"ケラタン硫酸-IIKS-IIを有効成分とする樹状細胞免疫受容体刺激剤。ケラタン硫酸-IIの存在下またはケラタン硫酸-IIを対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定することを特徴とする樹状細胞免疫受容体刺激剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤のスクリーニング方法。ケラタン硫酸-II様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体。モノクローナル抗体である請求項3記載の抗体。破骨細胞産生抑制作用及びTNF-α産生抑制作用を有する請求項3又は4記載の抗体。請求項3~5のいずれか1項記載の抗体を含有する医薬。骨代謝異常を伴う疾患予防治療剤又は炎症性疾患予防治療剤から選ばれるものである請求項6記載の医薬。ケラタン硫酸-II阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体。モノクローナル抗体である請求項8記載の抗体。破骨細胞産生促進作用及びTNF-α産生促進作用を有する請求項8又は9記載の抗体。請求項8~10のいずれか1項記載の抗体を含有する医薬。抗がん剤及び免疫賦活剤から選ばれるものである請求項11記載の医薬。樹状細胞免疫受容体を刺激するために使用するケラタン硫酸-IIKS-II。骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患を予防又は治療するために使用する請求項3~5のいずれか1項記載の抗体。がん治療又は免疫賦活のために使用する請求項8~10のいずれか1項記載の抗体。ケラタン硫酸-IIKS-IIを投与することを特徴とする樹状細胞免疫受容体の刺激方法。請求項3~5のいずれか1項記載の抗体を投与することを特徴とする骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患の予防治療方法。請求項8~10のいずれか1項記載の抗体を投与することを特徴とするがん治療法又は免疫賦活方法。しかしながら、DCIRに対する内因性のリガンドは未だ発見されておらず、本来の意味でのDCIRの生体内での作用メカニズムは解明されていない。また、DCIR刺激剤やDCIR拮抗剤も全く見出されていない。従って、本発明の課題は、DCIRのリガンドを見出し、その刺激剤及び拮抗剤を探索し、その応用を図ることにある。そこで本発明者は、DCIRのリガンドを見出すべく種々検討した結果、全く意外にもそのリガンドがケラタン硫酸-IIKS-IIであることを見出し、さらにKS-IIとDCIRとの結合による作用を検討したところ、KS-IIはDCIRに結合することにより、骨芽細胞及び破骨細胞の機能を制御しており、特に破骨細胞形成を強く抑制しており、また炎症を抑制していることを見出した。これらの知見に基づき、さらに、DCIRに対する抗体を作製し、その作用を検討したところ、抗DCIR抗体の中には、KS-II阻害性のDCIR拮抗作用を有する抗体だけでなく、KS-II様のDCIR刺激作用を有する抗体が存在することを見出した。また該KS-II様のDCIR刺激作用を有する抗DCIR抗体は優れた破骨細胞成形抑制作用、TNF-α産生抑制作用を有し、骨代謝異常を伴う疾患や炎症性疾患の予防治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、KS-IIを有効成分とする樹状細胞免疫受容体刺激剤を提供するものである。また、本発明は、KS-IIの存在下またはKS-IIを対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定することを特徴とする樹状細胞免疫受容体刺激剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤のスクリーニング方法を提供するものである。また、本発明は、KS-II様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体、及びこれを含有する医薬を提供するものである。さらに本発明は、KS-II阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体、及びこれを含有する医薬を提供するものである。また、本発明は、樹状細胞免疫受容体を刺激するために使用するKS-IIを提供するものである。また、本発明は、樹状細胞免疫受容体刺激剤製造のための、KS-IIの使用を提供するものである。また、本発明は、骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患を予防又は治療するために使用する、KS-II様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体を提供するものである。また、本発明は、骨代謝異常を伴う疾患予防治療剤又は炎症性疾患予防治療剤製造のための、KS-II様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体の使用を提供するものである。また本発明は、がん治療又は免疫賦活のために使用する、KS-II阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体を提供するものである。また、本発明は、抗がん剤又は免疫賦活剤製造のための、KS-II阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体の使用を提供するものである。また、本発明は、KS-IIを投与することを特徴とする樹状細胞免疫受容体の刺激方法を提供するものである。また、本発明は、KS-II様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体を投与することを特徴とする骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患の予防治療方法を提供するものである。また、本発明は、KS-II阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する抗体を投与することを特徴とするがんの予防治療方法又は免疫賦活方法を提供するものである。本発明によれば、KS-IIがDCIRのリガンドであることが見出され、これは破骨細胞の形成抑制作用等を有し、新たな医薬として有用である。また、抗DCIR抗体のうち、KS-II様作用を有する抗体は、DCIR刺激作用を有し、骨代謝異常を伴う疾患、炎症性疾患等の予防治療剤として有用である。一方、KS-II阻害作用を有する抗体は、DCIR拮抗作用を有し、抗がん剤、免疫賦活剤等として有用である。本発明のDCIR刺激剤の有効成分はKS-IIである。ケラタン硫酸は、ガラクトースGalにN-アセチルグルコサミンGlcNAcが結合した、Gal-GlcNAcの基本構造を有する硫酸化グリコサミノグリカンである。