"ストレス性疾患に罹患した哺乳動物から採取される尿、血液、唾液又は脳脊髄液の生体液からなる試料から検出されるストレス性疾患のバイオマーカーであって、負電荷又は正電荷エレクトロイオンスプレー質量分析法におけるm/z値が、2891、4967、3051、2911、3792、3932、2931、7603、7152、3571、7322、4072、6422、3031、8054、3051、6293、6833、6052、3071、4611、2751、2911、2630、2610、6324、3122、2551、3632、2771、2942、3312、4092、3852、2792、3431、2862、及び3162で示される代謝化合物及びその前駆化合物から選ばれる少なくとも1種類の化合物であることを特徴とするストレス性疾患のバイオマーカー。下記化学式1並びに2で表される3-ヒドロキシ-5-メガスチグメン-9-オン類並びにその3-O-硫酸抱合化合物、それらの不飽和基又はカルボニル基が還元された化合物とその硫酸抱合化合物、及びそれらの水酸基置換化合物とその硫酸抱合化合物;下記化学式3で表される3-ヒドロキシ-5-メガスチグメン-9-オン類のグルクロン酸抱合化合物、それの不飽和基又はカルボニル基が還元された化合物とそのグルクロン酸抱合化合物、及びそれらの水酸基置換化合物とグルクロン酸抱合化合物;下記化学式4並びに5で表される2-カルボキシエチル-6-ヒドロキシクロマン類並びにそれの硫酸抱合化合物、該硫酸抱合化合物の二量体並びに該硫酸抱合化合物の位置異性体、及びそれらの前駆化合物;3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール類、及び下記化学式6で表される3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール類の硫酸抱合体;ホモバニリン酸、及び下記化学式7で表されるそれの硫酸抱合化合物;下記化学式8式8中、-CO-R1は、オクテノイル基、デカジエノイル基、イソ-デカジエノイル基、デカエノイル基及びゲラノイル基から選ばれる不飽和アシル基、又はそれらの飽和アシル基を表す。で表されるアシル化カルニチン類;下記化学式9で表されるプロゲスタゲン類縁体、及びそれの水酸基位置異性体;下記化学式10式10中、R2は水素原子、又はメチル基を表す。で表されるベンゾキノン類;の何れかであることを特徴とする請求項1に記載のストレス性疾患のバイオマーカー。該ストレス性疾患が、過敏性腸症候群であることを特徴とする請求項1に記載のバイオマーカー。下記化学式2で表される化合物。下記化学式10式10中、R2は水素原子、又はメチル基を表す。で表される化合物。ストレス性疾患に罹患しており被験薬物が投与された哺乳動物から採取された尿、血液、唾液又は脳脊髄液の生体液からなる試料と、ストレス性疾患に罹患している哺乳動物の器官若しくは組織又はそれらの何れかから採取した細胞へ被験薬物が添加されている試料とから選ばれる生体由来試料について、請求項1又は2に記載のバイオマーカーの濃度又は存否を指標とした測定を行うことにより、該被験薬物を該哺乳動物に対するストレス性疾患の治療薬として峻別する方法。該バイオマーカーの濃度に応じて、該哺乳動物に対する該被験薬物の感受性と非感受性とを選別し、又は該哺乳動物に対する該被験薬物の有効投与量を推定することを特徴とする請求項6に記載の方法。該指標が、健常な同種の該哺乳動物の生体由来試料における該バイオマーカーの濃度と比較した増減であることを特徴とする請求項6又は7に記載の方法。該被験薬物が、ミトコンドリア型ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬であることを特徴とする請求項6乃至8の何れかに記載の方法。該ストレス性疾患が、過敏性腸症候群であることを特徴とする請求項6乃至9の何れかに記載の方法。該測定が、質量分析測定、液体クロマトグラフ測定、ガスクロマトグラフ測定、及び/又は核磁気共鳴スペクトル測定であることを特徴とする請求項6乃至10の何れかに記載の方法。ストレス性疾患に罹患した哺乳動物から採取された尿、血液、唾液又は脳脊髄液の生体液と、該哺乳動物から摘出した器官若しくは組織又はそれらの何れかから採取した細胞とから選ばれる生体由来試料について、請求項1又は2に記載のバイオマーカーの濃度又は存否を指標として、液体クロマトグラフ法、ガスクロマトグラフ法、質量分析法、核磁気共鳴スペクトル測定法、又はそれらの何れかを組み合わせた測定法により、ストレス性疾患のバイオマーカーを測定する方法。本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、生体試料中に安定に存在した非ペプチド性の低分子量の化合物であって、過敏性腸症候群のようなストレス性疾患の病態を的確に反映でき、簡易な汎用分析機器を用い簡便な方法で迅速かつ正確に検出でき、検出条件下で分解し難く、ストレス性疾患治療薬として峻別するのに用いられるバイオマーカーを提供することを目的とする。さらにこのバイオマーカーを用いて、被験薬物をストレス性疾患の治療薬の適否の観点で峻別する方法を提供することを目的とする。前記の目的を達成するためになされた本発明は、1ストレス性疾患に罹患した哺乳動物から採取される尿、血液、唾液又は脳脊髄液の生体液からなる試料から検出されるストレス性疾患のバイオマーカーであって、負電荷又は正電荷エレクトロイオンスプレー質量分析法におけるm/z値が、2891、4967、3051、2911、3792、3932、2931、7603、7152、3571、7322、4072、6422、3031、8054、3051、6293、6833、6052、3071、4611、2751、2911、2630、2610、6324、3122、2551、3632、2771、2942、3312、4092、3852、2792、3431、2862、及び3162で示される代謝化合物及びその前駆化合物から選ばれる少なくとも1種類の化合物であることを特徴とするストレス性疾患のバイオマーカー;2下記化学式1並びに2で表される3-ヒドロキシ-5-メガスチグメン-9-オン類並びにその3-O-硫酸抱合化合物、それらの不飽和基又はカルボニル基が還元された化合物とその硫酸抱合化合物、及びそれらの水酸基置換化合物とその硫酸抱合化合物;下記化学式3で表される3-ヒドロキシ-5-メガスチグメン-9-オン類のグルクロン酸抱合化合物、それの不飽和基又はカルボニル基が還元された化合物とそのグルクロン酸抱合化合物、及びそれらの水酸基置換化合物とグルクロン酸抱合化合物;下記化学式4並びに5で表される2-カルボキシエチル-6-ヒドロキシクロマン類並びにそれの硫酸抱合化合物、該硫酸抱合化合物の二量体並びに該硫酸抱合化合物の位置異性体、及びそれらの前駆化合物;3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール類、及び下記化学式6で表される3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール類の硫酸抱合体;ホモバニリン酸、及び下記化学式7で表されるそれの硫酸抱合化合物;下記化学式8式8中、-CO-R1は、オクテノイル基、デカジエノイル基、イソ-デカジエノイル基、デカエノイル基及びゲラノイル基から選ばれる不飽和アシル基、又はそれらの飽和アシル基を表す。