細胞における神経栄養因子の発現に対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。作用が発現促進作用である請求項1記載の判定又は評価方法神経栄養因子がBDNFである請求項1又は2記載の判定又は評価方法。神経栄養因子がNGF又はNT3である請求項1又は2記載の判定又は評価方法。細胞におけるCREBに対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。作用がCREBのリン酸化促進作用である請求項5記載の判定又は評価方法。CREBのリン酸化促進作用をc-Fosの産生を測定して指標とする請求項6記載の判定又は評価方法。細胞におけるMAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質活性化に対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。作用がタンパク質のリン酸化促進作用である請求項8記載の判定又は評価方法。MAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質が、MEK/ERK経路におけるタンパク質である請求項9記載の判定又は評価方法。MEK/ERK経路におけるタンパク質が、Grb2、Sos、Ras、Raf、MEK12、ERK12又はRskである請求項10記載の判定又は評価方法。MAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質が、PI3K/Akt経路におけるタンパク質である請求項11記載の判定又は評価方法。PI3K/Akt経路におけるタンパク質が、PI3K、Akt又はP38MAPKである請求項12記載の判定又は評価方法。細胞が培養細胞である請求項1乃至13にいずれか一項記載の判定又は評価方法。細胞がSHSY5Y細胞である請求項14記載の判定又は評価方法。炎症組織が皮膚組織である請求項1乃至15のいずれか一項記載の判定又は評価方法。炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である請求項1乃至15のいずれか一項記載の判定又は評価方法。請求項1乃至17のいずれか一項記載の判定又は評価方法によって品質規格が担保されたワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物。請求項1乃至17のいずれか一項記載の判定又は評価を行うことによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の品質規格を担保する方法。本発明の目的は、培養細胞におけるBDNF等の神経栄養因子の発現それに関与する細胞内シグナル伝達系路における各種タンパク質に対する作用を指標としたワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法を提供することにある。本発明者らは、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の薬理作用について鋭意研究を行った結果、該抽出物が培養細胞におけるBDNF等の神経栄養因子の発現に対して作用を及ぼすこと、並びに、BDNF等発現に関与する細胞内シグナル伝達系路における各種タンパク質に対して作用を及ぼすことを見出し、これらを指標としたワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法として本発明を完成した。ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、培養細胞におけるBDNF等の神経栄養因子の発現及びそれに関与する細胞内シグナル伝達系路における各種タンパク質に対する作用を有することが明らかになった。このBDNF等の発現及びそれに関与するタンパク質に対する作用は簡便な方法を用いて測定することができる。ワクシニアウイルス接種炎症皮膚抽出物は非常に膨大な数の成分からなる多成分系の物質であることから、その作用を単一あるいは複数の含有成分の含量等で判定又は評価し、薬効等を担保することは極めて困難である。その点、本発明の判定又は評価方法によれば、簡便にワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の作用を判定又は評価でき、引いては該抽出物の薬効を担保することに利用できるなど、極めて有用性の高いものである。なお、本願における判定又は評価には、試験、検査等により対象物を調べて見定める概念のすべてが包含されるものである。本発明は、培養細胞をワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物によって処理し、BDNF等の発現又はそれに関与する細胞内シグナル伝達系路における各種タンパク質の活性化等を測定することによって、被検物質であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を判定又は評価する方法に関する。本発明に使用可能な細胞としては、最も簡便には市販の培養細胞がある。その最も好ましい例のひとつとして、BDNF等及びその高親和性受容体TrkBを発現するヒト神経芽細胞腫SHSY5Y細胞が挙げられる。