"アラビノースを転化できる細胞を製造する方法であって、以下の工程:aアラビノースを転化できない宿主株に、遺伝子araA、遺伝子araBおよび遺伝子araDを導入する工程であって、この細胞は構築細胞と呼ばれる工程;bアラビノースを転化する細胞が得られるまで、前記構築細胞を適応進化にかける工程、c任意選択的に、前記第1アラビノース転化細胞を適応進化にかけて、前記アラビノース転化を改良する工程であって;工程bまたはcで製造される前記細胞は、第1アラビノース転化細胞と呼ばれる工程;d前記第1アラビノース転化細胞の全ゲノムまたはゲノムの一部および前記構築細胞の全ゲノムまたはゲノムの一部を分析する工程;e前記第1アラビノース転化細胞における一塩基変異多型SNP’sを同定する工程;およびf前記SNP’sの情報を、アラビノースを転化できる細胞の合理的設計で使用する工程;g工程fで設計される、アラビノースを転化できる細胞の構築の工程;を含む、方法。工程e、fおよび/またはgで、表現型検査の1つ以上の技術が、遺伝子型決定の1つ以上の技術と併用される、請求項1に記載の方法。前記方法で、アラビノースを転化できる前記酵母細胞は、前記宿主株と比較して増幅される染色体を有し、前記増幅される染色体は、前記araA遺伝子、araB遺伝子およびaraD遺伝子が前記宿主株に導入された前記染色体と同数を有する、請求項1または2に記載の方法。前記増幅される染色体が染色体VIIである、請求項3に記載の方法。電気泳動法で測定するとき、酵母細胞BIE201を除き、染色体VIIが1300~1600Kbのサイズを有する、araA遺伝子、araB遺伝子およびaraD遺伝子を有する酵母細胞。前記araA遺伝子、araB遺伝子およびaraD遺伝子のコピー数がそれぞれ3~5である、請求項5に記載の酵母細胞。SSY1遺伝子における突然変異G1363T、YJR154w遺伝子における突然変異A512T、CEP3遺伝子における突然変異A1186G、およびGAL80遺伝子における突然変異A436Cからなる群から選択される、前記一塩基多型の1つ以上を有する、請求項6に記載の酵母細胞。GAL80遺伝子に単一多型A436Cを有する、請求項7に記載の酵母細胞。CEP3遺伝子に一塩基多型A1186Gをやはり有する、請求項8に記載の酵母細胞。ポリペプチド類:a.SSY1に置換E455stopを有するポリヌクレオチド配列番号14によりコード化される配列を有するポリペプチド、およびその他の位置の1つ以上が、AAトランススーパーファミリーにおける既存のアミノ酸である別のアミノ酸を有するアミノ酸の突然変異を有する、その変異形ポリペプチド類;b.YJR154wに置換D171Gを有するポリヌクレオチド配列番号16によりコード化される配列を有するポリペプチド、およびその他の位置の1つ以上が、PhyHスーパーファミリーにおける既存の保存アミノ酸である別のアミノ酸を有するアミノ酸の突然変異を有する、その変異形ポリペプチド;c.CEP3に置換S396Gを有するポリヌクレオチド配列番号18によりコード化される配列を有するポリペプチド;d.GAL80に置換T146Pを有する配列番号20によりコード化される配列を有するポリペプチド、および、その他の位置の1つ以上がNADBRossmannスーパーファミリーにおける既存の保存アミノ酸であるアミノ酸を含むアミノ酸の突然変異を有してもよい、その変異形ポリペプチド類;からなる群に属するポリペプチド。グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびキシロースを含む糖組成物から1つ以上の発酵産物を生成する方法であって、前記糖組成物が請求項5~9のいずれか1項に記載の酵母細胞を用いて発酵される方法。a前処理済のリグノセルロース物質を生成するための、1つ以上のリグノセルロース物質の前処理;b前記糖組成物を生成するための、前記前処理済リグノセルロース物質の酵素処理;によって、前記糖組成物がリグノセルロース物質から生成される、請求項11に記載の方法。前記発酵が嫌気的に実施される、請求項11または12に記載の方法。