"対照DNAポリメラーゼと比較して、増大した3’末端ミスマッチ識別活性を有するDNAポリメラーゼであって、配列番号1の664番目に対応するDNAポリメラーゼのアミノ酸がA又はG以外の任意のアミノ酸であり、そして当該対照DNAポリメラーゼは、配列番号1の664番目に対応する対照DNAポリメラーゼのアミノ酸がA又はGであることを除き、当該DNAポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、DNAポリメラーゼ。V-X1-X2-X3-X4-R-R-X5-X6-K-X7-X8-N-F:[ここで、X1は、D、T、N又はSであり;X2は、P、G、E、A又はSであり;X3は、L、A、E、Q又はNであり;X4は、M又はQであり;X5は、A、V、Q又はSであり;X6は、A又はG以外の任意のアミノ酸であり;X7は、T、M又はAであり;そしてX8は、V又はIである]をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる、請求項1に記載のDNAポリメラーゼ配列番号8。V-X1-X2-X3-M-R-R-X5-X6-K-X7-X8-N-F:[ここで、X1は、D、T又はNであり;X2は、P、G又はEであり;X3は、L、A又はEであり;X5は、A又はVであり;X6は、A又はG以外の任意のアミノ酸であり;X7は、T又はMであり;そしてX8は、V又はIである]をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる、請求項1に記載のDNAポリメラーゼ配列番号9。V-D-P-L-M-R-R-A-X6-K-T-V-N-F:[ここで、X6は、A又はG以外の任意のアミノ酸である]をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる、請求項1に記載のDNAポリメラーゼ配列番号10。X6が、T又はVである、請求項4に記載のDNAポリメラーゼ配列番号11。配列番号1の580番目に対応するアミノ酸がD又はE以外の任意のアミノ酸である、請求項1~5のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ。配列番号1の580番目に対応するアミノ酸が、L、G、T、Q、A、S、N、R及びKからなる群から選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ。配列番号1、2、3、4、5、6、7、36、37、38、39、40又は41と少なくとも80、好ましくは少なくとも90、より好ましくは少なくとも95配列が同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項1~7のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ。配列番号1と少なくとも80、好ましくは少なくとも90、より好ましくは少なくとも95の配列同一性を有する、請求項4又は5に記載のDNAポリメラーゼ。前記DNAポリメラーゼがZ05DNAポリメラーゼであり、580番目のアミノ酸が、L、G、T、Q、A、S、N、R及びKからなる群から選択される、請求項9に記載のDNAポリメラーゼ。請求項1~10のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼをコードする、組換え核酸。プライマー伸長を行うための方法であって:請求項1~10のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼと、プライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸とを、当該プライマーの伸長に適切な条件下で接触させ、伸長プライマーを生成することを含んでなる、方法。伸長プライマーを生成するキットであって:請求項1~10のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼを提供する少なくとも1つの容器を含んでなる、キット。aプライマー伸長条件下で、所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なプライマーを提供する容器;bヌクレオシド三リン酸を提供する容器;及びcプライマー伸長に適切な緩衝液を提供する容器からなる群から選択される1つ以上の追加の容器をさらに含んでなる、請求項13に記載のキット。請求項1~10のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ、少なくとも一つのプライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸を含んでなる反応混合物。本発明は、ポリメラーゼドメイン内の1つ以上のアミノ酸が、1つ以上のポリメラーゼ活性又は特性を改良するものとして同定された改良DNAポリメラーゼを提供する。本発明のDNAポリメラーゼは、本明細書で述べるアミノ酸の差異を除いては同一なポリメラーゼの非改変型に対して、3’末端ミスマッチ識別活性が増大した活性酵素であるすなわち、本明細書に記載する本発明のポリメラーゼは、プライマーの3’末端で、又は3’末端近傍で鋳型と一致しないプライマーを伸長させる可能性が低い。前記DNAポリメラーゼは、例えば、DNA組換え研究や疾病の医療診断における用途を含む、ポリヌクレオチド伸長又は鋳型ポリヌクレオチドの増幅が関わる様々な用途において有用である。本発明のポリメラーゼ態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる:Val-X1-X2-X3-X4-Arg-Arg-X5-X6-Lys-X7-X8-Asn-Phe本明細書において、1文字コードで、V-X1-X2-X3-X4-R-R-X5-X6-K-X7-X8-N-Fとも呼ぶ;ここで、X1は、AspD、ThrT、AsnN又はSerSであり;X2は、ProP、GlyG、GluE、AlaA又はSerSであり;X3は、LeuL、AlaA、GluE、GlnQ又はAsnNであり;X4は、MetM又はGlnQであり;X5は、AlaA、ValV、GlnQ又はSerSであり;X6は、AlaA又はGlyG以外の任意のアミノ酸であり;X7は、ThrT、MetM又はAlaAであり;そしてX8は、ValV又はIleIである配列番号8。態様によっては、X6は、V、I、L、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R又はHから選択される配列番号42。態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができるサーマス及びサーモトガに由来するDNAポリメラーゼに対応する:Val-X1-X2-X3-Met-Arg-Arg-X5-X6-Lys-X7-X8-Asn-Phe本明細書において、1文字コードで、V-X1-X2-X3-M-R-R-X5-X6-K-X7-X8-N-Fとも呼ぶ;ここで、X1は、AspD、ThrT又はAsnNであり;X2は、ProP、GlyG又はGluEであり;X3は、LeuL、AlaA又はGluEであり;X5は、AlaA又はValVであり;X6は、AlaA又はGlyG以外の任意のアミノ酸であり;X7は、ThrT又はMetMであり;そしてX8は、ValV又はIleIである配列番号9。態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる:Val-Asp-Pro-Leu-Met-Arg-Arg-Ala-X6-Lys-Thr-Val-Asn-Phe本明細書において、1文字コードで、V-D-P-L-M-R-R-A-X6-K-T-V-N-Fとも呼ぶ;ここで、X6は、AlaA又はGlyG以外の任意のアミノ酸である配列番号10。