ウイルス粒子、場合によって1種又は複数種の糖、並びに式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル2~5NHC5~15CH3を表しR3は、C1~6アルキルである及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル2又はSを表しRa及びRbは、独立して、C1~6アルキルを表しRcは、カルボキシレートアニオンで及びアミン部分で置換されたC1~6アルキルを表すの水溶液を提供する工程と、前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する工程とを含む、ウイルス粒子を保存する方法。前記水溶液が、式の化合物若しくはこの生理学的に許容される塩、又は式の化合物若しくはこの生理学的に許容される塩を含む、請求項1に記載の方法。前記式の化合物が、NNジグリシン、NNNトリグリシン若しくはNC1~6アルキルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、請求項1又は2に記載の方法。前記式の化合物が、NNジメチルグリシン、NNNトリメチルグリシン、若しくはNメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、或いはNメチルグリシン、NNジメチルグリシン若しくはNNNトリメチルグリシン又はこの塩酸塩である、請求項3に記載の方法。前記式の化合物が、NNジメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、請求項4に記載の方法。前記式の化合物が、式2~5NHC5~15CH3を表すの化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり前記式の化合物が、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり前記式の化合物が、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり又は前記式の化合物が、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、請求項1又は2に記載の方法。前記式又は式の化合物が、ジメチルスルホン、トリメチルグリシン、コカミドプロピルベタイン、プロリンベタイン若しくはSメチルLメチオニン、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、請求項1、2又は6のいずれか一項に記載の方法。前記水溶液が、1種又は複数種の糖を含み、前記式若しくは式の化合物又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が01mMから25Mであり、糖濃度、又は2種以上の糖が存在する場合の合計糖濃度が少なくとも001Mであるか、或いは前記式若しくは式の化合物又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が、01mMから3Mである、請求項2から7のいずれか一項に記載の方法。式若しくは式の化合物又は生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が、0001Mから25M、001Mから25M若しくは01Mから2M、又は7mMから15M若しくは007Mから07M、又は7mMから15M若しくは007Mから1M、又は005Mから2M、002Mから2M若しくは007Mから1Mである、請求項2から7のいずれか一項に記載の方法。前記水溶液が、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩、及び式の化合物又はこの生理学的に許容される塩を含む、請求項1に記載の方法。前記水溶液が、請求項3から5のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩、及び式のスルホン化合物である式の化合物を含む、請求項10に記載の方法。前記水溶液中における前記式の化合物又はこの生理学的に許容される塩の濃度が、01Mから15Mである、請求項11に記載の方法。前記式のスルホン化合物が、メチルスルホニルメタンである、請求項11又は12に記載の方法。前記水溶液中における前記式のスルホン化合物の濃度が、01Mから15Mである、請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。前記糖濃度、又は合計糖濃度が、01Mから3M又は02Mから2Mであり、前記乾燥のための溶液が、1種又は複数種の糖を、少なくとも01Mの濃度、又は2種以上の糖が存在する場合は合計糖濃度で含み、或いは前記水溶液の糖濃度が、005Mから1Mである、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。前記水溶液が、非還元糖又は糖アルコールを含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。2種以上の糖が用いられ、且つ前記糖の1種がスクロースである、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。スクロースとその他の糖との濃度の比が、11から201である、請求項17に記載の方法。前記他の糖が、ラフィノースである、請求項17又は18に記載の方法。前記乾燥のための溶液が、マンニトールを含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。マンニトールである1種の糖が存在するか、又はスクロース及びラフィノースである2種の糖が存在する、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。前記水溶液が、スクロース又はマンニトールを含む、請求項16に記載の方法。前記水溶液が、凍結乾燥されるか、又は前記水溶液が、凍結乾燥若しくは噴霧乾燥されるか、又は前記水溶液が、バイアル若しくはアンプル中で凍結乾燥され、次いで前記バイアル若しくはアンプルが密封される、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。前記ウイルス粒子が、生ウイルス又は死滅ウイルスから構成される、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。前記生ウイルスが、全ウイルス又は弱毒化生ウイルスである、請求項24に記載の方法。前記水溶液が、アデノウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルスを含む、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。前記ウイルスが、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、インフルエンザウイルス又は麻疹ウイルスから選択されるウイルスである、請求項26に記載の方法。請求項1又は3から7のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び或いは請求項1、3から7、11又は13のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖を含み、且つウイルス粒子を組み入れている組成物。固体であり、及び又は1種若しくは複数種の糖を含み、及び又は凍結乾燥されており、及び又は非還元糖若しくは糖アルコールを含む、請求項28に記載の組成物。スクロース若しくはマンニトールである1種の糖が存在し、又はスクロース及びラフィノースである2種の糖が存在する、請求項28又は29に記載の組成物。ウイルス誘発の毒性、ウイルス感染、ウイルス感染の続発症、癌若しくはアレルギーの予防若しくは治療における又は遺伝子治療若しくは自己免疫疾患の治療における、ワクチンとしての使用のための、請求項28から30のいずれか一項に記載の組成物。非感染性ウイルス粒子及び場合によってアジュバントを組み入れている、請求項28から30のいずれか一項に記載の組成物を含むワクチン。ウイルス粒子を組み入れているワクチンを調製する方法であって、ウイルス粒子、請求項1又は3から7のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び或いは請求項1、3から7、11又は13のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の水溶液を提供する工程とこの混合物に、アジュバント、緩衝剤、抗生物質及び又は添加物を場合によって添加する工程と前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物又は固体組成物を形成する工程とを含む方法。1種又は複数種の糖を含み、前記式若しくは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が01mMから25Mであり、前記糖濃度、又は2種以上の糖が存在する場合は合計糖濃度が、少なくとも001Mであるか、或いは前記式若しくは式の化合物又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が、01mMから3Mである、請求項33に記載の方法。前記ワクチンが、多価ワクチンである、請求項28から31のいずれか一項に記載の組成物、請求項32に記載のワクチン、又は請求項33若しくは34に記載の方法。ウイルス粒子又は非感染性ウイルス粒子を含み、請求項1から27、33又は34のいずれか一項に記載の方法によって得られる、組成物又は乾燥粉末。請求項28から31及び36のいずれか一項に記載の組成物を含有する密封されたバイアル又はアンプル。ウイルス粒子を保存するための、請求項1又は3から7のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び或いは請求項1、3から7、11又は13のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用。ウイルス粒子、場合によって1種又は複数種の糖、並びに請求項1又は3から7のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは請求項1、3から7、11又は13のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの水溶液を提供する工程と前記溶液を最大5年間密封容器に貯蔵する工程とを含む、乾燥前にウイルス粒子を保存する方法。前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を含む非晶質固体マトリックスを形成する工程をさらに含む、請求項39に記載の方法。前記溶液が、冷蔵庫に貯蔵されるか、又は前記溶液が、冷凍庫に貯蔵される、請求項39又は40に記載の方法。密封容器で提供され、乾燥前に冷蔵庫又は冷凍庫で貯蔵される、ウイルス粒子、場合によって1種又は複数種の糖、並びに請求項1又は3から7のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは請求項1、3から7、11又は13のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルのバルク水溶液。前記バルク水溶液が、01から100リットルの容量を有する、請求項42に記載の溶液。ウイルス粒子を含む水溶液中における前記ウイルス粒子を乾燥前に保存するための、請求項1又は3から7のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び或いは請求項1、3から7、11又は13のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用。ウイルス粒子を含む乾燥又は凍結乾燥生成物である組成物のための再懸濁剤としての、請求項1又は3から7のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び或いは請求項1、3から7、11又は13のいずれか一項に記載の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用。前記組成物が、請求項28から31、及び36のいずれか一項に記載されるとおりである、請求項45に記載の使用。本発明者らは、ウイルス製剤が、本明細書で定義されるとおりの式及び若しくは式の化合物又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステル並びに場合によって1種又は複数種の糖によって、乾燥の間に安定に保存されることを見出した。ウイルス活性は、熱負荷後にも保護された。ウイルス活性は、長期安定性試験の間も保存された。ウイルス活性は、乾燥前に水溶液中でも保存され得る。ウイルスは、凍結、凍結乾燥及び解凍によって生じた損傷に対して保護された。したがって、本発明は、ウイルス粒子、場合によって1種又は複数種の糖、並びに式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル2~5NHC5~15CH3を表しR3は、C1~6アルキルである及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル2又はSを表しRa及びRbは、独立して、C1~6アルキルを表しRcは、カルボキシレートアニオンで及びアミン部分で置換されたC1~6アルキルを表すの水溶液を提供する工程と、該溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する工程とを含む、ウイルス粒子を保存する方法を提供する。