"胸腺リンパ球形成を行う非ヒト動物であって、a亜致死全身照射で処置されたレシピエント免疫不全動物と、b前記レシピエント動物の腎臓被膜下に移植される、T細胞が枯渇している胎児胸腺組織と、c成体骨髄ドナーのCD34細胞とを含み、前記胎児胸腺組織および前記CD34細胞は、HLA対立遺伝子を共有する、非ヒト動物。胸腺リンパ球形成を行う非ヒト動物であって、aステップbもしくはステップcの前またはそれと同時に、亜致死全身照射でレシピエント免疫不全動物にγ線照射を行うことと、b前記レシピエント動物に、T細胞が枯渇している胎児胸腺組織を移植することと、c前記レシピエント動物に、ある量の成体骨髄ドナーのCD34細胞を投与することと、を含む方法によって作製され、前記胎児胸腺組織および前記CD34細胞は、HLA対立遺伝子を共有する、非ヒト動物。前記胎児胸腺組織は、採取後に凍結保存し、埋め込み前に解凍することによって、T細胞を枯渇させられる、請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物。レシピエント動物は、マウス、ラット、またはブタである、請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物。前記胎児胸腺組織は、ヒト胎児胸腺組織であり、前記成体骨髄ドナーのCD34細胞は、ヒトのものである、請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物。前記レシピエント動物は、NOD/SCID、NOG、またはNSGマウスである、請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物。前記モデルは、ナイーブCD45RACD45RO-、CD62LCCR7細胞の存在によって特徴付けられる、回復したT細胞表現型を呈する、請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物。前記レシピエント動物は、末梢多系統細胞の再構成を呈する、請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物。前記成体骨髄ドナーのCD34細胞は、I型糖尿病を患うヒトドナーに由来する、請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物。前記動物レシピエントは、任意で、抗CD2mAbで処置される、請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物。前記成体骨髄ドナーのCD34細胞は、静脈内注射によって投与される、請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物。同種移植片ドナーのCD34細胞または造血細胞移植HCTレシピエントのCD34細胞をさらに含み、前記同種移植片ドナーのCD34細胞およびHCTレシピエントのCD34細胞は、前記レシピエント動物において、前記成体骨髄ドナーならびに前記同種移植片ドナーまたはHCTレシピエントの両方に寛容性であるT細胞を生成するために、互いに相互に寛容性であるT細胞を前記レシピエント動物において生成するように、前記胎児胸腺組織および前記成体骨髄ドナーのCD34細胞と、HLA対立遺伝子を共有する、請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物。胸腺リンパ球形成を行う非ヒト動物を作製するための方法であって、aステップbもしくはステップcの前またはそれと同時に、亜致死全身照射でレシピエント免疫不全動物にγ線照射を行うことと、b前記レシピエント動物に胎児胸腺組織を移植することであって、前記ヒト胎児胸腺組織はT細胞が枯渇していることと、c1~5×105の成体骨髄ドナーのCD34細胞を投与することと、を含み、前記胎児胸腺組織および前記CD34細胞は、HLA対立遺伝子を共有する、方法。前記胎児胸腺は、採取後に凍結保存し、埋め込み前に解凍することによって、T細胞を枯渇させられる、請求項13に記載の方法。レシピエント動物は、マウス、ラット、またはブタである、請求項13に記載の方法。前記胎児胸腺組織は、ヒト胎児胸腺組織であり、前記成体骨髄ドナーのCD34細胞は、ヒトのものである、請求項13に記載の方法。前記レシピエント動物は、NOD/SCID、NOG、またはNSGマウスである、請求項13に記載の方法。前記マウスモデルは、ヒト胸腺リンパ球形成を支持するか、主にナイーブなCD45RACD45RO-CD62LCCR7細胞の存在によって特徴付けられる回復したT細胞表現型を呈するか、末梢多系統細胞の再構成を呈するか、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項13に記載の方法。前記成体骨髄ドナーのCD34細胞は、I型糖尿病を患うヒトドナーに由来する、請求項13に記載の方法。前記動物レシピエントは、任意で、抗CD2mAbで処置される、請求項13に記載の方法。1~5×105の同種移植片ドナーのCD34細胞または1~5×105のHCTレシピエントのCD34細胞を投与することであって、前記同種移植片ドナーのCD34細胞およびHCTレシピエントのCD34細胞は、前記レシピエント動物において、前記成体骨髄ドナーならびに前記同種移植片ドナーまたはHCTレシピエントの両方に寛容性であるT細胞を生成するために、互いに相互に寛容性であるT細胞を、前記レシピエント動物において生成するように、前記胎児胸腺組織および前記成体骨髄ドナーのCD34細胞と、HLA対立遺伝子を共有することをさらに含む、請求項13に記載の方法。投与は、静脈内注射によって行われる、請求項13に記載の方法。前記成体骨髄ドナーのCD34細胞は、遺伝子修飾を有する、請求項13に記載の方法。前記ヒト成体骨髄ドナーのCD34細胞は、遺伝子修飾を有し、それによって、前記ヒト成体骨髄ドナーのCD34に由来する前記T細胞が、前記成体ドナーに留まるウイルスに耐性である、請求項16に記載の方法。前記遺伝子修飾は、CCR5、またはCXCR4、またはこれらの組み合わせのノックダウンまたは突然変異体を含み、それによって、前記成体ドナーのCD34細胞に由来する前記T細胞は、HIVに対する感受性が低くなるか、またはそれに対して耐性となる、請求項23に記載の方法。対象とされる抗原に対して特異性を有するT細胞を増殖させるための方法であって、請求項13に記載のステップa、ステップb、およびステップcを含み、d対象とされる抗原を前記動物モデルに投与し、それによって前記T細胞に前記抗原を認識させること、をさらに含み、ステップdは、ステップa、ステップb、もしくはステップcの前に、ステップa、ステップb、もしくはステップcと同時に、またはステップa、ステップb、およびステップcの後に行われる、方法。対象とされる抗原をさらに含み、それによって、前記対象とされる抗原に対して特異性を有するT細胞を増殖させる、請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物。請求項11に記載のステップa、ステップb、およびステップcを含み、d制御性T細胞を分化させるために、前記動物モデルを抗原に暴露すること、をさらに含む、T細胞を分化させるための方法。暴露は、APC、またはサイトカイン、またはこれらの組み合わせを、前記非ヒト動物に投与することを介して行われる、請求項28に記載の方法。対象において、胸腺欠乏、移植片拒絶、GVHD、自己免疫疾患、またはこれらの組み合わせを治療または予防するための方法であって、請求項1または請求項2に記載の動物モデルにおいて生成したヒトT細胞を、前記対象に投与することを含む、方法。請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物において生成される、単離したCD4、CD8T細胞、B細胞、単球、または樹状細胞、またはこれらの組み合わせ。請求項1または請求項2に記載の非ヒト動物において生成される、次の細胞のうちのいずれか1つ以上を含む、薬学的組成物:CD4T細胞、CD8T細胞、B細胞、単球、または樹状細胞。前記生成される細胞は、CD4T細胞、CD8T細胞、B細胞、単球、または樹状細胞である、請求項31に記載の単離細胞。前記生成さるた細胞は、ナイーブCD45RARO-CD62LCCR7T細胞を含む、請求項32に記載の薬学的組成物。対象における免疫関連または免疫媒介性障害または疾患を治療するための方法であって、請求項1または請求項2に記載の動物モデルにおいて生成されるT細胞を、対象に投与することを含む、方法。前記抗原は、腫瘍特異性抗原もしくは腫瘍に由来するもの、またはウイルス抗原、または自己抗原である、請求項26に記載の方法。自己腫瘍に対する癌患者の免疫応答を増加させるための方法であって、請求項26に記載の方法によって生成された、ある量のヒトT細胞を、癌患者に投与することを含む、方法。EBV、または日和見感染症によって引き起こされるリンパ増殖性疾患を患う免疫抑制された個体を治療するための方法であって、請求項26に記載の方法によって生成された、ある量のT細胞を、前記免疫抑制された個体に投与することを含む、方法。免疫抑制された個体においてEBVによって引き起こされるリンパ増殖性疾患を治療するための方法であって、請求項26に記載の方法によって生成されたT細胞を、前記免疫抑制された個体に投与することを含む、方法。前記個体は、HIV感染または免疫抑制処置のために免疫抑制されている、請求項38または請求項39に記載の方法。EBVによって引き起こされる前記リンパ増殖性疾患は、移植後のリンパ増殖性疾患である、請求項38に記載の方法。前記日和見感染症は、CMV疾患、アスペルギルス症、またはこれらの組み合わせである、請求項38に記載の方法。前記レシピエント動物は、2.5Gyでγ線照射される、請求項13に記載の方法。対象への薬物または治療の効果を判定するための方法であって、a請求項1に記載の動物モデルに薬物または治療を施すことと、b前記再構成された対象の免疫系に対する前記薬物または治療の前記効果を判定し、前記再構成された免疫系に対する前記薬物または治療の前記効果は、前記対象の前記免疫系に対する前記薬物または治療の前記効果を示すことと、を含む、方法。皮膚同種移植片拒絶を調節する免疫抑制剤を特定するためのインビボ方法であって、a請求項1に記載の動物に、皮膚同種移植片を移植することと、b前記動物に候補薬剤を投与することと、c前記皮膚同種移植片が、前記候補薬剤の存在下および非存在下において、前記動物によって拒絶されたかどうかを判定し、それによって、前記薬剤の存在下での拒絶の抑制の判定により、免疫抑制剤を特定することと、を含む、方法。I型糖尿病T1DMは、多重遺伝子の遺伝性および不明瞭な環境要因の相互作用からもたらされる。HLA遺伝子型が、最も強く疾患と関連するが15、非HLA関連の座位は、明らかにT1DMの危険性と関連している69。これらの座位の多くは、T1DMにおける免疫学的障害を最も厳密に複製したモデルである10121331418、NODマウスにおける自己免疫に寄与する非MHC座位に対してシンテニーである7。これらは、サイトカイン、副刺激分子、および阻害分子等の免疫調節遺伝子を含む761920。制御性CD4T細胞2124およびNK/T細胞2526における欠陥は、マウスおよびヒトの両方の疾患と関連している。遺伝子研究により、これらの遺伝子のうちのいくつかがNODマウスモデルにおいて自己免疫を促進する、機構の分析が可能となった671927。T1DMを有するヒトにおいては、しかしながら、非HLA関連の遺伝子から生じる根本的な欠陥は、大部分が定義されていない。これらの座位の多くが、免疫制御性遺伝子を含むことを考慮すると、造血幹細胞HSCを起源とする、免疫系の細胞における内在性異常が、自己免疫の発達に寄与することが推定できる。実際に、T、B、NK、NKT、および樹状細胞における異常は、NODマウスおよび/またはT1DM患者に関係している252735。しかしながら、これらの研究のほとんどが、疾患発症後のT1DM患者の分析に関与したものであり、原因と、疾患または疾患を引き起こす他の例えば、環境的要因の影響とを区別するものではない。したがって、制御された前向きな方法で、このような欠陥の分析を可能にするモデルに対する必要性が存在する。ある特定の態様において、本発明は、T1DMを促進する、HSC内在性の遺伝的に決定される免疫系の異常の特定を可能にすることができる、T1DM患者のHSCから強力な免疫再構成を可能にするヒト化マウスモデルの作製を提供する。この研究の目標は、このようなモデルを作製し、T1DMと関連するT細胞においてHSC内在性異常の探求を開始することである。ある特定の態様において、本発明は、対象のHSCから強力な免疫再構成を可能にする、ヒト化マウスモデルの作製を提供する。ある特定の実施形態において、対象は、疾患または障害を患っており、疾患または障害を促進する、HSC内在性の遺伝的に決定される免疫系の異常を特定することを可能にし得る。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、免疫障害である。ある特定の実施形態において、疾患は、HIVまたはAIDSである。他の実施形態において、疾患または障害は、自己免疫のものである。他の実施形態において、疾患または障害は、癌である。ヒト化マウスモデルを作製した。ヒトPBMCは、免疫不全マウスに定植させることができ36、ヒトT細胞は、免疫不全マウスの腎臓被膜下にHSC源胎児肝臓LIVを埋め込んだヒトHU胎児胸腺THY移植片において、正常に発達し得る37。しかしながら、これらのモデルで行うことができる免疫分析には、ヒトPBMCのレシピエントにおけるEBV関連のリンパ増殖性疾患の発症3638、ならびに高レベルで末梢免疫系に定植させるか、または正常に機能させるために、HUTHY/LIV移植片において生成されたT細胞不全373940を含む、制限がある。NK細胞が欠損した、クラスI欠損もしくは共通γ鎖γcノックアウトNOD-SCIDまたはRAGノックアウトのいずれかのマウスをヒトHSCのレシピエントとして使用することで4145、免疫機能の改善が報告されているが4142、それらは、HSCの周産期の注射を必要とし、マウス胸腺に定植するヒト胸腺細胞はわずかである。ヒトHSCの注射と腎臓被膜下へのヒト胎児THY/LIVの埋め込みとの組み合わせは、移植片内に多数約108の正常ヒト胸腺細胞、ならびにヒトT細胞、B細胞、免疫グロブリン、および骨髄と形質細胞様の両方の樹状細胞4647の高レベルの末梢再構成を有する、高レベルのヒト免疫再構成を可能にしている。異種移植片の自発的拒絶が、ヒト化マウスモデルに達成されており4647、T細胞および抗体の両方の応答が、タンパク質の免疫付与によって誘発される。このモデルは、最近、EBVでの免疫付与を示す応答を伴って再生成された48。このモデルにヒト胎児THYを埋め込むことにより、ヒト胸腺細胞前駆体の最適なホーミング、増殖、および発達を可能にし、いったんT細胞が発達して末梢に移動すると、末梢内の再構成されたリンパ組織およびヒト同系APC集団は、これらのT細胞の増殖、生存、および機能を促進する。機能性および表現型的に正常な制御性T細胞Tregもまた、これらの移植片において生成される。これらのTregが、胸腺での正の選択の際に存在するものと同じHLA/ペプチド複合体との相互作用によって、機能性となることが、証拠によって示される。胸腺上皮細胞MHC/ペプチド複合体は、Tregの正の選択を行い4951、マウスのデータは、末梢でのMHC52および同種抗原53との接触は、制御性T細胞が完全な機能を取得し、それを維持することを可能にすることを示す。胸腺からの移出に続いて、末梢T細胞は、T細胞の損失が、ナイーブおよびメモリーT細胞の恒常性増殖によって均衡される、動的状態に入り54、非常に安定した寸法のT細胞のプール寸法を維持する5556。この種類の増殖を受けるナイーブT細胞は、特異性抗原の接触なしに、それらの表現型をメモリーT細胞のものに恒久的に変換し5763、サイトカイン生成等、ある特定のエフェクター機能を得ることができる6465。年齢に伴う胸腺機能の減少、感染によるクローン性増殖、およびウイルス感染または治療的介入によるリンパ球減少等の生存中のイベントは、これらの恒常性プロセスによって均衡される54。T細胞の恒常性増殖は、正の選択の際に胸腺中に存在するものと同じ自己MHC/ペプチド複合体5458667163677274、ならびにIL-7およびIL-15等のサイトカイン54727579を必要とすることが示されている。さらに、末梢内のMHC/ペプチド複合体は、それらの自己免疫能力52を制限するために、通常のT細胞を調整することに重要な役割を果たす。リンパ球減少によってもたらされる増殖における異常は、NODマウスおよびヒトにおけるT1DMの病因と関係している。NODマウスにおける免疫欠陥を説明する1つのモデルは、T細胞による抗アポトーシス分子の発現の減少と関連して、末梢T細胞のアポトーシスの増加を伴い、リンパ球減少、IL-21生成、およびIL-21によってもたらされるT細胞の活性化および増殖につながる80。自己寛容性の低下は、部分的に、自己反応性T細胞クローンが、自己抗原に対するそれらの親和性のために、この環境で競合および生存する能力を反映する548082。実際に、T1DM9091を含む、いくつかのヒト自己免疫疾患8389は、リンパ球減少と関連しており、T1DMの発症は、リンパ球減少を誘発するウイルス感染に続いて起こる場合がある54。Tregの数および機能における欠陥が、T1DM患者およびNODマウスに報告されている22249297。さらに、Tregの移入9899は、NODマウスにおいて自己免疫を逆転させ得る。しかしながら、Tregの欠陥は、全ての研究に見られたわけではない。いくつかの場合では、NODマウスは、加齢および疾患の発症を伴ってさえも99、Tregの数および機能を保存したことが判明しており100101、いくつかのヒト研究は、T1DM患者におけるTregの保存を示している102。これらの矛盾するデータのうちのいくつかは、以前の研究ではCD4Tregの識別にCD25マーカーのみを使用し、このマーカーが活性化されたT細胞も特定するため、これによって説明することができる99101102。より最近の研究は、リンパ系組織ではなく膵臓内の炎症部位でのTregの不足、および制御に対するエフェクター細胞の相対的耐性により、NODモデルにおける疾患進行の最終段階を特徴付けることができることを示す101。しかしながら、T1DMを有するヒトにおける研究は、末梢血試料の分析に限定されており、ヒトTregに一次欠陥が存在するかどうか、およびそれがT1DM患者では遺伝子にプログラムされているかどうかについては、多くが不明なままである。さらに、NODマウスの末梢253031103104および胸腺105106、ならびにT1DM患者の血液において、NKT細胞の欠陥が説明されている2692101。NKT細胞数の減少は、全てのT1DM患者の研究に見られているわけではないが107108、これらの細胞による活性化の欠損、ならびにIFN-γ3292103およびIL-492106109の両方を含むサイトカインの生成が、疾患病因に関係している。NKT細胞の数を増加させること110111、ならびに既存のNKT細胞のインビボでの活性化112114により、NODマウスにおける自己免疫を逆転させることができる。これらの動物におけるNKT細胞機能の異常についての遺伝的根拠は、NODバックグラウンドでの、Idd6座位を有するNK複合体への繁殖によるその逆転によって示される115。ある特定の態様において、本発明は、T1DM患者のHSCから発達するTregの発達、末梢生存、または末梢調整52における欠陥の可能性を試験するためのヒト化マウスモデルおよび方法を提供する。本モデルは、TregおよびNKT細胞の発達における、遺伝子にプログラムされた胸腺内および末梢の両方の欠陥の役割を試験する機会を提供する。ある特定の態様において、本発明は、成体ドナーに由来する骨髄細胞を使用して、マウスにおいて多数の多様な機能性ナイーブT細胞を生成する方法を提供する。本方法は、HLA対立遺伝子を成人患者の骨髄ドナーに由来するCD34細胞と共有する、凍結保存して解凍したヒト胎児胸腺組織を使用することを伴う。胎児胸腺を腎臓被膜下に埋め込み、CD34細胞を、限定されないが、NOD-scid-共通γ鎖ノックアウトNSG免疫不全マウス、NOD/Shi-scid/IL-2RγnullNOGマウス、または好適な遺伝子型を有する任意の他のマウス等の任意の好適なマウスに静脈内注射する。胸腺と成人患者ドナーから生成された抗原提示細胞との間でHLAを共有するため、生成されるT細胞は、同じ成体ドナーの抗原提示細胞と最適に機能することができる。ある特定の実施形態において、移植片内に既に存在するT細胞が、成体骨髄ドナー細胞またはレシピエントマウスを攻撃することがないように、胸腺移植片の凍結保存および解凍と併せて、抗CD2抗体をマウスに与える。注入された成体骨髄CD34細胞に由来する胎児胸腺移植片で発達するT細胞は、CD34細胞ドナーおよびマウスに対して、おそらく、これらがいずれも胸腺内で寛容性の誘発に寄与する抗原提示細胞を生成するため、寛容性である。胸腺および成体CD34細胞移植片を受容するマウスの末梢に定植するT細胞は、機能性および寛容性であることが示されている。さらに、成体骨髄ドナーと比較して、再構成されたマウスにおけるT細胞の免疫系は、回復している、すなわち、抗原と接触経験のないナイーブ型のT細胞の割合が、大幅に増加する。元の骨髄ドナーに注入するために多数のナイーブT細胞が利用可能であることは、高齢、広範な化学/放射線療法治療、T細胞を枯渇させた造血細胞の移植、免疫抑制剤治療、移植片対宿主病、またはHIV感染のために、胸腺が不足した患者において、非常に多くの治療用途を有する。ある特定の態様において、本発明は、患者のT細胞の再構成/免疫療法のために、T細胞を含むがこれに限定されない細胞を、治療的に使用する方法を提供する。ある特定の態様において、本発明は、本発明のヒト化マウスモデルによって生成された免疫細胞の養子移入の治療的方法を提供する。種々の疾患または障害を治療するための養子移入方法を記載する参考文献を本明細書に提供し、これらの参考文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。PJAmroliaGMuccioliCasadeiHHulsSAdamsADurettAGeeEYvonHWeissMCobboldHBGasparCRooneyIKuehnleVGhetieJSchindlerRKranceHEHeslopPVeysEVitettaandMKBrennerAdoptiveimmunotherapywithallodepleteddonorTcellsimprovesimmunereconstitutionafterhaploidenticalstemcelltransplantationBlood108179718082006、HEHeslopKSSlobodMAPuleGAHaleARousseauCASmithCMBollardHLiuMFWuRJRochesterPJAmroliaJLHurwitzMKBrennerandCMRooneyLongtermoutcomeofEBVspecificTcellinfusionstopreventortreatEBVrelatedlymphoproliferativediseaseintransplantrecipientsBlood1159259352010、PJHanleyCRCruzBSavoldoAMLeenMStanojevicMKhalilWDeckerJJMolldremHLiuAPGeeCMRooneyHEHeslopGDottiMKBrennerEJShpallandCMBollardFunctionallyactivevirusspecificTcellsthattargetCMVadenovirusandEBVcanbeexpandedfromnaiveTcellpopulationsincordbloodandwilltargetarangeofviralepitopesBlood114195819672009、AMLeenAChristinGDMyersHLiuCRCruzPJHanleyAAKennedyNasserKSLeungAPGeeRAKranceMKBrennerHEHeslopCMRooneyandCMBollardCytotoxicTlymphocytetherapywithdonorTcellspreventsandtreatsadenovirusandEpsteinBarrvirusinfectionsafterhaploidenticalandmatchedunrelatedstemcelltransplantationBlood114428342922009、CMBollardSGottschalkAMLeenHWeissKCStraathofGCarrumMKhalilMFWuMHHulsCCChangMVGresikAPGeeMKBrennerCMRooneyandHEHeslopCompleteresponsesofrelapsedlymphomafollowinggeneticmodificationoftumorantigenpresentingcellsandTlymphocytetransferBlood110283828452007、CQuintarelliJFVeraBSavoldoGMGiordanoAttianeseMPuleAEFosterHEHeslopCMRooneyMKBrennerandGDottiCoexpressionofcytokineandsuicidegenestoenhancetheactivityandsafetyoftumorspecificcytotoxicTlymphocytesBlood110279328022007、BSavoldoJAGossMMHammerLZhangTLopezAPGeeYFLinREQuirosTejeiraPReinkeSSchubertSGottschalkMJFinegoldMKBrennerCMRooneyandHEHeslopTreatmentofsolidorgantransplantrecipientswithautologousEpsteinBarrvirusspecificcytotoxicTlymphocytesBlood108294229492006、AMLeenGDMyersUSiliMHHulsHWeissKSLeungGCarrumRAKranceCCChangJJMolldremAPGeeMKBrennerHEHeslopCMRooneyandCMBollardMonoculturederivedTlymphocytesspecificformultiplevirusesexpandandproduceclinicallyrelevanteffectsinimmunocompromisedindividualsNatMed12116011662006、YCuiHZhangJMeadorsRPoonMGuimondandCLMackallHarnessingthephysiologyoflymphopeniatosupportadoptiveimmunotherapyinlymphorepletehostsBlood114383138402009、GBrestrichSZwingerAFischerMSchmuckARohmhildMHHammerAKurtzLUharekCKnosallaHLehmkuhlHDVolkandPReinkeAdoptiveTcelltherapyofalungtransplantedpatientwithsevereCMVdiseaseandresistancetoantiviraltherapyAmJTransplant9167916842009、KPMicklethwaiteLClancyUSandherAMHansenEBlythVAntonenasMMSartorKFBradstockandDJGottliebProphylacticinfusionofcytomegalovirusspecificcytotoxicTlymphocytesstimulatedwithAd5f35pp65genemodifieddendriticcellsafterallogeneichemopoieticstemcelltransplantationBlood11239743981200、BGTillMCJensenJWangEYChenBLWoodHAGreismanXQianSEJamesARaubitschekSJFormanAKGopalJMPagelCGLindgrenPDGreenbergSRRiddellandOWPressAdoptiveimmunotherapyforindolentnonHodgkinlymphomaandmantlecelllymphomausinggeneticallymodifiedautologousCD20specificTcellsBlood112226122712008、GParmianiADeFilippoLNovellinoandCCastelliUniquehumantumorantigensimmunobiologyanduseinclinicaltrialsJImmunol178197519792007、JJSussmanRPariharKWinsteadandFDFinkelmanProlongedcultureofvaccineprimedlymphocytesresultsindecreasedantitumorkillingandchangeincytokinesecretionCancerRes64912491302004。本発明は、対象において、例えば癌であるがこれに限定されない疾患、または免疫不全を治療または予防する方法を提供する。本方法の実施形態は、ヒト化マウスモデルから単離した自己T細胞を含む組成物を、疾患または免疫不全を治療するのに効果的な量で対象に投与することを含み、自己T細胞は、体外で増殖、培養、または活性化されない。ある特定実施形態において、本発明は、任意でリンパ球枯渇化学療法を受けている患者における癌を治療する方法を提供し、本方法は、NKTを含むがこれに限定されない、本マウスモデルから単離した自己T細胞を含む組成物を、癌を治療するのに効果的な量で対象に投与することを含む。当業者は、治療効果を達成するために、本ヒト化マウスモデルから単離した細胞を投与するための用量およびレジメンを容易に決定することができる。本発明の一態様によると、抗原特異的養子T細胞免疫療法を、マウスモデルからT細胞を得ることによって提供し、ここで、T細胞を、この療法が対象とする特異的な抗原の存在下でマウスモデルにおいて体外ではなくインビボで増殖させて、増殖したT細胞を患者内に戻す。別の態様によると、本発明は、少なくとも1つの標的抗原に特異的なT細胞の調製物を生成するための方法を提供する。このような調製物は、特に、感染性疾患、癌、および抗原特異的T細胞が対象に有効である他の疾患の治療における、医療目的での養子移入に使用することができる。本発明による方法は、上述のようなヒト化マウスモデルを作製するステップ、マウスモデルを対象となる抗原に暴露するステップ、抗原特異的T細胞の集団を生成するステップ、マウスからT細胞集団を単離するステップ、および単離したT細胞を治療効果をもたらすのに十分な量で骨髄ドナーに投与するステップを含む。単離ステップは、任意の好適な方法によって行うことができ、例として、例えば、注射による細胞調製物の患者への適用を促進するように、遠心分離または他の手段で細胞調製物を濃縮することによる、細胞の沈降を含んでもよい。本発明の別の態様により方法を提供し、それによって、1つ以上の標的抗原またはそのペプチド断片をマウスに投与する。例えば、ペプチドもしくはタンパク質断片として可溶性形態で、または担体構造に複合化されたこのような標的抗原の存在が、ヒト化マウスモデルの免疫系を刺激して、標的抗原に対抗する免疫細胞を生成することになる。ある特定の態様において、本発明は、例えば、特定の感染症または癌を含むがこれらに限定されない、疾患または障害の治療のための方法であって、ヒトT細胞を投与することを含み、非限定的な例において、これらは、特許請求されるマウスモデルの胸腺周辺から単離した細胞である、方法を提供する。具体的な用途に応じて、治療方法に使用する細胞は、特定の細胞集団または全レパートリーのT細胞の移植を含み得る。ある特定の態様において、本発明は、免疫系の再構成を、それを必要とする対象、例えば、限定されないが、胸腺が正常に機能していない対象に行うための方法であって、非限定的な例においては、マウスモデルの末梢から単離したヒトT細胞を投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、養子移入方法で使用する細胞は、マウスモデルに由来するT細胞である。ある特定の実施形態において、T細胞を単離し、精製する。ある特定の実施形態において、養子移入によって注入されるT細胞は、CD8T細胞である。他の実施形態において、養子移入によって注入される細胞は、ナイーブT細胞を含む、T細胞の全レパートリーを含むか、本質的にそれから構成されるか、またはそれから構成される。ある特定の実施形態において、養子移入方法に使用する細胞は、ヒト対象への投与に好適な治療的組成物に含まれる。元の骨髄ドナーに注入するために多数のナイーブT細胞が利用可能であることは、高齢、広範な化学/放射線療法治療、T細胞を枯渇させた造血細胞の移植、免疫抑制剤治療、移植片対宿主病、またはHIV感染のために胸腺が不足した患者において、非常に多くの治療用途を有する。ある特定の態様において、本方法は、特異的抗原での免疫付与を含み、それによって、マウスが、骨髄ドナー/患者では有効な免疫応答に達することができない、特異的抗原を認識するT細胞を提供することもまた可能となる。非限定的な例において、腫瘍特異的T細胞が腫瘍自体によって寛容性となっている癌患者に、本マウスモデルから得たT細胞を注入することができ、マウスは、癌患者由来のCD34細胞で再構成され、マウスは、患者の癌に由来する抗原に暴露されている。別の実施形態において、EBVによって引き起こされるリンパ増殖性疾患、例えば、限定されないが、例として、移植後のリンパ増殖性疾患を発症した免疫抑制患者に、本マウスモデルから得られたT細胞を注入することができる。ある特定の実施形態において、マウスモデルは、EBV抗原で免疫付与される。別の実施形態において、免疫抑制された患者、および/または日和見感染症、例えば、限定されないが、CMV疾患、アスペルギルス症、または任意の他のウイルス性、細菌性、もしくは真菌性の感染が発症するHIV感染を有する患者に、本マウスモデルから得られたT細胞を注入することができる。ある特定の実施形態において、マウスモデルは、CMV抗原で免疫付与される。ある特定の実施形態において、成体ドナーのCD34細胞は、マウスにおいて生成されたT細胞を受容することになる成人患者内に残存するウイルスに耐性となるように、遺伝子修飾することができる。このような修飾の非限定的な例には、HIV感染患者に由来するCD34細胞におけるCCR5および/またはCXCR4のノックダウンまたは突然変異が含まれ、患者に戻されたときに、マウスモデルで生成された新しいT細胞を、HIV感染に耐性にすることになる。マウスの免疫付与による、所望の特異性を有するT細胞の増殖に加えて、特定の所望される機能のためのT細胞の分化もまた、マウスモデルにおいて行うことができる。非限定的な例において、それぞれ、移植片拒絶/GVHDまたは自己免疫疾患を治療/予防するために、マウスを、例えば、特定のAPC、サイトカインを介して、制御性T細胞の分化を促す方法で、ドナーの抗原または患者の自己抗原に暴露することができる。他の実施形態において、マウスはまた、器官または造血細胞の移植が、レシピエント、またはドナーのHCT移植片、T細胞枯渇の使用を伴う状況において、同種移植片ドナーまたはHCTレシピエントに先験的寛容性の免疫系を生成するために使用することができる。例えば、患者は、同じドナーに由来する器官に対する混合キメラ/寛容性誘発の目的で、同種HCTのための骨髄非破壊的レジメンの一部として、徹底的なインビボT細胞枯渇を受ける場合がある。混合キメラが患者において生成されている間、またはその前でさえも、ドナーおよび患者両方に由来するCD34細胞は、マウスにおいて互いに対して相互に寛容性であるT細胞を再構成することができる。これらは、年齢および/または前処置療法のためにその胸腺がうまく機能していない、成体レシピエントの迅速な免疫の再構成を達成するために、注入することができる。ある特定の態様において、本発明は、マウスモデルを提供し、このマウスは、ドナーおよびレシピエントに由来するCD34細胞の静脈内注入を受容しており、それによって、再構成された免疫系は、混合キメラを示し、再構成されたT細胞は、レシピエントおよびドナーの両方の組織および/または細胞に寛容性である。一態様において、本発明は、非ヒト動物が、大型プールの自己多クローン性の多様なナイーブT細胞のインビボ発達を効果的にもたらすように、ドナーに由来するCD34細胞、および例えば凍結保存および解凍によって事前にCD34細胞を枯渇させた胸腺由来組織のレシピエントである、非ヒト動物を提供する。上述の混合キメラは、骨髄移植、器官または組織の移植に利点を提供する。実施例1I型糖尿病T1DMの遺伝的要因は、制御性細胞の機能および恒常性増殖におけるT細胞内在性の異常と関連する可能性がある。制御性T細胞機能における異常は、NODマウスモデルおよびT1DM患者に関連づけられている。リンパ球減少および増加した恒常性増殖もまた、NODマウスにおける自己免疫の発展と関連づけられている。しかしながら、これらの現象の分析が可能であるモデルは、これまで、ヒトT細胞に利用可能ではなかった。本発明は、ヒト胸腺異種移植片と組み合わせたヒト抗原提示細胞APCでの強力な末梢再構成が、Tregを含む、ヒトT細胞の最適な発達、末梢生存、および機能を可能にする、ヒト化マウスモデルを提供する。さらに、胸腺異種移植片と一緒に埋め込まれた胸腺上皮細胞は、胸腺細胞の選択および寛容性に影響を及ぼし得る。ある特定の態様において、本発明は、HLA決定済みヒト胸腺異種移植片でのヒト胸腺リンパ球形成を可能にする、ヒト胸腺移植モデルを再凝集させるための方法を提供する。これらの研究は、ヒト化マウスモデルを拡張し、インタクトな胎児胸腺組織を埋め込む代わりに、HLA型判定済みヒト胎児胸腺組織から凍結保存されたCD45陰性胸腺間質細胞を、NOD-SCIDマウスの腎臓被膜下に埋め込む。共通の糖尿病感受性HLA対立遺伝子を保有する胸腺は、これらの対立遺伝子を共有する正常対照および1型糖尿病対象に由来する、静脈内注射されたCD34細胞からのT細胞の胸腺リンパ球形成を支持するであろう。代替的なアプローチには、HLAトランスジェニックNODマウスに由来する胸腺上皮細胞をインタクトなヒト胸腺組織に注射すること、または糖尿病感受性対立遺伝子をコードする遺伝子を胸腺異種移植片にアデノウイルス形質導入することが含まれる。ある特定の態様において、本発明は、正常対照と対比して、T1DMのCD34細胞に由来する通常のT細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型の変換、および自己寛容性を比較するための方法を提供する。T1DM患者に由来するT細胞が、胸腺ドナーの自己抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかを判定する。恒常性における内在性の異常が、T1DM患者のT細胞を特徴付けるかどうかを判定する。ある特定の態様において、本発明は、正常対照と対比して、T1DMのCD34細胞に由来する制御性T細胞の数、機能、および末梢表現型の変換を比較するための方法を提供する。T1DM患者の幹細胞に由来するTregおよびNKT細胞は、欠陥を示す場合がある。これらの研究は、T1DM患者由来、およびそれらの胸腺対胸腺後の起源に由来する制御性細胞における内在性異常を特定するであろう。ある特定の実施形態において、骨髄は、HLA型判定済みのT1DM患者および健常志願者から採取する。5~6mlのBM吸引液は、10~12匹のNOD-SCIDマウスに移植するために十分なCD34細胞約1.25×106を提供するであろう。HLAトランスジェニックNODマウスが利用可能であり、当該技術分野で既知の方法によって作製することができる。T1DM患者および対照のHSCからの胸腺リンパ球形成を支持するために同種ヒト胸腺を使用するアプローチを支持するデータを、本明細書に提供する。ある特定の実施形態において、以下が提供される:1ヒト通常および制御性T細胞の発達、機能、および恒常性の詳細な分析を可能にするヒト化マウスモデルの作製、2異種胸腺でのヒトT細胞の発達を伴うこのモデルにおける変形。これらの研究を通じて得られたデータは、ある特定の実施形態において、MHC分子をHSCドナーと共有するヒト胸腺移植片を伴うモデルが、最適なヒトTregの発達および機能ならびにT細胞の恒常性に不可欠であることを示す、3胸腺移植片への胸腺上皮細胞の埋め込みが、正常なTregおよび通常T細胞の発達および機能を促進し得ることを示す、さらなる異種胸腺の移植モデルを提供する。ヒト免疫応答を評価するためのヒト化マウスモデル。ヒト胎児胸腺THYを、胎児肝臓LIV組織片とともにマウスの腎臓被膜下に埋め込むことにより、免疫不全マウスでの正常なヒト胸腺リンパ球形成およびT細胞の発達を達成する116図1。これらのマウスにおけるヒトT細胞の発達は、強力な同種および異種の混合リンパ球応答MLRを示したが、ブタ皮膚の異種移植片を拒絶する能力はなかった46117。胸腺後のT細胞の自己ペプチドMHCリガンドとの接触が成熟T細胞の抗原反応性を維持するため118、およびHSC由来のAPCが抗原特異的なT細胞の応答を促進するため119、理論に束縛されることなく、末梢ヒトAPCの不足は、THY/LIVを移植したマウスにおいてヒト胸腺移植片で発達するヒトT細胞のインビボ免疫応答を制限し得る。免疫不全マウスへのヒトHSCの静脈内投与が、高レベルの非T細胞ヒト免疫の再構成を可能にするため120129、T細胞の再構成および機能の改善は、ヒトTHY/LIV移植片のNOD-SCIDレシピエントにCD34細胞の静脈内移植を追加することによって達成することができる。NOD-SCIDマウスに、1.5~3GyのTBIを受けさせ、続いて腎臓被膜下にヒト胎児THY/LIV組織を、単独またはCD34胎児肝臓細胞FLC、1×105とともに、静脈内移植した。CD34HSCの静脈内添加は、ヒト造血再増殖およびリンパ球形成を有意に改善した図2。機能性のヒト胸腺リンパ球形成すなわち、CD3T細胞の発達は、両方の群に検出されたが、CD19B細胞および骨髄細胞系統の著しい再増殖は、THY/LIV/CD34FLCを移植したマウスにのみ見られた図2。さらに、THY/LIVを移植したものではなく、THY/LIV/CD34FLCを移植したマウスに由来するレシピエントのリンパ節は、対照であるNOD-SCIDの未発達な節と比較して、著しく増大した免疫応答性マウスのリンパ節に類似する寸法まで。前者は、ヒトCD3T、CD19B、ならびにLinクラスII骨髄および形質細胞様の樹状細胞である図3および47。THY/LIV/CD34FLCを移植したマウスはまた、ヒトIgの血清レベルを有意に増加させた図4A、B。これらのマウスは、ブタ皮膚図4C、Dおよび膵島図4E、F異種移植片を拒絶する能力によって示されるように、著しく改善されたインビボでのヒト免疫応答を示した。この研究は、最初に、事前に活性化したヒトT細胞を注射することなく、ヒト化免疫不全マウスにおける異種移植片の拒絶を実証するものであった。抗原特異的ヒトT細胞および抗体応答を、ヒトThy/Liv/CD34FLCを移植したすなわちヒト化NOD-SCIDマウスにおいて評価した。