"設計ポリマー-シグナル分子複合体であって、以下:標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対応する配列内で互いに会合された複数の設計モノマーを含む設計ポリマーであって、1つ以上の設計モノマーが、1つ以上の所定のヌクレオチド塩基に対応する、設計ポリマーと;複数のシグナル分子であって、各シグナル分子が設計モノマーと関連付けられ、そして、各シグナル分子が設計モノマーに結合している、複数のシグナル分子と;を備える、複合体。前記標的ポリヌクレオチドがDNAおよびRNAからなる群より選択される、請求項1に記載の複合体。前記標的ポリヌクレオチドがDNAである、請求項2に記載の複合体。前記DNAがcDNAまたはgDNAである、請求項3に記載の複合体。前記設計モノマーが、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対応する配列内で互いに連結される、請求項1に記載の複合体。前記シグナル分子が電磁シグナルを生成する、請求項1に記載の複合体。前記シグナル分子が発光実体を含む、請求項1に記載の複合体。前記シグナル分子がDNA、RNAおよび/またはPNAを含む、請求項1に記載の複合体。前記設計モノマーがDNA、RNAおよび/またはPNAを含む、請求項1に記載の複合体。前記設計モノマーが、約5ヌクレオチド塩基~約20ヌクレオチド塩基に及ぶヌクレオチド塩基の範囲を有する、請求項9に記載の複合体。前記標的ポリヌクレオチド内の各ヌクレオチドが二進コードにより表される、請求項1に記載の複合体。前記ヌクレオチドが、アデニン、シトシン、ウラシル、グアニン、チミンおよびこれらの改変からなる群より選択される、請求項11に記載の複合体。前記二進コードが2つの光検出可能な部分から構成され、該光検出可能な部分の特定の配列がヌクレオチドに対応している、請求項11に記載の複合体。各シグナル分子が前記設計モノマーにハイブリダイズされる、請求項1に記載の複合体。前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが約90以上である、請求項14に記載の複合体。前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが約60~約90の間である、請求項14に記載の複合体。各シグナル分子が分子ビーコンである、請求項1に記載の複合体。前記分子ビーコンが1つ以上のフルオロフォアおよび/または1つ以上のクエンチャーを含む、請求項17に記載の複合体。前記分子ビーコンがヌクレオチド配列を含み、該ビーコンの5’末端上のヌクレオチド配列が、該ビーコンの3’末端上のヌクレオチド配列と相補的である、請求項18に記載の複合体。2つの分子ビーコンが存在し、各々のビーコンが特定の設計モノマーに対応する、請求項17に記載の複合体。第一の分子ビーコンが第一の設計モノマーに対応し、第二の分子ビーコンが第二の設計モノマーに対応する、請求項20に記載の複合体。ナノ細孔システムをさらに備える、請求項1に記載の複合体。前記ナノ細孔システムが、複数のナノ細孔と、1つ以上の検出システムとを備える、請求項22に記載の複合体。前記ナノ細孔システムが、合成の有機または無機の薄いフィルム内に製造された1つ以上のナノ細孔を備える、請求項22に記載の複合体。前記ナノ細孔のサイズが、約0.5nm~約9nmである、請求項24に記載の複合体。前記ナノ細孔システムが、ナノ細孔アレイを含む、請求項22に記載の複合体。前記ナノ細孔システムが、1つ以上のチャネルと脂質二重層とを含む、請求項22に記載の複合体。前記ナノ細孔システム内のナノ細孔が、α溶血素、バクテリオファージλに対するレセプター、グラミシジン、バリノマイシン、OmpF、OmpC、PhoE、Tsx、F線毛およびミトコンドリアポーリンVDACからなる群より選択される、請求項23に記載の複合体。前記ナノ細孔がα溶血素である、請求項28に記載の複合体。前記α溶血素が前庭とチャネルとを含む、請求項29に記載の複合体。前記前庭が、約2.5nmの直径を有する、請求項30に記載の複合体。前記チャネルが、約1.5nmの直径を有する、請求項31に記載の複合体。前記チャネルが、約0.5nm~約2.0nmの範囲に及ぶ細孔サイズを有する、請求項32に記載の複合体。現在、ポリヌクレオチドを配列決定するためのより有効な方法に対する必要性が存在する。本発明は、このような方法を提供する。要旨本発明は、ポリマー分子を分析するため方法に関する。これらの方法は、単一の分子の感度でのDNA分子およびRNA分子の高スループットな読み取りに使用される。本発明の方法は、以下を包含する:1DNAまたはRNA二本鎖の電気的に制御された解離unzipping、21つ以上の分子シグナル検出を使用する、分子の正体identityまたはコードの読み取り、および3核酸とハイブリダイズしたプローブとの間の分子の相互作用例えば、強力に相互作用するプローブは、移行速度にさらなる低下を生じるによる、ナノ細孔通過プロセスnanoporethreadingprocessの制御された減速。本発明は、配列決定法に関し、この方法は、標的ポリヌクレオチド例えば、DNAを設計されたポリヌクレオチドポリマーまたは、単純に設計ポリマーへ変換することを包含する。この設計ポリマーは、検出器により読み取られる二進コードによりコードされ、それにより、元の標的ポリヌクレオチドを反映する配列情報を提供する。本発明の一実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチドは、設計ポリマーに変換される。一局面において、標的の一本鎖が加工される。この変換は、標的ポリヌクレオチドの各々のヌクレオチド塩基を2つの設計モノマーに置き換え、それによってそれらの塩基を二進コードとして表現することを包含する。例えば、塩基アデニンは00により、塩基シトシンは01により、塩基グアニンは10により、そして塩基チミンは11により表現され得る。特定の局面において、各々の設計モノマーは二本鎖ポリヌクレオチド配列である。設計モノマーの各々は、0または1のいずれかを表現する。したがって、標的ポリヌクレオチドの各々かつ全ての塩基に対して、2つの対応する二本鎖の設計モノマーが存在する。一局面において、設計モノマーは、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を反映するような様式で結合し、それによって設計ポリマーを形成する。一局面において、二本鎖の設計ポリマーは、一本鎖の分子に変換される。一本鎖の設計ポリマーは、適切な分子ビーコンとハイブリダイズされる。この各々の分子ビーコンは、1つ以上のシグナル分子と1つ以上のクエンチャーquencher分子とを含む。本発明の一局面において、設計ポリマーは、2つのセットの設計モノマーのみを含む:1一方のセットの設計モノマーは0をコードし、2他方のセットの設計モノマーは1をコードする。本発明の特定の局面において、2つのセットのみの分子ビーコンを使用する。一方のセットの分子ビーコンは0を表す設計モノマーにハイブリダイズする一方で、第二のセットの分子ビーコンは1を表す設計モノマーにハイブリダイズする。一局面において、2つのセットの分子ビーコンは固有のシグナル分子を含み、その結果、0設計モノマーにハイブリダイズする分子ビーコンは、1設計モノマーにハイブリダイズする分子ビーコンとは異なるシグナル分子を有する。個々の設計モノマーへの設計ポリマーのハイブリダイゼーションは、ビーコン-設計ポリマー複合体または単純にBDP複合体を形成する。本発明の一局面において、分子ビーコンは、シグナル分子として適切なフルオロフォアを含む。別の局面において、分子ビーコンは、フルオロフォアのみならず、クエンチャーも含む。特定の局面において、フルオロフォアは、ビーコンの5’末端に位置するが、クエンチャーは、その3’末端に位置する。本発明の方法は、電気的に駆動される二本鎖の核酸の解離を使用する。電気的に駆動されるナノ細孔解離方法を使用することにより、解離時間の制御を維持することができ、例えば、広範に使用される分子ビーコンのような自己クエンチされる蛍光プローブの使用を許容する。有利なことに、解離事象により定められる蛍光プローブの読み取りの瞬間まで、蛍光プローブがクエンチされる異なる測定スキームを使用することができる。本発明の一実施形態は、ナノ細孔システムに関する。一局面において、ナノ細孔は、α溶血素を含む。本発明のナノ細孔を使用して、ポリヌクレオチドの配列情報を得ることができる。BDP複合体を本発明のナノ細孔に導入することができる。一局面において、本発明のナノ細孔に導入される設計ポリマーBDP複合体の3’突出が存在する。この3’突出配列は、BDP複合体の二本鎖部分が細孔の入り口と並列されるまでナノ細孔を通過し得る。ナノ細孔の寸法は、一本鎖のポリヌクレオチドのみが通過し得、それによって二本鎖のBDP複合体の侵入を防止するようになっている。ナノ細孔を横切る電圧を印加して、二本鎖のBDP複合体を解離することができる。この二本鎖の解離は、設計ポリマーからの分子ビーコンの除去を容易にし、それによって、シグナル分子例えば、フルオロフォアがそのシグナル例えば、ルミネセンスを産生することを可能にする。さらに、解離は、ナノ細孔への、かつナノ細孔を通っての一本鎖の設計ポリマーの侵入を可能にする。シグナルは、適切な検出器により検出され得る。適切な時間後、遊離された分子ビーコンは、自己ハイブリダイズし、それによって自身のシグナルをクエンチする。これは反復プロセスである。印加された電圧は、一本鎖の設計ポリマーの次の部分が完全に通り抜けるまで、細孔を通っての解離された一本鎖の設計ポリマーのトランスロケーションを続ける。その際、適切な検出器によりシグナルが記録され、配列中の次の分子ビーコン由来のその次のシグナルが発せられる。その後、BDP複合体から遊離されると分子ビーコンは自己クエンチする。この様式で、設計されたポリマー全体を読むことができる。また、本発明は、単一の分子の検出に使用することができる光学系にも関する。この光学系は、1つ以上のナノ細孔システムと組み合わせて使用することができる。この光学系は、ナノ細孔支持体と2つの電極とを有する特製custommadeのフローセルを備える。電極を使用して、解離プロセスに必要とされる電場を印加する一方で、支持体は、ガラスカバースリップの近位でリン脂質二重層を懸架することを可能にし、高倍率の顕微鏡対物レンズを使用して、この二重層の画像化imagingを可能にする。フローセルは、倒立顕微鏡内のXYZナノポジショナーnanopositioner上にマウントされ、平行移動ステージを使用して、光軸と正確に位置合わせするために移動され得る。本発明は例えば、以下の項目を提供する:項目11つ以上の標的ポリヌクレオチド分子を分析する方法であって、該方法は:a該標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して、1つ以上の設計モノマーを設計する工程であって、ここで、個々の設計モノマーは0または1のいずれかにさらに対応し、2つの個々の設計モノマーは、所定のヌクレオチド塩基と対応し、該個々の設計モノマーは、1つ以上のシグナル分子を有する、工程;b複数の該設計モノマーを連結することにより、1つ以上の設計ポリマーを形成する工程;c1つ以上の所定の設計ポリマーが構築されるまで、工程aと工程bとを反復する工程;d該設計ポリマーとシグナル分子とを混合することによって、ハイブリダイゼーションに適切な条件下で、設計ポリマー-シグナル複合体を形成する工程;およびedの複合体を分析に供する工程、を包含する、方法。