態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる:Val-Asp-Pro-Leu-Met-Arg-Arg-Ala-X6-Lys-Thr-Val-Asn-Phe本明細書において、1文字コードで、V-D-P-L-M-R-R-A-X6-K-T-V-N-Fとも呼ぶ;ここで、X6は、T又はVである配列番号11。このモチーフは、多くのファミリーA型DNA依存性DNAポリメラーゼ、特に好熱性細菌由来の熱安定性DNAポリメラーゼのフィンガードメインの中に存在する。LietalEMBOJ17751475251998。例えば、図1は、以下のいくつかの細菌種由来のDNAポリメラーゼ中の、上記モチーフに対応する天然の配列を含んでなるアミノ酸配列アラインメントを示す:大腸菌、バチルスカルドテナクス、バシラスステアロサーモフィラス、デイノコッカスラディオデュランス、サーモシフォアフリカヌス、サーモトガマリティマ、サーモトガネアポリタナ、サーマスアクアティカス、サーマスカルドフィラス、サーマスフィリホルミス、サーマスフラバス、サーマス種Sps17、サーマス種Z05及びサーマスサーモフィルス。図示されるように、X6がA又はGであることを除いて配列番号8のモチーフがこれらのポリメラーゼの各々に存在しており、ポリメラーゼのこの領域が保存された機能を有することが示唆される。図2は、これらのDNAポリメラーゼの間の配列同一性を示す。したがって、態様によっては、本発明は、配列番号8、9、10又は11例えば、X6は、V、I、L、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R又はHから選択されるを含んでなり、本明細書に記載するように活性及び/又は特性が改良されているポリメラーゼを提供し、ここで、DNAポリメラーゼは、それ以外は、例えば、上記の好熱性細菌の任意の種由来のポリメラーゼのような野生型もしくは天然型のDNAポリメラーゼであるか、又はそのような野生型もしくは天然型のDNAポリメラーゼと実質的に同一である。例えば、態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号8、9、10又は11を含んでなり、配列番号1、2、3、4、5、6、7、36、37、38、39、40又は41と少なくとも80、85、90又は95同一である。一つの変形においては、ポリメラーゼの非改変型は、サーマス属の種由来である。本発明の態様によっては、非改変ポリメラーゼはサーマス以外の好熱性種、例えば、サーモトガ由来である。非常に多くの熱安定性DNAポリメラーゼの全核酸及びアミノ酸配列が入手可能である。サーマスアクアティカスTaq配列番号2、サーマスサーモフィルスTth配列番号6、サーマス種Z05配列番号1、サーマス種Sps17配列番号5、サーモトガマリティマTma配列番号38及びサーモシフォアフリカヌスTaf配列番号37のポリメラーゼの各配列が、国際公開第92/06200号で公開されている。サーマスフラバス配列番号4由来のDNAポリメラーゼの配列は、AkhmetzjanovandVakhitovで公開されている。サーマスカルドフィラス由来の熱安定性DNAポリメラーゼの配列配列番号7は、EMBLGenBankAccessionNoU62584で入手できる。サーマスフィリホルミス由来の熱安定性DNAポリメラーゼの配列は、表1で提供される配列情報とともに、例えば米国特許第4889818号で提供された方法を用いて、ATCC受託番号42380から得ることができる。サーモトガネアポリタナDNAポリメラーゼの配列配列番号39は、GeneSeqPatentDataBaseAccessionNoR98144及び国際公開第97/09451号のものである。バチルスカルドテナクス由来の熱安定性DNAポリメラーゼの配列配列番号41は、例えば、Uemorietal1134014101993SwissProtdatabaseAccessionNoQ04957andGenBankAccessionNosD12982andBAA02361も参照に記載されている。本明細書に記載されるように改変できるDNAポリメラーゼの非改変型の例はまた、例えば、米国特許第6,228,628号;第6346379号;第7030220号;第6881559号;第6794177号;第6468775号;及び米国特許出願公開第20040005599号;第20020012970;第20060078928号;第20040115639号にも記載されている。代表的な全長ポリメラーゼ配列はまた、本配列表でも提供されている。態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号8、9、10又は11を含んでなるポリメラーゼドメインを有するのと同時に、ヌクレアーゼドメイン例えば、Z05の1~291番目に対応するをも含んでなる。態様によっては、本発明のポリメラーゼはキメラポリメラーゼであり、すなわち、2つ以上の酵素由来のポリペプチド領域を含んでなる。そのようなキメラDNAポリメラーゼの例は、例えば、米国特許第6228628号に記載されている。特に適切なものは、キメラCSファミリーDNAポリメラーゼであり、それにはCS5配列番号29、CS6配列番号30ポリメラーゼ、及び配列番号29又は配列番号30と実質的な配列同一性又は類似性典型的には少なくとも80の配列同一性、より典型的には少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99の配列同一性を有するその変異体が含まれ、したがって、それらは配列番号8を含むように改変することができる。CS5及びCS6DNAポリメラーゼは、サーマス種Z05及びサーモトガマリティマTmaDNAポリメラーゼに由来するキメラ酵素である。それらは、サーマス酵素のN末端5’ヌクレアーゼドメインとTma酵素のC末端3’-5’エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼドメインを含んでなる。これらの酵素は効率的な逆転写酵素活性を有し、ヌクレオチド類似体含有プライマーを伸長することができ、アルファ-ホスホロチオエートdNTP、dUTP、dITPならびにフルオレセイン及びシアニン色素ファミリーで標識されたdNTPを利用することができる。CS5及びCS6ポリメラーゼは効率的なMg2活性化PCR酵素でもある。CS5及びCS6キメラポリメラーゼは、さらに例えば、米国特許出願公開第2004/0005599号に記載されている。態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号8、9、10又は11を含んでなり、さらに、天然のポリメラーゼと比較して1つ以上の追加のアミノ酸の変化例えば、アミノ酸置換、付加又は欠失によるを含んでなる。態様によっては、そのようなポリメラーゼは配列番号8のアミノ酸モチーフ又は配列番号9、10又は11のモチーフを保持し、さらに、以下のように配列番号27のアミノ酸モチーフZ05配列番号1のD580X変異に対応するを含んでなる:T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N;ここで、X7は、SerS又はThrTであり;X8は、D又はE以外の任意のアミノ酸である配列番号27。配列番号27により特徴づけられる変異は、例えば、米国特許出願公開第2009/0148891号でより詳細に述べられている。