"生aro変異B.bronchiseptica株および芳香族栄養補給物を含む、BordetelbronchisepticaB.bronchiseptica感染に起因する臨床疾患から動物を保護するためのワクチンであって、ここでワクチンが全身投与に適している前記ワクチン。芳香族栄養補給物がチロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンを含む請求項1のワクチン。芳香族栄養補給物がパラアミノ安息香酸をさらに含む請求項2のワクチン。芳香族栄養補給物が2,3‐ジヒドロキシ安息香酸をさらに含む請求項3のワクチン。生aro変異B.bronchiseptica株が生aroA変異B.bronchiseptica株である請求項1のワクチン。アジュバントをさらに含む請求項5のワクチン。アジュバントがアルミニウム塩を含む請求項6のワクチン。アルミニウム塩がリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムおよび水酸化アルミニウムから成る群より選択される請求項7のワクチン。イヌインフルエンザウイルス抗原、イヌパラインフルエンザウイルス抗原、またはイヌインフルエンザウイルス抗原およびイヌパラインフルエンザウイルス抗原の双方をさらに含む請求項8のワクチン。芳香族栄養補給物がチロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンを含む請求項9のワクチン。芳香族栄養補給物がパラアミノ安息香酸および2,3‐ジヒドロキシ安息香酸をさらに含む請求項10のワクチン。イヌインフルエンザウイルス抗原、イヌパラインフルエンザウイルス抗原、またはイヌインフルエンザウイルス抗原およびイヌパラインフルエンザウイルス抗原の双方を含む請求項5のワクチン。イヌインフルエンザウイルス抗原が不活化イヌインフルエンザウイルスおよびイヌパラインフルエンザウイルス抗原が改変型生イヌパラインフルエンザウイルスである請求項12のワクチン。生aroA変異B.bronchiseptica株および改変型生イヌパラインフルエンザウイルスが凍結乾燥球体中にありおよび不活化イヌインフルエンザウイルが希釈剤中にある請求項13のワクチン。生aro変異B.bronciseptica株およびアジュバントを含む、BordetellabronchisepticaB.bronchiseptica感染に起因する臨床疾患から動物を保護するためのワクチンであって;ここでワクチンが全身投与に適しており;およびアジュバントがアルミニウム塩を含む前記ワクチン。アルミニウム塩がリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムおよび水酸化アルミニウムから成る群より選択される請求項15のワクチン。イヌインフルエンザウイルスH3赤血球凝集素タンパク質をコードする核酸またはその抗原性フラグメントを含む生aro変異BordetellabronchisepticaB.bronchiseptica株を含む多価ワクチンであって;ここで前記核酸が操作可能にプロモーターに連結されており;およびそれによって前記生aro変異B.bronchiseptica株がイヌインフルエンザウイルスH3赤血球凝集素またはその抗原性フラグメントを発現することができる前記の多価ワクチン。ワクチンが芳香族栄養補給物を含む請求項17の多価ワクチン。請求項11のワクチンを当該イヌに全身的に投与することを含む、B.bronchiseptica感染に起因する臨床疾患からのイヌの保護における救援方法。請求項1のワクチンを当該動物に全身的に投与することを含む、B.bronchiseptica感染に起因する臨床疾患からの動物の保護における救援方法。不活化抗原と対照的に、本発明の生aro変異細菌は弱毒化される。従ってワクチンを調剤するときには、弱毒化細菌の力価を重大な有害事象がもたらされるよりも低い安全なレベルに維持するように注意しなければならない。しかし当該安全レベルの達成は、しばしば弱毒化生ワクチンの効果の低下をもたらす。本発明はワクチンに添加される弱毒化生細菌抗原の力価を増加することなく、ワクチンの効力を増加させることによってこの問題を克服した。加えて本発明は、安全かつ効果的なワクチンの作成に必要な弱毒化生細菌の量を顕著に減少させることによって、提供されるワクチンの製造コストを低減するための方法をも提供する。従って本発明は、全身投与に適した形態で生aro変異細菌を含む、安全かつ効果的なワクチンを提供する。1の態様において、本発明は生aro変異細菌および芳香族栄養補給物を含むワクチンを提供する。特定の実施態様において、生aro変異細菌はaroA変異細菌である。驚いたことに、生aroA変異細菌を含むワクチンの効力は、芳香族栄養補給物が当該ワクチン組成物に添加されたときに、許容できない注射部位反応を引き起こすことなく顕著に増加することが見出された。別の態様において、本発明はアジュバントの存在のためにより大きな効力を示す弱毒化生ワクチンを提供する。しばしばこのような効力の改善は、負の副作用を激しく増幅するアジュバントの添加によって達成された。それ故に、一方ではその安全性が許容可能なレベルに維持されると同時に、Bordetellabronchisepticaのaro変異株を含むワクチンの効力がアジュバントの添加によって改善することができる事は、思いがけなく見出された。この結果は、特に当該ワクチンに対する有効量の範囲の増加をもたらす。さらに別の態様において、本発明は、一方ではワクチンの安全性が許容可能なレベルになお維持されると同時に、アジュバントおよび芳香族栄養補給物の双方の存在のためにより大きな効力を示す、弱毒化生aro変異細菌ワクチンを提供する。本発明は、B.bronchiseptica感染に起因する臨床疾患から動物を保護するために、全身投与用ワクチンを製造するための生aro変異B.bronchisepticaを使用する方法をさらに提供する。また本発明は、B.bronchiseptica感染に起因する臨床疾患から動物を保護するための方法にも関係し、該方法は生aro変異B.bronchiseptica株を含むワクチンの全身投与を含む。本明細書において用いる場合、以下の用語は以下に提示する定義を有するものとする。本明細書において用いる場合、ワクチンとは、典型的には水を含む液体等の薬理学的に許容可能な担体と組み合わせられた1または複数の抗原を含む、動物一定の実施態様において人間を含むへの施用に適した組成物であり、それは動物へ投与されると、野生型の微生物感染に起因する臨床疾患から保護する最小限の救援にとって十分強力な、すなわち、臨床疾患の予防における救援、および/または臨床疾患の予防、寛解または治癒における救援にとって十分強力な、免疫応答を誘導する。本明細書において用いる場合、多価ワクチンとは2以上の異なる抗原を含むワクチンである。このタイプの特定の実施態様において、多価ワクチンは2以上の異なる病原体に対する受容者の免疫系を刺激する。本明細書において用いる場合、用語保護protectingまたは保護の提供providingprotectiontoおよび保護における救援aidsintheprotectionとは、任意の感染徴候からの完全な保護を要求するものではない。例えば、保護における救援とは、感染後に潜在的な感染の徴候が少なくとも減少するように、および/または潜在的な細胞性、生理学的または生化学的な原因または症状を引き起こす機構の1または複数が減少および/または除去されるように、保護が十分であることを意味することがある。この文脈で用いられる場合減少とは、感染の分子状態を含むが感染の生理学的状態を含まない、感染の状態に関係する意味である。本明細書において用いる場合、用語薬理学的に許容可能は、修飾される名詞が医薬製品の使用に適していることを意味するために形容詞的に使用される。例えば、医薬ワクチン中の賦形剤を記載するためにそれが使用される場合、それは組成物の他の原料と共存できる、しかも所期の受容者に不利や有害ではないものとして賦形剤を特徴づける。