"抗原性物質に対し被験体により発現される免疫反応性の型の同定方法であって、被検体に由来する1種若しくはそれ以上の免疫細胞を準備し、そして1種若しくはそれ以上の抗原フラグメントの存在下で培養する工程;該免疫細胞により産生されるサイトカインを同定する工程;および該抗原性物質に応答しての協調的サイトカイン発現に基づき免疫反応性の型を決定する工程を含んでなる、上記方法。抗原性物質が、抗原、ペプチド、微生物、細胞、タンパク質のアミノ酸配列が既知であってももしくはなくてもよく、かつ、フラグメントが、該タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーから採取される抗原タンパク質、複数の抗原性物質およびそれらの組合せの混合物からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。被験体の免疫状態の評価方法であって、被験体から免疫細胞を準備する工程;目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で該免疫細胞を培養する工程;免疫反応性の複数のパラメータについて該培養物を同時に分析し、該被験体について最低1種の免疫調節分子を同定して産生されるサイトカインの同定に基づき該免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定する工程を含んでなり、かつ、免疫反応性の型が該被験体の免疫状態の指標となることを特徴とする、上記方法。被験体の免疫抑制の程度を評価することを特徴とする、請求項3に記載の方法。被験体の免疫状態が、該被験体についての完全なT細胞レパートリーを提供するために複数の免疫調節分子について評価されることを特徴とする、請求項3に記載の方法。免疫調節分子および免疫反応性の型が、感染性疾患、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、癌、慢性炎症およびアレルギーよりなる群から選択される免疫関連疾患の該被験体の危険性の指標であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。ワクチン接種、受動免疫療法および養子細胞移入のような免疫療法に対する被験体の応答の予測方法であって、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーの存在下で、被験体からの免疫細胞を培養する工程;免疫反応性の複数のパラメータについて該培養物を分析して、該被験体について最低1種の免疫調節分子を同定する工程;およびサイトカインの産生について該培養物を分析し、産生されるサイトカインの同定に基づき免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定して処置の転帰の指標としての処置前の被験体の該エピトープに特異的な免疫状態を決定する工程を含んでなる、上記方法。被験体の疾患の経過および臨床転帰の予測方法であって、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で、被験体からの1種若しくはそれ以上の免疫細胞を培養する工程;細胞増殖およびサイトカイン産生プロファイルについて、該培養物を同時に分析して、該免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定する工程であって、かつ、サイトカイン産生プロファイルが疾患の重症度および疾患の進行若しくは後退の状態のマーカーとする工程を含んでなり、上記方法。疾患が、癌、腫瘍、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、関節炎、糖尿病、アレルギー、臓器移植および骨髄移植よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。被験体の治療的介入の調整方法であって、産生されるサイトカインの同定を包含する免疫反応性の複数のパラメータの分析に基づき、被験体について1種若しくはそれ以上の免疫調節分子を同定する工程;および該1種若しくはそれ以上の免疫調節分子を含んでなるエピトープ特異的な免疫ワクチンを製造する工程を含んでなる、上記方法。ワクチンが、被験体における特異的な型の免疫応答を高めるか、被験体におけるエピトープ特異的なサイトカイン産生を低下若しくは高めるか、被験体における抗体産生を高めるか、または被験体におけるエピトープ特異的なサイトカイン産生を高める1種若しくはそれ以上の抗原を含んでなることを特徴とする、請求項10に記載の方法。被験体の免疫モニタリング方法であって、被験体から免疫細胞を準備し、そして該細胞をペプチドライブラリーから同定される1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドにそれらを曝露することにより、被験体のエピトープ特異的な免疫状態を決定する工程;ライブラリーから同定される免疫調節ペプチドの1種若しくはそれ以上で被験体を免疫化する工程;1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドへの曝露後に被験体から免疫細胞を準備することにより、被験体のエピトープ特異的な免疫状態を決定する工程;ならびに免疫化の前および後の免疫応答の型を比較して、該被験体のエピトープ特異的な免疫状態の変化を決定する工程を含んでなる、上記方法。免疫療法のための新たな治療薬の同定および特徴付け方法であって、免疫調節物質、および目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの1種若しくはそれ以上のペプチドの存在および非存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程;該ペプチド上のエピトープに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析する工程;ならびに免疫調節物質が存在する場合の免疫反応性を、免疫調節物質が非存在である場合の免疫反応性と比較する工程であって、かつ、免疫反応性の阻害を免疫抑制性治療薬の指標とし、また、免疫反応性の増強をアジュバントの指標とする工程を含んで成る、上記方法。治療薬が、Th1、Th2、Tc1、Tc2およびそれらの組合せに対する免疫応答の型を駆動する免疫調節ペプチドの組合せであることを特徴とする、請求項13に記載の方法。免疫調節物質、および感染性疾患、癌、腫瘍、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、関節炎、糖尿病、アレルギー、臓器移植および骨髄移植よりなる群から選択される目的の抗原からの1種若しくはそれ以上のフラグメントの存在および非存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程;該フラグメントに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析する工程;ならびに免疫反応性の細胞を単離する工程を含んでなる方法により同定される治療薬。ワクチンエピトープの同定方法であって、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの1種若しくはそれ以上のペプチドの存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程;免疫反応性の複数のパラメータおよびサイトカイン産生について、該培養物を分析して、産生されるサイトカインの同定により該ペプチドに対する免疫反応性の型を決定する工程;ならびに同一の同定された配列を有する1種若しくはそれ以上のペプチドを伴うワクチンを製造する工程を含んでなる、上記方法。1種若しくはそれ以上のペプチドの配列が単離後に決定されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。ワクチンエピトープの特徴付け方法であって、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生虫若しくは蠕虫を含んでなる抗原から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程;培養物中での免疫反応性の複数のパラメータおよびサイトカイン産生について、該培養物を分析して、該1種若しくはそれ以上のペプチドに対する免疫反応性の型を決定する工程であって、かつ、該ワクチンエピトープが、それらが該抗原に対して導き出す免疫反応性を特徴とする工程を含んでなる、上記方法。細胞培養物が分析され、そして、1種若しくはそれ以上のT細胞、B細胞、樹状細胞、単球、好中球、肥満細胞および赤血球のフロファイルが決定される、請求項18に記載の方法。Th1およびTh2双方若しくはTc1およびTc2双方のT細胞についての反応性ペプチドが同定された特定の個体に対して免疫反応性と同定されたペプチドライブラリーから単離された、免疫応答の型を改変するために選択される1種若しくはそれ以上のペプチドを含んでなる組成物。免疫療法の必要な被検体の処置用医薬の製造するための免疫応答のある型に影響を与える免疫調節ペプチドの使用であって、かつ、1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドに被検体からの免疫細胞がインビトロで暴露されて該1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドにより誘発される免疫応答の型が決定され、そして該免疫応答の型が1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドの処置後に評価され、また、必要がある場合には、免疫応答の型を変えるように1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチド改変するものである、上記使用。