態様によっては、そのような機能的変異ポリメラーゼは、典型的には野生型又は天然型のポリメラーゼ例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、39、40、41、42、43又は44と実質的な配列同一性又は類似性、典型的には少なくとも80の配列同一性、より典型的には少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99の配列同一性を有するだろう。態様によっては、X6の位置のアミノ酸は配列番号8、9、10又は11に示されるアミノ酸で置換され、X8の位置のアミノ酸は配列番号27に示されるアミノ酸で置換される。このように、態様によっては、X6の位置のアミノ酸は、AlaA又はGlyG以外の任意のアミノ酸であり、X8の位置のアミノ酸は、AspD又はGluE以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、アミノ酸置換には配列番号27のX8の位置のロイシンL、グリシンG、スレオニンT、グルタミンQ、アラニンA、セリンS、アスパラギンN、アルギニンR、及びリジンKが含まれる。特定の態様においては、アミノ酸置換には、互いに独立してX6の位置のスレオニンT又はバリンV、及びX8の位置のグリシンGが含まれる。1つ以上の同定された部位での、他の適切なアミノ酸置換は、例えば、公知の部位特異的変異誘発法及びさらに本明細書に記載される、又は当業者に公知の他の分析法によるポリヌクレオチド伸長能の決定を用いて調べることができる。DNAポリメラーゼの正確な長さは変わるので、X6及びX8のそれぞれに対応する正確なアミノ酸位置は、使用する特定のポリメラーゼにより変化しうる。アミノ酸及び核酸配列アラインメントプログラムは容易に入手でき例えば、上述のもの参照、本明細書で同定された特定の得られたモチーフが、本発明に従った改変のための正確なアミノ酸及び対応するコドンを同定するのに役立つ。代表的なキメラ熱安定性DNAポリメラーゼ及び例示的な好熱性種由来の熱安定性DNAポリメラーゼにおける、X6及びX8のそれぞれに対応する位置を表1に示す。表1.例示的なポリメラーゼにおけるモチーフの位置X6例えば、配列番号8、9、10及び11のもの及びX8配列番号27のものに相当するアミノ酸の位置態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼはサーマス種Z05DNAポリメラーゼ配列番号1由来又はその変異体例えば、D580G変異等である。上述したように、サーマス種Z05DNAポリメラーゼにおいては、X6の位置は664番目のアラニンAに対応し;X8の位置は580番目のアスパラギン酸Dに対応する。このように本発明の特定の変形において、変異ポリメラーゼは、サーマス種Z05DNAポリメラーゼに対し、A664及びD580において、少なくとも1つのアミノ酸置換を含んでなる。従って、典型的には、664番目のアミノ酸は、Aではないあるいは任意で、Gではない。態様によっては、664番目のアミノ酸は、G、V、L、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R、H又はIから選択される。態様によっては、664番目のアミノがGでない場合、664番目のアミノ酸残基は、V、L、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R、H又はIから選択される。特定の態様においては、664番目のアミノ酸残基は、T又はVである。特定の態様においては、D580の位置のアミノ酸残基は、ロイシンL、グリシンG、スレオニンT、グルタミンQ、アラニンA、セリンS、アスパラギンN、アルギニンR及びリジンKから選択されうる。代表的なサーマス種Z05DNAポリメラーゼ変異体の例としては、アミノ酸置換A664T、A664V及びD580Gを含んでなるものが挙げられる。態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、配列番号1の664番目に対応する位置に、中性pH例えば、約pH7.4において、非極性で非荷電性の側鎖を持たないアミノ酸例えばA又はGを含む。態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼはサーマス種由来であり、配列番号1の664番目に対応する位置のアミノ酸は、中性pHにおいて、極性で非荷電性の側鎖を持つアミノ酸例えばN、Q、H、S、T又はYである。態様によっては、極性で非荷電性の側鎖を持つ配列番号1の664番目に対応する位置のアミノ酸は、Tである。態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼはサーマス種由来であり、配列番号1の664番目に対応する位置のアミノ酸は、中性pHにおいて、非極性で非荷電性の側鎖を持つアミノ酸例えば、C、I、L、M、F、P、W又はVである。態様によっては、非極性で非荷電性の側鎖を持つ配列番号1の664番目に対応するアミノ酸は、Vである。態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼはまた、置換によらない他の改変を含むことができる。そのような改変は、例えば当業界では公知の共有結合修飾を含むことができ、ポリヌクレオチド伸長を含んでなる用途に追加の利点を与える。例えば、特定の態様においては、変異DNAポリメラーゼはさらに、熱可逆的な共有結合修飾を含む。そのような熱可逆的修飾を含んでなるDNAポリメラーゼは、例えば、様々なホットスタートPCR技術のような、ホットスタートでの使用に特に適切である。本発明の変異DNAポリメラーゼに使用できる熱可逆的な修飾用試薬は、例えば、米国特許第5773258号Birchetalに記載されている。例えば、熱可逆的な共有結合修飾を含んでなる特に適切なポリメラーゼは、アルカリpHで、約25°C未満の温度で行われる、熱安定性酵素と以下の式I:ここで、R1とR2は、水素又は結合していてもよい有機基であるに示される一般式を有する、又は以下の式II:ここで、R1とR2は、結合していてもよい有機基であり、水素はシス配置であるを有する、本質的に上述のBirchetalに記載されるようなジカルボン酸無水物との混合物の反応により生成される。本発明のDNAポリメラーゼは、対応する非改変ポリメラーゼ例えば、野生型ポリメラーゼ又は本発明のポリメラーゼの由来となっている対応する変異体をコードするDNA配列を、部位特異的変異誘発と一般に呼ばれる技術を用いて変異させることにより生成することができる。ポリメラーゼの非改変型をコードする核酸分子を、当業者に周知の様々なポリメラーゼ連鎖反応PCR技術により変異させることができる例えば、PCRStrategiesatChapter14PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplicationsを含んでもよいGelfandetal米国特許第4,666,848号参照。転写及び翻訳調節核酸領域は、ポリメラーゼを発現させるために用いる宿主細胞に一般的に適したものである。様々な宿主細胞のための、非常に多くの種類の適切な発現ベクター及び適切な調節配列が当業界において公知である。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ならびにエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられる。典型的な態様では、調節配列はプロモーターと転写開始及び終結配列とを含む。ベクターは通常、外来DNAの挿入のための複数の制限部位を含むポリリンカー領域を含む。