"a図6に示されたヌクレオチド配列;baのヌクレオチド配列に対して少なくとも70同一性を示し、かつ自律的に複製でき、および/または自律的複製を誘導できるヌクレオチド配列;c自律的に複製できるaまたはbのヌクレオチド配列の断片;da、b、またはcのヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列;またはe前記ヌクレオチド配列のいずれかと比較して、遺伝子コードの縮重の結果として冗長であるヌクレオチド配列;を含む、再構成されたTTウイルスポリ核酸。a図6に示されたヌクレオチド配列;baのヌクレオチド配列に対して少なくとも70同一性を示し、かつ自律的に複製することができ、および/または自律的な複製を誘導することができるヌクレオチド配列;c自律的に複製することができるaまたはbのヌクレオチド配列の断片;da、bまたはcのヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列;またはe前記ヌクレオチド配列のいずれかと比較して、遺伝子コードの縮重の結果として冗長であるヌクレオチド配列:よりなる、請求項1記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸。前記a、b、c、dまたはeのヌクレオチド配列が、癌または自己免疫疾患に関連する哺乳動物蛋白質またはアレルゲンのシグネチャーモチーフを含有するポリペプチドをコードするポリ核酸に連結された、請求項1または2記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸。一本鎖または二本鎖の染色体外エピソームとして存在する、請求項1から3いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸。一本鎖DNAである、請求項1から4いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸。宿主細胞DNAに連結された、請求項1から5いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸。以下の特性:a成長-刺激;b癌遺伝子機能:c腫瘍サプレッサー遺伝子様機能;またはd自己免疫反応の刺激;のうちの少なくとも1つを有する、請求項6記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸。図8、9および11から13に示されたヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1から7いずれか1項に記載のTTウイルスポリ核酸。前記ポリペプチドが表1に示されたポリペプチドである、請求項1から8いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルス。請求項1から7いずれか1項に記載のポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプライマーであって、該プライマーが前記ポリ核酸を特異的に配列決定し、または特異的に増幅させるためのプライマーとして作用することができる、オリゴヌクレオチドプライマー。表2および図10に示されたヌクレオチド配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項10記載のオリゴヌクレオチドプライマー。請求項1から9いずれか1項に記載のポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、該プローブが前記ポリ核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチドプローブ。表2および図10に示されたヌクレオチド配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項12記載のオリゴヌクレオチドプローブ。検出可能に標識され、または固体支持体に付着された、請求項12または13記載のオリゴヌクレオチドプローブ。少なくとも13の塩基の長さを有する、請求項10もしくは11記載のオリゴヌクレオチドプライマー、または請求項12から14いずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。原核生物、真核生物またはウイルスの転写および翻訳制御エレメントに操作可能に連結された、請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸を含む発現ベクター。人工染色体である、請求項16記載の発現ベクター。請求項16または17記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸によってコードされたポリペプチド。請求項19記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片。検出可能に標識されている、請求項20記載の抗体またはその断片。請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸、または請求項19記載のポリペプチドの存在を決定するのに用いられる診断キットであって、請求項10、11または15記載のプライマー、請求項12から15いずれか1項に記載のプローブ、または請求項20または21記載の抗体を含む診断キット。癌または自己免疫疾患の素因または初期段階の診断用の診断剤組成物の調製のための、請求項10、11または15記載のプライマー、請求項12から15記載のいずれか1項に記載のプローブ、請求項19記載のポリペプチド、または請求項20または21記載の抗体の使用。生物学的試料における請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTVポリ核酸の検出方法であって、a試料ポリ核酸を抽出してもよく、b該ポリ核酸を請求項10または11記載の少なくとも1つのプライマー標識されたプライマーでもよいで増幅させ、および、c該増幅されたポリ核酸を検出することを含む、方法。生物学的試料中の請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTVポリ核酸の検出方法であって、a試料ポリ核酸を抽出してもよく、b前記ポリ核酸を請求項12から15いずれか1項に記載の少なくとも1つのプローブ標識されたプライマーでもよいとハイブリダイズさせ、および、c該ハイブリダイズされたポリ核酸を検出することを含む、方法。生物学的試料に存在する請求項19記載のポリペプチド、または請求項20もしくは21記載の抗体を検出する方法であって、a前記ポリペプチドまたは抗体の存在を調べる生物学的試料を接触させ、および、b該抗体および該ポリペプチドの間で形成された免疫学的複合体を検出することを含む、方法。請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸の発現を低下させ、または阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド。センス配列およびアンチセンス配列を含むiRNAであり、ここで、該センスおよびアンチセンス配列はRNAデュプレックスを形成し、および、該アンチセンス配列は請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸のヌクレオチド配列に対して十分に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項27記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。請求項20もしくは21記載の抗体、または請求項27もしくは28記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および適切な医薬担体を含む医薬組成物。癌または自己免疫疾患またはその初期段階の予防または治療用の医薬組成物の調製のための、請求項20もしくは21記載の抗体、または請求項27もしくは28記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。癌または自己免疫疾患またはその初期段階を予防し、または治療する方法で用いられる、請求項20もしくは21記載の抗体、または請求項27もしくは28記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。前記自己免疫疾患が多発性硬化症MS、喘息、多発性関節炎、糖尿病、紅斑性狼瘡、腹腔疾患、潰瘍性結腸炎、またはクローン病である請求項30または31記載の使用。前記癌が乳癌、結直腸癌、膵臓癌、頸癌、ホジキンリンパ腫、B-リンパ腫、急性リンパ球性白血病、またはバーキットリンパ腫である請求項30または31記載の使用。請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸、または請求項19記載のポリペプチドを含むワクチン。哺乳動物をTTウイルス感染に対して免疫化する方法において用いられる、請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸、または請求項19記載のポリペプチド。癌または自己免疫疾患を発生する危険性を決定するためのデータベースを生成させる方法であって、以下の工程:aエピソーム形態で存在する前記疾患のうちの少なくとも1つを患う患者からの試料中に存在してもよい、請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸に連結された宿主細胞DNAのヌクレオチド配列を決定し;および、b前記疾患に関して工程aにおいて決定された配列をデータベース中に蓄積する方法。癌または自己免疫疾患を発生する危険性があることが疑われる患者のそのような病気が発生する危険性を評価する方法であって、以下の工程:aエピソーム形態で存在する前記患者からの試料中に存在してもよい、請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTウイルスポリ核酸に連結されたゲノム宿主細胞DNAのヌクレオチド配列を決定し;次いで、b工程aにおいて決定された配列を請求項36記載の方法よって生成したデータベースに蓄積された配列と比較する;ことを含み、ここで、TTウイルスポリ核酸に連結された宿主細胞DNAの不存在、または該データベース中に提示されていないTTウイルスポリ核酸に連結されたゲノム宿主細胞DNAのみの存在が、そのような病気を発生する危険性の減少、または存在しないことを示す、方法。トルクテノウイルスTTVをインビトロで複製し、および増殖させる方法であって、以下の工程:a線状化されたTTVDNAを、高レベルのSV40大T抗原を発現する293TT細胞にトランスフェクトし;b当該細胞を採取し、およびTTVDNAの存在を示す細胞を単離し;c工程bで得られた細胞を少なくとも3日間培養し;およびd工程cの細胞を採取することを含む方法。前記TTVが請求項1から9いずれか1項に記載の再構成されたTTVである請求項38記載の方法。本発明は、a図6に示されたヌクレオチド配列;baのヌクレオチド配列に対して少なくとも70、80、90、95または少なくとも98同一性を示し、かつ自律的に複製することができるヌクレオチド配列;c自律的に複製することができおよび/または自律的複製を誘導することができるaまたはbのヌクレオチド配列の断片;da、bまたはcのヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列;またはe前記ヌクレオチド配列のいずれかと比較して、遺伝子コードの縮重の結果として冗長であるヌクレオチド配列;を含みまたはそれよりなり、ここにおいて、好ましくは、a、b、c、dまたはeの該ヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合を介して、癌または自己免疫疾患に関連する蛋白質のシグネチャーモチーフを含有する蛋白質をコードするポリ核酸に連結されていることを特徴とする再構成されたTTウイルスポリ核酸を提供する。好ましくは、該蛋白質は哺乳動物蛋白質である。特に好ましくは、該哺乳動物蛋白質はヒト蛋白質である。当該発明のもう1つの実施形態において、該蛋白質はグルテンのようなアレルゲンである。また、本発明は、自律的に複製することができる前記した本発明のヌクレオチド配列の断片も提供する。当業者であれば、過度な実験なくして全長分子の生物学的活性を依然として有する断片を導くことができる。しかしながら、該断片の長さは、臨界的ではなく、少なくとも45、55または65ntの長さを有する断片が好ましい。当業者であれば、いずれの核酸配列が図6のヌクレオチド配列に関連するか、またはいずれの断片が標準的なアッセイ、または後記実施例に記載されたアッセイを用いることによって依然として自律的に複製することができるかを容易に決定することができる。また、本発明は、先に与えたヌクレオチド配列のいずれかと比較して、遺伝子コードの縮重の結果として冗長であるポリ核酸配列も提供する。これらの変種ポリ核酸配列は、かくして、それらが由来するポリ核酸と同一のアミノ酸配列をコードする。用語ポリ核酸とは、一本鎖または二本鎖核酸配列をいう。ポリ核酸はデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたは修飾されたヌクレオチドよりなるものでよく、または治療目的に適合されていてもよい。好ましくは、再構成されたTTウイルスポリ核酸は一本鎖DNAである。好ましくは、当該発明の再構成されたTTウイルスポリ核酸は染色体外エピソームとして存在する。好ましくは、癌または自己免疫疾患、または自己免疫疾患に関連するアレルゲンに関連する哺乳動物蛋白質は表1に示された蛋白質である。表1ATTV-HD転写体および全長ゲノムから得られた推定蛋白質において同定されたシグネチャーモチーフの例プロタミン12ロイコトリエンB4受容体AIRE自己免疫調節剤グリアジンニューロペプチドYCHLAMIDIAOM3-クラミジアmol.模倣-心臓病アルギニン-リッチ参考Sospedraetal.,2005-molecularmimicryinMSオプシンサイクリンキナーゼプロキシソーム糖尿病ステロイド受容体バソプレッシンBDNF因子脳-由来神経栄養因子プレプロ-オレキシンコラーゲンらせん反復GIP受容体ニューロテンシンプリオンCD36抗原インスリン抵抗性欠乏、アテローム性硬化症カルシトニンプロスタノイドGABA受容体脳における主たる阻害性神経伝達物質アルギニンデアミナーゼオピオイド、成長因子受容体ゲラニンプレキシン/セマモルフィンNURRラットオーファン核ホルモン受容体脳由来神経栄養因子BDNコラゲナーゼエンドスタチンアエロリシンミエリンプロテオ脂質セロトニンムスカリン様受容体メラニン-濃縮ホルモン受容体シェーグレン症候群/強皮症自己-抗原p27プレキシン/セマフォリング/インテグリンタイプ反復シグネチャー雄特異的蛋白質ガストリンコラーゲンコラゲナーゼメタロプロテアーゼBaa配列整列DomainSweepは以下の蛋白質ファミリーデータベースをスキャンするのに種々のサーチ方法を使用する:BLOCKSPFAMAPRINTSPRODOMPROSITESMARTSUPERFAMILYTIGRFAMSオプシンgbCsCt38.4ikn.2.154オプシンRH3RH4_3:1のドメイン1、46から56:スコア8.4、E=5.