"PGE2受容体サブタイプEP4の細胞外ドメインに結合し、EP4の機能を阻害する抗体又はその機能的断片。前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項1に記載の抗体又はその機能的断片。前記抗体が国際寄託受託番号FERMBP-11402NBG016-mAb14、受託番号FERMBP-11403NBG016-mAb21のハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項2に記載の抗体又はその機能的断片。前記EP4の機能が、細胞内cAMP濃度を上昇させることである、請求項1乃至3のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。EP4の細胞外ドメインに特異的に結合し、その相補性決定領域1~3CDR1~3のアミノ酸配列について、下記A、B又はCのいずれかを満たすことを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。A配列番号5で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号9で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号10で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、B配列番号15で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号16で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号17で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号18で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号19で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号20で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。C配列番号45で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号46で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号47で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号48で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号49で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号50で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。EP4の細胞外ドメインに特異的に結合し、その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記a、b又はcのいずれかを満たすことを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。a配列番号2で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号4で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、b配列番号12で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号14で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。c配列番号43で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号44で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。EP4の細胞外ドメインに結合し、EP4の機能を阻害する抗体又はその機能的断片であって、請求項3乃至6のいずれかに記載の抗体と同一のエピトープに結合する、抗体又はその機能的断片。ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする請求項1乃至7のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。ヒト抗体であることを特徴とする請求項1乃至7のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディであることを特徴とする請求項1乃至9のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。配列番号1、配列番号3、配列番号11、配列番号13、配列番号41、配列番号42であらわされる請求項5又は6に記載の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸。請求項11に記載の核酸を含むベクター。請求項12に記載のベクターが導入された細胞。請求項1乃至10のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を含む医薬組成物。EP4の機能異常によって発症及び又は進展する疾患の予防あるいは治療に用いられる、請求項14に記載の医薬組成物。治療対象疾患が、免疫疾患であることを特徴とする請求項15に記載の医薬組成物。治療対象疾患が、腫瘍であることを特徴とする請求項15に記載の医薬組成物。治療対象疾患が、疼痛であることを特徴とする請求項15に記載の医薬組成物。請求項1乃至10のいずれかに記載の抗EP4抗体又はその機能的断片が担体に固定化されてなる抗体固定化担体。EP4発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からEP4発現細胞を除去するために用いられることを特徴とする請求項19に記載の抗体固定化担体。請求項1乃至10のいずれかに記載の抗EP4抗体を含む細胞表面上のEP4発現量を測定するキット。本発明は、免疫異常に起因する疾患、腫瘍、疼痛の治療薬として有用なヒトPGE2受容体のEP4サブタイプに対する抗体と当該抗ヒトEP4抗体を含む医薬組成物等の提供を目的とする。本発明者らは、ヒトPGE2受容体のEP4サブタイプに対するモノクローナル抗体の作製を試みたところ、EP4サブタイプの細胞外ドメインに特異的に結合し、かつEP4の機能例えば、細胞内cAMP濃度を上昇させる機能を抑制する抗体の取得に成功し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の1~21である。1PGE2受容体サブタイプEP4の細胞外ドメインに結合し、EP4の機能を阻害する抗体又はその機能的断片。2前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする上記1に記載の抗体又はその機能的断片。3上記抗体が国際寄託受託番号FERMBP-11402、受託番号FERMBP-11403のハイブリドーマから産生されることを特徴とする上記2に記載の抗体又はその機能的断片。4上記EP4の機能が、細胞内cAMP濃度を上昇させることである、上記1乃至3のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。5EP4の細胞外ドメインに特異的に結合し、その相補性決定領域1~3CDR1~3のアミノ酸配列について、下記A、B又はCのいずれかを満たすことを特徴とする上記1乃至3のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。A配列番号5で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号9で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号10で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、B配列番号15で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号16で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号17で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号18で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号19で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号20で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。C配列番号45で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号46で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号47で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号48で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号49で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号50で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。6EP4の細胞外ドメインに特異的に結合し、その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記a、b又はcのいずれかを満たすことを特徴とする上記1乃至5のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。a配列番号2で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号4で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、b配列番号12で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号14で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。c配列番号43で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号44で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。7EP4の細胞外ドメインに結合し、EP4の機能を阻害する抗体又はその機能的断片であって、上記3乃至6のいずれかに記載の抗体と同一のエピトープに結合する、抗体又はその機能的断片。8ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする上記1乃至7のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。9ヒト抗体であることを特徴とする上記1乃至7のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。10抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディであることを特徴とする上記1乃至9のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。11配列番号1、配列番号3、配列番号11、配列番号13、配列番号41、配列番号42であらわされる上記5又は6に記載の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸。