"バリアント免疫グロブリン軽鎖単一可変ドメインを含有する単離されたポリペプチドであって、前記バリアントが、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされるフレームワーク領域のアミノ酸配列を含有し、その36、38、43、44、46、および87位のアミノ酸のうち少なくとも1つが置換されており、前記の位置はKabatのアミノ酸ナンバリングシステムにしたがって割り当てられたものである、前記単離されたポリペプチド。前記バリアント免疫グロブリン軽鎖単一可変ドメインがヒトVL免疫グロブリン軽鎖単一可変ドメインである、請求項1に記載の単離されたポリペプチド。バリアントが実質的に溶液中で二量体である、請求項1または2に記載の単離されたポリペプチド。バリアントが、次のアミノ酸、Y36、Q38、A43、P44、L46、またはY87のうち少なくとも1つを有する、請求項3に記載の単離されたポリペプチド。バリアントが実質的に溶液中で単量体である、請求項1または2に記載の単離されたポリペプチド。バリアントが、アミノ酸Y36をアミノ酸A、Q、G、S、T、またはVのいずれかで置き換えたアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の単離されたポリペプチド。バリアントが、アミノ酸Q38をアミノ酸R、N、D、E、またはGのいずれかで置き換えたアミノ酸配列を含む、請求項5または6に記載の単離されたポリペプチド。バリアントが、アミノ酸A43をD、I、L、F、T、またはWで置き換えたアミノ酸配列を含む、請求項5~7のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチド。バリアントが、アミノ酸P44をR、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、T、Y、またはVで置き換えたアミノ酸配列を含む、請求項5~8のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチド。バリアントが、アミノ酸L46をアミノ酸R、D、Q、E、またはFのいずれか、たとえばDで置き換えたアミノ酸配列を含む、請求項5~9のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチド。バリアントが、アミノ酸Y87をアミノ酸D、C、L、またはFのいずれか、たとえばLで置き換えたアミノ酸配列を含む、請求項5~10のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチド。VLがκ系統VLVκである、請求項2~11のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチド。VLがκI系統VLである、請求項12に記載の単離されたポリペプチド。VLがκI系統、DPK9である、請求項13に記載の単離されたポリペプチド。Kabatのナンバリング法にしたがって決定された位置である36、38、43、44、46、または87位の少なくとも1つが変異していることを特徴とする、VκDPK9免疫グロブリンドメイン。Kabatのナンバリング法にしたがって決定された位置である36位が、A、Q、G、S、T、またはVから選択されるアミノ酸に変異していることを特徴とする、請求項15に記載のVκDPK9免疫グロブリンドメイン。Kabatのナンバリング法にしたがって決定された位置である38位が、R、N、D、E、およびGから選択されるアミノ酸に変異していることを特徴とする、請求項15または16に記載のVκDPK9免疫グロブリンドメイン。Kabatのナンバリング法にしたがって決定された位置である43位が、D、I、L、F、T、K、E、およびWから選択されるアミノ酸に変異していることを特徴とする、請求項15~17のいずれか1つに記載のVκDPK9免疫グロブリンドメイン。Kabatのナンバリング法にしたがって決定された位置である44位が、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、T、Y、およびVから選択されるアミノ酸に変異していることを特徴とする、請求項15~18のいずれか1つに記載のVκDPK9免疫グロブリンドメイン。Kabatのナンバリング法にしたがって決定された位置である46位が、R、D、Q、E、Fから選択されるアミノ酸、たとえばD、に変異していることを特徴とする、請求項15~19のいずれか1つに記載のVκDPK9免疫グロブリンドメイン。Kabatのナンバリング法にしたがって決定された位置である87位が、D、C、L、Fから選択されるアミノ酸、たとえばL、に変異していることを特徴とする、請求項15~20のいずれか1つに記載のVκDPK9免疫グロブリンドメイン。SECMALLSでの測定により実質的に単量体である、請求項15~21のいずれか1つに記載のVκDPK9免疫グロブリンドメイン。前記単離されたポリペプチドもしくは免疫グロブリンドメインが標的リガンドに対する結合特異性を有する、請求項1~22のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチドまたは免疫グロブリンドメイン。前記単離されたポリペプチドの抗原結合活性が、結合速度定数Kaの増大の結果として改善された、請求項1~22のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチドまたは免疫グロブリンドメイン。ポリペプチドの少なくとも70が単量体の形をとる、請求項1~24のいずれか1つに記載のポリペプチドもしくは免疫グロブリンを含むポリペプチドのリスト。Kabatのナンバリングシステムにしたがって割り当てられた位置である36、38、43、44、46、または87位のアミノ酸の少なくとも1つが変異している、請求項1~24のいずれか1つに記載のポリペプチドまたはバリアント免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン領域を含むライブラリー。43位がD、I、L、K、またはEから選択される、Vκ免疫グロブリンドメインのライブラリー。46位がR、D、Q、E、またはFから選択され、たとえばDである、Vκ免疫グロブリンドメインのライブラリー。87位がD、C、L、またはFから選択され、たとえばLである、Vκ免疫グロブリンドメインのライブラリー。請求項1~24のいずれか1つに記載のポリペプチドもしくはバリアント免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン領域を発現させるためのライブラリーであって、前記ポリペプチドもしくは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする一連の核酸配列を含む、前記ライブラリー。請求項1~24のいずれか1つに記載のポリペプチドもしくは免疫グロブリン軽鎖単一可変ドメインをコードする核酸のライブラリー。前記ライブラリーがCDR領域内にさらに多様性を有する、請求項25に記載のリスト、または請求項26~31のいずれか1つに記載のライブラリー。請求項1~24のいずれか1つに記載のポリペプチドもしくは免疫グロブリン軽鎖単一可変ドメインをコードする核酸。請求項1~24のいずれか1つに記載のポリペプチドもしくは免疫グロブリン単一可変ドメインを含有する医薬組成物。薬剤として使用するための、請求項1~24のいずれか1つに記載のポリペプチドもしくは免疫グロブリン単一可変ドメイン。発明の詳細な説明本明細書では、明瞭かつ簡潔な明細書を書くことができるように、実施形態に準拠して本発明を説明した。本発明から離れることなしに実施形態をさまざまに組み合わせ、または分けることができることが、意図され、理解される。特に断らない限り、本明細書で使用される科学技術用語はすべて、当技術分野たとえば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。分子、遺伝、および生化学的方法全般的には、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual2dedColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY、およびAusubeletalShortProtocolsinMolecularBiology4thEdJohnWileySonsIncを参照すべきであり、これらは参考として本明細書に組み入れられるおよび化学的方法のための標準的な技術が使用される。本明細書で使用される免疫グロブリンは、抗体分子に特徴的な、免疫グロブリンフォールドを保持するポリペプチドのファミリーを表し、それは2つのβシートおよび、通常は、保存されたジスルフィド結合を含んでいる。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、invivoで細胞間相互作用および非細胞性相互作用の多くの態様に関与するが、これには、免疫系における広範な役割たとえば、抗体、T細胞受容体分子など、細胞接着への関与たとえば、ICAM分子、および細胞内シグナル伝達たとえば、PDGF受容体のような受容体分子が含まれる。本発明は、結合ドメインを有するすべての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用可能である。本明細書で使用されるドメインは、タンパク質の残りの部分とは独立して三次構造を保持する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。概して、ドメインは、タンパク質の個別の機能的性質に関与するものであって、多くの場合、タンパク質の残りの部分およびまたはドメインの、機能の損失なしに、他のタンパク質に加えたり、取り除いたり、または移動させることができる。