"本明細書中に記載される発明。従って、多くのタンパク質に対する広範囲の免疫応答が要求される場合、HIVのような複雑な病原体に由来する多数のタンパク質を発現させることにおいて使用される革新的なプラスミドDNAの非ウイルスベクターの設計が依然として求められている。加えて、多数のHIV遺伝子の高レベルの発現を1個の細胞において行わせることができる多価のDNA型免疫原組成物が求められている。発明の要旨1つの実施形態において、本発明は、a第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニットと、b第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットと、c第3のプロモーターおよび第3のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第3の転写ユニットとを含み、該第1のプロモーター、該第2のプロモーターおよび該第3のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1のポリアデニル化シグナル、該第2のポリアデニル化シグナルおよび該第3のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来するDNAプラスミドを提供する。本発明の別の実施形態において、第1、第2および第3のポリペプチドが真核生物細胞において発現される。別の実施形態において、本発明は、選択された抗原に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、ai第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニットと、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットと、iii第3のプロモーターおよび第3のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第3の転写ユニットとを含み、該第1、第2および第3のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来するDNAプラスミド、および、b薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む免疫原組成物を提供する。本発明の1つの具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。本発明の別の実施形態において、第1、第2および第3のポリペプチドが真核生物細胞において発現される。本発明の特定の実施形態において、免疫原組成物は、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される。1つの具体的な実施形態において、エレクトロポレーションは、約25V/cm~約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激することを伴う。さらに別の実施形態において、本発明は、選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、ai第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニットと、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットと、iii第3のプロモーターおよび第3のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第3の転写ユニットとを含み、該第1、第2および第3のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来するDNAプラスミド;およびb薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する方法を提供する。本発明の別の実施形態において、第1、第2および第3のポリペプチドが真核生物細胞において発現される。本発明の別の実施形態において、選択された抗原は、細菌、ウイルス、アレルゲンおよび腫瘍からなる群に由来する。1つの具体的な実施形態において、選択された抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス1型、パラインフルエンザウイルス2型、パラインフルエンザウイルス3型、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルスおよびコロナウイルスSARSからなる群から選択されるウイルスに由来するウイルス抗原である。本発明のさらに別の実施形態において、選択された抗原は、Haemophilusinfluenzaeインフルエンザ菌分類可能型および分類不能型の両方、Haemophilussomnus、Moraxellacatarrhalis、Streptococcuspneumoniae肺炎連鎖球菌、Streptococcuspyogenes化膿連鎖球菌、Streptococcusagalactiae、Streptococcusfaecalis糞便連鎖球菌、Helicobactorpylori、Neisseriameningitidis髄膜炎菌、Neisseriagonorrhoeae淋菌、Chlamydiatrachomatisトラコーマクラミジア、Chlamydiapneumoniae肺炎クラミジア、Chlamydiapsittaciオウム病クラミジア、Bordetellapertussis百日咳菌、Alloiococcusotiditis、Salmonellatyphiチフス菌、Salmonellatyphimuriumネズミチフス菌、Salmonellacholeraesuis豚コレラ菌、Escherichiacoli大腸菌、Shigella赤痢菌属、Vibriocholeraeコレラ菌、Corynebacteriumdiphtheriaeジフテリア菌、Mycobacteriumtuberculosis結核菌、Mycobacteriumavium-Mycobacteriumintracellulare複合体、Proteusmirabilis、Proteusvulgaris、Staphylococcusaureus黄色ブドウ球菌、Staphylococcusepidermidis表皮ブドウ球菌、Clostridiumtetani破傷風菌、Leptospirainterrogans、Borreliaburgdorferi、Pasteurellahaemolytica、Pasteurellamultocida、ActinobacilluspleuropneumoniaeおよびMycoplasmagallisepticumからなる群から選択される細菌に由来する細菌抗原である。本発明の1つの実施形態において、脊椎動物宿主は、哺乳動物、鳥類および魚類からなる群から選択される。本発明の特定の実施形態において、脊椎動物宿主は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコの生物種からなる群から選択される哺乳動物である。本発明の1つの実施形態において、第1、第2および第3のプロモーターは真核生物細胞において活性である。本発明の他の実施形態において、第1、第2および第3のプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーター、マウスサイトメガロウイルスMCMVプロモーター、単純ヘルペスウイルスHSV潜伏期関連プロモーター-1LAP1、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群から選択される。本発明の特定の実施形態において、第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルは、ウサギβ-グロビンポリAシグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群から選択される。本発明の具体的な実施形態において、第1の転写ユニットはHIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の融合体からgag-pol融合タンパク質を発現する。本発明の1つの実施形態において、HIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の融合体、または、gag-pol遺伝子はHIVの単離体HXB2に由来する。本発明の特定の実施形態において、第2の転写ユニットはHIVのエンベロープ遺伝子からエンベロープタンパク質を発現する。本発明の具体的な実施形態において、エンベロープ遺伝子はHIVの初代単離体6101に由来する。本発明の具体的な実施形態において、第3の転写ユニットは、HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体ntvから、nef、tatおよびvifの融合タンパク質NTVを発現する。本発明の特定の実施形態において、HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体ntv、または、ntv遺伝子はHIVの単離体NL4-3に由来する。本発明の具体的な実施形態において、三転写ユニットプラスミドにおいて、第1の転写ユニットについての転写方向が第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向である。本発明の別の実施形態において、第1の転写ユニットについての転写方向が第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向である。本発明の特定の実施形態において、本発明は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む三転写ユニットプラスミドを提供する。1つの実施形態において、選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子からなる群から選択される。別の実施形態において、選択マーカーの存在位置が、スペーサー領域1、スペーサー領域2およびスペーサー領域3からなる群から選択される。具体的な実施形態において、選択マーカーの存在位置はスペーサー領域2である。本発明の別の実施形態において、本発明は、細菌の複製起点をさらに含む三転写ユニットプラスミドを提供する。別の実施形態において、複製起点の存在位置が、スペーサー領域1、スペーサー領域2およびスペーサー領域3からなる群から選択される。具体的な実施形態において、選択マーカーの存在位置はスペーサー領域3である。特定の実施形態において、複製起点はpUCの複製起点である。本発明の1つの実施形態において、本発明は、全体的なサイズが約15キロ塩基対未満である三転写ユニットプラスミドを提供する。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域1が約400塩基対未満であり、スペーサー領域2が約1100塩基対未満であり、スペーサー領域3が約1100塩基対未満である。1つの実施形態において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスHIVに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、aHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bi第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニットと、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットとを含み、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、また、第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる第2のDNAプラスミド;およびc薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む免疫原組成物を提供する。本発明の具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。具体的な実施形態において、第1のプラスミドにおけるプロモーターがヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーターであり、第1のプラスミドにおけるポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンポリAのポリアデニル化シグナルであり、第1のDNAプラスミドがHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードし、この場合、HIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の融合体、または、gag-pol遺伝子はHIVの単離体HXB2に由来する。特定の実施形態において、第2のプラスミドにおける第1のプロモーターがヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーターであり、第2のプラスミドにおける第1のポリアデニル化シグナルがSV40ポリAのポリアデニル化シグナルであり、ポリペプチドが、HIVの単離体NL4-3に由来するnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体ntvから発現される、nef、tatおよびvifの融合タンパク質NTVである。具体的な実施形態において、第2のプラスミドにおける第2のプロモーターがサルサイトメガロウイルスSCMVプロモーターであり、第2のプラスミドにおける第2のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンBGHのポリアデニル化シグナルであり、コードされるエンベロープポリペプチドがHIVの初代単離体6101に由来する。さらにさらなる実施形態において、本発明は、選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、aHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bi第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニットと、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットとを含み、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、また、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる第2のDNAプラスミド;およびc薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する方法を提供する。具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子はブピバカインである。具体的な実施形態において、第1のプラスミドにおけるプロモーターがヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーターであり、第1のプラスミドにおけるポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンポリAのポリアデニル化シグナルであり、第1のDNAプラスミドがHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードし、この場合、HIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の融合体、または、gag-pol遺伝子はHIVの単離体HXB2に由来する。特定の実施形態において、第2のプラスミドにおける第1のプロモーターがヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーターであり、第2のプラスミドにおける第1のポリアデニル化シグナルがSV40ポリAのポリアデニル化シグナルであり、ポリペプチドが、HIVの単離体NL4-3に由来するnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体ntvから発現される、nef、tatおよびvifの融合タンパク質NTVである。具体的な実施形態において、第2のプラスミドにおける第2のプロモーターがサルサイトメガロウイルスSCMVプロモーターであり、第2のプラスミドにおける第2のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンBGHのポリアデニル化シグナルであり、コードされるエンベロープポリペプチドがHIVの初代単離体6101に由来する。1つの実施形態において、免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される。具体的な実施形態において、エレクトロポレーションは、約25V/cm~約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激することを伴う。1つの実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。1つの実施形態において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスHIVに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、aHIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;ci第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニットと、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットとを含み、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、また、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる第3のDNAプラスミド;およびdアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;およびe薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む免疫原組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、aHIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;ci第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニットと、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットとを含み、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、また、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる第3のDNAプラスミド;およびdアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;およびe薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を提供する。具体的な実施形態において、エレクトロポレーションは、約25V/cm~約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激することを伴う。1つの実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。1つの実施形態において、本発明は、HIVに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、aHIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;cHIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;dアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;およびe薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む免疫原組成物を提供する。具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。別の実施形態において、ブピバカインを含有する免疫原組成物がエレクトロポレーションとの併用で投与される。具体的な実施形態において、HIVのエンベロープポリペプチド、gag-polポリペプチド、nef-tat-vifポリペプチドおよびアジュバントポリペプチドが真核生物細胞において発現される。1つの実施形態において、第1、第2、第3および第4のプラスミドは、真核生物細胞において活性であるプロモーターを含有する。1つの実施形態において、本発明は、免疫原組成物を脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法を提供し、この場合、免疫原組成物は、aHIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;cHIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;dアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;およびe薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む。具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。別の実施形態において、ブピバカインを含有する免疫原組成物がエレクトポレーションとの併用で投与される。具体的な実施形態において、HIVのエンベロープポリペプチド、gag-polポリペプチド、nef-tat-vifポリペプチドおよびアジュバントポリペプチドが真核生物細胞において発現される。1つの実施形態において、第1、第2、第3および第4のプラスミドは、真核生物細胞において活性であるプロモーターを含有する。本発明の特定の実施形態において、第1、第2、第3および第4のプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーター、マウスサイトメガロウイルスMCMVプロモーター、単純ヘルペスウイルスHSV潜伏期関連プロモーター-1LAP1、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含有する。本発明の特定の実施形態において、第1、第2、第3および第4のプラスミドは、ウサギβ-グロビンポリAシグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群から選択されるポリアデニル化シグナルを含有する。具体的な実施形態において、本発明は、上記で記載されるような4つのプラスミドを含み、かつ、それぞれのプラスミドがさらに、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子からなる群から選択される選択マーカーを含む、HIVに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物を提供する。別の実施形態において、それぞれのプラスミドはさらに細菌の複製起点を含む。さらに別の実施形態において、複製起点がpUCの複製起点である。本発明はまた、4つのDNAプラスミドが、調節エレメントに作動可能に連結された、2つのアジュバントポリペプチドをコードする2つのヌクレオチド配列を含む一次転写ユニットおよび二次転写ユニットを含む免疫原組成物を提供する。1つの実施形態において、一次転写ユニットは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、IL-12のp35ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、二次転写ユニットは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、IL-12のp40ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、本発明は、HIVに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、aHIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;cHIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;dHIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;eアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第5のDNAプラスミド;およびf薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む免疫原組成物を提供する。具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。別の実施形態において、ブピバカインを含有する免疫原組成物がエレクトポレーションとの併用で投与される。1つの実施形態において、HIVのエンベロープポリペプチド、gagポリペプチド、polポリペプチド、nef-tat-vifポリペプチドおよびアジュバントポリペプチドが真核生物細胞において発現される。別の実施形態において、本発明は、選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、aHIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;cHIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;dHIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;eアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第5のDNAプラスミド;およびf薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する方法を提供する。具体的な実施形態において、トランスフェクション促進因子がブピバカインである。別の実施形態において、ブピバカインを含有する免疫原組成物がエレクトポレーションとの併用で投与される。本発明の1つの実施形態において、第1、第2、第3、第4および第5のプラスミドは、真核生物細胞において活性であるプロモーターを含有する。特定の実施形態において、第1、第2、第3、第4および第5のプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーター、マウスサイトメガロウイルスMCMVプロモーター、および単純ヘルペスウイルスHSV潜伏期関連プロモーター-1LAP1、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターならびにヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含有する。本発明の他の実施形態において、第1、第2、第3、第4および第5のプラスミドは、ウサギβ-グロビンポリAシグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群から選択されるポリアデニル化シグナルを含有する。具体的な実施形態において、本発明は、上記で記載されるような5つのプラスミドを含み、かつ、それぞれのプラスミドがさらに、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子からなる群から選択される選択マーカーを含む、HIVに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物を提供する。別の実施形態において、それぞれのプラスミドはさらに細菌の複製起点を含み、この場合、複製起点はpUCの複製起点である。本発明はまた、第5のDNAプラスミドが、調節エレメントに作動可能に連結された、2つのアジュバントポリペプチドをコードする2つのヌクレオチド配列を含む一次転写ユニットおよび二次転写ユニットを含む免疫原組成物を提供する。1つの実施形態において、一次転写ユニットは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、IL-12のp35ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、二次転写ユニットは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、IL-12のp40ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の他の局面および実施形態が下記の詳細な説明において開示される。本発明は、例えば以下の項目を提供する。項目1DNAプラスミドであって、以下:a第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット;b第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニット;c第3のプロモーターおよび第3のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第3の転写ユニット;を含み、該第1のプロモーター、該第2のプロモーターおよび該第3のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1のポリアデニル化シグナル、該第2のポリアデニル化シグナルおよび該第3のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であり、かつ、該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向である、DNAプラスミド。