ケラタン硫酸には、骨や軟骨由来でO-グリコシド結合でタンパク質と結合するKS-IIと、角膜由来でN-グリコシド結合でタンパク質と結合するKS-Iとが存在するが、本発明ではKS-IIのみが使用できる。KS-Iには本発明の作用はない。KS-IIは、炎症等に関与することが知られている特許文献1が、DCIRとの関係については全く知られていなかった。KS-IIには、Gal-GlcNAcの繰り返し数及び硫酸残基数により種々の構造のものが存在するが、本発明ではいずれのものも使用できる。これらのKS-IIは、骨や軟骨由来のもの、また市販のものを使用することができる。後記実施例に示すように、KS-IIは、DCIRのリガンドであり、DCIRに結合することにより種々の作用を示す。すなわち、KS-IIはDCIRに結合することにより、骨芽細胞の成熟化と骨基質形成を阻害し、オステオポンチンの生産を促進する作用を有する。一方で、KS-IIは、DCIRに結合することにより、破骨細胞の形成を強力に抑制することも判明した。また、その作用はGM-CSF依存性の破骨前駆細胞の増殖を阻害することによるものである。なお、KS-IはDCIRのリガンドではない。従って、KS-IIは、骨形成調節剤として有用であり、種々の骨疾患、例えば骨粗鬆症、骨パジェット病、変形性骨炎等の予防治療剤として有用である。また、KS-IIはDCIRのリガンドであるから、KS-IIの存在下あるいはKS-IIを対照として、被検物質のDCIRへの結合性を測定すれば、DCIR刺激剤又はDCIR拮抗剤のスクリーニングが可能である。より具体的には、KS-II及び被検物質のDCIRへの結合性を測定し、KS-IIとDCIRとの結合性と対比すれば、被検物質がDCIRの刺激剤か拮抗剤かが判定できる。ここでDCIRへの結合性の測定は、KS-IIの作用、例えば破骨細胞形成能、TNF-α産生に対する作用、I型IFN産生に対する作用により判定してもよい。DCIR刺激剤又はDCIR拮抗剤のスクリーニングは、インビトロでもインビボでも行うことができる。インビボの場合には、破骨細胞形成能、TNF-α産生に対する作用、I型IFN産生に対する作用により判定するのが好ましい。本発明の抗DCIR抗体には、KS-II様のDCIR刺激作用を有する抗DCIR抗体抗DCIRアゴニスティック抗体と、KS-II阻害性のDCIR拮抗作用を有する抗DCIR抗体抗DCIRアンタゴニスティック抗体とがある。本発明において、KS-II様のDCIR刺激作用を有するとは、KS-IIと同様のDCIR刺激作用を有すればよく、他の物質によりDCIR刺激作用を有する場合も含まれる。KS-II様のDCIR刺激作用を有する抗体のうち、DCIRに対する結合性がKS-IIと同等またはそれよりも高いものが好ましく、当該結合性は1.2倍以上高いものが好ましく、2倍以上がより好ましく、5倍以上高いものがさらに好ましい。当該結合性は、DCIRに対する結合性を直接測定してもよいが、破骨細胞形成抑制能、TNF-α産生抑制作用などの活性を指標に測定してもよい。本発明におけるKS-II様のDCIR刺激作用を有する抗体は、破骨細胞形成抑制作用及びTNF-α産生阻害作用を有し、その作用はKS-IIと同等もしくはそれよりも強い。従ってKS-II様抗DCIR抗体は、骨吸収性疾患などの骨代謝異常を伴う疾患や炎症性疾患等の予防治療剤として有用である。骨代謝異常を伴う疾患や炎症性疾患の例としては、例えば、骨粗鬆症、骨パジェット病、変形性骨炎、関節リウマチなどを挙げることができる。KS-II様抗DCIR抗体が、これらの疾患に有効であることは、例えばコラーゲン誘発関節炎モデルを用いて確認することができる。KS-II阻害性のDCIR拮抗作用を有する抗体のうち、DCIRに対する結合性がKS-IIと同等もしくはそれよりも高いものが好ましく、当該結合性は1.2倍以上のものが好ましく、2倍以上のものがより好ましく、5倍以上のものがさらに好ましい。KS-II阻害性のDCIR拮抗作用を有する抗体は、強い破骨細胞形成促進作用及びTNF-α産生促進作用を有する。従ってKS-II阻害性抗DCIR抗体は、抗がん剤、免疫賦活剤等として有用である。本発明の抗DCIR抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、ならびに抗原決定基に特異的に結合する能力を保持している抗体及びT-細胞レセプターフラグメント等の、抗体の変種及び誘導体が含まれる。また、本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成reshapedヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域CDR;complementaritydeterminingregionをヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域frameworkregion;FRを連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる欧州特許出願公開番号EP239400、国際特許出願公開番号WO96/02576参照。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよいSato,K.etal.,CancerRes,1993,53,851-856.。また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をinvitroで所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる特公平1-59878参照。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができるWO93/12227,WO92/03918,WO94/02602,WO94/25585,WO96/34096,WO96/33735参照。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体scFvとしてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO92/01047,WO92/20791,WO93/06213,WO93/11236,WO93/19172,WO95/01438,WO95/15388を参考にすることができる。また、これらの抗体は、その特性を失わない限り、抗体断片フラグメント等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、Diabodyなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい例えば、Co,M.S.etal.,J.Immunol.1994152,2968-2976;Better,M.andHorwitz,A.H.,MethodsEnzymol.1989178,476-496;Pluckthun,A.andSkerra,A.,MethodsEnzymol.1989178,497-515;Lamoyi,E.,MethodsEnzymol.1986121,652-663;Rousseaux,J.etal.,MethodsEnzymol.1986121,663-669;Bird,R.E.andWalker,B.W.,TrendsBiotechnol.19919,132-137参照。