項目2前記標的ポリヌクレオチドが、DNA、RNAおよびPNAからなる群より選択される、項目1に記載の方法。項目3前記標的ポリヌクレオチドがDNAである、項目2に記載の方法。項目4前記DNAが、cDNAまたはgDNAのいずれかである、項目3に記載の方法。項目5前記標的ポリヌクレオチドが、一本鎖、二本鎖、またはそれらの両方の組み合わせからなる群より選択される、項目2に記載の方法。項目6前記標的ポリヌクレオチドが、真核生物または原核生物のものであり得る、項目1に記載の方法。項目7前記標的ポリヌクレオチドが、植物または動物のいずれかのものである、項目1に記載の方法。項目8前記標的ポリヌクレオチドが、約10ヌクレオチド塩基~約100,000ヌクレオチド塩基の範囲に及ぶサイズを有し得る、項目1に記載の方法。項目9前記設計モノマーが、1つ以上のヌクレオチド塩基を含む、項目1に記載の方法。項目10前記設計モノマーが、約1ヌクレオチド塩基~約100ヌクレオチド塩基に及ぶヌクレオチド塩基の範囲を有する、項目9に記載の方法。項目11前記設計モノマーが、約5ヌクレオチド塩基~約10ヌクレオチド塩基に及ぶヌクレオチド塩基の範囲を有する、項目9に記載の方法。項目12前記設計モノマーが、DNA、RNAまたはPNAを含み得る、項目9に記載の方法。項目13前記標的ポリヌクレオチドの各々個々の単位が、二進コードにより表される、項目1に記載の方法。項目14前記個々の単位が、アデニン、シトシン、ウラシルuricil、グアニン、チミンおよびこれらの改変からなる群より選択される、項目13に記載の方法。項目15前記二進コードが0と1から構成され、ここで、該0と該1との特定の配列が、前記個々の単位に対応する、項目13に記載の方法。項目16前記設計ポリマーが、前記標的ポリヌクレオチドに対応する特定の配列で整列された1つ以上の設計モノマーから構成される、項目1に記載の方法。項目17前記シグナル分子が前記設計モノマーにハイブリダイズされる、項目1に記載の方法。項目18前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、約90以上である、項目17に記載の方法。項目19前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、約80~約90の間である、項目17に記載の方法。項目20前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、約70~約80の間である、項目17に記載の方法。項目21前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、約60~約70の間である、項目17に記載の方法。項目22前記シグナル分子が分子ビーコンである、項目1に記載の方法。項目23前記分子ビーコンが、1つ以上のフルオロフォアと1つ以上のクエンチャーとを含む、項目22に記載の方法。項目24前記ビーコンの5’末端上のヌクレオチド配列が、該ビーコンの3’末端上のヌクレオチド配列と相補的である、項目23に記載の方法。項目252つの分子ビーコンが存在し、各々のビーコンが特定の設計モノマーに対応する、項目1に記載の方法。項目26第一の分子ビーコンが第一の設計モノマーに対応し、第二の分子ビーコンが第二の設計モノマーに対応する、項目25に記載の方法。項目27工程aと工程bとが、前記設計ポリマーを生成するためのサイクルを形成する、項目1に記載の方法。項目281つのサイクル後に、前記設計ポリマーが6個の設計モノマーを含み、それによって、各々のサイクルの完了後に、該設計ポリマーが、少なくとも6個の設計モノマーにより伸長されている、項目27に記載の方法。項目29前記設計モノマーが、前記設計ポリマー内で互いに共有結合されている、項目28に記載の方法。項目30工程bにおける前記設計ポリマーが二本鎖のポリヌクレオチド分子である、項目1に記載の方法。項目31工程dにおける前記設計ポリマーが部分的に一本鎖であるか、または完全に一本鎖である、項目1に記載の方法。項目32工程eが、ナノ細孔システムへ前記設計ポリマー-シグナル複合体を導入する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。項目33前記ナノ細孔システムが、複数のナノ細孔と1つ以上の検出システムとを備える、項目32に記載の方法。項目34前記ナノ細孔が、1つ以上のチャネルと脂質二重層とを含む、項目33に記載の方法。項目35前記ナノ細孔が、α溶血素、バクテリオファージλに対するレセプター、グラミシジン、バリノマイシン、大腸菌、赤痢菌属、Tsx、F線毛、ミトコンドリアポーリンからなる群より選択される、項目34に記載の方法。項目36前記ナノ細孔がα溶血素である、項目35に記載の方法。項目37前記α溶血素が前庭とチャネルとを含む、項目36に記載の方法。項目38前記前庭が、約2.5nmの直径を有する、項目37に記載の方法。項目39前記チャネルが、約1.5nmの直径を有する、項目37に記載の方法。項目40前記チャネルが、約0.5nm~約2.0nmの範囲に及ぶ細孔サイズを有する、項目34に記載の方法。項目41前記設計ポリマー-シグナル複合体の解離をさらに包含し、それにより該設計ポリマーの一本鎖部分が、前記ナノ細孔システムのチャネルに侵入し、それを通過する、項目32に記載の方法。項目42前記解離が、ナノ細孔システムを横切って確立された電場によりもたらされる、項目41に記載の方法。項目43前記チャネルへ、かつ該チャネルを通っての前記一本鎖の設計ポリマーの移動が、前記ナノ細孔システムを横切る電場により促進される、項目41に記載の方法。項目44前記解離プロセスが1つ以上のシグナル分子の遊離をもたらす、項目41に記載の方法。項目45前記遊離されたシグナル分子が、検出可能なエネルギーを放出する分子とクエンチャー分子とを含み、該遊離されたシグナル分子が自己ハイブリダイズし、それにより該放出する分子をクエンチする、項目44に記載の方法。項目46前記放出する分子がフルオロフォアである、項目45に記載の方法。項目47前記フルオロフォアが、TMR、Cy5およびCPMなどからなる群より選択される、項目46に記載の方法。項目48前記クエンチング分子が、ダブシルDabcyl、ダブシルDabsyl、メチルレッドおよびElleQuencherなどからなる群より選択される、項目46に記載の方法。項目49工程eの分析が、前記シグナル分子からのエネルギーの検出を包含する、項目1に記載の方法。項目50前記検出が蛍光の検出を包含する、項目49に記載の方法。項目51前記検出システムが光学的な検出システムである、項目33に記載の方法。項目52前記光学的な検出システムが蛍光検出器である、項目51に記載の方法。項目531つ以上の標的ポリヌクレオチド分子を分析するための方法であって、該方法は:a該標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して、1つ以上の設計モノマーを設計する工程であって、ここで、個々の設計モノマーは、0または1のいずれかにさらに対応し,2つの個々の設計モノマーは、所定のヌクレオチド塩基に対応し、該個々の設計モノマーは、1つ以上のシグナル分子を有する、工程;b複数の該設計モノマーを連結することにより、1つ以上の設計ポリマーを形成する工程;c1つ以上の所定の設計ポリマーが構築されるまで、工程aと工程bとを反復する工程;dハイブリダイゼーションに適切な条件下で、該設計ポリマーとシグナル分子とを混合することにより、設計ポリマー-シグナル複合体を形成する工程;eナノ細孔システムへdの該複合体を導入する工程であって、ここで、該複合体は解離され、かつ該設計ポリマーの一本鎖部分が該ナノ細孔システムに進入し通過する、工程;およびfeの該一本鎖の設計ポリマーを分析する工程、を包含する、方法。特定の実施形態の以下の説明において、説明の一部をなす添付の図面に対して参照がなされ、これらは、本発明が実施され得る特定の実施形態を例示する手段として示される。他の実施形態が利用され得、かつ構造的な変化が本発明の範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解されなければならない。任意の構造の場合、これらの図が幾分単純化されることが理解されなければならない。なぜなら、これらは、示される構造についての全ての従来の詳細を示しておらず、関連する要素のみを示しているにすぎないからである。さらに、本明細書で特定の実施形態が示されるが、これは、限定するとは意図されない。詳細な説明本発明は、ポリマー分子を分析する方法に関する。これらの方法は、単一の分子の感度での、DNA分子およびRNA分子の高スループットな読み取りに使用される。本発明の方法は、以下を包含する:1DNAまたはRNA二本鎖の電気的に制御された解離、21つ以上の分子シグナル検出を使用する分子の正体またはコードの読み取り、および3核酸とハイブリダイズしたプローブとの間の分子の相互作用例えば、強力に相互作用するプローブは、移行速度にさらなる低下を生じるによる、ナノ細孔通過プロセスの制御された減速。2種類の単一の分子の検出法の利用が本明細書に記載される:1ナノ細孔の検出、および2単一の分子シグナルの探索例えば、蛍光の探索。ナノ細孔に印加された電場の能動的な制御を使用して、二本鎖ポリヌクレオチド例えば、二重ヘリックスDNAを解離することができる。この二本鎖ポリヌクレオチドの解離は、ナノ細孔のチャネルを通過し得る一本鎖の要素を生成する一方で、二本鎖部分が侵入することは防止される。それゆえ、ポリヌクレオチドの一本鎖の要素が侵入することは、その分析例えば、配列情報を取得することを容易にする。本発明の方法は、二進コードの設計ポリマーへ標的ポリヌクレオチド分子を変換することを包含する。標的ポリヌクレオチドは、あらゆる供給源から取得することができる。一局面において、標的ポリヌクレオチドは、二本鎖のポリヌクレオチド分子例えば、二重ヘリックスDNAであり得る。他のポリヌクレオチドもまた本発明の範囲内であり、それらとしては、RNA分子およびPNA分子が挙げられるが、それらに限定されない。標的ポリヌクレオチドは一本鎖であってもよい。標的分子は、天然のヌクレオチド塩基と改変ヌクレオチド塩基との両方を含み得る。標的はあらゆる起源であってもよい。例えば、標的は、超高密度な様式で任意の情報をコードするように使用される、cDNA配列であっても、gDNA配列であっても、人工man-made合成配列であってもよい。標的ポリヌクレオチドは、部分的に合成されても、完全に合成されてもよい。標的は、天然起源植物および動物を含むのヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであってもよい。例えば、そのサイズの範囲は、約10ヌクレオチド塩基~約10万ヌクレオチド塩基以上であってもよい。図1を参照して、標的ポリヌクレオチド10が取得される図1a。この標的ポリヌクレオチド10は、生化学的な変換に供される。Lexowに対する米国特許第6,723,513号この全体の教示は、参考として本明細書に援用されるを参照のこと。