"α-ガラクトシダーゼA欠損症であると推測される患者を同定する段階と、ヒトα-galAを過剰発現し、かつ分泌するように遺伝的に修飾されたヒト細胞を該患者に導入する段階とを含む治療方法。細胞が、ヒトα-galA配列番号:26を含むポリペプチドをコードするコード配列を有するDNA分子でインビトロにてトランスフェクトされた請求項1記載の方法。ポリペプチドが異種シグナルペプチドをさらに含む請求項2記載の方法。異種シグナルペプチドがヒト成長ホルモンhGHシグナルペプチド配列番号:21である請求項3記載の方法。DNA分子が、前記シグナルペプチドをコードする配列にイントロンを含む請求項3記載の方法。DNA分子が、コード配列の終結コドンの3’に隣接して存在する少なくとも6個のヌクレオチドからなる非翻訳配列を含み、該非翻訳配列がポリアデニル化部位を含む請求項3記載の方法。hGHシグナルペプチド配列番号:21をコードし、イントロンを含む第1配列と、該第1配列の3’末端に結合し、ヒトα-galAを含むポリペプチドをコードする第2配列とを含むDNA分子。ポリアデニル化部位を含む3’非翻訳配列をさらに含む請求項7記載のDNA分子。請求項7記載のDNA分子を含み、ヒト細胞での発現に適当である発現構築物。a異種シグナルペプチドに結合されたヒトα-galAを含むポリペプチドをコードし、かつb細胞における該ポリペプチドの発現を可能にするDNA分子を含む培養されたヒト細胞。繊維芽細胞である請求項10記載の細胞。上皮細胞、内皮細胞、骨髄細胞、神経膠細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、神経細胞、またはこれらの細胞型の前駆体からなる群より選択される請求項10記載の細胞。シグナルペプチドが、hGHシグナルペプチド配列番号:21である請求項10記載の細胞。a異種シグナルペプチドに結合されたヒトα-galAを含むポリペプチドをコードし、かつb細胞における該ポリペプチドの過剰発現を可能にするDNA分子を用いてトランスフェクトされた複数の培養ヒト細胞から本質的になるクローン細胞株。細胞が繊維芽細胞である請求項14に記載のクローン細胞株。a異種シグナルペプチドに結合されたヒトα-galAを含むポリペプチドをコードし、かつb細胞における該ポリペプチドの過剰発現を可能にするDNA分子を用いてトランスフェクトされた複数の不死化ヒト細胞から本質的になるクローン細胞系。細胞が、Bowesメラノーマ細胞、Daudi細胞、Hela細胞、HL60細胞、HT1080細胞、Jurkat細胞、KB癌細胞、K562白血病細胞、MCF7乳癌細胞、MOLT4細胞、Namalwa細胞、Raji細胞、RPMI8226細胞、U937細胞、WI38VA13サブ系統2R4細胞、及び2780AD卵巣癌細胞からなる群より選択される請求項16記載のクローン細胞系。bヒトα-galAにペプチド結合によって結合されたahGHシグナルペプチド配列番号:21を含む蛋白質。前記DNA分子からヒトα-galAを発現させ、細胞の培養培地にグリコシル化ヒトα-galAが分泌されるような条件下で請求項11記載の細胞を培養する段階と、該培養培地からグリコシル化ヒトα-galAを単離する段階とを含むグリコシル化ヒトα-galAを製造する方法。請求項19記載の方法によって製造された精製グリコシル化ヒトα-galA。サンプルが疎水性の相互作用樹脂を通過する第1クロマトグラフィー工程を含む、サンプルからヒトα-galAを精製する方法。前記樹脂上の機能的部分がブチル基を含む請求項21記載の方法。前記DNA分子からヒトα-galAを発現させ細胞の培養培地にグリコシル化ヒトα-galAが分泌されるような条件下で請求項16記載の細胞を培養する段階と、前記培養培地からグリコシル化ヒトα-galAを単離する段階とを含む、グリコシル化ヒトα-galAを製造する方法。固定化ヘパリン樹脂、ハイドロキシアパタイト、アニオン交換樹脂、及びサイズ排除樹脂からなる群より選択される第2樹脂にサンプルを通す段階をさらに含む請求項21記載の方法。α-galA欠損症であると推測される患者を同定する段階と、請求項20記載の精製グリコシル化ヒトα-galAを該患者に投与する段階とを含む治療方法。薬学的に許容されるキャリア中にN-結合マンノース-6-ホスフェートを有する薬学的に許容される精製ヒトα-galAを含む治療用組成物。請求項20記載の精製ヒトα-galAと薬学的に許容される賦形剤とを含む治療用組成物。pH6.5またはそれ以下で処方された請求項27記載の治療用組成物。薬学的に許容される賦形剤がヒト血清アルブミンである請求項28記載の治療用組成物。hGH以外のポリペプチドに結合されたhGH配列番号:21のシグナルペプチドを含む蛋白質をコードするDNA分子。シグナルペプチドをコードする配列にイントロンを含む請求項30記載のDNA分子。aヒトα-galAを含むポリペプチドをコードし、かつb細胞における該ポリペプチドの過剰発現を可能にするDNA分子を含む培養されたヒト細胞。前記DNA分子からヒトα-galAが発現されるような条件下で、ヒトα-galAを含むポリペプチドをコードするDNA分子を含有するヒト細胞を培養する段階を含む、グリコシル化ヒトα-galAを製造する方法。薬学的に許容される賦形剤をさらに含む請求項26記載の治療用組成物。機能的部分としてブチル基を含む疎水性相互作用樹脂に前記サンプルを通す段階を含む、サンプルからヒトα-galAを精製する方法。詳細な説明α-galAのようなリソソームの酵素は、マンノース-6-ホスフェートM6P受容体、即ち、リソソームの区画のためと運命づけられた酵素のオリゴサッカライド部分に存在するM6P残基に結合する受容体との相互作用により細胞のリソソーム区画を標的として指向するKornfeldSandMellmanIAnnRevCellBiol54835251989。一次の相互作用はゴルジ体で起こり、そこではゴルジのM6P受容体に結合した酵素がリソソームに移行するために分離される。二次的なタイプの相互作用は、細胞表面にて細胞外のα-galAとM6Pとの間で起こると考えられている。細胞によってインターナリゼーションされた細胞外の基質はエンドサイトーシス小胞において細胞質を通って移行し、それは最初のリソソームと融合し、そのリソソームに内容物を移す。この過程で細胞表面のM6P受容体もエンドサイトーシス小胞に導入され、リソソームに移される。細胞外環境に存在するα-galAは、それがM6P残基を運搬している場合には細胞表面のM6P受容体に結合し、そのためその受容体とともにリソソームの区画に移行することができる。このスキャベンジャーの結果として一旦リソソームの区画に入ると、酵素は適当な機能を挙行できる。したがって、仮に細胞がそれ自身のα-galAを産生する場合に遺伝子的欠陥があったとしても、a酵素が適当にグリコシル化されていること及びb欠陥のある細胞がM6P受容体を運搬することによって、外因性で製造された酵素を取り上げるための機構が存在する。ファブリー病では、腎臓及び心臓の血管内皮細胞が重篤な組織病理学上の異常を示すこと、そしてその疾患の臨床上の病理学に関わることがわかっており、M6P受容体を運搬しているこれらの細胞は、本明細書で主張している本発明の特定のターゲットである。本発明によって製造されたα-galAは、影響を受けている細胞に局所的または全身的のいずれかで遺伝子治療によって即ち、患者の体内でグリコシル化酵素を発現しかつ分泌するように遺伝的に修飾された細胞によって、または従来の薬学的投与経路によって供給することができる。したがってM6PがN-結合オリゴサッカライドに存在する場合のα-galAは、本発明による治療法にとって非常に重要である。さらにα-galAのN-結合オリゴサッカライドがシアリル化によって修飾されている程度も非常に重要である。適当なシアリル化がなされていない場合α-galAは、肝臓のアシアロ糖蛋白質受容体によって結合されることに起因して循環系から急速に一掃され、その後インターナリゼーションされてから肝細胞によって分解を受けるAshwell及びHarfordのAnnRevBiochem515315541982。これによって、腎臓及び心臓の血管内皮細胞のようなファブリー病の臨床的病理学に寄与する細胞のM6P受容体に結合するために循環系で利用されるα-galAの量が減少する。