"第1の足場ドメインおよび該第1の足場ドメインの1つの末端に融合する第1の異種ドメインを含む第1の融合ポリペプチド鎖と、第2の足場ドメインを含む第2の融合ポリペプチド鎖と、第3の足場ドメインを含む第3の融合ポリペプチド鎖と、を含み、該第1、第2および第3の足場ドメインが、三重らせんコイルを形成するよう並んでいる組み換えタンパク質複合体。前記異種ドメインが結合ドメインを含む請求項1記載のタンパク質複合体。前記結合ドメインが、リガンド結合ドメイン、リガンド、レセプター、親和性タグ、またはプロテオグリカンを含む請求項2記載のタンパク質複合体。前記結合ドメインが、免疫グロブリンの1つまたはそれ以上の相補決定領域を含む請求項2記載のタンパク質複合体。前記結合ドメインが、抗原結合フラグメントの配列を含む請求項4記載のタンパク質複合体。前記抗原結合フラグメントがCD3またはEGFRに特異的に結合する請求項5記載のタンパク質複合体。前記抗原結合フラグメントが、一本鎖抗体の配列を含む請求項5記載のタンパク質複合体。前記第1の融合ポリペプチド鎖が、前記第1の足場ドメインのもう1つの末端に融合する第2の異種ドメインをさらに含む請求項1記載のタンパク質複合体。前記第1の異種ドメインが、CD3に特異的に結合する第1の一本鎖抗体の配列を含む請求項8記載のタンパク質複合体。前記第2の異種ドメインが、EGFRに特異的に結合する第2の一本鎖抗体の配列を含む請求項8記載のタンパク質複合体。前記第2の融合ポリペプチド鎖が、前記第2の足場ドメインの1つの末端に融合する第3の異種ドメインを含む請求項8記載のタンパク質複合体。前記第2の融合ポリペプチド鎖が、前記第2の足場ドメインのもう1つの末端に融合する第4の異種ドメインをさらに含む請求項11記載のタンパク質複合体。前記第3の融合ポリペプチド鎖が、前記第3の足場ドメインの1つの末端に融合する第5の異種ドメインを含む請求項12記載のタンパク質複合体。前記第3の融合ポリペプチド鎖が、前記第3の足場ドメインのもう1つの末端に融合する第6の異種ドメインを含む請求項13記載のタンパク質複合体。前記第1、第2または第3の足場ドメインが、1またはそれ以上の三重らせんリピートを含み、各リピートは次の式:X1-X2-X3nの配列を含んでおり、式中、X1はGly残基、X2またはX3は任意のアミノ酸残基であり、かつnは5またはこれより大きい数である請求項1記載のタンパク質複合体。前記第1、第2または第3の足場ドメインが、1つまたはそれ以上のC1q、コレクチン、またはコラーゲンポリペプチド鎖の三重らせんリピートを含む請求項15記載のタンパク質複合体。X3がプロリンまたはヒドロキシプロリン残基である請求項15記載のタンパク質複合体。各リピートがGPP10の配列を含んでいる請求項15記載のタンパク質複合体。前記異種ドメインが酵素ドメインまたは蛍光タンパク質の配列を含む請求項1記載のタンパク質複合体。前記第1、第2および第3の融合ポリペプチドが実質的に同一である請求項1記載のタンパク質複合体。三重らせんコイルを形成するための足場ドメインと、該足場ドメインの1つの末端に融合する第1の異種ドメインとを含む組み換え融合ポリペプチド。前記足場ドメインが、1またはそれ以上の三重らせんリピートを含み、各リピートが次の式:X1-X2-X3nの配列を含んでおり、式中、X1はGly残基、X2またはX3は任意のアミノ酸残基であり、かつnは5またはこれより大きい数である請求項21記載の融合ポリペプチド。X3がプロリンまたはヒドロキシプロリン残基である請求項22記載の融合ポリペプチド。前記足場ドメインのもう1つの末端に融合する第2の異種ドメインをさらに含む請求項21記載の融合ポリペプチド。前記足場ドメインが、C1q、コレクチン、またはコラーゲンポリペプチド鎖の、1つまたはそれ以上の三重らせんリピートを含む請求項21記載の融合ポリペプチド。前記異種ドメインが、リガンド結合ドメイン、リガンド、レセプターまたは多糖類を含む請求項21記載の融合ポリペプチド。前記異種ドメインがファージディスプレイスクリーニングによって得られる請求項26記載の融合ポリペプチド。請求項21記載の融合ポリペプチドをコードする配列またはその補体を含む単離核酸。請求項28記載の核酸を含む宿主細胞。前記細胞が哺乳類または昆虫の細胞である請求項29記載の宿主細胞。前記哺乳類の細胞がマウス骨髄腫NS0細胞である請求項30記載の宿主細胞。請求項28記載の核酸を含む発現ベクター。請求項29記載の宿主細胞を、前記核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能とする条件下、培地中で培養する工程と、前記培養された細胞または前記細胞の前記培地から前記ポリペプチドを精製する工程とを含む融合ポリペプチドの製造方法。請求項1記載のタンパク質複合体の製造方法であって、第1の足場ドメインおよび該第1の足場ドメインの1つの末端に融合する第1の異種ドメインを含む第1の融合ポリペプチド鎖をコードする第1の核酸と、第2の足場ドメインを含む第2の融合ポリペプチド鎖をコードする第2の核酸と、第3の足場ドメインを含む第3の融合ポリペプチド鎖をコードする第3の核酸とを含有する宿主細胞を、該3つの核酸にコードされるポリペプチドの発現およびそれらの間における三重らせんコイルの形成を可能とする条件下、培地で培養する工程、ならびに培養された細胞または細胞の培地からタンパク質複合体を精製する工程を含む方法。前記宿主細胞が、プロリン残基をヒドロキシル化する酵素活性を含む真核細胞である請求項34記載の方法。本発明の目的は、高い親和性、低い細胞分裂促進作用、および高いインビボ安定性を備えるタンパク質複合体ベースの結合試薬を提供することにある。該試薬は多価あるいは多重特異性とすることもできる。したがって、本発明の1態様は、第1の足場ドメインscaffolddomainおよび第1の足場ドメインの1つの末端にインフレームでinframe融合する第1の異種ドメインheterologousdomainを含む第1の融合ポリペプチド鎖と、第2の足場ドメインを含む第2の融合ポリペプチド鎖と、第3の足場ドメインを含む第3の融合ポリペプチド鎖とを含んでいる単離組み換えタンパク質複合体に特徴を有する。第1、第2および第3の足場ドメインは、三重らせんコイルtriplehelixcoilを形成するように並ぶ。第1の足場ドメインおよび第1の異種ドメインはインフレームで融合し、かつ同一のペプチド鎖に存する。異種ドメインには酵素ドメインまたは蛍光タンパク質の配列が含まれ得る。蛍光タンパク質の例としては、GFPおよびdsRed、さらにそれらの変異体などがある。酵素ドメインの例には、グルタチオンSトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、およびβラクタマーゼのドメインが含まれる。異種ドメインには、結合パートナーと結合する結合ドメイン例えばリガンド結合ドメイン、リガンド、レセプター、またはプロテオグリカンが含まれ得る。結合パートナーとは、目的とする所望の化合物例えばタンパク質の部分に対して特異的、共有結合的または非共有結合的な親和性を備える任意の分子を意味する。結合パートナーの例としては、抗原/抗体のペア、タンパク質/阻害剤のペア、レセプター/リガンドのペア例えば細胞表面または核レセプター/リガンドのペア、酵素/基質のペア例えばキナーゼ/基質のペア、レクチン/炭水化物のペア、オリゴマーまたはへテロオリゴマータンパク質のペア、DNA結合タンパク質/DNA結合部位のペア、およびRNA/タンパク質のペアがある。また、結合ドメインの例には、例えばヒスチジンタグ、mycタグ、またはヘマグルチンhemagglutinタグのような親和性タグの配列も含まれる。上述した第1の異種ドメインには、免疫グロブリンの1つまたはそれ以上の相補決定領域CDRが含まれてもよい。よって、異種ドメインには、例えばVHドメインおよびFabのような抗体の抗原結合部位が含まれ得る。1つの実施形態において、第1の異種ドメインには、抗原結合性フラグメントまたは一本鎖抗体、例えば分化抗原3CD3または上皮増殖因子レセプターEGFRに特異なものの配列が含まれる。第1のポリペプチド鎖はさらに、第1の足場ドメインのもう1つの末端にインフレームで融合する第2の異種ドメインを含んでいてもよい。第1の異種ドメインのように、第2の異種ドメインにも、結合パートナーと結合するドメインが含まれ得る。第1および第2の異種ドメインは互いに同一であってもまたは異なっていてもよい。これらは、同一の結合パートナーまたは2つの異なる結合パートナーに結合することができる。例えば、第1の異種ドメインおよび第2の異種ドメインには、CD3およびEGFRにそれぞれ特異的に結合する第1の一本鎖抗体および第2の一本鎖抗体の配列が各々含まれていてもよい。上述したタンパク質複合体において、第2の融合ポリペプチド鎖は、第2の足場ドメインの1つの末端にインフレームで融合する第3の異種ドメイン、第2の足場ドメインのもう1つの末端にインフレームで融合する第4の異種ドメイン、または2つの末端にインフレームで融合する両方のドメインを含んでいてもよい。同様に、第3の融合ポリペプチド鎖は、第3の足場ドメインの1つの末端にインフレームで融合する第5の異種ドメイン、または、第3の足場ドメインのもう1つの末端にインフレームで融合する第6の異種ドメイン、または、両方を含んでいてもよい。上述した第1および第2の異種ドメインのように、これら4つの異種ドメインの各々には、結合パートナーと結合する結合ドメインも含まれ得る。6つ全ての異種ドメインは互いに同一であってもよくまたは異なってもよい。よってこれらは、1、2、3、4、5または6つの結合パートナーと結合できる。言い換えると、当該タンパク質複合体は、一、二、三、四、五、または六価であり得る。