例示的な目的のために、例えば、3つのヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドから単離されている図1b。3つのヌクレオチドは、G、TおよびAそれぞれ、グアニン、チミンおよびアデニンである。これらの3つのヌクレオチドのみを使用して、変換プロセスを説明する。この変換プロセスにおいて、各々のヌクレオチドは、1と0とを使用する二進コードにより表される。したがって、例えば、グアニンGは二進コード10により表され得、チミンTは11により表され得、アデニンAは00により表され得、そしてシトシンCは01により表され得る。二進コードの1と0とは、設計モノマー12と呼ばれる、それら固有のポリヌクレオチドにより表される。図1bを参照のこと。図1bは、このような設計モノマー12の一例を提供する。図1bに示されるものは、0に対する設計モノマー12’および1に対する設計モノマー12’’である設計モノマーについての正確なポリヌクレオチド配列は、熟練者によって決定することができる。したがって、設計ポリマー12は二進コードからなるので、各々1または0のいずれかを表すが、同時には1と0との両方を表さない、2つの設計モノマー12’、12’’が存在する。図1に示される例において、0に対する設計モノマー12’と1に対する設計モノマー12’’とが存在する。もし各々のヌクレオチドが二進コードにより表されるとするならば、各々のヌクレオチドが2つの設計モノマーに表されることを必要とする。例えば、グアニンは、二進コード10により表されると、グアニンは、設計モノマー12’’により1と表され、設計モノマー12’により0と表される。しかしながら、設計モノマーは、それらが表している特定のヌクレオチドを反映するように適切な配列でなければならない。したがって、グアニンに対して、設計モノマー12’’1の次に設計モノマー12’0が続かなければならない5’→3’の従来のマップ割り当てmapassignmentを使用して。設計ポリマー14は、特定の配列で整列された設計モノマー12’、12’’からなる。図1cを参照のこと。設計モノマー12’、12’’が、元の標的ポリヌクレオチド10内のそれらの同起源のヌクレオチドにより見出される同じ順序で5’~3’に並べられるという点において、設計ポリマー14の配列は、元の標的ポリヌクレオチド10のヌクレオチド配列を反映する。図1に示されるプロセスを、全体のポリヌクレオチド分子について反復することができる。標的ポリヌクレオチドのサイズは、便宜上操作され得るが、その原理は同一なままである。本発明の設計モノマーは、ポリヌクレオチド分子からなる。設計モノマーのサイズは変動してもよい。一局面において、設計モノマーのサイズは、約10ヌクレオチド~約100ヌクレオチドの範囲に及び得る。別の局面において、設計モノマーは、二本鎖のポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、DNAであっても、RNAであっても、PNAであってもよい。設計モノマーのヌクレオチドの構成要素は、天然であっても、改変されていても、それらの組み合わせであってもよい。これらは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルおよびそれらの改変などからなる群から選択され得る。熟練者は、所定のプロトコルのパラメータに基づいて設計モノマーを構築することができる。本発明の二進コードの特徴を達成するために、少なくとも2つの異なる設計モノマーを構築しなければならないことが重要である。本発明の設計ポリマーは、複数の設計モノマーからなる。設計ポリマーは、生化学的に変換された標的ポリヌクレオチドを表す。設計ポリマーと元の標的ポリヌクレオチドとの間の関連性は、設計ポリマーのみを使用して、熟練者が元の標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができるようなものである。設計ポリマーの設計モノマーは、互いに連結例えば、共有結合されて、ポリヌクレオチド分子を形成する。再度、設計モノマーを連結することの順序は、その連結した配列が標的内のヌクレオチドの元の配列を反映するようなものである。ハイブリッドのシステムもまた本発明の範囲内である。例えば、標的ポリヌクレオチドはRNA分子であり、二進コードを構築するのに使用される設計モノマーはデオキシリボヌクレオチドdeoyribonucleotideから構成され得る。その逆も等しく有効である。熟練者が望む場合、ハイブリッドの構築物であってもよい。例えば、設計モノマー単数または複数は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとのハイブリッドを含んでもよい。種々のハイブリッドの置換もまた十分に本発明の範囲内である。図2を参照して、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドそのサイズに関してのみ異なるは、上記の方法にしたがって処理することができる。図1に記載される方法は反復的なプロセスであり得、それによってオリゴマーを設計ポリマーへ変換することを可能にする。図2は、このような状況を示す。この例に関して、21塩基対のオリゴマー16を使用して、本方法を例示する。種々のサイズのオリゴマーは、本発明の範囲内である。例えば、約10ヌクレオチド~約5000ヌクレオチドに及ぶオリゴヌクレオチドを処理することができる。先に記載されるように、当業者に周知の従来法を使用して、相当な長さのポリヌクレオチドを消化し、より短いオリゴヌクレオチドを形成することができる。図2aは、2つの設計モノマーを示す。一方の12’は0を表し、他方の12’’は1を表す。より詳細な試験の際に、2つの設計モノマー12’、12’’が異なるヌクレオチド配列から構成されることが観察され得る。この特定の例において、各々の設計モノマーは、10塩基対から構成される。ここで、これらの2つの設計モノマー12’、12’’を使用して、二進コードにより標的ヌクレオチド16配列を表すことができる。図2bは、二進コードの割り当てを例示し、また図2bは、設計モノマー12’、12’’を互いに連結することにより形成される設計ポリマー14を示す。設計モノマー12’、12’’の長さと配列とは可変性であり、これらは、生じる設計ポリマー14が注文どおりに作製されるtailoredmadeことを可能にする。図2cは、設計ポリマーへの標的の変換サイクルを示す。標的ポリヌクレオチド16は、3つの酵素的な工程A、BおよびCにより循環され得る。この図において、1サイクルあたり、3つの標的塩基が変換される。この図中の標的ポリヌクレオチド16は21塩基対から構成され、したがって、標的を完全に変換するのに全部で7回のサイクルが必要とされる。図2cにおいて、上側の鎖太字がこの図中で変換される。酵素的な工程Aは、変換および設計ポリマーの連結のための突出を生成するために、少なくとも2つのIIs制限酵素例えば、NlaIIIによる標的16の消化を含む。当該分野で公知の他の制限酵素を使用して、標的ポリヌクレオチドの消化を達成することができることは、当業者により十分に認識される。工程Bは、連結litigation工程であり、ここで、二進法の設計ポリマー配列が、その5’末端と対応する配列を有する標的フラグメントの3’末端に特異的に結合される。この工程は、別個のウェルへの標的フラグメントの分割を包含し、ここで、ウェルの個数は、変換されている塩基の置換の個数に一致する例えば、3つの塩基の変換には64個のウェルを必要とする。各々のウェルにおいて、その特定のウェル内で変換されるべき配列と一致する、設計ポリマー配列および特異的なアダプター示さずが存在するすなわち、各々のフラグメントの3’末端への設計ポリマーの非特異的な結合と正しいフラグメントの5’末端へのアダプターの特異的な連結とが存在する。連結後、これらのウェルは、一つの容器にプールされ得る。工程Cは、増幅工程である。ポリメラーゼ連鎖反応PCR工程を実行して、設計ポリマーと特異的なアダプターとに首尾よく結合したフラグメントを増幅および選択する。この変換法を、大量に並行して実行することができ、ここで、数十億の異なる標的分子が同一の反応で変換される。米国特許第6,723,513号を参照のこと。一度、設計ポリマーを形成すると、1つ以上のシグナル分子が設計ポリマーに結合する。一局面において、シグナル分子は分子ビーコンである。一本鎖の設計ポリマーは、当業者に周知の手段によって取得される。一本鎖の設計ポリマーは、ハイブリダイゼーションに適切な条件例えば、緩衝液100mMKCl、1mMMgCl2、10mMTris-Hcl、pH8.0中でのゆっくりとした温度の低下quenchingによる下で分子ビーコンと混合され、ビーコン-設計ポリマー複合体BDP複合体を形成する。図3は、代表的な分子ビーコン18を概略的に示すTyagiS,KramerFR.1996Molecularbeacons:Probesthatfluoresceuponhybridization,NatureBiotech.14:303-8;BonnetG,TyagiS,LibchaberA,andKramerFR.1999.ThermodynamicbasisoftheenhancedspecificityofstructuredDNAprobes.Proc.Natl.Acad.Sci.96:6171-76を参照のこと。分子ビーコンまたは、単純にビーコンは、フルオロフォアF20をオリゴヌクレオチドのある位置例えば、その5’末端に、そしてクエンチャーQ22をオリゴヌクレオチドの別の位置例えば、その3’末端に有する、オリゴヌクレオチドである。図3aを参照のこと。図3aに示されるように、フルオロフォア20は、蛍光シグナルを発することができる。なぜなら、それは、クエンチャー22により妨害されていないからである。しかしながら、ビーコン18の5’末端と3’末端とは、それらが相補的な塩基を有することにより自己ハイブリダイズすることができる。図3bを参照のこと。5’末端と3’末端とがハイブリダイズするか、または緊密に接近する場合に、クエンチャー22がフルオロフォア20をクエンチし、それによってシグナルが生成されることを防止する。本発明の方法において、少なくとも2つの異なる分子ビーコンを使用する。ある分子ビーコンは、0を表す設計モノマーにハイブリダイズする一方で、別の分子ビーコンは、1を表す設計モノマーにハイブリダイズする。設計モノマー0にハイブリダイズする分子ビーコンは、シグナル例えば、フルオロフォアを含み、このシグナルは、設計モノマー1にハイブリダイズする分子ビーコンとは異なる。例えば、分子ビーコン0すなわち、設計モノマー0にハイブリダイズする分子ビーコンはフルオロフォアF0を有し得、分子ビーコン1はフルオロフォアF1を有し得る。これらの両方は、互いに異なりかつ識別可能なシグナルを発する。一局面において、ビーコンと設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントは、約90以上である。別の局面において、設計モノマーに対するビーコンのハイブリダイゼーションのパーセントは、約80~約90である。なお別の局面において、設計モノマーに対するビーコンのハイブリダイゼーションのパーセントは、約70~約80である。