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコールPEG等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明の抗体及び抗体フラグメントは、任意の適当な方法、例えば、インビボ、培養細胞、インビトロ翻訳反応、及び組換えDNA発現系により製造することができる。モノクローナル抗体及びハイブリドーマを製造する手法は当該技術分野においてよく知られているCampbell,MonoclonalAntibodyTechnology:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology、ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,TheNetherlands,1984;St.Grothetal.、J.Immunol.Methods35:1-21,1980。DCIR又はそのフラグメントを免疫原として用いて、抗体を生成することが知られている任意の動物マウス、ウサギ等に皮下又は腹膜内注射することにより免疫することができる。免疫に際してアジュバントを用いてもよく、そのようなアジュバントは当該技術分野においてよく知られている。ポリクローナル抗体は、免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し、ELISAアッセイ、ウエスタンブロット分析、又はラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングすることにより得ることができる。モノクローナル抗体は、免疫した動物から脾臓細胞を切除し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することにより得ることができる。ELISAアッセイ、ウエスタンブロット分析、又はラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、目的とする蛋白質又はそのフラグメントを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。あるいは、ゼノマウス株を用いてヒト型モノクローナル抗体を製造してもよいGreen,J.Immunol.Methods231:11-23,1999;Wells,Eek,ChemBiol2000Aug;78:R185-6を参照。また、免疫を行わないファージディスプレイに基づいたモノクローナル抗体の作製も現在行われており、本発明の抗体はこれらの方法のいずれで製造されてもかまわない。本発明の医薬は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。経口投与用には、KS-II又は抗DCIR抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。非経口投与用には、KS-II又は抗DCIR抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の治療剤を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、KS-II又は抗DCIR抗体を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、KS-II又は抗DCIR抗体を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、KS-II又は抗DCIR抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。KS-II又は抗DCIR抗体の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人1日あたり1μg~500mgであるのが好ましい。次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。実験方法全ての動物実験は、東京大学医科学研究所動物使用委員会の承認を得、動物実験のための安全ガイドライン及び遺伝子複製実験のための倫理ガイドラインに従って行われた。1.DcirノックアウトKOマウスの作製Dcir-/-KOマウスは、NatureMedicine,2008,vol14,no2:176-180に記載される手順に従って、通常の遺伝子ターゲティング法によって作製した。5’末端相同領域、BamHIサイト、EcoRIサイト、ネオマイシン耐性遺伝子Neo、3’末端にネガティブセレクションのためのジフテリア毒素遺伝子DTを含むターゲティングベクターを作製した。これを用いて、マウス由来ES細胞のDcir遺伝子のエキソン1及び2をNeoで置換することにより、immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotifITIMを含む細胞質領域及び膜貫通ドメインの大部分をコードするゲノム配列を欠損させた図1a。ESクローンからの遺伝子をBamHI及びEcoRI処理した後、サザンブロットハイブリダイゼーション解析によってスクリーニングし、5’プローブ図1b、3’プローブ図1c及びNeoプローブ図1dを用いて遺伝子の欠損を確認した。Dcir欠損ESクローンを用いてDcir/-マウスを作製し、Dcir/-マウスの交配によりDcir-/-マウスを作製した。Dcir-/-マウスは実験に用いる前に、C57BL/6JSLCと8~9世代戻し交配させた。マウスにおけるDcir遺伝子の欠損は、ゲノムサザンブロット解析によって確認した図1e。ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析によって脾臓におけるDcirmRNAの発現が欠損していることを確認した図1f。2.骨表現型の解析マウス骨表現型の解析は、以下の方法によって行った。1コンピュータ断層撮影CT、大腿部及び関節部の3次元マイクロCTによる解析は、R_mCT理学メカトロニクス社製を使用して行なった。また、大腿部の2次元マイクロCTによる解析及び定量化は、ScanXmate-A090Sコムスキャンテクノ社製及びTRI/2D-BONシステムラトックシステムエンジニアリング社製を使用して行なった。さらに、大腿部の末梢骨定量CTPQCTによる解析及び定量化は、XCTResearchSAシステムStratecMedizitechnikGmbH社製を用いて行なった。