"シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞であって、a.前記シグナル配列が、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、b.前記組換え細胞が腸内細菌または共生細菌に由来し、c.前記シグナル配列が、GLP-2、その断片、もしくはその類似体、またはそれらの組合せである、組換え細胞。シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞であって、a.前記シグナル配列が、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、b.前記組換え細胞が腸内細菌または共生細菌に由来し、c.前記標的核酸が、前記宿主の第1の細胞を第2の細胞に再プログラミングすることができる哺乳動物因子をコードする、組換え細胞。前記宿主が哺乳動物である、請求項1または2に記載の組換え細胞。前記第2の細胞がβ様細胞、甲状腺細胞、肝細胞または免疫応答性細胞である、請求項2に記載の組換え細胞。前記宿主の前記第1の細胞が腸上皮細胞である、請求項2に記載の組換え細胞。前記第2の細胞がグルコース応答性インスリン分泌細胞である、請求項2に記載の組換え細胞。前記シグナル配列が、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節する、請求項1または2に記載の組換え細胞。前記プロモーターがグルコース応答性プロモーターである、請求項7に記載の組換え細胞。前記シグナル配列が、GLP-1、GIP、PDX-1、1つまたは複数のその断片、その類似体、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項2に記載の組換え細胞。前記シグナル配列が、GLP-1、PDX-1、GIP、GLP-2、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、トレフォイルファクター、細胞および組織修復因子、トランスホーミング増殖因子β、ケラチノサイト成長因子;逆平行4αヘリックス束構造をとる構造的第1群サイトカインであるIL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、IFNα/β;構造的第2群サイトカインであるTNF-ファミリーサイトカイン、TNFα、TNFβ、CD40、CD27、FASリガンド、IL-1-ファミリーサイトカイン、線維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子p、神経成長因子;短鎖α/β分子を含む構造的第3群サイトカインである上皮成長因子ファミリーサイトカイン、C-CケモカインまたはC-X-Cケモカイン、インスリン関連サイトカイン;構造的第4群サイトカインであるヘレグリン、ニューレグリン、EGF、免疫グロブリン様ドメイン、クリングルドメイン;1つまたは複数のその断片、その類似体、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項2に記載の組換え細胞。前記シグナル配列および前記プロモーターが前記組換え細胞内のプラスミドにコードされている、請求項1または2に記載の組換え細胞。プロバイオティクス細菌に由来する、請求項1または2に記載の組換え細胞。エシェリキア属、シュードモナス属、バクテロイデス属、乳酸桿菌属、ラクトコッカス属、バチルス属、プロテウス属、ビフィドバクテリウム属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、およびコリネバクテリウム属からなる群より選択される細菌である、請求項1または2に記載の組換え細胞。前記標的核酸が、前記宿主における生理的プロセスの所望の機能を促進することができる、または前記宿主における非感染性の疾患を処置することができる哺乳動物因子をコードする、請求項1または2に記載の組換え細胞。前記非感染性の疾患が、自己免疫疾患、癌、内分泌疾患、胃腸疾患、癌およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項14に記載の組換え細胞。前記非感染性の疾患が糖尿病である、請求項14に記載の組換え細胞。前記糖尿病が1型糖尿病、2型糖尿病またはメタボリックシンドロームである、請求項16に記載の組換え細胞。前記非感染性の疾患が、クローン病、肥満症、フェニルケトン尿症、カエデシロップ病、ヒスチジン血症、高血糖症、糖尿病性網膜症、冠動脈心疾患、毛細管内糸球体硬化症、腎症、ニューロパチー、四肢の潰瘍または壊疽、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高血圧、高タンパク血症、タンパク尿症、骨粗鬆症、貧血、高リポタンパク血症、ケトアシドーシス、高トリグリセリド血症、乳酸アシドーシス、心筋症、ウィルソン病、白質ジストロフィー、フコース蓄積症、癌、化学療法誘導性下痢、炎症性腸疾患、心室細動および心房細動、術後臓器不全、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎/膀胱疼痛症候群、短腸症候群、潰瘍性大腸炎、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項14に記載の組換え細胞。前記癌が胃腸癌、胃癌、胆嚢癌、消化管間質腫瘍、肝臓癌、膵癌、または結腸癌である、請求項18に記載の組換え細胞。前記哺乳動物因子が、腸の傷害または外科手術後の生理的プロセスの所望の機能を促進する、請求項14に記載の組換え細胞。前記宿主の体循環内に吸収されることなく腸絨毛に到達することができる、請求項2に記載の組換え細胞。前記プロモーターが誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターである、請求項1または2に記載の組換え細胞。前記プロモーターがfliCプロモーターである、請求項1または2に記載の組換え細胞。分泌タグをさらに含む、請求項1または2に記載の組換え細胞。前記分泌タグがfliC分泌タグである、請求項1または2に記載の組換え細胞。前記分泌タグがアルファ溶血素HlyA分泌タグである、請求項1または2に記載の組換え細胞。細胞透過性ペプチドCPP配列をさらに含む、請求項1に記載の組換え細胞。前記シグナル配列を、前記シグナル配列にコードされるシグナルおよび前記細胞透過性ペプチド配列にコードされる細胞透過性ペプチドを含む融合タンパク質として発現する、請求項26に記載の組換え細胞。宿主における糖尿病を処置するための方法であって、前記宿主に請求項2に記載の組換え細胞を投与するステップを含む、方法。標的シグナル配列が、疾患予防因子の発現を刺激する、または糖尿病の原因因子の発現を阻害する、請求項29に記載の方法。前記糖尿病が1型糖尿病、2型糖尿病またはメタボリックシンドロームである、請求項29に記載の方法。前記シグナル配列が、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節する、請求項29に記載の方法。前記環境刺激がグルコースである、請求項32に記載の方法。前記疾患予防因子がインスリンを含む、請求項30に記載の方法。前記標的核酸が、前記宿主における血中グルコースレベルの低下を促進する哺乳動物因子をコードする、請求項29に記載の方法。前記標的核酸が、前記宿主における血中インスリンレベルの上昇を促進する哺乳動物因子をコードする、請求項29に記載の方法。哺乳動物宿主において腸の細胞を別の細胞型に分化させるための方法であって、前記宿主に請求項2に記載の組換え細胞を投与するステップを含む、方法。前記別の細胞型がβ様細胞、甲状腺細胞、肝細胞または免疫応答性細胞である、請求項37に記載の方法。前記β様細胞がグルコース応答性細胞である、請求項38に記載の方法。有効量の前記組換え細胞が投与される、請求項29または37のいずれか一項に記載の方法。前記組換え細胞の前記有効量が少なくとも約104CFU/kgである、請求項29または37のいずれか一項に記載の方法。前記組換え細胞を、相乗効果を有する化合物と組み合わせて投与する、請求項29または37のいずれか一項に記載の方法。前記相乗効果を有する化合物が、DPP-4阻害剤、GLP-2、GLP-1アゴニスト、ジメチルスルホキシド、インスリン、アルファ-グルコシダーゼ阻害剤、プラムリンチド、メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド、クロルプロパミド、メトホルミン、スルホニル尿素、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、チアゾリジンジオン、その類似体、その断片、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項29または37のいずれか一項に記載の方法。前記シグナル配列が、GLP-1、PDX-1、GIP、GLP-2、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、トレフォイルファクター、細胞および組織修復因子、トランスホーミング増殖因子β、ケラチノサイト成長因子;逆平行4αヘリックス束構造をとる構造的第1群サイトカインであるIL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、IFNα/β;構造的第2群サイトカインであるTNF-ファミリーサイトカイン、TNFα、TNFβ、CD40、CD27、FASリガンド、IL-1-ファミリーサイトカイン、線維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子p、神経成長因子;短鎖α/β分子を含む構造的第3群サイトカインである上皮成長因子ファミリーサイトカイン、C-CケモカインまたはC-X-Cケモカイン、インスリン関連サイトカイン;構造的第4群サイトカインであるヘレグリン、ニューレグリン、EGF、免疫グロブリン様ドメイン、クリングルドメイン;1つまたは複数のその断片、その類似体、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される、請求項29または37のいずれか一項に記載の方法。前記シグナル配列がGIP、GLP-1、GLP-2、PDX-1、その断片、その類似体、およびそれらの組合せである、請求項29または37のいずれか一項に記載の方法。宿主において腸の細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングするための方法であって、GLP-1、GIP、PDX-1、その断片、その類似体、およびそれらの組合せからなる群より選択されるシグナル配列、ならびにプロモーターを含む組換え細胞を投与するステップを含む、方法。前記宿主が高血糖性であり、前記組換え細胞を前記高血糖性宿主に投与することにより外因性インスリンを前記宿主に治療的に投与する必要性が低下するか、または排除される、請求項46に記載の方法。したがって、血中グルコースレベルを制御することができれば、心臓血管疾患、網膜症、腎症、およびニューロパチーなどの合併症の危険度を低下させること、またはそれらの発症を遅延させることができる。総コレステロールおよびトリグリセリドレベルを低下させることができれば、心血管系合併症を減少させることができる。セクション2または本出願の任意の他のセクションの任意の参照の引用または同定は、そのような参照が本発明に対する先行技術として利用可能であると容認するものとみなされるべきではない。3.発明の概要組換え細胞が提供される。一実施形態では、組換え細胞は、シグナル配列およびプロモーターを含み、a.シグナル配列は、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、b.組換え細胞は腸内細菌または共生細菌に由来し、c.シグナル配列は、GLP-2、その断片、もしくはその類似体、またはそれらの組合せである。別の実施形態では、組換え細胞は、シグナル配列およびプロモーターを含み、a.シグナル配列は、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、b.組換え細胞は腸内細菌または共生細菌に由来し、c.標的核酸は、宿主の第1の細胞を第2の細胞に再プログラミングすることができる哺乳動物因子をコードする。別の実施形態では、宿主は哺乳動物である。別の実施形態では、第2の細胞は、β様細胞、甲状腺細胞、肝細胞または免疫応答性細胞である。別の実施形態では、宿主の第1の細胞は、腸上皮細胞である。別の実施形態では、第2の細胞は、グルコース応答性インスリン分泌細胞である。別の実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節する。別の実施形態では、プロモーターは、グルコース応答性プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、当技術分野で公知の任意の誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターであってよい。別の実施形態では、シグナル配列は、GLP-1、GIP、PDX-1、1つまたは複数のその断片、その類似体、およびそれらの組合せからなる群より選択される。別の実施形態では、シグナル配列は、GLP-1、PDX-1、GIP、GLP-2、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、トレフォイルファクターtrefoilfactor、細胞および組織修復因子cellandtissuerepairfactor、トランスホーミング増殖因子β、ケラチノサイト成長因子;逆平行4αヘリックス束構造をとる構造的第1群サイトカインであるIL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、IFNα/β;構造的第2群サイトカインであるTNF-ファミリーサイトカイン、TNFα、TNFβ、CD40、CD27、FASリガンド、IL-1-ファミリーサイトカイン、線維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子p、神経成長因子;短鎖α/β分子を含む構造的第3群サイトカインである上皮成長因子ファミリーサイトカイン、C-CケモカインまたはC-X-Cケモカイン、インスリン関連サイトカイン;構造的第4群サイトカインであるヘレグリンheregulin、ニューレグリンneuregulin、EGF、免疫グロブリン様ドメイン、クリングルドメインkringledomain;1つまたは複数のその断片、その類似体、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される。別の実施形態では、シグナル配列およびプロモーターは組換え細胞内のプラスミドにコードされている。別の実施形態では、細胞はプロバイオティクス細菌probioticbacteriumに由来する。別の実施形態では、細胞は、エシェリキア属、シュードモナス属、バクテロイデス属、乳酸桿菌属、ラクトコッカス属Lactococcus、バチルス属、プロテウス属、ビフィドバクテリウム属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、およびコリネバクテリウム属からなる群より選択される細菌である。別の実施形態では、標的核酸は、宿主における生理的プロセスの所望の機能を促進することができる、または、宿主における非感染性の疾患を処置することができる哺乳動物因子をコードする。別の実施形態では、非感染性の疾患は、自己免疫疾患、癌、内分泌疾患、胃腸癌およびそれらの組合せからなる群より選択される。別の実施形態では、非感染性の疾患は糖尿病である。別の実施形態では、糖尿病は1型糖尿病、2型糖尿病またはメタボリックシンドロームである。別の実施形態では、非感染性の疾患は、クローン病、肥満症、フェニルケトン尿症、カエデシロップ病、ヒスチジン血症、高血糖症、糖尿病性網膜症、冠動脈心疾患、毛細管内糸球体硬化症、腎症、ニューロパチー、四肢の潰瘍または壊疽、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高血圧、高タンパク血症、タンパク尿症、骨粗鬆症、貧血、高リポタンパク血症、ケトアシドーシス、高トリグリセリド血症、乳酸アシドーシス、心筋症、ウィルソン病、白質ジストロフィー、フコース蓄積症、癌、化学療法誘導性下痢、炎症性腸疾患、心室細動および心房細動、術後臓器不全、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎/膀胱疼痛症候群bladderpainsyndrome、短腸症候群、潰瘍性大腸炎、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される。別の実施形態では、癌は胃腸癌、胃癌、胆嚢癌、消化管間質腫瘍、肝臓癌、膵癌、または結腸癌である。別の実施形態では、哺乳動物因子は、腸の傷害または外科手術後の生理的プロセスの所望の機能を促進する。別の実施形態では、組換え細胞は、宿主の体循環内に吸収されることなく腸絨毛に到達することができる。別の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、fliCプロモーターである。別の実施形態では、組換え細胞は、分泌タグをさらに含む。別の実施形態では、分泌タグはfliC分泌タグである。別の実施形態では、分泌タグはアルファ溶血素HlyA分泌タグである別の実施形態では、組換え細胞は、細胞透過性ペプチドCPP配列をさらに含む。別の実施形態では、組換え細胞は、シグナル配列を、シグナル配列にコードされるシグナルおよび細胞透過性ペプチド配列にコードされる細胞透過性ペプチドを含む融合タンパク質として発現する。宿主における糖尿病を処置するための方法も提供され、この方法は、宿主に、シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞を投与するステップを含み、a.シグナル配列は、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、b.組換え細胞は腸内細菌または共生細菌に由来し、c.標的核酸は、宿主の第1の細胞を第2の細胞に再プログラミングすることができる哺乳動物因子をコードする。一実施形態では、標的シグナル配列は、疾患予防因子の発現を刺激する、または糖尿病の原因因子の発現を阻害する。別の実施形態では、糖尿病は、1型糖尿病、2型糖尿病またはメタボリックシンドロームである。別の実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節する。別の実施形態では、環境刺激はグルコースである。別の実施形態では、疾患予防因子はインスリンを含む。別の実施形態では、標的核酸は、宿主における血中グルコースレベルの低下を促進する哺乳動物因子をコードする。別の実施形態では、標的核酸は、宿主における血中インスリンレベルの上昇を促進する哺乳動物因子をコードする。哺乳動物宿主において腸の細胞を別の細胞型に分化させるための方法であって、宿主に、シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞を投与するステップを含み、a.シグナル配列は、宿主における標的核酸のシグナル依存性発現を調節し、b.