"コハク酸生成微生物において、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることによって得られる、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物。前記コハク酸生成微生物は、ルーメンバクテリアであることを特徴とする請求項1に記載のコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物。前記ルーメンバクテリアは、マンヘミア属Mannheimiasp、アクチノバチルス属Actinobacillussp及びアネロビオスピリルムAnaerobiospirillumspからなる群から選択されることを特徴とする請求項2に記載のコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物。前記マンヘミア属菌株は、マンヘミアサクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPであることを特徴とする請求項3に記載のコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物。前記コハク酸生成微生物における、異化代謝産物抑制機構の弱化は、プルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を欠失させて行うことを特徴とする請求項1に記載のコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物。前記変異微生物は、マンヘミアサクシニシプロデュセンスPALFKKCTC11694BPであることを特徴とする請求項4に記載のコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物。異化代謝産物抑制機構の弱化は、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子を導入して行うことを特徴とする請求項1に記載のコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物。前記変異微生物は、マンヘミアサクシニシプロデュセンスPALKGKCTC11693BPであることを特徴とする請求項7に記載のコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物。コハク酸生成微生物において、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることを含む、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物の製造方法。前記コハク酸生成微生物は、ルーメンバクテリアであることを特徴とする請求項9に記載のコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物の製造方法。前記ルーメンバクテリアは、マンヘミア属Mannheimiasp、アクチノバチルス属Actinobacillussp及びアネロビオスピリルムAnaerobiospirillumspからなる群から選択されることを特徴とする請求項10に記載のコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物の製造方法。前記マンヘミア属菌株は、マンヘミアサクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPであることを特徴とする請求項11に記載のコハク酸産生にスクロースとグリセロールを同時に利用可能な変異微生物の製造方法。前記コハク酸生成微生物における、異化代謝産物抑制機構の弱化は、プルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を欠失させて行うことを特徴とする請求項9に記載のコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物の製造方法。異化代謝産物抑制機構の弱化は、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子を導入して行うことを特徴とする請求項9に記載の、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物の製造方法。請求項1~8のいずれか一項に記載の変異微生物を嫌気的条件で培養する段階及び前記培養液からコハク酸を回収する段階を含むコハク酸の製造方法。前記培養は、スクロースとグリセロールとが同時に含まれた培地で行われることを特徴とする請求項15に記載のコハク酸の製造方法。副産物として、他の有機酸の生成量は、コハク酸生成重量の1以下であることを特徴とする請求項15に記載のコハク酸の製造方法。下記段階を含むコハク酸生成能が向上したコハク酸の製造方法a高い収率を持って副産物生成が低いコハク酸産生変異微生物、または請求項1~8のいずれか一項に記載の変異微生物を嫌気的条件で培養する段階;b前記培養液内の細胞濃度を高濃度に濃縮させる段階;c前記高濃度の細胞を培養する段階;及びd前記培養液からコハク酸を回収する段階。培養液内の細胞濃度を高濃度に濃縮させる前記段階bは、イノキュラム法またはメンブラン細胞リサイクリングバイオリアクターMCRB法で行うことを特徴とする請求項18に記載の製造方法。本発明の目的は、スクロースとグリセロールとを同時に利用可能な菌株を開発して、コハク酸産生収率が理論水準に近接するように最大化しながら、同時に他の副産物の産生を極力最小化して、純粋にコハク酸だけを産生する異化代謝産物抑制機構が弱化された変異微生物を提供することにある。