Gタンパク質共役受容体GPCR経路活性における検査条件の効果の査定方法であって、aレポーター酵素の1つの変異体への融合タンパク質としてGPCRを、また、別の酵素変異体への融合として相互作用するタンパク質パートナーを発現する細胞を提供し、ここで前記細胞は、前記GPCRへのアレスチンの結合を強化させるべく改変されたアレスチンを発現しており、前記アレスチンと前記GPCR間の結合強化が、前記検査条件の前記効果の検知感度を増加させる、b前記検査条件の下で前記GPCRのリガンドに対し細胞を提示し、およびc前記レポーター酵素の相補により、前記GPCRの活性を監視することを含み、前記検査条件が不在の場合と比較して細胞内のレポーター酵素活性が増加することは、相互作用するタンパク質パートナーとのGPCRの相互作用が、前記検査条件不在の場合と比較して増加することを示し、また、前記検査条件が不在の場合の発生と比べ細胞内のレポーター酵素活性が減少することが、相互作用するタンパク質パートナーとのGPCRの相互作用が前記検査条件が不在の場合と比べて減少することを示すものである方法。Gタンパク質共役受容体GPCR経路活性における検査条件の効果の査定方法であって、aレポーター酵素の1つの変異体への融合タンパク質としてGPCRを、また、別の酵素変異体への融合として相互作用するタンパク質パートナーを発現する細胞を提供し、ここで前記GPCR融合タンパク質が1または複数セットのセリンスレオニンクラスターを含むべく改変され、前記1または複数セットのセリンスレオニンクラスターが前記GPCRのアレスチンへの結合を強化させ、前記GPCRと前記アレスチン間で強化された前記結合が前記検査条件の前記効果の検知感度を増加させる、b前記検査条件の下で前記GPCRのリガンドに対し細胞を暴露し、およびc前記レポーター酵素の相補により、前記GPCRの活性を監視することを含み、前記検査条件が不在の場合と比較して細胞内のレポーター酵素活性が増加することは、相互作用するタンパク質パートナーとのGPCRの相互作用が、前記検査条件不在の場合と比較して増加することを示し、また、前記検査条件が不在の場合の発生と比べ細胞内のレポーター酵素活性が減少することが、相互作用するタンパク質パートナーとのGPCRの相互作用が前記検査条件が不在の場合と比べて減少することを示すものである方法。生物的に活性のハイブリッドGPCRをコードする配列を含むDNA分子であって、前記ハイブリッドGPCRがレポーター酵素の1つの変異体への融合タンパク質としてのGPCRを構成し、前記ハイブリッドGPCRが前記1または複数セットのセリンスレオニンクラスターを含むよう改変されており、前記1または複数セットのセリンスレオニンクラスターが前記ハイブリッドGPCRのアレスチンへの結合を強化させる、DNA分子。細胞内へ生物的活性ハイブリッドGPCRの発現を導き得、以下の操作的にリンクした要素:プロモーター、および生物的に活性なハイブリッドGPCRをコードする配列を含むDNA分子、を含み、前記ハイブリッドGPCRがレポーター酵素の1つの変異体への融合タンパク質としてのGPCRを構成し、前記ハイブリッドGPCRが前記1または複数セットのセリンスレオニンクラスターを含むよう改変されており、前記1または複数セットのセリンスレオニンクラスターが前記ハイブリッドGPCRのアレスチンへの結合を強化させるものであるDNA構築物。細胞内へ生物的活性ハイブリッドGPCRの発現を導き得るDNA構築物であって、以下の操作的にリンクした要素:プロモーター、および、生物的に活性なハイブリッドGPCRをコードする配列を含むDNA分子、を含み、前記ハイブリッドGPCRがレポーター酵素の1つの変異体への融合タンパク質としてのGPCRを構成し、前記ハイブリッドGPCRが前記1または複数セットのセリンスレオニンクラスターを含むよう改変されており、前記1または複数セットのセリンスレオニンクラスターが前記ハイブリッドGPCRのアレスチンへの結合を強化させるものであるDNA構築物によって形質転換された細胞。生物的に活性なハイブリッドアレスチンをコードする配列を含み、前記ハイブリッドアレスチンがレポーター酵素の1の変異体への融合タンパク質としてのアレスチンを構成し、前記ハイブリッドアレスチンがGPCRへの前記アレスチンの結合を強化するよう改変されているDNA分子。細胞内に生物的に活性なハイブリッドアレスチンの発現を導くことができ、以下の操作的にリンクした要素:プロモーター、および生物的に活性なハイブリッドアレスチンをコードする配列を含むDNA分子、を含み、前記ハイブリッドアレスチンがレポーター酵素の1の変異体への融合タンパク質としてのアレスチンを構成し、前記ハイブリッドアレスチンがGPCRへの前記アレスチンの結合を強化させるよう改変されている、DNA構築物。細胞内へ生物的に活性なハイブリッドアレスチンの発現を導くことができ、以下の操作的にリンクした要素:プロモーター、および生物的に活性なハイブリッドアレスチンをコードする配列を含むDNA分子、を含み、前記ハイブリッドアレスチンがレポーター酵素の1つの変異体への融合タンパク質としてのアレスチンを構成し、前記ハイブリッドアレスチンがGPCRへの前記アレスチンの結合を強化させるよう改変されているDNA構築物により形質転換された細胞。Gタンパク質共役受容体GPCR経路活性における検査条件の効果の査定方法であって、aレポーター酵素の1の変異体への融合タンパク質としてGPCRを、また、別の酵素変異体への融合として相互作用するタンパク質パートナーを発現させる細胞を提供し、ここで前記細胞はアレスチンをもまた発現し、前記アレスチンがリン酸化認識領域内のポイントミューテーションを誘導することによって、GPCRがアレスチンへ結合する際にGPCRのリン酸化必要であるという条件を取り除き、GPCRがリン酸化されているか否かに関わらず細胞内のGPCRへのアレスチンの結合を可能にしている、b前記検査条件の下で前記GPCRのリガンドに対し細胞を暴露し、およびc前記レポーター酵素の相補により、前記GPCRの活性を監視することを含み、前記検査条件が不在の場合と比較して細胞内のレポーター酵素活性が増加することは、相互作用するタンパク質パートナーとのGPCRの相互作用が、前記検査条件不在の場合と比較して増加することを示し、また、前記検査条件が不在の場合の発生と比べ細胞内のレポーター酵素活性が減少することが、相互作用するタンパク質パートナーとのGPCRの相互作用が前記検査条件が不在の場合と比べて減少することを示すものである方法。前記アレスチンが、活性化された非リン酸化GPCRの結合親和性および結合活性からなる群より選択される特性を増強するものである、請求項9記載の方法。