組換え細胞は腸内細菌または共生細菌に由来し、c.標的核酸は、宿主の第1の細胞を第2の細胞に再プログラミングすることができる哺乳動物因子をコードする方法。別の実施形態では、別の細胞型は、β様細胞、甲状腺細胞、肝細胞または免疫応答性細胞である。別の実施形態では、β様細胞は、グルコース応答性細胞である。別の実施形態では、組換え細胞を有効量で投与する。別の実施形態では、組換え細胞の有効量は少なくとも約104CFU/kgである。別の実施形態では、組換え細胞を、相乗効果を有する化合物と組み合わせて投与する。別の実施形態では、相乗効果を有する化合物は、DPP-4阻害剤、GLP-2、GLP-1アゴニスト、ジメチルスルホキシド、インスリン、アルファ-グルコシダーゼ阻害剤、プラムリンチド、メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド、クロルプロパミド、メトホルミン、スルホニル尿素、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、チアゾリジンジオン、その類似体、その断片、およびそれらの組合せからなる群より選択される。別の実施形態では、シグナル配列は、GLP-1、PDX-1、GIP、GLP-2、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、トレフォイルファクター、細胞および組織修復因子、トランスホーミング増殖因子β、ケラチノサイト成長因子;逆平行4αヘリックス束構造をとる構造的第1群サイトカインであるIL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、IFNα/β;構造的第2群サイトカインであるTNF-ファミリーサイトカイン、TNFα、TNFβ、CD40、CD27、FASリガンド、IL-1-ファミリーサイトカイン、線維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子p、神経成長因子;短鎖α/β分子を含む構造的第3群サイトカインである上皮成長因子ファミリーサイトカイン、C-CケモカインまたはC-X-Cケモカイン、インスリン関連サイトカイン;構造的第4群サイトカインであるヘレグリン、ニューレグリン、EGF、免疫グロブリン様ドメイン、クリングルドメイン;1つまたは複数のその断片、その類似体、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される。別の実施形態では、シグナル配列は、GIP、GLP-1、GLP-2、PDX-1、その断片、その類似体、およびそれらの組合せである。宿主において腸の細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングするための方法も提供され、この方法は、GLP-1、GIP、PDX-1、その断片、その類似体、およびそれらの組合せからなる群より選択されるシグナル配列、ならびにプロモーターを含む組換え細胞を投与するステップを含む。一実施形態では、宿主は高血糖であり、組換え細胞を高血糖宿主に投与することにより、外因性インスリンを宿主に治療的投与する必要性が低下するまたは排除される。4.図面の簡単な説明ここで、本発明を、いくつかの図全体を通して同様の参照符号が同様の要素を示す付属図を参照して説明する。いくつかの場合には、本発明の種々の態様は、本発明の理解を容易にするために誇張または拡大して示されていることがあることが理解されるべきである。5.発明の詳細な説明工学的に操作されたシグナル伝達能力を有する遺伝子操作された微生物例えば、細菌が提供される。工学的に操作された微生物またはそれに由来する組換え細胞を、疾患または障害を緩和する生体シグナル伝達biosignaling分子または生体化合物biocompoundを発現させるために使用するための方法。グルカゴン様ペプチド1GLP-1、PDX、GIFまたはグルカゴン様ペプチド2GLP-2またはそれらの断片、類似体または組合せを分泌するように工学的に操作された共生細菌株も提供される。そのような工学的に操作された細菌株を用いて高血糖症および/または真性糖尿病DMおよび他の疾患を緩和するための方法も提供される。グルカゴン様ペプチド1GLP-1、PDX、GIF、その断片、その類似体、またはそれらの組合せを分泌するように工学的に操作された共生細菌株を用いて、腸の細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングするための方法がさらに提供される。グルカゴン様ペプチド2GLP-2を分泌するように工学的に操作された共生細菌株を用いて、腸機能を増強するため、傷害、例えば、炎症性エピソード、外科手術などの後に腸の上皮表面を再生させるため、および腸の内層の治癒を促進するための方法も提供される。開示を明瞭にするために、また、限定する目的ではなく、発明の詳細な説明は下記の小節に分けられる。5.1.用語法本組成物および方法を説明する前に、記載されている特定のプロセス、組成物、または方法体系は変動し得るので、本発明は、これらに限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語法は、特定の見解または実施形態を説明するためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解される。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料がここに記載されている。本明細書で言及されている全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における全てが、本発明が先行発明の理由でそのような開示に先立つ権利が与えられないことを容認するものと解釈されるべきではない。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形a1つの、an1つの、およびtheそのは、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の参照を含むことにも留意しなければならない。したがって、例えば、組換え細胞への言及は、1つまたは複数の組換え細胞および当業者に公知のその等価物への言及などである。本明細書で使用される場合、約という用語は、使用されている数字の数値のプラスマイナス10を意味する。したがって、約50とは、45~55の範囲内を意味する。投与することとは、治療薬と同時に使用される場合、治療薬を標的組織内もしくは標的組織上に直接投与すること、または、治療薬を患者に投与し、それにより、治療薬が標的とする組織に正に影響を与えることを意味する。したがって、本明細書で使用される場合、投与することという用語は、組換え細胞と同時に使用される場合、これに限定されないが、経口投与、組換え細胞を標的組織内または標的組織上にもたらすこと;組換え細胞を患者に、例えば、静脈内注射によって全身的にもたらし、それにより、治療薬を標的組織に到達させること;組換え細胞を、それのコード配列の形態で標的組織にもたらすこと例えば、いわゆる遺伝子療法の技法によってを包含し得る。組成物を投与することは、経口的に、注射、局所投与によって、または、他の公知の技法と組み合わせた任意の方法によって実現することができる。動物または患者または宿主または被験体という用語は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、ヒトおよび非ヒト脊椎動物、例えば、野生動物、家畜動物および農場動物などを包含する。動物または患者または宿主または被験体という用語は、哺乳動物を指すことが好ましく、ヒトを指すことがより好ましい。改善するという用語は、本発明により、本発明が提供される、適用されるまたは投与される組織の外観、形態、特性および/または物理的属性のいずれかが変化することを伝えるために使用される。形態の変化は、以下のいずれかの単独または組合せによって実証することができる:腸上皮細胞のインスリン分泌細胞への変換、治療的シグナルの分泌、標的核酸の発現、または、癌、自己免疫性障害、内分泌障害もしくは心血管障害などの標的障害の症状の緩和、予防もしくは低減。阻害することという用語は、症状の発症を妨げるため、症状を軽減するため、または疾患、状態もしくは障害を排除するために本発明の組換え細胞を投与することを包含する。薬学的に許容されるとは、担体、希釈剤または賦形剤が、製剤の他の成分と適合しなければならず、かつそのレシピエントに対して有害であってはならないことを意味する。本明細書で使用される場合、治療薬という用語は、患者の望ましくない状態または疾患を処置する、それと闘う、それを緩和する、予防する、または改善するために利用される作用剤を意味する。部分的に、本発明の実施形態は、糖尿病の治療またはインスリン産生の増加、または、癌、自己免疫性障害、内分泌障害もしくは心血管障害の治療を対象とする。組成物の治療有効量または有効量は、所望の効果を実現するため、すなわち、癌、自己免疫性障害、内分泌障害、または心血管障害の症状を予防、緩和または低減するために算出された所定量である。本方法により意図される活性は、必要に応じて、医学的な治療的治療および/または予防的治療の両方を含む。治療効果および/または予防効果を得るために本発明に従って投与される組換え細胞の特定の用量は、当然、例えば、投与しようとするコードされるタンパク質、投与経路、および治療されている状態を含めた、その事例を取り巻く特定の状況によって決定される。組換え細胞は、広い投与量の範囲にわたって有効であり得る。しかし、投与される有効量は、治療される状態、投与しようとするコードされるタンパク質の選択、および選択された投与経路を含めた関連する状況を考慮して医師が決定し、したがって、上記の投与量の範囲は、本発明の範囲をいかなる形でも限定するものではないことが理解されよう。本発明の組換え細胞の治療有効量は、一般には、それを生理的に許容できる賦形剤組成物中に入れて投与すると、有効な全身濃度または組織における局部濃度が実現されるのに十分な量である。本明細書で使用される処置する、治療された、または治療しているという用語は、治療的治療および予防的措置または予防措置の両方を指し、その目的は、望ましくない生理的状態、障害もしくは疾患を予防することもしくは遅くする和らげること、または、有益なもしくは所望の臨床結果を得ることである。治療という用語は、本明細書で使用される場合、望ましくない生理的状態、障害または疾患の発症、確立および蔓延を予防することも包含する。本開示の目的に関して、有益なまたは所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、症状の軽減;状態、障害または疾患の程度の減弱;状態、障害または疾患の状態の安定化すなわち、悪化しないこと;状態、障害または疾患の発症の遅延または進行の減速;状態、障害または疾患の状態の緩和;および検出可能であろうと検出不可能であろうと寛解部分的であろうと完全であろうと、または状態、障害もしくは疾患の増強もしくは改善が挙げられる。治療とは、過剰なレベルの副作用を伴わずに臨床的に有意な応答を引き出すことを包含する。治療とは、治療を受けない場合に予測される生存と比較した生存の延長も包含する。一般的に言うと、組織という用語は、特定の機能の実行に一体化された同様に特殊化した細胞の任意の集合体を指す。5.2.GLP-1、PDX-1、GIPおよびGLP-23種のタンパク質、GLP-1グルカゴン様ペプチド1、PDX-1膵臓および十二指腸ホメオボックス遺伝子1、および胃抑制ポリペプチドGIPは、グルコースに応答してGIPおよびGLP-1、およびグルコースレベルに関係なくPDX-1、腸上皮細胞を刺激して、インスリンを合成させることができる。第4のタンパク質であるGLP-2は、消化GI管においていくつもの作用を有することが当技術分野で公知である。GLP-1グルカゴン様ペプチド-1GLP-1は、プログルカゴン遺伝子の転写産物に由来する。体内のGLP-1の主要な供給源は、GLP-1を消化管ホルモンとして分泌する腸のL細胞である。GLP-11~37は、GLP-1の細胞内前駆体であり、プログルカゴンから切断され、その後、N末端から最初の6アミノ酸が除去されて、生理活性ペプチドを形成する。主要な生物学的活性型のGLP-1は、GLP-17~37および優勢な循環活性型のGLP-17~36アミドである。GLP-1は、グルコースおよび他の栄養分に応答して、遠位小腸の腸上皮から分泌される。GLP-1は非常に短い半減期を有し、ジペプチジルペプチダーゼIVDPP-4によるその分解が血管において起こり腸粘膜が排出される。GLP-1は、膜受容体GLP-1Rに結合することによって膵臓のβ細胞におけるインスリン合成を活性化し、1型糖尿病および2型糖尿病の両方を処置するための治療薬になる可能性がある。驚いたことに、GLP-1を注射した腸上皮細胞はグルコース応答性インスリン分泌細胞になり得、その後、invitroにおいてGLP-1で刺激した上皮細胞を宿主に外科的に埋め込むことにより、宿主における真性糖尿病が逆転し得ることが見いだされた。本明細書に開示されている通り、生物学的に不活性型であるGLP-11~37により、腸の細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングすることができると考えられている。GIPGIPグルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチドとしても公知であるは、インスリン分泌を誘導し、主に十二指腸におけるグルコースの高浸透圧により刺激され得る。GIPはまた、脂肪細胞においてリポタンパク質のリパーゼ活性を刺激することにより、脂肪酸代謝に対して有意な効果を有すると考えられている。GIPは、GIP遺伝子にコードされる153アミノ酸のプロタンパク質に由来し、生物学的に活性な42アミノ酸のペプチドとして循環する。GIPは、消化管の十二指腸および空腸の粘膜において見いだされるK細胞により合成される。全ての内分泌ホルモンと同様に、GIPは血液により輸送される。胃抑制ポリペプチド受容体は膵臓のベータ細胞上に見いだされる7-膜貫通タンパク質である。PDX-1さらに、転写活性化因子PDX-1は、β細胞および腸上皮の両方におけるインスリン分泌を刺激する。サプリメントの腸細菌がプロバイオティクスとして広範に利用可能であり、一般に、食品医薬品局FoodandDrugAdministrationにより安全であるとみなされている。invivoにおける組換え遺伝子発現のために共生株を用いることの潜在的利点としては、それらが宿主特に宿主の免疫系と適合すること、それらが腸において制御可能に持続すること、および、それらを経口的に投薬することができることが挙げられる。動物モデルにおける共生細菌による種々の組換えサイトカインおよび組換え抗原の発現が報告されている。幹細胞をβ細胞またはインスリン分泌の潜在力を有する細胞に再プログラミングすることは、ここ10年にわたり、いくつかの試験の対象になってきた。移植するための幹細胞をinvitroで生成すること、ならびに膵臓特異的幹細胞または他の組織特異的幹細胞のいずれかを、invivoでβ細胞に変換させることに焦点があてられてきた。理論に束縛されることを望むものではないが、不活性型のグルカゴン様ペプチド1GLP-11~37は、発達中の腸の幹細胞および成人の腸の幹細胞を刺激して、Notchシグナル伝達経路を通じてグルコース応答性インスリン分泌細胞にさせることができると考えられている。GLP-1と一緒にinvitroでインキュベートし、成体糖尿病ラットに外科的に埋め込んだ発達初期の空腸E14.5は、STZ誘導性1型真性糖尿病T1DMを逆転させることができたが、成体腸細胞の分化腸陰窩から起こるでは有意な数のインスリン産生細胞が生じず、β様機能性を有する細胞に有意に分化するためには発達中の胎児E17前の増殖細胞および多列細胞が必要であると思われる。GLP-2全長のグルカゴン様ペプチド-2GLP-2は、小腸および大腸の腸内の分泌細胞からGLP-1と一緒に分泌される33アミノ酸のペプチドである。GLP-1と同様に、活性型GLP-21~33はプロテアーゼDPPIVにより切断されて不活性型GLP-23~33になる。GLP-2は、小腸および大腸の粘膜の成長の刺激、腸細胞の抑制および陰窩細胞のアポトーシス、腸細胞のグルコース輸送およびGLUT-2発現の刺激、栄養吸収の増加、胃内容排出および胃酸分泌の阻害、腸透過性の低下、腸の血流の刺激、ならびに腸管平滑筋の弛緩を含めた、消化GI管におけるいくつもの作用を有することが当技術分野で公知であるwwwglucagoncom、2011/10/3訪問。GLP-2は、ラット星状膠細胞培養物における細胞増殖の刺激を含めた、GI管の外側での作用も有するグルカゴン様ペプチド-2は培養されたラット星状膠細胞の増殖を刺激する。EurJBiochem2003年7月;270巻14号:3001~9頁;wwwglucagoncomに挙げられている、2011/10/3訪問。げっ歯類またはヒトにおいて、血漿グルコースはGLP-2投与した後に変化しないが、薬理学的レベルのGLP-2正常よりも約10倍高いは、正常なヒト宿主における絶食および食後の状態におけるグルカゴンの循環レベルの上昇を伴うヒトにおいて、グルカゴン様ペプチド2はグルカゴンの分泌を刺激し、脂質の吸収を増強し、胃酸分泌を阻害する;Gastroenterology2006年1月;130巻1号:44~54頁;wwwglucagoncomに挙げられている、2011/10/3訪問。理論に束縛されることを望むものではないが、GLP-2は腸における腸細胞の細胞増殖を刺激すると考えられている。5.3.組換え細胞本明細書に記載の実施形態は、概して、内分泌障害、心血管障害または自己免疫障害を直接または間接的に処置するための、単離された、工学的に操作された組換え細胞の使用に関する。複数の実施形態が、シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞を対象とし得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、組換え細胞によって発現させることができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、組換え細胞の細胞質からの治療的タンパク質の分泌を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、標的核酸のシグナル依存性発現を調節することができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節することができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列およびプロモーターは、組換え細胞内のプラスミドにコードされている。いくつかの実施形態では、シグナル配列およびプロモーターは、組換え細胞の核酸にコードされている。さらなる実施形態では、シグナル配列は、標的核酸の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、GIP、GLP-1、PDX-1、その断片、その類似体、またはそれらの組合せであってよい。いくつかの実施形態では、標的シグナル配列は、疾患予防因子の発現を刺激すること、または疾患の原因因子の発現を阻害することができ得る。複数の実施形態では、環境刺激はグルコースであり得る。