"人工コラーゲンを含む肩の腱板細胞、アキレス腱細胞、骨芽細胞及び筋細胞のコラーゲンの産生促進剤。前記コラーゲンが、タイプ1コラーゲンである請求項1に記載のコラーゲンの産生促進剤。前記人工コラーゲンが、濃度005~500の溶液である請求項1又は2に記載のコラーゲンの産生促進剤。前記人工コラーゲンが、濃度005~300の水溶液である請求項1~3のいずれか1に記載のコラーゲンの産生促進剤。前記人工コラーゲンが、以下1~3で表されるペプチドユニットで構成されているポリペプチドである請求項1~4のいずれか1項に記載のコラーゲンの産生促進剤。1[mCOpn]a2[mCOqr]b3[HNRNH]c式中、mは1~18の整数、p及びqは同一又は異なって0又は1、YはProまたはHypハイドロキシプロリンを表し、nは1~20の整数を表す。Zは1~10個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、rは1~20の整数を表し、Rは直鎖状又は分岐鎖状アルキレン基を表す。aとbとの割合はa/b=100/0~30/70モル比であり、p=1及びq=0であるときc=a、p=0及びq=1であるときc=bであり、p=1及びq=1であるときc=abであり、p=0及びq=0であるときc=0である。mが2~12の整数、nが2~15の整数、Zが、GlySarSerGluAspLysHisAla,Val、Leu、Arg、Pro、Tyr、Ileから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基又はペプチド残基で構成されているペプチド鎖、rが1~10の整数、RがC2~12アルキレン基である請求項5に記載のコラーゲンの産生促進剤。さらにヒアルロン酸ナトリウムを含む請求項1~6のいずれか1項に記載のコラーゲンの産生促進剤。さらにRGDペプチドを含む請求項1~7のいずれか1項に記載のコラーゲンの産生促進剤。以下のいずれか1のペプチドを含むコラーゲン産出促進剤。1PHG単位が1~12回の繰り返し配列であるペプチド2PHG配列番号13PHGPHG配列番号24PHGPHGPHGPHG配列番号35PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4以下のいずれか1のペプチドを含むプロテオグリカン産出促進剤。1PHG単位が1~12回の繰り返し配列であるペプチド2PHG配列番号13PHGPHG配列番号24PHGPHGPHGPHG配列番号35PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4以下のいずれか1のペプチドを含む細胞の遊走促進剤。1PHG単位が1~12回の繰り返し配列であるペプチド2PHG配列番号13PHGPHG配列番号24PHGPHGPHGPHG配列番号35PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4本発明の課題は、上記要望にこたえるべく、安全性が高いコラーゲンの産生促進剤、プロテオグリカン産出促進剤及び軟骨細胞の遊走促進剤を提供することである。本発明者らは、上記の目的を達成するために種々研究を重ねた結果、人工コラーゲン、及びPHGペプチドが、上記要望を充足することを見出し、本発明を完成した。つまり、本発明は、以下の通りである。1.人工コラーゲンを含む肩の腱板細胞、アキレス腱細胞、骨芽細胞及び筋細胞のコラーゲンの産生促進剤。2.前記コラーゲンが、タイプ1コラーゲンである前項1に記載のコラーゲンの産生促進剤。3.前記人工コラーゲンが、濃度005~500の溶液である前項1又は2に記載のコラーゲンの産生促進剤。4.前記人工コラーゲンが、濃度005~300の水溶液である前項1~3のいずれか1に記載のコラーゲンの産生促進剤。5.前記人工コラーゲンが、以下1~3で表されるペプチドユニットで構成されているポリペプチドである前項1~4のいずれか1項に記載のコラーゲンの産生促進剤。1[mCOpn]a2[mCOqr]b3[HNRNH]c式中、mは1~18の整数、p及びqは同一又は異なって0又は1、YはProまたはHypハイドロキシプロリンを表し、nは1~20の整数を表す。Zは1~10個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、rは1~20の整数を表し、Rは直鎖状又は分岐鎖状アルキレン基を表す。aとbとの割合はa/b=100/0~30/70モル比であり、p=1及びq=0であるときc=a、p=0及びq=1であるときc=bであり、p=1及びq=1であるときc=abであり、p=0及びq=0であるときc=0である。6.mが2~12の整数、nが2~15の整数、Zが、GlySarSerGluAspLysHisAla,Val、Leu、Arg、Pro、Tyr、Ileから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基又はペプチド残基で構成されているペプチド鎖、rが1~10の整数、RがC2~12アルキレン基である前項5に記載のコラーゲンの産生促進剤。7.さらにヒアルロン酸ナトリウムを含む前項1~6のいずれか1項に記載のコラーゲンの産生促進剤。8.