第1、第2、および第3の足場ドメインが三重らせんコイルを形成するよう、3つの足場ドメインのそれぞれは1つまたはそれ以上の三重らせんリピートを含んでおり、各リピートは次の式:X1-X2-X3nの配列を含み、式中、X1はGly残基であり、X2およびX3は任意のアミノ酸残基、好ましくはイミノ酸のプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、かつ、nは5またはこれより大きい数である。例えば、第1、第2、および第3の足場ドメインは、GPP10、または、1つもしくはそれ以上のヒト補体C1q、コレクチン、もしくはコラーゲンポリペプチド鎖の三重らせんリピートを含むことができる。1つの実施形態において、上述した第1、第2および第3の融合ポリペプチドは実質的に同じであり、互いに少なくとも75例えば75から100の間の任意の数を含むの配列同一性を有している。3つの同じ融合ポリペプチドから形成される複合体はホモ三量体である。これら3つの融合ポリペプチドは機能的に等価であり得る。機能的に等価とは、例えば、1もしくはそれ以上の点変異、挿入、欠失、切断を有するタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせなど共通のポリペプチドのポリペプチド誘導体が、三重らせんコイルを形成する能力と、例えばリガンドに結合するといった異種ドメインの活性を実質的に保持していることをいう。異種ポリペプチド、核酸、または遺伝子は異種から由来するもの、または、同種からのものである場合はその原形に実質的に修飾が加えられたものである。2つの融合ドメインまたは配列は、それらが天然のタンパク質または核酸中で互いに隣り合っていない場合は、互いに異種である。例えば、天然のヒトミニコラーゲンXXI型、コレクチンファミリータンパク質、または補体1qC1qの一部でないポリペプチド配列は、ヒトタンパク質におけるドメインに対して異種である。本発明はまた、i三重らせんコイルを形成するのに用いられる足場ドメイン、およびii足場ドメインの1つの末端にインフレームで融合する第1の異種ドメイン、または足場ドメインのもう1つの末端にインフレームで融合する第2の異種ドメインを含む単離組み換え融合ポリペプチド例えば上述した3つの各融合ポリペプチドにも特徴を有する。足場ドメインは、1つまたはそれ以上の上述した三重らせんリピート、例えばヒトC1qまたはコラーゲンポリペプチド鎖のそれを含み得る。異種ドメインは、上述した結合ドメインの1つを含んでいてもよく、かつ、ファージディスプレイスクリーニングのような当該分野で知られるさまざまな方法によって得ることができる。単離ポリペプチドまたはタンパク質複合体とは、天然の関連分子を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質複合体のことをいい、つまり、それは乾燥重量で少なくとも純度75すなわち75および100の間の任意の数を含むである。純度は任意の適した標準的方法、例えばカラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することができる。本発明の単離ポリペプチドまたはタンパク質複合体は、天然資源から精製でき、また組み換えDNA技術で作製することができる。本発明は、先ほど述べた融合ポリペプチドをコードする配列またはその配列の補体を含む単離核酸にも特徴を有する。核酸とはDNA分子例えばcDNAもしくはゲノムDNA、RNA分子例えばmRNA、またはDNAもしくはRNAアナログのことをいう。DNAまたはRNAアナログはヌクレオチドアナログから合成されたものであってよい。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましいのは二本鎖DNAである。単離核酸とは、その構造が、どの天然に存在する核酸の構造とも、またはどの天然に存在するゲノム核酸のフラグメントの構造とも同一でない核酸である。よってこの用語は、例えばa天然に存在するゲノムDNA分子の一部の配列を有するが、生物に天然に存在するゲノムにおいてその分子の一部の側方に位置する2つのコーディング配列の隣にはないDNA、b得られる分子がいかなる天然に存在するベクターまたはゲノムDNAとも同一にならないような方式で、ベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれる核酸、c例えばcDNA、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応PCRにより作製されたフラグメントまたは制限フラグメントのような分離された分子、およびdハイブリッド遺伝子、つまり融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換えヌクレオチド配列、を包含する。上述した核酸は本発明のポリペプチドを発現するのに用いることができる。この目的のために、核酸を適した調節配列へ動作可能に連結させて発現ベクターを生成することができる。ベクターとは、それに連結された別の核酸を運ぶ能力のある核酸分子のことをいう。ベクターは自己複製または宿主DNAと統一化することが可能である。ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、またはウィルスベクターなどがある。本発明のベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適したかたちで核酸を含む。ベクターが、発現させようとする核酸配列に操作により連結した1つまたはそれ以上の調節配列を含んでいると好ましい。調節配列には、プロモーター、エンハンサー、またはその他の発現制御要素例えばポリアデニル化信号が含まれる。調節配列には、組織特異的な調節および/または誘導inducible配列だけでなく、ヌクレオチド配列を直接構成的発現させるものも含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換させるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどといった要素に応じて行うことができる。発現ベクターを宿主細胞に導入することにより本発明のポリペプチドが生産される。上述した核酸を含む宿主細胞もまた本発明の範囲内に含まれる。例として、E.Coli細胞、昆虫細胞例えばショウジョウバエS2またはバキュロウイルス細胞を使用、酵母細胞、または哺乳動物の細胞例えばマウス骨髄腫NS0細胞などがある。例えば、Goeddel、1990GeneExpressionTechnologyMethodinEnzymology185、AcademicPress、SanDiego、CAを参照されたい。本発明の融合ポリペプチドを作製するには、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能とする条件下、培地中で宿主細胞を培養し、培養された細胞または細胞の培地からポリペプチドを精製することができる。あるいは、本発明の核酸は、例えばT7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いてインビトロの複写および翻訳がされてもよい。本発明のタンパク質複合体を作製するには、上述した第1、第2および第3の融合ポリペプチドをそれぞれコードする第1、第2および第3の核酸を含む宿主細胞を、これら3つの核酸によりコードされるポリペプチドの発現、および、発現されたポリペプチド間における三重らせんコイルの形成を可能とさせる条件下、培地中で培養し、培養された細胞または細胞の培地からタンパク質複合体を精製することができる。宿主細胞が、プロリン残基をヒドロキシル化する酵素活性を含む真核細胞であると好ましい。本発明の1つまたはそれ以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の記載において説明する。本発明のその他の特徴、目的および特長は、当該記載および図面から、そして特許請求の範囲から明らかとなるであろう。本発明は、ヒト三重らせんコイルの足場ドメインにインフレームで融合する異種タンパク質結合ドメインが結合活性を保持する、および得られる融合ポリペプチドが三重らせんコイルを形成する、という予期せぬ発見に、少なくとも一部基づいている。図1に示されているのは、本発明のタンパク質複合体の1例である。この図に示されているように、三重らせんコイルタンパク質複合体の6つの末端は、6つの異種タンパク質結合ドメイン、すなわち一本鎖抗体scFvのFvフラグメントにインフレームで融合する。本発明のタンパク質複合体は従来の抗体よりも優れている。また、6つのドメインのうち2つまたはそれ以上が互いに同一である場合、該タンパク質複合体は1つの結合パートナー例えば抗原に特異な2~6つの結合ドメインを備えることができ、これに比べて従来の抗体はそのようなドメインを2つしか備えない。言い換えると、抗原に対し二価でしかない従来の抗体とは異なり、当該タンパク質複合体は二、三、四、五または六価となり得る。その結果として、従来の抗体よりも高い各種親和性を持つようにすることができる。その高い親和性のために、従来の抗体よりも、必要とされるタンパク質複合体の量は少なく、かつインキュベーション期間は短くなり、望ましいゴールが達成される。例えば治療上の効果としては、これにより治療コストが低くなり、かつ副作用例えば望ましくない免疫反応が最小限に抑えられる。一方、6つのドメインのうち2つまたはそれ以上が互いに異なる場合、本発明のタンパク質複合体は、2~6つの異なる結合パートナーに特異である2~6つの結合ドメインを備えることができる。特異性の異なる多数の結合パートナー部位を1ユニットに統合することによって、多数の結合パートナーをまとめる能力が備わるため、治療、組織再生、および活性タンパク質機械activeproteinmachinery例えばマルチサブユニット酵素の組立において、ナノメーターレベルでの望ましい使用が可能となる。ヒトのインビボでの使用において、本発明のタンパク質複合体はヒト由来であることが好ましい。