"肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防する方法であって、前記肺炎連鎖球菌感染症が、Zn2及び/又はMn2の遊離濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境において生じており、薬学的に有効な量のPhtXタンパク質をヒト患者に投与する工程を含んでなる、上記方法。前記PhtXタンパク質がPhtA、PhtB、PhtD、及びPhtEからなる群より選択される、請求項1に記載の治療方法。前記PhtXタンパク質がPhtDである、請求項1に記載の方法。前記肺炎連鎖球菌感染症が血液中で生じる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。血液中のZn2の遊離濃度が、血清から測定したとき10nM、1nM、100pM、又は10pM未満である、請求項4に記載の方法。血液中のZn2の結合及び遊離濃度が、血清から測定したとき2若しくは1mg/L未満又は20μM未満である、請求項4に記載の方法。血液中のMn2の遊離濃度が、血清から測定したとき10nM、1nM、100pM、又は10pM未満である、請求項4に記載の方法。血液中のMn2の結合及び遊離濃度が、血清から測定したとき2若しくは1mg/L未満又は20μM未満である、請求項4に記載の方法。前記肺炎連鎖球菌感染症が肺で生じる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。肺中のZn2の遊離濃度が、気管支洗浄から測定したとき300、200、100、50、又は10μg/kg未満である、請求項9に記載の方法。肺中のMn2の遊離濃度が、気管支洗浄から測定したとき300、200、100、50、又は10μg/kg未満である、請求項9に記載の方法。肺組織中のZn2の濃度が、肺組織から測定したとき20、15、10、5、2、若しくは1μg/g未満、又は300、200、150、100、50、20又は10μM未満である、請求項9に記載の方法。前記肺炎連鎖球菌感染症が中耳で生じる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。中耳中のZn2の濃度が、300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2又は0.1μM未満である、請求項13に記載の方法。中耳中のMn2の濃度が、300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2又は0.1μM未満である、請求項13に記載の方法。前記肺炎連鎖球菌感染症が髄膜で生じる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。脳脊髄液中のZn2の濃度が、1.5、1、0.75、0.5、0.25、若しくは0.1μM未満、又は100、75、50、25、又は10μg/L未満である、請求項16に記載の方法。脳脊髄液中のMn2の濃度が、2.5、2、1.5、1、若しくは0.15μg/L未満、又は50、25、10、若しくは5nM未満である、請求項16又は17に記載の方法。気管支洗浄及び/又は血清試験により測定したとき、前記ヒト患者が低下したレベルのZn2及び/又はMn2を有する、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。前記ヒト患者がZn2及び/又はMn2を欠乏している、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。前記ヒト患者がストレスを受けている、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。前記ヒト患者が複数の細菌感染症を有する、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。前記ヒト患者が慢性細菌感染症を有する、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。前記慢性細菌感染症が肺炎球菌感染症である、請求項23に記載の方法。前記肺炎球菌感染症が、敗血症、菌血症、髄膜炎、中耳炎又は肺炎である、請求項1~24のいずれか一項に記載の方法。肺炎連鎖球菌感染症の治療又は予防において使用するための、薬学的に有効な量の単離PhtXタンパク質を含んでなる免疫原性組成物であって、前記肺炎連鎖球菌感染症が、Zn2及び/又はMn2の遊離濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境でヒト患者に生じる、上記免疫原性組成物。前記PhtXタンパク質がPhtA、PhtB、PhtD、及びPhtEからなる群より選択される、請求項26に記載の免疫原性組成物。前記PhtXタンパク質がPhtDである、請求項26に記載の免疫原性組成物。前記肺炎連鎖球菌感染症が血液中で生じる、請求項26~28のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。血液中のZn2の遊離濃度が、血清から測定したとき10nM、1nM、100pM、又は10pM未満である、請求項29に記載の免疫原性組成物。血液中のZn2の結合及び遊離濃度が、血清から測定したとき2若しくは1mg/L未満又は20μM未満である、請求項29に記載の免疫原性組成物。血液中のMn2の遊離濃度が、血清から測定したとき10nM、1nM、100pM、又は10pM未満である、請求項29に記載の免疫原性組成物。血液中のMn2の結合及び遊離濃度が、血清から測定したとき2若しくは1mg/L未満又は20μM未満である、請求項29に記載の免疫原性組成物。前記肺炎連鎖球菌感染症が肺で生じる、請求項26~33のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。肺中のZn2の濃度が、気管支洗浄から測定したとき300、200、100、50、又は10μg/kg未満である、請求項34に記載の免疫原性組成物。肺組織中のZn2の濃度が、肺組織から測定したとき20、15、10、5、2、若しくは1μg/g、又は300、200、150、100、50、20又は10μM未満である、請求項34に記載の免疫原性組成物。肺中のMn2の濃度が、気管支洗浄から測定したとき300、200、100、50、又は10μg/kg未満である、請求項34に記載の免疫原性組成物。前記肺炎連鎖球菌感染症が中耳で生じる、請求項26~30のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。中耳中のZn2の濃度が、300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2又は0.1μM未満である、請求項38に記載の免疫原性組成物。中耳中のMn2の濃度が、300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2又は0.1μM未満である、請求項38又は39に記載の免疫原性組成物。前記肺炎連鎖球菌感染症が髄膜で生じる、請求項1~3のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。脳脊髄液中のZn2の濃度が、1.5、1、0.75、0.5、0.25、若しくは0.1μM未満、又は100、75、50、25、又は10μg/L未満である、請求項41に記載の免疫原性組成物。脳脊髄液中のMn2の濃度が、2.5、2、1.5、1、若しくは0.5μg/L未満、又は50、25、10、若しくは5nM未満である、請求項41又は42に記載の免疫原性組成物。気管支洗浄及び/又は血液試験により測定したとき、前記ヒト患者が低下したレベルのZn2及び/又はMn2を有する、請求項26~43のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記ヒト患者がZn2及び/又はMn2を欠乏している、請求項26~44のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記ヒト患者がストレスを受けている、請求項26~45のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記ヒト患者が複数の細菌感染症を有する、請求項26~46のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記ヒト患者が慢性細菌感染症を有する、請求項26~47のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記慢性細菌感染が肺炎球菌感染症である、請求項48に記載の免疫原性組成物。前記肺炎連鎖球菌感染症が、敗血症、菌血症、髄膜炎、中耳炎又は肺炎である、請求項26~49のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防するための薬剤の製造における薬学的に有効な量の単離PhtXタンパク質の使用であって、前記肺炎連鎖球菌感染症が、Zn2及び/又はMn2の濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境でヒト患者に生じる、上記使用。前記PhtXタンパク質がPhtA、PhtB、PhtD、及びPhtEからなる群より選択される、請求項51に記載の使用。前記PhtXタンパク質がPhtDである、請求項51に記載の使用。前記肺炎連鎖球菌感染症が血液中で生じる、請求項51~53のいずれか一項に記載の使用。血液中のZn2の遊離濃度が、血清から測定したとき10nM、1nM、100pM、又は10pM未満である、請求項54に記載の使用。血液中のZn2の結合及び遊離濃度が、血清から測定したとき2若しくは1mg/L未満又は20μM未満である、請求項54に記載の使用。血液中のMn2の遊離濃度が、血清から測定したとき10nM、1nM、100pM、又は10pM未満である、請求項54に記載の使用。血液中のMn2の結合及び遊離濃度が、血清から測定したとき2若しくは1mg/L未満又は20、15、10、8、5、若しくは2μM未満である、請求項54に記載の使用。前記肺炎連鎖球菌感染症が肺で生じる、請求項51~58のいずれか一項に記載の使用。肺中のZn2の濃度が、気管支洗浄から測定したとき300、200、100、50、又は10μg/kg未満である、請求項59に記載の使用。肺組織中のZn2の濃度が、肺組織から測定したとき20、15、10、5、2、若しくは1μg/g未満、又は300、200、150、100、50、20若しくは10μM未満である、請求項59に記載の使用。肺中のMn2の濃度が、気管支洗浄から測定したとき300、200、100、50、又は10μg/kg未満である、請求項59に記載の使用。前記肺炎連鎖球菌感染症が中耳で生じる、請求項51~58のいずれか一項に記載の使用。中耳中のZn2濃度が、300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2又は0.1μM未満である、請求項63に記載の使用。中耳中のMn2濃度が、300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2又は0.1μM未満である、請求項63に記載の使用。前記肺炎連鎖球菌感染症が髄膜で生じる、請求項51~58のいずれか一項に記載の使用。脳脊髄液中のZn2の濃度が、1.5、1、0.75、0.5、0.25、若しくは0.1μM未満、又は100、75、50、25、若しくは10μg/L未満である、請求項66に記載の使用。脳脊髄液中のMn2の濃度が、2.5、2、1.5、1、若しくは0.5μg/L未満、又は50、25、10、若しくは5nM未満である、請求項66又は67に記載の使用。気管支洗浄及び/又は血液試験により測定したとき、前記ヒト患者が低下したレベルのZn2及び/又はMn2を有する、請求項51~68のいずれか一項に記載の使用。前記ヒト患者がZn2及び/又はMn2を欠乏している、請求項51~69のいずれか一項に記載の使用。前記ヒト患者がストレスを受けている、請求項51~70のいずれか一項に記載の使用。前記ヒト患者が複数の細菌感染症を有する、請求項51~71のいずれか一項に記載の使用。前記ヒト患者が慢性細菌感染症を有する、請求項51~72のいずれか一項に記載の使用。前記慢性細菌感染症が肺炎球菌感染症である、請求項73に記載の使用。前記肺炎球菌感染症が、敗血症、菌血症、髄膜炎、中耳炎又は肺炎である、請求項51~74のいずれか一項に記載の使用。特定の肺炎球菌性疾患を標的とすることができ、且つ肺炎球菌性疾患の特定の形態に対する最適な保護を提供することができるより優れた肺炎球菌ワクチンを開発する必要がある。したがって、Zn2及び/又はMn2の濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境において生じる肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防する方法であって、薬学的に有効な量のPhtXタンパク質をヒト患者に投与する工程を含んでなる方法を提供する。