項目2前記第1、第2および第3のポリペプチドが真核生物細胞において発現される、項目1に記載のプラスミド。項目3前記第1、第2および第3のプロモーターが真核生物細胞において活性である、項目1に記載のプラスミド。項目4前記第1、第2および第3のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーター、マウスサイトメガロウイルスMCMVプロモーター、単純ヘルペスウイルスHSV潜伏期関連プロモーター-1LAP1、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、項目1に記載のプラスミド。項目5前記第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルが、ウサギβ-グロビンポリAシグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、項目1に記載のプラスミド。項目6前記第1のプロモーターがサルサイトメガロウイルスSCMVプロモーターである、項目4に記載のプラスミド。項目7前記第1のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンBGHのポリアデニル化シグナルである、項目5に記載のプラスミド。項目8前記第2のプロモーターがヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーターである、項目4に記載のプラスミド。項目9前記第2のポリアデニル化シグナルがシミアンウイルス40SV40のポリアデニル化シグナルである、項目5に記載のプラスミド。項目10前記第3のプロモーターが単純ヘルペスウイルスHSV潜伏期関連プロモーター-1である、項目4に記載のプラスミド。項目11前記第3のポリアデニル化シグナルがウサギβ-グロビンのポリアデニル化シグナルである、項目5に記載のプラスミド。項目12前記第1の転写ユニットがHIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の融合体からgag-pol融合タンパク質を発現する、項目1に記載のプラスミド。項目13HIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の前記融合体、または、gag-pol遺伝子がHIVの単離体HXB2に由来する、項目12に記載のプラスミド。項目14前記第2の転写ユニットがHIVのエンベロープ遺伝子からエンベロープタンパク質を発現する、項目1に記載のプラスミド。項目15前記エンベロープ遺伝子がHIVの初代単離体6101に由来する、項目14に記載のプラスミド。項目16前記第3の転写ユニットが、HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体ntvから、nef、tatおよびvifの融合タンパク質NTVを発現する、項目1に記載のプラスミド。項目17HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の前記融合体、または、ntv遺伝子がHIVの単離体NL4-3に由来する、項目16に記載のプラスミド。項目18プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目1に記載のプラスミド。項目19前記選択マーカーが、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子からなる群より選択される、項目18に記載のプラスミド。項目20前記選択マーカーの存在位置が、スペーサー領域1、スペーサー領域2およびスペーサー領域3からなる群より選択される、項目19に記載のプラスミド。項目21前記選択マーカーの存在位置がスペーサー領域2である、項目20に記載のプラスミド。項目22細菌の複製起点をさらに含む、項目1に記載のプラスミド。項目23前記複製起点の存在位置が、スペーサー領域1、スペーサー領域2およびスペーサー領域3からなる群より選択される、項目22に記載のプラスミド。項目24前記選択マーカーの存在位置がスペーサー領域3である、項目23に記載のプラスミド。項目25前記複製起点がpUCの複製起点である、項目22に記載のプラスミド。項目26前記プラスミドの全体的なサイズが約15キロ塩基対未満である、項目1に記載のプラスミド。項目27スペーサー領域1が約400塩基対未満である、項目1に記載のプラスミド。項目28スペーサー領域2が約1100塩基対未満である、項目1に記載のプラスミド。項目29スペーサー領域3が約1100塩基対未満である、項目1に記載のプラスミド。項目30選択された抗原に対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物は、以下:aDNAプラスミドであって、以下:i第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニット、iii第3のプロモーターおよび第3のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第3の転写ユニット、を含み、ここで、該第1、第2および第3のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であり、かつ、該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向である、DNAプラスミド;およびb薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む、免疫原組成物。項目31前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、項目30に記載の免疫原組成物。項目32前記第1、第2および第3のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーター、マウスサイトメガロウイルスMCMVプロモーター、単純ヘルペスウイルスHSV潜伏期関連プロモーター-1LAP1、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、項目30に記載の免疫原組成物。項目33前記第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルが、ウサギβ-グロビンポリAシグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、項目30に記載の免疫原組成物。項目34前記第1のポリペプチドが、HIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の融合体から発現されたgag-pol融合タンパク質である、項目30に記載の免疫原組成物。項目35前記第2のポリペプチドが、HIVのエンベロープ遺伝子から発現されたエンベロープタンパク質である、項目30に記載の免疫原組成物。項目36前記第3のポリペプチドが、HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体ntvから発現された、nef、tatおよびvifの融合タンパク質NTVである、項目30に記載の免疫原組成物。項目37選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、aDNAプラスミドであって、以下:i第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニット、iii第3のプロモーターおよび第3のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、第3のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第3の転写ユニット、を含み、ここで、該第1、第2および第3のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であり、かつ、該第3の転写ユニットの転写方向とは反対方向である、DNAプラスミド;およびb薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む、免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。項目38前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、項目37に記載の方法。項目39前記エレクトロポレーションが、約25V/cm~約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、項目38に記載の方法。項目40前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、項目37に記載の方法。項目41前記第1、第2および第3のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーター、マウスサイトメガロウイルスMCMVプロモーター、単純ヘルペスウイルスHSV潜伏期関連プロモーター-1LAP1、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、項目37に記載の方法。項目42前記第1、第2および第3のポリアデニル化シグナルが、ウサギβ-グロビンポリAシグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、項目37に記載の方法。項目43ヒト免疫不全症ウイルスHIVに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、aHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;b第2のDNAプラスミドであって、以下:i第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットを含み、ここで、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第2のDNAプラスミド;およびc薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む、免疫原組成物。項目44前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、項目43に記載の免疫原組成物。項目45前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーター、マウスサイトメガロウイルスMCMVプロモーター、単純ヘルペスウイルスHSV潜伏期関連プロモーター-1LAP1、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群から選択される、項目43に記載の免疫原組成物。項目46前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギβ-グロビンポリAシグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、項目43に記載の免疫原組成物。項目47前記第1のプラスミドにおける前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーターである、項目45に記載の免疫原組成物。項目48前記第1のプラスミドにおける前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンポリAのポリアデニル化シグナルである、項目46に記載の免疫原組成物。項目49前記第1のDNAプラスミドがHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードし、HIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の前記融合体、または、gag-pol遺伝子がHIVの単離体HXB2に由来する、項目43に記載の免疫原組成物。項目50前記第2のプラスミドにおける前記第1のプロモーターがヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーターである、項目45に記載の免疫原組成物。項目51前記第2のプラスミドにおける前記第1のポリアデニル化シグナルがSV40ポリAのポリアデニル化シグナルである、項目46に記載の免疫原組成物。項目52前記HIVnef-tat-vif融合ポリペプチドが、HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体ntvから発現される、nef、tatおよびvifの融合タンパク質NTVである、項目43に記載の免疫原組成物。項目53HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の前記融合体、または、ntv遺伝子がHIVの単離体NL4-3に由来する、項目52に記載の免疫原組成物。項目54前記第2のプラスミドにおける前記第2のプロモーターがサルサイトメガロウイルスSCMVプロモーターである、項目45に記載の免疫原組成物。項目55前記第2のプラスミドにおける前記第2のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンBGHのポリアデニル化シグナルである、項目46に記載の免疫原組成物。項目56前記HIVエンベロープポリペプチドがHIVの初代単離体6101に由来する、項目43に記載の免疫原組成物。項目57選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下:aHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;b第2のDNAプラスミドであって、以下:i第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニット、を含み、ここで、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第2のDNAプラスミド;およびc薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。項目58前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、項目57に記載の方法。項目59前記エレクトロポレーションが、約25V/cm~約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、項目58に記載の方法。項目60前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、項目57に記載の方法。項目61前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーター、マウスサイトメガロウイルスMCMVプロモーター、単純ヘルペスウイルスHSV潜伏期関連プロモーター-1LAP1、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、項目57に記載の方法。項目62前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギβ-グロビンポリAシグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、項目57に記載の方法。項目63前記第1のプラスミドにおける前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーターである、項目61に記載の免疫原組成物。項目64前記第1のプラスミドにおける前記ポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンポリAのポリアデニル化シグナルである、項目62に記載の免疫原組成物。項目65前記第1のDNAプラスミドがHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードし、HIVのgag遺伝子およびpol遺伝子の前記融合体、または、gag-pol遺伝子がHIVの単離体HXB2に由来する、項目57に記載の方法。項目66前記第2のプラスミドにおける前記第1のプロモーターがヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーターである、項目61に記載の方法。項目67前記第2のプラスミドにおける前記第1のポリアデニル化シグナルがSV40ポリAのポリアデニル化シグナルである、項目62に記載の方法。項目68前記HIVnef-tat-vif融合ポリペプチドが、HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の融合体ntvから発現される、nef、tatおよびvifの融合タンパク質NTVである、項目57に記載の方法。項目69HIVのnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子の前記融合体、または、ntv遺伝子がHIVの単離体NL4-3に由来する、項目68に記載の方法。項目70前記第2のプラスミドにおける前記第2のプロモーターがサルサイトメガロウイルスSCMVプロモーターである、項目61に記載の方法。項目71前記第2のポリアデニル化シグナルがウシ成長ホルモンBGHのポリアデニル化シグナルである、項目62に記載の方法。項目72前記HIVエンベロープポリペプチドがHIVの初代単離体6101に由来する、項目57に記載の方法。項目73ヒト免疫不全症ウイルスHIVに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物が、以下:aHIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;cHIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;dアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;およびe薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む、免疫原組成物。項目74選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下:aHIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;cHIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;dアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;およびe薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む、免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。項目75前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、項目74に記載の方法。項目76前記エレクトロポレーションが、約25V/cm~約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、項目75に記載の方法。項目77HIVに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物が、以下:aHIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;cHIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;dHIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;eアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第5のDNAプラスミド;およびf薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む、免疫原組成物。項目78選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下:aHIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;cHIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第3のDNAプラスミド;dHIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;eアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第5のDNAプラスミド;およびf薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む、免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。項目79前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、項目78に記載の方法。項目80前記エレクトロポレーションが、約25V/cm~約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、項目79に記載の方法。項目81ヒト免疫不全症ウイルスHIVに対する免疫応答を脊椎動物宿主において誘発するための免疫原組成物であって、該免疫原組成物が、以下:aHIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;c第3のDNAプラスミドであって、以下:i第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットを含み、ここで、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第3のプラスミド;およびdアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;およびe薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む、免疫原組成物。項目82前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーター、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーター、マウスサイトメガロウイルスMCMVプロモーター、単純ヘルペスウイルスHSV潜伏期関連プロモーター-1LAP1、シミアンウイルス40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーターおよびヒト筋細胞特異的デスミンプロモーターからなる群より選択される、項目81に記載の組成物。項目83前記ポリアデニル化シグナルが、ウサギβ-グロビンポリAシグナル、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリA、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリA、ヒトβグロビンポリA、ポリオーマウイルスポリAおよびウシ成長ホルモンポリAからなる群より選択される、項目81に記載の組成物。項目84選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化する方法であって、該方法が、以下:aHIVのgagポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第1のDNAプラスミド;bHIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを含み、該単一転写ユニットが、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第2のDNAプラスミド;c第3のDNAプラスミドであって、以下:i第1のプロモーターおよび第1のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1の転写ユニット、ii第2のプロモーターおよび第2のポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された、HIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第2の転写ユニットを含み、ここで、該第1および第2のプロモーターはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、かつ、該第1および第2のポリアデニル化シグナルはそれぞれが、異なる転写ユニットに由来し、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向とは反対方向であるか、または、該第1の転写ユニットについての転写方向が該第2の転写ユニットの転写方向と同じ方向であり、該第1および第2の転写ユニットが少なくとも1キロ塩基対のスペーサー領域によって隔てられる、第3のプラスミド;およびdアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される第4のDNAプラスミド;およびe薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つを含む免疫原組成物を該脊椎動物宿主に投与する工程を包含する、方法。項目85前記免疫原組成物が、生体内エレクトポレーションを使用して哺乳動物に投与される、項目84に記載の方法。項目86前記エレクトロポレーションが、約25V/cm~約800V/cmの範囲での電場強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激する工程を包含する、項目85に記載の方法。項目87前記トランスフェクション促進因子がブピバカインである、項目86に記載の方法。項目88選択された抗原に対して脊椎動物宿主を免疫化するための医薬品の製造における、項目37~42、57~62、65~72、74~76、78~80または84~87のいずれか1項に記載される免疫原組成物の使用。発明の詳細な説明DNAに基づく免疫原組成物は、タンパク質抗原およびアジュバントの投与を含む従来の免疫原組成物の代替物を提供する。その代わり、DNAに基づく免疫原組成物では、1つまたは複数の抗原をコードするDNAを、その抗原が対象の組織の細胞によって発現される対象の組織に導入することが伴う。本明細書中で使用される場合、そのような免疫原組成物はDNAに基づく免疫原組成物または核酸に基づく免疫原組成物と呼ばれる。以前からの問題の1つは、多数の遺伝子が、保護免疫応答を生じさせるために要求されるとき、多数のプラスミドを、その多数の遺伝子を個々に発現させるために使用しなければならなかったことである。このことは製造および調節での負担を強いる。本発明の様々な実施形態は、この問題に対する解決策を、3つの独立したオープンリーディングフレームを同じ細胞において発現させることができるプラスミド設計により提供する。本発明の特定の実施形態では、遺伝子が、ポリタンパク質を作製するために融合され、このようにして、さらに多くのタンパク質を1つのプラスミドから発現させることができる。1つの実施形態において、6つのタンパク質が1つのプラスミドから発現させられる。非常に多数の要因が、抗原遺伝子の発現、および/または、DNAに基づく免疫原組成物の免疫原性に影響を及ぼし得る。そのような要因の例には、プラスミドベクターの構築、プラスミドベクターのサイズ、抗原遺伝子の発現を行わせるために使用されるプロモーターの選択、プラスミド上の転写ユニットの数およびサイズ、RNA転写物の安定性、プラスミド内での転写ユニットの配向、免疫化の再現性、ならびに、プラスミドにおける挿入された遺伝子の安定性が挙げられる。本発明の実施形態では、これらの重要なパラメーターの多くを最適化するプラスミド設計が提供される。多数の転写ユニットを有するプラスミドDNAベクターの設計および最適化は非常に重要である。免疫化された対象によって受け入れられる抗原の実際の用量を改善するために、プラスミドのサイズは最小限にしなければならず、その一方で、タンパク質生成物の数および産生されたタンパク質の量は最大にしなければならない。これらの事項をバランスさせるために、遺伝子の設置;転写ユニットの間隔;オープンリーディングフレームの転写方向;発現レベル;プロモーターのサイズ、配向および強さ;エンハンサーのサイズ、設置、配向および強さ;オープンリーディングフレームのサイズおよび構成;製造の容易さ;プラスミドの安定性;安全性;ならびに、対象を免疫化するために必要なベクターの最終的な用量を検討しなければならない。DNAプラスミドを免疫化のために使用することに関する重要な検討事項は、プラスミドの製造である。潜在的な安全性問題のために、製造プロセスおよび最終的な製造物は厳しい安全確保を受けなければならず、また、広範囲に及ぶ品質管理を受けなければならない。その結果はそのような手続きのための大きなコストで反映される。その結果として、多数のプラスミドを必要とするDNA免疫化はどれも、それに比例して費用がより大きくなり、効果的である可能性が低くなる。従って、本発明の特定の実施形態では、製造コストを抑制する必要がある場合、免疫応答を事実上任意の疾患プロセスにおいて誘発するために好適である適用あたり1つのプラスミドを含む免疫原組成物が提供される。一部の状況では、より大きな製造コストにもかかわらず、1つだけの転写ユニットまたは2つの転写ユニットをそれぞれが含有するプラスミドの組合せの使用により、より効果的な免疫原組成物がもたらされる場合がある。そのような場合、効果的な免疫応答を誘発するために必要な遺伝子のすべてをコードするプラスミドの最適な数を有するように免疫原組成物を設計することが重要である。1つだけの転写ユニットをそれぞれが含有する多数のプラスミドの代わりに、必要な遺伝子のすべてを発現する3つの転写ユニットを含有するプラスミドの使用は特定の抗原の免疫原性とバランスさせなければならない。一転写ユニットプラスミド法の組合せの利点の1つは、個々の遺伝子がそれぞれ、同じ強さのプロモーターによって駆動させられ得ることである。例えば、HCMVプロモーターを、三転写ユニットプラスミドでは当てはまるように、プラスミドあたり1回だけでなく、それぞれのプラスミドにおいて使用することができる。対照的に、三転写ユニットプラスミドを使用するとき、HCMVプロモーターは、内部での相同組換えおよびプラスミドの不安定性の可能性を防止するために1回のみ使用できる。例えば、一方のプラスミドが1つの転写ユニットを有し、第2のプラスミドが2つの転写ユニットを有する、2つの抗原発現プラスミドを有する組成物においてである。