下落する図1Fおよび図1G。1週間目の複合物の弾性率の減少は、空隙の密度に対応し、低いポロゲン密度では、空隙の密度と複合物の弾性率の減少との間に直線的な関係が存在する。複合材料25ポロゲン体積分率の破壊靱性は、ポロゲンを含まない標準ハイドロゲルの破壊靱性に初期には類似していたが、初期値の数分の一にまで減少する図HおよびI。弾性率と同様に、破壊靱性の減少は、非直線的ではあるが、ポロゲンの密度と相関する。これらの結果は、ポロゲンが、封入の間には完全性を保ち、インサイチューで分解して空隙を形成することを証明している。実施例2:インビトロおよびインビボの細胞の放出分解性アルギン酸ポロゲンを、骨髄間質幹細胞D1と共に、高分子量バルクアルギン酸ゲルへ封入することにより、孔形成性ハイドロゲルを形成した。ポロゲンは、20mgmLアルギン酸ジアルデヒド高Mw高グルロン酸含量アルギン酸内のアルギン酸糖残基の75の理論上の酸化と、75mgmL高Mw高グルロン酸GA含量アルギン酸との二成分混合物により形成された。この重合体混合物を、重合体を架橋するため、01MCaCl2および01MHEPESの槽へ同軸窒素気流によりガラス噴霧器を通して押し出した。ポロゲンを、無血清細胞培養培地により徹底的に洗浄した。バルクハイドロゲルは、アルギン酸重合体1本当たり2個のRGDペプチドにより修飾された、20mgmL高Mw高GA含量アルギン酸で形成された。D1細胞およびポロゲンを、注射器を使用して、バルクハイドロゲル材料へ混合し、次いで、複合物を硫酸カルシウムで架橋した。インビトロでの時間経過とともにこの系から放出されたD1細胞の数が、図2に示される。1ポロゲンを形成するために使用されるCaCl2の濃度を制御することにより、2ポロゲンの組成酸化度を変動させることにより、そして3細胞の区画化ポロゲン内かバルクゲル内かを変動させることにより、放出の動力学を修飾することができた。具体的には、インビトロの間葉系幹細胞配備が、図2に例示される。幹細胞は、インビトロで孔形成性ハイドロゲルから放出され、この放出は、ポロゲンの組成の変動、および細胞をポロゲン内に区画化するかバルク内に区画化するか、によって調整され得た。細胞充実性および孔形成性ハイドロゲルからの流出に対するポロゲン密度0~80体積パーセントの効果は、図2Cに示される。具体的には、孔形成性ハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真において、インビトロの4~10日後、生存している間葉系幹細胞MSCカルセインAM、緑色または死細胞エチジウムホモダイマー、赤色について染色した。球状の細胞形態は、ナノ多孔性材料に限局している細胞を示し、短い時間枠では両方の材料に存在するが、より長い時間枠では標準ハイドロゲルにのみ存在する。ポロゲン体積密度の関数としての、12日後に放出されたMSCの累積数が、図2Dに示される。図2Dに示されるように、ポロゲンのサイズは、複合材料全体のサイズに関係する。具体的には、材料の完全性を保つためには、ポロゲン直径は、複合物全体の最も小さな寸法の<10である。ポロゲンの密度は、細胞動員および細胞放出の両方のため、全体積の10~80パーセント、例えば、全体積の15~75、20~70、25~65、30~60、または35~55である。好ましくは、ポロゲンの密度は、全体積の少なくとも50である。相互接続された空隙の形成の動力学、およびそれに対応する間葉系幹細胞放出の動力学を決定するため、物理学的研究およびインビトロ研究を実施したそれぞれ、図2Aおよび図2E。クローン由来の市販のマウス間葉系幹細胞株D1を、これらのインビトロの研究のために使用した。キャピラリーアッセイを、空隙の形成を査定するために使用した。簡単に説明すると、まず、緩衝液を飽和させた複合孔形成性ゲルを計量し、次いで、ペーパータオルでゲルの表面にそっと触れて水を吸い取った後、ゲルを再計量することにより、相互接続された空隙の密度を測定した。質量の相対変化に基づき、空隙分率を計算した。インビトロ細胞放出アッセイについては、孔形成性ハイドロゲルのバルク成分は、2RGDペプチドアルギン酸重合体により修飾されており、60kPaの弾性率を有していた。浸透極限;80を超える極めて高い分率のポロゲンが存在しない限り、最初の7日間で相互接続された空隙が形成された。