本発明の他の目的は、前記変異微生物を嫌気条件下で、スクロース及びグリセロールを炭素源として用いて、コハク酸以外の他の副産物を生成することなく純粋にコハク酸を製造する方法を提供することにある。前記目的を達成するために、本発明は、コハク酸生成微生物において、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることによって得られる、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物を提供する。さらに本発明は、コハク酸生成微生物において、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることを含む、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物の製造方法を提供する。さらに本発明は、前記コハク酸生成変異微生物を嫌気的条件で培養する段階及び前記培養液からコハク酸を回収する段階を含むコハク酸の製造方法を提供する。他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。一観点において、本発明は、コハク酸生成微生物において、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることによって得られる、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物に関する。本発明で異化代謝産物抑制機構cataboliterepressionmechanismとは、種々の炭素源が存在する培地で微生物が培養される際に、好ましい炭素源を選択的に活用する。これを可能にするために多くの微生物は好ましい炭素源がある時、好ましくない炭素源の利用を阻害する機序を持っており、これを異化代謝産物抑制機構というGorkeetalNatureReviews66132008。コハク酸産生菌株のマンヘミア菌株においても、異化代謝産物抑制機構によって、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に活用できなかった。一般に、スクロースとグリセロールとが同時に存在する場合には、好ましい炭素源であるスクロースを先に消費し、グリセロールを後で消費する。マンヘミアでも同様にスクロースを好み、スクロースとグリセロールとが同時に存在する場合には、スクロースをより速く代謝するようになる。本発明では、このような異化代謝産物抑制機構を人為的に弱化させようにした。異化代謝産物抑制機構のメカニズムを詳しく調べると、大きく転写レベルの阻害とアロステリック阻害の二つに分けられるDeutscheretalMicrobiolMolBiolRev709392006GorkeetalNaturereviews66132008PettigrewetalJBacteriol17828461996ZwaigetalJBacteriol1027531970。先に転写レベルでは、GlpRレギュレーターの作用でグリセロールを細胞内に輸送し、利用するのに用いられる遺伝子の転写transcriptionが阻害される。アロステリック阻害とは、グリセロール代謝で核心的な機能を担うグリセロールキナーゼにフルクトース1,6-ビスホスフェートFBPやEIIA等が結合して、その活性を落とすことをいう。スクロースとグリセロールとが同時にある環境では、GlpRレギュレーターによる転写レベルの阻害と、FBPとEIIAによるアロステリック阻害が、同時に起きて、グリセロール代謝が全般的に阻害される。従って、このような異化代謝産物抑制機構を弱化できる戦略は、GlpRによる転写レベルの阻害を弱化し、FBPやEIIAによるアロステリック阻害を受けないようにすることである。図1は、マンヘミア菌株でスクロース及びグリセロール代謝経路と異化代謝産物抑制機構を図式化したものである。図1のAは、一般のスクロース及びグリセロールの代謝経路とこれらの間の異化代謝産物抑制機構を示したもので、図1のBは、Aのどの部分を代謝工学的に改良した際に、異化代謝産物抑制機構を弱化させることができるのか示したものである。実線矢印は、スクロースやグリセロールの代謝経路を示し、その太さは相対的な代謝速度を示す。細い点の矢印は、PEPからPTSIIBCユニットまでのリン酸化基phosphorylgroupの連続的伝達過程を示し、太い点線の矢印は、glpオペロンの発現を誘導できる多様な経路を模式化したもので、リン酸化されたphosphorylatedIIAから始まる経路、アデニレートサイクラーゼACから始まる経路、CRP-cAMPから始まる経路、G3P-GlpRから誘導される経路等多様な経路が存在する。太い点線からなる端がT字状に詰まった線は、glpオペロンで核心的な役割を果たすグリセロールキナーゼGlpKに加えられるリン酸化されなかったnonphosphorylatedIIA及び/またはフルクトース1,6-ビスホスフェートFBPによるアロステリック阻害とその程度を相対的に示す。図1のAに示されたに、スクロースとグリセロールとの間の異化代謝産物抑制機構は、大きくGlpR等による転写阻害、及びFBP及びEIIAによるアロステリック阻害からなる。これを克服するためには、図1のBに示したように種々のアクチベータactivatorの生成を誘導して、転写阻害を克服し、FBPやIIAの濃度を低くすることでGlpK対するアロステリック阻害を緩和する等の方法がある。