さらにRGDペプチドを含む前項1~7のいずれか1項に記載のコラーゲンの産生促進剤。9.以下のいずれか1のペプチドを含むコラーゲン産出促進剤。1PHG単位が1~12回の繰り返し配列であるペプチド2PHG配列番号13PHGPHG配列番号24PHGPHGPHGPHG配列番号35PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号410.以下のいずれか1のペプチドを含むプロテオグリカン産出促進剤。1PHG単位が1~12回の繰り返し配列であるペプチド2PHG配列番号13PHGPHG配列番号24PHGPHGPHGPHG配列番号35PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号411.以下のいずれか1のペプチドを含む細胞の遊走促進剤。1PHG単位が1~12回の繰り返し配列であるペプチド2PHG配列番号13PHGPHG配列番号24PHGPHGPHGPHG配列番号35PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4本発明では、安全性が高い、コラーゲンの産生促進剤、プロテオグリカン産出促進剤及び軟骨細胞の遊走促進剤を提供できる。以下、本発明を詳細に説明する。人工コラーゲン本発明の人工コラーゲンは、生体由来のコラーゲンではないことを意味する。例えば、以下のようなポリペプチドを本発明の人工コラーゲンとする。本発明の人工コラーゲンであるポリペプチドは、下記式1~3で表されるペプチドユニットで構成されている。1[mCOpn]a2[mCOqr]b3[HNRNH]c式中、mは1~18の整数、p及びqは同一又は異なって0又は1、YはProまたはHypを表し、nは1~20の整数を表す。Zは1~10個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、rは1~20の整数を表し、Rは直鎖状又は分岐鎖状アルキレン基を表す。aとbとの割合はa/b=100/0~30/70モル比であり、p=1及びq=0であるときc=a、p=0及びq=1であるときc=bであり、p=1及びq=1であるときc=abであり、p=0及びq=0であるときc=0である。より詳しくは、前記式1~3のユニットで構成されたポリペプチドにおいて、通常、mは2~12の整数、nは2~15の整数であり、Zは、GlySarSerGluAspLysHisAla,Val、Leu、Arg、Pro、Tyr、Ileから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基又はペプチド残基で構成されているペプチド鎖である。また、前記式において、通常、rは1~10の整数、RはC2~12アルキレン基である。また、本発明のポリペプチドは、下記の繰り返し単位、又はで構成されていてもよい。iペプチドユニット[n]a式中、Y及びnは、前記に同じと、ペプチドユニット[r]b式中、Z及びrは、前記に同じとを、a/b=100/0~40/60モル比の割合で含む繰り返し単位で構成されたポリペプチドiiペプチドユニット[mCOn]a式中、m、n及びYは、前記に同じと、ユニット[HNRNH]c式中、Rは前記に同じとを、実質的にa/c=1/1モル比の割合で含む繰り返し単位で構成されたポリペプチドiiiペプチドユニット[mCOn]a式中、m、n及びYは、前記に同じと、ペプチドユニット[mCOr]b式中、m、r及びZは、前記に同じと、ユニット[HNRNH]c式中、Rは前記に同じとを、a/b=100/0~40/60モル比の割合、なおかつ、実質的に/c=1/1モル比の割合で含む繰り返し単位で構成されたポリペプチド。なお、上記Rで表される直鎖状又は分岐鎖状アルキレン基は、ポリペプチドの物理的および生物学的性質を損なわない範囲であればよく、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、トリメチレン、テトラメチレンなどのC1~18アルキレン基が例示できる。前記アルキレン基Rは、直鎖状のメチレン鎖ssは1~18の整数を表すであってもよい。好ましいRは、C2~12アルキレン基さらに好ましくはC2~10アルキレン基,特にC2~6アルキレン基である。なお、これらの人工コラーゲンの詳細及び製造方法は、特開2003321500に記載されている。加えて、好ましくは、本発明の人工コラーゲンは、株式会社PHGより販売されている人工コラーゲンINCI名:Poly、CASNo60961946:httpwwwphgcojpresearchcollagenhtmlを使用することが好ましい。人工コラーゲンを含むコラーゲン産生促進剤本発明の人工コラーゲンを含む産生促進剤は、少なくとも上記記載の人工コラーゲンを含む。また、人工コラーゲンは、溶液、特に水溶液の形態、好ましくは010~50、より好ましく030~30、最も好ましくは050~20の水溶液にすることが好ましい。なお、人工コラーゲン水溶液とは、人工コラーゲンを水又は生理食塩水に溶解又は一部溶解した溶液を意味する。さらに、本発明のコラーゲン産生促進剤は、追加の活性成分、担体若しくはキャリア、又は添加剤などを含んでいてもよい。