"下式上式中、XはO、S、スルホニルまたはホスホノであり;X1は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y1は連結基または結合であり;X2は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y2は連結基または結合であり;A1とA2は各々水素であるか、またはA1とA2が一緒になって単結合を形成し、B1とB2は各々水素であるか、またはB1とB2が一緒になって単結合を形成し、E1とE2は各々水素であるか、またはE1とE2が一緒になって単結合を形成し、ただし、A1とA2、またはB1とB2、またはE1とE2の少なくとも1つが各々水素であるを有する還元型コルチゾール接合体。XがOでありそしてX1がウシ血清アルブミンである、請求項1に記載の還元型コルチゾール接合体。Y1がメチレンカルボニルオキシである、請求項2に記載の還元型コルチゾール接合体。X2がペルオキシダーゼであり、そしてY2が4-2,5-ジオキソ-3-{2-エチルカルボニルスルファニル}テトラヒドロ-1H-1-ピロリルメチル-1-シクロヘキサンカルボニルである、請求項3に記載の還元型コルチゾール接合体。水性組成物中の請求項1に記載の還元型コルチゾール接合体。下式上式中、XはO、S、スルホニルまたはホスホノであり;X1は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y1は連結基または結合であり;X2は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y2は連結基または結合であり;A1とA2は各々水素であるか、またはA1とA2が一緒になって単結合を形成し、B1とB2は各々水素であるか、またはB1とB2が一緒になって単結合を形成し、E1とE2は各々水素であるか、またはE1とE2が一緒になって単結合を形成し、ただしA1とA2、またはB1とB2、またはE1とE2の少なくとも1つが各々水素であるを有する還元型コルチゾール接合体の製造方法であって、下式の化合物を還元剤と反応させることを含んで成る方法。前記還元剤が水素化ホウ素塩である、請求項6に記載の方法。XがOであり、X1がウシ血清アルブミンであり、そしてY1がメチレンカルボニルオキシである、請求項7に記載の方法。X2がペルオキシダーゼである、請求項8に記載の方法。Y2が4-2,5-ジオキソ-3-{2-エチルカルボニルスルファニル}テトラヒドロ-1H-1-ピロリルメチル-1-シクロヘキサンカルボニルであり、そしてX2が西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項9に記載の方法。下式上式中、XはO、S、スルホニルまたはホスホノであり;X1は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y1は連結基または結合であり;X2は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y2は連結基または結合であり;A1とA2は各々水素であるか、またはA1とA2が一緒になって単結合を形成し、B1とB2は各々水素であるか、またはB1とB2が一緒になって単結合を形成し、E1とE2は各々水素であるか、またはE1とE2が一緒になって単結合を形成し、ただしA1とA2、またはB1とB2、またはE1とE2の少なくとも1つが各々水素であるを有する還元型コルチゾール接合体の製造方法であって、i下式の化合物を還元剤と反応させ、それにより化合物IAまたはICを形成させ;そしてii場合により、化合物IAまたはICを第一のカップリング剤と反応させて、下式の化合物上式中、G1はカップリング基であるを形成させ;iii場合により、X2を第二のカップリング剤と反応させて、X2-G2ここでG2はカップリング基G1と共に共有結合を形成することができるカップリング基であり、そしてG1とG2は同じであってもよいを形成させ;iv場合により、化合物IAまたはICをX2-G2ここでG2はX1の官能基と共有結合することができると反応させて、還元型コルチゾール接合体IBまたはIDを形成させ;v場合により、化合物IIIAまたはIIICをX2ここでG1はX2の官能基と共有結合することができると反応させて、還元型コルチゾール接合体IBまたはIDを形成させ;vi場合により、化合物IIIAまたはIIICをX2-G2と反応させて、還元型コルチゾール接合体IBまたはIDを形成させるという各段階を含んでなる方法。XがOであり、そしてX1がウシ血清アルブミンである、請求項11に記載の方法。Y1がメチレンカルボニルオキシである、請求項12に記載の方法。X2がペルオキシダーゼであり、第一のカップリング剤が4-N-マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、そして第二のカップリング剤がS-アセチルチオ酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項13に記載の方法。