図5Aに示されるように、対照ではなく、DNP-KLHで免疫付与したヒト化マウスに由来するT細胞が、インビトロでKLHに応答して増殖した。胚中心が、免疫付与したヒト化マウスの二次リンパ組織に検出された図5B。DNP特異的IgG主にIgG1およびIgG2が、免疫付与したヒト化マウスに検出されたが、対照には検出されなかった図5C。したがって、これらのマウスにおけるヒト免疫系の発達は、インビボで特異的なTおよびB細胞の応答を媒介することができる。ヒトCD34細胞をヒトTHY/LIV移植片のレシピエントに静脈内投与することによって達成されたT細胞機能の改善は、末梢におけるヒトAPCとの相互作用が、ヒト胸腺移植片から発生するヒトT細胞の免疫機能を促進することを示唆する。機能におけるこの改善は、接着受容体、サイトカイン等が、異種すなわち、マウスのものではなく同種である場合に、T細胞-APC相互作用の改善を反映し得る。ヒトTregの機能およびT細胞の恒常性増殖は、異種胸腺移植片と比較して、ヒト胸腺移植片での発達によって改善される。多様なレパートリー図7を有する高レベルの正常ヒト胸腺リンパ球形成図6はまた、HUFLを埋め込んだブタSW胸腺異種移植片でも起こり得、異種寛容性につながっている117図8。SW/HUTHY/LIVを移植したNOD/SCIDマウスSW/HUマウスと称されるに、ヒトCD34FLCを静脈内注射することにより、ヒト造血およびT細胞の再増殖を、HU/HUTHY/LIVに加えてヒトCD34FLCを受容させたマウス以降、HU/HUマウスと称されるに匹敵するレベルまで増加させる図9。HU/HUマウスの場合、末梢および胸腺上皮中のヒトAPCは、同じドナーに由来するものであり、一方で、SW/HUマウスの場合は、胸腺上皮は、ヒトT細胞および末梢のヒトAPCに対して異種である表1。ブタからの免疫応答性マウス異種胸腺生着を可能にするため、胸腺摘出、T細胞枯渇モデルにおける以前の実験は、異種胸腺上皮が、異種T細胞の正の選択に全面的に関与し、レシピエントMHCからの寄与は存在しないことを示した130132。胸腺異種移植片に定植するレシピエントのAPCは、負の選択に寄与し、ドナーおよびレシピエント抗原に対する寛容性の欠失をもたらした132135。理論に束縛されることなく、類似の状況が、SW/HUモデルにも適用可能である。ヒトAPCは、これらのブタ胸腺移植片に存在し図6C117、理論に束縛されるものではなく、ヒト自己反応性胸腺細胞の負の選択に重要な役割を果たし得る。類似の胸腺細胞数および正常なサブセットの分布が、SW/HUおよびHU/HU移植片に検出された図10。ヒトTregは、HU/HUおよびSW/HU移植片の両方において、類似の数のCD4SP胸腺細胞中のFoxP3細胞で図11、主にCD45RACD45ROHLA-DRloである類似の表現型で生成される。SW/HUおよびHU/HUマウスの末梢で、類似する割合のヒトFoxP3CD127low、CD25細胞が検出されたが図12、それらの表現型間で、いくつかの重大な表現型の違いが観察された。図13に示されるように、正常ヒトPBMC中のほとんどのCD4CD25hi細胞は、CD45RACD45ROメモリー型TregであるFoxP3Tregであり136137、大部分がHLA-DRを発現する。胸腺移植の18週間後に分析したHU/HUマウスのPBMCの中では、ほとんどのCD4CD25hi細胞もまた、FoxP3を発現したが図13、中央パネル、これらのうちの大部分はCD45RAおよびCD45ROの両方を発現し、多くはHLA-DRもまた発現した。CD45RA/CD45RO表現型は、正常成体ヒトドナーよりもはるかに若齢であるこれらの動物における、メモリー表現型へ移行中の細胞を示し得る。対照的に、SW/HUマウス由来のほとんどのCD4CD25hiPBMCもまた、FoxP3を発現したが、依然としてCD45RA/CD45ROナイーブ表現型を発現し、HLA-DRを発現したものはほとんどなかった図13、下パネルおよび図14。HLA-DRTregは、それらのHLA-DR対応物よりも優れた抑制機能を有することが報告されている138。これらのデータは、SW/HU移植片において発達するTregが、HU/HU移植片に由来するものよりも胸腺後に受ける刺激が少ない可能性があり、胸腺および末梢の両方において、同じMHCに接触することを示す。SW/HUマウスから単離した末梢Treg図15は、HU/HUマウスからのものと比較して、減少した抑制活性を示し、正常ヒトPBMCに由来するCD25CD4細胞と同程度に効果的にMLR応答を抑制した図16。TregCD45ROおよびHLA-DRの発現は、個々のSW/HUマウスに由来する細胞の抑制活性のレベルに比例して変化した図16および17。これらを合わせると、データは、HLA-DRの発現およびメモリー表現型への変換が、末梢活性化、または胸腺の正の選択に関与するものと同じMHC抗原との末梢接触によって最適化されるTregの調整のマーカーであることを示す。一貫して、マウスのTregの末梢増殖は、MHC/ペプチド複合体の正の選択を行うことによって促進されることが示されている139。SWにおいて生成されたヒトT細胞と自己HUTHY移植片のものとの間のリンパ球減少によってもたらされる増殖を比較するために、ナイーブCFSEで標識したナイーブT細胞図18を、SW/HUおよびHU/HUマウスから、ヒトAPCで再構成したがT細胞を欠くマウスへ、養子移入したHU-APCマウス、すなわち、ヒトFLCD34細胞をTHY移植片なしで静脈内に受容させたNOD-SCIDマウス、図19。図20に示されるように、これらのT細胞の多くの割合が、T細胞欠損宿主への養子移入後に増殖し、CD45RACD45RO表現型に変換された。分裂の量は、SW/HUおよびHU/HUマウス由来のT細胞で類似であったが、メモリー表現型への変換は、SW/HUマウスと比較して、HU/HUに由来するT細胞では、より広範であった。さらに、養子レシピエントにおいて回復したT細胞の数は、移入前の養子HU-APCレシピエントにおけるヒト造血再構成のレベルと相関し図21、ヒトAPCが、ヒトT細胞の増殖および/または生存を支持したことを示す。この解釈と一貫して、ヒトT細胞は、再構成されていないNOD-SCID養子レシピエントへの養子移入後に回復することができなかった図21。重要なことに、類似するレベルのヒト造血再構成を有する養子レシピエントについては、移植したT細胞の回復は、T細胞がSWで生成された場合、HUTHY移植片と比較して減少した図21。これらのデータは、リンパ球減少によってもたらされるヒトT細胞の増殖の分析のための養子移入モデルの利用性を確立する。データは、ヒトのナイーブT細胞が、マウスのように、リンパ球減少によってもたらされる増殖を受け、その際に、メモリー表現型に変換することを初めて示した。データは、正の選択を行う胸腺環境に存在するものと同じMHCの発現が、マウスに対して示されているように、リンパ球減少環境におけるヒトT細胞の生存および/または増殖を促進し得ることを示す54586671。自己胸腺上皮細胞の埋め込みは、胸腺移植片におけるT細胞の選択に影響を及ぼす。胸腺摘出ATXを行い、次にT細胞を枯渇させたmAbで処置した正常な免疫応答性マウスは、レシピエントの腎臓被膜下に移植したブタ胎児FPTHY組織の生着、成長、および機能を可能にする133図22。ブタのTHYが宿主のTHYと置き換わり、末梢T細胞の再構成を可能にし132133140、ドナー特異的異種移植片寛容性を達成する133134。末梢に入るマウスのT細胞は、機能性であり、日和見感染を除去する141。FPTHY移植片に存在するブタおよびマウスの両方のAPCは、胸腺内での負の選択を媒介し132135、一方で、正の選択は、ブタドナーMHCによって排他的に媒介される130132。FPTHY/LIVを移植したATXマウスは、概して、良好な健康状態を示すが、FPTHY/LIVを移植したヌードマウスの大部分60超は、多臓器自己免疫疾患を発症する135。ATXFPTHY/LIVを移植したマウスは、宿主の胸腺に由来する残留T細胞を末梢に有するが、ヌードマウスは、Tregを含む、既存のCD4のプールを欠いている。FPTHY/LIVを移植したヌードマウスから二次BALB/cヌードレシピエントへの養子移入は、自己免疫疾患が、FPTHY/LIVを移植したヌードマウスに由来するCD25脾細胞によって誘発されたことを明らかにした。さらに、FPTHY/LIVを移植したヌードマウスに由来するCD25CD4細胞は、正常なBALB/cマウスに由来する細胞と比較して、二次レシピエントでの疾患抑制能力が損なわれたことを示した。したがって、FPTHY/LIVを移植した後のT細胞欠損ヌードマウスにおける自己免疫は、Tregによる抗宿主免疫の抑制の損失、およびCD25CD4細胞間の自己反応性の増加を反映し得る。レシピエント胸腺上皮細胞TECをブタ胸腺異種移植片に付加することで、末梢で同じ抗原と接触することにより自己免疫を抑制することができる、Tregの正の選択をマウス胸腺上皮で行うことを可能にする4951142。さらに、マウス胸腺上皮による器官特異的タンパク質の異所生成51143146は、異種胸腺内の組織特異的CD25T細胞を欠失させることができる。したがって、BALB/cレシピエント型TEC[コラゲナーゼ/ディスパーゼ/DNase消化および抗CD45‐MACSビーズを用いた負の選択により得た]をFPTHY移植片に注射することの効果を評価した。図23に示されるように、BALB/cTECが埋め込まれている、FPTHY/LIVを移植したヌードマウスに由来する脾臓細胞は、BALB/cヌードマウスの養子レシピエントにおいて、あまり消耗症候群を誘発せず、これらの動物に由来する脾臓細胞は、BALB/cTECなしでFPTHY/LIVを移植したマウスに由来する脾細胞によって誘発される消耗症候群を部分的に抑制した。THY移植片のマウスTECを注入した2色蛍光染色は、これらの動物のFPTHY移植片におけるマウスTECの長期にわたる持続を明確に示した図24。これらの研究は、単離した胸腺上皮細胞の注射が、通常のT細胞およびTregの選択に影響を及ぼし得ることを立証する。実験計画および方法ある特定の態様において、本発明は、HLA決定済みヒト胸腺移植片でのヒト胸腺リンパ球形成を可能にする、再凝集ヒト胸腺移植モデルを作製する方法を提供する。これらの研究は、ヒト化マウスモデルを拡張するものであり、インタクトな胎児THY組織を埋め込む代わりに、HLA型判定済みヒト胎児胸腺組織から凍結保存したCD45陰性の胸腺間質細胞が、NOD-SCIDマウスの腎臓被膜下に埋め込まれる。共通の糖尿病感受性HLA対立遺伝子を有する胸腺は、これらの対立遺伝子を共有する正常対照およびT1DM対象に由来する静脈内注射したCD34細胞から、T細胞の胸腺リンパ球形成を支持することになる。HUTHY/LIV移植片および静脈注射で同じドナーに由来するCD34細胞を受容したNOD-SCIDマウスは、正常ヒト胸腺細胞、T細胞、B細胞、およびAPC集団を再構成し、二次リンパ器官を発達させ、T細胞および免疫付与に対する抗体応答を示す。さらに、正常な割合のTregを生成する。このモデルは、T1DMのHSCに由来する造血幹細胞HSC依存性T細胞を試験するために使用可能でありながら、胎児THYドナーがT1DMのHSCドナーに対して同種である。末梢生存、リンパ球減少にによってもたらされる増殖、Tregの機能は、胸腺での選択時に接触する末梢MHC-ペプチド複合体との相互作用によって最適化され、THY移植片が、HLA対立遺伝子をT1DMおよび正常な骨髄ドナーと共有する場合、有利であろう。これは、既にHLA型判定済みの凍結THY組織が、HLA型判定済みの志願ドナーのHSCとともに選択的に利用することが可能であれば、達成することができる。ある特定の一般的なクラスIIのHLA対立遺伝子が、T1DMと強く関連し、これらの患者に存在することが予測される。これらには、HLA-DRB103-DQB10201DR3、DRB104-DQB10302DR4、およびDQA10301、DQB10302DQ8が挙げられる15。幸運なことに、これらに対立遺伝子はまた、一般集団においても一般的であり、その30~50が、HLA-DR4および/またはDR3を有する1147148。したがって、ほとんどのT1DM患者にも発現するであろう、これらの対立遺伝子のうちの1つまたは両方を発現する、胎児組織および正常対照のCD34細胞を入手することは困難ではないであろう。さらに、ある特定のクラスIのHLA対立遺伝子は、非常に一般的であり例えば、HLA-A2は、約30の白色人種に存在する、単一のクラスI対立遺伝子を共有する、T1DM患者、正常対照、および胎児THYドナーの選択を可能なものにしている。ある特定の態様において、本発明は、胸腺間質細胞を培養し、APCを枯渇させ、次いで腎臓被膜下に埋め込む、胸腺器官培養物を再凝集させるための方法を提供し、これは、胸腺上皮細胞の胸腺リンパ球形成における影響を研究するための確立した手段である51149。この技術を凍結保存したヒト胸腺間質細胞に適応させることにより、胸腺およびCD34細胞のドナー間で、HLA対立遺伝子を確実に適合させることが可能となる。在胎17~20週のヒト胎児組織を、記載のように4647、AdvancedBIoscienceResources,Alameda,CAから入手する。FLの小片を、HLAの遺伝子型判定に使用する。CD34細胞を、記載のように46、MACSを使用してFLから精製し、凍結保存する。胸腺組織の半分を、2Gyで照射したNOD-SCIDマウスの腎臓被膜下に埋め込み、2×105の凍結保存して解凍した同じドナーのFLに由来するCD34細胞を、翌日に静脈注射で受容させる。胸腺の残り半分を、小片に切断し、0.2mg/mlコラゲナーゼ、0.2mg/mlディスパーゼI、2FCS、25mMHEPES、および25μg/mlDNAseIを含有するIMDM中で37°Cで消化させ、続いて5mMEDTA中でインキュベートする。洗浄後、胸腺間質細胞を、記載のように51149不連続のPercoll勾配上で単離し、次いで、MACSを使用してさらにCD45細胞を枯渇させ、洗浄し、凍結保存のために106細胞/μlまで再懸濁するか、またはスラリーとして再懸濁させ、48時間、0.5~1×106の間質細胞を含有する0.2~0.4μlの液滴で、3mlIMDMおよび10FCSを含有する6ウェルプレート中のGelfoamスポンジによって支持される0.45μmMilliporeナイロン膜上に設置する。各フィルターから取り出した1つの固化した再凝集を、記載のように51149腎臓被膜下に移植する。同じドナーのFLに由来する200,000のCD34細胞を、解凍し、間質細胞を埋め込むときに、静脈内注射する。2Gyで照射したNOD-SCIDマウスの群に、新鮮な胸腺間質細胞から形成された再凝集または凍結保存して翌日に解凍した間質細胞からのもののいずれかを、解凍したCD34細胞とともに、静脈注射で受容させる。ヒトT細胞およびAPCの再構成について、埋め込みの4週間後に動物の追跡調査を開始し、その後は2週間毎に行う。埋め込みの18週間後にそれらを安楽死させ、それらの移植片を全体的な細胞充実度について比較し、胸腺細胞サブセットおよび末梢リンパの再構成を比較する。このようにして、インタクトな胸腺、新鮮な胸腺間質細胞、および凍結保存して解凍した胸腺間質細胞で達成されたT細胞の再構成を比較する。理論に束縛されるものではないが、新鮮または凍結保存した胸腺間質細胞からの再凝集培養物を使用して、高レベルのヒト胸腺リンパ球形成を達成することができる。凍結保存した胸腺間質細胞を使用することの利点は、それが、HLA-DR3、DR4、およびDQ8を含む、HLA対立遺伝子を共有する、T1DM患者および対照に由来するCD34細胞と併せて使用するための、HLA型判定済み細胞のバンクの蓄積を可能にすることである。T細胞は、次いで、末梢での正の選択に関与する、T細胞の生存、機能、恒常性増殖、および制御を最適化し得る、同じHLA-ペプチド複合体のうち少なくともいくつかと接触することになる。再凝集胸腺培養物および/または移植片を、マウス51149およびヒトTHY組織150から生成することに成功している。しかしながら、理論に束縛されるものではないが、凍結保存は、胸腺間質細胞が再凝集した器官を生成する能力を低下させ得る。この場合、凍結保存および解凍の手順を最適化するように試みることになる。胸腺構築の発達を促進し、インビボで再凝集移植片へ胸腺細胞前駆体を輸送するための要件を克服するために、CD34細胞を、インビトロでの立位型液滴または腎臓被膜下への埋め込みの際に一緒に埋め込むことの効果を評価することもできる。必要に応じて変化する他のパラメータには、各フィルター上に設置される立位型液滴の寸法または埋め込まれた再凝集体の数、およびしたがって胸腺移植片の寸法、ならびに在胎期間が含まれる。代替的なアプローチは、CD34細胞のドナーによって共有される関連の糖尿病感受性対立遺伝子を発現するHLAトランスジェニックNODマウスに由来するTECを一緒に埋め込むこととともに、インタクトなHLA型判定済みヒト胸腺組織の埋め込みを伴う。埋め込まれたTECは、胸腺異種移植片での長期の生存を示し、胸腺選択に影響を与える図22~24。マウスのTECは、ヒト胸腺細胞を選択することができるため4142、理論に束縛されるものではなく、一緒に埋め込んだHLAトランスジェニックTECは、関連するHLA分子上で、ヒト胸腺細胞の正の選択を行うことができる。別の代替方法は、関連HLA対立遺伝子を有する凍結保存したヒトTECを、インタクトなヒト胸腺移植片に注射することである。最終的に、HLA遺伝子を有するヒト胸腺移植片は、Mathisらによる151154ナイーブ胸腺での実行が成功したように、これらのHLA分子をコードするDNAを含有するアデノウイルスベクターを注射することによって、形質導入することができる。したがって、これらのアプローチのうちの1つを通じて、理論に束縛されないが、HLA型判定済みの正常およびT1DMドナー由来のCD34の胸腺リンパ球形成が、共有のHLA対立遺伝子との関連において生じる、モデルの生成を成功させることができる。以前の研究例えば、図1~3を参照されたく、典型的に、1つのHU/HUマウスの脾臓およびリンパ節から、15~30×106の生成されたヒトT細胞を得ることができるにおいて観察された胎児胸腺の著しい成長および多数の胸腺細胞典型的に、移植片当たり2~3×108ならびに高レベルの末梢再構成に基づいて、理論に束縛されることなく、本明細書に記載の研究に十分な数の胸腺および末梢のT細胞を得ることができる。しかしながら、再凝集したTHY移植片で達成されるT細胞再構成のレベルが低い場合は、通常のNOD-SCIDマウスの代わりに、NOD-SCID-γcノックアウトマウスを利用することになる。NK細胞が欠損したNOD-SCID-γcマウスは、比較的低いレベルの胸腺リンパ球形成の存在下で、より高いレベルのヒト免疫再構成を可能にすることができる。高レベルのヒトT細胞再構成が、本モデルにおいてNOD-SCIDマウスで達成されているが、γcノックアウトマウスは、より低いレベルのヒト胸腺リンパ球形成を伴うモデルにおいて有利であり得る4142。ある特定の態様において、本発明は、正常細胞に対比して、T1DMのCD34細胞に由来する通常のT細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型変換、および自己寛容性を比較するための、記載されるマウスモデルおよび方法を提供する。T1DM患者に由来するT細胞が、胸腺ドナーの自己抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかを判定する。恒常性における内在性異常が、T1DM患者のT細胞を特徴付けるかどうかを判定する。図1~3に示されるように、NOD-SCIDにおけるヒトTHYおよびHSCの複合移植は、高レベルのヒト多系統造血をもたらす。このモデルは、クラスIおよびIIのHLA対立遺伝子が、T1DM患者および対照に由来する胸腺間質細胞とCD34細胞との間で共有されることを確実にするように、修飾される。NODマウスにおける自己免疫病因は、末梢T細胞のアポトーシスの増加に関与し、リンパ球減少をもたらし得る5480。T1DM90を含むヒト自己免疫疾患8389はまた、リンパ球減少と関連している。理論に束縛されるものではないが、T1DM患者のHSCに由来するT細胞は、正常対照のHSCに由来するものと比較して、生存の減少、ならびにリンパ球減少によってもたらされる増殖および活性化の増加を示す。開発された最良のレジメンを使用して、胸腺および末梢でクラスIおよびII対立遺伝子を共有するヒト化マウスを調製する。FLCD34細胞の代わりに、同じHLA対立遺伝子を胎児THYドナーと共有する、HLA型判定済みのT1DM患者または正常対照T1DMの家族歴が陰性に由来する、MACSで精製した105の骨髄CD34細胞を動物に受容させる図2。1回の5~6mlの吸引で約1.25×106のCD34細胞が得られるとして、1つの骨髄吸引液に由来するCD34細胞を用いて、10~12匹のNOD-SCIDマウスを再構成することができる。記載のように4647、ヒトCD3、CD19、およびCD14細胞について、移植の4週間後に動物の末梢血の監視を開始し、2週間毎に行う。5以上のヒトCD3T細胞が末梢血中に存在する場合、マウスは、本明細書に記載のようにさらなる研究に利用することになる。ヒト胸腺細胞サブセット、ならびに脾臓およびリンパ節LNのT細胞を計数する。T1DM患者に由来するCD34細胞のレシピエントのリンパ系組織は、NODマウスモデルに報告されたように80、メモリーT細胞における抗アポトーシスタンパク質発現の減少と関連して、対照と比較して細胞数が少ない場合がある。逆に、NODマウスにおけるこれらの異常は、疾患の原因ではなく、疾患の影響であり得る。本モデルは、T1DM患者のHSCに由来するT細胞の恒常性に主な異常があるかどうかを特定する機会を提供する。メモリー型およびナイーブ型のCD4およびCD8細胞の絶対数は、CD8α、CD8β、CD45RA、CD45RO、CD95、CD27、CCR7、およびCD62Lに対するmAbを含む、多色FCMによって計数する。可能な結果には、T1DM患者に報告されたように91155156、T1DMのHSCにより再構成された動物における二重陽性RORAT細胞数の増加、またはT1DMのHSCからクローン的に偏差したCD4-CD8αα胸腺細胞およびT細胞の数の減少が挙げられる。クローン的に偏差した細胞の生成における欠陥は、NODバックグラウンドに遺伝的にコードされる157。CD4およびCD8T細胞に、HLA-DR、CD69、およびCD25を含む、活性化マーカーの試験もまた行う。T細胞HLA-DRの発現は、新しく発症したT1DM158と関連して上昇する。これらのデータの全てを、B細胞ならびにリンパおよび骨髄DCサブセットを含む、ヒトAPC再構成のレベルに関連して分析する。メモリー型T細胞における抗アポトーシス分子であるBcl-xLおよびBcl-2の発現の減少は、NODマウスにおけるT細胞の代謝回転の増加および恒常性増殖と関連付られている80。したがって、多色FCMを使用して、ナイーブおよびメモリーマーカーによって定義される末梢T細胞サブセット中の、アポトーシスアネキシンおよびAADを使用してならびに抗アポトーシスタンパク質の発現透過性細胞を使用してを測定する。複写履歴を評価するために、T細胞受容体切除範囲TRECおよびテロメア長の分析を、記載のように159160qPCRを使用して、分類されたナイーブ型およびメモリー型CD4およびCD8細胞に行う。T1DM患者に由来するT細胞における恒常性の異常が、非常に重度であるため、上述の研究の全てを実行することを可能にするのに十分な数のT細胞を、再構成されたマウスから得ることができない場合がある。個々の再構成されたNOD-SCIDマウスからデータを取得することが好ましいが、必要であれば、同じCD34細胞で再構成した複数の動物に由来するリンパ球をプールする。さらに、必要であれば、γcノックアウトNOD-SCIDマウスを使用して、ヒト免疫再構成を強化する。T1DMのCD34細胞と対比して、正常なものに由来するヒトT細胞の末梢生存を、前述のように161THY移植片を除去し、ナイーブ型およびメモリー型のT細胞の減衰を監視することによって、比較する。さらに、BrDU標識化研究を、末梢T細胞のインビボ増殖を評価するために、上述のように80、胸腺正常および移植片摘除の両方の動物に行う。T1DMおよび対照HSCに由来するT細胞の機能を、B型肝炎ワクチンおよび破傷風トキソイドでのインビボ免疫付与後に比較する。T細胞増殖および抗体応答のインビトロアッセイを評価する。抗CD28および抗CD3Dynalビーズでの全体的なT細胞刺激に対する増殖性応答、ならびに第三者ならびに胸腺ドナーおよび自己CD34細胞ドナーの両方のAPCに対する同種応答を、FLまたは骨髄CD34細胞に由来するDCを使用して比較する。効果的な機能性DC生成は、0日目にGM-CSFおよびSCFを用いて、3日目にTNF-αを追加し、IL-4、GM-CSF、およびTNF-αを6日目から用いて、解凍された凍結保存ヒトFLCD34細胞から構築されている。後続のDC生成のための凍結保存に十分な、T1DMおよび正常な対照骨髄ドナーからのCD34細胞を有することが期待できないためそれらは、概して、全てがマウスの再構成に使用される、これらのドナーに由来するDCは、前述のように162、末梢血単球から生成されることになる。TおよびB細胞の応答は、1型糖尿病患者および正常の両方で同程度であるが、HSCおよび/またはTHYドナーのMHCに対する寛容性は、T1DMのHSC由来のT細胞で、低下する。養子移入を用いて、T1DM患者および対照に由来するT細胞の恒常性増殖および生存を比較する。リンパ球減少によってもたらされる増殖およびアポトーシスは、対照HSC由来のT細胞よりも、T1DMのHSC由来のものの方が大きくなる。HUTHY移植片で生成されたT細胞を、その末梢APC集団が胎児THY移植片なしでTHYと同じCD34ドナーに由来するFLCで再構成されている、二次NOD-SCIDマウスレシピエントに養子移入するHU-APCマウス。これらの動物は、ヒトAPCを再構成するが、T細胞は再構成しない図19。それらは、T細胞を有さず、それらのAPCは、もともとのTHY移植片で正の選択を媒介したものと同じHLA抗原を発現する。このモデルを、養子移入後のリンパ球減少によってもたらされるT細胞の増殖の測定に使用した図18~21。ナイーブCD4およびCD8単一陽性SP胸腺細胞を、移植片から二次HU-APCレシピエントに養子移入する。別個のアリコートは、CD25細胞を枯渇させずに、または枯渇させMACSでの分類によって、Tregの存在下または非存在下でのリンパ球減少に対する応答の比較が可能となる。リンパ球減少によってもたらされるTregの増殖を、特に比較する。これらの成熟した単一陽性胸腺細胞は、胸腺内選択を受けているが、胸腺後選択は受けていないことになる。それらを、CFSEで標識し、HU-APCマウスに養子移入するレシピエント当たり106の細胞。その後、決められた間隔で、HU-APCレシピエントを安楽死させる。T細胞を計数し、T細胞CFSEの希釈レベル、ならびにCCD45RAおよびCD45ROの発現、CD25CD25Tregを区別するため、FoxP3に対比して、CD69、ならびにアポトーシスAnnexinVおよびAADを使用してを、ヒトCD4およびCD8細胞に対して試験する。リンパ球減少によってもたらされる増殖は、通常、活性化マーカーCD25およびCD6960の上方制御とは関連しないが、T1DM患者のT細胞異常は、リンパ球減少によってもたらされる増殖と関連して、これらのマーカーの上方制御を伴う自己抗原によってもたらされる活性化に関与し得る。IFN-γおよびTNF-αの細胞内染色により、エフェクター機能の増加が、T1DMのHSCに由来するT細胞の恒常性増殖からもたらされるかどうかを示すことができる。何らかのこのような異常が観察される場合、ヒトIL-21、IL-7、IL-15、およびそれらの受容体の分析を養子レシピエントにおいて行い、これらの異常の病因を特定する。恒常性増殖を受けたT細胞におけるインビトロ寛容性を、本明細書に記載の方策を使用して検査する。理論に束縛されるものではなく、糖尿病患者由来のT細胞におけるリンパ球減少によってもたらされる増殖は、最も高い親和性を有する自己反応性T細胞の富化、およびしたがって自己寛容性の損失をもたらし得る。この場合の自己には、TECおよびFLCD34細胞のドナー、ならびにもともとのTECを移植した動物のHSCドナーが含まれる。正常とT1DMのCD34細胞のHLA型は常に異なり、そのため、HLA共有の度合い、ならびに各HSCおよびTHYドナー間の交差反応の度合いが、異なる。これは、例えば、末梢に発現するHLAがT細胞の恒常性増殖を支持することができる度合いにおける差異をもたらし得る。この理由のため、養子移入研究は、胸腺後の選択を受けていないSP胸腺細胞を利用する。さらに、両方のHSCドナーT1DM患者およびそれらの正常対照と同じHLA対立遺伝子のみを共有するTHYドナーを利用する。さらに、これらの研究は、個体間変動の均衡を助けるために、少なくとも5人のT1DMおよび5人の対照に由来するHSCで行うものとする。ある特定の態様において、本発明は、正常対照と対比して、T1DMのCD34細胞に由来する制御性T細胞の数、機能、および末梢表現型の変換を比較するためのマウスモデルおよび方法を提供する。T1DM患者の幹細胞に由来するTregおよびNKT細胞は、欠陥を示す。これらの研究は、胸腺後が起源のものと対比して、T1DM患者およびそれらの胸腺に由来する制御性細胞における内在性異常を特定する。議論の余地はあるが100102、Tregの数92および機能2224における欠陥が、T1DM患者およびNODマウスに報告されている9397。さらに、NKT細胞における欠陥が、NODマウスの末梢3031103104および胸腺105、ならびにT1DMを有するヒトの末梢血101において説明されている。NKT細胞の養子移入もしくは過剰発現110、またはTregの移入98は、NODマウスにおける自己免疫を逆転させ得る。膵臓内の炎症部位におけるTregの不足および制御に対するエフェクター細胞の相対的耐性の両方が、NODモデルの疾患進行の最終段階を特徴付けると見られる101。しかしながら、T1DMを有するヒトにおける研究は、末梢血試料の分析に限定されており、ヒトTregにおけるこれらの欠陥が、疾病の結果として生じるのか、または疾患の病因であり、T1DM患者の遺伝子にプログラムされているかどうかはわかっていない。理論に束縛されるものではなく、T1DM患者は、Tregの発達、末梢生存、またはそれらを完全に機能させるための末梢調整52における欠陥を示す。本モデルは、TregおよびNKT細胞の発達における胸腺内および末梢の両方の欠陥の役割を試験する機会を提供する。これらの研究は全て、選択する胸腺とCD34HSC細胞との間で糖尿病誘発性HLA分子の共有を確実に行うために作製された本モデルを利用する。このような共有は、THY移植片においてこれらの複合体で選択されたTregによる、末梢APCの同じMHC/ペプチド複合体との相互作用を可能にする。Tregは、胸腺でそれらを選択するMHC/ペプチド複合体に特異性を示し51、MHC/ペプチド複合体との末梢相互作用がTregの機能性を促進するため5253、胸腺と末梢ヒトAPCとの間のHLA共有は、かなりの重要性を有する可能性がある。Tregの分析:ヒトHLA-DR3、DR4、またはDQ8胸腺組織、ならびに正常個体またはT1DM患者に由来するCD34細胞を移植したNDO-SCIDマウスの胸腺内のCD127loFoxP3CD4CD8Tregの数を、比較する。多色FCMを使用して、これらの細胞の表現型を比較する。理論に束縛されるものではなく、図11に提示される胸腺のTregに類似して、これらの細胞は、主にCD45RACD45ROHLA-DRloであり得る。NODモデルでの研究に基づいて、胸腺内のTregの割合は、T1DM患者由来のHSCのレシピエントにおいて、対照と比較して減少し得る。CD127loFoxP3CD4CD8Tregの数を、上述の動物の末梢リンパ組織LNおよび脾臓で比較する。多色FCMを使用して、これらの細胞のナイーブ/メモリー表現型およびHLA-DR発現を比較する。図13にあるように、正常ドナーのHSCに由来するTregは、CD45RACD45ROおよびCD45RACD45ROのサブセットを、HLA-DRのサブセットとともに含むことが予測される。DR細胞は、高レベルのFoxP3を発現し138、本明細書の研究図13は、それらが、胸腺内で接触したものと同じMHC-ペプチド複合体と末梢内で相互作用し、最適な抑制活性を促進することを示す52。T1DMのHSC由来のTregが、機能に内在性欠陥を有する場合、それらは、完全な抑制活性と関連するCD45RACD45ROおよびHLA-DR表現型を得ることができない可能性がある。T1DM患者および正常対照由来のCD34細胞で再構成されたHU/HUマウスの胸腺および末梢リンパ組織に由来する、流動選別したCD127loCD25CD4CD8Tregの抑制機能を比較する。段階的な数のTregを、次の組み合わせのレスポンダー細胞および刺激細胞を含有するMLRに追加する。1ヒト化マウスの末梢リンパ組織から選別し、同種PBMCで刺激したCD25CD4T細胞、2ヒト化マウスの末梢リンパ組織から選別し、上述のように162自己PBMCCD34細胞ドナー由来に由来するDCで刺激したCD25CD4T細胞、3ヒト化マウスの末梢リンパ組織から選別し、THYドナーの凍結FL由来のCD34細胞に由来するCD25CD4T細胞。FLCD34細胞由来の機能性DCを、確実に生成することができる。T1DM患者および正常対照に由来する胸腺および末梢のTregが、同種応答ならびに胸腺およびHSCのドナーによって発現される自己抗原に対する応答を抑制する能力を、比較する。T1DM患者および正常対照に由来するT細胞は、胸腺および末梢で、同じ共有HLA-DR抗原に接触するため、制御機能において観察されるいずれの差異も、このような接触の失敗に起因し得ない。TIDMのHSC由来のTregに観察されるいずれの制御機能の低下も、前の段落で説明された研究からの表現型データと関連して解釈されるものとする。胸腺と末梢のTregを比較することで、T1DM患者におけるTreg機能の欠陥が表れるのが、胸腺での発達時か胸腺後の発達時かを判定することを可能にする。IL-10およびTGF-βのいずれも、Treg機能に重要なエフェクターサイトカインに関係するとされている163165。TGF-βはまた、少なくとも部分的にFoxP3の発現の誘発によって、Tregの増殖および末梢生成に重要な役割を果たす36163166170。NODマウスにおける研究は、より高齢の動物に由来するTregがIL-10を生成する能力の低下を示しており97、糖尿病の進行は、Tregによる膜結合型TGF-β発現の急激な低下と関連する94。抑制機能における欠陥がT1DM患者由来のTregに特定された場合、ヒト化マウスの胸腺および末梢から選別したCD127loCD25CD4CD8Tregを、IL-2を有する抗CD28/抗CD3Dynalビーズで刺激し171、サイトカインmRNAおよびタンパク質を測定する。養子移入研究:正常対照と対比して、T1DM患者のHSCに由来するナイーブなCD127loCD25CD4CD8Tregのリンパ球減少によってもたらされる増殖を比較するために、CFSEで標識したナイーブな胸腺Tregを、本明細書に記載のように、各群から二次HU-APCマウスに養子移入する。本明細書に記載の研究が、CD25細胞が枯渇したSP胸腺細胞を養子移入する際に自己反応性および/またはリンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示す場合、共移入研究において、正の選択が行われた胸腺Tregが自己免疫および/またはリンパ球減少によってもたらされる活性化を抑制する能力に取り組むこととなる。NKT細胞の分析:不変NKT細胞の数の減少および機能の欠陥が、T1DM患者に報告されている92。本モデルは、この欠陥が、T1DM患者のHSCに内在性であるかどうか、およびそれがこの細胞サブセットの胸腺の発達における欠陥を反映するものであるかどうかを判定する機会を提供する。多色FCMを使用して、胸腺および末梢における、不変鎖を発現するVα24Vβ11およびVα24JαQCD4CD8およびCD4CD8細胞を定量化する。T1DM患者由来の不変NKT細胞によるIFN-γ生成に欠陥が報告されているため92、これらの細胞を、上述のように92PMA/イオノフォアで刺激し、T1DM患者および正常なものに由来するNKT細胞におけるIFN-γおよびIL-4の細胞内レベルを、多色FCMを使用して比較する。これらの研究により、T1DM患者におけるHSCおよび胸腺起源のNKT細胞の欠陥を解明することができる。本明細書に記載の研究により、T1DM患者のHSCに由来するT細胞が、T細胞の制御および恒常性に関する内在性欠陥を遺伝子にプログラムされているかどうかを判定し、T1DMの病因におけるこのような欠陥の役割に関する議論を解決する。結果に応じて、その後の研究は、T1DMおよび正常のHSCに由来するT細胞の遺伝子発現プロファイリング、養子Treg発達の研究、ならびに自己免疫におけるAPCおよびHSCに由来する細胞の役割の調査を伴ってもよい。本モデルは、遺伝子操作を含む、疾患病因の遮断への新規なアプローチの評価を可能にする。凝固もしくは出血障害または免疫欠損を有さない18歳以上の1型糖尿病患者の志願者および正常対照の志願者を、本研究に含める。全ての志願者は、HLA型の判定によってスクリーニングし、共通の糖尿病関連のクラスIIHLA対立遺伝子および共通のクラスI対立遺伝子を有するものを、本研究対象に選択する。