前記活性成分としては、例えば、殺菌剤又は消毒剤、抗炎症剤、消炎鎮痛剤、鎮痒剤、抗潰瘍剤、抗アレルギー剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗生物質、皮膚軟化剤、褥瘡皮膚治療剤、ビタミン剤、漢方薬などが例示できる。さらに、ヒアルロン酸ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF、血小板分化増殖因子PDGF、インスリン、インスリン様増殖因子IGF、肝細胞増殖因子HGF、グリア誘導神経栄養因子GDNF、神経栄養因子NF、トランスフォーミング増殖因子TGF、および血管内皮細胞増殖因子VEGF等の増殖因子、骨形成タンパク質BMPや転写因子等のその他のサイトカイン、ホルモン、Mg、Ca及びCO3等の無機塩、クエン酸及びリン脂質等の有機物、抗がん剤等の薬剤等を挙げることができる。担体又はキャリアとしては、生体材料の剤形固形剤、半固形剤、液剤などに応じて、生理学的に許容される種々の担体やキャリアが使用できる。例えば、固形剤の担体としては、結合剤、賦形剤、崩壊剤などが例示できる。加えて、液剤の形態では、担体として、例えば、水、アルコールエタノールなど、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール-ポリプロピレングリコール共重合体、油脂トウモロコシ油、オリーブ油などなどが挙げられる。人工コラーゲンを含むコラーゲン産生促進剤の用途本発明のコラーゲン産生促進剤の用途は、肩の腱板細胞のコラーゲン、アキレス腱細胞のコラーゲン、骨芽細胞のコラーゲン、筋細胞のコラーゲン、特にタイプ1コラーゲンの産出を促進する。本発明のコラーゲン産生促進剤の別の用途としては、軟骨細胞のための足場材料、軟骨細胞の分化増殖材、軟骨再生材として使用することができる。例えば、本発明のコラーゲン産生促進剤は、軟骨細胞培養の好適な足場として、生体外および生体内における軟骨組織の構築を可能にする。また、例えば、本発明のコラーゲン産生促進剤を軟組織欠損部に移植すれば、移植された箇所で軟骨組織の再生分化増殖が促進される。加えて、本発明のコラーゲン産生促進剤の用途である足場材料およびインプラントの形態及び形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、及びペースト状等、任意の形態及び形状を用いることができる。こうした形態や形状は、足場材料やインプラントの使用目的に応じて適宜選択すればよい。人工コラーゲンを含むコラーゲン産生促進剤の投与方法本発明のコラーゲン産生促進剤の投与方法としては、以下の方法が例示されるが、特に限定されない。1本発明のコラーゲン産生促進剤を肩関節に注入して肩の腱板細胞のタイプIコラーゲンの産生を促進させる。2本発明のコラーゲン産生促進剤をアキレス腱部に注入してアキレス腱細胞のタイプIコラーゲンの産生を促進させる。3本発明のコラーゲン産生促進剤を筋肉内に注入して筋細胞のタイプIコラーゲンの産生を促進させる。4本発明のコラーゲン産生促進剤を骨欠損部に使用するスカフォルドに添加して骨芽細胞のタイプIコラーゲンの産生を促進させる。なお、上記1~4のコラーゲン産生促進剤の濃度は、001~50、好ましくは003~10、より好ましくは005~03の範囲で使用する。PHGペプチド本発明のPHGペプチドとは、PHG配列が繰り返し続いたペプチドを意味する。PHG配列の繰り返し単位は、1~12回であり、好ましくは、1、2、4、8回である。加えて、本発明のPHGペプチドは下記で述べる用途の効果を消失させない限りは、適宜、1~5個のアミノ酸の置換、挿入、消失があっても良く、さらに、化学的修飾があっても良い。PHGペプチドを含むコラーゲン産生促進剤の用途本発明のPHGペプチドを含むコラーゲン産生促進剤の用途は、コラーゲン産出促進、特にタイプIコラーゲンの産生を促進させる。より詳しくは、骨芽細胞のタイプIコラーゲンの産生を促進させる。なお、PHGペプチドを含むコラーゲン産生促進剤の濃度は、1~2000μM、好ましくは2~1500μM、より好ましくは3~1000μMの範囲で使用する。PHGペプチドを含むプロテオグリカン産出促進剤の用途本発明のPHGペプチドを含むプロテオグリカン産出促進剤の用途は、プロテオグリカンの産生を促進させる。より詳しくは、軟骨細胞のプロテオグリカンの産生を促進させる。なお、PHGペプチドを含むプロテオグリカン産出促進剤の濃度は、1~2000μM、好ましくは2~1500μM、より好ましくは3~1000μMの範囲で使用する。PHGペプチドを含む細胞の遊走促進剤の用途本発明のPHGペプチドを含む細胞の遊走促進剤の用途は、細胞特に、軟骨細胞、骨芽細胞の遊走を促進させる。なお、PHGペプチドを含むプロテオグリカン産出促進剤の濃度は、1~2000μM、好ましくは2~1500μM、より好ましくは3~1000μMの範囲で使用する。PHGペプチドを含むコラーゲン産生促進剤、プロテオグリカン産出促進剤、細胞の遊走促進剤の投与方法本発明の投与方法としては、以下の方法が例示されるが、特に限定されない。1PHGペプチドをヒアルロン等に添加した後に、肩関節内に投与することで肩の腱板を修復させる。また、関節内注射することで軟骨修復材や軟骨保護剤として使用できる。