タンパク質上のホーミングペプチドのための結合部位の近くでタンパク質中に置換基を選択的に導入する方法であって、タンパク質を式の化合物または標的タンパク質の血漿半減期を増加させることができる置換基であり、qは、1~9の整数であり、ここでqが1より大きい場合、それぞれのGは同じであるか、または異なると接触させて、標的化試薬をタンパク質に結合させる工程ならびにタンパク質上の結合部位の近くの部分を標的化試薬と反応させることによって、標的化試薬中に存在するエステル基からのタンパク質へのアシル基の移動を介して置換基Gをタンパク質上に移動させる工程を含む前記方法。ホーミングペプチドが非置換εアミノ基を有するリシン残基を含まず、標的タンパク質が表面に露出したリシンを含み、標的化試薬の総質量が3000Daを超えない、請求項1に記載の方法。タンパク質が第VII因子、第VIIa因子、第VIII因子、フォンウィルブランド因子、組織因子、サイトカイン、成長ホルモン、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1または2に記載の方法。タンパク質が第VIII因子である、請求項3に記載の方法。ホーミングペプチドが以下のアミノ酸配列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であるのうちの一つを含む、請求項4に記載の方法。リンカーLが、式または基により中断された直鎖状または分枝状C1~C25アルキレンを表し、前記アルキレンは、非置換であるか、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されており、L2は、直接結合または前記直鎖状もしくは分枝状C1~C25アルキレン鎖を表し、Pは、直接結合または1~20個のアミノ酸を含むペプチドを表し、Aは、直接結合または式の基を表し、Bは、直接結合または式もしくはの基を表し、mは、1~3の整数であり、nは、1~3の整数であるの基である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。前記置換基Gの少なくとも1つが後に改変することができる置換基である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。G1が、アルデヒド、ケトン、アセタール、ヘミアセタール、アジド、アルキン、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミンまたはその任意の誘導体を含む、請求項7に記載の方法。結合部位の近くに置換基G1を有する得られたタンパク質を、置換基Rを含む改変試薬と反応させることによって、前記置換基Rを有するタンパク質を提供する工程をさらに含む、請求項7または8に記載の方法。置換基Rが、タンパク質の血漿半減期を増加させることができる置換基である、請求項9に記載の方法。Rが、ビスホスホナート、血小板もしくは内皮細胞に結合する置換基、抗体、親水性ポリマー、アルブミンまたはアルブミン結合剤を含む、請求項9または10に記載の方法。前記親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項11に記載の方法。タンパク質上のホーミングペプチドのための結合部位の近くで置換されており、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって取得できるタンパク質。請求項13に記載のタンパク質と、製薬上許容し得る希釈剤または担体とを含む医薬組成物。本発明者らは、ホーミングペプチドF1rのための第VIII因子上の結合部位の近くで、第VIII因子中に置換基を選択的に導入する新規な方法を考案した。この方法は、一般的適用性を有し、これを用いて任意のタンパク質中に置換基を選択的に導入することができるが、大きいタンパク質に特に有用である。本発明の方法の一つの用途は、血漿半減期が増加した改変タンパク質を提供することである。血漿半減期の増加は投与量の減少およびまたは投与頻度の低下を可能にし得るため、そのような長時間作用する改変タンパク質は薬剤として潜在的に有用である。かくして、本発明は、タンパク質上のホーミングペプチドのための結合部位の近くでタンパク質中に置換基を選択的に導入する方法であって、式の化合物または標的タンパク質の血漿半減期を増加させることができる置換基であり、qは、1~9の整数であり、ここでqが1より大きい場合、それぞれのGは同じであるか、または異なると接触させて、標的化試薬をタンパク質に結合させる工程ならびにタンパク質上の結合部位の近くの部分を、標的化試薬と反応させることによって、標的化試薬中に存在するエステル基からのアシル基のタンパク質への移動を介して置換基Gをタンパク質上に移動させる工程を含む前記方法を提供する。本発明はさらに、ホーミングペプチドが非置換εアミノ基を有するリシン残基を含まない方法標的タンパク質が少なくとも1個の表面に露出したリシンを含む方法標的タンパク質がホーミングペプチドの結合部位の近くに少なくとも1個の表面に露出したリシンを含む方法標的化試薬が合成的に調製される方法標的化試薬の総質量が3000Da、2500Da、2000Da、1500Da、1000Da、または500Daを超えない方法タンパク質上のホーミングペプチドのための結合部位の近くで置換され、上記で定義された方法により取得できるタンパク質上記で定義された式の標的化試薬上記で定義されたタンパク質を選択的に改変するための上記で定義された式の標的化試薬の使用および上記で定義されたタンパク質と、製薬上許容し得る希釈剤または担体とを含む医薬組成物を提供する。本明細書に記載の配列の説明配列番号1~44は、本発明のポリペプチド配列を提供する。配列番号42は、化合物1、2、4、5、9、10、18~20の標的化試薬中に存在する。配列番号40は、化合物7、8および17中に存在する。一般的定義開示された方法の様々な用途は、当業界における特定の必要性に合わせることができることが理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるものに加えて、単数形a、anおよびtheは、本文が別途明確に区別しない限り、複数の指示対象を含む。かくして、例えば、タンパク質に対する言及はタンパク質を含み、ホーミングペプチドに対する言及は2つ以上のそのようなホーミングペプチドを含むことなどである。本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、上記のものであっても下記のものであっても、その全体が参照により本明細書に組入れられるものとする。別途特定されない限り、本明細書で用いられるC1~C6アルキル部分は、1~6個の炭素原子を含有する線状または分枝状アルキル部分、例えば、C1~C4アルキル部分である。C1~C6アルキル部分の例としては、メチル、エチル、nプロピル、iプロピル、nブチルおよびtブチル部分が挙げられる。疑いを避けるために、2個のアルキル部分が置換基中に存在する場合、アルキル部分は同じであるか、または異なってもよい。別途特定されない限り、本明細書で用いられるアルキレン基は、任意の二価の線状または分枝状アルキレン基であり、好ましくはC1~C10アルキレン基、より好ましくはC1~C4アルキレン基である。好ましい線状C1~C4アルキレン基はメチレン、エチレン、nプロピレンおよびnブチレン基である。メチレンおよびnプロピレン基が好ましい。分枝状C2~C4アルキレン基としては、CH、CHCH2およびCH2CHが挙げられる。別途特定されない限り、本明細書で用いられるC1~C6アルコキシ基は典型的には、酸素原子に結合したC1~C6アルキル基であり、このC1~C6アルキル基は線状または分枝状である。好ましいアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、nプロポキシ、iプロポキシ、nブトキシ、secブトキシおよびtブトキシが挙げられる。本明細書で用いられるハロゲンは、塩素、フッ素、臭素またはヨウ素である。ハロゲンは、典型的にはフッ素、塩素または臭素であり、好ましくはフッ素または塩素である。本明細書で用いられるC6~C10アリール基は、好ましくはフェニルまたはナフチル基である。より好ましくは、それはフェニル基である。本明細書で用いられるC6~C10アリーレン基は、C6~C10アリール基のジラジカルであり、好ましくはフェニレン基である。別途特定されない限り、本明細書で用いられるC3~C8シクロアルキル基は3~8個の炭素原子を含有する単環式シクロアルキル基、例えば、C3~C6シクロアルキル基である。好ましいC3~C6シクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。本明細書で用いられるC3~C8シクロアルキレン基は、C3~C8シクロアルキル基のジラジカル、好ましくはC3~C6シクロアルキル基のジラジカルである。標的化方法本発明は、タンパク質中に好適な部位で置換基を選択的に導入する方法に関する。特に、前記方法は、タンパク質を標的化試薬と接触させることを含む。標的化試薬は、ホーミングペプチド、リンカー部分および1つまたは複数の置換基を含む。ホーミングペプチドとリンカーとの間の結合は、典型的にはアミド結合である。前記置換基またはそれぞれの置換基は、以下に示されるように、エステルまたはカルバメート結合を介してリンカーに結合されているXは、好ましくは直接結合を表し、従って標的化試薬は式の化合物である。標的化試薬が標的タンパク質と接触すると、ホーミングペプチドは標的タンパク質上の特定の部位に結合する。標的化試薬をタンパク質に結合させる間、タンパク質上のホーミングペプチドの結合部位の近くのタンパク質上の反応部分を、置換基をリンカーに接続するエステルまたはカルバメートのカルボニル炭素と反応させる。かくして、ホーミングペプチドとタンパク質との相互作用は、標的タンパク質のどの領域に置換基が導入されるかを決定付ける。タンパク質上の反応部分は、典型的にはタンパク質中のアミノ酸の側鎖上にある。求核性側鎖、例えば、アルコールまたはアミンを含む側鎖が好ましい。かくして、本発明の方法の工程は、好ましくは結合部位の近くにあるセリン、トレオニンまたはチロシンアミノ酸残基の側鎖上のアルコール基を標的化試薬と反応させることを含む。あるいは、本発明の方法の工程は、好ましくは結合部位の近くにあるリシンアミノ酸残基の側鎖上のアミン基を標的化試薬と反応させることを含む。典型的には、十分な速度でこの反応を起こさせるために外部エネルギーを供給する必要はない。標的タンパク質上の前記反応部分と、置換基をリンカーに接続するエステルまたはカルバメートのカルボニル炭素との反応は、エステルまたはカルバメート結合を破壊し、標的タンパク質と、置換基に結合したカルボニル炭素との間に新しい共有結合が形成され、出発標的化試薬のリンカーホーミングペプチド部分OLPが遊離される。このように、置換基は、標的タンパク質上のホーミングペプチドの結合部位の近くで標的タンパク質中に選択的に導入される。標的タンパク質本発明の技術および方法は、任意のタンパク質中に置換基を選択的に導入するのに好適である。しかしながら、本発明は、特に大きいタンパク質に適用可能である。かくして、タンパク質は典型的には50~3000kDa、好ましくは100~3000kDa、より好ましくは150~3000kDaの質量を有する。好ましいタンパク質としては、第VII因子、第VIIa因子、第VIII因子およびフォンウィルブランド因子、組織因子、サイトカイン、成長ホルモン、抗体および抗体フラグメント、例えば、抗原結合フラグメントが挙げられる。上記タンパク質の活性断片、例えば、フォンウィルブランド因子の活性断片も好ましい。第VIII因子、第VII因子およびvWFはより好ましい標的タンパク質であり、第VIII因子が最も好ましい。第VII因子は、一本鎖酵素前駆体として血中に循環する血漿糖タンパク質である。酵素前駆体は触媒的には不活性である。一本鎖第VII因子は、第Xa因子によって二本鎖の第VIIa因子に変換され得る。第VIII因子の成熟分子は、2332個のアミノ酸からなり、3つの主要な相同なAドメイン、2つの相同なCドメイン、1つのBドメイン、および3つの小さいドメインに分類することができ、それらはA1a1A2a2Ba3A3C1C2の順序で配置される。一本鎖第VIII因子はBa3境界で切断されるため、血漿中へのその分泌の間に、第VIII因子は細胞内で一連の金属イオンに結合したヘテロダイマーにプロセッシングされる。このプロセッシングは、主にA1、A2およびBドメインからなる重鎖をもたらし、これは約200kDaの分子サイズを有する。重鎖は金属イオンを介して軽鎖に結合し、これは主にA3、C1およびC2ドメインからなる。血漿中では、この第VIII因子ヘテロダイマーは高い親和性でフォンウィルブランド因子に結合し、早すぎる異化作用からそれを保護する。