"糖タンパク質Jの変異を含む弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVを含む組成物であって、前記変異は、糖タンパク質Jの発現を阻害する、組成物。前記弱毒化ILTVは、USDAチャレンジ株USDA-chを含む、請求項1に記載の組成物。前記変異は、糖タンパク質Jのタンパク質の発現を阻害する、請求項1または2に記載の組成物。前記変異は、糖タンパク質Jのプロモーターエレメントの変異を含み、前記変異は、前記プロモーターエレメントの機能を阻害する、請求項3に記載の組成物。前記変異は、糖タンパク質Jのヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項1または2に記載の組成物。前記変異は、配列番号1の完全なまたは部分的な欠失を含む、請求項5に記載の組成物。前記変異は、配列番号1のヌクレオチド1~2291の欠失を含む、請求項6に記載の組成物。レポータータンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項6に記載の組成物。前記レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質である、請求項8に記載の組成物。前記変異は、配列番号1のヌクレオチド1~2188の欠失を含む、請求項6に記載の組成物。レポータータンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項10に記載の組成物。前記レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質である、請求項11に記載の組成物。ウイルスタンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項10に記載の組成物。前記ウイルスタンパク質発現カセットは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質Fである、請求項13に記載の組成物。前記変異は、配列番号1の少なくともヌクレオチド1~145の欠失を含む、請求項6に記載の組成物。前記欠失は、配列番号1のヌクレオチド2185~2190を含む、請求項6に記載の組成物。前記変異は、前記糖タンパク質Jのヌクレオチド配列の置換を含む、請求項1または2に記載の組成物。前記置換は、再編成されたILTV配列を含む、請求項17に記載の組成物。対象または集団における伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVの感染を予防する方法であって、1羽以上の対象に弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVを投与することを含み、前記弱毒化ILTVが卵内投与される、方法。前記弱毒化ILTVは、USDAチャレンジ株USDA-chを含む、請求項19に記載の方法。前記弱毒化ILTVは、糖タンパク質Jの変異を含む、請求項19に記載の方法。前記変異は、糖タンパク質Jのタンパク質の発現を阻害する、請求項21に記載の方法。前記変異は、糖タンパク質Jのプロモーターエレメントの変異を含み、前記変異は、前記プロモーターエレメントの機能を阻害する、請求項22に記載の方法。前記変異は、糖タンパク質Jのヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項21に記載の方法。前記変異は、配列番号1の完全なまたは部分的な欠失を含む、請求項24に記載の方法。前記変異は、配列番号1のヌクレオチド1~2291の欠失を含む、請求項25に記載の方法。レポータータンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項24に記載の方法。前記レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質である、請求項27に記載の方法。ウイルスタンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項24に記載の方法。前記ウイルスタンパク質発現カセットは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質Fである、請求項29に記載の方法。前記変異は、配列番号1のヌクレオチド1~2188の欠失を含む、請求項25に記載の方法。レポータータンパク質発現カセットが、前記欠失点に挿入される、請求項24に記載の方法。前記レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質である、請求項32に記載の方法。前記変異は、配列番号1の少なくともヌクレオチド1~145の欠失を含む、請求項25に記載の方法。前記欠失は、配列番号1のヌクレオチド2185~2190を含む、請求項25に記載の方法。前記変異は、前記糖タンパク質Jのヌクレオチド配列の置換を含む、請求項21に記載の方法。前記置換は、再編成されたILTV配列を含む、請求項36に記載の方法。対象において免疫応答を誘発する方法であって、前記対象に弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVを投与することを含み、前記弱毒化ILTVが卵内投与される、方法。糖タンパク質Jの変異を含む弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVを含むワクチンであって、卵内ワクチンである、ワクチン。弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVを含むワクチンであって、卵内ワクチンである、ワクチン。トリ対象の集団の伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVに対する集団免疫を高める方法であって、前記集団の1羽以上の対象を生じる1つ以上の卵に弱毒化ILTVを卵内投与することを含む、方法。前記弱毒化ILTVは、糖タンパク質Jの変異を含む、請求項40に記載の方法。糖タンパク質Jの変異を含む組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムであって、前記変異は、配列番号1のヌクレオチド1~2291の欠失である、ゲノム。配列番号1の少なくともヌクレオチド1~145の欠失を含む、組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノム。配列番号1のヌクレオチド2185~2190を含まない、組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノム。糖タンパク質Jの遺伝子に部分的または完全な欠失を有する組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む卵内ワクチン製剤。伝染性喉頭気管炎ILTは、ニワトリ、キジ、およびクジャクの気道のウイルス感染症である。鳥類の間で急速に広まり、感受性家禽に高い死亡損失率をもたらし得る。シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウは、この疾患には罹患しないが、それらはウイルスを伝播し得る。この疾患の病原体は、体系的にトリヘルペスウイルス1型と称される伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVである。ILTVの主な複製部位は、喉頭、気管、および結膜である。あえぎ、咳、血痰の喀出、および窒息等の呼吸症状として重度の臨床徴候が観察される。他の臨床徴候は、結膜炎および体重減少、ならびに産卵率の低下である。ILTVは、ヘルペスウイルス科アルファヘルペスウイルス亜科のイルトウイルス属のプロトタイプメンバーとして分類されている。過去50年間、この疾患は、バイオセキュリティ、およびニワトリ胚ニワトリ胚由来、CEOワクチンまたは組織培養物組織培養物由来、TCOワクチンのいずれかにおける連続継代により弱毒化した生ワクチンを用いたワクチン接種によって主に制御されていた。CEOワクチンは、現場での大流行を制限するのに効果的であることが証明されているが、ニワトリにおける継代の間に増加し得る残留毒性を保有する。現場において、CEOワクチンの無制限な使用、および粗雑な噴霧によるまたは飲料水を介した不良な集団ワクチン接種が、ワクチン株に毒性を回復させ、ILTの深刻な大流行を引き起こしてきた。より最近では、それらが伝染しないことおよび毒性復帰がないことから、ILTVの糖タンパク質遺伝子を担持するシチメンチョウのヘルペスウイルスおよび弱毒化鶏痘ウイルス等のウイルスベクターの使用が、より安全なワクチン接種の代替手段を提供してきた。しかしながら、1つまたは2つのILTV遺伝子の発現は、極度のチャレンジに耐えるために必要とされる完全な免疫を提供しない可能性がある。さらに、これらの組換えウイルスのいずれも、ILTVの主な感染部位である気道上皮内では複製しない。ウイルス感染の原発部位における粘膜免疫が、この疾患からの保護において重要な役割を果たす可能性が高い。