"IL-2Rβに対する平衡解離定数が、野生型のヒトIL-2hIL-2のものより小さい、IL-2Rβ結合タンパク質。IL-2ムテインである、請求項1に記載の結合タンパク質。野生型のhIL-2に従い番号付けされた24、65、74、80、81、85、86、89、92、および93位における1または複数のアミノ酸置換からなる、請求項2に記載のムテイン。74位がアルギニンである、請求項3に記載のムテイン。85位がバリンである、請求項3に記載のムテイン。以下の置換:80F、81D、85V、86I、89I、92F、および93Vを有する、請求項3に記載のムテイン。以下の置換:74S、80L、81T、85V、86I、89I、92F、および93Vを有する、請求項3に記載のムテイン。以下の置換:80F、81D、85V、86V、89I、92F、および93Vを有する、請求項3に記載のムテイン。前記ムテインが、IL-2RβとIL-2Rγとの間の相互作用を阻害する、請求項2に記載の結合タンパク質。野生型のhIL-2に従い番号付けされた18、22、24、65、74、80、81、85、86、89、92、93、および126位における1または複数のアミノ酸置換からなる、請求項9に記載のムテイン。以下の置換:18R、22E、80F、81D、85V、86I、89I、92F、93V、および126Tを有する、請求項10に記載のムテイン。以下の置換:18R、22E、74S、80L、81T、85V、86I、89I、92F、93V、および126Tを有する、請求項10に記載のムテイン。以下の置換:18R、22E、80F、81D、85V、86V、89I、92F、93V、および126Tを有する、請求項10に記載のムテイン。ヒトIL-2を突然変異させ、これにより、第1世代のIL-2ムテインを生成させる工程と、野生型のヒトIL-2のものより小さい、インターロイキン2受容体βに対する平衡解離定数を有する第1世代のIL-2ムテインを同定する工程と、同定された第1世代のIL-2ムテインを突然変異させ、これにより、第2世代のIL-2ムテインを生成させる工程と、野生型のIL2と比較してより低い程度で、インターロイキン2受容体γに結合し、かつ/またはインターロイキン2受容体γを介してシグナル伝達する第2世代のIL-2ムテインを同定し、これにより、IL-2結合タンパク質を生成させる工程と、を含む方法によって生成されるIL-2結合タンパク質。野生型IL-2と比べて低減したインターロイキン2受容体γへの結合を示す、請求項1に記載の結合タンパク質。野生型IL-2と比べて低減したインターロイキン2受容体γへの結合および/またはインターロイキン2受容体γを介するシグナル伝達を示す、請求項1または15に記載の結合タンパク質。0012IL-2は、免疫系に対して広範な効果を及ぼし、免疫の活性化およびホメオスタシスの両方を制御するのに極めて重要な役割を果たす。免疫系刺激剤として、IL-2は、がんおよび慢性ウイルス感染の治療において用いられている。IL-2の刺激効果はまた、自己免疫および移植拒絶を媒介し、被害も引き起こす。免疫の制御および免疫疾患におけるその手段的役割のために、品質を改善したIL-2分子の同定は、なお活発な研究領域であり続けている。0013これらの目的のため、本開示は、IL-2がその同源の受容体とどのように相互作用するのかについての洞察に基づき、新規のIL-2組成物を提供する。大半の状況では、IL-2が、3つの異なる受容体:IL-2Rα、IL-2Rβ、およびIL-2Rγを介して作用する。休止T細胞など、大半の細胞は、IL-2に対するアフィニティーが低いIL-2RβおよびIL-2Rγのみを発現するので、IL-2に応答しない。刺激されると、休止T細胞は、比較的高アフィニティーのIL-2受容体であるIL-2Rαを発現する。IL-2のIL-2Rαへの結合は、この受容体をIL-2RβおよびIL-2Rγに逐次的に会合させ、T細胞の活性化をもたらす。0014IL-2を介する刺激が、IL-2Rαの会合をもはや必要としないように、IL-2のその受容体との相互作用についての構造解析に基づき、野生型IL-2と比較した場合に、IL-2Rβに対するアフィニティーを比較的増大させたIL-2の突然変異体フォームを作製した。このような突然変異体は、強力なIL-2シグナル伝達アゴニストである。0015したがって、一実施形態では、IL-2Rβに対する平衡解離定数が、野生型のヒトIL-2のものより小さいIL-2Rβ結合タンパク質が開示される。0016これらの新規のスーパーアゴニストIL-2分子を出発点として用いて、IL-2Rβに結合することが可能であり、IL-2RβのIL-2Rγとの相互作用および受容体のシグナル伝達を低減するスーパーアンタゴニストも作製した。0017他の実施形態では、IL-2Rβ結合タンパク質を生成させる方法であって、ヒトIL-2を突然変異させ、これにより、第1世代のIL-2ムテインを生成させる工程と、野生型のヒトIL-2のものより小さいインターロイキン2受容体βに対する平衡解離定数を有する第1世代のIL-2ムテインを同定する工程と、同定された第1世代のIL-2ムテインを突然変異させ、これにより、第2世代のIL-2ムテインを生成させる工程と、野生型のIL2より低い程度でインターロイキン2受容体γに結合し、かつ/またはこれを介してシグナル伝達する第2世代のIL-2ムテインを同定し、これにより、IL-2結合タンパク質を生成させる工程とを包含する方法が記載される。0018これらのIL-2ムテインをまとめて、スーパー2と称する。0027本明細書の以下および全体では、本開示をより容易に理解させるために、特定の用語および語句が定義される。定義0028本明細書で引用される全ての参考文献は、全体が示されたと仮定した場合と同様に、参照によりそれらの全体において組み込まれる。別段に規定しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Singletonら、DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology、3版、J.WileySonsNewYork、NY2001;March、AdvancedOrganicChemistry:Reactions,MechanismsandStructure、5版、J.WileySonsNewYork、NY2001;ならびにSambrookおよびRussell、MolecularCloning:ALaboratoryManual、3版、ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarbor、NY2001は、当業者に、本開示で用いられる多くの用語への一般的な指針をもたらす。必要に応じ、市販のキットおよび試薬の使用を伴う手順は、別段に言及しない限り、一般に製造元により規定されたプロトコールおよび/またはパラメータに従い実行する。0029本明細書で用いられるIL-2とは、天然であれ、組換えであれ、野生型IL-2意味する。Fujitaら、PNASUSA、80、7437-74411983に記載される通り、成熟ヒトIL-2は、133アミノ酸の配列N末端のさらなる20アミノ酸からなるシグナルペプチドの分だけ短いとして生じる。ヒトIL-2配列番号1のアミノ酸配列は、Genbank受託番号:NP_000577.2下に見出される。成熟ヒトIL-2のアミノ酸配列を、配列番号2に示す。マウスMusmusculusIL-2のアミノ酸配列は、Genbank受託番号:配列番号3下に見出される。成熟マウスIL-2のアミノ酸配列を、配列番号4に示す。0030本明細書で用いられるIL-2ムテインとは、インターロイキン2タンパク質に対して特異的な置換がなされているポリペプチドを意味する。例えば、図3は、12のIL-2ムテインおよびそれらの対応するIL-2Rβに対する相対結合アフィニティーを開示する。IL-2ムテインはまた、天然のIL-2ポリペプチド鎖のうちの1もしくは複数の部位または他の残基におけるアミノ酸の挿入、欠失、置換、および修飾も特徴とする。本開示に従い、任意のこのような挿入、欠失、置換、および修飾は、IL-2Rβへの結合活性を保持するIL-2ムテインを結果としてもたらす。例示的なムテインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のアミノ酸の置換を包含しうる。0031ムテインはまた、IL-2の他の位置すなわち、ムテインの二次構造または三次構造に対して及ぼす効果が最小限の位置における保存的修飾および保存的置換も包含する。このような保存的置換には、Dayhoff、AtlasofProeinSequenceandStructure、51978、およびArgos、EMBOJ.、8:779-7851989により記載される保存的置換が含まれる。例えば、以下の群のうちの1つに属するアミノ酸は、保存的変化を表す群I:ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr;群II:cys、ser、tyr、thr;群III:val、ile、leu、met、ala、phe;群IV:lys、arg、his;群V:phe、tyr、trp、his;および群VI:asp、glu。0032IL-2に従い番号付けされたとは、そのアミノ酸が野生型IL-2の成熟配列において通常生じる位置を基準として選択されたアミノ酸を同定することを意味し、例えば、R81とは、配列番号2において生じる81位のアミノ酸であるアルギニンを指す。0033IL-2Rαβγ受容体を有する細胞型という用語は、この受容体型を有することが知られる細胞、すなわち、T細胞、活性化したT細胞、B細胞、活性化した単球、および活性化したNK細胞を意味する。IL-2Rβγ受容体を有する細胞型という用語は、この受容体型を有することが知られる細胞、すなわち、B細胞、休止単球、および休止NK細胞を意味する。0034ポリペプチド配列またはDNA配列に関して本明細書で用いられる同一性という用語は、2つの分子間におけるサブユニット配列の同一性を指す。両方の分子におけるサブユニットの位置が、同じ単量体のサブユニットすなわち、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められていれば、その分子は、その位置において同一である。2つのアミノ酸配列または2つのヌクレオチド配列の間の類似性とは、同一な位置の数の比例関数である。一般に、配列は、最高次のマッチが得られるように割り当てる。必要な場合、同一性は、公表されている技法およびGCSプログラムパッケージDevereuxら、NucleicAcidsRes12387、1984、BLASTP、BLASTN、FASTAAtschulら、JMolecularBiol215403、1990など、広く入手可能なコンピュータプログラムを用いて計算することができる。配列同一性は、UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter1710UniversityAvenue、Madison、Wis53705のGeneticsComputerGroupによる配列解析ソフトウェアパッケージなどの配列解析ソフトウェアをそのデフォルトのパラメータで用いて測定することができる。0035ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドという用語は、その長さまたは翻訳後修飾例えば、グリコシル化またはリン酸化に関わらず、アミノ酸残基の任意の鎖を指す。0036本開示の突然変異体のIL-2ポリペプチドが実質的に純粋である場合、それらは、対象のポリペプチド、例えば、突然変異体IL-2のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの重量乾燥重量の少なくとも約60でありうる。例えば、ポリペプチドは、対象のポリペプチドの重量の少なくとも約75、約80、約85、約90、約95、または約99でありうる。純度は、任意の適切な標準的方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC解析を介して測定することができる。0037作動可能に連結されたとは、対象のヌクレオチド配列すなわち、IL2ムテインをコードする配列が、ヌクレオチド配列の発現例えば、invitroの転写/翻訳系における、または、ベクターを宿主細胞へと導入する場合は、宿主細胞におけるを可能とする形で1または複数の制御配列に連結されていることを意味することが意図される。制御配列には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント例えば、ポリアデニル化シグナルが含まれる。例えば、Goeddel1990、GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185AcademicPress、SanDiego、Califを参照されたい。制御配列には、多くの種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、および特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現を指示する配列例えば、組織特異的な制御配列が含まれる。