12上記11に記載の核酸を含むベクター。13上記12に記載のベクターが導入された細胞。14上記1乃至10のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を含む医薬組成物。15EP4の機能異常によって発症及び/又は進展する疾患の予防または治療に用いられる14に記載の医薬組成物。16治療対象疾患が、免疫疾患であることを特徴とする上記15に記載の医薬組成物。17治療対象疾患が、腫瘍であることを特徴とする上記15に記載の医薬組成物。18治療対象疾患が、疼痛であることを特徴とする上記15に記載の医薬組成物。19上記1乃至10のいずれかに記載の抗EP4抗体又はその機能的断片が担体に固定化されてなる抗体固定化担体。20EP4発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からEP4発現細胞を除去するために用いられることを特徴とする上記19に記載の抗体固定化担体。21上記1乃至10のいずれかに記載の抗EP4抗体を含む細胞表面上のEP4発現量を測定するキット。本発明により、EP4特異的にその機能を抑制する抗体が初めて提供される。本発明により、EP4に関連する本発明の医薬はEP4に関連する免疫疾患、腫瘍および疼痛の治療又は予防が可能となる。特に、低分子化合物に比べ、EP4サブタイプに対して結合選択性の高い本発明の抗体を使用することで、副作用などの少ない治療効果を提供することができる。本発明の抗体固定化担体により、癌、自己免疫疾患などを罹患している患者の血液から、EP4発現細胞を選択的に除去することが出来る。本発明のEP4発現量を測定キットにより、癌、自己免疫疾患などを罹患している患者の血液からEP4発現細胞を検出し、疾病の状態を評価することができる。本発明は、ヒトPGE2受容体サブタイプEP4の細胞外ドメインに結合し、EP4の機能を抑制する抗体又はその機能的断片、及び、これらの抗体又はその機能的断片を含む医薬である。EP4タンパク質の定義本発明の抗原となるEP4タンパク質としては、EP4タンパク質をコードするcDNAなどから調製された組換えタンパク質などを使用することができる。あるいは、EP4を細胞表面に発現する適当な細胞などを抗原として使用してもよい。ヒトEP4タンパク質をコードする核酸配列は、GenBankなどの公開されたデータベースなどから検索できる例えば、アクセッション番号:NM_000958。この遺伝子配列などに基づいて作製したプローブ又はPCR増幅用のプライマーペアなどを使用して、適当なDNAライブラリーからEP4をコードするDNAcDNAなどを調製することができる。あるいは人工DNA合成法で、全cDNAを調整することができる。その一例として、配列番号21にヒトEP4に対応するアミノ酸配列を示す。ヒトEP4には、配列番号21に示すもの以外にアミノ酸置換体等の各種のバリアントが知られている。本発明におけるヒトEP4には、EP4としての機能を有する限り、前記バリアントが含まれる。ヒトEP4の細胞内および細胞外ドメインは、配列番号21に示すアミノ酸配列における以下の部分に相当すると考えられている。左側がアミノ酸番号、右側が各ドメインである。なお各ドメイン間の境界については、多少の前後1~5アミノ酸残基、好ましくは、1~3アミノ酸残基、より好ましくは1~2アミノ酸残基が生じ得る。1~19:N末端ドメイン44~54:細胞内第1ループドメイン80~96:細胞外第1ループドメイン116~135:細胞内第2ループドメイン161~184:細胞外第2ループドメイン212~267:細胞内第3ループドメイン296~312:細胞外第3ループドメイン333~488:C末端ドメイン抗体又は機能性抗体の定義本発明のEP4の機能を抑制する抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが含まれ、該抗体の機能的断片には、Fab又はF2などの抗体断片、又は、単一鎖抗体などが含まれ、抗体の一部をなすポリペプチドあるいは、ポリペプチド複合体、であってEP4の機能を抑制するものであれば、如何なるものも本発明の範囲に含まれる。EP4に対する特異的機能性抗体の定義と評価方法EP4の機能としては、例えば、細胞内におけるcAMPの上昇、Phosphoinositide3-kinasePI3Kの活性化などの機能を挙げることができる。これらの細胞内の変化が癌細胞の増殖、Tリンパ球の細胞増殖、サイトカイン産生を制御することが知られている。本発明の抗体がヒトPGE2受容体サブタイプEP4の細胞外ドメインに特異的に結合することは次のように示すことができる。ヒトEP4タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入し、ベクターを適当な宿主細胞例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞などに導入する。非破壊状態のアミノ酸の挿入、欠失、置換等を有しないEP4発現宿主細胞又はEP4非発現宿主細胞と、本発明の抗体とを接触させ一定時間反応させる。過剰な抗体を洗浄後、細胞をELISA法、RIA法あるいはフローサイトメトリー法で細胞に結合している抗体量を測定する。非発現宿主細胞と比較してEP4発現宿主細胞に本発明の抗体がより多く結合することでEP4の細胞外ドメインへの結合を示すことができる。さらに、ヒト又はマウス由来EP1、EP2、EP3もしくはEP4タンパク質をコードする核酸配列を挿入した発現ベクターを構築し、上述と同様に受容体発現宿主細胞を解析する。本発明の抗体はヒトEP4発現宿主細胞への結合がその他の受容体細胞発現細胞と比較して多い、好ましくは、ヒトEP4以外の受容体発現細胞への結合が認められないことを示すことができる。本発明の抗体が、EP4の機能を阻害する抗体であることは次のように示すことができる。ヒトEP4タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞などに導入する。ヒトEP4発現宿主細胞と抗体を0.01~30μg/mLで接触させたのちPGE2を1012~106Mの濃度でさらに接触させる。その後、細胞内のcAMPの上昇を適切な方法で測定する。本発明の抗体を添加した場合は、用量依存的にPGE2により誘発されたcAMPの上昇を抑制することができる。また、ヒトEP4を天然に発現している細胞株例えばヒトマクロファージ細胞に抗体を0.01~10μgmLで接触させたのちPGE2を1012~106Mの濃度でさらに接触させる。その後炎症刺激例えばリポポリサッカライドLPS時のサイトカインやケモカイン産生を調べる。PGE2は、LPS刺激によるサイトカイン産生をEP4あるいはEP2を介して抑制することが知られている。本発明の抗体は、EP4を介したPGE2によるサイトカイン産生抑制を回復することを指標にEP4の機能阻害を評価することができる。同様に、ヒト末梢血樹状細胞からのPGE2によるIL-23産生増強作用の阻害効果を指標に本抗体のEP4機能阻害を評価することができる。さらに、ヒト膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、肺癌、口腔癌、前立腺癌、また多発性骨髄腫に由来する癌細胞株例えば、MDAMB231細胞、HCA-7細胞あるいはHT-29細胞などをPGE2と接触させることで細胞の増殖性が高まる。これらの細胞に本発明の抗体をあらかじめ接触させたのち、PGE2による細胞の増殖性の増加が低減することを指標に機能阻害を評価することができる。本発明の抗体は、ヒトEP4のみに結合し、マウスEP4には反応しない。したがって動物試験による免疫異常や疼痛に関する薬効の評価は困難である。一方、抗腫瘍効果については、上記のヒト癌組織から樹立されたEP4を高発現している細胞を、免疫不全マウスに一匹あたり106~107個の細胞数で接種する。接種直後より本発明の抗体0.1~0.5mg/匹をマウスに腹腔内あるいは皮下投与する。アイソタイプコントロール抗体投与群と比較して本発明の抗体投与群が有意に腫瘍形成、転移頻度を軽減することで抗腫瘍効果を示すことができる。本発明の抗体の詳細な定義本発明の抗体及びその機能的断片の例として、例えば、国際寄託における受託番号FERMBP-11402NBG016-mAb14、FERMBP-11403NBG016-mAb21のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の他、後述の実施例に示される方法で調製されるモノクローナル抗体が挙げられる。さらに、本発明の抗体及びその機能的断片として、配列番号2で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号4で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、配列番号12で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号14で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、配列番号43で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号44で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、配列番号23で表されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号29で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、配列番号56で表されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号57で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、及びこれらの抗体の機能的断片、並びに、これらの抗体を構成する重鎖及び/又は軽鎖の各アミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び/又は軽鎖からなる抗体、及びこれらの抗体の機能的断片であって、EP4の機能を抑制するものを挙げることができる。本発明の抗体と同一のエプトープの定義さらに本発明の抗体及びその機能的断片としては、実施例において単離されたいずれかのモノクローナル抗体とエピトープが重複するまたは同一の抗体が特に好ましい。このような抗体を、本発明においては実質的に同じ部位に結合する抗体と呼ぶ。2つの抗体が抗原蛋白質と実質的に同じ部位に結合するかどうかは、例えば競合実験により決定することができる。具体的には、実施例の抗EP4抗体とEP4との結合が、第二の抗EP4抗体によって競合阻害を受けるとき、第一の抗体と第二の抗体は実質的に同じ抗原部位に結合していると判断される。このように、実施例で単離した抗体のEP4結合部位と実質的に同じ部位に結合する抗体であって、EP4の機能を阻害する作用を有する抗体は本発明に含まれる。本発明の抗体の取得方法本発明の抗EP4抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそれら機能的断片であってもよい。医薬組成物として均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。モノクローナルというのは、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、例えばハイブリドーマ法KohlerandMilstein,Nature256:4951975、又は、組換え方法米国特許第4,816,567号により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよいClacksonetal.,Nature352:624-6281991;Marksetal.,J.Mol.Biol.222:581-5971991。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、又は別の抗体クラス若しくはサブクラス由来であるキメラ抗体免疫グロブリン、抗体変異体、並びにその機能的断片が含まれる米国特許第4,816,567号;Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-68551984。