で表されるアシル化カルニチン類;下記化学式9で表されるプロゲスタゲン類縁体、及びそれの水酸基位置異性体;下記化学式10式10中、R2は水素原子、又はメチル基を表す。で表されるベンゾキノン類;の何れかであることを特徴とする前記1に記載のストレス性疾患のバイオマーカー;3該ストレス性疾患が、過敏性腸症候群であることを特徴とする前記1に記載のストレス性疾患のバイオマーカー;4下記化学式2で表される化合物;5下記化学式10式10中、R2は水素原子、又はメチル基を表す。で表される化合物;6ストレス性疾患に罹患しており被験薬物が投与された哺乳動物から採取された尿、血液、唾液又は脳脊髄液の生体液からなる試料と、ストレス性疾患に罹患している哺乳動物の器官若しくは組織又はそれらの何れかから採取した細胞へ被験薬物が添加されている試料とから選ばれる生体由来試料について、前記1又は2に記載のバイオマーカーの濃度又は存否を指標とした測定を行うことにより、該被験薬物を該哺乳動物に対するストレス性疾患の治療薬として峻別する方法;7該バイオマーカーの濃度に応じて、該哺乳動物に対する該被験薬物の感受性と非感受性とを選別し、又は該哺乳動物に対する該被験薬物の有効投与量を推定することを特徴とする前記6に記載の方法;8該指標が、健常な同種の該哺乳動物での生体由来試料における該バイオマーカーの濃度と比較した増減であることを特徴とする前記6又は7に記載の方法;9該被験薬物が、ミトコンドリア型ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬であることを特徴とする前記6乃至8の何れかに記載の方法;10該ストレス性疾患が、過敏性腸症候群であることを特徴とする前記6乃至9の何れかに記載の方法;11該測定が、質量分析測定、液体クロマトグラフ測定、ガスクロマトグラフ測定、及び/又は核磁気共鳴スペクトル測定であることを特徴とする前記6乃至10の何れかに記載の方法;及び12ストレス性疾患に罹患した哺乳動物から採取された尿、血液、唾液又は脳脊髄液の生体液と、該哺乳動物から摘出した器官若しくは組織又はそれらの何れかから採取した細胞若しくは生体液成分とから選ばれる生体由来試料について、前記1又は2に記載のバイオマーカーの濃度又は存否を指標として、液体クロマトグラフ法、ガスクロマトグラフ法、質量分析法、核磁気共鳴スペクトル測定法、又はそれらの何れかを組み合わせた測定法により、ストレス性疾患のバイオマーカーを測定する方法;である。本発明のストレス性疾患のバイオマーカーは、過敏性腸症候群のようなストレス性疾患の病態、例えばストレス性疾患病態モデルである反復低温ストレス負荷非ヒト哺乳動物や過敏性腸症候群のようなストレス性疾患患者の病態を、その非ヒト哺乳動物や患者からの尿血液、器官若しくは組織又はそれらの細胞若しくは生体液成分のような生体由来試料中の濃度又は存否によって、的確に反映できる生体代謝化合物である。このバイオマーカーは、生体由来試料中、とりわけ尿中に分析可能な十分な濃度で安定して存在しており、分析条件下で検出し易い非ペプチド性の低分子量の化合物である。このバイオマーカーは、簡易な汎用分析機器、特にクロマトグラフ装置、質量分析計、核磁気共鳴スペクトル測定装置等を用いた簡便な方法で、迅速かつ正確に、定性的に、また定量的に測定して検出できる。そのため、このバイオマーカーは、被験薬物をストレス性疾患の治療薬として適切か否かの観点から峻別するのに用いることができる。本発明の哺乳動物に対するストレス性疾患の治療薬として峻別する方法によれば、非ヒト哺乳動物におけるinvivoやinvitroで被験薬物の薬理応答性薬理効果を定性的又は定量的に評価したり、非ヒト哺乳動物や個々の患者の被験薬物の感受性と非感受性とを的確に評価したり、患者毎に被験薬物の有効投与量を正確に推定したりすることができる。そのため、この峻別方法によれば、患者に最適な被験薬物を峻別して投与したり適切な投与量を決定して投与したり治療効果を推し量り治癒の程度を判断したりする診療に役立つ。また、本発明のストレス性疾患のバイオマーカーを測定する方法によれば、貴重で微量な生体由来試料から、特定のバイオマーカーを、短時間で誤認すること無く、精密に検出することができ、これによりストレス性疾患の治療効果やその被験薬物の適否の判断の際に、有用なデータを供給することができる。このストレス性疾患のバイオマーカーを測定する方法によれば、測定感度に優れるので、尿血液等の採取を最小限に抑えて非ヒト哺乳動物や患者の肉体的精神的負担を軽減できる。以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。本発明のストレス性疾患のバイオマーカーは、過敏性腸症候群などのようなストレス性疾患の患者の病態を的確に反映する実験系として、ラットのような哺乳動物を室温下と低温下とに交互に反復して曝して反復低温ストレス以下にRCSとも称するを負荷する動物モデル、又は拘束ストレスケージを用いて拘束ストレスを負荷する動物モデルを用いて、ミトコンドリア型ベンゾジアゼピン受容体以下にMBRとも称する拮抗薬を被験薬物として投与したとき、該哺乳動物の尿中で、その投与に対して特異的に増加又は減少する化合物や、反復低温ストレス又は拘束ストレスの負荷に対して特異的に増加又は減少する化合物である。該バイオマーカーは、哺乳動物、とりわけヒトの尿、血液、唾液、又は脳脊髄液のような各種生体液中に存在する。このようなストレス性疾患のバイオマーカーの好ましい一例は、下記化学式1及び2で表される3-ヒドロキシ-5-メガスチグメン-9-オン類4butan2one、又は3hydroxy5megastigmene9one:以下にHMOとも称するやその硫酸抱合化合物355trimethyl4cyclohex3en1ylhydrogensulfate、又は3hydroxy5megastigmene9one3Osulfate:以下にHMOSとも称するである。化学式1及び2の化合物は、抗酸化物質であるカロテノイドの一種であるβ-カロテンに由来する代謝物であり、RCSの負荷により上昇し、MBR受容体拮抗薬投与によりそれに応答して上昇抑制する性質を有するものである。化学式1及び2の化合物は、光学活性体であってもよいがdl体であってもよい。化学式1及び2の化合物と同様にこの性質を有するストレス性疾患のバイオマーカーとして、それらの不飽和基の二重結合及び/又はカルボニル基が還元された還元化合物、例えばその不飽和基が単結合に還元された化合物あってジアステレオマー若しくはその混合物であってもよく、そのカルボニル基がヒドロキシ基に還元された化合物であってジアステレオマー又はその混合物であってもよい。これらの還元化合物の2、4、6、7又は8位の何れかに水酸基が導入された水酸基置換化合物であってもよい。また、ストレス性疾患のバイオマーカーは、下記化学式3で表されカロテノイド類に由来する代謝物である3-ヒドロキシ-5-メガスチグメン-9-オン類のグルクロン酸抱合化合物355trimethyl4cyclohex3en1ylhexopyranosiduronicacid、又は3OGlucronide3hydroxy5megastigmene9oneであってもよい。そのアグリコンは光学活性体であってもよいがdl体であってもよい。