"発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がんおよび致命的出血の治療または予防に用いるための、式で示される化合物。R1COOH式中、R1は骨格上の任意のCの位置にC16アルキル基分岐鎖として有していてもよいC711骨格を有するアルキルまたはアルケニル基であるか、またはそれらの薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステルであり、前記アルキル又はアルケニル基、及び/又は前記分岐アルキル基の骨格内に、1以上のヘテロ原子が介在していてもよく、ただし、R1がC7骨格を有するアルキル基の場合、分岐はR1のα位炭素上のヘキシル基のみから成ることはなく、もしくはR1のγ位炭素上のメチル基のみから成ることはなく、もしくはR1のβ位およびω1位の両方における炭素上の単一のメチル基のみから成ることはなく、R1がC8またはC11骨格を有するアルキル基の場合、分岐はR1のα位炭素上のプロピル基のみから成ることはない。R1がアルキル基である、請求項1の治療用化合物。R1がC710骨格を有するアルキル基である、請求項1または2の治療用化合物。R1が少なくとも1つの分岐点をもつアルキル基である、請求項1~3の何れか一項の治療用化合物。C14アルキル基から成る分岐鎖を有する、請求項1~4の何れか一項の治療用化合物。R1が分岐しないアルキル基である、請求項1~3の何れか一項の治療用化合物。発作関連障害の治療または予防のために用いる、請求項1~6の何れか一項の化合物。発作関連障害がてんかんである、請求項1~7の何れか一項の治療用化合物。ノナン酸、デカン酸、4-エチルオクタン酸、2-プロピルオクタン酸、2-ブチルオクタン酸、4-メチルオクタン酸、8-メチルオクタン酸、3-メチルノナン酸および3-メチルウンデカン酸から選ばれる、請求項1~8の何れか一項の治療用化合物。アルキル基またはアルケニル基中のヘテロ原子が、酸素、硫黄または窒素から成る群より選ばれる、請求項1~8の何れか一項の治療用化合物。VPAは、多数の広範な疾患に処方されているにもかかわらず、催奇形性や肝毒性を含む望まない副作用を多数有する。よって、副作用が低減された、より高い活性を有する抗てんかん薬が緊急に必要とされている。国際特許出願WO9902485には、VPAの誘導体がてんかん、躁病、双極性障害及び疼痛の治療に用いられることが開示されている。WO9902485は化合物として特に2-プロピルヘプチル酢酸、2-プロピルデカン酢酸及び1O-ステアロイル2プロピルヘプチルアセトイルsn-グリセロ3ホスホチジルコリンを開示している。本発明者等は、生物医学的モデルとしてタマホコリカビDictyosteliumを用い、VPAが急激なホスホイノシタイドの代謝回転の減衰の原因となっていることを見出し、この効果がホスファチジルイノシトール3キナーゼPI3K活性の直接の阻害に基づくものではなく、イノシトールの再利用の調節を通じて引き起こされるものでもないことを見出した。また、本発明者等は、VPAが、放射標識されたAA及びパルミチン酸飽和の長鎖脂肪酸の放出の減少及び再取り込みの増加の両方を引き起こすことを見出した。このVPAに触媒される効果は脂肪酸活性化の減少によるものではない。さらに、構造活性相関研究は、これらの作用機序に対する高度の構造特異性を示した。これにより、VPAに類似の治療可能性を示す一方で、副作用低減及び又は治療活性の増加の可能性を伴う化合物群を同定することが可能になった。本発明の第1の観点に従って、下記式で示される化合物を提供する。R1COOH式中、R1は、骨格上の任意のCの位置にC16アルキル基を分岐鎖として有していてもよいC711骨格を有するアルキル又はアルケニル基であるか、又はそれらの薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステルであり、前記アルキル又はアルケニル基、及び又は前記分岐アルキル基の骨格内に、1以上のヘテロ原子が介在していてもよく、ただし、R1がC7骨格を有するアルキル基の場合、分岐はR1のα位炭素上のヘキシル基のみから成ることはなく、もしくはR1のγ位炭素上のメチル基のみから成ることはなく、もしくはR1のβ位およびω1位の両方における炭素上の単一のメチル基のみから成ることはなく、R1がC8またはC11骨格を有するアルキル基の場合、分岐はR1のα位炭素上のプロピル基のみから成ることはなく、上記化合物は、発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がんおよび致命的出血の治療または予防に用いるためのものであり、化合物が2-メチル2-ペンタン酸である場合、疾患又は症状は双極性障害またはてんかんではない。本明細書に記載の上記化合物は、ホスホイノシトールの代謝回転及び又は脂肪酸の代謝回転を迅速に減衰させることが判明した。ホスホイノシトール及び脂肪酸代謝回転の減弱は、VPAの作用機序として特定されているから、これらの化合物はVPAで治療されうる症状、例えば、発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、特に、てんかん、双極性障害及び偏頭痛の治療または予防に有用である可能性を有する。一実施態様において、R1はC7骨格を有するアルキル基である場合、分岐はR1のω1炭素におけるメチル基のみから成ることはなく、好ましくはR1のω1炭素におけるメチル基を含むことはない。本発明の目的のために使用される化合物は、それだけに限られるものではないが、ノナン酸、デカン酸、4エチルオクタン酸、2プロピルオクタン酸、2ブチルオクタン酸、4-メチルノナン酸、8-メチルノナン酸、3メチルノナン酸、及び3メチルウンデカン酸が挙げられる。本明細書において、用語CXY骨格を有するアルキル基は、xからy個の炭素原子を含む直鎖の飽和炭化水素をいう。例えば、C14骨格を有するアルキル基は、分岐しない1から4の炭素原子を含む飽和炭化水素基をいう。C14骨格を有するアルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル及びブチルなどが含まれる。本明細書において、用語CXY骨格を有するアルケニル基は、xからy個の炭素原子と、少なくとも1例えば、1,2,3又は4の二重結合をを含む直鎖の不飽和炭化水素をいう。例えば、C35骨格を有するアルケニル基は、分岐しない3から5の炭素原子を含む不飽和炭化水素基をいう。C35骨格を有するアルキル基の例には、プロピレン、ブチレン及びペンチレンが含まれる。用語R1のα炭素、R1のβ炭素、R1のγ炭素とは、R1を形成する炭素鎖において、式のCOOH基自体は含めずCOOH基から数えて、それぞれ1番目、2番目及び3番目の炭素原子をいう。用語R1のω1炭素とは、R1を形成する炭素鎖において、再び式IのCOOHから数えて末端から2番目の炭素原子をいう。言い換えれば、用語R1のω1炭素とは、R1中の末端のメチル基又はメチレン基の隣の炭素をいう。本明細書において、用語CXYアルキルは、xからy個の炭素原子を含む、分岐又は非分岐の飽和炭化水素基をいう。例えば、C14アルキルは、分岐する又は非分岐の、炭素数14の飽和の炭化水素基をいう。C14骨格を有するアルキルの例には、メチル、エチル、nプロピル、イソプロピル、nブチル、イソブチル及びtブチル等が含まれる。本発明化合物の医薬的に許容される塩には、無機塩基の塩、有機塩基の塩、無機酸の塩、有機酸の塩、塩基性又は酸性のアミノ酸の塩などが含まれる。ある場合には、特に塩基の塩が採用される。本発明の化合物は水和物であっても無水物であってもよい。本発明化合物の医薬的に許容されるアミドとは、上記化合物のカルボキシルすなわち、COH基がアミンNHR1’R2’と反応してCNR1’R2’基を生成するような反応によって修飾されるものであり、ここで、R1’とR2’は場合により、独立してHC18アルキル例えばC16アルキル、アリール、ヘテロアリール及びC38シクロアルキル基である。本発明化合物の医薬的に許容されるエステルは、上記化合物のカルボキシルすなわち、COH基がアルコール部分WOHと反応してCOOW基を生成するような反応によって修飾されるものであり、ここで、WはC118アルキル例えば、C16アルキル、アリール、ヘテロアリール又はC38シクロアルキルである。塩、アミド及びエステルを調整するための一般的な方法は、当業者に周知である。塩、アミド及びエステルが医薬的に許容されるか否かは、製剤加工特性や生体内での挙動を含む種々の要因に依存する。当業者であれば、本開示に関するそれらの要因を容易に評価することができる。本発明のある実施形態では、R1はアルキル基である。本発明のある実施形態では、R1はC710骨格を有するアルキル基である。本発明のある実施形態では、R1はアルキル基であり、少なくとも1点で分岐を有し、例えば、1、2又は3点で分岐を有する。本発明のいくつかの実施形態において、R1はC710骨格アルキレン基は骨格上の任意の位置で分岐し、好ましくは、R1のα、β、γ又はω1炭素において分岐する。