"被験者を、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を有するまたはその素因があると分類する方法であって、前記被験者からの血球を含んだ試料に由来するLNK遺伝子の配列を決定すること;および決定されたLNK配列が少なくとも1つの変異を有する場合、前記被験者を、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を有するまたはその素因があると分類することを含む方法。前記LNK変異がプレクストリン相同PHドメインおよび/またはSH2ドメイン内にある、請求項1に記載の方法。前記LNK変異が、プレクストリン相同PHドメインおよび/またはSH2ドメインの全部または一部の欠失である、請求項1に記載の方法。前記LNK変異が、野生型LNKと比較して細胞におけるサイトカインシグナル伝達の増大を生じさせる、請求項1に記載の方法。前記LNK変異がE208Qおよび603_607delGCGCT;613C>Gから選択される、請求項1に記載の方法。前記試料が血液試料である、請求項1に記載の方法。前記血液リンパ系新生物または悪性腫瘍がJAK2V617F陰性骨髄増殖性新生物MPNである、請求項1に記載の方法。前記分類工程が、決定されたLNK配列を1またはそれ以上の参照LNK配列と比較することを含み、前記1またはそれ以上の参照LNK配列が、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍の素因があることが既知の被験者からのLNK配列;および血液リンパ系新生物または悪性腫瘍の素因がないことが既知の被験者からのLNK配列の一方または両方を含む、請求項1に記載の方法。前記配列決定工程が、PCR、核酸ハイブリダイゼーション、塩基配列解析および抗体結合アッセイの1またはそれ以上を含む、請求項1に記載の方法。被験者において血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を治療するための候補治療薬を同定する方法であって、野生型LNKと比較してサイトカインシグナル伝達の増大を細胞に付与する、変異LNKタンパク質を含有する細胞を薬剤と接触させること;および前記薬剤が対照と比較して前記細胞におけるサイトカインシグナル伝達を低減する場合、前記薬剤を被験者において血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を治療するための候補治療薬として同定することを含む方法。前記LNK変異がプレクストリン相同PHドメインおよび/またはSH2ドメイン内にある、請求項10に記載の方法。前記LNK変異が、プレクストリン相同PHドメインおよび/またはSH2ドメインの全部または一部の欠失である、請求項10に記載の方法。前記LNK変異がE208Qおよび603_607delGCGCT;613C>Gから選択される、請求項10に記載の方法。前記LNK変異体が血液リンパ系新生物または悪性腫瘍に関連する、請求項10に記載の方法。前記血液リンパ系新生物または悪性腫瘍がJAK2V617F陰性骨髄増殖性新生物MPNである、請求項14に記載の方法。前記接触工程が、細胞をサイトカインと接触させることをさらに含む、請求項10に記載の方法。前記サイトカインがTPOである、請求項16に記載の方法。LNK変異体が媒介するサイトカインシグナル伝達の増大を阻害する薬剤の有効量を投与することを含む、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を有する被験者を治療する方法。前記薬剤が、LNK変異体が媒介するSTAT3および/またはSTAT5の活性化をブロックする、請求項18に記載の方法。本発明を詳細に説明する前に、本発明の実施形態は、言うまでもなく、異なり得るので、本発明は記述される特定の実施形態に限定されないことが了解されるべきである。また、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、限定を意図されないことも了解されるべきである。値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈上明らかに異なる指示が為されない限り下限の単位の10分の1までの、各々の介在値およびその指定される範囲内の任意の他の指定値または介在値は、本発明に含まれる。これらのより小さな範囲の上限および下限は、指定される範囲内の任意の明確に除外される制限に従って、独立してそのより小さな範囲に含まれてもよく、同時に本発明に含まれる。指定される範囲が上下限の一方または両方を含む場合、それらの含まれる上下限のいずれかまたは両方を除外した範囲も本発明に含まれる。ある特定の範囲は、本明細書において数値の前に約という用語を付けて提示される。約という用語は、本明細書ではその後に続く正確な数、ならびにその用語の後に続く数に近い数または近似する数について明示の裏付けを与えるために使用される。ある数が明確に言及される数に近いまたは近似するかどうかを判定する際に、近いまたは近似する言及されていない数は、それが提示される文脈において、明確に言及される数の実質的等価物を提供する数であり得る。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で述べるものと類似または等価の任意の方法および材料も本発明の実施または試験において使用できるが、代表的な例示的方法および材料をここで説明する。本明細書で引用されるすべての公表文献および特許は、各々個別の公表文献または特許が、参照により組み込まれることが明確かつ個別に指示されているかのごとくに参照により本明細書に組み込まれ、関連して公表文献が引用される方法および/または材料を開示し、説明するために参照により本明細書に組み込まれるものである。任意の公表文献の引用は、出願日に先立つその開示のためであり、本発明が、先行発明によるそのような公表文献に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。さらに、提供される公表日は実際の公表日とは異なることがあり得、実際の公表日は独立して確認される必要があり得る。本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される場合、単数形のa、an、およびtheは、文脈上明らかに異なる指示が為されない限り、複数の指示対象を含むことが留意される。さらに、特許請求の範囲は任意の選択的要素を除外するように作成され得ることも留意される。そこで、この記述は、請求項の要素の言及に関連して唯一、のみ等の排他的用語を使用すること、または否定的な限定を使用することの先行詞となることが意図されている。本開示を読了後に当業者に明らかになるように、本明細書で記述および例示される個々の実施形態の各々は別個の構成要素および特徴を有し、それらは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、その他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るまたは前記特徴と組み合わされ得る。任意の言及される方法は、言及される事象の順序でまたは論理的に可能な任意の他の順序で実施することができる。血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を診断するまたは予測するための方法本発明の態様は、被験者を、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を有するまたはその素因があると分類する方法であって、被験者からの血球を含んだ試料に由来するLNK遺伝子の配列を決定すること;および決定されたLNK配列が少なくとも1つの変異を有する場合、被験者を、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を有するまたはその素因があると分類することを含む方法を含む。ある実施形態では、LNK変異はプレクストリン相同PHドメインおよび/またはSH2ドメイン内にある。