ストレス性疾患のバイオマーカーは、ビタミンE由来のもので、下記化学式4及び5で表される2-カルボキシエチル-6-ヒドロキシクロマン類32578tetramethyl634dihydro2Hchromen2ylpropanoicacid:以下にα-CEHCとも称する、及びそれの硫酸抱合化合物32578tetramethyl634dihydro2Hchromen2ylpropanoicacid:以下にα-CEHCSとも称するであってもよい。α-CEHCやその硫酸抱合化合物α-CEHCSの位置異性体やその類縁体、例えばβ-CEHCやβ-CEHCS、γ-CEHCやγ-CEHCS、δ-CEHCやδ-CEHCS、又はそれらの何れかの混合物であってもよい。その硫酸抱合化合物α-、β-、γ-又はδ-CEHCSの二量体、若しくはそれ以外の分子イオンとの複合体となったものであってもよい。また、同じくビタミンE由来のもので、CEHCやCEHCSの前駆化合物である34dihydro6hydroxyα2578pentamethyl2H1benzopyran2pentanoicacidα-CMBHC、その異性体であるβ-、γ-又はδ-CMBHCや、それらの硫酸抱合化合物であるβ-、γ-又はδ-CMBHCSであってもよい。ストレス性疾患のバイオマーカーは、カテコラミンに由来のもので、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール3methoxy4hydroxyphenylglycol:以下にMHPGとも称するや、その硫酸抱合体、例えば下記化学式6で表される3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコールの硫酸抱合体2hydroxy1ethylhydrogensulfate:以下にMHPGSとも称するであってもよい。ストレス性疾患のバイオマーカーは、カテコラミンに由来のホモバニリン酸以下にHVAとも称するであってもよく、下記化学式7で表されるそれの硫酸抱合化合物3methoxy4phenylaceticacid:以下にHVASとも称するであってもよい。ストレス性疾患のバイオマーカーは、カルニチンに由来するもので、下記化学式8例えば、-CO-R1が不飽和アシル基として、オクテノイル基であるカルニチン類Octenolycarnitine:以下にC81Carnitineとも称する、デカジエノイル基やイソデカジエノイル基やゲラノイル基であるカルニチン類2trans4cisDecadienoylcarnitineなど:以下にC102Carnitineとも称するであってもよく、-CO-R1が飽和アシル基としてそれらに対応する飽和アシル基、例えばデカノイル基であるカルニチン類Decanoylcarnitineなど:以下にC100Carnitineとも称するであってもよい。ストレス性疾患のバイオマーカーは、コレステロールに由来するプロゲスタゲン類縁体であって、下記化学式9で表される4Pregnen19ol320dione以下にC21Progestageneとも称するであってもよく、後述する表5に記載しているようなそれの水酸基の位置が異なる位置異性体やその構造異性体である各種Pregnen類やAndrostadien類やAndrosten類やEstren類であってもよい。ストレス性疾患のバイオマーカーは、下記化学式10式10中、R2は水素原子、又はメチル基を表す。で表されるベンゾキノン類であってもよい。化学式10の化合物は、光学活性体であってもよいが、dl体であってもよく、ジアステレオマー又はその混合物であってもよい。ストレス性疾患のバイオマーカーは、前記のm/zと、例えばC18修飾シリカゲル系充填剤又はポリマー系充填剤による液体カラムクロマトグラフィー保持時間Rtとで特定された化合物であれば、構わない。ここで、液体カラムクロマトグラフィーは、後記するUPLC条件で行うこともできることに加え、その測定条件は適宜変更してもよい。これらバイオマーカーは、殆ど、RCSにより増加し、MBR拮抗薬投与によりそれに応答して増加抑制する性質を有するものであるが、それとは逆に、m/zが632.4で保持時間が85秒の化合物のみが、RCSの負荷により減少し、MBR拮抗薬投与によりそれに応答して減少抑制する性質を有する。被験薬物は、過敏性腸症候群に対するミトコンドリア型ベンゾジアゼピン受容体別名:トランスロケータープロテイン18KDaTSPO拮抗薬の例を示したが、その他のストレス性疾患に対する薬物、例えば、抗不安薬例えば、ベンゾジアゼピン系抗不安薬、チエノジアゼピン系抗不安薬、非ベンゾジアゼピン系抗不安薬、セロトニン作動薬、CRF拮抗薬等、抗うつ薬例えば、モノアミン遊離薬、モノアミンオキシダーゼ阻害薬、モノアミン再取込み阻害薬SNRI、SSRI、CRF拮抗薬、ニューロテンシン拮抗薬、三環式抗うつ薬、四環式抗うつ薬等、抗コリン薬、消化管機能調整薬例えば、整腸薬、CCK-A拮抗薬、ニューロテンシン拮抗薬、オピオイド作動薬、ムスカリン作動薬、5-HT4作動薬等、消化管運動促進薬例えば、整腸薬、CCK-A拮抗薬、ニューロテンシン拮抗薬、オピオイド作動薬、ムスカリン作動薬、5-HT4作動薬等、止瀉薬例えば、止痢薬、オピオイドμ受容体刺激薬等、瀉下薬例えば、膨張性下剤、塩類下剤、刺激性下剤、親和性ポリアクリル樹脂、ルビプロストン等、粘膜麻痺薬、自律神経調節薬、カルシウム拮抗薬、ホスホジエステラーゼ阻害薬、セロトニン拮抗薬例えば、5-HT3拮抗薬、5-HT4拮抗薬、ダリフェナジン、ポリカルボフィルカルシウム、乳酸菌製剤、抗生物質例えば、リファキシミン等であってもよい。このストレス性疾患のバイオマーカーは、ストレスに起因する消化器系、中枢神経系、呼吸器系、循環器系、泌尿器系、生殖器系、婦人系、内分泌系、代謝系、眼系、耳鼻咽喉系、口腔系、歯系、皮膚系、整形外科外科系のような各種疾患に特異的な指標成分となり得るものである。とりわけ消化器系ストレス性疾患、例えば過敏性腸症候群の患者の指標成分として有用である。このストレス性疾患のバイオマーカーは、生体由来試料として哺乳動物の尿から検出される例を示したが、必要に応じ哺乳動物とりわけストレス性疾患患者の血液、器官若しくは組織又はそれらの何れかから採取した細胞のような生体由来試料からも検出が可能である。反復した採尿採血等による非ヒト哺乳動物や患者の肉体的精神的な負担軽減や、十分量確保したり試料保存したりする観点から、生体由来試料として尿を用いることが好ましい。ストレス性疾患のバイオマーカーは、これらの内から選ばれる1種又は複数種であることが好ましく、検出精度や信頼性の向上のため、2種程度の複数種であると一層好ましい。この複数のバイオマーカーとして、前記式2の化合物、前記式3の化合物、ホモバニリン酸、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコールの硫酸抱合化合物の何れかの組合せが、好ましい。