脳腫瘍の処理に使用される、エフリン受容体の発現及び/又は活性の阻害物質。前記腫瘍がグリア芽細胞腫である、請求項1に記載の阻害物質。前記脳腫瘍が多形性グリア芽細胞腫である、請求項1に記載の阻害物質。前記処理が、手術後の脳腫瘍再発の治療である、請求項1のいずれか1項に記載の阻害物質。前記処理が、手術後の脳腫瘍再発の予防処置であることを特徴とする、請求項1に記載の阻害物質。前記処理が、脳腫瘍塊の成長を阻害することを特徴とする、請求項1に記載の阻害物質。エフリン受容体の発現及び/又は活性の前記阻害物質が、癌幹細胞増殖の阻害物質であることを特徴とする、請求項1に記載の阻害物質。配列番号1及び配列番号3から成る群から選ばれる、請求項1から7のいずれか1項に記載の阻害物質。少なくとも一つのエフリン受容体の発現及び/又は活性の阻害物質、及び、薬学的に許容される生物活性手段を含む医薬組成物。エフリン受容体の発現及び/又は活性の前記阻害物質が、癌幹細胞増殖の阻害物質であることを特徴とする、請求項9に記載の医薬組成物。エフリン受容体の発現及び/又は活性の前記阻害物質が、癌幹細胞転移の阻害物質であることを特徴とする、請求項9に記載の医薬組成物。前記癌幹細胞が悪性脳癌幹細胞である、請求項10又は11のいずれか1項に記載の医薬組成物。エフリン受容体の発現及び/又は活性の前記阻害物質が、配列番号1及び配列番号3から成る群から選ばれる、請求項9、10、11、又は12のいずれか1項に記載の医薬組成物。従って、脳腫瘍に対し、新規で、より特異的な治療法を開発すること、特に、グリア芽細胞腫の成長及び増殖に対する抑制物質を特定することが本発明の目的である。本発明は、エフリン受容体の、発現の阻害物質及び/又は活性の阻害物質の内の少なくとも一つと、薬学的に許容される生体活性手段とを含む医薬組成物に関する。本発明の詳細な説明においてさらに詳述するように、本発明の医薬組成物は、エフリン受容体神経組織の発生の際高度に発現され、脳細胞内のシグナル伝達及び多くの生理過程の調節を左右するという分子標的に対し特異的である利点を有する。本発明のもう一つの側面は、エフリン受容体の発現阻害物質及び/又は活性阻害物質を脳腫瘍の治療に使用することである。本発明の特徴及び利点は、下記の詳細な説明、例示的非限定的目的のために提示される実施例、及び、添付の図面112から明白となろう。本発明は、エフリン受容体の発現阻害物質及び/又は活性阻害物質の内の少なくとも一つと、薬学的に許容される生体活性手段とを含む医薬組成物に関する。本発明では、エフリン受容体の活性阻害物質とは、生物学的反応は引き起こさないが、アゴニスト介在反応は阻止又は低減する、一種の受容体リガンドが意図される。本発明では、エフリン受容体の発現阻害物質とは、該受容体の発現及び/又は活性の下方調節因子であることが意図される。本発明の医薬組成物は、エフリン受容体、即ち、神経組織の発生の際高度に発現され、脳細胞内のシグナル伝達及び多くのプロセスの調節に必須であるエフリン受容体という分子標的に対し特異的である利点を有する。多形性グリア芽細胞腫GBMという分子標的に作用する特異的医薬組成物は、外科的切除を不要とするので、手術後の脳内における腫瘍細胞の広範な拡散これは、しばしば、腫瘍再発をもたらすを免れると予想される。本発明による医薬組成物のもう一つの利点は、腫瘍塊全体ではなく真の腫瘍原発細胞を標的とするので、一般に用いられる放射線療法及び化学療法の単独使用又は併用よりも、毒性が低く、効力が高く、特異的であることである。この治療法は、腫瘍原発細胞について、細胞毒性手段によって該細胞を殺そうとするのでははく、該細胞が非毒性表現形を獲得するよう細胞のリプログラミングを実行するというシナリオを演出する。もう一つの局面では、本発明は、エフリン受容体の、発現阻害物質及び/又は活性阻害物質の内の少なくとも一つを含む医薬組成物であって、エフリン受容体の、上記発現阻害及び/又は活性阻害物質が、癌幹細胞増殖の阻害物質である医薬組成物を提供する。GBMでは増殖性癌幹細胞の存在が確認されているので、腫瘍中に存在するこれらの癌幹細胞によって強化される、癌の増殖及び持続的成長に対しても、それらに作用する特異的組成物を求める必要性の認識が次第に高まっている。驚くべきことに、本発明の組成物は、幹細胞の増殖能力に対しても作用する可能性がある。さらに別の局面では、本発明は、エフリン受容体の発現阻害物質及び/又は活性阻害物質の内の少なくとも一つを含む医薬組成物であって、エフリン受容体の、上記発現阻害及び/又は活性阻害物質が、癌幹細胞転移の阻害物質でもある医薬組成物を提供する。本発明の利点はさらに、癌幹細胞の確立を阻害するだけでなく、癌幹細胞その転移能力が阻止されるの拡張をも阻害することによっても示される。さらに別の局面では、本発明は、エフリン受容体の発現阻害物質及び/又は活性阻害物質の内の少なくとも一つを含む医薬組成物であって、上記癌幹細胞が悪性脳腫瘍幹細胞である医薬組成物を提供する。GBMは、侵襲性が高く、悪性の進行を呈する、脳腫瘍の内でもきわめて重篤な型を代表する。本発明の医薬組成物は、多形性グリア芽細胞腫という分子標的に対し特異的に作用し、悪性癌幹細胞の進行を阻害するという利点を有する。さらに別の局面では、本発明は、エフリン受容体の発現阻害物質及び/又は活性阻害物質の内の少なくとも一つを含む医薬組成物であって、エフリン受容体の上記発現阻害物質及び/又は活性阻害物質が、配列番号1及び配列番号3から成る群から選ばれる医薬組成物を提供する。本発明の目的のために、エフリン受容体の各発現及び活性阻害物質は、下記のような対応配列番号を有する:配列番号1は、エフリンA1のアミノ酸配列、アミノ酸配列gi333596refNP0044192、エフリンA1異性形、前駆体[ホモサピエンス]に合致し;配列番号2は、エフリンA1のヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列gi33359681refNM0044282、ホモサピエンスephrinA1EFNA1、転写変異体1mRNAに合致し;配列番号3は、EphA2のアミノ酸配列、アミノ酸配列gi32967311refNP0044222、エフリンA型受容体2前駆体[ホモサピエンス]に合致し;配列番号4は、EphA2のヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列gi296010835refNM0044313、ホモサピエンスEPH受容体A2EPHA2mRNAに合致する。本発明のさらに別の局面は、脳腫瘍の治療に使用されるエフリン受容体の発現阻害物質及び/又は活性阻害物質である。本発明によって提供される利点は、脳腫瘍の発生及び進行に関与する分子標的に作用する特異的阻害物質の使用に基づく。好ましい実施態様では、本発明は、脳腫瘍の治療に使用されるエフリン受容体発現阻害物質及び/又は活性阻害物質を提供する。ここに、エフリン受容体の上記発現阻害抑制物質及び/又は活性阻害物質は、配列番号1及び配列番号3から成る群から選ばれる。本発明の目的のために、エフリン受容体の発現及び活性の各阻害物質は、前述の対応配列番号を有する。エフリン受容体の調節されない過剰発現は、腫瘍発生と相関し、腫瘍の成長及び生存に関わり、ヒト癌の進行では血管形成及び転移を伴う。従って、エフリン受容体の発現及び活性の阻害は、腫瘍進行の阻止のために有利である。本発明のさらに別の局面は、エフリン受容体の発現阻害物質及び/又は活性阻害物質の使用であって、上記脳腫瘍がグリア芽細胞腫である場合の使用であり、さらに別の局面では、上記脳腫瘍が多形性グリア芽細胞腫である場合の使用である。本発明のさらに別の局面は、エフリン受容体の発現阻害物質及び/又は活性阻害物質の使用であって、上記処理が、術後における、脳腫瘍再発の予防処理となる使用である。本発明のさらに別の局面は、エフリン受容体の発現阻害物質及び/又は活性阻害物質の使用であって、上記処理が、術後における、脳腫瘍再発の治療処理となる使用である。腫瘍血管において発現されるエフリン受容体も、その内在性リガンド、エフリンA1との連結を通じて、血管形成及び腫瘍の新規血管形成に重要な役割を果たす。腫瘍におけるそれらのシグナル伝達は、内皮細胞において、細胞骨格の可塑性、基質付着、及び/又は細胞間接着を調節することによって、該細胞の転移及び毛細管構造への集積を促進する。驚くべきことに、本発明によるエフリン受容体の発現阻害物質及び活性阻害物質は、血管形成及び腫瘍の新規血管形成を阻止し、腫瘍の成長及び術後の再発を抑制する。本発明のさらに別の局面は、エフリン受容体の発現阻害物質及び/又は活性阻害物質の使用であって、上記処理によって脳腫瘍塊の成長が抑制される使用である。本発明のさらに別の局面は、エフリン受容体の発現阻害物質及び/又は活性阻害物質の使用であって、エフリン受容体の上記発現阻害物質及び/又は活性阻害物質が、癌幹細胞増殖の阻害物質となる使用である。本発明の利点はさらに、エフリン受容体阻害が癌幹細胞の転移及び増殖を阻止するという事実によっても証明することが可能である。本発明による医薬組成物のもう一つの利点は、腫瘍塊中の特異的癌幹細胞集団を標的とし、該癌幹細胞だけを選択的に除去し発癌性を消去するよう効果的に設計された、個別の患者に合わせた治療法を提供することが可能となることである。腫瘍サンプルからの、多形性グリア芽細胞腫由来癌幹細胞GBMCSCの単離腫瘍標本は、神経外科治療室から患者の切除手術後に入手した。成人のグリア芽細胞腫GBM組織サンプルは、世界保健機構ガイドラインに従って入手し、分類した。各癌組織は、二つの組織片に分割した。第1のものは病理組織学的分析のために使用した:詳細には、組織を、4パラフォルムアルデヒドに24時間浸し、次いで、パラフィン包埋し、免疫組織化学検査に供するか、若しくは、40から始まる連続希釈濃度のスクロース液に入れて浮遊切片を得、共焦点顕微鏡検査に供した。第2組織片は、GBM癌幹細胞系統を得るために使用した。組織は切断して1mm3の小片とし、GrittA1996及びGalliR20046及び5に倣って、下記のように、機械的に、酵素的に細かくした:小片を、6ウェルプレートNuncに納めた、08mgmlのパパイン20UmLWorthinghton、02mgmLのLシステインSigma、02mgmLのEDTASigmaを含む4mLのEBSS液に移し、37°Cで45分インキュベートした。