例えば、図1のBの1でIIBCFを除去することでリン酸化されたIIAの濃度を相対的に高めてACの発現を誘導し、これによってcAMPがより多く生成することで、CRP-cAMPの生成が増加するようになり、結果的にglpオペロンの発現を誘導する方法が挙げられる。このように発現したGlpKによって生成されたG3Pは、追加的に転写抑制要素であるGlpRをglpレギュロンglpABC、glpF、glpK等DNAの結合部位bindingsiteから離してglpレギュロンの遺伝子の転写をより一層スムーズにする。この時、相対的にリン酸化されなかったIIAの濃度は低く維持され、IIBCFの除去による全体的なスクロースの代謝能低下により、FBP濃度が相対的に低下し、アロステリック阻害を緩和させることも可能になり、このような2要素の同時効果により、グリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法である。他の例として、図1のBの2でリン酸化されたIIA濃度を高めてACの発現を誘導し、これをよりcAMPがより多く生成されて、CRP-cAMPの生成が増加することになり、結果的にglpオペロンの発現を誘導する方法が挙げられる。このように発現したGlpKによって生成されたG3Pは、追加的に転写抑制要素であるGlpRをglpレギュロンDNAの結合部位bindingsiteから離してglpレギュロンの遺伝子らの転写をより一層スムーズにして、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法である。さらに他の例として、図1のBの3でACの過発現を誘導して、cAMPをより多く合成するようにして、CRP-cAMPの生成を増加させ、結果的にglpオペロンの発現を誘導する方法が挙げられる。このように発現したGlpKによって生成されたG3Pは、追加的に転写抑制要素であるGlpRをglpレギュロンDNAの結合部位から離してglpレギュロンの遺伝子の転写をより一層スムーズにして、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法である。さらに他の例として、図1のBの4でCRPの過発現と3でのACの過発現を同時に誘導することで、CRP-cAMPの生成を増加させ、結果的にglpオペロンの発現を誘導する方法が挙げられる。このように発現したGlpKによって生成されたG3Pは、追加的に転写抑制要素であるGlpRをglpレギュロンDNAの結合部位bindingsiteから離してglpレギュロンの遺伝子の転写をより一層スムーズにして、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法である。さらに他の例として、図1のBの4でCRPの過発現を誘導して、CRP-cAMPの生成を増加させ、結果的にglpオペロンの発現を誘導する方法が挙げられる。このように発現したGlpKによって生成されたG3Pは、追加的に転写抑制要素であるGlpRをglpレギュロンDNAの結合部位から離してglpレギュロンの遺伝子の転写をより一層スムーズにして、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法である。さらに他の例として、図1のBの5でGlpKの過発現を誘導して、G3Pの生成を増加させ、転写抑制要素のGlpRをglpレギュロンDNAの結合部位bindingsiteから離してglpレギュロンの遺伝子の転写をより一層スムーズにして、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法がある。さらに他の例として、glpレギュロンに含まれる遺伝子全体を過発現させるか、各々を組み合わせて過発現させてグリセロール代謝の増大を持たせる方法がある。さらに他の例として、5で染色体上のglpレギュロン各転写単位の発現のためのプロモーター部位にGlpRが結合できる部位を持っていない過発現プロモーターを導入することで、GlpRによる阻害を元から遮断する方法によって、glpレギュロンを過発現させる方法によって、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法が挙げられる。また、GlpRを除去することで、glpレギュロンの発現阻害を弱化させて、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法があって、さらに他の例として、図1のBの6及び7でIIA及び/またはFBPの濃度を低くすることで、GlpKにアロステリック阻害程度を低くする方法によるグリセロール代謝を増加させる方法によって、結果的にグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法が挙げられる。また、上述した方法以外にも、前記方法を組み合わせ可能な方法と、これらから自明に類推できる方法、例えば、アロステリック阻害を相対的に少なく受けるように設計されるか、或いは少なく受ける異種菌株由来のグリセロールキナーゼを過発現することでグリセロール代謝の全般的な増大を持たせる方法があり、上述した方法以外の異化代謝産物抑制機構を弱化させ、グリセロール代謝を活発にできる方法等が可能である。一方、コハク酸は、このような還元化学物質の代表的な例として、PEPphosphoenolpyruvateを中間前駆体として持つカルボキシル基が二つあるC4化学物質である。また、コハク酸生成微生物は、他の代謝産物に比べてコハク酸を過量に産生する微生物であり、発酵によるコハク酸産生に産業的に用いられる微生物を意味する。