"共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子に結合する発光プローブからの光を検出して前記粒子を検出する方法であって、前記粒子と前記発光プローブとを含む試料溶液を調製する過程と、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出する過程と、前記検出された光から個々の粒子に結合した発光プローブからの光信号を個別に検出して前記粒子を個別に検出する過程とを含むことを特徴とする方法。請求項1の方法であって、更に、前記個別に検出された粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。請求項1又は2の方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを特徴とする方法。請求項1乃至3のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記粒子に結合した前記発光プローブの拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。請求項1乃至4のいずれかの方法であって、前記個々の粒子に結合した発光プローブからの光信号を個別に検出して前記粒子を個別に検出する過程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、1つの粒子が前記光検出領域に入ったことが検出されることを特徴とする方法。請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記試料溶液を調製する過程に於いて、前記粒子に結合していない前記発光プローブを前記試料溶液内から分離する過程を含むことを特徴とする方法。請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記試料溶液を調製する過程に於いて、前記粒子に結合していない前記発光プローブに該発光プローブの発する光を吸収するアクセプターを結合させる過程を含むことを特徴とする方法。請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記発光プローブが、前記粒子に結合すると発光特性が変化する物質であり、前記検出される光が、前記粒子に結合した前記発光プローブから放出される光であることを特徴とする方法。請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記発光プローブが、互いに近接しているときに蛍光エネルギー移動現象を発生するエネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とを有し且つ前記粒子に結合した状態と前記粒子に結合していない状態との間で前記エネルギードナー部位と前記エネルギーアクセプター部位との距離が異なり、前記粒子に結合した状態と前記粒子に結合していない状態とで放出する光の波長特性が異なる物質であり、前記検出される光が前記粒子に結合した前記発光プローブから放出される光であることを特徴とする方法。請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記発光プローブが蛍光エネルギー移動を生ずるエネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とを有し、前記試料溶液を調製する過程が前記粒子と結合した前記発光プローブを分解する反応を実行する過程を含み、前記検出される光が前記反応により分解された前記発光プローブから放出される光であることを特徴とする方法。請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記発光プローブが、蛍光エネルギー移動現象に於けるエネルギードナーと成る第一のプローブと、前記蛍光エネルギー移動現象に於けるエネルギーアクセプターと成る第二のプローブとを含み、前記検出される光が、前記第一及び第二のプローブの両方が前記粒子に結合した状態に於いて生ずる蛍光エネルギー移動現象を経て発せられる前記第二のプローブの光であることを特徴とする方法。請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記粒子が前記発光プローブの発する光のエネルギーアクセプターと成る部位を有し、前記検出される光が、前記発光プローブが前記粒子に結合することにより生ずる蛍光エネルギー移動現象を経て前記粒子の有する前記エネルギーアクセプター部位から発せられる光であることを特徴とする方法。請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記粒子が発光部位を有し、前記発光プローブが前記粒子の発光部位の発する光のエネルギーアクセプターと成る部位を有し、前記検出される光が、前記発光プローブが前記粒子に結合することにより生ずる蛍光エネルギー移動現象を経て前記発光プローブから発せられる光であることを特徴とする方法。請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記粒子が核酸であり、前記発光プローブが核酸結合性タンパク質であることを特徴とする方法。請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記発光プローブが、少なくとも二つの構成要素から成る物質であって、前記粒子に結合すると前記少なくとも二つの構成要素の互いの位置が変化して蛍光を発する物質であることを特徴とする方法。上記のFCS、FIDA、PCHなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい典型的には、コンフォーカルボリュームの体積は、1fL程度となるので、蛍光分子等の濃度は、1nM程度若しくはそれ以上であることが好ましい。。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには例えば、1nMを大幅に下回るときには、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生し、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなるので、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。特許文献5、6に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定でき、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献6では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができず、例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献7に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出するものであり、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではないので、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献7の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含むため、検査に必要な試料量は、FCS、FIDA、PCHなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者に於いて複雑で高度な操作技術が要求されると考えられる。そこで、本願出願人は、特願2010-044714及びPCT/JP2011/53481に於いて、FCS、FIDA、PCHなどの光分析技術にて実行されている如き統計的処理を含まず、従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がそれらの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することを可能にするために、新規な原理に基づいて観測対象粒子を観測する光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、FCS、FIDA等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域の位置を移動させながら、即ち、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子以下、発光粒子と称する。が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術以下、走査分子計数法と称する。によれば、FCS、FIDA、PCHなどの光分析技術と同様に測定に必要な試料が微量例えば、数十μL程度であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、FCS、FIDA、PCHなどの光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。本発明の主な課題は、上記の特願2010-044714にて提案された走査分子計数法を更に発展させるべく、特に、発光プローブを用いて試料溶液中に分散してランダムに運動する粒子を観測するために走査分子計数法を有利に用いた方法を提案することである。本発明によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子に結合する発光プローブからの光を検出して粒子を検出する方法であって、粒子と発光プローブとを含む試料溶液を調製する過程と、前記の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出する過程と、検出された光から個々の粒子に結合した発光プローブからの光信号を個別に検出して粒子を個別に検出する過程とを含むことを特徴とする方法が提供される。かかる構成に於いて、試料溶液中に分散しランダムに運動する粒子とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子発光するもの又は発光しないもののいずれであってもよい。であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の物であってよい。また、発光プローブは、観測対象となる粒子に結合又は会合する性質を有し、且つ、光を発する物質通常、分子又はそれらの凝集体であり、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、かかる領域は、共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光プローブが照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する分子又はそれらの凝集体の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。なお、本明細書に於いて、光信号という場合には、特に断らない限り、粒子に結合した発光プローブからの光を表す信号を指すものとする。