"水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、前記水溶性ポリマーが、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、四酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、前記オキシム連結形成が、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される、方法。水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分に複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、前記治療用タンパク質が、第IX因子FIX、第VIII因子FVIII、第VIIa因子FVIIa、フォンヴィレブランド因子VWF、第FV因子FV、第X因子FX、第XI因子FXI、第XII因子FXII、トロンビンFII、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子TF、ADAMTS13プロテアーゼ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、コロニー刺激因子-1CSF-1、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、EPO、インターフェロンαIFN-α、コンセンサスインターフェロン、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、トロンボポエチンTPO、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1ANGPTL1、アンジオポエチン様ポリペプチド2ANGPTL2、アンジオポエチン様ポリペプチド3ANGPTL3、アンジオポエチン様ポリペプチド4ANGPTL4、アンジオポエチン様ポリペプチド5ANGPTL5、アンジオポエチン様ポリペプチド6ANGPTL6、アンジオポエチン様ポリペプチド7ANGPTL7、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子VEGF、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン-1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、オンコスタチンMOSM、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子SCF、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子TSLP、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質PUP、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラアダリムマブ、Proliaデノスマブ、Enbrelエタネルセプト、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、前記水溶性ポリマーが活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、四酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、前記オキシム連結中、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって形成が触媒される、方法。約0.3mg/mL~約3.0mg/mLの初期濃度の前記治療用タンパク質を含む溶液が、前記活性化水溶性ポリマーと接触させる前に、pH値が約5.0~約8.0になるように調整される、請求項2に記載の方法。前記治療用タンパク質の前記初期濃度が、約1.0mg/mLであり、前記pHが、約6.0である、請求項3に記載の方法。前記治療用タンパク質が、所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーによって接触され、前記過剰濃度が、約1モル~約300モル過剰である、請求項2に記載の方法。前記過剰濃度が、約50倍のモル過剰である、請求項5に記載の方法。前記治療用タンパク質が、約0.5時間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、前記活性化水溶性ポリマーとともにインキュベートされる、請求項5に記載の方法。前記条件が、約120分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、請求項7に記載の方法。前記求核触媒が、約0.1分~約30分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1.0mM~約50mMの求核触媒の最終濃度をもたらす量で添加される、請求項2に記載の方法。前記求核触媒の前記最終濃度が、約10mMであり、前記条件が、最大約15分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、請求項9に記載の方法。前記酸化剤が、約0.1分~120分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約50μM~約1000μMの酸化剤の最終濃度をもたらす量で添加される、請求項2に記載の方法。前記酸化剤の最終濃度が、約400μMであり、前記条件が、約10分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、請求項11に記載の方法。前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分への前記水溶性ポリマーの前記複合化が、L-システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウムNa2S2O5、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、前記反応停止剤が、約5分~約120分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM~約100mMの反応停止剤の最終濃度をもたらす量で添加される、請求項2に記載の方法。前記反応停止剤が、L-システインである、請求項13に記載の方法。前記L-システインが、約10mMの最終濃度をもたらすように添加され、前記条件が、約60分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、請求項14に記載の方法。apH値が約5.0~約8.0になるように、前記治療用タンパク質を含む溶液の前記pH値を調整させることを含み、前記治療用タンパク質濃度が、約0.3mg/mL~約3.0mg/mLである、第1のステップと、b前記治療用タンパク質において、1つ以上の炭水化物を酸化させることを含み、前記酸化剤が、約0.1分~約120分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約50μM~約1000μMの最終濃度をもたらすように、前記第1のステップ中の前記溶液に添加される、第2のステップと、c所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーと前記治療用タンパク質を接触させることを含み、前記過剰濃度が、約1モル過剰~約300モル過剰であり、約0.5時間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下である、第3のステップと、d前記第3のステップの前記溶液に、求核触媒を添加することを含み、前記求核触媒が、約0.1分~約30分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM~約50mMの最終濃度をもたらすように添加される、第4のステップと、e前記治療用タンパク質が、前記治療用タンパク質の1つ以上の酸化炭水化物への前記活性化水溶性ポリマーの前記複合化を可能にする条件下で、前記活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともにインキュベートされ、前記条件が、約0.5時間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、第5のステップと、f第5のステップ中の前記治療用タンパク質の前記1つ以上の酸化炭水化物への前記水溶性ポリマーの前記共役が、L-システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、Na2S2O5メタ重亜硫酸ナトリウム、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、前記反応停止剤が、約5分~約120分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM~約100mMの最終濃度をもたらすように添加される、第6のステップと、を含む、請求項2に記載の方法。前記第1のステップ中の前記治療用タンパク質の前記初期濃度が、約1mg/mLであり、前記pHが、約6.0であり、前記第2のステップ中の前記酸化剤の最終濃度が、約400μMであり、前記第5のステップ中の前記条件が、約10分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、前記第3のステップ中の前記過剰濃度が、約50モル過剰であり、前記第3のステップ中の前記条件が、約15分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、前記第4のステップ中の前記求核触媒の前記最終濃度が、約10mMであり、前記第4のステップ中の前記条件が、約15分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、前記第5のステップ中の前記活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともに前記治療用タンパク質をインキュベートする条件が、約2時間の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、前記第6のステップ中の前記反応停止剤が、L-システインであり、前記L-システインが、約10mMの最終濃度をもたらすように添加され、前記第6のステップ中の前記条件が、約60分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、請求項16に記載の方法。前記水溶性ポリマーがPSAである、請求項2に記載の方法。前記水溶性ポリマーがPEGである、請求項2に記載の方法。前記水溶性ポリマーがHESである、請求項2に記載の方法。前記水溶性ポリマーが、HASである、請求項2に記載の方法。前記PSAが約10~300個のシアル酸単位からなる、請求項18に記載の方法。前記治療用タンパク質がFIXである、請求項2~22のいずれか1項に記載の方法。前記治療用タンパク質がFVIIaである、請求項2~22のいずれか1項に記載の方法。前記治療用タンパク質がFVIIIである、請求項2~22のいずれか1項に記載の方法。前記酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4である、請求項2~25のいずれか1項に記載の方法。前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分が、前記血液凝固タンパク質の活性化ペプチド内に位置する、請求項23~25のいずれか1項に記載の方法。前記PSAが、活性化アミノオキシリンカーを、酸化PSAと反応させることによって、調製され、前記アミノオキシリンカーが、a式:の3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンリンカー、b式:の3,6,9-トリオキサ-ウンデカン-1,11-ジオキシアミンリンカー、およびc式:の3,6,9,12,15-ペナトキサpenatoxa-ヘプタデカン-1,17-ジオキシアミンリンカーからなる群より選択され、前記PSAが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、前記PSAの非還元末端において、末端アルデヒド基を形成する、請求項18に記載の方法。前記アミノオキシリンカーが、3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンである、請求項28に記載の方法。前記酸化剤が、NaIO4である、請求項1~29のいずれか1項に記載の方法。前記求核触媒が、約1mM~約50mMの濃度で提供される、請求項1~30のいずれか1項に記載の方法。前記求核触媒が、m-トルイジンである、請求項31に記載の方法。前記m-トルイジンが、約10mMの濃度で、複合化反応において存在する、請求項32に記載の方法。シアノホウ化水素ナトリウムNaCNBH3、アスコルビン酸ビタミンC、およびNaBH3からなる群から選択される還元化合物を含む緩衝液中で前記複合化された治療用タンパク質をインキュベートすることによって、前記複合化された治療用タンパク質中のオキシム連結を還元するステップを更に含む、請求項1~33のいずれか1項に記載の方法。前記還元化合物が、シアノホウ化水素ナトリウムNaCNBH3である、請求項34に記載の方法。前記複合化された治療用タンパク質を精製するステップを更に含む、請求項1~35のいずれか1項に記載の方法。前記複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって精製される、請求項36に記載の方法。前記クロマトグラフィが、疎水性相互作用クロマトグラフィHIC、イオン交換クロマトグラフィIEC、サイズ排除クロマトグラフィSEC、親和性クロマトグラフィ、および逆相クロマトグラフィからなる群から選択される、請求項37に記載の方法。抗カオトロピック塩が、クロマトグラフィの負荷ステップおよびクロマトグラフィの洗浄ステップにおいて使用される、請求項38に記載の方法。前記クロマトグラフィが、カラムにおいて行われる、請求項38に記載の方法。前記カラムが、フェニル-セファロースFFおよびブチル-セファロースFFからなる群から選択されるクロマトグラフィ樹脂を含む、請求項40に記載の方法。前記樹脂が、約5cm~約20cmの床高さでカラム中に存在する、請求項41に記載の方法。前記床高さが、約10cmである、請求項42に記載の方法。流れ方向が、上向流に設定され、前記流速が、約0.2cm/分~約6.7cm/分である、1つ以上の洗浄ステップを含む、請求項40に記載の方法。前記流速が、約2cm/分である、請求項44に記載の方法。流れ方向が、下向流に設定され、前記流速が、約0.1cm/分~約6.7cm/分である、1つ以上の溶出ステップを含む、請求項40~45のいずれか1項に記載の方法。前記流速が、約1cm/分である、請求項46に記載の方法。限外濾過/透析濾過UF/DFによって、前記複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、請求項36~47のいずれか1項に記載の方法。前記治療用タンパク質の前記最終濃度が、約0.5~約3mg/mLである、請求項36~48のいずれか1項に記載の方法。前記治療用タンパク質が、約5~約11個の水溶性ポリマー部分を含む、請求項36~49のいずれか1項に記載の方法。前記複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィを用いて精製され、抗カオトロピック塩が、負荷ステップおよび洗浄ステップにおいて使用され、前記方法が、流れ方向が、上向流に設定され、前記流速が、約0.2cm/分~約6.7cm/分である、1つ以上の洗浄ステップと、流れ方向が、下向流に設定され、前記流速が、約0.2cm/分~約6.7cm/分である、1つ以上の溶出ステップと、を含み、限外濾過/透析濾過UF/DFによって、前記複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、請求項2に記載の方法。前記クロマトグラフィが、疎水性相互作用クロマトグラフィHICであり、前記1つ以上の洗浄ステップの流速が、約2cm/分であり、前記1つ以上の溶出ステップの流速が、約1cm/分である、請求項51に記載の方法。請求項1~52のいずれか1項に記載の方法によって産生される、修飾された治療用タンパク質。治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結の形成方法であって、a過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、四酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、b前記オキシム連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結を形成するステップであって、活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、前記求核触媒が、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される、オキシム連結を形成するステップと、を含む、方法。治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結の形成方法であって、a過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、四酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、b前記オキシム連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分と、活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結を形成するステップであって、前記治療用タンパク質が、第IX因子FIX、第VIII因子FVIII、第VIIa因子FVIIa、フォンヴィレブランド因子VWF、第FV因子FV、第X因子FX、第XI因子FXI、第XII因子FXII、トロンビンFII、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子TF、ADAMTS13プロテアーゼ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、コロニー刺激因子-1CSF-1、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、EPO、インターフェロンαIFN-α、コンセンサスインターフェロン、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、トロンボポエチンTPO、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1ANGPTL1、アンジオポエチン様ポリペプチド2ANGPTL2、アンジオポエチン様ポリペプチド3ANGPTL3、アンジオポエチン様ポリペプチド4ANGPTL4、アンジオポエチン様ポリペプチド5ANGPTL5、アンジオポエチン様ポリペプチド6ANGPTL6、アンジオポエチン様ポリペプチド7ANGPTL7、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子VEGF、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン-1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、オンコスタチンMOSM、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子SCF、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子TSLP、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質PUP、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラアダリムマブ、Proliaデノスマブ、Enbrelエタネルセプト、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、前記求核触媒が、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される、オキシム連結を形成するステップと、を含む、方法。治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結の形成方法であって、a過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、四酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、b前記ヒドラゾン連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する前記活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結を形成するステップであって、活性ヒドラジド基を含有する前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、前記求核触媒が、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される、ヒドラゾン連結を形成するステップと、を含む、方法。治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結の形成方法であって、a過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、四酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、b前記ヒドラゾン連結本発明は、タンパク質にポリマーを複合化させるための物質および方法を提供し、それは種々の試薬に関連する費用を最小限に抑え、患者の受容者への健康上のリスクを最小限に抑えつつ、タンパク質の薬力学的および/または薬物動態特性を改善する。本発明の種々の実施形態において、アニリンの代わりに使用するための代替的な触媒が提供される。一実施形態において、水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分に複合化させる方法が提供され、本方法は、複合化を可能にする条件下で、酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、水溶性ポリマーは、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、該炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、四酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、オキシム連結が、酸化炭水化物部分と水溶性ポリマー上の活性アミノオキシ基との間に形成され、前記オキシム連結の形成が、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される。別の実施形態において、水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分に複合化させる方法が提供され、本方法は、複合化を可能にする条件下で、酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、該治療用タンパク質は、第IX因子FIX、第VIII因子FVIII、第VIIa因子FVIIa、フォンヴィレブランド因子VWF、第FV因子FV、第X因子FX、第XI因子FXI、第XII因子FXII、トロンビンFII、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子TF、ADAMTS13プロテアーゼ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、コロニー刺激因子-1CSF-1、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、EPO、インターフェロンαIFN-α、コンセンサスインターフェロン、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、トロンボポエチンTPO、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1ANGPTL1、アンジオポエチン様ポリペプチド2ANGPTL2、アンジオポエチン様ポリペプチド3ANGPTL3、アンジオポエチン様ポリペプチド4ANGPTL4、アンジオポエチン様ポリペプチド5ANGPTL5、アンジオポエチン様ポリペプチド6ANGPTL6、アンジオポエチン様ポリペプチド7ANGPTL7、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子VEGF、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン-1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、オンコスタチンMOSM、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子SCF、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子TSLP、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質PUP、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラアダリムマブ、Proliaデノスマブ、Enbrelエタネルセプト、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、水溶性ポリマーは、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、該炭水化物部分は、過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、四酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、オキシム連結が、酸化炭水化物部分と水溶性ポリマー上の活性アミノオキシ基との間に形成され、前記オキシム連結の形成は、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される。更に別の実施形態において、活性化水溶性ポリマーと接触させる前に、約0.3mg/mL~約3.0mg/mLの初期濃度の治療用タンパク質を含む溶液が、pH値が約5.0~約8.0になるように調整される、上述の方法が提供される。本明細書で使用される約という用語は、所与の値を上回るまたは下回る値を意味する。種々の実施形態において、約という用語は、所与の値の0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10をプラスまたはマイナスした所与の値を含む。また別の実施形態において、治療用タンパク質の初期濃度は約1.0mg/mLであり、pHは約6.0である、上述の方法が提供される。関連した実施形態において、治療用タンパク質の初期濃度は約0.75mg/mLであり、pHは約6.0である。また別の関連した実施形態において、治療用タンパク質の初期濃度は約1.25mg/mLであり、pHは約6.0である。別の実施形態において、治療用タンパク質は所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーによって接触され、過剰濃度は約1モル~約300モル過剰である、上述の方法が提供される。別の実施形態において、過剰濃度は約50倍のモル過剰である。更に別の実施形態において、治療用タンパク質は、約0.5時間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、活性化水溶性ポリマーとともにインキュベートされる、上述の方法が提供される。別の実施形態において、該条件は、約120分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。本明細書で使用される撹拌という用語は、一般に使用される実験または製造装置および製品によって様々な速度および強度で撹拌する例えば、穏やかに撹拌することを含むことを意味する。別の実施形態において、求核触媒が、約0.1分~約30分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1.0mM~約50mMの求核触媒の最終濃度をもたらす量で添加される、上述の方法が提供される。別の実施形態において、求核触媒の最終濃度は約10mMであり、該条件は、約15分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。更に別の実施形態において、酸化剤は、約0.1分~120分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約50μM~約1000μMの酸化剤の最終濃度をもたらす量で添加される、上述の方法が提供される。別の実施形態において、酸化剤の最終濃度は、約400μMであり、該条件は、約10分の期間、約22oCの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。また別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分への水溶性ポリマーの複合化が、L-システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウムNa2S2O5、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、該反応停止剤が、約5分~約120分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM~約100mMの反応停止剤の最終濃度をもたらす量で添加される、上述の方法が提供される。別の実施形態において、反応停止剤は、L-システインである。更に別の実施形態において、L-システインは、約10mMの最終濃度をもたらすように添加され、該条件は、約60分の期間、約22oCの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。別の実施形態において、apH値が約5.0~約8.0になるように、治療用タンパク質を含む溶液のpH値を調整させることを含み、治療用タンパク質濃度が約0.3mg/mL~約3.0mg/mLである、第1のステップと、b治療用タンパク質において、1つ以上の炭水化物を酸化させることを含み、酸化剤が、約0.1分~約120分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約50μM~約1000μMの最終濃度をもたらすように、第1のステップ中の溶液に添加される、第2のステップと、c所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーと治療用タンパク質を接触させることを含み、過剰濃度が約1モル過剰~約300モル過剰であり、約0.5時間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下である、第3のステップと、d第3のステップの溶液に、求核触媒を添加することを含み、求核触媒が、約0.1分~約30分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM~約50mMの最終濃度をもたらすように添加される、第4のステップと、e治療用タンパク質が、治療用タンパク質の1つ以上の酸化炭水化物への活性化水溶性ポリマーの複合化を可能にする条件下で、活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともにインキュベートされ、該条件が、約0.5時間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、第5のステップと、f第5のステップ中の治療用タンパク質の1つ以上の酸化炭水化物への水溶性ポリマーの複合化が、L-システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、Na2S2O5メタ重亜硫酸ナトリウム、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、反応停止剤が、約5分~約120分の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM~約100mMの最終濃度をもたらすように添加される、第6のステップと、を含む、上述の方法が提供される。別の実施形態において、第1のステップ中の治療用タンパク質の初期濃度が約1mg/mLであり、pHが約6.0であり、第2のステップ中の酸化剤の最終濃度が約400μMであり、第5のステップ中の条件が、約10分の期間、約22oCの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第3のステップ中の過剰濃度が約50モル過剰であり、第3のステップ中の条件が、約15分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第4のステップ中の求核触媒の最終濃度が約10mMであり、第4のステップ中の条件が、約15分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第5のステップ中の活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともに治療用タンパク質をインキュベートする条件が、約2時間の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第6のステップ中の反応停止剤がL-システインであり、L-システインが約10mMの最終濃度をもたらすように添加され、第6のステップ中の条件が、約60分の期間、約22°Cの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。別の実施形態において、水溶性ポリマーはPSAである、上述の方法が提供される。別の実施形態において、PSAは約10~300個のシアル酸単位からなる。別の実施形態において、水溶性ポリマーはPEGである。別の実施形態において、水溶性ポリマーはHESである。更に別の実施形態において、水溶性ポリマーはHASである。更に別の実施形態において、治療用タンパク質はFIXである、上述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用タンパク質はFVIIaである。別の実施形態において、治療用タンパク質はFVIIIである。また別の実施形態において、酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4である、上述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分は血液凝固タンパク質の活性化ペプチド内に位置する、上述の方法が提供される。一実施形態において、PSAが、活性化アミノオキシリンカーを酸化PSAと反応させることによって調製される、上述の方法が提供され、該アミノオキシリンカーが、a式:の3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンリンカー、b式:の3,6,9-トリオキサ-ウンデカン-1,11-ジオキシアミンリンカー、およびc式:の3,6,9,12,15-ペナトキサpenatoxa-ヘプタデカン-1,17-ジオキシアミンリンカーからなる群より選択され、PSAが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、PSAの非還元末端において末端アルデヒド基を形成する。関連した実施形態において、アミノオキシリンカーは3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンである。更に別の実施形態において、酸化剤はNaIO4である、上述の方法が提供される。別の実施形態において、求核触媒は約1mM~約50mMである、上述の方法が提供される。一実施形態において、求核触媒はm-トルイジンである。更に別の実施形態において、m-トルイジンは、約10mMの濃度で、複合化反応物において存在する。また別の実施形態において、シアノホウ化水素ナトリウムNaCNBH3、アスコルビン酸ビタミンC、およびNaBH3からなる群から選択される還元化合物を含む緩衝液中で複合化された治療用タンパク質をインキュベートすることによって複合化された治療用タンパク質中のオキシム連結を還元するステップを更に含む、上述の方法が提供される。一実施形態において、還元化合物はシアノホウ化水素ナトリウムNaCNBH3である。更に別の実施形態において、複合化された治療用タンパク質を精製するステップを更に含む、上述の方法が提供される。別の実施形態において、複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって精製される。別の実施形態において、クロマトグラフィは疎水性相互作用クロマトグラフィHIC、イオン交換クロマトグラフィIEC、サイズ排除クロマトグラフィSEC、親和性クロマトグラフィ、および逆相クロマトグラフィからなる群から選択される。更に別の実施形態において、抗カオトロピック塩が、クロマトグラフィの負荷ステップおよびクロマトグラフィの洗浄ステップにおいて使用される。また別の実施形態において、クロマトグラフィはカラムにおいて行われる。別の実施形態において、カラムはフェニル-セファロースFFおよびブチル-セファロースFFからなる群から選択されるクロマトグラフィ樹脂を含む。別の実施形態において、樹脂は約5cm~約20cmの床高さでカラム中に存在する。一実施形態において、床高さは約10cmである。