例えば、それには、ヒトC1q、コレクチンファミリータンパク質、またはコラーゲンポリペプチド鎖のようなヒト由来のらせんコイル足場にインフレームで融合するヒト化一本鎖抗体配列などが含まれる。ヒトC1qおよびコラーゲンはいずれも血中で極めて安定であるので、当該タンパク質複合体は従来の抗体に比べてより安定である。コラーゲンは哺乳動物に存在する最も豊富なタンパク質である。それは、リピートトリプレット配列Gly-X1-X2を含むと共に、かかるトリプレットの存在が3本のコラーゲンのポリペプチド鎖α鎖を三重らせん構造に折り畳ませ得る細胞外基質タンパク質である。トリプレット配列Gly-X1-X2におけるX2の位置のアミノ酸はプロリンであることが多く、それはコラーゲンの三重らせん構造を安定にするためコラーゲンポリペプチド鎖の翻訳後修飾によってしばしば4-ヒドロキシル化される。プロリンのヒドロキシル化なしには、コラーゲンの主要な三重らせん構造が生理的温度以下で熱的に不安定になるBergおよびProckop、BiochemBiophysResCommun52115120、1973;Rosenbloomら、ArchBiochemBiophys158478484、1973。ヒトの血清中には多くのコラーゲン様ドメインを有するコラーゲン様タンパク質が存在しており、感染性生物からの防御において先天性免疫システムの役目を果たす。これらには、補体タンパク質C1q、コレクチンファミリータンパク質-マンノース結合レクチンMBL、サーファクタントタンパク質AおよびDSP-AおよびSP-Dが含まれる。これらコラーゲン様タンパク質間で共通な構造的特徴は、これらがいずれも、そのコラーゲン様ドメインの三重らせんが集合した後、三量体分子が堆積または鎖間ジスルフィド架橋することにより、多量体タンパク質ユニットの形をとることにある。したがって、これら防御コラーゲン分子の結合ドメインの機能的親和性functionalaffinityは、多量体化を通して大いに向上する。本発明のタンパク質複合体またはポリペプチドは組み換え技術により得ることができる。該複合体のポリペプチドをコードする適当な宿主細胞の核酸に導入してから、該核酸にコードされたポリペプチドの発現と該ポリペプチド間における三重らせんコイルの形成とを可能とする条件下でポリペプチドを発現させることができる。三重らせんコイル足場の形成を促進するために、コラーゲン生合成の鍵酵素である宿主細胞のプロリル4-ヒドロキシラーゼP4HAで同時発現させることが可能である。異種タンパク質ドメインには抗体またはそのフラグメント例えばその抗原結合フラグメントが含まれ得る。ここで用いられる抗体という用語は、免疫グロブリン分子またはその免疫学的に活性である部位、すなわち抗原結合部位のことをいう。それは、少なくとも1つ、そして好ましくは2つの重H鎖可変領域VHと、少なくとも1つ、そして好ましくは2つの軽L鎖可変領域VLとを含むタンパク質のことをいう。VHおよびVL領域はさらに、フレームワーク領域FRと呼ばれるより保存性の高い領域の間に位置する、相補決定領域CDRと呼ばれる超可変の領域に細分されていてもよい。フレームワーク領域およびCDRの範囲ははっきりと定義がされている参照することにより本明細書に組み込まれるKabatら1991SequencesofProteinsofImmunologicalInteres、FifthEditionUSDepartmentofHealthandHumanServicesNIHPublicationNo913242、およびChothiaら1987JMolBiol196901917を参照。各VHおよびVLはアミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4、で並ぶ3つのCDRおよび4つのFRよりなっている。抗体はさらに、重および軽鎖定常領域を含み、これにより重および軽免疫グロブリン鎖がそれぞれ形成されるようになっていてもよい。重鎖定常領域は3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3からなる。軽鎖定常領域は1つのドメイン、CLからなる。重および軽鎖の可変領域は、抗原と作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は通常、免疫システムの各種細胞例えばエフェクター細胞および古典的補体系の第1成分C1qを含む宿主組織または因子への抗体の結合を仲介する。本明細書で免疫グロブリンという用語は、実質的に免疫グロブリン遺伝子によってコードされる1つまたはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質のことをいう。存在が認められているヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファIgA1およびIgA2、ガンマIgG1、IgG2,IgG3、IgG4、デルタ、エプシロンならびにミュー定常領域遺伝子、そしてさらに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子がある。完全長の免疫グロブリン軽鎖約25KDaまたは214のアミノ酸は、NH2末端約110のアミノ酸の可変領域遺伝子と、COOH末端のカッパまたはラムダ定常領域遺伝子とによってコードされる。同じように、完全長の免疫グロブリン重鎖約50KDaまたは446のアミノ酸は、可変領域遺伝子約116のアミノ酸と、他の上記定常領域遺伝子のうちの1つ、例えばガンマ約330のアミノ酸をコードするとによってコードされる。抗体の抗原結合フラグメントまたは抗体部分antibodyportion、またはフラグメントは、本明細書においては、例えばEGFRまたはCD3ポリペプチドあるいはそのフラグメントである抗原に特異的に結合する能力を保持する1つまたはそれ以上の完全長の抗体のフラグメントのことをいう。抗体の抗原結合フラグメントの例としては、限定はされないが、iFabフラグメント、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価フラグメント、iiFab’2フラグメント、ヒンジ領域にてジスルフィドブリッジにより連結される2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント、iiiVHおよびCHlドメインからなるFdフラグメント、iv抗体の1本のアームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント、vVHドメインからなるdAb領域Wardら、1987Nature341:544546、vi単離相補決定領域CDR、ならびにviiVLまたはVHドメインが含まれる。さらに、Fvフラグメントの2つのドメイン、VLおよびVHは、別々の遺伝子によりコードされるが、これらは組み換え法を用い、合成リンカーにより結合させることができ、この合成リンカーはこれらを、VLおよびVH領域が組になって一価分子を形成する一本のタンパク質鎖とさせることができる一本鎖FvscFvとして知られる。例えばBirdら1988Science242:423426、およびHustonら1988PROCNatlAcadSciUSA85:58795883参照。このような一本鎖抗体もまた、抗体の抗原結合フラグメントという用語に包含される。これらの抗体フラグメントは当業者に知られる従来の手法により得ることができ、かつ、当該フラグメントは実用に供することのできるよう、インタクト抗体と同じ方式で選別される。適した抗体にはモノクローナル抗体がある。別の実施形態において、抗体は、組み換え技術、例えばファージディスプレイまたはコンビナトリアル手法により作製したものであってもよい。抗体を作製するためのファージディスプレイおよびコンビナトリアル手法は当該技術分野において周知である例えば、Ladnerら、米国特許第5,223,409号明細書;Kangら、国際公開第92/18619号パンフレット;Dowerら、国際公開第91/17271号パンフレット;Winterら、国際公開第O92/20791号パンフレット;Marklandら、国際公開第92/15679号パンフレット;Breitlingら、国際公開第93/01288号パンフレット;McCaffertyら、国際公開第92/01047号パンフレット;Garrardら、国際公開第92/09690号パンフレット;Ladnerら、国際公開第90/02809号パンフレット;Fuchsら、1991BioTechnology913701372;Hayら、HumAntibodHybridomas38185;Huseら、1989Science24612751281;Griffthsら、1993EMBOJ12725734;Hawkinsら、1992JMolBiol226889896;Clacksonら、1991Nature352624628;Gramら、1992PNAS8935763580;Garradら、1991BioTechnology913731377;Hoogenboomら、1991NucAcidRes1941334137、およびBarbasら、1991PNAS8879787982を参照、これらすべての内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。1つの実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体例えば、ヒト免疫グロブリン配列からの抗体を産出するよう遺伝子操作を受けたマウスで作られた抗体、または非ヒト抗体、例えば齧歯動物マウスまたはラット、ヤギ、霊長類の動物例えばサル、ラクダの抗体である。非ヒト抗体は齧歯動物マウスまたはラット抗体とするのが好ましい。齧歯動物抗体を作製する方法は当該技術分野において周知である。ヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなく、ヒト免疫グロブリン遺伝子を持つトランスジェニックマウスを用いて生成することができる。