実施例1の参考文献1EmeryLMBabuSBugawanTLNorrisJMErlichHAEisenbarthGSRewersMNewbornHLADRDQgenotypescreeningageandethnicityspecifictype1diabetesriskestimatesPediatrDiabetes200561361442BarkerJMBarrigaKJYuLMiaoDErlichHANorrisJMEisenbarthGSRewersMPredictionofautoantibodypositivityandprogressiontotype1diabetesDiabetesAutoimmunityStudyintheYoungJClinEndocrinolMetab200489389639023KentSCChenYBregoliLClemmingsSMKenyonNSRicordiCHeringBJHaflerDAExpandedTcellsfrompancreaticlymphnodesoftype1diabeticsubjectsrecognizeaninsulinepitopeNature20054352242284ManneringSIHarrisonLCWilliamsonNAMorrisJSThearleDJJensenKPKayTWRossjohnJFalkBANepomGTPurcellAWTheinsulinAchainepitoperecognizedbyhumanTcellsisposttranslationallymodifiedJExpMed2005202119111975SuriAWaltersJJGrossMLUnanueERNaturalpeptidesselectedbydiabetogenicDQ8andmurineIAmoleculesshowcommonsequencespecificityJClinInvest2005115226822766UedaHHowsonJMEspositoLHewardJSnookHChamberlainGRainbowDBHunterKMSmithANDiGenovaGHerrMHDahlmanIPayneFSmythDLoweCTwellsRCHowlettSHealyBNutlandSRanceHEEverettVSminkLJLamACCordellHJWalkerNMBordinCHulmeJMotzoCCuccaFHessJFMetzkerMLRogersJGregorySAllahabadiaANithiyananthanRTuomilehtoWolfETuomilehtoJBingleyPGillespieKMUndlienDERonningenKSGujaCIonescuTirgovisteCSavageDAMaxwellAPCarsonDJPattersonCCFranklynJAClaytonDGPetersonLBWickerLSToddJAGoughSCAssociationoftheTcellregulatorygeneCTLA4withsusceptibilitytoautoimmunediseaseNature20034235065117WickerLSClarkJFraserHIGarnerVEGonzalezMunozAHealyBHowlettSHunterKRainbowDRosaRLSminkLJToddJAPetersonLBType1diabetesgenesandpathwayssharedbyhumansandNODmiceJAutoimmun200525Suppl29338SmythDJCooperJDBaileyRFieldSBurrenOSminkLJGujaCIonescuTirgovisteCWidmerBDungerDBSavageDAWalkerNMClaytonDGToddJAAgenomewideassociationstudyofnonsynonymousSNPsidentifiesatype1diabeteslocusintheinterferoninducedhelicaseregionNatGenet2006386176199SteckAKBugawanTLValdesAMEmeryLMBlairANorrisJMRedondoMJBabuSRErlichHAEisenbarthGSRewersMJAssociationofnonHLAgeneswithtype1diabetesautoimmunityDiabetes2005542482248610AtkinsonMALeiterEHTheNODmousemodeloftype1diabetesAsgoodasitgetsNatureMed1999560160411ShodaLKYoungDLRamanujanSWhitingCCAtkinsonMABluestoneJAEisenbarthGSMathisDRossiniAACampbellSEKahnRKreuwelHTAcomprehensivereviewofinterventionsintheNODmouseandimplicationsfortranslationImmunity20052311512612YoshidaKKikutaniHGeneticandimmunologicalbasisofautoimmunediabetesintheNODmouseRevImmunogenet2000214014613McDevittHOTheroleofMHCclassIImoleculesinsusceptibilityandresistancetoautoimmunityCurrOpinImmunol19981067768114NakayamaMAbiruNMoriyamaHBabayaNLiuEMiaoDYuLWegmannDRHuttonJCElliottJFEisenbarthGSPrimeroleforaninsulinepitopeinthedevelopmentoftype1diabetesinNODmiceNature200543522022315LiuCPJiangKWuCHLeeWHLinWJDetectionofglutamicaciddecarboxylaseactivatedTcellswithIAg7tetramersProcNatlAcadSciUSA200097145961460116ReijonenHMalloneRHeningerAKLaughlinEMKochikSAFalkBKwokWWGreenbaumCNepomGTGAD65SpecificCD4TCellswithHighAntigenAvidityArePrevalentinPeripheralBloodofPatientsWithType1DiabetesDiabetes2004531987199417YuBGauthierLHausmannDHWucherpfennigKWBindingofconservedisletpeptidesbyhumanandmurineMHCclassIImoleculesassociatedwithsusceptibilitytotypeIdiabetesEurJImmunol2000302497250618ChaoCCMcDevittHOIdentificationofimmunogenicepitopesofGAD65presentedbyAg7innonobesediabeticmiceImmunogenetics199746293419VijayakrishnanLSlavikJMIllesZGreenwaldRJRainbowDGreveBPetersonLBHaflerDAFreemanGJSharpeAHWickerLSKuchrooVKAnautoimmunediseaseassociatedCTLA4splicevariantlackingtheB7bindingdomainsignalsnegativelyinTcellsImmunity20042056357520BarkerJMType1diabetesassociatedautoimmunityNaturalHistoryGeneticAssociationsandScreeningJClinEndocrinolMetab200621RognerUCLepaultFGagneraultMCValloisDMorinJAvnerPBoitardCTheDiabetesType1LocusIdd6ModulatesActivityofCD4CD25RegulatoryTCellsDiabetes20065518619222ArifSTreeTIAstillTPTrembleJMBishopAJDayanCMRoepBOPeakmanMAutoreactiveTcellresponsesshowproinflammatorypolarizationindiabetesbutaregulatoryphenotypeinhealthJClinInvest200411345146323LindleySDayanCMBishopARoepBOPeakmanMTreeTIDefectiveSuppressorFunctioninCD4CD25TCellsFromPatientsWithType1DiabetesDiabetes200554929924BruskoTMWasserfallCHClareSalzlerMJSchatzDAAtkinsonMAFunctionaldefectsandtheinfluenceofageonthefrequencyofCD4CD25Tcellsintype1diabetesDiabetes2005541407141425EstebanLMTsoutsmanTJordanMARoachDPoultonLDBrooksANaidenkoOVSidobreSGodfreyDIBaxterAGGeneticcontrolofNKTcellnumbersmapstomajordiabetesandlupusLociJImmunol20031712873287826WilsonSBKentSCPattonKTOrbanTJacksonRAExleyMPorcelliSSchatzDAAtkinsonMABalkSPStromingerJLHaflerDAExtremeTh1biasofinvariantVα24JαQTcellsintype1diabetesNature199839117718127ZucchelliSHollerPYamagataTRoyMBenoistCMathisDDefectivecentraltoleranceinductioninNODmicegenomicsandgeneticsImmunity20052238539628NikolicTBunkMDrexhageHALeenenPJBonemarrowprecursorsofnonobesediabeticmicedevelopintodefectivemacrophagelikedendriticcellsinvitroJImmunol20041734342435129RodackiMSvorenBButtyVBesseWLaffelLBenoistCMathisDAlterednaturalkillercellsintype1diabeticpatientsDiabetes20075617718530BaxterAGKinderSJHammondKJScollayRGodfreyDIAssociationbetweenalphabetaTCRCD4CD8TcelldeficiencyandIDDMinNODLtmiceDiabetes19974657258231FalconeMYeungBTuckerLRodriguezESarvetnickNAdefectininterleukin12inducedactivationandinterferongammasecretionofperipheralnaturalkillerTcellsinnonobesediabeticmicesuggestsnewpathogenicmechanismsforinsulindependentdiabetesmellitusJExpMed199919096397232WilsonSBDelovitchTLRegulatoryLymphocytesJanuslikeroleofregulatoryiNKTcellsinautoimmunediseaseandtumourimmunityNatRevImmunol2003321122233TownsendSEGoodnowCCAbortiveproliferationofrareTcellsinducedbydirectorindirectantigenpresentationbyrareBcellsinvivoJExpMed19981871611162134GreeleySAKatsumataMYuLEisenbarthGSMooreDJGoodarziHBarkerCFNajiANoorchashmHEliminationofmaternallytransmittedautoantibodiespreventsdiabetesinnonobesediabeticmiceNatMed2002839940235HussainSSalojinKVDelovitchTLHyperresponsivenessResistancetoBCellReceptorDependentActivationInducedCellDeathandAccumulationofHyperactivatedBCellsinIsletsIsAssociatedWiththeOnsetofInsulitisbutnotType1DiabetesDiabetes2004532003201136MosierDEGuliziaRJBairdSMWilsonDBTransferofafunctionalhumanimmunesystemtomicewithseverecombinedimmunodeficiencyNature198833525625937McCuneJMNamikawaRKaneshimaHShultzLDLiebermanMWeissmanILTheSCIDhumouseMurinemodelfortheanalysisofhumanhematolymphoiddifferentiationandfunctionScience19882411632163938WagarEJCromwellMAShultzLDWodaBASullivanJLHesseltonRMGreinerDLRegulationofhumancellengraftmentanddevelopmentofEBVrelatedlymphoproliferativedisordersinHuPBLscidmiceJImmunol200016551852739SawadaTDellaPellePASeebachJDSachsDHCOLVINRBIacominiJHumancellmediatedrejectionofporcinexenograftsinanimmunodeficientmousemodelTransplantation1997631331133840AlegreMLPetersonLJJeyarajahDRWeiserMBluestoneJAThistlewaiteJRSeverecombinedimmunodeficientmiceengraftedwithhumansplenocyteshavefunctionalhumanTcellsandrejecthumanallograftsJImmunol19941532738274941IshikawaFYasukawaMLyonsBYoshidaSMiyamotoTYoshimotoGWatanabeTAkashiKShultzLDHaradaMDevelopmentoffunctionalhumanbloodandimmunesystemsinNODSCIDIL2receptorgammachainmiceBlood20051061565157342TraggiaiEChichaLMazzucchelliLBronzLPiffarettiJCLanzavecchiaAManzMGDevelopmentofahumanadaptiveimmunesystemincordbloodcelltransplantedmiceScience200430410410743KolletOPeledABykTBenHurHGreinerDShultzLLapidotTβ2microglobulindeficientNODSCIDmiceareexcellentrecipientsforstudyinghumanstemcellfunctionBlood2000953102310544ShultzLDLyonsBLBurzenskiLMGottBChenXChaleffSKotbMGilliesSDKingMMangadaJGreinerDLHandgretingerRHumanlymphoidandmyeloidcelldevelopmentinNODLtSzscidIL2RgammanullmiceengraftedwithmobilizedhumanhemopoieticstemcellsJImmunol20051746477648945MacchiariniFManzMGPaluckaAKShultzLDHumanizedmicearewethereyetJExpMed20052021307131146LanPWangLDioufBEguchiHSuHBronsonRSachsDHSykesMYangYGInductionofhumanTcelltolerancetoporcinexenoantigensthroughmixedhematopoieticchimerismBlood20041033964396947LanPTonomuraNShimizuAWangSYangYGReconstitutionofafunctionalhumanimmunesysteminimmunodeficientmicethroughcombinedhumanfetalthymusliverandCD34celltransplantationBlood200610848749248MelkusMWEstesJDPadgettThomasAGatlinJDentonPWOthienoFAWegeAKHaaseATGarciaJVHumanizedmicemountspecificadaptiveandinnateimmuneresponsestoEBVandTSST1NatMed2006121316132249BensingerSJBandeiraAJordanMSCatonAJLauferTMMajorhistocompatibilitycomplexclassIIpositivecorticalepitheliummediatestheselectionofCD425immunoregulatoryTcellsJExpMed200119442743850BaldwinTAHogquistKAJamesonSCThefourthwayHarnessingaggressivetendenciesinthethymusJImmunol20041736515652051AschenbrennerKDCruzLMVollmannEHHinterbergerMEmmerichJSweeLKRolinkAKleinLSelectionofFoxp3regulatoryTcellsspecificforselfantigenexpressedandpresentedbyAiremedullarythymicepithelialcellsNatImmunol2007835135852BhandoolaATaiXEckhausMAuchinclossHMasonKRubinSACarboneKMGrossmanZRosenbergASSingerAPeripheralExpressionofSelfMHCIIInfluencestheReactivityandSelfToleranceofMatureCD4TCellsEvidencefromaLymphopenicTCellModelImmunity20021742553SamyETSetiadyYYOhnoKPramoonjagoPSharpCTungKSTheroleofphysiologicalselfantigenintheacquisitionandmaintenanceofregulatoryTcellfunctionImmunolRev200621217018454MarleauAMSarvetnickNTcellhomeostasisintoleranceandimmunityJLeukocBiol20057857558455TanchotCRosadoMMAgenesFFreitasAARochaBLymphocytehomeostasisSeminImmunol1997933133756BerzinsSPBoydRLMillerJFAPTheroleofthethymusandrecentthymicmigrantsinthemaintenanceoftheadultperipherallymphocytepoolJExpMed19981871839184857ToughDFSprentJTurnoverofnaiveandmemoryphenotypeTcellsJExpMed19941791127113558GoldrathAWBevanMJLowaffinityligandsfortheTCRdriveproliferationofmatureCD8TcellsinlymphopenichostsImmunity1999111839059GoldrathAWBogatzkiLYBevanMJNaiveTCellsTransientlyAcquireaMemorylikePhenotypeduringHomeostasisdrivenProliferationJExpMed200019255756460MuraliKrishnaKAhmedRCuttingedgenaiveTcellsmasqueradingasmemorycellsJImmunol20001651733173761ChoBKRaoVPGeQEisenHNChenJHomeostasisstimulatedProliferationDrivesNaiveTCellstoDifferentiateDirectlyintoMemoryTCellsJExpMed200019254955662TanchotCLeCampionAMartinBLeaumentSDautignyNLucasBConversionofnaiveTcellstoamemorylikephenotypeinlymphopenichostsisnotrelatedtoahomeostaticmechanismthatfillstheperipheralnaiveTcellpoolJImmunol20021685042504663MinBMcHughRSempowskiGDMackallCFoucrasGPaulWENeonatessupportlymphopeniainducedproliferationImmunity20031813114064GoldrathAWLuckeyCJParkRBenoistCMathisDThemolecularprograminducedinTcellsundergoinghomeostaticproliferationProcNatlAcadSciUSA2004101168851689065GudmundsdottirHTurkaLAAcloserlookathomeostaticproliferationofCD4TcellscostimulatoryrequirementsandroleinmemoryformationJImmunol20011673699370766LeCampionABourgeoisCLambolezFMartinBLeaumentSDautignyNTanchotCPenitCLucasBNaiveTcellsproliferatestronglyinneonatalmiceinresponsetoselfpeptideselfMHCcomplexesProcNatlAcadSciUSA2002994538454367KieperWCJamesonSCHomeostaticexpansionandphenotypicconversionofnaiveTcellsinresponsetoselfpeptideMHCligandsProcNatlAcadSciUSA199996133061331168BrockerTSurvivalofmatureCD4TlymphocytesisdependentonmajorhistocompatibilitycomplexclassIIexpressingdendriticcellsJExpMed19971861223123269BoursalianTEBottomlyKSurvivalofnaiveCD4TcellsRolesofrestrictingversusselectingMHCclassIIandcytokinemilieuJImmunol19991623795380170ViretCWongFSJanewayJrCADesigningandmaintainingthematureTCRrepertoirethecontinuumofselfpeptideselfMHCcomplexrecognitionImmunity19991055956871ErnstBLeeDSChangJMSprentJSurhCDThepeptideligandsmediatingpositiveselectioninthethymuscontrolTcellsurvivalandhomeostaticproliferationinthetheperipheryImmunity19991117318172SchulerTHammerlingGJArnoldBCuttingEdgeIL7dependenthomeostaticproliferationofCD8TcellsinneonatalmiceallowsthegenerationoflonglivednaturalmemoryTcellsJImmunol2004172151973TakedaSRodewaldHRArakawaHBluethmannHShimizuTMHCclassIImoleculesarenotrequiredforsurvivalofnewlygeneratedCD4TcellsbutaffecttheirlongtermlifespanImmunity1997521722874KirbergJBernsAVonBoehmerHPeripheralTcellsurvivalrequirescontinualligationoftheTcellreceptortomajorhistocompatiblitycomplexencodedmoleculesJExpMed19971861269127575GoldrathAWSivakumarPVGlaccumMKennedyMKBevanMJBenoistCMathisDButzEACytokinerequirementsforacuteandbasalhomeostaticproliferationofnaiveandmemoryCD8TcellsJExpMed20021951515152276SchlunsKSKieperWCJamesonSCLEFRANCOISLInterleukin7mediatesthehomeostasisofnaiveandmemoryCD8TcellsinvivoNatImmunol2000142643277TanJTErnstBKieperWCLeRoyESprentJSurhCDInterleukin15andIL7jointlyregulatehomeostaticproliferationofmemoryphenotypeCD8cellsbutarenotrequiredformemoryphenotypeCD4cellsJExpMed20021951523153278BeckerTCWherryEJBooneDMuraliKrishnaKAntiaRMaAAhmedRInterleukin15isrequiredforproliferativerenewalofvirusspecificmemoryCD8TcellsJExpMed20021951541154879KieperWCTanJTBondiBoydBGapinLSprentJCeredigRSurhCDOverexpressionofinterleukin7leadstoIL15independentgenerationofmemoryphenotypeCD8TcellsJExpMed20021951533153980KingCIlicAKoelschKSarvetnickNHomeostaticexpansionofTcellsduringimmuneinsufficiencygeneratesautoimmunityCell200411726527781AlmeidaARBorghansJAFreitasAATcellhomeostasisthymusregenerationandperipheralTcellrestorationinmicewithareducedfractionofcompetentprecursorsJExpMed200119459159982LaGrutaNLDrielIRGleesonPAPeripheralTcellexpansioninlymphopenicmiceresultsinarestrictedTcellrepertoireEurJImmunol2000303380338683MirzayanMJSchmidtREWitteTPrognosticparametersforflareinsystemiclupuserythematosusRheumatology2000391316131984KirtavaZBlombergJBredbergAHenrikssonGJacobssonLManthorpeRCD4TlymphocytopeniawithoutHIVinfectionincreasedprevalenceamongpatientswithprimarySjogrenssyndromeClinExpRheumatol19951360961685KayeBRRheumatologicmanifestationsofHIVinfectionsClinRevAllergyImmunol19961438541686GerliRPaganelliRCossarizzaAMuscatCPiccoloGBarbieriDMariottiSMontiDBistoniORaiolaEVenanziFMBertottoAFranceschiCLongtermimmunologiceffectsofthymectomyinpatientswithmyastheniagravisJAllergyClinImmunol199910386587287KoetzKBrylESpickschenKOFallonWMGoronzyJJWeyandCMTcellhomeostasisinpatientswithrheumatoidarthritisProcNatlAcadSciUSA2000979203920888GoronzyJJWeyandCMAgingautoimmunityandarthritisTcellsenescenceandcontractionofTcellrepertoirediversitycatalystsofautoimmunityandchronicinflammationArthritisResTher2003522523489GoronzyJJWeyandCMTcellregulationinrheumatoidarthritisCurrOpinRheumatol20041621221790KaabaSAAlHarbiSAAbnormallymphocytesubsetsinKuwaitipatientswithtype1insulindependentdiabetesmellitusandtheirfirstdegreerelativesImmunolLett19954720921391PeakmanMWarnockTVatsAMcNabGLUnderhillJDonaldsonPTVerganiDLymphocytesubsetabnormalitiesautoantibodiesandtheirrelationshipwithHLADRtypesinchildrenwithtype1diabetesandtheirfirstdegreerelativesDiabetologia19943715516592KukrejaACostGMarkerJZhangCSunZLinSuKTenSSanzMExleyMWilsonBPorcelliSMaclarenNMultipleimmunoregulatorydefectsintype1diabetesJClinInvest200210913114093BrodeSRaineTZacconePCookeACyclophosphamideinducedtype1diabetesintheNODmouseisassociatedwithareductionofCD4CD25Foxp3regulatoryTcellsJImmunol20061776603661294GreggRKJainRSchoenleberSJDivekarRBellJJLeeHHYuPZaghouaniHAsuddendeclineinactivemembraneboundTGFbetaimpairsbothTregulatorycellfunctionandprotectionagainstautoimmunediabetesJImmunol20041737308731695YouSBelghithMCobboldSAlyanakianMAGouarinCBarriotSGarciaCWaldmannHBachJFChatenoudLAutoimmunediabetesonsetresultsfromqualitativeratherthanquantitativeagedependentchangesinpathogenicTcellsDiabetes2005541415142296PopSMWongCPCultonDAClarkeSHTischRSinglecellanalysisshowsdecreasingFoxP3andTGFbeta1coexpressingCD4CD25regulatoryTcellsduringautoimmunediabetesJExpMed20052011333134697GregoriSGiarratanaNSmiroldoSAdoriniLDynamicsofpathogenicandsuppressorTcellsinautoimmunediabetesdevelopmentJImmunol20031714040404798TangQHenriksenKJBiMFingerEBSzotGYeJMastellerELMcDevittHBonyhadiMBluestoneJAInVitroexpandedAntigenspecificRegulatoryTCellsSuppressAutoimmuneDiabetesJExpMed20041991455146599MellanbyRJThomasDPhillipsJMCookeADiabetesinnonobesediabeticmiceisnotassociatedwithquantitativechangesinCD4CD25Foxp3regulatoryTcellsImmunology20071211528100BerzinsSPVenanziESBenoistCMathisDTcellcompartmentsofprediabeticNODmiceDiabetes200352327334101TangQBluestoneJARegulatoryTcellphysiologyandapplicationtotreatautoimmunityImmunolRev2006212217237102BruskoTWasserfallCMcGrailKSchatzRVienerHLSchatzDHallerMRockellJGottliebPClareSalzlerMAtkinsonMNoAlterationsintheFrequencyofFOXP3RegulatoryTCellsinType1DiabetesDiabetes200756604612103FalconeMYeungBTuckerLRodriguezESarvetnickNAdefectininterleukin12inducedactivationandinterferonγsecretionofperipheralnaturalkillerTcellsinnonobesediabeticmicesuggestsnewpathogenicmechanismsforinsulindependentdiabetesmellitusJExpMed1999190963972104GroseSCriticsslamRussiantrialtotestpigpancreasfordiabeticsNatMed200713390391105GodfreyDIKinderSJSilveraPBaxterAGFlowcytometricstudyofTcelldevelopmentinNODmicerevealsadeficiencyinalphabetaTCRCDRCD8thymocytesJAutoimmun199710279285106GombertJMHerbelinATancredeBohinEDyMCarnaudCBachJFEarlyquantitativeandfunctionaldeficiencyofNK1likethymocytesintheNODmouseEurJImmunol19962629892998107LeePTPutnamABenlaghaKTeytonLGottliebPABendelacATestingtheNKTcellhypothesisofhumanIDDMpathogenesisJClinInvest2002110793800108OikawaYShimadaAYamadaSMotohashiYNakagawaYIrieJMaruyamaTSarutaTHighfrequencyofvalpha24vbeta11Tcellsobservedintype1diabetesDiabetesCare20022518181823109MiQSLyDZuckerPMcGarryMDelovitchTLInterleukin4butnotinterleukin10protectsagainstspontaneousandrecurrenttype1diabetesbyactivatedCD1drestrictedinvariantnaturalkillerTcellsDiabetes20045313031310110LehuenALantzOBeaudoinLLalouxVCarnaudCBendelacABachJFMonteiroRCOverexpressionofnaturalkillerTcellsprotectsValpha14Jalpha281transgenicnonobesediabeticmiceagainstdiabetesJExpMed199818818311839111DuarteNStenstromMCampinoSBergmanMLLundholmMHolmbergDCardellSLPreventionofdiabetesinnonobesediabeticmicemediatedbyCD1drestrictednonclassicalNKTcellsJImmunol200417331123118112HongSWilsonMTSerizawaIWuLSinghNNaidenkoOVMiuraTHabaTSchererDCWeiJKronenbergMKoezukaYVanKaerLThenaturalkillerTcellligandalphagalactosylceramidepreventsautoimmunediabetesinnonobesediabeticmiceNatMed2001710521056113SharifSArreazaGAZuckerPMiQSSondhiJNaidenkoOVKronenbergMKoezukaYDelovitchTLGombertJMLeiteDeMoraesMGouarinCZhuRHamegANakayamaTTaniguchiMLepaultFLehuenABachJFHerbelinAActivationofnaturalkillerTcellsbyalphagalactosylceramidetreatmentpreventstheonsetandrecurrenceofautoimmuneType1diabetesNatMed2001710571062114ChenYGChoisyRossiCMHollTMChapmanHDBesraGSPorcelliSAShafferDJRoopenianDWilsonSBSerrezeDVActivatedNKTcellsinhibitautoimmunediabetesthroughtolerogenicrecruitmentofdendriticcellstopancreaticlymphnodesJImmunol200517411961204115CarnaudCGombertJDonnarsOGarchonHHerbelinAProtectionagainstdiabetesandimprovedNKNKTcellperformanceinNODNK11micecongenicattheNKcomplexJImmunol200116624042411116NamikawaRWeilbaecherKNKaneshimaHYeeEJMcCuneJMLongtermhumanhematopoiesisintheSCIDhumouseJExpMed199017210551063117NikolicBGardnerJPScaddenDTArnJSSachsDHSykesMNormaldevelopmentinporcinethymusgraftsandspecifictoleranceofhumanTcellstoporcinedonorMHCJImmunol199916234023407118StefanovaIIDorfmanJRGermainRNSelfrecognitionpromotestheforeignantigensensitivityofnaiveTlymphocytesNature2002420429434119LiuYJDendriticcellsubsetsandlineagesandtheirfunctionsininnateandadaptiveimmunityCell2001106259262120WangJCYDoedensMDickJEPrimitivehumanhematopoieticcellsareenrichedincordbloodcomparedwithadultbonemarrowormobilizedperipheralbloodasmesuredbythequantitativeinvivoSCIDrepopulatingcellassayBlood19978939193924121DaoMAShahAJCrooksGMNoltaJAEngraftmentandretroviralmarkingofCD34andCD34CD38humanhematopoieticprogenitorsassessedinimmunedeficientmiceBlood19989112431255122BhatiaMBonnetDMurdochBGanOIDickJEAnewlydiscoveredclassofhumanhematopoieticcellswithSCIDrepopulatingactivityNatureMed1998410381045123vanderLooJCMHanenbergHCooperRJLuoFYLazaridisENWilliamsDANonobesediabeticseverecombinedimmunodeficiencymouseasamodelsystemtostudytheengraftmentandmobilizationofhumanperipheralbloodstemcellsBlood19989225562570124GothotAvanderLooJCMClappWSrourWFCellcyclerelatedchangesinrepopulatingcapacityofhumanmobilizedperipheralbloodCD34cellsinnonobeseseverecombinedimmunedeficientmiceBlood19989226412649125DaoMANoltaJAImmunodeficientmiceasmodelsofhumanhematopioeticstemcellengraftmentCurrOpinImmunol199911532538126PeledAKolletOPonomaryovTPetitIFranzitaSGrabovskyVSlavMMNaglerALiderOAlonRZiporDLapidotTThechemokineSDF1activatestheintegrinsLFA1VLA4andVLA5onimmaturehumanCD34cellsroleintransendothelialstromalmigrationandengraftmentofNODSCIDmiceBlood20009532893296127AngelopoulouMNovelliEGroveJERinderHMCivinCChengLKrauseDSCotransplantationofhumanmesenchymalstemcellsenhanceshumanmyelopoiesisandmegakaryocytopoiesisinNODSCIDmiceExpHematol200331413420128MatsumuraTKametaniYAndoKHiranoYKatanoIItoRShiinaMTsukamotoHSaitoYTokudaYKatoSItoMMotoyoshiKHabuSFunctionalCD5BcellsdeveloppredominantlyinthespleenofNODSCIDcommongammachainmicetransplantedeitherwithhumanumbilicalcordbloodbonemarrowormobilizedperipheralbloodCD34cellsExpHematol200331789797129PaluckaAKGatlinJBlanckJPMelkusMWClaytonSUenoHKrausETCravensPBennettLPadgettThomasAMarchesFIslasOhlmayerMGarciaJVBanchereauJHumandendriticcellsubsetsinNODSCIDmiceengraftedwithCD34hematopoieticprogenitorsBlood200310233023310130ZhaoYRodriguezBarbosaJIZhaoGShafferJArnJSSykesMMaturationandfunctionofmouseTcellswithatransgeneicTCRpositivelyselectedbyhighlydisparatexenogeneicporcineMHCCellMolBiol200047217228131ZhaoYSwensonKSergioJJSykesMPigMHCmediatespositiveselectionofmouseCD4TcellswithamouseMHCrestrictedTCRinpigthymusgraftsJImmunol199816113201326132ZhaoYSergioJJSwensonKAArnJSSachsDHSykesMPositiveandnegativeselectionoffunctionalmouseCD4cellsbyporcineMHCinpigthymusgraftsJImmunol199715921002107133LeeLAGritschHASergioJJArnJSGlaserRMSablinskiTSachsDHSykesMSpecifictoleranceacrossadiscordantxenogeneictransplantationbarrierProcNatlAcadSciUSA1994911086410867134ZhaoYSwensonKSergioJJArnJSSachsDHSykesMSkingrafttoleranceacrossadiscordantxenogeneicbarrierNatureMed1996212111216135ZhaoYRodriguezBarbosaJIShimizuASwensonKSachsDHSykesMDespiteefficientintrathymicnegativeselectionofhostreactiveTcellsautoimmunediseasemaydevelopinporcinethymusgraftedathymicmiceEvidenceforfailureofregulatorymechanismssuppressingautoimmunityTransplantation