そのような組成物では、HCMVプロモーターを、1つの転写ユニットを有するプラスミドにおいて1つだけの抗原または融合タンパク質の発現を行わせるために使用することができ、また、2つの転写ユニットを有するプラスミドにおいて複数のタンパク質または融合タンパク質のうちの1つの発現を行わせるために使用することもできる。病原体がヒト免疫不全ウイルスHIVである場合、HIVのエンベロープポリペプチド、HIVのgag-pol融合ポリペプチド、HIVのnef-tat-vif融合ポリペプチド、および、アジュバントポリペプチドをそれぞれコードするヌクレオチド配列を含有する4つの一転写ユニットプラスミドを伴う免疫原組成物が記載される。所望されるならば、HIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する一転写ユニットプラスミドの代わりに、HIVのgagポリペプチドおよびHIVのpol融合ポリペプチドをそれぞれコードするヌクレオチド配列を含有する2つの一転写ユニットプラスミドを使用することができる従って、この局面では、5つのプラスミドが使用される。一般に、その起源に依存して、プロモーターは、mRNA合成を開始する際の組織特異性および効率が異なる[Xiang他、Virology、209:564~5791994;Chapman他、Nucle.Acids.Res.、19:3979~39861981]。今日まで、哺乳動物系におけるほとんどのDNAに基づく免疫原組成物は、サイトメガロウイルスCMVに由来するウイルスプロモーターに依拠している。CMVは起源がヒトまたはサルであり得る。これらは数多くの哺乳動物種における筋肉免疫化および皮膚免疫化の両方で良好な効率を有する。DNA免疫化によって誘発される免疫応答に影響を及ぼすことが知られている別の要因は、DNAの送達方法である。例えば、非経口経路は低い割合の遺伝子移入をもたらし、かつ、遺伝子発現のかなりの変動を生じさせ得る。Montgomery他、DNACellBio.、12:777~7831993を参照のこと。遺伝子銃を使用するプラスミドの高速度接種では、おそらくはDNAトランスフェクションのより大きな効率および樹状細胞によるより効果的な抗原提示のために、マウスの免疫応答が高まった。Fynan他、Proc.Natl.Acad.Sci.、90:11478~114821993B;Eisenbraun他、DNACellBiol.、12:791~7971993を参照のこと。本発明の核酸型免疫原組成物を含有するベクターはまた、この分野で知られている他の方法によって、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、顕微注入マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクションリポソーム融合またはDNAベクター輸送体によって所望の宿主に導入することができる。例えば、Wu他、J.Biol.Chem.、267:963~9671992;WuおよびWu、J.Biol.Chem.、263:14621~146241988;Hartmut他、カナダ国特許出願第2,012,311号1990年3月15日出願を参照のこと。従って、本発明は、脊椎動物例えば、哺乳動物、鳥類および魚類などの遺伝子的免疫化のためのプラスミド、免疫原組成物および方法に関連する。本発明のプラスミド、免疫原組成物および方法は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコの生物種を含む哺乳動物対象のために特に有用であり得る。本発明のプラスミド、免疫原組成物および方法は、下記において詳しく、かつ、当業者に知られている詳細を提供するために参考として組み込まれる引用文献を参照して記載される。A.DNAプラスミド、ベクター、構築物、免疫原組成物プラスミド、構築物およびベクターの各用語が本明細書全体を通して使用される。本明細書中で使用される用語プラスミドは、調節配列、オープンリーディングフレーム、クローニング部位、停止コドン、スペーサー領域、または、構造的領域もしくは機能的領域のために選択された他の配列をコードする様々な核酸分子が組み立てられ、遺伝子を脊椎動物宿主において発現させるためのベクターとして使用される環状かつスーパーコイル状のDNA分子を示す。さらに、本明細書中で使用されるプラスミドは細菌株において複製することができる。本明細書中で使用される用語構築物は、遺伝子および調節エレメントの指定された構成を有する特定のベクターまたはプラスミドを示す。核酸配列は、外因性これは、核酸配列が、ベクターが導入されようとしている細胞に対して外来であることを意味する、異種これは、核酸配列が、異なる遺伝子源に由来することを意味する、または、同族これは、宿主細胞の核酸内の位置においてその配列が通常的には見出されないことを除いて、配列が細胞内の配列に対して構造的に近縁であることを意味するであることが可能である。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築し、または、本発明のプラスミドを改変するために十分な素養を有している。そのような技術は、例えば、Sambrook他、MolecularCloning.ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory、NewYork、1989およびその引用参考文献例えば、3.18頁~3.26頁および16.17頁~16.27頁での引用参考文献、ならびに、Ausubel他、CurrentProtocolsinMolecularBiologyWileyIntersciencePublishers、NewYork、1995に記載される両者は参考として本明細書中に組み込まれる。用語ベクターは、1つまたは複数の抗原をコードする示された核酸分子が、その核酸分子を発現させることができる細胞への導入のために挿入され得るキャリア核酸分子を示すために使用される。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルスバクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス、および、人工染色体例えば、YACが挙げられる。用語発現ベクターは、転写させることができる、遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを示す。場合により、RNA分子が、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合には、これらの配列は、例えば、発現した干渉性RNAeiRNA、短い干渉性RNAsiRNA、アンチセンス分子またはリボザイムの産生では翻訳されない。発現ベクターは様々な制御配列を含有することができ、この場合、制御配列は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の転写、および、可能ならば、その翻訳のために必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を同様に果たし、下記に記載される核酸配列を含有することができる。用語核酸および用語オリゴヌクレオチドは、多数のヌクレオチドすなわち、リン酸基に連結し、かつ、置換ピリミジン例えば、シトシンC、チミンTまたはウラシルUまたは置換プリン例えば、アデニンAまたはグアニンGのいずれかである交換可能な有機塩基に連結した糖例えば、リボースまたはデオキシリボースを含む分子を意味するために交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、これらの用語はオリゴリボヌクレオチドならびにオリゴデオキシリボヌクレオチドを示す。これらの用語はまた、ポリヌクレオシドすなわち、リン酸基を除いたポリヌクレオチドおよび任意の他の有機塩基含有ポリマーを包含するものとする。核酸分子は、既存の核酸源例えば、ゲノムまたはcDNAから得ることができ、しかし、合成的に製造することができる例えば、オリゴヌクレオチド合成によって製造することができる。本明細書中で使用される表現それぞれが、異なる転写ユニットに由来するは、類似する機能の調節制御エレメントのそれぞれ例えば、プロモーターなどがすべて異なる起源であり、かつ、組換えによる遺伝的不安定性がプラスミドにおいて生じ得るようなレベルに互いに相同的でないことを意味する。Herrera他、Biochem.Biophys.Res.Commun.、279:548~5512000を参照のこと。本発明の免疫原組成物は、免疫応答が所望される少なくとも3つの選択された抗原をコードするDNA配列を含む三連転写ユニットDNAプラスミドを含む。このプラスミドにおいて、選択された各抗原は、哺乳動物細胞または脊椎動物細胞におけるその発現を行わせる調節配列の制御下にある。本発明の免疫原組成物はまた、選択された抗原をコードするプラスミドの組合せを含む。そのような組合せは、さらなる選択された抗原をコードする2つ、3つまたは4つのプラスミドから構成され得る。1つ、2つまたは3つの転写ユニットが組合せ内の任意の特定のプラスミドにおいて存在し得る。さらに、アジュバントポリペプチドをコードするさらなるプラスミドを本発明の免疫原組成物に含めることができる。本発明において有用な非ウイル性スプラスミドベクターは、選択された免疫原および抗原をコードするDNA配列を含む単離および精製されたDNA配列を含有する。標的抗原をコードするDNA分子は、外因性または異種の核酸配列をコードするために設計されているウイルス性供給源または非ウイルス性供給源例えば、細菌種または腫瘍抗原などに由来し得る。そのようなプラスミドまたはベクターは、ウイルスまたはファージに由来する配列を含むことができる。様々な非ウイルス性ベクターがこの分野では知られており、これらには、限定されないが、プラスミド、細菌ベクター、バクテリオファージベクター、裸のDNA、カチオン性の脂質またはポリマーと縮合したDNA、ならびに、下記で議論される他のトランスフェクション促進因子例えば、ブピバカインなどの局所麻酔剤と配合されたDNAが挙げられ得る。本発明のプラスミドの構成成分を既存のベクターから得ることができる。細菌ベクターの例には、特に、カルメットゲラン菌BCG、サルモネラ属、赤痢菌属、大腸菌およびリステリア属に由来する配列が挙げられるが、これらに限定されない。構成成分を得るための好適なプラスミドベクターには、例えば、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pK37、pKC101、pAC105、pVA51、pKH47、pUB110、pMB9、pBR325、ColE1、pSC101、pBR313、pML21、RSF2124、pCR1、RP4、pBAD18およびpBR328が挙げられる。他の構成成分を誘導可能な発現ベクターから得ることができる。好適な誘導可能な大腸菌発現ベクターの例には、pTrcAmann他、Gene、69:301~3151988、アラビノース発現ベクター例えば、pBAD18、Guzman他、J.Bacteriol.、177:4121~41301995およびpETIIdStudier他、MethodsinEnzymology、185:60~891990が挙げられる。pTrcベクターからの標的遺伝子の発現はハイブリッド型のtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依る。pETIIdベクターからの標的遺伝子の発現は、同時発現したウイルスRNAポリメラーゼT7gnIにより媒介されるT7gn10-lac融合プロモーターからの転写に依る。このウイルスポリメラーゼは、T7gn1遺伝子をlacUV5プロモーターの転写制御下に有する常在性プロファージから宿主菌株のBL21DE3またはHMSI74DE3によって供給される。pBADシステムは、araC遺伝子によって調節される誘導可能なアラビノースプロモーターに依る。このプロモーターはアラビノースの存在下で誘導される。調節性の構成成分を、外部から供給された化合物によって調節される誘導可能なプロモーターから得ることができ、これらには、亜鉛誘導可能なヒツジメタロチオニンMTプロモーター、デキサメタゾンDex誘導可能なマウス乳腫瘍ウイルスMMTVプロモーター、テトラサイクリン誘導系Gossen他、Science、268:1766~17691995およびラパマイシン誘導系Magari他、JclinInvest、100:2865~28721997が挙げられる。真核生物における転写制御シグナルはプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントから構成される。本明細書中で使用されるプロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与するタンパク質と特異的に相互作用するDNA配列を示す。Maniatis,T.他、Science、236;12371987を参照のこと。上記で議論されたように、5’非翻訳領域を、選択された抗原の発現を高めるためにプロモーターおよびエンハンサーと組み合わせることができる。抗原の発現を所望の哺乳動物対象または脊椎動物対象において行わせるプロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列は同様に、その目的のために有用であることが知られているプロモーターの広範囲のリストから選択することができる。様々なそのようなプロモーターが下記に開示される。下記に記載される免疫原性DNAプラスミド組成物の実施形態において、有用なプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスHCMVプロモーター/エンハンサー例えば、米国特許第5,158,062号および同第5,385,839号これらは参考として本明細書中に組み込まれるに記載される、ヒトヘルペスウイルス潜伏期関連プロモーター1および2HSVLap1HSVLap2:これらは潜伏期活性プロモーター12と呼ばれることがある、および、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーターエンハンサーである。GoinsW.F.他、J.Virology、68:2239~22521994;Soares,K.J.他、Virology、70:5384~5394;GoinsW.F.他、J.Virology、73:519~5321999を参照のこと。マウスサイトメガロウイルスMCMVプロモーターもまた使用に好適である。他の有用な転写制御エレメントには、転写後制御エレメント、例えば、スプライシングされていないRNAまたは部分的にスプライシングされたRNAの細胞質への輸送を助ける構成的輸送エンハンサーCTEまたはCTE様エレメント例えば、RNA輸送エレメントRTEなどなどが挙げられる。米国特許第5,585,263号Hammarskjold他、および、Zolotukhin他、J.Virol.、68:944~79521994を参照のこと。CTEまたはRTEは、発現を改善することが示されているので、また、多くの遺伝子が転写後制御エレメントの存在を必要としているので望ましい。数タイプのCTEおよびCTE様エレメントが存在しており、それらは、異なる経路を使用して機能している。Tabernero他、J.Virol.、71:95~1011997を参照のこと。国際特許出願公開WO99/61596もまた参照のことこれは、CTEに取って代わることができる新しいタイプの転写後制御エレメントを記載する。遺伝子発現はまた、mRNAの蓄積を支援するというレベルで、または、mRNAの安定性を増大させるというレベルで、または、リボソーム進入の円滑化そのような機構のすべてがより大きなレベルの翻訳をもたらすによって機能するポリヌクレオチド配列を含むことによって高めることができる。本発明の特定の実施形態において、ある種の5’非翻訳領域およびイントロンを、より高レベルの遺伝子発現を行わせることができる複合プロモーターまたはキメラなプロモーターを作製するためにプロモーターおよびエンハンサーと組み合わせることができる。遺伝子発現を高めるために有用な5’非翻訳領域の例には、プロモーターの特異性を変化させることなく、翻訳を高めることによって遺伝子または導入遺伝子の発現を増大させるためにプロモーターの下流側に挿入することができるアデノウイルスの三成分リーダー配列Adtpが挙げられる。W.Sheay他、Biotechniques、155:856~621993を参照のこと。チンパンジーおよびマウスの伸長因子1αEF-1αmRNAの5’UTRは、RNA転写および/またはRNA安定性を増大することによって遺伝子発現を高めることが知られているイントロンを含有する。S.Y.Kim他、J.Biotechnol.、14;932:183~71993を参照のこと。真核生物の開始因子4geIF4gをコードするmRNAの5’-UTRは、推定される内部リボソーム進入部位IRESの存在によって特徴づけられ、強いプロモーター活性を示す。B.HanB.J.T.Zhang、MolCellBiol、2221:7372~842002を参照のこと。加えて、ヒト熱ショックタンパク質70Hsp70mRNAの5’UTRは、通常の細胞培養条件のもとでmRNA翻訳の効率を1桁までも増大させるエレメントを含有する。S.Vivinus他、EurJBiochem.、2687:1908~172001を参照のこと。NF-κB抑制因子の5’UTRは強力なIRESとして作用し、また、モノシストロンmRNAの状況では翻訳エンハンサーとしても機能する。A.Oumard他、MolCellBiol、208:2755~92000を参照のこと。CAPと開始コドンとの間に結合されて付加された場合、SV40の5’UTR、および、ヒトT細胞白血病ウイルスHTLVタイプIの長末端反復に由来するR領域SURは、おそらくはmRNA安定化により翻訳効率を増大させる。Y.Takebe他、MolCellBiol、81:466~4721988を参照のこと。本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸分子、DNAプラスミドまたはベクターに含められる調節配列には、限定されないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、5’非翻訳領域配列、イントロン、CTE、RTE、ポリアデニル化配列、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列、翻訳される遺伝子の開始部および末端部にそれぞれ配置される転写開始および転写終結のための部位、転写された領域における翻訳のためのリボソーム結合部位、エピトープタグ、核局在化配列、内部リボソーム進入部位IRESエレメント、ゴールドバーグホグネスTATAエレメント、制限酵素切断部位、ならびに、選択マーカーなどが含まれる。エンハンサー配列には、例えば、SV40DNAの72bpのタンデム反復、または、レトロウイルスの長末端反復もしくはLTRなどが挙げられ、エンハンサー配列は、転写効率を増大させるために用いられる。Wasylyk他、NucleicAcidRes.、12:5589~56081984を参照のこと。DNAプラスミドにおいて有用なこれらの他の構成成分には、例えば、複製起点、ポリアデニル化配列例えば、ウシ成長ホルモンBGHポリA、シミアンウイルス40SV40ポリA、および、薬物耐性マーカー例えば、カナマイシン耐性など含まれ、これらの他の構成成分もまた、実施例において記載される配列および下記において具体的に言及される配列を含む、広く知られている配列の中から選択することができる。個々のプロモーターおよび他の一般的なプラスミドエレメントの選択は通常的であり、多くのそのような配列を、本発明において有用なプラスミドを設計するために利用可能である。例えば、Sambrook他、MolecularCloning.ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory、NewYork、1989およびその引用参考文献例えば、3.18頁~3.26頁および16.17頁~16.27頁での引用参考文献、ならびに、Ausubel他、CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySons、NewYork、1989を参照のこと。本発明において有用なプラスミドの構成成分のすべてを、この分野における知られている材料、および、製薬業界から入手可能である、知られている材料の中から当業者によって容易に選択することができる。抗原またはポリペプチドを発現する好適な遺伝子の様々な例が下記の議論において特定される。本明細書中におけるプラスミドおよび免疫原組成物の1つの実施形態において、選択された抗原はHIV-1抗原であり、これらには、gag、pol、env、nef、vpr、vpu、vifおよびtatの各遺伝子によって発現される抗原が含まれる。1つの実施形態において、DNAプラスミドのコード配列および非コード配列ならびに他の構成成分が、例えば、意図された宿主に対して適切なコドン選択によって、また、何らかの阻害配列の除去これもまた、抗原調製に関して下記で議論されるによって最適化される。本発明の実施形態によれば、組成物は、少なくとも3つの選択された抗原を発現する1つのプラスミドを含有する。あるいは、プラスミド組成物はまた、少なくとも3コピーの同じ選択された目的とする抗原またはポリペプチドをコードするDNA配列を含む1つのDNAプラスミドを含む。本発明の1つの実施形態において、組成物は、多数の選択された抗原を多数のオープンリーディングフレームから発現する1つのプラスミドを含有する場合がある。別の実施形態において、プラスミド組成物は、多数の選択された抗原例えば、異なるクレードに由来する多数のenv遺伝子をコードする多数コピーの類似するオープンリーディングフレームをコードするDNA配列を含む1つのDNAプラスミドを含む。本発明の特定の実施形態において、それぞれが1つの抗原を発現するプラスミドの組合せの使用により、より効果的な免疫原組成物がもたらされる場合がある。例えば、1つの実施形態において、本発明は、それぞれがHIV免疫原またはアジュバントをコードする4つのプラスミドを含有する免疫原組成物を提供する。1つのそのような具体的な免疫原組成物は、4つのプラスミドの下記の組合せ:aHIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第1のDNAプラスミド;bHIVのgag-pol融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単一転写ユニットを含む第2のDNAプラスミド;cHIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第3のDNAプラスミド;dアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する第4のDNAプラスミドと、e薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはトランスフェクション促進因子の少なくとも1つとを含有する。具体的な実施形態において、これらのHIV遺伝子のそれぞれの発現を行わせるプロモーターはHCMVプロモーターであり、これらのHIV遺伝子のそれぞれについてのポリA配列はウシ成長ホルモンのポリAである。本発明の具体的な実施形態において、それぞれが1つの抗原を発現するプラスミドの組合せの使用が所望される場合、個々のポリペプチドをコードする個々の遺伝子をより多く含有し、かつ、融合ポリペプチドをコードする融合遺伝子をより少なく含有するプラスミドをより多く使用することが好都合である場合がある。例えば、1つの実施形態において、本発明は、それぞれがHIV免疫原またはアジュバントをコードする5つのプラスミドを含有する免疫原組成物を提供する。この実施形態において、免疫原組成物は、aHIVのエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第1のDNAプラスミド;bHIVのgag融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第2のDNAプラスミド;cHIVのpolポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第3のDNAプラスミド;dHIVのnef-tat-vif融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一転写ユニットを有する第4のDNAプラスミド;eアジュバントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する第5のDNAプラスミド、を含む。具体的な実施形態において、これらのHIV遺伝子のそれぞれの発現を行わせるプロモーターはHCMVプロモーターであり、これらのHIV遺伝子のそれぞれについてのポリA配列はウシ成長ホルモンのポリAである。さらにさらなる実施形態において、DNAプラスミドおよび免疫原組成物はさらに、望ましいサイトカイン、リンホカインまたは他の遺伝子アジュバントをコードするヌクレオチド配列を個々のDNAプラスミド構成成分として、または、抗原含有DNAプラスミドの一部として含有することができる。核酸配列が利用可能であるそのような好適なアジュバントの記載が下記に示される。本発明において例示される実施形態において、本発明のDNAプラスミド組成物とともに投与される望ましいサイトカインはインターロイキン-12である。DNAプラスミド組成物は、薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリア例えば、下記で議論される希釈剤、賦形剤またはキャリアなどにおいて投与することができる。組成物は任意の選択された投与経路によって投与され得るが、1つの実施形態において、望ましい投与方法は、下記で記載されるトランスフェクション促進因子としてのブピバカインとの、プラスミド分子を含む組成物の筋肉内同時投与である。B.プラスミド内におけるエレメントの物理的構成脊椎動物の免疫原組成物を設計するための実際的な検討事項は、対象を免疫化するときに効果的な投与され得るDNAの量である。用量が検討されるとき、プラスミドの全体的なサイズを制限し、その一方で、プラスミド内での完全な転写ユニットの数を同時に最大にすることは、プラスミドDNA設計をもたらすための方針を提供する。プラスミドのサイズを最小限に抑え、かつ、発現される遺伝子の数を最大にすることの利点は、1マイクログラムの注入されたDNAあたり送達される免疫原タンパク質の量が高まることである。加えて、ベクターのサイズが増大するに従い、ベクターの不安定性の可能性が増大することが知られている。Herrera他、Biochem.Biophys.Res.Commun.、279:548~5512000を参照のこと。従って、この目標を達成するために、個々の調節制御エレメント例えば、プロモーターなどのサイズを検討し、所与の発現レベルのために要求されるプロモーターの強さとバランスさせなければならない。同様に、オープンリーディングフレームのサイズがプラスミドの全体的なサイズの一因となる。本明細書中で使用される場合、転写ユニット間のDNA領域これは、調節的な役割または選択された抗原をコードする役割を有しないDNAによって占められるは、本明細書中ではスペーサー領域として指される。スペーサー領域のサイズは、転写ユニット間の転写干渉のレベル、立体的障害のレベル、および、全体的なプラスミドサイズを決定することにおいて重要である。従って、各エレメントのサイズは、それがタンパク質コードであるか、または調節制御であるか、またはスペーサー領域であるとしても、慎重に検討しなければならず、また、最小の効果的な塩基対数に制限しなければならない。本発明の実施形態では、全長が約18キロ塩基対kb以下のDNAである三連転写ユニットDNAプラスミドが提供される。代わりの実施形態において、本発明は、全長が約17kb以下のDNAである三連転写ユニットDNAプラスミドを提供する。本発明の別の実施形態では、全長が約16kb以下のDNAである三連転写ユニットDNAプラスミドが提供される。本発明の特定の実施形態では、全長が約15kb以下のDNAである三連転写ユニットDNAプラスミドが提供される。本発明のさらに別の実施形態では、全長が約14kb以下のDNAである三連転写ユニットDNAプラスミドが提供される。本発明の具体的な実施形態では、全長が約13kb以下のDNAである三連転写ユニットDNAプラスミドが提供される。本発明の特定の実施形態では、全長が約12kb以下のDNAである三連転写ユニットDNAプラスミドが提供される。本発明の別の実施形態では、全長が約11kb以下のDNAである三連転写ユニットDNAプラスミドが提供される。本明細書中で使用される約またはおよそは、示された値または範囲の20パーセント以内を一般に意味するものとする。図1において明らかにされるように、3つの転写ユニットの間における転写方向の配向はDNAプラスミド設計のためのもう1つの検討事項である。分子生物学の当業者は、環状DNAプラスミドにおいて、転写方向は2つしかないことを理解する。従って、3つの転写ユニットを有するプラスミドでは、それらのうちの少なくとも2つが同じ方向で進行する。本発明の特定の実施形態において、第1の転写ユニットについての転写方向が第2の転写ユニットの発現方向とは反対方向である。本発明の別の実施形態において、第1の転写ユニットについての転写方向が第2の転写ユニットの発現方向とは反対方向であり、かつ、第3の転写ユニットの転写方向が第2の転写ユニットと同じ方向である。本発明のさらに別の実施形態において、第1の転写ユニットについての転写方向が第2の転写ユニットの発現方向とは反対方向であり、かつ、第3の転写ユニットの転写方向が第1の転写ユニットと同じ方向である。当業者は、第1、第2および第3としての転写ユニットの番号付けが便宜上にすぎないことを理解する。これら3つの転写ユニットはプラスミドを周って任意の順で配置することができる。2つの転写ユニットを有するプラスミドでは、いくつかの制約が2つの転写ユニットの転写方向に関して存在する。2つの転写ユニットについての転写方向が反対方向であるならば、そのような2つの転写ユニットは200bpもの小さいスペーサー領域によって互いに隔てることができ、あるいは、300bpもの小さいスペーサー領域によって互いに隔てることができ、あるいは、400bpもの小さいスペーサー領域によって互いに隔てることができる。2つの転写ユニットを有するプラスミドにおいて、2つの転写ユニットについての転写方向が同じ方向であるならば、そのような2つの転写ユニットは少なくとも約500bpのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。別の実施形態では、そのような2つの転写ユニットは少なくとも約600bpのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。さらに別の実施形態では、そのような2つの転写ユニットは少なくとも約700bpのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。