単一抗体可変ドメインもしくは免疫グロブリン単一可変ドメインは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含有する、折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。したがって、これには、完全な抗体可変ドメインおよび改変された可変ドメインたとえば、この改変可変ドメインでは、1つもしくは複数のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列で置き換えられている、または、トランケートされ、あるいはNもしくはC末端伸長を含む、抗体可変ドメインが含まれるが、さらに、少なくともある程度は全長ドメインの結合活性および特異性を保持する、可変ドメインの折り畳みフラグメントも含まれる。VκDPK9免疫グロブリンドメインDPκ9とも記すは、ヒトフレームワークO12O2DPK9に由来する免疫グロブリンドメインである。このようなドメインは、ヒトフレームワークJk1由来の配列をさらに含有してもよい。免疫グロブリンドメインは、他のヒトフレームワーク領域に由来してもよい。ヒトVκドメインの構造的レパートリーの解析は、たとえば、TomlinsonetalEMBOJ14p162838に記載されている。それに加えて、マウスおよびヒトの生殖系列遺伝子レパートリー間の構造上の相違は、たとえば、AmalgroetalImmunogenetics47p355363に記載されている。免疫グロブリン単一可変ドメインという表現は、異なる、もしくは他の、V領域もしくはドメインとは独立して、抗原もしくはエピトープと特異的に結合する結合ドメイン、または抗体可変ドメインVH、VHH、VLを指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域もしくは可変ドメインとともに一定のフォーマットでたとえばホモ、またはヘテロ多量体として存在することができるが、この場合、他の領域もしくはドメインは、免疫グロブリン単一可変ドメインによる抗原結合のために必要とはされないすなわち、この場合、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の可変ドメインとは独立して、抗原と結合する。ドメイン抗体もしくはdAbは、本明細書で使用される免疫グロブリン単一可変ドメインである。単一抗体可変ドメインもしくは抗体単一可変ドメインは、本明細書で使用される免疫グロブリン単一可変ドメインと同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ある実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、齧歯類たとえばWO0029004に記載、その内容は参考としてその全体を本明細書に組み入れられる、テンジクザメ、およびラクダ科動物VHHdAbなどの他種由来の単一抗体可変ドメインも含まれる。ラクダ科動物VHHは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコなどの種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであって、これらの動物は自然に軽鎖を欠いた重鎖抗体を産生する。VHHはヒト化することができる。本発明のすべての態様において、当該の、もしくはそれぞれの、免疫グロブリン単一可変ドメインは、抗体重鎖および軽鎖単一可変ドメイン、たとえばVH、VLおよびVHHから独立して選択される。抗体重鎖ドメインはVHもしくはVH、VHH、VHHもしくはVHHで表される。抗体軽鎖ドメインはVLもしくはVLで示される。免疫グロブリン軽鎖単一可変ドメインに関するバリアントとは、天然に存在する生殖系列もしくは親免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列を含有するが、1つもしくは複数のアミノ酸が異なっているものである。すなわち、バリアントは、その起源である、天然に存在する配列または親配列と比較して1つもしくは複数のアミノ酸の相違を含有する。親配列は、天然に存在する免疫グロブリン軽鎖単一可変ドメイン配列、生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列、または当該抗原と結合することが確認されている免疫グロブリン軽鎖単一可変ドメインのアミノ酸配列であることが適当である。ある実施形態において、親配列は、それぞれWO2005093074およびWO04101790に記載の4Gまたは6Gライブラリーのようなライブラリーから選択することができる。系統は、同じ親クローンに由来する一連の免疫グロブリン単一可変ドメインを表す。たとえば、いくつかのバリアントクローンを含む系統は、親もしくは出発免疫グロブリン単一可変ドメインから、多様化、部位特異的変異誘発、エラーを起こしやすい、またはエラーを加えたライブラリーの作製によって、作製することができる。結合分子は、親和性成熟のプロセスで作製することが適当である。適当な免疫グロブリン軽鎖単一可変ドメインを特定するためのアッセイおよびスクリーニング法は、たとえば、PCTEP2010052008およびPCTEP2010052007に記載されている。親配列としては、本明細書に記載のDOM7h8のような免疫グロブリン単一可変ドメインが挙げられる。前記バリアントは、CDR配列中に変異を含んでいてもよく、そうした変異が抗原特異性の相違の一因となることが適当である。ある実施形態において、親配列は、溶液状態たとえば、MALLSおよびまたはSECMALLSまたはAUCによって測定されるおよび熱安定性たとえばDSCで測定されるを含めて、生物物理学的特性の1つもしくはいくつかを改善するよう、本発明にしたがって改変することができる。ある実施形態において、バリアントは、免疫グロブリン軽鎖単一可変ドメイン中の1つもしくは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を有する。本発明の免疫グロブリン軽鎖単一可変ドメインは、溶液中で単量体、二量体、三量体、または多量体を形成することができる。さまざまなオリゴマーが互いに平衡状態となることができる。平衡は、迅速であることもあるが、緩慢であることもある。実質的に単量体であるとは、単一可変ドメインの主たる形態が、溶液中で単量体であることを意味する。溶液状態は、本明細書に記載のSECMALLS、またはAUCで測定することができる。本発明が実質的に純粋な単量体を提供することが適当である。ある実施形態において、dAbは少なくとも70、75、80、85、90、95、98、99、995または100純粋な単量体である。同様に、実質的に二量体であるとは、溶液中の主たる形態が二量体型であることを意味する。ある実施形態において、dAbの二量体型は少なくとも70、75、80、85、90、95、98、99、995または100純粋な二量体である。単量体二量体状態をSECMALLSで測定する場合、dAb濃度は5~10μMの範囲内であれば適当である。ある実施形態において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドもしくはリガンドは、任意の抗体フォーマットとして提供することができる。本明細書で使用される抗体フォーマットは、抗原に対する結合特異性を構造に付与するために、1つもしくは複数の抗体可変ドメインを組み込むことができる、任意の適当なポリペプチド構造を表す。さまざまな、適当な抗体フォーマット、たとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖およびまたは軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合フラグメントたとえば、Fvフラグメント例、一本鎖Fv、ジスルフィド結合したFv、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F2フラグメント、一本鎖抗体可変ドメインたとえば、dAb、VH、VHH、VL、および前記のいずれかの改変型たとえば、ポリエチレングリコールもしくは他の適当なポリマー、またはヒト化VHHの共有結合によって修飾されているが当技術分野で知られている。本明細書で使用される抗体は、自然に抗体を産生する任意の種に由来するか、組換えDNA技術で作製されるかにかかわらず;たとえば、血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されるかどうかにかかわらず、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、またはフラグメントたとえば、Fab、F2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合scFv、diabodyを意味する。本明細書に記載される抗原は、本発明の結合ドメインが結合する分子である。典型的には、抗原は、抗体リガンドと結合して、invivoで抗体応答を引き起こす能力を有する。抗原はたとえば、ポリペプチド、タンパク質、核酸、または他の分子であってもよい。本明細書で使用される標的という表現は、結合部位を有するポリペプチドドメインが結合することができる、生物学的分子たとえば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物を表す。標的は、たとえば、細胞内標的たとえば、細胞内タンパク質標的、可溶性標的たとえば分泌型、または細胞表面標的たとえば、膜タンパク質、受容体タンパク質とすることができる。標的は疾患に関与する分子であって、前記標的と本発明の結合分子との結合が、前記疾患の改善または治療に役立つことがあれば好適である。標的抗原は、ポリペプチド、タンパク質、もしくは核酸であるか、またはその一部とすることができるが、これらは天然に存在していても、合成であってもよい。