本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原としての抗原及び/又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質A合成-トレハロースジコリノミコレートMPL-TDMが含まれる。免疫原処理の後、血中に産生されたEP4に対する抗体を、EP4結合特異性及び、EP4の機能抑制作用などを指標にして、所望の抗体を取得することができる。また、本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、例えば、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。この方法には以下に示す4つの工程が含まれる:i宿主動物又は、宿主動物由来にヒトEP4タンパク質を免疫する、iiモノクローナル抗体分泌性又は潜在的に分泌性のリンパ球を回収する、iiiリンパ球を不死化細胞に融合させる、iv所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、例えば、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼHGPRT又はHPRTを欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがHGPRT欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地HAT培地に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマが生育する培地から、常法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。このようにして調製したハイブリドーマをインビトロ培養し、あるいは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの腹水中でインビボ培養し、目的の抗体を培養上清、あるいは、腹水から調製することができる。本発明の核酸は、本発明の抗体における重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするものである。本発明の核酸である重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸をベクターに挿入し、これを細胞内で発現させてもよい。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞などに導入し、組換型の抗体を調製することもできる。本発明のキメラ抗体の定義と生産方法本発明の抗EP4抗体の実施形態には、遺伝子組換え抗体が含まれる。遺伝子組換え抗体としては、特に限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体、特に、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結した抗体でありProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,6851-6855,1984等を参照、キメラを作製する場合、そのように連結した抗体が得られるよう、当業者に周知の遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。ここで、マウス由来抗体の可変領域として、重鎖可変領域は、例えば、配列番号2又は配列番号12で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、軽鎖可変領域は、例えば、配列番号4又は配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。本発明のキメラ重鎖又はキメラ軽鎖をベクターに挿入する。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞などに導入し、組換型の抗体を調製することもできる。本発明のヒト型抗体の定義と生産方法本発明のキメラ抗体には、ヒト型化抗体が含まれる。ヒト型化抗体は、フレームワーク領域はヒト由来で、CDRはマウス由来の領域からなる抗体のことである。ヒト型化抗体は、まず、マウス抗体の可変領域からそのCDRをヒト可変領域に移植し、重鎖及び軽鎖可変領域を再構成した後、これらヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結することで作製することができる。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である例えば、Nature,321,522-5251986;J.Mol.Biol.,196,901-9171987;QueenCetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-100331989等を参照。ここで、本発明の抗EP4抗体に使用されるマウス由来CDR配列としては、限定はされないが、例えば、重鎖CDR1~3として配列番号5~7に示されるアミノ酸配列が、軽鎖CDR1~3として配列番号8~10に示されるアミノ酸配列あるいは軽鎖CDR1~3として配列番号18~20に示されるアミノ酸配列が挙げられる。ヒト型化抗体重鎖又はヒト型化抗体軽鎖を宿主細胞内において発現させるために、ヒト型化抗体重鎖又はヒト型化抗体軽鎖をベクターに挿入してもよい。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択することができる。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞などに導入し、宿主細胞内で抗体を再構築させて、組換型の抗体を調製することもできる。本発明のヒト抗体の定義と生産方法ヒト抗体完全ヒト抗体とは、可変領域の抗原結合部位である超過変領域HyperVariableregion、可変領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ただし、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト抗体は、公知の技術により当業者であれば容易に作製することができる。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法Tomizuka,K.etal.,NatureGenetics,199716,133-143;Kuroiwa,Y.et.al.,Nuc.AcidsRes.,199826,3447-3448;Yoshida,H.et.al.,AnimalCellTechnology:BasicandAppliedAspects,199910,69-73Kitagawa,Y.,Matuda,T.andIijima,S.eds.,KluwerAcademicPublishers;Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,200097,722-727等を参照や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法Wormstone,I.M.et.al,InvestigativeOphthalmologyVisualScience.,2002437,2301-8;Carmen,S.et.al.,BriefingsinFunctionalGenomicsandProteomics,200212,189-203;Siriwardena,D.et.al.,Opthalmology,20021093,427-431等を参照により取得することができる。本発明の抗体の機能的断片本発明の抗体の機能的断片としては、抗EP4抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Fab、Fab’、Fab’2、Fvvariablefragmentofantibody、一本鎖抗体重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域等、scFv、diabodyscFv二量体、dsFvジスルフィド安定化可変領域、並びに、CDRを少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、重鎖のN末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fabの作製は、抗体分子をパパインで処理して断片を取得する他、例えば、FabをコードするDNAを挿入した適当な発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞などに導入後、細胞内でFabを発現させることで実施することができる。また、Fab’2は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fab’2は、抗体分子ペプシンで処理して断片を取得する他、後述するFabをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて作製することも可能で、さらに、Fabと同様に遺伝子工学的手法によっても作製することができる。Fab’は、上記Fab’2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fab’も、Fab等と同様に遺伝子工学的な手法により作製することができる。scFvは、1本の重鎖可変領域VHと1本の軽鎖可変領域VLとを適当なペプチドリンカーを用いて連結した、VH-リンカー-VLないしはVL-リンカー-VHポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。scFvは、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、遺伝子工学的手法により作製することができる。diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一抗原結合活性であっても、又は、一方を異なる抗原結合活性であってもよい。diabodyは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をペプチドリンカーで結合したscFvを発現するcDNAを構築して、遺伝子工学的手法により作製することができる。dsFvは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のそれぞれ1アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、Reiterらにより示された方法などにより、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。dsFvは、抗体の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築して遺伝子工学的手法により作製することができる。CDRを含むペプチドは、重鎖又は軽鎖のCDRCDR1~3の少なくとも1領域以上を含むように構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含むペプチドは、抗体の重鎖又は軽鎖のCDRをコードするDNAを構築し、発現ベクターに挿入する。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞などに導入し製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法フルオレニルメチルオキシカルボニル法及びtBoc法t-ブチルオキシカルボニル法等の化学合成法によって製造することもできる。本発明の抗体の精製本発明の抗体の精製方法としては特に限定はなく、公知の手法を採用することができる。