いくつかの実施形態では、疾患予防因子はインスリンを含み得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞を投与することにより、健康な被験体における血中インスリンレベルの上昇は引き起こされない。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、グルカゴン様ペプチド-1GLP-1またはその断片もしくは類似体を含んでよい。いくつかの実施形態では、GLP-1は、GLP-11~37、GLP-17~37、GLP-17~36アミドまたはそれらの組合せを含んでよい。GLP-1の類似体は当技術分野で公知であり、下に記載されている。上に開示されている通り、GLP-1は、プログルカゴン遺伝子の転写産物に由来する。体内のGLP-1の主要な供給源は、GLP-1を消化管ホルモンとして分泌する腸のL細胞である。生物学的活性型のGLP-1は、GLP-1-6~37、GLP-1-7~37およびGLP-1-7~36NH2である。これらのペプチドは、プログルカゴン分子の選択的な切断から生じる。ある特定の実施形態では、長さが4~7アミノ酸、7~10アミノ酸、10~13アミノ酸、13~16アミノ酸、16~19アミノ酸、19~22アミノ酸、22~25アミノ酸、25~28アミノ酸、28~31アミノ酸、31~34アミノ酸または34~37アミノ酸のGLP-1の断片も使用することができる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、グルカゴン様ペプチド-2GLP-2またはその断片もしくは類似体を含んでよい。いくつかの実施形態では、GLP-2は、GLP-21~33、GLP-23~33、または、疾患予防因子の発現を刺激すること、もしくは疾患の原因因子の発現を阻害することができる任意の他の断片もしくは類似体を含み得る。GLP-2の類似体は当技術分野で公知であり、下に記載されている。循環中では、GLP-2は、2つの分子形態、GLP-21~33およびGLP-23~33で存在する。GLP-1と同様に、活性型GLP-21~33はプロテアーゼDPPIVにより切断されて不活性型GLP-23~33になる。GLP-2は、胃腸機能消化、吸収、運動性、上皮の成長、および血流および骨吸収の調節において重要な役割を果たすことが示されている。したがって、GLP-2またはその類似体は、クローン病および骨粗鬆症などの疾患を処置するための治療的潜在性を有し得る。ある特定の実施形態では、長さが4~7アミノ酸、7~10アミノ酸、10~13アミノ酸、13~16アミノ酸、16~19アミノ酸、19~22アミノ酸、22~25アミノ酸、25~28アミノ酸、28~31アミノ酸、または31~33アミノ酸であるGLP-2の断片も使用することができる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、任意の形質転換可能な細菌細胞であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、腸内細菌または共生細菌に由来し得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、プロバイオティクス細菌に由来し得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、これらに限定されないが、エシェリキア属、シュードモナス属、バクテロイデス属、乳酸桿菌属、ラクトコッカス属Lactococcus、バチルス属、プロテウス属、ビフィドバクテリウム属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、およびコリネバクテリウム属を含めた、種々のグラム陽性ファミリーおよびグラム陰性ファミリーから選択される細菌であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、Escherichiacoliの株であってよい。特定の実施形態では、組換え細胞は、E.coliNissleまたは乳酸桿菌属であってよい。いくつかの実施形態では、標的核酸は、宿主における生理的プロセスの正常な機能を促進する、または宿主における非感染性の疾患の発症、確立、もしくは蔓延の予防において有効である哺乳動物因子をコードしてよい。いくつかの実施形態では、宿主における非感染性の疾患は、自己免疫疾患、内分泌疾患、癌、心臓血管疾患またはそれらの組合せを含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、糖尿病を含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、1型糖尿病を含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、2型糖尿病を含んでよい。生理活性化合物を腸上部の管腔絨毛側に送達するための方法が提供される。この方法は、腸に定植し、生理活性化合物を分泌する共生細菌をもたらすことを含んでよい。この手法により、外科手術の潜在的な落とし穴または血流内での分解が回避される。この方法により、シグナルを連続的にまたは局部刺激に応答して発現させ、その後、血液ではなく腸粘膜を通じて輸送することが可能になる。複数の実施形態は、シグナル配列およびプロモーターを含む組換え細胞を対象とし得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、組換え細胞によって発現させることができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、組換え細胞の細胞質からの治療的タンパク質の分泌を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、標的核酸のシグナル依存性発現を調節することができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸のシグナル依存性発現を調節することができ得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列およびプロモーターは、組換え細胞内のプラスミドにコードされている。いくつかの実施形態では、シグナル配列およびプロモーターは、組換え細胞の核酸にコードされている。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、任意の形質転換可能な細菌細胞であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、腸内細菌または共生細菌であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、プロバイオティクス細菌であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、エシェリキア属、シュードモナス属、バクテロイデス属、乳酸桿菌属、ラクトコッカス属Lactococcus、バチルス属、プロテウス属、ビフィドバクテリウム属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、およびコリネバクテリウム属からなる群より選択される細菌であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、Escherichiacoliの株であってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、E.coliNissleであってよい。いくつかの実施形態では、標的核酸は、宿主における生理的プロセスの正常な機能を促進する、または宿主における非感染性の疾患の発症、確立、もしくは蔓延の予防において有効である哺乳動物因子をコードしてよい。いくつかの実施形態では、宿主における非感染性の疾患は、癌、または自己免疫疾患、内分泌疾患、心臓血管疾患またはそれらの組合せを含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、糖尿病を含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、1型糖尿病を含んでよい。いくつかの実施形態では、非感染性の疾患は、2型糖尿病を含んでよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、プロモーターおよびシグナル配列を含む。当技術分野で公知の任意の適切なプロモーターを使用することができる。プロモーターは、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターであってよい。特定の実施形態では、プロモーターは、グルコース応答性プロモーターである。一実施形態では、シグナル配列は、GLP-1またはその断片もしくは類似体を含んでよい。いくつかの実施形態では、GLP-1の類似体は、タスポグルチド、エクセナチド、エキセンディン-4、リラグルチド、アルビグルチド、Val8GLP-1、NN9924、CJC-1131、AVE010、LY548806、米国特許第5,545,618号に記載の類似体などからなる群より選択することができる。他の実施形態では、シグナル配列は、グルカゴン様ペプチド-2GLP-2またはその類似体を含んでよい。GLP-2は、小腸および大腸の腸内の分泌細胞からGLP-1と一緒に分泌される33アミノ酸のペプチドである。げっ歯類またはヒトにおいて、血漿グルコースはGLP-2を投与した後に変化しないが、薬理学的レベルのGLP-2正常よりも約10倍高いは、正常なヒト被験体における絶食および食後の状態におけるグルカゴンの循環レベルの上昇を伴う。GLP-2は、小腸および結腸の増殖因子としての役割も果たし得る。シグナル配列がGLP-2である、本明細書に開示されている方法は、例えば、1型糖尿病および2型糖尿病、肥満に関連する糖尿病、化学療法誘導性下痢;炎症性腸疾患、心室細動および心房細動、術後臓器不全、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎/膀胱疼痛症候群、短腸症候群、潰瘍性大腸炎、メタボリックシンドローム、クローン病、骨粗鬆症などの疾患を処置するために用いることができる、またはあらゆる種類の腸の外科手術後の宿主を処置するために用いることができる。GLP-2の類似体は当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、GLP-2の類似体は、脊椎動物に天然に存在するGLP-2および天然に存在する形態のGLP-2の類似体からなる群より選択することができ、GLP-2の類似体は腸栄養intestinotrophic作用を引き出し、また、所与の脊椎動物GLP-2と比較して、少なくとも1つのアミノ酸の付加、欠失、置換により、またはアミノ酸複数可へのブロック基の組み込みにより構造的に変更されている。他のGLP-2の類似体は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,834,428号;同第5,994,500号に記載されている。GLP-2の種々の脊椎動物の形態としては、例えば、ウシoxGLP-2を含めたラットGLP-2およびその相同体、ブタGLP-2、デグーGLP-2、ウシbovineGLP-2、モルモットGLP-2、ハムスターGLP-2、ヒトGLP-2、ニジマスGLP-2、およびニワトリGLP-2が挙げられ、その配列は、Buhlら、JBiolChem、1988年、263巻18号:8621頁、NishiおよびSteiner、MolEndocrinol、1990年、4巻:1192~8頁、ならびにIrwinおよびWong、MolEndocrinol、1995、9巻3号:267~77頁を含め、多くの著者により報告されている。脊椎動物GLP-2の類似体は、全て本明細書において提供される手引きに従って、ペプチド化学の標準の技法を用いて生成することができ、腸栄養活性について評価することができる。本発明の特に好ましい類似体は、以下のヒトGLP-2の配列に基づくものである:ここで、1つまたは複数のアミノ酸残基は、類似体が依然として脊椎動物における小腸の成長、膵島の成長、および/または陰窩/絨毛の高さの増大などの腸栄養活性を維持する限りは別のアミノ酸残基で保存的に置換される。任意の天然に存在するGLP-2、好ましくはヒトGLP-2配列における保存的置換は、以下の5群のいずれかの範囲内の交換と定義される:IAla、Ser、Thr、Pro、GlyIIAsn、Asp、Glu、GlnIIIHis、Arg、LysIVMet、Leu、Ile、Val、CysVPhe、Tyr、Trp。任意の脊椎動物GLP-2配列におけるアミノ酸の非保存的置換は、非保存的置換が異なる種から単離されたGLP-2において変動することが公知であるアミノ酸位で起こるのであれば包含される。非保存的な残基の位置は、公知の脊椎動物GLP-2配列の全てをアラインメントすることによって容易に決定される例えば、Buhlら、JBiolChem、1988年、263巻18号:8621頁、NishiおよびSteiner、MolEndocrinol、1990年、4巻:1192~8頁を参照されたい。哺乳動物において変動するアミノ酸位および非保存的な残基で置換することができるアミノ酸位は、いくつかの実施形態では、13位、16位、19位、20位、27位、および28位であり得る。脊椎動物において変動する追加的なアミノ酸残基および非保存的な残基で置換することもできる追加的なアミノ酸残基は、2位、5位、7位、8位、9位、10位、12位、17位、21位、22位、23位、24位、26位、29位、30位、31位、32位、および33位に現れる。あるいは、非保存的置換は、アラニンスキャニング突然変異誘発により、アミノ酸残基をアラニンで置換することにより全ての腸栄養活性が破壊されないという点で突然変異に対するいくらかの耐容能が示される任意の位置でなされてよい。アラニンスキャニング突然変異誘発の技法は、CunninghamおよびWells、Science、1989年、244巻:1081頁に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。大多数のGLP-2配列がおよそ33アミノ酸のみからなるまた、ヒトGLP-2ではアラニンがすでに4位に現れるので、当業者は、残りの位置のそれぞれにおけるアラニン類似体を腸栄養性作用について下記の実施例に教示されている通り容易に試験することができる。脊椎動物GLP-2の公知の配列をアラインメントすることにより、これらのGLP-2種の中の有意な配列相同性ならびに種間で変動することが公知である残基を考慮に入れた一般式が構築された。この式を使用して、置換、付加、欠失、またはアミノ酸ブロック基を加えることによる修飾のための特定の好ましい非保存的な残基の選択を手引きすることができる。したがって、本発明に包含される特定の脊椎動物GLP-2の類似体は、その態様のうちの1つによると、以下に配列番号2として示される一般式に合致する脊椎動物GLP-2の類似体およびGLP-2の類似体である。ここで、aaとは、任意のアミノ酸残基を指し、aa1~aa6は、異なる種から得たGLP-2配列の間で変動することが公知である残基の位置であり、Xは、群IIIから選択される1つまたは2つのアミノ酸、例えば、Arg、LysまたはArg-Argなどであり、Yは、群IIIから選択される1つまたは2つのアミノ酸、例えば、Arg、LysまたはArg-Argなどであり、mは、0または1であり、nは、0または1であり、R1は、HまたはN末端ブロック基であり、R2は、OHまたはC末端ブロック基である。本発明の実施形態のいくつかでは、aa1~aa6は下で定義される通りである:aa1は、群IVから選択され、aa2は、群IまたはIIから選択され、aa3は、群Iから選択され、aa4は、群IIIから選択され、aa5は、群IVから選択され、aa6は、群IIまたはIIIから選択される。本発明の特に好ましい実施形態では、aa1~aa6は、以下の通り、異なる種から単離されたGLP-2のその位置に現れることが公知である残基の群から選択される:aa1はIleまたはValであり、aa2はAsnまたはSerであり、aa3はAlaまたはThrであり、aa4はLysまたはArgであり、aa5はIleまたはLeuであり、aa6はGlnまたはHisである。ヒトGLP-2とラットGLP-2は、19位のアミノ酸残基のみが互いと異なる。ヒト配列では、この残基はアラニンであり、ラットGLP-2では、19位はトレオニンである。したがって、本発明に包含される特定のGLP-2またはGLP-2の類似体は、19位に可変性の残基を含有する。本発明のこれらの実施形態では、GLP-2ペプチドは以下に示される配列番号3に合致する:ここで、aa3、Y、m、X、n、R1およびR2は上で定義された通りである。他の実施形態では、シグナル配列は、これらに限定されないが、GLP-1、PDX-1、GIP、GLP-2、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、トレフォイルファクター、細胞および組織修復因子、トランスホーミング増殖因子β、ケラチノサイト成長因子;逆平行4αヘリックス束構造をとる構造的第1群サイトカイン、例えば、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRLまたはIFNα/βなど;多くの場合、細胞表面結合性であり、対称のホモ三量体を形成し、サブユニットが特定のウイルスコートタンパク質に関して説明されるβゼリーロールのコンフォメーションをとる構造的第2群サイトカイン、例えば、サイトカインのTNFファミリー、例えば、TNFα、TNFβ、CD40、CD27またはFASリガンド、サイトカインのIL-1ファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子pおよび神経成長因子など;大きな膜貫通前駆体分子として産生され、それぞれが細胞外領域に少なくとも1つのEGFドメインを含有する短鎖α/β分子を含む構造的第3群サイトカイン、例えば、サイトカインの上皮成長因子ファミリー、保存されたシステイン残基の周りに群分けされたアミノ酸配列を保有することによって特徴付けられるケモカインC-CまたはC-X-Cケモカインサブグループまたはインスリン関連サイトカイン;異なるドメイン、例えば、EGF、免疫グロブリン様およびクリングルドメインで構成されるヘレグリンまたはニューレグリンなどのモザイク構造を示す構造的第4群サイトカインを含めた、分泌されたペプチドまたはその類似体、断片もしくは部分を含んでよい。これらの分泌されたペプチドの生物学的に活性な類似体、断片および部分は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、誘導性プロモーターを含んでよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、グルコース応答性プロモーターであってよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、fliCプロモーターであってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、分泌タグをさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、分泌タグは、fliC分泌タグであってよい。