特定の態様においては、精製及び、所望であれば、続けて行うFLAGタグ配列の除去を容易にするために融合フラッグ、例えばHisタグが用いられる。しかしながら、一般的に、加熱工程を使用できる中温性宿主例えば、大腸菌から熱活性及び/又は熱安定性タンパク質を精製する際には、それらは不要である。複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子及び対象となる変異ポリメラーゼをコードするDNAを含む適切なベクターの生成は、標準的な組換えDNA法を用いて行われる。当業界で周知のように例えば、Sambrooketal、MolecularCloningALaboratoryManual参照、単離されたプラスミド、ウイルスベクター及びDNA断片を切断し、加工し、特定の順序で一緒に連結して所望のベクターを生成する。特定の態様においては、発現ベクターは形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当業界で周知であり、使用する宿主細胞により異なる。適切な選択遺伝子としては、例えば、アンピシリン及び/又はテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を挙げることができ、こうした耐性遺伝子により、それらのベクターで形質転換された細胞がそれらの抗生物質の存在下で増殖できるようになる。本発明の一つの面においては、本発明のDNAポリメラーゼをコードする核酸は、単独で又はベクターと共に細胞内に導入される。本明細書で使用する場合、に導入される又はその文法的同等語は、核酸がその後の核酸の組み込み、増幅及び/又は発現に適切な方法で細胞内に入ることを意味する。導入の方法は、標的となる細胞の種類により大きく異なる。導入方法の例としては、CaPO4沈澱、リポソーム融合、LIPOFECTIN登録商標、エレクトロポレーション、ウイルス感染等が挙げられる。態様によっては、本発明の最初のクローニング工程の宿主として、原核生物が用いられる。それらは、大量のDNAの迅速な生成、部位特異的変異誘発に用いる一本鎖鋳型DNAの生成、多数の変異体の同時スクリーニング、及び生成された変異体のDNA配列決定のために特に有用である。適切な原核生物宿主細胞としては、大腸菌K12株94ATCCNo.31,446、大腸菌W3110株ATCCNo.27,325、大腸菌K12株DG116ATCCNo.53,606、大腸菌X1776ATCCNo.31,537及び大腸菌Bが挙げられる;しかし、他の多くのHB101、JM101、NM522、NM538、NM539のような大腸菌株、及び、枯草菌Bacillussubtilisのようなバチルス属、ネズミチフス菌Salmonellatyphimurium又はセラチアマルセサンスSerratiamarcesansのような他の腸内細菌、様々なシュードモナスPseudomonas種を含む他の多くの原核生物の種及び属は、どれも宿主として使用することができる。原核宿主細胞又は堅い細胞壁を有する他の宿主細胞は、通常上述のsection182ofSambrooketalに記載されている塩化カルシウム法を用いて形質転換される。あるいは、それらの細胞の形質転換にエレクトロポレーションを使用することができる。原核生物の形質転換技術は、例えばDowerinGeneticEngineeringPrinciplesandMethods12275296HanahanetalMethEnzymol204631991に記載されている。大腸菌の形質転換に通常用いられるプラスミドとしては、pBR322、pUCI8、pUCI9、pUCI18、pUC119及びBluescriptM13が挙げられ、それらは全て上述のsections112120ofSambrooketalに記載されている。しかし、他の多くの適切なベクターも同様に利用可能である。態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼをコードする核酸を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、DNAポリメラーゼの発現を誘導するか又は引き起こすのに適切な条件下で培養することにより生成する。形質転換された宿主細胞をタンパク質発現に適切な条件下で培養する方法は、当業界で周知である例えば前述のSambrooketal参照。ラムダpLプロモーター含有プラスミドベクターからのポリメラーゼの生成に適切な宿主細胞としては、大腸菌株DG116ATCCNo.53606米国特許第5,079,352号及びLawyerFCetalPCRMethodandApplications2275871993参照が挙げられる。発現後、ポリメラーゼを回収、単離することができる。熱安定性DNAポリメラーゼの精製方法は、例えば前述のLawyeretalに記載されている。一旦精製されれば、DNAポリメラーゼの3’末端ミスマッチ識別能を調べることができる。例えば、態様によっては、3’末端ミスマッチ識別活性は、プライマーと完全に一致する標的配列の増幅を、プライマーの3’末端に一つの塩基のミスマッチを有する標的の増幅と比較することにより求められる。増幅は例えば、TaqMan登録商標プローブを用いてリアルタイムで検出できる。2つの標的配列を識別するポリメラーゼの能力は、2つの反応のCpを比較することにより推測できる。場合により、各ウェルで第二の標的遺伝子の増幅を同時に行い、対照として第二の光チャンネルで検出することができる。ΔCp値は、ミスマッチのある鋳型に関するCp値から一致する標的のCp値を引いた差異を指す例えば、実施例。態様によっては、配列番号8のX6の位置に天然のアミノ酸例えば、A又はGを有する以外は同一の対照ポリメラーゼと比較して、本発明の改良ポリメラーゼは、少なくとも1、2、3、4、5又はそれ以上のΔCp値を有する。態様によっては、この決定は実施例に記載する詳細な材料及び条件で行われる。本発明の方法本発明の改良DNAポリメラーゼは、この種の酵素活性が必要又は所望である任意の目的に使用してよい。改良DNAポリメラーゼは、本明細書に記載されるように熱活性又は熱安定性DNAポリメラーゼでありうる。したがって、本発明の一つの面においては、本発明のポリメラーゼを用いたPCRを含むポリヌクレオチド伸長方法が提供される。態様によっては、本発明は、鋳型核酸の増幅が不要な場合、例えば、標的核酸の存在を直ちに検出することが望まれる場合に、鋳型RNA又はDNAを伸長するのに有用な熱活性DNAポリメラーゼを提供する。態様によっては、本発明は、標的核酸を伸長及び/又は増幅するのが望まれる場合に有用な熱安定性DNAポリメラーゼを提供する。ポリヌクレオチド伸長に適切な条件は、当業界で公知である例えば、上述のSambrooketal参照。AusubeletalShortProtocolsinMolecularBiology4thedJohnWileySons1999も参照。一般に、プライマーを標的核酸にアニーリングし、すなわちハイブリダイズさせて、プライマー-鋳型複合体を形成させる。プライマー-鋳型複合体を適切な環境下で変異DNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸と接触させ、プライマーの3’末端に1つ以上のヌクレオチドを付加し、それにより標的核酸に相補的な伸長プライマーを生成する。プライマーとしては、例えば、1つ以上のヌクレオチド類似体を挙げることができる。さらに、ヌクレオシド三リン酸は、従来のヌクレオチド、特殊なヌクレオチド例えば、リボヌクレオチド又は標識されたヌクレオチド又はその混合物でありうる。変形によっては、ポリヌクレオチド伸長反応は、標的核酸の増幅を含んでなる。