より効果的なILTVワクチンの開発のための別のストラテジーは、非必須遺伝子の所定の欠失によって生の弱毒化ILTVワクチンを操作することである。構造糖タンパク質をコードするウイルス遺伝子は、免疫原性タンパク質であり、かつウイルスの付着、侵入、形態形成、および細胞間移行のプロセスに関与しているため、欠失の標的であり、そのため、それらの欠失は弱毒化をもたらす可能性が高い。また、1つ以上の糖タンパク質が不足する弱毒化ILTV変異体は、ワクチン接種した動物からの感染の血清学的鑑別を可能にするマーカーワクチンとして用いることができる。ILTVのgEおよびgI相同体をコードする遺伝子の欠失は、複製を行わない組換えウイルスを生じさせるため、ILTVの複製には2つの糖タンパク質が必須であることが示唆される。しかしながら、gC、gG、gJ、gM、およびgNをコードするILTV遺伝子は、ウイルスゲノムから良好に欠失され、ニワトリにおける様々な程度のインビトロ複製欠損および異なるレベルの弱毒化を伴う変異体をもたらした。予測された12のILTVの糖タンパク質のうち、gCおよびgJのみがILTV特異的モノクローナル抗体MAbによって認識された。MAbの1つのグループが、単純ヘルペスウイルス1型HSV-1糖タンパク質CのILTV相同体であることが示された60kDaのタンパク質を認識した。MAbの別のグループは、ILTVゲノムの固有の短いゲノム領域内に位置するオープンリーディングフレームORF5によってコードされ、したがってUS5と称される、HSV-1のgJの位置的な相同体を認識した。ILTVのgJは、スプライスおよび非スプライスmRNAから、85、115、160~200kDaの分子量に及ぶいくつかの形態で発現される。実験的感染の間、糖タンパク質JおよびCに対する抗体は、早期に、gBおよびgEに対する抗体よりも相対的に多い量で検出された。gJおよびgCをコードする遺伝子を持たない組換えウイルスが構築されており、これらの2つの主要な抗体誘導性の糖タンパク質は、ウイルスのインビトロ複製に不可欠ではないことが示唆される。gC変異体のインビトロ複製は、野生型親株およびgCレスキューウイルスに相当するものであった。インビボでのgC変異体ウイルスは、いくらかの毒性を保持し、疾患からの効果的な保護を誘発し、チャレンジ後のウイルス排出量を有意に減少させた。毒性ILTV株から構築したgJ変異体Fuchsetal.,2005J.Virol.792:705-716は、野生型ウイルスlog106.5pfu/mlおよびgJレスキューウイルスlog106.8pfu/mlと比較して、力価log105.7pfu/mlの有意な低下を示した。ニワトリにおいて、gJ変異体は有意に弱毒化され、チャレンジウイルスを排出することなく完全な保護を誘発した。しかしながら、完全な保護を誘発するためには、gJ欠失変異体が高用量で気管内に接種されなければならなかった。改変された伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVおよびそれを使用する方法を本明細書に提供する。例えば、弱毒化ILTVが提供される。弱毒化ILTVは、トリ種において免疫応答を誘発するために使用することができる。任意選択的に、弱毒化ILTVは、トリ対象またはトリ対象の集団にワクチン接種するために使用することができる。任意選択的に、弱毒化ILTVは、トリ集団の個体へと孵化する鳥卵に卵内投与される。1回以上のそのような卵内投与を使用して、トリ集団の免疫を高めることができる。トリ対象は、いずれのトリ種であってもよい。例えば、対象は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、キジ、ウズラ、ヤマウズラ、ホロホロチョウ、ダチョウ、エミュー、またはクジャク、ならびにいずれの他の商業的に加工されるトリおよび/あるいはいずれのトリまたはそれらの卵単数もしくは複数であってもよい。弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVは、糖タンパク質Jの変異を含み得、変異は、糖タンパク質Jの発現を阻害する。任意選択的に、変異は、糖タンパク質Jのタンパク質の発現を阻害することができる。例えば、変異は、糖タンパク質Jのプロモーターエレメントの変異を含み、変異は、プロモーターエレメントの機能を阻害する。また、例示的な変異は、糖タンパク質Jのヌクレオチド配列の完全なまたは部分的な欠失、例えば、配列番号1の欠失等も含み得る。任意選択的に、変異は、配列番号1のヌクレオチド1~2291の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号1のヌクレオチド1~2188の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号1の少なくともヌクレオチド1~145の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号1のヌクレオチド2185~2190を含まない。欠失にはレポータータンパク質発現カセットを挿入することができる。レポータータンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質であってもよい。欠失にはウイルスタンパク質発現カセットを挿入することができる。ウイルスタンパク質カセットは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質Fであってもよい。任意選択的に、糖タンパク質Jの変異は、糖タンパク質Jの置換を含み得る。置換は、例えば、再編成されたILTV配列を含み得る。再編成されたILTV配列とは、野生型と同じ数のヌクレオチドが存在し、したがって、ヌクレオチドが野生型ILTV配列と異なる順序でちょうど編成されるように、置換が、ゲノムの一部を移動させるための当該技術分野で既知の方法によって操作されたILTV配列のみを含有することを意味する。これにより、糖タンパク質Jの発現の欠如がもたらされ、外来DNAは、弱毒化ILTV内に導入されない。また、卵内での使用のために構成される、弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVを含むワクチンも提供される。卵内投与が使用される場合、限定されないが、気胞、卵白、絨毛尿膜、卵黄嚢、卵黄尿膜、羊膜を含む鳥卵の任意の領域に、またはトリの胎仔に直接的に組成物を導入することができる。例示的なワクチンは、糖タンパク質Jの変異を有する弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVを含む。任意選択的に、糖タンパク質Jの遺伝子に欠失を有する組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスゲノムを含む卵内ワクチン製剤が提供される。また、弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルスILTV、孵化卵に弱毒化ILTVを投与するための手段、および鳥卵に弱毒化ILTVを卵内投与するための指示を含み得るキットも提供される。改変された伝染性喉頭気管炎ウイルスを使用する方法は、対象または集団における伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVの感染を予防する方法であって、1羽以上の対象に弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVを投与することを含み、弱毒化ILTVが卵内投与される、方法を含む。弱毒化ILTVは、任意選択的に、部分的または完全な糖タンパク質Jの変異を含み得る。例えば、変異は、糖タンパク質Jのタンパク質の発現を阻害することができる。また、変異は、糖タンパク質Jのプロモーターエレメントの変異も含み得、変異は、プロモーターエレメントの機能を阻害する。また、例示的な変異は、糖タンパク質Jのヌクレオチド配列の欠失、例えば、配列番号1の欠失等も含み得る。任意選択的に、変異は、配列番号1のヌクレオチド1~2291の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号1のヌクレオチド1~2188の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号1の少なくともヌクレオチド1~145の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号1のヌクレオチド2185~2190を含まない。欠失点にはレポータータンパク質発現カセットを挿入することができる。レポータータンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質であってもよい。欠失にはウイルスタンパク質発現カセットを挿入することができる。ウイルスタンパク質カセットは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質Fであってもよい。任意選択的に、糖タンパク質Jの変異は、糖タンパク質Jの置換を含み得る。置換は、例えば、再編成されたILTV配列を含み得る。