これに関連して、本発明のリガンドは、標的抗原と結合して、アンタゴニストもしくはアゴニストたとえばEPO受容体アゴニストとして作用することができる。当業者には当然のことながら、選択は数多くさまざまである。それはたとえば、ヒトもしくは動物タンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体このサイトカイン受容体には、サイトカイン類の受容体が含まれる、酵素、酵素の補助因子、またはDNA結合タンパク質とすることができる。ある実施形態において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはポリペプチドは、二重特異性リガンドの一部であるとすることができるが、この二重特異性リガンドは、第1の抗原もしくはエピトープ結合部位たとえば、第1の免疫グロブリン単一可変ドメイン、および第2の抗原もしくはエピトープ結合部位たとえば、第2の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンドを指すものであって、この結合部位もしくは可変ドメインは、2つの抗原たとえば、異なる抗原、または同一抗原の2コピーと、または単一特異性免疫グロブリンが通常は結合しない、同一抗原上の2つのエピトープと、結合する能力を有する。たとえば、2つのエピトープは同一抗原上に存在してもよいが、同一エピトープではないか、または単一特異性リガンドが結合するほど近接していない。ある実施形態において、本発明の二重特異性リガンドは、異なる特異性を有する結合部位もしくは可変ドメインで構成されるが、同じ特異性を有する相互補完的な可変ドメインペアすなわちVHVLペアを含まないすなわち、単一結合部位を形成しない。二重特異性リガンド、および二重特異性リガンドを調製するための適当な方法は、WO2004058821、WO2004003019、およびWO03002609に記載されており、これらの公開された国際出願のそれぞれ教示する内容全体は、参考として本明細書に組み入れられる。ある実施形態において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを用いて、二重もしくは多重特異性組成物または融合ポリペプチドを作製することができる。したがって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを、より大きな構築物の中で使用することができる。適当な構築物には、抗SA免疫グロブリン単一可変ドメインdAbとモノクローナル抗体、NCE、タンパク質もしくはポリペプチドとの融合タンパク質などがある。したがって、本発明の抗SA免疫グロブリン単一可変ドメインを用いて、多重特異性分子、たとえば、dAbdAbすなわち、一方が抗SAdAbである2つ結合した免疫グロブリン単一可変ドメイン、mAbdAbまたはポリペプチドdAb構築物などの二重特異性分子を構築することができる。これらの構築物において、抗SAdAbAlbudAb登録商標成分は、血清アルブミンSAとの結合によって、半減期の延長をもたらす。適当なmAbdAb、およびこれらの構築物を作製するための方法は、たとえば、WO2009068649に記載されている。それに加えて、WO04003019およびWO2008096158は、抗SA免疫グロブリン単一可変ドメインdAbなどの抗血清アルブミンSA結合部分を明らかにしており、これは治療上有用な半減期を有する。これらの文書は、単量体抗SAdAb、ならびにそのようなdAbを含有する多重特異性リガンド、たとえば、TNFR1などの標的抗原と特異的に結合する、抗SAdAbおよびdAbを含有するリガンドを記載する。2種以上に由来する血清アルブミンと特異的に結合する結合部分、たとえば、ヒトマウス交差反応性抗SAdAbが公表されている。WO05118642およびWO2006059106は、薬物の半減期を長くするために、抗SA免疫グロブリン単一可変ドメインのような抗SA結合部分を薬物に結合させるコンジュゲート化または複合体化という着想を記載している。タンパク質、ペプチドおよび新規化学物質NCE薬物が開示および例示されている。WO2006059106は、インスリン分泌促進薬、たとえば、グルカゴン様ペプチド1などのインクレチンホルモンの半減期を長くするためにこのコンセプトを使用することを記載する。HoltetalAntiSerumalbumindomainantibodiesforextendingthehalflivesofshortliveddrugsProteinEngineeringDesignSelectionvol21no5pp2832882008についても言及しておく。本発明はまた、請求されたポリペプチドのカノニカル構造を提供する。ドメイン抗体dAbの構造および配列の分析から、6つの抗原結合ループVHドメインから3つおよびVκドメインから3つは、主鎖の立体構造、またはカノニカル構造のレパートリーが少ないことが示されたChothiaCLeskAMCanonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmunoglobulinsJMolBiol19690117ChothiaetalConformationsofimmunoglobulinhypervariableregionsNature342877883Tomlinsonetal上記。カノニカル構造は、下記によって決定される:1.抗原結合ループの長さ;2.ループそれ自体および抗体フレームワークの中の、重要な部位にある特有の残基。ヒトVκドメインのカノニカル構造は、Tomlinsonetalに記載されている。本明細書におけるヒトVκドメインに対する言及は、κ軽鎖遺伝子01202DPK9およびJK1を含む単一のフレームワークを基本として、抗原結合部位の位置に側鎖の多様性が組み込まれている。このフレームワークによってコードされるVκドメインのカノニカル構造は、211である。3つのループL1、L2、L3のそれぞれのカノニカル構造にとって構造上重要な残基は、これらの主鎖の立体構造を保つために、通常、多様化されない。本発明はまた、本明細書に記載のリガンド単一可変ドメイン、融合タンパク質、ポリペプチド、二重特異性リガンド、および多重特異性リガンドをコードする、単離された、およびまたは組換え型の、核酸分子を提供する。本発明はまた、本発明の組換え核酸分子を含有するベクターを提供する。ある実施形態において、ベクターは、本発明の組換え核酸分子に機能しうるように連結された、1つもしくは複数の発現調節領域もしくは配列を含有する、発現ベクターである。本発明は、本発明の組換え核酸分子またはベクターを含有する、組換え宿主細胞も提供する。適当なベクターたとえば、プラスミド、ファジミド、発現調節領域、宿主細胞、ならびに本発明の組換え宿主細胞を作製するための方法は、当業者によく知られており、本明細書では実施例をさらに記載する。適当な発現ベクターは、いくつかの成分、たとえば複製開始点、選択可能なマーカー遺伝子、1つもしくは複数の発現調節領域、たとえば転写調節領域例、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターおよびまたは1つもしくは複数の翻訳シグナル、シグナル配列またはリーダー配列などを含有することができる。発現調節領域およびシグナル配列が存在する場合、ベクターまたは他の起源が、それらを提供することができる。たとえば、抗体鎖をコードするクローン化された核酸の、転写およびまたは翻訳調節配列を用いて、発現を指示することができる。所望の宿主細胞で発現させるためにプロモーターを提供することができる。プロモーターは、構成的であっても、誘導性であってもよい。たとえば、プロモーターは、抗体、抗体鎖、またはその一部をコードする核酸に、その核酸の転写を指示できるよう、機能的に連結することができる。原核宿主用たとえば、大腸菌用にはlac、tac、T3、T7プロモーターおよび真核宿主用たとえば、サルウイルス40初期もしくは後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーターにさまざまな適当なプロモーターが利用できる。それに加えて、発現ベクターは典型的には、ベクターを保有する宿主細胞を選択するための選択マーカー、ならびに、複製可能な発現ベクターの場合には、複製開始点を含有する。抗生物質耐性もしくは薬剤耐性を付与する産物をコードする遺伝子は一般的な選択マーカーであって、原核細胞にもたとえば、ラクタマーゼ遺伝子アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性のためのTet遺伝子、真核細胞にもたとえば、ネオマイシンG418またはジェネテシン、gptミコフェノール酸、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子使用することができる。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は、さまざまな宿主において、メトトレキサートを用いた選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子たとえば、LEU2、URA3、HIS3は、しばしば酵母で選択可能なマーカーとして使用される。ウイルスたとえばバキュロウイルスもしくはファージベクター、ならびに、宿主細胞のゲノム中に組み込むことができるベクター、たとえばレトロウイルスベクター、の使用も考えられる。哺乳動物細胞および原核細胞大腸菌、昆虫細胞ショウジョウバエ属DrosophilaSchniederS2細胞、Sf9および酵母Pmethanolica、Ppastoris、Scerevisiaeで発現させるための適当な発現ベクターは当技術分野でよく知られている。