上記から理解される如く、本発明の基本的な構成に於いては、まず、検出したい粒子とその粒子に結合する発光プローブとが混合されている試料溶液を任意の手法にて調製した後、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出され、これにより、一つの粒子の存在が検出されることとなる実験の態様によっては、発光プローブは一旦検出したい粒子と結合した後に光の検出時には、粒子から解離している場合もあり得る。。そして、逐次的に検出された光に於いて発光プローブからの光信号を個別に検出して、これにより、発光プローブと結合した粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。具体的には、例えば、上記の構成に於いて、個別に検出された粒子を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数を計数するようになっていてよい粒子のカウンティング。かかる構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、上記の本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、FCS、FIDA等の場合と同様に微量1~数十μL程度の試料溶液にて計測及び分析が可能である。上記の本発明の方法の粒子を個別に検出する過程に於いて、逐次的に検出される光信号から、1つの粒子に結合した発光プローブ1つの発光プローブが1つの粒子に結合している場合、複数の発光プローブが1つの粒子に結合している場合、及び、実験態様によって1つの粒子に結合した後粒子から解離した発光プローブである場合を含む。以下同様が光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、1つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。また、上記の光検出領域の位置を移動する過程に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、粒子に結合した発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者に於いて理解される如く、粒子に結合した発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、1つの粒子に結合した発光プローブから得られる光量は低減することとなるので、1つの粒子に結合した発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。更に、上記の光検出領域の位置を移動する過程に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる粒子に結合した発光プローブ即ち、粒子及び発光プローブの結合体、或いは、実験の態様によっては、粒子に結合した後、その粒子から解離した発光プローブの拡散移動速度ブラウン運動による粒子の平均の移動速度よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の方法では、光検出領域が1つの粒子に結合した発光プローブの存在位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、1つの発光プローブから複数回、検出したい粒子の存在を表す光信号が検出されてしまい、検出された光信号と1つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、1つの粒子に結合した発光プローブを、1つの粒子の存在を表す光信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、粒子に結合した発光プローブによって変わるので、上記の如く、粒子に結合した発光プローブの特性特に、拡散定数に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。ところで、上記の説明から理解される如く、本発明の方法に於いては、検出したい粒子の存在は、その粒子と結合又は会合した発光プローブからの光を検出することによって確認される。従って、試料溶液中に粒子に結合していない発光プローブが存在すると、粒子の検出結果の精度が低下することとなる。そこで、本発明の方法の実施の態様に於いては、好適には、試料溶液中に粒子と結合していない発光プローブからの光を検出しないようにするための構成が含まれていてよい。かかる粒子に結合していない発光プローブからの光を検出しないようにするための構成の一つとして、本発明の方法に於ける試料溶液を調製する過程に於いては、粒子に結合していない発光プローブを試料溶液内から分離する過程が実行されてよい。具体的な粒子に結合していない発光プローブの分離方法は、単体の発光プローブ若しくは粒子に結合していない発光プローブと、粒子及び発光プローブの結合体若しくは粒子に結合した発光プローブとの特性の違い、例えば、それらの大きさ又は分子量、任意の物質に対する親和性、帯電状態等の違いを利用して複数の物質を物理的に分離する任意の手法が選択されてよい。発光プローブ単体若しくは粒子に結合していない発光プローブの分離方法の実施の形態としては、クロマトグラフィー親水/疎水性クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど、限外濾過、電気泳動、相分離、遠心分離、溶媒抽出又はフィルター吸着等による吸着抽出又は洗浄を含む操作等の任意の手法により、単体の発光プローブ若しくは粒子に結合していない発光プローブを、粒子及び発光プローブの結合体若しくは粒子に結合した発光プローブから分離して試料溶液内から単体の発光プローブ若しくは粒子に結合していない発光プローブを除去するようになっていてよい。また、粒子に結合していない発光プローブからの光を検出しないようにするための別の構成として、試料溶液中に於いて発光プローブ単体若しくは粒子に結合していない発光プローブと、粒子及び発光プローブの結合体若しくは粒子に結合した発光プローブとで発光特性が異なるように、或いは、発光プローブ単体又は粒子に結合していない発光プローブからの光が試料溶液から放出されないように、発光プローブ又は試料溶液中のその他の成分を選択し、発光プローブ単体若しくは粒子に結合していない発光プローブと、粒子及び発光プローブの結合体若しくは粒子に結合した発光プローブとを区別できるようになっていてもよい。かかる構成は、発光プローブ単体又は粒子に結合していない発光プローブを、粒子及び発光プローブの結合体若しくは粒子に結合した発光プローブから物理的に分離する処理操作を必要としない点で有利である。そのような構成の例の一つとして、上記の本発明の方法に於いて、発光プローブとして、検出したい粒子に結合するとその発光特性が変化する物質が選択され、光を検出する過程に於いて、検出したい粒子に結合した発光プローブからの光が選択的に検出されるようになっていてよい。例えば、検出したい粒子が核酸又は核酸類似物であるときには、発光プローブとして核酸又は核酸類似物に結合すると蛍光強度の増大や蛍光波長の変化が生ずるインターカレーター蛍光色素が選択され、検出したい粒子がタンパク質である場合には、発光プローブとしてタンパク質と結合して周囲環境が変化することにより蛍光強度や蛍光波長が変化する色素例えば、疎水性プローブANS、MANS、TNSといった蛍光色素が選択される。或いは、発光プローブとして、少なくとも二つの構成要素から成る物質であって、検出したい粒子に結合すると前記の少なくとも二つの構成要素の互いの位置が変化して蛍光を発する物質が採用されてもよい。そのような物質の例としては、或る粒子に結合すると、構造変化して強い蛍光を放出するようになる蛍光性タンパク質や、或る粒子に結合すると、集合して蛍光性金属錯体を形成する分子錯体の配位子が挙げられる。かかる構成によれば、いずれの場合も、発光プローブ単体若しくは粒子に結合していない発光プローブは、殆ど発光しないか、発光しても、粒子及び発光プローブの結合体と波長が異なるため、粒子及び発光プローブの結合体からの光を選択的に検出することが可能となる。また、試料溶液中に於いて発光プローブ単体又は粒子に結合していない発光プローブと、粒子及び発光プローブの結合体又は粒子に結合した発光プローブとで発光特性が異なるようにする別の例に於いては、蛍光エネルギー移動現象が有利に用いられてよい。そのような例の一つとしては、例えば、試料溶液を調製する過程に於いて、粒子に結合していない発光プローブに該発光プローブの発する光を吸収するアクセプターを結合させる過程が実行されてよい。ここで、アクセプターとは、発光プローブ単体若しくは粒子に結合していない発光プローブのみに結合又は会合する物質であって、蛍光エネルギー移動によって、発光プローブの放出する光をすぐに吸収する任意の物質クエンチャー消光剤又はエネルギーアクセプターなどである。この構成によれば、検出したい粒子に結合していない発光プローブが、光検出領域に進入しても、その発光プローブは、アクセプターと結合しており、光を発しないか、粒子及び発光プローブの結合体又は粒子に結合した発光プローブの発する光とは異なる波長の光しか放出しないので、粒子及び発光プローブの結合体又は粒子に結合した発光プローブの光のみを検出することが可能となる。具体例としては、検出したい粒子が核酸又は核酸類似物であり、発光プローブが蛍光標識された核酸又は核酸類似物である場合に、試料溶液中にて検出したい粒子と発光プローブと反応させて粒子及び発光プローブの結合体を形成した後に、発光プローブの蛍光標識の光に対するアクセプターが付加された核酸又は核酸類似物を試料溶液中へ添加することにより、検出したい粒子と結合していない発光プローブにアクセプターが付加された核酸又は核酸類似物が結合し、かくして、粒子及び発光プローブの結合体のみからの光を選択的に検出することが可能となる。また、蛍光エネルギー移動現象を利用した別の例では、互いに近接しているときに蛍光エネルギー移動現象を生ずるエネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とを有する物質であって、検出したい粒子に結合すると、エネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位との間の距離が変化するよう構成された物質が発光プローブとして採用されてもよいモレキュラービーコン法、スコーピオン法など。この場合には、発光プローブが検出したい粒子に結合しているか否かによって、蛍光エネルギー移動現象の発生の程度が異なり、従って、発光プローブ単体は発光しないか、その発光波長と粒子及び発光プローブの結合体の発光波長とが異なることとなるので、粒子及び発光プローブの結合体からの光を選択的に検出することが可能となる。更に、蛍光エネルギー移動現象を利用する別の例に於いては、発光プローブとして、蛍光エネルギー移動現象に於けるエネルギードナーと成る第一のプローブと、蛍光エネルギー移動現象に於けるエネルギーアクセプターと成る第二のプローブとを準備し、検出したい粒子と混合される。そうすると、粒子に第一及び第二のプローブの両方が結合して成る結合体からは、蛍光エネルギー移動現象を経て第二のプローブの光が発せられ、第一のプローブからの光と区別して、結合体からの光のみを選択的に検出することが可能となるこの場合、粒子に結合していない第二のプローブは、殆ど発光しない。。