"invivoで抗腫瘍活性を有する、ヒトTROP-2に対する抗体。5~20mg/kg体重の投与量で50以上の腫瘍成長阻害活性を示すものである、請求項1記載の抗体。前記腫瘍成長阻害活性を示すための投与回数が多くても1週間に1回である、請求項2記載の抗体。10mg/kg体重の単回投与で50以上の腫瘍成長阻害活性を示すものである、請求項1記載の抗体。2種以上のヒト腫瘍細胞株に対して抗腫瘍活性を有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体。解離定数Kd値が1.0×10-10M以下である、請求項1~5のいずれか1項に記載の抗体。抗体がモノクローナル抗体である、請求項1~6のいずれか1項に記載の抗体。腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌及びヒト乳癌からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項1~7のいずれか1項に記載の抗体。腫瘍がヒト膵癌である、請求項1~7のいずれか1項に記載の抗体。腫瘍が再発癌又は転移癌である、請求項1~9のいずれか1項に記載の抗体。腫瘍細胞株が、ヒト膵癌細胞株PK-59、ヒト膵癌細胞株BxPC-3、ヒト膵癌細胞株KP-3L、ヒト膵癌細胞株KP-2、ヒト膵癌細胞株PK-1、ヒト膵癌細胞株PK-45H、ヒト膵癌細胞株PK-45P、ヒト膵癌細胞株TCC-PAN2、ヒト膵癌細胞株SUIT-2、ヒト大腸癌細胞株CACO-2、ヒト大腸癌細胞株SW480、ヒト大腸癌細胞株DLD-1、ヒト大腸癌細胞株HCT116、ヒト乳癌細胞株JIMT-1、ヒト乳癌細胞株HCC1143、ヒト乳癌細胞株MCF-7、ヒト前立腺癌細胞株DU145及びヒト前立腺癌細胞株PC-3からなる群より選ばれる少なくとも2種である、請求項5~10のいずれか1項に記載の抗体。腫瘍細胞株が、ヒト膵癌細胞株PK-59及びヒト膵癌細胞株BxPC-3である、請求項5~10のいずれか1項に記載の抗体。抗体のH鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号36~38で示されるアミノ酸配列であり、及び/又は、抗体のL鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号41~43で示されるアミノ酸配列である、請求項1~12のいずれか1項に記載の抗体。抗体のH鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号46~48で示されるアミノ酸配列であり、及び/又は、抗体のL鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号51~53で示されるアミノ酸配列である、請求項1~12のいずれか1項に記載の抗体。抗体のH鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号56~58で示されるアミノ酸配列であり、及び/又は、抗体のL鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号61~63で示されるアミノ酸配列である、請求項1~12のいずれか1項に記載の抗体。抗体のH鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号66~68で示されるアミノ酸配列であり、及び/又は、抗体のL鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号71~73で示されるアミノ酸配列である、請求項1~12のいずれか1項に記載の抗体。抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項1~16のいずれか1項に記載の抗体。遺伝子組換え抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、請求項17記載の抗体。キメラ抗体は、H鎖V領域のアミノ酸配列が配列番号35で示されるアミノ酸配列からなり、及び/又は、L鎖V領域のアミノ酸配列が配列番号40で示されるアミノ酸配列からなるものである、請求項18記載の抗体。キメラ抗体は、H鎖V領域のアミノ酸配列が配列番号45で示されるアミノ酸配列からなり、及び/又は、L鎖V領域のアミノ酸配列が配列番号50で示されるアミノ酸配列からなるものである、請求項18記載の抗体。キメラ抗体は、H鎖V領域のアミノ酸配列が配列番号55で示されるアミノ酸配列からなり、及び/又は、L鎖V領域のアミノ酸配列が配列番号60で示されるアミノ酸配列からなるものである、請求項18記載の抗体。キメラ抗体は、H鎖V領域のアミノ酸配列が配列番号65で示されるアミノ酸配列からなり、及び/又は、L鎖V領域のアミノ酸配列が配列番号70で示されるアミノ酸配列からなるものである、請求項18記載の抗体。受領番号がFERMBP-11251であるハイブリドーマにより産生される、ヒトTROP-2に対するモノクローナル抗体。受領番号がFERMBP-11252であるハイブリドーマにより産生される、ヒトTROP-2に対するモノクローナル抗体。受領番号がFERMBP-11253であるハイブリドーマにより産生される、ヒトTROP-2に対するモノクローナル抗体。受領番号がFERMBP-11346であるハイブリドーマにより産生される、ヒトTROP-2に対するモノクローナル抗体。受領番号がFERMBP-11254であるハイブリドーマにより産生される、ヒトTROP-2に対するモノクローナル抗体。受領番号がFERMBP-11251、FERMBP-11252、FERMBP-11253、FERMBP-11346又はFERMBP-11254であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合する部位に結合する、請求項1~22のいずれか1項に記載の抗体。配列番号2に示されるヒトTROP-2のアミノ酸配列中の、第43番目~第65番目のアミノ酸からなる領域、第152番目~第165番目のアミノ酸からなる領域、第171番目~第183番目のアミノ酸からなる領域、第109番目~第120番目のアミノ酸からなる領域、第43番目~第56番目のアミノ酸からなる領域、及び第193番目~第206番目のアミノ酸からなる領域からなる群より選択される少なくとも1種の領域を含む部分と結合するものである、請求項1~22のいずれか1項に記載の抗体。配列番号2に示されるヒトTROP-2のアミノ酸配列中の、第43番目~第65番目のアミノ酸からなる領域を含む部分と結合するものである、請求項1~22のいずれか1項に記載の抗体。配列番号2に示されるヒトTROP-2のアミノ酸配列中の、第152番目~第165番目のアミノ酸からなる領域を含む部分と結合するものである、請求項1~22のいずれか1項に記載の抗体。配列番号2に示されるヒトTROP-2のアミノ酸配列中の、第171番目~第183番目のアミノ酸からなる領域を含む部分と結合するものである、請求項1~22のいずれか1項に記載の抗体。配列番号2に示されるヒトTROP-2のアミノ酸配列中の、第109番目~第120番目のアミノ酸からなる領域を含む部分と結合するものである、請求項1~22のいずれか1項に記載の抗体。請求項1~33のいずれか1項に記載の抗体に由来する抗体断片。配列番号36~38で示されるアミノ酸配列、及び/又は、配列番号41~43で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項34記載の抗体断片。配列番号35で示されるアミノ酸配列、及び/又は、配列番号40で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項35記載の抗体断片。配列番号46~48で示されるアミノ酸配列、及び/又は、配列番号51~53で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項34記載の抗体断片。配列番号45で示されるアミノ酸配列、及び/又は、配列番号50で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項37記載の抗体断片。配列番号56~58で示されるアミノ酸配列、及び/又は、配列番号61~63で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項34記載の抗体断片。配列番号55で示されるアミノ酸配列、及び/又は、配列番号60で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項38記載の抗体断片。配列番号66~68で示されるアミノ酸配列、及び/又は、配列番号71~73で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項34記載の抗体断片。配列番号65で示されるアミノ酸配列、及び/又は、配列番号70で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項41記載の抗体断片。請求項1~22及び28~33のいずれか1項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。受領番号がFERMBP-11251である、ヒトTROP-2に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。受領番号がFERMBP-11252である、ヒトTROP-2に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。受領番号がFERMBP-11253である、ヒトTROP-2に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。受領番号がFERMBP-11346である、ヒトTROP-2に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。受領番号がFERMBP-11254である、ヒトTROP-2に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。請求項1~33のいずれか1項に記載の抗体と、抗腫瘍活性及び/又は殺細胞活性を有する物質とを含む、抗体-薬剤複合体。請求項34~42のいずれか1項に記載の抗体断片と、抗腫瘍活性及び/又は殺細胞活性を有する物質とを含む、抗体断片-薬剤複合体。腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌及びヒト乳癌からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項49又は50記載の複合体。腫瘍がヒト膵癌である、請求項49又は50記載の複合体。腫瘍が再発癌又は転移癌である、49~52のいずれか1項に記載の複合体。請求項1~33のいずれか1項に記載の抗体、請求項34~42のいずれか1項に記載の抗体断片、及び請求項49~53のいずれか1項に記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも1種を含む、医薬組成物。腫瘍の治療に用いるものである、請求項54記載の組成物。体重減少の副作用を有しないものである、請求項55記載の組成物。腫瘍の診断に用いるものである、請求項54記載の組成物。腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌及びヒト乳癌からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項54~57のいずれか1項に記載の組成物。腫瘍が再発癌又は転移癌である、請求項55~58のいずれか1項に記載の組成物。請求項1~33のいずれか1項に記載の抗体、請求項34~42のいずれか1項に記載の抗体断片、及び請求項49~53のいずれか1項に記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも1種を含む、腫瘍治療剤。体重減少の副作用を有しないものである、請求項60記載の治療剤。腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌及びヒト乳癌からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項60又は61記載の治療剤。請求項1~33のいずれか1項に記載の抗体、請求項34~42のいずれか1項に記載の抗体断片、及び請求項49~53のいずれか1項に記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも1種を含む、腫瘍診断剤。腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌及びヒト乳癌からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項63記載の診断剤。請求項1~33のいずれか1項に記載の抗体、請求項34~42のいずれか1項に記載の抗体断片、及び請求項49~53のいずれか1項に記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも1種と、生体から採取された試料とを反応させ、反応した抗体及び/又は抗体断片のシグナルを検出することを特徴とする、腫瘍の検出方法。腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌及びヒト乳癌からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項65記載の方法。請求項1~33のいずれか1項に記載の抗体、請求項34~42のいずれか1項に記載の抗体断片、及び請求項49~53のいずれか1項に記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも1種を含む、腫瘍の治療用、診断用又は検出用キット。腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌及びヒト乳癌からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項67記載のキット。以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2010-113302号明細書2010年5月17日出願の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。1.本発明の概要ヒトTROP-2hTROP-2は、前述したように、全長323アミノ酸残基からなる1回膜貫通型の1型膜タンパク質である。そして、hTROP-2遺伝子及びその遺伝子産物は、種々の癌細胞において発現していることが知られている。前述したように、invivoにおいて高い抗腫瘍活性を有する抗ヒトhTROP-2抗体抗ヒトhTROP-2モノクローナル抗体などの開発が望まれていた状況の下、本発明者は、極めて多数のクローンからスクリーニングを行うことにより、invivoで高い抗腫瘍活性を有するクローンを取得することに成功した。具体的には、本発明は、invivoにおいてhTROP-2の細胞外領域を特異的に認識するモノクローナル抗体、特にピコモルオーダーpMの高い親和性を示すモノクローナル抗体を提供するものである。本発明の抗体は、裸抗体の単独投与で、既存の抗hTROP-2抗体と比較して、より少ない用量例えば1/20投与量で顕著な腫瘍成長阻害活性を有し、かつ複数のヒト癌細胞を用いた担癌マウス治療モデルにおいて顕著な腫瘍成長阻害活性を示す、抗hTROP-2モノクローナル抗体である点で、極めて有用なものである。2.抗hTROP-2抗体の作製1抗原の調製hTROP-2のアミノ酸配列配列番号2の情報は、例えばNCBIGenBankのウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/にAccessionnumber:NP002344として公表されている。なお、hTROP-2のアミノ酸配列をコードする塩基配列配列番号1の情報は、同ウェブサイトにAccessionnumber:NM002353として公表されている。抗原としては、hTROP-2のアミノ酸配列の少なくとも一部全部又は一部を含むポリペプチド又はペプチド単にペプチドともいうを使用することができ、好ましくは、hTROP-2の細胞外領域のアミノ酸配列の少なくとも一部全部又は一部を含むペプチドを使用することができる。hTROP-2の細胞外領域シグナルペプチドを含むは、配列番号2で示されるアミノ酸配列のうちの第1番目~第274番目のアミノ酸を含む領域シグナルペプチド:第1番目~第26番目のアミノ酸のことを言う。ここで、抗原に用いるペプチドにつき、上記アミノ酸配列の少なくとも一部とは、長さが特に限定されるわけではないが、例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列のうちの第1番目~第145番目のアミノ酸を含む領域や、当該アミノ酸配列のうちの第146番目~第274番目のアミノ酸を含む領域などが好ましい。抗原とするペプチドの作製方法は、化学合成でも、大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。ペプチドの化学合成を行う場合は、ペプチドの合成の周知方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置例えば、島津製作所製:PSSM-8などを使用してもよい。ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするDNAを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、全長hTROP-2遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のDNA領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、PCR法により行うことができる。そして、上記DNAを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得るSambrookJ.etal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001。ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌大腸菌、枯草菌等、酵母、動物細胞COS細胞、CHO細胞等、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。培養物とは、a培養上清、b培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。本発明においては、無細胞合成系を用いたinvitro翻訳により抗原となるペプチドを得ることもできる。この場合は、RNAを鋳型にする方法とDNAを鋳型にする方法転写/翻訳の2通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばExpresswayTMシステムインビトロジェン社、PURESYSTEM登録商標;ポストゲノム研究所、TNTシステム登録商標;プロメガ社等を用いることができる。上記のごとく得られたペプチドは、適当なキャリアタンパク質、例えば牛血清アルブミンBSA、キーホールリンペットヘモシアニンKLH、ヒトチログロブリン、ニワトリガンマグロブリン等に結合することも可能である。また抗原は、hTROP-2のアミノ酸配列配列番号2又は前述したその部分配列において1又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。例えば、hTROP-2のアミノ酸配列又はその部分配列のうち1又は複数個好ましくは1個又は数個例えば1個~10個、さらに好ましくは1個~5個のアミノ酸が欠失しており、1又は複数個好ましくは1個又は数個例えば1個~10個、さらに好ましくは1個~5個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されており、あるいは、1又は複数個好ましくは1個又は数個例えば1個~10個、さらに好ましくは1個~5個の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを使用することもできる。本発明において、細胞等に導入するための遺伝子としては、hTROP-2タンパク質若しくはその部分断片又はこれらの変異型のタンパク質又は断片をコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子としては、例えば、配列番号1に示される塩基配列又はその部分配列を有するものを使用することができる。また、細胞等に導入するための遺伝子としては、配列番号1に示される塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つhTROP-2活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、又はその部分配列を使用することも可能である。ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩ナトリウム濃度が10~500mMであり、温度が42°C~72°C、好ましくは、上記塩濃度が50~300mMであり、温度が55~68°Cでの条件をいう。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法やGappedduplex法等の公知手法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばGeneTailorTMSite-DirectedMutagenesisSystemインビトロジェン社製、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystemMutan-K、Mutan-SuperExpressKm等:タカラバイオ社製を用いて行うことができる。2ポリクローナル抗体の作製調製した抗原を、免疫のため哺乳動物に投与する。哺乳動物は特に限定はされず、例えばラット、マウス及びウサギなどを挙げることができ、なかでもマウスが好ましい。抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバントFCA、フロイント不完全アジュバントFIA、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、足蹠、皮下、腹腔内等に注入することにより行うことができる。また、免疫の間隔については、特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは1週間間隔で、1~10回、好ましくは2~3回免疫を行う。そして、最終の免疫日から3~7日後に、酵素免疫測定法ELISA又はEIAや放射性免疫測定法RLA等で抗体価を測定し、所望の抗体価を示した日に採血して、抗血清を得ることができる。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をELISA法などで測定する。3モノクローナル抗体の作製3-1抗体産生細胞の採取本発明の抗hTROP-2抗体は、限定はされないが、モノクローナル抗体であることが好ましい。調製した抗原を、免疫のため哺乳動物、例えばラット、マウス及びウサギなどに投与する。抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては上記と同様である。免疫手法も前記と同様である。そして、最終の免疫日から1~60日後、好ましくは1~14日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞及び末梢血細胞などが挙げられるが、なかでもリンパ節細胞及び脾臓細胞が好ましい。3-2細胞融合ハイブリドーマ抗体産生細胞株を得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。用いる細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むで生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば、P3-X63-Ag8.653、P3-X63-Ag8X63、P3-X63-Ag8.U1P3U1、P3/NSI/1-Ag4-1NS1及びSp2/0-Ag14Sp2/0等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。ミエローマ細胞の選択は、抗体産生細胞との適合性を適宜考慮して行うことができる。次いで、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM及びRPMI-1640培地などの動物細胞用培地中で、1×106~1×107個/mLの抗体産生細胞と2×105~2×106個/mLのミエローマ細胞とを混合する。抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比抗体産生細胞:ミエローマ細胞は、限定はされないが、通常、1:1~10:1とすることが好ましく、より好ましくは3:1である。次に、細胞融合促進剤の存在下で融合反応を行う。細胞融合促進剤として、例えば、平均分子量1,000~6,000ダルトンDのポリエチレングリコールなどを使用することができる。また、電気刺激例えばエレクトロポレーションを利用した市販の細胞融合装置を用いて、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。3-3ハイブリドーマの選別及びクローニング細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などに適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に播き、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリーマとして得ることができる。次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、hTROP-2に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定はされない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採取し、ELISA、EIA及びRIAなどによってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行うことができる。hTROP-2に強い反応性を示す抗体をフローサイトメトリー等により判定し、これを産生するハイブリドーマを選択し、クローンとして樹立する。3-4モノクローナル抗体の採取樹立したハイブリドーマを培養し、得られる培養物からモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法、又は腹水形成法等を採用することができる。培養とは、ハイブリドーマを培養皿又は培養ボトル中で生育させること、あるいはハイブリドーマを下記のように動物の腹腔内で増殖させることを意味する。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件例えば37°C、5CO2濃度で7~14日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約1x107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、2~3週間後に腹水を採取することが好ましい。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。3-5抗腫瘍活性を有するクローンの選別本発明の抗hTROP-2抗体は、invivoで抗腫瘍活性を有する抗体である。ここで、抗腫瘍活性とは、腫瘍細胞癌細胞を死滅させる活性又は腫瘍成長を阻害する活性を意味する。抗腫瘍活性としては、例えば、癌細胞の増殖阻害活性や腫瘍血管新生阻害活性が好ましく挙げられる。また、本発明の抗体が抗腫瘍活性を発揮しうるヒト腫瘍腫瘍細胞の種類としては、hTROP-2の発現が確認されている公知の各種ヒト腫瘍が挙げられ、特に限定はされないが、例えば、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌及びヒト乳癌のうちの1種又は2種以上が好ましく挙げられ、より好ましくはヒト膵癌である。さらに、上記腫瘍の種類としては、再発癌や転移癌であってもよく、本発明の抗体はこれらに腫瘍に対しても優れた抗腫瘍活性を発揮し得る。invivoでの抗腫瘍活性の確認は、例えば、所望の腫瘍細胞をマウスの皮下に移植した担癌マウス担癌動物治療モデルを用い、このマウスに前記のとおり得られた抗体を投与することにより行うことができる。この場合、抗体の投与は、腫瘍細胞の移植直後から行ってもよいしPreventionモデル、移植に腫瘍が所定の体積になったのを確認してから行ってもよいTreatmentモデル。投与方法は、限定はされないが、例えば、3日、1週間,10日又は2週間に1回あるいは単回1回のみで、5~20mg/kg体重、腹腔内投与等とすることができる。Preventionモデルの場合は、腫瘍形成頻度と腫瘍体積により抗腫瘍活性の有無及びレベルを評価することができる。Treatmentモデルの場合は、腫瘍体積により抗腫瘍活性の有無及びレベルを評価することができる。本発明において、invivoで抗腫瘍活性を有する抗hTROP-2抗体としては、例えば、H鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号36~38で示されるアミノ酸配列であり、及び/又は、L鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号41~43で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。当該H鎖V領域としては、例えば、配列番号35で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、当該L鎖V領域としては、例えば、配列番号40で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。また本発明の抗hTROP-2抗体の他の態様としては、例えば、H鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号46~48で示されるアミノ酸配列であり、及び/又は、L鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号51~53で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。当該H鎖V領域としては、例えば、配列番号45で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、当該L鎖V領域としては、例えば、配列番号50で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。同様に、本発明の抗hTROP-2抗体の他の態様としては、例えば、H鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号56~58で示されるアミノ酸配列であり、及び/又は、L鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号61~63で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。当該H鎖V領域としては、例えば、配列番号55で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、当該L鎖V領域としては、例えば、配列番号60で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。同様に、本発明の抗hTROP-2抗体の他の態様としては、例えば、H鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号66~68で示されるアミノ酸配列であり、及び/又は、L鎖V領域のCDR1~3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号71~73で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。当該H鎖V領域としては、例えば、配列番号65で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、当該L鎖V領域としては、例えば、配列番号70で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。本発明において、invivoで抗腫瘍活性を有する抗hTROP-2抗体としては、より具体的には、例えば、受領番号がFERMBP-11251であるハイブリドーマにより産生される抗hTROP-2モノクローナル抗体クローン名:K5-70、受領番号がFERMBP-11252であるハイブリドーマにより産生される抗hTROP-2モノクローナル抗体クローン名:K5-107、受領番号がFERMBP-11253であるハイブリドーマにより産生される抗hTROP-2モノクローナル抗体クローン名:K5-116-2-1、受領番号がFERMBP-11346であるハイブリドーマにより産生される抗hTROP-2モノクローナル抗体クローン名:T6-16及び受領番号がFERMBP-11254であるハイブリドーマにより産生される抗hTROP-2モノクローナル抗体クローン名:T5-86などが好ましく挙げられる。ここで、受領番号がFERMBP-11251であるハイブリドーマは、Mouse-MouseHybridomaK5-70と称し2010年5月12日付で、受領番号がFERMBP-11252であるハイブリドーマは、Mouse-MouseHybridomaK5-107と称し2010年5月12日付で、受領番号がFERMBP-11253であるハイブリドーマは、Mouse-MouseHybridomaK5-116-2-1と称し2010年5月12日付で、受領番号がFERMBP-11346であるハイブリドーマは、Mouse-MouseHybridomaT6-16と称し2011年3月1日付で、受領番号がFERMBP-11254であるハイブリドーマは、Mouse-MouseHybridomaT5-86と称し2010年5月12日付で、いずれも独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6に寄託されたものである。さらに、本発明の抗hTROP-2抗体としては、例えば、受領番号がFERMBP-11251、FERMBP-11252、FERMBP-11253、FERMBP-11346又はFERMBP-11254であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合認識する部位例えばエピトープに結合する抗hTROP-2抗体も好ましく挙げられる。エピトープとしては、下記3-6項において例示するものが好ましく挙げられる。