前記アレスチンがβアレスチン2であり、βアレスチン2がArg169を逆の電荷を有する残基に変換されるよう変異されている、請求項10記載の方法。逆の電荷を有する残基が、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、スレオニンにより成る群から選択される、請求項11記載の方法。前記アレスチンが活性化かつリン酸化されたGPCRの結合親和性および結合活性からなる群から選択される特性を増強する、請求項9記載の方法。Gタンパク質共役受容体GPCR経路活性における検査条件の効果の査定方法であって、aレポーター酵素の1つの変異体への融合タンパク質としてGPCRを、また、別の酵素変異体への融合として相互作用するタンパク質パートナーを発現させる細胞を提供し、ここで、前記GPCR融合タンパク質が1つあるいは複数のセリンスレオニンクラスターを含むべく改変され、セリンスレオニン残基として定義される前記1つあるいは複数のセリンスレオニンクラスターが前記GPCRのカルボキシル末端内の3つの連続する、あるいは、4つのうち3つの部位を占め、前記1または複数セットのセリンスレオニンクラスターが前記GPCRのアレスチンへの結合を強化させ、前記GPCRと前記アレスチン間で強化された前記結合が前記検査条件の前記効果の検知感度を増加させるものである、b前記検査条件の下で前記GPCRのリガンドに対し細胞を提示し、およびc前記レポーター酵素の相補により、前記GPCRの活性を監視することを含み、前記検査条件が不在の場合と比較して細胞内のレポーター酵素活性が増加することは、相互作用するタンパク質パートナーとのGPCRの相互作用が、前記検査条件不在の場合と比較して増加することを示し、また、前記検査条件が不在の場合の発生と比べ細胞内のレポーター酵素活性が減少することが、相互作用するタンパク質パートナーとのGPCRの相互作用が前記検査条件が不在の場合と比べて減少することを示すものである方法。改変された前記アレスチンが活性化リン酸化されたGPCRへの結合強化を誘導するものである、請求項1記載の方法。改変された前記アレスチンが、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、スレオニンにより成るグループから選択されるアミノ酸へのArg169の変換を含む、請求項14記載の方法改変された前記アレスチンがVAL170のアラニンへの変換を含む、請求項14記載の方法。前記アレスチンがβアレスチン1およびβアレスチン2から成る群から選択され、前記βアレスチン1または前記βアレスチン2がカルボキシル末端の全てまたは一部において前記βアレスチン1または前記βアレスチン2の半分に切形されている、請求項14記載の方法。前記βアレスチン1または前記βアレスチン2が前記βアレスチン1または前記βアレスチン2のアミノ酸190から前記βアレスチン1または前記βアレスチン2のカルボキシル末端まで切形されている、請求項18記載の方法。前記アレスチンがβアレスチン1、βアレスチン2および/または視覚系アレスチンのキメラである、請求項14記載の方法。前記アレスチンがβアレスチン1、βアレスチン2および/または視覚系アレスチンのキメラである、請求項10記載の方法。前記アレスチンがβアレスチン1、βアレスチン2および/または視覚系アレスチンのキメラである、請求項11記載の方法。前記アレスチンがβアレスチン1、βアレスチン2および/または視覚系アレスチンのキメラである、請求項12記載の方法。前記アレスチンがβアレスチン1であり、前記βアレスチン2がArg170を逆の電荷を有する残基と変換するよう変異されている、請求項10記載の方法。改変された前記アレスチンが、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、スレオニンにより成るグループから選択されるアミノ酸へのArg170の変換を含む、請求項14記載の方法。上記に参照された研究にはそれぞれ以下の例にような欠点がある。従来技術の方法では、タンパク質の過剰発現が必要であり、人為結果を招いたり、細胞調節器の均衡が崩れるなどの恐れがある。従来の可視化または造影アッセイ法ではスループットが低く、完全な定量化に欠く。従って、スループットの高い薬理運動学的アッセイ法には不適である。さらに、従来技術のアッセイ法では、GPCRの隔離を必要とし、細胞内でのGPCRの観察ができない。そのため、GPCR機能の監視のためには方法を改善する必要があった。発明の要約本発明は米国出願連続番号第09654499号における開示に変更を提供するものである。特に本発明は、アッセイ法の感度をさらに強化する下記の発明の側面を変更する方向付けを持つ。変更は、GPCRがリン酸化か非リン酸化に関わらず活性化されたGPCRへの結合を強化する、遺伝的変異されたアレスチンの利用、および、独自の構造的モチーフを有しないオーファン受容体のスクリーニングアッセイを簡易化するセリンスレオニンクラスター戦略の利用、および、さらに強化された検知を達成するための上記変更をの併用を含む。本発明の最初の側面はGPCR機能を受容体活性化の箇所で近位的に監視し、従って、より少数の競合メカニズムにより、薬剤発見目的に多くの情報を提供せしめる方法である。GPCRの活性化は、受容体と、アレスチン、Gタンパク質、GRK、または、その他のキナーゼなどの、受容体への結合が受容体のアゴニスト居住に依存する、調整化合物の相互作用の出力により測定される。本発明は、変異レポーター酵素の相補によるタンパク質タンパク質相互作用の検知に関するものである。活性化GPCRへのアレスチンの結合は、これまで研究されているほとんどのGPCRで実証されている脱感作の第一段階における共通の過程である。変異酵素相補検定ICASTなどを通してのGPCRのアレスチンとの相互作用の測定は、多様なGPCRとオーファン受容体に適用されるより一般的なアッセイ技術を提供するものである。本発明のさらなる側面は、変異レポーター酵素への融合タンパク質として、例えばムスカリン、アドレナリン、ドーパミン、アンギオテンシン、エンドセリン様のGPCRを発現せしめる検査細胞を提供し、例えばGタンパク質、アレスチン、GRKなど、相補変異レポーター酵素との融合タンパク質として、GPCR経路内でタンパク質を相互作用させることより、検査状況下でGPCR経路活性化を査定する方法である。検査状況下で、検査細胞がターゲットGPCRの既知のアゴニストに提示されると、GPCRの活性化がレポーター酵素の相補により監視される。増加したレポーター酵素活性は、相互作用するそのタンパク質パートナーとの、GPCRの相互作用を反映する。本発明のさらなる側面は、検査アレスチン、例えばβアレスチンなどの存在下でGPCR経路の活性化を査定する方法である。