用語担体とは、それと共に化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または媒介物vehicleをいう。薬理学的に許容可能な担体は、石油、動物、植物または合成起源の液体、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等を含む、水および/または油等の無菌の液体であることが可能である。水または水溶液、生理食塩水およびブドウ糖水溶液およびグリセリン溶液が担体として、特に注射可能な溶液用に使用し得る。本明細書において用いる場合、アジュバントとは、免疫事象の連鎖cascadeを促進または増大することができ、究極的には良好な免疫応答、即ち抗原に対する統合した身体的な応答をもたらすことのできる物質である。アジュバントは、免疫応答を起こさせるためには一般的には必要とされないが、当該応答を促進または増大する。本明細書において用いる場合、全身投与は、身体の循環系心血管系およびリンパ系を含むへの投与であり、従って、例えば消化管例えば、経口投与または直腸投与によるおよび呼吸系例えば、鼻腔内投与による等の特定部位よりは身体全体に影響を及ぼす。全身投与は、例えば、筋肉組織の中筋肉内、皮膚の中皮内、経皮または上皮、皮膚の下皮下、粘膜の下粘膜下、静脈の中静脈内等へ投与することによって実施され得る。非経口投与には、皮下注射、粘膜下注射、静脈注射、筋肉内注射、皮内注射および点滴が含まれる。本明細書において用いる場合、イヌcanineには、特に指示のない限り全てのイエイヌ、CanislupusfamiliarisまたはCanisfamiliarisが含まれる。本明細書において用いる場合、用語ネコとは、ネコ科の任意のメンバーをいう。この科のメンバーには、亜科Felinaeの任意のメンバー、例えば、ネコ、ライオン、トラ、ピューマ、ジャガー、ヒョウ、ユキヒョウ、黒ヒョウ、クーガー、チータ、オオヤマネコ、ボブキャット、カラカルまたはその任意の雑種等の野生、動物園飼育および家庭飼育のメンバーが含まれる。またネコには、イエネコ、純血種および/または雑種の愛玩用ネコ、見世物用ネコ、実験用ネコ、クローンネコおよび野生またはノラネコも含まれる。本明細書において用いる場合、細菌における遺伝子の遺伝子変異は、突然変異および/または欠失および/または遺伝子への挿入の結果であり得て、自然におよび/または実験室場面においておよび継代培養により、および/または1または複数の遺伝子組換え方法による設計によって起こる遺伝子事象を含むことが可能である。本明細書において用いる場合、aro変異細菌とは、コリスミ酸を合成することができないか、または対応する野生型細菌よりも顕著に少ないコリスミ酸しか合成できない細菌であり、そのことは結果的に栄養補給されない培地、自然環境または環境において細菌増殖の顕著な阻害および/または遮断をもたらす。aroA変異細菌は、その対応する遺伝子産物即ち、その遺伝によってコードされた酵素に対応する阻害および/または不活性化をもたらす、コリスミ酸生合成経路内の遺伝の遺伝子変異および/または翻訳後機能不全から生じ得る。本明細書において用いる場合、aroA変異細菌とは、遺伝子変異がaroA遺伝子内にあり、および/または対応するaroA遺伝子産物の同様の阻害および/または不活性化をもたらす翻訳後機能不全による、aro変異細菌である。本明細書において用いる場合、芳香族栄養補給物aromaticsupplementとは、aro変異細菌例えば、aroA変異株の非効率的な増殖を少なくとも部分的に代償することのできる、1又は複数の芳香族化合物を含む組成物である。従って、培地、自然環境および/または環境に芳香族栄養補給物が存在すれば、aro変異細菌がより効率的に増殖することを可能とする。このように、芳香族栄養補給物には、コリスミ酸が中間体例えば、フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸である生合成経路の1または複数の最終産物が含まれ得、および/またはさもなければコリスミ酸を含む生合成経路においてコリスミ酸の後に生合成される中間体例えば、葉酸の生合成経路の中間体であるパラアミノ安息香酸が含まれ得る。また芳香族栄養補給物には、コリスミ酸の代替資源および/またはaro変異細菌において不利な影響を及ぼしてきたコリスミ酸生合成経路内の1または複数の中間体の代替資源も含まれ得る。コリスミ酸経路:コリスミ酸は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、葉酸、ユビキノンおよびエンテロバクチンシデロホア生合成における中心的な中間体であるMoatら、MicrobialPhysiology2002Wiley‐Liss、第15章、525‐527ページを参照。ホスホエノ‐ルピルビン酸とD‐エリトロ‐ス‐4‐リン酸との組み合せから出発するコリスミ酸以前の生合成経路の反応物質、関連酵素の遺伝子コードおよび代謝産物、ならびにコリスミ酸生合成の終末を以下に提示する。ここで:PEPはホスホエノールピルビン酸であり;DAHPは3‐ハイドロキシ‐L‐アラビノ‐7‐ホスホヘプツロン酸であり;3‐P‐シキミ酸は3‐ホスホシキミ酸であり;およびEEPKは3‐エノイル‐ピルビル‐3‐ホスホシキミ酸である。明らかな通り、aro遺伝子は、F,G,H由来アイソザイムのコード、、B、D、E、K,L由来アイソザイムのコード、AおよびCという順番で、B.bronchisepticaにおけるコリスミ酸合成に関与している。B.bronchisepticaにおけるコリスミ酸の生合成においてバイパスは存在しないように思われる。それ故に、これらのaro遺伝子の任意の1または対応する遺伝子産物の不活性化は、重要な芳香族化合物の生合成における同様の遮断をもたらすはずである。特定の実施態様において、上述の通りB.bronchisepticaの他のaro遺伝子における欠失もコリスミ酸合成での同様の遮断をもたらし得、従って変異細菌と同じ表現型をもたらし得るとはいえ、B.bronchiseptica細菌のaro変異株はaroA変異株である。ワクチン本発明は、全身投与用の弱毒化生細菌を含む安全かつ効果的なワクチンを提供する。当該ワクチンは、アジュバント下記を参照、他の免疫応答賦活剤、および/または媒介物集合的に賦形剤excipientと称するを含む、従来の薬理学的に許容可能な1または複数の担体をさらに含んでもよいと考えられる。当該賦形剤は、一般的にワクチン中の活性成分に適合するように選択される。賦形剤の使用は、ワクチン開発分野の当業者に周知である。安定剤の構成成分には、糖類および糖アルコール例えば、砂糖、グルコース、トレハロース、ソルビトール等、ゼラチンタンパク質加水分解物ラクトアルブミン加水分解物、NZアミン、血清アルブミンウシ血清アルブミン、卵白アルブミンおよび緩衝剤bufferingcompoundが含まれてよい。選択的におよび/または加えて、例えば安定剤および粘度調整剤等の他の物質が、ワクチンの使用目的または要求性状に依存してワクチンに添加されてよい。ワクチンの多数の形態、例えば、溶解、乳化または懸濁した抗原を有する液剤等、および例えば、移植片または液体に懸濁した固形抗原担体等の固形剤等が全身性のワクチン接種に適している。全身性のワクチン接種および当該ワクチン接種用の適合した物理的ワクチン形態は、多年にわたって知られてきた。また、ワクチンは貯蔵のために凍結乾燥かさもなければ液量を減少し、それから投与の前または投与時に液体希釈剤で再構成してもよいとも考えられる。当該再構成は、例えばワクチングレードの水を使用して行ってよい。以下に例示する通り一定の実施態様において、多価ワクチンの凍結乾燥部分は1または複数の抗原を含むことが可能であり、一方では希釈剤は1または複数の異なる抗原を含むことが可能である。特定の実施態様において、本発明のワクチンまたはその一部は凍結乾燥形態であり得る。