20027518321840136CupedoTNagasawaMWeijerKBlomBSpitsHDevelopmentandactivationofregulatoryTcellsinthehumanfetusEurJImmunol200535383390137SeddikiNSantnerNananBTangyeSGAlexanderSISolomonMLeeSNananRSaintGrothBFPersistenceofnaiveCD45RAregulatoryTcellsinadultlifeBlood200610728302838138BaecherAllanCWolfEHaflerDAMHCclassIIexpressionidentifiesfunctionallydistincthumanregulatoryTcellsJImmunol200617646224631139CozzoCLarkinJIIICatonAJSelfpeptidesdrivetheperipheralexpansionofCD4CD25regulatoryTcellsJImmunol200317156785682140ZhaoYRodriguezBarbosaJISwensonKZhaoGArnJSSachsDHSykesMHighlydisparatexenogeneicskingrafttoleranceinductionbyfetalpigthymusinthymectomizedmiceConditioningrequirementsandtheroleofcoimplantationoffetalpigliverTransplantation20017216081615141ZhaoYFishmanJASergioJJOliverosJLPearsonDASzotGLWilkinsonRAArnJSSachsDHSykesMImmunerestorationbyfetalpigthymusgraftsinTcelldepletedthymectomizedmiceJImmunol199715816411649142JordanMSBoesteanuAReedAJPetroneALHolenbeckAELermanMANajiACatonAJThymicselectionofCD4CD25regulatoryTcellsinducedbyanagonistselfpeptideNatImmunol20012301306143DerbinskiJSchulteAKyewskiBKleinLPromiscuousgeneexpressioninmedullarythymicepithelialcellsmirrorstheperipheralselfNatImmunol2001210321039144AndersonMSVenanziESKleinLChenZBerzinsSPTurleySJVonBoehmerHBronsonRDierichABenoistCMathisDProjectionofanimmunologicalselfshadowwithinthethymusbytheaireproteinScience200229813951401145GotterJBrorsBHergenhahnMKyewskiBMedullaryEpithelialCellsoftheHumanThymusExpressaHighlyDiverseSelectionofTissuespecificGenesColocalizedinChromosomalClustersJExpMed2004199155166146KyewskiBDerbinskiJSelfrepresentationinthethymusanextendedviewNatRevImmunol20044688698147PetroneABattelinoTKrzisnikCBugawanTErlichHDiMarioUPozzilliPBuzzettiRSimilarincidenceoftype1diabetesintwoethnicallydifferentpopulationsissustainedbysimilarHLAsusceptibleprotectivehaplotypefrequenciesTissueAntigens200260244253148PetroneABugawanTLMesturinoCANisticoLGalganiAGiorgiGCascinoIErlichHADiMarioUBuzzettiRThedistributionofHLAclassIIsusceptibleprotectivehaplotypescouldpartiallyexplainthelowincidenceoftype1diabetesincontinentalItalyTissueAntigens200158385394149RodewaldHRPaulSHallerCBluethmannHBlumCThymusmedullaconsistingofepithelialisletseachderivedfromasingleprogenitorNature2001414763768150MartinezCaceresEJalecoACResPNoteboomEWeijerKSpitsHCharacterizationofCD34thymicstromalcellslocatedinthesubcapsularcortexofthehumanthymusExpHematol199826588596151RookeRWaltzingerCBenoistCMathisDPositiveselectionofthymocytesinducedbygenetransferMHCclassIImediatedselectionofCD8lineagecellsIntImmunol19991115951600152NakanoNRookeRBenoistCMathisDPositiveselectionofTcellsinducedbyviraldeliveryofneopeptidestothethymusScience1997275678683153RookeRWaltzingerCBenoistCMathisDTargetedcomplementationofMHCclassIIdeficiencybyintrathymicdeliveryofrecombinantadenovirusesImmunity19977123134154RookeRBenoistCMathisDIntrathymicdeliveryofMHCgenesusingrecombinantadenovirusesMethodsMolBiol20001346979155SmerdonRAPeakmanMHussainMJAlviggiLWatkinsPJLeslieRDVerganiDIncreaseinsimultaneouscoexpressionofnaiveandmemorylymphocytemarkersatdiagnosisofIDDMDiabetes199342127133156PetersenLDDuinkerkenGBruiningGJvanLierRAdeVriesRRRoepBOIncreasednumbersofinvivoactivatedTcellsinpatientswithrecentonsetinsulindependentdiabetesmellitusJAutoimmun19969731737157HollerPDYamagataTJiangWFeuererMBenoistCMathisDThesamegenomicregionconditionsclonaldeletionandclonaldeviationtotheCD8alphaalphaandregulatoryTcelllineagesinNODversusC57BL6miceProcNatlAcadSciUSA200710471877192158HehmkeBMichaelisDGensELaubeFKohnertKDAberrantactivationofCD8TcellandCD8TcellsubsetsinpatientswithnewlydiagnosedIDDMDiabetes19954414141419159ZippeliusAPittetMJBatardPRuferNDeSmedtMGuillaumePEllefsenKValmoriDLienardDPlumJMACDONALDHRSpeiserDECerottiniJCRomeroPThymicselectiongeneratesalargeTcellpoolrecognizingaselfpeptideinhumansJExpMed2002195485494160WolfDRumpoldHKoppelstatterCGastlGASteurerMMayerGGunsiliusETilgHWolfAMTelomerelengthofinvivoexpandedCD4CD25regulatoryTcellsispreservedincancerpatientsCancerImmunolImmunother20065511981208161RodriguezBarbosaJIZhaoYEzquerraAZhaoGSachsDHSykesMMurineCD4TcellsselectedinahighlydisparatexenogeneicporcinethymusgraftdonotshowrapiddecayintheabsenceofselectingMHCintheperipheryJImmunol200216966976710162RubioMTMeansTKChakravertyRShafferJFudabaYChittendenMLusterADSykesMMaturationofhumanmonocytederiveddendriticcellsinthepresenceofprostaglandinE2optimizesCD4andCD8TcellmediatedresponsestoproteinantigensroleofPGE2inchemokineandcytokineexpressionbyMoDCsIntImmunol20051715611572163HuberSSchrammCLehrHAMannASchmittSBeckerCProtschkaMGallePRNeurathMFBlessingMCuttingedgeTGFbetasignalingisrequiredfortheinvivoexpansionandimmunosuppressivecapacityofregulatoryCD4CD25TcellsJImmunol200417365266531164ZhengSGGrayJDOhtsukaKYamagiwaSHorwitzDAGenerationexvivoofTGFbetaproducingregulatoryTcellsfromCD4CD25precursorsJImmunol200216941834189165NakamuraKKitaniAFussIPedersenAHaradaNNawataHStroberWTGFbeta1playsanimportantroleinthemechanismofCD4CD25regulatoryTcellactivityinbothhumansandmiceJImmunol2004172834842166ChenWJinWHardegenNLeiKJLiLMarinosNMcGradyGWahlSMConversionofperipheralCD4CD25naiveTcellstoCD4CD25regulatoryTcellsbyTGFbetainductionoftranscriptionfactorFoxp3JExpMed200319818751886167PengYLaouarYLiMOGreenEAFlavellRATGFbetaregulatesinvivoexpansionofFoxp3expressingCD4CD25regulatoryTcellsresponsibleforprotectionagainstdiabetesProcNatlAcadSciUSA200410145724577168FuSZhangNYoppACChenDMaoMChenDZhangHDingYBrombergJSTGFbetainducesFoxp3TregulatorycellsfromCD4CD25precursorsAmJTransplant2004416141627169MarieJCLetterioJJGavinMRudenskyAYTGFbeta1maintainssuppressorfunctionandFoxp3expressioninCD4CD25regulatoryTcellsJExpMed200520110611067170BettelliECarrierYGaoWKornTStromTBOukkaMWeinerHLKuchrooVKReciprocaldevelopmentalpathwaysforthegenerationofpathogeniceffectorTH17andregulatoryTcellsNature2006441235238171PorterDLLevineBLBuninNStadtmauerEALugerSMGoldsteinSLorenAPhillipsJNastaSPerlASchusterSTsaiDSohalAVelosoEEmersonSJuneCHAphase1trialofdonorlymphocyteinfusionsexpandedandactivatedexvivoviaCD3CD28costimulationBlood200610713251331実施例2:MiniMeマウス:成体ヒトにおける免疫回復および免疫病因の個別化した分析のためのモデル多数の自己免疫疾患は、自己反応性T細胞によって媒介される。遺伝的要因は、実質的に、自己免疫に対する感受性に寄与する。HLA遺伝子型が、最も強く自己免疫疾患と関連しているが14、最近定義された非HLA関連遺伝子は、集合的に、実質的な危険性を与える310。類似の座位が、非肥満性糖尿病NODマウス8およびそのヒト対応物である1型糖尿病T1DM11において自己免疫に寄与する。これらの座位には、サイトカイン等の免疫調節遺伝子、共刺激分子、および阻害分子が含まれる81213。制御性CD4T細胞1416、NK/T細胞1719、APC2021http://www.plosone.org/article/info:doi2F10.13712Fjournal.pone.0003739-添付文書1、およびTエフェクター細胞22における欠陥は、マウスおよびヒトの両方のT1DMおよび他の自己免疫疾患22324と関連する。遺伝子研究により、これらの遺伝子のうちのいくつかがNODマウスにおける自己免疫を促進する、機構の分析が可能となった812。しかしながら、自己免疫疾患を有するヒトにおいては、非HLA関連遺伝子から生じる根本的な欠陥は、ほとんどが定義されていない。これらの座位の多くが、免疫制御性遺伝子を含有することを考慮して、疾患感受性はNODマウス25およびヒト26の両方において、造血幹細胞を介して移行されるため、造血幹細胞HSCを起源とする免疫系の細胞における内在性異常が、自己免疫の発達に寄与することが推定される。ほとんどの臨床研究は、疾患発症後の患者の分析を伴い、疾患感受性を与える、遺伝的に決定されたHSC内在性免疫制御性異常の定義を除き、原因と、疾患、その治療、またはそれを引き起こす環境要因の影響とを区別することができない。ヒト化マウスモデルを作製した。ヒト末梢血単核細胞PBMCを、免疫不全マウスに定植させることが可能であり27、ヒトT細胞を、胎児肝臓を腎臓被膜下に埋め込んだヒト胎児胸腺THY移植片で発達させる28。最近、腎臓被膜下のヒト胎児胸腺および肝臓THY/LIV移植片と、ヒトHSCの静脈内注入の組み合わせが、高レベルの末梢ヒトT細胞、B細胞、免疫グロブリン、ならびに骨髄および形質細胞様の両方の樹状細胞を伴う、ヒト免疫再構成を可能にすることが示された29。クラススイッチ型抗体応答を含む、強力な抗原特異的免疫応答を、インビボで観察する2931。抑制機能を有する制御性T細胞Tregの正常な胸腺発達が見られた。さらに、このモデルはまた、ヒトT細胞の恒常性末梢増殖の提示を可能にした32。ヒト自己免疫疾患病因における遺伝的に定義されたHSC内在性異常の役割を研究するためには、自己免疫を有する患者から得られた成体HSCを用いて、ヒト末梢T細胞の再構成および免疫機能を達成することが必要となる。しかしながら、これらの細胞は、大量に入手可能ではなく、成体ヒトHSCは、胎児CD34細胞のように免疫不全マウスに生着しない33。さらに、同種HSCは、胎児胸腺移植片内に既存の同種胸腺細胞によって拒絶される可能性がある。本発明は、少数の成体同種骨髄CD34細胞からのT細胞およびAPCの生成および末梢再構成を支持することができる、凍結保存/解凍したヒト胎児胸腺組織を使用する、新しいヒト化マウスモデルの作製を提供する。成体骨髄吸引液に由来するHSCから、回復した免疫系を生成する。このMiniMeマウスは、自己免疫の素因となるHSC内在性免疫異常の特定、免疫治療方針の個別の評価を可能にし、胸腺不足を有する成体での免疫再構成を達成することができる。胎児胸腺移植片において成熟T細胞によってもたらされる免疫バリアの克服:同種ヒト胎児胸腺組織を移植した免疫不全マウスにおいて、成体HSCからのヒト免疫再構成を評価するために、CD34細胞を廃棄されたヒト骨髄注入フィルターから単離し、胎児THY移植を受けた亜致死照射した非肥満性糖尿病の重症複合型免疫不全NOD/SCIDマウスに静脈内で与えた。未処置ヒト胎児THY移植片のレシピエントは、移植後最初の数週間は低い割合の末梢T細胞を見せ、これは最終的には消失し、これらの細胞が移植片から移出したこと、および非T細胞が、注入された同種CD34細胞から再構成されなかったことを示す。さらに、いくつかの長期20週間超動物は、GVHD様の消耗症候群を発症した。THY移植片に既に存在していた胸腺細胞は、同種CD34細胞を拒絶し、増殖してレシピエント組織を攻撃し、それによって、それぞれ、免疫再構成を妨げ、GVHDをもたらす可能性がある。移植片内に既存の胸腺細胞を枯渇させるための方法を、これらの現象を防止するために試験した。2-デオキシグアノシンdGuoでの胎児胸腺器官培養物FTOCは、再定着して胸腺リンパ球形成を支持し得る35基質成分を保護しながらも、胸腺細胞を枯渇させることを示した34。NOD/SCIDマウスに、dGuoの存在下で7または21日間培養した胎児THY組織に加えて同種成体CD34細胞を受容させた。対照動物に、dGuoで処置した胸腺組織のドナーに由来する胎児肝臓CD34細胞を受容させた。THY移植片なしで5×105の成体CD34細胞を受容したマウスは、10週目までに平均で20のヒトPBMCを再構成したが図25A、CD3細胞は検出不可能であった図25C。7日間dGuoで培養したTHY組織に加えて、同種CD34細胞を受容したマウスにおいて、平均でPBMC中約7のCD3レベルが、移植の6週間後までに検出されたが図25C、CD19細胞は現れず図25B、dGuoによる枯渇を回避した成熟T細胞が、注入した同種CD34細胞を拒絶したことを示し、THY移植片内の常在細胞が、多系統再構成を達成せず、最大限に末梢T細胞プールを再構成することもないことを示す図25C。5×105の同種成体CD34細胞を21日間dGuoで培養したTHY移植片と組み合わせて静脈内注入した後に、20週でPBMC中に平均約25のヒトCD3細胞を有して、ヒト胸腺リンパ球形成ならびに末梢CD19細胞の再構成を伴う胸腺生着が成功した図25C。したがって、末梢に注入された同種成体CD34細胞に由来する前駆体は、dGuoで処置した胸腺に定植可能であり、そこで、胸腺リンパ球形成が行われ、末梢に移出する。同種成体骨髄CD34細胞の代わりに4×105の自己胎児肝臓CD34細胞とともに、dGuoで処置した胎児胸腺組織の対照レシピエントは、14週までにPBMC中約35のヒト末梢血CD3を有し図25C、T細胞の再構成が、同種成体CD34細胞と対比して、自己胎児CD34細胞の注射後に、より効果的であったことを示す。21日間のFTOC移植片を受容したマウスのいずれの群も、高レベルの長期末梢B細胞の再構成を示したが図25B、5×105よりも少ない成体CD34細胞の注入は、生着およびB細胞再構成を成功させることが不可能であった。志願者の骨髄吸引液からは限定された数のHSCしか利用可能でないため、NK細胞を欠いており、ヒトHSC36の生着に対してより許容性のあるNOD/SCID/IL2受容体γ鎖nullNSGマウスを、次の実験に使用した。既存の胸腺細胞を枯渇させるためのTHY移植片の照射を、次に評価した。NSGマウスに、3×105の成体CD34細胞と組み合わせて、7Gyで照射した胸腺組織を、抗ヒトCD2mAbありまたはなしで腹腔内に受容させた。両方の群のマウスが、同種成体CD34細胞からの優れたB細胞および単球の再構成を示し、移植片のT細胞による拒絶が防止されたことを示す。しかしながら、これらのマウスは、20週までに生成される末梢T細胞が非常にわずかであり、移植片は開腹時にはほとんど確認できず、胸腺の照射が、胸腺の成長および/または機能を損なうことを示す。凍結保存/解凍した胎児THY移植片は、NSGマウスにおいて、T細胞の末梢再構成および同種の成体ヒト造血幹細胞から多数の造血系統を可能にする。凍結保存/解凍した胸腺組織の移植は、マウスにおける免疫機能を回復させることができる3738。ヒト胎児THY組織の凍結保存は、成長能力を損なうことなく、胸腺細胞を枯渇させることができる。亜致死照射したNSGマウスの群に、凍結保存/解凍したヒト胎児THY移植片に加えて、静脈注射で3~5×105の同種の成体HSCおよび2用量の抗CD2mAbを受容させた。図26に示されるように、全てのマウスは、6週までにヒトB細胞および単球のキメラ化を達成した。HSC単独のレシピエントとは対照的に、凍結保存/解凍したTHY移植片を受容したマウスは、末梢T細胞を生成し、これは、6週までに現れ、移植後16週で、3×105または5×105のCD34細胞を注入したマウスにおいて、それぞれ、PBMC中約10および約30でピークに達した。CD34細胞のレシピエント由来のTHY移植片は、移植後20週で著しく増大し、以前に胎児CD34細胞で観察されたように31、大半がCD4/CD8二重陽性ヒト胸腺細胞である図26B~C、強力なヒト胸腺リンパ球形成を示した。抗CD2mAbありまたはなしだが、CD34細胞の静脈注射なしで、凍結保存したTHYを受容した対照動物は、末梢で多数のヒトT細胞を再増殖させなかった。したがって、既存の移植片胸腺細胞を凍結保存によって枯渇させ、CD34細胞の静脈内注射が、ヒトT細胞の再構成に必要であった。凍結保存/解凍したTHYに加えて抗CD2mAbを受容した本研究の長期動物はいずれも、消耗症候群を発症せず、この症候群が、胸腺移植片から移出する既存の成熟T細胞の移植片対宿主反応に起因するという仮説と一致する。対照およびT1DMの志願者に由来する臨床骨髄吸引液からのヒト免疫の再構成。次に、臨床骨髄吸引液から単離した成体CD34細胞の再構成能力を評価した。15mlの骨髄吸引により、健常対照およびT1DM患者の志願者から、それぞれ、3.6×105および2.7×106のCD34細胞を得た。亜致死照射したNSGマウスに、それぞれ、凍結保存/解凍したヒト胎児胸腺移植片および抗ヒトCD2mAbに加えて、1.8×105の成体CD34細胞を受容させた。対照の照射したNSGマウスには、胸腺組織なしでCD34細胞を受容させた。ヒトキメラは、6週目から検出可能であり、20週までに約25~80でピークに達した図27。対照およびT1DM志願者に由来するCD34細胞の静脈注射に加えて、THY移植片を受容したマウスは、ピークのCD3細胞レベルが、約50~約90に達し、一方で、対照NSGマウスは、最小限のT細胞再構成を有した。CD19細胞およびCD14細胞もまた、T1DMおよび対照志願者の両方に由来するHSCから回復した図27。反復実験で類似の結果が得られ、単一のT1DM志願者の吸引液に由来する2×105のCD34細胞で、6匹のNSGマウスが再構成された。T1DMおよび対照の成体CD34細胞からのT細胞機能、自己寛容性、およびTregの発達。成体CD34細胞を受容した同種および異種ブタの皮膚を、THY移植済みのマウスに移植することによって、T細胞機能を評価した。図28Aに示されるように、これらのマウスは、同種ヒトおよび異種ブタ皮膚移植片を、すぐに拒絶した。T1DMおよび正常志願者の成体CD34細胞から生成されたT細胞の同種反応性およびT細胞の自己寛容性を評価するために、脾臓およびリンパ節から単離した精製されたT細胞を使用して、混合リンパ球反応MLRを行った。図28Bに示されるように、T1DMおよび対照対象から再構成されたマウスに由来するT細胞は、MLRにおいて、強い同種応答とともに、自己寛容性を示した。注目すべきことに、新しい成体ドナーT細胞および同じ健常対照骨髄ドナーに由来するCD34細胞を受容したマウスに由来するT細胞は、類似の強力な同種刺激因子に対する応答および類似の自己寛容性を示した。したがって、成体志願者の免疫応答性および自己寛容性が、MiniMeマウスに再現された。研究は、Tregの数が、T1DM患者の血液では、非糖尿病対照と比較して減少すること示した39。自然発生型Tregを、胸腺移植片および再構成したマウスの末梢において定量化した。図28Cに示されるように、CD4CD8-胸腺細胞中のCD25highFoxP3自然発生型Tregは、類似の数および割合で、対照およびT1DM志願者から再構成したヒト胸腺移植片に存在した。さらに、類似の割合のTregが、再構成されたマウスの両方の群で、末梢免疫系に検出された図28D。MiniMeマウスにおける回復したT細胞の表現型。移植後20週で、T1DMCD34細胞および正常志願者から再構成したマウスのCD4およびCD8SP胸腺細胞に、スペクトル型解析の分析を行った図29A。T1DMまたは対照志願者によって再構成された胸腺移植片からの両方の集団において、ヒトT細胞は、分析した全11BVファミリーの利用、およびそれらの全てに対して正常に近いCDR3の長さ分布を有する、多様なレパートリーを示した。全ての分析したBVファミリーの平均ハミング距離は、21.2であり、20の正常対照末梢血のCD4サブセットのものに類似のT細胞多クローン性を示す。成体対照志願者CD34細胞ドナーの血液中のT細胞の比較は、同じドナーから再構成されたMiniMeマウスにおけるナイーブ型CD45RACD45RO-CD4、CD8、およびTregサブセットの割合の著しい増加を示した図29B、C。したがって、成体ドナーの免疫系の回復形態は、MiniMeマウスにおいて生成される。成体骨髄に由来するCD34細胞が、凍結保存/解凍した同種胸腺組織を移植した、亜致死照射されたNSGマウスを再構成することができることを、本明細書に提示する。この再構成は、T細胞、B細胞、および骨髄細胞を含む、複数の造血系統に関与する。照射または7日間のdGuo処置とは対照的に、凍結保存/解凍した胎児胸腺組織に加えて、抗CD2mAbを投与することで、胸腺移植片から成熟T細胞を枯渇させることに成功し、同種CD34細胞の拒絶を防止し、消耗症候群の後期発症を防止し、胸腺機能を保存する。このような条件下において、成体ドナーの自己寛容性を再現する、胸腺リンパ球形成、胸腺移植片の成長、および機能性の多様な回復した免疫系の再構成を達成する。胎児肝臓断片が、この研究の基礎となるヒト化マウスモデルに含まれたが2931、注入したCD34細胞に由来する前駆体はヒト胸腺移植片に定植可能であるため、これらの断片は必要ではなかったことが見出された。dGuoで処置したヒト胸腺からのインビボ胸腺リンパ球形成および末梢再構成が示されるが、注入した成体CD34細胞からの末梢T細胞再構成は、同種CD34細胞の拒絶を防止するために十分な期間21日間胸腺をdGuoで処置した場合、低速であった。数週間dGuoで培養したヒト胸腺組織を使用して、完全型ディジョージ症候群を有する患者において、T細胞の再構成を達成した40。これらの小児において40T細胞の回復が低速であったことを考慮して、結果は、GVHDを予防しながら、より迅速なT細胞を回復させるためのアプローチとして、胸腺組織の凍結保存を示す。胎児胸腺組織の凍結保存は、自己免疫疾患と関連するクラスII対立遺伝子を共有する患者および対照に由来する成体CD34細胞とともに使用するためのHLA型判定済みの組織のバンクの蓄積を可能にする。これらの対立遺伝子は、一般集団に比較的共通している41。NSGマウスの使用は、比較的少数の同種成体HSCの生着を可能にし、そのため複数のマウス最大15匹が、成体志願者の15mlの骨髄吸引液から単離したCD34細胞から再構成可能である。NSGマウスにおける成体骨髄CD34細胞からの免疫再構成は、自己免疫疾患の発症と関連するHSC内在性免疫欠陥のインビボ分析を可能にする。これは、疾患によって変化しない免疫系を提供し、制御された有望な方法で、正常対照と患者との比較を可能にする。ヒト研究は、これまで、末梢血試料の分析に限定されており、疾患の原因と結果を区別することが困難であった。Tregの数および機能における欠陥が、T1DM15163942、全身性紅斑性狼瘡43、およびリウマチ性関節炎44に報告されている。しかしながら、Tregの欠陥は、全ての研究に見られるものではなく、NODマウスは、Tregの数および機能を保存したことがわかっている4546。いくつかのヒト研究は、T1DM患者におけるTregの保存を示している47。したがって、これまでのところ、T1DM患者のCD34細胞から生成されたT細胞集団に全体的な異常は観察されておらず、健常対照CD34細胞ドナーと類似の割合でTregを生成する。したがって、本研究は、T1DMの造血幹細胞からTregを生成するに能力における遺伝子にプログラムされた低下を除外する。本モデルでのさらなる研究は、T1DMに関係している無数の免疫制御性異常の徹底的な評価を、それらをもたらし得る遺伝子多型の理解とともに可能にするであろう。T1DMについては、ある程度ヒト疾患に類似の症状を呈する48NODマウス等の動物モデルにおける免疫病理学的な発見は、しかしながら、誤解および間違った推測にもつながっている4849。同種膵島の拒絶を、免疫病因の根底にある根本的な細胞内在性免疫制御性欠陥の分析を除いて、糖尿病ヒト化マウスモデルにおいてモデル化し50、感作し、疾患関連のPBMCを、既にT1DMを発症した個体から移入した。HLAトランスジェニック免疫応答性マウスは、自己免疫疾患の病因の見識を提供し、リウマチ性関節炎51、多発性硬化症52、セリアック病53、T1DM5456、および自然発症性糖尿病等が説明されている57。しかしながら、これらのモデルは、自己免疫病因を引き起こす、ヒトHSC内在性の遺伝的に決定される免疫異常の分析を可能にするものではない。対照的に、免疫不全マウスへの静脈注射でのCD34細胞および胎児THY組織の組み合わせ投与は、正常な構造特性ならびに形質細胞様および骨髄の両方の樹状細胞を有する二次リンパ器官の発達とともに、正常なT細胞機能の回復、T-B相互作用、クラススイッチ抗体応答を可能にする2931。Tregが正常に発達し、T細胞の恒常性をこのモデルにおいて研究することができるため32、それは、自己免疫疾患を有する患者のHSCに由来する細胞における根本的な制御性異常の評価を可能にするであろう。さらに、このMiniMeモデルはまた、免疫療法に対する成体骨髄ドナーの個別の応答性の分析を可能にするであろう。さらに、成体HSCに由来する多様なレパートリーを有するナイーブT細胞を用いた複数のマウスの再構成は、癌患者、造血細胞移植のレシピエント、またはHIV患者等の胸腺が不足した患者に、養子移入のための機能性の自己寛容性T細胞源を提供することができる。タンパク質抗原に対する応答が、ヒトTHYおよびCD34細胞移植片を受容するマウスにおいて生じるため30、腫瘍抗原またはウイルスタンパク質でマウスに免疫付与し、所望される特異的な免疫応答を生成することができる。さらに、マウスは、自己免疫疾患、GVHD、または同種移植片を有する患者の治療に所望される特異性を有する多数の自己Tregを生成することができる。本研究におけるCD34細胞ドナーの自己抗原に対する特異的寛容性およびGVHDの不在は、ヒトドナーおよびマウスレシピエントの両方のクラスIIhighAPCの存在が、免疫不全マウスにおける胸腺異種移植片内に、既に提示されているため58、それぞれ、ヒト胸腺移植片内のヒトHSCドナーおよびマウスレシピエントに由来するAPCの存在に起因する、胸腺内の枯渇を反映する可能性が高い。本発明は、成体HSCから多系統末梢ヒト造血細胞への発達を可能にするモデルを提供する。MiniMeマウスは、自己免疫障害に関連する免疫制御における内在性欠陥、および遺伝的に制御される免疫療法に対する応答の分析のための、疾患またはその治療によって変化しない、白紙の状態のcleanslate免疫系を提供する。これらのマウスはまた、患者での使用に所望される特異性および特性を有する多クローン性のナイーブまたは活性化T細胞源としての治療的可能性を有する。材料および方法動物およびヒトの組織および細胞。非肥満性糖尿病の重症複合型免疫不全NOD/SCIDおよびNOD/SCID/IL2受容体γ鎖nullNSGマウスを、JacksonLaboratoryBarHarbor,MEから入手し、特定の病原体を含まないマイクロアイソレーター環境で収容した。在胎17~20週のヒト胎児胸腺および肝臓の組織を、AdvancedBiosciencesResourceAlameda,CAから入手した。胎児胸腺組織の断片を、10DMSOおよび90ヒトAB血清AtlantaBiologicals,Lawrenceville,GA中で凍結保存し、実験計画に応じて、照射または培養した。CD34細胞を、15mlの骨髄吸引液から、または廃棄されたヒト骨髄フィルターから、または抗ヒトCD34マイクロビーズを用いた磁気活性化細胞分類装置MACS分離システムMiltenyiBiotec,Auburn,CAを使用して、ヒト胎児肝臓組織から、単離した。胎児胸腺器官培養。ヒト胎児胸腺の培養を既に公開されているように実行した34。簡単に述べると、胸腺の断片を、1cm2のGelfoamスポンジPharmaciaUpjohnCo,NY上の0.8μmのアイソポアメンブレンフィルターMillipore,Billerica,MAに設置した。内因性胸腺細胞を排除するために、器官培養物は、ダルベッコ変法イーグル培地DMEM,Sigma-Aldrich,St.Louis,MOにおいて、1.35mM2-デオキシグアノシンSigma-Aldrich,St.Louis,MOの存在下で、7または21日間、37°Cで成長させた。ヒト組織移植。NOD/SCIDおよびNSGマウスを、亜致死2.5Gy全身照射で前処置した。解凍済みの照射または培養したヒト胎児胸腺の約1mm3に測定した断片を、レシピエントの腎臓被膜の下に埋め込んだ。胎児胸腺器官移植の24時間以内に、1~5×105のヒトCD34細胞を、マウスに静脈内注射した。いくつかのレシピエントは、0日目および7日目に抗ヒトCD2mAbBTI322、100μg/マウスで処置した。皮膚の移植。MHCミニブタおよび同種ヒトドナー由来の分層2.3mm皮膚試料を、ヒト組織移植の39週後に、外側胸壁に移植した。皮膚移植片を、7日目以降4週まで毎日評価し、続いて、その後3日毎に少なくとも1回の調査を行った。移植片は、生存している移植片が10未満の場合、拒絶されたと定義した。フローサイトメトリーFCM。移植を受けたマウスにおけるヒト造血細胞のレベルを、4色フローサイトメトリーによって評価した。マウスに、移植後に一定の間隔で尾からの採血を行い、末梢血単核細胞PBMCを得、それをhistopaque-1077Sigma-Aldrich,St.Louis,MOで調製した。BDPharmingenSanDiego,CAから購入した蛍光色素で標識化したmAbを、異なる組み合わせで使用した。抗マウスCD45、抗マウスTer119、抗ヒトCD4、抗ヒトCD8、抗ヒトCD14、抗ヒトCD19、抗ヒトCD45、抗ヒトCD3、抗ヒトCD45RA、抗ヒトCD45RO、抗ヒトCD127、抗ヒトFoxP3、抗ヒトCD25、およびアイソタイプ対照mAb。FCM分析は、FACScalibur、FACScanto、またはLSRIIBDMountainView,CAを使用して行い、分析は、FLOWJOソフトウェアTreeStar,SanCarlos,CAによって行った。死細胞は、低い前方散乱および高いヨウ化プロピジウムPIをゲートアウトし、細胞を保持することによって分析から除外した。マウスの赤血球系細胞は、マウスTer119細胞をゲートアウトすることによりヒトキメラの分析から除外した。混合リンパ球反応。脾細胞およびリンパ節を、ヒト化マウスから採取し、単核細胞の懸濁液を、フィコール分離によって単離した。ヒトT細胞を、製造業者の説明に従って、抗マウスCD45およびTer-119マイクロビーズMiltenyiBiotec,Auburn,CAを使用してマウスの細胞を枯渇させることにより富化し、続いて、PanT細胞単離キットIIMiltenyiBiotec,Auburn,CAを使用してT細胞を精製した。純度は90超であった。レスポンダーT細胞ウェルあたり105を、照射したヒト同種PBMC3000rad、ウェルあたり105の細胞を刺激因子として用いて5日間培養し、増殖を、上述のように59[3H]チミジンの取り込みを介して測定した。データは、3通りの培養物中の平均の[3H]チミジン取り込みとして示される。スペクトル型解析。全RNAを、1~2×104のCD4またはCD8単一陽性胸腺細胞純度80超から直接抽出し、逆転写し、単鎖cDNAの合成を記載の通りに行った60。記載のように60、TCRβ鎖定常領域プライマーおよび個別の可変領域を使用して増幅反応を行った。生成物を、次いで、記載のように60、Cβ特異的FAM標識化プライマーIntegratedDNATechnologies,Coralville,IAでの流出反応に使用した。標識化した生成物を、次いで、TCRβ-鎖長の長さ分布の判定に使用した。DNA生成物に対応するピークの寸法および範囲を、ABI3100GeneticAnalyzerAppliedBiosystems,FosterCity,CAを使用して判定し、AppliedBiosystemsGenotyper3.7NTを使用して分析した。正常なヒトにおける末梢血CD4T細胞の実験および基準のβ-鎖長分布の間の定量的差異を評価するために、ハミング距離を、記載のように計算した60。統計分析。統計分析および比較を、PRISMソフトウェアのバージョン4.0GraphPad,SanDiego,CAを用いて行った。棒グラフのデータは、平均±標準誤差を表す。パラメータデータセットのスチューデントt検定、または非パラメータデータセットのマンホイットニー検定を、群の比較に使用した。0.05未満のp値を、統計的に有意であると見なした。ヒト化マウスのためのヒトCD34細胞の単離および胎児胸腺の調製。ヒト組織:ヒト胎児胸腺組織を、商業的供給源、例えば、Stem-exまたはAdvancedBioscienceResourcesから注文した。培地:骨髄培地500mlMedia199、5mlHEPES、5mlDNAse、40μlゲンタマイシン、MACS緩衝液500mlPBS、5gBSA、2ml0.5MEDTA、30分間脱気材料:滅菌の鋏および鉗子、滅菌6ml注射器、滅菌10cmペトリ皿、50mlファルコンチューブ、Histopaque-1077、40μm細胞染料、ヒトAB血清、および凍結保存の場合はDMSO、CD34MACS単離キット。全ての手順は、滅菌条件下で行うものとする。胎児胸腺組織の調製:1.胎児胸腺組織を、滅菌の鋏で約1~2mm3の大きな断片に切断する。2.胎児胸腺組織を、即時の被膜下移植のために氷上の培養培地に保持するか、または90ヒトAB血清および10DMSOを使用して、1.5mlの滅菌凍結保存チューブに凍結保存する。チューブを迅速に細胞凍結装置に移動させ、凍結プロセスを開始する。3.凍結させた後、胎児胸腺組織を有するチューブを-80°Cの凍結装置に移動させる。1週間以内に移植しない場合、組織片は液体窒素中で保存する。4.解凍するためには、チューブを液体窒素から取り出し、37°Cの水浴に入れる。氷が溶け出すとすぐに、チューブを取り出し、骨髄培地を含有する50mlの円錐容器に内容物を移す。5分後、DMSOを希釈するために、新しい骨髄培地を含有する新しい50mlの円錐容器に、胸腺片を移す。5分後に希釈ステップを繰り返す。5.胸腺片を、即時の被膜下への移植のために、氷上の培地に入れる。胎児肝臓CD34細胞の調製:1.胎児肝臓を10cmの滅菌ペトリ皿に入れ、3または6mlの注射器の滅菌プランジャーで骨髄培地に穏やかに砕いて入れる。細胞懸濁液を、40μmの細胞濾過器を通して50mlの円錐容器に移す。2.細胞懸濁液を、新しい50mlチューブの20mlのHistopaque1.077にゆっくりと穏やかに入れる。勾配層を破壊しないように注意する。3.チューブを遠心分離容器に移し、容器のバランスを取り、ブレーキをオフにして、室温で30分間1400~1500rpmで遠心分離する。4.遠心分離の後、軟膜を収集し、細胞濾過器を通して再度濾過する。新しい骨髄培地と十分に混合して、勾配の再形成を防止する。5.ブレーキをオンにして、5分間2000rpmで遠心分離する。6.上清を傾瀉し、ペレットを収集する。7.MACSヒトCD34単離キット130-046-702の説明書を使用して、CD34の富化を進める。FACSによって純度を確認し、BM培地中で洗浄する。8.90ヒトAB血清および10DMSO中に凍結保存するか、またはBM培地中でマウスあたり100~400,000のCD34細胞を静脈内に注射する。マウスは、少なくとも8時間前までに、2~2.5GyのTBIを受容していなければならない。