前記発酵産物が、エタノール、n-ブタノール、イソブタノール、乳酸、3-ヒドロキシ-プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、アミノ酸、たとえばリシン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、およびアスパラギン酸等、1,3-プロパン-ジオール、エチレン、グリセロール、β-ラクタム抗生物質およびセファロスポリン、ビタミン類、医薬品、動物飼料サプリメント、特殊化学品、化学的原料、プラスチック、溶剤、バイオ燃料およびバイオガスまたは有機ポリマーを含む燃料、および工業用酵素、たとえばプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ類、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼ等からなる群から選択される、請求項11~13のいずれか1項に記載の方法。[実施例]特に指定のない限り、本明細書に記載の方法は標準的な生化学的技術である。好適な一般的方法論教科書の例としては、Sambrooketal.,MolecularCloning,aLaboratoryManual1989およびAusubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology1995,JohnWileySons,Inc.などがある。[培地組成]増殖実験:サッカロマイセスセルビシエSaccharomycescerevisiae株を、以下の組成を有する培地で増殖させる:0.67w/v酵母窒素原基礎培地または合成培地Verduynetal.,Yeast8:501-517,1992および様々な濃度の、グルコース、アラビノース、ガラクトースまたはキシロース、あるいはこれらの基質の組合せ具体的詳細については実施例を参照されたい;重量を体積で割ったw/vで表した濃度。寒天プレートの場合、培地に2w/v細菌学的寒天を加える。[エタノール生成]100ml振盪フラスコ中、2グルコースを加えたVerduyn培地Verduynetal.,Yeast8:501-517,199225mlに、凍結保存培養または寒天プレート由来の単一コロニーを接種することによってプレカルチャーを調製した。オービタルシェーカー280rpm内、30°Cで約24時間インキュベートした後、この培養を回収してCO2発生の測定およびエタノール生成実験に使用した。エタノール生成用の培養は、BAMBiologicalActivityMonitor,Halotec,TheNetherlandsで、合成モデル培地5グルコース、5キシロース、3.5アラビノースおよび1ガラクトースを含むVerduyn培地Verduynetal.,Yeast8:501-517,1992100ml中、30°Cで実施した。培地のpHは、滅菌前に2MNaOH/H2SO4で4.2に調整した。嫌気的培養用の合成培地には、エタノールに溶解した0.01gl-1エルゴステロールおよび0.42gl-1Tween80を加えたAndreasenandStier.J.CellPhysiol.41:23-36,1953;およびAndreasenandStier.J.CellPhysiol.43:271-281,1954。約2という初期OD600で培地に接種した。培地をマグネティックスターラーで撹拌した。培養に通気しなかったため、発酵中に嫌気的条件が急速に生じた。CO2生成を常時監視した。糖転化および産物形成エタノール、グリセロールは、NMRで分析した。増殖は、下記の、LKBUltrospecK分光光度計を用いた600nmにおける、培養の光学濃度によって監視した。[S.セルビシエS.cerevisiaeの形質転換]S.セルビシエS.cerevisiaeの形質転換は、GietzandWoods2002;TransformationoftheyeastbytheLiAc/SScarrierDNA/PEGmethod.MethodsinEnzymology350:87-96によって記述されている通りに実施した。[コロニーPCR]単一コロニー分離株コロニー分離株をプラスチック製爪楊枝で採取してmilliQ水50μl中に再懸濁させた。この試料を99°Cで10分間インキュベートした。