aファージディスプレイライブラリを被験者へ注射する段階;b1つ又は複数の臓器又は組織の試料を得る段階;c試料の薄片を作製する段階;及びd薄片からファージを回収する段階を含む方法。PALMレーザーミクロビームを用いた位置決めおよび切除PositioningandAblationwithLaserMicrobeamsにより薄片の1つ又は複数の部分を選択する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。選択された部分が特異的な細胞型を含む、請求項2記載の方法。選択された部分が同種の細胞集団を含む、請求項2記載の方法。細胞が癌細胞である、請求項3記載の方法。ファージが、細菌にファージを感染させることにより回収される、請求項1記載の方法。新たなファージを作製するため、ファージ挿入物を増幅すること及び増幅された挿入物をファージDNAと連結することにより、ファージが回収される、請求項1記載の方法。ファージディスプレイライブラリを調製する方法であって、以下の段階を含む方法:a標的の臓器、組織、又は細胞型により宿主動物を免疫する段階;b宿主動物から抗体をコードするmRNAを得る段階;c抗体をコードするmRNAからcDNAを調製する段階;及びdcDNAからファージディスプレイライブラリを調製する段階。抗体に特異的なプライマーを使用して抗体をコードするcDNAを増幅する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。標的の臓器、組織、又は細胞が罹患している、請求項8記載の方法。標的が癌細胞を含む、請求項10記載の方法。iファージディスプレイライブラリを被験者へ注射する段階;及びii1つ又は複数の臓器、組織、又は細胞型からファージを回収する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。標的のタンパク質又はペプチドに対してライブラリをスクリーニングする段階をさらに含む、請求項8記載の方法。請求項8記載の方法により調製された、ファージディスプレイライブラリ。妊娠を妨害する方法であって、以下の段階を含む方法:a配列番号:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、配列番号:44、又は配列番号:45より選択される配列の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含むペプチドを得る段階;及びbペプチドを雌被験者に投与する段階。被験者が妊娠している、請求項15記載の方法。薬剤をペプチドへ結合させる段階をさらに含む、請求項15記載の方法。胎児へ薬剤を送達する方法であって、以下の段階を含む方法:a配列番号:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、配列番号:44、又は配列番号:45より選択される配列の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含むペプチドを得る段階;bペプチドを薬剤へ結合させる段階;及びcペプチドを妊娠被験者に投与する段階。薬剤が、薬物、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、酵素、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞毒性剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のFab断片、造影剤、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、微小装置、細胞、又は発現ベクターである、請求項17又は18記載の方法。脂肪組織へのターゲティング送達の方法であって、以下の段階を含む方法:a配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、又は配列番号:55より選択される少なくとも3個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含むターゲティングペプチドを得る段階;bペプチドを薬剤へ結合させて複合体を形成させる段階;及びc複合体を被験者に投与する段階。被験者において体重減少を誘導する段階をさらに含む、請求項20記載の方法。配列番号:5~配列番号:45、配列番号:47~配列番号:121、配列番号:123、及び配列番号:125~配列番号:250のいずれかより選択される配列の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含む、大きさが100アミノ酸以下の単離ペプチド。大きさが50アミノ酸以下の、請求項22記載の単離ペプチド。大きさが25アミノ酸以下の、請求項22記載の単離ペプチド。大きさが10アミノ酸以下の、請求項22記載の単離ペプチド。大きさが7アミノ酸以下の、請求項22記載の単離ペプチド。大きさが5アミノ酸以下の、請求項22記載の単離ペプチド。配列番号:5~配列番号:45、配列番号:47~配列番号:121、配列番号:123、及び配列番号:125~配列番号:250のいずれかより選択される配列の少なくとも5個の連続したアミノ酸を含む、請求項22記載の単離ペプチド。分子に結合している、請求項22記載の単離ペプチド。分子が、薬物、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞毒性剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のFab断片、造影剤、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、又は抗原である、請求項29記載の単離ペプチド。アポトーシス促進剤が、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシンdefensin、セクロピンcecropin、2配列番号:1、2配列番号:2、2配列番号:3、及び3配列番号:4からなる群より選択される、請求項30記載の単離ペプチド。抗血管新生剤が、トロンボスポンジン、アンジオスタチン5、色素上皮由来因子pigmentepitheliumdrivedfactor、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン12、血小板因子4、IP10、Groβ、トロンボスポンジン、2メトキシエストラジオール、プロリフェリンproliferin関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、CM101、マリマスタットMarimastat、ペントサンポリスルフェートpentosanpolysulphate、アンジオポエチン2Regeneron、インターフェロンα、ハービマイシンherbimycinA、PNU145156E、16Kプロラクチン断片、リノマイドLinomide、サリドマイド、ペントキシフィリンpentoxifylline、ゲニステインgenistein、TNP470、エンドスタチン、パクリタキセル、ドセタキセルDocetaxel、ポリアミン、プロテアソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナル伝達ペプチド、アキュチンaccutin、シドフォビルcidofovir、ビンクリスチン、ブレオマイシン、AGM1470、血小板因子4、及びミノサイクリンminocyclineからなる群より選択される、請求項30記載の単離ペプチド。サイトカインが、インターロイキン1IL1、IL2、IL5、IL10、IL11、IL12、IL18、インターフェロンγIFγ、IFα、IFβ、腫瘍壊死因子αTNFα、又はGMCSF顆粒球マクロファージコロニー刺激因子からなる群より選択される、請求項30記載の単離ペプチド。高分子複合体に結合している、請求項22記載の単離ペプチド。複合体が、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁性ビーズ、酵母細胞、哺乳動物細胞、又は細胞である、請求項34記載の単離ペプチド。真核生物発現ベクターに結合している、請求項34記載の単離ペプチド。ベクターが遺伝子治療ベクターである、請求項36記載の単離ペプチド。固体支持体に結合している、請求項22記載の単離ペプチド。薬学的に許容される担体の中に請求項22記載の単離ペプチドを含む組成物。単離ペプチドが、分子又は高分子複合体に結合している、請求項39記載の組成物。配列が、配列番号:5~配列番号:19のいずれかより選択される、請求項22記載の単離ペプチド。配列が、配列番号:20~配列番号:38のいずれかより選択される、請求項22記載の単離ペプチド。配列が、配列番号:210~配列番号:234のいずれかより選択される、請求項22記載の単離ペプチド。配列が、配列番号:56~配列番号:68のいずれかより選択される、請求項22記載の単離ペプチド。配列が、配列番号:69~配列番号:88のいずれかより選択される、請求項22記載の単離ペプチド。配列が、配列番号:235~配列番号:250のいずれかより選択される、請求項22記載の単離ペプチド。配列が、配列番号:89、配列番号:90、配列番号:91、又は配列番号:92より選択される、請求項22記載の単離ペプチド。それぞれ容器内に存在する請求項22記載の単離ペプチド及び対照ペプチドを含む、キット。単離ペプチドが、配列番号:5~配列番号:45、配列番号:47~配列番号:121、配列番号:123、及び配列番号:125~配列番号:250のいずれかより選択される配列の少なくとも3個の連続したアミノ酸を含む、単離ペプチドと選択的に結合する抗体。aファージディスプレイライブラリを被験者に注射する段階;b少なくとも1個の臓器、組織、又は細胞型の少なくとも1個の試料を回収する段階;c試料を、単離細胞又は細胞塊へと分離させる段階;dペレットを形成させるため、有機相を介して細胞を遠心分離する段階;及びeペレットよりファージを回収する段階を含む方法。異なる臓器、組織、又は細胞型に対して、ファージディスプレイライブラリを予備選択する段階をさらに含む、請求項50記載の方法。ターゲティングペプチド配列が、配列番号:5~配列番号:45、配列番号:47~配列番号:121、配列番号:123、及び配列番号:125~配列番号:250のいずれかより選択される少なくとも3個の連続したアミノ酸を含む、表面タンパク質の一部としてターゲティングペプチド配列を発現する、遺伝子治療ベクター。臓器又は組織へのターゲティング送達の方法であって、以下の段階を含む方法:a請求項22記載のペプチドを得る段階;bペプチドを薬剤へ結合させる段階;及びc薬剤を被験者に投与する段階。被験者がヒト又はマウスである、請求項53記載の方法。薬剤が、薬物、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、酵素、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞毒性剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のFab断片、造影剤、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁性ビーズ、微小装置、酵母細胞、哺乳動物細胞、細胞、又は発現ベクターである、請求項53記載の方法。薬剤が造影剤である、請求項53記載の方法。被験者の画像を得る段階をさらに含む、請求項56記載の方法。画像が疾患の診断用である、請求項57記載の方法。疾患が、癌、関節炎、糖尿病、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化、自己免疫疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、心血管疾患、又は変性疾患である、請求項58記載の方法。臓器又は組織が、骨髄、前立腺、前立腺癌、卵巣、尿管、胎盤、脂肪、脾臓、血管新生組織、又は腹水である、請求項53記載の方法。前立腺癌へのターゲティング送達の方法であって、以下の段階を含む方法:a配列番号:20~配列番号:38のいずれかより選択される少なくとも3個の連続したアミノ酸を含むターゲティングペプチドを得る段階;bペプチドを治療剤へ結合させて複合体を形成させる段階;及びc前立腺癌を有する被験者に複合体を投与する段階。前立腺癌を診断する方法であって、以下の段階を含む方法:a配列番号:20~配列番号:38のいずれかより選択される少なくとも3個の連続したアミノ酸を含むターゲティングペプチドを得る段階;b前立腺癌を有すると推測される被験者にペプチドを投与する段階;及びc前立腺癌細胞と結合したペプチドを検出する段階。血管新生組織に対するターゲティングペプチドを同定する方法であって、以下の段階を含む方法:a新生児被験者において低酸素を誘導する段階;bファージディスプレイライブラリを被験者に投与する段階;及びc被験者の網膜よりファージを回収する段階。細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、以下の段階を含む方法:a配列番号:93~配列番号:121のいずれかより選択される少なくとも3個の連続したアミノ酸を含むターゲティングペプチドを得る段階;bペプチドを透過処理剤へ結合させて複合体を形成させる段階;及びc複合体を細胞に投与する段階。透過処理剤が、配列番号:122のアミノ酸配列を有するペプチド又はHIVTatタンパク質より選択される、請求項64記載の方法。ターゲティングペプチドが配列番号:112のアミノ酸配列を有する、請求項64記載の方法。細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、以下の段階を含む方法:aアネキシンAnnexinVを透過処理剤へ結合させて複合体を形成させる段階;及びb複合体を細胞に投与する段階。透過処理剤が、配列番号:122のアミノ酸配列を有するペプチド又はHIVTatタンパク質より選択される、請求項67記載の方法。血管新生を調整する方法であって、以下の段階を含む方法:a配列番号:93~配列番号:131より選択される少なくとも3個の連続したアミノ酸を含むペプチドを得る段階;及びbペプチドを被験者に投与する段階。被験者が腫瘍を有し、かつペプチドが腫瘍の増殖又は生存を阻害する、請求項69記載の方法。ペプチドが薬剤に結合している、請求項69記載の方法。薬剤が、トロンボスポンジン、アンジオスタチン5、色素上皮由来因子、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン12、血小板因子4、IP10、Groβ、トロンボスポンジン、2メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、CM101、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン2Regeneron、インターフェロンα、ハービマイシンA、PNU145156E、16Kプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、TNP470、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、AGM1470、血小板因子4、またはミノサイクリンである、請求項71記載の方法。ペプチドが抗血管新生活性を有する、請求項69記載の方法。ペプチドが血管新生促進活性を有する、請求項69記載の方法。虚血を有する被験者にペプチドを投与する段階をさらに含む、請求項73記載の方法。心血管疾患を有する被験者にペプチドを投与する段階をさらに含む、請求項73記載の方法。癌、関節炎、糖尿病、心血管疾患、炎症、又は黄斑変性症を有する被験者にペプチドを投与する段階をさらに含む、請求項69記載の方法。血管新生組織へのターゲティング送達の方法であって、以下の段階を含む方法:a配列番号:123、配列番号:125、配列番号:126、配列番号:127、配列番号:128、配列番号:129、配列番号:130、又は配列番号:131より選択される少なくとも3個の連続したアミノ酸を含むペプチドを得る段階;bペプチドを治療剤へ結合させて複合体を形成させる段階;及びc複合体を被験者に投与する段階。ペプチドが、配列番号:123のアミノ酸配列を有する、請求項78記載の方法。血管新生組織が、癌、関節炎、糖尿病、心血管疾患、炎症、又は黄斑変性症を有する被験者に由来する、請求項78記載の方法。エンドスタチン又はアンジオスタチンの受容体を検出する方法であって、以下の段階を含む方法:a組織又は臓器より試料を得る段階;b試料をエンドスタチン又はアンジオスタチンと共にインキュベートする段階;及びc試料と結合したエンドスタチン又はアンジオスタチンの存在を検出する段階。試料が、組織又は臓器の薄片である、請求項81記載の方法。エンドスタチン又はアンジオスタチンに選択的なターゲティングペプチドを用いて結合を阻害することにより、特異性を評価する段階をさらに含む、請求項82記載の方法。例示的な態様の説明本明細書において使用されるように、一つのa又はanとは、1以上を意味しうる。本発明の特許請求の範囲において使用されるように、を含むという用語と関連して、一つのa又はanとは、1以上を意味しうる。本発明において使用されるように、もう一つのanotherとは、少なくとも第二又はそれ以上の項目を意味しうる。ターゲティングペプチドとは、ある臓器、組織、又は細胞型への選択的局在を特徴とする、連続的なアミノ酸の配列を含むペプチドである。選択的局在は、例えば、推定ターゲティングペプチド配列を、ファージの外表面上に表示されるタンパク質へと組み込む、後に開示される方法により、決定されうる。異なるアミノ酸配列のそのようなターゲティングペプチドを多数発現するよう遺伝学的に改変されたそのようなファージのライブラリを、被験者に投与した後、被験者から1つ又は複数の臓器、組織、又は細胞型を収集し、その臓器、組織、又は細胞型に見出されるファージを同定する。ターゲティングペプチド配列を発現するファージは、対照の組織又は臓器と比較して、より多い結合を、その組織又は臓器において示す場合、その組織又は臓器に選択的に局在するものと見なされる。好ましくは、ターゲティングペプチドの選択的局在は、対照の臓器、組織、又は細胞型と比較して2倍以上大きいファージの濃縮を、標的の臓器、組織、又は細胞型においてもたらすべきである。対照の臓器、組織、又は細胞型と比較して少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、又はそれ以上の濃縮を標的臓器においてもたらす選択的局在は、より好ましい。又は、選択的局在を示すターゲティングペプチド配列を発現するファージは、好ましくは、標的臓器から回収されたファージを、次回のスクリーニングのため第二の宿主へと再注射した場合に、対照臓器と比較して増加した濃縮を標的臓器において示す。3回目のスクリーニングの後には、さらなる濃縮が示されうる。選択的局在を決定するためのもう一つの別の手段は、推定標的ペプチドを発現するファージが、非特異的ペプチドを発現するか、又は推定標的ペプチドを発現するよう遺伝学的に改変されていない対照ファージと比較して、好ましくは2倍、より好ましくは3倍、又はそれ以上の濃縮を標的臓器において示すことである。選択的局在を決定するためのもう一つの手段は、標的ペプチドを発現するファージの標的臓器への局在が、標的ペプチド配列を含む合成ペプチドの共投与により少なくとも部分的に阻止されることである。ターゲティングペプチドおよび回帰ペプチドとは、本明細書において同義に使用される。ファージディスプレイライブラリとは、その外表面上に推定のターゲティングペプチドの組を発現するように遺伝子操作されているファージのコレクションを意味する。好ましい態様において、推定のターゲティングペプチドをコードするDNA配列は、ファージ莢膜タンパク質をコードする遺伝子にフレームが合うように挿入される。他の好ましい態様において、推定のターゲティングペプチド配列は、一部が20個全てのアミノ酸のランダム混合物であり、一部が非ランダム混合物である。特定の好ましい態様において、ファージディスプレイライブラリの推定のターゲティングペプチドは、ターゲティングペプチド配列内の固定位置で一つまたは複数のシステイン残基を示す。高分子複合体とは、その配列がランダム、規則正しい、または部分的に規則正しくてもよい分子のコレクションを意味する。この用語は、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、単細胞病原性生物、多細胞病原性生物、および原核または真核細胞のような生物を含む。この用語はまた、リポソーム、微小カプセル、微粒子、磁性ビーズおよび微小装置のような非生存分子群を含む。唯一の要件は、複合体が一つ以上の分子を含むことである。分子は同一であっても、または互いに異なっていてもよい。ターゲティングペプチドのための受容体には、ターゲティングペプチドに結合する任意の分子または分子の複合体が含まれるがこれらに限定されない。受容体の非限定的な例には、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、エピトープ、脂質、糖質、多分子構造、一つまたは複数の分子の特異的コンフォメーションおよび形態解剖学的実体が含まれる。好ましい態様において、受容体とは、標的臓器、組織、または細胞型内の血管を形成する細胞の管腔表面上に存在する天然に存在する分子または分子の複合体である。被験者とは、一般的に哺乳動物を意味する。特定の好ましい態様において、被験者は、マウスまたはウサギである。さらにより好ましい態様において、被験者はヒトである。ファージディスプレイターゲティングペプチドを同定するための本明細書に記載の方法は、ファージディスプレイライブラリのインビトロ投与を含む。ファージディスプレイの様々な方法およびペプチドの多様な集団を作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5223409号、第5622699号、および第6068829号は、ファージライブラリを調製する方法を開示する。ファージディスプレイ技術は、小さいペプチドがその表面上に発現されうるようにバクテリオファージを遺伝子操作することを含むSmithら、1985、1993。この技術を適用できる可能性がある範囲はかなり広く、過去10年の間に、ファージによって表示されたペプチドライブラリの構築、およびライブラリを用いてペプチドリガンドを単離するスクリーニング方法の開発にはかなりの進歩が認められている。例えば、ペプチドライブラリを用いることによって、相互作用部位、および炎症反応に関与する抗体または細胞接着を媒介するインテグリンのような多くのタンパク質における受容体リガンド結合モチーフの特徴を調べることが可能となった。この方法は同様に、ペプチド模倣薬または造影剤を開発するためのリードとして役立つ新規ペプチドリガンドを同定するためにも用いられているArapら、1998a。ペプチドの他に、一本鎖抗体のようなより大きいタンパク質ドメインもまた、ファージ粒子の表面上に表示されうるArapら、1998a。ある臓器、組織、又は細胞型に選択的なターゲティングアミノ酸配列は、バイオパニングbiopanningにより単離されうるPasqualiniおよびRuoslahti、1996;Pasqualini、1999。簡単に説明すると、推定ターゲティングペプチドを含むファージのライブラリを動物又はヒトに投与し、ファージを含む臓器、組織、又は細胞型の試料を回収する。繊維状ファージを利用した好ましい態様においては、バイオパニングとバイオパニングの間に、線毛陽性細菌においてインビトロでファージを繁殖させることができる。この細菌は、ファージによって溶解せず、特定の挿入物を表示するファージを、多コピー、分泌する。標的分子と結合するファージは、標的の臓器、組織、又は細胞型から溶出させ、次いで宿主細菌において増殖させることにより増幅することができる。所望により、増幅されたファージを宿主に投与し、臓器、組織、又は細胞型の試料を再び収集してもよい。選択的バインダーの集団が得られるまで、複数回のバイオパニングを実施することができる。ペプチドのアミノ酸配列を、ファージゲノム内のターゲティングペプチド挿入物に相当するDNAを配列決定することにより、決定する。次いで、同定されたターゲティングペプチドを、標準的なタンパク質化学技術Arapら、1998a、Smithら、1985により合成ペプチドとして作製することができる。この手法は、標的の性質を予想することなく、バイアスのない機能アッセイにおいて、循環ターゲティングペプチドを検出することを可能にする。候補標的がターゲティングペプチドの受容体として同定された後は、標準的な生化学的方法Pasqualini、1999;RajotteおよびRuoslahti、1999を使用することにより、それを単離、精製、クローニングすることが可能である。特定の態様において、バックグラウンドファージ結合をさらに減少させるため、サブトラクションプロトコルが使用される。サブトラクションの目的は、目的の細胞以外の細胞と結合するか、又は不活化された細胞と結合するファージをライブラリから除去することである。別の態様において、ファージライブラリは、ターゲティングされた細胞、組織、又は臓器を保有していない被験者に対してプレスクリーニングされうる。例えば、胎盤結合ペプチドは、男性又は非妊娠女性に対してライブラリをプレスクリーニングした後に同定されうる。サブトラクション後、ライブラリは、目的の細胞、組織、又は臓器に対してスクリーニングされうる。もう一つの別の態様において、刺激されていない休止期の細胞型、組織、又は臓器が、ライブラリに対してスクリーニングされ、結合するファージが除去される。次いで、細胞系、組織、又は臓器が、例えばホルモン、増殖因子、サイトカイン、又はケモカインの投与によって活性化され、活性化された細胞型、組織、又は臓器が、サブトラクトされたファージライブラリに対してスクリーニングされる。例えば、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第号5840841号、第5705610号、5670312号、及び第5492807号に開示されるように、他のサブトラクションプロトコルの方法も既知であり、本発明の実施において使用されうる。ファージディスプレイ系の選択マウスにおいて行われたこれまでのインビボ選択研究は、fUSE5ベクターにおけるIII遺伝子莢膜タンパク質との融合タンパク質として発現されたランダムペプチドのライブラリを好んで用いたPasqualiniおよびRuoslahti、1996。所定のライブラリに存在する個々のクローンの数および多様性は、インビボ選択の成否にとって重要な要因である。欠損ファージクローンの過剰発現を有する可能性が低い一次ライブラリを用いることが好ましいKoivunenら、1999。ライブラリの調製は、108~109形質導入単位TUmlのあいだで最適化しなければならない。特定の態様において、各選択ラウンドの間にバルク増幅戦略を適用する。直鎖、環状、または二環ペプチドを示すファージライブラリを、本発明の範囲内で用いてもよい。しかし、単環ペプチドは直鎖ペプチドより標的臓器に対して高い親和性を有する傾向があることから、環状挿入物CX310Cにおいて3~10個のランダム残基を表示するファージライブラリが好ましい。二環ペプチドを示すライブラリCX3CX3CX3Cなど;Rajotteら、1998も首尾よく用いられている。しかし、同源の合成ペプチドの産生は、可能ではあるが、異なるジスルフィド架橋配列を有する多数の配座異性体のために複雑となりうる。マウスにおけるインビボファージディスプレイによる回帰ペプチドおよび受容体の同定マウスに投与されたファージディスプレイペプチドライブラリ由来のペプチドのインビボ選択を用いて、正常なマウス脳、腎臓、肺、皮膚、膵臓、網膜、腸、子宮、前立腺、および副腎に関して選択的なターゲティングペプチドを同定したPasqualiniおよびRuoslahti、1996;Pasqualini、1999;Rajotteら、1998。