例えば、前記ハイブリドーマ又は前記組換え細胞の培養上清を回収し、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて、本発明の抗体を精製することができる。抗体のアイソタイプがIgGである場合には、プロテインAを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。本発明の抗体を含む医薬本発明の抗体又はその機能的断片は、これらを有効成分とした医薬として使用することができる。このような本発明の医薬は、EP4に関連する免疫疾患、腫瘍および疼痛の治療又は予防のために使用することができる。EP4に関連する免疫疾患とは例えば乾癬;多発性硬化症;関節リウマチ;全身性エリテマトーデス;クローン病等の炎症性腸疾患;I型糖尿病とその合併症例えば糖尿病性網膜症、糖尿病性細小血管症、糖尿病性腎障害、黄斑変性等;多発性筋炎;シェーグレン症候群;喘息アトピー性皮膚炎及び接触性皮膚炎;免疫不全疾患;臓器移植等を指す。本発明の医薬は、疼痛すなわち侵害受容性疼痛及び神経障害性疼痛の治療又は予防のために使用することができる。侵害受容性疼痛とは例えば、体性及び内臓性の侵害受容器の活性化に起因する疼痛、例えば関節における病的変形及び慢性関節痛例えば関節リウマチを含む関節炎、変形性関節症、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎、痛風性関節炎及び若年性関節炎等疾患の緩和と関節構造維持を含む;腰痛および頸部痛;筋骨格痛;筋炎;骨折;捻挫、挫傷;線維筋痛症に付随する疼痛;腫瘍及び腫瘍治療に関連する疼痛;インフルエンザ又は他のウイルス感染症感冒等に付随する疼痛;リウマチ熱;内臓痛;機能性の腸疾患例えば過敏性腸症候群、非心臓性胸痛、非潰瘍性消化不良等に付随する疼痛;心筋虚血に付随する疼痛;歯痛;術後および歯科処置後の疼痛;産後痛;一次性頭痛例えば片頭痛、緊張型頭痛、群発頭痛とその他の一次性頭痛;二次性頭痛例えば頭頸部外傷による頭痛、頭頸部血管障害による頭痛、非血管性頭蓋内疾患による頭痛、薬物乱用等物質又はその離脱による頭痛、感染症による頭痛、ホメオスターシスの障害による頭痛、頭蓋骨,頸,眼,耳,鼻,副鼻腔,歯,口あるいはその他の顔面頭蓋の構成組織の障害に起因する頭痛あるいは顔面痛薬物誘発性頭痛及び片頭痛に付随する疼痛等等を指す。神経障害性疼痛とは例えば物理的外傷や切断;幻肢痛;慢性炎症症状に起因する疼痛;帯状疱疹後神経痛;糖尿病性神経障害;非特異的腰痛;背部痛;坐骨神経痛;腫瘍とその治療に関連する神経障害;HIV関連神経障害;手根管症候群;慢性アルコール中毒;甲状腺機能低下症;三叉神経痛;三叉神経自律神経性頭痛;尿毒症;ビタミン欠乏症;多発性硬化症;線維筋痛症;毒素等に付随する疼痛等を指す。本発明の医薬は、腫瘍の治療又は予防に有用である。腫瘍の治療とは、腫瘍の成長、散開、転移の全面又は部分的阻止又は腫瘍細胞の全面又は部分的駆除のみならず、腫瘍に付随する症状疼痛、食欲不振、体重減少等の部分的または全面的解消を含む。腫瘍の治療又は予防としては、良性の腫瘍の異常増殖およびポリープ、悪性の腫瘍の異常増殖およびポリープ、新生物を対象とする。良性の腫瘍の異常増殖及びポリープとは例えば扁平上皮細胞乳頭腫;基底細胞腫瘍;移行細胞乳頭腫;腺腫;ガストリノーマ;胆管細胞腺腫;肝細胞腺腫;腎管状腺腫;膨大細胞腫;グロムス腫瘍;メラノサイト母斑;線維腫;粘液腫;脂肪腫;平滑筋腫;横紋筋腫;良性奇形腫;血管腫;骨腫;軟骨腫および髄膜腫等を指す。悪性の腫瘍の異常増殖及びポリープ、例えば肝細胞癌;胆管細胞癌;腎細胞癌;扁平上皮癌;基底細胞癌;移行細胞癌;腺癌;悪性ガストリノーマ;悪性黒色腫;線維肉腫;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;悪性奇形腫;血管肉腫;カポジ肉腫;骨肉腫;軟骨肉腫;リンパ管肉腫;悪性髄膜腫;非ホジキンリンパ腫;ホジキンリンパ腫;白血病及び脳腫瘍等を含む。新生物は、上皮細胞由来新生物上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、並びに、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌及び胃癌のような胃腸癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頚癌、肺癌、乳癌、並びに、扁平上皮細胞癌及び基底細胞癌のような皮膚癌、前立腺癌、腎細胞癌腫を含み、また、全身の上皮、間葉又は血液細胞を冒す他の既知の癌を含む。本発明の抗体と、抗腫瘍活性及び/又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体-薬剤複合体を提供することができる。また、遺伝子組換え技術を用い、抗腫瘍活性及び/又は殺細胞活性を有する化合物としてのタンパク質トキシンを、遺伝子上で抗体遺伝子と融合させて、1つのタンパク質として発現させて得られたものは、一般に、イムノトキシンと称される。抗腫瘍活性を有する化合物としては、例えば、ドキソルビシン、マイトマイシンCなどが挙げられる。抗体-薬剤複合体の作製方法としては、限定はされないが、例えば、ジスルフィド結合やヒドラゾン結合によって抗体と薬剤とをカップリングする方法などが挙げられる。本発明の抗体を含む医薬組成物本発明には、医薬又は医薬組成物も含まれる。本発明の医薬の有効成分としては、上述の本発明の抗体又はその機能的断片のほか、生理学的に許容されるその塩を用いてもよい。塩としては、例えば、酸性基が存在する場合には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩;アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、N,N-ビスヒドロキシエチルピペラジン、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、エタノールアミン、N-メチルグルカミン、L-グルカミン等のアミンの塩;又はリジン、δ-ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩を形成することができる。塩基性基が存在する場合には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩;メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩;又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などを挙げることができる。本発明の医薬は、有効成分である本発明の抗体又はその機能的断片自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分である抗体又はその機能的断片の他、1又は2以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。本発明の医薬の有効成分としては、発明の抗体又はその機能的断片の2種以上を組み合わせて用いることができ、上記医薬組成物には、公知の他の薬剤を併せて配合してもよい。医薬組成物の種類は特に限定されず、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。経口投与用又は非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。また、高分子などで被覆した徐放製剤を脳内に直接投与することも可能である。医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、又は医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機又は有機物質あるいは固体又は液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して1重量から90重量の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま、あるいはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸-メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのpH調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜等で被覆すればよい。本発明の医薬の投与量及び投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化進展の防止及び/又は治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は0.01~1000mg有効成分重量程度であり、一日1回又は数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量0.001~400mg有効成分重量を連続投与又は間欠投与することが望ましい。本発明の医薬は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。担体として、例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG誘導ホスファチジルエタノールPEG-PEを含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。本発明の医薬は、医薬組成物としてキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明の医薬組成物がキットとして供給される場合、該組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。キット中に含まれる試薬は、構成成分の活性を長期間有効に持続し、容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質することのない材質で製造された容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料によって構成される。また、キットには使用説明書が添付されてもよい。本キットの使用説明は、紙などに印刷され、及び/又はフロッピー登録商標ディスク、CD-ROM、DVD-ROM、Zipディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体に保存されて使用者に供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。さらに、本発明には、本発明の医薬又は医薬組成物を患者等に投与し、EP4に関連する免疫疾患、腫瘍および疼痛等を予防又は治療する方法が含まれる。ここで治療とは、EP4の機能異常例えば、機能の異常亢進などに起因して発症する疾患等に罹患した哺乳動物において、その病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、これによって該疾患の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする処置のことである。また、予防とは、EP4の機能異常例えば、機能の異常亢進などに起因して発症する疾患等に罹患するおそれがある哺乳動物について、該疾患の発症又は罹患を予め阻止することを意味し、これによって該疾患の諸症状等の発症を予め阻止することを目的とする処置のことである。治療の対象となる哺乳動物は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい哺乳動物は、ヒトである。本発明の抗体固定化担体本発明には、抗体固定化担体が含まれる。本発明の抗体固定化担体は、本発明の抗ヒトEP4抗体が担体に固定化されてなるものである。好ましい実施形態では、本発明の抗体固定化担体は、EP4発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からEP4発現細胞を除去するために用いられる。