或いは、検出したい粒子が発光プローブの発する光のエネルギーアクセプターと成る部位を有している場合には、そのドナーとなる発光プローブを選択し、かかる発光プローブが粒子に結合することにより生ずる蛍光エネルギー移動現象を経て粒子の有するエネルギーアクセプター部位から発せられる光を検出することにより、粒子及び発光プローブの結合体からの光のみを選択的に検出するようになっていてもよく、また、逆に、検出したい粒子が発光部位を有している場合には、発光プローブとして粒子の発光部位の発する光のエネルギーアクセプターと成る部位を有する物質を選択し、発光プローブが粒子に結合することにより生ずる蛍光エネルギー移動現象を経て発光プローブから発せられる光を検出することにより、粒子及び発光プローブの結合体からの光のみを選択的に検出するようになっていてもよい。本発明の方法により検出される粒子は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物又は非生物学的な粒子例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなどであってよく、発光プローブは、前記の粒子に特異的に又は非特異的に結合又は吸着する任意の物質であってよい。例えば、検出されるべき粒子が核酸であるときには、核酸に結合する色素分子、核酸結合性タンパク質などであってよい。上記の本発明の方法は、種々の発光プローブを用いて任意の粒子を検出する実験に利用可能である。例えば、本発明の方法は、発光プローブとして、蛍光エネルギー移動現象が発生するエネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とを有し、且つ、或る粒子と結合しているときには、所定の分解反応で分解される物質を採用して、かかる発光プローブを検査されるべき試料溶液中に添加して、試料溶液の光の検出を行い、蛍光エネルギー移動現象の有無に基づいて、発光プローブが前記の粒子に結合していたか否か、即ち、試料溶液中に前記の粒子が存在していたか否かを検査する、といった実験に利用することができる。即ち、上記の本発明の一つの態様によれば、発光プローブが蛍光エネルギー移動を生ずるエネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とを有し、試料溶液を調製する過程が検出したい粒子と結合した発光プローブを分解する反応を実行する過程を含み、検出される光が前記の反応により分解された発光プローブから放出される光であることを特徴とする方法が提供される。上記の本発明の方法により実現される光分析技術は、その光検出機構自体については、FCS、FIDA、PCHなどの光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、本発明に於いては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、本発明の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がFCS、FIDA、PCH等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。また、本発明では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するようになっているので、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。例えば、特許文献5,6に記載の技術では、所定時間内に於ける所定の閾値以上の強度を有する蛍光信号の頻度の集計値と試料溶液中の蛍光分子等の粒子数との相関を得ることが可能であるが、計測領域を通過する粒子の動的な振る舞い粒子が計測領域を真直ぐ通過したのか、粒子が計測領域内に滞留していたのかを把握することはできず、従って、所定の閾値以上の強度を有する蛍光信号と計測領域を通過する粒子との対応が不明確であったため、発光粒子のカウンティングは原理的に不可能であり、試料溶液中の粒子の濃度を精度よく決定することが困難であった。しかしながら、本発明によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを1対1に対応させて粒子を一つずつ検出するので、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。実際、実施形態の欄に記載されている如く、本発明に従って発光プローブを用いて試料溶液中の粒子を個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度まで決定可能であることが明らかになった。また、複数の発光プローブが1つの粒子に結合する系については、低濃度側だけでなく、高濃度側についても、従前に比して精度良く溶液中の粒子濃度を決定できることが明らかになった。更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する態様によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様に或いは試料溶液が機械的に安定した状態で観測することになるので、例えば、試料に流れを発生させる場合流れを与える場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上し、また、試料溶液中の検出対象となる粒子に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行えることとなる。本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。光分析装置の構成本発明による方法は、基本的な構成に於いて、図1Aに模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。同図を参照して、光分析装置1は、光学系2~17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光Exが、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1~数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域励起領域が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、かかる粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光プローブと結合又は会合した粒子実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後粒子から解離した発光プローブが励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光Emは、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過し、バリアフィルター14を透過してここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。、マルチモードファイバー15に導入されて、光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1Bに模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図1Bに例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1~10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。、コンフォーカルボリュームと称される。また、本発明では、1つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ図示せずには、観察するべきウェル10を変更するべく、マイクロプレート9の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置17aが設けられていてよい。ステージ位置変更装置17aの作動は、コンピュータ18により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図1Cに模式的に例示されている如く、反射ミラー7の向きを変更するミラー偏向器17が採用されてよい。かかるミラー偏向器17は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器17は、コンピュータ18の制御の下、光検出器16による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよいコンピュータ18に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。。なお、図示していないが、対物レンズ8を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域光検出領域のみで光の放出があるので、ピンホール13は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系2~5が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブがりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置1に於いては、図示の如く、複数の励起光源2が設けられていてよく、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器16も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。本発明の光分析技術の原理FCS、FIDA等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FCS、FIDA等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、図15Aに模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度フォトンカウントが検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図15Bに描かれているように、観測対象粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度フォトンカウントが、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。そこで、本発明に於いては、観測対象粒子の濃度が、上記の如きFCS、FIDA等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく光分析技術が提案される。本発明の光分析技術に於いて、実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構ミラー偏向器17を駆動して光路を変更し、図2にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域CVの位置を移動しながら、即ち、光検出領域CVにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図2Aの如く、光検出領域CVが移動する間図中、時間to~t2に於いて1つの粒子図中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。