"式X1a-F1d-X2b-F2e-X3cの組成物及びその多量体。式中:F1及びF2は半減期延長部分であり、並びにd及びeは、各々独立に、0又は1であり但し、d及びeの少なくとも1つは1である。;X1、X2及びX3は、各々独立に、-Lf-P-Lg-であり、並びにf及びgは、各々独立に、0又は1であり;Pは、少なくとも2つのペプチド内ジスルフィド結合を含む、約80アミノ酸残基長以下のトキシンペプチドであり;Lは、リンカーであり;並びにa、b及びcは、各々独立に、0又は1である但し、a、b及びcの少なくとも1つは、1である。。式P-Lg-F1の、請求項1に記載の組成物。式F1-Lf-Pの、請求項1に記載の組成物。式P-Lg-F1-Lf-Pの、請求項1に記載の組成物。式F1-Lf-P-Lg-F2の、請求項1に記載の組成物。式F1-Lf-P-Lg-F2-Lf-Pの、請求項1に記載の組成物。式F1-F2-Lf-Pの、請求項1に記載の組成物。式P-Lg-F1-F2の、請求項1に記載の組成物。式P-Lg-F1-F2-Lf-Pの、請求項1に記載の組成物。F1若しくはF2又は両方が、ポリエチレングリコール、エチレングリコールの共重合体、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/マレイン酸無水物共重合体、ポリアミノ酸、デキストランn-ビニルピロリドン、ポリn-ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモ重合体、プロピレンオキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチレン化されたポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖若しくは分岐のグリコシル化された鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、免疫グロブリンFcドメイン若しくはその一部、FcのCH2ドメイン、Fcドメインループ、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、トランスサイレチン、チロキシン結合グロブリン若しくは長い血清半減期の血清タンパク質に対して親和性を有し、ペプチドリガンド及び小分子リガンドからなる群から選択されるリガンド又はこれらの要素の何れかの組み合わせである、請求項1に記載の組成物。F1若しくはF2又は両方がヒトIgFcドメイン又はその一部を含む、請求項1に記載の組成物。ヒトIgGFcドメインがヒトIgG1Fcドメインを含む、請求項11に記載の組成物。ヒトIgGFcドメインがヒトIgG2Fcドメインを含む、請求項11に記載の組成物。F1及びF2が異なる半減期延長部分である、請求項1に記載の組成物。F1若しくはF2又は両方が、図3、4、11A~C、12A~C及び12E~Fに記載されているような配列番号:2、4、70、71、72、74、75、76、1340~1342及び1359~1363からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載の組成物。F1若しくはF2又は両方がヒト血清アルブミンタンパク質ドメインを含む、請求項1に記載の組成物。F1若しくはF2又は両方がトランスサイレチンタンパク質ドメインを含む、請求項1に記載の組成物。F1若しくはF2又は両方が生物学的に適切な重合体又は共重合体を含む、請求項1に記載の組成物。生物学的に適切な重合体がポリエチレングリコールPEGである、請求項18に記載の組成物。PEGが5kD及び20kDのPEGからなる群から選択される、請求項19に記載の組成物。F1がヒトIgGFcドメイン又はHSAであり、及びF2がPEGである、請求項5、6、8又は9の何れか1項に記載の組成物。F2がヒトIgGFcドメイン又はHSAであり、及びF1がPEGである、請求項5、6、7又は9の何れか1項に記載の組成物。非PEGF1若しくは非PEGF2に、又はPに、又はこれらの何れかのあらゆる組み合わせに抱合された1つ又はそれ以上のPEG部分をさらに含む、請求項1に記載の組成物。トキシンペプチドがヒトIgG1Fcドメインループ中に挿入されている、請求項1に記載の組成物。少なくとも1つのPがKv1.3アンタゴニストペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。Kv1.3アンタゴニストペプチドが、ShK、HmK、MgTx、AgTx1、AgTx2、HsTx1、OSK1、アヌロクトキシンAnuroctoxin、ノキシウストキシンNoxiustoxin、ホンゴトキシンHongotoxin、HsTx1、ChTx、チチストキシンTitystoxin、BgK、BmKTX、BmTx、Tc30、Tc32、Pi1、Pi2及びPi3トキシンペプチド又はこれらの何れかの類縁体からなる群から選択される、請求項25に記載の組成物。Kv1.3アンタゴニストペプチドが、表1に記されている配列番号21、17、18、19、61、23、85、25、62、30、27、36、86、9、26、40、87及び13からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の組成物。少なくとも1つのPがShKペプチド又はShKペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。ShKペプチド又はShKペプチド類縁体が、表2に記されている配列番号5、88~200、548~561、884~950及び1295~1300からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項28に記載の組成物。少なくとも1つのPが、HmKペプチド、BgKペプチド、AeKペプチド若しくはAsKSペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。HmKペプチド、BgKペプチド、AeKペプチド若しくはAsKsペプチド又はペプチド類縁体が、表3に記されている配列番号6~9、201~241からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項30に記載の組成物。少なくとも1つのPがMgTxペプチド又はMgTxペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。MgTxペプチド、MgTxペプチド類縁体が、表4に記されている配列番号28及び242~260からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項32に記載の組成物。少なくとも1つのPがAgTx2ペプチド又はAgTx2ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。AgTx2ペプチド又はAgTx2ペプチド類縁体が、表5に記されている配列番号23及び261~275からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項34に記載の組成物。少なくとも1つのPがHsTx1ペプチド又はHsTx1ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。HsTx1ペプチド又はHsTx1ペプチド類縁体が、表6に記されている配列番号61及び276~293からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項36に記載の組成物。少なくとも1つのPがOSK1ペプチド又はOSK1ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。OSK1ペプチド又はOSK1ペプチド類縁体が、表7に記されている配列番号25、294~298、562~636、980~1274及び1303~1308からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項38に記載の組成物。少なくとも1つのPがPi2ペプチド又はPi2ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。Pi2ペプチド又はPi2ペプチド類縁体が、表8に記されている配列番号17及び299~315からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項40に記載の組成物。少なくとも1つのPがAnTxペプチド又はAnTxペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。AnTxペプチド又はAnペプチド類縁体が、表9に記されている配列番号62及び316~318からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項42に記載の組成物。少なくとも1つのPがNTXペプチド又はNTXペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。NTXペプチド又はNTXペプチド類縁体が、表10に記されている配列番号30及び319~325からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項44に記載の組成物。少なくとも1つのPがKTX1ペプチド又はKTX1ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。KTX1ペプチド又はKTX1類縁体が、表11に記されている配列番号24及び326~328からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項46に記載の組成物。少なくとも1つのPがIKCa1アンタゴニストペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。IKCa1アンタゴニストペプチドが、MTxペプチド、ChTxペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項48に記載の組成物。MTxペプチド、ChTxペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体が、表12に記されている配列番号20、36及び329からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の組成物。少なくとも1つのPがMTXペプチド又はMTXペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。MTXペプチド又はMTXペプチド類縁体が、表13に記されている配列番号20、330~343、及び1301、1302、1304~1307、1309、1311、1312及び1315~1336からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項51に記載の組成物。少なくとも1つのPがChTXペプチド又はChTxペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。ChTxペプチド又はChTxペプチド類縁体が、表14に記されている配列番号36、59、344~346及び1369~1390からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項53に記載の組成物。少なくとも1つのPがSKCaアンタゴニストペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。SKCaアンタゴニストペプチドが、アパミンペプチド、ScyTxペプチド、BmP05ペプチド、P05ペプチド、タマピンペプチド、P01ペプチド若しくはTsKペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項55に記載の組成物。SKCaアンタゴニストペプチドが、表15に記されている配列番号16、47、50~53及び68からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項55に記載の組成物。少なくとも1つのPがアパミンペプチド又はアパミンペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。アパミンペプチド又はアパミンペプチド類縁体が、表16に記されている配列番号68及び348~353からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項58に記載の組成物。ScyTxペプチド、タマピンペプチド又はペプチド類縁体が、表17に記されている配列番号51、53及び354~356からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項56に記載の組成物。少なくとも1つのPがBKCaアンタゴニストペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。BKCaアンタゴニストペプチドが、表18に記されている配列番号29、35、38~41からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項61に記載の組成物。少なくとも1つのPがIbTxペプチド、ソロトキシンペプチド、BmTx1ペプチド若しくはBuTxペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項61に記載の組成物。IbTxペプチド、スロトキシンペプチド、BmTx1ペプチド、BuTxペプチド又はペプチド類縁体が、表19に記されている配列番号38及び357~398からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項63に記載の組成物。少なくとも1つのPがマルテントキシンペプチド又はマルテントキシンペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。マルテントキシンペプチド又はマルテントキシンペプチド類縁体が、表20に記されている配列番号35及び399~408からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の組成物。少なくとも1つのPがN型カルシウムチャンネル阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。N型カルシウムチャンネル阻害剤ペプチドが、表21に記されている配列番号64~66、347、409、1364~1367からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項67に記載の組成物。少なくとも1つのPがωMVIIAペプチド又はωMVIIAペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。ωMVIIAペプチド又はωMVIIAペプチド類縁体が、表22に記されている配列番号65及び410~421からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項69に記載の組成物。少なくとも1つのPがGVIAペプチド又はGVIAペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。GVIAペプチド又はGVIAペプチド類縁体が、表23に記されている配列番号64及び422~429からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項71に記載の組成物。少なくとも1つのPがPtu1ペプチド又はPtu1ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。Ptu1ペプチド又はPtu1ペプチド類縁体が、表24に記されている配列番号66及び430~437からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項73に記載の組成物。少なくとも1つのPがT型カルシウムチャンネル、P2X又はTRP阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。少なくとも1つのPがProTx1ペプチド又はProTx1ペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。ProTx1が、表25に記されている配列番号56、438~445からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項76に記載の組成物。少なくとも1つのPがBeKMIペプチド又はBeKMIペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。BeKMIペプチド又はBeKMIペプチド類縁体が、表26に記されている配列番号63及び446~458からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項78に記載の組成物。少なくとも1つのPがナトリウムチャンネル阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。ナトリウムチャンネル阻害剤ペプチドが、表27に記されている配列番号459~469からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項80に記載の組成物。少なくとも1つのPが塩化物チャンネル阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。塩化物チャンネル阻害剤ペプチドが、表28に記されている配列番号67及び470~493からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項82に記載の組成物。少なくとも1つのPがKv2.1阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。Kv2.1阻害剤ペプチドが、表29に記されている配列番号494~506からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項84に記載の組成物。少なくとも1つのPがKv4.3ペプチド及びKv4.2の阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。Kv4.3及びKv4.2の阻害剤ペプチドが、表30に記されている配列番号57及び507~518からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項86に記載の組成物。少なくとも1つのPがnACHRチャンネル阻害剤ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。nACHRチャンネル阻害剤ペプチドが、表31に記されている配列番号519~541からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の組成物。少なくとも1つのPがアガトキシンペプチド又はアガトキシンペプチド類縁体を含む、請求項1に記載の組成物。少なくとも1つのPが、表32に記されている配列番号959~975、1275~1287及び1368からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。請求項1に記載の組成物をコードするDNA。請求項92に記載のDNAを含む発現ベクター。請求項93に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。細胞が真核細胞である、請求項94に記載の宿主細胞。細胞が哺乳動物細胞である、請求項94に記載の宿主細胞。細胞がCHO細胞である、請求項94に記載の宿主細胞。細胞が原核細胞である、請求項94に記載の宿主細胞。細胞がE.コリ細胞である、請求項94に記載の宿主細胞。薬理学的に活性な、共有結合されたさらなるペプチドをさらに含む、請求項1に記載の組成物。さらなるペプチドがF1又はF2に結合されている、請求項100に記載の組成物。さらなるペプチドがPに結合されている、請求項100に記載の組成物。トキシンペプチドの活性に関してアゴニスト作用を示すペプチド若しくはアンタゴニスト作用を示すペプチド又は標的誘導ペプチドをさらに含む、請求項1に記載の組成物。表2に記されている配列番号88、89、92、148~200、548~561、884~949及び1295~1300からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表3に記されている配列番号201~225からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表4に記されている配列番号242~248及び250~260からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表5に記されている配列番号261~275からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表6に記されている配列番号276~293からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表7に記されている配列番号980~1274、1303及び1308からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表8に記されている配列番号299~315からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表9に記されている配列番号316~318からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表10に記されている配列番号319のアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表11に記されている配列番号327及び328からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表13に記されている配列番号330~337、341、1301、1302、1304~1307、1309、1311、1312及び1315~1336からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表14に記されている配列番号1369~1390からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表16に記されている配列番号348~353からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表19に記されている配列番号357~362、364~368、370、372~385及び387~398からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表20に記されている配列番号399~408からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表22に記されている配列番号410~421からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表23に記されている配列番号422、424、426及び428からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表24に記されている配列番号430~437からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表25に記されている配列番号438~445からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表26に記されている配列番号447、449、451、453、455及び457からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表28に記されている配列番号470~482及び484~493からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表29に記されている配列番号495~506からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。表30に記されている配列番号507~518からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトキシンペプチド類縁体を含む、組成物。請求項1、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125又は126の何れか1項に記載の組成物と、及び医薬として許容される担体とを含む医薬組成物。多発性硬化症の少なくとも1つの症候を以前に経験した患者に、多発性硬化症の少なくとも1つの症候の再発が予防され、又は多発性硬化症の少なくとも1つの症候が軽減されるように、請求項1、38、39、48、49、50、51、52、53、54、104、109、114又は115の何れか1項に記載の組成物の予防的有効量を投与することを含む、多発性硬化症の症候の再発を予防又は軽減する方法。組成物がKv1.3アンタゴニストペプチドを含む、請求項128に記載の方法。組成物が、ShKペプチド、OSK1ペプチド、ChTxペプチド若しくはマウロトキシンペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項128に記載の方法。多発性硬化症、1型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄restinosis、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病及び狼瘡からなる群から選択される自己免疫疾患と診断された患者に、前記疾患の少なくとも1つの症候が前記患者において緩和されるように、請求項1、38、39、48、49、50、51、52,53、54、104、109、114又は115の何れかに記載の組成物の治療的有効量を投与することを含む、自己免疫疾患を治療する方法。組成物がKv1.3アンタゴニストペプチド又はIKCa1アンタゴニストペプチドを含む、請求項131に記載の方法。組成物が、ShKペプチド、OSK1ペプチド、ChTxペプチド若しくはマウロトキシンペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む、請求項131に記載の方法。何れかのf又は何れかのgが1であり、並びにLが配列番号79、84及び637~656からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーである、請求項1に記載の組成物。用語の定義本明細書を通じて使用される用語は、具体的な事例において別段の限定がなければ、以下のとおり定義される。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されている単数形a、an及びtheには、文脈から別段の意味であることが明らかである場合を除き、複数表記も含まれる。半減期延長部分すなわち、式I中のF1又はF2という用語は、トキシンペプチドの非抱合形態に比べて、インビボタンパク分解によるトキシンペプチドの分解又はトキシンペプチドの活性を減少させる他の化学的修飾を抑制又は軽減し、吸収の速度を増加させるなど但し、これに限定されない。、半減期又はその他の薬物動態特性を増加させ、毒性を軽減し、溶解性を向上させ、目的の標的イオンチャンネルに関して、トキシンペプチドの生物学的活性及び/又は標的選択性を増加させ、製造可能性を増加させ、及び/又はトキシンペプチドの免疫原性を低下させる、トキシンペプチドに共有結合又は抱合された、医薬として許容される部分、ドメイン又はビヒクルを表す。PEG化されたペプチドとは、ペプチド自体のアミノ酸残基に共有結合されるか、又はペプチドの残基に共有結合されたペプチド若しくは非ペプチドリンカー芳香族リンカーを含むが、これに限定されない。に共有結合されたポリエチレングリコールPEG部分を有するペプチド又はタンパク質を意味する。ポリエチレングリコール又はPEGとは、カップリング剤あり若しくはなしの、又はカップリング若しくは活性化部分での例えば、アルデヒド、ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジド、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン、オキシラン、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド又はマレイミド部分での誘導体化あり若しくはなしの、ポリアルキレングリコール化合物又はその誘導体を意味する。本発明に従えば、有用なPEGには、実質的に直線の、直鎖PEG、分岐PEG又は樹状PEGが含まれる。例えば、Merrill,米国特許第5,171,264号;Harrisetal.,Multiarmed,monofunctional,polymerforcouplingtomoleculesandsurfaces,米国特許第5,932,462号;Shen,N-maleimidylpolymerderivatives,米国特許第6,602,498号を参照。ペプチボディという用語は、F1及び/又はF2が、免疫グロブリンFcドメイン又はFcのCH2ドメインなどのその一部である式Iの分子、又はF1及びF2が、それぞれ、トキシンペプチドがF1及びF2の間に挿入されたFcドメインであるように、トキシンペプチドがヒトIgG1Fcドメインループ中に挿入された式Iの分子を表す例えば、本明細書の図70~73及び実施例49を参照。。本発明のペプチボディは、本明細書にさらに記載されているように、Fcドメイン若しくはその一部の何れかにおいて、若しくは本発明の組成物のトキシンペプチド部分において、又は両方においてPEG化することも可能である。固有Fcという用語は、単量体形態であれ、又は多量体形態であれ、完全な抗体の消化から得られる非抗原結合断片の配列を含む分子又は配列を表す。固有Fcの元の免疫グロブリン源は、好ましくは、ヒト由来であり、免疫グロブリンの何れでもあり得るが、IgG1又はIgG2が好ましい。固有Fcは、共有すなわち、ジスルフィド結合及び非共有会合によって、二量体又は多量体形態へと連結されることが可能な単量体ポリペプチドから構成される。固有Fc分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス例えば、IgG、IgA、IgE又はサブクラス例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2に応じて、1から4の範囲である。天然Fcの一例は、IgGのパパイン消化から得られるジスルフィド結合された二量体であるEllisonetal.1982,NucleicAcidsRes10:4071-9参照。本明細書において使用される固有Fcという用語は、単量体、二量体及び多量体形態の総称である。Fcバリアントという用語は、固有Fcから修飾されているが、サルベージ受容体であるFcRnに対する結合部位をなお含む分子又は配列を表す。幾つかの公開された特許文献が、典型的なFcバリアント及びサルベージ受容体との相互作用を記載している。国際出願WO97/346311979年9月25日に公開;WO96/32478号、2000年8月1日に付与された米国特許第6,096,891号に対応、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる;及びWO04/110472号を参照。従って、Fcバリアントという用語には、非ヒト固有Fcからヒト化された分子又は配列が含まれる。さらに、除去可能な部位は、本発明の融合分子に対して必要とされない構造的特徴又は生物学的活性を与えるので、固有Fcは、除去可能な部位を含む。従って、Fcバリアントという用語は、1ジスルフィド結合形成、2選択された宿主細胞との非適合性、3選択された宿主細胞中で発現された際のN末端不均一性、4グリコシル化、5補体との相互作用、6サルベージ受容体以外のFc受容体への結合又は7抗体依存性細胞傷害ADCCに影響を与えるか、又はこれらに関与する1つ又はそれ以上の固有Fc部位又は残基を欠如する分子又は配列を含む。Fcバリアントは、以下でさらに詳しく記載されている。Fcドメインという用語は、上記定義の固有Fc及びFcバリアント分子及び配列を包含する。Fcバリアント及び固有Fcにおけるごとく、Fcドメインという用語には、完全な抗体から消化されたものであれ、又はその他の手段によって産生されたものであれ、単量体又は多量体形態の分子が含まれる。Fcドメイン又はFcドメインを含む分子に対して用いられる多量体という用語は、共有的に、非共有的に、又は共有的相互作用及び非共有的相互作用の両者によって会合された2つ又はそれ以上のポリペプチド鎖を有する分子を表す。IgG分子は、典型的には、二量体を形成し、IgMは五量体;IgDは二量体及びIgAは単量体、二量体、三量体又は四量体を形成する。当業者は、Fcの固有Ig源の配列若しくは生じた活性を調べることによって、又はこのような固有Fcを誘導体化以下に定義されている。することによって、多量体を形成することが可能である。Fcドメイン又はFcドメインを含む分子に対して用いられる二量体という用語は、共有的に又は非共有的に会合された2つのポリペプチド鎖を有する分子を表す。従って、本発明の範囲に属する典型的な二量体が、図2に示されている。誘導体化する及び誘導体又は誘導体化されたという用語は、それぞれ、1化合物が、環状部分、例えば、化合物内のシステイン残基間の架橋を有する;2化合物が架橋され、又は架橋部位を有する、例えば、化合物がシステイン残基を有し、従って、培養若しくはインビボにおいて架橋された二量体を形成する;3非ペプチド結合によって、1つ又はそれ以上のペプチド結合が置換されている;4N末端が、-NRR1、NRCOR1、-NRCOOR1、-NRSO2R1、-NHCONHR、スクシンイミド基又は置換された若しくは置換されていないベンジルオキシカルボニル-NH-R及びR1及び環置換基は、以下で定義されているとおりである。;5C末端が-COR2又は-NR3R4によって置換されているR2、R3及びR4は、以下に定義されているとおりである。;並びに6選択された側鎖又は末端残基と反応することができる因子での処理を通じて、各アミノ酸部分が修飾されている化合物、プロセス及び得られた化合物を含む。誘導体は、さらに、以下に記載されている。ペプチドという用語は、2~約80アミノ酸残基の分子を表し、約10~約60アミノ酸残基の分子が好ましく、約30~約50アミノ酸残基の分子が最も好ましい。典型的なペプチドは、あらゆる公知の方法によって無作為に作製され、ペプチドライブラリー例えば、ファージディスプレイライブラリー中に担持され、又はタンパク質の消化によって得ることができる。本発明の組成物の何れのペプチド部分、例えば、本明細書に記載されているトキシンペプチド又はペプチドリンカー部分においても、所定の配列のN末端又はC末端の一方又は両方に、追加のアミノ酸を含めることが可能である。もちろん、これらの追加のアミノ酸残基は、組成物の機能的活性を著しく妨害すべきでない。トキシンペプチドには、毒から単離することが可能な薬理学的に活性な天然に存在するペプチドの同じアミノ酸配列を有するペプチドが含まれ、天然に存在するこのような分子の修飾されたペプチド類縁体も含まれる。本発明を実施する上で有用なトキシンペプチドの例は、表1~32に列記されている。トキシンペプチド図2におけるP又はP1として示されている均等物は、例えば、図9に示されているように、少なくとも2つのペプチド内ジスルフィド結合を含む。従って、本発明は、aC1-C3及びC2-C4ジスルフィド結合C1、C2、C3及びC4は、ペプチドのN末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチドの一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第三のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第二及び第四のシステインがジスルフィド結合を形成する。。このようなC1-C3、C2-C4ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、アパミンペプチド、α-コノペプチド、PnlAペプチドPnlBペプチド及びMIIペプチド並びに前記の何れかの類縁体が含まれるが、これらに限定されない。bC1-C6、C2-C4及びC3-C5ジスルフィド結合上述のように、C1、C2、C3、C4、C5及びC6は、ペプチドのN末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチドの一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第六のシステインがジスルフィド結合を形成し、第二及び第四のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第三及び第五のシステインがジスルフィド結合を形成する。。このようなC1-C6、C2-C4、C3-C5ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、ShK、BgK、HmK、AeKS、AsK及びDTX1並びに前記の何れかの類縁体が含まれるが、これらに限定されない。cC1-C4、C2-C5及びC3-C6ジスルフィド結合上記のように、C1、C2、C3、C4、C5及びC6は、ペプチドのN末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチドの一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第四のシステインがジスルフィド結合を形成し、第二及び第五のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第三及び第六のシステインがジスルフィド結合を形成する。。このようなC1-C4、C2-C5、C3-C6ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、ChTx、MgTx、OSK1、KTX1、AgTx2、Pi2、Pi3、NTX、HgTx1、BeKM1、BmKTX、P01、BmKK6、Tc32、Tc1、BmTx1、BmTX3、IbTx、P05、ScyTx、TsK、HaTx1、ProTX1、PaTX2、Ru1、ωGVIA、ωMVIIA及びSmIIIa並びに前記の何れかの類縁体が含まれるが、これらに限定されない。dC1-C5、C2-C6、C3-C7及びC4-C8ジスルフィド結合C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7及びC8は、ペプチドのN末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチド一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第五のシステインがジスルフィド結合を形成し、第二及び第六のシステインがジスルフィド結合を形成し、第三及び第七のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第四及び第八のシステインがジスルフィド結合を形成する。。このようなC1-C5、C2-C6、C3-C7、C4-C8ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、アニュオロクトキシンAnTx、Pi1、HsTx1、MTXP12A,P20A及びPi4ペプチド並びに前記の何れかの類縁体が含まれるが、これらに限定されない。eC1-C4、C2-C6、C3-C7及びC5-C8ジスルフィド結合C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7及びC8は、ペプチドのN末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチドの一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第四のシステインがジスルフィド結合を形成し、第二及び第六のシステインがジスルフィド結合を形成し、第三及び第七のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第五及び第八のシステインがジスルフィド結合を形成する。。このようなC1-C4、C2-C6、C3-C7、C5-C8ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、クロロトキシン、Bm-12b及び何れかの類縁体が含まれるが、これらに限定されない。fC1-C5、C2-C6、C3-C4及びC7-C8ジスルフィド結合C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7及びC8は、ペプチドのN末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチドの一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第五のシステインがジスルフィド結合を形成し、第二及び第六のシステインがジスルフィド結合を形成し、第三及び第四のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第七及び第八のシステインがジスルフィド結合を形成する。。このようなC1-C5、C2-C6、C3-C4、C7-C8ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、マウロトキシン及びその類縁体が含まれるが、これらに限定されない。を含む分子に関する。ペプチド配列を表すために使用される無作為化されたという用語は、例えば、ファーディスプレイ法によって選択された完全に無作為な配列及び天然に存在する分子の1つ又はそれ以上の残基が、天然に存在する分子中の位置に出現しないアミノ酸残基によって置換された配列を表す。ペプチド配列を同定するための典型的な方法には、ファージディスプレイ、E.コリディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母を基礎としたスクリーニング、RNA-ペプチドスクリーニング、化学的スクリーニング、合理的設計、タンパク質構造分析などが含まれる。薬理学的に活性なという用語は、このようにして記載された物質が、医学的パラメータ例えば、血圧、血液細胞数、コレステロールレベル又は病状例えば、癌、自己免疫疾患に影響を与える活性を有することが決定される。従って、薬理学的に活性なペプチドは、以下に定義されている、アゴニストペプチド又は模倣的ペプチド及びアンタゴニストペプチドを含む。模倣的ペプチド及びアゴニストペプチドという用語は、天然に存在するトキシンペプチド分子例えば、天然に存在するShKトキシンペプチドと同等の生物学的活性を有するペプチドを表す。さらに、これらの用語は、天然に存在する分子の効果を強化することによるなど、天然に存在するトキシンペプチド分子の活性を間接的に模倣するペプチドを含む。アンタゴニストペプチド又は阻害剤ペプチドという用語は、対象の受容体イオンチャンネルなど但し、これに限定されない。の生物活性を遮断し、若しくは何らかの方法で妨害するペプチド、又は対象の受容体の公知のアンタゴニスト若しくは阻害剤と同等の生物活性を有するペプチドを表す。酸性残基という用語は、酸性基を含む側鎖を有するD型又はL型のアミノ酸残基を表す。典型的な酸性残基は、D及びEを含む。アミド残基という用語は、酸性基のアミド誘導体を含む側鎖を有するD型又はL型のアミノ酸を表す。典型的な残基は、N及びQを含む。芳香族残基という用語は、芳香族基を含む側鎖を有するD型又はL型のアミノ酸残基を表す。典型的な芳香族残基は、F、Y及びWを含む。塩基性残基という用語は、塩基性基を含む側鎖を有するD型又はL型のアミノ酸残基を表す。典型的な塩基性残基には、H、K、R、N-メチル-アルギニン、ω-アミノアルギニン、ω-メチル-アルギニン、1-メチル-ヒスチジン、3-メチル-ヒスチジン及びホモアルギニンhR残基が含まれる。親水性残基という用語は、極性基を含む側鎖を有するD型又はL型のアミノ酸残基を表す。典型的な親水性残基には、C、S、T、N、Q、D、E、K及びシトルリンCit残基が含まれる。非官能性残基という用語は、酸性、塩基性又は芳香族基を欠如する側鎖を有するD型又はL型のアミノ酸残基を表す。典型的な非官能性アミノ酸残基には、M、G、A、V、I、L及びノルロイシンNleが含まれる。中性極性残基という用語は、塩基性、酸性又は極性基を欠如する側鎖を有するD型又はL型のアミノ酸残基を表す。典型的な中性極性アミノ酸残基には、A、V、L、I、P、W、M及びFが含まれる。極性疎水性残基という用語は、極性基を含む側鎖を有するD型又はL型のアミノ酸残基を表す。典型的な極性アミノ酸残基には、T、G、S、Y、C、Q及びNが含まれる。疎水性残基という用語は、塩基性又は酸性基を欠如する側鎖を有するD型又はL型のアミノ酸残基を表す。典型的な疎水性アミノ酸残基には、A、V、L、I、P、W、M、F、T、G、S、Y、C、Q及びNが含まれる。本発明の組成物の幾つかの有用な実施形態において、固有ShK又はOSK1配列、それらのペプチド類縁体、又は表1~32の何れかに記載されているアミノ酸配列を有する他の何れかのトキシンペプチドなど但し、これらに限定されない。、対象の固有トキシンペプチド配列に比べて、1つ又はそれ以上の様式で、トキシンペプチドのアミノ酸配列が修飾されている。1つ又はそれ以上の有用な修飾には、公知の化学的技術によって達成される、アミノ酸の付加又は挿入、アミノ酸の欠失、ペプチド末端切断、アミノ酸置換及び/又はアミノ酸残基の化学的誘導体化が含まれ得る。このような修飾は、例えば、強化された効力、選択性及び/又はタンパク分解に対する安定性などを目的として為され得る。当業者は、アラニンスキャニング、公知のトキシンペプチド配列を用いた、アラインメントを介した突然変異導入に基づく合理的設計及び/又は分子モデリングなど、このような増強された特性を有するペプチド類縁体を設計するための技術を知悉している。