本発明はさらに、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖を含み、且つウイルス粒子を組み入れている組成物非感染性ウイルス粒子及び場合によってアジュバントを組み入れている、本発明の組成物を含むワクチンウイルス粒子を組み入れているワクチンを調製する方法であって、ウイルス粒子、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の水溶液を提供する工程とこの混合物にアジュバント、緩衝剤、抗生物質及び又は添加物を場合によって添加する工程と該溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物又は固体組成物を形成する工程とを含む方法ウイルス粒子又は非感染性ウイルス粒子を含み、且つ本発明の方法によって得られる、組成物又は乾燥粉末本発明の組成物を含む、密封バイアル又はアンプルウイルス粒子を保存するための、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用ウイルス粒子、場合によって1種又は複数種の糖、並びに本発明の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは本発明の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの水溶液を提供する工程と該溶液を密封容器中最大5年間貯蔵する工程とを含む、乾燥前にウイルス粒子を保存する方法密封容器で提供され、且つ乾燥前に冷蔵庫又は冷凍庫中で貯蔵される、ウイルス粒子、場合によって1種又は複数種の糖、並びに本発明の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの及び或いは本発明の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルのバルク水溶液乾燥前に、ウイルス粒子を含む水溶液中における前記ウイルス粒子を保存するための、本発明の式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用及びウイルス粒子を含む乾燥又は凍結乾燥生成物である組成物のための再懸濁剤としての、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用を提供する。概要本発明は、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種、2種又はそれを超える種類の糖によるウイルス粒子の保存に関する。ウイルス粒子は、水溶液中で式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖に接触させ、次いでウイルス粒子が存在している、得られた溶液は、乾燥させて、ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する。したがって、ウイルス粒子は、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の水溶液と混合され得る。次いで、得られた溶液は、乾燥させて、ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する。乾燥させた組成物は、ケーキ又は粉末の形態を取り得る。必要に応じて、ケーキは粉末に粉砕され得る。本発明は、ウイルス構造及び機能が乾燥工程の間に保存され得るようにする。したがって、乾燥後のウイルス活性は、維持され得る。したがって、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル単独の存在は、ウイルス活性の保存を可能にする。ウイルス活性の保存におけるさらなる改善は、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルと組み合わせて1種又は複数種の糖を用いて達成され得る。保存されたウイルス粒子は、在庫寿命の延長、貯蔵及び輸送の容易さ、並びに流通用のコールドチェーンを不要にすることを可能にする。したがって、本発明は、凍結保護剤、リオプロテクタント及び又は熱保護剤として保護を与え得る。さらに、ウイルス粒子は、乾燥工程以前に水溶液に保存される。これによって、調製後、乾燥工程が実施できるようになるまで、ウイルス活性の過度の喪失をもたらさずに、水溶液を貯蔵することが可能となる。ウイルス粒子本発明で用いられるウイルス粒子は、生ウイルス、死滅ウイルス、弱毒化生ウイルス、化学的に不活化されたウイルスなどの不活化ウイルス又はビルレント若しくは非ビルレントウイルスなどの全てのウイルスであり得る。生ウイルスは、宿主細胞内で感染及び複製することができる。死滅ウイルスは不活化しており、宿主細胞内で複製することができない。該粒子は、ウイルス様粒子又はヌクレオカプシドであってもよい。ウイルスは、原核細胞又は真核細胞に感染性であってもよい。ウイルスは、ヒト又は動物ウイルスであってもよい。ウイルス粒子は、dsDNAウイルス、ssDNAウイルス、dsRNAウイルス、ssRNAウイルス、ssRNAウイルス、ssRNARTウイルス又はdsDNARTウイルスであり得るか、又はそれらに由来し得る。限定的であることは意図されないが、一例として、ウイルス粒子は、以下のファミリーのウイルスであり得るか、又はこれらに由来し得るヒトアデノウイルス又は非ヒトアデノウイルスなどのアデノウイルス科、例えば、ヒトAd5、Ad2、Ad4、Ad6、Ad7、Ad11、Ad14、Ad24、Ad26、Ad35及びAd36血清型を含むヒトアデノウイルスA、B、C、D、E又はFカルシウイルス科、例えば、ノーウォークウイルスコロナウイルス科、例えば、ヒトコロナウイルス299E又はOC43、及びSARSコロナウイルスフィロウイルス科、例えば、エボラウイルスフラビウイルス科、例えば、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルスヘパドナウイルス科、例えば、B型肝炎ウイルスヘルペスウイルス科、例えば、単純ヘルペスウイルス、例えば、HSV1又はHSV2、ヒトヘルペスウイルス1、3、4、5又は6オルトミクソウイルス科、例えば、限定されるものではないが、インフルエンザAウイルス血清型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9H2、H7N2、H7N3及びN10N7を含むインフルエンザA、B、Cパピローマウイルス科、例えば、ヒトパピローマウイルスパラミクソウイルス科、例えば、ヒトパラインフルエンザウイルス1、麻疹ウイルス及び耳下腺炎ウイルスパルボウイルス科、例えば、アデノ関連ウイルスピコルナウイルス科、例えば、ヒトポリオウイルス、口蹄疫ウイルスポックスウイルス科、例えば、ワクチニアウイルス、痘瘡ウイルス及びトリポックスウイルスレオウイルス科、例えば、ブルータングウイルス群レトロウイルス科、例えば、ヒト免疫不全ウイルス1及び2を含むレンチウイルス及びトガウイルス科、例えば、風疹ウイルス。好ましい実施形態において、ウイルス粒子は、アデノウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科又はポックスウイルス科のウイルスであり得るか、又はこれらに由来し得る。特に好ましい実施形態において、ウイルス粒子は、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、インフルエンザウイルス、又は麻疹ウイルスであり得るか、又はこれらに由来し得る。ウイルスは、改変ワクチニアウイルスAnkara又はMVA由来のウイルス粒子であり得る。ウイルス様粒子は、ウイルスの構造タンパク質由来のウイルスタンパク質を含むが、ウイルス核酸を欠いている。過剰発現される場合、これらのウイルス構造タンパク質は、自然に粒子に自己組織化する。VLPは、複製能力がない。一部の実施形態において、VLPは、脂質二重層内に埋め込まれたウイルスタンパク質である。VLPの例としては、ファージ由来VLP、ヒトパピローマウイルスL1主要カプシドタンパク質VLP、ノーウォークウイルスカプシドタンパク質VLP並びにインフルエンザウイルス構造タンパク質、例えば、M1タンパク質、HA赤血球凝集素タンパク質及びN1ノイラミニダーゼタンパク質から組織化したVLPを含む。ウイルス粒子は、当業者に周知の標準的技術を用いて調製され得る。例えば、ウイルスは、培養宿主細胞を用いられるべきウイルス株に感染させ、ウイルスが培養細胞中で複製するように感染を進行させることによって調製されてもよく、ウイルスを収穫及び精製するために当技術分野で公知の標準的方法によって放出させ得る。式の化合物又はこの生理学的に許容される塩又はエステル、及び式の化合物又はこの生理学的に許容される塩又はエステル式及び式の化合物は、この生理学的に許容される塩又はエステルとして存在し得る。塩は、典型的には生理学的に許容される酸との塩であり、したがって、無機酸、例えば、塩酸若しくは硫酸、又は有機酸、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、マンデル酸、フマル酸若しくはメタンスルホン酸と形成されるものを含む。塩酸塩が好ましい。エステルは、典型的にはC1~6アルキルエステル、好ましくはC1~4アルキルエステルである。したがって、エステルは、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、イソブチルエステル又はtertブチルエステルであり得る。エチルエステルが好ましい。本明細書で使用される場合、C1~6アルキル基は、好ましくはC1~4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtertブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。疑いを避けるために、式及び式の化合物の定義は、カルボキシレートアニオンがプロトン化されて、COOHを与え、アンモニウム又はスルホニウムカチオンが薬学的に許容されるアニオンと結合している化合物も含む。さらに疑いを避けるために、上に定義された化合物は、任意の互変異性又はエナンチオマー形態で使用され得る。式の化合物典型的には、R1は、水素又はC1~6アルキルを表し、R4は水素を表す。典型的には、R2は、水素又はC1~6アルキルを表す。好ましくは、R1は、水素又はC1~6アルキルを表し、R4は水素を表し、R2は、水素又はC1~6アルキルを表す。より好ましくは、R1は、水素又はC1~6アルキルを表し、R4は水素を表し、R2はC1~6アルキルを表す。好ましくは、式の化合物は、NC1~6アルキルグリシン、NNジグリシン若しくはNNNトリグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、より好ましくは、NNジグリシン若しくはNNNトリグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。アルキル基は、典型的にはC1~4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtertブチルから選択される。メチル及びエチルが、特に好ましい。式の好ましい化合物は、Nメチルグリシン、NNジメチルグリシン若しくはNNNトリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。Nメチルグリシンは、サルコシンとも呼ばれる。NNジメチルグリシンは、ジメチルグリシン又は2酢酸とも呼ばれる。NNNトリメチルグリシンは、トリメチルグリシンと呼ばれる。代替として、式の化合物は、典型的には式のグリシン誘導体又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである2~5NHC5~15CH3を表す。式の好ましい化合物は、トリメチルグリシン及びコカミドプロピルベタイン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。トリメチルグリシンが好ましい。代替として、式の化合物は、典型的には式のプロリン誘導体又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。好ましくは、式の化合物は、Sプロリン誘導体である。好ましくは、R8及びR9は両方とも、メチルを表しこの化合物は、プロリンベタインとして公知である。Sプロリンベタイン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルが、特に好ましい式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルが好ましい。好ましくは、式の化合物は、NNジメチルグリシン若しくはNNNトリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。最も好ましくは、式の化合物は、NNジメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。式の化合物典型的には、Rcのカルボキシレート及びアミン置換基は、Rcアルキル部分の同じ炭素原子に結合している。典型的には、Rcは、C2~4又はC2~3アルキル部分である。式の化合物は、典型的には式のスルホン化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtertブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。好ましいスルホン化合物は、メチルスルホニルメタンであり、これは、ジメチルスルホンとしても公知である。式の化合物は、典型的には式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである部分で置換されたC1~6アルキル、例えば、メチル又はエチルなどのC1~4アルキルを表す。好ましくは、カルボキシレート置換基及びアミン置換基は、同じ炭素原子に結合している。式の好ましい化合物は、SメチルLメチオニン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。糖本発明における使用に適切な糖は、還元糖、例えば、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノース及びマルトース好ましくは非還元糖、例えば、スクロース及びラフィノース、より好ましくはスクロースを含む。糖は、単糖、二糖、三糖、又は他のオリゴ糖であってもよい。糖という用語は、糖アルコールを含む。したがって、一つの実施形態において、非還元糖又は糖アルコールの使用が好ましい。ガラクトース及びマンノースなどの単糖スクロース、ラクトース及びマルトースなどの二糖ラフィノースなどの三糖及びスタキオースなどの四糖が想定される。トレハロース、ウンベリフェロース、ベルバスコース、イソマルトース、セロビオース、マルツロース、ツラノース、メレジトース及びメリビオースも、本発明における使用に適切である。適切な糖アルコールはマンニトールである。マンニトールが用いられる場合、改善された外観のケーキを凍結乾燥後に得ることができる。糖の存在は、安定を改善するように作用し得る。糖の添加は、凍結乾燥ケーキの改変及びより速い再構成のための溶解度の改善などの他の利点ももたらし得る。凍結乾燥が用いられる場合、一般に1種又は複数種の糖が存在する。1種の糖が用いられる場合、糖は、好ましくはスクロース又はマンニトール、より好ましくはマンニトールである。ウイルス活性の保存は、2種以上の糖が保存混合物中に用いられる場合、特に有効である。2種、3種、又は4種の糖を用いることもできる。好ましくは、水溶液は、スクロース及びラフィノースの溶液である。スクロースは、グルコース及びフルクトースの二糖である。ラフィノースは、ガラクトース、フルクトース及びグルコースから構成される三糖である。