ある実施形態では、LNK変異は、プレクストリン相同PHドメインおよび/またはSH2ドメインの全部または一部の欠失である。ある実施形態では、LNK変異は、野生型LNKと比較して細胞におけるサイトカインシグナル伝達の増大を生じさせる。ある実施形態では、LNK変異はE208Qおよび603_607delGCGCT;613C>Gから選択される。ある実施形態では、試料は血液試料である。ある実施形態では、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍は、JAK2V617F陰性骨髄増殖性新生物MPNである。ある実施形態では、分類工程は、決定されたLNK配列を1またはそれ以上の参照LNK配列と比較することを含み、1またはそれ以上の参照LNK配列は、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍の素因があることが既知の被験者からのLNK配列;および血液リンパ系新生物または悪性腫瘍の素因がないことが既知の被験者からのLNK配列の一方または両方を含む。LNK核酸またはタンパク質の配列を決定するために任意の好都合な方法を使用してよく、そのためこれに関する限定は意図されていない。ある実施形態では、配列決定工程は、PCR、核酸ハイブリダイゼーション、塩基配列解析および抗体結合アッセイの1またはそれ以上を含む。本開示の方法は、本開示の方法から生じる結果または成績を提供する報告の作成に適する。本明細書で述べる報告は、診断または危険性評価およびその結果例えばLNK変異の結果および新生物/悪性腫瘍を有するまたは発症する可能性に関する関心対象の情報を提供する報告要素を含む電子文書または有形文書である。本発明の報告は、完全にまたは部分的に電子的に作成する、例えば電子表示例えばコンピュータのモニター上に提示することができる。報告はさらに、1試験施設に関する情報;2サービスプロバイダー情報;3患者データ;4試料データ;5a適応症;b遺伝子検査データを含む様々な情報を含み得る説明報告、および6他の特徴の1またはそれ以上を含み得る。本開示は、したがって、報告を作成する方法およびそれから生じる報告を提供する。報告は、電子形式または書類上で提示されてよく、患者または患者の医療サービス提供者に提供され得る。ある実施形態では、本明細書で開示される方法は、ユーザー、例えば患者または医療サービス提供者に対して本明細書で詳述される方法の結果の報告を作成するまたは出力する工程をさらに含み得る。報告を作成する人物または主体報告作成者はまた、その中でデータの評価を実施してもよい。報告作成者はまた、処理工程の任意の1またはそれ以上、例えば試料の収集、試料の処理およびデータ生成を実施してもよい。あるいは、報告作成者以外の主体が、試料の収集、試料の処理およびデータ生成の1またはそれ以上を実施することができる。ある実施形態、例えば本発明の方法が完全に1台のコンピュータ上で実行される実施形態では、ユーザーまたは顧客がデータ入力およびデータ出力の検討を提供する。ユーザーは、医療従事者例えば臨床医、検査技師、医師例えば癌専門医、外科医、病理学者等であり得る。ユーザーが方法の一部だけを実行する実施形態では、本発明の方法に従ってコンピュータ化されたデータ処理後、データ出力例えば、公表の前に完全な報告を提供する、または不完全な報告を検討し、手作業で介入して説明報告を完成させるを検討する個人を本明細書では検討者と称する。検討者はユーザーとは離れた場所に位置し得る例えば、ユーザーが位置し得る医療施設とは別途に提供される施設。政府の規制または他の制限事項例えば保健衛生、医療過誤または損害賠償保険による要求が適用される場合、すべての結果は、全面的または部分的に電子的に生成されたか否かに関わらず、ユーザーへの公表の前に品質管理ルーチンに供され得る。本開示によって提供される方法はまた、全体的または部分的に自動化され得る。薬剤スクリーニング本発明の態様は、被験者において血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を治療するための候補治療薬を同定する方法であって、野生型LNKと比較してサイトカインシグナル伝達の増大を細胞に付与する、変異LNKタンパク質を含有する細胞を薬剤と接触させること;および前記薬剤が対照と比較して細胞におけるサイトカインシグナル伝達を低減する場合、前記薬剤を被験者の血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を治療するための候補治療薬として同定することを含む方法を含む。ある実施形態では、LNK変異はプレクストリン相同PHドメインおよび/またはSH2ドメイン内にある。ある実施形態では、LNK変異は、プレクストリン相同PHドメインおよび/またはSH2ドメインの全部または一部の欠失である。ある実施形態では、LNK変異はE208Qおよび603_607delGCGCT;613C>Gから選択される。ある実施形態では、LNK変異体は血液リンパ系新生物または悪性腫瘍に関連する。ある実施形態では、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍は、JAK2V617F陰性骨髄増殖性新生物MPNである。ある実施形態では、接触工程は、細胞をサイトカインと接触させることをさらに含む。ある実施形態では、サイトカインはTPOである。治療方法、治療薬およびその医薬組成物本発明の態様は、LNK変異体が媒介するサイトカインシグナル伝達例えばTPOシグナル伝達からのの増大を阻害する薬剤の有効量を投与することを含む、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を有する被験者を治療することを含む。ある実施形態では、前記薬剤は、LNK変異体が媒介するSTAT3および/またはSTAT5の活性化をブロックする。治療薬の医薬組成物は、標的部位における保持および安定化のために最適化され得る。安定化技術は、分子量の増大を達成するために架橋する、多量体化するまたはポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、中性タンパク質担体等のような基に連結することにより、ポリペプチドのサイズを増大させることを含む。保持を増大させるために他の方法は、ポリペプチドを生分解性または生腐食性インプラントに封入することを含む。治療有効成分の放出速度は、ポリマーマトリックスを通過する輸送の速度およびインプラントの生体内分解によって制御される。ポリマー障壁を通過するポリペプチドの輸送はまた、化合物の溶解度、ポリマーの親水性、ポリマーの架橋の程度、ポリマー障壁を薬剤に対してより透過性にするための水吸収後のポリマーの膨張、インプラントの形状等によっても影響される。インプラントは、移植の部位として選択される領域の大きさと形状に相応した寸法である。インプラントは、粒子、シート、パッチ、プラーク、繊維、マイクロカプセル等であり得、選択される挿入部位と適合性の任意の大きさまたは形状であり得る。医薬組成物は、所望する製剤に応じて、動物またはヒトへの投与用の医薬組成物を製剤するために一般的に使用されるビヒクルと定義される、医薬的に許容される非毒性の担体または希釈剤を含み得る。希釈剤は、配合剤の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、PBS、リンガー液、デキストロース溶液およびハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバントまたは非毒性、非治療性、非免疫原性安定剤、賦形剤等を含み得る。組成物はまた、pH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤および界面活性剤などの、生理的条件に近づけるための付加的な薬剤も含み得る。組成物はまた、様々な安定剤のいずれか、例えば抗酸化剤なども含み得る。ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボでの安定性を高める、またはさもなければその薬理的特性を増強する例えばポリペプチドの半減期を延長させる、その毒性を低減する、溶解度または取り込みを増強する様々な周知の化合物と複合体を形成し得る。