別の実施形態において、流れ方向が上向流に設定され、流速が約0.2cm/分~約6.7cm/分である、1つ以上の洗浄ステップを含む、上述の方法が提供される。本明細書で使用される下向流という用語は、クロマトグラフィカラムの上部からクロマトグラフィカラムの底部への流れ方向正常な流れ方向/標準モードを指す。本明細書で使用される上向流という用語は、カラムの底部から上部への流れ方向逆の流れ方向を指す。一実施形態において、流速は約2cm/分である。別の実施形態において、流れ方向が下向流に設定され、流速が約0.1cm/分~約6.7cm/分である、1つ以上の溶出ステップを含む、上述の方法が提供される。関連した実施形態において、流速は約1cm/分である。更に別の実施形態において、限外濾過/透析濾過UF/DFによって複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを含む、上述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用タンパク質の最終濃度は約0.5~約3mg/mLである。別の実施形態において、治療用タンパク質は約5~約11個の水溶性ポリマー部分を含む、上述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用タンパク質は約1~約3個の水溶性ポリマーを含む。更に別の実施形態において、複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィを用いて精製され、抗カオトロピック塩が、負荷ステップおよび洗浄ステップにおいて使用され、本方法は、流れ方向が上向流に設定され、流速が約0.2cm/分~約6.7cm/分である、1つ以上の洗浄ステップと、流れ方向が下向流に設定され、流速が約0.2cm/分~約6.7cm/分である、1つ以上の溶出ステップと、を含み、限外濾過/透析濾過UF/DFによって複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、上述の方法が提供される。別の実施形態において、クロマトグラフィが疎水性相互作用クロマトグラフィHICであり、1つ以上の洗浄ステップの流速が約2cm/分であり、1つ以上の溶出ステップの流速が約1cm/分である。別の実施形態において、上述の方法のいずれかによって産生される、修飾された治療用タンパク質が提供される。更に別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結の形成方法が提供され、本方法は、a過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、四酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤とともに該タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、b該オキシム連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結を形成するステップであって、活性アミノオキシ基を含有する該水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、該求核触媒が、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される、オキシム連結を形成するステップと、を含む。また別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結の形成方法が提供され、本方法は、a過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、四酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤とともにタンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、b該オキシム連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結を形成するステップであって、治療用タンパク質が、第IX因子FIX、第VIII因子FVIII、第VIIa因子FVIIa、フォンヴィレブランド因子VWF、第FV因子FV、第X因子FX、第XI因子FXI、第XII因子FXII、トロンビンFII、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子TF、ADAMTS13プロテアーゼ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、コロニー刺激因子-1CSF-1、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、EPO、インターフェロンαIFN-α、コンセンサスインターフェロン、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、トロンボポエチンTPO、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1ANGPTL1、アンジオポエチン様ポリペプチド2ANGPTL2、アンジオポエチン様ポリペプチド3ANGPTL3、アンジオポエチン様ポリペプチド4ANGPTL4、アンジオポエチン様ポリペプチド5ANGPTL5、アンジオポエチン様ポリペプチド6ANGPTL6、アンジオポエチン様ポリペプチド7ANGPTL7、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子VEGF、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン-1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、オンコスタチンMOSM、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子SCF、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子TSLP、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質PUP、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラアダリムマブ、Proliaデノスマブ、Enbrelエタネルセプト、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、活性アミノオキシ基を含有する該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、求核触媒が、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される、オキシム連結を形成するステップと、を含む。また別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結の形成方法が提供され、本方法は、a過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤を用いて該タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、bヒドラゾン連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間の該ヒドラゾン連結を形成するステップであって、活性ヒドラジド基を含有する該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、該求核触媒が、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される、ヒドラゾン連結を形成するステップと、を含む。また別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結の形成方法であって、本方法は、a過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4、四酢酸鉛PbOAc4、および過ルテニウム酸カリウムKRuO4からなる群から選択される酸化剤とともにタンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、bヒドラゾン連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間の該ヒドラゾン連結を形成するステップであって、治療用タンパク質が、第IX因子FIX、第VIII因子FVIII、第VIIa因子FVIIa、フォンヴィレブランド因子VWF、第FV因子FV、第X因子FX、第XI因子FXI、第XII因子FXII、トロンビンFII、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子TF、ADAMTS13プロテアーゼ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、コロニー刺激因子-1CSF-1、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、EPO、インターフェロンαIFN-α、コンセンサスインターフェロン、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、トロンボポエチンTPO、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1ANGPTL1、アンジオポエチン様ポリペプチド2ANGPTL2、アンジオポエチン様ポリペプチド3ANGPTL3、アンジオポエチン様ポリペプチド4ANGPTL4、アンジオポエチン様ポリペプチド5ANGPTL5、アンジオポエチン様ポリペプチド6ANGPTL6、アンジオポエチン様ポリペプチド7ANGPTL7、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子VEGF、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン-1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、オンコスタチンMOSM、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子SCF、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子TSLP、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質PUP、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラアダリムマブ、Proliaデノスマブ、Enbrelエタネルセプト、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、活性ヒドラジド基を含有する該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、求核触媒が、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される、ヒドラゾン連結を形成するステップと、を含む。別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーが、約1分間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む活性化アミノオキシリンカーとともに、酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、bクロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、上述の方法が提供される。一実施形態において、活性化水溶性ポリマーという用語は、アルデヒド基を含有する水溶性ポリマーを指す。また別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーが、a約1分間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む活性化アミノオキシリンカーとともに、酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、b約1分間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したアルコキサミン連結の形成を可能にする条件下で、還元剤とともに、ステップaの活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、cクロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、上述の方法が提供される。更に別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーが、a約1分間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む活性化アミノオキシリンカーとともに、酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、b約1分間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したアルコキサミン連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒とともに、ステップaの活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、cクロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、上述の方法が提供される。また別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーが、a約1分間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む活性化アミノオキシリンカーとともに、酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、b約1分間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、求核触媒とともに、ステップaの活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、c約1分間~約24時間の期間、約2°C~約37°Cの温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したアルコキサミン連結の形成を可能にする条件下で、還元剤とともに、ステップbの活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、dクロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、上述の方法が提供される。別の実施形態において、酸化水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、PolyPEG登録商標WarwickEffectPolymers、Coventry,UK、ポリシアル酸PSA、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCからなる群から選択され、該水溶性ポリマーが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、該水溶性ポリマーの非還元末端において、末端アルデヒド基を形成する、上述の方法が提供される。一実施形態において、水溶性ポリマーはPSAである。別の実施形態において、酸化剤はNaIO4である、上述の方法が提供される。更に別の実施形態において、アミノオキシリンカーが、a式:の3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンリンカー、b式:の3,6,9-トリオキサ-ウンデカン-1,11-ジオキシアミンリンカー、およびc式:の3,6,9,12,15-ペナトキサpenatoxa-ヘプタデカン-1,17-ジオキシアミンリンカーからなる群から選択される、上述の方法が提供される。また別の実施形態において、還元剤が、シアノホウ化水素ナトリウムNaCNBH3、アスコルビン酸ビタミンC、およびNaBH3からなる群から選択される、上述の方法が提供される。一実施形態において、還元剤はシアノホウ化水素ナトリウムNaCNBH3である。別の実施形態において、求核触媒が、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンからなる群から選択される、上述の方法が提供される。一実施形態において、求核触媒はm-トルイジンである。別の実施形態において、求核触媒は約1.0mM~約50mMの求核触媒の最終濃度をもたらす量で添加される。別の実施形態において、限外濾過/透析濾過UF/DFによって複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、上述の方法が提供される。治療用タンパク質の薬理学的および免疫学的特性は、化学修飾、およびポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、ポリシアル酸PSA、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPC等のポリマー化合物との複合化によって改善することができる。得られる複合体の特性は、一般に、ポリマーの構造および大きさに強く左右される。したがって、画定された狭い大きさの分布を有するポリマーが、通常、当該技術分野において好ましいとされる。PEG等の合成ポリマーは、狭い大きさの分布で容易に製造することができ、一方、PSAは、狭い大きさの分布を有する最終PSA調製をもたらすような様式で精製することができる。加えて、画定されたポリマー鎖および狭い大きさの分布を有するPEG化試薬は、市場に出回っており、手頃な価格で市販されている。ポリシアル化等を介する可溶性ポリマーの添加は、血液凝固タンパク質FIX、ならびに他の凝固タンパク質例えば、VWF、FVIIa例えば、米国特許第2008/0221032A1号参照によって本明細書に組み込まれるを参照およびFVIII等等の治療用タンパク質の特性を改善するための1つの方法である。治療用タンパク質本発明のある実施形態において、上述のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの典型的なものは以下の治療用タンパク質である:酵素、抗原、抗体、受容体、血液凝固タンパク質、増殖因子、ホルモン、およびリガンド。ある実施形態において、治療用タンパク質は、第IX因子FIX、第VIII因子FVIII、第VIIa因子FVIIa、フォンヴィレブランド因子VWF、第FV因子FV、第X因子FX、第XI因子FXI、第XII因子FXII、トロンビンFII、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子TF、およびADAMTS13プロテアーゼ等の血液凝固タンパク質である。一実施形態において、本発明による治療用タンパク質は糖タンパク質であるか、または様々な実施形態において、インビボで自然にグリコシル化されないタンパク質即ち、天然にグリコシル化部位を含有しないタンパク質か、または精製前に宿主細胞中においてグリコシル化されないタンパク質である。ある実施形態において、治療用タンパク質は、免疫グロブリン、サイトカイン、例えばIL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、コロニー刺激因子-1CSF-1、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、EPO、インターフェロンαIFN-α、コンセンサスインターフェロン、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、トロンボポエチンTPO、例えばAng-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y等のアンジオポエチン、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチドANGPTL1~7、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子VEGF、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン-1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、オンコスタチンMOSM、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子SCF、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子TSLP、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、血管内皮増殖因子、ならびにそれらのキメラタンパク質および生物学的もしくは免疫学的に活性なフラグメントである。ある実施形態において、治療用タンパク質は、α-、β-、およびγ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質PUP、インスリン、レクチンおよびリシン等の植物タンパク質、腫瘍壊死因子および関連対立遺伝子、腫瘍壊死因子受容体の可溶性形態、インターロイキン受容体および可溶性形態のインターロイキン受容体、増殖因子、例えばTGFαまたはTGFβおよび上皮増殖因子のような組織増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、および免疫グロブリン、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、ガラクトシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、コルチコステロイド、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、DNase、インテグリン、トロンビン、造血成長因子、レプチン、グリコシダーゼ、ヒュミラアダリムマブ、Proliaデノスマブ、Enbrelエタネルセプト、ならびにそれらのフラグメント、または上記のタンパク質もしくはそれらのフラグメントのいずれかを含む任意の融合タンパク質である。上記のタンパク質に加えて、下表1は、本発明によって企図される治療用タンパク質を提供する。本明細書に提供される治療用タンパク質は、排他的であると考えられるべきではない。むしろ、本明細書に提供される開示から明白であるように、本発明の方法は、本発明に従って水溶性ポリマーの付着が望ましい任意のタンパク質に適用可能である。例えば、治療用タンパク質は、米国特許第2007/0026485号に記載され、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。血液凝固タンパク質一態様では、本発明の出発物質は、血液凝固タンパク質であり、これは、米国特許第4,757,006号、米国特許第5,733,873号、米国特許第5,198,349号、米国特許第5,250,421号、米国特許第5,919,766号、欧州特許第306968号に説明されるように、ヒト血漿に由来され得るか、または組換え体操作技術によって産生され得る。第IX因子FIX、第VIII因子FVIII、第VIIa因子FVIIa、フォンヴィレブランド因子VWF、第FV因子FV、第X因子FX、第XI因子FXI、第XII因子FXII、トロンビンFII、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子TF、およびADAMTS13プロテアーゼを含む血液凝固タンパク質等の治療的ポリペプチドは、タンパク質分解酵素によって急速に分解され、酵素によって中和される。これは、それらの半減期および循環時間を低下させ、それによってその治療効果を制限する。これらの凝固タンパク質の所望の治療効果または予防効果を達成し、かつ維持するには、比較的に高い投与量および頻繁な投与が必要である。結果として、適切な投与量の調節を得るのは困難であり、頻繁な静脈内投与を必要とするために、患者の生活様式を制限する。本明細書で説明されるように、第IX因子FIX、第VIII因子FVIII、第VIIa因子FVIIa、フォンヴィレブランド因子VWF、第FV因子FV、第X因子FX、第XI因子、第XII因子FXII、トロンビンFII、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子TF、およびADAMTS13プロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない、血液凝固タンパク質が、本発明によって企図される。本明細書で使用される血液凝固タンパク質という用語は、任意の第IX因子FIX、第VIII因子FVIII、第VIIa因子FVIIa、フォンヴィレブランド因子VWF、第FV因子FV、第X因子FX、第XII因子FXII、トロンビンFII、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子TF、およびADAMTS13プロテアーゼを指し、それらは特定の天然血液凝固タンパク質に関連する、生物学的活性を呈する。血液凝固カスケードは、3つの異なるセグメント、即ち、内因性、外因性、および一般的経路に分割されるSchenoneetal.,CurrOpinHematol.2004;11:272-7。カスケードには、一連のセリンプロテアーゼ酵素チモーゲンおよびタンパク質補因子が関与する。必要なとき、不活性キモーゼン前駆体が活性形態に変換され、それは、その後、カスケード中の次の酵素を変換する。内因性経路は、凝固因子VIII、IX、X、XI、およびXIIを必要とする。内因性経路の開始は、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン、第XI因子FXI、および第XII因子FXIIが負荷電された表面に暴露されるときに生じる。血小板から分泌されるカルシウム鉄およびリン脂質も必要とされる。外因性経路は、血管の血管腔が損傷されたときに開始される。膜糖タンパク質組織因子が暴露され、次いで、循環因子VIIFVIIに、次いで既存の少量のその活性型FVIIaに結合する。この結合は、FVIIaへのFVIIの完全な変換を促進し、続いてカルシウムおよびリン脂質の存在下で、第IX因子FIXの第IXa因子FIXaへの変換、および第X因子FXの第Xa因子FXaへの変換を促進する。組織因子とのFVIIaの会合は、基質FIXおよびFXのためのFVIIの結合部位を接近させることによって、および構造変化を誘発させて、FVIIaの酵素活性を増進することにより、タンパク質分解活性を増進させる。FXの活性化は、2つの経路の共有点である。リン脂質およびカルシウムとともに、第Va因子FVaおよび第Xa因子は、プロトロンビンをトロンビンに変換させプロトロンビナーゼ複合体、それは、次いで、フィブリノゲンを開裂して、フィブリンモノマーを形成する。モノマーは、重合してフィブリン鎖を形成する。第XIIIa因子FXIIIaは、これらの鎖を互いに共有結合させて、剛性のメッシュを形成する。FVIIのFVIIaへの変換もまた、トロンビン、FIXa、FXa、第XIa因子FXIa、および第XIIa因子FXIIaを含む、多くのプロテアーゼによって触媒される。カスケードの初期段階の阻害のために、組織因子経路阻害剤は、FVIIa/組織因子/FXa産物複合体を標的にする。第VIIa因子FVII安定因子またはプロコンベルチンとしても公知であるは、止血および凝固で中枢的役割を有する、ビタミンK依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質であるEigenbrot,CurrProteinPeptSci.2002;3:287-99。FVIIは、肝臓内で合成され、48kDの単鎖糖タンパク質として分泌される。FVIIは、すべてのビタミンK依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質と、脂質膜とのタンパク質の相互作用に関与する、9~12残基を有するアミノ末端γカルボキシシグルタミン酸Glaドメイン、カルボキシ末端セリンプロテアーゼドメイン触媒ドメイン、および組織因子との相互作用を媒介する、カルシウム鉄結合部位を含有する2つの上皮成長因子様ドメインからなる類似するタンパク質ドメイン構造を共有する。γグルタミルカルボキシラーゼは、分子のアミノ末端部分でGla残基のカルボキシル化を触媒する。カルボキシラーゼは、その作用のために還元型ビタミンKに依存し、それは、エポキシド型に酸化される。ビタミンKエポキシド還元酵素が、ビタミンKのエポキシド型を還元型に再変換するために必要である。FVIIの主要部分は、チモーゲン型で、血漿中で循環し、この型の活性化は、アルギニン152とイソロイシン153との間のペプチド結合の開裂をもたらす。結果として生じる活性化FVIIaは、単一ジスルフィド結合Cys135~Cys262を介して連結した、NH2由来軽鎖20kDおよびCOOH末端由来重鎖30kDからなる。軽鎖は、膜結合Glaドメインを含有し、重鎖は、触媒ドメインを含有する。遺伝因子および環境因子によって決定されるFVIIの血漿濃度は約0.5mg/mLであるPinottietal.,Blood.2000;95:3423-8。FVIIの異なる遺伝子型は、FVIIの平均レベルにおいて数倍の差異をもたらし得る。血漿中FVIIレベルは、健康な女性では妊娠中に上昇し、また、年齢とともに上昇し、女性および高トリグリセリド血症に罹患しているヒトにおいてより高い。FVIIは、すべての凝固原因子のうちで最短の半減期3~6時間を有する。健康な個人におけるFVIIaの平均血漿濃度は3.6ng/mLであり、FVIIaの循環半減期は、他の凝固因子と比較して、比較的長い2.5時間。遺伝性FVII欠損症は、稀な常染色体劣性出血性障害であり、その有病率は一般集団において500,000人当たり1症例であると推定されるAcharyaetal.,JThrombHaemost.2004;2248-56。阻害剤からの後天的FVII欠損症もまた、非常に稀である。セファロスポリン、ペニシリン、および経口抗凝固剤等の薬物に関連して生じる欠損症の症例も報告されている。更にまた、後天的FVII欠損症は、自然発症的に、または例えば骨髄腫、敗血症、再生不良性貧血等の他の状態とともに、インターロイキン-2および抗胸腺細胞グロブリン療法で生じることが報告されている。参照ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列としては、例えば、ゲノム配列のGenBank受託番号J02933、cDNAのM13232Hagenetal.PNAS1986;83:2412-6、およびポリペプチド配列のP08709参照は、その全体が本明細書に組み込まれるが挙げられる。FVIIの種々の多型性は、例えば、Sabater-LlealらHumGenet.2006;118:741-51を参照参照は、その全体が本明細書に組み込まれるに説明されている。第IX因子FIXは、カルシウム鉄、リン脂質、およびFVIIIaの存在下で、FXをその活性型に変換することによって、血液凝固の内因性経路に関与するビタミンK依存性血漿タンパク質である。FIXの主な触媒能は、FX内の特定のアルギニン-イソロイシン結合に対して特異性を有するセリンプロテアーゼとしての触媒能である。FIXの活性化は、FIXからの活性化ペプチドの除去をもたらし、1つまたは複数のジスルフィド結合によって保持される2つの鎖を含む活性化したFIX分子を産生する、FXIaによって生じる。FIXの欠損は、劣性X連鎖血友病Bの原因である。血友病AおよびBはそれぞれ、FVIIIおよびFIXポリペプチドの欠損を特徴とする遺伝性疾患である。欠損の根本的な原因は、頻繁に、FVIIIおよびFIX遺伝子の突然変異の結果であり、それらの両方は、X染色体上に位置する。血友病に対する従来の療法は、しばしば、正常の個人からのプール血漿または半精製された凝固タンパク質の静脈内投与を伴う。これらの調製は、感染性プリオン、HIV、パルボウイルス、A型肝炎、およびC型肝炎等の病原体またはウイルスによって汚染される可能性がある。したがって、ヒト血清の使用を必要としない治療薬に対する緊急の必要性がある。FIX活性の減少レベルは、血友病Bの重症度に正比例する。血友病Bの現在の治療は、血漿由来または組換えFIXFIX置換または交換治療もしくは療法と称されるによる、不足したタンパク質の交換からなる。FIXのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、例えば、UniProtKB/Swiss-Prot受託番号P00740、米国特許第6,531,298号、および図1配列番号1において見出すことができる。第VIII因子凝固第VIII因子FVIIIは、非常に低い濃度で血漿中を循環し、フォンヴィレブランド因子VWFに非共有結合する。止血中、FVIIIは、VWFから分離され、カルシウムおよびリン脂質、または細胞膜の存在下で、活性化の速度を強化させることによって、活性化第IX因子FIXa媒介のFX活性化のための補因子として機能する。FVIIIは、ドメイン構造A1-A2-B-A3-C1-C2を有する、約270~330kDの単鎖前駆体として合成される。血漿から精製されるとき例えば、血漿由来または血漿性、FVIIIは、重鎖A1-A2-Bおよび軽鎖A3-C1-C2からなる。軽鎖の分子量は80kDであり、Bドメイン内のタンパク質分解により、重鎖は90~220kDの範囲内である。FVIIIはまた、出血性障害における治療用途のための組換えタンパク質としても合成される。種々のインビトロアッセイが、治療薬物としての組換えFVIIIrFVIIIの潜在的有効性を決定するために考案されている。これらのアッセイは、内在性FVIIIのインビボ効果を模倣する。FVIIIのインビトロトロンビン治療は、インビトロアッセイによって測定される、その凝固促進活性の迅速な増加およびその後の減少をもたらす。この活性化および不活性化は、例えば、FVIIIをVWFから解離させ、かつリン脂質表面に結合させて、異なる結合エピトープの有効性を調整するか、またはある特定のモノクローナル抗体への結合能を調整する、重鎖および軽鎖の両方における特定の制限されたタンパク質分解と一致する。FVIIIの欠如および機能不全は、最も頻度の高い出血性障害である血友症Aと関連する。血友症Aの管理のための治療選択は、血漿由来、またはrFVIII濃縮物を用いる交換療法である。1を下回るFVIIIレベルを有する重篤な血友症Aに罹患している患者は、一般に、FVIIIを用量との間で1を超えて維持することを目的とする予防療法を受けている。循環血中の種々のFVIII産物の平均半減期を考慮すると、この結果は、通常、FVIIIを週に2~3回投与することによって達成することができる。参照ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列としては、例えば、UniProtKB/Swiss-ProtP00451FA8_HUMAN、GitschierJetal.,CharacterizationofthehumanFactorVIIIgene,Nature,3125992:326-301984、VeharGHetal.,StructureofhumanFactorVIII,Nature,3125992:337-421984、ThompsonAR.StructureandFunctionoftheFactorVIIIgeneandprotein,SeminThrombHemost,2003:29;11-292002が挙げられる。フォンヴィレブランド因子フォンヴィレブランド因子VWFは、約500~20,000kDの範囲のサイズの一連の多量体として血漿中を循環する糖タンパク質である。VWFの多量体形態は、ジスルフィド結合によって相互に連結された250kDのポリペプチドサブユニットからなる。VWFは、損傷した血管壁の内皮下層への初期血小板粘着を媒介する。より大きな多量体のみが止血活性を呈する。内皮細胞は大きいポリマー形態のVWFを分泌し、低分子重量を有するVWFの形態低分子重量のVWFはタンパク質分解開裂から生じることが想定されている。高分子質量を有する多量体は、内皮細胞のバイベルパラーデ小体内に保存され、刺激時に遊離される。VWFは、大部分の反復ドメインからなるプレプロVWFとして内皮細胞および巨核球によって合成される。シグナルペプチドの開裂時に、プロVWFは、そのC末端領域においてジスルフィド連結を介して二量体化する。二量体は、多量体化のためのプロトマーとして機能し、それは、遊離末端間のジスルフィド連結によって支配される。多量体へのアセンブリの後、プロペプチド配列のタンパク質分解除去が続くLeyteetal.,Biochem.J.2741991,257-261。VWFのクローン化cDNAから予測される一次翻訳生成物は、2813残基の前駆体ポリペプチドプレプロVWFである。プレプロVWFは、22個のアミノ酸シグナルペプチドおよび741個のアミノ酸プロペプチドからなり、成熟VWFは2050個のアミノ酸を含むRuggeriZ.A.,andWare,J.,FASEBJ.,308-3161993。VWFの欠損は、ある程度の顕著な出血性表現型を特徴とする、フォンヴィレブランド病VWDの原因である。3型VWDは、VWFが完全に欠損している最も重度な形態であり、1型VWDは、VWFの量的減少に関連し、その表現型は、非常に軽度である可能性がある。2型VWDは、VWFの質的欠損に関連し、3型VWDと同様の重度である可能性がある。2型VWDは、多くの亜種形態を有し、そのうちの幾つかは、高分子重量の多量体の損失または減少に関連する。2a型フォンヴィレブランド病VWD-2Aは、中間体および大きい多量体の両方の損失を特徴とする。VWD-2Bは、最も高い分子重量の多量体の損失を特徴とする。VWFに関連する他の疾患および障害は、当該技術分野において既知である。プレプロVWFのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、GenBankアクセッション番号NM_000552およびNP_000543で入手可能である。