保存手順本発明では、ウイルス粒子、場合によって1種又は複数種の糖、並びに式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルを含む水溶液を、乾燥させる。任意の適切な水溶液を用いてもよい。この溶液は緩衝化されてもよい。溶液は、HEPES溶液、リン酸緩衝溶液、トリス緩衝溶液又は純水溶液であってもよい。溶液は、2から約12のpHを有してもよく、緩衝化されてもよい。溶液は、HEPES緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、クエン酸ナトリウム緩衝剤、ビシン緩衝剤グリシン緩衝剤又はMOPS緩衝剤プロパンスルホン酸緩衝剤で緩衝化されてもよい。溶液は、NaClを含んでも、含まなくてもよい。したがって、溶液は、生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝溶液であってもよい。一般に、ウイルス粒子の調製物は、保存混合物と、すなわち、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種、2種又はそれを超える種類の糖と混合される。保存混合物はそれ自体緩衝化されてもよい。それは、HEPES溶液、リン酸緩衝溶液、トリス緩衝溶液又は純水溶液であってもよい。代替として、この水溶液は、典型的にはウイルス粒子、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖からなっても、又は本質的になってもよい。式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度、並びにそれぞれの場合による糖の濃度は、通常の実験によって決定され得る。したがって、最良の安定性をもたらす最適化濃度が、選択され得る。式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、化合物は、安定性を改善するために相乗的に作用し得る。乾燥のために水溶液中に存在する場合、糖の濃度は、少なくとも001M、典型的には飽和までである。一般に、存在する場合、糖の濃度は、少なくとも01M、少なくとも02M又は少なくとも05Mで飽和、例えば、室温での飽和まで、又は3M、25M若しくは2Mまでである。したがって、糖の濃度は、例えば、01Mから3M又は02Mから2Mの範囲であり得る。好ましくは、糖は存在する。代替として、糖の濃度、又は2種以上の糖が存在する場合、合計の糖の濃度は、008Mから3M、015Mから2M又は02Mから1Mの範囲であってもよい。適切な範囲は、005Mから1Mである。2種以上の糖が存在する場合、好ましくはそれらの糖の1種は、スクロースである。スクロースは、005M、01M、025M又は05Mから飽和、例えば、室温での飽和又は3M、25M若しくは2Mまでの濃度で存在してもよい。スクロースのモル濃度とその他の糖のモル濃度との比は、典型的には11から201、例えば、51から151である。したがって、2種の糖が存在する場合で、特にスクロース及びラフィノースが存在する場合、スクロースのモル濃度の比は、典型的には11から201、例えば、51から151、好ましくは約101である。乾燥のための水溶液中におけるそれぞれの式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、一般に0001Mから25M、より特には001Mから25Mの範囲である。例えば、濃度範囲は、01Mから25Mであってもよい。代替として、例えば、式の化合物がDMG又は塩若しくはエステルである場合、乾燥のための水溶液中におけるそれぞれの式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、一般に01mMから3M又は1mMから2Mの範囲である。濃度は、1mMから15M又は5mMから1M又は007Mから07Mであってもよい。好ましい濃度は、7mMから15M又は007Mから12Mである。特に、式の化合物が、DMGなどのNアルキル化グリシン誘導体である場合、別のさらなる好ましい範囲は、05Mから15Mである。用いられる式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの特定の濃度は、保存されるべきウイルス粒子の種類用いられる特定の化合物1種、2種又はそれを超える種類の糖が存在するかどうか及び糖の同一性並びに乾燥手順及び条件を含むいくつかの因子に依存する。したがってXがS2を表す式の化合物若しくは式の化合物、例えば、MSM、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、好ましくは02mMから1M、例えば、035mMから1M、35mMから05M、0035Mから05M又は0035Mから025Mである。式の化合物又は式若しくは式の化合物、例えば、TMG、或いはこの生理学的に許容される塩又はエステルの濃度は、好ましくは001Mから2M、例えば、007Mから2M、02Mから15M、023Mから15M又は007Mから07Mの濃度で用いられる。XがSを表す式の化合物若しくは式の化合物、例えば、SメチルLメチオニン、又はこれらの生理学的に許容される塩又はエステルの濃度は、好ましくは0005Mから2M、例えば、0007Mから2M、002Mから2M、0023Mから15M又は007Mから1Mである。糖が存在しない場合、式の化合物、例えば、NNジメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、5mMから15M又は70mMから15M若しくは12M又は7mMから1Mである。より好ましい濃度は、0023Mから07M若しくは1M、又は007Mから07M若しくは1M、例えば、約07Mである。1種又は複数種の糖が存在する場合、式の化合物、例えば、NNジメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、一般により低く、1mMから1M若しくは15M又は5mMから1Mの範囲である。より好ましい濃度は、0007Mから07M又は1M、例えば、約0007Mである。特に好ましい範囲は、05Mから15Mである。式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルが存在する場合、好ましくはNアルキル化グリシン誘導体又はこの塩若しくはエステル及び式又は式のスルホン化合物が存在する場合、化合物は、相乗作用をもたらす量で存在し得る。例えば乾燥のための水溶液中におけるNアルキル化グリシン誘導体又はこの塩若しくはエステルの濃度は、一般に01mMから3M又は1mMから2Mの範囲である。濃度は、1mMから15M又は5mMから1Mであってもよい。好ましい濃度は、01Mから15M又は05Mから125Mである。乾燥のための水溶液中における式又は式のスルホン化合物の濃度は、一般に01mMから3M、1mMから2M又は02mMから1Mである。濃度は、01Mから15M又は05Mから125Mであってもよい。典型的には、乾燥は、凍結乾燥、真空乾燥、流動床乾燥又は噴霧乾燥によって達成される。凍結乾燥が好ましい。材料中の水を減少させ、材料をバイアル中に密封することによって、材料は、容易に保存、出荷され、その後にその元の形態に再構成され得る。乾燥条件は、通常の実験によって適切に最適化され得る。乾燥後、ウイルス粒子を組み入れている組成物が形成される。ウイルス粒子を組み入れているマトリックスが作製される。組成物は、典型的には非晶質固体である。したがって、一般に非晶質固体マトリックスである固体マトリックスが、一般に形成される。非晶質のによって、非構造化された、及び分子の観測可能な規則正しい又は繰り返された組織を持たないが意味される。存在する場合、糖又は糖は、乾燥された組成物中で非晶質マトリックスを与える。式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルは、糖マトリックス中に分散される。したがって、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルは、糖マトリックス内に組み入れられる。ウイルス粒子も、糖マトリックス内に組み入れられる。したがって、乾燥手順は、例えば、ウイルス粒子が組み入れられている非晶質ケーキを形成する凍結乾燥によって実施され得る。乾燥工程は、一般に水溶液が調製されるとすぐに、又はその後間もなく行われる。代替として、水溶液は、典型的には乾燥工程前に貯蔵される。水溶液中のウイルス粒子は、貯蔵の間に、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖によって保存される。水溶液、又はバルク中間溶液は、一般に最大5年、例えば、最大4年、3年、2年又は1年貯蔵される。好ましくは、溶液は、最大6ヶ月、より好ましくは最大3ヶ月又は最大2ヶ月、例えば、1日から1ヶ月又は1日から1週間貯蔵される。乾燥前に、溶液は典型的には、冷蔵庫又は冷凍庫で貯蔵される。冷蔵庫の温度は、通常は2から8°C、好ましくは4から6°C、又は例えば、約4°Cである。冷凍庫の温度は、通常は10から80°C、好ましくは10から30°C、例えば、約20°Cである。溶液は、典型的には、密封容器、好ましくは密封不活性プラスチック製容器、例えば、袋又は瓶に貯蔵される。容器は典型的には滅菌である。バルク中間溶液の容量は、典型的には01から100リットル、好ましくは05から100リットル、例えば、05から50リットル、1から20リットル又は5から10リットルである。容器は、典型的には01から100リットル、好ましくは05から100リットル、例えば、05から50リットル、1から20リットル又は5から10リットルの容量を有する。貯蔵されたバルク中間溶液が、凍結乾燥される場合、それは典型的には、乾燥工程前に凍結乾燥用トレイ中に注ぎこまれる。溶液の安定な貯蔵は、製造工程の柔軟性を増加させる。したがって、溶液は、容易に貯蔵、出荷され、その後に乾燥させ得る。凍結乾燥凍結乾燥は、典型的には傷みやすい材料を保存するために又はその材料を輸送にとってより都合よくさせるために使用される脱水工程である。凍結乾燥は、固体タンパク質及びワクチン医薬品を製造するための鍵となる工程に相当する。しかし、生物材料は、操作の間に凍結及び乾燥のストレスの両方を受け、これは、タンパク質をアンフォールディング又は変性し得る。さらに、凍結生物材料からの水蒸気拡散の速度は非常に低く、したがって、この過程は、時間がかかる。本発明の保存技術は、生物材料が、凍結乾燥操作の乾燥及び又は熱ストレスに対して保護されることを可能にする。この技術には、主な3段階、すなわち、凍結、一次乾燥及び二次乾燥がある。凍結は、典型的には凍結乾燥機を使用して行われる。この工程では、生物材料を、単純な結晶生成物の場合は、その共融点未満に、又は非晶質生成物の場合は、ガラス転移温度未満に、すなわち、材料の固相及び液相が共存し得る最低温度未満に冷却することが重要である。これにより、融解よりもむしろ昇華が、次の一次乾燥段階で起こることが確実にされる。一次乾燥の間に、圧力は、適当なレベルの真空をかけることによって制御される一方、水が昇華し得るように十分な熱が供給される。材料中の水の少なくとも50、典型的には60~70が、この段階で昇華する。過剰な熱は生物材料の構造を劣化又は変化させ得るので、一次乾燥はゆっくりでよい。冷凝縮器チャンバー及び又は冷凝縮器プレートは、水蒸気が再固化によって捕捉される面を与える。二次乾燥プロセスにおいて、水和の水は、さらに熱をかけることによって除去される。典型的には、圧力も、さらなる乾燥を促進させるために低くされる。凍結乾燥プロセスの終了後、真空は、密封前に窒素などの不活性ガスで解除され得るか、又は材料は真空下で密封され得る。真空乾燥ある種の実施形態において、乾燥は、1300Pa付近での真空乾燥を用いて行われる。しかし、真空乾燥は、本発明にとって必須ではなく、他の実施形態において、ウイルス粒子と接触した保存混合物は、回転させられるか、又は凍結乾燥される。有利には、本発明の方法は、ウイルス粒子を含む保存混合物を真空にかける工程をさらに含む。都合良くは、真空は、20000Pa以下、好ましくは10000Pa以下の圧力でかけられる。有利には、真空は、少なくとも10時間、好ましくは16時間以上の期間かけられる。当業者に公知であるように、真空適用期間は、試料の大きさ、使用される機械及び他のパラメータに依存する。噴霧乾燥及び噴霧凍結乾燥別の実施形態において、乾燥は、本発明の保存混合物と混合されたウイルス粒子を噴霧乾燥又は噴霧凍結乾燥させることによって達成される。これらの技術は、当業者に周知であり、気体、例えば、空気、酸素を含まない気体若しくは窒素、又は噴霧凍結乾燥の場合には、液体窒素によって液体原料を乾燥させる方法を含む。液体原料は、液滴の噴霧中に霧化される。次いで、液滴は、乾燥チャンバー中で気体との又は液体窒素との接触によって乾燥させる。流動床乾燥さらなる実施形態において、乾燥は、本発明の保存混合物と混合されたウイルス粒子を流動床乾燥させることによって達成される。この技術は、当業者に周知であり、典型的には、制御された速度条件下で気体を生成物層に通して、流動化状態を生じさせる工程を含む。この技術は、粒子状生成物物質の乾燥、冷却、凝集、粒状化及びコーティングの段階を含み得る。熱は、流動気体、及び又は流動層に埋没された他の加熱面によって供給され得る。冷却は、冷たい気体を用いて及び又は流動層中に埋没された面を冷却して達成され得る。凝集及び粒状化の工程は、当業者に周知であり、達成されるべき生成物の特性に応じて多様な方法で行われ得る。粉末、顆粒又は板状小片などの粒子状生成物のコーティングは、制御条件下で流動粒子上に液体を噴霧することによって達成され得る。乾燥組成物低い残留含水率を有する組成物を得ることができる。冷蔵温度を超える温度、例えば、4°Cから56°C若しくはそれを超える範囲内で、又は冷蔵温度より低い温度、例えば、0から70°C若しくはそれ未満の範囲内で長期の保存を可能にする残留含水率のレベルが達成される。したがって、乾燥組成物は、重量で10以下、5以下、2以下又は1以下の残留含水率を有し得る。好ましくは、残留含水率は、05以上又は1以上である。典型的には、乾燥組成物は、重量で05から10、好ましくは重量で1から5の残留含水率を有する。組成物は、乾燥粉末形態で得ることができる。例えば、凍結乾燥から得られるケーキは、粉末形態に粉砕され得る。したがって、本発明による固体組成物は、自由に流動する流動する粒子の形態を取り得る。固体組成物は、典型的には密封されたバイアル、アンプル又は注射器中の粉末として提供される。吸入のためである場合、粉末は乾燥粉末吸入器で提供され得る。固体マトリックスは、代替としてパッチとして提供され得る。粉末は、錠剤形態に加圧されてもよい。組成物は、典型的にはウイルス粒子、式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖からなっても、又はこれらから本質的になってもよい。