3-6抗hTROP-2抗体のエピトープ本発明の抗hTROP-2抗体のエピトープ抗原決定基は、抗原であるhTROP-2の少なくとも一部であればよく限定はされないが、例えば、配列番号2に示されるhTROP-2のアミノ酸配列中の、第252番目~第260番目のアミノ酸からなる領域とを除く領域の少なくとも一部であることが好ましく、より好ましくは、第1番目~第69番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部又は第100番目~第274番目のアミノ酸からなる領域第252番目~第260番目のアミノ酸からなる領域を除くの少なくとも一部であり、さらに好ましくは第27番目~第69番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部又は第109番目~第206番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部である。上記エピトープとして、特に好ましくは、配列番号2に示されるhTROP-2のアミノ酸配列中の、第43番目~第65番目のアミノ酸からなる領域、第152番目~第165番目のアミノ酸からなる領域、第171番目~第183番目のアミノ酸からなる領域、第109番目~第120番目のアミノ酸からなる領域、第193番目~第206番目のアミノ酸からなる領域、及び第43番目~第56番目のアミノ酸からなる領域、並びにこれらを含む部分であり、中でも特に好ましいのは、第43番目~第65番目のアミノ酸からなる領域、第152番目~第165番目のアミノ酸からなる領域、第171番目~第183番目のアミノ酸からなる領域、及び第109番目~第120番目のアミノ酸からなる領域、並びにこれらを含む部分である。当該領域を認識する当該領域又はそれを含む部分と結合する抗hTROP-2抗体は、例えば、腫瘍細胞内へのインターナリゼーション活性が高く、後述するイムノコンジュゲート等の用途に極めて有用なものである。3-7抗hTROP-2抗体の特性本発明の抗hTROP-2抗体は、前述の通り、低用量で高いinvivo抗腫瘍活性を有する抗体である。具体的には、担癌動物モデルに対して、20mg/kg体重以下好ましくは10mg/kg体重以下、より好ましくは5mg/kg体重以下、さらに好ましくは1mg/kg体重以下の投与量裸抗体で50以上好ましくは80以上、より好ましくは90以上、さらに好ましくは95以上、特に好ましくはほぼ100例えば98以上又は99以上の腫瘍成長阻害活性を示すものであることが好ましい。ここで、腫瘍成長阻害活性は、例えば、下記式により算出することができる。腫瘍成長阻害活性=100-抗体投与群の腫瘍体積又は腫瘍重量÷対照群の腫瘍体積又は腫瘍重量×100また、本発明の抗hTROP-2抗体は、2種以上のヒト腫瘍細胞株に対して抗腫瘍活性を有するものであることが好ましい。ヒト腫瘍細胞株としては、限定はされないが、例えば、各種ヒト膵癌細胞株、ヒト前立腺癌細胞株、ヒト大腸癌細胞株及びヒト乳癌細胞株からなる群より選ばれる少なくとも2種が挙げられ、具体的には、ヒト膵癌細胞株PK-59、ヒト膵癌細胞株BxPC-3、ヒト膵癌細胞株KP-3L、ヒト膵癌細胞株KP-2、ヒト膵癌細胞株PK-1、ヒト膵癌細胞株PK-45H、ヒト膵癌細胞株PK-45P、ヒト膵癌細胞株TCC-PAN2、ヒト膵癌細胞株SUIT-2、ヒト大腸癌細胞株CACO-2、ヒト大腸癌細胞株SW480、ヒト大腸癌細胞株DLD-1、ヒト大腸癌細胞株HCT116、ヒト乳癌細胞株JIMT-1、ヒト乳癌細胞株HCC1143、ヒト乳癌細胞株MCF-7、ヒト前立腺癌細胞株DU145及びヒト前立腺癌細胞株PC-3からなる群より選ばれる少なくとも2種が好ましく挙げられる。中でも、前記2種以上のヒト腫瘍細胞株としては、ヒト膵癌細胞株PK-59及びヒト膵癌細胞株BxPC-3がより好ましく挙げられる。さらに、本発明の抗hTROP-2抗体は、解離定数Kd値が1.0×10-10M以下であることが好ましく、より好ましくは1.0×10-11M以下であり、さらに好ましくは1.0×10-12M以下である。ここで、抗体の結合能親和性は、例えば、スキャッチャード解析やBiacoreと呼ばれる表面プラズモン共鳴センサーにより、解離定数Kd値、解離速度定数Kdiss[1/Sec]、結合速度定数Kass[1/M.Sec]として測定することができる。Biacore装置としては、例えばBiacore3000、Biacore2000、BiacoreX、BiacoreJ、BiacoreQいずれもBiacore社などが挙げられる。抗体は、解離定数Kd値が小さい値であるほど結合能親和性が高いという点で好ましい。Kd値は、Kdiss及びKassの2つのパラメーターにより決定され、例えば、式:Kd[M]=Kdiss/Kassにより表すことができる。なお、Kd値の算出方法については、後述する実施例具体的には実施例10に記載の方法も好ましく採用することができる。4遺伝子組換え抗体、及び抗体断片4-1遺伝子組換え抗体本発明の抗hTROP-2抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト抗体等が挙げられる。キメラ抗体すなわちヒト型キメラ抗体は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結接合した抗体でありProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,6851-6855,1984等を参照、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。ヒト型化抗体を作製する場合は、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域CDRをヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域FRはヒト由来のものでCDRはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製するいわゆるCDRグラフティングCDR移植。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知であるNature,321,522-5251986;J.Mol.Biol.,196,901-9171987;QueenCetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-100331989;特表平4-502408号公報特許第2828340号公報;クイーンら等を参照。ヒト抗体完全ヒト抗体は、一般にV領域の抗原結合部位である超可変領域HyperVariableregion、V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のH鎖及びL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法Tomizuka,K.etal.,NatureGenetics,197716,133-143;Kuroiwa,Y.et.al.,Nuc.AcidsRes.,199826,3447-3448;Yoshida,H.et.al.,AnimalCellTechnology:BasicandAppliedAspects,199910,69-73Kitagawa,Y.,Matuda,T.andIijima,S.eds.,KluwerAcademicPublishers;Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,200097,722-727等を参照や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法Wormstone,I.M.et.al,InvestigativeOphthalmologyVisualScience.,2002437,2301-8;Carmen,S.et.al.,BriefingsinFunctionalGenomicsandProteomics,200212,189-203;Siriwardena,D.et.al.,Opthalmology,20021093,427-431等を参照により取得することができる。上記キメラ抗体、ヒト型抗体及びヒト抗体は、抗体Fc領域におけるN-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるものが好ましく、詳しくは、該フコースの1位がN-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの6位にα結合していない糖鎖を抗体分子のFc領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体が挙げられる。このような抗体であれば、ADCC活性を飛躍的に向上させることができる。なお、この点抗体Fc領域におけるN-グリコシド結合複合型糖鎖の特徴は、前述したポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体についても同様に好ましい。4-2抗体断片本発明の抗hTROP-2抗体の断片部分断片も、本発明の抗体に含まれるものとする。ここで、本発明の抗体断片は、本発明の抗hTROP-2抗体と同様に、hTROP-2に対する結合活性を有するものすなわちhTROP-2に結合し得るものであってinvivoで抗腫瘍活性を有するものである。当該抗体の断片としては、抗hTROP-2ポリクローナル抗体又は抗hTROP-2モノクローナル抗体の一部分の領域すなわち、本発明の抗hTROP-2抗体に由来する抗体断片を意味し、例えば、Fab、Fab’、Fab’2、Fvvariablefragmentofantibody、一本鎖抗体H鎖、L鎖、H鎖V領域、及びL鎖V領域等、scFv、diabodyscFv二量体、dsFvジスルフィド安定化V領域、並びに、相補性決定領域complementaritydeterminingregion:CDRを少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のFabをコードするDNAを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Fabを製造することもできる。Fab’2は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、後述するFabをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて、作製することもできる。Fab’は、上記Fab’2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のFab’断片をコードするDNAを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Fab’を製造することもできる。scFvは、1本のH鎖V領域VHと1本のL鎖V領域VLとを適当なペプチドリンカーPを用いて連結した、VH-P-VLないしはVL-P-VHポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。scFvは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。diabodyは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAをPのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるように構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。dsFvは、VHおよびVL中のそれぞれ1アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、Reiterらにより示された方法ProteinEngineering,7,697-704,1994に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。dsFvは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。CDRを含むペプチドは、VHのCDRCDR1~3及びVLのCDRCDR1~3の中の少なくとも1領域以上を含んで構成され、VHのCDRをすべて含むもの、及びVLのCDRをすべて含むものがより好ましく、VH及びVLのCDR計6領域をすべて含むものが特に好ましい。CDRのアミノ酸配列としては、例えば、前述した配列番号36~38、41~43、46~48、51~53、56~58、61~63、66~68及び71~73に示されるアミノ酸配列が好ましく挙げられる。複数のCDRを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含むペプチドは、抗体のVHおよびVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法フルオレニルメチルオキシカルボニル法及びtBoc法t-ブチルオキシカルボニル法等の化学合成法によって製造することもできる。本発明の抗体断片としては、そのままの形状でN-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Fc領域の一部または全部を含む抗体断片でもよく、また、上述した抗体断片とN-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Fc領域の一部または全部との融合タンパク質であってもよい。このような抗体断片であれば、ADCC活性を飛躍的に向上させることができるため、好ましい。以下、本明細書中の説明においては、上述した抗体断片も、本発明の抗hTROP-2抗体に含まれるものとする。3.抗体-薬剤複合体の作製上記本発明の抗hTROP-2抗体を用いたイムノコンジュゲート等として、当該抗体と、抗腫瘍活性及び/又は殺細胞活性を有する物質化合物等とを含む、抗体-薬剤複合体を提供することができる。なお、予め、当該抗体分子と、抗腫瘍活性及び/又は殺細胞活性を有する物質とを、それぞれ調製したのち、これらを複合化させて得られたものは、一般に、イムノコンジュゲートと称される。また、遺伝子組換え技術を用い、抗腫瘍活性及び/又は殺細胞活性を有する物質としてのタンパク質トキシンを、遺伝子上で抗体遺伝子と連結させて、1つのタンパク質融合タンパク質として発現させて得られたものは、一般に、イムノトキシンと称される。抗腫瘍活性を有する物質としては、例えば、ドキソルビシン、カリケアマイシン、マイトマイシンC、AuristatinE、放射性同位体RIなどが挙げられる。殺細胞活性を有する物質としては、例えば、サポリン、リシン、緑膿菌外毒素、ジフテリアトキシン、放射性同位体RI等が挙げられ、なかでもサポリン及び緑膿菌外毒素が好ましく用いられる。なお、抗腫瘍活性及び/又は殺細胞活性を有するRIとしては、限定はされないが、例えば、90Y、111In、125I、3H、35S、14C、186Re、188Re、189Re、177Lu、67Cu、212Bi、213Bi、211At、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、94mTc、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、111Ag、197Pt、109Pd、32P、33P、47Sc、153Sm、177Lu、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、18F、75Se、201Tl、225Ac、76Br、86Y、169Yb、166Dy、212Pb及び223Ra等が挙げられる。抗体-薬剤複合体の作製方法としては、限定はされないが、例えば、ジスルフィド結合やヒドラゾン結合によって抗体と薬剤とをカップリングする方法などが挙げられる。上記本発明の抗hTROP-2抗体は、hTROP-2を発現する標的腫瘍細胞内へのインターナリゼーション活性に優れたものである。そのため、予め、抗腫瘍活性及び/又は殺細胞活性を有する物質を複合化させておくことにより、これら物質を腫瘍細胞に直接かつ高選択的に作用させることができる。本発明の抗体-薬剤複合体は、標的腫瘍細胞への薬剤送達能に極めて優れたものである。なお、細胞内へのインターナリゼーション活性は、抗体をローダミン等により蛍光標識し、細胞内への移行挙動及び抗体の局在性について蛍光顕微鏡等を用いて観察することにより評価することができる。また本発明においては、抗体-薬剤複合体において、抗体の代わりに前述の抗体断片を用いた抗体断片-薬剤複合体を提供することもできる。抗体断片-薬剤複合体の詳細については、上述の抗体-薬剤複合体の説明を適宜適用することができる。以下、本明細書中の説明においては、抗体断片-薬剤複合体も、本発明の抗体-薬剤複合体に含まれるものとする。4.医薬組成物本発明の抗hTROP-2抗体及び抗体-薬剤複合体は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。当該医薬組成物は、腫瘍の治療用及び/又は診断用の医薬組成物として有用である。特に、本発明の抗hTROP-2抗体、及び該抗体を含む抗体-薬剤複合体は、抗腫瘍活性として優れた腫瘍成長阻害活性を有するものであるため、腫瘍の治療用に使用されることが好ましい。すなわち、本発明の抗hTROP-2抗体及び抗体-薬剤複合体は、腫瘍治療剤及び腫瘍診断剤に含まれる有効成分として有用なものである。なお、本発明において、上記腫瘍の治療には、腫瘍の成長阻害及び成長抑制の意味も含むものとし、具体的には、例えば腫瘍治療剤であれば、腫瘍の成長阻害剤及び成長抑制剤の形態も含むものとする。