目的の抗原で免疫されたこれらトランスジェニックマウスからの脾細胞は、ヒトタンパク質のエピトープに対し特異的親和性があるヒトmAbを分泌するハイブリドーマを作出するのに用いられる例えば、Woodら、国際公開第91/00906号パンフレット;Kucherlapatiら、国際公開第91/10741号パンフレット;Lonbergら、国際公開第92/03918号パンフレット;Kayら、国際公開第92/03917号パンフレット;Lonberg,Nら、1994Nature368856859、GreenLLら、1994NatureGenet71321;Morrisonら、1994ProcNatlAcadSciUSA8168516855;Bruggemanら、1993YearImmunol73340;Tuaillonら、1993PNAS9037203724;Bruggemanら、1991EurJImmuno2113231326を参照。。抗体は、可変領域または例えばCDRなどその一部が、非ヒト生物、例えばラットまたはマウスにおいて産出されたものであってよい。キメラ、CDR-グラフト、およびヒト化抗体が使用可能である。例えばラットまたはマウスのような非ヒト生物で産出されてから、ヒトにおける抗原性を低減するために例えば可変フレームワークまたは定常領域において修飾がなされた抗体は、本発明の範囲に含まれる。キメラ抗体は、当該技術分野において周知である組み換えDNA技術によって作製することができる。例として、マウスまたはその他の種のモノクローナル抗体分子のFc定常領域をコードする遺伝子を制限酵素により消化して、マウスFcをコードする領域を除去してから、ヒトFc定常領域をコードする遺伝子の相当部位で置換するRobinsonら、国際特許出願PCT/US86/02269号;Akiraら、欧州特許出願第184,187号明細書;TaniguchiM、欧州特許出願第171,496号明細書;Morrisonら、欧州特許出願第173,494号明細書;Neubergerら、国際公開第86/01533号パンフレット;Cabillyら、米国特許第4,816,567号明細書;Cabillyら欧州特許出願第125,023号明細書;Betterら、1998Science24010411043;Liuら、1987PNAS8434393443;Liuら、1987JImmunol13935213526;Sunら、1987PNAS84214218;Nishimuraら、1987CancRes479991005;Woodら、1985Nature314446449;およびShawら、1998JNatlCancerInst8915531559を参照。ヒト化またはCDRグラフト抗体は、少なくとも1つまたは2つ、ただし通常は3つすべてのレシピエントの重およびまたは軽免疫グロブリン鎖のCDRが、ドナーCDRで置き換えられる。抗体が非ヒトCDRの少なくとも1部で置き換えられても、あるいは、CDRのいくつかだけが非ヒトCDRで置き換えられてもよい。ヒト化抗体またはそのフラグメントの結合に要されるCDRの数だけ置き換えればよいのである。ドナーが齧歯動物の抗体、例えばラットまたはマウス抗体であり、かつレシピエントがヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークであると好ましい。一般に、CDRを提供する免疫グロブリンはドナーと呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンはアクセプターと呼ばれる。1つの実施形態において、ドナー免疫グロブリンはヒト以外例えば齧歯動物である。アクセプターのフレームワークは、天然例えばヒトフレームワークまたはコンセンサスフレームワーク、または、約85またはこれ以上、好ましくは90、95、99またはこれ以上がそれと同一な配列である。本明細書でコンセンサス配列とは、関連配列のファミリー中にて最も頻繁に出現するアミノ酸またはヌクレオチドから形成される配列のことをいう例えば、Winnaker、FromGenestoClones参照。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は、該ファミリーにおけるその位置に最も頻繁に出現するアミノ酸によって占められる。2つのアミノ酸が同等に頻繁に出現する場合は、どちらかがコンセンサス配列に含まれ得る。コンセンサスフレームワークとは、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域のことをいう。抗体は当該技術分野において周知の方法でヒト化することができる。ヒト化抗体は、抗原の結合に直接かかわりのないFv可変領域の配列を、ヒトFv可変領域からの相当する配列で置き換えることによって生成することができる。ヒト化抗体を生成する一般的な方法は、MorrisonSL、1985Science22912021207、Oiら、1986BioTechniques4214、ならびにQueenら、米国特許第5,585,089号明細書、米国特許第5,693,761号明細書および米国特許第5,693,762号明細書により提示されており、これらのすべての内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。それらの方法は、少なくとも1つの重または軽鎖からの免疫グロブリンFv可変領域のすべてまたは一部をコードする核酸配列を単離する工程、操作する工程、および発現させる工程を含む。かかる核酸のソースは当業者にはよく知られており、例えば、目的のポリペプチドまたはそのフラグメントに対する抗体を産出するハイブリドーマから得ることができる。よって、ヒト化抗体またはそのフラグメントをコードする組み換えDNAを、適当な発現ベクターにクローニングすることができる。特定のアミノ酸が置換、欠失または追加されたヒト化抗体は足場に融合することもできる。好ましいヒト化抗体は、例えば抗原への結合を改善する目的で、フレームワーク領域にアミノ酸置換基を有する。例えば、ヒト化抗体は、ドナーのフレームワークの残基またはレシピエントのフレームワーク残基以外の別なアミノ酸と同一であるフレームワークの残基を備える。このような抗体を生成するため、選択された、少数のヒト化免疫グロブリン鎖のアクセプターフレームワーク残基を、対応するドナーアミノ酸で置き換えることができる。好ましい置換基の配置としては、アミノ酸残基をCDRに隣接させる、またはCDRと作用することのできる配置などがある。ドナーからアミノ酸を選ぶ基準は、US5,585,089号に記載されており、その内容は本明細書では参照することにより組み込まれる。ヒト化抗体のその他の技術は、Padlanら、欧州特許出願公開第519596号明細書に記載されている。本発明は、本発明のタンパク質複合体を形成する融合ポリペプチドをコードする核酸をも含む。核酸は、ファージディスプレイライブラリーから選別された、または上記の適した抗体または抗体の誘導体を発現する細胞株からRT-PCRによって単離されたものとすることができる。核酸は発現ベクターに機能的にライゲートされてもよい。核酸またはベクターで形質転換された細胞を、本発明の融合ポリペプチドまたはタンパク質複合体を作製するのに用いることができる。抗体を作製するのに有用な細胞としては、昆虫細胞および哺乳動物の細胞例えばCHOまたはリンパ細胞などがある。本発明のタンパク質複合体は、細胞毒素のような治療成分therapeuticmoiety、治療薬または放射性イオンにコンジュゲートすることができる。細胞毒素または細胞毒性薬には、細胞に有害なあらゆる薬剤が含まれる。例としては、タクソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシドtenoposide、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイドmaytansinoids、例えばメイタンシノールmaytansinol米国特許第5,208,020号明細書参照、CC-1065米国特許第5,475,092号明細書、米国特許第5,585,499号明細書、米国特許第5,846,545号明細書参照およびそのアナログまたはホモログがある。治療薬には、限定はされないが、代謝拮抗物質例えばメトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン、アルキル化剤例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシルthioepachlorambucil、CC-1065、メルファラン、カルムスチンBSNUおよびロムスチンCCNU、シクロトスファミドcyclothosphamide、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金IIDDPシスプラチン、アントラサイクリン例えばダウノルビシン旧ダウノマイシンおよびドクソルビシン、抗生物質例えばダクチノマイシン、旧アクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシンAMC、ならびに抗分裂剤例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、タクソールおよびメイタンシノイドが含まれる。放射性イオンには、限定はされないが、ヨード、イットリウムおよびプラセオジムが含まれる。コンジュゲートは所定の生物学的反応を修飾するのに用いることができ、薬物成分drugmoietyは古典的な化学治療薬に限定されると解されるべきではない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を備えたタンパク質またはポリペプチドであり得る。