"aジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチド;ならびにbiFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異および/もしくは置換;および/またはiiFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチド;を含む組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが、a高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含むか;またはb組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれている;請求項1に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、該少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む、上記組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、該少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれている、組換え宿主細胞。Fe-Sクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、表8および表9中の遺伝子からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項1または2に記載の組換え宿主細胞。Fe-Sクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、表7中の遺伝子からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項1または2に記載の組換え宿主細胞。Fe-Sクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、CCC1、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項5または6に記載の組換え宿主細胞。前記ポリペプチドが、構成的突然変異株であるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項7に記載の組換え宿主細胞。前記構成的突然変異株が、AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、AFT1C293F、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項8に記載の組換え宿主細胞。Fe-Sクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、またはCCC1である、請求項1または2に記載の組換え宿主細胞。Fe-Sクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、AFT1、AFT2、FRA2、またはCCC1である、請求項1または2に記載の組換え宿主細胞。Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換が、FRA2、GRX3、CCC1、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1または2に記載の組換え宿主細胞。Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが、AFT1、AFT2、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1または2に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが多コピーで発現される、請求項1に記載の組換え宿主細胞。前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む、請求項14に記載の組換え宿主細胞。前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが、組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれている、請求項14に記載の組換え宿主細胞。前記Fe-Sクラスター生合成が、内因性Fe-Sクラスター生合成を有する組換え宿主細胞と比較して増大された、請求項1、2、または5~16のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項1~17のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkiaおよびピキア属Pichiaからなる群から選択される、請求項18に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、前記宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される、請求項1~19のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、10-5よりも小さいE値で表12のプロファイルHMMとマッチするアミノ酸配列を有し、ポリペプチドがさらに、配列番号168に相当するストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDHAD酵素のアミノ酸配列における位置56、129、および201に相当する3つの保存システイン全てを含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、配列番号168または配列番号232に対して少なくとも約90の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1~21のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、aジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約5倍よりも大きい比活性、bジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約8倍よりも大きい比活性、およびcジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約10倍よりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する、請求項1~22のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、a約0.25U/mgよりも大きい比活性、b約0.3U/mgよりも大きい比活性、c約0.5U/mgよりも大きい比活性、d約1.0U/mgよりも大きい比活性、e約1.5U/mgよりも大きい比活性、f約2.0U/mgよりも大きい比活性、g約3.0U/mgよりも大きい比活性、h約4.0U/mgよりも大きい比活性、i約5.0U/mgよりも大きい比活性、j約6.0U/mgよりも大きい比活性、k約7.0U/mgよりも大きい比活性、l約8.0U/mgよりも大きい比活性、m約9.0U/mgよりも大きい比活性、n約10.0U/mgよりも大きい比活性、o約20.0U/mgよりも大きい比活性、およびp約50.0U/mgよりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する、請求項1~22のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。前記組換え宿主細胞がイソブタノールを産生する、請求項1~24のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。前記組換え宿主細胞がイソブタノール生合成経路を含む、請求項25に記載の組換え宿主細胞。生産物を製造する方法であって、a請求項1~24のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、b上記生産物が産生される条件下、発酵培地中でaの組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップとを含み、該生産物が、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記方法。a請求項1~24のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、bイソブタノールが産生される条件下、発酵培地中でaの組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップとを含む、イソブタノールの製造方法。2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換方法であって、a請求項1~24のいずれか一項に記載の組換え宿主を備えるステップと、b2,3-ジヒドロキシイソバレレートがα-ケトイソバレレートに変換される条件下でaの組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含み、2,3-ジヒドロキシイソバレレートがα-ケトイソバレレートへ変換される、上記方法。組換え宿主細胞においてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドの比活性を増大させるための方法であって、a請求項1~24のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、b上記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドが、該異種ポリペプチドを持たない同一の宿主細胞よりも大きい比活性を有する機能性形態で発現される条件下でaの組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む、上記方法。宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるための方法であって、a請求項3~24のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を備えるステップと、b該宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスが増大される条件下でaの組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む、上記方法。組換え宿主細胞におけるFe-Sクラスター要求タンパク質の活性を増大させる方法であって、aFe-Sクラスター要求タンパク質を含む組換え宿主細胞を備えるステップと、b該宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、c上記Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性が増大される条件下でbの組換え宿主細胞を増殖させるステップと、を含む、上記方法。前記活性の増大が、a約10よりも多い量、b約20よりも多い量、c約30よりも多い量、d約40よりも多い量、e約50よりも多い量、f約60よりも多い量、g約70よりも多い量、h約80よりも多い量、i約90よりも多い量、およびj約95よりも多い量からなる群から選択される量である、請求項32に記載の方法。前記活性の増大が、a約5倍よりも多い量、b約8倍よりも多い量、およびc約10倍よりも多い量からなる群から選択される量である、請求項32に記載の方法。宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、aFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、b異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性を測定するステップと、cステップaのポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定される異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性と、ステップaのポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定される異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性とを比較するステップとを含み、異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性の増大が、上記Fe-Sクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す、上記方法。宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、aFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、bジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性を測定するステップと、cステップaのポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性と、ステップaのポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性とを比較するステップとを含み、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性の増大が、上記Fe-Sクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す、上記方法。Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性の前記変化が、欠失、突然変異、置換、発現、上方制御、下方制御、細胞位置の変更、タンパク質の状態の変更、および/または補因子添加を含む、請求項30~36のいずれか一項に記載の方法。Fe-Sクラスター要求タンパク質がジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有し、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する該Fe-Sクラスター要求タンパク質が、10-5よりも小さいE値で表12のプロファイルHMMとマッチするアミノ酸配列を有し、ポリペプチドがさらに、配列番号168に相当するストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDHAD酵素のアミノ酸配列における位置56、129、および201に相当する3つの保存システイン全てを含む、請求項32~37のいずれか一項に記載の方法。Fe-Sクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、CCC1、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項32~38のいずれか一項に記載の方法。請求項35~37のいずれか一項に記載の方法によって同定されたポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞。前記宿主細胞がさらに、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む、請求項40に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記異種ポリヌクレオチドが多コピーで発現される、請求項41に記載の組換え宿主細胞。前記異種ポリヌクレオチドが、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む、請求項41に記載の組換え宿主細胞。前記異種ポリヌクレオチドが、組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれている、請求項41に記載の組換え宿主細胞。前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項35または36に記載の方法。前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkia、およびピキア属Pichiaからなる群から選択される、請求項45に記載の方法。前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項28~39のいずれか一項に記載の方法。前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkia、およびピキア属Pichiaからなる群から選択される、請求項47に記載の方法。前記組換え宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項40~44のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。前記酵母宿主細胞が、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkia、およびピキア属Pichiaからなる群から選択される、請求項49に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される、請求項40~44または49~50のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記異種ポリペプチドが、10-5よりも小さいE値で表12のプロファイルHMMとマッチするアミノ酸配列を有し、ポリペプチドがさらに、配列番号168に相当するストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDHAD酵素のアミノ酸配列における位置56、129、および201に相当する3つの保存システイン全てを含む、請求項40~44または49~50のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。前記組換え宿主細胞が、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される生産物を産生する、請求項40~44または49~50のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。前記組換え宿主細胞がイソブタノールを産生する、請求項53に記載の組換え宿主細胞。前記組換え宿主細胞がイソブタノール生合成経路を含む、請求項54に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、aジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約3倍よりも大きい比活性、およびbジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に対して約6倍よりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する、請求項1~22のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。前記活性の増大が、a約3倍よりも多い量、およびb約6倍よりも多い量からなる群から選択される量である、請求項32に記載の方法。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する前記ポリペプチドのモノマーが、a少なくとも約10、b少なくとも約15、c少なくとも約20、d少なくとも約25、e少なくとも約30、f少なくとも約35、g少なくとも約40、h少なくとも約45、i少なくとも約50、j少なくとも約60、k少なくとも約70、l少なくとも約80、m少なくとも約90、およびn少なくとも約95からなる群から選択されるFe-Sクラスター負荷を有する、請求項1~22、40~44、または49~50のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの前記変換が、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含有する対照宿主細胞と比較して、a少なくとも約5、b少なくとも約10、c少なくとも約15、d少なくとも約20、e少なくとも約25、f少なくとも約30、g少なくとも約35、h少なくとも約40、i少なくとも約45、j少なくとも約50、k少なくとも約60、l少なくとも約70、m少なくとも約80、n少なくとも約90、およびo少なくとも約95からなる群から選択される量で増大される、請求項29に記載の方法。Fe-Sクラスター生合成に影響を与える前記ポリペプチドが、ARN1、ARN2、ATX1、CCC2、COT1、ENB1、FET3、FET5、FIT1、FIT2、FIT3、FRE1、FRE2、FRE3、FRE4、FRE5、FRE6、FTH1、FTR1、HMX1、SIT1、SMF3、TIS11、VHT1、AFT1、AFT2、AIM1、ARH1、ATM1、BUD32、CAD1、CCC1、CFD1、CIA1、CMK1、CTH1、CTI6、CYC8、DAP1、DRE2、ERV1、ESA1、FET4、FRA1、FRA2、GEF1、GGC1、GRX1、GRX2、GRX4、GRX5、HDA1、IBA57、ISA1、ISA2、ISU1、ISU2、JAC1、MGE1、MRS3、MRS4、MSN5、NAR1、NFS1、NFU1、NHP6a、NHP6b、PSE1、SMF1、SNF1、SNF2、SNF3、SNF4、SSQ1、TIM12、TUP1、NP_011911.1、VPS41、YAP5、YFH1、YRA1、ZPR1、iscAnif、nifU、nifS、cysE1、cysE2、iscS、iscU、iscA、hscB、hscA、Fdx、sufS、sufE、cysE3、sufS2、iscA2、Nfu、nfuA、nfuV、nfu、sufA、sufB、sufC、sufD、sufE1、sufS2、またはsufE2によってコードされる、請求項1、2または5~26のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの形態の濃度を測定する方法であって、a第1のクロマトグラフィ手順を用いて、該ポリペプチドを含有する画分を粗抽出物から分離するステップと、b第2のクロマトグラフィ手順を用いて、該ポリペプチドの形態を含有する画分をaから分離するステップと、cbで得られた該ポリペプチドの該形態の濃度を測定するステップとを含む、上記方法。高レベルの異種Fe-Sクラスター要求タンパク質を発現する組換え宿主細胞は、少なくとも1つのFe取込み、利用、および/またはFe-Sクラスター生合成タンパク質のレベルが変更されれば、Fe-Sクラスターの補体をそのタンパク質に提供することができるという驚くべき発見が本明細書に開示されている。本明細書には、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供されており、前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。また、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供されており、前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれている。また、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供されており、前記宿主細胞は、鉄代謝またはFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む。また、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドと、鉄代謝またはFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞も提供されている。実施形態では、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、表7、表8および表9中の遺伝子からなる群から選択される。実施形態では、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、AFT1、AFT2、CCC1、FRA2、およびGRX3、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態では、ポリペプチドは、構成的突然変異体であるポリヌクレオチドによってコードされる。実施形態では、前記構成的突然変異体は、AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、AFT1C293F、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態において、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含むポリヌクレオチドによってコードされる。実施形態では、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされる。実施形態では、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換は、CCC1、FRA2、およびGRX3、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態では、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、AFT1、AFT2、これらの突然変異体、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、多数コピーで発現される。実施形態では、前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。実施形態では、前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれている。実施形態では、前記Fe-Sクラスター生合成は、内因性Fe-Sクラスター生合成を有する組換え宿主細胞と比較して増大される。実施形態では、前記宿主細胞は酵母宿主細胞である。実施形態では、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkiaおよびピキア属Pichiaからなる群から選択される。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、10-5よりも小さいE値で表12のプロファイルHMMと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号168に相当するストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDHAD酵素のアミノ酸配列における位置56、129、および201に相当する3つの保存システイン全てを含む。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、配列番号168または配列番号232に対して少なくとも約90の同一性を有するアミノ酸配列を有する。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約5倍よりも大きい比活性、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約8倍よりも大きい比活性、またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約10倍よりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する。実施形態において、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約3倍よりも大きい比活性、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約6倍よりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、約0.25U/mgよりも大きい比活性、約0.3U/mgよりも大きい比活性、約0.5U/mgよりも大きい比活性、約1.0U/mgよりも大きい比活性、約1.5U/mgよりも大きい比活性、約2.0U/mgよりも大きい比活性、約3.0U/mgよりも大きい比活性、約4.0U/mgよりも大きい比活性、約5.0U/mgよりも大きい比活性、約6.0U/mgよりも大きい比活性、約7.0U/mgよりも大きい比活性、約8.0U/mgよりも大きい比活性、約9.0U/mgよりも大きい比活性、約10.0U/mgよりも大きい比活性、約20.0U/mgよりも大きい比活性、および約50.0U/mgよりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する。実施形態では、前記組換え宿主細胞はイソブタノールを産生し、実施形態では、前記組換え宿主細胞はイソブタノール生合成経路を含む。また、本明細書には産物の製造方法も提供されており、本方法は、組換え宿主細胞を提供するステップと、前記産物が産生される条件下、発酵培地中で組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップとを含み、この産物は、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態では、本方法はさらに、場合により前記産物を回収するステップを含む。実施形態では、本方法はさらに、前記産物を回収するステップを含む。また、組換え宿主細胞を提供するステップと、イソブタノールが産生される条件下、発酵培地中で組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップとを含む、イソブタノールの製造方法も提供されている。実施形態では、本方法はさらに、場合により前記イソブタノールを回収するステップを含む。実施形態では、本方法はさらに、前記イソブタノールを回収するステップを含む。また、2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換方法も提供されており、本方法は、組換え宿主細胞を提供するステップと、2,3-ジヒドロキシイソバレレートがα-ケトイソバレレートに変換される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。実施形態では、2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞と比較して、a少なくとも約5、b少なくとも約10、c少なくとも約15、d少なくとも約20、e少なくとも約25、f少なくとも約30、g少なくとも約35、h少なくとも約40、i少なくとも約45、j少なくとも約50、k少なくとも約60、l少なくとも約70、m少なくとも約80、n少なくとも約90、およびo少なくとも約95からなる群から選択される量で増大される。また、組換え宿主細胞においてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドの比活性を増大させるための方法も提供されており、本方法は、組換え宿主細胞を提供するステップと、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドを持たない同一の宿主細胞よりも大きい比活性を有する機能性形態で発現される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。