特定の実施形態では、そのような2つの転写ユニットは少なくとも約800bpのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。別の実施形態では、そのような2つの転写ユニットは少なくとも約900bpのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。さらに別の実施形態では、そのような2つの転写ユニットは少なくとも約1000bpのスペーサー領域によって互いに隔てなければならない。本発明の別の実施形態において、第1の転写ユニットについての転写方向が第2の転写ユニットの発現方向と同じ方向である。本発明のさらに別の実施形態において、第1の転写ユニットについての転写方向が第2の転写ユニットの発現方向と同じ方向であり、かつ、第3の転写ユニットの転写方向が第2の転写ユニットと同じ方向である。本発明の特定の実施形態において、第1の転写ユニットについての転写方向が第2の転写ユニットの発現方向と同じ方向であり、かつ、第3の転写ユニットの転写方向が第1の転写ユニットとはは反対方向である。スペーサー領域のサイズは、転写ユニット間の転写干渉を緩和し、立体障害を軽減し、かつ、全体的なプラスミドサイズを抑制するために操作することができる1つの変数である。図1に示される実施形態では、SCMVプロモーターとHCMVプロモーターとの間に配置されている、転写ユニット1および転写ユニット2を隔てるスペーサー領域が存在する。本明細書中で使用される場合、転写ユニット1および転写ユニット2を隔てるスペーサー領域がスペーサー領域1として理解される。図1に示される実施形態において、SV40polyAとHSVLap1プロモーターとの間に配置されている、転写ユニット2および転写ユニット3を隔てるスペーサー領域が存在する。本明細書中で使用される場合、転写ユニット2および転写ユニット3を隔てるスペーサー領域がスペーサー領域2として理解される。図1に示される実施形態において、BGHpolyAとウサギβグロビンpolyAとの間に配置されている、転写ユニット3および転写ユニット1を隔てる第3のスペーサー領域が存在する。本明細書中で使用される場合、転写ユニット3および転写ユニット1を隔てるスペーサー領域がスペーサー領域3として理解される。図1を参照のこと。本発明の別の特徴は、全体的なプラスミドサイズが、プラスミドおよび/またはアジュバントの機能を満たすために真核生物プラスミドのスペーサー領域を使用することによって最小限に抑えられ得ることである。例えば、図1に示される実施形態において、スペーサー領域3はまた、細菌の複製起点を含む。加えて、図1に示される実施形態において、スペーサー領域2はカナマイシン遺伝子を細菌における成長のために含む。他の実施形態において、スペーサー領域は、免疫応答を刺激するためにCpGアイランド配列を含む。別の実施形態において、スペーサー領域は、抗原の発現を高めるためにCTE配列および/またはRTE配列を含む。本発明のさらに別の実施形態において、スペーサー領域はエンハンサー配列を含むことができる。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域は、発現を高めることにおいて有用であることが知られている非翻訳配列を含むことができる。本発明の1つの実施形態において、スペーサー領域1はサイズが約5kb未満であり、あるいは約4kb未満である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域1はサイズが約3kb未満であり、あるいは約2kb未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域1はサイズが約1b未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域1はサイズが約800塩基対bp~約1000bpの間である。本発明の代わりの実施形態において、スペーサー領域1はサイズが約600bp~約800bpの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域1はサイズが約400bp~約600bpの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域1はサイズが約300bp~約400bpの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域1はサイズが約400bp未満である。本発明の具体的な実施形態において、スペーサー領域1はサイズが約200bp~約300bpの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域1はサイズが約100bp~約200bpの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域1はサイズが約10bp~約100bpの間である。本発明の1つの実施形態において、スペーサー領域2はサイズが約5kb未満であり、あるいは約4kb未満である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域2サイズが約3kb未満であり、あるいは約2kb未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域2はサイズが約1b未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域2はサイズが約1100bp未満である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域2はサイズが約800塩基対bp~約1000bpの間である。本発明の代わりの実施形態において、スペーサー領域2はサイズが約600bp~約800bpの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域2はサイズが約400bp~約600bpの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域2はサイズが約300bp~約400bpの間である。本発明の具体的な実施形態において、スペーサー領域2はサイズが約200bp~約300bpの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域2はサイズが約100bp~約200bpの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域2はサイズが約10bp~約100bpの間である。本発明の1つの実施形態において、スペーサー領域3はサイズが約5kb未満であり、あるいは約4kb未満である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域3はサイズが約3kb未満であり、あるいは約2kb未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域3はサイズが約1b未満である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域3はサイズが約1100bp未満である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域3はサイズが約800bp~約1000bpの間である。本発明の代わりの実施形態において、スペーサー領域3はサイズが約600bp~約800bpの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域3サイズが約400bp~約600bpの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域3サイズが約300bp~約400bpの間である。本発明の具体的な実施形態において、スペーサー領域3はサイズが約200bp~約300bpの間である。本発明の特定の実施形態において、スペーサー領域3はサイズが約100bp~約200bpの間である。本発明の別の実施形態において、スペーサー領域3はサイズが約10bp~約100bpの間である。C.本発明の免疫原組成物により発現される抗原本明細書中で使用されるポリペプチドは、本発明のプラスミドおよび免疫原組成物によってコードされる選択されたタンパク質抗原、糖タンパク質抗原、ペプチド抗原または他の改変されたタンパク質抗原を指す。本発明の実施形態では、選択された抗原に対して脊椎動物宿主におけるポリペプチドに対する免疫応答を誘発するプラスミドおよび免疫原組成物が提供される。本明細書中で使用される用語選択された抗原はこのようなポリペプチドを指す。ポリペプチドを含む選択された抗原には、プラスミドDNAによって発現されるとき、病原性のウイルス、細菌、菌類、寄生虫、プリオンまたはそれらの組合せに由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る。あるいは、選択された抗原には、ガン細胞または腫瘍細胞に由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る。別の実施形態において、選択された抗原には、IgEの産生を妨害し、その結果、アレルゲンに対するアレルギー性応答を和らげるようにするために、アレルゲンに由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る。さらに別の実施形態において、選択された抗原には、望ましくない様式、量または存在位置で宿主によって産生される分子自己分子を表す分子またはその一部分に由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらのフラグメントまたは融合体が挙げられ得る例えば、脊椎動物宿主におけるアミロイド沈着によって特徴づけられる疾患を防止または処置するようにするために、アミロイド前駆体タンパク質に由来する分子など。本発明の1つの実施形態において、選択された抗原には、HIV-1に由来するタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントが含まれ得る。本発明の実施形態はまた、1脊椎動物宿主において免疫応答を誘発するために、病原性のウイルス、細菌、菌類または寄生虫に由来する選択された抗原、あるいは2哺乳動物対象において治療的または予防的な抗ガン作用を誘発するために、ガン細胞または腫瘍細胞由来のガン抗原または腫瘍関連抗原に由来する選択された抗原、あるいは3IgEの産生を妨害し、その結果、アレルゲンに対するアレルギー性応答を和らげるようにするために、アレルゲンに由来する選択された抗原、あるいは4望ましくない様式、量または存在位置で宿主によって産生される分子自己分子を表す分子またはその一部分に由来する、そのような望ましくない作用を軽減するようにするために選択された抗原、をコードするプラスミドを含む免疫原組成物に関する。別の実施形態において、望ましい免疫原組成物は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス1型~3型、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、トリニューモウイルス以前では、七面鳥鼻気管炎ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパーウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻気管炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、ブタ呼吸繁殖症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび様々な脳炎ウイルス、ならびに、コロナウイルス例えば、SARSウイルスなどのウイルス疾患のうちの1つを防止または処置することを目指した免疫応答を誘発するための選択された抗原をコードする本発明の三連転写ユニットプラスミドを利用することができる。特定の実施形態において、本発明の三連転写ユニットプラスミドを含む免疫原組成物は、新出現疾患を引き起こす病原体、例えば、重症急性呼吸器SARSウイルス、ヒトヘルペスウイルス8HHV-8、ハンターンウイルス、コレラ菌Vibriocholera0139、ヘリコバクターピロリHelicobacterpyloriおよびボレリアブルグドルフェリBorreliaburgdorferiなどに由来する選択された抗原をコードするプラスミドを含む。別の実施形態において、本発明のプラスミドを含む免疫原組成物は、Haemophilusinfluenzaeインフルエンザ菌分類可能型および分類不能型の両方、Haemophilussomnus、Moraxellacatarrhalis、Streptococcuspneumoniae肺炎連鎖球菌、Streptococcuspyogenes化膿連鎖球菌、Streptococcusagalactiae、Streptococcusfaecalis糞便連鎖球菌、Helicobacterpylori、Neisseriameningitidis髄膜炎菌、Neisseriagonorrhoeae淋菌、Chlamydiatrachomatisトラコーマクラミジア、Chlamydiapneumoniae肺炎クラミジア、Chlamydiapsittaciオウム病クラミジア、Bordetellapertussis百日咳菌、Alloiococcusotiditis、Salmonellatyphiチフス菌、Salmonellatyphimuriumネズミチフス菌、Salmonellacholeraesuis豚コレラ菌、Escherichiacoli大腸菌、Shigella赤痢菌属、Vibriocholeraeコレラ菌、Corynebacteriumdiphtheriaeジフテリア菌、Mycobacteriumtuberculosis結核菌、Mycobacteriumavium-Mycobacteriumintracellulare複合体、Proteusmirabills、Proteusvulgaris、Staphylococcusaureus黄色ブドウ球菌、Staphylococcusepidermidis表皮ブドウ球菌、Clostridiumtetani破傷風菌、Leptospirainterrogans、Borreliaburgdorferi、Pasteurellahaemolytica、Pasteurellamultocida、ActinobacilluspleuropneumoniaeおよびMycoplasmagallisepticumこれらに限定されないによって引き起こされる細菌疾患の防止および/または処置に向けられたプラスミドを含む。本発明の実施形態はまた、Aspergillisアスペルギルス属、Blastomycesブラストミセス属、Candidaカンジダ属、Coccidiodesコクシジオイデス属、Cryptococcusクリプトコックス属およびHistoplasmaヒストプラスマ属これらに限定されないに由来する選択された抗原をコードするプラスミドを含む免疫原組成物に関する。特定の実施形態において、菌類に由来する選択された抗原をコードするプラスミドを含むそのような免疫原組成物は、菌類疾患の防止および/または処置のために使用される。別の実施形態において、本発明はまた、Leishmaniamajor森林型熱帯リーシュマニア、Ascaris回虫属、Trichuris鞭虫属、Giardiaジアルディア属、Schistosoma住血吸虫属、Cryptosporidiumクリプトスポリジウム属、Trichomonasトリコモナス属、ToxoplasmagondiiトキソプラズマおよびPneumocystiscariniiニューモシスティスこれらに限定されないに由来する選択された抗原をコードするプラスミドを含む免疫原組成物に関する。特定の実施形態において、寄生虫の選択された抗原をコードするプラスミドを含むそのような免疫原組成物は寄生虫疾患の防止および/または処置のために使用される。特定の実施形態において、本発明は、前立腺特異的抗原、ガン胎児性抗原、MUC-1、Her2、CA-125およびMAGE-3が非限定的に挙げられるガン抗原または腫瘍関連抗原などの選択された抗原をコードするプラスミドを含む、脊椎動物宿主における治療的または予防的な抗ガン作用を誘発するための免疫原組成物を提供する。一部の実施形態では、同じ抗原または抗原の変化種を、特定の標的抗原の転写および最終的な服用量を高めるために多数の転写ユニットに配置することができる。本発明の実施形態は、脊椎動物宿主においてアレルゲンに対する応答を和らげる際に使用される、アレルゲンである選択された抗原をコードするプラスミドを含む免疫原組成物もまた提供し、アレルゲンまたはそのフラグメントを含有する免疫原組成物を包含する。そのようなアレルゲンの様々な例が米国特許第5,830,877号および国際特許出願公開WO99/51259に記載されるこれらは本明細書により参考として組み込まれる。そのようなアレルゲンには、限定されないが、花粉、昆虫毒、動物鱗屑、菌類胞子および薬物が挙げられる。本発明の免疫原組成物は、IgE抗体の産生アレルギー性反応の知られている原因を妨害するために使用することができる。本発明の実施形態はまた、脊椎動物宿主において自己分子に対する応答を和らげるための選択された抗原をコードするプラスミドを含む免疫原組成物に関する。そのような選択された抗原には、自己分子またはそのフラグメントを含有する抗原が挙げられる。そのような自己分子の例には、糖尿病に関与するインスリンのβ鎖、胃食道逆流疾患に関与するG17分子、および、様々な疾患例えば、多発性硬化症、狼瘡およびリウマチ様関節炎などにおいて自己免疫応答をダウンレギュレーションする抗原が挙げられる。β-アミロイドペプチドこれはまたAβペプチドと呼ばれるもまた含まれ、これはアミロイド前駆体タンパク質APPの内部の39アミノ酸~43アミノ酸のフラグメントであり、このフラグメントはβセクレターゼ酵素およびγセクレターゼ酵素によるAPPのプロセシングによって生じる。Aβ1~42ペプチドは下記の配列を有する:。選択された抗原をコードする遺伝子配列、ならびに、その遺伝子配列が挿入されるDNAプラスミドのコドン使用を、抗原の発現を増大させ、かつ/または、それにおける阻害配列を除くために変更することもまた、本発明のDNAプラスミドを設計するための、選択された抗原をコードする配列の選択および使用において望ましい。阻害配列の除去を、米国特許第5,965,726号、同第5,972,596号、同第6,174,666号、同第6,291,664号および同第6,414,132号、ならびに、国際特許出願公開WO01/46408これらは参考として本明細書中に組み込まれるに詳しく議論される技術を使用することによって達成することができる。簡単に記載すると、この技術は、選択された遺伝子における特定された阻害因子/不安定性配列を好ましくは多数の点変異により変異させることを伴う。下記に例示される1つの具体的な実施形態として、本発明のDNAプラスミドおよび免疫原組成物では、望ましくは、HIV-1の遺伝子例えば、gag、pol、env、nef、tatおよびvifなどについて最適化された1つまたは複数の配列が用いられる。本発明の三連転写ユニットプラスミドはまた、宿主細胞をトランスフェクションし、または形質転換し、または感染させて、3つ以上のタンパク質またはポリペプチドをインビトロで発現させるための使用に好適である。D.転写ユニットにおいて有用なプロモーター本発明のDNAプラスミドは、1つ、2つまたは3つの転写ユニットを含む。それぞれの転写ユニットが少なくとも1つのプロモーターを含む。従って、本発明の特定の実施形態において、選択された抗原をコードする核酸はプロモーターの転写制御下にある。プロモーターは、遺伝子の特異的な転写を開始するために要求される、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識されるDNA配列を指す。表現転写制御下は、プロモーターが、遺伝子のRNAポリメラーゼによる開始および転写を制御するために核酸に関して正しい存在位置および配向にあることを意味する。プロモーターの用語は、RNAポリメラーゼのための開始部位の付近にクラスター化している一群の転写制御モジュールを指すために本明細書中では使用される。プロモーターがどのように構成されるかについての考えの多くは、HSVチミジンキナーゼtk転写ユニットおよびSV40初期転写ユニットについてのプロモーターを含むいくつかのウイルスプロモーターの分析に由来する。これらの研究は、より近年の研究によって増大しているが、プロモーターがいくつかの異なった機能的モジュールから構成され、そのそれぞれがおよそ7bp~20bpのDNAからなり、かつ、転写活性化因子タンパク質または転写抑制因子タンパク質のための1つまたは複数の認識部位を含有することを示している。それぞれのプロモーターにおける少なくとも1つのモジュールが、RNA合成のための開始部位を設置するように機能する。このことの最もよく知られている例がTATAボックスであり、しかし、TATAボックスを有していない一部のプロモーター、例えば、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーター、および、SV40後期遺伝子についてのプロモーターなどでは、開始部位そのものに重なる異なったエレメントが、開始場所を固定することを助ける。転写ユニットのいずれかにおいて使用される好適なプロモーターには、真核生物細胞において活性なすべてのプロモーターが含まれる。好適な真核生物プロモーターの例には、ヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーター場合によりHCMVエンハンサーを伴う例えば、Boschart他、Cell、41:521~5301985を参照のこと、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーター、マウスサイトメガロウイルスMCMVプロモーター、単純ヘルペスウイルスHSVLAP1プロモーター、シミアンウイルス40SV40プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーター、レトロウイルスの長末端反復LTR、筋細胞特異的なデスミンプロモーター、または、抗原提示細胞において活性な任意の他のプロモーターが挙げられる。加えて、好適な真核生物プロモーターは、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーターおよび組織特異的なプロモーターなどの中から選択されるとして特徴づけることができる。活性において非特異的であり、かつ、選択された抗原をコードするDNAプラスミドにおいて用いられる構成的プロモーターの例には、限定されないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスRSVのプロモーター、レトロウイルスのLTRプロモーター場合によりRSVエンハンサーを伴う、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼPGKプロモーターおよびEF1αプロモーターInvitrogenが挙げられる。外部から供給された化合物によって調節される誘導可能なプロモーターには、限定されないが、アラビノースプロモーター、亜鉛誘導可能なヒツジメタロチオニンMTプロモーター、デキサメタゾンDex誘導可能なマウス乳腫瘍ウイルスMMTVプロモーター、T7ポリメラーゼプロモーター系国際特許出願公開WO98/10088、エコジソン昆虫プロモーターNo他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93:3346~33511996、テトラサイクリン抑制系Gossen他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:5547~55511992、テトラサイクリン誘導系Gossen他、Science、268:1766~17691995;Harvey他、Curr.Opin.Chem.Biol.、2:512~5181998もまた参照のこと、RU486誘導系Wang他、Nat.Biotech.、15:239~2431997、および、Wang他、GeneTher.、4:432~4411997、ならびに、ラパマイシン誘導系Magari他、J.Clin.Invest.100:2865~28721997が挙げられる。本発明のDNAプラスミドにおいて有用であり得る誘導可能なプロモーターの他のタイプは、特定の生理学的状態例えば、温度または急性期によって調節されるプロモーター、または、複製中の細胞においてのみ調節されるプロモーターである。有用な組織特異的なプロモーターには、骨格β-アクチン、ミオシン軽鎖2A、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに、天然に存在するプロモーターよりも大きい活性を有する合成された筋肉プロモーターLi他、Nat.Biotech.、17:241~2451999を参照のことが挙げられる。組織特異的であるプロモーターの例が下記の組織について知られている:中でも、肝臓アルブミン、Miyatake他、J.Virol.、71:5124~321997;B型肝炎ウイルスのコアプロモーター、Sandig他、GeneTher.、3:1002~91996;α-フェトタンパク質AFP、Arbuthnot他、Hum.GeneTher.、7:1503~141996、骨オステオカルシン、Stein他、Mol.Biol.Rep.、24:185~961997;骨シアロタンパク質、Chen他、J.BoneMiner.Res.、11:654~641996、リンパ球CD2、Hansal他、J.Immunol.、161:1063~81988;免疫グロブリン重鎖;T細胞受容体α鎖、ニューロンニューロン特異的エノラーゼNSEプロモーター、Andersen他、Cell.Mol.Neurobiol.、13:503~151993;ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Piccioli他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:5611~51991;ニューロン特異的ngf遺伝子、Piccioli他、Neuron、15:373~841995。この関連で有用な、知られているプロモーターのさらなる列挙については、例えば、国際特許出願公開WO00/55335を参照のこと。E.転写ユニットにおいて有用なポリアデニル化シグナル本発明のDNAプラスミドは3つの転写ユニットを含み、それぞれの転写ユニットが少なくとも1つのポリアデニル化シグナルを含む。本明細書中で定義されるポリアデニル化シグナルは、特定の転写ユニットの転写を終結させ、かつ、ポリペプチドをコードする核酸配列が適切に転写および翻訳されることを確実にする停止配列または停止コドンを指す。停止部位は合成または天然起源が可能である。停止部位の例には、ポリアデニル化シグナルおよび合成された二方向転写停止部位が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、ポリアデニル化シグナルにより、DNA配列の転写が停止する。転写ユニットのいずれかにおいて使用される好適なポリアデニル化シグナルには、真核生物細胞において活性なすべてのポリアデニル化シグナルが挙げられる。真核生物のポリアデニル化シグナルの例には、ウサギβ-グロビンポリAシグナルが挙げられ、これは、強いとして文献において特徴づけられているシグナルであるGilおよびProudfoot、Cell、49:399~4061987;GilおよびProudfoot、Nature、312:473~4741984。その重要な特徴の1つが、UGリッチドメインおよびUリッチドメインの両方を含有するその下流側エレメントの構造である。他のポリAシグナルには、合成ポリA、HSVチミジンキナーゼポリAColeC.N.およびT.P.Stacy、Mol.Cell.Biol.、5:2104~21131985を参照のこと、ヒトαグロビンポリA、SV40ポリASchek,N、Cooke,C.およびJ.C.Alwine、Mol.CellBiol.、12:5386~53931992を参照のこと、ヒトβグロビンポリAGil,A.およびN.J.Proudfoot、Cell、49:399~4061987を参照のこと、ポリオーマウイルスポリABatt,D.BおよびG.G.Carmichael、Mol.Cell.Biol.、15:4783~47901995を参照のこと、ウシ成長ホルモンポリAGimmi,E.R.、Reff,M.E.およびI.C.Deckman、NucleicAcidRes.1989が挙げられる。多くの他のポリアデニル化シグナルがこの分野では知られており、これらもまた本発明の実施形態において有用である。SV40の初期ポリアデニル化シグナルおよび後期ポリアデニル化シグナルはともに本発明の様々な実施形態において有用である。Schek他、Mol.CellBiol.、12:5386~53931992を参照のこと。これらの配列は、SV40ゲノムのヌクレオチド2533におけるBamnHI部位と、ヌクレオチド2770におけるBclI部位との間の237塩基対のフラグメントにおいてコードされるCarswellおよびAlwine、Mol.Cell.Biol.、9:4248;1989。CarswellおよびAlwineは、最も考えられることには、効率的な切断およびポリアデニル化を容易にする下流側配列エレメントおよび上流側配列エレメントの両方を含むので、SV40のこれら2つのポリアデニル化シグナルのうち、後期シグナルの方が効率的であると結論していた。さらなるポリアデニル化部位を、この分野で知られている方法を使用して特定または構築することができる。最小限のポリアデニル化部位が、AAUAAAと、約30ヌクレオチド下流側で見出される第2の認識配列一般には、G/Uリッチ配列とから構成される。本明細書中で使用される場合、配列は、発現ベクターへの組み込みのための好適なDNAの調製を容易にするために、RNAではなく、DNAとして提供される。DNAとして提供されるとき、ポリアデニル化部位は、例えば、G/Tリッチ領域を下流側に伴うAATAAAから構成される。両方の配列が、効率的なポリアデニル化部位を形成するために存在しなければならない。これらの部位の目的は、特異的なRNA結合タンパク質をRNAに呼び寄せることである。AAUAAAは切断ポリアデニル化特異性因子CPSF;MurthyK.G.およびManleyJ.L.1995、GenesDev、9:2672~2683と結合し、第2の部位頻繁には、G/U配列は切断刺激因子CstF;TakagakiY.およびManleyJ.L.1997、MolCellBiol、17:3907~3914に結合する。CstFは数個のタンパク質から構成され、しかし、RNA結合を担うタンパク質はCstF-64であり、これはリボ核タンパク質ドメインファミリーのタンパク質の1つであるTakagaki他1992、ProcNatlAcadSciUSA、89:1403~1407。