いくつかの実施形態では、分泌タグは、アルファ溶血素HlyA分泌タグであってよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、細胞透過性ペプチドCPP配列をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、シグナル配列を、シグナル配列にコードされるシグナルおよび細胞透過性ペプチド配列にコードされる細胞透過性ペプチドを含む融合タンパク質として発現することができ得る。5.4.治療方法疾患または障害を処置するための方法が提供される。一実施形態では、方法は、疾患予防因子の発現を刺激するため、または疾患の原因因子の発現を阻害するために有効な条件下で細胞を宿主に投与することを含んでよい。いくつかの実施形態では、疾患は、自己免疫疾患、癌、内分泌疾患、代謝疾患、心臓血管疾患またはそれらの組合せであってよい。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、糖尿病これらに限定されないが、1型糖尿病、2型糖尿病および肥満に関連する糖尿病を含む、肥満症、メタボリックシンドローム、クローン病、フェニルケトン尿症、カエデシロップ病、ヒスチジン血症、高血糖症、糖尿病性網膜症、冠動脈心疾患、毛細管内糸球体硬化症、腎症、ニューロパチー、四肢の潰瘍もしくは壊疽、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高血圧、高タンパク血症、タンパク尿症、骨粗鬆症、貧血、高リポタンパク血症、ケトアシドーシス、高トリグリセリド血症、乳酸アシドーシス、心筋症、ウィルソン病、白質ジストロフィー、フコース蓄積症、ならびに、胃腸癌、胃癌、胆嚢癌、消化管間質腫瘍、肝臓癌、膵癌、結腸癌などの癌、化学療法誘導性下痢;炎症性腸疾患、心室細動および心房細動、術後臓器不全、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎/膀胱疼痛症候群、短腸症候群、潰瘍性大腸炎、または骨粗鬆症であってよいまたはそれを含んでよい。本明細書に開示されている方法は、あらゆる種類の腸の外科手術後の宿主を処置するためにも用いることができる。本明細書に開示されている方法に従って投与される細胞の有効量または治療有効量は、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。有効量は、望ましくない生理的状態もしくは疾患の病期、投与経路および/または当業者に公知の他の因子に左右され得る。例えば、種々の実施形態では、細胞の有効量は、少なくとも約104CFU/kg、少なくとも約105CFU/kg、少なくとも約106CFU/kg、または少なくとも約107CFU/kgであり得る。他の実施形態では、細胞の有効量は、宿主の体重1kg当たり約104~1014CFU、109~1012CFU、または1010~1011CFUである。別の実施形態では、細胞の有効量は、宿主の体重1kg当たり約1×1010CFU、2×1010CFU、3×1010CFU、4×1010CFU、5×1010CFU、6×1010CFU、7×1010CFU、8×1010CFU、9×1010CFUまたは10×1010CFUである。例えば、一実施形態では、有効量は、以下の通り算出することができる。8×1010CFU/kgの所望量がおよそ4.0×1011CFU/g市販されている通りのプロバイオティクスサプリメントで投与されると仮定し、ヒトの体重範囲を小児について25kg~成人について75kgと仮定すると、これは、5~15g/dの1日用量を意味することになる。しかし、コロニー形成効率が2桁高い場合には報告されている通り、Rao、Sら、TowardalivemicrobialmicrobicideforHIVCommensalbacteriasecretinganHIVfusioninhibitorpeptide;ProcNatlAcadSciUSA102巻、11993~11998頁2005年を参照されたい、用量は50~150mg/dになる。他の実施形態では、用量は、10~100mg/d、100~200mg/d、200~300mg/d、300~400mg/d、400~500mg/d、500~600mg/d、600~700mg/d、700~800mg/d、800~900mg/d、900~1000mg/dまたは1000~2000mg/dである。腸上皮細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングするための方法も提供される。一実施形態では、該方法は、プロモーターおよびシグナル配列を含む組換え細胞を投与するステップを含んでよい。複数の実施形態は、プロモーターおよびシグナル配列を含む組換え細胞を投与することによって糖尿病を処置する方法を対象とし得る。さらなる実施形態では、シグナル配列は、標的核酸の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、環境刺激に応答して標的核酸の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、GIP、GLP-1、GLP-2、PDX-1、その断片、その類似体、またはそれらの組合せであってよい。いくつかの実施形態では、標的シグナル配列は、疾患予防因子の発現を刺激すること、または疾患もしくは障害の原因因子の発現を阻害することができ得る。いくつかの実施形態では、環境刺激はグルコースであり得る。いくつかの実施形態では、疾患予防因子は、インスリンを含んでよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞を投与することにより、健康な宿主における血中インスリンレベルの上昇は引き起こされない。血中グルコースレベルを低下させるための方法も提供される。一実施形態では、該方法は、有効量の組換え細胞を、それを必要とする宿主に投与することを含んでよい。いくつかの実施形態では、該方法により、血中グルコースレベルが低下し、その結果、宿主は血糖正常のレベルを有する。いくつかの実施形態では、該方法により、血中グルコースレベルが、処置の30日後に、約20~約80、約30~約70、または約40~約60低下する。いくつかの実施形態では、宿主が高血糖である場合、組換え細胞を投与することにより、外因性インスリンを宿主に治療的投与する必要性が減少する、または排除される。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、宿主におけるグルコースのレベルに応答する。例えば、いくつかの実施形態では、宿主のグルコースレベルがほんのわずかに上昇している場合、組換え細胞は、グルコースレベルを、血糖正常のレベルに到達するようにだけ低下させ、グルコース欠乏を引き起こさないように働く。血中インスリンレベルを上昇させるための方法も提供される。一実施形態では、該方法は、有効量の組換え細胞を、それを必要とする宿主に投与することを含む。いくつかの実施形態では、血中インスリンレベルを上昇させる方法により、宿主が血糖正常のレベルを有するようになる。いくつかの実施形態では、該方法により、グルコースに応答して血中インスリンレベルが上昇する。いくつかの実施形態では、該方法により、処置の30日後に、血中インスリンレベルが約20~約80、約30~約70、または約40~約60上昇する。腸の細胞を再プログラミングするまたは分化させるための方法も提供される。一実施形態では、腸の細胞は、腸上皮細胞、例えば、腸内分泌細胞、パネート細胞、吸収腸細胞または杯細胞である。一実施形態では、該方法は、有効量の組換え細胞を腸の細胞に投与することまたは局在化させることを含む。そのような方法は、invitroまたはinvivoで行うことができる。該方法は、そのような再プログラミングされた、分化した、または前処理された腸の細胞を、それを必要とする宿主または患者に投与することをさらに含んでよい。該方法は、そのような再プログラミングされた、分化した、または前処理された腸の細胞を、それを必要とする宿主または患者に移植することをさらに含んでよい。腸上皮細胞を再プログラミングするための方法も提供される。そのような方法は、より伝統的なウイルスに媒介される手法を超えるいくつかの有利な点を有し得る。理論に束縛されることを望むものではないが、GLP-1を送達するために共生細菌を使用することによって、例えば、腸粘膜が排出される、脈管構造におけるGLP-1の酵素による分解が回避され得る。GLP-1は、血液に曝露されることなく管腔側面から腸陰窩に直接浸透し得る。腸陰窩では、腸の幹細胞が4種類の腸細胞に発達する。腸細胞の1種類である腸内分泌細胞は、脈管構造内にホルモンを分泌する。理論に束縛されることを望むものではないが、腸内分泌細胞は細菌によって分泌されたGLP-1の存在下でインスリン分泌性になると考えられる。そのような細菌株を開発して、基本的に体の他の部分では欠けていると思われる機能を交換しながら腸の幹細胞をいくつかの異なる種類の細胞に分化させることができる。例としては、β細胞以外の他の膵臓の機能例えばα細胞、さらには、おそらく、甲状腺機能、肝細胞機能または免疫応答性機能が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている細胞を再プログラミングする方法をinvitroで用いて、細胞を再プログラミングし、それらを増殖させることができる。そのような再プログラミングされた細胞は、その後回収し、当技術分野で公知の方法を用いて宿主に投与するまたは埋め込むことができる。5.5.診断方法および使用いくつかの実施形態では、組換え細胞を別の治療用化合物と組み合わせて投与することができる。特定の実施形態では、組換え細胞を、相乗効果を有する化合物と組み合わせて投与することができる。他の実施形態では、組換え細胞を、DPP-4阻害剤、GLP-2、GLP-1アゴニスト、ジメチルスルホキシド、インスリン、アルファ-グルコシダーゼ阻害剤、プラムリンチド、メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド、クロルプロパミド、メトホルミン、スルホニル尿素、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、チアゾリジンジオン、その断片、その類似体、またはそれらの組合せと併せて投与することができる。DPP-4阻害剤の例としては、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、デュトグリプチンdutogliptin、ジェミグリプチンgemigliptin、アログリプチン、ベルベリンなどが挙げられる。例えば、一部の態様では、上で定義された組換え細胞、および薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物、または上で定義された組換え細胞を含む有効量の医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、1つまたは複数の安定剤をさらに含んでよい。共生細菌を使用する本明細書に開示されている方法の複数の実施形態では、追加的な利点は、ウイルスに媒介される手法には欠けるものである、ほぼ100年プロバイオティクスとして使用されていることによって確立されたそれらの安全性である。さらに、共生細菌は、必要であれば通常の抗生物質を使用して容易に死滅させることができる。共生細菌を使用することの別の利点は、共生細胞にフィードバックループを装備させ、特異的な管腔シグナル例えば、グルコースまたはIL-8に応じてGLP-1分泌を正確に制御させることが可能になることである。さらに、GLP-1を使用することにより腸細胞がグルコース応答性になり、腸細胞に、健康な個体においてβ細胞によって媒介されるインスリン制御とほぼ同様にインスリン用量の制御がもたらされることが示されている。最後に、腸細胞を再プログラミングするための共生細菌の使用により、最終的に、1型糖尿病、2型糖尿病、およびメタボリックシンドロームに対する単純な経口的に投薬される有効な治療薬が導かれる。5.6.投与経路および製剤本発明の組換え細胞は、活性が残る任意の経路によって慣習的な様式で投与することができる。組換え細胞の活性が残る有効な経路は、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。組換え細胞の投与は、全身性、局所的、または経口的であってよい。例えば、投与は、これらに限定されないが、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路、経口経路、頬側経路、もしくは眼経路であってよい、または膣内へのもの、吸入にもの、デポ注射によるもの、もしくは埋め込みによるものであってよい。したがって、本明細書に開示されている組換え細胞単独で、または他の医薬品と組み合わせてのいずれかでの投与形式は、これらに限定されないが、舌下投与形式、注射可能な投与形式皮下または筋肉内に注射する、短時間作用形態、デポ剤形態、埋め込み形態、ビーズ形態、またはペレット形態を含む、または膣クリーム剤、坐剤、膣坐薬、膣リング、肛門坐薬、子宮内デバイス、ならびにパッチ剤およびクリーム剤などの経皮的な形態を使用することによる投与形式であってよい。特定の投与形式は、適応症に左右される。特定の投与経路および用量レジメンの選択は、最適な臨床応答を得るために、臨床医により、臨床医に公知の方法に従って調整または用量設定される。投与される組換え細胞の量は、治療的に有効な量である。投与される投与量は、治療されている宿主の特性、例えば、治療される特定の動物、年齢、体重、健康、もしあれば、併用治療の種類、および治療の頻度に左右され、当業者例えば、臨床医が容易に決定することができる。組換え細胞および適切な担体を含む医薬製剤は、これらに限定されないが、有効量の組換え細胞を含む、錠剤、カプセル剤、カシェ剤、ペレット剤、丸剤、散剤および顆粒剤を含む固体剤形;これらに限定されないが、溶液、散剤、流体エマルション、流体懸濁剤、半固体、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ゲル剤およびゼリー剤、ならびに泡を含む局所用剤形;ならびにこれらに限定されないが、溶液、懸濁剤、エマルション、および乾燥散剤を含む非経口用剤形であってよい。活性成分は、そのような製剤中に、薬学的に許容される希釈剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、界面活性物質、疎水性ビヒクル、水溶性ビヒクル、乳化剤、緩衝液、湿潤剤、保湿剤、可溶化剤、保存料などと一緒に含有されてよいことも当技術分野で公知である。投与するための手段および方法は当技術分野で公知であり、当業者は手引きのために種々の薬理的な参考文献を参照することができ、例えば、ModernPharmaceutics、BankerRhodes、MarcelDekkerInc1979年;およびGoodmanGilmansThePharmaceuticalBasisofTherapeutics、第6版、MacMillanPublishingCo、NewYork1980年、およびRemingtonsTheScienceandPracticeofPharmacy、第21版、LippincottWilliamsWilkins、Baltimore、MD2006年を見ることができる。組換え細胞は、注射によって、例えば、ボーラス注射または連続注入によって非経口投与するために製剤化することができる。組換え細胞は、約15分~約24時間の期間にわたって皮下に連続注入することによって投与することができる。注射用の製剤は、単位剤形で、例えば、アンプル内または複数回用量容器内に、添加した保存料とともに存在してよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液またはエマルションなどの形態をとってよく、製剤化作用剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤などを含有してよい。経口投与するために、組換え細胞は、それを当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体により、本発明の組換え細胞を、治療される患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液体、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することができる。経口使用するための医薬調製物は、固体賦形剤を添加し、場合によって生じた混合物を粉砕し、所望であれば、錠剤または糖剤のコアを得るために適切な助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を加工することによって得ることができる。適切な賦形剤としては、これらに限定されないが、これらに限定されないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールを含めた糖;セルロース調製物、例えば、これらに限定されないが、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびポリビニルピロリドンPVPなどの増量剤が挙げられる。所望であれば、崩壊剤、例えば、これらに限定されないが、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などを添加することができる。糖剤のコアに適切なコーティングをもたらすことができる。この目的のために、場合によってアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールcarbopolゲル、ポリエチレングリコール、および/もしくは二酸化チタンを含有し得る濃縮糖溶液、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を使用することができる。異なる活性組換え細胞用量の組合せを同定するため、または特徴付けるために、錠剤または糖剤のコーティングに染料または色素を添加することができる。経口使用することができる医薬調製物としては、これらに限定されないが、ゼラチンで作られた押し込み型push-fitカプセル剤、ならびに、ゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作られた軟らかい密閉されたカプセル剤が挙げられる。押し込み型カプセル剤は、ラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤、および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合によって安定剤との混和物中に活性成分を含有してよい。軟カプセル剤では、活性組換え細胞は、脂肪性油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁されていてよい。さらに、安定剤を添加することができる。経口投与するための製剤は全て、そのような投与に適した投与量であるべきである。頬側投与するために、組成物は、例えば、慣習的な様式で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとってよい。一実施形態では、製剤は制御放出製剤である。米国特許第8,007,777号Borekら、2011年8月30日には、プロバイオティクスの制御放出製剤の当技術分野で公知の例が開示されている。