本発明の医薬組成物は、本発明の抗hTROP-2抗体及び/又は抗体-薬剤複合体を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。また、本発明の医薬組成物は、公知の抗腫瘍剤との併用もすることができる。併用によりさらに高い抗腫瘍効果が得られる。本発明の医薬組成物の適用の対象となる疾患腫瘍としては、hTROP-2の発現が確認されている前述した公知の各種ヒト腫瘍が挙げられる。なかでも特に、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌及びヒト乳癌のうちの1種又は2種以上が好ましく挙げられる。これらの疾患は単独であってもよく、2つ以上が併発してもよい。また、対象となる腫瘍は、再発癌や転移癌であってもよく、本発明の医薬組成物ひいては、本発明の抗hTROP-2抗体及び/又は抗体-薬剤複合体は、再発癌や転移癌の治療剤及び診断剤としても有効に用いることができる。薬学的に許容され得る担体とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の1種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、1つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。特に、本発明の抗hTROP-2抗体由来の抗体断片中でも低分子のものを生体内に投与する場合は、上記に加えて、コロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物抗体断片の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであればよく限定はされないが、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げることができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞であるManninoetal.,Biotechniques,1988,6,682;BlumeandCevc,Biochem.etBiophys.Acta,1990,1029,91;Lappalainenetal.,AntiviralRes.,1994,23,119;ChonnandCullis,CurrentOp.Biotech.,1995,6,698。本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明の抗hTROP-2抗体及び抗体-薬剤複合体の種類などにより異なる。通常、成人一人あたり、一回につき600μgから6000mgの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、1回の投与において1kg体重あたり、100μg~100mgの量を、1日平均あたり1回~数回投与してもよく、好ましくは3日、1週間、10日又は2週間に1回投与したり、あるいは単回合計投与回数が1回投与する態様も採ることができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。なお、本発明は、腫瘍を治療及び/又は診断する医薬薬剤を製造するための、前記本発明の抗hTROP-2抗体及び/又は抗体-薬剤複合体の使用を提供するものでもある。また、本発明は、腫瘍を治療用及び/又は診断用の、前記本発明の抗hTROP-2抗体及び/又は抗体-薬剤複合体を提供するものでもある。さらに、本発明は、前記本発明の抗hTROP-2抗体及び/又は抗体-薬剤複合体を用いるすなわち患者に投与することを特徴とする腫瘍の治療及び/又は診断方法を提供するものであり、また、腫瘍を治療及び/又は診断するための、前記本発明の抗hTROP-2抗体及び/又は抗体-薬剤複合体の使用を提供するものでもある。5.腫瘍の検出方法本発明の腫瘍の検出方法は、前記本発明の抗hTROP-2抗体と、生体から採取された試料以下、生体試料とを反応させ、反応した抗体のシグナルを検出することを特徴とする方法である。前述したように、hTROP-2は各種腫瘍細胞において特異的に発現することが確認されているため、hTROP-2、特に遊離hTROP-2hTROP-2の細胞外領域部分は、各種腫瘍マーカーとして利用することが可能である。なかでも、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌及びヒト乳癌のマーカーとして利用することが好ましい。そこで、本発明の抗hTROP-2抗体を生体試料と反応させ、反応した抗体のシグナルを検出することにより、腫瘍を検出することができる。得られた抗体のシグナルは、生体試料中の抗原量すなわちhTROP-2量又は遊離hTROP-2量の指標となる。本発明の抗体を用いた腫瘍の検出は、まず、検体として被験者から採取した生体試料、例えば検査対象とする組織片又は血液等と、本発明の抗体とを、抗原抗体反応によって結合させる。次いで、結合した抗体量の測定結果に基づいて、生体試料中の目的とする抗原量を測定することにより行う。当該測定は、公知の免疫学的測定法に従って行えばよく、例えば、免疫沈降法、免疫凝集法、標識免疫測定法、免疫比懸濁法、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法などを用いることができる。標識免疫測定法では、抗体のシグナルは、標識抗体を用いて直接検出した標識量で表すほか、既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準液として相対的に表してもよい。すなわち、標準液と検体を測定計により測定し、標準液の値を基準にして生体試料中の抗体シグナルを相対的に表すことができる。標識免疫測定法としては、例えばELISA法、EI法、RIA法、蛍光免疫測定FIA法、化学発光免疫測定法Luminescenceimmunoassay等が挙げられる。なかでも特に、ELISA法が、簡便かつ高感度という点で好ましい。本発明においては、上記検出方法により得られた検出結果を指標として腫瘍の状態を評価又は診断することができる。例えば、検出結果が所定の基準値を超えるものを腫瘍陽性、所定の基準値以下のものを腫瘍陰性とし、陽性の場合には、いずれかの腫瘍を発症している可能性があると判断し、腫瘍の状態を評価することができる。ここで、腫瘍の状態とは、腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味し、腫瘍の発症の有無、進行度、悪性度、転移の有無及び再発の有無等が挙げられる。上記評価にあたり、腫瘍の状態としては1つを選択してもよいし、複数個を組み合わせて選択してもよい。腫瘍の有無の評価は、得られた検出結果に基づいて、所定の基準値を境界として腫瘍に罹患しているか否かを判断することにより行うことができる。腫瘍の悪性度は、癌がどの程度進行しているのかを示す指標となるものであり、検出結果に基づいて、病期Stageを分類して評価したり、あるいは早期癌や進行癌を分類して評価したりすることも可能である。例えば、検出結果を指標として早期癌又は進行癌であると評価することもできる。腫瘍の転移は、検出結果を指標として、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価することができる。再発は、間欠期又は寛解の後に検出結果が再び所定の基準値を超えたか否かにより評価することができる。6.腫瘍の検出用又は診断用キット本発明の抗hTROP-2抗体は、腫瘍の検出用又は診断用キットの形態で提供することができる。本発明のキットは抗体を含むが、その他に、標識物質、あるいは抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質発色性基質等、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器エッペンドルフチューブ等、ブロッキング剤BovineSerumAlbuminBSA,Skimmilk,Goat血清等の血清成分、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル説明書等を含んでいてもよい。本発明のキットは、上記本発明の検出方法を行うために有効に用いることができ、極めて有用性が高いものである以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。[hTROP-2遺伝子のクローニング]hTROP-2遺伝子全長の単離は、ヒト胎児肝臓胎生10週からRT-PCR法により行った。まずhTROP-2遺伝子GenbankaccessionNo.NM_002353の配列をもとに以下に示すPCRプライマーを設計した。このとき、リバース側プライマーにはストップコドンを除き、XhoIによる制限酵素消化配列を付加した。これらのプライマーとヒト胎児肝臓胎生10週より調製した全RNATAKARAから合成したcDNAを鋳型としてPCR反応を行った。その後、アガロースゲル電気泳動による展開、目的のバンドの抽出を行い、pCRIIベクターInvitrogenにクローニングしたpCRII-hTROP2。クローニングしたhTROP-2のcDNAはシークエンスにより確認した。発現ベクターの構築は、pCRII-hTROP2からhTROP-2遺伝子を含むEcoEcoRI/XhoI部位に挿入して行ったpcDNA4-hTROP2-myc/His。またpcDNA4-hTROP2-myc/HisからhTROP-2遺伝子を含むHindIII/PmeI断片を切り出しHindIII切断部位は平滑末端化した、pcDNA3.1ベクターInvitrogenのPmeI部位へ挿入することでネオマイシン耐性遺伝子を持つ発現ベクターを構築したpcDNA3.1-hTROP2-myc/His。[hTROP-2遺伝子安定細胞株の構築]上記の方法で作製したhTROP-2の全長cDNAをコードした発現ベクターpcDNA3.1-hTROP2-myc/Hisを、HEK293細胞RIKEN、HuH-7細胞HSRRB、7E2-C細胞WO2005/052156に記載、CHO-K1細胞HSRRBにリポフェクタミン2000試薬Invitrogenを用いて遺伝子導入し、抗生物質G418geneticin,GIBCOBRLによる選択を行った後、hTROP-2を安定して発現している細胞株を樹立することにより得た。[hTROP-2細胞外領域のリコンビナントタンパク質作製]hTROP-2細胞外領域の一部具体的には、配列番号2で示されるアミノ酸配列のうちの第1番目~第263番目のアミノ酸からなる領域をコードする遺伝子断片はPCR法により増幅した。増幅に使用したプライマーは以下の通りである。このとき、リバース側プライマーにXhoIによる制限酵素消化部位を付加した。PCR法により増幅したDNA断片はアガロースゲル電気泳動により展開し、QIAquick登録商標GelExtractionKitQIAGENを用いて精製した。精製したDNA断片はpCRBluntベクターInvitrogenにサブクローニングしpCRB-hTROP-2EC、遺伝子配列を確認した。次にpCRB-hTROP-2ECからhTROP-2の細胞外領域をコードする遺伝子断片を含むEcoRI/XhoI断片を挿入したpcDNA4mH-hTROP-2EC。さらにpcDNA4mH-hTROP-2ECのBamHI/EcoRI部位にNruI制限酵素切断部位を作製するため、以下に示すオリゴヌクレオチドを会合させ挿入した。同様にpcDNA4mH-hTROP-2ECのPmeI部位にpBglIIリンカーTAKARAを挿入したpcDNA4mH-NB-hTROP-2EC。バキュロウイルスを用いたリコンビナントタンパク質作製のため、pcDNA4mH-NB-hTROP-2ECからhTROP-2の細胞外領域をコードする遺伝子断片を含むNruI/BglII断片を切り出し、pPSC8ベクター日本農産工業のNruI/BglII部位に挿入したpPSC8-hTROP2EC。バキュロウイルスを用いたhTROP-2細胞外領域のリコンビナントタンパク質作製は日本農産工業に委託した。hTROP-2細胞外領域のリコンビナントタンパク質の精製は以下のように行った。リコンビナントタンパク質を含む培養上清にNiSepharose6FastFlowGEHealthcareを加え、4°C、2時間結合させた。その後、エコノカラムBIORADを用いて20mMイミダゾールを含むリン酸緩衝液で洗浄、300mMイミダゾールを含むリン酸緩衝液で溶出を行い精製した。[ヒトEpCAMcDNAの単離と発現ベクターの構築]ヒトEpCAM遺伝子全長の単離は、ヒト胎児肝臓胎生10週からRT-PCR法により行った。まずヒトEpCAM遺伝子GenbankaccessionNo.NM002354の配列をもとに以下に示すPCRプライマーを設計した。このとき、リバース側プライマーにはストップコドンを除き、XhoIによる制限酵素消化配列を付加した。これらのプライマーとヒト胎児肝臓胎生10週由来の全RNATAKARAから合成したcDNAを鋳型としてPCR反応を行った。その後、アガロースゲル電気泳動による展開、目的のバンドの抽出を行い、pCRIIベクターInvitrogenにクローニングしたpCRII-hEpCAM。クローニングしたヒトEpCAMのcDNAはシークエンスにより確認した。発現ベクターの構築は、pCRII-hEpCAMからヒトEpCAM遺伝子を含むEcoEcoRI/XhoI部位に挿入して行ったpcDNA4-hEpCAM-myc/His。またpcDNA4-hEpCAM-myc/HisからヒトEpCAM遺伝子を含むHindIII/PmeI断片を切り出しHindIII切断部位は平滑末端化した、pcDNA3.1ベクターInvitrogenのPmeI部位へ挿入することでネオマイシン耐性遺伝子を持つ発現ベクターを構築したpcDNA3.1-hEpCAM-myc/His。[抗hTROP-2モノクローナル抗体の作製]免疫原としては、hTROP-2発現安定細胞株HEK293-hTROP-2細胞、CHO-K1-hTROP-2細胞、7E2-C-hTROP-2細胞、内在的にhTROP-2タンパク質を細胞表面に発現している、ヒト膵臓癌細胞株PK-59,RCB1901;RIKENcellbankより購入、または上記の方法で作製した、hTROP-2の細胞外領域のリコンビナントタンパク質を用いた。hTROP-2発現安定細胞株の場合は1×107細胞、リコンビナントhTROP-2タンパク質の場合は、20μgのタンパクを、それぞれ免疫補助剤TiterMaxGoldフナコシ株式会社と、1:1で混合してエマルジョンを調製し、マウスC57/BL6,Balb/cの両足蹠、または腹腔内に注射した初回免疫。両足蹠への短期免疫の場合は、初回免疫から3日後及び10日後に追加免疫を行い、最終免疫の翌日に、両膝膏リンパ節を採取し、リンパ球を調製した。腹腔内への長期免疫の場合は、初回免疫から1週間に1回の割合で、追加免疫を行い1~2ヵ月間実施、常法に従い、脾臓よりB細胞を単離した。追加免疫は、細胞免疫では5×106細胞のPBSによる細胞懸濁液を用い、タンパク質抗原の場合は、5μgのPBS溶液を用いた。調製したリンパ球とマウスミエローマ細胞株P3-X63-Ag8.653とを、3:1の割合で混合し、ポリエチレングリコール法で細胞融合を行い、HATヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含むメチルセルロース培地商品名:ClonaCell-HYCloningMediumD;StemCellで7~28日間培養し、増殖してきたハイブリドーマの単一コロニーを、1つ1つを96穴平底プレートにピックアップして、HATを含む液体選択培地を用い、5CO2インキュベーターで培養した。増殖してきた単一コロニー由来のハイブリドーマの培養上清を、CellELISA後述による一次スクリーニング、HuH-7-hTROP-2細胞,PK-59を用いたFACS解析で2次スクリーニングを行うことで、生細胞の細胞表面に発現しているhTROP-2タンパク質を認識する抗hTROP-2モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを300種類樹立した。[CellELISAを用いた一次スクリーニング]96穴培養プレートBDファルコンに、CHO-K1細胞hTROP-2陰性コントロール:ヒューマンサイエンス振興事業団より購入とCHO-K1-hTROP-2細胞または、HuH-7細胞hTROP-2陰性コントロール:ヒューマンサイエンス振興事業団より購入とHuH-7-hTROP-2細胞を3×104細胞/ウェルで交互に播種し、5CO2、37°Cで1~2日間培養した。デカンテーションで細胞培養液を除去し、次いで、氷冷PBSで洗浄後、4パラホルムアルデヒド-PBSで5分間処理することにより細胞を固定し、氷冷PBSで洗浄後ELISAプレートとした。以後、常法に従い、ELISA法を行った。具体的には以下のとおりである。まず、2スキムミルク-PBS溶液によるブロッキングを室温で30分~1時間行った。次に、ハイブリドーマ培養上清を加え、室温で1時間反応させた後、0.1Tween20-PBS溶液で3回洗浄した。二次抗体として、ブロッキング溶液で1000倍希釈した、HorseradishperoxidaseHRP標識抗マウスIgGGEヘルスケアバイオサイエンスを加え、室温で1時間反応させた後、0.1Tween20-PBS溶液で3回洗浄した。TMB3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine:SIGMA基質溶液を添加して発色反応を行い、1M硫酸を加えて反応を停止させた。MicroplatereaderModel550バイオラッドを用いて、吸光度405nmを測定した。陰性コントロールに対して、高い吸光度の値を示したハイブリドーマ培養上清に対応するハイブリドーマを24穴平底プレートに拡大培養を行い、FACS解析を用いた二次スクリーニング後述に移行した。