適当な宿主細胞は、大腸菌Ecoli、枯草菌Bsubtilis、およびまたは他の適当な細菌を含む原核細胞;真核細胞、たとえば真菌もしくは酵母細胞例、ピキアパストリスPichiapastoris、アスペルギルス属菌Aspergillussp、出芽酵母Saccharomycescerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomycespombe、アカパンカビNeurosporacrassa、または他の下等真核細胞、ならびに高等真核生物の細胞、たとえば昆虫例、ショウジョウバエ属DrosophilaSchniederS2細胞、Sf9昆虫細胞、哺乳動物例、COS細胞、たとえばCOS1およびCOS7、CHO42164220、293、HeLa、CV1、WOP、3T3、293T、NSO細胞、SP20、HuT78細胞など、または植物例、タバコ由来の細胞とすることができる。たとえば、AusubelFMetaledsCurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenePublishingAssociatesandJohnWileySonsIncを参照されたい。ある実施形態において、宿主細胞は、分離された宿主細胞であり、多細胞生物たとえば、植物または動物の一部ではない。ある実施形態において、宿主細胞はヒト以外の宿主細胞である。ある実施形態において、本発明のポリペプチドもしくは免疫グロブリン単一可変ドメインは、適当な発現系で発現されると分泌される。本発明のアミノ酸置換または変異が発現の損失を招かないことが適当である。追加の発現系としては、たとえば、に記載のような無細胞系がある。さらに別の実施形態において、PCTGB2005003243およびWO2006046042に記載のような無細胞発現系を用いて、可変ドメインの発現を達成することができる。本発明の実施形態に適用することができる開示の詳細に関する、WO200708515、161ページ、24行~189ページ、10行に言及しておく。この開示は、それが本明細書の文中に明確に掲載されて本発明の実施形態に関わるとして、また、下記の請求項に組み入れるべき内容に明確な裏付けを与えるために、参考として本明細書に組み入れられる。これには、免疫グロブリンに基づくリガンドの調製、ライブラリーベクター系、ライブラリー構築、単一可変ドメインの組み合わせ、リガンドの性質検討、治療用および診断用の組成物および使用、ならびに機能しうるように連結する、ナイーブな、予防、抑制、治療、治療上有効な用量および有効なの定義について詳細を提供する、WO200708515、161ページ、24行~189ページ、10行に示される内容が含まれる。実施例方法SECおよびSECMALLS多角度光散乱検出器付きサイズ排除クロマトグラフィーは、溶液中の巨大分子の特徴を明らかにするための非破壊的手法である。簡単に述べると、通常、DulbeccoのPBSバッファー中1mgmlの濃度のタンパク質は、その流体力学的性質にしたがって、PBS中でサイズ排除クロマトグラフィー使用したカラム:TosohBiosciencesTSKgel3000G3000SWXLおよびSuperdex200または7510300GL、それぞれにより分離される。分離後、散乱光に対するタンパク質の性向を、多角度光散乱MALLS検出器WyattUSを用いて測定した。タンパク質が検出器を通過する間の散乱光の強度を、角度の関数として測定する。屈折率RI検出器により測定されたタンパク質濃度と合わせて得られたこの測定値によって、適当な等式を用いて分子量の計算が可能となる解析ソフトウェアAstrav53412の必須部分。溶出ピークの中間点での最高濃度は、約810μMであり、これが、結果的に、MALLSがタンパク質の溶液中での単量体二量体状態を測定する濃度となる。示差走査熱量測定DSCは、サンプルおよび基準物の温度を上げるのに必要とされる熱量の差を温度の関数として測定する、熱分析の技術である。それは、タンパク質における広範な温度遷移を調べるために使用することができるが、融解温度ならびに熱力学パラメーターの測定に有用である。手短に述べると、タンパク質を、180°C時間通常PBS中1mgmlという一定の割合で加熱し、熱変性に伴う検出可能な熱容量変化を温度の関数として測定する。遷移中点Tmを測定するが、これは、タンパク質の50が未変性コンフォメーションをとり、残りの50が変性している温度とされている。この状況で、調べたタンパク質の大半は、完全に可逆的にアンフォールドするわけではないので、DSCは、見かけの遷移中点appTmを測定した。TmもしくはappTmが高いほど、分子はいっそう安定である。この実施例で使用したソフトウェアパッケージはOriginRv70383であった。分析用超遠心AUC:沈降平衡は溶液の分子量を測定するための方法であるたとえば、LebowitzetalProteinScience1120672079に記載。本実施例において、3つの6チャネル平衡セルに、原液サンプルを10、20、30、150、200、300、400、500および600倍希釈して作製した9つのタンパク質溶液540~90μgmlの範囲を入れた。各サンプルチャネルに、120μlタンパク質溶液を入れ、対照チャネルには、Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水DPBS希釈バッファーを入れた。上記のセルをAN90TIローターに入れ、吸光度およびレイリー光学干渉計屈折率検出を備えたBeckmanCoulterProteomeLabXL1分析用遠心機の中に設置した。3つの最高濃度について280nmで吸光度スキャンを記録した;最低濃度については230nmを用いた。温度は25°Cに設定した。その後ローターを25000rpmの回転状態とした。次に、25000rpmで12、16、および20時間後にセルをスキャンした。ベースライン補正を実験的に測定するために、運転終了時にローター速度を48,000rpmに上げ、1つのオーバースピードスキャンを8時間後に記録した。KDALTONプログラムAllianceProteinLaboratoriesPhiloetalJBiolChem269p2784027846PhiloJSMethodsEnzymol321100120を用いて、得られたデータを解析した。ポリペプチドの偏比容は、SENDTERPプログラムLaueetalInAnalyticalultracentrifugationinbiochemistryandpolymerscienceSEHardingAJRoweandJCHortonedsRoyalSocietyofChemistrypp90125を用いて、与えられたアミノ酸配列から計算される理論的アミノ酸組成に基づいて、25°Cで07256mlgと算出された。DPBSの溶媒密度は、25°Cで、以前行った測定に基づいて103994gmlとした。Biacore解析:表面プラズモン共鳴SPR、GEHealthcare実験は、リガンドdAbの、その抗原たとえば血清アルブミン、ProteinLなどに対する結合反応速度およびKDの測定を可能にする。単一のアルブミン結合dAbAlbudAb商標名の、その抗原に対する結合親和性KDを測定するために、精製dAbを、HBBIAcoreバッファー中で5000nMから39mM5000nM、2500nM、1250nM、625nM、312nM、156nM、78nM、39nMまでのAlbudAb濃度で、1級アミンカップリングでCM5チップBIAcore上に固定化されたヒト血清アルブミン上に40μl分の流速で注入した。データ解析は、機器のソフトウェアBiaevaluation32RC1を用いて、通常の確立されたアルゴリズムにしたがって行った。データ解析は次のパラメーター:KD-Mka-M1sec1kd-sec1をもたらすが、このKDは解離平衡定数、Mはモル濃度、Kaは会合速度定数、Kdは解離速度定数、およびsecは時間秒である。dAb溶液状態を予測するためのProteinL結合速度論の利用:ProteinLPpLとも称するは、Peptostreptococcusmagnusの細胞壁で最初に発見されたB細胞スーパー抗原であってBjorckLProteinLAnovelbacterialcellwallproteinwithaffinityforIgLchainsJImmunol1514011947、フレームワーク1領域内の残基との相互作用によって、κアイソタイプの免疫グロブリンIg軽鎖可変ドメインVκと結合するMGrailleESturaNHousdenJBeckinghamSBottomleyDBealeMTaussigBSuttonMGoreJCharbonnierComplexbetweenPeptostreptococcusmagnusProteinLandaHumanAntibodyRevealsStructuralConvergenceintheInteractionModesofFabBindingProteinsStructureVolume9Issue8Pages679687。菌株に応じて、ProteinLは、4つPmagnus菌株312または5つPmagnus菌株3316の、相同な70タンパク質配列同一性、タンデムのVκ結合ドメインを含み、これは可動性ペプチドリンカー領域で隔てられているKasternWSjobringUBjorckLStructureofpeptostreptococcalproteinLandidentificationofarepeatedimmunoglobulinlightchainbindingdomainJBiolChem25267128205。ProteinLがある種のVκドメインを含有するIgGまたはFab分子と結合すると、強いアビディティ効果が見られるが、この効果は、複数のProteinLドメインが存在すること、ならびに単一ProteinLドメイン内に高親和性および低親和性の結合界面が存在することの両方によってもたらされると推定されるKasternetal1992。