また、宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるための方法も提供されており、本方法は、組換え宿主細胞を提供するステップと、宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスが増大される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。また、組換え宿主細胞におけるFe-Sクラスター要求タンパク質の活性を増大させる方法も提供されており、本方法は、Fe-Sクラスター要求タンパク質を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、前記宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性が増大される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。実施形態では、前記活性の増大は、約10よりも多い量、約20よりも多い量、約30よりも多い量、約40よりも多い量、約50よりも多い量、約60よりも多い量、約70よりも多い量、約80よりも多い量、約90よりも多い量、および約95、98、または99よりも多い量からなる群から選択される量である。実施形態では、活性の増大は、約5倍よりも多い量、約8倍よりも多い量、約10倍よりも多い量からなる群から選択される量である。実施形態では、活性の増大は、約3倍よりも多い量、および約6倍よりも多い量からなる群から選択される量である。宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、本方法は、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性を測定するステップと、ポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定される異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性と、ポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定される異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性とを比較するステップとを含み、ここで、異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性の増大は、前記Fe-Sクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。本明細書には、宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチド同定するための方法が提供されており、本方法は、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性を測定するステップと、変化が存在する場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性と、変化が存在しない場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性とを比較するステップとを含み、ここで、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性の増大は、前記Fe-Sクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。実施形態では、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性の変化は、欠失、突然変異、置換、発現、上方制御、下方制御、細胞位置の変更、タンパク質の状態の変更、および/または補因子の付加を含む。実施形態では、Fe-Sクラスター要求タンパク質はジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有し、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するFe-Sクラスター要求タンパク質は、10-5よりも小さいE値で表12のプロファイルHMMと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号168に相当するストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDHAD酵素のアミノ酸配列における位置56、129、および201に相当する3つの保存システイン全てを含む。実施形態では、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、表7、表8および表9中の遺伝子からなる群から選択される。また、本明細書において提供される方法によって同定されたポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞も提供される。実施形態では、前記宿主細胞はさらに、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、多数コピーで発現される。実施形態では、前記異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。実施形態では、前記異種ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれている。実施形態では、前記宿主細胞は酵母宿主細胞である。実施形態では、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkia、およびピキア属Pichiaからなる群から選択される。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される。実施形態では、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、10-5よりも小さいE値で表12のプロファイルHMMと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号168に相当するストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDHAD酵素のアミノ酸配列における位置56、129、および201に相当する3つの保存システイン全てを含む。実施形態では、前記組換え宿主細胞は、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される産物を産生する。実施形態では、組換え宿主細胞はイソブタノールを産生する。実施形態では、前記組換え宿主細胞は、イソブタノール生合成経路を含む。実施形態では、前記イソブタノール生合成経路は、宿主細胞にとって異種であるポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも1つのポリペプチドを含む。実施形態では、前記イソブタノール生合成経路は、宿主細胞にとって異種であるポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも2つのポリペプチドを含む。実施形態では、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する本発明のポリペプチドのモノマーは、a少なくとも約10、b少なくとも約15、c少なくとも約20、d少なくとも約25、e少なくとも約30、f少なくとも約35、g少なくとも約40、h少なくとも約45、i少なくとも約50、j少なくとも約60、k少なくとも約70、l少なくとも約80、m少なくとも約90、およびn少なくとも約95からなる群から選択されるFe-Sクラスター負荷を有する。本明細書には、Fe-Sクラスターが負荷されたFe-Sクラスター要求タンパク質の画分を増大させる方法が記載される。また、DHAD酵素などの機能性Fe-Sクラスター要求タンパク質と、少なくとも1つの異種のFe取込み、利用、またはFe-Sクラスター生合成タンパク質とを発現する組換え宿主細胞、機能性DHAD酵素を発現し、Fe利用またはFe-Sクラスター生合成に関与する天然タンパク質において少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む組換え宿主細胞、あるいはこれらの組み合わせを含む組換え宿主細胞も記載される。さらに、本発明は、宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法を記載する。また、Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性を変更するポリペプチドを同定するための方法も記載される。定義他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本出願が支配するであろう。また、文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書において言及される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、全ての目的のためにその全体が参照によって援用される。本発明をさらに定義するために、本明細書において以下の用語および定義が提供される。本明細書で使用される場合、含むcomprises、含んでいるcomprising、含むincludes、含んでいるincluding、有するhas、有しているhaving、含有するcontainsもしくは含有しているcontainingという用語、またはこれらの他のあらゆる変化形は、記載される完全体integerまたは完全体のグループの包含を意味するが、任意の他の完全体または完全体のグループの排除は意味しないと理解されるであろう。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの要素だけに限定されるのではなく、明白に記載されていないか、あるいはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素も含み得る。さらに、反対する明確な記載がない限り、またはorは包括的なまたはを指し、排他的なまたはを指さない。例えば、条件AまたはBは以下のいずれか1つによって満たされる:Aが真でありまたは存在しかつBが偽であるまたは存在しない、Aが偽でありまたは存在せずかつBが真であるまたは存在する、ならびにAおよびBの両方が真であるまたは存在する。本明細書で使用される場合、からなるconsistsofという用語、またはからなるconsistofもしくはからなっているconsistingofなどの変化形は、本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、列挙される任意の完全体または完全体のグループの包含を示すが、指定の方法、構造、または組成物に付加的な完全体または完全体のグループを追加することはできない。本明細書で使用される場合、から本質的になるconsistsessentiallyofという用語、またはから本質的になるconsistessentiallyofもしくはから本質的になっているconsistingessentiallyofなどの変化形は、本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、列挙される任意の完全体または完全体のグループの包含を示し、場合により、指定の方法、構造または組成物の基本的または新規の特性を実質的に変化させることのない、列挙される任意の完全体または完全体のグループの包含も示す。M.P.E.P.§2111.03を参照されたい。また、本発明の要素または成分に先行する不定冠詞aおよびanは、その要素または成分の例の数、すなわち発生の数に関して非限定的であることが意図される。そのため、aまたはanは1つまたは少なくとも1つを含むように読み取られるべきであり、要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数形であることを意味しない限りは複数形も含む。発明または本発明という用語は、本明細書で使用される場合、非限定的な用語であり、どれか1つの特定の本発明の実施形態を指すことは意図されず、本出願で開示される全ての可能性のある実施形態を包含する。本明細書で使用される場合、使用される本発明の原料または反応物の量を修飾する約という用語は、例えば、実際に濃縮物または溶液の製造のために使用される典型的な測定および液体処理手順によって、これらの手順における不注意な誤差によって、組成物の製造または方法の実行のために使用される原料の製造、供給源、または純度の差異によって、そして同様のことによって生じ得る数量の変動を指す。また約という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。約という用語によって修飾されているかどうかにかかわらず、特許請求の範囲はその量と同等の量を含む。一実施形態では、約という用語は、報告される数値の10以内、好ましくは、報告される数値の5以内を意味する。イソブタノール生合成経路という用語は、ピルベートからイソブタノールを産生するための酵素経路を指す。通性嫌気性菌という用語は、好気環境および嫌気環境の両方において増殖することができる微生物を指す。炭素基質または発酵性炭素基質という用語は、本発明の宿主生物によって代謝されることが可能な炭素源、特に、単糖、オリゴ糖、多糖類、および一炭素基質、またはこれらの混合物からなる群から選択される炭素源を指す。Fe-Sクラスター生合成という用語は、Fe-Sクラスターの生合成例えば、Fe-Sクラスターの構築および負荷を含むを指す。Fe-Sクラスター生合成遺伝子、Fe-Sクラスター生合成タンパク質またはFe-Sクラスター生合成経路という用語は、Fe-Sクラスターの生合成例えば、Fe-Sクラスターの構築および負荷を含むに関与するようなポリヌクレオチド/遺伝子およびコード化ポリペプチドを指す。Fe取込みおよび利用という用語は、Feの感知、取込み、利用、および恒常性などの、Fe-Sクラスター生合成をもたらすことができるプロセスを指す。Fe取込みおよび利用遺伝子は、Feの取込み、利用、および恒常性に関与するようなポリヌクレオチド/遺伝子およびコード化ポリペプチドを指す。これらのポリヌクレオチド/遺伝子のいくつかは、文献において記載されており、そして以下にさらに説明されるFeレギュロンに含有される。本明細書で使用される場合、Fe取込みおよび利用遺伝子ならびにFe-Sクラスター生合成遺伝子は、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードすることができる。比活性という用語は、本明細書で使用される場合、所与の量のタンパク質における活性の単位であるであると定義される。従って、比活性は直接的に測定されないが、1酵素サンプル1ml当たりの単位単位/mlにおける活性を、2そのサンプル中のタンパク質の濃度で割ることによって計算され、従って、比活性は単位/mgで表現される。純粋で完全に活性な酵素のサンプルの比活性は、その酵素の特徴である。タンパク質の混合物のサンプルの比活性は、対象となる活性酵素から構成されるそのサンプル中のタンパク質の相対的な画分の尺度である。本発明のポリペプチドの比活性は、約0.25U/mgよりも大きい比活性、約0.3U/mgよりも大きい比活性、約0.4U/mgよりも大きい比活性、約0.5U/mgよりも大きい比活性、約0.6U/mgよりも大きい比活性、約0.7U/mgよりも大きい比活性、約0.8U/mgよりも大きい比活性、約0.9U/mgよりも大きい比活性、約1.0U/mgよりも大きい比活性、約1.5U/mgよりも大きい比活性、約2.0U/mgよりも大きい比活性、約2.5U/mgよりも大きい比活性、約3.0U/mgよりも大きい比活性、約3.5U/mgよりも大きい比活性、約4.0U/mgよりも大きい比活性、約5.5U/mgよりも大きい比活性、約5.0U/mgよりも大きい比活性、約6.0U/mgよりも大きい比活性、約6.5U/mgよりも大きい比活性、約7.0U/mgよりも大きい比活性、約7.5U/mgよりも大きい比活性、約8.0U/mgよりも大きい比活性、約8.5U/mgよりも大きい比活性、約9.0U/mgよりも大きい比活性、約9.5U/mgよりも大きい比活性、約10.0U/mgよりも大きい比活性、約20.0U/mgよりも大きい比活性、または約50.0U/mgよりも大きい比活性から選択され得る。一実施形態では、本発明のポリペプチドの比活性は、約0.25U/mgよりも大きい。別の実施形態では、比活性は、約1.0U/mgよりも大きい。さらに別の実施形態では、比活性は、約2.0U/mgよりも大きいか、あるいは約3.0U/mgよりも大きい。ポリヌクレオチドという用語は単一の核酸および複数の核酸を包含することが意図され、核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーRNAmRNAまたはプラスミドDNApDNAを指す。ポリヌクレオチドは、全長cDNA配列、またはその断片非翻訳5’および3’配列ならびにコード配列を含むのヌクレオチド配列を含有することができる。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成することができ、非修飾RNAまたはDNAでも修飾RNAまたはDNAでもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRNA、そして一本鎖またはより一般的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子から構成することができる。ポリヌクレオチドは、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。ポリヌクレオチド配列は、単離されたその天然環境から取り出されているとみなされることもある。例えば、ベクター中に含有されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする異種ポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されていると考えられる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の精製部分的または実質的にポリヌクレオチドが含まれる。本発明に従う単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、さらに、合成的に生成されたその分子を含む。DNAのポリマー形態の単離ポリヌクレオチド断片は、cDNA、ゲノムDNAまたは合成DNAの1つまたは複数のセグメントから構成され得る。遺伝子という用語は、特異的タンパク質として発現されることが可能なポリヌクレオチドを指し、場合により、コード配列の前の制御配列5’非コード配列およびコード配列の後の制御配列3’非コード配列が含まれる。天然遺伝子は、その独自の制御配列を有する天然に見出される遺伝子を指す。キメラ遺伝子は、天然に一緒に見出されない制御およびコード配列を含む、天然遺伝子でない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する制御配列およびコード配列、あるいは同じ源に由来するが、天然に見出されるものとは異なった形で配列された制御配列およびコード配列を含むことができる。本明細書で使用される場合、コード領域は、アミノ酸に翻訳されたコドンからなる核酸の一部である。終止コドンTAG、TGA、またはTAAはアミノ酸に翻訳されないにもかかわらず、コード領域の一部と考えることができるが、フランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。本発明の2つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物例えば、単一のベクター、あるいは別個のポリヌクレオチド構築物例えば、別箇の異なるベクターに存在することができる。さらに、どのベクターも、単一のコード領域を含有してもよいし、あるいは2つ以上のコード領域を含んでいてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、異種のコード領域をコードしてもよい。内因性という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドに関連して使用される場合、生物のゲノム中のその天然位置にある天然ポリヌクレオチドまたは遺伝子を指すか、あるいは天然ポリペプチドの場合は、ゲノム中のこの位置から転写および翻訳される。異種という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドに関連して使用される場合、通常は宿主生物中に見出されないポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドを指す。また異種は、対応する天然遺伝子とは異なる形態でソース生物中に再導入された例えば、生物のゲノム中のその天然位置にない天然コード領域またはその一部も含む。異種ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、例えば、遺伝子導入によって、宿主生物中に導入され得る。異種遺伝子は、天然宿主中に再導入された非天然制御領域を有する天然コード領域を含むことができる。導入遺伝子は、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。組換え遺伝子発現要素という用語は、タンパク質のコード配列の前の制御配列5’非コード配列およびコード配列の後の3’終結配列を含む、1つまたは複数の特異的タンパク質を発現する核酸断片を指す。キメラ遺伝子は、組換え遺伝子発現要素である。オペロンのコード領域は、作動可能に連結されたプロモーターおよび終結領域と共に、組換え遺伝子発現要素を形成することができる。制御配列は、コード配列の上流5’非コード配列、内部、または下流3’非コード配列に位置し、関連コード配列の転写、RNAプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終結シグナル、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。プロモーターという用語は、コード配列または機能性RNAの発現を調節することができる核酸配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の3’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよいし、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されてもよいし、さらに、合成核酸セグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、あるいは異なる発達段階で、あるいは異なる環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは当業者によって理解される。ほとんどの時点でほとんどの細胞型において遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に構成的プロモーターと称される。一方、誘導性プロモーターは、プロモーター特異的シグナルまたは分子によってプロモーターが誘導またはオンにされる場合に遺伝子の発現を引き起こす。さらに、ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが認識される。作動可能に連結されたという用語は、一方の機能が他方によって影響されるような単一の核酸断片における核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現をもたらすことができるすなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある場合、そのコード配列と作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結され得る。発現という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の核酸断片に由来するセンスmRNAまたはアンチセンスRNAの転写および蓄積を指す。また発現は、mRNAからポリペプチドへの翻訳を指すこともある。プロセスは、細胞内で発現されるポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドの機能性存在の出現遺伝子ノックダウンを制限なしに含むならびに一過性発現および安定発現の両方を含む。過剰発現という用語は、本明細書で使用される場合、同一または関連のポリヌクレオチドまたは遺伝子の内因性発現よりも高い発現を指す。また、異種ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、同等の内因性遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、あるいは、ポリヌクレオチドまたは遺伝子を過剰発現しない手段によって導入された同じポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現よりもその発現が高ければ、過剰発現される。例えば、ポリヌクレオチドは、低コピー数プラスミドほんの限られたまたは少数のコピー中に存在するから宿主細胞において発現され、同じポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミド多数コピー中に存在するから宿主細胞において過剰発現され得る。宿主細胞においてポリヌクレオチドのコピーを増大させることができる限り、任意の手段を使用してポリヌクレオチドを過剰発現させることができる。高コピー数プラスミド、または制御可能なコピー数を有するプラスミドの使用に加えて、ポリヌクレオチドは、多数の染色体組込みによって過剰発現され得る。組換え宿主細胞における本発明のポリペプチドの発現または過剰発現は、当業者に知られているあらゆる方法に従って定量化することができ、例えば、細胞タンパク質全体のパーセントによって表すことができる。タンパク質全体のパーセントは、細胞タンパク質全体の約0.001よりも多い量、細胞タンパク質全体の約0.01よりも多い量、細胞タンパク質全体の約0.1よりも多い量、細胞タンパク質全体の約0.5よりも多い量、細胞タンパク質全体の約1.0よりも多い量、細胞タンパク質全体の約2.0よりも多い量、細胞タンパク質全体の約3よりも多い量、細胞タンパク質全体の約4.0よりも多い量、細胞タンパク質全体の約5よりも多い量、細胞タンパク質全体の約6.0よりも多い量、細胞タンパク質全体の約7.0よりも多い量、細胞タンパク質全体の約8.0よりも多い量、細胞タンパク質全体の約9.0よりも多い量、細胞タンパク質全体の約10よりも多い量、または細胞タンパク質全体の約20よりも多い量から選択される量であり得る。一実施形態では、発現されるポリペプチドの量は、細胞タンパク質全体の約0.5よりも多い。別の実施形態では、発現されるポリペプチドの量は、細胞タンパク質全体の約1.0よりも多い、または細胞タンパク質全体の約2.0よりも多い。本明細書で使用される場合、形質転換という用語は核酸断片の宿主生物への転移を指し、選択を有するまたは有さない遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、遺伝子導入または組換えまたは形質転換生物と称される。プラスミドおよびベクターという用語は、本明細書で使用される場合、細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖DNA分子の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、任意のソースに由来する一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAの自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列線状または環状であってもよく、ここで、多数のヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびDNA配列を適切な3’非翻訳配列と共に細胞内に導入することができる独特の構成に結合または組換えられている。本明細書で使用される場合、コドン縮重という用語は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝コードの性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞によって示されるコドンバイアスをよく知っている。そのため、宿主細胞における発現の改善のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。種々の宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域を指すようなコドン最適化という用語は、DNAによってコードされるポリペプチドを改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用を反映するための、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を指す。このような最適化は、その生物の遺伝子中でより頻繁に使用される1つまたは複数のコドンによる、少なくとも1つ、または2つ以上、またはかなりの数のコドンの置換を含む。任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における偏差は、遺伝子をコードする配列における変動を可能にする。各コドンは3つのヌクレオチドからなり、DNAを構成するヌクレオチドは4つの特定の塩基に限定されるので、64個の可能なヌクレオチドの組み合わせが存在し、そのうち61個がアミノ酸をコードする残りの3個のコドンは翻訳を終了させるシグナルをコードする。遺伝コードは、表1のように本明細書においてどのアミノ酸が再現されるかをどのコドンがコードするかを示す。結果として、多数のアミノ酸が2つ以上のコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは4つのトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは6つによってコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンはただ1つのトリプレットによってコードされる。この縮重によって、DNA塩基組成は、DNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく広範囲にわたって変化することができる。多数の生物は、成長しているペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドンの使用に対するバイアスを示す。生物間のコドン使用における差異であるコドン選択またはコドンバイアスは遺伝コードの縮重によって提供され、多数の生物の間で十分に実証されている。コドンバイアスはメッセンジャーRNAmRNAの翻訳効率と相関することが多く、これは次に、特に、翻訳中のコドンの特性および特定の転移RNAtRNA分子の利用能に依存していると考えられる。細胞中で選択されるtRNAが優勢であることは、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。