これらのストレス性疾患のバイオマーカーは、尿、血液、唾液又は脳脊髄液、器官若しくは組織又はそれらの細胞を採取した生体試料中の存否同定や濃度について、各種機器分析、具体的には、物理化学的理化学分析、より具体的には、クロマトグラフ法、例えば高速液体クロマトグラフ法HPLC法、超高速液体クロマトグラフ法UHPLC法、超臨界液体クロマトグラフ法SFC法、ガスクロマトグラフ法GC法;質量分析法MS法、例えば電子イオン化法EI-MS法、化学イオン化法CI-MS法、電解脱離法FD-MS法、高速原子衝突法FAB-MS法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法MALDI-MS法、エレクトロスプレーイオン化法ESI-MS法、大気圧化学イオン化法APCI-MS法などによる、磁場偏向型、四重極型QMS、三連四重極型TQ-MS、イオントラップ型IT-MS、飛行時間型TOF-MS、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型FI-ICR-MS、タンデム型MS/MSでの手法;核磁気共鳴スペクトル測定法NMR法、例えば1H-NMRや13C-NMR、より具体的には一次元1H-NMR又は13C-NMR、HH-若しくはCH-COSY,NOESY,TOCSY,wetTOCSYのような二次元NMR;又はそれらの何れかを組み合わせた測定法、例えば液体クロマトグラフ-質量分析法LC-MS好ましくは超高速液体クロマトグラフ-質量分析法UPLC/MS法;UPLCは登録商標、高速液体クロマトグラフ-質量分析法HPLC-MS、液体クロマトグラフ-タンデム型質量分析法LC-MS/MS、液体クロマトグラフ-核磁気共鳴スペクトル測定法LC-NMR法、液体クロマトグラフ-核磁気共鳴スペクトル/質量分析法LC-NMR/MSにより、正常状態の健常哺乳動物と比較して、定性的に、又は定量的に、測定して検出される。ストレス性疾患のバイオマーカーの他の検出方法としては、生化学的理化学分析、具体的には、抗原抗体反応を利用したEIA法EnzymeImmunoassay酵素免疫測定法、とりわけELISA法EnzymelinkedImmunosorbentAssay酵素結合免疫溶媒測定法、RIA法Radioimmunoassay放射線免疫測定法等を用いることもできる。生体試料中でのストレス性疾患のバイオマーカーの同定は、標品の質量分析スペクトルや核磁気共鳴スペクトルとの比較、標品のクロマトグラムの保持時間の比較によって行うことができ、又、バイオマーカーの濃度の算定は、それらスペクトルの強度又はクロマトグラムのピーク面積と、標品での強度又はピーク面積及び濃度の標準検量線との対比によって行うことができる。このようなストレス性疾患のバイオマーカーは、生体由来試料に含有された多数の成分から網羅的に分析し得られたデータを解析してマーカーとして特定の物質を選び出す以下のようなメタボローム解析により、絞り込まれて、有用マーカー成分として同定されたものである。その同定の過程を、図1を参照しながら、詳細に説明する。i先ず、ストレス性疾患に罹患していない正常な非ヒト哺乳動物を、予備飼育した。iiこの哺乳動物から1回目の採尿を行い、尿から尿中代謝物を抽出し、その全成分を、超高速液体クロマトグラフ-質量分析法UPLC/TOF-MS法にかけて、ポジティブモードとネガティブモードとでm/zを測定し、夫々得られた1万数千成分の保持時間とm/zと相対強度との生データを基に、行列データを作成する。そのデータから、その横軸を保持時間とし縦軸をm/zとして、プロットグラフを作成する。iiiまた、これと同種の予備飼育した哺乳動物を日中、1時間毎に低温下と室温下とに交互に曝して数日間飼育することによって、この哺乳動物に作為的にRCS負荷をかける。このストレス負荷は、ヒトのストレス性疾患、特に過敏性腸症候群の病態と極めて近似しているので、過敏性腸症候群の動物モデルとなり得るものである。ivRCS負荷後に、何も投与しないか、若しくは媒体又は被験物質を投与した後、2回目の採尿を行い、同様にその全成分を、超高速液体クロマトグラフ-質量分析法にかけ、行列データとプロットグラフとを作成する。1回目の採尿と2回目の採尿との行列データとプロットグラフとを比較し、RCS負荷に特異的な強度の増減成分として数千成分を、一次選別する。v一方、RCSを負荷しない哺乳動物からか、若しくはRCS負荷をかけつつその哺乳動物に、媒体又は被験物質を投与し暫くしてから、3回目の採尿を行い、同様に超高速液体クロマトグラフ-質量分析法にかけ、行列データとプロットグラフとを作成する。一次選別した成分ピークの中から、RCS負荷に関わらず強度が増減する成分や、被験物質の投与によっても殆ど強度が増減しない成分や、強度の増減に再現性のない成分のような偽陽性マーカー成分を除外し、RCS負荷によって強度が増加し被験物質の投与によって強度が減少するか、又はRCS負荷によって強度が減少し被験物質の投与によって強度が増加する数百成分だけを、二次選別する。viさらに、定量測定を確実にするために、感度不足であったり夾雑成分に影響されてしまったりする強度シグナル値の低い成分を除外し、被験物質を再投与して再現性の高い成分を、UPLC/MRM法UPLCを用いたMS/MS分析を用い、定量分析することにより、三次選別して、数十成分をストレス性疾患のバイオマーカーとする。viiこのストレス性疾患のバイオマーカーを、各種機器分析、例えば質量分析法、核磁気共鳴スペクトル測定法などにより、同定する。なお、一次~三次選別は、適宜、主成分分析、回帰分析、クラスター解析、分散解析のような多変量解析、Welchのt検定、pairedt検定、差の比較検定、又はunpairedt検定により、行われる。前記のように特定されたストレス性疾患のバイオマーカーは、生体由来試料中の濃度とストレス性疾患の治療効果との間に、正の相関性又は負の相関性を有するものである。例えば、ストレスモデル動物へのストレス負荷期間中の脱糞量と、尿中のバイオマーカー濃度との間に、相関傾向が認められる。そのためこのバイオマーカーの濃度に基づき、ストレス性疾患の病状レベルとして換算して数値化することができる。また、その濃度に基づき、投与した被験薬物についてストレス性疾患治療薬の有効性レベルとして換算して数値化することもできる。また、ストレス性疾患の患者に投与した被験薬物の感受性の有無又はその感受レベルとして換算して数値化し、必要に応じて被験薬物の投与の適否を判断するのに用いてもよい。また、哺乳動物、特にストレス性疾患の患者に対する被験薬物の有効投与量や最適投与量や投与可能範囲などを推定するのに用いてもよい。以下、本発明のストレス性疾患のバイオマーカーを具体的に同定した例について、詳細に説明する。実施例1先ず、ストレス性疾患であって全人口の数が罹患していると言われている過敏性腸症候群の病態に、極めて近似している過敏性腸症候群動物モデルを、ラットへのRCS負荷により作製し、ストレス性疾患のバイオマーカーの同定を行った。雄性Wistar系ラット日本チャールスリバー株式会社を、過敏性腸症候群動物モデルの作製開始時に7週齢となるように、室温で、予備飼育し、必要に応じ検疫し、馴化させた。ラットにRCS負荷をかけた過敏性腸症候群動物モデルの具体的作製手順は、1日目は午前9時から午後7時までの間に飼育環境温度を、1時間毎に8回、2°Cと室温24±2°Cとに交互に変化させ、その後、翌朝まで2°Cの飼育環境温度で飼育し、2日目から6日目までは午前9時から午後8時までの間に飼育環境温度を、1時間毎に9回変化させ、9回目終了後から翌朝まで2°Cの飼育環境温度で飼育するというものである。これによって、直腸伸展刺激に対する感受性亢進のようなヒトの過敏性腸症候群の症状に似た病態を誘発し、ストレス性疾患の動物モデルとなっている。2群のラットに夫々、前記のようにしてRCS負荷をかけつつ、被験物質としてMBR拮抗薬、又は対照物質として0.5w/vメチルセルロース水溶液である媒体を投与し、夫々、被験物質投与群、媒体投与対照群とした。