固体担体上への乾燥しかし、本発明の方法のさらなる実施形態において、ウイルス粒子を含む混合物は、固体担体上に乾燥させる。固体担体は、ビーズ、試験管、マトリックス、プラスチック製担体、マイクロタイター皿、マイクロチップ、又は膜を含み得る。別の実施形態において、本発明の方法によって保存されるウイルス粒子がその上に乾燥又は結合される固体担体が提供される。ウイルス粒子の保存性の測定ウイルス粒子に関連した保存は、乾燥、凍結、0°C未満又は25°C未満の温度、凍結乾燥、室温、0°Cを超える温度、25°C又は30°Cを超える温度の条件への曝露下での、核酸又はタンパク質の劣化、トランスフェクション効率の損失、細胞性又は体液性免疫応答を刺激する能力の損失、ウイルス感染性の損失、免疫原性の損失、ウイルス力価の損失、宿主細胞応答の損失又はワクチン効力の損失などの物理的若しくは化学的劣化及び又は生物活性の損失に対するウイルス粒子の耐性を指す。好ましくは、本発明による保存は、凍結保護、溶解保護及び又は熱保護を含む。感染性及び又は免疫原性などのウイルス活性をアッセイする方法は、当業者に周知であり、限定されるものではないが、細胞培養中のウイルスの増殖、血液中のウイルス特異的抗体の検出、T細胞及び若しくはB細胞応答を誘発する能力、ウイルス抗原の検出、ウイルスがコードされたDNA若しくはRNAの検出、又は顕微鏡を用いたウイルス粒子の観察を含む。さらに、ウイルスの存在は、宿主細胞の形態学的変化を生じさせ、これを測定して、ウイルス活性の指標を得ることができる。検出可能な変化、例えば、ウイルス感染による宿主細胞における変化は、細胞変性効果として公知である。細胞変性効果は、細胞の円形化、方向性喪失、膨張又は収縮、死滅及び表面からの剥離からなり得る。多くのウイルスは、TUNELアッセイなどの技術及び当業者に周知の他の技術によって測定可能な、感染細胞におけるアポトーシスを誘導する。ウイルスは、宿主細胞遺伝子の発現の制御に影響を与えることもでき、これらの遺伝子は、分析され、ウイルス活性が存在するか否かの指標を与えることができる。このような技術は、ウイルス発現産物との酵素反応又は化学反応を完了させるための、細胞培養への試薬の添加を含み得る。さらに、ウイルスゲノムは、ウイルス感染性の検出を高めるために修飾され得る。例えば、位相差顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査又は放射線イメージングによって容易に検出され得るマーカーを発現させるために、ウイルスゲノムは遺伝的に修飾され得る。マーカーは、GFPなどの発現された蛍光タンパク質又は比色反応又は放射性標識化反応に関与し得る発現された酵素であってもよい。マーカーはまた、試験される細胞の特定の機能を妨げる又は阻害する遺伝子産物であり得る。プラーク形成単位のアッセイを用いて、ウイルス感染性を測定し、ウイルス力価を示すことができる。このアッセイでは、適切な宿主細胞は、それらがプラスチック製瓶又は皿を覆う細胞の単層を形成するまで、平らな表面で増殖させる。特定の宿主細胞の選択は、ウイルスの型に依存する。適切な宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、CHO、BHK、MDCK、10T12、WEHI細胞、COS、BSC1、BSC40、BMT10、VERO、W138、MRC5、A549、HT1080、293、B50、3T3、NIH3T3、HepG2、Saos2、Huh7、HEK293及びHeLa細胞が挙げられる。次いで、宿主細胞の単層を、ウイルス粒子に感染させる。感染の結果として、産生された任意のウイルス粒子が、それらの産生部位から遠くに移動することができないように、液体培地は、半固体培地と置き換えられる。ウイルス粒子が細胞に感染し、複製し、次いで、その細胞を死滅させるときに、プラークは形成される。プラークは、例えば、顕微鏡下で他の細胞より丸く、より濃く見える、又は目により視覚化される場合に白色の点として見える細胞変性効果を示す、単層内の細胞の領域を指すプラーク中心は、ウイルスに誘導される溶解のために細胞を欠くことがあり得る。新たに複製したウイルスは、周囲の細胞に感染し、それらも死滅させる。この過程は、数回繰り返され得る。次いで、細胞は、生細胞だけを染色するメチレンブルーなどの色素で染色される。プラーク内の死細胞は、染まらず、着色背景上で非染色領域として見える。各プラークは、1個のウイルスによる1個の細胞の感染性、続いて、そのウイルスの複製及び蔓延の結果である。しかし、細胞を死滅させないウイルスは、プラークを形成し得ない。プラークは、例えば、顕微鏡下で他の細胞より丸く、より濃く見える、又は目により視覚化される場合に白色の点として見える細胞変性効果を示す、単層内の細胞の領域を指すプラーク中心は、ウイルスに誘導される溶解のために細胞を欠くことがあり得る。ウイルス力価の指標は、プラーク形成単位を測定することによって与えられる。ウイルス感染性のレベルは、本発明によって保存される生物材料の試料で測定して、本発明の保存混合物を添加することなく乾燥及び又は熱変化に供した新たに収穫されたウイルス又は試料などの対照試料と比較し得る。本発明のウイルス粒子の一部の型、例えば、ウイルスタンパク質、VLP、又は一部の不活化ウイルスは、プラークアッセイでプラークを形成する能力をもたない。この場合、保存性は、当業者に周知である免疫原性を決定する方法などの他の方法によって測定され得る。例えば、抗体又は細胞媒介性宿主免疫応答を測定するインビボ及びインビトロでのアッセイが、当技術分野で公知であり、本発明における使用に適切である。例えば、抗体に基づく免疫応答は、本発明の保存ウイルス粒子を用いた免疫の前後に、動物モデルにおける血清抗体の量、アビディティ及びアイソタイプ分布を比較することによって測定され得る。本発明の保存ウイルス粒子の用途ワクチン本発明の保存ウイルス粒子は、ワクチンとして使用し得る。例えば、死滅全ウイルス、弱毒化生ウイルス、化学的不活化ウイルス、VLP又は生ウイルスベクターなどの保存ウイルス粒子は、ワクチンとしての使用に適する。ワクチンとして、本発明の保存ウイルス粒子は、ウイルス感染、ウイルス誘発の毒性を含むがこれに限定されないウイルス感染の続発症、癌及びアレルギーを含むがこれらに限定されない多くの状態の治療又は予防のために、抗原として又はウイルスタンパク質などの抗原をコードするために使用され得る。このような抗原は、宿主の免疫系を刺激して、体液性及び又は細胞性抗原特異的応答を生じる一つ又は複数のエピトープを含む。本発明の保存ワクチンは、ウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス、HIV、HSV2HSV1、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、RSVウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、A型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、エンテロウイルス、アストロウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、アデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトT細胞リンパ腫I型ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、ポックスウイルス及びワクチニアウイルスによる感染を予防又は治療するために使用され得る。ワクチンはさらに、多数の獣医学的疾患、例えば、口蹄疫、コロナウイルス、ブルータングウイルス、ネコ白血病ウイルス、トリインフルエンザ、ヘンドラ及びニパーウイルス、ペスチウイルス、イヌパルボウイルス及びウシウイルス性下痢ウイルスに対する適切な免疫応答を与えるために使用され得る。一つの実施形態において、ワクチンは、サブユニット、結合型又は多価ワクチンである。例えば、本発明の保存ワクチンは、2種以上の異なる型のウイルス、例えば、麻疹、耳下腺炎及び風疹ウイルスによる感染を治療するために使用され得る。本発明のワクチン組成物は、1種又は複数種の糖、及びスルホキシド、スルホン、スルホニウム、テチン又はベタイン化合物を含有する本発明の保存用混合物と混合されたウイルス粒子を含む。ワクチン組成物は、適切な緩衝剤、及び添加物、例えば、抗生物質、アジュバント、又は免疫系の特定の細胞に対するワクチン抗原の提示を強める他の分子をさらに含み得る。当技術分野で周知の種々のアジュバントを、ワクチンの効力を増加させるために、並びに又は体液性及び細胞性免疫応答を調節するために用いることができる。適切なアジュバントとしては、限定されるものではないが、鉱塩、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、粒子状アジュバント、微生物誘導体、CpGモチーフ、フラジェリンなどのTLRアジュバントを含む修飾毒素、植物誘導体及び内因性免疫刺激性アジュバントが挙げられる。本発明のワクチン組成物は、適切な貯蔵を与え、及び調製物の保存寿命を最大化するために、凍結乾燥形態であり得る。これは、長期間のワクチンの備蓄を可能にし、免疫原性、効力及び有効性を維持するのに役立つ。本発明の保存用混合物は、凍結乾燥プロトコルの間に遭遇する乾燥及び熱のストレスに対してウイルス物質を保存するのに特に適している。したがって、保存用混合物は、収穫のすぐ後及び試料を凍結乾燥操作に供するすぐ前の、ウイルス又はウイルス粒子への添加に適する。本発明によって調製したワクチンの保存性を測定するために、当業者に周知の技術を用いてワクチンの効力は測定され得る。例えば、細胞性又は体液性免疫応答の生成は、ワクチンに対する抗体又は免疫細胞応答の生成をモニターすることにより適当な動物モデルで試験され得る。免疫応答を誘発する、本発明の方法に従って調製されたワクチン試料の能力は、同じ保存技術に供さなかったワクチンと比較され得る。ウイルスベクター本発明の方法に従って保存されたウイルス又はウイルスベクターは、標的細胞に異種遺伝子又は他の核酸配列を移入するために使用され得る。適切には、異種配列は、標的細胞で発現され得るタンパク質又は遺伝子産物をコードする。適切な導入遺伝子は、望ましいレポーター遺伝子、治療用遺伝子及び免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。遺伝子発現不全に関連する疾患の治療又は予防のための手法である遺伝子治療は、細胞内への治療用遺伝子の挿入、続いて必要なタンパク質の発現及び産生を含む。この手法により、損傷遺伝子の置換え又は望ましくない遺伝子の発現の阻止が可能になる。特に、保存ウイルス又はウイルスベクターは、治療用導入遺伝子又は免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を患者に移入するために、遺伝子治療に使用され得る。好ましい実施形態において、保存ウイルス粒子は、生ウイルスベクターである。生ウイルスベクターによって、標的種に対して非病原性又は低病原性であり、且つ他のウイルス又は微生物に対して保護的な免疫応答を刺激する抗原をコードする1種又は複数種の遺伝子、レポーター遺伝子又は治療用タンパク質が挿入されている生ウイルスベクターが意味される。特に、ウイルスベクターが依然として複製することができ、それにより、挿入核酸配列によってコードされたポリペプチドを発現し、及びワクチンの場合には、感染宿主動物における免疫応答を誘発するように、核酸は、ウイルスベクター中に導入される。一つの実施形態において、生ウイルスベクターは、弱毒化生ウイルスベクターであり、すなわち、野性型ウイルスよりもビルレントでないように改変されている。組換えウイルスを潜在性ワクチンとして使用する基盤には、病原性生物からの特定の遺伝子の、非病原性又は弱毒化ウイルスのゲノム中への組込みが含まれる。次いで、組換えウイルスは、インビボ又はインビトロでのいずれかで特定の真核細胞に感染して、それらに組換えタンパク質を発現させ得る。疾患生物由来の配列をコードする遺伝子の挿入によって誘導される生ウイルスベクターワクチンは、弱毒化生ウイルス、不活化ワクチン、サブユニット又はDNA手法に比べて好ましくあり得る。生ウイルスベクターの最も重要な安全性特徴の一つは、受容者が、病因物質それ自体に曝露されることなく病原性生物からの特定の抗原に対して免疫され得ることである。安全性は、宿主に対して弱毒化されるか、又は対象の異種抗原をまだ発現することができるが宿主内で複製することができないウイルスベクターを選択することによってさらに調節される。標的種における安全性の履歴を有するワクチン株は、さらなる安全性特徴を与える。ベクターが必須遺伝子を欠失しているいくつかの系が開発されており、ワクチンの調製は、欠けている機能を与える細胞系で行われる。様々なベクター、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスベクターが、標的細胞への異種遺伝子の送達のために使用され得る。対象の異種遺伝子は、ウイルスベクターに挿入され得る。本発明のウイルスベクターは、例えば、複製起点、場合によって異種遺伝子の発現のためのプロモーター、及び場合によってプロモーターの調節因子を備えたウイルスベクターを含み得る。例えば、本発明の実施に有用なアデノウイルスは、E1及び若しくはE3及び若しくはE4領域に欠失を有し得るか、又はそうでなければ異種DNAを受け入れるために最大化され得る。ウイルスベクターは、対象の異種遺伝子に作動可能に連結された他のウイルス核酸配列と一緒に、構成的プロモーター、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、SV40ラージT抗原プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、SV40初期プロモーター、アデノウイルスプロモーター、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター、HSVプロモーター、HPVプロモーター、例えば、HPV上流調節領域又はラウス肉腫ウイルスプロモーターを含み得る。組織特異的又は誘導的プロモーターも、対象の異種遺伝子の発現を調節するために使用され得る。プロモーターはまた、発現が設計される宿主細胞と適合性であるように選択され得る。ウイルスベクターはまた、エンハンサーなどの他の転写調節エレメントを含み得る。エンハンサーは、プロモーター遺伝子配列に作動可能に連結される場合、その遺伝子配列の転写を増加させる、シス作用因子として広義に定義される。エンハンサーは、他の発現調節エレメントよりも対象の配列からさらに非常に離れた位置から機能することができ、対象の配列に対していずれの方向で位置する場合も作動し得る。エンハンサーは、ポリオーマウイルス、BKウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40、モロニー肉腫ウイルス、ウシパピローマウイルス及びラウス肉腫ウイルスを含む、多くのウイルス源から同定されてきた。