担体に固定化される抗ヒトEP4抗体は、1種類のみでもよいし、2種以上でもよい。本発明の抗体固定化担体の具体的形態としては、例えば、本発明の抗体が水不溶性担体に固定され、容器に充填されたものが挙げられる。ここで、水不溶性担体としてはいかなる材質も使用可能であるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを列記すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属材料が挙げられる。担体の形状としては、粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体、平板状、などが挙げられるが、体積当たりの表面積が大きいという点で粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。例えば、抗体が固定された水不溶性担体を予め容器に充填した多孔質体フィルターに末梢血液を通過させ、疾患に関わるEP4発現細胞を効率よく除去することができる。本発明の抗体固定化担体と他の構成要素とを組み合わせて、EP4発現細胞除去用キットを作製することができる。当該他の構成要素としては、抗凝固剤、体外循環回路が挙げられる。本発明の抗EP4抗体を含む診断用キット本発明の抗EP4抗体は、診断用キットの形態で提供することができる。本発明の診断用キットは抗体を含むが、その他に、標識物質、又は2次抗体もしくはその標識物含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明の診断用キットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質発色性基質等、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器エッペンドルフチューブ等、ブロッキング剤BovineSerumAlbuminBSA,Skimmilk,Goat血清等の血清成分、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル説明書等を含んでいてもよい。測定法としては、例えばELISA法、EI法、RIA法、蛍光免疫測定法FIA、化学発光免疫測定法Luminescenceimmunoassay、フローサイトメトリー法が考えられるが、なかでも特に、フローサイトメトリー法が、簡便かつ高感度という点で好ましい。また、その他の細胞表面抗原を認識する抗体キットと組み合わせて使用することができる。本発明の診断用キットを、癌、自己免疫疾患などを罹患している患者の血液細胞と反応させ、EP4発現細胞の血液中での割合を検出することができる。その他の細胞表面抗原抗体と組み合わせることにより特定の細胞集団例えば樹状細胞、TH17細胞、Treg細胞でのEP4発現細胞の割合を検出することができる。EP4発現細胞の割合の増減を評価することで、疾病の状態を評価することができる。以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。1ヒトEP4発現ベクターpcDNADEST40hEP4の作製GenBankに登録済みのヒトEP4遺伝子の、ORF配列から終止コドンを除いた配列の5’末端に5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC-3’配列配列番号30を、3’末端に5’-GACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC-3’配列配列番号31を付加したDNAを合成し、pDONR221ベクターインビトロジェン社製にGatewayシステムインビトロジェン社を使用して組み込み、pDONR-hEP4とした。インサートの塩基配列は常法に従って決定し、配列に誤りがないことを確認した。次にGatewayシステムにより、ヒトEP4遺伝子を含む配列をpcDNA-DEST40ベクターインビトロジェン社製に組み替え、pcDNA-DEST40-hEP4を得た。このプラスミドから発現するヒトEP4は、C末端にV5と6×HISタグが付加された融合タンパク質である。pcDNA-DEST40-hEP4のプラスミドDNAは、常法に従って大腸菌DH5α株を形質転換して増幅し、PureLinkHiPurePlasmidFilterMaxiprepKitインビトロジェン社製を用いて使用説明書に従い調製した。2ヒトEP4発現293FT細胞の調製100mmのコラーゲンIコート細胞培養用ディッシュに播種した293FT細胞インビトロジェン社製に、上述のpcDNADEST40hEP4プラスミドDNA10μgを、リポフェクトアミン2000インビトロジェン社製25μLを用いて、使用説明書に従い遺伝子導入した。遺伝子導入24時間後に細胞をHBSSHanks’BalancedSaltSolutions、インビトロジェン社製で洗浄し、酵素不含細胞解離バッファーインビトロジェン社製によって細胞培養用ディッシュから剥がし取り、遠心操作により回収した。EP4遺伝子導入293FT細胞および遺伝子未導入293FT細胞は、CytofixCytopermKitBD社製を用いて細胞膜透過処理を施し、抗V5タグ抗体と混合してインキュベートした。洗浄バッファー0.1ウシ胎児血清を含むPBSPhosphateBufferedSaline,インビトロジェン社製で3回洗浄した後、2次抗体のAlexa488標識抗マウスIgG抗体によって染色し、再度洗浄バッファーで3回洗浄した後、フローサイトメーターQuantaSCMPLで解析した。その結果、遺伝子導入293FT細胞のみがAlexa488蛍光陽性を示したことから、ヒトEP4を発現していることが確認できた。そこで、このヒトEP4発現293FT細胞を感作抗原として使用した。3免疫抗原免疫は129Ola系統の7週齢のメスマウスに対して行った。2で記載したヒトEP4発現293FT細胞を生理食塩水に懸濁した後、10~14日の間隔を空けて5回腹腔内投与を行った。4ハイブリドーマの作製5回目の免疫から3日後にマウスの脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞とマウスミエローマP3X63Ag8.653細胞ECACCとをポリエチレングリコール4000メルク社製を用いて、常法に従って細胞融合させた。融合細胞は、100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、非必須アミノ酸、2mML-グルタミン、NCTC109培地以上インビトロジェン社製を含むGIT培地和光純薬社製に懸濁し、96ウェルプレートに100μL/ウェルの割合で播種、37°C、5CO2条件下で培養した。融合の翌日からは、上述の培地にHATSupplementインビトロジェン社製を加えた培地に交換して、融合後13日間培養を継続した。その結果、約700クローンのハイブリドーマのコロニーを得た。5ヒトEP4安定発現NS0細胞株の構築1で述べたpDONR-hEP4からpEF-DEST51ベクターインビトロジェン社製へGatewayシステムによる配列の組み換えを行い、pEF-DEST51hEP4プラスミドを得た。このプラスミドから発現するヒトEP4は、C末端にV5と6×HISタグが付加された融合タンパク質である。10のウシ胎児血清と、100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンインビトロジェン社製を含むRPMI培地で培養した、マウスミエローマNS0細胞理化学研究所細胞バンク1×107細胞に、LipofectaminLTXインビトロジェン社製35μLとPlusReagent14μLを使って、使用説明書に従ってpEF-DEST51-hEP4プラスミド14μgを遺伝子導入した。遺伝子導入の翌日からは、2.5μg/mLの抗生物質ブラストシジンを加えたRPMI培地で、3日目ごとに培地を交換しながら2週間培養した。形成されたコロニーからペニシリンキャップ法により、ブラストシジン耐性NS0細胞をクローニングした。得られたブラストシジン耐性NS0細胞を、FcBlockベクトンディッキンソン社製で4°C15分間ブロッキングした後、2と同様の方法でフローサイトメトリーによりEP4融合タンパク質の発現を確認した。その結果、得られたブラストシジン耐性NS0細胞がヒトEP4を安定発現していることが確認できた。6抗EP4抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング5で作製したヒトEP4安定発現NS0細胞株2×105細胞を、2と同様の方法で染色しフローサイトメーターによる解析を行った。細胞膜透過処理は施さず、1次抗体として、4で得られたハイブリドーマの培養上清50μLを使用した。その結果、21ウェルの上清でAlexa488蛍光陽性の反応が見られた。陽性だったウェルの細胞は限界希釈法によりクローニングし、2週間後の培養上清についても同様の方法で、フローサイトメトリーによるヒトEP4安定発現NS0細胞株との結合試験を行った。同様のクローニングと結合試験を再度繰り返し、最終的に2クローンの抗EP4抗体産生ハイブリドーマを得た。これらのハイブリドーマを、それぞれNBG016-mAb14、NBG016-mAb21と名付けた。得られたハイブリドーマ細胞NBG016-mAb14、NBG016-mAb21は、2010年6月29日原寄託日付で、茨城県つくば市東1丁目1番地1つくばセンター中央第6郵便番号305-8566、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、それぞれ受託番号FERMP-21978及びFERMP-21979として、寄託された。その後、ブダペスト条約に基づき、原寄託より国際寄託に移管された原寄託についての受託証及び生存に関する証明書の通知日;2011年9月5日。受託番号はそれぞれFERMBP-11402及びFERMBP-11403である。中で、細胞の約9割が死滅するまで培養を継続し、抗体を産生させた。この培養上清100mLから遠心操作1,500rpm、15分間により細胞をとり除いた後、HiTrapProteinGHPカラムに通すことでIgGを精製濃縮した。得られた精製IgGについて、IsoStripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットロシュダイアグノスティックス社製を用いてサブクラスと軽鎖の種類を決定したところ、共にIgG2a、κであった。以降、NBG016-mAb14、NBG016-mAb21とはこれらの精製抗体のことを指し、ハイブリドーマもしくは細胞と記載した場合はこれらの抗体を産生するハイブリドーマのことを指す。2、3、4、6と同様に、サブクラスの異なる抗EP4抗体産生ハイブリドーマ細胞を取得した。このハイブリドーマの培養上清から、7と同様にしてサブクラスと軽鎖の種類がIgG1、κである精製IgGを得た。この精製抗体をNBG016-mAb9とした。8ヒトEP4安定発現CHO細胞株の作製pDONRhEP4から、GatewayシステムでpEF5/FRT/V5-DESTベクターにヒトEP4遺伝子を乗せ換え、pEFFRThEP4を得た。このプラスミドから発現するヒトEP4は、C末端にV5と6×HISタグを付加した融合タンパク質である。10のウシ胎児血清と、100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを含むHam’sF12培地で培養した、FlpInCHO細胞に、リポフェクトアミン2000を用いてpEFFRThEP4プラスミドとpOG44プラスミドを同時に遺伝子導入した。遺伝子導入の翌日から、500μg/mLの抗生物質ハイグロマイシンを加えたHam’sF12培地に培地を交換し、3日目ごとに培地を交換しながら2週間培養した。形成されたコロニーから、ペニシリンキャップ法によりハイグロマイシン耐性細胞をクローニングした。2に記載した方法で、2次抗体としてはフィコエリスリンPE標識抗マウスIgG抗体ベックマンコールター社を使用し、得られたハイグロマイシン耐性細胞と抗V5タグ抗体との結合をフローサイトメーターで解析した。その結果、得られたハイグロマイシン耐性Flp-In-CHO細胞がPE陽性を示したことから、ヒトEP4を安定発現していることが確認できた。