様々な種類の動物、植物および微生物種に対して多数の遺伝子配列が利用可能であれば、相対的なコドン使用頻度を計算することが可能である。コドン使用表は、例えば、http://www.kazusa.or.jp/codon/2008年3月20日訪問で入手可能なCodonUsageDatabaseにおいて容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合させることができる。Nakamura,Y.,etal.Nucl.AcidsRes.28:2922000を参照されたい。GenBankRelease128.0[2002年2月15日]から計算される酵母のためのコドン使用表は、以下の表2のように再現される。この表はmRNA命名法を使用するので、DNA中に見出されるチミンTの代わりに、この表では、RNA中に見出されるウラシルUが使用される。表2は、頻度が64個の全てのコドンに対してではなく各アミノ酸に対して計算されるように適合されている。この表または類似の表を用いることによって、当業者は任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするが所与の種にとって最適なコドンを使用するコドン最適化コード領域の核酸断片を生じることができる。コドンを最適化頻度でランダムに割り当てて所与のポリペプチド配列をコード化することは、各アミノ酸のコドン頻度を計算し、次にコドンをポリペプチド配列にランダムに割り当てることによって手作業で行うことができる。さらに、種々のアルゴリズムおよびコンピュータソフトウェアプログラムは、当業者にとって容易に利用可能である。例えば、DNAstar,Inc.Madison,WIから入手可能なLasergenePackageにおけるEditSeq機能、InforMax,Inc.Bethesda,MDから入手可能なVectorNTISuiteにおける折り返し翻訳backtranslation機能、およびAccelrys,Inc.SanDiego,CAから入手可能なGCG-WisconsinPackageにおけるbacktranslate機能である。さらに、例えば、http://www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.phplang=eng2008年4月15日訪問におけるbacktranslation機能、およびhttp://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html2002年7月9日訪問において利用可能なbacktranseq機能など、種々の資源がコドン最適化コード領域配列にとって公的に入手可能である。所与の頻度に基づいてコドンを割り当てるために基本的なアルゴリズムを構築することも、基本的な数学関数を用いて当業者により容易に達成され得る。コドン最適化コード領域は、syntheticgenedesignerhttp://phenotype.biosci.umbc.edu/codon/sgd/index.phpなどのソフトウェアパッケージを含む、当業者に知られている種々の方法によって設計することができる。本明細書で使用される場合、ポリペプチドという用語は単一のポリペプチドおよび複数のポリペプチドを包含することが意図され、アミド結合ペプチド結合としても知られているによって直線的に連結されたモノマーアミノ酸から構成される分子を指す。ポリペプチドという用語は、任意のアミノ酸鎖または2つ以上のアミノ酸の鎖を指し、産物の特定の長さを指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、またはアミノ酸鎖もしくは2つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の任意の用語は、ポリペプチドの定義の中に含まれ、ポリペプチドという用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または交換可能に使用することができる。ポリペプチドは天然の生物学的ソースに由来してもよいし、あるいは組換え技術によって作製されてもよいが、必ずしも指定される核酸配列から翻訳されるわけではない。化学合成を含む任意の方法で生成することができる。単離ポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現される組換えで産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドなので、本発明の目的では単離されていると考えられる。本明細書で使用される場合、変異体という用語は、例えば、変異誘発などの組換えDNA技術を用いて作製された、アミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および置換によって、DHADなどの特に列挙される本発明のポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。どのアミノ酸残基が対象となる活性を消滅させることなく置換、付加、または欠失され得るかを決定するためのガイダンスは、特定のポリペプチドと、相同ポリペプチド例えば、酵母または細菌との配列を比較し、相同性の高い領域保存領域において成されるアミノ酸配列の変化の数を最小限にすることによって、あるいはコンセンサス配列によりアミノ酸を置換することによって見出すことができる。あるいは、これらの同一または類似のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド変異体は、遺伝コードの冗長性を用いることによって、合成または選択され得る。種々の制限部位を生じるサイレント変化などの種々のコドン置換を導入して、発現のためのプラスミドまたはウイルスベクターへのクローニングを最適化することができる。ポリヌクレオチド配列の突然変異はポリペプチドまたはポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインに反映され、ポリペプチドの任意の部分の特性を修飾することができる。例えば、突然変異は、標的タンパク質の発現を低減または除去するために使用可能であり、全遺伝子または遺伝子の一部の欠失、タンパク質が発現されないかあるいはより低いレベルで発現されるような遺伝子プロモーターまたはコード領域のいずれかのへのDNA断片の挿入、機能性タンパク質が発現されないような終止コドンまたはフレームシフトを付加するコード領域への突然変異の導入、そして非機能性または酵素活性の低いタンパク質が発現されるようにアミノ酸を改変するためのコード領域への1つまたは複数の突然変異の導入が含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸置換は、類似の構造および/または化学特性を有する別のアミノ酸による1つのアミノ酸の置換、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であってもよいし、あるいは、異なる構造および/または化学特性を有するアミノ酸による1つのアミノ酸の置換、すなわち非保存的アミノ酸置換の結果であってもよい。保存的アミノ酸置換は、関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性疎水性アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含み、極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含み、正帯電塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含み、そして負帯電酸性アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。あるいは、非保存的アミノ酸置換は、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性における差異を選択することによって行うことができる。挿入または欠失は、組換えタンパク質により構造的または機能的に許容される変異の範囲内であり得る。可能とされる変異は、組換えDNA技術を用いて、ポリペプチド分子においてアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に行い、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることによって、実験的に決定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列の実質的な部分は、当業者による配列の手動評価によって、あるいはBLASTAltschul,S.F.,etal.,J.Mol.Biol.,215:403-4101993などのアルゴリズムを用いるコンピュータ自動化配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同であると推定的に同定するためには、10以上の近接アミノ酸または30以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、配列依存性の遺伝子同定法例えば、サザンハイブリダイゼーションおよび単離法例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイツハイブリダイゼーションにおいて、20~30の近接ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用されてもよい。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、PCRにおける増幅プライマーとして12~15塩基の短いオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。従って、ヌクレオチド配列の実質的な部分は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および/または単離するために十分な配列を含む。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告されるような配列の利益を得て、開示される配列の全てまたは実質的な部分を当業者に既知の目的のためにこれから使用することができる。従って、本発明は、添付の配列表において提供されるような完全な配列と、上記で定義したこれらの配列の実質的な部分とを含む。相補的という用語は、互いにハイブリッド形成することができるヌクレオチド塩基間の関係を表すために使用される。例えば、DNAに関して、アデニンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的であり、そしてRNAに関して、アデニンはウラシルに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。同一性パーセントという用語は、当該技術分野において知られているように、配列を比較することによって決定される、2つ以上のポリペプチド配列の間または2つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、同一性は、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。同一性および類似性は、1.ComputationalMolecularBiologyLesk,A.M.,Ed.OxfordUniversity:NY1988、2.Biocomputing:InformaticsandGenomeProjectsSmith,D.W.,Ed.Academic:NY1993、3.ComputerAnalysisofSequenceData,PartIGriffin,A.M.,andGriffin,H.G.,Eds.Humania:NJ1994、4.SequenceAnalysisinMolecularBiologyvonHeinje,G.,Ed.Academic1987、および5.SequenceAnalysisPrimerGribskov,M.andDevereux,J.,Eds.Stockton:NY1991に記載される方法を含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイートDNASTARInc.,Madison,WIのMegAlign商標プログラムを用いて実施され得る。配列の多重アライメントは、ClustalVと標識されるアライメント法に相当するClustalVアライメント法HigginsandSharp,CABIOS.5:151-1531989、Higgins,D.G.etal.,Comput.Appl.Biosci.,8:189-1911992によって記載されるを含む数種類のアルゴリズムを包含し、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイートDNASTARInc.のMegAlign商標プログラムにおいて見出されるClustalアライメント法を用いて実施される。多重アライメントの場合、デフォルト値は、GAPPENALTY=10およびGAPLENGTHPENALTY=10に相当する。Clustal法を用いるタンパク質配列のペアワイズアライメントおよび同一性パーセントの計算のためのデフォルトパラメータは、KTUPLE=1、GAPPENALTY=3、WINDOW=5およびDIAGONALSSAVED=5である。核酸については、これらのパラメータは、KTUPLE=2、GAPPENALTY=5、WINDOW=4およびDIAGONALSSAVED=4である。ClustalVプログラムを用いた配列のアライメントの後、同じプログラム内の配列距離表を見ることによって同一性パーセントを得ることが可能である。さらに、ClustalWアライメント法も利用可能であり、ClustalWと標識されるアライメント法HigginsandSharp,CABIOS.5:151-1531989、Higgins,D.G.etal.,Comput.Appl.Biosci.8:189-1911992によって記載されるに相当し、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイートDNASTARInc.のMegAlign商標v6.1プログラムにおいて見出される。多重アライメントのためのデフォルトパラメータGAPPENALTY=10、GAPLENGTHPENALTY=0.2、DelayDivergenSeqs=30、DNATransitionWeight=0.5、ProteinWeightMatrix=GonnetSeries、DNAWeightMatrix=IUB。ClustalWプログラムを用いた配列のアライメントの後、同じプログラム内の配列距離表を見ることによって同一性パーセントを得ることが可能である。他の種からのポリペプチドここで、このようなポリペプチドは、同一または類似の機能または活性を有するの同定において、あるいは対応するポリヌクレオチドの記述において、多数の配列同一性レベルが有用であることは当業者によって十分に理解されている。同一性パーセントの有用な例としては、55、60、65、70、75、80、85、90、または95が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99などの55~100の任意の整数の百分率が本発明の記述において有用であり得る。適切なポリヌクレオチド断片は上記の相同性を有するだけでなく、通常、少なくとも50個のヌクレオチド、少なくとも100個のヌクレオチド、少なくとも150個のヌクレオチド、少なくとも200個のヌクレオチド、または少なくとも250個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。さらに、上記の相同性を有する適切なポリヌクレオチド断片は、少なくとも50個のアミノ酸、少なくとも100個のアミノ酸、少なくとも150個のアミノ酸、少なくとも200個のアミノ酸、または少なくとも250個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。配列分析ソフトウェアという用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。配列分析ソフトウェアは市販のものでもよいし、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、1.GCGプログラム一式WisconsinPackageVersion9.0,GeneticsComputerGroupGCG,Madison,WI、2.BLASTP、BLASTN、BLASTXAltschuletal.,J.Mol.Biol.,215:403-4101990、3.DNASTARDNASTAR,Inc.Madison,WI、4.SEQUENCHERGeneCodesCorporation,AnnArbor,MI、および5.Smith-Watermanアルゴリズムを組み込んだFASTAプログラムW.R.Pearson,Comput.MethodsGenomeRes.,[Proc.Int.Symp.]1994,MeetingDate1992,111-20.Editors:Suhai,Sandor.Plenum:NewYork,NYが含まれ得るが、これらに限定されない。本出願との関連において、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、他に指定されない限り、分析結果が、参照されるプログラムのデフォルト値に基づくことは理解されるであろう。本明細書で使用される場合、デフォルト値は、最初の初期化の際にソフトウェアと共に最初にロードされた値またはパラメータの任意のセットを意味するであろう。本明細書で使用される標準組換えDNAおよび分子クローニング技術は当該技術分野においてよく知られており、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY1989以下、Maniatisと称するによって、そしてSilhavy,T.J.,Bennan,M.L.andEnquist,L.W.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY1984によって、そしてAusubel,F.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscienceによる出版1987によって記載されている。Fe-Sクラスター要求タンパク質の機能Fe-Sクラスターを含有するタンパク質の機能は様々である。これらの機能を分類するためのより完全な取り組みの1つは、Johnson,D.C.,etal.,Structure,function,andformationofbiologicaliron-sulfurclusters.Annu.Rev.Biochem.,2005.74:p.247-281から適合された以下の表において与えられる。上記種類のメンバーのうちの1つまたは複数へのFe-Sクラスターの負荷の供給および効率の増大は商業的および/または医学的な利益を有し得ると考えられる。当業者によって認識され得る多数の可能性のうち、3つの例が与えられる。1Fe-Sクラスター含有酵素が発酵産物への経路において使用され、産物への経路において高フラックスを維持するために高レベルで発現される必要がある場合例えば、イソブタノールへの経路におけるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ。2Fe-Sクラスター含有酵素が発酵産物への経路において使用され、Fe-Sクラスターが触媒作用中に代謝回転を受ける場合例えば、グルコースからビオチンへの商業的発酵におけるビオチンシンターゼ。3良好な健康のために重要なFe-Sクラスター含有タンパク質の正常な濃度が低いような病的状態例えば、フリードライヒ運動失調症の場合。DHADおよびDHADアッセイDHADは、デヒドラターゼより適切にはヒドロリアーゼ類のFe-Sクラスター要求タンパク質である。DHAD酵素をコードする遺伝子は、組換え宿主細胞においてDHAD活性の発現を提供するために使用することができる。DHADは、2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換および2,3-ジヒドロキシメチルバレレートからα-ケトメチルバレレートへの変換を触媒し、E.C.4.2.1.9として分類される。組換え宿主細胞における使用に適したDHADのコード配列は、細菌、真菌、または植物源に由来することができる。使用され得るDHADは、[4Fe-4S]クラスターまたは[2Fe-2S]を有することができる。表4a、4b、5、および6には、本発明において使用され得る典型的なDHADのコード領域およびタンパク質の配列番号が記載されている。記載された特定の配列に対して少なくとも約95の同一性を有するタンパク質は単純化のために省略されているが、表4a、4b、5、および6に記載されるタンパク質のいずれかに対して少なくとも約95の配列同一性を有し、DHAD活性を有するタンパク質単純化のために省略されたものを含むは、本明細書において開示されるように使用可能であると理解される。付加的なDHADタンパク質およびそのコード化配列は、当業者に周知であるように、公開データベースのBLAST検索によって同定することができる。通常、本明細書において提供されるものなどの既知のDHAD配列による公的に入手可能なデータベースのBLAST上記検索は、本発明の細胞において発現され得るDHADおよびそのコード化配列を同定するために使用される。例えば、表3のDHADタンパク質のいずれかに対して少なくとも約80~85のアミノ酸配列同一性、少なくとも約85~90、少なくとも約90~95、または少なくとも約98の配列同一性を有するDHADタンパク質は、本発明の細胞において発現され得る。同一性は、GAPPENALTY=10、GAPLENGTHPENALTY=0.1、およびタンパク質重量マトリックスのGonnet250シリーズのデフォルトパラメータを用いるClustalWアライメント法に基づく。付加的な[2Fe-2S]DHADは、2009年9月29日に出願された米国特許出願第12/569,636号明細書参照によって本明細書中に援用されるに記載される分析を用いて同定することができる。分析は次の通りである:8つの機能的に検証されたDHADのアミノ酸配列に基づいてプロファイル隠れマルコフモデルHMMを作成した。プロファイルHMMの適用については記載されている。例えば、Kroghetal.,J.Mol.Biol.235:1501-15311994およびDurbinetal.,MarkovchainsandhiddenMarkovmodels,inBiologicalSequenceAnalysis:ProbabilisticModelsofProteinsandNucleicAcids,CambridgeUniversityPress1998を参照されたい。プロファイルHMMは、試験配列が特定の配列ファミリーに属するかどうかを決定するために使用することができる多重配列アライメントで構築された統計モデルである。同文献参照。プロファイルHMMは、まず従来の配列アライメントツールを用いて機能的に検証された配列のアライメントを作成することによって構築することができる。次に、この配列アライメントを使用して、位置特異的スコアリングシステムを使用する公的に入手可能なソフトウェアプログラム例えば、HMMERを用いてプロファイルHMMを構築し、入力配列の多重アライメントにおける種々のアミノ酸位置での保存の程度についての情報を得る。より具体的には、式:log__2p_x/null_xに比例する、一致状態すなわち、一致状態エミッションスコアまたは挿入状態すなわち、挿入状態エミッションスコアにあるアミノ酸残基のスコアが獲得される。同文献参照。この式において、項p_xは、プロファイルHMMによる、アライメント内の特定の位置におけるアミノ酸残基の確率であり、項null_xはNullモデルによる確率である。同文献参照。Nullモデルは、アミノ酸の分布から誘導されるアミノ酸のそれぞれに対するエミッション確率の予め計算されたセットを有する単純な1つの状態の確率モデルである。同文献参照。状態遷移スコアはログオッズパラメータとしても計算され、Log__2t_xに比例する。同文献参照。この式において、項t_xは、エミッタまたは非エミッタ状態への遷移の確率である。同文献参照。プロファイルHMMを作成するための特定の統計的分析に関するさらなる詳細は、Kroghetal.,J.Mol.Biol.235:1501-15311994およびDurbinetal.,MarkovchainsandhiddenMarkovmodels,inBiologicalSequenceAnalysis:ProbabilisticModelsofProteinsandNucleicAcids,CambridgeUniversityPress1998、ならびに米国特許出願第12/569,636号明細書において入手可能である。プロファイル隠れマルコフモデルHMMは、ニトロソモナスユーロパエアNitrosomonaseuropaeaDNA配列番号309、タンパク質配列番号310、シネコシスティス種PCC6803DNA配列番号297、タンパク質配列番号298、ストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDNA配列番号167、タンパク質配列番号168、ストレプトコッカスサーモフィルスStreptococcusthermophilusDNA配列番号163、配列番号164、ラルストニアメタリデュランスRalstoniametalliduransDNA配列番号345、タンパク質配列番号346、ラルストニアユートロファRalstoniaeutrophaDNA配列番号343、タンパク質配列番号344、およびラクトコッカスラクティスLactococcuslactisDNA配列番号231、タンパク質配列番号232からの8つの機能的に検証されたDHADのアミノ酸配列に基づいて作成した。さらに、大腸菌E.coliにおいて発現される場合に、フラボバクテリウムジョンソニアエFlavobacteriumjohnsoniaeDNA配列番号229、タンパク質配列番号230からのDHADがジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有することを発見し、Profileを作成するために使用した。プロファイルHMMは、HMMERJaneliaFarmResearchCampus,Ashburn,VAから利用可能であるユーザーガイドに従って、HMMERソフトウェアパッケージプロファイルHMMの背後にある理論は、R.Durbin,S.Eddy,A.Krogh,andG.Mitchison,Biologicalsequenceanalysis:probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids,CambridgeUniversityPress,1998、Kroghetal.,1994、J.Mol.Biol.235:1501-1531に記載されているを用いて作成される。HMMERソフトウェアプログラムの出力は、入力配列を特徴付けるプロファイル隠れマルコフモデルHMMである。8つのDHADタンパク質に対して作成されたプロファイルHMMは、2009年9月29日に出願された米国特許出願第12/569,636号明細書において、そして表12において与えられる。各位置についての表12の最初の行には、各アミノ酸がその状態一致状態エミッションスコアにある確率が報告される。第2行目には挿入状態エミッションスコアが報告され、第3行目には状態遷移スコアが報告される。各位置について最高確率が協調される。これらのスコアをE値期待値に変換することができ、これは、全く偶然に得ることが期待され得るプロファイルHMMへのヒットまたは一致の数である。プロファイルHMMに対して10-5よりも小さいE値を有するタンパク質の一致は、そのタンパク質がプロファイルHMMを構築するために使用されるシードタンパク質との著しい配列類似性を共有し、そのタンパク質がプロファイルHMMによって表されるファミリーに属することを示す。10-5よりも小さいE値でプロファイルHMMと一致するタンパク質はどれも、[4Fe-4S]DHAD、[2Fe-2S]DHAD、アラボネートデヒドラターゼ、およびホスホグルコネートデヒドラターゼを含むDHAD関連タンパク質である。実施形態では、プロファイルHMMに一致する配列は、次に、ストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDHADの位置56、129、および201に相当する3つの保存システインの存在について分析される。3つの保存システイン全ての存在は、[2Fe-2S]クラスターを有するタンパク質に特有である。3つの保存システインを有するタンパク質は、アラボネートデヒドラターゼおよび[2Fe-2S]DHADを含む。[2Fe-2S]DHADは、ストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDHADアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、[2Fe-2S]DHADまたはアラボネートデヒドラターゼ中に存在することが分かっている特徴的な保存アミノ酸を分析することによって、アラボネートデヒドラターゼと識別することができる。これらの特徴的なアミノ酸は、[2Fe-2S]DHADまたはアラボネートデヒドラターゼ中に、それぞれ以下の位置において存在する90よりも大きい発生率で:88アスパラギン対グルタミン酸、113非保存対グルタミン酸、142アルギニンまたはアスパラギン対非保存、165非保存対グリシン、208アスパラギン対非保存、454ロイシン対非保存、477フェニルアラニンまたはチロシン対非保存、および487グリシン対非保存。さらに、本明細書において提供されるDHADコード領域の配列は、事実上他の相同体を同定するために使用することができる。このような方法は、当該技術分野においてよく知られており、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離するために使用され得る種々の方法は、2009年9月29日に出願された米国特許出願第12/569,636号明細書に記載されており、このような方法は参照によって本明細書中に援用される。異種DHADを発現するように操作された細胞におけるDHAD活性の存在は、当該技術分野において既知の方法を用いて確認することができる。一例として、そして本明細書の実施例において実証されるように、細菌DHADを発現するように操作された細胞からの粗抽出物は、ジニトロフェニルヒドラジンを用いる、FlintおよびEmptageJ.Biol.Chem.19882638:3558-64によって記載されるようなDHADアッセイにおいて使用することができる。別の例では、DHAD活性は、内因性DHAD活性を持たない酵母株において、本明細書に開示される方法によって同定可能な異種DHADを発現させることによってアッセイされ得る。DHAD活性が存在する場合、酵母株は分枝鎖アミノ酸の非存在下で増殖し得る。また、DHAD活性は、より間接的な方法、例えば、DHAD活性を必要とする経路の下流産物についてアッセイすることなどによって確認することもできる。経路中間体としてα-ケトイソバレレートまたはα-ケトメチルバレレートを有する産物はどれも、DHAD活性のためのアッセイにおいて測定され得る。このような産物のリストには、バリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、およびイソブタノールが含まれるが、これらに限定されない。DHAD活性の過剰発現本出願人らは、異種DHADの発現は、宿主細胞において発現されるとDHAD活性を提供できることを見出した。本明細書に記載されるように同定され得るDHADの発現は、2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換または2,3-ジヒドロキシメチルバレレートからα-ケトメチルバレレートへの変換を含む生合成経路にDHAD活性を提供することができる。