さらなる局面において、設計モノマーに対するビーコンのハイブリダイゼーションのパーセントは、約60~約70である。図4は、BDP複合体24を形成する、分子ビーコンMl18’’またはM018’と一本鎖の設計ポリマー24とのハイブリダイゼーションを示す。このBDP複合体24において、Ml分子ビーコン18’’は設計モノマー112’’にハイブリダイズする一方で、M0分子ビーコン18’は設計モノマー012’にハイブリダイズする。図4に示されるように、M1分子ビーコン18’’はフルオロフォアFlを有するが、M0分子ビーコン18’はフルオロフォアF0を有する。これらの2つのフルオロフォアは、異なる波長のシグナルを発する例えば、Flは青色を発し得る一方で、F0は橙色を発し得る。本方法は、二進コードベースのポリマーすなわち、設計ポリマーへの標的ポリヌクレオチドの変換を包含するので、本方法は2つのフルオロフォアのみを必要とする。一方のフルオロフォアは0を表し、他方のフルオロフォアは二進コード01の1を表す。当業者は、他のシグナル分子を、本明細書に記載されているものと矛盾することなく使用し得ることを認識する。ここで、ビーコン-設計ポリマー複合体がナノ細孔システムに導入され得る。本発明のナノ細孔システム例えば、細菌のα溶血素α-HLのようなタンパク質チャネルを使用して、ポリヌクレオチドの長さおよび配列についての情報を取得し、細孔の改変された部分に対する種々の分析物の確率論的な結合動態bindingkineticsを検出することができる。Kasianowicz,Jら、1996,PNASUSA,93,13770-3;Akeson,M.ら、1999,Biophys.J.,77,3227-33;Meller,A.ら、2001,PNASUSA,97,1079-1084;およびMeller,A.ら、2001,Phys.Rev.Lett,86,3435-38これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用されるを参照のこと。一局面において、ポリヌクレオチドは、一本鎖の分子例えば、一本鎖の設計ポリマーである。複数のナノ細孔を使用し得、そして多くの設計ポリマー、それゆえ多くの標的ポリヌクレオチドの分析を可能とし得ることに留意することが重要である。一局面において、ナノ細孔システムに使用される細孔の個数は、5個~約10個の範囲に及ぶ。より多くの細孔を使用することができることが当業者により認識されるはずである。ナノ細孔システムは、設計ポリマーを受容し、所定のプロトコルに基づいてそれらを分析することができる。ナノ細孔システムは、当該分野で周知の種々のデバイス検出器が挙げられるを備え得る。ナノ細孔システムを分子例えば、レセプターなどに結合させてもよい。当業者は、当該分野で周知の方法を利用し、薬品または、ペプチド例えば、ナイスタチン;イオノフォア例えば、A23187Calcimycin、ETH5234、ETH157全てFluka,Ronkonkoma,N.Y.から利用可能な薬品;ペプチドチャネル例えば、Alamethicinなどを使用して、化学的なチャネルまたは細孔を脂質二重層中に形成することができることを認識する。本発明の範囲内であるナノ細孔システムとしては、米国特許第5,795,782号、同第6,015,714号、WO01/81896A1、およびWO01/81908A1これらの教示は、参考として本明細書に援用されるに記載されるものが挙げられる。本発明のナノ細孔システムは、細孔分子例えば、バクテリオファージλLamBまたはα溶血素に対するレセプターを有し得る。ナノ細孔システムに使用される装置は以下を備える:aイオン伝導性細孔またはチャネル;b設計ポリマーを特徴付けるのに必要な試薬;およびc設計ポリマーが細孔に侵入し前進するにつれての、細孔を横切ってのコンダクタンスの変化を検出するための記録機構。種々の電子デバイスが利用可能である。それらは、本発明に使用される測定を実行するのに十分に感度がよく、コンピュータによる取得の収集rales能力および保管能力は、迅速な速度の配列データの蓄積に適している。他の細孔形成タンパク質としては、グラミシジン例えば、グラミシジンA、B、C、DまたはSBacillusbrevis由来;Fluka,Ronkonkoma,N.Y.から利用可能;バリノマイシンStreptomycesfulvissimus由来;Flukaから利用可能、大腸菌、赤痢菌属および他の腸内細菌科由来のOmpF、OmpCまたはPhoE、Tsx、F線毛、およびミトコンドリアポーリンVDACが挙げられる。本発明で有用なチャネルおよび細孔は変動し得る例えば、最小の細孔サイズは約2nm~9nmである。ポリマーを引き込む細孔サイズは、例えば、一本鎖のDNAに対して、約0.5nm~2.0nmである。同一のメンブレンに包埋された複数の細孔が存在してもよい。同一のメンブレンに包埋された多くの細孔例えば、ナノ細孔の組み合わせ、またはナノ細孔アレイにより、本発明に記載の光学的な読み取りプラットフォームは、大量の並行するシグナルの読み取りに適している。最近、研究者は、最先端の電子増幅CCDカメラを使用して、毎秒200フレームより速いフレームレートで256×256画素領域の読み取りを達成できることを示した。重要なことに、このフレームレートで、個々のフルオロフォアから発せられる光を解析し得ることが示されている。このことは、高度に並行化されたparalleled読み取りを達成できることを実証する。原理上は、半導体solid-stateフィルム内に製造された100×100個の細孔のアレイは、単一のCCDカメラを使用して画像化され得る。したがって、読み取りのスループットは、単一のナノ細孔のスループットと比較して、約4桁の大きさで加速され得る。ヒトゲノムは、約3×109塩基対を含む。迅速かつ安価なゲノム配列決定を可能にする方法は、高度に並行化されなければならない。一局面において、1つのナノ細孔あたり、毎秒500塩基の本発明の読み取り速度は、100×100個の細孔を含む単一のチップ内で、全部で毎秒5×l06ヌクレオチドの読み取りをもたらす。このことは、約10分以内にヒトゲノム全体を単回で読み取ることに等しく、最先端の方法よりも、4~5桁の大きさでの増大である。改変された電位型チャネル天然か、または不活化を除去するための改変後のいずれかもまた本発明で使用することができ、かつ、例えば、ポリメラーゼの付着組換え融合タンパク質に適した物理的パラメータを有するか、またはポリマーの通過に適した細孔の直径を有する。電位型チャネルの不活化特徴を変更する方法は、当該分野で周知である例えば、Pattonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10905-091992;Westら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10910-141992;Auldら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:323-271990;Lopezら、Neuron,7:327-361991;Hoshiら、Neuron,7:547-561991;Hoshiら、Science,250:533-381990これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用されるを参照のこと。本方法の一局面において、ナノ細孔はα-HLである。米国特許第6,528,258号これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用されるを参照のこと。α-HL細孔は、2つの主要な部分から構成される:約2.5nmの直径の空洞前庭および約1.5nmの直径のチャネル基部stemこれは細胞膜を貫通している。二本鎖のポリヌクレオチドドメインは、2.5nmの前庭部分に留まることができるが、1.5nmのチャネルには侵入することはできないdsDNAの直径は大体2.2nmである。最近、短い平滑末端DNAヘアピン3~8塩基対の開閉closing-opening動態が、ナノ細孔を使用して、α-HLの前庭にヘアピンを留まらせ、ヘアピンの熱的に活性化された開口に必要とされる時間を検出することによって、直接測定され得ることが実証されている。ヘアピンの自発的な開口の際に、一本鎖のDNAは1.5nmのチャネルに侵入し、細孔を通って流れるイオン電流の短時間だが、識別可能なの遮断を生じ、それによって、ヘアピンまたは、二本鎖ポリヌクレオチドの滞留からその最初の開口までの時間間隔の検出を可能にする。図5を参照して、ビーコン-設計ポリマー複合体24’は、ナノ細孔システム26に導入される。示されるように、設計ポリマー16’’の一本鎖28が、ナノ細孔システム26の細孔30を通過する。一局面において、一本鎖部分は、設計ポリマー16’’の3’末端である。一本鎖28設計ポリマー16’’の移動のための駆動力は、ナノ細孔26を横切って確立される電場により提供される。2つの電極を使用することにより、電場を印加および使用して、二本鎖のビーコン-設計ポリマー複合体24’を解離させる。この電場fieldはまた、生じる一本鎖の設計ポリマー16’’がナノ細孔に侵入するための駆動力を提供する。解離が起こるにつれ、分子ビーコンの部分32、34は、システム26自身のチャネル30においてか、またはその近傍で、設計ポリマー16’’との相互作用から遊離される。最初の先導するleadingビーコンがBDP複合体24’から外れるにつれて、それに続くフルオロフォアが最初のビーコンのクエンチャーから遊離され、それにより、フルオロフォアが発光し得、適切な検出器により検出され得る。例えば、図5における分子ビーコン32は、クエンチャー22’’を有し、これは、フルオロフォアF220’’のシグナルをクエンチし、分子ビーコン34上に位置する。最初の分子ビーコン32が解離され、B-D複合体から外れる場合、フルオロフォアF220’’は、クエンチャー22’’の作用から遊離され、それによりそのシグナルを発する。図5bを参照のこと。最初の分子ビーコン32は自己ハイブリダイズし、その結果、そのクエンチャー22’’部分が、そのフルオロフォアF120’をクエンチする。この自己クエンチ機構は、バックグラウンドのノイズを最小限にする。このプロセスは、設計ポリマー16’’全体が分析されるまで反復させることができる。まとめると、設計ポリマーからハイブリダイズしたビーコンを解離または、融解meltoffさせるために、電圧ランプrampを印加するのと同時に、設計ポリマーへハイブリダイズした分子ビーコンの一番目のフルオロフォアが検出され、記録される。先に記載されるように、解離は、電圧ランプの開始からほぼ10ms後に生じ、フルオロフォアの記録に十分な時間を提供する。解離は、最初のビーコンの遊離と、設計ポリマーにハイブリダイズした次のフルオロフォアの即時の露出クエンチされないことun-quenchingをもたらす。遊離されたビーコンは、直ちに自己ハイブリダイズし、そして自身のフルオロフォアを自己クエンチングする。蛍光強度2つの色のうちのいずれかの変化は、次の電圧ランプの印加により検出および誘発される。このサイクルは、設計ポリマー全体が読み取られるまで反復する。一局面において、設計ポリマーはヘアピンを有する。最終的なヘアピンは、設計ポリマーの5’末端に配置され、分子が一方の方向すなわち、一本鎖の3’末端でのみ、ナノ細孔システムに侵入することを強いる。