次に、組織切片を、焼成研磨パスツールピペットで注意深く細かくした。細胞を遠心によって収集し、ばらばらの単一細胞を、いわゆる完全培養液、DMEMF1211vvGibco血清無添加培養液に懸濁させて、25cm2組織培養フラスコに8000cm2の密度となるように撒いた。完全培養液は、2mMのLグルタミン、06グルコース、96μgmlのプトレッシン、63ngmlのプロゲステロン、52ngmlの亜セレン酸ナトリウム、0025mgmlのインスリン、01mgmlのトランスフェリンナトリウム塩、II級、Sigmaを、20ngmLの上皮増殖因子EGF、Peprotech及び線維芽細胞増殖因子FGF2、Peprotechの存在下に含む。新鮮培養液を4日毎に加えた。撒布後1020日に、各フラスコに生じた一次球体の数を評価した。次に、球体を、15ml試験管BDにおいて192×gで10分遠心することによって収集した。次に、一次球体を機械的に細かくして単一細胞懸濁液とし、再度プレートに撒いて培養した。各系統において通常27日までに、継代を可能とするほどの新規球体が形成された。これらの細胞系統は、グリア芽細胞腫由来癌幹細胞又は、腫瘍原発細胞GBMCSCという名称によって特定された。無事に確立された細胞系統から得たGBMCSCの一部を、完全培養液プラス10DMSOSigmaにおいて、第3、第4サブカルチャー各工程において凍結し、保存した。残余のものはさらに拡張させた。結果:脳腫瘍、特にグリア芽細胞腫は、腫瘍発現能力を持って生まれ、神経幹細胞の機能的特徴によって定義される細胞GBMCSCとなる。従って、正常な神経発生の調節機構に関する研究は、GBMCSCの新規阻害物質の特定を実現し、脳腫瘍に対する、より特異的な治療戦略の開発を導く可能性がある。RTPCR及び細胞フルオロメトリー分析による、GBMCSC細胞系統におけるEph受容体発現の定量制御されていない又は過剰発現Eph受容体は、形質転換、腫瘍の増殖及び生存を増進する可能性がある。ヒトのGBM標本と、その中に含まれるGBMCSCについて、新鮮単離、連続サブカルチャーの両標本において、エフリン及びエフリン認識受容体の発現と制御を調べた。RNA抽出及びcDNA調製RNeasyMiniキットを用いて、全体RNAを下記から抽出した:グリア芽細胞腫と診断された、様々な患者から単離されたGBMCSC細胞系統、新鮮な一次GBM標本、非侵襲性U87細胞市販のヒト星状細胞腫系統、及び、正常なヒトの神経幹細胞HNSC、我々の研究室で取得可能、13。cDNAは、SuperscriptRNaseH逆転写酵素Gibcoをメーカーの指示に従って用いて得た。cDNA合成のため、1μgの全体RNAをオリゴdTプライマーに付着させた。PCR増幅これらのcDNAは、それぞれ個別に、EphA1EphA2EphA3EphA4EphA5EphA7EphA8EphA10EphB1EphB2EphB3EphB4EphB6受容体、及び、EFNA1EFNA2EFNA3EFNA4EFNA5EFNB1EFNB2EFNB3リガンドの特定のために設計されたPCRプライマーを用いて増幅した。鋳型として使用されるcDNAは全て、下記のプライマーペアを22回の増幅サイクルで用いるβアクチンRTPCRによってあらかじめ正規化した:βアクチンF1及びβアクチンR1。次に、610bpのPCR産物を、2アガロースゲルの上に走らせ、1μgのヒト脳の全体RNAAmbion由来のcDNAから得た同じPCR産物に対し信号強度に関して比較した。特異的プライマーを下記のように設計した:EphA1順行5GCCTGACACCACATACATCG3逆行5ATATGCGGGTGGCTAAACTG3EphA2順行5AAAGCCGGCTACACAGAGAA3逆行5TTGGACAACTCCCAGTAGGG3EphA3順行5GAGTTTGCCAAGGAATTGGA3逆行5TTGGGATCTTCCCTCCTCTT3EphA4順行5ACCAAGCAGTGCGAGAGTTT3逆行5CTCCCCGTACGACATCACTT3EphA5順行5CAAGCCTAATATGGCGGTGT3逆行5GTGAACTGCCCATCGTTTTT3EphA7順行5ATCATTGGGAGAAGGCACTG3逆行5ATGGACAACATTTGGGTGGT3EphA8順行5GAGAACGGCTCTCTGGACAC3逆行5CCTCCACAGAGCTGATGACA3EphA10順行5CGACTAATGCTCGACTGCTG3逆行5TGATCAAGCAACTGCCACTC3EphB1順行5CAGGGTACTCGGAGAAGCAG3逆行5CCAGCATGAGCTGGTGTAGA3EphB2順行5AGTTCGGCCAAATTGTCAAC3逆行5AGGCAGGTGAATGTCAAACC3EphB3順行5AGCAACCTGGTCTGCAAAGT3逆行5GGATGAGCTTGTCCAGGGTA3EphB4順行5GAGAGCTGTGTGGCAATCAA3逆行5TGTAGGTGGGATCGGAAGAG3EphB6順行5TCATTGCACATGGAAAGCAT3逆行5GGGTGAGTCCAGACAAGGAA3EFNA1順行5GGTGACTGTCAGTGGCAAAA3逆行5AGTGGAAGGAGCAGCACAT3EFNA2順行5ATCTACTGCCCGCACTATGG3逆行5AGGCGTGGCAGAGATGTAGT3EFNA3順行5CATGCGGTGTACTGGAACAG3逆行5GTGGAACTCGTAGCCCAGAG3EFNA4順行5ACATTGTCTGCCCCCACTAC3逆行5TGGGCTGACTCAGACTTCCT3EFNA5順行5AGGACTCCGTCCCAGAAGAT3逆行5ATCTGGGATTGCAGAGGAGA3EFNB1順行5GCCTGGAGTTCAAGAAGCAC3逆行5GAACAATGCCACCTTGGAGT3EFNB2順行5GTGCCAAACCAGACCAAGAT3逆行5GATGTTGTTCCCCGAATGTC3EFNB3順行5AGGCAGAGGGTGGTTATGTG3逆行5TCTCTTTCCATGGGCATTTC3細胞系統に関するフローサイトメトリー分析各種GBMCSC細胞系統におけるEph受容体発現を定量するために、細胞標本各試験管当たり500000個の細胞を遠心し、02mLの完全培養液に再懸濁した。次に、細胞を、暗い中4°Cで30分一次抗体に暴露した。U87細胞を腫瘍細胞に対する参照コントロールとして、HNSCを神経幹細胞の参照コントロールとして用いた。細胞内染色のために、細胞標本各試験管当たり500000個の細胞を、交互に、05mLのCytofixCytoperm液BDBiosciencesで室温で30分処理することによって透過可能とした。細胞を、2mLのBDPermWash1XBDで洗浄し、室温で10分インキュベートした。遠心後、それらの細胞を、適切な一次抗体混合物を含む02mLのBDPermWash液1XBDに再懸濁した。用いた一次抗体は下記の通り:抗EphA1山羊ポリクロナール抗体抗EphA2山羊ポリクロナール抗体抗EphA3山羊ポリクロナール抗体抗EphA5兎ポリクロナール抗体抗EphA7兎ポリクロナール抗体抗EphA8山羊ポリクロナール抗体抗EphB1兎ポリクロナール抗体抗EphB2兎ポリクロナール抗体抗EphB6兎ポリクロナール抗体十分に洗浄した後、03mLの適切な二次抗体を加えた:驢馬抗山羊IgPE標識抗体驢馬抗兎IgFITC標識抗体各サンプルを、暗い中4°Cで30分インキュベートした。2回の洗浄後、細胞を、05mLの完全培養液に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。これらのアッセイでは、自発性蛍光及びアイソタイプコントロールの検査を通例として行った。上記全てのアッセイにおいて、分析は、Summit43ソフトウェア使用のフローサイトメトリー検査機CyanCoulterによって実行した。背景蛍光は、特異的一次抗体を、特異的アイソタイプコントロールで置換することによって評価した。さらに、自発性蛍光の測定も、試験した各条件について通例的に行った。結果:エフリン受容体及びそれらの認識リガンドの過剰発現は、多くのタイプのヒト癌の進行と関連する可能性がある。図1Aに示すように、エフリン受容体13種を分析とリガンド8種を分析のメッセンジャーRNA転写物は、通常のPCRによって回収することが可能である。全てのcDNAは、βアクチンによってあらかじめ正規化した。腫瘍細胞に対する参照としてヒトの星状細胞腫細胞系統U87を用い、正常神経幹細胞の参照としてヒトの神経幹細胞HNSCを用いた。興味あることに、正常及び癌幹細胞と違って、エフリンA1リガンドは、U87細胞では、メッセンジャーRNA転写物レベルでもタンパクレベルでも回収されない。注目すべきことに、図1Baに示すように、GBMCSCにおけるエフリン受容体の発現がサイトフルオロメトリー分析によってタンパクレベルで裏付けられた。さらに、図1Bbに見られるように、EphA2が、GBM由来癌幹細胞系統n6において広く強調される。このヒストグラムは、3回の別々のアッセイの平均±semを示す。さらに、代表的GBMCSC細胞系統におけるEphA2受容体及びエフリンA1リガンドの広範な発現例が図1Cに示される。免疫蛍光標識の共焦点画像は、腫瘍細胞における、EphA2受容体a、及び、その局所拡大画像bc、及び、エフリンA1リガンドd、及び、その局所拡大画像eの存在及び微弱な陽性染色を裏付ける。スケールバーは、40μm20μm13μmである。一次GBM組織におけるEphA2受容体発現の定量強化レベルのEphA2がGBMCSC細胞系統において再現可能であることが明らかにされた後、新鮮腫瘍組織においても免疫反応性EphA2の存在が特定され、これによって、この受容体が単にインビトロで長期に培養されたために生じたものなのかもしれない、という可能性は排除された。一次組織の免疫組織化学検査免疫組織化学的染色のために、一次GBM腫瘍組織を、採取後、パラフォルムアルデヒド中で24時間固定した。次に、組織を、PBSに溶解した10、20、及び30スクロース液において4°Cで凍結しないように冷却保存し、次いで、21vvの20スクロース/TissueTekOCT包埋化合物混合物embeddingcompoundmixtureにおいて一晩包埋工程embeddingstep処理した。