F.本発明の免疫原組成物のために有用なキャリア、希釈剤、促進因子、アジュバントおよび配合物本発明において有用なDNAプラスミドおよび免疫原組成物はさらに、薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤または薬学的に受容可能なキャリアを含む。1つの実施形態において、前記薬学的に受容可能な希釈剤は、無菌水、無菌の等張性生理的食塩水、または生物学的緩衝液である。抗原性組成物はまた、そのような希釈剤またはキャリアと従来の様式で混合することができる。本明細書中で使用される表現薬学的に受容可能なキャリアは、ヒトまたは他の脊椎動物宿主に対する投与との適合性を有するありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性薬剤および吸収遅延剤などを包含することが意図される。適切なキャリアは当業者には明白であり、主として投与経路に依存する。本発明の免疫原組成物に存在させることができるさらにさらなる賦形剤が、アジュバント、促進因子、保存剤、表面活性剤、および、化学的安定化剤、懸濁化剤または分散化剤である。典型的には、安定化剤、アジュバントおよび保存剤が、ヒト対象または動物対象における効力のための最良の配合物を決定するために最適化される。1.アジュバントアジュバントは、免疫原または抗原と一緒に投与されたときに免疫応答を高める物質である。数多くのサイトカインまたはリンホカインが免疫調節活性を有することが示されており、従って、アジュバントとして使用することができ、それらには、インターロイキン1-α、インターロイキン1-β、インターロイキン2、インターロイキン4、インターロイキン5、インターロイキン6、インターロイキン7、インターロイキン8、インターロイキン10、インターロイキン12例えば、米国特許第5,723,127号を参照のこと、インターロイキン13、インターロイキン14、インターロイキン15、インターロイキン16、インターロイキン17およびインターロイキン18およびその変異形態、インターフェロン-α、インターフェロン-βおよびインターフェロン-γ、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子例えば、米国特許第5,078,996号およびATCCアクセション番号39900を参照のこと、マクロファージコロニー刺激因子MCSF、顆粒球コロニー刺激因子GCSF、ならびに、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子βTNFが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において有用なさらに他のアジュバントには、ケモカインが挙げられ、これには、限定されないが、MCP-1、MIP-1α、MIP-1βおよびRANTESが挙げられる。接着分子例えば、セレクチン例えば、L-セレクチン、P-セレクチンおよびE-セレクチンなどもまたアジュバントとして有用である場合がある。さらに他の有用なアジュバントには、限定されないが、ムチン様分子例えば、CD34、GlyCAM-1およびMadCAM-1、インテグリンファミリーのメンバー例えば、LFA-1、VLA-1、Mac-1およびp150.95など、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー例えば、PECAM、ICAM例えば、ICAM-1、ICAM-2およびICAM-3、CD2およびLFA-3など、共刺激分子例えば、CD40およびCD40Lなど、増殖因子血管成長因子、神経成長因子、繊維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、B7.1、B7.2、PDGF、BL-1および血管内皮細胞増殖因子が挙げられる、受容体分子Fas、TNF受容体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2およびDR6が挙げられるが挙げられる。さらに別のアジュバント分子には、カスパーゼICEが挙げられる。国際特許出願公開WO98/17799および同WO99/43839もまた参照のことこれらは参考として本明細書中に組み込まれる。1つの実施形態において、所望されるアジュバントは、プラスミドから発現されるIL-12タンパク質である。例えば、米国特許第5,457,038号、同第5,648,467号、同第5,723,127号および同第6,168,923号を参照のことこれらは参考として本明細書中に組み込まれる。1つの実施形態において、サイトカインはタンパク質として投与することができる。特定の実施形態において、IL-12が、本発明のDNAプラスミドの3つの転写ユニットのうちの1つまたは2つから発現される。あるいは、IL-12は別個のプラスミドから独立的に発現される。別の実施形態において、IL-15をコードし、かつ、発現するプラスミドが、IL-12をコードし、かつ、発現するプラスミドの代わりに投与される。免疫応答を高めるために使用される好適なアジュバントには、限定されないが、米国特許第4,912,094号これは本明細書により参考として組み込まれるに記載されるMPLTM3-O-脱アセチル化モノホスホリル脂質A;Corixa、Hamilton、MTが挙げられる。アジュバントしての使用のために同様に好適なものが、CorixaHamilton、MTから入手可能であり、かつ、米国特許第6,113,918号これは本明細書により参考として組み込まれるに記載される合成された脂質Aアナログまたはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物AGP、あるいは、その誘導体またはアナログである。1つのそのようなAGPが2-[R-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]エチル2-デオキシ-4-O-ホスホノ-3-O-[R-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-2-[R-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル-アミノ]-b-D-グルコピラノシドであり、これはまた、529以前にはRC529として知られていたとして知られている。この529アジュバントは水性形態または安定なエマルションとして配合される。さらに他のアジュバントには、鉱油および水のエマルション、アルミニウム塩ミョウバン例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど、Amphigen、Avridine、L121/スクアレン、D-ラクチド-ポリラクチド/グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド、死菌化Bordetella、サポニン例えば、米国特許第5,057,540号これは本明細書により参考として組み込まれるに記載されるStimulonTMQS-21Antigenics、Framingham、MA.など、および、それらから作製される粒子例えば、ISCOMS免疫刺激複合体など、結核菌、細菌リポ多糖、合成ポリヌクレオチド例えば、CpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチド米国特許第6,207,646号、これは本明細書により参考として組み込まれる、百日咳毒素PT、または、大腸菌の熱不安定毒素LT特に、LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129;例えば、国際特許出願公開WO93/13302および同WO92/19265これらは参考として本明細書中に組み込まれるを参照のことが挙げられる。アジュバントして同様に有用なものが、コレラ毒素およびその変異体であり、これらには、国際特許出願公開WO00/18434に記載されるものこの場合、アミノ酸位置29のグルタミン酸が別のアミノ酸アスパラギン酸以外好ましくは、ヒスチジンによって置換されるが挙げられる。類似するCT毒素または変異体が国際特許出願公開WO02/098368に記載され、この場合、アミノ酸位置16のイソロイシンが、単独で、または、アミノ酸位置68のセリンを別のアミノ酸によって置換することとの組合せでのいずれかで別のアミノ酸によって置換され、かつ/あるいは、アミノ酸位置72のバリンが別のアミノ酸によって置換される。他のCT毒素が国際特許出願公開WO02/098369に記載され、この場合、アミノ酸位置25のアルギニンが別のアミノ酸によって置換され、かつ/または、アミノ酸がアミノ酸位置49において挿入され、かつ/または、2つのアミノ酸がアミノ酸位置35およびアミノ酸位置36において挿入される。一部の実施形態において、アジュバントをコードするDNAプラスミドを免疫原組成物において投与することができる。そのような場合、本発明の免疫原組成物に含まれるためにそのDNAがプラスミドに挿入されるアジュバントには、インターロイキン-1IL-1、IL-5、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、TNF-α、TNF-βおよびBL-1これらは国際特許出願公開WO98/17799に記載される;B7.2これは国際特許出願公開WO00/514312に記載される;IL-8、RANTES、G-CSF、IL-4、変異型IL-18、IL-7、TNF-Rこれらは国際特許出願公開WO99/43839に記載される;および変異型CD80これは国際特許出願公開WO00/66162に記載されるが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される用語IL-12タンパク質は、単鎖のIL-12タンパク質この場合、その2つのサブユニットが1つのコード配列によってコードされ、2つのサブユニットをつなぐリンカー配列を有する1つのタンパク質として発現されるを含めて、ヒトIL-12の一方のサブユニットまたは両方のサブユニットを指すことが意味される。特定の実施形態において、サイトカインが、哺乳動物細胞におけるその発現を行わせる調節配列の制御下でサイトカインをコードするDNA配列を含む核酸組成物として投与される。さらに別の実施形態において、サイトカイン発現プラスミドが、免疫原組成物において、選択された抗原をコードするDNAプラスミドとともに投与される。さらに別の実施形態において、サイトカインが、初回免疫刺激用の免疫原組成物の投与と、追加抗原投与用の免疫原組成物の投与との間で投与される。さらに別の実施形態において、サイトカインが追加抗原投与工程とともに投与される。さらに別の実施形態において、サイトカインが初回免疫刺激用組成物および追加抗原投与用組成物の両方とともに投与される。本発明の特定の実施形態において、CpGDNAをアジュバントとしてプラスミドに含むことができる。本明細書中で使用される場合、CpGDNAは、非メチル化シトシン-グアニンジヌクレオチド配列すなわち、CpGDNAを含み、すなわち、5’シトシンと、それに続く3’グアノシンとを含み、かつリン酸エステル結合によって連結されたDNAを含有し、そして免疫系を活性化する、少なくとも1つの非メチル化CpGジヌクレオチド核酸分子を含有するオリゴヌクレオチドを指す。米国特許第6,406,705号Davis他および米国特許第6,207,646号Krieg他を参照のことこれらは本明細書によりその全体が参考として組み込まれる。脊椎動物DNAからではなく、細菌DNAから得られたCpGDNAは、末梢血単核細胞PBMCに対する直接的な免疫刺激作用をインビトロで有する。このリンパ球活性化は非メチル化CpGジヌクレオチドのためであり、この非メチル化CpGジヌクレオチドは、細菌DNAでは予想された頻度1/16で存在するが、脊椎動物DNAでは低く表されCpG抑制、1/50~1/60、そしてメチル化されている。CpGDNAに対する応答における迅速な免疫活性化が、微生物の分子に対して特異的な構造的パターンを認識する生来的な免疫防御機構の1つの構成要素として進化してきたかもしれないことが示唆されている。米国特許第6,406,705号Davis他および米国特許第6,207,646号Krieg他を参照のことこれらは本明細書によりその全体が参考として組み込まれる。特定の実施形態において、対象にはアジュバントの組合せが投与され、この場合、アジュバントの組合せは、少なくとも1つの非メチル化CpGDNAジヌクレオチドを含有する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと、少なくとも1つの非核酸アジュバント例えば、IL-12などとを含む。2.促進因子または共薬剤ポリヌクレオチド分子から構成される免疫原組成物は望ましくは、ポリヌクレオチドトランスフェクション促進因子または共薬剤などの、場合により使用される賦形剤、例えば、細胞へのポリヌクレオチド移入を容易にする、局所麻酔剤、ペプチド、脂質カチオン性脂質、リポソームまたは脂質粒子が含まれる、ポリカチオン例えば、ポリリシンなど、枝分かれした三次元ポリカチオン例えば、デンドリマーなど、炭水化物、カチオン性の両親媒性物質、界面活性剤、ベンジルアンモニウム系界面活性剤または別の化合物などを含有する。そのような促進因子には、局所麻酔剤のブピバカインまたはテトラカインが挙げられる米国特許第5,593,972号、同第5,817,637号、同第5,380,876号、同第5,981,505号および同第6,383,512号、ならびに、国際特許出願公開WO98/17790を参照のこと;これらは本明細書により参考として組み込まれる。本発明において有用なそのような促進因子または共薬剤の他の非網羅的な例が、米国特許第5,703,055号、同第5,739,118号、同第5,837,533号;国際特許出願公開WO96/100381996年4月4日公開および国際特許出願公開WO94/167371994年8月8日公開に記載されるこれらはそれぞれが参考として本明細書中に組み込まれる。より好ましくは、トランスフェクション促進因子が、核酸分子との1つまたは複数の複合体を形成する量で存在する。トランスフェクション促進因子が本発明の核酸分子またはプラスミドと混合されるとき、トランスフェクション促進因子は、DNAを詰め込み、かつ、均一である様々な小さい複合体または粒子を形成する。従って、本発明の免疫原組成物の1つの実施形態において、複合体が、トランスフェクション促進因子を本発明の少なくとも1つのプラスミドと混合することによって形成される。特定の実施形態において、本発明の免疫原組成物が2つ以上のタイプのプラスミドから構成される場合がある。あるいは、本発明の組成物の別の実施形態において、トランスフェクション促進因子がそれぞれのプラスミドと別々に予備混合される場合がある。その後、別個の混合物は、すべてのプラスミドが1回のボーラス投与で投与される場合に、プラスミドの所望する比率が1つの免疫原組成物に存在することを確保するために1つの組成物において一緒にされる。あるいは、トランスフェクション促進因子および各プラスミドを別々に混合し得、所望する比率が得られるように別々に投与することができる。以降、複合体または1つまたは複数の複合体または複合体の用語が、免疫原組成物のこの実施形態を定義するために使用される場合、この用語は1つまたは複数の複合体を包含することが理解される。それぞれの複合体がプラスミドを含有する。好ましくは、複合体は直径が約50nm~約150nmの間である。使用される促進因子が局所麻酔剤好ましくは、ブピバカインである場合、ポリヌクレオチド組成物の総重量に基づいて約0.1重量パーセント~約1.0重量パーセントの量が好ましい。国際特許出願公開WO99/21591もまた参照のこと。これは本明細書により参考として組み込まれ、好ましくは約0.001重量パーセント~0.03重量パーセントの間での量で投与される共薬剤としてのベンジルアンモニウム系界面活性剤の配合を教示する。本発明によれば、局所麻酔剤のそのような量が、約1μg/ml~10μg/mlの核酸に対して約0.01w/v~2.5w/vの局所麻酔剤の前記核酸分子に対する比率で存在する。別のそのような範囲は約100μg/ml~1mg/mlの核酸に対して約0.05w/v~1.25w/vの局所麻酔剤である。3.免疫原組成物に対する他の添加剤他の賦形剤を本発明の免疫原組成物に含めることができ、そのような賦形剤には、保存剤、安定化成分および表面活性剤などが含まれる。好適な例示的保存剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールが含まれる。使用することができる好適な安定化成分には、例えば、カザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、N-Zアミン、二リン酸一カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物および粉乳が含まれる。好適な表面活性剤には、限定されないが、フロイント不完全アジュバント、キノンアナログ、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクチルアンモニウム、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール;ポリアミン、例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリIC、カルボポール;ペプチド、例えば、ムラミルペプチドおよびムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン;オイルエマルション;および無機ゲル、例えば、リン酸アルミニウムなど、ならびに、免疫刺激複合体ISCOMが含まれる。プラスミドはまた、免疫原組成物として使用されるリポソームに組み込むことができる。免疫原組成物はまた、免疫原組成物の選択された投与様式のために好適な他の添加剤を含有することができる。本発明の免疫原組成物はまた、凍結乾燥ポリヌクレオチドを伴い得、これは、粉末、液体または懸濁物の投薬形態を開発するための他の薬学的に受容可能な賦形剤とともに使用され得る。例えば、Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy第2巻、第19版1995、例えば、第95章エアロゾルおよび国際特許出願公開WO99/45966を参照のことそれらの教示は、参考として本明細書に援用される。これらの免疫原組成物は、任意の従来の投与経路での投与に適した添加剤を含有することができる。一部の実施形態において、本発明の免疫原組成物は、例えば、液体、粉末、エアロゾル、錠剤、カプセル、腸溶性被覆の錠剤またはカプセル、あるいは坐薬の形態でのヒト被験体への投与のために調製される。従って、免疫原組成物にはまた、懸濁物、溶液、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中のエマルション、ペースト、および、埋め込み可能な持続放出処方物または生分解性処方物が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の1つの実施形態において、免疫原組成物が非経口投与のための処方物として調製され、有効成分が、再構成された組成物の非経口投与に先立って好適なビヒクル例えば、無菌の発熱因子非含有水により再構成される乾燥形態すなわち、粉末または顆粒で提供される。他の有用な非経口投与可能な処方物には、有効成分を微結晶形態で、またはリポソーム調製物で、または生分解性ポリマー系の構成成分として含む処方物が含まれる。持続放出または埋め込みのための組成物は、薬学的に受容可能なポリマー材料または疎水性材料例えば、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーまたは難溶性塩などを含むことができる。本発明の免疫原組成物は、従来の生理学的に許容され得るキャリア、希釈剤および賦形剤例えば、上記で記載されたタイプの医薬調製物において有用な溶媒、緩衝剤、アジュバント、促進因子または他の成分などの選択によって制限されない。適切なpH等張性、安定性および他の従来の特徴を有し、上記で記載された構成成分からこれらの薬学的に受容可能な組成物を調製することはこの技術分野の技術の範囲内である。F.免疫原組成物のための投薬量および投与経路、エレクトロポレーション一般に、本発明の免疫原組成物の構成成分についての適切な有効量または投薬量の選択はまた、用いられる免疫原組成物中の選択された抗原の正体、ならびに、被験体の身体状態特にとりわけ、免疫化被験体の全身の健康状態、年齢および体重が含まれるに基づく。投与方法および投与経路、ならびに、免疫原組成物中のさらなる構成成分の存在もまた、DNAプラスミド組成物の投薬量および量に影響を及ぼし得る。有効用量のそのような選択および上方調節または下方調節はこの技術分野の技術の範囲内である。免疫応答好ましくは、保護応答を誘発するために、または、著しい有害な副作用を伴うことなく患者において外因性の作用を生じさせるために要求されるプラスミドの量は、これらの要因に依存して変化する。好適な用量が当業者によって容易に決定される。本発明の免疫原組成物はヒトまたは非ヒト脊椎動物に様々な経路によって投与され、そのような経路には、鼻腔内、経口、膣、直腸、非経口、皮内、経皮例えば、国際特許出願公開WO98/20734これは、参考として本明細書に援用されるを参照のこと、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内および動脈内が含まれるが、これらに限定されない。適切な経路が、使用される免疫原組成物の性質、ならびに、患者の年齢、体重、性別および全身の健康状態の評価、ならびに、免疫原組成物中に存在する抗原、ならびに、類似する様々な要因に依存して主治医によって選択される。免疫原組成物の投与順序および個々の投与の間隔期間を、その方法の適用に対する受容者の身体的特徴および正確な応答に基づいて主治医または当業者によって選択することができる。そのような最適化は十分にこの技術分野の技術の範囲内であることが予想される。別の実施形態において、別個の遺伝子産物の、1つ、2つまたは3つのオープンリーディングフレームを1つの細胞においてインビボで同時発現させるための方法が提供され、この方法は、約0.1μg~約100mgのポリヌクレオチドを哺乳動物の組織に導入する工程を包含する。免疫原組成物は、投与時のエレクトロポレーションの使用によって投与され得、そして、プラスミドの取り込みを投与時のエレクトロポレーションの使用によって高めることができる。エレクトロポレーションを行うために、電極が、ポリヌクレオチドが注入される領域の近くに約1mm~4mm離して設置される。電極の正確な位置または設計は、電流が、注入されたポリヌクレオチドの領域内のそれらの方向に対して筋繊維を直交して通過し得る限り様々であり得る。米国特許第5,273,525号G.A.Hofmann、米国特許第5,869,326号G.A.Hofmann、米国特許第5,993,434号S.B.Dev他、米国特許第6,014,584号G.A.Hofmann他、米国特許第6,068,650号G.A.Hofmann他、米国特許第6,096,020号G.A.Hofmann、米国特許第6,233,482号G.A.Hofmann他、米国特許第6,241,701号G.A.Hofmann、米国特許第6,418,341号G.A.Hofmann他、米国特許第6,451,002号S.B.Dev他、米国特許第6,516,223号G.A.Hofmann、米国特許第6,763,264号G.A.Hofmann、米国特許第6,110,161号I.Mathiesen他を参照のことこれらのすべてがその全体について参考として援用される。電極が所定の位置に置かれると、筋肉がエレクトロポレーションされ、すなわち、電気的に刺激される。刺激は、所定の振幅および持続時間を有するパルスとして送達される。トランスフェクション効率を最適化するために、パルスの持続時間、電圧、キャパシタンス、電場の強さ、数、波形のパラメーターを変化させることができ、トランスフェクション効率を比較することができる。電気パルスは、エレクトロポレーションにより加えられたパルス状の電場である。パルスは、単極性、双極性、指数的または矩形の波形が可能である。電圧はおよそ0ボルト~1000ボルトの範囲を有する;パルスの持続時間は5マイクロ秒~5ミリ秒の範囲を有する;パルスの数は単パルス~30,000パルスの範囲を有する;一連のパルス列におけるパルス振動数は0.5Hz~1000Hzの範囲を有する。電場の強さについての有用な範囲は約25V/cm~約800V/cmの範囲である。本発明の実施における使用のために意図される電気パルスには、エレクトロポレーションを生じさせるための十分な電圧および持続時間のそのようなパルスが含まれる。Hofmann,G.A.、CellsinelectricfieldsE.Neumann、A.E.SowersC.A.Jordan編、Electroporationandelectrofusionincellbiology389頁~407頁、PlenumPublishingCorporation1989を参照のこと。G.キット構成成分さらに別の実施形態において、本発明は、選択された抗原に対する免疫応答が所望される上記の疾患または状態のいずれかを処置するための免疫原レジメン、予防的レジメンまたは治療的レジメンを即座に施すための医薬用キットを提供する。このようなキットは、高レベルの抗原特異的な免疫応答を哺乳動物被験体または脊椎動物被験体において誘発する方法で使用するために設計される。キットは、1セットの選択された抗原またはペプチドをコードする3つの転写ユニットを含むDNAプラスミドを含む少なくとも1つの免疫原組成物を含有する。免疫原組成物の多数回分の事前に包装された投薬量を多数回投与のためにキットにより提供することができる。DNAプラスミドを含む上記の免疫原組成物によっても、サイトカインまたは他のアジュバント例えば、IL-12などが発現されない場合、キットはまた必要に応じて、別個のサイトカイン/アジュバント組成物を含有するか、または、多数回分の事前に包装された投薬量のサイトカイン/アジュバント組成物を多数回の投与のために含有する。これらのサイトカイン組成物は一般に、選択されたサイトカインを、哺乳動物細胞または脊椎動物細胞におけるその発現を誘導する調節配列の制御下にコードするDNA配列を含む核酸組成物である。他のアジュバントを必要に応じて、事前に包装されたバイアルにより、溶液、液体または固体のいずれかとして提供することができる。キットはまた、免疫原組成物を初回免疫/追加抗原投与法において使用するための説明書を含有する。キットはまた、特定のアッセイを行うための説明書、上記で記載された様々なキャリア、賦形剤、希釈剤およびアジュバントなど、ならびに、組成物を投与するための装置例えば、シリンジ、スプレーデバイスなどを含むことができる。他の構成成分には、他の組成の中でも特に、使い捨て手袋、汚染除去説明書、アプリケータースティックまたはアプリケーター容器が含まれ得る。本発明がより良く理解され得るために、下記の実施例が示される。実施例は例示目的のためだけであり、本発明の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。下記の実施例において引用されているすべての文書、刊行物および特許は参考として本明細書中に援用される。実施例1.HIV遺伝子の選択および改変当業者は、多くのウイルスおよび細菌からの配列情報がこの技術分野では利用できることを理解する。より具体的には、配列情報を、ポリペプチドを本発明のプラスミドにおいて発現させる際に使用される遺伝子をクローン化するために使用することができる。HIVおよび他の病原体に由来する多くの配列に関する情報を、LosAlamosNationalLaboratoryロスアラモス国立研究所、および、UnitedStatesNationalLibraryofMedicine国立医学図書館8600RockvillePike、Bethesda、MD20894でのNationalCenterforBiotechnologyInformation国立バイオテクノロジー情報センターにおけるHIV配列データベースから入手することができる。本発明の1つの実施形態において、下記のHIV遺伝子が、HIVゲノムのほとんどを発現する1つの例示的なDNAプラスミドに含むために選択された:単離体HXB2に由来するgag遺伝子、および、単離体HXB2に由来するpol遺伝子。完全なHXB2配列が登録番号K03455でGenBankコンピューターデータベースに登録されている。nef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子が単離体NL4-3に由来した。完全なNL4-3配列が登録番号M19921でGenBankコンピューターデータベースに登録されている。HIVエンベロープ遺伝子が、DavidMontefiore博士から得られた初代単離体6101に由来した。完全なHIVエンベロープ配列が登録番号AY612855および同bankit625244でGenBankコンピューターデータベースに登録されている。HIVゲノムのほとんどを1つの発現プラスミドに含むことを可能にするために、遺伝子融合体を、全長のgag-pol遺伝子およびほぼ全長のnef-tat-vif遺伝子を使用して調製した。加えて、gag遺伝子とpol遺伝子との間のプロテアーゼ切断部位を除いた。本発明の実施形態で使用されたすべてのHIV遺伝子は、高レベルのタンパク質発現のために最適化された配列改変されたRNAであった。米国特許第5,965,726号、同第5,972,596号、同第6,174,666号、同第6,291,664号および同第6,414,132号を参照のこと。あるいは、これらのHIV遺伝子を米国特許出願第60/576,819号2004年6月4日出願に提供される方法に従って最適化することができる。この方法に従って、遺伝子の発現が、特定の野生型コドンを代用コドンにより置換することによって高められる。ポリヌクレオチドの強化された配列が、好適な代用コドンを選択することによって決定される。代用コドンは、天然に存在する野生型遺伝子の、AおよびTあるいは、RNAの場合にはAおよびUの含有量を変更させるために選択される。代用コドンは、アラニン、アルギニン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、セリン、トレオニンおよびバリンのアミノ酸をコードするコドンである。従って、改変された核酸配列は配列全体を通してこれらのアミノ酸のそれぞれについての代用コドンを有する。残る11個のアミノ酸については、変化を行わず、それにより、対応する天然に存在するコドンがその位置に残っている。標準的な技術を用いて、上記のHIV遺伝子を、それらの安全性を改善し、かつ、それらの発現を最適化するために改変した。SambrookJ、FritschEFおよびManiatisT.、Molecularcloning:Alaboratorymanual第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarborNY1989を参照のこと。