当業者には、発現ベクターのデザインが、形質転換される宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現レベルなどの因子に依存しうることが理解されるであろう。本発明の発現構築物を宿主細胞に導入し、これにより、本明細書で開示されるヒトIL-2ムテインを生成させることもでき、その生物学的に活性な変異体を生成させることもできる。0038本明細書では、宿主細胞という用語と組換え宿主細胞という用語とが互換的に用いられる。このような用語は、特定の対象細胞を指すのみでなく、また、このような細胞の後代または潜在的な後代も指すことが理解される。後続の世代では、突然変異または環境的影響に起因して特定の修飾が生じうるため、このような後代は、実のところ、親細胞と同一でない場合もあるが、本明細書で用いられる用語の範囲内にやはり包含される。0039本明細書で用いられる形質転換という用語およびトランスフェクションという用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムによる共沈殿、DEAEデキストランを介するトランスフェクション、リポフェクション、遺伝子銃、または電気穿孔を含めた、外来の核酸例えば、DNAを宿主細胞へと導入するための、当技術分野で認識される多様な技法を指すことが意図される。0040本明細書で用いられる薬学的に許容可能な担体という用語には、医薬投与に適合的な生理食塩液、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれるがこれらに限定されない。また、補助的な活性化合物例えば、抗生剤も組成物に組み込むことができる。0041本明細書で用いられる通り、本発明者らは、がんまたはがん性、過剰増殖性、および新生物性という用語を、自律的成長能すなわち、急速な増殖を伴う細胞成長を特徴とする異常な状態stateまたはconditionを有する細胞を指すのに用いることができる。過剰増殖性疾患状態および新生物性疾患状態は、病的状態としてすなわち、疾患状態を特徴づけるかまたは構成する状態として類別することもでき、非病的状態としてすなわち、正常状態からの逸脱ではあるが、疾患状態とは関連しない状態として類別することもできる。この用語は、組織病理学的種類または侵襲性の段階に関わらず、がん成長または発がん過程、転移性組織、または悪性形質転換細胞、悪性形質転換組織、もしくは悪性形質転換器官の全ての種類を包含することを意味する。病的過剰増殖性細胞は、悪性腫瘍成長を特徴とする疾患状態において生じる。非病的過剰増殖性細胞の例は、創傷の修復と関連する細胞の増殖を包含する。がんまたは新生物という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ節、およびリンパ組織、消化器官、および泌尿生殖路が罹患する悪性腫瘍を含めた、多様な器官系の悪性腫瘍を指すほか、一般に大半の結腸がん、腎細胞がん、前立腺がん、および/または精巣腫瘍、非小細胞肺がん、小腸がん、ならびに食道がんなどの悪性腫瘍を包含すると考えられる腺がんを指すのにも用いられる。0042がん腫という用語は、当技術分野で認知されており、呼吸器系がん、消化器系がん、泌尿生殖器系がん、精巣がん、乳がん、前立腺がん、内分泌系がん、および黒色腫を含めた、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。腺がんとは、腺組織に由来するか、または腫瘍細胞が、認識可能な腺構造を形成するがん腫を指す。0043本明細書で用いられる、造血系の新生物性障害という用語は、造血系由来の、例えば、骨髄系、リンパ系、もしくは赤血球系、またはこれらの前駆体細胞から生じる過形成性/新生物性細胞を伴う疾患を包含する。分化が低度な急性白血病例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じる疾患であることが好ましい。さらなる例示的な骨髄障害には、急性前骨髄性白血病APML、急性骨髄性白血病AML、および慢性骨髄性白血病CMLVaickus、L1991CritRevinOncol/Hemotol1126797において総説されているが含まれるがこれらに限定されず;リンパ性悪性腫瘍には、B細胞系列のALLおよびT細胞系列のALLを包含する急性リンパ芽球性白血病ALL、慢性リンパ性白血病CLL、前リンパ球性白血病PLL、有毛細胞白血病HLL、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症WMが含まれるがこれらに限定されない。悪性リンパ腫のさらなるフォームには、非ホジキンリンパ腫およびそれらの変種、末梢T細胞リンパ腫、成人性T細胞白血病/リンパ腫ATL、皮膚性T細胞リンパ腫CTCL、大型顆粒リンパ球白血病LGF、ホジキン病、およびリード-シュテルンベルク病が含まれるがこれらに限定されない。IL-2ムテイン0044多様な実施形態では、本開示は、実質的に精製されうるが必ずしも精製されていないIL-2ポリペプチドであって、IL-2の生物学的活性のうちの1または複数例えば、細胞増殖の刺激を果たし、野生型IL-2のアゴニストとして機能しうる、IL-2ポリペプチドを提供する。IL-2は、抗原により活性化したT細胞の増殖およびNK細胞の刺激を誘導する、T細胞成長因子として特徴づけられている。0045また、野生型IL-2のアンタゴニストとして機能しうる、すなわち、IL-2の生物学的活性を防止するIL-2ポリペプチドも、記載されている。0046例示的な突然変異体のIL-2ポリペプチドは、配列番号2により表されるポリペプチドがIL-2Rβに結合するアフィニティーより高いアフィニティーでIL-2Rβに結合する、配列番号2と少なくとも約80同一なアミノ酸配列を包含する。例えば、突然変異体のIL-2ポリペプチドは、野生型IL-2と比べて少なくとも1つの突然変異例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換を有することが可能であり、野生型IL-2より高いアフィニティーでIL-2Rβに結合する。0047例示的な突然変異体のIL-2ポリペプチドはまた、配列番号2と少なくとも約80同一であり、配列番号2により表されるポリペプチドがIL-2Rγに結合するアフィニティーより低いアフィニティーでIL-2受容体γIL2Rγに結合するアミノ酸配列も包含しうる。例えば、突然変異体のIL-2ポリペプチドは、野生型IL-2と比べて少なくとも1つの突然変異例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換を有することが可能であり、野生型IL-2より低いアフィニティーでIL-2Rγに結合する。0048例示的な突然変異体のIL-2ポリペプチドは、野生型IL-2と少なくとも約50、少なくとも約65、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約87、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約97、少なくとも約98、または少なくとも約99同一でありうる。突然変異は、アミノ酸残基の数または内容の変化からなりうる。例えば、突然変異体のIL-2は、野生型IL-2より多数のアミノ酸残基を有する場合もあり、少数のアミノ酸残基を有する場合もある。代替的に、または加えて、例示的な突然変異体のポリペプチドは、野生型IL-2に存在する1または複数のアミノ酸残基の置換を含有しうる。多様な実施形態では、突然変異体のIL-2ポリペプチドが、単一のアミノ酸残基の添加、欠失、または置換、例えば、69位における残基の置換により野生型IL-2と異なりうる。同様に、例示的な突然変異体のポリペプチドは、2つのアミノ酸残基、例えば、配列番号2の24、65、74、80、81、85、86、89、92、および93位における残基の置換により野生型と異なりうる。0049例示を目的として述べると、配列番号2の基準アミノ酸配列と少なくとも95同一なアミノ酸配列を包含するポリペプチドは、配列番号2の基準アミノ酸の最大5カ所にわたる変更の組入れを除き、基準配列と同一な配列を包含するポリペプチドである。例えば、基準配列におけるアミノ酸残基のうちの最大5を欠失させるかまたは別のアミノ酸で置換することもでき、基準配列における全アミノ酸残基のうちの最大5の数のアミノ酸を基準配列へと挿入することもできる。これらの基準配列の変更は、基準アミノ酸配列のアミノN末端の位置またはカルボキシC末端の位置に施すこともでき、これらの末端の位置の間のいずれかに、基準配列の残基間に個別に散在させて施すこともでき、基準配列内の1または複数の連続する群に施すこともできる。0050置換されるアミノ酸残基1または複数のは、以下の群グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;リシン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシン内の置換を包含することが典型的な保存的置換でありうるが、必ずしも保存的置換ではない。これらの突然変異は、IL-2Rβおよび/またはIL-2Rγに接触するアミノ酸残基における突然変異でありうる。0051より具体的に述べると、突然変異1または複数の付加または1または複数の欠失に関して保存的であれ、非保存的であれは、1または複数の位置に施すことができる。例えば、突然変異は、I24V、P65H、Q74R、Q74H、Q74N、Q74S、L80F、L80V、R81I、R81T、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F、V93Iでありうる。例示的なIL-2ムテイン領域の配列は、以下の通りである5-1:配列番号5;5-2:配列番号6;6-6:配列番号7;A2:配列番号8;B1:配列番号9;B11:配列番号10;C5:配列番号11;D10:配列番号12;E10:配列番号13;G8:配列番号14;H4:配列番号15およびH9:配列番号16。0052アフィニティーに関して、本明細書では、IL-2Rβに、野生型IL-2ポリペプチドより少なくとも約2、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、または少なくとも約40以上高いアフィニティーで結合する例示的な突然変異体のIL-2ポリペプチドが開示される。野生型IL-2ポリペプチドは、IL-2Rβに約280nMのKdで結合する。開示される例示的な突然変異体のIL-2ポリペプチドの結合アフィニティーはまた、IL-2Rβに対して野生型IL-2より1.2、1.4、1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、200、250倍またはそれ以上の倍率のアフィニティーとしても表すことができる。0053代替的に、または加えて、例示的な突然変異体のIL-2ポリペプチドは、T細胞増殖アッセイにおける効力を野生型IL-2と比べて増大させることが可能であった。突然変異体のIL-2ポリペプチドがIL-2Rβに結合する能力は、本明細書で記載される細胞結合アッセイおよび細胞増殖アッセイを含めた多数のアッセイを介して評価することができる。0054例示的な突然変異体のIL-2ポリペプチドは、突然変異体のIL-2ポリペプチドに対する一過性の曝露後の長時間にわたり受容体/リガンド複合体からのシグナル伝達が存続するように、野生型IL-2と比較して、IL-2Rβ受容体サブユニットからの解離速度の低下を示す能力を有しうる。0055本開示ではまた、その相互作用が、野生型IL-2と比べて約2、約5、約10、約15、約20、約50、約75、約90、約95またはそれ以上低減されるように、IL-2RβのIL-2Rγとの会合を破壊する突然変異体のポリペプチドも提供される。0056また、IL-2Rβに対するアフィニティーの増大、およびIL-2RβのIL-2Rγとの相互作用の破壊の両方の特性を保有する例示的な突然変異体のIL-2ポリペプチドも開示される。0057以下でさらに記載される通り、本開示では、酵母表面ディスプレイを用いて、野生型IL-2と比べると、IL-2Rβに対する結合アフィニティーが増大し、かつ/またはIL-2Rγに対する結合アフィニティーが減小した、突然変異体のIL-2ポリペプチドの例示的なクラスが提供される。IL-2ムテインの野生型IL-2との構造的比較IL-2ムテイン、発現ベクター、および宿主細胞の組換え発現0058多様な実施形態では、本発明を実施するのに用いられるポリペプチドが、合成であるか、または組換え核酸分子の発現を介して生成する。キメラ例えば、少なくとも突然変異体のIL-2ポリペプチドおよび異種ポリペプチドを含有する融合タンパク質である場合、ポリペプチドは、突然変異体IL-2の全部または一部をコードする1つの配列、および異種ポリペプチドの全部または一部をコードする第2の配列を含有するハイブリッドの核酸分子によりコードされうる。例えば、突然変異体のIL-2ポリペプチドは、ヘキサヒスチジンタグと融合させて、細菌により発現されるタンパク質の精製を容易にすることもでき、ヘマグルチニンタグと融合させて、真核細胞により発現されるタンパク質の精製を容易にすることもできる。0059IL-2ムテインをコードするDNA配列を構築し、これらの配列を適切に形質転換された宿主により発現する方法には、PCR支援突然変異誘発法の使用が含まれるがこれらに限定されない。