浸透ポロゲン密度未満では、実質的な相互接続された空隙の形成は観察されなかった。ポロゲンへ封入されたD1細胞について、ポロゲン製作条件の関数としての、孔形成性ハイドロゲルのポロゲン相からのMSC配備の動力学が、図2Fに例示される。その後、マウスMSC株で、放出研究を実施した。全体孔密度、およびミクロンスケール限局の損失を反映する細胞形態の緩徐な変化に比例して、細胞放出が観察された。ハイドロゲル内の細胞充実性および細胞増殖に対する孔形成の効果を決定するための実験を実施した。カルセインAM染色を使用して、細胞充実性を定性的に決定し、Ki67発現についての免疫染色により定性的に、または3Hチミジン取り込みを測定することにより定量的に、増殖を決定した。孔形成性ハイドロゲルの全体に分布させたカルセインAM染色細胞の三次元再構築は、図2Bに提示される。孔形成性ハイドロゲルにおいては、細胞形態の実質的な変化が、遊走し増殖する細胞の能力を示しているが、標準ハイドロゲルにおいては、細胞は低密度で、円形のままであった。Ki67免疫蛍光は、孔形成性ハイドロゲルにおいて、標準ハイドロゲルと比較して、より高い細胞充実性、および増加した増殖を示した。3Hチミジン取り込みの定量分析は、RGD依存的に増強された細胞増殖を示した図2G。化学組成またはポロゲンを形成するために使用される架橋条件を変動させることにより、細胞放出の動力学がモジュレートされるか否かを決定するための研究を実施したBouhadirKHLeeKYAlsbergEDammKLAndersonKWMooneyDJDegradationofPartiallyOxidizedAlginateandItsPotentialApplicationforTissueEngineeringBiotechnolProg20011794550。図2Hは、細胞放出動力学が、細胞をポロゲンへ区画化するか、その周囲のバルクゲルへ区画化するかにより制御されたこと、およびより低い濃度のカルシウムで架橋されたポロゲンが、より緩徐に分解し、より遅い時点で細胞を放出したことを示している。ポロゲンを製作するために使用されるカルシウムの濃度が低いほど、架橋はより均質になった。一定のバルク成分2RGD重合体、60kPaおよび一定のポロゲン密度50で、ポロゲン組成を変動させて、孔形成性ハイドロゲルを形成した。アルギン酸重合体の理論上の酸化度を変動させることにより、ポロゲンの化学組成を操作した。酸化反応中の過ヨウ素酸ナトリウムとアルギン酸との比率を変動させることにより、酸化度を制御したBouhadir2001。20mgmL酸化型アルギン酸と、5mgmL未修飾高MWアルギン酸との二成分混合物を、ポロゲンを形成するために使用した。25~100mMCaCl2の槽において架橋することにより、ポロゲンを形成した。細胞放出に対するアルギン酸酸化度の効果が、図2Hに示される。ポロゲンを架橋するためのカルシウムのレベルが一定100mMの時、3から75へ酸化度を増加させると、放出される細胞の総数が実質的に増加し、酸化度を低下させると、細胞放出がわずかに遅延した。ポロゲンの酸化度が一定75の時、ポロゲンを架橋するために使用されるカルシウムの濃度を25mMから100mMへ増加させると、放出される細胞の総数が低下し、細胞放出の開始がわずかに遅延した。実施例3:インビボの間葉系幹細胞の配備、生着、および増殖の制御最後に、インビボのMSCの放出動力学を操作するために、孔形成性ハイドロゲルを使用し得るか否かを決定するためのインビボ研究を実施した。そのため、mCherryを発現するマウスMSCを、ヌードマウスへ皮下移植した。細胞の生着、増殖、および配備を、非侵襲性の蛍光画像化により観察した。これは、孔形成性ゲルが、生理食塩水で送達された細胞と比較して、生着を遅延させることのみならず、これらの材料が、最終的により大きな増殖をもたらすことを示した。ハイドロゲルは、孔が形成された後、増殖に適した微小環境を提供する。最後に、これらの材料が、インビボのMSCの放出および拡張を促進するのに有用であったため、ヒトMSCを、ヌードラットの頭蓋欠損を再生するために投与した。これは、初期の時点ですら、石灰化された骨の再生の改善をもたらした。