2PHGペプチドをアキレス腱や筋細胞に注入することで細胞の修復を促進させる。加えて、PHGペプチドを湿布剤に含ませて皮膚より浸透させることで、靱帯や筋肉損傷の修復を促進させる。3PHGペプチドを骨欠損部に充填するスカフォルドに添加することで、周囲より骨芽細胞を遊走させて欠損部に集めて骨欠損の修復を促進させる。4PHGペプチドを軟骨骨欠損部に充填するスカフォルドに添加することで、周囲より軟骨細胞を遊走させて欠損部に集めて軟骨欠損の修復を促進させる。軟骨細胞本発明における使用のための軟骨細胞は、関節軟骨、骨膜および軟骨膜から単離される同種異系または自家細胞、ならびに骨髄からの間葉間質幹細胞を包含する細胞供給源から得られ得る。同種異系細胞は免疫応答および感染性合併症に関する潜在的能力を保有するので、自家細胞から、特に自家の関節軟骨から軟骨細胞を単離することが好ましい。細胞を収集するための技法は既知であり、酵素的消化または外部成長培養が含まれる。次に、収集細胞は、身体への再導入前に細胞培養で増やされる。概して、軟骨組織の最適な再生を提供するためには、少なくとも106、好ましくは少なくとも107細胞が軟骨培養用基材中に含浸されるべきである。プロテオグリカンプロテオグリカンproteoglycanは、糖側鎖としてGAGグリコサミノグリカンを有するタンパク質であり、古くはムコ多糖と呼ばれてきた。骨、軟骨、皮膚などの結合組織に豊富に存在しており、細胞内や細胞膜に存在が認められている。RGDRGDアルギニン-グリシン-アスパラギン酸;配列番号5配列は、いくつかの重要な細胞外マトリックスタンパク質中に見出され、そして細胞表面受容体のインテグリンファミリーのメンバーへの接着リガンドとして働く。典型的なRGD配列は、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-ProGRGDSP;配列番号6である。環状RGDもまた、細胞接着モチーフとして使用可能である。典型的な配列はArg-Gly-Asp-D-Phe-Val配列番号7である。RGD修飾表面は、膜上にそのままでinsitu細胞単層の形成を導く。すなわち、本発明の軟骨培養用基材は、上記いずれかのRGDペプチドを含むことにより、軟骨細胞との接着能力を高め、軟骨細胞の増殖能力を高めることができると考えられる。関節機能改善剤現在、変形性関節症、スポーツ障害後の変形性関節症、関節リウマチ、などの疾患に軟骨保護作用のあるヒアルロン酸製剤を関節内に注射することで有効な治療効果が得られている。例えば、関節機能改善剤であるヒアルロン酸ナトリウム関節内注射液であるスベニール登録商標製造販売元:中外製薬株式会社、アルツ登録商標製造販売元:生化学工業株式会社が販売されている。上記関節機能改善剤の用法用量は、以下の通りである。変形性膝関節症:通常、成人1回25mlヒアルロン酸ナトリウム25mgを1週間毎に連続5回膝関節腔内に投与する。その後、症状の維持を目的とする場合は、2~4週間隔で投与する。肩関節周囲炎:通常、成人1回25mlヒアルロン酸ナトリウム25mgを1週間毎に連続5回肩関節肩関節腔、肩峰下滑液包又は上腕二頭筋長頭腱腱鞘内に投与する。慢性関節リウマチにおける膝関節痛:通常、成人1回25mlヒアルロン酸ナトリウム25mgを1週間毎に連続5回膝関節腔内に投与する。本発明の人工コラーゲン水溶液には軟骨修復効果がある。関節の体積の小さい指関節から、体積の大きい膝関節や股関節など全身の関節軟骨の修復を行うために、濃度を01mgml~300mgmlで変えて投与を行うことが好ましい。また、人工コラーゲン水溶液をヒアルロン酸などと混合することで、軟骨保護効果や軟骨修復効果を増強できる。ここで記載している軟骨には、硝子軟骨と半月板膝関節、関節唇股関節などの線維軟骨を含む。すなわち、本発明の人工コラーゲンをヒアルロン酸又は上記の関節機能改善剤に添加した関節機能改善剤を関節内に投与することで、下記実施例の結果から明らかなように、軟骨保護効果を有し軟骨修復を促進させる効果があると考えられる。また、1cm3の溶液に対して01mgから300mgまでの人工コラーゲンを上記関節機能改善剤25mlに添加することで関節系脳改善剤を製造することができる。本発明のコラーゲン産生促進剤、プロテオグリカン産出促進剤、細胞の遊走促進剤を医療用途に用いる場合には、殺菌又は滅菌して用いることが好ましい。殺菌、滅菌方法としては、種々の殺菌滅菌方法、例えば、湿熱蒸気滅菌、ガンマ線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、薬剤殺菌、紫外線殺菌などが例示できる。これらの方法のうち、ガンマ線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌は、滅菌効率と材料に与える影響が少なく好ましい。本発明のコラーゲン産生促進剤、プロテオグリカン産出促進剤、細胞の遊走促進剤は、種々の被検体被験体の組織例えば、表皮組織及び真皮組織などへ適用できる。被検体は、ヒトに限らず、非ヒト動物例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物であってもよい。