当該凍結乾燥形態の例には、ケーキ、錠、球体および/または楕円体が含まれ、後者の3形態はその内容をすべて本明細書に援用するWO2010/125084に記載された方法によって作成することが可能である。特に、急速崩壊する錠/球体/楕円体を生産する方法を記載する、WO2010/125084の15ページ28行目から27ページの9行目までは実施例に援用する。当該凍結乾燥形態は、ワクチンの全身投与を可能とするために希釈剤に容易に溶解することができる。また当該希釈剤はワクチンの1または複数の追加の活性成分をさらに含むことも可能である。アジュバント:上述の通り、本発明のワクチンはアジュバントを含むことが可能である。より特定の実施態様において、アジュバントはアルミニウム塩を含む。アジュバントとしてのアルミニウム塩の使用は、ワクチン開発の技術分野において周知である。アルミニウム塩は特に類毒素を含むワクチン用に開発されてきたが、また他のサブユニットワクチンおよび不活化ホール微生物を含むワクチンと併用して使用されてもきた。また生ウイルスワクチンと併用するアルミニウム塩の使用も記載されてきたが、にもかかわらず一般的にアルミニウム塩は生細菌ワクチンの効力を改善するために使用されていない。しかし驚いたことに、アルミニウム塩が生のB.brochisepticaに結合するかもしれないという事実は、これらの塩の生のB.bronchisepticaのaro変異株に対するアジュバント特性に負の効果を有さないように思われる。このことが、当該アジュバントの周知の安全記録と重なり、例えば炭化水素油、サポニン等の他のアジュバントよりもその応用をより望ましくしている。改良された実施態様において、アルミニウム塩はリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムおよび水酸化アルミニウムから成る群より選択される。本発明の所定のワクチンに添加すべきアジュバントの最適量は、例えばワクチン中に含まれる抗原およびワクチン接種される菌種等のいくつかの可変要素に依存して変動し得るが、ワクチン開発分野の当業者によって本開示を用いて容易に決定され得る。本発明の一定の実施態様において、ワクチン中の水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムおよび/またはリン酸アルミニウムの量は0.5ないし15の間であり得る。より特定の実施態様において、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムおよび/またはリン酸アルミニウムの量は1.0ないし10の間であり得、さらにより特定の実施態様において、ワクチン中の水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムおよび/またはリン酸アルミニウムの量は1.5ないし7.5の間であり得る。以下に例示する通り、ワクチン中の水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムの量は約2、もしくは約5だった。aroA混合物:上述の通り、本発明のaro変異細菌ワクチンは芳香族栄養補給物を含み得る。芳香族栄養補給物は1または複数の芳香族化合物を含み得る。当該芳香族化合物の例には、限定されるものではないが、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プレフェン酸、アントラニル酸、インドール、パラアミノ安息香酸、葉酸、2,3‐ジヒドロキシ安息香酸およびエンテロバクチンが含まれる例えば、Moatら、MicrobialPhysiology2002Wiley‐Liss、第15章、525‐527ページを参照。また芳香族栄養補給物には、コリスミ酸の代替資源および/またはaroA変異株において不利に影響を及ぼされてきたコリスミ酸生合成経路内の1または複数の中間体の代替脂源も含まれ得る。一定の実施態様において、抗酸化剤および/またはキレート剤が芳香族栄養補給物と共に含まれ得る。本発明の所定のワクチンに添加されるべき芳香族栄養補給物に含まれる芳香族化合物の最適量は、例えば、芳香族化合物それ自体、芳香族化合物と共に使用される溶媒系、ワクチン中に含まれる抗原およびワクチン接種される菌種等のいくつかの可変要素に依存して変動し得るが、ワクチン開発分野の当業者によって本開示を用いて容易に決定され得る。本発明の一定の実施態様において、芳香族栄養補給物を含むワクチン中の各々の芳香族アミノ酸の量は4μg/mLから0.4mg/mLまで変動し得る。特定の実施態様において、ワクチン中の各々の芳香族アミノ酸の量は10μg/mLから0.2mg/mLまで変動し得る。より特定の実施態様において、ワクチン中の各々の芳香族アミノ酸の量は20μg/mLから0.1mg/mLまで変動し得る。さらにより特定の実施態様において、ワクチン中の各々の芳香族アミノ酸の量は30μg/mLから60μg/mLまで変動し得る。以下に例示する通り、ワクチン中のフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの個々の量は約40μg/mLだった。本発明の一定の実施態様において、芳香族アミノ酸の生合成経路に存在しないワクチン中の任意の芳香族化合物の付与量は、1μg/mLから0.1mg/mLまで変動し得る。特定の実施態様において、当該芳香族化合物の量は、ワクチン中で2.5μg/mLから50μg/mLまで変動し得る。より特定の実施態様において、ワクチン中の当該芳香族化合物の量は、ワクチン中で5μg/mLから20μg/mLまで変動し得る。以下に例示する通り、ワクチン中の2,3‐ジヒドロキシ安息香酸およびパラアミノ安息香酸の個々の量は5ないし10μg/mLであった。多価ワクチン:また本発明は多価ワクチンも提供する。1の実施態様において、本発明のB.bronchisepticaの弱毒化生aro変異株を含むワクチンは、イヌインフルエンザウイルスCIV抗原および/またはイヌパラインフルエンザウイルスCPI抗原をさらに含む。この実施態様によるワクチンは、イヌにおけるイヌ伝染性気管気管支炎および/またはイヌ伝染性呼吸器病CIRD症候群に対する防御を提供するはずである。本発明の弱毒化生aro変異B.bronchiseptica株および/または別の弱毒化生aro変異B.bronchiseptica株および/またはイヌインフルエンザウイルス抗原および/またはイヌパラインフルエンザウイルス抗原と組み合わせ得る多価ワクチンを形成するための他の抗原の例には、次のイヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス2型、イヌパルボウイルス、イヌ肺炎ウイルス、イヌコロナウイルス、イヌヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、マイコプラズマ種、イヌエーリキア症原因菌、Anaplasma種、イヌレピトスピラ、Leptospiragrippotyphosa、Leptospirahardjo、黄だん出血病レプトスピラ、Leptospirapomona、Leptospirainterrogans、Leptospiraautmnalis、Leptospirabratislavaの1または複数が含まれる。加えて、本発明の弱毒化生aro変異B.bronchiseptica株を含むワクチンには、次のネコ病原菌、即ちネコヘルペスウイルスFHV、ネコカリシウイルスFCV、ネコ肺炎ウイルスFPN、ネコクラミジア、ネコ汎血球減少症ウイルスFPV、ネコ白血病ウイルスFeLV、ネコ伝染性腹膜炎ウイルスFIPV、ネコ免疫不全ウイルスFIV、ボルナ病ウイルスBDV、ネコインフルエンザウイルス、トリインフルエンザおよびBartonella種例えば、ネコ引っ掻き病原因菌の1または複数が含まれ得る。