驚くべきことに出願人は、安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって分泌されるα-galAが、遺伝子治療によってか精製した分泌蛋白質の従来の薬学的投与法によってファブリー病の治療を行うために適切なグリコシル化の性質をもっていることを見いだした。このことは、最も研究の進んだリソソームの酵素であるグルコセレブロシダーゼについての状況、即ちヒトの胎盤から精製されるかまたは体内で臨床的に関連する細胞にトランスフェクトしたCHO細胞から分泌された酵素を供給するには、複雑な酵素の酵素的修飾、それに続く精製が必要であるという状況cfBeutlerNewEnglJMed325135413601991と対照的である。本発明の治療法は二通りの一般法、即ち酵素を過剰発現し分泌するように遺伝的に修飾された培養ヒト細胞から得られる精製ヒトα-galAの治療上の有効量を患者に導入することによって、またはその患者に過剰発現する細胞自体を導入することによっての二通りの一般法のいずれかで行うことができる。必要な遺伝的修飾を達成する手法については、精製、配合、及び治療の方法として下記に記載されている。実施例I.α-galAを輸送し発現するように設計された構築物の調製及び利用二つの発現プラスミドであるpXAG-16及びpXAG28を構築した。これらのプラスミドには、α-galA酵素の398のアミノ酸をコードしているヒトα-galA酵素α-galAシグナルペプチドを欠いている、ヒト成長ホルモンhGH遺伝子の第1イントロンによって割り込まれたhGHシグナルペプチドのゲノムDNA配列、及びポリアデニル化のシグナルを含むhGH遺伝子の3’非翻訳配列UTSが含まれる。プラスミドpXAG-16はヒトサイトメガロウイルスの即時型-初期CMVIEプロモーターおよび第1イントロン非コードエクソン配列に隣接を有しており、これに対してpXAG28はコラーゲンIα2プロモーターによって推進され、またβ-アクチン遺伝子の第1イントロンを持つβ-アクチン遺伝子の5’UTSも含んでいる。A.完全なα-galAのcDNAのクローニング及びα-galA発現プラスミドpXAG-16の構築ヒトα-galAのcDNAは、次のように構築したヒト繊維芽細胞のcDNAライブラリーからクローニングした。Poly-AmRNAは全RNAから単離し、cDNAの合成は製造指示書にしたがってラムダザップIIlambdaZapII:登録商標システムの試薬を用いて行ったStratageneIncLaJollaCA。簡単に述べると第1鎖のcDNAは、内部XhoI制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオリゴ-dTプライマーの存在下で逆転写を行うことで生成した。続いてRNaseHを用いて処理し、そのcDNAを二本鎖のcDNAを生成するためにDNAポリメラーゼIを用いてニック-トランスレーションした。このcDNAはT4DNAポリメラーゼを用いて平滑末端を形成し、EcoRIアダプターに連結した。この連結の生成物をT4DNAキナーゼで処理してからXhoIを用いて切断した。そのcDNAをセファクリル-400Sephacryl400:登録商標クロマトグラフィーによってフラクションに分けた。大量で中間の大きさのフラクションを集め、そのcDNAをEcoRIとXhoI-切断性のラムダザップIIlambdaZapIIアームに連結した。次にこの連結反応の生成物を包装し、力価を測定した。主なライブラリーは力価が1.2×107pfu/mlであり、平均的な挿入物の大きさは925bpであった。ヒトα-galA遺伝子のエキソン7から得られる210bpのプローブ図1の配列番号:19を、cDNAを単離するために用いた。このプローブ自体は次のオリゴヌクレオチド、即ち5’-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3’オリゴ1;配列番号1及び5’-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3’オリゴ2;配列番号:2を用いてポリメラーゼ連鎖反応PCRを行うことによってゲノムDNAから単離した。続いてこのPCR生成物を繊維芽細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングするために用い、ポジティブのクローンを単離してからさらに特徴を明らかにした。一つのポジティブなクローンであるファージ3Aを、ラムダザップIIlambdaZapII:登録商標システム摘出プロトコールStratageneIncLaJollaCAに、その製造指示書に従ってかけた。この方法によってプラスミドpBASAG3Aが得られ、それはpBluescriptSK-商品名プラスミドバックボーンにα-galAのcDNA配列を含んでいる。DNAの配列決定によってこのプラスミドはcDNA配列の完全な5’末端を含まないことが明かとなった。したがって5’末端は、ヒトゲノムのDNAから増幅したPCRフラグメントを用いて再構築した。これを達成するために、268bpのゲノムDNAフラグメント図2の配列番号:20を次のオリゴヌクレオチド、即ち5’-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3’オリゴ;配列番号:3及び5’-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3’オリゴ4;配列番号:4を用いて増幅した。このフラグメントをTAクローニングプラスミドInvitrogenCorpSanDiegoCAにサブクローニングすることでプラスミドpTAAGEIを生成した。プラスミドpBSAG3Aはα-galAのcDNA配列の大部分を含んでおり、またpTAAGEIはα-galAのcDNAの5’末端を含んでいて、その両方をそれぞれSacII及びNcoIを用いて切断した。増幅したDNAフラグメント内のSacII及びNcoI部位に関連した位置が図2に示されている。pTAAGEIから得られる0.2kbのSacII-NcoIフラグメントを単離して、同等に切断したpBSAG3Aに連結した。このプラスミド、pAGALは完全なα-galAのcDNA配列を含んでいて、それにはα-galAシグナルペプチドをコードする配列が含まれている。このcDNAは完全に配列決定されα-galAシグナルペプチド、配列番号:18を含んでいて図3に示されている、ヒトα-galAのcDNAについて公開されている配列GenebanksequenceHUMGALAと同一であると判明した。このプラスミドpXAG-16は、次のような数種の中間体を経て構築した。まず第一にpAGALをSacII及びXhoIを用いて切断し、平滑末端にした。第二にこの完全なα-galAのcDNAの末端をXbaIリンカーに連結してから、XbaIで切断したpEF-BOSにサブクローニングしMizushimaらのNuclAcidsRes1853221990、pXAG-1を作成した。この構築物は、ヒト顆粒球-コロニー刺激因子G-CSFの3’UTSと、α-galAにα-galAのシグナルペプチドをプラスしてコードしたcDNAをフランキングするヒト延長因子-1αEF-1αプロモーターとを含んでおり、それによってα-galAのcDNAの5’末端がEF-1αプロモーターに融合できるようになっている。CMVIEプロモーターと第1イントロンを用いて構築物を形成するために、α-galAのcDNAとG-CSFの3’UTSを2kbのXbaI-BamHIフラグメントとしてpXAG-1から除去した。このフラグメントを平滑末端化してBamHIリンカーに連結し、BamHI切断したpCMVflpNeo下記に記載したように構築したに挿入した。この方針は、α-galAのcDNAの5’末端がCMVIEプロモーター領域に融合するようになっている。pCMVflpNeoは次のように作成した。CMVIE遺伝子プロモーターフラグメントは鋳型としてのCMVのゲノムDNAとオリゴヌクレオチド、即ち5’-TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3’配列番号:23及び5’-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3’配列番号:24とを用いてPCRを行って増幅した。