これらの結果は、正常な臓器の血管内皮が、ペプチドプローブによる異なるターゲティングを可能にするために十分に不均一であることを示しているPasqualiniおよびRuoslahti、1996;Rajotteら、1998。腫瘍の新生血管に回帰するペプチドを同定する手段は、下記のように考案されている。ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管を標的とするペプチドモチーフのパネルが構築されているArapら、1998a;Pasqualini、1999により概説。これらのモチーフには、配列RGD4C、NGR、およびGSLが含まれる。RGD4Cペプチドはこれまで、選択的に結合するαvインテグリンとして同定されており、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管に回帰することが示されているArapら、1998a、1998b;Pasqualini、1997。腫瘍回帰RGD4Cターゲティングペプチドの受容体は、αvインテグリンとして同定されているPasqualiniら、1997。αvインテグリンは、血管新生において重要な役割を果たす。αvβ3およびαvβ5インテグリンは、正常な内皮細胞には存在しないか、または発現されても低レベルであるが、腫瘍の新生血管では誘導されるBrooksら、1994;Hammesら、1996。アミノペプチダーゼNCD13は最近、NGRモチーフの血管新生受容体であると同定されているBurgら、1999。アミノペプチダーゼNCD13は、TRAMPにおける前立腺癌の新生血管においてだけでなく、正常上皮前立腺組織においても強く発現されている。腫瘍回帰ファージは、腫瘍の新生血管においてその受容体と共局在するが、正常組織の非新生血管には存在しないArapら、1998b。免疫組織化学的証拠から、血管ターゲティングファージが、組織切片においてヒト腫瘍血管に結合するがPasqualiniら、2000、正常血管には結合しないことが示されている。挿入物を有さない陰性対照ファージfdファージは、正常または腫瘍組織切片に結合しなかった。血管新生受容体の発現を、細胞株、非増殖血管、および腫瘍の活性化血管、ならびに黄体のような他の血管新生組織において評価した。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学から、これらの受容体が多くの腫瘍細胞および活性化HUVECsにおいて発現されていることが示されたデータは示さない。血管新生受容体は、マウスまたはヒト組織の正常臓器の血管において検出されなかった。これらの受容体の分布を、腫瘍細胞、腫瘍血管、および正常血管において免疫組織化学によって分析した。αvインテグリン、CD13、アミノペプチダーゼA、NG2、および腫瘍血管における既知の受容体であるMMP2MMP9は、ヒトおよびマウス起源の双方の新生血管の内皮細胞および周皮細胞において特異的に発現される。新生血管は、非増殖性の内皮細胞では非常に低レベルで発現されるか、または全く発現されないマーカーを発現する示していない。新生血管内皮のマーカーには、VEGFおよび塩基性FGF受容体の特異的サブタイプ、ならびに中でもαvインテグリンのような血管増殖因子の受容体が含まれるMustonenおよびAlitalo、1995。これまで、新生血管の特徴である新規分子の同定および単離は、主に内皮細胞を培養で増殖させると表現型が劇的に変化するために遅れているWatsonら、1995。これらの腫瘍血管マーカーの多くはプロテアーゼであり、マーカーのいくつかは、ウイルス受容体として作用する。αvインテグリンは、アデノウイルスの受容体でありWickhamら、1997c、CD13はコロナウイルスの受容体であるLookら、1989。MMP2およびMMP9は、エコーウイルスの受容体であるKoivunenら、1999。アミノペプチダーゼAも同様にウイルス受容体であるように思われる。バクテリオファージは真核細胞ウイルスと同じ細胞受容体を利用する可能性がある。これらの知見は、インビボファージディスプレイによって単離された受容体が、同定されたペプチドモチーフを標的遺伝子治療担体として利用するための重要な特徴である、細胞内部移行internalization能を有することを示唆している。標的化送達腫瘍血管に回帰するペプチドを細胞毒性薬またはアポトーシス促進ペプチドにカップリングさせると、腫瘍異種移植片を有する実験的マウスモデルにおいて親化合物より有効でより毒性の低い化合物が得られているArapら、1998a;Ellerbyら、1999。下記に示すように、RGD4Cペプチドをアデノウイルスの表面タンパク質に挿入すると、腫瘍標的化遺伝子治療のために用いてもよいアデノウイルスベクターが得られるArapら、1998b。BRASIL好ましい態様において、標的臓器、組織、または細胞型の細胞に結合したファージを未結合のファージから分離することは、BRASIL技術を用いて行う2000年9月8日に提出された米国特許仮出願第60231266号;参照として本明細書に組み入れられており、本明細書と共に提出された、Arap、Pasqualini、およびGiordanoによる選択的相互作用リガンドのバイオパニングおよび迅速な分析BiopanningandRapidAnalysisofSelectiveInteractiveLigandsBRASILと題する米国特許。BRASIL可溶性相互作用リガンドのバイオパニングおよび迅速な分析では、臓器、組織、または細胞型を細胞または小さい細胞塊に穏やかに分離して、これを水相に懸濁する。水相を、適当な密度の有機相の上に層にして、遠心分離する。結合したファージに接着した細胞は遠心管の底に沈殿して、未結合のファージは水相に残ったままとなる。これによって、ファージと細胞との結合相互作用を維持しながら、結合したファージを未結合のファージからより効率よく分離することができる。臓器、組織、もしくは細胞型を静脈内投与によりファージディスプレイライブラリに曝露する、インビボプロトコールにおいて、または、細胞を水相においてファージライブラリに曝露してから遠心分離する、エクスビボプロトコールによって、BRASILを行ってもよい。タンパク質とペプチド特定の態様において、本発明は、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドを含む新規組成物に関する。本明細書において用いられるように、タンパク質またはペプチドは一般的に、アミノ酸約200個以上で遺伝子から翻訳された完全長の配列までのタンパク質;アミノ酸約100個以上のポリペプチド;およびまたはアミノ酸約3~約100個のペプチドを意味するがこれらに限定されない。便宜上、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドという用語は、本明細書において互換的に用いられる。特定の態様において、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドの大きさは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約275、約300、約325、約350、約375、約400、約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、約625、約650、約675、約700、約725、約750、約775、約800、約825、約850、約875、約900、約925、約950、約975、約1000、約1100、約1200、約1300、約1400、約1500、約1750、約2000、約2250、約2500個のアミノ酸残基またはそれ以上を含んでもよいがこれらに限定されない。本明細書において用いられるように、アミノ酸残基とは、当技術分野で既知の任意の天然のアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または任意のアミノ酸模倣体を意味する。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であって、アミノ酸残基の配列を中断する任意の非アミノ酸は存在しない。他の態様において、配列は一つまたは複数の非アミノ酸部分を含んでもよい。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、一つまたは複数のアミノ酸部分によって中断されてもよい。したがって、タンパク質またはペプチドという用語は、天然に存在するタンパク質において認められる一般的なアミノ酸20個の少なくとも一つ、または下記の表1に示すアミノ酸を含むがこれらに限定しない少なくとも一つの改変もしくはまれなunusualアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。表1改変アミノ酸およびまれなアミノ酸タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術を用いたタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、タンパク質もしくはペプチドの天然資源からの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に既知の任意の技術によって作製してもよい。様々な遺伝子に対応するヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド配列がこれまでに開示されており、当業者に既知のコンピューターデータベースにおいて認められるであろう。そのような一つのデータベースは、国立バイオテクノロジー情報センターのGenBankおよびGenPeptデータベースであるhttpwwwncbinlmnihgov。既知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示の技術を用いて、または当業者に既知であるように増幅およびまたは発現してもよい。または、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの様々な市販の調製物が、当業者に既知である。ペプチド模倣体本発明に従ってポリペプチドを調製するためのもう一つの態様は、ペプチド模倣体を用いることである。模倣体は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、バイオテクノロジーと薬学BiotechnologyandPharmacy、ペズットPezzutoら編、ChapmanandHall、ニューヨーク1993内、ジョンソンJohnsonら、ペプチド折り返し模倣体PeptideTurnMimeticsを参照のこと。ペプチド模倣体を用いる背景の基礎となる根本的理由は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体と抗原の相互作用のような分子間相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を主に向けるように存在する点である。ペプチド模倣体は、天然の分子と類似の分子間相互作用を可能にすると予想される。これらの原理を用いて、本明細書に開示のターゲティングペプチドの天然の特性の多くを有するが、改変および改善すらされた特徴を有する第二世代の分子を操作してもよい。融合タンパク質本発明の他の態様は、融合タンパク質に関する。これらの分子は一般的に、ターゲティングペプチドの全てまたは実質的な部分が、N末端またはC末端で第二のポリペプチドまたはタンパク質の全てまたは実質的な部分に結合している。例えば、融合体は、異種宿主においてタンパク質の組み換え型を発現させるように他の種からのリーダー配列を用いてもよい。もう一つの有用な融合には、融合タンパク質の精製を促進するために、抗体のエピトープのような免疫学的に活性なドメインを付加することが含まれる。融合部またはその近傍に切断部位を含めると、精製後の外来性のポリペプチドの除去が促進されるであろう。他の有用な融合には、酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル、または膜貫通領域のような機能的ドメインの連結が含まれる。好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、治療タンパク質またはペプチドに結合したターゲティングペプチドを含む。融合タンパク質に組み入れてもよいタンパク質またはペプチドの例には、細胞分裂阻害タンパク質、殺細胞タンパク質、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、ペプチド薬、抗体、Fab断片抗体、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、MHCタンパク質、細胞接着タンパク質、および結合タンパク質が含まれる。これらの例は、制限することを意味しておらず、実質的に本発明の範囲内において、タンパク質またはペプチドはターゲティングペプチドを含む融合タンパク質に組み入れることができることを意図している。融合タンパク質を作製する方法は、当業者に周知である。そのようなタンパク質は、例えば二官能架橋剤を用いる化学的結合によって、完全な融合タンパク質の新規合成によって、またはターゲティングペプチドをコードするDNA配列を第二のペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列に結合させた後、無傷の融合タンパク質を発現させることによって、産生することができる。タンパク質の精製特定の態様において、タンパク質またはペプチドは単離または精製してもよい。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、一つのレベルで細胞、組織、または臓器のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーションならびに粗分画化を含む。関心対象のタンパク質またはポリペプチドは、部分的または完全な精製を得るためにまたは均一になるまで精製、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、免疫アフィニティクロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。アフィニティクロマトグラフィーによる受容体タンパク質精製の例は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5206347号に開示されている。ペプチドを精製する特に効率のよい方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーFPLCまたはHPLCである。精製タンパク質またはペプチドは、タンパク質またはペプチドが、その天然に得られる状態と比較して任意の程度にも精製されている、他の成分から単離可能な組成物を意味すると解釈される。したがって、単離または精製タンパク質またはペプチドも同様に、天然に存在する可能性がある環境を含まないタンパク質またはペプチドを意味する。一般的に、精製されたとは、様々な他の成分を除去するために分画化が行われている、および組成物がその発現された生物活性を実質的に保持しているタンパク質またはペプチド組成物を意味するであろう。実質的に精製されたという用語を用いる場合、この用語は、タンパク質またはペプチドが、組成物におけるタンパク質の約50、約60、約70、約80、約90、約95、またはそれ以上を構成するような、組成物の主成分を形成する組成物を意味する。タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量する様々な方法が、本開示に照らして当業者に既知である。これらには、例えば、活性な画分の比活性を決定する、またはSDSPAGE分析によって画分内でのポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価する好ましい方法は、画分の比活性を計算すること、それを最初の抽出物の比活性と比較すること、およびこのように、~精製倍率によって評価して、その純度を計算することである。活性の量を示すために用いられる実際の単位は、当然、精製を行うために選択される特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存するであろう。タンパク質精製に用いるために適した様々な技術は、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体等による沈殿、または熱変性の後に遠心分離;イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー段階;等電点電気泳動;ゲル電気泳動;ならびにこれらおよび他の技術の組み合わせが含まれる。当技術分野で一般的に既知であるように、様々な精製段階を行う順序は、変更してもよく、または特定の段階を省略してもよいと考えられ、なおも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製するための適した方法が得られる。タンパク質またはペプチドは常にその最も精製された状態で提供すべきであるという一般要件はない。実際に、実質的にあまり精製されていない産物は、特定の態様において有用であると考えられる。部分精製は、より少ない精製段階を組み合わせて用いて、または同じ一般的精製スキームの異なる型を用いて行ってもよい。例えば、HPLC装置を用いて行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同じ技術より大きい精製倍率が得られるであろうと認識される。相対的により低い程度の精製を示す方法は、タンパク質産物の総収量や、または発現されたタンパク質の活性を維持する点において長所を有する可能性がある。アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質と、それが特異的に結合する分子との特異的親和性に依存するクロマトグラフィー技法である。これは、受容体リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの一つを不溶性のマトリクスに共有結合カップリングさせることによって合成される。次に、カラム材料は溶液から物質を特異的に吸収することができる。条件を結合が起こらない条件に変更すると例えば、pH、イオン強度、温度等の変化、溶出が起こる。マトリクスは、如何なる有意な程度にもそれ自身が分子を吸収せず、しかも広い範囲の化学、物理、および熱安定性を有する物質でなければならない。リガンドはその結合特性に影響を及ぼさないようにカップリングしなければならない。リガンドは、比較的堅固な結合を提供しなければならない。そして、試料またはリガンドを破壊することなく、物質を溶出することができなければならない。合成ペプチド本発明のターゲティングペプチドは、その大きさが比較的小さいために、従来の技術に従って溶液または固体支持体上で合成することができる。様々な自動シンセサイザーが市販されており、既知のプロトコールに従って用いることができる。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、スチュワートStewartおよびヤングYoung、1984;タムTamら、1983;メリフィールドMerrifield、1986;およびバラニーBaranyおよびメリフィールドMerrifield、1979を参照のこと。通常、アミノ酸約6個から約35~50個までの短いペプチド配列は、そのような方法によって容易に合成することができる。または、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適した条件で培養される組み換え型DNA技術を用いてもよい。抗体特定の態様において、同定されたターゲティングペプチドまたはその受容体に対する抗体を作製することが望ましいかもしれない。適当なターゲティングペプチドまたは受容体、またはその一部をリンカー、ポリリンカー、または誘導体化アミノ酸によって一つまたは複数の物質にカップリング、結合bonded、結合bound、接合、または化学的に結合させてもよい。これは、二重特異的、または多価組成物またはワクチンが産生されるように行ってもよい。これらの組成物の調製において用いられる方法は、当業者に周知であり、ヒトに投与するために適していなければならない、すなわち薬学的に許容されなければならないとさらに想像される。好ましい物質は、担体であり、キーホールリンペットヘモシアニンKLH、またはウシ血清アルブミンBSAである。抗体という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を意味するために用いられ、Fab、Fab、F2、一本鎖ドメイン抗体DABs、Fv、scFv一本鎖Fv等のような抗体断片が含まれる。様々な抗体に基づく構築物および断片を調製および用いる技術は、当技術分野で周知である。抗体を調製および特徴付けする手段も同様に、当技術分野で周知である例えば、抗体:実験マニュアルAntibodies:ALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratory、1988を参照のこと;参照として本明細書に組み入れられる。サイトカインとケモカイン特定の態様において、臓器、組織、または細胞型に標的化送達するために、特異的生物活性物質を一つまたは複数のターゲティングペプチドにカップリングさせることが望ましいかもしれない。そのような物質には、サイトカイン、ケモカイン、アポトーシス促進因子、および抗血管新生因子が含まれるがこれらに限定されない。サイトカインという用語は、細胞間メディエータとしてもう一つの細胞に作用する、一つの細胞集団によって放出されたタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、増殖因子、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Nメチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;リラキシン;プロリラキシン;卵胞刺激ホルモンFSH、甲状腺刺激ホルモンTSH、および黄体形成ホルモンLHのような糖タンパク質ホルモン;肝増殖因子;プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン;胎盤ラクトゲン、OBタンパク質;腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β;ムレリアン阻害物質;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子;インテグリン;トロンボポエチンTPO;NGFβのような神経生長因子;血小板増殖因子;TGFαおよびTGFβのようなトランスフォーミング増殖因子TGF;インスリン様増殖因子Iおよびインスリン様増殖因子II;エリスロポエチンEPO;骨誘導因子;インターフェロンα、β、およびγのようなインターフェロン;マクロファージCSFMCSF、顆粒球マクロファージCSFGMCSF、および顆粒球CSFGCSFのようなコロニー刺激因子CSF;IL1、IL1α、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18のようなインターロイキンIL、LIF、GCSF、GMCSF、MCSF、EPO、キットリガンドまたはFLT3、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子ならびにLTが含まれる。本明細書において用いられるように、サイトカインという用語には、天然起源からのタンパク質または組み換え型細胞培養からのタンパク質、および本来の配列サイトカインの生物活性同等物が含まれる。ケモカインは、一般的に、ケモカイン発現部位に免疫エフェクター細胞を動員するための化学誘引物質として作用する。例えば、他の免疫系成分の治療部位への動員を増強するために、サイトカイン遺伝子と併用して特定のケモカイン遺伝子を発現することが有利であろう。ケモカインには、RANTES、MCAF、MIP1α、MIP1β、およびIP10が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、特定のサイトカインも同様に化学誘引作用を有することが知られており、それらも同様にケモカインという用語の下に分類されうることを認識するであろう。造影剤と放射性同位元素特定の態様において、本発明で主張されるペプチドまたはタンパク質は、様々な疾患を有する臓器、組織、または細胞型を造影および診断するために用いられる造影剤に結合してもよい。多くの適当な造影剤が、それらをタンパク質またはペプチドに結合させる方法と共に当技術分野で既知である例えば、いずれも参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5021236号および第4472509号を参照のこと。タンパク質またはペプチドはまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。蛍光マーカーとの接合体は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製する。造影剤として用いられる可能性がある常磁性イオンの非限定的な例には、クロムIII、マンガンII、鉄III、鉄II、コバルトII、ニッケルII、銅II、ネオジムIII、サマリウムIII、イッテルビウムIII、ガドリニウムIII、バナジウムII、テルビウムIII、ジスプロシウムIII、ホルミウムIII、およびエルビウムIIIが含まれ、ガドリニウムが特に好ましい。X線造影のような他の状況において有用なイオンには、ランタンIII、金III、鉛IIおよび特にビスマスIIIが含まれるがこれらに限定されない。造影剤または治療剤として用いられる可能性がある放射性同位元素には、アスタチン211、14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152ユーロピウム、ガリウム67、3水素、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、32リン、レニウム186、レニウム188、75セレニウム、35硫黄、テクネチウム99m、およびイットリウム90が含まれる。125Iは、特定の態様における使用に好ましいことが多く、テクネチウム99mおよびインジウム111も同様に、低エネルギーであって、長い範囲の検出に適しているため、好ましいことが多い。本発明の放射活性標識タンパク質またはペプチドは、当技術分野で周知の方法に従って産生してもよい。例えば、それらは、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および次亜塩素酸ナトリウムのような化学酸化剤またはラクトペルオキシダーゼのような酵素的酸化剤と接触させることによってヨウ化することができる。本発明によるタンパク質またはペプチドは、リガンド交換プロセスによって、例えば、ペルテクネートをスズ溶液によって還元して、還元したテクネチウムをセファデックスカラム上でキレート化して、ペプチドをこのカラムに適用することによって、または直接標識技術によって、例えばペルテクネート、SNCl2のような還元物質、フタル酸ナトリウムカリウム溶液のような緩衝液、およびペプチドをインキュベートすることによって、テクネチウム99mによって標識してもよい。金属イオンとして存在する放射性同位元素に結合するために用いられることが多い中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸DPTAおよびエチレンジアミン四酢酸EDTAである。ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート、およびレノグラフィンを含む蛍光標識も同様に用いることが考慮される。特定の態様において、主張されるタンパク質またはペプチドは、色素産生基質に接触させると着色産物を生じる二次結合リガンドまたは酵素酵素タグに結合してもよい。適した酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュ水素ペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼが含まれる。好ましい二次結合リガンドはビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン化合物である。そのような標識の利用は当業者に周知であり、例えば、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第3817837号、第3850752号、第3939350号、第3996345号;第4277437号;第4275149号;および第4366241号に記載されている。架橋剤crosslinker二官能架橋試薬は、アフィニティマトリクスの調製、多様な構造の改変および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の同定、ならびに構造研究を含む多様な目的のために広く用いられている。二つの同一の官能基を有するホモ二官能試薬は、同一および異なる高分子または高分子サブユニット間の架橋を誘導するために、ならびにポリペプチドリガンドをその特異的結合部位に結合させるために非常に効率がよいことが判明した。ヘテロ二官能試薬は、異なる二つの官能基を含む。異なる二つの官能基の異なる反応性を利用することによって、架橋は、選択的および連続的に制御することができる。二官能架橋試薬はその官能基の特異性に従って、例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特異的基に分類することができる。これらの中で、遊離のアミノ基に対する試薬は、それらが市販されているため、合成が容易であるため、およびそれらを適用できる緩和な反応条件のために特に一般的となった。ヘテロ二官能架橋試薬の大部分は、一級アミン反応基とチオール反応基とを含む。リガンドをリポソームに架橋させる例示的方法は、それぞれが特に参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5603872号、および米国特許第5401511号に記載されている。様々なリガンドをアミン残基の架橋によってリポソーム表面に共有結合させることができる。リポソーム、特に、それぞれがホスファチジルエタノールアミンPEを含む微小乳化リポソームMELおよび大きい単層リポソームLUVETのような多層小胞MLVまたは単層小胞は、確立された技法によって調製されている。リポソームにPEを含めこと、架橋目的のためにリポソーム表面上に活性な官能残基、1級アミンを提供する。上皮細胞増殖因子EGFのようなリガンドは、PEリポソームに首尾よく結合されている。リガンドは、リポソーム表面上の明確な部位に共有結合している。これらの部位の数および表面密度は、リポソーム製剤およびリポソームタイプによって決まる。リポソーム表面はまた、非共有結合部位を有してもよい。リガンドとリポソームとの共有結合体を形成するために、架橋試薬を有効性および生体適合性に関して調べられている。架橋試薬には、グルタルアルデヒドGAD、二官能オキシランOXR、エチレングリコールジグリシジルエーテルEGDE、および水溶性カルボジイミド、好ましくは1エチル3カルボジイミドEDCが含まれる。架橋の複合体化学によって、認識物質のアミン残基とリポソームとの結合が確立される。もう一つの例において、ヘテロ二官能架橋試薬および架橋試薬を用いる方法を記載する特にその全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5889155号。架橋試薬は、求核性のヒドラジド残基を求電子性のマレイミド残基と組み合わせて、それによって一つの例においてアルデヒドを遊離のチオールにカップリングさせることができる。架橋試薬は、様々な官能基を架橋するように改変することができる。核酸本発明による核酸は、ターゲティングペプチド、受容体タンパク質、または融合タンパク質をコードしてもよい。核酸は、ゲノムDNA、相補的DNAcDNA、または合成DNAに由来してもよい。発現ベクターに組み入れることが望ましい場合、核酸はまた、天然のイントロンまたはもう一つの遺伝子に由来するイントロンを含んでもよい。そのような操作された分子は時に、ミニ遺伝子と呼ばれる。本明細書において用いられる核酸には、一本鎖および二本鎖分子と共に、DNA、RNA、化学改変核酸および核酸類似体が含まれる。本発明の範囲内の核酸は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約275、約300、約325、約350、約375、約400、約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、約625、約650、約675、約700、約725、約750、約775、約800、約825、約850、約875、約900、約925、約950、約975、約1000、約1100、約1200、約1300、約1400、約1500、約1750、約2000、約2250、約2500個のヌクレオチド残基またはそれ以上の長さであってもよいと考えられる。ターゲティングペプチド、融合タンパク質、および受容体は、適当なアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列によってコードされうると考えられる。所望のアミノ酸配列をコードする核酸の設計および産生は、標準化コドン表を用いて当業者に周知である下記の表2を参照のこと。好ましい態様において、それぞれのアミノ酸をコードするために選択されたコドンは、関心対象の宿主細胞において核酸の発現を最適にするように改変してもよい。宿主細胞の様々な種のコドン選択性は当技術分野で周知である。表2所望のターゲティングペプチド、融合タンパク質または受容体アミノ酸配列をコードする核酸の他に、本発明は、そのようなコードする核酸配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする相補的核酸を含む。核酸ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件は当技術分野で周知である。例えば、条件は、温度約50°C~約70°Cで約002M~約015MNaClによって提供される条件のように、低い塩およびまたは高い温度条件を含んでもよい。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は特定の核酸の長さ、標的配列の長さおよびヌクレオチド含有量、核酸の荷電組成物、およびハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウム、または他の溶媒の存在または濃度によって部分的に決定される。クローニング、遺伝子移入、および発現のためのベクター特定の態様において、発現ベクターを用いてターゲティングペプチドまたは融合タンパク質を発現して、次にこれを精製および用いることができる。他の態様において、発現ベクターは、遺伝子治療において用いられる。発現は、適当なシグナルがベクターにおいて提供される必要があり、宿主細胞において関心対象の遺伝子の発現を促進するウイルスおよび哺乳動物起源の双方からのエンハンサープロモーターのような様々な調節要素が含まれる。宿主細胞においてメッセンジャーRNA安定性および翻訳可能性を最適にするように設計した要素も同様に既知である。調節要素発現構築物または発現ベクターという用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることが可能である遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物が含まれることを意味する。好ましい態様において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下である。プロモーターとは、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識され、遺伝子の特異的転写を開始するために必要なDNA配列を意味する。転写制御下という用語は、プロモーターが、RNAポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に対して正しい位置および方向に存在することを意味する。関心対象の核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、標的細胞において核酸の発現を指示することができる限り、重要ではないと考えられている。このように、ヒト細胞が標的となる場合、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接してその制御下にあるように核酸コード領域を配置することが好ましい。一般的に、そのようなプロモーターには、ヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかが含まれてもよい。様々な態様において、ヒトサイトメガロウイルスCMV前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを用いて、関心対象のコード配列の高レベル発現を得ることができる。関心対象のコード配列の発現を得るために、当技術分野で周知である他のウイルスもしくは哺乳動物の細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターを用いることも同様に、発現レベルが所定の目的にとって十分である限り考慮される。cDNA挿入物を用いる場合、典型的にこれは遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含むであろう。ポリアデニル化シグナルの特性は、本発明の実践の成功にとって重要ではないと考えられ、ヒト成長ホルモン、およびSV40ポリアデニル化シグナルのようなそのような任意の配列を用いてもよい。同様に、ターミネータも発現構築物の要素として同様に考慮される。これらの要素は、メッセージレベルを増強して構築物からの他の配列への読み過ごしを最小限にするように作用しうる。選択マーカー本発明の特定の態様において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現構築物にマーカーを含めることによってインビトロまたはインビボで同定してもよい。そのようなマーカーは、細胞に対して同定可能な変化を付与して、発現構築物を含む細胞を容易に同定できるようにするであろう。通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニングおよび選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン、およびヒスチジノールに対して抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼtkのような酵素、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCATのような酵素を用いてもよい。免疫学的マーカーも同様に用いることができる。用いられる選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要ではないと考えられる。選択マーカーのさらなる例は当業者に周知である。発現ベクターの送達発現ベクターを細胞に導入する多くの方法がある。本発明の特定の態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する操作された構築物を含む。特定のウイルスは受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内に入ることができること、宿主細胞ゲノムに組み入れられうること、およびウイルス遺伝子を安定かつ効率よく発現できることによって、それらは、哺乳動物細胞に外来遺伝子を移入するための魅力的な候補物質となるRidgeway、1988;NicolasおよびRubenstein、1988;BaichwalおよびSugden、1986;Temin、1986。一般的に、好ましい遺伝子治療ベクターはウイルスベクターである。外来の遺伝子材料を許容することができるいくつかのウイルスは、それらが収容することができるヌクレオチドの数およびそれらが感染する細胞の範囲が制限されるが、これらのウイルスは遺伝子発現を首尾よく行うことができることが証明されている。しかし、アデノウイルスは、宿主ゲノムにその遺伝子材料を組み入れず、したがって、遺伝子発現のために宿主複製を必要とせず、そのためそれらは迅速で、効率のよい、異種遺伝子発現にとって理想的に適している。複製欠損ウイルスを調製する技術は当技術分野で周知である。ウイルス送達系を用いる場合、それがベクター構築物を受け入れる細胞、動物または個体において望ましくない反応を引き起こさないように、欠損干渉ウイルス粒子またはエンドトキシンおよび他の発熱物質のような望ましくない混入物を本質的に含まないようにするために十分にビリオンを精製することが望ましいであろう。ベクターを精製する好ましい手段は、塩化セシウム勾配遠心分離のような浮遊密度勾配を用いることを含む。遺伝子ベクターとして用いられるDNAウイルスは、パポバウイルス例えば、シミアンウイルス40、ウシ乳頭腫ウイルス、およびポリオーマRidgeway、1988;BaichwalおよびSugden、1986およびアデノウイルスRidgeway、1988;BaichwalおよびSugden、1986が含まれる。インビボ送達のための好ましい方法の一つは、アデノウイルス発現ベクターを用いることを含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムDNAに対する組み込み能が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって得られる遺伝子移入効率が高いことによって相殺される。アデノウイルス発現ベクターとは、a構築物のパッケージングを支持するため、およびbその中にクローニングされているアンチセンスまたはセンスポリヌクレオチドを発現するために十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味するがこれらに限定されない。発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作型を含む。アデノウイルスの遺伝子構築が、36kbの直線状の二本鎖DNAウイルスであることを理解すれば、アデノウイルスDNAの大きい断片を7kbまでの外来配列に置換することが可能であるGrunhausおよびHorwitz、1992。レトロウイルス感染症とは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染症は、アデノウイルスDNAがエピソームにおいて複製できることから、染色体組み込みが起こらず、可能性がある遺伝子毒性を示さない。同様に、アデノウイルスは構造的に安定であり、十分に増幅させた後もゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、その細胞周期段階によらず、実質的に全ての上皮細胞に感染することができる。これまで、アデノウイルス感染症は、ヒトにおける急性呼吸器疾患のようにごく軽度の疾患に関係しているように思われる。アデノウイルスは、そのゲノムの大きさが中等度であること、操作が容易であること、高力価、広い細胞範囲、および高い感染性のために、遺伝子移入ベクターとして用いるために特に適している。ウイルスゲノムの両端は100塩基対~200塩基対の逆方向反復配列ITRを含み、これはウイルスDNA複製およびパッケージングにとって必要なシス要素である。ゲノムの初期Eおよび後期L領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される異なる転写単位を含む。E1領域E1AおよびE1Bは、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。E2領域E2AおよびE2Bの発現によって、ウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成が起こる。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞の遮断Renan、1990に関係している。ウイルスカプシドタンパク質の大多数を含む後期遺伝子の産物は、主要な後期プロモーターMLPによって生じた単一の主転写物の有意なプロセシングの後に限って発現される。MLP168muに存在は、感染の後期段階において特に効率的であり、このプロモーターに由来する全てのmRNAは、53連tripartiteリーダーTPL配列を有し、それによってそれらは翻訳にとって好ましいmRNAとなる。現在用いられている系において、組み換え型アデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの相同的組み換えによって生じる。二つのプロウイルスベクターのあいだの可能性がある組み換えにより、野生型アデノウイルスがこのプロセスから生じる可能性がある。したがって、個々のプラークからウイルスの単一のクローンを単離して、そのゲノム構造を調べることが重要である。複製欠損であるアデノウイルスベクターの作製および増殖は、Ad5DNA断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、E1タンパク質を構成的に発現する293と呼ばれる独自のヘルパー細胞株に依存するGrahamら、1977。E3領域は、アデノウイルスゲノムにとって重要ではないためJonesおよびShenk、1978、現在のアデノウイルスベクターは、293細胞の助けを借りて、E1、E3、または双方の領域のいずれかに外来DNAを有するGrahamおよびPrevecら、1991。本質的に、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約105をパッケージングすることができGhoshChoudhuryら、1987、約2kbの余分のDNAの容量を提供する。E1領域およびE3領域において置換可能な約55kbのDNAと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は75kb以下、またはベクターの全長の約15である。アデノウイルスウイルスゲノムの80以上がベクター骨格に残っており、ベクター媒介細胞毒性の原因となる。同様に、E1欠失ウイルスの複製欠損も不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現の漏出は、現在利用可能なベクターについて高い感染多重度MOIで認められるMulligan、1993。ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉細胞または上皮細胞のようなヒト細胞に由来してもよい。または、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスにとって許容される他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。そのような細胞には、例えば、Vero細胞、または他のサル胎児間葉もしくは上皮細胞が含まれる。考察したように、好ましいヘルパー細胞株は293である。レイチャーRacherら1995は、293細胞を培養して、アデノウイルスを増殖させる改善された方法を開示した。一つの形式において、個々の細胞を培地100ml~200mlを含む1Lのシリコン処理スピナーフラスコTechne、Cambridge、UKに接種して天然の細胞凝集体を増殖させる。40rpmで攪拌した後、細胞生存率をトリパンブルーによって推定する。もう一つの形式において、フィブラセル微小担体5glBibbySterlin、Stone、UKを以下のように用いる。培地5mlに再懸濁させた細胞接種物を250mlアーレンマイヤーフラスコ中の担体50mlに加えて、時折攪拌しながら1時間~4時間静置した。次に、培地を新鮮な培地50mlに交換して振とうを開始する。ウイルスを産生するために、細胞を約80コンフルエントまで増殖させて、その後培地を交換して最終容積の25、アデノウイルスをMOI005で加える。培養物を一晩静置して、その後容積を100まで増加させて、振とうをさらに72時間行う。アデノウイルスベクターが複製欠損である、または少なくとも条件的に欠損であるという要件以外に、アデノウイルスベクターの特性は、本発明の実施の成功にとって重要ではないと考えられる。アデノウイルスは、既知の異なる血清型42個またはサブグループA~Fのいずれかであってもよい。サブグループCのアデノウイルス5型は、本発明において用いられる条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始材料である。これは、5型アデノウイルスが、それに関する膨大な生化学および遺伝子情報が既知であるヒトアデノウイルスであるためであり、このためこのアデノウイルスは、歴史的にアデノウイルスをベクターとして用いるほとんどの構築物について用いられている。本発明を実践するために適用可能な典型的なベクターは、複製欠損であり、アデノウイルスE1領域を有さないであろう。このように、E1コード配列が除去されている位置で遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は重要ではない。関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドも同様に、カールソンKarlssonら、1986によって記載されるようにE3置換ベクターにおいて欠失されたE3領域の代わりに、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがE4欠損を補う場合にはE4領域の代わりに挿入してもよい。アデノウイルスは、増殖および操作が容易で、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高い力価、例えば、109~1011プラーク形成単位mlで得ることができ、それらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は宿主細胞ゲノムに組み入れられる必要はない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソームであり、したがって、宿主細胞に対する遺伝子毒性は低い。野生型アデノウイルスをワクチン接種した研究では副作用は報告されておらずCouch、1963;Topら、1971、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのその安全性および治療能を証明する。アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子発現Levreroら、1991;GomezFoixら、1992およびワクチン開発GrunhausおよびHorwitz、1992;GrahamおよびPrevec、1991に用いられている。動物試験から、組み換え型アデノウイルスが遺伝子治療に用いられ得ることが示唆されたStratfordPerricaudetおよびPerricaudet、1991;StratfordPerricaudetら、1990;Richら、1993。異なる組織に組み換え型アデノウイルスを投与する研究には、気管注入Rosenfeldら、1991;Rosenfeldら、1992、筋肉注射Ragotら、1993、末梢静脈注射HerzおよびGerard、1993、および脳への定位注射LeGalLaSalleら、1993が含まれる。他の遺伝子移入ベクターは、レトロウイルスから構築してもよい。レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞においてそのRNAを二本鎖DNAに変換できることを特徴とする一本鎖RNAウイルスの群であるCoffin、1990。次に、得られたDNAは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組み入れられ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組み込みによって、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする3つの遺伝子、gag、pol、およびenvを含む。gag遺伝子から上流に認められる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含む。二つの長末端反復LTR配列は、ウイルスゲノムの5および3末端に存在する。これらは、強いプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、同様に、宿主細胞ゲノムへの組み込みにとって必要であるCoffin、1990。レトロウイルスベクターを構築するために、関心対象のタンパク質をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを産生するために、gag、pol、およびenv遺伝子を含むが、LTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築するMannら、1983。レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と共にcDNAを含む組み換え型プラスミドをこの細胞株に導入する場合例えば、リン酸カルシウム沈殿によって、パッケージング配列によって、組み換え型プラスミドのRNA転写物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能となり、次に、これを培養培地に分泌するNicolasおよびRubenstein、1988;Temin、1986;Mannら、1983。次に、組み換え型レトロウイルスを含む培地を回収して、任意に濃縮し、遺伝子移入のために用いる。レトロウイルスベクターは広く多様な細胞型に感染することができる。しかし、組み込みおよび安定な発現には宿主細胞の分裂を必要とするPaskindら、1975。レトロウイルスベクターを用いることには特定の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノムにおけるランダムな部位に組み入れられる。このため、宿主遺伝子の中断によって、または隣接遺伝子の機能を妨害することができるウイルス調節配列の挿入によって挿入変異誘発が起こりうるVarmusら、1981。欠損レトロウイルスベクターを用いる場合のもう一つの懸念は、パッケージング細胞において野生型複製コンピテントウイルスが出現する可能性である。これは、gag、pol、env配列から上流の組み換え型ウイルス挿入物からの無傷の配列が宿主細胞ゲノムに組み入れられる組み換え事象が原因である可能性がある。しかし、今では新しいパッケージング細胞株を利用することができ、それらは組み換えの可能性を大きく減少させるはずであるMarkowitzら、1988;Hersdorfferら、1990。他のウイルスベクターを発現構築物として用いてもよい。ワクシニアウイルスRidgeway、1988;BaichwalおよびSugden、1986;Couparら、1988、アデノ随伴ウイルスAAVRidgeway、1988;BaichwalおよびSugden、1986;HermonatおよびMuzycska、1984、およびヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターを用いてもよい。