そのような修飾または複合体化剤の例は、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩を含む。組成物のポリペプチドはまた、それらのインビボでの特性を増強する分子と複合体形成することもできる。そのような分子は、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガンおよび脂質を含む。様々なタイプの投与に適した製剤に関するさらなる指針は、Remington’sPharmaceuticalSciences,MacePublishingCompany,Philadelphia,PA,17thed.1985に認められ得る。薬物送達のための方法の簡単な総説については、Langer,Science249:1527-15331990参照。医薬組成物は、予防的および/または治療的処置のために投与することができる。有効成分の毒性および治療効果は、例えば、LD50集団の50に対して致死的な用量およびED50集団の50において治療的に有効な用量を測定することを含む、細胞培養物および/または実験動物における標準的な医薬的手順に従って決定できる。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養および/または動物実験から得られたデータを、ヒトについての投与量の範囲を策定する際に使用することができる。有効成分の投与量は、典型的には、低い毒性でED50を含む循環濃度範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本明細書で述べる医薬組成物は、様々な異なる方法で投与することができる。例としては、経口、鼻内、経直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下subcutaneous、subdermal、経皮、髄腔内および頭蓋内方法によって医薬的に許容される担体を含有する組成物を投与することを含む。例えば静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路等による非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および製剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る、水性および非水性等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含有し得る水性および非水性滅菌懸濁液を含む。医薬組成物を製剤するために使用される成分は、好ましくは高純度であり、潜在的に有害な夾雑物を実質的に含まない例えば、少なくともナショナルフードNF等級、一般には少なくとも分析等級、より典型的には少なくとも医薬品等級。さらに、インビボでの使用を意図される組成物は、通常は無菌である。所与の化合物を使用前に合成しなければならない限り、生じる生成物は、典型的には合成または精製工程の間に存在し得るいかなる潜在的毒性物質、特にいかなる内毒素も実質的に含まない。非経口投与用の組成物もまた無菌で、実質的に等張であり、GMP条件下で製造される。表現型決定遺伝子の発現プロフィールのデータベースLNK遺伝子配列および血液リンパ系新生物または悪性腫瘍とそれらの関連性についてのデータベースも提供される。配列および対応する関連性は、それらの使用を容易にする様々な媒体で例えばユーザーがアクセス可能/読み取り可能な形式で提供され得る。媒体は、本発明の発現プロフィール情報を含む製造物を指す。本発明のデータベースは、コンピュータ読み取り可能媒体、例えばコンピュータを使用するユーザーが直接読み取り、アクセスすることができる任意の媒体上に記録され得る。そのような媒体は、フレキシブルディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープなどの磁気記憶媒体;CD-ROMなどの光記憶媒体;RAMおよびROMなどの電気記憶媒体;ならびに磁気/光記憶媒体などのこれらのカテゴリーのハイブリッドを含むが、これらに限定されない。当業者は、現在公知のコンピュータ読み取り可能媒体のいずれかを使用して、どのようにして本発明のデータベース情報の記録を含む製造物を作製できるかを容易に認識し得る。記録されるとは、当分野で公知の任意の方法を使用して、コンピュータ読み取り可能媒体に情報を保存するためのプロセスを指す。保存した情報にアクセスするために使用される手段に基づき、任意の好都合なデータ記憶構造を選択し得る。様々なデータ処理プログラムおよびフォーマット、例えばワードプロセシングテキストファイル、データベースフォーマット等が保存のために使用できる。したがって、本発明の発現プロフィールデータベースはユーザーによってアクセス可能である、すなわちデータベースファイルはユーザーの読み取り可能なフォーマット例えばユーザーがコンピュータを制御する場は、コンピュータが読み取り可能なフォーマットで保存される。本明細書で使用される場合、コンピュータベースシステムは、本発明の情報を解析するために使用されるハードウエア手段、ソフトウエア手段およびデータ記憶手段を指す。本発明のコンピュータベースシステムの最小限のハードウエアは、中央処理装置CPU、入力手段、出力手段およびデータ記憶手段を含む。当業者は、現在利用可能なコンピュータベースシステムの任意の1つが本発明における使用に適することを容易に認識し得る。データ記憶手段は、上述した本発明の記録を含む任意の製造物、またはそのような製造物にアクセスできる記憶アクセス手段を含み得る。そこで、本発明は、被験者が血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を有するまたはその素因があるかどうかを判定するためのコンピュータプログラム製品をさらに含む。コンピュータプログラム製品は、コンピュータに搭載される場合、血球含有試料からのLNK遺伝子またはタンパク質配列を使用して、被験者についての血液リンパ系新生物または悪性腫瘍カテゴリーを決定するように構成される。決定されると、臨床的な血液リンパ系新生物または悪性腫瘍カテゴリーがユーザーに読み取り可能なフォーマットでユーザーに提供される。加えて、コンピュータプログラム製品は、患者の臨床移植カテゴリーを決定するために用いられる1またはそれ以上の参照または対照LNK配列を含み得る。試薬、システムおよびキットまた、上記で述べた方法の1またはそれ以上を実施するための試薬、システムおよびそれらのキットも提供される。本発明の試薬、システムおよびそれらのキットは大きく異なり得る。関心対象の試薬は、LNK核酸および/またはタンパク質配列を決定する際に使用するために特に設計された試薬を含む。システムという用語は試薬の収集物を指すが、例えば、同じまたは異なる供給源からの試薬の収集物を購入することにより、蓄積されたものを指す。キットという用語は、一緒に提供される、例えば販売される、試薬の収集物を指す。LNK遺伝子またはタンパク質の配列を決定するために特にオーダーメードされた試薬は、そのうちの少なくとも1つがLNK変異遺伝子/cDNA等を選択的に検出するおよび/または増幅する例えばハイブリダイゼーションアッセイ、PCRに基づく技術、線形増幅等を用いてように設計された、LNK特異的プライマーまたはプローブの収集物を含む。本発明のシステムおよびキットは、変異アミノ酸配列例えばポジティブスクリーニングアッセイに関してまたはLNK変異体において欠失していることが公知の配列例えばネガティブスクリーニングアッセイにおいてに特異的な抗体を含み得る。システムおよびキットは、様々な方法において用いられる1またはそれ以上の付加的な試薬、例えば標的核酸を作製するためのプライマー、あらかじめ混合されるかまたは別々であってよいdNTPおよび/またはrNTP、1またはそれ以上の独自に標識されたdNTPおよび/またはrNTP、例えばビオチニル化またはCy3もしくはCy5標識dNTP、種々の散乱スペクトルを有する金または銀粒子、または他の合成後標識試薬、例えば蛍光染料の化学的に活性な誘導体、一次および二次抗体標識抗体を含む、酵素、例えば逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ等、様々な緩衝媒質、例えばハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液、作製済みのプローブアレイ/基質、スピンカラム等のような標識プローブ精製試薬および成分、シグナル生成および検出試薬、例えばストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ複合体、化学蛍光または発光基質等をさらに含み得る。