代表的なコハク酸生成微生物としては、ルーメンバクテリアが挙げられ、ルーメンバクテリアにはアクチノバチラスActinobacillus属、アネロビオスピリルムAnaerobiospirillum属、及びマンヘミアMannheimia属Basfia属も含んで通称する。Basfia属は最初に分離された時マンヘミア属と命名されたが、後にBasfia属に分類され、16SrRNA配列も998一致する等の非常に類似する菌株であるため、ここではこれを全部併せてマンヘミア属と通称する。ScholtenetalWO2009024294A1KuhnertetalIntJSystEvolMicrobiol6044等が知られている。最近まで知らされたコハク酸を産生する種々のルーメンバクテリアの部分的な遺伝情報16srRNA、酵素分析、及び発酵結果を調べると、これらルーメンバクテリアのコハク酸産生のための炭素源の主要生合成経路が、ルーメンバクテリアの一種であるマンヘミア属のコハク酸産生生合成経路と略同じであることが分かる。特に、コハク酸生成に係るいずれのルーメンバクテリアも、コハク酸生成時二酸化炭素固定化酵素を利用して、C3化学物質であるホスホエノールピルビン酸phosphoenolpyruvateとピルビン酸pyruvateをC4化学物質であるオキサロ酢酸oxaloacetateとリンゴ酸malateに転化後、最終的にフマル酸fumarateを経てコハク酸を産生するZeikusetalApplMicrobiolBiotechnol515451999LeeetalApplEnvironMicrobiol7219392006。即ち、マンヘミア属を含む全てのルーメンバクテリアが同じコハク酸生合成経路を持つため、当業者において本発明の遺伝的変異を本実施例で示されたM.サクシニシプロデュセンス以外のルーメンバクテリア由来のコハク酸産生菌株に適用可能であることを予測できることは自明である。本発明において、前記コハク酸生成微生物は、ルーメンバクテリアであることを特徴とし、前記ルーメンバクテリアは、マンヘミア属Mannheimiasp、アクチノバチルス属Actinobacillussp及びアネロビオスピリルムAnaerobiospirillumspからなる群から選択されることを特徴とする。本発明において、前記マンヘミア属菌株は、マンヘミアサクシニシプロデュセンスMannheimiasucciniciproducensPALKKCTC10973BPであってもよい。本発明において、異化代謝産物抑制機構の弱化は、プルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を欠失させて行ってもよく、前記変異微生物は、マンヘミアサクシニシプロデュセンスPALFKKCTC11694BPであってもよい。本発明において、異化代謝産物抑制機構の弱化は、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子を導入して行ってもよく、前記コハク酸生成変異微生物マンヘミアサクシニシプロデュセンスPALKGKCTC11693BPであってもよい。本発明では、コハク酸産生微生物であるルーメンバクテリアの遺伝子操作を介して、コハク酸産生収率を最大化しながら、他の有機酸を全く産生しないコハク酸産生変異微生物を作製した。本発明の一実施例において、マンヘミアサクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPのゲノムDNAでプルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子fruAを欠失させることで、スクロースを代謝すると同時にグリセロールを代謝する能力を持った菌株であるM.サクシニシプロデュセンスPALFKKCTC11694BPを作製することで、副産物を全く産生することなく、コハク酸の生産性と収率を共に高水準に維持する菌株を作製した。本発明で前記各遺伝子の欠失は、相同組換え方法を利用して、該当遺伝子の不活性化させる方法を用いたが、該当遺伝子によってコードされる酵素が生成されないように、該当遺伝子を変形または除去させることができる遺伝子操作方法であるならば、制限なしに使用可能である。本発明に係るコハク酸生成変異微生物の培養及びコハク酸の取得過程は、従来発酵工程で通常知られた培養方法及びコハク酸の分離精製方法を用いて行われる。本発明で、M.サクシニシプロデュセンスPALFKKCTC11694BPのコハク酸収率と副産物生成程度及び炭素源代謝能を既存の変異菌株と比較した。これのために使った変異菌株は、M.サクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPである。M.サクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPは、マンヘミア属菌株のゲノムで乳酸脱水素化酵素をコードする遺伝子ldhA、ホスホトランスアセチル化酵素をコードする遺伝子pta及び酢酸キナーゼをコードする遺伝子ackAが欠失されている変異微生物であり、本発明に係る変異微生物であるM.サクシニシプロデュセンスPALFKKCTC11694BPでプルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子fruAが欠失されなかった菌株である。本発明に係るコハク酸生成変異微生物M.サクシニシプロデュセンスPALFKKCTC11694BPは、コハク酸産生に用いられる変異菌株であるM.サクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPと比較して、乳酸、ピルビン酸、酢酸、ギ酸等の副産物産生を最小化し、コハク酸産生収率を略理論収率水準1.71~1.86mol/molに高めて、コハク酸産生菌株として優れた特徴を示す。