本発明のさらなる側面は、検査Gタンパク質の存在下でGPCR経路の活性化を査定する方法である。本発明のさらなる側面は、検査細胞を検査リガンドに提示した状態でのGPCR経路の活性化を査定する方法である。本発明のさらなる側面は、セカンドレセプターの検査細胞内の共発現におけるGPCR経路の活性化を査定する方法である。セカンドレセプターは同一GPCRまたはオーファン受容体ホモダイマー、異なるGPCRまたはオーファン受容体ヘテロダイマーか、あるいは、別のタイプのレセプターがあり得る。本発明のさらなる側面は、オーファンGPCRのリガンドまたはアゴニストのスクリーニング方法である。リガンドまたはアゴニストは自然または合成ライブラリまたは混合に含まれるか、あるいは、物理的刺激があり得る。検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素との融合タンパク質として、オーファンGPCRを発現させ、さらに、例えば、別のβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーター酵素との融合タンパク質としてアレスチンまたはアレスチンの変異体を発現するものが提供されている。受容体活性時におけるアレスチンのオーファンGPCRとの相互作用は、相補されたレポーター酵素の酵素的活性により測られる。検査細胞は検査化合物に曝され、レポーター酵素活性の増加がリガンドまたはアゴニストの存在を示す。本発明のさらなる側面は、リン酸化または活性化されたGPCRへの結合能力を知るために、着目するタンパク質、例えばアレスチンタンパク質または、アレスチンタンパク質の変異体をスクリーニングする法である。検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素との融合タンパク質としてGPCRを発現させ、さらに、例えば、別のβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーター酵素との融合タンパク質としてアレスチンまたはアレスチンの変異体を含むものが提供されている。受容体活性時におけるアレスチンのGPCRとの相互作用は、相補されたレポーター酵素の酵素的活性により測られる。検査細胞は周知のGPCRアゴニストに曝され、その後レポーター酵素活性が検知される。レポーター酵素活性の増加が、βアレスチン分子がリン酸化または活性化された検査細胞内のGPCRと結合され得ることを示す。本発明のさらなる側面は、特定のGPCRのアゴニストのスクリーニング方法である。アゴニストは自然または合成ライブラリまたは混合に含まれるか、あるいは、物理的刺激があり得る。検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素との融合タンパク質としてGPCRを、さらに、例えば、別のβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーター酵素との融合タンパク質としてアレスチンを発現するものが提供されている。受容体活性時におけるアレスチンのGPCRとの相互作用は、相補されたレポーター酵素の酵素的活性により測られる。検査細胞は検査化合物に曝され、レポーター酵素活性の増加がアゴニストの存在を示す。検査細胞は既知のGPCR、または、既知の多種GPCRを発現するか、または、未知の多種GPCRをGPCR発現することもある。このGPCRは例えば臭気GPCRまたはβARGPCRともなり得る。本発明のさらなる側面は、GPCRアンタゴニスト活性の検査化合物のスクリーニング方法である。検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素との融合タンパク質としてGPCRを、さらに、例えば、もうひとつのβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーター酵素との融合タンパク質としてアレスチンを発現するものが提供されている。受容体活性時におけるアレスチンのGPCRとの相互作用は、相補されたレポーター酵素の酵素的活性により測られる。検査細胞は検査化合物に曝され、レポーター酵素活性の増加がアゴニストの存在を示す。細胞はの検査細胞およびGPCRアゴニストに曝され、その後レポーター酵素活性が検知される。検査化合物への提示と同時、または、それに続いてアゴニストへの提示が提起されると、検査化合物への提示後のレポーター酵素活性の増加が、検査化合物がGPCRに対するアンタゴニスト活性を有していることを示す。本発明のさらなる側面は、GPCRへのアゴニスト、アンタゴニスト、リガンドの存在をみるための、試料液のスクリーニング方法である。検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素との融合タンパク質としてGPCRを発現し、さらに、例えば、もうひとつのβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーターとの融合タンパク質としてβアレスチンを含んでいる。検査細胞は試料液に提示され、レポーター酵素活性が検知される。試料液への提示の後に変化したレポーター酵素活性は、試料液が細胞内に発現したGPCRに対しアゴニスト、アンタゴニスト、または、リガンドを含んでいることを示す。本発明のさらなる側面は、GPCRの存在をみるための細胞スクリーニング方法である。この側面に従うと、変異レポーター酵素を含むアレスチン融合タンパク質、および、変異レポーター酵素を含むGPCRの下流信号融合タンパク質がGPCR活性の見地のために採用されている。細胞本側面の変更を、GPCRを含むこれらの細胞の細胞数多性をスクリーニングする方法として用いることもできる。本側面に従うと、レポーター酵素とともに融合タンパク質としてのβアレスチンで構成される共役を含む細胞数多性が提供され、数多細胞をGPCRアゴニストに提示し、レポーター酵素の活性化が検知される。GPCRアゴニストへの提示後のレポーター酵素活性の増加がβアレスチンタンパク質がGPCRに結合していることを示し、その結果、細胞がGPCRアゴニストに応答するGPCRを含んでいることが示される。本発明のさらなる側面は、GPCR仲介のシグナル経路のマッピング方法である。例えば本システムを、cSRCのβアレスチン1との、GPCR活性化時の相互作用を監視するために利用することも可能である。さらに本システムを、GPCRシグナリング経路と、レセプターチロシンキナーゼやRasRafなどのその他経路間のクロストークに関わるタンパク質タンパク質相互作用を監視するために利用することも可能である。