得られた産物1.6kbのフラグメントをBamHIを用いて切断し、CMVプロモーターを含み結合性のBamHI-切断した末端を持つフラグメントを得た。この新しく発現したユニットを、1.1kbのXhoI-BamHIフラグメントとしてプラスミドpMClneopAStratageneIncLaJollaCAから単離した。このCMVプロモーターを含み新生のフラグメントを、BamHI-、XhoI-切断プラスミドpUC12に挿入した。注目すべきことにpCMVflpNeoは、ヌクレオチド546で始まりヌクレオチド2105で終わるGenebanksequenceHS5MIEPについてCMVIEプロモーター領域と、このCMVIEプロモーターフラグメントに直接5’が結合するヘルペスシンプレックスウイルスHerpesSimplexVirus:HSVのチミジンキナーゼプロモーターTKneo遺伝子によって推進されるネオマイシン抵抗性遺伝子を含んでいる。新生遺伝子の転写の方向は、CMVプロモーターフラグメントの方向と同じである。この中間構築物はpXAG-4と言われた。hGH3’UTSを追加するために、GCSF3’UTSをXbaI-SmaIフラグメントとしてpXAG-4から除去し、pXAG-4の末端を平滑化した。hGH3’UTSは、0.6kbのSamI-EcoRIフラグメントとしてpXGH5SeldenらのMolCellularBiol6317331791986から除去した。このフラグメントを平滑末端化した後でそれを、pXAG-4の平滑末端化したXbaI部位のすぐ後でpXAG-4に連結した。この中間体はpXAG-7と言われた。TKneoフラグメントをHindIII-ClaIフラグメントとしてこのプラスミドから除去し、そのプラスミドの末端をDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントで充填fillinginすることによって平滑化した。SV40初期プロモーターによって推進されるネオマイシン耐性遺伝子は、pcDNeoChenらのMolCellularBiol7274527521987の切断物由来の平滑化ClaI-BsmBIフラグメントとして連結し、α-galA転写物ユニットとして同じ方向に新しい転写ユニットが位置づけられる。この中間体はpXAG-13と言われた。26個のアミノ酸hGHシグナルペプチドをコードする配列及びhGH遺伝子の第1イントロンを持っているpXAG-16を完成させるために、pXAG-13の2.0kbのEcoRI-BamHIフラグメントを初めに除去した。このフラグメントはα-galAのcDNAとhGHの3’UTSを含んでいた。この大きなフラグメントを3個のフラグメントと置き換えた。第1番目のフラグメントはpXGH5の0.3kbのPCR産物からなり、それはhGHシグナルペプチドをコードする配列を含んでいて、Kozak共通配列のすぐ上流側に位置している合成のBamHI部位からhGHシグナルペプチドをコードする配列の末端までであった。次のオリゴヌクレオチド、即ち5’-TTTTGGATCCACCATGGCTA-3’オリゴHGH101;配列番号:5及び5’-TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3’オリゴHGH102;配列番号:6を、このフラグメントフラグメント1を増幅するために用いた。第2番目のフラグメントは、398アミノ酸のα-galA酵素即ち、α-galAシグナルペプチドを欠くをコードするcDNAの開始部からNheI部位までに対応する配列を含む0.27kbのPCR産物からなっていた。次のオリゴヌクレオチド、即ち5’-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3’オリゴAG10;配列番号:7及び5’-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3’オリゴAG11;配列番号:8は、このフラグメントフラグメント2を増幅するために用いた。第3番目のフラグメントはhGH3’UTSと同様に、残っているα-galA配列を含むpXAG-7のNheI-EcoRIフラグメントからなっていたフラグメント3。フラグメント1BamHIとNaeIを用いて切断されている、フラグメント2PvuIIとNheIを用いて切断されている、及びフラグメント3を、新生遺伝子とCMVIEプロモーターを含むpXAG-13の6.5kbのBamHI-EcoRIフラグメントと混合し、プラスミドpXAG-16図4を生成するために一緒に連結した。B.α-galA発現プラスミドpXAG28の構築ヒトコラーゲンIα2プロモーターを次のようにα-galA発現構築物pXAG28で利用すべく単離した。ヒトコラーゲンIα2プロモーターの部分を含むヒトゲノムのDNAからなる408bpのPCRフラグメントを次のオリゴヌクレオチド、即ち5’-TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3’オリゴ72;配列番号:9及び5’-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3’オリゴ73;配列番号:10を用いて単離した。このフラグメントは、EMBL3ClontechIncPaloAltoCAにおいてヒト白血球ライブラリーをスクリーニングするために用いた。3.8kbのEcoRIフラグメントを含む一つのポジティブなクローンファージ7Hを単離し、EcoRI部位pBS/7H.2を形成するでpBSIISKStratageneIncLaJollaCAにクローニングした。AvrII部位を、pBSIISKポリリンカーで開裂するSpeIで切断し、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントを用いて充填し、さらにオリゴヌクレオチド5’-CTAGTCCTAGGA-3’配列番号:11を挿入することによってpBSIISKに導入した。pBSIISKのこの変形物をBamHI及びAvrIIを用いて切断し、上記に記載した初めの408bpコラーゲンIα2プロモーターPCRフラグメントの121bpからなるBamHI-AvrIIフラグメントに連結してpBS/121COL.6を作成した。このプラスミドpBS/121COL.6を、pBSIISKポリリンカー配列で開裂するXbaIを用いて切断し、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントで充填してからAvrIIを用いて切断した。pBS/7H.2の3.8kbのBamHI-AvrIIフラグメントを単離し、BamHI部位をKlenow酵素で処理することによって平滑末端化した。続いてこのフラグメントをAvrIIを用いて切断し、AvrII-切断ベクターに連結することによってコラーゲンプロモータープラスミドpBS/121bpCOL7H.18を作成した。次にこのコラーゲンプロモーターを、ヒトβ-アクチン遺伝子の第1イントロンを含むヒトβ-アクチン遺伝子の5’UTSに融合した。この配列を単離するために2kbのPCRフラグメントを、次のオリゴヌクレオチド、即ち5’-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3’オリゴBA1;配列番号:12及び5’-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3’オリゴBA2;配列番号:13を用いてヒトゲノムのDNAから単離した。このフラグメントをBamHI及びBsiHKAIで切断することによって、β-アクチンの5’UTS及びイントロンを含む0.8kbのフラグメントを開放した。それから3.6kbのSalI-SrfIフラグメントをコラーゲンプロモータープラスミドpBS/121bpCOL7H.18から次のように単離した。pBS/121bpCOL7H.18をBamHIBamHI部位は、コラーゲンIα2プロモーターフラグメントの5’末端に位置する。を用いて部分的に切断し、Klenowフラグメントを用いて処理することによって平滑末端を作り、続いてSalIリンカー5’-GGTCGACC-3’に連結することによって、コラーゲンIα2プロモーターの上流にSalI部位を位置づける。