この細胞を以下、ヒトEP4安定発現CHO細胞株と記載する。9抗ヒトEP4抗体とヒトEP4発現細胞の結合試験抗ヒトEP4抗体と、ヒトEP4安定発現CHO細胞株の結合試験を6に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。ヒトEP4安定発現CHO細胞株もしくは親株Flp-In-CHO細胞を5×105使用し、1次抗体としては1μgのNBG016-mAb14、NBG016-mAb21もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体BioRegend社製を、2次抗体としてはPE標識抗マウスIgG抗体を使用した。図1にその結果を示す。親株Flp-In-CHO細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトEP4安定発現株細胞を黒の実線で示している。NBG016-mAb14、NBG016-mAb21が共に、ヒトEP4安定発現CHO細胞株にのみ結合していることから、これらの抗体がヒトEP4に特異的に結合することが示された。同様にしてNBG016-mAb9についても、ヒトEP4安定発現CHO細胞株との結合試験を行った。結果を図2に示す。この結果よりNBG016-mAb9もヒトEP4に特異的に結合することが示された。10PGE2によるcAMP産生に対する抗体の阻害試験ヒトEP4安定発現CHO細胞株もしくは親株Flp-In-CHO細胞を、アセチルサリチル酸1mMを含む培地で18時間培養した後、細胞解離バッファーで細胞培養ディッシュから回収して、CulturPlate96に1ウェルあたり2,500個分注した。各ウェルにNBG016-mAb14、NBG016-mAb21もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体を0.05~30μg/mLになるように加え、室温で15分間静置した。次にPGE2を5×10-11Mになるように加え、さらに室温で30分間静置した。細胞内で産生されたcAMP量は、LANCEUltracAMPKitパーキンエルマー社製を用いて、使用説明書に従った反応を行い、プレートリーダーARVO1420HTSで測定した。その結果を図3に示す。マウスアイソタイプコントロール抗体を加えても、PGE2により誘導されたcAMP産生量に関して有意な阻害効果が見られなかったのに対し、NBG016-mAb14、NBG016-mAb21を加えた場合には、抗体濃度依存的にcAMP産生阻害効果が見られた。データ解析ソフトウェアOriginPro8.1OriginLab社製を用いてロジスティック関数による解析を行ったところ、IC50値はNBG016-mAb14では0.15μg/mL約1.0nM、NBG016-mAb21では0.24μg/mL約1.6nMであった。この結果からNBG016-mAb14、NBG016-mAb21はヒトEP4に対するアンタゴニスト活性を有する機能性抗体であり、ヒトEP4に対するアンタゴニスト活性を有する既存の物質例えば低分子化合物に比して同等以上の強い受容体機能阻害活性を有していることが示された。同様にしてNBG016-mAb9について、PGE2を1.5×10-10M添加して行った試験の結果を図4に示す。上述の解析を行ったところ、NBG016-mAb9のIC50値は4.6μg/mL約28.8nMであった。この結果から、NBG016-mAb9もヒトEP4に対するアンタゴニスト活性を有する機能性抗体であることが示された。11ヒトEP1~4、マウスEP1~4の発現ベクター作製ヒトEP1GenBank登録番号NM_000955、ヒトEP2GenBank登録番号NM_000956ヒトEP3a1GenBank登録番号X83857、マウスEP1GenBank登録番号NM_013641、マウスEP2GenBank登録番号NM_008964、マウスEP3GenBank登録番号NM_011196、マウスEP4GenBank登録番号NM_008965の終止コドンを除くORF配列の5’末端に、CACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC配列配列番号32を付加したDNA断片を、KODFXを用いて常法に従ってPCR増幅した。増幅したDNAは、pENTR/D-TOPOベクターに組み込み、それぞれpENTR-hEP1、pENTR-hEP2、pENTR-hEP3、pENTR-mEP1、pENTR-mEP2、pENTR-mEP3、pENTR-mEP4とした。インサートの塩基配列は常法に従って決定し、配列に誤りがないことを確認した。これら7種類のプラスミドと、1で作製したpDONR-hEP4プラスミドを用いて、GatewayシステムによりそれぞれのインサートをpcDNADEST47ベクターに組み替えた。その結果、pcDNADEST47-hEP1、pcDNADEST47-hEP2、pcDNADEST47-hEP3、pcDNADEST47-hEP4、pcDNADEST47-mEP1、pcDNADEST47-mEP2、pcDNADEST47-mEP3、pcDNADEST47-mEP4を得た。これらのプラスミドからは、それぞれのPGE2受容体のC末端にCycle3GreenFluorescentProteinGFPを付加した融合タンパク質が発現される。12抗EP4抗体の結合特異性試験11で作製したpcDNADEST47-hEP1、pcDNADEST47-hEP2、pcDNADEST47-hEP3、pcDNADEST47-hEP4、pcDNADEST47-mEP1、pcDNADEST47-mEP2、pcDNADEST47-mEP3、pcDNADEST47-mEP4、各10μgを、リポフェクトアミン2000を使用して293FT細胞に遺伝子導入した。その翌日に細胞をHBSSで洗浄し、酵素不含細胞解離バッファーによって細胞培養用ディッシュから剥がし取り、遠心操作により回収した。これらの細胞をEP一過性発現293FT細胞と記載する。本発明の抗EP4抗体と、EP一過性発現293FT細胞の結合試験を6に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。8種類のPGE2受容体サブタイプそれぞれの一過性発現293FT細胞は5×105個使用し、1次抗体としては1μgの抗EP4抗体NBG016-mAb14、NBG016-mAb21もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体BioRegend社製を、2次抗体としてはPE標識抗マウスIgG抗体を使用した。例としてNBG016-mAb14の結果を図5に示す。GFP由来の蛍光陽性細胞が存在することから、それぞれのPGE2受容体が293FT細胞上に発現していることが確認できた。しかし8種類の細胞の中でPE蛍光陽性を示したのは、ヒトEP4の発現細胞のみであった。NBG016-mAb21も同様の結果であったことから、本発明の抗EP4抗体はヒト型のEP4に強い特異性を有することが分かった。PGE2受容体サブタイプ結合特異性が、ヒトEP4に対するアンタゴニスト活性を有する既存の物質よりも高いことが示された。同様にNBG016-mAb9の結合特異性を調べた結果を図6に示す。8種類のPGE2受容体サブタイプをそれぞれ発現する細胞のうち、PE蛍光陽性を示したのはヒトEP4の発現細胞のみであった。この結果から、NBG016-mAb9もヒト型のEP4に強い特異性を有することが分かった。13ヒトリンパ球と抗EP4抗体の結合性試験凍結ヒト末梢血単核細胞CellularTechnologyLtd.社製は、使用説明書に従ってCTL-Anti-Aggregate-WashSupplementCellularTechnologyLtd.社製を使用して解凍、調製した。ヒトリンパ球と本発明の抗EP4抗体の結合性試験は、6に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。調製したヒト末梢血単核細胞9×105個に、1次抗体としてNBG016-mAb14、NBG016-mAb21もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体を1.5μg使用し、2次抗体にはAlexa488標識抗マウスIgG抗体を使用した。フローサイトメーターによる解析の際には、前方散乱光と側方散乱光のドットプロットに基づき、細胞集団をリンパ球画分と単核球マクロファージ画分とに区分して、リンパ球画分のAlexa488蛍光強度を調べた。フローサイトメトリーによる解析結果を図7に示す。マウスアイソタイプコントロール抗体による結果を灰色で塗りつぶしたヒストグラムで、抗EP4抗体による結果を黒の実線で示している。抗EP4抗体と反応させた場合にのみ、ヒトリンパ球画分の大部分がAlexa488陽性を示したことから、ヒトリンパ球と抗EP4抗体が結合していることが分かる。この結果より、本発明の抗EP4抗体はヒトの内在性EP4に結合する能力を有していることが明らかとなった。NBG016-mAb9についても同様に、ヒトリンパ球との結合確認実験を行った。ヒト新鮮末梢血からLymphoprepAXISSHIELD社製を使用して、使用説明書に従いヒト末梢血単核細胞を単離した後、抗ヒトCD14マイクロビーズMiltenyiBiotec社製を使用してCD14陰性の細胞画分を分取し、ヒトリンパ球画分とした。以降の結合確認実験は2次抗体としてフルオレセインイソチオシアネートFITC標識抗マウスIgG抗体を用いて、上述の通り行った。図8に示した通り、ヒトリンパ球の大部分がNBG016-mAb9と結合しており、NBG016-mAb9もまたヒトの内在性EP4に結合できることがわかった。14PMA刺激THP1の抗EP4抗体による免疫染色ヒト単球系THP1細胞株は、PMAPhorbol12-myristate13acetate、シグマアルドリッチ社製100nMを含むRPMI培地で、4ウェルカルチャースライドベクトンディッキンソン社製に1ウェルあたり1.5×105細胞になるように播種し、3日間培養してマクロファージ様に分化させた。培地を除いてからPBSで3回洗浄し、1パラホルムアルデヒド溶液200μLにより細胞を固定4°Cで30分間静置した。再度PBSで3回洗浄した後、ヒトガンマグロブリン1mg/mLを含む1BSABovineSerumAlbumin,和光純薬社製を300μL加えてブロッキングした。次に0.1Tween20MPバイオ社製を含むPBSで3回洗浄してから、1mg/mLに調製したNBG016-mAb14、NBG016-mAb21もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体を200μL加えて、4°Cで1時間インキュベートした。免染洗浄バッファーで3回洗浄後、2次抗体のFITC標識抗マウスIgG抗体によって染色した。免染洗浄バッファーで3回洗浄したスライドは、最後にPropidiumIodideを含むVECTASHIELDMountingMediumVectorLaboratories社製で封入した。作製したスライドは蛍光顕微鏡を用いて観察した。免疫染色したTHP1細胞の蛍光顕微鏡観察像を図9に示す。左の像は、マウスアイソタイプコントロール抗体での染色像で、中央にPIで染められた細胞核のみが観察できる。右の像は抗EP4抗体での染色像で、細胞核の周辺にFITCの蛍光が粒状に観察された。この結果から、THP1細胞株をPMAによって分化させたマクロファージ様細胞の細胞膜表面上の天然型EP4に本発明の抗体が結合することが分かった。15PGE2によるサイトカイン抑制効果の抗EP4抗体による阻害PGE2は、マクロファージにおいてLPS刺激によるサイトカイン産生をEP4あるいはEP2を介して抑制することが知られている。本発明の抗体が、EP4を介したPGE2によるサイトカイン産生抑制を回復させるかを、EP4受容体を発現しているPMA分化THP1を用いて調べた。THP1細胞株は、PMA100nMを含むRPMI培地で48ウェル細胞培養プレートに1ウェルあたり2.5×105細胞播種した。3日間培養後、NBG016-mAb14、NBG016-mAb21、マウスアイソタイプコントロール抗体3.0μg/mLを含むRPMI培地に培地交換し、30分間インキュベートした。