また、IL-2ポリペプチドに対するアミノ酸残基の欠失または付加からなる突然変異も、標準的な組換え法により作製することができる。欠失または付加の場合、IL-2をコードする核酸分子を、任意選択により、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化させる。結果として得られるフラグメントは、直接発現させることもでき、例えば、それを第2のフラグメントへとライゲーションすることによりさらに操作することもできる。核酸分子の2つの末端が互いに重複する相補的なヌクレオシドを含有する場合に、ライゲーションは容易となりうるが、また、平滑末端のフラグメントもライゲーションすることができる。また、PCRにより生成させた核酸も、多様な突然変異体の配列を生成させるのに用いることができる。0060完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。IL-2ムテインをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードする複数の低分子オリゴヌクレオチドを合成し、次いで、ライゲーションすることができる。個別のオリゴヌクレオチドは、相補的なアセンブリーのための5’突出または3’突出を含有することが典型的である0061組換え分子生物学法により変化させた核酸分子の発現を介して突然変異体のポリペプチドを生成させることに加えて、突然変異体のポリペプチドは、化学合成することもできる。化学合成されたポリペプチドは、当業者が日常的に生成させているものである。0062アセンブリングしたら合成、部位指向的突然変異誘発、または別の方法を介して、IL-2ムテインをコードするDNA配列を、所望の形質転換宿主におけるIL-2ムテインの発現に適する発現ベクターおよび作動的に連結された発現制御配列へと挿入する。適正なアセンブリーは、ヌクレオチドの配列決定、制限マッピング、および適切な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現により確認することができる。当技術分野でよく知られている通り、宿主においてトランスフェクトされた遺伝子の高発現レベルを得るためには、この遺伝子を、選択された発現宿主において機能的な、転写および翻訳の発現制御配列に作動的に連結しなければならない。0063IL-2ムテインをコードするDNA配列はまた、部位指向的突然変異誘発、化学合成、または他の方法のいずれにより調製したのであれ、シグナル配列をコードするDNA配列も包含しうる。存在する場合、このようなシグナル配列は、IL-2ムテインを発現させるために選択される細胞により認識される配列である。それは、原核細胞のシグナル配列である場合もあり、真核細胞のシグナル配列である場合もあり、2つの組合せの場合もある。それはまた、天然IL-2のシグナル配列でもありうる。シグナル配列の組入れは、それがなされる組換え細胞からIL-2ムテインを分泌させることが望まれるかどうかに依存する。選択される細胞が原核細胞である場合、DNA配列がシグナル配列をコードしないことが一般に好ましい。選択される細胞が真核細胞である場合は、シグナル配列をコードすることが一般に好ましく、野生型IL-2のシグナル配列を用いることが最も好ましい。IL-2ムテイン融合タンパク質0064上記で言及した通り、例示的な突然変異体のIL-2ポリペプチドは、突然変異体のIL-2ポリペプチドおよび異種ポリペプチドすなわち、IL2またはその突然変異体でないポリペプチド例えば、米国特許第6,451,308号を参照されたいを包含する融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製することができる。例示的な異種ポリペプチドは、invivoにおいて、キメラポリペプチドの循環半減期を延長することが可能であり、したがって、突然変異体のIL-2ポリペプチドの特性をさらに増強することが可能である。多様な実施形態では、循環半減期を延長するポリペプチドが、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンの場合もあり、IgGの重鎖可変領域を欠く抗体のIgGサブクラスのFc領域の場合もある。例示的なFc領域は、補体の結合およびFc受容体の結合を阻害する突然変異を包含する場合もあり、溶解性の場合もある、すなわち、補体に結合する場合もあり、抗体依存性補体溶解ADCC;1994年12月12日に出願されたUSSN08/355,502などの別の機構を介して細胞を溶解させる場合もある。0065Fc領域とは、パパインによるIgGの消化を介して生成する、IgGのC末端ドメインと相同な天然または合成のポリペプチドでありうる。IgGFcの分子量は、約50kDaである。突然変異体のIL-2ポリペプチドは、Fc領域の全体、またはそれがその一部であるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持する小部分を包含しうる。加えて、全長のFc領域またはフラグメント化されたFc領域は、野生型分子の変異体でもありうる。すなわち、それらは、ポリペプチドの機能に影響を及ぼす場合もあり、及ぼさない場合もある、突然変異を含有することが可能であり、以下でさらに記載される通り、天然の活性が全ての場合に必要または所望なわけではない。0066Fc領域は、溶解性の場合もあり、非溶解性の場合もあるが、非溶解性であることが典型的である。非溶解性のFc領域は、高アフィニティーのFc受容体結合部位およびC’1q結合部位を欠くことが典型的である。マウスIgGFcの、高アフィニティーのFc受容体結合部位は、IgGFcの235位にLeu残基を包含する。したがって、Fc受容体結合部位は、Leu235を突然変異させるかまたは欠失させることにより破壊することができる。例えば、Leu235のGluによる置換は、Fc領域が高アフィニティーのFc受容体に結合する能力を阻害する。マウスC‘1q結合部位は、IgGのGlu318残基、Lys320残基、およびLys322残基を突然変異させるかまたは欠失させることにより機能的に破壊することができる。例えば、Glu318、Lys320、およびLys322をAla残基で置換すると、IgG1のFcは、抗体依存性細胞補体溶解を指示することが可能でなくなる。これに対して、溶解性のIgGFc領域は、高アフィニティーのFc受容体結合部位およびC’1q結合部位を有する。高アフィニティーのFc受容体結合部位は、IgGFcの235位においてLeu残基を包含し、C’1q結合部位は、IgG1のGlu318残基、Lys320残基、およびLys322残基を包含する。溶解性IgGFcは、これらの部位において野生型残基または保存的アミノ酸置換を有する。溶解性IgGFcは、細胞を抗体依存性細胞毒性または補体誘導性細胞溶解CDCの標的としうる。また、ヒトIgGに適する突然変異も知られる例えば、Morrisonら、TheImmunologist2119124、1994およびBrekkeら、TheImmunologist2125、1994を参照されたい。0067他の実施形態では、キメラポリペプチドは、突然変異体のIL-2ポリペプチドおよびFLAG配列などの抗原性タグとして機能するポリペプチドを包含しうる。FLAG配列は、本明細書で説明される、ビオチニル化されて高度に特異的な抗FLAG抗体により認識されるまた、Blanarら、Science2561014、1992LeClairら、ProcNatlAcadSciUSA898145、1992も参照されたい。一部の実施形態では、キメラポリペプチドが、C末端のc-mycエピトープタグをさらに含む。0068他の実施形態では、キメラポリペプチドが、突然変異体のIL-2ポリペプチドおよびAga2pアグルチニンのサブユニット例えば、BoderおよびWittrup、NatureBiotechnol155537、1997を参照されたいなど、突然変異体のIL-2ポリペプチドの発現を増強するかまたは細胞内局在化を指示するように機能する異種ポリペプチドを包含する。0069他の実施形態では、突然変異体のIL-2および抗体またはその抗原結合部分を含めたキメラポリペプチドを生成させることができる。キメラタンパク質の抗体成分または抗原結合成分は、ターゲティング部分として用いられうる。例えば、それを用いて、キメラタンパク質を細胞または標的分子の特定のサブセットへと局在化させることができる。サイトカイン-抗体キメラポリペプチドを生成させる方法は、例えば、米国特許第6,617,135号に記載されている。突然変異体のIL-2をコードする核酸分子0070一部の実施形態では、上記の突然変異体のIL-2ポリペプチドなど、単独の、またはキメラポリペプチドの一部としての突然変異体のIL-2ポリペプチドは、核酸分子を発現させることにより得ることができる。突然変異体のIL-2ポリペプチドが、それらの野生型IL-2ポリペプチドとの同一性との関係で記載しうるのと全く同様に、それらをコードする核酸分子も、野生型IL-2をコードする核酸分子との一定の同一性を必然的に有する。例えば、突然変異体のIL-2ポリペプチドをコードする核酸分子は、野生型IL-2をコードする核酸例えば、配列番号2と少なくとも50、少なくとも65、好ましくは少なくとも75、より好ましくは少なくとも85、および最も好ましくは少なくとも95例えば、99同一でありうる。成熟IL-2およびそのシグナル配列をコードする核酸配列は、配列番号17に見出される。0071提供される核酸分子は、天然配列を含有する場合もあり、遺伝子コードの縮重性に起因して天然の配列と異なるが同じポリペプチドをコードする配列を含有する場合もある。これらの核酸分子は、RNAまたはDNA例えば、ゲノムDNA、cDNA、またはホスホルアミダイトベースの合成を介して生成させる合成DNAなどの合成DNAからなる場合もあり、これらの核酸の種類のうちのヌクレオシドの組合せまたは修飾からなる場合もある。加えて、核酸分子は、二本鎖の場合もあり、一本鎖すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖の場合もある。0072核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列に限定されず、これにはまた、コード配列例えば、IL2のコード配列の上流または下流に位置する非コード配列の一部または全部も包含されうる。分子生物学法の当業者は、核酸分子を単離する日常的な手順に精通している。核酸分子は、例えば、ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼで処理することにより生成させることもでき、ポリメラーゼ連鎖反応PCRを実施することにより生成させることもできる。核酸分子がリボ核酸RNAである場合、分子は、例えば、invitroにおける転写を介して生成させることができる。0073本開示の例示的な単離核酸分子は、天然状態ではそれ自体として見出されないフラグメントを包含しうる。したがって、本開示は、核酸配列例えば、突然変異体のIL2をコードする配列をベクター例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクターへと組み込む場合もあり、異種細胞のゲノムまたは天然の染色体位置以外の位置における同種細胞のゲノムへと組み込む場合もある組換え分子など、組換え分子を包含する。0074上記の通り、本発明の突然変異体のIL-2ポリペプチドは、キメラポリペプチドの一部として存在しうる。上記の異種ポリペプチドに加えて、またはこの代わりに、本発明の核酸分子は、マーカーまたはレポーターをコードする配列も含有しうる。マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子の例には、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT、アデノシンデアミナーゼADA、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼneor、G418r、ジヒドロ葉酸レダクターゼDHFR、ハイグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼHPH、チミジンキナーゼTK、laczβ-ガラクトシダーゼをコードする、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼXGPRTが含まれる。本発明の実施と関連する標準的な手順の多くと同様に、当業者は、さらなる有用な試薬、例えば、マーカーまたはレポーターの機能をもたらしうるさらなる配列について承知しているであろう。0075本発明の核酸分子は、突然変異を、哺乳動物の細胞など、任意の生物学的細胞から得られる、IL-2をコードするDNAへと導入することにより得ることができる。したがって、本発明の核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、ヒヒ、イヌ、またはネコの核酸でありうる。一実施形態では、核酸分子がヒトの核酸分子である。突然変異体のIL-2遺伝子産物の発現0076上記の核酸分子は、例えば、それを形質導入した細胞における核酸分子の発現を指示することが可能なベクター内に含有させることができる。