他の観点において、本発明は、コハク酸生成微生物において、スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることを含む、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物の製造方法に関する。本発明の一実施例で、マンヘミアサクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPのゲノムDNAに大腸菌のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を導入させることで、スクロースを代謝すると同時にグリセロールを代謝する能力を持った菌株であるM.サクシニシプロデュセンスPALKGKCTC11693BPを作製することで、副産物を全く産生することなく、コハク酸の生産性と収率が共に高い水準に維持する菌株を作製した。本発明に係るコハク酸生成変異微生物M.サクシニシプロデュセンスPALKGKCTC11693BPも前記のような方法で比較した。また他の観点において、本発明は、前記コハク酸生成変異微生物を嫌気的条件で培養する段階及び前記培養液からコハク酸を回収する段階を含むコハク酸の製造方法に関する。本発明において、前記培養は、スクロースとグリセロールとが同時に含まれた培地で行われることを特徴とし、前記副産物として、他の有機酸の生成量は、コハク酸生成重量の1以下であることを特徴とする。また他の観点において、本発明は、a高い収率を持って副産物生成が低いコハク酸産生変異微生物、または前記スクロースによるグリセロールの異化代謝産物抑制機構を弱化させることによって得られる、コハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物を嫌気的条件で培養する段階;b前記培養液内の細胞濃度を高濃度に濃縮させる段階;c前記高濃度の細胞を培養する段階;及びd前記培養液からコハク酸を回収する段階、を含むコハク酸生成能が向上したコハク酸の製造方法に関するものである。本発明において、培養液内の細胞濃度を高濃度に濃縮させる前記段階bは、播種時高濃度の生産菌株を注入するイノキュラム法以下、イノキュラム法またはメンブラン細胞リサイクリングバイオリアクターmembranecellrecyclingbioreactor;MCRB方法以下、MCRB法で行う方法を含むことを特徴とする。本発明に係るコハク酸産生にスクロースとグリセロールとを同時に利用可能な変異微生物を利用したコハク酸の産生方法によると、副産物が全くなく、高純度でコハク酸を産生可能であり、この時、コハク酸産生収率は、理論収率に近い超高収率で産生可能である。また、スクロースは、通常微生物発酵を介してコハク酸産生に用いられる葡萄糖価格の1/4であり、グリセロールは世界的なバイオディーゼル生産産業の急成長と共に、副産物として発生して供給過剰による価格下落と、適切な処理方法の開発が求められ、従ってその価格が非常に安く、持続的に減少傾向にあるMillerKleinAssociatesOct2006。これは、原料物質として莫大な原料費用の節減を介して現在化学合成法によって生産されているコハク酸を微生物発酵を介して安く生産できるようにする側面、そしてコハク酸産生収率を理論収率に近い超高効率で生産する側面、また、分離精製にかかる費用を最小化できるように超高純度で生産可能であるという側面から、その価値が非常に高いと言える。本発明に係るPALFK菌株を利用すると、副産物を略完璧に除去させながら、単独のコハク酸だけ産生することができ、この時、コハク酸産生収率yieldは、略理論収率1.71~1.86mol/molに近い非常に高収率が得られる。生産性productivity、収率yield、副産物の程度byproductssuccinicacid比の三つの要素は、コハク酸産生工程の産業化に当たり、最も核心的な要素であり、生産性工場の規模と連携され、初期工場設立費用capitalcost及びエネルギー費用energycostと関わる。収率は原料物質を如何に効果的に用いるかに関する尺度であり、バイオ工程で相当部分を占める原料費用rawmaterialcostと関わる。副産物の程度は、バイオ工程全費用の半分以上を占める分離精製費用separationandpurificationcostと関わる。従って、本発明の一実施例では、PALFK菌株を利用して収率を最大化し、副産物の産生程度を最小化することで、上述した三つの核心要素中の二つ収率及び副産物程度を達成可能な極端な水準に向上させた。更に、生産性を向上させるための方法を探すために鋭意努力し、その結果、イノキュラム法及びMCRB法を活用する等の培養液内の細胞濃度を増加させることによって母菌株に比べて各々2倍及び10倍以上生産性が向上することを確認した。以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。特に、下記実施例では、本発明に係る遺伝子を除去するために、特定ベクターと宿主細胞として、コハク酸生成微生物であるマンヘミア属微生物のみを例示したが、他種のコハク酸生成微生物を用いても、高い純度のコハク酸を生成する変異微生物を取得できることは当業界で通常の知識を有する者には自明であろう。実施例1:fruA欠失ベクターpSacHR06fruAの作製コハク酸生成微生物のゲノムからfruA遺伝子プルクトースホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を相同組換え方法で除去するために、遺伝子交換ベクターを次のように作製した。