被験物質及び媒体の投与手順は、RCS負荷1日目から6日目までの午前中凡そ午前9時~11時までの間及び午後凡そ午後5時~6時半の間にそれぞれ1回ずつ、被験物質10mg/kg又は媒体5mL/kgを経口投与するというものである。なお、被験物質であるMBR選択的リガンドとして、ヨーロピアンジャーナルオブファーマコロジーEuropeanJournalofPharmacology、1985年、第119巻、p153~167に記載の1-2-クロロフェニル-N-メチル-N-1-メチルプロピル-3-イソキノリンカルボキサミドであるPK11195、国際公開第2004/113300号や国際公開第2006/068164号に記載の実施例の化合物の何れかを用いた。aRCS負荷前日及びRCS負荷7日目に、負荷終了後、ラットを代謝ケージに入れ、7時間経過してから、無投与群、媒体投与群と被験物質投与群の各ラットから、尿を全量採取し、夫々、無投与-RCS負荷群試料、媒体投与-RCS負荷群試料、及び被験物質投与-RCS負荷群試料とした。bRCS負荷前日及びRCS負荷7日目に、負荷終了後、ラットを代謝ケージに入れ、7時間経過してから、媒体投与群と被験物質投与群の各ラットから、尿を全量採取し、夫々、RCS負荷前後の媒体投与-RCS負荷群試料、被験物質投与-RCS負荷群試料とした。媒体投与を6日間行い、RCSを負荷しない群として、媒体投与-非RCS負荷群を設けた。これらについても前記と同様に各群の試料を採取した。各試料につき、採取した尿の容量を測定した後、室温下、12000Gで5分間、遠心分離し、上清に1.2のアジ化ナトリウム水溶液を1/60量終濃度0.02添加後、液体窒素で凍結し、分析に供するまで-80°Cで保存した。前記aで取得した各試料を、UPLC/TOF-MS法で分析するのに供するため、前記凍結した試料を再溶解して用い、その採取した尿の50μLに、0.1容量ギ酸含有水溶液150μLを添加して混和し、16000Gで3分間、4°Cで遠心分離することにより得られた上清を、2μmのポリテトラフルオロエチレンPTFE製フィルタで、ろ過した。それを、UPLC/TOF-MS法システム機器により、ネガティブモード及びポジティブモードで質量分析した。その機器は、超高速液体クロマトグラフ装置がACQUITYUltraPerformanceLiquidChromatographysystemWaters社製であり、質量分析計が、直交加速飛行時間型のMicromassLCTPremierWaters社製であって、それらを組み合わせたシステムである。ネガティブモードの測定条件<UPLC条件>カラム:ACQUITYUPLCBEHC18カラムオーブン温度:40°C移動相成分A:0.1重量ギ酸水溶液移動相成分B:0.1重量ギ酸アセトニトリル溶液移動相成分A/Bの溶出のグラジエント条件0分100A0B7分0A100B14分0A100B14.1分100A0B21分100A0B流速:300μL/分オートサンプラー内温度:4°C測定サンプル注入量:4μL<MS条件>極性:ネガティブキャピラリー電圧:2700Vコーン電圧:35V噴霧ガス温度:350°Cイオンソース温度:120°Cコーンガス流速:50L/h噴霧ガス流速:500L/hモード:Wモードポジティブモードの測定条件<UPLC条件>カラム:ACQUITYUPLCBEHC18カラムオーブン温度:40°C移動相成分A:0.1重量ギ酸水溶液移動相成分B:0.1重量ギ酸アセトニトリル溶液移動相成分A/Bの溶出のグラジエント条件0分100A0B7分0A100B15分0A100B15.1分100A0B20分100A0B流速:300μL/分オートサンプラー内温度:4°C測定サンプル注入量:4μL<MS測定条件>極性:ポジティブキャピラリー電圧:2800Vコーン電圧:44V噴霧ガス温度:350°Cイオンソース温度:120°Cコーンガス流速:50L/h噴霧ガス流速:600L/hモード:WモードUPLC/TOF-MS法で絞り込まれたバイオマーカー候補化合物について、さらに、UPLC/MRM法で定量分析するのに供するため、前記bで採取した尿を、10000Gで5分間、4°Cで遠心分離することにより得られた上清50μLに、0.1重量ギ酸水溶液を200μL添加し、攪拌した。それを、超高速液体クロマトグラフ装置としてACQUITYUltraPerformanceLiquidChromatographysystemWaters社製を用い、質量分析計として、MRMMultiplereactionMonitoringモードを有する三連四重極型であるAPI4000QTRAPLCMSMSSystemAppliedBiosystems社製を組み合わせて分析した。<UPLC測定条件>カラム:ACQUITYUPLCBEHC18カラムオーブン温度:40°C移動相成分A:0.1重量ギ酸水溶液移動相成分B:0.1重量アセトニトリル溶液移動相成分A/Bの溶出のグラジエント条件0分100A0B7分0A100B14分0A100B14.1分100A0B21分100A0B流速:300μL/分測定サンプル注入量:4μL<MS条件>スキャンタイプ:MRM極性:ネガティブイオン化方法:ESIエレクトロスプレーイオン法ソース温度:400°Cこの条件下でのバイオマーカー候補化合物のQ1Q3でのモニターイオンのm/z、及び分析条件は、下記表1-1及び表1-2の通りであるDP:DeclusteringPotential、CE:CollisionEnergy、CXP:CollisionCellExitPotential。<MS条件>スキャンタイプ:MRM極性:ポジティブイオン化方法:ESIエレクトロスプレーイオン法ソース温度:400°Cこの条件下でのバイオマーカー候補化合物のQ1Q3でのモニターイオンのm/z、及び分析条件は下記表2の通りであるDP:DeclusteringPotential、CE:CollisionEnergy、CXP:CollisionCellExitPotential。UPLC/TOFMS法で絞り込まれたバイオマーカー候補化合物の関連化合物についても、さらに、UPLC/MRM法で定量分析するのに供するため、前記bで採取した尿を、10000Gで5分間、4°Cで遠心分離することにより得られた上清50μLに、0.1重量ギ酸水溶液を200μL添加し、攪拌した。それを、超高速液体クロマトグラフ装置としてACQUITYUltraPerformanceLiquidChromatographysystemWaters社製を用い、質量分析計として、MRMMultiplereactionMonitoringモードを有する三連四重極型であるAPI4000QTRAPLCMSMSSystemAppliedBiosystems社製を組み合わせて分析した。<UPLC測定条件>カラム:ACQUITYUPLCBEHC18カラムオーブン温度:40°C移動相成分A:Positive0.1重量ギ酸水溶液,Negative65mM炭酸水素アンモニウム水溶液移動相成分B:Positive0.1重量メタノール溶液,Negative65mM炭酸水素アンモニウム95メタノール水溶液移動相成分A/Bの溶出のグラジエント条件0分100A0B4分30A70B4.5分2A98B10分2A98B10.1分100A0B17分100A0B流速:350μL/分測定サンプル注入量:4μL<MS条件>スキャンタイプ:MRM極性:ネガティブイオン化方法:ESIエレクトロスプレーイオン法ソース温度:400°Cこの条件下でのバイオマーカー候補化合物のQ1Q3でのモニターイオンのm/z、及び分析条件は、下記表3の通りであるDP:DeclusteringPotential、CE:CollisionEnergy、CXP:CollisionCellExitPotential。