本発明の第2の態様では、肺炎連鎖球菌感染症の治療又は予防において使用するための、薬学的に有効な量の単離PhtXタンパク質を含んでなる免疫原性組成物であって、前記肺炎連鎖球菌感染症が、Zn2及び/又はMn2の濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境でヒト患者に生じる免疫原性組成物を提供する。本発明の第3の態様では、肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防するための薬剤の製造における薬学的に有効な量の単離PhtXタンパク質の使用であって、Zn2及び/又はMn2の濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境でヒト患者に生じる使用を提供する。本発明は、Zn2及び/又はMn2の濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境において生じる肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防する方法であって;薬学的に有効な量のPhtXタンパク質をヒト患者に投与する工程を含んでなる方法を提供する。Zn2及びMn2は、遊離又は結合の両方でヒトの体内に存在する。結合Zn2又はMn2は、アルブミン等のタンパク質に結合しており、これらイオンの大部分を占める。他方、少量の遊離Zn2又はMn2は、血液、リンパ、間質液又は脳脊髄液等の体液中に存在する。用語結合とは、アルブミン等のタンパク質に密接に会合しているイオンに関する。用語遊離とは、アルブミン等のタンパク質に密接に会合していないイオンに関する。このような遊離イオンの方が、肺炎連鎖球菌による取込みに利用されやすい。1つの実施形態では、本発明の方法は、Zn2及び/又はMn2の遊離濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境において生じる肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防する方法を提供する。1つの実施形態では、本発明の方法は、Zn2及び/又はMn2の結合及び/又は遊離濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境において生じる肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防する方法を提供する。本発明の目的のための用語少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現を上方制御するのに十分低いとは、Zn2及び/又はMn2結合及び/又は遊離のレベルが、aヒトの体内の等価な位置で通常みられるよりも低く、その結果、体内に存在する肺炎連鎖球菌における少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現レベルが、正常条件下におけるすなわち、平均的なZn2又はMn2レベルを有する個体における体内の等価な区画でみられる肺炎連鎖球菌におけるPhtXの発現レベルよりも高いか;あるいはb体内のZn2利用可能性の高い領域でみられるよりも低く、その結果、その箇所に存在する肺炎連鎖球菌における少なくとも1つのPhtXタンパク質の発現レベルが、同じ個体の体内のZn2利用可能性の高い領域でみられる肺炎連鎖球菌におけるPhtXの発現レベルよりも高いことを意味する。1つの実施形態では、Zn2の結合レベルが低下している。1つの実施形態では、Zn2の遊離レベルが低下している。状況aは、Zn2及び/又はMn2の全体的なレベルの減少を通じて実現し得るが、一方、状況bは、比較的低レベルのZn2及び/又はMn2を有する部位で生じる肺炎連鎖球菌感染症により実現し得る。PhtXタンパク質は、タンパク質のヒスチジントライアドファミリーのメンバーである。PhtXタンパク質は、場合により完全長タンパク質であるが、タンパク質の断片又は少なくとも1つの断片若しくは完全長のPhtXタンパク質を含む融合タンパク質であってもよい。肺炎連鎖球菌において発現するPhtXタンパク質は完全長タンパク質になるが、ヒト患者に投与されるPhtXタンパク質は、任意で、完全長PhtXタンパク質、PhtXタンパク質の断片、又は少なくとも1つのPhtXタンパク質若しくはその断片を含む融合タンパク質である。1つの実施形態では、PhtXタンパク質は、PhtA、PhtB、PhtD及びPhtEからなる群より選択される。1つの実施形態では、PhtXタンパク質はPhtDである。本発明は、ポリヒスチジントライアドファミリーPhtタンパク質のメンバー、その断片、又はその融合タンパク質に関する。PhtA、PhtB、PhtD又はPhtEタンパク質は、国際公開第00/37105号パンフレット又は国際公開第00/39299号パンフレットに開示されている配列例えば、PhtDについては、国際公開第00/37105号の配列番号4のアミノ酸配列1~838又は21~838と80、85、90、95、98、99又は100の同一性を共有するアミノ酸配列を有し得る。Phtポリヒスチジントライアドファミリーは、タンパク質PhtA、PhtB、PhtD及びPhtEを含む。前記ファミリーは、脂質化配列、恐らく金属若しくはヌクレオシド結合又は酵素活性に関与している、プロリンリッチ領域及び幾つかのヒスチジントライアドにより分離されている2つのドメイン、3~5つのコイルドコイル領域、保存されているN末端、及び不均一なC末端を特徴とする。これは試験した肺炎球菌の全ての株に存在する。また、他の連鎖球菌及びナイセリア属でも相同なタンパク質が見出されている。しかし、用語PhtA、B、D及びEは、上記又は下記引用に開示される配列を有するタンパク質に加えて、参照されるタンパク質と少なくとも90同一である配列相同性を有するその天然に存在する及び人工の変異体を指すと理解される。任意で、それは少なくとも95同一であるか、又は少なくとも97同一である。PhtXタンパク質に関して、PhtAは、国際公開第98/18930号パンフレットに開示されており、Sp36とも称されている。上述のように、それはポリヒスチジントライアドファミリーのタンパク質であり、LXXCのII型シグナルモチーフを有する。PhtDは、国際公開第00/37105号パンフレットに開示されており、Sp036Dとも称されている。上述のように、それもポリヒスチジントライアドファミリーのタンパク質であり、II型LXXCシグナルモチーフを有する。PhtBは、国際公開第00/37105号パンフレットに開示されており、Sp036Bとも称されている。PhtBファミリーの別のメンバーは、国際公開第00/17370号パンフレットに開示されているようなC3-分解ポリペプチドである。このタンパク質もポリヒスチジントライアドファミリーであり、II型LXXCシグナルモチーフを有する。例えば、免疫学的に機能的な等価物は、国際公開第98/18930号パンフレットに開示されているタンパク質Sp42である。PhtB切頭物約79kDは、国際公開第99/15675号パンフレットに開示されており、これもPhtXファミリーのメンバーであると考えられる。PhtEは、国際公開第00/30299号パンフレットに開示されており、BVH-3と称されている。任意のPhtタンパク質が本明細書において言及される場合、Phtタンパク質の免疫原性断片又はその融合物を使用することができることを意味する。例えば、PhtXへの言及は、任意のPhtタンパク質に由来する免疫原性断片又はその融合物を含む。PhtD又はPhtBへの言及は、例えば、国際公開第0198334号パンフレットにみられる通り、PhtDE又はPhtBEの融合物への言及でもある。本発明の治療法又は使用法は、完全長PhtXタンパク質、PhtXタンパク質の断片、又はPhtXタンパク質の少なくとも1つ若しくは2つの断片を含有している融合タンパク質の投与を含み得る。別々に又は融合タンパク質の一部としてPhtタンパク質の断片を使用する場合、各断片は、任意で、このようなポリペプチドの1以上のヒスチジントライアドモチーフ及び/又はコイルドコイル領域を含有する。ヒスチジントライアドモチーフは、配列HxxHxH式中、Hはヒスチジンであり、xはヒスチジン以外のアミノ酸であるを有するポリペプチドの部分である。コイルドコイル領域は、Coilsアルゴリズムにより予測される領域である。Lupus,Aら1991年Science252;1162-1164。1つの実施形態では、断片又は各断片は、少なくとも1つのコイルドコイル領域に加えて1以上のヒスチジントライアドモチーフも含む。1つの実施形態では、断片又は各断片は、正確に又は少なくとも2、3、4又は5つのヒスチジントライアドモチーフを含有する任意で、2以上のトライアド間にネイティブなPht配列を含むか、又はネイティブな肺炎球菌のトライアド内Pht配列、例えば、PhtDについては国際公開第00/37105号パンフレットの配列番号4に示されているトライアド内配列と50、60、70、80、90超又は100同一であるトライアド内配列を含む。1つの実施形態では、断片又は各断片は、正確に又は少なくとも2、3又は4つのコイルドコイル領域を含有する。1つの実施形態では、本明細書に開示するPhtタンパク質は、シグナル配列が結合している完全長タンパク質、シグナルペプチド例えばN末端の20アミノ酸が除去されている成熟した完全長タンパク質、Phtタンパク質の天然に存在する変異体、及びPhtタンパク質の免疫原性断片例えば、上記断片、あるいは国際公開第00/37105号パンフレット配列番号4、6、8又は10又は国際公開第00/39299号パンフレット配列番号2、4、6、8、10又は14中のアミノ酸配列に由来する少なくとも15、20、30、40、50、125、150、175、200、250、300、350、400、450又は500の隣接するアミノ酸を含むポリペプチドであって、国際公開第00/37105号パンフレット又は国際公開第00/39299号パンフレットにおける前記アミノ酸配列に特異的な免疫反応を誘発することができるポリペプチドを含む。1つの実施形態では、PhtXタンパク質は、国際公開第09/12588号パンフレットに記載されている断片、例えば、配列番号2、3、又は4の配列を含むかこれらからなる断片である。特に、本発明で使用する用語PhtDは、シグナル配列が結合している完全長タンパク質、シグナルペプチド例えばN末端の20アミノ酸が除去されている成熟した完全長タンパク質、天然に存在するPhtDの変異体、及びPhtDの免疫原性断片例えば、上記断片、あるいは国際公開第00/37105号パンフレット又は国際公開第00/39299号パンフレット中のPhtDアミノ酸配列に由来する少なくとも15又は20の隣接するアミノ酸を含むポリペプチドであって、国際公開第00/37105号パンフレット又は国際公開第00/39299号パンフレットにおける前記PhtDアミノ酸配列に特異的な免疫反応を誘発することができるポリペプチド例えば、PhtDについては、国際公開第00/37105号パンフレットの配列番号4又は国際公開第00/39299号パンフレットの配列番号14を含む。上述のPhtDの全ての形態を本発明で用いることができる。本発明の1つの実施形態では、治療又は予防の方法は、例えば、敗血症又は菌血症の治療又は予防については、患者の血液において増殖する肺炎連鎖球菌を対象とする。1つの実施形態では、血液中のZn2の遊離濃度は、血清から測定したとき、10nM、7nM、5nM、3nM、2nM、1nM、700pM、500pM、300pM、200pM、100pM、70pM、50pM、30pM、20pM、又は10pM未満である。標準手順を使用して血液サンプルから血清サンプルを調製し、黒鉛炉吸光度分光光度計GF-AASを使用してサンプルを分析することにより、又は原子吸光分析を使用することにより、例えばVistaAX-CCD同時ICP-AES分光計を使用することにより、Zn2のレベルを測定することができる。本発明の1つの実施形態では、血液中のZn2の結合及び遊離濃度は、血清から測定したとき、5、3、2、1、0.5、0.3、0.2又は0.1mg/L未満、あるいは20、18、15、12、10、8、5、3、2、1、0.5又は0.1μM未満である。標準手順を使用して血液サンプルから血清サンプルを調製し、黒鉛炉吸光度分光光度計GF-AASを使用してサンプルを分析することにより、又は原子吸光分析を使用することにより、例えばVistaAX-CCD同時ICP-AES分光計を使用することにより、Zn2のレベルを測定することができる。本発明の1つの実施形態では、血液中のMn2の遊離濃度は、血清から測定したとき、10nM、7nM、5nM、3nM、2nM、1nM、700pM、500pM、300pM、200pM、100pM、70pM、50pM、30pM、20pM、又は10pM未満である。標準手順を使用して血液サンプルから血清サンプルを調製し、原子吸光分析を使用してサンプルを分析することにより、例えばVistaAX-CCD同時ICP-AES分光計を使用することにより、Mn2のレベルを測定することができる。本発明の1つの実施形態では、血液中のMn2の結合及び遊離濃度は、血清から測定したとき、5、3、2、1、0.5、0.3、0.2又は0.1mg/L未満、あるいは20、18、15、12、10、8、5、3、2、1、0.5、0.2又は0.1μM未満である。