DNAポリメラーゼ及びプライマー対を用いた核酸増幅に適切な条件もまた、当業界で公知である例えば、PCR増幅法。例えば、上述のSambrooketal;上述のAusubeletal;PCRApplications:ProtocolsforFunctionalGenomicsInnisetaledsAcademicPress1999参照。態様によっては、増大した3’末端ミスマッチ識別能を有する本ポリメラーゼの使用により、例えば、稀な対立遺伝子の検出が可能になる。例えば、特定のポリメラーゼの3’末端ミスマッチ識別能のフィデリティーは、その感度異なっているが標的配列と関連のある、標的配列ではない配列が大量に存在するなかで、少量の標的配列を正確に検出する能力を規定する。このように、3’末端ミスマッチ識別能を増大させることにより、稀な対立遺伝子の検出感度が上がる。稀な対立遺伝子の検出は、例えば、生検又は他の稀な遺伝子変化の試料、例えば、多くの正常細胞の中にあるがん対立遺伝子を持つ細胞のスクリーニングの際に有用である。態様によっては、改良ポリメラーゼは、対立遺伝子特異的PCR又は一塩基多型SNP検出に関わるポリヌクレオチド伸長で使用される。SNP検出法の例はChenetalSinglenucleotidepolymorphismgenotypingbiochemistryprotocolcostandthroughputPharmacogenomicsJ37796KwoketalDetectionofsinglenucleotidepolymorphismsCurrIssuesMolBiol54360ShiTechnologiesforindividualgenotypingdetectionofgeneticpolymorphismsindrugtargetsanddiseasegenesAmJPharmacogenomics2197205andKwokMethodsforgenotypingsinglenucleotidepolymorphismsAnnuRevGenomicsHumGenet223558に記載されている。ハイスループットSNP検出high-throughputSNPdetection技術の例は、MarnellosHighthroughputSNPanalysisforgeneticassociationstudiesCurrOpinDrugDiscovDevel631721に記載されている。一般的なSNP検出法としては、これらに限定するものではないが、TaqMan分析、分子標識分析、核酸アレイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的PCR、アレイプライマー伸長、ホモジニアスプライマー伸長分析homogeneousprimerextensionassays、質量分析による検出を伴うプライマー伸長、パイロシークエンシング、遺伝子アレイに基づき分類された多重プライマー伸長、ライゲーションローリングサークルligationwithrollingcircle増幅、ホモジニアスライゲーション、OLA米国特許第4988167号、遺伝子アレイに基づき分類された多重ライゲーション反応、制限断片長多型、一塩基伸長-タグアッセイ及びインベーダーアッセイInvaderassayが挙げられる。そのような方法は、例えば、発光又は化学発光検出、蛍光検出、時間分解蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光偏光、質量分析及び電気的検出のような検出機構と組み合わせて用いてもよい。異なる複対立遺伝子の検出は多重反応を用いて行うこともでき、多重反応を使えば、異なる複対立遺伝子を1回の反応で検出することができる。多重反応では、SNP又は多塩基多型又は対立遺伝子を伸長、増幅するのに、2つ以上の対立遺伝子-特異的プライマーを用いる。一塩基多型又は多塩基多型の多重検出方法の例は、米国特許出願公開第2006/0172324号に記載されている。本明細書に記載する改良ポリメラーゼを用いた、伸長産物又は増幅産物の他の検出方法としては、蛍光二本鎖ヌクレオチド結合色素又は蛍光二本鎖ヌクレオチドインターカレーション色素の使用が挙げられる。蛍光二本鎖DNA結合色素の例としては、SYBRgreenMolecularProbesが挙げられる。蛍光二本鎖インターカレーション色素の例としては、臭化エチジウムが挙げられる。二本鎖DNA結合色素は、プライマー伸長産物及び/又は増幅産物を測定する融解曲線分析と併せて使用できる。融解曲線分析は、ABI5700700096ウェル型又はABI7900384ウェル型装置のようなリアルタイムPCR装置と搭載ソフトウェアSDS2.1を用いて行うことができる。もしくは、融解曲線分析はエンドポイント分析として行うこともできる。融解曲線分析の方法の例が米国特許出願公開第2006/0172324号に記載されている。更に他の態様においては、DNAシークエンシング、DNAラベリング又はプライマー伸長産物のラベリングにおいて、本発明のポリメラーゼはプライマー伸長に用いられる。例えば、サンガーのジデオキシヌクレオチド法によるDNAシークエンシングSangeretalProcNatlAcadSciUSA7454631977は、特殊な鎖停止ヌクレオチドを取り込むことができるポリメラーゼのために、本発明により改良される。基本的なサンガーらの方法が進展し、新規のベクターYanischPerronetalGene331031191985及び塩基類似体MillsetalProcNatlAcadSciUSA76223222351979andBarretalBiotechniques44284321986が提供された。一般に、DNAシークエンシングには、鎖停止塩基類似体の存在下で鋳型依存的プライマー伸長が必要であり、それにより続いて大きさによって分離される部分断片の分布ができる。基本的なジデオキシシークエンシング法はi場合により標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型にアニーリングさせ;iiDNAポリメラーゼを用いて、標識されていないdNTPと、場合により標識された1種のddNTPのような少量の鎖停止剤の混合物を各々含む、4回の別々の反応でプライマーを伸長し;iii4セットの反応産物を高解像変性ポリアクリルアミド/尿素ゲルで分析する工程を含む。使用した標識によって、反応産物はオートラジオグラフィー又は蛍光検出によりゲル中で検出することができ、そのイメージを調べてヌクレオチド配列を推測することができる。それらの方法では、大腸菌PolIのクレノウ断片のようなDNAポリメラーゼ又は改変T7DNAポリメラーゼを使用する。TaqDNAポリメラーゼのような熱安定性ポリメラーゼが利用できるようになり、熱安定性DNAポリメラーゼを使ったシークエンシングの改良法InnisetalProcNatlAcadSciUSA8594361988参照及びサイクルシークエンシングMurrayNucAcidsRes1788891989と呼ばれるその改変がもたらされた。したがって、本発明の熱安定性ポリメラーゼは、そのような方法と併せて使用することができる。基本的なジデオキシシークエンシングに代わるものとして、サイクルシークエンシングは、鎖停止剤の存在下での鋳型配列に相補的な標的配列の直鎖状で非対称の増幅である。1回のサイクルで可能な全ての長さの伸長産物のファミリーが生成される。鋳型DNAからの伸長反応産物の変性に続き、プライマーアニーリングとプライマー伸長の複数サイクルがddNTPのような停止剤の存在下で起こる。サイクルシークエンシングは、従来の鎖停止シークエンシングよりも少ない鋳型DNAしか必要としない。