しかし、本発明においては、SHSY5Y細胞に限らず、PC12細胞ラット副腎髄質由来褐色細胞腫やシュワン細胞新生児ラット坐骨神経といった別の細胞も適宜使用することができる。本発明判定又は評価方法の被検物質は、ワクシニアウイルスを動物に接種した炎症組織において産生される生理活性物質ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物であり、該物質を病態組織から抽出する方法並びにそれらの薬理活性等が上述のようにすでに種々報告されている上記特許文献1乃至15等参照。また、本発明被検物質として使用可能な市販されている製剤として、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤がある。この製剤は、日本の医療用医薬品集2010年版、財団法人日本医薬情報センター編集発行の2978乃至2980頁に記載されているように、ワクシニアウイルスを接種した家兎の炎症皮膚組織から抽出分離した非タンパク性の活性物質を含有するものである。腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神経痛、肩関節周囲炎、変形性関節症、皮膚疾患湿疹、皮膚炎、じんま疹に伴う掻痒、アレルギー性鼻炎、スモン後遺症状の冷感異常知覚痛み、帯状疱疹後神経痛等に対する適応が認められており、皮下、筋注、静注用の注射剤並びに錠剤が医療用医薬品として承認を受けて販売されている。以下、本発明被検物質であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を製造する方法等について説明する。本発明被検物質であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、ワクシニアウイルスを接種して発痘した炎症組織を破砕し、抽出溶媒を加えて組織片を除去した後、除蛋白処理を行い、これを吸着剤に吸着させ、次いで有効成分を溶出することによって得ることができる。ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、例えば、以下の工程で製造される。aワクシニアウイルスを接種し発痘させたウサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液またはフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えた後、濾過または遠心分離することによって抽出液濾液または上清を得る。b前記抽出液を酸性のpHに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過または遠心分離する。c得られた濾液または上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。d前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性のpHに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得ることができる。その後、所望に応じて、適宜溶出液を減圧下に蒸発乾固または凍結乾燥することによって乾固物とすることもできる。上記各工程を更に詳しく述べると次のとおりである。aについてワクシニアウイルスを接種し炎症組織を得るための動物としては、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、ラット、マウスなどワクシニアウイルスが感染する種々の動物を用いることができ、炎症組織としてはウサギの発痘皮膚組織が好ましい。これら炎症組織を採取して破砕し、その1乃至5倍量の抽出溶媒を加えて乳化懸濁液とする。抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、グリセリン等の安定化剤、フェノール等の殺菌防腐剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。bについて得られた乳状抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、タンパク質変性剤、例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒などによる処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙セルロース、ニトロセルロース等、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離などにより析出してきた不溶タンパク質を除去する。cについてこうして得られた有効成分含有抽出液を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて酸性、好ましくはpH35乃至55に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、有効成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。dについて吸着剤より有効成分を溶出脱離させるには、前記吸着剤に溶出溶媒を加え、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去して達成できる。