コルチゾールについての競合アッセイの実施方法であって、Aコルチゾールを含む疑いのある試料をiコルチゾールを結合する固定化されたまたは固定化可能なレセプターと接触させ、それにより固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合したコルチゾールと、固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合しないコルチゾールとを形成させ、ii下式上式中、XはO、S、スルホニルまたはホスホノであり;X1は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y1は連結基または結合であり;X2は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y2は連結基または結合であり;A1とA2は各々水素であるか、またはA1とA2が一緒になって単結合を形成し、B1とB2は各々水素であるか、またはB1とB2が一緒になって単結合を形成し、E1とE2は各々水素であるか、またはE1とE2が一緒になって単結合を形成し、ただしA1とA2、またはB1とB2、またはE1とE2の少なくとも1つが各々水素であり、そしてX1とX2の少なくとも1つが標識された天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であるを有する還元型コルチゾール接合体と接触させ、それにより固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体と、固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体とを形成させ;そしてB試料中のコルチゾールの量の指標として、前記固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体か、前記固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体のいずれかを検出するという各段階を含んで成る方法。XがOであり、そしてX1がウシ血清アルブミンである、請求項15に記載の方法。Y1がメチレンカルボニルオキシであり、そしてX2がペルオキシダーゼである、請求項16に記載の方法。X1がペルオキシダーゼであり、Y2が4-2,5-ジオキソ-3-{2-エチルカルボニルスルファニル}テトラヒドロ-1H-1-ピロリルメチル-1-シクロヘキサンカルボニルであり、そしてX2が西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項17に記載の方法。前記固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体から、前記固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体を分離することを更に含んで成る、請求項15に記載の方法。コルチゾールについての競合結合アッセイの実施方法であって、該方法はa展開区画、b1または複数の試薬区画、c支持体、並びに前記区画の1区画または複数区画において一緒にまたは別々に、コルチゾールを結合する固定化されたレセプター、および場合により下式上式中、XはO、S、スルホニルまたはホスホノであり;X1は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y1は連結基または結合であり;X2は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y2は連結基または結合であり;A1とA2は各々水素であるか、またはA1とA2が一緒になって単結合を形成し、B1とB2は各々水素であるか、またはB1とB2が一緒になって単結合を形成し、E1とE2は各々水素であるか、またはE1とE2が一緒になって単結合を形成し、ただしA1とA2、またはB1とB2、またはE1とE2の少なくとも1組が各々水素であり、そしてX1とX2の少なくとも1つが標識された天然もしくは合成ポリマーであるか、または標識であるを有する標識還元型コルチゾール接合体を含んで成る乾式分析要素を使用し、A前記乾式分析要素の展開区画をiコルチゾールを含む疑いのある試料と接触させ、それにより固定化されたレセプターに結合したコルチゾールと、固定化されたレセプターに結合しないコルチゾールとを形成させ、ii前記標識還元型コルチゾール接合体が乾式分析要素中に存在しない場合には、その標識還元型コルチゾール接合体と接触させ、それにより前記固定化されたレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体と、前記固定化されたレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体とを形成させ、B試料中のコルチゾールの量の指標として、前記固定化されたレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体か、前記固定化されたレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体のいずれかを検出するという各段階を含んで成る方法。XがOであり、そしてX1がウシ血清アルブミンである、請求項20に記載の方法。Y1がメチレンカルボニルオキシである、請求項21に記載の方法。X1がペルオキシダーゼであり、Y2が4-2,5-ジオキソ-3-{2-エチルカルボニルスルファニル}テトラヒドロ-1H-1-ピロリルメチル-1-シクロヘキサンカルボニルであり、そしてX2が西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項22に記載の方法。前記固定化されたレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体から、前記固定化されたレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体を分離することを更に含んで成る、請求項20に記載の方法。