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クエリrheuef241148長さ148タイプP>IPB0081611/1は合わせたE-値をブロックする=0.0075:コラーゲンらせん反復ブロックフレーム位置aaブロックE-値IPB00816106710900068他の報告された整列IPB008161Q9L470STAEP1076GKPAEPGKPAEPGKPAEPGTPAEPGKPAEPGTPAEPGKPAEPGrheuef24114867HLATTLGRPPRPGPPGGPRTPQIRnLPALPAPQGEPGDRATWRクエリrheuef238rev1482774sreformat長さ148>IPB0081611/1は合わせたE-値をブロックする=0.0075:コラーゲンらせん反復ブロックフレーム位置aaブロックE-値IPB00816106710900068他の報告された整列IPB008161Q9L470STAEP1076GKPAEPGKPAEPGKPAEPGTPAEPGKPAEPGTPAEPGKPAEPGrheuef238rev14867HLATTLGRPPRPGPPGGPRTPQIRnLPALPAPQGEPGDRATWRHMMER2.3.22003年10月著作権C1992-2003HHMI/ワシントン大学医学部GNU一般公衆利用許諾GPL下で自由に頒布HMMファイルpfamhmm配列ファイルrheuef241148コラーゲン:1のドメイン1、73から133:スコア-74.8、E=3.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>IPB0039831/6は合わせたE-値をブロックする=0.0094:ロイコトリエンB4タイプ1受容体シグネチャーブロックフレーム位置aaブロックE-値IPB003983C0284400096他の報告された整列141アミノ酸IPB003983AAABBCCCDDDEEEFFrheucd215rev17CCCIPB003983CC27LT4R1RATQ9R0Q2206GRRLQARRFRRSRRTGRrheucd215rev1728rRRrpARRFRaRRRvrRzpr5B412dk209長さ:209タイプ:Pファミリーストランドブラック合わせた値IPB003983ロイコトリエンB4タイプ1受容体表示6のうちの100078zpr5B412dk>IPB0039831/6は合わせたE-値をブロックする=0.0078:ロイコトリエンB4タイプ1受容体シグネチャーブロックフレーム位置aaブロックE値IPB003983C0324800081他の報告された整列141aminoacidsIPB003983AAABBCCCDDDEEEFFzpr5B412dk2092CCCIPB003983CC31Q9WTK1Q9WTK1CAVPO207SRRLRVRRFHRRRRTGRzpr5B412dk209232rRRpRrRRvRRRRRwrRシェーグレン症候群/強皮症自己抗原1自己抗原p27HMMER2.3.22003年10月著作権C1992-2003HHMI/ワシントン大学医学部GNU一般公衆利用許諾GPL下で自由に頒布HMMファイル:pfamhmm配列ファイル:rheucd211rev164Autoantip271のドメイン1、117から156:スコア-12.1、E=4.6eiskkmaelLlkGatMLdehCpkCGtPLFrlKdGkvfCPiCeRaGgrRrGrRtGsPsEGArvRaGgrRrGrRtGsPsEGArvTQAgRverrGWRTWDksSsSLvqPFRLtrWRtRYKtiRinisLGPpGGWRqALLAGLisLGPpGGWRqALLAGLEWRslGvqqslGWvhKtEtdasLHPLLqKmPmvDpEAqAPtKqPPkLAPGAWGWaRGAPRPPPssseLsrGrggprcmsmplvRsPsEtPGPrPAGParDEPAEWiFDvqnPdevaknsskikvkqRvqPessvqRzc3r11B411NVQDPEEQNESSRFRVQQR29gc;CD36抗原gx;PR01610gn;化合物13ga;2001年12月23日gt;接着分子CD36シグネチャーgp;PRINTS;PR01609CD36FAMILY;PR01611LIMPIIgp;MIM;173510gr1OKUMURATANDJAMIESONGAgrPlateletglycocalicinOrientationofglycoproteinsonthehumanplateletgrsurfacegrJBIOLCHEM25159445949gr2NICHOLSONACFEBBRAIOMHANJSILVERSTEINRLANDgrHAJJARDPgrCD36inatherosclerosisTheroleofaclassBmacrophagescavengerreceptorgrANNNYACADSCI902128131gr3SILVERSTEINRLANDFEBBRAIOMgrCD36andatherosclerosisgrCURROPINLIPIDOL11483491gr4SAVILLJHOGGNRENYANDHASLETTCgrThrombospondincooperateswithCD36andthevitronectinreceptorgrinmacrophagerecognitionofneutrophilsundergoingapoptosisgrJCLININVEST9015131522gr5TANDONNNKRALISZUANDJAMIESONGAgrIdentificationofglycoproteinIVasaprimaryreceptorgrforplateletcollagenadhesiongrJBIOLCHEM26475767583gr6MCGREGORJLCATIMELBPARMENTIERSCLEZARDINPDECHAVANNEMgrANDLEUNGLLgrRapidpurificationandpartialcharacterizationofhumanplateletgrglycoproteinIIIbInteractionwiththrombospondinanditsroleinplateletgraggregationgrJBIOLCHEM264501506gr7BARNWELLJWASCHASNACHMANRLYAMAYAMAIKAWAMANDgrINGRAVALLOPgrAhuman88KDmembraneglycoproteinfunctionsinvitroasareceptorgrforacytoadherenceligandonPlasmodiumfalciparuminfectederythrocytesgrJCLININVEST84765772gr8BULLHABRICKELLPMANDDOWDPMgrSrcrelatedproteintyrosinekinasesarephysicallyassociatedwiththegrsurfaceantigenCD36inhumandermalmicrovascularendothelialcellsgrFEBSLETT3514144gr9MIYAOKAKKUWASAKOTHIRANOKNOZAKISYAMASHITASgrANDMATSUZAWAYgrCD36deficiencyassociatedwithinsulinresistancegrLANCET357686687gd;CD36は、単球、マクロファージ、血小板、ミクロ血管内皮細胞および脂肪組織[2]によって発現された膜貫通の高度にグリコシル化された88kDa糖蛋白質[1]である。gd;それは、酸化されたLDLOxLDL、長鎖脂肪酸、アニオン性リン脂質、アポトーシス細胞、トロンボスポンジンTSP、コラーゲンおよび熱帯熱マラリア-感染赤血球に結合する多機能受容体である。gd;CD36は多数の細胞機能を有する。それは、マクロファージによるOxLDLの摂取において主要な役割をする、タイプBスカベンジャー受容体である。次いで、該脂質-リッチなマクロファージは泡沫細胞に分化し、アテローム性動脈硬化症病巣の形成に寄与する[3]。gd;加えて、マクロファージのCD36は、TSPおよびインテグリンアルファvベータ3と一緒に、アポトーシス好中球を貧食できる[4]。gd;さらに、該蛋白質は血小板接着および凝集におけるコラーゲンの受容体のうちの1つである[5,6]。gd;CD36もまた、異なる器官の毛細管後小静脈の内皮に対する熱帯熱マラリア-感染赤血球の細胞接着を媒介することができる[7]。gd;さらに、細胞質CD36は、Srcファミリーチロシンキナーゼと相互作用することによって単一の変換において重要な役割をする[8]。gd;アジアおよびアフリカの人口におけるCD36の欠乏はインスリン抵抗性と関連付けられている[9]。gd;CD36はCD36接着分子についてのシグネチャーを提供する13-エレメントのフィンガープリントである。該フィンガープリントは4つの配列の最初の整列に由来し、CD36接着分子を特徴付けるが、それらを、CD36のファミリーの残りから識別するセクションに焦点を当てており:gd;モチーフ1は最初の推定N-末端TMドメインにわたり;モチーフ2-12は細胞外ドメインに存在し;およびモチーフ13は第二の推定C-末端TMドメインにわたる。SPTR4018Fでの2つの反復は収束に到達するのに必要であり、その時点において、6つの配列を含む真の組が同定された。bb;fc;CD36抗原3fl23ft接着分子CD36モチーフIII2fdWVFDVQNPEEVAKNSSKIKVIQRCD36RAT6518fdWIFDVQNPDDVAKNSSKIKVKQRCD36MOUSE6518fdWIFDVQNPDEVTVNSSKIKVKQRCD36BOVIN6518fdWIFDVQNPQEVMMNSSNIQVKQRCD36HUMAN6518fdWIFDVQNPDEVAVNSSKIKVKQRCD36MESAU6518fdWIFDVQNPEEVAKNSSKIKVKQRO357546618ミエリンプロテオ脂質蛋白質PLPシグネチャーHMMER2.3.22003年10月著作権C1992-2003HHMI/ワシントン大学医学部GNU一般公衆利用許諾GPL下で自由に頒布HMMファイル:printshmm配列ファイルzc312B1120dtrrev48009sreformatミエリンPO5:1のドメイン1、70から91:スコア-0.1、E=9.3gc;ミエリンPLPgx;PR00214gn;化合物7ga;1994年7月11日;更新1999年6月7日gt;ミエリンプロテオ脂質蛋白質PLPシグネチャーgp;INTERPRO;IPR001614gp;PROSITE;PS00575ミエリン_PLP_1;PS01004ミエリン_PLP_2gp;BLOCKS;BL00575gp;PFAM;PF01275ミエリン_PLPgr1SAKAMOTOYKITAMURAKYOSHIMURAKNISHIJIMATANDUYEMURAKgrCompleteaminoacidsequenceofP0proteininbovineperipheralnervegrmyelingrJBIOLCHEM26242084214gr2SHAWSYLAURSENRAANDLEESMBgrIdentificationofthiolgroupsandadisulfidecrosslinksiteinbovinegrmyelinproteolipidproteingrFEBSLETT250306310gr3DIEHLHJSCHAICHMBUDZINSKIRMANDSTOFFELWgrIndividualexonsencodetheintegralmembranedomainsofhumanmyelingrproteolipidproteingrPROCNATLACADSCIUSA8398079811gd;ミエリン鞘は、絶縁体として機能して、軸索インパルス伝導の速度を大いに増加させる、神経系にとってユニークな多層膜である[1]。gd;ミエリンプロテオ脂質蛋白質PLPは中枢神経系の神経の鞘で見出される主要な蛋白質である[2]。gd;それは膜4回にわたり[3]、および多数-ラメラ構造の形成または維持において役割をしていると考えられる。gd;該蛋白質は数個のシステイン残基、ジスルフィド結合の形成に関与するいくつか、パルミトイル化されている他のものを含有する[2]。gd;PLPにおける突然変異の結果、ヒトにおけるペリツェウス‐メルツバッハー病、マウスにおけるジンピーおよびイヌにおけるシェーキングパップのような神経学的障害をもたらす。gd;ミエリンPLPはミエリンプロテオ脂質蛋白質についてのシグネチャーを提供する7-エレメントフィンガープリントである。該フィンガープリントは4つの配列の最初の整列に由来し:モチーフ1、2、5および7は4回膜貫通TMドメインをコードし-gd;モチーフ4はPROSITEパターンミエリンPLP1PS00575によってコードされる領域を含み、これは第二および第三のTMセグメントの間に位置し、かつパルミトイル化された2つのCys残基を含有し;gd;モチーフ7は、PROSITEパターンミエリンPLP2によってコードされた領域の部分を含むPS01004。gd;OWL23.2での2つの反復は収束に到達するのに必要であり、その時点において、9つの配列を含む真の組が同定された。数個の部分的マッチもまた見出され、その全ては欠失突然変異体またはミエリンPLP断片である。gd;SPTR379fについての更新は8つの配列の真の組、および9つの部分的マッチを同定した。クラミジアOMHMMER2.3.22003年10月著作権C1992-2003HHMI/ワシントン大学医学部GNU一般公衆利用許諾GPL下で自由に頒布HMMファイル:printshmm配列ファイル:xheucd212rp36522305sreformatクラミジアOM33:1のドメイン1、88から100:スコア4.6、E=9.7gr;抗原模倣を介して連結されたクラミジア感染および心臓病。gd;やはりリポ蛋白質であると考えられる3つのシステイン-リッチ蛋白質はクラミジア外側膜の細胞外マトリックスを形成する[1]。gd;それらは基本小体EBおよび網様体RB相の双方の必須の構造的一体性に関与する。これらの細菌はほとんどのグラム-陰性微生物に共通のペプチドグリカン層を欠如するので、そのような蛋白質は生物の病原性において高度に重要である。gd;これらのうち最大は主要外側膜蛋白質MOMPであって、該膜についての全蛋白質の60程度を構成する[2]。gd;OMP2は58kDaの分子質量を持つ2番目に大きく、他方、OMP3蛋白質は~15kDaである[1]。MOMPは最大の免疫応答を誘導すると考えられ、最近、ネズミ心筋特異的アルファミオシンに対するその配列類似性を通じて心臓病に関連付けられた[3]。gd;gd;OMP3ファミリーはクラミジア細胞のEB段階の間に外側膜において構造的な役割をし、および異なるビオバルはペプチド電荷レベルにおいて小さいが、高度に有意な変化を示す[1]。このファミリーのメンバーはC.trachomatis、C.pneumoniae、およびC.psittaciを含む。gd;gd;クラミジアOM3は、クラミジアのシステイン-リッチな外側膜3蛋白質OMP3ファミリーについてのシグネチャーを提供する3-エレメントフィンガープリントである。gd;該フィンガープリントは3つの配列の最初の整列から由来し:gd;モチーフは十分な整列長さ~90アミノ酸にわたる保存された領域から引き出された。gd;SPTR3710Fでの2つの反復は収束に到達するのに必要であり、その時点において、8つの配列を含む真の組が同定された。また、本発明は、先に定義されたポリ核酸の一部を含む、またはそれよりなるオリゴヌクレオチドプライマーに関し、該プライマーは当該発明のTTウイルスHCRポリ核酸および付着された細胞宿主DNA配列を特異的に配列決定し、または特異的に増幅するためのプライマーとして作用することができる。