クライオスタットで10ミクロン厚の連続切片に切り出し、ゼラチン被覆スライドガラスにマウントし、二重免疫標識を実行した。手短に言うと、切片を空気乾燥し、0005BSA及び01トリトンを含む01MTrisHClバッファーpH76で濯ぎ、一次抗体と、4°Cで一晩インキュベートした13。組織切片は、山羊抗ヒトEphA2150、RD抗体、又は、モノクロナールマウスIgG1抗ヒトEphA2クローンD7抗体1100、Sigmaによって染色した。一次組織のフローサイトメトリー前述の酵素的消化及び機械的分離の直後に、一次腫瘍標本から単離した細胞懸濁液に対し、EphA2受容体発現に関してFACS分析を行った。手短に言うと、GBM組織解離から得られる細胞をLDS75110ngmLMolecularProbesによって室温で15分染色して無傷の有核細胞を特定した。細胞をフローサイトメータFACSAriaBDBiosciencesによって分析し、バックゲーティング技術LDS751陽性細胞を用いて、FSC対SSCドットプロットにおいて、無傷の有核細胞を特定する領域P1を導出した。無傷の有核生細胞を特定するために、7AAD陰性細胞を含む領域に領域P1を加えることによって複合ゲートを創出した。次に、陽性/死亡細胞を特定するために、GBM組織解離から得られたCSCを、山羊抗ヒトEphA205μgRD及び7AAD5μgmLCoulterとインキュベートした。結果:グリオーマ患者から得られた一次グリオーマ及びその隣接する正常周辺部分におけるEphA2受容体の局在を調べるために免疫組織化学法を用いた。図2の上部パネルに示す結果は、腫瘍の中心部aの方が、悪性度の低い周辺部b少なくとも2cm中心部から離れているよりもEphA2信号がより高まっていることをはっきりと示す。スケールバーは50μm。同じ図の下部パネルに示すように、サイトフルオロメトリー分析によって、EphA2受容体タンパクは、速やかに解離されたGBMCSCにおいても患者の腫瘍から構造的に回収、検出されたn4矢印。可溶性ephrinA1FcRD及び可溶性EphA2Fc受容体RDの、ヒトGBMCSCにおけるEphA2発現及びリン酸化に及ぼす作用リガンド誘発性受容体変性によって、EphA2発現の低下が起こることがあり、これは、細胞外基質ECMに対する細胞接着性の上昇、細胞転移の低下、及び悪性増殖の抑制をもたらす。従って、GBMCSC細胞におけるこの受容体の過剰発現は、細胞の悪性行動に反映されると考えられ、ephrinA1Fcによる該受容体への結合は、発癌性に対抗すると考えられる。この観点から、GBMCSCにおいて、EphA2の発現又は活性の強制的抑制の、発癌性に及ぼす作用を定量した。EphA2受容体に結合させてその発現を下げ、それが、これらの細胞の全体機能特性の調節にどのように影響するのかを、インビトロ及びインビボで定量した。EphA2には、可溶性ephrinA1Fc、マウスephrinA1ヒトIgG1Fcキメラタンパクを結合させた。さらに、EphA2は、そのキナーゼ活性が、リガンド結合に完全に依存するものではないという点で、Eph受容体の中でも特異であるようである。EphA2の、このリガンド独立作用は、悪性進行を左右する影響プロセスにおいて重要である。それとは別に、内在性EphA2リン酸化阻止の作用を、EphA2Fc受容体受容体の細胞外リガンド結合部分を、ヒトIgG1のFc部分に融合させたキメラタンパクで、これも周辺リガンドと競合的に結合するを用いて分析した。サイトフルオロメトリー分析用量反応分析のために、機械的解離の直後に、ephrinA1Fcの存在下に0001001010510μgmL、細胞を撒き、24時間インキュベートした。継時分析のために、細胞を、ephrinA1Fc10μgmLと6、24、48、72時間インキュベートした。細胞標本500000細胞/サンプルを遠心し、02mLの完全培養液に再懸濁した。次に、細胞を、抗EphA2山羊ポリクロナール抗体05μgRDに、暗い中4°Cで30分暴露した。十分洗浄した後、驢馬抗山羊IgFITC標識抗体056μg/サンプル、JacksonImmunoresearchを加え、各試験管を、暗い中4°Cで30分インキュベートした。2回の洗浄後、細胞を、05mLの完全培養液に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。これらの全てのアッセイにおいて、常法に従って、自発性蛍光及びアイソタイプコントロールisotypecontrolを行った。免疫細胞化学細胞は、Cultrex被覆12mm直径ガラス製カバースリップTrevigenに、25×104細胞cm2の密度となるように、コントロールとして完全培養液にて、若しくは、ephrinA1Fcの存在下に0510μgmL撒き、24時間インキュベートした。細胞は洗浄し、4パラフォルムアルデヒドPBS液pH74中で固定し、免疫染色を実行した。カバースリップは、10正常山羊血清NGS又は10牛胎児血清FBS、03TritonX100、及び適当な一次抗体又は抗血清兎抗ヒトエフリンA1150Abcam、山羊抗ヒトEphA2150RDを含むPBSにおいて4°Cで一晩インキュベートした。それとは別に、細胞は、マウスのモノクロナールIgG1EphA2クローンD71100Sigmaによって免疫染色した。PBSで十分に洗浄した後、細胞は、暗い中室温RTで、下記の適当な二次抗体と45分反応させた:CianineCy2又はAlexaFluor488接合山羊抗兎1200JacksonImmunoresearch12000InvitrogenCianineCy3又はAlexaFluor546接合驢馬抗山羊1500JacksonImmunoresearch12000InvitrogenCiannineCy3接合山羊抗マウス1800JacksonImmunoresearch洗浄後、細胞核を、46ジアミジン2フェニルインドールジヒドロクロリドDAPI、50gmlのPBS溶液、Sigmaによって室温で10分カウンター染色し、PBS中で3度、蒸留水中で1度濯ぎ、FluorsaveCalbiochemと共にガラススライドにマウントした。一次及び二次抗体に対する適切なコントロールにおいて、非特異的染色及び抗体同士の交差反応のいずれも検出されなかった。画像は、ZeissAxioplan2顕微鏡及びLeicaDMIRE2共焦点顕微鏡によって分析した。ウェスタンブロット細胞は、解離後直ぐ、ephrinA1Fc50μgmL又はEphA2Fc50μgmLの存在下に完全培養液に撒き、10、30、60分、及び24時間インキュベートした。細胞はさらに、Cultrex被覆Trevigenフラスコに撒き、その分化を、EGFFGF2の除去及び白血病阻害因子の添加LIF10ngmLによって誘発し、710日間インキュベートした。次に、細胞を、再懸濁し、遠心し、分解した。分解バッファーは、1プロテアーゼ抑制因子カクテルSigma及び10フォスファターゼ抑制因子カクテルRocheを添加した、50mMTrisHClpH74、1mMEDTA、及び、1TritonX100から構成される。細胞を収集し、PBSで洗浄し、14460×gで遠心した。タンパクの定量は、一連のアルブミン標準使用のDCProteinAssayBioRadによって行った。70μgの各分解産物にゲル負荷バッファーを加え、タンパクは、標準プロトコールに従って、10ポリアクリルアミドゲルによって溶解し、HybondECLニトロセルロース膜GE上に移動させた。膜は、Trisバッファー生理的食塩水TBSTTBSプラス002Tween20及び5ミルクでブロックし、下記の一次抗体と4°Cで一晩インキュベートした:IgG山羊抗ヒトEphA21750RDIgG1マウス抗ヒトEphA2クローンD71500Sigmaこの工程に次いで、西洋わさびペルオキシダーゼHRPを接合させた下記の二次抗体110000BioRadと30分インキュベートした:驢馬抗山羊IgG15000Promega兎抗マウスIgG110000GEペルオキシダーゼ活性は、化学蛍光強化システムをメーカーの指示に従って用いることによって検出した。負荷コントロールとして、マウス抗グリセルアルデヒド3フォスフェートデヒドロゲナーゼGAPDH抗体1500Zymedを用いた。免疫沈降細胞は、ephrinA1の不在下又は存在下1050μgmLに、若しくは、マウスモノクロナールIgG1異性体コントロールRDの不在下又は存在下に24時間育成し、次いで前述の通りに分解した。EphA2リン酸化のレベルを定量するために、100μgの総タンパクを含む細胞分解物をマウス抗ヒトEckEphA21500Upstateと、ゆっくりと掻き回しながら4°Cで一晩インキュベートした。メーカーの指示に従って、ビーズDynalInvitrogenビーズ分離を分解バッファーによって十分に洗浄し、免疫複合体を、2xLDSサンプルバッファーInvitrogenによって溶出し、煮沸し、短時間遠心した。タンパクを溶解し、マウス4G10白金抗ヒトフォスフォチロシン11000Upstate使用のウェスタンブロットによって検出した。結果:リガンド誘発性受容体内部移行ligandinducedreceptorinternalization、細胞内移動の低下及び変性は、このタンパクの安定性を増し、EphA2の過剰発現に寄与すると考えられる。受容体リン酸化と、それに続く受容体の低減の結果として発癌性シグナル伝達の抑制を含むephrinA1Fcには、二重の腫瘍抑制機能が認められる。図3Aの細胞フルオロメトリー分析は、ephrinA1Fcが、ヒトGBMCSCにおいて、EphA2受容体下降を介して発癌性シグナル伝達を抑制することを明瞭に示す。ephrinA1Fcの抑制作用は、用量依存性か時間依存性かのいずれかである。数値は、2回の測定の平均値±semを表す。さらに、図3Bの上部パネルに掲げるように、GBMCSCで行ったヒトEphA2に関する免疫蛍光検査は、細胞の多くが、受容体に関しては陽性であるが、一方、ephrinA1Fc10μgmL後及び50μgmL後では、同じ抗原に関してごく僅かな細胞しか標識されなかったことを裏付ける。スケールバーは20μmである。同じ図の中央パネルにおいて、全細胞分解産物のウェスタンブロットによって、ephrinA1Fc処理GBMCSCにおいて、EphA2受容体の発現の低下がタンパクレベルで確認された。