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。このようにして得られた抽出物溶出液は、製剤用原体や医薬品製剤として好ましい形態に適宜調製することができる。例えば、溶液のpHを中性付近に調整して製剤用原体とすることもでき、また濃縮希釈によって所望の濃度に合せることもできる。さらに注射用製剤として塩化ナトリウムを加えて生理食塩液と等張の溶液に調製することもできる。また、これら溶液を濃縮乾固又は凍結乾燥することによって、錠剤等の原料として利用できる固形物の形態に調製してもよい。患者への投与方法としては、経口投与の他に皮下、筋肉内、静脈内投与等が挙げられ、投与量はワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の種類によって適宜設定することができる。市販製剤で認められている投与量は、前記日本の医療用医薬品集2978頁によれば、基本的には内服では1日16NU、注射剤では1日36乃至72NUを投与するよう示されているが、疾患の種類、重傷度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減可能であるNU:ノイロトロピン単位。ノイロトロピン単位とは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるSARTストレスマウスを用い、RandallSelitto変法に準じて試験を行い、鎮痛効力のED50値をもって規定する。1NUはED50値が100mg/kgであるときのノイロトロピン製剤の鎮痛活性含有成分1mgを示す活性である。。以下に、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の製造方法の具体例、並びに該抽出物によるBDNFの発現亢進に関する薬理試験結果を示すが、本発明はこれらの実施例の記載によって何ら制限されるものではない。実施例1健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、発痘した皮膚を剥出し、これを破砕してフェノール水を加えた。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5に調整した後、90~100°Cで30分間加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9とし、さらに90~100°Cで15分間加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH45に調整し、2の活性炭を加えて2時間撹拌した後、遠心分離した。採取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10とし、60°Cで15時間撹拌した後、遠心分離濾過して上清を得た。採取した活性炭に再び水を加え、水酸化ナトリウムでpH11とし、60°Cで15時間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。両上清を合せて、塩酸で中和し、ワクシニアウイルス接種家兔炎症皮膚抽出物を得た。実施例2健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し感染させた後、発痘した皮膚を無菌的に剥出しこれを細切した後フェノール加グリセリン水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状とした。次いでこれを濾過し、得た濾液を塩酸で弱酸性pH45乃至55に調整した後、100°Cで加熱処理し濾過した。濾液を水酸化ナトリウムで弱アルカリ性pH85乃至100とし、さらに100°Cで加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH45とし、約15の活性炭を加えて1乃至5時間撹拌した後濾過した。濾取した活性炭に水を加え水酸化ナトリウムでpH94乃至10に調整し、3乃至5時間撹拌した後、濾過し濾液を塩酸で中和した。実施例3健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、活性化させた後、活性化した皮膚を無菌的に剥出し、これを細切して水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状物とした。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH50に調整した後、流通蒸気下100°Cで加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH91とし、さらに100°Cで加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸でpH41に調整し、活性炭2を加えて2時間撹拌した後濾過した。濾液は更に活性炭55を加えて2時間攪拌した後濾過した。最初に濾取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH99とし、60°Cで15時間撹拌した後濾過した。