例えば、ShK類縁体は、HmKを用いた、アラインメントを介した突然変異導入例えば、図6参照及び分子モデリングに部分的に基づいて、本発明のShKペプチド含有組成物又は本発明のShK類縁体含有組成物中のプロテアーゼ切断部位例えば、K若しくはR残基におけるトリプシン切断部位及び/又はF、Y若しくはW残基におけるキモトリプシン切断部位を除去するために設計することが可能である。例えば、Kalmanetal.,ShK-Dap22,apotentKv1.3-specificimmunosuppressivepolypeptide,J.Biol.Chem.27349:32697-7071998;Kernetal.,米国特許第6,077,680号;Mouhatetal.,OsK1derivatives,WO2006/002850A2参照。プロテアーゼという用語は、ペプチダーゼと同義である。プロテアーゼは、タンパク質内の点でペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼ、及び、それぞれ、N末端又はC末端の何れから1つ又はそれ以上のアミノ酸を除去するエキソペプチダーゼという酵素の2つの群を含む。プロテイナーゼという用語は、エンドペプチダーゼに対する同義語としても使用される。プロテイナーゼの4つの機構的クラスは、セリンプロテイナーゼ、システインプロテイナーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼである。これらの4つの機構的クラスの他に、同定されていない触媒機構のプロテアーゼに対して割り当てられる酵素命名法の部門が存在する。これは、触媒機構が特定されていないことを示している。切断サブサイト命名法は、SchechterとBergerによって作製されたスキームから一般に採用されているSchechterI.BergerA.,Onthesizeoftheactivesiteinproteases.I.Papain,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunication,27:1571967;SchechterI.BergerA.,Ontheactivesiteofproteases.3.Mappingtheactivesiteofpapain;specificinhibitorpeptidesofpapain,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunication,32:8981968。このモデルに従って、切断を経験する基質中のアミノ酸残基は、切断された結合からN末端の方向に、P1、P2、P3、P4などと表記される。同様に、C末端方向での残基は、P1’、P2’、P3’、P4’などと表記される。当業者は、目的のプロテアーゼ結合部位又はプロテアーゼ切断部位を特定するための様々なツールを知悉している。例えば、SwissInstituteofBioinformaticsSIB;www.expasy.org/tools/peptidecutterのExPASyExpertProteinAnalysisSystemプロテオミクスサーバを通じて、PeptideCutterソフトウェアツールを入手することが可能である。PeptideCutterは、SWISS-PROT及び/又はTrEMBLデータベース又はユーザが入力したタンパク質配列から、プロテアーゼ切断部位についてタンパク質配列を検索する。単一のプロテアーゼ及び化学物質、プロテアーゼ及び化学物質の選択又は完全なリストを使用することが可能である。酵素名に従ってアルファベットでグループ化されるか、又は順次、アミノ酸番号に従ってグループ化された切断部位の表という、結果の出力の様々な形態が入手可能である。出力のための第三の選択肢は、切断部位のマップである。マップにマッピングされた配列及び切断部位は、ブロックにグループ化され、そのサイズは、ユーザによって選択されることができる。プロテアーゼ切断部位を決定するための他のツールも公知である。例えば、Turk,B.etal.,Determinationofproteasecleavagesitemotifsusingmixture-basedorientedpeptidelibraries,NatureBiotechnology,19:661-6672001;BarrettA.etal.,Handbookofproteolyticenzymes,AcademicPress1998。セリンプロテイナーゼには、キモトリプシン、トリプシン又はエラスターゼ又はカリクレインなどの哺乳動物のプロテアーゼ酵素を含むキモトリプシンファミリーが含まれる。セリンプロテイナーゼは、基質残基と相互作用する様々な酵素サブサイト中のアミノ酸置換に関連する異なる基質特異性を示す。幾つかの酵素は、基質との幅広い相互作用部位を有するが、他の酵素はP1基質残基に限定した特異性を有する。トリプシンは、位置P1のR又はKで優先的に切断する。Keil1992によって実施された統計学的研究は、トリプシン切断時における、Arg結合及びLys結合を取り囲む残基すなわち、それぞれ、位置P2及びP1’の負の影響を記載した。Keil,B.,Specificityofproteolysis,Springer-VerlagBerlin-Heidelberg-NewYork,3351992。位置P1’中のプロリン残基は、通常、トリプシン切断に対して強力な負の影響を発揮する。同様に、P1’中のR及びK並びに位置P2及びP1’における負に帯電した残基は阻害をもたらす。キモトリプシンは、位置P1のW、Y又はFで優先的に切断し高親和性、これより低い程度で、位置P1のL、M又はH残基で切断する。Keil,1992。これらの規則に対する例外は、以下のとおりである。Wが位置P1に見出され、M又はPが、同時に位置P1’に見出される場合には、切断は遮断される。さらに、位置P1’におけるプロリン残基は、位置P1に見出されるアミノ酸とは無関係に、切断をほぼ完全に遮断する。M残基が位置P1に見出される場合には、切断は、位置P1’におけるY残基の存在によって遮断される。最後に、Hが位置P1に位置する場合には、D、M又はW残基の存在も、切断を遮断する。膜メタロエンドペプチダーゼNEP;中性エンドペプチダーゼ、腎臓刷子縁中性プロテイナーゼ、エンケファリナーゼ、EC3.4.24.11は、疎水性アミノ酸残基のアミノ側でペプチドを切断する。Connelly,JCetal.,NeutralEndopeptidase24.11inHumanNeutrophils:CleavageofChemotacticPeptide,PNAS,8224:8737-87411985。トロンビンは、位置P1のR残基で優先的に切断する。Keil,1992。トロンビンの天然基質は、フィブリノーゲンである。最適な切断部位は、R残基が位置P1に存在し、Glyが位置P2及び位置P1’に存在する場合である。同様に、疎水性アミノ酸残基が位置P4及び位置P3に見出される場合には、位置P2におけるプロリン残基、位置P1におけるR残基並びに位置P1’及び位置P2’における非酸性アミノ酸残基。その天然基質であるフィブリノーゲンに対する極めて重要な残基は、P10中のD残基である。カスパーゼは、保存されたアミノ酸配列を有する活性部位を有し、及びD残基の後ろでペプチドを特異的に切断するシステインプロテアーゼのファミリーである。EarnshawWCetal.,Mammaliancaspases:Structure,activation,substrates,andfunctionsduringapoptosis,AnnualReviewofBiochemistry,68:383-4241999。Arg-Cプロテイナーゼは、位置P1のR残基で優先的に切断する。切断の挙動は、位置P1’の残基によって、穏やかに影響を受けるに過ぎないように見受けられる。Keil,1992。Asp-Nエンドペプチダーゼは、位置P1’のD残基との結合を特異的に切断する。Keil,1992。前述の記載は単なる例示に過ぎず、当業者が本発明を実施する際に除去することに関心を抱き得るプロテアーゼ結合及び/又は切断部位に関して、当業者に利用可能な知識を網羅的に取り扱ったものではない。他の例では、天然に存在するペプチドアミノ酸配列から修飾されるトキシンペプチドアミノ酸配列は、目的の固有トキシンペプチド配列のアミノ酸と比べて、その中に挿入又は置換された少なくとも1つのアミノ酸残基を含み、ここにおいて、挿入又は置換されたアミノ酸残基は、ペプチドがリンカー又は半減期延長部分に抱合される求核的又は求電子的反応性官能基を含む側鎖を有する。本発明に従えば、このような求核的又は求電子的反応性官能基の有用な例には、チオール、一級アミン、セレノ、ヒドラジド、アルデヒド、カルボン酸、ケトン、アミノオキシ、遮蔽された保護されたアルデヒド又は遮蔽された保護されたケト官能基が含まれるが、これらに限定されるものではない。求核的反応性官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基の例には、リジン残基、α,β-ジアミノプロピオン酸残基、α,γ-ジアミノ酪酸残基、オルニチン残基、システイン、ホモシステイン、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基又はセレノシステイン残基が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書においてトキシンペプチドをさらに記載する際には、天然に存在するペプチド及びタンパク質中に一般的に取り込まれる20の標準アミノ酸残基の種類を表すために、一文字略号システムがしばしば適用される表1A。このような一文字略号は、意味の上で、三文字略号又は省略されていないアミノ酸名と完全に互換的である。本明細書に使用されている一文字略号システムにおいて、本明細書に別段の記載がなければ、大文字はLアミノ酸を示し、小文字はDアミノ酸を示す。例えば、略号RはL-アルギニンを表し、略号rはD-アルギニンを表す。本明細書において、アミノ酸配列中のアミノ酸置換は、特定の位置におけるアミノ酸残基に対する一文字略号に続き、目的の固有トキシンペプチド配列に対する数字のアミノ酸位置、次いで、これに続く、置換されたアミノ酸残基に対する一文字記号によって典型的に表される。例えば、T30Dは、仮想の固有トキシンペプチド配列に対して、アミノ酸位置30におけるアスパラギン酸残基によるスレオニン残基の置換を表す。さらなる例として、R18hR又はR18Citは、仮想の固有トキシンペプチド配列に対して、それぞれ、アミノ酸位置18におけるホモアルギニン又はシトルリン残基によるアルギニン残基の置換を表す。本明細書に記載されているあらゆる特定のトキシンペプチド又はペプチド類縁体のアミノ酸配列内のアミノ酸位置は、ペプチドアミノ酸配列のN末端又はC末端を、適宜、固有トキシンペプチド配列のN末端又はC末端と併置して決定されるように、固有配列に対するその位置とは異なり得る。例えば、このようにして、固有のShK1-35配列番号5のC末端と併置された配列SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTCShK2-35;配列番号92固有ShK配列のN末端切断のアミノ酸位置1は、固有配列におけるアミノ酸位置2に対応し、配列番号92のアミノ酸位置34は、固有配列配列番号5におけるアミノ酸位置35に対応する。本発明のある種の実施形態において、アミノ酸置換は、ペプチド又はタンパク質中では天然には稀なアミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基を含むことができる非標準アミノ酸残基を包含する。非標準アミノ酸残基は、組換え的に発現する細胞などの生物学的系での合成によるより、むしろ、化学的ペプチド合成によってペプチド中に取り込むことが可能であり、あるいは、当業者は、組換え的に発現している細胞を使用するタンパク質工学の公知の技術を使用することが可能である。例えば、Linketal.,Non-canonicalaminoacidsinproteinengineering,CurrentOpinioninBiotechnology,146:603-6092003参照。非標準アミノ酸残基という用語は、天然に存在するタンパク質中に一般的に取り込まれる20個の標準アミノ酸に属さないD又はL型のアミノ酸残基、例えば、β-アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び誘導体化された側鎖を有するアミノ酸を表す。例には、L型又はD型の:シトルリンCit、ホモシトルリンhCit、N-メチルシトルリンNMeCit、N-メチルホモシトルリンNMeHoCit、オルニチンOrn又はO、N-メチルオルニチンNMeOrn、サルコシンSar、ホモリジンhK又はHlys、ホモアルギニンhR又はhArg、ホモグルタミンhQ、N-メチルアルギニンNMeR、N-メチルロイシンNMeL、N-メチルホモリジンNMeHoK、N-メチルグルタミンNMeQ、ノルロイシンNIe、ノルバリンNva、1、2、3、4-テトラヒドロイソキノリンTic、ニトロフェニルアラニンnitrophe、アミノフェニルアラニンaminophe、ベンジルフェニルアラニンbenzylphe、γ-カルボキシグルタミン酸γ-carboxyglu、ヒドロキシプロリンhydroxypro、p-カルボキシル-フェニルアラニンCpa、α-アミノアジピン酸Aad、アセチルアルギニンacetylarg、α、β-ジアミノプロピオン酸Dpr、α、γ-ジアミノ酪酸Dab、ジアミノプロピオン酸Dap、β-1-ナフチル-アラニン1Nal、β-2-ナフチル-アラニン2Nal、シクロヘキシルアラニンCha、4-メチル-フェニルアラニンMePhe、β,β-ジフェニル-アラニンBiPhA、アミノ酪酸Abu、4-フェニル-フェニルアラニン4Bip、α-アミノ-イソ酪酸Aib及び本明細書に記載されているこれらの何れかの誘導体化された形態が含まれる。UPAC-IUB生物化学の命名法に関する合同委員会JCBNによるアミノ酸及びペプチドに対する命名法及び記号表記は、以下の文書:Biochem.J.,1984,219,345-373;Eur.J.Biochem.,1984,138,9-37;1985,152,1;1993,213,2;Internat.J.Pept.Prot.Res.,1984,24,followingp84;J.Biol.Chem.,1985,260,14-42;PureAppl.Chem.,1984,56,595-624;AminoAcidsandPeptides,1985,16,387-410;BiochemicalNomenclatureandRelatedDocuments,2ndedition,PortlandPress,1992,pages39-69]に公表されている。本明細書に記載されているように、本発明に従って、トキシンペプチド又はペプチドリンカーなどの本発明の組成物のペプチド部分は、1つ又はそれ以上のアミノ酸残基において化学的に誘導体化することも可能である。誘導体化されたアミノ酸残基を含有するペプチドは、公知の有機化学技術によって合成することが可能である。ペプチドという文脈における化学的誘導体又は化学的に誘導体化されたとは、官能的側基の反応によって化学的に誘導体化された1つ又はそれ以上の残基を有する対象ペプチドを表す。このような誘導体化された分子には、例えば、遊離のアミノ基が、アミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾオキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成するように誘導体化されている分子が含まれる。遊離のカルボキシル基は、塩、メチル及びエチルエステル又はエステル若しくはヒドラジドの他の種類を形成するように誘導体化され得る。遊離の水酸基は、O-アシル又はO-アルキル誘導体を形成するように誘導体化され得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、N-im-ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。L型又はD型を問わず、20個の標準アミノ酸の1つ又はそれ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも、化学的誘導体として含まれる。例えば、4-ヒドロキシプロリンは、プロリンが置換され得;5-ヒドロキシリジンは、リジンが置換され得;3-メチルヒスチジンは、ヒスチジンが置換され得;ホモセリンは、セリンが置換され得;及びオルニチンは、リジンが置換され得る。本発明の幾つかの実施形態において、目的のトキシンペプチドの塩基性残基例えば、リジンは、他の残基非官能性残基が好ましい。で置換することが可能である。このような分子は、それを与えた分子より塩基性が低く、その他の点では、それを与えた分子の活性を保持しており、これは安定性及び免疫原性の点で利点をもたらし得る。しかしながら、本発明は、この理論によって限定されるべきではない。さらに、本発明の組成物が分子又は化合物として本明細書において表記される場合には、本発明の組成物の生理的に許容される塩も包含される。生理的に許容される塩とは、医薬として許容されることが公知であるか、又は後に発見されるすべての塩を意味する。幾つかの例は、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、塩化水素酸塩及び臭化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、コハク酸塩、メシル酸塩、ベシル酸塩及びシュウ酸塩である。化合物の構造:総論。組換えタンパク質は、数ある手段のうちとりわけ、半減期延長部分への共有結合を通じて、治療剤として開発されてきた。このような部分には、EnbrelRエタネルセプトで使用されるような、抗体のFcドメイン及びNeulastaRペグフィルグラスチムで使用されるような、生物学的に適切なポリマー例えば、ポリエチレングリコール又はPEGが含まれる。Feigeらは、2003年12月9日に付与された米国特許第6,660,843号参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。において、このような半減期延長物質をペプチドとともに使用することを記載した。本発明者らは、本発明の分子少なくとも2つのペプチド内ジスルフィド結合を有する、約80アミノ酸又はそれ以下のペプチドが、半減期延長部分に共有結合されると、治療的利点を有することを決定した。本発明の分子は、半減期延長部分F1及び/又はF2に又はペプチド部分Pに結合されることが可能な、薬理学的に活性な共有結合されたさらなるペプチド部分をさらに含むことが可能である。2以上の半減期延長部分F1及びF2を含有する本発明の組成物の実施形態には、F1及びF2が同一又は別異の半減期延長部分であるものが含まれる。例各ドメイン間にリンカーを有するか、又は有しない。には、図75に図示されている構造及び以下の実施形態並びに本明細書及び実施例に記載されているその他のものが含まれる。20KPEG-トキシンペプチド-Fcドメイン、式[F11-X21-F21]と合致;20KPEG-トキシンペプチド-FcCH2ドメイン、式[F11-X21-F21]と合致;20KPEG-トキシンペプチド-HSAドメイン、式[F11-X21-F21]と合致;20KPEG-Fcドメイン-トキシンペプチド、式[F11-X21-X31]と合致;20KPEG-FcCH2ドメイン-トキシンペプチド、式[F11-F21-X31]と合致;及び20KPEG-HSA-トキシンペプチド、式[F11-X21-X31]と合致。トキシンペプチド。トキシンペプチドすなわち、P又は図2においてP1として等価に示されている。のあらゆる数を、本発明とともに使用することが可能である。特に興味深いのは、トキシンペプチドShK、HmK、MgTx、AgTx2、OsK1OSK1とも称される。、アガトキシン及びHsTx1並びにこれらの修飾された類縁体並びにこのようなトキシンペプチドの活性を模倣するその他のペプチドである。本明細書に上述されているように、本発明の組成物中に2以上のトキシンペプチドPが存在すれば、Pは、独立に、同じく本発明の組成物中に存在する他の何れのトキシンペプチドと同一又は別異であることが可能である。例えば、式P-Lg-F1-Lf-Pを有する組成物において、両トキシンペプチドPは、ShKの同じペプチド類縁体、ShKの異なるペプチド類縁体であり得、又は一方がShKのペプチド類縁体、及び他方がOSK1のペプチド類縁体であり得る。本発明の幾つかの実施形態において、対象となる他のペプチドは、構造式Iの分子に対してさらなる特徴を有する分子中で特に有用である。このような分子において、式Iの分子は、薬理学的に活性な共有結合されたさらなるペプチドをさらに含み、これは、アゴニストペプチド、アンタゴニストペプチド又は標的誘導ペプチドである。本ペプチドは、F1又はF2又はPに抱合されることが可能である。このようなアゴニストペプチドは、トキシンペプチドに対してアゴニスト作用を示す活性を有するが、トキシンペプチドと同じ機序によってこのような活性を発揮する必要はない。ペプチドアンタゴニストも、本発明の実施形態において有用であり、トキシンペプチドの活性に対して相補的であり得る活性を有するペプチドアンタゴニストが好ましい。分子を特定の細胞種、臓器などに誘導するペプチドなど、標的誘導ペプチドも興味深い。ペプチドのこれらのクラスは、本明細書及びその他の参考文献に引用されている参考文献中に記載されている方法によって発見することが可能である。本発明において使用するためのトキシンペプチドを作製する上で、ファージディスプレイが特に有用である。任意の遺伝子産物の任意の部位に対してペプチドリガンドを同定するために、ランダムペプチドのライブラリーからの親和性選択を使用することが可能である。Dedmanetal.,1993,J.Biol.Chem.268:23025-30。ファージディスプレイは、細胞表面受容体又は直鎖エピトープを有する何れかのタンパク質としてのこのような対象タンパク質に結合するペプチドを同定するために特に極めて適している。Wilsonetal.,1998,Can.J.Microbiol.44:313-29;Kayetal.1998,DrugDisc.Today3:370-8を参照されたい。このようなタンパク質は、Herzetal.,1997,J.ReceptorandSignalTransductionRes.175:671-776参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。に広く概説されている。このような目的のタンパク質は、本発明において使用するのに適している。特に好ましいペプチドは、以下の表に見られる。これらのペプチドは、本分野で開示された方法又は本明細書の以下に記載されている方法によって調製することが可能である。一文字アミノ酸略号が使用される。別段の記載差がなければ、各Xは、独立に、非官能性残基である。表2に記載されている多くのペプチドは、Kemらに対して2000年6月20日に付与された米国特許第6,077,680号参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。に記載されているとおりに調製することが可能である。表2の他のペプチドは、本分野で公知の技術によって調製することが可能である。例えば、ShKL5配列番号950は、Beetonetal.,TargetingeffectormemoryTcellswithaselectivepeptideinhibitorofKv1.3channelsfortherapyofautoimmunediseases,Molec.Pharmacol.674:1369-812005参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。に記載されているとおりに調製することが可能である。表2及び本明細書を通じて、Xs15、Xs21、Xs22、Xs23及びXs27は、各々独立に、非官能性アミノ酸残基を表す。表3及び本明細書を通じて、Xh6、Xh22、Xh26は、各々独立に、非官能性残基である。表4に記載されている多くのペプチドは、出願人がMerckCo.,Inc.である、1995年2月2日に公開されたWO95/03065号に記載されているとおりに調製することが可能である。この出願は、1993年7月22日に出願された米国特許出願07/096,942号参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。に対応する。表5に記載されているペプチドは、Lebrunらに対して2004年2月10日に付与された米国特許第6,689,749号参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。に記載されているとおりに調製することが可能である。表7に記載されている配列の全ては、そのN末端又はC末端の何れかにおいて、4~10個の炭素原子を有し及び0~2個の炭素-炭素二重結合を有する脂肪酸又はω-アミノ脂肪酸などのその誘導体で誘導体化することも可能である。例えば、Mouhatetal.,WO2006/002850A2参照。参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。。このような脂肪酸の例には、吉草酸又はC末端に対するω-アミノ吉草酸が含まれる。表13及び本明細書を通じて、Xm19及びXm34は、各々独立に、非官能性残基である。本発明に従えば、分子のトキシンペプチドP部分の少なくとも1つがKv1.3アンタゴニストペプチドを含む分子である。ShK、HmK、MgTx、AgTx1、AgTx2、ヘテロメトラススピニファーHeterometrusspinniferHsTx1、OSK1、アヌロクトキシンAnuroctoxinAnx、ノキシウストキシンNoxiustoxinNTX、KTX1、ホンゴトキシンHongotoxin、ChTx、チチストキシンTitystoxin、BgK、BmKTX、BmTx、AeK,AeKSTc30、Tc32、Pi1、Pi2及び/又はPi3トキシンペプチド及びこれらの何れかのペプチド類縁体からなる群から選択されるアミノ酸配列が好ましい。有用なKv1.3アンタゴニストペプチド配列の例には、本明細書の上記表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10及び/又は表11に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態は、IKCa1アンタゴニストペプチドである少なくとも1つのトキシンペプチドPを含む。有用なIKCa1アンタゴニストペプチドには、マウロトキシンMTx、ChTxペプチド及びこれらの何れかのペプチド類縁体が含まれ、その例には、表12、表13及び/又は表14に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態は、SKCa阻害剤ペプチドである少なくとも1つのトキシンペプチドPを含む。有用なSKCa阻害剤ペプチドには、アパミン、ScyTx、BmP05、P01、P05、タマピン、TsK及びこれらの何れかのペプチド類縁体が含まれ、その例には、表15に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、アパミンペプチド及びアパミンのペプチド類縁体である少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表16に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、シロトキシンファミリーペプチド及びこれらの何れかのペプチド類縁体である少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表17に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、BKCa阻害剤ペプチドである少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表18に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、スロトキシンファミリーペプチド及びこれらの何れかのペプチド類縁体である少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表19に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、マルテントキシンペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表20に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、N型Ca2チャンネル阻害剤ペプチドである少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表21に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、ωMVIIAペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表22に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、ωGVIAペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表23に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、PTu1ペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表24に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、ProTx1ペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表25に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、BeKM1ペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表26に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、Naチャンネル阻害剤ペプチドである少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表27に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、Cl-チャンネル阻害剤ペプチドである少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表28に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、Kv2.1阻害剤ペプチドである少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表29に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、Kv4.2/Kv4.3阻害剤ペプチドである少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表30に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、nACHR阻害剤ペプチドである少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表31に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明の組成物の他の実施形態には、アガトキシンペプチド、そのペプチド類縁体又は他のカルシウムチャンネル阻害剤ペプチドである少なくとも1つのトキシンペプチドPが含まれ、その例には、表32に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。半減期延長部分。本発明は、N末端、C末端又は中間のアミノ酸残基1つの側鎖を通じてペプチドに結合された少なくとも1つの半減期延長部分式I中のF1及び/又はF2の存在を含む。複数の半減期延長部分を使用することも可能である例えば、各末端のFc又は末端のFc及び他の末端若しくは側鎖のPEG基。他の実施形態において、例えば、式F1-F2-Lf-P;P-Lg-F1-F2;又はP-Lg-F1-F2-Lf-Pに従ってFcドメインをPEG化することが可能である。半減期延長部分は、本発明の組成物はインビボでの腎臓ろ過によるクリアランスを妨げるのに十分な流体力学的サイズを達成するように選択することが可能である。例えば、実質的に直鎖、分岐鎖又は樹状形態のポリマー性高分子である半減期延長部分を選択することが可能である。あるいは、インビボで、本発明の組成物が血清タンパク質に結合して複合体を形成するように、このようにして形成された複合体が実質的な腎臓クリアランスを回避するように、半減期延長部分を選択することが可能である。半減期延長部分は、例えば、脂質、コレステロール基ステロイドなど、炭水化物若しくはオリゴ糖、又はサルページ受容体に結合するあらゆる天然若しくは合成タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドであり得る。本発明に従って、使用可能な典型的な半減期延長部分には、免疫グロブリンFcドメイン若しくはその一部、又は生物学的に適切な重合体若しくは共重合体、例えば、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール化合物が含まれる。他の適切なポリアルキレングリコール化合物には、以下の種類の帯電したポリマー又は中性ポリマー:デキストラン、ポリリジン、コロミン酸又は他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー及びビオチン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本発明において、半減期延長部分の他の例には、エチレングリコールの共重合体、プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/マレイン酸無水物共重合体、ポリアミノ酸例えば、ポリリジン、デキストランn-ビニルピロリドン、ポリn-ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモ重合体、プロピレンオキシド重合体、エチレンオキシド重合体、ポリオキシエチレン化されたポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖若しくは分岐グリコシル化された鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、免疫グロブリンFcドメイン若しくはその一部例えば、Feigeetal.,Modifiedpeptidesastherapeuticagents,米国特許第6,660,843号参照、FcのCH2ドメイン、アルブミン例えば、ヒト血清アルブミンHSA;例えば、Rosenetal.,Albuminfusionproteins,米国特許第6,926,898号及びUS2005/0054051;Bridonetal.,Protectionofendogenoustherapeuticpeptidesfrompeptidaseactivitythroughconjugationtobloodcomponents,米国特許第6,887,470号参照、トランスサイレチンTTR;例えば、Walkeretal.,Useoftransthyretinpeptide/proteinfusionstoincreasetheserumhalf-lifeofpharmacologicallyactivepeptides/proteins,US2003/0195154A1;2003/0191056A1参照又はチロキシン結合グロブリンTBGが含まれる。従って、本発明の組成物の典型的な実施形態には、ShK、OSK1又はこれらのトキシンペプチドの修飾された類縁体とのHSA融合物など但し、これらに限定されない。HSA融合構築物も含まれる。例には、HSA-L10-ShK2-35;HSA-L10-OsK11-38;HSA-L10-ShK2-35;及びHSA-L10-OsK11-38が含まれる。本発明において、半減期延長部分の他の実施形態には、温度、pH及びイオン強度の生理的条件下で長い半減期の血清タンパク質に対して結合親和性を有するペプチドリガンド又は小有機分子リガンドが含まれる。例には、アルブミン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、トランスサイレチン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、チロキシン結合グロブリン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、抗体結合ペプチド若しくは小分子リガンド又は長い半減期の血清タンパク質に対して親和性を有する別のペプチド若しくは小分子が含まれる。例えば、Blaneyetal.,Methodandcompositionsforincreasingtheserumhalf-lifeofpharmacologicallyactiveagentsbybindingtotransthyretin-selectiveligands,米国特許第5,714,142号;Satoetal.,Serumalbuminbindingmoieties,US2003/0069395A1;Jonesetal.,Pharmaceuticalactiveconjugates,米国特許第6,342,225号を参照。長い半減期の血清タンパク質は、いわゆる担体タンパク質アルブミン、トランスフェリン及びハプトグロビンなど、フィブリノーゲン及びその他の血液凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害剤、アンギオテンシン及びブラジキンなどの物質の前駆体並びにタンパク質の他の多くの種類など、哺乳動物の血漿中に溶解された様々な何百ものタンパク質の1つである。本発明は、本発明に記載されているものなど但し、これらに限定されない。、医薬として許容される半減期伸長部分のあらゆる単一種の使用又はPEG及び免疫グロブリンFcドメイン又はFcのCH2ドメイン、アルブミン例えば、HSA、アルブミン結合タンパク質、トランスサイレチン又はTBGなど2つ又はそれ以上の半減期延長部分の組み合わせの使用を包含する。本発明の幾つかの実施形態において、Fcドメイン又はその一部FcのCH2ドメインなどが、半減期延長部分として使用される。Fcドメインは、トキシンペプチドのN末端例えば、式F1-Lf-Pに従って又はC末端例えば、式P-Lg-F1に従って又はN末端及びC末端の両方に例えば、式F1-Lf-P-Lg-F2又はP-Lg-F1-Lf-Pに従って融合することが可能である。本明細書に記載されているように、Fcドメインとトキシンペプチドの間に、ペプチドリンカー配列を場合によって含めることが可能である。式F1-Lf-Pの例には、Fc-L10-ShKK22A[2-35];Fc-L10-ShKR1K/K22A[1-35];Fc-L10-ShKR1H/K22A[1-35];Fc-L10-ShKR1Q/K22A[1-35];Fc-L10-ShKR1Y/K22A[1-35];Fc-L10-PP-ShKK22A[1-35]及び本明細書に記載されている他の全ての実施例が含まれる。式P-Lg-F1の例には、ShK1-35-L10-Fc;OsK11-38-L10-Fc;Met-ShK1-35-L10-Fc;ShK2-35-L10-Fc;Gly-ShK1-35-L10-Fc;Osk11-38-L10-Fc;及び本明細書に記載されている他の全ての実施例が含まれる。Fcバリアントが、本発明の範囲に属する適切な半減期延長部分である。サルベージ受容体への結合が維持される限り、固有Fcは、本発明において、Fcバリアントを形成するために広く修飾することが可能である。例えば、WO97/34631、WO96/32478及びWO04/110472参照。このようなFcバリアントにおいて、本発明の融合分子によって必要とされない構造的特徴又は機能的活性を与える固有Fcの1つ又はそれ以上の部位を除去することが可能である。例えば、残基を置換若しくは欠失させ、部位中に残基を挿入し、又は部位を含有する部分を末端切断させることによって、これらの部位を除去することが可能である。挿入された又は置換された残基は、ペプチド模倣体又はDアミノ酸などの変化されたアミノ酸であることも可能である。Fcバリアントは、多数の理由のために望ましいことがあり得、これらの幾つかは以下に記載されている。典型的なFcバリアントには、以下の分子及び配列が含まれる。1.ジスルフィド結合の形成に関与する部位が除去される。このような除去は、本発明の分子を作製するために使用される宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を避けることが可能である。この目的のために、N末端のシステイン含有セグメントは末端切断することが可能であり、又はシステイン残基は欠失されるか、若しくは他のアミノ酸例えば、アラニル、セリルで置換することが可能である。特に、配列番号2のN末端の20アミノ酸セグメントを末端切断するか、又は配列番号2の7位及び10位のシステイン残基を欠失又は除去することが可能である。システイン残基が除去されている場合でさえ、一本鎖Fcドメインは、非共有的に互いに結合された二量体Fcドメインをなお形成することができる。2.固有Fcは、選択された宿主細胞とより適合性があるように修飾される。例えば、プロリンイミノペプチダーゼなどの、E.コリ中の消化酵素によって認識され得る典型的な固有FcのN末端に近いPA配列を除去することが可能である。分子が、E.コリなどの細菌細胞中で組み換え的に発現されている場合には特に、N末端メチオニン残基を付加することも可能である。配列番号2のFcドメイン図4は、このようなFcバリアントの1つである。3.固有FcのN末端の一部は、選択された宿主細胞中で発現されたときにN末端の不均一性を防ぐために除去される。この目的のために、N末端の最初の20アミノ酸残基、特に位置1、2、3、4及び5の残基の何れをも欠失させることが可能である。4.1つ又はそれ以上のグリコシル化部位が除去される。典型的にグリコシル化される残基例えば、アスパラギンは、細胞溶解応答を付与することが可能である。このような残基は、欠失させるか、又はグリコシル化されない残基例えば、アラニンで置換することが可能である。5.C1q結合部位などの補体との相互作用に関与する部位が除去される。例えば、ヒトIgG1のEKK配列を欠失又は置換することが可能である。補体の動員は、本発明の分子にとって有利でない場合があり得、このようなFcバリアントを用いて回避することが可能である。6.サルベージ受容体以外のFc受容体への結合に影響を与える部位が除去される。固有Fcは、本発明の融合分子に対して必要とされないある種の白血球を妨害するための部位を有することがあり、従って、除去され得る。7.ADCC部位が除去される。ADCC部位は、本分野において公知である。例えば、IgG1中のADCC部位に関して、Molec.Immunol.295633-91992を参照。これらの部位も、本発明の融合分子にとって不要であり、従って、除去することが可能である。8.固有Fcが非ヒト抗体に由来する場合には、固有Fcはヒト化することが可能である。典型的には、固有Fcをヒト化するために、ヒト固有Fc中に通常見出される残基で、非ヒト固有Fc中の選択された残基を置換する。抗体のヒト化のための技術は、本分野において周知である。好ましいFcバリアントには、以下のものが含まれる。配列番号2では、15位のロイシンはグルタミン酸で、99位のグルタミン酸はアラニンで、並びに101位及び103位のリジンはアラニンで置換されることが可能である。さらに、フェニルアラニン残基は、1つ又はそれ以上のチロシン残基を置換することが可能である。別の半減期延長部分は、サルベージ受容体に結合することが可能な、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片又は小分子例えば、ペプチド模倣化合物である。例えば、1998年4月14日にPrestaらに付与された米国特許第5,739,277号に記載されているような半減期延長部分としてポリペプチドを使用することが可能である。ペプチドは、FcRnサルベージ受容体への結合について、ファージディスプレイによって選択することも可能である。このようなサルベージ受容体結合化合物も、半減期延長部分の意味の中に含まれ、本発明の範囲に属する。このような半減期延長部分は、例えば、プロテアーゼによって認識される配列を避けることによって増加した半減期について選択されるべきであり、及び例えば、抗体のヒト化で発見されるように、非免疫原性配列を優先することによって減少した免疫原性について選択されるべきである。上述のように、ポリマー半減期延長部分は、F1及びF2に対して使用することも可能である。半減期延長部分として有用な化学的部分を付着させるための様々な手段が、現在利用可能である。例えば、N-TerminallyChemicallyModifiedProteinCompositionsandMethodsと題された特許協力条約PCT国際公開WO96/11953号参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。を参照されたい。このPCT公報は、とりわけ、タンパク質のN末端への、水溶性ポリマーの選択的付着を開示している。本発明の組成物の幾つかの実施形態において、ポリマー半減期延長部分は、F1及び/又はF2としてのポリエチレングリコールPEGであるが、本発明の組成物は、位置F1及び/又はF2以外に、トキシンペプチド上の1つ又はそれ以上の部位など、分子中の他の部位に抱合された1つ又はそれ以上のPEGを含むことも可能である。従って、本発明の組成物の幾つかの実施形態は、F1及び/又はF2である非PEG半減期延長部分に、又はトキシンペプチドPに、又はこれらの何れかのあらゆる組み合わせに抱合された1つ若しくはそれ以上のPEG部分をさらに含む。