標準手順を使用して血液サンプルから血清サンプルを調製し、原子吸光分析を使用してサンプルを分析することにより、例えばVistaAX-CCD同時ICP-AES分光計を使用することにより、Mn2のレベルを測定することができる。本発明の1つの実施形態では、治療又は予防の方法は、例えば、肺炎の治療又は予防については、患者の肺において増殖する肺炎連鎖球菌を対象とする。1つの実施形態では、肺中のZn2の遊離濃度は、気管支洗浄から測定したとき、300、200、100、80、50、20、10、5、3又は1μg/kg未満である。1つの実施形態では、肺中のMn2の遊離濃度は、気管支洗浄から測定したとき、300、200、100、80、50、20、10、5、3又は1μg/kg未満である。任意で、Zn2又はMn2のレベルは、肺組織から測定するとき、肺組織中のZn2又はMn2の濃度が、20、15、10、5、2又は1μg/g、あるいは300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0.5又は0.1μM未満である組織サンプルから測定される。同様に、組織サンプル中のイオンのレベルは、原子吸光分析により、例えばVistaAX-CCD同時ICP-AES分光計を使用することにより測定することができる。1つの実施形態では、肺炎連鎖球菌感染症は、耳、例えば中耳の区画において、例えば中耳炎感染症として生じる。1つの実施形態では、中耳におけるZn2及び/又はMn2のレベルは、300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2又は0.1μM未満である。1つの実施形態では、肺炎連鎖球菌感染症は、髄膜において、例えば髄膜炎感染症として生じる。1つの実施形態では、脳脊髄液におけるZn2の濃度は、1.5、1、0.75、0.5、0.25又は0.1μM未満、あるいは100、75、50、40、25又は10μg/L未満である。1つの実施形態では、脳脊髄液におけるMn2の濃度は、2.5、2、1.5、1又は0.5μg/L未満、あるいは50、25、10又は5nM未満である。本発明の1つの実施形態では、ヒト患者は、気管支洗浄及び/又は血液検査によって測定したとき、Zn2及び/又はMn2のレベルが低下していた。レベルが低下しているとは、気管支洗浄又は血液検査によって測定したときのZn2及び/又はMn2のレベルが平均的なヒトのレベル未満であることを意味する。本発明の1つの実施形態では、PhtXで治療されるヒト患者は、Zn2及び/又はMn2が欠乏している。すなわち、Zn2及び/又はMn2のレベルが、体液、例えば、血清、脳脊髄液、間質液、気管支洗浄における通常のレベルの90、80、70、60、50、40、30、20、10、5又は1未満である。1つの実施形態では、ヒト患者はストレスを受けている。ストレスを受けた患者は、体内、例えば、血液、間質液、脳脊髄液及び/又はリンパにおけるZn2及び/又はMn2のレベルがより低下している。1つの実施形態では、ヒト患者は、菌株、例えば、肺炎連鎖球菌S.pneumoniae、髄膜炎菌N.meningitidis、インフルエンザ菌H.influenzae、黄色ブドウ球菌S.aureus、表皮ブドウ球菌S.epidermidis、クロストリジウムディフィシレC.difficile、A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、及び/又はカタル球菌M.catarrhalisの株の感染経験により、体内のZn2及び/又はMn2レベルがより低下している。感染経験は、任意で慢性細菌感染である。1つの実施形態では、PhtX、例えば、PhtDの投与は、敗血症、菌血症、髄膜炎、中耳炎又は肺炎の形態の肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防するためである。また、PhtXタンパク質は、本発明の方法又は使用において更なる抗原と有益に組合せてもよい。組合せるとは、キャリアタンパク質、又は遊離タンパク質、又は2つの混合物のいずれかとして、以下の組合せの中からタンパク質の全てを含む免疫原性組成物を意味する。例えば、下記のような2つのタンパク質の組合せでは、両方のタンパク質をキャリアタンパク質として使用してもよく、両方のタンパク質が遊離タンパク質として存在してもよく、両方がキャリア及び遊離タンパク質として存在してもよく、一方がキャリア及び遊離タンパク質として存在し、他方がキャリアタンパク質のみ又は遊離タンパク質のみとして存在してもよく、一方がキャリアタンパク質として存在し、他方が遊離キャリアタンパク質として存在してもよい。3つのタンパク質を組合せる場合、類似の可能性が存在する。組合せとしては、PhtDNR1xR2、PhtDNR1xR2-Sp91C末端のキメラ又は融合タンパク質、PhtDPly、PhtDSp128、PhtDPsaA、PhtDPspA、PhtANR1xR2、PhtANR1xR2-Sp91C末端のキメラ又は融合タンパク質、PhtAPly、PhtASp128、PhtAPsaA、PhtAPspA、R1xR2PhtD、R1xR2PhtAが挙げられるが、これらに限定されない。任意で、NR1xR2又はR1xR2はCbpA又はPspCに由来する。任意で、それはCbpAに由来する。他の組合せとしては、PhtDNR1xR2Ply及びPhtANR1xR2PhtD等の3つのタンパク質の組合せが挙げられる。1つの実施形態では、ワクチン組成物は、キャリアタンパク質として解毒されたニューモリシン及びPhtD又はPhtDEを含む。更なる実施形態では、ワクチン組成物は、遊離タンパク質として解毒されたニューモリシン及びPhtD又はPhtDEを含む。1つの実施形態では、タンパク質の組合せは、PhtD及びニューモリシン又はPhtD及び解毒されたニューモリシンを含む。1つの実施形態では、本発明の方法又は使用は、PhtD、解毒されたニューモリシン、及び少なくとも1つの肺炎連鎖球菌の莢膜糖の組合せを使用し、好ましくはキャリアタンパク質にコンジュゲートしている。1つの態様では、本発明は、PhtXタンパク質と、異なる肺炎連鎖球菌の血清型に由来する糖類を含有する少なくとも4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、17、18、又は20の肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートとを含む免疫原性組成物を提供する。このような実施形態では、少なくとも1つの糖は、PhtD等のPhtXタンパク質又はその融合タンパク質にコンジュゲートしており、免疫原性組成物は、PhtX、例えばPhtDに対する有効な免疫反応を誘発することができる。本発明の更なる態様では、免疫原性組成物は、異なる肺炎連鎖球菌の血清型に由来する糖類を含有する少なくとも4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、17、18、又は20の肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートと、遊離又はコンジュゲートしていないタンパク質としてPhtXタンパク質、例えばPhtDとを含む。1つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ニューモリシンを含む。ニューモリシンは、例えば化学処理、又は少なくとも1つのアミノ酸の突然変異によって解毒されることが好ましい。本発明は、更に、薬学的に許容しうる賦形剤及び/又はアジュバントを含有する免疫原性組成物を提供する。本発明の免疫原性組成物は、特に高齢者集団における使用だけではなく幼児集団における使用を意図するとき、アジュバントを添加してもよい。好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル又はリン酸アルミニウム又はアラム等のアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、マグネシウム、鉄又は亜鉛等の他の金属塩であってもよい。アジュバントは、任意で、TH1型の応答の優先的な誘導因子であるように選択される。このような高レベルのTh1型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞媒介性免疫反応を誘導する傾向があるが、高レベルのTh2型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫反応を誘導する傾向がある。Th1型免疫反応とTh2型免疫反応との区別は絶対的ではない。実際には、個体は、主にTh1又は主にTh2であると説明される免疫反応を支持する。しかし、Mosmann及びCoffmanMosmann,T.R.及びCoffman,R.L.1989年TH1andTH2cells:differentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalproperties.AnnualReviewofImmunology,7,p145-173によってマウスCD4veT細胞クローンに記載されている観点からはサイトカインのファミリーを考慮することが多くの場合便利である。従来より、Th1型応答は、Tリンパ球によるINF-γ及びIL-2サイトカインの産生に関係している。Th1型免疫反応の誘導に直接関連していることが多い他のサイトカインは、IL-12等のT細胞によって産生されるものではない。対照的に、Th2型応答は、Il-4、IL-5、IL-6、IL-10の分泌に関係している。主にTh1応答を促進する好適なアジュバント系としては以下が挙げられる:モノホスホリルリピドA又はその誘導体又は一般的には解毒されたリピドA、例えば国際公開第2005107798号パンフレットを参照されたい、特に3-de-O-アシル化モノホスホリルリピドA3D-MPL調製については、英国特許出願公開第2220211A明細書を参照されたい;及びモノホスホリルリピドA、任意で3-de-O-アシル化モノホスホリルリピドAと、アルミニウム塩例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム又は水中油型エマルションのいずれかとの組合せ。このような組合せでは、抗原及び3D-MPLが同じ微粒子構造に含有されているので、抗原性及び免疫賦活性シグナルをより効率的に送達することが可能になる。3D-MPLがアラム吸着抗原の免疫原性を更に増強できることが研究により示されている[Thoelenら、Vaccine1998年16:708-14;欧州特許第689454-B1号明細書]。増強された系は、モノホスホリルリピドA及びサポニン誘導体の組合せ、特に国際公開第94/00153号パンフレットに開示されているQS21及び3D-MPLの組合せ、又は国際公開第96/33739号に開示されているQS21がコレステロールでクエンチされている反応性の低い組成物を含む。水中油型エマルション中にQS21、3D-MPL及びトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤が、国際公開第95/17210号パンフレットに記載されている。1つの実施形態では、免疫原性組成物は、更にサポニンを含み、それはQS21であってよい。また、前記製剤は、水中油型エマルション及びトコフェロールを含んでもよい国際公開第95/17210号パンフレット。また、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド国際公開第96/02555号パンフレット及び他の免疫調節性オリゴヌクレオチド国際公開第0226757号パンフレット及び国際公開第03507822号パンフレットも、TH1応答の優先的な誘導因子であり、本発明で使用するのに好適である。水中油型エマルションアジュバントは、それ自体、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており欧州特許第0399843B号明細書、また水中油型エマルション及び他の活性剤の組合せは、ワクチン用のアジュバントとして記載されている国際公開第95/17210号パンフレット;国際公開第98/56414号パンフレット;国際公開第99/12565号パンフレット;国際公開第99/11241号パンフレット。油中水型エマルション米国特許第5,422,109号明細書;欧州特許第0480982B2号明細書及び水中油中水型エマルション米国特許第5,424,067号明細書;欧州特許第0480981B号明細書等の他のオイルエマルションアジュバントが記載されている。これらは全て、本発明のアジュバント及び組成物を形成するためにオイルエマルション系特にトコールを組込む場合を形成する。1つの実施形態では、オイルエマルション例えば、水中油型エマルションは、TWEEN80等の乳化剤及び/又はコレステロール等のステロールを更に含む。1つの実施形態では、オイルエマルション場合により、水中油型エマルションは、スクアラン、スクアレン又はαトコフェロール等のトコフェロール等の代謝可能な非毒性油及び任意でスクアレン及びαトコフェロールの両方、及び任意でTween80等の乳化剤又は界面活性剤を含む。また、ステロール例えばコレステロールを含んでいてもよい。水中油型エマルションを製造する方法は、当業者に周知である。一般に、方法は、トコール含有油相をBS/TWEEN80商標溶液等の界面活性剤と混合し、次いで、ホモジナイザーを使用して均質化することを含む。