本発明のある実施形態において、分岐はC14アルキル基、メチル、エチル、プロピル又はブチル基、好ましくはメチル、エチル又はプロピル基から成る。特定の実施形態において、R1は分岐したエチル、プロピル又はブチル基を有する、C7骨格のアルキル基である。特定の実施形態において、R1は分岐したメチル基を有する、C8骨格のアルキル基である。特定の実施形態において、R1は分岐しないアルキル基である。特定の実施形態において、R1はC89の分岐しないアルキル基である。いくつかの実施形態において、アルキル又はアルケニル基中の1又はそれ以上のヘテロ原子が酸素、硫黄及び窒素から成る群より選ばれる。好ましくは、1又はそれ以上のヘテロ原子は酸素である。特定の実施形態において、本発明の化合物は、発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がんおよび致命的出血、特にてんかん、双極性障害及び偏頭痛から選ばれる疾患又は生物医学的症状の治療又は予防に用いられる他の薬理活性物質と組み合わせて独立に、同時に、又は連続して投与される。特定の実施形態によれば、本発明の第1の観点に従う化合物を2種以上用い、これらを独立に、同時に、又は連続して投与してもよい。2番目の観点として、本発明はまた、発作関連障害、発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がんおよび致命的出血、特にてんかん、双極性障害及び偏頭痛から選ばれる疾患又は生物医学的症状の予防又は治療の方法を提供し、その方法は、治療又は予防を必要とする被験体に対して、本発明の第1の観点により用いられる治療有効量の化合物を投与することを含む。上記化合物は、1又はそれ以上の、無毒の医薬的に許容される担体、アジュバント又は賦形剤とともに投与してもよい。本発明の最初の見地に従って使用される無毒の医薬的に許容される担体、アジュバント又は賦形剤は、製剤設計の分野で慣用的に採用されるものであり、限定されるものではないが、例えば、糖、糖アルコール、デンプン、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク、例えば、ヒト血清アルブミン、リン酸塩などの緩衝剤、グリセリン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、部分的にグリセリド混合した飽和植物性脂肪酸、水、塩又は電解質、例えばプロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース物質、ポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロック重合体、ポリエチレングリコール及びラノリンが挙げられる。化合物は経口又は非経口で、例えば吸入スプレー、直腸、経鼻、舌下、経膣又は埋め込み容器により投与される。ここで非経口の用語は皮下、皮内、静脈内、筋肉内、間接内、滑液内、胸骨内、莢膜内、病変部内、頭蓋内の注射又は点滴の投与技術をいう。本発明において使用される化合物は無菌注射用調製物、例えば、無菌水性又は油性懸濁液等の形態で投与される。この懸濁液は分散剤、湿潤剤例えば、Tween80等及び懸濁剤を用い、公知の技術により形成される。また、無菌注射用調製物は、無毒性の非経口投与可能な希釈剤又は溶液中の無菌注射用溶液又は懸濁液、例えば、13ブタンジオール溶液等であってもよい。許容される賦形剤及び溶媒のうち、マンニトール、水、リンゲル液Ringer’ssolution及び生理食塩水が用いられ得る。加えて、殺菌された固定油脂が溶媒又は懸濁化剤として用いられる。この目的のために、合成されたモノ又はジグリセリドを含む無刺激の固定油脂が用いられ得る。脂肪酸、例えばオレイン酸及びそのグリセリド誘導体は注射物質の調製に有用であり、同様に天然の医薬的に許容される油脂、例えばオリーブ油、ヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチレン化された型のものなどが挙げられる。これらの油脂の溶液又は懸濁液はまた、PhHelvに掲載されているような長鎖アルコールの希釈剤又は分散剤、又は類似のアルコールが用いられ得る。本発明の化合物は、任意の経口的投与可能な投薬形態で経口投与することができる。例としては、これらに限定されるものではないが、カプセル、錠剤、粉末剤、顆粒剤、水性の懸濁液又は溶液が含まれる。これらの投薬形態は製剤処方における周知の方法により調製される。経口投与のための錠剤の場合、一般的に用いられる担体としてラクトース及びコーンスターチを含む。潤滑剤として、通常、例えばステアリン酸マグネシウムも加えられる。経口投与のためのカプセル剤のために、有用な希釈剤としてラクトース及び乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液が経口投与される場合、活性成分は乳化剤及び懸濁剤と組み合わせられる。必要であれば、甘味料、及び又は香料、及び又は色素が添加され得る。また、本発明のための化合物は、直腸投与剤型として直腸投与してもよい。この目的においては、当該化合物を、室温では固体であるが直腸の温度では液体であり、直腸内で溶融して活性薬物を放出し得る、適切な無刺激性の賦形剤と混合すればよい。これらの物質には、限定されるものではないが、カカオ油脂、ミツロウ及びポリエチレングリコールが含まれる。本発明に用いられる化合物は、鼻エアロゾル又は吸入によって投与してもよい。この目的においては、当該化合物は、製剤処方における周知の方法により調製される。生理食塩水溶液としては、ベンジルアルコール又は他の適した保存料、バイオアベイラビリティを増強させるための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び又は技術的に知られた他の溶解又は分散補助剤を用いて調製され得る。本発明のために用いられる化合物は、治療又は予防される症状に応じて、及び化合物とともに投与される物質の性質に応じて、1回投与につき約1から約20000μgkgの投与量で投与される。多くの例において、投与量は1回投与につき約1から約1500μgkgである。特定の化合物の用法は当業者がこの開示を利用することにより、容易に決定される第3番目の観点において、本発明は、発作関連疾患、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がんおよび致命的出血から選ばれる疾患又は生医学的症状の治療または予防のための治療薬の調製における、本発明の第1の観点によって定義される化合物の使用を提供する。1.材料と方法11化学物質と遺伝子全ての化学物質はシグマ社SigmaUKLtdより提供された。バルプロ酸誘導体はアルドリッチ社AldrichUKアルファエイサーアボカドAlfaAesarAvocadoケムサンプコChemSampCoケムコChemCoTheNCIDTPOpenChemicalRepository又はTCIeuropeより提供された。放射標識されたATPはパーキンエルマー社より提供された。タマホコリカビDictyostelium変異株はディクティベースDictybaseorgより提供された。ただし、5xPI3Kノックアウト及びrPKAノックアウト型の菌株についてはRKay及びANoegelより寄贈された。タマホコリカビDictyostelium培地はフォメディウムFormedium、NorfolkUKより供給された。3H標識アラキドン酸はHartmannanalyticより、3H標識パルミチン酸はパーキンエルマー社より購入した。12細胞及び培養タマホコリカビDictyostelium細胞はアキセニックAxenic培地中又はサスマンスSussmans培地プレート上で、ラオウルテアプランティコラRaoultellaplanticolaとともに培養した。全標識細胞の人工培養は、22°Cの細胞振盪器を用い、cAMPによる刺激を6分毎に4時間に亘って印加しながら、リン酸緩衝液1ml中25×106細胞に達するまで、前述のように実施した。13タマホコリカビDictyosteliumリン脂質標識化及びイノシトール解析タマホコリカビDictyostelium用のサポニンによる細胞透過化処理のプロトコルを本発明の実験に適用した。DictyosteliumAX2細胞は前述のように5時間培養し、静置培養皿に移送し、KK2中で静置してコンフルエントな単層を生じさせ、これを化合物により3分間に亘って予処理した。所定の間隔を措いて、緩衝液を標識溶液サポニン1xホスファターゼ阻害剤混合物1及び2及び1μCimlγ32PATPで置換し、化合物を規定の濃度となるように補充した。6分間のインキュベーションに続き、標識された溶液を除去し、細胞を酸性化メタノールで溶解させ、リン脂質を分離した先に詳述した手順のとおり。リン脂質標識体はTyphoonリン酸撮像装置Typhoonphosphorimagerを用いて定量した。硫酸銅による総脂質染色を用いて均一なロード量を決定した。イノシトール濃度は、細胞を5時間培養した後、凍結乾燥してから測定した前述のとおり。14インビトロてんかんモデルラットを過剰のペントバルビトンpentobarbitoneの腹腔内投与により屠殺した後、断頭した。