例えば、下記の遺伝子改変を、安全性を高めるためにすなわち、ウイルス酵素を不活性化することによって、また、その後のベクターに含まれるHIV遺伝子の大きさを最大限にするために使用した。1HIV-1のgag-polの融合ポリペプチドを、gag終結因子およびpol開始因子をそれぞれの遺伝子から除くことによって1つのオープンリーディングフレームで作製し、変異を、2つの個々のタンパク質が形成されないようにするために野生型のフレームシフト領域に導入した。融合構築物のこの例では、野生型gagpolにおけるフレームシフトすべるslippery配列TTTTTT配列番号2をcTTcTg配列番号3に変化させている。gag-pol融合遺伝子を構築することに関する情報については、Megede,J.Z.他、J.Virology、77:6197~62072003を参照のことこの開示は本明細書によりその全体が参考として組み込まれる。野生型gag-pol融合タンパク質は、gag遺伝子およびpol遺伝子を隔てる、機能を有しない56アミノ酸のオープンリーディングフレームのポリペプチドを含有する。この構築物の全体的なサイズを最小限に抑えるために、Lys-Gly-Arg-Pro配列番号4の最後の4残基を有するgagポリタンパク質を、短縮した10アミノ酸の遺伝子間領域Asp-Arg-Gln-Gly-Thr-Val-Ser-Phe-Asn-Phe配列番号5が続くように改変した。polポリタンパク質の最初の4残基はそのままであるPro-Gln-Ile-Thr配列番号6。三連転写ユニットプラスミドでの発現を容易にするために、gag遺伝子およびpol遺伝子の野生型コード領域からの逸脱を行わなかった。2HIV-1プロテアーゼのすべてのタンパク質分解活性を、3つの活性部位アミノ酸25位~27位のAsp-Thr-Glyをコードするヌクレオチドを欠失させることによって不活性化した。Loeb他、Nature、340:3971989;Wu他、JVirol、70:33781996を参照のこと。3逆転写酵素RTを、下記の4つのアミノ酸をコードするヌクレオチドを欠失させることによって不活性化した:Tyr183、Met184、Asp185、Asp186。Larder他、Nature、327:716~7171987;Larder他、PNAS、86:4803~48071989を参照のこと。4RNAse活性を、1個のアミノ酸glu478をコードするヌクレオチドを欠失させることによって失わせた。Davies他、Science、252:88~951991;Schatz他、1989、FEBSlett.、257:311~3141989を参照のこと。5インテグラーゼ機能を、下記の3つのアミノ酸をコードするヌクレオチドを欠失させることによって失わせた:Asp626、Asp678およびGlu714。Wiskerchen他、J.Virol、69:376~3861995;Leavitt他、J.Biol.Chem.、268:2113~21191993を参照のこと。61つのオープンリーディングフレームを、1つのポリタンパク質をコードするように読み枠を合わせて下記のコード領域nefアミノ酸残基4~206;tatアミノ酸残基2~80;vifアミノ酸残基2~192を融合することによって、HIV-1のnef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子について作製した。このポリタンパク質はnef-tat-vifまたはntvとして示される。7安全上の措置として、nefタンパク質およびtatタンパク質を、nefのミリスチル化シグナル残基1~3、MGGの除去およびtatからの2つのシステインC30C34の欠失によって不活性化した。実施例2.単一転写ユニットプラスミド、二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドの構築これらの例において議論されるプラスミドを表1および表2に示す。三連転写ユニット発現カセットを、環状の二本鎖DNAプラスミドにおいて様々な構成成分を使用することによって構築した。図1を参照のこと。第1の構成成分は、サルサイトメガロウイルスSCMVプロモーターと、クローニング部位と、ウシ成長ホルモンBGHポリAシグナルとから構成される、ポリペプチドを真核生物細胞において発現させるための第1の転写ユニットであった。第2の構成成分は、ポリペプチドを真核生物細胞において発現させるための第2の転写ユニットであり、これは、ヒトサイトメガロウイルスHCMV即時初期プロモーターと、クローニング部位と、SV40ポリアデニル化ポリAシグナルとから構成される。第1の転写ユニットと第2の転写ユニットとを隔てるのがスペーサー領域1である。第3の構成成分は、ポリペプチドを真核生物細胞において発現させるための第3の転写ユニットであり、単純ヘルペスウイルスLap1プロモーターと、SV40のスプライスドナー/アクセプターと、クローニング部位と、ウサギのβグロビンポリAシグナルとから構成される。GoinsW.F.他、J.Virology、68:2239~22521994;Soares,K.J.他、Virology、70:5384~5394;GoinsW.F.他、J.Virology、73:519~5321999を参照のこと。第2の転写ユニットと第3の転写ユニットとを隔てるのがスペーサー領域2である。細菌由来のキメラなカナマイシン耐性kmr遺伝子アデニリル4’-ヌクレオチジルトランスフェラーゼタイプ1aもまたスペーサー領域2とともに含まれる。ShawKJ他、Microbial.Reviews、57:138~1631993、および、Sadale,Y.他、J.Bacteriol.、141:1178~11821980を参照のこと。この遺伝子は、プラスミドを含有する細菌の選択を可能にしながら、限定された数のアミノグリコシドに対する耐性を与えるために考案されている。第3の転写ユニットと第1の転写ユニットとを隔てるのがスペーサー領域3である。スペーサー領域3は、細菌におけるプラスミドの増殖のために必要とされるpUCの細菌複製起点を含む。実施例3.6つのHIV遺伝子を含有する三連転写ユニットプラスミド三転写ユニットプラスミドDNAベクターの使用の実例として、3つの真核生物オープンリーディングフレームを同時発現することができるプラスミドベクターを作製した。三転写ユニットプラスミドDNAベクターを、HIV-1抗原をコードする下記の選択された遺伝子を実施例2に記載される三連転写ユニット発現カセットに挿入することによって作製した。すべてのクローニング技術を通常的な手順Sambrook他、1989に従って行った。最初に、HIV-1のgag-pol融合遺伝子を第1の転写ユニットのSCMV部位とBGHポリA部位との間にあるPmeI-XhoIクローニング部位に挿入した。gag遺伝子は単離体HXB2に由来し、同様に、pol遺伝子もまた単離体HXB2に由来した。完全なHXB2配列が登録番号K03455でGenBankコンピューターデータベースに登録されている。当業者は、他のクレードに由来する他のHIV-1のgag遺伝子およびpol遺伝子、あるいは、他のウイルス遺伝子または細菌遺伝子が同様の様式で挿入され得ることを理解する。HIVおよび他の病原体に関する配列情報は、LosAlamosNationalLaboratoryロスアラモス国立研究所、および、UnitedStatesNationalLibraryofMedicine国立医学図書館8600RockvillePike、Bethesda、MD20894でのNationalCenterforBiotechnologyInformation国立バイオテクノロジー情報センターにおけるHIV配列データベースから入手することができる。次に、HIV-1の初代単離体6101に由来する全長のエンベロープ遺伝子gp160を第2の真核生物転写ユニットのHCMV部位とSV40ポリA部位との間にあるMluIクローニング部位に挿入した。6101のエンベロープ配列は、登録番号AY612855および同bankit625244でGenBankコンピューターデータベースにおいて得ることができる。最後に、tatの残基2~80に融合され、かつ、vifの残基2~192に融合されたnefの残基4~206を含む、HIVのnef-tat-vifNTV融合タンパク質をコードする遺伝子構築物を、HSVLap1プロモーターとウサギβ-グロビンポリAシグナルとの間にあるKpnI-EcoRVクローニング部位に挿入した。nef遺伝子、tat遺伝子およびvif遺伝子はHIV-1の単離体NL4-3に由来した。HIV-1NL4-3の完全な配列が登録番号M19921でGenBankコンピューターデータベースに登録されている。従って、構築されたように、gag-polのオープンリーディングフレームが第1の転写ユニットにおけるSCMVプロモーターおよびBGHポリA部位の制御下に置かれ、エンベロープのオープンリーディングフレームが第2の真核生物転写ユニットにおけるHCMVプロモーターおよびSV40ポリAシグナルの制御下に置かれ、nef-tat-vif融合体のオープンリーディングフレームが第3の真核生物転写ユニットにおけるHSVLap1/SV40イントロンおよびウサギβ-グロビンポリAシグナルの制御下に置かれた。実施例4.単一転写ユニットプラスミド、二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドからのHIV遺伝子の発現材料および方法;細胞およびトランスフェクション実施例3で記載された6つのHIV遺伝子を発現するプラスミドを、コードされたタンパク質を発現する能力についてインビトロで評価した。すべてのインビトロ発現研究のために使用した細胞は、AmericanTypeCultureCollectionATCCから得られた293細胞およびRD細胞であった。HIVタンパク質をこれらの細胞において発現させるための手順は下記の通りであった:細胞をトランスフェクションの24時間前に直径35mmのウエルあたり2×105細胞の密度でプレートし、精製したプラスミドDNAによりトランスフェクションした。トランスフェクションのために、2μgのプラスミドをFugeneトランスフェクション試薬RocheDiagnostics、Indianapolis、INと混合し、100μlの総体積で細胞に重層した。次いで、細胞を、10のFBSを含む2mlのDMEM培地BRLにより48時間インキュベーションした。最後に、細胞溶解物をさらなる分析のために集めた。発現タンパク質の検出HIVタンパク質の特異的な検出を、ウェスタンブロットアッセイを使用して達成した。例えば、gagタンパク質、polタンパク質、エンベロープタンパク質およびvifタンパク質のそれぞれについてのウェスタンブロットアッセイを、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してタンパク質混合物を分離することによって行った。次いで、分離したタンパク質をPVDFメンブランInvitrogen、Carlsbad、CAに転写した。事前に染色された分子量マーカー、ならびに、HIV-1の組換えp24gagタンパク質、組換えp66polタンパク質、組換えgp160envタンパク質および組換えvifタンパク質Invitrogenをサイズ標準物およびポジティブコントロールとしてそれぞれ使用した。gag、pol、envおよびvifの発現の検出を免疫染色によって達成し、結合している分離されたタンパク質を有するPVDFメンブランをそれぞれのタンパク質に対して特異的な抗体とインキュベーションした。アルカリホスファターゼに結合体化された二次抗体Invitrogenを使用し、発色検出を、発色検出キットInvitrogenを使用することによって行った。単一転写ユニットプラスミド、二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドからのHIV遺伝子の発現三連転写ユニットプラスミドからのHIV遺伝子の発現を評価し、単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミドのそれぞれからの同じ遺伝子の発現と比較した。単一転写ユニットプラスミドは、HCMVプロモーターおよびBGHポリAシグナルを発現調節エレメントとして含有する単一の真核生物転写ユニットを有していた。単一転写ユニットプラスミドには、表1に示されるように、101~105、ならびに、110および111の番号が付けられている。例えば、プラスミド101はHIVのenv遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。同様に、プラスミド102はHIVのgag遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。加えて、プラスミド103はHIVのpol遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有し、プラスミド104はHIVのnef-tat-vifntv融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。プラスミド101はまた、プラスミド104内のHCMVではなく、Lap1プロモーターによって駆動されることを除いて、HIVのnef-tat-vifntv融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。最後に、プラスミド110はHIVのgag-pol-nef-tat-vif融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有し、プラスミド111はHIVのgag-pol融合遺伝子を単一転写ユニットにおけるオープンリーディングフレームとして含有していた。二連転写ユニットプラスミドは2つの完全な真核生物転写ユニットを有していた。二連転写ユニットプラスミドには、表1に示されるように、201~204および212の番号が付けられた。二連転写ユニットプラスミドのための発現調節エレメントは、第1の転写ユニットではSV40ポリAと共役したHCMVプロモーターから構成され、第2の転写ユニットではBGHポリAシグナルと共役したSCMVプロモーターから構成された。この実施形態において、プラスミド201はHIVのpol遺伝子を第1の転写ユニットに含有し、HIVのgag遺伝子を第2の転写ユニットに含有した。プラスミド202はHIVのnef-tat-vif融合遺伝子の遺伝子を第1の転写ユニットに含有し、HIVのenv遺伝子を第2の転写ユニットに含有した。プラスミド203はHIVのgag-pol-nef-tat-vif融合遺伝子の遺伝子を第1の転写ユニットに含有し、HIVのenv遺伝子を第2の転写ユニットに含有した。プラスミド204はHIVのgag-pol融合遺伝子の遺伝子を第1の転写ユニットに含有し、HIVのenv遺伝子を第2の転写ユニットに含有した。一部の実施形態において、アジュバントが、アジュバントをプラスミドから発現させることによって提供される。そのような場合、プラスミドは適切な数の転写ユニットを含有しなければならない。明確化のために、また、抗原プラスミドと区別するために、一次、二次および三次の用語法が、1つまたは2つまたは3つの転写ユニットを有するアジュバントプラスミドを示すために使用される。例えば、IL-12は、2つのポリペプチドから構成されるアジュバントである。適切なプラスミドがプラスミド212であり、これは、一次転写ユニットにおいてHCMV即時初期プロモーターおよびSV40ポリアデニル化シグナルの制御下で発現させられるIL-12のp35サブユニットと、二次転写ユニットにおいてサルCMVSCMVプロモーターおよびBGHポリアデニル化シグナルの制御下で発現させられるIL-12のp40サブユニットとを含有した。三連転写ユニットプラスミドは3つの完全な真核生物転写ユニットを有し、301、302および303の番号が付けられた。表2を参照のこと。これら3つのプラスミドの間の違いは、挿入されているHIVのオープンリーディングフレームの数であった。三連転写ユニットプラスミドのための発現調節エレメントは、第1の転写ユニットではBGHポリAシグナルと共役したSCMVプロモーターから構成され、第2の転写ユニットではSV40ポリAと共役したHCMVプロモーターから構成され、第3の転写ユニットではウサギβグロビンポリAシグナルと共役したHSVLap1プロモーターから構成された。表2に示されるように、プラスミド番号301は三連転写ユニットプラスミドであるが、挿入されたオープンリーディングフレームを有する転写ユニットが1つだけである。具体的には、プラスミド301はgag-pol融合遺伝子のオープンリーディングフレームを第1の転写ユニットに含有した。プラスミッド番号302は、挿入されたオープンリーディングフレームを有する転写ユニットが2つである三連転写ユニットプラスミドである第1の転写ユニットにおけるgag-pol、および、第3の転写ユニットにはHIVのnef-tat-vif融合遺伝子のオープンリーディングフレーム第2の転写ユニットには遺伝子が挿入されなかった。最後に、プラスミド番号303は、3つの転写ユニットのすべてが、挿入されたオープンリーディングフレームを有する三連転写ユニットプラスミドである第1の転写ユニットにはgag-pol融合遺伝子のオープンリーディングフレーム、第2の転写ユニットにはenv遺伝子のオープンリーディングフレーム、および、第3の転写ユニットにはnef-tat-vif融合遺伝子のオープンリーディングフレーム。表1.単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミド下記の略号が使用される:SCMV:サルサイトメガロウイルスプロモーター、HCMV:ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、HSVlap1:単純ヘルペス潜伏期関連プロモーター1、gag-pol:HIVのgag-pol融合体、ntv:HIVのnef-tat-vif融合体、env:HIVのエンベロープ、mIL-12:マウスインターロイキン-12。表2.三連転写ユニットプラスミド下記の略号が使用される:SCMV:サルサイトメガロウイルスプロモーター、HCMV:ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、HSVlap1:単純ヘルペス潜伏期関連プロモーター1、gag-pol:HIVのgag-pol融合体、ntv:HIVのnef-tat-vif融合体、env:HIVのエンベロープ、HCMV-[none]、Lap1-[none]は、転写ユニットがオープンリーディングフレームを含有しなかったことを示すプラスミド301を参照のこと;IL-12はマウスまたはアカゲザルまたはヒトのいずれかに由来し得る。上記で議論されたように、多数の単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミドを、三連転写ユニットプラスミドの発現と比較することに使用するために構築した。表1および表2を参照のこと。これらのgag含有構築物、pol含有構築物、env含有構築物、nef-tat-vif含有構築物、gag-pol含有構築物およびgag-pol-nef-tat-vif含有構築物の発現パターンを、293細胞および/またはRD細胞を、単一転写ユニットプラスミド、二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドで一過的にトランスフェクションし、細胞溶解物を、適切な抗体を使用するウェスタンブロットによって分析することによって評価した。様々な構築物からの細胞溶解物におけるgagのインビトロ発現を行い、その結果を、ウェスタンブロットを使用して検出した。図2および表1を参照のこと。gagタンパク質およびpolタンパク質がマウス抗gagモノクローナル血清およびヒトポリクローナル血清によりそれぞれ検出された。分子量マーカーおよびHIVp24を標準物として最初の2つのレーンに含めた。gagを発現した単一転写ユニットプラスミド102を最初のサンプルレーンにおいて泳動した。2つの転写ユニット、すなわち、挿入されたオープンリーディングフレームを伴う2つの転写ユニットを有するプラスミドが、プラスミド201、プラスミド203およびプラスミド204であり、すべてがかなりの量のgagまたはgag含有ポリタンパク質例えば、gag-pol-nef-tat-vifなどまたはgag-polを発現した。gag-pol融合構築物において、gagとpolとの間におけるフレームシフト配列を、同じ読み枠からのgagおよびpolの発現を可能にするように変異させた。二転写ユニットプラスミドの201、203および204は、単一転写ユニットプラスミド102よりも少ないgagを産生した。gag-pol融合体をコードした二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドは、約180kdの予想サイズで移動した等しい量のgag-polポリタンパク質を発現した。大型のgag-pol-ntvポリタンパク質をコードするプラスミド203からのgagの発現もまた、トランスフェクションされた細胞の細胞溶解物において検出され、このタンパク質は約220kDの予想サイズで移動した。しかしながら、この大型の融合体プラスミド203からの発現は、gag-polをコードするプラスミド302およびプラスミド303の発現よりも低かった。三転写ユニットプラスミド303もまた、かなりの量のgagをgag-polポリタンパク質の形態で産生したが、gagは単一転写ユニットプラスミドよりも少なく、また、二連転写ユニットプラスミドから産生されたレベルとほぼ等しかった。挿入された2つのオープンリーディングフレームと、オープンリーディングフレームを含まない1つの転写ユニットとを有した三転写ユニットプラスミド302は二転写ユニットプラスミドとほぼ同じレベルでgagを産生した。図2を参照のこと。様々な構築物からの細胞溶解物におけるpolのインビトロ発現プロフィールを行い、ウェスタンブロットを使用して検出されたときの結果は、gagの場合に観測されたものと類似するパターンであった。図3および表1を参照のこと。この場合、polタンパク質がヒトポリクローナル血清により検出された。分子量マーカーおよびHIV逆転写酵素を標準物として最初の2つのレーンに含めた。polを発現した単一転写ユニットプラスミド103を最初のサンプルレーンにおいて泳動した。次に、2つの転写ユニット、すなわち、挿入されたオープンリーディングフレームを伴う2つの転写ユニットを有するプラスミド201、プラスミド203およびプラスミド204はすべてが、かなりの量のpolまたはpol含有ポリタンパク質例えば、gag-pol-nef-tat-vifなどまたはgag-polを発現した。gagに関する状況とは対照的に、二転写ユニットプラスミドの201、203および204は、単一転写ユニットプラスミド103とほぼ同じレベルのpolを産生した。polおよびgag-pol融合物は、polについてはおよそ110kdの予想サイズで、gag-polについてはおよそ180kdの予想サイズで、gag-pol-nef-tat-vifについてはおよそ250kdの予想サイズで移動したpolポリタンパク質を発現した。三転写ユニットプラスミド303もまた、polをgag-polポリタンパク質の形態で産生したが、単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミドよりも少ないpolを産生した。再度ではあるが、挿入された2つのオープンリーディングフレームと、オープンリーディングフレームを含まない1つの転写ユニットとを有した三転写ユニットプラスミド302は二転写ユニットプラスミドの201および203とほぼ同じレベルでpolをgag-polポリタンパク質の形態で発現した。図3を参照のこと。この実施例では、プラスミド204が他の二転写ユニットプラスミド201および203よりも高いレベルのpolを発現した。図3を参照のこと。同様の分析を、nef-tat-vifまたはNTVとして知られているHIV調節タンパク質の融合体の細胞溶解物においてインビトロ発現について行った。図4および表1を参照のこと。NTVタンパク質がマウス抗vifモノクローナル抗体により検出された。分子量マーカーおよび組換えHIVvifp23を標準物として最初の2つのレーンにそれぞれ含めた。NTVをHCMVプロモーターまたはLap1プロモーターのいずれかからそれぞれ発現した2つの単一転写ユニットプラスミド104および105を最初の2つのサンプルレーンにおいて泳動した。図4を参照のこと。両方のプラスミドからのnef-tat-vifの発現レベルはほぼ同じであった。次に、挿入されたオープンリーディングフレームを有する2つの完全な転写ユニットを有する2つのプラスミドプラスミド202およびプラスミド203はともにかなりの量のnef-tat-vifポリタンパク質を産生した。nef-tat-vifタンパク質の発現レベルは、プラスミド203についてはより少ないようであったが、このことは、発現しているポリタンパク質が非常に大きかったgag-pol-nef-tat-vif、約220kDためであると予想された。挿入された2つのオープンリーディングフレームと、オープンリーディングフレームを含まない1つの転写ユニットとを有した三転写ユニットプラスミド302は単一転写ユニットプラスミドとほぼ同じレベルのnef-tat-vifを産生した。図4を参照のこと。挿入された3つのオープンリーディングフレームを有した三転写ユニットプラスミド303もまた、かなりの量のnef-tat-vifポリタンパク質を産生した。具体的には、三転写ユニットプラスミド303は単一転写ユニットプラスミド104および105よりも少ないnef-tat-vifを産生し、二重転写ユニットプラスミド202および203から産生されたnef-tat-vifポリタンパク質のレベルとほぼ等しいか、または、それよりも良好にnef-tat-vifを産生した。図4を参照のこと。様々な単一転写ユニットプラスミド、二連転写ユニットプラスミドおよび三連転写ユニットプラスミドがHIVのエンベロープ遺伝子を発現する能力を細胞溶解物において評価した。図5および表1を参照のこと。エンベロープタンパク質がマウス抗envモノクローナル抗体により検出された。分子量マーカーおよび組換えHIVgp120を標準物として最初の2つのレーンにそれぞれ含めた。最初のサンプルレーンは、単一転写ユニットプラスミド101これは、envをHCMVプロモーターから発現するから発現したタンパク質を含有する。図5を参照のこと。かなりの量のエンベロープ糖タンパク質が発現した。次に、2つの挿入されたオープンリーディングフレームを有する2つの完全な転写ユニットを有する3つのプラスミドプラスミド202、プラスミド203およびプラスミド204はかなりの量のエンベロープ糖タンパク質を産生した。それぞれの場合において、エンベロープ遺伝子はSCMVプロモーターによって制御されていた。三転写ユニットプラスミド303もまた、かなりの量のenv糖タンパク質を産生したが、発現レベルは、単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミド101、202、203および204と比較したとき、1/2~1/3ほど低下していた。図5を参照のこと。結論半定量的なインビトロ発現分析に基づいて、データは、gag-pol、envおよびntvを含む、挿入されたHIV遺伝子のすべてが、3つの独立した転写ユニットを保持する三連プロモータープラスミドから著しいレベルで発現したことを示している。実施例5:プラスミドあたり一定のDNA濃度での、多数のプラスミドを介するか、または、単一のプラスミドによる多数の遺伝子の発現次に、多数の遺伝子をコードする1つの三連転写ユニットプラスミドからの発現を、それぞれが1つの遺伝子を同じ遺伝子アレイから発現する多数のプラスミドからの発現と比較した。この場合、プラスミドあたりのDNAを1μgで一定に保った。それぞれの場合において、DNAの総量もまた、オープンリーディングフレームのインサートを有しないプラスミドDNAを補充することによって4μgで一定に保った。HIVgagの発現を、1μgのそれぞれのプラスミドで一過的にトランスフェクションされた培養細胞を使用して評価し、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。図6に示されるように、HIVgagの発現が、レーン22つのプラスミド、レーン31つのプラスミド、レーン41つのプラスミドおよびレーン54つのプラスミドにおいて容易に検出された。HIVgagの発現がレーン13つのプラスミドでは低かった。再度ではあるが、三転写ユニットプラスミド303はかなりの量のgagタンパク質を産生したが、2つ以上のプラスミドを含有する組合せよりも少なかった。1つのプラスミドまたは複数のプラスミドからのHIVenvの発現を評価した。結果を図7に示す。再度ではあるが、1μgのそれぞれのプラスミドを培養細胞に一過的にトランスフェクションし、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。結果は、HIVenvの発現が、レーン13つのプラスミド、レーン22つのプラスミド、レーン31つのプラスミド、レーン41つのプラスミドおよびレーン54つのプラスミドにおいて容易に検出されたことを明らかにしている。それぞれの場合において、DNAの総量を、オープンリーディングフレームのインサートを有しないプラスミドDNAを補充して、DNAの総量を4μgにすることによって4μgで一定に保った。再度ではあるが、三転写ユニットプラスミド303はかなりの量のenv糖タンパク質を産生した。図7を参照のこと。この場合、1つの三転写ユニットプラスミド303は、4つのプラスミドが使用されたレーン5において産生された量と匹敵する量のenv糖タンパク質を産生した。図8に示されるように、1つのプラスミドまたは複数のプラスミドからのHIVnef-tat-vifの発現を、培養細胞に一過的にトランスフェクションさせ、1μgのそれぞれのプラスミドを使用して評価し、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。図8を参照のこと。結果は、HIVnef-tat-vifの発現が、レーン13つのプラスミド、レーン22つのプラスミド、レーン31つのプラスミド、レーン41つの三転写ユニットプラスミドおよびレーン54つのプラスミドにおいて検出されたことを明らかにしている。図8を参照のこと。DNAの総量を4μgで一定に保った。三転写ユニットプラスミド303はかなりの量のnef-tat-vifタンパク質を産生したが、2つのプラスミドを含有する組合せよりも少なかった。結論図6、図7および図8に示されるように、三転写ユニットプラスミド303を使用して、gag-polタンパク質、envタンパク質およびntvタンパク質をコードする3つのオープンリーディングフレームのすべてが、類似したレベルで同時に発現された。従って、このことから、このプラスミドの機能性が確認される。実施例6:一定の総DNA濃度での、2つのプラスミドを介するか、または、単一のプラスミドによる多数の遺伝子の発現gag、pol、envおよびnef-tat-vifのHIV遺伝子の発現を、2μgの濃度での三連転写ユニットプラスミドと、それぞれ1μgのDNAの2つのプラスミドの組合せとの間で比較した。