用語プライマーとは、コピーされるべき核酸ストランドに対して相補的なプライマー延長産物の合成のための開始点として作用することができる一本鎖DNAオリゴヌクレオチド配列をいう。プライマーの長さおよび配列は、それらが延長産物の合成の起点となることを可能とするものでなければならない。好ましくは、プライマーは約5から50ヌクレオチドである。特異的な長さおよび配列は、必要とされるDNAおよびRNA標的の複雑性に、ならびに温度およびイオン強度のようなプライマーの使用条件に依存する。増幅プライマーは対応する鋳型配列と正確に一致して、適切な増幅を保証する必要はないという事実は、文献に十分に記載されている。用いる該増幅方法はポリメラーゼ鎖反応PCR、リガーゼ鎖反応LCR、核酸配列-ベースの増幅NASBA、転写-ベースの増幅系TAS、ストランド変位増幅SDA、またはプライマー延長を用いて核酸分子を増幅するためのQβレプリカーゼまたはいずれかの他の適切な方法による増幅であり得る。増幅の間に、増幅された産物は、便宜には、標識されたプライマーを用い、または標識されたヌクレオチドを取り込むことによってのいずれかにより、標識することができる。標識は同位体32P、35S等または非-同位体ビオチン、ジゴキシゲニン等であってよい。増幅反応は20および70回の間、有利には、25および45回の間反復される。当該分野で知られた種々の配列決定反応のいずれかを用いて、ウイルス遺伝子情報を直接的に配列決定し、および試料の配列を対応するアミノ酸配列に翻訳することによってorfを決定することができる。例示的な配列決定反応は、SangerまたはMaxamおよびGilbertによって開発された技術に基づくものを含む。また、種々の自動配列決定手法は、質量分析法による配列決定を含めた対象のアッセイを行う場合に利用してもよい例えば:PCT公開国際公開第94/16101号パンフレット参照。当業者にとって、例えば、2または3のみの核酸塩基の出現は配列決定反応において決定される必要があるのは明らかであろう。好ましくは、これらのプライマーは長さが約5から50ヌクレオチド、より好ましくは約10から25ヌクレオチドである。最も好ましいのは、少なくとも13塩基の長さを有するプライマーである。好ましい実施形態において、本発明のプライマーは表2に示されたヌクレオチド配列を有する。また、本発明は、先に定義された再構成されたTTウイルスポリ核酸の一部を含む、またはそれよりなるオリゴヌクレオチドプローブにも関し、該プローブは、本発明によるTTV核酸の特異的検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして作用することができる。用語プローブとは、検出されるべき再構成されたTTVポリ核酸の標的配列に対して相補的な配列を有する一本鎖配列-特異的オリゴヌクレオチドをいう。好ましくは、これらのプローブは長さが約5から50ヌクレオチド、より好ましくは約10から25ヌクレオチドである。最も好ましくは、少なくとも13塩基の長さを有するプローブである。該プローブは標識されているか、または固体支持体に付着させることができる。用語固体支持体とは、オリゴヌクレオチドプローブをカップリングさせることができるいずれの基質もいうことができ、但し、それはそのハイブリダイゼーション特徴を保有し、および但し、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルが低いままであるものとする。通常、固体基質はマイクロタイタ-プレート、膜例えば、ナイロンまたはニトロセルロースまたはミクロスフィアビーズである。膜への適用または固定に先立ち、核酸プローブを修飾して、固定を促進し、またはハイブリダイゼーション有効性を改良するのが便宜である。そのような修飾はホモポリマーテイリング、脂肪族基、NH2基、SH基、カルボン酸基のような異なる反応性基とのカップリング、またはビオチンまたはハプテンのカップリングを含むことができる。プライマーまたはプローブとして用いられた本発明によるオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、アルキルホスホリエートまたはペプチド核酸のようなヌクレオチドアナログも含み、またはそれよりなるものであってよく、インターカレーティング剤を含有してもよい。これらの修飾は、オリゴヌクレオチドを用いて、必要な特異性および感受性を得るべき条件に関して適合を必要とする。しかしながら、最終的な結果は、修飾されていないオリゴヌクレオチドで得られたものと実質的に同一である。これらの修飾の導入は、ハイブリダイゼーション動態学、ハイブリッド-形成の可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性等のような特徴に積極的に影響させるためには有利である。当該発明のポリ核酸は、いずれかの種類の組成物中に含まれてよい。該組成物は診断、治療または予防の用途のためであってよい。また、本発明内には、ヌクレオチド配列のいずれかから選択されたポリ核酸の配列変種であり、該配列変種は1以上のヌクレオチドの欠失および/または挿入いずれか、特に、主として、オリゴヌクレオチドの末端3’または5’いずれかにおける1以上のコドンの挿入または欠失、または修飾されたヌクレオチドおよび/またはイノシンを含めた他のものによるいくつかの非-必須ヌクレオチドの置換を含有する。図1に示された配列と同様である本発明による再構成されたTTVポリ核酸配列が、配列-特異的プライマーによる増幅、多かれ少なかれストリンジェントな条件下での配列-特異的プローブとのハイブリダイゼーション、TTVの遺伝的情報の配列決定等のような、当該分野で知られた技術のいずれかに従って特徴付け、および単離することができる。また、本発明は、原核生物、真核生物またはウイルス転写および翻訳制御エレメントに操作可能に連結された先に定義された当該発明の再構成されたTTVポリ核酸を含む組換え発現ベクターにも関する。用語ベクターはプラスミド、コスミド、人工染色体、ファージ、またはウイルスまたはトランスジェニック非-ヒト動物を含んでもよい。ワクチン開発で特に有用なのはTTウイルス組換え分子、BCGまたはアデノウイルスベクター、ならびに禽痘組換えウイルスであってよい。本発明の関係内で用いられる用語組換えにより発現されたとは、以下に詳細に議論されるように、原核生物、下等または高等真核生物におけるものである、本発明のポリペプチドは組換え発現方法によって生産されるという事実をいう。用語下等真核生物とは、酵母、真菌等の宿主細胞をいう。下等真核生物は一般的にしかしながら必ずしもそうではない単細胞である。好ましい下等真核生物は酵母、特に、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluiveromyces、Pichia例えば、Pichiapastoris、Hansenula例えば、Hansenulapolymorph、Schwaniomyces、Schizosaccharomyces、Yarowia、Zygosaccharomyces等内の種である。Saccharomycescerevisiae、S.carlsbergensisおよびK.lactisは最も普通に用いられる酵母宿主であって、便宜な真菌宿主である。用語高等真核生物とは、哺乳動物、爬虫類、昆虫等のような高等生物に由来する宿主細胞をいう。現在好ましい高等真核生物宿主細胞はチャイニーズハムスター例えば、CHO、サル例えば、COSおよびVero細胞、ベビーハムスター腎臓BHK、ブタ腎臓PK15、ウサギ腎臓13細胞RK13、ヒト骨肉腫細胞系143B、ヒト細胞系HeLaおよびHepG2のようなヒト関腫瘍細胞系、および昆虫細胞系例えば、Spodopterafrugiperdaに由来する。宿主細胞は懸濁液またはフラスコ培養、組織培養、器官培養等において供することができる。別法として、宿主細胞はトランスジェニック非-ヒト動物であってもよい。用語原核生物とは、E.coli、Lactobacillus、Lactococcus、Salmonella、Streptococcus、BacillussubtilisまたはStreptomycesのような宿主をいう。また、これらの宿主は本発明内のものであると考えられる。用語宿主細胞とは、組換えベクターまたは他の導入ポリヌクレオチドに対する受容体として用いることができ、または用いられてきた細胞をいい、トランスフェクトされている元来の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、天然、偶然の、または故意の突然変異または組換えのため、形態において、または元来の親としてのゲノムまたは全DNA相補体において必ずしも完全に同一でなくてもよいものと理解されている。用語レプリコンは、いずれかの遺伝子エレメント、例えば、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律ユニットとして挙動する、すなわち、それ自体の制御の下で複製できるプラスミド、染色体、ウイルス、コスミド等である。用語ベクターは、所望のオープンリーディングフレームの複製および/または発現を提供する配列をさらに含むレプリコンである。用語制御エレメントとは、それらが連結されるコーディング配列の発現を行うのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存して異なり;原核生物においては、そのような制御配列は一般にはプロモータ、リボソーム結合部位、スプライシング部位およびターミネータを含み;真核生物においては、一般に、そのような制御配列はプロモータ、スプライシング部位、ターミネータおよび、いくつかの例においては、エンハンサーを含む。用語制御エレメントは、最小限、その存在が発現に必要である全ての成分を含むことが意図され、およびその存在が有利である追加の成分、例えば、分泌を支配するリーダー配列も含んでよい。用語プロモータは、mRNAの生産が隣接する構造遺伝子についての正常な転写開始部位において開始するように、RNAポリメラーゼをDNA鋳型への結合を可能とするコンセンサス配列よりなるヌクレオチド配列である。表現操作可能に連結したとは並置をいい、そこでは、そのように記載された成分は、それらがそれらの意図されたように機能するのを可能とする関係にある。コーディング配列に操作可能に連結された制御配列は、コーディング配列の発現が対照配列と適合する条件下で達成されるように連結される。ベクター配列に挿入された所望の配列をコードする再構成されたTTVDNAのセグメントはシグナル配列に付着されてもよい。該シグナル配列は非-TTV源からのものであってよいが、本発明によると特に好ましい構築体は、各蛋白質の開始点前にTTVゲノムに出現するシグナル配列を含有する。高等真核生物はベクターで形質転換してもよく、または組換えウイルス、例えば、組換えワクニシアウイルスで感染させてもよい。外来性DNAのワクシニアウイルスへの挿入用の技術およびベクターは当該分野でよく知られており、および例えば相同組換えを利用する。全て哺乳動物発現に必要な、広く種々のウイルスプロモータ配列、恐らくはターミネータ配列およびポリA-負荷配列、恐らくはエンハンサー配列および恐らくは増幅配列は当該分野で入手可能である。ワクシニアは特に好ましい。というのは、ワクシニアは宿主細胞の蛋白質の発現を停止させるからである。ヒトのワクチン接種では、禽痘およびアンカラ修飾ウイルスMVAが特に有用なベクターである。また、ヘルパー-独立性ウイルス発現ベクターである、バキュロウイルスAutographacalifornica核多角体ウイルスAcnpvに由来する昆虫発現導入ベクターも知られている。この系に由来する発現ベクターは、通常、強力なウイルスポリヒドリン遺伝子プロモータを用いて、異種遺伝子の発現を駆動させる。異なるベクターならびに異種DNAのバキュロウイルスの所望の部位への導入のための方法は、バキュロウイルス発現のために当業者に入手可能である。また、昆虫細胞によって認識される翻訳後修飾のための異なるシグナルが当該分野で知られている。また、本発明は、先に定義された組換えベクターで形質転換された前記定義の宿主細胞もいう。本発明は、先に定義された再構成されたTTVポリ核酸、または実質的に類似のかつ生物学的に同等なその一部またはアナログによってコードされたアミノ酸配列を有するポリペプチドにも関する。好ましくは、このポリペプチドは、哺乳動物蛋白質のシグネチャーモチーフを含有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。用語ポリペプチドとはアミノ酸ポリマーをいい、生成物の特異的な長さをいわない。かくして、ペプチド、オリゴペプチド、または蛋白質はポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化等をいわず、またはそれらを排除する。該定義内に含まれるのは、例えば、共に天然に生じるおよび天然に生じない、例えば、非天然アミノ酸、ペプチド核酸PNA等を含めたアミノ酸の1以上のアナログを含有するポリペプチド、置換された連結を持つポリペプチド、ならびに当該分野で知られた他の修飾である。明細書および特許請求の範囲を通じて用いられる生物学的に同等なとは、組成物が先にまたは後に定義される当該発明のポリペプチドと免疫原性的に同等であることを意味する。ポリペプチドを記載するのに明細書および特許請求の範囲全体を通じて用いられる実質的に相同なとは、当該発明のポリペプチドに対するアミノ酸配列における相同性の程度を意味する。好ましくは、相同性の程度は70過剰、好ましくは80過剰であり、蛋白質の特に好ましい群は当該発明のポリペプチドに対して90過剰、または95さえ相同である。本発明のポリペプチドを記載するための明細書を通じて用いられる用語アナログは、1以上の残基が生物学的に同等な残基で保存的に置換されている本明細書中で具体的に示した配列に対して実質的に同一のアミノ酸残基配列を有するいずれのポリペプチドも含む。保存的置換の例は、もう1つのものに代えてのイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような1つの非極性疎水性残基の置換、アルギニンおよびリシンの間、グルタミンおよびアスパラギンの間の、グリシンおよびセリンの間のようなもう1つのものに代えての1つの極性親水性残基の置換、もう1つのものに代えてのリシン、アルギニンまたはヒスチジンのような1つの塩基性残基の置換、またはもう1つのものに代えてのアスパラギン酸またはグルタミン酸のような1つの酸性残基の置換を含む。フレーズ保存的置換は、非-誘導体化残基の代わりの化学的に誘導体化された残基の使用も含むが、但し、得られた蛋白質またはペプチドは当該発明の蛋白質またはペプチドに対して生物学的に同等なものとする。化学的誘導体とは、機能的側鎖の基の反応によって化学的に誘導体化された1以上の残基を有する蛋白質またはペプチドをいう。そのような誘導体化分子の例は、限定されるものではないが、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンズオキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子を含む。遊離カルボキシル基は誘導体化して、塩、メチルおよびエチルエステル、または他のタイプのエステルまたはヒドラジドを形成してもよい。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されて、O-アシルまたはO-アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化して、N-イムベンジルヒスチジンを形成してもよい。それらの蛋白質またはペプチドもまた、20の標準アミノ酸の1以上の天然に生じるアミノ酸誘導体を含有する化学的誘導体として含まれる。