実施例2の参考文献1SuriAWaltersJJGrossMLUnanueERNaturalpeptidesselectedbydiabetogenicDQ8andmurineIAmoleculesshowcommonsequencespecificityJClinInvest115226822762GoronzyJJWeyandCMDevelopmentsinthescientificunderstandingofrheumatoidarthritisArthritisResTher112493DanskaJSPoussierPAftertheGWASrushnuggetsofinsightintothepathogenesisofautoimmunediseaseSeminImmunol213133174SvejgaardATheimmunogeneticsofmultiplesclerosisImmunogenetics602752865UedaHetalAssociationoftheTcellregulatorygeneCTLA4withsusceptibilitytoautoimmunediseaseNature4235065116SmythDJetalAgenomewideassociationstudyofnonsynonymousSNPsidentifiesatype1diabeteslocusintheinterferoninducedhelicaseregionNatGenet386176197SteckAKetalAssociationofnonHLAgeneswithtype1diabetesautoimmunityDiabetes54248224868WickerLSetalType1diabetesgenesandpathwayssharedbyhumansandNODmiceJAutoimmun25Suppl29339JakkulaEetalGenomewideassociationstudyinahighriskisolateformultiplesclerosisrevealsassociatedvariantsinSTAT3geneAmJHumGenet8628529110CoenenMJetalCommonanddifferentgeneticbackgroundforrheumatoidarthritisandcoeliacdiseaseHumMolGenet184195420311AtkinsonMALeiterEHTheNODmousemodeloftype1diabetesAsgoodasitgetsNatureMed560160412VijayakrishnanLetalAnautoimmunediseaseassociatedCTLA4splicevariantlackingtheB7bindingdomainsignalsnegativelyinTcellsImmunity2056357513BarkerJMType1diabetesassociatedautoimmunityNaturalHistoryGeneticAssociationsandScreeningJClinEndocrinolMetab14RognerUCetalTheDiabetesType1LocusIdd6ModulatesActivityofCD4CD25RegulatoryTCellsDiabetes5518619215ArifSetalAutoreactiveTcellresponsesshowproinflammatorypolarizationindiabetesbutaregulatoryphenotypeinhealthJClinInvest11345146316LindleySetalDefectiveSuppressorFunctioninCD4CD25TCellsFromPatientsWithType1DiabetesDiabetes54929917EstebanLMetalGeneticcontrolofNKTcellnumbersmapstomajordiabetesandlupusLociJImmunol1712873287818WilsonSBetalExtremeTh1biasofinvariantVα24JαQTcellsintype1diabetesNature39117718119RodackiMetalAlterednaturalkillercellsintype1diabeticpatientsDiabetes5617718520JinYetalAPCdysfunctioniscorrelatedwithdefectivesuppressionofTcellproliferationinhumantype1diabetesClinImmunol13027227921AlardPetalDeficiencyinNODAntigenPresentingCellFunctionMayBeResponsibleforSuboptimalCD4CD25TCellMediatedRegulationandType1DiabetesDevelopmentinNODMiceDiabetes552098210522DAliseAMetalThedefectinTcellregulationinNODmiceisaneffectontheTcelleffectorsProcNatlAcadSciUSA105198571986223CrispinJCetalPathogenesisofhumansystemiclupuserythematosusrecentadvancesTrendsMolMed16475724VenkenKHellingsNLiblauRStinissenPDisturbedregulatoryTcellhomeostasisinmultiplesclerosisTrendsMolMed16586825SerrezeDVLeiterEHWorthenSMShultzLDNODmarrowstemcellsadoptivelytransferdiabetestoresistantF1miceDiabetes3725225526LampeterEFMcCannSRKolbHTransferofdiabetestype1bybonemarrowtransplantationLancet35156856927MosierDEGuliziaRJBairdSMWilsonDBTransferofafunctionalhumanimmunesystemtomicewithseverecombinedimmunodeficiencyNature33525625928McCuneJMetalTheSCIDhumouseMurinemodelfortheanalysisofhumanhematolymphoiddifferentiationandfunctionScience2411632163929LanPTonomuraNShimizuAWangSYangYGReconstitutionofafunctionalhumanimmunesysteminimmunodeficientmicethroughcombinedhumanfetalthymusliverandCD34celltransplantationBlood10848749230TonomuraNHabiroKShimizuASykesMYangYGAntigenspecifichumanTcellresponsesandTcelldependentproductionofhumanantibodiesinahumanizedmousemodelBlood1114293429631LanPetalInductionofhumanTcelltolerancetoporcinexenoantigensthroughmixedhematopoieticchimerismBlood1033964396932OnoeTetalHomeostaticexpansionandphenotypicconversionofhumanTcellsdependonperipheralinteractionswithAPCJImmunol33LepusCMetalComparisonofhumanfetalliverumbilicalcordbloodandadultbloodhematopoieticstemcellengraftmentinNODscidcommongammachainBalbcRag1commongammachainandCB17scidbgimmunodeficientmiceHumImmunol7079080234JenkinsonEJAndersonGFetalthymicorganculturesCurrOpinImmunol629329735JenkinsonEJFranchiLLKingstonROwenJJEffectofdeoxyguanosineonlymphopoiesisinthedevelopingthymusrudimentinvitroapplicationintheproductionofchimericthymusrudimentsEurJImmunol1258358736ShultzLDIshikawaFGreinerDLHumanizedmiceintranslationalbiomedicalresearchNatRevImmunol711813037CacheiroLHGloverPLPerkinsEHRestorationofimmunecompetencewithcryopreservedthymusTransplantation4011011238CheersCLeucharsEDaviesAJWallisVRestorationofthymectomizedirradiatedmicebyfrozenandstoredthymusgraftsTransplantation1050551139KukrejaAetalMultipleimmunoregulatorydefectsintype1diabetesJClinInvest10913114040DavisCMetalNormalizationoftheperipheralbloodTcellreceptorVbetarepertoireafterculturedpostnatalhumanthymictransplantationinDiGeorgesyndromeJClinImmunol1716717541BarkerJMetalTwosinglenucleotidepolymorphismsidentifythehighestriskdiabetesHLAgenotypepotentialforrapidscreeningDiabetes573152315542BruskoTMWasserfallCHClareSalzlerMJSchatzDAAtkinsonMAFunctionaldefectsandtheinfluenceofageonthefrequencyofCD4CD25Tcellsintype1diabetesDiabetes541407141443BonelliMetalPhenotypicandfunctionalanalysisofCD4CD25FoxP3TcellsinpatientswithsystemiclupuserythematosisJImmunol1821689169544FloresBorjaFJuryECMauriCEhrensteinMRDefectsinCTLA4areassociatedwithabnormalregulatoryTcellfunctioninrheumatoidarthritisProcNatlAcadSciUSA105193961940145BerzinsSPVenanziESBenoistCMathisDTcellcompartmentsofprediabeticNODmiceDiabetes5232733446TangQBluestoneJARegulatoryTcellphysiologyandapplicationtotreatautoimmunityImmunolRev21221723747BruskoTetalNoAlterationsintheFrequencyofFOXP3RegulatoryTCellsinType1DiabetesDiabetes5660461248vonHerrathMNepomGTAnimalmodelsofhumantype1diabetesNatImmunol1012913249RoepBOAreinsightsgainedfromNODmicesufficienttoguideclinicaltranslationAnotherinconvenienttruthAnnNYAcadSci110311050KingMetalDevelopmentofnewgenerationHUPBMCNODSCIDmicetostudyhumanisletalloreactivityAnnNYAcadSci1103909351TanejaVDavidCSRoleofHLAclassIIgenesinsusceptibilityresistancetoinflammatoryarthritisstudieswithhumanizedmiceImmunolRev233627852LangHLetalAfunctionalandstructuralbasisforTCRcrossreactivityinmultiplesclerosisNatImmunol394094353BlackKEMurrayJADavidCSHLADQdeterminestheresponsetoexogenouswheatproteinsamodelofglutensensitivityintransgenicknockoutmiceJImmunol1695595560054SerrezeDVNiensMKulikJDiLorenzoTPBridgingmicetomenusingHLAtransgenicmicetoenhancethefuturepredictionandpreventionofautoimmunetype1diabetesinhumansMethodsMolBiol60211913455KingMPearsonTRossiniAAShultzLDGreinerDLHumanizedmiceforthestudyoftype1diabetesandbetacellfunctionAnnNYAcadSci1150465356GregersenJWHolmesSFuggerLHumanizedanimalmodelsforautoimmunediseasesTissueAntigens6338339457WenLChenNYTangJSherwinRWongFSTheregulatoryroleofDR4inaspontaneousdiabetesDQ8transgenicmodelJClinInvest10787188058NikolicBetalNormaldevelopmentinporcinethymusgraftsandspecifictoleranceofhumanTcellstoporcinedonorMHCJImmunol1623402340759KrausABetalEarlyhostCD8TcellrecoveryandsensitizedantidonorIL2producingandcytolyticTcellresponsesassociatedwithmarrowgraftrejectionfollowingnonmyeloablativebonemarrowtransplantationExpHematol3160962160WuHDetalThelymphocyticinfiltrationincalcificaorticstenosispredominantlyconsistsofclonallyexpandedTcellsJImmunol17853295339実施例3T、B、NK、NKT、および樹状細胞DCを含む、免疫系の細胞における内在性異常が、NODマウスおよび/または1型真性糖尿病T1DMにおける自己免疫病因に関連づけられている。しかしながら、ほとんどのヒト研究は、疾患発症後のT1DM患者の分析を伴うため、疾患の原因と結果を区別することができない。制御された有望な方法で、このような欠陥の分析を可能にするであろう新しいヒト化マウスモデルを、本明細書に記載のように作製した。ヒトCD34胎児肝臓細胞の静脈内注入に加えて、ヒト胎児胸腺および肝臓組織を移植することによって、NOD/SCIDマウスが機能性ヒト免疫系を伴って再構成される、ヒト化マウスモデルについて記載した。これらのマウスは、B、T、およびDCを含む、多系統ヒト造血細胞の末梢再構成を示し、正常な寸法のリンパ組織を発達させ、インビボで強い抗原特異的免疫応答を示す。正常な胸腺の発達は、制御性T細胞を示すものであり、Tregの機能および末梢での活性化した表現型への変換を示した。このモデルはまた、これまでのところ適切なインビボモデルに欠けている、ヒトT細胞の恒常性末梢増殖の試験を可能にする。ヒト化マウスからT細胞欠損ヒト化マウスへの自己T細胞の養子移入は、リンパ球減少状況において、インビボでの2つの目立った増殖性応答を示した。急速な増殖を受けるヒトナイーブCD4およびCD8T細胞は、メモリー様の表現型およびIFN-γを急速に生成する能力を取得し、一方で、低速な増殖を受けているものは、ナイーブ表現型の機能的特徴を維持する。両方の集団の回復は、レシピエントのヒト化マウスの末梢における、ヒトの非T細胞キメラのレベルに依存する。本発明は、少数の成体同種骨髄CD34細胞に由来するT細胞およびAPCを有する、NOD/SCID共通γ鎖ノックアウトマウスの末梢の生成および定植を支持することが可能な凍結保存/解凍したヒト胎児胸腺組織を使用して、ヒト化マウスモデルの構築を提供する。T1DM患者および健常対照に由来する骨髄CD34細胞を、T1DM関連HLAクラスII対立遺伝子およびHLA-A0201を発現するヒト胎児胸腺移植片を受容したマウスに注射する。このモデルは、正常対照に対比して、T1DMのCD34細胞に由来する、通常および制御性T細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型変換、ならびに自己寛容性の比較を可能にするであろう。T1DM患者に由来する造血幹細胞が自己免疫に寄与する内在性異常を示すことが、可能である。1型真性糖尿病は、インスリンを生成するβ細胞の自己免疫破壊によって引き起こされる。自己免疫の発達に重要な役割を果たす環境要因は明確に定義されていないが、遺伝的要因は、実質的に疾患の感受性に寄与する。HLAの遺伝子型が、最も強くT1DMに関連する。しかしながら、非HLA関連の座位もまた、明らかに自己免疫に寄与する。これらの座位の多くは、免疫制御性遺伝子を含有する。したがって、理論に束縛されるものではなく、造血幹細胞HSCを起源とする、免疫系の細胞における内在性異常は、自己免疫の発達に寄与し得る。NODマウスモデルは、これらの遺伝子のうちのいくつかが自己免疫を促進する、機構を分析するための遺伝学的研究を可能にしたが、臨床研究は、疾患発症後の患者の分析を伴い、原因と、疾患、その治療、またはそれを引き起こす環境要因の影響とを区別することができない。したがって、制御された有望な方法で、ヒトの免疫学的欠陥の分析を可能にするモデルに対する必要性が存在する。亜致死照射したNOD/SCID/IL2受容体γ鎖欠損NSGマウスにおいて、少数で投与された成体同種骨髄CD34細胞から、多系統末梢ヒト造血細胞の発達を可能にする、ヒト化マウスモデルを本明細書に提示する。このモデルは、制御された有望な方法で、自己免疫疾患を有する患者と対比して、正常対照のCD34細胞に由来するT細胞および他の免疫細胞の比較を可能にする。多数のヒト化マウスモデルを作製した。ヒト末梢血単核細胞PBMCは、免疫不全マウスに定植させることが可能であり、ヒトT細胞を、胎児肝臓を腎臓被膜下に埋め込んだヒト胎児胸腺THY移植片で発達させる。胎児CD34細胞の静脈内注入と、腎臓被膜下のヒト胎児胸腺および肝臓THY/LIV移植片との組み合わせが、末梢ヒトT細胞、B細胞、免疫グロブリン、ならびに骨髄および形質細胞様の両方の樹状細胞を伴うヒト免疫の再構成を可能にすることが示された。これらのマウスは、正常な寸法のリンパ組織を発達させ、タンパク質免疫付与後に強力なクラススイッチ型抗体応答を含む、強い抗原特異的免疫応答をインビボで示す。さらに、制御性T細胞Tregの正常な胸腺発達は、Tregの機能および末梢での活性化した表現型への変換を提示した。このモデルはまた、これまでのところ適切なインビボモデルに欠けている、ヒトT細胞の末梢の恒常性増殖の試験を可能にする。成体骨髄に由来するCD34細胞は、亜致死照射した、凍結保存/解凍した同種胸腺組織を移植したNSGマウスを再構成し、T細胞を含む、複数の末梢造血細胞系統を再構成することができる。照射または7日間のdGuo処置とは対照的に、凍結保存/解凍した胎児胸腺組織に加えて、抗CD2mAbの投与は、胸腺内T細胞の枯渇を成功させ、同種CD34細胞の拒絶を防止し、胸腺機能を保存する。したがって、自己免疫疾患を有する患者および健常対照に由来する骨髄CD34細胞を、疾患関連のHLAクラスII対立遺伝子を発現するヒト胎児胸腺移植片を受容するマウスに注射することができる。少数の吸引した骨髄細胞を使用して、このモデルは、自己免疫疾患を有する患者におけるHSC内在性の免疫異常の特定を可能にするであろう。実施例4ある特定の態様において、本発明は、HLA決定済みヒト胸腺移植片でヒト胸腺リンパ球形成を可能にする、再凝集ヒト胸腺移植モデルを作製する方法を提供する。この実施例において、インタクトな胎児胸腺組織を埋め込む代わりに、HLA型判定済みのヒト胎児胸腺組織から凍結保存したCD45陰性胸腺間質細胞を、NOD-SCIDマウスの腎臓被膜下に埋め込むことができる。共通の糖尿病感受性HLA対立遺伝子を保有する胸腺は、これらの対立遺伝子を共有する正常対照および1型糖尿病対象に由来する静脈内注射したCD34細胞から、T細胞の胸腺リンパ球形成を支持するであろう。代替的なアプローチには、インタクトなヒト胸腺組織に、HLAトランスジェニックNODマウス由来の胸腺上皮細胞を注射すること、または糖尿病感受性対立遺伝子をコードする遺伝子を胸腺異種移植片にアデノウイルス形質導入を行うことが含まれる。ある特定の態様において、本発明は、正常細胞に対比して、T1DMのCD34細胞に由来する通常のT細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型変換、および自己寛容性を比較するためのマウスモデルおよび方法を提供する。T1DM患者に由来するT細胞が、胸腺ドナーの自己抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかを判定することができる。恒常性における内在性異常が、T1DM患者のT細胞を特徴付けるかどうかを判定することができる。ある特定の態様において、本発明は、正常対照と対比して、T1DMのCD34細胞に由来する制御性T細胞の数、機能、および末梢表現型変換を比較するための方法を提供する。T1DM患者の幹細胞に由来するTregおよびNKT細胞は、欠陥を示す。これらの研究により、胸腺後が起源のものと対比して、T1DM患者およびそれらの胸腺に由来する制御性細胞における内在性異常を特定する。種々のレジメンを、同種CD34細胞からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にするであろうNOD.scidマウスのヒト胎児胸腺移植片の生着について評価した。ヒト骨髄フィルターからのCD34細胞の単離:研究のために正常および1型糖尿病ドナーに骨髄の採取を行う前に、成体CD34細胞および同種胎児胸腺組織を受容するNOD-SCIDマウスにおいて、ヒト胸腺リンパ球形成のためのモデルを構築することが必要であった。これらの研究のための成体CD34細胞源として、MassachusettsGeneralHospitalBoneMarrowTransplantUnitから廃棄された骨髄フィルターを使用した。各フィルターから、フィルター当たり5~25×106の正常ドナーのCD34細胞を、MACSビーズを使用して単離した。フローサイトメトリー分析により、純度約90であることがわかった。これらの細胞を、これらの研究で使用するために凍結保存した。胎児胸腺器官培養物:ヒト胎児胸腺組織を、AdvancedBioscience,Californiaから入手した。胎児胸腺移植片内に存在する成熟T細胞による同種CD34細胞に由来する胸腺細胞の拒絶を防止するために、1.35MdGuoの存在下で培養物を評価した。胸腺内のCD4およびCD8単一陽性細胞の割合は、10日間の培養後、それぞれ、43および14から、3.4および2.1に減少した。比較として、dGuoなしで類似の期間培養した後のCD4およびCD8単一陽性細胞の割合は、それぞれ、20.1および13.3であった。しかしながら、dGuoありでの胎児胸腺器官培養物は、20日間でさえ、全ての成熟胸腺細胞を完全に枯渇させることはなかった。dGuoで処置したヒト胎児胸腺移植片からのヒトT細胞の再構成:NOD/SCIDマウスに、dGuoの存在下で20日間培養したヒト胎児胸腺を移植する1日前に、2.5GyのTBIを受容させた。ヒト胸腺リンパ球形成を伴う胸腺生着の成功は、同種成体CD34細胞の静脈内注入後に生じた:ヒトCD3細胞は、移植の20週後、全てのマウスの末梢血において検出可能であり、平均でPBMC中約25に相当する。新鮮またはdGuoで処置したかのいずれかであるが、CD34細胞を含まないヒト胎児胸腺組織を受容させた年齢適合対照マウスは、移植後のどの時点においても、血中に検出可能なヒトCD3細胞を有さなかった。これらの結果は、胸腺移植片内に存在する幹細胞および成熟T細胞が、末梢ヒトT細胞を生成するのに十分な胸腺リンパ球形成を維持することができず、追加のCD34の注入が必須であることを示す。研究は、dGuoで処置した胎児胸腺組織中の胸腺細胞が、同種CD34細胞に由来する胸腺細胞前駆体を拒絶しないことを示す。さらに、末梢に注入されたCD34細胞に由来する前駆体は、dGuoで処置した胸腺に定植することができ、そこで胸腺リンパ球形成が行われることが示された。dGuoで処置した胎児胸腺組織を受容させた別の年齢適合対照群にもまた、同種成体骨髄に由来するCD34細胞の代わりに、同じ胎児ドナーの肝臓から単離したCD34細胞を静脈内注入で受容させた。これらの同系胎児CD34細胞の注入後、CD3細胞の移植の14週間後までに、平均でPBMC中約35までの末梢血CD3の再構成が検出可能であった。したがって、ヒト末梢CD3細胞の再構成は、成体から得られた同種CD34細胞で達成されたものと比較して、自己胎児CD34細胞の注射後では、より急速であると考えられる。データは、CD34細胞の静脈内投与とともに、dGuoで20日間培養した移植片で達成されたT細胞の再構成が、胎児肝臓断片を一緒に埋め込み、同じドナーの胎児肝臓に由来するCD34細胞を静脈注射した、新鮮な胎児胸腺移植片で達成されたものよりも低速であり得ることを示す。このような研究において、高レベルのCD3細胞は、移植の9週間以内に末梢血中に検出可能であった。ヒトCD3T細胞の再構成を加速させる試みの中で、dGuoの存在下で7日間だけ培養したヒト胎児胸腺移植片を用いて、別の群を構築した。平均でPBMC中約7のCD3レベルが、移植後6週間以内に検出可能であったが、これらのレベルは、その後数週間にわたって低下した。移植20週間後までに、血中のCD3T細胞レベルは、平均で5未満となった。さらに、注射したCD34細胞から多系統ヒト白血球再構成が観察された、20日間dGuoで培養した胸腺およびCD34細胞の静脈注射で達成された結果とは対照的に、いずれの時点においても、検出可能なCD19細胞は存在しなかった。これらの結果は、注射した同種CD34細胞が、7日間dGuoで処置した胸腺移植片中の、dGuo処置によって枯渇されなかった成熟T細胞によって拒絶された可能性があることを示す。したがって、胎児胸腺移植片から成熟胸腺細胞を排除し、それによって、同種CD34細胞およびそれらの子孫の生存および機能を可能にするためには、より長いdGuo培養期間が必要であるという結論に達する。他のレジメンでのヒトT細胞の再構成:実験により、ヒト胎児胸腺移植片における同種CD34細胞の生着を達成するさらなる方法を調査する。NOD-SCIDマウスの群に、移植前に凍結保存したヒト胎児胸腺移植片を受容させた。胎児胸腺組織の凍結保存は、研究の他の部分でブタ胸腺移植片において胸腺細胞の数を減少させることが示されており、ヒトCD34細胞に由来する前駆体による、さらに急速な再増殖をもたらす。代替的なアプローチとして、1つの群のマウスに、移植前に7Gyで照射したヒト胎児胸腺組織を受容させた。別の群において、インビボで胸腺細胞前駆体を移植片へ輸送するための要件を克服するために、dGuoで培養した胎児胸腺組織とCD34細胞とを埋め込み前に懸滴培養で共培養することの有効性を試験した。OP9-DL1共培養:ヒト胸腺リンパ球形成を促進するための別のアプローチは、CD34細胞とOP9-DL1細胞とを、同種懸滴または再凝集胸腺培養物に添加する前に、共培養することによってT細胞前駆体を増殖させることであり得る。OP9-DL1細胞系を使用することにより、プロトコルは、ヒト成体CD34細胞から前駆T細胞へのインビトロでの分化を可能にするようになった。単分子層のOP9-DL1細胞上での1ウェル当たり5×105のCD34細胞の28日間の共培養後、合計4×105の細胞を得、そのうちの67は、前駆T細胞マーカーのCD1aおよびCD7に二重陽性であった。しかしながら、1ウェル当たりに必要なCD34細胞の数が多いために骨髄吸引を介して糖尿病患者および健常対照から得られるCD34細胞の数が限られていることから、このアプローチは、これらの目的には実用的ではない可能性がある。さらに、MACSビーズを使用して、CD45細胞の枯渇ありおよびなしの再凝集胸腺培養物の評価を行う。CD34細胞での培養後、これらの再凝集組織を、照射済みNOD.scidマウスに移植する。最も高く、最も高速なヒトCD3細胞の再構成を可能にするレジメンを選択する。糖尿病患者ならびに健常志願者の骨髄吸引液に由来するCD34細胞を、約10のNOD-SCIDマウスに移入する。共通の糖尿病感受性HLA対立遺伝子を有する胎児胸腺組織を、これらのマウスの腎臓被膜の下に移植する。ヒトT細胞の再構成後に、T細胞、Treg、およびNKT細胞の分析が可能となる。実施例5dGuoで処置したヒト胎児胸腺移植片からのヒトT細胞の再構成:NOD/SCIDマウスに、dGuoの存在下で20日間培養したヒト胎児胸腺の移植の1日前に、2.5GyのTBIを受けさせた表3。ヒト胸腺リンパ球形成を伴う胸腺生着の成功は、5×105の同種成体CD34細胞の静脈内注入後に生じた:ヒトCD3細胞は、移植の20週間後に、全てのマウスの末梢血に検出可能であり、平均でPBMC中約25に相当する。新鮮またはdGuoで処置かのいずれかであるが、CD34細胞を含まないヒト胎児胸腺組織を受容させた年齢適合対照マウスは、移植後のどの時点においても、血中に検出可能なヒトCD3細胞を有さなかった。これらの結果は、胸腺移植片内に存在する幹細胞および成熟T細胞が、末梢ヒトT細胞を生成するのに十分な胸腺リンパ球形成を維持することができず、追加のCD34の注入が必須であることを示す。研究はまた、20日間dGuoで処置した胎児胸腺組織中に既存の胸腺細胞が、同種CD34細胞に由来する胸腺細胞前駆体を拒絶しなかったことを示した。さらに、データは、末梢に注入されたCD34細胞に由来する前駆体は、dGuoで処置した胸腺に定植することができ、そこで胸腺リンパ球形成が行われることを示した。dGuoで処置した胎児胸腺組織を受容させた別の年齢適合対照群に、同種成体骨髄に由来するCD34細胞の代わりに、同じ胎児ドナーの肝臓から単離した4×105のCD34細胞を静脈内注入で受容させた。これらの同系胎児CD34細胞を注入した後、CD3細胞の移植14週間後までに、末梢血CD3の再構成が、平均でPBMC中約35まで検出可能であった。したがって、ヒト末梢CD3細胞の再構成は、成体から得た同種CD34細胞で達成されたものと比較して、自己胎児CD34細胞の注射後では、より効率的であると考えられる。データは、既に公開されているように、CD34細胞の静脈内投与とともに、dGuoで20日間培養した移植片で達成されたT細胞の再構成が、胎児肝臓断片を一緒に埋め込み、同じドナーの胎児肝臓に由来するCD34細胞を静脈注射した、新鮮な胎児胸腺移植片で達成されたものよりも低速であり得ることを示す。これらの研究において、高レベルのCD3細胞が、移植の9週間以内に末梢血中に検出可能であった。ヒトCD3T細胞の再構成を加速させる目的で、dGuoの存在下で7日間だけ培養したヒト胎児胸腺移植片を用いて、別の群を構築した。平均でPBMC中約7のCD3レベルが、移植後6週間以内に検出可能であったが、これらのレベルは、その後数週間にわたって低下した。移植の20週後までに、血中のCD3T細胞レベルは、平均で5未満となった。さらに、注射したCD34細胞から多系統ヒト白血球再構成が観察された、20日間dGuoで培養した胸腺およびCD34細胞の静脈注射で達成された結果とは対照的に、いずれの時点においても、検出可能なCD19細胞は存在しなかった。これらの結果は、注射した同種CD34細胞が、7日間dGuoで処置した胸腺移植片中の、dGuo処置によって枯渇されなかった成熟T細胞によって拒絶された可能性があることを示す。したがって、胎児胸腺移植片から成熟胸腺細胞を排除し、それによって、同種CD34細胞およびそれらの子孫の生存および機能を可能にするためには、より長いdGuo培養期間が必要であるという結論に達した。ヒト胎児胸腺組織の凍結保存および照射:胎児胸腺組織の凍結保存は、研究の他の部分でブタ胸腺移植片において胸腺細胞の数を減少させることが示されており、ヒトCD34細胞に由来する前駆体による、より急速な再増殖をもたらす。したがって、NOD-SCIDマウスの群に、移植前に凍結保存したヒト胎児胸腺移植片を受容させた表4。代替的なアプローチとして、1つの群のマウスに、移植前に7Gyで照射を行ったヒト胎児胸腺組織を受容させ、対照群には未処置の新鮮なヒト胎児胸腺組織を受容させた。全ての動物に、2.5GyのTBIおよび2.5×105の成体CD34細胞を静脈注射で受容させた。この数の細胞が、ヒト胎児肝臓に由来するCD34細胞を使用した場合、高レベルの多系統ヒト再構成を達成するのに十分であることが見出された。この研究の対照群には、2×105の自己胎児肝臓に由来するCD34細胞を受容させた。この対照群は、このモデルに典型的に見られるように、強力な多系統ヒトT、B、および骨髄の再構成を達成した。16週間の移植後経過観察の間、成体骨髄に由来するCD34細胞の全てのレシピエントにおけるヒト造血の再構成は、非常にわずかであった。未処置のヒト胸腺組織を受容したNOD-SCIDマウスにおいては、PBMC中のヒト細胞の割合は、6週目までに平均で約10となり、移植後16週目までごくわずかな変動を有しただけである。注目すべきことには、移植の6週間後までに、これらのマウスにおけるT細胞のレベルは、既に平均でPBMC中約7となり、10週間で平均レベル約12.5のピークに達し、移植後16週間で平均約2.3まで低下した。対照的に、これらの動物におけるB細胞のレベルは、経過観察期間中、PBMC中約2を上回るレベルに達することはなかった。これらの結果は、移植後早期に末梢に現れたT細胞が、移植の時点で胎児胸腺移植片内に存在しており、後で末梢に移出した、胸腺細胞に由来することを示す。CD34細胞のドナーは、これらの胸腺細胞に対して同種であったため、多系統キメラを提示できなかったことは、CD34細胞移植片がこれらのT細胞によって拒絶されたことを示す。さらに、移植片中に存在する成熟T細胞および/または前駆細胞は、移植16週間後の末梢CD3細胞の割合が低いことによって示されるように、長期の胸腺リンパ球形成を維持することができなかった。未処置胸腺移植片のレシピエントにおけるこれらの結果とは対照的に、ヒトB細胞およびT細胞のレベルは、照射を行った胸腺移植片を受容したマウスでは、移植後に約1を上回ることはなく、7Gyでの照射が、移植片に担持される胸腺細胞の枯渇を成功させたことを示した。しかしながら、これらのマウスにおいて非T細胞の再構成を達成できなかったことは、与えられた成体CD34細胞の数2.5×105があまりにも少なく、強力な多系統ヒト造血再構成を達成できなかったことを示唆した。同じ実験において、凍結保存した胎児胸腺組織を受容した群は、移植8週間後まで、末梢に検出可能なT細胞を有さなかったが、10および12週間で、それぞれ、PBMC中に約3.5および5のヒトT細胞を提示した。これらのデータは、凍結保存により、既存の成熟胸腺細胞を枯渇させることに成功したことを示す。移植後10週間で開始する、低いが徐々に増加するT細胞の再構成は、胸腺内の前駆体が、凍結保存にもかかわらず保存された可能性があることを示す。移植後の観察期間のいずれの時点においても、著しいB細胞のキメラ化は検出されなかったため、後期のT細胞再構成が、与えられた成体CD34細胞に由来する可能性はより低い。上述の3つの群のマウスのヒト胸腺移植片の外観の比較は、情報価値が高いことが判明した図36。未処置ヒト胸腺移植片および凍結保存した胸腺レシピエントは、いずれも、移植の20週間後の致死時点で、腎臓被膜下に豊富な生存胸腺組織を有した図36A。対照的に、照射した胸腺組織のレシピエントは、この時点で、腎臓被膜下に確認できる胸腺をほとんど有さなかった図36B。これらのデータは、照射が、胸腺上皮細胞の分裂能力を排除し、したがって移植片が成長する能力を排除した、および/または胸腺細胞前駆体を移植片から排除した、のいずれかであることを示す。前者の説明が正しい場合、未処置または凍結保存の胸腺移植片のレシピエントにおいては、ヒトAPCが存在しないため、これらのT細胞は末梢に移動すると生存できないことにより、末梢T細胞再構成なしでの強力な胸腺リンパ球形成の存在は、開始成体CD34細胞移植片に由来する前駆体による、これらの移植片の早期再増殖を反映し得る。行われた研究は、末梢におけるヒトAPCが、ヒト胸腺移植片で発達するヒトT細胞の生存に不可欠であることを示唆する。NOD.scid-IL2R-γnullマウスにおけるヒト細胞の再構成:成体骨髄CD34細胞は、NOD-scidマウスにおいて多系統ヒト造血再構成を達成する際に、胎児肝臓CD34細胞よりも効果的ではないと考えられるため、成体CD34細胞の効率を改善する方法が、この結果を達成するために必要である。NOD-SCID-共通γ鎖ノックアウトマウスNSGマウスは、これらのマウスが、NK細胞を欠いており、最適なヒト細胞の生着が他のモデルに報告されているため、より許容性である可能性が高い成体CD34細胞のレシピエントとして評価した。記載の実験において、胸腺の凍結保存ならびに照射の両方が、胸腺内の同種反応性T細胞の枯渇を成功させたため、これらのレジメンを、NSGマウスにおいて試験した。さらに、0日目および7日目に、単クローン性抗ヒトCD2抗体BTI322、100μgの2つの用量をプロトコルに加え、胸腺移植片に由来するT細胞の枯渇を強化した表5。2.5Gyで照射したNSGマウスの群に、3×105の成体骨髄に由来するCD34細胞を単独で、または凍結保存もしくは7Gyで照射したヒト胎児胸腺組織に加えて、受容させた。1つの群の動物に、凍結保存した胎児胸腺組織に加えて、5×105の成体骨髄に由来するCD34細胞を受容させ、一方で対照には、凍結保存した胸腺組織を、単独で、またはBTI322と併せてのいずれかで、受容させた。注目すべきことに、おおよそ25のヒト細胞が、3または5×105の成体骨髄CD34細胞を、単独または凍結保存したヒト胎児胸腺組織と併せてのいずれかで受容したNSGマウスへの移植後6週間で、既にPBMC中に検出可能であった図37。ヒト細胞レベルのピークPBMC中約60~75は、8週間で検出可能であり、その後、平均で約30~60であった。ヒトCD19細胞は、移植6週間後に、PBMC中約30で開始する高いレベルで検出可能であり、8週間で約55のピークに達した。凍結保存したヒト胎児胸腺組織を受容させたNSGマウスにおいて、T細胞は、移植後6週間目までに末梢に検出可能でありPBMC中約3、それぞれ、3×105または5×105の成体ヒトCD34細胞を受容させたマウスにおいて、約10および約30のピークまで増加した図37。対照的に、ヒト胎児胸腺移植片を受容しなかったNSGマウス、または7Gyで照射した胸腺移植片を受容したマウスにおいては、ヒトT細胞は検出不可能であったPBMC中1未満。これらの結果は、7Gyの胸腺照射は、胸腺の成長および/または機能を損ない、本発明のモデルへの移植後の胸腺リンパ球形成を可能にするものではなかった。BTI322ありまたはなしだが、CD34細胞の静脈注入なしで、凍結保存したヒト胎児胸腺組織を受容させた対照は、末梢で多くのヒトT細胞を生成しなかった。この結果は、胸腺内の前駆体および成熟胸腺細胞が、凍結保存によって十分に枯渇していること、および/または、ヒトAPCの再増殖が付随する、CD34細胞の静脈内注射が、高レベルの末梢ヒトT細胞の再構成を支持するために必要であることを示す。抗CD2mABBTI322での処置が本モデルに必要であるかどうかを判定する研究が、現在進行中である。重要なことに、移植の前に凍結保存した同種ヒト胎児胸腺移植片で少数の成体骨髄CD34細胞からヒト胸腺リンパ球形成を成功させる、ヒト化マウスモデルを構築し、本明細書に提供した。最も高く、最も高速なヒトCD3細胞の再構成を可能にするレジメンを選択する。実験計画を図38に示す。糖尿病患者、ならびに健常志願者からの骨髄吸引液に由来するCD34細胞を、約10匹のNSGマウスに輸注する。HLA型判定済みであるヒト胎児胸腺組織のバンクを蓄積させた。共通の糖尿病感受性HLAクラスII対立遺伝子を有する胎児胸腺組織を、これらのマウスの腎臓被膜の下に移植する。HLAクラスIIに加えて、共通のHLAクラスI対立遺伝子A201のための、PCRに基づくアッセイが存在する。これは、胸腺移植片とCD34細胞ドナーとの間、さらに白人種の約30に存在するHLA-A201を共有する骨髄ドナーと胸腺移植片との間の、糖尿病感受性クラスII対立遺伝子の適合を可能にする。ヒトT細胞の再構成の後、ナイーブ型およびメモリー型T細胞、Treg、ならびにNKT細胞の再構成のレベルを比較することができる。養子移入を行って、T1DM患者のCD34細胞に由来するT細胞と、健常志願者との間で、T細胞の恒常性増殖および生存を比較することができる。Tregの機能およびインビトロでのTregに対するエフェクターT細胞の感受性の比較を行うことができる。末梢生存を、正常対照と対比して、T1DMのCD34細胞に由来する通常T細胞の恒常性増殖、表現型の変換、および自己寛容性と比較することができる。T1DM患者に由来するT細胞が、胸腺ドナーの自己抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかの判定を行うことが可能である。T1DM患者において、恒常性における内在性異常が、T細胞を特徴付けるかどうかの判定を行うことができる。NODマウスにおける自己免疫病因は、リンパ球減少をもたらす末梢T細胞のアポトーシスの増加に関与し得る。T1DMを含むヒト自己免疫疾患はまた、リンパ球減少と関連している。T1DM患者のHSCに由来するT細胞は、正常対照のHSCに由来するものと比較して、生存率が低下し、リンパ球減少によってもたらされる増殖および活性化の増加を示す。ヒト胸腺細胞サブセット、ならびに脾臓およびリンパ節LNのT細胞を、計数する。T1DM患者に由来するCD34細胞のレシピエントのリンパ組織は、NODマウスモデルに報告されたように、メモリーT細胞における抗アポトーシスタンパク質発現の減少と関連して、対照と比較して細胞数が低い場合がある。逆に、NODにおけるこれらの異常は、疾患の原因ではなく疾患の影響であり得る。本モデルは、T1DM患者のHSCに由来するT細胞の恒常性に主な異常があるかどうかを特定する機会を提供する。メモリー型およびナイーブ型のCD4およびCD8細胞の絶対数は、CD8α、CD8β、CD45RA、CD45RO、CD95、CD27、CCR7、およびCD62Lに対するmAbを含む、多色FCMによって計数する。結果には、T1DM患者に報告されたように、T1DMのHSCで再構成された動物における二重陽性のRORAT細胞数の増加、T1DMのHSCからクローン的に偏差したCD4-CD8αα胸腺細胞およびT細胞の数の減少が挙げられる。クローン的に偏差した細胞の生成における欠陥は、NODのバックグラウンドに遺伝的にコードされる。CD4およびCD8T細胞に、HLA-DR、CD69、およびCD25を含む、活性化マーカーの試験を行ってもよい。T細胞HLA-DR発現は、T1DMの新たな発症と関連して上昇する。これらのデータの全ては、B細胞ならびにリンパおよび骨髄のDCサブセットを含む、ヒトAPC再構成のレベルに関連して分析することができる。養子移入を使用して、T1DM患者および対照に由来するT細胞の恒常性増殖および生存を比較することができる。リンパ球減少によりもたらされる増殖およびアポトーシスは、対照HSC由来のT細胞よりもT1DMのHSC由来のものに対して、増加し得る。HUTHY移植片で生成されたT細胞を、その末梢APC集団が胎児THY移植片なしでTHYと同じCD34ドナーに由来するFLCで再構成されている、二次NOD-SCIDマウスレシピエントに養子移入するHU-APCマウス。これらの動物は、ヒトAPCを再構成するが、T細胞は再構成しない。