さらに、S.ミュータンスS.mutans[2Fe-2S]DHADは、2009年9月29日に出願された関連の米国特許出願第12/569,636号明細書参照によって本明細書中に援用されるにおいて、大腸菌E.coli[4Fe-4S]DHADの空気中での感受性と比較してより高い空気中の安定性を有することが示されており、これは、異種宿主細胞においてより良い活性を得るために望ましい。さらに、本明細書に記載されるように、より高いレベルでの異種DHADタンパク質の発現は、宿主細胞において発現されると増大したDHAD活性を提供できることが分かった。組換えポリヌクレオチドの高発現は、少なくとも2つの方法で達成することができる:1組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドのコピー数を増大させることによる、あるいは2対象の遺伝子の多数コピーを宿主細胞の染色体内に組み込むことによる。本明細書において例示されるように、異種DHADの多数コピーの発現は、異種DHADの比活性の増大を提供する。組換えポリヌクレオチドは、通常、リボソーム結合部位および終結調節領域と共にコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、形質転換のために使用されるキメラ遺伝子の一部としてコード配列を用いて発現のためにクローン化される。コード領域は形質転換のための宿主細胞に由来し、DHADをコードする天然遺伝子に対して天然でない制御配列と結合されてもよい。あるいは、コード領域は別の宿主細胞に由来してもよい。様々な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターは一般的であり、文献に記載されている。通常、ベクターは、選択可能なマーカー、ならびに所望の宿主における自己複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。さらに、適切なベクターは、コード領域DNA断片が間に挿入され得る転写開始調節および転写終結調節領域を有するプロモーター領域を含むことができ、挿入されたコード領域の発現を提供する。調節領域は両方とも形質転換宿主細胞に相同の遺伝子に由来してもよいが、このような調節領域が、産生宿主として選択される特定の種にとって天然でない遺伝子に由来してもよいことは理解されるはずである。異種細菌DHADの発現または過剰発現のための宿主であり得る酵母細胞は遺伝子操作を受け入れられる任意の酵母細胞であり、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkia、およびピキア属Pichiaを含むが、これらに限定されない。適切な株としては、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、シゾサッカロミセスポンベSchizosaccharomycespombe、クルイベロミセスラクティスKluyveromyceslactis、クルイベロミセスサーモトレランスKluyveromycesthermotolerans、カンジダグラブラタCandidaglabrata、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、ピキアスティピティスPichiastipitis、およびヤロウイアリポリティカYarrowialipolyticaが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、宿主はサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeである。発現は、DHAD、例えば、表4a、4b、5または6に記載されるDHAD、または2009年9月29日に出願された関連の米国特許出願第12/569,636号明細書参照によって本明細書中に援用される中のスクリーニング方法を用いて同定されるDHADをコードする配列を含む遺伝子で宿主細胞を形質転換することによって達成される。DHADが発現されるためのコード領域は、当業者に良く知られているように、標的宿主細胞に対してコドン最適化され得る。酵母における遺伝子発現のための方法は当該技術分野において知られている例えば、MethodsinEnzymology,Volume194,GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiologyPartA,2004,ChristineGuthrieandGeraldR.FinkEds.,ElsevierAcademicPress,SanDiego,CAを参照されたい。酵母における遺伝子の発現は、通常、対象のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターおよび転写ターミネーターを必要とする。多数の酵母プロモーターは、酵母において遺伝子のための発現カセットを構築する際に使用することができ、以下の遺伝子に由来するプロモーターが含まれるが、これらに限定されない:CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、CUP1、FBA、GPD、GPM、およびAOX1。適切な転写ターミネーターには、FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GAL1t、CYC1、およびADH1が含まれるが、これらに限定されない。適切なプロモーター、転写ターミネーター、およびDHADコード領域は、大腸菌E.coli-酵母シャトルベクター内にクローン化され、酵母細胞に形質転換され得る。これらのベクターは、大腸菌E.coliおよび酵母株の両方における菌株の増殖を可能にする。一実施形態では、使用されるベクターは、選択可能なマーカー、ならびに所望の宿主における自己複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。酵母において使用されるプラスミドの例としては、シャトルベクターpRS423、pRS424、pRS425、およびpRS426AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VAが挙げられ、これらは、大腸菌E.coli複製開始点例えば、pMB1、酵母2-ミクロン複製開始点、および栄養選択のためのマーカーを含有する。これらの4つのベクターのための選択マーカーは、His3ベクターpRS423、Trp1ベクターpRS424、Leu2ベクターpRS425およびUra3ベクターpRS426である。記載されるDHADをコードするキメラ遺伝子を有する発現ベクターの構築は、大腸菌E.coliにおける標準分子クローニング技術、あるいは酵母におけるギャップ修復組換え法のいずれかによって実施することができる。ギャップ修復クローニングアプローチは、酵母における高効率の相同組換えを利用する。例えば、酵母ベクターDNAは消化され例えば、その複数のクローニング部位において、その配列内にギャップが形成される。互いに、そしてベクターDNAの5’および3’終端と順次重なる21bp以上の配列を5’および3’端部の両方に含有する、対象のいくつかの挿入DNAが生成される。例えば、遺伝子Xのための酵母発現ベクターを構築するために、酵母プロモーターおよび酵母ターミネーターが発現カセットのために選択される。プロモーターおよびターミネーターは酵母ゲノムDNAから増幅され、遺伝子Xはそのソース生物からPCR増幅されるか、あるいは遺伝子X配列を含むクローニングベクターから得られる。直線化ベクターの5’端部とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Xとの間、遺伝子Xとターミネーター配列との間、そしてターミネーターと直線化ベクターの3’端部との間には、少なくとも21bpのオーバーラップ配列が存在する。次に、ギャップベクターおよび挿入DNAは酵母株に同時形質転換され、プラスミド上の栄養選択マーカーの相補性を可能にする適切な化合物の混合物を含有する培地にプレーティングされる。正しい挿入断片の組み合わせの存在は、選択された細胞から調製されるプラスミドDNAを用いて、PCRマッピングにより確認することができる。次に、酵母通常、低濃度から単離されたプラスミドDNAを、大腸菌E.coli株、例えばTOP10に形質転換した後、ミニプレップおよび制限酵素マッピングを行い、プラスミド構築物をさらに検証することができる。最後に、構築物を配列分析によって検証することができる。ギャップ修復技術と同様に、酵母ゲノムへの組込みも、酵母における相同組換えシステムを利用する。例えば、コード領域と、調節要素プロモーターおよびターミネーターおよび栄養要求性マーカーとを含有するカセットは、このカセットとハイブリッド形成し、挿入が所望されるゲノム領域の領域5’および3’に対して配列相同性を有する40~70の塩基対を含有するプライマーを用いて、高忠実度DNAポリメラーゼによりPCR増幅される。次に、PCR産物は酵母に形質転換され、組み込まれた栄養要求性マーカーの選択を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地にプレーティングされる。例えば、遺伝子Xを染色体位置Yに組み込むために、プロモーター-コード領域X-ターミネーター構築物がプラスミドDNA構築物からPCR増幅され、SOEPCRまたは一般的な制限消化およびクローニングのいずれかによって、独立栄養性マーカーURA3などに結合される。プロモーター-コード領域X-ターミネーター-URA3領域を含有する全カセットは、酵母染色体における位置Yの領域5’および3’に対する相同性を有する40~70bpを含有するプライマー配列によりPCR増幅される。PCR産物は酵母に形質転換され、ウラシルが欠けた増殖培地上で選択される。形質転換体は、コロニーPCRまたは染色体DNAの直接配列決定のいずれかによって検証することができる。異種DHADを発現させるために使用され得る上記の材料および方法に加えて、これらの同一または類似の材料および方法を使用し、当業者に既知の修正を用いて、異種DHADを過剰発現させることができる。例えば、プラスミドに基づくシステムを用いて組換えポリヌクレオチドを過剰発現させる場合、高コピー数ベクター、または制御可能なコピー数を有するベクターが構築され得る。このような制御可能または誘導可能なシステムは、本明細書中、実施例1において記載されているが、他のシステムも当業者に知られており、他の高コピー数またはコピー数制御可能なベクターを構築するために使用することができる。あるいは、組込みに基づくシステムを用いて組換えポリペプチドを過剰発現させる場合、組込みベクターは、複数の組込み部位を標的にすることが必要である。多重組込みベースのシステムは、本明細書中、実施例2に記載されているが、他の多重組込みベースのシステムも当業者に知られており、組換えポリペプチドの多重組込み例えば、rDNA領域への組込みを標的とするために使用することができる。組換え宿主細胞は、例えば、細胞タンパク質全体のパーセントによって定量化することができる。このような過剰発現は、a細胞タンパク質全体の約0.001よりも多い量、b細胞タンパク質全体の約0.01よりも多い量、c細胞タンパク質全体の約0.1よりも多い量、d細胞タンパク質全体の約0.5よりも多い量、e細胞タンパク質全体の約1.0よりも多い量、f細胞タンパク質全体の約2.0よりも多い量、g細胞タンパク質全体の約5よりも多い量、h細胞タンパク質全体の約10よりも多い量、およびi細胞タンパク質全体の約20よりも多い量、からなる群から選択される量で定量化することができる。組換え宿主細胞において産生される異種DHADの比活性は、例えば、U/mgで定量化することができる。異種DHAD比活性は、a約0.25U/mgよりも大きい、b約0.3U/mgよりも大きい、c約0.5U/mgよりも大きい、d約1.0U/mgよりも大きい、e約1.5U/mgよりも大きい、f約2.0U/mgよりも大きい、g約3.0U/mgよりも大きい、h約4.0U/mgよりも大きい、i約5.0U/mgよりも大きい、j約6.0U/mgよりも大きい、k約7.0U/mgよりも大きい、l約8.0U/mgよりも大きい、m約9.0U/mgよりも大きい、n約10.0U/mgよりも大きい、o約20.0U/mgよりも大きい、およびp約50.0U/mgよりも大きい、からなる群から選択することができる。また異種DHAD比活性は、例えば、内因性DHAD比活性または何か他の対照DHAD比活性に対するパーセント比較として定量化することもできる。対照DHAD比活性の一例は、低コピー数プラスミドまたは他の形で誘導可能または制御可能でないプラスミドを用いて組換え宿主細胞において発現された異種DHADからのものである。このような対照はベースラインを確立し、そこから、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを用いて組換え宿主細胞において発現されるか、あるいは以下に記載されるようにFe-Sクラスター生合成またはFe取込みおよび利用に影響を与えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同時発現される、同一の異種DHADの比活性が比較される。従って、対照DHAD比活性と比較したときの異種DHADの比活性の増大は、約10よりも大きい増大、約20よりも大きい増大、約30よりも大きい増大、約40よりも大きい増大、約50よりも大きい増大、約60よりも大きい増大、約70よりも大きい増大、約80よりも大きい増大、約90よりも大きい増大、約95よりも大きい増大、約98よりも大きい増大、および約99よりも大きい増大からなる群から選択される量であり得る。また異種DHAD比活性は、対照と比較した倍増によって表現することもできる。従って、比活性の増大は、対照よりもa約2倍よりも大きい増大、b約5倍よりも大きい増大、c約8倍よりも大きい増大、またはd約10倍よりも大きい増大からなる群から選択することができる。Fe-Sクラスター形成タンパク質ならびにFe制御、利用、および恒常性上記のように、DHAD酵素は機能するためにFe-Sクラスターを必要とし、従って、これらが機能性形態で発現されるのであれば、Fe-Sクラスターを産生してそれをアポタンパク質に負荷する遺伝機構を有する宿主において発現されなければならない。本明細書中の他の部分に記載されるように、正常な酵母では、ミトコンドリアがFe-Sクラスター生合成における重要な役割を果たす。正常な酵母におけるミトコンドリアからサイトゾル内のFe-Sクラスター要求タンパク質へのFe-Sクラスター前駆体の形成および移動のフラックスは、制限されると考えられる。例えば、ある点を過ぎると、サイトゾルにおける異種DHADのタンパク質の発現のさらなる増大は、対応するDHAD活性の増大をもたらさない。理論によって束縛されることは望まないが、これは、上記の条件下で起こるFe-Sクラスターに対する要求の増大を細胞が供給できないので、異種DHADの増大量が活性のために必須のFe-Sクラスターによって負荷されていないためであると考えられる。本明細書において、酵母細胞は、2つの方法で別箇にまたは同時期に遺伝子修飾することができ、これにより、その必須のFe-Sクラスターが負荷された、サイトゾルにおいて発現される異種DHADの画分の増大をもたらし得ることが実証されている。1つの方法は、Fe-Sクラスター生合成経路遺伝子またはFe取込みおよび利用遺伝子などの、Fe-Sクラスターの形成に関与する酵母遺伝子の発現を修飾することである。他方の方法は、酵母の細胞質におけるFe-Sクラスター生合成またはFe取込みおよび利用に関与する異種遺伝子を発現させることである。Fe取込みおよび利用ならびにFe-Sクラスター生合成に関与するポリペプチドをコードする酵母遺伝子は、発現の修飾の候補である。実施形態では、修飾は、選択されたFe-Sクラスター要求タンパク質の機能の増大をもたらす。一例として、Aft1は、鉄レギュロンへの遺伝子の転写活性化因子としての役割を果たすことが分かっているKumanovics,etal.J.Biol.Chem.,2008.283,p.10276-10286、Li,H.,etal.,TheYeastIronRegulatoryProteinsGrx3/4andFra2formHeterodimericComplexesContainingA[2Fe-2S]ClusterwithCysteinylandHistidylLigation.Biochemistry,2009.4840:p.9569-9581。本明細書において例示されるように、Aft1トランスロケーションの既知のインヒビターの欠失は、タンパク質のFe-Sクラスター負荷の増大をもたらすので、結果として、Fe-Sクラスター要求タンパク質の比活性が増大される。従って、理論によって束縛されることは望まないが、Feレギュロンの特定の遺伝子の発現の変更は、直接的でも、インヒビターの欠失または上方制御によるものであっても、Fe-Sクラスター要求タンパク質の負荷および機能を同様に増大し得ると考えられる。例えば、酵母におけるFeの利用および恒常性における役割を果たすか、あるいはその一部である遺伝子Feレギュロン遺伝子などは、変更された発現の標的とされ得る。このような遺伝子は当該技術分野において知られており、これらの遺伝子の例は、表7に記載されている表7のリストは、Rutherford,J.C.,etal.,ActivationoftheIronRegulonbytheYeastAft1/Aft2TranscriptionFactorsDependsonMitochondrialbutNotCytosolicIron-SulfurProteinBiogenesis.,J.Biol.Chem.,2005.28011:p.10135-10140、Foury,F.andD.Talibi,MitochondrialControlofironhomeostasis.Agenomewideanalysisofgeneexpressioninayeastfrataxin-deficientstrain.J.Biol.Chem.,2001.27611:p.7762-7768、およびShakoury-Elizeh,M.,etal.,TranscriptionalremodelinginresponsetoirondeprivationinSaccharomycescerevisiae.Mol.Biol.Cell,2004.153:p.1233-1243から得られる。その機能と、Fe取込みおよび利用との関連とに基づいて、表7に開示される遺伝子によってコードされるタンパク質は、Fe-Sクラスター生合成に影響を与える候補である。Fe取込みおよび利用またはFe-Sクラスター生合成に関連する付加的な酵母遺伝子は、表8に記載されるものを含む。他の宿主細胞からのFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする付加的な遺伝子が同定されており、表9に記載される遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。Fe取込みおよび代謝ならびに/またはFe-Sクラスター生合成遺伝子表7、8または9に記載されるものを含むがこれらに限定されないは、潜在的に、欠失、突然変異、発現、上方制御、または下方制御されて、Fe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させ、DHADなどのFe-Sクラスター要求タンパク質の比活性を改善することができる。さらにFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させ、DHAD比活性を改善するために、補助因子を添加して、Fe-Sクラスター制御活性を有するポリペプチドの活性を変化させることができる。例えば、適切な量のFe-Sクラスターをアポ酵素に提供することによって、Fe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させる遺伝子を発現させて、DHADの活性を改善することができる。表7、8、もしくは9に記載される1つまたは複数の遺伝子などの任意の遺伝子、またはこれらの組み合わせは、実施例4に記載されるように、pRS411プラスミドにおいてクローン化および発現させることができる。得られる構築物は、次に、DHAD発現ベクターpHR81FBAilvDSmと共に野生型BY4741に形質転換させることができる。対照として、対象となる遺伝子を持たないpRS411およびベクターpHR81FBAilvDSmが野生型株に形質転換される。形質転換体は、実施例4に記載されるように両方のプラスミドを維持するためにウラシルおよびメチオニンを含まないSD培地を有する寒天板において選択される。形質転換からの種々の菌株の粗抽出物中のDHADの酵素活性を測定することができる。結果は、野生型株に形質転換された対象となる遺伝子を持たない対照pRS411およびベクターpHR81FBAilvDSmから得られる比活性と比較することができる。比活性の増大は、Fe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるために使用可能な遺伝子を示す。加えて、Fe-Sクラスターを含有する酵素またはタンパク質の改善における相加効果を提供するために、Fe-Sクラスター制御活性に関与する遺伝子の2つ以上において欠失を有する株を作成することができる。例えば、FRA2およびGXR3遺伝子の両方における欠失を有する二重突然変異体は、ベクターpHR81FBA-IlvDsmを形質転換するために使用することができ、形質転換体からの粗抽出物中のDHAD活性を測定することができる。別の選択肢は、例えば、Aft1pの核への移入に関与するタンパク質をコードするPSE1配列番号777遺伝子の発現を改変することであるFukunaka,etal,2003,J.BiologicalChem.,vol.278,pp.50120-50127。この遺伝子の発現は、上記のようなベクターpRS411内にクローン化することによって達成することができる。従って、本明細書には、Fe取込みおよび利用またはFe-Sクラスター生合成遺伝子によってコードされる任意のポリペプチドの発現の改変を含む組換え宿主細胞が提供される。上記のFe-Sクラスター生合成遺伝子のいずれか1つの少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が包含される。また、宿主細胞が上記のFe取込みおよび利用またはFe-Sクラスター生合成遺伝子のいずれか1つの内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む組換え宿主細胞も包含される。また、上記のFe取込みおよび利用またはFe-Sクラスター生合成遺伝子のいずれか1つの少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞も提供され、この宿主細胞は、上記のFe取込みおよび利用またはFe-Sクラスター生合成遺伝子のいずれか1つの内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む。またこれらの組換え宿主細胞は、少なくとも1つの異種Fe-Sクラスター要求タンパク質を含むこともできる。例えば、本明細書には、少なくとも1つの異種DHAD、およびFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供される。また、宿主細胞がFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む、少なくとも1つの異種DHADを含む組換え宿主細胞も提供される。また、少なくとも1つの異種DHADおよび、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞も提供され、この宿主細胞は、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む。本発明において使用可能な宿主細胞には、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkia、およびピキア属Pichiaを含むがこれらに限定されない酵母宿主細胞が含まれる。また細菌宿主細胞も、DHAD活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチド、およびFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を作製するために使用することができる。例えば、組換えDHAD、およびFe-Sクラスター形成タンパク質をコードする少なくとも1つの組換え遺伝子発現要素を含む乳酸菌は、2009年9月29日に出願された米国特許出願第12/569,103号明細書参照によって本明細書中に援用されるの主題である。DHAD活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドと、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドとを含む本発明の組換え宿主細胞は、2009年9月29日に出願された米国特許出願第12/569,103号明細書参照によって本明細書中に援用されるに記載されるような乳酸菌を含まない。Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、表7、8および9のFe取込みおよび利用またはFe-Sクラスター生合成経路遺伝子からなる群から選択することができる。一実施形態では、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、ARN1、ARN2、ATX1、CCC2、COT1、ENB1、FET3、FET5、FIT1、FIT2、FIT3、FRE1、FRE2、FRE3、FRE4、FRE5、FRE6、FTH1、FTR1、HMX1、SIT1、SMF3、TIS11、VHT1、AFT1、AFT2、AIM1、ARH1、ATM1、BUD32、CAD1、CCC1、CFD1、CIA1、CMK1、CTH1、CTI6、CYC8、DAP1、DRE2、ERV1、ESA1、FET4、FRA1、FRA2、GEF1、GGC1、GRX1、GRX2、GRX4、GRX5、HDA1、IBA57、ISA1、ISA2、ISU1、ISU2、JAC1、MGE1、MRS3、MRS4、MSN5、NAR1、NFS1、NFU1、NHP6a、NHP6b、PSE1、SMF1、SNF1、SNF2、SNF3、SNF4、SSQ1、TIM12、TUP1、NP_011911.1、VPS41、YAP5、YFH1、YRA1、ZPR1、iscAnif、nifU、nifS、cysE1、cysE2、iscS、iscU、iscA、hscB、hscA、Fdx、sufS、sufE、cysE3、sufS2、iscA2、Nfu、nfuA、nfuV、nfu、sufA、sufB、sufC、sufD、sufE1、sufS2、またはsufE2によってコードされる。一実施形態では、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、GRX3、またはMSN5である。一実施形態では、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、GRX3、MSN5、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、MSN5、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、GRX3、MSN5、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、プラスミドを含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、DHADは、AFT1、AFT2、PSE1、およびこれらの組み合わせと同時発現される。Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、AFT1C293F、およびこれらの組み合わせなどの構成的突然変異体であってもよいが、これらに限定されない。Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における欠失、突然変異、および/または置換は、FRA2、GRX3、MSN5、およびこれらの組み合わせからなる群から選択することができる。また本発明は、組換え宿主細胞におけるFe-Sクラスター要求タンパク質の活性を増大させるための方法も提供し、この方法は、Fe-Sクラスター要求タンパク質を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性が増大される条件下で、発現または活性が変化された組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。このような方法を使用して、内因性Fe-Sクラスター要求タンパク質、または異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性を増大させることができる。このような方法を使用して、本明細書に記載されるかあるいは本明細書に記載される方法によって同定されるDHADの比活性を増大させることができる。Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性の増大は、約10よりも多い量、約15よりも多い量、約20よりも多い量、約25よりも多い量、約30よりも多い量、約35よりも多い量、約40よりも多い量、約45よりも多い量、約50よりも多い量、約55よりも多い量、約60よりも多い量、約65よりも多い量、約70よりも多い量、約75よりも多い量、約80よりも多い量、約85よりも多い量、約90よりも多い量、および約95よりも多い量から選択される量であり得る。活性の増大は、約3倍より大きくても、約5倍より大きくても、約8倍より大きくても、または約10倍より大きくてもよい。実施形態では、Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性は、理論値の少なくとも約60、理論値の少なくとも約70、理論値の少なくとも約80、または理論値の少なくとも約90の量であり得る。また本発明を使用して、宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させること、そして宿主細胞においてFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定することができる。一実施形態では、宿主細胞においてFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるための方法が提供され、この方法は、Fe-Sクラスター要求タンパク質と、Fe-Sクラスター生合成に影響を与える少なくとも1つのポリペプチドか、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換のいずれか、またはこれらの両方の組み合わせとを含む組換え宿主細胞を提供するステップと、宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスが増大される条件下で組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。別の実施形態では、宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法が提供され、この方法は、aFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、bFe-Sクラスター要求タンパク質の活性を測定するステップと、cステップaのポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定されるFe-Sクラスター要求タンパク質の活性と、ステップaのポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定されるFe-Sクラスター要求タンパク質の活性とを比較するステップとを含み、異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性の増大は、前記Fe-Sクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。