抗コルチゾール抗体の産生方法であって、A下式上式中、XはO、S、スルホニルまたはホスホノであり;X1は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y1は連結基または結合であり;X2は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y2は連結基または結合であり;A1とA2は各々水素であるか、またはA1とA2が一緒になって単結合を形成し、B1とB2は各々水素であるか、またはB1とB2が一緒になって単結合を形成し、E1とE2は各々水素であるか、またはE1とE2が一緒になって単結合を形成し、ただしA1とA2、またはB1とB2、またはE1とE2の少なくとも1つが各々水素であるを有する還元型コルチゾール接合体を用いて宿主動物を免疫し、それによりコルチゾールを結合する抗体を産生させ;B前記宿主動物の血清または血漿からコルチゾールを結合する抗体を単離し;またはC抗体産生細胞を含有する脾臓、リンパ系組織または他の組織を取り出し;D前記抗体産生細胞を取り出し;E前記抗体産生細胞からハイブリドーマを作製し;Fコルチゾールを結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し;そしてGコルチゾールを結合する抗体を単離するという各段階を含んで成る方法。市販のコルチゾールアッセイは、上述したステロイドの全てと交差反応を示し得る。例えば、10より大きい11-デオキシコルチゾールとの交差反応性が観察されており、これはコルチゾールについてのアッセイの正確度を大きく害する。コルチゾールについての従来技術のアッセイに伴う課題は、本明細書に記載する接合体標識を使って解決される。本発明は、新規還元型コルチゾール接合体を含んで成る組成物、それらの製造方法およびコルチゾールについてのイムノアッセイにおけるそれらの使用方法に関する。別の面では、本発明は、抗コルチゾール抗体または抗還元型コルチゾール抗体を惹起させるための免疫原またはハプテンとしての還元型コルチゾールの接合体に関する。意外にも、本発明の標識還元型コルチゾール接合体が、抗コルチゾール抗体への結合を目当てにコルチゾール様ステロイドと効率的に競争し、それによって従来技術の標識コルチゾール接合体と比較して有意に低い交差反応性を示すことがわかった。本発明の標識還元型コルチゾール接合体を含んで成るコルチゾールについてのイムノアッセイは、コルチゾールの測定のための改善された特異性と感受性の両方を示す。従って、本発明は、下式上式中、XはO、S、スルホニルまたはホスホノであり;X1は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y1は連結基または結合であり;X2は標識されたもしくは未標識の天然もしくは合成ポリマーであるかまたは標識であり;Y2は連結基または結合であり;A1とA2は各々水素であるか、またはA1とA2が一緒になって単結合を形成し、B1とB2は各々水素であるか、またはB1とB2が一緒になって単結合を形成し、E1とE2は各々水素であるか、またはE1とE2が一緒になって単結合を形成し、ただしA1とA2、またはB1とB2、またはE1とE2の少なくとも1つが各々水素であるを有する還元型コルチゾール接合体を提供する。別の面では、本発明は還元型コルチゾール接合体の製造方法にも関する。従って、本発明者らは、下式上式中、X,X1,Y1,X2,Y2,A1,A2,B1,B2,E1およびE2は前に定義した通りであるを有する還元型コルチゾール接合体の製造方法であって、下式の化合物を還元剤と反応させることを含んで成る方法を提供する。本発明者らは、下式上式中、X,X1,Y1,X2,Y2,A1,A2,B1,B2,E1およびE2は前に定義した通りであるを有する還元型コルチゾール接合体の別の製造方法であって、i下式の化合物を還元剤と反応させ、それにより化合物IAまたはICを形成させ;そしてii場合により、化合物IAまたはICを第一のカップリング剤と反応させて、下式の化合物上式中、G1はカップリング基であるを形成させ;iii場合により、X2を第二のカップリング剤と反応させて、X2-G2ここでG2はカップリング基G1と共に共有結合を形成することができるカップリング基であり、そしてG1とG2は同じであってもよいを形成させ;iv場合により、化合物IAまたはICをX2-G2ここでG2はX1の官能基と共有結合することができると反応させて、還元型コルチゾール接合体IBまたはIDを形成させ;v場合により、化合物IIIAまたはIIICをX2ここでG2はX2の官能基と共有結合することができると反応させて、還元型コルチゾール接合体IBまたはIDを形成させ;vi場合により、化合物IIIAまたはIIICをX2-G2と反応させて、還元型コルチゾール接合体IBまたはIDを形成させることを含んでなる方法も提供する。別の面では、本発明は、新規標識還元型コルチゾール接合体を使用するコルチゾールの定性または定量測定方法に関する。従って、コルチゾールについての競合アッセイの実施方法であって、Aコルチゾールを含む疑いのある試料をiコルチゾールを結合する固定化されたまたは固定化可能なレセプターと接触させ、それにより固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合したコルチゾールと、固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合しないコルチゾールとを形成させ、ii前に定義した式IA,IB,ICまたはIDの標識還元型コルチゾール接合体と接触させ、それにより固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体と、固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体とを形成させ;B試料中のコルチゾールの量の指標として、前記固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体か、前記固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体のいずれかを検出するという各段階を含んで成る方法を提供する。