当該dAbの溶液状態と相関する上記アビディティ効果の調節が観察されること、すなわち、単量体、二量体、および他のオリゴマー状態が、適正な条件下で、ProteinLに対して差のある結合反応速度を示すことが想定された。このように、ProteinL結合反応速度論を、dAbの溶液状態を決定するための代用物として使用することができる。したがって、リアルタイム速度論的ProteinLdAb結合データは、代表的な溶液状態のdAbパネルに対する表面プラズモン共鳴BIAcoreによって得られた。4ドメインProteinLPmagnus3316由来;SigmaP3101およびビオチン化ProteinA別称bPpA;SigmaP2165を、pH45酢酸バッファーBIAcore中で10μgmlに希釈し、BIAcoreCM5チップに固定化した。この結果、下記を保持するチップとなった:Fc1ブランク、Fc2363RUbPpA、およびFc3311RUProteinL。チップ表面へのdAbの再結合を最小限にとどめるために、ProteinLの表面密度は低く、しかも流速は高くして使用した。既知の代表的な溶液状態SECMALLSによりあらかじめ測定の8つの精製VκdAbのパネルは、HBで25μMに希釈した後、156nMまで全体で5段階に2倍段階希釈した。結合は、各希釈物100μlを流速50μl分で注入し、BIAcore3000BIAcoreSweden機器上で600秒の解離時間をとることによって測定した。チップ表面は、サイクルの間に、pH25グリシンバッファーBIAcoreの25μlパルスで再生した。25μMのdAbのProteinL結合解析に関する代表的なセンサーグラムデータを示す図1。示されたセンサーグラムの配置および形は、調べた各dAbの濃度範囲の全体で維持された。ProteinLで誘導体化したチップの全体にdAbを注入した後、会合段階の終点反応ポイント1、図1参照、および解離段階に入って5分の時点反応ポイント2、図1参照に設定したレポートポイントを用いて、これらの時点でProteinLに結合したdAbの量を得ることができる関連対照フローセルから得られた値を上記データから差し引く。下記の等式を用いて、5分の時点で結合したdAbの割合B5とも呼ばれるを決定することができる:Resp1Resp2B5。当該dAbが単量体であるならば、B5は低い典型的には05が、当該dAbが二量体であれば、B5は高くなる典型的には60100。問題のdAbサンプルが単量体と二量体溶液状態の間の平衡状態で存在する場合、または単量体と二量体の混合物からなる場合、B5の値は、単量体と二量体dAbのB5の間となる。したがって、B5値は、当該dAbの予想される溶液状態を数字で表すものである。Vκ単量体および二量体に関するProteinL結合反応速度には明確な差異が示されたので、解離の速度および程度に基づいて、溶液状態間の区別が可能となった。それぞれのdAbに関する曲線の相対的配置および形は、分析した濃度に関わりなく不変であったことに留意すべきである。ラングミュアLangmuir11モデルへのカーブフィッティングは、onrateについてはこれが急激すぎると判断されたので試みられず、offratekdに関するフィッティングは、解離曲線の激しい二相性により妨げられた。関連の対照dAbを用いて、単量体および二量体が見いだされる範囲を明らかにすることができるので、dAbの溶液状態を予測することができる。さまざまなVL免疫グロブリン単一可変ドメインにおけるA43D変異の影響抗原に対する結合親和性を有するいくつかのdAbを取り上げ、変異を導入して、43位のアミノ酸をで置き換えた。変異は、部位特異的変異誘発によって導入した。下記のdAbを取り上げた: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溶液中の状態は上記のようにSECMALLSで測定した:表1:dAbおよびA43D変異体の生物物理学的性質元の境界面の残基で変異誘発させたDOM7h8またはDOM7h14ライブラリーの調製および解析背景:ヒト軽鎖サブグループhuVκIに由来する2つのVκdAbを変異解析のために選択したが、そのDOM7h8およびDOM7h14は、いずれもヒト血清アルブミンHSAと結合する。便宜のために、使用されたDOM7h8クローンは、BsaI制限酵素認識部位を除去するサイレント変異を有する。ヒトVκ軽鎖はProteinLに結合する下記のより詳細に記載する。ProteinL結合の維持は、免疫グロブリンドメインの適切なフォールディングを明確に示す。使用したDOM7h8およびDOM7h14のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は下記の通りである:DOM7h8ヌクレオチド配列:GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATC↓TGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCGGAATTCCCCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGACGTATAGGGTGCCTCCTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGアミノ酸配列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRNSPLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYRVPPTFGQGTKVEIKRDOM7h14ヌクレオチド配列:GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTGCGGCGTTGCCTAGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGアミノ酸配列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR上記dAbの生化学的性質を以下に示す。表2:DOM7h8およびDOM7h14の生物物理学的性質および抗原結合化学量論。DOM7h8は二量体としてHSAと結合する表2を参照されたい。元のVHVL境界面にある残基を分析のために選択した。これらの変異は、dAbに抗原結合活性を与える超可変CDR領域とは対照的に、Vκドメイン抗体の保存されたフレームワーク領域内にある。DOM7h14はPBS中250μM未満の濃度で主に単量体として存在する。DOM7h14を含めることによって、すでに主として単量体状態であるdAbの抗原結合およびProteinL結合活性に及ぼす、変異の影響を評価することが可能になる。実施例2ADOM7h8DOM7h8については、元のVHVL境界面にある残基、Q38、A43およびP44の変異を有する3つの個別のライブラリーを作製した:大腸菌発現ベクターpDOM5の中のDOM7h8を鋳型として用いて、部位特異的変異誘発によって変異を導入したpDOM5はLacZプロモーターの制御下で、pUC119に基づく発現ベクターである。部位特異的変異誘発は、鋳型である100ngプラスミドDNA、およびそれぞれ必要な変異を含有する相補的プライマーを用いて、PCRによって行った。反応は、25UPfuTurboポリメラーゼをPCR混合物100ngプラスミドテンプレート、プライマー、dNTP、1ホルムアミド1xPfuTurboバッファーに添加することにより、ホットスタートで開始した。反応は次の温度サイクルで行った94°C2分;18回;68°C2分;10°C保持。PCR反応物をQIAquickPCR精製キットQiagenで精製し、50μlH2Oで溶出した。精製DNAを、DpnINewEnglandBiolabsで1時間、制限酵素消化して、インプットプラスミドテンプレートを除去した。制限酵素処理したDNAサンプルをエタノール沈殿して、5μlH2Oに懸濁した。沈殿したDNAを、2xTYカルベニシリン01mgmlプレート上に蒔いた、化学的にコンピテントにした大腸菌細胞に入れて形質転換し、37°Cにて一晩インキュベートした。プライマーは次のとおりであった。Q38;5’GGGGCTTTCCCTGGTTTMNNCTGATACCAATTTAAATAGCTGC3’、A43;5’CCGATAGATCAGGAGCTTAGGMNNTTTCCCTGGTTTCTGCTG3’、P44;5’GGGAATTCCGATAGATCAGGAGCTTMNNGGCTTTCCCTGGTTTCTGCTG3’。多様性を導入するために使用されるNNKコドンは、20個のアミノ酸すべてとTAG終止コドンをコードする。ProteinLと結合すると確認されたクローンは、プライマーDOM8AGCGGATAACAATTTCACACAGGAを用いて配列決定した。各ライブラリーから96個のコロニーを無作為に採取して96ウェルプレートフォーマットに入れ、メーカーの説明書Novagenにしたがって、OnEx溶液1、2および3を添加した1ml2xTY01mgmlカルベニシリン中で発現させた。培養物はInforsHT振盪器内で、950rpm高湿度で3日間、30°Cにて増殖させた。細胞を遠心分離ベンチトップSorvall遠心機にて45krpm、30分によりペレットとし、上清75μlを等量のHBバッファーGEHealthcareに加えた。発現した上清を、ストレプトアビジンコートBIAcoreチップ495RUに結合したビオチン化ProteinLPierceを用いて、ProteinLの結合についてBIAcoreでスクリーニングした。ProteinLとの結合が確認されたクローンは、プライマーDOM8上記の配列番号16を用いて配列決定した。Q38、A43およびP44位でのアミノ酸変異のすべてを得るために、ライブラリーのランダムスクリーニングでは確認されなかったクローンを部位特異的変異誘発によって作製したが、これには、表3に挙げたプライマーとともに、鋳型として、大腸菌発現ベクターpDOM5中のDOM7h8を使用した。