例えば、本発明の組成物中のFcドメイン又はその一部F1及び/又はF2としては、還元的アルキル化の方法によって、モノPEG化され、ジPEG化され又はその他マルチPEG化されることが可能である。ポリエチレングリコールPEGとの、タンパク質及びペプチドの共有的抱合は、治療的タンパク質のインビボ循環半減期を著しく延長させるためのアプローチとして広く認識されている。PEG部分は、タンパク質にかなりの流体力学的半径を加えるので、PEG化は、主として腎クリアランスを遅延させることによって、この効果を達成する。Zalipsky,S.,etal.,Useoffunctionalizedpolyethyleneglycolsformodificationofpolypeptides.,inpolyethyleneglycolchemistry:Biotechnicalandbiomedicalapplications.,J.M.Harris,Ed.,PlenumPress:NewYork.,347-3701992。タンパク質及びペプチドのPEG化によってしばしば付与されるさらなる利点には、増加した溶解度、タンパク分解による分解に対する耐性及び治療用ポリペプチドの減少した免疫原性が含まれる。タンパク質PEG化の長所は、PEG-アデノシンデアミナーゼAdagenTM/EnzonCorp,、PEG-L-アスパラギナーゼOncasparTM/EnzonCorp.、PEG-インターフェロンα-2bPEG-IntronTM/Schering/Enzon、PEG-インターフェロンα-2aPEGASYSTM/Roche及びPEG-G-CSFNeulastaTM/Amgen並びに臨床試験中の多数のその他など、幾つかのPEG化されたタンパク質の商品化によって証明されている。要約すると、PEG基は、一般に、PEG部分上の反応性基例えば、アルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基を通じた、本発明の化合物上の反応性基例えば、アルデヒド、アミノ又はエステル基へのアシル化又は還元的アルキル基を介して、本発明の組成物のペプチド部分へ付着される。合成ペプチドのPEG化のための有用な戦略は、溶液中での抱合体結合を形成することを通じて、ペプチド及びPEG部分各々が他のPEG部分に対して相互に反応性である特別な官能性を有する。を結合させることからなる。ペプチドは、慣用の固相合成を用いて容易に調製することが可能である例えば、図5及び6並びに本明細書に添付されている説明文を参照されたい。。ペプチドは、特異的な部位における適切な官能基で予め活性化される。前駆体は、PEG部分との反応前に精製され、完全に性質決定される。ペプチドのPEGとの連結は、通常、水相で起こり、逆相分析HPLCによって容易にモニターすることが可能である。PEG化されたペプチドは、調製用HPLCによって容易に精製し、分析用HPLC、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析法によって性質決定することが可能である。PEGは、市販されている周知の水溶性ポリマーであるか、又は、当技術分野で周知の方法に従い、エチレングリコールの開環重合により調製することができるSandler及びKaro、PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,Vol.3、138-161頁。本願において、PEGという用語は、サイズ又はPEGの末端への修飾に関わらず、1、2又は多官能型のあらゆるポリエチレングリコール分子を包含するために広く使用され、式:X-OCH2CH2On-1CH2CH2OHXnは20~2300であり、Xは、H又は末端修飾、例えばC1-4アルキルである。によって表される。幾つかの有用な実施形態において、本発明で使用されるPEGは、一方の末端がヒドロキシ又はメトキシで終わっている即ち、Xは、H又はCH3メトキシPEGである。。PEGの他の末端式IIでは、OHで終結するように示されている。は、エーテル酸素結合、アミン結合又はアミド結合を介して活性化部分に共有結合することが注目される。化学的構造において使用される場合、PEGという用語は、示されている水酸基の水素なしの上記式IIを含み、エーテル結合を形成するためにリンカーの遊離炭素原子との反応に利用可能な酸素が残存する。より具体的には、PEGをペプチドに抱合するために、ペプチドは、活性化された形態のPEGと反応されなければならない。活性化されたPEGは、式:PEG-AXlPEG上で定義されている。は、活性化部分Aの炭素分子に共有結合して、エーテル結合、アミン結合又はアミド結合を形成し、Aは、ペプチドのアミノ酸残基上のアミノ、イミノ若しくはチオール基又はペプチドに共有結合されたリンカー部分と反応することが可能な反応性基を含有する。によって表すことができる。活性化されたPEGの調製及び生物学的に活性なペプチドへのその抱合のための技術は、本分野において周知である。例えば、米国特許第5,643,575号、同第5,919,455号、同第5,932,462号及び同第5,990,237号;Thompsonetal.,PEGylationofpolypeptides,EP0575545B1;Petit,Sitespecificproteinmodification,米国特許第6,451,986号及び同第6,548,644号;S.Hermanetal.,Polyethyleneglycolwithreactiveendgroups:I.Modificationofproteins,J.BioactiveCompatiblePolymers,10:145-1871995;Y.Luetal,PegylatedpeptidesIII:Solid-phasesynthesiswithPEGylatingreagentsofvaryingmolecularweight:synthesisofmultiplyPEGylatedpeptides,ReactivePolymers,22:221-2291994;A.M.Felixetal.,PEGylatedPeptidesIV:Enhancedbiologicalactivityofsite-directedPEGylatedGRFanalogs,Int.J.PeptideProteinRes.,46:253-2641995;A.M.Felix,Site-specificpolyethyleneglycolylationofpeptides,ACSSymposiumSeries680polyethyleneglycol:218-2381997;Y.lkedaetal.,Polyethyleneglycolderivatives,theirmodifiedpeptides,methodsforproducingthemanduseofthemodifiedpeptides,EP0473084B1;G.E.Meansetal.,Selectedtechniquesforthemodificationofproteinsidechains,in:Chemicalmodificationofproteins,HoldenDay,Inc.,2191971参照。。PEG-アルデヒド又はPEG-アルデヒド水和物などの活性化されたPEGは、公知の手段によって化学的に合成し、又は商業的な入手源例えば、ShearwaterPolymers,Huntsville,Al又はEnzon,Inc.Piscataway,N.J.から取得することができる。本発明における有用な活性化されたPEGの例は、ShearwaterPolymersHuntsville,AIから市販されているPEG-プロピオンアルデヒドなどのPEG-アルデヒド化合物例えば、メトキシPEG-アルデヒドである。PEG-プロピオンアルデヒドは、式PEG-CH2CH2CHOによって表される。例えば、米国特許第5,252,714号参照。有用な活性化されたPEGの他の例は、PEGアセトアルデヒド水和物及びPEGビスアルデヒド水和物であり、後者は、二機能性に活性化された構造を与える。例えば、Bentleyetal.,Polyethyleneglycolaldehydehydratesandrelatedpolymersandapplicationsinmodifyingamines,米国特許第5,990,237号参照。本発明のPEG抱合されたペプチドを作製するための別の有用な活性化されたPEGは、メトキシPEG-マレイミドマレイミドモノメトキシPEGなどなどの但し、これに限定されない。PEG-マレイミド化合物であり、本発明のPEG抱合されたペプチドを作製するために特に有用である。例えば、Shen,N-maleimidylpolymerderivatives,米国特許第6,602,498号;C.Delgadoetal.,TheusesandpropertiesofPEG-linkedproteins.,Crit.Rev.Therap.DrugCarrierSystems,9:249-3041992;S.Zalipskyetal.,Useoffunctionalizedpolyethyleneglycolsformodificationofpolypeptides,in:Polyethyleneglycolchemistry:BiotechnicalandbiomedicalapplicationsJ.M.Harris,Editor,PlenumPress:NewYork,347-3701992;S.Hermanetal.,Polyethyleneglycolwithreactiveendgroups:I.Modificationofproteins,J.BioactiveCompatiblePolymers,10:145-1871995;P.J.Shadleetal.,Conjugationofpolymertocolonystimulatingfactor-1,米国特許第4,847,325号;G.Shawetal.,CysteineaddedvariantsIL-3andchemicalmodificationsthereof,米国特許第5,166,322号及びEP0469074B1;G.Shawetal.,CysteineaddedvariantsofEPOandchemicalmodificationsthereof,EP0668353A1;G.Shawetal.,CysteineaddedvariantsG-CSFandchemicalmodificationsthereof,EP0668354A1;N.V.Katreetal.,lnterleukin-2muteinsandpolymerconjugationthereof,米国特許第5,206,344号;R.J.GoodsonandN.V.Katre,Site-directedpegylationofrecombinantinterleukin-2atitsglycosylatesite,Biotechnology,8:343-3461990。ポリエチレングリコールビニルスルホンは、チオール化されたアミノ酸残基での、例えば、C残基での抱合によって、本発明のPEG抱合されたペプチドを作製するための別の有用な活性化されたPEGである。例えば、M.Morpurgoetal.,Preparationandcharacterizationofpolyethyleneglycolvinylsulfone,Bioconj.Chem.,7:363-3681996;Harris,Functionalizationofpolyethyleneglycolforformationofactivesulfone-terminatedPEGderivativesforbindingtoproteinsandbiologicallycompatiblematerials,米国特許第5,446,090号;同第5,739,208号;同第5,900,461号;同第6,610,281号及び同第6,894,025号;andHarris,Watersolubleactivesulfonesofpolyethyleneglycol,WO95/13312A1も参照されたい。。本発明において有用であるPEGの別の活性化された形態は、PEG-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、例えば、メトキシPEG-N-ヒドロキシスクシンイミジルNHSエステルである。PEGのヘテロ二機能的にheterobifunctionally活性化された形態も有用である。例えば、Thompsonetal.,PEGylationreagentsandbiologicallyactivecompoundsformedtherewith,米国特許第6,552,170号を参照されたい。典型的には、トキシンペプチド又はトキシンペプチドを含む融合タンパク質は、チオール活性化されたPEG化合物、ジオール活性化されたPEG化合物、PEGヒドラジド化合物、PEG-オキシアミン化合物又はPEG-ブロモアセチル化合物など但し、これらに限定されない。などの活性化されたPEG化合物と、公知の化学的技術によって反応される。例えば、S.Herman,PolyethyleneglycolwithReactiveEndgroups:I.ModificationofProteins,J.BioactiveandCompatiblePolymers,10:145-1871995;S.Zalipsky,ChemistryofPolyethyleneGlycolConjugateswithBiologicallyActiveMolecules,AdvancedDrugDeliveryReviews,16:157-1821995;R.Greenwaldetal.,Polyethyleneglycolconjugateddrugsandprodrugs:acomprehensivereview,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,17:101-1612000を参照されたい。。N末端のPEG化のための方法は、実施例31~34、45及び47~48において、本明細書に例示されているが、当業者によって利用可能なPEG化法を決して限定するものではない。実際に所望されるように、PEGに対するあらゆる分子量、例えば、約1,000又は2,000ダルトンDa~約100,000Danは、20~2300である。を使用することが可能である。好ましくは、本発明のPEG抱合されたペプチド中で使用されるPEGの総分子量又は合計分子量は、約3,000Da又は5,000Daから約50,000Da又は60,000Da合計のnは、70~1,400、より好ましくは約10,000Da~約40,000Da合計のnは、約230~約910である。PEGに対する最も好ましい総質量は、約20,000Da~約30,000Da合計のnは、約450~約680である。である。PEG中の反復単位の数nは、ダルトンで記載された分子量に対して近似される。活性化されたリンカー上のPEGの総分子量は、医薬用途に対して適切であることが好ましい。従って、PEG分子の総分子量は、約100,000Daを超えるべきでない。多糖ポリマーは、タンパク質修飾のために使用することができる水溶性ポリマーの別の種類である。デキストランは、主にα1-6結合によって連結されたグルコースの各サブユニットから構成される多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で入手可能であり、約1kD~約70kDまでの分子量で容易に入手可能である。デキストランは、単独の半減期延長部分として、又は別の半減期延長部分例えば、Fcと組み合わせて、本発明において使用するための適切な水溶性ポリマーである。例えば、WO96/11953及びWO96/05309を参照されたい。治療用免疫グロブリン又は診断用免疫グロブリンに抱合されたデキストランの使用が報告されており、例えば、欧州特許公報0315456号参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。を参照されたい。本発明における半減期延長部分としてデキストランが使用される場合、約1kD~約2kDのデキストランが好ましい。リンカー。何れのリンカー基又は部分すなわち、式I-IX中の-Lf-又は-Lg-も、場合によって使用される。リンカーが存在する場合、リンカーは、主にスペーサーとして働くので、その化学構造は重要でない。本明細書に上述されているように、リンカー部分-Lf-及び/又は-Lg-は、存在するとすれば、本発明の組成物中に存在し得る、他の何れのリンカーとも独立に同一又は別異であることが可能である。例えば、Lfは、本発明における他の何れのLf又は何れのLgとも同一の部分又は異なる部分を表すことが可能である。リンカーは、好ましくは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸から構成される。したがって、幾つかの実施形態において、リンカーは、ペプチド結合により連結された1~約30個のアミノ酸から構成され、アミノ酸は、天然に存在する20個のアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸の幾つかは、当業者によって十分に理解されているように、グリコシル化することが可能である。例えば、シアル化部位を構成する有用なリンカー配列は、X1X2NX4X5G配列番号637であり、X1、X2、X4及びX5は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。である。幾つかの実施形態において、1~20個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。より好ましくは、リンカーは、グリシン及びアラニンなどの、立体的に妨害されないアミノ酸の過半数から構成される。従って、好ましいリンカーには、ポリグリシン特に、Gly4、Gly5、ポリGly-Ala及びポリアラニンが含まれる。他の好ましいリンカーは、本明細書においてL5GGGGS;配列番号638、L10GGGGSGGGGS;配列番号79、L25GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;配列番号84として特定されるリンカー、並びに、以下の実施例に使用されている全てのリンカーである。しかしながら、本明細書に記載されているリンカーは、典型的なものであり、本発明の範囲に属するリンカーは、さらに長くすることが可能であり、他の残基を含むことが可能である。ペプチドリンカーブ部分Lを含む、本発明の組成物の幾つかの実施形態において、酸性残基、例えば、グルタミン酸又はアスパラギン酸残基が、リンカー部分Lのアミノ酸配列中に配置される。例には、以下のペプチドリンカー配列が含まれる。他の実施形態においては、リンカーは、リン酸化部位、例えば、X1X2YX3X4G配列番号654X1、X2、X3及びX4は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。;X1X2SX3X4G配列番号655X1、X2、X3及びX4は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。;又はX1X2TX3X4G配列番号656X1、X2、X3及びX4は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。を構成する。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、-NH-CH2s-CO-式中、s=2~20などのアルキルリンカーを使用することが可能である。これらのアルキルリンカーは、さらに、低級アルキル例えば、C1-C6低級アシル、ハロゲン例えば、Cl、Br、CN、NH2、フェニルなどの、立体的に妨害を生じないあらゆる基によって置換することが可能である。典型的な非ペプチドリンカーは、PEGリンカー、nは、リンカーが100~5000kD、好ましくは100~500kDの分子量を有するようになる。である。ペプチドリンカーは、上記と同一の様式で誘導体を形成するために改変することが可能である。誘導体。本発明者らは、化合物のペプチド及び/又は半減期延長部分の一部を誘導体化することも想定している。このような誘導体は、化合物の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善することが可能である。あるいは、前記部分は、化合物の全ての望ましくない副作用などを削除又は軽減することが可能である。典型的な誘導体には、以下のとおりである化合物が含まれる。1.化合物又はそのある部分が環状である。例えば、ペプチド部分は、例えばリンカー中に2つ又はそれ以上のCys残基を含有するように修飾することが可能であり、これはジスルフィド結合形成によって環状化することができる。2.化合物は、架橋されているか、又は分子間を架橋できるようにされる。例えば、ペプチド部分は、1つのCys残基を含有し、これにより、リンカー分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができるように修飾することが可能である。化合物は、以下に示されている分子におけるように、そのC末端を通じて架橋することも可能である。3.非ペプチジル連結結合が、1つ又はそれ以上のペプチジル[-CONR-]連結を置換する。典型的な非ペプチジル連結は、-CH2-カルバマート[-CH2-OCONR-]、ホスホナート結合、-CH2-スルホンアミド[-CH2-SO2NR-]、尿素[-NHCONH-]、-CH2-二級アミン及びアルキル化されたペプチド[-CONR6-式中、R6は低級アルキルである。]である。4.N末端が、化学的に誘導体化されている。典型的には、N末端は、アシル化され、又は置換されたアミンへと修飾することが可能である。典型的なN末端誘導体基には、-NRR1-NH2以外、-NRCOR1、-NRCOOR1、-NRSO2R1、-NHCONHR1、スクシンイミド又はベンジルオキシカルボニル-NH-CBZ-NH-R及びR1は、各々独立に、水素又は低級アルキルであり、フェニル環は、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群から選択される1~3この置換基で置換されることが可能である。が含まれる。5.遊離のC末端が、誘導体化されている。典型的には、C末端は、エステル化され又はアミド化される。例えば、配列番号504~508の何れかを有する本発明の化合物のC末端に、NH-CH2-CH2-NH22を付加するために、本分野で記載されている方法を使用することが可能である。同様に、例えば、配列番号924~955、963~972、1005~1013又は1018~1023の何れかを有する本発明の化合物のC末端に、NH2を付加するために、本分野で記載されている方法を使用することが可能である。典型的なC末端誘導体基には、例えば、-COR2R2は、低級アルコキシ又は-NR3R4であるR3及びR4は、独立に、水素又はC1-C8アルキル好ましくは、C1-C4アルキルである。。が含まれる。6.ジスルフィド結合は、別の、好ましくはより安定な、架橋部分例えば、アルキレンと置換される。例えば、Bhatnagaretal.1996J.Med.Chem.39:3814-9;Albertsetal.1993ThirteenthAm.Pep.Symp.,357-9を参照されたい。7.1つ又はそれ以上の各アミノ酸残基が修飾される。以下に詳しく記載されているように、様々な誘導体化剤が、選択された側鎖又は末端残基と特異的に反応することが知られている。リジン残基及びアミノ末端残基を、コハク酸又は他のカルボキシル酸無水物と反応させることが可能であり、これは、リジン残基の電荷を逆転させる。αアミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、イミドエステルメチルピコリンイミダートなど、ピリドキサルリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4-ペンタンジオン及びグリオキシラートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。アルギニル残基は、1個又は数個の慣用の試薬の組み合わせフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンなどとの反応により修飾することができる。グアニジン官能基のpKaが高いため、アルギニン残基の誘導体化の際には、該反応をアルカリ条件中で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リシンの基及びアルギニンのεアミノ基と反応させることができる。チロシン残基の具体的な修飾は広範に研究されており、特に、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシン残基内へのスペクトル標識の導入に関心がもたれている。最も一般的には、N-アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれO-アセチルチロシル種及び3-ニトロ誘導体が形成される。カルボキシル側鎖基アスパルチル又はグルタミルは、カルボジイミドR’-N=C=N-R’1-シクロヘキシル-3-2-モルホリニル-4-エチルカルボジイミド又は1-エチル-3-4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチルカルボジイミドなどとの反応により選択的に修飾することができる。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換することができる。グルタミン及びアスパラギン残基は、対応するグルタミン酸及びアスパラギン酸残基に脱アミド化することが可能である。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化され得る。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。システイン残基は、ジスルフィド結合を除去するために、又は、逆に架橋を安定化させるために、アミノ酸残基又は他の部分によって置換することが可能である。例えば、Bhatnagaretal.,1996,J.Med.Chem.39:3814-9を参照されたい。二官能性物質での誘導体化は、ペプチド若しくはそれらの官能性誘導体を水溶性支持マトリックスに、又は他の高分子半減期延長部分に架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋剤には、例えば、1,1-ビスジアゾアセチル-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル例えば、4-アジドサリチル酸とのエステルなど、ホモ二官能性イミドエステル3,3’-ジチオビススクシンイミジルプロピオナートなどのジスクシンイミジルエステルなど、及び二官能性マレイミドビス-N-マレイミド-1,8-オクタンなどが含まれる。メチル-3-[p-アジドフェニルジチオ]プロピオイミダートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成しうる光活性化可能な中間体を与える。あるいは、反応性の水不溶性マトリックス、例えば、臭化シアンで活性化される炭水化物、及び米国特許第3,969,287号、第3,691,016号、第4,195,128号、第4,247,642号、第4,229,537号及び第4,330,440号に記載の反応性基質が、タンパク質の固定化に使用される。炭水化物オリゴ糖基は、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に都合よく結合させることができる。一般には、それらが配列Asn-X-Ser/Thr式中、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸でありうる。の一部である場合には、O-結合オリゴ糖はセリンSer又はトレオニンThr残基に、N結合オリゴ糖はアスパラギンAsn残基に結合させる。Xは、好ましくは、プロリンを除く19個の天然に存在するアミノ酸の1つである。N結合及びO-結合オリゴ糖ならびに各タイプに見出される糖残基の構造は様々である。それらの両方に一般に存在する糖の1つのタイプは、N-アセチルノイラミン酸シアル酸と称される。である。シアル酸は、通常、N-結合及びO-結合オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷のため、グリコシル化化合物に酸性特性を付与する。このような部位を本発明の化合物のリンカー内に含めることが可能であり、該部位は、好ましくは、例えば、CHO、BHK、COSなどの哺乳動物細胞中でのポリペプチド化合物の組換え産生中に細胞によりグリコシル化される。しかしながら、このような部位は、当技術分野で公知の合成又は半合成方法により更にグリコシル化することができる。他の可能な修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリン又はトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化が、Cys中の硫黄原子の酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化が含まれる。Creighton,Proteins:StructuresandMolecularPropertiesWHFreemanCo.,SanFrancisco,pp.79-861983を参照されたい。本発明の化合物は、DNAレベルでも変化させることが可能である。化合物の何れの部分のDNA配列も、選択された宿主細胞とより適合的なコドンへと変化させることが可能である。好ましい宿主細胞であるE.コリの場合、最適化されたコドンが本分野において公知である。制限部位を除去するために、又はサイレントな制限部位を含めるためにコドンを置換することが可能であり、これは、選択された宿主細胞中でのDNAのプロセッシングを補助することができる。半減期延長部分、リンカー及びペプチドDNA配列は、先述の配列の変化の何れをも含むように修飾することが可能である。抱合誘導体を調製する方法も想定される。腫瘍細胞は、例えば、腫瘍細胞の正常な対応物には見出されないエピトープを示す。このようなエピトープには、例えば、それらの迅速な増殖から生じる様々な翻訳後修飾が含まれる。従って、本発明の一態様は、a標的エピトープに特異的に結合する少なくとも1つの無作為化されたペプチドを選択すること、並びにbi少なくとも1つの半減期延長部分Fcドメインが好ましい。、ii選択されたペプチドの少なくとも1つのアミノ酸配列及びiiiエフェクター分子を含む薬剤を調製すること、を含む方法である。標的エピトープは、好ましくは、腫瘍特異的エピトープ又は病原性生物に対して特異的なエピトープである。エフェクター分子は、上記抱合対の何れでもあり得、好ましくは放射性同位体である。製造の方法本発明は、本発明のポリペプチドを作製する上で有用な核酸、発現ベクター及び宿主細胞にも関する。宿主細胞は、真核細胞とすることが可能であり、哺乳動物細胞が好ましく、CHO細胞が最も好ましい。宿主細胞は、原核細胞とすることも可能であり,E.コリ細胞が最も好ましい。本発明の化合物は、概ね、組換えDNA技術を用いて、形質転換された宿主細胞中で作製することが可能である。これを行うために、ペプチドをコードする組換えDNA分子が調製される。このようなDNA分子を調製する方法は、本分野において周知である。例えば、ペプチドをコードする配列は、適切な制限酵素を用いてDNAから切り出すことが可能である。あるいは、DNA分子は、ホスホルアミダート法などの化学的合成技術を用いて合成することが可能である。また、これらの技術の組み合わせも使用することが可能である。本発明は、適切な宿主中でペプチドを発現することが可能なベクターも含む。ベクターは、適切な発現調節配列に作用可能に連結されたペプチドをコードするDNA分子を含む。DNA分子の前又は後の何れかに、ベクター中にこの作用可能な結合を挿入する方法は、周知である。発現調節配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル及び転写又は翻訳の調節に関わる他のシグナルが含まれる。その上にDNA分子を有する生じたベクターは、適切な宿主を形質転換するために使用される。この形質転換は、本分野において周知な方法を用いて実施することが可能である。多数の利用可能な、周知の宿主細胞の何れをも、本発明の実施において使用することが可能である。特定の宿主の選択は、本分野によって認知される多数の因子に依存する。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、DNA分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチドの回収の容易さ、発現の特徴、生物学的安全性及び費用が含まれる。全ての宿主が特定のDNA配列の発現に対して等しく効果的であり得るわけではないことを理解して、これらの因子の釣り合いを決定しなければならない。これらの一般的な指針の中で、有用な微生物宿主には、細菌E.コリ種など、酵母サッカロミセス種など及び他の真菌、昆虫、植物、培養中の哺乳動物ヒトを含む。細胞又は本分野において公知の他の宿主が含まれる。次に、形質転換された宿主は、培養及び精製される。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように慣用の発酵条件下で培養することが可能である。このような発酵条件は、本分野において周知である。最後に、ペプチドは、本分野において周知の方法によって、培養物から精製される。化合物は、合成法によって作製することも可能である。固相合成は、小ペプチドを作製する最も費用対効果が優れた方法であるので、各ペプチドを作製する好ましい技術である。例えば、周知の固相合成技術には、保護基、リンカー及び固相支持体の使用、並びに特異的な保護及び脱保護反応条件、リンカー切断条件、スカベンジャーの使用及び固相ペプチド合成の他の態様が含まれる。適切な技術は、本分野において周知である。例えば、Merrifield1973,Chem.Polypeptides,pp.335-61KatsoyannisandPanayotiseds.;Merrifield1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149;Davisetal.1985.Biochem.Intl.10:394-414;StewartandYoung1969,SolidPhasePeptideSynthesis:米国特許第3,941,763号;Finnetal.1976,TheProteins3rded.2:105-253;andEricksonetal.,1976,TheProteins3rded.2:257-527;ProtectingGroupsinOrganicSynthesis,3rdEdition,T.W.GreeneandP.G.M.Wuts,Eds.,JohnWileySons,Inc.,1999;NovaBiochemCatalog,2000;SyntheticPeptides,AUser’sGuide,G.A.Grant,Ed.,W.H.FreemanCompany,NewYork,N.Y.,1992;AdvancedChemtechHandbookofCombinatorialSolidPhaseOrganicChemistry,W.D.Bennet,J.W.Christensen,L.K.Hamaker,M.L.Peterson,M.R.Rhodes,andH.H.Saneii,Eds.,AdvancedChemtech,1998;PrinciplesofPeptideSynthesis,2nded.,M.Bodanszky,Ed.,Springer-Verlag,1993;ThePracticeofPeptideSynthesis,2nded.,M.BodanszkyandA.Bodanszky,Eds.,Springer-Verlag,1994;ProtectingGroups,P.J.Kocienski,Ed.,GeorgThiemeVerlag,Stuttgart,Germany,1994;FmocSolidPhasePeptideSynthesis,APracticalApproach,W.C.ChanandP.D,White,Eds.,OxfordPress,2000,G.B.Fieldsetal.,SyntheticPeptides:AUser’sGuide,1990,77-183。本発明の組成物が合成技術又は組換え技術によって調製されるか否かによらず、適宜、適切なタンパク質精製技術を含めることも可能である。本発明の組成物の幾つかの実施形態において、トキシンペプチド部分及び/又は半減期延長部分又は他の何れかの部分は、定量又は検出を容易にするために、適切な同位体標識例えば、1251、14C、13C、35S、3H、2H、13N、15N、18O、17Oなどを含むように調製することが可能である。誘導体化されたペプチドを含有し、又は非ペプチド基を含有する化合物は、周知の有機化学技術によって合成することが可能である。化合物の使用総論。本発明の化合物は、このような対象タンパク質の固有リガンドのアゴニスト、模倣物又はアンタゴニストとして、対象タンパク質に結合するそれらの能力に起因する薬理学的活性を有する。イオンチャンネルへの公知の関連を有する遺伝病チャンネル症channelopathyは、医薬の様々な分野を包含し、その幾つかには、神経学、腎臓学、筋肉学及び心臓学が含まれる。イオンチャンネルを原因とする遺伝疾患のリストには、以下のものが含まれる。嚢胞性繊維症Cl-チャンネル;CFTR、デント病タンパク質尿及び高カルシウム尿症;Cl-チャンネル;CLCN5、骨粗鬆症Cl-チャンネル;CLCN7、家族性高インシュリン血症SUR1;KCNJ11;Kチャンネル、糖尿病KATP/SURチャンネル、アンデルセン症候群KCNJ2、Kir2.1Kチャンネル、バーター症候群KCNJ1;Kir1.1/ROMK;Kチャンネル、遺伝性難聴KCNQ4;Kチャンネル、遺伝成高血圧リドル症候群;SCNN1;上皮Naチャンネル、拡張型心筋症SUR2、Kチャンネル、QT延長症候群又は心不整脈心臓のカリウム及びナトリウムチャンネル、ティモシー症候群CACNA1C、Cav1.2、筋無力症CHRNA、CHRNB、CNRNE;nAChR及び他の様々なミオパシー、高カリウム性周期性四肢麻痺Na及びKチャンネル、てんかんNa及びKチャンネル、方麻痺性偏頭痛CACNA1A、Cav2.1Ca2チャンネル及びATP1A2、セントラルコア病RYR1、RyR1;Ca2チャンネル、及びパラミオトニア及びミオトニアNa、Cl-チャンネル。L.J.PtacekandY-HFu2004,Arch.Neurol.61:166-8;B.A.Niemeyeretal.2001,EMBOreports21:568-73;F.Lehmann-HornandK.Jurkat-Rott1999,Physiol.Rev.79:1317-72参照。先述のリストは遺伝性の疾患に関するが、これらの疾患中に引用されているチャンネルを標的とする分子も、他の起源又は起源が不明な関連疾患を治療する上でも有用であり得る。先述の疾患に加えて、イオンチャンネルを以下の治療のための標的として裏付ける証拠も提供されている。鎌型赤血球貧血症IKCa1-鎌型赤血球貧血症では、赤血球からの水分の喪失が、ヘモグロビンの重合をもたらし、その後、溶血及び血管の閉塞をもたらす。いわゆるガルドスチャンネルすなわち、IKCa1を通じたカルシウム流出後に、水分の喪失が起こる。従って、IKCa1の遮断は、鎌形赤血球貧血症に対する治療的処置となり得る。緑内障BKCa-緑内障では、眼内圧が高すぎ、視神経の損傷、異常な眼機能を引き起こし、失明に至る場合もある。BKCaカリウムチャンネルの遮断は、眼内液の分泌を低下させ、平滑筋収縮を増加させることが可能であり、より低い眼内圧と眼内の神経保護をもたらす可能性がある。多発性硬化症Kv、KCa、乾癬Kv、KCa、関節炎Kv、KCa、喘息KCa、Kv、アレルギーKCa、Kv、COPDKCa、Kv、Caアレルギー性鼻炎KCa、Kv、肺繊維症、狼瘡IKCa1、Kv、移植、GvHDKCa、Kv、炎症性骨吸収KCa、Kv、歯周病KCa、Kv、糖尿病、I型Kv-I型糖尿病は、異常なグルコース、タンパク質及び脂質代謝を特徴とする自己免疫疾患であり、インシュリン欠乏又は耐性を伴う。本疾患では、Kv1.3発現Tリンパ球が、膵島を攻撃及び破壊し、β細胞の喪失をもたらす。Kv1.3の遮断は、炎症性サイトカインを減少させる。さらに、Kv1.3の遮断は、形質膜へのGLUT4の転位を促進し、これにより、インシュリン感受性を増加させる。肥満Kv、-Kv1.3は、エネルギー恒常性の調節及び食事によって誘発される肥満からの保護において重大な役割を果たしているようである。従って、Kv1.3遮断剤は、代謝速度を増加させることが可能であり、より大きなエネルギー使用及び減少した体重をもたらす。再狭窄KCa、Ca2、-血管平滑筋細胞の増殖及び遊走は、新生内膜肥厚及び血管の再狭窄をもたらすことが可能である。過剰な新生内膜血管平滑筋細胞増殖には、IKCa1の上昇した発現を伴う。従って、IKCa1の遮断は、血管形成術後の再狭窄を防ぐための治療的戦略となり得る。虚血KCa、Ca2-神経又は心虚血、細胞膜の脱分極は、電圧開口型ナトリウム及びカルシウムチャンネルの開口をもたらす。次いで、これにより、カルシウムの過剰負荷が引き起こされ得、これは細胞毒性である。電圧開口型ナトリウム及び/又はカルシウムチャンネルの遮断は、カルシウムの過剰負荷を低減し、細胞保護効果を与えることが可能である。さらに、細胞膜電位の調節及び安定化におけるそれらの重大な役割のために、電圧及びカルシウム活性化されるカリウムチャンネルの調節物質も、カルシウムの過剰負荷を低減し、細胞を保護するように作用することが可能である。腎失禁KCa、腎失禁は、機能亢進した膀胱平滑筋細胞に関連する。カルシウムによって活性化されるカリウムチャンネルは、膀胱平滑筋細胞中で発現され、これらは膜電位を調節し、細胞収縮の力及び頻度を間接的に調節する。従って、カルシウムによって活性化されるカリウムチャンネルの開口剤は、膀胱内の電気的及び収縮活性を弱め、排尿の刺激の低下をもたらす機構を提供する。骨粗鬆症Kv、偏頭痛を含む疼痛Nav、TRP[一過性受容体電位チャンネル]。P2X、Ca2、N型電圧開口型カルシウムチャンネルは、脊髄中の侵害受容神経伝達の中心的制御物質である。ジコノチドN型カルシウムチャンネルのペプチド遮断剤は、侵害受容神経伝達を低下させ、ヒトにおける重度の慢性痛の症状の緩和について、世界で広く承認されている。侵害受容特異的N型カルシウムチャンネルの新規遮断剤は、減少した副作用特性を有する鎮痛剤で改善される。高血圧Ca2、-L型及びT型電圧開口型カルシウムチャンネルは、血管平滑筋細胞中で発現され、ここで、興奮-収縮のカップリング及び細胞の増殖を調節する。特に、T型カルシウムチャンネルの活性は、高血圧時の新生内膜形成に関連している。L型及びT型カルシウムチャンネルの遮断剤は、カルシウム流入を低下させ、平滑筋細胞の収縮を阻害するので、高血圧の臨床的治療に対して有用である。創傷治癒、細胞遊走は、創傷治癒において中心的な役割を果たしている。細胞内カルシウム勾配は、ケラチン生成細胞及び繊維芽細胞中の細胞遊走機構の重要な制御物質として推定されている。さらに、細胞膜を横切るイオン流動は、細胞容積の変化を伴う。細胞容積を調節することによって、イオンチャンネルは、細胞遊走機構の稼働に必要とされる細胞内環境に寄与する。特に、IKCa1は、細胞遊走のために、全般的に必要とされるようである。さらに、Kv1.3、Kv3.1、NMDA受容体及びN型カルシウムチャンネルは、リンパ球及び神経細胞の遊走と関連する。発作又は卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病nACHR、Nav双極性疾患Nav、Cav癌、多くのカリウムチャンネル遺伝子が増幅され、タンパク質サブユニットが多くの癌性症状において上方制御されている。カリウムチャンネル上方制御のための病態生理学的役割と合致して、カリウムチャンネル遮断剤は、おそらくは、カルシウム流入の阻害及びカルシウム依存性遺伝子発現に対する効果を通じて、子宮癌細胞及び肝細胞癌細胞の増殖を抑制することが示されている。様々な神経系疾患、新血管疾患、代謝疾患及び自己免疫疾患。イオンチャンネルのアゴニスト及びアンタゴニストは何れも、治療的な利益を達成することが可能である。治療的な利益は、例えば、Kv1.3、IKCa1、SKCa、BKCa、N型又はT型Ca2チャンネルなどを拮抗することから得ることが可能である。これらのチャンネルの小分子及びペプチドアンタゴニストは、インビトロ及びインビボでの有用性を有することが示されている。しかしながら、産生効率及び薬物動態における限界が、イオンチャンネルの阻害剤ペプチドの臨床的な調査を大きく妨げてきた。電位開口型カリウムチャンネルKv1.3のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の組成物は、自己免疫疾患に対する治療的価値を有する免疫抑制剤として有用である。例えば、このような分子は、多発性硬化症、1型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患及び関節リウマチを治療する上で有用である。例えば、H.Wulffetal.2003J.Clin.Invest.111,1703-1713andH.Rusetal.2005PNAS102,11094-11099;Beetonetal.,TargetingeffectormemoryTcellswithaselectiveinhibitorpeptideofKv1.3channnelsfortherapyofautoimmunediseases,Molec.Pharmacol.674:1369-812005;1Beetonetal.2006,Kv1.3:therapeutictargetforcell-mediatedautoimmunedisease,electronicpreprintat//webfiles.uci.edu/xythoswfs/webui/2670029.1を参照。電圧開口型カリウムチャンネルの阻害剤であるKv1.3は、炎症の様々な前臨床動物モデルにおいて調べられてきた。