かかるタンパク質には、例として、アブリン、リシンA、緑膿菌外毒素もしくはジフテリア毒素のような毒素、腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベータのようなタンパク質、または、例えばリンフォカイン、インターロイキン-1IL-1、インターロイキン-2IL-2、インターロイキン-6IL-6、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子GCSFもしくはその他の成長因子のような生物学的反応修飾物質が含まれる。異種結合ドメインの特異性をベースとしている上述のタンパク質複合体およびコンジュゲートは、ガン、炎症疾患、代謝疾患、繊維化疾患、および心臓血管疾患を含むさまざまな疾患を治療するために用いることができる。よって本発明は、例えば、それを必要とする対象に本発明のタンパク質複合体を有効量投与することによって、このような疾患を治療する方法に特徴を有する。治療を受けるべき対象は、疾患に特徴付けられる状態を持つまたは獲得する危険があるものとして確認することができる。この方法は、単独で、またはその他の薬物もしくは治療法と併用して行うことが可能である。その多重特異性という特徴により、本発明のタンパク質複合体は、本来は互いにつながっていない分子または細胞を架橋するのに用いられ得る。この特徴は細胞ベースの治療に対しとりわけ有用である。一例において、タンパク質複合体における1つの異種ドメインは、細胞障害性細胞上のエフェクター抗原に特異的に結合することによって細胞傷害性細胞例えば細胞傷害性T細胞を活性化させることができ、同時に他の異種ドメインは、破壊するべき病原細胞または悪性細胞上の標的抗原に特異的に結合する。このようにして、タンパク質複合体は病原または悪性細胞によって引き起こされる疾病を治療することができるのである。細胞傷害性T細胞の活性化は、本発明のタンパク質複合体による、細胞障害性T細胞表面のエフェクター抗原としてのCD3抗原の結合を通して起こり得る。その他のリンパ球様細胞結合型lymphoidcellassociatedエフェクター抗原には、ヒトCD16抗原、NKG2D抗原、NKp46抗原、CD2抗原、CD28抗原、CD25抗原、CD64抗原、およびCD89抗原などがある。これらエフェクター抗原に結合することによって、単球、好中性顆粒球および樹枝状細胞のようなエフェクター細胞の活性化がもたらされる。よって、これら活性化された細胞は、標的細胞に対し細胞傷害またはアポトーシス効果を発揮する。標的抗原は、病気の状態に付随する標的細胞上にユニークに発現uniquelyexpressする抗原であるが、健康な状態では発現しない、低レベルで発現する、あるいはアクセスできないnonaccessibleものである。悪性細胞に関連するかかる標的抗原の例には、EpCAM、CCR5、CD19、HER-2neu、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1ムチン、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5.sub.AC、MUC5.sub.B、MUC7、ベータ.hCG、ルイス-Y、CD20、CD33、CD30、ガングリオシドGD3、9-O-アセチル-GD3、GM2、GloboH、フコシルGM1、ポリSA、GD2、カルボアンヒドラーゼCarboanhydraseIX、D44v6、ソニックヘッジホッグ、Wue-1、形質細胞抗原、膜結合性IgE、メラノーマコンドロイチンサルフェートプロテオグリカンMCSP、CCR8、TNF-アルファ前駆体、STEAP、メソテリンmesothelin、A33抗原、前立腺幹細胞抗原、Ly-6;デスモグレイン4、E-カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリンレセプター、CD25、CA19-9マーカー、CA-125マーカーおよびミュラー管抑制物質MISレセプタータイプII、sTnシリル化Tn抗原TAG-72、FAP、エンドシアリンendosialin、EGFRvIII、LG、SASならびにCD63などがある。治療するtreatingという用語は、病気、病気の症状、病気による二次的な病状、または病気にかかり易い素因を治すcure、緩和するalleviate、軽減するrelieve、修復するremedy、予防するprevent、または改善するameliorateことを目的とし、対象に組成物を投与することとして定義される。有効量とは、治療を受ける対象において例えば上述したような医学的に望ましい結果を生じさせることのできる組成物の量のことである。1つのインビボアプローチでは、治療組成物例えば本発明のタンパク質複合体を含む組成物を対象に投与する。通常、該複合体は医薬的に許容される担体例えば生理食塩水に懸濁されており、経口でもしくは静脈内注射により投与される、または皮下、筋肉、鞘内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内もしくは肺内に注射もしくは注入される。必要な投与量は、投与経路の選択、剤形の性質、対象の疾病の性質、対象の大きさ、体重、表面積、年齢および性別、投与されている他の薬物、ならびに主治医の判断によって決まる。適切な投与量は0.01~100.0mg/kgの範囲である。必要とされる投与量の増減は、利用可能な組成物の種類、および各種投与経路の異なる効率を考慮して予測される。例えば、経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を要するであろうことが予想できる。これら投与量の増減の程度は、当該技術分野においてよく理解されているような、標準的な経験的ルーチンによって調整し至適化することができる。適した運搬媒体例えば高分子微粒子または埋め込み型装置に組成物をカプセル封入すれば、特に経口デリバリーにおいて、運搬の効率を向上させることができる。医薬的に許容される担体および有効量の本発明のタンパク質複合体を含む医薬組成物も、本発明の範囲内に含まれる。医薬組成物は上記した疾患を処置するのに用いることができる。医薬的に許容される担体には、溶剤、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、ならびに等張および吸収遅延剤が含まれる。医薬組成物は、従来の方法を用い、それぞれ異なる投与経路に合った剤形に形成することができる。本発明の組成物の有効性はインビトロとインビボの両方において評価できる。インビボ試験では、組成物を動物例えばマウスモデルに注射してから、その治療上の効果を調べることができる。その結果に基づいて、適切な投与量の範囲と投与経路が決められる。以下の具体例は、説明にすぎず、いかなる方式においてもこの開示以外のものを限定するものではないと解されるべきである。詳述はしなくとも、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明を最大限利用できると考えられる。本明細書に引用されるすべての刊行物は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。実施例1M13ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングして、EGFRに特異的に結合するヒト一本鎖可変フラグメントを同定した。多数のクローンを同定した。ウェスタンブロッティングおよびELISAによる確認ののち、さらなる実験のために1つのクローン、erbscFvを選んだ。標準方法により、erbscFvをコードするcDNAを得てから、発現ベクターにライゲートした。以下に示すのは、erbscFvのポリペプチド配列配列番号1とそれをコードするヌクレオチド配列配列番号2である。配列番号1MetAlaGluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyrAlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValSerAspIleGlyAlaSerGlySerAlaThrSerTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysSerThrThrThrPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerThrAspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyrAspAlaSerAlaLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrAlaAspTyrProThrThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLysArg配列番号2ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGATATTGGTGCTTCTGGTTCTGCTACATCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCTACTACTACTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTATGCTGATTATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG次いで、発現ベクターを昆虫細胞株ショウジョウバエS2中で発現させた。抗EGFRerbscFvを精製し、ウェスタンブロット分析およびELISAにかけて、そのEGFRに対する特異性を確認した。RT-PCRを行って、抗CD3モノクローナル抗体OKT3の重鎖可変領域および軽鎖可変領域VLをコードするcDNAをハイブリドーマ細胞株から得た。続いて、2つのcDNAをライゲートして、OKT3のVH-VLの融合タンパク質をコードする融合配列を作製した。