それらは様々な哺乳動物細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を提供するFriedmann、1989;Ridgeway、1988;BaichwalおよびSugden、1986;Couparら、1988;Horwichら、1990。発現構築物を培養哺乳動物細胞に移入するためのいくつかの非ウイルス法もまた、本発明によって考慮される。これらには、リン酸カルシウム沈殿GrahamおよびVanDerEb、1973;ChenおよびOkayama、1987;Rippeら、1990、DEAEデキストランGopal、1985、エレクトロポレーションTurKaspaら、1986;Potterら、1984、直接マイクロインジェクション、DNA負荷リポソーム、およびリポフェクタミンDNA複合体、細胞の超音波処理、高速微小弾丸を用いた遺伝子衝突、および受容体媒介トランスフェクションWuおよびWu、1987;WuおよびWu、1988が含まれる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエクスビボでの使用に首尾よく適合させてもよい。本発明のさらなる態様において、発現構築物はリポソームに封入してもよい。リポソームはリン脂質二重膜と内側の水性媒体とを特徴とする小胞構造である。多層リポソームは水性媒体で分かれた多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると自然に形成する。脂質成分は閉鎖構造を形成する前に自己再配列を受けて、脂質二重層の間に水と溶存溶質とを捕獲する。同様に、リポフェクタミンDNA複合体も考慮される。リポソーム媒介核酸送達および外来DNAのインビトロでの発現は非常に成功している。ウォンWongら、1980は、培養ニワトリ胚、HeLa、および肝腫細胞において外来DNAのリポソーム媒介送達および発現の実現可能性を証明した。ニコラウNicolauら、1987は、静脈内注射後のラットにおいてリポソーム媒介遺伝子移入に成功した。tk細胞、hgprt細胞、またはapart細胞においてそれぞれ、HSVチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むがこれらに限定されない多くの選択系を用いてもよい。同様に、抗代謝物抵抗性を、メソトレキセートに対する抵抗性を付与するdhfr、ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するgpt、アミノグリコシドG418に対する抵抗性を付与するneo、およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するhygroを選択するための基礎として用いることができる。薬学的組成物臨床応用を考慮する場合、薬学的組成物発現ベクター、ウイルス保存液、タンパク質、抗体、および薬物を意図する適用にとって適当な形で調製する必要があるかもしれない。一般的に、これは、ヒトまたは動物に対して有害となりうる不純物を本質的に含まない組成物を調製することを含むであろう。一般的に、送達ベクターを安定にして、標的細胞によって取り込まれることができるように、適当な塩および緩衝液を用いることが望まれるであろう。組み換え型細胞を患者に導入する場合には緩衝液も同様に用いる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性培地に溶解または分散させたタンパク質またはペプチドの有効量を含む。そのような組成物も同様に、接種物と呼ばれる。薬学的または薬理学的に許容されるという用語は、動物またはヒトに投与した場合に有害、アレルギー、またはその他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体および組成物を意味する。本明細書において用いられるように、薬学的に許容される担体には、任意のおよび全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。そのような培地および物質を薬学的活性物質のために用いることは当技術分野で周知である。従来の培地または物質が本発明のタンパク質またはペプチドと不適合である場合を除き、治療的組成物において用いることが考慮される。補助活性成分も同様に組成物に組み入れることができる。本発明の活性組成物には、古典的な薬学的調製物が含まれてもよい。本発明によるこれらの組成物は、標的組織がその経路によって利用可能である限り、任意の一般的な経路によって投与される。これには、経口、鼻腔内、口腔内、直腸内、膣内、または局所投与が含まれる。または、投与は、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、または静脈内注射であってもよい。そのような組成物は通常、上記の薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。注射によって用いるために適した薬学的剤形は、滅菌水溶液または分散液、および注射可能滅菌溶液または分散液の即時調合製剤のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、製剤は滅菌でなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等、その適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散培地となりうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において用いることによって得ることができる。注射可能滅菌溶液は、必要な量の活性化合物を、先に列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒において組み入れて、必要であれば濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、様々な滅菌活性成分を滅菌媒体に組み入れることによって調製される。注射可能滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および先に濾過滅菌したその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。治療剤特定の態様において、化学療法剤を、腫瘍に選択的に送達するためのターゲティングペプチドまたは融合タンパク質に結合してもよい。用いるために適した物質または因子には、細胞に適用した場合にDNA損傷を誘導する任意の化学化合物が含まれてもよい。化学療法剤には、5フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチンCDDP、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合物質、エトポシドVP16、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミドDTICの水溶性型、トランスプラチナ、ビンブラスチンおよびメソトレキセート、ビンクリスチン、または上記の任意の類似体もしくは誘導体変種が含まれるがこれらに限定されない。ほとんどの化学療法剤は以下の分類に入る:アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質、コルチコステロイドホルモン、有糸分裂阻害剤、およびニトロソウレア、ホルモン物質、雑多な物質、およびその任意の類似体または誘導体変種。化学療法剤および投与方法、用量等は、当業者に周知であり例えば、関連部分が参照として本明細書に組み入れられる、医師用添付文書集、GoodmanおよびGilmanの治療の薬理学的基礎ThePharmacologicalBasisofTherapeutics、およびレミントンの薬化学RemingtonsPharmaceuticalSciences、を参照のこと、本明細書に開示に照らして本発明と組み合わせてもよい。用量の何らかの変更は、治療すべき被験者の状態に応じて必要に応じて起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者に関して適当な用量を決定するであろう。特定の化学療法剤および用量レジメの例も同様に本明細書に記載する。当然、これらの用量および物質および投与レジメは全て、制限するためではなく一例であって、特定の患者または適用に関して当業者は他の用量または物質を用いてもよい。これらの点のあいだの任意の用量、またはそこから誘導されうる範囲も同様に、本発明において用いられると予想される。アルキル化剤アルキル化剤は、ゲノムDNAと直接相互作用して癌細胞の増殖を防止する薬物である。この範疇の化学療法剤は、細胞周期の全ての期に影響を及ぼす、すなわちそれらは期特異的ではない物質を表す。アルキル化剤には、ニトロジェンマスタード、エチレニメン、メチルメラミン、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、またはトリアジンが含まれてもよいがこれらに限定されない。それらには、ブスルファン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミドシトキサン、ダカルバジン、イフォスファミド、メクロレタミンマスタージェン、およびメルファランが含まれるがこれらに限定されない。抗代謝剤抗代謝剤はDNAおよびRNA合成を破壊する。アルキル化剤とは異なり、それらは細胞周期のS期に特異的に影響を及ぼす。抗代謝剤は、葉酸類似体、ピリミジン類似体およびプリン類似体ならびに関連阻害化合物のような様々な範疇に分類することができる。抗代謝剤には、5フルオロウラシル5FU、シタラビンAraC、フルダラビン、ゲミシタビンおよびメソトレキセートが含まれるがこれらに限定されない。天然物天然物は一般的に、最初に天然資源から単離された化合物を意味する。そのような化合物、その類似体および誘導体は天然起源から単離してもよく、当業者に既知の任意の技術によって化学合成または組み換えによって産生してもよい。天然物には、分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、酵素および生物反応修飾剤のような分類が含まれる。有糸分裂阻害剤には、細胞分裂または有糸分裂に必要ないずれかのタンパク質合成を阻害することができる植物アルカロイドおよび他の天然物が含まれる。それらは、細胞周期の特定の期において作用する。有糸分裂阻害剤には、例えば、ドセタキセル、エトポシドVP16、テニポシド、パクリタキセル、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれる。タキソイドは、トネリコashの木であるタクサスブレビフォリアTaxusbrevifoliaの樹皮から単離された関連化合物の一種である。タキソイドにはドセタキセルおよびパクリタキセルのような化合物が含まれるがこれらに限定されない。パクリタキセルはチューブリンに結合してビンカアルカロイドによって用いられるものとは異なる部位で、微小管の集合を促進する。ビンカアルカロイドは、薬学的活性を有すると同定された植物アルカロイドのタイプである。それらには、ビンブラスチンVLBおよびビンクリスチンのような化合物が含まれる。抗腫瘍抗生物質抗腫瘍抗生物質は、抗菌および細胞毒性活性の双方を有する。これらの薬物はまた、酵素および有糸分裂を化学的に阻害することによって、または細胞膜を変化させることによって、DNAを妨害する。これらの物質は、それらが細胞周期の全ての期において作用するため細胞周期特異的ではない。抗腫瘍抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシンアドリアマイシン、プリカマイシンミスラマイシン、およびイダルビシンが含まれるがこれらに限定されない。ホルモンコルチコステロイドホルモンは、それらが癌細胞を殺すまたは増殖を遅らせる場合に、化学療法薬と見なされる。コルチコステロイドホルモンは、他の化学療法剤の有効性を増加させるため、併用治療において用いられることが多い。プレドニゾンおよびデキサメタゾンは、コルチコステロイドホルモンの例である。カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロールのようなプロゲスチンは、子宮内膜および乳房の癌において用いられてきた。ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールのようなエストロゲンは、乳房および前立腺のような癌に用いられている。タモキシフェンのような抗エストロゲン剤は、乳癌のような癌に用いられてきた。プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンのようなアンドロゲンも同様に、乳癌の治療に用いられてきた。フルタミドのような抗アンドロゲンは、前立腺癌の治療に用いられている。リュープロリドのようなゴナドトロピン放出ホルモン類似体は、前立腺癌の治療に用いられている。雑多な物質いくつかの化学療法剤は、その活性に基づくこれまでの範疇に入らない。それらには、白金配位複合体、アントラセンジオン、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アムサクリン、Lアスパラギナーゼ、およびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。それらは、本発明の組成物および方法において用いてもよいと考慮される。白金配位複合体には、カルボプラチンおよびシスプラチンシスDDPのような化合物が含まれる。ミトキサントロンのようなアントラセンジオンは、急性顆粒球白血病および乳癌の治療に用いられている。ヒドロキシウレアのような置換ウレアは、慢性顆粒球白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、および悪性黒色腫を治療するために用いられている。プロカルバジンNメチルヒドラジン、MIHのようなメチルヒドラジン誘導体は、ホジキン病の治療に用いられている。ミトタンのような副腎皮質抑制剤は、副腎皮質癌を治療するために用いられており、アミノグルテチミドは、ホジキン病を治療するために用いられている。プログラムされた細胞死の調節物質アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、正常な胚発生の際に、成人組織において恒常性を維持し、および発癌を抑制するための本質的なプロセスであるKerrら、1972。Bcl2タンパク質ファミリーおよびICE様プロテアーゼが、他の系においてアポトーシスの重要な調節物質およびエフェクターであることが証明されている。濾胞性リンパ腫に関連して発見されたBcl2タンパク質は、アポトーシスの制御および多様なアポトーシス刺激に反応した細胞の生存を増強するために顕著な役割を果たしているBakhshiら、1985;ClearyおよびSklar、1985;Clearyら、1986;Tsujimotoら、1985;TsujimotoおよびCroce、1986。進化的に保存されたBcl2タンパク質は今では、関連タンパク質ファミリーのメンバーであると認識され、これらは死のアゴニストまたは死のアンタゴニストとして分類することができる。その発見後、Bcl2は、様々な刺激によって誘発された細胞死を抑制するように作用することが示された。同様に、共通の構造および配列相同性を有するBcl2細胞死調節タンパク質のファミリーが存在することが今では明らかである。これらの異なるファミリーメンバーは、Bcl2と類似の機能BclXL、Bclw、Bcls、Mcl1、A1、Bfl1を有するか、またはBcl2機能を相殺して細胞死を促進するか例えば、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiriのいずれかであることが示されている。本発明の範囲内で考慮されるアポトーシス促進剤の非限定的な例には、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、2配列番号:1、2配列番号:2、2配列番号:3、または3配列番号:4が含まれる。血管新生阻害剤特定の態様において、本発明は、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン12、血小板因子4、IP10、Groβ、トロンボスポンジン、2メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキサミドトリアゾール、CM101、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン2レジェネロン、インターフェロンα、ハービマイシンA、PNU145156E、16Kプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、TNP470、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、AGM1470、血小板因子4、またはミノサイクリンのような抗血管新生剤に結合したターゲティングペプチドを投与することに関してもよい。用量当業者は、レミントンの薬科学RemingtonsPharmaceuticalSciences、第15版、第33章、特に624頁~652頁に従う。治療すべき被験者の状態に応じて用量の何らかの変更が必然的に起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者にとって適当な用量を決定するであろう。その上、ヒトでの投与に関して、調製物は、FDAの生物医薬品標準局によって必要とされる滅菌性、発熱性、および全身的安全性および純度標準を満たさなければならない。以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含められる。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実践において十分に機能するように本発明者らによって発見された技術を表し、このように、その実践のために好ましい様式を構成すると見なされうると、当業者によって認識されなければならない。しかし、当業者は、開示の特定の態様に多くの変更を行うことができ、それらも本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなおも得ることができることを、本開示に照らして認識すべきである。実施例1骨髄ターゲティングペプチドターゲティングペプチドに関して特に関心対象となる臓器の非限定的な例は骨髄である。骨は、前立腺癌を有する患者の大多数において転移の好ましい部位であるFidler、1999。この顕著な選択性は、癌の進行にとって必須である部位特異的相互作用の例として見なされているRak、1995;Zetter、1998。臨床での関連性にもかかわらず、骨に広がった前立腺癌を制御する機構に関してはほとんどわかっていない。さらに、転移性前立腺癌の治療のために治療剤をターゲティングするための有効な戦略はなかったBrodtら、1996。体循環を通して骨髄に選択的に回帰することができるペプチドのサブセットは、骨転移形成の際に前立腺癌細胞の挙動を刺激する可能性がある。ファージディスプレイを用いることによってターゲティングされる血管マーカーも同様に、腫瘍細胞が転移するために利用される可能性がある。この考え方は既に、肺回帰ペプチドに関して当てはまることが証明されている。肺の血管に回帰するペプチドは、実験的転移を阻害する。これらの結果は、部位特異的転移の根本となっているのは、転移が選択的に起こる特定の組織の血管に回帰受容体が存在することであるという改変された種子と土壌モデルに適合する。そのような選択的血管マーカーを、転移カスケードの第一段階である接着の際に腫瘍細胞に曝露する。骨髄回帰ペプチドの単離は、転移プロセスの際に前立腺癌細胞回帰を媒介するそれらの血管マーカーを同定するために、および骨転移を阻止するために可能性がある治療的介入にとって、または骨に既に転移した癌を選択的に造影するおよびまたは治療するために有用である。方法マウスにおいて骨髄と結合するペプチドを単離するために、ファージライブラリのインビボスクリーニングを使用した。骨髄ターゲティングペプチドを、前立腺癌マウスモデルにおいて転移を阻害する能力に関して特徴決定した。骨髄結合ペプチドの受容体を同定するために、アフィニティクロマトグラフィ及び分子クローニングを使用した。ここに開示される組成物及び方法は、骨転移の予防及び治療に焦点を当てた、新たな抗前立腺癌治療戦略を開発するために有用であった。マウスにおける骨髄へと回帰するペプチドを単離するためのインビボスクリーニングファージライブラリを静脈注射した。後述の改良を施したSmithおよびScott1985のプロトコルに従い、ライブラリを調製した。これらのライブラリに含まれるファージは、5残基~11残基の範囲の挿入物を表示していた。ガラスチューブ内の1mlDMEMPIへと移すことによりファージレスキューのため組織試料を処理し、グラインダーでホモジナイズした。骨髄は、ホモジナイゼーションを必要としないが、対照として使用された他の臓器は、効率的にホモジナイズされうる前に切り刻む必要があった。試料を、オートクレーブ処理された2mlエッペンドルフチューブへと移した。組織を、1BSAを含む氷冷DMEMPIで洗浄した。3回の洗浄後、ペレットを再懸濁させ、37°Cにした後、細胞を添加した。ファージ粒子を回収するため、洗浄された組織試料の、15mlのコンピテントK91kan細菌1:10希釈率でOD60002との、室温における1時間のインキュベーションを使用した。複数のアリコートを、40μgmlのテトラサイクリン及び100μgmlのカナマイシンを含むLBtetkanプレート又はシャーレに播いた。播種は、広範囲の試料をカバーするいくつかの濃度、即ち、3ml、1ml、300μl、100μl、30μlで実施した。播種に使用されたビーズを、ビーズ表面に捕捉された可能性があるファージ感染細菌クローンを全て回収するため、2個の次の10cmLBtetkanプレートへと継代した。シャーレを37°Cで一晩インキュベートした。残りの2~3mlの感染培養物ホモジナイズされた組織を含むを、40μgmlのテトラサイクリン及び100μgmlのカナマイシンを含む10mlのLB培地LBtetkanへと移し、37°Cの振とう器内に2時間置いた。12mlの培養物を、1リットルのLBtetkanへと拡張し、37°Cの振とう器内で一晩増殖させた。12時間~16時間後、標準的なプロトコルに従い、バルク増幅された細菌培養物からファージをレスキューし、2回目の選択のため取り分けた。インキュベーター内のプレートシャーレから、骨髄由来の十分分離したコロニーを配列決定した。配列決定のため、1ウェル当たり20μlのPBSを含む96ウェルプレートへ、コロニーを移した。抗M13抗体を用いた免疫組織化学的染色を、様々な組織におけるファージターゲティングを調査するために使用したPasqualiniおよびRuoslahti、1996;Arapら、1998。ファージをIV注射し、5分間又は24時間、循環させた。5分間の実験においては、循環系から未結合のファージを除去するため、ファージ注射の後、マウスにDMEMを灌流させた。24時間後には、循環ファージはほとんど存在しなかったArapら、1998a、1998b。動物を屠殺し、組織を収集し、ブワンBouin溶液で固定し、切片化し、ファージに対する抗体で染色した。結果マウスにおけるインビボのマウス骨髄ターゲティングファージライブラリをマウスへと静脈注射し、骨髄よりファージを回収することにより、骨髄ターゲティング配列モチーフが同定された。ファージは、静脈注射され、骨髄より回収され、十分な濃縮が得られるまで反復的にインビトロで増幅され、再注射された。3回の選択の後、マウス骨髄へと回帰するファージ調製物が得られた。個々のファージは、静脈注射の後、プールされたファージと類似した臓器特異性を示した。いくつかのペプチドモチーフが同定され、特徴決定された。インビボで特異性を示す最も有望なモチーフを、表3に示す。表3インビボでマウス骨髄をターゲティングするファージ内の配列当業者であれば、ここで同定された骨髄ターゲティングペプチド配列が、治療剤の標的化送達又は遺伝子治療、正常な又は罹患した臓器、組織、又は細胞型のインビボ画像化、臓器、組織、又は細胞型における受容体及び受容体リガンドの同定、並びに多数のヒト疾患、特に転移性前立腺癌の治療的処置を非限定的に含む、本発明の範囲内の多数の用途に有用であろうことを理解するであろう。実施例2前立腺及び前立腺癌に対するターゲティングペプチドターゲティングのための特に重要な非限定的なもう一つの臓器は、前立腺である。前立腺は、成体期の間中、増殖を継続するため、通常とは異なる臓器である。結果として、良性前立腺肥大BPHは、大部分の高齢の男性に、ある程度の影響を与えている。さらに重大なことに、前立腺は悪性腫瘍の好発部位である。11人に1人の男性が、一生のうちに前立腺癌を発症するとされる。前立腺癌の血清マーカーが利用可能となったため、現在では、これらの悪性腫瘍の多くは、疾患の経過の初期に検出された。臨床的に進行するであろう者を予測するための信頼性の高い手段が存在しないため、多くは、失禁及び性交不能のような壊滅的な副作用を伴うことが多い、手術又は放射線療法により侵襲的に治療されたLaneおよびShah、1999;Mikolajczykら、2000。ヒト前立腺癌の検出、診断、及び治療のための改良された方法が、明らかに必要とされている。前立腺の多くの関心対象の遺伝子が、前立腺血管系のような限定されたしかし、おそらくは高度に特異的又は到達可能な細胞位置に発現する可能性がある。従って、微小解剖学的又は生理学的な環境に固有の分子の不均一性を考慮に入れないハイスループット配列決定法又は遺伝子アレイ法では、介入のための可能性のある標的が容易に見落とされる可能性がある。本発明の方法は、インビボで特異的な標的部位へと回帰するペプチドの同定を可能にするPasqualiniら、1996、1997、Koivunenら、1999;Pasqualini、1999。ファージペプチドライブラリのインビボ選択は、循環系を介して標的組織の特異的受容体へと回帰することができるペプチドを与える。これらの研究は、様々な正常組織における驚くべき程の特殊化を明らかにしたPasqualini、1999;Rajotteら、1998、1999。本発明は、前立腺癌ターゲティングペプチドの組成物及び使用法に関する。方法前立腺のインビボファージターゲティングファージディスプレイライブラリを静脈注射した。試料は、常に、氷上に維持した。前立腺組織試料を、以下のようにして処理した。第一の試料は、バックアップとして80°Cで保存した。第二の試料は、組織学病理学、及びHE又は抗M13ファージ免疫染色のため処理した。第三の試料は、同じ重量の断片を3個得るため、清潔な条件下で分割した。第三の前立腺試料に由来する3通りの試料を、宿主細菌感染及びファージ回収のため処理した。前立腺試料をガラス組織グラインダー内の1mlのDMEMプロテアーゼ阻害剤PIへと移し、ホモジナイズし、細胞懸濁物をオートクレーブ処理された2mlエッペンドルフチューブへと移した。次に、前立腺組織試料を、1BSAを含む氷冷DMEMPIで3回洗浄した。各洗浄後に、組織をDMEMPIと混合し、30秒間ボルテックス処理した。4000rpmで3分間スピンした後、上清を注意深く廃棄した組織ペレットには触れないようにした。次に、15mlのDMEMPIBSAを添加した。3回目の洗浄の後、ペレットを再懸濁させるため短時間ボルテックス処理し、溶解したペレットを、短時間37°Cに加温した後、宿主細菌を添加した。次いで、混合物を15mlのコンピテントK91kan細菌OD600=2と共に室温で1時間インキュベートした。