本側面に従うと、検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素を含むGPCRや関連タンパク質を発現し、さらに、例えば、もうひとつのβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーター酵素を含む融合タンパク質としての、別の経路からのタンパク質を含むものが提供されている。レポーター酵素の増加がタンパク質/タンパク質相互作用を示す。本発明の更なる側面は、アゴニストまたはアンタゴニスト刺激時の、GPCRのホモダイマーまたはヘテロダイマーの監視方法である。GPCRダイマーが生体活動に重要であることは多くの文献証拠で示されている。アブダーラetal編集、AT1受容体ヘテロダイマーが示すGタンパク質活性強化および変容受容体金属イオン封鎖ATIreceptorheterodimersshowenhancedGproteinactivationandalteredreceptorsequestrationNature誌4079498;ボッカートetal編集Gタンパク質共役受容体の分子操作:進化成功度EMBOJ誌18172329;ジョーダンetal編集Gタンパク質共役受容体ヘテロダイマーによる受容体機能の調節GproteincoupledreceptorheterodimerizationmodulatesreceptorfunctionNature誌399697700は、2つの非機能性オピオイドレセプター、kappaおよびdeltaがヘテロダイマー化し、機能性レセプターを形成することを示している。ゴードンetal編集BiochBiophysResCommun誌227200204は、ドーパミンレセプターD2におけるモノメリックおよびダイメリックフォームに関連する異なる薬理学的特性を示している。D2レセプターは、スピペロンの選択的ターゲットであるモノマーとして、または、ネモナプリドのターゲットであるダイマーフォームとして存在する。ハーバートetal編集β2アドレナリンレセプター膜貫通領域から発生するペプチドによる受容体のダイマー化および活性化の阻害JBC誌2711638492は、アゴニスト刺激により、受容体の二量体状態が安定化し、そこにおいて逆拮抗薬がモノメリックフォームに有利に働くことが発見されていることを示している。実際に、同じ研究が、β2アドレナリンレセプターの第六膜貫通領域に対応するペプチドが、受容体のダイマー化と活性化を阻害したことを示している。さらに、アンガースetal編集生物発光エネルギー伝達を利用した生細胞内β2アドレナリンレセプターダイマー化の検知ProcNatlAcadSci誌USA9736843689は、β2アドレナリンレセプターダイマー化研究のためのβ2アドレナリンレセプター融合タンパク質の使用を開示している。細胞性理学および薬理学的意味合いにおけるGPCRダイマー化は、本発明に従って監視が可能である。例えばβガラクトシダーゼ相補は、例えばGPCR1ΔαやGPCR2Δωなどのβガラクトシダーゼ変異酵素のGPCR融合タンパク質を共発現する検査細胞内で測定可能である図27を参照されたい。本側面に従うと、GPCRまたはオーファン受容体の単量体と二量体間の相互変換が変異レポーター酵素相補により測定可能である。図27は、βガラクトシダーゼのΔα体を有する融合タンパク質例えばGPCR1ΔαとしてGPCRまたはオーファン受容体を、また、同じGPCRまたはオーファン受容体をβガラクトシダーゼのΔω体を有する融合タンパク質例えばGPCR1Δωとして共発現している検査細胞を示している。GPCRホモダイマーの形成は活性酵素の形成により反転され、これはGalScreenアッセイ法などの酵素活性アッセイで測ることができる。同様に、2つの個別GPCR間か、2つのオーファン受容体間、または、1つの既知GPCRと1つのオーファン受容体間のヘテロダイマー化を例えばGPCR1ΔαやGPCR2Δωなどの融合タンパク質を共発現する検査細胞内で測ることもできる。βガラクトシダーゼ活性の増加が2つの受容体がヘテロダイマーを形成できることを示している。本発明の更なる側面は、アゴニストまたはアンタゴニスト治療影響下で、GPCRの単量体および二量体相互変換を監視する方法である。検査受容体は、同じGPCRまたはオーファン受容体ホモダイマー間、または、2つの個別GPCRあるいはオーファン受容体ヘテロダイマー間に置くことができる。化合物を使った治療後のβガラクトシダーゼ活性の増加は、その化合物が受容体の二量体に結合および/またはそれを安定化することを意味している。化合物を使った治療後のβガラクトシダーゼ活性の減少は、その化合物が受容体の単量体に結合および/またはそれを安定化することを意味している。本発明のさらなる側面は、GPCRアゴニストに対するGPCRの応答をみるための細胞スクリーニング方法である。細胞はGPCR経路内の下流方向に相互作用するタンパク質パートナーを含むものが提供される。タンパク質パートナーは、酵素を相補しながら変異体との融合タンパク質として発現され、GPCR活性監視に使われる。検査細胞はGPCRアゴニストに提示され、その後レポーター酵素の酵素的活性が検知される。レポーター酵素活性の増加は、細胞がアゴニストに応答するGPCRを含んでいることを示す。本発明は、GPCRシグナリング内のタンパク質/タンパク質相互作用を監視するための独自開発技術ICAST、IntercistronicComplementationAnalysisScreeningTechnology、GalScreen等の併用に関連する。米国出願番号第09654499号で開示されているごとく、本発明の方法は、結果的に2つの非活性化βガラクトシダーゼ変異体それぞれがGPCRやアレスチンなどの2つの相互作用ターゲットタンパク質ペアの1つに融合の利用に関与するICASTの使用と一部関連している。活性化βガラクトシダーゼ群の形成は、ターゲットタンパク質の相互作用により促される。本システムでは、βガラクトシダーゼ活性化は例えば、直接細胞溶解とβガラクトシダーゼレポーター酵素の高速超高感度化学発光法検知とを組み合わせるGalScreenアッセイシステム等を使って検知できる。このシステムは、GPCR活性の出力として照度計内の測定に例えばGalactonStarchemiluminescentsubstrateを使っている。図23は、本発明の方法に相補技術を利用した例を表す概略図である。図23は、アレスチン分子と活性化GPCRまたはオーファン受容体の融合パートナー間で、特定の相互作用により強制的に結合された際に活性化する、2つの非活性βガラクトシダーゼ変異体を示している。このアッセイ技術は、オーファン受容体を釣り餌としてリガンドを同定する脱オーファンと呼ばれるプロセスハイスループットスクリーニングアッセイに有効である。