対象において免疫応答を誘発する方法は、対象に弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVを投与することを含み、弱毒化ILTVが卵内投与される。また、トリ対象の集団の伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVに対する集団免疫を高める方法であって、集団の1羽以上の対象を生じる1つ以上の卵に弱毒化ILTVを卵内投与することを含む方法も提供される。弱毒化ILTVは、糖タンパク質Jの変異を含み得る。また、例示的な変異は、糖タンパク質Jのヌクレオチド配列の部分的または完全な欠失、例えば、配列番号1の欠失等も含み得る。任意選択的に、変異は、配列番号1のヌクレオチド1~2291の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号1のヌクレオチド1~2188の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号1の少なくともヌクレオチド1~145の欠失を含む。任意選択的に、変異は、配列番号1のヌクレオチド2185~2190を含まない。また、CK細胞およびニワトリ胚において好適な力価まで成長し、18日齢の発育SPF卵の卵内接種後のチャレンジからの完全な保護を誘発する、糖タンパク質Jの欠失変異体も提供される。記載される組成物およびワクチンは、好適な担体と、有効量の記載される改変された例えば、組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスのうちのいずれかとを含み得る。化合物およびワクチンは、不活化組換えウイルスまたは生の組換えウイルスのいずれかを含有してもよい。組換えウイルスに好適な担体は、当該技術分野において周知であり、タンパク質、糖類等を含む。そのような好適な担体の一例は、タンパク質加水分解物、乳糖等の1つ以上の安定化剤を含有する生理学的に平衡な培養培地である。また、アジュバントがワクチンの担体の一部であってもよい。生ワクチンは、組織培養液を用いて、安定化作用のあるタンパク質加水分解物等の安定化剤を加えることによって作製することができる。不活化ワクチンは、ウイルスの不活化直後に組織培養液を使用することができる。本明細書に記載される組成物およびワクチンは、いずれの好適な経路によって投与されてもよい。例えば、組成物およびワクチンは、卵内に、経口的に、非経口的に例えば、静脈内に、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、器官への直接的な注射によって、経皮的に、体外的に、局所的に局所鼻腔内を含む等、および気管内に投与することができる。ワクチンおよび組成物は、呼吸器系または眼等のいずれの器官系に適用されてもよい。卵内での投与またはワクチン接種は、卵の殻を貫通する任意の手段を用いて免疫原性組成物を導入することにより、生きた発育中の胚を含有する鳥卵に免疫原性組成物例えば、ワクチンを投与することを含む。そのような投与の手段は、限定されないが、免疫原性組成物の卵内注射を含む。記載される組成物を卵内に導入するために、卵内注射、卵の殻を通した高圧噴霧、および組成物を担持する微粒子を用いた卵の弾道衝撃を含む任意の好適な方法を使用することができる。いくつかの例において、記載される組成物は、筋肉等のトリの組織内に水溶性の薬学的に許容される溶液溶液は沈着される組成物を含有するを沈着させることによって投与することができる。卵内注射が使用される場合、注射の機序は重要ではないが、その方法は、処置が孵化率を低下させないように、胚またはそれを取り囲む胚体外膜の組織および器官を過度に損傷しないことが好ましい。卵内投与には、任意選択的に改変されたILTVを収容する注射器を備える好適なデバイスを使用することができ、注射器は、卵にILTVを注射するように位置付けられる。さらに、必要に応じて、卵に注射した後でその穴を密封するために、注射装置と動作可能に関連する密封装置が提供されてもよい。投与される改変されたILTVを含む組成物の適切な体積および投与量は、当業者によって容易に決定され得る。ワクチン接種等の治療的処置は、対象に治療的有効量の本明細書に記載される組成物を投与することを含む。有効量および有効投与量という用語は交換可能に使用される。有効量という用語は、所望の生理学的反応例えば、感染性喉頭気管炎からの部分的もしくは完全な保護、または対象における免疫応答の誘発を生じさせるために必要な任意の量として定義される。組成物を投与するための有効量およびスケジュールは、経験的に決定されてもよい。投与のための用量域は、所望の効果を生じさせるために十分に大きい用量域である。投与量は、有害な副作用を引き起こすほど大量であるべきではない。卵内投与が使用される場合、卵のサイズ等の要因に応じて、投与量を調節することができる、一般的に、大きな卵には、小さい卵に対するよりも大きい体積および投与量が投与される。卵内または他の投与経路のための投与量または体積に影響を及ぼし得る他の要因は、限定されないが、ワクチン接種されるトリ種を含む。伝染性喉頭気管炎を予防する方法およびワクチン接種方法は、トリまたはトリの集団において伝染性喉頭気管炎の影響または感染性喉頭気管炎の1つ以上の症状例えば、1つ以上の呼吸器症状、またはトリ間でのILTVの伝染を減少させることを含む。有効性は、確立された伝染性喉頭気管炎の重症度または伝染性喉頭気管炎の1つ以上の症状における、または個々のトリもしくはトリの集団がILTVに感染するかもしくはILTVへの曝露後に伝染性喉頭気管炎の症状が現れる速度における、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100の減少を意味し得る。以下の実施例は、本明細書において請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および/または方法が、どのように作製され、評価されるかの完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、純粋に本発明の例示であることが意図され、それらが添付の特許請求の範囲に含まれる場合を除いて、またその程度まで、発明者が彼らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。2つのgJ陰性組換えILTVを作製した。これらのウイルスを野生型ウイルスUSDA-chおよび対応するgJレスキュー変異体と比較してインビトロおよびインビボで分析した。gJの発現の分析のために、バキュロウイルスに発現させたgJに対する抗gJウサギ過免疫血清を作製した。ILTVのgJは、ゲノムの短いセグメントに位置するUS5によってコードされ、HSV-1ゲノム内のその位置的な相同体にちなんで名付けられた。ILTVのUS5の推定アミノ酸配列は、オウムヘルペスウイルス1PsHV-1のそれぞれの相同遺伝子ORF2と18の同一性を共有する。ILTVおよびPsHV-1は密接に関連しており、ヘルペスウイルス科アルファヘルペスウイルス亜科のイルトウイルス属の2つの種を意味する。ILTVのgJは、ウマヘルペスウイルスEHV-1およびEHV-4におけるその対応物gJはgp-2と称されると限定された配列相同性を共有する。gp-2は、EHV-1の毒性において重要な役割を果たすことが示された。ILTVのgJは、スプライスおよび非スプライスmRNAから翻訳される後期糖タンパク質として同定されており、SDS-PAGEにおいて4つの高分子量タンパク質として現れる。gJは、感染CK細胞において4つの形態約85、115、160、および200kDaで発現される。gJは、毒性株A489の複製には不要であり、そのA489株由来のgJ陰性変異体は、高用量で気管内に接種されるとニワトリを感染させることができた。ニワトリは、軽度の疾患の徴候のみを示し、チャレンジ感染から保護された。gJがILTVの主要な抗体誘導性抗原であることを意味するという観察の観点から見ると、これは重要な発見であった。ILTVのgJは、ILTに対する遺伝子欠失マーカーワクチンの開発を標的とした。2つのgJ欠失変異体を作製した:一方は、CMV前初期プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質を発現し、他方には、いずれの外来DNAも挿入されていなかった。組換えウイルス変異体の対照として、再構成したgJ遺伝子を有するgJレスキュー変異体も作製した。US5の部分欠失は、両方の欠失変異体ADgJ4.1およびBDgJ3.2におけるgJの発現を完全に無効にし、変異体ADgJ4.1のゲノムへの野生型US5の再導入は、レスキュー変異体gJR4.3におけるgJの発現を再構成した。抗gJMAbおよびウサギ抗gJ血清の両方の蛍光免疫検査法およびウエスタンブロットにおける反応性の欠如から、これらの変異体に保持されたUS5の668bpレムナントからのgJの切断形態の発現は除外された。変異体ウイルス中のgJ以外のウイルス糖タンパクの発現の存在をモニターするための対照として、gCの発現を測定した。