混合物を、10mlのLB培地02μgmlテトラサイクリンを含むファルコンFalconチューブへ、RTで20分間、移した。複数のアリコートを、40μgmlのテトラサイクリン及び100μgmlのカナマイシンを含むLBtetkanプレート又はシャーレに播いた。最後に、シャーレを37°Cでインキュベートし、一晩のインキュベーションの後、ファージ形質導入単位数を決定した。前立腺癌ターゲティング腫瘍血管は、漏出性であることが知られている。マウス被験者のファージディスプレイライブラリへの比較的長期間の曝露は、ファージの遊走及び前立腺癌細胞マーカーとの結合をもたらしうる。癌細胞マーカーをターゲティングするため、マウスを、ファージライブラリと共に24時間インキュベートした。雄ヌードマウス4匹に、106個のDU145細胞を含むPBSを注射した。腫瘍増殖の後、マウスにいずれかのCX10Cファージディスプレイライブラリを注射した。ライブラリを24時間循環させた後、マウスを屠殺し、組織試料を収集した。試料をダウンスDounceホモジナイザーでホモジナイズし、ファージを回収するためK91細菌を添加した。一連の希釈度で、細菌を3通り、kantetLBプレートに播いた。細菌を含む残りの腫瘍ホモジネートを、10mlのLBtetkanと共にRTで1時間インキュベートした。大量のファージストックを得るため、さらに10mlのLKtetkanを添加し、37°Cで振とう器内でインキュベートした。2回目のスクリーニングのための、混和されたストックを作成するため、216個のコロニーをプレートから選出した。クローンを増幅した後、それらをプールし、ファージをPEGNaClで沈殿させた。1回目から回収されたプールされたファージを使用して、前立腺腫瘍を保持するヌードマウスを、前記と同様の2回目の選択に供した。3回目のスクリーニングを、前記と同様にして実施した。結果正常マウス前立腺上に開示された方法により得られたマウス前立腺ターゲティングペプチドモチーフを、表4に示す。表4インビボファージディスプレイにより得られたマウス前立腺ターゲティングペプチド前立腺癌3回目のインビボスクリーニングにより、対照正常腎組織と比較して高い腫瘍局在の選択性を示したファージが得られた示していない。ファージ挿入物をDNA配列決定することにより同定された前立腺癌ターゲティング配列を、表5に挙げる。表5前立腺癌ターゲティングペプチド当業者であれば、ここで同定された前立腺ターゲティングペプチド配列が、治療剤の標的化送達又は遺伝子治療、正常な又は罹患した臓器、組織、又は細胞型のインビボ画像化、臓器、組織、又は細胞型における受容体及び受容体リガンドの同定、並びに多数のヒト疾患、特に前立腺癌の治療的処置を非限定的に含む、本発明の範囲内の多数の用途に有用であろうことを理解するであろう。実施例3マウスの胎盤、脂肪、卵巣、及び尿管に対するターゲティングペプチドの同定胎盤回帰ペプチドの同定マウス胎盤へと回帰するペプチドを、ファージディスプレイライブラリを使用したポストクリアリングpostclearingプロトコルにより同定した。1回目のバイオパニングを、妊娠マウスにおいて実施した。胎盤の試料を摘出し、一つの修飾を含む前記の標準的なプロトコルに従いファージをレスキューした。典型的なバイオパニングプロトコルにおいては、単一の臓器、組織、又は細胞型から数千個のファージが回収されうる。典型的には、播種されたファージから200個~300個の独立のコロニーを選択し、これらを増幅し、プールして、2回目又は3回目のバイオパニングのためのファージディスプレイライブラリを形成させた。本実施例においては、1回目のバイオパニングからレスキューされたファージ全てを固体培地上でバルク増幅し、次いで2回目のバイオパニングのためのファージディスプレイライブラリを形成させるため、プールした。即ち、1回目のバイオパニングからレスキューされたファージの制限が存在しなかった。この制限なしのインビボバイオパニングを3回1回目~3回目実施し、次いでポストクリアリング法を使用した。ポストクリアリングプロトコル4回目においては、ファージを非妊娠マウスに投与した。胎盤以外の組織と結合したファージを、循環系から吸収した。残りのファージを非妊娠マウスの胎盤から回収した。このプロトコルは、胎盤と結合し、他のマウスの臓器、組織、又は細胞型とは結合しないファージを単離するために設計された。以下の胎盤ターゲティングペプチドが、それらの頻度と共に同定された。GenBankデータベースの検索は、以下に挙げた配列番号のうち、既知のペプチド配列と100相同なものは存在しないことを開示した。示されている通り、ポストクリアリング法の使用は、胎盤ターゲティングペプチドを保持するファージの実質的な濃縮をもたらした。この手法は胎盤に関して使用されたが、当業者であれば、その臓器、組織、又は細胞型を欠いている被験者へとファージライブラリが投与されうる場合には、任意の臓器、組織、又は細胞型に関してポストクリアランスが実施されうることを理解するであろう。例えば、前立腺又は精巣に対するターゲティングペプチドのためのポストクリアリング法は、雌被験者において実施されうるし、卵巣、膣、又は子宮に関しては、雄被験者において実施されうる。相同性検索によって、TCRγ1TPKTSVT、配列番号:39、テネイシンRMDGPVR、配列番号:40及びRAPGGVR、配列番号:41、MHCクラスIILGLRSVG、配列番号:44、アンジオテンシンIYIRPFTL、配列番号:43、及びMHCH2Dqα鎖VGLHARA、配列番号:42を含むいくつかの候補タンパク質が、胎盤ターゲティングペプチドの内因性類似体として、同定された。胎盤回帰ペプチドの確認及び妊娠の阻害妊娠マウスへの注射及び胎盤からの回収により、胎盤回帰ペプチドの確認をインビボで行った。図1は、選択された胎盤回帰ファージに関する確認研究の結果を示している。ファージクローンは、PATPKTSVT配列番号:39、PCRAPGGVR配列番号:41、PELGLRSVG配列番号:44、PFYIRPFTL配列番号:43として同定される。PAクローンが、対照fdtetファージで観察されたよりも1桁超大きい胎盤回帰を示したことが、示されている。PCクローンも、有意に高い胎盤局在を示したが、PEクローン及びPFクローンは、対照ファージと比較して、胎盤において実質的には濃縮されなかった。胎盤組織におけるPFクローンの明らかな濃縮の欠如にも関わらず、PAペプチド及びPFペプチドは、いずれも、抗胎盤活性を示した。表6は、妊娠マウスへ注射された、FITCフルオレセインイソチオシアネート、GSTグルタチオンSトランスフェラーゼ、又はファージに結合した胎盤ターゲティングペプチドPA及びPFの効果を示している。比較的低い用量計450μgにおいて、FITCと接合したPA及びPFは、妊娠に対するわずかな効果を示した表6。比較的高い用量800μg~1000μgタンパク質又は45×1010ファージにおいては、タンパク質と接合したペプチドPA及びPFも、ファージと接合したペプチドPA及びPFも、胎児発達を実質的に妨害し表6、大部分の場合に、明らかに胎児の死をもたらした。CARACペプチド配列番号:46、脂肪ターゲティングペプチドFE、TREVHRS、配列番号:47、又はfdtetファージを、非胎盤ターゲティング対照として使用した。表6胎盤ターゲティングペプチドの胎児発達に対する効果これらの結果により、上で同定された胎盤ターゲティングペプチド配列が確認される。さらに、ターゲティング配列を保持するファージの標的臓器への実質的な濃縮が欠如している場合例えば、ペプチドPF、図1ですら、ターゲティングペプチドが、治療剤の標的臓器への標的化送達を提供しうることを証明している。この研究において、PAペプチドが何倍も高レベルにファージを胎盤へと局在させたという観察にも関わらず、比較的低い用量では、PFペプチドの方が、妊娠を妨害する効果がPAペプチドより高いようであった。当業者であれば、開示された方法及びペプチドが、胎盤を介した治療剤の胎児への標的化送達、及び妊娠を終結させるための新規手法に有用であり得ることを理解するであろう。脂肪ターゲティングペプチド遺伝的に肥満のマウスZhangら、1994;Pelleymounterら、1995より、脂質ターゲティングペプチドを単離するため、正常マウスにおいて実施されたポストクリアリングを含む、類似のプロトコルを使用した。単離された脂質ターゲティングペプチドには、TRNTGNI配列番号:48、FDGQDRS配列番号:49、WGPKRL配列番号:50、WGESRL配列番号:51、VMGSVTG配列番号:52、KGGRAKD配列番号:53、RGEVLWS配列番号:54、TREVHRS配列番号:47、及びHGQGVRP配列番号:55が含まれる。相同性検索によって、幹細胞増殖因子を含むいくつかの候補タンパク質が、脂質ターゲティングペプチドの内因性類似体として同定された。脂肪ターゲティングペプチドの確認図2に示されるように、脂質回帰ペプチドの確認を、インビボ回帰により行った。選択された脂質回帰クローンは、FAKGGRAKD配列番号:53、FCRGEVLWS配列番号:54、FETREVHRS配列番号:47、及びFXVMGSVTG配列番号:52であった。図2に示されるように、これらのクローンは、全て、脂肪組織への回帰の上昇を示し、クローンFXは、対照fdtetファージよりも数桁高い脂肪局在を示した。クローンFXは、他の選択された脂質回帰クローンよりも実質的に高い局在を示した。しかしながら、上に開示された胎盤回帰ペプチドからの類推により、当業者であれば、比較的低レベルの脂肪組織局在を示す脂質回帰クローンであっても、治療剤の標的化送達に有用であり得ることを理解するであろう。当業者であれば、脂肪組織内の血管新生性血管系に選択的なターゲティングペプチドが、体重減少、又は体重増加の予防に有用であろうことを理解するであろう。抗血管新生性又は毒性の部分を脂肪ターゲティングペプチドに結合させることにより、新たな脂質組織へ栄養を供給する血管を選択的に阻害し、新たな脂質沈着物の成長を予防することが可能であり、既存の脂質沈着物を消滅させることも可能であるかもしれない。卵巣及び腹水に対するターゲティングペプチドさらに、以下に挙げられる、マウスの卵巣及び腹水に対するターゲティングペプチド配列が同定された。マウス卵巣ターゲティングペプチドには、GLAKLIP配列番号:56、HLISDMS配列番号:57、LQHWLLS配列番号:58、ALVLQG配列番号:59、TGVALQS配列番号:60、YVQSREG配列番号:61、PLFWPYS配列番号:62、DGSG配列番号:63、EGSG配列番号:64、SSPRPGV配列番号:65、DGYPAIA配列番号:66、GHAIE配列番号:67、及びIWSTSER配列番号:68が含まれる。マウス腹水に対するターゲティングペプチドには、YRLRG配列番号:69、YRARG配列番号:70、SQPLG配列番号:71、SQPWG配列番号:72、QRLVTP配列番号:73、QVLVTP配列番号:74、QRLVHP配列番号:75、QVLVHP配列番号:76、ITRWRYL配列番号:77、SLGGMSG配列番号:78、SQLAAG配列番号:79、SLLAAG配列番号:80、SQLVAG配列番号:81、SLLAAG配列番号:82、GLPSGLL配列番号:83、HGGSANP配列番号:84、SLEAFFL配列番号:85、CVPELGHEC配列番号:86、CELGFELGC配列番号:87、及びCFFLRDWFC配列番号:88が含まれる。子宮ターゲティングペプチド表7に開示される、C57B1マウスにおける尿道ターゲティングペプチドを同定するため、類似のプロトコルを使用した。表7尿道ターゲティングペプチド実施例4:BRASILによるα脾臓抗体ライブラリのインビボスクリーニング脾臓に対するターゲティングペプチドは、従来同定されていない。網膜内皮系の一部として、非特異的なファージの脾臓への局在の高いバックグラウンドのため、脾臓組織に対するバイオパニングは複雑である。BRASIL法によるバイオパニングにおいて観察される減少したバックグラウンドは、脾臓のような組織に対するターゲティングペプチドの同定にとって有利である。本実施例は、BRASIL法の例示的な態様を証明する。標識臓器マウス脾臓に対して得られた免疫グロブリンに基づくファージライブラリを開発し、次いでインビボバイオパニングに供した。免疫グロブリンライブラリを構築するため、マウス脾臓をニワトリに注射した。追加接種の後、ニワトリ脾臓を収集し、免疫グロブリン可変ドメイン配列を、ニワトリ脾臓mRNAのPCR商標増幅により得た。増幅された免疫グロブリン可変配列を、ファージディスプレイライブラリへと挿入しαライブラリ、次いで、それをマウス脾臓に対するインビボバイオパニングに使用した。従って、インビボでマウス脾臓へと局在したファージから得られた脾臓ターゲティングペプチドは、マウス脾臓抗原に応答してニワトリにおいて産生された抗体断片に由来していた。本実施例の成功は、さらに、BRASIL法の広範な利用可能性を示す。当業者であれば、本発明がここに開示された態様に限定されないこと、及びBRASIL方法論の多くのさらなる開発が本発明の範囲内に含まれることを理解するであろう。材料及び方法ライブラリ構築白色レグホンwhiteleghornニワトリを、還流10mlMEMされたBalbcマウスに由来する脾臓ホモジネート注射1回当たり約150mgで免疫した。初回免疫後4週目及び8週目に、脾臓ホモジネートの追加接種をニワトリに与えた。FACS分析によるマウス脾臓に対する免疫応答は、ニワトリ免疫血清が、マウス細胞系TRAMPC1に対する抗体を含むことを示した。初回免疫後12週目に、ニワトリを屠殺し、その脾臓をTRI試薬MolecularResearchCenterInc、Cincinatti、OHへと摘出した。TRI試薬の製造業者のプロトコルを使用して、ニワトリ脾臓から全RNAを調製した。オリゴdTプライマー及びスーパースクリプトSuperscript酵素LifeTechnologiesを使用して、全RNAからcDNAを調製した。ニワトリ脾臓免疫グロブリン可変領域をコードするcDNAを、標準的な技術に従い、CHybVHプライマー及びChybIgBプライマーVheavy、又はCSCVKプライマー及びCHHybLBプライマーVκにより増幅した。軽鎖の可変領域及び定常領域は、CSCFプライマー及びleadBプライマー、並びにVκ鋳型及びCκ鋳型を使用して、共にPCR商標増幅した。重鎖の可変領域及び定常領域は、dpseqプライマー及びleadFプライマー、並びにVheavy鋳型及びCheavy鋳型を使用して、共にPCR商標増幅した。重鎖断片及び軽鎖断片は、CSCFプライマー及びdpExプライマーを用いて、共にPCR商標増幅した。PCRプライマーは、コールドスプリングハーバーラボラトリー講座マニュアルコンビナトリアル抗体ライブラリのファージディスプレイPhageDisplayofCombinatorialAntibodyLibrariesBarbasら、2000この内容は、参照として本明細書に組み込まれるに挙げられているプライマー配列を使用して、ジェノシスGenosys又はゲンベースGenBaseより購入した。SfiIで消化した後、ファージライブラリへの挿入のため、増幅産物をSfiI消化pComb3xと連結させた。連結したpComb3123プラスミドをER2537大腸菌へとエレクトロポレーションし、その後のVCM13ヘルパーファージ感染によりファージ産生を開始させた。得られたライブラリサイズは、約5×106cfuであった。BRASILを使用したα脾臓ライブラリのインビボスクリーニングニワトリα脾臓ライブラリを使用して、マウスにおける4回のインビボスクリーニングを実施した。約08~20×1010TUをBalbcマウスに注射した。ライブラリを5分間循環させた。屠殺後、マウス脾臓を回収し、70μm細胞濾過ナイロンメッシュへと脾臓を通すことにより、単一細胞懸濁液を調製した。BRASIL技術を使用して、単一細胞懸濁液を油9:1ジブチルフタレート:シクロヘキサンで遠心分離し、対数増殖期のER2537大腸菌200μlにペレットを感染させた。マウス脾臓から回収された増幅されたファージを、次回のスクリーニングに使用した。BRASILの前に得られた脾臓片を使用した従来のバイオパニング法と比較して、脾臓及び脳へと回帰するファージの数に、スクリーニング中、明らかな濃縮は見られなかった。ニワトリFab挿入物の4回目のスクリーニングからのマウス脾臓に局在したファージを、PCR商標増幅し、PCR産物をBstIで消化した。分析された90個のクローンのうちの半分が、類似の制限パターンを与えた。そのうち、20個のクローンを配列決定したところ、同一の制限パターンを有するものはわずか2個であった。抗体に基づくファージクローンのうちの4個2番、6番、10番、及び12番を、結合アッセイ及び局在アッセイを使用したさらなる分析に供した。BRASILを使用したインビトロでのクローンの試験単一細胞懸濁液を、2個のマウス脾臓より調製した。懸濁液を5個のチューブに分割し、3×109TUのFabクローン2、6、10、12、及び2×109TUのtetファージと共に、氷上でインキュベートした。マウス脾細胞と結合したファージをBRASILにより回収した。200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させ、ファージ結合の評価のため、段階希釈物をLBカルベニシリンプレート及びLBテトラサイクリンプレートに播いた。fdtetを、全てのファージ回帰実験を規準化するための内部標準として使用した。BRASILによるインビボでのクローンの試験Fabクローン2、6、10、12のファージ3×109、及び2×109TUのtetファージを、Balbcマウスの尾静脈に注射し、5分間循環させた。脾臓を回収し、全脾臓から単一細胞懸濁液を氷上で調製した。細胞結合ファージをBRASILにより回収した。200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させ、ファージ回収の評価のため、段階希釈物をLBカルベニシリンプレート及びLBテトラサイクリンプレートに播いた。BRASILによるインビボでのクローン10の試験対照ファージNPC3TTと比較Fabクローン10及びNPC3TT対照Fabファージのファージ3×109TU、並びに1×109TUのFdtetファージをマウスNPC3TTについて2匹、クローン10について2匹に注射し、5分間循環させた。脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を氷上で調製した。細胞結合ファージをBRASILにより回収した。200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させ、段階希釈物をLBカルベニシリンプレート及びLBテトラサイクリンプレートに播いた。NPC3TTファージは、ヒト抗破傷風毒素Fab断片を表示しているファージである。脾臓へのFabクローン10の回帰骨髄と比較Fabクローン10及びNPC3tt対照のファージ3×109TU、並びに1×109TUのFdtet対照ファージをマウスNPC3TTについて2匹、クローン10について2匹に注射し、5分間循環させた。脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を氷上で調製した。臓器特異的回帰の対照として、同じマウスから骨髄両大腿骨を回収した。細胞結合ファージをBRASILにより回収した。Fab断片の作製ニワトリFab挿入物を含むプラスミドpComb3を、ER2537大腸菌へとエレクトロポレーションした。段階希釈物をLBカルベニシリンプレートに播き、37°Cで一晩インキュベートした。Fab産生培養物100μgmlのカルベニシリンを含むスーパーブロスsuperbroth中を、単一の播種されたコロニーから開始させた。1mMIPTGにより、30°Cで7時間、Fab産生を誘導した。細菌上清、周辺質画分SN1及びSN2、並びに細菌溶解物の中のFab濃度のELISAによる決定の後、アフィニティ精製により、周辺質画分SN2からFab断片を精製した。標準的なプロトコルHarlowおよびLane、1988を使用して、αFabプロテインGカラムに、ジメチルピメリミデートDMPをカップリングさせた2mgml。Fab断片を精製するため、以下の方法を使用した。2時間スーパーループsuperloopを用いて、50ml未満の容量を使用する場合又は一晩蠕動ポンプを使用して、50ml超の容量を用いる場合かけて、SN2画分を1mlのHiTrapプロテインGαFabカラムAmershamPharmaciaBiotech、Piscataway、NJにロードした。カラムを10~20mlのPBSリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。Fab断片を10mlの20mMグリシン緩衝液、pH22、150mMNaClを用いて溶出させ、1ml画分を収集した。画分を、溶出直後に1Mトリスで中和した。タンパク質濃度は、A280により定量した。血管内染色回収されたFab断片のインビボ分布を決定するため、50~60μgのFab断片Fab10、NPC3tt、又はR16をBalbcマウスの尾静脈に注射し、8分間循環させた。50μgのトマトLesculentumレクチンFITCをマウスに注射し、2分間のレクチン循環の後、25~30mlの4パラホルムアルデヒドPBSの灌流によりマウス組織を固定した。組織を摘出し、4パラホルムアルデヒドで、1時間、後固定した。固定された組織を、溶液を少なくとも2回変えながら、4°Cで一晩、30ショ糖PBS中でインキュベートした。組織を凍結培地で包埋し、ドライアイス上で凍結させた。固定された組織切片を、以下のようにしてFabに関して染色した。凍結組織切片55μmをミクロトーム上で切り分け、PBSで3回洗浄した。PBS03TritonX1005ヤギ血清で、室温で1時間、薄片をブロッキングした。切片を、1:400のCy3と接合したαヒト抗Fab抗体と共に、室温で一晩、インキュベートした。接合した切片を、PBS03TritonX100で6回、PBSで3回洗浄し、4パラホルムアルデヒドで15分間固定した。固定後、切片をPBSで2回洗浄し、蒸留水で2回洗浄し、次いでベクターシールドVectorShieldを用いてスライドガラス上に設置した。結果ニワトリFab断片を発現するファージクローンのマウス脾細胞へのインビトロ局在を、BRASILにより調査した。図3に示されるように、BRASILにより単離されたFabファージクローンは、挿入物を含まないFdtet対照ファージと比較して、ディファレンシャルなマウス脾細胞との結合を示した。クローン6は、Fab断片を含むが、マウス脾臓から単離されたのではない対照ファージNPC3TTと類似した、最も低い程度のディファレンシャル結合を示した。クローン2、10、及び12は、全て、Fdtet対照と比較して、マウス脾細胞との選択的な結合を示し、クローン2及び10については少なくとも2倍増加した結合が観察された。クローン挿入物について決定されたアミノ酸配列は、以下の通りである:NPC3TTと比較されたFabクローンについてのインビトロファージ結合の直接比較を行った。図4に示されるように、クローン2及び10は、最高レベルのマウス脾細胞との結合をインビトロで示した。クローン6及び12は、ファージNPC3TTの結合よりも極わずかに高いレベルのマウス脾臓との結合を示した。ニワトリFabファージクローンの優先的な結合を、BRASILを使用したインビボ研究により確認した。図5に示されるように、マウス脾臓への選択的局在は、インビボでははるかに劇的であり、Fabクローン2、6、及び10は、Fdtetファージと比較して、何倍にも増加した脾臓との結合を示した。対照的に、Fabクローン12は、Fdtetファージと比較して有意に上昇したマウス脾臓との結合を示さなかった。これらの結果は、脾臓ターゲティングファージを用いて得られたインビトロの結果が、インビボで確認されることを示している。Fabクローン10を、インビボのマウス脾臓への局在によるさらなる特徴決定のため、選択した。図6に示されている結果は、Fabクローン10が、Fdtetと比較して3~10倍の脾臓における濃縮を示したことを確認している。Fab対照ファージNPC3TTは、挿入物を含まないFdtetファージと比較して選択的な脾臓局在を示さなかったため、この効果は、一般的なFab結合によるものではなかった。図7において証明されるように、Fabクローン10の結合は臓器特異的であった。Fabクローン10及びNPC3TT対照に由来するファージを、同一の注射されたマウスの脾臓及び骨髄から回収した。図7より、Fabクローン10は、脾臓への選択的局在を示すが、骨髄組織への選択的局在は示さなかったことが明らかである。対照ファージは、骨髄図7又は脾臓示していないへの選択的局在を示さなかった。これらの結果は、Fabクローン10が、インビトロにおいてもインビボにおいても結合に関してマウス脾臓組織を選択的にターゲティングすることを示している。これらの結果は、インビボファージ分布に関する血管染色によりさらに確認された。この研究に使用された対照ファージは、クローンNPC3TTFab断片及びクローンR16血管新生性網膜スクリーニングより単離であった。蛍光染色により、Fabクローン10は、インビボでマウス脾臓組織と結合することが観察された示していない。対照ファージNPC3TT及びR16は、同一条件下で脾臓組織を染色しなかった。クローン10及びNPC3TTのファージは、おそらくは糸球体濾過のため、注射された動物の腎臓を強く染色することが観察された示していない。その他の対照臓器肺、脳、肝臓、心臓、及び骨格筋は、クローン10による染色を示さなかった示していない。これらの結果は、脾臓ターゲティングファージペプチドが、BRASIL法により同定されうることを証明している。さらに、出発ファージライブラリを得るための、標的の臓器、組織、又は細胞型に対する抗体断片を使用したファージディスプレイ技術の実施可能性を示している。高い非特異的バックグラウンドのために、標準的なファージディスプレイプロトコルを使用したバイオパニングが適用できなかった組織である脾臓に対するターゲティングペプチドを得ることが可能であったことは、BRASIL法の利点を示している。実施例5:血管新生性網膜におけるαカポジ肉腫ライブラリのインビボスクリーニング血管新生性網膜系は、血管新生性腫瘍組織のモデルとして開発された。新生マウスにおける低酸素は、網膜における血管新生応答を引き起こす。血管新生性網膜組織受容体は、ファージディスプレイ結合に関して血管新生性腫瘍組織との類似性を示す。材料及び方法血管新生性モデル系1週齢C57BL6Jマウスを、5日間、75酸素雰囲気に曝露し、次いでさらに5日間、大気中で維持した。6μm横断切片において網膜から硝子体領域へと伸長した新血管の核を計数することにより、増殖性新生血管応答を定量した。このモデルを、マウスへ静脈注射されたファージディスプレイライブラリの、新たに形成された血管新生性血管への結合を評価するために使用した。血管新生のピークは、生後17~21日目に観察された。ファージディスプレイ脾臓に関して既に開示したのと同じ方法を使用して、ウサギへと免疫されたカポジ肉腫腫瘍組織に対するFabファージライブラリαKSを作製した。血管新生性網膜モデル系において、αKSライブラリを使用して、3回のインビボスクリーニングを実施した。生後18~20日目に低酸素により誘導された網膜血管新生を有する2匹のC57BL6Jマウスに、約3~10×1010TUのαKSファージを注射した。ライブラリを5分間、循環させた。眼を摘出し、網膜を眼の残部から分離した。2枚のスライドガラスの間で破砕することにより、網膜から単一細胞懸濁液を調製した。単一細胞懸濁液を、前記のようなBRASILにより処理し、200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させた。一晩増幅したファージを網膜組織から回収し、次回のスクリーニングに使用した。各選択後の回収は、3400~5000TUであった。3回の選択後、90個の選択されたクローンを、HUVEC細胞との結合能に関して試験した。マイクロタイターウェルに、HUVECを含む完全培地をコーティングした。