先にM.サクシニシプロデュセンスMBEL55EKCTC0769BPのゲノムDNAを鋳型として、配列番号1と2、配列番号3と4、配列番号5と6のプライマーを用いてfruA左側相同性部位HL、クロラムフェニコールCmを抵抗性遺伝子として含むPCR切片、及びfruA右側相同性部位HR各々のPCR切片を取得した。その後、配列番号1と6のプライマーを用いて前記三つのPCR切片を鋳型として、オーバーラッピングPCRを行って、このように得られたDNAの切片をSacIとPstIで切断し、これをpSacHR06ベクターに導入して、pSacHR06fruAベクターを完成した。配列番号1:5ATCGCGGATCCGGTGGAAACCCTCGGTTTATT配列番号2:5AATCTGCTCTGATGCGCAGCTAAAACCTGGTGCAATA配列番号3:5CCAGGTTTTAGCTGCGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAG配列番号4:5AATTACACTTGAAACCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTAC配列番号5:5ATCCACAGAATCAGGGTTTCAAGTGTAATTGGCGGAG配列番号6:5TCGACGCGTCGACTTCATCTAACCCCAACGCTTG実施例2:M.サクシニシプロデュセンスPALFK菌株の作製実施例1で作製されたfruA遺伝子除去用ベクターpSacHR06fruAを利用して、M.サクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPのゲノムにおいてfruAを欠失させて変異菌株を作製した。即ち、M.サクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPをBHIBrainHeartInfusion固体培地に塗抹して、36時間39°Cで培養した後、コロニーをBHI液体培地10mLに播種して、12時間培養した。十分に育った細胞培養液を再度BHI液体培地100mL1に播種して、39°Cの静置培養器で培養した。約4~5時間後、細胞成長が、OD600基準で0.3~0.5程度になった時、前記細菌培養液を0~4°Cに20分間置いて細胞成長がそれ以上進行されないように防ぎ、これを4°C、4,500rpmで15分間遠心分離して細胞を取得した。その後、4°Cの10グリセロール溶液200mLでセルを再懸濁した後、また前記条件で遠心分離し、このような再懸濁と遠心分離を、10グリセロール溶液を半分に減らしながら合わせて3回行った。最終的に得られたセルは、同じ体積の10グリセロール溶液で再懸濁し分株して、-80°Cに保管した。前記取得された細胞濃縮懸濁液と実施例1で作製した遺伝子除去ベクターpSacHR06fruAを混合して、2.5kV、25μF、200ohmsの条件でエレクトロポレーションelectroporationを行って、前記ベクターでM.サクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPの形質転換を試みた。このようにエレクトロポレーションelectroporationされた細胞は、BHI液体培地を加えて、39°C静置培養器で1時間回復培養した後、培養液を全部抗生剤クロラムフェニコール6.8μg/mLを含有するBHI固体培地に塗抹して、39°C静置培養器で48時間以上培養した。二重交叉doublecrossoverが起きたコロニーを選別するために、形成されたコロニーをクロラムフェニコール6.8μg/mLと100g/Lのスクロースを含有したBHI固体培地に塗抹してから、24時間培養した後、形成されたコロニーを同じ固体培地に再塗抹した。前記培地で形成された変異株を抗生剤が含まれたBHI液体培地で培養して、Rochelle等の方法RochelleetalFEMSMicrobiolLett100591992を応用して、培養菌株のゲノムDNAを分離した。前記分離された変異株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った後、取得されたPCR産物を電気泳動することで、ゲノムDNAのfruA遺伝子欠失の有無を確認した。fruA遺伝子の欠失の有無は、下記のように2回のPCRを行って確認した。まず、前記変異株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号7と8、そして配列番号9と10のプライマーを利用してPCRを各々行った。前記2回のPCR反応で得られたPCR断片を電気泳動してPCR断片の大きさを確認して最終fruAの欠失の有無を確認し、最終的にはM.サクシニシプロデュセンスPALFKKCTC11694BPを作製し、前記菌株を韓国生命工学研究院に受託したKCTC11694BP。配列番号7:5CTATGATTTGGTCGGGCGTTT配列番号8:5TGAATGGCAGAAATTCGAAA配列番号9:5TGATCTTCCGTCACAGGTAT配列番号10:5TTGACCGCACTTTGCACATC実施例3:pME18glpK22ベクターの作製及びこれを導入したM.サクシニシプロデュセンスPALKG菌株の作製大腸菌由来グリセロールキナーゼをコードする遺伝子glpK22を含むDNAを取得するために大腸菌K-12MG1655ATCC47076AmericanTypeCultureCollectionManassasVAUSAのゲノムDNAを鋳型として、配列番号11と12、配列番号13と14、配列番号15と16のプライマーを用いて各々PCRを行った。