2組織学的検査大腿部のHE染色は、NatureMedicine,2008,vol14,no2:176-180に記載されている方法に従って行なった。関節部はトルイジンブルーTB染色及びフォンコッサ染色を行い、脛骨部はTB及びTRAP染色を行った。染色は、試料を10中性緩衝ホルマリンで固定し、それを脱灰なしでグリコールメタクリル樹脂又はパラフィンで処理した後、3μm切片にスライスした。脛骨近位端における成長板及び骨梁の組織形態学的解析をOsteoplanIICarlZeiss社製を使用して行なった。動的組織形態計測Dynamichistomorphometryanalysisのため、カルセイン1.6mg/kg体重を3日おきに2回皮下注射した。最初の注射から4日後、脛骨部を細分化し、70エタノールで固定した。5μm厚の非脱灰凍結切片をLeicaCM3050ScryostatLeicaMicrosystems社製を用いて作製した。骨石灰化速度及び骨形成速度は、ZeissAxioskop及びOsteoplanIICarlZeiss社製を使用して解析した。3.骨発達の解析マウスの鼻-肛門nasoanal長を週2回測定し、成長曲線を作成した。新生マウスを100エタノールで4日間固定し、その後アセトン溶液に移し、3日後水で洗浄し、0.1アリザリンレッドSSigma社製/95エタノール1重量部、0.3アルシアンブルー6GXSigma社製/70エタノール1重量部、100酢酸1重量、及びエタノール17重量部からなる染色液で10日間染色した。96エタノールで洗浄した後、骨格形成が明らかに視認できるまで標本を20グリセロール/1水酸化カリウム中に室温で保存し、その後100グリセロールに移して保存した。4.インビトロ破骨細胞形成及びピット形成アッセイ非接着骨髄細胞をウェルプレート24ウェルプレート中5×105細胞/ウェル、又は6ウェルプレート中3×106細胞/ウェルの中に播種し、10FCSBiowest社製及び10ng/mLM-CSFRDSystems社製を含有するα-MEMGIBCO中で培養した。2日後、非接着細胞リンパ球を含むを洗い流し、残った接着細胞を骨髄由来マクロファージbonemarrow-derivedmacrophage,BMMとして使用した。これらの破骨前駆細胞pOCを100ng/mL溶解性RANKLPeprotech社製又はOrientalYeast社製及び10ng/mLM-CSFの存在下でさらに培養することにより、破骨細胞を得た。3日後、破骨細胞を10中性緩衝ホルマリン中で3分間固定し、さらにエタノール/アセトン混合液50:50v:v中で1分間保存した後、TRAP染色液NaphtholAS-MXリン酸塩5mg;N,N-dimethylformamide0.5mL;fastredvioletLB塩30mg;50mM酒石酸ナトリウム含有0.1M酢酸ナトリウム緩衝液pH5.050mL中で室温でインキュベートした。TRAP陽性多核細胞MNC;≧3核を計数した。ピット形成アッセイにおいては、破骨細胞を30ng/mLM-CSFの存在下で2日間にわたって生成させ、その後、30ng/mLM-CSF及び150ng/mLRANKLによりさらに3日間処理した。その後、トリプシンを使って細胞を回収し、回収した細胞を播種し96ウェルプレート中1×105細胞/ウェル、象牙質スライス上で30ng/mLM-CSF及び150ng/mLRANKLを用いて2日間培養した。試料を1モルNH4OH中で超音波処理し、ヘマトキシリンで染色した。TRAP陰性MNC、及び吸収ピットによって浸蝕された領域を、BiorevoBZ-9000Keyence社製を使って観測、測定した。GM-CSFが破骨細胞形成に及ぼす影響を調べるため、mouseGM-CSFenzymeimmunoassayPerSeptiveBiosystems社製、組換えGM-CSFPeprotech社製、抗マウスGM-CSF中和抗体RDSystems社製を使用した。さらに増殖アッセイを行なうため、pOCを播種し96ウェルプレート中1×104細胞/ウェル、10ng/mLM-CSFのみにより、又は、M-CSF100ng/mLRANKL若しくは20ng/mLGM-CSFにより3日間培養した。その後、細胞を[3H]TdR0.5μCi/mLで一晩曝露した。5.骨芽細胞の分化及び石灰化の検出1初代骨芽細胞の培養初代骨芽細胞を新生マウスの頭蓋冠から単離した。頭蓋冠をPBSで洗浄し、0.25トリプシン及び2mg/mLcollagenasePRoche社製を含有するα-MEM中、37°Cで20分間消化した。上清を除去した後、細胞をさらに60分間消化した。骨形成を誘導するため、初代骨芽細胞96ウェルプレート中2×104細胞/ウェル、24ウェルプレート中5×104細胞/ウェル、又は6ウェルプレート中2×105細胞/ウェルをコンフルエントまで培養し、10mMβ-glycerophosphate及び50μg/mLアスコルビン酸を添加した培地に置き換えた。培地は21日間で3回交換した。21日間培養した骨芽細胞の、アリザリンレッド染色、フォンコッサ染色、及びアルカリホスファターゼALP染色を行った。2アリザリンレッド染色21日間培養した骨芽細胞をPBSで溶液を取り除いた後、3.7ホルマリン溶液nacalaitesqueにて10分間固定した。その後PBSでもう1度洗い、ALP染色液0.1mg/mLNaphtolAS-MXphosphatenacalaitesque、0.6mg/mLアゾイックジアゾコンポーネント20TGI、5μL/mLN,N-dimetylformamidenacalaitesque、7.5mLTris-HCL1.5M、pH8.8nacalaitesqueにて20分間反応させた。反応溶液を取り除きPBSで洗った後、乾燥させBIOREVOKEYENCEにて撮影を行った。3フォンコッサ染色21日間培養した骨芽細胞をイオン交換水で溶液を取り除いた後、3.7ホルマリン溶液にて30分間固定した。その後イオン交換水でもう1度洗い、5硝酸銀溶液nacalaitesqueを直射日光下15分間反応させた。反応を停止させるため5硝酸銀溶液を取り除き5チオ硫酸ナトリウムnacalaitesqueを加え2分間静置した。5チオ硫酸ナトリウムをイオン交換水で洗浄し、乾燥させた後BIOREVOKEYENCEにて撮影を行った。4ALP染色初代骨芽細胞を96ウェルプレートにて21日間培養し、TRACPALPAssayKitTaKaRaを用い測定を行った。培養細胞上清を回収し、原液及び10倍希釈液をテンプレートとした。テンプレート50μlに反応基質溶液を加え、37°Cで15分間反応させた。反応停止液50μlを加えて反応を停止させた後、MICROPLATEREADERMTP-300CORONAELECTRICを用いOD405にて活性の測定を行った。6.初代骨芽細胞及び骨髄細胞BMCの共培養初代骨芽細胞及びBMCそれぞれ48ウェルプレート中3×103細胞/ウェル、2×105細胞/ウェルは、10-3M1.25OH2D3Sigma社製及び10-7MPGE2NakalaiTesque社製中で8日間培養した。