図5Eに観察されるように、変異体ADgJ4.1およびBDgJ3.2のいずれかから発現されたgC図5E、レーン5および6は、gJR4.3およびUSDA-chに感染させた細胞によって発現されたgC図5E、レーン3および4と比較して、電気泳動の移動性に若干の低下を示した。gJR4.3はADgJ4.1に由来し、gCはゲノムの大きなセグメントに位置するUL44によってコードされるため、gJ欠失変異体におけるgCの移動性の変化が、ゲノムの固有の短いセグメントにおける相同組換え事象の間に引き起こされた可能性は低い。複製動態実験により、gJ欠失変異体ADgJ4.1およびBDgJ3.2は、gJを発現するウイルスUSDA-ch株、レスキュー変異体gJR4.3よりも複製効率が低かったことが示された。複製動態実験中のいずれの時点においても、gJ欠失変異体に感染させた細胞の上清には、親ウイルスUSDA-chおよびレスキュー変異体gJRよりも100倍低い力価の感染性ウイルスが検出された。gJレスキュー変異体と比較して、gJ欠失変異体は、細胞侵入動態の障害を示さなかったため、糖タンパク質JがILTVのウイルス侵入に関与していないことが示唆された。gJ欠失変異体の平均プラークサイズは、USDA-chまたはgJRウイルスの平均プラークサイズよりも大きかったため、gJ欠失変異体ADgJおよびBDgJが細胞間に広がる能力は損なわれなかった。細胞培養物中のADgJ4.1およびBDgJ3.2の複製と同様に、USDA-chおよびレスキュー変異体gJR4.3と比較すると、発育鶏卵におけるgJ欠失変異体の複製が妨げられた。gJR4.3は、CK細胞よりも10~50倍高い力価に達し、ADgJ4.1の複製は、最初は効率が悪かったが4継代後には向上し、レスキュー変異体gJR4.3107TCID50/mlよりもわずか10倍低い力価106TCID50/mlに達した。一方、CAMにおけるBDgJ3.2の複製は、非常に非効率的であった。結膜/経鼻経路により3週齢のニワトリに投与された時、結膜および気管内のウイルスDNAの欠如によって示唆されたように、gJ欠失変異体は強い弱毒化を示した。ニワトリ胚におけるADgJ4.1の効率的な複製にもかかわらず、偽接種対照と比較した場合に、どちらのgJ欠失変異体も孵化率を低下させなかった。重度のILTVチャレンジ後の臨床徴候の有意な減少によって示唆されるように、両方の変異体が、卵内投与された時に疾患から保護することができた。実施例1:伝染性喉頭気管炎ウイルスILTVの糖タンパク質J欠失変異体の作製:卵内投与後のインビトロ成長特性および保護効率材料および方法細胞およびウイルス以前に記載されたようにTripathy1998,ALaboratoryManualfortheIsolationandIdentificationofAvianPathogens,4thed.初代ニワトリ腎CK細胞を調製し、ウイルスの増殖および組織培養感染量50TCID50として力価を決定するために使用した。10ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ基礎培地DMEMにてニワトリ肝細胞癌細胞株LMHKawaguchietal.,1987CancerResearch,47,4460-4464を培養し、トランスフェクションおよびプラーク精製に使用した。2FBSおよび抗生物質/抗真菌剤Invitrogen,Carlsbad、CA,USAを含有するDMEMにて、感染またはトランスフェクトしたLMH細胞をインキュベートした。細胞は、加湿インキュベーター内で39°C/5CO2でインキュベートした。使用したウイルス株は、USDA標準株USDA-chと、以前に遺伝子型Vとして特徴付けられたOldonietal.,2008AvianDis.52:59-63野外分離株63140/C/08/BRであった。組換えバキュロウイルスの作製および組換えタンパク質の生成にはヨトウガ卵巣細胞株Sf-9を使用した。ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するHyCloneSFX登録商標培地Fisher、Pittsburg,PAにて、Sf-9細胞を28°Cで培養した。組換え糖タンパク質Jの作製および精製使用した全てのオリゴヌクレオチドは、IntegratedDNATechnologiesIDT、Coralville,IA,USAによって合成されたものであり、表1に列挙される。Aクローニング手順に使用した制限酵素B下線部は制限酵素切断配列である。RGS-6xHis配列をコードする配列を小文字で示す。gJのORFの開始コドンおよび終止コドンは太字で記載する。PfxポリメラーゼInvitrogen、Carlsbad,CAおよびプライマーgJfw配列番号2/gJrev配列番号3表1を使用した高忠実度PCRにより、gJ配列番号1をコードするオープンリーディングフレームORFUS5をILTV63140の精製したウイルスDNAから増幅した。ILTVのUS5オープンリーディングフレーム糖タンパク質Jをコードするは、配列番号1である。C末端に位置するRGS-6xHisタグ配列をコードするPCR産物を、真核生物発現ベクターpcDNA3登録商標Invitrogen、Carlsbad,CAおよびバキュロウイルス転移ベクターpFastBacDual登録商標Invitrogen、Carlsbad,CAにクローン化した。製造者の推奨に従ってBac-to-Bac登録商標システムInvitrogen、Carlsbad,CAを使用して、組換えバキュロウイルスを作製した。端的に述べると、pFastBacDual登録商標Invitrogen、Carlsbad,CAからバキュロウイルスバクミドDNAに発現カセットを転位させるために必要なシャトルベクターおよびヘルパープラスミドを含有するE.coliDH10Bac登録商標Invitrogen、Carlsbad,CAに、組換えpFastBacDual登録商標プラスミドを形質転換した。製造者から推奨されるように組換えバキュロウイルスバクミドを選択し、GoTaq登録商標ポリメラーゼPromega、Madison,WIを使用したPCRによって同定した。一旦選択してから、MirusTransIT-Insectaトランスフェクション試薬Roche、Basel,SEを使用して、組換えバキュロウイルスバクミドのDNAをSf-9細胞にトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスを、レスキューし、プラーク精製し、間接免疫蛍光法IFAならびにRGS-6xHisに対するモノクローナル抗体Qiagen、Hilden,DEおよびFITCコンジュゲート抗マウス抗体SIGMA、St.Louis,MOを使用したウエスタンブロットにより分析した。組換えバキュロウイルスの増殖のために、Sf-9細胞を振盪培養器で成長させ、感染多重度m.o.i.1および細胞密度4x106細胞/mlで、72時間28°Cで感染させた。製造者によって提供された指示に従って、Talon登録商標キットClontech、MountainView,CAを使用した固定化金属アフィニティクロマトグラフィーIMACにより、ILTVの感染Sf-9培養物から糖タンパク質Jを精製した。端的に述べると、3000rpm、4°Cで15分間遠心分離することにより細胞を沈降させ、上清を廃棄し、1x完全プロテアーゼ阻害剤Roche、Basel,SEを含有する平衡化バッファーpH8.0、Talon登録商標キット中、2w/vIgepal630SIGMA、St.Louis,MOを含有する溶解バッファーに細胞ペレットを再懸濁した。氷上にて15分間のインキュベーション後、可溶化液を上述のように遠心分離した。予め洗浄したTalon登録商標樹脂を上清に加え、ロッカープラットフォーム上で、室温で1時間インキュベートした。製造者によって推奨されるようにHisタグ化タンパク質の洗浄および溶出を行った。MicroBCAProteinAssayKitPierce、Waltham,MAを使用して溶出したタンパク質のタンパク質濃度を決定した。SDS-PAGEおよびウエスタンブロットにより調製物の同一性および純度を分析した。組換え糖タンパク質Jの過免疫血清の作製UniversityofGeorgiaAthens,GAのPolyclonalAntibodyFacilityユニットで過免疫血清を生成した。端的に述べると、PBS500ulおよび等しい体積の完全フロイントアジュバントに再懸濁した精製糖タンパク質J400μgをニュージーランド白ウサギSPFに注射した。不完全フロイントアジュバントを用いて追加免疫注射を行った。2回の追加免疫注射の後でウサギを失血させ、血清を-20°Cで保存した。相同組換えプラスミドおよび発現プラスミドの構築糖タンパク質JgJの発現を不活性化するために、PfxポリメラーゼInvitrogen、Carlsbad,CA,USAを用いた高忠実度PCRによりウイルスDNA断片を増幅した。それぞれEcoRIおよびXmaI制限酵素RE切断部位を含有するプライマーgJdel5’FW/gJdel5’REV表1、図1cを使用して、US5の上流に位置する1375bp断片を増幅した。gJの3’コード領域は、糖タンパク質DgDの下流コード領域US6と部分的に重複しているため、gDの発現の不活性化を避けるようにgJのコード配列は完全には欠失させなかった図1。