正常ドナーのPBMCのウイルスペプチドとの単純なインキュベーションにより約48時間で検出された抗原特異的免疫応答。抗原特異的免疫応答がPBMCおよび単一ペプチドを使用して本発明の方法により検出され得るかどうかを決定するために、HLA-A0201正常志願者から新たに調製したPBMCを、HLA-A0201拘束性ペプチドとともにインキュベートした。ドナーは、他の方法により、Flu-MP特異的CD8T細胞を有するが、しかしMage3特異的CD8T細胞を有しないことが既知であったデータは示されない。末梢血単核細胞PBMCを、HLA-A0201健康志願者から新たに採取した血液から、Ficoll-Paque密度勾配遠心分離により単離した。PBMCを、10熱不活性化ヒトAB血清GeminiBio-Products、L-グルタミン2mM、ペニシリン200UI/ml、ストレプトマイシン200μg/ml、ピルビン酸ナトリウム1mM、1非必須アミノ酸、2-β-メルカプトエタノール50μM、SigmaおよびHEPESpH7.425mM、Gibcoを補充したRPMI培地完全培地すなわちCM中1×106細胞/mlの濃度で再懸濁した。2×105細胞/ウェルを三重で丸底96ウェルプレートに接種し、そして1μlのHLA-A0201拘束性ペプチドストック濃度1mg/ml、培養物濃度10μg/ml;Flu-MP58-66GILGFVFTL若しくはMAGE-3271-279FLWGPRALV、MultiPeptideSystems、カリフォルニア州サンディエゴ若しくはペプチド希釈剤H2O中5DMSOのいずれかとともにインキュベートした。培養上清を48時間後に収集し、そしてサイトカインおよびケモカインをLuminexで測定した。Flu-MPペプチドで刺激したPBMCは、48時間以内に、IFN-γを包含する多数のサイトカインを誘導したデータは示されない。該結果は、正常ドナーからの新鮮PBMCがFlu-MPペプチドに応答しかつ多数のサイトカインを産生したこと、および、抗原特異的免疫応答がペプチドとのPBMCの単純なインキュベーションにより約48時間で検出され得ることを示す。腫瘍抗原を包含するPBMC中のペプチド反応性細胞の広範なレパートリーについて約48時間で検出された抗原特異的免疫応答。ウイルス抗原はしばしば、腫瘍抗原より強い想起recall応答を誘導することが可能である。腫瘍抗原特異的免疫応答が本発明の方法により検出され得るかどうかを決定するため、DCワクチン黒色腫関連抗原の4種のHLA-A2ペプチドを負荷した自己CD34造血前駆細胞由来DCの最低8注入を受領した2例の黒色腫患者からの液体窒素中の低温保存PBMCを、冷PBS中で融解した。PBSでの第二の洗浄後に、PBMCをCM中37°Cで15分間インキュベートし、そして細胞破片をナイロン細胞フィルターで除去した。細胞をCMで再度洗浄しそして1×106/mlでCMに再懸濁した。その後、2×105細胞/ウェルを丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして、1μlのHLA-A0201拘束性ペプチドすなわちストック濃度1mg/ml、培養物濃度10μg/ml;Flu-MP58-66、CMVPP65NLVPMVATV、Biosynthesis、テキサス州ルイスビル、MAGE-3271-279、MART-127-35AAGIGILTV、gp100g209-2MIMDQVPFSV、チロシナーゼ368-376YMDGTMSQV、NCI若しくはペプチド希釈剤H2O中5DMSOのそれぞれとともにインキュベートした。培養上清を48時間後に収集し、そして産生されたサイトカインをLuminex技術で測定した。加えて、抗原特異的IFN-γ産生T細胞の検出のため、製造元のプロトコルMabtechに従ってELISPOTアッセイを実施した。簡潔には、PBMC2×105細胞/ウェルを、10μg/mlのペプチドの存在若しくは非存在下に10μg/mlの一次抗IFN-γモノクローナル抗体Mabtech、スウェーデンストックホルムで前被覆したプレートに添加した。直接IFN-γELISPOTにより、Flu-MPおよびCMVに対するCD8T細胞を有することが既知であったデータは示されない患者1は、Flu-MP若しくはCMVペプチドに応答してIL-1α、IFN-γ、TNF-αおよびIP-10の誘導を示したが、しかし4種の黒色腫ペプチドではしなかったデータは示されない。これは、黒色腫ペプチドが免疫応答を非特異的に調節しないことを示す。MART-1特異的CD8T細胞ならびにFlu-MP若しくはCMVを有することが示されたデータは示されない患者2は、MART-1ペプチドに応答してのIL-1αのわずかな増大およびIP-10の顕著な増大を表したが、しかし他の黒色腫ペプチドではしなかったデータは示されない。結果は、正常ドナーからの新鮮PBMCがFlu-MPペプチドに応答しかつIL-1αおよびIP-10を産生することを示す。サイトカイン/ケモカイン産生プロファイルは2例の異なる正常ドナー間で異なり、同一のFlu-MPペプチドを認識する異なる型のCD8T細胞がEPIMAXアッセイで同定され得ることを示唆する。IP-10がIFNに応答してアップレギュレートされ得るという事実を考えれば、DCとTの相互作用はT細胞からのIFN-γ産生を誘導することができ、それはDCからのIP-10産生につながる。従って、IP-10はタイプ1T細胞応答の有用なマーカーであり得る。ペプチドを負荷したCD34-DCをワクチン接種した黒色腫患者におけるMart-1ペプチドに応答してのIP-10の誘導はIFN-γに依存する。IP-10産生がIFN-γに依存するかどうかを検査するために、HLA-A2黒色腫ペプチドを負荷した自己CD34-DCをワクチン接種した黒色腫患者から得たPBMCを、ブロッキング抗IFN-γR1mAbの存在下で、MART-1ペプチド610μM若しくはFlu-MPHLA-A2ペプチド10μg/mlのいずれかで刺激した。IP-10産生はIFN-γR1の遮断により完全に無効にされたデータは示されない。従って、IP-10産生はIFN-γ産生に依存し、IP-10がIFN-γ産生の代理マーカーとなり得ることを示した。DCワクチン黒色腫関連抗原の4種のHLA-A2ペプチドを負荷した自己CD34造血前駆細胞由来DCの最低8注入を受容した2例の黒色腫患者からの液体窒素中の融解された低温保存PBMCを、丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして10μg/mlのHLA-A0201拘束性ペプチドすなわちFlu-MP58-66、CMVPP65NLVPMVATV、MAGE-3271-279FLWGPRALV、MART-127-35AAGIGILTV、gp100g209-2MIMDQVPFSV、チロシナーゼ368-376YMDGTMSQV若しくはペプチド希釈剤H2O中5DMSOのそれぞれとともにインキュベートし;そして培養上清を48時間後に収集しかつサイトカインおよびケモカインの存在についてLuminex技術を使用して量的に評価した。抗原特異的IFN-γ産生T細胞の検出のためELISPOTアッセイを実施し、ここで、PBMC2×105細胞/ウェルを、10μg/mlのペプチドの存在若しくは非存在下に10μg/mlの一次抗IFN-γモノクローナル抗体で前被覆したプレートに添加した。該結果は、PBMC中のペプチド反応性細胞の広範なレパートリーが本発明の方法により同定されたことを示した。本発明の方法は、T細胞により認識される特異的ペプチド配列の同定を可能にする。T細胞により認識される抗原エピトープ1種若しくは複数およびそのエピトープにより誘導される免疫応答が本発明の方法で同定され得るかどうかを決定するため、15-merのMART-1ペプチドライブラリーからの4~7種のペプチドよりなるペプチドの5クラスターを、CD34-DCワクチンを受領したHLA-A0201黒色腫患者から得たPBMCとともにインキュベートした。4アミノ酸のオフセットを伴う15-merのオーバーラップペプチドは、MART-1の全アミノ酸配列を包含するよう設計したMimotopes、カリフォルニア州サンディエゴ。各ペプチドは2mMで50アセトニトリルで再構成し、そして使用まで-80°Cに保管した。PMBCはDCワクチンを受領した黒色腫患者から得た。4~6種のクラスターを形成したclusteredペプチド1ペプチドあたり1μl若しくは単一のペプチド1μlを96ウェルプレートに三重で接種し、そして室温で乾燥した。その後、200μlのCM中の2×105PBMCを各ウェルに添加し、そして加湿5CO2インキュベーター中37°Cで48時間インキュベートした。培養上清中のサイトカイン若しくはケモカイン濃度をLuminexで測定した。有意により多量のIP-10がクラスター1培養物中で検出されたことが見出された。次に、MART-1ライブラリーからの単一ペプチドを含むPBMCの第二の培養物を、クラスター1内の原因であるペプチドを同定するために作成した。ペプチド6は顕著なIP-10を誘導し、このペプチドが黒色腫患者のT細胞のエピトープであることを示す。興味深いことに、このペプチドはHLA-A0201のドミナントなエピトープ配列MART-127-35;AAGIGILTVを含有する。DCワクチンを受領した黒色腫患者からPBMCを得た。この患者はHLA-A0201posであり、そして、四量体結合アッセイで、HLA-A0201拘束性のドミナントなエピトープMART-126-35を認識するMART-1特異的CD8T細胞を有することが示されたデータは示されない。PBMCをこのHLA-A0201のドミナントなMART-1ペプチドと共に培養した場合、2種のサイトカインIL-1αおよびIP-10が特異的に誘導されたが、しかしIFN-γのアップレギュレーションは示されなかったデータは示されない。