このような方法では、Fe-Sクラスター要求タンパク質は、宿主細胞にとって内因性であっても異種性であってもよい。Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性は、欠失、突然変異、置換、発現、上方制御、下方制御、細胞位置の変更、タンパク質の状態の変更、および/または補因子の付加、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない当該技術分野において周知の方法によって変化させることができる。タンパク質の状態の改変には、リン酸化またはユビキチン化などの改変が含まれるが、これらに限定されない。選択されるFe-Sクラスター要求タンパク質に応じて、本明細書に記載されるかあるいは当該技術分野において既知のあらゆる方法を使用して、Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性を測定することができる。例えば、DHADがFe-Sクラスター要求タンパク質である場合、実施例7に記載されるアッセイを使用して、DHADの活性を測定し、宿主細胞のFe-Sクラスター生合成経路のフラックスの増大が存在するかどうかを決定することができる。イソブタノールおよび他の産物組換え宿主細胞におけるDHADの発現は、本明細書に記載されるように、2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換または2,3-ジヒドロキシメチルバレレートからα-ケトメチルバレレートへの変換のためのジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する、形質転換された組換え宿主細胞を提供する。α-ケトイソバレレートまたはα-ケトメチルバレレートを経路中間体として有する産物は、本明細書において開示される所望の異種DHADを有する宿主細胞において、より効果的に産生され得る。このような産物のリストには、バリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、およびイソブタノールが含まれるが、これらに限定されない。例えば、酵母におけるバリンの生合成は、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼILV5によるアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシ-イソバレレートへの変換ステップと、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼによる2,3-ジヒドロキシ-イソバレレートからα-ケトイソバレレート2-ケトイソバレレートとも呼ばれるへの変換ステップと、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼBAT2および分枝鎖アニモanimo酸アミノトランスフェラーゼBAT1によるα-ケトイソバレレートからバリンへの変換ステップとを含む。ロイシンの生合成は、α-ケトイソバレレートまでの同じステップと、その後の、アルファ-イソプロピルリンゴ酸シンターゼLEU9、LEU4によるα-ケトイソバレレートからアルファ-イソプロピルマレートへの変換ステップと、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼLEU1によるアルファ-イソプロピルマレートからベータ-イソプロピルマレートへの換ステップと、ベータ-IPMデヒドロゲナーゼLEU2によるベータ-イソプロピルマレートからアルファ-ケトイソカプロエートへの変換ステップと、最後に、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼBAT2および分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼBAT1によるアルファ-ケトイソカプロエートからロイシンへの変換ステップとを含む。細菌経路も同様であるが、異なる名称のタンパク質および遺伝子を含む。2,3-ジヒドロキシ-イソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換の増大は、特に、経路の1つまたは複数の付加的な酵素が過剰発現される場合に、これらの経路への流入を増大させるであろう。従って、バリンまたはロイシンの産生は、本明細書に開示される菌株を使用することが所望される。パントテン酸の生合成は、DHADによって実施されるステップと、ケトパントイン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼおよびパントテン酸シンターゼによって実施されるステップとを含む。微生物におけるパントテン酸生合成の産生の増強のためのこれらの酵素の発現の操作は、米国特許第6,177,264号明細書に記載されている。DHADのα-ケトイソバレレート産物は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第20070092957A1号明細書に開示されるイソブタノール生合成経路における中間体である。開示されるイソブタノール生合成経路の図は、図5に提供される。本明細書に開示される菌株におけるイソブタノールの産生は、DHAD活性の増大から利益を得ることができる。本明細書に開示されるように、DHAD活性の増大は、宿主細胞におけるDHADの発現によって、例えば、DHADの過剰発現によって、Fe-Sクラスター制御活性を有するポリペプチドの発現または活性の調節によって、あるいはDHADの発現およびFe-Sクラスター制御活性を有するポリペプチドの発現または活性の調節の両方の組み合わせによって提供される。参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第20070092957A1号明細書に記載されるように、例となるイソブタノール生合成経路のステップは、-例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒されるような、ピルベートからアセトラクテートへの変換図5の経路ステップaを参照と、-例えば、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒されるような、アセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレートへの変換図5の経路ステップbを参照と、-例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼDHADとも呼ばれるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されるような、2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換図5の経路ステップcを参照と、-例えば、分枝鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されるような、α-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換図5の経路ステップdを参照と、-例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されるような、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換図5の経路ステップeを参照とを含む。代替の経路のステップf、g、h、I、j、およびkについては、産物変換の基質、およびこれらの反応に関与する酵素は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第20070092957A1号明細書に記載される。本明細書に開示されるDHAD以外の上記で指名された経路ステップ酵素の発現、および付加的なイソブタノール経路の発現のために使用可能な遺伝子は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第20070092957A1号明細書に記載される。使用可能な付加的な遺伝子は、バイオインフォマティクスを通して、あるいは参照によって本明細書中に援用される2009年9月29日に出願された米国特許出願第12/569,636号明細書に記載される種々の方法などの当該技術分野において周知の方法を用いて、相同体を単離することによって、当業者により同定され得る。適切なケトール酸レダクトイソメラーゼKARI酵素は、米国特許出願公開第20080261230A1号明細書、米国特許出願公開第20090163376号明細書、米国特許出願公開第20100197519号明細書、および米国特許出願第12/893077号明細書全て、参照によって本明細書中に援用されるに開示されている。これらにおいて開示されるKARIの例としては、ビブリオコレラエVibriocholerae、シュードモナスエルギノーサPseudomonasaeruginosaPAO1、およびシュードモナスフルオレッセンスPseudomonasfluorescensPF5からのものが挙げられる。参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第2009/0269823号明細書および米国仮特許出願第61/290,636号明細書には、適切なアルコールデヒドロゲナーゼが記載されている。さらに、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第20070092957A1号明細書には、開示される生合成経路を用いるイソブタノール産生のために、キメラ遺伝子の構築、ならびに細菌および酵母の遺伝子操作が記載されている。付加的な修飾本明細書において提供される細胞において有用であり得る付加的な修飾の例としては、米国特許出願公開第20090305363号明細書参照によって本明細書中に援用されるに記載されるような、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減するための修飾、および/またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子における破壊、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する制御要素をコードする少なくとも1つの遺伝子における破壊と、米国特許出願公開第20100120105号明細書参照によって本明細書中に援用されるに記載されるような、Entner-Doudoroff経路による炭素フラックスの増大または還元当量バランスreducingequivalentsbalanceを提供する宿主細胞への修飾とが挙げられる。その他の修飾としては、米国仮特許出願第61/380563号明細書参照によって本明細書中に援用されるに記載されるピルベート利用生合成経路におけるステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの組込みが挙げられる。適切であり得る付加的な修飾は、米国特許出願第12/893089号明細書に記載される。さらに、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、およびホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、米国仮特許出願第61/356379号明細書に記載されている。産生のための増殖本明細書に開示される組換え宿主細胞は、適切な炭素基質を含有する発酵培地中で増殖される。適切な炭素基質は、グルコースやフルクトースなどの単糖、ラクトース、マルトース、ガラクトース、もしくはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースなどの多糖類、またはこれらの混合物と、チーズ乳清透過物、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、および大麦モルトなどの再生可能な原料からの未精製混合物とを含むことができるが、これらに限定されない。その他の炭素基質としては、エタノール、ラクテート、スクシネート、またはグリセロールが挙げられる。さらに、炭素基質は、重要な生化学的中間体への代謝的変換が実証されている二酸化炭素、またはメタノールなどの一炭素基質であってもよい。エタノールなどの二炭素基質も適切であり得る。一および二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、代謝活性のためにメチルアミン、グルコサミンおよび様々なアミノ酸などの多数の他の炭素含有化合物も利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母はメチルアミンからの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られているBellionetal.,Microb.GrowthC1Compd.,[Int.Symp.],7th1993,415-32,Editors:Murrell,J.Collin;Kelly,DonP.Publisher:Intercept,Andover,UK。同様に、様々なカンジダ種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝するであろうSulteretal.,Arch.Microbiol.153:485-4891990。従って、本発明において利用される炭素源は様々な種類の炭素含有基質を包含することができ、生物の選択によってのみ制限され得ることが意図される。上記の炭素基質およびその混合物は全て本発明において適切であることが意図されるが、いくつかの実施形態では、炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロースであるか、あるいはC5糖を使用するように修飾された酵母細胞についてはこれらとキシロースおよび/またはアラビノースなどのC5糖との混合物である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、およびこれらの混合物などの再生可能な糖源に由来し得る。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびこれらの混合物などの穀類を含むデンプンベースの原料の糖化による再生可能な穀類源に由来し得る。さらに、発酵性の糖は、例えば、参照によって本明細書中に援用される共同所有および同時係属中の米国特許出願公開第20070031918A1号明細書に記載されるような前処理および糖化プロセスにより再生可能なセルロースまたはリグノセルロース系バイオマスに由来し得る。バイオマスは任意のセルロースまたはリグノセルロース系材料を指し、セルロースと、場合によりさらに、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および/または単糖とを含む材料が含まれる。またバイオマスは、タンパク質および/または脂質などの付加的な成分も含み得る。バイオマスは単一のソースに由来してもよいし、あるいはバイオマスは2つ以上のソースに由来する混合物を含むこともでき、例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびトウモロコシ茎葉の混合物、または草および葉の混合物を含むことができる。バイオマスには、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業からのスラッジ、庭の廃棄物、木材および林業廃棄物が含まれるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、作物残渣、例えばトウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦わら、大麦、大麦わら、干し草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、大豆、穀粒の製粉から得られる成分、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花、動物性肥料、並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。適切な炭素源に加えて、増殖培地には、適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、ならびに培養物の増殖と、Fe-Sクラスター要求タンパク質例えば、DHADなどを含む酵素経路の促進とに適した当業者に既知の他の成分が含有されなければならない。培養条件通常、細胞は、適切な培地中、約20°C~約40°Cの範囲の温度で増殖される。本発明における適切な増殖培地は、LuriaBertaniLBブロス、SabouraudDextroseSDブロス、YeastMediumYMブロス、または酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム、およびデキストロース炭素/エネルギー源としてを含むブロス、またはYPD培地ほとんどのサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株を増殖させるために最適な割合のペプトン、酵母抽出物、およびデキストロースのブレンドなどの一般的な市販の培地である。その他の定義された増殖培地または合成増殖培地も使用することができ、特定の微生物の増殖のための適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者には分かるであろう。異化産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている薬剤、例えば環状アデノシン2’:3’-一リン酸塩の使用も増殖培地中に組み込むことができる。増殖のために適切なpH範囲は、約pH5.0~約pH9.0の間である。一実施形態では、約pH6.0~約pH8.0が初期条件として使用される。酵母の発酵のために適切なpH範囲は、通常、約pH3.0~約9.0の間である。一実施形態では、約pH5.0~約pH8.0が初期条件として使用される。他の微生物の発酵のために適切なpH範囲は、約pH3.0~約pH7.5の間である。一実施形態では、約pH4.5~約pH6.5が初期条件として使用される。増殖は、好気条件または嫌気条件下で実施することができる。一実施形態では、増殖のために嫌気条件または微好気条件が使用される。工業的バッチおよび連続発酵イソブタノールまたは他の産物は、バッチ発酵方法を用いて産生することができる。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、培地の組成は発酵の最初に設定され、発酵は人為的な変更を受けない。標準的なバッチ系の変化形は、流加系である。流加発酵プロセスも本発明において適切であり、発酵が進行するにつれて基質が徐々に添加される点以外は典型的なバッチ系を含む。流加系は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合、および培地中の基質の量が制限されることが望ましい場合に有用である。バッチ発酵および流加発酵は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、その例は、ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,SecondEdition1989SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA.,orDeshpande,MukundV.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,1992参照によって本明細書中に援用されるにおいて見出すことができる。イソブタノールまたは他の産物は、連続発酵法を用いて産生することもできる。連続発酵は開放系であり、定義された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、処理のために同時に等量の条件培地が除去される。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数増殖期にあるときに、培養物を一定の高い密度に維持する。連続発酵は、細胞増殖または最終産物濃度に影響を与える1つの因子または任意の数の因子の調節を可能にする。連続発酵プロセスのための栄養物および成長因子の調節方法、ならびに産物形成速度を最大にするための技術は工業微生物学の分野でよく知られており、様々な方法が上記のBrockによって詳述されている。イソブタノールまたは他の産物の産生はバッチ、流加または連続プロセスを用いて実施可能であり、任意の既知の発酵モードが適切であり得ることが意図される。さらに、細胞は全細胞触媒として基質上に固定化可能であり、イソブタノール産生のための発酵条件にさらされることが意図される。発酵培地からのイソブタノールの単離方法バイオ産生されたイソブタノールは、ABE発酵のための当該技術分野において既知の方法を用いて、発酵培地から単離することができる例えば、Durre,Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639-6481998,Grootetal.,Process.Biochem.27:61-751992、およびその中の参考文献を参照。例えば、固体は、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどによって発酵培地から除去され得る。次に、イソブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、またはパーベーパレイションなどの方法を用いて発酵培地から単離され得る。イソブタノールは水と低沸点の共沸混合物を形成するので、蒸留を用いて、混合物をその共沸組成まで分離することができる。蒸留は、共沸混合物付近の分離を得るために、別の分離方法と組み合わせて使用することができる。ブタノールを単離および精製するために蒸留と組み合わせて使用することができる方法には、デカンテーション、液液抽出、吸着、および膜ベースの技術が含まれるがこれらに限定されない。さらに、ブタノールは、共沸剤を用いた共沸蒸留を用いて単離され得る例えば、DohertyandMalone,ConceptualDesignofDistillationSystems,McGrawHill,NewYork,2001を参照。ブタノール-水混合物は不均一な共沸混合物を形成するので、イソブタノールを単離および精製するために、蒸留は、デカンテーションと組み合わせて使用され得る。この方法では、イソブタノール含有発酵ブロスは、共沸組成近くまで蒸留される。次に、共沸混合物は濃縮され、デカンテーションによって発酵培地からイソブタノールが分離される。デカントされた水相は、還流として第1の蒸留塔に戻すことができる。デカントされたイソブタノールが豊富な有機相は、第2の蒸留塔において、蒸留によりさらに精製され得る。またイソブタノールは、蒸留と組み合わせて液液抽出を用いて発酵培地から単離することもできる。この方法では、イソブタノールは、適切な溶媒による液液抽出を用いて発酵ブロスから抽出される。次に、イソブタノール含有有機相は、ブタノールを溶媒から分離するために蒸留される。蒸留を吸着と組み合わせて使用して、発酵培地からイソブタノールを単離することもできる。この方法では、イソブタノールを含有する発酵ブロスは共沸組成近くまで蒸留され、次に、モレキュラーシーブなどの吸着剤の使用により残存する水が除去されるAdenetal.LignocellulosicBiomasstoEthanolProcessDesignandEconomicsUtilizingCo-CurrentDiluteAcidPrehydrolysisandEnzymaticHydrolysisforCornStover,ReportNREL/TP-510-32438,NationalRenewableEnergyLaboratory,June2002。さらに、蒸留をパーベーパレイションと組み合わせて使用して、発酵培地からイソブタノールを単離および精製することもできる。この方法では、イソブタノールを含有する発酵ブロスは共沸組成近くまで蒸留され、次に、親水性膜を通るパーベーパレイションによって残存する水が除去されるGuoetal.,J.Membr.Sci.245,199-2102004。本発明の実施形態実施形態1E1.ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。E2.ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチは、組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれている。E3.ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞は、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む。E4.ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドと、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞。E5.実施形態E3~E4のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、表8および表9中の遺伝子からなる群から選択される。E6.実施形態E3~E4のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、表7の遺伝子からなる群から選択される。E7.実施形態E5またはE6の組換え宿主細胞であって、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、GRX3、MSN5、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。E8.実施形態E7の組換え宿主細胞であって、前記ポリペプチドは、構成的突然変異体であるポリヌクレオチドによってコードされる。E9.実施形態E8の組換え宿主細胞であって、前記構成的突然変異体は、AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、AFT1C293F、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。E10.実施形態E7の組換え宿主細胞であって、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含むポリヌクレオチドによってコードされる。E11.実施形態E7の組換え宿主細胞であって、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされる。E12.実施形態E3の組換え宿主細胞であって、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換は、FRA2、GRX3、MSN5、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。E13.実施形態E4の組換え宿主細胞であって、Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、AFT1、AFT2、PSE1、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。E14.実施形態E3~E13のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、多数コピーで発現される。E15.実施形態E14の組換え宿主細胞であって、前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。E16.実施形態E14の組換え宿主細胞であって、前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれている。E17.実施形態E3~E16のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記Fe-Sクラスター生合成は、内因性Fe-Sクラスター生合成を有する組換え宿主細胞と比較して増大される。E18.実施形態E1~E17のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞は、酵母宿主細胞である。E19.実施形態E18の組換え宿主細胞であって、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkiaおよびピキア属Pichiaからなる群から選択される。E20.実施形態E1~E19のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される。E21.実施形態E1~E20のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、10-5よりも小さいE値で表12のプロファイルHMMと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号168に相当するストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDHAD酵素のアミノ酸配列における位置56、129、および201に相当する3つの保存システイン全てを含む。E22.実施形態E1~E21のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、配列番号168または配列番号232に対して少なくとも約90の同一性を有するアミノ酸配列を有する。E23.実施形態E1~E22のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは:a.ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約5倍よりも大きい比活性、b.ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約8倍よりも大きい比活性、およびc.ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に関して約10倍よりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する。E24.実施形態E1~E22のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは:a.約0.25U/mgよりも大きい比活性、b.約0.3U/mgよりも大きい比活性、c.約0.5U/mgよりも大きい比活性、d.約1.0U/mgよりも大きい比活性、e.約1.5U/mgよりも大きい比活性、f.約2.0U/mgよりも大きい比活性、g.約3.0U/mgよりも大きい比活性、h.約4.0U/mgよりも大きい比活性、i.約5.0U/mgよりも大きい比活性、j.約6.0U/mgよりも大きい比活性、k.約7.0U/mgよりも大きい比活性、l.約8.0U/mgよりも大きい比活性、m.約9.0U/mgよりも大きい比活性、n.約10.0U/mgよりも大きい比活性、o.約20.0U/mgよりも大きい比活性、およびp.約50.0U/mgよりも大きい比活性からなる群から選択される比活性を有する。E25.実施形態E1~E24のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、イソブタノールを産生する。