混合物を注射針に2回通すことを含む方法が、少量の液体を均質化するのに好適であることが当業者には明らかであろう。同様に、6barの最大圧力入力約850barの出力圧力で2分間、最大50パス、マイクロ流体装置M110Sマイクロ流体装置における乳化プロセスを、より少量又はより大量のエマルションを製造するために当業者が適合させることができる。この適合は、必要とされる直径の油滴の調製物が得られるまで、得られたエマルションを測定することを含むルーチンな実験により行うことができる。水中油型エマルションでは、油及び乳化剤は水性担体中に存在すべきである。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であってよい。安定な水中油型エマルション中にみられる油滴の大きさは、光子相関分光法によって測定したとき、任意で1ミクロン未満であり、実質的に30~600nmの範囲であってよく、任意で実質的に直径約30~500nmであり、任意で実質的に直径150~500nmであり、特に直径約150nmである。この点では、油滴の数の80が上記範囲内でなければならず、任意で油滴の数の90超、任意で95超が、規定の大きさの範囲内である。本発明のオイルエマルション中に存在する成分の量は、従来、総投与体積の0.5~20又は2~10のスクアレン等の油;及び存在する場合、2~10のαトコフェロール;並びに0.3~3のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の界面活性剤である。任意で、油例えばスクアレン:トコール例えばα-トコフェロールの比率は1以下であるが、その理由は、これがより安定なエマルションを提供するためである。また、Tween80又はSpan85等の乳化剤が、約1のレベルで存在してもよい。場合によって、本発明のワクチンは安定剤を更に含有することが有利である場合もある。エマルション系の例は、国際公開第95/17210号パンフレット、国際公開第99/11241号パンフレット、及び国際公開第99/12565号パンフレットに記載されており、これらは、任意で免疫賦活剤QS21及び/又は3D-MPLと共に製剤化される、スクアレン、α-トコフェロール、及びTWEEN80に基づくエマルションアジュバントについて開示している。したがって、本発明の1つの実施形態では、本発明のアジュバントは、LPS若しくはその誘導体及び/又はサポニン等の更なる免疫賦活剤を更に含んでもよい。更なる免疫賦活剤の例は、本明細書及びVaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach1995年,PharmaceuticalBiotechnology,第6巻,Powell,M.F.及びNewman,M.J.編,PlenumPress,NewYorkandLondon,ISBN0-306-44867-Xに記載されている。全身又は粘膜経路を介して前記ワクチンを投与することにより、本発明の免疫原性組成物を含有するワクチン調製物を用いて、感染症に罹患しやすい哺乳類を保護するか治療することができる。これら投与は、筋肉内IM、腹腔内IP、皮内ID又は皮下SCの経路を介して;あるいは粘膜投与を介して、口道/消化管、呼吸管、尿生殖器管に注入することを含み得る。肺炎又は中耳炎を治療するためのワクチンの鼻腔内IN投与も可能である肺炎球菌の鼻咽頭保菌をより有効に予防することができるので、最も早い段階で感染症が緩和されるため。本発明のワクチンは、単回用量として投与してもよく、またその成分を同時に又は異なる時点で共投与してもよい例えば、肺炎球菌の糖コンジュゲートは、別々に、同時に、又は互いに対する免疫反応を最適に協調させるためにワクチンの任意の細菌タンパク質成分を投与した1~2週間後に投与してよい。共投与の場合、任意のTh1アジュバントは、異なる投与のいずれか又は全てに存在し得る。1つの投与経路に加えて、2つの異なる投与経路を使用してもよい。例えば、糖類又は糖類コンジュゲートは、IM又はID投与してもよく、また、細菌タンパク質は、IN又はID投与してもよい。更に、本発明のワクチンは、初回抗原投与はIN投与し、追加抗原投与はIM投与してもよい。ワクチン中のタンパク質抗原の含有量は、典型的に、1~100μg、任意で5~50μgの範囲、例えば、5~25μgの範囲である。初回ワクチン接種に続いて、被験体に1回又は適切な間隔で数回の追加免疫を行ってもよい。ワクチン調製物は、一般に、VaccineDesignThesubunitandadjuvantapproachPowellM.F.NewmanM.J.編1995年PlenumPressNewYorkに記載されている。リポソームへのカプセル化については、Fullertonにより米国特許第4,235,877号に記載されている。本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、溶液で保存してもよく、凍結乾燥させてもよい。1つの実施形態では、スクロース、トレハロース、グルコース、マンノース、麦芽糖又はラクトース等の非晶質の凍結保護剤lyoprotectantとして作用する糖の存在下で溶液を凍結乾燥させる。1つの実施形態では、非晶質の凍結保護剤として作用する糖、及びグリシン又はマンニトール等のケーキ構造を改善する増量剤の存在下で溶液を凍結乾燥させる。結晶質増量剤の存在により、高塩濃度の存在下で凍結乾燥周期を短くすることができる。本発明の免疫原性組成物又はワクチンの凍結乾燥で使用されるこのような混合物の例としては、スクロース/グリシン、トレハロース/グリシン、グルコース/グリシン、マンノース/グリシン、マルトース/グリシン、スクロース/マンニトール/トレハロース/マンニトール、グルコース/マンニトール、マンノース/マンニトール及びマルトース/マンニトールが挙げられる。典型的に、2つの成分のモル比は、任意で1:1、1:2、1:3、1:4、1:5又は1:6である。本発明の免疫原性組成物は、任意で、上記凍結乾燥試薬を含む。上記安定剤及び安定剤の混合物は、ポリビニルピロリドンPVP、ヒドロキシエチルデンプン又はデキストラン等の製剤のガラス転移温度Tg’を上昇させることができるポリマー、又は、例えば1500~6000の分子量を有するポリエチレングリコールPEG及びデキストラン等の結晶質増量剤として作用するポリマーを更に含んでもよい。本発明の免疫原性組成物は任意の経路で投与することができるが、記載されているワクチンの皮膚への投与IDが、本発明の1つの実施形態を形成する。ヒトの皮膚は、表皮を覆う角質層と呼ばれる外部の角質クチクラを含む。この表皮の真下に、真皮と呼ばれる層があり、それは、次に皮下組織を覆う。研究者らは、皮膚、特に真皮へのワクチン注入が免疫反応を刺激することを示し、これも多くの更なる利点に関係している可能性がある。本明細書に記載するワクチンの皮内接種は、本発明の任意の特徴を形成する。皮内注射の従来の技術であるmantoux手順は、皮膚を清浄にし、次いで、一方の手で伸ばし、ゲージの小さな針26~31ゲージの斜面を針の上方に向けた状態で10~15°の角度で針を挿入する工程を含む。一旦針の斜面を挿入すると、針の注射外筒を下げ、僅かに加圧しながら更に進めて、それを皮膚の下で上昇させる。次いで、液体を非常にゆっくりと注入し、それによって、皮膚表面に水疱又は隆起が形成され、次いで、針をゆっくりと引き抜く。より近年では、皮膚に又は皮膚を貫通して液剤を投与するために特別に設計された装置が報告されており、例えば、国際公開第99/34850号パンフレット及び欧州特許第1092444号明細書に記載されている装置、また国際公開第01/13977号パンフレット;米国特許第5,480,381号明細書、米国特許第5,599,302号明細書、米国特許第5,334,144号明細書、米国特許第5,993,412号明細書、米国特許第5,649,912号明細書、米国特許第5,569,189号明細書、米国特許第5,704,911号明細書、米国特許第5,383,851号明細書、米国特許第5,893,397号明細書、米国特許第5,466,220号明細書、米国特許第5,339,163号明細書、米国特許第5,312,335号明細書、米国特許第5,503,627号明細書、米国特許第5,064,413号明細書、米国特許第5,520,639号明細書、米国特許第4,596,556号明細書、米国特許第4,790,824号明細書、米国特許第4,941,880号明細書、米国特許第4,940,460号明細書、国際公開第97/37705号パンフレット及び国際公開第97/13537号パンフレットに記載されているジェット式注射装置である。ワクチン調製物の皮内投与の代替方法としては、従来の注射器及び針、又は固体ワクチンを弾道的に送達するために設計された装置国際公開第99/27961号パンフレット、又は経皮的貼付剤国際公開第97/48440号パンフレット;国際公開第98/28037号パンフレット;又は皮膚表面への塗布経皮的transdermal又は経皮膚的transcutaneous送達、国際公開第98/20734号パンフレット;国際公開第98/28037号パンフレットを挙げることができる。本発明における用語含むcomprising、comprise、及びcomprisesは、いかなる場合においても、用語なるconsistingof、consistof、及びconsistsofと任意で置換可能であることを本発明者らは意図している。本発明のワクチン組成物に関する本発明の実施形態は、本発明の免疫原性組成物に関する実施形態にも適用可能であり、逆も同様である。本明細書に引用する全ての参考文献又は特許出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。より深く本発明を理解することができるように、以下の実施例を記載する。これら実施例は、例示のみを目的とし、いかなる方法であっても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。方法動物この研究において使用したOF1及びCBA/Jの雌マウスは、CharlesRiverlaboratoriesLyon,Franceから購入した。Balb/cマウスは、HarlanHorst,TheNetherlandsから購入した。全ての実験及びアッセイは、Belgiannationalguidelinesforanimalexperimentationに従ってGlaxoSmithKlineBiologicalsGSK,Rixensart,Belgiumで行った。細菌の株及び培養条件株2/D39は、JCPaton氏UniversityofAdelaide,Australiaから供与頂いた。株4/CDC及び6B/CDCは、CenterforDiseaseControlandPreventionCDCから入手し、19F/2737株は、AmericantypeculturecollectionATCCから入手した。株3/43は、EYourassowski氏BrugmannHospital,UniversityofBrussel,Belgiumから供与頂いた。肺炎連鎖球菌株TIGR4{Tettelin2001年}は、AndrewCamilli氏TuftsUniversitySchoolofMedicine,Boston,MA,USAから供与頂いた。WU2株は、DavidEBriles氏UniversityofAlabamaatBirmingham,Birmingham,Alabama,USAから供与頂いた。4型株は、CDCCenterforDiseaseControlPreventionから入手した。肺炎球菌は、慣例的に、37°C/8のCO2で0.5w/vの酵母抽出物を含むTodd-HewittブロスTHB、Difco中で増殖させた。適切な場合、それぞれ0.2及び250μg/mLの濃度のエリスロマイシン及び/又はスペクチノマイシンSigma-Aldrich,Bornem,Belgiumを添加した。大腸菌DH5α及びJM109株GibcoBRL,LifeTechnologyは、37°Cで16時間、1.5w/vのBacto-agarDifcoを含む又は含まないLuria-BertaniブロスLBT、Difco中で増殖させた。適切な場合、100μg/mLの濃度のエリスロマイシン又はスペクチノマイシンを添加した。Phtの発生率に関する研究については、23のインハウス及びpneumococcalmolecularepidemiologynetworkPMENの株に加えて、34の分離菌をTJMitchell氏Scotlandから、6つの分離菌をREGertz氏USAから、2つの分離菌をABBrueggemannUKから供与頂き、9つの分離菌をAmericanTypeCultureCollectionATCCから入手した。抗原CbpA又はPspCは、Brookes-WalterらJ.Infect.Dis.67;6533-65421999年に記載の通り切頭型組換え型タンパク質であり、JCPaton氏から供与頂いた。このタンパク質は、D39株の配列から構築されており、したがって、クレードA.PspAクレード2に属しており、PsaAは、2/D39株に由来する組換えタンパク質である。OgunniyiらInfect.Immun.68;3028-30332000年。両方とも、JCPaton氏から供与頂いた。