細胞を固定し、ファージ感染細胞のIPTG誘導培養物からの上清と共に一晩インキュベートした。αFabELISAにより、Fab産生を検出した。FabのHUVECとの結合は、αFabAFOSELISAにより検出した。図8は、αKSファージライブラリを使用したFabクローンのHUVECとの結合の結果を示している。クローン16は、インビトロでHUVECとよく結合するようであった。これらの結果は、ファージディスプレイライブラリの作製のため、Fab抗体断片を使用することの可能性を確認している。そのようなライブラリは、従来のバイオパニング法において使用されてきたランダム配列ファージディスプレイライブラリと比較して、宿主動物を免疫するために使用された特定の臓器、組織、又は細胞型に対してターゲティングされるペプチド配列に富んでいるはずである。結果は、ターゲティングペプチド配列を同定するためのBRASIL法の利用可能性も確認している。実施例6受容体リガンド対の同定:インテグリン受容体に対するターゲティングペプチド本発明のいくつかの態様は、様々な用途のための受容体リガンド対の同定に関する。臓器、組織、又は細胞型に選択的なターゲティングペプチドは、通常は標的内の血管の内腔側表面上に位置している前記定義のような受容体と結合する。いくつかの態様において、ターゲティングペプチドは、直接的又は間接的に、そのような受容体を同定又は特徴決定するために使用されうる。遺伝子治療ベクター、その他の治療剤、又はインビボ画像化用の造影剤の送達のための標的としての使用に加え、そのような天然に存在する受容体は、受容体自体に対する新たな治療剤の開発、受容体に対するワクチンの開発、及び様々な疾患状態の基礎となっている分子機構の理解のための可能性のある標的として有用である。当然、ターゲティングペプチド自体は、受容体に対する新たな治療剤のための基礎として有益であり得る。ターゲティングペプチドは、ターゲティングされた受容体と結合する内因性リガンドのミメオトープmimeotopesとして作用する場合が多い。他の態様において、開示された方法を使用して、内因性リガンドが同定され、特徴決定されうる。そのようなリガンドも、新たな治療剤の開発等のための標的として潜在的に有用である。本実施例は、受容体この場合にはインテグリン受容体リガンド対の同定に関する一つの態様を例示する。インテグリンに対するターゲティングペプチドの用途の例には、細胞の増殖及び走化性の制御、アポトーシス促進、並びに抗血管新生が非限定的に含まれる。この態様においては、固体基質に結合した精製されたインテグリンを、インテグリンに対するターゲティングペプチドを同定するため、ファージディスプレイライブラリをスクリーニングするために使用した。背景インテグリンの機能は、多様な生物学的系においてサイトカイン及びその他の可溶性因子により制御されている。最も一般的には、そのような因子の曝露は、受容体の活性化状態の変化即ち、特定のリガンドに対する親和性の増加もしくは減少、及び又は原形質膜内での受容体クラスター形成をもたらすコンフォメーションの改変へと至る。インテグリン依存性接着の変化は、最終的には、様々な複雑なシグナル伝達経路を活性化する。分子レベルにおいては、誘導された細胞骨格タンパク質のインテグリン細胞質ドメインとの共局在が、シグナル伝達を調節する。細胞質ドメインは、インテグリン機能の重要な制御因子であるHynes、1992;Ruoslahti、1996の総説。個々のαサブユニット及びβサブユニットの細胞質ドメインは、異なる種間で高度に保存されているHemlerら、1994。様々なβサブユニットの細胞質ドメインは、類似の一次構造を共有しているが、いくつかの機能的特徴に関しては異なっている。キメラインテグリンを用いた実験によって、β鎖の細胞質ドメインが、受容体の分布及び限局性付着focaladhesion部位への動員の制御を担っていることが示されているPasqualiniおよびHemler、1994。従って、いくつかの細胞質ドメインは、インテグリンによって媒介される細胞へのシグナル伝達外から内へのシグナル伝達、及びインテグリンリガンド結合活性の活性化内から外へのシグナル伝達にとって重要であるHemlerら、1994。インテグリンαvβ3及びαvβ5は、正常血管系には発現しておらず、血管新生性血管系に選択的に発現するBrooksら、1994a、1994b;Pasqualiniら、1997;Arapら、1998。さらに、αvインテグリンアンタゴニストは、新生血管の成長を阻止することが示されているBrooksら、1994a、1994b、1995;Hammesら、1996。これらの実験において、内皮細胞のアポトーシスが、血管新生の阻害のための機構として同定されたBrooksら、1994a、1994b、1995。bFGFにより開始する血管新生は、抗αvβ3阻止抗体によって阻害され、VEGFにより媒介される血管新生は、αvβ5に対する阻止抗体によって防止されうる。インテグリンαvβ3及びαvβ5は、異なる型の眼新生血管疾患において優先的に表示されることが報告されているFriedlanderら、1995、1996。従って、別個のサイトカインにより誘導される血管新生へと至る経路は、特異的なαvインテグリンに依存していると考えられる。インテグリンαvβ3及びαvβ5は、いずれも、ビトロネクチンと結合するが、おそらくは、異なるリガンド結合後事象を媒介する。例えば、外因性可溶性因子の非存在下では、インテグリンαvβ5は、細胞の接着、拡散、遊走、及び血管新生を促進することができない。他方、αvβ3インテグリンは、サイトカインによる付加的な刺激なしに、そのような事象を誘導することができるKlemkeら、1994;Lewisら、1996;Friedlanderら、1995。サイトカインによるαvβ5機能の制御に関する分子的基礎を研究するために設計された実験によって、固定化されたビトロネクチンとの結合時、不活化されたαvβ5は、アクチン、αアクチニン、テーリン、テンシンtensin、p130cas、及びビンキュリンと会合して検出されることはほとんどないことが示されている。対照的に、αvβ3は、そのような分子の局所的な蓄積を誘導する。プロテインキナーゼCPKCの活性化により、αvβ5は、αvβ3と類似の挙動を示すようになるが、テーリンを動員することはできないLewisら、1996。さらに、PKCの阻害剤であるカルホスチンcalphostinCは、αvβ5により媒介される血管新生を阻止するが、αvβ3により媒介されるものは阻止しないようであるFriedlanderら、1995。これらの観察は、PKC活性化が、おそらく、β5細胞質ドメインのコンフォメーション又はリン酸化状態に影響を与えることを示唆している。細胞質タンパク質においても、類似の変化が起こりうるKolanusおよびSeed、1997。サイトカインによるαvβ5インテグリンの制御は、リガンド結合は不変であるが、リガンド結合後の事象が異なる点で、通常とは異なるLewisら、1996。従って、αvβ3又はαvβ5により媒介される細胞事象は、明らかに、異なる機構によって調節されているFilardoおよびCheresh、1994b。αvインテグリン会合分子の検索は、技術的な問題によって妨げられてきた。第一に、含まれている物理的会合が、細胞が完全でない場合にはもはや起こらない多量体リガンドの集合に頼っている可能性が高い。第二に、それらのインテグリンとの会合は、通常、低親和性である。最後に、会合タンパク質のコンフォメーション及びリン酸化状態の変化が、これらの一時的に調整される相互作用の複雑度をさらに増大させている可能性がある。これらの問題のため、インテグリン細胞質ドメインと結合するタンパク質は、限定された数しか同定されていない。パキシリンpaxillin及びICAP1のようなこれらのタンパク質は、主に、β1鎖と会合するShattilおよびGinsberg、1997。サイトヘシンcytohesin1及びフィラミンは、β2の細胞質ドメインと会合する。いくつかの他のタンパク質テーリン、フィラミン、αアクチニン、限局性付着キナーゼ、セリントレオニンキナーゼILK、及びスケルミンskeleminは、βインテグリン細胞質ドメイン全般と相互作用することが報告されている。テーリン、αアクチニン、及び限局性付着キナーゼは、β1細胞質ドメイン内の推定結合部位を欠失させた後には、もはやβ1インテグリンと共局在しない。類似の手法により、他の細胞骨格関連タンパク質及びシグナル伝達分子が、インテグリンと共局在することが示されている。インテグリンは、増殖因子シグナル伝達に関与している分子と会合する。αvβ3と会合して見出されうる190kDaタンパク質及びIRS1VuoriおよびRuoslahti、1994に加え、αvβ3インテグリンと、インスリン及びPDGFのシグナル伝達経路に関連している分子との会合の分析は、インスリン受容体及びPDGFβ受容体の両方がαvβ3と共免疫沈降することを明らかにした。インテグリンと会合した受容体分子は、そのような分子の高度にリン酸化され高度に活性化された亜画分を表している。これらの結果は、インテグリンにより媒介される細胞接着が、増殖因子に対する細胞応答と同調しているという見解を強化するため、重要である。インテグリン依存性シグナル伝達過程は、増殖シグナルと協同しているFrischおよびRuoslahti、1997;ClarkおよびBrugge、1995;LonghurstおよびJennings、1998。タンパク質リン酸化は、インテグリン刺激に対する応答において検出される最初期事象の一つである。チロシンキナーゼ阻害剤が、限局性付着の形成を抑制することができることから、インテグリン受容体と連結されているシグナル伝達経路におけるチロシンリン酸化の役割が示唆されるDefilippiら、1994。プロテインキナーゼCPKC及びマイトジェン活性化プロテインMAPキナーゼのようなセリントレオニンキナーゼファミリーも、インテグリン刺激によって活性化され、PKCの阻害剤は、いくつかの細胞システムにおける細胞の接着及び拡散を阻止するVuoriおよびRuoslahti、1993。インテグリンは、やはりチロシンリン酸化に依存している応答であるプログラム細胞死を制御することにより細胞生存に影響を与えると考えられる。インテグリンタンパク質複合体と会合するいくつかのタンパク質は、タンパク質タンパク質カップリングを特異的に媒介するSrcホモロジー2SH2及び3SH3と呼ばれるモジュラードメインを含む。SH2ドメインは、ホスホチロシンを含む特異的ペプチドモチーフとの相互作用を介してタンパク質と結合し、SH3ドメインは、タンパク質標的上の短いプロリンリッチなペプチドモチーフと結合するClarkおよびBrugge、1995。インテグリンにより媒介される細胞接着は、MAPキナーゼの活性化を引き起こし、限局性付着キナーゼFAKのチロシンリン酸化を増加させる。FAKの自己リン酸化は、Srcファミリーキナーゼ及びGrb2Sos複合体を含むSH2ドメインタンパク質の結合へと至る。一つの妥当な仮説は、インテグリンにより媒介されるFAKのチロシンリン酸化が、Rasカスケードの活性化に至り、最終的にはMAPキナーゼ活性化へと至るというものである。しかしながら、インテグリンにより媒介されるMAPキナーゼ活性化は、FAKとは無関係であることが示されており、そのことは、i分裂促進シグナル及び生存シグナルにおいて役割を果たしうるMAPキナーゼ活性化、並びにii細胞骨格組織化に明らかに関与しているFAKチロシンリン酸化、という少なくとも2個の別個のインテグリンシグナル伝達経路が存在することを示しているLinら、1997。ペプチド基質及び相同性に基づく分子モデルの以前の研究より、ペプチド基質の約9~13残基が、キナーゼドメインの活性部位間隙と接触することが示唆されたBossemeyerら、1993。ファージディスプレイ技術は、多様なコンビナトリアルペプチドライブラリを生成させ、選択するための代替的な手法を提供するSmith、1991;WellsおよびLowman、1992。ファージディスプレイライブラリ内の化学的多様性は、複製され増幅されうるDNAによってコードされているため、ファージライブラリの選択は複数回実施することが可能であり、従って稀少なモチーフですら同定することが可能である。合成化学ライブラリとは対照的に、ファージディスプレイは、プールされた種ではなく単一の種の分析を許容する。この技術の力は、大規模なコンビナトリアルライブラリからの稀少な抗体又はペプチドの選択によって主に証明されてきた。コンビナトリアルファージライブラリは、全てSrcファミリーの近縁メンバーである異なるプロテインチロシンキナーゼPTK及び1個の比較的遠縁のPTK、Sykの好ましい基質配列を決定するために使用されたSchmitzら、1996。組換えPTKによるその後のリン酸化、及び抗ホスホチロシン抗体によるリン酸化されたファージの選択が、基質ペプチドを表示しているファージを濃縮するために使用された。数回の選択の後、試験された各PTKについて別個の基質配列が見出された。Srcファミリーと関連したPTKについては、これらの正準配列の重要な特質が、既知又は仮定のタンパク質基質において再利用された。最も注目すべきことは、不変のチロシン残基と直接隣接しているアミノ酸が、高度に保存されており、試験された各PTKに対して特異的であった点である。従って、同定されたモチーフは、PTKの触媒ドメインの小さい特異的な阻害剤を開発するための合理的基礎を提供しうるSchmitzら、1996。さらなる研究は、SrcファミリーのプロテインキナーゼであるFynの基質特異性を検討するために、如何にしてペプチドライブラリが使用されうるかを示すことにより、ファージディスプレイ技術の範囲を拡大したDenteら、1997;Gramら、1997。ファージによって表示された修飾されたペプチドが、タンパク質Shcのホスホチロシン結合ドメインPTBのホスホチロシン特異性を決定するために使用されたDenteら、1997。他の関連する実験は、ファージ上に確立されたランダムペプチドライブラリをスクリーニングすることによる、アダプタータンパク質Grb2のSrcホモロジー2SH2ドメインと相互作用するホスホペプチドリガンドの同定に焦点を当てた。ホスホチロシンキナーゼcSrc、Blk、及びSykの混合物により、ファージの不変チロシン残基がインビトロでリン酸化された。グルタチオンSトランスフェラーゼGST融合タンパク質として発現させたGrb2の組換えSH2ドメインとのライブラリの相互作用により、結合モチーフが選択された。その後の数回の選択によって、先にリン酸化された場合にのみGSTGrb2SH2ドメインと結合するファージが濃縮された。配列分析によって、選択されたファージが、全て、コンセンサスモチーフYMNWYはホスホチロシンを意味するを含むペプチドを表示していることが明らかとなった。1個のペプチドは、天然リガンドShcに由来するペプチドモチーフYVNVより3倍高い親和性でGrb2SH2ドメインと結合した。これらの所見は、ファージディスプレイが、SH2ドメインに対する高親和性リガンド及びシグナル伝達に関与しているその他の相互作用タンパク質を迅速に同定するために使用されうることを示している。β5の細胞質ドメインは、他のインテグリンサブユニットと較べて構造的及び機能的に独特であり表8、わずか38というβ3の細胞質ドメインとの相同性を有しているHemlerら、1994。αvとの会合のための構造的要件が、β3とβ5とのさらなる一次配列の相違を防止しているが;既存の差異が、αvβ5のテーリンとの減少した相互作用の原因となっている可能性が高いことが提唱されているLewisら、1996。β5の細胞質ドメインを、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞において、β1の細胞外ドメインとのキメラとして発現させた場合、キメラ受容体はβ5と同様の挙動を示し、細胞遊走及び受容体の限局性付着への局在の欠損を促進したPasqualiniおよびHemler、1994。しかしながら、インテグリンサブユニットβ1及びβ3の細胞質ドメインは、機能的に相互に交換可能であることが示されたSolowskaら、1991。他の研究によって、αvβ3及びαvβ5が、限局性付着への局在及び細胞遊走への寄与に関して異なっていると考えられることが示されたDelannetら、1994;Filardoら、1995。しかしながら、これらは、機能的相違が、特定のドメインにマッピングされていないことを報告した。表8類似のインテグリンβサブユニット細胞質ドメインの整列化β3細胞質ドメインとβ5細胞質ドメインとの主要な差異が強調されている。血管新生スイッチが誘発された後は、別個の分子が、β3又はβ5のいずれかと会合する可能性が高い。さらに、αv細胞質ドメインとの選択的会合も、各ヘテロダイマーの環境において可能性がある。例えば、インテグリンαvサブユニットの細胞質テール内のβターンは、αvβ3のコンフォメーション及びリガンド結合に影響を与えることが示されているFilardoおよびCheresh、1994。選択的シグナル伝達特性の基礎は、それぞれの細胞質ドメインと会合する特異的分子の集合であるのかもしれない。本研究は、β3及びβ5の細胞質ドメインに対するファージディスプレイライブラリのパニング、並びに細胞質ドメイン結合ペプチドの生物学的特性の決定という新規な戦略を活用することにより、αvβ3及びαvβ5に選択的な血管新生シグナル伝達に関与している分子を確定する。開示された方法は、従来の手法と比していくつかの利点を有している。iインテグリン細胞質ドメインと直接的又は間接的に相互作用する細胞内分子を特徴決定する能力;ii極めて少量でインテグリン細胞質ドメインと結合する分子に対する抗体の開発;及びiiiファージディスプレイライブラリスクリーニングは、細胞質ドメイン結合タンパク質を模倣するペプチドの同定に至るであろう。方法二次元細胞培養β3及びβ5インテグリンを発現する3個のヒト内皮細胞系:KS1767細胞Herndierら、1996、HUVECATCC、及びBCE細胞Solowskaら、1991を使用した。異なるタンパク質即ち、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン、又はラミニンで覆われた無菌のガラス製カバーガラスを基質として使用した。細胞が接着し拡散した後、005ウシ胎仔血清を含む培地中での12時間のインキュベーションにより、単層を休止状態にした。ペネトラチンpenetratin膜透過性タグ下記参照を使用して、ペプチドを細胞へと導入した。細胞を、接着及び拡散のため、ECMタンパク質へと播いた。単層を、bFGF、TNFα、VEGF、及びTGFβを含む、αvにより媒介される血管新生に関与している各増殖因子で6時間刺激した。未処理の細胞が、陰性対照であった。三次元細胞培養:24穴組織培養プレートのウェルに各150μlのマトリゲルMatrigelを添加し、37°Cで10分間ゲル化させた。2FCSが補足されたM199培地中で24時間、HUVECを枯渇状態にした後、トリプシン処理したものを使用した。104個の細胞を3通り、各ウェルに穏和に添加し、37°Cで30分間、ゲルコーティングへと接着させた。次いで、培地を、ペプチドを含む完全培地に交換した。24時間後、倒立顕微鏡Canonを用いて、プレートをモニタリングし、写真撮影した。走化性アッセイ:細胞遊走アッセイを、以下のようにして実施した。48ウェルマイクロケモタキシスチャンバーを使用した。8μm孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルターNucleopore、Cambridge、MAに、室温で10分間、1ゼラチンをコーティングし、2FCSが補足されたM199培地で平衡化した。ペプチドを含む2FCS、20ngmlVEGFARDSystem、及び1Umlヘパリンが補足されたM199を、ボイデンBoydenチャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を迅速にトリプシン処理し、最終濃度2×106個mlで、2FCSが補足されたM199に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、50μlの細胞懸濁液を上室に蒔いた。5CO2を含む湿潤雰囲気中で37°Cで5時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマンpolicemanを用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液DiffQuick、BaxterDiagnostics、Rome、Italyで染色した。各ウェル内の5個のランダムな高倍率視野40倍を計数した。増殖アッセイ:細胞増殖は、記載されているようにしてPasqualiniおよびHemler、1994測定した。簡単に説明すると、4×104個のHUVECを24ウェルプレート内でインキュベートした。細胞を24時間枯渇状態にし、次いで培地を除去し、VEGF及び15μMの各ペプチドの存在下で交換し、18時間インキュベートした。次いで、50μlの3Hチミジン1μCimlを含む培地をウェルに添加し、さらに6時間37°Cでインキュベートした後、培地を除去し、細胞を10TCAで4°Cで30分間固定し、エタノールで洗浄し、05NNaOHで可溶化した。LS6000SCベックマンBeckmanシンチレーションカウンターを用いて液体シンチレーションにより放射能を計数した。各実験を3通り3回実施し、結果を平均値±SDで表した。アポトーシスアッセイヨウ化プロピジウム染色サブジプロイドsubdiploid集団およそ1×106個の細胞を完全培地中に採集し、15μMのペプチドを4時間、8時間、又は12時間添加した。次いで、細胞をPBSで洗浄し、05mlのヨウ化プロピジウム溶液50μgmlPI、01TritonX100、01クエン酸ナトリウムに再懸濁させた。4°Cで24時間のインキュベーションの後、細胞を、488nmレーザーを用いてXLコールターCoulterCoulterCorporationで計数し;各ヒストグラムについて12000個の細胞を計数し、細胞周期分布をマルチサイクルMulticycleプログラムで分析した。ペプチド及び適切な対照の微小注入又はペネトラチン媒介取り込みの後、アポタグApopTagキットを使用して細胞アポトーシスをモニタリングした。実験は、カスパーゼ阻害剤及び特異的カスパーゼに対する抗体の存在下で実施した。サイトカイン及び腫瘍により誘導される血管新生のアッセイCAMへと移植された血管新生因子及び腫瘍細胞は、新たな毛細血管の成長を刺激する。10日ニワトリ胚に由来するCAMにおいて、以前には無血管であった領域に移植されたVEGF又はbFGFのフィルターにより、血管新生を誘導した。異なる処理ペネトラチンペプチド及び対照を局所適用し、3日後、フィルター及び周囲のCAMを切除しホルマリンで固定した。立体顕微鏡を用いて、CAMの焦平面内で、ディスクに侵入した血管の数を定量した。各群8個のCAMからの血管数の平均値及び標準誤差を比較した。リン酸化及びリン酸化されたファージライブラリのパニングsrcファミリーのプロテインキナーゼFyn、cSrc、Lyn、及びSyc、並びにMAPキナーゼのようなセリントレオニンキナーゼによるペプチドライブラリのリン酸化を、以前に記載されたようにして実施したSchmitzら、1996;Denteら、1997;Gramら、1997。簡単に説明すると、20ポリエチレングリコール8000を含む25MNaClによる二重沈殿により、培養上清からファージ粒子を収集した。粒子を1012個mlで溶解させた。精製されたファージ10μlを、50μlの反応緩衝液容量で、異なる濃度35~3500単位のプロテインキナーゼと共に、室温で3時間インキュベートした。リン酸化されたペプチドを表示しているファージを選択するため、反応混合物を、10μgのアガロースと接合した抗PTyr、抗PSer、又は抗PThrモノクローナル抗体を含むチューブに移した。結合したファージを、03mlの溶出緩衝液01MNaClグリシン1mgmlBSA、pH235でカラムを洗浄することにより溶出させた。溶出液を2Mトリス塩基で中和し、2mlの対数増殖期中期midlogの細菌培養物と共にインキュベートした。その一部20μlを播種のため取り出し、記載されているようにしてファージを採集した。リン酸化から選択までの工程を繰り返した。β3及びβ5の細胞質ドメインと結合するリン酸化されたペプチドを、先のセクションに記載されたようにして分析した。β3及びβ5の細胞質ドメイン上のリン酸化部位、並びに細胞質ドメイン結合ペプチドをインビトロでマッピングするため、マトリックス支援レーザーデソープション飛行時間型MatrixassistedlaserdesorptiontimeofflightMALDITOF質量分析計を使用した。融合タンパク質又はペプチドを記載されたようにしてインビトロでリン酸化し、RPHPLC又はRPマイクロチップカラムにより精製した。リン酸化されたペプチドを、三つの方法により同定した。1キナーゼ反応後の80Daの質量シフト;2ホスファターゼ処理後の80Daの欠損;又は3チロシンリン酸化ペプチド又はセリン、トレオニンリン酸化ペプチドについての、リニアlinearモードに対するリフレクターreflectorモードでのそれぞれ80Da又は98Daの欠損。必要に応じて、ペプチドをRPHPLCにより精製し、配列ラダーを作製するため、カルボキシペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼによる消化に供した。これは、1個のペプチドが2個またはそれ以上のリン酸化部位を内含している場合に特に有用であった。リン酸化されたGST融合タンパク質に対するパニングGST融合タンパク質を記載されたようにしてインビトロでリン酸化したSchmitzら、1996;Denteら、1997;Gramら、1997。簡単に説明すると、10μgmlを、55単位のFynプロテインキナーゼを含む反応緩衝液50mMTris、5mMMgCl2、500μMNa3VO4、500μMATP、全容量50μlと共に室温で3時間インキュベートした。40のTCAを添加することにより、反応を停止させた。キナーゼ基質タンパク質を沈殿させた後、それをPBSに再懸濁させ、マイクロタイターウェル上に10μgウェルでコーティングした。CX7Cライブラリの一部25×1011形質導入単位をGST融合タンパク質上でインキュベートした。ランダムに選択されたクローンから、ファージを配列決定した。質量分析研究質量分析によるペプチド質量マッピングを、β3及び又はβ5の細胞質ドメインの新規リガンドを同定するために使用した。細胞質ドメイン結合ペプチドに対して産生させたポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を、標的タンパク質細胞骨格分子又はシグナル伝達分子を精製するために使用した。これらのタンパク質をSDSPAGEにより分離し、SDSゲルから切り出し、トリプシンでゲル内消化した。ペプチドの抽出後、ペプチド質量のリストを作製するためMALDITOF質量分析を実施した。このペプチド質量のリストは、プロテアーゼ特異性と組み合わされ、配列データベースを検索するために使用されうる比較的特異的なサインを与える。タンパク質配列がデータベース内に存在する場合には、この方法により、高い信頼性でタンパク質が同定されうる。この手法の検出下限は、現在のところ、N末端エドマン配列決定法よりも少なくとも10~20倍低い1pmolである。結果β3及びβ5の細胞質ドメインに対するファージペプチドライブラリのパニングβ3及びβ5の細胞質ドメインと結合するタンパク質を、マイクロタイターウェルにコーティングされたGSTβ3cyto又はGSTβ5cytoのいずれかを含む組換えGST融合タンパク質を用いた複数のファージライブラリのスクリーニングにより単離した。固定化GSTを、各細胞質ドメインのパニングにおける濃縮についての陰性対照として使用した。他に開示されたようにしてKoivunenら、1995;Pasqualiniら、1995、3回のパニングの後、ランダムに選択されたクローンからファージを配列決定した。