E26.実施形態E25の組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、イソブタノール生合成経路を含む。E27.産物を製造する方法であって、a.実施形態E1~E24のいずれか1つの組換え宿主細胞を提供するステップと、b.前記産物が産生される条件下、発酵培地中でaの組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップとを含み、この産物は、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせらなる群から選択される。E28.イソブタノールを製造する方法であって、a.実施形態E1~E24のいずれか1つの組換え宿主細胞を提供するステップと、b.イソブタノールが産生される条件下、発酵培地中でaの組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップとを含む。E29.2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換方法であって、a.実施形態E1~E24のいずれか1つの組換え宿主を提供するステップと、b.2,3-ジヒドロキシイソバレレートがα-ケトイソバレレートに変換される条件下でaの組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含み、2,3-ジヒドロキシイソバレレートはα-ケトイソバレレートに変換される。E30.組換え宿主細胞においてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドの比活性を増大させるための方法であって、a.実施形態E1~E24のいずれか1つの組換え宿主細胞を提供するステップと、b.ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドを持たない同一の宿主細胞よりも大きい比活性を有する機能性形態で発現される条件下でaの組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。E31.宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるための方法であって、a.実施形態E3~E24のいずれか1つの組換え宿主細胞を提供するステップと、b.宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスが増大される条件下でaの組換え宿主細胞を増殖させるステップとを含む。E32.組換え宿主細胞におけるFe-Sクラスター要求タンパク質の活性を増大させる方法であって、a.Fe-Sクラスター要求タンパク質を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、b.前記宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、c.Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性が増大される条件下でbの組換え宿主細胞を増殖させるステップと、を含む。E33.実施形態E32の方法であって、前記活性の増大は:a.約10よりも多い量、b.約20よりも多い量、c.約30よりも多い量、d.約40よりも多い量、e.約50よりも多い量、f.約60よりも多い量、g.約70よりも多い量、h.約80よりも多い量、i.約90よりも多い量、およびj.約95よりも多い量からなる群から選択される量である。E34.実施形態E32の方法であって、前記活性の増大は:a.約5倍よりも多い量、b.約8倍よりも多い量、c.約10倍よりも多い量、からなる群から選択される量である。E35.宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、a.Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、b.異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性を測定するステップと、c.ステップaのポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定される異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性と、ステップaのポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定される異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性とを比較するステップとを含み、異種Fe-Sクラスター要求タンパク質の活性の増大は、前記Fe-Sクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。E36.宿主細胞におけるFe-Sクラスター生合成経路のフラックスを増大させるポリペプチドを同定するための方法であって、a.Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性を変化させるステップと、b.ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性を測定するステップと、c.ステップaのポリペプチドの発現または活性の変化が存在する場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性と、ステップaのポリペプチドの発現または活性の変化が存在しない場合に測定されるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性とを比較するステップとを含み、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの活性の増大は、前記Fe-Sクラスター生合成経路のフラックスの増大を示す。E37.実施形態E30~E36のいずれか1つの方法であって、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドの発現または活性の変化は、欠失、突然変異、置換、発現、上方制御、下方制御、細胞位置の変更、タンパク質の状態の変更、および/または補因子の付加を含む。E38.実施形態E32~E37のいずれか1つの方法であって、Fe-Sクラスター要求タンパク質はジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有し、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するFe-Sクラスター要求タンパク質は、10-5よりも小さいE値で表12のプロファイルHMMと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号168に相当するストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDHAD酵素のアミノ酸配列における位置56、129、および201に相当する3つの保存システイン全てを含む。E39.実施形態E32~E38のいずれか1つの方法であって、前記Fe-Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、表7、8および9の遺伝子からなる群から選択される。E40.実施形態E35~E37のいずれか1つの方法によって同定されたポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。E41.実施形態E40の組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞はさらに、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを含む。E42.実施形態E41の組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、多数コピーで発現される。E43.実施形態E41の組換え宿主細胞であって、前記異種ポリヌクレオチドは、高コピー数プラスミドまたは制御可能なコピー数を有するプラスミドを含む。E44.実施形態E41の組換え宿主細胞であって、前記異種ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞DNA中に少なくとも1回組み込まれている。E45.実施形態E35またはE36の方法であって、前記宿主細胞は、酵母宿主細胞である。E46.実施形態E45の方法であって、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkia、およびピキア属Pichiaからなる群から選択される。E47.実施形態E28~E39のいずれか1つの方法であって、前記宿主細胞は、酵母宿主細胞である。E48.実施形態E47の方法であって、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkia、およびピキア属Pichiaからなる群から選択される。E49.実施形態E40~E44のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、酵母宿主細胞である。E50.実施形態E49の組換え宿主細胞であって、前記酵母宿主細胞は、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、イサタケンキア属Issatchenkia、およびピキア属Pichiaからなる群から選択される。E51.実施形態E40~E44またはE49~E50のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、宿主細胞のサイトゾルにおいて発現される。E52.実施形態E40~E44またはE49~E50のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する異種ポリペプチドは、10-5よりも小さいE値で表12のプロファイルHMMと一致するアミノ酸配列を有し、ここでポリペプチドはさらに、配列番号168に相当するストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansDHAD酵素のアミノ酸配列における位置56、129、および201に相当する3つの保存システイン全てを含む。E53.実施形態E40~E44またはE49~E50のいずれか1つの組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、分枝鎖アミノ酸、パントテン酸、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、イソブタノール、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される産物を産生する。E54.実施形態E53の組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、イソブタノールを産生する。E55.実施形態E54の組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞は、イソブタノール生合成経路を含む。略語の意味は次の通りである:minは分を意味し、hは時間を意味し、secは秒を意味し、μlはマイクロリットルを意味し、mlはミリリットルを意味し、Lはリットルを意味し、nmはナノメートルを意味し、mmはミリメートルを意味し、cmはセンチメートルを意味し、μmはマイクロメートルを意味し、mMはミリモル濃度を意味し、Mはモル濃度を意味し、mmolはミリモルを意味し、μmoleはマイクロモルを意味し、gはグラムを意味し、μgはマイクログラムを意味し、mgミリグラムを意味し、rpmは1分当たりの回転数を意味し、w/vは重量/体積を意味し、ODは光学濃度を意味し、そしてOD600は600nmの波長で測定された光学濃度を意味する。一般的な方法実施例において使用される標準組換えDNAおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989によって、T.J.Silhavy,M.L.Bennan,andL.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1984によって、そして,Ausubel,F.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,N.Y.,1987によって記載されている。細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法も当該技術分野において周知である。以下の実施例において使用するために適切な技術は、ManualofMethodsforGeneralBacteriology,PhillippGerhardt,R.G.E.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester,WillisA.Wood,NoelR.KriegandG.BriggsPhillips,eds.,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.,1994において、あるいは、ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,SecondEdition,SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA,1989によって見出すことができる。細菌細胞の増殖および維持のために使用される試薬、制限酵素および材料は全て、他に指定されない限り、AldrichChemicalsMilwaukee,WI、BDDiagnosticSystemsSparks,MD、LifeTechnologiesRockville,MD、またはSigmaChemicalCompanySt.Louis,MOから入手した。実施例1.酵母サイトゾルにおいてプラスミドに基づく系を用いたS.ミュータンスS.mutansからのilvD遺伝子によりコードされるDHADタンパク質の過剰発現組換えポリヌクレオチドの過剰発現は、組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドのコピー数を増大させることによって達成することができる。酵母においてDHADタンパク質を過剰発現させるために、誘導性ベクターを構築した。pHR81ベクターは、Ura3マーカーと、欠損プロモーターを有するLEUマーカーとを含有する参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第2007/0092957号明細書を参照。酵母合成ドロップアウトsyntheticdropoutSD、完全最小培地completeminimalmediaとしても知られている、Teknova増殖培地がSDマイナスウラシルからSDマイナスロイシンに切り替えられると、pHR81プラスミドのコピー数が増大し、はるかにより高いレベルの組換えポリヌクレオチドの発現が得られる。pHR81ベクター骨格はpLH472JEG4y配列番号921に由来し、pLH472JEG4yベクターをSpeIおよびSacIIによりを消化することによって作製した。DHADタンパク質の過剰発現のために、S.ミュータンスS.mutansからのDHAD遺伝子ilvD配列番号167を使用した参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第2009-0305363A1号明細書を参照。この遺伝子は、ベクターpRS423FBAilvDStrep-lumio中にFBAプロモーターの調節下でクローン化されている参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第2009-0305363A1号明細書を参照。FBAプロモーター、ilvD遺伝子、およびFBAターミネーターカセットを含有する領域を、FBAp-FNheIおよびFBAt-RSacII配列番号915および916プライマーセットにより増幅して、pHR81ベクターにクローン化した。得られた発現ベクターをpHR81FBA-IlvDSmと命名した配列番号917、図1A。S.ミュータンスS.mutansDHADタンパク質を過剰発現させるために、発現ベクターpHR81FBA-IlvDSmを野生型酵母株BY4741に形質転換した。SDマイナスウラシルを有する寒天板において形質転換体を選択した。過剰発現のために、最初にSD液体培地マイナスウラシル中、30°Cでプラスミドを含有する酵母株を増殖させた。次に、新鮮な一晩培養物5mlを、75mlのSD培地マイナスロイシンを含有する125mlのフラスコに移した。対照として、別の5mlの新鮮な一晩培養物を、75mlのSDマイナスウラシルを含有するフラスコに移した。遠心分離によって回収する前に、培養物を一晩インキュベートした。実施例7に記載されるアッセイを用いて、これらのサンプル中の粗抽出物中のDHAD活性を測定した。SDマイナスウラシル中で増殖された対照サンプルの粗抽出物中で得られたDHAD比活性は、0.2~0.3Umg-1の範囲であった。しかしながら、SD培地マイナスロイシン中で増殖された菌株から得られた平均比活性は1.6Umg-1であり、対照サンプルからの活性よりもはるかに高かった約5~8倍高い。DHADはその機能のためにFe-Sクラスターを必要とし、天然酵母Fe-Sクラスター生合成経路が酵母サイトゾル中で過剰発現されたFe-Sクラスター要求タンパク質を受け入れられるかどうかはこれまでわかっていなかった。非誘導性の低コピー数ベクターを用いるこれまでのスクリーニング実験では、S.ミュータンスS.mutansからのDHADは酵母サイトゾル中で組換え発現可能であり、粗抽出物中、比活性は0.1~0.2Umg-1の範囲であった参照によって本明細書中に援用される2009年9月29日に出願された米国特許出願第12/569,636号明細書を参照。従って、一実施形態では、高コピー数ベクターを用いて酵母においてDHADなどのFe-Sクラスター要求タンパク質を過剰発現させると比活性の増大が提供され、比活性は、少なくとも約5倍~少なくとも約8倍増大される。実施例2.染色体組込みによるS.ミュータンスS.mutansからのilvD遺伝子によってコードされるDHADタンパク質の過剰発現酵母における遺伝子の発現を増大させるための代替の方法は、対象となる遺伝子の多数コピーを宿主細胞の染色体に組み込むことである。S.ミュータンスS.mutansからのilvD遺伝子配列番号167を酵母染色体に組み込むために、組込みベクターpZK-Deltas-Leu2-FBA-ilvDSm-FBAt配列番号918、図1Bを構築した。組込みベクター骨格は、pSuperscriptStratagene,LaJolla,CAに由来した。ilvD遺伝子が酵母デルタ配列補体ストランドのヌクレオチド118~267および5061~5760に隣接され得るように、S.ミュータンスS.mutansilvD遺伝子補体ストランドのヌクレオチド1306~3018を、FBAプロモーター補体ストランドのヌクレオチド3026~4023の調節下で組込みベクターにクローン化した。S.セレビシエS.cerevisiaeは、200を超える酵母デルタ配列を含有するKimJmetal.GenomeRes.1998;8:464-478。これらのデルタ配列は、多数の組込みの標的である。また組込みベクターを、多数の組込み事象を有する形質転換株の選択のために欠損LEU2マーカー補体ストランドのヌクレオチド4100~5191を含有するように操作した。組込みのために、AscIおよびAatII消化によりベクターDNAを直線化して、ilvD遺伝子を含むベクターDNAのデルタ配列隣接ストランドを生成し、これを次に、酵母株BY4741に形質転換した。SD寒天培地マイナスロイシンにおいて形質転換体を選択した。次に、SD液体培地マイナスロイシンにおいて30°Cで、これらの形質転換体を増殖させ、培養物を回収し、DHAD活性について分析した。粗抽出物中で得られたDHADの比活性は、0.7~1.2Umg-1の範囲であった。この比活性は、過剰発現のないilvD遺伝子含有プラスミドで形質転換されたBY4741株において見出される非活性よりも約3~6倍高かった。実施例3.酵母欠失株におけるDHADの比活性の改善実施例1および2に記載される過剰発現株は高レベルの活性を有したが、発現されるDHADタンパク質のすべてが活性とは限らなかった。例えば、過剰発現DHADタンパク質は細胞タンパク質全体の約5~10を占め、約0.7~1.6Umg-1の非活性をもたらした。S.ミュータンスS.mutansからの精製DHAD酵素の比活性が100Umg-1であるとすると、細胞タンパク質全体の10でのDHADの発現は、5~10Umg-1以上の比活性をもたらすことが期待される。1つの理論によって束縛されることを望まないが、期待される比活性と実測される比活性との間の差は、おそらく、不十分なFe-Sクラスター負荷の結果であった。従って、過剰発現株のさらなる操作によりFe-Sクラスター負荷を増大させることを用いて、DHADの比活性を増大させることができる。比活性を改善するために、鉄代謝およびFe-Sクラスター感知に関与する遺伝子の欠失を有する酵母株を用いて、DHAD比活性に対するこれらの効果を調べた。これらの菌株BY4741バックグラウンドはOpenBiosystemHuntsville,ALから購入したものであり、表10に記載される。実施例1に記載されるように、高コピー数プラスミドpHR81FBA-IlvDSmをこれらの菌株に形質転換し、増殖培地をSDマイナスロイシンに変えることによってDHAD過剰発現を誘導した。培養物からの粗抽出物を調製し、DHAD活性についてアッセイした。結果は表10に示される。驚くことに、FRA2またはGRX3遺伝子のいずれかの欠失を有する株における粗抽出物中のDHAD比活性は2~3倍増大した。試験した欠失の多くはDHAD比活性を増大させなかったので、これは予想外であった。酵母におけるサイトゾルの鉄硫黄構築CIA機構は、イソプロピルマレートイソメラーゼLeu1などのサイトゾルタンパク質のためのFe-Sクラスターの構築に関与することが示された。これまでの結果から、このCIA機構は、Aft1およびGrx3/Grx4-Fra2ヘテロダイマーをリプレッサーとして含む鉄の感知システムから独立していることが示されているRutherfordetal,JBiolChem.280:10135-101402005。別の予想外の知見は、DHAD活性に対するGrx3欠失の効果である。Grx3およびGrx4は機能が同等であることが示された。GRX3およびGRX4遺伝子の両方における二重突然変異は、Feレギュロンの激しい活性化をもたらしたが、Grx4単独の突然変異は最小の表現型を与えるPujol-Carrion,etal,JCellSci.119:4554-45642006、Ojeda,etal,JBiolChem.281:17661-176692006。上記の表10に示されるように、GRX3欠失は単独でDHAD比活性の著しい改善をもたらす。従って、これらの結果により、鉄の代謝に関与する遺伝子の調節は、酵母サイトゾルにおいて発現される場合にDHADなどのFe-Sクラスター要求タンパク質の活性を増大させることができと実証される。図10において概説されるように、DHAD比活性に対するFRA2およびGRX3遺伝子の欠失の効果は、例えば、全般的制御因子Aft1pによって鉄レギュロン中の遺伝子の1つまたは複数の転写を活性化することから生じ得る。どれか1つの理論によって束縛されることは望まないが、このような遺伝子の活性化は、鉄の取込みの増大および細胞質のFe-Sクラスター生合成の増大をもたらすことができ、タンパク質のより高いFe-Sクラスター負荷につながる図10。Fe-Sクラスター負荷の増大の実証は実施例11に記載される。実施例4.DHAD比活性に対するAft1pおよびその突然変異体の発現の効果実施例3に記載され、図10において概説されるように、Fra2、Grx3、およびGrx4は、Aft1pの機能を制御するリプレッサーであるKumanovics,etal.,J.Biol.Chem.283:10276-102862008。Aft1pは、鉄の全般的な制御因子である。鉄の取込みおよび代謝に関与する遺伝子の活性化は、Aft1pの核局在化を必要とする。Aft1の構成的突然変異体の発現または野生型Aft1pの発現の増大は、野生型株またはAFT1欠失株におけるFeレギュロンの活性化を導き得るYamaguchi-Iwai,etal,EMBOJ.14:1231-12391995、Yamaguchi-Iwai,etal,J.Biol.Chem.277:18914-189182002、Kaplan,etal,Chem.Rev.109:4536-45522009。実施例3に記載される新規の知見に基づいて、Aft1pタンパク質およびその構成的突然変異体の発現は、その活性のためにFe-Sクラスターを必要とするDHAD酵素の活性画分を改善することが可能である。この可能性を検討するために、野生型AFT1遺伝子およびその構成的突然変異体を、セントロメアベクターpRS411を用いてクローン化したATCC登録商標番号:87538、配列番号919。このベクターは、大腸菌E.coliにおける増殖のためのアンピシリン選択マーカーと、酵母における選択のためのメチオニン栄養マーカーとを有する。その独自のプロモーターおよびターミネーターを含む野生型AFT1遺伝子はKpnI部位とSacI部位との間にクローン化することができ、その結果、構築物pRS411-Aft1フランキングが得られる配列番号920、図2。同様の戦略を用いて、Aft1の構成的突然変異体をコードする遺伝子をクローン化することができる。アミノ酸L99~AおよびC291~F配列番号703に関するにおける置換を有するAft1の構成的突然変異体を最初に検討した。野生型AFT1遺伝子または構成的突然変異体をコードする遺伝子を有するpRS411構築物を、発現ベクターpHR81FBAIlvDSmと共に、野生型酵母株BY4741またはAFT1、GRX3、もしくはFRA2の欠失を有する酵母株に形質転換した。SD培地マイナスメチオニンおよびウラシルを有する寒天板において、形質転換体を選択した。形質転換株をSD培地マイナスメチオニンおよびロイシン中で増殖して、これらの遺伝子または突然変異体の存在下でDHADタンパク質を過剰発現させた。これらの培養物の粗抽出物中のDHAD活性を測定した。野生型Aft1p、Aft1pC291F、およびAft1pL99Aの発現の結果は、表11に示される。Aft1pC291Fでは、野生型Aft1pと比較して、DHAD比活性の中程度の増大が観察された。Aft1pL99Aでは、はるかにより高いDHAD活性の増大が観察された。Aft1pL99Aを発現する酵母におけるDHADの比活性は、GRX3欠失株において得られる比活性と類似していた表10を参照。実施例5.CCC1欠失株におけるサイトゾルDHAD比活性の増大サイトゾルDHADタンパク質のためのFe-Sクラスター生合成能力を増大させる正確なメカニズムは不明である。FRA2およびGRX3欠失株実施例3ならびにAft1p突然変異体の発現実施例4による知見に基づいて、サイトゾル中のFe含量の利用能を増大させると、DHAD比活性も改善され得る。CCC1欠失は、サイトゾルのFe含量を増大させることが示されているLiL,etal,JBiolChem.276:29515-295192001。この仮説を試験するために、BY4741のCCC1欠失株を実施例1に記載されるようなプラスミドpHR81FBA-IlvDSmで形質転換した。プラスミドを有する細胞の粗抽出物をDHAD活性についてアッセイした。表13は実験の結果を示す。DHADプラスミドを有するCCC1欠失株がウラシルを欠いたSD培地中で増殖される場合、DHAD比活性の増大は、同じプラスミドを有する野生型細胞と比較して見出された。追加のFeを添加すると、CCC1欠失株においてDHADのさらなる増大が観察された。Feの添加は、野生型細胞のDHAD比活性に対する効果は示さなかった。DHADタンパク質の過剰発現を達成するために、ロイシンを欠いたSD培地中で菌株を増殖させた実施例1。これらの条件下では、DHAD比活性の増大が検出された。実施例6.酵母において発現されるL.ラクティスL.lactisからのDHADの比活性の改善実施例1~5では、S.ミュータンスS.mutansからのDHAD酵素を使用して、酵母において発現される場合にDHADの比活性を増大させるための新規の方法を特定した。この実施例では、L.ラクティスL.lactisからのDHAD酵素配列番号958の比活性を改善するために、これらの方法の適用を調査した。L.ラクティスL.lactisからのIlvD遺伝子配列番号959を、FBAプロモーターの調節下でpHR81ベクターにクローン化した図11。得られた構築物pHR81FBA-IlvDLl-ADHt図11、配列番号960を、FRA2またはGRX3遺伝子のいずれかの欠失を有する株に形質転換した。L.ラクティスL.lactisからのDHADに対する構成的突然変異体Aft1pL99Aの効果を研究するために、pHR81FBA-IlvDLl-ADHtを、ベクターpRS411-Aft1L99Aと共に、酵母宿主に同時形質転換した実施例4を参照。IlvD遺伝子を過剰発現させるために、菌株に応じてロイシンを欠くかあるいはロイシンおよびメチオニンの両方を欠いた酵母合成ドロップアウト培地において、形質転換体を増殖させた。酵素アッセイの結果は、表14に要約される。FRA2およびGRX3遺伝子の欠失は、酵母において発現される場合に、L.ラクティスL.lactisからのDHADの比活性を増大させた。さらに、Aft1構成的突然変異体L99Aの発現は、同様に、L.ラクティスL.lactisからのDHADの比活性を増大させた。実施例7.DHADの比活性の決定アッセイ法Fe-Sクラスターを必要とするタンパク質の活性の定量化は、アッセイ形式で行うことができる。タンパク質がDHADなどの酵素である場合、活性は、通常、活性の単位に関して表現される。酵素活性の単位は、国際生化学連合の酵素委員会EnzymeCommissionoftheInternationalUnionofBiochemistryによって、標準条件下、1分間当たりの1マイクロモルの基質の形質転換を触媒し得る酵素の量であると定義されているInternationalUnionofBiochemistry,ReportoftheCommissiononEnzymes,Oxford:PergamonPress,1961。さらに、比活性という用語は、所与の量の酵素における活性の単位であると定義される。従って、比活性は直接測定されないが、1酵素サンプル1ml当たりの単位単位/mlにおける活性を、2そのサンプル中のタンパク質の濃度で割ることによって計算され、従って、比活性は単位/mgで表現される。純粋で完全に活性な酵素のサンプルの比活性は、その酵素の特徴である。タンパク質の混合物のサンプルの比活性は、対象となる活性酵素から構成されるそのサンプル中のタンパク質の相対的な画分の尺度である。DHAD活性は、Flint,D.H.andm.H.Emptage,J.Biol.Chem.263:3558-641988に記載されるような2,4-ジニトロフェニルヒドラジン2,4-DNPH法を用いるエンドポイントアッセイにおいて分光光度的に測定することができる。このアッセイでは、2,4-DNPHは、2-ケトイソ吉草酸産物のケト基と反応してヒドラゾンを形成し、これを550nmにおけるその吸光度によって検出する。アッセイ緩衝液は、50mMのTris-HC1、10mMのMgCl2、pH8.0TM8緩衝液を含有する。アッセイ混合物中のその最終濃度が10mMであるように、十分な2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸をアッセイ緩衝液に添加する。各アッセイにおいて、最終容積が1mlであるように、酵素含有溶液および十分な基質含有緩衝液を混合する。