の存在する領域を通過する際t1には、図2Bに描かれている如く有意なパルス状の光強度Emが検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域CVの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図2Bに例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光プローブの結合した粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる本発明の光分析技術の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出されるので、FCS、FIDA等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。また、後に説明される実施例に於いて示されている如く、本発明による試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することが可能である。蛍光分光光度計やプレートリーダーによって或る蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、その場合、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなりS/N比の悪化、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化することとなる。他方、本発明の方法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する過程で、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度を算出するので、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも低い濃度まで検出できることとなる。更にまた、観測対象粒子の1つに複数の発光プローブが結合する場合には、本発明による試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下に濃度を決定する従前の方法よりも、粒子濃度の高い側での粒子濃度の測定精度も向上する。観測対象粒子の一つに複数の発光プローブが結合する場合で或る量の発光プローブが試料溶液に添加されているとき、観測対象粒子の濃度が高くなると、相対的に粒子に結合する発光プローブの数が低減する。その場合、一つの観測対象粒子当たりの蛍光強度が低減するために、蛍光標識された粒子の濃度と光量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化することとなる。他方、本発明の方法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する過程で、一つの粒子当たりの蛍光強度の低減の影響は少なく、粒子数から濃度を算出するので、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも高い濃度まで検出できることとなる。本発明の処理操作過程図1Aに例示の光分析装置1を用いた本発明による方法に於いては、具体的には、1発光プローブとそれが結合する観測対象粒子を含む試料溶液の調製、2試料溶液の光強度の測定処理過程と、3測定された光強度の分析処理過程とが実行される。1試料溶液の調製本発明の方法の観測対象粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象粒子は、典型的には、試料溶液典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。中にて、発光標識蛍光分子、りん光分子、化学生物発光分子が任意の態様にて付加された発光プローブと混合され、発光プローブが観測対象粒子と結合又は会合して結合体を形成することにより、発光プローブの発する光が観測対象粒子の存在の目印となり、観測対象粒子が検出されることとなる後で述べる如く、実験の態様によっては、観測対象粒子に一旦結合した後、所定の処理を経て粒子から遊離した発光プローブが検出されることにより観測対象粒子が検出される。。観測対象粒子と発光プローブの組合せの例としては、観測対象粒子が核酸であるときには、発光プローブは、観測対象粒子である核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸又は核酸類似物、核酸結合性タンパク質、核酸結合性抗体などが選択される。具体的な例として、DNA-RNAの会合体である観測対象粒子に対して、発光プローブとして蛍光標識されたDNA-RNAハイブリッド識別抗体とする例ハイブリッドキャプチャー法が挙げられる。上記の如く、観測対象粒子と発光プローブとを混合して粒子と発光プローブとの結合体を形成することに関して、注意されるべきことは、試料溶液中の実質的に全ての観測対象粒子が発光プローブと結合又は会合している必要があるという点である。即ち、発光プローブと結合又は会合していない観測対象粒子が存在していると、その数だけ試料溶液中の観測対象粒子の数及び/又は濃度が低く観測されてしまう。従って、確実に、実質的に全ての観測対象粒子を発光プローブと結合又は会合させるためには、粒子及び発光プローブの結合体の形成に際して、試料溶液中に於いて、発光プローブの数が観測対象粒子の数よりも上回るように発光プローブを試料溶液へ添加する必要がある。しかしながら、その場合、当然に、試料溶液中で、観測対象粒子に結合又は会合していない発光プローブが存在することとなり、かかる観測対象粒子に結合していない発光プローブ又は発光プローブ単体からの光が粒子及び発光プローブの結合体からの光と区別なく検出されると、やはり観測対象粒子の検出精度が悪化することとになる。従って、発光プローブを用いて観測対象粒子を個別に検出する光分析技術による本発明の方法に於いては、好適には、観測対象粒子に結合していない発光プローブ又は発光プローブ単体からの光が検出されないようにするための構成、即ち、観測対象粒子に結合していない発光プローブ又は発光プローブ単体からの光を検出結果から排除する構成が用いられてよい。かかる構成としては、例えば、以下の構成が採用されてよい。i試料溶液中からの観測対象粒子に結合していない発光プローブの分離観測対象粒子に結合していない発光プローブからの光を検出結果から排除する構成の一つに於いては、図3aに模式的に示されている如く、粒子及び発光プローブの結合体の形成後に、観測対象粒子に結合していない発光プローブ又は発光プローブ単体と、粒子及び発光プローブの結合体又は観測対象粒子に結合した発光プローブとの特性の違い、例えば、それらの大きさ又は分子量、任意の物質に対する親和性、帯電状態等の違いを利用して複数の物質を物理的に分離する任意の手法により、観測対象粒子に結合していない発光プローブ又は発光プローブ単体が試料溶液から分離され除去されてよい。具体的には、クロマトグラフィー親水/疎水性クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど、限外濾過、電気泳動、相分離、遠心分離、溶媒抽出、或いは、フィルター吸着等による吸着抽出又は洗浄を含む操作等の、この分野で通常行われる物理的な物質の分離方法が採用されてよい。また、ELISA法の如く、観測対象粒子及び発光プローブを混合した試料溶液に、更に、観測対象粒子に結合する別のプローブ分離用プローブを混合して観測対象粒子に結合させ、次いで、試料溶液を分離用プローブに結合する担体に曝して、観測対象粒子と発光プローブと分離用プローブとからなる結合体のみを担体に保持する一方、試料溶液中の発光プローブ単体を分離及び除去し例えば、洗浄する、試料溶液から発光プローブ単体を排除する方法が用いられてもよい。ii波長特性が変化する蛍光色素の利用この分野に於いて、或る物質に結合している場合と結合していない場合とで波長特性が変化する蛍光色素が種々知られている。そこで、観測対象粒子に結合していない発光プローブ又は発光プローブ単体からの光を検出結果から排除するために、図3cに模式的に描かれている如く、観測対象粒子に結合すると波長特性が変化する蛍光色素が、発光プローブとして採用されてよい。かかる発光プローブを採用する場合には、発光プローブが観測対象粒子に結合した場合に発光プローブから放出される光を選択的に検出することにより、単体の又は観測対象粒子に結合していない発光プローブを物理的に排除する操作を要することなく、観測対象粒子及び発光プローブの結合体又は観測対象粒子に結合した発光プローブからの光を選択的に検出できることとなる。そのような蛍光色素としては、観測対象粒子に結合すると、励起及び/又は発光波長が変化するもの、或いは、観測対象粒子に結合すると、蛍光強度を顕著に増大するものであってよい。そのような例としては、例えば、核酸又は核酸類似物である観測対象粒子に対しては、核酸のインターカレーター蛍光色素エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、SYTOXOrange、SYTOXRed、SYBRGreenI、SYBRGreenII、SYBRGold、Picogreen、OllGreen、GelRed、GelGreen、RiboGreen、EvaGreen、シアニン骨格を有する色素などが発光プローブとして採用可能である。また、観測対象粒子がタンパク質である場合には、タンパク質と結合して周囲環境が変化することにより蛍光強度や蛍光波長が変化する色素が、発光プローブとして採用可能である。そのような色素としては、例えば、疎水性プローブである1-アニリノナフタレン-8-スルホン酸ANS、N-メチル-2-アニリノナフタレン-6-スルホン酸MANS、2-p-トルイジニルナフタレン-6-スルホン酸TNSなどのナフタレンスルホン酸類、ジメチルアミノナフタレンダンシル類、局所的なpHや誘電率の影響を受けやすいTAMRA、フルオレセイン、6joe、BODIPY、TMR、BODIPYTR、Alexa488、Alexa532、BODIPYFL、BODIPYFLC3、BODIPYFLC6、FITC、EDANS、ローダミン6G、TMR、TMRITC、x-ローダミン、TexasRed、BODIPY5FAM、BODIPYR6G、BODIPY581といった蛍光色素が利用可能である。また、上記の如き蛍光色素の他、少なくとも二つの構成要素から成る物質であって、検出したい粒子に結合すると前記の少なくとも二つの構成要素の互いの位置が変化して蛍光を発する物質が、観測対象粒子に結合すると波長特性が変化する発光プローブとして、採用することが可能である。そのような物質の例としては、或る粒子に結合すると、構造変化して強い蛍光を放出するようになる蛍光性タンパク質や、或る粒子に結合すると、集合して蛍光性金属錯体を形成する分子錯体の配位子が挙げられる。iii蛍光エネルギー移動現象の利用観測対象粒子に結合していない発光プローブからの光を検出結果から排除するための別の構成として、少なくとも2種類の蛍光色素を用いて蛍光エネルギー移動現象の効果を利用して、観測対象粒子に結合していない発光プローブから光が発せられないようにするか、観測対象粒子及び発光プローブの結合体又は観測対象粒子に結合した発光プローブからの光の波長と、単体の又は観測対象粒子に結合していない発光プローブからの光の波長とが互いに異なるようにし、観測対象粒子及び発光プローブの結合体又は観測対象粒子に結合した発光プローブからの光のみを装置1で検出する手法が採用されてもよい。蛍光エネルギー移動現象を利用した態様は、例えば、以下の如くであってよい。