培地は、2日ごとに交換した。TRAP染色を行ない、MNCを計数した。7.RT-PCR解析半定量RT-PCR及びリアルタイムRT-PCRは、若干変更を加えたものの、基本的にはNatureMedicine,2008,vol14,no2:176-180及びArthritisResTher,2006,8,R100,1-13に記載の方法に従って行った。トータルRNAを標準的なグアニジノ酢酸チオシアン酸塩/フェノールクロロホルム法、又はSepasol-RNAISuperNacalaiTesque社製を使用する方法によって調製した。調製したRNAは、SuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCRInvitrogen社製を使って逆転写し、cDNAを調製した。半定量的RT-PCRは、上記で調製したcDNAを鋳型として行った。反応液は1試料あたり20μlとし、10×PCRreactionbufferRoche2μl、dNTPsRoche1.6μl、表1に記載のプライマー0.4μl、TaqDNApolymeraseRoche0.2μl、templateDNA1μlとなるように調整した後、iCyclerBio-Radを用いて増幅反応を行った。PCR後の反応溶液は、1.5アガロースゲルを用いて、定電圧100V、30分間の電気泳動により分離し、15分間0.05μg/mLエチジウムブロマイドで染色後、UVイルミネ-ターBAS-IIIでDNA断片を検出した。リアルタイムRT-PCRは、表1に記載のプライマー、SYBRGreenqPCRキットInvitrogen社製及びiCyclerBio-Rad社製を使用して行った。8.イムノブロット1ウエスタンブロットウエスタンブロットは、NatureMedicine,2008,vol14,no2:176-180に記載された方法に従って行った。PVDF膜BioRadをメタノールで浸し、電気転写用緩衝液25mMTris-HClpH8nacalaitesque、15mg/mLGlycinenacalaitesque、20メタノールWakoに移し変え、30分程度浸透させて前処理を行った。TRANS-BLOTSDSEMI-DRYTRANSFERCELLBioRadを用い、ゲル面積1cm2あたり2mAで1時間通電し、PVDF膜に転写した。転写後、一次抗体として以下のタンパクに特異的な抗体を使用して、PVDF膜をブロットした。Phospho-p38MAPKThr180/Tyr182;p38MAPK;Phospho-p44/42MAPKThr202/Tyr204;p44/42MAPK137F5;Phospho-SAPK/JNKThr183/Tyr185:81E11;SAPK/JNK56G8;Phospho-AktThr3O8;C31E5;AktpanC67E7;Phospho-NF-κBp65Ser536;93H1;NF-κBp65C22B4;Phospho-PLCγ1Tyr783;PLCγ1;Phospho-PLCγ2Tyr759;PLCγ2;β-tubulinAbcam;Phospho-Stat5Tyr694CellSignalingTechnology;Stat5C17SantaCruzBiolechnology二次抗体には抗ウサギIgG、HRP-LinkedAntibodyCellSignalingを用いた。膜を洗浄後、ECL-PlusGEHealthcareを用いて発光させ、FLA-5000FUJIFILMで解析を行った。2免疫沈降分析免疫沈降分析においては、ProteinG-Sepharose4FastFlowGEHealthcare社製、マウスDCIR特異抗体320511:RDSystems社製、phospho-Tyr4G10:ミリポア社製、及びSHP-1HG213;Upstateを使用した。また、ウサギIgG特異的HRP-結合ポリクローナル抗体CellSignaling社製又はラットIgG特異的HRP-結合ポリクローナル抗体Zymed社製を二次抗体として使用した。9.糖鎖及び糖鎖結合アッセイ牛関節軟骨由来ケラタン硫酸KS-II精製物は、K.Yoshida理研及びA.TawazaHydroxInc.より入手した。他の糖鎖牛角膜由来ケラタン硫酸、クジラ関節由来コンドロイチン硫酸A、豚皮膚由来コンドロイチン硫酸デルマタン硫酸、及びN-acetyllactosamineは、SeikagakuBiobusiness社より購入した。糖鎖結合アッセイは、JBioChem,2004,279,29043-29049に記載された方法に従って実施した。KS-IIを100mM酢酸ナトリウムpH5.5によって2mg/mLの濃度に希釈し、氷上で1時間、2mMメタ過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化を行ない、反応性アルデヒド基を得た。さらに希釈を行なった後、KS-IIをCovalinkELISAプレート上で4°Cで一晩インキュベートし、その後、KS-IIを室温で1.5時間、0.3シアン化ホウ化水素ナトリウムによる還元反応によって共有結合させた。プレートを洗浄し、2ウシ血清アルブミンfractionV:Sigma社製により37°Cで2時間ブロッキングした。細胞外ドメイン99~238番残基を含む組み換えマウスDCIRmDCIRを、pGMT7プラスミドを使用してE.coliBL21DE3pLysSの封入体として発現させ、標準的希釈法によってリフォールドしたブロッキングしたプレートで、mDCIRを4°Cで一晩インキュベートした。タンパク質の結合は、TMB基質Dako社製の存在下で抗DCIR抗体320507及び320511の混合物:RDSystems社製及びHRP-結合ラットIgGZymed社製を使用して検出した。実施例1Dcir-/-KOマウスにおける骨形成Dcir-/-KOマウスは、加齢に伴い、付着部炎に由来する硬直症enthesitis-inducedankylosisを発症するとの報告があるがNatureMedicine,2008,vol14,no2:176-180、硬直症状が未発症の若齢KOマウス8週齢、及び硬直症状を示さない正常な高齢KOマウス12月齢の骨量を3次元マイクロCT測定し、野生型と比較したところ、若齢KOマウス、及び正常高齢KOマウスの骨量は、野生型WTに比べて増加していた図2a,b及び図3。従って、骨形成は、穏やかな骨硬化症を示すDcir-/-マウスにおいては促進されることが示された。次いで、マウスの骨におけるDCIRの発現をPT-PCRにより測定した。DCIRは、骨髄由来破骨細胞OC及び初代骨芽細胞OBにおいて発現していたが、初代軟骨細胞では発現していなかった図4。この結果からも、Dcirの骨代謝への関与が支持される。鼻-肛門nasoanal長に基づく成長曲線、及びアリザリンブルー及びアリザリンレッドによる新生マウスの骨染色の結果からは、Dcir-/-マウスにおいても骨は正常に発達することが示された図5。