最初の活性炭及び次の活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH109とし、60°Cで15時間撹拌した後濾過した。濾液を合わせ塩酸で中和した後、分子量100の膜を用いた電気透析法で脱塩処理を行い、減圧下に乾固した。次に、上記実施例1で得られた本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を被検物質として、その存在下にヒト神経芽細胞腫SHSY5Y細胞を培養した際の薬理試験の結果の一例を示す。なお、SHSY5Y細胞については、Hamano等の方法MolecularBrainResearch、137巻、70-76頁、2005年に従い、10ウシ胎仔血清FCS、1mLピルビン酸、037ブドウ糖及び25mIUmLペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地GibcoDMEM;Invitrogen社中、37°C、5CO2の加湿インキュベータで前培養したものを用いた。また、被検物質で処理した後の各培養細胞について、48時間以内の形態学的変化や、トリパンブルー色素排除試験による細胞生存率の低下は見られないことを確認した。また、試験終了後、全データについてStudentのt検定SASSystemversion82、SASInstituteJapan社により統計解析し、0055及び0011を有意水準として有意差検定を行った。薬理試験1:BDNFの経時的発現SHSY5Y細胞5×105細胞を被検物質30mNUmL又はポジティブコントロールとしてレチノイン酸1μMで処理し、無血清DMEMDulbeccosmodifiedEaglesmedium培地で0、1、3、6、12、18、24時間培養した。培養上清を除去した後、トータルRNAをトリゾル試薬Invitrogen社により単離し、回収率と純度を260nm及び280nmの紫外部吸収より測定したGeneQuantPro、GEHealthcare社。RNA等量をスーパースクリプトIIIファーストストランドDNA合成キットInvitrogen社によってランダムプライマーを用いて一本鎖DNAに逆転写し、続いてTaqDNAポリメラーゼInvitrogen社による半定量的PCRPolymerasechainreactionを行った。なお、BDNF及びシクロフィリンA内部標準遺伝子用のPCRプライマーInvitrogen社はYamamoto等の方法NeurochemicalResearch、21巻、8号、929-938頁、1996年に従って設計した。PCR産物を3アガロースゲルNuSieve31アガロース、タカラバイオ社電気泳動により分離し、BDNF及びシクロフィリンAのバンドをエチジウムブロマイド01μgmL染色して可視的に検出した。PCRにおける鋳型と産物の量の直線性は別途確認した。上記試験結果の一例を図1に示す。薬理試験2:神経栄養因子の用量依存的発現SHSY5Y細胞約5×105細胞を被検物質0、2、10、50、250mNUmLで処理し、無血清DMEM培地で24時間培養した。次に、上記薬理試験1と同様に、抽出したトータルRNAについて半定量的PCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、NGF、BDNF、NT3、TrkA、TrkB及びGAPDHGlyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseのバンドを可視的に検出した。なお、NGF、BDNF及びNT3用の各PCRプライマーInvitrogen社はYamamoto等の方法NeurochemicalResearch、21巻、8号、929-938頁、1996年に従って設計し、TrkATropomyosinrelatedkinaseA、TrkBTropomyosinrelatedkinaseB及びGAPDH用の各PCRプライマーSigmaGenosys社は以下の配列として独自に設計したTrkA:5tggacaaccctttcgagttc35cgtccacatttgttgagcac3、TrkB:5ccgagattggagcctaacag35tgcaggttgctgtttttcag3、GAPDH:5atcactgccacccagaagac35tttctagacggcaggtcagg3。また、抽出したトータルRNAについて、濃度が既知である目的物の鋳型cDNAを用いてリアルタイムPCRシステムPrism7900HT、AppliedBiosystems社により、BDNFのmRNAを定量した。なお、BDNF及びGAPDH用のPCRプライマーは以下のヌクレオチド配列であるBDNF:5gctgcaaacatgtccatgag35atgggattgcacttggtctc3、GAPDH:5atcactgccacccagaagac35tttctagacggcaggtcagg3。結果は、GAPDHに対するBDNFの転写コピー数の比率を8回測定した平均値を得、コントロール生理食塩水処理を10とした場合の値として表示した。上記試験の半定量的PCRの結果の一例を図2に、定量的PCRの結果の一例を図3に示す。薬理試験3:細胞内BDNFの発現SHSY5Y細胞1×106細胞を被検物質0、2、10、50mNUmL存在下で24時間培養した。