図28で示されている通り、オーファン受容体のβガラクトシダーゼ融合タンパク質例としてGPCRorphanΔαはβアレスチンの融合タンパク質例としてβArrΔwを伴う検査細胞内に共発現される。検査細胞の被験が天然または合成化合物に対して行われる場合は、βガラクトシダーゼ活性の増加は、化合物がこのGPCRの自然の、または、代理のリガンドであることを意味する。同じアッセイシステムは新規GPCRの薬剤リード発見に使うことも可能である。治療後の検査細胞内におけるβガラクトシダーゼ活性の増加は、化合物のアゴニスト作用を示している。治療後の検査細胞内におけるβガラクトシダーゼ活性の減少は、化合物のアンタゴニスト作用または逆アゴニスト作用を示している。さらに、本発明の方法は、Gタンパク質、GRK、プロトオンコジーンcSrcなどのその他下流シグナリング化合物を介したGPCR仲介シグナリング経路の監視にも使うことが可能である。本発明は、シグナリング経路のマッピングにICASTタンパク質タンパク質相互作用スクリーニングを使用して、一部達成されている。本技術は多様な機能を備える、多様な既知未知のGPCRに適用可能である。それらは下記を含むがこれに限定されないGPCRのサブファミリーを含む。アミン様リガンドアセチルコリンムスカリン様レセプターM1M5、αおよびβアドレノセプター、ドーパミンレセプターD1、D2、D3、D4、ヒスタミンレセプターH1およびH2、オクトパミンレセプター、セロトニンレセプター5HT1、5HT2、5HT4、5HT5、5HT6、5HT7に結合するレセプター;ペプチドリガンドアンギオテンシンレセプター、ボンベシンレセプター、ブラジキニンレセプター、CCケモキネレセプターCCR1CCR8およびCCR10、CXXタイプケモキネレセプターCXCR5、コレシストキニンタイプAレセプター、CCKタイプレセプター、エンドセリンレセプター、ニューロテンシンレセプター、FMLP関連レセプター、ソマトスタチンレセプタータイプ15、オピオイドレセプタータイプD、K、M、Xに結合するレセプター;ホルモンタンパク質卵胞刺激ホルモンレセプター、甲状腺刺激レセプター、ルトロピン絨毛性性腺刺激ホルモンレセプターに結合するレセプター;神経伝達物質サブスタンスPレセプター、サブスタンスKレセプター、神経ペプチドYレセプターに結合するレセプター;嗅受レセプター嗅受タイプ111、味覚レセプター、臭覚レセプター;プロスタノイドレセプター、プロスタグランジンE2EP1EP4サブタイプ、プロスタサイクリン、トロンボキサン;メタボトロピックサブスタンスメタボトロピックグルタミングループIIIIレセプターと結合するレセプター光などの物理的刺激に応答するレセプターおよび味覚、嗅覚などの化学的刺激に応答するレセプター;オーファンGPCRレセプターの自然なリガンドは未定義。本発明と組み合わせたICAST技術の使用は、GPCRスクリーニングプロセスに多くの利点を提供するものである。それらには、細胞以下のすべての部分膜、サイトソル、核とのタンパク質相互作用を監視する能力;タンパク質の過剰発現の必要なく、生理学的により関連の深いモデルを達成する能力;レセプター結合のための機能的アッセイを達成し、高い情報内容を提供する能力、が含まれる。好適な態様の詳細な説明本発明はGPCR機能と経路を探索する方法を提供する。Gタンパク質共役スーパーファミリーは、新規受容体としての急速な拡大を続け、cDNAライブラリまたはゲノムDNAの自動配列をとおして発見される。ヒトゲノムには数千のGPCRが存在すると推定されている。クローン化されているのはその一部のみで、リガンドと結び付けられている数はさらに少ない。これら、または新規発見されるオーファン受容体をそれぞれの同族リガンドや生理学的機能と結び付ける方法は、生物学的生物医学的研究の大きな課題である。オーファン受容体の同定は一般的に個別化されたアッセイと機能に関する推測を必要とする。本発明は、検査GPCRまたはオーファン受容体とβアレスチン間の活性依存タンパク質タンパク質相互作用を利用した、受容体の活性化の監視によるGPCR機能の探索に関連する。この特定のタンパク質タンパク質相互作用は、本明細書に開示されている変異体酵素相補技術により測られる。このアッセイシステムは、その他シグナリングイベントの既存の知識の有無に関わらず、実行できるため、必要な推定を限定するものである。これは感度が高く、高速に、簡易に実行できるものであり、これら受容体の大部分が共通のメカニズムにより脱感受されているため、ほとんどすべてのGPCRに適用できる。本発明は、GPCR経路内のタンパク質タンパク質相互作用監視のための完全なアッセイシステムを提供するものである。本発明は相補技術、ICASTを採用しているICASTテクノロジーは、着目するタンパク質に融合されたレポーター酵素の2つの変異体の使用に関連する。着目するタンパク質が相互に作用しない場合、レポーター酵素は不活性のままである。着目するタンパク質が相互に作用しない場合、レポーター酵素は不活性状態のままである。本発明の態様によると、βガラクトシダーゼの活性は、化学発光法サブストレートであるGalactonStarに関連する、AdvancedDiscoverySciencesによる開発のGalScreenアッセイシステムで検知が可能である。GalScreenアッセイシステムおよびGalactonStar化学発光法サブストレートは米国特許番号第5851771号、第5538847号、第5326882号、第5145772、第4978614号、第4931569号で開示されており、その全開示は引用により本明細書に編入する。本発明は高速、非放射性アッセイフォーマットである、GPCR結合アッセイを含む一連のアッセイを提供するものである。本発明の方法は、緑色蛍光融合タンパク質を含む融合としてのGPCRコンポーネントの顕微鏡的画像化や分光法に依存する、米国特許番号第5891646号および第6110693号、また、前記アンガースetal編集で開示の発明をさらに発展させたものである。米国特許番号第5891646号および第6110693号とAngersetalでの分光法ベースの技術は、ロースループットおよび完全定量化の不足により制限を受ける。AdvancedDiscoverySciencesテクノロジーと本発明のアッセイシステムを組み合わせることにより、ハイスループットスクリーニングが可能なGPCR経路探索用高感度細胞ベースアッセイ法が実現される。本発明と併用が可能なAdvancedDiscoverySciences開発のテクノロジーには、GalScreenアッセイシステムおよびcANPScreenイミュノアッセイシステム等がある。cAMPScreenイミュノアッセイシステムは、細胞溶解液中のcAMP濃度を超高感度で測定する。