大脳を除去し、氷冷したスクロース溶液単位:mM、:NaCl87KCl25MgCl27CaCl205NaH2PO4125スクロース75グルコース25を充填し、95O25CO2の平衡状態とした。Leicavibratomeにより内嗅皮質海馬結合水平切片350μmを調製した後、この切片を人工脳脊髄液含有量:mM、NaCl119KCl25MgSO44CaCl24NaHCO3262NaH2PO41グルコース11を含み、95O25CO2のガスを充填したインターフェイスチャンバー内で保存した。1時間以上の保存後、当該切片を予め浸潤させた記録チャンバーに移送した。記録チャンバーには記録のためカルボゲン化carbogenatedされたaCSF連続的に還流させた。磁場電位の記録は、aCSF溶液で満たされたCA1ガラス微小電極、CA1の放線状層stratumradiatumに留置することにより行った。切片の生死を判別するために、双極性の刺激電極をシャファー側枝交連神経線維経路の放線状層stratumradiatumに留置した。PTZ急性発作モデルでは、PTZを還流液に加え、カリウムイオン濃度Kを6mMまで増加させ、目的となるてんかん様の活動を誘導した。低濃度マグネシウムイオンMg2急性発作モデルでは、Mg2を含まないaCSFを適用して、律動性の短期反復性の放出を発生させた。てんかん様の放出の頻度及び強度が10分間に亘って安定したところで、新規な抗痙攣剤を投与した。抗痙攣剤の評価は、放出頻度の変動を毎分ごとに測定することにより行った。新規な抗痙攣剤の投与後30分から40分の間に得られたデータをANOVAにより比較した後、Tukey検定及びSPSS統計解析を用いて事後試験を行った。15インビボのてんかんの症状この方法はすでに詳細に述べたとおりである。端的には、雄のSpragueDawleyラットを12イソフランO2で麻酔した。接地電極を皮下に装着し、単極の記録用電極を右海馬内へ定位的に留置した座標、ブレグマから側方25mm、尾方4mm。有孔質路を刺激するために、双極記録用電極を右脳半球内の角神経束angularbundle内に挿入した座標、ブレグマから側方44mm、尾方81mm。電極の深さは、歯状回顆粒細胞の電場電位の傾斜が最大になるように調節した。デンタルアクリル及び頭蓋骨用ねじを用いて電極を設置した。動物を放置して麻酔から覚醒させた。7日後、有孔質路に対して4~5mAの50μsecの単極パルスで、20Hzで2hrに亘って電気刺激を与えることにより、自律的なてんかん様症状の状態を誘導した。自律的なてんかん様症状を10分間継続した後、化合物またはビヒクルを投与し、発作による行動及びEEGを3時間にわたって測定した。この時点でてんかん様症状を止めるため、全ての動物に対してジアゼパムを投与した。各群をANOVAにより比較された後、テューキー検定及びSPSSを用いた事後試験を行った。16脂肪酸の取込み及び放出タマホコリカビDictyostelium細胞を以下の手順でトリチウム化脂肪酸により標識した。即ち、15×106細胞mlの培養液を、05μCiの3H標識脂肪酸を加えた05BSAとともに、2回ごとにインキュベートした。45×106の細胞を除去し、リン酸緩衝液で1回洗浄し、リン酸緩衝液に再懸濁することにより一定時間で検体を調製し、シンチレーションカウンターによる計測に供した。脂肪酸放出実験のために、細胞を上記のように4時間電気刺激し、脂肪酸不含有BSAを添加したリン酸緩衝液に15×106細胞mlの濃度で再懸濁され、更に1時間に亘ってサンプリングを行った。取込まれない放射活性物を除去するため、細胞を洗浄し、規定時間ごとに上清をシンチレーションカウンターで測定した。結果のモデル化にはGraphpadPrismソフトウェアを用いた。ボディパイBodipy標識化は4時間刺激後の細胞を用い、蛍光化脂肪酸とともに、VPAの存在又は非存在下、30分間インキュベートすることにより行った。OlympusIX71倒立蛍光顕微鏡及びRetigaFastA1394カメラによって画像を記録し、ImageProTM登録商標ソフトウェアによって解析した。17変異体の単離、反復発生、及び成長REMIライブラリのスクリーニングは、前述のように、Ax2バックグラウンドを用い、1mMVPAの存在下でのR.プランチコラRplanticolaの成長能力に基づいて選択された、VPA抵抗性変異体を用いて行った。除去された遺伝子を同定することにより、ノックアウトカセットの相同組み換えを用いて、同定されたPLAaを反復させることが可能となった。遺伝子のオープンリーディングフレーム領域の増幅は、プライマーとしてpCR21TOPOによりクローン化されたを挿入物のEcoRV挿入部位へ挿入した。遺伝子破壊はPCR解析によって確認された。VPAに対する成長抵抗性は、1mMVPA又は対照の何れかを含むリン酸緩衝液に浸漬した47mmニトロセルロースフィルター上に被覆した細胞をプレーティングし、特に指定のない限り30時間後の成長状態を記録することにより評価した。が、1mMVPA又は対照のいずれかを含むリン酸緩衝液中に浸潤されることによって評価され、特に指定のない限り30時間後の成長状態を記録した。成長の画像はLeicaCLS150X顕微鏡を用いて観察し、QICAMFAST1394カメラを用いて記録した。脂肪酸の活性化は、Wilsonらの方法に若干の改良を加え確立された方法により決定した。簡潔には、無菌培養された1×107細胞を沈殿させ、10mlの予冷1MTrisHClで1回洗浄し、それらを4°Cで30分間、1Triton及びプロテアーゼ阻害剤混合物を含む100μlの1MTrisHClで溶解させることにより、抽出物を調製した。20μgのタンパク質を含む体積140μlの抽出物を、250mMTrisHCl、10mMMgCl2、3mMATP、06mMEDTA、025Triton及び25mMDTTを含む緩衝液400μlで希釈された。100μMのメタノールストック由来の放射標識されていないパルミチン酸40μl、及び5μlの3Hパルミチン酸を基質として用いた。反応は、20μlの10mMコエンザイムA溶液を加えて35°Cでインキュベートした。10分後、500μlのドール培地を反応停止のためにが加た。卓上遠心分離機を用いて14000rpm、30秒の遠心分離を行うことにより層分離を行った。有機層は廃棄し、水層を300μlのnヘプタンで6回洗浄し、活性化されない脂肪酸を除去し、水層に残るアシルCoAチオエステルの放射活性を、2mlのLumasafeTM登録商標、Plusfluidを用いて、シンチレーションカウンターで測定し決定した。2結果21VPAはホスホイノシタイドのシグナル伝達を減衰させる。VPAのホスホイノシタイドのシグナル伝達における急性効果は明らかにされていないが、最初に、発明者等はタマホコリカビDictyosteliumにおける時間及び濃度依存の薬物の挙動を検証した。05mMVPA処置に続いてホスホイノシタイドのリン酸化の急激な減少が観察され、6分間のVPA処置において、放射標識されたPIP及びPIP2両方の代謝回転が49減少し、60分間のVPA処置において、各ホスホイノシタイド化合物の代謝回転が94減少にまで進行した。これらの値は、ホスホイノシタイドの合成及び分解の組合せが細胞内で起こっていることを示しており、実際ホスホイノシタイドの代謝回転に反映しているが、一方、ホスファターゼ活性は阻害剤の混合物の使用により阻害された。当該効果の急性の程度は、マウスの発作モデルにおけるVPAの静脈内注射に続いて起こる、発作の制御と近似する速さで起こるものである。また、当該ホスホイノシタイドシグナル伝達の減衰は濃度にも依存し、9分間のVPA処置において、025mMのVPA投与に対しPIP及びPIP2代謝回転はそれぞれ25及び42の阻害を示し、05mMのVPA投与に対し68及び79の阻害にまで進行した-当該濃度はVPAの治療用途から導かれるものである。これらの条件下、当該VPA阻害活性はEC50が154μMを示し、取込みとは無関係であるただし、細胞はサポニン透過性である。この急性且つ強力なホスホイノシチドシグナル伝達はVPAによって引き起こされ、当該効果は治療可能性への関心を高めるものである。ホスホイノシタイドのリン酸化の急速な減衰は、当初は未知の脂質キナーゼ活性の阻害を通じて起こるものと考えられていた。脂質キナーゼの解析には従来、酵素の分類に特異的な化合物の薬理学的阻害が採用されるが、これらの研究は多数のホスファチジルイノシトールキナーゼ酵素の存在、及び阻害剤との間の重複した影響のため、複雑である。以前の研究は、VPAの、ホスファチジルイノシトール3キナーゼシグナル伝達経路影響における減衰に対する役割を提示してきたが、本発明者らは単一の細胞株由来の1PI3K遺伝子の5つの異なる型の混合物の、ホスホイノシタイドシグナル伝達における効果について解析した。これらの細胞は野生型細胞に対し28a及び44のPIP及びPIP2の産生の形成をそれぞれ示し、ホスホイノシタイドシグナル伝達における当該酵素の主要な役割であることを示唆している。VPAが触媒するホスホイノシタイドの減少がPI3K依存性であるか否かを確認するため、VPAをこれらの細胞に加えた。