次に、SHSY5Y細胞1×106細胞をプレートよりこそげ取り、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄し、細胞ペレットをプロテアーゼ阻害剤混合物Sigma社を含有する溶解バッファー20mMHEPES:41piperazineethanesulfonicacid;pH72、1NonidetP40、10glycerol、50mMNaF、1mMphenylmethylsulfonylfluoride、1mMNaVO4で処理した。細胞残屑を除去した後、ELISAenzymelnkedimmunosolventassay、酵素免疫測定法を行うまで細胞溶解物を80°Cで保存した。なお、細胞溶解物のタンパク含量はBCAタンパクアッセイキットThermoFisherScientific社で測定した。次に、保存しておいた細胞溶解物中のBDNFを市販のELISAキットEmaxELISAkits、Promega社を用い、我々の標準プロトコールに準じて定量した。すなわち、BDNF捕獲用の対応抗体を96wellポリスチレンプレートlumulon4HBX、ThermoFisherScientific社の表面に結合させ、次に、取り込んだBDNFを二次抗体と結合させ、西洋ワサビペルオキシダーゼhorseradishperoxidase:HRPで標識した種特異的抗体により検出した。結合していない標識抗体を除去した後、マイクロプレートリーダーBenchmarkmicroplatereader、BioRad社で450nmにおける発色性基質を測定して、結合している酵素の活性を算定した。これらキットを使用して、39~500pgmLの範囲で細胞内BDNFを定量した。なお、他の神経栄養因子タンパク質との交差反応は2未満である。結果はn3の平均値及び標準誤差で示した。上記試験結果の一例を図4に示す。薬理試験4:cFosの発現SHSY5Y細胞5×105細胞を被検物質0、2、10、50mNUmLで24時間培養した。次に、上記薬理試験1と同様に、単離したRNAについて半定量的RTPCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、cFosのバンドを可視的に検出した。なお、cFos用のPCRプライマーSigmaGenosys社は以下の配列として独自に設計したcFos:5gcttcccttgatctgactgg35atgatgctgggaacaggaag3。上記試験結果の一例を図5に示す。薬理試験5:CREB経路に対する効果細胞内シグナル伝達分子を、CREBMAB5432;Millipore社、リン酸化CREBPCREB:Clone10E9;Millipore社、P4244MAPキナーゼERK12;CellSignalingTechnology社、リン酸化P4244MAPキナーゼPMAPK:Tyr202Tyr204;CellSignalingTechnology社及びcFosGeneTex社に対して産生される各特異抗体を用いてイムノブロット法により検出した。すなわち、まずSHSY5Y細胞1×106細胞を無血清DMEM培地で6時間培養し、ヒトリコンビナントBDNF50pgmL;Peprotech社又は被検物質0、2、10、50mNUmLで10分又は30分間処理した。次いで、該細胞をセルスクレイパーBDBiosciences社でこそげ取り、すぐに氷冷したPBSで洗浄した後、Mutoh等の方法ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica、92巻、5087-5091頁、1995年に従って細胞溶解した。細胞溶解物について4~20ゲルePAGEL;AttoChmicals社のSDSPAGE電気泳動を行い、PVDFPolyvinylideneflorideメンブレンにブロッティングした。該メンブレンを3無脂肪乳及び01Tween20TBSTを含有するトリス緩衝生理食塩水TBS;20mMTrisHCl、pH75、015MNaClで1時間ブロッキングした後、一次抗体及びHRP標識二次抗体との反応をTBST中室温で1時間行った。CREB、リン酸化CREB、P4244MAPキナーゼ、リン酸化P4244MAPキナーゼ及びcFosの免疫反応性バンドを電気化学的発光による検出システムECL;GEHealthcare社により可視的に検出した。上記試験結果の一例を図6に示す。薬理試験6:BDNF発現における細胞内シグナル伝達阻害剤による影響SHSY5Y細胞5×105細胞を被検物質10mNUmL存在下、無血清DMEM培地中で24時間培養した。培養終了30分前に、培地に溶解したPD98059MEK阻害剤、10μM、LY294002PI3K阻害剤、15μM又はSB203580p38MAPK阻害剤、05μMを培養物に添加した。次に、上記薬理試験1と同様に、抽出したトータルRNAについて半定量的RTPCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、BDNF及びシクロフィリンAのバンドを可視的に検出した。上記試験結果の一例を図7に示す。薬理試験7:細胞内cAMP含量SHSY5Y細胞を24well培養プレートに375×105細胞/wellで播種し、無血清DMEM培地において、被検物質2、10、50mNUmL又はポジティブコントロールとしてのフォルスコリン10μM;Sigma社で30分間処理した。