ナノ細孔システムへの、かつそれを通っての設計ポリマーのトランスロケーション完了の際に、イオン電流が開口open細孔レベルに上昇し、光学系以下で考察されるは、ポリマーの読み取りが終了したことDNAが細孔を通過したことを検知する。DNAのより長い二本鎖ヘリックスドメイン50bpの力forceに誘発される解離は、α-HLの細孔を使用して実証されている。Sauer-Budge,A.F.ら、2003,Phys.Rev.Lett.,90,238101これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用されるを参照のこと。特徴的な通過細孔への一本鎖の滑走slidingを含む時間とそれらの解離時間とが、印加される電圧140mV~180mVの範囲に対する指数関数的な相関関係にしたがうことが見出されている。したがって本発明において、ビーコンを解離させるために印加される電圧を、繊細な制御パラメータとして使用して、DNAに沿う連続的なビーコンの各々の解離工程の間の時間遅延を決定することができる。このことは、本発明者らの最近のデータにより詳細に示されている図10~図15。電圧に制御される解離は、BiophysicalJournal:MatheJ.ら、2004Biophys.J.87,3205-12この全体の教示は、参考として本明細書に援用されるに記載されている。この論文は、長い相補的な一本鎖のDNAにハイブリダイズした短いオリゴヌクレオチド約10塩基が、電圧に制御される様式によりナノ細孔内で解離され得、この解離プロセスの特徴的な時間スケールが電圧に強く依存し、さらに、この時間を、1ms~10msの範囲内であるように選択することができることを実証する。この時間スケールは、非常に重要であり、これは、以下のことを示す:a細孔内のDNAのトランスロケーション速度を制御することができ、特に、これは、DNAプローブの解離により減速され得る。トランスロケーションが減速される量は、DNAとハイブリダイズしたプローブとの相互作用の強さおよび印加された電圧に指数関数的に依存する。したがって、プローブの配列を選択することにより、異なるレベルの減速を達成することができる。印加される電圧を使用して、解離、それゆえトランスロケーション速度を調整することができることも示されている。DNAトランスロケーションの減速は、この分野において長年にわたる課題である;ならびにb研究者は、単一のフルオロフォアの光学的な検出に適合する速度1塩基あたり、0.1ms~50msの範囲までトランスロケーションを減速することができた。この減速がない場合、読み取り時に光子のノイズが著しく目立ち、既存の技術を使用して、単一のフルオロフォアの読み取りを実現することはできない。本発明にしたがう使用のための光学因子opticalagentは、例えば、クエンチャー分子と近接した場合にクエンチされる蛍光分子を含む。蛍光および、この挙動を示す他の型の分子、ならびにこれらの化合物の特定の特性例えば、蛍光減衰時間、吸光スペクトル、発光スペクトル、光安定性、および量子効率を記載する、広範な文献が利用可能である例えば、Gilbertら、EssentialsofMolecularPhotochemistry,CRCPress,1991;Laxowicz,JR,PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy第2版,Kluweracademic1999これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用されるを参照のこと。蛍光のクエンチングの詳細な説明が利用可能である例えば、Kavarnosら、Chem.Rev.86:401,1986;Wagoner,MethodsEnzymol.246:362,1995;Millar,Curr.Opin.Struct.Biol.6:637,1996;Petitら、Biol.Cell78:1,1993これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用される。近年、単一の蛍光分子の検出において、大きな進展がなされている例えば、Mathisら、Bioimaging5:116-128,1997;Haら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:6264-6268,June1996;Goodwinら、Ace.Chem.Res.29:607,1996;Mullerら、Chem.Phys.Lett.262:716,1996;Sauerら、Chem.Phys.Lett.254:223,1996これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用されるを参照のこと。このような分子は、特徴的な蛍光減衰時間を有し、かつ分子の電子的な環境に感受性であり、それゆえ、その環境を変更するポリマーとの会合よりクエンチされ得る。本発明において使用することができるフルオロフォアの例としては、TMRおよびCy5が挙げられる。使用され得る他の型の蛍光分子は、CPM、MolecularProbes,Inc.からのAlexaシリーズの蛍光マーカー、ローダミンファミリー、およびTexasRedである。当業者に公知の他のシグナル分子は、本発明の範囲内である。本発明において、多くの他のフルオロフォアが使用され得、それらとしては、米国特許第6,528,258号この全体の教示は、参考として本明細書に援用されるに列挙されるものが挙げられる。本発明で使用され得るクエンチング分子としては、ダブシルDabcyl、ダブシルDabsyl、メチルレッドおよびElleQuencherTMが挙げられる。当業者に公知の他のクエンチャー分子は、本発明の範囲内である。本発明で使用される検出システムは、使用されている光学因子に依存する。検出システムは、本明細書に記載の配列決定法に関連する、時間スケール上での光学因子の光学特性の変化を検出することが可能でなければならない。一局面において、フルオロフォアは、光学因子として使用される。したがって、適切な蛍光検出器が妥当である。当業者は蛍光検出器を熟知する。図6を参照して、パネルaは、印加された電圧対時間ミリ秒を示す。単一のナノ細孔チャネルを通って流れるイオン電流のリアルタイム分析において、一本鎖のポリヌクレオチドが細孔に侵入するのにつれて、ナノ細孔システムの電圧ランプが引き起こされる。ナノ細孔への一本鎖のポリヌクレオチドの侵入細孔電流の急落により合図されるから約0.1ms以内に、電圧は保持holdingレベルへ低下し、その後一定の割合で上昇する。図6bは、測定された、細孔を通るイオン電流を示す。チャネルへ分子の一本鎖部分が侵入した後、細孔電流は、その閉鎖blockedレベル開口細孔電流の約10または約10pAまで低下する。電圧ランプが始まると、電流は最初は、閉鎖レベルに留まるが、t~10msにおいて、電流が開口細孔レベルまで急激に上昇する。なぜなら、二本鎖ポリヌクレオチドが解離し、迅速に細孔を通過するからである細孔の通過は、0.05ms未満続く。解離電圧破線は、容易に測定することができる。図7を参照して、A、B、CおよびDにより表される4つの異なる工程が示され、これらはサンプルポリヌクレオチドの代表的な分析において生じる。これらの工程は、配列決定が完了するまで反復され得る。上部のパネルは、ナノ細孔チャネル30を通ってのBDP複合体24’’の侵入および移行を示す。中央のパネルは、光子カウント/ms対時間を示し、そして下部のパネルは、記録されている電圧を示す。工程Aにおいて、設計ポリマー28’の一本鎖の突出が、電場により引き入れられるにつれて細孔30’が侵入する場合に、読み取りを開始する。細孔30’を通って流れるイオン電流の急激な低下これは、設計ポリマー28’の侵入に起因するは、以下により読み取りを始動させる:1駆動drivingレベルから保持holdレベルまで電圧を低下させ、最初の電圧ランプを開始すること;および2例えば、蛍光分析用のレーザーの電源を入れる。設計ポリマーにハイブリダイズした最初のビーコンはクエンチされないので、それに対応する蛍光レベルの即時の上昇を引き起こす中央パネルの薄いトレースとして示される。代表的な解離時間は約10msであることに留意すること。この時点で、最初のクエンチされていないフルオロフォアから発せられた光子が適切な検出器により記録される。工程Bは、最初のビーコン32’が解離された直後に開始される。分子ビーコン32’の解離は、一本鎖の設計ポリマー16’’’がナノ細孔26のさらに内部へ移動することを可能にする。この解離プロセスは、分子ビーコンを遊離することにより、次のフルオロフォアがクエンチされないことをもたらす。遊離したビーコンは、熱力学的な力によって自動的に自己ハイブリダイズし、それゆえ、ビーコン自身のフルオロフォアがクエンチされる。自己ハイブリダイズしたビーコンは、最終的に拡散する。有利なことに、この特徴は、バックグラウンドのノイズを回避するか、最小限にするのに役立つ。生じる蛍光シグナル中央パネルは、フルオロフォア34に対応する赤色暗色発光の増大、ならびに分子ビーコン32’の喪失および自己ハイブリダイゼーションに対応する橙色明色発光の低下を示す。ビーコンが自己クエンチするのにかかる限定された時間によって、最初のビーコン32’のクエンチングにわずかな遅延約50μsが存在する。このわずかな遅延時間の間に、移行を正確に指し示すのに使用することができる、フルオロフォア32’と34との両方からの蛍光強度が存在し、これを、電圧ランプを始動させるのに使用することができる。工程Cにおいて、最初のビーコン32’に対する類似の読み取りが存在し、これは、より明るい線により示される。同一の型に由来する両方のビーコンが読み取られる工程Cと工程Dとの間に、橙色の強度明灰色に一過的な急上昇spikeが存在することに留意すること。これは、先に説明されるように、2つのフルオロフォアの寄与に起因する。この方法で、システムは、設計ポリマー全体を読み取る。設計ポリマー16’’’がその5’その3’ではなくから細孔に侵入することを防止するために、7塩基のヘアピン36を、設計ポリマー16’’’の変換プロセスの間に付加することができる。このヘアピン26は、最終的に解離され、設計ポリマー16’’’がナノ細孔システム26の内部または前庭へ完全にトランスロケーションすることを可能にする。本発明はまた、ポリヌクレオチドの配列を決定するための装置にも関する。メンブレンに包埋されたナノ細孔の内部を通過した、個々のDNA分子からの蛍光シグナルの検出のための光学系300が、本明細書に記載される。図8は、本発明の配列決定法と組み合わせて使用することができる光学系300の概略図であり、ここで、システム300は、光学的なシグナルの検出に必要とされる構成要素を備える。詳しくは、図8は、1つ以上の二重層メンブレンを使用する、単一の分子の光学的な検出のための光学的な構成を示す。本光学系300は、ナノ細孔支持体304と2つの電極306および308とを含む特製のフローセル302を備える。電極306および308を使用して、解離プロセスに必要な電場を印加する一方で、支持体304は、ガラスカバースリップ312の近位にリン脂質二重層310を懸架することを可能にし、それにより、高倍率の顕微鏡の対物レンズ314を使用して二重層310の画像化を可能にする。