<MS条件>スキャンタイプ:MRM極性:ポジティブイオン化方法:ESIエレクトロスプレーイオン法ソース温度:400°Cこの条件下でのバイオマーカー候補化合物のQ1Q3でのモニターイオンのm/z、及び分析条件は下記表4の通りであるDP:DeclusteringPotential、CE:CollisionEnergy、CXP:CollisionCellExitPotential。UPLC/TOF-MS分析によって得られたクロマトグラムデータを、質量分析ソフトウェアMassLynxVer41Waters社製を用いて、netCDFフォーマットのデータに変換した。次いで、得られたデータを、解析ソフトMZmineVer191フリーソフトウェア:httpmzminesourceforgenetdownloadshtmlより入手を用いて得られた各ピークの精密質量数ポジティブ、ネガティブ、溶出時間RT;RetentionTime、ピークエリア値、ピーク強度値データを、行列形式に変換した。この行列形式のデータを用いて、アレイ解析ソフトExpressionistProAnalystVer514Genedata社、又はOfficeExcel2007Microsoft社により、変動比及びp値を算出した。先ず、1無投与-RCS負荷群及び媒体投与-RCS負荷群の夫々、RCS負荷の前日試料と7日目試料とを用いて、Welchのt検定を行い、p値が0.2未満、両群間で1.5倍以上又は0.67倍以下のシグナル値の変動比を示し、かつ媒体投与-RCS負荷群と被験物質投与-RCS負荷群の夫々、RCS負荷後の7日目試料を用いて、Welchのt検定を行い、p値が0.3未満、両群間で1.33倍以上又は0.75倍以下の変動比を示したピークを、バイオマーカー候補として、315ピーク選別した。次に、2無投与-RCS負荷群及び媒体投与-RCS負荷群の夫々、RCS負荷7日目とRCS負荷前日との差7日目のシグナル値-0日目のシグナル値を比較し、Welchのt検定を用いて、p値が0.2未満、両群間で1.5倍以上又は0.67倍以下のシグナル値の変動比を示し、かつ媒体投与-RCS負荷群のRCS負荷7日目とRCS負荷前日との差のメジアン値から、被験物質投与-RCS負荷群のRCS負荷7日目とRCS負荷前日との差のメジアン値を差し引いた値が、0より大きいか、又は0未満の変動を示したピークを、バイオマーカー候補として、379ピーク選別した。上記1の手順で選別したピークと、上記2の手順で選別したピークでは夫々、統計学的手法が異なることから、両方の手法で重複して抽出されたピークは言うまでもなく、いずれかの手法で抽出されたピークも、バイオマーカー候補として考えられ、合計515ピーク選別した。上記で選別したバイオマーカー候補のうち、89ピークネガティブ:62ピーク、ポジティブ:27ピークについては、別途UPLC-MRM定量測定を実施した。測定データ処理には、AnalystVer142AppliedBiosystems社製、Excel2002Microsoft社を用いた。全ピークのAnalytePeakAreacounts値を、コントロールとしてクレアチニンのAnalytePeakAreacounts値により補正を行った。媒体投与-非RCS負荷群、媒体投与-RCS負荷群、及び被験物質投与-RCS負荷群の各群の試料について、RCS負荷前から負荷後の変動差の比較、各群のRCS負荷又は非負荷7日後の比較と変動比を評価した。比較解析は、unpairedt検定両側により行った。これにより、RCS負荷により増強し被験物質投与により減少するバイオマーカー、及びRCS負荷により減少し被験物質投与により増加するバイオマーカーも、選別できた表5。また、同定されたバイオマーカーに関連する化合物についても、標品を購入し前記と同様にストレス性疾患のバイオマーカーとなり得るかについて評価したところ、αCEHC、β及びγCEHCS、C81carnitineオクテノイルカルニチン、C100carnitineデカノイルカルニチンが、バイオマーカーになり得ることがわかった表6。その結果、ストレス性疾患のバイオマーカーとして、下記表5、及び表6に示す通り、合計38種類の化合物が、見出された。化合物No2の推定構造としては、3Osulfated3Hydroxy56epoxy5megastigmene9dione、3又は6Osulfated36Dihydroxy4megastigmen9one、3又は7Osulfated37Dihydroxy5megastigmen9one、3又は11Osulfated311Dihydroxy5megastigmen9one、3又は6Osulfated36Dihydroxy7megastigmen9one、若しくは36Epoxy7megastigmene59diol、35methyl2furanone、3Oxo2pentylcyclopentaneaceticacidMeester、56Epoxy7megastigmene39diol、58Epoxy6megastigmene39diol、545dihydro3hydroxy5methyl2furanone、52furanone、69Dihydroxy47megastigmadien3one78Dihydro、69Dihydroxy7megastigmen3one、69Epoxy4megastigmene39diol、Durgamone、Stegobiol、又はこれらの硫酸抱合体が挙げられる。化合物No3の推定構造としては、12propen1ol3Meether、41Ac、1OCoumaroylglycerol4Meether、23Oisopropylidene、11Hydroxy12methoxydihydrokawainMeether、11Hydroxy38dioxo14eudesmadien12oicacidMeester、15Hydroxy1411germacratrien126olid14oicacidMeester、32propen1ol3Meether、4O1Ac、32propenoicacid4Methyl3oxopentylester、32propenoicacid4O、57Dihydroxy22dimethyl2H1benzopyran6propanoicacidDiMeether、67Epoxy1hydroxy13nor9eremophilene811dioneAc、89Dihydroxy14oxo1411germacratrien126olide9Meether、87hydroxy2H1benzopyran2one37DiMeether、8Acetyl567trihydroxy22dimethyl2H1benzopyranTriMeether、8Hydroxy147germacratrien128olid15oicacidMeester、8Hydroxy137elematrien128olid15oicacid8OHformMeester、8Hydroxy7eremophilene128156diolideMeether、Cladosporin、CoriandroneA、CoriandroneB、Curvularin、Evodione、Isosecotanapartholide3EpimerMeether、IsosecotanapartholideMeether、MorininA3Methoxy,5hydroxy、Sericealactone、Sinapylalcohol1O、Sinapylalcohol1OAngeloyl、109hydroxy48dimethyl9hydroxy4decenoicacidが挙げられる。