次に、PGE2を20nMになるように加えてさらに30分間インキュベートした。さらにLPSを100ng/mLになるように加えてから18時間培養した。培養上清を回収し、TNFαHumanDuoSetKitRDシステムズ社製を使用して使用説明書に従い、培養上清中のTNFαの量を測定した。一方、培養上清を回収した後の細胞には、RPMI培地で10倍希釈したアラマーブルーMorphoSys社製を0.5mL加えた。4時間インキュベートした後に、励起波長535nm、検出波長595nmの条件でプレートリーダーARVO1420HTSで蛍光測定した。このアラマーブルーでの測定結果を基に、各ウェル間の相対的な生存細胞数比を求め、生存細胞数比当たりのTNFα生産量を算出した。本発明の抗体が、どの程度PGE2によるサイトカイン産生抑制を回復するかは、以下の基準に基づいて算出した。すなわち、LPS刺激のみを加えたウェルのTNFα量を回復率100、LPS刺激とPGE2を加えたウェルのTNFα量を回復率0として、LPS刺激とPGE2と当該抗体を加えた場合の回復率を算出した。試験結果を表1に示した。マウスアイソタイプコントロール抗体を加えても、PGE2によるTNFα産生抑制に有意な変化は見られなかった。しかしNBG016-mAb14、NBG016-mAb21を加えた場合には、PGE2によるTNFα産生抑制を約50程度回復することが分かった。独立した2回の試験で同様の結果を得た。以上よりNBG016-mAb14、NBG016-mAb21はヒト内在性EP4に対してアンタゴニスト活性を有する機能性抗体であることが明らかになった。16抗EP4抗体の可変領域をコードするcDNAの単離、解析抗EP4抗体を産生するハイブリドーマNBG016-mAb14、NBG016-mAb21約1×107個よりRneasyMiniKitキアゲン社製を用いて、添付の使用説明書に従ってTotalRNAの抽出を行った。5’3’RACEキット、2ndジェネレーションロシュダイアグノスティックス社製にて5’-RACErapidamplificationofcDNAends法によるPCRを行い、重鎖または軽鎖の可変領域の増幅を行った。3’プライマーはマウス定常領域γ1とκに相当するプライマーを使用した。重鎖可変領域増幅のための3’プライマーは5’-AGGGGCCAGTGGATAGACCGATG-3’配列番号33と5’-GGCTGTTGTTTTGGCTGCAGAGAC-3’配列番号34である。軽鎖可変領域増幅のための3’プライマーは5’-ACTGGATGGTGGGAAGATGGATAC-3’配列番号35と5’-TGGATACAGTTGGTGCAGCATCAG-3’配列番号36である。次に、得られた増幅断片をアガロースゲルによって電気泳動し、バンドを切り出し、ゲルを溶かし出すことによってDNAの精製を行った。精製したDNAをT-VectorpMD20タカラバイオ社製に組み込み、塩基配列を解析してアミノ酸配列を決定した。シーケンス反応はABIPrismBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKitsVersion3.1アプライドバイオシステムズ社を使用し、AppliedBiosystems3130xlGeneticAnalyzerアプライドバイオシステムズ社により塩基配列を決定した。塩基配列を解析した結果、NBG016-mAb14の重鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号1、軽鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号3であった。また重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号2、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号4が得られた。さらに、NBG016-mAb21の重鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号11、軽鎖可変領域をコードする核酸配列としてとして配列番号13であった。また重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号12、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号14が得られた。以上の結果から、KabatらSequencesofProteinsofImmunologicalInterestFiftheditionUSDepartmentofHealthandHumanServicesUSGovernmentPrintingOfficeにより定義されるCDR領域のアミノ酸配列が明らかとなった。NBG016-mAb14の重鎖CDR1~3はそれぞれ、配列番号5~7であった。また軽鎖CDR1~3はそれぞれ配列番号8~10であった。また、NBG016-mAb21の重鎖CDR1~3はそれぞれ、配列番号15~17であった。また軽鎖CDR1~3はそれぞれ配列番号18~20であった。重鎖CDRについて両クローンは完全一致していた。NBG016-mAb9に関しても上述の方法に従って、重鎖可変領域は配列番号33と配列番号34のプライマーを、軽鎖可変領域は配列番号35と配列番号36のプライマーを用いて増幅し、可変領域の配列を決定した。NBG016-mAb9の重鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号41、軽鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号42であった。また重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号43、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号44が得られた。NBG016-mAb9の重鎖CDR1~3はそれぞれ、配列番号45~47であった。また軽鎖CDR1~3はそれぞれ配列番号48~50であった。17抗EP4抗体遺伝子のクローニングFirstStrandcDNASynthesisKitForRTPCRAMVロシュダイアグノスティックス社製に付属のOligo-dTPrimerを用いて、使用説明書に従ってcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として、本発明の抗EP4抗体の重鎖および軽鎖遺伝子全長をPCR増幅した。重鎖及び軽鎖の5’末端側は5’-RACEで判明した塩基配列を参考に、3’末端側は定常領域特異的配列を参考に設計した。重鎖遺伝子増幅のための5’プライマーは5’-CACTGACCCTACGCGTATGGAATGGAGATGGATCTTTCTCTTC-3’配列番号37、3’プライマーは5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAG-3’配列番号38である。軽鎖可変領域増幅のための5’プライマーは5’-TTGCAGCCAGGAACGCGTATGGACATGAGGACCCCTGCT-3’配列番号39と5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAACACTCATTCCTGTTGAAGCT-3’配列番号40である。得られた重鎖および軽鎖増幅断片は制限酵素MluIとNotIで切断し、重鎖はpEHX1.1、軽鎖はpELX2.1のMluIとNotIサイトに組み込み、塩基配列を解析してアミノ酸配列を決定した。塩基配列を解析した結果、NBG016-mAb14の重鎖をコードする核酸配列として配列番号22、軽鎖をコードする核酸配列として配列番号24となった。また重鎖のアミノ酸配列として配列番号23、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号25が得られた。NBG016-mAb21の重鎖をコードする核酸配列として配列番号26、軽鎖をコードする核酸配列として配列番号28となった。また重鎖のアミノ酸配列として配列番号27、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号29が得られた。重鎖ならびに軽鎖可変領域のアミノ酸配列は上記5’-RACE法で解析したアミノ酸配列と同一であった。NBG016-mAb9に関しても、上述の方法に従ってcDNAを合成し、それを鋳型としてNBG016―mAb9の重鎖および軽鎖遺伝子全長をPCR増幅した。重鎖遺伝子増幅のための5’プライマーは5’-CACTAGAGCCCCCATACGCGTATGGCTGTCCTGGTGCTGTTCC-3’配列番号51、3’プライマーは5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGTGGGAGAG-3’配列番号52である。軽鎖遺伝子増幅のための5’プライマーは5’-TCCTCAGGTTGCCTCACGCGTATGAAGTTGCCTGTTAG-3’配列番号53と5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAACACTCATTCCTGTTGAAGCT-3’配列番号40である。得られた重鎖および軽鎖増幅断片は制限酵素MluIとNotIで切断し、重鎖はpEHX1.1、軽鎖はpELX2.1のMluIとNotIサイトに組み込み、塩基配列を解析してアミノ酸配列を決定した。NBG016-mAb9の重鎖をコードする核酸配列として配列番号54、軽鎖をコードする核酸配列として配列番号55となった。また重鎖のアミノ酸配列として配列番号56、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号57が得られた。18得られた抗体遺伝子配列が抗EP4抗体をコードしていることの確認NBG016-mAb14、NBG016-mAb21のリコンビナント抗体は、MammalianPowerExpressSystem東洋紡績社製を用いて生産した。軽鎖遺伝子が挿入されたpELX2.1を制限酵素EcoRIとBglIIで切断し、アガロースゲルによって電気泳動して軽鎖遺伝子を含む断片を精製した。精製した軽鎖遺伝子断片を、重鎖遺伝子を挿入されたpEHX1.1のEcoRI-BglIIサイトに組み込み、軽鎖および重鎖両方の遺伝子を保持するプラスミドを作製した。このプラスミドをリポフェクトアミン2000を用いて293FT細胞に形質導入し、一過性での抗体発現を行った。形質導入から72時間後の細胞培養上清を採取し、ヒトEP4安定発現CHO細胞株との結合試験を6に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。コントロールとしては抗体遺伝子未導入の293FT細胞の培養上清を使用した。その結果、培養上清中に分泌されたリコンビナント抗体NBG016-mAb14、NBG016-mAb21は、ヒトEP4に対する結合性を保持していた。このことから、17で得られた抗体遺伝子配列は、抗EP4抗体をコードしていることが確認できた。NBG016―mAb9のリコンビナント抗体も、上述の方法と同様に生産した。軽鎖遺伝子が挿入されたpELX2.1は制限酵素SalIとSpeIで切断し、アガロースゲルによって電気泳動して軽鎖遺伝子を含む断片を精製した。精製した軽鎖遺伝子断片を、重鎖遺伝子が挿入されたpEHX1.1のSalI-SpeIサイトに組み込み、軽鎖および重鎖両方の遺伝子を保持するプラスミドを作製した。このプラスミドを293FT細胞に形質導入し、一過性での抗体発現を行った。形質導入から72時間後の細胞培養上清を採取し、ヒトEP4安定発現CHO細胞株との結合試験を6に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。コントロールとしては抗体遺伝子未導入の293FT細胞の培養上清を使用した。結果を図10に示す。親株Flp-In-CHO細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトEP4安定発現CHO細胞株を黒の実線で示している。