例1蛍光エネルギー移動現象を利用した構成として、蛍光消光法が用いられてよい。具体的には、図3bに模式的に示されている如く、観測対象粒子と発光プローブとの結合体の形成後に、単体の又は観測対象粒子に結合していない発光プローブには結合するが、粒子と発光プローブとの結合体には結合しない物質であって、発光プローブの発する光を蛍光エネルギー移動により吸収する物質光アクセプターが、試料溶液中に添加され、試料溶液中の観測対象粒子に結合していない発光プローブ又は発光プローブ単体にのみ結合させられる。そして、かくして光アクセプターを混合した試料溶液を光分析装置1にて観測した場合、粒子及び発光プローブの結合体に於いては、発光プローブから光が発せられ、光検出器にて検出されるが、光アクセプターが結合した単体の又は観測対象粒子に結合していない発光プローブから発せられた光は、かかる光アクセプターに吸収され、従って単体の又は観測粒子に結合していない発光プローブからの光が消光され、検出結果に反映されないこととなる。そのような例として、例えば、核酸又は核酸類似物である観測対象粒子に対して、発光プローブとして、蛍光標識した核酸又は核酸類似物を用いた場合に、観測対象粒子に発光プローブを結合させた後に、光アクセプターとして、発光プローブの蛍光標識の光を吸収する光アクセプター部位を有し且つ発光プローブに相補的な塩基配列を有する核酸又は核酸類似物を添加することにより、発光プローブに光アクセプターが結合し、これにより、観測対象粒子に結合していない発光プローブの蛍光を消光することが可能である。例2発光プローブとして、エネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とを有する物質であって、該発光プローブが観測対象粒子に結合すると、エネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位との間の距離が変化するよう構成された物質が採用されてよい。そのような発光プローブの例として、例えば、モレキュラービーコン、即ち、図3dに模式的に描かれている如く、蛍光エネルギー移動現象に於いてエネルギードナー及びエネルギーアクセプターと成る二つの色素が付加された核酸分子が挙げられる。かかるモレキュラービーコンに於いては、単体では図3d左、付加された色素が近接し、これにより、エネルギードナーに対する励起光の照射の際に蛍光エネルギー移動現象が生じてエネルギードナーの放出する光がエネルギーアクセプターに移動して消光されるか、エネルギーアクセプターの色素の発光波長の光波長2の光が放出されるが、モレキュラービーコンが観測対象粒子核酸又は核酸類似物に結合すると図3d右、二つの色素間の距離が離れ、エネルギードナーに対する励起光の照射の際に蛍光エネルギー移動現象が起こらず、その結果、エネルギードナーの発光波長の光波長1の光が放出される。従って、観測の際には、モレキュラービーコンのエネルギードナーの発光波長の光のみを選択的に検出することにより、試料溶液中にモレキュラービーコン単体が存在していても、観測対象粒子を検出することが可能となる。また、類似の原理としてスコーピオンプローブが用いられてもよい。なお、図示の例とは逆に、発光プローブ単体又は観測対象粒子に結合していない発光プローブに於いて、蛍光エネルギー移動現象が発生せず、粒子及び発光プローブの結合体に於いて蛍光エネルギー移動現象が発生するよう構成された発光プローブが用いられてもよいその場合には、エネルギーアクセプターの発光波長の光が選択的に検出される。。更に、発光プローブは、核酸又は核酸類似物に限らず、少なくとも二つの発光部位を有し、観測対象粒子に結合又は会合すると、少なくとも二つの発光部位間の距離が変化し、これにより、放出される光の波長が変化する物質であってもよい。例3図2eに模式的に示されている如く、発光プローブとして、エネルギードナーと成る第一のプローブ発光プローブ1と、エネルギーアクセプターと成る第二のプローブ発光プローブ2とがそれぞれ準備され、試料溶液中へ添加される。そうすると、観測対象粒子には、発光プローブ1と発光プローブ2との双方が結合して結合体を形成し、かかる状態で発光プローブ1を励起する光が照射されると、結合体内で、蛍光エネルギー移動現象が生じ、結合体からは、発光プローブ2の発光波長の光波長2が放出される。一方、観測対象粒子に結合していない発光プローブ1からは、その発光波長の光波長1が放出され、観測対象粒子に結合していない発光プローブ2は、実質的に励起されず、発光しないこととなる。かくして、図3eの系では、発光プローブ1を発光させることにより、発光プローブ2の発光波長の光が結合体のみから放出されることになるので、発光プローブ2の発光波長の光を選択的に検出することにより、試料溶液中から発光プローブを物理的に除去せずに、高精度にて観測対象粒子の検出をすることが可能となる。例4観測対象粒子が発光部位を有している場合には、発光プローブとして、観測対象粒子の発光部位に対するエネルギードナーとなる物質が選択されてよい。その場合、図3fに模式的に記載されている如く、発光プローブ単体からは、その発光波長の光波長1が放出される一方、発光プローブが結合した観測対象粒子に於いては、発光プローブから放出された光が観測対象粒子の発光部位に吸収され、しかる後、観測対象粒子の発光部位の発光波長の光波長2が放出される。かくして、発光プローブを発光させながら、観測対象粒子の発光部位の発光波長の光を選択的に検出することにより、試料溶液中から発光プローブを物理的に除去せずに、高精度にて観測対象粒子の検出をすることが可能となる。そのような例として、例えば、観測対象粒子が核酸であるときに、発光プローブとして、核酸に結合すると、核酸中のグアニンにエネルギーを与えるグアニンがエネルギーアクセプターと成る任意の蛍光標識された物質が選択されてよい。また、観測対象粒子がタンパク質であるときに、発光プローブとして、タンパク質に結合すると、タンパク質中のトリプトファンにエネルギーを与える即ち、トリプトファンがエネルギーアクセプターと成る任意の標識された物質が選択されてよい。例5観測対象粒子が発光部位を有している場合には、発光プローブとして、観測対象粒子の発光部位に対するエネルギーアクセプターとなる物質が選択されてよい。その場合、図3gに模式的に記載されている如く、発光プローブが結合した観測対象粒子に於いては、発光プローブが観測対象粒子の発光部位から放出された光を吸収し、更に発光プローブの発光波長の光波長2を放出するのに対し、発光プローブ単体は発光しないこととなる。かくして、観測対象粒子の発光部位を発光させながら、発光プローブの発光波長の光を選択的に検出することにより、試料溶液中から発光プローブを物理的に除去せずに、高精度にて観測対象粒子の検出をすることが可能となる。iv観測対象粒子又は発光プローブの分解反応を伴う計測への利用ところで、核酸の塩基配列、構造又は特性を研究する分野に於いて、蛍光エネルギー移動現象が発生するエネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とを有する核酸分子であって、その塩基配列と相補的な核酸に結合した状態に於いて所定の分解反応で分解されるよう構成された核酸分子を、核酸の塩基配列を探索するためのプローブとして利用する実験方法が知られている。かかる実験方法に於いては、端的に述べれば、まず、検査したい試料へ上記のプローブが添加され、もしその試料中にプローブの塩基配列と相補的な塩基配列を含む核酸が存在している場合には、その核酸にプローブが結合することとなる図3h左図参照。その状態で所定の分解反応が実行されると、核酸に結合したプローブのみ又はプローブと核酸の両方が分解され、プローブ上のエネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とがばらばらになるため図3h右図参照、蛍光エネルギー移動現象が発生しなくなり、その結果、エネルギードナー部位からの光波長1が観測可能となる。一方、試料中にプローブの塩基配列と相補的な塩基配列を含む核酸が存在しない場合には、プローブは、核酸に結合せず、所定の分解反応を実行してもプローブは分解されず、従って、プローブ上で、エネルギードナー部位からの光は、エネルギーアクセプター部位に吸収され外部に放出されないままとなる。即ち、上記の実験では、エネルギードナー部位からの光が検出されるか否かによって、試料中に検出したい核酸が試料中に存在するか否かが検出できることとなる。本発明の方法は、上記の如き、蛍光エネルギー移動現象が発生する発光プローブであって、観測対象粒子例えば、核酸に結合すると、所定の分解反応で分解される発光プローブを用いた実験に利用することが可能である。その場合、装置に於いて検出される光は、観測対象粒子に結合し、更に分解された発光プローブの放出する光となる。このような実験方法の例としては、例えば、a検査されるべき核酸又は核酸類似物観測対象粒子を含む試料溶液に、蛍光エネルギー移動現象が発生するエネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とを有するDNAである発光プローブを添加し、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼにより発光プローブが分解されるか否かを検出する方法Taqman法、b検査されるべき核酸又は核酸類似物観測対象粒子を含む試料溶液に、蛍光エネルギー移動現象が発生するエネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とを有し一部にRNAを含むDNAである発光プローブを添加し、RNaseHにより発光プローブが分解されるか否かを検出する方法Cycleave法、c検査されるべき核酸又は核酸類似物観測対象粒子を含む試料溶液に、蛍光エネルギー移動現象が発生するエネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とを有し一部に制限酵素識別領域を含むDNAである発光プローブを添加し、制限酵素により発光プローブが分解されるか否かを検出する方法、d検査されるべき核酸又は核酸類似物観測対象粒子を含む試料溶液に、蛍光エネルギー移動現象が発生するエネルギードナー部位とエネルギーアクセプター部位とを有するDNAである発光プローブを添加し、二重鎖核酸を特異的に分解するエキソヌクレアーゼにより発光プローブが分解されるか否かを検出する方法などが挙げられる。これらの実験を本発明の方法を用いて実行する場合、試料溶液は、それぞれの実験に於ける通常の態様にて調製されてよい。後に詳細に述べる光強度の測定に於いて検出されるべき光の波長は、発光プローブが分解された後に放出される光の波長となる。また、検出される粒子数は、直接的には、分解した発光プローブの数であるが、その数は、発光プローブが結合した核酸又は核酸類似物の分子の数と等しいこととなる。