具体的には、インビボ研究のため、D1細胞を、検出可能マーカー、例えば、mCherryまたは緑色蛍光タンパク質GFPを構成的に発現するよう修飾し、ポロゲンを含まない標準バルクゲル、孔形成性ハイドロゲルのいずれかへ封入するか、または生理食塩水と混合した。次に、細胞を18ゲージ針を通してヌードマウスの背部に注射した。IVIS系CaliperLifeSciences上で観察されたmCherry蛍光を介して、時間経過による細胞の放出および増殖をモニタリングした。これらのデータは、孔形成性ハイドロゲルからの細胞の放出および増殖が、標準ゲルより有意に多いことを明らかにした図3。さらに、単純な生理食塩水注射により送達された場合にも、細胞は増殖したが、孔形成性ハイドロゲルからの配備は、1局所的な細胞の送達および増殖の動力学を改変し、2実質的により多数の細胞を最終的に送達した図3。具体的には、ポロゲンの組成を変動させることにより、インビボの細胞放出の動力学を操作する能力を決定するための実験を実施した。図3に示されるように、ヌードマウスの皮下空間においてインビボで孔形成性ハイドロゲルから幹細胞を放出させた。標準ハイドロゲル左、100mMもしくは50mMCaCl2によりポロゲンが架橋された孔形成性ハイドロゲル中央、または生理食塩水右での注射の7日後または30日後に、2×106個のmCherry発現MSCを、ヌードマウスへ配備した。ハイドロゲルのバルク成分は、2RGD重合体鎖で修飾されていた。初期には、生理食塩水のみの条件においてより多くの細胞が生着したが、後の時点では、この条件ではより少ない細胞が生着し、孔形成性ハイドロゲルから放出された時、実質的に多い細胞が最終的に生着した。孔形成性ハイドロゲル、標準ハイドロゲル、または生理食塩水で注射されたmCherryMSCの細胞密度に比例する相対放射効率の定量化が、図3Bに示される。ポロゲンを架橋するために使用されるカルシウムの密度を減少させると、放出される細胞の全密度が実質的に減少し、配備の動力学がわずかに遅延した図3C;エラーバーはSEM、n=4~6である。ヒト間葉系幹細胞により媒介される骨再生を増強する、孔形成性ハイドロゲルの能力を、ヌードラット頭蓋欠損モデルにおいて証明した図3D。臨界サイズの欠損を、ヌードラットCharlesRiverの頭蓋において形成した。欠損形成直後に、市販のヒト間葉系幹細胞Lonzaを、生理食塩水細胞のみ、標準ハイドロゲル2RGDアルギン酸重合体、60kPa、または孔形成性ハイドロゲルのいずれかで、欠損空間へ移植した。図3Dの上列は、埋め込みの4週間後の頭蓋欠損部における新たな骨形成のマイクロコンピュータによる断層撮影分析の代表的な横断面を示す。孔形成性ハイドロゲルを介して細胞が送達された欠損部において、実質的に多くの新たな骨が形成された。埋め込み後12週間目の新たに形成された骨へのドキシサイクリン取り込み緑色は、孔形成性ハイドロゲルが、皮下組織の偽陽性染色ではなく、組織内の陽性ドキシサイクリン染色をもたらすことを証明している。実施例4:2種の異なる細胞集団の別個の時点におけるインビトロ放出孔形成性ハイドロゲルを、実施例1および2に記載されたようにして形成した。等しい数複合孔形成性ハイドロゲル1mL当たりおよそ106細胞のGFP発現筋芽細胞および成長内皮細胞OEC、血管前駆細胞を、この材料の別々のコンパートメントへ封入した。5日間のインビトロ培養の後、放出された細胞および組織培養プラスチックへ接着した細胞を、エチジウムホモダイマーEtD1;赤色により染色した。図4に示されるように、バルクゲルへ封入された細胞型は、より急速に配備された。配備のこのパターンは、GFP筋芽細胞より緩徐に遊走し、GFP筋芽細胞ほど広範に増殖しないOECですら起こった等しい数の両方の細胞型が添加された基質の分析に基づく;図4d。具体的には、異なる時点で別個の集団を放出するための孔形成性ハイドロゲルの使用は、図4に示される。孔形成性ハイドロゲルにおける4日間の培養の後の、組織培養プラスチックへ接着したGFP発現筋芽細胞および成長内皮細胞OECの蛍光顕微鏡写真が、図4A~4Cに示される。ここで、ポロゲンを形成するために使用される化学を変化させ、異なる細胞型を別個のコンパートメントに初めに置いた。