以下に示すのは、この融合タンパク質のポリペプチド配列配列番号3とそれをコードするcDNAの配列配列番号4である。配列番号3ValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuAlaArgProGlyAlaSerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrArgTyrThrMetHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIleGlyTyrIleAsnProSerArgGlyTyrThrAsnTyrAsnGlnLysPheLysAspLysAlaThrLeuThrThrAspLysSerSerSerThrAlaTyrMetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCysAlaArgTyrTyrAspAspHisTyrCysLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleValLeuThrGlnSerProAlaIleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMetAsnTrpTyrGlnGlnLysSerGlyThrSerProLysArgTrpIleTyrAspThrSerLysLeuAlaSerGlyValProAlaHisPheArgGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrIleSerGlyMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTrpSerSerAsnProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluLeuLysArg配列番号4GTCCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTGCTAACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCACTTCAGGGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGA同じ手順を行って、抗EGFRモノクローナル抗体528のVHおよびVLをコードするcDNA、ならびに抗EGFR528のVH-VLの融合タンパク質をコードする融合配列を得た。528モノクローナル抗体は、細胞膜、例えばヒト類表皮癌A431細胞などの細胞膜上のEGFRに結合する。この528一本鎖抗体のポリペプチド配列配列番号5およびそれをコードするcDNAの配列配列番号6を以下に示す。配列番号5ValLysLeuGlnGluSerGlySerGluMetAlaArgProGlyAlaSerValLysLeuProCysLysAlaSerGlyAspThrPheThrSerTyrTrpMetHisTrpValLysGlnArgHisGlyHisGlyProGluTrpIleGlyAsnIleTyrProGlySerGlyGlyThrAsnTyrAlaGluLysPheLysAsnLysValThrLeuThrValAspArgSerSerArgThrValTyrMetHisLeuSerArgLeuThrSerGluAspPheAlaValTyrTyrCysThrArgSerGlyGlyProTyrPhePheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerMetThrGlnThrProLeuSerLeuProValSerLeuGlyAspGlnAlaSerIleSerCysArgSerSerGlnAsnIleValHisAsnAsnGlyIleThrTyrLeuGluTrpTyrLeuGlnArgProGlyGlnSerProLysLeuLeuIleTyrLysValSerAspArgPheSerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIleSerArgValGluAlaGluAspLeuGlyIleTyrTyrCysPheGlnGlySerHisHisProProThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGlu配列番号6GTCAAGCTGCAGGAGTCAGGGTCTGAGATGGCGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGCCCTGCAAGGCTTCTGGCGACACATTCACCAGTTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCATGGACATGGCCCTGAGTGGATCGGAAATATTTATCCAGGTAGTGGTGGTACTAACTACGCTGAGAAGTTCAAGAACAAGGTCACTCTGACTGTAGACAGGTCCTCCCGCACAGTCTACATGCACCTCAGCAGGCTGACATCTGAGGACTTTGCGGTCTATTATTGTACAAGATCGGGGGGTCCCTACTTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTACATAATAATGGAATCACCTATTTAGAATGGTACCTGCAAAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCGACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTAGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATCATCCTCCCACGTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGGAA上述の抗EGFRscFv03、OKT3VH-VL、および抗EGFR528VH-VLをコードするcDNAを、5’末端の短いヒンジ配列、および3’末端のヒスチジンタグ配列を含むXXI型ヒトミニコラーゲンのcDNAにそれぞれインフレームで融合した。以下に示すのは、XXI型ヒトミニコラーゲンのポリペプチドおよびcDNAの配列それぞれ配列番号7および8である。配列番号7GlyGlyArgGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSerIleProGlyProProGlyProIleGlyProGluGlyProArgGlyLeuProGlyLeuProGlyArgAspGlyValProGlyLeuValGlyValProGlyArgProGlyValArgGlyLeuLysGlyLeuProGlyArgAsnGlyGluLysGlySerGlnGlyPheGlyTyrProGlyGluGlnGlyProProGlyProProGlyProGluGlyProProGlyIleSerLysGluGlyProProGlyAspProGlyLeuProGlyLysAspGlyAspHisGlyLysProGlyIleGlnGlyGlnProGlyProProGlyIleCysAspProSerLeuCysPheSerValIleAlaArgArgAspProPheArgLysGlyProAsnTyrSerLeuAspAspSerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGly注:Proはプロリンまたはヒドロキシプロリンである配列番号8GGCGGCCGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAGATCTATTCCTGGGCCACCTGGTCCGATAGGCCCAGAGGGTCCCAGAGGATTACCTGGTTTGCCAGGAAGAGATGGTGTTCCTGGATTAGTGGGTGTCCCTGGACGTCCAGGTGTCAGAGGATTAAAAGGCCTACCAGGAAGAAATGGGGAAAAAGGGAGCCAAGGGTTTGGGTATCCTGGAGAACAAGGTCCTCCTGGTCCCCCAGGTCCAGAGGGCCCTCCTGGAATAAGCAAAGAAGGTCCTCCAGGAGACCCAGGTCTCCCTGGCAAAGATGGAGACCATGGAAAACCTGGAATCCAAGGGCAACCAGGCCCCCCAGGCATCTGCGACCCATCACTATGTTTTAGTGTAATTGCCAGAAGAGATCCGTTCAGAAAAGGACCAAACTATAGTCTAGACGACAGCAGCCATCATCACCATCACCATAGCAGCGGC得られた3つの発現ベクターを、ショウジョウバエS2細胞に同時トランスフェクトcotransfectした。その細胞をブラストサイジン存在下で培養し、ブラストサイジンに耐性を持つ細胞を選別した。細胞培養上清を回収してから、EGFRおよびCD3に対する抗体活性に対して、ウェスタンブロットとELISAでスクリーニングした。一部のクローンの細胞が三重らせん状の複合体triplehelixcomplexを安定に発現していることが発見された。XXI型ヒトミニコラーゲンに似たこれら三重らせん状の複合体は、熱およびペプシンに耐性を示した。より重要なのは、これらがEGFRとCD3の両方に特異的に結合したということである。実施例2この実施例では、3つの融合ポリペプチド、OKT3scFv-Col、erbscFv-Col、およびerbNSPD-scFvを作製した。