本発明のシステムおよびキットは、ペプチドまたはタンパク質レベルの測定のための試薬、例えばELISAアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、MSアッセイ例えばLC-MS、HPLCアッセイ、フローサイトメトリアッセイ等において使用されるものをさらに含み得る。本発明のシステムおよびキットはまた、表現型決定要素も含んでもよく、表現型決定要素は、多くの実施形態において、入力されたLNK核酸またはタンパク質配列に基づき被験者に関して血液リンパ系新生物または悪性腫瘍カテゴリーを決定するために、例えば適切なコンピュータ手段によって、使用できる参照または対照配列である。上記成分に加えて、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための説明書をさらに含む。これらの説明書は、様々な形態で本発明のキットに存在してよく、そのうちの1またはそれ以上はキット中に存在し得る。これらの説明書が存在し得る1つの形態は、適切な媒体または被印刷物、例えば情報が印刷された1または複数の紙片上、キットの包装中、添付文書中等に印刷された情報としてである。さらに別の手段は、情報が記録されているコンピュータ読み取り可能媒体、例えばディスケット、CD等である。存在し得るさらに別の手段は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを介して使用し得るウエブサイトアドレスである。任意の好都合な手段がキット中に存在し得る。以下の実施例は説明として提供されるものであり、限定としてではない。実験概要LNKは、トロンボポエチンTPOおよびJAK2を阻害するアダプタータンパク質である。ここで本発明者らは、JAK2V617F陰性骨髄増殖性新生物を有する2名の患者における新規LNK変異を報告する。1名の患者は、中途終止コドンおよびプレクストリン相同PHドメインおよびSH2ドメインの喪失をもたらす5塩基対の欠失およびミスセンス変異を示した。2番目の患者は、PHドメイン内にミスセンス変異E208Qを有していた。これらのLNK変異体で形質導入したBaF3-MPL細胞は、TPO依存性増殖およびシグナル伝達の調節不全を示した。サイトカイン応答性CD34細胞が両方の患者において異常に豊富であった。したがって、LNKの負のフィードバック調節の喪失はJAK-STATシグナル伝達の異常を推進し、MPNの病因の新規機構を構成する。緒言チロシンキナーゼの活性化変異によるシグナル伝達異常は、慢性骨髄増殖性新生物MPNの顕著な特徴である。JAK2のエクソン14におけるV617F変異は、真性赤血球増加症PVを有する患者の>95、ならびに本態性血小板血症ETおよび原発性骨髄線維症PMFを有する患者の約50において記述されている参考文献1~4。JAK2遺伝子のエクソン12における機能獲得型変異が、V617F変異を有さないPV患者のごく少数で認められており参考文献5、またトロンボポエチンTPO受容体MPLにおける活性化変異W515K/Lが、JAK2V617F陰性PMFおよびETを有する患者の約5で同定されている参考文献6、7。したがって、ETおよびPMF患者の約40~50は明確な遺伝的異常を有さない。JAK2またはMPLに変異が存在しない場合でも、JAK-STATシグナル伝達の活性化を一部のMPN患者で明らかにすることができ参考文献8~10、この経路における他の調節要素の変化がMPNの病因に寄与し得ることを示唆する。JAK-STATシグナル伝達の1つの調節因子はLNKSH2B3であり、LNKは、プロリンに富むN末端の二量体化ドメイン、プレクストリン相同PHドメイン、SH2ドメインおよびC末端近くの保存されたチロシン残基を含む、いくつかの構造モチーフを共有するアダプタータンパク質のファミリーの成員である参考文献11図1A。LNKは、そのSH2ドメインを介してMPLに構成的に結合し、そのPHドメインを介して形質膜に共局在する参考文献12、13。TPOでのサイトカインの刺激後、LNKはJAK2に強く結合し、下流のSTAT活性化を抑制するまたは終結させる参考文献12。LNK-/-マウスは、造血幹細胞HSC画分の拡大、巨核球過形成、巨脾腫、白血球増加および血小板増加を含む、MPN表現型と一致する特徴を示す参考文献14~16。TPO-/-マウスと交配したLNK-/-マウスはこれらの特徴を示さないので、この表現型はTPO依存性である参考文献17。加えて、LNK-/-HSCは、TPO刺激に応答して増強されたJAK2の活性化を示す参考文献12。これらの試験は、LNKが造血の調節において中心的な役割を果たすこと、およびLNK活性の消失がMPNの重要な病因特徴であり得ることの説得力のある証拠を提供する。本発明者らはそれゆえ、JAK2V617F陰性MPNのコホートにおいてLNKを塩基配列決定し、ここで、JAK-STATシグナル伝達および増殖の調節不全を導く新規LNK変異の同定を報告する。結果JAK2V617F陰性MPNにおける体細胞性LNK変異の同定PHおよびSH2ドメインを含むLNKの領域部分的エクソン2~エクソン7図1Aの直接塩基配列決定を、JAK2V617F陰性MPN世界保健機構によって定義されるを有する33名の患者からの試料に関して実施し表1、LNKのエクソン2において2つの新規変異を同定した。図1Bに示すように、中途終止コドンを導く、5bpの欠失およびミスセンス変異NM_005475.2:c.[603_607delGCGCT;613C>G]、以下DELと称するが、PMFを有する患者01において同定された。この変異は、PHドメインおよびSH2ドメインの両方の不在を生じさせる図1CおよびD。ETを有する患者02図4の症例経過記録では、PHドメインに局在するグルタミン酸のグルタミン置換E208Qを導くミスセンス変異NM_005475.2:c.622G>Cが同定された。どちらの症例もMPLW515変異に関しては陰性であったデータは示していない。これらの患者の培養皮膚線維芽細胞からの生殖系DNAの塩基配列決定は野生型LNK配列を明らかにし図1E、これらの変異が体細胞性であることを確認した。これらの変異のいずれもが、公的に利用可能なSNNPデータベースでは報告されていない。全体として、本発明者らのJAK2V617F陰性MPN患者のコホートにおいて同定されたLNK変異の頻度は2/336であった。LNK変異はTPO依存性増殖およびSTAT3/5活性化の調節不全を引き起こすMPNの病因におけるLNK変異の機能的影響を検討するため、野生型WTまたは変異型LNKをレトロウイルスによってTPO依存性BaF3-MPL細胞株で発現させた。BaF3-MPL細胞はTPO用量依存性増殖を示し、この増殖はWTLNKの発現によって阻害された図2A。先の試験参考文献13と一致して、SH2ドメインを破壊する合成点変異R392Eは、LNKが媒介するTPO依存性増殖の阻害を排除した。同様に、DEL変異体は、LNKの負のフィードバック機能の喪失と一致して、TPO媒介性増殖を阻害する能力を欠如していた。これに対し、E208Q変異体は部分的な阻害活性を保持しており、LNK変異が様々な表現型を付与し得ることを示唆した。この区別的な作用は、下記の、これらの変異を担持するMPN患者からの一次試料におけるJAK-STATシグナル伝達の分析においてさらに強調された。LNKは、MPLおよびJAK2に結合し、下流のSTAT3/5活性化をブロックすることによってTPO媒介性増殖を阻害する参考文献12、13。それゆえ、本発明者らは、JAK2-STAT3/5経路のTPO媒介性活性化へのLNK変異の影響を検討した。