組換えベクターとしてのB.ronchisepticaのaroA変異株の使用:ワクチンにおける組換えaroA変異B.bronchisepticaベクターの使用を含むStevensonおよびRoberts、Vaccine20、2325‐23352002;StevensonおよびRoberts、FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology37:121‐1282003;StevensonおよびRoberts、Vaccine22:4300‐43052004、生非病原性変異Bordetellaベクターの構築が報告されている例えば、米国特許公開第2008/0254062号を参照。それ故に、当該構築物の作成のための方法は既に準備されていた。さらに、対応する異種抗原を発現するために異種核酸DNAを本発明のaroA変異B.bronchiseptica株に挿入することは、例えば、異種核酸およびB.bronchisepticaの双方の末端が対合する制限部位を含む場合には容易に達成される。あるいは、平滑末端を作成するために制限エンドヌクレアーゼ切断によって生じた一本鎖DNAの突出末端を消化することによって、異種核酸および/またはB.bronchisepticaの末端を修飾するか、または適切なDNAポリメラーゼにより一本鎖末端を埋め込むことによって同様の結果を達成するかの必要があるかもしれない。さらに別の方法において、望ましい部位は、例えば末端にヌクレオチド配列リンカーを連結することによって作成してもよい。当該リンカーは、望ましい制限部位を定められた特異的なオリゴヌクレオチド配列を含んでよい。また制限部位は、ポリメラーゼ連鎖反応法PCRの使用により作成することも可能である例えば、Saikiら、Science239:4871988を参照。必要であればまた、開裂したベクターおよび核酸フラグメントは、ホモポリマーテーリング法によって修飾してもよい。異種核酸は内在性プロモーターかまたは異種プロモーター例えば、組換えB.bronchisepticaに対し内在性に操作可能に連結することが可能である。従って、異種核酸は、それ自身の自然発生プロモーターを含むことができるか、またはそれがコードする抗原を発現するプロモーター例えば、常に発現し得る、E.coliのlacプロモーター等の細菌プロモーターを含むように改変することができる。特に、StevensonおよびRobertsはVaccine22:4300‐43052004、B.bronchiseptica由来の繊維状赤血球凝集素fhaの使用を明確に例証した。あるいは異種核酸は、aroA変異B.bronchisepticaに既に存在するプロモーターが異種抗原を発現できるようにするために、生aroA変異B.bronchisepticaに配列することが可能である。異種核酸は、いくつかの病原菌由来の抗原をコードすることが可能であり、限定されるものではないが、イヌインフルエンザウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス2型、イヌパルボウイルス、イヌ肺炎ウイルス、狂犬病ウイルス、イヌコロナウイルス、マイコプラズマ種、イヌエーリキア症原因菌、Anaplasma種、ネコヘルペスウイルスFHV、ネコカリシウイルスFCV、ネコ肺炎ウイルスFPN、ネコインフルエンザウイルスおよび/またはネコクラミジアを含む。本発明で考慮した実施態様において、異種核酸は、上に列挙したネコまたはイヌの病原菌由来のタンパク質抗原をコードする。より特定の実施態様において、タンパク質抗原はイヌインフルエンザウイルスから得られる米国特許第7,959,929B2号を参照。その内容は全てを本明細書に援用する。他の実施態様において、タンパク質抗原はネコインフルエンザから得られる。このタイプの一定の実施態様において、異種核酸はイヌインフルエンザウイルスの赤血球凝集素をコードする。このタイプの特定の実施態様において、異種核酸はイヌインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼをコードする。このタイプのさらに他の実施態様において、異種核酸はイヌインフルエンザウイルスの赤血球凝集素およびノイラミニダーゼの双方をコードする。本明細書において用いる場合、用語ポリペプチドは用語タンパク質と同じ意味で使用し、さらにペプチドを包含することを意味する。それ故に、本明細書において用いる場合、ポリペプチドとは、2以上のアミノ酸がペプチド結合で連結したポリマーである。好ましくは、用語ポリペプチドは、ペプチド結合で連結した20以上のアミノ酸残基を含むポリマーを指すが、一方でペプチドはペプチド結合で連結した2ないし20のアミノン酸残基を含む。本明細書において用いる場合、特定のタンパク質に関する用語抗原性フラグメントとは、抗原性である、即ち、例えば免疫グロブリン抗体またはT細胞抗原受容体等の免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することのできる、当該タンパク質のフラグメントである完全長タンパク質からわずか単一のアミノ酸が欠失しているほどの大きなフラグメントをも含む。ポリヌクレオチドまたは核酸は、限定されるものではないがRNA、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNA配列までをも含む分子である。また用語は、DNAおよびRNAの当該技術分野で既知の任意の塩基類似体を含む核酸を包含することも意図する。本明細書において用いる場合、異種ヌクレオチド配列とは、自然界において自然には形成されない構築物を形成するために、遺伝子組換え法によってヌクレオチド配列および/またはゲノムに付加されるヌクレオチド配列である。また当該核酸は、融合例えば、キメラタンパク質をコードし得る。異種ヌクレオチド配列は、抗原特性、制御特性およびまたは構造特性を有するペプチドおよび/またはタンパク質をコードし得る。異種ヌクレオチド配列は、制限部位、調節部位、プロモーター等を含む非コード配列を含み得る。本明細書において用いる場合、用語操作可能に連結しているoperablylinkedおよび効果を生むように連結しているoperativelylinkedとは同じ意味で使用され、このように記載された成分がその通常の機能を果たすため配置されている遺伝子要素の配列を意味する。従って、コード配列に操作可能に連結している制御要素は、コード配列の発現に影響を及ぼし得る。制御要素は、それがその発現を指揮するために機能する限り、コード配列と隣接する必要はない。例えば、転写された非翻訳の介在配列はプロモーターとコード配列の間に存在し得て、プロモーターはコード配列にいまだ操作可能に連結していると考え得る。本明細書において用いる場合、用語制御配列および制御要素は、同じ意味で用いられる。転写および翻訳調節配列は、宿主細胞のコード配列の発現を準備する、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等のDNA制御配列である。真核細胞において、ポリアデニル化信号は調節配列である。発現調節配列がそのヌクレオチド配列の転写および翻訳を調節または制御するとき、コード配列は発現調節配列に操作可能に連結している。操作可能に連結しているという用語には、適切な開始信号を有するこが含まれ得る。RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、それからそれが適切な条件、時期および場所でトランススプライシングされ、コード配列によってコードされたタンパク質に翻訳されるとき、コード配列は細胞において転写および翻訳調節配列の制御下にある。ワクチ投与:本発明のワクチン多価ワクチンを含むは、例えば全身投与により併用療法、即ちワクチン自身に加えて1または複数の追加の活性成分、治療法等を含む治療法の一部として投与してよい。その場合には、治療的に有効な量を構成するワクチン量は、ワクチンが単独で投与されるならば治療的に有効な量を構成するだろうワクチン量よりも多くまたは少なくなり得ることを認識すべきである。