SphIおよびHindIIIRE切断部位を含有するプライマーgJdel3’FW/gJdel3’REV表1、図1cを使用して、US52958bpの3’末端からの658bpおよびUS61305bpの5’末端からの1191bpを含有する1844bp断片を増幅した。BamHIおよびNotIを用いた制限酵素消化によりEGFPのORFをプラスミドpEGFP1Clontech、MountainView,CA,USAから切除し、適切に消化されたpcDNA3Invitrogen、Carlsbad,CA,USAにサブクローン化してpcEGFPを得た。LMH細胞中の一過性トランスフェクションおよび蛍光顕微鏡法によりpcEGFPの機能性を検査した。XmaIRE切断部位表1を含有するプライマーEGFPexFW/EGFPexREVを使用して、CMVプロモーター、EGFPのORF、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列からなるEGFP発現カセットを、Pfxポリメラーゼとともに増幅した。1375bpの5’PCR産物をEcoRIおよびXmaIで切断し、EGFP発現カセットをXmaIおよびSphIで切断し、1844bpの3’末端PCR産物をSphIおよびHindIIIで切断した。断片をゲル精製し、EcoRI/HindIIIで切断したpUC19DNAに連結した。この組み合わされた4898bpインサートを含有する組換えプラスミドpU-EGFPdeltagJをクローン化し、制限消化、一過性トランスフェクション、および蛍光顕微鏡法により分析した。gJレスキュー変異体を作製するために、PfxポリメラーゼInvitrogen、Carlsbad,CAならびにプライマーgJrescFWおよびgJrescREV表1、図1cを使用した高忠実度PCRにより、US4、US5、およびUS6を包含するUS領域の5483bp断片図1をウイルスDNAから増幅し、XmaIを用いた制限消化およびアガロースゲル精製後に、XmaIで切断したpUC19にクローン化した。制限酵素分析により組換えプラスミドを分析し、配列を確認したpU-gJresc。挿入された外来DNA配列を持たないgJ欠失変異体を作製するために、それぞれXmaIおよびEcoRIRE断部位を有するgJrescFWおよびgGrevプライマー表1、図1fを使用した高忠実度PCRにより、US4を含む上流US5の1384bp断片を増幅した。次に、EcoRIおよびXmaIを含有するプライマーgDpfwおよびgJrescREV表1、図1fを使用して、US5の3’部分およびUS6の一部を包含する1937bp断片を増幅した。XmaIおよびEcoRIで2つのPCR断片を切断し、XmaIで切断したpUC19に連結し、大腸菌NEB5-αNewEnglandBiolabs、Ipswich,MAに形質転換した。制限消化および配列決定により組換えプラスミドを分析し、1つのプラスミドpU-deltagJを選択した。ウイルスDNAとのコトランスフェクション後にウイルスレスキューにおけるヘルパータンパク質として使用するために、それぞれBamHIおよびNotI制限部位を特定するプライマーUL48fwおよびUL48rev表1を使用した高忠実度PCRにより、精製したウイルスDNAからILTVのUL48相同体をコードするオープンリーディングフレームORFを増幅した。1211bpのPCR産物をBamHIおよびNotIとともにインキュベートし、適切に切断したpcDNA3にクローン化した。制限消化および配列決定により組換えプラスミドpcUL48を分析した。ILTVのICP4pRcICP4をコードする真核生物発現プラスミドを使用した。ILTVのgJ欠失変異体の作製82667xg、4°Cで1時間遠心分離することにより、感染CK細胞培養物の上清からUSDAチャレンジ株USDA-chからのビリオンを沈降させた。標準的なフェノールクロロホルム抽出法によりウイルスDNAを調製し、EcoRIを使用した酵素消化により分析した。Mirus登録商標mRNATransfectionKitRoche、Basel,SEを使用して、1、2、3、4、5、または6μgのウイルスDNA、0.5μgの各ヘルパープラスミドpRcICP4、pcUL48、および1μgの組換えプラスミドpU-EGFPdeltagJ、pU-gJresc、またはpU-deltagJのいずれかとともにLMH細胞にコトランスフェクトした。細胞変性効果CPEを示すトランスフェクト培養物を培地に掻き入れ、異なる希釈度でLMH細胞を感染させるために使用した。倒立型蛍光顕微鏡Axiovert登録商標40CFL、CarlZeissMicroImaging,Inc.Thornwood,NY,USAを使用して培養物を検査し、観察下で100μlピペットを使用して緑色蛍光プラークを吸引した。採取したプラークを100μlのDMEM/2FBSに再懸濁し、LMH細胞の感染に使用した。2回の連続継代で蛍光を示さないプラークが観察されなくなるまでプラーク精製を繰り返した。QiAmp登録商標DNABloodMiniKitQiagen、Hilden,DEを使用して、感染細胞培養物からPCRによる分析のためのDNAを調製した。間接免疫蛍光法モノクローナル抗体、ニワトリおよび/またはウサギ血清を用いて感染LMH細胞の二重免疫蛍光を行い、レスキュー変異体において、欠失変異体によるgJの発現の欠如およびgJの発現の再構成を確認した。端的に述べると、チャンバースライドにLMH細胞を播種し、感染多重度m.o.i.0.05で、USDA-ch、ADgJ4.1、およびgJR4.3に感染させた。72時間後、感染後細胞を氷冷エタノールで固定し、gJmab25-5またはgCmab28-5に特異的なモノクローナル抗体を使用する免疫蛍光のために処理した。ILTVに感染させたニワトリの回復期血清またはgJウサギ過免疫血清を2種抗体として使用して二重免疫蛍光を行った。リン酸緩衝生理食塩水PBS中、抗gJおよびgCMAbを1:100に希釈し、ポリクローナル血清ILTVニワトリ回復期血清、gJウサギ過免疫血清を1:200に希釈した。一次抗体とともにインキュベートした後、細胞をPBSで3回洗浄し、二次ヤギ抗マウスCy5コンジュゲート抗体を使用してMAbの結合を可視化し、ヤギ抗種FITCコンジュゲート抗体SIGMAとのインキュベーションにより、結合したニワトリおよび/またはウサギ抗体を可視化した。0.001のエバンスブルーを含有するPBS中で二次抗種抗体を希釈し、1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、蒸留水で手早くすすいでから空気乾燥し、2.5の1,4ジアザビシクロ[2.2.2]オクタンDABCO/90グリセロール中で免疫応答を開始させた。Axiovert登録商標40CFL蛍光顕微鏡CarlZeissMicroImagingGmbH、Jena,Germanyを使用した従来の蛍光顕微鏡法、または共焦点レーザー走査顕微鏡LSM510CarlZeissMicroImagingGmbH、Jena,Germanyを使用した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡法のいずれかによりスライドを調べた。ウエスタンブロットCK細胞をUSDA-ch株またはADgJ4.1変異体にm.o.i.0.01で感染させた。感染後3~4日目に、大半の細胞が剥離した時に、低速遠心分離2000xg、10分、4°Cにより培地から細胞片を除去した。82667xg、4°Cで60分の超遠心分離法により上清からビリオンを沈降させた。MicroBCAProteinKitPierce、Waltham,MAを使用してタンパク質濃度を決定した。20mMTris-ClpH7.4、1mMEDTA、1x完全プロテアーゼ阻害剤Roche、Basel,SEおよび0.5vol3N-ラウリルサルコシネートを含有する150mMNaCl、75mMTris-ClpH8.0、25mMEDTA中に沈降物を溶解した。1レーン当たり30μgのタンパク質をローディングし、SDS-10ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEにより還元条件下で分離し、TransblotSDTransferCellBioRad、Hercules,CA,USAを22Vで80分間使用して、25mMTris、150mMグリシン、10メタノール中、半乾燥エレクトロトランスファーによりニトロセルロース膜に移した。TBS-TTris3.0g、NaCl8.8g、KCl0.2g/L、pH7.4中の5脱脂粉乳中、一晩4°Cで膜をブロックした。TBS-TにMAbを1:500に希釈し、ウサギ抗gJ過免疫血清を1:1000に希釈し、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、TBS-Tで10分間、3回膜を洗浄し、TBS-T中の5脱脂粉乳で再びブロッキングしてから、TBS-Tに希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼHRPコンジュゲート抗種抗体SIGMAとともに室温で2時間インキュベートした。TBS-T中で3回洗浄した後、ImmobilonWesternHRPSubstrateMillipore、Billerica,MA,USAを使用した化学発光により固定化HRPを検出した。