DNA処理及び分析PlasmidMidi又はMiniPurificationKitQiagenBenelux,Venlo,TheNetherlandsを使用して、大腸菌プラスミドDNAを得た。QIAquickPCRPurificationKitを用いてPCR生成物を精製し、QIAquickGelExtractionKitQiagenを用いて1w/vのアガロースゲル上でDNA分解産物を精製した。制限酵素及びライゲーション酵素は、NewEnglandBioLabsWestburg,Leusden,Belgiumから入手した。これら研究の各PCR反応にはExpandHighFidelitySystemRoche,Mannheim,Germanyを用いた。全ての市販商品は、供給元により推奨されている条件下で用いた。DNAの配列決定は、AppliedBiosystems自動DNAシーケンサモデル3100AppliedBiosystemsInc,ForsterCity,CA,USAにおいてBigDyeTerminatorSequencingKitを用いて実施した。配列解析は、MacVectorV6.5ソフトウェアOxfordMolecularLtd.,Madison又はVectorNTI7.1ソフトウェアInformaxを用いて実施し、入手可能な肺炎連鎖球菌のTIGR4ゲノム配列www.tigr.orgと配列を比較した{Peterson2001年}。肺炎連鎖球菌のゲノムDNA抽出1又は2つの高濃度にheavily接種した血液寒天培地からコンフルエントになるまで一晩増殖させたものを1mLのTE10mMのTris-HCl;5mMのEDTA;pH7.8に収集することにより、各株から染色体DNAを得た。微量遠心機において最高速度で5分間細菌懸濁液を遠心分離し、ペレットを75μLのTEに再懸濁させた。リゾチーム100mg/mL20μL及びプロテイナーゼK20mg/mL20μLを順次添加し、37°Cで45分間インキュベートすることにより細胞溶解物を得た。次いで、500μLの溶解バッファ10mMのTris-HCl、pH8.0;0.14MのNaCl;0.1Mのクエン酸ナトリウム;1mMのEDTA、pH8.0;0.1w/vのデオキシコール酸ナトリウムを添加し、室温で10分間インキュベートした。このインキュベート期間の最後に、酢酸アンモニウム7.5mM、pH7.7250μLを粗溶解物に添加し、氷上で10分間インキュベートした。フェノール/クロロホルム/イソアミル25:24:1で粘着性のDNAを2度抽出し、イソプロピルアルコール中で沈殿させた。得られたDNAを70v/vのエタノールで洗浄し、0.6μLのRNaseA10mg/mLを含有する50μLのTEに再懸濁させた。DNA懸濁液を4°Cで保存した。RNAの単離THYにおける600nmの光学密度OD6000.01から異なるOD600まで増殖させた肺炎連鎖球菌から全RNAを単離し、様々な増殖期初期対数期、OD600=0.3;後期対数期、OD600=0.9;静止期、OD600=1.2における遺伝子発現を評価した。細胞を遠心分離し、6mgのリゾチームmL-1及び1mgのデオキシコール酸ナトリウムmL-1を含有するRNAase不含Tris-EDTAに再懸濁させ、室温で10分間インキュベートした。インキュベート後、製造業者の指示に従って、QIAGENRNeasyMiniKitを用いてRNA単離を行った。37Cで1時間、RNA1μg当たり1ユニットのDNaseと共にRNAサンプルをインキュベートし、次いで、65°Cで10分間2.5mMのEDTAでDNaseを不活化することによりゲノミックDNAの混入を除いた。製造業者の指示に従って、Ribogreen登録商標RNAQuantificationKitMolecularProbesを使用して全RNAを定量した。cDNA末端の5’-迅速増幅RACE転写開始点を同定するために使用した方法は、RanasingheHobbsの改良法であった{Ranasinghe1998年}。簡潔に述べると、phtE遺伝子の3’末端に特異的なプライマーを用いて、製造業者の指示に従ってSuperscriptII逆転写酵素Invitrogenで全RNAから第1鎖の相補的DNAcDNAを合成した。次いで、室温で1時間かけてRNAaseAを添加し、cDNA-RNAハイブリッドにおいて3’平滑末端を作製した。T4DNAリガーゼを使用して、EcoRVで切断されたpKSプラスミドStratageneに前記ハイブリッドを挿入した一晩16°Cでインキュベート。別の3’末端に特異的なphtEリバースプライマー及びpKSに特異的なT7プロモータプライマーを使用して、5’末端を増幅させるためのPCR反応を設定した。pKS-cDNA接合物の配列を決定して、1塩基を同定した。転写ターミネーターの同定BrendelTrifonovの方法に基づいてWisconsinSequenceAnalysisPackageバージョン10.1GeneticsComputerGroupを用いてターミネータの同定を行った{Brendel1984年}。RT-PCR以下の通りRT-PCR研究を行った。まず、全体積10μLの、3’-末端の遺伝子に特異的なリバースプライマー10μM及びRNaseOut20ユニットを含有する混合物中にて、65°Cで5分間RNA2μgを変性させた。次いで、5mMのジチオトレイトール、1mMのdNTP、15ユニットのThermoscript逆転写酵素Invitrogen、1×cDNA合成バッファ、及び体積が20μLになるまでリボヌクレアーゼ不含滅菌水を添加することにより、逆転写反応を行った。1時間56~58°Cで逆転写混合物をインキュベートし、次いで、85°Cで5分間逆転写酵素を変性させた。1ユニットのRNaseHと共に20分間37°Cで逆転写溶液をインキュベートすることにより、RNA-cDNAハイブリッド上のRNA鎖を分解した。逆転写反応に用いるための様々な5’遺伝子に特異的なフォワードプライマー及び3’遺伝子に特異的なリバースプライマー最終濃度0.5μM、0.2mMのdNTP、TaqDNAポリメラーゼ反応バッファ、2.5ユニットのTaqDNAポリメラーゼAmershamBiosciences、及び体積が50μLになるまで滅菌水を用いて、2μLのcDNAに対してPCR反応を実施した。PCRサイクルは、94°Cで5分間の初期変性と、次いで、94°Cで15~30秒間の変性、55°CphtE、phtD又は63°CphtB、D、Aで15~30秒間のアニーリング、及び72°Cで1分間の伸長の25~30サイクルとからなり、そして、72°Cで5~7分間の最後の伸長工程で完了する。RNA調製物におけるDNAの混入を除くために、逆転写反応していないRNAで構成されるネガティブコントコールも実施した。1w/vのアガロースゲル電気泳動によりPCR生成物を分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。Pht突然変異体の調製肺炎連鎖球菌ではなく大腸菌において複製するpGEM-TベクターPromegaBenelux,Leiden,theNetherlandsからミューテーターベクターを構築した。それらは、抗生物質耐性遺伝子の周囲に、除去されPCRにより増幅されるpht遺伝子の上流及び下流の領域に相当する組換え領域を含有する必要に応じて、ミューテーターベクターを構築するために用いられるプライマー及び制限酵素部位を備えてもよい。Pht欠損四倍変異株を調製するためには、2つの異なる遺伝子座遺伝子座phtD/phtE、及び遺伝子座phtA/phtBにおける欠損を組合せるために、2つの異なる抗生物質耐性遺伝子を使用しなければならなかった。phtD/phtE遺伝子座については、pJDC9ベクターの誘導体から増幅されるエリスロマイシン耐性遺伝子ermBを選択した。phtA/phtB遺伝子座については、スペクチノマイシン耐性遺伝子aad9遺伝子をpR350プラスミドJPaton氏から供与頂いたから精製した。様々な構築されたプラスミドを用いてDH5α又はJM109大腸菌株でクローニングを実施し、それぞれの抗生物質を含むLB寒天にプレーティングした。CaCl2で処理した細胞を用いる標準的な方法により、プラスミドDNAで大腸菌を形質転換した。{Hanahan1985年}2つの連続する培養工程により、形質転換用の4/CDC肺炎連鎖球菌株を調製した後、CTM培地10g/Lのカザミノ酸;5g/Lのトリプトン;5g/LのNaCL;10g/Lの酵母抽出物;0.4MのK2HPO4;20のグルコース;30mg/mLのグルタミン;1のBSA、0.1MのCaCL2;pH7.8に再懸濁させ、分注し、15グリセロール中で凍結させた。これらアリコートを形質転換に使用した。融解させた後、CSP-1又はCSP-2CTM培地中100ng/mLを添加して受容能を誘導し、37°Cで細菌をインキュベートした。様々な時間をかけて5、10、15、及び20分、受容能を最適化させた。1μgのミューテーターベクターを添加した後、振盪させながら32°Cで30分間細胞をインキュベートし、次いで5CO2下で37°Cにて2~4時間インキュベートした。最後に、適切な抗生物質を含む血液寒天に細菌をプレーティングした。四重突然変異体については、上記と同じプロトコールを用いることによりPhtA、Bを欠損させるプラスミドでPhtD、E-KO株を形質転換した。SDS-PAGE及びウェスタンブロット分析5つの高濃度に接種した血液寒天プレートからコンフルエントになるまで一晩増殖させたものを滅菌PBS1mL0.14MのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa2HPO4、1.8mMのKH2PO4、pH7.2に収集し、56°Cで45分間のインキュベート工程を行うことにより、加熱殺菌された細菌懸濁液を得た。次いで、前記加熱殺菌された懸濁液にサンプルバッファ60mMのTrizma塩基、1w/vのSDS、10v/vのグリセロール、0.01w/vのブロモフェノールブルー、2v/vのβ-メルカプトエタノールを添加した。5分間調製物を沸騰させて、2分間微量遠心機において最高速度で遠心分離し、Laemmli{Laemmli1970年}によって記載されている通り、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEによって分離した。{Towbin1979年}に記載されている通り、アクリルアミドゲルからタンパク質を電気泳動でニトロセルロース膜Bio-Rad,Richmond,CA上に転写した。phtDに対して増加するマウスポリクローナル抗体をプローブとして膜を探索し、次いで、アルカリホスファターゼPromegaBenelux.にコンジュゲートしているヤギ抗マウスIgGで探索した。酵素で標識したバンドをNBT/BCIP基質系で可視化した。イオン欠損培地における培養物の増殖野生型の4/CDC株、及び対応するPhtD-及びPht-欠損四重突然変異体株を、化学的に定義される合成培地MSにおける様々なイオン枯渇又は補充条件下で培養した{SICARD1964年}。あるいは、Mn2、Fe2、Fe3、Cu2、又はZn2の濃度を上昇させることによりMS培地に補充した。対数増殖期の間及び静止期に600nmにおける光学密度をモニタした。結果を野生型のものと比較した。野生型のWU2株を、Zn特異的キレート剤であるN,N,N’,N’,-テトラキス2-ピリジルメチルエチレンジアミンTPENと共に又は無しで培養して、RT-PCRによりRNA及びフローサイトメトリーによりタンパク質レベルでPht発現に対する亜鉛枯渇の効果を観察した。フローサイトメトリー対数増殖期まで、37°C、8CO2でTHB0.5の酵母抽出物中でWU2細菌を増殖させた。あるいは、培地にTPEN30μM亜鉛キレート剤を添加した。遠心分離後に、対照として抗PhtE、抗PhtB/D、抗PhtD/E又は抗3型多糖モノクローナル抗体を含有する溶液中に細菌のペレットを再懸濁させた。4°Cで2時間後;溶液を遠心分離し、細菌のペレットをPBS-BSA2で洗浄した後、PBS-BSA2中のAlexaFluor商標MolecularProbesにコンジュゲートしているヤギ抗マウス二次抗体中で室温にて1時間インキュベートした。洗浄後、PBS-ホルムアルデヒド0.25で細胞を固定し、FACS分析を行った。表面の蛍光のメジアンを記録した。定量逆転写酵素PCRO.D.が約0.5対数増殖期の中間まで増殖させたD39株の全RNAを、RNeasy商標MidiKitQiagenを用いて精製し、Quant-iT商標RiboGreen商標RNAAssayKitInvitrogenで定量した。37°Cで30分間、RQ1RNase不含DNasePromega1.5μLでサンプル1μgを2度処理した。1μLのDNaseSTOPを添加し、次いで、65°Cで10分間インキュベートすることにより反応を停止させた。SuperScript商標II逆転写酵素Invitrogen、ランダムプライマーInvitrogen、及び組換え型RNasin商標リボヌクレアーゼ阻害剤Promegaを用いて第1鎖のcDNAを生成した。製造業者が記載の通り、TaqMan商標PCRCoreReagentsKitAppliedBiosystemsを用いて、反応体積50μLでリアルタイムPCRを実施した。