vWFに結合した非活性化第VIII因子の半減期は、血漿中では約12時間である。軽鎖はドメインa3A3C1C2からなる。トロンビンにより活性化された場合、a3ドメインは失われてA3C1C2になる。血液凝固プロセス中に、第VIII因子は、重鎖内のアミノ酸Arg372およびArg740ならびに軽鎖中のArg1689での第Xa因子およびトロンビンによるタンパク質分解的切断によって活性化され、フォンウィルブランド因子の遊離をもたらし、活性化された第VIII因子ヘテロダイマーを生成し、Ca2が存在するという条件で第IXa因子および第X因子とリン脂質表面上でテナーゼ複合体を形成する。このヘテロダイマーは、50kDaの断片であるA1ドメイン、43kDaの断片であるA2ドメインおよび73kDaの断片である軽鎖からなる。かくして、第VIII因子の活性形態は、二価金属イオン連結を介してトロンビンにより切断されたA3C1C2軽鎖に結合したA1サブユニットならびにA1およびA3ドメインと比較的緩く結合した遊離A2サブユニットからなる。Bドメインから誘導された小さいリンカーと接続された第VIII因子の重鎖および軽鎖からなる第VIII因子の分子は、完全長第VIII因子の生物学的活性を保持する。本明細書で用いられる用語第VIII因子は、治療上有用である、例えば、出血の防止または治療において有効である任意の第VIII因子を含む。これは、限定されるものではないが、野生型ヒト第VIII因子、ヒトブタハイブリッド第VIII因子およびBドメインが欠失したヒト第VIII因子を含む。用語第VIII因子は、限定されるものではないが、Tooleら、Nature1984312342~347に記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに他の種、例えば、ウシ、ブタ、イヌ、マウス、およびサケなどの第VIII因子から誘導された野生型第VIII因子を包含することが意図される。用語第VIII因子はさらに、ある個体から別の個体に存在し、生じ得る第VIII因子の天然の対立遺伝子変異体を包含する。また、グリコシル化またはその他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択された宿主細胞および宿主細胞環境の性質に応じて変化し得る。用語第VIII因子は、切断されていない形態、ならびに第VIIIa因子と呼ばれる、タンパク質分解的にプロセッシングされてその対応する生物活性形態になったものを包含することも意図される。用語第VIII因子は、わずかに改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、N末端アミノ酸の欠失もしくは付加を含む改変されたN末端を有するポリペプチド、およびまたはヒト第VIII因子と比較して化学的に改変されたポリペプチドを包含することが意図される。用語第VIII因子は、野生型第VIII因子と実質的に同じか、もしくはそれより高い生物活性を示すか、またはあるいは、野生型第VIII因子と比較して実質的に改変された、もしくは低下した生物活性を示す、第VIII因子の変異体を含むことが意図され、限定されるものではないが、1つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換により野生型第VIII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。第VIII因子の非限定例としては、例えば、Fulcherら、ProcAcadNatSciUSA1982791648~1652、およびRotblatら、Biochemistry1985244294~4300に記載の血漿由来ヒト第VIII因子、ならびにFassら、Blood198259594~600およびKnutsonら、Blood198259615~624に記載の血漿由来ブタFVIIIが挙げられる。第VIII因子配列変異体の非限定例は、例えば、Lollarら、Blood200095564~568およびLollarら、Blood200197169~174に記載されている。第VIII因子のcDNAのクローニングNature312330~336VeharGAらNature312337~342により、第VIII因子を組換え発現させることが可能になり、いくつかの組換え第VIII因子産物の開発をもたらし、これらは1992年~2003年に規制当局によって認可された。アミノ酸Arg740とGlu1649との間にある第VIII因子ポリペプチド鎖の中央Bドメインは完全な生物学的活性にとって必要ではないようであるという事実も、Bドメインが欠失した第VIII因子の開発をもたらした。KjalkeMHedingATalboGPerssonEThomsenJおよびEzbanM、Aminoacidresidues721729arerequiredforfullFactorVIIIactivity、EurJBiochem234773~779も参照されたい。本明細書で用いられる第VIII因子は、1つまたは複数のドメインまたは領域が欠失したものなどの第VIII因子の全ての変異体を含む。本発明においては、置換基は典型的には第VIII因子の重鎖中に、好ましくは重鎖のA1、A2またはBドメイン中に、例えば、重鎖のA2ドメイン中に導入される。フォンウィルブランド因子は、血漿中に存在する糖タンパク質である。塩基性vWFモノマーは、DD3ドメインなどのいくつかのドメインを含む2050個のアミノ酸のタンパク質であり、第VIII因子に結合する。組織因子は、トロンボプラスチンまたは第III因子としても知られる。サイトカインは、典型的にはインターロイキン1、インターロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン8、インターロイキン21、インターロイキン32、インターロイキン35、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、インターフェロンγおよびコロニー刺激因子から選択される。抗体は、ヒト抗体またはキメラ抗体であってよい。好ましくは、モノクローナル抗体である。好ましくは、抗体は、IgG1、IgG3およびIgG4抗体である。しかしながら、IgG2、IgM、IgA1、IgA2、分泌IgA、IgD、およびIgEなどの他の抗体アイソタイプも本発明により包含される。そのような抗体の好適な抗原結合フラグメントとしては、Fab、F2、Fv、一本鎖Fvフラグメントまたは二特異的抗体が挙げられる。さらに、抗原結合フラグメントとして、免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド、ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖CH2定常領域、およびCH2定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖CH3定常領域を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質が挙げられる。そのような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、US20030118592およびUS20030133939にさらに開示されている。ホーミングペプチド本明細書で用いられる用語ホーミングペプチドとは、改変しようとするタンパク質に結合することができるペプチドを指す。ホーミングペプチドは、好ましくは合成ペプチドである。かくして、ホーミングペプチドは親和性リガンドである。あるいは、ホーミングペプチドを、標的化リガンドと記載することもできる。タンパク質へのホーミングペプチドの結合は、当業者には公知の技術によって容易に決定することができる。本発明のホーミングペプチドは典型的には、ホーミングペプチドではない別のタンパク質に結合するよりも高い親和性で標的タンパク質に結合する。典型的には、標的タンパク質に対するホーミングペプチドの結合親和性は、1000nM未満、好ましくは100nM未満およびより好ましくは10nM未満である。好適なホーミングペプチドは、任意の起源、例えば、ライブラリー、特に、コンビナトリアルライブラリーから誘導されたものであってよい。好ましいコンビナトリアルライブラリーとしては、ビーズライブラリー、アプタマーライブラリー、ファージディスプレイライブラリーおよび合理的に設計されたライブラリーが挙げられる。ホーミングペプチドは、合理的に設計されたペプチドまたは特定のタンパク質に結合することが既に知られているペプチドであってよい。例えば、特定の改変部位が望ましい場合、ホーミングペプチドを、WO200000823、WO200242773、WO2003046200、WO2003046200およびWO2003087054に記載のような、Sunesis技術を用いてinsituで構築することができる。あるいは、目的のタンパク質に結合することが知られるペプチドの模倣体または断片をスクリーニングすることができる。例えば、ヘパリン模倣体および断片は、ヘパリンが結合することが知られるタンパク質のための潜在的なホーミングペプチドである。別の例では、vWFの断片は第VIII因子のための潜在的なホーミングペプチドである。ホーミングペプチドの合理的設計は、例えば、標的タンパク質における負に荷電したドメインを標的化するための正に荷電したホーミングペプチドの使用を含む。一度、潜在的なホーミングペプチドが例えば、ライブラリーの形態で調製されたら、標準的な技術を用いてどのペプチドが標的タンパク質に結合するかを決定することができる。典型的には、ペプチドディスプレイ技術を用いてホーミングペプチドを同定する。一般に、そのような技術においては、固相ビーズライブラリーを、標識された型の目的のタンパク質と共にインキュベートする。インキュベーション後、ビーズライブラリーを洗浄した後、標識されたタンパク質に結合する試薬と共にインキュベートする。例えば、典型的にはビオチン化タンパク質をストレプトアビジン試薬と共にインキュベートする。多くの標識されたタンパク質を担持するビーズをライブラリーから分離し、ホーミングペプチドを配列決定する。あるいは、無作為の配列または当業者には公知の方法を用いて公知の相互作用タンパク質もしくはリガンドから誘導された配列に基づく市販のライブラリーまたは特別注文のライブラリーを用いて、ファージディスプレイ技術を行うことができる。結合しているファージの溶出は、典型的にはpH変化によるか、または標的タンパク質自体もしくは結合が破壊されるべきリガンドとの競合的溶出として行われる。コンビナトリアルライブラリーの高効率スクリーニングが好ましい技術である。一度、ホーミングペプチドが同定されたら、ホーミングペプチドとタンパク質との結合が起こるタンパク質上の部位をマッピングするのが望ましい場合がある。これを達成するために、ホーミングペプチドを、スルホSBEDなどのコンジュゲート基またはビオチン化コンジュゲート基に結合させてプローブを提供する。次いで、このプローブを用いて、1つまたは複数の下記方法消化、親和性吸着、LCMS、MSまたはHXMSによりタンパク質表面上のホーミングペプチドの結合部位をマッピングする。このマッピング技術に基づいて、公知の生物学的に重要であるタンパク質の領域に結合する任意のホーミングペプチドを排除することができる。ホーミングペプチドは典型的には、5~50個のアミノ酸、好ましくは5~20、5~19、5~18、5~17、5~16、5~15、5~12、5~10、6~15、6~12、6~10、7~15個、および最も好ましくは7~13個のアミノ酸を含む。リンカーに接続されていないホーミングペプチドの末端は、カルボキシル基、アミノ基、またはその任意の変異体もしくは誘導体で終結するのが好ましい。典型的には、C末端またはN末端を保護して、望ましくない反応を防止する。例えば、C末端を、CO2NH2などのアミドとして保護するのが好ましい。第VIII因子に結合するいくつかのペプチド配列が同定されている。これらを配列番号1~44として列挙する。かくして、本発明の好ましい実施形態においては、ホーミングペプチドは、配列番号1~44のいずれか一つを含む5~50アミノ酸長のペプチドである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一覧中、1Aib2LNal23LTic4LSty5LBip6Pya37LDip8LHphである。あるいは、本発明の別の実施形態においては、第VIII因子に結合するホーミングペプチドは、Knorら、JournalofThrombosisandHaemostasis6470~477Jungbauerら、JPeptideRes200259174~182Jungbauerら、JournalofChromatographyB715191~201およびCA2301959Aに記載の配列の一つを含む。