IP-10がタイプI若しくはタイプIIインターフェロンに応答して多くの細胞型により分泌されることを考え、われわれは、IP-10がMART-1特異的T細胞から分泌されるIFN-γに応答して産生されたと推測した。従って、IP-10産生はIFN-γの機能を阻害することにより完全に無効にされた図4C。該結果は、ペプチドを負荷したCD34-DCをワクチン接種した黒色腫患者におけるMART-1ペプチドに応答してのIP-10の誘導が、IFN-γに依存することを示す。この患者のPBMCが、このドミナントなエピトープを認識するCD8T細胞を含有するかどうかを確認するために、PBMCを、MART-127-35若しくは他のHLA-0201ペプチド例えばMage-3、チロシナーゼおよびFlu-MPを負荷した自己単球由来DCとともに培養し、そして抗原特異的CD8T細胞集団の誘導について特異的四量体で検査した。図4B-4Eに示されるとおり、MART-1特異的CD8T細胞は7日以内に容易に増殖し、この患者がMART-1に対するメモリー若しくはエフェクターCD8T細胞を有すること、およびこのCD8T細胞集団が本発明の方法によりMART-1ライブラリーを用いて認識されたことを示した。本発明の方法は多様な型の免疫応答の同定を可能にする。本発明の方法は、免疫応答のためのエピトープならびに誘導される応答の型の同時の同定を可能にする。実施例4に示される一般的方法により、黒色腫患者からのPBMCプレワクチン若しくはポストワクチンいずれかを、MART-1若しくはNY-ESO1ペプチドライブラリーからの5~6種のペプチドクラスターとともに48時間インキュベートしたMART-1は5クラスターと;NY-ESO1は8クラスターと。典型的な結果は、多様な免疫応答に対応するサイトカインプロファイルのシグネチャを表すことが示されたデータは示されない。各免疫応答のパターンを表した該ペプチドクラスターは灰色の棒で示した。タイプ1応答において、IL-10産生は抑制されかつIP-10が誘導される。対照的に、抑制性T応答において、タイプ1応答の阻害により、より多くのIL-10が誘導されかつIP-10産生が無効にされる。IL-13およびエオタキシンは、IP-10のレベルに影響を及ぼすことなくタイプ2応答で検出される。従って、本発明は、いかなる種類の抗原によっても約48時間で誘導される多様な型の免疫応答を同定する。HLA-A0201ドナーからの2×105の新鮮PBMCを、HLA-A0201拘束性Flu-MP58-66、Mage3271-279若しくは希釈剤で、示された時間、三重で刺激した。培養上清中のサイトカインを多重ビーズに基づくサイトカインアッセイで測定した。三重のデータからの平均±SDを示す。この結果は、IL-1aおよびIP-10のペプチド特異的産生が、48時間のペプチド刺激でプラトーに達したことを示す。本発明の方法は、非T細胞により誘導される他の型の免疫応答の同定を可能にする。15-merペプチドがB細胞、NK細胞若しくはNK-T細胞のような他の免疫細胞により認識されること、および数種のペプチドは同定されていない受容体に結合して免疫応答の調節に至ることが既知である。本発明の別の例を使用して、MHC非拘束性中で調節シグネチャを表したペプチドで非T細胞により誘導される免疫応答を同定した。黒色腫患者からのPBMCを、スルビビンライブラリーからのペプチドクラスターとともにインキュベートした。図6A-6Hに示されるとおり、スルビビンクラスター3からのペプチド15はサイトカイン産生の強い調節パターンを誘導した。すなわち、IL-10およびIL-1βが強く誘導され、そして、タイプ1応答のマーカーであるIL-1αおよびIP-10はひどく無効にされた。この応答がある型のMHC分子に制限されるかどうかを決定するため、5名の正常健康志願者から採取したPBMC由来新鮮血をスルビビンペプチド15とともに48時間インキュベートし、そして本発明の方法に従ってサイトカイン濃度を測定した。ペプチド15は全5名の正常志願者でIP-10産生を阻害しデータは示されない、このペプチドがあるHLAサブタイプに制限されないことを示した。スルビビンペプチド15は免疫応答を改変する強い能力を有することが示された。ペプチド15の存在下に生インフルエンザウイルスで刺激した黒色腫患者からのPBMCは、明らかにIL-10産生によるIP-10誘導の強い廃止を表したからであるデータは示されない。さらに、ペプチド15はTSST-1誘発性のT細胞増殖を部分的に阻害したデータは示されない。枯渇研究は、CD56細胞がIL-10産生およびIP-10阻害の原因であったことを示しデータは示されない、スルビビンペプチド15がNK、NK-T細胞若しくはγ/δT細胞集団に作用することを示した。ペプチド15はまたCD3-CD56NK細胞の生存を維持することも示されたデータは示されない。従って、本発明の方法は、ある型のペプチドにより誘導されるいかなる種類の免疫調節の同定にも有用である。本発明の方法は、ワクチン接種の間の黒色腫患者の免疫モニタリングを見込む。細胞を、暗号化し予め馴化した96ウェルの第I相培養プレート中にウェルあたり2×105で接種した。第I相培養プレートは、クラスターあたり長さ各15アミノ酸の12種のオーバーラップペプチドとともに四重で腫瘍抗原GP100、MAGE3、NY-ESOおよびMART-1のそれぞれ5ペプチドクラスター、ならびにKLHおよび死Colo細胞対照を含有する。プレートは、処理量を最大化しかつアッセイ間の変動性を最小限にするために事前に準備してもよい。細胞を37°Cで5日間インキュベートする。同時に、再刺激に指定された細胞を、30:1のPBMC対DCの比の、完全な範囲の抗原ペプチドクラスターを負荷した自己成熟DCの存在下で7日間培養する。第7日にこれらの細胞を徹底的に洗浄し、そして第I相培養プレートに24時間移す。インキュベーション後に、これらの再刺激した細胞はペレットにされることができ、そして150マイクロリットルの各上清を、TECANGenesisRPSロボットサンプル処理装置TECANを装備した完全自動化Luminex100CytokineMultiplexワークステーションに96ウェル形式で移す。オペレータに依存しないサンプル処理が可能なワークステーションを、バーコード識別および無作為マイクロプレート分析とともに使用しうる。上清を、予め調製しかつ検証した多重ビーズおよび試薬のマスターミックスを使用して、IFN-γ、TNF-α、IL-13、IL-10およびグランザイムBの存在について二重で迅速にスクリーニングする。残存する上清サンプルは後の分析のため凍結する。共培養物からのDCが、第I相プレートでの24時間インキュベーションの間のバックグラウンドのサイトカイン産生に寄与しうることが予期される。成熟DCからの上清は、従ってサイトカイン多重分析において対照としてはたらく。一次刺激アッセイからの細胞を回転して落としspundown、そしてH3チミジンを含有する培地に再懸濁しかつ37°Cをインキュベートする。5日後に、抗原特異的増殖をチミジン取り込みアッセイにより四重で評価する。一次刺激アッセイからの上清は後日での分析のため-80°Cで凍結する。再刺激後のサイトカイン産生について陽性であるペプチドクラスターを、一次刺激の間のサイトカイン産生についてスクリーニングする。第I相サイトカイン多重アレイにより反応性について陽性であると判明している腫瘍抗原クラスターを、第II相培養プレート上で抗原ペプチド同定のためそれらの構成成分に分解する。第II相培養プレートは、各クラスターについて12種の成分ペプチドを含有するウェルストリップを二重で包含する。第II相ペプチドウェルストリップは事前に準備し、そしてバーコードラベルを貼付した枠にセットする。融解したPBMCを、第I相で同定された特異的ペプチドクラスターを負荷した自己の成熟DCと37°Cで7日間共培養し、洗浄し、そしてウェルあたり2×105で第II相培養プレートに24時間移す。インキュベーション後に細胞をペレットにし、そして150マイクロリットルの上清を分析のためLuminexワークステーションに移す。所定のペプチドストリップについての第II相での多重スクリーニングは、第I相分析の間にその親クラスターに応答して産生されたサイトカイン1種若しくは複数よりなる。成熟DC単独が第II相分析のためのバックグラウンド対照としてはたらく。所定のクラスターの抗原ペプチド1種若しくは複数が一旦同定されれば、それらを使用して、抗原特異的エフェクター集団を単離する。第III相モニタリングはペプチド特異的エフェクター細胞の同定および特徴付けよりなる。この手順において、2×106個のPBMCを融解し、そして、第II相で単離された各抗原ペプチドを負荷した自己の成熟DCとともに37°Cで7日間インキュベートする。細胞をその後洗浄しそして24時間の再刺激にかける。再刺激後に、細胞をブレフェルジンA処理し、固定し、浸透化し、そして表面マーカーおよび細胞内サイトカイン発現双方を特徴づけるために一団の抗体で染色する。抗原特異的エフェクター集団の同定は、9色分析および分取が可能なFACSariaフローサイトメーター/ソーターBecton-Dickinsonを使用する多色サイトメトリー分析により達成される。刺激されたT細胞のCTL機能を、ペプチドを負荷され、EBVで形質転換された自己B-LCLを標的として使用するCr51遊離アッセイによりinvitroで測定する。同定後、抗原特異的エフェクター細胞集団を、IL-2およびIL-6の存在下で自己の成熟した抗原ペプチドを負荷したDCと7日間共培養すること、次いでIL-2およびIL-7の存在下でのペプチドを負荷した成熟DCでの毎週の再刺激により、サブクローニングする。クローンのエフェクター細胞集団が一旦確立されれば、遺伝子発現パターンおよび細胞傷害性機能の広範囲の特徴付けに着手する。本発明の方法は癌におけるワクチンエピトープの選択を可能にする。この技術を使用する特定の腫瘍関連エピトープに対するタイプ1、タイプ2若しくは抑制性Tのいずれかの反応性の検出および特徴付けは、ワクチン接種に使用される場合に所望の型の免疫応答を導き出す、腫瘍関連タンパク質に対する抗原エピトープの同定および特徴付けのためのツールとしてはたらき得る。