骨硬化症は、軟骨細胞、OC又はOBの異常を有する動物において観察されるGenesDev,1999,13,3037-3051。Dcir-/-マウスにおける骨硬化症の原因を解明するため、組織形態計測によりマウスの骨を調べた。脛骨成長板近位部における増殖層の厚さは、WTとKOマウスとで差がなかったことから、軟骨細胞はKOマウスにおいても正常に形成されることが示された図2c、d。TRAP陽性OCの数及び骨梁におけるOC表面積は、KOマウスにおいて有意に増加していた図2e、f。硬直変化を示さないKOマウスで骨形成が増加していたことを考慮すると、この結果は予想外である。次に、これらのマウスにおける骨ターンオーバーを調べるため、生後8週のマウスにおいて新たに形成された骨を動的組織形態計測Dynamichistomorphometryanalysisによって計測した。すなわち、マウスに3日おきに2回カルセインを投与して骨を標識し、その間に形成された骨を測定した。KOマウスの脛骨の形成速度及び石灰化は、WTマウスと比較して高かった図2g、h。従って、Dcir-/-マウスでは、破骨細胞骨吸収及び骨芽細胞による骨形成とがともに増進しており、骨ターンオーバーがより高まっていることが示された。Dcir-/-マウスでは全体としては骨密度が増大していたことから、生理的条件下では骨吸収に対する影響よりも骨形成に対する効果が上回ると考えられる。実施例2破骨細胞形成におけるDCIRの役割上記の実験からは、Dcir-/-マウスが破骨細胞OCを多く有していたことが示された。そこで、破骨細胞形成におけるDCIRの役割について調べた。WT及びKOマウス由来初代骨髄細胞BMCを、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF及び核因子κBリガンドの受容体活性化因子RANKLを用いた標準インビトロOC分化系で培養し、OC分化を誘導した。その結果、Dcir-/-BMC培養物においては、TRAP陽性多核OCへの分化が有意に増加した図6a,b。多くのKO由来OCは多核であり、骨ページェット病患者の骨の表現型に似ていた。Dcir-/-OCのでは、骨吸収によってできた穴pitのサイズが拡大しており、Dcir-/-OCの骨吸収活性が大きく増強されたことが明らかとなった図6c,d。また、Dcir-/-細胞を含む培地においてはTRAP活性が上昇した図6e。これらの結果から、DCIRがBMCからの成熟OCの分化に関与していることが示された。次いで、DCIRの多核OC形成に対する影響を評価するため、Dcir-/-OCにおけるT細胞活性化核因子1Nfatc1とT細胞活性化核因子2Nfatc2の発現量を調べた。Nfatc1及びNfatc2は、ともにOC成熟のための主要な調節因子であり、Acp5TRAPやCtskカテプシンKと同様に、OC特異的なマーカーである。Nfatc1及びNfatc2遺伝子の発現量は、野生型OCと同等であった図6f。従って、DCIRはNFAT発現に影響しないことが示された。BMCからのOC分化はRANK及びimmunoreceptortyrosine-basedactivationmotifharboringadaptorITAM保有アダプタにより活性化されるシグナル伝達経路により制御されることからNature,2004,428,758-763、これらの細胞におけるRANKの下流のシグナル伝達について調べた。MAPKp38、ERK、JNK、Akt及びNF-κB全てTRAF6の下流に位置するのRANKL誘導性の活性化は正常であり、またPLCγ1とPLCγ2のRANKL誘導性ITAM保有アダプタ依存性チロシンリン酸化も、WTと成熟OCにおいて変化がなかった図6g,h。これらのデータは、DCIRがOC前駆細胞pOCからのRANKL依存性のOC分化に影響しないことを示す。OC分化の初期段階におけるDcir欠損の影響をみるため、インビトロ培養2日後の、TRAP陽性単核OCの数を計測した。単核OCの数は、M-CSFで処理したDcir-/-BMCにおいて有意に増加し図6i,j、DCIRが、OC分化の初期段階で機能していることが示された。一方、WTとDcir-/-pOCをM-CSFとRANKLとで処理した場合の増殖反応には差は見られなかった図6k。この結果は、破骨細胞形成の主要シグナル伝達カスケードと考えられているRANKL依存性シグナル伝達を阻害することなく、DCIRがOC形成をネガティブに制御することを示している。さらに、GM-CSFに対するpOCの反応を調べた。従来の報告では、GM-CSFが骨髄細胞前駆体の樹状細胞への分化を促進することから、GM-CSFがOCの発現を抑制することが示されていたBlood,2001,98,2544-2554。しかし最近、GM-CSFが、特定の条件下で、pOCの分化、増殖、生存及び融合を促進することが報告されたJBoneMinerRes,2004,19,190-199、NatMed,2007,13,62-69、NatMed,2008,14,81-87、JImmunol,2009,183,3390-3399、BiochemBiophysResCommun,2008,367,881-887。そこで、培養細胞を用いてGM-CSFの破骨細胞形成に対する影響を調べた。WTpOCではなくDcir-/-pOCの分化が、GM-CSFによって有意に上昇した図7a。GM-CSF濃度は、WTとDcir-/-マウスの培養物との間で変化がなかった図7b。WTBMCと比較すると、Dcir-/-BMCからのOC分化は、0.1ng/mLの組換えGM-CSF存在下で有意に上昇したが、1ng/mL以上では上昇が見られなかった図7c。対照的に、抗GM-CSF中和抗体による処理によって、Dcir-/-マウスの破骨細胞形成は顕著に抑制された図7d。また、GM-CSF刺激後のDcir-/-pOCにおけるシグナル伝達因子と転写因子5Stat5活性化因子のリン酸化について調べたところ、Dcir-/-細胞のGM-CSF誘導型Stat-5リン酸化が顕著にアップレギュレートされた図7e。これらの結果からは、DCIRはGM-CSFシグナル伝達の阻害によってpOC増殖を抑制していることが示された。実施例3DCIRリガンドの同定DCIRのリガンドはこれまで報告されていなかった。そこで本発明者らは、破骨細胞形成に関与する生体内のDCIRリガンドを同定するため、公共のグリカンアレイデータベースを用いてDCIRに結合する糖鎖を検索した。その結果、DCIRリガンドとして、硫酸化ガラクトースβ1-4N-アセチル-D-グルコサミンN-アセチルラクトサミン又はLacNAc構造図8aを有する糖鎖が特定された。硫酸化poly-LacNAcは、主に角膜N結合型KS-Iや関節軟骨O結合型KS-IIに存在するケラタン硫酸KSの内部にプロテオグリカンの硫酸化グリコサミノグリカンGAG側鎖として存在する分子である。そこでマウスの関節や骨髄細胞BMCおけるKSの発現を調べたところ、これらの領域でKSが発現されていることを確認した。