"i低酸素応答配列HREエンハンサー配列と、iiE2Fプロモーター配列とを含み、前記E2Fプロモーターが、前記HREエンハンサー配列の下流に位置し、前記HREエンハンサー配列及び前記E2Fプロモーターが、協同的に同一の遺伝子の発現を促進することを特徴とする遺伝子発現調節配列。E2Fプロモーター配列が、2回~10回繰り返される請求項1に記載の遺伝子発現調節配列。HREエンハンサー配列が、2回~20回繰り返される請求項1に記載の遺伝子発現調節配列。遺伝子発現調節配列が、テロメラーゼ逆転写酵素TERTプロモーター配列を更に含む請求項1に記載の遺伝子発現調節配列。遺伝子発現調節配列が、組み換えアデノウイルスベクターのE1領域に挿入され、5’から3’方向にHRE配列、E2Fプロモーター配列及びTERTプロモーター配列を含む請求項4に記載の遺伝子発現調節配列。HRE配列が6回繰り返され、かつE2F配列が2回繰り返される請求項5に記載の遺伝子発現調節配列。a請求項1から6のいずれかに記載の遺伝子発現調節配列と、b前記遺伝子発現調節配列に作動的に連結された、発現させようとする目的遺伝子と、を含むことを特徴とする腫瘍特異的発現の改善された遺伝子伝達システム。遺伝子伝達システムが、プラスミド、組換えアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリマー、リポソーム又はニオソームである請求項7に記載の遺伝子伝達システム。遺伝子伝達システムが、組換えアデノウイルスベクターである請求項8に記載の遺伝子伝達システム。aアデノウイルスの末端逆位配列ITR配列と、bi低酸素応答配列HREエンハンサー配列と、iiE2Fプロモーター配列とを含み、前記E2Fプロモーターが、前記HREエンハンサー配列の下流に位置し、前記HREエンハンサー配列及びE2Fプロモーターが、協同的に同一の遺伝子の発現を促進する遺伝子発現調節配列と、c前記遺伝子発現調節配列に作動的に連結された、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、アポトーシス遺伝子及び抗血管新生遺伝子から構成された群から選択される治療学的トランス遺伝子と、を含むことを特徴とする癌細胞特異的退縮活性の改善された組換えアデノウイルス。遺伝子発現調節配列内のE2Fプロモーター配列が、2回~10回繰り返される請求項10に記載の組換えアデノウイルス。遺伝子発現調節配列内のHREエンハンサー配列が、2回~20回繰り返される請求項10に記載の組換えアデノウイルス。遺伝子発現調節配列が、テロメラーゼ逆転写酵素TERTプロモーター配列を更に含む請求項10に記載の組換えアデノウイルス。遺伝子発現調節配列が、組み換えアデノウイルスベクターのE1領域に挿入され、5’から3’方向にHRE配列、E2Fプロモーター配列及びTERTプロモーター配列を含む請求項13に記載の組換えアデノウイルス。HRE配列が6回繰り返され、かつE2F配列が2回繰り返される請求項14に記載の組換えアデノウイルス。治療学的トランス遺伝子が、アポリポタンパク質Klingle8LK8遺伝子、シトシンキナーゼCD遺伝子、チミジンキナーゼTK遺伝子及びデコリン遺伝子から構成された群から選択される一つ又は二つ以上の遺伝子である請求項10に記載のアデノウイルス。a請求項10から16のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、b薬剤学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする抗腫瘍組成物。組成物が、有効成分としてガンシクロビルGCVを更に含む請求項17に記載の抗腫瘍組成物。請求項10から16のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの治療学的有効量を含む抗腫瘍組成物を哺乳動物対象に投与する工程を含むことを特徴とする癌治療方法。組成物が、有効成分としてガンシクロビルGCVを更に含む請求項19に記載の方法。本発明者らは、優れた腫瘍選択的遺伝子伝達効率を通じて腫瘍特異的な退縮活性がさらに向上した遺伝子治療剤を開発するために鋭意研究した。その結果、HREエンハンサー、E2Fプロモーター及びTERTプロモーターから構成される発現調節配列を含むアデノウイルスを利用する場合、腫瘍選択的退縮活性が大いに向上することを見出し、本発明を完成した。したがって、本発明の目的は、腫瘍特異的発現の改善された遺伝子伝達システムを提供することにある。本発明の他の目的は、癌細胞特異的退縮活性の改善された組換えアデノウイルスを提供することにある。本発明のまた他の目的は、本発明の組換えアデノウイルスの治療的有効量を含む抗腫瘍組成物を提供することにある。本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。本発明の一様態によると、本発明は、i低酸素応答配列hypoxia-responseelements,HREエンハンサー配列と、iiE2Fプロモーター配列とを含み、前記E2Fプロモーターが、前記HREエンハンサー配列の下流に位置し、前記HREエンハンサー配列及びE2Fプロモーターが、協同的に同一の遺伝子の発現を促進する遺伝子発現調節配列を提供する。本発明者らは、優れた腫瘍選択的遺伝子伝達効率を通じて腫瘍特異的な退縮活性がさらに向上した遺伝子治療剤を開発するために鋭意研究した。その結果、HREエンハンサー、E2Fプロモーター及びTERTプロモーターから構成される発現調節配列を含むアデノウイルスを利用する場合、腫瘍選択的退縮活性が大いに向上することを見出した。本明細書において、用語‘E2Fプロモーター配列’は、アデノウイルスのE2プロモーターの活性化を促進させ、細胞周期の進行を主管する多様な遺伝子の転写も同時に促進させる転写因子であるE2F遺伝子のプロモーターを意味する。E2は、癌遺伝子であって、pRb網膜芽細胞腫タンパク質と結合してその活性が抑制される。本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用するE2Fプロモーター配列は、配列番号1のヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、E2Fプロモーター配列による腫瘍選択的発現を向上させるために、E2Fプロモーター反復配列を利用する。本発明の反復配列は、同一な配列が連続的に反復されるかimmediatelyadjacent、又はプロモーターやエンハンサーの活性に影響を与えない範囲内で適切な長さのリンカーヌクレオチドを介在して不連続的に反復されるdiscontinuousrepeated。さらに好ましくは、本発明で利用するE2F配列は、配列番号1のヌクレオチド配列が2回~10回繰り返された配列、よりさらに好ましくは、2回~7回繰り返された配列、最も好ましくは、2回繰り返された配列を有する。本明細書において、用語‘HREエンハンサー配列’は、低酸素応答エンハンサー配列を意味する。低酸素条件で細胞の特定遺伝子の発現が調節されるBunnandPoytonPhysiol.Rev.76:839-8851996;DachsandStratfordBr.J.Cancer74:5126-51321996;GuilleminandKrasnowCell89:9-121997。大部分の腫瘍細胞は、不十分な血液供給を受けるようになるが、これは、腫瘍細胞が一般的に血管を形成させる内皮細胞より速く成長するからであって、これは、腫瘍で低酸素状態を誘発するようになる。大部分の固形主要内で引き起こされるこのような低酸素状態は、解糖系酵素や血管新生誘発前駆因子のような生存因子の生産を引き起こすことにより、放射線治療や化学抗癌治療に抵抗性を有するようになる。これに本発明者らは、E2FプロモーターとHREエンハンサーによりアデノウイルスのE1の発現が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスを開発した。低酸素反応の主要な媒介者は、転写複合体HIF-1α低酸素誘導因子-1αであり、これは、多様な遺伝子の調節部位にあるHREと相互作用して、前記遺伝子は、例えば血管内皮成長因子VEGF遺伝子、及びエノラーゼ-1とGAPDHグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素のような解糖系酵素のコーディング遺伝子を含む。本発明は、このように低酸素条件で遺伝子の発現を調節して、HIF-1αと相互作用する配列であるHREを利用する。HREは、遺伝子伝達システム、特に、組換えアデノウイルスの腫瘍細胞選択性を大きく向上させる作用をする。本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用するHRE配列は、配列番号2のヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、HRE配列による転写活性を向上させるために、HRE反復配列を利用する。