したがって、発現ベクターは、突然変異体のIL-2ポリペプチドに加えて、突然変異体のIL-2ポリペプチドをコードする核酸分子も含有し、これらのベクターでトランスフェクトした細胞も、好ましい実施形態のうちにある。0077当然ながら、全てのベクターおよび発現制御配列が同等に良好に機能して、本明細書で説明されるDNA配列を発現するわけではないことを理解されたい。また、全ての宿主が、同じ発現系と共に同等に良好に機能するわけでもない。しかし、当業者は、過度の実験なしに、これらのベクター、発現制御配列、および宿主の中で選択を行うことができる。例えば、ベクターの選択では、その中でベクターを複製しなければならないため、宿主についても考慮しなければならない。また、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および抗生剤マーカーなど、ベクターによりコードされる他の任意のタンパク質の発現についても考慮すべきである。例えば、用いうるベクターには、IL-2ムテインをコードするDNAのコピー数を増幅させるベクターが含まれる。当技術分野では、このような増幅可能なベクターがよく知られている。それらには、例えば、DHFR増幅例えば、Kaufman、米国特許第4,470,461号KaufmanおよびSharp、ConstructionofaModularDihydrafolateReductasecDNAGeneAnalysisofSignalsUtilizedforEfficientExpression、MolCellBiol、2、130419頁1982を参照されたい、またはグルタミンシンテターゼGS増幅例えば、米国特許第5,122,464号および欧州出願公開第338,841号を参照されたいを介して増幅することが可能なベクターが含まれる。0078一部の実施形態では、本開示のヒトIL-2ムテインが、ベクター、好ましくは発現ベクターから発現する。ベクターは、宿主細胞における自律的複製に有用であるか、または宿主細胞へと導入されると宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿主のゲノムと共に複製される例えば、非エピソーム性の哺乳動物ベクター。発現ベクターは、それらが作動可能に連結されたコード配列の発現を指示することが可能である。一般に、組換えDNA法において有用な発現ベクターは、プラスミドベクターのフォームであることが多い。しかし、また、ウイルスベクター例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなど、発現ベクターの他のフォームも包含される。0079例示的な組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択される1または複数の制御配列であって、発現する核酸配列に作動可能に連結された制御配列を包含しうる。0080発現構築物またはベクターは、原核宿主細胞または真核宿主細胞におけるIL-2ムテインまたはその変異体の発現用にデザインすることができる。0081ベクターのDNAは、従来の形質転換法を介して原核細胞へと導入することもでき、トランスフェクション法を介して真核細胞へと導入することもできる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする適切な方法は、Sambrookら1989、MolecularCloning:ALaboratoryManual2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、Plainview、NY、および他の標準的な分子生物学法についての実験室用マニュアルにおいて見出すことができる。0082原核生物におけるタンパク質の発現は、Escherichiacoliにおいて、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを含有するベクターにより実行することが極めて多い。E.coliにおける組換えタンパク質の発現を最大化する戦略は、例えば、Gottesman1990GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185AcademicPress、SanDiego、Calif、119-128頁;およびWadaら1992NucleicAcidsRes.20:2111-2118に見出すことができる。細胞に由来するIL-2ムテインまたはその変異体を増殖させるか、採取するか、破壊するか、または抽出する過程は、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第4,604,377号;同第4,738,927号;同第4,656,132号;同第4,569,790号;同第4,748,234号;同第4,530,787号;同第4,572,798号;同第4,748,234号;および同第4,931,543号に実質的に記載されている。0083一部の実施形態では、組換えIL-2ムテインまたは生物学的に活性なその変異体はまた、酵母細胞またはヒト細胞などの真核生物においても作製することができる。適切な真核宿主細胞には、昆虫細胞培養昆虫細胞例えば、Sf9細胞においてタンパク質を発現するのに利用可能なバキュロウイルスベクターの例には、pAcシリーズSmithら1983MolCellBiol321562165およびpVLシリーズLucklowおよびSummers1989Virology1703139が含まれる;酵母細胞酵母であるScerenvisiaeにおける発現用のベクターの例には、pYepSeclBaldariら1987EMBOJ6229234、pMFaKurjanおよびHerskowitz1982Cell30933943、pJRY88Schultzら1987Gene54113123、pYES2InvitrogenCorporation、SanDiego、Calif、およびpPicZInvitrogenCorporation、SanDiego、Califが含まれる;または哺乳動物細胞哺乳動物用の発現ベクターには、pCDM8Seed1987Nature329840およびpMT2PCKaufmanら1987EMBOJ6187195が含まれるが含まれる。適切な哺乳動物細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOまたはCOS細胞が含まれる。哺乳動物細胞では、発現ベクターの制御機能が、ウイルス制御エレメントによりもたらされることが多い。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス40に由来する。原核細胞および真核細胞のいずれにも適する他の発現系については、Sambrookら1989MolecularCloning:ALaboratoryManual、16および17章2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、Plainview、NYを参照されたい。Goeddel1990、GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185AcademicPress、SanDiego、Califも参照されたい。0084本開示のヒトIL-2ムテインをコードする配列は、対象の宿主細胞における発現について最適化することができる。配列のG-C含量は、宿主細胞において発現させた既知の遺伝子を参照することにより計算した、所与の細胞の宿主について平均したレベルに調整することができる。当技術分野では、コドンを最適化する方法が十分に知られている。コード配列内のコドンのうちの約1、約5、約10、約25、約50、約75、または最大100が、特定の宿主細胞における発現について最適化されるように、IL-2ムテインのコード配列内のコドンを最適化して、宿主細胞における発現を増強することができる。0085使用に適するベクターには、細菌において用いられるT7ベースのベクター例えば、Rosenbergら、Gene56125、1987を参照されたい、哺乳動物細胞において用いられるpMSXND発現ベクターLeeおよびNathans、JBiolChem2633521、1988、および昆虫細胞において用いられるバキュロウイルス由来のベクター例えば、Clontech、PaloAlto、Calif製の発現ベクターであるpBacPAK9が含まれる。0086一部の実施形態では、このようなベクターにおいて対象のポリペプチドをコードする核酸挿入配列を、例えば、発現が求められる細胞型に基づき選択されるプロモーターに作動可能に連結することができる。0087発現制御配列の選択ではまた、多様な因子についても考慮するべきである。これらには、例えば、配列の相対強度、その制御可能性、および本発明のIL-2ムテインをコードする実際のDNA配列との、とりわけ、潜在的な二次構造に関するその適合性が含まれる。宿主は、選択されたベクターとのそれらの適合性、本発明のDNA配列によりコードされる産物の毒性、それらの分泌特徴、それらがポリペプチドを適正にフォールドする能力、それらのフラグメント化または培養の要件、およびDNA配列によりコードされる産物の精製の容易さを考慮することにより選択すべきである。0088これらのパラメータのうちで、当業者は、フラグメント化により、または大スケールの動物培養物において、例えば、CHO細胞またはCOS7細胞を用いて所望のDNA配列を発現する、多様なベクター/発現制御配列/宿主の組合せを選択することができる。0089一部の実施形態では、発現制御配列および発現ベクターの選択が、宿主の選択に依存する。多種多様な発現宿主/ベクターの組合せを使用することができる。真核宿主に有用な発現ベクターには、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を伴うベクターが含まれる。細菌宿主に有用な発現ベクターには、colE1、pCRI、pER32z、pMB9、およびそれらの派生体を含めたE.coliに由来するプラスミドなど、既知の細菌プラスミド、RP4など、宿主範囲の広いプラスミド、ファージDNA、例えば、ファージラムダの多数の派生体、例えば、NM989、ならびにM13および繊維状一本鎖DNAファージなど、他のDNAファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターには、2μプラスミドおよびその派生体が含まれる。昆虫細胞に有用なベクターには、pVL941およびpFastBac商標1GibcoBRL、Gaithersburg、Mdが含まれるCateら、IsolationOfTheBovineAndHumanGenesForMullerianInhibitingSubstanceAndExpressionOfTheHumanGeneInAnimalCells、Cell、45、68598頁1986。0090加えて、これらのベクターでは、多種多様な発現制御配列のうちのいずれかも用いることができる。このような有用な発現制御配列は、前出の発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現制御配列を包含する。有用な発現制御配列の例には、例えば、SV40ウイルスまたはアデノウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターであるlac系、trp系、TAC系、またはTRC系、ラムダファージの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、例えば、PL、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、例えば、PhoA、酵母接合系のプロモーター、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーター、ならびに原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られる他の配列、ならびにこれらの多様な組合せが含まれる。0091T7プロモーターは、細菌において用いることができ、ポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞において用いることができ、サイトメガロウイルスプロモーターまたはメタロチオネインプロモーターは、哺乳動物細胞において用いることができる。高等真核生物の場合はまた、組織特異的プロモーターおよび細胞型特異的プロモーターも広く入手可能である。これらのプロモーターは、それらが体内の所与の組織または細胞型における核酸分子の発現を指示する能力のためにそのように名づけられている。当業者は、核酸の発現を指示するのに用いうる多数のプロモーターおよび他の制御エレメントについて十分に承知している。0092挿入された核酸分子の転写を容易にする配列に加えて、ベクターは、複製起点および選択マーカーをコードする他の遺伝子も含有しうる。例えば、ネオマイシン耐性neor遺伝子は、それが発現する細胞にG418耐性を付与し、したがって、トランスフェクトされた細胞の表現型の選択を可能とする。当業者は、所与の制御エレメントまたは選択マーカーが特定の実験の文脈において用いるのに適切であるかどうかを容易に決定することができる。