また、DCIRとKSとの結合をELISA法を利用した糖鎖結合アッセイにより調べた結果、組換えマウスDCIRはウシ関節軟骨由来のKS-IIと濃度依存的に結合することがわかった図8b。さらに、KSのOC分化への影響を、インビトロでTRAP陽性OCの数を計測することにより評価した。KS-IIは、野生型WT骨髄細胞培養物におけるOC形成を著しく阻害したが、Dcir-/-の培養細胞では阻害しなかった図8c及びd。OC分化は、角膜由来のKS-I、非硫酸化LacNAc、又はコンドロイチン硫酸CSやデルマタン硫酸DSといった他の硫酸化グリコサミノグリカンには影響を受けなかった図8e。次に、DCIRがKSにより活性化されることを確認するため、免疫沈降分析を行った。その結果、DCIRにおけるimmunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotifITIMのリン酸化、及びチロシンホスファターゼSHP-1動員は、KS-IIによって濃度依存的に増加することが分かった図8f。これらの結果は、KS-IIがDCIRに特異的なリガンドであり、DCIRの活性化を介して破骨細胞形成の阻害に関与していることを示している。実施例4骨芽細胞OB形成におけるDcirの役割骨芽細胞OB形成におけるDcirの役割を調べた。初代頭頂骨OBの増殖は、WTマウスにおいてもDcir-/-マウスにおいても同様であった図9。頭蓋冠骨由来のOBにおいて、Dcirは、β-グリセロリン酸とアスコルビン酸による骨形成分化の誘導後に発現し、その発現は石灰化過程の間中続いた図10a。Dcir-/-OBにおいて、カルシウム図10bやリン酸カルシウム付加図10cやアルカリホスファターゼALP発現図10dは、培養初期14日に亢進されていたことから、石灰化はWTのOBに比べDcir-/-OBで促進されていることが分かった。これらの結果より、DCIRが末端OB分化と石灰化基質形成に関与していることが示唆された。Runx2、Osterix、ALPといったOBマーカー、骨シアロタンパク質BSP、I型コラーゲンColI、オステオカルシンといった骨基質タンパク質をコードする遺伝子の発現量は、Dcir-/-マウスで高かった図10e。また、骨吸収に必要なオステオポンチンOPNの発現量が、WTの骨芽細胞に比べDcir-/-の骨芽細胞で顕著に低くなっていた。これらのデータにより、DCIRが骨芽細胞の成熟化と骨基質形成を阻害し、OPNの生産を促進することで、骨形成を負に制御していることが示唆された。さらに、骨形成性培養物のアリザリンレッド染色及びALP染色より、KS-II存在下でWTのOBでは石灰化が抑制されたのに対し、Dcir-/-OBでは抑制がみられないことが分かった図10f。次に、破骨細胞形成の制御における骨芽細胞の役割を、Dcir-/-マウス由来のBMCとOBとの共培養系において調べた。Dcir-/-BMCとWTのOBの共培養物では、通常の破骨細胞形成がみられた図10g,h。一方、WTのBMCとDcir-/-OBの共培養物では、破骨細胞形成が大きく減少した図10g,i。この結果より、DCIRが骨芽細胞と破骨細胞との正常なカップリングに関与していることが示された。OC形成は、骨芽細胞由来のRANKLとオステオプロテジェリンOPGにより制御されるので、Dcir-/-OBにおけるこれらの発現量を調べた。RANKLの発現量には実質的な差はみられなかったが、OPGの発現量はWTのOBに比べてDcir-/-OBで有意に増加し、変異骨芽細胞のOPG/RANKL比を増加させた図10j、図11。さらに、KS-II処理は、WTのOBでのみOPG/RANKL比を減少させたことから図10k,l、KS-IIがOPGの生産をDCIR依存的に制御することが示された。従って、DCIRは、OPGの発現を抑制することで破骨細胞形成を促進しているようである。また、DCIRは破骨細胞だけでなく骨芽細胞でも機能し、生体の骨のターンオーバーを制御していると考えられる。実施例5抗DCIR抗体の作製1DCIR発現細胞の作製Dcir遺伝子を含む発現ベクターはDcir遺伝子を含む配列NM_011999の137番目から989番目のヌクレオチドをPCR法により増幅し、pcDNA3.1ベクターに挿入して調製し、リポフェクトアミン2000インビトロジェンを用いて293T細胞及びCOS7細胞に形質導入した。約48時間後、細胞を回収し凍結保存した。2DCIRの発現確認1で作製した一過性発現細胞について、抗DCIR抗体を用いたウエスタンブロットをDCIR発現細胞及びその野生株について行い、DCIR発現細胞特異的に予想される35kDa付近にバンドが検出できるか確認することにより、DCIRの発現確認を行い、DCIR発現細胞株を取得した。3マウスへのfootpad法による免疫アジュバントcompleteadjuvantFREUND三菱化学ヤトロンRM606-1とPBSを混ぜたエマルジョンを、マウス4匹の片足の裏に免疫した。1週間後、2で得たDCIR発現細胞株でマウスを免疫した。毎週1回、計5回の免疫を行った。4細胞融合5回目の免疫の3日後に、免疫したマウスの両足から肥大したリンパ節を取り出し、その中から細胞を回収した。培養フラスコ培地:10FBS-RPMIでミエローマ細胞P3U1を増殖させ、細胞を回収した。回収したリンパ節由来細胞とミエローマ細胞を混和し、遠心した。ペレットにPEGPEG4000:MERCKCatNo1097270100、RPMIで等量希釈を加え、細胞融合を行った。RPMI血清無添加培地RPMI1640、SIGMA、CatNoR8758で細胞を洗浄後、15FBS-HAT培地HATsupplement50×:GIBCOCatNo21060-017、初期の不安定なハイブリドーマをレスキューするためsupplementを添加で懸濁し、96ウェルプレート4枚に播種した。播種より3日後に培地を交換し、ハイブリドーマのコロニー形成が確認された後2~3週間後、ウェルプレートから培養上清を採取し、1次スクリーニングを行った。5ハイブリドーマの1次スクリーニングCellELISA/フローサイトメトリー法FCMを用いてハイブリドーマを1次スクリーニングした。CellELISA凍結ストックの細胞トランスフェクタントを起眠させ、0.5BSA/2mMEDTA/PBSに懸濁し、CellELISA用プレートNUNC24957096VNWPSに100μL/ウェル分注した。96ウェルプレート1枚あたり1×107個の細胞を使用した。2000rpm、4°Cで2分間遠心後、上清を捨て、4で採取した培養上清を50μL/ウェル加え、室温で30分間反応させた。0.5BSA/2mMEDTA/PBSで2回洗浄後2000rpm、4°Cで2分間遠心後、上清捨てる、Goat抗マウスIgG-POD標識MBL製品Code.330をBufferMBL製希釈液で10,000倍希釈したものを加え、室温で30分間反応させた。3回洗浄後、発色基質を加え5~10分間発色させた。450-620nmで吸光度測定を行った。FCMCellELISAで陽性の可能性のあるクローンの培養上精について、2で得たDCIR発現細胞との反応性をFCMにより確認した。