例えば:4-ヒドロキシプロリンはプロリンに代えて置換することができ;5-ヒドロキシリシンはリシンに代えて置換することができ;3-メチルヒスチジンはヒスチジンに代えて置換することができ;ホモセリンはセリンに代えて置換することができ;オルニチンはリシンに代えて置換することができる。本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドが当該発明のポリペプチドと生物学的に同等である限り、1以上の付加および/または欠失、またはその配列が本明細書中に示されたポリペプチドの配列に対する残基を有するいかなるポリペプチドも含む。本発明によるポリペプチドは、好ましくは少なくとも3、好ましくは4または5の連続アミノ酸、6または7の好ましいが少なくとも8つの連続アミノ酸、少なくとも10または少なくとも15を含有する。本発明のポリペプチドは、古典的な化学的合成によって調製することができる。合成は、均一溶液中で、または固体相によって行うことができる。例えば、用いることができる均一溶液中での合成技術は、E.Wunshによって編集されたMethodederorganischenChemie有機化学の方法と題された書籍、vol.15-IetII.THIEME.Stuttgart1974においてHoubenweylによって記載されたものである。本発明のポリペプチドは、例えば、Solidphasepeptidesynthesisと題された書籍IRLPress,Oxford,1989においてAthertonおよびShepardによって記載された方法に従って固相で調製することもできる。本発明によるポリペプチドは、例えば、Maniatisetal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork,ColdSpringHarborLaboratory,1982によって記載されているような組換えDNA技術によって調製することもできる。本発明は:a適当な細胞宿主を、先に定義されたポリ核酸またはその一部が適切な調節エレメントの制御下で挿入されている組換えベクターで形質転換し、b該インサートの発現を可能とする条件下で該形質転換された細胞宿主を培養し、およびc該ポリペプチドを採取することを含む、先に定義された組換えポリペプチドの生産方法にも関する。本発明は、先に定義された少なくとも1つのポリペプチドでの免疫化に際して生起した抗体にも関し、該抗体は該ポリペプチドのいずれかと特異的に反応性であり、および該抗体は好ましくはモノクローナル抗体である。用語抗体は、好ましくは、異なるエピトープ特異性を持つプールされたモノクローナル抗体より実質的になる抗体、ならびに明確に区別されるモノクローナル抗体調製物に関する。モノクローナル抗体は、当業者によく知られた方法によって、当該発明のTTVポリ核酸またはその断片によってコードされたポリペプチドを例えば含有する抗原から作成される。本明細書中で用いるように、用語抗体Abまたはモノクローナル抗体Mabは無傷分子ならびに蛋白質に特異的に結合することができる例えば、FabおよびFab’2断片のような抗体断片を含ませるつもりである。FabおよびFab’2断片は無傷抗体のFc断片を欠如し、循環からより迅速に除去され、および無傷抗体よりも非-特異性が低い組織結合を有してもよい。かくして、これらの断片は好ましく、ならびにFABまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明の目的で有用な抗体はキメラの単一鎖、およびヒト化抗体を含む。好ましくは、該抗体またはその抗原結合断片は検出可能な標識を運ぶ。抗体/断片は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、バイオルミネセント化合物、ケミルミネセント化合物、金属キレーターまたは酵素で直接的または間接的に検出可能に標識することができる。当業者であれば、抗体に結合させるための他の適当な標識を知っており、またはルーチン的な実験を用いてそれを確認することができるであろう。本発明は、当該発明のTTウイルスポリ核酸またはポリペプチドの存在を決定するのに用いられる診断キットに関し、該キットは当該発明のプライマー、プローブ、および/または抗体を含む。別法として、本発明は:a試料ポリ核酸を抽出してもよく、b先に定義された少なくとも1つのプライマー、標識されたプライマーで前記したポリ核酸を増幅させてもよく、次いで、c増幅されたポリ核酸を検出することを含む、生物学的試料に存在する本発明による再構成されたTTVポリ核酸の検出のための方法に関する。用語ポリ核酸は、分析物ストランドということもでき、一本鎖または二本鎖ポリ核酸分子に対応する。用語標識されたとは、標識された核酸の使用をいう。これは、増幅または標識プライマーのポリメラーゼ工程の間に、または当業者に知られたいずれかの他の方法によって取り込まれた標識されたヌクレオチドの使用を含むこともできる。本発明は:a試料ポリ核酸を抽出してもよく、b先に定義されたポリ核酸を先に定義された少なくとも1つのプローブでハイブリダイズさせ、次に、cハイブリダイズされたポリ核酸を検出することを含む、生物学的試料に存在する当該発明による再構成されたTTVポリ核酸の検出のための方法にも関する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はストリンジェントとして理解されるべきであり、一般に当該分野で知られている例えば、Maniatisetal.,MolecularCloning;ALaboratoryManual,NewYork,ColdSpringHarborLaboratory,1982。しかしながら、ハイブリダイゼーション溶液SSC、SSPE等によると、これらのプローブは、それらの適切な温度にてハイブリダイズして、十分な特異性を達成すべきである。ハイブリダイゼーション溶液SSC、SSPE等によると、これらのプローブはそれらの適切な温度にてストリンジェントにハイブリダイズして、十分な特異性を達成すべきである。しかしながら、いずれかの端部3’または5’いずれかの1または数個のヌクレオチドを付加または欠失させることによって、またはいくつかの非-必須ヌクレオチドすなわち、タイプの間の区別にとって必須ではないヌクレオチドを修飾されたヌクレオチドまたはイノシンを含めた他のものによって置換することによって、DNAプローブをわずかに修飾することにより、これらのプローブまたはその変種を同一のハイブリダイゼーション条件すなわち、同一の温度および同一のハイブリダイゼーション溶液において特異的にハイブリダイズさせることができる。また、用いるプローブの量濃度を変化させることは、より特異的なハイブリダイゼーション結果を得るのに有益である。この関係で、同一長さのプローブは、それらのGC含有量に拘わらず、TMACI溶液中でほぼ同一の温度にて特異的にハイブリダイズすることに注意すべきである。試料中のオリゴヌクレオチドプローブおよびポリ核酸配列の間で形成されたハイブリッドを検出するための本発明の目的で適当なアッセイ方法は、慣用的なドット-ブロット様式、サンドイッチハイブリダイゼーションまたは可逆的ハイブリダイゼーションのような、当該分野で知られたアッセイ様式のいずれを含んでもよい。例えば、検出は、ドットブロット様式を用いて達成することができ、標識されていない増幅されていない試料は膜に結合し、該膜は適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で少なくとも1つの標識されたプローブと一体化され、および結合したプローブの存在はモニターされる。別法および好ましい方法は、可逆的ドット-ブロット様式であり、そこでは、増幅された配列は標識を含有する。この様式においては、標識されていないオリゴヌクレオチドプローブは固体支持体に結合され、および適当なストリンジェントハイブリダイゼーションおよび引き続いての洗浄条件下で標識された試料に暴露される。試料のポリ核酸および本発明によるオリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリッドの形成に依拠するいずれの他のアッセイ方法も用いてもよいことは理解されるべきである。また、本発明は:a先に定義されたそのようなポリペプチドまたは抗体の存在について生物学的試料を接触させ、次いでb該抗体および該ポリペプチドの間で形成された免疫学的複合体を検出することを含む、本発明の再構成されたTTVポリ核酸によってコードされたポリペプチドまたは生物学的試料に存在する該ポリペプチドに対する抗体を検出するための方法にも関する。本発明によるイムノアッセイ方法は、本発明の新しくかつユニークなポリペプチド配列の異なるドメインからの抗原を利用してもよい。例えば、単一のまたは特異的オリゴマー抗原、ダイマー抗原、ならびに単一または特異的オリゴマー抗原を用いるのは本発明の範囲内のものである。本発明のTTV抗原は、抗体を検出するために公知の抗原を使用する実質的にいずれのアッセイ様式においても使用することができる。勿論、TTV立体配座エピトープを変性する様式は避けるべきか、または適合させるべきである。これらのアッセイの共通の特徴は、抗原を、TTV抗体を含有することが疑われる体成分と、該抗原が該成分に存在するいずれのそのような抗体に結合することも可能とする条件下で接触させることである。そのような条件は、典型的には、過剰な抗原を用いる生理学的温度、pHおよびイオン強度である。抗原と検体とのインキュベーションに続いて、抗原を含む免疫複合体の検出を行う。イムノアッセイの設計は、多量の変異に従い、および多くの様式が当該分野で知られている。プロトコルは、例えば、固体支持体、または免疫沈澱を用いてもよい。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み;標識は、例えば、酵素、蛍光、ケミルミネセント、放射性活性、または色素分子であってよい。シグナルを免疫複合体から増幅させるアッセイもまた知られており;その例は、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンを利用するアッセイ、およびELISAアッセイのような、酵素-標識および媒介イムノアッセイである。イムノアッセイは不均一または均一様式における、標準的なまたは競合的タイプのものであってよい。不均一様式においては、ペプチドは、典型的には、固体マトリックスまたは支持体に結合して、インキュベーションの後に、ポリペプチドから試料の分離を促進する。用いることができる固体支持体の例は、例えば、膜またはマイクロタイタ-ウエル形態のニトロセルロース、例えば、シートまたはマイクロタイタ-ウエルにおけるポリ塩化ビニル、例えば、ビーズまたはマイクロタイタ-プレートにおけるポリスチレンラテックス、イミュノロンImmunolonとして知られたポリフッ化ビニリデン、ジアゾ化された紙、ナイロン膜、活性化されたビーズ、およびプロテインAビーズである。抗原ポリペプチドを含有する固体支持体は、典型的には、テスト試料からそれを分離した後に、かつ結合した抗体の検出に先立って洗浄する。標準および競合的標識の双方は当該分野で知られている。均一様式では、テスト試料を溶液中で抗原の組合せと共にインキュベートする。例えば、それは形成されるいずれかの抗原-抗体複合体を沈澱させる条件下であってよい。これらのアッセイのための標準的および競合的様式の双方は当該分野で知られている。標準的な様式においては、抗体-抗原複合体におけるTTV抗体の量は直接的にモニターされる。これは、抗-TTV抗体上のエピトープを認識する標識された抗-異種間例えば、抗-ヒト抗体が複合体形成により結合するか否かを決定することによって達成することができる。競合様式において、試料中のTTV抗体の量は、複合体における標識された抗体または他の競合リガンドの既知の量の結合に対する競合効果をモニターすることによって推論される。抗-TTV抗体を含む形成された複合体または競合アッセイの場合には、競合する抗体の量は、様式に応じて、多数の公知の技術のうちのいずれかによって検出される。例えば、複合体における標識されていないTTV抗体は、標識例えば、酵素標識と複合体化された抗-異種間Igのコンジュゲートを用いて検出することができる。免疫沈澱または凝集アッセイ様式においては、TTV抗原および抗体の間の反応は、溶液または懸濁液から沈澱するネットワークを形成し、および沈澱の見える層またはフィルムを形成する。抗-TTV抗体がテスト検体に存在しないならば、目に見える沈澱は形成されない。現在、3つの特異的タイプの粒子凝集PAアッセイが存在する。これらのアッセイは、支持体にコーティングされた場合に、種々の抗原に対する抗体の検出で用いられる。このアッセイの1つのタイプは、RBCに対して受動的に吸着する抗原または抗体によって増感される赤血球細胞RBCを用いる赤血球凝集アッセイである。身体の構成要素に存在する特異的抗原-抗体の付加は、ある場合、精製された抗原で被覆されたRBCを凝集させる。赤血球凝集アッセイにおける可能な非-特異的反応を排除するために、PAにおけるRBCの代わりに2つの人工的な担体を用いてもよい。これらの最も共通するのはラテックス粒子である。選択された固相はポリマーまたはガラスビーズ、ニトロセルロース、ミクロ粒子、反応トレイのミクロウエル、試験管および磁気ビーズを含むことができる。シグナル発生化合物は酵素、ルミネセント化合物、色原体、放射性活性元素およびケミルミネセント化合物を含むことができる。酵素の例はアルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびベータ-ガラクトシダーゼを含む。エンハンサー化合物の例はビオチン、抗-ビオチンおよびアビジンを含む。エンハンサー化合物結合メンバーの例はビオチン、抗-ビオチンおよびアビジンを含む。前記方法は、患者の細胞内の特定の宿主遺伝子または遺伝子断片に連結されたサブゲノムTTVポリヌクレオチド配列の存在の有害効果による癌または自己免疫疾患のような病気を発生させる危険性を評価するのに有用であって、適切な対応策を取るのを可能とする。また、本発明は、当該発明の再構成されたTTウイルスポリ核酸に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはiRNAにも関する。適当なアンチセンスオリコヌクレオチドまたはiRNAの生成は、アンチセンス相互作用が、所望の効果、例えば、ポリペプチドの発現の阻害が得られるように起こるには、再構成されたTTウイルスポリ核酸内での部位または複数部位の決定を含む。好ましい遺伝子内部位はa当該遺伝子のオープンリーディングフレームORFの翻訳開始または終止コドンを含む領域またはbループまたはバルジである、すなわち、二次的構造の一部ではないmRNAの領域である。一旦1以上の標識部位が同定されたならば、標識に対して十分に相補的な、すなわち、十分によく、かつ十分な特異性をもってハイブリダイズして、所望の効果を与えるオリゴヌクレオチドが選択される。本発明との関係では、ハイブリダイゼージョンは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基の間の、ワトソン-クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってよい水素結合を意味する。本明細書で用いるように、相補的なとは、2つのヌクレオチドの間の正確な対合についての能力をいう。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置におけるヌクレオチドがDNAまたはRNA分子の同一位置にあるヌクレオチドと水素結合できるならば、該オリゴヌクレオチドおよび該DNAまたはRNAは、その位置において相互に対して相補的であると考えられる。