適切なエンハンサーの例としては、SV40初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復由来のエンハンサープロモーター、及びヒト又はマウスCMV由来のエレメント、例えば、CMVイントロンA配列に含まれるエレメントが挙げられる。次いで、対象の異種遺伝子を含むウイルスベクターは、貯蔵、凍結乾燥などのさらなる保存技術に供すること、又は患者若しくは宿主細胞への投与の前に、本発明の方法によって保存され得る。抗ウイルス活性を示すことが公知であるポリペプチドをコードする核酸、免疫調節分子、例えば、サイトカイン、アジュバント並びに共刺激分子及び補助分子は、本発明のウイルスベクターに含め得る。代替として、このようなポリペプチドは、例えば、本発明の保存混合物中で、別個に提供され得るか、又は本発明のウイルスベクターと同時に、連続的に又は別個に投与され得る。好ましくは、本発明の保存されたウイルスベクターは、当業者に公知である様々なウイルス技術、例えば、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びアデノウイルスなどの組換えウイルスベクターによる感染を用いて、適切な宿主細胞に導入され得る。好ましくは、対象の遺伝子を含む本発明の保存されたウイルスベクターの投与は、標的細胞のウイルス感染によって媒介される。多数のウイルスに基づく系が、哺乳動物細胞をトランスフェクトするために開発された。例えば、選択された組換え核酸分子は、当技術分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子としてパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスは、単離され、インビボ又はエクスビボのいずれかで被験者の細胞に送達され得る。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに基づき得る。レトロウイルスベクターでは、ウイルス遺伝子の1種又は複数種は、一般に対象の遺伝子と置き換えられる。多くのアデノウイルスベクターが公知である。アデノウイルスサブグループC血清型2及び5が、ベクターとして一般に使用される。野性型アデノウイルスゲノムは、約35kbであり、その30kbまでを外来性DNAで置き換えることができる。調節機能を有する四つの初期転写単位、及び構造タンパク質をコードする後期転写物がある。アデノウイルスベクターは、不活化されたE1及び又はE3遺伝子を有し得る。次いで、ミッシング遺伝子は、ヘルパーウイルス、プラスミドによってイントランスで供給され得るか、又はヘルパー細胞ゲノムに組み込まれ得る。アデノウイルスベクターは、E2a温度感受性突然変異体又はE4欠失を利用し得る。最小アデノウイルスベクターは、逆方向末端反復配列及び導入遺伝子の周囲のパッケージング配列だけを含むことができ、必要なウイルス遺伝子のすべては、ヘルパーウイルスによってイントランスで提供される。したがって、適切なアデノウイルスベクターとしては、Ad5ベクター並びにシミアンアデノウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、ワクチニアウイルス及びトリポックスウイルス、例えば、鶏痘ワクチンを含む、ウイルスのポックスファミリー由来であってもよい。例えば、改変ワクチニアウイルスAnkaraは、正常のヒト組織を含む、大部分の細胞型で複製しないワクチニアウイルスの株である。したがって、組換えMVAベクターは、本発明のポリペプチドを送達するために使用され得る。付加型のウイルス、例えば、アデノ関連ウイルス及び単純ヘルペスウイルスも、適切なベクター系を開発するために使用され得る。添加剤本発明では、ウイルス粒子の保存のための添加剤も提供される。添加剤は、場合によって1種若しくは複数種の糖並びに式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルを含む。好ましくは1種又は複数種の糖が存在する。好ましくは、添加剤は、これらの成分からなるか、又は本質的になる。添加剤によって、本発明のウイルス粒子のための担体として用いられる不活性物質が意味される。典型的には、ウイルス粒子は、添加剤中に溶解され、又はそれと混合され、これは、ウイルス粒子の保存剤として作用し、並びに又は一部の文脈では身体の中への投与及び吸収を助ける。本発明の保存用混合物と同様に、添加剤も、当技術分野で周知の酸化防止剤などの他の保存剤、潤沢剤及び結合剤を、それらの成分が本発明の保存用混合物の有効性を著しく低下させない限り、含み得る。固体担体上でのアッセイ固体担体上に貯蔵された保存ウイルス粒子は、診断目的に、又はワクチン接種計画をモニターするために使用され得る。例えば、体液などの患者試料は、患者試料及び本発明の保存用混合物を含む混合物を固体担体上に乾燥させることによって、本明細書で記載される方法によって保存され得る。次いで、保存された患者試料は、抗ウイルス抗体を用いて試料中のウイルス抗原エピトープの存在について試験され得る。代替として、対象のウイルス粒子は、ウイルス粒子及び本発明の保存用混合物を含む混合物を固体担体上に乾燥させることによって、本明細書で記載される方法によって保存され得る。患者試料は、患者試料と、対象のウイルス粒子がその上に結合している固体担体とを接触させることによって、抗ウイルス抗体の存在について試験され得る。抗原抗体複合体の形成は、測定可能なシグナルを誘発させ得る。試料中のウイルス粒子抗原抗体複合体の存在及び又は量は、ウイルス感染の存在又は患者におけるワクチン接種計画の進行を示すために用いることができる。投与本発明による保存ワクチン又はウイルス粒子は、様々な公知の経路及び技術を用いてインビボで被験者に、一部の場合に乾燥又は凍結乾燥生成物の再構成後に、投与され得る。例えば、保存ワクチンは、注射剤、懸濁製剤又はエマルション製剤として提供され、従来の針及び注射器を用いて非経口的、皮下、経口、表皮、皮内、筋内、動脈内、腹腔内、静脈内注射によって、又は液体噴流注入システムを用いて投与され得る。保存ワクチンは、皮膚若しくは粘膜組織に局所的に、例えば、経鼻、髄腔内、腸内、舌下、経直腸若しくは経膣的に投与され、又は呼吸器若しくは肺投与に適した微粉化噴霧として提供され得る。一つの実施形態において、本発明の方法は、該混合物を、液体注入としての投与に適した配合物に処理する工程をさらに含む。好ましくは、該方法は、該混合物を、消化を介する又は肺経路を介する投与に適した配合物に処理する工程をさらに含む。保存生成物は、投与製剤と適合しており、予防的に及び又は治療的に有効である量で被験者に投与される。本発明の保存生成物又はワクチンの投与は、予防的又は治療的のいずれかのためであり得る。本明細書で使用される場合、治療的又は治療の用語は、以下、すなわち、感染又は再感染の予防症状の低減又は除去及び病原体の低減又は完全な除去のいずれも含む。治療は、予防的に又は治療的に行うことができる。式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び或いは式の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖は、典型的にはウイルス粒子を含む乾燥又は凍結乾燥生成物、好ましくは本発明の生成物のための、例えば、それが、患者への投与前に液体形態に変えられる場合に、再懸濁剤として作用する。以下の実施例により、本発明は例証される。以下の材料、装置及び技術は、特に断りのない限り、実施例において用いた材料HEK293細胞ジメチルグリシンDMGジメチルスルホンスクロースラフィノースPBS水HydranalメタノールHydranalComposite5mlガラスバイアル14ml凍結乾燥栓14mmキャップアデノウイルスGFP麻疹ウイルス株3A及び1Aダルベッコ改変イーグル培地ウシ胎仔血清ペニシリンストレプトマイシン生理食塩水クエン酸ナトリウムBHK21細胞系HEK293MVA2mlガラスバイアル13mm凍結乾燥用栓クリンプ装置Advantage凍結乾燥機HERA安全クラスIIキャビネットVirTisAdvantage凍結乾燥機BinderCO2インキュベータBinderAPTlineTMMK熱サイクル試験チャンバーThermoScientificMaxQ4450インキュベータKERNEW2203NM天秤Elcold45°C冷凍庫Forma900シリーズ80°C冷凍庫カールフィッシャー容量滴定器DMILLEDインバータ顕微鏡ATL841Atlion天秤IP25037°Cインキュベータ凍結乾燥プロトコル約3日間継続する事前にプログラム化されたプロトコルを用いて、試料をVirTisAdvantage凍結乾燥機により凍結乾燥した。試料を40°Cで1時間凍結させ、その後、ThemoSavantVLPポンプによって、最初に200ミリトールで真空をかけた。棚温度及び真空は、この処理を通して調整し、凝縮器は80°Cに維持した。工程8は、真空を開放する前に試料に栓をするまで、延長した。用いた乾燥サイクルを以下に示す一次乾燥期において、棚温度は、45°Cから32°Cに上昇させる。二次乾燥期は、乾燥が終了するまで20°Cへの傾斜を含んだ。凝縮器温度は、一定の80°Cでとどめるように設定した。プローブにより、棚温度及び凝縮器温度を記録した。統計分析PRISMGraphpadソフトウェアバージョン400を用いて、異なる添加剤間の有意性を分析するために、一元配置分散分析検定、続いてテューキー対比較を行った。p値摘要は、p01でなければならない。Q2は、良いモデルについて05でなければならない。R2Q205は、有意を意味する。[実施例1]凍結乾燥添加剤のそれぞれの種類を原液として作製し、250μlを適切に標識した5mlガラスバイアルに添加した。次いで、50μlのアデノウイルスをそれぞれのバイアルに添加した。ボルテックスした後、バイアルをVirTisAdvantage凍結乾燥機に積載し、上記一般実験技術の項で示したプロトコルに従って凍結乾燥させた。熱負荷凍結乾燥に続いて、試料を、BinderAPTラインTMMK温度試験チャンバーにおいてインキュベートした。37°Cの温度で12時間、20°Cに1時間の傾斜、20°Cで10時間、続いて37°Cに1時間の傾斜によってサイクルさせた。それぞれのサイクルは合計で24時間になり、2週間の期間繰り返し、その後、以下に記載するとおりにアデノウイルスアッセイを行った。アデノウイルスアッセイ96平底細胞培養皿に、HEK293細胞を1ml当たり105細胞で播種し、37°C、5CO2で維持した。90の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを300μlPBSで再構成した。次いで、再構成したバイアルから20μlを取って、180μlのダルベッコ改変イーグル培地に添加することによって、10分の1希釈工程を行った。この10分の1希釈液20μlを取って、それを180μlのDMEMに添加することによって、さらに100分の1希釈を行った。次いで、得られた希釈液のそれぞれ100μlを、HEK293細胞を含むプレートのウェルに添加した。さらに、添加剤処理液で用いた同じ供給源由来で、同じ力価を有する、アデノウイルスのさらなる試料を解凍し、10分の1希釈シリーズを作製するために用いた。10分の1から106分の1の範囲の希釈液も、HEK293を含む個々のウェルに添加した。接種48時間後に、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP細胞の数を数え、その後に、これを適用した容量及び接種材料の希釈を考慮に入れて、処理試料のpfumlに換算した。結果及び検討この実験は、貯蔵の間に添加剤の存在下でウイルス回復に対する冷却及び加熱の影響を評価するために設計した。結果は、糖のみ又はPBSを含む添加剤において回復不良を示す。糖に加えてジメチルスルホンを含む添加剤において、回復は有意により高かった。さらに、ジメチルスルホンを含む添加剤は、対照試料と比較して熱及び凍結負荷後の劣化が少ないことを示した。結果は、糖単独又はPBSなどの不適当な添加剤は、FD後に有意なウイルス力価をまったくもたらすことができないので、FDプロセスの間に熱保護が、欠かせないことを示す。しかし、ジメチルスルホンを含む添加剤が、糖とともに用いられる場合、ウイルス力価は、凍結解凍サイクルの間でさえも元の力価のものに近いままである。[実施例2]ウイルスを加えた添加剤のそれぞれの種類を、PBS中原液として作製し、適切に標識した5mlガラスバイアルに250μlを添加した。バイアルすべてを3連で調製した。50μlのアデノウイルスをそれぞれのバイアルに添加した。ボルテックスした後、ゴム栓を部分的に挿入し、バイアルをVirTisadvantageに積載し、上記一般実験技術の項に示した凍結乾燥プロトコルに従って凍結乾燥させた。凍結乾燥に続いて、試料をウイルス力価について、実施例1に記載したアデノウイルスアッセイを用いて評価した。結果を図3に示す。PBS、糖のみ及びMSMのみの添加剤は、回復不良を示した。添加剤が糖に加えてMSMを含む場合、ウイルスの回復は有意に増加した。結果は、MSMと糖の間の相乗作用を示した一方、分離して用いたMSMは、不良な安定性添加剤であることを示した。残留水分プロトコル残留水分測定のために一部のバイアルを取った。容量カールフィッシャー滴定器を用いて、残留水分の評価を行った。滴定器は、1モルのI2が、それぞれのモルのH2Oに対して消費される原理で作動する。滴定器は、10mgmlの水標準を用いて検証した。天秤を用いて、乾燥した添加剤混合物を含むバイアルの重さを量ることによって、滴定を行った。チャンバーからの1mlの液体を、5mlの注射器及び針を用いて滴定チャンバーからガラスバイアルに移す。添加剤が溶解するとすぐに、液体を注射器中に上方へ引き取り、液体を滴定チャンバー中に注入する。バイアルの重さを再度量り、重量の差を滴定器中に投入した。次いで、滴定器により、残留水分が計算された。測定は、MSMの存在が、二次乾燥の間のケーキの乾燥を補助し得ることを示す。[実施例3]添加剤にウイルスを加えた混合物を調製し、実施例2で記載したとおりに処理した。添加剤は、TMG及び場合によって糖を含んだ。乾燥前の添加剤中それぞれの成分の最終濃度を以下の表4に示す。バイアルはすべて3連で調製した。添加剤中TMGの使用の結果を、図4に示す。TMGは、凍結乾燥試料からのアデノウイルス感染性の回復を高めるように見える。しかし、最低濃度は、最大の保護を与え、この濃度を超えてTMG濃度を増加させることは、与えられる保護を減少させる。007MのTMG処理液は、糖単独よりも大きい保護を与えた。[実施例4]実施例4は、アデノウイルスの凍結乾燥配合物中添加剤としてのSメチルLメチオニン、スクロース及びラフィノース間の相互作用を明らかにするための実験を記載する。ウイルスの調製及び凍結乾燥2×106pfumlの力価を有する、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルスを、80°Cでの貯蔵から取り出し、解凍させた。