0093本発明において用いうるウイルスベクターには、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴のベクター、ヘルペスウイルスベクター、サルウイルス40SV40ベクター、およびウシパピローマウイルスベクターが含まれる例えば、Gluzman編、EukaryoticViralVectors、CSHLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NYを参照されたい。0094突然変異体のIL-2ポリペプチドをコードする核酸分子を含有および発現する原核細胞または真核細胞もまた、本発明の特色である。本発明の細胞は、トランスフェクトした細胞、すなわち、核酸分子、例えば、突然変異体のIL-2ポリペプチドをコードする核酸分子を組換えDNA法を介して導入した細胞である。また、このような細胞の後代も、本発明の範囲内にあると考えられる。0095発現系の正確な構成要素は、それほど重要ではない。例えば、突然変異体のIL-2ポリペプチドは、細菌であるE.coliなどの原核宿主において生成させることもでき、昆虫細胞例えば、Sf21細胞または哺乳動物細胞例えば、COS細胞、NIH3T3細胞、またはHeLa細胞などの真核宿主において生成させることもできる。これらの細胞は、AmericanTypeCultureCollectionManassas、Vaを含めた多くの供給源から入手可能である。発現系の選択では、構成要素が互いに適合的であることのみが重要である。当業者は、このような決定を下すことが可能である。さらに、発現系を選択するのに指針を必要とする場合、当業者は、AusubelらCurrentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileyandSons、NewYork、NY、1993およびPouwelsらCloningVectorsALaboratoryManual、1985、増補版1987を参考にすることができる。0096発現させたポリペプチドは、日常的な生化学的手順を用いて発現系から精製し、例えば、本明細書で記載される療法剤として用いることができる。0097一部の実施形態では、得られるIL-2ムテインを、ムテインを生成させるのに用いられる宿主生物に応じてグリコシル化または非グリコシル化させる。宿主として細菌を選択する場合は、生成させるIL-2ムテインを非グリコシル化させる。他方、真核細胞は、おそらく天然のIL-2がグリコシル化するのとは別の形ではあるが、IL-2ムテインをグリコシル化させる。形質転換された宿主を介して生成するIL-2ムテインは、任意の適切な方法により精製することができる。IL-2を精製するための多様な方法が知られている。例えば、CurrentProtocolsinProteinScience、2巻、JohnE.Coligan、BenM.Dunn、HiddeL.Ploehg、DavidW.Speicher、PaulT.Wingfield編、ユニット6.5著作権:1997、JohnWileyandSons、Incを参照されたい。IL-2ムテインは、E.coliにおいて生成させる封入体から単離することもでき、カチオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および/または逆相液体クロマトグラフィーを用いて所与のムテインを生成させる哺乳動物培養物または酵母培養物に由来する条件付け培地から単離することもできる。0098IL-2ムテインをコードするDNA配列を構築する別の例示的な方法は、化学合成を介する。これには、記載される特性を示すIL-2ムテインをコードするタンパク質配列の、化学的手段による直接的なペプチド合成が含まれる。この方法は、IL-2のIL-2Rα、IL-2Rβ、および/またはIL-2Rγとの相互作用に影響を及ぼす位置において、天然のアミノ酸および非天然のアミノ酸の両方を組み込みうる。代替的に、所望のIL-2ムテインをコードする遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成機を用いる化学的手段を介して合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のIL-2ムテインのアミノ酸配列に基づきデザインし、組換えムテインを生成させる宿主細胞において好適なコドンを優先的に選択する。この点で、遺伝子コードは縮重であることアミノ酸は複数のコドンによりコードされうることが十分に認識されている。例えば、PheFは、2つのコドンであるTICまたはTTTによりコードされ、TyrYは、TACまたはTATによりコードされ、hisHは、CACまたはCATによりコードされる。TrpWは、単一のコドンであるTGGによりコードされる。したがって、特定のIL-2ムテインをコードする所与のDNA配列について、そのIL-2ムテインをコードする多くの縮重のDNA配列が存在することが理解される。例えば、図2に示されるムテイン5-2に好ましいDNA配列に加えて、示されるIL-2ムテインをコードする多くの縮重のDNA配列が存在することが理解される。これらの縮重のDNA配列も、本開示の範囲内にあると考えられる。したがって、本発明の文脈におけるその縮重の変異体とは、特定のムテインをコードし、これにより、その発現を可能とする全てのDNA配列を意味する。0099IL-2ムテインの生物学的活性は、当技術分野で知られる任意の適切な方法を介してアッセイすることができる。このようなアッセイには、PHA-blast増殖およびNK細胞増殖が含まれる。治療法00100一部の実施形態では、突然変異体IL-2のポリペプチドおよび/またはそれらを発現する核酸を対象に投与して、アポトーシス過程または分化過程の異常と関連する障害を治療する例えば、能動的免疫または受動的免疫を生成させることにより、例えば、がんなどの細胞増殖障害または細胞分化障害を治療することができる。このような疾患の治療において、開示されるIL-2ムテインは、血管漏出症候群の軽減などの有利な特性を保有する。00101細胞増殖障害および/または細胞分化障害の例には、がん例えば、がん腫、肉腫、転移性障害、または造血系の新生物性障害、例えば、白血病が含まれる。転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、乳房、および肝臓の腫瘍が含まれるがこれらに限定されない、多数の原発性腫瘍型から生じうる。本発明の組成物例えば、突然変異体のIL-2ポリペプチドおよび/またはそれらをコードする核酸分子はまた、ウイルス感染例えば、AIDSインフルエンザを有する患者にも投与することができる。00102突然変異体のIL-2ポリペプチドを用いて、腎がんもしくは黒色腫、または任意のウイルス疾患を含めた任意の種類のがんを有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを発症する危険性が高い可能性がある患者を治療することができる。例示的ながん腫には、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸、および卵巣の組織から形成されるがん腫が含まれる。この用語また、がん腫性組織および肉腫性組織からなる悪性腫瘍を包含するがん肉腫も包含する。00103増殖性障害のさらなる例には、造血系の新生物性障害が含まれる。00104他の増殖性障害および/または分化障害の例には、皮膚障害が含まれる。皮膚障害は、真皮層、表皮層、または皮下層における細胞もしくは細胞群または層群の活性異常を伴う場合もあり、真皮-表皮間接合部における異常を伴う場合もある。例えば、皮膚障害は、ケラチン生成細胞例えば、基底層および基底層直上の過剰増殖性ケラチン生成細胞、メラニン生成細胞、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、免疫細胞、および表皮層、例えば、基底層stratumbasalestratumgerminativum、有棘層、顆粒層、透明層、または角質層のうちの1または複数において見出される他の細胞の活性異常を伴いうる。他の実施形態では、障害が真皮細胞、例えば、真皮層、例えば、乳頭層または網状層において見出される、真皮内皮細胞、真皮線維芽細胞、真皮免疫細胞例えば、マスト細胞またはマクロファージの活性異常を伴いうる。00105皮膚障害の例には、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎湿疹、例えば、剥脱性皮膚炎、またはアトピー性皮膚炎、毛孔性紅色粃糠疹、バラ色粃糠疹、類乾癬、苔癬状粃糠疹、扁平苔癬、光沢苔癬、魚鱗癬様紅皮症、角皮症、皮膚疾患、円形脱毛症、壊疽性膿皮症、尋常性白斑、類天疱瘡例えば、眼部瘢痕性類天疱瘡または水疱性類天疱瘡、蕁麻疹、汗孔角化症、関節包を満たす上皮関連細胞の過剰増殖および炎症を伴う関節リウマチ;脂漏性皮膚炎および日光皮膚炎などの皮膚炎;脂漏性角化症、老人性角化症、光線角化症、光誘起角化症、および毛包性角化症などの角化症;尋常性ざ瘡;ケロイドおよびケロイド形成に対する予防;母斑;疣贅、コンジローマまたは尖圭コンジローマ、および性病疣などのヒトパピローマウイルスHPV感染を含めた疣;白板症;扁平苔癬;および角膜炎が含まれる。皮膚障害は、皮膚炎、例えば、アトピー性皮膚炎またはアレルギー性皮膚炎の場合もあり、乾癬の場合もある。00106治療に適する患者はまた、乾癬を有する場合もある。乾癬という用語は、その医学的意味、すなわち、主に皮膚が罹患し、隆起性、肥厚性、落屑性、非瘢痕性の病変をもたらす疾患という意味を有することが意図される。病変は通常、重なり合い光沢のある落屑で覆われる、輪郭の鮮明な紅斑性丘疹である。落屑は、銀色がかっているか、わずかに乳白色であることが典型的である。爪の病変が高頻度で生じ、結果として陥凹、爪甲剥離、肥厚、および変色をもたらす。乾癬は、関節炎と関連する場合があり、麻痺性でありうる。ケラチン生成細胞の過剰増殖は、表皮炎症およびケラチン生成細胞の分化の減殺と共に乾癬性表皮過形成の重要な特色である。ケラチン生成細胞の過剰増殖を説明するのに、乾癬を特徴づける複数の機構が提起されている。乾癬の発症機序にはまた、細胞性免疫の障害も関与している。乾癬性障害の例には、慢性定常性乾癬、尋常性乾癬、発疹性滴状乾癬、乾癬性紅皮症、汎発性膿疱性乾癬ツンブッシュ全身性膿疱性乾癬、環状膿疱性乾癬、および限局性膿疱性乾癬が含まれる。00107代替的に、または患者へと直接的に投与する方法に加えて、一部の実施形態では、突然変異体のIL-2ポリペプチドを、exvivo法において用いることもできる。例えば、細胞例えば、末梢血リンパ球、または患者から単離され、培養物中に静置されるかもしくは維持される精製されたリンパ球の集団は、invitroの培養培地中で培養することができ、接触させる工程は、IL-2突然変異体を培養培地へと添加することから影響を受ける場合がある。培養工程は、細胞を他の薬剤で刺激または処理して、例えば、増殖を刺激するか、または対象の抗原例えば、がん抗原またはウイルス抗原に対して反応性である細胞集団を増殖させるさらなる工程を包含しうる。次いで、細胞を、それらを処理した後で患者へと投与する。医薬組成物および投与法00108一部の実施形態では、突然変異体のIL-2ポリペプチドおよび核酸を、医薬組成物を含めた組成物へと組み込むことができる。このような組成物は、ポリペプチドまたは核酸分子および薬学的に許容可能な担体を包含することが典型的である。00109医薬組成物は、その意図される投与経路に適合的となるように調合する。本発明の突然変異体のIL-2ポリペプチドは、経口でも施しうるが、非経口経路を介して投与する可能性の方が大きい。非経口投与経路の例には、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮局所投与、経粘膜投与、および直腸内投与が含まれる。非経口適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を包含しうる:注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒など、滅菌の希釈剤;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート化剤;酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤;および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど、等張性を調整するための薬剤。pHは、一塩基性リン酸ナトリウムおよび/もしくは二塩基性リン酸ナトリウム、塩酸、または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整する例えば、約7.2~7.8、例えば、7.5のpHまで。非経口調製物は、アンプル、ディスポーザブルの注射器、またはガラスもしくはプラスチックで作製された複数回投与用のバイアルに封入することができる。