2試料溶液の光強度の測定本発明の光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器17を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動試料溶液内の走査を行う他は、FCS又はFIDAに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、記憶装置図示せずに記憶されたプログラム試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器17は、ミラー7ガルバノミラーを駆動して、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎BINTIMEに、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、或いは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、観測対象粒子より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブのランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図4Aに模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度が図4Bの如くランダムに変化し既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。、個々の観測対象粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図5Aに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図5Bに例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。、個々の観測対象粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度拡散移動速度よりも速く設定される。具体的には、拡散係数Dを有する観測対象粒子より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブがブラウン運動によって半径Woの光検出領域コンフォーカルボリュームを通過するときに要する時間Δtは、平均二乗変位の関係式2Wo2=6DΔt...1から、Δt=2Wo2/6D...2となるので、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度拡散移動速度Vdifは、概ね、Vdif=2Wo/Δt=3D/Wo...3となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、D=2.0×10-10m2/s程度であると予想される場合には、Woが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.2×10-3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の15mm/sなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル典型的には、励起光強度分布と略同様となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。3光強度の分析上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。i一つの観測対象粒子の検出時系列の光強度データに於いて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図5Aに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図7Aに模式的に描かれている如く、光学系により決定される光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル通常、略釣鐘状を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法に於いて、光強度に対して閾値Ioが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Io及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブから発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められるところ、具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブの特性によって選択的に決定されてよい。また、観測対象粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布:I=Aexp-2t2/a2...4であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイルバックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイルに対して式4をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。しかしながら、強度A及び幅aが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析に於いて無視される。ii観測対象粒子のカウンティング観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図6及び図7Bに例示された処理により為されてよい。図6及び図7Bを参照して、時系列の光強度フォトンカウントデータから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例に於いては、上記に説明された光強度の測定、即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データフォトンカウントデータが取得された後ステップ100、かかる時系列光信号データ図7B、最上段検出結果未処理に対して、スムージング平滑化処理が為されるステップ110、図7B中上段スムージング。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度走査速度、BINTIMEに応じて適宜設定されてよい。次いで、スムージング処理後の時系列光信号データに於いて、有意な信号が存在する時間領域パルス存在領域を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算されるステップ120。時系列光信号データの時間微分値は、図7B中下段時間微分に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号パルス信号の始点と終点を有利に決定することができる。しかる後、時系列光信号データ上に於いて、逐次的に、有意な信号パルス信号を検出し、検出されたパルス信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定されるステップ130。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ図7B下段釣鐘型関数フィッティング、釣鐘型関数のピーク強度Imax、パルス幅半値全幅w、フィッティングに於ける最小二乗法の相関係数等のパラメータが算出されるステップ140。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定されるステップ150。かくして、図8左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる粒子数がカウントアップされる。ステップ160。一方、図8右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。上記のステップ130~160の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のパルス信号の探索が完了するとステップ170、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データに於いて検出された観測対象粒子の数とされる。iii観測対象粒子の数密度又は濃度の決定観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難であり、従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液参照溶液について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブと同様の波長特性を有する発光標識蛍光色素等であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Cの参照溶液について、その粒子の検出数がNであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Vtは、Vt=N/C...5により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたVtの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Vtとして採用されるようになっていてよい。そして、Vtが与えられると、粒子のカウンティング結果がnの試料溶液の粒子の数密度cは、c=n/Vt...6により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Cと粒子の数Nとの関係式5の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。蛍光色素を用いた核酸の濃度測定発光プローブとして、DNAのインターカレーター蛍光色素DNAに結合したときに蛍光強度が顕著に増大する色素であるSYTOXOrangeを用い、本発明の方法による試料溶液中のDNAの濃度の測定可能範囲を検証した図3c参照。なお、対照実験として、プレートリーダーにより計測される蛍光強度によるDNAの濃度の測定可能範囲も測定した。試料については、SYTOXOrangeインビトロジェン社、CatNoS11368を10nMにて含むリン酸緩衝液0.05Tween20を含む中に、観測対象粒子として、DNApbr322、タカラバイオ株式会社、CatNo3035を、DNA分子の濃度が0M対照溶液、100fM、1pM、10pM、100pMとなるように溶解して、複数の試料溶液を調製した。なお、SYTOXOrangeは、DNAに結合すると、蛍光強度が約500倍増大する蛍光色素である図3cの波長特性が変化する蛍光色素の例。本発明の方法による計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた1分子蛍光測定装置MF-20オリンパス株式会社を用い、上記の2試料溶液の光強度の測定にて説明した態様に従って、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、633nmのレーザー光を用い、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて660-710nmとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、15mm/秒とし、BINTIMEを10μ秒とし、測定時間は、2秒間とした。光強度の測定後、上記の3ii観測対象粒子のカウンティングに記載された処理手順に従って、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから時系列データ中にて検出された光信号を計数した。ステップ110に於けるデータの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は9個とし、移動平均処理を5回繰り返した。