別の態様では、上述したアッセイ方法に、固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体から、固定化されたまたは固定化可能なレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体を分離するという段階を組み合わせることができる。更に、コルチゾールについての競合結合アッセイの別の実施方法であって、該方法はa展開区画、b1または複数の試薬区画、c支持体、並びに前記区画の1区画または複数区画において一緒にまたは別々に、コルチゾールを結合する固定化されたレセプター、および場合により前に定義した式IA,IB,ICまたはIDの標識還元型コルチゾール接合体を含んで成る乾式分析要素を使用し、A前記乾式分析要素の展開区画をiコルチゾールを含む疑いのある試料と接触させ、それにより固定化されたレセプターに結合したコルチゾールと、固定化されたレセプターに結合しないコルチゾールとを形成させ、ii前記標識還元型コルチゾール接合体が乾式分析要素中に存在しない場合には、その標識還元型コルチゾール接合体と接触させ、それにより前記固定化されたレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体と、前記固定化されたレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体とを形成させ;B場合により、前記固定化されたレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体から前記固定化されたレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体を分離し;そしてC試料中のコルチゾールの量の指標として、前記固定化されたレセプターに結合した標識還元型コルチゾール接合体か、前記固定化されたレセプターに結合しない標識還元型コルチゾール接合体のいずれかを検出するという各段階を含んで成る方法も提供する。別の面では、本発明は前に定義した式IA,IB,ICまたはIDのハプテンまたは免疫原およびそのような免疫原を含んで成る組成物に関する。本発明はまた、抗コルチゾール抗体の産生方法であって、本発明の免疫原を使用して宿主動物を免疫し、前記宿主動物から血液を採取し、そして前記宿主動物の血清または血漿からコルチゾールを結合する抗体を分離することを含んで成る方法にも関する。別の関連した方法では、免疫した宿主動物から抗体産生細胞が存在する脾臓、胸腺または他の組織を除去し、除去された前記脾臓、胸腺または他の組織の抗体産生細胞を使って抗体を分泌するハイブリドーマを作製し、そしてコルチゾールを結合する抗体を選択する。別の態様では、本発明は、コルチゾールについてのイムノアッセイにおける交差反応性を減少させる方法であって、式IA,IB,ICまたはIDの標識還元型コルチゾール接合体を使用することを含んで成る方法にも関する。上述した本発明の標識還元型コルチゾール接合体は、抗コルチゾール抗体への結合を目当てにコルチゾール様ステロイドと効率的に競争し、それによって従来技術の標識コルチゾール接合体と比較して有意に少ない交差反応性を示す。ウシ血清アルブミンと西洋ワサビペルオキシダーゼを含んで成る特定の還元型コルチゾール接合体に関して本発明を詳細に説明する。これは、本発明を例示するために行うのであって、決してこの特定例に本発明を限定するつもりではない。別の還元型コルチゾール接合体、それらの合成、および免疫原としての使用または競合もしくは非競合イムノアッセイにおける還元コルチゾール標識としての使用、並びに本明細書中に与えられる教示から明らかであるかまたは当業者に既知である他の面も包含される。本発明の目的上、天然ポリマーは、下記のものを含むがそれに限定されない生物学的起源より得られるものとして定義される:微生物、真菌、ウイルス、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ネコ、イヌ、ラットまたは昆虫。そのような天然ポリマーとしては、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、並びにそれらの組換え種および化学的に修飾された種、多糖類、セルロース、コラーゲン、並びにラテックスが挙げられる。幾分具体的な例としては、デキストラン、ブタ、ヒト、マウス、ラットおよびウシ血清アルブミンまたはグロブリン、ストレプトアビジン、抗体、酵素、例えばペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。合成ポリマーは、本明細書中では必ずしも生物学的起源より直接得られないポリマーとして定義される。それは当業者に周知である方法により調製されるものである。例えば、乳化重合、イオン重合、カルボニル重合、ラジカル重合などを使ったモノマー縮合によって調製される。合成ポリマーとしては、ホモポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリスチレン、置換ポリアクリルアミド、ポリメタクリルレートおよびポリスチレン、並びに2以上の異なるモノマー単位を含んで成るコポリマー、例えばアクリルアミドまたは置換アクリルアミド、スチレンおよび置換スチレンなどが挙げられ、それらは当業者に周知であろう。それはブロックコポリマー、グラフトコポリマー、水性可溶性および水性不溶性ポリマー、並びに天然ポリマーとの共有結合および非共有結合体も包含する。本明細書中で定義される用語標識としては、例えば吸収、蛍光もしくは反射分光光度法、または放射線検出法を使って、直接または間接的に検出することができる化学要素、化合物および酵素が挙げられる。