培養上清原液を細胞と室温で30分間反応させ、2回洗浄後、FITC標識抗マウスIgG抗体MBL製品IM-0819を100倍希釈で30分間反応させた。2回洗浄後、400μlのbufferで懸濁し、FC500ベックマンコールターで測定した。洗浄及び細胞の懸濁Bufferは0.5mMEDTA、5BSAPBSを使用した。擬陽性等のアーティファクトを除くため、継代培養を行いながら何度か反応性を確認した。6単クローン化5の1次スクリーニングで陽性と判断されたハイブリドーマの培養上清から選択されたハイブリドーマに対して、単クローン化を行った。対数増殖期のハイブリドーマをパスツールピペットでピペッティングした後採取し、培地で希釈後、1ウェルあたりの細胞数が1~32,000個になるように細胞濃度を調整し、96ウェルプレートに播種した。ハイブリドーマのシングルコロニーの形成が確認された後1~2週間後、ウェルプレートから培養上清を採取し、5の方法に従って活性を確認した。7単クローナルアイソタイプの確認培養上清をPBSで100倍希釈したものをディベロップメントチューブに滴下し、着色ラテックスビーズを再懸濁する。チューブにアイソタイプ用ストリップIsoStripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット:Roche,Cat.No.1-493-027を浸漬し、5分後、特定のサブクラス部分に検出されたバンドを確認し、クローンを選択した。8単クローン化ハイブリドーマの凍結単クローン化されたハイブリドーマを96ウェルプレート1穴から、48ウェルプレート、24ウェルプレート、12ウェルプレートまで継代培養した。1ウェルの細胞を遠心回収し、セルバンカー十慈フィールド、CatNoBLC-1500μLで懸濁し、ストックチューブSUMILON、CatNoMS-4601W1本に入れ-80°Cで保存した。凍結時に回収した培養上清を最終評価培地として各10mLの作製を行った。最終評価用培養上清を提供し、目的の活性が保持されているかどうかを最終確認した。実施例6抗DCIR抗体の評価実施例4で作製されたハイブリドーマ由来の抗DCIR抗体の、DCIRに対する結合能を評価した。DCIRは免疫反応の抑制に関与することが示されているためNatureMedicine,2008,vol14,no2:176-180、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子αTNF-αの発現を基準に抗体のDCIR結合能を評価した。実施例4で作製したハイブリドーマをCpG濃度1μMを含む培地で12時間培養し、培養上清を回収した。同様に、CpGODN1668株オペロン社を同じ培地、又はさらにケラタン硫酸KS-II;10ng/mLを含む同じ培地で培養し、上清を回収した。コントロールとしてCpG非含有培地で細胞を培養したNT。上清中のTNF-α産生量をELISA法によって測定した。結果を図12に示す。CpG含有培地で細胞を培養することにより、TNF-α産生が誘導されたCpG。ネイティブなDCIRリガンドであるKS-IIを培地に添加した場合、TNF-α産生は抑制されたCpGKS。複数のハイブリドーマ培養上清において、KS-II添加の場合よりもTNF-α産生が抑制された図12中の3、4、5株。これらのハイブリドーマ由来の抗体は、ネイティブなDCIRリガンドであるKS-IIよりも高いDCIR結合能を有しており、DCIRの活性を促進するDCIRアゴニストとして有用である。一方、一部のハイブリドーマ培養上清においては、逆にKS-II添加の場合よりもTNF-α産生が促進された図12中の1、2株。これらのハイブリドーマ由来の抗体は、DCIRの活性を抑制するDCIRアンタゴニストとして有用である。また、上記結果に示されるように、ネイティブなDCIRリガンドであるKS-IIのDCIRに対する作用を指標として、DCIRを特異的に活性化又は抑制することができる物質を評価又は選択することができる。実施例7破骨細胞生成に対する抗Dcir抗体の影響さらに、ケラタン硫酸の作用を指標に、上記抗体の破骨細胞形成に対する作用を評価した。非接着骨髄細胞をウェルプレート96ウェルプレート中1×105細胞/ウェルの中に播種し、10FCSBiowest社製及び10ng/mLM-CSFRDSystems社製を含有するα-MEMGIBCO中で培養した。2日後、非接着細胞リンパ球を含むを洗い流し、残った接着細胞を骨髄由来マクロファージbonemarrow-derivedmacrophage,BMMとして使用した。これらの破骨前駆細胞pOCを100ng/mL溶解性RANKLPeprotech社製又はOrientalYeast社製及び10ng/mLM-CSFの存在下でさらに培養することにより、破骨細胞を得た。培養期間中ハイブリドーマ上清10分の1量又はケラタン硫酸KS-II;10ng/mLを加えた。3日後、細胞を回収し、TRAP染色を行い、TRAP陽性破骨細胞核数3個以上の数を計測した。未処理細胞をコントロールとしたNT。結果を図13に示す。ネイティブなDCIRリガンドであるKS-IIを添加した場合、破骨細胞への分化は抑制されたKS。実施例5でケラタン硫酸よりも高いDCIR結合能を示したハイブリドーマ上清DCIRアゴニスト図13中3、4、5株は、ケラタン硫酸に比べて破骨細胞分化を抑制した。実施例5でDCIRアンタゴニスト活性を示したハイブリドーマ上清は図13中1、2株、ケラタン硫酸に比べて破骨細胞分化を促進した。これらの結果から、本発明のハイブリドーマ由来の抗体のようなDCIRアゴニストは、破骨細胞分化を抑制することにより骨量を増加させる作用を有し、骨粗鬆症等の骨減少性疾患、又は骨折などの骨の障害の治療に有用であることが示された。また、本発明の別のハイブリドーマ由来の抗体のようなDCIRアンタゴニストも、破骨細胞分化を促進することにより骨量を調整させる作用を有するので、各種骨疾患の治療に有用であることが示唆される。試験例コラーゲン誘発関節炎に対する効果は、以下のようにして確認することができる。材料と方法:マウスC57BL/6B6H-2bコラーゲン誘発関節炎CIA:完全プロイントアジュバントCFAは、20mLのIFASigmaChemical社製、St.Louis,MOに100mgの結核菌加熱死菌体M.tuberculosis,H37Ra;DifcoLaboratories社製,Detroit,MIを破砕して調製する。エマルジョンは、2mg/mLチックchickII型コラーゲンCIISigma社製を10mM酢酸に4°Cで一晩溶解し、等容量のCFAに混ぜて調製する。該混合物を、シリンジ-シリンジ法を用いて乳化させる。CII溶液及びそのCFAエマルジョンは、常に新しいものを調製する。マウスは、尾部近傍の背基部の数か所に、総量で100μgのCII及び250μgの結核菌M.tuberculosisを含有100μlエマルジョンを皮内注射する。この注射を21日間繰り返す。関節炎の臨床的評価:動物について、肢の赤みと腫れについて評価する。"