KodakGelLogicImagingSystemCarestreamHealth、NewHaven,CT,USAを使用して化学発光を可視化した。ウエスタンブロットにより、変異体に感染させた細胞におけるgJの欠如、およびレスキュー変異体に感染させた細胞におけるgJの発現の再構成も検査した。端的に述べると、CK細胞をm.o.i.0.1でUSDA-ch、gJR4.3、BDgJ3.2、およびADgJ4.1に感染させた。感染細胞は、SDS-PAGEサンプルバッファーに感染後48時間溶解させた。SDS-PAGEgCは10ポリアクリルアミド、gJは7.5により同様の量を分離し、エレクトロトランスファーによりニトロセルロース膜に移した。ウサギ抗gJ過免疫血清、またはgJおよびgCに特異的なMabのいずれかでブロットをプローブした。変異体ウイルスおよび野生型ウイルスの複製および侵入動態2段階複製動態試験を行って、gJの発現の欠如がウイルス変異体のインビトロ複製に影響を与えたかどうかを決定した。端的に述べると、CK細胞をUSDA-ch、ADgJ4.1、BDgJ3.2、およびgJR4.3にm.o.i.0.01で感染させた。60分間39°Cで吸着後、細胞から接種材料を除去し、培養液で洗浄し、DMEM/2FBS/抗生物質で細胞の表面を覆い、39°Cでインキュベートした。感染後0、24、48、および72時間目に上清を回収し、CK細胞上のTCID50としてウイルス力価を決定した。USDA-chおよびgJレスキュー変異体と比較してgJ欠失変異体のウイルス侵入に異常があるかどうかを評価するために、3つの変異体ウイルスおよび親ウイルスUSDA-chの各々の500プラーク形成単位pfuを、氷上で60分間、6ウェルプレート内のLMH細胞に吸着させた。接種材料を除去し、加温した培養液で細胞の表面を覆い、39°Cでインキュベートした。5、10、20、40、および60分後、pH3.0のクエン酸バッファー40mMクエン酸、10mMKCl、135mMNaClとともに室温で1分間インキュベートすることにより細胞外ウイルスを不活化し、DMEM/2FBS/抗生物質で1回洗浄し、最後に0.5メチルセルロース、2FBS、および抗生物質を含有するMEMで表面を覆った。感染後5日目に、PBS中の5ホルムアルデヒドで細胞を固定し、50エタノール中の1クリスタルバイオレットで染色した。プラークを数え、異なる時点での数を60分の時点でのそれぞれのプラーク数のパーセンテージとして表し、異なる時間に対してプロットした。ニワトリ胚における変異体および野生型ウイルスの増殖発育卵におけるgJ変異体ADgJ4.1およびBDgJ3.2の複製を評価するために、9日齢ニワトリ胚のCAMに、104TCID50を含有するADgJ4.1およびBDgJ3.2をそれぞれ100μl接種した。37°Cで5日間卵をインキュベートし、CAMを回収し、FastPrep登録商標SystemMPbiomedical、Solon,OHを使用して細胞培養培地にてホモジナイズした。上清の力価を初代CK細胞上のTCID50として決定した。上清の残りは、上述のように、9日齢ニワトリ胚のCAM上で連続継代のために使用した。変異体の結膜/経鼻接種およびチャレンジ実験4週齢SPF白色レグホン種ニワトリに、結膜/経鼻経路を介して104TCID50の変異体ADgJ4.1およびBDgJ3.2、ならびにUSDA野生型株USDA-chを接種して、ウイルス変異体の毒性を評価した。同時期に孵化した雛hatchmateの1グループには、対照として細胞培養培地を偽接種した。臨床徴候を毎日モニターし、接種後1~6日目まで、以前に記載されたように0~5のスケール上でOldonietal.,2009AvianDis.52:59-63スコア化した。ILTV変異体を接種したニワトリがチャレンジ感染から保護されたかどうかを決定するために、接種から3週間後に、感染ニワトリおよび対照ニワトリに、生まれたトリ当たり104TCID50のUSDA株を結膜および経鼻経路を介してチャレンジした。チャレンジ後6日目まで臨床徴候をモニターし、上述のようにスコア化した。定量PCR最初の接種から4日目に拭き取り検体を回収し、QiAmp登録商標DNABloodMiniKitQiagen、Hilden,DEを使用して処理した。記載されるようにCallisonetal.,2007AvianDis.50:50-54、リアルタイムPCRによりウイルスゲノムのコピーを定量化した。変異体の卵内接種およびチャレンジ実験発育卵におけるgJ変異体の弱毒化レベルを決定するために、25個の18日齢SPF胚SunriseFarms、Catskill,NY,USAにADgJ4.1またはBDgJ3.2のいずれかを接種した。第3のグループの胚には、滅菌細胞培養培地を偽接種した。接種した卵をさらにインキュベートし、孵化率を決定した。孵化から35日後、結膜および経鼻経路により、接種されるニワトリ当たり105TCID50の用量でUSDA-ch株をニワトリにチャレンジした。チャレンジ後7日目まで、Oldonietal.,2009AvianDis.52:59-63によって以前に記載されたように0~5のスケール上で臨床徴候をスコア化した。結果組換え糖タンパク質Jの発現Sf-9細胞中の組換えバキュロウイルスから発現された精製gJをSDS-7.5PAGEにより分離し、クマシーブルー染色およびウエスタンブロット図2により分析した。クマシーブルーで染色したゲルに複数の高分子量タンパク質が観察された図2、レーン1。並行して行ったウエスタンブロットでは、抗RGS-6xHisMabが同様のタンパク質に結合し、RGS-6xHis配列レーン2の存在が確認された。抗gJMAbレーン3およびILTVに感染させたニワトリレーン4の回復期血清は、どちらも約80、100、140、および180kDaの4つのタンパク質に結合した。また、ニワトリ血清は、約60kDaおよび40kDaのタンパク質を認識した。組換え糖タンパク質Jは、精製プロセスの間に著しく濃縮されたものの、ゲルのクマシー染色により、なおも細胞タンパク質が検出されたレーン1。しかしながら、組換えgJタンパク質調製物を用いた3回の免疫付与により特異的なウサギ過免疫血清が生じたため、gJ欠失変異体を特徴付けるために免疫蛍光およびウエスタンブロットに使用した図2。gJ欠失変異体の作製USDAチャレンジ株USDA-chからのDNAをプラスミドpU-EGFPdeltagJならびにヘルパープラスミドpRcICP4およびpcUL48とともにコトランスフェクトした。トランスフェクションから5日後、緑色蛍光を示したいくつかの個別のプラークを、倒立型蛍光顕微鏡を使用して単離した。LMH細胞において3つのプラークを連続的に2回プラーク精製した。緑色蛍光プラークのみの子孫を生成したプラークだけを選択し、その後増殖させた。EGFPをコードするクローンADgJ4.1に感染させた細胞からのウイルスDNAをPCRにより分析し、相同組換えの正確性を確認した図3。ILTVの野生型DNAを対照として使用した。CMVCMVprevプロモーターに結合する逆方向プライマーおよびgGのORFであるUS4の上流に位置する配列に相補的な順方向プライマーgGupfwは、予想された2378bp産物を生成し図1および図3A、EGFPのORFEGFP578fwに相補的な順方向プライマーおよびUS7の下方領域に相補的な逆方向プライマーClaIgIrev図1および図3Aは、予想されたように2480bp産物を増幅した。この結果から、ゲノムの標的領域にEGFP発現カセットの挿入が起こったことが示唆された。変異体ウイルスADgJ4.1調製物中に野生型ウイルスDNAが存在しないことを検証するために、両方のウイルスゲノムに結合するが、組換え配列の外側にあるプライマーを用いてPCR分析を行った。USDA-chおよびADgJ4.1DNAを鋳型として使用した時に、BamHIgGfwおよびgJ2381revプライマー図1、表1は、それぞれ3015bpおよび2215bp断片を増幅した図3B。この結果から、短いPCR断片によって示唆されるように、標的部位に短いDNA配列が存在していたことが示された。標的インサートの同一性を検証するために、両方のPCR断片をBamHIで消化した。ADgJ4.1から得られた2215bpのPCR産物をCMVプロモーターとEGFPのORFとの間に位置するBamHI部位で切断して1346および869bpの2つの断片を得た一方で、USDA-chのDNAからのPCR産物はインタクトな状態のままにした図3C。変異体および野生型DNAの配列を確認するために、PCRに使用したプライマーを、ADgJ4.1および野生型DNAからのPCR産物を部分的に配列決定するためにも使用した。いずれの外来DNAも担持しない不活性なgJ遺伝子を有するILTV変異体を作製するために、gJ欠失変異体ADgJ4.1を発現するEGFPをCK細胞上で増殖させ、ビリオンを精製し、ウイルスゲノムDNAを調製した。ヘルパープラスミドおよび組換えプラスミドpU-deltagJとのLMH細胞のコトランスフェクション後、いくつかの非蛍光プラークを単離し、プラーク精製して増殖させた。この場合、選択基準は、緑色蛍光が存在しないことであった。これらのウイルスプラークのうち3つを精製し、BDgJ1.1、BDgJ3.1、またはBDgJ3.2と名付けた。