特に、第VIII因子のためのホーミングペプチドは、典型的には以下の配列、配列番号45~139のうちの一つを含む。本発明はまた、置換基Gを第VIII因子に標的化するための上記配列の使用にも関し、それによって該置換基は第VIII因子に移される。標的タンパク質が第VII因子である場合、ホーミングペプチドは典型的には以下の配列Robergeら、BiochemJ2002363387~393に記載のALCDDPRVDRWYCQFVEGおよびEEWEVLCWTWETCER、Dennisら、Nature2000404465~470に記載のEAALCDDPRLDRWYCIFAGE、Dennisら、Biochemistry2001409513~9521に記載のEWEVLCWTWETCERGE、EEWEVLCWTWETCERGEG、MEEWEVLCWTWETCERGEGQ、EVLCWTWETCER、VLCWTWETCER、LCWTWETCER、CWTWETCERGEGQ、WEVLCWTWETCEおよびWEVLCWTWETCまたはRobergeら、Bioechemistry2001309522~9531に記載のSAEWEVLCWTWEGCGSVGLV、SEEWEVLCWTWEDCRLEGLE、EGTLCDDPRIDRWYCMFSGV、およびWEVLCWTWETCERのうちの一つを含む。同様の技術を用いて、第VIII因子および第VII因子のためのさらなるホーミングペプチドを調製し、またその他の目的の標的タンパク質のための新しいホーミングペプチドを調製することができる。FabIgG1に結合するペプチドの例は、例えば、AArouriら、EurBiophysJ200736647~660DOI101007s0024900701408HYangら、JPeptideRes200666120137doi101111j17470285200600342xおよびその中の参考文献に記載されている。リンカー本明細書で用いられる用語リンカーは、ホーミングペプチドを、置換基に結合したエステルまたはカルバメート基に接続することができる任意の部分を指す。リンカーは、好ましくは比較的化学的に不活性であり、従って本発明の方法の間の任意の点で化学的に改変されない。リンカーは、好ましくは50~2000の分子量を有する。qが2以上である場合、リンカーは、GCO部分を結合させることができる2個以上の部位を有する必要がある。かくして、qが1である場合、リンカーLはジラジカルであり、qが2である場合、リンカーLはトリラジカルであり、より高いqの値についても同様である。リンカーとホーミングペプチドとの結合は、好ましくはアミド結合である。一実施形態においては、アミド結合のC部分はリンカーの一部であり、アミド結合のNH部分はホーミングペプチドの一部である。別の実施形態においては、アミド結合のNH部分はリンカーの一部であり、アミド結合のC部分はホーミングペプチドの一部である。GCO部分は、好ましくはリンカー上の炭素原子に結合する。そのような炭素原子は、典型的にはアルキレン基中の炭素原子またはアリール基、例えば、フェニル基中の炭素原子である。リンカーは典型的には、O、S、NH、C、非置換または置換C6~C10アリール基およびから選択される1つまたは複数の基、ならびに必要に応じて、1~15個のアミノ酸を含む1つまたは複数のペプチドにより中断された線状または分枝状アルキレン鎖である。部分は、アルキレン鎖中の三価窒素原子を示す。当業者には明らかであるように、そのような部分を有する中断されたアルキレン鎖は分枝状である。好ましくは、リンカーは式または基により中断された直鎖状または分枝状C1~C25アルキレンを表し、該アルキレンは非置換であるか、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されており、L2は直接結合または前記直鎖状もしくは分枝状C1~C25アルキレン鎖を表し、Pは直接結合または1~20個のアミノ酸を含むペプチドを表し、Aは直接結合または式の基を表し、Bは直接結合または式もしくはの基を表し、mは1~3の整数であり、ならびにnは1~3の整数であるの基である。nまたはmが1より大きい場合、1より多いA、L2、PまたはBがリンカー中に存在し、A、L2、PまたはBはそれぞれ、同じであるか、または異なる。L1は、好ましくは、O、NH、Cおよびから選択される1つまたは複数の基により中断された直鎖状または分枝状非置換C5~C18アルキレン鎖である。より好ましくは、L1は0~6個のO、0~4個のNH、1~2個のCおよび0~2個のにより中断された直鎖状非置換C5~C18アルキレン鎖である。典型的には、L1はホーミングペプチドに結合した末端でC基で終結し前記C基はホーミングペプチドとのアミド結合の一部を形成する。あるいは、L1はホーミングペプチドに結合した末端でNH基で終結し前記NH基はホーミングペプチドとのアミド結合の一部を形成する。L1が1つまたは複数の基により中断される場合、この基により導入される分枝は、2以上、典型的には2のn値を可能にする。1より大きいnの値は、他の形態の分枝、例えば、アルキレン鎖中の分枝からも生じる。nが1である場合、L1はジラジカルでありnが2である場合、L1はトリラジカルでありnが3である場合、L1はテトララジカルであることが当業者には明らかである。L1は、以下の式、、、またはの基のうちの一つであるのが最も好ましい。上記の式の基の全部において、アミド結合は典型的には式の化合物の右手側のCと、ホーミングペプチド上の末端NH部分との間で形成される。L2は好ましくは、直接結合またはO、NHおよびCから選択される1つもしくは複数の基により中断された直鎖状非置換C1~C10アルキレン鎖である。かくして、L2は、直接結合でない場合、ジラジカルを表す。典型的には、それぞれの前記C1~C10アルキレン鎖は、0~6個のO、1~4個のNHおよび0~2個のCにより中断される。より好ましくは、L2は直接結合または0~3個のO、1~2個のNHおよび0~1個のCにより中断された直鎖状もしくは分枝状C2~C6アルキレン鎖である。最も好ましくは、L2は直接結合または式もしくはの基である。Pは好ましくは、直接結合または1~8個のアミノ酸、好ましくは1~3個のアミノ酸からなるペプチドを表す。前記ペプチドPはジラジカルである。Pが直接結合でない場合、前記ペプチドは一般的には、水中での標的化試薬の溶解性を改善するためにリンカー中に包含される。ペプチドP中に存在するアミノ酸は、好ましくは極性または荷電アミノ酸、例えば、酸性または塩基性アミノ酸である。典型的には、ペプチドPは1~8個、例えば、1~3個の極性または荷電アミノ酸からなる。好ましい極性または荷電アミノ酸としては、セリン、トレオニン、チロシン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸およびグルタミンが挙げられる。あるいは、非天然極性または荷電アミノ酸を用いることができる。前記ペプチドPは、好ましくはグルタミン酸、トリプトファンおよびチロシンのうちの1つまたは複数を含む。より好ましくは、前記ペプチドPは少なくとも1個のグルタミン酸残基を含む。最も好ましくは、前記ペプチドPは、配列E、EREまたはWEYを有する。式およびの基において、式およびの基の右手側上のカルボニル炭素はL1に結合し、典型的には、L1に由来するNH部分とアミド結合を形成する。式およびの基中のCHラジカルは、典型的には酸素原子、好ましくはOCG部分に結合する。当業者であれば理解できるように、この部分は酒石酸基に基づく。式の基の左手側上のカルボニル炭素は、典型的にはNH部分に結合し、アミド結合を形成する。前記NH部分は、例えば、L2が式の基である場合、好ましくはL2部分に由来するものである。Bが式またはの基を表す場合、mは1より大きい。Bが式の基である場合、mは2に等しい。Bが式の基である場合、mは3に等しい。当業者であれば理解できるように、式の基はトリラジカルであり、式の基はテトララジカルである。Bが式またはの基である場合、Aは典型的には直接結合である。式の基において、Zは好ましくは非置換であるか、もしくは1もしくは2個のハロゲン原子、ニトロ基もしくはC1~C4アルキル基により置換されたフェニレン基、または非置換であるか、もしくは1もしくは2個のハロゲン原子で置換されたC1~C4アルキレン基を表す。より好ましくは、Zは非置換フェニレン環1個のニトロ基により置換されたフェニレン環またはメチレンもしくはエチレン基を表す。mおよびnが1より大きい場合、A、L2、DおよびBはそれぞれ、同じであるか、または異なる。かくして、式中のqは好ましくは、1、2、3、4、6および9、より好ましくは1、2、3または4、最も好ましくは1の値を取る。L2、P、BおよびL1を連結する結合は、好ましくはアミド結合である。好ましい非分枝状リンカーは、L2、PおよびBが直接結合であり、Aが直接結合ではなく、mおよびnが両方とも1である場合に提供される。その場合、リンカーはAL1により表される。L2およびBが直接結合であり、AおよびPが直接結合ではなく、mおよびnが両方とも1である場合に提供される。その場合、リンカーはAPL1により表される。Bが直接結合であり、A、L2およびPが直接結合ではなく、mおよびnは両方とも1である場合に提供される。その場合、リンカーはAL2PL1により表される。好ましい分枝状リンカーは、BおよびL2が直接結合であり、Pが直接結合ではなく、nが2であり、mが1である場合に提供される。その場合、リンカーは2L1により表される。L2、PおよびAが直接結合であり、Bが直接結合ではなく、nが1であり、mが2である場合に提供される。その場合、リンカーはにより表される。Pが直接結合であり、Bが直接結合ではなく、nが1であり、mが3である場合に提供される。かくして、このリンカー中には3個の分枝が存在し、2個は直接結合としてAおよびL2を有し、1個は直接結合でないものとしてAおよびL2を有する。その場合、リンカーはにより表される。L2、PおよびAが直接結合であり、Bが直接結合ではなく、nが2であり、mが2である場合に提供される。その場合、リンカーはにより表される。さらなる実施形態においては、リンカーは、式の部分および式の部分を含み、かくして、典型的には、この実施形態においては、リンカーはにより表される。置換基置換基は、後に改変することができる置換基、またはタンパク質の血漿半減期を増加させる置換基のいずれかを指す。典型的には、標的化試薬は、1または2個の置換基を有する。しかしながら、標的化試薬は、最大9個の置換基、例えば、3~4個を有していてもよい。2個以上の置換基が存在する場合、置換基はそれぞれ同じであるか、または異なる。例えば、前記置換基はG1置換基とG2置換基との混合物であってよい。さらに、1より多いG1またはG2置換基が存在する場合、G1またはG2はそれぞれ同じであるか、または異なる。しかしながら、それぞれの置換基は同じであるのが好ましい。後に改変することができる置換基後に改変することができる置換基は、該置換基G1を有するタンパク質を、さらなる置換基を有する改変試薬と反応させることにより、置換基Rを前記タンパク質に選択的に導入するのに用いられる置換基である。置換基G1および置換基Rを有する改変試薬の反応性は、置換基Rを有する改変試薬が置換基G1を有するタンパク質と反応する場合、置換基Rを有する改変試薬のみがタンパク質上の置換基G1と反応するように選択される。結果として、置換基Rは、典型的には置換基G1が存在するタンパク質の領域中にのみ導入され、置換基Rは典型的には該タンパク質の任意の他の領域に導入されない。換言すれば、置換基Rは典型的には標的タンパク質上のホーミングペプチドの結合部位の近くの部位にのみ導入される。典型的には、置換基G1はアルデヒド、ケトン、アセタール、ヘミアセタール、アジド、アルキン、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミンまたはその任意の誘導体を含む。好ましくは、置換基G1はアジド、アセタール、ヘミアセタール、またはケトンを含む。ケトンは、好ましくはαβ不飽和カルボニルである。置換基G1の残りの部分は、典型的には、非反応性であり、ケトン、アセタール、ヘミアセタール、アジド、アルキン、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミンまたはその誘導体を、最初に標的化試薬のエステルまたはカルバメートのカルボニル炭素、および続いて、標的タンパク質に接続する機能を有する。かくして、置換基G1の残りの部分は、典型的には非置換もしくは置換、直鎖状もしくは分枝状アルキレン部分、非置換もしくは置換シクロアルキレン部分、非置換もしくは置換アリーレン部分、第三級アミン部分、非置換もしくは置換アルケニル部分、またはそれらの任意の組合せを含む。上記の基のための好ましい置換基は、ハロゲン原子、C1~C6アルキル、C1~C4アルコキシおよびニトロ基である。ハロゲン原子が最も好ましい置換基である。置換基G1は典型的には25~500の分子量を有する。