該オリゴヌクレオチドおよび該DNAまたはRNAは、各分子における十分な数の対応する位置が、相互に水素結合できるヌクレオチドによって占められている場合、相互に対して相補的である。かくして、特異的にハイブリダイズ可能および相補的は、オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNA標的の間で安定かつ特異的な結合が起こるように、相補性または正確な対合の十分な程度を示すように用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸のそれに対して100相補的である必要はないと当該分野で理解されている。アンチセンス化合物は、標的DNAまたはRNA分子への化合物の結合が標的DNAまたはRNAの正常な機能に干渉して、利用性の喪失を引き起こし、かつ特異的な結合が望まれる条件下で、すなわち、治療的処置の場合において、アンチセンス化合物の非-標的配列への非-特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。アンチセンス化合物との関係でのオリゴヌクレオチドとは、リボ核酸RNAまたはデオキシリボ核酸DNAのオリゴマーまたはポリマー、またはそのミメティックスをいう。この用語は、天然に生じるヌクレオベース、糖およびヌクレオチド間骨格共有結合ならびに同様に機能する天然に生じない部分を有するオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾された、または置換されたオリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば、増強された細胞摂取、核酸標的に対する増強された親和性およびヌクレアーゼの存在下での増加した安定性のような望ましい特性のため、天然の形態よりも好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明では、限定されるものではないが、後に記載されるように、オリゴヌクレオチドミメティックスを含めた他のオリゴマーアンチセンス化合物を含む。本発明に従ったアンチセンス化合物は約8から約50ヌクレオベースすなわち、約8から約50の連結されたヌクレオシドを含む。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチド、なおより好ましくは、約15から約25ヌクレオベースを含むものである。アンチセンス化合物はリボザイム、外部ガイド配列EGS、オリゴヌクレオチドオリゴ酵素、および標的核酸にハイブリダイズし、かつその発現を阻害する、他の短い触媒RNAまたは触媒オリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物はセンス配列およびアンチセンス配列を含むiRNAも含み、ここにおいて、該センスおよびアンチセンス配列はRNAデュプレックスを形成し、およびここにおいて、該アンチセンス配列は本発明のTTウイルスポリ核酸のヌクレオチド配列に対して十分に相補的なヌクレオチド配列を含む。別法として、本発明は、例えば、哺乳動物宿主において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを転写するのを可能とするベクターを提供する。好ましくは、そのようなベクターは遺伝子治療で有用なベクターである。遺伝子治療で有用な好ましいベクターはウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクニシア、またはより好ましくは、レトロウイルスのようなRNAウイルスである。なおより好ましくは、レトロウイルスベクターはネズミまたは鳥類レトロウイルスの誘導体である。本発明で用いることができるそのようなレトロウイルスベクターの例は、モロニ-ネズミ白血病ウイルスMoMuLV、ハーベイHarveyネズミ肉腫ウイルスHaMuSV、ネズミ乳腺腫瘍ウイルスMuMTVおよびラウス肉腫ウイルスRSVである。最も好ましくは、ネズミベクターと比較してより広い宿主範囲を提供するテナガザル白血病ウイルスGaLVのような非-ヒト霊長類レトロウイルスベクターが使用される。組換えレトロウイルスは欠陥があるので、感染性粒子を生じさせるのに援助が必要である。そのような援助は、例えば、LTR内の調節配列の制御下にあるレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系と用いることによって供することができる。適当なヘルパー細胞系は、当業者によく知られている。該ベクターは、加えて、形質導入細胞を同定することができるように、選択マーカーをコードする遺伝子を含有することができる。さらに、レトロウイルスベクターはそれらが標的特異的となるように修飾することができる。これは、例えば、糖、糖脂質、または蛋白質、好ましくは抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって達成することができる。当業者であれば、標的特異的ベクターを生じさせるためのさらなる方法を知っている。インビトロ-またはインビボ遺伝子治療のためのさらなる適切なベクターおよび方法は文献に記載されており、当業者に知られている;例えば、国際公開第94/29469号パンフレットまたは国際公開第97/00957号パンフレット参照。標的器官においてのみ発現を達成するためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドの転写のためのDNA配列は組織特異的プロモータに連結させることができ、かつ遺伝子治療で用いることができる。そのようなプロモータは当業者によく知られている。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、共通して、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するといわれる。RNAおよびDNAの正常な連結または骨格は3’から5’ホスホジエステル結合である。本発明で有用な好ましいアンチセンス化合物の特異的例は、修飾された骨格または非-天然ヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドを含む。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは骨格中にリン原子を保有するもの、および骨格中にリン原子を有しないものを含む。増大した安定性をもたらすことができる修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は当業者に知られており、好ましくは、そのような修飾はホスホロチオエート連結である。好ましいオリゴヌクレオチドミメティックは、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチドミメティックであって、ペプチド核酸PNAといわれる。PNA化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖-骨格はアミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。ヌクレオベースは保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合される。修飾されたオリゴヌクレオチドは1以上の置換されたまたは修飾された糖部位も含有してもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは2’位置における以下のうちの1つを含む:OH;F;O-、S-、またはN-アルキル;O-、S-、またはN-アルケニル;O-、S-またはN-アルキニル;またはO-アルキル-O-アルキル、ここにおいて、該アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換された、または置換されていないC1からC10アルキルまたはC2からC10アルケニルおよびアルキニルであってよい。特に好ましい修飾された糖部位は2’-O-メトキシエチル糖部位である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはヌクレオベースの修飾または置換を含んでもよい。修飾されたヌクレオベースは5-メチルシトシン5-me-C、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン等のような他の合成および天然ヌクレオベースを含み、5-メチルシトシン置換が好ましい。というのは、これらの修飾は核酸デュプレックスの安定性を増加させることが示されているからである。当該発明のオリゴヌクレオチドのもう1つの修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布まては細胞摂取を増強させる1以上の部位またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に連結させることを含む。そのような部位はコレステロール部位、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪族鎖などの脂質部位、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、ポリアミドまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部位、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部位を含む。本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。キメラアンチセンス化合物またはキメラは、本発明との関係では、各々が少なくとも1つのモノマーユニット、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドよりなる、2以上の化学的に区別される領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも1つの領域を含有し、ここにおいて、オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する増大した抵抗性、増大した細胞摂取、および/または標的核酸に対する増大した結合親和性を付与するように修飾されている。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを開裂させることができる酵素に対する基質として働くことができる。例として、RNaseHは、RN:DNAデュプレックスのRNAストランドを開裂させる細胞エンドヌクレアーゼである。従って、RNaseHの活性化の結果、RNA標的が開裂され、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率性を大いに増強させる。結果として、匹敵する結果が、しばしば、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラオリゴヌクレオチドが用いられる場合により短いオリゴヌクレオチドで得ることができる。当該発明のキメラアンチセンス化合物は、2以上の前記したようなオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/またはオリゴヌクレオチドミメティックスの複合構造として形成できることができる。そのような化合物は当該分野においてはハイブリッドまたはギャップマーとしてもいわれてきた。本発明は、本発明の抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、および適当な賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物にも関する。好ましくは、医薬組成物においては、前記したようなそのような組成物は医薬上許容される担体と合わせられる。医薬上される許容されるは、有効成分の生物学的活性の有効性と干渉せず、それが投与される宿主に対して毒性を持たないいずれかの担体を含ませるつもりである。適当な医薬担体の例は当該分野でよく知られており、リン酸緩衝化生理食塩水、水、油/水エマルジョンのようなエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液等を含む。そのような担体は慣用的な方法によって処方することができ、および活性な化合物は有効な用量で対象に投与することができる。有効な用量とは、病気を妨げ、または病気の経過および重症度に影響するのに十分であり、そのような病理学の低下または緩解に導く有効成分の量をいう。これらの病気または障害を治療し、および/または予防するのに有用な有効な用量は、当業者に知られた方法を用いて決定することができる。適切な組成物の投与は、異なる方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって行うことができる。投与の経路は、勿論、療法の種類および医薬組成物に含有された化合物の種類に依存する。投与計画は主治医および他の臨床的因子によって決定される。医学分野においてよく知られているように、いずれかの一人の患者についての用量は、患者のサイズ、身体の表面積、年齢、性別、投与すべき特定の化合物、投与の時間および経路、療法の種類、一般的な健康および同時に投与されるべき他の薬物を含めた多くの因子に依存する。本発明の好ましい実施形態において、予防/治療可能な疾患は、多発性硬化症MSまたはいずれかの他の神経学的病気、喘息、多発性関節炎、糖尿病、紅斑性狼瘡、腹腔病、潰瘍性結腸炎、またはクローン病のような自己免疫疾患またはその初期段階である。用語自己免疫疾患は、未だ知られていない自己免疫病をやはり含む。また、本発明は、a癌または自己免疫疾患を発生する危険性の決定用のデータベースを生じさせるための方法であって、以下の工程:i本発明による、好ましくは、存在する場合、該病気の少なくとも1つを患う患者からの試料中の、エピソーム形態で存在する再構成されたTTウイルスポリ核酸に連結されたゲノム宿主細胞DNAのヌクレオチド配列を決定し;およびiiデータベース中の該病気に関連する工程aにおいて決定された配列を蓄積することを含む方法;ならびにb癌または自己免疫疾患が発生する危険性があることが疑われる患者のそのような病気に対する危険性を評価するための方法であって、以下の工程:i本発明によるかつ好ましくは、存在する場合、該患者からの試料中のエピソーム形態で存在する再構成されたTTウイルスポリ核酸に連結されたゲノム宿主細胞DNAのヌクレオチド配列を決定し;およびii工程aにおいて決定された配列を前記した方法によって生じさせたデータベース中に蓄積された配列と比較することを含み、ここにおいて、TTウイルスポリ核酸に連結されたゲノム宿主細胞DNAの不存在、または該データベース中に表されていないTTウイルスポリ核酸に連結された宿主細胞DNAのみの存在はそのような病気を発生する危険性が減少し、または存在しないことを示すことを特徴とする方法も提供する。最後に、本発明は、トルクテノウイルスTTV、好ましくは本発明による再構成されたTTVのインビトロ複製および増殖のための方法であって、以下の工程:aSV40大T抗原の高いレベル、好ましくは、少なくとも、Buckatal.2004において報告されたレベルを発現する線状化されたTTVDNAを293TT細胞にトランスフェクトし;b該細胞を採取し、およびTTVDNAの存在を示す細胞を単離し;c実験条件および関心があるTTVタイプに依存して、bで得られた細胞を少なくとも3日間、好ましくは少なくとも1週間以上の間培養し;およびd工程cの細胞を採取する:方法も提供する。