表3:NNKライブラリー上記において確認されなかったQ38、A43、またはP44位でのDOM7h8変異体の作製に使用したプライマーペアDOM7h8変異体のスクリーニング:コグネイトHSA結合およびスーパー抗原ProteinLに対するdAb結合活性の特徴を明らかにするために、細菌上清からの精製の前後で、Q38、A43、またはP44位のDOM7h8変異体をBIAcoreでスクリーニングした。精製タンパク質に対してSECおよびSECMALLSを使用し、親dAbおよび変異体のオリゴマー化状態の特徴を明らかにした。ProteinLおよびHSA結合活性に関する細菌上清中のdAbのスクリーニング:細菌クローンを採取して96ウェルプレートフォーマットに入れ、メーカーの説明書Novagenにしたがって、OnEx溶液1、2および3を添加した1ml2xTY01mgmlカルベニシリン中で発現させた。培養物はInforsHT振盪器内で、950rpm高湿度で3日間、30°Cにて増殖させた。細胞を遠心分離ベンチトップSorvall遠心機にて45k、30分によりペレットとし、上清75μlを等量のHBバッファーGEHealthcareに加えた。希釈された上清を、CM5BIAcoreチップ789RUにカップリングしたProteinLSigmaおよび同じCM5チップ6036RU上の別のフローセルに結合したHSAを用いて、ProteinLの結合についてBIAcoreでスクリーニングした表4~6を参照されたい。ProteinLおよびHSA結合をアッセイするための、ならびにSECおよびSECMALLS分析のための、VκdAbの精製:メーカーの説明書Novagenにしたがって、OnEx溶液1、2および3を添加した2xTYカルベニシリン100μgml、消泡剤、中の05l培養において、Q38、A43、またはP44位でのDOM7h8変異体を発現する全クローンからタンパク質を発現させた。培養物は、InforsHT振盪器内で、250rpmで3日間、30°Cにて増殖させた。培養物は、ベンチトップ遠心機で45分間4,500rpmで遠心分離し、回転させながら2時間StreamlineProteinL15mlにバッチ結合させることによって、清澄化した上清からタンパク質を精製した。高塩濃度PBSバッファーで十分に洗浄した後、01MグリシンpH2を用いてタンパク質を、95の純度で樹脂から溶出した。さらに生化学的生物物理学的な性質検討を行う前に、タンパク質を濃縮し、バッファーをPBSに交換した。1μM、500nM、250nM、125nM、625nMおよび3125nMの濃度範囲の精製タンパク質は、CM5チップ上の別々のフローセルにカップリングした、ProteinL311RUとの結合およびHSA559RUとの結合について、BIAcoreでアッセイした。親分子DOM7h8二量体より有意に早くProteinLから解離するクローンは、安定な単量体か、または二量体と平衡状態にある単量体のいずれかであるとされた図2;表4~6を参照されたい。精製タンパク質は、HSA結合についても分析し、抗原と接触するdAbのCDR領域のコンフォメーションに及ぼす変異の影響を評価した表4~6を参照されたい。05mgmlおよび16mgmlの濃度範囲で精製タンパク質を、SECおよびまたはSECMALLSで分析し、それらの溶液中での状態を明らかにした表4~6を参照されたい。表46:DOM7h8発現上清および精製タンパク質のBIAcoreおよび生物物理学的分析。網掛けした行は、DOM7h8VκdAb二量体を単量体化する変異を特定する。xはBIAcoreチップ上に固定化されたリガンドに結合しないことを示す;√はBIAcoreチップ上に固定化されたリガンドとの良好な結合を示す;√wはBIAcoreチップ上に固定化されたリガンドとの弱い結合を示す;Mは単量体を示す;Dは二量体を示す;MDは二量体と平衡状態にある単量体を示す;DTはサンプル中にdAb二量体および三量体が存在することを示す;は平衡状態でないMDが、より単量体に向かう傾向があることを示す。結論:P44での変異は、DOM7h8の溶液中の状態を変化させる。いくつかの変異が二量体DOM7h8を単量体化する。2BDOM7h14DOM7h14について、元のVHVL境界面にある残基、Q38、A43およびP44に変異を有する3つの個別のライブラリーを作製した。大腸菌発現ベクターpDOM5の中のDOM7h14を鋳型として使用し、さらに上記のようにNNKコドンを用いて、部位特異的変異誘発によって変異を導入した。プライマーは次のとおりであった:Q385’GGGGCTTTCCCTGGTTTMNNCTGGTACCAAGATAACTGAGACCC3’A435’CCACATGATCAGGAGCTTAGGMNNTTTCCCTGGTTTCTGCTG3’またはP445’GGAACGCCACATGATCAGGAGCTTMNNGGCTTTCCCTGGTTTCTGCTG3’スクリーニングするために、ライブラリーで大腸菌HB2151細胞を形質転換した。DOM7h14のQ38、A43、またはP44位での全アミノ酸バリアントの単離:プライマーDOM8上記配列番号16およびDOM9CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACを用いて、Q38、A43、もしくはP44位で変異させたDOM7h14ライブラリーからランダムに選択した96コロニーについて、コロニースクリーンPCRを行った。PCR産物を、DOM8上記配列番号16を用いて配列決定し、ProteinL結合を分析して、全dAbが発現されること、ならびにそれらがProteinL結合を維持していることを確認した。最初のスクリーニングの試みから得られないクローンは、下記のプライマーを用いて、部位特異的変異誘発で作製した表7:表7:NNKライブラリーにおいて確認されなかったQ38、A43、またはP44位でのDOM7h14変異体を作製するための部位特異的変異誘発用プライマーペアDOM7h14変異体のスクリーニング:VκdAbの構造、ひいては抗原結合活性に影響を及ぼすQ38、A43、またはP44での変異の可能性を特徴付けるために、単量体VκdAbDOM7h14のQ38、A43、またはP44位での全アミノ酸バリアントを、ProteinLおよびHSA結合活性についてBIAcoreでスクリーニングした。同一チップ上の別々のフローセルに存在するProteinLとの結合は、dAb発現が生じたこと、または損なわれなかったことを確認した。ProteinLおよびHSA結合に関する発現上清のスクリーニング:細菌クローンを採取して96ウェルプレートフォーマットに入れ、メーカーの説明書Novagenにしたがって、OnEx溶液1、2および3を添加した1ml2xTY01mgmlカルベニシリン中で発現させた。培養物はInforsHT振盪器内で、950rpm高湿度で3日間、30°Cにて増殖させた。細胞を遠心分離ベンチトップSorvall遠心機にて45k、30分によりペレットとし、上清75μlを等量のHBバッファーGEHealthcareに加えた。発現上清を、CM5BIAcoreチップ789RUにカップリングしたProteinLSigmaおよび同じCM5チップ6036RU上の別のフローセルにカップリングしたHSAを用いて、ProteinLの結合についてBIAcoreでスクリーニングした表8を参照されたい。表8:ProteinLおよび抗原HSA結合に関するDOM7h14発現上清のBIAcore分析。√は結合を示す;ndは未測定を示す。結論:調べたすべての変異体は、ProteinLに結合し、HSA結合を維持しているので、これは変異がdAb構造ひいては抗原結合に影響を与えないことを示す。PEP1519P44変異体のスクリーニング別のクローンで変異を引き起こすことの効果を究明するために、プライマーとともに、大腸菌発現ベクターpDOM5内のPEP1519を鋳型として使用して、PEP1519のP44での変異を部位特異的変異誘発により引き起こした。5’GCAGAAACCAGGGAAAGCCNNKAAGCTCCTGATCTATAGTGC3’、5’GCACTATAGATCAGGAGCTTMNNGGCTTTCCCTGGTTTCTGC3’。親PEP1519、ならびにPEP1519P44ライブラリーからランダムに選択した94コロニーを、96ウェルプレートフォーマットで、メーカーの説明書Novagenにしたがって、OnEx溶液1、2および3を添加した1ml2xTY01mgmlカルベニシリン中で発現させた。培養物はInforsHT振盪器内で、950rpm高湿度で3日間、30°Cにて増殖させた。細胞を遠心分離ベンチトップSorvall遠心機にて45krpm、30分によりペレットとし、上清75μlを等量のHBバッファーGEHealthcareに加えた。発現上清を、CM5BIAcoreチップにカップリングしたProteinLSigmaを用いて、ProteinLの結合についてBIAcore311RUでスクリーニングした。すべてのクローンはプライマーDOM8上記配列番号16を用いて配列決定した。親分子PEP1519二量体より有意に早くProteinLから解離するクローンは、安定な単量体か、または二量体と平衡状態にある単量体のいずれかであるとされた表9を参照されたい。表9:ProteinL結合に関するPEP1519P44変異体の上清スクリーニングDは二量体を示す;Mは単量体を示す;MDは単量体二量体を示す;ndは配列決定した94クローンの中に変異体が特定されなかったため未測定。結論:P44位でのDOM7h8変異体について見られたように、変異は、元の二量体PEP1519の溶液中の状態を変化させた。43位で変異させたナイーブなVκdAbプールの構築元のVHVL境界面での変異が、ナイーブライブラリーに関連するdAbライブラリーの単量体含量を高める可能性について、さらに理解を深めるために、4GVκdAbライブラリーWO2005093074に記載を用いて、部位特異的変異誘発により43位に変異を導入した。