注目すべきことに、ブロットは、ephrinA1Fc介在によるEphA2受容体の招集は、濃度/時間依存的に、GBMCSCにおけるEphA2発現を著明に下げることを裏付ける。細胞は、ephrinA1Fcの不在下又は存在下に表示の期間育成した。定量される免疫反応タンパクの濃度は60分内に完全に排除された。このことは、その認識リガンドによるEphA2の結合が、受容体の急速な陥入と一致することを示唆する。ヒトの線維芽細胞系統HFを、EphA2抗体の陰性コントロールとして用いた。GAPDHを、分解産物と等しい負荷コントロールとして含める。提示のデータは、3種の異なるGBMCSC系統の内の1つの代表例である。ephrinA1Fcは、GBMCSCにおいて、EphA2受容体のリン酸化及び変性をトリガーする。ephrinA1Fcによる処理後の免疫沈降によって評価されるように図3B、下部パネル、GBMCSCにおいてチロシンリン酸化EphA2の濃度レベルは急激に増加する。これは、ephrinA1Fc介在性の受容体活性化を示す。解離後直ぐに、細胞は、漸増濃度のephrinA1Fcか、又はFc異性形コントロールisotypecontrolによって48時間処理した。全細胞分解産物に対する、免疫沈降EphA2レベルのフォスフォチロシン特異的4G10抗体によるイムノブロットは、ephrinA1Fcによる、EphA2の活性化及びリン酸化の上昇を裏付ける。最後に、図3Cに示すように、EphA2Fc処理は、GBMCSCにおいて、EphA2タンパクの発現を下げるというよりむしろ内在的EphA2のリン酸化を阻止すると考えられる。安静GBMCSC、及び、表示の期間EphA2Fc50μgmLによって活性化されたGBMCSCに対しウェスタンブロット分析を行った。分化GBMCSCにおいてEphA2受容体の発現レベルが検出されなかったことに注意。これは、EphA2受容体が、GBM癌幹細胞の発癌性、例えば、異常増殖及び転移の調節に与るという可能性を示している。表示の免疫ブロットは、それぞれ異なる時期に分析された3回のブロットの代表例である。インビトロにおける、ephrinA1Fc又はEphA2Fc受容体のヒトGBMCSC増殖に対する作用EphA2の下方制御/リン酸化強化、又はその認識リガンドとの競合結合が、GBMCSCの発癌性に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ここでは、最重要な幹細胞のパラメータ、例えば、分裂の全体的対称性に対する、ephrinA1Fc及びEphA2Fcの細胞分裂抑制作用を分析した。成長の活性状態におけるGBMCSC細胞を、可溶性ephrinA1Fc又はEphA2Fcに暴露し、次いで、動態からの偏差を評価した。成長曲線GBMCSC細胞の増殖指数を分析するために、神経球懸濁液を、15mLの試験管BDに移し、192×gで10分遠心し機械的に細かくして、単一細胞懸濁液とした。トリパンブルー排除によって細胞をカウントし、8×103細胞cm2の生細胞を、マウスのモノクロナールIgG1アイソタイプコントロールRD、ephrinA105102030又は50μgmL、又はEphA2Fc50μgmLの存在下に撒いた。次いで、サブカルチャー工程0DIVで得られた全細胞数をプロットした。各サブカルチャー継代46日置きにおいて、単一細胞懸濁液を得、生細胞の全数をトリパンブルー排除によってカウントした。8×103細胞cm2の生細胞を同じ条件下に再度撒いた。これによって、動態パラメータkineticparameter成長曲線勾配、GrittiA2001を参照7の定義が得られるので、CSCHNSC拡大率、腫瘍細胞に対する参照コントロールとして使用されるU87細胞、神経幹細胞の参照コントロールとして使用されるHNSCの定量において上述の組み換えタンパクの役割の指標が得られる。ephrinA1Fc及びEphA2Fc処理の結果が真正幹細胞に対し作用を及ぼすかどうかを評価するために、急性解離細胞acutelydissociatedcellsによる増殖分析を、GBMCSCについて、前述のようにそれらを一次腫瘍組織標本から単離して直ぐにEphA2Fc50μgmLの存在下にサブカルチャーすることによって実行した。KI67免疫反応性この研究は、KI67分析1による増殖指数の定義によって補完した。手短に言うと、細胞を、EGFFGF2の存在下に、Cultrex被覆Trevigenガラス製カバースリップに撒き、ephrinA1Fc0510μgmLに24時間暴露した。増殖細胞は、IgG兎ポリクロナール抗Ki6711000Novocastraによる間接的免疫細胞化学法によって定量した。Cy2山羊抗兎二次抗体を上述のように使用した1:200JacksonImmunoresearch。各フィールドの細胞の全数は、46ジアミジン2フェニルインドールジヒドロクロリドDAPI、Sigma50gmlのPBS溶液によって室温で10分細胞核をカウンター染色することによって定量した。BrdUアッセイ増殖は、メーカーRocheによって提供された説明書に従ってBrdU比色アッセイキットを用いて監視した。手短に言うと、GBMCSCを、96ウェルマイクロプレートに5000細胞/ウェルの密度で撒いた。この細胞を、エフリンA10001001010510μgmLに24時間暴露し、その後、BrdU110に24時間暴露した。細胞増殖指数は3重に評価した。結果:図4Aの成長動態実験によってはっきり示されるように、ephrinA1FcリガンドによるEphA2受容体の活性化及び急速な内部移行internalizationは、GBMCSC系統の増殖指数を大きく下げる。アイソタイプコントロールFcによる細胞成長に比べ、培養下のGBMCSCに対するephrinA1Fcの添加後には、成長動態における様々な違いがac、ヒトの神経幹細胞添加後では同様のd、U87ヒトグリオーマ系統eとは相違する変化が検出された。ephrinA1Fcは、濃度依存的にGBMCSC細胞の増殖を減衰させる。成長曲線は、3種のGBMCSC系統を代表する。fephrinA1Fcと共に育成した細胞に対し、EphA2Fcは、GBMCSCの成長動態の大きな低下を誘発することが示された。このデータはまたしても、GBMCSCプールの消失におけるephrinA1Fc及びEphA2Fcの機能的役割を示唆すると考えられる。図示のグラフは全て3回の実験を代表する。fの成長曲線は、一つのGBMCSC細胞系統を代表する。図4Bに報ずるように、BrdUの取り込みaも、K167免疫反応細胞bのいずれも、表示の濃度の可溶性リガンドの存在下では大きく低下した。ephrinA1Fcは、U87細胞の増殖に対しては何ら抑制作用を発揮しなかった。aは、一つのGBMCSC細胞系統を表す。表示のデータは、4回の独立実験の平均±semである。図4Cは、GBMCSC細胞を、一次腫瘍組織標本から単離後直ぐにEphA2Fc50μgmLに暴露すると、培養下のそれらの細胞の拡張が阻止されることをはっきりと示す。二つの急性解離GBMCSC細胞系統由来の神経球の、EphA2Fcの不在下ac又は存在下bdにおける位相差顕微鏡画像は、クローン形態の明瞭な差を示す。未処理GBMCSC由来クローンは、典型的な円形形態を呈するのに、一方、EphA2Fc処理後に得られた神経球は、不規則な形状を持ち、細胞接着の増大、及び恐らくは細胞分化を示唆する、たくさんの突出長尺細胞の存在によって特徴づけられるn4。バー、50μm。可溶性ephrinA1Fc又は可溶性EphA2Fc受容体の、ヒトGBMCSCのクローン形成能及び自己再生能に及ぼす作用GBMCSCの自己再生能癌幹細胞が、自己の複数のコピーを一定時間に生産する能力と定義されるは、それらの細胞の振る舞いがどの程度活動的であるかの予測指数となる。ここでは、分裂の全体対称性を左右する重大な幹細胞パラメータ、例えば、関連自己再生活性を分析した。ephrinA1Fc又はEphA2Fc暴露後の自己再生指数を、クローン原性アッセイ及びGBMCSC細胞仕分けによって評価した。クローン原性アッセイ単一クローンの解離によって得られたGBMCSC系統をカウントし、1000生細胞/ウェルを、Lポリリシン被覆01mgmLSigma24ウェルプレートに撒いた。710日後、生成された二次球の数を評価した7。細胞を、マウスのモノクロナールIgG1アイソタイプコントロールRD、ephrinA1Fc0510203050μgmL、又はEphA2Fc50μgmLの存在下に撒いた。幹細胞コントロールとしてHNSCを用いた。細胞仕分け2×106個のGBMCSC細胞を遠心し、DNアーゼ11000、最終濃度1μgmLSigma添加の、05mLの完全培養液に再懸濁した。次に、96マルチウェルプレートの各ウェルの単一細胞仕分けのために、単一細胞仕分けモード及びACDUAutomatedCellDepositionUnit自動化細胞集積機を用いて、GBMEphA2受容体陽性又は陰性細胞を仕分けし、分析したFACSAria、BDBiosciences。FACSAriaには、488、633、及び紫色レーザーが装備される。細胞は、前進及び直交光散乱信号によって特定され、電子的に開門通過される。抗EphA2に結合する細胞を表す事象は、その光散乱FSC及びSSC及び蛍光サインFITCによって特定される。最大3種の細胞集団が同時に仕分けされた。機器の生データは、記録保存及びデータ処理のために電子的に保存された。細胞撒布の1014日後DAP、各ウェルにおいて生成された一次球の数クローン効率を評価した。結果:図5Aに示すように、ephrinA1Fcは、インビトロのヒトGBMCSCにおいて全体的分裂対称性及び関連自己再生能に影響を及ぼす。方法に記述された連続的クローン原性アッセイにおいて、コントロールFcと共に育成させた細胞に比べ、表示濃度の可溶性ephrinA1Fcによって刺激されたGBMCSCは、より低いクローン効率を表すことが示され、それは、HNSCには近似するが、U87細胞とはまったく異なっていた。EphA2のリガンド介在性活性化は、神経前駆体クローン形成のパーセントクローン効率を用量依存的に低下させた。コラムは、3回の別々のアッセイの平均であり、バーは、semである。さらに、ephrinA1Fcは、インビトロのGBM細胞において形態変化を誘発する。二つのGBMCSC系統培養体から得られた、図5Bに掲げる神経球の位相差顕微鏡写真は、ephrinA1Fcのクローンサイズに及ぼす作用をはっきりと示す。