化合物No6の推定構造としては、3Osulfated47Megastigmadiene39diol4578Tetrahydro、9Osulfated47Megastigmadiene39diol4578Tetrahydro、若しくは、5Megastigmene39diol56dihydroxy、8Hydroxy5isopropyl8methyl6nonan2one、9Dodecan1olFormyl、又はこれらの硫酸抱合体が挙げられる。化合物No11の推定構造としては、13714Tetrahydroxy16kaurene1215dione1617Dihydro3Ac、17141820Pentahydroxy16kauren15one18Ac、1220Epoxy111320trihydroxy314clerodadien2one34Epoxide11Ac、1220Epoxy7111320tetrahydroxy314clerodadien2one11Ac、1516Epoxy34712tetrahydroxy1314clerodadien20al7Ac、1516Epoxy691320tetrahydroxy14labden19oicacid196Lactone20Ac、21941811161516Tetraepoxy14clerodene619diol1415Dihydro6Ac、3411Trihydroxy6eudesmen8one34Ac、3411Trihydroxy6eudesmen8one11Hydroperoxide3angeloyl4Ac、3411Trihydroxy6eudesmen8one34Ac、34Dihydroxy7eudesmen8one711Epoxide34Ac、357Trihydroxypmenth1en6one6Alcohol36ditigloyl5Ac、4181516Diepoxy1314clerodadiene361219tetrol6Ac、720Epoxy16kaurene1671115pentol11Ac、720Epoxy16kaurene1671415pentol1Ac、720Epoxy16kaurene1671519pentol19Ac、720Epoxy16kaurene67111415pentol6Ac、781618Tetrahydroxy19serrulatanoicacid18Ac、913Epoxy36dihydroxy7oxo1516labdanolide3Ac、CinncassiolA19Deoxy1Ac、DysodanthinE、Hymenoxon2Tigloyloxy4Etether、JavanicinZ、NigakilactoneN12Meether、PicrasinolDが挙げられる。化合物No13の推定構造としては、3Osulfated3Hydroxy5megastigmene49dione、3Osulfated3Hydroxy5megastigmene79dione、若しくは1Butoxy3phenoxy2propanol、10Hydroxy8dodecen11ynoicacidMeester、11Hydroxy4methyl246dodecatrienoicacid、13Oxo911tridecadienoicacid、311Dihydroxy5megastigmen9one11Aldehyde、35Dihydroxy67megastigmadien9one、511Epoxy9hydroxy7megastigmen3one、513Epoxy7megastigmene39dione78Dihydro、56Epoxy7megastigmene39diol9Ketone、56Epoxy7megastigmene39diol3Ketone、53methoxy244trimethyl2cyclopenten1one、52furanone7Ketone、69Dihydroxy47megastigmadien3one、6Hydroxy7megastigmene39dione、Guaymasol、Hyalopyrone、JasmonicacidMeester、Jhanilactone、Norannuicacid、SimilinA、Stegobiol2Ketone、pMentha135triene235triolTriMeester、又はこれらの硫酸抱合体が挙げられる。化合物No14の推定構造としては、11Hydroxy9tridecenoicacid、7Hydroxy4dodecenoicacidMeether、7Megastigmene349triol、7Megastigmene369triol、7Megastigmene569triol、89Dihydroxy5isopropyl8methyl6nonen2one、8Hydroxy5isopropyl8methyl6nonen2one67Epoxide、913Dihydroxy3megastigmanone、Trimethyl268dioxabicyclo321octane7methanol、又はこれらのグルクロン酸抱合体、若しくは、511Epoxy7megastigmene369triol、7Megastigmene2569tetrol9Ketone、9Hydroxy224trimethyl6oxo3decenoicacid、又はこれらのO-グリコシドが挙げられる。化合物No20の推定構造としては、11Hydroxy9tridecenoicacid、7Hydroxy4dodecenoicacidMeether、7Megastigmene349triol、7Megastigmene369triol、7Megastigmene569triol、89Dihydroxy5isopropyl8methyl6nonen2one、8Hydroxy5isopropyl8methyl6nonen2one67Epoxide、913Dihydroxy3megastigmanone、Trimethyl268dioxabicyclo321octane7methanol、又はこれらの硫酸抱合体が挙げられる。化合物No22の推定構造としては、2Osulfated2hydroxydihydroactinidiolide、3Osulfated3hydroxydihydroactinidiolide、4Osulfated4hydroxydihydroactinidiolide又はその開環体が挙げられる。化合物No23の推定構造としては、3Osulfated39dihydroxy5megastigmene、9Osulfated39dihydroxy5megastigmene、3Osulfated3hydroxy5megastigmene9one56dihydro、若しくは47Megastigmadiene39diol78Dihydro、8Hydroxy5isopropyl8methyl6nonen2one、9Dodecen1olFormyl又はこれらの硫酸抱合体が挙げられる。