アルデヒドまたはケトンを含む置換基G1は、典型的には式の飽和ケトンである。好ましくは、Dは非置換である直鎖状もしくは分枝状C2~C6アルキレンまたは非置換であるか、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されたフェニレンを表しおよびEは非置換であるか、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換された直鎖状もしくは分枝状C1~C6アルキルまたは非置換であるか、または1つもしくは複数のハロゲン原子、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシもしくはニトロ基により置換されたC6~C10アリールを表す。より好ましくは、Dは非置換である直鎖状もしくは分枝状C2~C4アルキレンを表し、Eは非置換である直鎖状もしくは分枝状C1~C4アルキルを表す。あるいは、ケトンを含む置換基G1は、好ましくはαβ不飽和カルボニルである。αβ不飽和カルボニル基を含む置換基G1は、典型的には式または非置換であるか、または1つもしくは複数のハロゲン原子、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシもしくはニトロ基により置換されたC6~C10アリールを表すまたはDは2~10N部分を表し、EはCOを表し、Dの窒素はEに結合して、例えば、Dが2Nである場合と共に5員環を形成するの基である。上記構造において、2~10アルキレン鎖は非置換であるか、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換される。好ましくは、それは非置換2~6部分であり、より好ましくは上記のように非置換2である。好ましくは、Dは非置換である直鎖状もしくは分枝状C2~C6アルキレンを表し、Eは水素、非置換である直鎖状もしくは分枝状C1~C4アルキル、または非置換であるか、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されたフェニルを表すまたはDおよびEは上記の環式構造を形成する。あるいは、αβ不飽和カルボニル基を含む置換基G1は、好ましくは式の基である。好ましくは、Dは非置換である直鎖状もしくは分枝状C2~C6アルキレンを表し、Eは非置換である直鎖状もしくは分枝状C1~C4アルキル、または非置換であるか、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されたフェニルを表す。アセタールまたはヘミアセタールを含む置換基G1は、典型的には式の基である。当業者であれば理解できるように、式の基は、Q2が水素である場合はヘミアセタールであり、Q2が水素でない場合はアセタールである。アセタールまたはヘミアセタールは、Q3が水素である場合、アルデヒドから誘導される。アセタールまたはヘミアセタールは、Q3が水素ではない場合、ケトンから誘導される。ヘミアセタールはアセタールより安定性が低く、かくして、アセタールが好ましい。両方の基とも穏やかな条件下で容易に脱保護されて、アルデヒドまたはケトン官能性を示す。アジド基を含む置換基G1は、典型的には式の化合物である。JがC1~C10アルキレン基を表す場合、N3は末端または非末端炭素原子、好ましくは末端炭素原子に結合する。好ましくは、Jは非置換C1~C6アルキレン基または非置換であるか、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換されたフェニレン基を表す。最も好ましくは、Jはパラ位にある非置換フェニレン基およびN3を表すアルキン基を含む置換基G1は、典型的には非置換であるか、または1つもしくは複数のハロゲン原子により置換された直鎖状もしくは分枝状C2~C10アルキニル基である。前記アルキニル基は、1つまたは複数の炭素炭素三重結合、好ましくは1個の炭素炭素三重結合を含む。好ましくは、アルキニル基は非置換直鎖状または分枝状C2~C7アルキニル基である。アルキニル基の例は、直鎖状もしくは分枝状エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルまたはへプチニルである。好ましくは、三重結合はアルキニル基中の末端結合である。ピリジルジスルフィド基を含む置換基G1は、典型的には式、またはの基である。Kは好ましくは、非置換直鎖状または分枝状C1~C6アルキレン基である。ピリジルジスルフィド基は、アルキレン基中の末端または非末端炭素原子、好ましくは末端炭素に結合する。アルコキシアミン基を含む置換基G1は、典型的には式の基である。Wは好ましくは、非置換直鎖状または分枝状C1~C6アルキレン基である。アルコキシアミン基は、アルキレン基中の末端または非末端炭素原子、好ましくは末端炭素に結合する。置換基Rの導入後に改変することができる置換基を用いて、標的タンパク質上のホーミングペプチドの結合部位の近くにある部位で、タンパク質中にさらなる置換基を導入することができる。置換基は、好ましくは標的タンパク質の血漿半減期を増加させる置換基である。タンパク質は、典型的にはいくつかのクリアランス部位を有する。本明細書で用いられる用語クリアランス部位は、タンパク質の分解を担う生理学的機構により認識されるタンパク質分子上の領域と定義される。かくして、タンパク質中に置換基を導入することにより前記クリアランス部位を破壊することによって、タンパク質の半減期を増加させることができる。破壊されたクリアランス部位は、上記改変の結果として、タンパク質分子の同種受容体または相互作用パートナーへの結合の減少を示すタンパク質分子上のクリアランス部位と定義される。かくして、クリアランス部位を破壊する1つまたは複数の部位をタンパク質に導入することにより、タンパク質の血漿半減期を改善することができる。そのような部分は、典型的にはタンパク質上の1つまたは複数のクリアランス部位を隠す、マスクするか、または覆い隠す。かくして、一実施形態においては、本発明は血漿半減期が改善したタンパク質誘導体を提供する。この改善は、対応する非改変タンパク質に関するものである。タンパク質またはタンパク質誘導体の血漿半減期は、invivoでの血漿半減期を測定することにより決定される。タンパク質のinvivoでの血漿半減期はかなり変化する。例えば、ヒト第VIII因子は、約12~14時間の血漿半減期を有する。タンパク質のinvivoでの血漿半減期は、タンパク質またはタンパク質誘導体の50が消失する前に血漿または血流中に循環する時間である。血漿半減期の決定は、典型的には機能的半減期の決定よりも簡単であり、血漿半減期の規模は通常、invivoでの機能的半減期の規模の良い指標である。血漿半減期の別名としては、血清半減期、血中半減期、循環半減期、血清クリアランス、血漿クリアランス、およびクリアランス半減期が挙げられる。血漿半減期と関連して用いられる用語増加したは、タンパク質誘導体の関連する半減期が比較可能な条件下で決定される場合、非改変タンパク質のものと比較して統計的に有意に増加したことを指すように用いられる。例えば、関連する半減期を、少なくとも約25、例えば、少なくとも約50、例えば、少なくとも約100、150、200、250または500増加させることができる。一実施形態においては、本発明のタンパク質誘導体は、親タンパク質の半減期と比較して、少なくとも約5時間、好ましくは約24時間、より好ましくは少なくとも約72時間、および最も好ましくは少なくとも約7日間の半減期の増加を示す。本明細書で用いられる用語親タンパク質とは、問題のタンパク質誘導体が誘導される特異的タンパク質を指す。invivoでの血漿半減期の測定を、文献に記載されたようないくつかの方法で実行することができる。invivoでの血漿半減期の増加を、クリアランスの低下または平均滞留時間の増加として定量することができる。CLが、好適なアッセイにおいて決定した親タンパク質のCLの70未満、例えば、50未満、20未満、10未満に低下した本発明のタンパク質誘導体を、増加したinvivoでの血漿半減期を有すると言う。MRTが、好適なアッセイにおいて親タンパク質のMRTの130以上、例えば、150以上、200以上、500以上に増加した本発明のタンパク質誘導体を、増加したinvivoでの血漿半減期を有すると言う。クリアランスおよび平均滞留時間を、好適な試験動物を用いる標準的な薬物動態試験において評価することができる。所与のタンパク質について好適な試験動物を選択することは、当業者の能力の範囲内にある。勿論、ヒトにおける試験が究極的な試験を表す。典型的に、および一例として、マウス、ラット、イヌ、サルまたはブタに目的の化合物を注射する。注射する量は、試験動物に依存する。続いて、CLおよびMRTの評価のために、必要に応じて1~5日間の期間にわたって血液サンプルを採取する。血液サンプルを、ELISA技術により都合良く分析する。典型的には、置換基Rは、ビスホスホナート、血小板もしくは内皮細胞に結合する置換基、抗体、親水性ポリマー、アルブミンまたはアルブミン結合剤を含む。本明細書で用いられる用語ビスホスホナートは、典型的にはから選択されるジラジカルを含む置換基を指す。そのような部分は、典型的にはカルシウムに対する高い結合親和性を有する。本明細書で用いられる用語血小板または内皮細胞に結合する置換基は、典型的には配列RGDを含有するペプチド、例えば、エキスタチンもしくはフィブリノーゲンまたはその断片に関する。本明細書で用いられる用語抗体は、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成された多特異的抗体、および所望の生物学的活性を示す限り、抗体フラグメントを包含する。抗体は、例えば、IgM、IgG、IgD、IgAまたはIgEであってよい。用語抗体は、抗体フラグメント、例えば、抗体のFCフラグメントまたは抗体のFABフラグメントを含む。本明細書で用いられる用語親水性ポリマーとは、ポリ、多糖、エチレングリコール、プロピレングリコールのコポリマー、ポリ、PC、ポリ、ポリ、ポリ、ポリ、ポリ、ポリ、ポリホスファゼンおよびポリオキサゾリンを指す。前記親水性ポリマーは、好ましくは03~150kDa、より好ましくは5~120kDaの質量を有する。置換基Rは、好ましくはPEGを含む。かくして、一実施形態においては、本発明は、タンパク質を選択的にPEG化する方法を提供する。本明細書で用いられる用語PEGとは、ポリまたはポリオキシエチレンとしても知られるポリを指し、これらはポリエーテルである。PEGは、エチレンオキシドの重合により調製され、300gmol~10000000gmolの広範囲の分子量にわたって市販されている。また、重合プロセスに用いられる開始剤に応じて、様々な形態のPEGが入手可能である。最も一般的な形態のPEGは、一官能性メチルエーテルPEGであり、mPEGと省略される。PEGはまた、線状および分枝状PEGなどの異なる形状で入手可能である。PEGは構造HOnH、および分子式C2nH4n2On1、およびCAS番号25322683を有する。分子質量は勿論、nに依存する。PEGの名称に含まれることが多い数字はその平均分子量を示し、例えば、n80を有するPEGは約3500ダルトンの平均分子量を有し、PEG3500を標識される。多くのPEGは、ある分布の分子量を有する分子を含む、すなわち、それらは多分散系である。その重量平均分子量およびその数平均分子量によってサイズ分布を統計的に特性評価することができ、その比率は多分散指数と呼ばれる。MwおよびMnは質量分析法により測定することができる。従って、多分散指数は、1より大きいか、または1と等しい数であり、GelPermeationChromatographicデータから見積もることもできる。多分散指数が1である場合、生成物は単分散性であり、かくして、単一の分子量を有する化合物から作られる。多分散指数が1より大きい場合、ポリマーは多分散性であり、多分散指数は異なる分子量を有するポリマーの分布がどれぐらい広いかを言う。多分散指数は、典型的にはPEGまたはmPEGの分子量と共に増加する。本発明の目的のために、用語PEGおよびPegは互換的に用いられ、基本的には構造を含むラジカルまたはジラジカルを意味する。用語PEGは、ポリならびにポリモノアルキルエーテルを示すことが意図される。従って、好ましい実施形態においては、本発明による使用のためのPegは、下記式により表される。上記で説明したように、Sがメチルオキシを示し、Tが存在しないこの式の化合物を、mPEGとも呼ぶ。本発明による使用のためのPEGの分子量は、好ましくは約300Da~約150000Daである。kDaで表されるPegの分子量を、括弧内に示すことができる。例えば、mPEGは、約30kDaの分子量を有するポリモノメチルエーテルを示す。ところで、このポリマーは、約680±100のエチレングリコール単位から構成され得る。