00110注射用に適する医薬組成物には、滅菌水溶液水溶性の場合または滅菌分散液および滅菌注射用溶液もしくは滅菌注射用分散液を即席で調製するための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与では、適切な担体が、生理食塩液、静菌水、CremophorEL商標BASF、Parsippany、NJ、またはリン酸緩衝生理食塩液PBSを包含する。全ての場合において、組成物は、滅菌であり、容易な注射針通過可能性が存在する程度まで流体であるものとする。担体は、製造条件下および保管条件下において安定であるものとし、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から防護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど、およびこれらの適切な混合物を含有する、溶媒の場合もあり、分散媒の場合もある。例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、分散液の場合には必要とする粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを用いることにより、適正な流体性を維持することができる。微生物作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど、多様な抗菌剤および抗真菌剤により達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。注射用組成物の遅延吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。00111滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、必要とする量の活性化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの1つまたは組合せと共に組み込んだ後、濾過による滅菌処理を施すことにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒と、上記で列挙した成分に由来する、必要とする他の成分とを含有する滅菌媒体へと組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、任意のさらなる所望の成分を有効成分に加えた粉末を、既に滅菌濾過したその溶液から生成させる、真空乾燥および凍結乾燥である。00112用いられる場合、経口組成物は一般に、不活性の希釈剤または可食性の担体を包含する。経口療法剤投与の目的では、活性化合物を賦形剤と共に組み込むことができ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルのフォームで用いる。経口組成物はまた、口内洗浄液として用いられる流体の担体を用いて調製することもできる。薬学的適合性の結合剤および/または補助剤物質を、組成物の一部として組み入れることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、性質が類似する以下の成分または化合物のうちのいずれかを含有しうる:結晶セルロース、トラガントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤;デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Primogel商標、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムもしくはSterotes商標などの潤滑剤;コロイド状の二酸化ケイ素などの流動促進剤;スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤;またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香味剤などの芳香剤。00113吸入投与の場合、突然変異体のIL-2ポリペプチドまたはそれらをコードする核酸は、適切な高圧ガス、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくは分注器または噴霧器からのエアゾールスプレーのフォームで送達する。このような方法には、米国特許第6,468,798号において記載される方法が含まれる。00114突然変異体のIL-2ポリペプチドまたは核酸の全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段も介しうる。経粘膜投与または経皮投与では、透過される障壁に適切な浸透剤を処方物中で用いる。当技術分野では、このような浸透剤が一般に知られており、これらには、例えば、経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐剤の使用を介して達成することができる。経皮投与では、活性化合物を、当技術分野で一般に知られる軟膏ointments、salves、ゲル、またはクリームへと調合する。00115一部の実施形態ではまた、化合物突然変異体のIL-2ポリペプチドまたは核酸を、坐剤例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなど、従来の坐剤ベースを伴うまたは直腸内送達用の停留浣腸のフォームで調製することもできる。00116一部の実施形態では、化合物突然変異体のIL-2ポリペプチドまたは核酸はまた、McCaffreyらNature4186893、2002、XiaらNatureBiotechnol2010061010、2002、またはPutnamAmJHealthSystPharm53151160、1996AmJHealthSystPharm53325、1996に訂正掲載において記載されている方法が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で知られる方法を用いるトランスフェクションまたは感染を介して投与することもできる。00117一実施形態では、突然変異体のIL-2ポリペプチドまたは核酸を、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系を含めた制御放出処方物など、突然変異体のIL-2ポリペプチドを体内からの急速な消失から保護する担体と共に調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマーを用いることができる。このような処方物は、標準的な技法を用いて調製することができる。材料もまた、AlzaCorporationおよびNovaPharmaceuticals,Inc.から市販されている。また、リポソーム懸濁液ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染させた細胞を標的とするリポソームを含めたも、薬学的に許容可能な担体として用いることができる。例えば、米国特許第4,522,811号において記載される通り、これらは、当業者に知られる方法に従い調製することができる。00118このような突然変異体のIL-2ポリペプチドまたは核酸化合物の用量、毒性、および治療有効性は、例えば、LD50集団のうちの50に対して致死的な用量およびED50集団のうちの50において治療的に有効な用量を決定するための、細胞培養物または実験動物による標準的な薬学的手順を介して決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、これは、比LD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物も用いうるが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小化し、これにより、副作用を軽減するためには、罹患組織部位をこのような化合物の標的とする送達系をデザインするように注意を払うべきである。00119細胞培養物によるアッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて用いられる用量の範囲を処方するのに用いることができる。このような化合物の用量は、毒性をほとんどまたは全く伴わないED50を包含する循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、使用される剤形および使用される投与経路に応じてこの範囲内で変化させることができる。本明細書の方法で用いられる任意の化合物の場合、治療有効用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて処方して、細胞培養物中で決定されるIC50すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する被験化合物の濃度を包含する循環血漿濃度の範囲を達成することができる。このような情報を用いてヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。00120本明細書で規定される治療有効量の突然変異体IL-2ポリペプチドすなわち、有効用量は、選択されるポリペプチドに依存する。例えば、患者体重1kg当たり約0.001~0.1mgの範囲の単回投与量を投与することができるが、一部の実施形態では、約0.005、0.01、0.05mg/kgを投与することもできる。一部の実施形態では、600,000IU/kgを投与するIUは、リンパ球増殖バイオアッセイを介して決定することができ、TheWorldHealthOrganization1stInternationalStandardforInterleukin2humanにより確立された国際単位IUで表される。この用量は、PROLEUKIN登録商標に処方された用量と同様でありうるが、これより少ないと予測される。組成物は、隔日1回を含め、毎日1回~1または複数回~毎週1または複数回投与することができる;当業者は、疾患もしくは障害の重症度、既往の治療、全般的な健康、および/または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患が含まれるがこれらに限定されない特定の因子が、対象を有効に治療するのに必要とする用量およびタイミングに影響を及ぼしうることを理解するであろう。さらに、治療有効量の本発明の突然変異体IL-2ポリペプチドによる対象の治療は、単回の治療を包含する場合もあり、一連の治療を包含する場合もある。一実施形態では、組成物を8時間ごとに5日間にわたり投与した後、2~14日間、例えば、9日間の休薬期間に続いて、さらに8時間ごとに5日間にわたり投与する。00121医薬組成物は、投与のための指示書と併せて、容器内、パック内、または分注器内に組み入れられる。00122本発明は、非限定的な例として用いられる以下の研究においてさらに記載され、これらにより例示される。実施例1酵母の表面におけるIL-2の機能的発現00123IL-2は既にバクテリオファージ上で提示されているBuchliら、ArchBiochemBiophys3397984、1997が、このかつての系は、指向的進化に適さず、したがって、IL-2Rのサブユニットに対する結合を改善したIL-2の突然変異体を得るのには適切でない。これを克服するため、IL-2を、酵母細胞の表面で発現させた。ヒトIL-2DNAを、酵母用ディスプレイベクターであるpCT302へとクローニングした。SaccharomycescerevisiaeのEBY100株を、pCT302_IL-2ベクターで形質転換し、SD-CAAプレート上、30°Cで3日間にわたり増殖させた。IL-2酵母の個別のコロニーを、SD-CAA中、30°Cで一晩にわたり増殖させ、次いで、20°Cで2日間にわたりSGCAAに導入した。酵母を、四量体化されたビオチニル化IL-2Rβ、ビオチニル化γ、またはビオチニル化γの存在下におけるビオチニル化IL-2Rβで染色した。IL-2Rβおよびγの細胞外ドメインをC末端においてビオチニル化し、染色分取試薬として用いられるフィコエリトリンコンジュゲートストレプトアビジンに連結した。IL-2Rβの四量体は、2μΜのビオチニル化IL-2Rβを、氷上で15分間にわたり470nMのストレプトアビジン-フィコエリトリンSAPE、Invitrogenと共にインキュベートすることにより形成した。これらの受容体の四量体は、単量体の細胞外ドメインECDによるIL-2との低アフィニティーの相互作用のアビディティーを増強し、ライブラリーからのIL-2変異体の最大限の回収を可能とした。溶体の野生型IL-2と同様に、IL-2Rβ単独に弱く結合する、酵母により提示されるIL-2は、γ単独には全く結合せず、フローサイトメトリーデータは示さないにより見られる対角染色を介して証拠立てられる通り、IL-2Rβの存在下ではγに結合した。したがって、酵母により提示されるIL-2は、可溶性のIL-2と共に見られる、細胞上におけるヘテロ二量体の受容体複合体の協調的アセンブリーを再現するものであり、したがって、ライブラリーによる選択のためのプラットフォームとして適する。実施例2IL-2突然変異体ライブラリーの構築およびスクリーニング00124第1世代のinvitro戦略は、IL-2遺伝子全体のエラープローンPCRライブラリーを創出することであった。第1世代の突然変異体IL-2ライブラリーは、以下の通りに構築した。