ワクチンエピトープを選択するため、患者のPBMCを、腫瘍関連タンパク質からの抗原エピトープを表す一連のペプチドライブラリーに曝露する。48時間培養後に上清を収集し、そして分泌されたサイトカインを本明細書の教示に従って分析する。タイプ1T細胞応答、例えばIFN-γの産生を誘導するがしかしIL-10抑制性T応答若しくはタイプ2サイトカインの産生を誘導しないペプチドのクラスターを同定する。次の段階で、所定の患者のHLAタイプに対応するペプチドをさらに選択し得、そしてこの特定の患者のワクチン接種に使用し得る。従って、患者において所望の型の免疫応答を生じさせるよう調整されたワクチン接種のための剤を、本発明を用いて決定し得る。本発明の方法は感染性疾患におけるワクチンエピトープの選択を可能にする。微生物病原体に対する現在利用可能なワクチンの多くは保護免疫を賦与しないことが既知である例えばデングウイルスワクチン。保護免疫の欠如は不適切な免疫応答の誘導による可能性があり、例えば、現在のワクチンエピトープのいくつかは、タイプ1T細胞よりむしろタイプ2若しくは抑制性T細胞を誘導することができ、従って免疫応答を非保護的応答にゆがませかつ/若しくは阻害する。本実施例にて、本発明の技術は、ワクチン接種に使用される場合に所望の型の免疫応答を導き出す微生物関連抗原の抗原エピトープの同定および特徴付けのためのツールとしてはたらき得る。ワクチンエピトープを選択するため、患者のPBMCを、微生物、例えばデングウイルスからの抗原エピトープを表す一連のペプチドライブラリーに曝露する。48時間培養後に上清を収集し、そして分泌されたサイトカインを本発明の教示に従って分析する。タイプ1T細胞応答、例えばIFN-γの産生を誘導するがしかしIL-10抑制性T応答若しくはタイプ2サイトカインの産生を誘導しないペプチドのクラスターを同定する。次の段階で、ペプチドをさらに選択しかつワクチン接種に使用する。従って、本発明の方法は、ワクチン接種に際して保護的微生物免疫の誘導を可能にするエピトープの選択を見込む。図1は、本発明により評価される正常ドナーの免疫応答を描くグラフであり、ここで、末梢血単核細胞PBMCをHLA-A0201健康志願者から新たに採取した血液から単離し、2×105細胞/ウェルで丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして1μlのHLA-A0201拘束性ペプチドFlu-MP58-66GILGFVFTL若しくはMAGE-3271-279FLWGPRALV、またはペプチド希釈剤H2O中5DMSOのいずれかとともにインキュベートし;そして培養上清を48時間後に収集し、そしてLuminex技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。結果は、正常ドナーからの新鮮PBMCがFlu-MPペプチドに応答しかつ多数のサイトカインを産生したことを示す。図2は、本発明による正常ドナー中でのHLA-A0201拘束性ペプチドFlu-MP58-66GILGFVFTLに対する免疫応答の別の例を描くグラフである。PBMCを、別のHLA-A0201健康志願者から新たに採取した血液から単離し、5×105細胞/ウェルで丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして10μg/mlのHLA-A0201拘束性ペプチドFlu-MP58-66GILGFVFTL若しくはMART-127-35AAGIGILTV、またはペプチド希釈剤H2O中5DMSOのいずれかとともにインキュベートし;そして培養上清を48時間後に収集し、そしてLuminex技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。結果は、正常ドナーからの新鮮PBMCがFlu-MPペプチドに応答しかつIL-1αおよびIP-10を産生することを示す。該サイトカイン/ケモカイン産生プロファイルは2名の異なる正常ドナー間で異なり、同一のFlu-MPペプチドを認識する異なる型のCD8T細胞がEPIMAXアッセイで同定され得ることを示唆する。図3A-3Dは、本発明により評価されるところの2例の黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。それぞれ患者1および2についての図3Aおよび3Cにおいて、DCワクチン黒色腫関連抗原の4種のHLA-A2ペプチドを負荷した、自己のCD34造血前駆細胞由来DCの最低8注入を受領した2例の黒色腫患者からの液体窒素中の融解した低温保存PBMCを、丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして10μg/mlのHLA-A0201拘束性ペプチドすなわちFlu-MP58-66、CMVPP65NLVPMVATV、MAGE-3271-279FLWGPRALV、MART-127-35AAGIGILTV、gp100g209-2MIMDQVPFSV、チロシナーゼ368-376YMDGTMSQV、若しくはペプチド希釈剤H2O中5DMSOのそれぞれとともにインキュベートし;そして培養上清を48時間後に収集しそしてLuminex技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。それぞれ患者1および2についての図3Bおよび3Dにおいて、抗原特異的IFN-γ産生T細胞の検出のためELISPOTアッセイを実施し、ここで、PBMC2×105細胞/ウェルを、10μg/mlのペプチドの存在若しくは非存在下に10μg/mlの一次抗IFN-γモノクローナル抗体で前被覆したプレートに添加した。該結果は、PBMC中のペプチド反応性細胞の広範なレパートリーが本発明の方法により同定されたことを示す。図4A-4Cは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。図4Aについて、DCワクチンを受領したHLA-A0201pos黒色腫患者からPBMCを得、そしてHLA-A0201拘束性のドミナントなMART-1ペプチドMART-126-35を負荷した自己DCで刺激した。患者は、四量体結合アッセイで、HLA-A0201拘束性のドミナントなエピトープMART-126-35を認識するMART-1特異的CD8T細胞を有することが示された図4A。PBMCをこのHLA-A0201のドミナントなMART-1ペプチドと直接培養した場合、2種のサイトカインIL-1αおよびIP-10が特異的に誘導されたが、しかしIFN-γのアップレギュレーションは示されなかった図4B。IP-10がタイプI若しくはタイプIIのインターフェロンに応答して多くの細胞型により分泌されることを考え、われわれは、IP-10がMART-1特異的T細胞から分泌されるIFN-γに応答して産生されたと推測した。従って、IP-10産生は、IFNγRブロッキングmAbを使用してIFN-γの機能を阻害することにより完全に無効にされた図4C。該結果は、ペプチドを負荷したCD34-DCでワクチン接種した黒色腫患者におけるMART-1ペプチドに応答してのIP-10の誘導がIFN-γに依存することを示す。図5は、本発明により評価した正常ドナーの免疫応答のキネティクスを描くグラフである。HLA-A0201ドナーからの2×105新鮮PBMCを、HLA-A0201拘束性ペプチドFlu-MP58-66若しくはMage3271-279または希釈剤で、指定された時間、三重で刺激した。培養上清中のサイトカインを多重ビーズに基づくサイトカインアッセイで測定した。三重のデータからの平均±SDを示す。これらの結果は、EPIMAXアッセイでのIL-1aおよびIP-10のペプチド特異的産生が、48時間のペプチド刺激でプラトーに達したことを示す。図6は本発明のエピトープフォーカシングのスキームを描く。最初に、抗原タンパク質をコードする15-merのオーバーラップペプチドのライブラリーを、ペプチドのクラスター5~10種のペプチド/クラスターに二重で分割する。5×105のPBMCを、ペプチドの各クラスターで最初に刺激するクラスター分析。培養上清の複数のサイトカインを多重ビーズに基づくサイトカインアッセイで測定し、そしてヒットクラスターを決定した。第二の培養物中、すなわちエピトープフォーカシングで、PBMCをヒットクラスターからの個別のペプチドとともに48時間培養し、そしてその後抗原ペプチドを多サイトカイン分析で測定した。図7は、特異的T細胞により認識されるエピトープの同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。PBMCはDCワクチンを受領した黒色腫患者から得た。この患者はHLA-A0201posであり、そして四量体結合アッセイで、HLA-A0201拘束性のドミナントなエピトープMART-126-35を認識するMART-1特異的CD8T細胞を有することが示された図4A。4~6種のクラスター形成したペプチドペプチドあたり10μM若しくは単一ペプチド10μMのいずれかとしてMART-1の全アミノ酸配列を包括する、4アミノ酸のオフセットを伴う15-merのオーバーラップペプチドを、96ウェルプレートに三重で接種し;そして、200μlのCM中の2×105細胞のPBMCを各ウェルに添加し、そして加湿5CO2インキュベーター中37°Cで48時間インキュベートし;そして培養上清中のサイトカイン若しくはケモカイン濃度をLuminexで測定した。図7に示されるとおり、MART-1の6ペプチドは、ワクチン接種した黒色腫患者から得たPBMCでのIP-10の強い産生を誘導する。MART-1ペプチド6は、図4Aに描かれるところの10-merのHLA-A2のドミナントなエピトープを含有する。従って、本発明の方法は、ペプチド特異的T細胞応答の同定を可能にする。図8は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。