本発明に従う他の血液凝固タンパク質は、例えば、MannKG,ThrombHaemost,1999;82:165-74の当該技術分野において説明されている。A.ポリペプチド一態様では、本発明の出発物質は、タンパク質またはポリペプチドである。本明細書に説明するとき、治療用タンパク質という用語は、治療用タンパク質に関連する生物学的活性を呈する、任意の治療用タンパク質分子を指す。本発明の一実施形態において、治療用タンパク質分子は、完全長のタンパク質である。企図される治療用タンパク質分子は、完全長のタンパク質、完全長のタンパク質の前駆体、完全長のタンパク質の生物学的に活性なサブユニットまたはフラグメント、ならびに治療用タンパク質のこれらの形態のうちのいずれかの生物学的に活性な誘導体および変異体を含む。したがって、治療用タンパク質は、1少なくとも約25、約50、約100、約200、約300、約400、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、参照核酸、または本明細書に説明されるアミノ酸配列によってコードされたポリペプチドと、約60超、約65超、約70超、約75超、約80超、約85超、約90超、約91超、約92超、約93超、約94超、約95超、約96超、約97超、約98超、または約99超、またはそれ以上より高いアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、および/または2本明細書に説明される参照アミノ酸配列を含む免疫原、その免疫原性フラグメント、および/またはその保存的に修飾された変異体に対して生成された抗体、例えば、ポリクロナールまたはモノクローナル抗体に特異的に結合する、治療用タンパク質を含む。本発明に従い、組換え治療用タンパク質という用語は、組換えDNA技術を介して得られた任意の治療用タンパク質を含む。ある実施形態において、この用語は、本明細書に説明されるタンパク質を包含する。本明細書で使用される内在性治療用タンパク質は、治療を受けることを意図されている哺乳動物に由来する治療用タンパク質を含む。該用語はまた、該哺乳動物に存在する導入遺伝子または任意の他の外来DNAから転写された治療用タンパク質を含む。本明細書で使用される外在性治療用タンパク質は、治療を受けることを意図されている哺乳動物に由来しない治療用タンパク質を含む。本明細書で使用される血漿由来治療用タンパク質または血漿性は、凝固経路に関与する特性を有する哺乳動物から得られた、血中に見られるタンパク質のすべての形態を含む。本明細書で使用される生物学的に活性な誘導体または生物学的に活性な変異体は、該分子の実質的に同一の機能的および/または生物学的特性結合特性等、および/または同一の構造基盤ペプチド主鎖または塩基ポリマー単位を有する分子の任意の誘導体または変異体を含む。変異体または誘導体等の類似体は、天然由来の分子と構造が実質的に同様であり、ある特定の例では、異なる程度ではあるが、同一の生物学的活性を有する化合物である。例えば、ポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドと実質的に同様の構造を共有し、同一の生物学的活性を有するポリペプチドを指す。変異体または類似体は、類似体が由来する天然ポリペプチドと比較して、iポリペプチドの1つまたは複数の末端および/または天然ポリペプチド配列例えば、フラグメントの1つまたは複数の内部領域における1つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、iiポリペプチドの1つまたは複数の末端一般的に付加または融合、および/または天然ポリペプチド配列の1つまたは複数の内部領域一般的に挿入における1つまたは複数のアミノ酸の挿入または付加、あるいはiii天然ポリペプチド配列での1つまたは複数のアミノ酸の他のアミノ酸に代えての置換を含む1つまたは複数の変異に基づき、それらのアミノ酸配列の組成が異なる。例として、誘導体は、一種の類似体であり、例えば、化学的に修飾されている参照ポリペプチドと同一または実質的に同様の構造を共有するポリペプチドを指す。変異体ポリペプチドは、1種の類似体ポリペプチドであり、挿入変異体を含み、そこでは1つまたは複数のアミノ酸残基が本発明の治療用タンパク質アミノ酸配列に付加される。挿入は、タンパク質のいずれか末端または両末端に位置してもよい、および/または治療用タンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置付けられてもよい。いずれかの末端または末端に付加残基を有する挿入変異体は、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは他のアミノ酸標識を含むタンパク質を含む。一態様では、血液凝固タンパク質分子は、特に、分子が大腸菌等の細菌性細胞内に組換え発現させるとき、任意に、N-末端Metを含有する。欠失変異体では、本明細書に説明される治療用タンパク質ポリペプチド内の1つまたは複数のアミノ酸残基が除去される。欠失は、治療用タンパク質ポリペプチドの1つまたは両方の末端において、および/または治療用タンパク質アミノ酸配列内の1つまたは複数の残基の除去によって達成することができる。したがって、欠失変異体は、治療用タンパク質ポリペプチド配列のフラグメントを含む。置換変異体では、治療用タンパク質ポリペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基が除去され、代替の残基と置き換えられる。一態様では、置換は、保存的な性質を有し、このタイプの保存的置換は、当該技術分野において周知である。あるいは、本発明は、非保存的でもある置換を包含する。例示的な保存的置換を、Lehninger,[Biochemistry,2ndEdition;WorthPublishers,Inc.,NewYork1975,pp.71-77]に記載されており、すぐ下に提示する。あるいは、例示的な保存置換をすぐ下に提示する。B.ポリヌクレオチド本発明の治療用タンパク質をコードする核酸としては、例えば、遺伝子、pre-mRNA、mRNA、cDNA、多形変異体、対立遺伝子、合成、および天然変異体が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、1ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に説明される参照アミノ酸配列をコードする核酸、およびその保存的に修飾された変異体に特異的にハイブリダイズする、2少なくとも約25、約50、約100、約150、約200、約250、約500、約1000、またはそれ以上のヌクレオチド最大、成熟タンパク質の1218ヌクレオチドの完全長配列の領域にわたって、本明細書に説明される参照核酸配列と、約95超、約96超、約97超、約98超、約99超、またはそれ以上より高いのヌクレオチド配列同一性を有する、核酸配列を有するポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50のホルムアミド、5×SSC、20mMのNaPO4、pH6.8中の42oCでのハイブリダイゼーション、および30分間、55oCでの1×SSCの洗浄を含む。これらの例示的な条件の変化は、ハイブリダイズされる配列の長さおよびGCヌクレオチド含有量に基づき行うことができることを理解されたい。当該技術分野における標準的な式は、適切なハイブリダイゼーション条件を決定するために適切である。Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManualSeconded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989§§9.47-9.51を参照。天然naturally-occurringポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的には、霊長類例えば、ヒト、齧歯類例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または任意の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない哺乳動物に由来する。本発明の核酸およびタンパク質は、組換え分子例えば、異種であり、野生型配列またはその変異体をコードする、または非天然のであり得る。C.治療用タンパク質の産生治療用タンパク質の産生には、i遺伝子操作による組換えDNAの産生、ii例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションによるこれらに限定されない原核細胞または真核細胞への組換えDNAの導入、iii該形質転換細胞の培養、iv例えば構造的または誘発時の治療用タンパク質の発現、v精製した治療用タンパク質を得るために、例えば培養培地から、または形質転換細胞を収集することによる該血液凝固タンパク質の単離、に関して当該技術分野で公知の任意の方法が含まれる。他の態様では、治療用タンパク質は、薬理学的に許容される血液凝固タンパク質分子を産生することによって特徴付けられる好適な原核または真核宿主系内の発現によって産生される。真核細胞の例は、CHO、COS、HEK293、BHK、SK-Hep、およびHepG2等の哺乳動物細胞である。多種多様なベクターが治療用タンパク質の調製に使用され、真核および原核発現ベクターから選択される。原核発現のためのベクターの例としては、pRSET、pET、およびpBAD等のプラスミドが挙げられるが、これらに限定されず、原核発現ベクターに使用されるプロモーターは、lac、trc、trp、recA、またはaraBADのうちの1つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。真核発現のためのベクターの例としては、i酵母における発現では、AOX1、GAP、GAL1、またはAUG1等であるが、これらに限定されないプロモーターを使用する、pAO、pPIC、pYES、またはpMET等であるが、これらに限定されないベクター、ii昆虫細胞における発現では、PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、またはpolh等であるが、これらに限定されないプロモーターを使用する、pMT、pAc5、pIB、pMIB、またはpBAC等であるが、これらに限定されないベクター、およびiii哺乳動物細胞における発現では、pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、またはpBPV等であるが、これらに限定されないベクター、および一態様では、CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV、およびβ-アクチン等であるが、これらに限定されないプロモーターを使用する、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルス等であるが、これらに限定されないウイルス系に由来するベクターが挙げられる。D.投与一実施形態において、本発明の複合化された治療用タンパク質は、静脈内、筋肉内、または腹腔内注入等の注入によって投与されてもよい。本発明の複合化された治療用タンパク質を含む組成物をヒトまたは試験動物に投与するために、一態様では、組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む。薬学的にまたは薬理学的に許容されるという用語は、下に説明されるように、安定しており、凝集および開裂生成物等のタンパク質分解を阻害し、加えて、当該技術分野で周知の経路を使用して投与されるとき、アレルギー反応または他の有害反応を起こさない分子的実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体としては、上に開示した薬剤を含む、任意かつ全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が挙げられる。本明細書で使用される有効量は、疾患または障害を治療するまたは疾患または障害の症状を改善するために好適な用量を含む。一実施形態において、有効量は、本明細書に説明される出血性障害を有する哺乳動物を治療するために好適な用量を含む。組成物は、経口的、局所的、経皮的、非経口的、吸引スプレーによって、経膣的、経直腸的、または頭蓋内注入によって、投与されてもよい。本明細書で使用される非経口という用語には、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、胸骨内注射、または注入技法が含まれる。静脈内、皮下、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、眼球後、肺内注入、およびまたは特定の部位での外科的移植による投与も企図される。一般に、組成物は、発熱物質、ならびに受容者に有害である可能性がある他の不純物を本質的に含んでいない。組成物の単回または複数回投与は、治療する医師によって選択される用量レベルまたはパターンで実行することができる。疾患の予防または治療では、適切な投与量は、上述のように、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度および経過、薬物が予防または治療目的のために投与されているか、治療歴、患者の病歴および薬物への応答、ならびに担当医の裁量に依存する。本発明はまた、本明細書に定義する有効量の複合化された治療用タンパク質を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、塩、緩衝液、または賦形剤を更に含んでもよい。薬学的組成物は、上に定義する出血性障害を治療するために使用することができる。本発明の薬学的組成物は、溶液または凍結乾燥された生成物であってもよい。薬学的組成物の溶液は、任意の好適な凍結乾燥プロセスに供してもよい。さらなる態様として、本発明は、対象に投与するためのその使用を促進する様式で梱包された本発明の組成物を含むキットを含む。一実施形態において、かかるキットは、本明細書に説明される化合物または組成物例えば、複合化された治療用タンパク質を含む組成物を含み、それは密封ボトルまたは器等の容器に梱包され、方法を実践する上での化合物または組成物の使用法を説明するラベルがその容器に貼られているか、パッケージに含まれる。一実施形態において、キットは、複合化された治療用タンパク質を含む組成物を有する第1の容器、および第1の容器内の組成物のための生理的に許容される再構成溶液を有する第2の容器を含有する。一態様では、化合物または組成物は、単位容量形態で梱包される。キットは、特定の投与経路に従い組成物を投与するための好適な装置を更に含んでもよい。好ましくは、キットは、治療用タンパク質またはペプチド組成物の使用法を説明するラベルを含有する。水溶性ポリマー一態様では、提供される治療用タンパク質誘導体即ち、複合化された治療用タンパク質分子は、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、ポリシアル酸PSA、ヒドロキシアルキルデンプンHAS、ヒドロキシエチルデンプンHES、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル-デキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPG、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレン-コマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCが挙げられるが、これらに限定されない、水溶性ポリマーに結合される。本発明の一実施形態において、水溶性ポリマーは、350~120,000、500~100,000、1000~80,000、1500~60,000、2,000~45,000Da、3,000~35,000Da、および5,000~25,000Daの範囲の分子量を有する、シアル酸分子からなる。水溶性ポリマーの結合は、タンパク質への直接結合によって、またはリンカー分子を介して実行することができる。化学的リンカーの一例は、炭水化物-選択的ヒドラジドおよびスルフヒドリル反応マレイミド基を含有する、MBPH4-[4-N-マイレインイミドフェニル]酪酸ヒドラジドであるChamowetal.,JBiolChem1992;267:15916-22。他の例示的および好ましいリンカーは、下に説明される。一実施形態において、誘導体は、天然の治療用タンパク質生成物の完全な機能活性を保持し、天然の治療用タンパク質生成物と比較して、延長したインビボ半減期を提供する。別の実施形態において、誘導体は、天然の血液凝固タンパク質に対して、少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56,57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、または150パーセントの生物学的活性を保持する。関連する態様では、誘導体および天然の血液凝固タンパク質の生物学的活性は、血液凝固因子抗原値に対する色原体活性の比血液凝固因子:Chr:血液凝固因子:Agによって決定される。本発明の更に別の実施形態において、構築物の半減期は、天然の治療用タンパク質のインビボ半減期に対して、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、または10倍減少または増大する。A.シアル酸およびPSAPSAは、N-アセチルノイラミン酸のポリマー通常、ホモポリマーからなる。二級アミノ基は、一般に、アセチル基を保有するが、その代わりにグリコシル基を保有してもよい。ヒドロキシル基における可能な置換基としては、アセチル基、ラクチル基、エチル基、硫酸基、およびリン酸基が挙げられる。シアル酸N-アセチルノイラミン酸の構造PSAおよびmPSAは、一般的には、2,8-または2,9-グリコシド連結、あるいはこれらの組み合わせ例えば、2,8-および2,9-で交互に連結したものによって連結されたN-アセチルノイラミン酸部分から本質的になる直鎖状ポリマーを含む。特に好ましいPSAおよびmPSAでは、グリコシド連結はa-2,8である。そのようなPSAおよびmPSAは、好都合には、コロミン酸に由来し、本明細書中ではCAおよびmCAと称される。典型的なPSAおよびmPSAは、少なくとも2個、好ましくは少なくとも5個、より好ましくは少なくとも10個、および最も好ましくは少なくとも20個のN-アセチルノイラミン酸部分を含む。したがって、それらは、2~300個のN-アセチルノイラミン酸部分、好ましくは5~200個のN-アセチルノイラミン酸部分、または最も好ましくは10~100個のN-アセチルノイラミン酸部分を含み得る。PSAおよびCAは、好ましくは、N-アセチルノイラミン酸以外の糖部分を本質的に含まない。したがって、PSAおよびCAは、好ましくは、少なくとも90、より好ましくは少なくとも95、および最も好ましくは少なくとも98のN-アセチルノイラミン酸部分を含む。PSAおよびCAがN-アセチルノイラミン酸以外の部分を含む場合例えば、mPSASおよびmCA等の場合、これらは、好ましくは、ポリマー鎖の一端または両端に位置している。例えば、そのような他の部分は、酸化または還元により末端N-アセチルノイラミン酸部分から誘導された部分であり得る。例えば、国際公開第-A-0187922号には、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応によって、非還元末端N-アセチルノイラミン酸単位がアルデヒド基に変換されたmPSAおよびmCAが記載されている。更に、国際公開第2005/016974号には、還元末端N-アセチルノイラミン酸単位が還元を受け、この還元末端N-アセチルノイラミン酸単位で還元的に開環し、それによって隣接ジオール基が形成され、続いて、酸化され、隣接ジオール基をアルデヒド基に変換したmPSAおよびmCAが記載されている。シアル酸リッチの糖タンパク質は、ヒトおよび他の生物でセレクチンに結合する。それらは、ヒトインフルエンザ感染に重要な役割を果たす。例えば、シアル酸は、マンノース結合レクチンから、宿主細胞または細菌の表面上のマンノース抗原を隠し得る。このことは、補体の活性化を妨げる。また、シアル酸は、最後から2番目の位置にあるガラクトース残基を隠し、肝実質細胞上のガラクトース受容体による、糖タンパク質の急速な排除を妨げる。コロミン酸N-アセチルノイラミン酸のホモポリマーの構造コロミン酸PSAの部分集合は、α2→8ケトーシス連結によるN-アセチルノイラミン酸NANAのホモポリマーであり、とりわけ、K1抗原を有する大腸菌の特定の株によって産生される。コロミン酸は、多くの生理学的機能を有する。それらは、薬物および化粧品の原材料として重要である。ポリシアル酸化および非修飾アスパラギナーゼとのインビボ比較研究は、ポリシアル酸化が酵素の半減期を増大させたことを明らかにしたFernandesandGregoriadis,BiochimicaBiophysicaActa1341:26-34,1997。本明細書で使用されるシアル酸部分は、水性溶液または懸濁液中で可溶性であり、薬学的に有効量のPSA-血液凝固タンパク質複合体の投与時に、哺乳動物への副作用等の悪影響がわずか、または全くない、シアル酸モノマーまたはポリマー多糖類を含む。一態様では、ポリマーは、1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、または500個のシアル酸単位を有することを特徴とする。ある特定の態様では、異なるシアル酸単位が鎖に組み込まれる。本発明の一実施形態において、多糖化合物のシアル酸部分は、非常に親水性であり、別の実施形態において、全化合物は、非常に親水性である。親水性は、主に、シアル酸単位のペンダントカルボキシル基、ならびにヒドロキシル基によって与えられる。糖類単位は、アミン基、ヒドロキシル基、または硫酸基等の他の官能基、またはその組み合わせを含有してもよい。これらの基は、天然の糖類化合物上に存在してもよいか、または誘導体多糖類化合物中に導入されてもよい。天然ポリマーPSAは、広域な大きさの分布例えば、SigmaC-5762、および高い多分散性PDを示す、多分散調製物として利用可能である。多糖類は、通常、共精製する内毒素の特有のリスクを持つ細菌内で産生されるため、長いシアル酸ポリマー鎖の精製は、内毒素含有量の増大の可能性を上げる場合がある。1~4個のシアル酸単位を有する短いPSA分子はまた、合成的に調製することができKangSHetal.,ChemCommun.2000;227-8、RessDKandLinhardtRJ,CurrentOrganicSynthesis.2004;1:31-46、したがって、高い内毒素レベルのリスクを最小限化させる。しかしながら、ここで、内毒素もない、狭い大きさの分布および低い多分散性を有するPSA調製物を製造することができる。一態様では、本発明のための特定の使用の多糖類化合物は、細菌によって産生された多糖類化合物である。これらの天然の多糖類のうちの幾つかは、糖脂質として知られている。一実施形態において、多糖類化合物には、末端ガラクトース単位を実質的に含まない。B.ポリエチレングリコールPEGおよびPEG化ある特定の態様では、治療用タンパク質は、種々の化学的方法のいずれかによって、水溶性ポリマーに複合化されるRobertsJMetal.,AdvanDrugDeliveryRev2002;54:459-76。例えば、一実施形態において、治療用タンパク質は、PEGの複合化によって、N-ヒドロキシスクシンイミドNHSエステルを使用して、タンパク質の遊離アミノ基に修飾される。別の実施形態において、水溶性ポリマー、例えば、PEGは、マレインイミド化学、または前酸化後に、治療用タンパク質の炭水化物部分へのPEGヒドラジドもしくはPEGアミンの結合を使用して、遊離SH基に結合される。一態様では、複合化は、水溶性ポリマーの直接結合またはリンカー系を介する結合によって、安定結合の形成下で、治療用タンパク質に対して実行される。さらに、分解性、放出性または加水分解性リンカー系が本発明のある特定の態様に使用されるTsuberyetal.JBiolChem2004;279:38118-24/Greenwaldetal.,JMedChem1999;42:3657-67/Zhaoetal.,BioconjChem2006;17:341-51/国際公開第2006/138572A2号/米国特許第7259224B2号/米国特許第7060259B2号。本発明の一実施形態において、治療用タンパク質は、コハク酸スクシンイミジル、グルタル酸スクシンイミジル、またはプロピオン酸スクシンイミジル等のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルNHSを含有するポリエチレングリコール誘導体の使用によって、リシン残基を介して修飾される。これらの誘導体は、安定アミド結合を形成することによって、温和な条件下で、治療用タンパク質のリシン残基と反応する。本発明の一実施形態において、PEG誘導体の鎖長は、5,000Daである。直鎖および分岐構造を含む、500~2,000Da、2,000~5,000Da、5,000以上~最大10,000Da、または10,000以上~最大20,000Da、または20,000以上~最大150,000Daの鎖長を有する他のPEG誘導体が、種々の実施形態に使用される。アミノ基のPEG化のための代替の方法としては、ウレタン結合を形成することによるPEGカルボン酸との化学的複合化、または二級アミド結合を形成する還元アミノ化によるアルデヒドもしくはケトンとの反応が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において、治療用タンパク質分子は、市販されるPEG誘導体を使用して化学修飾される。代替的態様におけるこれらのPEG誘導体は、直鎖または分岐構造を有する。NHS基を含有するPEG誘導体の例が、下に列挙される。以下のPEG誘導体は、NektarTherapeuticsHuntsville,Ala.、www.nektar.com/PEG試薬カタログ、NektarAdvancedPEGylation、価格表2005~2006を参照から市販されるPEG誘導体の非制限的な例である:mPEG-プロピオン酸スクシンイミジルmPEG-SPAmPEG-スクシンイミジルα-メチルブタノアートmPEG-SMBmPEG-CM-HBA-NHSCM=カルボキシメチル、HBA=ヒドロキシ酪酸分岐PEG誘導体NektarTherapeuticsの構造:分岐PEGN-ヒドロキシスクシンイミドmPEG2-NHS分岐構造を有するこの試薬は、KozlowskiらBioDrugs2001;5:419-29によって、より詳細に記載されている。PEG誘導体の他の非制限的例は、NOFCorporationTokyo,Japan、www.nof.co.jp/english:カタログ2005を参照から市販されている。直鎖PEG誘導体NOFCorp.の一般構造:X=カルボキシメチルX=カルボキシペンチルX=コハク酸X=グルタル酸分岐PEG誘導体NOFCorp.の構造:2,3-ビスメチルポリオキシエチレン-オキシ-1-1,5-ジオキソ-5-スクシンイミジルオキシ、ペンチルオキシプロパン2,3-ビスメチルポリオキシエチレン-オキシ-1-スクシンイミジルカルボキシペンチルオキシプロパンこれらのプロパン誘導体は、1,2置換パターンを有するグリセロール主鎖を示す。本発明では、1,3置換を有するグリセロール構造、または米国特許第2003/0143596A1号に説明される他の分岐構造に基づく分岐PEG誘導体もまた、企図される。TsuberyらJBiolChem2004;279:38118-24およびShechterら国際公開第04089280A3号によって説明される、分解性を有するPEG誘導体例えば、加水分解性リンカーもまた、企図される。驚くべきことに、本発明のPEG化された治療用タンパク質は、延長したインビボ半減期と組み合わせて、機能活性を呈する。加えて、PEG化されたrFVIII、FVIIa、FIX、または他の血液凝固因子は、トロンビン不活性化に対してより耐性であるように思える。C.ヒドロキシアルキルデンプンHASおよびヒドロキシエチルデンプンHES本発明の種々の実施形態において、治療用タンパク質分子は、ヒドロキシアルキルデンプンHASもしくはホドロキシエチルデンプンHES、またはそれらの誘導体を使用して化学的に修飾される。HESは、天然アミロペクチンの誘導体であり、体内ではα-アミラーゼによって分解される。HESは、炭水化物ポリマーのアミロペクチンの置換誘導体であり、これはコーンスターチ中に最大95重量の濃度で存在する。HESは、有利な生物学的特性を示し、血液量置換剤として診療所の血液療法で使用されるSommermeyeretal.,1987,Krankenhauspharmazie,88,271-278、およびWeidleretal.,1991,Arzneim.-Forschung/DrugRes.g419494-498。アミロペクチンは、主鎖においてα-1,4-グリコシド結合が存在し、分岐鎖部位においてα-1,6-グリコシド結合が見出される、グルコース部分からなる。この分子の物理化学的特性は、主に、グリコシド結合の型によって決定される。ギザギザのnickedα-1,4-グリコシド結合のために、1回転当たり約6つのグリコースモノマーを有するらせん構造が作られる。ポリマーの物理化学的特性ならびに生化学的特性は、置換により改変し得る。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリ性ヒドロキシエチル化により達成することができる。反応条件を適合させることにより、ヒドロキシエチル化に関して非置換グルコースモノマーにおけるそれぞれのヒドロキシ基の異なる反応性を活用することが可能である。この事実により、当業者は限定される程度まで置換パターンに影響を及ぼすことができる。HASは、少なくとも1つのヒドロキシアルキル基によって置換されているデンプン誘導体を指す。したがって、ヒドロキシアルキルデンプンという用語は、末端炭水化物成分がヒドロキシアルキル基R1、R2、および/またはR3を含む化合物に限定されず、少なくとも1つのヒドロキシ基がどこかに存在し、末端炭水化物成分および/またはデンプン分子の残りの部分のいずれかにて、HAS’がヒドロキシアルキル基R1、R2、またはR3で置換されている化合物も指す。アルキル基は、直鎖または分岐鎖アルキル基であってもよく、これは好適に置換されてもよい。好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、1~10個の炭素原子、より好ましくは1~6個の炭素原子、より好ましくは1~4個の炭素原子、なおより好ましくは2~4個の炭素原子を含有する。したがって、ヒドロキシアルキルデンプンは、好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、およびヒドロキシブチルデンプンを含み、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンが特に好ましい。2つ以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンもまた、本発明に含まれる。HASに含まれる少なくとも1つのヒドロキシアルキル基は、2つ以上のヒドロキシ基を含有してもよい。一実施形態によれば、HASを含む少なくとも1つのヒドロキシアルキル基は、1つのヒドロキシ基を含有する。HASという用語はまた、アルキル基がモノ置換または多置換である誘導体も含む。一実施形態において、アルキル基がハロゲン、特にフッ素、またはアリール基で置換されていることが好ましいが、但し、HASは水溶性のままであるものとする。更に、ヒドロキシアルキル基の末端ヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化することができる。HAS誘導体は、国際公開第2004/024776号に説明されており、これは参照によってその全体が組み込まれる。D.付着方法治療用タンパク質は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって、多糖類化合物に共有連結され得る。本発明の種々の態様では、シアル酸部分は、例えば、米国特許第4,356,170号に説明される方法参照により、本明細書に組み込まれるによって、治療用タンパク質、例えば、FIX、FVIII、FVIIa、またはVWFに結合される。PSAをポリペプチドに結合するための他の技術もまた、知られており、本発明によって企図される。例えば、米国公開第2007/0282096号は、例えば、PSAのアミンまたはヒドラジド誘導体をタンパク質に複合化させることを説明する。加えて、米国公開第2007/0191597号は、還元末端において基質例えば、タンパク質との反応のためのアルデヒド基を含有するPSA誘導体を説明する。これらの参照文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。種々の方法が米国特許第5,846,951号の7列、15行~8列、5行に開示される参照によりその全体が組み込まれる。例示的な技術は、血液凝固タンパク質または多糖類のうちのいずれかの上のカルボキシル基と、血液凝固タンパク質または多糖のアミン基との間のペプチド結合、または血液凝固タンパク質または多糖のカルボキシル基と、治療用タンパク質または多糖類のヒドロキシル基との間のエステル連結を介する連結を含む。治療用タンパク質が多糖類化合物に共有結合される、別の連結は、過ヨウ素酸塩酸化によって多糖類の非還元末端において形成されたアルデヒド基と反応させられる血液凝固タンパク質上の遊離アミノ基の間のシッフ塩基を介するJenningsHJandLugowskiC,JImmunol.1981;127:1011-8、FernandesAIandGregoriadisG,BiochimBiophysActa.1997;1341;26-34。一態様では、生成されたシッフ塩基は、NaCNBH3での特異的還元によって安定化され、二級アミンを形成する。代替のアプローチは、前酸化後のNH4Clでの還元アミノ化によるPSA内の末端遊離アミノ基の生成である。二官能性試薬を、2つのアミノ基または2つのヒドロキシル基に連結するために使用することができる。例えば、アミノ基を含有するPSAが、BS3ビススルホスクシンイミジルスベリン酸/Pierce,Rockford,IL等の試薬で、タンパク質のアミノ基に結合される。加えて、スルホ-EMCSN-ε-マレインイミドカプロイルオキシスルホスクシンイミドエステル/Pierce等のヘテロ二官能性架橋連結試薬を使用して、例えば、アミン基およびチオール基を連結する。別のアプローチでは、PSAヒドラジドが、前酸化、およびアルデヒド官能基の生成の後に調製され、タンパク質の炭水化物部分に結合される。上述の通り、治療用タンパク質の遊離アミノ基は、シアル酸残基の1-カルボキシル基と反応してペプチジル結合を形成するか、またはエステル連結が1-カルボキシル酸基と血液凝固タンパク質上のヒドロキシルまたは他の好適な活性基との間に形成される。代替的には、カルボキシル基は、脱アセチル化5-アミノ基とのペプチド連結を形成するか、または治療用タンパク質の分子のアルデヒド基は、シアル酸残基のN-脱アセチル化5-アミノ基を有するシッフ塩基を形成する。代替的には、多糖類化合物は、非共有様式で治療用タンパク質と会合する。例えば、一態様では、多糖類化合物および薬学的に活性な化合物は、疎水性相互作用を介して連結される。他の非共有会合は、相互に求引する逆帯電されたイオンでの静電相互作用を含む。種々の実施形態において、治療用タンパク質は、化学量論量例えば1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:7、1:8、1:9、または1:10等の多糖類化合物に連結、または会合される。種々の実施形態において、1~6、7~12、または13~20の多糖類が血液凝固タンパク質に連結される。更に他の実施形態において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上の多糖類が血液凝固タンパク質に連結される。種々の実施形態において、治療用タンパク質は、修飾されて、グリコシル化部位即ち、天然のグリコシル化部位以外の部位が導入される。かかる修飾は、当該技術分野で公知の標準分子生物学的技術を用いて達成されてもよい。その上、1つまたは複数の炭水化物部分を介する水溶性ポリマーへの複合化の前に、治療用タンパク質は、インビボまたはインビトロでグリコシル化されてもよい。これらのグリコシル化部位は、水溶性ポリマーとのタンパク質の共役のための標的として機能することができる米国特許出願第20090028822号、米国特許出願第2009/0093399号、米国特許出願第2009/0081188号、米国特許出願第2007/0254836号、米国特許出願第2006/0111279号、およびDeFreesS.etal.,Glycobiology,2006,16,9,833-43。例えば、インビボで天然にグリコシル化されないタンパク質例えば糖タンパク質ではないタンパク質は、上述の通り、修飾され得る。E.アミノオキシ連結本発明の一実施形態において、オキシム基を形成するための、アルデヒド例えば過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後の炭水化物部分上とのヒドロキシルアミンまたはヒドロキシルアミン誘導体の反応が、血液凝固タンパク質の複合体の調製に適用される。例えば、糖タンパク質例えば本発明に従う治療用タンパク質は、まず、過ヨウ素酸ナトリウムNaIO4等の酸化剤で酸化されるRothfusJAetSmithEL.,JBiolChem1963,238,1402-10、およびVanLentenLandAshwellG.,JBiolChem1971,246,1889-94。糖タンパク質の過ヨウ素酸塩酸化は、1928年の過ヨウ素酸塩との隣接ジオールの酸化に説明された古典的マラプラード反応に基づいて、活性アルデヒド基を形成するMalapradeL.,Analyticalapplication,BullSocChimFrance,1928,43,683-96。かかる酸化剤のさらなる例は、四酢酸鉛PbOAc4、酢酸マンガンMnOAc3、酢酸コバルトCoOAc2、酢酸タリウムTlOAc、硫酸セリウムCeSO42米国特許第4,367,309号、または過ルテニウム酸カリウムKRuO4Markoetal.,JAmChemSoc1997,119,12661-2である。酸化剤とは、炭水化物中の隣接ジオールを酸化し、それによって、生理学的反応条件下で、活性アルデヒド基を生成することが可能な温和な酸化化合物を意味する。第2のステップは、オキシム連結を形成するための、酸化炭水化物部分へのアミノオキシ基を含有するポリマーの結合である。