フローセル302を、特製の倒立顕微鏡内のXYZナノポジショナー316にマウントされ、平行移動ステージを使用して、光軸208と正確に位置合わせするために移動され得る。フルオロフォアは、ダイオードレーザー318から光学系300へ放射された光により励起され得る。レーザー318は、単一モード、偏光保存性光ファイバー320と連結された、532nmの半導体レーザー例えば、NewFocus3951-20またはPointSourceiFLEX2000であり得る。レーザー光は、ミラー321を介して、自家製homemadeの調整可能なビームエクスパンダー5×322に向けられ、拡大され、ミラー324および326ならびにダイクロイックミラー328Chromaz532rdcを使用して、対物レンズ314の背後の開口部に向かう。レーザー光は、対物レンズ314の焦点でわずかに拡大され、より大きな照射面積を可能にする。ビームの拡大は、入射する拡大されたレーザー光を顕微鏡の対物レンズ314への入り口でわずかに発散させることにより達成される。ビームエクスパンダー322上のレンズの一つを他方のものに対して動かすことにより、ビームは、対物レンズ314の焦点でわずかに焦点を外されdefocuse、より大きな照射面積約10μmを達成する。蛍光の発光は、同一の対物レンズ314を使用して収集され、ロングパスlongpassフィルター330Chromahq560lpを使用してフィルター処理されるfiltered。次に、光は、フレーム転送バック照射backilluminated冷却CCDカメラ332、または、まずピンホール334に光の焦点をあわせ、2つの高速検出用のアバランシェ光ダイオード点検出器336および338PerkinElmerSPCMAQR-14上でピンホールを画像化することのいずれかにより画像化される。光学系300励起経路と発光経路を除くは、遮蔽された銅製の箱示さずに完全に封入され、ひろいあげる電磁気ノイズを低減する。CCDカメラを使用することにより、数個の細孔が、同時に画像化されること可能にし、それにより検出システム300のスループットを増大させる。機器制御およびデータ収集のソフトウェアを使用して、自動的な位置決めおよび単一の分子の画像化ならびにリアルタイムのナノ細孔力force分光法を制御する。蛍光と電流との両方のデータ収集のための主要なトリガーは、ナノ細孔302に侵入する単一の分子の閉鎖電流シグナルである。ハードウェアの電気機器は、以下の3つのPCボードを備える:PZTコントローラを有するインターフェースへの高速デジタルI/OPhysikInstrumentePI-E710、光子計数ボードNationalInstrumentsPCI-6602、およびイオン電流をサンプリングし、細孔を横切ってのプログラム可能な電圧勾配を生成する高速A/Dボード例えば、NationalInstrumentsPCI-6052E。機器は、約20μmのリン脂質二重層を水平に支持し、緩衝溶液を交換するために使用される特製の微小流体microfluidicセルから構成される。図9を参照して、微小流体セル402が示され、これは、以下を備える:a石英基板404、b特製のcustommachinedポリテトラフルオロエチレンPTFEフィルム406、cポリジメチルシロキサンPDMS製のチャンバー408、d覆い410、ならびにe電極412および414。20~30μmの開口部416は、機械的なインプリントによりPTFEフィルム406内に製造される。挿入図416は、RNA分子422を含むメンブレン418とα-HL細孔420とを示し、メンブレン418は、開口部416により支持される。図10は、PTFEフィルム406内に製造された約30μmの開口部416のSEM像を示す。メンブレン418は、12μm厚のテフロン登録商標フィルム406内の円状開口部416に懸架され、約100μm、ガラスカバースリップ424の上方にある。このことは、60×/1.2N.A.水浸顕微鏡対物レンズ426OlympusUPLAPO60XWを使用して、メンブレン418の高分解能の蛍光画像化を可能にする。これは、油浸を使用する先行技術の設計とは対照的である。油浸対物レンズではなく水浸顕微鏡対物レンズ426高NAを使用することは、より長い作業用距離を提供する約250μm。テフロン登録商標フィルム406は、特別なチュービングtubingによる流体の交換に利用できる2つの小型のチャンバー428と430それぞれ約50μlとを分ける。2つのAg/Ag-Cl電極412および414は、流体チャンバー428および430と接触し、高分解能のパッチクランプ上部ステージhead-stageの増幅器示さず例えば、AxonInstruments200Uに接続される。これらを使用して、メンブレンを横切っての電圧を印加する。図9を参照して、ナノ細孔例えば、α-HL細孔420は、文献例えば、Meller,A.ら、2000Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,1079-1084;Meller,A.ら、2001Phys.Rev.Lett.86,3435-3438全て、参考として援用されるを参照のことに記載される方法を使用して、メンブレン418に包埋され、そして細孔420を通って流れるイオン電流が、パッチクランプ増幅器を使用して測定され、リアルタイムで分析される。先に検討されるように、セル402は、XYZナノポジショナー例えば、PolytecPI-P527.3CL上にマウントされ、対物レンズの視野でセル402とナノ細孔420とを正確に位置合わせし、シグナルのリアルタイム分析に基づいて側面で蛍光標識されたナノ細孔420を追跡することを可能にする。メンブレンセルの少なくとも2つの異なる実施形態が存在し、これらは本発明の範囲内である。メンブレンセルは、上部の流体チャンバーおよび下部の流体チャンバーを有する特製のPDMSガスケットにテフロン登録商標フィルムを包埋することによって作製され得る。PDMSガスケットは、支持プラスティックキャップに収容される。セルは、幅約25mm、厚み約3mmである。これは、チュービングを使用するのに利用可能な下部チャンバー約10μlを備える。下部チャンバーのAg/AgCl電極およびテフロン登録商標フィルムは、PDMSガスケットに包埋される。セルは、ガラスカバースリップにより底面から覆われ、このガラスカバースリップを通して画像化が行われる。あるいは、メンブレンセルは、2つの同軸シリンダー、上部チャンバーおよび下部チャンバーからなり得、これらは、互いに数ミリメータースライドし得る。上部チャンバーの底面において、テフロン登録商標フィルムは熱により融合される。上部チャンバーは、テフロン登録商標フィルムがカバースリップに達するまで、下部チャンバー内を自由にスライドし、顕微鏡により下から画像化され得る。約20μmの円状開口部が、脂質二重層を支持するために使用されるテフロン登録商標フィルム内に製造され得る。下部チャンバーは、幅約20mmのチャンバー高さ6mmであり、その底面に配置される薄いガラスカバースリップを支持する。セルは、流体チュービングと2つの電極とに接続される。本発明の一実施形態は、所定のサンプルマトリクスにおいて、ポリマーの個数または量を定量化することに関する。例えば、ポリマーは、ポリヌクレオチドであってもよい。一局面において、所定のポリマーがサンプル内にあると推定される。この局面において、少なくとも一部の配列が既知である。この部分は、約5ヌクレオチド~約50ヌクレオチド以上の範囲に及び得る。本発明の方法を使用して、設計モノマーは、目的のポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計され得、そして本明細書に記載されるナノ細孔システムを使用して、標的ポリヌクレオチドが検出および測定され得る。本発明の別の実施形態は、サンプルマトリクスにおいて、ポリヌクレオチドの検出に関する。所定のヌクレオチド配列に特異的な設計モノマーが構築され得る。これらの設計モノマーは、ポリヌクレオチドを含むサンプルへ導入され得る。サンプルは、異種サンプルであっても、同種サンプルであってもよい。設計モノマーは、当業者に周知のハイブリダイゼーションに適切な条件下でサンプルに導入される。したがって、本発明の方法を使用して、所定の設計モノマーにハイブリダイズするポリヌクレオチドが単離および/または加工され得る。特定のポリヌクレオチド配列の検出は、本発明の方法により達成され得る。例えば、PCRに使用されるポリメラーゼのフィデリティは100ではなく、それゆえPCRを使用して生成されるポリヌクレオチドは、配列のフィデリティについてモニタリングされなければならない。本明細書に記載される方法を使用して、熟練者は、ポリメラーゼおよびPCRプロセス全体のフィデリティを確かめることができる。標的ポリヌクレオチドの一部を反映し、続いて本方法を使用して配列決定され得る設計ポリマーを形成する、所定の設計モノマーが構築され得る。一実施形態は、所定のポリヌクレオチド配列内の単一または複数の突然変異の検出に関する。標的配列が部分的に既知であるか、またはその全体が既知であると仮定すると、ポリヌクレオチド配列の試験を達成することができるように設計モノマーが構築され得る。設計モノマーは、設計ポリマーを形成するハイブリダイゼーションに適切な条件下で、推定標的ポリヌクレオチドを有するサンプルマトリクスに導入され得る。次に、この構築物は、配列決定のための本発明の方法に供され得る。突然変異は、1つ以上の設計モノマーのミスマッチにより反映される。本発明の一実施形態は、情報の保管に関する。本発明が任意のポリヌクレオチド配列に対する二進コードを利用することを考えると、ヌクレオチド配列を、二進コードのみを使用して保存することができる。一局面において、設計ポリマーは、ちょうどコンピュータファイルのように数0および1の配列をコードするように設計され得る。ある意味では、DNAを、静的な、超高密度の保存媒体とみなすことができる。本発明のナノ細孔システムは、配列にコードされる情報を回収する読み取るのに有効な手段である。本明細書に記載される方法は多くの実用的な応用を有し、これらは本発明から逸脱しないことが当業者により理解されるべきである。実施例:α-HLを使用する、個々のDNAヘアピン分子のナノ細孔解離時間依存的な電場によるナノ細孔測定例えば、配列決定法を可能にするために、解離法を開発した。本解離法は、解離電圧を可変にしたまま、細孔への侵入速度を最適化する高い電圧を使用する。したがって、数百の個々の分子を、短い間の時間数秒間で調べることができる。本方法は、ポリヌクレオチドの通過の間に、熟練者が、ナノ細孔を横切って印加される電場を迅速に変化させることを可能にする。この解離法は、30mV~150mVにわたる広範囲の電圧、そして異なる負荷速度0.5V/s~100V/sで、個々のDNAヘアピン分子の解離動態を研究するのに特に有利である。さらに、本方法は、一定の力ではなく一定の負荷速度が印加される動態作用の測定を可能とする。これら2つの相補的な測定は、DNAヘアピンの小さなエンタルピー変化を1kcal/molに至るまで決定することを可能にする。DNAヘアピンのナノ細孔解離プロセスには、以下の3つの連続的な工程が存在する:Aそれ自身の二本鎖ヘリックス部分がα-HLの2.5nm前庭に滞留するまで、一本鎖のDNA突出50ntが進入およびスライドすること;Bヘリックス部分の解離;ならびにC解離された一本鎖部分が細孔を通ってトランスロケーションすること。