Kv1.3の小分子及びペプチド阻害剤は、オボアルブミン[C.Beetonetal.2005Mol.Pharmacol.67,1369]及び破傷風トキソイド[G.C.Kooetal.1999Clin.Immunol.197,99]に対する遅延型過敏症応答を遮断することが示されている。皮膚中の炎症を抑制することに加え、阻害剤は、抗体産生も低下させた[G.C.Kooetal.1997J.Immunol.158,5120]。Kv1.3アンタゴニストは、多発性硬化症MSのラット養子免疫伝達実験自己免疫脳脊髄炎AT-EAEモデルにおいて有効性を示した。KV1.3チャンネルは、MS患者から得たミエリン特異的T細胞上に過剰発現されており、MSを治療する上でKv1.3阻害剤が与え得る有用性に対するさらなる裏づけをもたらす。炎症性骨吸収も、歯周病の前臨床養子免疫伝達モデルにおけるKv1.3阻害剤によって抑制された[P.Valverdeetal.,2004J.BoneMineralRes.19,155]。本研究では、阻害剤は、細菌の外膜タンパク質歯肉の炎症を誘発するために使用される細菌の一成分に対する抗体産生をさらに遮断した。最近、前臨床ラットモデルにおいて、Kv1.3阻害剤の有効性が、プリスタンによって誘発された関節炎及び糖尿病を治療する上で示された[C.Beetonetal.2006preprintavailableat//webfiles.uci.edu/xythoswfs/webui/_xy-2670029_1.]。Kv1.3チャンネルは、T細胞及びB細胞の全てのサブセット上に発現されているが、エフェクターメモリーT細胞及びクラスが転換されたメモリーB細胞は、Kv1.3に特に依存している[H.Wulffetal.2004J.Immunol.173,776].Gad5/insulin-specificTcellsfrompatientswithnewonsettype1diabetes,myelin-specificTcellsfromMSpatientsandTcellsfromthesynoviumofrheumatoidarthritispatientsalloverexpressKv1.3[C.Beetonetal.2006preprintat//webfiles.uci.edu/xythoswfs/webui/_xy-2670029_1]。高脂肪食上に配置されたときに、Kv1.3を欠失したマウスの体重増加はより少なく[J.Xuetal.2003HumanMol.Genet.12,551]、変化したグルコース利用を示した[J.Xuetal.2004Proc.Natl.Acad.Sci.,101,3112]からである。Kv1.3は、肥満及び糖尿病の治療に対しても調査されている。乳癌試料[M.Abduletal.2003AnticancerRes.23,3347]及び前立腺癌細胞株[S.P.Fraseretal.2003PflugersArch.446,559]も、Kv1.3を発現することが示されており、Kv1.3の遮断は、癌の治療に対して有用であり得る。Kv1.3阻害剤トキシンペプチドが関与する自己免疫疾患を治療する本発明の方法に従って治療することが可能な疾患は、多発性硬化症、1型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病並びに全身性紅斑性狼瘡SLE及び狼瘡の他の形態が含まれる。中間伝導IKCa1のカルシウム活性化カリウムを発現する細胞の幾つかには、T細胞、B細胞、肥満細胞及び赤血球RBCが含まれる。IKCa1を欠損するマウスから得られたT細胞及びRBCは、容積制御の欠損を示す[T.Begenisichetal.2004J.Biol.Chem.279,47681]。前臨床及び臨床試験は、鎌形赤血球貧血症を治療する上でのIKCa1阻害剤の有用性を示した[J.W.Stackeretal.2003Blood101,2412;www.icagen.com]。IKCa1チャンネルの遮断剤は、EAEを遮断することも示されており、それらがMSの治療において有用性を有し得ることを示唆している[E.P.Reichetal.2005Eur.J.Immunol.35,1027]。肥満細胞からのIgE媒介性ヒスタミン産生も、IKCa1阻害剤によって遮断され[S.MarkDuffyetal.2004J.AllergyClin.Immunol.114,66]、従って、IKCa1阻害剤は、喘息の治療においても有益であり得る。IKCa1チャンネルは、活性化されたT及びBリンパ球上で過剰発現されており[H.Wulffetal.2004J.Immunol.173,776]、従って、多様な免疫疾患の治療において有用性を示し得る。免疫系以外では、IKCa1阻害剤は、血管再狭窄のラットモデルにおいても有効性を示しており、従って、血管形成術後における再狭窄を防ぐための新規治療戦略となり得る[R.Kohleretal.2003Circulation108,1119]。阻害剤は、インビボで内皮細胞増殖及び血管新生を抑制したので、IKCa1アンタゴニストは、腫瘍血管新生の治療において有用であるとも考えられる[I.Grgicetal.2005Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.25,704]。IKCa1チャンネルは、膵臓腫瘍において上方制御されており、阻害剤は、膵臓癌細胞株の増殖を遮断した[H.Jageretal.2004Mol.Pharmacol.65,630]。IKCa1アンタゴニストは、外傷性脳傷害によって引き起こされた急性脳損傷を軽減するためのアプローチにもなり得る[F.Mauler2004Eur.J.Neurosci.20,1761]。IKCa1阻害剤で治療可能な疾患には、多発性硬化症、喘息、乾癬、接触媒介性皮膚炎、関節及び乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、移植拒絶、移植片対宿主病、狼瘡、再狭窄、膵臓癌、腫瘍血管新生及び外傷性脳傷害が含まれる。従って、中間伝導度のカルシウム活性化カリウムチャンネルのペプチドアンタゴニストを取り込む本発明の分子IKCaは、免疫機能不全、多発性硬化症、1型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病及び狼瘡を治療するために使用することが可能である。従って、本発明は、多発性硬化症、1型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病又は狼瘡などの自己免疫疾患と診断された患者に、前記疾患の少なくとも1つの症候が前記患者において緩和されるように、本発明の組成物の治療的有効量を投与することを含む、自己免疫疾患を治療する方法を含む。緩和されたとは、当該患者において、対象の症候が完全に消滅され、根絶され、除去され又は予防されているかどうかを問わず、和らげられ、提言され、減弱され、軟化され、軽減されすなわち、より穏やか又は緩やかにする。、鎮静され、鎮められ、減衰され、開放され、無化され、又は弱化されることを意味する。さらに、本発明は、多発性硬化症の少なくとも1つの症候を以前に経験した患者に、多発性硬化症の少なくとも1つの症候の再発が予防され、又は多発性硬化症の少なくとも1つの症候が軽減されるように、本発明の組成物の予防的有効量を投与することを含む、多発性硬化症の症候の再発を予防又は軽減する方法に関する。自己免疫疾患を治療する本発明の方法及び多発性硬化症の症候の再発を予防又は軽減する方法において使用するのに好ましい本発明の組成物は、P式Iにおけるように抱合される。として、ShKペプチド、OSK1ペプチド、ChTxペプチド及び/又はマウロトキシンMtxペプチドなどのKv1.3若しくはIKCa1アンタゴニストペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む。例えば、抱合されたShKペプチドペプチド又はShKペプチド類縁体は、以下のものから選択されるアミノ酸配列を含むことが可能である。表2に記されている配列番号5、88~200、548~561、884~950又は1295~1300。抱合されたOSK1ペプチドペプチド又はOSK1ペプチド類縁体は、以下のものから選択されるアミノ酸配列を含むことが可能である。表7に記されている配列番号25、294~298、562~636、980~1274、同じく例として、抱合されたMTXペプチド、MTXペプチド類縁体、ChTxペプチド又はChTxペプチド類縁体は、以下から選択されるアミノ酸を含むことが可能である。表13に記されている配列番号20、330~343、1301、1302、1304~1307、1309、1311、1312若しくは1315~1336;又は表14に記されている配列番号36、59、344~346若しくは1369~1390。同じくこれらの方法において有用なのは、以下から選択されたアミノ酸配列を含む、抱合された又は抱合されていない、Kv1.3又はIKCa1阻害剤トキシンペプチド類縁体である。表2に示されている配列番号88、89、92、148~200、548~561、884~949若しくは1295~1300;又は表7に示されている配列番号980~1274;又は、表13に記されている配列番号330~337、341、1301、1302、1304~1307、1309、1311、1312及び1315~1336。これらの本発明の方法に従って、多発性硬化症、1型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病若しくは狼瘡など但し、これらに限定されない。自己免疫疾患と診断された患者、又は多発性硬化症の少なくとも1つの症候を以前に経験したことがある患者は、自己免疫疾患及びそれらの症候を熟知した、熟練した医療従事者医師などによって、十分に認識可能であり、及び/又は診断される。例えば、多発性硬化症の症候には、以下のものが含まれ得る。視覚的な症候、視神経炎かすみ眼、眼痛、色覚の喪失、失明;複視複視;眼振痙攣性の眼の動き;眼の測定障害oculardysmetria定常的な過少又は過剰な眼の動き;核間性眼筋麻痺両眼間の協調の欠如、眼振、複視;運動及び音の眼内閃光眼を動かしたとき、又は突然の騒音に応答した閃光;求心性の瞳孔の異常異常な瞳孔の応答など;運動的症候、不全麻痺、不全単麻痺、不全対麻痺、不全片麻痺、四肢不全麻痺筋衰弱-部分的な又は穏やかな麻痺;麻痺、対麻痺、片麻痺、四肢麻痺tetraplegia、四肢麻痺quadraplegia麻痺-筋力の完全な喪失又はほぼ完全な喪失;痙性剛直、疼痛を引き起こし、罹患した四肢の自由な運動を制限する筋緊張の喪失;構音障害不明瞭な発語及び関連する発語上の問題;筋萎縮使用の欠如による筋肉の萎縮;痙攣、こむら返り筋肉の不随意的収縮;緊張低下、間代性痙攣姿勢に伴う問題;間代性筋痙攣、筋波動症痙動及び単収縮する筋肉、チック;下肢静止不能症候群特に、夜間に厄介な問題となる、不随意的な下肢の運動;下垂足歩行時に床に沿って足を引きずる;反射機能不全MSR、バビンスキー反射、ホフマン反射、チャドック反射など;感覚性の症候、知覚異常部分的な無感覚、刺痛、耳鳴り及び振動感覚;知覚麻痺完全な無感覚/感覚の喪失;神経痛、神経病及び神経性の疼痛明確な原因のない疼痛、灼熱感、掻痒感及び電気ショック感覚;レルミッテ症候頭を動かしているときの電気ショック及び耳鳴り感覚など;固有感覚機能不全身体部分の位置感覚の喪失;三叉神経痛顔面痛;協調及び平衡の症候、運動失調協調運動障害;企図振戦細かい運動を行うときの震え;測定障害恒常的な過少又は過剰な四肢運動;前庭運動失調内耳中の異常な平衡機能;めまい前庭運動失調に由来する悪心/嘔吐/乗り物酔いに対する感覚;会話運動失調協調した会話の困難、吃音;ジストニア四肢位置フィードバックの遅延;反復拮抗運動不全素早く交互運動例えば、リズムに合わせて運動するを行う能力の喪失など;腸、膀胱及び性的症候、頻尿、膀胱痙性尿意逼迫及び失禁;弛緩性膀胱、排尿筋括約筋筋失調排尿困難及び尿閉;勃起障害男性及び女性の性的不能;オルガズム障害オルガズムに達することができない;逆行性射精膀胱内への射精;冷感症性的に興奮した状態になることができない;便秘低頻度又は不定期な腸運動;便意逼迫腸の逼迫;便失禁腸失禁など;認知症候、うつ病;認知機能障害短期及び長期記憶障害、健忘症、言葉を思い出す速度の遅延;認知症;気分変動、情動不安定、多幸感;躁鬱症候群;不安;失語症、不全失語症会話の理解及び発語の障害など;並びにその他の症候、疲労、ウートホフ症候群熱を伴う症候の重度の増加;胃食道逆流胃酸逆流;味覚及び嗅覚の障害;てんかん発作;嚥下困難、呼吸困難;並びに睡眠障害など。上に列記されている多発性硬化症の症候は単なる例示であり、一人の患者によって、又は複合した数人の患者によって経験され、本発明が適用される全ての可能な症候を網羅的に記載することを意図したものではない。当業者は、各患者によって罹患される自己免疫疾患の様々な臨床症候及び様々な症状を知悉しており、自己免疫疾患を治療し、又は多発性硬化症の症候の再発を予防若しくは軽減する本発明の方法は、これらの症候にも向けられる。自己免疫疾患を治療する本発明の方法又は多発性硬化症の症候の再発を予防若しくは軽減する本発明の方法に関与する治療的有効量、予防的有効量及び投薬計画は、患者の年齢、症状、体重、性別及び食事、治療されている症状の重度、投与の時間及び他の臨床的因子など、治療剤の作用を変化させる様々な因子を考慮して、担当医によって決定される。一般的に、一日の量又は投薬計画は、体重キログラムkg当りのビヒクル抱合されたペプチドの約1~約10,000マイクログラムμgの範囲、好ましくは体重キログラム当り約1~約5000μg、最も好ましくは体重キログラム当り約1~約1000μgの範囲とすべきである。電位開口型カリウムチャンネルKv2.1のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、II型糖尿病を治療するために使用することが可能である。M電流のペプチドアンタゴニスト例えば、BeKm-1を取り込んだ本発明の分子はアルツハイマー病を治療するために、及び認知を増強させるために使用することが可能である。電位開口型カリウムチャンネルKv4.3のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、アルツハイマー病を治療するために使用することが可能である。小伝導度のカルシウム活性化カリウムチャンネルSKCaのペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、てんかん、記憶、学習、神経精神病、神経性、神経筋肉性及び免疫疾患、統合失調症、躁うつ病、睡眠時無呼吸、神経変性並びに平滑筋疾患を治療するために使用することが可能である。N型カルシウムチャンネルアンタゴニストペプチドを取り込んだ本発明の分子は、疼痛を緩和する上で有用である。このような活性を有するペプチド例えば、ZiconotideTM、ω-コノトキシン-MVIIAは、臨床的に有効性が確認されている。T型カルシウムチャンネルアンタゴニストペプチドを取り込んだ本発明の分子は、疼痛を緩和する上で有用である。証拠の複数の系列が合わさって、後根神経節中のCav3.2の阻害が慢性的疼痛からの緩和をもたらし得ることを示している。T型カルシウムチャンネルは、DRG中の神経細胞のサブセットの細胞体中に極めて高いレベルで見出されている。これらは、ゆっくり移動する刺激を検出するように適合された機械的受容体であると思われShinetal.,NatureNeuroscience6:724-730,2003、T型チャンネル活性は、バーストスパイクに必要であると思われるNelsonetal.,JNeurosci25:8766-8775,2005。ミベフラジル又はエトスキシミドによるT型チャンネルの阻害は、神経傷害によってDogruletal.,Pain105:159-168,2003又は化学療法によってFlattersandBennett,Pain109:150-161,2004誘発された、動物中の機械的異痛を回復させる。Cav3.2に対するアンチセンスは、動物における疼痛の閾値を増加させるが、Cav3.1又はCav3.3は増加させず、Cav3.2に対するアンチセンスは、DRG中でのCav3.2タンパク質の発現を低下させるBourinetetal.,EMBOJ24:315-324,2005同様に、局所的に注射された還元剤は、疼痛を引き起こし、Cav3.2電流を増加させ、酸化剤は疼痛を減少させ、Cav3.2電流を阻害し、末梢に投与された神経ステロイドは鎮痛性であり、DRGからのT型電流を阻害するTodorovicetal.,Pain109:328-339,2004;Pathirathnaetal.,Pain114:429-443,2005。従って、DRG神経細胞の細胞体中のCav3.2の阻害は、慢性疼痛状態を伴うこれらの神経細胞の反復的スパイクを阻害することが可能であると考えられている。L型カルシウムチャンネルアンタゴニストペプチドを取り込んだ本発明の分子は、高血圧を治療する上で有用である。このような活性を有する小ペプチド例えば、DHPは、臨床的に有効性が確認されている。Nav1TTXs型チャンネルのペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、疼痛を緩和するために使用することが可能である。このような活性を有する局所麻酔及び三環系抗欝剤は、臨床的に有効性が確認されている。本発明のこのような分子は、特に、筋弛緩剤として有用であり得る。Nav1TTXR型チャンネルのペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、神経及び/又は組織傷害から生じる疼痛を緩和するために使用することが可能である。膠細胞及び上皮細胞のCa2活性化塩化物チャンネルのペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、癌及び糖尿病を治療するために使用することが可能である。NMDA受容体のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、疼痛、てんかん、脳及び脊髄の傷害を治療するために使用することが可能である。ニコチン性受容体のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、筋弛緩剤として使用することが可能である。このような分子は、疼痛、胃の運動障害、尿失禁、ニコチン中毒及び気分障害を治療するために使用することが可能である。5HT3受容体のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、悪心、疼痛及び不安を治療するために使用することが可能である。ノルエピネフリン輸送体のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、疼痛、抗うつ剤、学習、記憶及び尿失禁を治療するために使用することが可能である。ニューロテンシン受容体のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、疼痛を治療するために使用することが可能である。治療的用途に加えて、本発明の化合物は、それらの関連する対象タンパク質の機能不全を特徴とする疾病を診断する上で有用であり得る。一実施形態において、生物学的試料中に、活性化されることができる対象タンパク質例えば、受容体を検出する方法であり、a前記試料を、本発明の化合物と接触させる工程と、及びb前記化合物による、前記対象タンパク質の活性化を検出する工程とを含む前記方法。生物学的試料には、組織試料、完全な状態の細胞又はそれらの抽出物が含まれる。本発明の化合物は、生物学的試料中における、それらの関連する対象タンパク質の存在を検出するための診断キットの一部として使用することが可能である。このようなキットは、検出を可能とするために付着された標識を有する本発明の化合物を使用する。前記化合物は、正常な又は異常な対象タンパク質を同定するのに有用である。本発明の治療法、組成物及び化合物は、疾病の治療において、単独で、又は他の分子と組み合わせて使用することも可能である。医薬組成物総論。本発明は、本発明の組成物と、及び医薬として許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、多様な送達経路、例えば、注射若しくは注入によるなどの血管内送達経路、皮下、筋肉内、腹腔内、硬膜外又は髄腔内送達経路、又は経口、腸内、経肺例えば、吸入、鼻内、経粘膜例えば、舌下投与、経皮又はその他の送達経路及び/又は本分野において公知の投与の形態によって、患者に投与するように設定することが可能である。本発明の医薬組成物は、液体形態で調製することができ、又は凍結乾燥された形態などの乾燥された粉末形態であり得る。経口又は経腸用途の場合、医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性若しくは油性懸濁液剤、分散性散剤又は顆粒剤、エマルジョン、硬若しくは軟カプセル剤、シロップ、エリキシル、経腸処方として、設定することが可能である。本発明の実施において、医薬として許容される担体は、単一で又は組み合わせた、医薬として許容される全ての希釈剤、賦形剤、分散剤、結合剤、充填剤、流動促進剤、抗摩擦剤、圧縮補助、錠剤崩壊剤崩壊剤、懸濁剤、潤滑剤、着香剤、着臭剤、甘味剤、浸透若しくは貫通強化物質、防腐剤、界面活性剤、可溶化剤、乳化剤、濃縮剤、アジュバント、色素、コーティング、封入材料及び/又は他の添加物など、医薬組成物を調合する上で有用である、当業者に公知の生理的に耐容される全ての物質である。このような医薬組成物は、様々な緩衝液内容物例えば、Tris-HCl、アセタート、ホスファート、pH及びイオン強度の希釈剤;界面活性剤及び可溶化剤例えば、TweenR80、Polysorbate80、抗酸化剤例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、防腐剤例えば、TimersolR、ベンジルアルコール及び増量物質例えば、ラクトース、マニトールなどの添加物;ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー性化合物の粒状調製物中への、又はリポソーム中への材料の取り込みを含むことが可能である。ヒアルロン酸も使用することが可能であり、これは、循環中の持続時間を促進する効果を有し得る。このような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度及びインビボクリアランス速度に影響を与えることが可能である。例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences,18thEd.1990,MackPublishingCo.,Easton,PA18042pages1435-1712参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。を参照されたい。前記組成物は、液体形態で調製することが可能であり、又は凍結乾燥された形態などの乾燥された粉末とすることが可能である。経皮又は経粘膜製剤のように、埋め込み可能な徐放製剤も有用である。これに加えて又はこれに代えて、本発明は、当業者に公知の様々な持続放出若しくは徐放製剤又は微粒子製剤の何れかにおいて、例えば、経肺、鼻内又は皮下送達経路を介して投与されることが可能な徐放微粒子製剤において使用するための組成物を提供する。不活性材料を用いて、本発明の組成物を希釈し、又は本発明の医薬組成物の容量を増加させることが可能である。このような希釈剤は、炭水化物、特に、マニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾されたデキストラン及びデンプンを含むことが可能である。ある種の無機塩は、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムなど、充填剤としても使用し得る。幾つかの市販の希釈剤は、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress及びAvicellである。様々な慣用の濃縮剤が、アルギナート、キサンタンガム又は石油などこれらに限定されない。、医薬組成物のクリーム、軟膏、坐薬及びゲル構造において有用であり、本発明の医薬組成物のこのような構成においても使用し得る。ポリエチレングリコールモノラウラート、ジメチルスルホキシド、N-ビニル-2-ピロリドン、N-2-ヒドロキシエチル-ピロリドン又は3-ヒドロキシ-N-メチル-2-ピロリドンなどの浸透又は貫通増強物質も使用することが可能である。ヒドロゲルマトリックスを製造するための有用な技術は公知である。例えば、Feijen,Biodegradablehydrogelmatricesforthecontrolledreleaseofpharmacologicallyactiveagents,米国特許第4,925,677号;Shahetal.,BiodegradablepH/thermosensitivehydrogelsforsustaineddeliveryofbiologicallyactiveagents,WO00/38651A1。このような生物分解性ゲルマトリックスは、例えば、タンパク質成分と多糖又はムコポリ多糖成分を架橋した後、送達すべき本発明の組成物を充填することによって形成することが可能である。無菌溶液又は懸濁液である本発明の液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、血管内例えば、静脈内又は動脈内、腹腔内又は皮下注射によって、患者に投与することが可能である。例えば、Goldenbergetal.,Suspensionsforthesustainedreleaseofproteins,米国特許第6,245,740号及びWO00/38652A1を参照されたい。。無菌溶液は、静脈内注入によって投与することも可能である。本発明の組成物は、無菌水、生理的食塩水、緩衝化された生理的食塩水又は他の適切な無菌注射可能溶媒を用いて患者に投与する前に、都合の良い時点で溶解又は懸濁することが可能な無菌固体医薬組成物凍結乾燥された粉末など中に含めることが可能である。埋め込み可能な徐放製剤も、本発明の医薬組成物の有用な実施形態である。例えば、医薬として許容される担体体内又はヒト若しくはヒト以外の脊椎動物の皮膚の下に埋め込まれた生物分解性マトリックスである。は、上記のものと類似のヒドロゲルであり得る。あるいは、医薬として許容される担体は、ポリ-αアミノ酸成分から形成され得る。Sidman,Biodegradable,implantabledrugdeliverydevice,andprocessforpreparingandusingsame,米国特許第4,351,337号。薬物の送達用インプラントを作製するための他の技術も公知であり、本発明において有用である。粉末形態において、医薬として許容される担体は、細かく分割された固体であり、これは、本発明の組成物を含む細かく分割された活性成分と混合される。例えば、幾つかの実施形態において、医薬組成物が吸入剤として構成されている場合には、粉末形態が有用である。例えば、Zengetal.,Methodofpreparingdrypowderinhalationcompositions,WO2004/017918;Trunketal.,SaltsoftheCGRPantagonistBIBN4096andinhalablepowderedmedicamentscontainingthem,米国特許第6,900,317号を参照されたい。。不活性材料を用いて、本発明の化合物を希釈し、又は本発明の化合物の容量を増加させることが可能である。これらの希釈剤は、炭水化物、特に、マニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾されたデキストラン及びデンプンを含むことが可能である。ある種の無機塩は、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムなど、充填剤としても使用することが可能である。幾つかの市販の希釈剤は、Fast-FloTM、EmdexTM、STA-RxTM1500、EmcompressTM及びAvicellTMである。固体剤形への医薬組成物の製剤化中に、崩壊剤を含めることが可能である。崩壊剤として使用される材料には、デンプンをベースとした市販の崩壊剤ExplotabTMを含むデンプンが含まれるが、これに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、AmberliteTM、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、橙皮、酸性カルボキシメチルセルロース、海綿及びベントナイトを使用することが可能である。不溶性陽イオン交換樹脂は、崩壊剤の別の形態である。粉末化されたゴムは、崩壊剤として、及び結合剤として使用することが可能であり、これらは、寒天、Karaya又はトラガカントなどの粉末化されたゴムを含むことが可能である。アルギン酸及びそのナトリウム塩は、崩壊剤としても有用である。結合剤は、治療剤を一体化させて硬い錠剤を形成するために使用することが可能であり、アラビアゴム、トラガカント、デンプン及びゼラチンなどの天然産物から得られる材料を含む。その他には、メチルセルロースMC、エチルセルロースEC及びカルボキシメチルセルロースCMCが含まれる。ポリビニルピロリドンPVP及びヒドロキシプロピルメチルセルロースHPMCは何れも、治療剤を顆粒化するためにアルコール溶液中で使用することが可能である。抗摩擦剤は、調合プロセス時の粘着を防ぐために、治療剤の製剤中に含めることが可能である。潤滑剤は、治療剤とダイ壁との間の層として使用することが可能であり、これらには、ステアリン酸のマグネシウム及びカルシウム塩などのステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレンPTFE、液体パラフィン、植物油及び蝋が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Carbowax4000及び6000などの可溶性潤滑剤も使用することが可能である。調合時の薬物の流動特性を改善することができ、及び圧縮時の転位を補助するための流動促進剤を添加し得る。流動促進剤には、デンプン、タルク、焼成シリカ及び水和されたケイアルミン酸が含まれ得る。本発明の化合物の水性環境中への溶解を補助するために、界面活性剤を、湿潤剤として添加し得る。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤が含まれ得る。陽イオン性界面活性剤を使用し得、塩化ベンズアルコニウム又は塩化ベンゾエトニウムを含み得る。界面活性剤として製剤中に含めることができる可能性がある非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール400、ポリオキシル40ステアラート、ポリオキシエチレン硬化ひまし油10、50及び60、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート40、60、65及び80、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース並びにカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独で、又は異なる比率での混合物として、タンパク質又は誘導体の製剤中に存在することができる。経口剤形。本発明の組成物の経口剤形も有用である。必要であれば、組成物は、経口送達が有効であるように化学的に修飾することが可能である。一般的に、想定される化学的修飾は、分子自体への少なくとも1つの部分の付着であり、前記部分は、aタンパク質分解の阻害及びb胃又は腸からの血流中への取り込みを可能とする。化合物の全体的な安定性の増加及び体内での循環時間の増加も望まれる。本発明において、共有結合された半減期延長部分として有用な部分も、この目的のために使用することが可能である。このような部分の例には、PEG,エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが含まれる。例えば、AbuchowskiandDavis1981,SolublePolymer-EnzymeAdducts,EnzymesasDrugsHocenbergandRoberts,eds.,Wiley-lnterscience,NewYork,NY,pp367-83;Newmark,etal.,1982,J.Appl.Biochem,4:185-9を参照されたい。使用され得る他のポリマーは、ポリ-1,3-ジオキソラン及びポリ-1,3,6-チオキソカンである。前記のとおり、医薬的な使用に好ましいのは、PEG部分である。経口送達剤形の場合、本発明の治療用化合物の吸収を増加させるための担体として、ナトリウムN-8-[2-ヒドロキシベンゾイル]アミノカプリラートSNACなどの修飾された脂肪族アミノ酸の塩を使用することも可能である。SNACを使用するヘパリン製剤の臨床的効力は、EmisphereTechnologiesにより行われた第II相試験において証明されている。米国特許第5,792,451号,Oraldrugdeliverycompositionandmethodsを参照されたい。一実施形態において、医薬として許容される担体は液体とすることが可能であり、医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル又は圧縮された組成物の形態で調製される。活性成分例えば、本発明の組成物は、水、有機溶媒、両者の混合物、又は医薬として許容される油若しくは脂肪などの医薬として許容される液体担体中に溶解し、希釈し又は懸濁することが可能である。液体担体は、界面活性剤及び/又は可溶化剤例えば、Tween80、Polysorbate80、乳化剤、適切なpHの緩衝液例えば、Tris-HCl、アセタート、ホスファート、アジュバント、抗酸化剤例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、防腐剤例えば、Thimersol、ベンジルアルコール、甘味剤、着香剤、懸濁剤、濃縮剤、増量物質例えば、ラクトース、マンニトール;着色料、粘度調節物質、安定化物質、電解質、浸透溶質又は浸透圧制御物質などの他の適切な医薬添加物を含有することが可能である。本発明の組成物の取り込みを増強させるために、製剤中に添加物を含めることも可能である。この特性を有する可能性がある添加物は、例えば、脂肪酸オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。有用なのは、上記Remington’sPharmaceuticalSciences1990の第89章参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。に一般的に記載されている経口固体剤形である。固体剤形には、錠剤、カプセル、丸薬、トローチ又はドロップ、カプセル又はペレットが含まれる。また、本組成物を調合するために、例えば、米国特許第4,925,673号に報告されているプロテイノイド小球体のようなリポソーム封入又はプロテイノイド封入を使用することが可能である。リポソーム封入を使用することが可能であり、様々なポリマーでリポソームを誘導体化することが可能である例えば、米国特許第5,013,556号。治療剤に対して可能な固体剤形の記述は、Marshall,K.,ModernPharmaceutics1979,editedbyG.S.BankerandC.T.Rhodes,inChapter10参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。に記載されている。一般に、製剤は、本発明の化合物、及び胃環境に対する保護及び腸内での生物学的に活性な材料の放出を可能とする不活性成分を含む。本発明の組成物は、粒径約1mmの顆粒又はペレットの形態の細かい多微粒子状物質として、製剤中に含めることが可能である。カプセル投与用の材料の製剤は、粉末、軽く圧縮されたプラグ又は錠剤でもあり得る。治療剤は、圧縮によって調製することが可能である。着色剤及び着香剤は、全て含めることが可能である。例えば、リポソーム又は小球体封入などによってタンパク質又は誘導体を調合し、次いで、着色剤及び着香剤を含有する冷蔵された飲料などの飲食物内にさらに含有させることが可能である。錠剤形態で、活性成分は、適切な割合で、必要な圧縮特性を有する医薬として許容される担体と混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。粉末及び錠剤は、好ましくは、活性成分の最大99を含有する。適切な固体担体には、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点蝋及びイオン交換樹脂が含まれる。徐放製剤が望ましい場合があり得る。本発明の組成物は、拡散又は浸出機構の何れか、例えばガムによって放出を可能とする不活性マトリックス中に取り込ませることが可能である。ゆっくり変性するマトリックス、例えば、アルギナート、多糖を、製剤中に取り込ませることも可能である。本発明の組成物の徐放の別の形態は、OrosTM治療システムAlzaCorp.に基づく方法による。すなわち、薬物は、水の浸入を可能とし、浸透圧効果によって、単一の小さな開口部を通じて薬物を押し出すことが可能な半透膜中に封入される。幾つかの腸溶コーティングも、遅延した放出効果を有する。製剤化のために、他のコーティングを使用することが可能である。これらには、コーティングパン中に適用可能な様々な糖が含まれる。また、治療剤は、フィルムコーティングされた錠剤として提供されることも可能であり、この場合に使用される物質は、2つのグループに分類される。第1のグループは、非腸溶性物質であり、これらには、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドン及びポリエチレングリコールが含まれる。第2のグループは、一般にはフタル酸のエステルである腸溶性物質からなる。最適なフィルムコーティングを得るために、材料の混合物を使用し得る。フィルムコーティングは、パンコーター内若しくは流動床内で、又は圧縮コーティングにより行なうことができる。経肺送達形態。本発明の組成物の経肺送達も有用である。該タンパク質又は誘導体は、吸入されて哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層lungepithelialliningを越えて血流に入る。これに関する他の報告には、Adjeiら,Pharm.Res.7:565-5691990;Adjeiら,Internatl.J.Pharmaceutics63:135-441990酢酸ロイプロリド;Braquetetal.1989,J.Cardiovasc.Pharmacol.13suppl.5:s.143-146エンドセリン-1;Hubbardetal.1989,AnnalsInt.Med,3:206-12α1-アンチトリプシン;Smithetal.1989,J.Clin.Invest.84:1145-6α1-プロテイナーゼ;Osweinetal.March1990,AerosolizationofProteins,Proc.Svmp.Resp.DrugDeliveryII,Keystone,Colorado組換えヒト成長ホルモン;Debsetal.1988,J.Immunol.140:3482-8インターフェロンγ及び腫瘍壊死因子ルファ及びPlatzetal.,米国特許第5,284,656号顆粒球コロニー刺激因子が含まれる。本発明の実施において有用であるのは、治療用産物の経肺送達用に設計された多種多様な機械装置例えば、噴霧器、定量吸入器及び粉末吸入器などの、いずれも当業者によく知られたものが含まれるが、これらに限定されるものではない。である。本発明の実施に適した市販の装置のいくつかの具体例としては、Mallinckrodt,Inc.,St.Louis,Missouri製のUltravent噴霧器、MarquestMedicalProducts,Englewood,Colorado製のAcornII噴霧器、GlaxoInc.,ResearchTrianglePark,NorthCarolina製のVentolin定量吸入器及びFisonsCorp.,Bedford,Massachusetts製のSpinhaler粉末吸入器が挙げられる。例えば、Helgessonetal.,Inhalationdevice,米国特許第6,892,728号;McDermentetal.,Drypowderinhaler,WO02/11801A1;Ohkietal.,Inhalantmedicator,米国特許第6,273,086号。このような何れの装置においても、本発明の化合物の投薬に適した製剤を使用することが必要である。典型的には、各製剤は、用いる装置のタイプに特有のものであり、治療に有用な希釈剤、佐剤及び/又は担体に加えて適切な噴射物質の使用を伴いうる。遠位の肺への最も有効な送達のためには、本発明の化合物は、10μm又はミクロン未満、最も好ましくは0.5~5μmの平均粒径を有する粒子形態で調製されるのが最も有利なはずである。医薬として許容される担体には、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、ソルビトールなどの炭水化物が含まれる。製剤中で使用する他の成分には、DPPC、DOPE、DSPC及びDOPCが含まれ得る。天然又は合成界面活性剤を使用することができる。PEGを使用することができるこれは、該タンパク質又は類縁体の誘導体化におけるその使用と独立して使用することさえ可能である。シクロデキストランなどのデキストランを使用することができる。胆汁酸塩及び他の関連した増強剤を使用することができる。セルロース及びセルロース誘導体を使用することができる。緩衝液製剤中での使用など、アミノ酸を使用することができる。また、リポソーム、マイクロカプセル又は小球体、包接複合体、又は担体の他のタイプの使用も想定される。噴霧器ジェット式又は超音波式のいずれかと併用するのに適した製剤は、典型的には、溶液1mL当たり生物学的活性タンパク質約0.1~25mgの濃度で水に溶解された本発明の化合物を含む。また、該製剤は、緩衝液及び単糖例えば、タンパク質の安定化及び浸透圧の調節用のものを含み得る。エーロゾルの形成において該溶液の噴霧により生じる該タンパク質の界面誘導凝集を抑制又は防止するために、該噴霧製剤は界面活性剤を含有することも可能である。定量吸入装置と併用する製剤は、一般に、界面活性剤の補助により噴射剤中に懸濁された本発明の化合物を含有する微細化粉末を含む。該噴射剤は、この目的に用いる任意の慣用物質クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、又は炭化水素、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、1,1,1,2-テトラフルオロエタンなど、又はそれらの組合せとすることが可能である。適切な界面活性剤には、ソルビタントリオレアート及び大豆レシチンが含まれる。オレイン酸も界面活性剤として有用であり得る。例えば、Backstrometal.,Aerosoldrugformulationscontaininghydrofluoroalkanesandalkylsaccharides,米国特許第6,932,962号を参照されたい。。粉末吸入装置からの投薬のための製剤は、本発明の化合物を含有する微細化乾燥粉末を含み、装置からの粉末の分散を促進する量例えば、製剤の50~90重量の増量剤ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース又はキシリトールなどを含むことも可能である。経鼻送達形態。本発明において、本発明の組成物及び/又は医薬組成物の鼻内送達も有用であり、鼻内運搬においては、鼻の内部への投与後、該産物の肺内への堆積を要することなく、本発明の組成物及び/又は医薬組成物を直接血流へ通過させることが可能である。鼻内投与に適した製剤には、デキストラン又はシクロデキストランを有する製剤が含まれ、鼻内送達装置は公知である。例えば、Freezer,Inhaler,米国特許第4,083,368号を参照。経皮及び経粘膜例えば、口腔送達形態。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、医薬として許容される経皮又は経粘膜パッチ又はトローチの一部として構成される。経皮パッチ薬物送達系、例えば、マトリックスタイプの経皮パッチは公知であり、本発明の医薬組成物の幾つかの実施形態を実施するのに有用である。例えば、Chienetal.,Transdermalestrogen/progestindosageunit,systemandprocess,米国特許第4,906,169号及び同第5,023,084号;Clearyetal.,Diffusionmatrixfortransdermaldrugadministrationandtransdermaldrugdeliverydevicesincludingsame,米国特許第4,911,916号;Teillaudetal.,EVA-basedtransdermalmatrixsystemfortheadministrationofanestrogenand/oraprogestogen,米国特許第5,605,702号;Venkateshwaranetal.,Transdermaldrugdeliverymatrixforcoadministeringestradiolandanothersteroid,米国特許第5,783,208号;Ebertetal.,Methodsforprovidingtestosteroneandoptionallyestrogenreplacementtherapytowomen,米国特許第5,460,820号。治療剤の経粘膜送達用の医薬として許容される様々なシステムも本分野において公知であり、本発明の実施と適合性がある。例えば、Heiberetal.,Transmucosaldeliveryofmacromoleculardrugs,米国特許第5,346,701号及び同第5,516,523号;Longeneckeretal.,Transmembraneformulationsfordrugadministration,米国特許第4,994,439号。本発明の組成物の口腔送達も有用である。口腔送達製剤は、ペプチドとともに使用するために、本分野において公知である。