製剤は、親水化剤hydrophilicagent、電解剤および多糖を含有してよく、腸系に経口的に送達するための一体化した錠剤の形態であってよい。特定の実施形態では、組換え細胞を噴霧乾燥し、乾燥した細胞を当技術分野で公知の標準の方法を用いてカプセルに入れる。カプセルに入れる前に細胞を完全に乾燥させることが好ましい。他の好ましい投与経路および製剤は、当業者が、手引きのために標準の薬理学的な参考文献を見ることにより決定することができる。例えば、RemingtonsTheScienceandPracticeofPharmacy、第21版、LippincottWilliamsWilkins、Baltimore、MD2006年、45~47章には、本明細書に開示されている組換え細胞および方法と使用することができる適切な経口用固体剤形、薬剤形のコーティングならびに持続放出および標的化薬物送達システムが開示されている。吸入による投与については、本発明に従って使用するための組換え細胞は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用して、加圧されたパックまたはネブライザーからエアロゾルスプレープレゼンテーションaerosolspraypresentationの形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合では、投与単位は、計量された量を送達するための弁をもたらすことによって決定することができる。吸入器または吹き入れ器で使用するための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、組換え細胞とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有させて製剤化することができる。本発明の組換え細胞は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの慣習的な坐薬基剤を含有する坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に製剤化することもできる。上記の製剤に加えて、組換え細胞は、デポ剤として製剤化することもできる。そのような長時間作用性製剤は、埋め込みによって例えば、皮下または筋肉内に、または筋肉内注射によって投与することができる。デポ注射は、約1ヶ月~約6ヶ月またはそれより長い間隔で施すことができる。したがって、例えば、組換え細胞は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料例えば、許容できる油中エマルションとしてまたはイオン交換樹脂と一緒に、あるいはやや難溶の誘導体として、例えば、やや難溶の塩として製剤化することができる。経皮投与では、本発明の組換え細胞は、例えば、貼付剤に適用することができる、または結果的に生物体に供給される経皮的治療系によって適用することができる。組換え細胞の医薬組成物は、適切な固体担体もしくはゲル相担体または賦形剤も含んでよい。そのような担体または賦形剤の例としては、これらに限らないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー、例えばポリエチレングリコールなどが挙げられる。組換え細胞は、例えば、アジュバント、プロテアーゼ阻害剤などの他の活性成分、または他の適合する薬物もしくは組換え細胞と組み合わせることが本明細書に記載の方法の所望の効果の実現に望ましいまたは有利であると思われる場合に、そのような組合せで投与することもできる。いくつかの実施形態では、崩壊剤成分は、クロスカルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、クロスポビドン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウム、イオン交換樹脂、食物酸およびアルカリ性炭酸成分に基づく発泡系、粘土、タルク、デンプン、アルファ化デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、セルロースフロック、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ケイ酸カルシウム、金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、またはリン酸カルシウムのうちの1つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、希釈剤成分は、マンニトール、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、ソルビトール、キシリトール、粉末セルロース、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、アルファ化デンプン、リン酸カルシウム、金属炭酸塩、金属酸化物、または金属アルミノケイ酸塩のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、任意選択の潤滑剤成分が存在する場合、それは、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、フマル酸ステアリルナトリウム、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ベヘン酸グリセリル、鉱油、植物油、パラフィン、ロイシン、シリカ、ケイ酸、タルク、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリエトキシル化ステロール、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリエトキシル化植物油、または塩化ナトリウムのうちの1つまたは複数を含む。以下の実施例は、限定する目的ではなく、例示する目的で提供される。6.実施例6.1.実施例1EscherichiacoliNissleにおけるGLP-1の構成的発現この実施例により、EscherichiacoliNissleにおけるGLP-1の構成的発現が実証される。プラスミド構築:クローニングは全て、以前に記載された技法を用いて実施したSambrookJRussellDW、Molecularcloningalaboratorymanual第3版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NY;2001年。図1は、この試験において使用したプラスミドの概略図を提供する。E.coliDH5α由来のP0/P1プロモーターを試験するために、2種のプラスミドを作製したpFD1およびpFD2。pFD1は高感度緑色蛍光タンパク質EGFPの発現を駆動するためのP0/P1領域全体をコードした。pFD2は、EGFPの上流のプロモーターのP0領域のみをコードした。Caco-2細胞におけるインスリン分泌を刺激するための、組換え細菌からのインスリン分泌性タンパク質の分泌の有効性を試験するために、プラスミドpFD-PDX、pFD-GLP.およびpFD-20を本明細書に記載の通り構築した。図2は、グルコースに対するP0応答およびP0/P1応答を示す。EGFPの発現を用いて、P0プロモーターおよび/またはP1プロモーターの、異なる培地条件に対する応答を測定した。P0=P0のみ;P0P1=P0プラスP1フランキング領域;DH5α=lacオペロン対照。グルコースに応答して組換えタンパク質を産生させるためのグルコース応答性プロモーター系の有効性を試験するために、2つの長さのE.coliDH5α由来のグルコース応答性プロモーター領域をpGlow-GFPの上流に、GFPとインフレームにTAクローニングした図2に結果が示されている。2種の構築物は、GFP開始のインフレームかつ上流で、P0プロモーター、またはP0プロモーターとP1プロモーターの両方にわたる領域からなったRyuSGargesS、PromoterSwitchintheEscherichiacoliPtsOperonJournalofBiologicalChemistry269巻、4767~4772頁1994年。簡単に述べると、P0領域をE.coliDH5αのゲノムDNAからpGLOW-GFPInvitrogen、Carlsbad、CAにクローニングしてpFD2を作製した。P0/P1領域をpGLOW-GFPにクローニングしてpFD1を作製した。哺乳動物PDX-I遺伝子をNissleにおいて発現させるために。プラスミドpFD-PDXを以下の通り構築した。2ラウンドの高忠実度PCRStratagene、LaJolla、CAを用いて発現カセット6×HiS-Xpress-EK-PDX-1-CPPを得た。高忠実度PCRによってDH5αから全長FLICを得た。これらの2つの断片を、pBluescript-KSにクローニングして6×HiS-Xpress-EK-PDX-1-CPP-FLICを創出した。次に、6×HiS-Xpress-EK-PDX-1-CPP-FLIC断片をpGLOW-P0-GFPにクローニングして、E.coliのP0プロモーターを用いて6×HiS-Xpress-EK-PDX-1-CPP-FLICの発現を駆動するベクターpFD-PDXを創出した。タンパク質GLP-IをEscherichiacoliNissleにおいて構成的に発現させるために、プラスミドpFD-GLPを以下の通り構築した。配列6×HiS-Xpress-EK-GLP-11~37を合成により作製したIDT、Coralville、IA。この断片を高忠実度PCRによってpBluescript-KSに挿入してpBluescript-GLPを作製した。高忠実度PCRを用いて、pKS104由来の5’UTR-FLIC20配列をpBluescript-GLPにクローニングしてpBluescipt-20-GLPを作製した。得られたベクターは、配列:5’UTR-FLIC20-6×HiS-Xpress-EK-GLP-11~37を含有した。この配列をpKS121FLICの3’UTRを含有するにクローニングして、高忠実度PCRにより構築物:5’UTR-FLIC20-6×HiS-Xprcss-EK-GLP-11~37-3’UTRを得た。pFD-20を得るために、高忠実度PCRを用いて、pFD-GLPから5’UTR-FLIC20-6×HiS-Xpress-EK配列をクローニングした。PCR断片をpKS121にクローニングして、構築物:5’UTR-FLIC20-6×HiS-Xpress-EKを得た。pKS104およびpKS121は、UniversityofHelsinki、Finland、LaboratoryofBenitaWesterlund-Wikstroemから得た。しかし、pKS104およびpKS121の配列は、商業的な供給源から得ること、または従来の方法を用いてゲノムから直接誘導し例えば、GenBank、httpwwwncbinlmnihgovgenbankからダウンロードされた配列、当技術分野で公知の標準の方法を用いて構築することもできる。6.2.実施例2:E.coliNissleを、GLP-1またはPDX-1-CPPを分泌するように工学的操作することEscherichiacoliNissle1917市販のプロバイオティクス株、以下Nissleと称されるを、fliCプロモーターの制御下でGLP-1アミノ酸1~37またはグルコース応答性エレメントの制御下でPDX-1-CPPを分泌するように工学的に操作した。PDX-1は、分泌後の上皮への急速な進入を容易にするために、細胞透過性ペプチドCPPとの融合物として分泌させた。PDX-1は、漏出性発現がほとんど観察されないグルコース応答性プロモーターエレメントの制御下で分泌させた。細胞を6~8時間成長させ、600nmにおける光学濃度1に対して正規化し、遠心分離した。Nissleの上清中およびNissleの細胞ペレット中の分泌タンパク質GLP-1上のブロットおよびPDX-1-CPP下のブロットについてのウエスタンブロットが図3に示されている。図3に関して、ペレットを溶解させ、各タンパク質の量を決定した画分C。上清を保存し、同様に分析した画分M。PDX-1-CPPを発現している細胞について、グルコース0.4またはグリセロール0.4を含有する培地で成長させた細胞間で比較を行った。空のプラスミドを発現している細胞20を陰性対照として使用した。これらのデータから、どちらのタンパク質も分泌されたことが明らかであった。6.3.実施例3:GLP-1またはPDX-1-CPPを分泌するように工学的に操作されたE.coliNissleによるインスリン分泌の誘導この実施例により、GLP-1またはPDX-1-CPPを分泌するように工学的に操作されたE.coliNissleによるインスリン分泌の誘導が実証される。工学的に操作されたNissle株がヒト上皮細胞におけるインスリン分泌を誘導することができるかどうかを試験するために、Caco-2細胞を、PDX-1-CPP、GLP-1、または陰性対照として20アミノ酸配列タグを発現しているNissle株の一晩培養物由来の無細胞培地CFMで培養した。一晩培養物を、グルコースを伴わないF-12K培地Mediatech、Manassas、VAPDX-1を産生するためにグルコースを必要とするPDX-1株は例外で成長させた。Caco-2細胞を、グルコースを伴わない新鮮なF-12K培地と、PDX-1-CPPP、GLP-1G、20アミノ酸配列タグ20、またはPDX-1-CPPCFMとGLP-1CFMの1:1の組合せGPを分泌しているNissleの一晩培養物由来のCFMの1:1混合物中で16時間培養した後、培地を除去し、Caco-2細胞をグルコース0.4またはグリセロール0.4のいずれかを伴う培地で2時間培養した。グルコースチャレンジ後、各試料を、インスリン分泌および転写について分析した。陽性対照として、Caco-2細胞を新鮮なF-12K培地グルコースを伴わないでインキュベートし、同じく16時間GLP-1アミノ酸1~37を獲得した後、グルコース0.4またはグリセロール0.4と一緒に2時間培養した。転写および酵素結合免疫吸着検定法の両方のデータにより、ヒト上皮を、一緒または別々のGLP-1およびPDX-1-CPP由来のCFMと一緒にインキュベートすると、インスリンを産生するように刺激されたことが示された図4A~B。GLP-1アミノ酸1~37CFMとのインキュベーションについて最大量のインスリン産生が一貫して見られた。PDX-1-CPPCFMにより、単独で添加しようとGLP-1と一緒に添加しようと、グルコース応答性インスリン分泌が刺激された。GLP-1-媒介性インスリン分泌とPDX-1媒介性インスリン分泌の両方がグルコースに応答して起こった。20アミノ酸配列タグ一晩培養物由来のCFMで培養した陰性対照の上皮ではグルコース応答性インスリン産生は示されなかった図4A~B。PDX-1-CPP処置によりCaco-2細胞におけるグルコース応答性インスリン分泌がもたらされたこと図4A~Bは予想外であった。血液中のインスリンレベルは、106CFUmL~109CFUmLにわたるNissle生存レベルに対して、それぞれ164fmol/リットル~164pmol/リットルであることが推定された。成人の非糖尿病患者について食後の血清インスリン濃度が400pmolリットルまでの高さになり得るとすれば、最適化されていない工学的に操作された細菌は、インスリン放出を少なくとも正常な代謝に必要であるのと同じ桁の範囲内で刺激することができ得る。6.4.実施例4:腸の細胞のグルコース応答性インスリン分泌細胞への再プログラミングこの実施例により、腸の細胞のグルコース応答性インスリン分泌細胞への再プログラミングが実証される。Nissleを、上記の通り、fliCプロモーターおよび分泌タグを使用して、GLP-11~37を分泌するように工学的に操作した。Nissleに挿入したカセットが図5に示されている。この株の培養物におけるGLP-1の分泌を検証し、pKD3染色体挿入カセットを伴わず同じ配列を含有するプラスミド担持株からの分泌と比較した図5。Nissle-GLP-1についての分泌量はプラスミド担持株の分泌量のおよそ半分であり、invivoで試験することにより、いずれの株で処置したマウスの間でもグルコースレベルには有意差がないことが明らかになった図6。したがって、これらの調査の全体を通して、プラスミドにGLP-1を担持する株の代わりにNissle-GLP-1を使用した。Nissle-GLP-1を摂食させたマウスではinvivoで組換えタンパク質の有意な発現が実証されたヒスチジンタグ染色によって決定された通り図5。GLP-1を分泌するように工学的に操作されたヒト共生細菌株を単純に経口投薬することにより、1型糖尿病のマウスモデルにおける高血糖症が、腸の細胞がグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングされることによって緩和されるかどうかを調査するために、ストレプトゾトシンストレプトゾシン、Zanosar登録商標STZ処置したマウスに、GLP-11~37を分泌するように工学的に操作された共生細菌Nissle-GLP-1を毎日摂食させた。耐糖能検査において、Nissle-GLP-1により、マウスの血中グルコースレベルが有意に低下し、インスリンレベルが有意に増加した。Nissle-GLP-1を摂食させた健康な非糖尿病マウスでは血中グルコースレベルまたは体重に変化はなかった。Nissle-GLP-1で処置したマウスでは腸上部の絨毛内でインスリン分泌細胞が発生した。クロモグラニンAChr-Aを用いたインスリン分泌細胞の共免疫染色により、腸内分泌細胞のβ様細胞への細菌媒介性再プログラミングが示唆されている。これらの結果により、GLP-1を分泌するように工学的に操作されたヒト共生細菌株を投与することを含む、1型糖尿病を治療または緩和するための方法を、非常に低い費用で経口的に実行することができることが実証される。6.5.実施例5:GLP-1を発現しているE.coliNissle1917細菌を用いたストレプトゾトシンSTZ誘導性糖尿病マウスの治療この実施例では、ストレプトゾトシンSTZ誘導性糖尿病マウスを、GLP-1を発現しているE.coliNissle1917細菌を用いて処置するための典型的な方法を記載している。6~8週齢の雄のストレプトゾトシンSTZ誘導性糖尿病マウスC57B6に、細胞透過性ペプチドを有するGLP-1を発現しているE.coliNissle1917細菌STZGLP、またはランダムな20アミノ酸配列を発現しているE.coliNissle1917細菌STZベクターのいずれかを摂食させた。対照マウスは、STZで処置しなかった。図7に関して、Nissle前の測定値は、STZ処置により血中グルコースレベルが有意に上昇した後、STZ処置したマウスにNissle細菌を摂食させる前に取得した。全ての細菌の摂食を30日後に停止した。細菌の摂食を開始した60日後に血中グルコースを再度測定した60日。値は、4匹のマウスの平均を示す。エラーバーは1標準偏差を示す。p値はスチューデントのt検定によるn=4。結果は、GLP-1分泌細菌を摂食させた糖尿病マウスは処置の30日後に血糖正常のレベルに戻ったことを示す。驚いたことに、これらのマウスでは、さらに30日間、いかなる処置もせずに血中グルコースの正常なレベルが維持された。これらのマウスの解剖および免疫組織学的検査により、それらの腸組織におけるインスリンのレベルが、ランダムなペプチド配列を分泌する共生細菌のみを摂食させた対照と比較して高かったことが示された図8A~B。図8Aに関して、高濃度のインスリンは矢印で示されている。6.6.