熱安定性DNAポリメラーゼは、サイクルシークエンシングにおいていくつかの利点を有する;それらは、核酸標的へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションに必要なストリンジェントなアニーリング温度に耐え、同時に各サイクルで起こる、例えば90~95°Cの高温変性の多数のサイクルに耐える。この理由で、AMPLITAQ登録商標DNAポリメラーゼとその誘導体及び派生物、例えばAmpliTaqCSDNAポリメラーゼ及びAmpliTaqFSDNAポリメラーゼが、PerkinElmer及びAppliedBiosystemsのような会社により市販されているTaqサイクルシークエンシングキットに入っている。改良ポリメラーゼは、454シークエンシングRocheにおいて用いることができるMarguliesMetal2005Nature437376380。454シークエンシングには2つの工程が含まれる。第一の工程において、DNAは約300~800塩基対の断片へと切断され、その断片は平滑末端を有する。次にオリゴヌクレオチドアダプターが断片の末端にライゲーションする。アダプターは、断片の増幅及びシークエンシングのためのプライマーとして機能する。例えば、5’ビオチンタグを含むアダプターBを用いて、断片をDNA捕捉ビーズ、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに付着させることができる。ビーズに付着した断片を、油-水エマルジョンの液滴内でPCR増幅する。その結果、各ビーズ上にクローン増幅されたDNA断片の複数のコピーが得られる。第二の工程では、このビーズをウェル中に捕捉する。各DNA断片上で同時にパイロシークエンシングを行う。1つ以上のヌクレオチドが付加すると光シグナルが生成され、そのシグナルはシークエンシング装置に搭載されたCCDカメラにより記録される。シグナル強度は、取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。パイロシークエンシングは、ヌクレオチドの付加時に放出されるピロリン酸PPiを利用している。PPiはアデノシン-5’-ホスホ硫酸の存在下、ATPスルフリラーゼによりATPに変換される。ルシフェラーゼはルシフェリンをオキシルシフェリンに変換するためにATPを使い、この反応が検出、分析される光を生成する。鎖停止シークエンシング方法の変形としては、色素プライマーシークエンシング及び色素停止剤シークエンシングが挙げられる。色素プライマーシークエンシングでは、ddNTP停止剤は標識されておらず、標識されたプライマーを使って伸長産物を検出するSmithetalNature326746791986。色素停止剤DNAシークエンシングでは、dNTPと蛍光標識ddNTPをDNAプライマーの末端に取り込むのにDNAポリメラーゼを用いるLeeetalNucAcidsRes2024711992。この方法には、色素標識プライマーを合成しなくてよいという利点がある。さらに、色素停止剤反応は、4つの反応全てを同一チューブ内で実施できるという点でより便利である。色素プライマー法と色素停止剤法は両方とも、AppliedBiosystems製の自動シークエンシング装置を用いて自動化してもよい米国特許第5,171,534号。この装置を使用する場合、反応を終えたシークエンシング反応混合物は、装置に搭載した変性ポリアクリルアミドゲル又はキャピラリー上で分画される。ゲル上でサイズにしたがって電気泳動されると、装置の底にあるレーザーが蛍光産物を検出する。色素停止剤シークエンシングで用いる停止剤を標識するために、通常2種類の蛍光色素が用いられる。負に帯電した蛍光色素と両性イオン性蛍光色素である。負に帯電した蛍光色素としては、フルオレセイン及びBODIPYファミリーのものがあげられる。BODIPY色素44-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセンは、国際公開第97/00967号に記載されている。両性イオン性蛍光色素としては、ローダミンファミリーのものが挙げられる。市販のサイクルシークエンシングキットは、ローダミン誘導体で標識された停止剤を使用している。しかし、ローダミン標識された停止剤はかなり高価である。また、それらはシークエンシング産物と共に移動するため、ゲルにロードする前に取り込まれなかった色素-ddNTPから産物を分離しなければならない。ローダミン色素ファミリー停止剤は、GCリッチ領域においてヘアピン構造を安定化させるようであり、これにより産物が変則的に移動する。これには、二次構造を緩めるが停止剤の取り込み効率にも影響を及ぼすdITPの使用を必要とする可能性がある。これに対し、フルオレセイン標識停止剤は、より大きな正味負電荷を有し、シークエンシング産物よりも速く移動するので、ゲルロード前の分離工程が不要となる。その上、フルオレセイン標識シークエンシング産物は、ローダミンで標識されたシークエンシング産物よりも良好に電気泳動で移動する。野生型TaqDNAポリメラーゼはフルオレセインファミリー色素で標識された停止剤を効率的に取り込まないが、これは、米国特許出願公開第2002/0142333号に記載されているように、今や改変酵素の使用により効率的に達成することができる。したがって、米国特許出願第20020142333号に記載のような改変は、プライマー伸長率が改良されたフルオレセインファミリー色素を取り込む熱安定性ポリメラーゼを生成するために、本発明に関して使用することができる。例えば、特定の態様において、本発明による非改変DNAポリメラーゼは、米国特許出願公開第20020142333号に記載され、配列番号8に記載のモチーフ又は配列番号9、10又は11のモチーフ、及び場合により配列番号27のモチーフを有する改変熱安定性ポリメラーゼである。本発明の変異DNAポリメラーゼが使用できる、他の核酸シークエンシング法の例としては、リボヌクレオチドの2’-PO4類似体を含むターミネーター化合物に関するものが挙げられる例えば、米国特許出願公開第2005/0037991号及び第2005/0037398号、及び米国特許出願番号12/174488。キット本発明の別の面では、本明細書に記載するプライマー伸長方法に用いられるキットが提供される。態様によっては、キットは、使用の簡易性のために区分され、本発明にしたがって増大した3’末端ミスマッチ識別能を有する本発明のDNAポリメラーゼを提供する少なくとも1つの容器を含む。追加の試薬を提供する1つ以上の追加の容器を含むこともできる。そのような追加の容器は上述の方法にしたがったプライマー伸長法で用いる、当業者に認識された任意の試薬又は他の要素を含むことができ、それには、例えば、核酸増幅法例えば、PCR、RT-PCR、DNAシークエンシング法又はDNAラベリング法で用いる試薬が含まれる。例えば、特定の態様においては、キットはさらに、プライマー伸長条件下で所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な5’センスプライマー、又は5’センスプライマーと対応する3’アンチセンスプライマーを含んでなるプライマー対を提供する容器を含む。態様によっては、キットは一塩基多型又は多塩基多型と完全に相補的な1つ以上のプライマーを含む1つ以上の容器を含み、ここでプライマーは、上述のように多重反応に有用である。他の相互排他的でない変形においては、キットはヌクレオシド三リン酸従来の及び/又は特殊なを提供する1つ以上の容器を含む。特定の態様では、キットはアルファ-ホスホロチオエートdNTP、dUTP、dITP及び/又は、例えばフルオレセイン又はシアニン色素ファミリーdNTPのような標識されたdNTPを含む。さらに他の相互排他的でない態様においては、キットは、プライマー伸長反応に適切な緩衝液を提供する1つ以上の容器を含む。