化合物No32の推定構造としては、4Pregnen19ol320dioneが最も好ましく、他には4Pregnen6βol320dione、4Pregnen7αol320dione、4Pregnen7βol320dione、4Pregnen11αol320dione、4Pregnen11βol320dione、4Pregnen21ol320dione、4Pregnen17ol320dione、4Pregnen12αol320dione、4Pregnen16αol320dione、4Pregene18ol320dione、4Pregne18ol320dione1820hemiketal、5Pregnen1617epoxy3βol20one、5Pregnen3βol720dione、5Pregnen3βol1120dione、5Pregnen3βol1620dione、16Pregnen3αol1120dione、16Pregnen3βol1120dione、516Androstadien3βol17βcarboxylicacidmethylester、1Androsten17βol3oneacetate、2Androsten3ol17oneacetate、2Androsten11αol17oneacetate、4Androsten3βol17oneacetate、4Androsten17αol3oneacetate、4Androsten17βol3oneacetate、4Androsten3one17βcarboxylicacidmethylester、5Androsten317dione3ethylenketal、5Androsten3βol16oneacetate、5Androsten3αol17oneacetate、5Androsten3βol17oneacetate、4Estren7αmethyl17βol3oneacetate、又は4Estren17βol3onepropionate又はこの硫酸抱合体が挙げられる。それらストレス性疾患のバイオマーカーの幾つかについて、以下のようにして同定した。61バイオマーカーのNMR分析用サンプルの分取精製及び構造推定RCS負荷有り媒体投与群試料の尿10mLを凍結乾燥したのち、水300μLに再溶解した。この再溶解したサンプルを、HPLC-MSシステム機器Varian社製に注入し、溶出液を20秒毎に分画して採取した。採取した分画のうち質量分析でm/zが289として検出される分画を集め、減圧下、濃縮乾固し、水50μLに再溶解した。異なる3種のカラムを用いて、同様なHPLC-MSによる分画の採取と濃縮操作を、さらに3回順次行った。4回目は所望の分画を減圧下濃縮乾固後、重メタノール180μLに溶解させ、尿精製NMR測定用サンプルを調製した。なお、HPLC条件、MS測定条件及びNMR測定条件は以下の通りである。<HPLC条件>カラム:1回目UnisonUKC82回目UnisonUKPhenyl3回目CadenzaCDC184回目UnisonUKPhenyl移動相成分A:0.1重量ギ酸水溶液移動相成分B:アセトニトリル移動相成分A/Bの溶出のグラジエント条件時間/Bの割合:0分/12→33分/45流速:1.0mL/分カラム温度:35°Cサンプル注入量:50~95μL<MS測定条件>イオン化法:ネガティブエレクトロスプレーイオン化法質量測定範囲:m/z100~500<NMR測定条件>測定機器:600MHz核磁気共鳴分析装置VNMRS600プローブ:600MHz1H13C15N5mmφPFGTripleResonance13CEnhancedColdProbe化学シフト基準:CD3OD測定法:wet1次元1H-NMR、及びwetTOCSY法1H-NMR測定の結果を以下に示す。δ457255244228221213212195161152106このNMRスペクトル解析により、質量分析でm/zが289の化合物化合物No16の構造は、分子式がC13H22O5Sであり分子量290であって、下記化学式2で示されるものであると、推定した。62LC-NMR/MSによるバイオマーカーの同定前記のm/zが289の尿精製NMR測定用サンプルを、そのままLC-NMR/MS測定用サンプルとして用いた。一方、別途合成することで得た化学式2の構造が特定された標品を、2mg/mLとなるように重メタノールに溶解して、LC-NMR/MS測定用標品サンプルとした。両サンプルを、それぞれHPLCに注入し、質量分析のm/z値を用いて、フラクションループに採取した。夫々、該当分画について、NMRで測定を行なった。<LC-NMR/MSシステム機器>HPLC装置:PROSTARNMR装置:VNMRS600MS装置:1200L<HPLC条件>カラム:CadenzaCDC18移動相成分A:0.1容量重ギ酸重水溶液移動相成分B:重アセトニトリル移動相成分A/Bの溶出のグラジエント条件時間/Bの割合:0分/25→15分/40流速:1.0mL/分カラム温度:40°Cサンプル注入量:10~45μL<MS条件>イオン化法:ネガティブエレクトロスプレーイオン化法質量測定範囲:m/z100~500<NMR条件>プローブ:600MHz1H13C15N5mmφPFGTripleResonance13CEnhancedColdProbe分画採取法:フラクションループ法化学シフト基準:TSPd4測定法:wet1次元1H-NMR、及びwetTOCSY法NMR測定の結果を以下に示す。尿精製NMR測定用サンプルδ455258238226222210189159154104標品サンプルδ455258238226222210189159154104両者は、NMRスペクトルデータが完全に一致していることから、尿精製NMR測定用サンプルの化合物は、前記化学式2の化合物であると、同定された。他のバイオマーカー候補化合物については、1MS/MSによる同定、又は2m/z値を用いて、各種データベースHumanmetabolomedatabasehttphmdbcalabmjspmlimsMSDbParentjsp、MassBank.jphttpwwwmassbankjpQuickSearchhtml及びMetabolome.jphttpwwwmetabolomejpmasssearchを用いて構造決定あるいは構造推定を行った。7拘束ストレスモデルにおける脱糞量とバイオマーカー量の検討雄性Sprague-DawleySD系ラット日本チャールスリバー、使用時7週齢を用いて、拘束ストレスを負荷したジャーナルオブファーマコロジカルサイエンシズJournalofPharmacolgicalSciences,2007年,第104巻,p263~273。ラットに媒体又は被験物質を投与した2時間後、ラットを拘束ストレスゲージW250×L110×H190mm;KN468;夏目製作所に入れることにより、ストレス負荷を開始した。当該拘束ストレスを負荷したラットの尿を経時的に採取し、かつラットの排便総湿重量g/hを測定した。採取した尿について、上記実施例で選別したバイオマーカー候補化合物について、UPLC/MRM法を用いて定量した。その結果、ストレスの一指標であるストレス負荷中脱糞量と本発明のバイオマーカー量は正の相関関係を示すものが多いことがわかった。特に、化合物No29のバイオマーカーについては、r=059の正相関を示し、ストレス症状との関連性が示唆された。"