このウイルスの50μlアリコートを、可変濃度のそれぞれの添加剤を含むPBS中で300μlに希釈した。試験した添加剤配合物の完全一覧は、表5に見ることができる。それぞれの処理液は、6連のバイアルで作製した。これらの試料を、5mlガラスバイアル中で調製し、ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、VirTisadvantageに積載し、図5に示す条件下で凍結乾燥した。凍結乾燥アデノウイルスの熱負荷凍結乾燥後、試料を直ちに取り出し、それぞれの処理液の3連を熱負荷のために37°Cで置く一方、他の3連を凍結乾燥後対照として4°Cで貯蔵した。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルのすべてを対照バイアルに戻し、それらを実際にアッセイするまで、すべてを4°Cで維持した。水で戻したケーキ由来の回復した感染性ウイルスのアッセイ96平底細胞培養皿に、HEK293細胞を1ml当たり105細胞で播種し、37°C、5CO2で維持した。90の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを300μlのPBSで再構成した。再構成した試料を、DMEMに加えて5FBS中110及び1100に連続的に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100μlを、プレートの個々のウェルに添加した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP細胞の数を数えた。凍結乾燥の間のアデノウイルス感染性の保護試料を凍結33日後に、及び熱負荷をかけた試料の場合、37°Cで7日、続いて4°Cでさらに26日貯蔵後にアッセイした。結果を図6Aに示す。SメチルLメチオニン単独は、凍結乾燥の間にアデノウイルスの濃度依存性の保護を示す。この濃度範囲で、配合物中SメチルLメチオニンの増加は、再構成した試料からの回復ウイルス感染性の増加を示した。SメチルLメチオニンと糖の低濃度処理液との共配合は、この関係を有意に変えなかった。しかし、SメチルLメチオニンと高濃度糖処理液との共配合は実に、低いSメチルLメチオニン濃度でウイルス感染性の回復を有意に高めた。この証拠の上に、凍結乾燥の間のウイルス感染性の保護のための最適配合は、糖を含まないSメチルLメチオニンの高濃度、又は高濃度の糖との共配合物中の023M未満のSメチルLメチオニンの濃度のいずれかであるように見える。凍結乾燥及び37°Cでの熱負荷の間のアデノウイルス感染性の保護配合物中いずれの糖も非存在下で、SメチルLメチオニンは、凍結乾燥及びその後の熱負荷の間のウイルス感染性の非常に限られた保持を与えただけであった。この限定された保護でさえも、007M及びそれを超える濃度で見られるだけである。低濃度の糖との共配合は、同様にあまり保護を示さないが、有効性は、低いSメチルLメチオニン濃度で増強させ得る。SメチルLメチオニンと高濃度の糖との共配合は、000Mと023Mとの間のSメチルLメチオニンで明らかな保護の増強を示し、この増強は、相加効果を十分に超えており、したがって、恐らくは、007M及び023Mの両方での真の相乗作用と考えることができた。高濃度の糖が配合された005Mと01Mとの間のSメチルLメチオニンが、最適濃度であるように見える。しかし、この範囲でさえも、回復は、ほぼ2~3×105pfumlであり、これは、投入ウイルスのアッセイした力価に関してほとんど対数減少値を示す。[実施例5]凍結乾燥後に、感染性アデノウイルスの回復レベルを容易にアッセイすることができるように、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルスを、添加剤混合物と配合した。ウイルスを加えた添加剤のそれぞれの種類をPBS中原液として作製し、300μlを適切に標識した5mlガラスバイアルに添加した。ボルテックスした後、ゴム栓を部分的に挿入し、上に示した凍結乾燥プロトコルに従って、バイアルをVirTisAdvantage凍結乾燥機に積載し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、試料のウイルス力価を以下に記載されるとおりのアデノウイルスアッセイで評価した。上記一般実験技術の項に示したプロトコルに従って、試料をVirTisAdvantage凍結乾燥機で凍結乾燥させた。凍結乾燥に続いて、試料を、実施例1で記載したとおりのアデノウイルスアッセイでアッセイした。結果を図7に示す。PBS中凍結乾燥したアデノウイルスの回復は、典型的には低く、これは、この実験で再現された。DMG単独は、凍結乾燥の間にアデノウイルス感染性の保護を与え、これは、糖単独と比べて勝る。糖及びDMGの配合は、用量依存性の保護を示した。最高濃度のDMGは、凍結乾燥前のアデノウイルスに匹敵するように見える。[実施例6]この実施例における実験は、熱負荷の間にアデノウイルスを保護するDMGの能力を調査することによって、ラフィノース及びスクロースとともに凍結乾燥の間にアデノウイルスを保護するDMGの能力についてさらに詳しく説明する。互いに固定比率の糖のそれぞれの2種類の濃度を試験した一方、DMGの5種類の濃度を調べた。凍結乾燥及び熱処理後に、感染性アデノウイルスの回復のレベルを容易にアッセイすることができるように、GFPを発現するアデノウイルス株に添加剤混合物を配合した。アデノウイルスに添加剤を配合し、凍結乾燥し、その後、4°C及び37°Cで1週間貯蔵した。その後、試料をHEK293細胞に接種し、接種48時間後にGFP発現細胞の数を数えることによって、回復ウイルスを評価した。材料及び方法配合ウイルスの調製及び凍結乾燥2×106pfumlの力価を有して、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルスを、80°Cでの貯蔵から取り出し、解凍させた。このウイルスの50μlアリコートを、可変濃度のそれぞれの添加剤を含むPBS中300μlに希釈した。試験した添加剤配合の完全一覧は、以下の表7に見ることができる。それぞれの処理液は、6連の5mlバイアルで作製した。ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後に、VirTisAdvantage凍結乾燥機に積載し、プログラム10で凍結乾燥させた。凍結乾燥アデノウイルスの熱負荷凍結乾燥後、試料を直ちに取り出し、3連のそれぞれの処理液を熱負荷のために37°Cで置いた一方、他の3連は、凍結乾燥後の対照として4°Cで貯蔵した。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルすべてを対照バイアルまで戻し、それらを実際にアッセイするまで4°Cで保持した。水で戻したケーキ由来の回復感染性ウイルスのアッセイ96平底細胞培養皿に、1ml当たり105細胞でHEK293細胞を播種し、37°C、5CO2で維持した。90の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを300mlのPBSで再構成した。再構成した試料を、5FBSを加えたDMEM中110及び1100に連続的に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100mlを、プレートの個々のウェルに添加した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いてウェル当たりGFP細胞の数を数えた。結果を図9A及び図9Bに示す。結果及び検討凍結乾燥の間のアデノウイルス感染性の保護凍結乾燥後の試験期間の継続の間に4°Cで貯蔵した試料を、凍結乾燥後の対照の代わりとして及びまた熱負荷の負の対照としてアッセイした。いずれの添加剤も非存在下で、この実験の間のアデノウイルスの凍結乾燥は、試料の感染性を15×106pfumlから10×104pfuml未満に低下させた。アデノウイルスと一緒の添加剤としてのDMGの使用は、凍結乾燥ケーキの再構成後にウイルス感染性の回復を高めた。この実験で凍結乾燥の間のアデノウイルスの保護のためのDMGの最適濃度は、007M以上であるように見える。添加剤を用いると、75~85×105pfumlの回復力価は、容易に達成できる。凍結乾燥、続いて37°Cでの熱負荷の間のアデノウイルス感染性の保護ウイルス感染性の検出可能な回復は、37°Cでの熱負荷後に、添加剤を含まないバイアルから観察されなかった。これは、4°Cで保持された同等の配合物の試料を上回るウイルス感染性の非常に有意な損失を示す。糖単独を配合した試料から熱負荷後にウイルス感染性を回復させることが可能である。残念なことに、回復ウイルス力価は、試験期間に4°Cで保持された試料の19×105pfumlに比べてわずか43×104pfumlでしかない。DMGが唯一の添加剤として用いられる場合、DMGの最適濃度は、ほぼ75×105pfumlの回復とともに、007M以上であるように見えた。最大007MのDMG濃度で、DMG濃度と回復ウイルスの間の正の相関がある。007MのDMGを超えると、その効果は飽和するように見える。アデノウイルスと、同じ低い濃度の糖及び007M以上のDMGとの共配合は、いずれの糖も非存在下での等しいDMG濃度と少なくとも同程度であり、おそらくは保護効果のわずかな増強を示した。0023M以下でのDMGと、高い糖濃度との共配合は、DMG効果が飽和したと考えられる処理に匹敵するレベルまで回復を高めた。しかし、007M以上のDMG濃度で、高い糖濃度の添加は、明らかな利点をまったく有しない。これらの所見は、高い濃度での糖のDMG配合物への添加は、その効果を飽和させるのに必要なDMGの量を減少させることを示唆する。[実施例7]凍結乾燥後に、感染性アデノウイルス回復のレベルを容易にアッセイし得るように、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルスに、添加剤混合物を配合した。添加剤のそれぞれの種類は、原液として作製し、250μlを適切に標識した2mlガラスバイアルに添加した。原液から50μlのアデノウイルスをそれぞれのバイアルに添加した。ボルテックスした後、バイアルをVirTisAdvantage凍結乾燥機に積載し、凍結乾燥した。凍結乾燥プロトコル約3日間継続する予めプログラム化したプロトコルを用いて、VirTisAdvantage凍結乾燥機によって、試料を凍結乾燥させた。試料を40°Cで1時間凍結し、その後、ThermoSavantVLPポンプを用いて最初は300ミリトールで真空をかけた。棚温度及び真空は、この処理を通して調整し、凝縮器は80°Cで維持した。工程9は、真空の開放前に試料に栓をするまで延長した。用いた乾燥サイクルは、以下の表9に示す。一次乾燥期において、棚温度は34°Cに保持する。二次乾燥期は、乾燥が終了するまで、20°Cへの傾斜を含んだ。凝縮器温度は一定の80°Cでとどまるように設定した。プローブにより、棚温度及び凝縮器温度を記録した。アデノウイルスアッセイ96平底細胞培養皿に、1ml当たり105細胞でHEK293細胞を播種し、37°C、5CO2に維持した。90の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを、5ウシ胎仔血清を加えたダルベッコ最小必須培地1mlで再構成した。再構成したバイアルから100μlを取り、900μlのDMEMに添加することによって、110希釈工程を行った。次いで、得られた希釈ウイルス100μlを、プレート上の第一列に添加し、12希釈をプレートで実行した。この過程を次の添加剤で繰り返した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP細胞の数を数えた。統計分析PRISMGraphpadソフトウェアバーション400を用いて種々の添加剤間の有意性を分析するために、一元配置分散分析検定、続いてボンフェローニ事後検定を行った。p値摘要は、p005p001p0001である。結果及び検討図11は、凍結乾燥後のアデノウイルス力価の保存についてのマンニトールとDMGとの組合せの利点を示す。凍結乾燥後、DMGをそのままで添加剤として用いた場合、ウイルス力価のほぼ対数の半分の降下があった。マンニトールが唯一の添加剤であった場合、力価の損失は、DMGより著しく、ウイルス力価は、2対数桁だけ低下した。しかしマンニトールとDMG両方を使用すると、力価に有意な損失は無く、凍結乾燥ケーキの外観は改善された。[実施例8]この実施例における実験の目的は、ケーキ形成を評価することであった。より広範なパネルの添加剤ミックスを用いた以外は実施例7と同様に、実施例8を行った。添加剤のそれぞれの種類を原液として作製し、300μlを適切に標識した2mlガラスバイアルに添加した。ボルテックスした後、バイアルをVirTisAdvantage凍結乾燥機に積載し、これを表9に示した凍結乾燥プロトコルに従って運転した。凍結乾燥後に、試料を写真に撮り、ケーキ形成を評価した。凍結乾燥後の凍結乾燥ケーキの外観を調べた。結果は図12に示す。07MのDMGの存在下で、様々な濃度のマンニトールを用いた。最も高いマンニトール濃度は058Mであり、最も低いものは0018Mであった。マンニトールの最高濃度で、白色不透明なケーキが形成された。濃度が低下するにつれて、あまり望ましくない透明で澄んだ泡が形成された。[実施例9]2種類の添加剤だけを調製したことを除いて実施例7と同様に、実施例9を行った。第1の添加剤は、最終容量300μlに作製したPBS中アデノウイルスであった。第2の添加剤は、2mlガラスバイアル中アデノウイルスと一緒のマンニトール及びDMGであった。ボルテックスした後、バイアルをVirTisAdvantage凍結乾燥機に積載し、表9に示した凍結乾燥プロトコルに従って凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料は、ウイルス力価をアッセイしたか、又は37°Cで1週間熱処理し、次いでアッセイした。結果は、図13に示す。凍結乾燥後、PBS対照中対数の半分を超えるウイルス力価の低下があった。元のウイルス原液と比較して、DMG及びマンニトールを含む試料では、ウイルス力価の有意な損失は見られなかった。37°Cでの熱処理後、PBS対照中対数の半分を超えるウイルス力価の降下が再度あった。DMG及びマンニトールを含む試料のウイルス力価は、元の原液力価と比較して、約03対数桁だけ低下した。[実施例10]アデノウイルスの安定化ウイルスの調製及び凍結乾燥CMVプロモーター下で増強GFPを発現し、SSC中67×105pfumlの力価を有する組換えヒトアデノウイルスAd5を、80°Cでの貯蔵から取り出し、解凍させた。50μlのアリコートを2mlの凍結乾燥バイアルに添加した。これらの50μlのウイルス試料に、DMG、MSM及び場合によってスクロースから構成される配合物混合物250μlを添加した。