WTおよび変異LNKを発現するBaF3-MPL細胞をTPOで刺激し、JAK2、STAT3およびSTAT5のリン酸化活性化をリン酸特異的フローサイトメトリによって測定した図2Bおよび図4。空のベクターEVで形質導入したBaF3-MPL細胞において、TPO1ng/mLでの刺激はJAK2-STAT3/5経路の堅固な活性化を生じさせ、前記活性化は約30分でピークに達し、60分まで維持された。これに対し、WTLNKを発現する細胞はJAK2-STAT3/5の低い活性化を示し、30分で一過性にピークに達し、直ちに低下した。SH2ドメイン変異体R392Eを発現するBaF3-MPL細胞はLNKの阻害能力を喪失しており、EVの2倍長い30~120分間、JAK2-STAT3/5活性化の最大値を達成し、維持した。DEL変異体を発現する細胞はEVに類似した成績であり、30~60分間、JAK2-STAT3/5活性化の維持を示した。E208Q変異体はこの系においてほぼ完全な阻害能力を保持し、増殖アッセイで見られた部分的阻害と一致して、機能のわずかな喪失をもたらし得ることを示唆した。これらの所見は、LNKが、サイトカイン刺激後にJAK-STATシグナル伝達を終結させる上で重要な役割を果たし参考文献12、機能喪失変異がMPNにおいて一般的に認められる減衰しないJAK-STAT活性化および細胞増殖の増大を可能にし得ることを示した以前の試験と一致する。TPO依存性STAT3/5活性化および増殖のLNK媒介性阻害におけるJAK2の役割をさらに評価するため、BaF3-MPL細胞を汎JAK阻害剤JAK阻害剤Iの存在下で培養した。WTまたは変異LNKを発現するBaF3-MPL細胞はJAK阻害に対して感受性のままであり、各々の細胞株について類似のIC50であった図2C。同様に、JAK2-STAT3/5活性化は、すべての細胞株においてJAK阻害剤Iによって有効に阻害された図5。これらの所見は、WTまたは変異LNKの存在下で、TPO媒介性増殖およびSTAT活性化がJAK阻害によって排除され得ることを確認する。LNK変異はCD34早期前駆細胞画分におけるJAK-STATの異常活性化に関連する。本発明者らは、健常ドナーならびにLNK、JAK2V617FまたはMPLW515L変異を担持するMPN患者からの循環未熟骨髄性細胞におけるJAK-STATシグナル伝達を検討した図6。図3A左側に示すように、TPOまたはG-CSFでの刺激は、健常ドナーの試料と比較してDELにおいて著明に増大している独特のリン酸化STAT3/5pSTAT3/5亜集団を明らかにした。同様のサイトカイン応答性pSTAT3/5亜集団がJAK2V617F陽性およびMPLW515L陽性PMF試料に関して認められ、これがPMF患者の間で共有される表現型であり得ることを示唆した。興味深いことに、E208Q変異を担持する患者からの細胞は、TPOに応答してSTAT3/5リン酸化の増大を示したが、GCSFでは増大を示さず、LNK機能の部分的喪失が特定のサイトカインに応答して区別的なSTAT活性化プロフィールをもたらし得ることを示唆した。STAT3/5活性化をJAK阻害剤Iの存在下でも測定した図3A、右側。各々の場合に、pSTAT3/5亜集団はJAK阻害によって完全に根絶され、STAT3/5活性化がJAK活性に依存することを確認した。サイトカイン応答性pSTAT3/5応答性集団をさらに特徴づけるため、このサブセットに関する広範な表面マーカー分析を実施した。図3Bに示すように、DELからの応答性細胞は主としてCD34でありTPO応答性の81およびGCSF応答性の89、応答性細胞が主として早期前駆細胞および/またはHSCから成ることを示唆した。加えて、サイトカイン応答性細胞と非応答性細胞集団を比較した場合、CD34発現は応答性細胞において著明に増大しており、サイトカイン応答性が早期前駆細胞画分の顕著な特徴であり得ることを指示した。CD34応答性細胞の全体的な頻度を計算し図3C、この亜集団が健常ドナーと比較してDELにおいて著明に増加していることを認めた。同様の結果がJAK2V617F陽性およびMPLW515L陽性PMF試料に関して認められた。TPO応答性であるがG-CSF応答性ではないE208Qでは、CD34細胞が増加していた。これらの所見は、CD34早期前駆細胞画分におけるTPOおよび/またはG-CSFを介したSTAT3/5の活性化はMPNにおいて頻発する特徴であるが、様々な表現型が存在し得ることを示唆する。DELにおけるサイトカイン応答性CD34細胞の異常な存在率を考慮して、LNK変異がこれらの細胞に存在するかどうかを検討した。図3Dに示すように、対立遺伝子特異的な定量的PCRは、サイトカイン応答性細胞におけるDEL変異の存在を確認した。加えて、T細胞中にDEL変異が存在しないことは、変異が骨髄系列に限定されていたことを示唆する。最後に、変異対立遺伝子負荷は、異型接合変異と一致して、検討したすべての骨髄性細胞において~50であった。これらの所見は、LNK変異がCD34早期前駆細胞画分において起こり、MPNの病因における早期遺伝的事象であることを示唆する。考察初めてヒト疾患に関係づけられた、本発明者らのMPN患者のサブセットにおけるLNK遺伝子の変異の同定は、阻害性アダプタータンパク質の破壊が、典型的にはチロシンキナーゼすなわちJAK2、MPLの活性化変異によって駆動される疾患を表現型模写できることを明らかにする。本発明者らは、33名のうち2名6のJAK2V617F陰性MPN患者においてLNK変異を検出した。この頻度は、ETおよびPMFにおけるMPLW515変異の発生率に類似するが、LNK変異の正確な頻度ならびにMPNの臨床病理学的特徴および予後とのそれらの関連性を決定するには、より大きなコホートのスクリーニングが必要である。以前のインビトロ試験は、LNKがMPLW515LおよびJAK2V617Fの両方の活性を阻害できることを明らかにしているので参考文献13、18、LNK機能の喪失もまた、これらのMPNの病因における協力的な事象として起こり得ることが考えられる。本明細書で述べるLNK変異の両方がPHドメインに影響を及ぼし、また他のタンパク質例えばAKT1のPHドメインにおける変異が固形腫瘍において報告されており参考文献19、20、これが次第に認識されつつある腫瘍形成の機構であり得ることを示唆する。LNKのPHドメインは形質膜局在化のために重要であるので、DELおよびE208Q変異は、LNKの誤った局在化ならびにMPLおよびJAK2に結合する能力の変化を生じさせ、下流のSTAT活性化を阻害し得る。実際に、PHドメインが欠失した合成LNK変異体はもはや形質膜に局在することができなかった参考文献13。DEL変異体はまたSH2ドメインも欠如しており、これは、そのより完全な機能の喪失を説明し得る。このことは以前の試験によって裏付けられ、その試験では、PHドメインに影響を及ぼす合成点変異はLNK機能の部分的喪失をもたらしたがE208Qと同様に、SH2ドメインに影響を及ぼす変異はMPLおよびJAK2への結合を排除し、より深刻な表現型を生じさせた参考文献12、13、16、21。本発明者らの対立遺伝子特異的な定量的PCRの結果は、DEL変異が異型接合であることを示唆し、一方の機能性LNK対立遺伝子の喪失すなわちハプロ不全はこれらの症例においてMPN病因を開始させるのに十分であり得るという概念を想起させる。マウス試験では、LNK機能の不在LNK-/-はMPN表現型を導いたが、異型接合性LNK/-は、ハプロ不全モデルと一致して、中間的な表現型を付与した参考文献15。あるいは、N末端のプロリンリッチ二量体化ドメインはDELおよびE208Q変異の両方に関して保持されるので、変異LNKの誤った局在化はWTLNKの分離を導き、それによって両方のLNK対立遺伝子の機能喪失をもたらし得るすなわちトランス優性。この仮説は、PHドメインとSH2ドメインの両方を破壊する合成変異体がドミナントネガティブ作用を及ぼした以前の試験によって裏付けられる参考文献22。LNKは負のフィードバックループの重要な成分であるので、TPOでのサイトカイン刺激はLNKがJAK2に強く結合し、下流のSTAT活性化を抑制するまたは終結させるように誘導する参考文献12。この負の調節は、正常な造血およびHSCの増殖と成長の調節に不可欠である。