[FACS解析を用いた二次スクリーニング]上記のCellELISAを用いた一次スクリーニングで陽性であったハイブリドーマについて、FACS解析を用いた二次スクリーニングを行った。細胞は、hTROP-2を発現していないヒト肝癌細胞株であるHuH-7細胞を陰性コントロールとして、hTROP-2を発現させた安定細胞株であるHuH-7-hTROP-2細胞に対する反応性を指標に評価し、次に内在的にhTROP-2タンパク質を細胞表面に発現しているヒト膵臓癌細胞株であるPK-59細胞RCB1901;RIKENcellbankより購入との反応性で評価した。細胞はトリプシン処理によって培養皿から剥がし、細胞懸濁液細胞密度2×106cells/mLを調製した。CellELISAを用いた一次スクリーニングで陽性反応を示したハイブリドーマ培養上清と細胞懸濁液100μLとを、4°Cで20分間反応させた。PBSで洗浄後、PE標識抗マウスIgGBDファーミンゲン0.1μgと反応4°C、30分させた後、FACSCaliburベクトンディッキンソンにより解析した。最終的に、生細胞の細胞表面に発現しているhTROP-2タンパク質を認識する抗hTROP-2モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを約300種類樹立した。[アイソタイプの同定]作製した抗hTROP-2モノクローナル抗体のアイソタイプは、MOUSEMONOCLONALANTIBODYISOTYPINGTESTKITSerotec社を用いて、キット添付の方法に従って行った。[TROP-2抗体の腹水化及び抗体精製]上記方法で作製したハイブリドーマのクローンを、予め7日前2,6,10,14-テトラメチルペンタデカンプリスタンを投与されたBALB/cヌードマウスの腹腔内に3×106個投与し、2週間後の腹水を採取した。さらに、この腹水から、カプリル酸沈澱、プロテインGカラムHiTrapproteinG;GEヘルスケアバイオサイエンス、またはプロテインAカラムHiTrapproteinA;GEヘルスケアバイオサイエンスを用いてアフィニティー精製を行うことで、各ハイブリドーマクローンが産生する抗hTROP-2モノクローナル抗体を得た。[抗原親和性の測定Kd値の測定]作製した抗hTROP-2モノクローナル抗体の抗原親和性Kd値は、ELISAを用いた方法で算出したDjavadi-OhanianceL.etal1996,InAntibodyEngineering,Chapter4,pp77-97.IRLPress,Oxford。具体的には、96穴培養プレートコーニングに、精製したリコンビナントhTROP-2タンパク質0.1μg/mLを添加して抗原を固相化した室温,1時間、または4°C,一晩。次に、PBSで3回洗浄し、2スキムミルクPBS溶液を加えてブロッキングを行った室温、1時間。PBSで2回洗浄後、予め抗原溶液精製hTROP-2タンパク質;50,25,12.5,6.25,3.125nMと抗hTROP-2モノクローナル抗体の各クローン0.5nMとを混合し平衡化させておいた抗原-抗体複合体を、上記ELISAプレートに添加して反応させた室温、1時間。PBSで3回洗浄した後、ブロッキング液で希釈したHRP標識抗マウスIgG最終濃度1μg/mLGEヘルスケアバイオサイエンスと反応させた室温、1時間。次いで、0.1Tween20-PBS溶液で3回洗浄した後に、TMB3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine:SIGMA基質溶液を添加して発色反応を行い、1M硫酸を加えて反応を停止させた。MicroplatereaderModel550バイオラッドを用いて、吸光度を測定した。解離定数Kdの計算式は以下の通りとした。抗原抗体反応は質量作用の法則により、Kd=k2/k1=Agf×Abf/Ag-Ab=Agf×Abf/x22式で、Agfは遊離抗原の濃度、Abfは遊離抗体の濃度、Ag-Abは抗原-抗体複合体の濃度を表し、Ag-Ab=xとおくと、遊離抗体濃度は、Abf=Abt-x32式は、Kd=Agf×Abt-x/x44式の両項にx/Kd×Abtをかけると、x/Abt=Agf×1-×/Abt×1/Kdx/Abt×1/Agf=1-x/Abt×1/Kd55式において、X=x/Abt,Y=x/Abt×Agfとおくと、Y=1-X×1/Kd66式から、Kd値を算出した。上記の方法で、作製した抗hTROP-2モノクローナル抗体300クローンのKd値を測定した結果、1×10-10M以下のKd値を示すクローンが133クローン、1×10-11M以下のKd値を示すクローンが59クローン、1×10-12M以下のKd値を示すクローンが2クローンであった。invivoで腫瘍成長阻害活性を示した、抗hTROP-2モノクローナル抗体のうち、K5-70マウスIgG2a、T6-16マウスIgG2a、K5-107マウスIgG1、K5-116-2-1マウスIgG1、及びT5-86マウスIgG1のKd値は、それぞれ順に、6.8×10-12M、4.3×10-12M、4.7×10-12M、2.69×10-11M、及び8.49×10-11Mであった図1、表1。[抗hTROP-2モノクローナル抗体のヒト癌細胞株との反応性]ヒト癌細胞株ヒト腫瘍細胞株は、ヒューマンサイエンス振興事業団HSRRB、RIKENcellbankRIKEN,ATCCAmericanTypeCultureCollection、ECACCEuropeanCollectionofCellCultures、DSMZGermanCollectionofMicroorganismsandCellCulturesより入手したものを使用した。具体的には、以下に列挙した通りである。huH-1HSRRB,HUH-6HSRRB,HuH-7HSRRB,JHH-5HSRRB,JHH-6HSRRB,JHH-7HSRRB,HLEHSRRB,HLFHSRRB,HepG2HSRRB,AlexanderHSRRB,KP-1NHSRRB,KP-1NLHSRRB,KP-2HSRRB,KP-3HSRRB,KP-3LHSRRB,PK-1RIKEN,PANC-1RIKEN,MIAPaCa-2HSRRB,PK-59RIKEN,PK-45HRIKEN,PK-45PRIKEN,BxPC-3ATCC,SUIT-2HSRRB,TCC-PAN2HSRRB,SW480ATCC,DLD-1HSRRB,LoVoHSRRB,COLO-320RIKEN,CACO-2RIKEN,CW-2RIKEN,HCT116ATCC,HCC-56HSRRB,MCF-7HSRRB,JIMT-1DSMZ,HCC1143ATCC,A549HSRRB,DU145RIKEN,PC-3HSRRB癌細胞はトリプシン処理によって培養皿から剥がし、細胞懸濁液細胞密度2×106cells/mLを調製した。細胞懸濁液100μLに抗hTROP-2モノクローナル抗体を加え0.1μg、4°Cで20分間反応させた。PBSで洗浄後、PE標識抗マウスIgGBDファーミンゲン0.1μgと反応4°C、30分させた後、FACSCaliburベクトンディッキンソンにより解析した。作製した抗hTROP-2抗体は、いずれも内在的にhTROP-2を発現していないヒト肝癌細胞株HuH-7とは結合せず、一方hTROP-2遺伝子を発現させた安定細胞株であるHuH-7-hTROP-2細胞には結合を示した図2。次に、作製した抗hTROP-2モノクローナル抗体のヒト癌細胞株内在的に細胞表面に発現しているhTROP-2タンパク質との反応性をFACS解析により検討した結果、作製した300種類の抗hTROP-2モノクローナル抗体は、全て、ヒト膵臓癌細胞株PK-59、BxPC-3との結合を示し、特に、invivoで腫瘍成長阻害活性を示した、K5-70,T6-16,K5-107,K5-116-2-1,T5-86抗体は、PE標識抗マウスIgGBDファーミンジェンのみと反応させた場合と比較して、PK-59細胞では、平均蛍光強度でK5-7044倍、T6-1659倍、K5-10789倍、K5-116-2-1122倍、T5-8615倍図3、BxPC-3細胞では、K5-7045倍、T6-1625倍、K5-10790倍、K5-116-2-1121倍、T5-8610倍と、いずれの抗体も高い結合を示した図4。PK-59とBxPC-3以外のヒト癌細胞株では、膵臓癌細胞株12種類のうち、KP-2,KP-3L,PK-1,PK-45H、SUIT-2、TCC-PAN2に結合し、KP-1N,KP-1NL,KP-3,PANC-1,MIA-PaCa2には結合しなかった図5。ヒト大腸癌細胞株では、CACO-2,SW480,DLD-1,HCT116に結合し、COLO-320,CW-2には結合しなかった図6。その他、JIMT-1,HCC1143いずれもヒト乳癌細胞株、PC-3,DU145いずれもヒト前立腺癌細胞株と結合し、多くのヒト癌細胞株の細胞表面に内在的に発現しているhTROP-2タンパク質を認識した図6。[マウスTROP-2タンパク質、ヒトTROP-1/EpCAMタンパク質との交差反応性]作製した抗hTROP-2モノクローナル抗体の特異性を調べる目的で、hTROP-2タンパク質とアミノ酸配列で80の相同性を示すマウスTROP-2タンパク質、hTROP-2タンパク質とアミノ酸配列で50の相同性を示すヒトTROP-1/EpCAMとの反応性をFACS解析にて行った。具体的には、マウスTROP-2遺伝子GenBankaccessionNo.NM_020047、Y08830の全長cDNAを含む発現ベクターマウスTROP-2-pcDNA3.1、東京大学分子細胞生物学研究所より供与、およびヒトTROP-1/EpCAM遺伝子GenBankaccessionNo.NM_002354の全長cDNAを含む発現ベクターpcDNA3.1-hEpCAM-myc/Hisを、それぞれLipofectamine2000試薬Invitrogenを用いて、一過性にCHO-K1細胞に遺伝子導入を行い、24~48時間後に細胞をトリプシン処理で培養皿から剥がして細胞懸濁液を調整し、作製した抗hTROP-2モノクローナル抗体0.1μg、PE標識抗マウスIgGと順次反応させた後、FACSCaliburにより解析した。マウスTROP-2遺伝子を一過性に発現させたCHO-K1細胞において、陽性対照として用いたマウスTROP-2と交差反応を示すT2-102抗体マウスIgG1は強い結合を示し、一方、K5-70,T6-16,K5-107,K5-116-2-1,T5-86抗体はマウスTROP-2との交差反応は示さなかった図7。同様に、ヒトEpCAM/TROP-1遺伝子を一過性に発現させたCHO-K1細胞において、陽性対照として用いた抗ヒトEpCAMモノクローナル抗体BDファーミンジェンは強い結合を示し、一方、K5-70,T6-16,K5-107,K5-116-2-1,T5-86抗体はヒトEpCAM/TROP-1との交差反応は示さなかった図8。以上の結果は、作製した抗hTROP-2モノクローナル抗体、特にinvivoで抗腫瘍活性を示したK5-70,T6-16,K5-107,K5-116-2-1,T5-86抗体は、hTROP-2に特異的に結合することが示された。[細胞増殖阻害活性の測定]抗hTROP-2モノクローナル抗体のhTROP-2の機能阻害を調べる方法の1つとして、内在的にhTROP-2を細胞表面に発現しているヒト癌細胞の細胞増殖に対する影響を、テトラカラーワン生化学工業を用いた生細胞数の測定に基づいて評価した。具体的には、PK-59細胞を0.5のウシ胎児血清BioWest社製を含むRPMI1640培地に2×105細胞/mLの細胞濃度となるように細胞懸濁液を調製し、96穴培養プレートに100μLずつ播種した。次いで、マウスIgG陰性コントロール、抗hTROP-2モノクローナル抗体最終濃度0.1,1μg/mLを添加し、37°C、5CO2インキュベーターで72時間培養した。比較対照として、市販の抗hTROP-2モノクローナル抗体クローンYY01,SantaCruzを使用した。細胞にテトラカラーワン生化学工業を添加し、5CO2インキュベーターで1~2時間反応させた。反応後の96穴プレートを、そのままマイクロプレートリーダーを用いて波長490nm対照波長:655nmの吸光度を測定した。各群3ウェルで実施し、Student’st検定Student’st-testで有意差検定を行い、P<0.05を統計的に有意と判定した。これまでに自社で作製した抗hTROP-2モノクローナル抗体のうち、約160クローンについて、上記の方法でPK-59細胞の細胞増殖に与える効果を調べたところ、invivoで腫瘍成長阻害活性を示した、T6-16,T5-86,K5-70,K5-107は、マウスIgG陰性コントロールと比較して、20~40の細胞増殖阻害活性が確認され、これら抗hTROP-2抗体は、ヒト癌細胞表面に発現するhTROP-2タンパク質に結合し、hTROP-2タンパク質の機能を中和し、癌細胞の増殖を阻害する活性を有することが明らかとなった図9。[スクラッチアッセイ]抗hTROP-2モノクローナル抗体のヒト癌細胞の移動能をスクラッチアッセイで評価した。PK-59細胞を10のウシ胎児血清を含むRPMI1640培地に3×105cell/mLの細胞濃度となるように細胞懸濁液を調製し、96穴培養プレートに100μLずつ播種した。細胞がコンフルエントに達した段階で、チップの先端で縦に線を引くようにして単層培養した細胞の一部を剥離した。抗hTROP-2モノクローナル抗体、および陰性コントロールとしてマウスIgGを最終濃度が0.1、および1μg/mLとなるように培地に添加し、24時間培養を行い、抗体添加前Day0と24時間培養後Day1の剥離した領域の写真を撮影し、細胞間距離を測定した。また、剥離領域の面積をScionImageソフトウェアで定量化した。各群8ウェルで実施し、Student’st-testで有意差検定を行い、P<0.05を統計的に有意と判定した。スクラッチ領域に浸潤する細胞の運動能に対するhTROP-2抗体の効果を調べた。細胞増殖阻害アッセイと同様に薬効のあった抗体を評価した。評価方法として、Day0抗体添加時およびDay124時間経過後の細胞を撮影し、移動距離μmおよび、スクラッチ領域の面積を画像解析した。結果、図10に示すように、細胞の運動能に明らかな違いが見られた。本試験に使用したT6-16およびK5-70はコントロールと比較し、どちらも有意な増殖阻害が見られ、再現性試験においても同様の傾向が確認できた。特にT6-16についてはP<0.01byStudent’st-testであり、invivoの試験との相関性が認められた。[担癌マウスでの抗hTROP-2モノクローナル抗体の薬効評価]PrevensionモデルhTROP-2を発現する膵癌細胞株PK-59,BxPC-3をトリプシン処理で剥がし、PBSで1×108cells/mLの細胞懸濁液を調製し、氷上にて等量のマトリゲルBDファーミンゲンと混合した。6週齢の雌のヌードマウスBalb/c,nu/nuの右脇腹の皮下に26Gのシリンジを用いて100μL5×106cell注射した。癌細胞移植当日Day1に、マウスを群分し、抗体の投与1,5,または10mg/kg体重、腹腔内投与を開始した。以降は、3日に1回の間隔で同様の投与を行った。抗腫瘍活性は、腫瘍形成頻度及び腫瘍体積により評価した。腫瘍体積の計測は、以下の計算式を用いた。腫瘍体積mm3=短径2×長径×π/6TreatmentモデルhTROP-2を発現する膵癌細胞株PK-59,BxPC-3をトリプシン処理で剥がし、PBSで1×108cells/mLの細胞懸濁液を調製し、氷上にて等量のマトリゲルBDファーミンゲンと混合した。6週齢の雌のヌードマウスBalb/c,nu/nuの右脇腹の皮下に26Gのシリンジを用いて100μL5×106cells注射した。癌細胞移植から5~6日後、腫瘍体積が50~150mm3平均値で約100mm3に成長したマウスを群分し、群分した当日を1日目Day1として、抗体投与を開始した。抗体は3日に1回の間隔で腹腔内投与を行った10mg/kg体重。抗腫瘍活性は、腫瘍体積を計測することによって評価した。有意差検定は、Student’st-testで行い、P<0.05を統計的に有意と判定した。[ヒト膵癌細胞Xenograftモデルにおける抗hTROP-2モノクローナル抗体のinvivoにおける抗腫瘍活性の検討]hTROP-2を標的とした癌治療用抗体は、XenograftTreatmentモデルにおいて、hTROP-2を発現する腫瘍組織を特異的に死滅させるか、腫瘍の成長を阻害する活性を示すことが必須である。本発明において新たに作製した抗hTROP-2モノクローナル抗体約160クローンを、膵癌細胞株PK-59細胞のXenograftTreatmentモデルで評価した。PK-59細胞は、膵臓癌幹細胞マーカーであるEpCAMを発現し図11AChenweiLi,etal.CancerRes2007;67:3.1030-1037,薬剤耐性に関わるABCトランスポーターであるP-glycoprotein/MDR1図11B,ABCG2/CDw338図11Cを細胞表面に発現しているChen,C.J.etal.Cell473,381-3891986,Allikmets,R.,etal.Hum.Mol.Genet.510,1649-16551996。また、膵臓癌幹細胞の特徴であるCD24とCD44共陽性の細胞画分8.93図11Dを含み、悪性度の高いヒト膵臓癌細胞株であると推測されるChenweiLi,etal.CancerRes2007;67:3.1030-1037、JaneE.VisvaderandGeoffreyJ.Lindeman.NatRevCancer.Vol.810:755-68,2008。新規に作製した約160クローンのうち、大部分のクローンはPK-59細胞XenograftTreatmentモデルでは薬効を示さなかったが、その中でも有意な腫瘍成長阻害活性を示す以下のクローン、すなわちクローンK5-70,T6-16,K5-107,T5-86及びK5-116-2-1が得られた。