さらに好ましくは、本発明で利用するHRE配列は、配列番号2のヌクレオチド配列が2回~20回繰り返された配列、よりさらに好ましくは、3回~8回繰り返された配列、最も好ましくは、6回繰り返された配列を有する。本発明の好ましい具現例によると、本発明の遺伝子発現調節配列は、テロメラーゼ逆転写酵素telomerereversetranscriptase,TERTプロモーター配列を更に含む。TERTは、染色体複製の間、テロメアーの長さを一定に維持することに関与する酵素であるテロメラーゼの構成要素であって、細胞老化、癌、細胞不滅に関与することが知られているCounter,C.M.etal.EMBOJ.11,1921-291992,Kim.N.W.etal.Science,21:2011-51994,Harley,C.B.etal.Nature,345:458-601990。テロメラーゼの活性は、人間の場合、卵巣と睾丸の生殖細胞及びリンパ球で観察されるが、その他、正常体細胞では観察されていないWright,W.E.etal.Dev.Genet.18:173-91996。したがって、正常体細胞は、制限された回数の細胞分裂後にはテロメアーの長さが一定長さ以下に減少し、それ以上分裂できず死滅するYasumoto,S.etal.Oncogene.3:433-91996。その反面、癌進行前段階である陽性腫瘍細胞及び癌細胞では、テロメラーゼの活性が増加されるBroccoli,D.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:9082-61995。卵巣癌でテロメラーゼの活性増加が最初に報告された後、血液癌、胃癌、肺癌、肝癌、大腸癌、脳癌、前立腺癌、頭頸部癌、乳癌など、ほぼ全ての癌でテロメラーゼの活性増加が観察されているCounter,C.M.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:2900-41994。テロメラーゼの機能に必須的な役割をするTERTの発現は、テロメラーゼの活性と関連しており、最近は、テロメラーゼの発現がTERTプロモーターの活性、即ち、TERTのmRNAの量によって調節されること、及びTERTの活性を調節するための最小のプロモーターの大きさが181bpであることが明らかにされた。本発明の遺伝子伝達システムにおいて、TERTは、腫瘍細胞に対する特異性を向上させる作用をする。好ましくは、本発明で利用するHRE配列は、配列番号3のヌクレオチド配列である。本発明のより好ましい具現例によると、本発明の遺伝子発現調節配列は、組み換えアデノウイルスベクターのE1領域に挿入され、5’から3’方向にHRE配列、E2Fプロモーター配列及びTERTプロモーター配列を含む。最も好ましくは、前記HRE配列が6回繰り返され、かつ前記E2F配列が2回繰り返される。本発明の他の様態によると、本発明は、a本発明の遺伝子発現調節配列と、b前記遺伝子発現調節配列に作動的に連結された、発現させようとする目的遺伝子と、を含む腫瘍特異的発現の改善された遺伝子伝達システムを提供する。本発明の遺伝子発現調節配列は、上述の遺伝子発現調節配列と同一であるため、過度なる重複を避けるためにその記載を省く。本明細書において、用語‘作動的に結合されたoperativelylinked’は、核酸発現調節配列例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイと他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これにより前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び/又は解読を調節するようになる。本発明の遺伝子発現調節配列に作動的に連結された発現対象の遺伝子は、特に制限されない。例えば、発現しようとする遺伝子は、遺伝子伝達システムのゲノム由来の遺伝子例えば、アデノウイルスのE1A遺伝子又は治療学的トランス遺伝子を含む。治療学的トランス遺伝子は、下記に詳細に説明されている。本発明の好ましい具現例によると、本発明の遺伝子伝達システムは、プラスミド、組換えアデノウイルス、アデノ関連ウイルスAdeno-associatedviruses,AAV、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリマー、リポソーム又はニオソームである。本発明の遺伝子発現調節配列と前記遺伝子発現調節配列に作動的に結合された、伝達しようとする遺伝子配列は、通常的な遺伝子治療に利用される全ての遺伝子伝達システムに適用でき、好ましくは、プラスミド、アデノウイルスLockettLJ,etal.,Clin.CancerRes.3:2075-20801997、アデノ-関連ウイルスLashfordLS.,etal.,GeneTherapyTechnologies,ApplicationsandRegulationsEd.A.Meager1999、レトロウイルスGunzburgWH,etal.,GeneTherapyTechnologies,ApplicationsandRegulationsEd.A.Meager,1999、レンチウイルスWangG.etal.,J.Clin.Invest.10411:R55-621999、ヘルペスシンプレックスウイルスChamberR.,etal.,Proc.Natl.Acad.SciUSA92:1411-14151995、ワクシニアウイルスPuhlmannM.etal.,HumanGeneTherapy10:649-6571999、ポックスウイルスGCE,NJL,KrupaM,EstebanM.,ThepoxvirusvectorsMVAandNYVACasgenedeliverysystemsforvaccinationagainstinfectiousdiseasesandcancerCurrGeneTher82:97-1202008、ポリマーHwangetal.,InvitroandInvivoTransfectionEfficiencyofHumanOsteoprotegerinGeneusingNon-ViralPolymerCarriers.,KoreanJ.BoneMetab.132:119-1282006、リポソームMethodsinMolecularBiology,Vol199,S.C.BasuandM.BasuEds.,HumanPress2002又はニオソームに適用できる。最も好ましくは、本発明の遺伝子伝達システムは、組換えアデノウイルスに適用して製造される。i.アデノウイルスアデノウイルスは、中間程度のゲノムサイズ、操作の便宜性、高い力価、広範囲のターゲット細胞、及び優れた感染性から、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。ゲノムの両末端は、100bp~200bpの末端逆位配列invertedterminalrepeat,ITRを含み、これは、DNA複製及びパッケージングに必須のシスエレメントである。ゲノムのE1領域E1A及びE1Bは、転写及び宿主細胞遺伝子の転写を調節するタンパク質をコードする。E2領域E2A及びE2Bは、ウイルスDNA複製に関与するタンパク質をコードする。現在開発されたアデノウイルスベクターの中で、E1領域が欠如した複製不能アデノウイルスがよく利用されている。一方、E3領域は、通常的なアデノウイルスベクターから除去され、外来遺伝子が挿入される座を提供するThimmappaya,B.etal.,Cell,31:543-5511982;Riordan,J.R.etal.,Science,245:1066-10731989。したがって、本発明の遺伝子発現調節配列は、E1A遺伝子プロモーター配列位置に挿入され、E1A遺伝子の発現を調節することができる。また、本発明の遺伝子発現調節配列-発現遺伝子カセットは、欠失したE1領域E1A領域及び/又はE1B領域、好ましくは、E1B領域、又はE3領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、欠失したE1領域に挿入される。また、本発明の遺伝子発現調節配列-発現遺伝子カセットは、欠失したE4領域にも挿入できる。本明細書において、ウイルスゲノム配列と関連して使用される用語、‘欠失’は、該当配列が完全に欠失したものだけではなく、部分的に欠失したものも含む意味を有する。また、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約105までパッケージングすることができるため、約2kbを更にパッケージングすることができるGhosh-Choudhuryetal.,EMBOJ.,6:1733-17391987。したがって、アデノウイルスに挿入される上述の外来配列は、アデノウイルスの野生型ゲノムに更に結合させることもできる。アデノウイルスにより運搬される外来遺伝子は、エピソームと同一の方式により複製され、そのため、宿主細胞に対して遺伝的毒性が非常に低い。したがって、本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムを利用した遺伝子治療が非常に安全であると判断される。