また、ステップ140のフィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、ガウス関数に於けるピーク強度、パルス幅半値全幅、相関係数を決定した。更に、ステップ150に於ける判定処理では、下記の条件20μ秒<パルス幅<400μ秒ピーク強度>1フォトン/10μ秒...A相関係数>0.95を満たすパルス信号のみを観測対象粒子に対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視し、観測対象粒子に対応する光信号であると判定された信号の数をパルス数として計数した。対照実験に於いては、プレートリーダーSH-8000labコロナ社を用いて、上記の各試料溶液について蛍光強度を測定した。励起光波長は、543nmとし、検出光波長は、570nmとし、バンド幅は、励起側、検出側共に12nmに設定した。蛍光強度の計測に際しては、励起光のフラッシュ回数を50回とした計測を3回実行し、その平均を最終的な蛍光強度値とした。図9A、Bは、それぞれ、各濃度の試料溶液について検出された上記の本発明の方法による測定結果パルス数及び対照実験による測定結果蛍光強度を示している。まず、図9Aを参照して、本発明の方法による測定されたパルス数カウントされた光信号数は、核酸濃度の増大に概ね比例して増大した。この結果により、本発明の方法によって、個々の核酸観測対象粒子一つ一つが検出可能であること、そして、本発明の方法に従って個々の観測対象粒子を計数することにより、その濃度を定量的に決定できることが明らかになった。また、図9Bの対照実験に於いては、核酸濃度が0Mであるときの蛍光強度と、核酸濃度が100pMであるときの蛍光強度に有意な差が見られないのに対し、図9Aの本発明の方法に於いては、核酸濃度が0Mであるときのパルス数と、核酸濃度が100pMであるときのパルス数に於いて有意な差が見られた。これは、プレートリーダーにより計測された蛍光強度には、ノイズや異物による光信号が重畳されているため、蛍光強度に対するノイズ又は異物の寄与が相対的に大きくなる低濃度域では、S/N比が悪化するのに対し、本発明の場合には、時系列光信号データに於ける個々のパルス信号が観測対象粒子に対応するか否かを判定し、ノイズ又は異物と判定される光信号を無視するので図8参照、蛍光強度に対するノイズ又は異物の寄与が相対的に大きくなる低濃度域でもS/N比を比較的良好に維持できるようになったためであると考えられる。かくして、本発明の方法によれば、従前の蛍光強度を利用した方法に於いて計測可能であった数密度又は濃度限界よりも低い濃度範囲まで、粒子の数密度又は濃度を決定可能であることが示された。更に、蛍光強度のゆらぎの算出などの統計的処理を含むFCS、FIDA、PCH等の光分析技術に於いて計測可能な粒子濃度の下限が1nM程度であったのに対し、本実施例の計測可能な粒子濃度の下限は、~100fMであり、従って、本発明によれば、FCS、FIDA、PCH等の光分析技術の場合よりも大幅に低い濃度域の粒子について計測可能であることが示された。ところで、図9の結果の高濃度側に着目すると、本発明の場合では、10pMから100pMへの10倍の濃度の増大に対してパルス数の増大幅が期待通り概ね10倍となっているのに対し、対照実験に於いては、10pMから100pMへの濃度の増大に対して蛍光強度の増大幅が期待される10倍よりも小さくなった。かかる現象は、次のように考えられる。即ち、本実施例の系に於いては、図9C左図に例示されている如く、観測対象粒子である核酸に対しては、複数の蛍光色素が結合する。その場合、核酸濃度が蛍光色素に比して低いときには、色素が十分に存在するため、一つの核酸に対する色素の結合数は安定しているところ、核酸の濃度が高くなると、色素が相対的に不足し、図9C右図に例示されている如く、一つの核酸に対する色素の結合数が低下するために、蛍光強度の増大が核酸の濃度に追従しにくくなったものと考えられる。これに対し、本発明は、観測対象粒子に対応する光信号の数を計数するよう構成されているので、一つの核酸に対する色素の結合数が低下することによる影響が小さく、その結果、より高濃度域までパルス数が期待通りに増大したものと考えられる。このことは、複数の発光プローブが観測対象粒子に結合する系に於いて、本発明の方法によれば、従前の蛍光強度が発光する粒子の数密度又は濃度に比例するとの仮定の下に計測可能な数密度又は濃度の上限よりも高い濃度範囲まで、粒子の数密度又は濃度を決定可能であることを示している。モレキュラービーコンを用いた核酸の検出本発明の方法によって、モレキュラービーコンを用いて特定の塩基配列の核酸分子が検出可能であることを検証した。モレキュラービーコンとは、既に触れた如く、両端にドナー色素とアクセプター色素がそれぞれ付加された核酸分子であり、単体では、ドナー色素とアクセプター色素との距離が近接しドナー色素からアクセプター色素への蛍光エネルギー移動現象が発生する一方、自身の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸又は核酸類似物に結合すると、ドナー色素とアクセプター色素との間の距離が離れ、蛍光エネルギー移動現象が発生しないよう構成された分子である図3d参照。実験に於いては、モレキュラービーコンとして、5’末端にTAMRAドナー色素が付加され、3’末端にBHQ-2アクセプター色素、ただし、この場合、蛍光は殆ど発せられない。が付加された下記の塩基配列を有する核酸を用いた。TAMRAcctacgccaacagctccaactacgtaggBHQ2また、観測対象粒子は、下記の塩基配列を有する核酸を用いた。gtagttggagctgttggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagなお、上記の核酸は、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。そして、上記のモレキュラービーコン及び観測対象粒子核酸は、それぞれ、500pM、100nMとなるように、リン酸緩衝液0.05Tween20を含むに溶解し、試料溶液とした。なお、対照溶液としては、観測対象粒子核酸を含まず、500pMにてモレキュラービーコンのみを含む溶液を調製した。本発明の方法による試料溶液及び対照溶液についての計測は、実施例1と同様の条件にて行った。また、対照実験として、プレートリーダーを用いて実施例1と同様に試料溶液及び対照溶液の蛍光強度を測定した。ただし、励起光波長は、550nmとし、検出光波長は、576nmとした。図10A、Bは、それぞれ、試料溶液MBTarget及び対照溶液MBのみについて検出された上記の本発明の方法による測定結果パルス数及び対照実験による測定結果蛍光強度を示している。まず、図10Aを参照して明らかな如く、観測対象粒子である核酸を含む試料溶液のパルス数は、対照溶液の場合に比して顕著に増大し約6倍の差、ばらつきも小さかった。これに対し、図10Bの対照実験の場合、試料溶液の蛍光強度と対照溶液の蛍光強度の平均値に於いて差は見られたが、ばらつきが大きかった。本実施例に於けるモレキュラービーコンの濃度は、上記の如く500pMであり、この濃度は、実施例1の結果から理解されるように、プレートリーダーを用いて蛍光強度から計測可能な濃度の下限に近いことを考慮すると、図10の結果は、本発明の方法によれば、モレキュラービーコンを用いた或る特定の塩基配列を有する核酸の検出が、従前の蛍光強度に基づく検出方法の場合に比して、発光プローブ濃度が低い溶液に於いても、より精度良く達成可能であることを示している。未反応の蛍光標識プローブを物理的な精製により除去した試料溶液中の核酸の検出発光プローブとして、蛍光標識された短い核酸蛍光標識プローブを観測対象粒子となる核酸標的核酸に結合させた後、未反応の蛍光標識プローブを物理的な精製方法により除去して得られた試料溶液に於いて、本発明の方法により、標的核酸が検出できることを検証した。図3a参照具体的には、標的核酸と蛍光標識プローブとを100pM:10nMの割合にてSTE緩衝液200mMNaCl10nMTris1nMEDTApH70に混合して得られた溶液にアニーリングアニーリング温度:95°C、90°C、80°C、70°C、60°C、50°C、40°C、30°C、20°C、各10分、-0.1°C/秒を施した検体ProbeTargetと、の蛍光標識プローブを10nMにてSTE緩衝液に溶解して得られた溶液を同様にアニーリングした検体Probeとを調製した。用いた標的核酸と蛍光標識プローブの塩基配列は、以下の通りである。標的核酸5’gaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttac3’蛍光標識プローブ:ATTO647NggggatcctctagagtcgaccATTO647Nは、蛍光色素である。しかる後、これらの検体の一部をシリカゲルメンブレンQIAGENの精製キットMinElutePCRPurificationkitを用いて精製し、50μLのSTE緩衝液で溶出した。そして、シリカゲルメンブレンによる精製された検体精製ありと精製していない検体精製なしとを、それぞれ、試料溶液として、実施例1と同様の条件にて本発明の方法に従って光の計測及びパルス信号の検出を行った。なお、励起光は、100μWのレーザー光を用い、光の測定時間は、20秒間として、測定は、3回行った。図11は、各検体に於いて検出されたパルス数の平均値棒グラフと標準偏差エラーバーを示している。同図から理解される如く、精製していない検体精製なしでは、標的核酸を含む場合ProbeTargetと標的核酸を含まない場合Probeとで検出されたパルス数に殆ど差異が見られないのに対し、精製した検体精製ありでは、標的核酸を含まない場合Probeのパルス数は、標的核酸を含む場合ProbeTargetに比して大幅に低減された。即ち、このことにより、物理的な精製シリカゲルメンブレンによる精製によって未反応の発光プローブが除去され、観測対象粒子を選択的に検出することが可能となることが示された。蛍光エネルギー移動FRETを用いた核酸の検出発光プローブとして互いに近接すると蛍光エネルギー移動を起こす2種類の蛍光標識された短い核酸供与体ペプチド核酸、受容体ペプチド核酸を観測対象粒子となる核酸標的核酸に結合させ、更に、未反応の発光プローブに特異的に結合する光アクセプター消光プローブを結合させて未反応の発光プローブの蛍光標識からの光を消光させた状態にて、標的核酸上の供与体ペプチド核酸と受容体ペプチド核酸との間で蛍光エネルギー移動現象を起こさせ図12a参照、受容体ペプチド核酸エネルギーアクセプターとなる発光プローブからの光を検出することにより、標的核酸を選択的に検出し、その濃度が決定できることを検証した図3b、e参照。具体的には、蛍光エネルギー供与体ペプチド核酸PANAGENEと受容体ペプチド核酸PANAGENEがそれぞれ200pM、標的核酸SIGMAGENOSYSが1pM、10pM、100pMとなるように0.1PluronicF127を含む10mMTrisHClに添加した試料溶液を調製した。また、標的核酸を含まない試料も用意した。そして、各試料溶液を95°Cで5分間加熱することにより変性させた後、20°Cまで徐々に液温を低下させて、標的核酸とペプチド核酸が結合した会合体を形成させた。降温速度は、0.1°C/秒とし、90°Cで5分間、80°Cで10分間、70°Cで10分間、60°Cで10分間、50°Cで10分間、40°Cで10分間、30°Cで10分間の降温処理を行った。しかる後、供与体ペプチド核酸用消光プローブSIGMAGENOSYSと受容体ペプチド核酸用消光プローブSIGMAGENOSYSをそれぞれ1nMとなるように添加し、20°Cで30分間インキュベーションした。