アッセイ混合物は、通常、37°Cで30分間インキュベートされる。250μlの10W/Vトリクロロ酢酸の添加によりアッセイを停止させる。数分後に、1NのHCl中の2,4-DNPHの飽和溶液500μlを添加する。混合物を室温で少なくとも10分間インキュベートして、ヒドラゾンの形成を可能にする。次に、1.75mlのNaOHを添加して、ヒドラゾンを可溶化し、未反応2,4-DNPHを沈殿させる。NaOHの添加の数分後に、アッセイチューブを10分間ソニケーター浴に入れて脱気する。次に、チューブをデスクトップ遠心分離機において最高速度で2分間遠心分離し、沈殿物を沈降させる。次に、上澄みの吸光度を1時間以内に550nmで読み取る。サンプルアッセイから対照アッセイを差し引いた吸光度を2600α-ケトイソ吉草酸標準曲線から決定されるで割って、アッセイにおける酵素活性の単位を見出す。このアッセイを本明細書に記載される実施例において使用し、DHAD比活性を決定した。実施例8.大腸菌E.coliにおいて発現されるS.ミュータンスS.mutansからのDHADの精製および特徴付けS.ミュータンスS.mutansからのDHADを以下のように精製して特徴付けた。S.ミュータンスS.mutansilvD遺伝子を含有するpET28aプラスミドを有する大腸菌E.coliTurner株の6リットルの培養物を増殖させ、IPTGにより誘導した。細胞をTM8緩衝液中でソニケーターにより破壊し実施例7を参照、粗抽出物を遠心分離して細胞片を除去してから、粗抽出物の上澄みをQSepharoseGEHealthcareカラム上に負荷し、TM8緩衝液中のNaCl濃度を上昇させてDHADを溶出させることによって、S.ミュータンスS.mutansDHADを精製した。DHADを含有する画分をプールし、1MのNH42SO4に提供し、1MのNH42SO4で平衡化されたPhenyl-SepharoseカラムGEHealthcare上に負荷した。NH42SO4の濃度を低下させてDHADを溶出させた。DHADを含有する画分をプールし、10ml以下まで濃縮し、35×600cmのSuperdex-200カラム577mlベッドボリュームGEHealthcareカラム上に負荷し、TM8緩衝液により溶出させた。SDSゲルにより判断されるように、Superdexカラムから溶出されるS.ミュータンスS.mutansDHADの純度は90以上であると評価された。精製S.ミュータンスS.mutansDHADのUV-可視スペクトルは図3に示される。300nmより上のピークの数は、[2Fe-2S]クラスターを有するタンパク質に特有である。S.ミュータンスS.mutansDHADを亜ジチオン酸ナトリウムにより還元し、そのEPRスペクトルを種々の温度で測定した。図4は、20°Kと70°Kの間の温度で測定されたEPRスペクトルを示す。S.ミュータンスS.mutansDHADのEPRスペクトルは70°Kまで測定可能であり、[4Fe-4S]クラスターを含有するタンパク質のEPRスペクトルは10°Kを大きく上回る温度では観察できないので、S.ミュータンスS.mutansDHADは[2Fe-2S]クラスターを含有するが、[4Fe-4S]クラスターを含有しないことが示される。Bradfordタンパク質アッセイを用いて最高の比活性を有する精製S.ミュータンスS.mutansDHADのバッチの正確なタンパク質含量を、定量的アミノ酸分析により決定した。活性をタンパク質含量と組み合わせることによって、このバッチの100単位/mg比活性を得た。当該技術分野において既知の方法論を用いてICP-MSによって決定されるこのバッチの鉄含量は、DHAD1分子当たり2分子の鉄であった。これは、S.ミュータンスS.mutansDHADのこのバッチが[2Fe-2S]クラスターの完全補体を含有することと一致する。実施例9.酵母粗抽出物中のDHADの形態を細胞中の他のタンパク質からそして互いに分離して、DHADの存在量を測定する。酵母細胞中のDHADタンパク質は、2つのFe-Sクラスター/ダイマー、1つのFe-Sクラスター/ダイマー、およびゼロのFe-Sクラスター/ダイマーを有するダイマーの形態で存在する。酵母粗抽出物中のDHADタンパク質のこれらの3つの形態の濃度を測定するための方法は、MonoQカラムおよびSource15PHEPE4.6/100カラム両カラムともGEHealthcareから入手したを用いて開発し、以下において説明する。凍結酵母細胞を解凍し、50mMのTris-HCl、10mMのMgCl2、pH8.0TM8中に懸濁させてから、ビーズビーティングbeadbeatingによって破壊した。破壊細胞を遠心分離して、細胞片を除去し、酵母粗抽出物を生成した。A緩衝液がTM8であり、B緩衝液が0.5MのNaClを含有するTM8であるAKTAクロマトグラフシステムGEHealthcareに取り付けられた4mlのMonoQカラム上に粗抽出物を負荷した。サンプルを負荷する前に、カラムをA緩衝液により平衡化した。これらの条件下で、S.ミュータンスS.mutansDHADはMonoQカラムに結合した。サンプルをカラム上に負荷した後、カラムを10mLのTM8緩衝液で洗浄し、次に溶離液中のNaClの濃度を0.22MのNaClまで上昇させた。この後、30mLで0.22Mから0.35MのNaClまで直線的に勾配させた。クロマトグラフィの間、カラム溶出液のA215をモニターし、1mL画分を採取した。画分をDHAD活性についてアッセイした。MonoQカラムからの画分中のDHADの活性の合計は、粗抽出物中の活性に近かった。1gまでの酵母細胞ペーストを表す5mLの量の粗抽出物を用いて、このカラムを用いて良好な分離が得られた。DHAD含有画分をプールし、PHEカラムにおけるクロマトグラフィに備えて、NH42SO4中1.35Mにした。またSource15PHEPE4.6/100カラムは、A緩衝液が1.5MのNH42SO4を含有するTM8であり、B緩衝液がTM8であるAKTAロマトグラフシステムにも取り付けた。各ランの前に、カラムを90のAで平衡化した。MonoQカラムからプールし、NH42SO4中1.35Mにした画分をPHEカラム上に負荷し、このNH42SO4濃度で、DHADはカラムに結合した。クロマトグラフィの間、カラム溶出液のA215をモニターし、1mL画分を採取した。1.35Mから0Mまで減少する30mLのNH42SO4の直線的勾配を用いてカラムを展開させると、DHADは3つのピークでカラムから溶出した。DHADピークのそれぞれの面積を積分により決定した。この溶出スキームは、S.ミュータンスS.mutansDHADを、MonoQカラムからそれと同時に溶出される他の酵母タンパク質から分離するためのスキームと同一であることが分かった。ピークが溶出された画分において実行したSDSゲルにより、酵母細胞中の可溶性タンパク質の1で発現されたときに、これらのピーク中に存在する90をはるかに上回るタンパク質がDHADであることが示された。3つのDHADピークのそれぞれを含有する画分を別々にプールした。これらのピーク中のDHADのUV-可視吸収スペクトルならびに鉄およびスルフィド含量に基づいて、第1のピークは、2つの[2Fe-2S]クラスター/ダイマーを有するDHADを含有し、第2のピークは、1つの[2Fe-2S]クラスター/ダイマーを有するDHADを含有し、そして第3のピークは、ゼロの[2Fe-2S]クラスター/ダイマーを有するDHADを含有することが決定された。従って、その天然状態では、S.ミュータンスS.mutansDHAD酵素は、2つの単量体DHADタンパク質のダイマーとして存在すると思われる。サンプル中に存在するDHADの量をPHEカラムからの3つのDHADピークの面積の合計と関連付ける標準曲線は、以下のように得られた。S.ミュータンスS.mutansDHADを含有しない酵母細胞からの粗抽出物に種々の量の精製S.ミュータンスS.mutansDHADを添加した。これらの抽出物に、上記のようなMonoQおよびPHEカラムにおけるクロマトグラフィを行った。3つのDHADピークのそれぞれの下側の面積を積分した。これらの面積の合計を、酵母粗抽出物に添加された純粋なDHADの量に対してプロットした。プロットを用いて、以下の式を導いた:粗抽出物サンプル中のμgDHAD=0.507×3つのDHADピークの面積カウントの合計。酵母の粗抽出物中のDHAD活性は、実施例7に記載される方法によって容易に決定することができる。酵母粗抽出物中のDHADタンパク質の量は、この実施例で概説される手順によって決定することができる。このデータを用いて、粗抽出物中のS.ミュータンスS.mutansDHADタンパク質自体の比活性を実施例10の手順に従って計算することができる。実施例10.Fe-Sクラスターが負荷された酵母粗抽出物中のDHADの画分を決定するための方法精製Fe-Sクラスター要求タンパク質は、クラスターの完全補体を含有する場合には、特徴的な比活性を有し得る。既に述べたように、S.ミュータンスS.mutansDHADについては、完全補体を有する場合にこの比活性は100単位/mgである。ダイマー当たり平均して1つのFe-Sクラスターを有するDHADサンプルは、2つのクラスターを有するいくつかのダイマー、1つのクラスターを有するいくつかのダイマー、およびクラスターを有さないいくつかのダイマーを含有し得る。あるいは、ダイマーへのクラスター付加が全てであるか無であり、サンプル中に平均して1つのFe-Sクラスター/ダイマーが存在する場合、DHADダイマーの半分はクラスターの完全補体を有し、半分はクラスターを有さない。実施例9の結果から、ダイマー当たり1つのクラスターを有する種は単離することができるので、S.ミュータンスS.mutansDHADによって全ての挙動が追随されるわけではないし、全く何も追随されないわけでもないことがわかる。1つのFe-Sクラスターを有するS.ミュータンスS.mutansDHADのダイマーは、2つのFe-Sクラスター/ダイマーを有するダイマーの1/2の活性を有することが見出され、すなわち、Fe-Sクラスターの完全補体の1/2を有するS.ミュータンスS.mutansDHADの比活性は、50単位/mgである。これは、ダイマーの一方のモノマーにおけるFe-Sクラスターの不在が、他方のモノマーそれがFe-Sクラスターを含有すればの活性に影響を与えないことを意味する。実施例9に記載される手順により得られる情報、およびこの実施例においてこれまで記載された情報を用いて、DHADサンプル中のFe-Sクラスター負荷の程度を2つの異なる方法で決定することができる。第1に、3つのDHADピークの量の比を比較して、ダイマー当たり2つのクラスター、ダイマー当たり1つのクラスター、およびダイマー当たりゼロのクラスターを有する相対的な量を決定することができる。これにより、クラスター負荷の程度が与えられる。例えば、PHEカラムからのピーク1の面積が、ピーク1、ピーク2およびピーク3の面積の合計の25であり、ピーク2が50であり、ピーク3が25であれば、クラスターが負荷されたモノマーのパーセントは、以下の式に従って、50であると計算することができる:100[2ピーク1の面積1ピーク2の面積0ピーク3の面積]/[2全ピーク面積]=Fe-Sクラスターを有するDHADモノマー。第2に、DHADの比活性パーセントを使用して、クラスター負荷の程度を計算することができる。実施例7に記載されるように決定された活性を、実施例9に記載されるように決定されたDHADタンパク質の量で割ることによって、比活性を決定する。次に、比活性を100U/mgで割って、クラスターが負荷されたモノマーの画分を決定する。この画分に100をかけて、Fe-Sクラスターを有するDHADモノマーパーセントを決定する。例えば、比活性が50U/mgであると分かれば、クラスターが負荷された画分は0.5であり、Fe-Sクラスターを有するDHADモノマーパーセントは50である。このような計算を行うために、比活性は、粗抽出物中のDHADタンパク質の濃度全タンパク質ではなくに基づいていなければならない。他のタンパク質の存在下におけるS.ミュータンスS.mutansDHADの濃度の決定は、実施例9に記載される方法を用いて達成することができる。実施例11.DHAD負荷タンパク質の比活性および推定画分異なる条件下で増殖されたいくつかの酵母株においてFe-Sクラスターが負荷されたDHADモノマーの画分を決定するために、上記の方法を使用した。結果は表15に示される。これらの結果は、これらの増殖条件下で、FRA2およびGRX3を欠いた株におけるDHAD中のFe-Sクラスター負荷レベルが、これらの遺伝子の機能性コピーを含有する株よりも高いことを示す。従って、より高い画分のDHADタンパク質は、Fe-Sクラスター活性のために必要とされるの含量がより高いので、欠失株における活性形態である。実施例12.サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株PNY1505、PNY1541、およびPNY1542の構築この実施例の目的は、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株PNY1505、PNY1541、およびPNY1542を構築することであった。これらの株はPNY1503BP1064に由来した。PNY1503は、CEN.PK113-7DCBS8340、CentraalbureauvoorSchimmelculturesCBSFungalBiodiversiryCentre,Netherlandsに由来した。PNY1503BP1064の構築は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第61/368,436号明細書および以下の実施例13において記載されている。PNY1505は、FRA2遺伝子の欠失を含有する。PNY1541およびPNY1542は、YPRCΔ15座位においてL99A突然変異AFT1-L99Aを有するAFT1遺伝子の組込みを含有する。標的遺伝子の上流および下流の相同性領域および形質転換体の選択のためのURA3遺伝子を含有するPCR断片による相同組換えによって、欠失/組込みを作製した。URA3遺伝子を相同組換えにより除去して、痕跡のないscarless欠失/組込みを作製した。痕跡のない欠失/組込み手順は、Akadaetal.,Yeast,235:399-4052006から適合させた。各欠失/組込みのためのPCRカセットは、欠失/組込み手順のためのPCRにより全カセットを増幅する前に、オーバーラップPCRによって、あるいは個々の断片、および組み込むべき遺伝子をプラスミドにクローン化ことによって、4つの断片A-B-U-Cを結合することにより作成した。PCRカセットは、選択可能/対抗選択可能なマーカー、天然CEN.PK113-7DURA3遺伝子からなるURA3断片Uを、プロモーターURA3遺伝子の上流250bpおよびターミネーターURA3遺伝子の下流150bp領域と共に含有した。断片A長さ150bp~500bpおよびC長さ250bpは、標的遺伝子のすぐ上流の配列断片Aおよび標的遺伝子の3’配列断片Cに相当した。断片AおよびCは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みのために使用した。断片B長さ500bpは標的遺伝子のすぐ下流の500bpに相当し、断片Bに相当する配列の直接反復はカセットの染色体への組込みの際に作成されるので、URA3マーカーおよび断片Cの相同組換えによる染色体からの切除のために使用した。PCR産物ABUCカセットを用いて、まずURA3マーカーを組込み、次に相同組換えにより染色体から切除した。最初の組込みは3’配列を除く遺伝子を欠失させた。切除の際、遺伝子の3’領域も欠失させた。この方法を用いる遺伝子の組込みのために、組み込むべき遺伝子を、断片AとBの間でカセットに包含させた。FRA2の欠失FRA2の欠失参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第61/380,563号明細書にも記載されているは、FRA2コード配列の最初の113個のヌクレオチドはインタクトのまま、コード配列の3’端部から250個のヌクレオチドを欠失するように設計した。インフレームの終止コドンは欠失の7ヌクレオチド下流に存在した。PhusionHighFidelityPCRMasterMixNewEnglandBioLabs、Ipswich,MAおよびCEN.PK113-7DゲノムDNAGentraPuregeneYeast/BactキットQiagen,Valencia,CAにより調製をテンプレートとしてを用いて、痕跡のないFRA2の欠失のためのPCRカセットの4つの断片を増幅した。プライマーoBP594配列番号961と、FRA2断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP595配列番号962とを用いて、FRA2断片Aを増幅した。FRA2断片Aの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP596配列番号963と、FRA2断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP597配列番号964とを用いて、FRA2断片Bを増幅した。FRA2断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP598配列番号965と、FRA2断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP599配列番号966とを用いて、FRA2断片Uを増幅した。FRA2断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP600配列番号967と、プライマーoBP601配列番号968とを用いて、FRA2断片Cを増幅した。PCR精製キットQiagenを用いてPCR産物を精製した。FRA2断片AおよびFRA2断片Bを混合し、プライマーoBP594配列番号961およびoBP597配列番号964により増幅することによって、オーバーラップPCRによりFRA2断片ABを作成した。FRA2断片UおよびFRA2断片Cを混合し、プライマーoBP598配列番号965およびoBP601配列番号968により増幅することによって、オーバーラップPCRによりFRA2断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、GelExtractionキットQiagenにより精製した。FRA2断片ABおよびFRA2断片UCを混合し、プライマーoBP594配列番号961およびoBP601配列番号968により増幅することによって、オーバーラップPCRによりFRA2ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCRPurificationキットQiagenにより精製した。PNY1503のコンピテント細胞を作り、Frozen-EZYeastTransformationIIキットZymoResearch,Orange,CAを用いて、FRA2ABUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、1のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において30°Cでプレーティングした。GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製されたゲノムDNAを用いて、fra2ノックアウトを有する形質転換体を、プライマーoBP602配列番号969およびoBP603配列番号970によるPCRによってスクリーニングした。正しい形質転換体をYPE酵母抽出物、ペプトン、1のエタノール中で増殖させ、1のエタノールが補充され、5-フルオロ-オロト酸0.1を含有する合成完全培地において30°Cでプレーティングして、URA3マーカーを失った分離株を選択した。欠失およびマーカー除去は、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP602配列番号969およびoBP603配列番号970によるPCRによって確認した。分離株からのFRA2遺伝子の不在は、FRA2の欠失コード配列、oBP605配列番号971およびoBP606配列番号972に特異的なプライマーを用いて、ネガティブPCR結果によって実証した。正しい分離株を株CEN.PK113-7DMATaura3Δ::loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ::loxPfra2Δとして選択し、PNY1505BP1135と命名した。YPRCΔ15の欠失およびAFT1-L99Aの組込みYPRCΔ15座位を欠失させ、AFT1からの天然プロモーター領域800bpおよびターミネーター領域800bpと共に、AFT1-L99Aで置換した。YPRCΔ15欠失-AFT1L99Aの組込みのための痕跡のないカセットを、まずプラスミドpUC19-URA3MCSにクローン化した参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第61/356,379号明細書に記載される。ベクターはpUC19に基づき、マルチクローニング部位MCS内に位置するS.セレビシエS.cerevisiaeCEN.PK113-7DからのURA3遺伝子の配列を含有する。pUC19AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA、ATCC37254は、pMB1レプリコン、およびエシェリキアコリEscherichiacoliにおける複製および選択のためにベータ-ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有する。URA3のコード配列に加えて、この遺伝子の上流250bpおよび下流150bpからの配列は、酵母におけるURA3遺伝子の発現のために存在する。ベクターはクローニングの目的で使用することができ、酵母組込みベクターとして使用することができる。サッカロミセスセレビシエSaccaromycescerevisiaeCEN.PK113-7DCBS8340、CentraalbureauvoorSchimmelculturesCBSFungalBiodiversiryCentre,NetherlandsゲノムDNAからのURA3コード領域の上流250bpおよび下流150bpと共に、URA3コード領域を包含するDNAを、BamHI、AscI、PmeI、およびFseI制限部位を含有するプライマーoBP438配列番号1033と、XbaI、PacI、およびNotI制限部位を含有するoBP439配列番号1034とにより増幅した。GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenを用いてゲノムDNAを調製した。PCR産物およびpUC19を、BamHIおよびXbaIによる消化の後、T4DNAリガーゼと連結させ、ベクターpUC19-URA3MCSを作成した。ベクターは、プライマーoBP264配列番号1031およびoBP265配列番号1032によるPCRおよび配列決定によって確認した。KpnI制限部位を含有するプライマーoBP622配列番号973と、YPRCΔ15断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP623配列番号974とを用いて、YPRCΔ15断片Aを、上記のように調製したゲノムDNAから増幅した。YPRCΔ15断片Aの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP624配列番号975と、FseI制限部位を含有するプライマーoBP625配列番号976とを用いて、YPRCΔ15断片BをゲノムDNAから増幅した。PCR産物をPCRPurificationキットQiagenにより精製した。〆YPRCΔ15断片AおよびYPRCΔ15断片BのPCR産物を混合し、プライマーoBP622配列番号973およびoBP625配列番号976により増幅することによって、オーバーラップPCRによりYPRCΔ15断片A-YPRCΔ15断片Bを作成した。得られたPCR産物をKpnIおよびFseIにより消化し、適切な酵素による消化の後、pUC19-URA3MCSの対応する部位にT4DNAリガーゼと共に連結させた。NotI制限部位を含有するプライマーoBP626配列番号977と、PacI制限部位を含有するプライマーoBP627配列番号978とを用いて、YPRCΔ15断片CをゲノムDNAから増幅した。YPRCΔ15断片CのPCR産物をNotIおよびPacIにより消化し、YPRCΔ15断片ABを含有するプラスミドの対応する部位にT4DNAリガーゼと共に連結させた。pRS411-AFT1L99A上記の実施例4に記載されるをテンプレートとして用いて、AscI制限部位を含有するプライマーoBP744配列番号979と、PmeI制限部位を含有するプライマーoBP745配列番号980とによって、AFT1からの天然プロモーター領域800bpおよびターミネーター領域800bpと共にAFT1-L99Aを増幅した。PCR産物をAscIおよびPmeIにより消化し、YPRCΔ15断片ABCを含有するプラスミドの対応する部位にT4DNAリガーゼと共に連結させた。プライマーoBP622配列番号973およびoBP627配列番号978を用いて、得られたプラスミドから組込みカセット全体を増幅した。PNY1503のコンピテント細胞を作り、Frozen-EZYeastTransformationIIキットZymoResearchを用いて、YPRCΔ15欠失/AFT1-L99A組込みカセットPCR産物で形質転換した。形質転換混合物を、1のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において30°Cでプレーティングした。形質転換体をYPE1のエタノール中で増殖させ、1のEtOHが補充され、5-フルオロ-オロト酸0.1を含有する合成完全培地において30°Cでプレーティングして、URA3マーカーを失った分離を選択した。GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製されたゲノムDNAを用いて、外側プライマーoBP636配列番号981およびoBP637配列番号982ならびにAFT1-L99A特異的プライマーHY840配列番号983および外側プライマーoBP637配列番号982によるPCRによってYPRCΔ15の欠失およびAFT1L99Aの組込みを確認し、PCRによりクローン化した。CEN.PK113-7DMATaura3Δ::loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ::loxPyprcΔ15Δ::AFT1L99Aの独立した正しい分離株を株PNY1541およびPNY1542と命名した。実施例13.サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株BP1064PNY1503の構築株BP1064は、CEN.PK113-7DCBS8340、CentraalbureauvoorSchimmelculturesCBSFungalBiodiversiryCentre,Netherlandsに由来し、以下の遺伝子:URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6、およびGPD2の欠失を含有する。標的遺伝子の上流および下流の相同性領域と、形質転換体の選択のためのG418耐性マーカーまたはURA3遺伝子のいずれかとを含有するPCR断片による相同組換えによって、コード配列全体を完全に除去した欠失を作成した。Creリコンビナーゼを用いて、loxP部位により隣接されるG418耐性マーカーを除去した。URA3遺伝子を相同組換えにより除去して痕跡のない欠失を作成するか、あるいはloxP部位に隣接される場合には、Creリコンビナーゼを用いて除去した。痕跡のない欠失の手順は、Akadaetal.2006Yeastv23p399から適合させた。一般に、4つの断片A-B-U-CをオーバーラップPCRにより結合することによって、痕跡のない欠失のそれぞれに対してPCRカセットを作った。PCRカセットは、選択可能/対抗選択可能なマーカー、天然CEN.PK113-7DURA3遺伝子からなるURA3断片Uを、プロモーターURA3遺伝子の上流250bpおよびターミネーターURA3遺伝子の下流150bpと共に含有した。断片AおよびCそれぞれ、長さ500bpは、標的遺伝子のすぐ上流500bp断片Aおよび標的遺伝子の3’の500bp断片Cに相当した。断片AおよびCは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みのために使用した。断片B長さ500bpは標的遺伝子のすぐ下流の500bpに相当し、断片Bに相当する配列の直接反復はカセットの染色体への組込みの際に作成されるので、URA3マーカーおよび断片Cの相同組換えによる染色体からの切除のために使用した。PCR産物のABUCカセットを用いて、まずURA3マーカーを組込み、次に相同組換えにより染色体から切除した。最初の組込みは、3’の500bpを除く遺伝子を欠失させた。切除の際、遺伝子の3’の500bpも欠失させた。この方法を用いる遺伝子の組込みのために、組み込むべき遺伝子を、断片AとBの間でPCRカセットに包含させた。URA3の欠失内因性URA3コード領域を欠失させるために、ura3::loxP-kanMX-loxPカセットを、pLA54テンプレートDNA配列番号986からPCR増幅した。pLA54は、K.ラクティスK.lactisTEF1プロモーターおよびkanMXマーカーを含有し、loxP部位によって隣接されて、Creリコンビナーゼによる組換えおよびマーカーの除去を可能にする。PCRは、PhusionDNAポリメラーゼならびにプライマーBK505およびBK506それぞれ、配列番号987および988を用いて行った。各プライマーのURA3部分は、loxP-kanMX-loxPマーカーの組込みがURA3コード領域の置換をもたらすように、URA3プロモーターの上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域に由来した。標準遺伝子技術MethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,pp.201-202を用いて、PCR産物をCEN.PK113-7Dに形質転換し、形質転換体を、G418100μg/mlを含有するYPDにおいて30°Cで選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーLA468およびLA492それぞれ、配列番号989および990を用いるPCRによって正しい組込みを検証し、CEN.PK113-7DΔura3::kanMXと命名した。HIS3の欠失PhusionHighFidelityPCRMasterMixNewEnglandBioLabs,Ipswich,MAおよびCEN.PK113-7DゲノムDNAGentraPuregeneYeast/BactキットQiagen,Valencia,CAにより調製をテンプレートとして用いて、痕跡のないHIS3欠失のためのPCRカセットの4つの断片を増幅した。プライマーoBP452配列番号991と、HIS3断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP453配列番号992とを用いて、HIS3断片Aを増幅した。HIS3断片Aの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP454配列番号993と、HIS3断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP455配列番号994とを用いて、HIS3断片Bを増幅した。HIS3断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP456配列番号995と、HIS3断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP457配列番号996とを用いて、HIS3断片Uを増幅した。