PBMCはDCワクチンを受領した黒色腫患者から得た。この患者はHLA-A0201posであり、そして、四量体結合アッセイで、HLA-A0201拘束性のドミナントなエピトープMART-126-35を認識するMART-1特異的CD8T細胞を有することが示された図4A。PBMCを、ブロッキングIFNγRmAb20μg/ml若しくは対照mAbの存在下で、A2-MART-1ペプチド若しくは15-merのMART-1ペプチド6で48時間刺激した。A2-HIVpolペプチドおよび15-merのMART-1ペプチド15を対照ペプチドとして使用した。培養上清中のL-1aおよびIP-10の濃度を示す。この結果は、IL-1aおよびIP-10の双方の産生が、ペプチド特異的T細胞からのIFN-γ産生に依存することを示し、IL-1aおよびIP-10がタイプ1T細胞応答、すなわちTh1およびTc1細胞の代理マーカーであることを示す。図9は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者から得たPBMCを、黒色腫抗原をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個別のペプチドのいずれかで48時間刺激した。48時間培養物での培養上清中のサイトカイン/ケモカインの濃度をLuminexで測定した。この結果は、エピトープフォーカシングの概念を、本発明の方法においていかなる抗原およびいかなるサイトカインにも応用し得ることを示す。図10は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。一連のDCワクチン接種を受領した黒色腫患者から得たPBMCを、黒色腫分化抗原MART-1をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個別のペプチドのいずれかで刺激した。培養48時間での培養上清中のIL-1aおよびIP-10の濃度を示す。クラスター分析上で、クラスター2および3はIL-1aおよびIP-10のアップレギュレーションを誘導した。エピトープフォーカシング下で、クラスター2からのペプチド6およびクラスター3からのペプチド13が、特異的T細胞のエピトープとして同定された。この結果は、本発明の方法が、IFN-γを作成することが可能な特異的T細胞のエピトープを同定することを可能にすることを示す。図11は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。PBMCは、白血球分離leukopheresisを用いて図10と同一の患者から得、クライオチューブcryotube中のアリコートを作成し、そして使用まで液体窒素中に保管した。融解したPBMCを、MART-1の15-merペプチド6、ペプチド13若しくは希釈剤で刺激した。この実験を別個に3回反復した。培養48時間での培養上清中のIL-1aおよびIP-10の濃度を示す。3回の実験のうち3回が、ペプチド6若しくはペプチド13での刺激に際してのIL-1aおよびIP-10のアップレギュレーションを示し、このEPIMAXアッセイの高再現性を示す。図12Aは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者図10と同一からDCワクチン接種前および8回のDCワクチン接種後に得たPBMCを、単一の15-merのMART-1ペプチド若しくは希釈剤で刺激した。培養48時間での培養上清中のIL-1aおよびIP-10の濃度を示す。後PBMCは、同定された2種の15-merペプチドすなわちペプチド6および13に応答してのIL-1aおよびIP-10のアップレギュレーションを示した一方、前PBMCはペプチド13に応答してのIL-1aおよびIP-10のアップレギュレーションに失敗した。ペプチド6に応答しての前PBMCからのIL-1aおよびIP-10産生は後PBMCからのものより少なかった。これらの結果は、DCワクチン接種がペプチド13特異的T細胞応答を誘導しかつペプチド6特異的T細胞応答を高めたことを示唆する。この仮説を検査するため、われわれは異なる十分に確立された方法論、細胞内サイトカイン検出アッセイを使用した。同一のPBMCを、抗DC28/CD49dmAbおよびモネンシンの存在下で、MART-1の15-merの単一ペプチドで8時間刺激した。細胞膜の浸透化後に、細胞を抗IFN-γmAbで染色し、そしてIFN-γ集団をフローサイトメーターで分析した図12B。約0.15のCD8T細胞が、後PBMC中でペプチド6若しくは13いずれかに応答してIFN-gを産生した一方、IFN-g産生は前PBMCで検出されなかった。これらの結果は、癌患者において抗原特異的T細胞応答をモニターするのにEPIMAXを使用し得ることを示し、また、各特異的T細胞応答の大きさが、EPIMAXでのサイトカイン/ケモカイン調節の大きさを見ることにより予測可能であることを示唆する。図13は本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。CFSE5,6-カルボキシフルオレセイン二酢酸塩スクシンイミジルエステルは、フローサイトメーターを用いて細胞分裂の数を同定することを可能にするトレーサー色素である。EPIMAXは非破壊的アッセイであるため、われわれは、抗原特異的T細胞の増殖能力を測定するため、EPIMAXおよびCFSE技術と組み合わせた。CFSE染色はEPIMAXでのサイトカイン産生を変えないことが確認された。同一の黒色腫患者図10と同一から得たPBMCを最初に1μMのCFSEで染色し、そしてMART-1をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個々のペプチドのいずれかで刺激した。培養第8日に、細胞をCD8-PE、CD3-PerCPおよびCD4-APCで染色し、そしてペプチド刺激に応答してのT細胞増殖を分析した。該図はCD8T細胞増殖の分析を示す。MART-1クラスター2および3、ならびにペプチド6および13は、いくつかのCD8T細胞集団においてCFSE強度の希釈を誘導し、ペプチド刺激が抗原特異的CD8T細胞の増殖を誘導したことを示す。この結果は、他の方法論との組合せが、抗原特異的T細胞のより表現型的および/若しくは機能的特徴付けを得ることを可能にすることを示す。図14は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。同一の黒色腫患者図10と同一から得たPBMCを、最初に1μMのCFSEで染色し、そしてMART-1をコードする個々のペプチドで三重で刺激した。培養第8日に、細胞をCD8-PE、CD3-PerCPおよびCD4-APCで染色し、そしてペプチド刺激に応答してのT細胞増殖を分析した。該図は、CD8T細胞集団内のCFSEが希釈されたCD8T細胞集団のを示す。MART-1ペプチド6および13は、いくつかのCD8T細胞集団においてCFSE強度の希釈を誘導し、ペプチド刺激が抗原特異的CD8T細胞の増殖を誘導したことを示す。図15は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。CD8T細胞は、抗原提示細胞上で発現されるMHCクラスI分子の情況で8~10merのペプチドを認識する。同定されたCD8T細胞の正確なエピトープを決定するため、オーバーラップする10merのペプチドを、15merのMART-1ペプチド13内で遅れるlagging1アミノ酸を伴い生成し、そして同一患者のPBMCを刺激するのに使用した。48時間での培養上清中のIL-1aおよびIP-10の濃度、ならびに培養第8日のCFSE希釈アッセイを示す。これらの結果は、MART-154-62が、IFN-γの産生および特異的CD8T細胞の増殖を可能にするCD8T細胞のエピトープであることを示す。従って、EPIMAXはCD8T細胞の正確なエピトープを同定することを可能にする。図16A-Dは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。HLA-A2neg黒色腫患者から得たPBMCを、黒色腫細胞の大部分で広範に発現されている癌精巣抗原NY-ESO1をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個々のペプチドのいずれかで刺激した。クラスター5内のNY-ESO1ペプチド24は48時間にIP-10のアップレギュレーションを誘導した図16A。これらの結果は、NY-ESO193-107が特異的T細胞によりエピトープとして認識されることを示す。どのT細胞サブセットがこのエピトープを認識するかを検査するため、該患者のPBMCを、抗MHCクラスIブロッキングmAbW6/32若しくはアイソタイプ対照mAbの存在下に、NY-ESO1ペプチド24で刺激した。図16Bに示されるとおり、ペプチド24に応答してのIP-10産生はW6/32により完全に無効にされ、IP-10の産生がMHCクラスI分子に依存していること、従ってCD8T細胞がペプチド24を認識することを示す。CD8T細胞の正確なエピトープを同定するため、ペプチド24内の9merのオーバーラップペプチドを生成し、そして患者のPBMCを刺激するのに使用した。図16Cに示されるとおり、NY-ESO194-102はIP-10の強いアップレギュレーションを誘導し、これがCD8T細胞のエピトープであることを示す。HLA拘束要素を同定するため、PBMCを、IL-210IU/mlの存在下に、NY-ESO1ペプチド24でパルスした自己単球由来DCで刺激した。培養第9日に、細胞を、NY-ESO194-102ペプチドでパルスしたか若しくはパルスしていない各HLAをコードする発現プラスミドでトランスフェクトした、MHCクラスI分子を欠くLCLで再刺激した。8時間の刺激の間のIFN-γ分泌をELISAで測定した。