培養上清を除去した後、すぐに300μLwellの01M塩酸で4°Cにて細胞溶解した。細胞溶解物の細胞内cAMP含有量をEIAenzymeimmunoassayキットCaymanChemicals社により、メーカーの使用説明書に従って直接測定した。なお、タンパク質濃度はBSA標準液ThermoFisherScientific社を用いたBCAプロトコールThermoFisherScientific社により測定した。結果は4回測定の平均値及び標準偏差で示す。上記試験結果の一例を図8に示す。薬理試験8:TrkB阻害の影響SHSY5Y細胞5×105細胞を被検物質10mNUmLで無血清DMEM培地中24時間培養した。培養終了30分前に、K252aチロシンキナーゼ阻害剤、500nM又はヒトTrkB特異抗体のウサギIgGαTrkB、20μgmLを培養物に添加した。次に、上記薬理試験1と同様に、抽出したトータルRNAについて半定量的RTPCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、BDNF及びシクロフィリンAのバンドを可視的に検出した。上記試験結果の一例を図9に示す。薬理試験9:TrkBの内在化細胞表面のTrkB分子の密度を一部改良されたSerresとCarneyの方法BrainResearch、1101巻、3642頁、2006年により測定した。すなわち、まず、SHSY5Y細胞を1×105mLで播種して培養し、1FCS含有DMEM培地において被検物質21050mUmLで処理した。受容体の内在化を防ぐために01mM塩化カルシウムと1mM塩化マグネシウムを添加した氷冷PBSで細胞を3回洗浄した。次に、細胞表面上の分子を、PBSに溶解した250μgmLEZLinksulfoLCLCNHSbiotinThermoFisherScientific社により4°Cで30分間ビオチン化した。未反応のビオチン化試薬を抑制するために10mMグリシン含有氷冷PBSで2回洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤混合物Sigma社を含有する最低量の細胞溶解バッファー1NonidetP40、05sodiumdeoxycholate、01SDSinPBSで細胞溶解した。タンパク濃度を細胞溶解バッファーで50μgmLに調整して試料とした。5μgの試料100μLをストレプトアビジンが固定されたプレート上、2時間室温でインキュベートした。02Tween20含有PBSで3回洗浄した後、ウサギ抗Trk抗体100μL;CloneC14、SantaCruzBiotechinology社を1:1000に希釈して添加し、1時間置いた。洗浄後、HRPで標識した抗ウサギIgG1:1000、100μL;AP132P、ChemiconInternational社を添加して1時間置き、次いで、TMBOneSubstrate100μL;Promega社との酵素反応を行った。01N塩酸50μLを添加して反応を停止し、結合した特異的抗体を450nmでの吸光度を測定することにより定量したBenchmarkmicloplatereader。結果はn3の平均値及び標準誤差で示し、コントロールに対するパーセンテージで表示した。上記試験結果の一例を図10に示す。薬理試験結果1被検物質によるSHSY5Y細胞におけるBDNF発現促進薬理試験1の結果図1より、SHSY5Y細胞を被検物質で処理することにより、BDNFの発現がmRNAレベルで経時的に亢進されることが確認された。また、培養24時間後の被検物質によるBDNF誘導の強さは、ポジティブコントロールであるレチノイン酸と同程度であった。薬理試験2の結果図2及び図3より、SHSY5Y細胞を被検物質で処理することにより、BDNF及びBDNF以外の神経栄養因子NGF、NT3の発現がmRNAレベルで亢進されることが認められた。しかし、神経栄養因子の高親和性受容体であるTrkAやTrkBの発現は亢進されなかった。また、これらの試験では、被検物質によるBDNFの発現促進効果には至適濃度10mNUmLがあると考えられた。さらに、薬理試験3の結果図4より、被検物質10mNUmL以上の濃度による処理で、細胞内のBDNF量タンパク質レベルが有意に上昇することが確認された。一方、細胞外に分泌された遊離BDNF量を測定する目的で、培養上清中のBDNF量を測定したが検出されなかった検出限界39pgmL。これは以前にBalkowiecらが報告している通りTheJournalofNeuroscience、20巻、7417-7423頁、2000年、遊離BDNFがTrkBによって即時に細胞内に取り込まれるためであると考えられた。2被検物質によるBDNF等発現促進のメカニズムBDNF等の発現はTrk受容体の下流に位置するRasMAPキナーゼカスケードやCREBのリン酸化等、細胞内シグナル伝達カスケードにより制御されていることが知られているCurrentOpinioninNeurobiology、11巻、272-280頁、2001年。BDNFの発現と同様に、プロトオンコジーン遺伝子であるcFosの発現もCREBの活性化により上昇するが、薬理試験4の結果図5より、SHSY5Y細胞を被検物質で処理することによって、cFosの発現が亢進されることが確認された。