このアプローチによって、普遍的で幅広い視点で変異を分析することが可能となるが、それは、特定の変異が、さまざまなCDRの組み合わせおよび組成を越えて有効となることを示唆する。プライマーは、Fw2の43位をA43A、D、K、R、E、IまたはLのいずれかに変更するようにStratageneQuikchangeプライマー設計ソフトウェアで設計し、Sigmaで合成されたOD1μmolスケールまで合成し、PAGEで合成した。プライマー配列:A43AfwdgcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatcA43ArevgatcaggagcttaggggctttccctggtttctgcA43DfwdgcagaaaccagggaaagaccctaagctcctgatcA43DrevgatcaggagcttagggtctttccctggtttctgcA43KfwdaaattggtaccagcagaaaccagggaaaaagcctaagctcctgatcA43KrevgatcaggagcttaggctttttccctggtttctgctggtaccaatttA43RfwdgtaccagcagaaaccagggaaacggcctaagctcctgA43RrevcaggagcttaggccgtttccctggtttctgctggtacA43EfwdcagcagaaaccagggaaagagcctaagctcctgatctatgA43ErevcatagatcaggagcttaggctctttccctggtttctgctgA43IfwdggtaccagcagaaaccagggaaaatccctaagctcctA43IrevaggagcttagggattttccctggtttctgctggtaccA43LfwdtggtaccagcagaaaccagggaaactgcctaagctcctgaA43Lrevtcaggagcttaggcagtttccctggtttctgctggtacca50mlの2xTY培地カルベニシリン100μgmlに、pDOM10グリセロール原液中のナイーブ4GVκライブラリー50μlを接種し、37°Cにて一晩インキュベートした。QiagenQIAfiltermidiprepを用いて、メーカーの使用説明書にしたがって、プラスミドDNAを単離した。pDOM10は、dAbの可溶性発現のために設計されたプラスミドベクターである。これはpUC119ベクターを基にしており、発現はLacZプロモーターの制御下である。dAbの上清中への発現は、dAb遺伝子をN末端で、一般的なGASリーダーシグナルペプチドWO2005093074参照に融合させることによって確実となった。それに加えて、FLAGタグがdAbのC末端に付加された。部位特異的変異誘発反応は、StratageneQuikchangeIIキットを用いて、下記を除いてメーカーのプロトコールにしたがって行った。反応は次のように実施した:50μl反応液あたり5μl10x反応バッファー、155μl120ngpDOM10ナイーブ4GVκMidiprep、125μlフォワードプライマー125ng、125μlリバースプライマー125ng、1μldNTPミックス、3895μl滅菌水、1μlPfuultra。変異誘発は以下のPCRプログラムで行った。1.95°C30秒、2.95°C30秒、3.55°C1分、4.68°C4分、5.ステップ2~4を17サイクル、6.4°Cに保持。1μlDpnIを各反応液に添加し、37°Cにて1時間インキュベートした。5μlの各DpnI消化反応液を、50μlに分けたエレクトロコンピテントなHB2151大腸菌細胞と混合し、02cmエレクトロポレーションキュベットBioradに入れて30分間氷上でインキュベートし、標準的な大腸菌K12の設定25kVcm、25μF、200Ωでエレクトロポレーションすることによって、形質転換した。950μlの加温したSOC培地Invitrogen15544034を、エレクトロポレーション後直ちに加え、14mlFalconチューブに移し、37°Cにて200rpmで1時間インキュベートした。回収培養物のすべてをLBカルベニシリン100μgmlに蒔き330μlx3、37°Cにて一晩インキュベートした。QPix2XTを用いて、クローンを採取して、125μl2xTY2グルコース100μgmlカルベニシリンを容れた96ウェルプレートCorningに入れ、37°Cにて、250rpmで一晩、加湿インキュベーターNewBrunswick内でインキュベートした。発現培養は、各ライブラリープールから2プレートについて準備した:1mlTB個別のOnEx成分カルベニシリン100μgml消泡剤2滴を2ml深型ウェルブロックに加えた。培養物は30°Cにて750rpm、湿度85で3日間インキュベートした。その後、粗製上清を集め、4°Cにて4500rpmで30分間遠心して清澄化し、80°Cで保存した。ナイーブライブラリーをバックグラウンドとしてA43D、K、R、E、IおよびLについて、単量体化能力、発現、および安定化効果をランク付けする上記A43変異体ライブラリーから作製された粗製上清サンプルを、上記方法の項で記載のように、BIAcore3000機器BIAcoreSwedenを用いてProteinL結合により分析した。2つの別々のBIAcoreCM5チップを用いてデータを収集した;2つのチップはいずれも、フローセル2および3Fc2およびFc3において小量約500~700RUのProteinLで誘導体化されており、フローセル1Fc1においてブランクの活性化不活化表面を有する。結果を図3に示す。データ解析は、MicrosoftExcelにエクスポートされた、Fc21またはFc31からのレポートポイントテーブルを用いて行った。2つのレポートポイントは上記方法に含まれ、B5値が得られた。このB5値を用いてクローンをランク付けした。対照dAbDOM7h8二量体対照、64±5およびDOM413054単量体対照、4±5に対するB5値を用いて、クローンを、単量体SM、二量体SD、または迅速平衡状態REとして分類した。DOM413054のアミノ酸配列および核酸配列は下記の通りである:DOM413054ヌクレオチド配列:ATGTTATTTAAATCATTATCAAAATTAGCAACCGCAGCAGCATTTTTTGCAGGCGTGGCAACAGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGATATTTACCTGAATTTAGACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCAATTTTGGTTCCGAGTTGCAAAGTGGTGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATATGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCTACGTACTACTGTCAACCGTCTTTTTACTTCCCTTATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTAATAA配列番号73アミノ酸配列MLFKSLSKLATAAAFFAGVATASTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIYLNLDWYQQKPGKAPKLLINFGSELQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQPSFYFPYTFGQGTKVEIKRA配列番号74。次の場合はクローンをスプレッドシート分析から除外した:レスポンス150RU、かつレスポンス2負の値、もしくはレスポンス1負の値、または配列決定から43位の残基がAであるこれがSDMによって変更されたライブラリーの場合ことが判明した場合、または配列決定から推定上対をなしていないシステイン残基がdAb中に存在することが判明した場合。表10:GraphPadPrismソフトウェアで計算した、図20に関する統計学的まとめ結論:ProteinLBIAcoreスクリーンはA43ライブラリーの中でProteinL結合に相違があることを明らかにしたと思われた。概要グラフおよび表図3、表10、ならびにセンサーグラムの視覚的検討によって、各ライブラリーにわたるデータの全体的な傾向を判定することができる。単量体様結合プロフィールの強化が、A43D、A43IおよびA43Lライブラリーでもっとも明確に認められたこれはA43残基の、上記残基のいずれかへの置換もしくは変異が、結果として単量体集団を多く含有するライブラリーをもたらすことを示す。平均B5値のわずかな減少がA43KおよびA43Eライブラリーで見られたが、A43RライブラリーはWTと同等の値を生じた。SDDOM7h8およびSMDOM413054対照は、分析した14プレートの全体にわたって非常に再現性の高いB5値を示し、このことは、使用したBIAcoreチップが多くの再生サイクルを越えてその結合能力を保持していることを示唆した。Y36、L46またはY87でのDOM7h8変異体DOM7h8について、さらに3つの追加のライブラリーを、元のVHVL境界面の残基:Y36、L46およびY87での変異によって作製した。変異は、実施例2Aに記載の部位特異的変異誘発によって、下記のプライマーを用いて導入した:Y365’CTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCTGCTGMNNCCAATTTAAATAGCTGC3’L465’CAAAGGGGAATTCCGATAGATCAGMNNCTTAGGGGCTTTCCCTGG3’Y875’CTATACGTCTGTTGACAMNNGTACGTAGCAAAATCTTCAGG3’。多様性を導入するために使用されるNNKコドンは、全20個のアミノ酸およびTAG終止コドンをコードする。