他の治療には、例えば、抗ウイルス剤、鎮痛剤、解熱剤、去痰薬、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、B.bronchiseptica感染治療用抗生物質および/または液体の投与等の、当該分野において既知の治療が含まれてよい。いくつかの実施態様において、本発明のワクチンは次の、インフルエンザワクチン、パラインフルエンザワクチン、ネコヘルペスウイルスワクチン、ネコカリシウイルスワクチン、ネコクラミジアワクチン、鼻気管炎ワクチン、汎白血球減少症ワクチン、免疫不全ウイルスワクチン、白血病ウイルスワクチンまたは狂犬病ワクチンの1または複数と併用して投与される。特別の実施態様において、本発明のワクチンは皮下に投与される皮下注射。免疫原性レベルは、当該技術分野において一般に知られているチャレンジ用量滴定研究法によって実験的に決定してよい。当該技法には一般的に、最小保護用量を決定するために、いくつかの動物検体を異なる投与量のワクチンで接種し、それから毒性ウイルスまたは細菌で動物検体を攻撃感染することが含まれる。好ましい投与計画に影響を及ぼす要因には、例えば、種または品種例えば、イヌまたはネコの、年齢、体重、性別、飼料、活動度、肺サイズおよび検体の状態;投与経路;使用される特定のワクチンの効力、安全性および免疫性の持続プロファイル;送達システムの使用有無;ならびに薬剤および/またはワクチン併用の一部としてのワクチンの投与有無、が含まれ得る。従って、実際に使用される投与量は、特定の動物に対し変動し得、それ故に上述の典型的な投与量からはずれ得る。当該投与量の調整を決定することは、一般的にワクチン開発分野の当業者の従来法を使用する技術範囲内である。以下の実施例4において使用された特別の条件下で、aroA変異B.bronchiseptica株の安全かつ効果的な用量は、アジュバントおよび/または芳香族栄養補給物の存在下で5x105ないし5x107cfu/mLの間であると決定された。同様に、当該用量を投与し得る容量は、典型的には典型的には皮内または経皮施用に対し0.1mLおよび5.0mLの間である。投与量に対する典型的な範囲は、筋肉内投与または皮下投与に対しては0.2および2.0mLの間、好ましくは約1.0ないし2.0mLである。ワクチンは、単回もしくは日、週、月または年にわたって2回以上ワクチン受容者に対して投与されてよいと考えられる。いくつかの実施態様において、ワクチンは少なくとも2回投与される。一定の当該実施態様において、例えば、2回目の用量例えば、追加免疫が初回用量の少なくとも2週間後に投与されるという状況で、ワクチンは少なくとも2回投与される。特定の実施態様において、2回目の用量が初回用量の長くても8週間後に投与されるという状況で、ワクチンは2回投与される。他の実施態様において、2回目の用量は初回用量の1週間後ないし2年後、初回用量の1.5週間ないし8週間後または初回用量の2ないし4週間後に投与される。他の実施態様において、2回目の用量は初回用量の約3週間後に投与される。上述の実施態様において、初回およびその後の投与量は、量および/または形態において変動し得る。しかし、しばしば投与量は量および形態において同じ程度である。単一用量だけが投与されるとき、その用量単独におけるワクチン量は一般的にワクチンの治療的に有効な量を含む。しかし、2用量以上が投与されるとき、これらを合わせた用量中のワクチン量が治療的に有効な量を構成してよい。加えて、上で論じた通り、ワクチンが初期に投与され、それから2ないし12週間後に追加免疫が投与されてもよい。しかし、ワクチンの後の投与は、追加免疫が投与されたか否かに関係なく、1年毎または2年毎に実施してよい。本発明は、本発明の例示として提供する以下の非限定的な実施例を参照することによってより良く理解され得る。以下の実施例は、本発明の実施態様をより完全に説明するために提示する。実施例は、しかしながら、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されてはならない。実施例BordetellabronchisepticaのaroA変異株の構築B.bronchisepticaのaroA欠失変異株は、最小限の副作用を有する効果的なワクチンを製剤化する目的で構築した。aroA遺伝子における欠失は、外因的に供給する1または複数の重要な芳香族化合物なしで増殖するためのB.bronchisepticaの能力を顕著に損なう。使用したB.bronchiseptica株は、もともと上気道疾患に罹患したイヌから単離した。B.bronchisepticaにおいて必須芳香族化合物を合成するために必須とされる代謝経路中の酵素をコードするaroA遺伝子は上を参照、隣接配列と共に、B.bronchisepticaのクロモソームからPCR法によってクローン化した。その後に、クローン化遺伝子を酵素SalIで制限酵素処理して90塩基対bpの欠失を作成した。aroA遺伝子の欠失変異体versionΔaroAは、次にMannheimiahaemolyticaウシ肺炎原因菌、Pasteurellamultocida動物パスルレラ症病原菌およびHemophilussomnusウシ感染症原因菌のaroA欠失株を作成するために記載されたベクターツールおよび選択方法を使用してB.bronchisepticaに再導入した。BriggsおよびTatum、AppliedandEnvironmentalMicrobiology、71117187‐71952005;TatumおよびBriggs、AppliedandEnvironmentalMirobiology,71117196‐72022005;米国特許第5,840,556号。その内容は本明細書でその全体を援用する。要するに、これらの方法は、Mannheimiahaemolyticaにおいて発見されたプラスミド中の複製起点の温度感受性Ts変異体versionの作成に依存する。これらのTsプラスミドは高温39°C以上では効率的に増殖することができない。これらのプラスミドは、カナマイシン耐性およびE.coli中での増殖のためのE.colの複製起点ColE1を含むようにさらに修飾した。いったんΔaroAを含むプラスミドがB.bronchisepticaに導入されると、ネイティブなaroA領域とプラスミドのaroA領域との間で相同組換え現象が起こり、その結果プラスミドの部分が宿主B.bronchisepticaに一定の頻度で導入される。抗生物質カナマイシンによる形質転換体の選択により、これらの特定の形質転換体の単離が可能となる。ΔaroA遺伝子の挿入の確認はPCR法によって行い、DNAサイズはアガロースゲル電気泳動によって測定した。ネイティブなaroA遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子および任意の他のベクター配列等の不必要な配列のクロモソームからの除去は、さらなる組換え現象で起こる。望ましい組換え体の選択は、プラスミド複製の非許容温度で抗生物質を添加せずに細胞の継代によって行った。カナマイシン感受性単離株は、ΔaroA遺伝子に関し、およびネイティブなaroA遺伝子の欠損に関しPCR法およびDNAアガロース電気泳動法によって選別した。aroA欠失領域周辺のB.bronchisepticaクロモソームの配列解析は、ベクターの外来DNAがaroA変異B.bronchiseptica単離株の中に保持されていないことを証明するために使用した。非弱毒化親株に対するB.bronchisepticaのaroA変異株のマウスLD50の比較そのLD50を測定するために、B.bronchisepticaのaroA変異株上述の実施例1を参照かまたはその非弱毒化親株かの段階希釈液の用量0.5mLにより、マウス8匹の群を腹腔内接種した。マウスの死亡数を毎日記録してマウスを7日間観察した以下の表1を参照。