実施例6:1型糖尿病マウスの、GLP-1を発現しているE.coliNissle1917細菌を用いた治療この実施例では、1型糖尿病マウスを、GLP-1を発現しているE.coliNissle1917細菌を用いて処置するための典型的な方法を記載している。Nissle-GLP-1の1型真性糖尿病T1DMに対する効果を決定するために、T1DMのSTZマウスモデルを作製した。雄のC57BL/6JB6マウスを、高用量のSTZで処置し、高血糖症が発症したらランダムなグルコースレベル>350mg/dL、マウスにNissle-GLP-1もしくはNissleのいずれかを摂食させた、または処置しなかった。共生細菌の摂食は、1日2回、およそ8時間の間隔を空けて行った。血糖正常の対照として、マウスの1つの群にはSTZ処置もせず、共生細菌も摂食させなかった対照。マウスのランダムなグルコースレベル図9Bおよび体重図9Cを80日にわたってモニターした。β細胞質量を測定した図9A。Nissle単独の摂食は、STZ処置し、共生細菌を与えなかったマウスと比較してランダムな血中グルコースレベルに対する有意な効果を有さなかった図9B。しかし、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスは、摂食を始めてから16日以内に、有意に低いランダムな血中グルコースレベルを示した。80日の期間にわたって、試験に含まれたマウスのいずれにおいても体重に有意差はなく、マウスのいずれにおいても有意な体重増加はなかった。共生細菌処置した89日後に、マウスを耐糖能検査に供した。マウスを10時間絶食させた後、グルコースをi.p.注射した。グルコース注射した後、30分ごとに1.5時間にわたって血中のインスリンレベルおよびグルコースレベルを測定したそれぞれ図9Dおよび9E。0.5時間および1.5時間の時点で、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスとSTZのみのマウスの間でインスリンレベルの有意差が見られた。いずれの時点でも、NissleGLP-1を摂食させたマウスと処置しなかった対照マウスの間でインスリンレベルに有意差はなかった図9D。実験全体を通して、マウスの4つの群全ての間で血中グルコースレベルに有意差があった。Nissle-GLP-1を摂食させたマウスは、耐糖能検査全体を通してSTZのみのマウスの50未満の血中グルコースレベルを示したが、STZを与えなかった対照マウスの2倍の高さの血中グルコースレベルを有した図9E。興味深いことに、グルコースを注射する前時間=0には、Nissle処置したマウスの血中グルコースはSTZ処置したマウスと有意差がなかったが、グルコース注射した1時間後には、Nissle処置したマウスは、STZ処置したマウスよりもほぼ33低い血中グルコースレベルを示した。マウスの腸を、インスリンの存在について免疫染色した図10A~F。インスリン含有細胞のポケットがNissle-GLP-1で処置したマウスにおいて見いだされたが、この試験に用いた他のマウスのいずれにおいても見いだされなかった。これらのポケットの相対的な発生頻度が示されている図10A~B。全体的な上皮細胞集団の百分率として、ポケットは1未満を構成すると推定される図10B。予測通り、STZはT1DM応答を引き出すことに有効であった。β細胞質量は、STZ処置したマウスについて有意に低く図9A、またSTZ処置したマウスの血中のグルコースレベルおよびインスリンレベルはT1DMと一致した図9B、D、E。STZ処置したマウス全てについてβ細胞質量が同等に低下したことにより、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスにおける膵臓のβ細胞の再生はインスリンを増加させる、または血中グルコースを低下させる機構ではないことが示された。どの種類の腸細胞パネート細胞、吸収細胞、杯細胞または腸内分泌細胞が、再プログラミングされてインスリン含有細胞になったかを決定するために、細胞を、4種の細胞型のそれぞれの代表的なタンパク質に対する抗体を用いて青色で共染色した:パネート細胞についてはNOD-2、杯細胞についてはムチン-2MUC-2、吸収細胞についてはスクロースイソマルターゼSI、および腸内分泌細胞についてはクロモグラニンAChr-A。NOD-2、MUC-2、またはSIについて重複した染色は見られなかったそれぞれ図10C、DおよびE。しかし、Chr-Aについてインスリンと重複した染色が見られた図10F。マウスの腸の免疫染色により、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスではインスリン含有細胞が示され図10A、Nissleを摂食させたマウスまたは対照マウスではインスリン含有細胞は示されなかった図10B。4種類の腸内細胞のそれぞれの代表的なタンパク質に対する抗体を用いた共染色により、これらの細胞の系列が腸内分泌細胞に関連することが示唆された図10F。この結果により、血液中へのホルモンの分泌は通常、腸内分泌細胞の機能であり、他の3つの細胞型の機能ではないと予測された。健康なマウスSTZ処置していないにもNissleおよびNissle-GLP-1を摂食させ、それらの血中グルコースレベルは、共生細菌を摂食させなかった健康なマウスの血中グルコースレベルと有意に異ならなかった図11A~B。結果は、94日の期間にわたって、処置していない健康なマウス対照といずれの処置マウスとの間にもランダムなマウスの血中グルコースレベルに有意な変化はないことを示している図11A。マウスの体重変化にも、この時間にわたって差異はなかった図11B。Nissle-GLP-1を摂食させた健康なマウス図11について血中グルコースまたは体重に変化がないことを示すデータを、Nissle-GLP-1により血中グルコースレベルが有意に低下し得ることを示すデータと並べて検討すると、全体像は、糖尿病に対する有効かつ安全な潜在的治療の1つであり、これは、グルコース応答性であり、非糖尿病系と同様のインスリンカイネティクスを伴うものである図9D。すなわち、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスにおけるインスリンレベルの変化は、健康なマウスにおいて起こるインスリンレベルの変化より少ない程度ではあるが、同じタイミングで起こる。これらのデータは、糖尿病マウスにNissle-GLP-1を摂食させることにより、グルコース応答性インスリン産生が引き起こされ、血中グルコースレベルが有意に低下し得ることを示唆している。理論に束縛されることを望むものではないが、インスリン分泌の機構は、再プログラミングされた腸の細胞のポケット由来のものであると思われる。これらのポケットは、インスリンに加えてChr-Aを発現し、これは、これらのポケットが腸内分泌細胞に由来することを示唆している。Nissle-GLP-1を摂食させた健康なマウスからの結果を考慮すると、証拠により、この治療は、たとえ非糖尿病患者が受けたとしても安全であると思われることが示唆される。6.7.実施例7:染色体を改変したE.coliNissleと、プラスミドを含有するE.coliNissleにおけるGLP-1の発現この実施例では、染色体を改変したE.coliNissleと、プラスミドを含有するE.coliNissleにおけるGLP-1の発現の比較について記載している。GLP-1発現を維持するために選択圧力が必要ない細菌を工学的に操作した。株の比較において、染色体を改変したNissleから培地中に分泌されるGLP-1の相対的な濃度は、プラスミド由来のGLP-1を発現しているNissleから分泌されるGLP-1の相対的な濃度よりも低いことが見いだされた。しかし、染色体からGLP-1を発現しているNissleは、invivoにおいてプラスミド由来のGLP-1を発現しているNissleと同様に有効であった図5。細菌培養物において分泌されたGLP-1の量とinvivoにおける血中グルコースレベルが低下したことの間に相関がないことにはいくつかの理由があり得る。マウスの腸におけるNissleの生存性を測定することにより、Nissle、プラスミド由来のGLP-1を発現しているNissleまたはNissle-GLP-1を摂食させた株間に差異がないことが明らかになった図12。腸粘膜におけるGLP-1安定性は、粘膜プロテアーゼにより損なわれ、それによって有効な輸送が分泌速度よりもはるかに低下する可能性がある。マウス消化管内の理想より劣る成長条件pH、栄養分などNissleは、ヒトプロバイオティクスであるにより、いずれの株についても最適より劣る遺伝子発現が導かれる場合もあり得た。グルコース応答試験におけるインスリン分泌のカイネティクスは、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスおよび対照マウスについて同様であると思われたが図9D、血中グルコースの低下はSTZで処置したマウスの全てにおいて遅延した図9E。しかし、Nissleを摂食させたマウスは対照マウスと同一のカイネティクスを示した。この結果は予想外であり、別の機構によって説明できる可能性がある。Nissleを摂食させたマウスについて、STZのみのマウスと比較して、グルコース応答試験において血中グルコースがより急速に低下したことも予想外であった図9E。これは、Nissle単独によるある程度の保護を示す。この保護はランダムなグルコースレベルでは現れなかったが、これは、血中グルコースのスパイクの影響を弱めると思われる。グルコースをi.p.注射すると見られるように、腸のグルコースの細菌による消費は可能性のある機構として除外することができる。6.8.実施例8:血中グルコースレベルに対するNissleの摂食の効果この実施例により、マウスにおける、血中グルコースレベルに対するNissleの摂食の効果が実証される。実験の開始時に、マウスにSTZを5日間摂食させた体重1kg当たり40mgSTZ処置はSTZ停止で終了する。300mg/dLを超えるランダムな血中グルコースレベルが持続し始めた後、マウスに、ダミープラスミドを発現しているNissle単独でSTZベクター、同じプラスミド由来のGLP-11~37を発現しているNissleSTZGLPのいずれかを含めたNissle処置を開始した、またはSTZなしで処置もしなかった対照。タイムラインにおいて摂食はNissle開始で示されている。Nissleを、Nissle停止で示されている時間まで1日2回摂食させた。マウスは、基本的に、この時点で、Nissle1回で示されている時間まで放置した通常の世話外。その時点で血中グルコースを測定し、Nissleをマウスに1回摂食させた。次いで、マウスを最後の時点まで放置し、そこで血中グルコースを測定した。図13を参照されたい。平均が提示されておりn=3、エラーバーは1標準偏差を示す。非肥満糖尿病NODマウスにNissle単独で、GLP-11~37を染色体性に発現しているNissleのいずれかを1日2回摂食させた、または処置しなかった。マウスを、血中グルコースを測定する直前の4時間絶食させた。図14に関して、時間は、処置を開始した後の日数を示す。平均が提示されておりn=少なくとも3、エラーバーは1標準偏差を示す。p値はスチューデントのt検定による。図15は、組換え細胞の推定作動方法を示す。左:粘膜Mの内部および上部の内腔B内に細菌を伴う正常な腸陰窩である。腸内分泌細胞Eは固有層LPおよび脈管構造V内にホルモンを分泌する。右:本明細書の実施形態の組換え細胞EBは、GLP-1EBから出ている点を陰窩内に分泌して、初期の腸内分泌細胞をインスリン分泌細胞REに再プログラミングする。次いで、グルコースに応答してインスリンIns、星印が血流中に分泌される。理論に束縛されることを望むものではないが、組換え共生株を単純な経口投薬で、有意なバックグラウンド発現はなく、グルコース応答性を伴い使用することにより、インスリン注射の必要性を有意に低下させること、または、排除することさえでき、その使用が、宿主インスリン合成の交換により、糖尿病患者によって示される長期合併症の減少に役立ち得ると考えられている。6.9.実施例9:GLP-1試験のための元の構築物および新しい構築物の配列本明細書に開示されている方法に従って以下の構築物を使用することができる。実施例1~11において使用した元のNissle-GLP-1構築物ここで、使用することができる別のプロモーターNissle-GLP-1構築物ここで、乳酸桿菌属構築物ここで、6.10.実施例10:糖尿病マウスにおいて、共生細菌により分泌されるGLP-1により腸の細胞が再プログラミングされて、高血糖症が減少する細菌によって分泌されたGLP-1を糖尿病マウスに、腸に摂食させることより、グルコース応答性インスリン産生が引き起こされ、血中グルコースレベルが有意に低下し得る。インスリン分泌の機構は、再プログラミングされた腸の細胞によるものであると思われる。これらの細胞は、PDX-1をほとんど発現せず、ほんの一部のみがインスリンに加えてChrAを発現するという点で大多数の膵臓のβ細胞とは別個のものである。導入グルカゴン様ペプチド1GLP-1は、マウスの腸上皮細胞のインスリン分泌細胞への変換を刺激する。本発明者らは、GLP-1を分泌するように工学的に操作されたヒト共生細菌株を単純に経口投薬することにより、腸の細胞がグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングされることによって1型真性糖尿病T1DMのマウスモデルにおける高血糖症が緩和され得るかを調査した。糖尿病マウスに、GLP-1を分泌するように工学的に操作された共生細菌Nissle-GLP-1を毎日摂食させた。Nissle-GLP-1を摂食させたマウスは、インスリンレベルの有意な増加を示し、また耐糖能が有意に大きかった。これらのマウスでは、腸上部に、健康なマウスに見いだされる膵臓のβ細胞のおよそ82が置き換わるために十分な数のインスリン産生細胞が発生した。驚いたことに、PDX-1の発現は、再プログラミングされた細胞において、上皮周囲よりも定性的に低かった。さらに、再プログラミングされた細胞のサブセットをクロモグラニンAChrA、腸内分泌およびβ細胞に対するマーカーについて共染色した。健康な非糖尿病のNissle-GLP-1を摂食させたマウスは同様に再プログラミングされた細胞を示したが、処置した後90日間を超えてさえ、血中グルコースレベルの変化はなく、体重は増加し、それは対照マウスと区別できないものであった。これらの結果は、T1DMに対する潜在的な経口的治療を指し、腸内細胞の運命を媒介するための細菌のシグナル伝達の概念を導入する。非β細胞をβ細胞またはインスリン分泌の潜在力を有する細胞に再プログラミングすることは、ここ10年にわたり、いくつかの試験の対象になってきた。研究は、移植するためにinvitroで膵臓細胞系列腺房細胞などおよび肝臓細胞系列からβ細胞を生成すること、ならびにinvivoで膵臓特異的細胞または他の組織特異的細胞のβ細胞への変換を引き起こすことを含めたいくつもの領域に焦点を合わせている。以前は不活性であると考えられていたグルカゴン様ペプチド1の形態GLP-11~37が、ラット腸上皮細胞を刺激して、Notchシグナル伝達経路を通じてグルコース応答性インスリン分泌細胞にさせ得るという発見SuzukiA、NakauchiHTaniguchiH、Glucagonlikepeptide1convertsintestinalepithelialcellsintoinsulinproducingcellsProcNatlAcadSciUSA100巻、5034~5039頁2003年により、この後者の手法の潜在性が実証された。Suzukiは、胎生期10.5日E10.5に、母親にGLP-1を腹腔内i.p.注射した発達中のラット胚の腸上部にいくつかのインスリン産生細胞が示されることを報告した。成体ラット10週間は、GLP-1を毎日、9日間注射すると、いくつかのずっと少ないが腸インスリン産生細胞を有した。これにより、未分化の腸上皮ラットにおける分化はE15後に起こるを有するラットは、腸の細胞をβ様細胞に分化させることができることが示唆された。この試験により、発達初期の空腸E14.5を、GLP-1と一緒にinvitroでインキュベートし、成体糖尿病ラットに外科的に埋め込むことにより、STZ誘導性T1DMを逆転させることができることも実証された。著者らは、成体腸細胞分化腸陰窩から起こるでは有意な数のインスリン産生細胞が生じないこと、ならびにβ様機能性を有する細胞に有意に分化するためには発達中の胎児E17前の増殖細胞および多列細胞が必要になる可能性が高いことを結論づけた。Suzukiの研究により、腸の細胞の再プログラミングを媒介し得る生理活性化合物を、外科手術をせずに送達することの難しさが実証された。GLP-1自体の血液中の半減期はたった数分である。この短い半減期が、GLP-1が腸陰窩に到達するために循環中に長く生存しなければならない成体ラットにおいて再プログラミング速度が低いことの理由になってきた。外科手術の潜在的な落とし穴または血流内での分解を回避する、生理活性化合物を腸上部の管腔絨毛側に送達する1つの方法は、腸に定植している共生細菌からシグナルを分泌させることである。この手法により、シグナルを連続的にまたは局部刺激に応答して発現させ、その後、血液ではなく腸粘膜を通じて輸送することが可能になる。工学的に操作された共生細菌により、invitroにおいてGLP-11~37をヒトの腸の細胞に送達し、グルコース応答性インスリン分泌を刺激することができるDuanF、CurtisKLMarchJC、SecretionofinsulinotropicproteinsbycommensalbacteriarewiringtheguttotreatdiabetesApplEnvironMicrobiol74巻、7437~7438頁2008年。その研究では、E.coliNissle1917EcNを、外因性誘導因子に応答してプラスミドからGLP-11~37を分泌するように形質転換した。この調査では、EcN染色体を、GLP-11~37を構成的に分泌するように改変することによりNissle-GLP-1、T1DMのマウスモデルにおいて正常血糖が回復するかどうかを試験した。本発明者らの目的は、Nissle-GLP-1を毎日摂食させることによってマウスの腸の細胞をグルコース応答性インスリン分泌細胞に再プログラミングすることであった。本発明者らは、β細胞および腸内分泌マーカーの同時発現も測定して、再プログラミングの程度ならびに再プログラミングされた細胞の系列を決定した。EcNを、fliCプロモーター、細胞透過性ペプチドCPPおよび分泌タグを用いて、GLP-11~37を分泌するように工学的に操作した図19の上。この株の培養物におけるGLP-1の分泌を検証し、pKD3染色体挿入カセットを伴わず同じ配列を含有するプラスミド担持株からの分泌と比較した図19の下。Nissle-GLP-1についての分泌量は、プラスミド担持株の分泌量のおよそ50であった。したがって、生じた差異は有意とみなされず、本発明者らはこれらの実験においてプラスミドを維持するための選択圧力を含めることを望まなかったので、invivo試験のためにプラスミド担持株ではなくNissle-GLP-1を使用した。免疫蛍光法IFにより明らかになった通り、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスは、腸上部でGLP-1について陽性に染色されたが、ダミーペプチドを発現しているEcNを摂食させたマウスNissleでは同様の染色が示されなかった図16a、b。粘液層を守るために、腸の切片はパラホルムアルデヒドに固定するのではなく、凍結させた。