β3又はβ5細胞質ドメインと特異的に相互作用する別個の配列が単離された表9。2回目及び3回目のパニングからランダムに選択されたクローンを配列決定した。ファージミドによりコードされたペプチドのアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列から推定した。示されたライブラリを用いたパニングの後、最も高頻度に見出されたモチーフが、表9に示されている。比率は、β3GSTでコーティングされたウェルから回収されたコロニーの数を、GST又はBSAから回収されたもので割ることにより計算した。表9β3又はβ5の細胞質ドメインと結合するファージにより表示された配列β3又はβ5の細胞質ドメインとの相互作用の特異性を、細胞質ドメイン含有融合タンパク質β3又はβ5と結合したファージの数と、GST単独陰性対照の数との比率を計算することにより決定した。図9は、GSTβ3cyto結合ファージを用いて実施された結合アッセイからの結果を示している。2回目及び3回目のパニングにおいて最も高頻度に見出されたモチーフを表示していた6個のファージを試験した。各パネルは、示されたようなβ3細胞質ドメインと結合する異なるペプチドを表示していたファージについての結合アッセイからの結果を示している。挿入物非含有ファージ、又は未選択のライブラリが、陰性対照として使用され、それらは、バックグラウンドを超える結合を示さなかった。各アッセイについて二つの播種希釈率が示されている。β5細胞質ドメイン融合タンパク質を含むスクリーニングにおいて単離されたファージの特異性を決定するため、類似の戦略を使用した。結合アッセイは、図10に示される個々に増幅されたファージを用いて実施した。2回目及び3回目のパニングにおいて最も高頻度に見出されたモチーフを表示していた5個のファージを試験した。各パネルは、β5細胞質ドメインと結合するペプチドを表示していたファージについての結合アッセイを示している。挿入物非含有ファージ、又は未選択のライブラリが、陰性対照として使用され、それらは、これらのアッセイにおいて、バックグラウンドを超える結合を示さなかった。選択されたモチーフの結合が各細胞質ドメインに特異的であるか否かを決定するため、個々のファージモチーフの、β1、β3、又はβ5細胞質ドメイン融合タンパク質との相互作用を比較する結合アッセイを実施した。抗GST抗体を用いたELISAは、3個のタンパク質が、等しい効率でプラスチックへとコーティングされうること、及び従って結合の差がコーティング濃度の差を反映するのではないことを示した示していない。β3で選択されたファージ及びβ5で選択されたファージの両方が、最初に選択されたタンパク質と選択的に相互作用し、β3β1=39、β3β5=37、β5β1=48、及びβ5β3=69という平均結合選択性が観察された示していない。BSAに対するインテグリン細胞質ドメインへの平均選択性は、約1~2桁大きかった示していない。試験されたファージは、いずれも、β1細胞質ドメインとは強く結合しないようであった示していない。インテグリン細胞質ドメイン結合ファージにより表示された配列に相当する合成ペプチドの特徴決定結合特性に基づき、さらなる研究のため、特定のファージを選択した。各ファージにより表示された配列に相当する合成ペプチドを、結合阻害研究を実施するために使用した。このアッセイにより、ファージ結合が各ファージにより表示されたターゲティングペプチドにより完全に媒介されるのか、又は非特異的成分も含んでいるのか、が決定された。予想通り、合成ペプチドは、用量依存的に対応するファージの結合を阻害した図11及び図12。無関係のアミノ酸を含む対照ペプチドは、同一濃度で試験した場合、ファージ結合に対する効果を有していなかった。リン酸化事象が、選択されたペプチドの細胞質ドメインとの相互作用を調整するリン酸化を含む事象は、シグナル伝達の制御において重要である。ファージディスプレイ系を、二つのレベルでチロシンリン酸化の効果を評価するために使用した。第一に、β3又はβ5の細胞質ドメインを含む組換え融合タンパク質を、チロシン含有ペプチドを表示しているファージライブラリのパニングに使用した。第二に、細胞質ドメイン自体をリン酸化した後、ファージ選択を実施した。特定のチロシンキナーゼの、選択されたペプチドの細胞質ドメインとの相互作用を調整する能力を調査するための実験を、実施した。チロシン含有ペプチドを表示しているファージライブラリのパニングにおいて得られた結果は、表10に示されている。3回目及び4回目からランダムに選択されたクローンを、Fynによりリン酸化されたX4YX4ライブラリから配列決定した。ファージミドによりコードされたペプチドのアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列から推定した。表10は、示されたライブラリをβ3又はβ5でパニングした後、最も高頻度に見出されたモチーフを示している。β3又はβ5との結合の比率は、パニング後に見出されたβ3又はβ5コロニーの数を、GST又はBSAコロニーの数で割ることにより計算した。β3又はβ5のFynによりリン酸化されたファージとの結合の、未リン酸化ファージとの結合に対する比率を、パニング後に見出されたコロニーの数を割ることにより計算した。表10インテグリン細胞質ドメインと結合するリン酸化されたファージにより表示された配列細胞質ドメイン結合の親和性及び特異性に対するリン酸化の効果を調査した。β3及びβ5の細胞質ドメインと結合するペプチドを表示しているファージを、Fynキナーゼを使用して、以前に記載されたようにしてSchmitzら、1996;Denteら、1997;Gramら、1997、インビトロでリン酸化した。ファージ表面上のチロシン含有ペプチドの特異的リン酸化を、キナーゼ反応において32PγdATPを使用し、ファージpIIIタンパク質をSDSPAGEで分離することにより確認した。インビトロでリン酸化されたファージは、β3インテグリン細胞質ドメインとの結合の親和性及び特異性の増加を示した図13。TLRKYFHSS配列番号:120ファージを、特異性を決定するため、他のGST細胞質ドメイン融合タンパク質を含むアッセイにおいても試験した図14。インテグリン結合ペプチドと既知の細胞骨格タンパク質及びシグナル伝達タンパク質との配列類似性インテグリン細胞質ドメイン結合ファージにより表示されたペプチドは、細胞骨格タンパク質及びシグナル伝達に関与しているタンパク質に見出されるいくつかの領域と類似していた表11。単離ペプチドのいくつかと、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ5のある領域MAPK5、アミノ酸227~234との類似性は、特に興味深かった。MAPKカスケード、細胞の接着、遊走、及び増殖を含む関連が提唱されているLinら、1997。表11インテグリン結合ペプチドと、既知の細胞骨格タンパク質及びシグナル伝達タンパク質との配列類似性膜透過性ペプチドペネトラチンは、親水性化合物に原形質膜を通過させることができるペプチドである。浸透部分との融合は、明らかな崩壊なしに、オリゴペプチドを細胞質、核、又はその両方へと直接的にターゲティングすることを可能にするDerossiら、1994。この膜透過性ペプチドは、ショウジョウバエDrosophila転写因子Jolietら、1991a、1991b;LeRouxら、1993であるアンテナペディアのホメオドメインのアミノ酸43~58に相当する16残基からなる。ペネトラチンにより媒介される取り込みは、37°C及び4°Cの両方で起こり、取り込まれたペプチドは細胞から完全な状態で回収されうる。β3又はβ5の細胞質ドメインと結合することが見出されたモチーフの配列と融合したペネトラチン配列を含むペプチドを設計した。ペプチドは、pヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレンHMP樹脂及び標準的なFmoc化学を使用して、431アプライドバイオシステムズAppliedBiosystemsペプチド合成機で合成した。ペプチドの取り込み及び可視化は、記載されているようにしてDerossiら、1994;Hallら、1996;Theodoreら、1995、実施した。簡単に説明すると、10~50μgmlのビオチン化ペプチドを細胞培養物へ添加した。ペプチドを、播種された細胞と共にインキュベートした。2~4時間後、培養物を組織培養培地で3回洗浄し、固定し、エタノール:酢酸9:1を使用して、20°Cで5分間、透過処理した。培養物を、10ウシ胎仔血清FCS及び002Tweenを含むトリス緩衝生理食塩水TBSと共に30分間インキュベートすることにより、非特異的タンパク質結合部位をブロッキングした。培養物を、FITCと接合したストレプトアビジン1:200希釈を含む同緩衝液の中でインキュベートし、TBSで洗浄した後、共焦点顕微鏡検による視察のため設置した。ペネトラチンと連結されたペプチドは、極めて効率的に取り込まれたデータは示していない。機能データは、β3又はβ5に対して選択された細胞質ドメイン結合ペプチドが、インテグリンにより媒介されるシグナル伝達及びその後の細胞応答即ち、内皮細胞の接着、拡散、増殖、遊走を妨害しうることを示した。ファージスクリーニングにより見出された合成モチーフSDNRYIGSW、配列番号:97;及びCEQRQTQEGC、配列番号:93;β3結合ペプチド、並びにVVISYSMPD、配列番号:112;β5結合ペプチドの取り込み可能型の市販のパネルを得た。これらの複合キメラペプチドは、ペネトラチンとカップリングした、β3又はβ5細胞質ドメイン結合ペプチドのうちの最も選択的なもの完全細胞へと取り込まれた後のペプチドの追跡を可能にするためのビオチン部分からなる。これらの膜透過性型のペプチドは、取り込まれ、β3及びβ5のリガンド結合後の細胞事象に影響を与え、多量のアポトーシスを誘導しうるデータは示していない。内皮細胞の増殖、走化性、及びアポトーシスβ3及びβ5インテグリン細胞質ドメイン結合モチーフの、内皮細胞増殖に対する効果を、内皮細胞を活性化する因子による刺激の後、評価した図15。細胞増殖は、パスカリーニPasqualiniおよびエルマーHemler1994に従い測定した。簡単に説明すると、4×104個のHUVECを24ウェルプレートでインキュベートし、24時間枯渇状態にし、その後、培地を除去し、VEGF及び15μMの各ペプチドの存在下で交換した。さらに18時間のインキュベーションの後、50μlの3Hチミジン1μCimlを含む培地をウェルに添加した。さらに6時間37°Cでインキュベートした後、培地を除去し、細胞を10TCAで4°Cで30分間固定し、エタノールで洗浄し、05NNaOHで可溶化した。LS6000SCベックマンBeckmanシンチレーションカウンターを使用することにより、液体シンチレーションにより放射能を計数した。各実験を3通り3回実施し、結果を平均値±SDで表した。β3及びβ5インテグリン細胞質ドメイン結合モチーフの、内皮細胞遊走に対する効果を、内皮細胞を活性化する因子による刺激の後、評価した。試験されたペプチドは、用量依存的かつ特異的に細胞機能に影響を与えた。それらの特性は、β3又はβ5細胞質ドメインに内在性のものと考えられる図16。走化性アッセイ細胞遊走は、48ウェルマイクロケモタキシスチャンバーにおいてアッセイした。8μm孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルターを、室温で10分間1ゼラチンでコーティングし、2FCSが補足されたM199培地で平衡化した。ペプチドを含む2FCS、20ngmlVEGFARDSystem、及び1Umlヘパリンが補足されたM199を、ボイデンチャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を迅速にトリプシン処理し、最終濃度2×106個mlで、2FCSを含むM199培地に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、50μlの細胞懸濁液を上室に蒔いた。5CO2を含む湿潤雰囲気中で37°Cで5時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマンを用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液で染色した。各ウェル内の5個のランダムな高倍率視野40倍を計数した。結果は、両方のβ3インテグリン細胞質ドメイン結合ペプチドが細胞の遊走を増加させたが、ペネトラチンは細胞に影響を与えなかったことを示している。アポトーシスアッセイヨウ化プロピジウムPI染色サブジプロイド集団およそ1×106個の細胞を完全培地中に採集し、15μMのペプチドを4時間、8時間、又は12時間添加した。次いで、細胞をPBSで洗浄し、05mlのヨウ化プロピジウム溶液50μgmlPI、01TritonX100、01クエン酸ナトリウムに再懸濁させた。4°Cでの24時間のインキュベーションの後、細胞を、488nmレーザーを用いてXLコールターCoulterCorporationで計数し;各ヒストグラムについて12000個の細胞を計数し、細胞周期分布をマルチサイクルプログラムで分析した。VISYペネトラチンキメラによる細胞の処理は、アポトーシスの誘導をもたらした図17、パネルd。細胞を他の増殖因子に曝露した場合には、アポトーシス促進効果は観察されなかった示していない。ペネトラチン単独及び他のペネトラチンキメラも、類似の効果を誘導することができなかった図17、パネルc。この所見は、血管新生を阻害するための新規な手法が、インテグリンターゲティングペプチドの使用に基づき開発されうることを示している。細胞質ドメイン結合ペプチドによる免疫、及び得られた抗体の特徴決定標準的な技術を使用して、αvβ3結合ペプチド及びαvβ5結合ペプチドを認識するポリクローナル抗体を、合成ペプチドを用いて作製されたKLH接合体を使用して生成させた。2個の異なる合成ペプチドに対する抗体を作製した図18。血清は、ウェスタンブロット分析により示されるように、固定化ペプチドを認識するだけでなく、全細胞抽出物中の特異的タンパク質も認識する図19。ウサギを、SDNRYIGSW配列番号:97KLH接合体又はGLDTYRGSP配列番号:96KLH接合体で免疫した。各ウサギに、200μgのKLHと接合したペプチドを含む完全フロイントアジュバントを注射した。20~60日後、ウサギに100μgの不完全フロイントアジュバントを注射した。3回目の免疫後、血清を収集した。最初の免疫の前に得られた免疫前血清を、実験において付加的な対照として使用した。ポリクローナル抗体をELISA、ウェスタンブロット、及び免疫沈降により試験した。ELISAアッセイにおいては、マイクロタイターウェルプレートに10μgmlのペプチドをコーティングした。プレートを37°Cで乾燥させ、PBS3BSAでブロッキングし、異なる血清希釈物を含むPBS1BSAと共にインキュベートした。洗浄及び二次抗体とのインキュベーションの後、アルカリホスファターゼ基質を添加し、抗体結合を405nmで比色検出した。マウスポリクローナル血清及びウサギポリクローナル血清の両方で観察された反応性は、高度に特異的であった。全ての場合に、抗体結合は、免疫に使用された対応するペプチドによるプレインキュベーションにより消失したが、対照ペプチドによっては消失しなかった図18及び図19。2個のβ3細胞質ドメイン結合ペプチドに対して産生された抗体は、35S標識抽出物を使用した免疫沈降実験において、全細胞抽出物上の特異的バンドを認識する。ポリクローナル血清及び精製されたIgGで、類似の結果が得られた示していない。本実施例は、細胞受容体の特定のドメインに対するターゲティングペプチドが、ファージディスプレイにより同定されうることを示している。そのようなペプチドは、エンドスタチンのような細胞受容体の内因性リガンドを同定するために使用されうる。さらに、ペプチド自体が、治療効果を有する場合もあるし、又はより有効な治療剤の同定のための基礎として有益である場合もある。ここで同定されたエンドスタチンターゲティングペプチドは、細胞へと導入した場合、細胞の増殖、走化性及びアポトーシスに対する効果を示した。当業者であれば、本発明が、開示されたペプチド又は治療効果に限定されないことを理解するであろう。その他の細胞受容体及びリガンド、並びにそれらの阻害剤及び活性化剤も、開示された方法により同定されうる。実施例7インテグリン結合ペプチドによるアポトーシスの誘導エンドタノスEndothanos実施例9は、ペネトラチンへの結合により細胞へと輸入されたVISYペプチドVVISYSMPD、配列番号:112が、HUVEC細胞においてアポトーシスを誘導しうることを示した。ここでアネキシンVとして同定されたペプチドの内因性細胞類似体を同定するため、VISYペプチドに対して産生された抗体が使用された。結果は、アネキシンVが、新規アポトーシス経路に関与しているインテグリンの内因性リガンドであることを示している。方法タンパク質精製前記実施例9に記載の方法を使用して、VISYペプチドVVISYSMPD、配列番号:112に対するポリクローナル抗体を調製した。MDAMB435乳癌細胞を、内因性VISYペプチド類似体の精製のため使用した。細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、冷水で20分間溶解させた。膜画分から細胞質画分を分離するため、細胞抽出物を100000×gで30分間遠心分離した。細胞質画分をゲル濾過カラム10~50kDa及び陰イオン交換カラムmonoQでのカラムクロマトグラフィに供した。陰イオン交換カラムを、50mM~1MNaClの塩勾配で溶出させた。1ml画分を収集し、SDSPAGEを実行し、抗VISY抗体と反応性の内因性タンパク質の存在に関してウェスタンブロッティングにより試験した。36kDaの抗体反応性バンドを含む目的の画分は、約300mMNaClで溶出した。36kDaは、抗VISY抗体との陽性の反応性を示す画分に必ず出現した。画分をSDSPAGE及び2Dゲル電気泳動、続いてウェスタンブロッティングにより分析した。カラムクロマトグラフィの後、36kDaタンパク質の実質的な濃縮が見られた示していない。36kDaペプチドをSDSPAGEゲルから切り出し、その配列を得るため質量分析により分析した。質量分析により得られた5個のペプチド配列は、全て、報告されているアネキシンVの配列GenBankアクセッション番号GI468888との100の相同性を示した。435細胞における存在に加え、36kDaバンドは、カポジ肉腫細胞、SKOV細胞、及びHUVEC細胞にも見られた示していない。市販のアネキシンVに対する抗体を入手したSantaCruzBiologics、SantaCruz、CA。抗VISY抗体及び抗アネキシンV抗体を使用して、競合ウェスタンブロットを実施した。両方の抗体が、36kDaタンパク質との反応性を示した示していない。これらの結果は、VISYペプチドの内因性タンパク質類似体がアネキシンVであることを示している。アネキシンV及びβ5細胞質ドメインによるタンパク質タンパク質相互作用アネキシンVのβ5インテグリンとの結合、及びVISYペプチドの効果を調査するため、競合結合アッセイを実施した。プレートに様々なインテグリンの細胞質ドメインのGST融合タンパク質をコーティングし、アネキシンVをプレートに添加した。抗アネキシンV抗体を使用して、アネキシンVの結合を決定した。図20Aに示されるように、アネキシンVはGSTβ1インテグリンともGSTβ3インテグリンとも結合しなかった。アネキシンVは、GSTβ5インテグリンと強く結合したが、結合は使用された緩衝液に依存していた図20A。トリス緩衝生理食塩水TBSにおいては低い結合が観察され、カルシウム2mMが添加された、又は添加されていない細胞質緩衝液100mMKCl、3mMNaCl、35mMMgCl2、10mMPIPES、3mMDTTでは高い結合が観察された図20A。カルシウムは、アネキシンV活性がカルシウムにより調整されることが報告されているため、使用した。アネキシンVのGSTβ5との結合は、VISYペプチドの添加により阻止された図20A。図20Bは、抗アネキシンV抗体の精製されたアネキシンV及びVISYペプチドとの結合の相対レベルを示している。プレートのコーティングにアネキシンVを使用し、インテグリン細胞質ドメインのGST融合タンパク質を添加する、逆の実験を実施した。抗GST融合タンパク質抗体を使用して結合を評価した。予想通り、GSTβ5のみがアネキシンVとの実質的な結合を示し、GSTβ1及びGSTβ3は、低レベルのアネキシンV結合を示した示していない。いくつかの実験において、カルシウムの存在下では減少した結合が観察され、カルシウムイオンは、GSTβ5とアネキシンVとの結合相互作用を妨害すると考えられた示していない。カルシウムの存在下67阻害では、カルシウムの非存在下45よりも大きい程度のVISYペプチドによるアネキシンVのGSTβ5との結合の阻害が観察された図20A。β5細胞質ドメインと結合するペネトラチンペプチドキメラはプログラム細胞死を誘導する実施例9において示されたVISYペプチドによるアポトーシスの誘導を確認した。106個のHUVEC細胞を15μMのVISYアンテナペディアペネトラチンキメラ、又は15μMのアンテナペディアペプチドペントラチンpentratin単独で2~4時間処理し、アガロースゲル電気泳動によりクロマチン断片化を分析した。図21は、クロマチン断片化により示されるようなVISYAntペネトラチンによるアポトーシスの誘導を示している。VISYも、ペネトラチンも、単独ではアポトーシスを誘導しなかった。アポトーシスの誘導は、カスパーゼ阻害剤zVAD、カスパーゼインヒビターcaspaseinhibitorI、Calbiochem627610、SanDiego、CAをVISYキメラペプチドと同時に培地へ添加した場合に、最大70阻害された。VISYペプチドにより誘導された細胞死の機構と他のアポトーシス促進剤によるものとの相違点は、細胞培養物において評価された他のアポトーシス機構には、細胞死の前に基質からの細胞の脱離が含まれる点である。対照的に、VISYにより誘導される細胞死においては、細胞は細胞死前に基質から脱離しない。従って、エンドタノス内からの死は、アノイキスanoikisホームレスネスhomelessnessとは異なっていると考えられる。実施例9及び本実施例の結果は、VISYペプチドがインテグリン依存性アポトーシス経路を活性化することを示している。本実施例は、VISYペプチドの内因性類似体がアネキシンVであることを示している。これらの結果は、アネキシンVとβ5インテグリンとの間の相互作用により媒介され、かつカスパーゼ活性に依存している新規アポトーシス経路の存在を証明している。この新規アポトーシス機構は、エンドタノスと呼ばれる。当業者であれば、アポトーシスを誘導又は阻害するための新規機構が、癌療法のような多様な用途に有用であることを理解するであろう。実施例8受容体リガンド対の同定:アミノペプチダーゼAは内皮細胞機能及び血管新生を制御する腫瘍血管の内皮細胞は、特異的な血管新生マーカーを発現する。アミノペプチダーゼAAPA、EC34117は、血管新生中の微小血管においてアップレギュレートされる。APAは、オリゴペプチドからN末端のグルタミル残基又はアスパルチル残基を加水分解するホモダイマーの膜結合型亜鉛メタロペプチダーゼであるNanusら、1993。インビボで、APAは、アンジオテンシンIIをアンジオテンシンIIIへと変換する。レニンアンジオテンシン系は、いくつかの内分泌機能、心血管機能、及び行動的機能の制御において重要な役割を果たしているArdaillou、1997;StrothおよびUnger、1999。最近の研究は、血管新生におけるアンジオテンシンの役割も示唆しているがAndradeら、1996、血管新生過程におけるAPAの機能は、従来検討されていない。本実施例においては、APA発現細胞に対してファージライブラリをスクリーニングすることにより、APAと結合することができるターゲティングペプチドが同定された。モチーフCPRECESIC配列番号:123を含むAPA結合ペプチドは、APA酵素活性を特異的に阻害した。可溶性CPRECESIC配列番号:123ペプチドはインビトロで内皮細胞の遊走、増殖、及び形態形成を阻害し、ニワトリ胚絨毛尿膜CAMアッセイにおいてインビボの血管新生を妨害した。さらに、APAヌルマウスは、未成熟マウスにおける低酸素により誘導される網膜症において、野生型wtマウスと比較して減少した量の網膜血管新生を有していた。これらの結果は、血管新生におけるAPAの役割のよりよい理解、及び新たな抗腫瘍治療戦略の開発をもたらしうる。材料及び方法細胞培養腎癌細胞系SKRC49に、全長APAcDNAGengら、1998をコードする発現ベクターをトランスフェクトした。細胞を、2mMグルタミン、1非必須アミノ酸、1ビタミンGibcoBRL、100Umlストレプトマイシン、100UmlペニシリンIrvineScientific、10mMピルビン酸ナトリウムSigmaAldrich、及び10ウシ胎仔血清FCSTissueCultureBiological、Tulare、CAが補足されたMEMIrvineScientific、SantaAna、CAの中で維持した。安定的にトランスフェクトされた細胞を、G418含有培地中で維持した。HUVECをコラゲナーゼ処理により単離し、1~4代の間で使用した。細胞を、ゼラチンでコーティングされたプラスチック上で、20FCS、ペニシリン100Uml、ストレプトマイシン50μgml、ヘパリン50μgml、ウシ脳抽出物100μgmlが補足されたM199培地Sigmaの中で増殖させた。培地補助剤は、全て商業的に入手したLifeTechnologiesInc、Milan、Italy。抗体及びペプチド抗APAmAbRC38Schlingemannら、1996を、トランスフェクトされた細胞溶解物からAPAを免疫捕獲immunocaptureするために使用した。CPRECESIC配列番号:123及びGACVRLSACGA配列番号:124環状ペプチドを化学合成し、非還元条件下で自発的に環状化させ、質量分析AnaSpecSanJose、CAにより精製した。CPRECESIC配列番号:123ペプチドの質量分析機分析は、おそらくは異なるジスルフィド結合の位置及びダイマーの形成を反映している6個の異なるピークを明らかにした。異なる画分のAPA酵素活性に対する生化学的挙動は類似していたため、下記の全ての手順において、6個のピークの混合物を使用した。APA免疫捕獲セミコンフルエントのプレートから、100mMNオクチルβグルコピラノシドCalbiochemを含む冷PBSへと細胞を剥離し、氷上で2時間溶解させ、13000×gで15分間遠心分離した。マイクロタイター丸底ウェルFalconに、2μgのRC38を室温で4時間コーティングし、室温で1時間、PBS3BSAIntergen、Purchase、NYでブロッキングし、その後、150μlの細胞溶解物1mgmlをmAbでコーティングされたウェル上で4°Cで一晩インキュベートし、PBS01Tween20Sigmaで5回洗浄し、PBSで2回洗浄した。APA酵素アッセイ細胞及び免疫捕獲されたタンパク質を、リルンLilnら1998に従い、特異的酵素活性について試験した。簡単に説明すると、接着細胞又はRC38で免疫捕獲された細胞の抽出物を、3mMαLグルタミルpニトロアニリドFluka及び1mMCaCl2を含むPBSと共に、37°Cで2時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーMolecularDevices、Sunnyvale、CAで405nmにおける吸光度ODを読み取ることにより、酵素活性を決定した。細胞パニングCX3CX3CX3CCはシステインであり、Xは任意のアミノ酸であるライブラリを調製したRajotteら、1998。ファージ粒子の増幅及び精製、並びにファージ表示された挿入物のDNA配列決定を、前記と同様にして実施した。25mMEDTAを含むPBSとのインキュベーションにより細胞を脱離させ、結合培地20mMHEPES及び2FCSが補足されたDMEMハイグルコースで1回洗浄し、2×106細胞mlの濃度で同培地に再懸濁させた。