製造業者により提供される取扱説明書に従ってPhusion登録商標DNAポリメラーゼFinnzymesを使用して、インキュベートした試料5μlをPCR反応の鋳型として使用した。[染色体DNA分離]酵母細胞は、ロータリーシェーカー内で、2グルコースを含むYEP-培地中で増殖させた30°Cおよび280rpmで一晩。こうした培養1.5mlをエッペンチューブEppendorftubeにトランスファーして最高速度で1分間遠心分離した。上澄を傾瀉し、ペレットをYCPS10mMTris.HClpH7.5中0.1SB3-14SigmaAldrich,theNetherlands;1mMEDTA200μlおよびRNase20mg/mlウシ膵臓由来RNaseA,Sigma,theNetherlands1μl中に再懸濁した。この細胞懸濁液を65°Cで10分間インキュベートした。この懸濁液をエッペンドルフ遠心分離機内、7000rpmで1分間遠心分離した。上澄を傾瀉した。ペレットを、CLS25mMEDTA、2SDS200μlおよびRNaseA1μl中に注意深く溶解した。65°Cで10分間インキュベートした後、この懸濁液を氷で冷却した。PPS10M酢酸アンモニウム70μlを加えた後、この混合液をボルテックスミキサーで完全に混合した。遠心分離エッペンドルフ遠心分離機内、最高速度で5分後、上澄を氷冷イソプロパノール200μlと混合した。DNAは容易に沈殿し、遠心分離5分、最高速度でペレット化させた。このペレットを氷冷70エタノール400μlで洗浄した。このペレットを室温で乾燥させ、TE10mMTris.HClpH7.5、1mMEDTA50μlに溶解した。[実施例1][株BIE104A2P1の構築][1.1アラビノース経路用遺伝子を含む発現ベクターの構築]図2に提示されている、プラスミドpPWT018は、以下の通りに構築した:ベクターpPWT006図1、SIT2-遺伝子座からなるGottlin-NinfaandKaback1986MolecularandCellBiologyvol.6,no.6,2185-2197および抗生物質G418を用いた形質転換体の選択およびアセトアミドでの増殖を可能にするマーカーを、制限酵素BsiWIおよびMluIで消化した。G418に対する耐性を与える、kanMX-マーカーは、p427TEFから分離されておりDualsystemsBiotech、amdS-マーカーを含むフラグメントは文献Swinkels,B.W.,Noordermeer,A.C.M.andRenniers,A.C.H.M1995TheuseoftheamdScDNAofAspergillusnidulansasadominant,bidirectionalselectablemarkerforyeasttransformation.YeastVolume11,Issue1995A,pageS579;および米国特許第6051431号明細書に記述されている。特許出願国際公開第2008/041840号パンフレットに開示されている、ラクトバチルスプランタムLactobacillusplantarum由来のアラビノースイソメラーゼaraA、L-リブロキナーゼaraBおよびL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼaraDをコード化する遺伝子を、BaseClearLeiden,theNetherlandsにより合成した。S.セルビシエS.cerevisiae由来の強力なプロモーター、すなわちaraA-遺伝子の発現を制御するTDH3-プロモーター、araB-遺伝子を制御するENO1-プロモーターおよびaraD-遺伝子を制御するPGI1-プロモーター、の制御下にあるまたは、に操作可能に連結されている、上述した3つのアラビノース-遺伝子を内部にもつ、1つの大きいフラグメントを合成した。このフラグメントを、独特の制限酵素Acc65IおよびMluIで包囲した。このフラグメントを、MluIおよびBsiWIで消化したpPWT006にクローニングし、結果としてプラスミドpPWT018図2を生じた。プラスミドpPWT018の配列を配列番号1に提示する。