画像解析により、GLP-1染色は、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスにおいて、Nissleを摂食させたマウスよりも有意に高いことが示された図16c。Nissle-GLP-1またはNissleを摂食させたマウスの腸中および糞便中の細菌の総数を測定した。Nissle-GLP-1を摂食させたマウスおよびNissleを摂食させたマウスの腸の細菌の総数および糞便の細菌の総数は同じであり図16d、これは、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスの切片について観察されたGLP-1の増加は組換えGLP-1の発現に由来し、EcN由来株が存在することによってもたらされる内在性のGLP-1産生に由来するものではない可能性が高いことを示している。糞便中ではなく大腸におけるコロニーを決定するために、下部GI管の切片を穏やかにこすり取り、洗浄して糞便を除去した。残った細菌の総数を得る。本発明者らによる小腸および糞便における細菌の総数は他で報告されているものほど高くなかったが、これは、マウスの品種が異なること、および代替の抗生物質前処理に起因する可能性がある。本発明者らは薬物誘導性T1DMマウスモデルおよび遺伝的な非肥満糖尿病NODマウスモデルにおいて、Nissle-GLP-1により、正常血糖を回復させることができるかどうかを試験したNODモデルからの結果がセクション6.11.実施例11に要約されている。薬物誘導性T1DMモデルの雄のC57BL/6JB6マウスに、ストレプトゾトシンSTZを高用量体重1kg当たり40mgまたは50mgで5日間継続的に注射した。高血糖症が発症した空腹時血糖レベル>250mg/dLマウスにNissle-GLP-1もしくはNissleのいずれかを摂食させた、または処置しなかった。共生細菌の摂食は、1日2回、およそ8時間の間隔を空けて行った。正常血糖対照として、マウスの1つの群にはSTZ処置もせず、共生細菌も摂食させなかった対照。血中グルコースレベルおよび体重を60日にわたってモニターした。膵臓の形態計測解析により、STZ処置したマウスのβ細胞質量が、対照マウスと比較して有意に減少したことが示された図17a。Nissle単独の摂食は、STZ処置し、共生細菌を与えなかったマウスと比較して、血中グルコースレベルに対する有意な効果を有さなかった図17b。しかし、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスは、摂食を始めた60日後に有意に低いp=.000017血中グルコースレベルを示した図17b。Nissle-GLP-1を摂食させたマウスについての血中グルコースレベルは、正常血糖対照と有意に異ならなかったp=.46。さらに、60日の期間中、試験に含めたマウスのいずれについても体重に有意な変化はなかった図20A~B。STZを摂食させたマウスの全てにおいてβ細胞質量が同等に減少したことにより、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスの血中グルコースレベルの低下がβ細胞再生の結果である可能性が除外された。健康な、STZ処置していないマウスにもNissleおよびNissle-GLP-1を摂食させ、それらの血中グルコースレベルは、共生細菌を摂食させなかった健康なマウスの血中グルコースレベルと有意に異ならなかった図17c。92日の期間にわたって、いずれの複数の処置と処置していない健康なマウス対照との間にもマウスの血中グルコースレベルに有意な変化はなかった図17c。同じ期間にわたってマウスの体重変化にも差異はなかった図20A~B。共生細菌で処置した60日後に、マウスの全群を耐糖能検査に供した。マウスを10時間絶食させた後、グルコース体重1kg当たり25gをi.p.注射した。グルコース注射した後、30分ごとに1.5時間にわたって血中のインスリンレベルおよびグルコースレベルを測定した図17d。Nissle-GLP-1を摂食させたマウスとSTZのみの群の間に、0.5時間および1.5時間の時点でインスリンレベルの有意差が見られたが、NissleGLP-1を摂食させたマウスと処置しなかった対照マウスの間では、いずれの時点でもインスリンレベルに有意差は検出されなかった図17d。耐糖能検査全体を通して、マウスの4つの群全てにわたって血中グルコースレベルに有意差があった。Nissle-GLP-1を摂食させたマウスは、耐糖能検査全体を通して、STZのみのマウスの50未満の血中グルコースレベルを示したが、STZを与えなかった対照マウスの2倍の高さの血中グルコースレベルを有した図17d。Nissle-GLP-1を摂食させたマウスの血中グルコースレベルは、正常血糖対照よりは高いが、耐糖能検査全体を通して275mg/dLを超えなかったSTZのみのマウスの600mg/dLと比較して。興味深いことに、血中グルコースについて、Nissle処置したマウスでは基礎レベル時間=0においてはSTZ処置したマウスとの有意差が示されなかったが、グルコース注射した1時間後には、Nissle処置したマウスは、STZ処置したマウスよりもほぼ33低い血中グルコースレベルを示した。この保護は、高レベルのグルコースを注射していないマウスでは明白ではなかったが、Nissleにより、血中グルコースのスパイクの影響がいくらかの程度緩和され得ると思われる。グルコースをi.p.注射したとすると、内腔内のグルコースの細菌による消費は可能性のある機構としては除外することができる。この知見を説明するためにはさらなる試験が必要である。処置した60日後および耐糖能検査後に、マウス小腸の切片を固定し、種々のマーカーについて免疫蛍光によりプロービングした。インスリン含有細胞のポケットが、Nissle-GLP-1で処置したマウスの小腸において見いだされたが、この試験に用いた他の群のいずれにおいても見いだされなかった図18a~d。画像解析から、インスリン産生細胞の相対的な発生頻度が小腸の細胞集団全体のおよそ0.013±0.002または上皮細胞10,000個中1個であると推定された。予測通り、試験に含めた全てのマウスで腸上部においてPDX-1産生が見られた図18a~dの赤色の染色。しかし、Nissle-GLP-1で処置したマウスのインスリン産生細胞は高レベルのPDX-1について染色されず、さらには、周囲の細胞よりも図18bおよびd、または対照マウス由来の膵ベータ細胞よりもデータは示していない、PDX-1発現が少ないとも思われた。これは興味深い転帰であるが、β細胞質量におけるPDX-1/インスリン分泌に不均一性が存在することが公知であるので、これらの細胞がβ細胞様の機能性を有するという可能性が残る。健康な非糖尿病マウスにNissleおよびNissle-GLP-1を摂食させた、より長期間の対照実験では、腸を、再プログラミングされた細胞の存在についても染色した。Nissle-GLP-1を摂食させた健康なマウスでは、インスリン染色が見られ、インスリン産生細胞におけるPDX-1の発現は同様に周囲の細胞より少なかった図18d。Nissleを摂食させた健康なマウスでは再プログラミングされた細胞は示されなかった図18c。再プログラミングされた細胞の生理機能をよりよく理解するために、マウスの腸の切片においてクロモグラニンAChrAおよびインスリンについて共染色した。ChrAは、通常、神経内分泌細胞、腸内分泌細胞によって発現され、島β細胞の分泌顆粒中にある。いくつかの場合には、インスリン染色はChrA染色赤色と重複し図18e、観察されたインスリン産生細胞のおよそ80において、ChrAは同じ細胞に局在しなかった図18f。図18eおよびfは、正常な腸内分泌細胞ChrA陽性、インスリン染色なしおよびインスリン産生インスリン染色細胞を示す。正常な腸内分泌細胞がインスリン産生細胞の極めて近傍に存在することは、腸内分泌細胞からインスリン産生細胞にいくらか変換されているにもかかわらず腸内分泌機能性が動物全体で保存されていることを示唆している。本発明者らによってインスリンとリゾチームの共局在は観察されず図18g、これにより、再プログラミングされた細胞がパネート細胞ではなかったことが示唆される。インスリンとスクラーゼイソマルターゼの同時発現SI、図18hにより、再プログラミングされた細胞がそれらの吸収力を維持することが示される。Nissle-GLP-1を摂食させた健康なマウスについて血中グルコース図17cまたは体重図20A~Bに変化がないことを示すデータと、2種のT1DMのげっ歯類モデルにおいてNissle-GLP-1により血中グルコースレベルが有意に低下し得ることを示すデータ図17bおよび21を並べると、この手法が糖尿病に対する有効かつ安全な治療であり得ることが示唆され、これは非糖尿病系と同様のインスリンカイネティクスを有し、グルコース応答性である図17d、すなわち、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスにおいて、血清インスリンレベルは低いが、インスリンレベルの変化が健康なマウスと同じタイミングで起こるものである。この試験で実現される再プログラミング効率の推定値下の再プログラミングされた細胞の数の算出および推定値において詳述されるは、再プログラミングされた細胞が、健康なマウスの膵臓におけるβ細胞の数のおよそ82の数に達することを示している。この数は、なぜマウスが日常条件下で正常化された血中グルコースレベルを示すことができたが、より厳しい耐糖能検査条件下では健康なマウスの血糖対照よりもわずかに低かったかを潜在的に説明する。ヒト患者が、本明細書で提示されたマウスに関する結果と同じ結果を実現するために毎日消費しなければならない細菌の量の推定値は、現在市場に出ている市販のプロバイオティクス製剤中に存在する細菌の量を考慮すると、1日およそ5~15gである。しかし、コロニー形成数がより高ければ、1日の摂取量は50mgまでの低さになり得る。この手法に伴う考慮すべき問題は、腸において新しく生成したβ様細胞に対する免疫応答が引き出される潜在性である。他の再生手法と同様にこれが起こる有意な潜在性が存在する。しかし、これらの細胞の生理機能ChrAをわずかに発現し、PDX-1の発現が比較的少ないは、β細胞とは別個であり、したがって、これらの細胞は免疫系から検出されない可能性がある。さらに、患者を、この試験でのマウスと同様に、GLP-1を分泌する細菌で毎日処置する場合、インスリン分泌細胞が永久的に再生することにより、おそらく、新しく形成されたβ様細胞が免疫学的に破壊されるにもかかわらず、継続した血中グルコースの低下が可能になる。46日後にさえ、NODマウス膵臓のβ細胞の免疫破壊を提示するにおける保護作用を示す本発明者らのデータを用いて、ヒト上皮細胞がおよそ2日ごとに交換されることを考えると、腸上部において再プログラミングされた細胞に対する免疫系による有意な応答はない可能性がある。しかし、そのような攻撃がある場合、粘膜の表面の永久的な炎症がもたらされ得る。この手法の免疫学的影響を決定するためには、さらなる試験が必要である。本発明者らは、本明細書において提示されているデータから、糖尿病マウスにNissle-GLP-1を摂食させることにより、グルコース応答性インスリン産生が引き起こされ、血中グルコースレベルが有意に低下し得ると結論づける。さらなる特徴付けが必要ではあるが、インスリン分泌の機構は、再プログラミングされた腸の細胞に由来すると思われる。これらの細胞は、PDX-1をほとんど発現せず、これらの細胞の一部のみがインスリンに加えてChrAを発現するという点で、大多数の膵臓のβ細胞とは別個である。マウスに、β細胞のインスリン分泌を刺激しない不活性型のGLP-1を摂食させるとし、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスが、Nissleのみを摂食させたマウスまたは細菌を摂食させなかったマウスと同じレベルの膵臓のインスリン産生を有するとすると、この手法により、残りのβ細胞からのインスリン産生が増加する見込みはない。Nissle-GLP-1を摂食させた健康なマウスからの結果を考慮すると、証拠により、この治療が、たとえ非糖尿病患者が受けたとしても安全であると思われることが示唆される。今後の研究により、インスリン産生細胞の生理機能およびこの治療の詳細な長期の薬物動態がより綿密に検査される。材料および方法プラスミド構築別段の指定のない限り、化学物質および試薬は全て、VWRInternationalWestChester、PAから購入した。クローニングは全て標準の技法を用いて行ったSambrookJRussellDW、Molecularcloningalaboratorymanual、第3版ColdSpringHarborLaboratoryPress、2001年。以前に記載されている通り、細胞透過性ペプチドCPPと融合したglp-11~37をfliCプロモーターの制御下で発現させるためのプラスミドを構築して、pFD-GLPを作製したDuanFMarchJC、InterruptingVibriocholeraeinfectionofhumanepithelialcellswithengineeredcommensalbacterialsignalingBiotechnolBioeng101巻1号:128~34頁2008年。配列6×HiS-EK-glp-11~37-CPPを合成により作製したIDT、Coralville、IA。この断片を、高忠実度PCRStrategeneによってpBluescript-KSに挿入して、pBluescript-GLPを作製した。得られたベクターは、配列:5’UTR-Flic20-6×HiS-EK-glp-11~37-CPPを含有した。この配列をpKS121fliCの3’UTRを含有するにクローニングして、高忠実度PCRにより構築物:5’UTR-Flic20-6×HiS-EK-glp-11~37-CPP-3’UTRを得た。pFDベクターを得るために、高忠実度PCRを用いて、pFD-GLP由来の5’UTR-FLIC20-6×HiS-EK配列をクローニングした。PCR断片をpKS121にクローニングして、構築物:5’UTR-Flic20-6×HiS-EK-3’UTRを得た。pKS104およびpKS121はUniversityofHelsinki、FinlandのBenitaWesterlund-Wikstroemからの好意の寄贈品であった。glp-11~37-CPPをネイティブなfliCプロモーターの制御下で染色体に挿入するために、確立された方法を用いて構築物pFD-GLPCを調製したDatsenkoKAWannerBL、OnestepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK12usingPCRproductsProcNatlAcadSciUSA97巻、6640~6645頁2000年。構築物のマップが、クローニングステップおよび使用したプライマーの詳細な説明と一緒に下に記載されている。簡単に述べると、一段階不活化を用いて、Flic20-6×HiS-EK-glp-11~37-CPP遺伝子を、Nissle染色体に、fliCプロモーター領域の下流のfliCの代わりに挿入した。本発明者らは、Nissle染色体のfliD遺伝子をノックアウトした。この技法では、3つのプラスミド、pKD3クロラムフェニコール耐性を付与する、pKD4カナマイシン耐性を付与する、およびpKD46アンピシリン耐性を付与するを使用するDatsenkoKAWannerBL、OnestepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK12usingPCRproductsProcNatlAcadSciUSA97巻、6640~6645頁2000年。染色体に挿入した後に生じた株はNissle-GLP-1と称した。ウエスタンブロットE.coliNissle1917EcNは、現在販売されているプロバイオティクスであるMutaflor商標から、以前に記載されている通り得たDuanFMarchJC、InterruptingVibriocholeraeinfectionofhumanepithelialcellswithengineeredcommensalbacterialsignalingBiotechnolBioeng101巻1号:128~34頁2008年。pFDベクターを有するEcN、pFD-GLPおよびpFD-GLPCの染色体挿入を伴うNissleを、LB中、37°C、225rpmで振とうしながら24時間成長させた。24時間後に、全ての細菌を遠心分離した。上清を濾過した0.2μm、PALLLifeSciences。無細胞培地CFMを同じOD600までLBで希釈し、プロテアーゼを阻害するために、10ng/mLのロイペプチン、0.04mMのPMSFおよび5ng/mLのアプロチニンに加えた。不純物を取り除いた上清14mLを、10トリクロロ酢酸TCA、VWRを用いて30分間、氷上で沈殿させ、ペレットを氷冷したエタノール/エーテル1:1で2回洗浄した。上清ペレットを真空下で乾燥させ、試料緩衝液2SDS、50mMのトリス、pH6.8、20グリセロール、10メルカプトエタノール、ブロモフェノールブルー50μlに溶解させ、95°Cで5分間煮沸した。細胞ペレットを14mLの培養物から、プロテアーゼ阻害剤10ng/mLのロイペプチン、200μMのPMSFおよび5ng/mLのアプロチニンを伴う500μlのBugBusterMasterMixを使用し、室温で穏やかにボルテックスすることによりBugBusterMasterMixに再懸濁させた。細胞浮遊液を、室温で、振とうプラットフォームVWR、Bristol、CT上、遅い設定で10~20分インキュベートした。5×試料緩衝液125μlを各試料に加えた後、95°Cで10分間煮沸した。GLP-1の発現量および分泌量を推定するために、ウエスタンブロットの標準の技法を用いた。簡単に述べると、試料50μlをポリアクリルアミドゲルにローディングし、Immobilon-PSQ転写膜Millipore、Billerica、MAにブロッティングした。膜を、マウス抗hisGEhealth、Piscataway、NJに対して1:1,000でプロービングした。膜を、HRP-コンジュゲートした抗マウスIgGAmershamBiosciences、Pittsburgh、PAと一緒にインキュベートし、高感度化学発光Pierce,Rockford,ILにより展開し、X線フィルムPhoenix、Candler、NCに曝露させた。マウスコロニー形成実験この試験において用いたマウスは全て、JacksonLaboratoryBarHarbor、MEから購入し、CornellUniversityVeterinarySchoolのEastCampusResearchFacilityECRFに収容した。試験は、CornellUniversityIACUCにより承認されたプロトコールに従って行った。STZモデルストレプトゾトシンSTZSigma、St.Louis、MOを、適用する直前に、氷冷した0.1Mのクエン酸ナトリウム緩衝液pH4.2中に溶解させた。6~8週齢の雄のC57BL/6JB6マウスの4つの群に、ベータ細胞アポトーシスを誘導するために、5日連続して毎日、体重1kg当たり40mgまたは50mgのSTZの腹腔内注射を受けさせた。クエン酸ナトリウム注射を受けるマウスの別の群を対照として用いた。最後に注射した3日後に、動物の血中グルコースレベルを、BayerBreeze血中グルコース試験紙BayerHealthcareLLCMishawaka、INを用いて、Breeze登録商標2血中グルコースモニタリングシステムBayerHealthcareLLCMishawaka、INによって決定した。