それからコラーゲンのプラスミドをSalI及びSrfIこのSrfI部位はコラーゲンのIα2プロモーターCAP部位の110bp上流に位置しているを用いて切断し、3.6bpのフラグメントを単離した。この0.8kbと3.6kbのフラグメントを、SalI-切断及びBamHI-切断のpBSIISK-StratageneIncLaJollaCAで結合し、次の4つのオリゴヌクレオチドからなるフラグメントを一緒にアニール化した平滑末端とBsiHKAI末端を持つフラグメントを形成している。5’-GGGCCCCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTTTTGGAGGCACCCTAGGGCCAGGAAACTTTTGCCGTAT-3’オリゴCOL-1;配列番号:14、5’-AAATAGGGCAGATCCGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGGCCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3’オリゴCOL-2;配列番号:15、5’-TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAGGGCCTCCACCAATGGGAGGGCTGGGGCTGGGGGCCC-3’オリゴCOL-3;配列番号:16、及び5’-CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAAATAATAAAGCCCGGATC-3’オリゴCOL-4;配列番号:17。これらの4つのオリゴヌクレオチドはアニール化すると、コラーゲンプロモーターのSrfI部位で始まり、β-アクチンプロモーターのBsiHKAI部位を通って続く領域に対応している。得られたプラスミドは、pCOL/β-アクチンと称した。pXAG28の構築物を完成させるために、コラーゲンIα2プロモーターとβ-アクチン5’UTSを含むpCOL/β-アクチンのSalI-BamHIフラグメントを単離した。このフラグメントをpXAG-16実施例1A及び図4参照から得られる二つのフラグメント、即ち16.0kbのBamHIフラグメント新しい遺伝子、プラスミドバックボーン、398アミノ酸α-galA酵素をコードするcDNA、及びhGH3’UTSを含む、及び20.3kbのBamHI-XholフラグメントpcDneo由来のSV40ポリA配列を含むに連結した。pXAG28は、ヒトβ-アクチン5’UTSに融合したヒトコラーゲンIα2プロモーター、hGHシグナルペプチドhGH第1イントロンによって割り込まれている、α-galA酵素をコードするcDNA、及びhGHの3’UTSを含む。完成した発現構築物のpXAG28の地図が図5に示されている。C.α-galA発現プラスミドを用いてエレクトロポレーションを行った繊維芽細胞のトランスフェクション及びセレクション繊維芽細胞においてα-galAを発現させるために、公開された方法にしたがって二次の繊維芽細胞を培養し、トランスフェクションしたSeldenらのWO9309222。プラスミドpXAG-13、pXAG-16及びpXAG28をエレクトロポレーションによってヒトの包皮の繊維芽細胞にトランスフェクションすることで、安定してトランスフェクトされたクローン細胞株を発生させることができ、そして得られたα-galAの発現レベルを実施例IDにおいて記載したようにモニターした。正常の包皮繊維芽細胞によるα-galAの分泌は2~10ユニット/106細胞/24時間の範囲内であった。対照的にトランスフェクトされた繊維芽細胞は、表1に示されているような平均の発現レベルを示した。平均のα-galA発現レベル/-標準偏差これらのデータは、三種すべての発現構築物がトランスフェクトされていない繊維芽細胞の発現の多数倍もα-galAの発現を増加させる能力があることを示している。α-galAシグナルペプチドに結合したα-galAをコードしているpXAG-13を用いて安定してトランスフェクトされた繊維芽細胞による発現は、シグナルペプチドがhGHシグナルペプチドである点だけが異なっていてそのコード配列がhGH遺伝子の第1イントロンによって割り込まれているようなpXAG-16を用いてトランスフェクトした繊維芽細胞による発現よりも実質的に低い。トランスフェクトした細胞を継代させる度ごとに分泌されたα-galAの活性を測定し、その細胞を計数して細胞密度を計算した。植え付けた細胞数とα-galAの分泌が可能になった時間に基づいてα-galAの特定の発現速度を測定し、24時間あたり106個の細胞につき分泌されるユニットα-galAとして表2及び3に報告されている。遺伝子治療を行う際、またはα-galAの精製用の材料の産出において利用する際に好適な細胞株は、数回の継代にわたって安定した成長と発現を示さなくてはならない。α-galA発現構築物pXAG-16を用いて安定してトランスフェクトされた、表2及び3に示された細胞株から得られるデータは、α-galAの発現が数回の継代にわたって安定して維持されているという事実を示している。α-galA発現構築物のpXAG-16を含むBRS-11細胞の成長及び発現α-galA発現構築物のpXAG-16を含むHF503-242細胞の成長及び発現D.α-galA発現の定量化α-galA活性を、水溶性の基質である4-メチルウンベリフェリル-α-D-ガラクロピラノシド4MUFgalResearchProductsIncを用い、IoannouらJCellBiol119113711501992により記載されたプロトコールの変形法によって測定した。この基質は、基質緩衝液0.1Mのクエン酸塩-燐酸塩、pH4.6に溶解して濃度を1.69mg/ml5mMにした。典型的には、10μlの培養液の上清を75μlの基質溶液に添加した。そのチューブを覆い、37°Cの水浴中、60分間インキュベートさせた。このインキュベーションの終わりに2mlのグリシン-炭酸塩緩衝液130mMのグリシン、83mMの炭酸ナトリウム、pH10.6を用いることによって、その反応を止めた。それぞれのサンプルの相対蛍光度を、365nmの固定励起波長を持っていて460nmの固定放出波長を検出するモデルTK0100蛍光度測定計HoeferScientificInstrumentsを用いて測定した。サンプルの判断は、1μMのメチルウンベリフェロンSigmaChemicalCoのストックから準備した標準と比較し、加水分解された基質の量を計算した。α-galAの活性はユニットで表し、即ち1ユニットのα-galA活性は37°Cで1時間あたりに加水分解された基質の1ナノモルに等価である。細胞発現のデータは一般に、分泌されたα-galA活性ユニット/106個の細胞/24時間として表した。またこのアッセイは、細胞溶菌液及び下記に記載したように種々のα-gal精製工程から得られるサンプルにおけるα-gal活性の量を測定するためにも用いた。実施例II.安定したトランスフェクトがなされたヒト細胞株の条件が整えられた培地から得られるα-galAの精製実施例IIA-IIEには、α-galAを産生するように安定してトランスフェクトされた培養のヒト細胞株の条件付けられた培地からほとんど等質性にその酵素を精製できる点が示されている。A.α-galAの精製における第1工程としてのブチルセファロース登録商標クロマトグラフィーの使用低温条件を整えた培地1.34リットルを遠心分離によって不純物を除去し、ガラス繊維製のプレフィルターを用いた0.45μmの酢酸セルロースフィルターを通して濾過した。攪拌しながら低温の濾過済み培地のpHを1NのHClを滴下して添加することによって5.6に調節し、続いて3.9Mの超純粋の硫酸アンモニウムのストック溶液室温を滴下により添加することで最終濃度が0.66Mになるまで硫酸アンモニウムを加えた。この培地をさらに4°Cで5分感攪拌し、濾過し、次にブチルセファロース登録商標の4高速カラム4FastFlowcolumn;カラム容積は81ml、2.5×16.5cm;PharmaciaUppsalaSweden、即ち0.66Mの硫酸アンモニウムを含む10mMのMES-トリス、pH5.6緩衝液Aで平衡化されたカラムにかけた。このクロマトグラフィーは、全蛋白質濃度と塩濃度をそれぞれ評価するためのライン上に設けたUV280nmと導電率モニターを装着したグラジ-フラクGradiFrac;商品名システムPharmaciaUppsalaSwedenにて4°Cで行った。