それぞれの配合物混合物をSSC中で作製した。ウイルス試料に添加後のそれぞれの配合物中のDMG、MSM及びスクロースの濃度を、表11に示すゴム栓を部分的に挿入した。ボルテックスした後、バイアルをVirTisAdvantagePlusEL85凍結乾燥機に積載し、プログラム4で凍結乾燥させた。したがって、以下の表12に示す乾燥サイクルを用いて、試料を凍結乾燥させた。試料を45°Cで1時間凍結し、その後、ThemoSavantVLPポンプによって、最初に300ミリトールで真空をかけた。棚温度及び真空は、この処理を通して調整し、凝縮器は42°Cに維持した。工程11は、真空を開放する前に試料に栓をするまで、延長した。熱処理において、棚温度は、40°Cに降下させた。凍結乾燥ウイルスの熱負荷凍結乾燥後、バイアルに直ちにキャップをし、取り出し、クリンプさせ、次いで、熱負荷のために37°Cで置いた。熱負荷は7日間であって、その後、バイアルすべてを、それらを実際にアッセイするまで4°Cに戻した。水で戻したケーキ由来の回復感染性ウイルスのアッセイ96平底細胞培養皿に、1ml当たり105細胞でHEK293細胞を播種し、37°C、5CO2で維持した。90の集密度に達した後、細胞を接種した。アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを、300μlのSSC中再構成した。次いで、再構成したバイアルから20μlを取り、180μlのダルベッコ改変イーグル培地に添加することによって、10分の1希釈工程を行った。10分の1希釈液20μlを取って、それを180μlのDMEMに添加することによって、さらに100分の1希釈を行った。次いで、得られた希釈液のそれぞれ100μlを、HEK293細胞を含むプレートのウェルに添加した。さらに、添加剤処理で用いた同じ供給源からで、同じ力価を有するアデノウイルスのさらなる試料を解凍し、10分の1の希釈シリーズを作製するために用いた。10分の1から106分の1の範囲の希釈液も、HEK293を含む個々のウェルに添加した。接種48時間後に、蛍光顕微鏡を用いて1ウェル当たりGFP細胞の数を数えて、その後に、これを、接種材料の適用された容量及び希釈を考慮に入れて、処理試料のpfumlに換算した。結果結果を図14に示す。MODDE90プログラムを用いて重回帰分析によってデータを分析したときに、MSM及びDMGを組み合わせて用いた場合並びにDMG及びスクロースを組み合わせて用いた場合、相乗作用が見られた。[実施例11]MVAの安定化ウイルスの調製及び凍結乾燥MVAを80°Cでの貯蔵から取り出し、解凍した。50μlのアリコートを2mlの凍結乾燥バイアルに添加した。これらのバイアル試料に、上の表11に記載した配合物混合物250μlを添加した。ゴム栓を部分的に挿入した。ボルテックスした後、バイアルをVirTisAdvantagePlusEL85冷凍乾燥機に積載し、実施例10で記載したとおりにプログラム4で凍結乾燥させた。凍結乾燥ウイルスの熱負荷凍結乾燥後、バイアルに直ちにキャップし、取り出し、クリンプさせ、次いで、熱負荷のために37°Cで置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルのすべてを、それらを実際にアッセイするまで4°Cに戻した。水で戻したケーキから回復した感染性MVAのアッセイ添加剤を加えたMVAを300mlのSSC中で再構成した。再構成した試料を希釈し、アッセイした。アッセイプレートに、BHK21細胞を播種した。10FBS及び1PSを補給したDMEM中に細胞を希釈した。プレートを37°C、5CO2で1から2時間置いた。その間に、配合したMVA試料の希釈シリーズを101から104の範囲で調製した。それぞれの希釈シリーズを4回調製した。BHK21細胞を含む個々のウェルにそれぞれの希釈液35μlを適用し、ウェルにさらに65μlの培地を継ぎ足した。接種後6日目に、細胞変性効果の存在又は非存在について記録し、TCID50を計算した。次いで、これらを用いて、熱負荷バイアルにおける1ml当たり感染性MVAの濃度を推定した。結果結果を図15に示す。このスクリーニング試験での応答の範囲は、開始力価の06~605であった。これを、アッセイまで80°Cで保持したウイルスの第2のアリコートに対して評価した。図15は、正の対照のパーセントとしてのそれぞれの配合処理液の応答を示す。最良の実行性配合物は、015Mのスクロース、1MのDMG、1MのMSMを含んだ。全体として、結果は、添加剤のこの組合せが、凍結乾燥環境におけるウイルスの安定化にかなりの可能性を有することを強く示唆する。[実施例12]材料化学薬剤生物学的薬剤その他装置方法実験設計MODDE90を用いて、3因子、2レベルの完全多元スクリーニング設計を作成した。この設計は、試験した範囲の高及び低レベルでの添加剤の組合せ、並びに反復中心点を検定することを含む。反復中心点は、実験における誤差の指標を与える。設計は、それぞれの試験因子及びこれらの間の相互作用の一次効果をモデル化し得る、すなわち、配合物への添加剤の存在の影響を決定し得る。それは、二次のより高い効果をモデル化し得ないが、それらが存在するかどうかの指標を与え得る。二次効果は、データ内の共分散から生じる、すなわち、二つ以上の変数は、互いに依存している。二次効果が予想されるが、この目的は、添加剤のいずれかの効果を検出し、次いで、効果を有するいずれかの添加剤を、その効果をより正確にモデル化し得るより精緻な試験に進めるために、この単純なスクリーニング試験を最少処理で用いることである。凍結乾燥環境におけるアデノウイルスの安定性凍結乾燥環境における配合されたアデノウイルスの調製及び熱負荷生理食塩水クエン酸ナトリウム中67×105pfumlの力価を有して、CMVプロモーター下で増強GFPを発現する組換えアデノウイルスを、80°Cでの貯蔵から取り出し、室温で解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを15本の個々の2mlガラス凍結乾燥バイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと一度混合した添加剤ブレンド配合物を表13に記載し、SSC中で作製した。ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、VirTisAdvantage凍結乾燥機に積載し、プログラム4で凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料に真空下で直ちにキャップをし、取り出し、クリンプさせて、熱負荷のために37°Cで置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルすべてを、それらを実際にアッセイするまで、4°Cで保持した。凍結乾燥試料は、アッセイ直前に、300μlのSSC中で再構成した。アデノウイルスのアッセイ1ml当たり105細胞で播種することによって、HEK293を接種のために96ウェル平底細胞培養皿に調製し、37°C、5CO2で維持した。2時間後、細胞を以下のとおりに接種した。熱負荷をかけたウイルス試料を、DMEM10FBS中10分の1及び100分の1に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100μlを、アッセイプレートの個々のウェルに添加した。さらに、元のSSC中アデノウイルスの第2のアリコートを80°Cから解凍し、10倍の希釈シリーズも、DMEM10FBS中で調製した。この正の対照希釈液シリーズの2反復を、用いたそれぞれの96ウェルプレートに接種した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、1ウェル当たりGFPの数を数えた。結果全般応答の良好な範囲をそれぞれの実験で観察した。わずか数パーセントと32~46との間の回復ウイルス活性の範囲が最も多く生じた。この応答の分散は、適切なモデルが適用可能となるのに十分であった。それはまた、配合物の保護効果を示す。いくつかのモデルにおいて、最低の応答は、アッセイの検出閾値未満であった。データセットの変換を容易にするために、これらの事例の応答に検出閾値のレベル6×102pfumlであるを割り当てた。さらなるモデル化分析を表15から表17に示す。以下の略語列が、表16にある。NE新規な添加剤、Sucスクロース、Raffラフィノース。NExSNEとスクロースの間の相互作用。NExRNEとラフィノースの間の相互作用。SxRスクロースとラフィノースの間の相互作用。曲率二次効果を示す。モデル安定性のためにモデルで保持される非有意な項。以下の略語列が、表17にある。NE新規な添加剤、Sucスクロース、Raffラフィノース。NExSNEとスクロースの間の相互作用。NExRNEとラフィノースの間の相互作用。SxRスクロースとラフィノースの間の相互作用。曲率二次効果を示す。二次の項データ中の曲率によって予測される二次効果、これはモデルを強化する。この実験設計は、特定の二次効果を特定することができない。DMGこのデータセットで、応答の良好な分散が見られ、特に最も低い応答は、検出限界を超えている。データ点の一つは、モデルの微調整の間に明らかな外れ値として印を付したのち、分析から削除した。この外れ値の理由は知られていないが、オペレータエラーであると推定される。モデル強度の四つの指標すべてが高く、データ中に曲率は見られなかった。このモデルで、重要因子二つのみが特定され、DMG及びスクロースは、それぞれ有意な正の一次効果であることがわかった。その他の効果又は相互作用は見られなかった。ラフィノースは、モデルに、したがって、試験した範囲でのウイルス回復に影響を与えないと示された。SMMこのデータセットで、応答の良好な範囲が見られたが、この範囲での最低値は、検出閾値未満であった。モデル微調整の間に、データ点の一つを、明らかな外れ値として分析から削除した。作成した一次モデルは、重要因子としてスクロースのみを特定したが、何らかの意味ある有意性を得るために、このモデル内で非有意な因子を保持することが必要であった。そうであっても、このモデルは、R2及びQ2に対して比較的弱く記録する。図22は、モデルにおける曲率の証拠を示す。これを認めた後に、二次効果を入れて、新たなモデルを展開した。前の実施例におけるように、特定の二次効果は、この実験設計で特定できない。新たなモデルは、四つのモデル評価パラメータすべてでより高く記録した。このモデルは、スクロース、及びラフィノースを一次効果として、並びにSMMとスクロースの間の相互作用及び一つの添加剤の推定二次効果を特定した。この新しいモデルは、モデル内の曲率の証拠を示さなかった。TMGこのデータセットで、応答の良好な分散が見られ、データ点のすべては、検出可能閾値を超えていた。四つのモデル評価パラメータのすべてについて、許容できるスコアを生成した。このモデルは、TMGの一次効果、並びにTMGとスクロースの間の相互作用を特定する。ラフィノース及びスクロースは、非有意な因子と特定されるが、スクロースは、階層モデルを保存するためにモデル中に保持される。図26は、モデル中の曲率を示唆するしかし、モデルは、二次相互作用を含めることによって改善されず、曲率の他の何らかの原因を示唆した。[実施例13]材料化学薬剤生物学的薬剤その他装置方法実験の設計MODDE90を用いて、Doehlert実験設計を作成した。Doehlert設計は、通常のシンプレックスから構築した応答面モデリング設計である。それらは、異なる方向に容易に拡張でき、新たな因子を既存の設計に加えることができる。通常の配合設計とは異なって、非有意な因子は、分析から削除することができ、したがって、交絡因子にならない。さらに、設計内の異なる因子は、異なる数のレベルで検定され、したがって、より重要であると疑われる因子に対してより多くの検定レベルを割り当てることが可能である。したがって、添加剤は7レベルで検定したが一方、スクロースは5レベル、及びラフィノースは3レベルで検定した。このモデルは、二次効果及び相互作用についてモデル化する能力を保有する。この設計は、3因子及び3反復中心点を含み、15の検定試料を生じさせた。スクロースは、0Mと1Mの間で検定した。スクロースの上限レベルは1Mに設定したが、許容できる凍結乾燥の限度に近いことがわかったからである。それは、前の試験における高度に首尾よいレベルであることもわかり、一般に、スクロース濃度が高いほど、非経口で望ましくない。スクロースの最低レベルは、0Mに設定した。ラフィノースは、0mMから300mMの範囲にわたって検定したが、Doehlert設計の性質が、検定レベルが0mMを含まないことを意味したからであり、代わりに、以下の濃度を検定した275mM、1500mM、及び2725mM。DMGは、0Mから2Mの線形範囲にわたって検定した。最適濃度が凍結乾燥環境でしばしば05Mと15Mの間であった前の実験に基づいて、この範囲を限定することが可能であった。凍結乾燥環境におけるアデノウイルスの安定性凍結乾燥環境における配合アデノウイルスの調製及び熱負荷SSC中67×105pfumlの力価を有し、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルスを、80°Cでの貯蔵から取り出し、解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを15の2mlガラス凍結乾燥用バイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと混合した後の添加剤ブレンド配合物を表18に記載し、SSC中で作製した。ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、Virtisadvantage凍結乾燥機に積載し、プログラム4で凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料に真空下で直ちにキャップをし、取り出し、クリンプさせ、熱負荷のために37°Cで置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルすべてを、それらを実際にアッセイするまで、4°Cで保持した。アッセイ直前に、凍結乾燥試料を300μlのSSC中で再構成した。アデノウイルスのアッセイ1ml当たり105細胞で播種することによって、接種のためにHEK293細胞を96ウェル平底細胞培養皿中で調製し、37°C、5CO2で維持した。2時間後、細胞を以下のとおりに接種した。熱負荷をかけたウイルス試料を、DEME10FBS中10分の1、及び100分の1に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100μlをアッセイプレートの個々のウェルに添加した。さらに、元のSSC中アデノウイルスの第2のアリコートを80°Cから解凍し、10倍希釈シリーズもDMEM10FBS中で調製した。