ファージライブラリーの選択上皮細成長因子レセプター細胞外ドメインEGFR-ECD結合可変フラグメントscFvを含むerbファージミドを、ヒトシングルフォールドscFvファージディスプレイライブラリーTomlinsonIJ;IMTomlinsonandGWinterより親切に提供された、MRCラボラトリーオブモレキュラーバイオロジー、ケンブリッジ、英国をスクリーニングすることにより単離した。精製したEGFレセプターの組み換え細胞外ドメインEGFRECD;リサーチダイアグノスティック社ResearchDiagnosticsInc10μgを塗布したイムノチューブMaxisorp;ヌンNunc、ロスキレ、デンマークを用いて選別を行った。メーカーのプロトコールにしたがって、ブロッキング、パンニングpanning、洗浄、溶出および溶出ファージの再増幅を行った。組み換えプラスミドの構築erbのscFvをコードするcDNAをPCRによりerbファージミドから増幅した。OKT3ハイブリドーマATCC、CRL8001の逆転写産物により、ムリンIgG2a抗CD3mAbOKT3オルトファーマシューティカルコーポレーションをコードする配列を得た。公開されたヌクレオチド配列を基に、RT-PCRによってOKT3mAbのVLおよびVHのcDNAを得た。グリシンリンカーGGGS3でVLおよびVH鎖をつなぐことにより、erbおよびOKT3のscFvPCRの融合を発生させた。scFvColを生成するよう、scFvColのコーディング領域には、N末端のscFvヌクレオチド配列と、ヒトIgGのヒンジ領域、コラーゲン様ドメイン下線部およびXXI型コラーゲンのNC1ドメインを含む、EPKSCDKTHTCPPCPRSIPGPP10GICDPSLCFSVIARRDPFRKGPNYのペプチド配列をコードするC末端合成コラーゲン足場遺伝子とが含まれる。以下に示すのは、合成コラーゲン足場ポリペプチドおよびcDNAの配列それぞれ配列番号9および10である。配列番号9SEQIDNO9GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSerIleProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyIleCysAspProSerLeuCysPheSerValIleAlaArgArgAspProPheArgLysGlyProAsnTyr配列番号10GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAGATCTATTCCTGGGCCACCTGGTCCCCCAGGTCCTCCAGGACCCCCAGGGCCCCCAGGCCCCCCCGGGCCGCCTGGACCCCCAGGGCCACCAGGCCCCCCAGGCATCTGCGACCCATCACTATGTTTTAGTGTAATTGCCAGAAGAGATCCGTTCAGAAAAGGACCAAACTATこの合成配列配列番号10をオーバーラップPCRにより作製し、NotIおよびXhoI部位の隣に位置するflankingPCR産物を、同部位の発現ベクターpSecTag2/Hygroにクローニングした。続いて、erbおよびOKT3のscFvを、AscIおよびNotI部位で上述したC末端コラーゲン足場含有構成体にインフレームでクローニングして、erbscFv-ColおよびOKT3scFv-Colの発現構成体をそれぞれ作った。次に、erbNSPD-scFvを作製した。NSPD-scFvのコーディング領域には、ヒトサーファクタントタンパク質DSPDのN末端の254のアミノ酸、コレクチンファミリーのメンバー、およびC末端のscFvが含まれていた。以下に示すのは、ヒトサーファクタントタンパク質DのポリペプチドのN末端254アミノ酸およびそのcDNAの配列であるそれぞれ配列番号11および12。配列番号11MetLeuLeuPheLeuLeuSerAlaLeuValLeuLeuThrGlnProLeuGlyTyrLeuGluAlaGluMetLysThrTyrSerHisArgThrMetProSerAlaCysThrLeuValMetCysSerSerValGluSerGlyLeuProGlyArgAspGlyArgAspGlyArgGluGlyProArgGlyGluLysGlyAspProGlyLeuProGlyAlaAlaGlyGlnAlaGlyMetProGlyGlnAlaGlyProValGlyProLysGlyAspAsnGlySerValGlyGluProGlyProLysGlyAspThrGlyProSerGlyProProGlyProProGlyValProGlyProAlaGlyArgGluGlyProLeuGlyLysGlnGlyAsnIleGlyProGlnGlyLysProGlyProLysGlyGluAlaGlyProLysGlyGluValGlyAlaProGlyMetGlnGlySerAlaGlyAlaArgGlyLeuAlaGlyProLysGlyGluArgGlyValProGlyGluArgGlyValProGlyAsnThrGlyAlaAlaGlySerAlaGlyAlaMetGlyProGlnGlySerProGlyAlaArgGlyProProGlyLeuLysGlyAspLysGlyIleProGlyAspLysGlyAlaLysGlyGluSerGlyLeuProAspValAlaSerLeuArgGlnGlnValGluAlaLeuGlnGlyGlnValGlnHisLeuGlnAlaAlaPheSerGlnTyrLysLysValGluLeuPhe配列番号12ATGCTGCTCTTCCTCCTCTCTGCACTGGTCCTGCTCACACAGCCCCTGGGCTACCTGGAAGCAGAAATGAAGACCTACTCCCACAGAACAATGCCCAGTGCTTGCACCCTGGTCATGTGTAGCTCAGTGGAGAGTGGCCTGCCTGGTCGCGATGGACGGGATGGGAGAGAGGGCCCTCGGGGCGAGAAGGGGGACCCAGGTTTGCCAGGAGCTGCAGGGCAAGCAGGGATGCCTGGACAAGCTGGCCCAGTTGGGCCCAAAGGGGACAATGGCTCTGTTGGAGAACCTGGACCAAAGGGAGACACTGGGCCAAGTGGACCTCCAGGACCTCCCGGTGTGCCTGGTCCAGCTGGAAGAGAAGGTCCCCTGGGGAAGCAGGGGAACATAGGACCTCAGGGCAAGCCAGGCCCAAAAGGAGAAGCTGGGCCCAAAGGAGAAGTAGGTGCCCCAGGCATGCAGGGCTCGGCAGGGGCAAGAGGCCTCGCAGGCCCTAAGGGAGAGCGAGGTGTCCCTGGTGAGCGTGGAGTCCCTGGAAACACAGGGGCAGCAGGGTCTGCTGGAGCCATGGGTCCCCAGGGAAGTCCAGGTGCCAGGGGACCCCCGGGATTGAAGGGGGACAAAGGCATTCCTGGAGACAAAGGAGCAAAGGGAGAAAGTGGGCTTCCAGATGTTGCTTCTCTGAGGCAGCAGGTTGAGGCCTTACAGGGACAAGTACAGCACCTCCAGGCTGCTTTCTCTCAGTATAAGAAAGTTGAGCTCTTCN末端SPDcDNAを、発現ベクター、pSecTag2/HygroインビトロジェンにNheIおよびAscI部位でクローニングした。続いて、erbのscFvを、AscIおよびXhoI部位で上述したN末端SPD含有構成体にインフレームでクローニングして、erbNSPD-scFvの発現構成体を作った。erbscFv-Col、erbNSPD-scFvおよびOKT3scFv-Colの各読み取り枠openreadingframeには、N末端リーダー配列と、分泌、検出および精製に利用されるC末端mycエピトープ/ポリヒスチジンタグとをコードする配列が含まれていた。下表にまとめたのは、上述の発現構成体によりコードされる各種組み換えタンパク質/抗体である。抗体の発現および精製組み換えタンパク質複合体/抗体を作製するため、EffecteneQiagenを用い、メーカーの取扱説明書にしたがって上述の構成体をマウス骨髄腫NS0細胞に導入した。ハイグロマイシン400μg/mlで4週間選別したのち、各安定クローンを、振盪フラスコ中の2のウシ胎仔血清を含む既知組成培地HyQCDM4NS0ハイクローンHycloneにて、初播種密度2×105細胞/mlとして培養した。該培養は37°Cで5日間、150rpmに保って行った。それら細胞が、上述の抗体ドメインと、コラーゲン足場ドメインつまりコラーゲン足場抗体CSAと、を含むタンパク質をコードする発現構成体を保持できるように、培地にアスコルビン酸ナトリウム80μg/mlを毎日加えた。erbscFv、erbscFv-Fc、erbscFv-Col、またはOKT3scFv-Colタンパク質あるいはタンパク質複合体を精製するべく、ろ過した各培地約2Lを、流速60ml/時間で、pH8.0の50mMトリスHClバッファーで平衡化したTゲルカラム1.5×8cm、Pierceにかけた。同バッファーで洗浄したのち、その組み換えタンパク質またはタンパク質複合体をpH4.0の50mM酢酸ナトリウムバッファーで溶出した。それらのUV吸収度を280nmで測定し、そのピーク画分を、流速60ml/時間で、pH8.0の0.5MNaCl含有50mMトリスHClバッファーにより平衡化したZnSO4チャージキレーティングセファロースハイトラップカラムZnSO4chargedchelatingSepharoseHighTrapcolumnベッドボリューム1-ml、GEヘルスケアにかけた。そのカラムを先ず20mMのイミダゾールで洗浄してから、結合タンパク質またはタンパク質複合体を同バッファー中にて0.25Mのイミダゾールで溶出した。最終的な調製液をpH7.0の50mMHepesバッファーに透析した。