HIS3断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP458配列番号997と、プライマーoBP459配列番号998とを用いて、HIS3断片Cを増幅した。PCR産物をPCRPurificationキットQiagenにより精製した。HIS3断片AおよびHIS3断片Bを混合し、プライマーoBP452配列番号991およびoBP455配列番号994により増幅することによって、オーバーラップPCRによりHIS3断片ABを作成した。HIS3断片UおよびHIS3断片Cを混合し、プライマーoBP456配列番号995およびoBP459配列番号998により増幅することによって、オーバーラップPCRによりHIS3断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、GelExtractionキットQiagenにより精製した。HIS3断片ABおよびHIS3断片UCを混合し、プライマーoBP452配列番号991およびoBP459配列番号998により増幅することによって、オーバーラップPCRによりHIS3ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCRPurificationキットQiagenにより精製した。CEN.PK113-7DΔura3::kanMXのコンピテント細胞を作り、Frozen-EZYeastTransformationIIキットZymoResearch,Orange,CAを用いて、HIS3ABUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、2のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において30°Cでプレーティングした。GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製されたゲノムDNAを用いて、his3ノックアウトを有する形質転換体を、プライマーoBP460配列番号999およびoBP461配列番号1000によるPCRによってスクリーニングした。正しい形質転換体を株CEN.PK113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3として選択した。Δura3部位からのKanMXマーカーの除去およびΔhis3部位からのURA3マーカーの除去Frozen-EZYeastTransformationIIキットZymoResearchを用いて、CEN.PK113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3を、pRS423::PGAL1-cre配列番号1011、米国仮特許出願第61/290,639号明細書に記載されるで形質転換し、2のグルコースが補充されたヒスチジンおよびウラシルを欠いた合成完全培地において30°Cでプレーティングすることによって、KanMXマーカーを除去した。1のガラクトースが補充されたYP中、30°Cで約6時間、形質転換体を増殖させて、CreリコンビナーゼおよびKanMXマーカーの切除を誘発させ、回収のために30°CでYPD2のグルコースプレートにプレーティングした。分離株をYPD中で一晩増殖させ、5-フルオロ-オロト酸0.1を含有する合成完全培地に30°Cでプレーティングして、URA3マーカーを失った分離株を選択した。pRS423::PGAL1-creプラスミドの除去のために、5-FOA耐性分離株をYPDにおいて増殖およびプレーティングした。YPDG418プレート、ウラシルを欠いた合成完全培地プレート、およびヒスチジンを欠いた合成完全培地プレートにおける増殖をアッセイすることによって、KanMXマーカー、URA3マーカー、およびpRS423::PGAL1-creプラスミドの損失について分離株を検査した。G418に対して感受性があり、ウラシルおよびヒスチジンに対して栄養要求性である正しい分離株を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3として選択し、BP857と命名した。欠失およびマーカー除去は、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製されたゲノムDNAを用いて、Δura3のためのプライマーoBP450配列番号1001およびoBP451配列番号1002、ならびにΔhis3のためのプライマーoBP460配列番号999およびoBP461配列番号1000によるPCRおよび配列決定によって確認した。PDC6の欠失PhusionHighFidelityPCRMasterMixNewEnglandBioLabsおよびCEN.PK113-7DゲノムDNAGentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製をテンプレートとして用いて、痕跡のないPDC6欠失のためのPCRカセットの4つの断片を増幅した。プライマーoBP440配列番号1003と、PDC6断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP441配列番号1004とを用いて、PDC6断片Aを増幅した。PDC6断片Aの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP442配列番号1005と、PDC6断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP443配列番号1006とを用いて、PDC6断片Bを増幅した。PDC6断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP444配列番号1007と、PDC6断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP445配列番号1008とを用いて、PDC6断片Uを増幅した。PDC6断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP446配列番号1009と、プライマーoBP447配列番号1010とを用いて、PDC6断片Cを増幅した。PCR産物をPCRPurificationキットQiagenにより精製した。PDC6断片AおよびPDC6断片Bを混合し、プライマーoBP440配列番号1003およびoBP443配列番号1006により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC6断片ABを作成した。PDC6断片UおよびPDC6断片Cを混合し、プライマーoBP444配列番号1007およびoBP447配列番号1010により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC6断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、GelExtractionキットQiagenにより精製した。PDC6断片ABおよびPDC6断片UCを混合し、プライマーoBP440配列番号1003およびoBP447配列番号1010により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC6ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCRPurificationキットQiagenにより精製した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3のコンピテント細胞を作り、Frozen-EZYeastTransformationIIキットZymoResearchを用いて、PDC6ABUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、2のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において30°Cでプレーティングした。GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製されたゲノムDNAを用いて、pdc6ノックアウトを有する形質転換体を、プライマーoBP448配列番号1012およびoBP449配列番号1013によるPCRによってスクリーニングした。正しい形質転換体を株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6::URA3として選択した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6::URA3をYPD中で一晩増殖させ、5-フルオロ-オロト酸0.1を含有する合成完全培地において30°Cでプレーティングして、URA3マーカーを失った分離を選択した。欠失およびマーカー除去は、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP448配列番号1012およびoBP449配列番号1013によるPCRおよび配列決定によって確認した。分離株からのPDC6遺伝子の不在は、PDC6のコード配列、oBP554配列番号1014およびoBP555配列番号1015に特異的なプライマーを用いて、ネガティブPCR結果によって実証した。正しい分離株を株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6として選択し、BP891と命名した。PDC1欠失ilvDSmの組込みPDC1遺伝子を欠失させ、ストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansATCC700610からのilvDコード領域で置換した。PhusionHighFidelityPCRMasterMixNewEnglandBioLabsおよびNYLA83米国仮特許出願第61/246709号明細書に記載ゲノムDNAGentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製をテンプレートとして使用して、PDC1欠失-ilvDSm組込みのためのPCRカセットのためのA断片およびその後のストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansからのilvDコード領域を増幅した。プライマーoBP513配列番号1016と、PDC1断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP515配列番号1017とを用いて、PDC1断片A-ilvDSm配列番号1053を増幅した。PhusionHighFidelityPCRMasterMixNewEnglandBioLabsおよびCEN.PK113-7DゲノムDNAGentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製をテンプレートとして用いて、PDC1欠失-ilvDSm組込みのためのPCRカセットのB、U、およびC断片を増幅した。PDC1断片A-ilvDSmの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP516配列番号1018と、PDC1断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP517配列番号1019とを用いて、PDC1断片を増幅した。PDC1断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP518配列番号1020と、PDC1断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP519配列番号1021とを用いて、PDC1断片Uを増幅した。PDC1断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP520配列番号1022と、プライマーoBP521配列番号1023とを用いて、PDC1断片Cを増幅した。PCR産物をPCRPurificationキットQiagenにより精製した。PDC1断片A-ilvDSmおよびPDC1断片Bを混合し、プライマーoBP513配列番号1016およびoBP517配列番号1019により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC1断片A-ilvDSm-Bを作成した。PDC1断片UおよびPDC1断片Cを混合し、プライマーoBP518配列番号1020およびoBP521配列番号1023により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC1断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、GelExtractionキットQiagenにより精製した。PDC1断片A-ilvDSm-BおよびPDC1断片UCを混合し、プライマーoBP513配列番号1016およびoBP521配列番号1023により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC1A-ilvDSm-BUCカセット配列番号1054を作成した。PCR産物をPCRPurificationキットQiagenにより精製した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6のコンピテント細胞を作り、Frozen-EZYeastTransformationIIキットZymoResearchを用いて、PDC1A-ilvDSm-BUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を2のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において30°Cでプレーティングした。GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製されたゲノムDNAを用いて、pdc1ノックアウトilvDSm組込みを有する形質転換体を、プライマーoBP511配列番号1024およびoBP512配列番号1025によるPCRによってスクリーニングした。分離株からのPDC1遺伝子の不在は、PDC1のコード配列、oBP550配列番号1026およびoBP551配列番号1027に特異的なプライマーを用いて、ネガティブPCR結果によって実証した。正しい形質転換体を株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm-URA3として選択した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm-URA3をYPD中で一晩増殖させ、5-フルオロ-オロト酸0.1を含有する合成完全培地において30°Cでプレーティングして、URA3マーカーを失った分離株を選択した。PDC1の欠失、ilvDSmの組込み、およびマーカーの除去は、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP511配列番号1024およびoBP512配列番号1025によるPCRおよび配列決定によって確認した。正しい分離株を株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmとして選択し、BP907と命名した。PDC5欠失sadBの組込みPDC5遺伝子を欠失させ、アクロモバクターキシロスオキシダンスAchromobacterxylosoxidansからのsadBコード領域で置換した。PDC5欠失-sadB組込みのためのPCRカセットのセグメントをまずプラスミドpUC19-URA3MCSにクローン化した。pUC19-URA3MCSはpUC19に基づき、マルチクローニング部位MCS内に位置するサッカロミセスセレビシエSaccaromycescerevisiaeからのURA3遺伝子の配列を含有する。pUC19は、pMB1レプリコン、およびエシェリキアコリEscherichiacoliにおける複製および選択のためにベータ-ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有する。URA3のコード配列に加えて、この遺伝子の上流および下流からの配列は、酵母におけるURA3遺伝子の発現のために含まれる。ベクターはクローニングの目的で使用することができ、酵母組込みベクターとして使用することができる。サッカロミセスセレビシエSaccaromycescerevisiaeCEN.PK113-7DゲノムDNAからのURA3コード領域の上流250bpおよび下流150bpと共に、URA3コード領域を包含するDNAを、PhusionHigh-FidelityPCRMasterMixNewEnglandBioLabsを用いて、BamHI、AscI、PmeI、およびFseI制限部位を含有するプライマーoBP438配列番号1033と、XbaI、PacI、およびNotI制限部位を含有するoBP439配列番号1034により増幅した。GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenを用いてゲノムDNAを調製した。PCR産物およびpUC19配列番号1056を、BamHIおよびXbaIによる消化の後、T4DNAリガーゼと連結させ、ベクターpUC19-URA3MCSを作成した。ベクターは、プライマーoBP264配列番号1031およびoBP265配列番号1032によるPCRおよび配列決定によって確認した。sadBのコード配列およびPDC5断片BをpUC19-URA3MCSにクローン化して、PDC5A-sadB-BUCPCRカセットのsadB-BU部分を作成した。pLH468-sadB配列番号1051をテンプレートとして用いて、AscI制限部位を含有するプライマーoBP530配列番号1035と、PDC5断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP531配列番号1036とによりsadBのコード配列を増幅した。sadBの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP532配列番号1037と、PmeI制限部位を含有するプライマーoBP533配列番号1038とを用いて、PDC5断片Bを増幅した。PCR産物をPCRPurificationキットQiagenにより精製した。sadBおよびPDC5断片BのPCR産物を混合し、プライマーoBP530配列番号1035およびoBP533配列番号1038により増幅することによって、オーバーラップPCRによりsadB-PDC5断片Bを作成した。得られたPCR産物をAscIおよびPmeIにより消化し、適切な酵素による消化の後、pUC19-URA3MCSの対応する部位にT4DNAリガーゼと共に連結させた。プライマーoBP536配列番号1039と、PDC5断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するoBP546配列番号1040とを用いて、sadB-断片B-断片Uの増幅のために、得られたプラスミドをテンプレートとして使用した。PDC5sadB-断片B-断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP547配列番号1041と、プライマーoBP539配列番号1042とを用いて、PDC5断片Cを増幅した。PCR産物をPCRPurificationキットQiagenにより精製した。PDC5sadB-断片B-断片UおよびPDC5断片Cを混合し、プライマーoBP536配列番号1039およびoBP539配列番号1042により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC5sadB-断片B-断片U-断片Cを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、GelExtractionキットQiagenにより精製した。天然PDC5コード配列のすぐ上流の50個のヌクレオチドに対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP542配列番号1043と、oBP539配列番号1042とを用いてPDC5sadB-断片B-断片U-断片Cを増幅することによって、PDC5A-sadB-BUCカセット配列番号1055を作成した。PCR産物をPCRPurificationキットQiagenにより精製した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmのコンピテント細胞を作り、Frozen-EZYeastTransformationIIキットZymoResearchを用いて、PDC5A-sadB-BUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を1のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地グルコースなしにおいて30°Cでプレーティングした。GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製されたゲノムDNAを用いて、pdc5ノックアウトsadB組込みを有する形質転換体を、プライマーoBP540配列番号1044およびoBP541配列番号1045によるPCRによってスクリーニングした。分離株からのPDC5遺伝子の不在は、PDC5のコード配列、oBP552配列番号1046およびoBP553配列番号1047に特異的なプライマーを用いて、ネガティブPCR結果によって実証した。正しい形質転換体を株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB-URA3として選択した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB-URA3をYPE1のエタノール中で一晩増殖させ、エタノールが補充され、5-フルオロ-オロト酸0.1を含有する合成完全培地グルコースなしにおいて30°Cでプレーティングして、URA3マーカーを失った分離を選択した。PDC5の欠失、sadBの組込み、およびマーカーの除去は、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenにより調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP540配列番号1044およびoBP541配列番号1045によるPCRによって確認した。正しい分離株を株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadBとして選択し、BP913と命名した。GPD2の欠失内因性GPD2コード領域を欠失させるために、loxP-URA3-loxPPCR配列番号1052をテンプレートDNAとして用いて、gpd2::loxP-URA3-loxPカセット配列番号1057をPCR増幅した。loxP-URA3-loxPは、loxPリコンビナーゼ部位に隣接されるATCC♯77107からのURA3マーカーを含有する。PhusionDNAポリメラーゼならびにプライマーLA512およびLA513それぞれ、配列番号1029および1030を用いてPCRを行った。loxP-URA3-loxPマーカーの組込みがGPD2コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのGPD2部分は、GPD2コード領域の上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域に由来した。PCR産物をBP913に形質転換し、形質転換体を1のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地グルコースなしにおいて選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーoBP582およびAA270それぞれ、配列番号1048および1049を用いるPCRによって正しい組込みを検証した。pRS423::PGAL1-cre配列番号1011による形質転換と、1のエタノールが補充され、ヒスチジンを欠いた合成完全培地における30°Cでのプレーティングとによって、URA3マーカーを再利用した。形質転換体を1のエタノールが補充され、5-フルオロ-オロト酸0.1を含有する合成完全培地上に画線し、30°Cでインキュベートして、URA3マーカーを失った分離株を選択した。pRS423::PGAL1-creプラスミドを除去するために5-FOA耐性分離株をYPE1のエタノール中で増殖させた。欠失およびマーカー除去は、プライマーoBP582配列番号1048およびoBP591配列番号1050によるPCRによって確認した。正しい分離株を株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadBΔgpd2::loxPとして選択し、BP1064と命名した。実施例14.2,3-ジヒドロキシイソバレレートの蓄積およびイソブタノールの産生を測定するための振とうフラスコ実験この実施例の目的は、イソブタノール経路中間体2,3-ジヒドロキシイソバレレートDHIVの蓄積に対する効果を示し、AFT1-L99A遺伝子の組込みコピーまたはFRA2欠失を有するイソブタノロゲンisobutanologen株におけるイソブタノール産生を親株と比較して示すことであった。イソブタノール経路プラスミドpYZ090配列番号984、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第61/368,436号明細書に記載およびpLH468配列番号985、参照によって本明細書中に援用される米国仮特許出願第61/246,844号明細書に記載で菌株を形質転換した。またこれらのプラスミドは、以下のように、簡単に説明される。ALSの発現のために酵母CUP1プロモーターnt2-449から発現され、その後にCYC1ターミネーターnt2181-2430が続くバチルススブチリスBacillussubtilisからのalsS遺伝子nt位置457-2172のコード領域を有するキメラ遺伝子と、KARIの発現のために酵母ILV5プロモーター2433-3626から発現され、その後にILV5ターミネーターnt4682-5304が続くラクトコッカスラクティスLactococcuslactisnt3634-4656からのilvC遺伝子のコード領域を有するキメラ遺伝子とを含有するように、pYZ090配列番号984を構築した。DHADの発現のためにFBA1ターミネーターnt4858-5857が後に続くS.セレビシエS.cerevisiaeFBA1プロモーターnt2109-3105によって発現されたストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansnt位置3313-4849からのilvD遺伝子のコード領域を有するキメラ遺伝子と、ADHの発現のためにADH1ターミネーターnt5962-6277が後に続くS.セレビシエS.cerevisiaeGPM1プロモーターnt7425-8181から発現されたコドン最適化ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼnt6286-7413のコード領域を有するキメラ遺伝子と、KivDの発現のためにTDH3ターミネーターnt8237-9235が後に続くTDH3プロモーターnt10896-11918から発現されたラクトコッカスラクティスLactococcuslactisnt9249-10895からのコドン最適化kivD遺伝子のコード領域を有するキメラ遺伝子とを含有するように、pLH468配列番号985を構築した。PNY1503親株の形質転換体をPNY1504と命名した。PNY1505fra2欠失株の形質転換体をPNY1506と命名した。PNY1541およびPNY1542AFT1-L99A組込み株の形質転換体を、PNY1541に対してはPNY1543およびPNY1544、そしてPNY1542に対してはPNY1545およびPNY1546と命名した。100mMのMESpH5.5、0.2のグルコース、および0.2のエタノールが補充された合成培地アミノ酸を含まないYeastNitrogenBaseSigma-Aldrich,St.Louis,MO、ならびにウラシルおよびヒスチジンを含まないYeastSyntheticDrop-OutMediaSupplementClontech,MountainView,CA中で菌株を増殖させた。NewBrunswickScientificI24シェーカーにおいて30°C、225RPMで、125mLの通気孔付vented三角フラスコ内の15mLの培地中で一晩培養物を増殖させた。125mLの固くフタをした三角フラスコ中の18mlの培地を一晩培養物と共に、OD600が0.5になるまでインキュベートし、NewBrunswickScientificI24シェーカーにおいて、30°C、225RPMで6時間増殖させた。6時間後、グルコースを2.5まで添加し、酵母抽出物を5g/Lまで添加し、ペプトンを10g/Lまで添加したタイム0時間。24時間および48時間後に、HPLC参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第2007/0092957号明細書に記載される方法およびLC/MSによって、培養物の上澄みSpin-X遠心管フィルターユニット、CostarCat.No.8169を用いて採取を分析した。グルコースおよびイソブタノールの濃度は、HPLCにより決定した。AtlantisT3パーツ186003539カラムを用いるWatersMilford,MAAcquityTQDシステムにおけるLC/MSによってDHIVを分離および定量した。カラムは30°Cで保持し、流速は0.5mL/分であった。A移動相は水中0.1のギ酸であり、B移動相はアセトニトリル中0.1のギ酸であった。各ランは、99のAで1分間、25のBまで1分間にわたる直線的な勾配の後、99のAで1分間からなった。WatersACQ_TQDs/nQBA688質量分析検出器により、コーン電圧32.5Vで、m/z=133負のESIにおけるピークについてカラムの溶出をモニターした。DHIVは、通常、1.2分で出現した。ベースラインの分離を得て、1M水溶液ストックから作った標準溶液の分析を参照してDHIVのピーク面積をDHIV濃度μMに変換した。表18は、24時間および48時間における、親株バックグラウンドPNY1504と比較したAFT1-L99A株PNY1543、PNY1544、PNY1545、およびPNY1546、ならびにFRA2欠失株PNY1506のDHIVのモル収量消費されたグルコース1モル当たりのDHIVのモル数およびイソブタノール力価を示す。AFT1-L99Aの発現またはFRA2の欠失はいずれも、DHIVの蓄積の約50の低下をもたらした。データは、PNY1504およびPNY1506については2つの独立したフラスコの平均である。AFT1-L99A株PNY1543-PNY1544およびPNY1545-PNY1546については2つの独立した形質転換体の平均である。特定の実施形態の上記の説明は本発明の一般的性質をとても十分に明らかにし得るので、他者は、当該技術分野の技能の範囲内の知識を適用することによって、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、過度の実験を行わなくてもこのような特定の実施形態を容易に変更することができ、および/または種々の用途に適合させることができる。従って、本明細書において提示される教示およびガイダンスに基づいて、このような適合および変更は、開示される実施形態の等価物の意味および範囲内に含まれることが意図される。本明細書中の表現または用語は説明のためのものであって限定ではないので、本明細書の用語または表現は教示およびガイダンスを考慮して当業者により解釈されるべきであると理解されるはずである。"