VPAはPIP及びPIP2の産生を、処置後9分間でそれぞれ未処置の細胞と比較して48及び70の減少が確認された。当該5つの酵素の混合物はホスホイノシタイドの代謝回転の減衰におけるVPAの標的となっていないことを示唆している。VPAが触媒するホスホイノシタイド減衰作用における他の脂質キナーゼの役割を検討するために、発明者らは2つの独立したホスファチジルイノシトールキナーゼを解析した:ホスファチジルイノシトール5キナーゼドメインを含む、エンドソームのGタンパク質共役受容体タンパク質が欠如したrPKAノックアウト変異及び核内ホスファチジルイノシトール45キナーゼ活性が欠如したPIPKinA変異。rPKAの破壊PIP及びPIP2産生において30及び54の減少を示し、それぞれ野生株型と比較し、VPA処置により、未処置のものと比較してさらに72及び33の減少となった。PIPKinAの破壊はPIP及びPIP2産生において顕著な変化を示さず、VPA処置により、未処置のものと比較して、PIP及びPIP2の合成においてそれぞれ54及び68の減少となった。3種の細胞株は全てPI3K活性の薬理学的阻害に感受性であり、これらの多様性はホスホイノシタイド代謝活性の減衰と関係することが確認される。3種の脂質キナーゼ変異全てについて感受性が減弱したことは、VPA活性の通常の作用機序が、特異的なホスファチジルイノシトールキナーゼ活性とは無関係であることを示している。ホスホイノシタイドシグナル伝達調節のもう1つの作用機序は、イノシトールリン酸経由のホスファチジルイノシトールの再利用であるが、発明者等は同質遺伝子変異におけるホスホイノシチジド代謝回転について、当該再利用経路を遮断又は活性化させ解析した。単一のホスホリパーゼC遺伝子が欠如する細胞は、野生型細胞と比較して、PIP及びPIP2代謝回転において著しい減少を示さなかった、また、VPAが触媒するPIP及びPIP2代謝回転の減衰は野生型細胞に対する場合と近いことを示した。プロピルオリゴペプチダーゼ破壊により引き起こされる約3倍高いイノシトールトリホスフェートをともなう細胞は、未処置細胞においてPIP濃度の若干の減少を示しまた、PIP2濃度は著しい変化はなくそしてVPAが触媒するPIP及びPIP2のシグナル伝達の減衰はそれぞれ66及び68であった。さらに、発明者らは、10mMのリチウムによるイノシトールモノホスファターゼ活性の阻害は、急性の処置後のホスホイノシタイドシグナル伝達を減衰させないことを示したが、長時間のリチウム処置によりPIP及びPIP2濃度が減少し、この効果はIMPaseの過剰発現により打ち消される。対して、IMPaseの過剰発現は長時間のVPA処置を打ち消さなかった。これらの結果は、イノシトールホスフェートシグナル伝達を通じたイノシトール再利用の上昇又は減少が、急性のホスホイノシタイド産生において主要な調節機能を担当せず、本モデルのVPAが触媒する急性のホスホイノシタイドシグナル伝達を克服しないことを示唆している。これらの結果は事実、VPAの作用機序イノシトールの枯渇とは無関係のホスホイノシタイドシグナル伝達に関する、最初の強力な証拠を示す。22ホスホイノシチド減衰作用の増強を示す新規化合物の同定VPAの急性のホスホイノシチドシグナル伝達減衰作用を同定することにより、当該効果に必要な化学構造を検討した。本発明のホスホイノシチド減衰作用効果を確認した化合物群につき、試験結果のまとめを以下の表1に示す。試験された化合物の大多数はホスホイノシタイド代謝回転作用をある程度阻害することが示されたが、いくつかの化合物はVPAよりも高いホスホイノシタイドシグナル伝達阻害作用を示した。当該高活性の化合物は構造的に2つの群に分類される第1群はVPAと構造が概ね類似する分岐脂肪酸から成り第2群は骨格の様々な位置において短い側鎖を有するか又は有しない、新規の化合物群である。後者において、脂肪酸の示す活性は鎖長に強く依存し、C810骨格の酸が高活性を示し例えば、4メチルオクタン酸は、PIP及びPIP2シグナル伝達を各々88及び93減衰させ、ノナン酸は各々92又は93減衰させる。表1参照、骨格の鎖長がそれより増加しても減少しても活性は減弱する。当該群において高い活性を示す化合物は全て脂肪酸であり、催奇形性の予見はなく、高い脂溶性との関連性が示されている。また、当該効果は酸性度と無関係であり、なぜならば同等の酸性度を有する直鎖カルボン酸であっても多様な活性を示すからであるにおけるホスホイノシタイドの減衰作用と酸性度pKaとを比較したものである。当該化学構造の違いは、VPAの誘導体の、ホスホイノシタイド減衰作用に対する第1の特徴を提供する。興味深いことに、脂肪酸の高い化学構造特異性は抗痙攣作用及び抗アロデニア抗ニューロパシー痛活性においても、以前より示されてきた。ある関連化合物についての、動物モデルにおける行動の予備的な観測では、強い鎮静作用は示されなかった。VPAはイノシトールのデノボ生合成の阻害剤として同定され、間接的にグルコース6リン酸からのイノシトール1リン酸産生を阻害する。イノシトールシグナル伝達のVPAによる減衰作用の役割は広く示されており、その範囲は酵母及びタマホコリカビDictyosteliumから、シノラブディスエレガンスCaenorhabditiselegansラット及びヒトに亘る。イノシトール及びイノシトール3リン酸濃度、並びにイノシトールに依存する哺乳類の成長円錐拡散性の測定は、すべてイノシトールの枯渇を示した。VPAが誘導するイノシトール濃度減少は、ここで示されるホスホイノシタイドシグナル伝達における急性の減少であるか否かは明確にされていないが、本発明者等はホスホイノシタイド代謝回転の解析を、イノシトール枯渇において活性を示す、VPAに関連する化合物を用いて行った。タマホコリカビDictyosteliumにおいて、哺乳類の成長円錐肥大に依存性のイノシトールの枯渇を伴いInsP3の強い枯渇作用を示す化合物として2メチル-2-ペンテン酸があり、当該化合物はVPAと比べてより強力なホスホイノシチド減衰作用を示した。興味深いことに、化合物のカルボン酸部分をカルボキシアミド基へ置換する対応するアミドとすると、ホスホイノシチド代謝回転の阻害作用は減弱し、また成長円錐の拡散作用も減弱した。また、VPDは、イノシトール枯渇におけるVPAの標的となるヒト筋肉イノシトール合成酵素myoinositolsynthaseについて、弱い阻害活性を示した。当該イノシトール枯渇及びホスホイノシチド減衰作用を有する化合物は、前述の第1群の化学構造群に含まれ、また、最近の研究によれば、これらの化合物は抗痙攣活性を有するいくつかの第2世代のVPAが含まれる。本研究で同定された、より長鎖の骨格の化合物群は、イノシトール枯渇に関する研究では解析されていない。イノシトール濃度の減少は当該化合物のホスホイノシタイド減衰作用における作用機序を提示する可能性があるため、本発明者等はイノシトール濃度の解析を行うにあたり、ホスホイノシタイド減衰作用効果を示す化学構造の2群のうち両群から一定範囲の化合物を用いて処置を行った。当該実験結果において、VPAは、ホスホイノシタイド減衰作用の惹起を示すのに要する時間9分間ではイノシトール濃度の顕著な減少を与えず、また他の試験化合物についても同様であり、そしてホスホイノシタイド減衰作用とイノシトール枯渇作用との間には関連性は認められなかった。この結論はタマホコリカビDictyosteliumにおける前出のデータ、すなわちイノシトールモノホスファターゼリチウムによるの急性阻害作用はホスホイノシチド減衰作用を引き起こすものではないことと合致し、そしてこの実験モデルでのイノシトール3リン酸の枯渇にはVPAの6時間の処置ここで用いられる時間よりかなり長時間を要する。よって、当該実験は、ホスホイノシタイド減衰作用がタマホコリカビDictyosteliumにおけるVPAの新規な作用を提供することを示し、当該効果において活性が増加することを示す化合物の範囲を特定するものである。発作動物モデルにおいてPIP及びPIP2の濃度増加が観察されたことからVanRooijenetal1986、本発明者等は当該作用を引き起こす新規の化合物群を見出した。23新規化合物はインビトロてんかん様モデルにおいて薬効の増強を示す本発明の放射標識化実験をインビボ動物モデルにおいて繰り返し、発明者らの作用機序に関連する知見をより高度なモデルにおいて再現することは不可能であるため、代わりに発明者等は新規化合物群の薬効について、発作制御において解析した。当該実験のため、それら彼らはVPA感受性ペンテレンテトラゾールPTZのインビトロてんかん様活性モデルを採用し、様々な側鎖の置換位置や鎖長をもつC8骨格の、新規化合物群のうち3化合物を解析した。VPAはてんかん様放出作用を顕著に減少させた。また等モル濃度のC8骨格の化合物を適用すると、VPAよりも顕著に強い薬効を示し、強力に放出作用を減少させた。新規3化合物すべての適用において、それぞれ発作の放出回数が大幅に減少した。また、発明者等は化合物を直鎖がC9及びC10骨格のものにも拡張し、同様の結果を示した。当該活性はより短鎖の骨格では見られなかった例えば、炭素数5であるペンタン酸の場合-データ示さず。これらの高活性を示す化合物は以前より発作の制御作用とは関連性はなく、また催奇形性作用の発現は予見されていなかった。