流速10ml/分でサンプルを適用してからそのカラムを、カラム容積の10倍の緩衝液Aで洗浄した。α-galAは、緩衝液A硫酸アンモニウムを含むから10mMのMES-トリス、pH5.6硫酸アンモニウムを含まないまで直線状の勾配をつけた14カラム容積の溶媒を用いてブチルセファロース登録商標カラムより溶出した。フラクションを4-MUF-galアッセイによってα-galA活性について評価し、適当な酵素活性を含むフラクションを集めた。図6及び精製の概要表3に示すように、この工程によって約99の不純物としての蛋白質が除去されているカラムに通す前のサンプル=全蛋白質は8.14g、カラムを通った後のサンプル=全蛋白質は0.0638g。安定してトランスフェクトされたヒト繊維芽細胞の条件を整えた培地から得られるα-galAの精製B.α-galAの精製のための工程として、ヘパリンセファロース登録商標クロマトグラフィーの利用ブチルセファロース登録商標カラムのピークフラクションを、10mMのMES-トリス4リットル、pH5.6一度交換に対して4°Cで透析した。透析物の導電度を、必要に応じてH2OまたはNaClを添加することによって4°Cで1.0mMHOに調節した。その後でサンプルを、9mMのNaClを含んだ10mMのMES-トリス、pH5.6緩衝液Bで平衡化したヘパリンセファロース登録商標6高速のカラムPharmaciaUppsalaSweden29mlのカラム容積、2.5×6cmにかけた。これは10ml/分の流速で4°Cにて行った。ライン上のUV280nmと導電度モニターによって全蛋白質と塩の濃度を測定した。そのサンプルを適用した後でそのカラムを10カラム容量の緩衝液Bで洗浄し、続いて3カラム容量の8緩衝液C/92緩衝液Bここでの緩衝液Cは、250mMのNaClを含む10mMのMES-トリス、pH5.6であるまでの線形勾配をつけた溶媒、さらに10カラム容量の8の緩衝液Cを用いて洗浄した。この後、1.5カラム容量の29までの線形勾配をつけた緩衝液Cを用いて、続いて10カラム容量の35までの線形勾配をつけた緩衝液Cを用いてα-galAの溶出を行った。フラクションはα-galA活性についてアッセイし、適当な活性を含むフラクションを集めた。C.α-galAを精製するための工程として、ハイドトキシアパタイトの利用ヘパリンのプールを濾過し、1mMの燐酸ナトリウム、pH6.0緩衝液Dで平衡化したセラミックハイドロキシアパタイトHC40μm;AmericanInternationalChemicalNtickMA;12mlのカラム容量、1.5×6.8cmからなるカラムに直接かけた。そのクロマトグラフィーは、ライン上にUV280nmと導電度モニターを装着したハイブリッドグラジ-フラクGradiFrac:商品名/FPLC登録商標システムPharmaciaUppsalaSwedenにて室温で行った。サンプルを適用した5ml/分後でそのカラムを10カラム容量の緩衝液Dで洗浄した。α-galAを7カラム容量の42緩衝液E/58緩衝液Dここでの緩衝液Eは、250mMの燐酸ナトリウム、pH6.0であるまでの線形勾配をつけた溶媒、さらに10カラム容量の52までの勾配をつけた緩衝液Eを用いて溶出した。フラクションはα-galA活性についてアッセイし、適当な活性を含むフラクションを集めた。D.α-galAを精製するための工程として、Qセファロース登録商標アニオン交換クロマトグラフィーの利用ハイドロキシアパタイトのプールをH2Oを用いて約1.5倍に希釈して、最終的な導電度が室温で3.4~3.6mMHOにした。濾過してからそのサンプルを、10の緩衝液G/90の緩衝液Fで平衡化したQセファロース登録商標HPPharmaciaUppsalaSweden;5.1mlのカラム容量、1.5×2.9cmからなるカラムに直接かけた。ここで緩衝液Fは25Mの燐酸ナトリウム、pH6.0であり、また緩衝液Gは25mMの燐酸ナトリウム、pH6.0、250mMのNaClである。このクロマトグラフィーは、グラジ-フラクGradiFrac:商品名/FPLC登録商標ハイブリッドシステムPharmaciaUppsalaSwedenにて室温で行い、全蛋白質と塩の濃度をライン上に設けたモニターで測定した。そのサンプルに5ml/分の流速を適用してから、次の工程を行った。即ち、110の緩衝液Gで5カラム容量の洗浄、212の緩衝液Gで7カラム容量の洗浄、33カラム容量の50までの線形勾配をつけた緩衝液G、410カラム容量の53までの線形勾配をつけた緩衝液G、53カラム容量の100までの勾配をつけた緩衝液G、及び610カラム容量の100の緩衝液Gで洗浄工程。α-galは工程3及び4の間におもに溶出した。適当な活性を含むフラクションを集めたQプール。E.α-galAを精製するための工程として、スーパーデックス登録商標-200ゲル濾過クロマトグラフィーの利用QプールをCentriprep登録商標-10遠心濃縮機ユニットAmiconBeverlyMAを用いて約5倍に濃縮し、スーパーデックス登録商標200PharmaciaUppsalaSweden;189mlのカラム容量、1.6×94cmからなるカラムにかけた。このカラムを、150mMのNaClを含む25mMの燐酸ナトリウム、pH6.0を用いて平衡化し、溶出した。このクロマトグラフィーは、蛋白質の溶出を追跡するためにライン上のUVモニター280nmを用いたFPLC登録商標システムPharmaciaUppsalaSwedenにて室温で行った。そのカラムにかけたサンプルの容量は≦2ml、流速は0.5ml/分、そしてフラクションの量は2mlであった。多数回カラムの作動を遂行し、フラクションをα-galA活性についてアッセイして適当な活性を含むフラクションを集めた。このスーパーデックス登録商標200カラムから得られるプールされたフラクションをCentriprep-10ユニットを用いて濃縮し、アリコートにしてからスナップ冷凍し、-80°Cで短期間保存した。α-galAの精製についてこの実施例の要約が表3に示されている。α-galAの最終収率は出発物質の活性の59であり、また精製した産物の比活性は2.92×106ユニット/mg蛋白質であった。得られた産物は、4~15のSDS-ポリアクリルアミドゲル上で還元条件にして電気泳動を行った後に高いレベルの純度を示し、続いて銀染色を行った。実施例III.精製されたα-galAの配合及び保存高度に精製したα-galAは、精製された蛋白質≦1mgの蛋白質/mlの希釈溶液として保存した場合、長い期間は安定していない。したがって配合剤を長く保存する間、即ち数週間から少なくとも数カ月間不変のまま保存を行う間、安定性を改善できるように工夫した。精製された酵素を、遠心濃縮機25mMの燐酸ナトリウムpH6.0及び150mMのNaClからなる酵素緩衝液中でを用いて少なくとも1mg/mlに濃縮した。ヒト血清アルブミンHSA;ブミネートBuminate:登録商標、BaxterHylandを添加して最終濃度を2.5mg/mlにした。それからこの蛋白質溶液を、シリンジに取り付けた0.2μmの酢酸セルロースフィルターSchleicherandSchuellを用いて滅菌濾過した。α-galA溶液を、滅菌した発熱体フリーのガラス溶液に分配し、テフロン登録商標製の蓋で密閉し、スナップ冷却を行ってから-20°Cで保存した。α-galA活性の安定性は、4-MUF-galアッセイを用いて3カ月間にわたって評価した。表5に示されたデータは、テストした期間にわたって酵素活性の喪失が起こらなかったことを証明している。配合剤が酸性pH6.5であることは、高度に精製した酵素の安定性にとって重要である。配合されたα-galAの-20°Cにおける安定性実施例IV.ヒト細胞株によって産生したα-galAは、α-galA欠損症を治療するのに適当である。本発明により調製した精製ヒトα-galAの構造的及び機能的特徴を、この明細書に記載されたDNA分子とトランスフェクトしたヒト細胞株によって産生された対応する発現糖蛋白質とがそれぞれ遺伝子治療または酵素置換治療で利用可能であることを証明するために調べた。A.培養中の安定してトランスフェクトされたヒト細胞により産生したα-galAのサイズα-galAの分子質量をMALDI-TOF質量分光測定法で見積った。