ii.レトロウイルスレトロウイルスは、自分の遺伝子を宿主のゲノムに挿入し、大量の外来遺伝物質を運搬することができ、感染できる細胞のスペクトルが広いため、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。レトロウイルスベクターを構築するために、運搬しようする目的ヌクレオチド配列は、レトロウイルスの配列の代わりにレトロウイルスゲノムに挿入され、複製不能のウイルスを生産する。ビリオンを生産するために、gag、pol及びenv遺伝子を含むが、末端反復配列longterminalrepeat,LTRとΨ配列は含まないパッケージング細胞株を構築するMannetal.,Cell,33:153-1591983。運搬しようとする目的ヌクレオチド配列、LTR及びΨ配列を含む組み換えプラスミドを前記細胞株に移入すると、Ψ配列は組み換えプラスミドのRNA転写体の生産を可能にし、この転写体はウイルスにパッケージングされ、ウイルスは培地に排出されるNicolasandRubinsteinRetroviralvectors,In:Vectors:Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,RodriguezandDenhardteds.,Stoneham:Butterworth,494-5131988。組み換えレトロウイルスを含有する培地を収集して濃縮し、遺伝子伝達システムに利用する。次世代レトロウイルスベクターを利用した遺伝子伝達が発表された。KasaharaらScience,266:1373-13761994は、モロニーマウス白血病ウイルスmoloney-murineleukemiavirusの変異体を製造して、ここで、EPOエリスロポエチン配列をエンベロープ部位に挿入し、新しい結合特性を有するキメラタンパク質を生産した。本発明の遺伝子伝達システムも、このような次世代レトロウイルスベクターの構築戦略により製造することができる。iii.AAVベクターアデノ関連ウイルスAAVは、非分裂細胞を感染させることができ、多様な種類の細胞に感染できる能力を有しているため、本発明の遺伝子伝達システムに適している。AAVベクターの製造及び用途に対する詳細な説明は、米国特許第5,139,941号及び第4,797,368号に詳細に開示されている。遺伝子伝達システムとしてのAAVに対する研究は、LaFaceetal,Viology,162:4834861988,Zhouetal.,Exp.Hematol.NY,21:928-9331993,Walshetal,J.Clin.Invest.,94:1440-14481994、及びFlotteetal.,GeneTherapy,2:29-371995に開示されている。最近、AAVベクターは、嚢胞性線維症の治療剤としてヒト臨床試験の第I相試験を実施している。典型的に、AAVウイルスは、二つのAAV末端リピートが両側に位置されている目的の遺伝子配列リラクシン遺伝子及び運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を含むプラスミドMcLaughlinetal.,J.Virol.,62:1963-19731988;及びSamulskietal.,J.Virol.,63:3822-38281989及び末端リピートのない野生型AAVコーディング配列を含む発現プラスミドMcCartyetal.,J.Virol.,65:2936-29451991を同時形質転換させて製造される。iv.他のウイルスベクター他のウイルスベクターも、本発明の遺伝子伝達システムとして利用することができる。ワクシニアウイルスPuhlmannM.etal.,HumanGeneTherapy10:649-6571999;Ridgeway,Mammalianexpressionvectors,In:Vectors:Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses.RodriguezandDenhardt,eds.Stoneham:Butterworth,467-4921988;BaichwalandSugden,VectorsforgenetransferderivedfromanimalDNAviruses:Transientandstableexpressionoftransferredgenes,In:KucherlapatiR,ed.Genetransfer.NewYork:PlenumPress,117-1481986及びCouparetal.,Gene,68:1-101988、レンチウイルスWangG.etal.,J.Clin.Invest.10411:R55-621999、又は単純ヘルペスウイルスChamberR.,etal.,Proc.Natl.Acad.SciUSA92:1411-14151995、ポックスウイルスGCE,NJL,KrupaM,EstebanM.,ThepoxvirusvectorsMVAandNYVACasgenedeliverysystemsforvaccinationagainstinfectiousdiseasesandcancerCurrGeneTher82:97-1202008由来のベクターも、目的ヌクレオチド配列を細胞内に運搬可能な運搬システムとして利用することができる。v.ポリマー非ウイルス性遺伝子伝達システムとして幅広く使用されるポリマー系伝達システムとしては、ゼラチン、キトサンCarrenoGB,DuncanR.Evaluationofthebiologicalpropertiesofsolublechitosanandchitosanmicrospheres.IntJPharm148:231-2401997、PLLポリ-LリジンMaruyamaA,IshiharaT,KimJS,KimSW,AkaikeT.NanoparticleDNAcarrierwithpolyL-lysinegraftedpolysaccharidecopolymerandpolyD,Llactide.BioconjugateChem8:735-7421997及びPEIpolyethyleneamineAbdallahB,HassanA,BenoistC,GoulaD,BehrJP,DemeneixBA.Apowerfulnonviralvectorforinvivogenetransferintotheadultmammalianbrain:Polyethyleneimine.HumanGeneTher7:1947-19541996などが利用されている。ポリマー系遺伝子伝達システムの長所は、免疫反応と急性毒性の発現率が低く、製造法が簡単であり、大量生産が可能であるという点である。vi.リポソーム及びニオソームリポソームは、水相に分散された燐脂質により自然に形成される。外来DNA分子をリポソームにより成功的に細胞内に運搬した例は、Nicolau及びSene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-1901982、及びNicolauetal.,MethodsEnzymol.,149:157-1761987に開示されている。一方、リポソームを利用した動物細胞の形質転換に最もよく利用される試薬としては、LipofectamineGibcoBRLがある。運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を内包したリポソームは、エンドサイトーシス、細胞表面への吸着又はプラズマ細胞膜との融合などのメカニズムを通じて細胞と相互作用し、細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を運搬する。リポソームがリン脂質を利用して生成されるのに対し、ニオソームは、非イオン性界面活性剤及びコレステロールの混合物から構成された二重膜輸送体により極性及び非極性物質を封入することができ、浸透圧的に活性があり、リン脂質などによる脂質微粒子の運搬体のリポソームに比べ安定し、また製造時に使用される界面活性剤が、保管及び取り扱い時に特別な条件が必要ないという長所を有する。一方、上述の本発明の遺伝子伝達システムを細胞内に導入する方法は、当業界に公知された多様な方法を通じて実施することができる。本発明において、遺伝子伝達システムがウイルスベクターに基づいて製作された場合は、当業界に公知されたウイルス感染方法により実施される。ウイルスベクターを利用した宿主細胞の感染は、上記に引用した文献に記載されている。