ad安静restingコントロール、beephrinA1Fc05μgmL、cfephrinA1Fc10μgmL。これは、GBMCSCプールの消失におけるephrinA1Fcの関与を裏付けるものと考えられる。注目すべきことに、ephrinA1Fcの飽和用量5μgmLは、HNSCの神経球形成を完全に阻止したデータ図示せず。スケールバー100μm50μm。最後に図5Cに掲げるように、EphA2/細胞仕分けを実行したところ、インビトロにおいて、EphA2陽性サブ集団は、EphA2陰性細胞に対し、クローン原性が顕著に高かった。コラムは、5回の別々のアッセイの平均であり、バーは、semである。可溶性ephrinA1Fc又は可溶性EphA2Fc受容体の、発癌性GBMCSCプールに及ぼす作用エフリンA1Fc及びEphA2Fc処理の結果が、波及的関与wavecommittedの前駆細胞ではなく、真正の幹細胞に影響を及ぼすかどうかを評価するために、ephrinA1Fc及びEphA2Fcの、GBMCSC副集団SPに及ぼす作用を調べた。さらに、EphA2Fc刺激GBMCSC50μgmL、24時間を、神経幹細胞、脳腫瘍幹細胞、及び癌幹細胞/発癌細胞集団マーカーの発現に関して、FACSによってその特徴を明らかにした。副集団このSP細胞は、二重波長分析のドットプロットにおいて特徴的低蛍光尾部によって特定され、研究対象とするGBMCSC関門通過生細胞の141対骨髄の003において検出された。ベラパミルHoechst33342排出を仲介する特異的ABCトランスポーターを抑制することが知られる薬剤によるGBMCSC処理は、この集団を消滅させた。細胞は、Mofloにおいて、350nmUV光による励起後、二重波長分析青、450465nm;赤、630730nmを用いて分析した。細胞は、50μgmLのephrinA1Fc又はEphA2Fcの存在下に24時間育成し、次いで、DMEMF12、プラス、DNアーゼ1μgmLSigma、BSA2mgmLSigma、ヘパリン4μgmLSigma、及びEDTA200μgmLSigmaにおいて最終濃度が2×106mLとなるように再懸濁した。次に、GBMCSCを、2μgmLのHoechst33342染料Invitrogenによって、時折掻き回しながら37°Cで2時間放置して標識した。抑制コントロールとして、カルシウムチャンネルブロッカーベラパミルSigmaを、Hoechst33342による標識前に、最終濃度が50μMとなるように加え、室温で10分インキュベートした。インキュベーション終了時、細胞を冷却下に遠心し、氷冷PBSに再懸濁した。ヨウ化プロピジウムPI2μgmL、最終濃度、Sigmaを加え室温で5分放置し、次いで、蛍光活性化細胞仕分けFACS分析を行った。これは、死細胞対生細胞の区別を可能とする。ABCトランスポーター遺伝子ABCG2Bcrp1とも呼ばれるは、マウス骨髄及びその他の組織中のSP表現型の主要介在因子の一つである。我々は、マウスモノクロナールIgG2b抗体150eBioscience、及びalexaFluor488接合二次山羊抗マウス抗体12000Invitrogenを用い、前述のように免疫蛍光染色試験を行って、GBMCSC細胞においてABCG2タンパクを検出した。フローサイトメトリーによる免疫表現型プロファイリングフローサイトメトリー分析は前述のように行った。下記の一次接合抗体を用いた。マウス抗CD133PE接合マウス抗CD44PE接合マウス抗CD184CXCR4APC接合マウス抗CD81TAPA1FITC接合マウス抗CD15SSEA1FITC接合マウス抗CD117cKitPE接合細胞は暗い中室温で30分インキュベートし、洗浄し、05mLの完全培養液に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。これらのアッセイでは、自発性蛍光及びアイソタイプコントロールを常法として、これらの分析において実行した。結果:図6に明瞭に記載されるように、GBMCSCSPは、ephrinA1Fc及びEphA2Fcによる処理によって完全に消失又は激減した。Hoechst33342単独、又は、100μmolLのベラパミルと組み合わせてHoechst33342によって細胞を標識し、次いでフローサイトメトリーによって分析した。可溶性リガンド又は受容体のいずれかによって処理したGBMCSCは、ベラパミル存在下と同様、検出不能の副集団細胞を示した。図示のデータは、少なくとも2回の独立した実験の代表的ドットプロットである。EphA2Fcは、癌幹細胞又は腫瘍原発細胞において、副集団の増加に関与すると考えられる。いくつかのマーカーの発現量又は発現パターンは、EphA2Fc刺激後減少したデータ図示せず。可溶性ephrinA1Fc又は可溶性EphA2Fc受容体の、ヒトGBMCSC多能性に及ぼす作用幹細胞の資格を持つためには、GBMCSCは多能性でなければならない。そこで、ephrinA1Fc又はEphA2Fc処理後のGBMCSCにおいて、より分化した表現型が獲得されるかどうかを調べるために分化実験を行った。ephrinA1Fc又はEphA2Fcの不在下又は存在下に育成したクローン小球において、蛍光信号強度に関して細胞蛍光測定を行った。フローサイトメトリー自己再生アッセイによって得られたクローン球に対しFACS分析を行い、神経マーカー発現を、系統特異的マーカーを用いて評価した。星状細胞グリア繊維状酸性タンパク、GFAP、神経細胞βIIIチューブリン、及び希突起神経膠細胞ガラクトセレブロシドCGalCの定量には、虹色較正粒子混合物8ピーク、3034μmBDBiosciencesを較正のために用い、細胞標識の強度は、当量フィコエリスリン分子量MEPE又は当量フルオレセイン分子量MEFLとして表した。手短に言うと、細胞内染色のために、細胞は、10又は50μgmLのエフリンA1の存在下に撒き24時間放置し、次いで再懸濁し、05mLのCytofixCytoperm液BDと室温で30分インキュベートすることによって膜透過させた。細胞を、2mLのBDPermWash1×BDによって洗浄し、室温で10分インキュベートした。遠心後、この細胞を、適切な一次抗体混合物を含む02mLのBDPermWash1×BDに再懸濁した。膜抗原のために、細胞は、02mLの培養液に再懸濁し、次いで、下記の一次抗体と4°Cで30分インキュベートした:兎ポリクロナール抗GFAP1400DakoCorporation、マウスモノクロナール抗bIIIチューブリン1400Babco、及び、マウスモノクロナール抗GalC1400Chemicon。細胞は、洗浄し、二次抗体に4°Cで30分暴露した。細胞内抗原の場合は、二次抗体は、1800山羊抗兎IgFITC標識抗体又は山羊抗マウスIgGRPE標識抗体BDであり、一方、膜抗原の場合は、11000FITC接合F2山羊抗マウスIgM又はFITC接合山羊抗マウスIgMJacksonImmunoResearchを用いた。十分に洗浄した後、細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。結果:図7に示すように、コントロールFcに対し、可溶性リガンド及び受容体は共に、GBMCSCにおいて明瞭な形態的変化を誘起した。蛍光信号強度の細胞蛍光測定法を用いることによって、ephrinA1Fcによって刺激された細胞は、グリアGFAPの免疫反応性に関して当量フルオレセイン分子量において用量依存性増加を示すことが明らかになった。インビトロにおいて、ephrinA1Fc及びEphA2Fcは、より成熟した表現型の獲得を誘発し、これらの表現型は、主に星状膠細胞様運命を辿るので、発癌性GBMCSCプールを衰滅する。ヒストグラムは三重測定値の平均±semを示す。可溶性ephrinA1Fc又は可溶性EphA2Fc受容体の、ヒトGBMCSCのアポトーシス又は細胞周期に及ぼす作用細胞周期分析及びBrdUDNA分析及び検出細胞周期分析のために、1×106細胞/サンプルを、ephrinA1Fc5μgmL又はEphA25μgmLの存在下に6、24、48時間培養した。次に、細胞を、20μMの5ブロモ2デオキシウリジンBrdU1500Sigmaに37°Cで20分暴露し、70エタノールPBS液で固定し、4°Cに維持し染色に備えた3。DNAは、1mLの3NHCl、20分RT室温によって変性し、得られたペレットを、1BSASigmaを含む1mLの05Tween20SigmaとRTで15分インキュベートした。次に、細胞を、抗BrdUモノクロナール抗体110、BDと暗い中RTで60分インキュベートした。使用した二次抗体は、Alexa488山羊抗マウスIgG1500、Invitrogenである。次に、細胞を、25μgmLのヨウ化プロピジウムPIのPBS液、及び7μLのRNアーゼ3mgmLの水溶液に再懸濁し、暗い中4°Cで一晩染色した。各サンプルで少なくとも30000個の細胞について、FACSCaliburを用いて、2パラメータBrdUDNA分析を行い、データはSummit43ソフトウェアを用いて分析した。末端デオキシヌクレオチジルトランフェラーゼ介在dUTPFITCニック末端標識アッセイTUNELアポトーシスは、TUNELアッセイキットRocheDiagnosticsを、2パラメータフローサイトメトリーに関するメーカーの指示に従って用いることによって測定した。分析は、FACSCaliburBDBiosciencesで行い、データは、Summit43ソフトウェアCoulterを用いて分析した。結果:FACSTunel及びBrdUによって測定すると、コントロール細胞に対し、可溶リガンド、可溶受容体のいずれも、細胞死/アポトーシスを誘発せず、又は、GBMCSC及びHNSCの細胞周期相を変えないデータ図示せず。可溶性ephrinA1Fc又は可溶性EphA2Fc受容体の、GBMCSCの拡散及び移動、及び、包含される関連細胞内経路に及ぼす作用EphA2の過剰発現又は活性消失は、GBMCSC細胞浸襲においても組み込まれた介在因子であり、細胞骨格修飾又は持続的リン酸化、及びFAK及びその他の細胞内経路のキナーゼ活性を引き起こす。細胞の運動性は、細胞骨格の修飾に依存するので、GBMCSCの細胞骨格再編成及び形態変化を阻止することによる、ephrinA1Fc及びEphA2Fcの発癌抑制機能は、Fアクチンリング束を示す細胞の頻度をファロイジンphalloidinによって測定することによって評価した。