このように得られた三つのPCR産物を鋳型として再度PCRを行うことで、一つのPCR産物を取得し、このPCR産物にはコード配列の913番目の塩基対が本来大腸菌K-12MG1655のglpK遺伝子が持っていたグアニンがアデノシンに転化されているglpK22遺伝子が含まれているが、本遺伝子から発現するグリセロールキナーゼglycerolkinaseは変異前のglpKに比べてFBPとIIAによるアロステリック阻害を相対的に少なく受けることが知られているPettigrewetalJBacteriol17828461996。配列番号11:5ACTCCGGAATTCAACGCACTGACAATCTCACTT配列番号12:5CAGCGAAGCTTTTTGGGTAGAAAGTATAAAGACAGAATCACA配列番号13:5TTTATACTTTCTACCCAAAAAGCTTCGCTGTAATATG配列番号14:5CCATAAACACCGCACTTTCCAACGCATAGTTCACTTC配列番号15:5AACTATGCGTTGGAAAGTGCGGTGTTTATGGCAGG配列番号16:5ACCTGCGAGCTCATTATTGATGTGTGCGGGGTこのように得られたPCR産物をpME18JangetalApplEnvironMicrobiol7354112007にEcoRIとSacI部位にクローニングして、pME18glpK22ベクターを完成した。また、下記配列番号17~21のプライマーを利用して、ソルゼンントSolgentKoreaにシーケンシングを依頼して塩基配列の一致の有無を確認した。配列番号17:5TAGCTATGTGTTAAAGCCTT配列番号18:5ACCAGGGCACCACCAGCTCC配列番号19:5CCGATTACACCAACGCCTCT配列番号20:5ATGTGGTTCCGGCATTTACC配列番号21:5TTATGCCGCATCCGGTAGTCCC前記のように作製されたpME18glpK22をM.サクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPに導入することで、最終的にM.サクシニシプロデュセンスPALKGKCTC11693BP菌株を完成した。本発現ベクター導入のためには、実施例2に記載の細胞濃縮懸濁液製造方法と、エレクトロポレーションelectroporation方法と同様に行い、抗生剤クロラムフェニコールの代わりにアンピシリン25μg/mLを含有するBHI固体培地に塗抹して、39°C静置培養器で48時間以上培養した。純粋コロニーからBHI液体培地で8時間培養した後、最終濃度が15w/vとなるようにグリセロール溶液を混合した後、-80°Cに使用時まで保管した。実施例4:M.サクシニシプロデュセンスPALFK菌株及びPALKG菌株を利用した単一コハク酸産生前記実施例2及び3で作製されたM.サクシニシプロデュセンスPALFKKCTC11694BP、またはPALKGKCTC11693BP菌株を10g/Lスクロースを含んだ10mLのMH5培地リットル当り、2.5g酵母エキスyeastextract、2.5gポリペプトンpolypeptone、1gのNaCl、0.02gのCaCl22H2O、0.2gのMgCl26H2O、8.7gのK2HPO4、及び10.0gのNaHCO3に播種して嫌気条件下39°Cで8時間培養した後、これをまた同じ培地300mLに移して培養した。発酵は、前記培養液を2.5Lの合成培地リットル当り、1gのNaCl、2gのNH42HPO4、0.02gのCaCl22H2O、0.2gのMgCl26H2O、8.709gのK2HPO4、0.5gシステインcysteine、0.5gメチオニンmethionine、0.5gアラニンalanine、0.5gアスパラギンasparagine、0.5gアスパラギン酸asparticacid、2.46gプロリンproline、0.5gセリンserine、0.005gニコチン酸nicotinicacid、0.005gCa-パントセネートCapantothenate、0.005gピリドキシンHClpyridoxineHCl、0.005gチアミンthiamine、0.005gアスコルビン酸ascorbicacid及び0.005gビオチンbiotinを含有した微バイオリアクターBioflo3000NewBrunswickScientificCoEdisonNJUSAに播種して行い、発酵条件は、22.25g/L65mM初期スクロース濃度、4.6g/L50mM初期グリセロール濃度で、温度39°C200rpm条件で0.2vvm二酸化炭素体積/培養器内稼動体積workingvolume/分速度で純粋二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中pHはアンモニア水を用いて65に調整し、抗生剤は、PALKの場合、スペクチノマイシン50μg/mL、PALFKの場合、クロラムフェニコール6.8μg/mL、PALKGの場合、アンピシリン25μg/mLを各々添加した。高濃度のコハク酸産生のために、炭素源が完全に消耗した場合には、必要時700g/Lのスクロース及びグリセロール溶液を半連続的に添加した。前記と同様の方法でコハク酸産生用変異菌株であるM.サクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BPをPALFK菌株の性能と比較のために培養した。培養液内の細胞濃度は、分光光度計を利用して測定し、予め測定した分光光度計の吸光度と乾燥細胞の重量検証線を利用して細胞濃度を計算した。