以下に、本発明の実施例を示し、本発明を更に具体的に明らかにすることとするが、本発明が、そのような実施例の記載によって何等の制約をも受けるものでないことはいうまでもないところである。また、本発明には、以下の実施例の他にも更には上記した発明の実施の形態における記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱し得ない限りにおいて、当業者の知識に基づいて、種々なる変更、修正、改良等を加え得るものであることが理解されるべきである。人工コラーゲン水溶液の効果確認本発明の人工コラーゲンを含む水溶液のアキレス腱、肩腱板に対する効果を確認した。詳細は、以下の通りである。人工コラーゲン本発明の人工コラーゲンは、株式会社PHGより販売されている人工コラーゲンINCI名:Poly、CASNo60961946:httpwwwphgcojpresearchcollagenhtmlを使用した。細胞の調整NewZealandWhiterabbit7週令♂3羽を麻酔下で屠殺してアキレス腱、rotatorcuff肩の腱板を無菌的に採取した。培養液DMEMwithLGlutamineandPhenolRedPenicillinstreptomycin10FetalBovineSerum50μgmL2phosphoLascorbicacidtrisodiumsalt試薬CollagenaseType1PBSで01に調整後、フィルター滅菌した。TrypsinPBSで025に調整後、フィルター滅菌した。DulbeccosPBS1.靭帯を遠沈管PBS10mLに入れて振とうし、1300rpm20°C5minで遠心し、上清を吸引した。2.靭帯を裁断した後、01コラゲナーゼ溶液45mLを加え、37°Cの恒温槽で揺らしながら12時間処理した。3.上記の溶液に025トリプシンを45mL加え撹拌し、37°Cで揺らしながらさらに2時間処理した。4.上記の溶液にDMEMを9mL加えセルストレイナーに通して組織を取り除いた。5.1300rpm20°C5minで遠心し、上清を吸引した。6.ascorbicacid入り10FBS加DMEMにペレットを懸濁した。7.100mmdishに播種し、37°C、5CO2にて培養した。靱帯細胞の播種semiconfluentに達した靱帯細胞をtripsinEDTA溶液処理によりdishから剥離し、培養液を加えて遠心洗浄した。その後、15×106cellswellにて6wellplateに播種し、37°C、5CO2にて培養を行った。人工コラーゲン水溶液の添加培養開始24時間後において、人工コラーゲンを0コントロール、005、01、02、03に調整した培養液に交換し、7日間作用させた。靱帯細胞の回収RNA抽出上記培養終了後、靱帯細胞を回収し、RNA抽出はRNeasyMiniKitを用いて行った。逆転写反応はQuantiTectReverseTranscriptionKitを用いて行った。より詳しくは以下の方法でRealtimePCRを行った。RealtimePCRRealtimePCRに使用した機種はABIPRISM7000であり、使用した試薬はRealtimePCRMasterMixとPreDevelopedTaqManregAssayReagentsEukaryotic18SrRNA、TaqManregProbekitであった。加えて、使用したprimer配列と反応条件を以下に示す。rabbitcollagentypeIalpha1Oc03396074g1AppliedBiosystems販売COL3A1F5GCTCCTGGACAGAATGGTGAG3配列番号8R5CGCCTTTGACACCTTGAGGA3配列番号9Probe5AAGGAGAAAGAGGTGCTCCC3配列番号10GAPDHF5CCCTCAATGACCACTTTGTGAA3配列番号11R5AGGCCATGTGGACCATGAG3配列番号12Probe5CGAATTTGGCTACAGCAACA3配列番号13反応条件50°C2min95°C10min×50cyclesで行った。肩の腱板に関する結果NewZealandwhiterabbit7週令の肩関節から腱板を採取して1週間人工コラーゲンを添加して培養した場合のtypeIcollagenmRNAの発現を確認した参照:図1。さらに、NewZealandwhiterabbit7週令の肩関節から腱板を採取して1週間人工コラーゲンを添加して培養した場合のtypeIIIcollagenmRNAの発現を確認した参照:図2。以上により、人工コラーゲンを00503の濃度で添加することで肩の腱板のタイプIコラーゲンの産生を促進することができる。さらに、腱板断裂の治療で関節内に定期的に注入することで腱板断裂の修復を促進できる。アキレス腱に関する結果NewZealandwhiterabbit7週令のアキレス腱を採取して1週間人工コラーゲンを添加して培養した場合のtypeIcollagenmRNAの発現を確認した参照:図3。さらに、NewZealandwhiterabbit7週令のアキレス腱を採取して1週間人工コラーゲンを添加して培養した場合のtypeIIIcollagenmRNAの発現を確認した参照:図4。以上により、人工コラーゲンを00503の濃度で添加することでアキレス腱のタイプIコラーゲンの産生を促進することができる。