これらの結果から、ダイマーの分子質量が102,353Daであり、これに対してモノマーの分子質量が51,002Daであることが証明された。アミノ酸組成に基づいてモノマーについて予測された分子質量は45,400Daである。したがって、酵素の炭水化物含有量は5,600Daまでの分子量であるとの計算が推測できる。精製した蛋白質に対して行った標準的なアミノ酸分析の結果は、トランスフェクトしたヒト細胞によって産生された蛋白質がヒト組織から精製した蛋白質にアミノ酸レベルで同一であるという推断と一致している。B.安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって産生されたα-galAのN末端処理ヒトα-galAのcDNAヌクレオチド配列は429個のアミノ酸をコードする。31個のN末端アミノ酸はシグナルペプチド配列を構成し、それは形成されつつある蛋白質が内部細胞質の網状質を通過するように開裂するLeDonneらのJBiolChem26220621987。α-galAが異型のシグナルペプチド配列例えば、ヒト成長ホルモンのシグナル配列と関連していて、トランスフェクトしたヒト繊維芽細胞において発現する場合にα-galAが適当に処理されることを確認するために、分泌された蛋白質の10個のN末端アミノ酸をミクロシークエンシングした。サンプルをSDS-PAGEによって電気泳動し、10mMのCAPSpH11.0、10のメタノール緩衝液システムを用いてプロブロットProBlott:登録商標、ABIFosterCityCAに転写した。プロブロット上の蛋白質はクマージー染色によって可視化し、そして適当サイズ50kDaのバンドを削り取った。N末端の配列は、自動化エドマン分解を行うアプライドバイオシステムズAppliedBiosystemsパルス-液相アミノ酸配列同定装置を用いて得た。得られたN末端配列、LDNGLARTPT配列番号:28は、シグナルペプチドの適切な開裂と一致しており、分泌された蛋白質に対して予測されているN末端配列と適合する。C.安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって産生されたα-galAのC末端アミノ酸本発明により産生された分泌α-galAのC末端アミノ酸残基は、自動化ヒューレットパッカードC末端配列決定装置HewlettPackardCterminalsequencerを用いて同定した。この結果はC末端がロイシン残基であることを示しており、それはこのDNA配列によって予言されたC末端アミノ酸と一致している。D.安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって産生されたα-galAの炭水化物の修飾本発明により産生されたα-galAのグリコシル化パターンも評価した。適当にグリコシル化されることは、α-galAがインビボで最適な活性を示すために重要である。即ち非グリコシル化システムで発現したα-galAは不活性であったりまたは不安定であったりするHantzopolousらのGene571591987。またグリコシル化は、α-galAが目的とする標的細胞にインターナリゼーションされるためにも重要であり、インビボでの酵素の循環血中半減期に影響を与える。α-galAのそれぞれのサブユニットには、アスパラギンに結合する炭水化物鎖の付加にとって役立つ4つの部位があり、そのうち3つの部位だけが占められているDesnickらのInTheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDiseasepp27412780McGrawHillNewYork1995。安定してトランスフェクトされた細胞によって産生したα-galAのサンプルを、Aurafaciensから単離したノイラミニダーゼで処理することBoehringerMnnheimIndianapolisINによりシアリル酸を除去した。この反応は、5μgのα-galAを10mUのノイラミニダーゼとともに室温で一晩、全体で10μlの酢酸緩衝塩溶液ABS、20mMの酢酸ナトリウム、pH5.2、150mMのNaCl中で処理することによって進行させた。安定してトランスフェクトされた細胞によって産生した精製α-galAも、アルカリホスファターゼ子ウシ小腸のアルカリホスファターゼ、BoehringerMnnheimIndianapolisINを用いて脱リン酸化したが、それは5μgのα-galAを、ABS1MのトリスでpHを7.5に上昇させた中に入れた15Uのアルカリホスファターゼを用いて室温で一晩処理することによって行った。このサンプルを、α-galA特異性抗体を用いたウエスターンブロットにより分析した。用いた抗体はウサギのポリクローナル抗ペプチド抗体であり、それは免疫原としてα-galAのアミノ酸68~81を表すペプチドを用いて産生させた。その後この蛋白質をPVDFMilloporeBedfordMAに移してからその膜を、抗血清が2.5のブロット脱脂したドライミルクの20mMのトリス-HCl溶液、pH7.5、0.05のトウィーン-20中に含まれる1:2000希釈液を用いてプローブした。この後で、セイヨウワサビのペルオキシダーゼOrganonTeknikaCappelDurhamNC15000希釈液に複合化したヤギ抗ウサギIgGとECL化学ルミネセンスキットAmershamArlingtonHeightsINの試薬を用いて検出した。ノイラミニダーゼを用いてα-galAを処理すると分子質量にわずかなシフト約1500~2000ダルトンまたは4~6シアリル酸/モノマーが起こるが、これはシアリル酸によりα-galAが広範囲に修飾されたことを示唆している。参考のために言うと、α-galAの血しょうの形態にはモノマー1個あたり5~6個のシアリル酸残基があり、また胎盤の形態にはモノマー1個あたり0.5~1.0個のシアリル酸残基があるBishopらの、JBiolChem25613071981。α-galAのシアリル酸とマンノース-6-燐酸による修飾を調べるために用いられる別の方法としては等電点分離法IEFがあり、それではサンプルが等電点PIまたは正味の電荷に基づいて分離される。こうしてα-galAから得られるシアリル酸や燐酸のようなチャージした残基が除去されると、IEFシステムにおいて蛋白質の移動度が変わって来ると予測される。IEF実験を行うためには本発明により産生したα-galAのサンプルを、2×Novexサンプル緩衝液8Mのウレアを用いている、pH3.0~7.0とともに1:1で混合したノイラミニダーゼ及びアルカリホスファターゼを用いて処理し、ファルマライトPharmalyte:登録商標、PharmaciaUppsalaSweden、pH3.0~6.5、Pharmalyte4~6.5及び2.5~5.5、ゲルあたりそれぞれ0.25mlを用いて作った6MウレアのIEFゲル5.5ポリアクリルアミドにかけた。等電点の標準物質BioRadも含ませた。電気泳動を行ったあとでそのゲルをPVDFに移し取り、ウエスターンブロット分析を上記に記載したように行った。安定してトランスフェクトしたヒト繊維芽細胞によって産生したα-galAは、約4.4~4.65の範囲のpIを持つ三種の主要なイソ型からなる。これらの値はα-galAの血しょうの型及び胎盤の型のpIと同じであるBishopらの、JBiolChem25613071981。酵素のノイラミニダーゼ処理によって三種すべてのイソ型のpIが増加したが、このことは全てがサリチル酸によってある程度修飾されていることを示している。これらのデータは、安定したトランスフェクトがなされたヒト細胞によって産生されたα-galAが望ましい血しょう半減期を持っているに違いないことを示唆しており、そのことはこの材料が薬学的利用するのに充分ふさわしいことを示している。さらに、ノイラミダーゼ処理したα-galAをアルカリホスファターゼ処理すると、蛋白質の部分のpIが約5.0~5.1にまでさらに増加したが、このことは酵素が一つまたはそれ以上のマンノース-6-ホスフェート残基を運搬していることを示している。この修飾は、標的細胞によってα-galAの効率のよいインターナリゼーションが起こるために必要である点で重要である。E.安定したトランスフェクトを行った繊維芽細胞から精製されたα-galAの比活性精製されたα-galAの能力または比活性を、酵素の触媒活性4-MUF-galアッセイを用いてと、蛋白質濃度の両方を測定することによって計算する。