発酵過程中バイオリアクターから周期的にサンプルを採取し、採取された試料は13,000rpmで10分間遠心分離した後、上澄液の各種代謝産物及びコハク酸濃度、スクロース及びグリセロール濃度を液体クロマトグラフィーHPLCで分析した。その結果、図2及び表1に示した通り、M.サクシニシプロデュセンスPALFKKCTC11694BPは、M.サクシニシプロデュセンスPALKKCTC10973BP菌株と比較すると、より優れたコハク酸産生収率を示し、副産物を全く産生することなく、純粋にコハク酸だけを産生することが分かる。また、コハク酸と還元された程度が同じグリセロールの使用量が7倍程増え、これはグリセロールの摂取時に、スクロースを用いた時とは異なり、副産物産生と直接関わるピルビン酸産生が媒介されないことで、相対的に少ない副産物の産生となる。また、増えたグリセロール摂取量は、相対的に少ない量のスクロースを使用させることで、少ない量の炭素源で単一コハク酸だけを産生することで、より高いコハク酸産生収率yieldを示す。また、M.サクシニシプロデュセンスPALKGKCTC11693BPの場合には、PALFK菌株とは若干異なるパターンを示すが、それはスクロース利用能と細胞成長を阻害しない範囲内でグリセロール利用を増加させることで、ピルビン酸蓄積がPALK水準に維持される点である。それにもかかわらずPALK菌株と比較して2倍以上高いグリセロール利用能を示し、結果的に1.39mol/molの収率でコハク酸を産生して、PALKの1.24mol/molより高いコハク酸産生収率yieldを示す。実施例5:高収率単一コハク酸産生菌株であるM.サクシニシプロデュセンスPALFK菌株を利用した生産性向上本実施例では高収率単一コハク酸産生菌株であるM.サクシニシプロデュセンスPALFKの生産性向上方法を確認した。図2のBから分かるように、PALFK菌株は播種してから13~15時間後、最大生産性に到達しており、この時の細胞濃度が最も高いことが分かる。従って、生産性を最大化させるために、現在水準より細胞濃度をより高めた時、生産性の変化を先に調べた。実施例4と同様の培養条件で、PALFK初期細胞濃度をOD600=9.03水準に高めた時、コハク酸生産性の変化を調べようと、実施例4と同様にMH5培地に22.25g/Lスクロースと10g/Lグリセロールを含んだ5L培地条件で、微生物培養器Bioflo3000で温度39°C、200rpmの条件で、0.2vvm二酸化炭素体積/培養器内稼動体積workingvolume/分の速度で純粋な二酸化炭素を供給しながら発酵させた。発酵中pHは、アンモニア水を用いて6.5に調整し、抗生剤はクロラムフェニコール6.8μg/mLを添加した。PALFKを発酵させて、細胞濃度がOD600値が4.6近くなった時、培養を終了し、培養液を常温で6000rpm、10分間遠心分離することで、細胞ペレットを取得した。取得した細胞ペレットを再びMH5培地300mLに再懸濁させて、高濃度の接種材料が得られた。これを播種し、実施例4の条件で合成培地で培養した結果、図3及び表2に示したように、コハク酸生産性が6.03g/L/h最大区間生産性10.69g/L/hとなり、本来発酵条件に比べて2倍以上増加したことが分かり、副産物生成程度と収率が略類似することが分かった。従って、このような結果を基に、細胞濃度を人為的により増加させるために、メンブラン細胞リサイクリングバイオリアクターMCRBシステムを用いた図4のA。MCRBシステムは、細胞循環のために中空繊維膜ユニットhollowfibermembraneunitCellFloPlusModuleSpectrumLaboratoriesIncRanchoDominguezCAUSAをBioflo110リアクターNewBrunswickScientificCoに連結して用いて、この時workingvolume稼動体積は、0.4Lに維持させた。培養器内の撹拌速度は、100rpmに維持させ、細胞再循環のための隔膜diaphragmポンプの速度は、150mL/minに維持させた。合成培地組成は、プロリンのみが0.5g/L添加されたことを除いて実施例4と同様であった。培養器内の初期スクロース濃度は、22.25g/L、及び初期グリセロール濃度は、4.6g/Lであり、供給タンクfeedtank内では、30g/Lスクロースと21g/Lグリセロールが用いられた。MCRB操業のための希釈速度dilutionrate、Dは、1.027h-1に維持され、正常状態での成長を決めるcellbleeding速度は、0.015h-1に維持された。MCRB操業で正常状態は最小ターンオーバturnover時間希釈速度に応じて培養が進められた時、操業体積を1回満たすのにかかる時間を意味、D=1、または2なら操業体積を満たすには1h及び0.2hかかる以上の間隔で5回以上試料を分析して、細胞濃度、代謝産物の生成程度、炭素源の消費量等を測定し、これらが一定に維持された時と決めた。これにより、MCRB培養を進めた結果、図4のB及び表2に示したように、生産性が母菌株の10倍以上29.73g/L/hに増加した。また、コハク酸産生収率は、そのまま維持され、副産物の程度も実施例4の場合よりは若干高いが、低い水準を維持することが分かった。結論的に本実施例で示したように、産生収率及び副産物減少程度を最大化した後に、生産性を高める戦略で理論収率に近い高効率1.54mol/molでコハク酸を超高生産性で29.73g/L/hの産生に成功した。本実施例で提示したコハク酸生産性は、以前にあらゆる方法でも達成されたことのない超高生産性であり、さらに1.54mol/molの理論値に近い収率を達成すると共になされた点からその意義がより大きい。"