これら化合物の当該効果が発作モデルに特異的なものではないことを示すために、発明者等はさらにこれらの化合物のうちの1つをインビトロ低濃度マグネシウム発作モデルinvitrolowMg2seizuremodelにおいて検討した。本発明者等は4メチルオクタン酸を、動物系統の内因性物質であるという理由から選択した。VPAの投与は、当該モデルにおける頻発性の短期放出の回数を僅かに減少させた。4メチルオクタン酸を適用した場合は、投与後3040分後の頻発性の短い放出の回数は殆ど消失した。よってこれらの結果は、4メチルオクタン酸は複数のインビトロてんかん様活性モデルにおいてVPAの活性以上の増強を示すことを示唆している。24新規化合物はてんかん重積症状statusepilepticus制御の増強を示す当該化合物について発作の動物モデルにおける薬理活性をさらに実証するため、発明者等はてんかん重積症状statusepilepticusの動物モデルにおいて4メチルオクタン酸を試験した。この試験のため、てんかん重積症状は、覚醒し自由に行動するラットにおいて、有孔質路を刺激することにより、既報告の通り誘発させた。発明者等は以前、VPAは本モデルでは高用量において効果的であるが、低用量においては部分的にのみ効果的であることを確認している。よって、発明者等は4メチルオクタン酸と、VPAとを比較した。4メチルオクタン酸の分子量は、VPAと比べて僅かに高いため、本試験の用量では4メチルオクタン酸のモル濃度が僅かに低いのみである。VPAは本モデルの発作を投与後2時間で強力に減衰させ、投与後3時間で薬効が減少し、このとき4メチルオクタン酸は実験時間を通して発作を抑制し続けた。両方の化合物はスパイク波の振幅及び頻度を減少させた:VPAはスパイク波の振幅を減少させた。これに対し、4メチルオクタン酸はより優れた制御活性を顕著に示し、スパイク波の頻度を1時間目で393±113まで減少させ、2時間目で181±103、3時間目で269±123まで減少させた。4メチルオクタン酸はてんかん重積症状を、すべてのてんかん重積症状の動物において終了させたここではスパイク波の頻度が1Hz以下で終了と定義する。さらに、4メチルオクタン酸は7匹の動物全ての発作を投与後2時間で停止させたが、一方、VPAは発作のseizure重症度を軽減させるものの発作は終了しなかった、そしてこの効果は、メチルオクタン酸投与後3時間で7匹中5匹の動物で維持された。25VPAは脂肪酸取込及び放出を調節するタマホコリカビDictyosteliumにおける、VPAに仲介されたアラキドン酸放出の調節機能の役割を解析するために、発明者等は経時的な3H標識化された脂肪酸を含む評価系を開発した。このアッセイ系評価系を用い、発明者等は、細胞の3HAA標識後、放射標識体の媒体への放出は45分間以上に亘って線形であることを示した。AA標識された細胞からの標識体の放出における、当該VPAの効果は急性且つ用量依存的であり、一方、VPAは放出活性の減少を導き、その結果はIC50が89μMであった。当該効果はAAに対して特異的ではなく、何故ならばパルミチン酸3H標識体放出もまた、VPAの存在下IC50of163μMの阻害を受けるからである。当該効果が急性であるとの性質は、30分の曝露時間後の顕著な阻害活性にみられる。放射標識された脂肪酸の放出減少は脂質中への再取込みが原因となる可能性があることから、発明者等は脂肪酸の細胞内への取込みを放射測定することにより、脂肪酸の取込みも行った。脂肪酸の放出のように、滴定後のAAの取込みは30分間に亘り線形であったが、VPAは用量依存的なAA取込みの増加を引き起こし、結果はEC50が47μMであった。この効果はパルミチン酸を用いた場合にも見られ、結果はEC50が160μMであり、薬物処置後30分後で顕著な薬効となった。上記の効果が脂肪酸の単なる膜挿入を通じて起こるか否かを試験することを目的として、発明者等は脂肪酸の取込みについて、脂肪酸の炭素数12の炭素鎖を有し、該炭素鎖が蛍光の頭部基を結合させたものである化合物を用いて可視化した。細胞をボディピーbodipyで標識化された脂質と共にインキュベートしたところ、VPA05mMで処理することにより、未処置の細胞と比較して細胞内の蛍光化された脂質滴の蛍光強度及び直径の増加が引き起こされた。当該結果は、VPAはこの脂肪酸の取込みも増加させること、また薬物が脂質滴内の脂肪酸の貯留を増加させることを示している。26VPAにより誘導される脂質取込はアクチンの動的作用とは無関係であるタマホコリカビDictyosteliumにおける化合物の取込及び放出は、マクロピノサイトーシスmacropinocytosisを制御する細胞の作用機序より調節されていると考えられ、実際、脂肪酸取込は当該プロセスの単純な調節機能による可能性がある。このことについて試験検討することを目的として、またマクロピノサイトーシスはアクチン重合に依存することから、発明者等はアクチン重合阻害剤であるラツルンクリンlatrunculinを用い、脂肪酸取込の効果を観察した。アクチン重合阻害は、対照実験の細胞における再取込を減少させた。しかし、ラツルンクリンはVPAが誘導するAA取込みを減衰させることはなく、VPAが誘導する脂肪酸調節は小胞の動力作用とは無関係であることを示唆した。27PLA2活性の遺伝子除去は脂肪酸の摂取活性を反転しない当該動物モデルにおけるVPAの効果を制御している特定の遺伝子を明らかにするため、発明者等はREMI法restrictionenzymemediatedintegrationを用いた変異体スクリーニングにより、発生過程においてVPAの効果を制御する遺伝子座の同定を試みた。VPAはタマホコリカビDictyosteliumの成長を、VPA処置を受けた患者の血漿中で確認される濃度において阻害する。当該スクリーニングにより単離された変異体の1つが切断されたPLA2遺伝子を有し、Ca2非依存性酵素との類似性を示すと共に、保存されたATPase及びリパーゼモチーフを含んでいた。また、当該変異体は、発生時にVPAに対する部分的な抵抗性を示した。しかし、ノックアウト細胞系統は放射標識化された細胞からの放出を減衰させなかった、PLA2遺伝子の断絶が、VPAの保護を成長段階において部分的に呈しているが、VPAが誘導する脂肪酸放出の全てを阻害するには十分でないことを示唆している。28VPAの脂肪酸シグナル伝達調節はPLA2阻害作用による遺伝表現型模写ではないVPAはホスホリパーゼA2に関連するシグナル伝達の調節を示したことから、また単一のPLA2遺伝子断片が、VPAに対する抵抗性を成長段階において一部のみ示し、脂肪酸の放射標識放出の総計には影響を示さないことにより、発明者等はAA調節におけるPLA2の薬理学的阻害作用の役割を評価した。異なるPLA2クラスに対し特異的な化学的阻害剤MAFP50μMCa2依存性及びCa2非依存性の細胞質性のPLA2阻害剤及びBPB20μMホスホリパーゼA2阻害剤は、全てVPA処置の場合と同様に3HAA細胞からの放射標識体の放出を減少させた。これらの阻害剤に対する特異性の違いは、3つの阻害剤の全てを混合した場合、放出が累積的に阻害されたことにより、示された。一方、VPAの放出における効果経時的な脂肪酸の増加によるものに対しては、PLA2の化学的阻害剤の活性は脂肪酸の取込みを減少を引き起こしている。当該データはPLA2阻害活性は、AAのシグナル伝達を修飾するうえでのVPAの効果を部分的に遺伝表現型模写するが、VPAは脂肪酸代謝のシグナル伝達におけるより一般化された効果を有することが示された。29VPAが誘導する脂肪酸取込は脂肪酸の活性化に依存しない脂肪酸の取込は活性化に依存するか否かを試験するために、最初に発明者等は細胞抽出物の、パルミチン酸を活性化させPaACoAを形成する能力について試験した。当該実験結果において、細胞抽出物を3HPaA及びcoenzymeAとともにインキュベートされることにより脂肪酸の活性化を可能とし、続いて脂肪酸は溶媒の溶解度の違いによって分離され、定量された。VPA10mMで処理する場合、活性化アッセイの間、細胞抽出物と共存させる場合、又は抽出物の調製の前に細胞を予め処理する場合のいずれにおいても、脂肪酸の活性化には影響しなかった。一方で、ペルオキシゾームの脂肪酸のCoA合成A酵素peroxisomalfattyacidCoAsynthaseAenzymeエンドソームにおける脂肪酸CoA活性化に貢献する酵素が除去されていても、野生型細胞と比べて顕著なPaACoA合成の減少を示した。さらに、fcsA欠如の細胞系統は、VPAが誘導する脂肪酸取込の増加を、野生型細胞と同様に示した当該結果は、VPAの脂肪酸シグナル伝達の調節における効果は脂肪酸CoAの活性化とは無関係であることを示しており、以前に示唆された結果と同じであった210脂肪酸の放出誘導に関する構造特異性SAR研究は効果を及ぼすために必須の物理学的性質を同定し、当該研究は各化合物間での効果を識別することの一助となり得る。VPAの、3HAAの取込みに続く放射標識体の放出の構造依存性を検証することを目的として、本発明者等はVPA関連化合物として様々な炭素骨格と側鎖長、先頭の置換基、立体的特異性及び飽和を有する範囲の化合物を採用し、05mM、処置後30分での放出を測定した。