クローンK5-70マウスIgG2a投与群では、腫瘍成長速度が統計的に有意に阻害され、投与開始後21日目Day21において、コントロール群N=14の腫瘍体積が1200.8±377.3mm3に対し、クローンK5-70投与群では748.7±162.9mm3P<0.01byStudent’st-testであった図12A。抗体投与開始時点での腫瘍体積を1.0としたときの、21日目Day21における腫瘍体積は、コントロール群が12.5であるのに対し、クローンK5-70投与群では7.8であった図12A。摘出した腫瘍重量も、コントロール群が0.73±0.26gであったのに対し、クローンK5-70投与群では0.43±0.14gP<0.01byStudent’st-testであり、約60の阻害を示した図12B。同様に、クローンK5-107マウスIgG1投与群N=8、クローンT6-16マウスIgG2a投与群N=8、クローンT5-86マウスIgG1及びクローンK5-116-2-1マウスIgG2a投与群N=8でも、腫瘍成長速度が統計的に有意に阻害された。クローンK5-107投与群N=8並びにクローンT6-16投与群N=8では、投与開始後17日目Day17において、コントロール群N=8の腫瘍体積が1039.3±271.6mm3に対し、それぞれ698.2±175.9mm3P<0.05byStudent’st-test、707.2±254.5mm3P<0.05byStudent’st-testであった。同様に、クローンK5-116-2-1投与群N=8では、投与開始後16日目Day16において、コントロール群N=8の腫瘍体積が797.0±172.9mm3に対し、508.5±225.2mm3P<0.05byStudent’st-testであった図13。一方、クローンT5-86については、投与開始後15日目Day15において、コントロール群N=8の腫瘍体積が1033.2±319.4mm3に対し、クローンT5-86投与群N=8では744.1±289.1mm3であり、腫瘍体積の比較では有意差はつかなかったものの、同日における腫瘍重量の比較では、コントロール群が0.62±0.14gであったのに対し、クローンT5-86投与群では0.44±0.13gP<0.05byStudent’st-testであり有意な阻害が示された。また、下記表2に、各クローン抗体投与群の実験最終日におけるコントロール群との比率T/Cを、腫瘍体積および腫瘍重量のそれぞれについて示した。表2に示した通り、各クローン抗体投与群において、それぞれT/C=62~72の有意な阻害が得られた。また、クローンK5-70、クローンT6-16、クローンK5-116-2-1について、それぞれ膵癌細胞株PK-59細胞のXenograftPreventionモデルでの抗腫瘍活性を検討した。それぞれのクローンにおいて、抗体投与後全ての個体でN=8腫瘍成長が阻害され、クローンK5-70投与群10mg/kg体重では、投与開始後18日目Day18において、コントロール群N=8の腫瘍体積が880.8±206.4mm3に対し、62.4±80.4mm3P<0.01byStudent’st-testと92.9の腫瘍成長阻害活性を示し、クローンT6-16投与群10mg/kg体重では、投与開始後28日目Day28において、コントロール群N=8の腫瘍体積が992.3±250.8mm3に対し、152.4±122.3mm3P<0.01byStudent’st-testと84.6の腫瘍成長阻害活性、クローンK5-116-2-1投与群10mg/kg体重では、クローンK5-116-2-1投与群10mg/kg体重では、投与開始後20日目Day20において、コントロール群N=8の腫瘍体積が1159.4±413.3mm3に対し、207.7±319.2mm3P<0.01byStudent’st-testと82.1の腫瘍成長阻害活性を示した図14,表3。また、すべての実験において、試験期間を通じて、コントロール群と抗hTROP-2抗体投与群の間に、平均体重の変化に有意な差はなかった。下記表3に、各クローン抗体投与群の、実験最終日におけるコントロール群との比率T/Cを、腫瘍体積および腫瘍重量それぞれについて示した。表3に示したとおり、各クローン抗体投与群において、有意な腫瘍成長阻害が見られ、特にクローンK5-70投与群では、T/C=10以下の顕著な効果が確認された。公知の抗TROP-2抗体AR47A6.4.2米国特許第7420041号は、様々なヒト癌細胞株を用いた20mg/kgの投与量で、Xenograftprevensionモデルで腫瘍成長阻害効果を示しているが、ヒト膵臓癌細胞株PL45細胞では、ほぼ100の腫瘍成長を阻害しているものの、膵臓癌細胞株BxPC-3では約50、前立腺癌細胞株PC-3では約40,乳癌細胞株であるMCF-7では約60,大腸癌細胞株Colo205で約40の腫瘍成長阻害効果であったことに対して、本願発明の抗hTROP-2抗体は、半分の投与量10mg/kgで、より強い腫瘍成長阻害効果を発揮した。[ヒト膵癌細胞株BxPC-3細胞のXenograftモデルPreventionモデルおよびTreatmentモデルにおける抗腫瘍活性の検討]上記のヒト膵癌細胞株PK-59細胞のXenograftTreatmentモデルを用いた場合と同様に、ヒト膵癌細胞株BxPC-3細胞のXenograftPreventionモデル及びXenograftTreatmentモデルでの抗腫瘍活性を、クローンK5-70について検討した。クローンK5-70投与群N=8では、コントロール群N=8と比較して、腫瘍成長が有意に阻害され、52日目Day52において、コントロール群N=8の腫瘍体積が616.3±266.8mm3であったのに対し、クローンK5-70投与群N=8では236.0±136.4mm3と61.7の腫瘍成長阻害効果を示したP<0.01byStudent’st-test図15。以上の結果より、抗hTROP-2モノクローナル抗体は、少なくとも2つ以上の複数の癌細胞種に対して、invivoでの有意な腫瘍成長阻害活性を示すことが明らかとなった。[抗hTROP2抗体クローンK5-70の、hTROP2発現膵癌細胞株PK-59細胞Xenograftpreventionモデルにおける用量依存的な抗腫瘍活性]抗hTROP-2抗体のinvivoにおける腫瘍成長阻害活性を、より詳細に検討する目的で用量依存性試験を行った。図16に示したとおり、PK-59細胞の腫瘍の成長はK5-70の投与によって用量依存的に阻害され、抗体投与後21日目Day21において、コントロール群N=7の腫瘍体積が937.8±295.3mm3であったのに対し、K5-701mg/kg投与群N=8が493.5±305.1mm3と50の阻害率を示し、K5-705mg/kg投与群N=8が124.7±89.0mm3と90の阻害効果を示し、公知の抗TROP-2抗体AR47A6.4.2米国特許第7420041号と比較して、20分の1の投与量でほぼ同等のinvivoにおける腫瘍成長阻害効果を示し、4分の1の投与量では、より高い90の阻害効果を示すことが明らかになった。[エピトープアッセイ]ヒト/マウスキメラTROP-2タンパク質の作製ヒト/マウスキメラTROP-2遺伝子はPCR法を用いて作製した。ヒトTROP-2遺伝子配列およびマウスTROP-2遺伝子配列GenbankaccessionNo.NM_020047をもとに以下に示すPCRプライマーを設計した。ヒト/マウスTROP-2-Cプライマーヒト/マウスTROP-2-Aプライマーヒト/マウスTROP-2-Bプライマーマウス/ヒトTROP-2-Dプライマーマウス/ヒトTROP-2-Eプライマーマウス/ヒトTROP-2-FプライマーマウスTROP-2プライマーマウスTROP-2リバース側プライマーにはストップコドンを除き、XhoIによる制限酵素消化配列を付加した。作製したヒト/マウスキメラTROP-2タンパク質の模式図を図17に示す。hmTROP-2-Aキメラタンパク質は、hTROP-2タンパク質のN末端から69番目までのポリペプチドとマウスTROP-2タンパク質の64番目からC末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。hmTROP2-Bキメラタンパク質は、hTROP-2タンパク質のN末端から101番目までのポリペプチドとマウスTROP-2タンパク質の96番目からC末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。hmTROP2-Cキメラタンパク質は、hTROP-2タンパク質のN末端から145番目までのポリペプチドとマウスTROP-2タンパク質の140番目からC末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。mhTROP-2-Dキメラタンパク質は、マウスTROP-2タンパク質のN末端から139番目までのポリペプチドとhTROP-2タンパク質の146番目からC末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。mhTROP-2-Eキメラタンパク質は、マウスTROP-2タンパク質のN末端から187番目までのポリペプチドとhTROP-2タンパク質の194番目からC末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。mhTROP-2-Fキメラタンパク質は、マウスTROP-2タンパク質のN末端から227番目までのポリペプチドとhTROP-2タンパク質の234番目からC末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。上記キメラタンパク質を作製するための発現ベクターは、具体的には以下の方法で構築した。hmTROP-2-Aキメラ遺伝子を作製するためhTROP-2遺伝子を鋳型にして、hTROP-2フォワード側プライマー及びヒト/マウスTROP-2-AプライマーY613を用いてPCRを行った。同様にマウスTROP-2遺伝子を鋳型にして、ヒト/マウスTROP-2-AプライマーY612及びマウスTROP-2リバース側プライマーを用いてPCRを行った。PCRにより増幅したDNA断片はアクリルアミドゲルを用いて展開、目的バンドの抽出により回収した。次に抽出した2種類のDNA断片を混合して鋳型とし、hTROP-2フォワード側プライマー及びマウスTROP-2リバース側プライマーを用いてPCRを行った。PCR産物はアガロースゲル電気泳動により展開し、目的のDNA断片を抽出した。抽出したDNA断片はpCR登録商標-BluntベクターInvitrogenにクローニングしpCRB-hmTROP-2-A、遺伝子配列を確認した。動物細胞用発現ベクターは、pcDNA3.1-hTROP-2-myc/HisからEcoRI/XhoI消化によりhTROP-2遺伝子を除き、pCRB-hmTROP-2-Aから調製したhmTROP-2-Aキメラ遺伝子を含むEcoRI/XhoI断片を挿入することで作製したpcDNA3.1-hmTROP-2-A-myc/His。その他hmTROP-2-BヒトTROP-2フォワード側プライマー、ヒト/マウスTROP-2-BプライマーY615、ヒト/マウスTROP-2-BプライマーY614及びマウスTROP-2リバース側プライマーを使用、hmTROP-2-CヒトTROP-2フォワード側プライマー、ヒト/マウスTROP-2-CプライマーY607及びヒト/マウスTROP-2-CプライマーY606、マウスTROP-2リバース側プライマーを使用、mhTROP-2-DマウスTROP-2フォワード側プライマー、マウス/ヒトTROP-2-DプライマーY609及びマウス/ヒトTROP-2-DプライマーY608、ヒトTROP-2リバース側プライマーを使用、mhTROP-2-EマウスTROP-2フォワード側プライマー、マウス/ヒトTROP-2-EプライマーY617及びマウス/ヒトTROP-2-EプライマーY616、ヒトTROP-2リバース側プライマーを使用、mhTROP-2-FマウスTROP-2フォワード側プライマー、マウス/ヒトTROP-2-FプライマーY619及びマウス/ヒトTROP-2-FプライマーY618、ヒトTROP-2リバース側プライマーを使用についても同様の方法でキメラ遺伝子を作製し、発現ベクターを構築したpcDNA3.1-hmTROP-2-B-myc/His、pcDNA3.1-hmTROP-2-C-myc/His、pcDNA3.1-hmTROP-2-D-myc/His、pcDNA3.1-hmTROP-2-E-myc/His、pcDNA3.1-hmTROP-2-F-myc/His。hTROP-2、ヒト/マウスキメラTROP-2-C、及びマウス/ヒトキメラTROP-2-Dタンパク質を恒常的に発現するHEK293細胞株の樹立HEK293細胞株に上記発現ベクターpcDNA3.1-hTROP-2-myc/His、pcDNA3.1-hmTROP-2-C-myc/His及びpcDNA3.1-mhTROP-2-D-myc/Hisをそれぞれ遺伝子導入した。抗生物質G418Calbiochemによる選択を行い、hTROP-2タンパク質、hmTROP-2-Cキメラタンパク質およびmhTROP-2-Dキメラタンパク質を恒常的に発現するHEK293細胞株を樹立した。膵臓癌細胞株PK-59を用いたXenografttreatmentモデルにおいて、薬効を示した抗hTROP-2モノクローナル抗体K5-70、T5-86、K5-107、T6-4、T6-16、K5-116-2-1について結合領域の同定を行った。まずhmTROP-2-C、mhTROP-2-D、それぞれのキメラタンパク質を恒常的に発現するHEK293細胞を用いて、薬効を示した抗hTROP-2モノクローナル抗体の反応性をFACS解析により検討した図18。その結果、K5-70、K5-107、T5-86、K5-116-2-1はhmTROP-2-Cと反応したがmhTROP-2-Dとは反応しなかった。一方、T6-4、T6-16はmhTROP-2-Dと反応したがhmTROP-2-Cとは反応しなかった。これらのことからK5-70、K5-107、T5-84、K5-116-2-1の結合領域はhTROP-2のN末端から145番目のアミノ酸までの領域、T6-4、T6-16の結合領域はhTROP-2の146番目のアミノ酸から274番目のアミノ酸までの領域に限定された図18。さらに詳細に結合領域の解析を行うため、hmTROP-2-A、hmTROP-2-B、mhTROP-2-E及びmhTROP-2-Fキメラタンパク質発現用ベクターを作製し、薬効を示す抗hTROP-2モノクローナル抗体との反応性を検討した図19。新たに作製したキメラタンパク発現用ベクターをHEK293細胞に遺伝子導入し、一過性に発現させた細胞を用いてFACS解析を行った。K5-70、K5-107、T5-86、K5-116-2-1はhmTROP-2-Aとは反応したがmhTROP-2-Bとは反応しなかった。調べた6種類のモノクローナル抗体はすべてhTROP-2とは反応を示した。このことからK5-70、K5-107、T5-86、K5-116-2-1の結合領域はhTROP-2のN末端から69番目のアミノ酸までの領域に存在することが明らかとなった。またT6-4、T6-16はmhTROP-2-E、mhTROP-2-F共に反応しなかったことから、hTROP-2の146番目から193番目のアミノ酸までの領域を認識することが示唆された。[免疫組織化学]<材料方法>免疫組織染色に使用した正常および癌組織アレイは以下の通りである。ヒト正常組織アレイ:Human,NormalorgansinduplicatesCatalogNo.:AB1,SuperBioChipsNormaltissuesmorethansinglespotsCatalogNo.:A103VI,ISUABXIS肺癌組織アレイ:HumanLungcancer-metastasis-normalCatalogNo.:CCA3,SuperBioChipsHumanlungcarcinomatissuewithmargintissue,2locationcoresCatalogNo.:OD-CT-RsLug03-002,ShanghaiOutdoBiotech膵臓癌組織アレイ:HumanPancreascarcinomatissuewithmono-pathologicaltypefrom60cases,2locationcoresCatalogNo.:OD-CT-DgPan03-001,ShanghaiOutdoBiotech肝臓癌組織アレイ:Hepatocellularcarcinoma,gradeI~IIIwithnormaltissuecontrols,63casestissuearraysCatalogNo.:CS03-01-002U,CybrdiHumanlivercarcinomatissuewithmono-pathologicaltypefrom30cases,2locationcoresCatalogNo.:OD-CT-DgLiv02-002,ShanghaiOutdoBiotech大腸癌組織アレイ:Human,ColorectalcancerCatalogNo.:CD3,SuperBioChipsHumancoloncarcinomawithmargintissue,2locationcoresCatalogNo.:OD-CT-DgCol03-002,ShanghaiOutdoBiotech大腸癌リンパ節転移、肝転移組織アレイ:Colorectalcolonandrectumcancerwithmatchedlymphnodemetastasistissuearray,44cases/99cores,trialslideCatalogNo.:CO991t,BiomaxusColorectalcolonandrectumcancerwithmatchedlymphnodemetastasisandnormaladjacenttissuearray,43cases/99coresCatalogNo.:CO992,BiomaxusColoncancertissues_livermetastasisCatalogNo.:A203IV,ISUABXIS乳癌組織アレイ:Human,Breastcancer-metastasis-normalCatalogNo.:CBA3,SuperBioChipsHumanbreastcarcinomawithmargintissue,2locationcoresCatalogNo.:OD-CT-RpBre03-002,ShanghaiOutdoBiotech胃癌組織アレイ:Human,StomachcancerCatalogNo.:CQ1,SuperBioChipsHumangastriccarcinomawithmargintissue,2locationcoresCatalogNo.:OD-CT-DgStm03-002,ShanghaiOutdoBiotech食道癌組織アレイ:Human,EsophaguscancerCatalogNo.:CR1,SuperBioChipsHumanesophaguscarcinomawithmargintissue,2locationcoresCatalogNo.:OD-CT-DgEso03-002,ShanghaiOutdoBiotech卵巣癌組織アレイ:Human,OvarycancerCatalogNo.:CJ1,SuperBioChips前立腺癌組織アレイ:Human,Prostatecancer-normalCatalogNo.:CA3,SuperBioChips膀胱癌組織アレイ:Bladdercarcinoma/transitionalcellcarcinoma,gradeI~IIIwithnormaltissuearraysCatalogNo.:CC12-01-001U,Cybrdi上記組織アレイの患者情報および臨床情報は添付のデータシートおよび各社のホームページから入手した。