本発明において、遺伝子伝達システムがネイキッドnaked組み換えDNA分子又はプラスミドの場合は、微細注入法Capecchi,M.R.,Cell,22:4791980;及びHarlandとWeintraub,J.CellBiol.101:1094-10991985、リン酸カルシウム沈殿法Graham,F.L.etal.,Virology,52:4561973;及びChen及びOkayama,Mol.Cell.Biol.7:2745-27521987、電気穿孔法Neumann,E.etal.,EMBOJ.,1:8411982;及びTur-Kaspaetal.,Mol.CellBiol.,6:716-7181986、リポソーム媒介トランスフェクション法Wong,T.K.etal.,Gene,10:871980;Nicolau及びSene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-1901982;及びNicolauetal.,MethodsEnzymol.,149:157-1761987、DEAE-デキストラン処理法Gopal,Mol.CellBiol.,5:1188-11901985、及び遺伝子銃Yangetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:9568-95721990などの方法により、遺伝子を細胞内に移入させることができる。本発明のまた他の様態によると、本発明は、aアデノウイルスの末端逆位配列invertedterminalrepeat,ITR配列と、bi低酸素応答配列hypoxia-responseelements,HREエンハンサー配列と、iiE2Fプロモーター配列とを含み、前記E2Fプロモーターは、前記HREエンハンサー配列の下流に位置し、前記HREエンハンサー配列及びE2Fプロモーターは、協同的に同一の遺伝子の発現を促進する遺伝子発現調節配列と、c前記遺伝子発現調節配列に作動的に連結された、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、アポトーシス遺伝子及び抗血管新生遺伝子から構成された群から選択される治療学的トランス遺伝子とを含む、癌細胞特異的退縮活性の改善された組換えアデノウイルスを提供する。本発明の遺伝子発現調節配列は、上述の遺伝子伝達システムで利用される遺伝子発現調節配列と同一であるため、過度なる重複を避けるためにその記載を省く。本発明の遺伝子発現調節配列は、組換えアデノウイルスのE1A遺伝子の上流、欠失したE3遺伝子領域、又はE1A遺伝子の上流と欠失したE3遺伝子領域の両方に位置することができる。本発明の遺伝子発現調節配列がE1A遺伝子の上流に位置する場合、即ち、E1A遺伝子に本発明の遺伝子発現調節配列が作動的に連結された場合HRE-E2F-TERT-E1A、組換えアデノウイルスの複製が本発明の遺伝子発現調節配列により調節される。本発明の遺伝子発現調節配列が欠失したE3遺伝子領域に位置する場合は、‘遺伝子発現調節配列-トランス遺伝子-ポリA’発現カセット形態で欠失したE3遺伝子領域に挿入できる。本発明の明細書において、用語‘治療学的トランス遺伝子therapeutictransgene’は、癌細胞内で発現して、治療学的効果を示すヌクレオチド配列を意味する。本発明の明細書において、用語‘腫瘍抑制因子遺伝子tumorsuppressorgene’は、標的細胞内で発現し、腫瘍表現型を抑制できるかアポトーシスを誘導できるヌクレオチド配列を意味する。本発明の実施に有用な腫瘍抑制因子遺伝子には、p53遺伝子、APC遺伝子、DPC-4/Smad4遺伝子、BRCA-1遺伝子、BRCA-2遺伝子、WT-1遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子Leeetal.Nature,329:6421987、MMAC-1遺伝子、大腸腺腫症タンパク質米国特許第5,783,666号、大腸癌欠失遺伝子DCC遺伝子、MMSC-2遺伝子、NF-1遺伝子、染色体3p21.3に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子Chengetal.Proc.Nat.Acad.Sci.,95:3042-30471998、MTS1遺伝子、CDK4遺伝子、NF-1遺伝子、NF-2遺伝子及びVHL遺伝子が含まれる。本明細書において、用語‘抗原性遺伝子antigenicgene’は、ターゲット細胞内で発現し、免疫システムで認識できる細胞表面抗原性タンパク質を生産するヌクレオチド配列を意味する。このような抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原carcinoembryonicantigen,CEA、HER-2、PSA前立腺特異抗原及びp53Levine,A.,WO94/02167が含まれる。免疫システムが容易に認識するようにするために、前記抗原性遺伝子をMHC第I型抗原に結合させることができる。本明細書において、用語細胞毒性遺伝子Cytotoxicgeneは、細胞内で発現して毒性効果を示すヌクレオチド配列を意味する。このような細胞毒性遺伝子の例には、シュードモナス外毒素exotoxin、リシン毒素、ジフテリア毒素、CDシトシンデアミナーゼ、TKチミジンキナーゼなどをコードするヌクレオチド配列が含まれる。本明細書において、用語細胞増殖抑制遺伝子cytostaticgeneは、細胞内で発現されて、細胞周期途中に細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。このような細胞増殖抑制遺伝子の例には、p21、網膜芽細胞腫遺伝子、E2F-Rb融合タンパク質遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子をコードする遺伝子例えば、p16、p15、p18及びp19、成長停止特異性ホメオボックスgrowtharrestspecifichomeobox,GAX遺伝子WO97/16459及びWO96/30385などがあるが、これに限定されるものではない。本明細書において、用語アポトーシス遺伝子apoptoticgeneは、発現されて、プログラムされた細胞死を誘導するヌクレオチド配列を意味する。このようなアポトーシス遺伝子の例には、p53、アデノウイルスE3-11.6KAd2及びAd5由来又はアデノウイルスE3-10.5KAd由来、アデノウイルスE4遺伝子、p53経路遺伝子及びカスパーゼをコードする遺伝子が含まれる。本発明の明細書において、用語抗血管新生遺伝子anti-angiogenicgeneは、発現し、抗血管新生因子を細胞外に放出するヌクレオチド配列を意味する。抗血管新生因子には、アンジオスタチン、Tie2PNAS,1998,95,8795-800のような血管内皮成長因子VEGFの抑制因子、エンドスタチンなどが含まれる。組換えアデノウイルスに挿入されるトランス遺伝子は、プロモーター-トランス遺伝子-ポリA配列の発現カセットで挿入されることが好ましい。この場合、前記プロモーターとして、本発明の遺伝子発現調節配列HRE-TERT,HRE-E2F,HRE-TERTE2F又はHRE-E2F-TERT又は通常的なプロモーターを利用することができる。トランス遺伝子に結合される通常的なプロモーターは、好ましくは動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞で作動し、トランス遺伝子の転写を調節できるものであって、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、U6プロモーター、H1プロモーター、CMVサイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40プロモーター、HSVtkプロモーター、RSVプロモーター、EF1アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、β-アクチンプロモーター、ヒトIL-2遺伝子プロモーター、ヒトIFN遺伝子プロモーター、ヒトIL-4遺伝子プロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子プロモーター、ヒトGM-CSF遺伝子プロモーター、誘導性プロモーター、癌細胞特異的プロモーター例えば、TERTプロモーター、PSAプロモーター、PSMAプロモーター、CEAプロモーター、E2Fプロモーター及びAFPプロモーター及び組織特異的プロモーター例えば、アルブミンプロモーターを含むが、これに限定されるものではない。トランス遺伝子を発現させるための発現コンストラクトにおいてトランス遺伝子の下流にポリアデニル化配列が結合されていることが好ましい。前記ポリアデニル化配列は、牛成長ホルモンターミネーターGimmi,E.R.,etal.,NucleicAcidsRes.17:6983-69981989、SV40由来のポリアデニル化配列Schek,N,etal.,Mol.CellBiol.12:5386-53931992、HIV-1polyAKlasens,B.I.F.,etal.,NucleicAcidsRes.26:1870-18761998、β-グロビンpolyAGil,A.,etal,Cell49:399-4061987、HSVTKpolyACole,C.N.andT.P.Stacy,Mol.Cell.Biol.5:2104-21131985、又はポリオマーウイルスpolyABatt,D.BandG.G.Carmichael,Mol.Cell.Biol.15:4783-47901995を含むが、これらに限定されるものではない。