蛋白質濃度は、BCAシステムPierceを用いるようなどれかの標準法によって、または280nmでの吸収を測定し、吸光度係数2.3mg/mlアミノ酸分析から決定したを用いて値を計算することによって決定することができる。これらの手法を用いると、トランスフェクトしたヒト繊維芽細胞の条件を整えた培地から精製されたα-galAの比活性は2.2~2.9×106ユニット/蛋白質のmgであり、それはヒト組織から精製されるα-galAの比活性に匹敵するBishopらの、JBiolChem25613011981。F.マンノースまたはマンノース-6-ホスフェートが仲介するα-galAのインターナリゼーション安定したトランスフェクトがなされた細胞によって産生されるα-galAがα-galA欠損症の有効な治療薬となるためには、その酵素は影響を受けた細胞によってインターナリゼーションされなくてはならない。α-galAは生理学的なpHレベルでは活性でなく、また血液や小腸液では有効となりそうではない。リソソームの酸性環境でインターナリゼーションされる場合にのみ、蓄積した脂質基質は最適に代謝される。このインターナリゼーションは、細胞表面に現れていて、エンドサイトーシス経路によってリソソームにそのα-galAを供給するマンノース-6-ホスフェートM6P受容体にα-galAが結合することによって仲介される。M6P受容体はいたるところに現れており、ほとんどの体細胞はそれをある程度まで発現する。糖蛋白質上にある露出したマンノース残基に特異的なマンノース受容体はほとんど行き渡ってはいない。後者の受容体は一般に、マクロファージ及びマクロファージ様の細胞にのみ見られるもので、これらの細胞型にα-galAが入る別の手段を提供する。M6P-仲介型のα-galAのインターナリゼーションを証明するために、ファブリー病の患者から得られる皮膚の繊維芽細胞NIGMSHumanGeneticMutantCellRepositoryを、増加させた濃度の本発明の精製α-galAが存在するところで一晩培養した。そのサンプルのいくつかは5mMの可溶性M6Pを含んでおり、それはマンノース-6-ホスフェート受容体への結合を競合的に阻害し、結果的にその受容体によるインターナリゼーションを競合的に阻害した。他のサンプルは30μg/mlのマンナンを含んでおり、それはマンノース受容体への結合を阻害し、結果的にその受容体によるインターナリゼーションを阻害した。インキュベーションを行ってからその細胞を洗浄し、溶解緩衝液10mMのトリス、pH7.2、100mMのNaCl、5mMのEDTA、2mMのPefabloc商品名、BoehringerMannheimIndeanapolisIN及び1のNP-40に削り落とすことによって採集した。次にその溶解したサンプルを蛋白質濃度とα-galA活性についてアッセイした。結果はα-galA活性ユニット/細胞の蛋白質mgとして表した。ファブリー細胞は用量-依存性の態様でα-galAをインターナリゼーションしていた図7。このインターナリゼーションはマンノース-6-ホスフェートによって阻害されたが、マンナンでは阻害されなかった。したがって、ファブリー繊維芽細胞におけるα-galAのインターナリゼーションはマンノース-6-ホスフェート受容体によって仲介されるが、マンノース受容体によっては仲介されない。またα-galAは、内皮細胞、即ちファブリー病の治療で重要な標的となる細胞によってもインビトロでインターナリゼーションされる。ヒトの臍の緒の血管の内皮細胞HUVECを、7500ユニットのα-galAとともに一晩培養した。ウェルのいくつかはN6Pを含んでいた。インキュベート期間を終えてから細胞を採集し、上記に記載したようにα-galAをアッセイした。α-galAのみとともにインキュベートした細胞は、コントロールα-galAとともにインキュベートしなかったの細胞の酵素レベルのほとんど10倍もの酵素レベルであった。M6Pはα-galAの細胞内の蓄積を阻害するが、このことはHUVECによるα-galAのインターナリゼーションがM6P受容体によって仲介されることを示唆している。したがって本発明のヒトα-galAは、臨床的に関連する細胞によってインターナリゼーションされる。マンノース受容体を発現することがわかっている培養ヒト細胞株はほとんどない。しかしながらマンノース受容体を運搬するが、マンノース-6-ホスフェート受容体があるならばほんの少しだけ運搬するマウスのマクロファージ様細胞系J774.Eを、本発明の精製α-galAがマンノース受容体を経てインターナリゼーションされるかどうかを調べるために用いることができるDimentらのJLeukocyteBiol424854901987。J774.E細胞を10,000ユニット/α-galAのmlが存在するところで一晩培養した。選択したサンプルも2mMのM6Pを含んでいたが、他のものは100μg/マンナンのmlを含んでいた。その細胞を洗浄してから上記に記載したように収集し、それぞれのサンプルの全蛋白質とα-galAの活性を決定した。その結果が表6に示されている。M6Pはこれらの細胞によるα-galAの取り込みを阻害しないが、マンナンは蓄積されたα-galAのレベルを75まで減少させた。しがたって本発明のα-galAは、マンノース受容体、即ちこの特定の細胞表面受容体を発現する細胞型にあるマンノース受容体によってインターナリゼーションされるらしい。J774.E細胞によるα-galAのインターナリゼーションα-galA活性ユニット/全蛋白質のmgこれらの実験は、安定してトランスフェクトしたヒト細胞によって産生されたα-galAがマンノースまたはマンノース-6-ホスフェート受容体を介して細胞によってインターナリゼーションされるらしいことを証明している。G.α-galAを発現するヒト繊維芽細胞によるファブリー繊維芽細胞の修正遺伝子治療では、α-galAを産生する自家細胞の移植片が適当に修飾された形態でその酵素を産生することによって、標的細胞のα-galA欠損症を修正できなくてはならない。ファブリー細胞におけるトランスフェクトしたヒト繊維芽細胞によるα-galAの産生の効果を評価するために、ファブリー病の患者から採集した繊維芽細胞NIGMSHumanGeneticsMutantCellRepositoryを、トランスウェルズ登録商標、CostarCambridgeMAでα-galA-産生細胞株BRS-11とともに共培養した。その実験スキームが図8に図示されている。ファブリー細胞は12ウェルの組織培養皿にて培養し、そのうちのいくつかは、細胞が成長できる表面を持つインサートトランスウェルズTranswells、登録商標、0.4μmの孔径を含んでいた。このインサートの成長マトリックスは多孔性であり、巨大分子が上方から下方の環境へと通ることを可能にする。1セットのインサートは、最小レベルのα-galAを分泌するヒトの包皮HFの繊維芽細胞を含んでおり、これに対して別のセットは大量のα-galAを分泌する安定にトランスフェクトしたヒト繊維芽細胞株、BRS-11を含んでいた。α-galA-産生細胞とともに共培養したウェルでは、α-galAがファブリー細胞を浸している培地に入ることができ、ファブリー細胞によってインターナリゼーションされる可能性を秘めている。表7のデータは、ファブリー細胞が分泌されたα-galAをインターナリゼーションしたことを示している。α-galAの細胞内レベルを3日間モニターした。単独でインサートなしで培養するか、トランスフェクトされていない包皮の繊維芽細胞HFインサートの存在下で培養したこれらの細胞は、α-galA活性の細胞内レベルが非常に低かった。しかしながらα-galA-産生BRS-11インサート細胞とともに培養したファブリー細胞は、二日目の終わりまでには正常細胞の酵素レベルと同じくらいの酵素レベルを示した正常の繊維芽細胞は、α-galAが25~80ユニット/蛋白質のmgである。この修正が、M6P受容体を介して取り上げられるα-galAに起因していることは、マンノース-6-ホスフェートBRS-11インサートM6Pを用いてそれが阻害されることによって証明される。α-galAを発現するヒト繊維芽細胞によるファブリー繊維芽細胞の修正α-galA活性ユニット/全蛋白質のmgH.他の細胞型の利用他の細胞型をこの明細書に記載された方法で利用できる。