野生型ヒトインターロイキン2IL2を、製造元の指示書に従いGeneMorph登録商標IIRandomMutagenesisキットを用いるエラープローン突然変異誘発にかけた。エラープローンPCRには、以下のプライマーを用いた:5’-GCACCTACTTCAAGTTCTAC-3’IL2errproneforおよび5’-GCCACCAGAGGATCC-3’IL2errpronerev。次いで、以下のプライマー:5’-AGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCGCACCTACTTCAAGTTCTAC-3’および5’-ACACTGTTGTTATCAGATCTCGAGCAAGTCTTCTTCGGAGATAAGCTTTTGTTCGCCACCAGAGGATCC-3’を用いて、エラープローンPCR反応の産物を増幅して、DNA約130μgを得た。酵母ディスプレイベクターであるpCT302を、制限酵素NheIおよびBamHIで二重消化し、ゲル精製した。IL-2DNAおよびpCT302DNAを併せて、エレクトロコンピテントのEBY100酵母と5:1μgの比で混合した。酵母を電気穿孔して、ライブラリーDNAの酵母への移入を容易にした。この電気穿孔を約20回にわたり繰り返し、最終ライブラリーサイズ1×108の形質転換体を得た。第1世代のIL-2ライブラリーの選択:ライブラリーは、IL-2Rβに対する6回にわたる選択ラウンドにかけた図2A。第1ラウンドでは、ライブラリーを、2μMのビオチニル化されたIL-2Rβを470nMのストレプトアビジン-フィコエリトリンコンジュゲートSAVPEと15分間にわたり混合することにより形成した470nMの四量体のIL-2Rβで標識した。ライブラリーを、IL-2Rβと共に1.5時間にわたりインキュベートし、PBS-BSA緩衝液リン酸緩衝生理食塩液ウシ血清アルブミンで洗浄し、Miltenyi抗PEMicroBeadsと共に4°Cで20分間にわたりインキュベートした。細胞を再度洗浄し、選択用の磁気カラムを流過させた。IL-2Rβの濃度ラウンド2:1μM、ラウンド3:1μM、ラウンド4:300nM、ラウンド5:300nM、ラウンド6:100nM、全て単量体のIL-2Rβのみを変更して、この選択法をさらに5回にわたり反復することに成功した。選択が終了したら、ラウンド5およびラウンド6の酵母培養物をSD-CAAプレート上に塗布したが、これにより、個別の酵母コロニーがもたらされた。結果として得られる18の酵母コロニーを、500nMのIL-2Rβへの結合について調べた。これらの18の酵母コロニーから単離されたIL-2DNAを、配列決定した。これらの18の酵母コロニーの間の、野生型IL-2の対応する残基と比べたアミノ酸の差違を、表1に示す。第2世代のIL-2ライブラリーのライブラリー構築L85Vを含有するクローンの比率が高いことに基づき、第2のIL-2ライブラリーを、主に疎水性のコア残基に焦点を当てて構築した。Q74、L80、R81、L85、I86、I89、I92、V93において突然変異を伴う部位指向的IL-2ライブラリーを構築した。Q74は、H/K/N/Q/R/Sとして変化させた。R81は、縮重のNNKコドンを伴う20アミノ酸の全てにおいて変化させた[配列中、Nは、アデニンヌクレオシド、チミンヌクレオシド、グアニンヌクレオシド、およびシトシンヌクレオシドの各々による25のミックスを表し、Kは、グアニンまたはチミンである]。残りの残基は、F/I/L/Vとして変化させた。ライブラリーは、以下のオリゴを用いるアセンブリーPCRにより構築した。部位指向的PCRは、以下のオリゴにより増幅した:PCR増幅オリゴ50bpの相同性を包むPCRにより、DNA40μgがもたらされ、これを二重消化されたpCT302およびエレクトロコンピテントのEBY100酵母と混合し、第1世代のライブラリーの場合と同様に電気穿孔した。第2世代のIL-2ライブラリーの選択:ライブラリーを、IL-2Rβに対する5回にわたる選択ラウンドにかけた図2B。この選択法は、用いられるIL-2Rβの濃度に対する改変ラウンド1:1μM、ラウンド2:100nM、ラウンド3:30nM、ラウンド4:30nM、ラウンド5:10nM、全て単量体のIL-2Rβを伴うことを除き、第1世代のライブラリーの場合と全く同様に実施した。選択が終了したら、ラウンド4およびラウンド5の酵母培養物をSD-CAAプレート上に塗布したが、これにより、個別の酵母コロニーがもたらされた。両方のラウンドに由来する48の個別の酵母クローンを96ウェルのブロックフォーマットで増殖させ、5nMのIL-2Rβ、次いで、SAV-PEで標識することによりスクリーニングした。スクリーンは、IL-2Rβに対する7つの高アフィニティー結合剤をもたらした。これらの7つの高アフィニティー結合剤の間の、野生型IL-2の対応する残基と比べたアミノ酸の差違を、IL-2Rβに対する結合アフィニティーと共に表2に示す。実施例3IL-2ムテインタンパク質の発現および精製00125ヒトIL-2変異体アミノ酸1~133、IL-2Rβ細胞外ドメインアミノ酸1~214、およびγcアミノ酸34~232を、N末端のgp67シグナル配列およびC末端のヘキサヒスチジンタグとインフレームでpAcGP67-AベクターBDBiosciencesへとクローニングし、バキュロウイルスによる発現系を用いて生成させた。バキュロウイルスの原液は、SF900II培地Invitrogen中で増殖させたSpodopterafrugiperdaSf9細胞におけるトランスフェクションおよび増幅により調製し、タンパク質の発現は、BioWhittaker登録商標昆虫XPRESS商標培地Lonza中で増殖させたTrichoplusianiHighFive商標細胞懸濁液中で実行した。タンパク質を発現させ、ニッケルアガロースQIAGENを介する48~60時間後のHighFive商標上清から捕捉し、10mMのHEPESpH7.2および150mMのNaCl中で平衡化したSuperdex商標200カラムGEHealthcareによるサイズ除外クロマトグラフィーを介して濃縮および精製した。SPRおよび細胞ベースのアッセイで用いられるIL-2変異体は、完全にグリコシル化させて発現させた。ビオチニル化させた受容体の発現では、IL-2Rβおよびγcを、C末端ビオチンアクセプターペプチドBAPLNDIFEAQKIEWHEおよびヘキサヒスチジンタグと共にpAcGP67-Aベクターへとクローニングした。受容体タンパク質は、過剰なビオチン100uMを伴うBirAリガーゼと共に共発現させた。実施例4CD25-ナチュラルキラーYT1細胞およびCD25ナチュラルキラーYT1細胞の刺激00126YT-1細胞およびCD25YT-1細胞を、10のウシ胎仔血清、2mMのL-グルタミン、最小限の非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、25mMのHEPES、およびペニシリン-ストレプトマイシンGibcoを補充したRPMI1640培地中で培養した。CD25YT-1細胞は、以下の通りに精製した:1×107個の細胞をFACS緩衝液リン酸緩衝生理食塩液2のウシ血清アルブミンで洗浄し、FACS緩衝液1mL中、4°Cで20分間にわたり、PEとコンジュゲートした抗ヒトCD251:20Biolegend、SanDiego、CAで染色した。染色された細胞を抗PEIgGへと連結された常磁性マイクロビーズで標識し、製造元MiltenyiBiotec、BergischGladbach、Germanyの指示書に従い、LSMACS登録商標分離カラムにより分離した。溶出させた細胞を、完全RPMI培地中に1×105個の細胞濃度で再懸濁させ、後続の実験のために増殖させた。細胞の濃縮は、Accuri登録商標C6フローサイトメーターを用いて、FL-2チャネルによるフローサイトメトリーを介してモニタリングした。00127YT-1細胞に対するH9、D10、および6-6の用量反応関係は、フローサイトメトリーによりSTAT5のリン酸化をアッセイすることにより決定した図4aおよび4b。CD25YT-1細胞またはCD25-YT-1細胞をFACS緩衝液で洗浄し、96ウェルプレート内のFACS緩衝液200μL中に表示される濃度の野生型、6-6、H9、またはD10と共に再懸濁させた。細胞を室温で20分間にわたり刺激し、次いで、ホルムアルデヒドを1.5まで添加することにより固定し、10分間にわたりインキュベートした。氷上で20分間にわたり、100の氷冷メタノールで細胞を透過処理した後、-80°Cで一晩にわたりインキュベーションした。固定されて透過処理された細胞を過剰なFACS緩衝液で洗浄し、FACS緩衝液中で1:20に希釈した、Alexa647コンジュゲート抗STAT5pY694BDBiosciences、SanJose、CA50μLと共に20分間にわたりインキュベートした。細胞をFACS緩衝液中で2回にわたり洗浄し、Accuri登録商標C6フローサイトメーターのFL-4チャネルを用いて細胞の平均蛍光発光を決定した。00128IL-2の42位におけるフェニルアラニンからアラニンへの十分に特徴づけられた突然変異F42Aであって、CD25への結合は消失させるが、IL-2RβまたはIL-2Rγに結合するその能力には影響を及ぼさない突然変異Mott、1995を利用することにより、IL-2ムテインいわゆるスーパー2分子のCD25非依存性についてさらに調べた。この突然変異はH9ムテインにも導入し、H9F42Aを得た。IL-2、IL-2F42A、H9、およびH9F42Aによる、CD25-YT-1細胞およびCD25YT-1細胞に対するSTAT誘導の比較を実施した図5。IL-2F42A突然変異は、CD25細胞に対する野生型IL-2の用量反応曲線を約1log右側にシフトさせたが、F42A突然変異は、CD25-細胞におけるSTAT誘導に対する観察可能な効果を及ぼさなかった図5a。これに対して、H9およびH9F42Aについての用量反応曲線は、CD25-細胞およびCD25細胞のいずれにおいても本質的に重なり合った。したがって、これらの実験は、IL-2ムテインが、見かけ上はCD25の存在から利益を受けないが、それらの活性は、CD25のインターフェースを破壊する突然変異に対して非感受性であることを裏付ける。実施例5CD25-T細胞およびCD25T細胞刺激00129ヒトおよびマウスのCD4T細胞を、BALB/CマウスのPBMCStanfordBloodBank、脾臓、およびリンパ節から、それぞれ、抗体でコーティングされたCD4T細胞単離用磁気ビーズStemCellTechnologiesおよびMiltenyiBiotecを用いて調製した。天然細胞刺激アッセイでは、細胞を即座に用いた。invitroにおいて抗原経験のあるT細胞世代を生成するために、100ng/mLの抗CD3ヒトにはOKT3であり、マウスには2C11である;eBiosciencesでプレートをコーティングする前に、ウェルを、pH9.6の重炭酸緩衝液中の二次抗体VectorLabsであらかじめコーティングした。T細胞を、可溶性の抗CD28ヒトにはCD282であり、マウスには3751である;eBiosciencesと共に、ウェル1つ当たり0.1×106個の細胞で播種した。細胞を、刺激された完全なTCRと共に3日間にわたり培養した後、条件付け培地中で2日間にわたり静置し、新鮮な培養培地中で2日間にわたり静置した。使用前に、Lympholyte-MCederlaneによる遠心分離を介して生細胞を回収し、カウントした。00130CD25の発現が欠損するT細胞またはCD25を発現するT細胞に対するIL-2ムテインの活性を評価した図6。野生型IL-2および6つのIL-2ムテインの用量反応関係を、1ng/ml~1000ng/mlの範囲のタンパク質濃度におけるSTAT5のリン酸化についてアッセイした。IL-2ムテインがCD25欠損T細胞におけるSTAT5のリン酸化を刺激する能力は、それらのIL-2Rβに対するアフィニティーと良好に相関した。IL-2ムテインによるSTAT5のリン酸化の増大は、IL-2より2桁大きかった。00131また、IL-2ムテインが、大量の完全IL-2受容体複合体であるCD25IL2Rα、IL-2Rβ、およびγcを発現する、抗原経験のあるヒトCD4T細胞におけるSTAT5のリン酸化を刺激する能力も評価した図7。ヒトCD4T細胞をinvitroにおいてTCR刺激し、静置し、抗原経験のあるヒトCD4CD25Tリンパ球を生成させた。1ng/mLでは、STAT5リン酸化の差違がほとんど観察されなかった。野生型を含めた各IL-2変異体により、細胞のうちの90超を刺激した。0.1ng/mLでは、わずかな差違が観察された。野生型IL-2は、48のpSTAT5刺激を結果としてもたらし、IL-2ムテインは、65~79のpSTAT5刺激をもたらした。したがって、IL-2ムテインは、見かけ上は抗原経験のあるヒトT細胞を野生型IL-2より良好に刺激するが、増強は、CD25を欠く細胞における場合ほど顕著ではない。実施例6NK細胞による細胞傷害作用アッセイ00132EGFR内皮成長因子受容体を発現する扁平上皮がん細胞系SCC6と、EGFRに対するモノクローナル抗体であるセツキシマブとを用いて、D10IL-2ムテインの、ナチュラルキラー細胞の機能、とりわけ、自発的な抗体依存性細胞介在性細胞毒性ADCCに対する効果を評価した。