さらに、アキレス腱断裂の手術時で人工コラーゲンを添加することでアキレス腱断裂の修復を促進できる。また、アキレス腱断裂部の皮膚に人工コラーゲンを塗布することで人工コラーゲンを浸透させ、腱の修復を促進することができる。ペプチドが軟骨のプロテオグリカン産生に与える影響の確認PHGペプチドが軟骨のプロテオグリカン産生に与える影響を確認した。使用したPHGペプチドは、以下の通りである。なお、純度は95以上である。PHG配列番号1PHGPHG配列番号2PHGPHGPHGPHG配列番号3PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4軟骨細胞の作製NewZealandwhiterabbit、雄性、89週5匹の肩関節、膝関節を摘出しメスで軟骨層のみを削って採取した。滅菌PBS溶液で洗浄後、DulbeccosModifiedEaglesmedium25mlgentacin25μgmlに04となるようにpronaseを添加して37°Cで2時間インキュベーションした。その溶液を022μmSteriflipを用いて濾過滅菌した。濾過滅菌した溶液に0025となるようにcollagenaseを添加して37°Cでovernightインキュベーションした。その溶液を022μmSteriflipを用いて濾過滅菌した。得られた溶液を洗浄して軟骨細胞を回収後、直径90mmのシャーレに1~2×106cellsdishの軟骨細胞を播き3日一度液替えをした。Confluentになった時点で一回のみ系代培養を行った。以下の実験は1回系代培養した細胞を用いて行った。また、培養液の構成は以下の通りである。培養液の組成DulbeccosModifiedEaglesmediumnutrientmixtureF12HAMSIGMA20FETALBOVINESERUM20ugmlascorbicacidSIGMAを使用し、3日に一度液替えを行った。各ペプチドは0コントロール30100300μmolの濃度で添加した。軟骨細胞のプロテオグリカン産生能の解析各ペプチドを含む水溶液を添加することによる軟骨細胞のプロテオグリカン産生能を測定した。詳細は、以下の通りである。軟骨細胞の播種semiconfluentに達した軟骨細胞をtripsinEDTA溶液処理によりdishから剥離し、培養液を加えて遠心洗浄した。その後15×106cellswellにて6wellplateに播種し、37°C、5CO2にて培養を行った。ペプチド水溶液の添加培養開始24時間後において、それぞれのペプチドを0、30、100、300μmolの濃度に調整した培養液に交換し、7日間作用させ、最後の24時間は更に10μCimlNa35SO4を添加して培養を行った。培養液は3日に1回交換した。回収抽出上記培養終了後、新しい培養液で洗浄し、proteaseinhibitorsを加えたlysisbufferを各wellに入れ、4°Cで4時間抽出を行い、4°C、15000rpmにて20分間遠心した。分離放射活性測定PD10prepackedcolumnを用いて、elutionbufferで溶出し、サンプルを分取した。各フラクションに、ethanolとシンチレーターを加えて混合し、液体シンチレーションカウンターで放射能含有量を測定した。また、この際用いたサンプルのDNA量をHoechst33258dyeにより測定し、cpmmgDNA値を求めた。軟骨細胞のDNA合成能の解析PHGペプチドを含む水溶液を添加することによる軟骨細胞のDNA合成能を測定した。詳細は、以下の通りである。軟骨細胞の播種semiconfluentに達した軟骨細胞をtripsinEDTA溶液処理によりdishから剥離し、培養液を加えて遠心洗浄した。その後、15×105cellswellにて6wellplateに播種し、37°C、5CO2にて培養した。ペプチド水溶液の添加培養開始24時間後において、それぞれのペプチドを0、30、100、300μmolの濃度に調整した培養液に交換し、24時間作用させた。最後の4時間はさらに1μCimlmethyl3HThymidineを添加して培養を行った。回収抽出上記培養終了後、細胞を冷PBSで洗浄し、milliQ水を加えて室温で10分間放置した。セルスクレイパーで細胞をはがしてエッペンに回収し、10TCAを加えて混合した後、室温で30分間放置した。15000rpm4°C5分間遠心した後、上清を取り除き、01NNaOHを加えて沈殿を懸濁した。放射活性測定サンプルにethanolとシンチレーターを加えて混合し、液体シンチレーションカウンターで放射能含有量を測定した。ペプチドが軟骨のプロテオグリカン産生に与える影響の結果NewZealandwhiterabbit7週令の軟骨を採取して4種類のペプチドを各濃度で添加した場合のプロテオグリカン産生能とDNA量を検討した参照:図5、6。以上により、PHG~8までのペプチドで1000μmolの範囲で投与することで軟骨細胞のプロテオグリカン産生を亢進させることができる。軟骨の遊走性の検討本発明の人工コラーゲン及びPHGペプチド投与による軟骨の遊走性を検討した。詳細は、以下の通りである。使用したペプチドは、以下の通りである。なお、純度は95以上である。