以下のプライマー及びプローブを用いた:gyrB、GGGAAATAGCGAAGTGGTCAAGフォワード、GGAATCGGAGAAGGCTTCACリバース及びTTACCAATCGCCTCTTCプローブ;phtD、CCCATGCGGACAATATTCGフォワード、TGACTGCGTTCCTGCTTCTGリバース、CGTTTAATCTCTTCTTTTGTプローブ。全てのアッセイをデュープリケートで行い培養からq-PCRまで、キャリブレータとしてTHBのみ中で増殖させたgyrBを内部対照として用いて2-ΔΔCT法LivakSchmittgen、2001年により相対的な遺伝子転写を分析した。Pht出現率の測定肺炎連鎖球菌の代表的な株を選択するために、MLSTMulti-LocusSequenceType;www.mlst.netによって決定したときの株の遺伝子型に従って母集団構造を分析した。MLST分離配列型STに基いて、主なクローンの系統を決定した。各群について、出現率を分析するための代表的な株を選択した。これは、抗PhtDポリクローナル抗体A、B及びDと交差反応し得る又は抗PhtEを用いて全細菌抽出物に対してウェスタンブロッティングを行うにより、及びPhtA、B、D又はEに特異的なプライマーを用いて肺炎球菌のゲノミックDNAに対してPCRを行うことにより実施した。PhtD保存分析のためのDNAの配列決定PhtDに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、107のMLSTで選択された株のDNAをPCR増幅した。107の配列をClustalXプログラムによって整列させ、Superneedleプログラムにより同一性を計算した同一性の割合は100×同一数/最短配列の長さである。実施例1pht遺伝子の特性評価pht遺伝子のゲノムの構成先行研究において、肺炎連鎖球菌SP64株のゲノミックライブラリーに由来する重複クローンのDNA配列決定{Hamel2004年}及びPCR分析により、この種の6B株におけるpht遺伝子及びその近傍の遺伝子のゲノムの構成を推定することができた。PhtD及びPhtE遺伝子に加えてphtA及びphtBの遺伝子も対として構成されていた。TIGRウェブサイトwww.tigr.orgにおけるBLAST分析{Peterson2001年}は、2つの遺伝子タンデムが肺炎連鎖球菌TIGR4ゲノム中に161kbp離れて位置していること、及びゲノムの構成がSP64株でみられるものと同一であることを示した図1。また、後者ではphtAが欠けていることを除いて4/CDC株及びWU2株にも同じpht遺伝子構成がみられたデータは示さない。TIGR4株DNAにおけるpht遺伝子の周囲を配列決定することにより、後者の所見が確認されたデータは示さない。更なる分析により、TIGR4株においてphtA及びphtBは157bpが離れているが、一方phtD及びphtEは209bp離れていることが示され、これを更なる研究のために選択した。phtD-phtEのタンデム側では、ラミニン結合タンパク質をコードするA群及びB群の連鎖球菌lmb遺伝子それぞれ、アクセッション番号AAK34689{Ferretti2001年}及びAAD13796{Spellerberg1999年}に対して72の類似性を示す遺伝子が、PhtD遺伝子の7bp上流に位置していた図1。また、この遺伝子産物は、最近、AdcAIIと命名され、ABC輸送体様亜鉛結合タンパク質であると説明された{Loisel2008年}。lmb遺伝子ホモログの142bp上流に位置する1392bpのORFは、枯草菌Bacillussubtilis代謝産物輸送体YfnAタンパク質アクセッション番号D69814と64の配列類似性を表し、化膿性連鎖球菌S.pyogenesアクセッション番号AAK33157の推定アミノ酸透過酵素と81の類似性を表すタンパク質をコードしている{Ferretti2001年、Kunst1997年}。phtEの最初の481bpと79の同一性を示す配列phtFと提案が、phtEの終止コドンの226bp後にみられた図1。また、この配列は、phtA、B及びD遺伝子と72の同一性を示す。phtA-phtBのタンデム側では、唾液連鎖球菌StreptococcussalivariusのptsI遺伝子アクセッション番号P30299{Gagnon1992年}と73の配列相同性を表す1332bpのORFが、phtA遺伝子の253bp上流に位置していた図1。この遺伝子は、全ゲノム配列アクセッション番号AAK75285で見出されたptsI遺伝子と比較して、本発明者らが配列決定したTIGR4株におけるフレームシフトを示した。両方の遺伝子対の直下流には機能的なORFは位置していなかった。実施例2pht遺伝子の転写機構pht遺伝子のゲノムの構成は、タンデムな遺伝子が協調して転写される可能性があることを示唆していた。したがって、この仮説について考察するために更なる研究を行った。まず、pht遺伝子の推定上のプロモーター及びリボソーム結合部位を同定した。phtE遺伝子における5’-RACEにより、その転写開始点を同定することができ、それからプロモーター領域を推定した。転写開始部位1は、PhtE翻訳開始部位の96塩基上流、典型的な肺炎連鎖球菌の-10~-35RNAポリメラーゼ結合部位の下流{Morrison1990年}、及びリボソーム結合部位の上流に位置することが見出された図2a。類似した配列構成は、phtA、phtB及びyfnA遺伝子の上流にもみられ、これは推定上のプロモーターの存在を示す図2b、c及びe。しかし、lmb遺伝子に極近接しているため7bp、phtD遺伝子についてはプロモーター配列が同定されなかった。他方、他のpht遺伝子の-35配列と同一の配列は、lmb遺伝子の上流に位置していた図2d。リボソーム結合部位は、全ての開始コドンの5~7bp上流に観察された。また、pht及び隣接する遺伝子の転写終結部位を同定した。予測されるmRNA二次構造のコンピューター分析により、遺伝子の3’末端にステムループターミネーター様構造の存在が示唆された。ヘアピン構造を形成することができ、計算された自由エネルギーの解離ΔGは、Turnerら1988年の方法{Turner1988年}により測定したとき、それぞれ、phtB、PhtD、phtA、及びPtsIについて-9.4、-27.0、-16.8、及び-21.6kcalmol-1であった。実際、phtD遺伝子について同定されたターミネーターは、ORFSP1003についてはTIGRウェブサイトによって報告されたものと同一であり、phtD遺伝子のホモログに一致していたwww.tigr.org。他のpht又は周囲の遺伝子については、TIGRのグループでは転写ターミネーターが同定されなかったが、これは恐らく両方の研究によって使用されるアルゴリズム差が反映されている。ほとんどのヘアピンは、原核生物の転写ターミネーターで典型的にみられるT残基の伸張で終端しており{Rosenberg1979年}、終止コドンの70bp下流に位置していた図3。興味深いことに、phtEターミネーター配列ΔGは-4.7kcalmol-1であるは、その終止コドン及びphtF遺伝子の1867bp下流に位置しており、後者のORFは、インフレームの終止コドンを含有しており、翻訳が妨げられていた図3a。yfnA及びlmbの遺伝子の下流にターミネーター配列は同定されなかった。ゲノムの構成は、phtEがyfnA、lmb、phtD、phtE及びphtF遺伝子から構成されるオペロンの一部である可能性があることを示唆した。しかしながら、5’-RACE図2a及びターミネーター同定図3aは、phtEが、phtE及びphtFの遺伝子から構成されているバイシストロニックなメッセージにおいて転写される最初の遺伝子であることを示し、これは、RT-PCRによって確認された。phtE~phtFの領域はRT-PCRによって増幅されたが図4a、レーン4及び6、一方、遺伝子phtDとphtEとの間の領域に特異的なプライマー対を用いても増幅産物は得られなかった図4a、レーン5。これは、phtDの下流で転写が終結することを示す図3c。図4aレーン1~3において示されるように、RT-PCRによりyfnA~phtDの領域が増幅された。更に、Loiselら{Loisel2008年}は、このphtD転写物が、yfnA、lmb及びphtDに加えて、yfnAの上流の2つの遺伝子もコードすることを示したシトクロムcの生物発生に関与するccdA及びチオレドキシンと類似性を示すspr0904。興味深いことに、lmb遺伝子の上流の推定上のプロモーターの同定図2dは、phtD及びlmbの遺伝子の転写カップリングを示唆した。phtB及びphtAの遺伝子について得られた結果は、プロモーター図2b及びc及びターミネーター部位同定図3b及びdによって示唆される通り、これらがモノシストロニックなmRNAとして転写されることを示した。RT-PCRによるphtA及びphtBの転写機構の分析は、phtBに特異的なプライマーを用いてphtBに特異的なアンプリコンを明らかにした図4a、レーン7。phtAとphtBとの間の領域を増幅するプライマーを用いたRT-PCRでは増幅産物は得られなかった図4a、レーン8。これは、phtA及びphtBの遺伝子のモノシストロニックな構成を示す。ターミネーター部位同定図3eは、ptsIがモノシストロニックなメッセージとして転写されることを示し、これはまた、phtAがポリシストロニックな転写物の一部ではないことを確認した。実施例3Pht突然変異体の構築及び使用突然変異体の特性評価突然変異体PhtA-、PhtB-、PhtD-、PhtE-及び四重突然変異体PhtABDE-を構築した。組換えの正確さを評価するために、突然変異株のゲノミックDNAを精製し、組み換え領域の配列を決定したデータは示さない。更に、マウスのポリクローナル抗PhtD抗体を使用して、突然変異体の表現型をイムノブロッティングにより特性評価した図5。この抗体は4つのPhtアイソタイプを全て認識した。しかし、PhtEバンドはより弱く、他の3つからのこのPhtが最も離れていることが確認された。細菌増殖に対する様々なイオンの影響Phtの四重突然変異体の増殖は、野性型株及び様々なPht単一突然変異体と比べて、MSの培地において劇的に減少した図6a。200μM以下のFe2、Zn2又はMn2を培地に添加した場合、野生型及びPhtD欠損突然変異体の増殖は僅かに改善されたMSのみに対する増殖率:96~130。対照的に、四重突然変異体の挙動は著しかった。MSに対して200μMのFe2を添加した場合、増殖は25.3しか増加しなかったが図6d、同濃度のZn2又はMn2は、四重突然変異体の増殖能を回復させた図6b、c。これは、MSのみにおいて得られたものと比較して、増殖速度が最大92.3増加したことを表す。しかし、この増殖速度の回復は遅く、培養の最初の数時間以内には改善がみられず、一晩インキュベートした後にしかみられなかった。Zn2又はMn2が増殖を回復させたように、Mg2の添加は200μMでは完全に増殖を回復させられなかったが、1mg/mLのMg2をMSに添加したときには、類似する増殖速度の増加がみられたデータは示さない。高濃度のCu2の添加は、野生型及び突然変異株に対して有毒であったデータは示さない。実施例4pht発現に対する亜鉛枯渇の効果培養培地に亜鉛キレート剤TPENを添加した場合、フローサイトメトリー実験によって測定したとき、Phtタンパク質の発現レベルが増加した図7a、b、c。対照として、同じ亜鉛枯渇条件下における抗3型多糖抗体では平均蛍光の変化がみられなかった図7d。RNAレベルでは、亜鉛枯渇条件でphtE転写レベルが最大25倍増加することをRT-PCRにより測定することができたデータは示さない。更に、THB又はTHB25μMのTPENのいずれか中で増殖させた肺炎球菌分離菌D39株から精製したmRNAを用いて、q-RT-PCR実験を実施した。培地に添加したキレート剤の濃度は、予備実験で求められた通り、最適以下であった。これは、TPENが、TPEN濃度が、培地中の全てのイオンをキレート化するのに十分高いときにみられる通り増殖を妨げはしないが、増殖を遅らせるデータは示さないことを意味する。培地にTPENを添加することにより、phtDのmRNA発現レベルが4.84倍増加した。25μMのZnSO4でTHBTPENを補償することにより、phtDのmRNAの発現は、培地のみでみられたレベルと同様のレベルにまで回復した。これは、TPENによりキレート化され得る全てのイオンZn、Mn、Cd、Co、Ni、Cu、Mg、Caの中でも、ZnがphtDの発現レベルに対して大きさ影響を有することを示唆する。実施例5肺炎球菌におけるPht出現率合計74株23のPMEN及びインハウス株を含むについて調査した。この代表的な株のセットでは、18のクローンの系統が示され、27の異なるSTを備えた46株61が3つの主なクローン群1、11及び23に属し、56の異なるSTが存在し、その中で更に説明されるのは81、90、124、156、162及び19922株であり、27の異なる血清型が存在し、更に説明されるのは19F、6B、3及び23F全ての株の47であった。ゲノミックDNAに対するPCRによって、それぞれ株の100、97、81及び62にPhtD、PhtE、PhtB及びPhtAの遺伝子が見出された。株の54パーセントは、そのゲノムに4つのpht遺伝子を有することが見出された。PhtDに対して増加するポリクローナル抗体を用いたイムノブロットにおいて、全ての株でPhtDを検出することができた。同様に、他のPhtは、それぞれの遺伝子を有する全ての株においてイムノブロッティングによって見出された。