cAMPScreenアッセイは、超高感度化学発光アルカリフォスタファーゼサブストレートCSPDtricyclo331137decan4ylphenylphosphateおよびSapphireII発光エンハンサーを利用している。高スループットアッセイのタンパク質/タンパク質相互作用監視に使われるyeastbasedtwohybridアッセイとは違い、本発明では哺乳動物細胞、植物細胞、大腸菌などの原生細胞、また、酵母、粘菌変形菌昆虫などの無脊椎源の細胞、など種々の細胞を利用でき、例えばヌクレアスなどの限定された細胞限局化ではなく、受容体ターゲット部位の膜における、あるいは、下流ターゲットタンパク質の部位におけるシトソル内の相互作用を検知できる他、転写活性化などの間接的出力に依存しない。従って、本発明はより高い生理学的関連性と、偽陽性の減化を提供するものである。本発明は、発明GPCRアッセイ法の感度を強化するために、前記記載の米国特許出願番号第053614号開示の態様に改変を加えて開発されている。態様に従うと、本発明はGPCRアレスチンの相互作用を強化延長化して検知の信頼性をより高めるため、セリンスレオニンクラスターの利用を伴うものである。これらクラスターは、これらのシークエンスモチーフを持たないオーファン受容体または既知GPCRに利用できる。このシークエンスを受容体のc末端に付加し、例えばβガラクトシダーゼ変異体を伴うターゲットタンパク質の融合タンパク質からのβガラクトシダーゼ相補など、GPCRへのアレスチン結合を出力することにより、受容体の活性化が簡易に検知できる。別の態様に従うと、本発明は、特定GRKの活性化によるリン酸化の必要を回避する目的で、活性時にGPCRのc末端上または細胞間ループ上のアレスチンポイントミューテーションを利用する。態様はi特定のGPCRまたはオーファン受容体と同族のGRKが未知であり、また、ii着目するまたは検査下の受容体の特定GRKが、受容体活性化アッセイに使われるホスト細胞内に不存在または低活性である可能性を含む。別の態様に従うと、本発明は、活性化されたGPCRへのアレスチンの結合効果を強化し、GPCR脱感作中、GPCRアレスチン群を安定化する目的でのスーパーアレスチンの利用を伴う。本態様はGPCRが通常、脱感作後急速に再感作する、ICASTGPCR態様の信頼性を増すために利用できる。これら方法を各、以下に述べる。本発明を、限定されない以下の実施例で説明する。実施例:本発明のひとつの態様によると、GPCR活性化はリガンド活性化GPCRへのアレスチンの結合監視を通して測定できる。本アッセイシステムでは、例えばβアドレナリン受容体などのGPCRおよび例えばβアレスチンなどのアレスチンは、例えばβガラクトシダーゼなどのレポーター酵素の変異体を伴う融合タンパク質と同じ細胞内に共発現される。図23で示されている通り、β2ARはβgal変異体のΔαを伴う融合タンパク質として、βアレスチンはβgal変異体のΔωを伴う融合タンパク質として発現する。当初、例えばGPCRの膜とアレスチンのシトソルなど、2つの異なる区画内の静止または非刺激性細胞内に存在する、これら2つの融合タンパク質は、活性のβガラクトシダーゼ酵素を形成することはできない。かかる細胞がアゴニストまたはリガンドにより治療されると、リガンド居住の活性化受容体は、アレスチンにとっての高親和結合部位となる。活性化GPCR、β2ARΔα、アレスチンβArrΔω間の相互作用がβgal変異体相補を誘導する。酵素活性化は、分割に際して比色、蛍光、化学発光例えばGalScreenアッセイシステム等法により測定可能な生成物を解離する、酵素基質を使って測定できる。実験プロトコル1まず始めに、選択可能なレトロウイルスベクターpICASTALC図18で説明およびpICASTOMC図15で説明に、β2ARΔαおよびβArr2Δωの発現ベクターを組み込んだ。2第二に、2つの発現体を、C2Cl2心筋細胞、あるいはCOS7、CHO、A431、HEK293、CHWなどの他の哺乳類細胞株に形質導入した。抗生物質を選択した後、2種類の融合タンパク質両方を適切なレベルで発現している、安定なクローンを選択した。3最後に、β2ARΔαおよびβArr2Δωの両方を発現している細胞の反応性を、アゴニスト/リガンドで刺激されるβガラクトシダーゼ活性により測定した。3種類の細胞サンプルを、96ウェル培養プレートのウェルに、100マイクロリットル、10000細胞にて播種した。細胞は24時間培養し、アッセイを行った。アゴニストのアッセイ図3および4については、イソプロテレノール、プロカテロール、ドブタミン、LLフェニレフリンなど、アゴニストの濃度を変えて、60分、37°Cにて細胞を処理した。誘導したβガラクトシダーゼの活性は、TropixGalScreenTMアッセイ系の基質AppliedBiosystems社を加えて測定し、発光はTropixTR717TM照度計AppliedBiosystems社を用いて測定した。アンタゴニストのアッセイ図5については、まず調整したばかりの培地に、血清なし、ICI118551あるいはプロプラノロール存在下で10分間細胞をインキュベートし、次に10マイクロモル濃度のイソプロテレノールを加えた。セリンスレオニンクラスターストラテジー背景βアレスチンの構造機能研究によると、βアレスチンのアミノ末端内の大領域活性化認識領域と呼ばれるがGPCRのアゴニスト活性化状況を認識する。βアレスチンにおけるこの領域は、正電荷を帯びたリン酸化認識領域と呼ばれる小領域ネット電荷7で約20個のアミノ酸も含み、これはGRKリン酸化されたGPCRのカルボキシル末端と相互作用しているように見られる。GPCRはβアレスチンへの親和性により2つのクラスに分けられる。オークリーetal編集クラスリン仲介飲食作用中のβアレスチンのGタンパク質共役受容体との結合による受容体再感作のプロフィールの検知JBiolChem誌、2743224832257。この分類の根底にある分子決定因子が、受容体のカルボキシル端子に位置する特定セリンまたはスレオニン残基内に存在しているようである。カルボキシル末端に、離散したセリンおよびスレオニン残基のみしか備えていない受容体クラスは、低い親和性でβアレスチンと結合し、内在化時にβアレスチンから解離するのに対し、カルボキシル端子内のセリンスレオニンクラスター連続する3つ、または、4つのうち3つの配列を持つセリンまたはスレオニン残基として定義されるを含む受容体クラスは、活性化およびリン酸化時、高い親和性でβアレスチンと結合し、受容体の内在化後もβアレスチンと結合を維持する。