図4Aは、バルク成分への筋芽細胞、ポロゲン成分へのOECを示し、図4Bは、ビーズ成分への筋芽細胞、ポロゲン成分へのOECを示している。図4Cは、バルク成分への筋芽細胞およびOECの両方を示している。等しい数のGFP筋芽細胞およびOECをプラスチック基質へ播種した図4D。筋芽細胞はOECよりも増殖した。細胞をエチジウムホモダイマー赤色で染色したため、GFP筋芽細胞は黄色に見え、OECは赤色に見える。実施例5:異なるポロゲン製剤を含む孔形成性ハイドロゲルによる皮下組織からの宿主リンパ球の動員孔形成性ハイドロゲルを、実施例1および2に記載されるようにして形成した。ポロゲン相を形成するため、75mgmLの高MwGAリッチアルギン酸重合体を、20mgmLのアルギン酸ジアルデヒド75の理論上の酸化度、またはアルデヒド基がアルコール基に還元されたアルギン酸ジアルデヒドのいずれかと組み合わせた。細胞が封入されていない孔形成性ハイドロゲルを、次に、C57BL6マウスまたはBalbcマウスの背部に注射した。14日後、宿主樹状細胞の動員を組織学的検査により観察した。以下に詳細に記載されるように、孔形成性ハイドロゲルを、ケモカインにより媒介される細胞動員のために利用した。最初は糖であったものをアルコール基に置換するため、アルギン酸を、まず酸化し、次いで、水素化ホウ素ナトリウムにより還元した。図5Aおよび図5Bは、標準分解性アルギン酸ハイドロゲルによる樹状細胞DC動員と、孔形成性アルギン酸ハイドロゲルによる樹状細胞DC動員との比較を示す。ハイドロゲルの両方のセットに、2ugの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を負荷した。これは、ハイドロゲル隣接組織画像の端に近い細胞充実性が高い区域からの、孔形成性ハイドロゲルへの細胞の浸潤の方が、実質的に多かったことを示している。図5Cおよび5Dは、GMCSFを含まないアルギン酸ジアルデヒド図5Cまたは還元型アルギン酸ジアルデヒド図5Dからポロゲンが形成された孔形成性ハイドロゲルへの基線DC侵入の比較を示す。GMCSFが存在しない場合には、実質的に少ない基線細胞浸潤が起こった。組織学的検査のため、樹状細胞がCD11c緑色およびNIHCII赤色について染色され、核がヘキストで対比染色されている青色。この図は、酸化型アルギン酸から形成されたポロゲンを含む材料による宿主細胞動員と、還元型アルギン酸から形成されたポロゲンを含む材料による宿主細胞動員との違いを示している。実施例6:バルク相組成を変動させることによる孔形成性ハイドロゲルにおける幹細胞増殖の制御このアプローチの目的は、不溶性の合図を使用して、細胞の拡張および放出を操作することである。従って、接着リガンドの密度、およびポロゲン周囲の非分解性ハイドロゲルの機械的特性が、細胞に対する効果を有するか否かを決定した。図6に示されるように、リガンドの密度は、DNA合成を有意に改変し、弾性率の改変は、1週間にわたりDNA合成および細胞放出の両方を改変した。図6Dに組織像により示されるように、接着リガンド密度などの不溶性の合図は、長い時間枠で、細胞に対する効果を有した。具体的には、孔形成性ハイドロゲルのバルク成分の組成が、インビボの細胞の増殖および生着をモジュレートするか否かを決定するための研究を実施した。60kPaの率を有するバルクゲルにおけるRGDペプチドの密度、または10RGDペプチドアルギン酸重合体を提示するバルクハイドロゲルの弾性率の関数としての、DNA合成に比例する間葉系幹細胞による24hr3Hチミジン取り込みD1;赤色曲線または7日間の培養の後の孔形成性ハイドロゲルからの累積的なMSC配備青色曲線の分析データは平均値SEM、n=3~5であるが、図6Aおよび6Bに示される。RGD密度は、細胞増殖に対する有意な効果を有し、弾性率は、増殖および放出の両方に対する効果を有したp<005、ANOVA。孔形成の関数としてのDNA合成の分析は、図6Cに示される。50日間の培養の後の、凍結切片化された孔形成性ハイドロゲルの中のD1細胞におけるKi67増殖マーカー、緑色についての染色が、図6Dに示される。配備された幹細胞の運命の、バルクハイドロゲルの組成を介した制御孔形成性ハイドロゲルを、実施例1に記載されるようにして形成した。