例えば、経口粘膜例えば、舌下粘膜を通じた薬物送達用に設計された公知の錠剤又はパッチ系には、薬物を含有する内側層と、胆汁酸塩又はフシジン酸塩fusidateなどの浸透増強物質と、及びヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、ペクチン、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン又はこの目的に対して有用であることが知られた他のポリマーのあらゆる数などの親水性ポリマーとを含む幾つかの実施形態が含まれる。内側層は、口腔の湿った粘膜組織と接触して、これに粘着するように適合された1つの表面を有することが可能であり、上に存在する非粘着性の不活性層に付着する反対側表面を有することが可能である。場合によって、このような経皮送達系は、内側層がさらなる結合剤、着香剤又は充填剤も含有する二層錠剤の形態であり得る。幾つかの有用な系は、浸透増強物質とともに、非イオン性界面活性剤を使用する。経粘膜送達装置は、クリーム、ゲル若しくは軟膏など遊離形態であり得、又は錠剤、パッチ若しくはトローチなどの明確な形態を含み得る。例えば、本発明の組成物の送達は、例えば、粘着層、裏打ち層、本発明の組成物を含有する貯蔵槽を画する浸透膜、該膜の下に位置する剥離シールディスク、1つ又はそれ以上の熱シール及び除去可能な剥離ライナーの薄層化された複合物を含む経皮送達系を介することが可能である。例えば、Ebertetal.,Transdermaldeliverysystemwithadhesiveoverlayandpeelsealdisc,米国特許第5,662,925号;Changetal.,Deviceforadministeringanactiveagenttotheskinormucosa,米国特許第4,849,224号及び同第4,983,395号。これらの例は、利用可能な経粘膜薬物送達技術の単なる例示であり、本発明を限定するものではない。投薬量。上記症状の治療方法に関わる投与計画は、薬物の作用を改変する種々の要因例えば、患者の年齢、状態、体重、性別及び食事、いずれかの感染の重症度、投与時間ならびに他の臨床的要因を考慮して担当医師により決定される。一般には、1日用量は、本発明の化合物0.1~1000μg/kg体重、好ましくは0.1~150μg/kgの範囲とすべきである。実施例上記の組成物は以下の記載に従って調製することができる。これらの実施例は、いかなる場合においても、本願の特許請求の範囲を限定するものと解釈してはならない。Fc-L10-ShK[1-35]の哺乳類動物での発現Fc-L10-ShK[1-35]は、Fc-2xL-ShK[1-35]とも呼ばれ、Kvl.3の阻害剤である。リンカー配列及びKvl.3阻害剤ペプチドShK[1-35]の単量体へインフレームに融合されたヒトIgG1のFc領域をコードするDNA配列を後述のように構築した。哺乳類細胞HEK293及びチャイニーズハムスター卵巣細胞からペプチボディpeptibodyを発現及び精製するための方法は、本明細書に開示されている。pcDNA3.1中のMluIとHindIIIの間のCMVプロモーターをCMVプロモーターイントロンInvitrogenと置換することによって、発現ベクターpcDNA3.1CMVi図13Aを構築した。5’コザック配列、シグナルペプチド及びヒトFcリンカー―HindIII-NotIで消化されたpcDNA3.1CMViの大きな断片とのアクチビンRIIB融合タンパク質を含有するHindIII-NotIで消化されたPCR産物をクローニングすることによって、発現ベクターpcDNA3.1CMVi-hFc-アクチビンRIIB図13Bを作製した。pcDNA3.1CMVi-hFc-アクチビンRIIB中のヒトIgG1Fc領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図3に示す。このベクターは、BamHI部位によって分断されたGGGGSGGGGSL10、配列番号79も有し、これにより、以下のオリゴを用いて、最終Fc-L10-ShK[1-35]ヌクレオチド及びアミノ酸配列に対して、FcとShK[1-35]ペプチド図14参照間に10個アミノ酸のリンカーを形成することが可能となる。以下に示されているように、2つの停止コドンを有し、BamHI及びNotI制限部位が隣接した、4個のグリシン及び1個のセリンアミノ酸リンカー本明細書での小文字は、L型アミノ酸残基のリンカー配列を示すに連結された完全長ShK遺伝子を作製するためのPCR戦略を使用して、Fc-L10-ShK[1-35]発現ベクターを構築した。以下に記載される配列を有する2つのオリゴを、94°C-30秒、50°C-30秒、72°C-1分の30周期で、Herculase商標ポリメラーゼStratageneを使用するPCR反応で使用した。得られたPCR産物を1アガロースゲル上で150bpバンドとして分離した。150bpのPCR産物を、BamHI及びNotIRoche制限酵素で消化し、ゲル精製キットQiagenによってアガロースゲル精製した。同時に、pcDNA3.1CMVi-hFc-アクチビンRIIBベクター図13Bを、BamHI及びNotI制限酵素で消化し、ゲル精製キットにより、大きな断片を精製した。ゲル精製されたPCR断片を、精製された大きな断片へ連結し、XL-1ブルーバクテリアStratageneへと形質転換した。形質転換された細菌コロニー由来のDNAを単離し、BamHI及びNotI制限酵素消化で消化し、1アガロースゲル上で分離した。予想されたパターンを生じるDNAを配列決定へ供した。クローンの幾つもの配列の分析は、上述の配列と100一致したが、大規模プラスミド精製のために単一のクローンを選択した。Fc及びリンカー領域を確認するため、pcDNA3.1CMVi中のFc-2xL-ShKからのDNAを再配列決定し、配列は、図14に示される推定されたコード化配列と100同一であった。DMEM高グルコースGibco、10ウシ胎仔血清FBS、Gibco製、1×非必須アミノ酸NEAA、Gibco製を含有する増殖培地中で、pcDNA3.1CMViタンパク質中のFc-2xL-ShK[1-35]の一過性形質移入発現において使用されるHEK-293細胞を培養した。Fugene6Rocheを使用して、フェノール/クロロホルム抽出したpcDNA3.1CMViプラスミド中のFc-2xL-ShK[1-35]5.6μgを、HEK-293細胞に形質移入した。細胞を24時間回復した後、DMEM高グルコース及び1×NEAA培地中に48時間配置した。CentriprepYM-10フィルターAmiconへ30mLを流し、さらにCentriconYM-10Amiconフィルターによって濃縮することによって、培養上清を50倍濃縮した。濃縮した培地の多様な量を自家4×添加液B-メルカプトエタノールなしと混合し、NovexXcellII装置を使用して、BenchMark染色済みタンパク質ラダーInvitrogen10μLとともに、5×タンク緩衝液0.123トリス塩基、0.96Mグリシン中、101V/46mAで2時間、Novex4ないし20トリス-グリシンゲル上で電気泳動した。次に、ゲルをエレクトロブロット緩衝液35mMトリス塩基、20メタノール、192mMグリシン中に30分間浸漬した。Novex製のPDVFメンブレンカタログ番号LC2002、孔サイズ0.2μmを活性化させるため、前記PVDFメンブレンをメタノール中に30秒浸漬し、脱イオン水ですすぎ、エレクトロブロット緩衝液中に浸漬した。XCellIIブロットモジュールを使用して、製造者の説明書Novexに従って、PVDFメンブレンへ40mAで2時間、あらかじめ浸漬したゲルをブロットした。次に、まずトリス緩衝塩類溶液pH7.5TBS中の5ミルクCarnation中に室温で、ブロットを1時間浸漬し、0.1トゥイーン20含有TBSTBST、Sigma及び1ミルク緩衝液中で、HRP結合抗ヒトFc抗体ZymedLaboratoresカタログ番号05-3320の1:500希釈を、室温で2時間浸漬するために温置した。次に、室温で1回の洗浄につき15分間、TBST中で、ブロットを3回洗浄した。製造者の説明書に従ってAmershamPharmaciaBiotechのECLウェスタンブロット検出試薬を使用して、一次抗体を検出した。ECL検出に際し、ウェスタンブロット分析は、非還元型ゲル条件下で、66kDaの予期されるサイズを表示した図24A。DMEM高グルコース、10ウシ胎仔血清、1×ヒポキサンチン/チミジンHT、Gibco製、1×NEAAを含有するAM1CHOd増殖培地中で、Fc-LI0-ShK[1-35]タンパク質の安定した発現に使用されるAM1CHOdAmgenProprietary細胞を培養した。Fugene6を使用して、pcDNA3.1CMVi-Fc-ShKプラスミド6.5μgもAM1CHOd細胞へと形質移入した。翌日、形質移入した細胞を20個の15cm皿へと播種し、DMEM高グルコース、10FBS、1×HT、1×NEAA、ジェネテシンG418miあたり800μg、Gibco製を使用して13日間選択した。48個の生存コロニーを、2つの24ウェルプレート中に摘出した。増殖させるため、プレートを1週間放置した後、凍結のために複製した。10FBSなしのAM1CHOd増殖培地へ、各プレートの1セットを48時間移動させて、培養上清を回収した。安定したCHOクローンを発現させるための培養上清15μLを選別するために、同一の抗ヒトFc抗体による検出を使用する一過性ウェスタンブロット分析と同様のウェスタンブロット分析を使用した。48個の安定したクローンのうち、50超は66kDaの予期されたサイズでShKを発現した。一次クローンBB6に対するバックアップとして、BB6、BD5、BD6クローンをBD5及びBD6で選択した図24B。AM1CHOd増殖培地を使用して、BB6クローンを、10個のローラー瓶Corningへとスケールアップし、顕微鏡下で判断される培養密度まで増殖させた。次に、培地を、50DMEM高グルコース並びに1×HT及び1×NEAA含有50HamのF12Gibcoを含有する無血清培地と交換し、1週間温置した。培養上清を1週間の温置時点で回収し、0.45μmフィルターCorningでろ過し、凍結した。新鮮な無血清培地を添加し、さらに1週間温置した。培養無血清上清を初回と同様に回収し、凍結した。水槽中、室温で、培養上清約4Lを解凍した。SatoriusSartoconPolysulfon10接線流限外ろ過カセット0.1m2を室温で使用して、培地を約450mLまで濃縮した。次に、プレフィルターを有する0.22μm酢酸セルロースフィルターで保持液retentateをろ過した。次に、7°C、5mL/分で、5mLのAmershamHiTrapタンパク質Aカラムへ保持液をかけ、二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液PBSの数カラム容積で前記カラムを洗浄し、100mMグリシン、pH3.0にする工程で、試料を溶出した。タンパク質A溶出プール約9mLを、50mLになるように水で希釈し、S-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.0中の5mLのAmershamHiTrapSP-HPカラムへと、7°C、5mL/分で負荷した。次に、数カラム容積のS-緩衝液Aで、カラムを洗浄した後、25から75のS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.0の直線勾配を5mL/分で使用した後、7°Cで100のS-緩衝液Bまでの工程を展開した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、PallLifeSciencesMacrosep10KOmega遠心限外ろ過装置を使用して、プールした材料を約3.4mLまで濃縮した後、Costar0.22μm酢酸セルロースシリンジフィルターでろ過した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈したろ過済み材料10μLに対して、スペクトル走査を実施した図26A。32,420g/molの算出された分子量及び47,900M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が5.4mg/mLであると決定した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した図26B。次に、PBS中の試料の108倍希釈を使用するCharlesRiverLaboratoriesEndosafe-PTSシステム0.05ないし5EU/mL感度を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、タンパク質1mgあたり1EUであった。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9中のPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへと1mL/分で注入された生成物20μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図26C。次に、試料1μLをシナピン酸10μL0.05トリフルオロ酢酸、50アセトニトリル中10mg/mL中に希釈することによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液1μLを、MALDI試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーが装備されたVoyagerDE-RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した337nm、3ナノ秒パルス。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して、外部質量較正を実施し図26D、精製されたペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。その後、生成物を-80°Cで保存した。精製されたFc-L10-ShK[1-35]は、電気生理学法によって測定されるように、ヒトKv1.3を強く遮断した図30A及び図30B実施例36参照。精製されたFc-L10-ShK[1-35][1-35]分子は、T細胞増殖図36A及び図36B並びにサイトカインIL-2図35A及び図37A及びIFN-g図35B及び図37Bの生成も遮断した。Fc-L-ShK[2-35]の哺乳類での発現標準的なPCR技術を使用して、Kv1.3阻害剤ペプチドShK[2-35]の単量体へ、インフレームで融合されたヒトIgG1のFc領域をコードするDNA配列を構築した。ShK[2-35]及び前記分子の5、10又は25アミノ酸リンカー部分を、pcDNA3.1CMVi中の固有Fc-2xL-ShK[1-35]をテンプレートとして使用するPCR反応において生成させた実施例1、図14。全てのShKコンストラクトは、以下のアミノ酸配列を有するべきであり、配列番号野生型配列の最初のアミノ酸は欠失している。Fc-1xL-ShK[2-35]とも呼ばれるFc-L5-ShK[2-35]を作製するために使用されるプライマーの配列を以下に示す。Fc-2xL-ShK[2-35]とも呼ばれるFc-L10-ShK[2-35]を作製するために使用されるプライマーの配列を以下に示す。Fc-5xL-ShK[2-35]とも呼ばれるFc-L25-ShK[2-35]を作製するために使用されるプライマーの配列を以下に示す。BamHI及びNotIRoche制限酵素でPCR産物を消化し、ゲル精製キットQiagenによってアガロースゲル精製した。同時に、pcDNA3.1CMVi-hFc-アクチビンRIIBベクターを、BamHI及びNotI制限酵素で消化し、ゲル精製キットによって大きな断片を精製した。精製した各PCR産物を大きな断片へ連結し、XL-1ブルーバクテリア中に形質転換した。形質転換された細菌コロニー由来のDNAを単離し、BamHI及びNotI制限酵素消化に供し、1アガロースゲル上で分離した。予想されたパターンを生じるDNAを配列決定へ供した。クローンの幾つもの配列の分析は、上述の配列と100一致したが、大規模プラスミド精製のために1つのクローンのみを選択した。Fc領域及びリンカー領域を確認するために、このクローン由来のDNAを再配列決定し、配列は予想された配列と100同一であった。pcDNA3.1CMViベクター中にFc-1xL-Shk[2-35]、Fc-2xL-Shk及びFc-5xL-Shk[2-35]インサートを含有するプラスミドを、Xba1及びXho1Roche制限酵素で消化し、ゲル精製した。NotI及びSalIRocheで消化したpDSRα-22AmgenProprietary発現ベクターへ、前記インサートを個々に連結した。得られたコンストラクトの完全性をDNA配列決定によって確認した。最終的なプラスミドDNA発現ベクターコンストラクトは、pDSRα-22-Fc-1xL-Shk[2-35]、pDSRα-22Fc-2xL-Shk[2-35]図13C及び図15及びpDSRα-22-Fc-5xL-Shk[2-35]図16であり、それぞれ5、10及び25アミノ酸リンカーを含有していた。形質移入の24時間前に、1.2e7AM-1/DCHOdAmgenProprietary細胞を、T-175cmの滅菌済み組織培養フラスコ中に播種し、形質移入当日に70ないし80培養密度にした。DMEM高グルコース、5FBS、1×グルタミンPen/StrepGibco、1×HT、1×NEAA及び1×ピルビン酸ナトリウムGibcoを含有するAM-1/DCHOd培地中で前記細胞を維持した。翌日、直鎖状にしたpDSRα22:Fc-1xL-ShK[2-35]、pDSRα22:Fc-2xL-ShK[2-35]及びpDSRα22:Fc-5xL-ShK[2-35]RDS番号20050037685、20050053709、20050073295の各プラスミド18μgを、直鎖状SelexisMARプラスミド72μg及びpPAGO1RDS20042009896と混合し、50mLコニカルチューブ中のOptiMEM6mL中へ希釈し、5分間温置した。LF2000210μLをOptiMEM6mLへ添加し、5分間温置した。希釈したDNA及びLF2000を互いに混合し、室温で20分間温置した。その間、細胞をPBSで1回洗浄した後、抗生物質を有さない30mLのOptiMEMを細胞へ添加した。OptiMEMを吸引除去し、DNA/LF2000混合物12mLとともに、振とうしている37°Cインキュベーター中で6時間又は一晩、細胞を温置した。形質移入から24時間後、コロニー選択のために、異なる希釈で、AM-1/DCHOd培地中に細胞を1:5に分割した。形質移入から72時間後、細胞培地を、DMEM高グルコース、及び1×グルタミンPen/Strep、1×NEAA及び1×ピロリン酸ナトリウム中に10透析済みFBSGibcoを含有するDHFR選択培地と置換し、細胞培地中へタンパク質を発現及び分泌させた。コロニーが、摘み取るのに十分大きくなるまで、選択培地を1週間に2回交換した。pDSRa22発現ベクターは、形質移入した細胞をヒポキサンチン及びチミジンの不存在下で増殖させるDHFR発現カセットを含有する。得られたコロニーの5つのT-175プールを、ローラー瓶へスケールアップし、無血清条件下で培養した。馴化培地を回収し、1週間置きに交換した。得られた馴化培地3Lを、0.45μm酢酸セルロースフィルターCorning,Acton,MAでろ過し、精製のためにProteinChemistryに転移させた。バックアップとして、DHFR選択培地上で、10ないし14日後に、10cmプレートから12個のコロニーを選択し、HRP抱合された抗ヒトIgGFcをプローブとして使用するウェスタンブロットによって、発現レベルを評価した。異なるリンカー長のFc-L-ShK[2-35]融合タンパク質の各々の最高レベルを発現する3つの最良のクローンを繁殖させ、将来の使用のために凍結した。Fc-L10-ShK2-35の精製室温、水槽中で、培養上清約1Lを解凍した。5mLのAmershamHiTrapタンパク質Aカラムへ、7°C、5mL/分で、培地を負荷し、二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液PBSの数カラム容積で前記カラムを洗浄し、100mMグリシン、pH3.0への工程で、試料を溶出した。タンパク質A溶出プール約8.5mLを、3M酢酸ナトリウム71μLと組み合わせた後、50mLになるように水で希釈した。次に、7°C、5mL/分で、S-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.0中の5mLのAmershamHiTrapSP-HPカラムへと、希釈した材料を負荷した。次に、S-緩衝液Aの数カラム容積で、カラムを洗浄した後、0から75までのS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.0の直線勾配を5mL/分で使用して展開した後、7°Cで100S-緩衝液Bにする工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、プールした材料を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、PallLifeSciencesMacrosep10KOmega遠心限外ろ過装置を使用して、約3.9mLまで濃縮した。次に、室温、2mL/分で、0.22μm、25mmのMustangEメンブレンを有するPallLifeSciencesAcrodiscを用いて、濃縮した材料をろ過した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈したろ過済み材料10μLに対して、スペクトル走査を実施した図27E。30,008g/molの算出された分子量及び36,900M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が2.76mg/mLであることを決定した。透過液中に材料が認められたため、新しいMacrosepカートリッジを使用して、透過液に対して濃縮工程を反復した。次に、室温、2mL/分で、0.22μm、25mmのMustangEメンブレンを有するPallLifeSciencesAcrodiscを通して、濃縮された材料の新たなバッチをろ過した。濃縮された材料の両ロットを1つのプールへと組み合わせた。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈した、合わせたプール10μLに対して、スペクトル走査を実施した。30,008g/molの算出された分子量及び36,900M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が3.33mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した図27A。次に、PBS中への試料の67倍希釈を使用して、CharlesRiverLaboratoriesEndosafe-PTSシステム0.05ないし5EU/mL感度を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、1EU/タンパク質mg未満であった。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9中のPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmに1mL/分で注入された生成物50μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図27B。次に、試料1μLをシナピン酸10μL0.05トリフルオロ酢酸、50アセトニトリル中10mg/mL中に希釈することによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液1μLをMALDI試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyagerDE-RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した337nm、3ナノ秒パルス。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し図27F、本実験は、ペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。次に、生成物を-80°Cで保存した。図31Bは、精製されたFc-L10-ShK[2-35]がヒトKv1.3電流を強く遮断することを示す電気生理学的実験を実施例36に記載されるとおり実施した。。精製したFc-L10-ShK[2-35]分子は、ヒト全血中のIL-2図64A及び図64B及びIFN-g図65A及び図65Bの生成も、T細胞に関するCD40L図66A及び図66B及びIL-2R図67A及び図67Bの上方制御と同様に遮断した。Fc-L5-ShK2-35の精製5mLのAmershamHiTrapタンパク質Aカラムへ、7°C、5mL/分で、培養上清約1Lを負荷し、二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液PBSの数カラム容積で前記カラムを洗浄し、100mMグリシン、pH3.0への工程で試料を溶出した。タンパク質A溶出プール約9mLを1MトリスHCl、pH8.5の450μLと組み合わせた後、2M酢酸230μLと組み合わせ、次に水で50mLに希釈した。次に、pH調整した材料を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、7°C、5mL/分でS-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.0中の5mLのAmershamHiTrapSP-HPカラムへ負荷した。次に、S-緩衝液Aの数カラム容積でカラムを洗浄した後、0から75までのS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.0の直線勾配を5mL/分で使用して展開した後、7°Cで100S-緩衝液Bへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、PallLifeSciencesMacrosep10KOmega遠心限外ろ過装置を使用して、プールした材料を約5.5mLまで濃縮した。次に、濃縮した材料を室温で2mL/分で、0.22μm、25mmのMustangEメンブレンを有するPallLifeSciencesAcrodiscでろ過した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈した組み合わせたプール10μLに対して、スペクトル走査を実施した図27G。29,750g/molの算出された分子量及び36,900M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が4.59mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した図27C。次に、CharlesRiversエンドトキシン特異的緩衝液BG120中に試料を92倍希釈したものを使用して、CharlesRiverLaboratoriesEndosafe-PTSシステム0.05ないし5EU/mL感度を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、1EU/タンパク質mg未満であった。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9中のPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへと1mL/分で注入された生成物50μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図27H。次に、試料1μLをシナピン酸10μL0.05トリフルオロ酢酸、50アセトニトリル中10mg/mLへと希釈することによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液1μLをMALDI試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyagerDE-RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した337nm、3ナノ秒パルス。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し図27I、ペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。次に、生成物を-80°Cで保存した。図31Cは、精製したFc-L5-ShK[2-35]が非常に活発で、全細胞パッチクランプ電気生理学的実験によって測定されるように、ヒトKv1.3を遮断することを示す実施例36参照。Fc-L25-ShK2-35の精製7°C、5mL/分で、5mLのAmershamHiTrapProteinAカラムへ、培養上清約1Lを負荷し、前記カラムを二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液PBSの数カラム容積で洗浄し、100mMグリシン、pH3.0への工程で試料を溶出した。タンパク質A溶出プール約9.5mLを3M酢酸ナトリウム119μLと組み合わせた後、水で50mLに希釈した。次に、7°C、5mL/分でS-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.0中の5mLのAmershamHiTrapSP-HPカラムへと、pH調整した材料を負荷した。次に、カラムをS-緩衝液Aの数カラム容積で洗浄した後、0から75までのS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.0の直線勾配を5mL/分で使用して展開した後、7°Cで100S-緩衝液Bへの工程で溶出した。クロマトグラムからの主要ピークを含有する画分をプールし、0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈した組み合わせたプール20μLに対して、スペクトル走査を実施した図27J。31,011g/molの算出された分子量及び36,900M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が1.40mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した図27D。次に、CharlesRiversエンドトキシン特異的緩衝液BG120中に試料を28倍希釈したものを使用して、CharlesRiverLaboratoriesEndosafe-PTSシステム0.05ないし5EU/mL感度を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、1EU/タンパク質mg未満であった。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9中のPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmに1mL/分で注入された生成物50μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図27K。次に、試料1μLをシナピン酸10μL中に希釈する0.05トリフルオロ酢酸、50アセトニトリル中10mg/mLことによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液1μLをMALDI試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyagerDE-RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した337nm、3ナノ秒パルス。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し図27L、これにより、ペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。次に、生成物を-80°Cで保存した。精製したFc-L25-ShK[2-35]は、HEK293/Kv1.3細胞に関するホールセルパッチクランプ電気生理学によって、約150pMのIC50でヒトKv1.3を阻害した実験36。Fc-L-ShK[1-35]の細菌での発現細菌のペプチボディ発現ベクター並びにペプチボディのクローニング及び発現に関する手法の記載細菌発現に使用されるクローニングベクター実施例3ないし30は、米国特許第2004/0044188号に元来記載されるpAMG21に基づいている。ベクターのユニークなBstBI部位とNsiI部位の間でDNAを切り出し、アンピシリンに対する耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子のテンプレート源としてのpUC19DNAとともに、PCRプライマーを使用して、β-ラクタマーゼ遺伝子を搭載する適切に消化されたPCR断片と置換することによって、カナマイシン耐性要素がアンピシリン耐性と置換された点が改変されている。新たなバージョンは、pAMG21ampRと呼ばれる。15及び16を除く、実施例3ないし30において使用されるクローニングベクターpAMG21ampR-Fc-Pepの記載。図11A-C及び図11D模式図は、Fc遺伝子のC末端へのペプチド融合のクローニングを可能にするために基本ベクターpAMG21ampRへ付加された二本鎖DNAを示す。前記DNAは、pAMG21ampRベクター中のユニークなNdel部位とBamHI部位の間に導入されている。DNAのこの完全な領域を図11AないしCに示す。Fcのコード領域は、ヌクレオチド5134から5817まで及び、タンパク質配列はDNA配列の下に表される。この後に、フレーム中にglyX5リンカーが続くヌクレオチド5818ないし5832。BsmBI部位GAGACGは、ヌクレオチド5834ないし5839に及ぶ。DNA開裂は、上部DNA鎖のヌクレオチド5828と5829の間、及び下部DNA鎖のヌクレオチド5832と5833の間に生じる。本明細書に示されるように、消化によって、4bpの付着末端が作製される。BsmBI部位には下線を付されている。第二BsmBI部位は、ヌクレオチド6643ないし6648、すなわちCGTCTCに存在する。DNA開裂は、上部鎖のヌクレオチド6650と6651の間、及び下部鎖の6654と6655の間に生じる。2つのBsmBI部位の間に存在するのは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを構成的に発現する非必須クロラムフェニコール耐性カセットであるcat遺伝子。catタンパク質配列、すなわちは、図11AないしCに示されており、ヌクレオチド5954から6610まで及ぶ。実施例15及び16を除く各実施例における、ペプチドをコードする二本鎖は、ベクターによって表されるものと相補的な付着末端を有する。実施例15及び16において使用されるクローニングベクターpAMG21ampR-Pep-Fcに関する記載。図12AないしC、及び図12Dの模式図は、Fc遺伝子のN末端へのペプチド融合のクローニングを可能にするために、基本ベクターpAMG21ampRへ付加された二本鎖DNA配列を示す。DNAは、pAMG21ampRベクター中のユニークなNdel部位とBamHI部位との間に導入されている。Fcに対するコード領域は、ヌクレオチド5640から6309まで及び、タンパク質配列はDNA配列の下に表されている。この後、フレーム中にglyX5リンカーが続くヌクレオチド5614ないし5628。BsmBI部位は、ヌクレオチド5138ないし5143、すなわちGAGACGに及ぶ。切断は、上部DNA鎖のヌクレオチド5132と5133の間、及び下部DNA鎖の5136と5137の間で生じる。示されるように、消化によって4bpの付着末端が作製される。BsmBI部位は下線を付されている。第二BsmBI部位は、ヌクレオチド5607ないし5612、すなわちCGTCTCに存在する。切断は、上部鎖のヌクレオチド5613と5614の間、及び下部鎖の5617と5618の間に生じる。BsmBI部位の間に存在するのは、赤痢菌bleタンパク質を構成的に発現する必須で無いゼオシン耐性カセットである。bleタンパク質配列、すなわちは、図12AないしCにおいてヌクレオチド5217から5588まで及ぶことが示されている。実施例15及び16における、ペプチドをコードする二本鎖は、ベクターによって表されるものと相補的な付着末端を有する。実施例52及び53において使用されるクローニングベクターpAMG21ampR-Pep-Fcに関する記載。図12EないしFは、ペプチドの最初の2つのコドンがmet-glyであるべきFc遺伝子の、N末端へのペプチド融合のクローニングを可能にするために、基本ベクターpAMG21ampRへ付加された二本鎖DNA配列を示す。前記DNAは、pAMG21ampRベクター中の独特なNdel部位とBamHI部位との間に導入されている。Fcに対するコード領域は、ヌクレオチド5632から6312まで及び、タンパク質配列はDNA配列の下に表されている。この後、フレーム中にglyX5リンカーが続くヌクレオチド5617ないし5631。BsmBI部位は、ヌクレオチド5141ないし5146、すなわちGAGACGに及ぶ。切断は、上部DNA鎖のヌクレオチド5135と5136の間、及び下部DNA鎖の5139と5140の間で生じる。示されるように、消化によって4bpの付着末端が作製される。BsmBI部位には下線が付されている。第二のBsmBI部位は、ヌクレオチド5607ないし5612、すなわちCGTCTCに存在する。切断は、上部鎖のヌクレオチド5613と5614との間、及び下部鎖の5617と5618との間に生じる。BsmBI部位の間に存在するのは、赤痢菌bleタンパク質を構成的に発現する必須でないゼオシン耐性カセットである。bleは、上述のように、ヌクレオチド5220から5591まで及ぶことが示されている。本明細書で以下の実施例52及び53におけるペプチドコード化二本鎖は、ベクターによって表されるものと相補的な付着末端を有する。全てが細菌発現用である実施例3ないし30において、クローニングされたペプチド配列は全て、適切なベクター中に直接連結されたDNA二本鎖を作製するための、オリゴヌクレオチドのアニーリングから得られる。実施例20については、2つのオリゴで十分であり、全ての他の実施例には4つが必要である。二本鎖がFcのN末端において挿入されるべき場合本明細書の実施例15、16、52及び53参照には、デザインは次のとおりであり、順序を示す数は、各実施例におけるオリゴのリストと一致する。残りの全ての実施例は、FcのC末端において二本鎖が挿入され、次のデザインを利用する。何れのオリゴのリン酸化にも、キナーゼ化kinasing工程は必要ではない。二本鎖が首尾よく挿入されると、必須でない抗生物質耐性カセットpAMG21ampR-Pep-Fcについてはゼオシン耐性、pAMG21ampR-Fc-Pepについてはクロラムフェニコール耐性が置換される。得られた表現型の変化は、組換えクローンを非組換えクローンと識別するのに有用である。以下の記載は、本明細書で具体化されている、細菌によって発現された30個の組換えタンパク質全てのクローニングを実施するための一様な方法を与える。オリゴヌクレオチド及びベクターのセットのみが変動する。これらの仕様は、以下の各実施例に記載されている。各実施例に列挙されているオリゴヌクレオチドのアニーリングによって、所定のペプチドに対するコード領域を含有するオリゴヌクレオチド二本鎖を形成した。制限酵素BsmBIで予め消化された適切なベクター0.3μgとともに1×連結緩衝液を含有する10μLの最終容積中に、各オリゴ10pmolを混合した。混合物を80°Cまで加熱し、0.1°C/秒で室温まで冷却させた。これに、1×連結緩衝液10μL及びT4DNAリガーゼ400単位を添加した。試料を14°Cで20分間温置した。65°Cで10分間加熱することによって、リガーゼを失活させた。次に、制限酵素BsmBIを10単位添加した後、再形成された全ての親ベクター分子も開裂させるために、55°Cで1時間温置した。化学的に形質転換受容性のあるE.コリE.coli細胞50μLを添加し、2°Cで20分間保持した後、42°Cで5秒間熱ショックを付与した。200μg/mLのカルベニシリンを補充したルリアアガープレートへ、全容積を拡散させた。置換可能な抗生物質耐性マーカーに対する耐性の損失に関して、コロニーを検査した。二本鎖インサートの予想されたサイズを確認するため、標準的なPCR検査を使用し得る。プラスミド調製物を得、組換えインサートをDNA配列決定によって確認した。配列の確認されたコンストラクトの0.5L培養物をTerrificBroth中で増殖させ、50ng/mLのN-3-オキソ-ヘキサノイル-ホモセリンラクトンの添加によって、ペプチボディの発現を誘導し、37°Cで4ないし6時間振とうした後、細胞を遠心分離し、細胞ペーストを-20°Cで保存した。以下では、各実施例について、クローニングベクター及び各融合タンパク質を構築するために使用されるオリゴヌクレオチドのセットを記載する。DNA/タンパク質地図も示されている。Kv1.3のFc-L-ShK[1-35]阻害剤の細菌での発現細菌中で、ペプチボディをクローニング及び発現させるための方法は上述されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-ShK[1-35]の細菌中でのクローニング及び発現のために二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴ:ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。細菌で発現されたFc-L10-ShK1-35の精製は、本明細書の以下の実施例38でさらに記載されている。Fc-L-ShK[2-35]の細菌での発現Fc-L-ShK[2-35]の細菌での発現細菌中で、ペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-ShK[2-35]の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。細菌で発現するFc-L10-ShK2-35の精製は、本明細書の以下の実施例39に、さらに記載されている。Fc-L-HmKの細菌での発現Fc-L-HmKの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-HmKの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-KTX1の細菌での発現Fc-L-KTX1の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-KTX1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。細菌中で発現されたFc-L-KTX1の精製及び再折りたたみ凍結したE.コリペースト28gを室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH8.0の21mLと組み合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置microfluidizerへ12,000PSIで2回通過させた。次に、細胞可溶化液を4°C、22,000gで20分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを200mLの1デオキシコール酸中に再懸濁した後、4°C、22,000gで20分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを200mLの水中に再懸濁した後、4°C、22,000gで20分間遠心分離した。次に、ペレット4.8gを48mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に溶解した。次に、30μLの1Mジチオスレイトールを前記溶液3mLへ添加し、37°Cで30分間温置することによって、溶解したペレットを還元した。次に、還元したペレット溶液を室温、14,000gで5分間遠心分離した後、上清2.5mLを、再折りたたみ緩衝液2M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、5mMEDTA、1mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH8.5250mLへ、4°Cで激しく撹拌しながら転移させた。次に、撹拌速度を低下させ、4°Cで2日間、温置を継続した。次に、0.22μm酢酸セルロースフィルターで再折りたたみ溶液をろ過し、4°Cで3日間保存した。次に、保存した再折りたたみ液を水1Lで希釈し、1MH3PO4を使用して、pHを7.5へ調整した。次に、7°C、10mL/分でS-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.3中の10mLのAmershamHiTrapカラムへと、pH調整した材料を負荷した。次に、カラムをS-緩衝液Aの数カラム容積で洗浄した後、0から60までのS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.3の直線勾配で溶出した後、7°C、5mL/分で100S-緩衝液Bへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした45mL。次に、7°C、2mL/分でPBS中の1mLのAmershamrProteinAHiTrapカラムへと前記プールを負荷した。次に、カラムをPBSの数カラム容積で洗浄し、100mMグリシン、pH3.0で溶出した。溶出ピーク2.5mLへ、62.5μLの2Mトリス塩基を添加した後、pH調整した材料を室温、2mL/分で、0.22μm、25mmのMustangEメンブレンを有するPallLifeSciencesAcrodiscでろ過した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈した組み合わせたプール20μLに対して、スペクトル走査を実施した図28C。