本発明の一実施形態において、このステップは、触媒量の求核触媒アニリンまたはアニリン誘導体の存在下で実行することができるDirksenAetDawsonPE,BioconjugateChem.2008、ZengYetal.,NatureMethods2009;6:207-9。アニリン触媒は、オキシムライゲーションを著しく加速させ、非常に低い濃度の試薬の使用を可能にする。本発明の別の実施形態において、オキシム連結は、NaCNBH3での還元により安定化され、アルコキシアミン連結を形成する図2。さらなる触媒を以下に説明する。アミノオキシ技術についてのさらなる情報は、以下の参照文献で確認することができ、それらのそれぞれは、その全体が組み込まれる:欧州特許第1681303A1号HAS化エリスロポエチン、国際公開第2005/014024号オキシム連結基によって連結されるポリマーおよびタンパク質の複合体、国際公開第96/40662号アミノオキシ含有リンカー化合物、およびそれらの複合体における用途、国際公開第2008/025856号修飾タンパク質、PeriFetal.,Tetrahedron1998,54,12269-78、Kubler-KielbJet.PozsgayV.,JOrgChem2005,70,6887-90、LeesAetal.,Vaccine2006,246,716-29、およびHerediaKLetal.,Macromoecules2007,4014,4772-9。本発明の種々の実施形態において、本明細書に説明するアミノオキシ技術に従う治療用タンパク質例えば、FVIII、FVIIa、またはFIXの酸化炭水化物部分に連結される水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコールPEG、分岐PEG、ポリシアル酸PSA、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル-デキストラン、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリプロピレングリコールPPGポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレン-コマレイン酸無水物、ポリ1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマールPHF、2-メタクリロイルオキシ-2’-エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPCが挙げられるが、これらに限定されない。求核触媒本明細書に説明される通り、治療用タンパク質への水溶性ポリマーの複合化は、アニリンによって触媒され得る。アニリンは、アルデヒドおよびケトンの水性反応を強く触媒し、ヒドラゾンおよびオキシム等の安定したイミンを形成する。以下の略図は、無触媒反応とアニリン触媒オキシムライゲーション反応を比較するKohlerJJ,ChemBioChem2009;10:2147-50:しかしながら、アニリンに関連する多くの健康リスクを考慮すると、代替となる触媒が望ましい。本発明は、代替となるオキシムライゲーション触媒としてアニリン誘導体を提供する。かかるアニリン誘導体としては、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、スルファニル酸、o-アミノベンズアミド、o-トルイジン、m-トルイジン、p-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、およびp-アニシジンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において、m-トルイジンメタ-トルイジン、m-メチルアニリン、3-メチルアニリン、または3-アミノ-1-メチルベンゼンとしても知られているを使用して、本明細書に説明される複合化反応を触媒する。M-トルイジンおよびアニリンは、同様の物理的特性、および本質的に同じpKa値m-トルイジン:pKa4.73、アニリン:pKa4.63を有する。本発明の求核触媒は、オキシムライゲーション例えばアミノオキシ連結を使用またはヒドラゾン形成例えばヒドラジド化学を使用において有用である。本発明の種々の実施形態において、求核触媒は、複合化反応において0.1、0.2、0.3、0.5、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、または50mMの濃度で提供される。一実施形態において、求核触媒は、1~10mMで提供される。本発明の種々の実施形態において、複合化反応のpH範囲は、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、および7.5である。一実施形態において、pHは、5.5~6.5である。共役タンパク質の精製種々の実施形態において、酸化剤でインキュベートされているタンパク質および/または本開示に従って水溶性ポリマーで複合化されている治療用タンパク質の精製が望ましい。多くの精製技術が、当該技術分野で知られており、これには、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および親和性クロマトグラフィ、またはそれらの組み合わせ等のクロマトグラフ法、濾過法、ならびに沈殿法GuidetoProteinPurification,Meth.EnzymologyVol463editedbyBurgessRRandDeutscherMP,2ndedition,AcademicPress2009が挙げられるが、これらに限定されない。以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態を制限するものではなく、例示目的のみである。実施例1ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]2ONH2の調製ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]2ONH22つの活性アミノオキシ基を含有する3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンを、一級アミンの修飾ガブリエル合成を採用する2ステップ有機反応で、BoturynらTetrahedron1997;53:5485-92に従って合成した図3。第1のステップでは、2,2-クロロジエチルエーテルの1つの分子を、ジメチルホルムアミドDMF中で、エンド-N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシミドの2つの分子と反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、得られた中間体からエタノール中のヒドラジン分解によって調製した。実施例2ホモ二官性リンカーNH2[OCH2CH2]4ONH2の調製ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]4ONH22つの活性アミノオキシ基を含有する3,6,9-トリオキサ-ウンデカン-1,11-ジオキシアミンを、一級アミンの修飾ガブリエル合成を採用する2ステップ有機反応で、BoturynらTetrahedron1997;53:5485-92に従って合成した図3。第1のステップでは、ビス-2-2-クロロエトキシ-エチル-エーテルの1つの分子を、DMF中で、エンド-N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシミドの2つの分子と反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、得られた中間体からエタノール中のヒドラジン分解によって調製した。実施例3ホモ二官性リンカーNH2[OCH2CH2]6ONH2の調製ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]6ONH22つの活性アミノオキシ基を含有する3,6,9,12,15-ペナトキサpenatoxa-ヘプタデカン-1,17-ジオキシアミンを、一級アミンの修飾ガブリエル合成を採用する2ステップ有機反応で、BoturynらTetrahedron1997;53:5485-92に従って合成した。第1のステップでは、ヘキサエチレングリコール二塩化物の1つの分子を、DMF中で、エンド-N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシミドの2つの分子と反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、得られた中間体からエタノール中のヒドラジン分解によって調製した。実施例4アミノオキシ-PSA試薬の詳細な合成3-オキサ-ペンタン-1,5ジオキシアミンを、実施例1に概説される2ステップ有機合成で、BotyrynらTetrahedron1997;53:5485-92に従って合成した。ステップ1:700mLの無水N,N-ジメチルホルムアミド中のエンド-N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド59.0g、1.00当量の溶液に、無水K2CO345.51g、1.00当量および2,2-ジクロロジエチルエーテル15.84mL、0.41当量を添加した。反応混合物を50°Cで22時間撹拌した。混合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残渣を、2Lのジクロロメタン中で懸濁し、NaCl飽和水溶液各1Lで2回、抽出した。ジクロロメタン層を、Na2SO4で乾燥させ、次いで、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、高真空内で乾燥して、白黄色の固体中間体1として64.5gの3-オキサペンタン-1,5-ジオキシ-エンド-2’,3’-ジカルボキシジイミドノルボルネンを得た。ステップ2:800mLの無水エタノール中の中間体164.25g、1.00当量の溶液に、31.0mLのヒドラジン水和物4.26当量を添加した。次いで、反応混合物を2時間還流させた。混合物を、減圧下で溶媒を蒸発させることによって、出発体積の半分まで濃縮した。生じた沈殿物を濾去した。残りのエタノール層を、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。粗生成物3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンを含有する残渣を、真空内で乾燥させ、46.3gを得た。粗生成物を更にに、カラムクロマトグラフィシリカゲル60、ジクロロメタン/メタノール混合物での定組成溶離、9/1によって精製して、11.7gの純最終生成物3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンを得た。実施例5アミノオキシ-PSAの調製SerumInstituteofIndiaPune,Indiaから得た1000mgの酸化PSA分子量=20kDを、16mLの50mMのリン酸緩衝液、pH6.0中に溶解した。次いで、170mgの3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンを反応混合物に添加した。室温で2時間振とうした後、78.5mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、反応を、一晩かけて18時間行った。次いで、反応混合物を、再生成されたセルロース50cm2、Milliporeから作製された5kDのカットオフを有する膜を使用する限外濾過/透析濾過の手順UF/DFに供した。実施例6クロマトグラフィ精製ステップを採用するアミノオキシ-PSAの調製SerumInstituteofIndiaPune,Indiaから得た1290mgの酸化PSA分子量=20kDを、25mLの50mMのリン酸緩衝液緩衝液A、pH6.0中に溶解した。次いで、209mgの3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンを反応混合物に添加した。室温で1時間振とうした後、101mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、反応を、3時間行った。次いで、混合物を、FractogelEMDDEAE650-Mクロマトグラフィゲルカラム寸法:XK26/135を採用する穏やかな陰イオン交換クロマトグラフィに供した。反応混合物を110mLの緩衝液Aで希釈し、1cm/分の流速で、緩衝液Aで事前に平衡化したDEAEカラム上に負荷した。次いで、カラムを20CVの緩衝液B20mMのHepes、pH6.0で洗浄し、2cm/分の流速で、遊離3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンおよびシアン化物を除去した。次いで、アミノオキシ-PSA試薬を、67の緩衝液Bおよび43の緩衝液C20mMのHepes、1MのNaCl、pH7.5からなるステップ勾配で溶出した。溶出液を、ポリエーテルスルホン50cm2、Milliporeから作製された5kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを緩衝液D20mMのHepes、90mMのNaCl、pH7.4に対して行った。調製物を、全PSAレゾルシノールアッセイおよび全アミノオキシ基TNBSアッセイを測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付けた。更に、多分散性、ならびに遊離3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンおよびシアン化物を決定した。実施例7還元ステップを行わないアミノオキシ-PSAの調製SerumInstituteofIndiaPune,Indiaから得た573mgの酸化PSA分子量=20kDを、11,3mLの50mMのリン酸緩衝液緩衝液A、pH6.0中に溶解した。次いで、94mgの3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンを反応混合物に添加した。次いで、室温で5時間振とうした後、混合物を、FractogelEMDDEAE650-Mクロマトグラフィゲルカラム寸法:XK16/105を採用する穏やかな陰イオン交換クロマトグラフィに供した。反応混合物を50mLの緩衝液Aで希釈し、1cm/分の流速で、緩衝液Aで事前に平衡化したDEAEカラム上に負荷した。次いで、カラムを20CVの緩衝液B20mMのHepes、pH6.0で洗浄し、2cm/分の流速で、遊離3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンおよびシアン化物を除去した。次いで、アミノオキシ-PSA試薬を、67の緩衝液Bおよび43の緩衝液C20mMのHepes、1MのNaCl、pH7.5からなるステップ勾配で溶出した。溶出液を、ポリエーテルスルホン50cm2、Milliporeから作製された5kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを緩衝液D20mMのHepes、90mMのNaCl、pH7.4に対して行った。調製物を、全PSAレゾルシノールアッセイおよび全アミノオキシ基TNBSアッセイを測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付けた。更に、多分散性、ならびに遊離3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンを決定した。実施例8求核触媒m-トルイジンの存在下で、還元ステップを行わないアミノオキシ-PSAの調製SerumInstituteofIndiaPune,Indiaから得た573mgの酸化PSA分子量=20kDを、9mLの50mMのリン酸緩衝液緩衝液A、pH6.0中に溶解する。次いで、94mgの3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンを溶液に添加する。続いて、2.3mLの50mMのm-トルイジン原液をこの反応混合物に添加する。次いで、室温で2時間振とうした後、FractogelEMDDEAE650-Mクロマトグラフィゲルカラム寸法:XK16/105を採用する穏やかな陰イオン交換クロマトグラフィステップに供する。反応混合物を50mLの緩衝液Aで希釈し、1cm/分の流速で、緩衝液Aで事前に平衡化したDEAEカラム上に負荷する。次いで、カラムを20CVの緩衝液B20mMのHepes、pH6.0で洗浄し、2cm/分の流速で、遊離3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンおよびシアン化物を除去する。アミノオキシ-PSA試薬を、67の緩衝液Bおよび43の緩衝液C20mMのHepes、1MのNaCl、pH7.5からなるステップ勾配で溶出する。溶出液を、ポリエーテルスルホン50cm2、Milliporeから作製された5kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを緩衝液D20mMのHepes、90mMのNaCl、pH7.4に対して行う。調製物を、全PSAレゾルシノールアッセイおよび全アミノオキシ基TNBSアッセイを測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付ける。更に、多分散性、ならびに遊離3-オキサ-ペンタン-1,5-ジオキシアミンを決定する。実施例9アミノオキシ-PSA試薬の調製アミノオキシ-PSA試薬を実施例4~8に従い調製した。透析濾過後、生成物を-80°Cで凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、試薬を適切な体積の水中で溶解し、炭水化物修飾を介するPSA-タンパク質複合体の調製のために使用した。実施例10異なる代替の求核触媒の有効性の評価rFIXを、異なる求核触媒アニリン、m-トルイジン、o-アニシジン、m-アニシジン、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、p-アミノベンゾアミド、スルファニル酸/標準濃度:10mMを使用して、標準条件20mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中の1mg/mLのrFIX、pH6.0、5倍のモル過剰のアミノオキシ-PSA試薬、100μMのNaIO4下で、過ヨウ素酸ナトリウム、アミノオキシ-PSA試薬でインキュベートした。反応を、穏やかな撹拌下で、暗室で、室温で2時間行い、1mMの最終濃度によるシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行った。カップリング効率を、InvitrogenX-cellミニシステムを使用するSDS-PAGEによって決定した。試料をリチウムドデシル硫酸塩LDS緩衝液でスパイクし、70°Cで10分間変性した。次いで、試料を3~8のトリス-酢酸塩ゲルに適用し、150Vで60分間行った。続いて、ゲルをクマシーで染色した。加えて、試料を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するSEC-HPLCシステムの使用によって特徴付けたKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。不希釈の50μLの試料を注入し、0.5mL/分の流速で、20mMのNaH2PO4、50mMのNa2SO4、pH6.1の0.22μmの濾過溶液を使用して均一濃度で溶出した。溶出パターンを280nmで記録した。これらの結果を図5A~Cおよび6SDSPAGEならびに表2SEC-HPLCの結果に要約する。異なる調製物の触媒効果を示す。m-トルイジンの使用が、アニリンで得たものと同等の結果をもたらすことが示される。実施例11アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するrFIXのポリシアル化方法1:12.3mgのrFIXを、6.1mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解した。次いで、254μLの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、6.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行った。続いて、その混合物をVivaspin15R10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去した。酸化rFIXを含有する残余分8.8mLを、2.46mLのm-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートした。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加して、5倍モル過剰の試薬を得た。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートした。遊離rFIXを、陰イオン交換クロマトグラフィAECによって除去した。反応混合物を、15mLの緩衝液A50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepQFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷した。次いで、カラムを緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、5mMのCaCl2、pH7.5で溶出した。遊離rFIXは、12~25mS/cmの伝導率で溶出し、複合体は、27~45mS/cmの伝導率で溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液C50mMのHepes、5MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9を用いて190mS/cmに引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9を用いて事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷した。遊離アミノオキシ-PSA試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄した。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.4で溶出する。複合体を含有する画分を、Vivaspin15R10kDの遠心分離濾過機を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClおよび5mMのCaCl2を含有するヒスチジン緩衝液、pH7.2に対して行った。調製物を、総タンパク質BradfordおよびFIX色原体活性の測定によって分析的に特徴付けた。PSA-rFIX複合体は、天然のrFIXと比較して50超の特異的活性を決定することを示した。方法2:12.3mgのrFIXを、L-ヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解し、rFIXの1mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、100μMの最終濃度を得、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、pH6.0で、4°Cで1時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液または他の反応停止試薬の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。続いて、その混合物をVivaspin15R10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。酸化rFIXを含有する得られた残余分8.8mLを、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、10mMの最終濃度を得、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、pH6.0で、室温で2.5時間インキュベートし、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで0.5時間~18時間インキュベートした。遊離rFIXを、陰イオン交換クロマトグラフィAECによって除去する。反応混合物を、適切な量の緩衝液A50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepQFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する前に、溶液の伝導率およびpHを修正する。次いで、カラムを緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、5mMのCaCl2、pH7.5で溶出する。遊離rFIXを、25の緩衝液Bを使用するステップ勾配によって溶出し、得られた画分中12~25mS/cmの伝導率をもたらし、その複合体を、50の緩衝液Bのステップ勾配を使用して溶出し、複合体画分中27~45mS/cmの間の間の伝導率をもたらす。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Cを使用して50mMのHepes、5MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9、または例えば硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩の使用によって、190mS/cmに引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CTまたは同等のHIC培地上に負荷する。遊離アミノオキシ-PSA試薬を、5CV緩衝液D内で洗浄する。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.4で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD、Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClおよび5mMのCaCl2を含有するL-ヒスチジン緩衝液、pH7.2に対して行う。調製物を、総タンパク質BradfordおよびBCA手順およびFIX色原体活性および凝固活性の測定によって分析的に特徴付ける。PSA-rFIX複合体に対して、天然のrFIXと比較して50超の特異的活性を決定する。方法3:25.4mgのrFIXを、18.7mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解した。次いで、531μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMおよび5.07mLのm-トルイジン水溶液50mMを添加した。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得た。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、25μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行った。遊離rFIXを、陰イオン交換クロマトグラフィAECによって除去した。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepQFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷した。次いで、カラムを緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、5mMのCaCl2、pH7.5で溶出した。遊離rFIXを、12~25mS/cmの伝導率で溶出し、複合体を、27~45mS/cmの伝導率で溶出した。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9で事前に平衡化した緩衝液C50mMのHepes、5MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9を用いて190mS/cmに引き上げ、20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷した。遊離アミノオキシ-PSA試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄した。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.4で溶出した。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD、Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClおよび5mMのCaCl2を含有するヒスチジン緩衝液、pH7.2に対して行った。調製物を、総タンパク質BradfordおよびFIX色原体活性を測定することによって分析的に特徴付けた。PSA-rFIX複合体に対して、天然のrFIXと比較して50超の特異的活性を決定した。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けたKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離FIXを含有しないことを示した。複合体は、57のモノポリシアル化、31のジポリシアル化、および12のトリポリシアル化された生成物からなった。方法4:25.4mgのrFIXを、L-ヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解し、rFIXの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得た。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分間以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分以内に10mMの最終濃度を得た。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得た。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得た。遊離rFIXを、イオン交換クロマトグラフィIECによって除去した。反応混合物を、適切な量の緩衝液A50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepQFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する前に、溶液の伝導率およびpH値を修正した。次いで、カラムを緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、5mMのCaCl2、pH7.5で溶出した。遊離rFIXを、25の緩衝液Bを使用するステップ勾配によって溶出し、得られた画分中12~25mS/cmの伝導率をもたらし、その複合体を、50の緩衝液Bのステップ勾配を使用して溶出し、複合体画分中27~45mS/cmの伝導率をもたらした。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Cを使用して50mMのHepes、5MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9、例えば酢酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩の使用によって、190mS/cmに引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT;または同等のHIC培地上に負荷した。遊離アミノオキシ-PSA試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄した。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.4で溶出した。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD、Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClおよび5mMのCaCl2を含有するL-ヒスチジン緩衝液、pH7.2に対して行った。調製物を、総タンパク質BradfordおよびBCA手順およびFIX色原体活性および凝固活性を測定することによって分析的に特徴付けた。PSA-rFIX複合体に対して、天然のrFIXと比較して50超の特異的活性を決定した。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けたKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離FIXを含有しないことを示した。複合体は、57のモノポリシアル化、31のジポリシアル化、および12のトリポリシアル化された生成物からなった。実施例12アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するrFVIIIのポリシアル化方法1:50mgのrFVIIIを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得た。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得た。酸化を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間行った。次いで、反応物は、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行った。溶液を、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化した20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供した。カラムを、5CVの緩衝液Aで平衡化した。次いで、酸化rFVIIIを、緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0を使用して溶出した。rFVIIIを含有する画分を収集した。タンパク質含有量を決定しクマシー,Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整した。次いで、50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒最終濃度:10mMとして、m-トルイジンを添加した。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行った。過剰のアミノオキシ-PSA試薬をHICによって除去した。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって130mS/cmに引き上げ、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷した。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出した。最後に、PSA-rFVIIIを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース88cm2、Milliporeから作製された30kDの膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供した。調製物を、総タンパク質クマシー、BradfordおよびFVIII色原体活性の測定によって分析的に特徴付けた。PSA-rFVIII複合体は、天然rFVIIIと比較して70超の特異的活性を決定することを示した。方法2:Hepes緩衝液50mMのHEPES、約350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.1のポリソルベート80、pH7.4中のADVATEプロセス由来の58mgの組換え因子VIIIrFVIIIを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化rFVIIIを、EMDTMAEMMerck上で陰イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。混合物を、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH6.5で希釈し、5ms/cmの伝導率を得る。この溶液を、1.5cm/分の流速を用いて、10mLのカラム体積を有するIEXカラム床高さ:5.4cm上に負荷する。続いて、このカラムを、5CVの緩衝液Aと緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1.0MのNaCl、pH7.0の92:8の混合物w/wで洗浄する流速:1.5cm/分。次いで、酸化rFVIIIを、緩衝液Aと緩衝液Bの50:50w/wの混合物で溶出し、続いて、5CVの緩衝液Bを使用して後溶出のステップを行う。1.0cm/分の流速の使用によって溶出ステップを行う。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化rFVIIIを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPSA-rFVIII複合体を、15cmの床高さhおよび81mLの得られたカラム体積CVを有するGEHealthcareによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースFF低sub樹脂GEHealthcareを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィHICによって精製する。反応混合物を、350mMの塩化ナトリウム、8Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を含有する50mMのHepes緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクする。2体積の反応混合物を、緩衝液システムを含有する1体積の酢酸アンモニウムと混合し、pH値は、0.5NのNaOH水溶液の滴加によってpH6.9に修正する。この混合物を、1cm/分の流速でHICカラム上に負荷し、続いて、3CV超の平衡化緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、2.5Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用する洗浄ステップを行う。副生成物および抗カオトロピック塩の反応物の除去に関しては、第2の洗浄ステップを、2cm/分の流速の上向流モードで、5CV超の洗浄緩衝液150mMのHepes、3Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用して行う。次いで、精製されたPSA-rFVIII複合体の溶出を、1cm/分の流速の下向流モードで、40の洗浄緩衝液250mMのHepes、1.5Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9および60の溶出緩衝液20mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5のステップ勾配を使用して行う。PSA-rFVIII複合体の溶出は、UV280nmでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、4CV未満以内で収集する。後溶出のステップを同じ条件下で、3CV超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および/または修飾されないrFVIIIを分離する。最後に、精製された複合体を、30kDの分子量カットオフを有する再生成されたセルロース88cm2、Milliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、FVIII色原体活性の測定によって、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。得られた複合体に対して、50超の特異的特性および5.0超のPSAの度合いを算出する。方法3:50mgのrFVIIIを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得た。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMおよびNaIO4最終濃度:400μMを添加した。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行った。続いて、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行った。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウムを含有する緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を添加することによって、130mS/cmに引き上げ、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷した。続いて、その複合体を50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出した。最後に、PSA-rFVIIIを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース88cm2、Milliporeから作製された30kDの膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供した。調製物を、総タンパク質BradfordおよびFVIII色原体活性の測定によって分析的に特徴付けた。PSA-rFVIII複合体に対して、天然のrFVIIIと比較して70超の特異的活性を決定した。方法4:50mMのHepes緩衝液50mMのHEPES、約350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.1のポリソルベート80、pH7.4中のADVATEプロセス由来の50mgの組換え因子VIIIrFVIIIを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得た。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正した。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このrFVIII溶液に最長期間tの15分以内で添加した。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得た。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得た。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートした。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートした。得られたPSA-rFVIII複合体を、15cmの床高さhおよび81mLの得られたカラム体積CVを有するGEHealthcareによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースFF低sub樹脂GEHealthcareを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィHICによって精製した。反応混合物を、350mMの塩化ナトリウム、8Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を含有する50mMのHepes緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクした。2容量の反応混合物を、緩衝液システムを含有する1容量の酢酸アンモニウムと混合し、pH値は、0.5NのNaOH水溶液の滴加によってpH6.9に修正した。この混合物を、1cm/分の流速でHICカラム上に負荷し、続いて、3CV超の平衡化緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、2.5Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用する洗浄ステップを行った。副生成物および抗カオトロピック塩の反応物の除去に関しては、第2の洗浄ステップを、2cm/分の流速の上向流モードで、5CV超の洗浄緩衝液150mMのHepes、3Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用して行った。次いで、精製されたrFVIII複合体の溶出を、1cm/分の流速の下向流モードで、40の洗浄緩衝液250mMのHepes、1.5Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9および60の溶出緩衝液20mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5のステップ勾配を使用して行った。PSA-rFVIII複合体の溶出は、UV280nmでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、4CV未満以内で収集した。後溶出のステップを同じ条件下で、3CV超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および/または修飾されないrFVIIIを分離した。最後に、精製された複合体を、30kDの分子量カットオフを有する再生成されたセルロース88cm2、Milliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮した。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、FVIII色原体活性の測定によって、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付けた。分析データ6つの連続するバッチの平均:プロセス収率Bradford:58.9プロセス収率FVIII色原体活性:46.4特異的活性:FVIII色原体活性/mgタンパク質:4148IU/mg特異的活性出発物質の割合:79.9PSAの度合いmol/mol:8.1実施例13アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するrFVIIIのPEG化方法1:rFVIIIを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。14.7mgのrFVIIIを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、296μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin15R10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去した。酸化rFVIIIを含有する残余分10.9mLを、2.94mLのm-トルイジン溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加して、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートした。最後に、PEG-rFVIII複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、30kDの膜50cm2、Milliporeを使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、総タンパク質クマシー、BradfordおよびFVIII色原体活性の測定によって分析的に特徴付ける。PEG-rFVIII複合体では、天然のrFVIIIと比較して70超の特異的活性が決定されることを示すことが予測される。方法2:rFVIIIを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。出発重量または濃度のrFVIIIを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応を、T=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間で行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中での10mM最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化rFVIIIを、EMDTMAEMMerck上で陰イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。混合物を、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH6.5で希釈し、5ms/cmの伝導率を得る。この溶液を、1.5cm/分の流速を用いて、10mLのカラム体積を有するIEXカラム床高さ:5.4cm上に負荷する。続いて、このカラムを、5CVの緩衝液Aと緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1.0MのNaCl、pH7.0の92:8の混合物w/wで洗浄する流速:1.5cm/分。次いで、酸化rFVIIIを、緩衝液Aと緩衝液Bの50:50w/wの混合物で溶出し、続いて、5CVの緩衝液Bを使用して後溶出のステップを行う。1.0cm/分の流速の使用によって溶出ステップを行う。続いて、20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化rFVIIIを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-rFVIII複合体を、15cmの床高さhおよび81mLの得られたカラム体積CVを有するGEHealthcareによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースFF低sub樹脂GEHealthcareを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィHICによって精製する。反応混合物を、350mMの塩化ナトリウム、8Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を含有する50mMのHepes緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクする。2容量の反応混合物を、緩衝液システムを含有する1容量の酢酸アンモニウムと混合し、pH値は、0.5NのNaOH水溶液の滴加によってpH6.9に修正する。この混合物を、1cm/分の流速でHICカラム上に負荷し、続いて、3CV超の平衡化緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、2.5Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用する洗浄ステップを行う。副生成物および抗カオトロピック塩の反応物の除去に関しては、第2の洗浄ステップを、2cm/分の流速の上向流モードで、5CV超の洗浄緩衝液150mMのHepes、3Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用して行う。次いで、精製されたrFVIII複合体の溶出を、1cm/分の流速の下向流モードで、40の洗浄緩衝液250mMのHepes、1.5Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9および60の溶出緩衝液20mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5のステップ勾配を使用して行う。PEG-rFVIII複合体の溶出は、UV280nmでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、4CV未満以内で収集する。後溶出のステップを同じ条件下で、3CV超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および/または修飾されないrFVIIIを分離する。最後に、精製された複合体を、30kDの分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法3:rFVIIIを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。6mLのHepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解される7.84mgのrFVIIIを、314μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mM、および1.57mLのm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-rFVIII複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、30kDの膜88cm2、Milliporeを使用する限外濾過/透析濾過に供する。FVIII色原体アッセイおよび総タンパク質Bradfordの決定による複合体の分析的特徴付けは、rFVIII出発物質と比較して60超の特異的活性を示す。方法4:rFVIIIを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のrFVIIIを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、rFVIIIの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。遊離rFVIIIを、イオン交換クロマトグラフィIECによって除去する。反応混合物を、適切な量の緩衝液A50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepQFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する前に、溶液の伝導率およびpH値を修正した。次いで、カラムを緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、5mMのCaCl2、pH7.5で溶出した。遊離rFVIIIを、25の緩衝液Bを使用するステップ勾配によって溶出し、得られた画分中12~25mS/cmの伝導率をもたらし、その複合体を、50の緩衝液Bのステップ勾配を使用して溶出し、複合体画分中27~45mS/cmの伝導率をもたらした。続いて、複合体を含有する画分の伝導率は、緩衝液Cを使用して50mMのHepes、5MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9、例えば硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩の使用によって、引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CTまたは同等のHIC培地上に負荷する。遊離PEG試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄した。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.4で溶出した。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD、Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例14アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するrFVIIaのポリシアル化方法1:出発濃度または重量の組換え因子VIIarFVIIaを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのNaOH水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、50μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化rFVIIaを、EMDTMAEMMerck上で陰イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。混合物を、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH6.5で希釈し、5ms/cmの伝導率を得る。この溶液を、1.5cm/分の流速を用いて、10mLのカラム体積を有するIEXカラム床高さ:5.4cm上に負荷する。続いて、このカラムを、5CVの緩衝液Aと緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1.0MのNaCl、pH7.0の92:8の混合物w/wで洗浄する流速:1.5cm/分。次いで、酸化rFVIIaを、緩衝液Aと緩衝液Bの50:50w/wの混合物で溶出し、続いて、5CVの緩衝液Bを使用して後溶出のステップを行う。1.0cm/分の流速の使用によって溶出ステップを行う。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化rFVIIaを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPSA-rFVIIa複合体を、15cmの床高さhおよび81mLの得られたカラム体積CVを有するGEHealthcareによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースFF低sub樹脂GEHealthcareを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィHICによって精製する。反応混合物を、350mMの塩化ナトリウム、8Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を含有する50mMのHepes緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクする。2容量の反応混合物を、緩衝液システムを含有する1容量の酢酸アンモニウムと混合し、pH値は、0.5NのNaOH水溶液の滴加によってpH6.9に修正する。この混合物を、1cm/分の流速でHICカラム上に負荷し、続いて、3CV超の平衡化緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、2.5Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用する洗浄ステップを行う。副生成物および抗カオトロピック塩の反応物の除去に関しては、第2の洗浄ステップを、2cm/分の流速の上向流モードで、5CV超の洗浄緩衝液150mMのHepes、3Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用して行う。次いで、精製されたrFVIIa複合体の溶出を、1cm/分の流速の下向流モードで、40の洗浄緩衝液250mMのHepes、1.5Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9および60の溶出緩衝液20mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5のステップ勾配を使用して行う。PSA-rFVIIa複合体の溶出は、UV280nmでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、4CV未満以内で収集する。後溶出のステップを同じ条件下で、3CV超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および/または修飾されないrFVIIaを分離する。最後に、精製された複合体を、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロース例えば10kDのMWCO、88cm2、Milliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法2:出発重量または濃度のrFVIIaを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのNaOH水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このrFVIIa溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、150μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたPSA-rFVIIa複合体を、15cmの床高さhおよび81mLの得られたカラム体積CVを有するGEHealthcareによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースFF低sub樹脂GEHealthcareを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィHICによって精製する。反応混合物を、350mMの塩化ナトリウム、8Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を含有する50mMのHepes緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクする。2容量の反応混合物を、緩衝液システムを含有する1容量の酢酸アンモニウムと混合し、pH値は、0.5NのNaOH水溶液の滴加によってpH6.9に修正する。この混合物を、1cm/分の流速を使用するHICカラム上に負荷し、続いて、3CV超の平衡化緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、2.5Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用する洗浄ステップを行う。副生成物および抗カオトロピック塩の反応物の除去に関しては、第2の洗浄ステップを、2cm/分の流速の上向流モードで、5CV超の洗浄緩衝液150mMのHepes、3Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用して行う。次いで、精製されたrFVIIa複合体の溶出を、1cm/分の流速の下向流モードで、40の洗浄緩衝液250mMのHepes、1.5Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9および60の溶出緩衝液20mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5のステップ勾配を使用して行う。PSA-rFVIIa複合体の溶出は、UV280nmでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、4CV未満以内で収集した。後溶出のステップを同じ条件下で、3CV超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および/または修飾されないrFVIIIを分離する。最後に、精製された複合体を、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例15アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するrFIXのPEG化方法1:rFIXを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。出発重量または濃度のrFIXを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化rFVIIIを、EMDTMAEMMerck上で陰イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。混合物を、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH6.5で希釈し、5mS/cmの伝導率を得る。この溶液を、1.5cm/分の流速を用いて、10mLのカラム体積を有するIEXカラム床高さ:5.4cm上に負荷する。続いて、このカラムを、5CVの緩衝液Aと緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1.0MのNaCl、pH7.0の92:8の混合物w/wで洗浄する流速:1.5cm/分。次いで、酸化rFIXを、緩衝液Aと緩衝液Bの50:50w/wの混合物で溶出し、続いて、5CVの緩衝液Bを使用して後溶出のステップを行う。1.0cm/分の流速の使用によって溶出ステップを行う。続いて、20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化rFIXを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-rFIX複合体を、15cmの床高さhおよび81mLの得られたカラム体積CVを有するGEHealthcareによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースFF低sub樹脂GEHealthcareを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィHICによって精製する。反応混合物を、350mMの塩化ナトリウム、8Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を含有する50mMのHepes緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクする。2容量の反応混合物を、緩衝液システムを含有する1容量の酢酸アンモニウムと混合し、pH値は、0.5NのNaOH水溶液の滴加によってpH6.9に修正する。この混合物を、1cm/分の流速でHICカラム上に負荷し、続いて、3CV超の平衡化緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、2.5Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用する洗浄ステップを行う。副生成物および抗カオトロピック塩の反応物の除去に関しては、第2の洗浄ステップを、2cm/分の流速の上向流モードで、5CV超の洗浄緩衝液150mMのHepes、3Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用して行う。次いで、精製されたrFIX複合体の溶出を、1cm/分の流速の下向流モードで、40の洗浄緩衝液250mMのHepes、1.5Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9および60の溶出緩衝液20mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5のステップ勾配を使用して行う。PSA-rFIX複合体の溶出は、UV280nmでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、4CV未満以内で収集する。後溶出のステップを同じ条件下で、3CV超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および/または修飾されないrFIXを分離する。最後に、精製された複合体を、10kDの分子量カットオフを有する再生成されたセルロース88cm2、Milliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:rFIXを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のrFIXを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、rFIXの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。遊離rFIXを、イオン交換クロマトグラフィIECによって除去する。反応混合物を、適切な量の緩衝液A50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepQFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する前に、溶液の伝導率およびpH値を修正した。次いで、カラムを緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、5mMのCaCl2、pH7.5で溶出した。遊離rFIXを、25の緩衝液Bを使用するステップ勾配によって溶出し、得られた画分中12~25mS/cmの伝導率をもたらし、その複合体を、50の緩衝液Bのステップ勾配を使用して溶出し、複合体画分中27~45mS/cmの伝導率をもたらした。続いて、複合体を含有する画分の伝導率は、緩衝液Cを使用して50mMのHepes、5MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9、例えば酢酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩の使用によって、引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CTまたは同等のHIC培地上に負荷する。遊離アミノオキシ-PSA試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄した。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.4で溶出した。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD、Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従って総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例16アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するrFVIIaのPEG化方法1:rFVIIaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。出発重量または濃度のrFVIIaを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのNaOH水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、50μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化rFVIIaを、EMDTMAEMMerck上で陰イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。混合物を、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH6.5で希釈し、5mS/cmの伝導率を得る。この溶液を、1.5cm/分の流速を用いて、10mLのカラム体積を有するIEXカラム床高さ:5.4cm上に負荷する。続いて、このカラムを、5CVの緩衝液Aと緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1.0MのNaCl、pH7.0の92:8の混合物w/wで洗浄する流速:1.5cm/分。次いで、酸化rFVIIaを、緩衝液Aと緩衝液Bの50:50w/wの混合物で溶出し、続いて、5CVの緩衝液Bを使用して後溶出のステップを行う。1.0cm/分の流速の使用によって溶出ステップを行う。続いて、20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化rFVIIaを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-rFVIIa複合体を、15cmの床高さhおよび81mLの得られたカラム体積CVを有するGEHealthcareによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースFF低sub樹脂GEHealthcareを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィHICによって精製する。反応混合物に、350mMの塩化ナトリウム、8Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を含有する50mMのHepes緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムを添加する。2容量の反応混合物を、緩衝液システムを含有する1容量の酢酸アンモニウムと混合し、pH値は、0.5NのNaOH水溶液の滴加によってpH6.9に修正する。この混合物を、1cm/分の流速でHICカラム上に負荷し、続いて、3CV超の平衡化緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、2.5Mの酢酸アンモニウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用する洗浄ステップを行う。副生成物および抗カオトロピック塩の反応物の除去に関しては、第2の洗浄ステップを、2cm/分の流速の上向流モードで、5CV超の洗浄緩衝液150mMのHepes、3Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9を使用して行う。次いで、精製されたrFVIIa複合体の溶出を、1cm/分の流速の下向流モードで、40の洗浄緩衝液250mMのHepes、1.5Mの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9および60の溶出緩衝液20mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5のステップ勾配を使用して行う。PSA-rFVIIa複合体の溶出は、UV280nmでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、4CV未満以内で収集する。後溶出のステップを同じ条件下で、3CV超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および/または修飾されないrFVIIaを分離する。最後に、精製された複合体を、10kDの分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:rFVIIaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のrFVIIaを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、rFVIIaの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。遊離rFVIIaを、イオン交換クロマトグラフィIECによって除去する。反応混合物を、適切な量の緩衝液A50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepQFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する前に、溶液の伝導率およびpH値を修正した。次いで、カラムを緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、5mMのCaCl2、pH7.5で溶出した。