また、薬理試験5の結果図6より、被検物質でSHSY5Y細胞を処理して10分以内に、CREBの133番目のセリン残基のリン酸化やその上流モジュレーターであるp4244MAPキナーゼERK12のリン酸化が亢進されることが認められた。なお、PC12細胞やシュワン細胞を用いた試験系においても、被検物質がERK12のリン酸化を亢進することが認められている。細胞外から与えたBDNFでも同様にこれらCREBや4244MAPキナーゼのリン酸化を亢進したが、図1に示した通り、被検物質によるBDNFの発現促進作用は比較的時間がかかるため、細胞外に放出促進されたBDNFがこの被検物質の作用を間接的に起こしているのではないと考えられた。また、この結果に符合して、PI3K、MEK12、p38MAPKはいずれもTrkB受容体から開始されるCREB活性化経路のモジュレーター介在するタンパク質であるが、薬理試験6の結果図7より、これらモジュレーターに対する阻害剤によって、被検物質によるBDNFの発現促進が抑制されることが認められた。つまり、PI3K阻害剤LY294002によってAktのリン酸化が、MEK12阻害剤PD98059によってERK12のリン酸化が、p38MAPK阻害剤SB203580によってCREBのリン酸化が各々阻害される。このことから、被検物質はPI3K/MAPキナーゼ経路やRasMAPキナーゼカスケードといった上流のシグナル伝達カスケードを標的とすると考えられた。一方、薬理試検7の結果図8より、CREB活性化における上記経路とは異なる経路のモジュレーターであるcAMPの細胞内レベルは被検物質により上昇されず、特に濃度50mNUmLの被検物質では有意に抑制されることが認められた。この結果より、被検物質はcAMP依存性プロテインキナーゼ経路ではなくMAPキナーゼ経路を活性化することによりCREBに関係する転写を促進して、BDNFやcFosの発現を促進すると考えられた。3被検物質の作用に対するTrkBの関与MAPキナーゼ/CREB経路における神経作用はTrkBの活性化を通じて協調的に調節されることが知られているが、上記薬理試験より、被検物質の作用におけるTrkBの関与が明らかにされた。具体的には、薬理試験8の結果図9より、チロシンキナーゼ阻害剤K252a又はTrkB特異抗体の存在下で、被検物質により促進されたBDNFの発現はほほ完全に抑制されることが確認された。このことより、被検物質は直接TrkBを標的にして内因性のチロシンキナーゼを活性化し、MAPキナーゼ/CREB経路の活性化によりBDNFの発現を促進していると考えられた。また、薬理試験9の結果図10より、被検物質で48時間処理すると細胞表面のTrkBの発現が有意に減少することが認められ、TrkBの細胞内取込みが起こっていると考えられた。以上のことから、本発明として、次のようなものを導くことができる。もっとも、これらは例示であって、本発明はこれらに限られるものではない。細胞における神経栄養因子の発現に対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。作用が発現促進作用である記載の判定又は評価方法神経栄養因子がBDNFである又は記載の判定又は評価方法。神経栄養因子がNGF又はNT3である又は記載の判定又は評価方法。細胞におけるCREBに対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。作用がCREBのリン酸化促進作用である記載の判定又は評価方法。CREBのリン酸化促進作用をc-Fosの産生を測定して指標とする記載の判定又は評価方法。細胞におけるMAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質活性化に対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。作用がタンパク質のリン酸化促進作用である記載の判定又は評価方法。MAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質が、MEK/ERK経路におけるタンパク質である記載の判定又は評価方法。MEK/ERK経路におけるタンパク質が、Grb2、Sos、Ras、Raf、MEK12、ERK12又はRskである記載の判定又は評価方法。MAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質が、PI3K/Akt経路におけるタンパク質である記載の判定又は評価方法。PI3K/Akt経路におけるタンパク質が、PI3K、Akt又はP38MAPKである記載の判定又は評価方法。細胞が培養細胞である乃至にいずれかに記載の判定又は評価方法。細胞がSHSY5Y細胞である記載の判定又は評価方法。炎症組織が皮膚組織である乃至のいずれかに記載の判定又は評価方法。炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である乃至のいずれかに記載の判定又は評価方法。乃至のいずれかに記載の判定又は評価方法によって品質規格が担保されたワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物。乃至のいずれかに記載の判定又は評価を行うことによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の品質規格を担保する方法。