免疫組織染色法ヒト正常組織および癌組織の組織アレイパラフィン切片は、脱パラフィン処理後、37°Cで5分間ペプシンによるプロテアーゼ処理を行い、抗hTROP-2モノクローナル抗体を用いた免疫染色に使用した。DAB3,3’-ジアミノベンチジンを基質とて発色反応を行った後、対比染色としてヘマトキシリンによる核染色を行った。これらの操作はより具体的には次のようにして行なった。パラフィン包埋された切片を脱パラフィン処理した後、37°Cで5分間ペプシンDAKOによるプロテアーゼ処理を行った。抗原賦活化後、メタノールに終濃度0.3となるように過酸化水素水を加えた溶液により、室温で20分間処理し内因性のペルオキシダーゼ活性を除いた。PBSで室温5分間の洗浄を2回行った後、1.5の正常ウマ血清DAKOを含むPBS溶液を用いて室温30分間のブロッキングを行い、組織中の非特異的結合部位をふさぐ操作を行った。次に1.5の正常ウマ血清を含むPBS溶液により希釈した抗hTROP-2モノクローナル抗体cloneK5-63-17終濃度10μg/mlを室温で1時間反応させた後、PBSで室温5分間の洗浄を3回行い、続いて1.5の正常ウマ血清を含むPBS溶液により200倍に希釈したビオチン化抗マウスIgG抗体Vectorを室温で30分間反応させた。PBSによる室温5分間の洗浄を3回行った後、VectastainABCキットVectorの試薬を説明書通りに混合しABCコンプレックスを作り、これを室温で30分間反応させた。PBSで室温5分間の洗浄を3回行った後、ヒストファインペルオキシダーゼ基質シンプルステインDAB溶液ニチレイバイオサイエンスによって発色を行った。発色を確認した後、脱イオン水で5分間洗浄し、マイヤーヘマトキシリン溶液和光純薬によって核を染色し、その後アルコールで脱水、キシレンで透徹してエンテランニューメルクジャパン株式会社で封入した。<結果>ヒト正常組織におけるhTROP-2の発現ヒト正常組織におけるhTROP-2の発現パターンについて、抗hTROP-2モノクローナル抗体クローンK5-63-17を用いて解析した。ヒト正常組織組織アレイCatalogNo.:AB1,SuperBioChipsを脱パラフィン、親水化処理を行った後、タンパク質分解酵素ペプシンによる抗原の賦活化を行い、抗hTROP-2モノクローナル抗体クローンK5-63-17で免疫染色を行った図20。その結果、皮膚、食道、腎臓皮質及び髄質、膵臓、前立腺、膀胱、扁桃腺で染色が見られた。ほとんどの染色像は細胞膜への局在を示していたが図20A,B,C,D,F,G.H、一部細胞質にも発現が見られた図20.E,H。一方、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、骨格筋、肺、脾臓、胸腺などでは染色されなかった図20.I,J。ヒト癌組織におけるhTROP-2の発現ヒト癌組織におけるhTROP-2の発現hTROP-2の陽性率を調べるため、抗hTROP-2モノクローナル抗体クローンK5-63-17を用いて、ヒトの各癌種の癌組織アレイの免疫染色を行った。癌細胞の10以上が染色される組織切片をhTROP-2陽性とした。この染色結果を表4に示した。また、代表的な染色像を図21に示した。hTROP-2の発現を検討した癌種では、前立腺癌で最も陽性率が高く92.1、肺癌65.4、食道癌76.7、膀胱癌71.2などで高い陽性率であった。最も陽性率の低かったのは肝臓癌で7.61であった。癌細胞でも正常細胞と同様に、hTROP-2は細胞膜に強く局在している染色像が見られた図21.A~F,H,I。また一部は細胞質にも発現していた図21.A,B,E,G。膵臓癌でのhTROP-2の陽性率は41.9であった。このときのhTROP-2陽性率と膵臓癌のグレード分化度との関係について検討した。その結果、グレードが高い、すなわち低分化膵臓癌で高頻度に発現していた表5。[K5-70抗体の単回投与による、ヒト膵臓癌細胞株PK-59XenograftPreventionモデルでの抗腫瘍効果]クローンK5-70マウスIgG2aのinvivoにおける強い抗腫瘍活性は、ヒト膵癌細胞株PK-59を用いたXenograftPreventionモデルにおいて、10mg/kg体重の投与量で1回投与した場合においても示された。コントロール群マウスIgG10mg/kg体重,N=3では、全ての個体において腫瘍形成が観察され、細胞移植後28日目Day28における腫瘍体積は781.7±74.5mm3であったのに対して、癌細胞移植日Day1に1回K5-70を投与した群では10mg/kg体重、N=3、Day28における腫瘍体積は144.4±176.9mm3P<0.05byStudent’st-testと81.5の腫瘍成長阻害活性を示した図22A。腫瘍重量においては、Day28においてコントロール群が0.59±0.06gであったのに対し、クローンK-70投与群では0.07±0.10gP<0.01bybyStudent’st-testと88の阻害活性を示した図22B。腫瘍体積、腫瘍重量のいずれにおいても、K5-70投与群では3個体中2個体では、1回の10mg/kg体重の投与で、完全に腫瘍形成が阻害された図22C。[ヒト大腸癌細胞株SW480細胞Xenografttreatmentモデルにおける抗ヒトTROP-2モノクローナル抗体の抗腫瘍活性]抗ヒトTROP-2モノクローナル抗体クローンK5-70,K5-116-2-1,T6-16の抗腫瘍活性を、ヒト大腸癌細胞株SW480を用いたXenografttreatmentモデルで検討した。5×106cellsのSW480細胞を6週齢雌のNOD-scidマウスの右脇腹皮下に移植Day1し、平均の腫瘍体積が100mm3に達した段階で群分けを行いDay7又はDay10,Day7又はDay10から3日に1回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を開始した。クローンK5-70の抗腫瘍活性評価と、クローンK5-116-2-1およびクローンT6-16の抗腫瘍活性評価は、それぞれ独立した試験で評価した。K5-70の抗腫瘍活性評価試験においては、癌細胞移植から44日目Day44におけるコントロール群マウスIgG10mg/kg体重,N=8の腫瘍体積が365.4±214.6mm3であったのに対して、K5-7010mg/kg体重投与群では、27.4±29.4mm3P<0.01byStudent’st-testと著しく腫瘍形成が阻害された阻害率92.5図23A。腫瘍重量においては、コントロール群が0.11±0.07gであったのに対して、K5-70投与群では0.005±0.007gP<0.01byStudent’st-testと95.5の阻害率であった図23B。特に、K5-70投与群では8個体中2個体では、完全に腫瘍形成が阻害され腫瘍の確認が出来なかった。別に行ったK5-116-2-1とT6-16の抗腫瘍活性評価試験においては、Day42におけるコントロール群の腫瘍体積が713.8±354.5mm3N=8であったのに対して、K5-116-2-1投与群10mg/kg体重では、188.9±97.4mm3N=8,P<0.01byStudent’st-test図24A,T6-16投与群10mg/kg体重では、292.8±199.7mm3N=8,P<0.01byStudent’st-test図25Aと、それぞれ73.5,59.0の阻害率であった。腫瘍重量についても同様に、コントロール群では0.39±0.19gであったのに対して、K5-116-2-1投与群、T6-16投与群では、0.10±0.07gP<0.01byStudent’st-test,0.17±0.14gP<0.05byStudent’st-testと、それぞれ72.2,56.4の阻害率を示した図24B,図25B。[ヒト大腸癌細胞株SW480細胞XenografttreatmentモデルにおけるクローンK5-70の用量依存的な抗腫瘍活性]次に、クローンK5-70マウスIgG2aの用量依存的な抗腫瘍活性を、ヒト大腸癌細胞株SW480を用いたXenografttreatmentモデルにおいて検討した。5×106cellsのSW480細胞を6週齢雌のNOD-scidマウスの右脇腹皮下に移植し、移植から10日後Day10に平均の腫瘍体積が100mm3に達した段階でコントロール群マウスIgG10mg/kg体重投与群、N=8,104.4±17.6mm3,K5-701mg/kg体重投与群N=8,104.3±16.1mm3,K5-705mg/kg体重投与群N=8,104.6±15.9mm3,K5-7010mg/kg体重投与群N=8,104.8±14.9mm3に群分を行い、3日に1回の腹腔内投与を行った。Day42におけるコントロール群の腫瘍体積が713.8±354.5mm3であったのに対して、K5-70投与群では用量依存的な腫瘍形成阻害活性が観察され、1mg/kg体重投与群では、485.0±207.3mm3阻害率32.1,5mg/kg体重投与群では、339.5±253.2mm3阻害率52.4,10mg/kg体重投与群では、355.4±202.8mm3阻害率50.2,P<0.05byStudent’st-testであった図26A。同様に、Day42における腫瘍重量については、コントロール群が0.39±0.19gであったのに対して、K5-701mg/kg体重投与群では,0.24±0.11g阻害率37.8,5mg/kg体重投与群では、0.17±0.14g阻害率55.8,P<0.05byStudent’st-test,10mg/kg体重投与群では、0.20±0.13g阻害率47.1となり、用量依存的な抗腫瘍活性が確認された図26B。[ヒト大腸癌細胞株SW480細胞XenografttreatmentモデルにおけるクローンK5-70の投与間隔の検討]さらに、クローンK5-70マウスIgG2aの至的投与間隔を検討するために、週に1回7日に1回投与を行った際の抗腫瘍活性を、ヒト大腸癌細胞株SW480を用いたXenografttreatmentモデルにおいて検討した。5×106cellsのSW480細胞を6週齢雌のNOD-scidマウスの右脇腹皮下に移植し、移植から10日後Day10に平均の腫瘍体積が100mm3に達した段階でコントロール群マウスIgG10mg/kg体重投与群、N=8,104.4±17.6mm3,K5-7010mg/kg体重、週1回投与群N=8,104.3±16.1mm3に群分を行い、7日に1回の腹腔内投与を行った。Day42におけるコントロール群の腫瘍体積が713.8±354.5mm3であったのに対して、K5-70週1回投与群では、323.3±239.9mm3阻害率55,P<0.05byStudent’st-testとなり図27A、更に、投与間隔を10日に1回、2週間に1回と広げた場合においては、Day39におけるコントロール群の腫瘍体積が956.9±367.8mm3であったのに対して、K5-70投与群10日に1回投与では、525.4±180.6mm3阻害率45.1,P<0.01byStudent’st-testとなり、K5-70投与群14日に1回投与では459.4±217.6mm3阻害率52.0,P<0.01byStudent’st-testとなり図27B、先行技術US7420040,US7420041が膵臓癌細胞株BxPC-3を用いたXenografttreatmentモデルにおいて、20mg/kg体重の投与量で、週に3回投与投与間隔2日間で、阻害率50-60の抗腫瘍活性を示しているのに対し、K5-70抗体は1回の投与量が半分の投与量10mg/kg体重、2週間に1回の投与投与間隔12日間で、先行技術に匹敵する抗腫瘍活性を示し、1回の投与量と投与間隔を考えると、少なくとも先行技術の12分の1の総投与量で顕著な抗腫瘍活性を示すことが明らかとなった。[ヒト大腸癌細胞株SW480細胞XenografttreatmentモデルにおけるクローンT6-16の用量依存的な抗腫瘍活性]次に、クローンT6-16マウスIgG2aの用量依存的な抗腫瘍活性を、ヒト大腸癌細胞株SW480を用いたXenografttreatmentモデルにおいて検討した。5×106cellsのSW480細胞を6週齢雌のNOD-scidマウスの右脇腹皮下に移植し、移植から10日後Day10に平均の腫瘍体積が100mm3に達した段階でコントロール群マウスIgG10mg/kg体重投与群、N=8,105.8±9.9mm3,T6-161mg/kg体重投与群N=8,104.4±13.3mm3,T6-165mg/kg体重投与群N=8,104.7±13.0mm3,T6-1610mg/kg体重投与群N=8,104.8±12.4mm3に群分を行い、3日に1回の腹腔内投与を行った。Day43におけるコントロール群の腫瘍体積が473.5±137.0mm3であったのに対して、T6-16投与群では用量依存的な腫瘍形成阻害活性が観察され、1mg/kg体重投与群では、397.9±97.5mm3阻害率16.0,5mg/kg体重投与群では、195.9±89.7mm3阻害率58.7,P<0.01byStudent’st-test,10mg/kg体重投与群では、190.2±56.5mm3阻害率59.8,P<0.01byStudent’st-testであった図28A。同様に、Day43における腫瘍重量については、コントロール群が0.19±0.07gであったのに対して、T6-161mg/kg体重投与群では,0.20±0.08g,5mg/kg体重投与群では、0.08±0.04g阻害率57.9,P<0.01byStudent’st-test,10mg/kg体重投与群では、0.09±0.04g阻害率52.6,P<0.01byStudent’st-testとなり、用量依存的な抗腫瘍活性が確認された図28B。[ヒト大腸癌細胞株SW480細胞XenografttreatmentモデルにおけるクローンT6-16の投与間隔の検討]さらに、クローンT6-16マウスIgG2aの至的投与間隔を検討するために、週に1回7日に1回および10日に1回の投与間隔での抗腫瘍活性を、ヒト大腸癌細胞株SW480を用いたXenografttreatmentモデルにおいて検討した。5×106cellsのSW480細胞を6週齢雌のNOD-scidマウスの右脇腹皮下に移植し、移植から10日後Day10に平均の腫瘍体積が100mm3に達した段階でコントロール群マウスIgG10mg/kg体重投与群、N=8,105.8±9.9mm3,T6-1610mg/kg体重、週1回投与群N=8,105.0±11.6mm3,T6-1610mg/kg体重、10日に1回投与群N=5,130.8±2.4mm3に群分けを行い、投与を開始した。Day43におけるコントロール群の腫瘍体積が473.5±137.0mm3であったのに対して、T6-16週1回投与群では、243.7±65.3mm3阻害率48.5,P<0.01byStudent’st-test,T6-1610日に1回投与群では、297.8±54.4mm3阻害率37.1,P<0.05byStudent’st-testとなり図29、先行技術US7420040,US7420041が膵臓癌細胞株BxPC-3を用いたXenografttreatmentモデルにおいて、20mg/kg体重の投与量で、週に3回投与投与間隔2日間で、阻害率50-60の抗腫瘍活性を示しているのに対し、T6-16抗体は、1回の投与量が、先行技術の半分の用量で、10日に1回の投与投与間隔8日間で、顕著な抗腫瘍活性を示すことが明らかとなり、1回の投与量と投与間隔を考えると、少なくとも先行技術の8分の1の総投与量で顕著な抗腫瘍活性を示すことが明らかとなった。[ヒト前立腺癌細胞株DU-145XenograftPreventionモデルにおける抗腫瘍活性の検討]クローンK5-70のヒト前立腺癌に対する抗腫瘍活性を、DU-145細胞RIKENCellBank,RCB2143を用いたXenograftPreventionモデルで評価した。5×106細胞のDU-145細胞を6週齢の雌のヌードマウスBalb/c,nu/nuの皮下に移植し、移植当日をDay1とし、コントロール群N=8とK5-70投与群N=8に群分けを行い、Day1から3日の1回の頻度で10mg/kg体重の投与量で腹腔内投与を行った。