以下の実施例は当該発明を説明する。材料および方法ATTウイルスの単離および特徴付けTTウイルス単離体TTV-HD3aTTH8、受け入れ番号AJ620231およびTTV-HD1atth25、受け入れ番号AJ620222の単離は従前に記載したJelcicetal.,2004。TTV-HD3aおよびTTV-HD1aの双方の全長ゲノム配列を、各々、制限酵素SalILeppikatal.,2007およびEcoR1を用いてベクターpUC18にクローン化した。さらなるTTV配列を、従前に記載したように、プライマーNG472/NG352およびNG473/NG351を用いるDNAネステッド増幅によってヒト試料中で同定したPengetal.,2002;Leppiketal.,2007。多数のバイオプシーおよび血清試料についてのDNAの限定された入手可能性は、TempliPhiキットGEHealthcareでのローリングサークル増幅を用いる先立っての増幅を必要とした。全ての増幅された産物をクローン化し、および配列決定したLeppiketal.,2007。TTウイルスDNAを保有する試料は、TaKaRaLATaq酵素TAKARABIOINC.,日本国および最初に同定されたTTVDNA配列に基づいて設計された各プライマーを用いる長距離-PCR増幅に引き続いて付した。これらの逆並列プライマーは以下の組合せを含んだ:tth25-1sおよびtth25-2as、jt34f-1Sおよびjt34f-2as、jt34f-7sおよびjt34f-8as、jt34f-5sおよびjt34f-6as、tth4-1sおよびtth4-2as、t3pb-1sおよびt3pb-2as、ならびにtth8-1sおよびtth-2as表2。長-PCR増幅は、プライマーの組合せt3pb-1/2、jt34f-5/6およびtth4を例外として、従前に記載されたタッチダウン段階的反応を用いて行ったLeppiketal.,2007。t3pb-1/2およびjt34f-5/6-プライマーでのPCR増幅のためのPCR条件は1分間の94°Cにおける最初の変性、続いての、30秒間の94°Cの30サイクル、1分間の65°Cにおけるアニーリング、および10分間の72°Cにおける最終の伸長と共に4分間の72°Cにおける伸長であった。tth4プライマーでの増幅のためのPCR条件は、アニーリングを68°Cで行った以外は同様であった。3.8kbの範囲の全ての得られたアンプリコンを溶出させ、およびゲル電気泳動後に精製し、ベクターpCR2.1TA-Cloning-Kit,Invitrogenに溶出させ、およびNovaBlueSinglesCompetent細胞MerckChemicals,UKにおいて増幅させた。全ての全長ゲノムを双方のストランドを通じて配列決定した。合計53の全長ゲノムが得られた。B配列分析および系統学DNA配列を、HUSARソフトウエアパッケージJelcicetal.,2004を用いて全てのデータバンクで入手可能なTTV配列を比較した。大きなオープンリーディングフレーム1ORF1のDNA配列に基づいて、ICTVは、最近、TTウイルスをアネロウイルス科に分類したBiaginiおよびdeMicco、2010。得られた単離体のゲノムの特徴付けは、ORF1領域における配列の再構成を明らかとした。アルファトルクウイルス族および単離体の全長ゲノムを、従って、従前に記載されたように系統学的分析に付したJelcicetal.,2004。系統学的系統樹図4は、グラスゴー大学のTreeviewプログラムを用いて提示した。翻訳されたORFを相同蛋白質および機能的ドメインについてProtSweepdelValetal.,2004を用いることによって分析した。C細胞の培養およびトランスフェクションヒト胚腎臓細胞系293TTBucketal.,2004を、10胎児子ウシ血清、1Glutamax、1非-必須アミノ酸共にInvitrogen,Karlsruhe、ドイツ国および400μg/mlヒグロマイシンBRocheDiagnostics,Mannheimを補足したDMEMに維持した。線状化されたウイルスDNA6-ウエルプレート上のウエル当たり2μgを、製造業者の指示Feietal.,2005に従って、リポフェクタミン試薬Invitrogenを用いてヒグロマイシンBなくして成長させた細胞にトランスフェクトした。培養基2mlに、37°Cにおける4時間のインキュベーションに先立って800μlのOpti-MEMを補足した。トランスフェクトされた培養を、引き続いて、ヒグロマイシンBを含有する新鮮な培地と共にインキュベートし、および密集に到達すると増殖させた。12のTTV単離体の全長ゲノムを、全ての時点において平行して、トランスフェクトし、維持し、および採取した。TTウイルスゲノムはTTV-HD14a、TTV-HD14b、TTV-HD14c、TTV-HD14e、TTV-HD15a、TTV-HD16a、TTV-HD20a、TTV-HD3a、TTV-HD1a、TTV-HD23a、TTV-HD23bおよびTTV-HD23dを含んだ表3。ウイルスDNAはトランスフェクションに先立ってベクターから放出した。対照はベクター単独でのトランスフェクションを含み、および細胞を1×TEでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞および培養基を-80°Cで凍結し、およびDNAおよびRNA抽出用の試料を増殖の間に各時点において採取した。RNeasyminiキットQiagen,Hilden,ドイツ国を用い、DNAをフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコールおよびRNAで抽出した。ウイルスDNAの複製をモニターし、および前記したように長-PCR増幅によって実証した。全てのトランスフェクション実験は、一次トランスフェクションの間に6週間の間隔で3回行った。凍結された細胞または精製されたウイルス調製物を4から6回の間継代した。Dウイルスの増殖、精製および電子顕微鏡観察振盪、続いて、200gにおける10分間の遠心によって、トランスフェクトされた細胞をフラスコから採取した。細胞ペレットをDPBS-MgInvitrogenに再懸濁し、234,000gにおける3.5時間の27-33-39OptiprepSigma,St.Louis,Mo工程グラジエントで分離したBucketal.,2005。グラジエントを分画し、および溶解されたアリコットのゲル電気泳動によってウイルスDNAの存在についてスクリーニングした。アリコットを、ゲルへの負荷の直前に、プロテイナーゼK、0.25mM、EDTAおよび0.5SDSで56°Cにて10分間溶解させた。再懸濁させた細胞の上清を、別法として、0.22μmフィルターを通して濾過した。グラジエント画分のアリコット、ならびに濾過された上清を、接種物として用いるために-80°Cで凍結した。濾過されたアリコットをペレット化した。ペレットを陰性染色に付し、および電子顕微鏡観察によって可視化した。クローン化されたサブウイルスμTTVゲノムを、全長ゲノムと同一の方法で293TTにトランスフェクトした。培養を数週間にわたって増殖させた。残りの細胞の伸長を可能としつつ、単層細胞の一部を掻き取ることによって細胞を部分的に取り出した。取り出した細胞をペレット化し、電子顕微鏡観察における可視化前に、上清を、0.22μmフィルターを通して濾過した。細胞ペレットを、遠心およびOptiprepグラジエントを通す分離に先立って、前記したように処理した。アリコットを溶解させ、およびゲル電気泳動後にDNAを可視化した。E転写分析2つの異なるアプローチを用い、TTV-HD全長ゲノムの転写体を分析した。5’-および3’-RACE産物を一本鎖ならびに二本鎖cDNAから生じさせた。一本鎖5’-RACE-Readyおよび3’-RACE-RreadycDNAを、各々、SMARTerTMRACEcDNA増幅キットClontechcat634923を用いて10μlの反応ミックス中で1μgの精製された合計RNAから合成し、ここにおいて、RNAは42°Cにおける90分間のSMARTScribeTM逆転写酵素によって逆転写する。3’RACE-CDSプライマーAを3’RACE-ReadycDNAの合成で用い、他方、5’RACE-CDSプライマーAおよびSMARTerIIAオリゴヌクレオチドを5’-RACE-ReadycDNAの合成で用いた。二本鎖cDNAを同時に合成した。ここにおいて、全長一本鎖cDNAを製造業者のプロトコルに従って、SMARTerTMPCRcDNA合成キットClontechcat634925を用いて最初に合成した。精製された全RNA1μgを、SMARTScribeTM逆転写酵素およびプライマー3’SMARTCDSプライマーIIAおよびSMARTerIIAオリゴヌクレオチドを用いて転写した。これらのプライマーは、共に、非-鋳型ヌクレオチドストレッチを含有し、それにより、延長された鋳型を作り出した。第二の鎖のcDNAの増幅は5’PCRプライマーIIAおよびAdvantage2ポリメラーゼミックスClontechcat639201での長距離PCR増幅LDPCRによって得られた。PCR増幅は、最適な条件を決定するために、以下のように行った:サイクルおよびサイクルの範囲数当たり95°Cにおける15秒、65°Cにおける30秒、および68°Cにおける3分。5’-および3’-RACEPCR増幅は、各々、5’-RACE-Readyまたは3’-RACE-ReadycDNA、または双方の場合に二本鎖cDNA鋳型を用いて行った。PACE-PCRはAdvantage2ポリメラーゼミックス、SMARTerTMRACEcDNA増幅キットからのユニバーサルプライマーAミックスUPMおよび各TTVタイプにフィットする順方向および逆方向プライマーを用いて行った表4。増幅についての条件は:29サイクルの94°Cにおける30秒、68°Cにおける30秒間のアニーリングおよび72°Cにおける3分間の伸長であり、72°Cにおける15分間の最終の延長を伴う。全ての産物はゲル電気泳動によって分析し、ゲル溶出後に精製し、ベクターpCR2.1InvitrogencatK2020-40にクローン化し、配列決定した。2つのさらなる制御を行って、非-特異的増幅について制御した。1つの制御において、増幅は唯一のTTV-特異的プライマーを用い、第二において、UPMプライマー単独を用いて行った。これらのいずれにおいても産物は検出されなかった。悪性腫瘍に由来する組織培養系からの細胞におけるTTVDNAの持続性の実証悪性腫瘍に由来する細胞系は一次腫瘍バイオプシー材料よりも優れた1つの利点を保有する。それらは通常は癌細胞の純粋な調製物を表し、他方、一次材料は、通常、正常な間葉細胞によって、造血系の細胞および正常な上皮細胞によって汚染されている。他方、組織培養系の1つの不利点は組織培養条件下で成長する特異的クローンの選択、および長期培養の間における二次遺伝的修飾の獲得から生起させることができる。加えて、胎児子ウシ血清は、血清不活化手法で生き残るウシウイルス例えば、ウシポリオーマウイルスの導入による危険性をもたらす;これらの利点/不利点をまとめる表5参照。ヒト一次腫瘍材料においてTTV-DNAを見出す試みでは、1つの不利点:ヒト材料における複数のTTV遺伝子型に悩んでいる。これは、それをヒト癌タイプについての病因としての特異的遺伝子型を同定するのを実質的に不可能とする。これらの理由で、癌組織培養系に由来する細胞におけるTTVDNA配列の持続性についての実験を開始した。これまでのところ、結果は極めて驚くべきものであった:TTV大オープンリーディングフレームの領域を発見するのに用いられたPCRプライマーは完全に不成功であった。しかしながら、約71塩基のTTVゲノムの短いGC-リッチな調節領域を専ら発見する他のプライマー組合せは、より多数の細胞系においてこの配列を検出した図1。この調節領域は異なるTTV遺伝子型内で高度に保存されており、ヒトゲノムデータバンクでは存在しない。実験の最初のシリーズにおいて、同一の配列が多数のさらなる細胞系で発見された。これらは以下の系を含む:MCF7乳癌系:HAK-1、KMH-2、L1236全てのエプスタイン-バールウイルス陰性ホジキンリンパ腫系:Y69エプスタイン-バールウイルス陰性B-リンパ腫HSB-2急性リンパ球性白血病;P3HR-1エプスタイン-バールウイルス-陽性バーキットリンパ種;BJABエプスタイン-バールウイルス陰性バーキットリンパ種;Ng多発性硬化症を持つ患者からのEBV-不滅化Bリンパ芽球-これらの9つの陽性系とは別に、2つのメラノーマ細胞系IGLおよびKR,図1およびヒト胎盤DNAは最初の実験において陰性であった。興味深いことには、L1236細胞からのスプールドDNAの除去、および残りの溶液のRNアーゼ処理後に、ミトコンドリアDNA以外に、同様なサイズの2つの弱いバンドがアガロースゲルにおいて位置4.3から6.6kb二本鎖DNAサイズマーカーの間の目に見えるバンド固定となった図2。これらの配列の分析は、再度、TTV調節領域の存在を明らかとした。一本鎖DNAを選択的に消化するマング-ビーンヌクレアーゼは、前者の一本鎖性質を強調する、二本鎖対照DNAとは対照的に、4つの多数の硬化症バイオプシーからの細胞DNA-含有バンドを完全になくした。同様な実験が腫瘍DNAからの単離体について現在行われている。キメラTTV/切形宿主細胞DNA配列の分析最初に、全ての試みは、この領域を囲うフランキングTTウイルスDNAを見出すために、調節領域内で出発し、外向きにプライマーを用いるのに失敗した。しかしながら、不変的にヒト細胞DNAは各クローンにおいて実証された図3。これらのクローンにおけるヒト遺伝子、およびTTV71塩基領域によって明らかに制御された一本鎖エピソームDNA内でのそれらの配置は、現在分析中である。入手可能なデータは、通常は切形された宿主細胞遺伝子の摂取における実質的な変動を示す。成長-刺激癌遺伝子への、または腫瘍サプレッサー遺伝子に干渉する機能へのそれらの可能な変換は、現在調査中である機能的テストを必要とする。それは、再構成されたTTVウイルス配列を占める。入手可能なデータのいくつかを図7、8、9および11から13に提示する。TTVゲノムの同定および特徴付け血清およびバイオプシー試料中のTTウイルスの短い保存されたGC-リッチな領域の最初の増幅は、大部分の場合においてTTVDNAの同定に導いた。完全なゲノムの引き続いての増幅は、特異的なTTVタイプを同定するのに必要である。というのは、多くは制御領域に存在する増幅された71bpにおける正確なDNA相同性を共有するが、それらのゲノムの残りにおける配列同一性において60から80のかなりが異なるからである。多数の逆並列プライマー組合せは、調査の間に得られた配列に対して設計された表2。長距離PCR増幅はTTVDNA陽性試料に対して行った。3から4kbの間の範囲のアンプリコンをクローン化し、配列決定した。TTVDNA陽性試料は健康な対象ならびに白血病、多発性硬化症、関節リウマチおよび腎臓病を持つ患者から由来した。これらのデータの一部は従前に記載されているLeppiketal.,2007;Sospedraetal.,2005;deVilliersetal.,2009。合計53の全長DNAゲノムを特徴付けた。12におよぶ多くの区別される全長単離体が、単一のバイオプシーからの19のゲノムを配列決定した後に同定された。1つのTTVタイプの異なる単離体のゲノム組織化は1から4の範囲のヌクレオチドの低い多様性にも拘わらず変化した。大きなオープンリーディングフレームORF1が主として関連していたが、非コーディング領域および他の遺伝子内の差もまた注記された。これらのデータは、先述の観察を確認したJelcicetal.,2004;Leppiketal.,2007;deVilliersetal.,2009。