別の例として、mPEGにおいては、nは90であり、分子量は3991Da、すなわち、約4kDaである。同様に、mPEGは、20kDaの平均分子量および454の平均nを有する。本発明による使用のためのPEGは、線状または分枝状であってよい。特定の実施形態においては、本発明による使用のためのPEGは、a多分散性、またはb単分散性である。特定の実施形態においては、本発明による使用のためのPegの多分散指数は、i106以下、ii105以下、iii104以下、iv103以下、またはv102~103である。本明細書で用いられる用語アルブミンとは、血清に由来する血清アルブミンを指し、ヒト血清アルブミンならびに他の起源に由来する血清アルブミンを含む。本明細書で用いられる用語アルブミンは、アルブミンの任意の誘導体または改変型のアルブミンを含む。本明細書で用いられる用語アルブミン結合剤とは、アルブミンに結合することができる任意の部分を指す。アルブミンに結合する化合物の能力を、参照により本明細書に組入れられるものとするJMedChem4320001986~1992に記載のように決定することができる。本発明の意味において、RuDaが005より高い、例えば、010より高い、例えば、012より高い、またはさらには015より高い場合、化合物はアルブミンに結合すると定義される。アルブミン結合剤は、典型的には高度に疎水性の分子であり、好ましくは脂肪酸から誘導される。かくして、アルブミン結合剤は、好ましくは12部分を含む。他のアルブミン結合剤としては、チバクロームなどのペプチドが挙げられる。置換基を導入するのに用いられる方法、技術および反応条件は、いくつかの因子に依存する。重要なことは、反応条件が、タンパク質が不可逆的に損傷されないように十分に穏やかであるべきであることである。正確な試薬は、例えば、標的タンパク質中に導入された置換基G1および置換基Rを有する改変試薬の性質および反応性に依存する。さらに、改変試薬の反応性は、改変試薬がタンパク質上の置換基G1とのみ反応し、いかなる意味でも該タンパク質の残りの部分を改変しないようなものであるべきである。好適な技術および試薬は当業者には公知である。G1がアルデヒドまたはケトンを含む場合、置換基Rを導入するために、典型的には求核改変試薬が用いられる。例えば、G1がαβ不飽和カルボニル部分、例えば、マレオイルを含む場合、コンジュゲート付加により置換基を導入するためには、RSHなどのソフトな求核試薬を用いる以下の型の反応が好ましいG1がアジド部分を含む場合、所望の置換基を導入するために、典型的にはクリックケミストリーまたはStaudinger支援還元的アシル化などの標準的な技術が用いられる。G1がピリジンジスルフィド基を含む場合、SS結合を切断し、それによって、Rとタンパク質との間に新しい結合であるジスルフィド結合を形成するために、典型的にはRSHなどの求核試薬が用いられるG1がアルコキシアミン基を含む場合、置換基Rを導入するために、典型的には式RCHOのアルデヒドとの反応が用いられるG1がアルキンを含む場合、置換基Rを導入するために、当業者には公知の反応が用いられる。例えば、クリックケミストリーなどの標準的な技術を用いて所望の置換基を導入することができる。G1がアセタールまたはヘミアセタールを含む場合、アルデヒドまたはケトン官能性を示すために、典型的には穏やかな条件下で、脱保護反応が用いられるのが好ましい。次いで、ケトンを用いて、例えば、上記のように置換基Rを導入することができる。アルデヒドは、典型的には求核試薬と反応して、置換基Rを導入する。例えば、式RONH2のアルコキシアミン化合物は、以下のようにアルデヒドケトンと反応する上記反応は、限定を意図するものではなく、当業者であれば、置換基Rの導入の成功のために、必要に応じて代替的な技術、試薬および反応条件を選択することができる。標的タンパク質の血漿半減期を増加させる置換基代替的な実施形態においては、本発明は、標的タンパク質の血漿半減期を直接増加させる置換基を導入するのに用いられる。用語血漿半減期を増加させるは上記で定義された通りである。置換基G2は、好ましくはビスホスホナート、血小板もしくは内皮細胞に結合する置換基、抗体、親水性ポリマー、ポリエチレングリコール、ヒドロキシルエチルスターチなど、アルブミン、Fcドメイン、または例えば、脂肪酸もしくは脂肪酸誘導体などのアルブミン結合剤を含み、ここでこれらの用語は上記で定義された通りである。好ましくは、置換基G2はPEGを含み、かくして、一実施形態においては、本発明はタンパク質を選択的にPEG化する方法を提供する。改変タンパク質のスクリーニング上記の試薬および技術を用いて改変されたタンパク質は一般に、本質的な生物学的活性が影響されたかどうかを確認するためにその後のスクリーニングを受ける。好ましくは、本発明の改変タンパク質は、親タンパク質と実質的に同じ活性を有する。タンパク質活性は、タンパク質の本質的な生物学的活性を実行する能力と定義され、そのような活性は当業者には周知である。例えば、FVIII活性は、凝固カスケード中で機能し、活性化された血小板上での第IXa因子との相互作用により第Xa因子の形成を誘導し、血栓の形成を支援する能力と定義される。本明細書で用いられる用語タンパク質活性が親タンパク質の活性と実質的に同じであるとは、改変されたタンパク質の活性が、親タンパク質の活性の少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、例えば、少なくとも100であることを意味する。改変されたタンパク質活性は、特に親タンパク質の活性の約50~約75、約75~約85、約85~約95であり、さらには100を超える。特異的スクリーニングアッセイは、改変されたタンパク質に依存する。好適なアッセイは当業者には公知である。そのようなその後のスクリーニング工程により、その本質的な生物学的活性を喪失した改変タンパク質を同定することができる。典型的には、市販のキットが用いられる。例えば、ヒト血漿、血液画分および精製された調製物における第VIII因子活性の決定のためには、発色アッセイキットが一般に用いられる。第VIII因子活性の決定のための好ましいキットは、CoamaticChromogenicアッセイキットおよびCoaTestSPFVIIIアッセイキットである。式の標的化試薬を、当業者には公知の標準的な方法により調製することができる。医薬組成物本発明の方法により得られる改変タンパク質は、ヒトまたは動物の身体の治療において有用である。かくして、本発明はまた、本発明の方法により得られるタンパク質を含む医薬組成物に関する。典型的には、前記医薬組成物はさらに、製薬上許容し得る担体または希釈剤を含む。好ましい製薬上許容し得る担体または希釈剤は、水性緩衝化溶液である。かくして、本発明は、本発明の改変タンパク質とバッファーとの水性溶液を含む医薬製剤であって、改変タンパク質が0001mgml以上の濃度で存在し、前記製剤が約20~約100のpHを有する前記医薬製剤に関する。典型的には、バッファーは酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、グリチルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ジナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリスアミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはそれらの混合物からなる群より選択される。これらの特定のバッファーのそれぞれの一つは、本発明の代替的な実施形態を構成する。典型的には、前記製剤はさらに、製薬上許容し得る保存剤を含む。本発明のさらなる実施形態においては、保存剤は、フェノール、oクレゾール、mクレゾール、pクレゾール、メチルpヒドロキシ安息香酸、プロピルpヒドロキシ安息香酸、2フェノキシエタノール、ブチルpヒドロキシ安息香酸、2フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、およびチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミドウレア、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、エチルpヒドロキシ安息香酸、ベンゼトニウム塩化物、クロルフェネシンまたはそれらの混合物からなる群より選択される。本発明のさらなる実施形態においては、保存剤は、01mgml~20mgmlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態においては、保存剤は、01mgml~5mgmlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態においては、保存剤は、5mgml~10mgmlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態においては、保存剤は、10mgml~20mgmlの濃度で存在する。これらの特定の保存剤のそれぞれの一つは、本発明の代替的な実施形態を構成する。医薬組成物における保存剤の使用は、当業者には周知である。便宜上、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy、第19版補遺、1995に対する参照を行う。典型的には、前記製剤はさらに、等張剤を含む。本発明のさらなる実施形態においては、等張剤は、塩、糖もしくは糖アルコール、アミノ酸、アルジトール、12プロパンジオール、13プロパンジオール、13ブタンジオール、ポリエチレングリコール、またはそれらの混合物からなる群より選択される。モノ、ジ、もしくはポリサッカリド、または水溶性グルカン、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロースNaなどの任意の糖を用いることができる。一実施形態においては、糖添加物はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも1個のOH基を有するC4~C8炭化水素と定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ダルシトール、キシリトール、およびアラビトールが挙げられる。一実施形態においては、糖アルコール添加物はマンニトールである。上記の糖または糖アルコールは、個別に、または組合わせて用いることができる。糖または糖アルコールが液体調製物中で可溶性であり、本発明の方法を用いて達成される安定化効果に有害に作用しない限り、用いられる量に固定的限界はない。一実施形態においては、糖または糖アルコール濃度は、約1mgml~約150mgmlである。本発明のさらなる実施形態においては、等張剤は1mgml~50mgmlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態においては、等張剤は1mgml~7mgmlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態においては、等張剤は8mgml~24mgmlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態においては、等張剤は25mgml~50mgmlの濃度で存在する。これらの特定の等張剤のそれぞれの一つは、本発明の代替的な実施形態を構成する。医薬組成物における等張剤の使用は当業者には周知である。便宜上、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy、第19版補遺、1995に対する参照を行う。典型的には、前記製剤はさらに、キレート化剤を含む。本発明のさらなる実施形態においては、キレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、ならびにそれらの混合物から選択される。本発明のさらなる実施形態においては、キレート化剤は、01mgml~5mgmlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態においては、キレート化剤は、01mgml~2mgmlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施形態においては、キレート化剤は、2mgml~5mgmlの濃度で存在する。これらの特定のキレート化剤のそれぞれの一つは本発明の代替的な実施形態を構成する。医薬組成物におけるキレート化剤の使用は当業者には周知である。便宜上、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy、第19版補遺、1995に対する参照を行う。典型的には、前記製剤はさらに、安定剤を含む。医薬組成物における安定剤の使用は当業者には周知である。