供与体ペプチド核酸、受容体ペプチド核酸、供与体ペプチド核酸消光用核酸、受容体ペプチド核酸消光用核酸、標的核酸の塩基配列は、それぞれ、以下の通りである。供与体ペプチド核酸:Alexa488OOcctacgccaccagctccaac受容体ペプチド核酸:agctgtatcgtcaaggcactOLysAlexa594供与体ペプチド核酸用消光プローブ:ggagctggtggcgBHQ1dTaggBHQ1受容体ペプチド核酸用消光プローブ:BHQ2agBHQ2dTgccttgacgataca標的核酸:atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaat標的核酸に於いて、左下線部は、供与体ペプチド核酸の結合配列であり、右下線部は、受容体ペプチド核酸の結合配列である。Alexa488、Alexa594は、蛍光色素であり、BHQ1、BHQ2は、それぞれ、Alexa488、Alexa594に対する消光分子である。次いで、上記の試料溶液を用いて、本発明の方法に従い、光の計測、パルス信号の検出及びその計数を行った。計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた1分子蛍光測定装置MF20オリンパス株式会社を用い、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、1mWの488nm供与体ペプチド核酸の蛍光色素Alexa488の励起波長に対応する。のレーザー光を用い、検出光波長は、ロングパスフィルターを用いて615nm~受容体ペプチド核酸の蛍光色素Alexa594の発光波長に対応する。とした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、67.5mm/秒とし、BINTIMEを10μ秒とし、測定時間は、2秒間とした。また、測定は各試料5回行った。光強度の測定後、実施例1の場合と同様に、各試料溶液について取得された時系列フォトンカウントデータに於いてパルス信号の検出及び計数を行った。そして、それらの検出パルス数の平均値と標準偏差を算出した。図12Bは、上記の各濃度の標的核酸の試料溶液に於いて、検出されたパルス数の平均値棒グラフと標準偏差エラーバーを示している。同図を参照して、パルス数は、標的核酸濃度が1pM以上に於いて、濃度の増大と共に増大した。これにより、蛍光エネルギー移動を起こす2種類の発光プローブを観測対象粒子に結合させ、エネルギーアクセプターとなる発光プローブの光を検出することにより、観測対象粒子の選択的検出及びその濃度の決定が可能となることが示された。蛍光消光法を用いた核酸観測対象粒子の検出発光プローブとして、蛍光標識された短い核酸蛍光標識プローブを観測対象粒子となる核酸標的核酸に結合させた後、未反応の蛍光標識プローブに対して蛍光消光分子を標識した核酸消光プローブを作用させた試料溶液に於いて、本発明の方法により、標的核酸が検出できることを検証した。図3b参照具体的には、5’末端に蛍光色素Alexa488が修飾された一本鎖核酸プローブ蛍光プローブと、3’末端に消光分子BHQ1が修飾された一本鎖核酸プローブ消光プローブとを、それぞれ5nM、2μMとなるように100mMTrisHClの溶液トリス緩衝液にて溶解した。また、同様にして二本鎖核酸標的核酸を100pM、1nM、10nMとなるようにトリス緩衝液にて溶解した。次いで、5μLの蛍光プローブ溶液、5μLの消光プローブ溶液、5μLの各標的核酸溶液及び35μLのトリス緩衝液を混合した。これらの溶液の温度を、サーマルサイクラーを用いて、95°Cまで上げた後、90分かけて20°Cまで下げることによって、蛍光プローブを標的核酸に対してハイブリダイゼーションさせた。蛍光プローブ、消光プローブ、標的核酸の塩基配列は、以下の通りである。5’→3’方向で記載蛍光プローブ:aaacttgtggtagttggagctgttggcgtagg消光プローブ:aacagctccaactaccacaagttt標的核酸:gaagtacagttcattacgatacacgtctgcagtcaactggaattttcatgattgaattttgtaaggtattttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttgatacagataaaggtttctctgaccattttcatgagtacttattacaagataattatgctgaaagttaagttatctgaaatgtaccttgggtttcaagttatatgtaaccattaatatgggaactttact上記の試料溶液に於いて、消光プローブは多量に存在するので、標的核酸に結合しなかった蛍光プローブは、全て消光プローブに結合し、消光プローブに結合した蛍光プローブからの蛍光は、実質的に消光される。図13A参照次いで、上記の試料溶液を用いて、本発明の方法に従い、光の計測、パルス信号の検出及びその計数を行った。計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた1分子蛍光測定装置MF-20オリンパス株式会社を用い、上記の各々の試料溶液について、時系列光強度データフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、200μWの488nmのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、510-560nmの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域は15mm/秒の移動速度にて回転させ、BINTIMEを10μ秒とし、測定時間は2秒間で5回測定を行なった。そして、実施例1と同様に、測定によって得られた時系列光強度データをスムージング後、微分によりピークの検出を行った。パルス信号とみなされた領域のうち、ガウス関数に近似でき、強度が1以上となるパルスを計数した。各試料溶液から得られたパルス数五回の測定の平均値が図13Bに示されている。同図から理解される如く、パルス数は、標的核酸濃度の増大と共に増加した。特に、5回の測定の標準偏差が0Mの場合と100pMの場合とで重複していないことから、本実施形態の方法によれば、100pM以上の核酸濃度の測定が可能であることが示唆される。QUAL反応を用いた核酸の検出本発明の方法によって、QUALQuenchedautoligation反応非特許文献4を用いて特定の塩基配列の核酸分子が検出可能であることを検証した。図14Aに示されている如く、QUAL反応に於いては、5’末端が蛍光分子白丸と消光分子黒丸とが近接して標識された一本鎖核酸Eプローブ-発光プローブと、3’末端がホスホサルフェイト修飾された一本鎖核酸Nプローブとが、塩基配列が検査されるべき一本鎖核酸標的核酸-観測対象粒子上に、Eプローブの5’末端とNプローブの3’末端とが互いに近接して結合したとき図14A上段、EプローブとNプローブとが互いに結合すると共に図中Xが付された個所、5’末端上の消光分子が遊離することにより図14A下段、5’末端の蛍光分子が発光し、これにより特定の塩基配列を有する核酸の存在が検出される。即ち、観測対象粒子の種類に依存して発光効率が変化する反応の一例である。図3h参照具体的には、5’末端に消光分子Dabcyl、5’末端から3塩基目のtに蛍光分子Alexa488が修飾された一本鎖核酸プローブEプローブ、日本バイオサービス、3’末端がホスホサルフェイト修飾された一本鎖核酸プローブNプローブ、日本バイオサービスをそれぞれ10nM、100nMとなるように100mMTrisHClの溶液に溶解した。また、同様にして一本鎖核酸標的核酸を10pM、100pM、1nM、10nMとなるように100mMTrisHClの溶液にそれぞれ溶解した。そして、3μLのEプローブ溶液、3μLのNプローブ溶液、3μLの各標的核酸溶液、及び、21μLの400mMNaClを含む100mMTrisHClの溶液を混合し、サーマルサイクラーを用いて、これらの溶液の温度を95°Cまで上げた後、50°Cで1時間反応させた。Eプローブ、Nプローブ、標的核酸の塩基配列は、以下の通りである。Eプローブ:tcttgcctacgccaccagctccaacNプローブ:ttctgaattagctgtatcgtcaaggcac標的核酸:gttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaa従って、標的核酸にEプローブとNプローブとが結合し、Eプローブ上の消光分子Dabcylが遊離した場合のみ、Eプローブ上のAlexa488の光が検出されることとなる。次いで、上記の試料溶液を用いて、本発明の方法に従い、光の計測、パルス信号の検出及びその計数を行った。計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた1分子蛍光測定装置MF20オリンパス株式会社を用い、上記の各々の試料溶液について、時系列光強度データフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、200μWの488nmのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、510-560nmの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域は15mm/秒の移動速度にて回転させ、BINTIMEを10μ秒とし、測定時間は2秒間で5回測定を行なった。そして、実施例1と同様に、測定によって得られた時系列光強度データをスムージング後、微分によりピークの検出を行った。パルスとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似でき、強度が1以上となるパルスを計数した。図14Bに於いて示されている如く、パルス数は、標的核酸濃度の増大とともに増大した。特に、5回測定の標準偏差が0pMの場合と10pMの場合とで重複していないことから、本実施形態の方法によれば、10pM以上の核酸濃度の測定が可能であることが示唆される。かくして、上記の本発明の方法によれば、試料溶液内に於いて光検出領域である微小領域の位置を移動させながら、即ち、試料溶液内を走査しながら、光検出領域内を横切る粒子に結合した発光プローブを個別に検出することにより、粒子の存在を個別に検出し、或いは、かかる粒子のカウンティングを行うという手法によって、FCS、FIDA等に於いて実行される蛍光強度のゆらぎの演算等の統計的処理を含まず、従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がFCS、FIDA等で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能となる。なお、本発明の光分析技術は、基本的には、FCS、FIDA等と同様の光学系を使用するので、FCS、FIDA等と組み合わせて実行されてもよい。例えば、複数種の物質を含む溶液中に於いて複数種の物質の間の相互作用等検出する場合などであって、物質の濃度差が大きいとき、例えば、一方の物質の濃度がnMオーダーであり、他方の物質がpMオーダーであるときなどに於いて、濃度の高い物質については、FCS又はFIDAにより測定及び分析を行い、濃度の低い物質については、本発明の光分析技術を用いて測定及び分析を行うといった分析態様が実行されるであろう。そのような場合、図1Aに例示されている如く、複数個の光検出器を準備しておくと有利である。"