さらに、血管細胞の運動性及び浸襲能の調節における可溶性リガンド又は受容体の有効性も定量した。細胞骨格マーカーの免疫染色GBMCSCを、ephrinA1Fc50μgmL又はEphA2Fc50μgmLの不在下又は存在下に、Cultrex被覆ガラス製カバースリップ12mm直径に、25×104細胞cm2の密度で撒き、5及び30分放置した。Fアクチン染色のために、細胞を、4パラフォルムアルデヒドに20分放置して固定し、01TritonX100によって膜透過させ、Alexa555標識ファロイジン140Invitrogenと室温で30分インキュベートした。移動性アッセイ浸襲度アッセイは、Pennacchietti2003に倣って、24ウェルトランスウェルチェンバー8μmポアサイズ、65mm、033cm2、CorningCostarにおいて実行した。フィルターの上面にはCultrexをコートし、1×105のヒト皮膚微少血管内皮細胞HMVECを、EphA2Fc50μgmLの不在下又は存在下に15mLのDMEMF12に撒いた。下方分画には、移動の陽性刺激として、血管内皮増殖因子VEGF、20ngmL、又は、GBMCSC細胞調整培養液1×106細胞撒布後1日の培養液から採取した1mLを用いた。刺激は、EphA2Fcの不在下又は存在下に、26mLのDMEMF12基礎培養液に溶解してフィルターの上面に加えた。撒布後714日、フィルター上面の細胞は機械的に除去し、下面に移動したものを固定し、DiffQuickDadeBehringをメーカーの指示に従って染めた。細胞の移動度は、デンシトメータスキャナーによって得た体積密度値によって評価した。ウェスタンブロットephrinA1Fc又はEphA2Fc処理の、GBMCSCの悪性態様に与える影響の結果を定量するために、細胞を、ephrinA1Fc10又は50μgmL又はEphA2Fc50μgmLの存在下に撒き、適当時間インキュベートし、次いで分解した。手順は全て前述の通りに行った。下記の一次抗体を用いた:兎抗フォスフォFAK兎抗ヒト全体p42p44MAPK兎抗ヒトフォスフォERK12Thr202Tyr204兎抗フォスフォAkt兎抗フォスフォmTOR兎抗フォスフォPI3Kp85p55兎抗ヒトEカドヘリンマウス抗ヒトゲルソリンこの工程に続いて、驢馬抗兎HRP110000GE及び兎抗マウスHRP110000GEとインキュベートした。組織コントロールとして、ヒト脳タンパク混合物70μgClontech、又は、ヒト脳腫瘍全タンパク分解産物LYS05470μgAbserotechを用いた。さらに、ERK12のリン酸化物は免疫細胞化学法によっても検出した。細胞は、ephrinA1Fc50μgmL又はEphA2Fc50μgmLの不在下又は存在下に、Cultrex被覆Trevigenガラス製カバースリップに撒き、1、6、及び24時間放置した。安静細胞restingcells、又は、MEK12抑制剤UO12610μM2時間、CellSignalingで前処理した細胞をコントロールとして用いた。免疫細胞化学試験は、兎ポリクロナール抗フォスフォMAPK、及び、AlexaFluor488IgG12000Invitrogenを用いて前述の通りに行った。結果:可溶性受容体、可溶性リガンドのいずれも細胞拡散を阻止する。接着及び拡散は、アクチン及び微少管細胞骨格の二つの変化に相伴って進行する。図8Aに掲載される細胞骨格再編成から、高い移動性表現型を有し、Cultrexの上に広く拡散する未処理のGBMCSC細胞aは、平らな多角形形態によって特徴付けられ、それらは、良く組織されたwellorganizedアクチン細胞骨格、ストレス線維に高密度に配置される比較的多数のFアクチンフィラメント、及び線維芽細胞様形態を伴うことがはっきりと見てとれる。bd挿入画像、GBMCSC態様に特徴的なリング状アクチン束。逆に、ephrinA1Fce及びEphA2Fcf処理細胞は、円形を持続し、双極性細長細胞によって特徴付けられ、拡散はせず、比較的無秩序な微少管を提示し、細胞細胞接触部に焦点的Fアクチン陽性を伴う。大パネルのバーは5μm;小パネルのバーは10μm。図8Bの上部パネルに示されるデータは、EphA2活性化は、インビトロにおいて、細胞の接着、拡散、及び移動を抑制し、FAKの急速な不活性化及び脱リン酸化を誘発する可能性のあることを裏付ける。細胞は、ephrinA1Fcの不在下-又は存在下に、表示の期間育成し、次いで分解した。処理細胞のチロシン残基576577又は925におけるリン酸化FAKの発現低下は、ウェスタンブロットによってタンパクレベルで評価した。もっとも著明なレベルは、処理後60分及び24時間に観察された。FAKは再びチロシンリン酸化される。負荷コントロール:GAPDH。注目すべきことに、図8B下部パネルに掲げるCultrex浸襲アッセイによって示されるように、EphA2発現内皮細胞のインビトロ移動も、組み換えEphA2Fcの投与によって高度に抑制された。血清無添加HMVECをチェンバーの頂上に撒き、フィルターの下面に向かって6時間移動させた。aコントロールとして基礎培養液に懸濁したHMVEC。下部分画のVEGF20ngmL添加又はGBMCSC調整培養液を、それぞれ、チェンバー上面のEphA2Fc50μgmLの不在bc又は存在efと組み合わせる。上面のコントロールヒトIgGは、VEGFに反応する細胞移動に影響を及ぼさない。膜の下面に移動した細胞を、方法に記載したように、固定、染色した。スケールバーは200μm。最後に、ephrinA1Fc及びEphA2Fcは、GBMCSCにおいて、ERK12のリン酸化によってMAPキナーゼ依存性経路の活性化を起動する可能性のあることが示された。図8Cの共焦点免疫蛍光画像によって示されるように、Fc処理コントロールaに比べると、リン酸化ERK12陽性出現頻度の特異的な急激増加が、育成培養液にEphA2Fcc又はephrinA1Fcdの添加後6時間に検出可能であった。観察される陽性の平均レベルは24時間安定であった。bERK基質部位における可溶性リガンド及び受容体介在性リン酸化は、UO126MEK1活性化の化学的抑制因子、によって細胞を前処理することによって阻止される。スケールバーは20μm。同じ図の下部パネルに掲載されるウェスタンブロット分析は、ephrinA1Fc濃度の上昇は、GBMCSCにおいてERK12活性化を強化することを裏付ける。GAPDHをサンプル負荷のコントロールとして用いた。ephrinA1Fcは、Akt及びmTORの強い活性化が検出されたことから図示せず、MAPKの下流へのシグナル伝達を強化する可能性さえあることが考えられる。BMP4は、GBMにおいて、インビトロでもインビボでも、癌幹細胞プールの消滅をもたらす分化促進カスケードを誘導する11。下記に、BMP4及びephrinA1Fcの併用処理の作用を述べる。リアルタイムPCRGBMCSC細胞を、組み換えヒトBMP4100ngmLRDに48時間暴露した。全体RNA及びcDNAを前述に倣って取得し、次いで、EphA2発現の定量分析を行った。定量的RTPCR反応を、BrilliantSYBRGreenQPCRCoreReagentKitを用いて3重に実施した。SYBRグリーン染料は、いずれのPCR産物にも結合するので、配列特異的プローブの使用を要しない。蛍光発光をリアルタイムで記録したChromo4FourColorRealTimePCRDetectorMJ。遺伝子発現プロファイリングは、相対的定量化の比較Ct法を用いて完了した。RNAの相対量は、2つの内在コントロールであるGAPDH及び18SリボソームRNA18SrRNAに対して正規化した。成長曲線:GBMCSCを、ephrinA1Fc10μgmL又は50μgmLの存在下に、および、それぞれ、BMP4100ngmLRD、又は白血病阻害因子LIF10ngmLChemiconヒトCNS幹細胞継代progenyにおける神経分化の強力な調節因子の存在下に撒いた。細胞増殖指数を上述の成長曲線分析によって評価した。結果:図9に示すように、rhBMP4暴露は、分化およびGBMCSCプールの消滅を通じて、GBMCSCにおけるEphA2タンパクの降下を加速する。a特異的プライマーによるQRTPCR分析から、rhBMP4処理細胞では、GAPDH正規化EphA2転写物は、対応コントロールに比べ減少することが明らかになった。ヒストグラムは、2種類のGBMCSC系統による3回の異なる実験で定量した正規化平均±semを示す。さらに、図9に掲げるように、rhBMP4は、GBMCSC及びHNSC増殖に対するephrinA1Fc抑制作用を誘発する。成長動態の違いが、rhBMP4の不在下又は存在下にephrinA1Fcと共に育成されたGBMCSC細胞の間に検出された。即ち、前者は、より速い成長率によって特徴付けられ、後者は、低速で分裂するGBMCSCを含む。bにおける成長曲線は、一つのGBMCSC系統を代表する。同じ結果がLIF刺激後にも得られたデータ図示せず。ヒトGBMCSCの皮下sc異種移植腫瘍の成長に及ぼすephrinA1Fc及びEphA2Fc投与の作用EphA2の過剰発現は腫瘍発生の原因となることが知られる。さらに、分裂の全体的対称性及び関連自己再生能などの、上に分析したGBMCSCの幹細胞の重要なパラメータは、これらの細胞の腫瘍原発性能と直線的に相関する。ephrinA1Fc又はEphA2Fcによる、EphA2発現又は活性の下降作用をインビボで調べた。この実験では、発癌性GBMCSCプールのインビトロ低下は、ephrinA1Fc又はEphA2Fc処理細胞の、インビボにおける腫瘍形成能力における同様の低下と関連するかどうかを、皮下sc異種移植において評価した。sc注入には、免疫機能不備の無胸腺nunuマウス雌34週齢、CharlesRiverを用いた。ヒトGBM皮下腫瘍異種移植は、100μLのPBSを、等容量のCultrexTrevigenと混ぜた混合液に3×106hGBMCSC細胞を懸濁し、23ゲージ針を用いて、レシピエントマウスの右横腹に注入することによって確立した。マウスは735日監視し、試薬は、1×/日を35日間、GBMCSC注入部位の近傍に投与した腫瘍辺縁注入。M-CSSの腫瘍発現能の低下、及び、腫瘍確立と成長の阻止における可溶性リガンド/受容体の能力を試験するために、動物を下記の群にランダムに割り当てた。