バソプレシンV2レセプター、ニューロテンシンレセプター1、アンジオテンシンIIレセプタータイプ1Aetal編集Gタンパク質共役受容体βアレスチンエンドサイトーシス群の細胞輸送JBiolChem誌、2741099911006など、カルボキシル末端内にこのようなセリンスレオニンクラスターを1つあるいは複数持ついくつかの既知のGPCRは、βアレスチンを高い親和性で結合することが示されている。実施例本発明の態様によると、セリンスレオニンクラスターストラテジーは、独自にこういった構造的モチーフを持たないオーファン受容体のスクリーニングアッセイ法の簡易化に利用できる。オーファン受容体は連鎖配列により簡単に分類化ができる。セリンスレオニンクラスターを備えないオーファン受容体を、それぞれ、受容体のカルボキシル末端に1つあるいは複数のセリンスレオニンクラスターを誘導すべく改変された発現ベクターにクローニングする。図24セリンスレオニンクラスターが、強力なイオン相互作用を通して、活性化およびリン酸化された受容体負電荷とβアレスチンリン酸化認識領域中に正電荷との間の受容体活性化依存相互作用を強化させる。オーファン受容体末端の修飾により、このように、受容体活性化の検知信頼性が強化される。実験プロトコル1まず始めに、セロトニン/トレオニンクラスターのない、オーファン受容体のオープンリーディングフレームORFを、図10Aで説明したpICASTALCなどの修飾した発現ベクターにクローニングする。この修飾したpICASTALCには、1つ以上のセロトニン/トレオニンクラスター例えばSSSあるいはSSTのコード配列が、オーファン受容体のORF挿入部位下流に位置している図24。2第二に、キメラオーファン受容体であるORForphannΔαを、図15で説明したβArr2Δωなどのβアレスチンキメラを持つ哺乳類細胞に共発現させる。3第三に、この細胞にアゴニストまたはリガンドを処理し、リン酸化セリンクラスターを持つ活性型受容体を、βgal相補性の値が強いシグナルを示す高親和性βアレスチンに結合させる。このアッセイは、オーファン受容体の機能活性化を測定できる高感度の方法であり、オーファン受容体の天然リガンドあるいは代理リガンドのスクリーニングに用いることができる。このプロセスは、新しいGPCRのデオーファニングdeorphaningあるいはターゲット発見と呼ばれる図28。さらに、このアッセイは、GPCRのリード発見に用いる潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングにも有用である。GPCRリン酸化の存在時、非存在時における強化アレスチン結合背景これまでGタンパク質共役受容体キナーゼの6つの異なるクラスが特定され、さらにこれら各クラスが複数のmultiplevariantとして発現することが報告されている。クループニックetal編集Gタンパク質共役受容体調節におけるレセプタキナーゼおよびアレスチンの役割AnnRevPharmacolToxicol誌、38289319。細胞株は多くが種々のGRKを発現するが、あるGPCRのリン酸化に必要な特定のGRKが、組換GPCRおよびアレスチン発現に使われる細胞株に、常に存在するとは限らない。これは、同族GRKが未知である可能性が高い、オーファン受容体を使う態様で特に問題となる。その他の場合では、組換え発現作業に使われる細胞株が必要なGRKを備えていたとしても、GRKの発現率が低い可能性がある。このような危険性を回避するために、活性化GPCRに特異的に結合されているがGRKリン酸化の必要のない、遺伝子的に改変されたアレスチンが採用されている。アレスチン上の変異誘発に関する研究は、リン酸化認識領域におけるポイントミューテーション、特にArg175視覚系アレスチンのを逆の電荷を帯びたグルタミンなどの残基へと変換する変異R175E変異は、GPCRに特異的に結合するアレスチンを生むが、リン酸化の必要なくそれを行うことを示している。多くの研究により、アレスチンがGPCRへの親和性の低い非活性状態中に存在するとの仮説を導いている。GPCRの活性化とリン酸化の両方がひとたび起こると、GPCRC末端のリン酸化領域がアレスチンのリン酸化認識領域と相互作用し、アレスチンの構造変化、引いては、活性化認識領域の提示と活性化リン酸化された受容体への結合が導かれる。ヴィシュニヴェツキーetal編集ロドプシンのリン酸化過程に対するアレスチンの応答JBiolChem誌2741145111454;グレヴィッチetal編集Gタンパク質共役受容体とのアレスチンの相互作用:野生変異型アレスチンとロドプシンβ2アドレナリンm2ムスカリン様アセチルコリン受容体の直接結合研究JBiolChem誌270720731;グレヴィッチetal編集視覚系アレスチンによるリン酸化認識と高親和性結合部位へのアレスチンの転位メカニズムMolPharmacol誌51161169;コーヴァーetal編集細胞内に構成活性性を有するリン酸化非依存性βアレスチン変異体のターゲット構成JBiolChem誌27468316834。結論的には、非活性化、非活性化リン酸化、活性化非リン酸化、リン酸化された視覚系非視覚系GPCRとの単一変異株、二重変異株、欠失、キメラアレスチンの結合研究のすべてが本モデルを論証してるのである。実施例変異レポータータンパク質に融合されたアレスチンのリン酸化非感作変異体を、リン酸化非依存の様態で活性化されたGPCRと結合すべく産生することが可能である。この考え方の証明として、本発明に従い、βアレスチン2、R170Eβアレスチン2のポイントミューテーションが産生され、β2ARとの相互作用が分析された。実験プロトコル:1まず始めに、Arg170をGluに変換するなど、βアレスチン2を変異させた。この変異は、視覚系アレスチンのR175E変異と同等である。変異型βアレスチン2のオープンリーディングフレームを、pICASTOMC発現ベクターのΔωβガラクトシダーゼフレームにクローニングし、修飾発現ベクターR170Eβアレスチン2を作成した図25。2第二に、R170Eβアレスチン2発現体をC2C12心筋細胞株に形質導入した。C2C12心筋細胞株は、図18、米国出願シリアル番号09654499に説明した通り、Δαβガラクトシダーゼに融合させてβ2ARを発現させるために設計したものである。抗生物質を選択した後、2種類の融合タンパク質両方を発現しているクローンを採取した。3最後に、R170Eβアレスチン2Δωおよびβ2ARΔαの両方を発現しているこの細胞集団の反応性を、図26に示されている通り、アゴニスト/リガンドで刺激されるβガラクトシダーゼ活性により測定した。β2ARΔαおよび野生型βアレスチン2Δωを共発現しているC2Cl2クローン438図26を、対照として用いた。3種類の細胞サンプルを、96ウェル培養プレートのウェルに、100マイクロリットル、10000細胞にて播種した。