本発明者らの所見は、LNKの変異がこのフィードバック軸を分断し、それによってサイトカイン刺激に応答したSTAT3/5活性化の増強と維持を可能にし、BaF3-MPL増殖アッセイによって明らかにされたように、増殖の増大を生じさせることを指示する。これらの作用は、LNK変異を担持するMPN患者におけるサイトカイン応答性CD34早期前駆細胞の過剰として生理的に発現された。さらに、CD34画分におけるDEL変異の存在は、LNKの破壊がこれらの細胞に増殖上の利点を与え、PVにおけるJAK2V617Fに関する以前の所見と同様に参考文献23、MPNの病因における早期遺伝的事象であり得ることを示唆する。LNK変異を担持する患者からの一次試料におけるpSTAT3/5応答は、JAK2V617FまたはMPLW515L変異を担持するPMF患者においても認められた。明らかに、JAK-STAT活性化はMPN生物学の主要な特徴である;JAK2またはMPL変異の不在下で、LNK変異はこの異常な応答を駆動し得る。さらに、pSTAT3/5応答の異常は、急性骨髄性白血病において認められる亜集団を想起させ参考文献24、このシグナル伝達表現型が様々な骨髄性新生物において認められる頻発特徴であることを示唆する。LNK変異を担持する細胞株および一次試料のTPO媒介性シグナル伝達および増殖はJAK阻害剤によって有効に阻害されたので、JAK2阻害剤による治療はLNK変異を有する患者のために実施可能であり得る。実際に、JAK2阻害剤に関する早期治験において、JAK2V617F陽性および陰性の両方のMPN患者で応答が認められており参考文献25、それゆえこれらの後者の個人をLNK変異に関してスクリーニングすることは興味深い。方法臨床試料すべての臨床試料は、インフォームドコンセントおよびスタンフォード大学医学部の治験審査委員会による承認を得て入手した。末梢血試料をヘパリンナトリウム中で得て、直ちにサイトカインで刺激するか、または標準的な手順に従ったフィコール密度勾配分離による末梢血単核細胞PBMCの単離後にサイトカインで刺激した参考文献24、26。皮膚線維芽細胞を皮膚パンチ生検の機械的解離によって単離し、標準的な方法を用いて短期単層培養において樹立した。塩基配列決定ゲノムDNAgDNAを、QIAampDNABloodMiniまたはGentraPurgeneBloodKitQiagen,Valencia,CAのいずれかを製造者の説明書に従って使用して末梢血試料または培養した皮膚線維芽細胞から抽出した。gDNAの品質と量を、Nanodrop分光光度計ThermoScientific,Wilmington,DEを用いて評価した。PHドメインおよびSH2ドメインを含む、LNKエクソン2~7についてのPCRおよび配列決定プライマーを以下のように設計した:配列番号:1LNK_PART_EX2_F:CGGAGAGGCTGCTGAGAC配列番号:2LNK_PART_EX2_R:TTGCACTCGGCCTAAAAGTT配列番号:3LNK_PART_EX2_F_nest:AAGAAGTTCCTGCCCTGGAG配列番号:4LNK_PART_EX2_R_nest:CTGGAAAGCCATCACACCTC配列番号:5LNKEX3-5_F:AACTCAGGCCTGGCTGG配列番号:6LNKEX3-5_R:GGGCTACCTTATGTCCTGGG配列番号:7LNKEx3-5_F_INTSEQ:GGTGGGAGACGAGCAG配列番号:8LNKEx3-5_R_INTSEQ:CTGTGCACTCCGAGAGC配列番号:9LNK_Ex6-7_F:GTACGCTGGAACCCAGACTC配列番号:10LNK_Ex6-7_R:GTCTGCAGCAAGCCTCTACC配列番号:11LNK_Ex6-7_Nest_F:ACTCAGCCCAGGACATAAGG配列番号:12LNK_Ex6-7_Nest_R:GCCTCTACCCTCTACCCAGTG配列番号:13LNK_EX6_NEST_SEQF:GCTCATGGAGTGTTCCTGGT配列番号:14LNK_EX6_NEST_SEQR:AGGTGCTGTGGGAGGAGAGタッチダウンPCRを標準的なプロトコールに従って実施し、次いで配列分析の前に適切な増幅を確認するためにアガロースゲル電気泳動を行った。BigDyev3.1AppliedBiosystems,FosterCity,CAおよびAppliedBiosystems3100または3730xlDNAAnalyzerを使用して、製造者のプロトコールに従って両方向塩基配列決定を実施した。細胞培養BaF3-MPL細胞はJ.Tyner/B.DrukerOregonHealthandSciencesUniversity,Portland,ORの好意によって提供され、これらを10FBSおよびIL-31ng/mLPeprotech,RockyHill,NJを含有するRPMI培地に維持した。増殖アッセイのために、BaF3-MPL細胞をサイトカイン不含培地で2回洗浄し、10FBSおよびTPO0~10ng/mLPeprotech,RockyHill,NJを含むRPMIに再塗布した。JAK阻害剤増殖アッセイのために、BaF3-MPL細胞を様々な濃度のDMSO対照またはJAK阻害剤IEMD/Calbiochem,SanDiego,CAの存在下でTPO10ng/mLと共に増殖させた。ヨウ化プロピジウムPIで染色することによって生細胞を毎日計数し、LSRIIフローサイトメータでTruCountビーズBDBiosciences,SanJose,CAを用いて定量した。Phoenix-Ecoレトロウイルスパッケージング細胞を、10FBSを含有するDMEM培地に維持した。発現ベクター野生型LNKおよびDEL配列をGateway適合性ドナーベクター中のDNA2.0MenloPark,CAによって合成した。pSRαレトロウイルス発現ベクターはJ.Tyner/B.Drukerの好意によって提供され、GatewayVectorConversionSystemInvitrogen,Carlsbad,CAを製造者の説明書に従って使用してGateway適合性デスティネーションベクターpSRα-GWに転換した。WTおよびDEL配列を、LRクロナーゼInvitrogen,Carlsbad,CAを用いてpSRα-GWに移入した。E208QおよびR392E変異体を、QuikChangeLightningKitStratagene,LaJolla,CAを用いてWTLNKから作製し、直接塩基配列決定によって確認した。レトロウイルス形質導入Lipofectamine2000Invitrogen,Carlsbad,CAを使用してレトロウイルス発現ベクターをPhoenix-Eco細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後にレトロウイルス上清を収集し、レトロネクチン被覆プレート上でポリブレン4mg/mLと共にBaF3-MPL細胞に添加して、1500×gで90分間遠心分離した。形質導入の2日後、形質導入された細胞が安定に増殖し続けるまで、細胞を少なくとも1週間G418750ng/mL中で選択した。サイトカイン刺激およびリン酸特異的フローサイトメトリBaF3-MPL細胞をサイトカイン不含培地中で一晩飢餓させ、15分~16時間にわたる時点で37°CにてTPO1または10ng/mLで刺激した。末梢血試料をTPO50ng/mLまたはG-CSF20ng/mLPeprotech,RockyHill,NJのいずれかで37°Cにて15分間刺激した。PBMCを、サイトカイン刺激の前に10FBSを含有するRPMI中で37°Cにて1時間休ませた。JAK阻害剤実験のために、PBMCをJAK阻害剤IEMD/Calbiochem,SanDiego,CA5μMと共に最後の30分間インキュベートした後、サイトカインで刺激した。サイトカイン刺激後、細胞をパラホルムアルデヒドElectronMicroscopySciences,Hatfield,PAに固定した。末梢血試料のために、赤血球を低張条件下で溶解した。次に、固定した細胞を氷冷メタノール中で透過処理し、標準的な手順に従って細胞表面マーカーおよび/または細胞内リン酸特異的エピトープを染色した参考文献24、26。