親株の2.8x107cfu/doseコロニー生成ユニット/用量以上LD508.9x106およびaroA変異株の1.2x109cfu/dose以上LD503.8x108でワクチン接種した群において100の死亡率だった。特に、親株でもaroA変異株でも低い希釈液では、それぞれ死亡は認められなかった。これらの結果は、aroA遺伝子における失欠がB.bronchisepticaを顕著に弱毒化し、親株よりもマウスにおいて約40倍弱毒化することを証明している。安全かつ効果的なワクチン用量の決定安全かつ効果的な用量範囲を見出そうとして、実施例1のB.bronchisepticaのaroA変異ΔaroA株を含む試験ワクチンを3の異なる通常の適用投与量レベルでイヌに皮下投与した。従って、ΔaroAのB.bronchiseptica株の生培養液の用量1mLを処理群A、BおよびC各々の8匹のイヌに以下の通り投与した。即ち試験0日および21日目に、細菌をトリプトースフォスフェイトブロスTPBで12時間培養し、それからそれぞれの標的用量の1.0x108cfu/mLA群、1.0x107cfu/mLB群、および1.0x106cfu/mLC群に希釈して投与した。対照のD群のイヌにはイヌ9匹、無菌のTPBを与えた。ワクチン接種各々のイヌは、無菌針22G1を有する注射器を使用して、試験の0および21日目にそれぞれのワクチンの用量1mLで首の付け根に皮下接種した。最初のワクチン接種は右側、および2回目のワクチン接種は左側に行った。投与用量を決定するために、各々のワクチン接種の前後に細菌の平板計数を行った。ワクチン接種後モニタリングワクチン接種後に、抗体力価を測定するために全血を採取した。注射部位反応が感じられなくなるまで、毎日、注射部位を触診した。ノギスを使用してセンチメートルcm単位で注射部位反応の高さ、幅および深さを測定した。注射部位反応は、肥厚した、柔らかい、硬いまたは敏感のようにさらに特徴付けを行った。攻撃感染攻撃感染は以下の材料により実施した。B.bronchisepticaD‐2株Musserら、JournalofBacteriology、1696:2793‐2803June1987をトリプトースフォスフェイトブロスTPB寒天平板培地平板当たり200μLにワクチン接種し、平板を36±2°Cで約16~18時間インキュベートした。純粋な細菌増殖物を平板当たりTPB10mLで寒天平板から洗い落とし、それから密度を1.0x1010cfu/mL以上に調整した。各々の攻撃感染の日に対し、調製したての攻撃感染材料を準備した。試験35および36日目に、塗布器付の3mLの注射器を使用して鼻孔当たり0.5mLを点滴することによって、攻撃感染材料の鼻腔内投与を実施した。攻撃感染後モニタリングイヌは、限定されるものではないが抑うつ、嗜眠、食欲不振、咳嗽、鼻漏および呼吸困難を含む臨床徴候に対して攻撃感染後の21日間、毎日観察した。イヌは、咳嗽を誘発するために軽い気管触診を毎日受けた。臨床徴候粘液排出、粘液膿性鼻漏、誘発咳嗽、自発咳嗽、悪心を伴う自発咳嗽および呼吸困難を記録した。攻撃感染微生物の排出を測定するために3週間にわたり週に2回、各々のイヌから鼻腔拭い試料を採取した。データ解析:重要な臨床結果変量は、疾患の臨床徴候および/または細菌排出だった。本研究の実験単位は個々のイヌだった。臨床所見に従って行動特性および身体的特性に対して数値化スコアを選定した。各々のイヌに関し、各日に臨床スコアを合計し、スコアの中央値を計算した。排出データに対しては、i各々の処理群の、ii各々の鼻腔拭い試料採取物に対する、iii排出の日数における、鼻腔拭い試料から単離された微生物B.bronchisepticaの平均cfu/mLを算出した。結果ワクチン接種前に、全てのイヌはB.bronchisepticaに対し低い抗体力価64以下を有し、鼻腔拭い試料単離によって測定した通りB.bronchiseptica感染に対して陰性だった。1.0x106cfu/mLのB.bronchisepticaのaroA-処理群Cおよびプラセボ処理群Dによるワクチン接種は、B.bronchisepticaに特異的な抗体の増強を誘発しなかった。対照的に試験28日目に、1.0x108の用量処理群Aによるワクチン接種は、イヌの1008/8において256以上の抗体力価を誘発し、ならびに1.0x107cfu/mLの用量によるワクチン接種は、イヌの252/8において128以上の力価を誘発した。試験28日目における処理群A、B、CおよびDに対する幾何平均はそれぞれ470、76、35および40だった表2。処理群Aのイヌは、注射部位にワクチン接種後9~13日以内に回復した腫脹を発生した。処理群Aにおいて測定された最大の注射部位反応は、2x2x1.5cmであり、イヌ8匹中2匹が触診のさいに圧痛のある注射部位反応を有した。処理群Bのイヌは、注射部位にワクチン接種後3~6日以内に回復した腫脹を発生し、2x2x1.5cmと測定される最大の注射部位反応を有した。処理群Cにおいては1匹のイヌだけが軽度の腫脹を発生し0.5x0.5x0.5cm、それは1日間だけ測定可能だった。処理群Dにおいて注射部位反応は観察されなかった。最初のワクチン接種後の各々のイヌに対する最大サイズの注射部位反応を使用して算出した各々の処理群に対する平均注射部位反応を表3に示す。どのワクチンも接種後にいかなる有害な全身反応も引き起こさなかったとはいえ、群AおよびBにおける腫脹の大きさと特性は獣医学治療において通常許容可能ではないだろう。攻撃感染後に、各々のイヌに対し臨床徴候をスコア化し、21日間の観察期間にわたり合計した。1.0x108cfu/mLおよび1.0x107cfu/mLでのB.bronchisepticaのaroA-株によるワクチン接種は、B.bronchiseptica感染に付随する臨床徴候を減少させた。プラセボ接種対照群処理群Dのイヌ9匹中7匹78および処理群C1.0x106cfu/mLのイヌ8匹中5匹63は、21日間の観察期間の間、1以上の咳嗽スコアを有したが、一方では1.0x108cfu/mL処理群Aによりワクチン接種したイヌ8匹中1匹13および処理群Bのイヌ8匹中2匹25だけが、21日間の観察期間の間の1日間に1以上の咳嗽スコアを有した。実施例1の生aroA変異B.bronchiseptica株によりワクチン接種しそれから病原性のB.bronchisepticaにより攻撃感染したイヌの各々の群に対し、臨床スコアの中央値を表4に示す。攻撃感染微生物の排出を測定するために、攻撃感染後21日間の観察期間の6の時点で鼻腔拭い試料を採取した。攻撃感染後21日目に、処理群Aのイヌ8匹中4匹50および処理群Bの8匹中5匹63がまだ排出していたのと比較すると、処理群CおよびDの全てのイヌ100が多数のB.bronchisepticaを排出していた。群A、BおよびCのイヌの鼻から単離されたB.bronchiseptica微生物の平均菌数は、群Dのイヌから単離された微生物の平均菌数より少なかった表4。結論として、生B.bronchisepticaのaroA変異株は、イヌへの全身投与用の生ワクチンとして使用し得る。しかし、生B.bronchisepticaのaroA変異株が最も効果的な力価において、またワクチンは許容できない注射部位反応も引き起こした。安全なレベルでの効力の改善たとえあったとしても注射部位反応を最小限に維持する一方で、試験した最低用量1x106cfuの効力を顕著に改善することが可能かどうかを評価するために引き続き研究を行った。新処理群A、B、CおよびD各々イヌ5匹に対する試験ワクチンは、用量1mLで投与される実施例1のaroA変異B.bronchiseptica株の生培養物を含んでいた。処理群Eのイヌは、いかなる抗原も含まない無菌DMEMを受容した。aroA変異B.bronchiseptica株をトリプトースフォスフェートブロスTPBで5Lファーメンター中17時間増殖し、OD580nmが1.0ないし2.0に達したときに収穫した。発酵培養液を安定剤と共に混合し凍結乾燥した。