標識は天然または合成ポリマーであってもよい。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは標識と天然ポリマーの両方である。しかし標識は必ずしも天然または合成ポリマーでなくてもよい。直接検出できる標識は、本質的に検出可能なシグナルを生成することができるものである。そのような標識としては、蛍光またはリン光を生成できる有機および無機物質、例えば非限定的にフルオレセインおよびその誘導体、並びにN-3-フルオロアントリルマレイミド、放射性核種、例えば炭素14、トリチウムおよびリン32などが挙げられる。適当なスペクトル吸収を有する物質、例えば非限定的にアゾ-オキソ、アゾ-テトラゾ、アジン、オキサジン、チアジン、キノリン、インダミン、ピロンおよびピラゾロン色素も含まれる。間接検出できる標識は、検出可能なシグナルの生成のために1または複数の追加の物質の存在を必要とする。そのような標識としては、典型的には、1または複数の基質、補因子、金属などの存在を必要とする酵素が挙げられるが、それらに限定されない。ペルオキシダーゼ、特に一般的な標識である西洋ワサビペルオキシダーゼは、化学発光生成物または色素を生成するのに、それぞれ電子供与体と酸化剤、例えばルミノール、ジ-もしくはトリアリールイミダゾールロイコ色素および過酸化水素を必要とする。他の酵素、例えばβ-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなども含まれる。一般に、標識としては放射性標識、酵素、発色団、蛍光団、安定な遊離基、並びに酵素補因子、阻害剤およびアロステリックエフェクターが挙げられる。本発明の目的上、還元剤は、二重結合、例えば炭素-炭素、炭素-窒素、炭素-酸素および炭素-硫黄二重結合を水素化することができる任意の化合物または試薬混合物である。有用な還元剤としては、非限定的に、水素化アルミニウム、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素、およびそれらの塩が挙げられる。パラジウム、白金もしくはニッケル上での接触水添、または他の水素化法を使用することもできる。水素化ホウ素ナトリウムが好ましい還元剤である。連結基は、本明細書中では、1または複数の原子を含んで成る化学基として定義される。連結基は、各分子との共有結合を通して、例えば天然ポリマーを天然ポリマーに、合成ポリマーを合成ポリマーに、天然ポリマーを合成ポリマーに、標識を天然または合成ポリマーに、標識を還元型コルチゾールに、標識をコルチゾールになどというように或る分子を別の分子に結合する。連結基は、置換されたまたは未置換の直鎖また分枝鎖アルキルまたはヘテロアルキル、例えばオキシアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、置換されたもしくは未置換のアルケニル、単置換もしくは多置換されたまたは未置換の炭化水素複素環、単置換もしくは多置換されたまたは未置換のアリールまたはヘテロアリール環、例えば非限定的に、イミダゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、ピリダジル、ピリミジル、ピラジニル、キノリニルおよびキナゾリニルが挙げられる。別の巨大分子への天然および合成ポリマーのような巨大分子の連結もしくはカップリング、または巨大分子へのコルチゾールまたはコルチゾールの類似体のような小分子の連結は当該技術分野で周知である。コルチゾールに特に関連して、炭素3C3は求核試薬、例えばアミン、オキシムおよびチオオキシム並びに当該技術分野で既知の他のものと反応性である。求核性種は、カップリング結合剤、標識、天然または合成ポリマーであることができる。コルチゾールのC3に共有結合する際に、それがカップリング剤または反応性官能基を有する他の種例えば標識である場合、それは別のカップリング剤または適当な反応性官能基を有する他の種と更に反応させることができる。そのように誘導体化されたコルチゾールは、本発明の還元型コルチゾール化合物を調製するための出発点として使用することができる。カップリング化学および連結基の詳細は、多数の刊行物中に見つけることができ、例えば、米国特許第3654090号;同第3791932号;同第3875011号;同第4016043号;同第4040907号;同第4092479号;同第4213894号;同第4243749号;同第4376165号;同第4410643号;同第4752658号;同第4828978号;同第4879249号;同第4997772号;同第5053497号;同第5106732号;同第5147777号;同第5155166号;同第5162219号;同第5177023号;同第5284948号;同第5298403号;同第5308749号;同第5374516号;同第5391483号;同第5397695号;同第5401633号;同第5527709号;同第5543311号;同第5578457号;同第5652346号;同第5763588号;同第5770390号明細書およびその中に引用された参考文献;Yoshitake他EurJBiochem101395およびTjssenLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology221278頁およびその中に引用された参考文献中に見つけることができる。簡単に言えば、連結基およびそれに共有結合される分子は、アミド、エステル、エーテル、チオエステルおよびジスルフィド結合を会して連結され得る。例えば分子を縮合剤例えばカルボジイミド、マレイミド、エチルクロロホルメートおよびグルタルアルデヒドとカップリングさせるために分子を反応させることを含むカップリングおよび連結化学は、当該技術分野で周知である。