図16Dに示されるとおり、NY-ESO194-102ペプチドでパルスしたHLA-B3501トランスフェクタントはT細胞からのIFN-γ産生を誘導し、この新規ペプチドがHLA-B3501分子により提示されることを示す。これらの結果は、EPIMAXが、HLA-A2neg患者においてCD8T細胞の新規エピトープを同定することを可能にすることを示し、そして、他の方法論との組合せが、われわれがそれらのHLA拘束要素を同定することを可能にする。図17は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。黒色腫患者図10と同一から得たPBMCを、MART-1の15-merペプチド6および13内の10merのオーバーラップペプチドで48時間刺激した。図17は、48時間での培養上清中のIP-10の濃度を示す。MART-126-35既知エピトープおよびMART-153-62新規エピトープがエピトープである。図18は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。2例のHLA-A2neg黒色腫患者から得たPBMCを、MART-1の15-merペプチド6内の10merのオーバーラップペプチドで48時間刺激した。48時間での培養上清中のIP-10の濃度を示す。MART-126-35既知エピトープは双方の患者についてエピトープである。このエピトープはHLA-A2に拘束されるとして既知である。これらの患者はHLA-A2negであり、かつ、HLAクラスIのサブタイプはこれら2例の患者間で完全に異なるため、このエピトープは最低3種の異なるMHCクラスI分子により提示される。これは、EPIMAXを用いるCD8T細胞のエピトープの同定の別の例である。図19は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。黒色腫患者図10と同一から得たPBMCを、6から15までの個別のMART-1の15-merペプチドで三重で48時間刺激した。48時間での培養上清中のIL-2の濃度を示す。MART-1ペプチド10および11はIL-2のアップレギュレーションを誘導した。この結果は、EPIMAXでのエピトープ同定の別の例を示す。図20は、図19に示されるところの同定された15-merペプチドでの刺激に際してのCD4T細胞からのIL-2産生を描く。同一患者のPBMCを、抗CD28/CD49dmAbおよびモネンシンの存在下にMART-1の15-merペプチド10で8時間刺激した。IL-2の産生を、特異的mAbで染色することにより分析した。該図は、MART-1ペプチド10に応答してIL-2を産生するCD4T細胞集団を示す。これらの結果は、EPIMAXがCD4T細胞のエピトープもまた同定し得ることを示す。図21A-Bは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。同一の黒色腫患者図19と同一から得たPBMCを、最初に1μMのCFSEで染色し、そしてMART-1をコードする個別のペプチドで三重で刺激した。培養第8日に、細胞をCD8-PE、CD3-PerCPおよびCD4-APCで染色し、そしてペプチド刺激に応答してのT細胞増殖を分析した。図21Aは、CD4T細胞集団内のCFSEが希釈されたCD4T細胞集団のを示す。MART-1ペプチド10および11は、ペプチドなしより多いCFSEが希釈されたCD4T細胞集団を誘導し、これらのペプチドが抗原特異的CD4T細胞の増殖を誘導したことを示す。図21Bは、CD4T細胞集団内の各MART-1の15-merペプチドに応答してのCFSEが希釈されたCD4T細胞集団を描く。MART-1ペプチド10および11は、他の15-merペプチドよりもCD4T細胞の有意により多い増殖を誘導した。これらの結果は、EPIMAXがCD4T細胞のエピトープの同定を可能にし、そしてCFSE技術と組み合わせることにより特異的CD4T細胞の増殖能力を決定することを可能にすることを強く示す。図22A-Cは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。CDワクチン接種を受領したHLA-A2neg黒色腫患者から得たPBMCを、最初に1μMのCFSEで染色し、そしてNY-ESO1をコードするペプチドのクラスターで刺激した。培養第8日に、細胞を、CD8-PE、CD3-PerCPおよびCD4-APCで染色し、そしてペプチド刺激に応答しての分析されたT細胞増殖を、フローサイトメーターを用いてCFSE希釈に基づき分析した。図22Aは、CD4T細胞集団内のCFSEが希釈されたCD4T細胞のパーセントを示す。NY-ESO1クラスター8は他のクラスターよりも多くのCFSEが希釈されたCD4T細胞集団を誘導し、これらのペプチドが抗原特異的CD4T細胞の増殖を誘導したことを示す。図22Bは、培養48時間での培養上清中のIL-2濃度を描く。IL-2はNY-ESO1のクラスター8を含む培養物で産生された。CD4T細胞のエピトープを同定するため、CFSEで染色したPBMCを、NY-ESO1クラスター8内の個別のペプチドで刺激した。増殖するCD4T細胞を、フローサイトメーターを用いてCFSE希釈に基づき第8日に分析した。図22Cに示されるとおり、NY-ESO1149-167およびNY-ESO1165-180はCD4T細胞のより多い増殖を誘導し、これらがエピトープであることを示す。この結果は、黒色腫抗原中のCD4T細胞エピトープの同定の別の例を示す。図23は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。黒色腫患者図10と同一から得たPBMCを、6から15までの個別のMART-115-merペプチドで三重で48時間刺激した。48時間での培養上清中のIL-5の濃度を示す。MART-1ペプチド10および11はIL-5のアップレギュレーションを誘導した。この結果は、EPIMAXでのエピトープ同定の別の例を示す。図24は、図23に示されるところの同定された15-merペプチドでの刺激に際してのCD4T細胞からのIL-5産生を描く。同一患者のPBMCを、抗CD28/CD49bmAbおよびモネンシンの存在下でMART-115-merペプチド11で8時間刺激した。IL-5の産生を、特異的mAbで染色することにより分析した。該図は、MART-1ペプチド11に応答してIL-5を産生するCD4T細胞集団を示す。この結果は、EPIMAXがエピトープならびに特異的CD4T細胞により産生されるサイトカインの型を同定し得ることを示す。図25は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。2例の黒色腫患者から得たCFSE染色したPBMCを、TRP-1クラスター25若しくはgp100クラスター15いずれかからの個別の15-merペプチドで刺激した。培養上清中のサイトカインを48時間に測定し、そして、T細胞の増殖を、CFSE希釈アッセイに基づき培養第8日に分析した。該結果は、TRP-1ペプチド124およびgp100ペプチド152がCD4T細胞のエピトープであり、それらの双方がCD4T細胞の新規エピトープであることを示す。ペプチド刺激は、IL-2、IL-5、IL-13およびIP-10IFN-γのような多様なエフェクターサイトカインの産生、ならびに特異的CD4T細胞の増殖を誘導した。これらの結果は、黒色腫抗原中のCD4T細胞エピトープの同定の別の例を示し、また、EPIMAXを使用して多様な型のT細胞応答を同定し得ることを示唆する。図26は、本発明により評価されるところの3例の黒色腫患者の免疫応答を描く。EPIMAXは、タイプ1Th1およびTc1、タイプ2Th2およびTc2細胞のような異なるT細胞サブセットを同定することを可能にする。転移性黒色腫を伴う患者から得たPBMCを、新たに同定された黒色腫ペプチド15-merで48時間刺激し、そして培養上清中のサイトカインを多重ビーズに基づくアッセイで測定した。色を付けた行は示されたペプチドでのサイトカインの濃度を表し下、また、白色の行は希釈剤での濃度を表す。3種の異なるT細胞サブセットすなわちタイプ1、2およびタイプIL-10の代表的なサイトカイン産生を示す。タイプ1応答はIL-1aおよびIP-10のアップレギュレーションにより同定される一方、タイプ2応答は、IP-10のアップレギュレーションを伴わない、IL-4、IL-5およびIL-13のようなタイプ2サイトカインのアップレギュレーションにより同定される。EPIMAXを使用して、IL-10のアップレギュレーションを特徴とする新規T細胞応答タイプIL-10を同定した。図27は、EPIMAX方法論で同定される4種の黒色腫抗原すなわちgp100、MART-1、NY-ESO1およびTRP-1内のCD4およびCD8T細胞の新たなエピトープの要約を描く。これらの新たなエピトープは、13例の黒色腫患者のPBMCをEPIMAXでスクリーニングすることにより同定された。表1は、EPIMAXを用いて同定したCD8T細胞のエピトープの要約を描く。同定された15-merペプチドおよびそれらのアミノ酸配列番号を示す。数種の15-merペプチドは、9-mer若しくは10-merいずれかのオーバーラップペプチドでフォーカシングされ、そして表中に示される。表2は、EPIMAXで同定されたTh0、Th1およびTh2細胞のエピトープの要約を描く。同定された15-merペプチドおよびそれらのアミノ酸配列番号を示す。表3は、EPIMAXで同定されたタイプIL-10のCD4T細胞のエピトープの要約を描く。同定された15-merペプチドおよびそれらのアミノ酸配列番号を示す。図28は、本発明により評価されるところの3例の黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。MART-1、gp100、NY-ESO1およびTRP-1のオーバーラップペプチドでの、転移性黒色腫を伴う患者13例の患者から得たPBMCのEPIMAX分析は、タイプ1応答を誘導する16種のペプチド、タイプ0/2応答を誘導する15種のペプチド、およびタイプIL-10を誘導する9種のペプチドを生じた。