血中グルコースレベルを、糖尿病のグルコースレベル>250mg/dLに到達するまで、3日ごとにモニターした。糖尿病の血中グルコースレベルに到達しなかったSTZ処置したマウスはこの試験には用いなかった。高血糖症を確立した後、常在通性細菌を排除するために、マウスに、クロラムフェニコール処理した1g/リットル飲料水を18時間与えた。pFD-GLPCを用いて染色体を改変したNissle株Nissle-GLP-1を、LB培地中の一晩培養500倍希釈物からOD600=1になるまでクロラムフェニコールと一緒に成長させた。1000×gで3分遠心分離することによって細菌を採取した。生じたペレットを、1スクロースを伴う200μlの滅菌LBに再溶解させた。クロラムフェニコール処置後、マウスに、109CFU/mLOD600=20のルリア培地Luriabrothで成長させたNissle株NissleまたはNissle-GLP-1を別々に含有する、1スクロースを伴うLBを体重25g当たり50μl摂食させた。摂食させた細菌の体積をマウスの体重により正規化した。Nissle株を摂食させたマウスは全て、実験全体を通して、1日当たり2回Nissleを摂食させた。全てのマウスについて、7~10日ごとに体重およびグルコースレベルを取得した。ほとんどの場合、空腹時血糖レベルを測定した。これらの測定は、マウスのストレスレベルを最小限にするために間隔を空けた。耐糖能検査およびELISAマウスを10時間絶食させ、秤量し、ヘパリン添加したMicro-HematocritCapillaryTubeFisher、PAを使用して尾静脈から血液試料を採取した。次いで、マウスに体重1kg当たり25mgのグルコースを腹腔内注射し、0.5時間、1時間、1.5時間の時点で血液試料を取得した。Breeze登録商標2血中グルコースモニタリングシステムを使用して血漿グルコースを測定した。Rat/MouseInsulinELISAキットMillipore、MAを製造者の説明書に従って使用して血漿インスリンを測定した。細菌の計数6~8週齢の雄のC57BL/6JB6マウスに、常在通性細菌を排除するために、クロラムフェニコール1g/リットルを飲料水に入れて18時間与えた。Nissle株NissleおよびNissle-GLP-1の一晩培養物をLB培地中に1:500希釈し、OD600=1まで成長させた。1000×gで3分間遠心分離することによって細菌を採取した。生じたペレットを、1スクロースを伴う滅菌LB中に再懸濁させてOD600=20にした。クロラムフェニコール処置後、マウスに、濃縮した再懸濁液を含有する、1スクロースを伴うLBを体重25g当たり50μlで経口胃管栄養によって摂食させた結果として生じる用量は、1日2回、動物当たり109CFUである。20日間摂食させた後、マウスを新しいケージに移して3日間置いた。新しいケージから糞便を採取し、マウスを安楽死させた。各処置から少なくとも3匹のマウスを解剖し、それらのGI管を取り出した。GI管を2つの小片に切った上部GI-小腸および下部GI-大腸。下部GIを片側にそって開き、穏やかにこすり取ることによって糞便を除去し、1×PBSで洗浄した。上部GIは洗浄もこすり取ることもせずに秤量した。上部GI管および下部GI管をそれぞれ秤量し、新鮮なLB培地4mL中でホモジナイズした。ホモジナイズされた組織を、対応する抗生物質を伴うMacConkey寒天プレートに、段階希釈により播いた。プレートを、37°Cで一晩インキュベートし、それらのコロニーを計数した。免疫組織学的検査この試験で用いた、処置したマウスを全て、標準のプロトコールの通りCO2を用いて安楽死させた。耐糖能検査後に屠殺したマウスの消化管および膵臓の組織を4パラホルムアルデヒドに一晩固定し、1×PBSで3回洗浄し、70エタノールに浸漬した。次いで、固定された組織を解剖した。脱パラフィンした後、固定された組織スライドを、IHC-Tek商標エピトープ回収溶液IHCWorld、Woodstock、MD中で蒸し、メタノール中0.5過酸化水素Fisher、Pittsburgh、PAに10分間浸して、内在性のペルオキシダーゼをブロッキングした。0.01MのPBSpH7.2で洗浄した後、10の通常のブロッキングヤギ血清Invitrogen、Carlsbad、CAを、加湿チャンバー内、室温で30分間適用した。PBSプラス1×カゼインVector,Burlingame,CA中に1:50希釈したウサギ抗インスリンH-86、SantaCruzBiotechnologyを適用して試料をブロッキングし、次いで、その試料を加湿チャンバー内、37°Cで1.5時間インキュベートした。PBSで4回洗浄した後、PBS中に1:200希釈したビオチン化二次抗体ヤギAnti-RabbitVectorを試料に、加湿チャンバー内、室温で20分間適用した。試料を、ストレプトアビジンペルオキシダーゼInvitrogenと一緒に加湿チャンバー内、室温で20分間インキュベートし、PBSで3回洗浄した。試料を、AEC色素原/基質溶液Invitrogenと一緒に室温でインキュベートした。色の発生を、通常の光学顕微鏡の下でおよそ5~15分間モニターした。蒸留H2Oによるすすぎを用いて反応を停止させた。一部の消化管組織および膵臓を、ヘマトキシリンFisherを30秒間用いて対比染色した後、水道水で5分間すすいだ。試料を、水性封入剤であるFluoromountFisherを使用して封入した。通常の光学顕微鏡Leica、Bannockburn、ILの下でカラーカメラを用いて写真を取得した。染色された膵臓組織の写真を、赤色の着色から推定されるβ細胞によるパーセント適用範囲についてImageJソフトウェアNIH-NCBIによって解析した。免疫蛍光法パラフィン免疫蛍光法-インスリン、PDX-1、ChrA、リゾチームおよびSINissle株NissleおよびNissle-GLP-1を60日間摂食させた後に屠殺したマウスの消化管および膵臓の組織を、4パラホルムアルデヒドに一晩固定し、1×PBSで3回洗浄し、70エタノールに浸漬させた。次いで、固定された組織を解剖した。脱パラフィンした後、固定された組織スライドを、0.01Mのクエン酸緩衝液中で蒸した。0.01MのPBSpH7.2で洗浄した後、10の通常のブロッキングロバ血清SantaCruzBiotechnology、CAを加湿チャンバー内、室温で1時間適用した。1:50希釈したウサギ抗インスリンSantaCruzBiotechnology、CA、およびPBSプラス1×カゼインVector,Burlingame,CA中1:500のヤギ抗PDX-1Abcam、Cambridge、MA、1:50に希釈された抗ヤギChrA、抗ヤギリゾチーム、または抗ヤギスクラーゼイソマルターゼSISantaCruzBiotechnology、CAのいずれかを適用して試料をブロッキングし、次いで、その試料を加湿チャンバー内、4°Cで一晩インキュベートした。PBSで4回洗浄した後、PBS中1:200希釈した、蛍光色素とコンジュゲートした二次抗体AlexaFluor登録商標488ロバ抗ウサギIgGおよびAlexaFluor登録商標555ロバ抗ヤギIgGInvitrogenを、加湿チャンバー内、室温で1.5時間、試料に適用した。PBSで3回洗浄した後、300nMのDAPI染色溶液Invitrogenを、試料と一緒に3分間インキュベートした。次いで、試料を、ProLong登録商標Gold退色防止antifade試薬Invitrogenを用いて封入した。検体を、各フルオロフォアについて、適切な励起波長を用いてすぐに検査した。Zeiss710共焦点顕微鏡Zeiss、Jena、Germanyを用いて画像を取得した。凍結切片免疫蛍光法-Glp-1Nissle株を10日間摂食させたマウスの腸および膵臓を回収し、OCT化合物中でスナップ凍結させ、凍結切片にした8μM。スライドを1時間風乾し、氷冷したアセトンに5分間固定した。一晩風乾した後、スライドをPBST0.05Tweenでの3回洗浄で洗浄した。以下のプロトコールをM.O.M.商標キット染色手順Vectorから改変した。細胞を、0.1TritonX100を用いて15分間透過処理し、その後、PBSで2回洗浄した。M.O.M.商標Igブロッキング試薬の検量線用溶液中10の通常のロバ血清SantaCruzBiotechnology、CAを加湿チャンバー内、室温で1時間適用した。切片を2回、2分間、それぞれPBSで洗浄した。組織切片を、M.O.M.商標希釈剤の検量線用溶液中で5分間インキュベートした。次いで、試料を、M.O.M.商標希釈剤中1:100のウサギ抗GLP-11~19Abcamと一緒に37°Cで30分間、その後RTで30分間インキュベートした。PBSTで2回洗浄し、次にPBSで4回洗浄した後、PBS中に1:200希釈した、蛍光色素とコンジュゲートした二次抗体AlexaFluor登録商標488ロバ抗ウサギIgGおよびAlexaFluor登録商標555ロバ抗ヤギIgGInvitrogenを加湿チャンバー内、室温で1時間、試料に適用した。その後PBSTで3回洗浄した後、試料を300nMのDAPI染色溶液Invitrogen中で3分間インキュベートした。試料をPBSで3回すすぎ、ProLong登録商標Gold退色防止試薬Invitrogenを用いて封入した。検体を、各フルオロフォアについて、適切な励起波長を用いてすぐに検査した。Zeiss710共焦点顕微鏡で写真を取得した。再プログラミングされた細胞の数の算出および推定値Nissle-GLP-1を摂食させたマウスにおいて再プログラミングされた細胞の数を決定するための算出マウス当たりのベータ細胞は1×106個でありBockT、SvenstrupK、Pakkenberg、BBuschardK、UnbiasedestimationoftotalbetacellnumberandmeanbetacellvolumeinrodentpancreasApmis107巻、791~799頁1999年、腸上部1cm2当たりの細胞は1.9×107個であるChengHBjerknesM、CellproductioninmouseintestinalepitheliummeasuredbystathmokineticflowcytometryandCoulterparticlecountingAnatRec207巻、427~434頁、doi101002ar10920703051983年と仮定して、本発明者らはマウスの腸上部十二指腸空腸、332.4cm2、CasteleynC、RekeckiA、VanderAaA、SimoensPVandenBroeckW、SurfaceareaassessmentofthemurineintestinaltractasaprerequisitefororaldosetranslationfrommousetomanLabAnim44巻、176~183頁、doi101258la20090091122010年を参照されたいの推定表面積に、推定の再プログラミングされた細胞の百分率0.00013を掛け、これに1cm2当たりの細胞数を掛けて、再プログラミングされた細胞の推定値を得、それは、健康なマウスにおけるベータ細胞の数のおよそ82であった。マウス実験に基づく推定用量の算出本発明者らは本実施例で報告される実験では、マウスに109cfu/mLを1日当たり2回摂食させた。これは、マウスの体重1kg当たり8×1010CFUと等しい。市販されている通り、プロバイオティクスサプリメントを4.0×1011CFU/gとし、ヒトの体重範囲を小児について25kg~成人について75kgと仮定すると、これは、5~15g/dの1日用量を意味することになる。しかし、コロニー形成効率が2桁高い場合には報告されている通り、RaoSら、TowardalivemicrobialmicrobicideforHIVCommensalbacteriasecretinganHIVfusioninhibitorpeptideProcNatlAcadSciUSA102巻、11993~11998頁2005年を参照されたい、用量は50~150mg/dになる。6.11.実施例11:GLP-1を分泌する共生細菌を非肥満糖尿病のNODマウスに摂食させることの効果この実施例により、GLP-11~37を分泌する共生細菌を、遺伝学的に実現した糖尿病マウス非肥満糖尿病、NODに摂食させることの効果が実証される。本発明者らはNODマウスに、ダミーペプチドを発現しているE.coliNissle1917Nissle、GLP-11~37を分泌しているNissleNissle-GLP-1または細菌を含有しない培地を46日間摂食させた。その結果、Nissle-GLP-1を摂食させたマウスにおいて、培地のみを摂食させた対照NODマウスと比較してp=.0003、またはNissleを摂食させたマウスと比較してp=.0008、血中グルコースレベルが有意に低下した。さらに、Nissle-GLP-1マウスの尿量がはるかに低いことが観察された。Nissleを摂食させたマウスも、培地のみを摂食させたマウスよりも有意に低い血中グルコースレベルを示したp=.01。この試験では、Nissleを摂食させたマウスおよび対照マウスは外見が不健康であり、血中グルコースレベルが常に400mg/dLを超えたが、Nissle-GLP-1を摂食させたマウス同様に不健康に見えるについての血中グルコースレベルは、46日の期間全体を通して160~250mg/dLの範囲内であった。諸言1型糖尿病T1DMを試験するための標準モデル生物体のうちの1つと考えられ、NODマウスは膵ベータ細胞ならびに全身の他の内分泌系の破壊を招く遺伝的欠陥を有する。T1DM様病態に加えて、他の全身性の病状を有するので、オフターゲットの効果により、NODマウスはT1DMを試験するために理想的なものではなくなっている。この限定にもかかわらず、当技術分野においてNODマウスは依然として早期概念実証研究の十分なモデルであるとみなされている。この実施例に関して、ペプチドGLP-11~37を腸上皮細胞に送達するための共生細菌の使用の、NODマウスにおける血中グルコースレベルに対する効果について調査した。実験手順これらの実験に用いた雌のNODマウスNOD/ShiLtJマウスは、CornellUniversityIACUCにより承認されたプロトコールに従って処置した。全てのマウスをCornellUniversityVeterinarySchoolのEastCampusResearchFacilityECRFに収容した。マウスは全て、JacksonLaboratoryBarHarbor、MEから購入した。6週齢の雌のNOD/ShiLtJマウスの3つの群n=5について、それらの血中グルコースレベルを、BayerBreeze登録商標血中グルコース試験紙BaerHealthcareを用いて、Breeze登録商標2血中グルコースモニタリングシステムBaerHealthcareLLCMishawaka、INによってモニターした。糖尿病のグルコースレベル>250mg/dLに到達するまで、5~7日間ごとに血中グルコースレベルを測定した。糖尿病の血中グルコースレベルに到達するには、12~14週間を要した。高血糖の血中グルコースレベルに到達できなかったマウスは安楽死させた。高血糖症を確立した後、全てのマウスに、常在共生細菌を排除するために、クロラムフェニコール1g/リットル飲料水を18時間与えた。Nissle株Nissle、Nissle-GFP-1を、一晩培養物からOD600=1まで成長させ、LB培地中に1:500希釈した。1000×gで3分間遠心分離することによって細菌を採取した。生じたペレットを、1スクロースを伴う滅菌LB200μLに再溶解させた。クロラムフェニコール処置した後、マウスに、経口胃管栄養によって、109CFUOD600=20の、Nissle、Nissle-GLP-1を含有する、または細菌を含有しないただのスクロースを伴う滅菌培地、1スクロースを伴うLBを体重25g当たり50μLで摂食させた。株は、単独で、添加物なしでマウスに摂食させた。胃管栄養を開始したら、クロラムフェニコール処理した水はマウスゲージから除去した。Nissle株またはスクロースを伴う滅菌培地を、1日2回、46日間胃管栄養により摂食させた。細菌の摂食を開始した後11日目、21日目、30日目および46日目にマウスの体重および血中グルコースを測定した。結果NODマウスに1日2回、46日間、Nissle-GLP-1もしくはNissleを経口的に摂食させた、または細菌を摂食させなかった。表1は、実験に含まれたマウスについての生存および糖尿病発症のデータを示す。全ての処置を各々マウス5匹で開始した。Nissle-GLP-1を摂食させたマウス以外の全てのマウスが、実験全体を通して高レベルの尿を排泄することが観察された。Nissle-GLP-1を摂食させたマウスは、尿量のレベルの上昇を示したが、他のマウスほどではなかった。Nissle株の摂食を開始する前に、全てのマウスが、500mg/dLを超える血中グルコースレベルを示し、高血糖症について陽性であるとみなされた。処置当たりの平均のマウスの空腹時6時間血中グルコースレベルが図21に示されている。Nissleを摂食させたマウスおよびNissle-GLP-1を摂食させたマウスのどちらとも、対照マウスとの間で血中グルコースが有意に低下した。46日後に、Nissle摂食は対照に対して有意な効果p=01を有し、Nissle-GLP-1はさらに著しい効果を有したp=.0003。Nissle-GLP-1とNissleの間の差異も有意であったp=.0008。比較は全て、スチューデントの両側t検定n=4、3または2、表1参照を用い、同等の分散を仮定して行った。実験の間、複数の処置間または1つの処置間でマウスの体重に有意差はなかった。全てのマウスの体重が、概して経時的に減少した図22。結論これらのデータは、NissleおよびNissle-GLP-1のどちらによっても、NODマウスにおける血中グルコースレベルが有意に低下し得ることを示している。しかし、これらのデータは、非常に小規模のマウスの群からのものである。46日間までに、各群に残ったマウスは2匹のみである。それはそうとして、Nissle-GLP-1群のマウスの血中グルコースレベルは、他の2つの群よりもはるかに低く、これは、NODマウスにより任意の再プログラミングされた細胞に対して開始され得るいかなる免疫応答もこの時間枠内では影響を有さなかったことを示している。表1:この実施例に関するマウスの生存本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、当業者には、本明細書に記載のものに加えて、本発明の種々の改変および変形が前述の説明から明らかになり、本発明に対して本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくそれらを行うことができる。したがって、本発明は、それらが添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内に入るという条件で、本発明の改変および変形を包含するものとする。本明細書において引用された全ての参考文献は、個々の刊行物、特許または特許出願について、その全体があらゆる目的について具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたのと同じ程度に、その全体が参照によりあらゆる目的について本明細書に組み込まれる。いずれの刊行物の引用も出願日より前のその開示に対するものであり、本発明が、先行発明に基づいてそのような刊行物に先立つ権限がないことを容認するものと解釈されるべきではない。"