ヒトEGFR陽性扁平上皮細胞がん細胞系であるSCC6は、J.Sunwoo研究室Stanford、CAから恵与された。SCC6細胞系は、加熱により不活化した10のFCSHyCloneLaboratories、100U/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシンいずれもInvitrogenLifeTechnologies製を補充したDMEM/F12培地InvitrogenLifeTechnologies中で培養した。細胞は、5CO2中37°Cの培養物中で接着させて増殖させた。セツキシマブマウスキメラ抗ヒト表皮成長因子受容体EGFRIgG1IMCC225Erbitux登録商標は、Bristol-MyersSquibbから購入した。00133クロム放出は、以下の通りに実施した:NK細胞は、約1×109個の細胞を含有する、健康なドナーによる白血球低減系LRS産物から単離した。NK細胞は、製造元の指示書に従いNK細胞単離用ビーズMiltenyiBiotecを用いる負磁気細胞分取を介して単離した。NK細胞を純度CD3CD56フローサイトメトリーにより規定される>90の純度について評価した。SCC6標的細胞を細胞1×106個当たり150μCiの51Crで2時間にわたり標識した。培地単独中、セツキシマブ100pg/mL中、IL-21000IU/mL中、IL-2D101pg/mL中、IL-2D1010pg/mL中、またはセツキシマブ100pg/mLにIL-21000IU/mLを加えた組合せ、セツキシマブ100pg/mLにIL-2D101pg/mLを加えた組合せ、もしくはセツキシマブ100pg/mLにIL-2D1010pg/mLを加えた組合せを含めた組合せ中に51Crで標識したSCC6細胞と共に、エフェクター細胞標的細胞比を0:1、1:1、および5:1で変化させて、精製されたNK細胞を5時間にわたり培養した後に、溶解百分率を決定した。アッセイは、3連で実施した。精製されたNK細胞を、51Crで標識したSCC6細胞と共に、濃度を変化させるセツキシマブ、IL-2またはIL-2D10の存在下または非存在下で培養した。D10によるNK細胞の自発的細胞傷害作用に対する刺激は、高用量のIL-2図8、p008、p001を上回り、IL-2またはD10による刺激を伴わない場合の自発的細胞傷害作用は最小限であった。セツキシマブに結合したSCC6のADCCも、D10による刺激を介して、高用量のIL-2またはセツキシマブ単独と比較して同様に増大したp=.0005、p=.0001。とりわけ、D10により、自発的な細胞毒性およびADCCの両方の、高用量のIL-2と比較して優越する機能的増強が、1:1を含め全てのエフェクター:標的比において生じた。実施例7IL-2ムテインは、抑制型T細胞Tregsの刺激を比較的低下させながら、メモリー表現型増殖の増強を結果としてもたらす00134IL-2ムテインであるH9の、CD25は低レベルで発現するがIL-2Rβγは高レベルで発現するメモリー表現型CD8T細胞の増殖に対する効力を、invivoにおいて評価した。C57B1/6マウスに、PBS、IL-220μg、H920μg、またはIL-2/抗IL-2モノクローナル抗体の複合体1.5μgを施し、脾臓のCD3CD8CD44highメモリー表現型T細胞の全細胞カウントをフローサイトメトリーにより評価した。脾臓細胞の懸濁液を調製し、蛍光色素をコンジュゲートしたモノクローナル抗体で、CD3クローン1452C11、eBioscience、CD4クローンRM45、CaltagLaboratories、CD8aクローン5367、BDBiosciences、CD25クローンPC61、BDBiosciences、CD44クローンIM7、eBioscience、NK1.1クローンPK136、BDBiosciences、およびThy1.1クローンHIS51、eBioscienceを染色した。BDFACSCanto商標IIフローサイトメーターを用いて少なくとも100,000個の生細胞を収集し、FlowJoソフトウェアTriStarIncを用いて解析した。図10Aに示される通り、開示されるIL-2ムテインによる処置は、他の処置モダリティーと比べて大幅な、メモリー表現型T細胞の増殖を結果としてもたらしたが、CD3CD4CD25highT細胞である制御性T細胞の増殖は制限された図10B。実施例8invivoにおけるIL-2ムテインの毒性の低減00135IL-2による処置は、急性肺浮腫などの重度の有害作用をもたらしうることが知られ、これは、現在のところIL-2の有効な使用を阻止する制約となっている。したがって、開示されるIL-2ムテインのIL-2と比べた毒性を評価した図11A。C57B1/6マウスに、PBS、IL-220μg、H920μg、またはIL-2/抗IL-2モノクローナル抗体の複合体1.5μgによる毎日の腹腔内注射を、連続5日間にわたり施した。養子細胞移入の6日後、肺を摘出し、真空下58°Cで一晩にわたる乾燥の前および乾燥の後に秤量した。肺の湿潤重量は、初期の肺重量を脱水後の肺重量から減じることにより計算した。実施例9invivoにおけるIL-2ムテインの抗腫瘍活性の増大00136開示されるIL-2ムテインの腫瘍細胞に対する効力をinvivoにおいて調べた。RPMI100μl中に106個のB16F10黒色腫細胞を、マウス群1つ当たりのマウス3~4匹背部の真皮上層へと注射した。処置は、PBS、IL-220μg、H920μg、またはIL-2/抗IL-2モノクローナル抗体の複合体IL2mAb1.5μgによる5回にわたる毎日の注射からなり、腫瘍小塊が約15mm2のサイズではっきりと目視可能および触知可能となって1日後に開始した。図11Bで裏付けられる通り、開示されるIL-2ムテインは、invivoにおける抗腫瘍活性の増強を結果としてもたらした。実施例10IL-2ムテインとIL-2との構造比較00137表面プラズモン共鳴SPRによりIL-2Rβに対するそれらの結合アフィニティーおよび反応速度を測定するために、IL-2ムテインのうちのいくつかを組換えにより発現させた。IL-2とIL-2Rβとのアフィニティーは、KD=280nMであった。IL-2ムテインを、低アフィニティーのクラス、中程度のアフィニティーのクラス、および高アフィニティーのクラスへとクラスター分割した。低アフィニティーのIL-2ムテイン5-2および6-6は、それぞれ、50~70nMのKDでIL-2Rβに結合し、野生型IL-2の4~6倍のアフィニティーの増分は、ほぼ完全にL85V置換を介するものであった。第2の部位指向的ライブラリーから選択された、アフィニティーが中程度の突然変異体および高アフィニティーの突然変異体のKDは、それぞれ、10~15nMC5、H4および1.2~1.7nMB1、D10、E10、G8、H9であった。アフィニティーの増大は、オフ速度の低減により一様に明示され、高アフィニティーのIL-2ムテインは、L80F/R81D/L85V/I86V/I92Fのうちの無作為化された位置にコンセンサス配列を含有した。00138IL-2ムテインの構造的帰結を理解するために、D10ムテインのほか、IL-2Rβおよびγcに結合したD10の三元複合体を結晶化させた。D10単独の構造では、6つの突然変異のうちの5つが、B-Cループ上およびCヘリックスのコア内のIL-2Rβに接触しない位置にクラスター化した。とりわけ、B-Cヘリックスのリンカー領域は、電子密度マップにおいて、この領域が部分的にまたは完全に無秩序的である他のIL-2構造と比較して秩序立っている図9。F80、V85、およびV86の置換基は、まとまって、ループを安定化させCヘリックスを分子のコアへとピン止めしヘリックスBを充填する疎水性のクラスターへと崩れこんでいると考えられる。H74の突然変異およびD81突然変異は、溶媒に曝露されており、したがって、それらの構造的役割はそれほど明らかではないが、Aspは、ヘリックスC構造にさらに寄与しうる、ヘリックスのよく知られたNキャッピング残基である。6つのコンセンサス突然変異のうちの1つであるI92Fのみが、受容体複合体におけるIL-2Rβに接触する位置に置かれた。Phe92は、CヘリックスとAヘリックスとの間に深く挿入され、複合体のIL-2Rβにより覆い隠された分子表面のうちの、Ile92と比較した、さらなる10Å2に寄与するに過ぎない。したがって、そのIL-2Rβとの接触は、合計で約300倍に及ぶD10のアフィニティーの増分に対してわずかな寄与をなすに過ぎない可能性が高い。00139また、D10三元受容体複合体の低解像度3.8Åによる構造も決定して、突然変異がIL-2Rβ/γc受容体の結合形状を攪乱したかどうかを評価した。安定的なD10とIL-2Rβとの三元複合体を結晶化させ、CD25の非存在下で精製した。D10の三元複合体におけるIL-2Rβ/γcヘテロ二量体全体の骨格およびサイトカイン/IL-2Rβの接触方式は、既に報告されている四元アセンブリーの場合と本質的に同一である。したがって、スーパー2の効力の増大は、受容体二量体の骨格の構造変化に起因するものではなく、アフィニティーの増強に起因する可能性が高い。00140上述で論じた通り、IL-2のCヘリックスは、二元複合体および四元複合体のいずれにおいても見られる、IL-2Rαへの結合時に微細な再配置を受けると考えられる。これに対して、PDBデータベースにおいて、3つの野生型のリガンド結合していない構造を検査することにより、Cヘリックスの位置のばらつきが、このヘリックスにおけるB因子の、この分子の残りの部分と比べた増大と符合することが明らかとなる。D10の構造の、リガンド結合していないIL-2、および受容体複合体におけるIL-2の構造との比較を企図した。D10におけるCヘリックスは、遊離フォームの場合より、2つの受容体に結合したIL-2の立体構造において見られるCヘリックスとより類似し、ヘリックスコアの上方および内部へのシフトを経ていることが観察された。00141分子動力学MDシミュレーションを用いて、IL-2ムテインがIL-2Rβに対する結合アフィニティーを増大させる機構を探査した。IL-2ムテインと対比した、IL-2の相対的な立体構造の可撓性を直接探索するために、原子レベルの詳密なマルコフ状態モデルMSMを構築した。このMSMにおける状態は、原子論的シミュレーションから結果として得られる、急速に相互変換する立体構造の反応速度論的クラスター化に由来する。これらの準安定状態の各々は、系の構造および動態を最終的に決定する根底的な自由エネルギーランドスケープにおける局所的な極小値に対応する。MSMの解析は、IL-2ムテインがIL-2より安定的であり、IL-2が、IL-2ムテインのほぼ2倍のクラスターをビジットすることを裏付ける。例えば、IL-2ムテインの最も密度の高い状態の平衡確率は、IL-2の約-0.05と比較して約-0.20である。IL-2ムテインでは、ヘリックスB、B-Cループ、およびヘリックスCが、IL-2の場合と比較して硬直している。発生した突然変異は、B-Cループ内H74、D81、およびBヘリックスとCヘリックスとの充填インターフェース内F80、V85、V86に存在するので、いずれのヘリックスヘリックスCのみでなくも突然変異から利益を受け、集合的な安定化を経る。F92は、ヘリックスCとヘリックスAとの間の分子的楔として作用し、ヘリックスのよりC末端側の端部でさらなる安定化のための影響力として作用すると考えられる。MDシミュレーションにより、スーパー2では、ヘリックスBもまた安定化を経ていることが示唆されることは、IL-2の結晶構造の比較からは自明でなかったので驚きであった。IL-2Rαは、主にBヘリックスおよびDヘリックスの一部において、IL-2に結合する。MDシミュレーションは、IL-2RαのIL-2への結合は、ヘリックスBを硬直させることが可能であり、この構造的安定化は、B-CループおよびヘリックスCへと伝播しうる可能性を示唆する。原理的には、IL-2ムテインにおいて発生した突然変異の見かけの効果と同様である。00142最も密度の高い立体構造を各タンパク質のシミュレーションから視覚化することにより、ヘリックスCは、IL-2ムテインにおける場合よりIL-2における場合にはるかに可撓性が大きいことが示され、また、IL-2ムテインにおける突然変異が、受容体結合様の立体構造を実際に安定化させることも示される。他の実施形態00143本発明をその詳細な記載と共に記載してきたが、前出の記載は、添付の特許請求の範囲により規定される、本発明の範囲を例示することを意図するものであり、これを限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。例えば、IL-2は、明細書の全体において言及されているが、当業者であれば、本明細書で記載される方法および組成物が、他のサイトカイン、例えば、この特性を伴う顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、またはIL-15にも同等に適用可能であることを理解するであろう。したがって、本発明はまた、それらのそれぞれの受容体に対する結合アフィニティーを野生型と比較して増大させた、GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、およびIL-15の突然変異体、ならびにこれらの突然変異体を同定する方法および用いる方法も包含する。"