凍結乾燥ケーキを、処理群Aに対し標的用量1.0x108cfu/mLに滅菌水で再水和した。処理群B、CおよびDに対し凍結乾燥ケーキを標的用量1.0x106cfu/mLに滅菌水で再水和した:ここで、群Bに対し2リン酸アルミニウムを;群Cに対し2水酸化アルミニウムを;または群Dに対し芳香族化合物ミックスを添加した。処理群Eに対し凍結乾燥ケーキを滅菌水で再水和した。以下の表6参照。使用した2リン酸アルミニウムアジュバントは2Rehydraphos登録商標であり、一方で使用した2水酸化アルミニウムアジュバントは2Rehydorogel登録商標LVだった。これらアジュバントの双方は,ReheisInc.,BerkeleyHeights,NJ,USAから市販されている。芳香族化合物ミックス芳香族栄養補給物は以下の表5に記載する。試験0および21日目に、イヌを上述のワクチンまたはDMEMプラセボにより接種した。ワクチン接種各々のイヌは、試験0および21日目に無菌針22G1を有する注射器を使用して、それぞれのワクチンの用量1mLにより首の付け根に皮下接種した。最初のワクチン接種は右側、2回目のワクチン接種は左側に行った。細菌の平板計数は、投与用量を決定するために各々のワクチン接種の前後に実施した。ワクチン接種後モニタリングワクチン接種後に、抗体力価を測定するために全血を採取した。注射部位反応が感じられなくなるまで、毎日、注射部位を触診した。ノギスを使用してセンチメートルcm単位で注射部位反応の高さ、幅および深さを測定した。注射部位反応は、肥厚した、柔らかい、硬いまたは敏感のようにさらに特徴付けを行った。攻撃感染攻撃感染は以下の材料により実施した。B.bronchisepticaD‐2株をトリプトースフォスフェイトブロスTPB寒天平板培地平板当たり200μLにワクチン接種し、平板を36±2°Cで約16~18時間インキュベートした。純粋な細菌増殖物を平板当たりTPB10mLで寒天平板から洗い落とし、それから密度を1.0x1010cfu/mL以上に調整した。各々の攻撃感染の日に対し、調製したての攻撃感染材料を準備した。試験42日目に、塗布器付の3mLの注射器を使用して鼻孔当たり0.5mLを点滴することによって、調製したての攻撃感染培養物を鼻腔内に投与した。試験43日目に、電動ポンプ付きの噴霧器を使用して鼻孔当たり0.5mLを点滴することによって、調製したての攻撃感染培養物を鼻腔内に投与した。攻撃感染後モニタリングイヌは、限定されるものではないが抑うつ、嗜眠、食欲不振、咳嗽、鼻漏および呼吸困難を含む臨床徴候に対して攻撃感染後の21日間、毎日観察した。イヌは、咳嗽を誘発するために軽い気管触診を毎日受けた。臨床徴候粘液排出、粘液膿性鼻漏、誘発咳嗽、自発咳嗽、悪心を伴う自発咳嗽および呼吸困難をスコア化した。結果ワクチン接種前に、全てのイヌはB.bronchisepticaに対し低い抗体力価64以下を有し、鼻腔拭い試料単離によって測定した通りB.bronchiseptica感染に対し陰性だった。対照のイヌは処理群E、試験28日目に100のイヌ5匹中5匹において32以下の抗体力価を有した。対照的に、1.0x108cfu/mLのaroA変異B.bronchiseptica株によるワクチン接種は処理群A、80のイヌ5匹中4匹において256以上の抗体力価を誘発し、1.0x106cfu/mL2Rehydraphos登録商標によるワクチン接種は処理群B、80のイヌ5匹中4匹において128以上の抗体力価を誘発し、1.0x106cfu/mL2Rehydragel登録商標LVによるワクチン接種は処理群C、40のイヌ5匹中2匹において128以上の抗体力価を誘発し、1.0x106cfu/mL1XAroMixによるワクチン接種は処理群D、60のイヌ5匹中3匹において128以上の抗体力価を誘発した。試験28日目における処理群A、B、C、DおよびEに対する幾何平均力価はそれぞれ338、111、84、97および14だった表6。イヌはワクチン接種後、熱がないことも含め臨床的に正常のままだった。処理群Aのイヌは、注射部位にワクチン接種後16~19日以内に回復した中等度の腫脹を発生した。処理群Aにおいて測定された最大の反応は3.0x3.0x0.5cmであり、イヌ5匹中3匹が触診のさいに圧痛のある反応を有した。処理群Bのイヌは5匹中4匹、注射部位にワクチン接種後9~11日以内に回復した軽度の腫脹を発生し、1.0x1.0x0.5cmと測定される最大反応を有し、イヌ5匹中1匹は触診のさい圧痛のある反応を有した。処理群Cのイヌは5匹中5匹、注射部位にワクチン接種後9~10日以内に回復した軽度の腫脹を発生し、1.0x1.0x0cmを測定する最大反応を有した。処理群Dのイヌ5匹中2匹だけが、注射部位にワクチン接種後5~8日以内に回復した軽度の腫脹を発生し、0.5x0.5x0cmを測定する最大反応を有した。処理群Eにおいて注射部位反応は観察されなかった。最初のワクチン接種後の各々のイヌに対する最大サイズ注射部位反応を使用して算出した各々の処理群に対する平均注射部位反応を表7に示す。これらの結果は、ワクチン用量1.0x108cfu/mLは若いイヌにおける使用にとって安全でないという以前の観察を確証するが、一方ではアジュバントと共に投与されたときでも、用量1.0x106cfu/mLは、獣医学治療において許容可能と考えられるより安全なプロファイルを提供する。攻撃感染後に、各々のイヌに対し臨床徴候をスコア化し、21日間の観察期間にわたり合計した。少なくとも50の対照イヌが疾患の臨床徴候および/または細菌排出を示したので、攻撃感染用量はワクチンの効力を測定するために適切であると判断した。もし、攻撃感染後の観察期間のあいだに、不連続の3日以上に自発咳嗽または悪心を伴う自発咳嗽が観察されたならば、イヌは持続性咳嗽を発生した罹患イヌと定義された。表8に示す通り、aroA変異B.bronchiseptica株の1.0x106cfu/mLの力価を含むワクチンへのアジュバントかまたは芳香族化合物ミックス芳香族栄養補給物の添加は、結果として病原性のB.bronchisepticaによる攻撃感染からワクチン接種されたイヌを保護した。処理群A、BおよびDのイヌ中0匹、および処理群Cのイヌ1匹だけと比較して、プラセボ接種対照イヌの5匹中4匹がワクチン接種後に持続性咳嗽を発生した。処理群A、B、C、DおよびEに対する臨床スコアの中央値はそれぞれ2、1、3、1および13だった表8。攻撃感染微生物の排出を測定するために、攻撃感染後21日間の観察期間の6の時点で鼻腔拭い試料を採取した。攻撃感染後21日目に試験63日目、処理群Eの全てのイヌ100が多数のB.bronchisepticaを排出していた。試験63日目に鼻腔拭い試料から単離されたB.bronchiseptica攻撃感染微生物の平均cfu/mLは、処理群A、B、C、DよびEに対してそれぞれ726、5,048、17,400、594および135,840だった。全ての試験日に鼻腔拭い試料から単離されたB.bronchiseptica攻撃感染微生物の総平均cfu/mLは、処理群A、B、C、DよびEに対してそれぞれ6,899、3,662、6,671、8,060および24,067だった表8。結論として、異なる4の弱毒化生aroA変異B.bronchisepticaワクチン製剤の安全性および効力が評価された。力価1.0x106のaroA変異B.bronchiseptica株に水酸化アルミニウムアジュバントか、リン酸アルミニウムアジュバントか、または芳香族栄養補給物かを加えたワクチンは、注射部位に顕著な腫脹を起こすことなくイヌを疾患の臨床徴候から保護するのに役立った。それ故に、本研究は、B.bronchiseptica株の弱毒化生aro変異株を含むワクチンへのアジュバントおよび/または芳香族栄養補給物の添加が当該ワクチンにとって効果的であるために必要とされる用量を顕著に減少させ、同様にワクチンの投与のために生じる任意の注射部位反応をも最小化するのに役立つことを最小限証明している。