バルクハイドロゲルの組成インテグリン結合RGDペプチドの密度および弾性率を操作することにより、インビトロの間葉系幹細胞MSCの増殖および放出を制御することが可能であった。インビボで、RGDペプチドの密度をアルギン酸重合体鎖1本当たり2ペプチドから10ペプチドへ増加させることにより、皮下空間へ配備されたmCherry標識マウスMSCの全体密度を増加させることができた図6E。治療的研究のため、ヒトMSCをヌードラットの頭蓋欠損部へ配備した。4週間後、ラットを安楽死させ、新たな骨形成による治癒の程度を、ヘマトキシリン/エオシン染色により査定した。簡単に説明すると、治癒パーセント計量を生成するため、欠損部内の新たに形成された骨の面積を、欠損部の全面積で割った。この定量的計量を使用して、孔形成性ハイドロゲルでのMSC送達が、新たな骨形成を誘導する能力に関して、標準ハイドロゲルまたは生理食塩水を介した送達より実質的に優れていることが見出された図6F。さらに、60kPa、10RGDアルギン酸重合体バルク相を含む孔形成性ハイドロゲルからの配備は、8kPa、10RGDアルギン酸重合体バルク相を含む孔形成性ハイドロゲルからの配備より、有意に多い骨形成をもたらしたようにp<005、両側t検定、バルクハイドロゲル成分の弾性率は、4週間目の新たな骨形成に対する実質的な効果を有していた。従って、mCherry標識D1を、孔形成性ハイドロゲルを介してヌードマウスの皮下組織へ配備した時、バルク成分のRGD密度が2RGDペプチドアルギン酸重合体から10RGDペプチドアルギン酸重合体へ増加すると、細胞配備動力学には有意に影響せずに、生着した細胞の総数が実質的に増加した。本明細書に記載されるように、本実施例は、細胞により媒介される組織再生に対するバルクハイドロゲルの弾性の効果を証明したが、バルクハイドロゲル相の他の多くの局面、例えば、マトリックスに結合した増殖因子またはそのペプチド模倣体の提示が、細胞により媒介される組織再生に影響を及ぼすために操作される。実施例7:二成分アルギン酸から形成されたハイドロゲルの機械的特性およびインビトロ分解20mgmLの一定の密度の酸化型アルギン酸5の理論上の酸化度と未修飾高MWアルギン酸との二成分組み合わせを架橋することにより形成されたバルクハイドロゲルの弾性率および分解が、図7Aおよび図7Bに示される。インビトロでの4日後の乾燥質量を、初期乾燥質量と比較することにより、分解を査定した。20mgmL酸化型アルギン酸と75mgmL未修飾アルギン酸との二成分混合物から形成されたポロゲンの直径は、図7Cに示される。ポロゲン直径は、アミノフルオレセイン標識アルギン酸から調製されたポロゲンの蛍光顕微鏡写真の処理により測定された。他の態様本発明を、その詳細な説明と共に記載したが、上記の説明は、本発明を例示するためのものであって、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の範囲を制限するためのものではない。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。本明細書において言及された特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書に引用された米国特許および公開されたまたは未公開の米国特許出願は、全て、参照により組み入れられる。本明細書に引用された公開された外国特許および特許出願は、全て、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に引用されたアクセッション番号により示されるGenbankおよびNCBIの寄託は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に引用されたその他の公開された参照、文書、原稿、および科学文献は、全て、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の好ましい態様を参照しながら、本発明を具体的に示し記載したが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細の様々な変化をそれらに施し得ることが、当業者には理解されるであろう。