細胞は24時間培養し、アッセイを行った。図26のアゴニストアッセイについては、細胞を03mMアスコルビン酸で安定化させた10μmイソプロテレノールにより、37°C、0、5、10、15、30、45あるいは60分間、処理した。誘導したβガラクトシダーゼの活性は、TropixGalScreenTMアッセイ系の基質AppliedBiosystems社を加えて測定し、発光はTropixTR717TM照度計AppliedBiosystems社を用いて測定した。図26に示した通り、変異型アレスチンは、アゴニスト依存的にβ2ARと相互作用し、野生型アレスチンと同等であった。4リン酸化非感受性のアレスチンを用いた応用に拡張するため、C2C12、CHO、HEK293などの細胞株をR170Eβアレスチン2Δω構造を発現させる開発を行う。アゴニストおよびアンタゴニストスクリーニング用の細胞株を開発するため、これらの細胞株を用いて、Δαβガラクトシダーゼに融合させて、オーファンあるいは既知のGPCRを形質導入することができる。スーパーアレスチンの開発背景アレスチン経路によるGPCRシグナリングのアティニュエーションは、細胞または微生物が刺激に対し過剰に反応を防ぐ作用をする。同時に、アレスチン経路はGPCRを、一時的に非活性化し、すばやく再感作して新規刺激に対する感作を可能にするために再循環する作用も持つ。ダウンレギュレーション過程では、アレスチンとエンドサイトーシスとを結合しながら、受容体のリン酸化が行われる。脱感作された受容体のエンドサイトーシスに続き、受容体はライソソームにディグレードするか、または、再感作され、膜に戻される。再感作により、アレスチンが受容体から解離、リン酸化が行われ、膜へと戻る。活性化に伴いGPCRがたどる実際の経路は、生物学的機能と生体のニーズに拠る。ダウンレギュレーション経路の必要の可能性を含むこれら経路の多様性により、活性化したGPCRへのアレスチン親和性は受容体により異なる。そのため、自然が提供するものよりも高い、活性化されたGPCRへの親和性と結合活性を備えたスーパーアレスチンの精製は極めて有益である。アレスチンの変異、欠失、キメラ研究は、これまで、GPCRリン酸化状態に応答する分子の調節スイッチの解明に集中してきたが、アレスチンの改変組換えが活性化リン酸化されたGPCRへの分子内の結合強化をもたらしている。Arg175の、ヒスチジン、タイロシン、フェニルアラニン、スレオニンへの変換は、野生型アレスチンまたはR175Eアレスチンよりも、リン酸化、活性化されたロドプシンへの相当量に高い結合量を導いているが、これら変異体は活性化、非リン酸化された受容体には低い結合となっている。ビレヴィッチetal編集。さらに、バリン170のアラニンへの変換は、R175E変異の構成効果を増加させているが、野生型アレスチンの活性化リン酸化ロドプシンとの相互作用量もほとんど倍化させている。グレヴィッチetal編集。βアレスチン1のアミノ酸382での切形は、R169EアレスチンR175Eと同等と野生型βアレスチンのいずれもの、活性化または活性化リン酸化受容体への結合をそれぞれ強化していることが報告されている。コーヴァーetal編集。視覚系アレスチンの機能領域がβアレスチン1のそれとスワップされている、キメラアレスチンの場合、活性化リン酸化されたGPCRへの結合親和性が変化することが報告されている。グレヴィッチetal編集。これらキメラのうち、視覚系アレスチン極性N末端を伴うβアレスチン1などのいくつかのキメラが、野生型βアレスチン1よりも、リン酸化活性化されたGPCRに特異的に結合を増加させていることを示している。ブレクイヴィッチetal編集。前記に説明の、活性化GPCRへのアレスチン親和性を強化する改変は、アレスチンGPCR群が安定化およびまたは長命化することから、リン酸化か非リン酸化かに関わらず、βガラクトシダーゼ活性のノイズへのシグナルも強化させる可能性がある。活性化されたGPCRとより高い親和性を持つ変異体アレスチンを利用することにより、GPCRターゲットの発明技術の改善が、受容体リガンドの生物学を妥協させることなく、実現される。さらに、このスーパーアレスチンアプローチとアレスチンポイントミューテーションの利用とを組み合わせて、GRKの必要の有無に関わらずノイズへのシグナルを強化させることもできる。実施例変異レポーターと融合されたアレスチン変異体を、活性化GPCRへのアレスチンの結合強化目的のため産生、結果、検知の感度を強化する。実験プロトコル1まず始めに、変異型βアレスチン2構造に、R170ETYあるいはH、V165Aを組み込み、視覚系アレスチンのaa143とaa147を置換、あるいはC末端を欠失させるか、これらの変質を組み合わせて行う。図25に示したR170Eβアレスチン2変異のクローニングと同様に、変異型βアレスチン2のオープンリーディングフレームを、pICASTOMC発現ベクターのΔωβガラクトシダーゼ骨格にクローニングする。2第二に、変異型発現体を、Δαβガラクトシダーゼに融合させるとβ2ARを発現するように設計したC2Cl2心筋細胞株に形質導入する。抗生物質を選択した後、2種類の融合タンパク質両方を発現しているクローン個体を採取する。野生型およびR170Eβアレスチン2の構造を形質導入し、対照の基準クローンを作成する。3第三に、βアレスチン2Δω変異型あるいは野生型およびβ2ARΔαの両方を発現した細胞集団の反応性を、アゴニスト/リガンドで刺激されるβガラクトシダーゼ活性により測定する。4次に、野生型βアレスチン2Δωと比較し、アゴニストアッセイでノイズ比よりも有意に高いシグナルを示した変異型スーパーβアレスチン2Δω構造を選択する。この構造を用い、既知あるいはオーファンGPCRに形質導入することができ、スーパーβアレスチン2Δωを発現している安定な細胞株を開発する。スーパーβアレスチン2Δωを用い、ICASTGPCRの応用に関し、ノイズに対するシグナルを増加させることができ、リードおよびリガンド発見のためのスクリーニング効果を改善することができる。スーパーアレスチンを用い、GPCRの脱感作中、活性型GPCRおよび安定したGPCR/アレスチン複合体へのアレスチンの結合効率を向上させる。この応用技術を用いることで、通常はGPCRが脱感作後、急速に再感作されるケースで、ICASTGPCR技術の信頼性を高めることができる。本発明のアッセイ、応用と調整法は、包括的にも、特定の例を用いても説明してある。例は、限定的なものとして用いているわけではない。他の代替アイデンティティ、性質、アッセイは、発明力を駆使しなくとも、この分野における普通の技術の中で見出されることであろう。後述する特許請求の範囲に関する詳述で除外されていない限り、そのような修正は本発明の範囲内に収まるものである。