遊離rFVIIaを、25の緩衝液Bを使用するステップ勾配によって溶出し、得られた画分中12~25mS/cmの伝導率をもたらし、その複合体を、50の緩衝液Bのステップ勾配を使用して溶出し、複合体画分中27~45mS/cmの伝導率をもたらした。続いて、複合体を含有する画分の伝導率は、緩衝液Cを使用して50mMのHepes、5MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9、例えば酢酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩の使用によって、引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、5mMのCaCl2、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CTまたは同等のHIC培地上に負荷する。遊離PEG試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄した。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.4で溶出した。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD、Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例17o-アミノ安息香酸の存在下でのrFIXのポリシアル化方法1:8.2mgのrFIXを、4.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、82μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、4μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin610kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。酸化rFIXを含有する残余分6.5mLを、1.64mLのo-アミノ安息香酸50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートした。本明細書に説明される通りに複合体のさらなる精製を行う。方法2:5倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を含有する0.65mLのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中の1mgのrFIXの溶液を調製した。333μLのo-アミノ安息香酸溶液30mMを求核触媒として添加し、10mMの最終濃度を得た。続いて、20μLのNaIO4水溶液5mMを添加し、100μMの最終濃度を産出した。カップリングプロセスを、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行い、1μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行った。本明細書に説明される通りに複合体のさらなる精製を行う。実施例18アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するEPOのポリシアル化方法1:出発濃度のエリスロポエチンEPOを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化された20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムは、5CVの緩衝液Aで平衡化される。酸化EPOを緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0を使用して溶出する。EPOを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ-PSA試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-EPOを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMWCO10kD、50cm2、Milliporeで作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。10mgのEPOを、5mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、100μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、50μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin15R10kDの遠心分離機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。酸化EPOを含有する残余分約7mLを、2mLのm-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。遊離EPOを、陰イオン交換クロマトグラフィAECによって除去する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH7.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepQFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH7.5で溶出する。遊離EPOを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液C50mMのHepes、5MのNaCl、pH6.9を使用して約190mS/cmに引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。遊離PSA試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄する。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、pH7.4で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD、Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH7.2に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PSA-EPO複合体に対して、天然のEPOと比較して50超の特異性活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離EPOを含有しないことを示す。方法2:EPOを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化EPOを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化EPOを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化EPOを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたPSA-EPO複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-EPO複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法3:エリスロポエチンEPOを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA-EPOを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMWCO10kD、88cm2、Milliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。10mgのEPOを、8mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、200μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMおよび2mLのm-トルイジン水溶液50mMを添加する。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、100μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。遊離EPOを、陰イオン交換クロマトグラフィAECによって除去する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH7.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepQFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH7.5で溶出する。遊離EPOを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液C50mMのHepes、5MのNaCl、pH6.9を使用して約190mS/cmに引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。遊離PSA試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄する。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、pH7.4で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD、Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH7.2に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PSA-EPO複合体に対して、天然のEPOと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離EPOを含有しないことを示す。方法4:EPOを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このEPO溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたPSA-EPO複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-EPOを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMWCO10kD、88cm2、Milliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例19アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するAng-2のポリシアル化方法1:出発濃度のアンジオポエチン-2Ang-2を、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化した20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムは、5CVの緩衝液Aで平衡化される。酸化Ang-2を緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0を使用して溶出する。Ang-2を含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-Ang-2-を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。アンジオポエチン-2Ang-2を、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。PSA-Ang-2複合体を含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:Ang-2を、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化Ang-2を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化Ang-2を含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化Ang-2を含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたPSA-Ang-2複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-Ang-2複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法3:アンジオポエチン-2Ang-2を、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するPSAアミノオキシ試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA-Ang-2-を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。アンジオポエチン-2Ang-2を、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するPSAアミノオキシ試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSAAng-2-を含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:Ang-2を、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このAng-2溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたPSA-Ang-2複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-Ang-2を含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例20アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するVEGFのポリシアル化方法1:出発濃度の血管内皮増殖因子VEGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化された20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムは、5CVの緩衝液Aで平衡化される。酸化VEGFを、緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0で溶出する。VEGFを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのNaOHの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-VEGF-を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。血管内皮増殖因子VEGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。PSA-VEGF-を含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:VEGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化VEGFを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化VEGFを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化VEGFを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたPSA-VEGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-VEGF複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法3:血管内皮増殖因子VEGFを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するPSAアミノオキシ試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA-VEGF-を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。血管内皮増殖因子VEGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-VEGFを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:VEGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このVEGF溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたVEGF-複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-VEGFを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例21アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するEGFのポリシアル化方法1:出発濃度の上皮増殖因子EGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化された20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムは、5CVの緩衝液Aで平衡化される。酸化EGFを緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0で溶出する。EGFを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-EGFを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。上皮増殖因子EGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。PSA-EGFを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:EGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化EGFを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化EGFを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化EGFを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたPSA-EGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-EGF複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法3:上皮増殖因子EGFを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するPSAアミノオキシ試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA-EGF-を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。上皮増殖因子EGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するPSAアミノオキシ試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:EGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このEGF溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたEGF-複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-EGFを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例22アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するNGFのポリシアル化方法1:出発濃度の神経増殖因子NGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化された20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムは、5CVの緩衝液Aで平衡化される。酸化NGFを緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0を使用して溶出する。NGFを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-NGFを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。神経増殖因子NGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。PSA-NGFを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:NGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化NGFを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化NGFを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製されたNGFを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたPSA-NGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-NGF複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法3:神経増殖因子NGFを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA-NGFを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。神経増殖因子NGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。次いで、PSA-NGFを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:NGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、それに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このNGF溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたNGF-複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-NGFを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例23アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するHGHのポリシアル化方法1:本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。出発濃度のヒト成長ホルモンHGHを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化された20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムを、5CVの緩衝液Aで平衡化する。酸化HGHを、緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0で溶出する。HGHを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-HGHを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。HGHを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。PSA-HGHを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。HGHを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化HGHを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化HGHを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化HGHを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたPSA-HGH複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-HGH複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法3:本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。ヒト成長ホルモンHGHを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSAHGHを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。HGHを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。次いで、PSA-HGHを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。HGHを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このHGH溶液に最長時間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたHGH-複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-HGHを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例24アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するTNF-αのポリシアル化出発濃度の腫瘍壊死因子-αTNF-αを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化された20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムを、5CVの緩衝液Aで平衡化する。酸化TNF-αを緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0で溶出する。TNF-αを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-TNF-α-を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。腫瘍壊死因子-αTNF-αを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。PSA-TNF-αを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:TNF-αを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化TNF-αを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化TNF-αを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化TNF-αを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたPSA-TNF-α複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-TNF-α複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法3:腫瘍壊死因子-αTNF-αを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA-TNF-αを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。腫瘍壊死因子-αTNF-αを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-TNF-αを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:TNF-αを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このTNF-α溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたTNF-α複合体をイオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-TNF-αを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例25アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するインスリンのポリシアル化方法1:本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。出発濃度のインスリンを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化された20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムを、5CVの緩衝液Aで平衡化する。酸化インスリンを、緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0で溶出する。インスリンを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-インスリンを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。PSA-インスリンを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化インスリンを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化インスリンを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化インスリンを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたPSA-インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-インスリン複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法3:本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA-インスリンを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-インスリンを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このインスリン溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたインスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-インスリンを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例26アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するインターフェロンαのポリシアル化方法1:出発濃度のインターフェロンαを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化された20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムを、5CVの緩衝液Aで平衡化する。酸化インターフェロン-αを緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0で溶出する。インターフェロンαを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-インターフェロンαを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。インターフェロンαを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。PSA-インターフェロンαを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:インターフェロンαを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化インターフェロンαを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化インターフェロンαを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化インターフェロンγを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたPSA-インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-インターフェロンα複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。方法3:インターフェロンαを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するPSAアミノオキシ試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA-インターフェロンαを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。インターフェロンαを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-インターフェロンαを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:インターフェロンαを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このインターフェロンα溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたインターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-インターフェロンαを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例27アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するインターフェロンγのポリシアル化方法1:10mgのインターフェロンγを、5mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、100μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、50μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin15R10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。酸化インターフェロンγを含有する残余分約7mLを、2mLのm-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。遊離インターフェロンγを、陽イオン交換クロマトグラフィCECによって除去する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH6.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepSPFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH6.5で溶出する。遊離インターフェロンγを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液C50mMのHepes、5MのNaCl、pH6.9を使用して約190mS/cmに引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。遊離PSA試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄する。