[1.2酵母形質転換]製造業者の取扱説明書に従って、SfiINewEnglandBiolabsを用いて事前に直線化した、プラスミドpPWT018で、CEN.PK113-7DMATaURA3HIS3LEU2TRP1MAL2-8SUC2を形質転換した。合成SfiI部位を、SIT2-遺伝子の5’-隣接領域内に設計した図2参照。形質転換混合物を、1ml当たり100μgのG418SigmaAldrichを含むYPD-寒天1リットル当たり:酵母エキス10g、1リットル当たり20gのペプトン、1リットル当たり20gのデキストロース、寒天20g上にプレーティングした。2~4日後、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照すなわち、形質転換実験でDNA無添加は空のYPD/G418-プレートに終わった。プラスミドpPWT018の組み込みは、SIT2-遺伝子座に向けられる。形質転換体は、PCR技術およびサザンブロット技術を使用して特性化した。プラスミドpPWT018の1コピーの正しい組み込みを示す、PCR反応を、配列番号2および配列番号3、ならびに配列番号3および配列番号4で示されるプライマーを用いて実施した。配列番号2と配列番号3のプライマー対を用いて、SIT2-遺伝子座における正しい組み込みをチェックした。プラスミドpPWT018が複数のコピーで組み込まれる場合頭-尾組み込み、配列番号3と配列番号4のプライマー対はPCR産物を与える。後者のPCR産物がない場合、これはpPWT018の1コピー組み込みを示す。プラスミドpPWT018の1コピーがSIT2-遺伝子座に組み込まれた株は、BIE104R2と呼ばれる。[1.3マーカーレスキュー]同じ選択マーカー類を使用した他の構築物で酵母株を形質転換できるためには、選択可能マーカーを除去することが必要である。プラスミドpPWT018の設計は、pPWT018を染色体に組み込むとき、相同配列が互いにごく近接しているというものであった。この設計は、こうした相同領域の自然発生的分子内組み換えによって、選択可能マーカーが失われることを可能にする。栄養増殖の際に、低頻度ではあるが、分子内組み換えが起こる。この組み換え頻度は、相同性の長さおよびゲノムにおける遺伝子座に左右される未発表の結果。培養の副画分を用時調製培地に連続トランスファーするとき、やがては分子内組み換えが蓄積する。この目的を達成するために、株BIE104R2を、単一コロニー分離株から開始して、YPD-培地1リットル当たり:酵母エキス10g、1リットル当たり20gのペプトン、1リットル当たり20gのデキストロース中で培養した。一晩培養25μlを使用して、用時調製YPD培地に接種した。少なくとも5回のこのような連続トランスファーの後、培養の光学濃度を測定して細胞を1ml当たり約5000の濃度に希釈した。この細胞懸濁液100μlを、30mMKPipH6.8、0.1NH42SO4、40mMフルオロアセトアミドAmershamおよび1.8寒天Difcoを含む酵母炭素原基礎培地Difco上にプレーティングした。株BIE104R2の細胞と同一の細胞、すなわち細胞内組み換えがない細胞は、まだamdS-遺伝子を含む。こうした細胞に対して、フルオロ-アセトアミドは有毒である。これらの細胞は、フルオロ-アセトアミドを含む培地で増殖できず、コロニーを形成しないであろう。しかし、分子内組み換えが起こっている場合、選択可能マーカーを喪失したBIE104R2-変異形は、フルオロ-アセトアミドを増殖阻害化合物に転化できないため、フルオロ-アセトアミド培地で増殖することができるであろう。こうした細胞は、この寒天培地上でコロニーを形成するであろう。このようにして得られたフルオロ-アセトアミド耐性コロニーを、配列番号2および配列番号3、ならびに配列番号4および配列番号5のプライマーを使用するPCR分析にかけた。意図した通りに選択可能マーカーの組み換えが起こっていれば、配列番号2および配列番号3のプライマーはバンドを与えるであろう。結果として、強力な酵母プロモーターの制御下にある遺伝子araA、araBおよびaraDを含むカセットが、宿主株のゲノムのSIT2-遺伝子座に組み込まれていた。