Bordetellabronchiseptica、イヌインフルエンザウイルスおよびイヌパラインフルエンザウイルスに対するワクチンイヌインフルエンザウイルスCIV、イヌパラインフルエンザウイルスCPIおよびBordetellabronchiseptiB.bronchisepticaに対する多価ワクチンを製剤化した。イヌワクチンには実施例1記載の通り、改変型生イヌパラインフルエンザウイルス、不活化イヌインフルエンザウイルスおよびB.bronchisepticaの弱毒化生aroA変異株が含まれる。ワクチンは皮下投与用に設計される。生産物は、B.bronchiseptica、イヌパラインフルエンザウイルスに起因する疾患の予防における救援、およびイヌインフルエンザウイルスに起因する疾患の制御における救援として推奨される。ワクチンの各々の用量は、105.7TCID5050組織培養感染量のCPI、1x106cfuのB.bronchisepticaおよび1000HAUヘマグルチニン単位のCIVを少なくとも含むことが期待される。B.bronchisepticaの産生培養液はファーメンター中で冷却し、以下の表9に記載した通りの芳香族化合物ミックス芳香族栄養補給物を培養液に添加した。それから改変型生CPIを、安定剤、5グルタチオン溶液、表9の芳香族化合物ミックス芳香族栄養補給物おおびDMEM培地と共に、生aroA変異B.bronchiseptica株と混合した。この混合物は次に凍結乾燥し貯蔵した。凍結乾燥ケーキは、不活化CIVおよび2水酸化アルミニウムアジュバントかまたは5水酸化アルミニウムアジュバントかを含む希釈剤で再水和した。処理群BおよびCのイヌは、生aroA変異B.bronchiseptica株の標的用量5.0x105cfu/mLに滅菌水で再水和した、生aroA変異B.bronchiseptica株およびCPIを含む凍結乾燥ワクチンによりワクチン接種した:ここで、B群に対してはCIVおよび2水酸化アルミニウムアジュバントを加え;またはC群に対してはCIVおよび5水酸化アルミニウムアジュバントを加えた。処理群Dのイヌは、CIVに2水酸化アルミニウムアジュバントを加えただけのワクチンにより接種した。全3処理群において使用した水酸化アルミニウムはRehydragel登録商標LVだった。ワクチン接種各々のイヌは,無菌針22G1を使用して、試験の0および21日目にそれぞれのワクチンの用量1mLで首の付け根に皮下接種した。最初のワクチン接種は右側、および2回目のワクチン接種は左側に行った。投与用量を決定するために、各々のワクチン接種の前後に細菌の平板計数を行った。ワクチン接種後モニタリングワクチン接種後に、抗体力価を測定するために全血を採取した。注射部位反応が感じられなくなるまで、毎日、注射部位を触診した。ノギスを使用してセンチメートルcm単位で注射部位反応の高さ、幅および深さを測定した。注射部位反応は、肥厚した、柔らかい、硬いまたは敏感のようにさらに特徴付けを行った。攻撃感染攻撃感染は以下の材料により実施した。B.bronchisepticaD‐2株をトリプトースフォスフェイトブロスTPB寒天平板培地平板当たり200μLにワクチン接種し、平板を36±2°Cで約16~18時間インキュベートした。純粋な細菌増殖物を平板当たりLTB10mLで寒天平板から洗い落とし、それから密度を1.0x1010cfu/mL以上に調整した。各々の攻撃感染の日に対し、調製したての攻撃感染材料を準備した。試験35日目に、塗布器付の3mLの注射器を使用して鼻孔当たり0.5mLを点滴することによって、攻撃感染材料を鼻腔内経路で投与した。試験36日目に、噴霧器および電動ポンプを使用して鼻孔当たり約0.5mLを点滴することによって、攻撃感染材料を鼻腔内経路で投与した。攻撃感染後モニタリングイヌは、限定されるものではないが抑うつ、嗜眠、咳嗽および鼻漏を含む臨床徴候に対して攻撃感染後の21日間、毎日観察した。攻撃感染微生物の排出を測定するために攻撃感染後3週間にわたり3~4日の採取間隔で週に2回、各々のイヌから鼻腔拭い試料を採取した。結果ワクチン接種前に、全てのイヌはB.bronchisepticaに対し低い抗体力価64以下を有し、鼻腔拭い試料単離によって測定した通りB.bronchiseptica感染に対し陰性だった。試験28日目に、プラセボ接種対照イヌ処理群Dの5匹中4匹80は64以下の抗体力価を有した。対照的に、aroA変異B.bronchiseptica株5.0x105cfu/mL、CPI、CIVおよび2RehaydragelLV処理群Bまたは5RehydragelLV処理群Cを含む試験ワクチンを受容した全てのイヌは64以上の抗体力価を有した。試験28日目における処理群B、CおよびDに対する幾何平均力価はそれぞれ111、111および64だった表10。イヌはワクチン接種後、熱がないことも含め臨床的に正常のままだった。処理群Bのイヌ5匹中3匹は、1.0x1.0x0.5cmを測定する最大注射部位反応を有し、ワクチン接種後1~5日以内に回復した軽度の腫脹を注射部位に有した。処理群Cの全てのイヌは、1.0x1.0x0.5cmを測定する最大注射部位反応を有し、ワクチン接種後7~11日以内に回復した軽度の腫脹を注射部位に発生した。処理群Dのイヌ5匹のどれも、いずれのワクチン接種後にも注射部位反応を発生しなかった。最初のワクチン接種後の各々のイヌに対する最大注射部位反応を使用して算出した各々の処理群に対する平均注射部位反応を表11に示す。攻撃感染後に、各々のイヌに対し臨床徴候をスコア化し、21日間の観察期間にわたり合計した。攻撃感染が効果的であることを示しているが、プラセボ接種対照群イヌの5匹中4匹は、攻撃感染後に自発性咳嗽を含む疾患の臨床徴候を発生した。対照的に、対照イヌと比較したとき2の試験ワクチンは、B.bronchiseptica感染に付随する臨床徴候、特に咳嗽を減少させた。処理群B、CおよびDに対する咳嗽スコアの中央値はそれぞれ1、0および2であり表12、臨床疾患を発生したイヌのパーセントはそれぞれ20、20および40だった。攻撃感染微生物の排出を測定するために、攻撃感染後21日間の観察期間の6の時点で鼻腔拭い試料を採取した。攻撃感染後21日目に試験55日目、処理群Dの全てのイヌ100が多数のB.bronchiseptica微生物を排出していたが、一方ではいずれの2のワクチン群においても排出は顕著に少なかった。試験55日目に鼻腔拭い試料から単離されたB.bronchisepticaD2攻撃感染微生物の平均cfu/mLは、処理群B、CおよびDに対してそれぞれ15,494、26,802および150,620だった。総体的に、処理群Bのイヌは、処理群CおよびDのイヌよりも少ないB.bronchiseptica微生物を排出した。全試験日において鼻腔拭い試料から単離されたB.bronchisepticaD2攻撃感染微生物の総平均cfu/mLは、処理群B、CおよびDに対しそれぞれ38,642、206,713および178,609だった表12。結論として、異なる2の弱毒化生aroA変異B.bronchisepticaCPICIVワクチン製剤の安全性および効力が評価された。aroA変異B.bronchiseptica株の1.0x105に芳香族栄養補給物および2かまたは5の水酸化アルミニウムアジュバントを加えた力価を有するワクチンは、注射部位に顕著な腫脹を起こすことなくイヌを疾患の臨床徴候から保護するのに役立った。それ故に、本研究は、B.bronchiseptica株の弱毒化生aro変異株を含むワクチンへのアジュバントおよび芳香族栄養補給物の添加が、当該ワクチンにとって効果的であるために必要とされる用量を顕著に減少させ、同様にワクチンの投与のために生じる任意の注射部位反応をも最小化するのに役立つことを最小限証明している。本発明は本明細書に記載された特定の実施態様による範囲に限定されるものではない。実際のところ、本明細書の記載物に加えた本発明の種々の改変は、前述の記載より当業者にとって明白であろう。当該改変は、添付の特許請求の範囲に属することを意図するものである。"