ORF1における修飾は、この領域における別々のより小さなORF、超可変領域におけるかなりの配列多様性Nishizawaetal.,1999;Jelcicetal.,2004に導く早期終止コドンまたはプロトタイプに存在するよりも大きなORF1がもたらされる終止コドンの不存在を含んだ図16。アネロウイルス科の公的な分類はORF1DNA配列の比較に基づくBiaginianddeMicco,2010。得られた単離体におけるORF1修飾のため、全長ゲノム配列が、ここに提示された系統的分析に含まれた。この分析の目的は、樹立されたTTV種に関する単離体TTV-HDの外観を獲得することであった図18。全ての従前の単離体は同様にこのツリーに含まれるJelcicetal.,2004;Leppiketal.,2007;deVilliersetal.,2009。TTV-HDのインビトロ複製トルクテノウイルス感染を特定の病気の病因と関連付ける試みは過去において繰り返し報告されている。大きな範囲の病気からの試料が分析されてきた。インビトロ調査は、これらのウイルスをより長い期間にわたって容易に増殖させることができる細胞培養系を同定するための消極的試みによって妨げられた。ウイルス粒子は、最初に、Okamoto,2009においてレビューされている密度勾配および免疫グロブリン凝集体の助けを借りて特徴付けられ、後に、血清および糞から可視化されたItohetal.,2000。トルクテノウイルスは、圧倒的に、造血系の細胞で起こるOkamoto,2009。第一の単離体は、ホジキンリンパ腫を持つ患者の脾臓から得られたJelcicetal.,2004。従って、L428細胞系を、TTV-HD3aのインビトロ複製および転写を実証するための最初の試みで用いた。線状化されたウイルスDNAのトランスフェクション後における7日間までの全長ゲノムの複製が達成されたLeppiketal.,2007。複製のこの期間を延長するために、全長TTVゲノムを、高レベルのSV40大T抗原を発現するように作成されたヒト胚腎臓細胞系293TTにトランスフェクトしたBucketal.,2004。第二に、1ORF1における変動がウイルス粒子の複製および形成に影響するか否か、2多様なTTVタイプがそれらの複製の態様で変化するか否かを決定するために、本実験において12の全長単離体を含めるよう決心した。取り扱いの間に起こり得る限りは、変動を排除するために、平行して全ての12の単離体を増殖させるにおいて大きな注意を払った。以下の単離体をトランスフェクションおよび増殖のために選択した:TTV-HD3aLeppiketal.,2007およびTTV-HD1aJelcicetal.,2004。TTV-HD1aは種TTV3hel32およびTTV-HD3aに関して、種TTV12ct44fに最も近い図4。TTV-HD16a種TTV22-関連、TTV-HD15a種TTV12-関連、TTV-HD14a、TTV-HD14b、TTV-HD14cおよびTTV-HD14e種TTV29-関連は、全て、多発性硬化症を持つ患者からの脳バイオプシーから単離した。TTV-HD20a種TTV13-関連は腎臓組織に由来し、およびTTV-HD23a、TTV-HD23bおよびTTV-HD23d種TTV3-関連は関節リウマチを持つ患者から採取した血清から増幅した。TTV-HD14a、TTV-HD14b、TTV-HD14cおよびTTV-HD14eの配列はそれらの全長ゲノムにおいて1から2の間変化する。プロトタイプは、サイズが648アミノ酸aaの無傷ORF1を持つTTV-HD14aである。TTV-HD14bのORF1はサイズが660aaであり、554aaのみがTTV-HD14aORF1に対して同一性を共有しており、他方、ORFの残りはdeSchmidtandNoteborn,2009後にORF4に対して融合を示す。同様に、TTV-HD14cORF1は712aaであって、ORF5に融合したORF1第一の645aaを構成する。TTV-HD14eORF1は中断されており、その結果、サイズが467aaおよび179aaの2つのORFがもたらされる。TTV-HD23b、TTV-HD23dおよびTTV-HD23aゲノムは、配列同一性において1から3の間変化するに過ぎないが、それらのORF1遺伝子は以下のように異なる:プロトタイプとしてのTTV-HD23aORF1はサイズが736aaであり、TTV-HD23bORF1DNA配列は、18.4アミノ酸において、34.2だけ超可変領域においてTTV-HD23aのそれから変化する。TTV-HD23bおよびTTV-HD23dDNA配列は全同一性が1異なるに過ぎないが、TTV-HD23dORF1は中断され、その結果、サイズが307aaおよび365aaの2つのORFがもたらされる図16。トランスフェクションを半-密集293TT細胞で行った。その多くの丸い細胞が単層に付着した、この細胞の系の性質は細胞病理効果の明快な同定を可能としない。密集した場合、または細胞が表面から脱着を開始した場合に、細胞を継代した。フラスコを振盪して、全ての細胞をほぐした。細胞を遠心し、およびアリコットを凍結し、ならびにDNAおよびRNA抽出および電子顕微鏡分析のために用いた。凍結された感染された細胞を、最初に、新しい293TT培養を再度感染させるのに用いた。というのは、細胞が採取の時点においてそれまでにトリプシン処理されていれば再感染は失敗したからである。ウイルスの複製は、感染した細胞から抽出したDNAに対して長距離PCRを行うことによってモニターした。再感染および細胞採取の間の期間は、培養密度に依存して3から7日の間変化した。異なるTTV単離体の培養の間で、明らかな形態学的差は認められなかった。1つの実験の経過の間における再感染は、凍結された細胞アリコットを用いて数回行った。TTウイルスのインビトロ増殖は今まで記載されていない。制限酵素消化は、最初にトランスフェクトされた試料から得られた細胞DNAに対して行って、いずれの残存する細菌-生成ウイルスDNAも除去した。長PCR増幅の結果は、ウイルスDNAのデノボ複製を示した。感染された細胞DNAを鋳型として用いるこれらのTTVDNAアンプリコンの例は図19に提示される。全長DNA分子の長距離PCR増幅は、培養の間にかなりの差を示した。第一ラウンドにおけるのと同一のプライマーを用い第二ラウンドの増幅は、系統学的分析図18に従うそれらの多様性45から50ヌクレオチド相同性に拘わらず、脳バイオプシーからの単離体、すなわち、TTV-HD16a、HD15aおよび4つの個々のTTV-HD14単離体図19Aで感染させた全ての培養に対して必要であった。ORF1における修飾は、全長DNAの増幅において可視化されたように、増幅または増殖に影響するようには見えなかった図21Aa-c。サイズは変化するさらなるDNAアンプリコンがHD15a-感染培養で観察された。これらの分子の発生は、全長ゲノムにおける同時低下を伴う引き続いての増殖の間に増大した図21Aa-cレーン5。我々は、従前に、ヒト血清試料における同様な性質のサブウイルス分子を報告したLeppiketal.,2007。同様なオフサイズドoff-sizedアンプリコンもまたTTV-HD16a-感染培養において時折認められレーン6、および稀にしかTTV-HD14培養において認められなかったレーン1-4。大きな差が他の6つの単離体の挙動において認められた。この変動は実験および継代の間においても明らかであり図19Bb1、b2、b3、これは培養条件における非常に些細な修飾に対して見掛けの高い感受性を反映する。最初に複製する全長ゲノム3.8kbは、TTV-HD20a-、TTV-HD3a-およびTTV-HD1a-感染細胞における範囲の顕著なサブゲノムアンプリコンと同時の増殖図19Ba-cの間に失われたレーン7から9、図19B。長距離PCR増幅で用いられる入力DNAの量、ならびにゲルに負荷されるアンプリコンの量は全ての培養について同一であった。長距離PCRの単一ラウンドの後における単離体TTV-HD23b、TTV-HD23dおよびTTV-HD23aの高レベルのDNAアンプリコンは、従って、初期の継代の間におけるより強い複製能力を示すことができる。単離体の2つの群の間で観察される差のため、変動が系列的サンプリングの間に観察され得るか否かを調査した。TTV-HD14eおよびTTV-HD23bの同等な継代が平行に増殖され、および試料は毎日採取した。長距離増幅は、培養において10日後に失われた図19C、DNA増幅の単一ラウンド後に既に目に見えたTTV-HD23bの減少する複製とは対照的に、DNA増幅の2ラウンド後に目に見えるTTV-HD14eの一定複製を示した。これらの培養は継代されず、および培養の間の形態学的差は認識できなかった。μTTVサブウイルス分子のインビトロ形成、複製および特徴付け単離体TTV-HD14b、TTV-HD14c、TTV-HD14dおよびTTV-HD14e、ならびにTTV-HD1aおよび3つのTTV-HD23単離体からの培養における一定のサイズのより小さなDNAアンプリコンの出現はトランスフェクション後に早く既に認められ、および継代の間に維持された図19AおよびB。それらをクローン化し、および特徴付けた。TTV-HD14bおよび3つのTTV-HD14単離体からのこれらのサブウイルスDNA分子μTTV-HD14、サイズは719塩基は、全て、DNA配列において同一であって、親TTV-HD14ゲノムに由来する円形サブゲノム再構成分子を表した図20A。同様に、再構成されたサブウイルスDNA分子μTTV-HD1、621塩基は親TTV-HD1aゲノムに由来した図20B。興味深いことには、全長TTV-HD1aゲノムの消失にも拘わらず、継代の間に、μTTV-HD1の複製が維持された。TTV-HD23培養におけるサブウイルス分子のこの存在または不存在は、培養条件の可能な影響を示す。ここにおいて、これらの分子は、サイズが400から900塩基の範囲であり、642および401塩基分子の増大したレベルを伴った。クローン化された分子の特徴付けは、明らかに進化的に好ましい成熟プロセスを示した。というのは、401塩基のサブウイルス分子のセグメントμTTV-HD23.1が642塩基のサブウイルスDNAにおいて複製されたからであるμTTV-HD23.2;図20C。このセグメントの多数のバージョンはより大きな分子において存在した。TTV-HD23b、TTV-HD23dならびにTTV-HD23a培養に由来するサブウイルスゲノムは、全て、DNA配列において同一であった。293TT細胞におけるこれらのサブウイルス再構成分子のトランスフェクションの結果、PCR増幅の後に可視化されたそれらのゲノムの複製がもたらされた図21。興味深いことには、各μTTVは親ゲノムと同一の方法で正確に反応し、すなわち、ゲノムμTTV-HD15DNAの最初の複製は強力であったが、引き続いて、ネステッドPCR増幅後に可視化されたに過ぎなかった図21。サイズが10nmの小さな蛋白質様構造は、これらの細胞培養からの培養基の濾過0.22μm後に電子顕微鏡観察によって可視化された図22。ウイルス様粒子完全なゲノムおよびμTTVの精製ウイルス粒子を精製する試みは、第二ラウンドの再感染後に開始された。粗製細胞抽出物を27-33-39Opti-prep工程グラジエントで遠心したBucketal.,2005。グラジエント画分のアリコットを、ゲル電気泳動による分離に先立って溶解させた。ウイルスDNAを示すグラジエント画分を-80°Cで凍結し、およびさらなる再感染で用いた。二本鎖DNAサイズのマーカーの2kbおよび1.0kbレベルにおける2つのDNAバンドが明らかに見えた図8A。これらのDNA分子の正確なサイズは決定できなかった。というのは、適当な一本鎖DNAマーカーが入手できないからである。細胞懸濁液は、加えて、グラジエント遠心に先立って0.22μmフィルターを通して濾過した。これらの試料の陰性染色は、サイズがほぼ30nmのウイルス様粒子を示した図8。同様に、蛋白質構造サイズが約10nmが、μTTV-HDゲノムの増殖後の培養基の濾過の後に見られた図22。これらの濾液を溶解させ、およびDNAをアガロースゲルで分離した図22。インビトロ転写TTVの詳細な転写パターンは単離体TTV-P1C1Mulleretal.,2008、TTV-HEL32Qiuetal.,2005;Kakkolaetal.,2009およびTTV-HD3aLeppiketal.,2007について報告されてきた。3つの主なmRNA種1.0、1.2および3.0kbは骨髄細胞Okamotoetal.,2000aにおいて、およびCOS1細胞Kamahoraetal.,2000において以前に報告された。交互のスプライスアクセプターおよびドナー部位Leppiketal.,2007の使用と組み合わせたKozak規則Jelcicetal.,2004に従った開始コドンの使用についての予測は、トルクテノウイルスの転写の間における非-保存的メカニズムの関与を示した。単離体の転写は、3’-および5’RACEマッピングのために、鋳型として一本鎖ならびに二本鎖cDNAを用いることによって調べた。二本鎖cDNAは非-特異的ハイブリッドの形成についての可能性を低下させる。加えて、通常使用される遺伝子-特異的プライマーの代わりに、遺伝子間領域内に位置するプライマー順方向および逆方向を選択した。これは、TTVゲノムにおけるいずれかの予測されない遺伝子の発現をカバーする目的でなされた。全ての培養からのRNAはトランスフェクションから7日後に抽出した。ベクター単独での対照トランスフェクションからのRNAを含ませて、偽陽性増幅について制御させた。転写分析を反復して、単離体TTV-HD14eの場合において、トランスフェクションから48時間後にRNAを抽出することによって、mRNAを採取するための適当な時点につき制御した。観察された転写パターンは2日および7日の間で同じであった。転写分析で得られた全ての結果は図17に提示される。豊富な転写体をTTV-HD23感染培養から単離した。それらの転写パターン、ならびにTTV-HD20a、TTV-HD15a、TTV-HD16aについてのそれは、一般に、Kakkolaetal.,2009でレビューされた従前に記載された転写パターンと同様であった。例外は、単離体の全てからの全長ORF1転写体の不存在である。これは、ウイルス様粒子が同時に生産されるという事実に鑑みれば驚くべきことである。ORF1遺伝子のセクション5’-または3’-末端のいずれかをカバーし、より小さな蛋白質についてコードできる転写体が存在した図17における例。推定蛋白質についてのインシリコ分析は、そこから今まで何が報告されているのかさらなる情報を明らかにした。例は、ORF2またはORF2aとORF1との、またはTTV-HD16aにおけるORF5との間のスプライシング融合である6.3s.2、6.3s.3、6.3s.9。ORF1およびORF5の間のスプライシングはもう1つの可能性である6.3.7。TTV-HD20aにおけるORF2の領域をカバーする短い転写体もまたより小さなORF1蛋白質として発現され得る7.3.5、7.3.4、7.5.13図17。転写体は、加えて、対照領域に位置するプライマー順方向または逆方向を用いて得られた。2つの観察がなされた。逆方向プライマーの結果、ゲノムの延長された領域をカバーするスプライシングされた、またはスプライシングされていない転写体12.5.19、12.5.20、12.5.21、5.5s.16、5.5s.17、5.5s.18、5.5s.19またはいずれのコーディング能力も有しなかった長さが変化する転写体5.5s.12、5.5s.13、5.5s.14、5.5s.15、11.5.7、11.5.8、11.5.9をもたらした。この領域における順方向プライマーでの増幅の結果、ORF5と同程度に遠いさえのコーディング能力を持つ他の短い非-コーディング転写体、またはスプライシングされた転写体がもたらされる4.3.4、3.3.1、3.3.2図17。