最も好ましくは、本発明の治療学的トランス遺伝子は、アポリポタンパク質Klingle8LK8遺伝子、シトシンキナーゼCD遺伝子、チミジンキナーゼTK遺伝子、リラクシン遺伝子、及びデコリン遺伝子から構成された群から選択される一つ又は二つ以上の遺伝子である。デコリンは、TGFtumorgrowthfactor-βの活性を抑制させることにより、コラーゲンの繊維化を防ぎ、細胞外基質の構成matrixassemblyに関与して、腫瘍細胞成長を抑制し、腫瘍の形成と成長に拮抗剤として作用する。アポリポタンパク質Klingle8LK8は、血管内皮細胞の増殖を阻害することにより、腫瘍の成長及び増殖を阻害することが知られている。チミジンキナーゼTKは、チミジンだけではなく、ヌクレオチド類似体でありながら抗ウイルス製剤として利用されるガンシクロビルもリン酸化させることができ、リン酸化されたガンシクロビル-トリホスフェートは、DNA合成時、DNA鎖に挿入され、DNA鎖形成を中断させ、結果的にDNA合成を抑制する。TKが移入されなかった癌細胞にもガンシクロビル-トリホスフェートが入って細胞死を起こし傍観者効果bystandereffectを誘導することができ、癌細胞退縮による癌細胞特異的免疫反応が誘導されることによっても傍観者効果を誘導することができる。シトシンデアミナーゼCDは、毒性のない5-FC5-fluorocytosineを強力な細胞毒性を有する5-FU5-fluorouracilに転換させて、癌細胞退縮効果があることが報告された。本発明の他の様態によると、本発明は、a前記本発明の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、b薬剤学的に許容される担体とを含む抗腫瘍組成物を提供する。本発明の他の様態によると、本発明は、前記本発明の組換えアデノウイルスの治療学的有効量を含む抗腫瘍組成物を哺乳動物対象に投与する工程を含む癌治療方法を提供する。本発明の組成物に含まれる組み換えアデノウイルスは、上述のように、多様な腫瘍細胞に対して退縮効能を示すため、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍に係る様々な疾病又は疾患、例えば、胃癌、肺癌、乳房癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、子宮頸部癌などの治療に利用できる。本明細書において、‘治療’は、i腫瘍細胞形成の予防;ii腫瘍細胞の除去による、腫瘍に係る疾病又は疾患の抑制;及びiii腫瘍細胞の除去による、腫瘍に係る疾病又は疾患の軽減を意味する。したがって、本明細書における用語‘治療学的有効量’は、上記した薬理学的効果を達成するに十分な量を意味する。本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含むことができる。本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は、局部投与を利用して投与することができる。卵巣癌で腹腔内に投与する場合及び肝癌で門脈に投与する場合は、注入方法により投与することができ、乳房癌の場合は、腫瘍塊に直接注射して投与することができ、結腸癌の場合は、浣腸で直接注射して投与することができて、膀胱癌の場合は、カテーテル内に直接注射して投与することができる。本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって様々であり、普通に熟練した医者は、目的する治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。一般に、本発明の薬剤学的組成物は、1×105~1×1015pfu/mLの組換えアデノウイルスをを含み、通常的に、1×1010pfuを二日に一回、2週間注射する。本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び/又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造する。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エリキシル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態でもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができるが、これらに限定されない。本発明の薬剤学的組成物は、単独療法として利用してもよいが、他の通常的な化学療法又は放射療法と共に利用してもよく、このような並行療法を実施する場合は、より効果的に癌治療をすることができる。本発明の組成物と共に利用できる化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシンplicomycin、マイトマイシン、エトポシド、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナ、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びメトトレキサートなどを含む。本発明の組成物と共に利用できる放射療法は、X線照射及びγ線照射などである。本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、有効成分としてガンシクロビルGCVを更に含む。GCVは、CMVサイトメガロウイルス感染の予防及び治療のための抗ウイルス剤として使用されるフリン系化合物であって、HSV-TKによりリン酸化されることにより、活性化されたガンシクロビルトリホスフェート形態に転換される。このようなリン酸化されたGCVは、ヌクレオチド類似体として作用し、DNA合成時DNA鎖に挿入されることにより、DNA合成を抑制するようになる。したがって、本発明の組成物をGCVと共に併用投与する場合、HSV-TKを発現する腫瘍特異的ウイルスに感染された癌細胞でのみGCVのリン酸化が誘導されて、癌細胞を死滅させることができるようになる。また、HSV-TKが移入されなかった癌細胞においても、リン酸化されたGCVが細胞間の間隙結合gapjunctionを通じて入り、細胞死を起こす傍観者効果を通じて極大化された細胞退縮を誘導することができるため、非常に極大化された抗腫瘍活性を有する抗癌組成物として有用に利用できる。本発明の組成物は、上述の遺伝子伝達システムとGCVとを同時に含めて、一つの製剤として構成することもでき、遺伝子伝達システム組成物とGCVをそれぞれ別途の製剤として併用投与することもできる。本発明の特徴及び利点を要約すると、以下の通りである:a本発明は、HRE、E2F及びTERTの組み合わせからなる遺伝子発現調節配列及び選択的腫瘍細胞退縮活性の大きく改善された遺伝子伝達システムを提供する。b本発明は、特に低酸素条件で更に向上した抗腫瘍効果を示し、TK遺伝子の挿入及びGCVの併用投与により、現在癌の遺伝子治療療法の最も大きい制限である、全ての癌細胞に治療遺伝子を移入することができないという欠点を大きく改善する。以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。E-Rd19,EE-Rd19,HE-Rd19及びHEE-Rd19の製作E2Fプロモーター2コピーによりアデノウイルスの腫瘍選択的退縮活性がさらに向上したアデノウイルスを製作するために、pSP72-E2FクローニングベクターからSalI/NheIでE2FプロモーターDNAを切り取った後、p△E1sp1B-E2FクローニングベクターのXhoI/BamHI位置に挿入してp△E1sp1B-E2F-E2Fベクターを製作し、このベクターのEcoRI/BglII部位にEcoRI/BamHIで切り取ったRb7△19DNAをサブクローニングして、E2Fプロモーター2コピーを有したp△E1sp1B-E2F-E2F-Rb7△19アデノウイルスE1シャトルベクターを製作した。製作したp△E1sp1B-E2F-E2F-Rb7△19シャトルベクターを、アデノウイルストータルベクターであるdl324BstのE1部分に相同組み換えさせて、腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるEE-Rd19を製作した。また、低酸素症の腫瘍においてより活性を有する腫瘍選択的退縮アデノウイルスを開発するために、HRE6コピーとE2Fプロモーターを合体させて、合体したプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスを製作した。まず、HRE6コピーとE2Fプロモーターとが合体したE1アデノウイルスシャトルベクターを製作するために、E1シャトルベクターであるp△E1sp1AのXhoI部位に、pSP72-HRE6をSalI/XhoIで切断して得たHRE6コピーDNAを挿入してp△E1sp1A-HRE6アデノウイルスE1シャトルベクターを製作した。