培養上清中に分泌されたリコンビナント抗体NBG016―mAb9がヒトEP4に対する結合性を保持していたことから、17で得られたNBG016―mAb9の抗体遺伝子配列は、抗EP4抗体をコードしていることが確認できた。19リコンビナント抗EP4抗体安定発現CHO細胞の作製18で作製した、NBG016-mAb14、NBG016-mAb21の軽鎖および重鎖の遺伝子を保持するベクターを制限酵素SspIで切断し、エタノール沈殿法で精製した。リポフェクトアミン2000を用いてCHO-K1細胞理化学研究所細胞バンクに形質導入し、10ウシ胎児血清を含むHam’sF12培地で24時間培養した。24時間後、10ウシ胎児血清および10μgmLピューロマイシンを含むHam’sF12培地に交換し、3日毎に培地交換をしながら12日間培養した。12日後にペニシリンキャップ法でコロニーを分離した。分離したCHO―K1細胞を24wellplateに播種し、10μgmLピューロマイシンを含むHam’sF12培地で3日間培養した。3日後に10μgmLピューロマイシンを含むHam’sF12培地ウシ胎児血清無添加に交換し、72時間培養後の培養上清を回収した。培養上清中のマウスIgGはELISA法により検出した。PBSを用いて培養上清の希釈系列を作製し、Maxisorp96wellplateNunc社製に分注して4°Cで一晩静置した。翌日、3BSAを含むPBSを加えて室温で1時間静置してブロッキングした。0.1Tween20を含むPBSで洗浄した後、1BSAを含むPBSで4,000倍に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼHRP標識抗マウスIgG抗体ミリポア社製を加え、室温で1時間静置した。0.1Tween20を含むPBSで洗浄した後、発色試薬SureblueTMBmicrowellperoxidasesubstrate、KirkegaardPerryLaboratories社製を100μL加えて室温で5分静置した後、100μLの1N硫酸を加えて反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。その結果、軽鎖および重鎖の遺伝子を保持するベクターを導入して株化したCHO-K1細胞の上清で、IgGの発現を確認した。リコンビナント抗EP4抗体とヒトEP4安定発現CHO細胞株の結合試験19で樹立した細胞株培養上清から7と同様にして、リコンビナント抗体NBG016-mAb14、リコンビナント抗体NBG016-mAb21を精製した。得られた精製リコンビナント抗EP4抗体と、ヒトEP4安定発現CHO細胞株の結合試験を6に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。精製リコンビナント抗EP4抗体もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体は細胞5×105個あたり1μgを使用した。2次抗体にはPE標識抗マウスIgG抗体を使用した。図11にその結果を示す。親株Flp-In-CHO細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトEP4安定発現CHO細胞株を黒の実線で示している。リコンビナント抗体NBG016-mAb14、リコンビナント抗体NBG016-mAb21が共に、ヒトEP4安定発現CHO細胞株にのみ結合していることから、精製リコンビナント抗EP4抗体が、ヒトEP4に対する結合性を保持していることが確認された。21マウスIgG1型抗体NBG016-mAb21発現ベクターの作製7で精製したNBG016-mAb21はサブクラスがIgG2aであった。そこで、NBG016-mAb21のサブクラスをIgG1に改変し、マウスIgG1型抗体NBG016-mAb21を作製した。マウスIgG1型抗体NBG016-mAb21遺伝子はOverlappingPCR法で以下の通り作製した。NBG016―mAb21の重鎖遺伝子を鋳型として、5’-CACTGACCCTACGCGTATGGAATGGAGATGGATCTTTCTCTTC-3’配列番号37と5’-GACAGATGGGGGTGTCGTTTTAGCGCTAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3’配列番号58を用い、NBG016―mAb21の可変領域遺伝子をPCR増幅した。一方で、マウスIgG1を産生するハイブリドーマのTotalRNAから合成したcDNAを鋳型にして、5’-GGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGCGCTAAAACGACACCCCCATCTGTC-3’配列番号59と5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAG-3’配列番号38を用い、マウスIgG1のCH1から定常領域遺伝子までをPCR増幅した。増幅して得られた重鎖可変領域遺伝子とCH1―定常領域遺伝子断片を混合し、配列番号37と配列番号38のプライマーを用いてPCR増幅した。増幅して得られたDNA断片を制限酵素MluIとNotIで切断し、発現ベクターpEHX1.1のMluI-NotIサイトに挿入した。得られた発現ベクターを制限酵素EcoRIとBglIIで切断し、NBG016-mAb21の軽鎖遺伝子断片EcoRI-BglII断片を挿入してマウスIgG1型抗体NBG016-mAb21発現ベクターとした。22マウスIgG1型抗体NBG016-mAb21安定発現株作製方法8mMグルタミンを含むEX-CELLCDCHO培地SAFCBioscience社製で培養した浮遊CHO-KI細胞東洋紡績社25×105cells/mlを24穴プレートの2ウェルに1mlずつ分注した。Opti-MEM136μl、リポフェクトアミン200015μl、および制限酵素SspIで切断したマウスIgG1型抗体NBG016-mAb21発現ベクター4μgを混合し、室温で20分放置した後、CHO-K1を入れたウェルに68μlずつ添加し、CO2インキュベーターで24時間インキュベートした。24時間後の細胞を8mMグルタミンを含むEX-CELLCDCHO培地8mlに細胞を懸濁し、6穴プレートの2ウェルに4mlずつ分注した。一方のウェルに10mg/mlのピューロマイシンを3μl、もう一方のウェルに4μl添加し、3日または4日毎に培地を交換しながら18日間培養した。増殖したウェルの細胞を回収して、5cells/mlになるようにConditionedmedium1l当たりEX-CELLCDCHO培地700ml、浮遊CHO-KI細胞培養上清300ml、10mg/mlピューロマイシン1mlまたは0.75mlを混合した培地に懸濁して、96穴プレートに200μlずつ分注した。1週間後にConditionedmediumを100μl添加し、さらに1週間培養した。数回継代培養した後、薬剤耐性細胞4×104cells/mlを24穴プレートに500μl入れ、5日間培養した。5日後にMouseIgGEIAKitタカラバイオ社製を用いて上清中の抗体量を定量して抗体生産細胞をスクリーニングした。この細胞をマウスIgG1型抗体NBG016-mAb21安定発現CHO細胞株とした。23マウスIgG1型抗体NBG016-mAb21の精製マウスIgG1型抗体NBG016-mAb21安定発現CHO細胞株を、8mMグルタミン、7.5μg/mlピューロマイシンを含むEX-CELLCDCHO培地で10日間培養して抗体を産生させた。この培養上清200mLから7と同様にして精製IgGを得た。以降、得られた精製IgGをマウスIgG1型抗体NBG016-mAb21とした。24マウスIgG1型抗体NBG016-mAb21とヒトEP4の結合試験マウスIgG1型抗体NBG016-mAb21と、ヒトEP4安定発現CHO細胞株の結合試験を9と同様に実施した。結果を図12Aに示す。親株Flp-In-CHO細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトEP4安定発現CHO細胞株を黒の実線で示している。マウスIgG1型抗体NBG016-mAb21がヒトEP4安定発現CHO細胞株にのみ結合していることから、作製したマウスIgG1型抗体NBG016-mAb21が、ヒトEP4に対する結合性を保持していることが確認された。25PGE2によるcAMP産生に対するマウスIgG1型抗体NBG016-mAb21の阻害試験マウスIgG1型抗体NBG016-mAb21が、PGE2によるcAMP産生を阻害するかを10と同様に調べた。細胞と抗体を室温で15分間反応させた後、PGE2を1.5×10-10Mになるように加え、さらに室温で30分間静置した。cAMP量は、LANCEUltracAMPKitパーキンエルマー社製を用いて、使用説明書に従った反応を行って測定した。その結果を図12Bに示す。マウスアイソタイプコントロール抗体を加えても、PGE2により誘導されたcAMP産生量に関して有意な阻害効果が見られなかったのに対し、マウスIgG1型抗体NBG016-mAb21を加えた場合には、その抗体濃度に依存的なcAMP産生阻害効果が見られた。IC50値は1.1μg/mL約6.9nMであった。この結果からNBG016-mAb21をマウスIgG1型抗体に改変してもEP4に対するアンタゴニスト活性を保持していることが示された。26ヒトキメラ型抗体NBG016―mAb14および21の作製NBG016―mAb14および21のCH1領域以降をヒト抗体遺伝子に置換したヒトキメラ型抗体は、MammalianPowerExpressSystem東洋紡績社製を用いて生産した。NBG016―mAb14および21の重鎖可変領域遺伝子を、5’-CACTGACCCTAAGCTTATGGAATGGAGATGGATCTTTCTCTTC-3’配列番号60と5’-GGCTGTTGTGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT-3’配列番号61を用いてPCR増幅した。得られた重鎖遺伝子断片は制限酵素HindIIIとNheIで切断し、発現ベクターpEHγX1.1のHindIII-NheIサイトに挿入した。一方で、NBG016―mAb14および21の軽鎖可変領域遺伝子を5’-ATTGCAGCCAGGAGAATTCATGGACATGAGGACCCCTGCT-3’配列番号62と5’-GGTGCAGCATCCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCC-3’配列番号63を用いてPCR増幅した。得られた軽鎖遺伝子断片は制限酵素BsiWIとEcoRIで切断し、発現ベクターpELκX2.1のBsiWI-EcoRIサイトに挿入した。軽鎖遺伝子が挿入されたpELκ2.1を制限酵素BglII、NotI、ScaIで切断し、アガロースゲルによって電気泳動して軽鎖遺伝子を含む断片を精製した。精製した軽鎖遺伝子断片を、重鎖遺伝子が挿入されたpEHγX1.1のBglII―NotIサイトに組み込み、軽鎖および重鎖両方の遺伝子を保持するプラスミドを作製した。このプラスミドをリポフェクトアミン2000を用いて293FT細胞に形質導入し、一過性での抗体発現を行った。形質導入から72時間後の細胞培養上清を採取し、ヒトEP4安定発現CHO細胞株との結合試験を6に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。コントロールとしては抗体遺伝子未導入の293FT細胞の培養上清を、2次抗体としてはPE標識抗ヒトIgG抗体アブカム社製を使用した。図13に結果を示す。親株Flp-In-CHO細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトEP4安定発現CHO細胞株を黒の実線で示している。この結果より、培養上清中に分泌されたヒトキメラ型抗体NBG016―mAb14および21は、ヒトEP4に対する結合性を保持していることが確認された。これらの結果から、本発明により提供される抗体をコードする核酸配列を用いて、その機能を保持するリコンビナント抗体例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト抗体等の生産が可能であることが示された。"