この細胞はさまざまな組織から得ることができ、またそれには培養して維持できる全ての細胞型が含まれる。例えば、本発明によってトランスフェクトすることのできる一次細胞及び二次細胞には、ヒト繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、上皮細胞例えば、乳房または小腸の上皮細胞、内皮細胞、神経膠細胞、神経細胞、血液を形成する要素例えばリンパ球や骨髄細胞、筋肉細胞、及びこれらの体細胞型の前駆体が含まれる。繊維芽細胞は特に関心がもたれる。一次細胞は、患者の免疫システムによってそれらが拒絶されることのないように、トランスフェクトした一次または二次の細胞を投与すべき患者から得ると好ましい。しかしながら、免疫拒絶下記に記載したようなを阻止したり抑制したりするために適当な注意が払われるならば、患者以外のヒトドナーの細胞をうまく用いることができる。このことは、標準化され、確立され、安定してトランスフェクトされた細胞系の使用を、全ての患者において可能にするであろう。I.α-galA-発現細胞の投与上記に記載した細胞は、それらが例えば腎臓の被膜下、皮下の区画部分、中枢神経系、脊髄内空間、肝臓、腹膜腔内空間、または筋肉内などに存在するように、種々の標準化された投与経路を経てヒトに導入することができる。またこの細胞は、ヒトの血流で循環するように静脈内または動脈内に注入してもよい。一旦ヒトに移植すると、そのトランスフェクトされた細胞は治療用産物であるグリコシル化ヒトα-galAを産生しかつ分泌する。ヒトに導入できるように遺伝的に修飾された細胞の数はいろいろ変えることができるが、技術的熟練者によって決定することができる。酵素の分配容積、半減期及び生物利用可能性、並びにインビボでの遺伝的に修飾された細胞の産生性はもちろんのこと、それぞれの患者の年齢、体重、性別及び全身状態が、用量及び投与経路を決定する際のおもに考慮すべきことに入るであろう。通常は、1日あたり106個の細胞につき100~100,000ユニットの範囲の発現レベルを呈する100万個から10億個の細胞が用いられる。必要であればこの手法は、望ましい結果が得られるまで、例えばファブリー病が関与する症状から開放されるまで繰り返してもよいし、また修飾してもよい。上記に記載したように用いた細胞は、それらが患者の免疫系によって拒絶されないように一般には患者特異的であり、即ちトランスフェクトされた一次細胞または二次細胞が投与されるべきヒトから得られる細胞である。しかしながらこの計画が可能でなかったり望ましくなかったりする場合には、細胞を別のヒトから入手してこの明細書に記載したように遺伝的に修飾し、そしてα-galA欠損症にかかっている患者に移植すればよい。受容者以外のヒトから得た細胞を用いると、免疫抑制剤の投与、組織適合抗原の変更、または移植した細胞の拒絶反応を抑制するためのバリア装置の利用が必要となるかもしれない。バリア装置は、分泌された産物が受容者の循環器や組織に入ることを可能にするが、移植された細胞と受容者の免疫システムとの間の接触を阻止し、それにより受容者によるその細胞に対する免疫応答及び起こりうる拒絶反応を阻止する材料例えば、AmiconBeverlyMAから得られるXM-50のような膜からなる。遺伝子治療に関する更なるガイダンスについてはSeldenらWO9309222を参照のこと。またこの細胞は、ハイブリッドマトリックス移植物を用いることを記載した共同者自身の文献、USSN08548002に記載されているように、あるいは親水性のゲル材料に分泌細胞をマクロカプセル封入化することについて記載しているJainらの出願PCT出願WO9519430に記載されているように、マトリックスまたはゲル材料に埋め込まれていてもよいそのそれぞれは参照文献として本明細書に組み入れられる。J.α-galA蛋白質を簡便に投与するための製薬配合剤安定してトランスフェクトしたまたは別の方法で遺伝的に修飾したヒト細胞によって発現して分泌され、そして本明細書に記載したように精製されるα-galA蛋白質を、α-galA蛋白質産生が不十分または欠損している患者に投与することができる。この蛋白質は、薬学的に受容可能なキャリアに入れて、例えば実施例IIIに記載されたような配合剤に入れてpH6.5以下で投与することができる。配合剤で含まれていてもよい賦形剤の例は、クエン酸塩緩衝液、燐酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、もしくは重炭酸塩緩衝液のような緩衝液、アミノ酸、ウレア、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、血清アルブミンもしくはゼラチンのような蛋白質、EDTA、塩酸ナトリウム、リポソーム、ポリビニルピロリドン、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール例えば、PEG-4000、PEG-6000である。投与経路は例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、脳内、筋肉内、肺内、または粘膜経由であるとよい。投与のルート及び分配される蛋白質の量は、技術熟練者の評価能力に充分入るファクターによって決定することができる。さらに技術熟練者は、治療用蛋白質の投与経路及び用量を、治療用量レベルが得られるまで対象の患者において変化させるとよいことがわかっている。典型的には、α-galAは0.01~100mg/体重1kgの用量で投与されるであろう。この蛋白質を調節しながら繰り返し投薬することは、患者の生涯にわたって必要であろう。K.酵素欠損症によって起こる他の状態の治療α-galA以外のリソソーム貯蔵酵素の欠損症によって引き起こされる他の状態は、本明細書に記載した方法に匹敵する方法による治療に影響を受けるであろうと見込まれる。これらの場合では、欠乏した酵素の機能的な型をコードするDNAを、本明細書に開示された発現構築物でのα-galAをコードするDNAと置換すればよい。確認されている酵素欠損症候群、及び本明細書に記載されたような治療に影響される可能性のある酵素欠損症候群の例が表8に示されている。この表における情報はNeufeldAnnRevBiochem602572801991から得られるものであり、それは参照文献として本明細書に組み入れられる。V.他の態様本明細書に記載された本発明は、トランスフェクション、即ち遺伝子産物をコードするとともに、コード配列の発現をコントロールする調節要素を持っている構築物の導入後に特定の遺伝子産物を発現する細胞を用いる治療方法によって部分的に説明した。またこれらの方法は、他の工程、即ち遺伝子の標的化及び遺伝子の活性化によって遺伝的に修飾された細胞を用いて行ってもよい参照文献として本明細書に組み入れられるTrecoらのWO9531560参照、またSeldenらのWO9309222も参照。hGHシグナルペプチドは、異型の蛋白質の発現と分泌のレベルを大きくするためにα-galA以外の異型の蛋白質とともに用いてもよい。このような蛋白質の例にはα-1アンチトリプシン、アンチトロンビンIII、アポリポ蛋白質E、アポリポ蛋白質A-1、血液凝固因子V,VII,VIII,IX,X,及びXIII、骨成長因子-2、骨成長因子-7、カルシトニン、触媒性抗体、DNAse、エリスロポエチン、FSH-β、グロビン、グルカゴン、グルコセレブロシダーゼ、G-CSF、GM-CSF、成長ホルモン、免疫応答変更遺伝子、イムノグロブリン、インシュリン、インシュリノトロピン、インシュリン様成長因子、インターフェロン-β、インターフェロン-β神経成長因子、インターロイキン-1、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-4、インターロイキン-6、インターロイキン-11、インターロイキン-12、IL-2受容体、IL-1受容体のアンタゴニスト、低密度リポ蛋白質受容体、M-CSF、パラチロイドホルモン、プロテインキナーゼC、可溶性CD4、スーパーオキサイドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、TGF-β、腫瘍壊死因子、TSHβ、チロシンヒドロキシラーゼ、及びウロキナーゼが含まれる。他の態様は次の請求の範囲内に含まれる。"