以下の抗体を使用した特に断りのない限り、すべての抗体はBDBiosciences,SanJose,CAから得た:pSTAT3pY705、クローン4/P、pSTAT5pY694、クローン47、pJAK2pY1007/1008、CellSignalingTechnology,Danvers,MA、CD34クローン8G12、CD38クローンHIT2、Invitrogen,Carlsbad,CA、CD14クローンM5E2、CD66クローンB1.1、CD33クローンP67.6、CD3クローンUCHT1、BeckmanCoulter,Brea,CA。細胞をBDLSRIIフローサイトメータで測定した。選別実験のために、BDFACSAriaIIセルソータを用いて細胞を直接PBS中に選別した。フローサイトメトリのデータをFACSDivaソフトウエアで入手し、FlowJoTreeStar,Ashland,ORまたはCytobankを用いて標準的な手順に従って解析した参考文献24、26。対立遺伝子特異的な定量的PCR選別した細胞からのDNAを、RecoverALLAmbion,Austin,TXを製造者の説明書に従って使用して抽出した。PowerSYBRGreenPCRMasterMixAppliedBiosystemsを使用してRotor-Gene3000Corbett/Qiagen,Valencia,CAで、5DMSOの存在下に3組の複製と共に増幅を実施した。LNKの両方の対立遺伝子に区別なくハイブリダイズするプライマー[配列番号:15GCTGAAGGAGGCGGTGCTおよび配列番号:16GCTGTCCATGGAGGCCTCGT]ならびに変異体DEL対立遺伝子に特異的なプライマー[配列番号:17GGAGGCGGTGCTATAGCGTおよび配列番号:16GCTGTCCATGGAGGCCTCGT]を使用して全LNKまたは変異LNKのいずれかを増幅した。WTまたは変異LNKDNAプラスミドの段階希釈を使用して別々の標準曲線を構築した。変異LNK対立遺伝子の相対的存在率を、分析した細胞サブセット内の変異LNK対全LNKの絶対濃度の比として推定した。LNK変異を有する2名の患者の臨床症例報告患者01は、2007年に疲労を呈した75歳の男性であった。理学的検査は、肋骨縁の下の20cm以上の巨脾腫が顕著であった。白血球数は12,100/mm3、ヘモグロビンは6.3g/dL、血小板数は323,000/mm3であった。末梢血スメアは、涙滴赤血球および有核赤血球形態ならびに未熟骨髄性細胞を含む白赤芽球症を示した。骨髄穿刺液は針骨状aspiculateであり、細胞遺伝学分析は実施しなかった。骨髄生検は、巨核球の過形成およびクラスタリングを伴うびまん性の著明な線維症を明らかにした。フローサイトメトリは、末梢血中で6および骨髄で8の芽細胞を示した。JAK2V617F変異分析は陰性であった。原発性骨髄線維症の診断が与えられた。患者は赤血球輸血依存性であり、プレドニゾン、ダナゾール、エリスロポエチンおよびヒドロキシ尿素を含むいくつかの療法に対して不応答性であった。患者は現在、JAK2阻害剤臨床試験のために考慮されている。患者02は59歳の男性で、2002年に1,200,000/mm3の血小板数を示し、そのほかの血球算定は正常であった。検査で臓器巨大症は存在しなかった。血小板増加症の反応性原因は除外された。末梢血スメアは、他の有意の形態学異常を伴わない巨大血小板形態を明らかにし、骨髄生検は、本態性血小板血症と一致して、巨核球増加を伴う正常細胞性であった。細胞遺伝学は正常であり、JAK2V617F変異分析は陰性であった。患者は、アスピリンならびにアナグレリドおよびヒドロキシ尿素を含む細胞減少薬の間欠的使用で治療されており、血栓出血性合併症は有していなかった。さらなる研究LNK変異体の細胞内局在の検査:これまでの試験は、LNKがPHドメインを介して形質膜に局在し、形質膜においてMPLおよびJAK2と直接相互作用することを示したBersenevetal.,J.Clin.Invest2008,118:2832-2844;およびGeryetal.,Blood2007,110:3360-3364。LNKSH2変異体R392EおよびSH2ドメインを欠く欠失変異体は、どちらも形質膜に局在する能力を保持する。しかし、SH2ドメインとPHドメインの両方を欠く欠失変異体delPH/SH2はこの能力を喪失するGeryetal.,Blood2007,110:3360-3364。LNKのN末端二量体化ドメインを含む、次いでPHドメインの直前の中途終止コドンを保持するこの変異体は、本発明者らが同定したLNKDEL変異体に著しく類似する図7。それゆえ、本発明者らは、LNKDEL変異体もまた、もはや形質膜に局在しないと予測する。この仮説を調べるため、野生型LNKならびにLNKDELおよびE208Q変異体を発現する細胞をLNK特異的抗体で染色し、共焦点顕微鏡で検査する免疫蛍光実験を実施する予定である。LNKに特異的な市販の抗体が利用可能であるが、本発明者らは、これらの実験を容易にするためにLNKのN末端にエピトープタグ例えばHAタグを導入するつもりである。潜在的ドミナントネガティブとしてのLNK変異体の評価:新たに記述されたLNKDELおよびE208Q変異体は、野生型LNK機能の一部または全部を欠如し得る。加えて、野生型LNKタンパク質の存在下で発現された場合これらの変異を担持する患者について述べたように異型接合状態であるので、それらはドミナントネガティブとして作用し得る。これは、おそらくPHドメインの欠如のために形質膜に局在する能力を喪失している、LNKDEL変異体に関して特に当てはまる。しかし、この変異体は二量体化ドメインを保持するので、本発明者らは、この変異体が野生型LNKと二量体化して、野生型タンパク質の誤った局在化も引き起こし得ると推測する。この概念は、同様に構造化された変異体PHドメインの欠失およびSH2ドメインを破壊する点変異を含む図7がドミナントネガティブ作用を及ぼす能力を有することが示された以前の試験Takizawaetal.,Blood2006,107:2968-2975によってさらに裏付けられる。参考文献1.BaxterEJ,ScottLM,CampbellPJ,etal.AcquiredmutationofthetyrosinekinaseJAK2inhumanmyeloproliferativedisorders.Lancet2005;365:1054-61.2.JamesC,UgoV,LeCouedicJP,etal.AuniqueclonalJAK2mutationleadingtoconstitutivesignallingcausespolycythaemiavera.Nature2005;434:1144-8.3.KralovicsR,PassamontiF,BuserAS,etal.Again-of-functionmutationofJAK2inmyeloproliferativedisorders.NEnglJMed2005;352:1779-90.4.LevineR,WadleighM,CoolsJ,etal.ActivatingmutationinthetyrosinekinaseJAK2inpolycythemiavera,essentialthrombocythemia,andmyeloidmetaplasiawithmyelofibrosis.CancerCell2005;7:387-97.5.ScottLM,TongW,LevineR,etal.JAK2exon12mutationsinpolycythemiaveraandidiopathicerythrocytosis.NEnglJMed2007;356:459-68.6.PikmanY,LeeBH,MercherT,etal.MPLW515Lisanovelsomaticactivatingmutationinmyelofibrosiswithmyeloidmetaplasia.PLoSMed2006;3:e270.7.PardananiA,LevineR,LashoT,etal.MPL515mutationsinmyeloproliferativeandothermyeloiddisorders:astudyof1182patients.Blood2006;108:3472-6.8.TeofiliL,MartiniM,CenciT,etal.DifferentSTAT-3andSTAT-5phosphorylationdiscriminatesamongPh-negativechronicmyeloproliferativediseasesandisindependentoftheV617FJAK-2mutation.Blood2007;110:354-9.9.HellerP,LevP,SalimJ,etal.JAK2V617Fmutationinplateletsfromessentialthrombocythemiapatients:correlationwithclinicalfeaturesandanalysisofSTAT5phosphorylationstatus.EurJHaematol2006;77:210-6.10.MesaR,TefferiA,LashoT,etal.Januskinase2V617Fmutationstatus,signaltransducerandactivatoroftranscription-3phosphorylationandimpairedneutrophilapoptosisinmyelofibrosiswithmyeloidmetaplasia.Leukemia2006;20:1800-8.11.RuddCE.Lnkadaptor:novelnegativeregulatorofBcelllymphopoiesis.SciSTKE2001;2001:PE1.12.BersenevA,WuC,BalcerekJ,TongW.LnkcontrolsmousehematopoieticstemcellselfrenewalandquiescencethroughdirectinteractionswithJAK2.JClinInvest2008.13.GeryS,GuellerS,ChumakovaK,KawamataN,LiuL,KoefflerHP.AdaptorproteinLnknegativelyregulatesthemutantMPL,MPLW515Lassociatedwithmyeloproliferativedisorders.Blood2007;110:3360-4.14.TakakiS,MoritaH,TezukaY,TakatsuK.Enhancedhematopoiesisbyhematopoieticprogenitorcellslackingintracellularadaptorprotein,Lnk.JExpMed2002;195:151-60.15.VelazquezL,ChengAM,FlemingHE,etal.CytokinesignalingandhematopoietichomeostasisaredisruptedinLnk-deficientmice.JExpMed2002;195:1599-611.16.TongW,LodishHF.LnkinhibitsTpo-mplsignalingandTpo-mediatedmegakaryocytopoiesis.JExpMed2004;200:569-80.17.Buza-VidasN,AntonchukJ,QianH,etal.Cytokinesregulatepostnatalhematopoieticstemcellexpansion:opposingrolesofthrombopoietinandLNK.GenesDev2006;20:2018-23.18.GeryS,CaoQ,GuellerS,XingH,TefferiA,KoefflerHP.Lnkinhibitsmyeloproliferativedisorder-associatedJAK2mutant,JAK2V617F.JLeukocBiol2009;85:957-65.19.CarptenJD,FaberAL,HornC,etal.AtransformingmutationinthepleckstrinhomologydomainofAKT1incancer.Nature2007;448:439-44.20.ShojiK,OdaK,NakagawaS,etal.TheoncogenicmutationinthepleckstrinhomologydomainofAKT1inendometrialcarcinomas.BrJCancer2009;101:145-8.21.TongW,ZhangJ,LodishHF.LnkinhibitserythropoiesisandEpo-dependentJAK2activationanddownstreamsignalingpathways.Blood2005;105:4604-12.22.TakizawaH,Kubo-AkashiC,NobuhisaI,etal.Enhancedengraftmentofhematopoieticstem/progenitorcellsbythetransientinhibitionofanadaptorprotein,Lnk.Blood2006;107:2968-75.23.JamiesonCH,GotlibJ,DurocherJA,etal.TheJAK2V617Fmutationoccursinhematopoieticstemcellsinpolycythemiaveraandpredisposestowarderythroiddifferentiation.ProcNatlAcadSciUSA2006;103:6224-9.24.IrishJM,HovlandR,KrutzikPO,etal.Singlecellprofilingofpotentiatedphospho-proteinnetworksincancercells.Cell2004;118:217-28.25.VerstovsekS,KantarjianHM,PardananiAD,etal.TheJAKinhibitor,INCB018424,demonstratesdurableandmarkedclinicalresponsesinprimarymyelofibrosisPMFandpostpolycythemia/essentialthrombocythemiamyelofibrosispostPV/ETMF.ASHAnnualMeetingAbstracts2008;112:1762.26.KotechaN,FloresN,IrishJ,etal.Single-cellprofilingidentifiesaberrantSTAT5activationinmyeloidmalignancieswithspecificclinicalandbiologiccorrelates.CancerCell2008;14:335-43.前述の本発明を、理解を明瞭にするために図面および実施例によってある程度詳細に説明したが、本発明の教示に照らして、付属の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく特定の変更および修正を行い得ることは当業者に容易に明白である。したがって、前記説明は単に本発明の原理を例示するものである。当業者は、本明細書において明白に説明または示されてはいないが、本発明の原理を具現化し、その精神および範囲に含まれる様々な仕組みを考案できることが認識される。さらに、本明細書で言及されるすべての例および条件付き言語は、主として、本発明の原理および当分野の技術を推進するために発明人によって寄与される概念を理解する閲覧者の助けとなることが意図されており、そのような特定して言及される例および条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様および実施形態を列挙する本明細書のすべての記述ならびにその特定例は、その構造的および機能的等価物の両方を含むことが意図されている。加えて、そのような等価物は、現在公知の等価物および将来開発される等価物、すなわち、構造にかかわりなく同じ機能を実施する開発された任意の要素の両方を含むことが意図されている。本発明の範囲は、それゆえ、本明細書で示され、説明される例示的な実施形態に限定されることを意図されない。むしろ、本発明の範囲および精神は付属の特許請求の範囲によって具現化される。"