図11~17を参照して、異なる電圧で、代表的な時間スケールを決定するための工程を特徴付けた。能動的な電圧制御法を使用することにより、突出の侵入部分Aは、その他の工程から切り離され得、そして、解離された鎖部分Cのトランスロケーション時間は、代表的な解離時間より大幅に短いので、これを無視することができる。最初に、実験により、10bpヘアピンの解離についての代表的な時間スケールがssDNAの通過時間よりもかなり短いことを示すことによって、電圧の関数として、細孔内の一本鎖のDMAssDNA通過に伴う時間スケールを特徴付けた。次に、30mV~150mVの範囲に及ぶ定常または、工程の作用電圧についての解離動態の情報を示し、細孔内のDNA鎖についての有効電荷を決定した。最後に、実験により、負荷速度に対する解離動態の依存性を示した。データは、他の単一の分子SM解離unbinding実験のために開発されたものと類似する、単純な理論的なモデルを使用して解釈した。材料と方法PAGEで精製されたssDNAおよびDNAヘアピンEurogentec,SanDiego,CAを、10mMTris、1mMEDTA、pH8.5溶液中で緩衝化させ、測定の前に、10分間、75°Cまで加熱し、その後、4°Cまで急冷した。ヘアピン分子は、3’の一本鎖の突出50マーのポリ-dA、以下の配列自己相補的な部分には下線が施してあるを有し、介在する6塩基ループを含む10bpのヘリックス部分から構成されている:さらに、5’末端から5番目の塩基に単一のTTミスマッチを有する、同様なヘアピンHP2を、以下の配列とともに調製した:また、7bpのヘリックスヘアピンHP3は、以下の配列を有する:水平に支持された平面状脂質二重層にα-HLチャネルを再構成するのに使用される基本的な装置および実験法は、先に記載される。システムの温度を、特注のセル設計を使用して、15.0±0.1°Cに維持した。緩衝溶液は、1MKCl、10mMTris-Hcl、pH8.5であった。これらの条件下でのα-HL開口細孔コンダクタンスは、順方向バイアスforwardbiasで0.82pSであった。パッチクランプ増幅器Axopatch200B,AxonInstruments,UnionCity,CAを使用して、イオン電流を測定し、100kHzローパスlow-pass4極ButterworthフィルターKrohnHite3302,Avon,MAを使用して、シグナルをフィルター処理した。DAQカードを使用して、シグナルを1MHz/22ビットでデジタル処理した。全ての制御ソフトウェアおよび取得ソフトウェアを、NationalInstruments’LabViewを使用して作成した。装置は、膜を貫通する印加電圧を制御するために使用するフィードバックループを内蔵する。制御電圧による、工程に対する膜電位の応答時間は、4±1μsであった。各々の実験電圧または電圧ランプにより設定される所定の条件で実行されたにおいて、代表的にデータを、1,000回より多い解離事象を収集した。ソフトウェアおよびハードウェアは、高スループットの無人のデータ収集を可能にし、その結果、各々の実験についての総取得時間は約10分間であった。各々の解離事象は、以下の3つの部分からなる:1ヘリックス部分がα-HLの前庭の内部に引っかかるまで、一本鎖の突出が通過およびスライドすること;2低電圧で細孔内にヘアピンを保持すること;および3二本鎖DNAを解離させること。第一の部分と第二の部分とを設計して、第三の部分のためのシステムを調製し、その結果、解離が、細孔に対する分子の所定の構成で常に開始する。あらゆる単一の分子の実験と同様に、分子間または事象間のバリエーションは不可避である。コントロールの測定のセット以下に記載されるが存在し、データの散乱を低減するために、多数回の解離実験を反復した。解離部分は、以下の2つの型の測定からなった:定常の力での解離、および固定の負荷速度での解離。これらの実験は、結果のセクションで記載される。最初の2つの部分スライドおよび保持について選択した電圧および時間は、全ての実験において変えなかった。図11は、一定の力で実行した代表的な解離事象の最初の数ミリ秒msを示す。上部のパネルは、時間の関数として印加される電圧を示し、下部パネルは、生じた細孔電流である。事象は、細孔内での一本鎖のポリdA末端の通過から始まる。チャネルへのポリヌクレオチドの侵入は、開口細孔電流の急激な低下により検出され、これは取得システムのトリガーを作動させ、かつt=0の点破線を規定する。分子は、V=220mVでチャネル内に、td=300μsの時間で引き込まれる。結果に示されるように、この時間は、40マーのDNAについて最も可能性のあるトランスロケーション時間tpよりもわずかに長いように選択した。したがって、t=tdにおいて、大半のDNAヘアピンがα-HLの前庭内に完全に滞留することが予測される。この仮定を、以下の2つの相補的な測定により確かめた:最初の実験において、tdは50~700μsまで変動し、t=tdにおいて、V=-120mVへの電圧の逆転に際しての、遊離escape時間の分布を測定した。50μsと300μsとのtd値の間に分子が細孔から引き抜かれるのに必要とされる代表的な時間に単調な増加が存在した。しかし、td>300μsに関して、曲線は一定のレベルに飽和しsaturate、このことは、DNAの一本鎖の突出がチャネルを通過し、その後、二本鎖のヘリックス部分が前庭に侵入した場合に停止したことを示した。さらに、証拠は、tdの間における、閉鎖イオン電流のレベルの分析から得られた。詳しくは、平均の電流td=300μsは、明確な2つのピークを示した:約6pAでの低電流の主要なピーク、および通常のポリdA閉鎖レベル約11pAにおける副次的なピーク。より低い電流のピークは、α-HLの前庭を占めるヘアピンのヘリックス部分による、細孔のさらなる閉鎖に起因した。t=td=300μsでの解離したヘアピンの画分はほんのわずかであった。V=120mVでのヘアピン分子のトランスロケーションの確率分布を測定することにより、この画分を定量化したデータは示していない。この分布から、t=td=300μsでの解離したヘアピンの画分は0.5未満であることを推定した。t=tdでのDNAの最初のスライドに続いて、時間tH=500μsの間、電圧を、低い保持電位20mVまで低下させた。この電圧は、前庭内にヘアピンを保持するのに十分大きいが、以下に示されるデータから明らかなように、著しい解離を誘発するには小さいことが見出されている。500μsを選択したことは、便利ゆえであった実験の別のセットにおいて、5秒間まで、ヘアピンを細孔に保持した。保持期間の終わりにおいて、解離電圧であるVUまたは、負荷速度を印加した。結果ssDNAのトランスロケーション時間の分布各々個々のDNAのトランスロケーション時間tTは、α-HLの細孔のチャネル部分内へ最初の数塩基のDNA分子の侵入から、チャネルの他方の側から分子が抜け出るまでの時間間隔として規定される。これらの事象は、開口細孔電流の約10までの、細孔を通って流れるイオン電流の急激な低下により明確に観察される。ヘアピンの場合に、DNAは、その一本鎖の3’突出によりチャネルに侵入することしかできない。なぜなら、その他方の末端のループは、細孔に侵入するには大きすぎるからである。この場合において、tTは、上記の3つの連続的なプロセスの合計であるすなわち、tT=ts1tunzipts2、ここで、ts1は、一本鎖の突出ポリdA50のスライド時間であり、ts2は、解離したヘアピンループ26塩基のスライド時間であり、そしてtunzipは解離時間である。図12は、V=120mVおよび15°Cで測定される、一本鎖のDNAポリdA90のトランスロケーション時間の分布を示す。ヒストグラムを約1,500回の個々の事象から構築した。ssDNAの分布は、tP=0.5msでの顕著なピークを示し、これを使用してプロセスを特徴付けた。tT>tP=0.5ms最も可能性のあるトランスロケーション時間の後、分布は、0.32msの時間定数を有する、単一の指数関数にフィットする。先の研究は、tPが塩基の個数22マー以上とともに線形に上昇することを実証した。したがって、ポリdA90のトランスロケーション分布から、ts1が0.28ms0.5ms×50/90であることを推定した。この時間は、同様な方法で測定されるDNAヘアピンの特徴的なtT約2ms~10msデータは示していないよりも大幅に短いことに留意すること。それにもかかわらず、以下に記載されるように、解離プロセスから最初のスライドを切り離すことが可能であり、それにより、ts1を完全に除去する。解離プロセスへのts2の寄与を、Vの関数として、ポリdAのトランスロケーション時間の研究から推定することができる。これらの測定に基づいて、26ヌクレオチドに関して、ts2は30mVで約660μs、150mVで約100μsと推定される。電圧の関数としてのts2の推定値を、各々の事象で測定される解離時間全体から引くことができ、tunzipについてのより正確な推定を得ることができる。この補正は小さく以下参照のこと、結果に影響しない。ts2の測定はまた、1ヌクレオチドあたりの平均スライド時間例えば、100mVで6μsについての考えを与える。以下に示されるように、この時間スケールは、細孔内での解離機構の解明に重要である。ヘアピンが細孔内で滞留される場合、その解離動態は、再会合re-zippingとスライドプロセスとの間の競合により影響される解離したヌクレオチドは、ヘアピンと再会合rejoinし得るか、またはチャネルに沿ってスライドし得、それによって再会合をブロックする。再会合時間と比べて、スライド時間が短い場合、再会合が阻害される。対照的に、スライド時間が長い場合、解離を完了する前に、ヘアピンは、開閉opening-closingの移行を頻発する。1.一定の力での解離動態定常電圧または、力でのDNAヘアピンの解離を研究した。電圧の急激な変化をナノ細孔を横切って印加し、そして解離動態を測定した。この実験で使用した代表的な電圧および電流のトレースを図13に示す。DNAは、時間t=0でチャネルに侵入する。図10に説明されるように、分子は、短時間の間、細孔内に引き込まれ、保持される。t=0.8msにおいて、解離電圧90mVを印加するが、解離がt=tU=70ms電流の急激な上昇により示されるで生じるまで、電流はブロックされるより低いレベル。解離電圧VUを印加すると、電流は、その適切な閉鎖細孔レベルまでわずかに上昇し細孔電流の拡大図については、図11を参照のこと、t~70ms解離電圧の印加から測定されるまで、この閉鎖レベルに留まった。この時点において、電流は、この電圧に対応する開口細孔電流レベルまで急激に上昇した。解離したヘアピンのスライド時間は、図13の時間スケールで決定するには短すぎるので、この移行は、ヘアピンの解離の瞬間を示す。1分間あたり約100回の個別の解離事象を累積する自動化手順を使用して、解離プロセスを反復した。時間間隔[0~t]ここで、t=0は、VUが印加される瞬間として規定される内で解離事象が生じる確率を計算することによって、データを分析した。この計算のために、約1000回の解離事象を取得し、時間tを中心とする50μsの時間枠timewindow内に測定された平均細孔電流をプロットした。