製作したp△E1sp1A-HRE6アデノウイルスE1シャトルベクターのEcoRI/BglII部位に、EcoRI/BamHIで切り取ったRb7△19DNAを挿入してp△E1sp1A-HRE6-Rb7△19を製作した。最後に、p△E1sp1A-HRE6-Rb7△19のXbaI/EcoRV部位に、NheI-EcoRVで切り取ったE2FDNAをサブクローニングして、HRE6コピーとE2Fプロモーターとが合体したプロモーターを有したE1シャトルベクターであるp△E1sp1A-HRE6-E2F-Rb7△19を製作した。製作したp△E1sp1A-HRE6-E2F-Rb7△19アデノウイルスE1シャトルベクターを、アデノウイルストータルベクターでありdl324BstのE1部分に相同組み換えさせて腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるHE-Rd19を製作完了した。さらに、E2Fプロモーター2コピーのプロモーターとHRE6とを同時に合体することにより、E2Fプロモーター2コピーによりさらに向上した腫瘍選択的退縮活性と共に低酸素症の腫瘍で活性をさらに増加した、より改善された腫瘍選択的退縮アデノウイルスを製作するために、pSP72-E2FクローニングベクターからSalI/NheIでE2Fプロモーターを切り取った後、p△E1sp1B-E2FクローニングベクターのXhoI/BamHI位置に挿入してp△E1sp1B-E2F-E2Fベクターを製作し、p△E1sp1A-HRE6をEcoRI-XbaI制限酵素で切断し、p△E1sp1B-E2FE2FをEcoRI-NheI制限酵素で切断した後、ライゲーションして、p△E1sp1B-HRE6-E2F-E2Fを製作した。このように製作したE1シャトルベクターをアデノウイルストータルベクターであるdl324BstのE1部分に相同組み換えさせて腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるHEE-Rd19を製作した。E-Rd19,EE-Rd19,HE-Rd19及びHEE-Rd19プロモーターを有する腫瘍選択的退縮アデノウイルスの癌細胞退縮活性検証-MTT分析前記製作したE-Rd19、EE-Rd19、及びHEE-Rd19腫瘍選択的退縮アデノウイルスの癌細胞特異的退縮活性を検証するために、それぞれのウイルスを様々な濃度の力価で、種々の癌細胞と、BJ及びMRC5のような正常細胞に感染させた後、細胞退縮の程度を比較観察した。図2から分かるように、HRE-E2F-E2Fプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスHEE-Rd19の癌細胞退縮活性は、E2F,HRE-E2F又はE2F-E2Fにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスE-Rd19,HE-Rd19,EE-Rd19より優れた癌細胞退縮力を示すことを確認し、特に、本発明に使用された全ての癌細胞株において組み換えられたHREE2F-E2Fプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスHEERd19の癌細胞退縮活性が、対照群であるRd19又は野生型アデノウイルスXCと比較して類似しているか、より向上したことが観察されたのに対し、正常細胞株では、野生型アデノウイルスに比べ、細胞退縮力が減少することを確認することができ、癌細胞特異性にも優れていることを確認した。癌細胞退縮活性をより定量化するためのMTT分析結果においても、組み換えられたHRE-E2F-E2Fプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスHEE-Rd19の癌細胞退縮活性が、対照群であるAd-Rb7△19又は野生型アデノウイルスと比較して類似しているか、より向上したことを確認し、HEE-Rd19の癌細胞退縮活性がHREにより、正常条件に比べ低酸素条件でさらに増加したことを確認した図3。これと同様に、HRE6が組み合わされたHE-Rd19の癌細胞退縮活性がE-Rd19に比べて低酸素症状態で増加することを確認することができ、低酸素症状態でHRE6がエンハンサーとして作用することが分かった。E2Fプロモーターが組み換えられてLK8を発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスの製作血管内皮細胞の増殖を阻害するLK8が挿入されたE1シャトルベクターを製作するために、pcDNAに挿入されているLK8遺伝子をNheI/XhoIで切り取った後、NheI/SalIを処理したp△E1sp1A-HRE-E2F-E2F-Rb7△19に挿入してE1アデノウイルスシャトルベクターとしてp△E1sp1A-LK8-HRE-E2F-E2F-Rb7△19を製作した。アデノウイルストータルベクターであるdl324-35KのE1部分をBstBI制限酵素で切断した後、XmnIで切断したLK8を発現するE1シャトルベクターp△E1sp1A-LK8-HRE-E2F-E2F-Rb7△19を相同組み換えてE1にLK8を発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるHEE-Rd19-K35/LKを製作した図4。製作したアデノウイルスを、A549細胞株で増殖させ、制限力価分析limitingtiterationassayで、生産されたアデノウイルスの力価プラーク形成単位;PFUを算出した図4。E2Fプロモーターが組み換えられてLK8を発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるHEE-Rd19-K35/LKの癌細胞退縮活性検証LK8を発現する組み換えられたE2Fプロモーターにより複製が調節されるアデノウイルスであるHEE-Rd19-K35/LKの癌細胞退縮活性を検証するために、それぞれのウイルスを様々な濃度の力価で癌細胞に感染させた後、癌細胞退縮程度を比較観察した図5。図5から分かるように、HEE-Rd19-K35/LKの癌細胞退縮活性力は、対照群であるRd19又は野生型アデノウイルスであるXCと比較し、非常に向上したことを観察することができた。また、HEE-Rd19-K35/LKの癌細胞退縮効果をより定量化するためにMTT分析を行った結果、種々のヒト肺癌細胞株A549,H358,H2009,H596,H2172,HCC827に、陰性対照群である複製不能アデノウイルスのdE1、ファイバーを置換しなかった対照群複製可能アデノウイルスのRd19、修飾されたE2Fプロモーターにより複製が調節されてアデノウイルスタイプ35のファイバーで置換された腫瘍選択的退縮アデノウイルスのHEE-Rd19-K35/LKウイルスを0.1-0.5MOI力価で感染させた後、時間帯別に生き残った細胞の生存率をMTT分析を通じて測定した図6。図6から分かるように、本実験に利用された全ての肺癌細胞株において、対照群ウイルスであるRd19に比べ、HEE-Rd19-K35/LKの細胞退縮活性が増加したことを観察することができた。特に、H322細胞株では、ファイバーが置換されなかった対照群ウイルスであるRd19が、アデノウイルスタイプ35のファイバーで置換された腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるHEE-Rd19-K35/LKと類似したウイルス複製能と癌細胞退縮活性を確認し、このような結果は、H322がアデノウイルス細胞受容体であるCARコクサッキーウイルスアデノウイルス受容体の発現が高く、タイプ35ファイバーのレセプターであるCD46の発現が低いことと一致する結果である。上記の結果を要約すると、本研究で製作した修飾されたE2Fプロモーターにより複製が調節され、アデノウイルスタイプ35ファイバーで置換した改善された腫瘍選択的退縮アデノウイルスのHEE-Rd19-K35/LKは、プロモーターの組み換えとファイバーの置換による癌細胞感染能が増加し、これにより、効果的な癌細胞退縮活性を誘導することを検証することができた。E2Fプロモーターが組み換えられてLK8を発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるHEE-Rd19-K35/LKの抗腫瘍効果検証HEE-Rd19-K35/LK腫瘍選択的複製可能アデノウイルスの生体内抗腫瘍効果を検証するために、ヒト肺癌細胞株であるA549細胞株をヌードマウスの腹部皮下に注射して、形成された腫瘍に、1×1010VPのRd19又はHEE-Rd19-K35/LKアデノウイルスを陰性対照群のPBSと共に二日間隔で3回腫瘍内に投与した後、腫瘍の成長を観察した図7。対照群のPBSを投与したマウスの場合、ウイルス投与後25日頃に腫瘍の容積が約500mm3に急激に成長したが、腫瘍特異的退縮アデノウイルスであるRd19又はHEE-Rd19-K35/LKを投与した場合は、腫瘍の成長が非常に遅延されることを確認した。