30,504g/molの算出された分子量及び35,410M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が2.49mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した図28A。次に、CharlesRiversエンドトキシン特異的緩衝液BG120中に試料を50倍希釈したものを使用して、CharlesRiverLaboratoriesEndosafe-PTSシステム0.05ないし5EU/mL感度を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、1EU/タンパク質mg未満であった。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9中のPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへと1mL/分で注入された生成物45μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図28B。次に、試料1μLをシナピン酸10μL0.05トリフルオロ酢酸、50アセトニトリル中10mg/mLへと希釈することによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液1μLをMALDI試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyagerDE-RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した337nm、3ナノ秒パルス。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し図28D、本実験は、精製されたペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。次に、生成物を-80°Cで保存した。精製したFc-L-KTX1は、電気生理学的手法によって、用量依存的様式でヒトKv1.3電流を遮断した方法を実施例36に記載した。。Fc-L-HsTx1の細菌での発現Fc-L-HsT1の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-HsTx1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-MgTxの細菌での発現Fc-L-MgTxの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-MgTxの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-AgTx2の細菌での発現Fc-L-AgTx2の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-AgTx2の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。以下に示されている二本鎖を形成するために、上記オリゴを使用した。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。細菌中で発現したFc-L-AgTx2の再折りたたみ及び精製冷凍したE.コリペースト15gを、室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH8.0の120mLと合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、12,000PSIで2回通過させた。次に、4°C、22,000gで20分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、1デオキシコール酸200mL中にペレットを再懸濁した後、4°C、22,000gで20分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、200mLの水中にペレットを再懸濁した後、4°C、22,000gで20分間遠心分離した。次に、ペレット4.6gを46mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に溶解した。次に、30μLの1Mジチオスレイトールを前記溶液3mLへ添加し、37°Cで30分間温置することによって、溶解したペレットを還元した。次に、還元されたペレット溶液を、室温、14,000gで5分間遠心分離した後、上清2.5mLを、再折りたたみ緩衝液2M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、5mMEDTA、1mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH9.5250mLへ、4°Cで激しく撹拌しながら転移させた。次に、撹拌速度を低下させ、温置を4°Cで2日間続行した。次に、再折りたたみ溶液を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、-70°Cで保存した。次に、保存した再折りたたみ液を水1Lで希釈し、1MH3PO4を使用して、pHを7.5へ調整した。次に、pH調整した材料を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、7°C、10mL/分でで、S-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.3中の10mLのAmershamSP-HPHiTrapカラムへと負荷した。次に、カラムをS-緩衝液Aの数カラム容積で洗浄した後、0から60までのS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.3の直線勾配で溶出した後、7°C、5mL/分で100S-緩衝液Bへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした15mL。次に、7°C、2mL/分でPBS中の1mLのAmershamrProteinAHiTrapカラムへ前記プールを負荷した。次に、カラムを20mMNaH2PO4、pH6.5、1MNaClの数カラム容積で洗浄し、100mMグリシン、pH3.0で溶出した。溶出ピーク1.5mLへ、1MトリスHCl、pH8.5を添加した後、pH調整した材料を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈した組み合わせたプール20μLに対して、スペクトル走査を実施した図29C。30,446g/molの算出された分子量及び35,410M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が1.65mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した図29A。次に、CharlesRiversエンドトキシン特異的緩衝液BG120中に試料を33倍希釈したものを使用して、CharlesRiverLaboratoriesEndosafe-PTSシステム0.05ないし5EU/mL感度を使用して、エンドトキシンレベルを測定した。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9中のPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへと1mL/分で注入された生成物20μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図29D。次に、試料1μLをシナピン酸10μL中に希釈する0.05トリフルオロ酢酸、50アセトニトリル中10mg/mLことによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液1μLをMALDI試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyagerDE-RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した337nm、3ナノ秒パルス。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し図29E、本実験は、精製されたペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。その後、生成物を-80°Cで保存した。Fc-L-OSK1の細菌での発現Fc-L-OSK1の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-OSK1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、これより後の使用のためにペーストを冷凍保存した。E.コリペーストからのFc-L10-OSK1の精製を、以下の本明細書の実施例40に記載する。Fc-L-OSK1E16K,K20Dの細菌での発現Fc-L-OSK1E16K,K20Dの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-OSK1E16K,K20Dの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、これより後の使用のためにペーストを冷凍保存した。Fc-L-アニュロクトキシンAnuroctoxinの細菌での発現Fc-L-アニュロクトキシンの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-アニュロクトキシンの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-ノキシウストキシンNoxiustoxinの細菌での発現Fc-L-ノキシウストキシン又はFc-L-NTXの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記述される。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-NTXの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-Pi2の細菌での発現Fc-L-Pi2の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-Pi2の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。ShK[1-35]-L-Fcの細菌での発現ShK[1-35]-L-Fcの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Pep-Fcであり、ShK[1-35]-L-Fcの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。met-ShK[1-35]-Fcの精製は、以下の本明細書の実施例51に記載されるとおりであった。ShK[2-35]-L-Fcの細菌での発現ShK[2-35]-L-Fcの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Pep-Fcであり、ShK[2-35]-L-Fcの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。ShK[2-35]-Fcの精製は、以下の本明細書の実施例50に記載されるとおりであった。Fc-L-ChTxの細菌での発現Fc-L-ChTxの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-ChTxの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-MTXの細菌での発現Fc-L-MTXの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させるための方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターはpAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-MTXの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-ChTxK32Eの細菌での発現Fc-L-ChTxK32Eの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-ChTxK32Eの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-アパミンApaminの細菌での発現Fc-L-アパミンの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-アパミンの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-スキラトキシンScyllatoxinの細菌での発現Fc-L-スキラトキシン又はFc-L-ScyTxの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現する方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-ScyTxの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-IbTxの細菌での発現Fc-L-IbTXの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-IbTxの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-HaTx1の細菌での発現Fc-L-HaTx1の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-HaTx1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。細菌中で発現したFc-L-HaTx1の再折りたたみ及び精製凍結したE.コリペースト13gを、室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH8.0の100mLと合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、12,000PSIで2回通過させた。次に、4°C、22,000gで20分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、200mLの1デオキシコール酸中にペレットを再懸濁した後、4°C、22,000gで20分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを200mLの水中に再懸濁した後、4°C、22,000gで20分間遠心分離した。次に、ペレット2.6gを26mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に溶解した。次に、30μLの1Mジチオスレイトールを前記溶液3mLへ添加し、37°Cで30分間温置することによって、溶解したペレットを還元した。次に、還元されたペレット溶液を室温、14,000gで5分間遠心分離した後、上清2.5mLを、再折りたたみ緩衝液2M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、5mMEDTA、1mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH8.5250mLへ、4°Cで激しく撹拌しながら転移させた。次に、撹拌速度を低下させ、温置を4°Cで2日間続行した。次に、再折りたたみ溶液を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、-70°Cで保存した。次に、保存した再折りたたみ液を解凍した後、水1Lで希釈し、1MH3PO4を使用して、pHを7.5へ調整した。次に、7°C、10mL/分でS-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.3中の10mLのAmershamSP-HPHiTrapカラムへと、pH調整した材料を負荷した。次に、カラムをS-緩衝液Aの数カラム容積で洗浄した後、0から60までのS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.3の直線勾配で溶出した後、7°C、5mL/分で100S-緩衝液Bへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした15mL。次に、7°C、2mL/分でPBS中の1mLのAmershamrProteinAHiTrapカラムへと前記プールを負荷した。次に、カラムを20mMのNaH2PO4、pH6.5、1MNaClの数カラム容積で洗浄し、100mMグリシン、pH3.0で溶出した。溶出ピーク1.4mLへ、1MトリスHCl、pH8.5の70μLを添加した後、pH調整した材料を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈した組み合わせたプール20μLに対して、スペクトル走査を実施した図29F。30,469g/molの算出された分子量及び43,890M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が1.44mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した図29B。次に、CharlesRiversエンドトキシン特異的緩衝液BG120中に試料を33倍希釈したものを使用して、CharlesRiverLaboratoriesEndosafe-PTSシステム0.05ないし5EU/mL感度を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、4EU/タンパク質mg未満であった。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9中のPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへと1mL/分で注入された生成物20μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図29G。次に、試料1μLをシナピン酸10μL中に希釈する0.05トリフルオロ酢酸、50アセトニトリル中10mg/mLことによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液1μLをMALDI試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyagerDE-RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した337nm、3ナノ秒パルス。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し図29H、本実験は、精製されたペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。次に、生成物を-80°Cで保存した。Fc-L-PaTx2の細菌での発現Fc-L-PaTx2の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-PaTx2の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-wGVIAの細菌での発現Fc-L-wGVIAの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-wGVIAの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-ωMVIIAの細菌での発現Fc-L-ωMVIIAの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-ωMVIIAの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-Ptulの細菌での発現Fc-L-Ptu1の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-Ptu1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-ProTx1の細菌での発現Fc-L-ProTx1の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-ProTx1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-BeKM1の細菌での発現Fc-L-BeKM1の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-BeKM1の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Fc-L-CTXの細菌での発現Fc-L-CTXの細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されている。使用されるベクターは、pAMG21ampR-Fc-Pepであり、Fc-L-CTXの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。N末端がPEG化されたDes-Arg1-ShK還元型Des-Arg1-ShKのペプチド合成Tentagel商標-SPHBFmoc-CysTrt樹脂上にて、0.1mmol当量の樹脂スケールで、ヘキサフルオロリン酸2-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムHBTU/N-メチルモルフォリンNMM/N,N-ジメチル-ホルムアミドDMFカップリング化学反応を使用する固相ペプチド合成SPPSによって、Symphony商標多重ペプチド合成装置上で、段階的な様式で、配列SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTCペプチド1、配列番号92を有するDes-Arg1-ShKを合成した。N-アルファ-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-及び側鎖保護されたアミノ酸は、MidwestBiotechIncorporatedから購入した。Fmoc-CysTrt-Tentagel商標樹脂は、Flukaから購入した。以下の側鎖保護戦略、すなわち、AspOtBu、ArgPbf、CysTrt、GlnTrt、HisTrt、LysNε-Boc、SerOtBu、ThrOtBu及びTyrOtBuを使用した。2つのオキサゾリジンジペプチド、すなわちFmoc-Gly-ThrΨMe,MePro-OH及びFmoc-Leu-SerΨMe,MePro-OHを鎖重合に使用し、NovaBiochemから入手し、配列の合成に使用した。保護されたアミノ酸誘導体20mmolをDMF中の20v/vジメチルスルホキシドDMSO100mL中に溶解した。DMF中の20DMSO中の20mMHBTU、400mMNMMで、保護されたアミノ酸を活性化し、20DMF/DMSO中の0.5mmolの保護されたアミノ酸、0.5mmolのHBTU、1mmolのNMMで、25分間、次いで40分間の2回の処理を使用して、カップリングを実施した。DMF中の20v/vピペリジンの溶液を使用する、10分間、次いで15分間の2回の処理で、Fmoc脱保護反応を実施した。合成の後、次に、樹脂を排水し、DCM、DMF、DCMで洗浄した後、真空で乾燥した。TFA/EDT/TIS/H2O92.5:2.5:2.5:2.5v/v溶液で、室温で1時間処理することによって、ペプチド-樹脂を脱保護し、樹脂から放出した。次に、揮発性物質を窒素ガス流で除去し、粗ペプチドを冷ジエチルエーテルで2回沈殿させ、遠心分離により回収した。次に、Jupiter4μmProteo商標90Åカラム上での直線勾配0ないし60緩衝液B、12分、A:水中の0.1TFA、B:アセトニトリル中の0.1TFAを使用するWaters2795分析用RP-HPLCシステムで、粗ペプチドを分析した。正確なペプチド生成量を確認するために、PE-Sciex商標API電気スプレー質量分析計を使用した。分析用RP-HPLC分析によって概算されるもの基づいて約70純度で、粗ペプチドを143mg収量で入手した。還元型Des-Arg1-ShKペプチド1の保持時間室温=5.31分、算出された分子量=3904.6917Da平均、実験的に観察された分子量3907.0Daであった。Des-Arg1-ShKの折りたたみジスルフィド結合形成TFA開裂及びペプチド沈殿の後、ペプチドを折りたたむため、還元型Des-Arg1-ShKを、空気で酸化した。水中の20AcOHv/vを使用して、開裂した粗ペプチドを抽出した後、約0.15mg/mLの還元型Des-Arg1-ShKの濃度まで水で希釈し、NH4OH28ないし30を使用してpHを約8.0に調整し、室温で36時間静かに撹拌した。LC-MS分析により、折りたたみ工程をモニターした。この後、0ないし40の直線勾配の緩衝液Bで120分間A=水中0.1TFA、B=アセトニトリル中0.1TFA1Luna5μmC18100ÅProteo商標カラムを使用する逆相HPLCを使用して、折りたたまれたDes-Arg1-ShKペプチドを精製した。折りたたまれた粗Des-Arg1-ShKペプチドを、約25の緩衝液Bでその還元型における溶出時間と比較して早期に溶出した。分析用RP-HPLC分析によって概算されるように、97超の純度で、折りたたまれたDes-Arg1-ShKペプチド2を23.2mgの収量で入手した図20。算出された分子量=3895.7693モノアイソトピック、実験的に観察された分子量=3896.5DaWatersLCTPremierMicromassMSTechnologiesで分析であった。Des-Arg1-ShKジスルフィドの結合性は、C1-C6、C2-C4、C3-C5であった。折りたたまれたDes-Arg1-ShKのN末端PEG化折りたたまれたDes-Arg1-ShKペプチド2を、1mg/mLの濃度で水中に溶解した。50mMNaOAc、pH4.5中の2MMeO-PEG-アルデヒド、CH3O-[CH2CH2O]n-CH2CH2CHO平均分子量20kDa溶液、及び別途のNaCNBH3の1M溶液を新たに調製した。次に、ペプチド溶液をMeO-PEG-アルデヒド含有溶液へ添加した後、NaCNBH3溶液を添加した。反応化学量論はそれぞれ、ペプチド:PEG:NaCNBH31:2:0.02であった。反応を48時間放置し、直線勾配16分中6ないし60B、A:水中0.1TFA、B:水中0.1TFA/90ACNで、40°CでZorbax商標300SB-C85μmカラムを使用するAgilent1100RP-HPLCシステムで分析した。モノPEG化された、折りたたまれたDes-Arg1-ShKは、分析用RP-HPLCによって粗生成物の約58を構成した。次に、25カラム容積中の0ないし50Bの勾配を使用して、4°C、1mL/分でAKTAFPLCシステムにおいてHiTrap商標5mLSPHP陽イオン交換カラムを使用して、モノPEG化されたDes-Arg1-ShKを単離した緩衝液:A=20mM酢酸ナトリウム、pH4.0、B=1MNaCl、20mM酢酸ナトリウム、pH4.0。粗生成物に関して記載されるとおり4ないし20のトリス-GlySDS-PAGEゲル及びRP-HPLCを使用して、画分を分析した。SDS-PAGEゲルを125V、35mA、5Wで1.5時間使用した。次に、プールした生成物を4°Cで、A4S緩衝液10mMNaOAc、5ソルビトール、pH4.01Lの3回の交換で透析した。次に、透析した生成物を10Kの微量遠心フィルター中で2mL容積まで濃縮し、最終生成物を付与するため、0.2μMシリンジフィルターを使用してろ過滅菌した。N末端がPEG化されたDes-Atg1-ShKペプチド3を、分析用RP-HPLC分析によって85純度と概算された1.7mg収量で単離した図23。PEG-ShK[2-35]とも呼ばれるN末端がPEG化されたDes-Arg1-ShKは、パッチクランプ電気生理学的実験によって測定されるように図36、ヒトKv1.3を遮断する上で活性があった図38A及び図38B。N末端がPEG化されたShk作働する本実施例の実験的手法は、図17に示される結果に対応する。還元型ShKのペプチド合成Tentagel商標-SPHBFmoc-CysTrt樹脂上、0.1mmol当量の樹脂規模で、ヘキサフルオロリン酸2-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-1,1,3-3-テトラメチルウロニウムHBTU/N-メチルモルフォリンNMM/N,N-ジメチル-ホルムアミドDMFカップリング化学反応を使用する固相ペプチド合成SPPFによるSymphony商標多重ペプチド合成装置での段階的な方法で、アミノ酸配列RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTCペプチド4、配列番号5を有するShKを合成した。N-アルファ-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル及び側鎖保護されたアミノ酸は、MidwestBiotechIncorporatedから購入した。Fmoc-CysTrt-Tentagel商標樹脂は、Flukaから購入した。以下の側鎖保護戦略を採用した。すなわち、AspOtBu、ArgPbf、CysTrt、GlnTrt、HisTrt、LysNε-Boc、SerOtBu、ThrOtBu及びTyrOtBuであった。2つのオキサゾリジンジペプチドであるFmoc-Gly-ThrΨMe,MePro-OH及びFmoc-Leu-SerΨMe,MePro-OHを鎖重合に使用し、NovaBiochemから得、配列の合成に使用した。保護されたアミノ酸誘導体20mmolをDMF中の20v/vジメチルスルホキシドDMSO100mL中に溶解した。保護されたアミノ酸をDMF中の20DMSO中の200mMHBTU、400mMNMMで活性化し、20DMF/DMSO中の0.5mmolの保護されたアミノ酸、0.5mmolのHBTU、1mmolのNMMで25分間、次いで40分間の2回の処理を使用して、カップリングを実施した。DMF中の20v/vピペリジンの溶液を10分間、次いで15分間使用する2回の処理で、Fmoc脱保護反応を実施した。合成の後、次に、樹脂を排水し、DCM、DMF、DCMで洗浄した後、真空で乾燥した。室温で1時間TFA/EDT/TIS/H2O92.5:2.5:2.5:2.5v/v溶液による処理によって、ペプチド-樹脂を脱保護し、樹脂から放出した。次に、揮発性物質を窒素ガス流で除去し、粗ペプチドを冷ジエチルエーテルで2回沈殿させ、遠心分離により回収した。次に、Jupiter4μmProteo商標90Åカラム上での直線勾配0ないし60緩衝液B、12分、A:水中の0.1TFA、B:アセトニトリル中の0.1TFAを使用するWaters2795分析用RP-HPLCシステムで、粗ペプチドを分析した。正確なペプチド生成量を確認するため、PE-SciexAPI電気スプレー質量分析計を使用した。分析用RP-HPLC分析によって約45純度と概算される約170mgの収量の粗ペプチドを入手した。還元型Des-Arg4-ShKペプチド1の保持時間室温=5.054分、算出された分子量=4060.8793Da平均、実験的に観察された分子量4063.0Daであった。ShKの折りたたみジスルフィド結合形成TFA開裂及びペプチド沈殿の後、ペプチドを折りたたむため、還元型ShKを空気で酸化した。水中の20AcOHv/vを使用して、開裂した粗ペプチドを抽出した後、約0.15mg/mLの還元型ShKの濃度まで水で希釈し、NH4OH28ないし30を使用してpHを約8.0に調整し、室温で36時間静かに撹拌した。LC-MS分析により、折りたたみ工程をモニターした。この後、0ないし40の直線勾配の緩衝液Bで120分間A=水中0.1TFA、B=アセトニトリル中0.1TFA1Luna5μmC18100ÅProteo商標カラムを使用する逆相HPLCによって、折りたたまれたShKペプチドを精製した。折りたたまれた粗ShKペプチドを、約25の緩衝液Bでその還元型における溶出時間と比較して早期に溶出した。分析用RP-HPLC分析によって概算されるように、97超の純度で、折りたたまれたShKペプチド5を25.5mgの収量で入手した。図60を参照されたい。算出された分子量=4051.8764Daモノアイソトピック、実験的に観察される分子量=4052.5DaWatersLCTPremierMicromassMSTechnologiesで分析であった。ShKジスルフィドの結合性は、C1-C6、C2-C4、C3-C5であった。は、水中に1mg/mL濃度で溶解させることができる。50mMNaOAc、pH4.5中の2MMeO-PEG-アルデヒド、CH3O-[CH2CH2O]n-CH2CH2CHO平均分子量20kDa溶液、及びNaCNBH3の別個の1M溶液は、新たに調製できる。次に、ペプチド溶液をMeO-PEG-アルデヒド含有溶液へ添加した後、NaCNBH3溶液を添加できる。反応化学量論はそれぞれ、ペプチド:PEG:NaCNBH31:2:0.02であり得る。反応を48時間放置し、直線勾配16分中6ないし60B、A:水中0.1TFA、B:水中0.1TFA/90ACNで、40°CでZorbax商標300SB-C85μmカラムを使用するAgilent商標1100RP-HPLCシステムで分析できる。次に、25カラム容積中の0ないし50Bの勾配を使用して、4°C、1mL/分でAKTAFPLCシステムにおいて、HiTrap商標5mLSPHP陽イオン交換カラムを使用して、モノPEG化されたShkを単離できる緩衝液:A=20mM酢酸ナトリウム、pH4.0、B=1MNaCl、20mM酢酸ナトリウム、pH4.0。4ないし20のトリス-GlySDS-PAGEゲル及びRP-HPLCを使用して、画分を分析できる。SDS-PAGEゲルを125V、35mA、5Wで1.5時間使用できる。次に、プールした生成物を4°Cで、A4S緩衝液10mM酢酸ナトリウム、5ソルビトール、pH4.01Lの3回の交換で透析できる。次に、透析した生成物を10Kの微量遠心フィルター中で2mL容積まで濃縮し、最終生成物を付与するため、0.2μMシリンジフィルターを使用してろ過滅菌できる。オキシム形成によってN末端がPEG化されたShK還元型ShKのペプチド合成配列を有するShKは、Tentagel商標-SPHBFmoc-CysTrt樹脂上、0.1mmol当量の樹脂規模で、ヘキサフルオロリン酸2-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムHBTU/N-メチルモルフォリンNMM/N,N-ジメチル-ホルムアミドDMFを使用する固相ペプチド合成SPPSによって、Symphony商標多重ペプチド合成装置で段階的な様式で合成できる。N-アルファ-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-及び側鎖保護されたアミノ酸は、MidwestBiotechIncorporatedから購入できる。Fmoc-CysTrt-Tentagel商標樹脂は、Flukaから購入できる。以下の側鎖保護戦略が採用できる。すなわち、AspOtBu、ArgPbf、CysTrt、GlnTrt、HisTrt、LysNε-Boc、SerOtBu、ThrOtBu及びTyrOtBuであった。2つのオキサゾリジンジペプチド、すなわちFmoc-Gly-ThrΨMe,MePro-OH及びFmoc-Leu-SerΨMe,MePro-OHは、鎖重合に使用でき、NovaBiochemから入手でき、配列の合成に使用できる。保護されたアミノ酸誘導体20mmolは、DMF中の20v/vジメチルスルホキシドDMSO100mL中に溶解できる。保護されたアミノ酸は、DMF中の20DMSO中の200mMHBTU、400mMNMMで活性化でき、20DMF/DMSO中の0.5mmolの保護されたアミノ酸、0.5mmolのHBTU、1mmolのNMMで25分間、次いで40分間の2回の処理を使用して、カップリングを実施できる。DMF溶液中の20v/vピペリジンを10分間、次いで15分間使用する2回の処理で、Fmoc脱保護反応を実施できる。Shkペプチドの鎖重合の後、DMF中の0.5MHBTUを4当量のコリジンとともに5分間使用して、Boc-アミノオキシ酢酸1.2当量をN末端にカップリングできる。合成の後、次に、樹脂を排水し、DCM、DMF、DCMで洗浄した後、真空で乾燥できる。室温で1時間、TFA/アミノオキシ酢酸/TIS/EDT/H2O90:2.5:2.5:2.5:2.5溶液での処理によって、ペプチド-樹脂を脱保護でき、樹脂から放出できる。次に、揮発性物質を窒素ガス流で除去し、粗ペプチドを冷ジエチルエーテルで2回沈殿し、遠心分離により回収できる。次に、Jupiter4μmProteo商標90Åカラム上での直線勾配12分で0ないし60緩衝液B、A:0.1アミノオキシ酢酸も含有する水中の0.1TFA、B:アセトニトリル中の0.1TFAを使用するWaters2795分析用RP-HPLCシステムで、アミノオキシ-Shkペプチドペプチド7を分析できる。逆相HPLC精製調製用逆相高速液体クロマトグラフィーを、C185μm、2.2cm×25cmカラムで実施できる。クロマトグラフィー分離は、15mL/分で90分にわたって、典型的には5ないし95のA中の緩衝液の直線勾配A=0.1TFA水溶液、B=0.09TFA及び0.1アミノオキシ酢酸を含有する90ACN水溶液を使用して達成できる。調製用HPLC画分は、ESMS及び光ダイオードアレイPDAHPLCによって性質決定でき、合わせて、凍結乾燥できる。オキシム形成によるShkのN末端のPEG化凍結乾燥したアミノオキシShkペプチド7は、50HPLC緩衝液A/B5mg/mL中に溶解でき、MeO-PEG-アルデヒド、CH3O-[CH2CH2O]n-CH2CH2CHO平均分子量20kDaの2倍モル過剰量へ添加できる。反応を24時間放置でき、直線勾配16分中6ないし60B、A:水中0.1TFA、B:水中0.1TFA/90ACNで、40°CでZorbax商標300SB-C85μmカラムを使用するAgilent商標1100RP-HPLCシステムで分析できる。モノPEG化された還元型ShKは、分析用RP-HPLCによって粗生成物の約58を占めた。次に、25カラム容積中の0ないし50Bの勾配を使用して、4°C、1mL/分でAKTAFPLCシステムにおいてHiTrap商標5mLSPHP陽イオン交換カラムを使用して、モノPEG化されたShKを単離できる緩衝液:A=20mM酢酸ナトリウム、pH4.0、B=1MNaCl、20mM酢酸ナトリウム、pH4.0。4ないし20のトリス-GlySDS-PAGEゲル及びRP-HPLCを使用して、画分を分析できる。SDS-PAGEゲルを、125V、35mA、5Wで1.5時間使用できる。次に、プールした生成物を4°Cで、A4S緩衝液10mMNaOAc、5ソルビトール、pH4.01Lの3回の交換で透析できる。次に、透析した生成物を、10Kの微量遠心フィルター中で2mL容積まで濃縮でき、最終生成物を付与するため、0.2μMシリンジフィルターを使用してろ過滅菌できる。ShKの折りたたみジスルフィド結合形成モノPEG化されたオキシム化されたShKは、水中の20AcOHv/v中に溶解でき、次に約0.15mgペプチドmLの濃度まで水で希釈し、NH4OH28ないし30を使用してpHを約8.0に調整し、室温で36時間静かに撹拌することができる。LC-MS分析により、折りたたみ工程をモニターすることができる。この後、0ないし40の直線勾配の緩衝液Bで120分間A=水中0.1TFA、B=アセトニトリル中0.1TFA1Luna5μmC18100ÅProteo商標カラムを使用する逆相HPLCを使用することによって、折りたたまれたモノPEG化されたオキシム化されたShKペプチド9を精製できる。モノPEG化されたオキシム化されたShKジスルフィドの結合性は、C1-C6、C2-C4、及びC3-C5であり得る。N末端がPEG化されたShKアミド化本実施例の実験的手法は、図18に示される結果に対応する。アミド形成によるShkのN末端のPEG化Shkに対するmPEG-SPA1.5モル濃度過剰量を使用して、室温で20kDaPEGプロピオン酸mPEG-SPA;CH3O-[CH2CH2O]n-CH2CH2CO-NHSの固体サクシニミジルエステルへ、100mMビシン、pH8.0中の折りたたまれたShKぺプチド5の10mg/mL溶液を添加できる。静かに撹拌した1時間後、混合物を水で2mg/mLへ希釈でき、pHを希HClで4.0へ調整できる。1mL/分で0.05MNaH2PO4、0.05MNa2HPO4、0.15MNaCl、0.01MNaN3、pH6.8で溶出したSuperdex商標75HR10/30カラムAmershamを使用するSECHPLCによって、モノPEG化されたShkペプチド10、幾つかのジPEG化されたShk又はトリPEG化されたShk、修飾されていないShk及びサクシニミジルエステル加水分解の程度を測定できる。4ないし20のトリス-GlySDS-PAGEゲル及びRP-HPLCを使用して、画分を分析できる。SDS-PAGEゲルを125V、35mA、5Wで1.5時間使用できる。次に、4°Cで、A4S緩衝液10mMNaOAc、5ソルビトール、pH4.01Lの3回の交換で、プールした生成物を透析できる。次に、透析したN末端PEG化アミド化ShKペプチド10を、10Kの微量遠心フィルター中で2mL容積まで濃縮でき、最終生成物を付与するため、0.2μMシリンジフィルターを使用してろ過滅菌できる。Fc-L-SmIIIAFc-SmIIIA発現ベクター部分的リンカー配列及びヒト高頻度コドンでコードされるSmIIIAペプチドを含有する104bpのBamHI-NotI断片を、重複プライマー3654-50及び3654-51を使用するPCRによって重合し、実施例1に記載されているpcDNA3.1CMVi-hFc-SmIIIAを作製するために、7.1kbのNotI-BamHI主鎖中にクローニングした。最終コンストラクト中のBamHIからNotIへの断片の配列を、配列決定により確認した。Fc-L-Smlllaの一過性発現毒素ペプチドFc融合コンストラクトpcDNA3.1CMVi-hFc-SmIIIA7.5μgを、形質移入剤FuGENE6を有する10cm組織培養プレート中の293-T細胞に形質移入した。形質移入から24時間後、培地を無血清培地と交換し、形質移入の5日目に培養上清を回収した。抗hFc抗体で標識したウェスタンブロットによって、293-T細胞からのFc-SmIIIAの一過性発現を分析した図25A及び図25B。概算された分子量を有する発現されたタンパク質の単一バンドが、還元型及び非還元型試料の両者において示された。さらに、Fc-SmIIIAの一過性発現レベルが、ELISAによると、73.4μg/mLであることを決定した。電気生理学実験細胞培養ヒトKv1.3チャネルを発現する安定な細胞系が、Biofocusから使用許諾された。5CO2環境中、37°Cで、細胞を維持した。培地は、GlutaMax商標Invitrogen、1×非必須アミノ酸、10ウシ胎仔血清及び500μg/mLジェネテシンを有するDMEMを含有する。電気生理学実験の少なくとも24時間前に、細胞を播種し、35mm培養皿上で低集密度で増殖させた。パッチクランプによる電気生理学記録パッチクランプ技術の密封配置を使用することによって、全細胞電流を単一細胞から記録した。135mMNaCl、5mMKCl、1.8mMCaCl2、10mMHEPES及び5mMグルコースを含有する記録緩衝液を有する培地ですすぎ、交換した後、35mm培養皿を記録ステージへと移した。NaOHで、pHを7.4になるように調整し、モル浸透圧濃度を300mOsmに設定した。平行に配置され、電動ロッド電動ロッドは、記録されている細胞の上に、ガラス毛細管を直接配置する。に装着されたガラス毛細管の1つを介して、細胞に、記録緩衝液を連続的に灌流した。記録ピペット溶液は、90mMK-グルコン酸塩、20mMKF、10mMNaCl、1mMMgCl2-6H2O、10mMEGTA、5mMK2-ATP及び10mMHEPESを含有した。内部溶液に対するpHを、KOHで7.4に調整し、モル浸透圧濃度を280mOsmに設定した。実験は室温20ないし22°Cで実施し、Multiclamp商標700A増幅装置MolecularDevicesInc.を使用して記録した。ピペットの抵抗は、典型的には、2ないし3MΩであった。Kv1.3電流に関するタンパク質毒素作用強度測定ヒトKv1.3チャネルを安定して発現するHEK293細胞を、-80mV保持電位で電位固定した。-80mVの保持電位から30mVへの200ミリ秒長の脱分極工程を付与することによって、外向きのKv1.3電流を活性化し、3kHzでフィルターにかけた。各脱分極工程は、その後の脱分極工程から10秒間間隔で分離した。類縁体信号をDigidata商標1322AデジタイザーMolecularDevicesによってデジタル化した後、Clampfit商標9MolecularDevicesInc.を使用するオフライン分析のために、コンピュータディスクに保存した。全ての研究において、漸増濃度のタンパク質毒素の灌流を開始する4分間前に、安定したベースラインKv1.3電流振幅を確立した。タンパク質毒素のその後の濃度の灌流を開始する前に、定常状態の遮断を常に達成した。データ解析対照の百分率POCを次式に基づいて算出する。すなわちタンパク質毒素添加後のKv1.3電流/対照におけるKv1.3電流×100である。IC50値を算出するため、タンパク質毒素の少なくとも5つの濃度例えば、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、100nMを使用した。XLfitソフトウェアMicrosoftCorp.の4つのパラメータロジスティック適合を使用して、IC50値及び曲線適合を概算した。IC50値を平均値±s.e.m.平均の標準誤差として表す。薬物の調製タンパク質毒素典型的には10ないし100μMを蒸留水中に溶解し、-80°Cで冷凍保存した。