コントロールベヒクル:細胞移植後、100μLの生理的食塩水を腫瘍周辺部位に注入した、ephrinA1Fc同時処理群:細胞の移植と、同時に、100μLの、生理的食塩水に溶解したephrinA1Fc液10μg用量の腫瘍周辺注入が伴った。ephrinA2Fc同時処理群:細胞の移植には、100μLの、生理的食塩水に溶解したEphA2Fc液10μg用量の腫瘍周辺注入が伴った。EphA2Fc移植後処理群:細胞移植後、細胞を710日育成し、次いで、マウスに、100μLのEphA2Fcの腫瘍辺縁注入を行った移植後腫瘍形成10μg用量。処理に対する腫瘍成長率の変化を評価するために、腫瘍測定値は週に一度ノギスによって定量し、絶対体積の外、それを1日目投与を開始の個別腫瘍体積に対し正規化して表した。Vπ6xaxbxc同じ期間に亘って動物の体重を定量し、分析した。コントロール、ephrinA1Fc及びEphA2Fc処理動物由来のGBMCSC腫瘍異種移植片を切り出し、上述のように固定し、冷凍保存した。10ミクロン厚の連続切片を下記の抗体/抗血清によって免疫標識した:マウスIgG1抗ヒト核1100Chemicon、マウスIgG1抗ヒトミトコンドリア150Chemicon、及びマウスIgG2抗ヒトHLAabc1100Dako。これは、腫瘍のヒト性を確認するためである。兎IgG抗Ki6711000NovoCastraを増殖指数検出のために用いた。切片を、十分に濯いだ後、適当な二次抗体:山羊抗マウス又は抗兎IgGAlexaFluor48854611000Invitrogenと共に室温で1時間インキュベートした。切片を洗浄し、Fluorsaveでカバー保護マウントした。ヘマトキシリンエオジン染色及び免疫組織化学検査を実行した。サンプルは、ZeissAxiophot2蛍光顕微鏡及びLeicaDMIRE2共焦点顕微鏡によって観察し、撮影した。コントロール実験では、一次抗体又は抗血清を省略するか、又は、正常の非免疫血清を使用したが、標識は全く観察されなかった。結果:図10に明瞭に示されるように、ephrinA1Fc又はEphA2Fcの投与は、ヒトGBMCSCの腫瘍発現能、及びマウス皮下モデルにおける腫瘍進行を強力に抑制した。ephrinA1Fc/EphA2Fcのインビボ送達は、皮下における腫瘍の確立及び成長を阻止する。あらかじめ確立させた腫瘍を可溶性受容体で処理すると、インビボで、その成長の大きな低下がもたらされた。GBMCSCは、nunuマウスの右横腹に注入された。生理的食塩水コントロールベヒクル又は試薬ephrinA1Fc又はEphA2Fcは、細胞注入から始めて毎日、腫瘍塊の周囲に投与した100μL用量。達成体積7日に対する移植後処理分析では、腫瘍担持ヌードマウスに毎日100μL用量を投与した。グラフは、6匹のマウスから成る4群における平均±semを示す。GBMCSCのephrinA1Fc及びEphA2Fcに対するインビトロ暴露が、それらの細胞の同所性異種移植組織形成能に及ぼす作用可溶性受容体及びリガンド分子の癌の成長における抗癌効力EphA2による発現又は活性の低下を評価するために、より臨床との関連性の高い同所性腫瘍モデルを用いた。上記scモデルにおいて得られた結果を裏付け、発展させるために、前処理実験を行った。可溶性リガンド又は受容体50μgmLに対する48時間の暴露後、GBMCSCルシフェラーゼのリポーター遺伝子に感染させたもの、lucGBMCSCを、scidbgマウスの線条体に注入した。この実験により、エフリンリガンドに対する一過性の暴露が、GBMCSCの発癌性を低下/阻止するかどうかを知ることができる。GBMCSCのレンチウィルス感染GBMCSCを、リポーター遺伝子の蛍ルシフェラーゼによって感染させた。新規生成レンチウィルスベクターそこでは、二方向性合成プロモーターによって二つのmRNAの協調的転写が仲介され、効率的二遺伝子転移が可能とされる、ベクターを用いた2。このプロウィルスベクターは、上流側接続の、ヒトのサイトメガロウィルスmCMV由来の最少コアプロモーター要素と、反対方向において、ヒトのフォスフォグリセレートキナーゼPGK由来の効率的プロモーターとから構成される二方向性プロモーターから成る。このベクターデザインは、プロモーター遺伝子として蛍ルシフェラーゼfluc及び緑色蛍光タンパクGFPを利用可能とし、これらは下記のために使用される:iインビトロでは、FACSによって、限界希釈によって、又は、インビボで、IvisImagingXenogen分析によって導入遺伝子発現細胞を濃縮すること;iiインビボで、脳の内部における腫瘍細胞の分布を簡単に監視すること。293T細胞に対し4プラスミドを一過性同時トランスフェクションし超遠心によって濃縮することによって、VSV疑似型第3世代LVが生産される。ベクターの発現力価は、HeLa細胞において限界希釈法によって推定した。ベクターの粒子は、HIV1gagp24antigenimmuocaptureによって測定した。ベクターの感染能は、各ベクターについて力価と粒子の間の比として計算した。GBMCSC細胞を、トランスフェクト293T細胞の一晩育成培養液の上清に16時間暴露した。次に、ウィルスを含む培養液を排除し、新鮮培養液lucGBMCSCで置換した。感染効率は、GFP発現細胞をカウントするか、又は、インビボLumina分析のいずれかによって評価した。発光細胞は、完全培養液において5000細胞から100細胞へ連続希釈し、黒色、透明底部付き96ウェルプレートNuncに撒いた。DルシフェリンONEGlo、ルシフェラーゼアッセイシステム、Promegaを、各ウェル100μlの完全培養液に再懸濁した、単一細胞を含むに11で加え、3分後に画像を撮影した。撮影時間は、1分/プレートである。GBMCSCの、scidbgマウス線条体への移植LucGBMCSC細胞を、ephrinA1Fc5μgmL又はEphA2Fc5μgmLの不在下又は存在下に撒き、48時間後に同所性注入した。DNアーゼ11000Sigma添加DMEMに撒いた1×105細胞/uL懸濁液の3μLを、Hamiltonシリンジに接続したガラス電極による脳定位注入によって右側線条体へ送達した。脳実質の最適コンプライアンスを確保するため、注入は全て、6分という期間で行った。動物は、正常生理的食塩水溶液として、ケタミン塩酸塩8mgmL、キシラジン08mgmL、及び、1425のエチルアルコールを含む保存液、02mlkgを腹腔内に注入することによって麻酔した。麻酔されたマウスの頭部を、70エチルアルコールとポビドンヨードの溶液で消毒した。頭部背面に正中切開を施し、頭蓋骨膜を外側に反転しブレグマを露出した。2mmのドリル孔を作製した。硬膜を破らないように注意した。下記の座標ブレグマからのmmを用いた:前後AV0;内外側ML25mm;背腹側DV30mm、頭蓋表面から。微量注入針を撤収し、皮膚は、40Vicrylによって閉じた。動物は、神経学的機能不全の何らかの兆候がないかどうか毎日監視した。XenogenIVISLuminaシステムによる腫瘍成長の評価腫瘍の形成、拡張、及び体積は、インビボLumina分析Xenogenで撮影した連続画像によって、数回/週、間接的に計算し、試薬処理をしないGBM細胞を移植されたコントロール動物のものと比較した。メーカーの指示に従って、インビボ画像のために、画像撮影の15分前に、基質DルシフェリンCaliperを、動物に、PBS溶液として150mgKgで腹腔内注入によって投与し、次いで麻酔した25イソフルオラン8。次にマウスを、遮光カメラボックス内の温めた載物台の上に置き、2イソフルオランに連続暴露した。画像撮影時間は、腫瘍成長と時点に依存して、自動モードで20秒から1分に亘った。蛍光測定は、細胞接種後第1週の終わりから第6週まで、週に一度行った。発光性腫瘍から発射された低レベルの光は、IVISTMカメラシステムによって検出し、積分し、ディジタル化し、表示した。表示画像における興味の領域ROIは、腫瘍部位の周囲に特定され、LivingImageソフトウェアXenogenによって全体フラックスフォトン/秒として定量した。組織切片に対する免疫組織化学検査6週後動物を屠殺した。屠殺した動物に、100mLの015MNaClによって経心臓灌流/固定を行い、次いで、4PFAを含む01Mリン酸カリウムバッファーKBS、250mLを、WatsonMarlowペリスタルティックポンプを用いて120mmHg圧で注入した。その後、前述のように、脳を固定し冷凍保存した。ヘマトキシンエオジンHE染色及び免疫組織化学検査を実行した。10ミクロン厚の連続切片を前述のように処理した。組織切片においてヒト腫瘍細胞を回収するために、我々は、ヒト特異的抗体:マウスIgG1抗ヒトミトコンドリア150Chemicon、マウスIgG1抗ヒト核1100Chemicon、マウスIgG2a抗ヒトHLAabc1100Dakoのいずれかを用いるか、若しくは、我々は、ルシフェラーゼマウスIgG1125Invitrogen、又は、ベクター中に存在するリポーター遺伝子緑色蛍光タンパクGFP1500MolProbesを利用した。腫瘍細胞の増殖、分化、及び新規血管形成は、下記の抗体/抗血清使用の免疫組織化学検査によって評価した:兎抗GFAP1500Dako、抗K1671200Novocastra、マウス抗ヒトPCNA11500Sigma、ラット抗CD1471600serotech、兎抗NG21300Chemicon。腫瘍体積及び拡張は連続再構築serialreconstructionによって計算した。組織切片はさらに、下記の一次抗体によって染色した:山羊抗ヒトEphA2150RD、モノクロナールマウスIgG1抗ヒトEphA2クローンD71100Sigma、兎ポリクロナール抗ヒトエフリンA1150Abcam、兎抗ヒトフォスフォエフリンBTyr3243291100CellSignaling、山羊抗エフリンB2110RD、山羊抗ヒトエフリンB3110RD、兎抗フォスフォS339CXCR41100Abcam、山羊抗ヒトWnt5a110RD、兎抗ヒトEカドヘリン1100CellSignaling。結果:図11に示すように、lucGBMCSC細胞を、scidbgマウスの線条体に移植する前に、ephrinA1Fc又はEphA2Fc50μgmLにインビトロで48時間暴露すると、腫瘍発現能は劇的に低下した。図11Aに掲げられる発光監視は、腫瘍からの対応的シグナル増加を明瞭に示す。