Day40において、コントロール群における腫瘍体積が368.2±307.8mm3であったのに対し、K5-70投与群では30.6±29.6mm3P<0.05byStudent’st-testと約90の腫瘍形成阻害活性を示した図30A。腫瘍重量においては、更に顕著な抗腫瘍活性が認められ、Day40におけるコントロール群の腫瘍重量が0.18±0.18gであったのに対して、K5-70投与群では8個体の全てにおいて腫瘍が消失しており、完全に腫瘍形成が阻害された図30B。以上の結果から、抗ヒトTROP-2モノクローナル抗体クローンK5-70は、ヒト前立腺癌に対しても強い抗腫瘍活性を示すことが明らかとなった。[ヒト膵癌細胞株PK-59細胞の肝転移モデルを用いたクローンK5-70の転移抑制活性]消化器癌の治療において、癌の転移は臨床上の予後を左右する重要な因子であり、転移をコントロールすることは治療上重要な意味を有する。TROP-2を標的とした癌治療用抗体投与により、腫瘍形成の抑制のみならず、癌細胞の他臓器への転移を抑制することが可能であれば、高い臨床上の有用性が期待されるため、癌治療抗体として望ましい特性である。TROP-2は多くの癌腫における発現が確認されているが、特に転移巣において高発現していることが示されているBr.J.Cancer2008;99:1290-1295,Clin.CancerRes.2006;12:3057-3063,Mod.Pathol.2008;21:186-191。さらに、Trop-2遺伝子を導入した癌細胞を経脾的あるいは経膵的にヌードマウスに移植した場合に、肝転移の発症率が増加することWO2010/089782、MolecularCancer2010;9:253が報告され、TROP-2の癌転移過程における重要性が示唆されている。しかしながら、TROP-2を標的とした抗体を用いてinvivoで転移抑制作用を具体的に示した報告はこれまでに認められない。本発明により見出された抗hTROP-2マウスモノクローナル抗体K5-70は、膵臓癌細胞を皮下に移植したゼノグラフトモデルにおいて高い治療効果が示されているが、癌細胞の増殖抑制効果に加え、膵癌細胞PK-59の遊走能を抑制することが、invitroのスクラッチアッセイで示されており、癌の転移をinvivoにおいても抑制する可能性が考えられた。そこで、膵癌細胞PK-59をヌードマウスの脾臓から注入し、肝転移を発生させるモデルを用いて抗hTROP-2マウスモノクローナル抗体の転移抑制効果を検証した。hTROP-2を内在的に発現する膵癌細胞株PK-59をトリプシン処理で剥がし、PBSで2×107cells/mLの細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液は移植時まで氷上に保管した。6~7週齢の雌のヌードマウスBalb/c,nu/nuをペントバルビタールの腹腔内投与により麻酔し、麻酔下で左側腹部を10~15mm切開し、脾臓を腹腔外に引き出し、26Gのシリンジを用いて50μLの細胞懸濁液1x106cellを脾臓内に注入した。細胞注入4分後に脾門部を5-0silkにて結紮し、脾臓を摘出した。切開した腹膜を5-0silkで閉創し、WoundClipsAUTOCLIP9mm,BectonDickinsonを用いて閉腹した。癌細胞移植の前日に、マウスを群分し、抗hTROP-2モノクローナル抗体K5-70あるいは対照抗体精製マウスIgGを10mg/kg体重にて腹腔内投与した。また、癌細胞移植7日後に、同様に抗体の投与を行った。癌細胞移植から4~6週間後に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させ、肝臓を摘出し、転移巣の有無を確認した。コントロールとして用いたマウスIgGを投与した群においては、PK-59細胞を移植した6匹のマウス中、4匹において、移植後4から6週間後に肝葉辺縁部への明らかな転移巣2~7個が認められた図31A、転移発生率67,表6。これに対し、K5-70投与群では、PK-59細胞を移植した4匹のマウスにおいて、いずれの個体でもまったく肝臓への転移巣が認められず、転移発生率は0であった図31B,表6。これらの結果から、抗hTROP-2抗体K5-70は、膵癌細胞PK-59の肝転移に対して極めて強い抑制作用を有することが明らかとなった。[大腸癌細胞株SW480Xenograftモデルにおける塩酸イリノテカン投与後の癌再発モデルにおけるK5-70抗体の抗腫瘍活性]癌治療剤として近年、癌細胞の増殖を抑制する化学療法剤が多く開発され、一定の治療成績を上げているが、癌細胞以外の正常細胞に対する増殖抑制作用に伴う副作用と、治療中止後の癌の再発が大きな問題となっている。したがって、TROP-2を標的とした癌治療用抗体投与により、化学療法剤による治療後の腫瘍再発を抑制することが可能であれば、高い臨床上の有用性が期待されるため、癌治療抗体として望ましい特性である。大腸癌の治療剤としては、5-FU,白金製剤に加え、トポイソメラーゼ阻害効果を有する塩酸イリノテカントポテシン、第一三共株式会社が近年臨床適応され、動物モデルにおいても、大腸癌をはじめとした種々のヒト腫瘍細胞を移植したマウスモデルにおける抗腫瘍効果が報告されているCancerChemotherPharmacol.1991;283:192-8。そこで、塩酸イリノテカン投与後の腫瘍再発に対する抗hTROP-2抗体クローンK5-70マウスIgG2aの再発予防効果について、ヒト大腸癌細胞株SW480を用いたXenograftモデルにおいて検討した。5×106cellsのSW480細胞を8週齢雌のNOD-scidマウスの右脇腹皮下に移植し、移植から11日後Day11に平均の腫瘍体積が100mm3以上に達した段階で無処置群生理食塩水投与群、N=8,130.7±16.2mm3,塩酸イリノテカンCPT-11,トポテシン、第一三共株式会社投与群N=16,123.0±21.4mm3に群分けを行い、塩酸イリノテカンを40mg/kg体重で3日に1回、合計3回Day11,14,17腹腔内投与した。塩酸イリノテカンの最終投与から3日目Day20に、無処置群の腫瘍体積は232.1±21.1mm3に達したのに対し、塩酸イリノテカン投与群は126.6±26.6mm3P<0.01byStudent’st-testであり、明らかな腫瘍抑制効果が認められた。この段階で腫瘍サイズに基づき塩酸イリノテカン投与群を2群に分け、片方の群はK5-7010mg/kg体重投与群N=8,Day20の腫瘍体積126.0±28.0mm3とし、もう片方の群はマウスIgG10mg/kg体重投与群N=8,Day20の腫瘍サイズ127.2±27.0mm3とし、それぞれ3日に1回の腹腔内投与と腫瘍体積の測定を行い腫瘍の再発を評価した図32。マウスIgG投与群では、塩酸イリノテカンの最終投与から18日目Day35より腫瘍体積が300mm3を超える明らかな再発腫瘍を有する個体が複数認められ、塩酸イリノテカンの最終投与から30日目Day47においては、8例中5例で300mm3を超える腫瘍が認められた腫瘍平均体積401.7±172.7mm3。これに対し、K5-70投与群では顕著に腫瘍再発が抑制され、腫瘍平均体積は、180.5±142.1mm3,P<0.05byStudent’st-testであった図32。特に、K5-70投与群では、Day47における腫瘍体積が群分け時126.0±28.0mm3よりも退縮し、100mm3未満となった個体が8例中4例認められた。これらの結果から、抗hTROP-2抗体K5-70は、塩酸イリノテカン投与後の腫瘍再発に対しても極めて強い抑制作用を有することが明らかとなった。[CLIPS技術を用いたエピトープマッピング]<材料と方法>ペプチド合成本実験で使用した直鎖型15-mer及び30-merのTROP-2細胞外領域に由来するペプチドは、Fmoc9-Fluorenylmethoxycarbonyl法による固相合成により取得した。また不連続エピトープ解析のため、両端にシステイン残基を付加したTROP-2細胞外領域に由来する17-merのペプチドを合成し、CLIPS技術ChemicallyLinkedPeptidesonScaffoldstechnologyによりループ構造を一つまたは二つ有する立体構造を再構築した。付加したシステイン残基近傍に別のシステイン残基が存在する場合、アラニンに置換した。エピトープスクリーニングELISA5034種類の合成したペプチドをPEPSCANカード445ペプチド/カードへ共有結合させ、ELISA法により合成ペプチドと抗体の結合を検証した。PEPSCANカードはブロッキングバッファー4ウマ血清、5卵白アルブミン、1Tweenを含むリン酸緩衝液で1μg/mLに希釈した抗ヒトTROP-2モノクローナル抗体K5-70、K5-107、K5-116-2-1、T5-86、T6-16と反応させた。洗浄後、1000倍希釈したペルオキシダーゼ-二次抗体複合体と25°C、1時間反応させた。洗浄後、基質溶液2,2’-azino-di-3-ethylbenzthiazolinesulfonateABTSと2μLの3過酸化水素水を含む溶液を加え、1時間発色反応を行った。抗体結合活性はCCDカメラで撮影し、画像解析を行い定量した。<結果>薬効を示した抗ヒトTROP-2モノクローナル抗体K5-70、K5-107、K5-116-2-1、T5-86、T6-16についてCLIPSChemicallyLinkedPeptidesonScaffolds技術を利用しエピトープ解析を行った。なお、以下、本実施例においてアミノ酸番号とは、配列番号2に示されるアミノ酸配列hTROP-2タンパク質323アミノ酸残基中のアミノ酸番号を意味する。K5-70抗体についての解析結果を下記表7に示す。その結果、33ペプチドがK5-70抗体と強い結合を示すことが明らかとなった。これら33ペプチドの中で、VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDアミノ酸番号43-65を含む配列表7中ペプチドNo.1-7,9、HHILIDLRHRPTAGアミノ酸番号152-165を含む配列表7中ペプチドNo.14,22-25,28,29,31,33、VHYEQPTIQIELRQアミノ酸番号193-206を含む配列表7中ペプチドNo.8,10,12,13,15,18,20,21,23,26,28,30,32、DAELRRLFRERアミノ酸番号171-183を含む配列表7中ペプチドNo.11,12,14,16,18,19,21,22,25,29,31は、繰り返し出現した。K5-70抗体は、特にVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDを含む配列に強く結合した。これらの結果から、hTROP-2タンパク質中、上記4種類のペプチド配列領域がK5-70抗体のエピトープである可能性が示唆された。K5-107についての解析結果を下記表8に示す。その結果、VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDアミノ酸番号43-65を含む配列が20ペプチド中10ペプチド表8中ペプチドNo.1-6,8,13,14,17に含まれていた表8。従って、hTROP-2タンパク質中、上記VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDのペプチド配列領域がK5-107抗体のエピトープであることが示唆された。K5-116-2-1抗体についての解析結果を下記表9に示す。当該解析では、VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDアミノ酸番号43-65を含む配列表9中のペプチドNo.1-7,15,25、HHILIDLRHRPTAGアミノ酸番号152-165を含む配列表9中のペプチドNo.8-11,16,17,19,20,22-24,27-29、DLDAELRRLFRERアミノ酸番号171-183を含む配列表9中のペプチドNo.11-14,17,19,21,23,29の3種類のペプチド配列が複数回出現した表9。従って、hTROP-2タンパク質中、これら3種類のペプチド配列領域がK5-116-2-1抗体のエピトープであることが示唆された。T5-86及びT6-16抗体についての解析結果を下記表10及び表11に示す。当該解析では、DPEGRFKARQCNアミノ酸番号109-120の配列を含むペプチドと強く結合した。T5-86抗体に対しては結合する26ペプチド中22ペプチド表10中のペプチドNo.1-3,5-8,10-13,15-19,21-26に、T6-16抗体に対しては結合する26ペプチド中4ペプチド表11中のペプチドNo.1,2,9,13に、上記ペプチド配列が含まれていた表10及び表11。またT5-86抗体についての解析では、DPEGRFKARQCNアミノ酸番号109-120を含む配列以外にもVCSPDGPGGRCQCRアミノ酸番号43-56を含む配列表10中のペプチドNo.4,14,20が複数回出現した。さらに、T6-16抗体についての解析でも、他の配列としてHHILIDLRHRPTAGアミノ酸番号152-165を含む配列表11中のペプチドNo.4-8,10-12,19,21,23,25,26が複数回確認された。従って、T5-86抗体のエピトープとしては、hTROP-2タンパク質中、DPEGRFKARQCNアミノ酸番号109-120、VCSPDGPGGRCQCRアミノ酸番号43-56の2種類のペプチド配列領域が示唆され、T6-16抗体のエピトープとしては、hTROP-2タンパク質中、DPEGRFKARQCNアミノ酸番号109-120、HHILIDLRHRPTAGアミノ酸番号152-165の2種類のペプチド配列領域が示唆された。[マウス抗ヒトTROP-2抗体クローンK5-70,K5-107,K5-116-2-1,T6-16の抗体遺伝子の可変領域の配列決定]3×106個のマウス抗TROP-2モノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、TRIzol試薬Invitrogenを用いて全RNAを抽出した。クローンK5-70,クローンK5-107,クローンK5-116-2-1については、SMARTerTMRACEcDNAAmplificationkitClontechを用いて、キット添付の方法に従い、マウスIgGのH鎖特異的プライマー5’-TCCAKAGTT-3’配列番号24と、L鎖特異的プライマー5’-GCTGTCCTGATC-3’配列番号25を用いてcDNAを合成した。クローンT6-16については、GeneRacerKitInvitrogenを用いて、キット添付の方法に従い、オリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成した。クローンK5-70マウスIgG2a,クローンK5-107マウスIgG1、およびクローンK5-116-2-1マウスIgG2aのH鎖及びL鎖の可変領域VH,VLをコードする遺伝子は、上記合成後のcDNAを鋳型として、PCR法を用いてクローニングした。この際、5’-プライマーはSMARTerTMRACEcDNAAmplificationkitに添付されている10×UniversalPrimerAMixUPMを使用した。一方、3’-プライマーは、VH増幅用3’-プライマーとしてはマウスIgGH鎖に特異的な配列を有するものを使用し、VL増幅用3’-プライマーとしてはマウスIgGL鎖に特異的なな配列を有するものを使用した。5’-プライマー10×UniversalPrimerAMixUPM:Long0.4μMShort2μM3’-プライマーRプライマー:上記各プライマーを用いたPCRは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。またVHのcDNA増幅のRプライマーは上記の2配列を等モル数ずつ混合して使用した。<反応液組成><反応条件>94°C10sec反応させた後、熱変性解離:98°C10sec→アニーリング:60°C5sec→合成伸長:72°C60secを1サイクルとして計30サイクル反応させた後、最後に72°C3min反応させた。合成したVH及びVLのcDNAを、pMD20-Tvectorタカラバイオにサブクローニングして、塩基配列を決定した。複数のVHクローン及びVLクローンの塩基配列を解読し、マウスH鎖及びL鎖の可変領域に典型的な塩基配列を同定した。図33及び図34に、K5-70のVH及びVLのコンセンサスcDNA塩基配列、ならびに推定アミノ酸配列を示した。図35及び図36に、K5-107のVH及びVLのコンセンサスcDNA塩基配列、ならびに推定アミノ酸配列を示した。図37及び図38に、K5-116-2-1のVH及びVLのコンセンサスcDNA塩基配列、ならびに推定アミノ酸配列を示した。クローンT6-16のH鎖及びL鎖の可変領域VH,VLをコードする遺伝子は、上記合成後のcDNAを鋳型として、PCR法を用いてクローニングした。この際、この際、5’-プライマーはGeneRacerKitに添付されているものを使用した。一方、3’-プライマーは、VH増幅用3’-プライマーとしてはマウスIgGH鎖に特異的な配列を有するものを使用し、VL増幅用3’-プライマーとしてはマウスIgGL鎖に特異的な配列を有するものを使用した。5’-プライマーFプライマー:3’-プライマーRプライマー:上記各プライマーを用いたPCRは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。<反応液組成><反応条件>熱変性解離:98°C10sec→アニーリング:57°C10sec→合成伸長:72°C60secを1サイクルとして計35サイクル。合成したVH及びVLのcDNAを、pCR4Blunt-TOPOvectorInvitrogenにサブクローニングして、塩基配列を決定した。複数のVHクローン及びVLクローンの塩基配列を解読し、マウスH鎖及びL鎖の可変領域に典型的な塩基配列を同定した。図39及び図40に、T6-16のVH及びVLのコンセンサスcDNA塩基配列、ならびに推定アミノ酸配列を示した。"