試料なる語は、着目の分析物を含むことがある任意の物質を言う。試料は生物学的液体、例えば脳脊髄液、精液、膣分泌物、痰、腹水、涙液、汗、血清、血漿、尿、全血、赤血球、白血球および血小板などの全血成分、並びに着目の分析物を含む場合がある他の体液または体組織であることができる。場合により、試料は水、土壌および植物から得られる。自然の免疫反応を利用するイムノアッセイは、臨床化学における分析手段として広範囲な用途が見出されている。反応の特異性のために、イムノアッセイは生物学的液体中にごく低濃度で存在する生物学的分析物を定量する場合に特に有利である。そのような分析物としては、例えば、抗体、治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン、タンパク質などが挙げられる。競合結合イムノアッセイでは、標識分析物この用語は免疫応答能のある分析物の類似体も包含するが、一定量の適当なレセプターこれはしばしば固体支持体上に固定化されているか、またはそれに固定化することができるとの反応を目当てに未標識の分析物と競争状態に置かれる。レセプターに結合した標識分析物を遊離の標識分析物から分離する。分析物の未知濃度は、結合した標識分析物かまたは遊離の標識分析物のいずれかの測定シグナルから求めることができる。反応は次のように進行する:イムノアッセイは溶液中で、可溶性成分と不溶性成分を分離できる試験装置中で、または乾式分析要素中で実施することができる。イムノアッセイは不均一または均一アッセイであることができ、これらの用語は当該技術分野で既知である。不均一アッセイでは、シグナル測定の前に、結合した標識免疫反応体と遊離の標識免疫反応体標識分析物または分析物に対する標識レセプターが分離され;一方、均一アッセイでは、結合した標識免疫反応体から遊離の標識免疫反応体を分離する必要がない。本発明の還元型コルチゾール接合体は、均一アッセイと不均一アッセイの両方に使用できる。連結基およびカップリング化学に関する多数の上記刊行物も包含する、イムノアッセイおよびイムノアッセイ法に関する多数の刊行物が入手可能である。追加の刊行物としては次のものが挙げられる:米国特許第4372745号;同第4670381号;同第4483921号;同第4517288号;同第4822747号;同第4824778号;同第4829012号;同第4839299号;同第4847194号;同第4847195号;同第4853335号;同第4855226号;同第4857453号;同第4857454号;同第4859610号;同第4863876号;同第4868106号;同第4868130号;同第4879219号;同第5663054号;同第5776973号明細書およびその中に引用された参考文献;並びにImmunoassaysintheClinicalLaboratoryNakamura他編AlanRLissIncQuantitativeEnzymeImmunoassayEngvell他編BlackwellScientificPublicationsClinicalChemistrySommer他Vol3217701774頁ClinicalChemistrySommer他201206頁APrimerforMultilayerImmunassayBerkeAmericanChemicalSocietyConferenceProceeding303312頁PlenumPressおよびその中に引用された参考文献。競合イムノアッセイでは、標識分析物と遊離の分析物を含む試料とを同時にまたは別々に、該分析物を結合する固定化されたまたは固定化可能なレセプターを含む混合物に添加することができる。乾式分析要素の場合、標識分析物と固定化されたレセプターは、試料との接触前に要素中に一緒に存在する場合、好ましくは別々の区画に存在する。乾式薄膜分析要素を組み立てるための常用の材料および手段は、例えば、米国特許第3867258号;同第3992158号;同第4042435号;同第4050898号;同第4066403号;同第4153668号;同第4258001号;同第4292272号および同第4430436号明細書に記載されている。適当な宿主動物を免疫することにより特定の分子を結合する抗体を獲得する方法は周知である。そのような方法は十分に確立されており、そして例えば、次の刊行物に記載されている:MethodsinImmunologyGarveyJSCremerNESussdorfDHWABenjaminInc第3版およびHandbookofExperimentalImmunologyWeirDM編BlackwellScientificPublications第3版。抗体の分泌のためのハイブリドーマ細胞系の作製方法も周知であり、例えば、米国特許第4950592号;同第5338671号および同第5650324号明細書に記載されている。HRP標識還元型コルチゾール-3-CMO-BSAの調製下記に西洋ワサビペルオキシダーゼHRP標識還元型コルチゾール接合体の調製方法を与える。この方法では、水素化ホウ素ナトリウムでのウシ血清アルブミン-コルチゾールオキシム接合体コルチゾール-3-CMO-BSAの還元を、HRPとの接合前に実施した。しかしながら、コルチゾールの還元はHRPとのカップリングの後に実施することができる。コルチゾール-3-CMO-BSAの還元部位は3箇所あり、それらは下記に示す構造中に星印により記してある。これらの部位のいずれかまたは全部を、二重結合を水素化することができる還元剤または還元性混合物での処理により還元すると、当業者には容易に明らかなように、下記に示す構造のように1部位だけが還元された生成物:並びに、それらの部位のいずれか2部位が還元された化合物3つの異なる還元種を与える、および3部位全部が還元された化合物を与えることができる。