便宜上、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy、第19版補遺、1995に対する参照を行う。典型的には、本発明の医薬組成物はさらに、該組成物の保存中にポリペプチドによる凝集物形成を低下させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含んでもよい。アミノ酸塩基とは、任意の所与のアミノ酸がその遊離塩基形態またはその塩形態で存在する、アミノ酸またはアミノ酸の組合せを意図する。アミノ酸の組合せを用いる場合、全てのアミノ酸はその遊離塩基形態で存在してもよく、全てその塩形態で存在してもよく、またはいくつかはその遊離塩基形態で存在してもよいが、その他はその塩形態で存在する。一実施形態においては、本発明の組成物を調製する際に使用するアミノ酸は、荷電した側鎖を有するアミノ酸、例えば、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸である。特定のアミノ酸の任意の立体異性体またはこれらの立体異性体の組合せは、特定のアミノ酸がその遊離塩基形態またはその塩形態で存在する限り、本発明の医薬組成物中に存在してもよい。一実施形態においては、L立体異性体を用いる。本発明の組成物は、これらのアミノ酸の類似体と共に製剤化することもできる。アミノ酸類似体とは、本発明の液体医薬組成物の保存中にポリペプチドによる凝集物形成を低下させる所望の効果をもたらす天然アミノ酸の誘導体を意図する。好適なアルギニン類似体としては、例えば、アミノグアニジン、オルニチンおよびNモノエチルLアルギニンが挙げられ、好適なメチオニン類似体としては、エチオニンおよびブチオニンが挙げられ、好適なシステイン類似体としては、SメチルLシステインが挙げられる。その他のアミノ酸と同様、アミノ酸類似体はその遊離塩基形態またはその塩形態で組成物中に組入れられる。本発明のさらなる実施形態においては、アミノ酸またはアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を防止するか、または遅延させるのに十分な濃度で用いられる。本発明のさらなる実施形態においては、治療剤として作用するポリペプチドがメチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を受けやすい少なくとも1個のメチオニン残基を含むポリペプチドである場合、メチオニンを添加して、そのような酸化を阻害することができる。阻害するとは、時間と共にメチオニン酸化種の蓄積が最少になることを意図する。メチオニン酸化の阻害は、ポリペプチドの適切な分子形態でのそのより長い保持をもたらす。メチオニンの任意の立体異性体またはその組合せを用いることができる。添加される量は、メチオニンスルホキシドの量が規制当局に許容されるようにメチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量であるべきである。典型的には、これは、組成物が約10~約30以下のメチオニンスルホキシドを含有することを意味する。一般に、これは、メチオニン残基に添加されるメチオニンの比率が約11~約10001、例えば、101~約1001の範囲になるようにメチオニンを添加することにより達成することができる。典型的には、前記製剤はさらに、高分子量ポリマーまたは低分子化合物の群から選択される安定剤を含む。本発明のさらなる実施形態においては、安定剤は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシヒドロキシセルロースまたはその誘導体、シクロデキストリン、硫黄含有物質、例えば、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2メチルチオエタノール、ならびに様々な塩から選択される。これらの特定の安定剤のそれぞれの一つは本発明の代替的な実施形態を構成する。医薬組成物はまた、その中の治療上活性なポリペプチドの安定性をさらに増強する追加の安定化剤を含んでもよい。本発明に対して特定の目的の安定化剤としては、限定されるものではないが、メチオニン酸化に対してポリペプチドを保護する、メチオニンおよびEDTA、ならびに凍結解凍または機械的剪断と関連する凝集に対してポリペプチドを保護する、非イオン性界面活性剤が挙げられる。本発明のさらなる実施形態においては、前記製剤は界面活性剤を含む。界面活性剤は、洗剤、エトキシル化ヒマシ油、多解糖グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンブロックポリマー、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体、例えば、アルキル化およびアルコキシル化誘導体、モノグリセリドまたはそのエトキシル化誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチンおよびリン脂質、リン脂質の誘導体およびリゾリン脂質ならびにリゾホスファチジルおよびホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル、アルコキシ誘導体、例えば、リゾホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンのラウロイルおよびミリストイル誘導体、および極性頭部基、すなわち、コリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、トレオニン、グリセロール、イノシトールの改変物、および正に荷電したDODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルトレオニン、ならびにグリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体、長鎖脂肪酸およびその塩C6~C12、アシルカルニチンおよび誘導体、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンのNsupαアシル化誘導体、またはリシン、アルギニンもしくはヒスチジンの側鎖アシル化誘導体、またはリシンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンと、中性もしくは酸性アミノ酸との任意の組合せを含むジペプチドのNsupαアシル化誘導体、中性アミノ酸と、2個の荷電アミノ酸との任意の組合せを含むトリペプチドのNsupαアシル化誘導体、DSS、ドクサートカルシウム、ドクサートカリウム、SDS、カプリル酸ナトリウム、コール酸またはその誘導体、胆汁酸およびその塩ならびにグリシンまたはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、NヘキサデシルNNジメチル3アンモニオ1プロパンスルホナート、陰イオン性一価界面活性剤、双性イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、プロピレンオキシドおよびエチレンオキシドのエチレンジアミンへの連続付加から誘導された四官能性ブロックコポリマーであるポロキサミンであってよく、または界面活性剤をイミダゾリン誘導体、もしくはその混合物の群から選択することができる。これらの特定の界面活性剤のそれぞれの一つは本発明の代替的な実施形態を構成する。医薬組成物における界面活性剤の使用は当業者には周知である。便宜上、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy、第19版補遺、1995に対する参照を行う。他の成分を本発明の医薬製剤中に存在させることも可能である。そのような追加成分としては、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、等張性改変剤、キレート化剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質および双性イオンが挙げられる。そのような追加成分は勿論、本発明の医薬製剤の全体の安定性に有害に作用しないべきである。医薬組成物の非経口投与は、典型的にはシリンジ、必要に応じて、ペン型シリンジを用いる皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射により実施される。あるいは、非経口投与を、輸液ポンプを用いて実施することができる。さらなる選択肢は、鼻内または経肺スプレーの形態での投与のための溶液または懸濁液であってよい組成物である。さらなる選択肢として、医薬組成物を、例えば、針を使用しない注入によるか、もしくはパッチ、必要に応じて、イオン導入パッチからの経皮投与、または経粘膜、例えば、頬投与に適合させることもできる。本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これはさらなる限定と解釈されるべきではない。1ビーズ1ペプチド法に基づく固相ライブラリーを、1~2時間、インキュベーションバッファー中の01~10μgmlのビオチン化FVIIIを用いてスクリーニングした。インキュベーション後、ライブラリーを洗浄バッファーを用いて、2倍樹脂容量に相当する容量で約5~6回洗浄した。洗浄後、ライブラリーを、約15~30分間、インキュベーションバッファー中の01μgmlのストレプトアビジンアルカリホスファターゼと共にインキュベートした。インキュベーション後、ライブラリーを洗浄バッファーで洗浄し、着色バッファーを、2mgの5ブロモ4クロロ3インドリルホスフェートと一緒に添加した。ビーズの染色を1~2時間行い、10AcOHで洗浄することにより反応を停止させた。最も暗い青色のビーズをライブラリーから回収し、AppliedBiosystemsのProcise装置で、Edman配列決定を用いて配列決定した。このように、FVIIIに結合するペプチドを同定した。例1~20は、標的化試薬の調製に関する。これらの標的化試薬がタンパク質中に導入する置換基は後に改変することができる置換基または改変することができる置換基ではないため、これらの標的化試薬のいくつかを参考と命名した。むしろ、ビオチンおよびピレンから誘導されたこれらの置換基は、置換基が付加されたタンパク質の領域を標識した。を有さない標的化試薬リンカー中に分枝またはペプチドを有さない以下の標的化試薬を調製した。Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。予め混合した、NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中の4アセトキシ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NMP中のビオチンの懸濁液を樹脂に添加した。溶液を樹脂と混合したら、NMP中のDICおよび4ピリジンの溶液を添加した。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5トリエチルシランで切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS8022。同じ樹脂を、化合物1の調製と同様に用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中の4アセトキシ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NMP中の4アジド安息香酸、DIC、およびDMAPの溶液を樹脂に添加した。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5トリエチルシランで切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS1522Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中のジグリコール酸無水物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中の4710トリオキサトリデカン113ジアミンおよびPyBOPの溶液を、樹脂に添加した。混合物を2時間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中の4アセトキシ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NMP中の4アジド安息香酸、DIC、およびDMAPの溶液を樹脂に添加した。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5トリエチルシランで切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS1081Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中の4アセトキシ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NMP中の1ピレン酪酸、DIC、およびDMAPの溶液を樹脂に添加した。