総DNA濃度を、図9、図10、図11および図12に示されるように2μgで一定に保った。図9は、polタンパク質の発現が、2つのプラスミドの組合せのいずれかからであっても、または、三連転写ユニットプラスミドからであっても類似していたことを示す。レーン2は、プラスミド201およびプラスミド202gag、pol、nef-tat-vifおよびenvの完全なHIV遺伝子アレイを発現させるために構築された2つの二連転写ユニットプラスミドの組合せから発現したpolタンパク質のウェスタンブロットを示す。次に、二連転写ユニットプラスミドおよび単一転写ユニットプラスミドこれらは、gag、pol、envおよびnef-tat-vifを様々な構成で発現しているの2つの組合せからのpolタンパク質の発現を、polタンパク質のウェスタンブロットを使用して評価した。図9のレーン3プラスミド204およびプラスミド104およびレーン5プラスミド302およびプラスミド101を参照のこと。それぞれの場合において、検出可能なpol発現が認められる。レーン4は、プラスミド203これは、gag-pol-nef-tat-vifおよびenvの完全なHIV遺伝子アレイを発現する二連転写ユニットプラスミドであるから発現したpolタンパク質のウェスタンブロットを含む。図9を参照のこと。レーン6は、プラスミド303これは、実施例2および実施例3で記載されるように、gag-pol、envおよびnef-tat-vifの完全なHIV遺伝子アレイを発現する三連転写ユニットプラスミドの一例であるから発現したpolタンパク質のウェスタンブロットを含む。図9を参照のこと。図10および図11では、2つのプラスミドの組合せからのgagおよびエンベロープのタンパク質発現と三連転写ユニットプラスミドからのタンパク質発現とを比較する。レーン2は、プラスミド201およびプラスミド202これらは、gag、pol、nef-tat-vifおよびenvの完全なHIV遺伝子アレイを発現するために構築された2つの二連転写ユニットプラスミドであったの組合せから発現したgagタンパク質およびenvタンパク質のウェスタンブロットを示す。次に、二連転写ユニットプラスミドおよび単一転写ユニットプラスミドの組合せからのgagタンパク質およびenvタンパク質の発現を、ウェスタンブロットを使用して評価した。図10および図11を参照のこと:レーン3プラスミド204およびプラスミド104およびレーン5プラスミド302およびプラスミド101。プラスミド302は、2つの挿入されたオープンリーディングフレームのみを有するので、二転写ユニットプラスミドとして機能する三転写ユニットプラスミドである。表2を参照のこと。検出可能なgag発現およびenv発現がそれぞれの場合に認められた。図10を参照のこと。レーン4は、プラスミド203これは、gag-pol-nef-tat-vifおよびenvの完全なHIV遺伝子アレイを発現する二連転写ユニットプラスミドであったから発現したgagタンパク質およびenvタンパク質のウェスタンブロットを例示する。図10および図11を参照のこと。レーン6は、実施例2および実施例3で記載される三連転写ユニットプラスミド303から発現したgagタンパク質およびenvタンパク質のウェスタンブロットを含む。図10および図11を参照のこと。三連転写ユニットプラスミド303からのgagタンパク質およびenvタンパク質の発現は、プラスミドの組合せからのgagタンパク質およびenvタンパク質の発現と匹敵していた。図12では、様々なプラスミドの組合せからのnef-tat-vifポリタンパク質の発現と、三連転写ユニットプラスミドからのタンパク質発現とを、ウェスタンブロット検出を使用して比較する。レーン2は、プラスミド201およびプラスミド202これらは、gag、pol、nef-tat-vifおよびenvのHIV遺伝子を発現するように設計された2つの二連転写ユニットプラスミドであったの組合せから発現したnef-tat-vifポリタンパク質のウェスタンブロットを示す。レーン3およびレーン5は、ウェスタンブロットを使用して検出される、二連転写ユニットプラスミドおよび単一転写ユニットプラスミドの2つの異なる組合せからのnef-tat-vifポリタンパク質の発現を示す。図12を参照のこと:レーン3プラスミド204およびプラスミド104およびレーン5プラスミド302およびプラスミド101。上記で議論されたように、プラスミド302は、2つの挿入されたオープンリーディングフレームのみを有するので、二転写ユニットプラスミドとして機能する三転写ユニットプラスミドである。表2を参照のこと。この場合、レーン5において見られるプラスミド302からのnef-tat-vifタンパク質の発現は、201および202のプラスミドの組合せレーン2または204および104のプラスミドの組合せレーン3よりも低いレベルであった。図12を参照のこと。レーン4は、プラスミド203これは、gag-pol-nef-tat-vifおよびenvの完全なHIVタンパク質アレイを発現する二連転写ユニットプラスミドであったから発現したnef-tat-vifポリタンパク質を示す。図12を参照のこと。レーン6は、三連転写ユニットプラスミド303から発現したnef-tat-vifポリタンパク質を示す。図12を参照のこと。303からのnef-tat-vifの発現はプラスミド302からのものよりも著しく多かった。特筆すべきことに、大型のgag-pol-nef-tat-vifポリタンパク質を1つのプロモーターから発現し、かつ、envタンパク質をもう一方のプロモーターから発現する二転写ユニットプラスミド203からの発現は、3つの独立した転写ユニットからの同じ遺伝子をコードするプラスミド303からの発現よりもかなり低かった。まとめると、三連転写ユニットプラスミドを使用して、3つのオープンリーディングフレームをほぼ等しいレベルで同時に発現させることができ、かつ、全体的なレベルが、そのような遺伝子をコードする単一のプロモーター構築物および二連でのプロモーター構築物の両方と匹敵していた。このインビトロ発現データは、多数のHIV遺伝子が三重転写ユニットプラスミドから発現されるとき、著しいプロモーター干渉がないことを示す。従って、個々の転写ユニットがベクター内に適切に設置されている。実施例7:総DNA濃度を一定に保つことなく、多数のプラスミドを介するか、または、単一のプラスミドによる多数の遺伝子の発現多数の遺伝子をコードする1つの三連転写ユニットプラスミドからの発現を、同じ遺伝子アレイを発現する多数のプラスミドと比較した。この場合、プラスミドあたりのDNAが1μgで一定に保たれた。実施例5とは対照的に、DNAの総量は、DNAの総量を補うため、オープンリーディングフレームのインサートを有しないプラスミドDNAにより補充しなかった。データを示さないが、下記にまとめる。本実施例では、HIVgag、pol、envおよびntvの発現を、1μgのそれぞれのプラスミドで一過的にトランスフェクションした培養293細胞を使用して評価し、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。HIVgagの発現が、3つのプラスミド101、104、301、2つのプラスミド201および202、1つのプラスミド203、1つのプラスミド303、および、4つのプラスミド101、102、103、104との様々な組合せによるトランスフェクションから検出された。三転写ユニットプラスミド303は、より多くのプラスミドを必要とする組合せと比較したとき、かなりの量のgagタンパク質を産生した。具体的には、三転写ユニットプラスミド303は、6個すべてのHIV遺伝子を有する二転写ユニットプラスミド203よりも多くのgagタンパク質を産生し、そして6個すべてのHIV遺伝子を有する二転写ユニットプラスミドの201および202の組合せよりもわずかに少ないgagタンパク質を産生した。gagが、SCMVプロモーターによって駆動されるgag-pol融合体として発現された場合、3つのプラスミド101、104、301の組合せからのgagの発現は乏しかった。単一のプラスミドまたは複数のプラスミドからのHIVenvの発現もまた評価した。結果は、HIVenvの発現が、3つのプラスミド301、101および104、2つのプラスミド201および202、1つのプラスミド203、1つのプラスミド303、および、4つのプラスミド101、102、103、104による様々な組合せから容易に検出されたことを明らかにしている。DNAの総量は、使用されているプラスミドの数に依存し、プラスミドあたり1μgのDNAをトランスフェクションした。この場合、三転写ユニットプラスミド303は、あらゆる他のプラスミドまたはプラスミドの組合せよりも多くのenvタンパク質を産生した。単一のプラスミドまたは複数のプラスミドからのHIVnef-tat-vifの発現を、培養細胞に一過的にトランスフェクションさせた、1μgのそれぞれのプラスミドを使用して評価し、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。HIVnef-tat-vifの発現が、3つのプラスミド301、101および104、2つのプラスミド201および202、1つのプラスミド203、1つのプラスミド303、および、4つのプラスミド101、102、103、104による様々な組合せから検出された。三転写ユニットプラスミド303はかなりの量のnef-tat-vifタンパク質を産生した。結論高レベルの特定のタンパク質をrev非依存的様式で発現する、多数のHIV遺伝子をコードする三連転写ユニットプラスミドを設計し、構築した。これにより、単一のプラスミド構築物により、3つの転写物が独立的かつ効率的に発現したことが確認された。本実施例では、三連転写ユニットプラスミドからのHIV遺伝子の発現を、単一転写ユニット構築物または二連転写ユニット構築物のいずれかからの同じ遺伝子の発現と比較した。データは、一発現カセットまたは二連発現カセットによって発現された遺伝子発現と比較したとき、三連転写ユニットプラスミドからの遺伝子発現の方が低かったことを示している。しかしながら、上記実施例では、HCMVプロモーターに駆動される遺伝子発現がSCMVプロモーターよりも高く、HSV-lap1プロモーターがそれに続いたことが見出された。三連転写ユニット構築物におけるプロモーターの強さにおけるこの違いは、より低い免疫原性の抗原に対してより高い免疫原性の抗原を発現させるための遺伝子をプラスミドに配置するときには考慮しなければならない。実施例8.1つ、2つまたは3つの完全な転写ユニットを含有するプラスミドベクターを用いたマウス免疫化研究マウス研究を、gag、pol、env、nef、tatおよびvifを含む6つのHIV-1遺伝子からタンパク質を発現する三転写ユニットプラスミドベクターの免疫原機能性を明らかにし、かつ、比較するために行った。具体的には、様々な1個、2個または3個のプラスミドDNAに基づく免疫原組成物が、多重抗原特異的な細胞媒介性免疫応答をBalb/cマウスにおいて誘発する、相対的な能力を比較した。Balb/cマウスを、表3に概略されるように、100μg総用量のDNAにより皮下に免疫化した。すべての場合において、免疫原組成物を0.25ブピバカインにより処方し、大腿四頭筋に100μlの体積で注射した。2回目の免疫化の10日後、動物を屠殺し、血清および脾臓を免疫アッセイのために単離した。免疫化マウスの血清を抗gag特異的抗体力価および抗env特異的抗体力価について分析した。脾臓を使用して、下記に記載されるようなELISPOTアッセイを使用して抗原特異的なIFN-γ分泌細胞を測定した。動物これらの研究のために、4週齢~6週齢のメスのBalb/cマウスを使用した。マウスを、研究室動物の管理および使用のための指針NationalResearchCouncil、NationalAcademicPress、Washington,D.C.、1996に従って飼育した。加えて、マウスの使用および管理のための手順はWyethResearchの施設内動物管理使用委員会によって承認された。免疫原組成物および免疫化HIVのenvgp160、gagp55、polまたはnef-tat-vif融合タンパク質をコードする様々なプラスミドDNA発現ベクターを実験用免疫原組成物として使用し、空の発現ベクターバックボーンをコントロールの免疫原組成物ベクターとして使用した。研究設計については下記の表3を参照のこと。様々な発現ベクターによるHIV遺伝子の発現を、ヒト横紋筋肉腫RD細胞の一過的トランスフェクションの後、ウェスタンブロットによって確認した。実施例4~実施例7を参照のこと。これらの研究のために使用されたアジュバントもまた、DNAプラスミドによって送達した。本実施例では、すべての動物に、IL-12を発現するプラスミド番号212の25μgを同時注射した。このアジュバントプラスミドは、マウスIL-12のp35遺伝子およびp40遺伝子をコードする二転写ユニット発現プラスミド表1におけるプラスミド番号212である。表1を参照のこと。IL-12のp35サブユニットをHCMV即時初期プロモーターおよびSV40ポリアデニル化シグナルの制御下で発現させ、同時に、IL-12のp40サブユニットをサルCMVプロモーターSCMVおよびBGHポリアデニル化シグナルの制御下で発現させた。RD細胞の一過的トランスフェクションの後、マウスIL-12の産生を、抗マウスIL-12p70捕獲ELISAEndogen、Woburn、MAを使用して細胞上清をスクリーニングすることによって確認したデータは示していない。表3.マウス研究設計-2回の免疫化免疫化用の発現プラスミドをPuresyn,Inc.Malvern、PAによって作製した。プラスミドを大腸菌において増殖させ、アルカリ溶解によって単離し、カラムクロマトグラフィーによって精製した。このプラスミドを、DNA:ブピバカイン複合体の形成を可能にするための促進因子として0.25のブピバカインを含有する等張性クエン酸塩緩衝液29.3mMのクエン酸ナトリウム、0.67mMのクエン酸、150mMのNaCl、0.34mMのEDTA、pH=6.4~6.7により2.5mg/mLの濃度で個別に処方した。すべての群について、アジュバントプラスミドを免疫原組成物の一部として抗原発現プラスミドと混合した。最終的なプラスミド調製物は、90を越えるスーパーコイル状プラスミドDNAからなることが示され、残留エンドトキシンが30EU/mgDNA未満であることが示されたデータは示していない。免疫化直前に、免疫原組成物を、適切なプラスミド発現ベクター処方物を混合することによって調製した。得られた免疫原組成物を、18ゲージのニードルおよび0.3mLのシリンジを使用して両方の大腿四頭筋に筋肉内注射によって投与した部位あたり0.05ccによる0.1ccの総注射体積。マウスIFN-γELISPOTアッセイELISPOTまたはElisaSpot、これは酵素結合免疫スポットアッセイの省略形であるは最初、抗体を分泌するB細胞を検出するための方法として開発された。この方法は現在、特定の抗原に対するT細胞の反応通常、百万個あたりの活性化細胞の数として表されるを明らかにするために適合化されている。本実施例では、インターフェロン-γIFN-γの産生を単一の細胞の活性化についての読み取りとして使用した。この分析では、ELISPOTが、特定のHIV抗原を発現する免疫原組成物によって誘発される細胞傷害性T細胞の活性を明らかにするために役立った。IFN-γのELISPOT応答を測定するために、マウスIFN-γELISPOTキット製品番号551083、BDBiosciences、SanDiego、CAを使用した。ELISPOTアッセイを、各ウエルにメンブランの底部を有する96ウエルマイクロタイタープレートで行った。具体的には、96ウエル平底ELISPOTプレートImmunoSpot、CellularTechnologyLimited、Cleveland、Ohioを、精製抗マウスγ-インターフェロンmIFN-γモノクローナル抗体製品番号51-2525KC、BD-Biosciences、SanDiego、CAにより10mcg/mLの濃度で一晩被覆し、その後、プレートを滅菌した1×リン酸緩衝化生理食塩水1×PBSにより3回洗浄し、次いで、R10完全培養培地10の熱不活化HIウシ胎児血清FBSおよび2mMのL-グルタミン、100ユニット/mLのペニシリン、100mcg/mLの硫酸ストレプトマイシン、1mMのピルビン酸ナトリウム、1mMのHEPES、100mcMの非必須アミノ酸を含有するRPMI-1640により2時間ブロッキング処理した。ますマウスの脾臓を、2枚の滅菌された顕微鏡用スライドガラスのすりガラス端の間で脾臓をすりつぶすことによって処理した。得られたホモジネートを10mlの不完全R05培養培地5のFBS、2mMのL-グルタミン、100ユニット/mLのペニシリン、100mcg/mLの硫酸ストレプトマイシン、1mMのピルビン酸ナトリウム、1mMのHEPES、100mcMの非必須アミノ酸を補充したRPMI1640培地に再懸濁し、続いて脾臓細胞をFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離によって単離し、2mcg/mLのCon-ASigma、または、HIVのgagp55、HIV-16101envgp160、pol、nef、tat、vifにわたるペプチドプール11アミノ酸が重複する15mer体;各2.5mcMの最終ペプチド濃度、または、培地単独のいずれかを含有する完全R10培養培地で再懸濁した。投入細胞数はウエルあたり4×105個の脾臓細胞1mLあたり4×106個の脾臓細胞であり、二連のウエルでアッセイした。脾臓細胞を37°Cで22時間~24時間インキュベーションし、その後、まず脱イオン水で3回洗浄して、そして氷上での10分間~20分間のインキュベーションによってELISPOTプレートから除いた。その後、プレートを、0.1のTween-20を含有する1×PBSにより6回洗浄した。その後、プレートを、R10で希釈した抗マウスIFN-γビオチン化検出抗体5.0mcg/ml、製品番号51-1818KZ、BD-Biosciences、SanDiego、CAで処理し、4°Cで一晩インキュベーションした。その後、ELISPOTプレートを、0.1のTween-20を含有する1×PBSにより10回洗浄し、R10で1:100希釈した100mcL/ウエルのストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体カタログ番号51-9000209、BD-Biosciences、SanDiego、CAで処理し、室温でさらに1時間インキュベーションした。結合していないストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を、プレートを、0.1のTween-20を含有する1×PBSにより6回、次いで、1×PBSにより3回すすぎ洗いすることによって除いた。次に、ペルオキシダーゼ基質を、AEC基質溶液中の20mcL/mLのAEC発色原カタログ番号551951、BD-Biosciences、SanDiego、CAを希釈することによって調製した。発色を、100mcL/ウエルの基質溶液を3分間~5分間加えることによって開始させた。最後に、プレートを水によりすすぎ洗いし、風乾した。結果を、ELISPOTプレートの1個のウエルを写真撮影するELISPOTアナライザーまたは画像化装置を使用して測定し、スポットを数えた。この場合、生じたスポットを、ImmunospotReaderCTLInc.、Cleveland、OHを使用して計数した。ペプチド特異的なIFN-γELISPOT応答は、応答-培地バックグランドが培地応答の3倍以上であり、かつ、106個の脾臓細胞あたりの、インターフェロン-γを分泌するスポット形成細胞SFC/106脾臓細胞が50個以上であったならば、陽性であると見なした。表4に示されるように、多プラスミドDNA免疫化後のマウスにおける個々のHIV-1抗原応答および全体的なHIV特異的IFN-γELISPOT応答を、表3に示されるプラスミドから構成された免疫原組成物による2回の免疫化の後で測定した。表4.2回の免疫化の後でのマウス免疫応答抗原特異的なIFN-γELISPOT応答が、106個の脾臓細胞あたりの、インターフェロン-γを分泌するスポット形成細胞SFC/106脾臓細胞として報告された。ntv、nef-tat-vif融合タンパク質すべての場合において、nef-tat-vif特異的な応答は比較的低かった。nef-tat-vifがlap1プロモーターの制御下にある群1マウスでは最も低かった。しかしながら、上記の実施例4~実施例7では、HCMVプロモーターに駆動される遺伝子発現がSCMVプロモーターの場合よりも大きく、SCMVプロモーターに駆動される遺伝子発現がHSV-lap1プロモーターの場合よりも大きいことが見出されていた。三連プロモーター構築物において利用されているプロモーターの強さのこの違いが、この構築物が免疫原組成物において使用されたときに観測された、誘発された免疫応答がより低いことの原因であると考えられる。融合タンパク質の使用に関して、3aおよび3cにおいてHIVpolに対するELISPOT応答を比較すると、単一のポリペプチドではなく、融合ポリペプチドを使用したときには免疫原性がある程度低下しているようである。別の検討事項は、調べられているタンパク質の相対的な免疫原性である。例えば、HCMVプロモーターに駆動される遺伝子発現により、単一の転写ユニットを含有する単一のプラスミドにおけるその遺伝子のそれぞれenv、gag、polおよびnef-tat-vifが作動する場合3bを3cに対して調べることによって、おおまかにはenv>pol>gag>nef-tat-vifである免疫原性の序列が依然として存在する。上記で議論されたように、プロモーターの強さおよび相対的な免疫原性はともに、個々のプラスミドの設計、および、免疫原組成物で使用されるプラスミドの組合せにおいて考慮しなければならない。次に、別の研究を、1つ、2つおよび3つのプラスミド免疫原組成物を使用する3回の免疫化のときの免疫応答に対する影響を評価するために行った。表5を参照のこと。6匹のマウスからなる群を、3週間間隔で2回ではなく、3週間間隔で3回免疫化したことを除いて、上記で記載されたように免疫化した。表5を参照のこと。群1、群2eおよび群3aでは、表3の場合と同じ免疫原組成物を用いる。加えて、3回の免疫化を使用するこの研究では、新しいプラスミドこれは301と称されるを構築し、gag/pol融合タンパク質のHCMVプロモーターに駆動される遺伝子発現とgag/pol融合タンパク質のSCMVプロモーターに駆動される遺伝子発現とを直接比較した。表5および表6における群3aおよび群4bを比較のこと。このプラスミドはまた、三連転写ユニットプラスミドから発現されているgag-pol融合体の潜在的な免疫原能力を、類似するプロモーターにより駆動される3つの単一転写ユニットプラスミドから発現されているgag-pol融合遺伝子およびenv遺伝子と比較することを可能にした。表5および表6における群1および群4bを比較のこと。脾臓組織を最後の追加抗原投与の17日後に集め、個々のHIVタンパク質に対する抗原特異的なELISPOT応答について分析した。表5.マウス研究設計-3回の免疫化1群1、群2eおよび群3aでは、3回の免疫化が行われたことを除いて、表3の場合と同じ免疫原組成物が用いられる。三転写ユニットプラスミドから誘発された全体的な細胞性免疫応答は、単一転写ユニットプラスミドおよび二連転写ユニットプラスミドを含有する免疫原組成物によって誘発された細胞性免疫応答とほぼ同じであったか、または、それらよりも大きかった。表6を参照のこと。表6.マウスの細胞性免疫応答-3回の免疫化抗原特異的なIFN-γELISPOT応答がSFC/106脾臓細胞として報告された。ntv、nef-tat-vif融合タンパク質免疫原組成物による3回の免疫化後のELISPOT結果は、三転写ユニットプラスミドに基づく免疫原組成物による3回の免疫化の後におけるHIV細胞性免疫応答が3回目の免疫化の後で100増大したことを示した。しかしながら、応答のバランスは、関与したプロモーターの強さ、および、抗原の相対的な免疫原性に依存して、依然として変化し得る。明らかではあるが、製造上の利点が必要であるいくつかの状況では、三連転写ユニットプラスミドは、3つ以上の遺伝子を免疫原組成物により投与するための良好なビヒクルである。免疫原組成物によりこれまでに調べられたすべてのプラスミド設計体は、その抗原を正しく発現し、かつ、免疫原性であり、細胞性免疫応答を3回の免疫化の後で活性化していることが見出されている。しかしながら、nef、tatおよびvifに特異的な応答は、三連転写ユニットプラスミドにおいてHSVLap1プロモーターの制御下に置かれたときには検出することができなかった。いくつかの状況のもとでは、様々な抗原に対する広範囲で、かつ、バランスの取れた細胞性免疫応答を誘発する免疫原組成物が好ましい。この場合、表3および表4に示されるような2つおよび3つのpDNA免疫原組成物の設計2d、3aおよび3cが、強力>600SFC/106細胞、かつ、バランスの取れたHIV特異的なELISPOT応答を誘発することができるようであり、これらを非ヒト霊長類でのさらなる試験のために選択した。実施例9を参照のこと。実施例9.1つまたは2つの完全な転写ユニットを含有するプラスミドベクターを用いたマカク免疫化研究実施例8の表3および表4において、3つのpDNA免疫原組成物、特に、群2d、群3aおよび群3cで使用された免疫原組成物は、6個すべてのHIVタンパク質に対する強力>600SFC/106細胞、かつ、バランスの取れたHIV特異的なELISPOT応答を誘発することができるようであった。これらを非ヒト霊長類でのさらなる試験のために選択した。実験設計この研究のために、合計で30頭のMamu-A01陰性の、自家繁殖させたオスのインド産アカゲザルMacacamulattaを使用した。マカクをNewIberiaResearchCenterNewIberia、LAに収容し、研究室動物の管理および使用に関する指針NationalResearchCouncil、NationalAcademicPress、Washington,D.C.、1996に従って飼育した。加えて、マカクの使用および管理に関する手順はWyethResearchの施設内動物管理使用委員会によって承認された。免疫化免疫化用の発現プラスミドをPuresyn,IncMalvern、PAによって作製した。プラスミドを大腸菌により増殖させ、アルカリ溶解によって細胞から単離し、カラムクロマトグラフィーによって精製した。その後、プラスミドを個々に、DNA:ブピバカイン複合体の形成を可能にするために0.25のブピバカインを含有する等張性クエン酸塩緩衝液29.3mMのクエン酸ナトリウム、0.67mMのクエン酸、150mMのNaCl、0.34mMのEDTA、pH=6.4~6.7により2.5mg/mLの濃度で処方した。最終的なプラスミド調製物は、90を越えるスーパーコイル状プラスミドDNAからなることが示され、残留エンドトキシンは30EU/mgDNA未満であることが示されたデータは示していない。このアカゲザル研究のために使用されたアジュバントは、免疫原組成物の一部として送達されたDNAプラスミドであった。このアジュバントプラスミドは、アカゲザルのIL-12のp35遺伝子およびp40遺伝子をコードする二転写ユニット発現プラスミドである表1におけるプラスミド番号212。表7を参照のこと。IL-12のp35サブユニットをHCMV即時初期プロモーターおよびSV40ポリアデニル化シグナルの制御下で発現させ、同時に、IL-12のp40サブユニットをサルCMVプロモーターSCMVおよびBGHポリアデニル化シグナルの制御下で発現させた。プラスミド発現によるアカゲザルIL-12の生物活性を、一過的にトランスフェクションしたRD細胞由来の上清が、アカゲザルの休止末梢血リンパ球PBLにIFN-γ分泌を誘導する能力についてアッセイすることによって確認したデータは示していない。表7.マカク研究設計1すべての群に、アカゲザルのIL-12rIL-12をコードするプラスミド番号212HCMV-IL-12p35、SCMV-IL-12p40の1.5mgをアジュバントとして与えた。2別の一群3cが含められ、この群では、エレクトロポレーションが投与プロトコルに加えられた。3さらなる群4aが、示された4つのベクターワクチン設計の免疫原性を明らかにするために後日、このマカク研究に加えられた。すべてのマカクを0週間、4週間および8週間のスケジュールで免疫化した。免疫化直前に、適切なプラスミド発現ベクター処方物を、免疫原組成物を作製するために混合し、18ゲージのニードルおよび3mLのシリンジを使用した両方の三角筋および両方の大腿四頭筋への筋肉内注射1mLの注射体積、部位あたり2.5mgのDNAによって投与した群2d、群3a、群3cおよびコントロール。群3cEのマカクは、標準的な1mLのシリンジを使用し、21ゲージのニードルBraunを8.0mm離して配置して両方の三角筋および両方の大腿四頭筋への筋肉内注射を行い、その直後、電気刺激すなわち、エレクトロポレーションを行うことによって、pDNAにより免疫化された。注射体積は0.2mlであり、これにより、合計で2mgの総DNAのための部位あたり、注射あたり0.5mgのプラスミドDNAが与えられた。従って、エレクトロポレーション群3cEには、それ以外の群に投与された総DNAの1/5を与えた。本実施例において、エレクトロポレーション条件は下記の通りであった:250mAかつ約100V/cmでの6回の20ms単極性パルス。各パルスの間には250msの中断があった。エレクトロポレーションがない場合、表8に示される結果は、単一の転写ユニットを有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物群3aが、2つ以上の転写ユニットを有する少なくとも1つのプラスミドを含有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物と比較した場合、10週間後または16週間後、最も大きい全体的な細胞性免疫応答を生じさせたことを示した。3aを2dおよび3cと比較のこと。表8.多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的な全体的なHIV特異的IFN-γELISPOT応答全体的なHIV特異的IFN-γELISpot応答が平均SFC/106PBL±標準誤差として報告される。1nd、測定されず驚くべき結果は、エレクトロポレーションにより、全体的な細胞性免疫応答が10週で450より高く増大し、16週で990より高く増大したことであった。3cEを3cと比較のこと。表8に示される結果は、2つ以上の転写ユニットを有する少なくとも1つのプラスミドを含有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物が、エレクトロポレーションと組み合わされたとき、単一の転写ユニットを有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物と比較して、最大の全体的な細胞性免疫応答を10週間後または16週間後に生じさせていたことを示していた。群3cおよび群3aを比較のこと。