コルチゾールを含んで成る他の接合体は、還元すると構造IA,IBおよびIDに包括的に示される化合物を生じるが、コルチゾール-3-CMO-BSAについて前に例示したような還元型コルチゾール種とは異なる還元種を生成するだろう。水素化できないコルチゾールのC3に共有結合を有する化合物は、コルチゾールの環炭素-炭素二重結合および/または炭素-酸素二重結合カルボニル基のところだけで還元されるだろう。全ての還元形態が個々にまたは任意の組合せで本発明に含まれる。実施例1:ウシ血清アルブミンに結合した3-コルチゾールカルボキシメチルオキシムの調製3-CMO-BSAヒドロコルチゾン-3-O-カルボキシメチルオキシム:ウシ血清アルブミンコルチゾール-3-CMO-BSAを下記に記載の通り調製した。あるいは、それはSigmaChemicalCoStLouisMissouriより購入することができる。20mgのN-ヒドロキシスクシンイミドNHSを30mLのジオキサンに溶かすことにより、NHSの原液を調製した。30mgのジシクロヘキシルカルボジイミドDCCを250mLのジオキサンに溶かすことによりDCCの原液を調製した。40mgのコルチゾール-3-カルボキシメチルオキシムコルチゾール-3-CMOの入ったガラス製バイアルに、1744mLのNHS原液と1744mLのDCC原液を添加した。混合物を攪拌しそして周囲温度で3時間インキュベートした。100gのウシ血清アルブミンBSAに12mLの01M炭酸水素ナトリウム溶液を添加した。この溶液を透明になるまで混合し、そして3時間インキュベーションの終わりに、このBSA溶液に30mLの活性化コルチゾール-3-CMOを添加した。混合物を攪拌し、周囲温度で2時間インキュベートした。2時間のインキュベーション後、01Mリン酸ナトリウム03M塩化ナトリウム緩衝液pH6015mLを添加した。50μmと045μmのSartoriusMinisartsを通して混合物を濾過し、次いで80mL/分の流速で5×70cmのSuperdex200PGカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。主ピークに相当する最初の試験管と、その後の10画分1分間ずつを収集し、そしてプールした。プールした画分を水に対して約15時間透析した。透析を繰り返した。透析物を02μmSartoriusMinsartを通して濾過し、次いで少量のアリコートを凍結乾燥し、必要になるまで凍結保存した。実施例2:コルチゾール-3-CMO-BSAの還元および活性化コルチゾール-3-CMO-BSA24mgを50mM炭酸ナトリウムと100mM塩化ナトリウムの溶液pH954mL中に溶かした。水素化ホウ素ナトリウムの水溶液4mgmLの060mLアリコートをコルチゾール-3-CMO-BSA溶液に添加し、次いで20°Cで30分間連続攪拌した。次いで約200μLの05Mリン酸ナトリウム溶液を使って、pH72~75の範囲内の値にpHを調整して過剰な水素化ホウ素を分解した。発泡が静まるまで溶液を穏やかに混合し、約15分間放置しておいた。次いで反応混合物を045μmフィルターを通して濾過し、そして002Mリン酸塩pH70で予め平衡化しておいたSephadexG2516×145cmカラム上で約40mL時間の流速でクロマトグラフィーを行った。集めた画分サイズは約067mL1分間であった。最も濃縮された15画分、即ち、280nmで大きな吸収を有する画分をプールした。スクシンイミジル4-N-マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレートSMCCを96mg/mLの最終濃度になるようにN,N-ジメチルホルムアミドDMF中に溶かした。上記のクロマトグラフィー段階より収集した還元型コルチゾール-3-CMO-BSA10mLに、SMCC溶液186μLを添加した。この溶液を穏やかに混合し、次いで20°Cで1時間インキュベートした。800μLのグリシン水溶液10重量/容量を使って反応をクエンチングした。クエンチングした反応混合物を、01Mリン酸塩5mMエチレンジアミン四酢酸EDTAの溶液pH60で予め平衡化しておいたSephadexG25を充填した32×10cmカラム上で約161mL/時間の流速でクロマトグラフィーを行った。1mL画分を集めた。最も濃縮された8画分280nmで大きな吸収を有するをプールし、そして活性化HRPへの接合に使用した。実施例3:HRPの活性化西洋ワサビペルオキシダーゼを10mgmLの最終HRP濃度になるように01Mリン酸塩pH75に溶かした。このHRP溶液5mLを20mLの反応バイアルに移した。HRP溶液を含む反応バイアルに、DMF中のS-アセチルチオ酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルSATA溶液25mgmLの05mLアリコートを添加した。この溶液を穏やかに混合し、次いで20°Cで60分間インキュベートした。005MEDTAと25Mヒドロキシルアミンを含む溶液pH70のアリコート500μLを反応混合物に添加し、穏やかに混合し、次いで20°Cで15分間インキュベートした。次いで混合物を、約63mL分の流速を使って、01Mリン酸塩5mMEDTA溶液pH60で予め平衡化されたSephadexG25の20×10cmカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。1分間ずつ画分を集めた。最も濃縮された11画分403nmで大きな吸収を有するをプールした。実施例4:活性化HRPと活性化された還元型コルチゾール-3-CMO-BSAとのカップリング活性化された還元型コルチゾール-3-CMO-BSA2147mLを活性化HRP1155mLと合わせた。溶液を穏やかに混合し、そして20°Cで20時間インキュベートした。