即ち、Rd19又はHEE-Rd19-K35/LKアデノウイルスを投与したマウスの場合、ウイルス投与後25日頃に腫瘍の容積が約300mm3又は100mm3で、それぞれ対照群に比べて60と20に大いに減少することを確認した。また、現在商品化された遺伝子治療剤であるゲンディシンを投与したマウスの場合、ウイルス投与後25日に腫瘍の容積が約350mm3であって、HEE-Rd19-K35/LKは、ゲンディシンに比べても著しく優れた抗腫瘍効果が誘導されることを確認することができた。E2FとTERTプロモーターが組み換えられた複製不能アデノウイルスHRE6-TERT-E2F又はHRE6-E2F-TERTの製作HRE6コピー、修飾されたTERTプロモーター及びE2Fプロモーターを合体させたプロモーターによるアデノウイルスの複製能の差を確認するために、まず、HRE6コピーと修飾されたTERTプロモーター及びE2FプロモーターをHRE6/TERT/E2F順に組み換えたプロモーターによりGFPの発現が調節される複製不能アデノウイルスを製作した。まず、本発明者らが製作したpSP72-mTERTのSfuI,SalI部位に、pSP72-E2FベクターからClaI,SalI制限酵素で切り取ったE2FプロモーターをクローニングしてpSP72-TERT-E2Fを製作し、ClaI部位にpGL3-HRE6-APFベクターからClaI制限酵素で切り取ったHRE6コピーをクローニングしてpSP72-HRE6/TERT/E2Fを製作した。次いで、アデノウイルスE1シャトルベクターであるpΔE1sp1BΨをXhoI,EcoRIで切り取って、pSP72-HRE6/TERT/E2FをSalI,EcoRIで切り取った組み換えプロモーターHRE6/TERT/E2FをクローニングしたpΔE1sp1BΨ-HRE6/E2F/TERTを製作した。pΔE1sp1BΨ-HRE6/E2F/TERTをEcoRI,XbaIで切断し、pCDNA3.1/zeo-EGFPをEcoRI,NheIで切断して得たEGFPをクローニングして、pΔE1sp1BΨ-HRE6/TERT/E2F-EGFPシャトルベクターを完成した。また、HRE6コピー、E2Fプロモーター及び修飾されたTERTプロモーターをHRE6/E2F/TERT順に組み換えたプロモーターによりGFPの発現が調節される複製不能アデノウイルスを製作するために、本発明者らが製作したpΔE1sp1BΨ-E2FTERT-Rb7Δ19をEcoRI,ClaIで切断して得たE2F-TERTを、E1シャトルベクターであるpΔE1sp1BΨのEcoRI,ClaI部位に挿入してpΔE1sp1BΨ-E2F-TERTを製作した。pΔE1sp1BΨ-E2F-TERTのClaI部位にpGL3-HRE6-APFベクターからClaI制限酵素で切り取ったHRE6をクローニングしてpΔE1sp1BΨ-HRE6/E2F/TERTを製作した。次いで、pΔE1sp1BΨ-HRE6/E2F/TERTをEcoRI,XbaIで切断して、pCDNA3.1/zeo-EGFPをEcoRI,NheIで切断して得たEGFPを挿入してpΔE1sp1BΨ-HRE6/E2F/TERT-EGFPシャトルベクターを完成した。このように製作したpΔE1sp1BΨ-HRE6/TERT/E2F-EGFP又はpΔE1sp1BΨ-HRE6/E2F/TERT-EGFPアデノウイルスE1シャトルベクターをアデノウイルストータルベクターであるdE1-k35のE1部分に相同組み換えさせてdE1-HmTE-k35/GFPとdE1-HEmTk35/GFPアデノウイルスを製作した図8。dE1-HmTE-k35/GFPとdE1-HEmT-k35/GFPアデノウイルスの遺伝子伝達効率の比較製作した組み換えプロモーターの活性を比較するために、種々の癌細胞に、製作した複製不能アデノウイルスを感染させて、36時間後FACSを利用してGFPの発現を確認した図9。図9から分かるように、HREエンハンサーがプロモーターに挿入されている二種類のdE1-HEmT-k35/GFPとdE1-HmTE-k35/GFPウイルスにより、低酸素条件におけるGFP発現が正常条件に比べ大きく増加することを確認した。このことは、HREが低酸素条件でエンハンサーとして作用し、ウイルスdE1-HEmT-k35/GFP,dE1-HmTE-k35/GFPの遺伝子の伝達効率を増加させることができることを意味する。また、脳癌細胞株であるU343とその他の癌細胞株Hep1,MDAMB231においてdE1-HEmTk35/GFPとdE1-HmTE-k35/GFPによる遺伝子伝達効率が優れており、特に、dE1-HEmT-k35/GFPが感染した細胞のGFP発現が、dE1-HmTE-k35/GFPが感染した細胞と比較して著しく増加することを確認した。このような結果を通じて、癌細胞におけるHEmT組み換えプロモーターの活性が、HmTE組み換えプロモーターの活性に比べて大きく増加することを確認した。図10から分かるように、CMVプロモーターによりGFPの発現が調節されるdE1-CMV-k35/GFPのGF発現が、癌細胞株であるU373MGと正常細胞であるBJ,CBHEL,IMR90の両方において高い。これに対して、dE1-HEmT-k35/GFPによるGFP発現は、癌細胞株であるU373MGではdE1-CMV-k35/GFPによるGFP発現と類似していた。したがって、プロモーター活性が非常に高いことを確認した。また、dE1-HEmT-k35/GFPによるGFP発現は、正常細胞では、何の処理もしなかった陰性対照群と類似しており、したがって、HEmTプロモーターの癌細胞特異性が非常に高いことを確認した。HRE6コピー,E2Fプロモーター,及び修飾されたTERTプロモーターが組み換えられたプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるHEmTRd19-k35とHmTE-Rd19-k35の製作HRE6コピー、E2Fプロモーター、及び修飾されたTERTプロモーター順に合体された組み換えプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるHEmT-Rd19-k35を製作するために、まず、本発明者らが製作したE1シャトルベクターのΔE1sp1BΨ-Rb7△19をClaI,SalIで切断し、pSP72-E2FにClaI,SalIで切断して得たE2Fプロモーターを挿入してpΔE1sp1BΨ-Rb7△19-E2Fを製作した。これを再びEcoRI,XhoI部位で切断した後、pcDNA3.1-mTERTをEcoRI,XhoI制限酵素で切断して得た修飾されたTERTプロモーターとクローニングし、そして、pSP72-E2FベクターからClaI,SalI制限酵素で切り取ったE2FプロモーターをクローニングしてpΔE1sp1BΨ-Rb7△19-E2F-TERTを製作した。最後に、pΔE1sp1BΨ-Rb7△19-E2F-TERTのClaI部位にpGL3-HRE6-APFベクターからClaI制限酵素で切り取ったHRE6をクローニングして、アデノウイルスE1シャトルベクターであるpΔE1sp1BΨ-Rb7△19-HRE6/E2F/mTERTを製作した。一方、HRE6コピーと修飾されたTERTプロモーター、及びE2Fプロモーター順に組み換えられたプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるHmTE-Rd19-k35を製作するために、まず、本発明者らが製作したアデノウイルスE1シャトルベクターのpΔE1sp1AΨをEcoRV,HindIIIで切断して、pSP72-E2FをEcoRV,HindIIIで切断して得たE2Fプロモーターを挿入してpΔE1sp1AΨ-E2Fを製作した。E1シャトルベクターのpΔE1sp1BΨをEcoRI,XhoI部位で切断した後、pcDNA3.1-mTERTをEcoRI,XhoI制限酵素で切断して得たTERTプロモーターとクローニングしてpΔE1sp1BΨ-TERTを製作した。pΔE1sp1AΨ-E2FのClaI,EcoRV部位にΔE1sp1BΨ-TERTをClaI,EcoRVで切断して得た修飾されたTERTを挿入してpΔE1sp1AΨ-TERT-E2Fを製作した。このように製作したpΔE1sp1AΨ-TERT-E2FをClaI,SalIで切断して、本発明者らが製作したE1シャトルベクターであるpΔE1sp1BΨ-Rb7△19のClaI,SalI部位に挿入したpΔE1sp1BΨ-Rb7△19-TERT-E2Fを製作した。最後に、pΔE1sp1BΨ-Rb7△19-TERT-E2FのClaI部位にpGL3-HRE6-APFベクターからClaI制限酵素で切り取ったHRE6をクローニングしてアデノウイルスE1シャトルベクターであるΔE1sp1BΨ-Rb7△19-HRE6/TERT/E2Fを製作した。