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5トリエチルシランで切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS8252Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中の4ヒドロキシ3ニトロ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NMP中の1ピレン酪酸、DIC、およびDMAPの溶液を樹脂に添加した。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5トリエチルシランで切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS8472Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中の4ヒドロキシ3ニトロ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NMP中のビオチンの懸濁液を樹脂に添加した。一度、溶液が樹脂と混合されたら、NMP中のDICおよび4ピリジンの溶液を添加した。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5トリエチルシランで切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS1177Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中の4アセトキシ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NマレオイルβアラニンをDCM中に懸濁した。Nメチルイミダゾールを添加した。溶液が透明になるまで混合物を振とうした。溶液を13ニトロ1H124トリアゾールと混合した。完全な溶解後、混合物を樹脂と混合した。得られた混合物を一晩振とうした。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5の水で切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS1792Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中のアセトキシ酢酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NマレオイルβアラニンをDCM中に懸濁した。Nメチルイミダゾールを添加した。溶液が透明になるまで混合物を振とうした。溶液を13ニトロ1H124トリアゾールと混合した。完全な溶解後、混合物を樹脂と混合した。得られた混合物を一晩振とうした。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5の水で切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS1730Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中の4アセトキシ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NマレオイルβアラニンをDCM中に懸濁した。Nメチルイミダゾールを添加した。溶液が透明になるまで混合物を振とうした。溶液を13ニトロ1H124トリアゾールと混合した。完全な溶解後、混合物を樹脂と混合した。得られた混合物を一晩振とうした。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5の水で切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS1529Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中のアセトキシ酢酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NマレオイルβアラニンをDCM中に懸濁した。Nメチルイミダゾールを添加した。溶液が透明になるまで混合物を振とうした。溶液を13ニトロ1H124トリアゾールと混合した。完全な溶解後、混合物を樹脂と混合した。得られた混合物を一晩振とうした。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5の水で切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS1467を有するが、分枝を有さない標的化試薬リンカー中にペプチドを有するが、分枝を有さない以下の標的化試薬を調製した。Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中のジグリコール酸無水物の溶液を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中の4710トリオキサトリデカン113ジアミンおよびPyBOPの溶液を、樹脂に添加した。混合物を2時間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。配列EREを合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。Fmoc保護基を除去した後、NMP中の4アセトキシ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NMP中の4アジド安息香酸、DIC、およびDMAPの溶液を樹脂に添加した。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5トリエチルシランで切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS7472Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中のジグリコール酸無水物の溶液を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中の4710トリオキサトリデカン113ジアミンおよびPyBOPの溶液を、樹脂に添加した。混合物を2時間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。配列EREを合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。Fmoc保護基を除去した後、NMP中の4アセトキシ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NMP中の1ピレン酪酸、DIC、およびDMAPの溶液を樹脂に添加した。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5トリエチルシランで切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS8102Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中の4アセトキシ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NMP中の4アジド安息香酸、DIC、およびDMAPの溶液を樹脂に添加した。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5トリエチルシランで切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS8882Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中の4アセトキシ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NマレオイルβアラニンをDCM中に懸濁した。Nメチルイミダゾールを添加した。溶液が透明になるまで、混合物を振とうした。溶液を13ニトロ1H124トリアゾールと混合した。完全な溶解後、混合物を樹脂と混合した。得られた混合物を一晩振とうした。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5の水で切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS1344Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中のアセトキシ酢酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NマレオイルβアラニンをDCM中に懸濁した。Nメチルイミダゾールを添加した。溶液が透明になるまで、混合物を振とうした。溶液を13ニトロ1H124トリアゾールと混合した。完全な溶解後、混合物を樹脂と混合した。得られた混合物を一晩振とうした。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5の水で切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS1280リンカー中の第三級アミン部分により提供された分枝を有する以下の標的化試薬を調製した。Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中のブロモ酢酸、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの混合物を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中の18ジアミノ36ジオキサオクタンの溶液。混合物を一晩振とうした。樹脂を洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。NMP中の4アセトキシ安息香酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NMP中の4アジド安息香酸、DIC、およびDMAPの溶液を樹脂に添加した。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5トリエチルシランで切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS11792リンカー中の酒石酸部分により提供された分枝を有する以下の標的化試薬を調製した。Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中のジアセトキシL酒石酸無水物の溶液を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NマレオイルβアラニンをDCM中に懸濁した。Nメチルイミダゾールを添加した。溶液が透明になるまで、混合物を振とうした。溶液を13ニトロ1H124トリアゾールと混合した。完全な溶解後、混合物を樹脂と混合した。得られた混合物を一晩振とうした。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5の水で切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS9772Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中のジアセトキシL酒石酸無水物の溶液を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。メタノール中のテトラヒドロフランと飽和ナトリウムメトキシドの混合物を樹脂に添加した。得られた混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、5酢酸を含むDCM、およびDCMで洗浄した。NマレオイルβアラニンをDCM中に懸濁した。Nメチルイミダゾールを添加した。溶液が透明になるまで、混合物を振とうした。溶液を13ニトロ1H124トリアゾールと混合した。完全な溶解後、混合物を樹脂と混合した。得られた混合物を一晩振とうした。