タンパク質毒素原液の連続希釈物を、0.1ウシ血清アルブミンBSAを含有する記録緩衝液中へ混合した後、ガラス灌流貯蔵器へと転移させた。電子挟みバルブは、貯蔵器から記録される細胞へのタンパク質毒素の流量を調節した。免疫生物学及びチャネル結合PBMCのPMA及び抗CD3抗体刺激後のT細胞サイトカイン生成の阻害。正常ヒトドナーLeulophoresisパックから、PBMCを予め単離し、密度勾配遠心FicollHypaqueによって精製し、CPZCryopreservationMediumCompleteINCELL,MCPZF-100プラス最終濃度10DMSO中で冷凍保存さした。PBMCを解凍し95生存率、洗浄し、96ウェル平底組織培養プレート中の10ウシ胎仔血清、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、2mML-グルタミン、100μM非必須アミン酸及び20μM2-MEを補充した培地RPMI培地1640、GIBCO中に、2×105細胞/ウェルで播種した。200μLの最終アッセイ容積中のPMA/抗CD3それぞれ1ng/mL及び50ng/mLで48時間刺激する前の90分間、連続希釈した最終濃度100nMないし0.001nMShK[1-35]、Fc-L10-ShK[1-35]又はfc対照とともに、細胞をあらかじめ温置した。電気化学発光ECLを利用することによってIL-2及びIFNgのタンパク質レベルを測定するため、MesoScaleDiscoveryMSDSECTOR商標Imager6000MesoScaleDiscovery,Gaithersbury,MDを使用して、アッセイ試料の分析を実施した。培養上清50μLをMSD多重スポット96ウェルプレートへ添加した各ウェルは、3つの捕捉抗体すなわちIL-2、TNF,IFNγを含有した。プレートを密封し、スズ箔で包み、プレート振とう器上、室温で2時間温置した。ウェルを200μLのPBSTBIOTEK、Elx405AutoPlateWasherで1回洗浄した。各ウェルに対して、ルテニウム標識した検出抗体抗体希釈緩衝液中の終濃度1μg/mL、IL-1、TNF、IFNγ20μL及び2×MSDReadBuffer130μLを添加し、終容積150μLとした。プレートを密封し、スズ箔で包み、プレート振とう器上、室温で1時間温置した。次に、プレートをSECTOR商標Imager6000で読み取った。図35A及び35Bは、CHO由来のFc-L10-ShK[1-35]ペプチボディが、T細胞由来のIL-2及びIFNg生成を用量依存的な様式で有力に阻害することを示す。固有のShK[1-35]ペプチドと比較して、ペプチボディは、阻害の程度がより大きい阻害剤の不在下での反応のPOC=対照の百分率。PBMCのPMA及び抗CD3抗体刺激後のT細胞サイトカイン生成の阻害正常ヒトドナーLeukopheresisパックから、PBMCをあらかじめ単離し、密度勾配遠心FicollHypaqueにより精製し、INCELLFreezingMediumを使用して冷凍保存した。PBMCを解凍し95生存率、洗浄し、血清交換物PSGを含有するRPMI完全培地中で2×105細胞/ウェルで96ウェル平底プレートへ播種した。200mLの最終アッセイ容積でaCD3及びaCD28の添加それぞれ2.5ng/mL及び100ng/mLの前の1時間、連続希釈した終濃度100nMないし0.003nMShK[1-35]、Fc-L10-ShK[1-35]、又はFc対照とともに、細胞をあらかじめ温置した。MSD多重スポット96ウェルプレートへ上清20mLを添加した各ウェルは、IL-2、TNFα及びIFNg捕捉抗体を含有した。プレートを密封し、プレート振とう器上、室温で1時間温置した。次に、ルテニウム標識した検出抗体抗体希釈緩衝液中のIL-2、TNFα及びIFNγの終濃度1μg/mL20mL及び2×MSDReadBuffer110mLを添加した。プレートを密封し、スズ箔で包み、プレート振とう器上、室温で1時間温置した。次に、プレートをSECTOR商標Imager6000で読み取った。図37A及び37Bは、CHO由来のFc-L10-ShK[1-35]ペプチボディが、T細胞由来のIL-2及びIFNg生成を用量依存的な様式で有力に阻害することを示す。部分的な阻害のみを示す固有のShK[1-35]ペプチドと比較して、ペプチボディは、炎症性サイトカイン反応をほぼ完全に阻害する。阻害剤の不在下での反応のPOC=対照の百分率。PBMCの抗CD3及び抗CD28抗体刺激後のT細胞増殖の阻害正常ヒトドナーLeukopheresisパックから、PBMCをあらかじめ単離し、密度勾配遠心FicollHypaqueにより精製し、CPZCryopreservationMediumCompleteINCELL,MCPZF-100プラス終濃度10DMSOを使用して冷凍保存した。PBMCを解凍し95生存率、洗浄し、96ウェル平底組織培養プレート中の10ウシ胎仔血清、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、2mML-グルタミン、100μM非必須アミン酸及び20μM2-MEを補充した培地RPMI培地1640、GIBCO中で2×105細胞/ウェルで播種した。抗ヒトCD32FcyRIIブロッキング抗体製造者の使用説明書EASYHumanBiotinSelectionKit18553番、StemCellTechnologiesVancouver,BCに従った。又はFc-L10-ShK終濃度100nMないし0.001nMのいずれかとともに、細胞を45分間予め温置した。次に、Fc-L10-ShK終濃度100nMないし0.001nMを、抗ヒトCD32ブロッキング抗体を含有する細胞へ添加する一方で、Fc-L10-ShLを含有する細胞へ培地を添加した。aCD3/aCD28それぞれ0.2ng/mL及び100ng/mLで48時間刺激する前のさらなる45分間に両セットを温置した。最終的なアッセイ容積は200μLであった。[3H]TdR1μCi/ウェルを添加し、プレートをさらに16時間温置した。次に、細胞をガラスファイバーフィルターへと回収し、放射能をBシンチレーションカウンタで測定した。図36A及び36Bは、CHO由来のFc-L10-ShK[1-35]ペプチボディが、T細胞の増殖を用量依存的な様式で有力に阻害することを示す。抗CD32FcRブロッキング抗体による前ブロッキングは、T細胞増殖を阻害するペプチボディの能力にほとんど効果を及ぼさず、FcR結合ではなくKv1.3阻害が、観察される阻害に関するメカニズムであることを示唆する阻害剤の不在下での反応のPOC=対照の百分率。ヒトKv1.3を過剰発現するHEK293細胞に対するFc-L10-ShK[1-35]結合の免疫組織化学分析ヒトKv1.3を過剰発現するHEK293細胞HEKKv1.3をBioFocusplcCambridge、UKから入手し、製造者の推奨に従って維持した。親HEK293細胞系を対照として使用した。ポリ-D-リジン24ウェルプレート35-4414番、Becton-Dickinson、Bedford、MA上に細胞を播種し、約70の集密状態まで増殖させた。培地1mL/ウェル中に、HEKKV1.3を、0.5×105細胞/ウェルで播種した。HEK293細胞を、培地1mL/ウェル中に、1.5×105細胞/ウェルの密度で播種した。染色前、細胞増殖培地を除去し、0.2mL/ウェルのホルマリン溶液SigmaHT50-1-1ホルマリン溶液、PBS/0.5BSAで使用前に1:1希釈を添加し、室温で10分間温置することによって、細胞をホルマリンで固定した。PBS/BSA中の5μg/mLのFc-L10-ShK[1-35]0.2mL/ウェルとともに温置することによって細胞を染色した。Fc-L10-ShK[1-35]を吸引した後、細胞をPBS/0.5BSAで1回洗浄した。検出抗体ヤギFab2抗ヒトIgGフィコエリスリン、SouthemBiotechAssociates,Birmingham、ALをPBS/0.5BSA中で5μg/mLでウェルへ添加し、室温で30分間温置した。PBS/0.5BSAで、細胞を1回洗浄し、共焦点顕微鏡LSM510MetaConfocalMicroscope、CarlZeissAG、Germanyを使用して検査した。図33Bは、Fc-L10-ShK[1-35]ペプチボディが、HEK293細胞を過剰発現するKv1.3に対する結合を保持することを示すが、形質移入されていない細胞に対する結合はほとんど示さず図33A、Fc-L10-ShK[1-35]ペプチボディが、Kv1.3チャネルを過剰発現する細胞を検出するための試薬として使用できることを示す。活性化されたTエフェクターメモリ細胞がKv1.3を過剰生成することが報告されている疾病状況において、この試薬は、これらの細胞をターゲットにする上でも、それらの検出においても有用性を見出せる。固定されたHEK293細胞に対して結合するFc-L10-ShK[1-35]を示すELISAアッセイ図34Aは、Kv1.3を過剰発現する固定された細胞に対するペプチボディ結合の用量依存的な増加を示し、前記ペプチボディがその標的に対する高親和性結合及び、チャネルを発現する細胞の検出におけるFc-L10-ShK[1-35]の有用性を示す。多発性硬化症患者において疾病を発症させる抗原特異的T細胞は、困難なアプローチであるホールセルパッチクランプ電気生理学によって、Kv1.3を過剰発現することが示されてきた。本ペプチボディ試薬は、患者におけるKv1.3チャネル発現をモニターするための有用かつ簡便なツールであり得、診断適用において有用である。図34A及び図34Bに示される手法は、以下のとおりである。図34A。Kv1.3の形質移入されたHEK293細胞に対する無処置のFc-L10-ShK[1-35]の結合を示すため、細胞全体の免疫アッセイを実施したBioFocusplc、Cambridge、UK。ポリ-Dリジンでコーティングした96ウェルプレート35-4461番、Becton-Dickinson、Bedford、MAにおいて、親HEK293細胞又はHEKKv1.3細胞を3×104細胞/ウェルで播種した。細胞増殖培地を除去し、0.2mL/ウェルのホルマリン溶液SigmaHT50-1-1ホルマリン溶液、PBS/0.5BSAで使用前に1:1希釈を添加し、室温で25分間温置した後、PBS/0.5BSA100μL/ウェルで1回洗浄することによって、細胞をホルマリンで固定した。BSAブロッカー50-61-00、KPL10BSA希釈剤/ブロッキング溶液、PBSで1:1希釈、KPL、Gaithersburg、MD0.3mL/ウェルの添加後、振とうしながら室温で3時間温置することによって、ウェルをブロッキングした。プレートを1×KB洗浄緩衝液50-63-00、KPLで2回洗浄した。試料を希釈緩衝液PBS/0.5トゥイーン20又は1雄ルイスラット血清RATSRM-M、BioreclamationInc.、Hicksville、NY含有希釈緩衝液中に希釈し、ブロッキングされたプレートへ0.1mL/ウェルを添加し、振とうしながら室温で1時間温置した。プレートを1×KP洗浄緩衝液で3回洗浄した後、PBS/0.1トゥイーン20中に1:5000で希釈したHRP-ヤギ抗ヒトIgGFc31416番、Pierce、Rockford、ILとともに、振とうしながら室温で1時間温置した。プレートを1×KP洗浄緩衝液で3回洗浄した後、0.1mL/ウェルのTMB基質52-00-01、KPLを添加した。0.1mL/ウェルの2N硫酸の添加により、反応を停止させた。MolecularDevicesSpectroMax340Sunnyvale、CAで、450nmの吸光度を読み取った。図34B。細胞全体の免疫アッセイを、以下の改変とともに上述のとおり実施した。ポリ-D-リジンでコーティングした96ウェルプレート中で、HEK293細胞を1×105細胞/ウェルで播種し、HEKKv1.3細胞を6×104細胞/ウェルで播種した。Fc対照を0.05mL/ウェルの容積で500ng/mLで添加した。HRP-ヤギ抗ヒトIgGFc31416番、Pierce、Rockford、ILをPBS/0.1トゥイーン20中に1:10,000希釈した。ABTS50-66-00、KPLを基質として使用した。1SDSの0.1mL/ウェルの添加によって反応を停止させた後、405nmで吸光度を読み取った。Fc-L10-ShK1-35の精製Fc-L10-ShK[1-35]の発現は、本明細書の上述の実施例3において記載されているとおりであった。凍結したE.コリペースト18gを室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH8.0の200mLと組み合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、12,000PSIで2回通過させた。次に、細胞可溶化液を、4°C、22,000gで15分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを1デオキシコール酸200mL中に再懸濁した後、4°C、22,000gで15分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、200mLの水中にペレットを再懸濁した後、4°C、22,000gで15分間遠心分離した。次に、32mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に、ペレット3.2gを溶解した。次に、室温、27,000gで15分間、ペレット溶液を遠心分離した後、再折りたたみ緩衝液3M尿素、20グリセロール、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、5mMEDTA、1mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH9.5500mLへ、4°Cで激しく撹拌しながら、上清5mLを移動させた。次に、撹拌速度を低下させ、4°Cで2日間、温置を続行した。次に、再折りたたみ溶液を-70°Cで保存した。保存した再折りたたみ液を解凍した後、水2Lで希釈し、1MH3PO4を使用して、pHを7.3へ調整した。次に、pH調整した材料を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、7°C、20mL/分でS-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.3中の60mLのAmershamSP-FF内径2.6cmカラムへと負荷した。次に、カラムをS-緩衝液Aの数カラム容積で洗浄した後、0から60までのS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.3の直線勾配で溶出した後、7°C、10mL/分で100S-緩衝液Bへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、7°C、1mL/分でPBS中の1mLのAmershamrProteinAHiTrapカラムへと前記プールを負荷した。次に、カラムを20mMのNaH2PO4、pH6.5、1MNaClの数カラム容積で洗浄し、100mMグリシン、pH3.0で溶出した。溶出ピークへ、3M酢酸ナトリウム0.0125容積25mLを添加した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLの水中に希釈した組み合わせたプール50μLに対して、スペクトル走査を実施した図46A。30,410g/molの算出された分子量及び36,900M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が2.56mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した図46B。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9でPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへと1mL/分で注入された生成物20μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図46C。次に、試料1μLをシナピン酸10μL中に希釈する0.05トリフルオロ酢酸、50アセトニトリル中10mg/mLことによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液1mLをMALDI試料プレート上に点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyagerDE-RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した337nm、3ナノ秒パルス。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。次に、生成物を-80°Cで保存した。Fc-L-ShK[1-35]とも呼ばれる、精製されたE.コリ由来のFc-L10-ShK[1-35]によるヒトKv1.3の遮断のためのIC50を、本明細書の以下の実施例50における表35に示す。細菌で発現したFc-L10-ShK2-35の精製Fc-L10-ShK[2-35]の発現は、本明細書の上述の実施例4において記載されているとおりであった。冷凍したE.コリペースト16.5gを室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH8.0の200mLと組み合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ12,000PSIで2回通過させた。次に、4°C、22,000gで15分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、200mLの1デオキシコール酸中にペレットを再懸濁した後、4°C、22,000gで15分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、200mLの水中にペレットを再懸濁した後、4°C、22,000gで15分間遠心分離した。次に、39mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に、ペレット3.9gを溶解した。次に、室温、27,000gで15分間、ペレット溶液を遠心分離した後、再折りたたみ緩衝液3M尿素、20グリセロール、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、5mMEDTA、1mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH9.5500mLへ、4°Cで激しく撹拌しながら、上清5mLを移動させた。次に、撹拌速度を低下させ、4°Cで2日間、温置を続行した。次に、再折りたたみ溶液を-70°Cで保存した。保存した再折りたたみ液を解凍した後、水2Lで希釈し、1MH3PO4を使用して、pHを7.3へ調整した。次に、0.22μm酢酸セルロースフィルターで、pH調整した材料をろ過し、7°CでS-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.3中の60mLのAmershamSP-FF内径2.6cmカラムへ20mL/分で負荷した。次に、カラムをS-緩衝液Aの数カラム容積で洗浄した後、0から60までのS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.3の直線勾配で溶出した後、7°C、10mL/分で100S-緩衝液Bへの工程で溶出した。望ましい生成物を含有する画分をプールし、0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過した。次に、7°C、2mL/分でPBS中の1mLのAmershamrProteinAHiTrapカラムへ前記プールを負荷した。次に、カラムを20mMのNaH2PO4、pH6.5、1MNaClの数カラム容積で洗浄し、100mMグリシン、pH3.0で溶出した。溶出ピークへ、3M酢酸ナトリウム0.0125容積18mLを添加し、0.22μm酢酸セルロースフィルターで試料をろ過した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLの水中に希釈した組み合わせたプール20μLに対して、スペクトル走査を実施した図40A。29,282g/molの算出された分子量及び36,900M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が3.20mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した図40B。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9でPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへと1mL/分で注入された生成物50μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図40C。次に、試料1μLをシナピン酸10μL中に希釈する0.05トリフルオロ酢酸、50アセトニトリル中10mg/mLことによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液1mLをMALDI試料プレート上に点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyagerDE-RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した337nm、3ナノ秒パルス。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した図40D。次に、生成物を-80°Cで保存した。Fc-L-ShK[2-35]とも呼ばれる、精製されたE.コリ由来のFc-L10-ShK[2-35]によるヒトKv1.3の遮断のためのIC50を、本明細書の以下の実施例50における表35に示す。細菌で発現したFc-L10-Osk1の精製冷凍したE.コリペースト129g、実施例10参照を室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH7.8の1290mLと組み合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ12,000PSIで2回通過させた。次に、4°C、17,700gで15分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、1デオキシコール酸1290mL中にペレットを再懸濁し、4°C、17,700gで15分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、1290mLの水中にペレットを再懸濁した後、4°C、17,700gで15分間遠心分離した。次に、160mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に、ペレット8g合計16.3gを溶解した。次に、ペレット溶液100mLを1MDTT1mLとともに、37°Cで60分間温置した。再折りたたみ緩衝液1M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、2.5mMEDTA、1.2mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH10.55000mLへ、激しく撹拌しながら4°C、2mL/分で、還元した材料を移した。次に、撹拌速度を低下させ、温置を4°Cで3日間続行した。酢酸を使用して、再折りたたみ液のpHを8.0に調整した。次に、pH調整した材料を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、室内の50AmershamProteinAカラム内径2.6cmで、8°CでQ-緩衝液A20mMトリス、pH8.5中の50mLのAmershamQセファロース-FF内径2.6cmカラムへ10mL/分で負荷した。負荷した後、Qセファロースカラムを回路から除去し、残存するクロマトグラフィーをタンパク質Aカラムで実施した。カラムをQ-緩衝液Aの数カラム容積で洗浄した後、100mMグリシン、pH3.0への工程を使用して溶出した。望ましい生成物を含有する画分をプールし、S-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.0中の50mLのAmershamSP-セファロースHPカラム内径2.6cmへ、8°C、20mL/分で即時負荷した。次に、カラムをS-緩衝液Aの数カラム容積で洗浄した後、5から60までのS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.0の直線勾配の後、100S-緩衝液Bへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析した。望ましい生成物のバルクを含有する画分をプールした後、8°C、5mL/分で、MEP緩衝液A20mMトリス、200mMNaCl、pH8.0中の75mLのMEPHypercelカラム内径2.6cmへ適用した。5から50までの直線勾配のMEP緩衝液B50mMクエン酸ナトリウム、pH4.0でカラムを溶出した後、100MEP緩衝液Bへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析し、望ましい生成物のバルクを含有する画分をプールした。次に、10kDaメンブレンを備えたPallJumbo-Sepを使用して、MEPプールを約20mLまで濃縮した後、同一メンブレンを使用して製剤緩衝液20mMNaH2PO4、200mMNaCl、pH7.0と緩衝液交換した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLの製剤緩衝液中に希釈した組み合わせたプール50μLに対して、スペクトル走査を実施した図41A。30,558g/molの算出された分子量及び35,720M-1cm-1の吸光係数を使用して、材料の濃度が4.12mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、前記材料の純度を評価した図41B。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9でPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへと1mL/分で注入された生成物123μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図41C。次に、RP-HPLCカラムVydacC4、1×150mmを通じて試料約4μgをクロマトグラフィーにかけることによって、生成物を質量スペクトル分析へ供した。溶媒Aは、水中の0.1トリフルオロ酢酸であり、溶媒Bは、90アセトニトリル、10水中の0.1トリフルオロ酢酸であった。80μL/分の流速で、10溶媒B中でカラムをあらかじめ平衡化した。10ないし90の溶媒Bの直線勾配を30分かけて使用して、タンパク質を溶出した。溶出液の一部をLCQイオントラップ質量分析計へ配向させた。質量分析計の製造者によって提供されるBioworksソフトウェアを使用して、質量スペクトルの逆重畳を行った図41D。生成物を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過した後、-80°Cで保存した。E.コリにより発現されたFc-L10-OSK1プレップの収量は、細胞ペースト40gから129g×8g/16.3g×100mL/160mL=39.6g、四捨五入により40g81mgであり、純度は、SDS-PAGEによって判断すると、80よりも大きく、SEC-HPLCによって判断する予想されと二量体として走行しており、質量はMSによって判断すると、予想された分子量の範囲内であった。精製されたE.コリ由来のFc-L10-OSK1Fc-L-OSK1とも呼ばれる。によるヒトKv1.3の遮断に対するIC50が、本明細書の以下の実施例50中の表35に示されている。哺乳類細胞によって発現されるFc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]、及びFc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]Kv1.3の阻害剤であるFc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]、及びFc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]を、哺乳類細胞中で発現させた。リンカー配列及びKvl.3阻害剤ペプチドShK[1-35]の単量体へ、インフレームで融合されるヒトIgG1のFc領域をコードするDNA配列を後述のように構築した。哺乳類細胞HEK293及びチャイニーズハムスター卵巣細胞からペプチボディを発現及び精製するための方法は、本明細書に開示されている。Fc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]及びFc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]発現ベクターの構築のために、2つの終止コドンを有する、4つのグリシン及び1つのセリンアミノ酸リンカーへ各々連結され、以下に示されるようにBamHI及びNotI制限部位によって隣接され完全長の遺伝子OSK1、OSK1[K7S]、OSK1[E16K,K20D]及びOSK1[K7S,E16K,K20D]を作製させるためにPCR戦略を採用した。以下に示される配列を有するOSK1、OSK1[K7S]、OSK1[E16K,K20D]及び[K7S,E16K,K20D]OSK1の各々に対する2つのオリゴを、95°C-30秒、55°C-30秒、75°C-45秒で35サイクル、PfuTurboHotStartDNAポリメラーゼStratageneを使用するPCR反応において使用した。BamHIggatcc及びNotIgcggccgc制限部位に下線が付されている。得られたPCR産物を、4アガロースゲル上で155bpバンドとして分離した。PCR精製キットQiagenを使用して155bpPCR産物を精製した後、BamHI及びNotIRoche制限酵素で消化し、アガロースゲルをゲル抽出キットQiagenによって精製した。同時に、pcDNA3.1CMVi-hFc-Shk[2-35]ベクターをBamHI及びNotI制限酵素で消化し、大きな断片をゲル抽出キットによって精製した。ゲル精製されたPCR断片を、精製された大きな断片へ連結し、Top10F’Invitrogen中に形質転換した。形質転換された細菌コロニー由来のDNAを単離し、BamHI及びNotI制限酵素で消化し、2アガロースゲル上で分離した。予想されたパターンを生じるDNAを配列決定へ供した。クローンの数個の配列の分析は、上述の配列と100一致したが、大規模プラスミド精製のために各遺伝子から1つのクローンのみを選択した。Fc及びリンカー領域を確認するため、pCMViベクター中のFc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]、及びFc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]のDNAを再配列決定し、配列は上述の配列と100同一であった。Fc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]、及びFc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]の配列及び模式図による表示を、図42AないしB、図43AないしB、図44AないしB及び図45AないしBにそれぞれ示す。pCMViタンパク質中のFc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]及びFc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]の一過性形質移入発現において使用されるHEK-293細胞を、DMEM高グルコースGibco、10ウシ胎仔血清FBS、Gibco製、1×非必須アミノ酸NEAA、Gibco製及び1×ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミンPen/Strep/Glu、Gibco製を含有する増殖培地中で培養した。FuGENE6Rocheを使用して、フェノール/クロロホルム抽出されたpCMViプラスミド中のFc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]、及びFc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]各5.6μgを、HEK-293細胞中に形質移入した。細胞を24時間回復させた後、DMEM高グルコース、1×NEAA及び1×Pen/Strep/Glu培地中に配置した。本明細書の以下の実施例50に記載のプロトコールを使用して、これらの形質移入されたHEK-293細胞によって、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]及びFc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]を培養上清から精製した。培養上清15μLを自家4×負荷緩衝液β-メルカプトエタノールなしと混合し、NovexXcellII装置を使用して、BenchMark染色済みタンパク質ラダーInvitrogen20μLとともに5×ランニング溶液25mMトリス塩基、192mMグリシン、3.5mMSDS中で101V/46mAで2時間、Novex4ないし20トリス-グリシンゲル上で電気泳動した。次に、エレクトロブロット緩衝液25mMトリス塩基、192mMグリシン、20メタノール中に、ゲルを5分間浸漬した。エレクトロブロット緩衝液中に、Invitrogen製ニトロセルロースメンブレンカタログ番号LC200、孔サイズ0.2μmを浸漬した。製造者の説明書Bio-RadLaboratoriesに従って、MiniTrans-BlotCellモジュールを使用して、あらかじめ浸漬されたゲルを、PVDFメンブレンへ300mAで2時間ブロットした。0.1トゥイーン20含有トリス緩衝塩類溶液、pH7.5TBST中でブロットをすすいだ。次に、まずTBST中の5ミルクCarnation中に、室温で1時間、ブロットを浸漬した後、1回の洗浄につき10分間で3回、TBST中で洗浄した。次に、5ミルク緩衝液を加えたTBST中のHRPの結合したヤギ抗ヒトIgGFcγ抗体PiereceBiotechnologyカタログ番号31413の1:1000希釈とともに、室温で1時間振とうしながら温置した。次に、室温で1回の洗浄につき15分間、TBST中で3回、ブロットを洗浄した。製造者の説明書に従ってAmershamPharmaciaBiotechのECLウェスタンブロット検出試薬を使用して、一次抗体を検出した。ECL検出に際し、ウェスタンブロット分析は、非還元型ゲル条件下で66kDaの予想されたサイズを表示した図46。pCMViベクター中のFc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]及びFc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]インサートを含有するプラスミドを、XbaI及びNotIRoche制限酵素で消化し、ゲル精製した。SpeI及びNotI及びSalIRocheで消化したpDSRα-24AmgenProprietary発現ベクターへ、前記インサートを個々に連結した。得られるコンストラクトの完全性をDNA配列決定によって確認した。クローンの数個の配列の分析は、上述の配列と100の一致を与えたが、大規模プラスミド精製のために1つのクローンのみを選択した。Fc-L10-OSK1タンパク質の安定した発現において使用されるAM1CHOd-AmgenProprietary細胞を、DMEM高グルコース、10ウシ胎仔血清、1×ヒポキサンチン/チミジンHT、Gibco製、1×NEAA及び1×Pen/Strep/Gluを含有するAM1CHOd増殖培地中で、Fc-LI0-ShK[1-35]タンパク質の安定した発現に使用されるAM1CHOdAmgenProprietary細胞を培養した。FuGene6を使用して、pDSRα-24-Fc-L10-OSK1プラスミド5.6μgをAM1CHOd-細胞に形質移入した。形質移入から24時間後、DHFR選択培地DMEM高グルコースプラス10透析済みウシ胎仔血清dFBS、1×NEAA及び1×Pen/Strep/Glu中へ、細胞を1:11で分割し、コロニー選択の場合には1:50で分割した。DHFR選択培地中で13日間、細胞選択した。得られたコロニーの10個の10cm2プールを10個のT-175フラスコへ展開した後、10個のローラー瓶にスケールアップし、AM1CHOd産生培地DMEM/F121:1、1×NEAA、1×ピルビン酸ナトリウムピルビン酸Na、1×Pen/Strep/Glu及び1.5DMSOのもとで培養した。馴化培地を回収し、1週間置きに交換した。得られた馴化培地6Lを0.45μm酢酸セルロースフィルターCorning、Acton、MAでろ過し、図47に示されるようにSDS-PAGE分析によって特徴付けた。次に、精製のために、ProteinChemistryに移した。DHFR選択培地上で13日後に、12個のコロニーを選択し、1個の24ウェルプレートへと摘出した。前記プレートを1週間増殖させた後、AM1CHOd産生培地へ、48ないし72時間移し、培養上清を回収した。培養上清5μLをスクリーニングするため、同一のHRP結合型ヤギ抗ヒトIgGFcγ抗体によって検出する一過性ウェスタンブロット分析と同様のウェスタンブロッティングによって、発現レベルを評価した。12個の全ての安定したクローンは、66kDaの予想されたサイズでの発現を示した。2つのクローン、A3及びC2を選択し、一次クローンC2に対するバックアップとしてのA3とともに凍結するため、T175フラスコへ展開した図48。選択培地を使用して、C2クローンを15個のローラー瓶Corningへスケールアップし、集密状態まで増殖させた。次に、培地を産生培地と交換し、1週間温置させた。馴化培地を採集し、1週間置きに交換した。0.45μm酢酸セルロースフィルターCorning、Agton、MAで、得られた培養上清15Lをろ過し、SDS-PAGE分析によって特徴付けたデータ非表示。以下の本明細書の実施例42に記載されているとおり、さらなる精製を行った。哺乳類細胞によって発現されたFc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1K7S、Fc-L10-OSK1E16K,K20D及びFc-L10-OSK1K7S,E16K,K20Dの精製Fc-L10-OSK1の精製CHOAM1CHOd-細胞培養上清約6L上述の実施例41参照を、35mLのモノクローナル抗体選択カラムGEHealthcareへ、7°C、10mL/分で負荷し、二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液PBSの数カラム容積で前記カラムを洗浄し、100mMグリシン、pH3.0にする工程で試料を溶出した。S-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.0中の室内の65mLのSP-HPカラムGEHealthcareへ、7°C、10mL/分で、モノクローナル抗体選択溶出液を直接負荷した。モノクローナル抗体選択カラムをはずした後、数カラム容積のS-緩衝液Aで、SP-HPカラムを洗浄した後、5から60までのS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.0の直線勾配を10mL/分で使用して展開した後、7°Cで100S-緩衝液Bへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、PallLifeSciencesJumbosep10KOmega遠心限外ろ過装置を使用して、プールした材料を約20mLに濃縮した。次に、20mMNaH2PO4、pH7.0の20mLで希釈することによって、濃縮した材料を緩衝液交換し、Jumbosep10KOmegaフィルターを使用して20mLに再濃縮した。次に、20mMNaH2PO4、200mMNaCl、pH7.0の20mLで材料を希釈した後、22mLに再濃縮した。次に、緩衝液交換した材料を、室温、1mL/分で、0.22μm、25mmのMustangEメンブレンを有するPallLifeSciencesAcrodiscでろ過した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈したろ過済み材料50μLに対して、スペクトルの走査を実施した図49A、黒のトレース。30,371g/molの算出された分子量及び35,410M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が4.96mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した図49B。次に、CharlesRiversエンドトキシン特異的緩衝液中に試料を30倍希釈したものを使用して、CharlesRiverLaboratoriesEndosafe-PTSシステム0.05ないし5EU/mL感度を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、1.8EU/タンパク質mgであった。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9でPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへ、1mL/分で注入された生成物149μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図49C。次に、試料1μLをシナピン酸10μL0.05トリフルオロ酢酸、50アセトニトリル中10mg/mLへと希釈することによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液1mLをMALDI試料プレート上に点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyagerDE-RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した337nm、3ナノ秒パルス。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した図49D。次に、生成物を-80°Cで保存した。哺乳類Fc-L10-OSK1プレップに関する収量は、6Lから115mgであり、純度は、SDS-PAGEによる判断によれば90超であり、Fc-L10-OSK1は、SEC-HPLCによる判断によれば予想された二量体として測定され、質量は、MSによる判断によれば予想された範囲であった。ヒトKv1.3及びヒトKv1.1を遮断する上での精製されたFc-L10-OSK1の活性を、本明細書の以下の実施例43に記載する。Fc-L10-OSK1K7S、Fc-L10-OSK1E16K,K20D及びFc-L10-OSK1K7S,E16K,K20Dの精製形質移入されたHEK-293による培養上清約500mL上述の実施例41参照を、モノクローナル抗体選択樹脂1.5mLGEHealthcareの65スラリー及び500μLの20NaN3と合わせた。次に、スラリーを4°Cで3日間静かに撹拌した後、ブレーキを使用せずに4°C、1000gで5分間遠心分離した。次に、上清の大部分を吸引し、ペレット中に残存するスラリーを14mLのコニカルチューブへ転移させ、二価の陽イオンを含まないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液PBS12mLと組み合わせた。低ブレーキを使用しながら、前記スラリーを4°C、2000gで1分間遠心分離し、上清を吸引した。PBS洗浄周期をさらに3回反復した。次に、100mMグリシン、pH3.0の1mLを添加し、室温で静かに5分間撹拌することによって、結合されたタンパク質を溶出した。次に、低ブレーキを使用しながら、前記スラリーを4°C、2000gで1分間遠心分離し、上清を第一溶出液として吸引した。溶出周期をさらに2回反復し、3つの全上清を合わせて単一プールとした。pHを上昇させるために、酢酸ナトリウム3M溶液37.5μLを溶出プールへ添加した後、10kDaSlideAlyzerPierceを使用して、10mM酢酸、5ソルビトール、pH5.0に対して室温で2時間透析した。透析緩衝液を交換し、透析を4°Cで一晩続行した。次に、0.22μm酢酸セルロースフィルターシリンジフィルターで、透析した材料をろ過した。次に、30,330の算出された分子量及び35,410M-1cm-1の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が1.27mg/mLであると測定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した図50B。次に、CharlesRiversエンドトキシン特異的緩衝液中に試料を25倍希釈したものを使用して、CharlesRiverLaboratoriesEndosafe-PTSシステム0.05ないし5EU/mL感度を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、1EU/タンパク質mg未満であった。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9でPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへと1mL/分で注入された生成物50μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図50C。