メルカプトエタノールを含む水溶液容量で1のチオールのアリコート224μLを反応混合物に添加し、生じた溶液を穏やかに混合し、そして約15分間放置しておいた。次いで、DMF中に10mgmLのN-エチルマレイミドを含む溶液の476μLアリコートを反応混合物に添加し、そして混合した後、更に20分間インキュベートした。反応混合物を、約344mL/時間の流速を使って、01Mリン酸塩03MNaCl溶液pH60で予め平衡化されたSuperdex200を充填した44×50cmカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。1分間ずつ画分を集めた。280nmで大きな吸収を有する最初の溶出液のあたりを中心として最も濃縮された26画分をプールした。接合体プールcjの吸収とHRP溶液実施例2に記載,活性化前で且つ正確な吸収測定値を得るためにリン酸緩衝液中に十分に希釈する前の吸収を280nmと403nmで測定したそれぞれA403cj,A280cjおよびA403HRPA280HRP。BSA濃度に基づいた還元型コルチゾール-3-CMO-BSA-HRP接合体の濃度を、それらの測定値から次の式を使って求めた:BSAmgmL=A280cj-A403cj/A403HRP/A280HRP/076実施例4:接合体の評価HRP標識還元型コルチゾール-3-CMO-BSA以後、HRP-RC接合体と称するの評価は、オルソ-クリニカルダイアグノスティクス社のVITROSECi化学発光アッセイ方法論を使って評価した。VITROSECi系での使用のために下記の試薬を調製した。標識溶液:-100ngmLの還元型コルチゾール-3-CMO-BSA-HRPまたは、本発明の接合体標識でないけれども、還元段階を除いて本発明の標識と同じ手順で担持された、20ngmLの比較用HRP-コルチゾール接合体標識-286gLの第二リン酸ナトリウム,無水-73gLの第一リン酸ナトリウム,一水和物-001gLのフェリシアン酸カリウム-25gLの8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸-20gLのウシ血清アルブミン-003gLのアポ西洋ワサビペルオキシダーゼ-02のウシαグロブリンCohn画分IVI-1gLのウシγグロブリン-5gLの正常ヒツジ血清-100gLの活性炭処理したヒト血漿-20gLのKathon5-クロロ-2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オンと2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オンを含む保存剤-pH64ビオチン化ヒツジポリクローナル抗コルチゾール溶液:-15μgmLのビオチン化ヒツジ抗コルチゾールγグロブリン-21gLの第二リン酸ナトリウム,無水-18gLの塩化ナトリウム-11gLのクエン酸-20gLのウシ血清アルブミン-20gLのKathon-pH54洗浄試薬:-039gLのホウ酸-035gLの四ホウ酸二ナトリウム-058gLの塩化ナトリウム-050gLのTRITONX100オクチルフェノキシポリエトキシエタノール-05wwBRONIDOX5-ブロモ-5-ニトロ-1,3-ジオキサンを含む保存剤-pH84シグナル試薬:A部-388gLのホウ酸-142gLの四ホウ酸ナトリウム-106gLのクエン酸ナトリウム-008gLの安息香酸ナトリウム-010gLのアジ化ナトリウム-0008gLのジエチレントリアミンペンタ酢酸-058gLのグリシン-040gLのルミノールB部-090gLのクエン酸-168gLのクエン酸ナトリウム-008gLの安息香酸ナトリウム-062gLの過ホウ酸ナトリウム-006gLの3-クロロ-4-ヒドロキシアセトアニリド-584gLの塩化ナトリウム抗コルチゾールビオチン化ヒツジ抗体のアリコート75μL、コルチゾールまたはコルチゾールに構造的に類似しているステロイドを含む血清後述の試料30μL、およびHRP-RC接合体75μLを、ストレプトアビジンが予め結合されているVITROSECi試料容器に添加した。溶液を37°Cで30分間インキュベートし、次いで上記の洗浄試薬を使って洗浄した。上記シグナル試薬溶液の200μLアリコートA部100μLとB部100μLを使用直前に混合したものを試料容器に添加した。溶液を37°Cで5分間インキュベートし、次いで化学発光強度を測定した。実施例5:交差反応性上記方法を使って、一定量の抗コルチゾール抗体に結合した一定量の比較用HRP標識コルチゾール接合体非還元型コルチゾール、HRP-NRCまたはHRP-RC接合体の50を置換する潜在的な交差反応体コルチゾールに構造的に類似しているステロイド:11-デオキシコルチゾール、プレドニソロン、コルチコステロンおよびコルチゾンの濃度を測定した。様々なレベルの潜在的な交差反応体を、比較用標識コルチゾール接合体非還元型コルチゾール、HRP-NRCまたは本発明のHRP-RC接合体のいずれかを含む試料容器へと添加した。到達し得る最大値全ての接合体が置換された値の50に相同する光シグナル測定値を生じる交差反応体の濃度を測定し、それを使って後述のように交差反応性を計算した。その結果を表1に列挙する。交差反応性は、上述のアッセイ方法ごとに測定した、HRP-NRC比較用接合体またはHRP-RC接合体の50を置換するコルチゾールの濃度を、HRP-NRCひ比較用接合体またはHRP-RC接合体の50を置換する交差反応体の濃度で割った値に、100を乗じた値として定義される。これらのデータは、本発明の代表的なHRP-RC接合体が、コルチゾールについてのイムノアッセイにおいて有意に低い交差反応性を提供することを示す。従って、本発明の標識還元型コルチゾールを使ったコルチゾールアッセイは、改善された正確度を示し、改善された診断、治療および追跡を提供するだろう。"