GBM腫瘍の成長は、EphA2Fc又はephrinA1Fcによって処理されたlucGBMCSC発光系統では強力に抑制される。腫瘍は、細胞注入後7日から始めて週に1度、インビボ画像撮影によって監視した。グラフは、6匹のマウスから成る3群における平均±semを示す。さらに、図11Bは、安静GBMCSC、及びEphA2Fc又はephrinA1Fcで前処理したGBMCSCの頭蓋内注入後、インビボで検出される腫瘍成長及び腫瘍サイズの違いを示す。移植注入された3匹の代表的scidbgマウスから経時的に取られた背面画像を示す。腫瘍部位における経時的相対変化を示すため、疑似カラースケールバーは全ての背面画像に適用される。図11Cに掲げられる、同所性移植6週後に取られた共焦点画像によると、未処理lucGBMCSCから得られた腫瘍aは、ルシフェラーゼ特異的免疫染色によって示されるように、ephrinA1Fc処理b及びEphA2Fc処理cの細胞から得られる腫瘍よりも効率的に脳実質に広がり、侵襲する。連続記録切片の免疫組織化学画像から得られる腫瘍サイズを、対応するBLI測定値と相関の程度を調べるために比較したデータ図示せず。スケールバー、1mm。あらかじめ確立された同所性腫瘍に対する、ephrinA1Fc及びEphA2Fcの、局所的直接的微少灌流の作用同様の方法を用いて、腫瘍成長のEphA2調節に及ぼす作用をインビボで調べた。これによって、EphA2受容体の活性化又は発現の状態と、GBMCSCの発癌性との間に明瞭な相関を、特に、この二つのパラメータの間に逆相関を定義することが可能となるかも知れない。これによってさらに、インビボにおけるEphA2調節を、患者の腫瘍におけるhGBMTCSCプールに対する有力な治療ツールとして使用する可能性を定めることが可能となるかも知れない。ephrinA1Fc又はEphA2Fcを注入するミニアルゼットポンプの、scidbgマウス線条体への埋設lucGBMCSC同所性注入の10日後、即ち、腫瘍は実質的サイズを持つが、運動又は行動異常を引き起こすことはない時点で、ミニ浸透圧ポンプAlzetの脳内カテーテルを、同じ穿頭孔からマウス線条体に挿入した。Alzetポンプは、塩スリーブsaltsleeveと呼ばれるポンプ内部の区画と、ポンプが埋設される組織環境の間の浸透圧差によって動作する。塩スリーブの高い浸透圧のために、水は、ポンプの外面を覆う半透膜を通じてポンプの中に入る。水が塩スリーブ中に入るにつれて、その水は、弾力的貯留槽を圧迫し、ポンプから試験液を指定の調節速度で移動させる。メーカー脳灌流キットの指示に従って、EphA2Fc30μg又はephrinA1Fc30μgのPBS液、100μLを貯留槽に入れ、14日間灌流した025μL/時。送達用量は18μg日であった。動物は毒性の兆候がないかどうか注意深く監視した。腫瘍の形成、拡張、及び体積は、上述のように、インビボLumina分析Xenogenで撮影した連続画像から、数回/週、間接的に計算した。灌流マウスは、処理無し100μLのPBS液でGBM細胞を投与されたコントロールマウスの結果と比較した。カテーテル設置の2週後GBMCSC注入の4週後、マウスを屠殺した。経心臓灌流/固定、切除後固定調整、及び免疫組織化学検査は、処理前の脳内実験に記載される。結果:図12は、GBMCSC移植の710日後、細胞注入部位でscidbgマウスの線条体に埋設されたミニアルゼットポンプによるephrinA1Fc又はEphA2Fcの連続投与が、腫瘍成長を抑制することを示す。scidbgマウスの右側線条体にlucGBMCSCを注入し、14日後、腫瘍が一定体積に達した時点で、ミニ浸透圧ポンプの脳内カテーテルを、同じ穿頭孔を通じてマウス線条体に挿入した矢印:浸透圧ポンプの埋設。腫瘍担持マウスに対し、EphA2Fc、ephrinA1Fc、又はコントロールベヒクルを、毎日の送達用量18μg日で14日間注入した。腫瘍細胞移植後7日目から始めて週に一度の発光監視を実行した。EphA2Fc、ephrinA1Fc処理群はいずれも、コントロール群の発光値の増加とは対照的に、21日目まで正規化発光値の低下を示す。各マウスの発光値は、治療開始時に得られた対応読み取り値に対して正規化した。グラフは、6匹のマウスから成る3群における平均±semを示す。上記説明及び前述の実施例から、本発明によって記載され、取得される産物によって実現される利点は明白である。参照文献1AloPLViscaPMazzaferroSSerpieriDEMangoniABottiCMonacoSCarboniMZaracaFTrombettaGDiTondoUImmunohistochemicalstudyoffattyacidsynthaseKi67proliferatingcellnuclearantigenandp53expressioninhyperplasticparathyroids細胞核抗原を増殖する脂肪酸合成酵素Ki67、及び、過形成副甲状腺におけるp53発現に関する免疫組織化学研究AnnDiagnPathol32872932AmendolaMVenneriMABiffiANaldiniLCoordinatedualgenetransgenessbylentiviralvectorscarryingsyntheticbidirectionalpromoters二方向性合成プロモーターを担持するレンチウィルスベクターによる、協調的二遺伝子導入NatBiotechnol23108163ErbaEBergamaschiDBassanoLDamiaGRonzoniSFairclothGTDIncalsiMEcteinascidin743anaturalmarinecompoundwithauniquemechanismofaction独特の作用機序を有する天然海洋化合物Ecteinascidin743EurJCancer37971054GaleNWYancopoulosGDEphrinsandtheirreceptorsarepulsivetopicエフリンとその受容体:不快な話題かCellTissueRes290227415GalliRBindaEOrfanelliUCipellettiBGrittiADeVitisSetalIsolationandcharacterizationoftumorigenicstemlikeneuralprecursorsfromhumanglioblastomaヒトグリア芽細胞腫から、癌幹細胞様神経前駆体の単離とその特徴CancerRes647011216GrittiAParatiEACovaLFrolichsthalPGalliRWankeEFaravelliLMorassuttiDJRoisenFNickelDDVescoviALMultipotentialstemcellsfromtheadultmousebrainproliferateandselfrenewinresponsetobasicfibroblastgrowthfactor成体マウス脳から得られた多能幹細胞、の線維芽細胞増殖基本因子に応答した、増殖と自己再生JNeurosci16109111007GrittiAGalliRALVCulturesofStemCellsoftheCentralNervousSystem中枢神経系幹細胞の培養HumanaPressEditionSFedoroff8JenkinsDEHornigYSOeiYDusichJandPurchioTBioluminescenthumanbreastcancercelllinesthatpermitrapidandsensitiveinvivodetectionofmammarytumorsandmultiplemetastasesinimmunedeficientmice免疫不全マウスにおいて乳腺腫瘍及び複数転移の、高速高感度のインビボ検出を可能とする発蛍光性ヒト乳癌細胞系統BreastCancerRes5R444549HollandECGlioblastomamultiformetheterminator多形性グリア芽細胞腫:ターミネーターProcNatlAcadSciUSA976242410PennacchiettiSMichieliPGalluzzoMMazzoneMGiordanoSandComoglioPMHypoxiapromotesinvasivegrowthbytranscriptionalactivationofthemetprotooncogene低酸素は、met癌原遺伝子の転写活性化によって侵襲的成長を促すCancerCell334736111PiccirilloSGReynoldsBAZanettiNLamorteGBindaEBroggiGetalBonemorphogeneticproteinsinhibitthetumorigenicpotentialofhumanbraintumorinitiatingcells骨の形態発生タンパクは、ヒト脳腫瘍原発細胞の発癌能力を抑制するNature444761512MasonWPvandenBentMJWellerMFisherBTaphoornMJBelangerKBrandesAAMarosiCBogdahnUCurschmannJJanzerRCLudwinSKGorliaTAllgeierALacombeDCairncrossJGEisenhauerEMirimanoffRORadiotherapyplusconcomitantandadjuvanttemozolomideforglioblastomaグリア芽細胞腫に対する放射線療法と、同時的、副次的テモゾロマイド投与NEnglJMed3529879613VescoviALParatiEAGrittiAPoulinPFerrarioMWankeEFrolichsthalSchoellerPCovaLArcellanaPanlilioMColomboAGalliRIsolationandcloningofmultipotentialstemcellsfromtheembryonichumanCNSandestablishmentoftransplantablehumanneuralstemcelllinesbyepigeneticstimulationヒト胎児CNSからの多能幹細胞の単離とクローニング、及び、エピジェネティック刺激による移植可能ヒト神経幹細胞系統の確立ExpNeurol1567183