次に、試料1μLをシナピン酸10μL0.05トリフルオロ酢酸、50アセトニトリル中10mg/mL中に希釈することによって、生成物を質量スペクトル分析へ供した。得られた溶液1mLをMALDI試料プレート上に点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたVoyagerDE-RP飛行時間質量分析装置を使用して分析した337nm、3ナノ秒パルス。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した図50D。次に、生成物を-80°Cで保存した。図51AないしDは、以下の点を除いて、Fc-L10-OsK1K7S分子に関するものと同一プロトコールを使用して実施した、Fc-L10-OsK1E16K,K20Dに対する精製及び分析からの結果を示す。30,357g/molの算出された分子量及び35,410の算出された吸光係数を使用して、濃度は1.59mg/mLであることが明らかとなった。発熱物質レベルは、32倍希釈を使用して、1EU/mg未満であることが明らかとなった。図52AないしDは、以下の点を除いて、Fc-L10-OsK1K7S分子上述に関するものと同一プロトコールを使用して実施した、Fc-L10-OsK1K7S,E16K,K20Dに対する精製及び分析からの結果を示す。30,316g/molの算出された分子量及び35,410の算出された吸光係数を使用して、濃度は0.81mg/mLであることが明らかとなった。発熱物質レベルは、16倍希釈を使用して、1EU/mg未満であることが明らかとなった。ヒトKv1.3及びヒトKv1.1を遮断する上での精製されたFc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]及びFc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]の活性を、本明細書の以下の実施例43に記載する。OSK1及びOSK1ペプチボディ類縁体の電気生理学カリウムチャネルファミリーのサブタイプであるヒトKv1.1及びKv1.3チャネルに及ぼす影響を評価するために、アジアサソリであるオルトキルススクロビキュロサスOrthochirusScrobiculosusの毒液の38残基ペプチド毒素OSK1を合成した実施例41参照。HEK293細胞発現系及び電気生理学の使用によって、ヒトKv1.1及びKv1.3チャネルを阻害する上での合成OSK1の有効性及び選択性を評価した図53。安定して発現したKv1.3チャネルのホールセルパッチクランプ記録によって、合成OSK1ペプチドは、Kv1.1と比較したとき、ヒトKv1.3を阻害する上でより有力であることが明らかとなった表33。OSK1ペプチボディを作製するための、抗体へのOSK1ペプチド毒素の融合血漿半減期を改善し、OSK1ペプチド毒素が中枢神経系を貫通するのを防止するため、本明細書の実施例41に記載されるとおり、10個のアミノ酸残基のリンカー鎖長を介して、ヒト抗体IgG1のFc断片へOSK1ペプチド毒素を融合した。この融合によって、合成OSK1ペプチドと比較すると、Kv1.3の有効性は5倍まで低下した。しかしながら、合成ペプチド単独のもの4倍、表33及び図54と比較すると、OSK1のKv1.1に対する選択性は210倍まで有意に改善した。OSK1ペプチボディFc-L10-OSK1の修飾OSK1は、集合的にα-KTx3と呼ばれるサソリ毒素の他のメンバーと60ないし80の配列相同性を共有する。OSK1及びα-KTx3ファミリーの他のメンバーの配列アラインメントによって、位置12、16、20及び36における4つの異なる構造的な差異が明らかとなった。OSK1のこれらの構造的な差異は、他のカリウムチャネルに対するそれらの多様な活性において重要な役割を果たしているものと推測され、これは、α-KTx3ファミリーの他のメンバーでは観察されない。従って、Kv1.2とのヘテロ四量体として、主に中枢神経系中に見出されるKv1.1などの他のカリウムチャネルに対する選択性に及ぼす影響を評価するために、位置16及び20に存在する2つのアミノ酸残基を、OSK1配列内のより保存されたアミノ酸残基へと回復させた。それぞれ保存されたリジン及びアスパラギン酸残基を、位置16のグルタミン酸、及び位置20のリジンと置換することによってすなわち、Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]、Fc-L10-OSK1の効力と比較したとき、効力に有意な変化は観察されなかった1.3倍差、図56及び表33。しかしながら、この二重変異によって、Kv1.1に対する遮断活性が排除された。Kv1.1/Kv1.3の選択性の比は403倍であり、Fc-L10-OSK1に関する選択比210倍に比べて有意に向上した。位置7のリジンからセリンへの単一アミノ酸突然変異Fc-L10-OSK1[K7S]は、Fc-L10-OSK1の有効性及び選択性と比較すると、有効性及び選択性が、それぞれ2倍及び1.3倍までわずかに変化した図55及び表33。Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]を作製させるために、3つの残基全てを突然変異させると、有効性が著しく低下した図57及び表33。表33の結果によって示されるように、ヒト抗体IgG1のFc断片へOSK1ペプチド毒素を融合させることによって、Kv1.1に対する選択性が劇的に改善されたが、Kv1.3に対する標的有効性は低下した。2つの重要な位置にある2残基がα-KTx3ファミリーの他のメンバーで見られる保存された残基へ回復されると、Kv1.1に対する選択性をさらに改善した。ラットにおけるPEG-ShK[1-35]分子の薬物動態学的研究約24kDaの20KPEG-ShK[1-35]分子及び約4kDaの小固有ShKペプチドの静脈内IV薬物動態学的特性を、スプラーグドーリー系ラットで測定した。固有ShKペプチド及び新規の本発明の20KPEG-ShK[1-35]分子に関するIV用量は、1mg/kgであった。この用量は、これら2つの分子の等しいモル量を表した。ラットの平均体重は約0.3kgであり、用量及び分子に関して各2匹のラットを使用した。IV注射後の多様な時点で採血し、血清約0.1mLを回収した。分析時まで、血清試料を-80°Cで冷凍保存した。電気生理学のためのアッセイプレート調製薬物動態学的研究由来の20KPEG-ShK[1-35]分子又は固有ShKペプチドを含有するラット血清試料を凍結した。実験前に、各試料を室温で解凍し、一定分量70ないし80μLを96ウェルポリプロピレンプレート中の1ウェルへ転移させた。アッセイプレートを調製するため、検査溶液を付与するために、薬物動態学的血清試料から何回も希釈した。薬物動態学的研究由来の血清試料を、10リン酸緩衝塩類溶液PBS、Ca2及びMg2含有へと希釈した。薬物動態学的研究から得られた血清試料中の新規の本発明の20KPEG-ShK[1-35]分子の量を測定する場合、検査溶液中の血清最終濃度は、90、30、10、3.3及び1.1であった。精製された20KPEG-Shk[1-35]標準阻害曲線も、AssayPlate中に調製した。これを実施するため、精製された20KPEG-ShK[1-35]分子標準物質の8点連続希釈液を、90、30、10、3.3又は1.1のラット血清に調製し、標準物質の最終濃度は、50、16.7、5.5、1.85、0.62、0.21、0.068及び0.023nMであった。電気生理学のための細胞調製電位により活性化されるKチャネルであるKv1.3を安定的に発現するCHO細胞を、実験の2日前に、T-175組織培養フラスコ中に5×106個の密度で播種し、約95の集密状態まで生育させた。実験の直前に、PBSで細胞を洗浄した後、トリプシン0.25及びベルセン1:5000の2mL混合物1:1容積比を使用して、37°Cで3分間剥離させた。その後、フラスコ中で、10FBS、1×NEAA及G418の750μg/mLを有する組織培地Glutamax含有HAMのF-12、InVitrogen、カタログ番号3176510mL中に細胞を再懸濁し、約1000rpmで1.5分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを、PBS中に、3ないし5×106細胞/mLで再懸濁した。IonWorks電気生理学及びデータ分析CHO-Kv1.3細胞中のK電流を阻害するための血清中の検査溶液又は標準物質の能力を、自動電気生理学システムIonWorksQuattroを使用して研究した。細胞を再懸濁し、AssayPlate、PopulationPatchClampPPCPatchPlate並びに適切な細胞内緩衝液90mMグルコン酸K、20mMKF、2mMNaCl、1mMMgCl2、10mMEGTA、10mMHEPES、pH7.35及び細胞外緩衝液Ca2及びMg2含有PBSをIonWorksQuattroに配置した。アンフォテリシンベースの穿孔パッチクランプ法を使用して、CHO-Kv1.3細胞からの電気生理学記録を実施した。IonWorksQuattroの電位クランプ回路素子を使用して、細胞を-80mVの膜電位に保持し、30mVへ400ミリ秒、膜電位を停止させることによって電位活性型K電流を惹起させた。対照条件下、すなわち、実験開始時阻害剤の不存在下で、及び検査溶液又は標準物質の存在下での10分間の温置の後に、K電流を惹起させた。430ミリ秒と440ミリ秒との間に、平均K電流振幅を測定し、MicrosoftExcelスプレッドシートへ、データを転送した。検査溶液又は標準物質の各濃度の存在下でのK電流の振幅を、同一ウェル中の対照条件下でのK電流の百分率として表した。ラット血清の多様なレベルの各標準物質に対して標準物質阻害曲線を作製し、対照の電流百分率POC対nM濃度の対数として表した。対照の百分率POCは、阻害と逆相関しており、ここで、100POCは阻害が全く存在せず、0POCは100阻害である。検査溶液内での薬物濃度の算出を可能にする方程式を導くために、前記曲線の選択された領域にわたる線形回帰を使用した。検査溶液中の薬物の濃度を算出するため、標準曲線の線形部分内の電流値のみを使用した。血清の所定レベルでの対応する標準曲線を、薬物レベルを算出するときの検査溶液の血清の同一レベルと常に比較した。ShK及び20KPEG-ShK[1-35]に対する標準曲線が、それぞれ図58A及び図58Bに示されており、各図は、血清の所定の百分率での各標準物質に対する線形回帰方程式を含んでいる。20KPEG-ShK[1-35]標準曲線については、標準曲線の線形部分は20POCから70POCまでであり、検査溶液内での薬物濃度を算出するため、この範囲内に収まる検査溶液から得られた電流値のみを使用した。静脈内注射後における、本発明の新規20KPEGShK[1-35]分子の薬物動態学的特性を図59に示す。この曲線から、前記分子の終末半減期t1/2bは、6時間と12時間の間の長さであると推定される。48時間を超えると、薬物のレベルは、標準曲線の線形範囲の外側に収まり、算出されない。本発明の新規20KPEG-ShK[1-35]分子の算出された6ないし12時間の半減期は、C.Beetonetal.[C.Beetonetal.2001Proc.NatlAcad.Sci.98,13942-13947]によって以前に報告された固有のShK分子の約0.33時間又は20分の半減期よりも実質的に長く、これは治療用分子の望ましい特徴である。ShK対20KPEG-ShK[1-35]の等モルの静脈内注射後のKv1.3阻害剤の相対的なレベルの比較を、図60に示す。5血清検査溶液を検討する前記図から明らかなように、20KPEG-ShK[1-35]分子は、24時間超の間、Kv1.3電流の有意な抑制70POC未満を示したのに対し、固有なShKペプチドは、最初の1時間にKv1.3電流の阻害の有意なレベルを示したに過ぎず、1時間を超えると有意な遮断を示さなかった。本データは、自己免疫疾患の治療用治療薬としての20KPEGShK[1-35]の望ましい特徴を再び示している。PEG化された毒素ペプチドは、動物モデルにおいて重度の自己免疫性脳脊髄炎を抑制したKv1.3の20KPEG-ShK阻害剤は、ラットにおける重度の自己免疫性能脊髄炎を抑制する上で改善された有効性を示す。以前に記載された多発性硬化症の適応性転移型実験的自己免疫性脳脊髄炎AT-EAEモデル[C.Beetonetal.2001J.Immunol.166,936]を使用して、本発明者は、本発明の新規20KPEG-ShK分子のインビボでの活性を検討し、その有効性をShK毒素ペプチド単独の有効性と比較した。研究デザインを図61に図示する。本インビボ研究からの結果を図62及び図63に示す。第1日から第3日まで10μg/kgで毎日皮下送達される20KPEG-ShK分子は、疾病の重度を有意に低下させ、生存性を亢進したのに対し、小さなShKペプチドの等モル投与量10μg/kgで処理した動物は、重度の疾病を発症し、死亡した。35個のアミノ酸の毒素ペプチドShKスティコダクチラヘリアンサスStichodactylahelianthus神経毒をBachemBioscienceから購入し、Kv1.3を有力に遮断するために電気生理学によって確認した本明細書の実施例36参照。20KPEGShK分子の合成、PEG化、精製は、本明細書に上記されている。ミエリン塩基性タンパク質MBPに特異的な脳骨髄性CD4ラットT細胞系PASは、EvelyneBeraud博士から入手した。インビトロでの前記細胞の維持及びAT-EAEモデルにおけるそれらの使用は、以前に記載されている[C.Beetonetal.2001PNAS98,13942]。抗原刺激又はMBP及び照射された胸腺細胞2日による活性化のラウンドを交互に行い、T細胞成長因子による伝播5日によって、PAST細胞をインビトロで維持した。PAST細胞3×105/mLは、前記細胞を、10μg/mLのMBP及び15×106/mLの同系の照射された3500ラド胸腺細胞とともに温置することを包含した。インビトロでの活性化から2日後に、10ないし15×106個の生存可能なPAST細胞を、6ないし12週齢の雌のルイスラットCharlesRiverLaboratoriesの尾静脈に注射した。媒体PBS中2ルイスラット血清、20KPEG-ShK又はShKの毎日の皮下注射を第-1日から第3日まで付与し図61、第-1日は、PAST細胞の注射第0日の1日前を表す。媒体で処理されたラットでは、一過性のEAEが、PAST細胞の注射後4ないし5日目に発症した図62。阻害剤のレベルの分析のため、第4日目に眼窩後部の出血により、第8日に心臓穿刺により、血清を回収した。第-1、4、6及び8日目にラットの体重を測定した。細胞転移当日第0日から第3日まで1日に1回、第4日から第8日まで1日に2回、動物を盲検した。各肢及び尾部の不全麻痺の程度の全体的なスコアとして、臨床徴候を評価した。臨床的なスコア化は、0=徴候なし、0.5=遠位跛行尾部、1.0=跛行尾部、2.0=軽度不全対麻痺、運動失調、3.0=中等度不全対麻痺、3.5=片後肢麻痺、4.0=完全後肢麻痺、5.0=完全後肢麻痺及び失禁、5.5=四肢麻痺、6.0=瀕死状態又は死亡であった。5.5のスコアに到達しているラットを安楽死させた。EAEの開始前のKv1.3遮断薬PEG-ShKによるラットの処理は、疾病の惹起を遅延させ、疾病の進行を阻害し、用量依存的様式で死亡を予防した図62。10μg/kgのPEG-ShK又は100μg/kgのPEG-ShKで処理されたラットにおける第4.5日と比較して、媒体単独、10μg/kgのShK又はPEG-ShK1μg/kgで処理したラットにおける疾病の惹起を第4日で観察した。さらに、媒体単独、10μg/kgのShK又はPEG-ShK1μg/kgで処理したラットは全て、5.5以上のEAEスコアで研究を終了するまで重度の疾病を発展させた。対照的に、10μg/kgのPEG-ShK又は100μg/kgのPEG-ShKで処理したラットは、2未満の臨床重度スコア平均のピークに到達し、1匹を除く全部のラットが研究の終了時まで生存した。さらに、本発明者は、ラットの体重が疾病の重度と相関することを発見した図63。媒体単独、10μg/kgのShK又はPEG-ShK1μg/kgで処理したラットは全部、それぞれ31g、30g及び30gの平均を喪失したのに対して、10μg/kgのPEG-ShK又は100μg/kgのPEG-ShKで処理したラットは、それぞれ18g及び11gを喪失した。後者の2群中のラットは、研究の終了時までに回復の徴候である体重の増加を表した。10μg/kgのShK及び10μg/kgのPEG-ShKで処理したラットは、ShKペプチドのモル当量を受容したことに留意すべきである。非結合型ShKに対してPEG-ShK分子の有意により大きな有効性は、PEG-ShK分子のより大きな安定性及びインビボでの長期間の半減期によるものであるらしい実施例44参照。Kv1.3アンタゴニストペプチドを包含する組成物は、ヒト全血において炎症を遮断するIL-2及びIFN-gの分泌に及ぼすKv1.3阻害剤の影響を検討するためのエクスビボアッセイ健常で、投薬を受けていないドナーから、ヘパリンバキュテナーvacutainer中にヒト全血を取得した。DMEM完全培地は、0.1ヒトアルブミンBayer68471番、55μM2-メルカプトエタノールGibco及び1×Pen-Strep-GlnPSG、Gibco、カタログ番号10378-016を含有するL-グルタミン及び25mMHepes緩衝液を有するイスコブDMEMであった。タプシガルジンは、AlomoneLabsIsraelから入手した。カルシウム動員のための4×タプシガルジンの刺激を与えるために、100DMEM中のタプシガルジンの10mMストック溶液をDMEM完全培地で40μM、4×溶液に希釈した。Kv1.3阻害剤であるペプチドShKスティコダシトラヘリアンサスStichodacytlahelianthus毒素、カタログ番号H2358及びBKCa1阻害剤であるペプチドIbTxイベリオトキシン、カタログ番号H9940はBachemBiosciencesから購入し、Kv1.1阻害剤であるペプチドDTX-kデンドロトキシン-KはAlomoneLabsIsrael製であった。Kv1.3のCHO由来のFc-L10-ShK[2-35]ペプチド阻害剤は、実施例4及び実施例39で本明細書に記載されているとおりに入手した。カルシウム阻害剤であるシクロスポリンAをAmgen試料バンクから入手したが、多様な売主からも市販されている。阻害剤の10個の3倍連続希釈を、4倍濃度の最終濃度で、DMEM完全培地中に調製し、96ウェルFalcon3075平底マイクロタイタープレートのウェルに各々50μLを添加した。マイクロタイタープレートの列1ないし5及び7ないし11は阻害剤を含有した各行は個別の阻害剤の希釈の連続を有したのに対し、列6中の8個のウェルには、DMEM完全培地単独50μLを添加し、列12の8ウェルには、DMEM完全培地単独100μLを添加した。実験を開始するために、マイクロタイタープレートの各ウェルへ、全血100μLを添加した。次に、プレートを37°C、5CO2で1時間温置した。1時間後、プレートを取り外し、8ウェルであった列12を除き、4倍濃度のタプシガルジン刺激40μM50μLを、プレートの全ウェルへ添加した。37°C、5CO2に、プレートを48時間再配置した。全血中に分泌されたIL-2及びIFN-gの量を測定するため、96ウェルプレートの各ウェルからの上清培養上清100μLを保存プレートに移した。サイトカイン産生のMSD電気化学発光分析のため、MSDMulti-SpotCustomCoatedプレートwww.meso-scale.comへ、上清馴化培地20μLを添加した。これらのプレート上の作業電極を、4つの捕捉抗体hIL-5、hIL-2、hIFNg及びhIL-4であらかじめコーティングした。馴化培地20μLをMSDプレートへ添加した後、検出抗体及びP4緩衝液の混合物150μLを各ウェルへ添加した。150μL混合物は、各1μg/mLの4つの検出抗体hIL-5、hIL-2、hIFNg及びhIL-420μL及び2×P4緩衝液130μLを含有した。プレートを覆い、振とうプラットフォーム上に一晩暗所に配置した。翌朝、MSDSectorImagerで、プレートを読み取った。各プレートの列6中の8ウェルには、タプシガルジン刺激のみのみが与えられ、阻害剤が与えられなかったので、プレートに対して高い値を算出するために、ここでは、平均MSD反応を使用した。プレートに対して算出された低い値は、タプシガルジン刺激及び阻害剤を含有しない列12の8ウェルから得られた平均MSD反応から求められた。対照の百分率POCは、刺激されていない対照と刺激された対照に対する反応の測定結果であり、100POCは、タプシガルジン刺激単独の平均反応又は高い値と等しい。それ故、100POCは、反応の0阻害を表す。対照的に、0POCは、反応の100阻害を表し、刺激が付与されない反応又は低値と等価である。対照の百分率POCを算出するため、次式:[ウェルのMSD反応-低い値]/[高い値-低い値]×100を使用する。カーブフィッティングの後、全血中の分子の有効性を阻害曲線ICから算出し、IC50は標準的なカーブフィッティングソフトウェアを使用して求めた。本発明者らは、ここに、高処理量のMSD電気化学発光アッセイを用いたサイトカイン産生の測定を記載しているが、当業者は、サイトカイン産生を測定するために、より小さな処理量のELISAアッセイを等しく適用できることに容易に想到する。Kv1.3がCD40L及びIL-2Rの細胞表面活性化を遮断することを示す生体外アッセイ健常で、投薬を受けていないドナーから、ヘパリンバキュテナー中に、ヒト全血を入手した。DMEM完全培地は、0.1ヒトアルブミンBayer68471番、55μM2-メルカプトエタノールGibco及び1×Pen-Strep-GlnPSG、Gibco、カタログ番号10378-016を含有するL-グルタミン及び25mMHepes緩衝液を有するイスコブDMEMであった。タプシガルジンは、AlomoneLabsIsraelより入手した。カルシウム動員のための4×タプシガルジンの刺激を与えるために、100DMEM中のタプシガルジンの10mMストック溶液をDMEM完全培地で40μM、4×溶液に希釈した。Kv1.3阻害剤であるペプチドShKスティコダシトラヘリアンサス毒素、カタログ番号H2358及びBKCa1阻害剤であるペプチドIbTxイベリオトキシン、カタログ番号H9940は、BachemBiosciencesから購入し、Kv1.1阻害剤であるペプチドDTX-kデンドロトキシン-KはAlomoneLabsIsrael製であった。Kv1.3のCHO由来のFc-L10-ShK[2-35]ペプチボディ阻害剤を、実施例4及び実施例39に記載されているとおりに入手した。カルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンAはAmgen試料バンクから入手したが、多様な売主から市販されている。イオンチャネル阻害剤であるShK、IbTx又はDTK-kを、DMEM完全培地中に、望ましい最終濃度の4×となるように希釈した終濃度=50又は100nM。カルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンAも、DMEM完全培地中に、4×最終濃度となるように希釈した最終濃度=10μM。96ウェルFalcon3075平底マイクロタイタープレートの適切なウェルへ、DMEM完全培地又は4×阻害剤溶液のいずれか50μLを添加した。次に、ヒト全血100μLを添加し、プレートを、37°C、5CO2で1時間温置した。1時間後、プレートを取り外し、阻害剤を含有するプレートの全ウェルへ、4×タプシガルジン刺激40μM50μLを添加した。阻害剤を含有しないが、DMEM完全培地のみを含有する幾つかのウェルにタプシガルジンも添加したのに対し、DMEM完全培地のみを有する他のウェルには、DMEM完全培地をさらに50μL添加した。阻害剤及びタプシガルジン刺激を有しないウェルは、処理されていない低対照を相当した。阻害剤を有しないが、タプシガルジン刺激を与えられたウェルは、最大刺激のための対照又は高対照に相当した。プレートを、37°C、5CO2に24時間再配置した。24時間後、プレートを取り出し、ウェルをFACS分析のために処理した。細胞をウェルから摘出し、染色緩衝液熱失活済みの2ウシ胎仔血清を含有するリン酸緩衝塩類溶液中で洗浄した。製造者の指示に従って、1.5ホルムアルデヒドBDBiosciencesを含有するBDFACSLysingSolutionを使用して、赤血球細胞を溶解した。チューブあたり染色緩衝液100μLあたり100万個の細胞の濃度で細胞を分配した。まず、ビオチン標識した抗ヒトCD4の1μLで、細胞を染色し、洗浄した後、1μLのストレプトアビジン-APC、FITC標識した抗ヒトCD45RA、及びフィコエリトリンPE標識した抗ヒトCD25IL-2Ra又はPE標識した抗ヒトCD40Lで同時に染色した。抗体添加工程の間に、細胞を染色緩衝液で洗浄した。全ての抗体は、BDBiosciencesSanDiego、CAから入手した。各試料に対して、2万ないし5万の生存事象を、BectonDickinsonFACSCaliberMountainView、CAフローサイトメーターで回収し、FlowJoソフトウェアTreeStarInc.、SanCarlos、CAを使用して分析した。前方向及び側部の散乱特性に基づいて、死滅した細胞、単球及び顆粒球を分析から排除した。図64及び図67は、CD4T細胞に及ぼすIL-2Rの活性を抑制したことに加え、Kv1.3阻害剤であるShK及びFc-L10-ShK[2-35]がヒト全血中のIL-2分泌を有効に遮断したことを示す。Kv1.3阻害剤であるFc-L10-ShK[2-35]は、IC50によって反映されるように、シクロスポリンAよりもヒト全血中のIL-2生成を遮断する上で200倍超有力であった図64図65は、Kv1.3阻害剤が、ヒト全血中のIFNgの分泌も有力に遮断したことを示し、図66は、T細胞に及ぼすCD40Lの上方制御をさらに遮断したことを示す。図64ないし67中のデータは、Fc-L10-ShK[2-35]分子が37°Cで48時間まで全血中で安定であり、炎症反応の強力な遮断を提供したことを示す。Kv1.3を標的にし、延長された半減期を有する毒素ペプチド治療薬が、インビボで、長期にわたって、これらの反応の持続的遮断を与えるために探索される。これに対して、Kv1.3阻害剤であるペプチドShKは、全血中で強力な遮断を示した事実にもかかわらず、ShKペプチドはインビトロで半減期が短く約20分C.Beetonetal.2001Proc.Natl.Acad.Sci.98,13942、それ故、長時間の遮断を提供できない。全血は、動物における反応を予測するための生理的に適切なアッセイに相当する。ここに記載されている全血アッセイは、患者の投与後の標的適用範囲及び薬物暴露を測定するための薬力学的PDアッセイとしても使用できる。これらのヒト全血データは、多発性硬化症、1型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触仲介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性強皮症、線維症、皮膚硬化症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植片拒絶反応、移植片対宿主病及び狼瘡などの、多様な免疫疾患の治療のための、本発明の組成物の治療的有用性を裏付ける。PEG化したペプチボディ実施例を通じて、本発明のPEG化したペプチボディを以下の方法によって作製した。CHOにより発現された、19.2mLのA5S、20mMのNaBH3CN、pH5中のFcL10-OsK119.2mg、分子量30,371Da、0.63μmolを、38mgのPEGアルデヒド分子量20kDa、3×、ロット104086で処理した。密閉した反応混合物を冷温室で一晩撹拌した。Superrose6HR10/30カラムAmershamPharmaciaBiotechを使用して、0.4mL/分で0.05Mリン酸塩緩衝液、0.5MNaCl、pH7.0で溶出したSECHPLCにより、反応の経過中のタンパク質修飾度をモニターした。反応混合物をA5S、pH5で一晩透析した。次に、透析した材料をA5S、pH5中のSPHPFPLCカラム16/10へ負荷し、1MNaCl勾配で溶出した。回収した画分をSECHPLCにより分析し、3つのプール中にプールし、DPBS中へと交換し、濃縮し、官能基検査に供した表34。別の実施例において、16.5mLのA5S、20mMのNaBH3CN、pH5中のFcL10-ShK116.5mg、分子量30,065Da、0.55μmolを44mgのPEGアルデヒド分子量20kDa、4×、ロット104086で処理した。密閉した反応混合物を冷温室で一晩撹拌した。Superrose6HR10/30カラムAmershamPharmaciaBiotechを使用して、0.4mL/分で0.05Mリン酸塩緩衝液、0.5MNaCl、pH7.0で溶出したSECHPLCにより、反応の経過中のタンパク質修飾度をモニターした。反応混合物をA5S、pH5で一晩透析した。透析した材料をA5S、pH5中のSPHPFPLCカラム16/10へ負荷し、1MNaCl勾配で溶出した。回収した画分をSECHPLCにより分析し、3つのプール中にプールし、DPBS中へと交換し、濃縮し、官能基検査に供した表34。表34中のデータは、Kv1.3阻害剤としてのPEG化されたペプチボディ分子の有効性を示す。PEG化された毒素ペプチドShK及びOsk-1のPEG化、精製及び分析合成ShK又はOSK1-1毒素ペプチドのN末端での還元的アルキル化によって、ペプチドを選択的にPEG化した。20mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム及び20kDaのモノメトキシ-PEG-アルデヒドNektarTherapeutics、Huntsville、ALの2モル過剰量を含有する50mMNaH2PO4、pH4.5反応緩衝液中の2mg/mLで、Shk又はOSK-1のいずれかの毒素ペプチドを使用して、結合を達成した。結合反応物を室温で一晩撹拌し、その進行をRP-HPLCによってモニターした。完了した反応を、20mMNaOAc、pH4による4倍希釈により停止し、pH3.5に調整し、4°Cに冷却した。次に、4°Cで、SPセファロースHPカラムGEHealthcare、Piscataway、NJを使用して、20mMNaOAc、pH4.0中の直線的な0ないし1MのNaCl勾配で溶出して、PEG-ペプチドをクロマトグラフィー精製した図68A及び図68B。溶出したピーク画分をSDS-PAGE及びRP-HPLCにより分析し、プールしたものを測定したところ、純度97超であった。観察される主な夾雑物質は、ジPEG化した毒素ペプチド及び修飾されていない毒素ペプチドであった。3kDaMWCO膜に対する遠心ろ過によって、選択されたプールを2ないし5mg/mLに濃縮し、5ソルビトールを有する10mMNaOAc、pH4中へと透析した。次に、透析したプールを0.2ミクロンフィルターでろ過滅菌し、SDS-PAGE及びRP-HPLCによって純度が97超であることを決定した図69A及び図69B。0.1TFA/H2O中のZorbax5μm300SB-C84.6×50mmカラムPhenomenexを1mL/分で稼動させ、カラム温度を40°Cに維持したAgilent1100モデルHPLCで、逆相HPLCを実施した。PEG-ペプチドの試料20μgを注入し、直線的な6ないし60勾配中に溶出する間、215nm及び280nmの波長でモニターした。ホールセルパッチクランプによって実施される電気生理学的実験実施例36参照は、ヒトKv1.3チャネルを安定して発現するHEK293細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断において、PEG-OSK1は1.285nMの、PEG-ShK[1-35]は0.169nMのピークIC50を生じた図74。20KのPEG-ShK[1-35]及びPEG-ShKとも呼ばれる精製されたPEG-ShK[1-35]分子は、小さなShKペプチドよりもインビボでの半減期が非常に長かった図59及び図60。PEG-ShK[1-35]はラットにおいて重度の自己免疫性脳脊髄炎を抑制し実施例45、図61ないし63、小さな固有のShKペプチドよりも大きな有効性を示した。ShK及びOSK1毒素ペプチドのFcループ挿入図70、図71、図72及び図73に例示されているように、Geggetal.,ModifiedFcmolecules、WO2006/036834A2[PCT/US2005/034273]中の実施例1に公開されている方法に従って、配列D137E138L139T140K141として定義されるヒトIgG1Fc-ループドメイン中にジスルフィドにより抑制される毒素ペプチドを挿入した。3つの連結されたドメインを有する典型的なFcループ-L2-OsK1-L2、Fcループ-L2-ShK-L2、Fcループ-L2-ShK-L4及びFcループ-L4-OsK1-L2を調製した。これらを回収、精製し、官能基検査へ供した。これらの実施例に関するペプチド挿入は、Fc残基Leu139とThr140との間であり、挿入されたペプチドのいずれかの側に隣接するリンカーとして2ないし4個のGly残基を包含した。しかしながら、本分野で公知のように、例えばGeggetal.,ModifiedFcmolecules,WO2006/036834A2[PCT/US2005/034273]の実施例13に記載されるとおり、ヒトIgG1Fc配列に関する代替的な挿入部位又は異なるリンカーも、本発明の実施においても有用である。E.コリからのShK2-35-L-Fcの精製本明細書の上述の実施例16に記載されるように入手された冷凍したE.コリペースト117gを、室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH7.5の1200mLと組み合わせ、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。冷却した懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置に12,000PSIで2回通過させた。次に、4°C、17,700gで30分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを1デオキシコール酸1200mL中に再懸濁した後、4°C、17,700gで30分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを1200mLの水中に再懸濁した後、4°C、17,700gで30分間遠心分離した。次に、ペレット6.4g合計14.2gを128mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に溶解した。次に、ペレット溶液を1MのDTT0.67mLとともに、37°Cで60分間温置した。還元した材料を4°C、2mL/分で再折りたたみ緩衝液3M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、2.5mMEDTA、2.5mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH9.55500mLへと、激しく撹拌しながら移した。次に、撹拌速度を低下させ、温置を4°Cで3日間続行した。再折りたたみ液を水5.5Lで希釈し、酢酸を使用してpHを8.0に調整した後、溶液を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過し、室内の35mLのAmershamMabSelectカラム内径2.6cmで、8°CでQ-緩衝液A20mMトリス、pH8.5中の35mLのAmershamQセファロース-FF内径2.6cmカラムへ10mL/分で負荷した。負荷した後、Qセファロースカラムを回路から除去し、残存するクロマトグラフィーをMabSelectカラムで実施した。カラムをQ-緩衝液Aの数カラム容積で洗浄した後、100mMグリシン、pH3.0への工程を使用して溶出した。望ましい生成物を含有する画分を8°CでS-緩衝液A10mMNaH2PO4、pH7.0中の5.0mLのAmershamSP-セファロースHPカラムへ5.0mL/分で直ちに負荷した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析した。望ましい生成物のバルクを含有する画分をプールした後、8°CでMEP緩衝液A20mMトリス、200mMNaCl、pH8.0中の50mLのMEPHypercelカラム内径2.6cmへ10mL/分で適用した。5ないし50の直線勾配のMEP緩衝液50mMクエン酸ナトリウム、pH4.0で、カラムを溶出した後、100MEP緩衝液Bへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して画分を分析し、望ましい生成物のバルクを含有する画分をプールした。次に、10kDaメンブレンを有するPallJumbo-Sepを使用して、MEPプールを約10mLに濃縮した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈した組み合わせたプール50μLに対して、スペクトル走査を実施した図76A。次に、30,253の算出された分子量及び36,900M-1cm-1の吸光係数を使用して、材料の濃度が3.7mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、材料の純度を評価した図76B。次に、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9中のPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへと1mL/分で注入された生成物70μgに対して、280nmでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図76C。次に、RP-HPLCカラムVydacC4、1×150mmを通じて、試料約4μgをクロマトグラフィーにかけることによって、生成物を質量スペクトル分析へ供した。溶媒Aは、水中の0.1トリフルオロ酢酸であり、溶媒Bは、90アセトニトリル、10水中の0.1トリフルオロ酢酸であった。80μL/分の流速で、10溶媒B中でカラムをあらかじめ平衡化した。質量分析計の製造者によって提供されるBioworksソフトウェアを使用して、質量スペクトルの逆重畳を行った図76D。生成物を0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過した後、-80°Cで保存した。表35では、E.コリ由来の精製されたShK[2-35]-L-Fcに関するIC50データを、本発明の組成物の他の幾つかの実施形態と比較する。E.コリからのShK1-35-L-Fcの精製本明細書の上述の実施例15に記載されているように入手された、冷凍したE.コリペースト65gを、室温の50mMトリスHCl、5mMEDTA、pH7.5の660mLと合わせて、約0.1mg/mLのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、12,000PSIで2回通過させた。次に、4°C、17,700gで30分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、660mLの1デオキシコール酸中にペレットを再懸濁した後、4°C、17,700gで30分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、660mLの水中にペレットを再懸濁した後、4°C、17,700gで30分間遠心分離した。次に、ペレット13gを130mLの8MグアニジンHCl、50mMトリスHCl、pH8.0中に溶解した。次に、1MのDTT0.1mLとともに、ペレット溶液10mLを、37°Cで60分間温置した。4°C、2mL/分で、激しく撹拌しながら、再折りたたみ緩衝液2M尿素、50mMトリス、160mMアルギニンHCl、2.5mMEDTA、2.5mMシスタミンHCl、4mMシステイン、pH8.51000mLへと、還元した材料を移した。次に、撹拌速度を低下させ、4°Cで3日間、温置を続行した。再折りたたみ液を水1Lで希釈し、0.22μm酢酸セルロースフィルターでろ過した後、室内の35mLのAmershamMabSelectカラム内径2.6cmで、8°CでQ-緩衝液A20mMトリス、pH8.5中の35mLのAmershamQセファロース-FF内径2.6cmカラムへ10mL/分で負荷した。負荷した後、Qセファロースカラムを回路から除去し、残存するクロマトグラフィーをMabSelectカラムで実施した。Q-緩衝液Aの数カラム容積でカラムを洗浄した後、100mMグリシン、pH3.0への工程を使用して溶出した。望ましい生成物を含有する画分を8°C、5.0mL/分で、S-緩衝液A20mMNaH2PO4、pH7.0中の5.0mLのAmershamSP-セファロースHPカラムへと直ちに負荷した。次に、カラムをS-緩衝液Aの数カラム容積で洗浄した後、5から60までのS-緩衝液B20mMNaH2PO4、1MNaCl、pH7.0の直線勾配の後、100S-緩衝液Bに至る工程を実施した。クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、画分を分析した。望ましい生成物のバルクを含有する画分をプールした。次に、10kDaメンブレンを有するPallJumbo-Sepを使用して、S-プールを約10mLに濃縮した。次に、HewlettPackard8453分光光度計を使用して、700μLのPBS中に希釈した組み合わせたプール20μLに関して、スペクトル走査を実施した図77A。次に、30,409g/molの算出された分子量及び36,900M-1cm-1の吸光係数を使用して、材料の濃度が3.1mg/mLであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス-グリシン4ないし20SDS-PAGEを使用して、材料の純度を評価した図77B。次に、280nmでの吸光度を観察する、50mMNaH2PO4、250mMNaCl、pH6.9中のPhenomenexBioSepSEC3000カラム7.8×300mmへと1mL/分で注入された生成物93μgに関して、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した図77C。次に、MALDI質量分析法による質量スペクトル分析へ、前記生成物を供した。試料プレート上で、MALDIマトリクスシナピン酸とともに、試料の一定分量を点状滴下した。スペクトルを回収するために、窒素レーザー337nm、3ナノ秒パルスを装備したVoyagerDE-RP飛行時間質量分析計を使用した。25kVの加速電位で陽イオン/直線モードを使用した。約200のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た図77D。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。ShK[1-35]-L-Fcとも呼ばれる、E.コリ由来の精製されたMet-ShK1-35-FcによるヒトKv1.3の遮断のためのIC50が、本明細書の上述の表35に示されている。Kv1.3のOsK1-L-Fc阻害剤の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されているとおりであった。使用されるベクターは、pAMG21amgR-pep-Fcであり、OsK1-L-Fcの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。Kv1.3のGly-ShK1-35-L-Fc阻害剤の細菌での発現細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例3に記載されているとおりであった。使用されるベクターは、pAMG21amgR-pep-Fcであり、Gly-ShK1-35-L-Fcの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖以下参照を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。ペプチボディの細菌での発現は、実施例3に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。略語本明細書を通じて使用される略語は、特異的な事情において別段の定義がなければ、以下に定義されるとおりである。Acアセチル化残基を指すのに使用されるアセチルAcBpaアセチル化p-ベンゾイル-L-フェニルアラニンADCC抗体依存的な細胞傷害性Aibアミノイソブチル酸bAβ-アラニンBpap-ベンゾイル-L-フェニルアラニンBrAcブロモアセチルBrCH2COBSAウシ血清アルブミンBzlベンジルCapカプロン酸COPD慢性閉塞性肺疾患CTL細胞傷害性Tリンパ球DCCジシクロヘキシルカルボジイミドDde1-4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデンエチルESI-MS電子スプレーイオン化質量分析法FmocフルオレニルメトキシカルボニルHOBt1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHPLC高速液体クロマトグラフィーHSLホモセリンラクトンIB封入体KCaILCa、BKCa、SKCaを含むカルシウム活性化カリウムチャネルKv電位開口型カリウムチャネルLauラウリン酸LPSリポ多糖LYMPHリンパ球MALDI-MSマトリクス介助レーザーデソープションイオン化質量分析法MeメチルMeOメトキシMHC主要組織適合遺伝子複合体MMPマトリクスメタロプロテアーぜ1-Nap1-ナフチルアラニンNEUT好中球NleノルロイシンNMPN-メチル-2-ピロリジノンPAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動PBMC末梢血単核細胞PBSリン酸緩衝塩類溶液Pbf2,2,4,6,7-ペンダメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニルPCRポリメラーゼ連鎖反応Pecピペコリン酸PEGポリエチレングリコールpGluピログルタミン酸Picピコリン酸pYホスホチロシンRBSリボソーム結合部位RT室温25°CSarサルコシンSDSドデシル硫酸ナトリウムSTKセリン-トレオニンキナーゼt-Boctert-ブトキシカルボニルtButert-ブチルTHF胸腺体液性因子Trtトリチル"