このマカク研究において、エレクトロポレーションの使用を除いた場合、群3aは、10週または16週での最大の全体的なHIV抗原特異的なELISPOT応答を発達させていた1,652SFC/106細胞および1015SFC/106細胞。この応答は群2d770SFC/106細胞または群3c787SFC/106細胞に対して統計学的に異なっていなかった。表8を参照のこと。しかしながら、最大のELISPOT応答がエレクトロポレーションの使用により達成された。表8において群3cEを参照のこと。興味深いことに、エレクトロポレーションを使用した追加抗原投与免疫化の後におけるピーク免疫応答は非エレクトロポレーション群の場合よりも後であった。例えば、群3aの動物についての全体的なHIV特異的IFN-γELIspot応答は、第4週の免疫化または追加抗原投与の後の第6週前後でピークに達した。表8を参照のこと。対照的に、エレクトロポレーション群については、ピークは第10週により近かった。表8を参照のこと。細胞性免疫応答を、6個のHIVタンパク質に対するIFN-γELISPOT応答としてさらに分析した。表9は、HIVのenvタンパク質、gagタンパク質、polタンパク質、および、nef-tat-vifタンパク質の融合タンパク質に対するIFN-γELISPOT応答を示す。このマカク研究において、再度ではあるが、エレクトロポレーションの使用を除いた場合、群3aは、envおよびnef-tat-vifに対する10週での最大のHIV抗原特異的なELISPOT応答を発達させた。表9を参照のこと。群3cの動物はgagに対する最大のELISPOT応答を発達させ、群2dはpolタンパク質に対する最大のELISPOT応答を発達させた。表9において3aを2dおよび3cと比較のこと。今までにないほどの最大のELISPOT応答がエレクトロポレーションの使用により達成された。表9において群3cEを参照のこと。表9.多プラスミドDNAワクチン接種の後での第10週における個々のHIV抗原特異的なIFN-γELISPOT応答個々のHIV抗原特異的なIFN-γELISPOT応答が平均SFC/106PBL±標準誤差として報告される。1群2dに対して統計学的により大きいenv特異的なELISPOT応答p<0.05。2群3aに対して統計学的により大きいgag特異的なELISPOT応答p<0.05。3群3cに対して統計学的により大きいntv特異的なELISPOT応答p<0.05。表10は、第16週最後の免疫化の8週間後での、HIVのenvタンパク質、gagタンパク質、polタンパク質、および、nef-tat-vifタンパク質の融合タンパク質に対するIFN-γELISPOT応答を示す。エレクトロポレーションの使用を除いた場合、群3aは、envおよびnef-tat-vifに対する16週での最大のHIV抗原特異的なELISPOT応答を発達させ、一方で、群3cの動物はgagおよびpolに対する10週での最大のHIV抗原特異的なELISPOT応答を発達させた。最大のELISPOT応答がエレクトロポレーションの使用により達成された。表10において群3cEを参照のこと。表9および表10は、抗原発現プラスミドの数を免疫原組成物中で3から4へ増やすことにより、これらHIVタンパク質のすべてに対する免疫応答が低下したことを示している。表9および表10を参照のこと。表9および表10はまた、免疫原組成物中に2つの抗原発現プラスミドこの場合、一方のプラスミドが2つの転写ユニットを有するを含む群2dのプラスミドが、これらHIVタンパク質のすべてに対する最も広く、かつ、最もバランスの取れた免疫応答を誘発したことを示す。表9および表10を参照のこと。表10.多プラスミドDNAワクチン接種の後での第16週における個々のHIV抗原特異的なIFN-γELISpot応答個々のHIV抗原特異的なIFN-γELISpot応答が平均SFC/106PBL±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表11は、30週最後の免疫化の22週間後での、HIVのenvタンパク質、gagタンパク質、polタンパク質、および、nef-tat-vifタンパク質の融合タンパク質に対するIFN-γELISPOT応答を示す。このマカク研究において、再度ではあるが、エレクトロポレーションの使用を除いた場合、群3aは、env、polおよびnef-tat-vifに対する最大のHIV抗原特異的なELISPOT応答を発達させた。表11を参照のこと。群3cの動物はgagに対する最大のELISPOT応答を発達させた。表11において3aを2dおよび3cと比較のこと。最大のELISPOT応答がエレクトロポレーションの使用により達成された。表11において群3cEを参照のこと。マウス研究およびマカク研究の両方において、抗原特異的なELISPOT応答は一般に、HCMVプロモーターの制御下でそれぞれの個々の遺伝子を単独で受け入れている群において最も大きかった。マカク研究では、エレクトロポレーションが、免疫応答を生じさせることにおいて、免疫原組成物が、2つの完全な転写ユニットに対して、1つの完全な転写ユニットを有するプラスミドを含有するかどうかよりも、または、融合タンパク質が使用されたかどうかよりも重要な要因であった。表11.多プラスミドDNAワクチン接種の後での第30週における個々のHIV抗原特異的なIFN-γELISpot応答個々のHIV抗原特異的なIFN-γELISpot応答が平均SFC/106PBL±標準誤差として報告された。1測定されず個々のHIVタンパク質に対する経時的な細胞性免疫応答IFN-γELISPOT応答を、表7に記載されるプラスミドによる免疫化の後、env、gag、pol、nef、tatおよびvifの個々のHIVタンパク質に対して、第2週、第4週、第6週、第8週、第10週および第16週で測定した。結果を表12~表17に示す。表12:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIVenv特異的なIFN-γELISpot応答HIVenv特異的なIFN-γELISpot応答が平均SFC/106PBL±標準誤差として報告された。1nd、測定されず表13:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIVgag特異的なIFN-γELISpot応答HIVgag特異的なIFN-γELISpot応答が平均SFC/106PBL±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表14:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIVpol特異的なIFN-γELISpot応答HIVpol特異的なIFN-γELISpot応答が平均SFC/106PBL±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表15:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIVnef特異的なIFN-γELISpot応答HIVnef特異的なIFN-γELISpot応答が平均SFC/106PBL±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表16:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIVtat特異的なIFN-γELISpot応答HIVtat特異的なIFN-γELISpot応答が平均SFC/106PBL±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表17:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的なHIVvif特異的なIFN-γELISpot応答HIVvif特異的なIFN-γELISpot応答が平均SFC/106PBL±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表12~表17は、個々のタンパク質に対する免疫応答を経時的に示しており、抗原発現プラスミドの数を免疫原組成物中で3から4へ増やすことにより、投与されたDNAのこの所定の濃度では、これらHIVタンパク質のすべてに対する免疫応答の低下がもたらされたことを示している。表12~表17を参照のこと。実施例10:HIV特異的CTLおよびヘルパー細胞の割合の推定HIV特異的CTLおよびヘルパー細胞の相対的な量を、全体的なHIV特異的IFN-γELISpot応答を、CD4細胞またはCD8細胞の未分画の末梢血リンパ球PBLをまず枯渇化させ、その後第10週および第16週で測定することによって推定した。ビーズ枯渇化PBLの調製CD4細胞またはCD8細胞を、抗ヒトCD4特異的マウスモノクローナル抗体または抗ヒトCD8特異的マウスモノクローナル抗体で被覆された磁性ポリスチレンビーズを製造者の説明書DynalBiotech、Oslo、ノルウェーに従って使用して未分画PBLから枯渇させた。簡単に記載すると、新しく単離されたアカゲザルPBLを洗浄し、2のFBSを含有する氷冷した1×PBSにより2×106細胞/mLの最終濃度に再懸濁した。抗ヒトCD4特異的マウスモノクローナル抗体または抗CD8特異的マウスモノクローナル抗体のいずれかで被覆されたDynalミクロビーズを、2のFCSを含有する1×PBSにより3回洗浄し、その後、未分画PBLに5:1のビーズ対細胞の比率で加え、回転/傾斜装置において4°Cで1時間インキュベーションした。インキュベーション後、ビーズ/細胞懸濁物を磁性カラムに入れ、CD4細胞枯渇化PBLまたはCD8細胞枯渇化PBLのいずれかを含有する貫流したものflowthroughを集めた。細胞を、5のFBSが補充された完全培養培地により1回洗浄し、5のFBSを補充した完全培養培地により元の体積に再懸濁した。等体積の未分画のビーズ枯渇化PBLをELISpotアッセイでそのまま使用した。続いて、CD4細胞サブセット枯渇化およびCD8細胞サブセット枯渇化の効率、ならびに、ELISpotプレートに加えられたCD4細胞およびCD8細胞の正確な数をフローサイトメトリーによって定量化した。簡単に記載すると、ビーズ枯渇化PBLを、2のFBSを含有する1×PBSにより1回洗浄し、下記のモノクローナル抗体により室温で15分間染色した:抗アカゲザルCD3-フルオレセインイソチオシアナートFITC、クローンSP34;BDPharmingen、SanJose、CA;抗ヒトCD4-フィコエリトリンPE、クローンM-T477;BDPharmingen、SanJose、CA;抗ヒトCD8-ペリジニンクロロフィルタンパク質PerCP;クローンSK1;BDPharmingen、SanJose、CA;および抗ヒトCD20-アロフィコシアニンAPC、クローンL27;BDPharmingen、SanJose、CA。その後、細胞を、2のFBSおよび0.02のアジ化物を含有する1×PBSにより1回洗浄し、1のパラホルムアルデヒドを含有する1×PBSに再懸濁した。FACS分析をFACSCaliburFlowCytometerBectonDickinson、FranklinLakes、NJで行い、CellQuestソフトウエアを使用して分析した。CD4細胞またはCD8細胞の枯渇化率は通常、95を越えていたデータは示していない。表18:未分画のCD4細胞またはCD8細胞を枯渇させたPBLにおける第10週および第16週での全体的なHIV特異的IFN-γELISpot応答全体的なHIV特異的IFN-γELISpot応答が平均SFC/106未分画のCD4枯渇化PBLまたはCD8枯渇化PBL±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表18に示される結果は、特定の誘発された免疫応答に関与するHIV特異的CTL細胞対ヘルパー細胞の相対的な百分率の推定を示す。2、3の一般的な観察をデータから引き出すことができる。第1に、群2d、群3aおよび群3cは、HIVに対する同様な強度の細胞性免疫応答を誘発している。群3aはより高レベルの免疫応答を誘発するようであり、しかし、アッセイにおける変動量もまた、その群に関してはより大きい。エレクトロポレーションを免疫化と組み合わせて使用した場合、群3cにおけるプラスミドに対する免疫応答の強度が約5倍~約10倍高まった。表18を参照し、3cEおよび3cを比較のこと。より多くの細胞が、エレクトロポレーションを免疫化とともに使用したことの結果として免疫応答に関係していたこともまた注目に値する。実施例11:多プラスミド免疫化により誘発されるHIV特異的な抗体力価プラスミドDNAを含有する免疫原組成物ICは、現在使用中の免疫原組成物技術の他のタイプを上回る利点をいくつか提供する。例えば、DNAに基づくICは、タンパク質に基づく従来のサブユニットICとは対照的に、コードされた抗原が主要組織適合性複合体MHCクラスI抗原プロセシング経路によって効率的にプロセシングおよび提示されることを可能にする。クラスI抗原プロセシング経路は、CD8T細胞により媒介される免疫応答の誘発のために非常に重要である。しかしながら、タンパク質に基づく従来のサブユニットICは、典型的には、抗原特異的な抗体応答を誘発するその能力に関して、DNAに基づくICよりも効率がよい。HIVウイルス溶解物に特異的な抗体力価を測定するために、ELISAプレートを、界面活性剤により破壊されたHIV-1MNにより20ng/ウエルで、4°Cで18時間被覆したAdvancedBiotechnologies、Columbia、MD。界面活性剤により破壊されたHIV-1MINを炭酸塩/重炭酸塩緩衝液15mMNa2CO3、35mMNaHCO3、pH9.6で希釈した。HIVのenvに特異的な抗体の力価を測定するために、ELISAプレートを、1×PBSに希釈された精製HIV-16101gp120これはLarryLiaoDuke大学によって譲渡された;20ng/ウエルにより被覆した。HIVタンパク質との18時間のインキュベーションの後、ELISAプレートを、0.1のTween20を含有する1×PBSにより5回洗浄し、その後、0.1のTween20および3のBSAを含有する1×PBSにより室温で2時間ブロッキング処理した。免疫化動物およびコントロール動物から得られた血清サンプルを、1のBSAおよび0.1のTween-20を含有する1×PBSで希釈し、1:100の開始希釈度でELISAプレートに加え、プレート上でさらに3倍希釈した。希釈された血清サンプルをタンパク質被覆プレートとともに4°Cで一晩インキュベーションした。抗原特異的な免疫グロブリンの検出を、霊長類IgGに対して特異的なビオチン結合体化一次抗体を室温で2時間インキュベーションすることによって達成した。この抗体は、0.1のTween-20、1のBSAが補充された1×PBSにより1:30,000希釈されたAccurateScientific、Westbury、NY。次いで、一次抗体を洗い流し、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗ビオチン二次抗体500ユニット/mlのストック液0.1のTween-20、1のBSAが補充された1×PBSで1:10,000希釈される、RocheImmunochemical、Indianapolis、INの1時間の室温でのインキュベーションを続けた。最後に、100mcL/ウエルのTMB3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン、Sigmaの添加によって発色させた。抗原特異的な抗体力価を、同じ動物の未投薬血清すなわち、第0週3標準偏差よりも大きいO.D.450を与える最終血清希釈度の逆数として定義した。多プラスミドDNA免疫化の最初の16週間での特定の時点についてのHIVエンベロープ力価を決定し、表19に示す。HIV-16106のenvgp120のELISA力価を、同じ動物の未投薬血清すなわち、第0週3標準偏差よりも大きいO.D.450を与える最終血清希釈度の逆数として計算した。表19ならびに下記の表20におけるデータを平均log10力価±平均の標準誤差として示された。この場合、2.00以下のHIV-1のenv力価は1:100未満のエンドポイントendpoint力価を表しており、これは検出限界未満であった。表19:多プラスミドDNA免疫化の後での経時的なHIV-16106のenvgp120特異的なELISA抗体力価データが平均log10力価±平均の標準誤差として報告された。2.00以下のHIV-1のenv力価は1:100未満のエンドポイント力価を表し、これは検出限界未満であった。1ndは、測定されなかったことを示す。表19に示されるように、2つ以上の転写ユニットを有する少なくとも1つのプラスミドを含有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物により免疫化された群3cの動物は第16週で最大の非エレクトポレーション力価を達成した。しかしながら、群2dおよび群3aについての結果はある程度類似していたが、群3aの動物は第8週および第10週で最大の力価を示した。表19を参照し、3aを2dおよび3cと比較のこと。2つ以上の転写ユニットを有する少なくとも1つのプラスミドを含有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物により免疫化され、かつ、エレクトポレーション-電気刺激を免疫化とともに受けた動物は、HIVエンベロープタンパク質に対するこれまでにない最大の力価を発達させた。表19を参照し、3cを3cEと比較のこと。ウイルス溶解物全体に対する総HIV力価を、多プラスミドDNA免疫化の第2週、第4週、第6週、第8週、第10週および第16週について測定した。その総HIV力価を表20に示す。HIV-1MNウイルス溶解物に特異的なELISA力価を、同じマカクの未投薬血清すなわち、免疫前3標準偏差よりも大きいO.D.450を与える最終血清希釈度の逆数として決定した。この表において、データは平均log10力価±平均の標準誤差として報告された。1.70以下の抗体力価は1:50未満のエンドポイント力価を表し、これは検出限界未満であったことには留意すること。第16週での表20における結果は、表19に示された結果と類似していた。表20:多プラスミドDNAワクチン接種の後での経時的かつ全体的なHIV-1特異的ELISA抗体力価データが平均log10力価±平均の標準誤差として報告された。1.70以下の抗体力価は1:50未満のエンドポイント力価を表し、これは検出限界未満であった。1ndは、測定されなかったことを示す。実施例12:マカクにおける様々な血清学的パラメーターおよび体重に対する多プラスミド免疫化の影響研究で使用されたマカクにおける末梢血白血球数WBCを完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均WBC×1000/ml±標準誤差として報告した。表21を参照のこと。表21:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総WBC数×1000完全血球計数分析によって測定された末梢血白血球数WBCが平均WBC×1000/ml±標準誤差として報告される。1nd、測定されず研究で使用された動物における末梢血赤血球数RBCを完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均RBC×106/ml±標準誤差として報告した。表22を参照のこと。研究で使用された動物における末梢血ヘモグロビンレベルg/dLを完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均ヘモグロビンレベル±標準誤差として報告した。表23を参照のこと。表7に記載されるプラスミドおよび免疫原組成物による多プラスミド免疫化は、この研究で使用された動物において、WBC、RBCおよびヘモグロビンレベルに対する有害な影響を何ら生じさせなかった。表21~表23を参照のこと。1つの明確なポジティブな効果が、群3cEを免疫化するために使用された免疫原組成物とともにエレクトロポレーションを使用したときに検出された。この群では、WBCの数が研究期間中を通して著しく上昇していた。表21を参照のこと。表22:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総RBC数×106末梢血赤血球数RBCが完全血球計数分析によって経時的に測定され、平均RBC×106/ml±標準誤差として報告された。表23:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総ヘモグロビンレベル完全血球計数分析によって測定された末梢血ヘモグロビンレベルg/dLが平均ヘモグロビンレベル±標準誤差として報告される。1nd、測定されずこの研究で使用された動物において測定される末梢血血小板レベルを完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均血小板レベル×1000±標準誤差として報告した。表24を参照のこと。この研究で使用された動物におけるパーセントヘマトクリットレベルを完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均パーセントヘマトクリットレベル±標準誤差として報告した。表25を参照のこと。この研究で使用された動物において測定される末梢血総リンパ球数を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均総リンパ球数±標準誤差として報告した。表26を参照のこと。この研究で使用された動物における末梢血総CD3Tリンパ球数を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均総CD3Tリンパ球数±標準誤差として報告した。表27を参照のこと。この研究で使用された動物における末梢血総CD3CD4Thリンパ球数を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均総CD3CD4Thリンパ球数±標準誤差として報告した。表28を参照のこと。この研究で使用された動物における末梢血総CD3CD8Tリンパ球数を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均総CD3CD8Tリンパ球数±標準誤差として報告した。表29を参照のこと。この研究で使用された動物における末梢血総CD20リンパ球数を完全血球計数分析によって経時的に測定し、平均総CD20リンパ球数±標準誤差として報告した。表30を参照のこと。表24:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総血小板数×1000完全血球計数分析によって測定された末梢血血小板レベルが平均血小板レベル×1000±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表25:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおけるパーセントヘマトクリット完全血球計数分析によって測定されたパーセントヘマトクリットレベルが平均パーセントヘマトクリットレベル±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表26:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総リンパ球数完全血球計数分析によって測定された末梢血総リンパ球数が平均総リンパ球数±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表27:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総CD3Tリンパ球数末梢血表28:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総CD3CD4Thリンパ球数完全血球計数分析によって測定された末梢血総CD3CD4Thリンパ球数が平均総CD3CD4Thリンパ球数±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表29:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用でのプラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総CD3CD8Tリンパ球数完全血球計数分析によって測定された末梢血総CD3CD8Tリンパ球数が平均総CD3CD8Tリンパ球数±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表30:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用での多プラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクにおける総CD20リンパ球数完全血球計数分析によって測定された末梢血総CD20リンパ球数が平均総CD20リンパ球数±標準誤差として報告される。1nd、測定されず表7に記載されるプラスミドおよび免疫原組成物による多プラスミド免疫化はまた、この研究で使用された動物において、血小板数表24、パーセントヘマトクリット表25、総リンパ球数表26、総CD3Tリンパ球数表27、総CD3CD4Thリンパ球数表28、総CD3CD8Tリンパ球数表29および総CD20Tリンパ球数表30に対する有害な影響を何ら生じさせなかった。再度ではあるが、これらの分析において、総リンパ球数表26、総CD3Tリンパ球数表27、総CD3CD4Thリンパ球数表28、総CD3CD8Tリンパ球数表29に対するポジティブな効果が、群3cEを免疫化するためにブピバカイン処方免疫原組成物と組み合わせてエレクトロポレーションを使用したときに検出された。この群において、これらのカテゴリーのそれぞれにおけるリンパ球の数が研究期間中の様々な時点で著しく上昇していた。この研究で使用された動物の体重を毎週モニターした。体重kgを平均体重±標準誤差として報告した。表31を参照のこと。表31:エレクトロポレーション併用およびエレクトロポレーション非併用での多プラスミドDNAワクチンにより免疫化されたマカクの体重kg体重kgが平均体重±標準誤差として報告される。1nd、測定されず最後に、この分析は、表7に記載されるプラスミドおよび免疫原組成物による多プラスミド免疫化がまた、この研究で使用された動物の体重表31に対する有害な影響を何ら生じさせなかったことを示している。実施例13:単一の転写ユニットをそれぞれ有する4つのプラスミドを含む免疫原組成物を使用するマウス免疫化研究前記実施例は、全体的な免疫応答を最大限にしなければならない状況では、プラスミドあたり1つの抗原を発現する単一の転写ユニットを有するプラスミドの組合せに基づく免疫原組成物を使用することが好都合であり得ることを示唆している。本実施例では、マウス免疫化研究を、4つのプラスミドに基づく免疫原組成物の免疫原機能性と3つのプラスミドに基づく免疫原組成物のそれとを比較するために行った。より具体的には、gag遺伝子、pol遺伝子、env遺伝子、および、nef-tat-vif遺伝子の融合体のみを含む6個のHIV-1遺伝子の発現を誘導する4つの個々のプラスミドに基づく免疫原組成物の免疫原機能性を、env遺伝子、gag-pol遺伝子の融合体、および、nef-tat-vif遺伝子の第2の融合体を含む6個のHIV-1遺伝子の発現を行わせる3つの個々のプラスミドに基づく免疫原組成物と比較した。免疫原機能性を、多重抗原特異的な細胞媒介性免疫応答をBalb/cマウスにおいて誘発する様々な3つおよび4つのプラスミドDNAに基づく免疫原組成物の相対的な能力として評価した。HIV遺伝子および配列を実施例1に記載した。群3aおよび群3cからの3つのプラスミド免疫原組成物は実施例8および実施例9に記載されるものと同じであった。表1および表32を参照のこと。免疫原組成物および免疫化HIVのenvgp160、gagp55、polもしくはgag-pol融合体またはnef-tat-vif融合タンパク質をコードするプラスミドDNA発現ベクターを実験用免疫原組成物として使用し、空の発現ベクターバックボーンをコントロールの免疫原組成物ベクターとして使用した。研究設計については下記の表32を参照のこと。様々な発現ベクターによるHIV遺伝子の発現を、ヒト横紋筋肉腫RD細胞の一過的トランスフェクションの後、ウェスタンブロットによって確認した。実施例4~実施例7を参照のこと。群3aは、プラスミドあたり単一の転写ユニットをそれぞれが有する3つのプラスミドを有するが、抗原の2つが融合タンパク質gag-polおよびnef-tat-vifである。群3cもまた3つのプラスミドを有するが、これらのプラスミドのうちの2つが単一の転写ユニットを有し、第3のプラスミドが2つの完全な転写ユニットを有する。表32を参照のこと。抗原の1つのみが融合タンパク質として発現されるnef-tat-vif。群4aは、単一転写ユニットプラスミドである4つのプラスミドをそれぞれ有するが、これらの抗原のうちの1つのみが融合タンパク質nef-tat-vifであった。これらの研究のために使用されたアジュバントもまた、DNAプラスミドによって送達された。本実施例では、すべての動物が、マウスIL-12のp35遺伝子およびp40遺伝子をコードし、マウスIL-12を発現するプラスミド番号212の25μgにより同時注入された。表1を参照のこと。Balb/cマウスを、表32に概略されるように100μgの総用量のDNAにより筋肉内に免疫化した。すべての場合において、免疫原組成物を0.25ブピバカインと処方し、大腿四頭筋に100μlの体積で注射した。2回目の免疫化の10日後、動物を屠殺し、血清および脾臓を免疫アッセイのために単離した。脾臓を使用して、抗原特異的なIFN-γ分泌細胞を、下記に記載されるようなELISPOTアッセイを使用して測定した。動物これらの研究のために、4週齢~6週齢のメスのBalb/cマウスを使用した。マウスを研究室動物の管理および使用に関する指針NationalResearchCouncil、NationalAcademicPress、Washington,D.C.、1996に従って飼育した。加えて、マウスの使用および管理についての手順はWyethReseachの施設内動物管理使用委員会によって承認された。表32.マウス研究設計-2回の免疫化1群3aおよび群3cでは、表3と同じ免疫原組成物を用いる。表33に示されるデータは、免疫原組成物中の抗原発現プラスミドの数を3から4へ増やすことにより、HIVタンパク質に対する免疫応答に劇的な増大は何ら生じなかったことを示している。表33を参照のこと。表33.2回の免疫化の後におけるマウス免疫応答抗原特異的なIFN-γELISPOT応答が、106個の脾臓細胞あたりの、インターフェロン-γを分泌するスポット形成細胞SFC/106脾臓細胞として報告される。ntv、nef-tat-vif融合タンパク質本明細書中で引用されるすべての文書は参考として援用される。方法および構成要素における様々な改変および小さな変更が当業者には明らかであると考えられる。"