それらは、T細胞を有さず、それらのAPCは、もともとのTHY移植片で正の選択を媒介したものと同じHLA抗原を発現する。このモデルを使用して、養子移入後にリンパ球減少によって生じるT細胞の増殖を測定した。移植片から二次HU-APCレシピエントへのナイーブCD4およびCD8単一陽性SP胸腺細胞の養子移入を、達成することができる。別個のアリコートは、CD25細胞を枯渇させずに、または枯渇させMACSでの分類によって、Tregの存在下または非存在下でのリンパ球減少に対する応答の比較が可能となる。リンパ球減少によってもたらされるTregの増殖を、特に比較する。これらの成熟した単一陽性胸腺細胞は、胸腺内選択を受けているが、胸腺後選択は受けていないことになる。それらを、CFSEで標識し、HU-APCマウスに養子移入するレシピエント当たり106の細胞。その後、決められた間隔で、HU-APCレシピエントを安楽死させる。T細胞を計数し、T細胞CFSEの希釈レベル、ならびにCCD45RAおよびCD45ROの発現、CD25CD25Tregを区別するため、FoxP3に対比して、CD69、ならびにアポトーシスAnnexinVおよびAADを使用してを、ヒトCD4およびCD8細胞で試験する。リンパ球減少によってもたらされる増殖は、通常、活性化マーカーCD25およびCD69の上方制御とは関連しないが、T1DM患者のT細胞異常は、リンパ球減少によってもたらされる増殖と関連して、これらのマーカーの上方制御を伴う自己抗原によってもたらされる活性化に関与し得る。IFN-γおよびTNF-αの細胞内染色により、エフェクター機能の増加が、T1DMのHSCに由来するT細胞の恒常的増殖からもたらされる可能性を特定する。何らかのこのような異常が観察される場合、ヒトIL-21、IL-7、IL-15、およびそれらの受容体の分析を養子レシピエントにおいて行い、これらの異常の病因を特定する。対照と対比した、T1DMのCD34細胞に由来する制御性T細胞の数、機能、および末梢表現型の変換の比較。T1DM患者の幹細胞に由来するTregおよびNKT細胞は、欠陥を示す。これらの研究により、胸腺後が起源のものと対比して、T1DM患者およびそれらの胸腺に由来する制御性細胞における内在性異常を特定する。T1DM患者は、Tregの発達、末梢生存、制御に対するエフェクター細胞の感受性、またはそれらを完全に機能させるためのTregの末梢調整に欠陥を示す。本モデルは、Tregの発達における胸腺内および末梢の両方の欠陥の役割を試験する機会を提供する。ヒトHLA-DR3、DR4、またはDQ8胸腺組織ならびに正常個体またはT1DM患者に由来するCD34細胞を移植した、NSGマウスの胸腺ならびに末梢リンパ組織LNおよび脾臓における、CD127loFoxP3CD4CD8Tregの数の比較。T1DMのHSCに由来するTregが、機能に内在性の欠陥を有する場合、それらは、完全な抑制活性と関連するCD45RACD45ROおよびHLA-DR表現型を得ることができない可能性がある。制御機能を、自己および同種CD25-CD4T細胞に加えて、正常とT1DMのCD34HSCのレシピエントの胸腺および末梢に由来するTregの滴定数で比較することができる。T1DMと対比して、正常CD34HSCに由来するエフェクター細胞抗CD3および抗CD28で刺激したCD25-CD4細胞のTregによる抑制に対する感受性を比較することができる。同じ第三者および両方のCD34細胞ドナーに由来するCD25highCD4細胞を、正常とT1DMの抗CD3および抗CD28で刺激したCD34細胞に由来するCD25-CD4T細胞を含有する培養物中に滴定する。NKT細胞の分析:不変NKT細胞の数の減少および機能の欠陥が、T1DM患者に報告されている。本モデルは、この欠陥が、T1DM患者のHSCに内在性であるかどうか、およびそれがこの細胞サブセットの胸腺の発達における欠陥を反映するものであるかどうかを判定する機会を提供する。多色FCMを使用して、胸腺および末梢における、不変鎖を発現するVα24Vβ11およびVα24JαQCD4CD8およびCD4CD8細胞を定量化することができる。実施例6種々のレジメンを、同種CD34細胞からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にするであろうNOD.scidマウスにおける胎児ヒト胸腺移植片の生着について評価した。ヒト骨髄フィルターからのCD34細胞の単離:これらの研究のために正常および1型糖尿病ドナーに骨髄の採取を行う前に、成体CD34細胞および同種胎児胸腺組織を受容するNOD.scidマウスにおいて、ヒト胸腺リンパ球形成のためのモデルを構築することが必要であった。これらの研究のための成体CD34細胞源として、廃棄された骨髄フィルターを使用した。MACSビーズを使用して、各フィルターから5~25×106の正常ドナーCD34細胞を単離することができた。フローサイトメトリー分析により、純度約90であることがわかった。これらの細胞を凍結保存した。胎児胸腺器官培養物:ヒト胎児胸腺組織を入手した。胎児胸腺移植片内に存在する成熟T細胞による同種CD34細胞に由来する胸腺細胞の拒絶を防止するために、1.35MdGuoの存在下で培養物を評価した。胸腺内のCD4およびCD8単一陽性細胞の割合は、10日間の培養後、それぞれ、43および14か、ら3.4および2.1に減少した。比較すると、dGuoなしで、類似の期間培養した後、CD4およびCD8単一陽性細胞の割合は、それぞれ、20.1および13.3であった。しかしながら、dGuoありでの胎児胸腺器官培養物は、20日間でさえ、全ての成熟胸腺細胞を完全に枯渇させることはなかった。dGuoで処置したヒト胎児胸腺移植片からのヒトT細胞の再構成:NOD.scidマウスに、dGuoの存在下で20日間培養したヒト胎児胸腺の移植の1日前に、2.5GyのTBIを受けさせた表6。ヒト胸腺リンパ球形成を伴う胸腺生着の成功は、5×105の同種成体CD34細胞の静脈内注入後に生じた:ヒトCD3細胞は、移植の20週間後に、全てのマウスの末梢血に検出可能であり、平均でPBMCの約25に相当する。新鮮またはdGuoで処置したかのいずれかであるが、CD34細胞はなしで、ヒト胎児胸腺組織を受容させた、年齢適合対照マウスは、移植後のどの時点においても、血中に検出可能なヒトCD3細胞を有さなかった。これらの結果は、胸腺移植片内に存在する幹細胞および成熟T細胞が、末梢ヒトT細胞を生成するのに十分な胸腺リンパ球形成を維持することができず、追加のCD34の注入が必須であることを示す。研究はまた、20日間dGuoで処置した胎児胸腺組織中に既存の胸腺細胞が、同種CD34細胞に由来する胸腺細胞前駆体を拒絶しなかったことを示した。さらに、データは、末梢に注入されたCD34細胞に由来する前駆体は、胸腺リンパ球形成が行われるdGuoで処置した胸腺に定植することができることを示した。dGuoで処置した胎児胸腺組織を受容させた別の年齢適合対照群に、同種成体骨髄に由来するCD34細胞の代わりに、同じ胎児ドナーの肝臓から単離した4×105のCD34細胞を静脈内注入で受容させた。これらの同系胎児CD34細胞を注入した後、CD3細胞の移植14週間後までに、末梢血CD3の再構成が、平均でPBMC中約35まで検出可能であった。したがって、ヒト末梢CD3細胞の再構成は、成体から得た同種CD34細胞で達成されたものと比較して、自己胎児CD34細胞の注射後では、より効率的であると考えられる。ヒトCD3T細胞の再構成を加速させる目的で、dGuoの存在下で7日間だけ培養したヒト胎児胸腺移植片を用いて、別の群を構築した。平均でPBMC中約7のCD3レベルが、移植後6週間以内に検出可能であったが、これらのレベルは、その後数週間にわたって低下した。移植20週間後までに、血中のCD3T細胞レベルは、平均で5未満となった。さらに、注射したCD34細胞から多系統ヒト白血球の再構成が観察された、20日間dGuoで培養した胸腺およびCD34細胞の静脈注射で達成された結果とは対照的に、いずれの時点においても、検出可能なCD19細胞は存在しなかった。これらの結果は、注射した同種CD34細胞が、7日間dGuoで処置した胸腺移植片中の、dGuo処置によって枯渇されなかった成熟T細胞によって拒絶された可能性があることを示す。したがって、胎児胸腺移植片から成熟胸腺細胞を排除し、それによって、同種CD34細胞およびそれらの子孫の生存および機能を可能にするためには、より長いdGuo培養期間が必要であるという結論に達した。胎児ヒト胸腺組織の凍結保存および照射:胎児胸腺組織の凍結保存は、研究でブタ胸腺移植片において胸腺細胞の数を減少させることが示されており、ヒトCD34細胞に由来する前駆体による、より急速な再増殖をもたらす。したがって、NOD.scidマウスの群に、移植前に凍結保存したヒト胎児胸腺移植片を受容させた表7。代替的なアプローチとして、1つの群のマウスに、移植前に7Gyで照射を行ったヒト胎児胸腺組織を受容させ、対照群には未処置の新鮮な胎児ヒト胸腺組織を受容させた。全ての動物に、2.5GyのTBIおよび静脈注射で2.5×105の成体CD34細胞を受容させた。この実験の対照群には、2×105の自己胎児肝臓に由来するCD34細胞を受容させた。この対照群は、このモデルに典型的に見られるように、強力な多系統ヒトT、B、および骨髄の再構成を達成した。16週間の移植後経過観察中の間、成体骨髄に由来するCD34細胞の全てのレシピエントにおけるヒト造血の再構成は、非常にわずかであった。未処置のヒト胸腺組織を受容したNOD.scidマウスにおいては、PBMC中のヒト細胞の割合は、6週目までに平均で約10となり、移植後16週目までごくわずかな変動を有しただけである。注目すべきことには、移植の6週間後までに、これらのマウスにおけるT細胞のレベルは、既に平均でPBMC中約7となり、10週間で平均レベル約12.5のピークに達し、移植後16週間で平均約2.3まで低下した。対照的に、これらの動物におけるB細胞のレベルは、経過観察期間中、PBMC中約2を上回るレベルに達することはなかった。これらの結果は、移植後早期に末梢に現れたT細胞は、移植の時点で胎児胸腺移植片内に存在しており、その後で末梢に移出した、胸腺細胞に由来することを示す。CD34細胞のドナーは、これらの胸腺細胞に対して同種であったため、多系統キメラを提示できなかったことは、CD34細胞移植片がこれらのT細胞によって拒絶されたことを示唆する。さらに、移植片に存在する成熟T細胞および/または前駆細胞は、移植16週間後の末梢CD3細胞の割合が低いことによって示されるように、長期の胸腺リンパ球形成を維持することができなかった。未処置胸腺移植片のレシピエントにおけるこれらの結果とは対照的に、ヒトB細胞およびT細胞のレベルは、照射を行った胸腺移植片を受容したマウスでは、移植後に約1を上回ることはなく、7Gyでの照射が、移植片に担持される胸腺細胞の枯渇を成功させたことを示した。しかしながら、これらのマウスにおいて非T細胞の再構成を達成できなかったことは、与えられた成体CD34細胞の数2.5×105があまりにも少なく、強力な多系統ヒト造血の再構成を達成できなかったことを示した。同じ実験において、凍結保存した胎児胸腺組織を受容した群は、移植8週間後まで、末梢に検出可能なT細胞を有さなかったが、10および12週間で、それぞれ、PBMC中約3.5および5のヒトT細胞を提示した。これらのデータは、凍結保存により、既存の成熟胸腺細胞を枯渇させることに成功したことを示す。移植後10週間で開始する、低いが徐々に増加するT細胞の再構成は、胸腺内の前駆体が、凍結保存にもかかわらず保存された可能性があることを示す。移植後の観察期間のいずれの時点においても、著しいB細胞のキメラ化は検出されなかったため、後期のT細胞再構成が、与えられた成体CD34細胞に由来する可能性は低い。上述の3つの群のマウスのヒト胸腺移植片の外観の比較は、情報価値が高いことが判明した。未処置ヒト胸腺移植片および凍結保存した胸腺レシピエントは、いずれも、移植の20週間後の致死時点で、腎臓被膜下に豊富な生存胸腺組織を有した。対照的に、照射した胸腺組織のレシピエントは、この時点で、腎臓被膜下に確認できる胸腺をほとんど有さなかった。これらのデータは、照射が、胸腺上皮細胞の分裂能力を排除し、したがって移植片が成長する能力を排除した、および/または胸腺細胞前駆体を移植片から排除した、のいずれかであることを示す。前者の説明が正しい場合、未処置または凍結保存の胸腺移植片のレシピエントにおいて、ヒトAPCが存在しないため、これらのT細胞は末梢に移動すると生存できないことにより、末梢T細胞再構成なしでの強力な胸腺リンパ球形成の存在は、開始成体CD34細胞移植片に由来する前駆体による、これらの移植片の早期再増殖を反映し得る。他の研究は、末梢におけるヒトAPCは、ヒト胸腺移植片で発達するヒトT細胞の生存に不可欠であることを示す。NOD.scid-IL2R-γnullマウスにおけるヒト細胞の再構成:成体骨髄CD34細胞は、NOD.scidマウスにおいて多系統ヒト造血再構成を達成することにおいて、胎児肝臓CD34細胞よりも効果的ではないと考えられるため、成体CD34細胞の効率を改善するための方法を、この結果を達成するために模索した。NOD-SCID-共通γ鎖ノックアウトマウスNSGマウスは、これらのマウスが、NK細胞を欠いており、最適なヒト細胞の生着が他のモデルに報告されているため、より許容性である可能性が高い成体CD34細胞のレシピエントとして評価した。上述の実験において、胸腺の凍結保存ならびに照射の両方が、胸腺内の同種反応性T細胞の枯渇を成功させたため、これらのレジメンを、NSGマウスにおいて試験した。さらに、0日目および7日目に、単クローン性抗ヒトCD2抗体BTI322、100μgの2つの用量をプロトコルに加え、胸腺移植片に由来するT細胞の枯渇を強化した表8。2.5Gyで照射したNSGマウスの群に、3×105の成体骨髄に由来するCD34細胞を単独で、または凍結保存もしくは7Gyで照射した胎児ヒト胸腺組織に加えて、受容させた。1つの動物群に、凍結保存したヒト胎児胸腺組織に加えて、5×105の成体骨髄に由来するCD34細胞を受容させ、一方で対照には、凍結保存した胸腺組織を単独で、またはBTI322と併せてのいずれかで受容させた。顕著なことに、3または5×105の成体ヒト骨髄CD34細胞を、単独または凍結保存したヒト胎児胸腺組織と併せてのいずれかで受容したNSGマウスにおいて、おおよそ25のヒト細胞が、移植6週後に既にPBMC中に検出可能であった。ヒト細胞レベルのピークPBMC中約60~75は、8週で検出可能であり、その後、平均で約30~60であった。ヒトCD19細胞は、移植6週間後に、PBMC中約30で開始する高いレベルで検出可能であり、8週間で約55のピークに達した。凍結保存したヒト胎児胸腺組織を受容させたNSGマウスにおいて、T細胞は、移植後6週間目までに末梢に検出可能でありPBMC中約3、それぞれ、3×105または5×105の成体ヒトCD34細胞を受容させたマウスにおいて、約10および約30のピークまで増加した。対照的に、ヒト胎児胸腺移植片を受容しなかったNSGマウス、または7Gyで照射した胸腺移植片を受容したマウスにおいては、ヒトT細胞は検出不可能であったPBMC中1未満。これらの結果は、7Gyの胸腺照射は、胸腺の成長および/または機能を損ない、本モデルへの移植後の胸腺リンパ球形成を可能にするものではなかった。BTI322ありまたはなしだが、CD34細胞の静脈注入はなしで、凍結保存したヒト胎児胸腺組織を受容させた対照は、末梢で多くのヒトT細胞を生成しなかった。この結果は、胸腺内の前駆体および成熟胸腺細胞が、凍結保存によって十分に枯渇していること、および/または、ヒトAPCの再増殖が付随する、CD34細胞の静脈内注射が、高レベルの末梢ヒトT細胞の再構成を支持するために必要であることを示す。臨床吸引液からのヒト細胞の再構成:この研究のために志願者を募集し、HLAクラスI対立遺伝子A201のためのPCRに基づくアッセイに加えて、HLAクラスIIの型の判定を行った。これは、胸腺移植片とCD34細胞のドナーとの間で、糖尿病感受性クラスII対立遺伝子の適合を可能にするだけでなく、白人種の約30に存在するHLA-A201を共有する、骨髄ドナーと胸腺移植片との間の適合を可能にする。HLA型判定済みの胎児ヒト胸腺組織のバンクを蓄積させた。上述のように、NSGマウスにおける多系統再構成が成功した後、臨床骨髄吸引液から単離した成体CD34細胞で、レジメンを試験した。15mlの骨髄吸引液は、健常対照および糖尿病患者から、それぞれ、3.6×105および2.7×106のCD34細胞の単離を可能にした。2.5Gyで照射を行ったNSGマウスに、凍結保存/解凍したヒト胎児胸腺移植片および抗CD2mAbに加えて、1.8×105の成体CD34細胞をそれぞれ受容させた。照射を行ったNSGマウスの対照群に、胸腺の移植なしで、CD34細胞を受容させた。ヒト細胞は、6週目から検出可能であり、移植後20週で、約25~約80の範囲のレベルでピークに達した図39。CD19細胞は再構成したが、おそらくはマウス1匹につき注射した成体CD34細胞の数が少なかった1.8×105ために、比較的低いレベルであった20未満。その後の実験では、2×105超のCD34細胞を注射することを目標とし、これは、強力なB細胞および単球の再構成を示した反復実験において行われた。いずれにせよ、成体CD34細胞の静脈内注入に加えて、胎児胸腺を受容させた動物は、約50~90のピークCD3細胞レベルを有し、一方で対照NSGマウスは、移植後に最低限のCD3レベルで再構成した図39。移植後20週で、これらのマウスの脾臓およびリンパ節から単離した精製T細胞を用いてMLRアッセイを行った。全てのマウスが自己寛容性を示しながらも、強い同種応答が観察された図40。健常対照に由来するCD34細胞を受容させたマウスから単離したT細胞は、ヒト対照ドナーの血液から富化したT細胞に対して、類似の同種応答を示した。さらに、これらのマウスのTregの正常な発達が示された。正常対照ドナーの血液からの試料と、そのドナーに由来するCD34細胞で再構成したヒト化マウスに由来する細胞との同時比較により、再構成したマウスにおいて、主にナイーブなCD45RACD45RO-CD62L陽性細胞を有する、回復したT細胞Tregを含む表現型が示された。CD4細胞中のCD25CD127-FoxP3細胞の割合、ならびにメモリー対ナイーブのCD4T細胞の割合の比較は、T1DMのCD34細胞で再構成したマウスと健常対照に由来するHSCとの間に差がないことを明らかにした。移植の前に凍結保存した同種ヒト胎児胸腺移植片において、少数の成体骨髄CD34細胞からヒト胸腺リンパ球形成を成功させるヒト化マウスモデルを構築した。新しく生成されたT細胞は、成体CD34細胞ドナーのものに類似する機能性および自己寛容性を示すが、免疫表現型は回復している。この新しい世代のヒト化マウスモデルは、T1DMまたは他の自己免疫疾患の素因となる造血幹細胞内在性の免疫制御性欠陥の、安全で制御された有望な分析を可能にする。臨床吸引液に由来する2×105の成体CD34細胞を受容させたNSGマウスの別の群が、再構成された。ヒトT細胞の再構成の後、ナイーブ型およびメモリー型のT細胞、Treg、ならびにNKT細胞の再構成のレベルを比較する。本明細書に記載のように、養子移入を行って、T1DM患者のCD34細胞に由来するT細胞と、健常志願者との間で、T細胞の恒常性増殖および生存を比較する。Tregの機能およびインビトロでのTregに対するエフェクターT細胞の感受性の比較を行う。正常対照と対比した、T1DMのCD34細胞に由来する通常T細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型の変換、および自己寛容性の比較。T1DM患者に由来するT細胞が、胸腺ドナーの自己抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかの判定を行うことが可能である。T1DM患者において、恒常性における内在性異常が、T細胞を特徴付けるかどうかの判定を行うことができる。対照と対比して、T1DMのCD34細胞に由来する制御性T細胞の数、機能、および末梢表現型の変換を比較する。T1DM患者の幹細胞に由来するTregおよびNKT細胞は、欠陥を示す。これらの研究により、胸腺後が起源のものと対比して、T1DM患者およびそれらの胸腺に由来する制御性細胞における内在性異常を特定する。自己免疫疾患の素因となる造血幹細胞内在性の免疫制御性欠陥、および免疫療法剤に対する個体の応答性の、安全で制御された有望な分析を可能にする、新しい世代のヒト化マウスモデルを作製した。ヒトT細胞を伴うヒト化マウスの再構成後に、ナイーブ型およびメモリー型のT細胞、Treg、ならびにNKT細胞の再構成のレベルを比較する。養子移入を行って、T1DM患者のCD34細胞に由来するT細胞と、健常志願者との間で、T細胞の恒常性増殖および生存を比較する。T1DM患者に由来するT細胞が、胸腺ドナーの自己抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかについての研究を行う。これにより、恒常性における内在性異常が、T1DM患者のT細胞を特徴付けるかどうかを判定する。さらに、Tregの機能およびインビトロでのTregに対するエフェクターT細胞の感受性を比較し、本研究は、T1DM患者およびそれらの胸腺起源と胸腺後起源に由来する制御性細胞における内在性異常を特定することを助けるはずである。実施例7混合キメラにおけるT細胞の免疫能力::同種移植片寛容性を達成するための混合キメラに関する初期の研究41は、部分的に、混合した同種のキメラが、MHCバリア全体が遮断された場合に完全に同種のキメラよりも免疫応答性であったという調査に基づくものであった4243。この免疫応答性は、胸腺上皮のMHCのT細胞の正の選択における役割を反映し、宿主MHCとの関連で、ペプチド抗原を選択的に認識するレパートリーにつながる42。レシピエントのAPCは、混合キメラの末梢に存在するが、完全に同種のキメラには存在せず、混合キメラにおける優れた免疫応答につながっている4244。それにもかかわらず、異種胸腺移植を含む他のモデルが、ある胸腺この場合においてはブタのMHCで選択されたT細胞は、完全に異なるレシピエントのMHCに関して活発なMHCによって制限免疫応答を増加させ得ることを示すため、これらの研究は、研究される抗原系の選択肢によって影響を受けた可能性がある4546。このような動物は、末梢で胸腺MHCを発現する細胞が存在しないにもかかわらず、日和見感染症を有さなかった45。同様に、それらのT細胞プールを再構成する、広範囲のHLA不適合同種胸腺移植片を受容した先天性胸腺形成不全を有するヒトは、強力な宿主によって制限されされるT細胞応答を示す47。異種系において、レシピエントのMHCは胸腺での正の選択に関与しないことが、非常に明確に示された454648。これらの調査およびブタ胸腺移植片で発達するヒトT細胞のスペクトル型解析に基づいて49、異種胸腺で選択された多様なT細胞のレパートリーが、APC上に存在するレシピエント異種のMHCによって制限される、強力な免疫応答を可能にするという結論に達した。資金援助プログラムの付与を受けて行われた研究は、末梢においてヒトAPCが、ヒト胸腺移植片で正の選択が行われたヒトT細胞の生存を促進するよりは効果的ではないが、ブタ胸腺移植片で正の選択が行われたヒトT細胞の生存を促進する能力を示した。したがって、混合異種キメラは、ドナーのAPCが末梢に存在するため、レシピエントに加えてドナーのMHCに関して免疫応答を生成することができる可能性がある。混合異種キメラにおけるT細胞の免疫応答性を予測する上述の理由にもかかわらず、混合同種キメラにおける研究は、完全にMHCが不適合のドナーを使用することに関する懸念を提起した。完全にMHCが不適合の同種ドナーで混合キメラを達成したマウスにおいて、LCMVによるウイルス感染は、感染したレシピエント動物細胞のクリアランスをもたらしたが、感染したドナー細胞は、動物に疾患をもたらすウイルスレザーバーとして留まった50。この現象は、抗ウイルスCTL活性の非常に強い宿主MHC制限のため、ドナーの造血細胞にレシピエントのMHC抗原を共有させることによって回避した4450。このようなMHCの共有は、ブタが、HLA対立遺伝子を発現するように改変されていない限り、混合異種キメラにおいては不可能である。HLAトランスジェニックブタは、既に生成されており275153、研究により、本発明のアプローチに対するそれらの必要性を判定する。複数のレベルで免疫寛容性を評価することを可能にするヒト化マウスは、有力な前臨床手段を提供する。ヒト化マウスモデルにおける優れた免疫機能は、先天性および適応性の両方の免疫系に関する重要な課題に取り組み、ブタ起源の動物のどのようなさらなる遺伝子修飾が、この治療的アプローチを向上させ得るかを判定することを可能にする。多数の病原体、特にウイルスは、それらの感染範囲に種特異性を示す。したがって、異種細胞が、慢性感染症を引き起こし得るヒト病原体の感染のレザーバーとして機能し得るかどうかを事前に予測することができず、関連する病原体、および特にブタからヒトへの組み合わせのものについて、検査する必要がある。ブタ混合異種キメラの存在下において、ヒト免疫系の機能の分析を可能にするモデルを本明細書に提供する。本研究は、このような問題に取り組むために、ブタサイトカイン導入遺伝子とともに、新しいヒト化マウスモデルを利用する。マウスにおける同種混合キメラモデルに由来する免疫機能に調査を拡大したが、ある特定の細胞と細胞の分子間相互作用は、異種の組み合わせにおいては無効であった5458。したがって、同種モデルにおいて寛容化されたものと同じ免疫系の要素の中で、寛容性を誘発する混合キメラの能力を、目的の種の組み合わせにおいて試験する必要がある。混合キメラの誘発は、ラットからマウスへの異種の組み合わせにおいて、B細胞およびNK細胞を寛容化することが観察された。ブタからヒトへの組み合わせにおけるNK細胞の寛容性およびB細胞の寛容性の問題に取り組むために、本明細書に提供されるヒト化マウスモデルおよびブタサイトカインTgマウスを、ヒトサイトカインベクターと併せて使用することは、革新的である。これらの細胞を異種移植片に寛容性にするための方法を本明細書に提供する。ヒト化マウスにおけるヒトT細胞の異種移植片拒絶。ヒト胎児胸腺THYおよび肝臓LIV移植片をNOD/SCIDマウスの腎臓被膜下に埋め込むことを伴い、同じ胎児肝臓に由来するCD34胎児肝臓細胞FLCの静脈内注射を併せて行う、ヒト化マウスモデルを本明細書に提供する。このような動物は、T、B、樹状細胞DC、および単球を含む、多系統のヒトリンパ球再構成を示し、構造化したリンパ組織を発達させる2。図41に示されるように、自発的な膵島異種移植片拒絶がこれらのHUマウスに生じた4。ブタ膵島異種移植片は、対照NOD/SCIDマウスで長期間生存したが、HUマウスでは完全に拒絶された図41A。ヒト化NOD/SCIDマウスに由来する移植片は、全てのインスリン生成細胞を失い、ヒトT細胞、B細胞、およびマクロファージが激しく浸潤し図41A、ヒト抗体が沈着した図41B。ヒトB細胞およびマクロファージによる浸潤を含む移植片拒絶は、抗ヒトCD2mAbBTI322でのヒトT細胞の枯渇によって、完全に防止され図41、ヒトT細胞が、ブタ膵島異種移植片拒絶に非常に重要な役割を果たし、ヒトB細胞およびマクロファージによる移植片浸潤に必要であることを提示する。したがって、T細胞寛容性の誘発が、ブタ膵島異種移植片の拒絶を克服するために重要である。ブタ胸腺移植は、T細胞を枯渇させた胸腺摘出マウスにおいて、強力な異種移植片寛容性を誘発することが示されている6263。このアプローチはまた、NHPにおけるブタαGalKO腎臓異種移植片の許容を促進する11。さらに、SWTHY異種移植は、SWTHY移植片において発達するヒトT細胞の特異的寛容性を導く64。ブタ胸腺移植片が、事前に構築したヒト免疫系を有するヒト化マウスにおいてヒトT細胞寛容性を誘発する能力を評価した。ブタ胎児THY移植片を、ヒトT細胞再構成が達成された後、おおよそ10~14週間までに、HUマウスの反対側の腎臓被膜下に移植した。既存のT細胞によるSWTHY移植片の拒絶を防ぐために、HUマウスに抗CD2mAbBTI322を注射した。BTI322は、末梢リンパ組織でのみ効率的なT細胞の枯渇を媒介し、胸腺ではそれを行わないため、HUTHY移植片は、SWTHYの埋め込みのときに除去した腎摘出術により。全てのBTI322で処置したHU/HUマウスに、SWTHY移植片の長期生存が見られたが、未処置の対照HUマウスには見られなかった。さらに、ヒトT細胞の再構成が、SWTHY移植の9~12週間後にBTI322で処置した移植片摘除HUマウスに生じ、SW移植片での正常なヒト胸腺リンパ球形成を反映する5。したがって、胸腺移植片摘除および抗CD2処置により、ヒト化マウスにおけるヒト抗ブタT細胞バリアが克服される。このレジメンを、SW混合キメラを達成するためのAim2で使用し、既存の異種反応性Nab生成細胞の寛容性を評価する。表9:ブタ-ヒト混合キメラにおけるドナー特異的皮膚移植片の寛容性を、上述のようにブタサイトカイントランスジェニックNOD-SCIDマウスに調製した。対照動物ブタBMTを単独で受容した再構成されていない動物およびブタBMTを受容させたかまたはさせなかった、長期ヒト化マウスヒトTHY/LIV/CD34細胞を移植したヒト免疫系を有するマウスに、ドナーSLA適合およびそれ以外のブタ皮膚を移植した。再構成されていない対象は、いずれの種類の移植片も拒絶できなかった。ブタBMTなしのヒト化マウスは、いずれの種類のブタ移植片も拒絶した。混合ブタ-ヒトキメラは、ドナー種のブタからの皮膚を許容し、それ以外のSLA不適合の皮膚を拒絶した。HUマウスにおける抗原特異的T細胞および抗体応答の誘発。抗原特異的ヒト応答を、完全フロイントアジュバントCFA中の2,4-ジニトロフェニルヘプタン-キーホールリンペットヘモシアニンDNP-KLHで免疫付与した、HUマウスにおいて移植の14週後に評価し、3週間後にIFA中のDNP-KLHで追加免疫した。CFSE増殖アッセイは、両方の群でマイトジェンと同程度の増殖を有し、DNP-KLHで免疫付与したHUマウスにおいてヒトT細胞応答を見せたが、PBSアジュバント中を注射した対照には見られなかった3。胚中心が、二次リンパ組織において観察され、DNP特異的IgG主にヒトIgG1およびIgG2、いくつかはIgG3が、DNP-KLHで免疫付与したHUマウスにおいて検出された65。したがって、効果的なT-B細胞の共同作用を示唆するクラススイッチを含む、T細胞依存性の抗原特異的免疫応答が、HUマウスに示された。タンパク質抗原および病原体での免疫付与に対する応答を評価するために、HU/HUマウスを、破傷風トキソイドTTで免疫付与し、TTおよび新抗原トリIgGに対する増殖性応答を、4週間後、追加免疫の3週間後に測定した。このような応答のMHC制限を評価するための、遮断HLA特異的mAbを特定した。マウスWBCおよび赤血球を枯渇させ、抗原を付加した脾細胞の応答、ならびに抗原パルス刺激した自己ヒトFLC由来のDCとともに、精製したヒトT細胞の応答を比較した。いずれの事例においても、HU/HUマウスに由来するヒトT細胞は、リコール抗原に対する強い応答を示し図42は、FLC由来のDCでの刺激の結果を示す、これは抗ヒトクラスIImAbによって遮断され、それらが、HLAによって制限されたことを示す。新抗原に対するインビトロ応答は検出されなかった図42。抗ブタ自然抗体をHUマウスにおいて発達させる:HUTHY-CD34細胞の移植の7~13週間後に収集した4匹中3匹のマウスからの血清は、ブタ標的に対する細胞毒性のNAbを含有していた。この観測結果を使用して、ブタ混合キメラが、HUマウスにおいてヒト抗ブタNAbを生成する細胞を寛容化させる能力を評価する。混合異種キメラが、ブタ-ヒト種の組み合わせにおいて、自然抗体を生成するB細胞の寛容性を誘発する能力を探索する。現在資金提供を受けている最中である研究によって、ヒト化マウスが、ブタに対して細胞毒性の自然抗体NAbを生成することが示された。既存および新しく開発中のヒト抗-ブタNabに対する、混合キメラ誘発の影響を評価することができる。ヒト抗ブタ非GalNabを生成する細胞を特定することができる。ヒト胸腺移植/CD34細胞の投与の時点で誘発される混合キメラのNAb形成への影響を調査する。ブタBMTをHUTHY/CD34移植と同時に行うときに、抗ブタNAbのレベルを、HUおよびHU-SW混合キメラのヒト化マウスにおいて比較する。これらの研究により、非Gal抗ブタNabのデノボ開発における、混合キメラの影響を検証することを可能にする。細胞毒性アッセイおよび間接的なフローサイトメトリーFCMの両方を、記載のように7071103行う。FCMは、Nabアイソタイプの特定を可能にする。IgMおよびIgGの両方のクラスのヒト抗ブタNabが、正常ヒト血清に検出されている104109。HUマウスの場合には、マウスがGalであり、したがって、Galに対する寛容性または任意の抗GalNabの吸収のいずれかが予測されるため、異種抗体は非Gal特異性を有し得る。HU-SWに観察された場合、ヒト抗ブタNAb寛容性がドナーのブタに特異的であるかまたは広範であるかを判定するために、SLAddドナーおよびそれ以外のYUCブタ細胞に対する反応性の比較を行ってもよい。ブタ混合異種キメラありおよびなしでのヒト化マウスにおける免疫応答を比較する。ヒト化マウスは、タンパク質免疫付与後に優れたT細胞の増殖および抗体応答を伴って、強い免疫応答を示す24図42。HUマウスおよびHU-SW混合キメラにおいて生成されたヒトT細胞中の免疫原に対する免疫応答の比較群当たり10。上述のように、ブタ造血サイトカインTgNRGレシピエントにおいてヒト化マウスを作製し、ブタBMCを、ヒトTHY/CD34の埋め込み/投与と同日に投与する1。対照HUマウスには、ブタBMCを受容させない。ヒトCD3、CD4、およびCD8の再構成、ならびにヒトB細胞および単球の動態を、埋め込みの3週間後に末梢血において監視を開始する。種々の系統のブタ細胞の再構成もまた、監視してもよい。全ヒトおよびブタIgGおよびIgMのレベルを、ELISAによって測定する。平均で5超のヒトT細胞が、全ての群のWBCに検出されたときに、1つの群当たり5匹の動物を、図42のようにCFAおよび破傷風トキソイドTTを使用して免疫付与し、続いて不完全フロイントアジュバントIFAおよびTTで3週間後に追加免疫する。対照動物群あたり5には、アジュバントを単独で受容させる。動物を、免疫追加の1週間後に安楽死させ、もともとのFLCドナーから調製されたDCによって提示されたTT、およびにブタドナーのSLA適合dd動物に由来するDCに対する、精製されたT細胞の増殖性応答を評価する。FLCD34細胞からヒトDCを調製するため図42を参照されたい、およびPBMCからブタDCを調製するための技術が確立されている118119。遮断抗ブタおよびヒトクラスIImAbを追加して、全ての観察された応答のヒトまたはブタMHCの制限を確実にする。記載のように3、DNP-KLHでの免疫付与を使用して、類似の研究を行う。T細胞増殖性応答を測定することに加えて、血清を、クラススイッチしたKLHに対する抗体応答について、ヒトおよびブタの両方に特異的なELISAによって試験する。同種および異種反応性および寛容性を評価するために、全てのインビトロ分析にはまた、ブタドナーSLA、それ以外のブタ、NODマウス、ヒトドナー、およびそれ以外のヒトに対する反応性の評価が含まれる。HU-SWキメラは、非ドナーのブタおよびヒトに対する強い反応とともに、ドナーのブタおよびヒト1、ならびにレシピエントマウス図45のブタ胸腺を移植したSW/HUマウスに類似に対する寛容性を示し得るが、一方でHUマウスは、ブタにではなく、ヒトドナーおよびマウスレシピエントのみに寛容性であり得る図45のHU/HUマウスにあるように。実施例7の参考文献1XuYYangYGOhdanHRyanDHarperDWuCKrugerGreyHSThallADAwwadMandSykesMCharacterizationofantiGalantibodyproducingcellsofbaboonsandhumansTransplantation819409482006PMID16570021PMCIDnotavailable2LanPTonomuraNShimizuAWangSandYangYGReconstitutionofafunctionalhumanimmunesysteminimmunodeficientmicethroughcombinedhumanfetalthymusliverandCD34celltransplantationBlood1084874922006PMID16410443PMCIDnotavailable3IdeKWangHLiuJWangXAsaharaTSykesMYangYGOhdanHRoleforCD47SIRPαsignalinginxenograftrejectionbymacrophagesProcNatlAcadSciUSA200710450626PMCIDPMC18292644WangHMadariagaMLWangSOldenborgPAYangYGLackofCD47onNonhematopoieticCellsInducesSplitMacrophageTolerancetoCD47nullCellsProcNatlAcadSciUSA20071041374413749PMID17699632PMCIDnotavailable5YangYGandSykesMXenotransplantationCurrentStatusandaPerspectiveontheFutureNatRevImmunol20077519531PMID17571072PMCIDnotavailable6YangYGandSykesMToleranceinxenotransplantationCurrOpinTransplant200712169175PMIDandPMCIDnotavailable7KawaharaTRodriguezBarbosaJIZhaoYZhaoGandSykesMGlobalUnresponsivenessasaMechanismofNaturalKillerCellToleranceinMixedXenogeneicChimerasAmJTransplant2007720902097PMID17640313PMCIDnotavailable8TonomuraNHabiroKShimizuASykesMYangYGAntigenspecifichumanTcellresponsesandTcelldependentproductionofhumanantibodiesinahumanizedmousemodelBlood200811142934296PMCIDPMC22887289TonomuraNShimizuAWangSYamadaKTchipashviliVWeirGCYangYGPigisletxenograftrejectioninamousemodelwithanestablishedhumanimmunesystemXenotransplantation200815129135PMID18447886PMCIDnotavailable10ShimizuIFudabaYShimizuAYangYGandSykesMComparisonofhumanTcellrepertoiregeneratedinxenogeneicporcineandhumanthymusgraftsTransplantation200886601610PMCIDPMC268068911HaspotFBardwellPDZhaoGandSykesMHighantigenlevelsdonotprecludeBcelltoleranceinductionwithalpha13GalviamixedchimerismXenotransplantation200815313320PMCIDPMC263310112FudabaYOnoeTChittendenMShimizuAShafferJBronsonRSykesMDefectiveregulatoryandeffectorTcellfunctionpredisposetoautoimmunityfollowingxenogeneicthymictransplantationJImmunol200818176497659PMCIDPMC267357813HabiroKSykesMYangYGThymicxenotransplantationinduceshumanTcelltolerancetoporcinexenoantigensinhumanizedmicewithanestablishedhumanimmunesystemAmJTransplant20099613241329PMCIDPMC275233714OnoeTChittendenMZhaoGYangYGandSykesMPhenotypicconversionsurvivalandorhomeostaticexpansionofhumanTcellsinvivodependsonperipheralinteractionswithhumanantigenpresentingcellsJImmunol20101841267566765PMID20483739PMCIDnotyetavailable15WangYWangHWangSFuYYangYGSurvivalandfunctionofCD47deficientthymicgraftsinmiceXenotransplantation201017160165PMID20522249PMCIDnotyetavailable16YangYGCD47inxenograftrejectionandtoleranceinductionXenotransplantation2010実施例8白血病モデルを作製する方法、および混合キメラhuマウスにおいてRLIの抗腫瘍効果を評価するための方法を、本明細書に提供する。3つの群のhuマウスを調製した表10:群A、白血病を有さない混合同種huマウスキメラ非白血病RLIおよび非RLIレシピエント。これらの群により、キメラ排除におけるRLIの有効性を確認する;群B、白血病を有する混合同種huマウス白血病のRLIレシピエントおよび非RLI対照;および群C、機能性のヒト免疫系を有するhuマウスRLIドナー。各レシピエント群は、少なくとも10匹の動物を含む。混合huマウスキメラを作製するために群A、表10、NSGマウスに、HLA-A201HLA-A2およびHLA-A2-の差次的発現を有する、2人の異なる同種ドナーに由来する、磁気単離した胎児肝臓CD34細胞を、HLA-A2ドナーに由来する胸腺組織とともに、移植する。これらのドナーにおけるHLA-A2の発現A2特異的mAb[OneLambda,Inc.]を用いて胎児肝臓細胞懸濁液のフローサイトメトリーによって試験は、フローサイトメトリーによる混合キメラの判定を可能にする。このモデルを使用する他の研究において、胎児胸腺移植片から既存のT細胞を枯渇させるための抗CD2mAbBTI-322の注射とともに、凍結保存/解凍した胎児胸腺組織は、静脈注射で与えた同種CD34細胞から、強力なヒト多系統造血の再増殖を可能にし、現在では、凍結保存した胸腺、抗CD2、および凍結させた同種CD34細胞の常用が、これらの研究において行われている。したがって、このような組織のHLA型の判定を行い、特定のHLA対立遺伝子を必要とする研究に使用するための小規模なバンクの構築がなされた。図47に示されるように、混合キメラを、huマウスモデルに誘発することができる。キメラは、移植に続いて、記載のように59、末梢血中のヒトCD14単球、CD19B細胞、およびCD3T細胞でのHLA-A2の発現を測定することによって監視する。