PHG配列番号1PHGPHG配列番号2PHGPHGPHGPHG配列番号3PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4軟骨細胞の作製NewZealandwhiterabbit、雄性、89週5匹の肩関節、膝関節を摘出しメスで軟骨層のみを削って採取した。滅菌PBS溶液で洗浄後、DulbeccosModifiedEaglesmedium25mlgentacin25μgmlに04となるようにpronaseを添加して37°Cで2時間インキュベーションした。その溶液を022μmSteriflipを用いて濾過滅菌した。濾過滅菌した溶液に0025となるようにcollagenaseを添加して37°Cでovernightインキュベーションした。その溶液を022μmSteriflipを用いて濾過滅菌した。得られた溶液を洗浄して軟骨細胞を回収後、直径90mmのシャーレに1~2×106cellsdishの軟骨細胞を播き3日一度液替えをした。Confluentになった時点で一回のみ系代培養を行った。以下の実験は1回系代培養した細胞を用いて行った。また、培養液の構成は以下の通りである。培養液の組成DulbeccosModifiedEaglesmediumnutrientmixtureF12HAMSIGMA20FETALBOVINESERUM20ugmlascorbicacidSIGMAを使用した。試薬MinimumessentialmediumalphamediumαMEMFetalBovineSerumFBSDulbeccosPBS025trypsinEDTAsolution96WellCellMigrationAssay方法96WellCellMigrationAssaykitを使用した。播種1.実験開始24hr前より、05FBS添加αMEMにて培養した細胞を回収し、カウントした。2.1200rpm、4°Cにて5min遠心し、上清をアスピレートし、washbufferで洗浄後、1×106cellsmLに懸濁した。3.ボトムチャンバーに試薬を添加したメディウムを150μLずつ加えた。4.トップチャンバーに細胞懸濁液を50μLずつ加え、12hrインキュベートした。5.50000、25000、10000、5000、2000及び1000の細胞数のwellを予め用意してコントロールを作成した。添加試薬PHG配列番号1は0コントロール、10、100、300、1000、3000、10000μMの濃度で用意した。PHGPHG配列番号2、PHGPHGPHGPHG配列番号3、PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4は0コントロール、10、30、100、300、1000μMの濃度で用意した。細胞数は、485nm520nmで吸光度を測定して算出した。軟骨の遊走性の検討結果NewZealandwhiterabbit7週令から採取して軟骨に対して、人工コラーゲンを各濃度で添加した溶液での軟骨細胞の遊走性を検討した参照:図7。さらに、NewZealandwhiterabbit7週令の軟骨を採取してPHGペプチドを各濃度で添加した溶液へ軟骨細胞の遊走性を検討した参照:図8。加えて、NewZealandwhiterabbit7週令の軟骨を採取してPHGPHG配列番号2、PHGPHGPHGPHG配列番号3、PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4ペプチドを各濃度で添加した溶液へ軟骨細胞の遊走性を検討した参照:図9。以上により、人工コラーゲンは軟骨細胞の遊走性の効果はなかった。一方、PHGペプチドを300~10000μMの範囲で添加することで軟骨細胞を遊走させることができた。さらに、8のペプチドは30~1000μMの濃度で添加することで軟骨細胞を遊走させることができる。骨芽様細胞に対する人工コラーゲンとPHGペプチドの効果の確認骨芽様細胞に対する人工コラーゲンとPHGペプチドの効果を確認した。詳細は以下の通りである。使用したペプチドは、以下の通りである。なお、純度は95以上である。PHG配列番号1PHGPHG配列番号2PHGPHGPHGPHG配列番号3PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4試薬MinimumessentialmediumalphamediumαMEM10FetalBovineSerum100μM2phosphoLascorbicacidtrisodiumsalt10mMGlycerol2phosphatedisodiumsalthydratefetalbovineserumFBSDulbeccosPBS025trypsinEDTAsolution方法<播種>10FBS添加αMEM培地にMC3T3E1細胞を懸濁させ、24wellplateに1×105cellswellとなるよう1mLずつ播種した。24時間後、メディウムをアスピレートし、人工コラーゲンを0コントロール、001、0025、005、01、02、03、04、05の濃度添加した溶液に置き換えて1週間培養する。PHGペプチドは、0コントロール、3、10、30、100、300、1000、3000、10000μM添加した溶液に置き換えて1週間培養した。