この正の対照希釈シリーズの2反復を、用いたそれぞれの96ウェルプレートに接種した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP細胞の数を数えた。結果四つの指標すべてが、良好な有意性を示唆する強いモデルが生じた。これらの中で、再現性の図は、唯一わずかに低いが、05を十分超えている。通例よりもわずかに低いこの値についての理由は、反復中心点間のわずかに高い変動である得るか、又はむしろ、これらの間の変動のレベルが、アッセイにおける全体の変動と比較して比例的により大きいからである。モデルは、スクロース及びDMG両方の一次効果、並びにDMGの二次効果を特定した。ラフィノースの一次又は二次効果は認められなかった。しかし、ラフィノースは、DMGと相互作用を実に有し、したがって、一次のラフィノースの係数は、モデル階層構造を保つために保持しなければならない。さらに、二次のラフィノースの効果は、それがより強いモデルをもたらすので保持した。いずれの場合も、二次のラフィノースの効果は、90の信頼区間で有意に近く、試験した範囲にわたって単に決定的に検出できないだけの真の効果であり得る。図31は、変化させたスクロース及びDMG濃度に対する回復ウイルス活性の一連の三次元プロットを示す。低は、0mMのラフィノース濃度を意味し、中は、150mMのラフィノース濃度を意味し、及び高は、300mMのラフィノース濃度を意味する。それぞれのプロットは、異なり且つ固定のラフィノース濃度でのモデルを示す。アデノウイルスの保存改善は、スクロース濃度を増加させることによって達成される。この傾向は、試験範囲を超えて続き、実験は、真のスクロース最適条件を特定することができない。対照的に、最適のDMG濃度は、明らかに試験範囲内である。ラフィノース濃度を増加させると、最適DMG濃度を低下させるように見える。モンテカルロシミュレーションを用いて、最適配合物を予測した。05Mのスクロース、1MのDMG、150mMのラフィノースの最適条件が、42×105pfumlの回復ウイルス力価又は熱負荷前のその投入の98をもたらすと予測された。予測最適条件は、最適条件を文脈中に導入する等高線プロットで示される。モデルは、配合物が100以上の回復ウイルス活性をもたらす設計空間の全領域を予測する。この領域は、ウイルス活性のゼロに近い損失が予想されるデータ中の平坦域と見ることが必要である。図33bは、この領域を強調表示する。この図は、ラフィノース濃度が増加すると、領域がY軸を下方に及びX軸を上方に動くことを示す。結論DMG、スクロース及びラフィノースの配合物は、凍結乾燥及び熱負荷を通してアデノウイルスの保存に有意な可能性を有すると特定された。データに基づくモデルは、ウイルス活性の100の回復が可能であることを予測する。このモデルにより、05と15Mの間の最適DMG濃度が特定された。最適スクロース濃度は、試験範囲を超えており、スクロース濃度の他の制約も超えているように思われる。ラフィノースは、このモデルにおける重要因子ではないと思われる。[実施例14]材料化学薬剤生物学的薬剤その他装置実験設計凍結乾燥環境におけるアデノウイルスのためのDMG、スクロース及びラフィノースの推定最適配合を検定するために、長期安定性試験を計画した。3種類の配合物を検定したSSC緩衝剤単独中アデノウイルスSSC中05Mのスクロース及び150mMのラフィノースにおけるアデノウイルス及びSSC中05Mのスクロース、150mMのラフィノース及び1MのDMGにおけるアデノウイルス。4°C±3の長期安定性試験温度を選択した。これは、冷蔵貯蔵を目的とした生成物の長期試験のための標準工業ガイドラインと大まかに一致する。ストレス試験温度、又はさらに高温の促進熱安定性温度に相当させるために、25°Cの促進安定性温度を採用し、37°Cの熱負荷を採用した。25°C及び37°Cでの試料を、凍結乾燥1週間後、2週間後、5週間後及び15週間後に試験した。4°Cでの試料を凍結乾燥15週間後に試験した。凍結乾燥環境における配合アデノウイルスの調製及び熱負荷SSC中67×105pfumlの力価を有し、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルスを、80°Cでの貯蔵から取り出し、解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを2ml凍結乾燥用ガラスバイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。用いた添加剤ブレンド配合物は、上に記載したとおり、すなわち、緩衝剤単独、糖、及び推定最適配合物であった。ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、VirTisAdvantage凍結乾燥機に積載し、プログラム1で凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料を真空下で直ちにキャップし、取り出し、クリンプさせ、三つの熱処理間に分配した。その後、それぞれの時点で、それぞれの配合物の二つのバイアルを上記日程に従って回復し、アッセイ直前に300μlのSSC中で再構成した。アデノウイルスのアッセイ1ml当たり105細胞で播種することによって、接種のためにHEK293細胞を96ウェル平底細胞培養皿中で調製し、37°C、5CO2で維持した。2時間後、細胞を以下のとおりに接種した。熱負荷をかけたウイルス試料を、上記のとおりに熱負荷から取り出し、DMEM10FBS中10分の1、及び100分の1に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100μlを、アッセイプレートの個々のウェルに添加した。さらに、SSC中、元のアデノウイルスの第2のアリコートを80°Cから解凍させ、10倍希釈シリーズもDMEM10FBS中で調製した。この正の対照希釈シリーズの2反復を、用いたそれぞれの96ウェルプレートに接種した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP細胞の数を数えた。結果15週目で、緩衝剤単独中で配合した試料から、ウイルス活性はまったく回復されなかった。糖との配合は、この損失の一部を防止する。しかし、4°Cで貯蔵された試料においてのみ、損失は、完全な対数降下未満の損失、すなわち、開始力価の10を超える回復活性である。この処理では、この時点で、損失は、温度の増加とともに漸進的に悪化する。高温は、比較的長い熱安定性試験をシミュレートする標準モードであるので、糖での損失は、4°Cで終点に達していないこと、及び時間経過とともにさらなる損失が予想され得ることが示唆される。推定最適配合物を用いると、損失はさらに減少する。実際、三つの貯蔵温度すべてで、損失は、ほぼ半分の対数損失である。三つの温度すべてにおける応答は、2784と3000の回復の間であり、これは、052~054対数の損失に相当する。この配合物に関して、三つの温度間の有意な差がないように見える。これは、劣化が終点に達しており、時間経過とともにさらなる劣化を予想できないこと、又は低下の速度が非常に遅くなってしまっているので、促進温度試験における差を検出することができないことのいずれかを意味する。図36及び図37は、これらの所見をさらに支持する。25°C及び37°Cの両方で、いずれの時点でも緩衝剤単独中に貯蔵された試料からウイルス活性は、回復されない。糖単独で配合されたものは、終始いくらかの活性を保持する。それらの活性は、わずかにより大きい程度だけ、及びより高い温度でわずかにより急速に低下する。推定最適配合では、37°Cでウイルス活性のより急な低下があるが、両方ともの温度で、時間経過とともに同様のレベルに低下する。試験した配合物のすべてに関して25°C及び37°Cの両方ともで、ウイルス活性の低下の大部分は、t0週とt5週の間に生じる。実際、緩衝剤単独及び糖の配合物の場合、劣化の圧倒的大部分は、t0週とt1週の間に生じる。t0として用いた応答の値は、凍結乾燥及び熱負荷前のウイルスの力価であったが、時点は、熱負荷後の週としてプロットする。したがって、t0週とt1週との間の認められた差は、凍結乾燥の間及び熱負荷の最初の週の間の劣化の合計である。[実施例15]材料化学薬剤生物学的薬剤その他装置方法実験設計実施例13に記載したとおりに、MODDE90を用いて、Doehlert実験設計を作成した。したがって、TMGを7レベルで検定したが一方、スクロースは5レベル、ラフィノースは3レベルで検定した。このモデルは、二次効果及び相互作用についてモデル化する能力を保有する。この設計は、3因子及び3反復中心点を含み、15の検定試料を生じさせた。スクロースは、0と1Mの間で検定した。Doehlert設計の性質は、検定レベルが0mMを含まなかったことを意味したが、ラフィノースは、0から300mMの範囲にわたって検定した。代わりに、以下の範囲を検定した275、1500、及び2725mM。TMGは、0から2Mの線形範囲にわたって検定した。凍結乾燥環境における配合MVAの調製及び熱負荷MVAを80°Cの貯蔵から取り出し、解凍させた。MVAの50μlアリコートを、凍結乾燥用2mlガラスバイアルに添加し、その後、250μlの添加剤ブレンドをそれぞれのバイアルに添加した。ウイルスと混合した後の添加剤ブレンド配合物を表19に記載し、SSC中で作製した。ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、Virtisadvantage凍結乾燥機に積載し、図39に記載するとおりに凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料を、直ちに真空下でキャップし、取り出し、クリンプさせ、熱負荷のために37°Cで置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルすべてを対照バイアルに戻し、それらを実際にアッセイするまで4°Cで保持した。凍結乾燥試料を、アッセイ直前に300μlのSSC中再構成した。MVAのアッセイアッセイプレートに、BHK21細胞を播種した。10FBS及び1PSを補給したDMEMに細胞を希釈した。プレートを37°C、5CO2で1から2時間置いた。その間に、配合MVA試料の10倍希釈シリーズを10分の1から10000分の1の範囲で調製した。それぞれの希釈シリーズを5回調製した。BHK21細胞を含む個々のウェルにそれぞれの希釈液100μlを適用した。接種後6日目に、ウェルは細胞変性効果の存在又は非存在について記録し、TCID50を計算した。次いで、これらを用いて、熱負荷バイアルにおける1ml当たり感染性MVAの濃度を推定した。結果この試験からのデータを表19に示す。応答は、開始力価の6から92に変化した。分析の間に、配合番号14は、明らかな外れ値として特定し、この分析から排除した。これは、モデル評価パラメータを強めた。ここで報告されるモデルは、スクロースの一次効果を実証する。ラフィノースは、一次効果は持たないことがわかったが、二次相互作用を実に実証した。TMGは、この試験で一次効果を持たないことがわかったが、二次効果は特定された。最終的に、スクロースとTMGの間の相互作用が特定された。図42は、モデルの等高線プロットを示す。最適TMG濃度は、モデルの中心に近いが、これは、他の添加剤を変化させるとわずかにドリフトする。ラフィノースも最適条件を示す。最終的に、一般に、スクロース濃度が高くなればなるほど、MVAの保存はより良好である。モンテカルロシミュレーションは、1Mのスクロース、114MのTMG及び14176mMのラフィノースの最適条件を特定し、114×106pfuml、すなわち、開始力価の877の予測回復を示した。[実施例16]材料化学薬剤生物学的薬剤その他装置方法MODDE90を用いて、中心複合面心設計を作成した。CCF設計は、それぞれの因子の3レベルのみを検定する応答面モデリング設計の方式であるが、二次のモデルを依然として支持する。通常の配合設計とは異なって、非有意な因子は分析から削除することができ、したがって、交絡因子にならない。凍結乾燥環境における配合MVAの調製及び熱負荷MVAを80°Cでの貯蔵から取り出し、解凍させた。MVAの50μlアリコートを凍結乾燥用2mlガラスバイアルに添加した。その後、250μlの添加剤ブレンドをそれぞれのバイアルに添加した。ウイルスと混合された後の添加剤ブレンド配合物は、表20に記載し、SSC中で作製した。ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、Virtisadvantage凍結乾燥機に積載し、図44に記載するとおりに凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料を直ちに真空下でキャップをし、取り出し、クリンプさせ、熱負荷のために37°Cで置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルすべてを対照バイアルに戻し、それらを実際にアッセイするまで4°Cで保持した。凍結乾燥試料は、アッセイ直前に300μlのSSC中で再構成した。MVAのアッセイアッセイプレートにBHK21細胞を播種した。10FBS、及び1PSで補給したDMEM中で細胞を希釈した。プレートを、37°C、5CO2で1~2時間置いた。その間に、配合MVA試料の10倍希釈シリーズを、10分の1から10000分の1の範囲の同じ増殖培地で調製した。それぞれの希釈シリーズを5回調製した。BHK21細胞を含む個々のウェルに、それぞれの希釈液100μlを適用した。接種6日後に、CPEの存在又は不存在についてウェルを記録し、TCID50を計算した。次いで、これらを用いて、熱負荷をかけたバイアル中1ml当たり感染性MVAの濃度を推定した。その後、配合MVA試料の2倍希釈シリーズを2000分の1から32000分の1の範囲で調製した。これらの希釈液を別個に、しかし前述同様にアッセイした。結果これらの試料のアッセイの最初の通過は、五つだけの応答レベルを生じさせたが、これらの一つは、検出閾値未満であった。より重要なことに、十一の処理の六つが、最大検出閾値を超えていた。これらの試料を再アッセイした。試料は、これらの二つのアッセイ間で4°Cで液体として保持した。一部の試料は、両方のアッセイで意味ある値を示した。これは、二つのアッセイ間の損失の決定を可能にした。第2の通過アッセイ後、検出閾値未満の力価を生じさせた処理はなかった。変換を容易にするために、この処理を最少検出閾値に等しい応答に割り当てた。このデータから作成されたモデルは比較的強い。モデル妥当性の四つのパラメータの三つが09を超えて記録する。モデルは、有意な因子を一つだけ特定した。DMGは、二次効果を有することがわかった。図47は、作成したRSMモデルを示す。それは、効果的には試験濃度範囲内でマンニトールによって変わらない単純なDMG用量応答曲線である。モンテカルロシミュレーションがするのと同様に、用量応答曲線は明らかな最適DMG濃度を特定する。予測された最適DMG濃度は、100Mであり、予測されたウイルス活性の回復は、開始力価の117である。