特に、遺伝的に最も分化しているので、PhtEは、それに対して特異的に増加するポリクローナル抗体でよりよく検出された図8。6つの分離菌でより小さなサイズ10kDa小さい、及び8つの株で更により小さなサイズ20kDa小さいのPhtE等の幾つかの特殊なPhtが見出された。同様に、4株は、切頭型PhtAを生成することが見出され図8、この遺伝子はPCRにより検出されなかった。興味深いことに、これらの4つの株は、20kDa切頭されたPhtEも発現した。少なくとも、phtB陰性株のphtA/B遺伝子座の配列決定により、この遺伝子座の中に存在する唯一の遺伝子がphtA及びphtB、又はphtA及びphtD遺伝子のいずれかのハイブリッドであったことが明らかになった。興味深いことに、配列分析により、pht遺伝子によってコードされるシグナル配列が各Phtファミリーのメンバーにとって特異的であったことが実証された。実際、Phtファミリーのメンバーに特異的なシグナル配列は、別のPhtファミリーのメンバーのシグナル配列と少なくとも1つの位置において異なる表1を参照されたい。次に、Pht発現プロファイルと分離物の遺伝子型/血清型との間を関連づけられるかどうか判定することを試みた。分析した株において、血清型2、4、14、6B及び7Fの分離菌は全て4つのPhtを有しており、血清型3、9、19F及び22Fの分離菌は全て、PhtAが欠けているか又はより小さなPhtAを有していた。MLST遺伝子型とPht発現プロファイルとの間の潜在的な関連に関して、以下の特徴を求めることができた:10kDa切頭されたPhtEは、主に遺伝子型ST199群で見出された。これら株の血清型は19F、19A、15A、1及び6Aである。全て同じクローン系統群1に属するが、異なる血清型9、19A、19F、14を有する8つの分離菌において20kDa切頭されたPhtEが観察された。最後に、異なるクローンの系統においてPhtAを欠く株が観察された。したがって、PhtAの欠損と遺伝子型との間の主な関連は同定されなかった。実施例6PhtDの保存Phtの出現率に関する研究では、PhtDは試験された全ての肺炎球菌株中に存在することが見出された。このことは、PhtDがPhtファミリーの中で最良のワクチン候補であることを示す。この点で、肺炎球菌株中の配列保存のレベルを決定することが必須であることが分かった。そのために、DNAの配列決定を実行した。107の株MLST分類に基いたの分析から、PhtDの長さが831~853アミノ酸で変動し、分子量は約100kDaであると求められた。PhtDは、試験された107の株の間で高度に保存されており、1つの配列だけが、切頭型タンパク質株4/75のため停止を示した。プロリンの多い領域は、全ての株について13~15のプロリンを含有していた7つの株では、プロリンは11~13のみであった。4未満のアミノ酸が変異している制限された伸長が、PhtDの配列で見出された。考察Phtタンパク質は、肺炎球菌感染症に対するワクチンに配合するのに有望な候補である。その点では、肺炎球菌の病因におけるその役割をより明確に定義するために、これらタンパク質の発現をいかに調節するかを調べることが重要であると考えられる。ゲノム分析は、4つの遺伝子ホモログがタンデムに配置されていることを示した。phtE遺伝子の下流に切頭されてはいるがpht遺伝子ファミリー5番目のメンバーが存在することも証明され、従来の研究における所見が確認された{Adamou2001年}。同じ構成が肺炎連鎖球菌のR6株ゲノムアクセッション番号AAK99714でもみられるので、この切頭は保存されていると考えられる。{Hoskins2001年}pht遺伝子のタンデムな構成がphtのバイシストロニックな転写とは相関していないことが本研究で示された。試験した条件下では、これら遺伝子はいずれもこれらと関連するpht近傍とは共転写されなかった。プロモーター及びターミネーターの分析は、従来のRT-PCR研究とよく相関していた。phtB、phtA及びphtE遺伝子は、全て個々の推定上のプロモーターを有しており、且つ対応する終止コドンの直後でmRNA転写が恐らく終結することが本研究で実証された。他方、phtD遺伝子の特色を観察した。実際、phtDについてインシリコで同定されたプロモーターは存在しなかった。その代り、phtDの上流に位置する2つの遺伝子であるlmb及びyfnA遺伝子についてプロモータは同定されたが、転写ターミネーターは同定されず、これは、これら遺伝子がオペロン系で構成されることを示す傾向があった。これは、上流の4つの遺伝子と共に大規模なオペロン系でphtDが発現し得るという最近の所見に確証を与える{Loisel2008年}。しかし、yfnA及びlmbについてプロモーターが同定されたという事実は、これらの位置で転写が開始され得ることを示し、これは、異なる長さのphtD含有転写物が生成され得ることを意味する。更に、lmb遺伝子の上流にadcR結合部位が同定され{Loisel2008年、Panina2003年}、これはlmb及びphtDを含む亜鉛で調節されるバイシストロニックな転写物も存在し得ることを示す傾向があり、これは、他の研究者によっても示唆されている。Spellerbergらによる研究{Spellerberg1999年}は、生成物がpht遺伝子産物アクセッション番号AF062533の最初の225phtE及び最初の228phtA、phtD及びphtBアミノ酸と67の配列相同性を示す遺伝子と、B群連鎖球菌GBSのlmb遺伝子とが共転写されることを示した。また、A群連鎖球菌GASのゲノムにおいて同等のゲノム配置が観察された{Ferretti2001年}。更に、lmb及びphtDの共転写は、機能的な関連を示す可能性があると提唱されており、後者の遺伝子産物は肺炎球菌の接着及び侵入に関与している{Panina2003年}。それぞれ輸送及び特異的結合活性に関与している可能性がある他の2つの遺伝子yfnA及びlmbを含むポリシストロニックなメッセージとしてphtD遺伝子が転写され得ることに留意することは興味深い。実際、肺炎連鎖球菌におけるYfnA{Hoskins2001年}、ならびに枯草菌{Yamamoto1997年}、化膿性連鎖球菌{Ferretti2001年}及びミュータンス菌{Ajdic2002年}における相同タンパク質は、透過酵素のスーパーファミリーのメンバーであるアミノ酸輸送体であると考えられる。Lmbタンパク質に関して、それは、ABC輸送体様亜鉛結合タンパク質{Loisel2008年}及び推定上のラミニン結合タンパク質{Spellerberg1999年}として記載されている。実際、このタンパク質は、口内連鎖球菌において最初に見出されたが{Jenkinson1994年}、その後他の連鎖球菌及び属でも発見された{Cockayne1998年}LraIとして知られているアドへリンファミリーと類似性を示す。LraI様タンパク質は、連鎖球菌によるヒト上皮のコロニー形成及びその後の血流への侵入に関与していることが示唆された{Elsner2002年}。オペロン系においてyfnA、lmb及びphtDが会合している理由は明らかではない。妥当性のある1つの仮説は、これら3つのタンパク質が、例えばそれらの機能において必ずしも関連する訳ではなく、侵入又は増殖のために細菌サイクルの同時点で必要であるということである。しかし、Phtタンパク質の役割を決定するkとは、このゲノム上の会合について幾つかの糸口を与える可能性がある。種内のPhtタンパク質間の類似性が交換可能な役割を示すと推測することができる。また、タンパク質がその相同領域を通して類似の機能を共有すると同時に、細菌の異なる発生段階でさえも異なる活性を発揮する可能性もある。本発明者らが生成した様々なPht欠損突然変異体からのタンパク質抽出物を用いたイムノブロッティングにおいて得られた結果は、残りのPht遺伝子産物の発現レベルを高めても遺伝子の喪失は補償されないことを示す傾向がある。また、この特徴は、RT-PCRの使用により、RNAレベルにおいても最近報告されている{Ogunniyi2009年}。上述の通り、Phtタンパク質は全て、金属結合に関与していると考えられるヒスチジントライアドモチーフを共有している{Adamou2001年、Hamel2004年、Zhang2001年}。興味深いことに、これらのモチーフは、特に立体構造的に機能的なPhtタンパク質を生成するための亜鉛結合に関与している可能性があると推測されている{Panina2003年}。また、同じ著者らは、亜鉛を制限した環境がPhtタンパク質の発現並びに好ましい連鎖球菌属のコロニー形成及び侵入を誘導することができると仮定した。この状況において、本発明者らは、野生型及びPht欠損株を様々なイオン枯渇及び補充条件下で培養する実験を実行した。最小合成培地では、野生型及びPhtD欠損株は、濃縮LB培地中よりも増殖速度が遅かったが、Pht四重欠損突然変異体は最小培地においてほとんど増殖しなかった。特に、Zn2又はMn2を添加した場合、これは20~200μMの範囲の濃度で特に顕著であり、四重突然変異体の増殖は野性型まで回復した。しかし、本発明者らの結果は、野生型と比較して、四重突然変異体の増殖が遅かったことを示した。これら所見は、細菌増殖に対するZn2及びMn2の必要性の確認に加えて、Zn2及びMn2の取り込みにおけるPhtファミリーの重要な役割を主張する。実際、本発明者らが観察した通り、Zn2の喪失がPhtファミリーのタンパク質のデノボ合成を誘導することは、PhtとZn2との間の緊密な関係を支持するための更なる論拠である。この調節は、肺炎連鎖球菌における亜鉛の取込みを調節するAdcRタンパク質によって生じる可能性が高い。実際、AdcRタンパク質用の推定上の結合部位は、phtA、phtB及びphtE遺伝子、並びにlmb-phtDオペロンの上流に見出されている{Panina2003年}。高Zn2濃度条件で誘導されるAdcRの結合は、その依存下で遺伝子の転写を阻害する。直接又は間接的な亜鉛飢餓条件下では、この金属の細胞内濃度が低下するので、AdcRによる抑制が軽減される{Brenot2007年、Claverys2001年}。この結果及び本研究で観察されたものとは対照的に、培養培地に亜鉛を添加すると、Pht産生が誘発されることが最近報告された{Ogunniyi2009年}。しかし、本研究では亜鉛の多い培地から亜鉛を除去したが、Ogunniyiらは亜鉛の少ない培地に亜鉛を添加したという意味で、用いられた2つの方法は異なっていた。所与の範囲内の亜鉛濃度において、Phtの産生は釣鐘状に調節されると推測することが合理的である。また、Ogunniyiらにより観察された高亜鉛濃度のPht発現の増加を導く効果は、ヒトホストにおいて利用可能な遊離亜鉛濃度が非常に低いので、インビボではほとんど関係しない可能性がある{Ogunniyi2009年}。1997年に、Dintilhacらは{Dintilhac1997年a}、彼らの研究において、ABC型Mn2透過酵素として記載されているPsa及びABC型Zn2透過酵素であるAdcに加えて、Zn2及びMn2の両方を輸送することができる第3の輸送体が存在するはずであると結論付けた。Phtタンパク質又はラミニン結合タンパク質が、この機能を果たすための候補であると考えられる。本発明者らの結果は、Phtについて異なる役割を示す。実際、Zn2及びMn2の非存在下において、最小培地中にて野生型及びPhtD欠損株が増殖することができるという事実は興味深い。更に、最小培地にZn2又はMn2を添加したとき、四重突然変異体の増殖が遅れて回復したという所見も興味深い。Phtタンパク質が、これら2価カチオンを格納し濃縮する機能を有するZn2及びMn2スカベンジャーとして作用すると考えれば、これらの所見を説明することができる。野生型及びPhtD欠損突然変異株を最小培地に入れた場合、より濃度の高い培地中に細菌が存在するときはPhtタンパク質内に既に格納されているイオンのために直ちに増殖を開始することができた。対照的に、Pht四重突然変異体は、好ましい条件下に置いたときにこれらイオンを格納することができず、次いで、濃度の低い培地に入れたときに増殖できなかった。Zn2又はMn2を最小培地に過剰に添加したとき、特定の金属透過酵素がイオンを捕捉することができるようになる前にある程度の時間が必要であった、その理由は、Phtタンパク質の助けなしに培養培地中でランダムにイオンを見つけなければならなかったためである。これは、Pht四重突然変異体がこのような条件で増殖し始めるのが遅れたことを説明できる。更に、Phtタンパク質がスカベンジャーの役割を果たす可能性は、5~6つの陽イオン結合ドメインが存在することと矛盾しない。確認された場合、この格納についての考察的な機序が、細菌が亜鉛及び恐らくマンガンホメオスタシスを調節する手段と考えることができる。亜鉛及びマンガンのような金属イオンは必須微量元素である。しかし、過剰に存在する場合、細菌に有害である可能性があるが、その理由は、幾つかの重要な酵素について補助因子としての他の元素と競合する場合があるためである。したがって、細菌が金属ホメオスタシスを調節することが必須であり、本発明者らは、これがPhtファミリーの主な役割であると示唆する。このような調節系は、イオンが制限された環境に直面した場合、例えば、ヒトの鼻咽腔におけるコロニー形成過程の初期段階中に肺炎連鎖球菌を生存させることができる{Bunker1984年、Harlyk1997年}。