これらのマウスは、両方のドナーに由来する相互に寛容性のT細胞集団を有する多系統の混合キメラを生成することが予測される。実際に、ドナー特異的な寛容性が、このモデルでの混合異種キメラ誘発の初期の研究において示された54。安定な混合キメラを有するマウスを、RLIのレシピエントとして使用する。白血病が、上述のWBC分析によって判定されるように、群Bのマウスの少なくとも半分に発症した後、RLIドナーhuマウス群Cから、群Aおよび群Bの混合キメラhuマウスレシピエントへ、ヒト脾細胞およびリンパ節細胞抗マウスCD45およびTer119mAbでコーティングしたMACSビーズで負の選択を行い、ヒト細胞のみを残すを注射することによって、RLIを行う。初期研究では、RLIドナーからプールしたヒトリンパ球の半分をレシピエントとして使用するが、この数は、初期実験の結果に応じて、加減することができる。このように、明らかな再発および微小残存病変の両方の症状を呈する段階の白血病を有する動物において、RLIの効果を評価することができる。RLIを受ける群または受けない群の比較によって、RLIが、どの程度顕性および潜在性の確立した白血病を予防するかを判定する。RLIの予防効果が検出された場合、HLA-A2ドナーのみから再構成され、したがってキメラではなく、RLIを受けた対照群、およびRLIに加えて同種ヒトリンパ球を受容した非キメラ群の追加を行ってもよい。マウスモデルにあるように、これらの群は、非RLI処置レシピエントのものに類似の腫瘍死亡率を示し得、したがって、構築された移植片の拒絶がRLIの抗腫瘍効果に必須であることを示し得る。RLIの抗腫瘍効果を増強するためにαGal-Cer処置によりiNKT細胞反応性を強化する能力の評価。比較には、RLIなし、RLI単独、αGal-Cer単独、およびRLIとαGal-Cerの組み合わせを受容する群が含まれる。マウスモデルにおける研究は、αGal-CerがRLIの抗腫瘍効果を強化することを示しており31、マウスモデルに採用したものに類似の投与レジメンを利用する。Huマウスが、iNKT細胞を生成し、これらは、αGal-Cerを投与するとIL-4を生成することが、既に示されている図46。実施例9:ウイルス特異的T細胞およびEBV誘発リンパ腫のモデルを生成するための方法マウスにおいて個々のヒト患者の免疫系を再構成する方法を本明細書に提供する。これらの方法により、広範なレパートリーの特異性を有する多数のナイーブT細胞を生成することができる。ある特定の実施形態において、これらの方法により、これらのヒト化マウスにおいてウイルス特異的T細胞応答を生成し、この技術が、日和見感染ウイルスの再活性化を除去することができない、および/またはEBV関連のリンパ腫を発症する患者に、保護T細胞を提供する可能性を示すことができる。骨髄もしくは実質臓器の移植を受けるか、またはHIV-1に感染した多数の患者は、ほとんどの個体に存在する共通のウイルスおよび細菌による日和見感染症を患う。T細胞免疫系はこれらの患者では正常に機能せず、それら自身の胸腺は新しいT細胞を生成することができないため、これらの患者は、しばしば、これらの感染の合併症により死亡するか、または、それらの感染に対する免疫を促進するために免疫抑制が減少してしまうために、それらの移植片を拒絶する。胸腺は、感染性微生物による攻撃からヒトを保護するために必要な、Tリンパ球の作製に関与する器官である。本明細書に記載のように、マウスにおいて、個々のヒト患者から新しい機能性免疫系を生成する方法を開発した。骨髄CD34造血幹細胞HSCを、腎臓被膜下にヒト胎児胸腺の断片もまた受容させた免疫不全マウスに注射することによって、これを達成する。胸腺組織を、患者のHSCが拒絶されないように、その既存のT細胞を破壊する方法で処置する。これらの患者のHSCは、免疫不全マウスにおいて、胸腺移植片で発達する多数のT細胞を含む、ヒト免疫系を生成する。これらのT細胞は、機能性であり、非常に多様なレパートリーの再配置されたT細胞受容体を有し、あらゆる種類の外来抗原を認識することを可能にする。中年期までによりメモリー表現型に偏る、すなわち、それらのT細胞部分が限定されたレパートリーのT細胞で満たされ、しばしば感染を除去する能力が欠けている、成体ヒトドナーとは非常に対照的に、これらのマウスの免疫系を再増殖させるT細胞は、ナイーブ表現型を有する。多数の移植患者、例えば、限定されないが、骨髄または臓器移植患者およびHIV患者は、胸腺機能が非常に乏しく、ナイーブT細胞をほとんど有さない。結果として、それらのT細胞レパートリーは、狭い範囲の認識能力で構成され、それらは、日和見感染症を除去する能力がない。これらの患者群に共通の日和見感染症の中でも特に、再活性したサイトメガロウイルスCMVおよびエプスタインバーウイルスEBV感染である。これらのCMV感染は、生死に関わる可能性があり、EBVの再活性化は、移植後のリンパ増殖性疾患PTLDに至る場合があり、治療が成功しない場合は致命的である。CMVまたはEBV反応性のT細胞の注入が、このような患者に有益であることが示されているが、しばしば、これらのT細胞は、数が限定されており、同種非自己ドナーに由来するため、大量に存在することができず、部分的な保護のみを提供し得る。免疫不全マウスにおいて、ナイーブT細胞のレパートリーをデノボ生成する本明細書に記載の方法は、免疫付与後に多数の自己自己に由来するため、患者の免疫系によって拒絶されない病原体特異的T細胞を提供することができる。ある特定の実施形態において、これらの個人免疫応答IIRマウスに、これらの特異性を有する多数のT細胞を生成し、それらが、ヒト化マウスモデルにおいてウイルス感染およびEBV関連PTLDを除去することができることを示すために、CMVおよびEBV抗原で免疫付与を行ってもよい。これらのデータは、IIRマウスにおいて生成されたT細胞を使用して、免疫障害を有するヒトにおける日和見感染症の治療を改善する可能性を示すことになる。本明細書に記載の実験は、成体ヒト志願者に由来する成体骨髄の臨床吸引液を使用して、免疫不全マウスにおいて強力なヒト免疫系を生成することができることを示した図27、28。これは、個別化免疫応答IIRマウスモデルと称される。新しく生成されたT細胞は、機能性かつ自己寛容性であり図27、28、多様なレパートリーを有し図29、正常な割合で制御性T細胞を含む。成体CD34細胞ドナーの免疫表現型は、成体ドナーのものと比較して、回復している図29。これらのマウスを、治療目的で広範なレパートリーを有する自己ナイーブT細胞源として使用して、胸腺不足状態例えば、HIV-1感染、造血細胞移植後等にある免疫能力を改善することができ、ヒト化マウスは、限定されないが、微生物抗原を含む任意の対象の抗原で免疫付与することができるため、これらの患者における難治性感染症を治療するための抗原特異的T細胞源を提供することができる。本質的にこれらのマウスの数は限定されず、したがって、多様なナイーブ自己T細胞を、患者の骨髄または動員した末梢血HSCから生成することができる。これらのマウスを使用して、日和見感染ウイルス再活性化疾患に応答するヒトT細胞を生成し、このような疾患、例えば、限定されないが、生命に関わるCMV疾患およびEBV関連リンパ腫から保護することができる。成体ヒト骨髄に由来するナイーブT細胞を有するヒト化マウスを生成し、好適な抗原、例えば、CMVまたはEBV抗原で、免疫付与する。このような抗原は、当該技術分野で既知であり、当業者によって容易に決定することができる。これらの免疫応答は、これらの抗原を認識し、防御応答を開始するT細胞を定量化することによって、測定する。これらのT細胞を、同じドナーに由来する免疫系を有するが、ヒト胸腺移植片を与えられていないためにT細胞を欠いている追加のマウスに養子移入し、それらが、T細胞欠損マウスにおいてCMVおよびEBVの感染を制御することができるかどうかを観察する。EBVに誘発される移植後リンパ増殖性疾患と類似のEBV誘発リンパ腫のモデルを、ヒト化マウスモデルにおいて生成した図48。このEBV誘発リンパ腫のモデルを使用して、EBVの免疫付与によりIIRマウスにおいて生成したT細胞の養子移入が、これらの腫瘍を排除または縮小する能力を評価する。非限定的な実施形態において、成体ヒト骨髄に由来するナイーブT細胞第1のヒトドナーに由来するCD34細胞を有するヒト化マウスを生成し、EBV抗原で免疫付与する。このような抗原は、当該技術分野で既知であり、当業者によって容易に決定することができる。これらの免疫応答は、これらの抗原を認識し、防御応答を開始するT細胞を定量化することによって、測定する。これらのT細胞を、EBV誘発リンパ腫、例えば、自己EBV誘発リンパ腫を有するマウスに養子移入して、EBV免疫付与によりIIRにおいて生成した自己T細胞が、EBV誘発リンパ腫/腫瘍を排除または縮小するかどうかを判定する。実施例10:Mini-Meマウス:1型糖尿病の細胞内在性免疫病因を研究するためのヒト化マウスモデル1型糖尿病TIDMにおいて、HLAをコードする複数の遺伝的決定基および免疫調節分子が、膵臓β細胞で、自己免疫攻撃を受けやすい免疫系を作製する。TIDM感受性は、マウスおよびおそらくは人間において、造血幹細胞HSCにより移行され、遺伝子にプログラムされたHSCに内在性の欠陥が、異常な免疫制御または自己寛容性をもたらすことを示す。ヒトの場合、なんらかの特定の免疫制御性異常が、疾患を引き起こすか、糖尿病の進行または治療の二次免疫作用の結果であるかを区別することは困難である。T1DMと関連する、HSCによって決定される免疫制御性異常を評価するために、多系統ヒト免疫細胞再構成を達成するヒト化マウスモデルを、NOD/SCID/IL2RtUliNSGマウスに同種凍結保存した胎児胸腺組織を移植した、少数の成体CD34HSCから作製した。NSGマウスを、成体TIDMおよび対照志願者の骨髄から吸引したHSCで、再構成した。新しく生成されたT細胞は機能性および自己寛容性であり、多様なレパートリーを有し、制御性T細胞を含む。これらのMiniMeマウスの免疫表現型は、成体骨髄ドナーと比較して、よりナイーブであるか、または回復している。T細胞集団の表現型または数、ならびに成体TIDMまたは対照HSCドナーのHSCに由来する制御性T細胞の表現型に、全体的な差は検出されなかった。MiniMeマウスは、糖尿病非存在下で、対照およびTIDM傾向の免疫系における免疫表現型および免疫制御性機能の比較を可能にする。このモデルを使用して、免疫制御性細胞集団が、TIDM免疫系において本質的に機能不全であるかどうかを判定する。1型糖尿病T1DMは、多遺伝子性遺伝とはっきりと定義されていない環境要因との相互作用からもたらされる自己免疫疾患であり、インスリンを生成する膵臓β細胞の破壊によって引き起こされる。それは、全ての糖尿病症例の5~15を占める。遺伝的特徴:HLAによってコードされるT1DM感受性は、遺伝性疾患の危険性の約50を占める可能性がある。免疫調節遺伝子例えば、サイトカインIL2/IL21、共刺激分子IL2Rα、および阻害分子CTLA-4を含む、多数の非HLAIDDM感受性遺伝子もまた、遺伝的にT1DMに関連する。T1DMの現在の動物モデルには、自発的に糖尿病を発症するNODマウスおよびBBラットが含まれる。モデルは、疾患に関する非常に貴重な見識を与え、NODマウスとヒトは、いくつかの感受性関連遺伝子を共有する。マウスにおいて展開された230を超える免疫介入療法のうち、ヒトにおいて臨床的有意性を有するものはほとんどない。ヒト化マウスモデルヒト化マウスモデルとは、機能性ヒト細胞、組織を生着させた、またはヒト導入遺伝子を発現するマウスである。それらは、ヒト細胞および組織の機能のインビボ研究を可能にし、基礎研究と臨床解釈との間の橋渡し的な役割を果たす。T1Dを研究するためのヒト化マウスモデルの原理:T1D患者は、疾患発症後に研究される。したがって、これらの研究は、原因と、疾患または他の環境要因の影響とを区別することができない。マウスの場合、T1Dに対する感受性は、造血幹細胞HSCによって移行され得る。HSCによって決定される、T1DM関連の免疫制御性異常を評価するために、多系統ヒト免疫細胞の再構成を達成するヒト化マウスモデルを、同種胎児胸腺組織をNOD/SCID/IL2Rgnullマウスに移植した、成体CD34HSCから作製した。理論に束縛されるものではなく、1型糖尿病の遺伝的要因は、制御性T細胞の機能、制御に対するエフェクターT細胞の応答、およびT細胞の恒常性におけるT細胞内在性の異常と関連付けられる。結論およびMiniMeモデルの今後の方向性:少数の成体CD34HSCからの多系統再構成の達成;B細胞の再構成および成体に由来するヒトT細胞の正常な胸腺リンパ球形成;CD34HSCは、マウスにおける持続したTおよびB細胞の再構成をもたらす;ヒト胸腺で発達したT細胞は、ヒトドナーと比較して、よりナイーブな、または回復した表現型を有する;T細胞は、機能性かつ自己寛容性である;MiniMeマウスにおいて再構成された対照HSCと比較して、類似の数の自然発生型T制御性細胞が、胸腺移植片によって生成され、T1DMのHSCの末梢血に存在する。NSGマウスにおける成体骨髄CD34細胞からの免疫再構成は、安全で制御された有望な方法で、HSC内在性の免疫欠陥のインビボ分析を可能にする。MiniMeマウスは、1型糖尿病に関連する免疫制御におけるHSC内在性の欠陥を分析するための、疾患またはその治療によって変化していない白紙の状態の免疫系を提供する。多系統ヒトリンパ造血細胞を有する新しいヒト化マウスモデルの作製は、ヒト胸腺組織の移植およびCD34細胞の末梢注射の組み合わせを伴う。このマウスモデルは、高い、持続した再増殖、ならびにインビボおよびインビトロでの強い免疫応答等、複数の利点を有する。図~49~57は、MiniMeマウスの作製について説明し、MiniMeマウスモデルを使用して得られた結果のうちいくつかを提示する。次のことを行い、観察した:1.8×105の成体ヒトCD34および凍結保存した同種ヒト胎児胸腺組織に加えて、100μg×2の抗CD2mAbの静脈注射による、NSGマウスにおける多系統ヒトリンパ造血細胞の再構成の成功。大部分がCD4CD8二重陽性胸腺細胞であるヒト胸腺細胞の正常な表現型の分布を有する胸腺移植片の肉眼的に著しい増加。成体ドナーの免疫系の回復形態の生成。THY移植片および同種成体CD34細胞で再構成したNSGマウスにおける、インビトロおよびインビボでの正常なT細胞機能に加えて、自己寛容性。ヒト化マウスにおける、主にナイーブ表現型を有する正常なFoxP3Treg細胞の発達。THY移植片および同種成体CD34細胞で再構成したNSGマウスにおける、正常なT細胞の多クローン性。T1DMおよび健常対照から再構成したNSGマウスにおける、THY移植片およびPBL中の類似の数および割合のTreg。実施例11:MiniMeマウス:1型糖尿病の細胞内在性病因を研究するためのヒト化マウスモデル1型真性糖尿病は、インスリンを生成するβ細胞の自己免疫破壊によって引き起こされる。はっきりと定義されていない環境要因が、自己免疫の発達に重要な役割を果たす一方で、遺伝的要因は、実質的に、自己免疫疾患に対する感受性を決定する。HLA遺伝子型が、最も強くT1DMと関連するが、しかしながら、非HLA関連の座位もまた、明らかに自己免疫の危険性に寄与する。これらの多くは免疫制御性遺伝子を含有し、したがって、理論に束縛されるものではなく、造血幹細胞HSCを起源とする、免疫系の細胞における内在性異常は、自己免疫の発達に寄与し得る。NODマウスモデルは、これらの遺伝子のうちのいくつかが自己免疫を促進する、機構を分析するための遺伝学的研究を可能にしたが、臨床研究は、疾患発症後の患者の分析を伴い、原因と、疾患、その治療、または疾患を引き起こす環境要因の影響とを区別することができない。BBラットおよびNODマウスは、T1DMに関する非常に貴重な洞察を与えたが、それらはまた、誤解および間違った推測にもつながった。したがって、制御された有望な方法で、ヒトの免疫学的欠陥の分析を可能にするモデルに対する必要性が存在する。亜致死照射したNOD/SCID/IL2受容体γ鎖欠損NSGマウスにおいて、少数で投与された成体同種骨髄CD34細胞から、多系統ヒト造血細胞の発達を可能にする、新しいヒト化マウスモデルを本明細書に提示する。このモデルは、制御された有望な方法で、自己免疫疾患を有する患者と対比して、正常対照のCD34細胞に由来するT細胞と他の免疫細胞の比較を可能にする。ヒト化マウス多数のヒト化マウスモデルを作製した。ヒト末梢血単核細胞PBMCは、免疫不全マウスに定植させることが可能であり、ヒトT細胞を、胎児肝臓を腎臓被膜下に埋め込んだヒト胎児胸腺THY移植片で発達させる。最近、胎児CD34細胞の静脈内注入と、腎臓被膜下のヒト胎児胸腺および肝臓THY/LIV移植片との組み合わせが、末梢ヒトT細胞、B細胞、免疫グロブリン、ならびに骨髄および形質細胞様の両方の樹状細胞を伴うヒト免疫再構成を可能にすることが示された。これらのマウスは、正常な寸法のリンパ組織を発達させ、タンパク質免疫付与後に強力なクラススイッチ型抗体応答を含む、強い抗原特異的な免疫応答をインビボで示す。さらに、制御性T細胞Tregの正常な胸腺発達は、Tregの機能および末梢での活性化した表現型への変換を提示した。このモデルはまた、これまでのところ適切なインビボモデルに欠けている、ヒトT細胞の末梢の恒常性増殖の試験を可能にする。図~58~66は、MiniMeマウスの作製について説明し、MiniMeマウスモデルを使用して得られた結果のうちいくつかを提示する。結論は、次の事柄を含む:持続した多系統再構成が、腎臓被膜下に同種胎児胸腺を移植した亜致死照射を行ったNSGマウスにおける、少数の成体ヒトCD34細胞の生着によって達成された。多様なレパートリーのVβTCRの生成および自然発生型制御性T細胞の生成を含む、成体CD34HSCに由来するヒトT細胞の正常な胸腺リンパ球形成が、胎児胸腺移植片で生じる。T細胞およびT制御性細胞は、ヒトドナーと比較して、よりナイーブまたは回復した表現型を有する。T細胞は、機能性および自己寛容性である。MiniMeマウスは、1型糖尿病に関連する免疫制御におけるHSC内在性の欠陥を分析するための、疾患またはその治療によって変化していない白紙の状態の免疫系を提供する。実施例12ヒト胸腺移植モデルHLA決定済みのヒト胸腺移植片において、成体CD34からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にする、再凝集ヒト胸腺移植モデルを作製するための方法を、本明細書に提供する。これらの研究は、ヒト化マウスモデルを拡張することになり、インタクトな胎児胸腺組織を埋め込む代わりに、HLA型判定済みヒト胎児胸腺組織から凍結保存したCD45陰性胸腺間質細胞を、NOD-SCIDマウスの腎臓被膜下に埋め込む。共通の糖尿病感受性HLA対立遺伝子を保有する胸腺は、これらの対立遺伝子を共有する正常対照および1型糖尿病対象に由来する静脈内注射したCD34細胞から、T細胞の胸腺リンパ球形成を支持するであろう。代替的なアプローチには、インタクトなヒト胸腺組織に、HLAトランスジェニックNODマウス由来の胸腺上皮細胞を注射すること、または糖尿病感受性対立遺伝子をコードする遺伝子を胸腺異種移植片にアデノウイルス形質導入を行うことが含まれる。これまでに、同種CD34細胞からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にし得る、NOD.scidおよびNOD.scid-IL2R-γnullマウスでのヒト胎児胸腺の生着のための種々のレジメンの評価が報告されている。これらの実験において、7もしくは21日間いずれかのヒト胎児胸腺組織のデオキシグアノシン処置、または移植前の胎児胸腺の凍結保存が、成体同種ヒトCD34造血幹細胞の多系統再構築を可能にするために十分に常在胸腺細胞を枯渇させ得るかどうかを試験した。これらのパイロット実験からの結果は、胎児胸腺の凍結保存が、常在胸腺細胞を十分に枯渇させ、組織のHLA型の判定およびNOD.scid-IL2R-γnullマウスにおける成体CD34ドナーからのヒト免疫細胞の多系統再構成の両方の時間を確保したことを示した。健常対照およびT1Dを有する対象からの臨床骨髄吸引液を使用した、複数の実験の編集からの観察結果を本明細書に簡単に要約する。臨床吸引液からのヒト細胞の再構成以前の報告で、凍結保存した同種ヒト胸腺および第1の組の健常対照およびT1DBMドナーの臨床骨髄吸引液から単離したCD34細胞を移植したNSGマウスの多系統再構成の成功データが記載された。過去1年間で、20の個体を採用し、そのうちの19の対象が、DNA単離およびSNP遺伝子型判定のために血液を提供した。これらの研究について、各組のBMドナー群および胎児胸腺移植片は、共通の糖尿病感受性座位HLAA201、DRB0302、および/またはDQB0301が適合している。HLAA201、DRB0302、および/またはDQB0301が適合する健常対照およびT1D臨床骨髄吸引液の追加4組の実行が成功した。HLA型判定済みの凍結保存した胎児胸腺組織もまた構築し、蓄積させる。研究に登録されたT1D対象と適合しない、BM吸引のために採用された健常対照を、実験に引き出す。これらの個体から、3つの骨髄吸引液を引き出した。10~15mlの骨髄吸引液は、健常対照またはT1D対象各群に対してn=5から、それぞれ、1.5×106および2.7×106のCD34細胞を、約85~90の純度で提供する。プロトコルを、移植の1日前に2GyのTBI、移植後0日目および7日目に2回の抗CD2モノクローナル抗体の注射、ならびに2×105の成体BMに由来するCD34細胞の注射を含むように標準化した。ヒトキメラの発達の監視は、移植の4週間後に開始し、以降2週間毎に移植20週間後まで継続する。全PBMC中の全体的なヒトキメラおよび系統特異的キメラを、4つの独立した実験からまとめた図67。対照として、照射したNSGマウスには、胸腺移植なしにCD34細胞を単独で受容させた。ヒト細胞は、移植の4週間後ほどの早期に検出可能であり、移植12週間後に、健常対照およびT1DのCD34細胞に由来するマウスにおいて、それぞれ、37および43でピークに達した。対照レシピエントではなく胸腺移植片のレシピエントにおいては、ヒトCD3細胞は、移植の8週間後までに、健常およびT1Dの両方のCD34細胞に由来するマウスにおいて存在しPBMCの約8、移植の20週間後までに、健常対照およびT1DのCD34細胞に由来するマウスにおいて、38および24まで増加した。ヒトB細胞キメラは、移植の8週間後までに、健常対照およびT1DのCD34細胞に由来するマウスにおいて、それぞれ、PBMC中10および17のCD19細胞でピークに達した。単球集団もまた、移植の8週間後に、健常対照およびT1DのCD34細胞に由来するマウスにおいて、PBMC中11および6.5でピークに達した。CD34細胞のみを受容した動物胸腺移植片なしのCD34のみのマウスは、ヒトキメラを、移植6週間後の最初の観測時点で、PBMC中57でピークに達し、移植20週間後まで着実に低下するレベルで発達した。これらのマウスにおけるヒト細胞集団は、主に、B細胞から構成され、CD3細胞のわずかな増加が、移植14週間後に見られた。CD34のみのマウスで観察されたT細胞は、マウスの胸腺で発達した可能性が高い。胸腺移植片を受容した動物の本来の胸腺は、移植9週間後に致死させた動物におけるヒト胸腺移植片中の胸腺細胞の数と比較すると0.3~43.1×106の範囲、全胸腺細胞をほとんど含まなかったn=6の動物全体で、0.9~2.7×106の範囲。CD34/ThyTx動物と比較した、CD34のみを注射したNSGに由来するPBMC集団の分析は、CD34のみの群におけるCD4CD45RAナイーブ細胞の割合の減少を示したCD34/ThyTX群の55と比較して、平均8.5。この観測は、少数のヒトT細胞は、遅い時点で、CD34のみの動物のマウス胸腺で発達し、末梢で増殖することを示す。長期22~25週間NOD.scid-IL2R-γnullマウスにおけるヒト胸腺移植片の分析は、成体CD34細胞の強力な胸腺リンパ球形成を呈した図68。正常な割合のCD4/CD8二重陽性および単一陽性細胞が存在した。さらに、単一陽性CD4およびCD8細胞のサブゲートは、自己胎児胸腺および胎児肝臓に由来するCD34細胞の移植によって作製されたヒト化マウスの胸腺移植片のものに類似するCD45RAおよびCD45ROの発現プロファイルを示した。T1D対象に由来する細胞を用いて再構成したマウスは、胸腺細胞数の減少傾向にあるが、T1Dまたは健常対照のCD34細胞ドナーで再構成した動物の間に有意な差はなかった。複数の組のT1Dおよび健常対照のCD34細胞ドナーに由来するさらに多くの動物を、これらの分析に加えて、T1Dに由来するCD34細胞からの胸腺リンパ球形成が、効率性が低いかどうかを判定する。胸腺移植片によって生成されたT細胞が、多様なTCR細胞レパートリーを有するかどうかを判定するために、対照およびT1D対象に由来するCD34細胞で再構成したNOD.scid-IL2R-γnullマウスにおいて、単一陽性のCD4およびCD8胸腺細胞を、移植の20週間後にTCRのβ鎖のスペクトル型解析を行うことにより分析した図69。これらのヒトT細胞は、多様なレパートリーを示し、類似するBVファミリーの利用および各BVに対する多クローン性CDR3の長さ分布を有した。再構成されたレパートリーは、12人の健常成人の平均のCD4T細胞レパートリーに類似しており、各試料中において分析した全てのBVファミリーの平均のハミング距離は、14.2~26.2の範囲であり、平均は20.6であった。ハミング距離は、各BVファミリーに対して観測されたTCRβ鎖の長さ分布の、多クローン性基準分布からの距離の平均である。再構成された胸腺細胞集団に見られるハミング距離は、健常対照の末梢血リンパ球に見られるような、典型的なT細胞の多クローン性の指標である。胸腺移植片の凍結保存は、移植片胸腺細胞の著しい枯渇をもたらし図70、静脈内注射される同種志願ドナーのCD34細胞の拒絶の回避に貢献し得る。上述の図67に示される、ヒト細胞の多系統再構成に加えて、凍結保存/解凍したTHYに加えて、抗CD2mAbを受容させた、消耗症候群または他のGVHDの兆候を発症した長期動物はいなかったことが観察された。しかしながら、抗CD2mAbを注射しなかった1匹の動物は、移植22週間後に始まる重度の脱毛症、皮膚の炎症、猫背姿勢、および体重減少によって特徴付けられる、GVHD様症候群を発症した。理論に束縛されるものではなく、抗CD2mAbの注射は、凍結保存後に胎児胸腺に残る残存生胸腺細胞を枯渇させるために重要であり得る。抗CD2mAbでの処置が、多系統再構成およびGVHD症状の予防に必要であるかどうかを直接試験するために、NOD.scid-IL2R-γnullマウスに、抗CD2mAbの注射ありおよびなしで、凍結保存した胎児胸腺および同種胎児肝臓に由来するCD34細胞を移植した図71。移植後最大15週間まで、ヒト再構成のレベルに差が見られなかったことから、抗CD2mAbは、同種ドナーの幹細胞の拒絶を予防するために必要ではなかった。さらに、ヒトCD3、CD19、およびCD14細胞による末梢再構成に、差は認められなかった。全ての動物はこの時点まで健康にそうに見え、マウスは、GVHDの兆候についての監視を継続する。したがって、同種ヒト胎児胸腺移植片において少数の成体骨髄CD34細胞からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にすることに成功するヒト化マウスモデルを構築した。作製したモデルを使用して、正常対照と対比して、T1DのCD34細胞に由来する通常のT細胞の末梢生存、恒常性増殖、表現型の変換、自己寛容性を比較するための方法を、本明細書に提供する。T1DM患者に由来するT細胞が、胸腺ドナーの自己抗原に対する寛容性の損失と関連して、リンパ球減少によってもたらされる増殖の増加を示すかどうかを判定する。恒常性における内在性異常が、T1DM患者のT細胞を特徴付けるかどうかもまた、判定する。T1Dおよび健常対照対象のHSCに由来するT細胞の表現型。理論に束縛されるものではないが、T1D対象のHSCに由来するT細胞は、正常対照のHSCに由来するものと比較して、生存の減少、およびリンパ球減少によって生じる増殖および活性化の増加を示し得る。これに取り組むために、CD4およびCD8細胞を、末梢血において分析し、ナイーブおよびメモリーT細胞のマーカーとして、CD45RAおよびCD45ROの発現を比較した図72。成体CD34細胞で再構成し、胎児胸腺を移植したNSGマウスにおける免疫系は、HSCドナーの末梢血と比較して、より高い割合のCD45RAナイーブ細胞が検出されたため、回復していることがわかった。さらに、T1D対照のHSCから生成された免疫系におけるナイーブ細胞の割合に、健常対照のものと比較して有意な減少があった。理論に束縛されるものではなく、この観察は、T1D個体のHSCにおける1つまたは多数の遺伝的異常が、Tエフェクター細胞の増殖および活性化を促進することを示す。これは、これらの動物が、膵臓の免疫組織学によって評価される、明らかな自己免疫症状を有さないため、T1D患者およびNODマウスにおいて観察されたこの表現型は、疾患の発症または進行によって生じたものではないことを示す。成体CD34細胞および胎児胸腺を用いて再構成したNSGマウスにおける、自己寛容性および免疫応答の評価。これまでの報告において、健常対照またはT1D対象に由来するヒトCD34細胞を、同種胎児胸腺とともに移植したマウスに由来するT細胞は、自己寛容性であるが、混合リンパ球反応において、強い同種応答を呈したことが示された。T細胞の再構成は、胎児胸腺を移植前の遅い時点で照射した別の実験では、遅い時点移植後>30週で明白であった。これらの動物におけるヒト免疫系は、同種ヒト組織および異種ブタ組織を認識し、それを拒絶する能力がある。同種ドナーすなわち、胎児ドナーでなく、成体CD34細胞ドナーでないに由来するブタ皮膚およびヒト皮膚を、移植の30週間後に、健常対照対象に由来するHSCCD34細胞を骨髄フィルターから回収で再構成したNSGマウスに移植した図73A。ヒト免疫細胞を有する動物は、5週間以内に皮膚移植片を拒絶したが、ナイーブNSG動物は、14週間を上回って、拒絶の兆候なく、ヒト皮膚移植片を許容した。成体CD34細胞によって再構成されたNSGマウスにおけるヒト免疫系が、抗原特異的リコールの能力を有するかどうかを判定するために、T1D対象のCD34細胞に由来する動物に、破傷風免疫付与またはPBSでの疑似免疫付与を行った。それらに、2回目の免疫付与により追加免疫を行い、ヒト細胞を、脾臓および末梢血から精製した。これらの細胞を、インビトロで破傷風トキソイドタンパク質により刺激し、滴定したチミジンの取り込みによって、増殖応答を測定した図73B。陽性対象として、破傷風に対して免疫付与した成体ドナーに由来するヒトPBMCの増殖応答を示す。これらのデータは、これらのNSGマウスの免疫系が、特異抗原に対するリコール応答を監視する能力があることを示す。作製したマウスモデルにおいて、健常対象と比較して、T1DのCD34細胞に由来する制御性T細胞の数、機能、および末梢表現型の変換を比較するための方法を、本明細書に提供する。理論に束縛されるものではなく、T1DM患者の幹細胞に由来するTregおよびNKT細胞は、欠陥を示し得る。これらの研究により、胸腺後が起源のものと対比して、T1DM患者およびそれらの胸腺に由来する制御性細胞における内在性異常を特定する。Tregの数および機能における欠陥が、T1D患者およびNODマウスに報告されている。NODマウスにおいては、膵臓の炎症部位におけるTregの欠損および関連するエフェクター細胞の制御に対する耐性が、疾患進行の最終段階に寄与すると見られている。作製したモデルは、T1Dの傾向がある免疫系から生じる、Treg表現型における遺伝的に決定される欠陥の予測分析を可能にする。健常対照またはT1DのCD34細胞および胎児胸腺を移植したNSG動物の胸腺移植片を分析し、Tregが胸腺移植片で発達しているかどうかを判定した。CD4CD8CD25FoxP3細胞の割合は、T1Dおよび健常対照対象に由来するCD34細胞で再構成した動物において、類似していた。しかしながら、FoxP3細胞の全細胞数は、T1DのCD34細胞に由来するマウスでは、健常対照に由来する移植片と比較して減少する傾向にあった図74A。この傾向は、T1D対象に由来するCD34細胞で再構成されたマウスの移植片から回収された全胸腺細胞数が、全体的に低くなる傾向を反映する。胸腺細胞の絶対数における減少は、有意性に達したわけではないが、これらのデータは、T1Dに由来する前駆体からの胸腺リンパ球形成に欠陥が存在する可能性があることを示す。別個の実験において、Heliosを自然発生型Tregに対するマーカーとして、FCMパネルに追加した。対照およびT1Dの骨髄で再構成した動物は、類似の割合のCD4CD8CD25CD127loFoxP3Helios細胞を有した図74B。胸腺での染色に加えて、末梢においてもまた、Tregの存在をアッセイした。健常対照およびT1DのCD34細胞で再構成したマウスの末梢血中に循環するTregの割合が、健常な成体志願者に見られるものと類似であったことがわかった図74C。IL-2は、Idd3座位の感受性遺伝子である。IL-2でのTregの刺激は、転写因子STAT5の活性化、および続いてFoxP3遺伝子転写の上方制御を媒介する。この刺激経路は、Tregの機能および生存に影響を及ぼす。T1DのHSCで再構成されたNSG動物に由来するTregにおいて、IL-2により刺激されるSTAT5の活性化に欠陥があるかどうかを判定するために、FCMプロトコルを設計し、IL-2で刺激した細胞中のSTAT5のリン酸化を測定した。結果n=1つのHCとT1Dドナーの組は、T1Dに由来するHSCから発達したT細胞における、IL-2シグナル伝達における欠陥の可能性を示す。T1DのCD34細胞に由来するマウスの細胞は、CD4およびTregゲートの両方のサブセットにおいて、成体ヒトPBMC対照と比較して、pSTAT5平均強度の早期偏移およびベースラインへの急速な戻りを示した図75。これは、このT1Dドナーについて、Tregシグナル伝達における遺伝的に定義される機能の欠陥を明らかにし得る。要約すると、移植前に凍結保存されている同種ヒト胎児胸腺移植片において、少数の成体骨髄CD34細胞からのヒト胸腺リンパ球形成を可能にすることを成功させる、ヒト化マウスモデルを構築した。この報告において、このモデルにおいて新たに生成されたT細胞は、成体CD34細胞ドナーのものに類似する機能性および自己寛容性を有するが、免疫表現型が回復している。プロトコルは、この新しいヒト化マウスモデルのために標準化されており、単球、B、およびT細胞が存在している移植後8~12週間早い時点で、これらの動物の免疫機能の調査を開始する。T1D対象における自己免疫攻撃の進化を説明し得る、T細胞における遺伝的に決定される欠陥を調査する。全ての1型糖尿病患者は、これらの研究から得られるであろうT細胞機能における幹細胞内在性の異常の理解から、利益を享受することができる。T1Dおよび健常対照のCD34細胞に由来する免疫系からの、ナイーブ型およびメモリー型T細胞、Treg、ならびにNKT細胞の再構成のレベルを、動物モデルにおいて比較する。このモデルにおいて、T細胞の養子移入を通じて、T細胞の恒常性増殖および生存を、T1Dおよび健常志願者のCD34細胞に由来するT細胞間で比較する。リコール応答における、T1Dおよび健常対照に由来する免疫系の応答を、破傷風トキソイドでの免疫付与後に比較する。Tregの抑制機能およびTregに対するエフェクター細胞の感受性を、分析する。フローサイトメトリーに基づくアッセイを継続して、Treg内の細胞シグナル伝達を監視する。Tregシグナル伝達の分析を、IL-21感受性座位Idd3内の別の遺伝子の刺激の下流のSTAT3の活性化を含むように拡大する。さらに、T1DドナーのHSCに由来する制御性T細胞において、欠陥のあるIL-2に刺激される、FoxP3、TGFβ、およびIL-10の遺伝子転写の上方制御が存在するかどうかを、本モデルにおいて特定する。これらの研究は、内在性の遺伝子欠陥のために生じるエフェクターおよび制御性T細胞集団の機能の欠陥を特定することを助け、T1Dがどのように発達するかに関する洞察に役立つであろう。自己免疫疾患の素因となる造血幹細胞内在性の免疫制御性欠陥、および免疫治療剤に対する個々の応答性の、安全な制御された予測分析を可能にする新しい世代のヒト化マウスモデルを作製した。T1Dおよび健常対照志願者に由来する免疫幹細胞を起源とするT細胞集団を、このヒト化マウスモデルにおいて調査する。実施例12の参考文献DanzlNKalscheuerHSykesMTheminimemouseahumanizedmousemodeltostudycellintrinsicimmunepathogenesisoftype1diabetesPresentedatthe11thAnnualRachmielLevineSymposiumPasadenaCAMarch2011KalscheuerHDanzlNOnoeTFaustTWinchesterRGolandRGreenbergESpitzerTRSavageDGChioGTaharaHYangYGandSykesMAmodelforimmunerejuvenationandindividualizedinvivoanalysisofhumanimmuneresponsivenessScienceTranslationalMedicineSubmittedNovember2011OneoTKalscheuerHDanzlNChittendenMZhaoGYangYGSykesMHumannaturalregulatoryTcelldevelopmentsuppressivefunctionandpostthymicmaturationinahumanizedmousemodelJournalofImmunology2011Oct11873895903実施例13:免疫回復およびヒト免疫応答性の個別化したインビボ分析のためのモデルヒト胎児胸腺移植片および静脈注射で胎児CD34細胞を受容させた免疫不全マウスは、強力なヒト免疫系を生成する。末梢ヒト抗原提示細胞は、胸腺移植片から移出されるT細胞の最適な機能を促進する。しかしながら、ヒト化マウスを使用してヒト免疫媒介性障害を研究または治療するためには、成熟胸腺細胞移植による拒絶を回避しながらも、成体造血細胞が同種胎児胸腺移植片に定植する必要がある。これらの障害は克服されており、マウスにおいて、1型糖尿病T1Dを有する成体および健常対照志願者の骨髄から吸引した造血幹細胞HSCでの強力な免疫再構成が示された。胎児胸腺の凍結保存により、HLA型の判定を可能にし、したがって、同種成体HSCの拒絶を予防しながら、共有される対立遺伝子の選択を可能にする。新しく生成されたT細胞は、機能性および自己寛容性であり、多様なレパートリーを有し、Tregを含む。成体CD34細胞ドナーの免疫表現型は、回復している。T1Dおよび対照のHSCは、類似する数の自然発生型Tregを、胸腺内で生成した。しかしながら、T1D対象に由来する末梢T細胞は、対照と比較して、活性化した/メモリー細胞の割合の増加を示し、T細胞の恒常性にHSC内在性の違いを示した。この個別化免疫応答IIRマウスは、遺伝的に制御された免疫制御異常および免疫療法に対する応答性の個別化した分析を可能にし、種々の免疫障害の治療のための自己T細胞源としての潜在的な治療的有用性を有する。ヒト末梢血単核細胞PBMCは、免疫不全マウスに定植することが可能であり1、ヒトT細胞を、胎児肝臓を腎臓被膜下に埋め込んだヒト胎児胸腺THY移植片で発達させる2。静脈内へのヒト造血幹細胞HSCの注入と、腎臓被膜下へのヒト胎児胸腺および肝臓THY/LIV移植片との組み合わせは、インビボでの抗原特異的免疫応答3~5とともに、高いレベルの末梢ヒトT細胞、B細胞、ならびに骨髄および形質細胞様の両方の樹状細胞3を伴うヒト免疫再構成を可能にする。抑制機能6およびヒトT細胞の恒常性末梢増殖7を伴う制御性T細胞Tregの正常な胸腺での発達が起こる。ヒト化マウスは、胸腺不足状態の治療のためのナイーブT細胞源として、免疫付与後の抗原特異的T細胞源として、または移植または自己免疫疾患における制御性細胞源として、治療目的で使用することができる。ヒト化マウスはまた、自己免疫に関連する遺伝子多型の、免疫制御に対する影響の分析の可能性を有する。最近定義された非HLA関連遺伝子は、集合的に、実質的な自己免疫疾患の危険性を与える8~11。自己免疫疾患を有するヒトにおいては、しかしながら、非HLA関連遺伝子から生じる根本的な欠陥は、大部分が定義されていない。これらの座位の多くが、サイトカイン、共刺激分子、および阻害分子等の免疫制御性遺伝子を含むことを考慮すると8~11、造血幹細胞HSCを起源とする、免疫系の細胞における内在性異常は、自己免疫の発達に寄与する可能性が高い。一貫して、糖尿病の疾患感受性は、NDOマウスにおいて12、さらに理論に束縛されるものではなく、ヒト13において、造血細胞を介して移行される。しかしながら、疾患を有する患者の研究は、根本的な原因と、疾患の発生、疾患の治療、またはそれを引き起こす環境要因の影響とを区別することができない。上述の治療的およびヒト化マウスの基礎研究目標の達成には、患者から得られた成体HSCでのヒト免疫の再構成および機能の達成が必要となる。しかしながら、これらの細胞は、研究の志願者から大量に入手することができず、成体HSCは、免疫不全マウスにおける生着効率が胎児CD34細胞よりも低い14。さらに、治療用途に大量に入手したとしても、成体HSCは、胎児胸腺移植片内に既に存在する同種胸腺細胞によって拒絶される可能性がある。少数の成体同種骨髄CD34細胞に由来するT細胞およびAPCの強力な末梢再構成を支持する、新しいヒト化マウスモデルの作製を提示する。この個別化免疫応答IIRマウスは、自己免疫の素因となるHSC内在性の免疫異常を特定するために使用することができ、ヒトの免疫再構成および免疫療法を提供する可能性を有し得る。結果胎児胸腺移植片において成熟T細胞によってもたらされる免疫バリアを克服すること。免疫不全マウスにおける成体HSCからのヒト免疫再構成を評価するために、CD34細胞を、廃棄されたヒト骨髄注入フィルターから単離し、胎児THY移植を受けた亜致死照射した非肥満型糖尿病との重度複合型免疫不全NOD/SCIDマウスに静脈注射で与えた。未処置ヒト胎児THY移植片のレシピエントは、移植後最初の数週間の間、低い末梢T細胞再構成を示し、それは長期間で著しく低下し、これらの細胞が、移植片から移出したことを示すn=5で、平均のCD3細胞の再構成は移植6週間後でPBMC中7.0±8.22、対する移植16週間後では2.34±2.26。非T細胞は、注射された同種CD34細胞から再構成されず、これらが拒絶されたことを示す。さらに、ヒト胎児THY移植片およびCD34細胞で再構成したいくつかの長期20週間超動物は、後期発症型の移植片対宿主病GVHD様の消耗症候群を発症した。理論に束縛されるものではなく、THY移植片に既に存在していた胸腺細胞は、それぞれ、同種CD34細胞を拒絶し、増殖してレシピエント組織を攻撃し、免疫再構成を妨害し、異種GVHDをもたらす可能性がある。したがって、これらの現象を予防するために、移植片の胸腺細胞を枯渇させるための方法を試験した。2-デオキシグアノシンdGuoでの胎児胸腺器官培養FTOCは、胸腺リンパ球形成16を支持することができる間質成分15を保存しながらも、胸腺細胞を枯渇させる。NOD/SCIDマウスに、同種成体CD34細胞に加えて、dGuoの存在下で7または21日間培養した胎児THY組織を受容させた。対照動物には、胸腺組織ドナーに由来する胎児肝臓CD34細胞を受容させた。THY移植片なしで5×105の成体CD34細胞を受容させたマウスは、10週目までに平均で20のヒトPBMCを再構成したが図76A、CD3細胞は、検出不可能であった図76C。