<骨芽様細胞の回収RNA抽出>上記培養終了後、靱帯細胞を回収し、RNA抽出はRNeasyMiniKitを用いて行った。逆転写反応はQuantiTectReverseTranscriptionKitを用いて行った。より詳しくは以下の方法でRealtimePCRを行った。<RealtimePCR>RealtimePCRに使用した機種はABIPRISM7000であり、使用した試薬はRealtimePCRMasterMixとPreDevelopedTaqManregAssayReagentsEukaryotic18SrRNA、TaqManregProbekitであった。加えて、使用したprimer配列と反応条件を以下に示す。MousecollagentypeIalpha1Mm00801666g1PreDevelopedTaqManAssayReagentsmouseGAPDH<反応条件>50°C2min95°C10min×50cyclesで行った。骨芽様細胞に対する人工コラーゲンとPHGペプチドの効果の確認結果マウスの3T3骨芽様細胞に人工コラーゲンを添加して1週後のtypeIcollagenのmRNAの発現を確認した参照:図10。さらに、マウスの3T3骨芽様細胞にPHGペプチドを添加して1週のtypeIcollagenのmRNAの発現を確認した参照:図11。以上により、骨芽細胞に00504の範囲で人工コラーゲンを添加することで、骨芽細胞のタイプIコラーゲンの産生を促進できる。さらに、骨芽細胞に10~300μMの範囲でPHGペプチドを添加して骨芽細胞のタイプIコラーゲンの産生を促進することができる。本ペプチドによる骨芽様細胞の遊走性の効果本ペプチドによる骨芽様細胞の遊走性の効果を確認した。詳細は以下の通りである。使用したペプチドは、以下の通りである。なお、純度は95以上である。PHG配列番号1PHGPHG配列番号2PHGPHGPHGPHG配列番号3PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4細胞MC3T3E1細胞試薬MinimumessentialmediumalphamediumαMEMFetalBovineSerumFBSDulbeccosPBS025trypsinEDTAsolution96WellCellMigrationAssay方法96WellCellMigrationAssaykitを使用した。播種1.実験開始24hr前より、05FBS添加αMEMにて培養した細胞を回収し、カウントした。2.1200rpm、4°Cにて5min遠心し、上清をアスピレートし、washbufferで洗浄後、1×106cellsmLに懸濁した。3.ボトムチャンバーに試薬を添加したメディウムを150μLずつ加えた。4.トップチャンバーに細胞懸濁液を50μLずつ加え、12hrインキュベートした。5.50000、25000、10000、5000、2000及び1000の細胞数のwellを予め用意してコントロールを作成した。添加試薬PHG配列番号1は0コントロール、3、30、100、300、1000、3000、10000μMの濃度で用意した。PHGPHG配列番号2、PHGPHGPHGPHG配列番号3、PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4は0コントロール、10、30、100、300、1000μMの濃度で用意した。細胞数は、485nm520nmで吸光度を測定して算出した。マウスの3T3骨芽様細胞を用いてPHG配列番号1、PHGPHG配列番号2、PHGPHGPHGPHG配列番号3、PHGPHGPHGPHGPHGPHGPHGPHG配列番号4ペプチドを添加して溶液へ骨芽様細胞の遊走性を検討した参照:図12~15。さらに、ヒト由来の骨芽様細胞を用いたPHGの遊走性を検討した参照:図16。以上により、PHG単独からPHGが8回繰り返しているまでのペプチドは、3~1000μMの範囲投与することで骨芽細胞を遊走させる効果を持つことを確認した。実施例の結果の総論上記実施例の結果から以下のことが言える。本発明は、人工コラーゲンを含むコラーゲン産生促進剤は以下の効果を有することを確認している。005~03の人工コラーゲンを含むコラーゲン産生促進剤を肩関節腱板に添加して肩の腱板のタイプIコラーゲンの産生を促進できる。005~03の人工コラーゲンを含むコラーゲン産生促進剤をアキレス腱に添加してアキレス腱のタイプIコラーゲンの産生を促進できる。人工コラーゲンを含むコラーゲン産生促進剤を骨に添加して骨芽細胞のタイプIコラーゲンの産生を促進できる。本発明のPHGペプチドを含むコラーゲン産生促進剤、プロテオグリカン産出促進剤、細胞の遊走促進剤は、以下の効果を有することを確認している。30~1000μmolのPHGペプチド{PHG~8}を軟骨細胞に投与することでプロテオグリカン産生を亢進できる。30~1000μMのPHGペプチド{PHG~8}を軟骨細胞に投与することで軟骨細胞を遊走させることができる。PHGペプチドを骨芽細胞に投与することでタイプIコラーゲンの産生を促進できる。30~1000μMのPHGペプチド{PHG~8}を骨芽細胞に投与することで骨芽細胞を遊走させることができる。"