次に、MOPSを用いる10NuPAGEビス-トリスポリアクリルアミドゲルか、酢酸ナトリウムをランニングバッファーインビトロジェンに用いる7SDS/トリスアセテートポリアクリルアミドゲルのいずれかにより、SDS-PAGEを実行した。続いてクマシーブリリアントブルーR-250でタンパク質を染色した。ChemiImager5500アルファイノテックAlphaInnotech、サンリアンドロ、カリフォルニアとソフトウェアAlphaEaseFCv4.0アルファイノテックを用い濃度測定を行うことによってタンパク質バンドの濃度を定量化した。三重らせんの性質を調べるため、精製されたerbscFv-Col1mg/mlを10mMDTTの非存在または存在下、37°Cで1時間インキュベートした。DDT処理サンプルのアリコートをさらに常温で50mMN-エチル-マレイミドNEMと30分間反応させて、遊離スルフヒドリル基および三量体の再編成を完全にブロックした。各サンプルからの等量のタンパク質を、酢酸ナトリウムをランニングバッファーとする7SDS/トリスアセテートポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。そのゲルをクマシーブルーで染色した。精製されたCSAは、ホモ三量体、または、マイルドな還元条件下で2つの三量体に解離可能な鎖間ジスルフィド結合六量体であることが発見された。erbscFv-Colの三量体構造の熱安定性を調べた。2M尿素含有50mMトリス-HClpH8.0中の精製されたerbscFv-Colを10mMトリス2-カルボキシエチルホスフィンTCEPの非存在または存在下常温で処理した。次いで、還元されたサンプルを常温下50mMNEMでアルキル化した。SDSローディングバッファーを混合する前に、等量のタンパク質を含む各サンプルを35、45、55、65、75および85°Cで10分間加熱した。そのサンプルを、非還元条件下、MOPSバッファーを用い10SDS/ビス-トリスポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。そのゲルをクマシーブルーで染色した。その結果、erbscFv-Col三量体が高い熱安定性を有することが示された。実際には、65°Cで10分間処理したのち、50を超える三量体が残っていた。また、erbscFv-Colのコラーゲン様ドメインの三量体構造は、プロリルのヒドロキシル化がなされていることもわかった。結合試験各種の型のerb抗体のEGFR-ECDに対する結合動態bindingkineticsを、ランニングバッファーHBpH7.4の10mMHEPES、150mMNaCl、3mMEDTA、0.005界面活性剤P20中で、BIAcoreXバイオセンサービアコア社BIACOREInc、ウプサラ、スウェーデンを用いて測定した。簡単に言うと、EGFR-ECDをアミンカップリングにより、レスポンス単位RUが1700程度となるまで、Clセンサーチップ上に固定化し、各種濃度で精製した抗体を流速10μl/分で注入した。pH3.5の10mMグリシン-HClを5μl注入することによってその表面を再生した。各濃度におけるセンサーグラムを得ると共に、プログラム、BIAEvaluation3.2を用いて評価した。結合データを1:1ラングミュア結合モデルでフィッティングし、解離速度kdiss/会合速度kassの比として定義される親和定数KDを計算した。その結果を以下の表2に示す。表2に示されるように、EGFR-ECDに対するerbscFvColの結合親和性は、二価erbscFv-Fcおよび一価mAbカウンターパートよりもそれぞれ約20倍および1000倍強かった。安定性および薬物動態アッセイ血清安定性アッセイでは、各種形態のerb抗体、erbscFvCol、erbscFv-FcまたはerbscFvの安定性を37°Cにてヒト血清でインキュベートすることにより測定した。各インキュベーション期間経過後に残った活性抗EGFRの量を定量的ELISAにより測定した。ELISAは、捕捉試薬としての組み換えEGFR-ECDと抗cmycmAb9E10、シグマケミカル社、続いて、HRPコンジュゲートアフィニティ精製ポリクローナルヤギ抗マウスIgGと化学発光基質ピアースバイオテクノロジー社PierceBiotechnologyIncを用いて行った。薬物動態アッセイでは、3匹のBALB/cヌードマウスを用いてerbscFv-Colのクリアランスを分析した。簡単に言うと、事前の採血prebleedを行ってから、各マウスに25μgのerbscFv-Colを皮下注射s.c.した。続く70時間の間に、定期的に血液サンプルを回収し、ELISAによってそれらのerbscFv-Colの含有量を評価した。タンパク質はきわめて安定しているということがわかった。T細胞増殖アッセイおよび混合リンパ球反応MLR5-ブロモ2-デオキシウリジン細胞増殖アッセイを行った。簡単に言うと、ヒト末梢血単核細胞PBMCを37°Cで66時間、10倍段階希釈したOKT3イーバイオサイエンス社eBioscienceIncまたはOLT3scFv-Colの存在下、ブラック96ウェル平底組織培養プレート中に2×105細胞/ウェルとなるように加えた10FBS含有100μlRPMI-1640培地にプレートした。次いでその細胞を10μMのBrdUにより5時間パルス処理した。培地を除去したのち、FixDenatによりワンステップで細胞の固定とDNAの変性を行った。その後、その細胞をペルオキシダーゼ標識抗BrdU抗体抗BrdUPOD、Fagフラグメントで1.5時間室温にてインキュベートした。マイクロプレートルミノメーターHidexCHAMELEONdetectionplatform、フィンランドを用いて化学発光検出および定量化を行った。一方向性混合リンパ球反応におけるT細胞増殖および免疫抑制を以下のようにして評価した。ヒトPBMCを2人の健康なドナーから採取した刺激および応答。刺激または応答細胞を、37°C、5のCO2を含んだ加湿空気中、完全培地10ヒトAB血清、2mMグルタミン、50nM2-メルカプトエタノール、ならびにそれぞれ100単位/mlのペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたRPMI1640にて25μg/mlのマイトマイシンCシグマ-アルドリッチで30分間処理してから、RPMI1640培地中で3回洗浄した。応答細胞を単独で、またはマイトマイシンC処理した刺激細胞もしくはマイトマイシンC応答細胞と1:1で混合し、2×105細胞/ウェルとして200μlの完全培地で培養した。応答細胞をプレートしたのち、精製したOKT3scFv-ColまたはOKT3を異なる濃度で培養物に速やかに加えた。5日後、培養細胞を10μMのBrdUでパルス処理し、24時間後に回収した。次いで、細胞増殖アッセイを上述の手法で行った。OKT3scFv-Colは、T細胞増殖の免疫抑制においてより効果が高く、かつ、T細胞増殖の刺激においては無視できる程度の細胞分裂促進活性を示すことが見出された。サイトカイン測定ヒトPBMCを、37°C、10倍段階希釈したOKT3またはOKT3scFv-Colの存在下、2×105細胞/ウェルとなるように、10FBS含有0.1mlRPMI-1640培地にプレートした。その上清を各時点で回収し、ヒトサイトカインイムノアッセイキットイーバイオサイエンス社を用いて多数のサイトカインを測定した。その結果、OKT3scFvColの投与は、マウスOKT3mAbに比較して、無視できる程度のサイトカイン放出しか生じさせないことが示された。抗体変位AntibodyDisplacementアッセイ下記する全ての手順は4°C下で行った。ヒトT細胞を1×106細胞/mlの密度でFCMバッファー2FBSおよび0.1アジ化ナトリウム含有リン酸緩衝食塩水に懸濁させた。その細胞をマウス総IgG2μg/ml、ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズで30分処理してから、段階希釈したOKT3scFv-ColまたはOKT3抗体で1時間インキュベートした。固定した、飽和量フローサイトメトリーにより判断のFITCコンジュゲートOKT30.25μg/ml、イーバイオサイエンス社より購入を直接加えた。1時間のインキュベーション後、その細胞をFCMバッファーで洗浄し、FACScanベクトンデッキンソン、サンジョゼ、カリフォルニアを用いフローサイトメトリー法により免疫発光解析を行った。そのデータを、遮断抗体の非存在下OKT3-FITCでT細胞を染色することにより得た平均蛍光強度として定義される最大蛍光強度の抑制率として表した。その結果、OKT3scFvColが、天然マウスOKT3mAbよりも、強力にヒトCD3T細胞に結合することがわかった。ヒトIgGを標準として、Bradfordアッセイピアースバイオテクノロジー社製、クーマシープラス試薬Coomassieplusreagentによりタンパク質濃度を測定した。アミノ酸分析については、精製したerbscFv-Colを50mM酢酸に透析し、110°Cで24時間、6NのHCl中で加水分解し、WatersPicoTag登録商標システムでアミノ酸分析を行った。これら結果によって、コラーゲン足場抗体が、抗腫瘍および免疫調節いずれの用途においても治療抗体設計に理想的な構造であるということが示される。本明細書に開示されたすべての特徴は、どのような組合せにも組み合わせることができる。本明細書に開示された各特徴は、同一、均等、または類似の目的を果たす他の特徴で置き換えられてもよい。したがって、特に明示する場合を除いては、開示された各特徴は、単に、包括的な一連の均等または同様の特徴の例に過ぎない。上述の記載から、当業者は、本発明の主要な特徴を容易に確認することができると共に、その精神と範囲を逸脱することなく、各種使用および条件に適合するように本発明をさまざまに変更および修飾することができる。よって、その他の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。"