サイトカインは培養第2日に測定した。各T細胞サブセットでのIL-1αおよびIP-10の濃度をそれぞれ示す。各点は、同定された単一ペプチドで刺激したこれらの患者のPBMC培養物からのそれぞれ別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。この結果は、IL-1αおよびIP-10がタイプ1応答で完全に相関することを明確に示す。図29A-Dは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者から得たPBMCを、NY-ESO1をコードするペプチドのクラスター若しくは個々のペプチドで刺激した。培養48時間での培養上清中のIL-10濃度を示す図29A。NY-ESO1ペプチド39および40はエピトープである。IL-10産生の起源を探求するため、PBMCを、抗CD28/CD49dmAbおよびモネンシンの存在下でペプチド39で8時間刺激し、そしてIL-10特異的mAbで染色した。図29Bに示されるとおり、約0.11のCD4T細胞が、NY-ESO1ペプチド39に応答してIL-10を産生した。この結果は、EPIMAXが黒色腫患者においてIL-10を産生する黒色腫抗原特異的CD4T細胞を可能にすることを示す。次に、このIL-10産生T細胞が調節特性を有したかどうか評価するため、ペプチド39若しくは無関係な15-merペプチドで刺激したPBMCをトランスウェル中で第三者MLRに添加して、可溶性媒介物質の放出によるT細胞増殖の抑制を試験した。MLRは、ペプチド特異的T細胞応答の影響を回避するため、CFSE標識したCD4T細胞および同種異系の成熟DC双方とも健康志願者からを使用した。NY-ESO1ペプチド39で刺激したがしかし対照ペプチドでしなかった患者のPBMCは、MLRでの増殖を有意に抑制した図29C、29D。これらの結果は、EPIMAXのアプローチが腫瘍抗原特異的抑制性T細胞を同定し得ることを示す。図30は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。図29A-Dでと同一の黒色腫患者から得たPBMCを、2つの異なる時間点、すなわちDCワクチン接種前および8回のワクチン接種後に、NY-ESO1をコードする個別のペプチドで刺激した。培養48時間での培養上清中のサイトカイン/ケモカインの濃度を示す。この結果は、タイプIL-10のシグネチャがワクチン後に消失したことを示し、IL-10産生CD4T細胞の機能がワクチン後に喪失されたことを示唆する。これらの結果は、EPIMAXアッセイを用いる、DCワクチンによるT細胞応答の調節の別の例を示す。図31は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。われわれは、タイプIL-10応答を誘導する黒色腫抗原中の9種の異なるエピトープを7例の黒色腫患者で同定した。黒色腫を伴う患者から得たPBMCを、各患者に特異的な同定された15-merペプチドとともに48時間インキュベートした。該図は、同定されたタイプIL-10ペプチドとのインキュベーションによる自発的IP-10産生の阻害を示す。これは、EPIMAXで同定されたIL-10産生CD4T細胞の抑制機能の別の立証である。図32は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。同定されたIL-10を誘導する15-merペプチドを含む各PBMC培養物中のIL-1βおよびIP-10濃度を示す。各点は、同定された独特の単一の15-merペプチドを含むPBMC培養物中の各別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。この結果は、IL-1βおよびIP-10が同定されたタイプIL-10応答で相関し、従って双方のサイトカインがEPIMAXでタイプIL-10細胞を同定するための良好なマーカーであり得ることを示す。図33は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。3名の正常健康志願者から得た新鮮PBMCを3バッチに分割した。各バッチからのPBMCを、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質Flu-MPをコードする15-merのオーバーラップペプチドのクラスターで二重で刺激し2×105細胞/ウェル、ペプチドあたり10μM、従って六重のサンプルを創製した。培養48時間でのIP-10の濃度を示す。黒棒および陰は、ペプチドを伴わない培養物中のIP-10の平均±3SD値を表す。IP-10の濃度が、このバックグラウンドの平均3SDの上で測定されたことは、ペプチドクラスターに応答してのIP-10の陽性の誘導である。正常ドナー1において、12種のペプチドクラスターのうち9種が六重のサンプルのうち4以上で陽性を記録し、このドナーがFlu-MPに特異的なT細胞の非常に広範なレパートリーを有したことを示した。対照的に、正常ドナー3では、どのクラスターもIP-10のアップレギュレーションを誘導しなかった。EPIMAXは所定の抗原タンパク質に対するT細胞応答の完全な幅の同定を可能にする。さらに、この研究はEPIMAXが高度に再現可能なアッセイであることを示す。図34は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。図33に示される同一の試験でのIL-6およびIP-10の濃度を示した。際立って、正常ドナー3において、いかなるヒットもIP-10産生で同定されなかったが、しかし、ペプチドの多くのクラスターがIL-6産生で陽性を記録した。この結果は、サイトカインの多様な組の測定がEPIMAXにおいてT細胞の多様なサブセットを同定し得ることを示す一例を示す。図35は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。図33に示される試験でのIL-1aおよびIP-10の濃度を示した。各点は、ペプチドクラスターを含むPBMC培養物中の各別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。全部のドナーにおいて、IL-1aおよびIP-10の濃度はEPIMAXで非常に良好に相関し、これら2種のマーカーがタイプ1応答で完全に相関することを確認する。図36は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ドナー1から得た凍結PBMCを融解し、そしてFlu-MPをコードする15-merペプチドのクラスター若しくは単一ペプチドのいずれかで刺激した。IL-1aおよびIP-10の濃度を示す。各点は、ペプチドクラスター若しくは単一ペプチドを含むPBMC培養物中の各別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。凍結PBMCででさえ、IL-1aおよびIP-10の濃度は非常に良好に相関しP<0.0001、r=0.9121、これら2種のマーカーが、PBMCがどんなに新鮮若しくは凍結で得られようと、EPIMAXでタイプ1応答を同定するのに使用し得ることを示す。図37は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ドナー1から得た新鮮若しくは凍結PBMCを、Flu-MPをコードする15-merペプチドのクラスターで刺激した。IL-1aおよびIP-10の濃度を示す。図37に示されるとおり、クラスター6および12双方が、新鮮および凍結PBMCでのIL-1aおよびIP-10のアップレギュレーションを誘導した。この試験は、EPIMAXで抗原特異的T細胞応答をモニターするのに凍結PBMCを使用し得ることを示す。図38A、38Bは、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ドナー1から得た凍結PBMCを融解し、そしてFlu-MPをコードするペプチドのクラスター若しくは個別のペプチドで六重で刺激した2×105細胞/ウェル、ペプチドあたり10μM。培養48時間でのIP-10の濃度を示す図37A。別の試験において、より多数のPBMC2×106細胞/ウェルを、同一濃度の15-merペプチドで三重で刺激した。図37Bに示されるとおり、ペプチド58および59が双方の試験でIP-10産生のスイッチを入れた一方、サンプルと対照培養物の間の対比は、ウェルあたりより多くのPBMCをEPIMAXアッセイで使用した場合により大きい。従って、ウェルあたりより多数のPBMCが、EPIMAXアッセイにおける変動性および感受性を低下させるのに役立つ。PBMC中の抗原特異的T細胞の低頻度通常105PBMCから1個を考慮すれば、T細胞応答は、ペプチド刺激に細胞がほとんど応答しなかった場合はEPIMAX若しくは事実上いかなる種類のアッセイでも検出されないことがあることがもっともらしい。従って、正規のEPIMAXアッセイにおいて、われわれは5×105PBMC/ウェルを使用している。図39Aおよび39Bは、EPIMAXアッセイで同定されたペプチドに対する正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。PBMCを1×106細胞/mlでCMに再懸濁し、そして1mlの細胞懸濁液を培養管に入れ、そしてFlu-MPライブラリーからの示された単一ペプチドで7日間刺激した。培養したPBMCを収集し、そしてモネンシンの存在下に示されたペプチドで5時間パルスしたDCで再刺激した。細胞質のサイトカインを、細胞浸透化後に特異的mAbで検査した。CD3CD4T細胞集団中のサイトカイン産生細胞の割合を示した図39A。ドミナントなペプチドでの刺激は特異的CD4T細胞の増殖を誘導した。ドナーのPBMCを1mMのCFSEで最初に染色した。