各ライブラリーからコロニーをランダムに採取して、プライマーDOM8およびDOM9前記を用いてコロニーPCRを行った。手短に述べると、単一コロニーをつまようじで採取して、23μlPlatinumBluePCRSupermix、1μlDOM8および1μlDOM9を含有するPCR混合液に入れた。反応はEppendorfMastercyclerGradient内で次のような温度サイクルで行った:95°C5分;30x。選別されたコロニーは、レプリカ平板法で2xTYCarb寒天平板上に蒔いて37°Cで一晩培養するか、または100μl2xTYCarbに接種してInforsHT振盪器で37°Cにて250rpmで一晩培養した。Y36、L46およびY87位での全アミノ酸バリアントを得るために、ライブラリーのランダムスクリーニングで確認されなかったクローンを、大腸菌発現ベクターpDOM5中のDOM7h8を鋳型として用い、表11に記載のプライマーを用いた、部位特異的変異誘発により作製した。表11:ランダムスクリーニングで発見されなかったY36、L46およびY87変異体を作製するためのプライマー。Y36、L46またはY87位でのDOM7h8変異体は、HSAおよびスーパー抗原ProteinLに対するdAb結合活性を特徴付けるために、BIAcoreによって、精製タンパク質としてスクリーニングした。Q38、A43またはP44位でのDOM7h8変異体を発現するすべてのクローンに由来するタンパク質を、メーカーの説明書NovagenにしたがってOnEx溶液1、2および3を添加した、2xTYカルベニシリン100μgml、消泡剤中で、50ml培養で発現させた。培養物はInforsHT振盪器において250rpmで30°Cにて3日間培養した。細胞を、遠心分離ベンチトップSorvall遠心機において45Kで30分によりペレットとし、発現されたdAbを上清から、PCC48TheAutomationPartnershipを用いてProteinLに対するアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製タンパク質は、可能な限り、1μMで、CM5チップ上の別々のフローセルにカップリングしたProteinL311RUとの結合、およびHSA559RUとの結合についてBIAcoreでアッセイした。親分子DOM7h8二量体より有意に早くProteinLから解離するクローンは、安定な単量体、または二量体と平衡状態にある単量体であるとされた。精製タンパク質は、HSA結合についても分析し、抗原と接触するdAbのCDR領域のコンフォメーションに及ぼす変異の影響を評価した表12を参照されたい。表12:DOM7h8精製タンパク質のProteinLおよび抗原HSA結合に関するBIAcore分析√は結合することを示す;xは結合しないことを示す;Mは単量体を示す;Dは二量体を示す;MDは二量体と平衡状態にある単量体を示す;ndは未測定を示す。全体をハイライトした変異体は単量体化して、HSA結合は壊れているが、L46DおよびY87L変異体は抗原結合を保持し、かつ安定な単量体を形成する。結論:DOM7h8親dAb分子の一部の変異体は、もはやHSAと結合しないが、それでもなお親の二量体状態は維持しており、それはProteinL結合の結果に基づく。これは、これらの変異が、見かけ上、ProteinL結合部位の完全性、または分子の二量体化状態に影響を与えることなく、HSA結合パラトープのコンフォメーションを破壊することを示唆する。Y36、L46またはY87でのいくつかの変異は、DOM7h8を単量体化すると思われる。変異体L46DおよびY87Lは、DOM7h8の単量体化を引き起こし、かつHSA結合を保持することが明らかになった。A43IおよびA43D変異は、下記のプライマーとともに、鋳型として大腸菌発現ベクターpET30a中のDOM7h1115を用いた部位特異的変異誘発によって、DOM7h1115に導入された:A43I5’AAGGATCAGGAGCTTAGGAATTTTCCCTGGTTTCTGCTG3’A43D5’AAGGATCAGGAGCTTAGGATCTTTCCCTGGTTTCTGCTG3’DOM7h1115のアミノ酸配列および核酸配列は次の通りである:DOM7h1115ヌクレオチド配列:GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGDOM7h1115アミノ酸配列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKRA43IおよびA43D変異は、下記のプライマーとともに、鋳型として大腸菌発現ベクターpET30a中のDOM7h1410を用いた部位特異的変異誘発によって、DOM7h1410に導入された:A43I5’CATGATCAGGAGCTTAGGAATTTTCCCTGGTTTCTGCTG3’A43D5’CATGATCAGGAGCTTAGGATCTTTCCCTGGTTTCTGCTG3’DOM7h1410のアミノ酸配列および核酸配列は次の通りである:DOM7h1410ヌクレオチド配列:GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGDOM7h1410アミノ酸配列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKR。親であるDOM7h1115、およびA43DもしくはA43I変異体、ならびに親のDOM7h1410、およびA43DもしくはA43I変異体のタンパク質を、2xTY培地中でOnExAutoinductionSystemを用いて、大腸菌細胞から発現させて精製した。精製親タンパク質もしくは変異タンパク質とHSAとの結合を、559RUHSAをカップリングさせた低密度CM5チップを用いてBiacore2000で分析した実施例の方法を参照されたい。タンパク質は1μM、05μM、025μM、62nM、32nM、16nMおよび8nM濃度で分析した。DOM7h1115のKDは38mMであり、DOM7h1115A43I変異体のKDは64nMである。変異体の抗原親和性は単量体のDOM7h1115親より1000倍向上している。A43DおよびA32I変異体の単量体状態は、分析用超遠心によって、別個に実証された。DOM7h1410のKDは26nMであり、A43IおよびA43D変異体のKDはそれぞれ117および131nMである。変異体は単量体DOM7h1410より抗原親和性が2倍向上している。A43DおよびA43I変異体の単量体状態は、分析用遠心によって、別個に実証された。表13:精製親タンパク質もしくは変異タンパク質とHSAとの結合分析の結果結論:驚くべきことに、抗体可変ドメインの元の境界面での変異が、パラトープに有利な影響を及ぼすことが示され、それによってドメイン抗体の抗原結合親和性が改善された。参考文献:Bathelemyetal2007ComprehensiveanalysisofthefactorscontributingtothestabilityandsolubilityofautonomoushumanVHdomainsJBiolChem283p36393654Chatellieretal1996FunctionalmappingoftheconservedresidueslocatedattheVLandVHdomaininterfaceofaFabJMolBiol246p16Chothiaetal1985DomainassociationinimmunoglobulinmoleculesthepackingofvariabledomainsJMolBiol186651663Fammetal2008ThermodynamicallystableaggregationresistantantibodydomainsthroughdirectedevolutionJMolBiol376p926931Jespersetal2004AggregationresistantdomainantibodiesselectedonphagebyheatdenaturationNatureBiotech22p11611165MatsuuraandPluckthun2003SelectionbasedonthefoldingpropertiesofproteinswithribosomedisplayFEBS539p2428MatsuuraandPluckthun2004StrategiesforselectionfromproteinlibrariescomposedofdenovodesignedsecondarystructuremodulesOriginsoflifeandevolutionofthebiosphere34p151157Raffenetal1998ReengineeringimmunoglobulindomaininteractionsbyintroductionofchargedresiduesProteinEngineering11p303309Sieberetal1998SelectingproteinswithimprovedstabilitybyaphagebasedmethodNature16p955960Stevensetal1980SelfassociationofthehumanimmunoglobulinкIlightchainsroleofthethirdhypervariableregionPNAS77pe11441148米国特許第6485943号。MethodforalteringantibodylightchaininteractionsVargasMadrazoandPazGarcia2003AnimprovedmodelofassociationforVHVLimmunoglobulindomainsasymmetriesbetweenVHandVLinthepackingofsomeoftheinterfaceresiduesJMolRecog16p113120"