BDgJクローンからウイルスDNAを調製し、PCRにより分析した。プライマーBamHIgGfwおよびgJ2381revは、BDgJウイルスDNAでは830bp断片、およびUSDA-ch野生型DNAでは3015bp断片を生成した図1Gおよび図3D。PCRプライマーを使用して両方のDNA断片から得られた配列から、両方の断片の同一性が確認された。次に、gJの発現が回復されたレスキュー変異体を作製した。ADgJ4.1からのウイルスDNAをpU-gJrescおよびヘルパープラスミドとのコトランスフェクションに使用した。pU-gJrescのインサートを用いた変異体ウイルスDNAの組換えにより、USセグメント内の変異部分を修復してUS5を完全に回復し、野生型ウイルスと同一の変異体がもたらされることが予想された。ここでも同様に非蛍光プラークを選択し、ウイルスをプラーク精製して増殖させた。gJR1.3、gJR2.4、またはgJR4.3と名付けられた3つのプラークからウイルスDNAを調製し、PCRにより分析した。プライマーBamHIgGfwおよびgJ2381revを使用した増殖により、予想されたようにgJRクローン4.3およびUSDA-chのDNAから3015bp断片が生成されたことから図1Gおよび図3E、組換えプラスミドpU-gJrescの正しい挿入が示唆された。クローン1.3および2.4からのDNAからはPCR産物は得られず、その後これらのウイルスは破棄された。US5の部分欠失はgJの発現を無効にするADgJ4.1変異体によるgJの発現の欠如およびレスキュー変異体gJR4.3におけるgJの発現の再構成を、二重免疫蛍光および共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡法により測定した図4。陽性対照としてLMH細胞をUSDA-chに感染させた。感染細胞は、抗gCMAbおよび抗gJMAbに陽性シグナルCy5-蛍光を示した。Cy5-蛍光は、ポリクローナルニワトリ抗ILTV血清FITC-蛍光と反応した細胞にのみ存在したことから、蛍光の特異性が確認された図4A。また、gJ欠失変異体ADgJ4.1に感染させた細胞は、ILTV感染ニワトリからの抗体およびgCmabとも結合したが、gJmabとは結合しなかった図4Bことから、gJを発現することができない組換えILTVの存在が示唆された。次に、LMH細胞をレスキュー変異体gJR4.3に感染させた後、gJの発現の有無について調べた。感染細胞における抗gCMAbCy-5蛍光およびウサギ抗gJ抗血清FITC-蛍光を使用した二重免疫蛍光により、gJの発現の再構成が確認された図4C。さらに、ウエスタンブロットによりADgJ4.1ビリオン中にgJが存在しないことが測定された図5。抗gJMAbは、約85、115、および160kDaのUSDA-chビリオンからの高分子量タンパク質と反応した図5A。約85、115、および200kDaのタンパク質が489ILTV株のビリオンにおいてgJとして同定された前回の報告とは対照的に、gJの200kDa形態は、USDA-ch株の精製ビリオンにおいて最初は検出されなかった。抗gJMAbは、ADgJ4.1ビリオンタンパク質のうちのいずれとも反応しなかった。対照的に、抗gCMAbは、USDA-ch株およびgJ欠失変異体ADgJ4.1の両方のビリオン調製物において約65kDaのタンパク質と反応した図5B。抗gJMAbがADgJ4.1のビリオン調製物と結合しなかったことは、対応するエピトープが存在しなかったことを示すものである。したがって、USDA-chおよびADgJ4.1のビリオン調製物のウエスタンブロットも、ポリクローナル血清、抗gJウサギ過免疫血清でプローブした。ADgJ4.1のビリオンタンパク質との結合は検出されなかったが、反対に、USDA-chビリオン調製物において85、115、および160kDaの3つのgJ種との強い反応が観察された図5C。特異性対照としての役割を果たす同じウサギからの免疫前血清を用いたインキュベーションは、非常にかすかな非特異的反応をもたらした。USDA-chのビリオン調製物、ならびにUSDA-ch、ADgJ4.1、BDgJ3.2、およびgJ-レスキューウイルスgJR4.3に感染させたCK細胞培養物のウエスタンブロットも、ポリクローナルウサギ抗gJ血清を用いてgJの存在について検査した図5D。未感染CK細胞は、陰性対照としての役割を果たした。高分子量タンパク質の検出に有利なように電気泳動および導入条件を調節することにより、異なる形態のgJの外観の解像に成功した。ポリクローナルウサギ血清は、USDA-chの精製ビリオン中図5D、レーン1、ならびにUSDA-chおよびレスキュー変異体gJR4.3に感染させた細胞培養物中図5D、レーン3および4で、約85、115、160、および200kDaの分子量のタンパク質を認識した。未感染細胞培養物および感染細胞培養物において、約45kDaでバンドが観察され図5D、レーン2~6、ウサギ血清の細胞タンパク質との反応性が示唆された。ブロットをウサギ免疫前血清とともにインキュベートして同時にウエスタンブロットを行ったところ、このブロットは非常にかすかな反応をもたらし、gJポリクローナルウサギ血清によって認識されたタンパク質が、実際にILTVのgJに特異的であることが示唆された。これらの結果から、gJ欠失変異体におけるgJの発現の欠如が確認された。対照として、全ての試料を抗gCMAbで並行してプローブした図5E。感染細胞図5E、レーン3~6またはビリオン図5E、レーン1のいずれかを含有する全ての試料に、抗gCMAbにより未感染細胞図5E、レーン2には存在しなかった65kDaタンパク質が検出され、感染細胞の試料中に相当量のウイルスタンパク質が存在することが示された。細胞培養物およびニワトリ胚におけるILTVのgJ欠失変異体の複製感染後24、48、および72時間目には、ADgJ4.1およびBDgJ3.2に感染させたCK細胞の上清のウイルス力価は、USDA-chおよびレスキュー変異体gJR4.3と比較して1.5~2log10低かった図6A。ウイルスレスキュー変異体gJR4.3における複製効率は完全に回復していたため、観察された表現型は、gJの発現の欠如によるものであり得る図6A。gJの発現の欠如によるウイルス複製の障害は、侵入から放出までのプロセスの間のいずれの段階でも引き起こされ得る。ウイルス侵入が妨げられるかどうかを調べるための実験において、USDA-ch、gJ欠失変異体ADgJ4.1およびBDgJ3.2、ならびにレスキュー変異体gJR4.3がLMH細胞に侵入する能力に有意差は示されなかった図6B。このことは、ウイルス侵入が、gJの発現の欠如によって検出可能な程度には影響されなかったことを示唆する。ILTVを増殖させる標準的な方法の1つは、ニワトリ胚CEの絨毛尿膜CAMで増殖させることである。gJ欠失変異体がCAM中で複製する能力を評価し、CK細胞において得られたウイルス力価と比較した。レスキュー変異体gJR4.3TCID507.4log10および野生型USDA-chTCID508.0log10のウイルス力価は、それぞれ、CEのCAM表2においてCK細胞図6Aよりも10~50倍高かった。gJ-欠失変異体であるADgJ4.1変異体を発現するEGFPは、CAMにおける4回の連続継代後に6.40log10の力価に達したのに対し、CAMにおけるgJ変異体BDgJ3.2の力価は、3回の連続継代後に2.50~1.75の範囲であった表2。Aニワトリ腎細胞においてTCID50log10として表した力価B実行せずニワトリにおけるgJ変異体の弱毒化およびそれらの保護効率予想されたように、4週齢SPFニワトリの感染後3~6日目に、野生型USDA-ch株およびgJRを接種したニワトリが疾患の特徴的な徴候を現した。最も顕著な疾患の徴候は、重度の結膜炎および鬱症状であった。対照的に、ADgJ4.1を接種した少数のニワトリは、感染後4日目および5日目に非常に軽度の結膜炎を示し、BDgJを接種したニワトリは、対照群と同様に臨床徴候を示さなかった。感染後4日目に回収された結膜および気管の拭き取り検体の定量PCRqPCRによりウイルス複製を測定した表3。AqPCRを使用して拭き取り検体の試料を調べたCallisonetal,2003AvianDis.50:50-54。BDNAコピーの数qPCRアッセイの検出限界がウイルスDNAの25コピーであったため、偽感染させたニワトリおよびgJ欠失変異体に感染させたニワトリの試料は、ウイルスDNAの存在について陰性と見なした。対照的に、野生型USDA-chまたはレスキュー変異体gJR4.3に感染させたニワトリからの試料において、相当量のウイルスDNAが検出された。gJ-欠失変異体を接種したトリおよび未感染対照のトリにUSDA-ch野生型ウイルスをチャレンジした。gJ欠失変異体ADgJ4.1およびBDgJ3.2に感染させたトリ、ならびに未感染対照のトリに疾患の臨床徴候が観察された。チャレンジ感染後4日目と5日目の間に臨床徴候のピークが観察された。結膜炎および鬱症状が、最も顕著な疾患の徴候であった。ワクチン未接種/チャレンジ群のニワトリとADgJ4.1およびBDgJ3.2を接種したニワトリとの間に検出された臨床徴候の重症度に有意差は観察されなかった図7A。