このように製作したアデノウイルスE1シャトルベクターであるpΔE1sp1BΨ-Rb7△19-HRE6/TERT/E2F,pΔE1sp1BΨ-Rb7△19-HRE6/TERT/E2Fを、アデノウイルストータルベクターであるdl324-35KのE1部分に相同組み換えさせて、組み換えられたプロモーターによりウイルスの複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるHEmTRd19-k35とHmTE-Rd19-k35の製作を完了した。HEmTプロモーターにより複製が調節されて、細胞外基質を分解することができるデコリン遺伝子を発現するHEmT-Rd19-k35/DCN腫瘍選択的退縮アデノウイルスの製作デコリンDecorinは、SLRPスモールロイシンリッチプロテオグリカン分類に属するタンパク質であって、10個~12個のロイシンリッチな反復配列から構成されており、コア部位は、アーチ状になっており、細胞外基質に存在する種々の成長因子あるいはデコリン受容体との結合が容易な構造に形成されている。デコリンは、TGFtumorgrowthfactor-βの活性を抑制させることにより、コラーゲンの繊維化を防ぎ、細胞外基質アセンブリーに関与し、腫瘍細胞成長を抑制し、腫瘍の形成と成長に天然の拮抗剤として作用すると知られている。また、デコリンは、成長因子や金属イオンのような細胞外基質の構成成分と反応し、MMP-1のような様々な種類のMMPの発現を促進させ細胞外基質を分解させる。最近の研究結果によると、デコリンを、EGFR上皮成長因子受容体の新しい生物学的リガンドとして、様々な種類の癌細胞に処理すると、EGFRと結合することにより、EGFRの役割を不活性化させると共に、内在性のサイクリン依存性p21WAF1の発現が促進され、細胞周期G1停止誘導により細胞退縮を誘導することが報告された。したがって、デコリンを発現するアデノウイルスは、ウイルスの拡散を増加させることにより、アデノウイルスを利用した治療遺伝子の伝達効率を高めることができるだけではなく、デコリンそのものによる癌細胞退縮効果も誘導することができる。これらの事実に基づいて、アデノウイルスのE1部位にデコリンを発現するウイルスを製作するために、pCA14クローニングベクターのBamHI部位に切断されたデコリンDNAをサブクローニングしてpCA14-デコリンを製作した。pCA14/DCNGプラスミドにBglII制限酵素を処理してDCNの発現カセットを獲得し、本発明者らが製作したpΔE1sp1BΨ-Rb7△19にBamHI制限酵素でクローニングして、pΔE1sp1BΨ-Rb7△19-DCNを製作した。一方、プロモーターをクローニングするために、pΔE1sp1BΨ-E2F-TERTをClaIとEcoRI制限酵素を処理してE2F-TERTを獲得した後、pΔE1sp1BΨ-Rb7Δ19-DCNGシャトルベクターにクローニングして、pΔE1sp1BΨ-E2F-mTERT-Rb7Δ19-DCNを製作した。PGL3-HRE6-AFPプラスミドで制限酵素ClaIを処理してHRE6コピーを獲得した後、pΔE1sp1BΨ-E2F-mTERT-Rb7Δ19-DCNプラスミドにClaI制限酵素でクローニングし、pΔE1sp1BΨ-HRE6/E2F/TERT-Rb7Δ19-DCNアデノウイルスシャトルベクターを製作した。製作したアデノウイルスシャトルベクターは、XmnIを利用して線形化した後、トータルベクターであるdE1-k35と相同組み換えてHEmT-Rd19-k35/DCNウイルスを製作した。以後、製作したアデノウイルスは、A549細胞株で増殖させて大量生産した。生産されたウイルスの力価を、制限力価分析で算出した図12。HemT組み換えプロモーターが挿入され、E1部位でデコリン遺伝子を、E3部位でCDTKを発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるHEmT-Rd19-k35/CDTKE3とHEmT-Rd19-k35/DCN/CDTKの製作HSV-TK単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼは、現在最も高い頻度で使用される薬剤感受性遺伝子であって、毒性のないプロドラッグであるガンシクロビルGCVをリン酸化させ、感染された細胞のDNA合成を抑制し、分裂する細胞を選択的に退縮できる癌治療遺伝子である。チミジンキナーゼTKは、DNA合成時、サルベージ経路に利用される酵素である。HSV-TKは、チミジンだけではなく、ヌクレオチド類似体でありながら抗ウイルス製剤として利用されるガンシクロビルもリン酸化させることができる。リン酸化されたガンシクロビル-トリホスフェートは、DNA合成時、DNA鎖に挿入され、DNA鎖形成を中断させ、結果的にDNA合成を抑制する。また、死んだ癌細胞のアポトーシスビヒクルを、隣接した生きている癌細胞が貪食ファゴサイトーシスすることにより、HSV-TKが移入されなかった癌細胞にもガンシクロビル-トリホスフェートが入って細胞死を起こし傍観者効果を誘導することができる。癌細胞退縮による癌細胞特異的免疫反応が誘導されることによっても傍観者効果を誘導することができる。また、CDシトシンデアミナーゼは、毒性のない5-FC5-フルオロシトシンを強力な細胞毒性と放射線感受性を有する5-FU5-フルオロウラシルに転換させる作用をする。最近、このようなCD遺伝子を移入させた遺伝子治療において、CD遺伝子の発現による癌細胞退縮効果が報告された。このようなことに着目し、癌細胞特異的活性に優れたHemT組み換えプロモーターにより複製が調節されるアデノウイルスのE1部位でデコリン遺伝子を、E3部位ではCDとTKを同時に発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスを製作した。CDとTKを発現するアデノウイルスのE3シャトルベクターを製作するために、pCKhTK-IRES-hCDプラスミドを、BamHI制限酵素を利用してヒト型のCD-IRES-TKを獲得した後、pSP72/E3/CMV-PolAベクターに挿入して、pSP72-E3/CMV-CD-IRES-TK-PolAアデノウイルスE3シャトルベクターを製作した。製作したベクターをPvuIで線形化した後、上記で製作したHEmT-Rd19-k35,HEmT-Rd19-k35/DCNトータルベクターとE3部位に相同組み換えて、HEmT-Rd19-k35/CDTKE3とHEmT-Rd19-k35/DCN/CDTKアデノウイルスをそれぞれ製作した図13。HEmT-Rd19-k35/DCN腫瘍選択的退縮アデノウイルスのデコリン発現検証ウエスタンブロットアッセイ上記の方法により製作したHEmT-Rd19-k35/DCN腫瘍選択的アデノウイルスがデコリンを十分発現するかどうか確認するために、ウエスタンブロットアッセイを行った図14。図14から分かるように、本研究に使用されたRd19-k35/DCN,HEmTRd19-k35/DCNアデノウイルスによりデコリンが正常に発現していることを確認した。HemT組み換えプロモーターにより複製が調節され、デコリンを発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスの退縮活性検証CPEアッセイ上記で製作したHEmT-Rd19-K35/DCN腫瘍選択的退縮アデノウイルスの退縮活性を検証するために、それぞれのウイルスを様々な濃度の力価で脳癌細胞株U373MG,U87MG,T98G,U343と頭頸部癌細胞株CAL27,IMR90,SJSA、その他の種々の癌細胞株H460,H358,C33A,Hep1、そして正常細胞株IMR90,BJ,CBHELに感染させた後、退縮程度を比較観察した図15。図15から分かるように、デコリンを発現するRd19-K35/DCN又はHEmT-Rd19-K35/DCN腫瘍選択的退縮アデノウイルスの癌細胞退縮活性が、対照群のRd19-K35又はHEmT-Rd19-K35に比べ、それぞれ増加したことを観察することができた。したがって、デコリン発現による癌細胞退縮活性増大効果を確認した。HEmT-Rd19-K35/DCN腫瘍選択的退縮アデノウイルスの退縮活性検証MTTアッセイデコリンを発現するHEmT-Rd19-k35/DCN腫瘍選択的退縮アデノウイルスの退縮活性をより定量的に検証するために、脳癌細胞株U343,U87MGとその他の種々の癌細胞株Huh7,C33AにRd19-k35,HEmT-Rd19-k35,Rd19-k35/DCN,HEmT-Rd19-k35/DCNをそれぞれ感染させた後、退縮程度を比較観察した図16。図16から分かるように、本研究に使用された全ての癌細胞株において、HEmTプロモーターにより複製が調節されるHEmT-Rd19-k35腫瘍選択的退縮アデノウイルスの癌細胞退縮活性が、対照群であるRd19-k35より優れていることを確認した。また、デコリンを発現するRd19-k35/DCN又はHEmT-Rd19-k35/DCN腫瘍選択的退縮アデノウイルスの癌細胞退縮活性が、各ウイルスの対照群であるRd19-k35,HEmT-Rd19-k35に比べ、大きく増加したことを確認することができた。以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。"