7日間dGuoで培養したTHY組織に加えて、同種CD34細胞を受容させたマウスにおいては、平均してPBMC中約7のレベルのCD3が、6週までに検出可能であり、その後低下したが図76C、CD19細胞は、見られなかった図76B。dGuoによる枯渇を逃れた成熟T細胞は、注入された同種CD34細胞を拒絶したと見られる。THY移植片内の細胞は、ヒト非T細胞の再構成も高レベルのT細胞再構成も達成しなかった図76C。対照的に、ヒト胸腺リンパ球形成ならびに末梢CD19細胞再構成を伴う胸腺生着の成功は、5×105の同種成体CD34細胞を21日間dGuoで培養したTHY移植片とともに静脈内注入した後に生じた20週で、平均でPBMC中約25のヒトCD3細胞、図76B、C。したがって、末梢に注入された同種成体CD34細胞に由来する前駆体は、dGuoで処置した胸腺に定植し、胸腺リンパ球形成を受け、末梢に移出した。同種成体骨髄CD34細胞ではなく4×105の自己胎児肝臓CD34細胞とともに、dGuoで処置した胎児胸腺組織の対照レシピエントは、同種成体CD34細胞で達成されたものよりも迅速なT細胞の再構成を示した図76C。上述の21日間のFTOC移植片のレシピエントは、高レベルの長期ヒトキメラ化を示したが図76、より少量の成体CD34細胞では、強力な免疫再構成を達成しなかった2×105のCD34細胞のレシピエントにおいて、20週で、平均でPBMC中3.89±9.89のヒト細胞、n=9。志願者の骨髄吸引を通じて利用可能なHSCは、限られている。したがって、NK細胞を欠いており、ヒトHSC17の生着に対してより許容性である、NOD/SCID/IL2受容体γ鎖nullNSGマウスを、次の実験に使用した。既存の胸腺細胞を枯渇させるためのTHY移植片の照射もまた、評価した。7Gyで照射したTHYに加えて、3×105の成体CD34細胞を受容させたNSGマウスは、20週までに、優れたB細胞および単球の再構成を示したが、末梢T細胞数は少なかった。THY移植片は、開腹時にはほとんど見られず図83、胸腺照射が、胸腺の成長および/または機能を損なうことを示した。最終的に末梢および胸腺移植片で再構成されたT細胞は、増大し、埋め込みの45週間超後の致死時点において細胞質であった。凍結保存/解凍した胎児THY移植片は、同種成体ヒト造血幹細胞から、T細胞および複数の造血系統の末梢再構成を可能にする。凍結保存/解凍したマウス胸腺組織の移植は、免疫機能を回復させる18、19。上述の研究により、ヒト胎児THY組織が、生存能力のある同種反応性および異種反応性の胸腺細胞を含有することを示したため、インタクトな胎児胸腺組織断片の凍結保存により、これらの胸腺細胞を枯渇させる能力を評価した。図84に示されるように、胸腺組織の凍結保存は、実際に、胎児胸腺組織から、全胸腺細胞サブセットの著しい枯渇>2~>3logをもたらした。凍結保存した胎児胸腺組織の有用性を試験するために、亜致死照射したNSGマウスに、凍結保存/解凍したヒト胎児THY移植片に加えて、3~5×105の同種成体CD34細胞を静脈注射で受容させた。既存の移植片の胸腺細胞に由来するT細胞の枯渇をさらに確実なものにするために、枯渇させる抗ヒトCD2mAbをマウスに受容させた。図77に示されるように、全てのマウスは、6週までにヒトB細胞および単球のキメラ化を達成した。最小限のT細胞再構成を示したCD34単独のレシピエントとは異なり、凍結保存/解凍したTHY移植片のレシピエントは、末梢T細胞を生成し、これは、6週までに現れ、3×105または5×105のCD34細胞の注入後、16週で、それぞれ、約10および約30でピークに達した図77A、右下パネル。21日間dGuoで処置した移植片ではT細胞再の構成を達成するのに20週間を要したが、凍結保存/解凍したTHY移植片では10週間までに類似のT細胞レベルが再構成された。動物の致死時点で、これらの凍結保存した移植片は、著しく増大しており、主にCD4/CD8二重陽性胸腺細胞を有する強力なヒト胸腺リンパ球形成の根拠を示す図77B、C。CD34細胞の静脈注射なしで凍結保存したTHY移植片を受容した対照動物抗CD2mAbあり[n=5]またはなし[n=4]は、末梢に、多数のヒトT細胞も非T細胞も再増殖させなかった移植20週間後に0.46±0.34のヒト細胞再構成、n=9。したがって、既存の移植片の胸腺細胞の大半を、凍結保存によって枯渇させ、CD34細胞を投与することが、ヒトT細胞および非T細胞の再構成に必要であった。新鮮な胸腺組織を同種CD34細胞とともに受容した追加の対照NSG動物は、5週までに、ヒトT細胞を示したが平均でPBMC中2.4、いずれの他の系統にもヒトキメラを示さず<0.006、一方で、自己CD34細胞のレシピエントは、この時点までに、有意なヒトT細胞平均3.4、B細胞平均2.1、および単球平均0.2の再構成を示した。したがって、NSGマウスに埋め込まれた新鮮な胸腺組織に由来するT細胞は、同種CD34細胞を拒絶した。凍結保存/解凍したTHYに加えて、抗CD2mAbを受容させた長期動物はいずれも、消耗症候群または他のGVHDの兆候を発症しなかった。マウスのクラスII細胞が、長期ヒトTHY移植片に存在し図85、静脈内注射したCD34細胞に由来する移植片で発達するヒト胸腺細胞が、負の選択によって、マウスレシピエントに対して寛容化されることを示した。理論に束縛されるものではなく、抗CD2mAbを含むことは、胎児ヒト胸腺移植片から移出する残留異種GVH反応性成熟T細胞によって誘発される消耗症候群を防ぐために重要であった。これは、凍結保存したTHY移植片加えて、同種CD34細胞の静脈注射を受容したNSGマウスの群のうち、抗CD2mAbを受容しなかったマウスにのみ、後期発症型22週でGVHD様症候群重度の脱毛症、皮膚の炎症、猫背姿勢、および体重の減少が発症したことによって示された。しかしながら、凍結保存した胸腺移植片および同種CD34細胞を、抗CD2mAb処置ありまたはなしで受容させたマウスの群を比較した場合に、15週までにヒト再構成のレベルに差が見られなかったため図86、抗CD2mAbは、同種ドナーの幹細胞の拒絶を防ぐためには必要なかった。対照およびT1D志願者に由来する臨床骨髄吸引液からのヒト免疫の再構成。臨床骨髄吸引液から単離した成体CD34細胞の再構成能力を、次に評価した。15mlの骨髄吸引液から、3.6×105および2.7×106のCD34細胞を、それぞれ、第1の健常対照およびT1D志願対象から得た。亜致死照射したNSGマウスに、それぞれ1.8×105の成体CD34細胞に加えて、凍結保存/解凍したヒト胎児THY移植片および抗ヒトCD2mAbを受容させた。対照の照射済みマウスには、THY組織なしでCD34細胞を受容させた。ヒトキメラは、6週目までに検出可能であり、約25~80でピークに達した。THY移植片に加えて静脈注射での対照およびT1D志願者に由来するCD34細胞のレシピエントは、8週までに、実質的なCD3細胞レベルを発達させたが、対照マウスTHY移植片なしは、T細胞の再構成が著しく遅かった図78。CD19細胞およびCD14細胞もまた、T1Dおよび対照志願者のHSCから発達した。3回の追加の実験で類似の結果が得られ、それぞれにおいて、4~14匹のNSGマウスが、それぞれ、単一の志願者の吸引液に由来する2~3×105のCD34細胞で再構成された。これらの実験からの複合データを、図78Aに示す。脾臓T細胞の再構成もまた、急速かつ強力であり、9週で致死させた3匹のT1D細胞で再構成したマウスの群では、1つの脾臓当たり平均2.47×106標準誤差0.6×106のヒトCD3細胞を有し、健常対照で再構成したマウスの脾臓では、106のCD3細胞を有した。図78Bは、胎児胸腺および胎児CD34細胞で見られたような6、正常な割合のCD4/CD8二重陽性および単一陽性細胞、ならびに単一陽性な胸腺細胞間で類似する割合のCD45ROおよびCD45RA細胞を含む、成体CD34細胞からの強力な胸腺リンパ球形成を示す。胸腺細胞の数は、健常対照のCD34細胞で再構成した動物と比較して、T1Dでは低下する傾向にあるが、2つの群の間に、統計的に有意な差は見られなかった。志願ドナーの骨髄CD34細胞で再構成したマウスにおけるT細胞の機能性および自己寛容性。成体CD34細胞を受容した同種ヒトおよび異種ブタの皮膚を、THYを移植したマウスに移植することによって、T細胞機能を評価した。これらのマウスは、同種ヒトおよび異種ブタの皮膚移植片を急速に拒絶し図79A、一方でナイーブな未処置NSGマウスは、浸潤または異種移植片もしくは同種移植片の組織構造上に拒絶の形跡を全く有することなく図87、同種ヒトおよび異種の皮膚移植片を、経過観察期間の間それぞれ、106および50日間許容した図79A。T1Dおよび健常志願者の成体CD34細胞から生成された、T細胞の自己寛容性を評価するために、脾臓およびリンパ節から単離した精製されたT細胞を使用して、混合リンパ球反応MLRを行った。T1Dおよび対照の対象から再構成されたマウスに由来するT細胞は、MLRにおいて同種ヒト刺激因子に対する強い応答とともに、自己寛容性を示した図79B、表11。特に、新しい成体ドナーのT細胞および同じ健常対照骨髄ドナーから再構成したマウスに由来するT細胞は、同種刺激因子に対する類似の強い応答および類似の自己寛容性を示した。したがって、成体志願者に対する免疫応答性および自己寛容性が、これらのマウスで再現された。それらは、個別の成体骨髄ドナーから免疫機能を生成するため、これらの動物は、これ以降個別化免疫応答[IIR]マウスと称される。表11:図79BのMLRアッセイに使用したT細胞表現型T1Dおよび対照の骨髄CD34細胞からの類似したTregの発達。Tregの存在を、胸腺移植片および再構成したマウスの末梢において評価した。図80Aに示されるように、CD25highFoxP3Tregが、IIRマウスのCD4CD8-胸腺細胞に存在していた。CD4CD8-CD25CD127lo胸腺細胞の分析は、FoxP3細胞の大半がまた、胸腺由来の自然発生型Tregを示すHeliosであったことを示した。類似する数および割合のTregが、対照およびT1D志願者から再構成されたTHY移植片において検出された。さらに、いくつかの研究は、Tregの数が、T1D対象の血液では健常対照20と比較して減少することを示したが、一方で類似の割合のTregが、再構成したマウスの両方の群の末梢血に検出された図80B。成体ドナーCD34細胞に由来する単一陽性SP胸腺細胞における多様なTCR細胞のレパートリー。移植後20週間で、T1DのCD34細胞および正常志願者から再構成されたマウスのCD4およびCD8SP胸腺細胞にスペクトル型解析分析を行った図81。これらのヒトT細胞は、多様なレパートリーを示し、類似するBVファミリーの利用および各BVに対する多クローン性CDR3の長さ分布を有した。再構成されたレパートリーは、12人の健康な成体の平均のCD4T細胞レパートリーに類似しており、各試料中において分析した全てのBVファミリーの平均のハミング距離は、14.2~26.2の範囲であり、平均は20.6であった表12。これは、健常対照のPBLに見られるような、典型的なT細胞の多クローン性を示す。表12:選択されたBVファミリーに対するハミング距離によって測定される、実験的に再構成したT細胞レパートリーと、12人の健常な成体のプールしたCD4T細胞の基準レパートリーとのb鎖長分布の類似性。IIRマウスにおけるナイーブ対メモリーT細胞の表現型。健常対照およびT1D志願者のCD34骨髄細胞から再構成されたマウスの末梢組織に定植するT細胞には、ナイーブ型CD45RACD45RO-細胞およびメモリー型CD45RA-CD45RO細胞の両方が含まれた図82A。対照CD34細胞ドナーの血液中のT細胞の比較により、同じドナーから再構成されたIIRマウスにおける、ナイーブ型CD45RACD45RO-CD4、CD8、およびTregのサブセットの著しい増加が明らかになった図82A、B。したがって、成体ドナーの免疫系の回復した形態が、IIRマウスに生成される。図82Cに示されるように、CD34細胞単独のレシピエントのPBMC中のナイーブ型T細胞の割合が、胸腺移植片もまた受容したマウスのものよりも、著しく低かったため、この回復にはヒト胸腺が必要であった。ナイーブ型およびメモリー型CD4およびCD8T細胞の割合を、T1Dまたは健常対照のドナーから同時に生成されたIIRマウスの血液において比較した際、T1DのCD34細胞に由来するT細胞は、健常対照に由来するものと比較して、有意に減少した割合のナイーブ型細胞を示した図82A。T1DドナーのCD34細胞に由来するTregは、健常対照に由来するものよりもメモリー表現型となる傾向にあったが、この傾向は、統計的有意性に達しなかった図82B、p=0.07。考察成体の骨髄に由来するCD34細胞は、凍結保存/解凍した同種胸腺組織を移植したNSGマウスを再構成し、T細胞、B細胞、および骨髄細胞を含む、複数の造血系統を生成することができることを、本明細書に提示する。胎児胸腺を凍結保存/解凍し、さらに抗CD2mAbを投与することによって、移植片から成熟T細胞を枯渇させ、同種CD34細胞の拒絶およびGVHDを予防し、同時に胸腺機能を保存する。胸腺リンパ球形成、胸腺移植片の成長、および機能性で多様な回復した免疫系の再構成を達成する。成体ドナーの自己寛容性を再現する。本研究の基礎であるヒト化マウスモデルには胎児肝臓断片が含まれたが3、5、注入したCD34細胞に由来する胸腺細胞前駆体は、ヒト胸腺移植片に定植したため、これらの断片は現在の研究では必要ない。インビボ胸腺リンパ球形成および末梢再構成は、dGuoで処置したヒト胸腺からも達成されたが、同種CD34細胞の拒絶を防ぐのに十分に長く21日間胸腺をdGuoで処置した場合、注入した成体CD34細胞からのT細胞再構成は時間がかかった。T細胞の回復の遅れは、数週間dGuoで培養した胸腺組織を受容させた完全型ディジョージ症候群を有する患者にも観察された21。結果は、胸腺組織の凍結保存が、GVHDを予防しながら、より迅速なT細胞の回復を支持することができることを示す。胎児胸腺組織の凍結保存は、最適な免疫機能に重要である、HLA対立遺伝子を共有する成体CD34細胞とともに使用するための、組織のHLA型の判定を行うことを可能にする。NSGマウスの使用は、比較的少数の同種成体HSCの生着を可能にし、臨床骨髄吸引液から、複数のマウスの再構成を可能にする。NSGマウスにおける、患者の成体骨髄CD34細胞からの免疫再構成は、疾患によって変化ない免疫系を提供し、制御された有望な方法で、個体の比較を可能にする。ヒト免疫分析は、典型的に、末梢血試料に限定され、根本的な免疫制御異常を、続いて起こる疾患に至る炎症事象と区別することができない。Tregの数および機能における欠陥が、T1D20、22~24、全身性紅斑性狼瘡25、およびリウマチ性関節炎26に対して報告されているが、これは、T1D27~29においては議論の余地がある。健常対照のCD34細胞と類似の割合でTregを胸腺内生成する、T1D対象のCD34細胞から生成されたT細胞集団には、全体的な異常は観察されなかった。しかしながら、T1Dから生成されたIIRマウスの血液中に、健常対照ドナーと比較して、著しく減少した割合のナイーブ型T細胞が観察され、NODマウス30において記載されるように、T細胞恒常性の異常が、T1Dに由来するHSCの特徴であり得ることを示した。本モデルは、素因となる遺伝子の対立遺伝子に関して、T1Dにおいて遺伝子にプログラムされたHSC内在性の免疫制御性異常の評価を可能にするであろう。HLAトランスジェニック免疫応答性マウスは、リウマチ性関節炎31、多発性硬化症32、セリアック病33、およびT1D34~37等の自己免疫疾患の病因に関する見識を提供した。しかしながら、これらのモデルは、自己免疫病因に寄与し得る、ヒトHSC内在性の遺伝的に決定される免疫異常の分析を可能にするものではない。対照的に、免疫不全マウスに静脈注射でのCD34細胞と胎児THY組織を組み合わせて投与することにより、二次リンパ器官が形質細胞様および骨髄の両方の樹状細胞3~5を含む状態で、機能性のヒトT細胞、T-B相互作用、クラススイッチ抗体応答を生成した。Tregは、正常に発達し6、T細胞の恒常性をこのモデルにおいて研究することができるため7、HSCドナーにおける自己免疫疾患と関連するHSC内在性の免疫制御性異常の評価を可能にするであろう。移植前に胸腺のHLA型を判定する能力は、疾患関連のHLA対立遺伝子を有する胸腺の選択を可能にする。理論に束縛されるものではなく、T1DのHSCの移植は、NSGマウスで自己免疫疾患を引き起こさないため、HLAトランスジェニックNSGマウスを使用した、このモデルのさらなる進化は、自己免疫疾患病因の研究を可能にすることができる。個別化免疫応答モデルは、免疫療法剤に対する成体骨髄ドナーの個別の応答性の分析を可能にするであろう。さらに、成体HSCに由来する多様なレパートリーを有するナイーブT細胞を伴う複数のマウスの再構成は、免疫抑制剤、化学療法、照射、またはHIVのために胸腺が不足した患者に、養子移入のための機能性の自己寛容性T細胞を提供することができる。ヒト胎児THYおよびCD34移植片を受容するマウスは、抗HIVまたは他の抗原特異的免疫応答4、38を生成し、このアプローチの免疫治療的な可能性を示す。マウスはまた、自己免疫疾患、GVHD、または臓器同種移植片を有する患者の治療に所望される特異性を有する、多数の自己Tregを生成するために使用することができる。本研究におけるCD34細胞ドナーの自己抗原に対する特異的寛容性およびGVHDの非存在は、別の胸腺異種移植片モデルにおいて既に示されたように39、それぞれ、ヒト胸腺移植片におけるヒトHSCドナーおよびマウスレシピエントに由来するAPCの存在に起因する胸腺内の枯渇を反映する可能性が高い。要約すると、成体HSCから多系統末梢ヒト造血細胞の発達を可能にするモデルを構築した。個別化免疫応答マウスは、自己免疫障害に関連する免疫制御における内在性欠陥、および遺伝的に制御される免疫療法に対する応答の分析を可能にし得る、疾患またはその治療によって変化しない免疫系を提供する。これらのマウスはまた、患者での使用に所望される特異性および特性を有する多クローン性のナイーブまたは活性化T細胞源としての、治療的可能性を有する。材料および方法動物およびヒトの組織および細胞。非肥満性糖尿病の重症複合型免疫不全NOD/SCIDおよびNOD/SCID/IL2受容体γ鎖nullNSGマウスを、JacksonLaboratoryBarHarbor,MEから入手し、特定の病原体を含まないマイクロアイソレーター環境で収容した。ヒト胎児胸腺および肝臓組織在胎17~20週を、AdvancedBiosciencesResourceAlameda,CAから入手した。胎児胸腺の断片を、10DMSOおよび90ヒトAB血清AtlantaBiologicals,Lawrenceville,GA中で凍結保存し、実験計画に応じて、照射または培養した。CD34細胞を、15mlの骨髄吸引液、またはMassachusettsGeneralHospitalMGHBoneMarrowProcessingLaboratoryから入手した廃棄されたヒト骨髄フィルターから、または抗ヒトCD34マイクロビーズMiltenyiBiotec,Auburn,CAを用いた磁気活性化細胞分類装置MACS分離システムを使用して、単離した。胎児胸腺器官培養物。ヒト胎児胸腺の培養を、既に公開されているように行った15。簡単に言うと、胸腺の断片を、1cm2のGelfoamスポンジPharmaciaUpjohnCo,NY上の0.8μmのアイソポアメンブレンフィルターMillipore,Billerica,MAに設置した。内因性胸腺細胞を排除するために、器官培養物は、ダルベッコ変法イーグル培地DMEM,Sigma-Aldrich,St.Louis,MOにおいて、1.35mM2-デオキシグアノシンSigma-Aldrich,St.Louis,MOの存在下で、7または21日間、37°Cで成長させた。ヒト組織の移植。マウスを、亜致死2.5Gy全身照射で前処置した。約1mm3に測定したヒト胎児胸腺の断片を、レシピエントの腎臓被膜の下に埋め込んだ。24時間以内に、1~5×105のヒトCD34細胞を、静脈内に注射した。いくつかのレシピエントは、0日目および7日目に、抗ヒトCD2mAbBTI32240、100μgで処置した。皮膚の移植。MHCミニブタおよび同種ヒトドナー由来の分層2.3mm皮膚試料を、ヒト組織移植の39週後に、外側胸壁に移植した。皮膚移植片を、7日目以降4週まで毎日評価し、続いて、その後3日毎に少なくとも1回の調査を行った。移植片は、生存している移植片が10未満の場合、拒絶されたと定義した。フローサイトメトリーFCM。移植を受けたマウスにおけるヒト造血細胞のレベルを、4色フローサイトメトリーによって評価した。マウスを、移植後に一定の間隔で尾から採血し、末梢血単核細胞PBMCを得、それをHistopaque-1077Sigma-Aldrich,St.Louis,MOで調製した。BDPharmingenSanDiego,CAから購入した蛍光色素で標識化したmAbを、別の組み合わせで使用した。抗マウスCD45、抗マウスTer119、抗ヒトCD4、抗ヒトCD8、抗ヒトCD14、抗ヒトCD19、抗ヒトCD45、抗ヒトCD3、抗ヒトCD45RA、抗ヒトCD45RO、抗ヒトCD127、抗ヒトFoxP3、抗ヒトCD25、およびアイソタイプ対照mAb。FCM分析は、FACSCalibur、FACSCanto、またはLSRIIBDMountainView,CAを使用して行い、分析は、FlowJoソフトウェアTreeStar,SanCarlos,CAによって行った。死細胞は、低い前方散乱および高いヨウ化プロピジウムPIをゲートアウトし、細胞を保持することによって分析から除外した。マウスの赤血球細胞は、マウスのTer119細胞をゲートアウトすることによって排除した。混合リンパ球反応。脾細胞およびリンパ節を、ヒト化マウスから採取し、単核細胞の懸濁液を、フィコール分離によって単離した。ヒトT細胞を、製造業者の説明に従って、抗マウスCD45および抗Ter-119マイクロビーズMiltenyiBiotec,Auburn,CAを使用してマウスの細胞を枯渇させることにより富化し、続いて、PanT細胞単離キットIIMiltenyiBiotec,Auburn,CAを使用してT細胞を精製した。純度は90超であった。レスポンダーT細胞ウェルあたり105を、照射したヒト同種PBMC3000rad、ウェルあたり105の細胞を刺激因子として用いて5日間培養し、増殖を、記載のように41[3H]チミジンの取り込みを介して測定した。自己刺激した対照培養物において、レスポンダー細胞を、マウスCD45およびTer119細胞を枯渇させた、同じヒト化マウスに由来する自己PBMCとともにインキュベートした。データは、3通りの培養物中の平均の[3H]チミジン取り込みとして示す。スペクトル型解析。全RNAを、1~2×104のCD4またはCD8単一陽性胸腺細胞純度80超から直接抽出し、逆転写し、単鎖cDNAの合成を記載の通りに行った42。記載のように42、TCRβ鎖定常領域プライマーおよび個別の可変領域を使用して増幅反応を行った。生成物を、次いで、記載のように42、Cβ特異的FAM標識化プライマーIntegratedDNATechnologies,Coralville,IAでの流出反応に使用した。標識化した生成物を、次いで、TCRβ-鎖長の長さ分布の判定に使用した。DNA生成物に対応するピークの寸法および範囲を、ABI3100GeneticAnalyzerAppliedBiosystems,FosterCity,CAを使用して判定し、AppliedBiosystemsGenotyper3.7NTを使用して分析した。正常なヒトにおける末梢血CD4T細胞の実験および参照のβ鎖長間の定量的差異を評価するために、ハミング距離を、記載のように計算した42。統計分析。統計分析および比較を、GraphPadPrismversion4.0GraphPadSoftware,LaJolla,CAを用いて行った。棒グラフのデータは、平均±標準誤差を表す。パラメータデータセットのためのスチューデントt検定または非パラメータデータセットのためのマンホイットニー検定を、群の比較に使用した。0.05未満のp値は、統計的に有意であると見なした。免疫組織化学。ホルマリンで固定した組織を、ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色のために、5μmで切断した。サイトケラチン染色のために、凍結させた皮膚片を、20分間、PBS中の4パラホルムアルデヒドに固定し、次いで、15分間0.05サポニン/10mMグリシン/5ロバ血清/RPMI中で透過化を行い、PBS中の5粉乳でブロッキングし、PBS中の0.05Tweenで洗浄し、抗ヒトサイトケラチンMFN116、Dakoとともに、一晩インキュベートした。断片を洗浄し、抗マウスIgGHLAlexaFluor488およびDAPIとともに、インキュベートした。マウスMHCII染色については、凍結片を、10分間4Cでアセトン中に固定し、続いて15分間0.05サポニン/10mMグリシン/5ロバ血清/RPMI中で透過化し、PBS中の10卵白/0.05BSAのビオチンブロッキング液でブロッキングした。断片を抗マウスMHCII-ビオチンM5/114.15.2、eBioscienceで1時間染色し、洗浄して、ストレプトアビジン-AlexaFluor568Invitrogenで染色した。AxioObserverD1顕微鏡CarlZeiss,Inc.を用いて画像を取得した。実施例13の参考文献1MosierDERJGuliziaSMBairdandDBWilson1988TransferofafunctionalhumanimmunesystemtomicewithseverecombinedimmunodeficiencyNature3352562592McCuneJMRNamikawaHKaneshimaLDShultzMLiebermanandILWeissman1988TheSCIDhumouseMurinemodelfortheanalysisofhumanhematolymphoiddifferentiationandfunctionScience241163216393LanPNTonomuraAShimizuSWangandYGYang2006ReconstitutionofafunctionalhumanimmunesysteminimmunodeficientmicethroughcombinedhumanfetalthymusliverandCD34celltransplantationBlood1084874924TonomuraNKHabiroAShimizuMSykesandYGYang2008AntigenspecifichumanTcellresponsesandTcelldependentproductionofhumanantibodiesinahumanizedmousemodelBlood111429342965LanPLWangBDioufHEguchiHSuRBronsonDHSachsMSykesandYGYang2004InductionofhumanTcelltolerancetoporcinexenoantigensthroughmixedhematopoieticchimerismBlood103396439696OnoeTHKalscheuerNDanzlMChittendenGZhaoYGYangandMSykes2011HumannaturalregulatoryTcelldevelopmentsuppressivefunctionandpostthymicmaturationinahumanizedmousemodelJImmunol187389539037OnoeTHKalscheuerMChittendenGZhaoYGYangandMSykes2010HomeostaticexpansionandphenotypicconversionofhumanTcellsdependonperipheralinteractionswithAPCJImmunol184675667658UedaHJMHowsonLEspositoJHewardHSnookGChamberlainDBRainbowKMHunterANSmithGDiGenovaMHHerrIDahlmanFPayneDSmythCLoweRCTwellsSHowlettBHealySNutlandHERanceVEverettLJSminkACLamHJCordellNMWalkerCBordinJHulmeCMotzoFCuccaJFHessMLMetzkerJRogersSGregoryAAllahabadiaRNithiyananthanETuomilehtoWolfJTuomilehtoPBingleyKMGillespieDEUndlienKSRonningenCGujaCIonescuTirgovisteDASavageAPMaxwellDJCarsonCCPattersonJAFranklynDGClaytonLBPetersonLSWickerJAToddandSCGough2003AssociationoftheTcellregulatorygeneCTLA4withsusceptibilitytoautoimmunediseaseNature4235065119SteckAKTLBugawanAMValdesLMEmeryABlairJMNorrisMJRedondoSRBabuHAErlichGSEisenbarthandMJRewers2005AssociationofnonHLAgeneswithtype1diabetesautoimmunityDiabetes542482248610SvejgaardA2008TheimmunogeneticsofmultiplesclerosisImmunogenetics6027528611DanskaJSandPPoussier2009AftertheGWASrushnuggetsofinsightintothepathogenesisofautoimmunediseaseSeminImmunol2131331712SerrezeDVEHLeiterSMWorthenandLDShultz1988NODmarrowstemcellsadoptivelytransferdiabetestoresistantF1miceDiabetes3725225513LampeterEFSRMcCannandHKolb1998Transferofdiabetestype1bybonemarrowtransplantationLancet35156856914LepusCMTFGibsonSAGerberIKawikovaMSzczepanikJHossainVAblamunitsNKirkilesSmithKCHeroldRODonisALBothwellJSPoberandMJHarding2009ComparisonofhumanfetalliverumbilicalcordbloodandadultbloodhematopoieticstemcellengraftmentinNODscidgammacBalbcRag1gammacandCB17scidbgimmunodeficientmiceHumImmunol7079080215JenkinsonEJandGAnderson1994FetalthymicorganculturesCurrOpinImmunol629329716JenkinsonEJLLFranchiRKingstonandJJOwen1982EffectofdeoxyguanosineonlymphopoiesisinthedevelopingthymusrudimentinvitroapplicationintheproductionofchimericthymusrudimentsEurJImmunol1258358717ShultzLDFIshikawaandDLGreiner2007HumanizedmiceintranslationalbiomedicalresearchNatRevImmunol711813018CacheiroLHPLGloverandEHPerkins1985RestorationofimmunecompetencewithcryopreservedthymusTransplantation4011011219CheersCELeucharsAJDaviesandVWallis1970RestorationofthymectomizedirradiatedmicebyfrozenandstoredthymusgraftsTransplantation1050551120KukrejaAGCostJMarkerCZhangZSunKLinSuSTenMSanzMExleyBWilsonSPorcelliandNMaclaren2002Multipleimmunoregulatorydefectsintype1diabetesJClinInvest10913114021DavisCMTMMcLaughlinTJWatsonRHBuckleySESchiffLPHaleBFHaynesandMLMarkert1997NormalizationoftheperipheralbloodTcellreceptorVbetarepertoireafterculturedpostnatalhumanthymictransplantationinDiGeorgesyndromeJClinImmunol1716717522ArifSTITreeTPAstillJMTrembleAJBishopCMDayanBORoepandMPeakman2004AutoreactiveTcellresponsesshowproinflammatorypolarizationindiabetesbutaregulatoryphenotypeinhealthJClinInvest11345146323LindleySCMDayanABishopBORoepMPeakmanandTITree2005DefectiveSuppressorFunctioninCD4CD25TCellsFromPatientsWithType1DiabetesDiabetes54929924BruskoTMCHWasserfallMJClareSalzlerDASchatzandMAAtkinson2005FunctionaldefectsandtheinfluenceofageonthefrequencyofCD4CD25Tcellsintype1diabetesDiabetes541407141425BonelliMASavitskayaCWSteinerERathJSSmolenandCScheinecker2009PhenotypicandfunctionalanalysisofCD4CD25FoxP3TcellsinpatientswithsystemiclupuserythematosisJImmunol1821689169526FloresBorjaFECJuryCMauriandMREhrenstein2008DefectsinCTLA4areassociatedwithabnormalregulatoryTcellfunctioninrheumatoidarthritisProcNatlAcadSciUSA105193961940127BerzinsSPESVenanziCBenoistandDMathis2003TcellcompartmentsofprediabeticNODmiceDiabetes5232733428TangQandJABluestone2006RegulatoryTcellphysiologyandapplicationtotreatautoimmunityImmunolRev21221723729BruskoTCWasserfallKMcGrailRSchatzHLVienerDSchatzMHallerJRockellPGottliebMClareSalzlerandMAtkinson2007NoAlterationsintheFrequencyofFOXP3RegulatoryTCellsinType1DiabetesDiabetes5660461230KingCAIlicKKoelschandNSarvetnick2004HomeostaticexpansionofTcellsduringimmuneinsufficiencygeneratesautoimmunityCell11726527731TanejaVandCSDavid2010RoleofHLAclassIIgenesinsusceptibilityresistancetoinflammatoryarthritisstudieswithhumanizedmiceImmunolRev233627832LangHLHJacobsenSIkemizuCAnderssonKHarlosLMadsenPHjorthLSondergaardASvejgaardKWucherpfennigDIStuartJIBellEYJonesandLFugger2002AfunctionalandstructuralbasisforTCRcrossreactivityinmultiplesclerosisNatImmunol394094333BlackKEJAMurrayandCSDavid2002HLADQdeterminestheresponsetoexogenouswheatproteinsamodelofglutensensitivityintransgenicknockoutmiceJImmunol1695595560034SerrezeDVMNiensJKulikandTPDiLorenzo2010BridgingmicetomenusingHLAtransgenicmicetoenhancethefuturepredictionandpreventionofautoimmunetype1diabetesinhumansMethodsMolBiol60211913435KingMTPearsonAARossiniLDShultzandDLGreiner2008Humanizedmiceforthestudyoftype1diabetesandbetacellfunctionAnnNYAcadSci1150465336GregersenJWSHolmesandLFugger2004HumanizedanimalmodelsforautoimmunediseasesTissueAntigens6338339437WenLNYChenJTangRSherwinandFSWong2001TheregulatoryroleofDR4inaspontaneousdiabetesDQ8transgenicmodelJClinInvest10787188038BrainardDMESeungNFrahmACariappaCCBaileyWKHartHSShinSFBrooksHLKnightQEichbaumYGYangMSykesBDWalkerGJFreemanSPillaiSVWestmorelandCBranderADLusterandAMTager2009InductionofrobustcellularandhumoralvirusspecificadaptiveimmuneresponsesinhumanimmunodeficiencyvirusinfectedhumanizedBLTmiceJVirol837305732139NikolicBJPGardnerDTScaddenJSArnDHSachsandMSykes1999NormaldevelopmentinporcinethymusgraftsandspecifictoleranceofhumanTcellstoporcinedonorMHCJImmunol1623402340740NizetYAAChentoufiBDeLaParraPLewalleRRouasACornetTBesseMMouradJMalaiseJPSquiffletHBazinandDLatinne2000TheexperimentalandclincialimmunosuppressiveeffectsofaratIgG2bantihumanCD2mAbLOCD2aBTI322Transplantation691420142841KrausABJShafferHCTohFPrefferDDombkowskiSSaidmanCColbyRGeorgeSMCafeeRSacksteinBDeyTRSpitzerandMSykes2003EarlyhostCD8TcellrecoveryandsensitizedantidonorIL2producingandcytolyticTcellresponsesassociatedwithmarrowgraftrejectionfollowingnonmyeloablativebonemarrowtransplantationExpHematol3160962142WuHDMSMaurerRAFriedmanCCMarboeEMRuizVazquezRRamakrishnanASchwartzMDTilsonASStewartandRWinchester2007ThelymphocyticinfiltrationincalcificaorticstenosispredominantlyconsistsofclonallyexpandedTcellsJImmunol17853295339実施例14:マウスゲノムは、ヒト細胞に感染し得る内因性レトロウイルスを含有する。これらは、ジェノトロピックマウス白血病ウイルスX-MLVおよびポリトロピックマウス白血病ウイルスP-MLV含む。一態様において、本発明は、これらのマウス白血病ウイルスがヒト細胞に感染することができないように作製された、本発明で使用するための遺伝子修飾したマウスの作製を提供する。これは、ヒト細胞に感染するために必要である重要なエンベロープタンパク質を標的とする、小型の阻害性RNAをコードする導入遺伝子を導入すること、ヒト細胞に感染するために必要である重要なエンベロープタンパク質を標的とする、中和抗体をコードする導入遺伝子を導入することを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の方法によって達成することができる。他の非限定的な実施形態において、MiniMeマウスを生成するために使用されるヒトCD34細胞に、小型の制御性RNAを形質導入された細胞の物理的な選択を可能にするマーカー遺伝子とともに形質導入して、X-MLVおよびP-MLVの受容体の発現をノックダウンすることができる。他の実施形態において、これらのマウス白血病ウイルスは、例えば、限定されないが、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3DE、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H等のヒトアポリポタンパク質BmRNA編集酵素の形質導入マウスを使用することによって、ヒト細胞に感染することができないように作製される。Conticello,2008,TheAID/APOBECfamilyofnnucleicacidmutators,GenomeBiol.,9:229.1-229.10を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。理論に束縛されるものではなく、マウスゲノムへのAPOBEC3遺伝子の挿入は、X-MLVおよびP-MLV等の内因性レトロウイルスがヒト細胞に感染する能力を妨げることになる。APOBEC3遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列は、当該技術分野で周知である。トランスジェニックマウスを作製する方法は、当業者に周知である。"