電流の分布は、ブロックされた細孔の状態および空の細孔の状態にそれぞれ関する、2つの良好に分離したピークを示す図13の挿入図。事象の総数に対する空の細孔高電流事象の個数の比を計算することによって、時間tにおける累積の解離の確率を取得した。以下の電圧レベルを使用した:円30mV、正方形60mV、三角形90mV、逆三角形220mVおよび菱形150mV。上記の測定をVUの種々の値30mV、60mV、90mV、220mVおよび150mVで反復し、同様の分析手順を適用した。探索時間の関数として、11ヘアピンを解離する確率を表すデータを、図14に示す。PUNZIPを、各々の探索時間に関して、事象の総数に対する、高い電流ピーク下での事象の個数の比として計算した図13の挿入図を参照のこと。短時間すなわち、t<1msで、VUの振幅amplitudeに関係なく、解離の確率は非常に低い。t~10msにおいて、小さなVU値と大きなVU値との間の解離の確率に明確な差異が存在する。解離の直後に、細孔を通っての26nt一本鎖のトランスロケーションが続くので、測定した解離時間は、以下の2つの期間を含む:真の解離時間および26マーのスライド時間ts2。先に説明されるように、ts2を推定することにより、測定を補正した。しかしながら、補正は、解離時間よりもはるかに小さい約1ので、結果に非常にわずかな影響しか与えない。図14に示される解離の確率分布を、単一の指数関数によってフィットさせ、種々の電圧レベルでの特徴的な解離時間τUを得た。図15において、解離電圧VUに対するτUの依存性を、それぞれHP1完全な円、HP2三角形およびHP3正方形に対してプロットする。直線フィットから明らかなように、τUがVUに指数関数的に依存することに留意すること。この依存性は、改変Kramers速度モデルから予測される:は、0電圧転移時間であり、Ebは、ヘアピンの解離についてのエネルギー障壁energybarrierであり、そして、Vβ=kBT/Qeff。図11の線の傾きは、Vβ=22±2mVの単一の値を与え、これを使用して、有効なDNA電荷を推定することができる。この電荷は、α-HLのチャネルにまたがる約22ヌクレオチドに伴い、したがって、1ヌクレオチドあたりの有効電荷は:1.13/12=0.094eである。このフィットと縦軸との切片から、τUO力が0の値を推測することができる。実験結果は、HPlについてτUO=2.1±0.2s、HP2について1.2±0.1s、そしてHP3について0.34±0.05であることを示した。2.一定の負荷速度での解離動態能動的な制御法によって、任意の時間依存的な電圧Vtを印加して、結合の切断の動態を測定することができる。特に、力分光法の測定を、代表的に、一定の負荷速度またはで実行する。以下の段落では、まず、任意の所定のに対する解離電圧の予測された分布の誘導の結果、およびに対する臨界電圧または、最も可能性のある解離電圧の依存性を示す。分析は、ナノ細孔の場合に適合されたEvansおよびRitchieのアプローチにしたがう。結果は、大きな負荷速度についてはこの単純化モデルに一致するが、より低い速度ではこのモデルから外れる。単一のエネルギー障壁とともに、印加された力の方向に沿う理想的な1Dエネルギー地形energylandscapeを仮定する。平衡力を印加しないにおいて、閉じたヘアピン状態は、エネルギー地形の深い最小値として表され、エネルギー障壁Ebにより開口状態から隔てられている。ヘアピンを解離させるために、分子はこのエネルギー障壁を横切らなければならない。バイアスをかけた電圧または、力の存在下で、障壁は低減され、Kramers時間τ0は、ここで、τ0およびVβは先に定義されるにしたがって改変される。ここで、V=Vtは時間依存性である。解離がtとtdtとの間で生じている単位時間あたりの確率は、により与えられる。この式は、Vt=Vtに関して表現され得、解離電圧の分布を与える:臨界解離電圧Vcは、この分布の最大値により規定され、これは:である。図16は、4.5V/sの一定の負荷速度で実行した、代表的な解離事象を示す。上部のパネルは印加された電圧を示し、下部のパネルは細孔電流を示す。解離は、電圧のランプの間の、閉鎖細孔電流レベルから開口細孔電流レベルへの電流の急上昇により容易に観察可能である。解離電圧VUは、各々の事象から直接取得される。先の実験と同様に、細孔へのDNAの最初の侵入を行ったすなわち、細孔内の分子の0.3msのスライドおよび0.5msの保持。電圧ランプを印加すると、電流は閉鎖レベルのままだが、t~22msランプの開始から測定されるにおいて、解離された鎖が迅速に細孔へスライドし、そして細孔電流に鋭い上昇が存在する。曲線から、解離電圧VUこの場合、130mVを直接測定することができる。スライド時間ts2は、見かけの解離時間それゆえVUをわずかに長くする。しかしながら、先に検討されるように、これは、ほんのわずかな影響である:ここで示される場合において、ts2~0.12msであり、したがって補正は、0.12/22=0.005観察した時間の微小な画分。十分な統計データを取得するために、解離実験を、任意の所定のランプ値について、少なくとも1,000回反復した。測定したVU値の代表的な分布は、図17の挿入図に示される。この分布は、式1により良好に近似される挿入図の実線。分布のピークは、最も可能性のある解離力unzippingforceまたは、臨界電圧、Vcである。HPl単一のミスマッチを有するヘアピン、HP2およびHP37bpヘリックスについて、測定を反復し、0.5~100V/sの範囲の電圧ランプに対するVcの依存性を取得した。データを、図14の片対数プロット上に示すHPl、HP2およびHP3に対して、それぞれ円、三角形および正方形。中程度および高い電圧ランプ5~100V/sにおいて、Vcは、式2により予測されるへの対数的な相関関係にしたがう。式2にしたがって、図17の直線の傾きは、単純にVβである。対数フィットからVβは、HPlについては24.7±1.0mV、HP2については22.5±1.1mV、そしてHP3については23.3±1.9mVであり、これらは、上記の一定電圧の測定と良好に一致する。Vβが細孔内のDNAの有効電荷にのみ依存する事実から予測されるように、全ての分子はほとんど同じ傾きを有した。より低いランプの方式において、データが、式2により予測される、単純な対数的な相関関係から外れることに留意すること。この偏差は、以下で議論される。式2へデータランプ>1.6V/sをフィットさせることにより、HPlおよびHP2について、それぞれ、τU0=0.72sおよび0.49sを得、これらの値は、一定の電圧の方法を使用して得た値よりも小さい。先の研究は、次のことを実証した。2.4nmのα-HLの前庭に滞留した、短い平滑末端のDNAヘアピンの開閉動態が、単一の工程プロセスとして記載され得、計算されたヘアピン全体の自由エンタルピーに近いエネルギー障壁を超えての急上昇に対応する時間スケールを得ることができる。これらの実験において、ほとんど力を印加しないか、または力を印加せずに、分子を変性させる。なぜなら、平滑末端DNAは、α-HLのチャネル部分に侵入することができないからである。電流実験において、DNAヘアピンの一方の末端から伸長する一本鎖の突出がチャネル内を通過し、それゆえ、おそらく鎖に力を印加することによってヘアピンの動態に偏りが生じる。能動的な制御法により、220mV以上から、より小さな電圧で実行される解離の測定を延長することができ、それゆえ、0の力と強力な力の限界とのギャップを埋めることができる。任意の所定の電圧Vにおいて、QeffV/dによりDNA鎖に印加される力を推定することができるここで、Qeffはチャネル内のssDNAの有効電荷であり、そしてd約5nmはチャネルの長さである。比較的小さな電圧小さなバイアスをかける力biasingforceにおいてさえも、熱的に融解した塩基対の迅速な再アニーリングが、ほとんどこの再アニーリング同じ速さの、細孔内の対合していない鎖の進行によりブロックされ得ることに留意すること。特徴的なssDNAのスライド時間を、トランスロケーション実験から推定した。この歯止めratchet機構は、ヘアピン全体の解離を数個の連続的な工程へ分けることができる。したがって、この場合における15の総解離時間は、0のバイアス動態biaskineticsと比較して、著しく短いことが予測される。実験は、一定の力τUで測定した特徴的な解離時間が解離電圧レベルVUにより指数関数的に減少することを示す。直線フィットの傾きが、ヘアピンの配列したがって、そのエンタルピーとは無関係であることが見出され、チャネル内のssDNAフラグメント上の有効電荷を推定することを可能にした。VU=0に対する指数関数フィットの切片が、τUOの推定を提供する。これらの値と、ヘアピンの完全な変性移行に十分近くするのにかかる、計算上の平衡時間スケールとを比較することが興味深い。1MNaでmfoldサーバを使用して、HPlについてΔG0=-16.4kcal/mole、そしてHP2についてΔG0=-12.2kcal/moleを得、数時間のおよその閉鎖から開口までを完了する時間スケールを得た。対照的に、推定により、τU0~1sを得、これは数桁の強度でより短い。時間スケールのこの相違は、先に示される歯止めの考えに合致する。特に、1つではなく2つの熱的に活性化された工程によりナノ細孔解離が生じる場合各々、約5塩基、これらの時間全体は、数秒のオーダーまで低減される。1.5nmのα-HLチャネル内のssDNA上の有効電荷を、2つの独立したアプローチ一定の力または固定の負荷速度により推定した。両方の方法は、細孔内の鎖について1.13eの有効電荷または1ヌクレオチドあたり0.094eの有効電荷を得、このことは、チャネル内のDNAの負電荷が、正に荷電したカリウムイオンの濃縮condensationおよびα-HLチャネルの内壁上の極性基の存在により効果的に釣り合うことを示し、また先の結果と合致する。この有効電荷を使用して、任意の所定のVでの力を計算することができる。動態作用の測定は、上記の図と合致する。高い負荷速度ランプ>2V/sにおいて、解離時間それゆえVcを、力による電位障壁の高さの急速な変化により決定する。この制限において、システムは、開口閉鎖移行を多数回は起こさず、Vcはに直接比例する。の小さな値に対して、負荷速度に対する臨界電圧の弱い依存性により特徴付けられる、別の方式への柔軟な重複softcrossoverが存在する。この方式において、電圧は、十分低いまま維持され、このことは、システムが、最終的な解離の前に、閉鎖状態と開口状態との間で変動することを可能にするのに十分長い時間を提供する。図17の対数曲線の傾きは、式2により定義されるVβを与える。フィットパラメータは、一定の力による方法を使用して得た値と極めて良好に合致する。さらに、へのフィットの外挿を使用して、2つのヘアピンについてのτUOを推定することができる。動的測定から取得した値は、一定の力で得た外挿値よりも一貫して小さい約2分の1。HPlおよびHP2に対応する曲線は、大体20mVで置き換えることに留意すること。DNA上の測定された有効電荷を使用して、この変化を、約1kBT約0.6kcal/molのエネルギーの相違に解釈することができる。本発明は、種々の実施形態に関して記載されたが、本発明が、添付の特許請求の範囲の意図および範囲内の、広範な種類のさらなる実施形態および他の実施形態も可能であることも認識されなければならない。"