PhtDによるポリシストロニックな転写物の存在は、機能を発揮するためにLmb、LraIファミリーのメンバー、及びYfnAがZn2又はMn2を必要とすることにより説明することができる。部分的にこの状況を支持するために、毒性のための重大な特徴であるタンパク質のLraIファミリーを通して付着するためにMn2が必要であることが示唆されている{Dintilhac1997年b、Papp-Wallace2006年}。更に、他の状況では、ラミニンがZn2に結合して、ラミニンとラミニン結合タンパク質との間の高親和性結合を促進することが実証されている{Ancsin1996年、Bandyopadhyay2002年}。したがって、本発明者らは、ラミニンにLmbが遭遇したとき、Zn2の存在を確実にするためにLmbがPhtDを必要とすると仮定することができ、これはホスト組織への結合を強化する。また、Phtによる亜鉛ホメオスタシスの調節は、これらタンパク質がC3bの阻害に関係している理由を説明することができるHostetter,1999年41/同上;Ogunniyi,2009年98/同上。実際、H因子の存在下におけるI因子によるC3bの切断は、亜鉛に調節されている{Blom2003年}。したがって、細菌環境における亜鉛濃度を制御することによって、Phtはいくつかの状況におけるC3b阻害の一因となり得る。これについては更に調査する必要がある。したがって、Phtタンパク質ファミリーを標的とすることによって、免疫系は、細菌がイオンを格納し使用する能力を妨害する可能性があり、これは浸潤過程にとって重大であると考えられる。結果的に、本発明の結果は、Phtタンパク質が肺炎球菌感染に対する真のワクチン候補であることを確認する。Phtファミリーの様々なメンバーは、肺炎球菌ワクチン抗原として使用される可能性について既に評価されている{Adamou2001年、Hamel2004年、Ogunniyi2007年、Zhang2001年}。これらの発見後、肺炎球菌の分離菌のサブセットからマウスを保護するPhtA、PhtB及びPhtDの能力について検討された{Adamou2001年}。PhtDは、最も広い保護を提供するPhtタンパク質であることが見出されているが、PhtAによる免疫は、より少ない数の試験株に対して有効であった。これは、PhtAは肺炎球菌株の62で発現するが、PhtDは100に存在することを示した本研究の結果と一致している。2つの研究において成功裡に使用されたが、PhtBが交差防御能を誘発する可能性は知られていない。その理由は、1つの株に対してしか評価されていないためである{Adamou2001年、Zhang2001年}。しかし、本発明者らは株の81にPhtBを見出したので、その株間適用範囲は最適ではない可能性があると予測することができる。PhtEに関しては、このタンパク質は株の97で見出されており、これは、広い交差防御能を示している可能性がある。しかし、このPhtは、3つの他のPhtとわずか32の同一性しか共有しておらず、最も免疫原性が強く且つ保存されているそのC末端部分は、PhtEに特異的である。他方のPhtと共通のPhtEの領域は抗体に接近できない{Adamou2001年、Hamel2004年}。したがって、肺炎球菌の中でも高度に保存されているアミノ酸配列を有し、またPhtA及びPhtBと交差反応性を示す試験株全てに存在するPhtDが、より優れた選択肢である。実施例7Phtタンパク質による免疫化は、マウス肺炎球菌致死性鼻腔内抗原投与モデルにおいて保護をもたらすマウスの肺炎球菌鼻腔内抗原投与においてPhtファミリーのメンバーによって付与される保護を評価するために、OF1雌マウス4週齢;n=20/群を、3-O-デアシル-4’-モノホスホリルリピドAMPL及びQS21を添加した水中油型エマルションからなるAS02アジュバント系と共に製剤化された1μgのPhtD、PhtA、PhtB、又はPhtEで0日目及び14日目に筋肉内i.m.免疫したGarconらExpertRev.Vaccines6;723-7392007年。対照動物にはAS02のみを注入した。28日目に、3/43型肺炎球菌株50μL中105cfuでマウスに鼻腔内抗原投与した。抗原投与後10日間死亡率を記録した。他の実験では、1μgのPhtDのワクチン接種を10μgのPspA及び10μgのCbpAと比較した。全ての抗原を、アルミニウム塩とMPLとからなるアジュバント系AS04と共に製剤化したGarconらExpertRev.Vaccines6;723-7392007年。0、14及び28日目にi.m.免疫を行った。対照動物にはアジュバントのみを接種した。42日目に、50μL中肺炎連鎖球菌4/CDC型5×106cfu2/D39型2×105cfu、又は3/43型105cfuでマウスに鼻腔内抗原投与した。抗原投与後10日間死亡率を記録した。ログランク検定Mantel-Haenszelで生存率のデータを分析した。結果は、Phtタンパク質のいずれかをワクチン接種することにより、マウスの約60が生存することができたが、対照群ではわずか20の動物しか生存しなかったことを示す図10。後の実験では、他の群の動物に、3つの異なる肺炎球菌抗原PspA、CbpA、及びPhtファミリーのうちの1つのタンパク質、すなわちPhtDをワクチン接種した。体液性応答の程度を評価し、最後の免疫化の2週間後に3つの異なる肺炎球菌株を動物に抗原投与した。全ての抗原/株の組合せについてマウスの生存率を記録した。得られた抗体のレベルは抗原依存性であった図11A。1μgのPhtDのワクチン接種は、10μgのCbpA又はPspAのワクチン接種よりも高い抗体価を誘発した。しかし、CbpA及びPspAが由来する2/D39株の鼻腔内致死性抗原投与に対する保護のレベルは、3つの抗原とも類似しており、生存率は約70であった図12A。他の株を使用したときの抗原間の違いを証明した。実際、PhtDのワクチン接種により、それぞれ3/43及び4/CDC株を抗原投与したマウスの60及び80が生存することができた。対照的に、CbpA及びPspAは、3型及び4型の抗原投与に対して全く保護をもたらさなかったか又は非常に弱い保護しかもたらさなかった。したがって、PhtDは、3つの株に対して保護をもたらすことができる唯一の抗原であった。実施例8Phtタンパク質による免疫は、肺炎連鎖球菌の鼻咽頭コロニー形成からマウスを保護するPhtDに対する免疫が中耳炎を防ぐ能力を評価するために鼻咽頭コロニー形成アッセイを使用した。幾つかの研究によって、鼻咽頭コロニー形成と中耳炎との間の関連が示されている。BogaertらLancetInfect.Dis.43;144-1542004年は、呼吸器感染症及び中耳炎の期間中に、コロニー形成率がより高い傾向があることを示した。実際、肺炎球菌性疾患は、同種の株による進行性及び/又は同時の鼻咽頭コロニー形成無しに生じることはないGreyらJ.Infect.Dis.142;923-9331980年,SyrjaneaらPaediatr.Infect.Dis.J.24;801-8062005年。最後の免疫を除いてアジュバントとして大腸菌の不安定毒素LT0.2μgを添加したPhtD、PhtA、PhtB又はPhtE5μgで、鼻腔内経路により0、14、及び28日目にBalb/cマウス4週齢;n=10/群を免疫した。同じプロトコールスケジュール及び投薬量を用いた別の実験は、PhtDをCbpA、PsaA及びPspAと比較することからなっていた。対照マウスにはLTのみを注入した。42日目に、7×104cfuの6B/CDC型株、4/CDC型、又は2/D39型をマウスに鼻腔内抗原投与した。少量の細菌接種材料10μLを使用して、抗原投与を行った。抗原投与の2及び6日後に収集した鼻の洗液中の細菌コロニーを計数した。麻酔をかけたマウスの鼻腔の内部を500μLのPBSで洗い流すことにより、鼻の洗液を得た。次に、細菌コロニーを計数するために、ToddHewittブロスで鼻の洗液100μLを10倍希釈した。これから、脱繊維滅菌ヒツジ血液及びゲンタマイシン3μg/mLを添加したDifco商標血液寒天基礎培地に10μLをプレーティングした。サンプルを広げるためにペトリ皿を傾け、37°Cで一晩インキュベートした後コロニーを数えた。全てのコロニー計数データを、正規化した後、分散分析で比較し、次いで、分散分析で有意差がみられなかった場合ダネット事後検定を行った。鼻咽頭保菌に対するワクチン接種の保護活性を評価するために、様々なPhtタンパク質でBalb/cマウスを鼻腔内免疫した後、2/D39株を同じ経路を介して抗原投与した。図13から分かる通り、PhtD又はPhtEのワクチン接種のみが2型株の抗原投与に対して有意な保護をもたらしたが、Phtファミリーの全てのメンバーが、ワクチン接種された動物の鼻咽腔における細菌量を低減することができた。このモデルにおけるPhtDの性能がより優れていたので、PhtDを他の肺炎球菌タンパク質と比較することからなる更なる実験のためにPhtファミリーのこのメンバーを選択した。したがって、PhtDを含む様々な肺炎球菌の抗原でマウスを免疫し、次いで、2型、4型、又は6B型株を抗原投与した。全身免疫後に観察されたように、鼻腔内免疫後に誘発された体液性応答は抗原依存性であった図11B。特に、CbpAはPspA及びPhtDよりも低い抗体価しか誘発しなかった。しかし、クレード相同2/D39株に対してCbpAによってもたらされる保護のレベルは、PspA及びPhtDに類似していた図14A。4/CDC型を抗原投与に使用したとき、PhtDによる免疫のみが、鼻咽腔コロニー形成に対して動物を保護することができ、一方、CbpA、PsaA又はPspAによる免疫は、LT対照と統計的に区別できなかった図14B。最後に、6B/CDC型による抗原投与は、動物がCbpA、PspA又はPhtDのいずれで免疫されたかによって、抗原投与の2日後における保護にいかなる差も証明されなかった図14C。PsaAだけがその点において効率が低いと思われた。抗原投与の6日後では、全ての群間に統計的な差は存在しなかった。しかし、PhtDについての結果を注意深く検討することにより、鼻咽頭コロニー形成から大多数の動物が保護され、不都合な統計的結論は恐らく2つの外れ値の存在にのみ起因することが明らかになった。結論として、PhtDは、この鼻咽頭コロニー形成のモデルにおいて、3つの株に対してある程度の保護を提供することができる唯一の抗原であった。実施例9PhtDによる免疫は、肺炎連鎖球菌の肺コロニー形成からマウスを保護するこのモデルは、BrilesらJ.Infect.Dis.188;339-3482003年の改良法であった。CBA/Jの雌マウス4週齢;30/群にAS02をアジュバントとして添加したPhtD3μgを0、14、及び28日目にi.m.免疫した。42日目に、2×107cfu/50μLの肺炎連鎖球菌19F/2737をマウスに鼻腔内抗原投与した。対照マウスにはアジュバントのみを注入した。抗原投与の3、4、及び5日後に収集した肺におけるコロニーを計数することにより、細菌量を測定した。全てのコロニー計数データを、正規化した後、分散分析で比較し、分散分析で有意差がみられなかった場合ダネット事後検定を行った。肺炎球菌感染症に罹患しやすい系統であるCBA/JマウスにPhtDをワクチン接種した後、中程度に有毒な19F菌株を抗原投与した。このようなプロトコールは、全身化した敗血症を伴わない気管支肺炎を誘導させる。抗原投与後、3、4及び5日目に肺における生菌数を評価した。プラセボと比較して、PhtDのワクチン接種が、肺における細菌量を大幅に95超低減したことが示された図15a。PhtDワクチン接種の有効性は、コロニー形成されていないマウスの数を分析したとき特に明白であった、その理由は、対照群の10に比べて、ワクチン接種されたマウスのうちの最大80が5日目に無細菌のままであったためである図15b。参考文献1AdamouJE,HeinrichsJH,ErwinALら.Identificationandcharacterizationofanovelfamilyofpneumococcalproteinsthatareprotectiveagainstsepsis.Infect.Immun.692,949-9582001年.2AjdicD,McShanWM,McLaughlinREら.GenomesequenceofStreptococcusmutansUA159,acariogenicdentalpathogen.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A9922,14434-144392002年.3AncsinJB,KisilevskyR.Laminininteractionsimportantforbasementmembraneassemblyarepromotedbyzincandimplicatelamininzincfinger-likesequences.J.Biol.Chem.27112,6845-68511996年.4BandyopadhyayK,KarmakarS,GhoshA,DasPK.HighaffinitybindingbetweenlamininandlamininbindingproteinofLeishmaniaisstimulatedbyzincandmayinvolvelamininzinc-finge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