文献のリスト1BelotserkovskiiBPLiuRTornalettiSKrasilnikovaMMMirkinSMandHanawaltPC2010MechanismsandimplicationsoftranscriptionblockagebyguaninerichDNAsequencesProcNatlAcadSciUSA10712816128212BiaginiPandPdeMicco2010LafamilledesAnelloviridaevirusTTVetgenresapparentesVirologie143163BiaginiPCharrelRNdeMiccoPandXdeLamballerie2003AssociationofTTvirusprimaryinfectionwithrhinitisinanewbornClinInfectDis361281294BuckCBPastranaDVLowyDRandJTSchiller2004EfficientintracellularassemblyofpapillomaviralvectorsJVirol787517575BuckCBPastranaDVLowyDRandJTSchiller2005GenerationofHPVpseudovirionsusingtransfectionandtheiruseinneutralizationassaysMethodsMolMed1194454626DelValCMehrleAFalkenhahnMSeilerMGlattingKHPoustkaASuhaiSandSWiemann2004HighthroughputproteinanalysisintegratingbioinformaticsandexperimentalassaysNucleicAcidRes327427487deSchmidtMHandMHMNoteborn2009ApoptosisinducingproteinsinchickenanemiavirusandTTvirusCurrTopicsMicrobiolImmunol3311311498deVilliersEMKimmelRLeppikLandKGunst2009IntragenomicrearrangementinTTvirusesapossibleroleinthepathogenesisofdiseaseCurrTopicsMicrobiolImmunol331911079deVilliersEMSchmidtRDeliusHandHzurHausen2002HeterogeneityofTTvirusrelatedsequencesisolatedfromhumantumorbiopsyspecimensJMolMed80445010FeiJWWeiQXAngelPandEMdeVilliers2005DifferentialenhancementofacutaneousHPVpromoterbyp63Junandmutantp53CellCycle468969611GarbugliaARIezziTCapobianchiMRPignoloniPPulsoniASourdisJPescarmonaEVitoloDandFMandelli2003DetectionofTTvirusinlymphnodebiopsiesofBcelllymphomaandHodgkinsdiseaseanditsassociationwithEBVinfectionIntJImmunopatholPharmacol1610911812ItohYTakahashiMFukudaMShibayamaTIshikawaTTsudaFTanakaTNishizawaTandHOkamoto2000VisualizationofTTvirusparticlesrecoveredfromtheseraandfecesofinfectedhumansBiochemBiophysResCommun27971872413JelcicIHotzWagenblattAHunzikerAzurHausenHandEMdeVilliers2004IsolationofmultipleTTvirusgenotypesfromspleenbiopsieytissuefromaHodgkin ́sdiseasepatientGenomereorganizationanddiversityinthehypervariableregionJVirol787498750714JeskeH2009GeminivirusesCurrTopMicrobiolImmunol33118522615KakkolaLBondenHHedmanLKiviNMoisalaSJulinJYlaLiedenpohjaMiettinenSKantolaKHedmanKandMSoderlundVenermo2008ExpressionofallsixhumanTorquetenovirusproteinsinbacteriaandininsectcellsandanalysisoftheirIgGresponsesVirology38218218916KakkolaLHedmanKQiuJPintelDandMSoderlundVenermo2009ReplicationofandproteinsynthesisbyTTvirusesCurrTopicsMicrobiolImmunol331536417KakkolaLTommiskaJBoeleLCLMiettinenSBlomTKekarainenTQiuJPintelDHoebenRCHedmanKandMSoderlundVenermo2007ConstructionandbiologicalactivityofafulllengthmolecularcloneofhumanTorquetenovirusgenotype6FEBSJ2744719473018KamadaKKamahoraTKabatPandSHino2004TranscriptionalregulationofTTviruspromoterandenhancerregionsinthe12kbnoncodingregionVirology32134134819KamahoraTHinoSandHMiyata2000ThreesplicedmRNAsofTTvirustranscribedfromaplasmidcontainingtheentiregenomeinCOS1cellsJVirol749980998620KandaYTanakaYKamiMSaitoTAsaiTIzutsuKYujiSOgawaSHondaHMitaniKCibaSYasakiYandHHirai1999TTvirusinbonemarrowtransplantrecipientsBlood932485249021KaziAMiyataHKurokawaKKhanMAKamahoraTKatamineSandSHino2000HighfrequencyofpostnataltransmissionofTTvirusininfancyArchVirol14553554022KovacsETompaPLiliomKandLKalmar2010DualcodinginalternativereadingframescorrelateswithintrinsicproteindisorderProcNatlAcadSciUSA1075429543423LeppikLGunstKLehtinenMDillnerJStrekerKandEMdeVilliers2007InvivoandinvitrointragenomicrearrangementofTTvirusesJVirol819346935624MaggiFAndreoliERienteLMeschiSRocchiJDelleSedieAVatteroniMLCeccheriniNelliLSpecterSandMBendinelli2007TorquetenovirusinpatientswitharthritisRheumatology4688588625MaggiFFocosiDAlbaniMLaniniLVatteroniMLPetriniMCeccheriniNelliLPistelloMandMBendinelli2010RoleofhematopoieticcellsinthemaintenanceofchronichumantorquetenovirusplasmaviremiaJVirol846891689326MaggiFFornaiCVatteroniMLSicilianoGMenichettiFTasciniCSpecterSPistelloMandMBendinelli2001aLowprevalenceofTTvirusinthecerebrospinalfluidofviremicpatientswithcentralnervoussystemdisordersJMedVirol6541842227MaggiFFornaiCZaccaroLMorricaAVatteroniMLIsolaPMarchiSRicchiutiAPistelloMandMBendinelli2001bTTvirusloadsassociatedwithdifferentperipheralbloodcelltypesandevidenceforTTreplicationinactivatedmononuclearcellsJMedVirol6419019428MaggiFPifferiMFornaiCAndreoliATempestiniEVatteroniMPresciuttiniSMarchiSPietrobelliABonerAPistelloMandMBendinelli2003aTTvirusinthenasalsecretionsofchildrenwithacuterespiratorydiseaserelationstoviremiaanddiseaseseverityJVirol772418242529MaggiFPifferiMTempestiniEFornaiCLaniniLAndreoliEVatteroniMPresciuttiniSPietrobelliABonerAPistelloMandMBendinelli2003bTTvirusloadsandlymphocytesubpopulationsinchildrenwithacuterespiratorydiseasesJVirol779081908330MariscalLFLopezAlcorochoJMRodriguezInigoEOrtizMovillaNdeLucasSBartolomeJandVCarreno2002TTvirusreplicatesinstimulatedbutnotinnonstimulatedperipheralbloodmononuclearcellsVirology30112112931MullerBMarzADobersteinKFinsterbuschTandAMankertz2008GeneexpressionofthehumanTorqueTenoVirusisolateP1C1Virology381364532NawazulRehmanMSandCMFauquet2009EvolutionofgeminivirusesandtheirsatellitesFEBSLetter5831825183233NishizawaTOkamotoKKonishiHYoshikawaHMiyakawaYandMMayumi1997AnovelDNAvirusassociatedwithelevatedtransaminaselevelsinposttransfusionhepatitisofunknownetiologyBiochemBiophysResCommun241929734NinomiyaMNishizawaTTakahashiMLorenzoFRShimosegawaTandHOkamoto2007Identificationandgenomiccharacterizationofanovelhumantorquetenovirusof32kbJGenVirology881939194435NinomiyaMTakahashiMNishizawaTShimosegawaTandHOkamoto2008DevelopmentofPCRassayswithnestedprimersspecificfordifferentialdetectionofthreehumananellovirusesandearlyacquisitionofdualortripleinfectionduringinfancyJClinMicrobiol4650751436OkamotoH2009HistoryofdiscoveriesandpathogenicityofTTvirusesCurrTopMicrobiolImmunol33112037OkamotoHNishizawaTTawaraATakahashiMKishimotoJSaiTandYSugai2000aTTvirusmRNAsdetectedinthebonemarrowcellsfromaninfectedindividualBiochemBiophysResCommun27970070738OkamotoHTakahashiMKatoNFukudaMTawaraAFukudaSTanakaTMiyakawaYandMMayumi2000bSequestrationofTTvirusofrestrictedgenotypesinperipheralbloodmononuclearcellsJVirol74102361023939OkamotoHTakahashiMNishizawaTTawaraASugaiYSaiTTanakaTandFTsuda2000cReplicativeformsofTTvirusDNAinbonemarrowcellsBiochemBiophysResCommun27065766240OkamotoHUkitaMNishizawaTKishimotoJHoshiYMizuoHTankaTMiyakawaYandMMayumi2000dCirculardoublestrandedformsofTTvirusDNAintheliverJVirol745161516741PaprotkaTMetzlerVandHJeske2010ThefirstDNA1likeasatelliteinassociationwithNewWorldbegomovirusinnaturalinfectionsVirology40414815742PatilBLandCMFauquet2010DifferentialinteractionbetweencassavamosaicgeminivirusandgeminivirussatellitesJGenVirol911871188243PengYHNishizawaTTakahashiTIshikawaTYoshikawaAandHOkamoto2002AnalysisoftheentiregenomesofthirteenTTvirusvariantsclassifiableintothefourthandfifthgeneticgroupsisolatedfromviremicinfantsArchVirol147214144PifferiMMaggiFAndreoliELaniniLMarcoEDFornaiCVatteroniMLPistelloMRagazzoVMacchiaPBonerAandMBendinelli2005Association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