この結果は以下の表3に示す。当該化合物群の試験結果は幅のある阻害活性を高い構造特異性を示すとともに、活性の強さは酸性度や脂溶性に依存しないことを示した。VPAは対照と比べてAAの放出活性について50の減少活性を示すことから、発明者等は例えば2プロピルオクタン酸のような、45又はそれ以下の減少活性を示す化合物を高活性化合物と定義した。当該高活性化合物はカルボン酸でありバルプロアミドは実質的に阻害活性を示さなかった。データは示していない、2番目の炭素において分岐し、最高活性を有する化合物はイソプロピル基を有した。催奇形性の場合とは異なり、3級で置換されC2も活性を示し、長い又は中程度の直鎖脂肪酸も活性を保持した。分岐鎖の化合物は対応する直鎖のものよりも強い活性を示し、より長い側鎖有するももが好ましいプロピル基側鎖はメチル基側鎖と比べて強い活性を示す。最後に、不飽和化合物は阻害活性の減少を示した。当該SAR研究はVPA触媒効果についての新規な説を提示するものである。脂肪酸の放出の減少及び取込みの増加の重畳的効果が単一の部位で起こるということを確認するため、発明者等は、標識体の放出における3HAA取込みについて、強弱の阻害活性を示す2化合物それぞれイソプロピルペンタン酸及び4メチルオクタン酸を解析した図9。当該実験結果から、VPAの場合と比較して、放射標識体の放出阻害の増強は細胞内への脂肪酸取込みの上昇と合致し、放出作用の減弱は、再取込みの減少と合致していた。当該データは、VPAへ作用する単独の高い構造特異的な部位が脂肪酸シグナル伝達調節と関連していることを示す。3考察VPAは、現在多く見られる症状であるてんかん、双極性障害、及び偏頭痛の治療に用いられ、またその役割はがん、HIV及びアルツハイマー病の治療虚血及び致命的出血を含む広範囲に拡張し得る。未知の1次標的とともに細胞が多様に変化することを引き起こし、当該変化は特定の臨床症状に無関係であるため、これらの症状をVPAによって制御する方法は高度に複雑であることがわかっており、そして構造活性研究は殆どなされていない。31ホスホイノシトールシグナル伝達の効果発明者等は、タマホコリカビDictyostelium生物医学的モデルにおいて、VPAがPIP及びPIP2の用量依存的減少を引き起こすことを示し、更にはこの作用こそが、急性期に生じ、誘導性の発作に対する保護を提供する、VPAの数少ない効果の1つであることを示した。VPAの作用機序に関する研究の大半は、長期投与が引き起こす遺伝子発現の変化、又は多重の間接的標的の調節を可能とする時間の変化により、惑わされてきた。そのため、ホスホイノシタイドシグナル伝達の急激な減衰は、VPAの急性作用に対する意義深い洞察をもたらす。発作中のホスホイノシタイド濃度の増加を考慮すると、当該結果は我々の発作制御の理解においてブレイクスルーを示す。哺乳類のインビボにおけるホスホイノシタイド代謝を調節する薬物標的の同定は困難であり、その原因は多数のキナーゼ及びホスファターゼ、及びリン脂質キナーゼ基質への雑多な選択性のためである。タマホコリカビにおいて進められる有利な実験アプローチは、破壊されたキナーゼ遺伝子を含む同質遺伝子系統を用いることである。VPAがPIP3産生を減衰させることが以前より示されていたため、発明者らは、全ての1型PI3K活性の活性を欠く細胞株におけるホスホイノシタイドにおける代謝回転、及び、無関係な脂質キナーゼを欠く2つのヌル変異体、即ち受容体結合性ホスファチジルイノシトール5キナーゼ及び核ホスファチジルイノシトール45キナーゼ活性における代謝回転を解析した図2。3種類の変異細胞株は全て、野生株と比較した減少レベルであるものの、VPA処置後のPIP代謝回転を大きく且つ著しい減少させることを示し、当該酵素はVPAの直接の標的となり得ないこと、さらなるキナーゼ試験は利益をほとんどもたらさないであろうことを示唆した。イノシトール枯渇に関する理論は、イノシトールのデノボ生合成の原因となる酵素であるmyoイノシトール1リン酸合成酵素myoinositol1phosphatesynthaseの間接的阻害を潜在的に通じて、双極性障害予防におけるVPA活性に関する十分支持された理論を示した。強いMIP阻害活性は限られた数のVPA誘導体で見られ、イノシトールの調節と発作の制御との関連性を示唆する。しかし、強力な発作制御を示すものとして新規に見出された化合物-は、発作制御の時間内でイノシトールの急激な枯渇をもたらすことはなく、イノシトールシグナル伝達が当該臨床の治療において担う役割に対し、逆の議論を提示する。また、Einatら2008は、MIPの薬理的阻害活性VPAと化学構造的に無関係の化合物によるはイノシトール感受性ピロカルピン誘導発作モデルに対して制御作用を示さない。代わりに、ここに示されるデータは、ホスホイノシタイドシグナル伝達は発作発生の鍵となる役割を果たすものであることを特定するのに重要性を増し、そして、ホスホイノシタイド代謝回転及び発作制御におけるVPAの効果は、イノシトール枯渇の効果とは無関係であることを示唆するものである。VPAの作用標的及び臨床効果に関する大多数の研究は、炭素数5の骨格2番目の炭素上で分岐を有する又は環化誘導体のいずれかの化合物周辺に集中していた。実際、さらに長鎖の炭素骨格を有する新規化合物群がホスホイノシタイド代謝回転活性阻害及び発作の制御を示すことが発見され、新規治療の発展に主要な進歩をもたらした。当該新規化合物群は2番目又は4番目の炭素における分岐を含み、化合物中の分岐の変化による薬効を示し、そして、実際に臨床的に興味深い大規模な新規化合物群を提供する。ここで、発明者等は、当該新規脂肪酸化合物群のうち5化合物の薬効を、インビトロてんかん様活性モデルであって強力な抗てんかん薬のスクリーニング用の重要なモデルにおいて試験した。PTZてんかん様活性モデルにおいて、全ての化合物は大幅な増加を生じたが可逆的低減を示した。1化合物は低濃度マグネシウムモデルで薬効を示したため、この効果はモデルに特異的ではない。しかし、インビトロモデルでの薬効が必ずしもインビボの薬効を示すとは限らない。なぜならば、薬物代謝、薬物標的に対する脳内透過性及び薬物標的への到達といった他の要因が重要な役割を果たしているからである。よって、発明者等は、4メチルオクタン酸を用いさらにインビボてんかん重積症状モデルでも評価し、VPAよりも高活性であることを示した。以前より当該モデルはフェニトイン抵抗性を示し、また高容量の他の抗痙攣剤のみに応答することが示された。よって当該結果は、当該化合物により、薬効が増強された新規発作制御薬が提供されること、また、催奇形性が予想されないことからVPAによる治療と比較して副作用低減がもたらされることを示唆する。これらの知見は、単純生物医学的モデルでのホスホイノシタイド代謝回転減衰におけるVPAの作用機序を同定し、当該効果は、ホスホイノシタイドキナーゼ酵素、イノシトールの再利用及び枯渇の範囲において独立して起こることを示した。本発明者等は当該試験系を用いて、ホスホイシタイド減衰増強を示す新規化合物群を同定した。そして、本発明者等は当該単純モデルに基づく研究を、多くの発作制御の臨床モデルへ置き換えて理解し、てんかん様活性海馬切片モデルにおいて当該化合物のうちの5化合物が、また、てんかん状態の全身動物モデルにおいて当該化合物のうちの1化合物が、VPAを超える大きな薬効の増加を示す。実際、当該研究は、発作制御の薬効を示す新規化合物が、VPAと比較して長い炭素骨格を有し、変化に富む側鎖長及び置換位置を有することを示唆する。ホスホイノシタイドシグナル伝達制御をつかさどる生合成経路の解析を継続することにより、てんかん、及び双極性障害や偏頭痛のようなVPAで治療可能な症状の理解が著しく進歩する可能性がある。32脂肪酸代謝回転における効果従来の研究は、VPAの作用機序としてアラキドン酸代謝回転の減衰が考えられることを示した。ここで発明者等は、タマホコリカビDictyosteliumdiscoideumモデルにおいて、VPAは、3H標識アラキドン酸の取込み後に標識体が放出されるのを顕著に減弱させることを示した。驚くべきことに、発明者等はVPAの存在下、3HAAの取込みが増強されたことをも確認した。アラキドン酸はタマホコリカビDictyostelium内因性の脂肪酸ではないため、発明者等はまた、タマホコリカビDictyosteliumdiscoideumにおいて発見された脂肪酸であるパルミチン酸についても当該検証を行った。多不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸の両方において観察された類似の結果から、通常のVPAによる脂肪酸代謝調節の作用機序が示される。また、当該結果の類似性は、ここに示され、また例えばAA代謝回転の減少及び脂質蓄積の増加のようなインビボ動物試験に見られ、タマホコリカビDictyosteliumはVPAが誘導する脂肪酸の力学的作用に関する研究の有用なモデルとなる可能性があることを示す。VPAの脂肪酸調節に関する研究について、単に濃度上昇した脂肪酸が細胞内へ輸送される場合のVPAの役割について、動物モデルにおける検討は殆どされていない。