PBMCを1×106細胞/mlでCMに再懸濁し、そして1mlの細胞懸濁液を培養管に入れ、そしてFlu-MPライブラリーからの示された単一ペプチドで6日間刺激した。刺激した細胞を抗CD3およびCD4mAbで染色し、そして増殖するCD4T細胞を、CFSE希釈に基づきフローサイトメーターを用いて分析した。CD3CD4T細胞集団中のCFSE細胞の割合を示した図39B。これらの結果は、EPIMAXが、機能的なFlu-MP特異的CD4T細胞のエピトープの同定を可能にしたことの証明を示す。図40は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。PBMCを図33中のドナー2から得た。凍結PBMCを融解し、そしてFlu-MPのクラスター11若しくはクラスター11内の単一の15-merペプチドのいずれかで刺激した5×105細胞/ウェル、ペプチドあたり20μM。培養48時間でのサイトカインの濃度を示す。これらの結果は、ペプチド52および53がFlu-MP特異的T細胞のエピトープであることを示し、特異的CD4T細胞の新規エピトープの同定の別の例を示す。図41A、41Bは、EPIMAXアッセイで同定されたペプチドに対する正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。図40の試験で使用したPBMCをCFSEで標識し、そしてFlu-Mpクラスター11内の単一ペプチドで刺激した。CFSEが希釈されたCD4T細胞を培養第8日に分析した図41A。別の試験において、CFSEが希釈されたCD4T細胞集団を、培養第6、7、8、および10日に分析した図41B。これらの試験は、EPIMAXを用いて同定されたペプチドFlu-MPペプチド52および53が、ペプチド特異的CD4T細胞の増殖を誘導し、また、増殖するCD4T細胞の集団がペプチド刺激第7若しくは8日にピークに達したことを示す。この試験は、特異的CD4T細胞の新規エピトープの同定の別の例を示し、そして増殖するCD4T細胞集団の分析を培養第8日に実施することを正当化する。図42は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。PBMCはDCワクチン接種を受けた黒色腫患者から得た。該患者は、殺した同種異系黒色腫細胞株を負荷した自己DCワクチンを受領した。DCワクチンが、DCワクチンに使用した同種異系黒色腫細胞株上で発現される同種異系抗原に特異的なこの患者でT細胞を誘導したことが可能である。この可能性を検査するため、患者PBMCを、黒色腫細胞株上で発現されるがしかし該患者細胞上でされない、HLA-B4001をコードする15-merのオーバーラップペプチドで刺激した。図42に示されるとおり、クラスター1内のペプチド5およびペプチド7はPBMC培養物中でIP-10産生を誘導した。期待されたとおり、これら2種のエピトープは、双方のペプチドがアミノ酸ミスマッチを含有するため、該患者の抗原エピトープであり得る。これらの結果は、EPIMAXが同種異系抗原特異的T細胞応答を同定し得ることを示す。従って、この方法論は、臓器移植の設定で同種異系抗原特異的T細胞を同定するのに有用であり得る。図43は、本発明により評価されるところの1型糖尿病患者の免疫応答を描くグラフである。PBMCは、セルセプトおよびプレドニゾロンのような免疫抑制薬を服用している1型糖尿病を伴う患者から得た。新鮮PBMC5×105細胞/ウェルを、IA-2膵β島細胞上で特異的に発現される自己抗原の1種をコードする単一の15-merペプチドで刺激した。培養48時間でのIP-10の濃度を示す。15-merペプチド47、60、61、62、64および66は、PBMC培養物中でのIP-10産生のアップレギュレーションを誘導した。この試験は、この患者がIA-2特異的タイプ1細胞の広範なレパートリーを有することを示す。さらに、6種のうち5種ペプチド47、60、61、62および66、配列は表4に示すがT細胞の新規エピトープである。従って、この試験は、EPIMAXが、免疫抑制薬の投薬下でさえ、われわれが自己免疫疾患モデルでエピトープおよびT細胞応答の型を同定することを可能にする。図44Aおよび44Bは、多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。前ワクチン黒色腫患者から得たPBMCを、スルビビンペプチドライブラリーの5種のペプチドクラスター7~8種のペプチド/クラスターとともにインキュベートした。スルビビンのクラスター3はIP-10のダウンレギュレーションおよびIL-10のアップレギュレーションを誘導した。PBMCをその後、クラスター3からの単一のペプチドとともにインキュベートして、原因となるペプチドすなわちペプチド15を同定した。IL-10のアップレギュレーションはIL-1bと相関した。データは、IP-10について図44Aおよび44C、IL-10について図44Bおよび44D、IL-1αについて図44Eおよび44G、ならびにIL-1βについて図44Fおよび44Hに示す。図45は、非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。PBMCを5名の健康志願者の新鮮血から単離し、スルビビンペプチド15とともに48時間インキュベートし、そして本発明の方法により評価した。培養上清中の産生されたIP-10を測定し、そして、図45のデータは、ペプチドが添加されない場合の培養物に対する相対値を示す。スルビビンペプチド15は、全5名の志願者でのIP-10産生をMHC非拘束性の様式で阻害することが示された。図46Aおよび46Bは、非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者からのPBMCを、スルビビンペプチド15および/若しくは生インフルエンザウイルスCharlesRiverLaboratories、コネチカット州の存在若しくは非存在下で18時間培養した。IP-10図46AおよびIL-10図46B濃度をLuminexで測定した。スルビビンペプチド15は、生インフルエンザウイルスで刺激したPBMCからのIP-10産生を阻害することが示された。図47は、非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者からのPBMCを、スルビビンペプチド15若しくはペプチド1611アミノ酸がペプチド15に同一であるの存在下で、滴定した濃度のTSST-1で5日間刺激した。5日後にトリチウム化チミジン1μCi/ウェルを添加した。プレートを16時間後に収集し、そして取り込まれた放射活性をWallacシンチレーションカウンターにより測定した。スルビビンペプチド15は、TSST-1で刺激されたT細胞増殖を阻害することが示された。図48A-48Dは、非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。CD4、CD8、CD14、CD56、BDCA-4またはBDCA-1若しくは3細胞を、各mAbMiltenyiと複合させたマイクロビーズを使用することにより、黒色腫患者のPBMCから枯渇させた。陰性対照として、PBMCを、いかなるビーズも含まないカラムを通過させた枯渇なし。枯渇させた細胞を1M/mlでCMに再懸濁し、そしてスルビビンペプチド15の存在若しくは非存在下で生インフルエンザウイルスで刺激した。上清を48時間に収集し、そしてIL-10およびIP-10濃度をLuminexで分析した。該データは、CD14若しくはCD56細胞が、ペプチド15がIL-10分泌を誘導するのに必要であることを示す。図49Aおよび49Bは、非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者からのPBMCを5μMCFSEで染色し、そして10μMのスルビビンペプチド15図49B若しくは対照ペプチド6図49Aとともに4日間培養した。NK集団をFACSで分析した。それらのCD56細胞はCFSEの強度を低下させず、それらが増殖していないことを示す示されない。従って、ペプチド15はCD3-CD56NK細胞の生存を維持することが示された。本明細書に記述される特定の態様は本発明の具体的説明として示されかつその制限として示されないことが理解されるであろう。本発明の原則的特徴は、本発明の範囲から離れることなく多様な態様で使用し得る。当業者は、本明細書に記述される特定の手順に対する多数の同等物を認識するであろうか、若しくは、わずかに慣例の実験を使用して確認することが可能であろう。こうした同等物は本発明の範囲内にあると考えられ、そして請求の範囲により包括される。本明細で挙げられた全部の刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の熟練の水準を暗示する。全部の刊行物および特許出願は、各個々の刊行物若しくは特許出願が引用することにより組み込まれることをとりわけかつ個々に示された場合と同一の程度まで、引用することにより本明細書に組み込まれる。本明細書に開示かつ特許請求される組成物および/若しくは方法の全部は、本開示に照らして過度の実験を伴わずに作成かつ実施し得る。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記述された一方、本明細書に記述される組成物および/または方法に対し、ならびに該方法の段階若しくは段階の順序において、本発明の概念、技術思想および範囲から離れることなく、変形が適用されうることが、当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的の双方で関係するある剤を、同一若しくは類似の結果が達成されるとみられる一方で、本明細書に記述される剤の代わりに用いうることが明らかであろう。当業者に明らかな全部のこうした類似の代替および改変は、付随する請求の範囲により定義されるところの本発明の技術思想、範囲および概念内にあると考えられる。"