1010TUのファージを500μlの細胞懸濁液に添加し、混合物を穏和に回転させながら一晩1回目又は2時間後続回4°Cでインキュベートした。細胞を室温で結合培地で5回洗浄し、100μlの同培地に再懸濁させた。1mlの対数増殖期K91kan大腸菌を添加し、混合物を室温で1時間インキュベートすることにより、ファージをレスキューした。細菌を、10mlの02μgmlテトラサイクリンが補足されたLB培地で希釈し、室温でさらに20分間インキュベートした。段階希釈物を40μgmlテトラサイクリンを含むLBプレートに播き、プレートを37°Cで一晩インキュベートした後、コロニーを計数した。ファージ結合特異性アッセイ細胞パニングについて記載したようにして、109TUの入力量を用いて細胞結合アッセイを実施した。増加性の濃度でCPRECESIC配列番号:123ペプチドを結合培地へ添加することにより、特異性を確認した。ファージを免疫捕獲されたAPAと結合させるため、ウェルをPBS3BSAで室温で1時間ブロッキングし、50μlのPBS3BSAの中で109TUと共に室温で1時間インキュベートした。PBS1BSA001Tween20で8回洗浄し、PBSで2回洗浄した後、200μlの対数増殖期K91kan大腸菌を添加することにより、ファージをレスキューした。各実験を少なくとも3回繰り返した。APA結合ファージのインビボ腫瘍回帰MDAMB435に由来する腫瘍異種移植片を、2ヶ月齢の雌ヌードマウスJacksonLabs、BarHarbor、Maineで確立した。マウスにアバーチンAvertin麻酔を施し、109TUのファージを含む200μl容量のDMEMを尾静脈から静脈注射した。ファージを5分間循環させ、5mlのDMEMで心臓を通って動物を還流した。各マウスから腫瘍及び脳を切除し、計量し、等量の組織をホモジナイズした。組織ホモジネートを、プロテイナーゼ阻害剤カクテル及び01BSAを含む氷冷DMEMで3回洗浄した。結合したファージをレスキューし、細胞パニングについて記載したようにして計数した。Fdtetファージを、対照として同じ入力量で注射した。その実験を2回繰り返した。平行して、同組織試料の一部をブアン溶液で固定し、組織切片の調製のためパラフィン包埋した。M13ファージに対する抗体AmershamPharmaciaを染色に使用した。細胞増殖アッセイHUVECを含む完全M199培地を、48ウェルプレート104個ウェルに蒔き、24時間付着させた。次いで、2FCSを含むM199培地中で24時間細胞を枯渇状態にした。CPRECESIC配列番号:123ペプチド又は対照GACVRLSACGA配列番号:124ペプチド1mMを含む、2FCS及び10ngmlVEGFARDSystem、Abingdom、UKを含む培地を、ウェルに添加した。示された時間インキュベートした後、細胞を25グルタルアルデヒドで固定し、01クリスタルバイオレットを含む20メタノールで染色し、10酢酸で可溶化した。全ての処理を3通り行った。細胞増殖は、マイクロプレートリーダーBiorad、Hercules、CAで590nmのODを測定することにより評価した。較正曲線を確立し、ODと細胞数との直線的な相関が、103~105細胞で観察された。走化性アッセイ細胞遊走アッセイは、ブリッソーニBussoliniら1995に従い、48ウェルマイクロケモタキシスチャンバーNeuroProbe、Gaithersburg、MDにおいて実施した。8μm孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルターNucleopore、Cambridge、MAを、室温で10分間1ゼラチンでコーティングし、2FCSが補足されたM199培地で平衡化した。CPRECESIC配列番号:123ペプチド又は対照GACVRLSACGA配列番号:124ペプチド1mMを含む、2FCS及び10ngmlVEGFARDSystemが補足されたM199培地を、ボイデンチャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を、25mMEDTAを含むPBSに採集し、PBSで1回洗浄し、最終濃度2×106個mlで2FCSを含むM199培地に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、50μlの細胞懸濁液を上室に蒔き、5CO2を含む湿潤雰囲気中で37°Cで5時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマンを用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液DiffQuick、BaxterDiagnostics、Rome、Italyで染色した。各ウェル内の5個のランダムな高倍率視野100倍を計数した。各アッセイを3通り実行した。三次元細胞培養48穴組織培養プレートのウェルに各100μlのマトリゲルMatrigelCollaborativeResearch、Bedford、MAを添加し、37°Cで10分間、固体化させた。2FCSが補足されたM199培地中で24時間、HUVECを枯渇状態にした後、25mMEDTAを含むPBSに採集した。104個の細胞を3通り各ウェルに穏和に添加し、37°Cで30分間、ゲルコーティングへと接着させた。次いで、培地を、示された濃度のCPRECESIC配列番号:123ペプチド又はGACVRLSACGA配列番号:124ペプチドを含む完全培地に交換した。24時間後、倒立顕微鏡Canonを用いてプレートを写真撮影した。そのアッセイを3回繰り返した。CAMアッセイCAMアッセイRibattiら、1994によりインビボ血管新生を評価した。白色レグホンニワトリ由来の受精卵を一定の湿度で37°Cで維持した。インキュベーション3日目、卵殻に四角形の窓を開け、殻から発達中のCAMを脱離させるために2~3mlの卵白を取り出した。同サイズのガラスプレートで窓を密封し、卵をインキュベーターに戻した。8日目、1mm3の滅菌したゼラチンスポンジGelfoam、UpjohnCo、Kalamazoo、Milanに、VEGFA20ng、RDSystemと、CPRECESIC配列番号:123又は対照GACVRLSACGA配列番号:124ペプチド1mMのいずれかとを含む3μlのPBSを吸収させ、無菌条件下で成長中のCAMの頂部に移植した。12日目まで毎日CAMを調査し、ライカLeica実体顕微鏡でインオボinovoで写真撮影した。スポンジから出現した毛細血管を計数した。そのアッセイを2回繰り返した。網膜血管新生の誘導APAヌルマウスは記載されているLinら、1998。P7生後7日目の仔マウスを授乳する母親と共に5日間75酸素に曝露した。P12に正常酸素大気へとマウスを戻した。組織学的分析のため、P17~P21にマウスを屠殺し、眼を摘出し、4パラホルムアルデヒドを含むPBSで4°Cで一晩固定した。固定された眼をパラフィン包埋し、5μmの連続切片を切り出した。切片をヘマトキシリンエオシンhe溶液で染色した。各眼について20個のhe染色切片から、内境界膜の硝子体側の新生血管核を計数した。切片1個当たりの新生血管核数の平均値を計算し、スチューデントt検定を使用して動物群間で比較した。結果ファージディスプレイによる細胞パニングによりAPA結合モチーフが選択されるAPAと結合することができるペプチドを同定するため、細胞をランダムペプチドファージライブラリでスクリーニングした。まず、天然コンフォメーションでのAPA発現のモデルを得るため、APAを発現していないSKRC49腎癌細胞に、全長APAcDNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの結果として発現されたAPAは、APA酵素アッセイにより立証されたように機能的に活性であったが示していない、親SKRC49細胞はAPAの発現も活性も示さなかった示していない。非特異的結合を減少させるため、CX3CX3CX3Cファージライブラリ1010形質導入単位[TU]を親SKRC49細胞に予備吸着させた。再懸濁させたSKRC49APA細胞を、親細胞と結合しなかったファージでスクリーニングした。SKRC49APA結合ファージを増幅し、2回の連続的な選択のため使用した。ファージのSKRC49親細胞との結合と較べたファージのSKRC49APA細胞との結合の増加が、2回目及び3回目に観察された示していない。それに続くファージの配列決定により、一般ライブラリ配列CX3CX3CX3Cのタンデム反復を含むペプチド挿入物の特異的な濃縮が明らかとなった。この配列は、2回目からランダムに選択され18個のファージ挿入物の50を占め、3回目からのファージ挿入物の100を占めていた。2回目から得られた4個のペプチド挿入物は、タンデムファージとの配列類似性を有していた表12、太字フォント。2回目ペプチドの中には、明らかに保存されているモチーフが他にもいくつか観察された表12、下線又はイタリック体。これらのうちの1個は、タンデムリピート配列と一部重複していた。選択されたペプチドのヒトデータベースに対する配列相同性の検索は、有意な一致を与えなかった。表12APA結合ペプチド配列選択されたファージ挿入物は、特異的なAPAリガンドであるペプチド挿入物を表示しているファージを、個々にAPA結合に関して試験した。3個のファージは、全て、SKRC49親細胞に対して6倍濃縮された類似のパターンで、特異的にSKRC49APA細胞の表面と結合した示していない。対照の挿入物非含有ファージは、結合優先性を示さなかった示していない。2回目に選択されたCGTGCAVECEVVC配列番号:128及びその他のファージは、SKRC49APA細胞との選択的結合を示さなかったデータは示していない。APA結合ファージ挿入物を再現するコンセンサス配列を含む可溶性ペプチドCPRECESIC配列番号:123を合成した。CPRECESIC配列番号:123ペプチドの存在下で、CPKVCPRECESNC配列番号:127ファージを用いて結合アッセイを実施した。可溶性CPRECESIC配列番号:123ペプチドは、SKRC49APA細胞との結合に関してCPKVCPRECESNC配列番号:127ファージと競合したが、SKRC49親細胞との非特異的結合に対する効果は有していなかった示していない。無関係の環状ペプチドGACVRLSACGA配列番号:124は競合活性を有していなかった示していない。ファージの結合も、CPRECESIC配列番号:123ペプチドによって置換されたが、CLGQCASICVNDC配列番号:126ファージの結合は影響を受けなかったデータは示していない。選択されたペプチド挿入物の基質特異性をさらに確認するため、mABRC38を用いた免疫捕獲により、APAでトランスフェクトされた細胞の抽出物からAPAを部分精製した。RC38でコーティングされたマイクロウェルの上に固定化されたAPAタンパク質は、酵素アッセイにより確認されたように機能性であった示していない。ファージは、RC38免疫捕獲されたSKRC49親細胞由来細胞溶解物とのファージの結合と比較して10~12倍の濃縮で、免疫捕獲されたAPAと選択的に結合した示していない。APA結合ファージはインビボで腫瘍をターゲティングする同定されたペプチドの、腫瘍へと回帰する能力を、ヒト乳房腫瘍異種移植片が移植されたヌードマウスをモデル系として使用して評価した。ファージを腫瘍保持マウスの尾静脈に注射し、組織ホモジネートからのファージ回収によりターゲティングを評価した。CPKVCPRECESNC配列番号:127ファージは、対照として使用された脳組織と比較して腫瘍移植片において4倍濃縮されていた図22。挿入物非含有ファージは、腫瘍をターゲティングしなかった図22。CYNLCIRECESICGADGACWTWCADGCSRSC配列番号:125ファージもCLGQCASICVNDC配列番号:126ファージも、腫瘍回帰優先性を示さなかったデータは示していない。CPKVCPRECESNC配列番号:127の回帰は、組織切片上の抗M13免疫染色によって確認された示していない。腫瘍血管系には強いファージ染色が見られたが、正常血管系には見られなかった示していない。挿入物非含有ファージは、腫瘍血管と結合しなかった。CPRECESIC配列番号:123はAPA活性の特異的阻害剤であるAPA酵素活性に対するCPRECESIC配列番号:123の効果を検討するため、SKRC49APA細胞を、増加性の濃度のCPRECESIC配列番号:123ペプチド又は対照GACVRLSACGA配列番号:124ペプチドの存在下で、APA特異的基質αグルタミルpニトロアニリドと共にインキュベートした。37°Cでの2時間のインキュベーションの後、比色アッセイにより酵素活性を評価した。CPRECESIC配列番号:123は、APA酵素活性を阻害し、試験された最高濃度では活性を60減少させた図23。酵素阻害に関するCPRECESIC配列番号:123のIC50は、800μMと計算された。CPRECESIC配列番号:123は、近縁のプロテアーゼであるアミノペプチダーゼNの活性には影響を与えなかったデータは示していない。CPRECESIC配列番号:123は内皮細胞の遊走及び増殖を阻害する抗血管新生薬としてのCPRECESIC配列番号:123ペプチドの可能性のある使用を決定した。まず、インビトロのCPRECESIC配列番号:123ペプチドによるAPA阻害の、VEGFA10ngmlで刺激されたヒト臍静脈内皮細胞HUVECの遊走及び増殖に対する効果を調査した。HUVEC上の機能性APAの存在を、酵素アッセイにより評価した示していない。試験された最高濃度1mMにおいて、CPRECESIC配列番号:123ペプチドは、ボイデンチャンバーアッセイにおいてHUVECの走化性を70阻害した図24。同じペプチド濃度で、細胞増殖は50阻害された図25。比較的低濃度のCPRECESIC配列番号:123ペプチド又はGACVRLSACGA配列番号:124対照ペプチドは、細胞の遊走及び増殖に対する有意な効果を有していなかった示していない。CPRECESIC配列番号:123はインビトロ及びインビボで血管新生を阻害する異なるインビトロ及びインビボの血管新生モデルにおけるCPRECESIC配列番号:123ペプチドの阻害効果を調査した。三次元マトリックスゲル上に播かれたHUVECは、毛細血管様の構造へと分化し、インビトロ血管新生モデルを与える。増加性の濃度のCPRECESIC配列番号:123ペプチドは、このネットワークの形成の進行的な減損をもたらした示していない。1mMのペプチド濃度で、血管様枝分かれ構造は、有意に少なく、かつ短くなり、結果として細胞は完全なネットワーク組織を形成することができなかった示していない。対照ペプチドGACVRLSACGA配列番号:124は、HUVEC形態形成に影響を与えなかった示していない。一般的に使用されている単純化されたインビボ血管新生のモデルは、胚発生中に血管新生が刺激されうるニワトリ胚絨毛尿膜CAMである。ゼラチンスポンジに吸収された適切な刺激は、新たな毛細血管のリモデリング及び分枝により達成される微小血管のスポンジそのものへの動員を誘導する。8日齢のニワトリ卵CAMをVEGFA単独20ng又はVEGFACPRECESIC配列番号:123ペプチド又はGACVRLSACGA配列番号:124ペプチド1mMで刺激した。12日目にCAMの写真を撮影した。VEGFAにより誘導された血管新生は、スポンジから出現した毛細血管の数に基づき、CPRECESIC配列番号:123により40阻害された表13。新生血管は、VEGFA刺激後に典型的に見られた高度に枝分かれした毛細血管構造を示さなかった示していない。対照ペプチドGACVRLSACGA配列番号:124又は比較的低いペプチド濃度のCPRECESIC配列番号:123による処理は、成長血管の数に対する効果を有していなかった示していない。表13血管新生に関するCAMアッセイスチューデントニューマンクールズStudentNewmanKeuls検定によりp<001。結果は、2回の独立の実験からの平均値及び標準誤差として表されている。APA欠損マウスは、減損した血管新生を示す未成熟マウスにおける低酸素網膜症のモデルにおいて、APAマウス及びAPAヌルマウスの血管新生能を調査した。相対的低酸素による網膜血管新生の誘導は、野生型マウスと比較してAPAマウスに既に存在していた示していない。APAヌルマウスにおいて、血管新生はほぼ検出不可能であった示していない。血管新生は、低酸素眼の切片20個から硝子体の突出している新生血管核を計数することにより定量した。P7~P12の75酸素処理の後、網膜血管新生の有意な誘導眼切片1個当たり1617±119個の新生血管核が生後17日目P17の野生型マウスにおいて見られた。P7~P12の75酸素曝露の後、P17のAPAマウス眼切片1個当たり1076±103個の新生血管核及びAPAヌルマウス眼切片1個当たり425±045個の新生血管核の網膜には、減少した量の新生血管核が見られた。考察インビボで、APAは、腫瘍を含む活性化された微小血管により過剰発現されているが、休止期血管系にはほぼ検出不可能であり、従って血管指向腫瘍療法のための適当な標的である。本実施例は、APAの新規ターゲティングペプチドリガンドCPRECESIC配列番号:123を同定した。可溶性CPRECESIC配列番号:123ペプチドは、800μMのIC50でAPA酵素活性を阻害した。インビトロ血管新生モデルとして培養HUVECを使用した場合、可溶性CPRECESIC配列番号:123ペプチドは、VEGFAにより誘導されるHUVECの遊走及び増殖を阻害した。これらのデータは、血管新生中には内皮細胞の遊走及び増殖が必要であることと一致している。CPRECESIC配列番号:123は、マトリゲルモデルにおいても毛細血管様構造の形成を阻止し、VEGFAにより刺激されたCAMにおける血管新生を阻害した。APAヌルマウスは、野生型マウスと比較して有意に低い網膜血管新生を有していたため、APAが、相対的低酸素により誘導された血管新生において重要な役割を果たしていることが示された。これらの結果は、腫瘍血管新生の阻害のための特異的な標的としてAPAを使用することの可能性を増強する。要約すると、可溶性ペプチドCPRECESIC配列番号:123は、選択的なAPAリガンドであり阻害剤である。CPRECESIC配列番号:123によるAPAの阻害は、異なるインビトロ及びインビボのアッセイにおいて血管新生を阻害し、このことから、血管新生過程におけるAPAの顕著な役割が初めて証明された。さらに、APA結合ファージは、腫瘍血管へと回帰することができ、このことは、CPRECESIC配列番号:123を腫瘍血管新生の阻害剤として治療的に使用することの可能性を示唆している。CPRECESIC配列番号:123の内因性類似体は、上に開示されたものと類似した、抗体に基づく精製又は同定の方法により同定されうる。実施例9PALMによるファージライブラリのスクリーニング特定の態様において、臓器または組織の不均一な試料から特定の細胞型を選択することができることが望ましい。そのような選択的サンプリングを行う一つの方法はPALMレーザーマイクロビームによる位置決定と剥離によることである。PALMロボットマイクロビームは、微量剥離のための正確なコンピューター誘導レーザーを用いる。パルス紫外線UVレーザーを顕微鏡にインターフェースで接続して、直径1マイクロメートル未満のビームスポットの大きさに対物鏡を通して焦点を合わせる。レーザー切断の原理は、加熱することなく局所的に制限された剥離的光分解プロセスであるHendrix、1999。有効なレーザーエネルギーは、微小な焦点スポットのみに濃縮され、ほとんどの生物学的物体は、適用されたレーザーの波長に関して透過性である。このシステムは、その後のファージ回収のために、同種の細胞集団、または単一の細胞もしくは細胞下構造を回収するための選択ツールであるように思われる。組織試料は、被験者にファージを投与後に選択域または単細胞を切除することによって回収してもよい。選択域と非選択域との明確なギャップが典型的に得られる。単離された組織標本は、対物平面から放射して、全く接触しないように、一般的な微量遠心管のキャップに直接発射することができる。このいわゆるレーザー圧発射LPC方法の基礎は、正確に焦点を当てたレーザーマイクロビームの極めて高い光子密度によって引き起こされた標本の下で生じたレーザー圧力であると考えられる。この組織採取技術によって、ファージは微小切除技法から生き残って、救済することができる。PALMは、本実施例において、下記のようにマウス膵臓組織に関するターゲティングファージを選択するために用いた。材料および方法インビトロおよびインサイチューパニングCX7Cペプチドファージライブラリ109TUを、C57BL6雄性マウスの尾静脈へ注射し、膵臓を採取して細菌感染によってファージを回収した。コロニー246個からのファージをLBカナマイシン100μgmlテトラサイクリン40μgml5ml中で37°Cの暗所で攪拌しながら個々に増殖させた。一晩培養物をプールして、ファージを別のインビボバイオパニングラウンドのためにNaClPEG沈殿によって精製した。コロニー300個を2回目のパニングラウンドから採取して、ファージを沈殿によって回収した。次に、2回目のバイオパニングラウンドからのファージをもう一回のバイオパニングラウンドのために用いて、同様に、一回のインサイチューパニングラウンドのために凍結融解したマウス膵臓切片と共にインキュベートした。3回目のインビボパニングラウンドにおいて、第二のラウンドからのファージ109TUを第三のマウスに注射して、6分間循環させた後、FITCレクチンVectorLaboratoriesInc50μlの静脈内注射を行った。2分間循環させた後、MEMEarle塩3mlによってマウスの左心室を還流した。膵臓を採取して、TissueTekSakuraにおいて80°Cで凍結して、調製スライドガラス上で切片にした。第三のインサイチューラウンドに関して、第二のラウンドから単離した精製ファージを、融解したマウス膵臓切片4~14μm切片と共に氷中で30分間インキュベートした。切片を氷冷PBS100μlによって室温RTで8回すすいだ。結合したファージを、RTで30分間~60分間感染させるために、K91KanROD600=203100μlを加えることによって各切片から回収した。感染したK91KanRをそれぞれの切片から回収して、LBKanTet02μgml10mlにおいて暗所で20分間回復させた。各培養物からのアリコートをLBKanTet40μgmlプレートに播種して、37°Cの暗所で一晩インキュベートした。各培養物の残りのテトラサイクリン濃度を40μgmlに増加して、ファージを増幅および精製するために培養物を37°Cの暗所で攪拌しながら一晩インキュベートした。DNA増幅ファージは、PALMレーザーマイクロビームによる位置決定と剥離コールドレーザー圧発射システムを用いて14μm切片から微小切除した、凍結保存FITCレクチン染色マウス膵島および周辺の腺房から回収した。膵島および対照切片をpH8の1mMEDTAに発射して、PCR増幅のために十分な材料が回収されるまで20°Cで凍結した。ファージDNAを、fUSE5プライマーを用いて増幅した。重なり合った組のプライマーを用いて、PCR産物に、もう1回のPCRラウンドを行った。第二のプライマーの組の3末端に、配列決定目的のためにM13リバースプライマーによってテールをつけた。用いた入れ子nestedプライマーセットは、であった。隣接するSfiI制限部位を含むペプチド挿入物配列を作製するために、さらに2つのプライマーを用いた。入れ子プライマーから作製したPCR産物をゲル精製してQiagen、自動配列決定によってM13リバースプライマーを用いてCX7Cペプチド挿入物が存在することを確認した。ライブラリプライマーから生じたPCR産物をゲル精製してQiagen、CsCl2精製fUSE5SfiIにライゲーションして、エレクトロコンピテントMC1061細胞にエレクトロポレーションして、LBストレプトマイシン100μgmlテトラサイクリン40μgml寒天プレート上に播種した。ゲル電気泳動によってCX7C挿入物配列の存在を確認するために、単一のコロニーにfUSE5プライマーを用いてコロニーPCRを行った。陽性クローンをBigDyeターミネーターPerkinElmerを用いて配列決定した。ファージ感染膵島および対照切片を1mMAEBSF、20μgmlアプロチニン、10μgmlロイペプチン、1mMエラスターゼ阻害剤I、01mMTPCK、1nMペプスタチンAのpH74のPBS溶液に入れて、十分な材料が収集されるまで48時間またはそれ未満凍結させた。切片を氷中で融解して、容量をpH74のPBSによって200μlに調節した。試料をK91KanROD=0221mlと共にRTで旋回装置上で2時間インキュベートした。各培養物をLBKanTet02μgml12mlに移して、RTの暗所で40分間インキュベートした。テトラサイクリンの濃度をそれぞれの培養物について40μgmlに増加して、培養物を攪拌しながら37°Cで一晩インキュベートした。翌日、各培養物をLBKanTet寒天プレートに播種して、37°Cの暗所で14時間インキュベートした。陽性クローンをコロニーPCRおよび自動配列決定のために採取した。結果PALMを用いたインビボパニングの一般的スキームを、図26に示す。最初のインビボ選択ラウンド後、ファージをバルク増幅するか、または膵臓、腎臓、肺、および副腎からファージの単一のコロニーを増幅して、インビボスクリーニングのさらなるラウンドを行った。マウス膵臓からのバルク増幅およびコロニー増幅ファージはいずれも、選択ラウンドが増加するにつれて連続的な濃縮を示した示していない。3回の選択ラウンドの後、コロニー増幅したファージは、バルク増幅したファージよりほぼ1次数高い濃縮を示した示していない。表14は、膵臓スクリーニングによって同定された選択されたターゲティング配列およびコンセンサスモチーフを記載する。表14膵臓のターゲティングペプチドとモチーフ図27は、PALM選択薄切片材料からのファージ挿入物配列の回収の一般的プロトコールを示す。表記のように、ファージは、薄切片試料のプロテアーゼ消化後に大腸菌宿主細菌の直接感染によって回収してもよい。または、ファージ挿入物はPCR増幅によって回収してもよく、新しいベクターDNAにクローニングした後、クローニングするために宿主細菌にエレクトロポレーションするか、または形質転換してもよい。ファージをPALM回収するいずれの方法も、膵ターゲティング配列の回収に成功した。直接細菌感染によって回収された膵配列には、が含まれた。ファージ挿入物の増幅およびファージへのクローニングによって回収された膵ターゲティング配列には、が含まれる。図28~図31は、選択された膵ターゲティング配列に関して同定された配列相同性を示す。膵組織に存在することが知られているいくつかのタンパク質を同定した。本実施例の結果は、組織薄切片から細胞型を選択するため、およびターゲティングファージ配列を回収するためにPALM法を用いてもよいことを示している。当業者は、この方法は、異種臓器または組織における細胞の特定のタイプに向けられたターゲティング配列を得るために、実質的に任意の組織に用いることができることを認識するであろう。本明細書において開示および主張される組成物、方法、および装置は全て、本開示に照らして不適当な実験を行うことなく作製され、実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して説明してきたが、組成物、方法、および装置、ならびに本明細書に開示の段階、または段階の順序に変更を行ってもよく、それらも本発明の概念、趣旨、および範囲に含まれることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理的に関連する特定の物質は、同じまたは類似の結果が得られれば、本明細書に記載の物質に置換してもよいことは明らかである。当業者に明らかであるそのような類似の置換基および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、および概念の範囲内であるように思われる。参照以下の参照は、これらが、例示的手法又は本明細書に記載されたもののその他の詳細を提供するという程度まで、本明細書において特に参照として組み入れられる。