実際にこの検討を目的とし、発明者等は、タマホコリカビDictyosteliumの細胞外栄養素の取込みは小胞の動的機能マクロピノサイトーシスによって調節されていることを利用して、重合化作用の阻害による小胞機能をブロックすることにより、VPAが触媒する脂肪酸取込み増加は阻害されないことを示した。当該結果は前述の結果に支持される。彼らは、VPA処置により小胞の動的機能もまたタマホコリカビDictyosteliumにおいて阻害されることを示したためである。よって、当該結果は、VPAは取込みとは無関係の脂肪酸シグナル伝達の調節効果をを示している。多不飽和脂肪酸の代謝回転は、主に脂質から遊離脂肪酸を放出させるためにPLA2触媒開裂によって調節され、またVPAは以前より示唆されていたようにPLA2依存シグナル伝達を調節する。我々のモデルにおいて、VPA依存シグナル伝達にPLA2が関与していることが示唆された。これは、発生時のVPAの作用に耐性を示す変異株のスクリーニングの結果、単一のPLA遺伝子の切断によりVIPに対する部分的な耐性が生じたことが明らかになったためである。これはVPAの臨床効果の可能性と強く関連することを示し、なぜならば双極性障害の患者Rossetal2006及び発作中においてPLA2濃度上昇が確認されたからである。しかし、遺伝子スクリーニングで同定された単一のPLA2アイソフォームの破壊は、VPAが誘導する放射標識放出の正味変化量に影響しなかった。このことは、ゲノムにおいて他に18のPLA2様遺伝子が存在するためと考えられ、当該遺伝子産生物の活性が全細胞アッセイでの単一の遺伝子破壊により引き起こされる僅かな変化を隠蔽する傾向のためである。しかし、同定された細胞は、タマホコリカビDictyosteliumの走化性及び成長において確実に的を絞られた役割を担っておりが示すとおり、実際、VPA関連性の成長効果については部分的に克服されている。このVPA依存性の成長阻害はここで採用されたアッセイでは可視化されていないが、なぜならば当該アッセイ系は細胞型に特異的な活性を区別できず、また発生過程における複数の時点での調査も不可能だからである。観察されたVPAの効果におけるPLA2シグナル伝達についてさらに検討するため、発明者等は薬理的PLA2活性阻害剤を用い、3HAA標識細胞からの放射標識放出減少について示した-実際には、VLAが当該モデルにおいてPLA2活性を再現していることを確認した。しかし、当該VPAの効果はPLA2による直接的なものではない、なぜならばVPAが誘導する脂肪酸の取込増加は、pLA2阻害剤により再生されないからである図9。このデータはVPAのPLA2阻害剤様効果は脂肪酸代謝調節における薬効のある1つの観点についてであることのみを示し、また、PLA2は当該効果におけるVPAの第1の標的ではないことの根拠となる。仮にPLA2がVPAの薬理活性標的ではないとすると、観察されたPLA2阻害剤の部分的遺伝子模写は脂質代謝において上流への分裂傾向を示す可能性がある。例えば、脂肪酸アシルCoA合成酵素の活性減少は、リン脂質への放射標識脂肪酸取込みの減少を引き起こし、結果として放射標識脂肪酸の放出の減少をもたらす事実、PLA2阻害様活性に類似する。最後に、本発明者等は、VPAが誘導する脂肪酸調節について調査するため、SAR研究を行った。当該アプローチはVPA活性に対するきわめて重要な明察を示し、VPAは広範な症状の治療処置に用いられ、非常に多数の細胞の効果が各疾患の役割ごとに無関係なままであり、そして当該効果の殆どは1次標的の同定に至っていないためである。SAR研究は当該治療処置、作用機序及び標的の識別の助けとなるよう用いられる。例えば、細胞機能のとしてヒストンジアセチラーゼ阻害を示すVPA関連化合物群は、生物医学的活性として催奇形性の誘導を示し、当該構造の特定により新規化合物における催奇形性が現在では予測可能である。脂肪酸代謝回転のSAR研究より、当該効果は催奇形性とは無関係であり、なぜならばいくつかの化合物が強い脂肪酸調節活性を示したものの催奇形性は予測されなかったためである。タマホコリカビDictyostelium及び哺乳類神経系における他のVPA細胞活性はイノシトールによるシグナル伝達を阻害する。いくつかの化合物例えば、イソプロピルペンタン酸は、イノシトールシグナル伝達減衰及び脂肪酸調節の両方において強い活性を有するものの、当該効果はすべての化合物について共有できるものではなく、事実、当該脂肪酸―及びイノシトールによるシグナル伝達活性は無関係である。実際、脂肪酸調節、即ちHDAC阻害活性、及びイノシトール枯渇は、VPAの3つの独立した作用機序を示す。よって、脂肪酸調節において活性の増加又は減少を示すVPAの化学構造を採用することは、VPAで治療可能な症状において、治療活性の増加又は望ましくない副作用の減少を引き起こす。当該研究の臨床上の結果は、VPA依存型脂質滴の形成において示される。出芽酵母Scerevisiaeから、ラット大脳海馬及び新皮質までの実験系において当該効果が示され、ここで報告される観察結果はモデル特異的ではないであろうことを明示する。さらに、脂質滴形成は肝毒性とも関連するが、作用機序については未だ明らかされていない。脂質調節における当該効果に対する構造特異性を同定することにより、当該副作用のない新規治療法を選択可能とする作用機序を提示する。また、VPA依存型の脂質蓄積増加をもたらす化学構造を識別し単離することは、VPA治療を継続中の患者の体重増加と関連していることを説明し得る。結論として、ここに、本発明者等はVPAが誘導する脂肪酸調節の研究について述べた。PLA2阻害作用は、一部のVPA依存性の効果を表現型模写し、しかしPLA2はVPAの一次活性標的ではないと考えらえる。当該効果の役割は双極性障害の治療及び発作制御の両者において作用する可能性があり、なぜならばPLA2活性が両者の症状と関連するためである。当該効果をもたらす新規化学構造は、短鎖炭素数5から中程度の鎖炭素数9である骨格及び側鎖エチル又はプロピル基により、C2位で分岐されたカルボン酸であると同定され、両症状の新しい治療の可能性を示す。当該効果の1次活性部位を解明することは、我々のVPAの解明及び関連治療の進歩に著しく貢献するであろう。ここに引用する全ての文献は、その全体が、参照により本明細書に組込まれる。参考文献:AckermannEJCondeFrieboesKDennisEAJournalofBiologicalChemistry270445450AlametalSurgery146325333ArmandVLouvelJPumainRHeinemannUEpilepsyRes32345355BackmanSAetalNatGenet29396403BakthavatsalamDMeijerHJNoegelAAGoversFTrendsMicrobiol1478382BlahetaMichaelisDrieverCinatlMedResRev253833973DeubzeretalLeukRes3011671175BalsindeJDennisEAJournalofBiologicalChemistry27167586765BasselinMChangLBellJMRapoportSINeuropsychopharmacology3116591674BasselinMChangLSeemannRBellJMRapoportSIJNeurochem8515531562BazanNGTuBRodriguezdeTurcoEBProgBrainRes135175185BazinetRPRaoJSChangLRapoportSILeeHJBiolPsychiatry59401407BazinetRPWeisMTRapoportSIRosenbergerTAPsychopharmacology184122129BerridgeMJDownesCPHanleyMRCell59411419BialerMWhiteHSNatRevDrugDiscov96882BialerMYagenBNeurotherapeutics4130137BoeckelerKAdleyKXuXJenkinsAJinTWilliamsRSEurJCellBiol8510471057ChangPChandlerKEWilliamsRSWalkerMCEpilepsiaChangMCContrerasMARosenbergerTARintalaJJBellJMRapoportSIJNeurochem77796803ChapmanAGMeldrumBSMendesELifeSci3220232031ChenCTGreenJTOrrSKBazinetRPProstaglandinsLeukotEssentFattyAcids798591ChenLIijimaMTangMLandreeMAHuangYEXiongYIglesiasPADevreotesPNDevCell12603614ChiuCCHuangSYSuKPLuMLHuangMCChenCCShenWWEurNeuropsychopharmacol1399103CostaetalStroke3713191326deOliveiraCAMantovaniBLifeScience4318251830DeutschJRapoportSIRosenbergerTANeurochemRes28861866DrancourtMBolletCCartaARousselierPIntJSystEvolMicrobiol51925932DrayerALVanDerKJMayrGWVanHaastertPJEMBOJ1316011609DSMVIVAmericanPsychiatricAssociationDiagnosticandstatisticalmanualofmentaldisordersEickholtBJTowersGJRyvesWJEikelDAdleyKYlinenLMChadbornNHHarwoodAJNauHWilliamsRSMolPharmacol6714261433EikelDLampenANauHChemResToxicol19272278EinatHTianFBelmakerRHFrostJWJNeuralTransm1155558EyalSYagenBShimshoniJBialerMBiochemPharmacol6915011508FaixJKreppelLShaulskyGSchleicherMKimmelARNucleicAcidsResearch32e143FeyPGaudetPCurkTZupanBJustEMBasuSMerchantSNBushmanovaYAShaulskyGKibbeWAChisholmRLNucleicAcidsResearch37D515519FujimuraHMurakamiNKurabeMToriumiWJApplToxicol29356363GuoQetalNatMed5101106GurvichNTsygankovaOMMeinkothJLKleinPSCancerRes6410791086HoellerOKayRRCurrBiol17813817HonackDLoscherWEpilepsyRes13215221HoltkampMTongXWalkerMCAnnNeurol49260263IsoherranenNYagenBBialerMCurrOpinNeurol16203211JohnsonCBWongEBirchEJLipids12340347KaufmannDBialerMShimshoniJADevorMYagenBJMedChem5272367248KeanePESimiandJMendesESantucciVMorreMNeuropharmacology22875879KestersonJWGrannemanGRMachinistJMHepatology411431152KimHWRapoportSIRaoJSMolPsychiatryKingJSetalDisModelMech2306312KortholtAvanHaastertPJCellSignal2014151422KuspaALoomisWFMethodsMolBiol3461530LagaceDCEischAJPsychiatrClinNorthAm28399414LandsWCrawfordCNewYorkJohnWileySonsLioYCReynoldsLJBalsindeJDennisEABiochimBiophysActa13025560LiuMJPollackGMPEpilepsia35234243LoscherWFisherJENauHHonackDJPharmacolExpTher25010671078LoscherWNauHNeuropharmacology24427435MaslanskiJABusaWBMethodsinInositideResearch113126MasuccioFVerrottiAChiavaroliVdeGiorgisTGianniniCChiarelliFMohnAJChildNeurolMeunierHCarrazGNeunierYEymardPAimardMTherapie18435438MitchellSMPoyserNLWilsonNHBrJPharmacol58295PMoraAGonzalezPoloRAFuentesJMSolerGCentenoFEurJBiochem266886891MoraASabioGAlonsoJCSolerGCentenoFBipolarDisord4195200NalivaevaNNBelyaevNDTurnerAJTrendsPharmacolSci30509514PawolleckNWilliamsRSMethodsMolBiol571283290PhielCJetalJBiolChem2763673436741PireddaSYonekawaWWhittinghamTSKupferbergHJEpilepsia26167174QingetalJExpMed20527812789RadatzMEhlersKYagenBBialerMNauHEpilepsyResearch304148RaoJSErtleyRNRapoportSIBazinetRPLeeHJJNeurochem10219181927RaoJSLeeHJRapoportSIBazinetRPMolPsychiatry13585596RapoportSIJNutr13825152520RapoportSIProstaglandinsLeukotEssentFattyAcids79153156RapoportSIBosettiFArchGenPsychiatry59592596RintalaJSeemannRChandrasekaranKRosenbergerTAChangLContrerasMARapoportSIChangMCNeuroreport1038873890RossBMHughesBKishSJWarshJJBipolarDisord8265270ShaltielGMarkSKofmanOBelmakerRHAgamGPharmacolRep59402407ShaltielGDaltonECBelmakerRHHarwoodAJAgamGBipolarDisord9281289ShaltielGetalValproatedecreasesinositolbiosynthesisBiolPsychiatry56868874ShimshoniJAetalMolPharmacol71884892SiesjoBKIngvarMWesterbergEJNeurochem39796802SilvaMFAiresCCLuisPBRuiterJPIjlstLDuranMWandersRJTavaresdeAlmeidaIJInheritMetabDisSobaniecLotowskaMEIntJExpPathol869196StoreyNMOBryanJPArmstrongDLCurrBiol122733SunQBiLSuXTsurugiKMitsuiKFEBSLett58139913995TerbachNWilliamsRSBiochemSocTrans3711261132TokuokaSMSaiardiANurrishSJMolBiolCell1922412250VadenDLDingDPetersonBGreenbergMLJBiolChem2761546615471vanHaastertPJKeizerGunninkIKortholtAJCellBiol177809816VanRooijenLAVadnalRDobardPBazanNGBiochemBiophysResCommun136827834VerrottiAMancoRAgostinelliSCoppolaGChiarelliFEpilepsia51268273vonLohneysenKPawolleckNRuhlingHManiakMEurJCellBiol82505514WalkerMCetalEpilepsia40359364WeeksGBiochimBiophysActa4502132WilliamsRSBClinicalNeuroscienceResearch4233242WilliamsRSChengLMudgeAWHarwoodAJNature417292295WilliamsRSEamesMRyvesWJViggarsJHarwoodAJEMBOJ1827342745WilsonDBPrescottSMMajerusPWDiscoveryofanarachidonoylcoenzymeAsynthetaseinhumanplateletsJBiolChem25735103515WirrellECPediatrNeurol28126129WorsfoldOTomaCNishiyaTBiosensBioelectron1915051511XuXMullerTaubenbergerAAdleyKEPawolleckNLeeVWWiedemannCSihraTSManiakMJinTWilliamsRSEukaryotCell6899906YedgarSCohenYShoseyovDBiochimBiophysActa176113731382YeginAAkbasSHOzbenTKorgunDKActaNeurolScand106258262"