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、pH6.9で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD、Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH6.9に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PSA-インターフェロンγ複合体に対して、天然のインターフェロンγと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。方法2:10mgのインターフェロンγを、8mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、200μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMおよび2mLのm-トルイジン水溶液50mMを添加する。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、100μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。遊離インターフェロンγを、陽イオン交換クロマトグラフィCECによって除去する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH6.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepSPFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH6.5で溶出する。遊離インターフェロンγを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液C50mMのHepes、5MのNaCl、pH6.9を使用して約190mS/cmに引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。遊離PSA試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄する。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、pH6.9で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH6.9に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PSA-インターフェロンγ複合体に対して、天然のインターフェロンγと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。方法3:10mgのインターフェロンγを、8mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、200μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMおよび2mLのm-トルイジン水溶液50mMを添加する。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、100μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。遊離インターフェロンγを、陽イオン交換クロマトグラフィCECによって除去する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH6.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepSPFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH6.5で溶出する。遊離インターフェロンγを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液C50mMのHepes、5MのNaCl、pH6.9を使用して約190mS/cmに引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。遊離PSA試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄する。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、pH6.9で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH6.9に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PSA-インターフェロンγ複合体に対して、天然のインターフェロンγと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。方法4:インターフェロンγを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このインターフェロンγ溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたインターフェロンγ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-インターフェロンγを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例28アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するG-CSFのポリシアル化方法1:出発濃度の顆粒球コロニー刺激因子G-CSFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化された20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムを、5CVの緩衝液Aで平衡化する。酸化G-CSFを緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0で溶出する。G-CSFを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-G-CSFを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。顆粒球コロニー刺激因子G-CSFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。PSA-G-CSFを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:G-CSFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化G-CSFを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化G-CSFを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化G-CSFを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたPSA-G-CSF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-G-CSF複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法3:顆粒球コロニー刺激因子G-CSFを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA-G-CSFを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。顆粒球コロニー刺激因子G-CSFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-G-CSFを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:G-CSFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このG-CSF溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたG-CSF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-G-CSFを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例29アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するヒュミラHumiraのポリシアル化方法1:出発濃度のヒュミラを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化された20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムを、5CVの緩衝液Aで平衡化する。酸化ヒュミラを緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0で溶出する。ヒュミラを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-ヒュミラを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。ヒュミラを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。PSA-ヒュミラを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:ヒュミラを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化ヒュミラを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化ヒュミラを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化ヒュミラを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたPSA-ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PSA-ヒュミラ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法3:ヒュミラを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA-ヒュミラを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。ヒュミラを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-ヒュミラを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:ヒュミラを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このヒュミラ溶液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-ヒュミラを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例30アミノオキシ-PSAおよび求核触媒としてm-トルイジンを使用するProliaのポリシアル化方法1:出発濃度のProliaを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン最終濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次に、溶液を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液A20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0で平衡化された20mLの体積を有するIEXカラムMerckEMDTMAEMに供する。カラムは、5CVの緩衝液Aで平衡化される。酸化Proliaを緩衝液B20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0を使用して溶出する。Proliaを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定しクマシー、Bradford、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整する。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン最終濃度:10mMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をHICによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出する。最後に、PSA-Proliaを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。10mgのProliaを、5mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、100μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、50μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin15R10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。酸化Proliaを含有する残余分約7mLを、2mLのm-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。遊離Proliaを、陽イオン交換クロマトグラフィCECによって除去する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH6.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepSPFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH6.5で溶出する。遊離Proliaを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液C50mMのHepes、5MのNaCl、pH6.9を使用して約190mS/cmに引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。遊離PSA試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄する。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、pH6.9で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD、Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH6.9に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PSA-Prolia複合体に対して、天然のProliaと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離Proliaを含有しないことを示す。方法2:Proliaを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化Proliaを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化Proliaを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化Proliaを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、pH6.0で120/-10分間インキュベートするタンパク質濃度:1mg/mL。得られたProlia複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。Prolia複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。方法3:Proliaを、反応緩衝液50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、続いて、求核触媒としてm-トルイジン10mMの最終濃度およびNaIO4最終濃度:400μMを添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システインシステイン濃度:10mMを使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFFGEHealthcare,Fairfield,CTで充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSAProliaを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。10mgのProliaを、8mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、200μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMおよび2mLのm-トルイジン水溶液50mMを添加する。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PSA試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、100μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。遊離Proliaを、陽イオン交換クロマトグラフィCECによって除去する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH6.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepSPFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH6.5で溶出する。遊離Proliaを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液C50mMのHepes、5MのNaCl、pH6.9を使用して約190mS/cmに引き上げ、緩衝液D50mMのHepes、3MのNaCl、pH6.9で事前に平衡化した20mLのHiPrepブチルFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。遊離PSA試薬を、5CVの緩衝液D内で洗浄する。続いて、その複合体を、100の緩衝液E50mMのHepes、pH6.9で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH6.9に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PSA-Prolia複合体に対して、天然のProliaと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離Proliaを含有しないことを示す。方法4:Proliaを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解するか、またはそれに移して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、アミノオキシ-ポリシアル酸PSA-ONH2試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、このProlia溶液に最長時間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。最後に、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、400μMの濃度を得る。反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、T=22/-2°Cの温度Tで120/-10分間インキュベートする。次いで、L-システイン水溶液1Mの添加によって反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。得られたProlia複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。PSA-Proliaを含有する溶出液の画分を収集し、再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびPSA含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定レゾルシノールアッセイによって分析的に特徴付ける。実施例31他の治療用タンパク質のポリシアル化本明細書に説明される、m-トルイジンまたはo-アミノ安息香酸のような代替的な求核触媒の存在下で行われるポリシアル化反応は、他の治療用タンパク質まで拡大され得る。例えば、本発明の種々の態様において、本明細書に説明される上述のポリシアル化またはPSAアミノオキシまたはPEGアミノオキシ試薬によるPEG化反応を、本明細書に説明されるこれらのタンパク質等の治療用タンパク質で繰り返す。実施例32アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するEPOのPEG化方法1:エリスロポエチンEPOを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。EPOを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化EPOを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-EPO複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。EPOを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。10mgのEPOを、5mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、100μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、50μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin15R10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。酸化EPOを含有する残余分約7mLを、2mLのm-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-EPO複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH7.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepQFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH7.5で溶出する。遊離EPOを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH7.2に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PEG-EPO複合体に対して、天然EPOと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離EPOを含有しないことを示す。方法2:EPOを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。EPOを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化EPOを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化EPOを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化EPOを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-EPO複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-EPO複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法3:EPOを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。EPOを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理をする。最後に、PEG-EPO複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。EPOを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。10mgのEPOを、約8mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、200μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMおよび2mLのm-トルイジン水溶液50mMを添加する。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、100μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-EPO複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH7.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepQFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH7.5で溶出する。遊離EPOを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH7.2に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PEG-EPO複合体に対して、天然のEPOと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離EPOを含有しないことを示す。方法4:EPOを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のEPOを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、EPOの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。PEG-EPO複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例33アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するAng-2のPEG化方法1:Ang-2を、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。Ang-2を、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化Ang-2を含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-Ang-2複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。Ang-2を、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。Ang-2を、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化Ang-2を含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-Ang-2複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、次いで、適切な分子量カットオフの膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:Ang-2を、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。Ang-2を、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化Ang-2を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化Ang-2を含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化Ang-2を含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-Ang-2複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-Ang-2複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法3:Ang-2を、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。Ang-2を、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理をする。最後に、PEG-Ang-2複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。Ang-2を、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。Ang-2を、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-Ang-2複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、次いで、限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:Ang-2を、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のAng-2を、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、Ang-2の2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。PEG-Ang-2複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。続いて、遊離Ang-2を、イオン交換クロマトグラフィIECによって除去する。複合体を含有する溶出液の画分を、限外濾過/透析濾過によって濃縮する。実施例34アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するVEGFのPEG化方法1:VEGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。VEGFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化VEGFを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-VEGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。VEGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。VEGFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化VEGFを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-VEGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:VEGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。VEGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化VEGFを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化VEGFを含有する溶出画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化VEGFを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-VEGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-VEGF複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法3:VEGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。VEGFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-VEGF複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。VEGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。VEGFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-VEGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体複合体の溶出液の画分を、収集し、次いで、限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:VEGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のVEGFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、VEGFの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。PEG-VEGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例35アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するEGFのPEG化方法1:EGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。EGFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化EGFを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-EGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。EGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。EGFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化EGFを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-EGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、次いで、適切な分子量カットオフの膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:EGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。EGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化EGFを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化EGFを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化NGFを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-EGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-EGF複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法3:EGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。EGFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-EGF複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。EGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。EGFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-EGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、収集し、次いで、限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:EGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のEGFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、EGFの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。PEG-EGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例36アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するNGFのPEG化方法1:NGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。NGFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化NGFを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-NGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。NGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。NGFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化NGFを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-NGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:NGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。NGFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化NGFを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化NGFを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化NGFを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-NGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-NGF複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法3:NGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。NGFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-NGF複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。NGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。NGFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-NGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:NGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のNGFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、NGFの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。PEG-NGF複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例37アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するHGHのPEG化方法1:本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。HGHを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。HGHを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化HGHを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-HGH複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。HGHを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。HGHを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化HGHを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-HGH複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。HGHを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。HGHを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化HGHを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化HGHを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化HGHを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-HGH複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-NGF複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法3:本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。HGHを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。HGHを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-HGH複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。HGHを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。HGHを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-HGH複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモンHGHのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。HGHを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のHGHを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、HGHの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。PEG-HGH複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例38アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するTNF-αのPEG化方法1:TNF-αを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。TNF-αを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化TNF-αを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-TNF-α複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。TNF-αを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。TNF-αを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化TNF-αを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-TNF-α複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、次いで、適切な分子量カットオフの膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:TNF-αを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。TNF-αを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化TNF-αを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化TNF-αを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化TNF-αを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-TNF-α複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-TNF-α複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法3:TNF-αを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。TNF-αを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-TNF-α複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。TNF-αを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。TNF-αを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-TNF-α複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:TNF-αを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のTNF-αを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、TNF-αの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。PEG-TNF-α複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例39アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するインスリンのPEG化方法1:本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。インスリンを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化インスリンを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。インスリンを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化インスリンを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、次いで、適切な分子量カットオフの膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。インスリンを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化インスリンを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化インスリンを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化インスリンを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-インスリン複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法3:本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。インスリンを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-インスリン複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。インスリンを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のインスリンを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、インスリンの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。PEG-インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例40アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するインターフェロンαのPEG化方法1:インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。インターフェロンαを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化インターフェロンαを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。インターフェロンαを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化インターフェロンαを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。インターフェロンαを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化インターフェロンαを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化インターフェロンαを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化インターフェロンαを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-インターフェロンα複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法3:インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。インターフェロンαを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-インターフェロンα複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。インターフェロンαを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のインターフェロンαを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、インターフェロンαの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。PEG-インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例41アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するインターフェロンγのPEG化方法1:インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。10mgのインターフェロンγを、5mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、100μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、50μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin15R10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。酸化インターフェロンγを含有する残余分約7mLを、2mLのm-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-インターフェロンγ複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH6.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepSPFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH6.5で溶出する。遊離インターフェロンγを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH6.9に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PEG-インターフェロンγ複合体に対して、天然のインターフェロンγと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。方法2:インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。インターフェロンγを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化インターフェロンγを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化インターフェロンγを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化インターフェロンγを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-インターフェロンγ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-インターフェロンγ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法3:インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。10mgのインターフェロンγを、約8mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、200μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMおよび2mLのm-トルイジン水溶液50mMを添加する。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、100μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-インターフェロンγ複合体を、SPセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH6.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepSPFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH6.5で溶出する。遊離インターフェロンγを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH6.9に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PEG-インターフェロンγ複合体に対して、天然のインターフェロンγと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。方法4:インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のインターフェロンγを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、インターフェロンγの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。PEG-インターフェロンγ複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例42アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するG-CSFのPEG化方法1:G-CSFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。G-CSFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化G-CSFを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-G-CSF複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。G-CSFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。G-CSFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化G-CSFを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-G-CSF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:G-CSFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。G-CSFを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化G-CSFを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化G-CSFを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化G-CSFを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-G-CSF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-G-CSF複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。方法3:G-CSFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。G-CSFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-G-CSF複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。G-CSFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。G-CSFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-G-CSF複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:G-CSFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のG-CSFを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、G-CSFの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加して、20倍のモル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。G-CSF複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例43アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するヒュミラのPEG化方法1:ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。ヒュミラを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化ヒュミラを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。ヒュミラを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化ヒュミラを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を収集し、次いで、適切な分子量カットオフの膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法2:ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。ヒュミラを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化ヒュミラを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化ヒュミラを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化ヒュミラを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-ヒュミラ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。方法3:ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。ヒュミラを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-ヒュミラ複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。ヒュミラを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mの添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。方法4:ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のヒュミラを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、ヒュミラの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加して、20倍のモル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例44アミノオキシ-PEG試薬および求核触媒としてm-トルイジンを使用するProliaのPEG化方法1:Proliaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。Proliaを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。次に、酸化Proliaを含有する残余分を、m-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-Prolia複合体を、イオン交換クロマトグラフィ例えばQセファロースFF上でによって精製する。例えば、1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質クマシー、Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法1を実行する。Proliaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。10mgのrFIXを、5mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、100μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMを添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4°Cで1時間インキュベートし、50μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin15R10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。酸化Proliaを含有する残余分約7mLを、2mLのm-トルイジン水溶液50mMと混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2.5時間インキュベートする。最後に、PEG-Prolia複合体を、SPセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH6.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepSPFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH6.5で溶出する。遊離Proliaを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH6.9に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PEG-Prolia複合体に対して、天然のProliaと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離Proliaを含有しないことを示す。方法2:Proliaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。Proliaを、反応緩衝液例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、1.0/-0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=22/-2°Cの温度Tで30/-5分間行う。次いで、T=22/-2°Cで、15分以内のL-システイン水溶液1Mの添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60/-5分間インキュベートする。酸化Proliaを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。酸化ヒュミラを含有する溶出液の画分を収集し、複合化反応に使用する。20kDの分子量の試薬を有するアミノオキシ-PEG試薬を、穏やかな撹拌下で、50倍モル過剰で、精製された酸化Proliaを含有する溶出液に最長期間tの15分以内で添加する。次いで、m-トルイジン水溶液50mMを15分以内で添加し、10mMの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、T=22/-2°Cの温度Tで、120/-10分間インキュベートする。得られたPEG-Prolia複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。PEG-Prolia複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースMilliporeから作製された膜を使用する限外濾過/透析濾過UF/DFによって濃縮する。方法3:Proliaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。EPOを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液10mMおよびm-トルイジン水溶液50mMと混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液1Mのの添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-Prolia複合体を、QセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。1.5mgのタンパク質/mLゲルを、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液、pH7.4で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、5mMのCaCl2および500mMの塩化ナトリウム、pH7.4を含有する50mMのHepes緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。代替的な実施形態において、以下の通りに方法3を実行する。Proliaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。10mgのProliaを、約8mLのヒスチジン緩衝液、pH6.020mMのL-ヒスチジン、150mMのNaCl中に溶解する。次いで、200μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液5mMおよび2mLのm-トルイジン水溶液50mMを添加する。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、100μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。最後に、PEG-Prolia複合体を、SPセファロースFF上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、20mLの緩衝液A50mMのHepes、pH6.5で希釈し、緩衝液Aで事前に平衡化した20mLのHiPrepSPFF16/10カラムGEHealthcare,Fairfield,CT上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B50mMのHepes、1MのNaCl、pH6.5で溶出する。遊離Proliaを、25の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50の緩衝液Bで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH6.9に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質Bradfordおよび生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PEG-Prolia複合体に対して、天然のProliaと比較して50超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、ShodexKW803カラムを搭載したAgilent1200HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付けるKolarichetal,Transfusion2006;46:1959-77。調製物が遊離Proliaを含有しないことを示す。方法4:Proliaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOFNOFCorp.,Tokyo,JapanのSunbright登録商標CAシリーズである。初期濃度または重量のヒュミラを、Hepes緩衝液50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0に移すか、またはその中に溶解して、Proliaの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm-トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ-PEG試薬上述を添加して、20倍のモル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL-システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。Prolia複合体を、イオン交換クロマトグラフィIECによって精製する。複合体を含有する溶出液の画分を、再生成されたセルロース88cm2、カットオフ10kD/Milliporeから作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをHepes緩衝液50mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.5に対して行う。調製物を、公知の方法に従う総タンパク質BradfordおよびBCA手順ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。実施例45分岐鎖PEGを使用する治療用タンパク質のPEG化本発明の治療用タンパク質のPEG化は、アルデヒドおよび活性アミノオキシ基を含有する適切なリンカーから作製される分岐鎖または直鎖PEG化試薬まで拡大され得る。"