gJ変異体は卵内ワクチン接種後に保護を提供する孵化時には、偽接種胚と比較してADgJ4.1接種群とBDgJ3.2接種群との間で孵化率に有意差は観察されず、卵内接種によるgJ欠失変異体の十分な弱毒化が示唆された。飼育期間中、偽接種群に有意差は観察されなかった。35日目に、結膜的および経鼻的に105TCID50/ニワトリを接種することによりニワトリにチャレンジした。チャレンジ後、臨床徴候が1~7日目まで観察され、ワクチン未接種のニワトリの100が重度の臨床徴候を示したことから、妥当なチャレンジが示唆された。BDgJ変異体を接種したニワトリのうち、39が臨床徴候を示したのに対し、残りのニワトリは、いずれの時点でも臨床徴候を示さなかった。ADgJ4.1を卵内接種したニワトリの14が臨床徴候を示したのに対し、86は実験を通じて健康な状態を維持した図7B。これらのデータは、gJ欠失変異体、特にADgJ4.1が卵内接種された時に、高用量チャレンジ感染後にILTからの保護を誘発することができたことを示している。実施例2:ILTV-ΔgJgreen中の緑色蛍光タンパク質GFPカセットのILTVタンパク質をコードしない配列との置換新規gJ欠失ILTV作製のための組換えDNAの設計Genbank受入番号NC_006623.1に保管されたILTVのゲノムヌクレオチド配列から、糖タンパク質DgDのUS6のコード配列CDSがヌクレオチド132675~133808であり、12のヌクレオチドが糖タンパク質JのUS5のCDS129739~132696と重複していることを予測した。ILTVのgDの転写開始部位がマッピングされていなかったため、ヌクレオチド132504から始まる長いCDSを検討した。その場合、US6は、US5と192bp重複する。新規ΔgJ変異体ILTVの設計では、US6の発現を確実にするためにUS6の上流のプロモーター配列は改変しなかった。gJのORFUS5を修飾するために、約10bpのセクションを切除して10bp下流にそれらを挿入することにより、US5の5’末端配列2357bpを著しく改変した。これらを50回行うことにより、GCの内容を変化させることなくナンセンス配列を生じさせた。また、約50のCGおよびATの交換をランダムに導入した。US6の考えられる一番最初の開始コドンを含むUS5の3’末端からの321ヌクレオチド断片、および潜在的プロモーター領域の130ヌクレオチド上流は変更しなかった。ウイルスゲノムへの相同組換えのために、操作したUS5の5’および3’末端に標準配列を加えた。5’末端には、US4の3’末端の270ヌクレオチドと、US4の終止コドンとUS5の元の開始コドンとの間の209ヌクレオチド配列とからなる、破壊したUS5開始コドンの上流の479bp断片を加えた。3’末端には、US6の非重複部からの450bp断片を加えた。結果として得られた3876bpのDNA断片を合成し、細菌プラスミドpUC57GenScript、Piscataway,NJにクローン化した。組換えNΔgJILTVの作製組換えDNA配列3876bpを含有する組換えプラスミドをHindIIIおよびEcoRIで制限消化してインサートを放出させ、アガロースゲル電気泳動により分離した。3876bpインサートをゲルから溶出し、緑色蛍光gJ欠失変異体GΔgJからのウイルスDNAとのコトランスフェクションに使用した。TransITmRNATransfectionKitRoche、Indianapolis,INを使用して、培養密度80でLMH細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから5日後、細胞を上清中にすすぎ入れ、-80°Cで保存した。段階希釈法を使用して6ウェルプレート内のLMH細胞を感染させた。生体蛍光顕微鏡法により非蛍光プラークを同定し、観察下で非蛍光プラークを吸引して、新しいLMH細胞培養物に接種した。プラーク精製を1度繰り返し、親緑色蛍光ウイルスの混入を排除した。プラーク精製したNΔgjの分離株を、初代ニワトリ腎細胞培養物に接種し、3日間39°Cでインキュベートした。感染細胞を上清中にすすぎ入れ、アリコートを-80°Cで保存した。QiAmpDNABloodMiniKitを使用して、各プラーク分離株のうちの1つのアリコートを用いてDNAを調製した。PCRによりプラーク分離株の遺伝子型を分析した。プライマー25upUS4FW/ClaIgIrevを使用して図8、NΔgJの3つの異なるプラーク分離株およびUSDA対照ウイルスDNAから5591bpのPCR産物を得、親ウイルスGDgJからのウイルスDNAを使用して4901bp断片を得た。プライマーは、組換え領域の外側に位置するウイルスゲノム内の領域に結合する。変異体NΔgJの結合部位は、野生型ウイルスUSDAと同一でなければならず、また、本来USDAに由来する親ウイルスGDgJにおいても同一でなければならない。5591bp断片の増幅は、プライマー結合部位が存在すること、そして、それらの間にあるゲノム領域は、USDAとは異ならないが、親GDgJとは異なる、予想された長さの領域であることを示した。NΔgJ分離株からのPCR産物をクローニングおよび配列決定のためにアガロースゲルから溶出した。プラーク分離株中の人工ナンセンスgJ配列の存在を確認するために、ナンセンスgJ配列には排他的に結合するが、USDAまたはGΔgJウイルスDNAには結合しないプライマーNgJ1390fw/NgJ2483revを使用して別のPCRを行った。予想されたように、1112bp産物図8は、NΔgJプラーク分離株からのみ増幅され、USDAウイルスDNAを鋳型として使用しても産物は得られなかった。次に、NDgJプラーク分離株のUS4、ナンセンスUS5、およびUS6を包含する5591bpのPCR産物をクローン化し、配列決定した。緑色蛍光タンパク質を発現せず、いずれの外来DNAも持たない新規ΔgJウイルスNΔgJウイルスを2回プラーク精製し、親または野生型ILTVからの鑑別を可能にするプライマーを使用した異なるPCRにより、3つの個別の分離株の遺伝子型を確認した。NΔgJをニワトリ腎細胞に増殖させた。3つの継代を通してCK細胞中に3つのプラーク精製ウイルスを得た:プラーク精製したウイルスは、log105.5~log106.4の範囲の力価を有する。この力価は、GΔgJで得られた力価よりも高い。NΔgJ株の無細胞ウイルス調製物の弱毒化および保護能力を、ブロイラーおよびレイヤーにおいて検査する。最初に、2週齢および6週齢で、点眼薬によりNΔgJ株を適用する。その後、このウイルスが噴霧により1日齢のニワトリに適用された場合および卵内を介した場合の保護の有効性を検査する。FΔGjの作製および増殖以前に作製したGFPを発現するgJ欠失変異体GΔgJに基づいて、ニューカッスル病ウイルスLaSota株の融合タンパク質Fを担持する組換えgJ欠失変異体を作製した。GFP発現カセットを除去し、NDVLaSota株の融合遺伝子と置換した。ウイルスDNAとのコトランスフェクション後に、GΔgJ、ヘルパープラスミドpRcICP4およびpcUL48、ならびに組換えDNA断片からFΔgJをレスキューした。GFPを発現していないウイルスを2回プラーク精製し、親または野生型ILTVからの鑑別を可能にするプライマーを使用したPCRにより、3つの個別の分離株の遺伝子型を確認した。プラーク精製したウイルスのうちの2つをニワトリ腎細胞で2回継代し、log104.6およびlog105.12TCID50/mlの力価に達するようにした。開示される方法および組成物のために使用することができるか、それらとともに使用することができるか、それらの調製において使用することができるか、またはそれらの生成物である、材料、組成物、および構成要素が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示されるが、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示される場合、これらの化合物の各々の種々の個別および集合的な組み合わせおよび順序に関する具体的な言及が明白に開示されていないかもしれないが、各々が本明細書において具体的に企図され、説明されることを理解されたい。例えば、ある方法が開示および議論され、その方法を含む分子の数に対して行われ得る多くの変更が議論される場合、そうではないと具体的に指定のない限り、その方法のあらゆる組み合わせおよび順序、ならびに考えられる変更が具体的に企図される。同様に、これらのあらゆるサブセットまたは組み合わせも、具体的に企図され、開示される。この概念は、限定されないが、開示される組成物を使用する方法におけるステップを含む、本開示の全ての態様に適用される。よって、行うことのできる多様な追加ステップが存在する場合、これらの追加ステップの各々は、開示される方法のいずれの特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせとともに行われてもよく、各々のそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットは、具体的に企図され、開示されると見なされるべきであることを理解されたい。本明細書に引用される出版物およびそれらが引用される材料は、参照により、それらの全体が本明細書に具体的に組み込まれる。"