態様によっては、キットは1つ以上の標識された、又は標識されていないプローブを含む。プローブの例としては、二重標識されたFRET蛍光共鳴エネルギー転移プローブ及び分子標識プローブが挙げられる。別の態様においては、キットは、例えば、ホットスタートPCR分析用のアプタマーを含む。反応混合物本発明の別の面においては、反応混合物は、本明細書に記載されるように、増大した3’末端ミスマッチ識別活性を有するポリメラーゼを含んで提供される。反応混合物は、例えば、核酸増幅法例えば、PCR、RT-PCR、DNAシークエンシング法又はDNAラベリング法で用いる試薬をさらに含むことができる。例えば、特定の態様においては、反応混合物はプライマー伸長反応に適切な緩衝液を含んでなる。反応混合物はまた、鋳型核酸DNA及び/又はRNA、1つ以上のプライマー又はプローブポリヌクレオチド、ヌクレオシド三リン酸例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、特殊なヌクレオチドを含む、塩類例えば、Mn2、Mg2、及び標識例えば、蛍光色素分子を含むこともできる。態様によっては、反応混合物はさらに、SYBRgreenのような二本鎖DNA結合色素、又は臭化エチジウムのような二本鎖DNAインターカレーション色素を含んでなる。態様によっては、反応混合物はプライマー伸長条件下で所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な5’センスプライマー、又は5’センスプライマーと対応する3’アンチセンスプライマーを含んでなるプライマー対を含む。特定の態様においては、反応混合物はさらに、増幅した鋳型核酸の検出のための蛍光FRET加水分解プローブ、例えばTaqman登録商標プローブを含んでなる。態様によっては、反応混合物は、一塩基多型又は多塩基多型と完全に相補的な2つ以上のプライマーを含む。態様によっては、反応混合物は、アルファ-ホスホロチオエートdNTP、dUTP、dITP及び/又は、例えばフルオレセイン又はシアニン色素ファミリーdNTPのような標識されたdNTPを含む。以下の実施例は本発明を例示するために提供されるが、何ら限定するものではない。実施例1:増大した3’末端ミスマッチ識別能を有する変異DNAポリメラーゼの同定本実施例の対照DNAポリメラーゼは、580番目のアミノ酸がグリシンであることを除き例えば、D580G置換、配列番号1のサーマス種Z05DNAポリメラーゼである以下Z05D580Gポリメラーゼ。鋳型に対して3’末端ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する能力を減少させる、Z05D580Gポリメラーゼにおける変異を同定した。簡単に言えば、このスクリーニング過程における工程には、ライブラリー作成、変異酵素の発現及び部分精製、所望の性質をもつ酵素のスクリーニング、DNAシークエンシング、クローン精製、選択された変異体候補のさらなる特性評価が含まれた。これらの工程のそれぞれについて、以下にさらに説明する。クローンライブラリー作成:Z05D580GDNAポリメラーゼのポリメラーゼドメインをコードする核酸を、この核酸配列を含むプラスミドのBlpI及びBglII制限部位の間でエラープローン変異誘発PCRにかけた。増幅した配列を配列番号33とした。これに用いたプライマーは以下の通りである:フォワードプライマー:5’-CTACCTCCTGGACCCCTCCAA-3’配列番号31;及びリバースプライマー:5’-ATAACCAACTGGTAGTGGCGTGTAA-3’配列番号32。様々な変異率のライブラリーを作成するために、1.8~3.6mMのMg2濃度の範囲でPCRを実施した。緩衝液条件は、50mMビシンpH8.2、115mMKOAc、8w/vグリセロール、0.2mMの各dNTPであった。GeneAmp登録商標AccuRTホットスタートPCR酵素を0.15UμLで使用した。反応容量50μL当たり5×105コピーの線状化Z05D580GプラスミドDNAで開始し、94°C、60秒で変性させ、続いて変性温度94°Cで15秒、アニーリング温度60°Cで15秒、伸長温度72°Cで120秒の条件で30サイクルの増幅を行い、最後に72°Cで5分間最終伸長を行った。得られた増幅産物をQIAquickPCR精製キットQiagenIncValenciaCAUSAで精製し、BlpI及びBglIIで切断し、次いでQIAquickPCR精製キットで再び精製した。Z05D580Gベクタープラスミドは、同じ2つの制限酵素で切断し、アルカリホスファターゼ、組換え体RAScat03359123001で処理し、QIAquickPCR精製キットで精製することにより調製した。切断したベクターと変異した挿入断片を1:3の比で混合し、室温で5分間T4DNAリガーゼにより処理したNEBQuickLigation登録商標キット。ライゲーションしたものをQIAquickPCR精製キットで精製し、エレクトロポレーションにより大腸菌宿主株を形質転換した。各形質転換における特徴的な形質転換体の数を調べるために、発現した培養物の一部をアンピシリン選択培地にまいた。形質転換体は、凍結保護物質としてのグリセロールの存在下-70°C~-80°Cで保存した。次に、各ライブラリーを大型のアンピシリン選択寒天培地にまいた。個々のコロニーを、自動コロニーピッカーQPix2GenetixLtdを用いて、アンピシリンと10w/vグリセロールを含む2×Luriaブロスの入った384ウェルプレートに移した。それらのプレートを30°Cで一晩インキュベートして培養物を増殖させ、その後-70°C~-80°Cで保存した。2×Luriaブロスに添加したグリセロールは、培養物の増殖を可能にするのに十分なほど少量だったが、凍結保護のためには十分多い量だった。後に使用するために、この方法により複数の変異誘発Mg2レベルで数千個のコロニーを調製した。抽出物ライブラリー調製1-発酵:上述のクローンライブラリーから、スクリーニング用に適切な、部分精製された抽出物の対応するライブラリーを調製した。この過程の第一工程は、各クローンの小規模の発現培養物を生成することであった。それらの培養物を96ウェルフォーマットで増殖させた;したがって、384ウェルライブラリープレート毎に4枚の発現培養物プレートとなった。0.5μLをクローンライブラリープレートの各ウェルから、150μLの培地A下記表2を参照を含む96ウェルの種プレートのウェルへと移した。この種プレートを、iEMSプレートインキュベーター/シェーカーThemoElectron中で、1150rpm、30°Cで一晩振盪培養した。次に、それらの種培養物を同じ培地に接種するのに用い、今度は大型の96ウェルプレートNunc267334の250μLの培地A中に20μLを接種した。それらのプレートを37°Cで一晩振盪しながらインキュベートした。発現プラスミドは、37°Cで発現するが30°Cでは発現しない転写調節因子を含んでいた。一晩インキュベートした後、培養物は典型的には全細胞タンパク質の1~10でクローンタンパク質を発現した。それらの培養物から細胞を遠心分離により回収した。それらの細胞を凍結するか-20°C又は後述するようにすぐに処理した。表2.培地A使用前に濾過滅菌したもの抽出物ライブラリー調製2-抽出:発酵工程で得た細胞ペレットを25μLの溶解緩衝液下記表3中に再懸濁し、384ウェルのサーモサイクラープレートに移して密閉した。なお、緩衝液は細胞溶解を補助するためにリゾチームを含み、抽出物からDNAを除去するためにデオキシリボヌクレアーゼDNaseを含む。細胞を溶解させるために、プレートを37°Cで15分間インキュベートし、-20°Cで一晩凍結し、37°Cで15分間再びインキュベートした。