混合物を24時間振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5の水で切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS8462Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。NMP中のブロモ酢酸およびDICの溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。反応の完了後、樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のエチレンジアミンの溶液を添加した。混合物を3時間振とうした。樹脂を洗浄した。NMP中のジアセチルL酒石酸無水物の溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。反応の完了後、樹脂をNMPで洗浄した。メタノールTHF中の飽和ナトリウムメトキシドの溶液を、樹脂に添加した。混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、NMP中の5AcOH、NMPおよびDCMで洗浄した。NマレオイルβアラニンをDCM中に懸濁した。Nメチルイミダゾールを添加した。溶液が透明になるまで、混合物を振とうした。溶液を13ニトロ1H124トリアゾールと混合した。完全な溶解後、混合物を樹脂と混合した。得られた混合物を一晩振とうした。混合物を24h振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5の水で切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS11132Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。N末端Fmoc保護基を除去し、続いて樹脂を洗浄した後、NMP中のジアセチルL酒石酸無水物の溶液を樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。反応の完了後、樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のエチレンジアミンおよびPyBOPの溶液を樹脂に添加した。混合物を3時間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中の4ヒドロキシ3ニトロ安息香酸、HOAtおよびDICの溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。樹脂をNMPで洗浄した。メタノールTHF中の飽和ナトリウムメトキシドの溶液を樹脂に添加した。混合物を1時間振とうした。樹脂をNMP、NMP中の5AcOH、NMPおよびDCMで洗浄した。Nマレオイルβアラニンを、DCM中に懸濁した。Nメチルイミダゾールを添加した。溶液が透明になるまで混合物を振とうした。溶液を13ニトロ1H124トリアゾールと混合した。完全な溶解後、混合物を樹脂と混合した。得られた混合物を一晩振とうした。混合物を24h振とうした。樹脂を洗浄し、TFA中の5の水で切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。LCMS10252配列Fmoc8アミノ36ジオキサオクタノイルGluTyrHisSerTrpGluTyrIleNH2を有するRinkアミドPS樹脂を、固定されたシリンジ中に入れた。樹脂を、ピペリジンおよびNMPの混合物中で約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のジアセチルL酒石酸無水物を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。反応の完了後、樹脂をNMPで手短に洗浄した。メタノールTHF中の飽和ナトリウムメトキシドの溶液を樹脂に添加した。混合物を1h振とうした。樹脂をNMP、NMP中の5AcOH、NMPおよびDCMで洗浄した。ヘキサンジオン酸およびDICをDCM中で混合した。得られた混合物を振とうした。DMAPを添加した。混合物を樹脂と混合した。混合物を一晩振とうした。樹脂をDCMで洗浄した。樹脂を、5の水を含有するTFAで2h処理した。ジエチルエーテルで磨砕した。LCMS9702Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。NMP中の無水酢酸の溶液中で1時間、樹脂を振とうすることにより、ペプチドをN末端アセチル化した。樹脂を洗浄した。樹脂を、NMP中のヒドラジンの混合物で2x3分間処理した。樹脂をNMPで洗浄した。樹脂を、NMP中のフェニルクロロギ酸およびDIPEAの混合物中で1h振とうした。樹脂をNMPおよびDCMで洗浄した。ペプチドをTFA中のトリエチルシランの溶液で2時間処理することにより、ペプチドを樹脂から切り出した。化合物をジエチルエーテルで磨砕した。粗化合物を、逆相HPLCを用いて精製した。選択された画分をプールし、凍結乾燥した。LCMS15582Rinkアミドリンカーアミノエチルポリスチレン樹脂を、シリンジに入れた。樹脂を、Nメチルピロリドン中のピペリジンの混合物中で30分間振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のFmocアミノ酸、7アザ1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびNNジイソプロピルカルボジイミドの予め混合した溶液を、樹脂に添加した。ブロモフェノールブルーをモニタリング試薬として用いた。色が完全なアシル化を示すまで、懸濁液を振とうした。樹脂をNMPで洗浄した。NMP中のピペリジンを添加した。得られた懸濁液を約1分間振とうした。シリンジを排水した。NMP中のピペリジンを添加した。懸濁液を30分間振とうした。上記に列挙された配列を合成するために、上記のプロトコルの反復サイクルを用いた。樹脂を洗浄した。4メチルベンジルで保護されたホスホナートを、NMP中のHOAtHOBtと混合した。混合物を樹脂に添加した。混合物を一晩振とうした。ペプチドを、TFA中の5メルカプトエタノール、5トリエチルシラン、および5フェノールで2時間処理することにより樹脂から切り出した。粗ペプチドをジエチルエーテルで磨砕した。LCMS1768と化合物22とのインキュベーションBドメインが欠失したFVIIIを、下記バッファー水中の20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002Tween80、150mMNaCl、1Mグリセロール、pH73に溶解した。化合物1を、FVIIIを溶解したのと同じバッファー中に部分的に溶解した。カルバメートの保存溶液を、希釈率1、10、100、および1000を用いて作製した。FVIII溶液および化合物23の溶液を混合した。サンプルを25°Cで20時間インキュベートした。結果を、AvidinHRPに対するウェスタンブロッティングにより分析した。サンプルを7トリス酢酸ゲル上にロードした。ゲルを150Vに60分間曝露した。ゲルをエレクトロブロットし、得られたブロットを、50mMTris、150mMNaCl、およびTween20、pH75からなるバッファー中の3ミルク粉末の溶液中で45分間処理した。ブロットをTBSバッファー中で5分間洗浄した。ブロットを、アビジンHRPの11000混合物およびバッファーミルク粉末混合物中、室温で2hインキュベートした。ブロットをTBSバッファーで4x5分間洗浄した。ブロットをWestPico発光混合物で5分間処理した。直後に化学発光を測定した。結果を図1に示す。各レーンは以下のものを含むレーン1ビオチン化マーカー細胞シグナリング技術、25μlレーン2N8レーン3バイアルAレーン4バイアルBレーン5バイアルCレーン6バイアルDレーン7バイアルAレーン8バイアルBレーン9バイアルCおよびレーン10バイアルD。図1は、ビオチン置換基の導入が主に重鎖中で起こったことを示している。図2は、下記のことを示す別のウェスタンブロットであるレーン1ビオチン化マーカー細胞シグナリング技術、2μlおよびシーブルー2マーカー、3μlレーン2N8バッチ7レーン3バイアルAレーン4バイアルB障害レーン5バイアルCレーン6バイアルDレーン7バイアルAトロンビン予備処理レーン8バイアルBトロンビン予備処理レーン9バイアルCトロンビン予備処理およびレーン10バイアルDトロンビン予備処理。図2は、ビオチン置換基の導入が主にA2ドメイン中でA2ドメインだけで起こったことを示している。と化合物17とのインキュベーションBドメインが欠失したFVIIIを、下記バッファー水中の50mMHEPES、10mMCaCl2、002Tween80、および050MNaCl、pH75中の様々な濃度の化合物17と共に25°Cで20時間インキュベートした。同じバッファー中の標識化合物1の様々な濃度の溶液を添加した。サンプルをバイアル中で4または18時間インキュベートした。化合物17、標識化合物1の量およびインキュベーション期間をTable1に示す。結果を、抗FLAGM2抗体に対するウェスタンブロッティングにより分析し、図3に示す。Table1は、図1の鍵を提供する。レーン1および2はそれぞれ、HiMark予備染色およびMagicMarkXPWesternProtein染色であった。18時間静置したバイアル中で沈降が起こり、これらのレーン中にシグナルが存在しないことを説明することができる。漸増量の化合物17は、増加した強度の検出シグナルをもたらした。シグナルはBDDFVIII重鎖のみに対応するバンドで観察される。と化合物17とのインキュベーションの後のPEG化Bドメインが欠失したFVIIIを、下記バッファー水中の50mMHEPES、10mMCaCl2、002Tween80、および050MNaCl、pH75中で様々な濃度の化合物17と共に25°Cで20時間インキュベートした。同じバッファー中のポリエチレンオキシチオールの溶液を添加した。サンプルを4または18時間インキュベートした。用いた化合物17およびポリエチレンオキシチオールの濃度ならびにインキュベーション時間をTable2に示す。得られた化合物を、SDSPAGEにより分析した。ゲルを150Vに60分間曝露した。結果を図4に示し、Table2はその鍵を提供する。レーン1はHiMarkHMW標準であった。18時間のインキュベーションまたはより高濃度の化合物17を用いるインキュベーションにより、PEG置換基のより広範囲の組込みが提供された。と化合物19とのインキュベーションの後のPEG化Bドメインが欠失したFVIIIを、下記バッファー水中の50mMHEPES、10mMCaCl2、002Tween80、および050MNaCl、pH75中で様々な濃度の化合物19と共に25°Cで3~18時間インキュベートした。同じバッファー中のポリエチレンオキシチオールの溶液を添加した。サンプルを4または18時間インキュベートした。用いた化合物19およびポリエチレンオキシチオールの濃度ならびにインキュベーション時間をTable3に示す。得られた化合物を、SDSPAGEにより分析した。ゲルを150Vに60分間曝露した。結果を図5に示し、Table3はその鍵を提供する。レーン1はHiMarkHMW標準であった。18時間のインキュベーションまたはより高濃度の化合物19を用いるインキュベーションにより、PEG置換基のより広範囲の組込みが得られた。と化合物19とのインキュベーションの後のPEG化BDDFVIIIを、様々な濃度で化合物19、続いて20kDaのPEGチオールと共にインキュベートした。トロンビンで処理した後、得られた化合物をSDSPAGEにより分析した。ゲルを150Vに60分間曝露した。この結果を図6に示し、Table4はレーンに対する鍵を提供する。レーン1はHiMarkHMW標準であり、レーン14はFVIIIであり、レーン15はFVIIIおよびトロンビンであった。18時間のインキュベーションまたはより高濃度のインキュベーションにより、PEG置換基のより広範囲の組込みが得られた。軽鎖およびA1に由来するバンドの強度は有意に変化しないようであったので、重鎖A2ドメイン中でのPEG置換基の組込みが好ましいようであった。目的のFabフラグメントに結合することが知られるペプチドの誘導体を、例えば、例18または21に従って調製する。ホーミングペプチドを、アシル化にとって好適と考えられるバッファー、例えば、Tween、ナトリウムカルシウム塩を含有する、HEPESまたはリン酸バッファー、pH7~9中、5~40°Cで前記抗体フラグメントと共にインキュベートする。形成された改変タンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、および親和性に基づくクロマトグラフィーなどの標準的な技術を用いて精製する。組込まれた置換基が標識タグを含む場合、公知の分析技術を用いてそれを可視化することができる。