硫酸アンモニウムを添加し2M溶液を1.5μL、外来的に添加された酵素を含む汚染タンパク質を沈澱、不活性化させるために、プレートを75°Cで15分間インキュベートした。プレートを3000×gで15分間、4°Cで遠心し、上清を新しい384ウェルサーモサイクラープレートに移した。それらの抽出物プレートを後にスクリーニングで使用するために-20°Cで凍結した。各ウェルには約0.5~3μMの変異ライブラリーポリメラーゼ酵素が含まれていた。表3.溶解緩衝液稀な対立遺伝子の検出が改良された抽出物ライブラリーのスクリーニング:抽出物ライブラリーを最初に圧縮し、先のスクリーニングからのデータに基づいて、不活性な変異体を除去した。これは、ライブラリー中の抽出物の数を5670個から2570個に減少させた。プライマーの3’末端において一塩基のミスマッチを有する標的を増幅するために、残った抽出物を、プライマーと完全に一致する標的配列の増幅を比較することによりスクリーニングした。増幅をTaqManプローブの使用によりリアルタイムに検出した。二つの標的配列を識別する変異酵素の能力を、二つの反応のCpを比較することにより見積もった。加えて、各ウェル中で、第二の標的遺伝子の同時増幅を行ない、第二の光学チャネルにおいてTaqManプローブにより検出した。この第二の増幅は、ヒトゲノムDNAの存在についての陽性対照としてのみ役割を果たした。これは、所定のウェルにおいて、完全に一致した標的の増幅が可能で有ること、即ち、酵素が実際にそのウェルに添加されたことを確認するために用いられた。これは、スクリーニングが、標的がプライマーとミスマッチである、ウェルにおける機能の損失を探しているので、重要である。前記標的がBRAFのコドン600にV600Kの変異を有する場合、ヒトBRAF遺伝子の領域を増幅し、そして前記標的と完全に一致するプライマーを用いた。ヒトゲノムDNAに存在する標的野生型BRAFに対し、対立遺伝子選択プライマーは3’末端において1つのA:Cミスマッチをもたらす。共通プライマーはプローブ配列であるので、BRAF遺伝子と完全に一致しており、増幅のリアルタイム、TaqMan検出を可能にする。上述のように生成された酵素抽出物を、384ウェルサーモサイクラープレート中で、2.2μLの抽出物と、20mMTris-HClpH8、100mMKCl、0.1mMEDTA及び0.2Tween-20を含む20μLの緩衝液とを混合することにより10倍に希釈し、カバーして、90°Cで10分間加熱した。1μLのこの希釈された抽出物を各反応に添加した。各反応はまた、以下の成分:50mMTrispH8.0、2.5v/vDMSO、3v/vグリセロール、0.01Tween20、0.09アジ化ナトリウム、0.1mMEDTA、0.2mMdATP、0.2mMdCTP、0.2mMdGTP、0.4mMdUTP、0.2μMアプタマー、0.02U/μLUNG、2.5mMMgCl2、0.1μMの各プライマーBRAF及び陽性対照及び0.05μMの各プローブBRAF及び陽性対照を含んだ。加えて、KClを各反応に添加し、合計K-Na濃度は、一連の3つのスクリーニング実験において、100、120又は140mMのいずれかであった。さらに、ヒトゲノムDNAを10μLの反応あたり10,000コピー添加した。また、完全に一致するBRAF変異標的を含むプラスミドを、10μLの反応あたり0又は1000コピーのいずれかで添加した。変異BRAF標的を有するプラスミドの存在下、及び非存在下で、各KClレベルにおいて、各抽出物を試験した各抽出物について6反応。前記反応は、以下の熱プロファイル:50°Cで2分UNG滅菌工程95°Cで10秒、及び62°Cで30秒の2サイクル93°Cで10秒、及び62°Cで30秒の55サイクルを用いてRocheLightCycler480リアルタイムPCR装置で行った。リアルタイム蛍光を最後の55サイクルの間、FAM及びCY5.5チャネルにおいて検出した。各反応についてのCpクロッシングポイントを、装置の固定点分析方法を用いて決定した。特定の抽出物を用いた全ての反応のCpを、試験されたBRAF遺伝子の二つの対立遺伝子を識別する抽出物の能力を評価するために比較した。2760個の変異体抽出物を上述のプロトコールを用いてスクリーニングした。22個のクローンをさらなる研究のために選択した。これらの改良された性能に寄与するアミノ酸変化を決定するために、これらのクローンを最初に配列決定した。前記クローンを、上述の増殖培地を用いて150mL培養物中で増殖させた。ポリメラーゼ発現をインキュベーション温度を37°Cに上昇させ、一晩振盪することにより誘導した。細胞を遠心分離により回収し、50mMTrispH7.5、10mMEDTA、及び0.5mg/mLリゾチームに再懸濁した。細胞を破壊するためにこれらを超音波処理し、その後0.2Mの最終濃度まで硫酸アンモニウムを添加した。前記抽出物を20分間75°Cで加熱した。その後、ポリエチレンイミンPEIを0.3の最終濃度まで添加し、前記抽出物を遠心分離の前に氷上で20分間インキュベートした。上清を保存し、その後、AKTAExplorer100A自動クロマトグラフィーシステムGEBioSciencesを用いて1mL/分において1mLHiTrapフェニルセファロースカラムに適用した。カラムを洗浄後、50エチレングリコールの存在下において、1mLHiTrapヘパリンHPカラム上でポリメラーゼを直接的に溶出させた。このカラムを順番に、50-500mMKCl勾配を用いて洗浄及び溶出させた。この溶出液を分画した0.2mL/画分。ポリメラーゼを含む画分をプールし、BioRadExperion自動電気泳動システムを用いてポリメラーゼの量を定量した。精製され、定量化された変異体酵素を、リアルタイムPCRに基づく稀な対立遺伝子検出を行なう能力について、親酵素Z05D580Gと比較した。再度、上記と同一のプライマー及びプローブとともに、BRAFV600K変異体を用いた。各反応はまた、以下の成分:50mMTrispH8.0、酵素保存緩衝液50v/vグリセロール、20mMTrispH8.0、100mMKCl、0.1mMEDTA、1mMDTT、0.5Tween20、0.2mMdATP、0.2mMdCTP、0.2mMdGTP、0.4mMdUTP、0.2μMアプタマー、0.02U/μLUNG、2.5mMMgCl2、0.1μMの上述の二つのBRAFプライマー、及び0.025μMの上述のBRAFプローブを含んだ。加えて、KClを各反応に添加し、合計K濃度は、25、40、55、70、85、100、115、又は130mMのいずれかであった。用いられる鋳型は、16μLの合計反応容量中、10,000コピーのヒトゲノムDNA、又は100若しくは10,000コピーのBRAFV600K標的配列を含むプラスミドDNAであった。試験されるポリメラーゼを、20nMの最終濃度まで添加した。野生型標的のミスマッチ増幅を回避し、それ故野生型の存在下において変異対立遺伝子の稀なコピーを検出する各ポリメラーゼの能力は、表4においてΔCpとして測定され、これは変異体及び野生型の対立遺伝子の同等のコピーの増幅における差として定義される。表4中のデータは、親酵素Z05D580Gと比較した場合、A664T及びA664V変異体の双方がこのパラメータの有意な増加を示したことを示す。表4.BRAFV600K変異プラスミド対ヒトゲノムDNAの増幅のCp本実施例は、A664T及びA664V変異酵素が、親酵素Z05D580Gとの比較で、稀な対立遺伝子の検出を改良したことを示す。本明細書に記載する実施例及び態様は、単に例示することが目的であり、その内容を踏まえた様々な改変又は変形が当業者に提示されるであろうことが分かる。非公式配列表"