その場合、プライマー4は、組み換えのために喪失したはずの領域でプライミングするため、配列番号4および配列番号5のプライマーを使用するPCR反応は、PCR産物をもたらさないはずである。後者のプライマーでバンドが得られるのであれば、これは完全なプラスミドpPWT018がゲノム中に存在すること、したがって組み換えが何も起こらなかったことを示す。配列番号2および配列番号3のプライマーがPCR産物をもたらさなければ、ゲノムの外で完全なプラスミドpPWT018が組み換わったという方法で、組み換えが起こっていた。選択可能マーカーのみならず、アラビノース-遺伝子も喪失した。事実、野生型酵母が回収されている。pPWT018の1コピー組み込みと一致したPCRを示した分離株をサザンブロット分析にかけた。株CEN.PK113-7Dの染色体DNAおよび正しい組み換え体をEcoRIおよびHindIIIで消化した二重消化。pPW018を鋳型として使用して、配列番号6および配列番号7のプライマーでSIT2-プローブを調製した。ハイブリダイゼーション実験の結果を図3に示す。野生型株で、野生型遺伝子の予想サイズと一致する、2.35kbのバンドが観測される。プラスミドpPWT018の組み換えによる組み込みおよび部分的喪失に際して、1.06kbのバンドが予想された。事実、図3レーン2に示す通り、このバンドが観測される。サザンブロットで正しいバンドパターンを示した図3から推定できる通り株の1つは、BIE104A2と呼ばれる株である。[1.4非酸化的ペントースリン酸経路の、構成的に発現される4遺伝子の導入]遺伝子araA、遺伝子araBおよび遺伝子araDを構成的に発現する、SaccharomycescerevisiaeサッカロマイセスセルビシエBIE104A2を、プラスミドpPWT080図4で形質転換した。プラスミドpPWT080の配列は配列番号8で提示される。1コピー組み込み形質転換体を選択した後の、形質転換および選択の手順は、セクション1.1、1.2および1.3で上述したものと同じである。要するに、BIE104A2をSfiI消化したpPWT080で形質転換した。形質転換混合物を、1ml当たり100μgのG418SigmaAldrichを含むYPD-寒天1リットル当たり:酵母エキス10g、1リットル当たり20gのペプトン、1リットル当たり20gのデキストロース、寒天20g上にプレーティングした。2~4日後、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照すなわち、形質転換実験でDNA無添加は空のYPD/G418-プレートに終わった。プラスミドpPWT080の組み込みはGRE3-遺伝子座に向けられる。形質転換体は、PCR技術およびサザンブロット技術を使用して特性化した。GRE3-遺伝子座におけるプラスミドpPWT080の正しい組み込みは、配列番号9および配列番号10のプライマー対を使用するPCRでチェックし、配列番号9および配列番号11のプライマー対を使用してプラスミドpPWT080の1コピー組み込みまたは多コピー組み込みを検出した。サザン分析用に、配列番号12および配列番号13を使用し、S.セルビシエS.cerevisiaeのRKI1-遺伝子の一部を増幅するPCRによってプローブを調製した。本来備わっているRKI1-遺伝子の隣に、プラスミドpPWT080の組み込みに起因する追加のシグナルが得られた不掲載データ。予想されるハイブリダイゼーションパターンと一致する、プラスミドpPWT080の1コピーの正しい組み込みを示す形質転換体を、BIE104A2F1と呼んだ。ラスミドpPWT080の組み込みによって導入された選択マーカーを除去するために、株BIE104A2F1を、1つのコロニー分離株から開始して、YPD-培地中で培養した。一晩培養25μlを使用して、用時調製YPD培地に接種した。5回の連続トランスファーの後、培養の光学濃度を測定して、細胞を1ml当たり約5000の濃度に希釈した。この細胞懸濁液100μlを、30mMKPipH6.8、0.1NH42SO4、40mMフルオロアセトアミドAmershamおよび1.8寒天Difcoを含むYeastCarbonBasemediumDifco上にプレーティングした。フルオロ-アセトアミド耐性コロニーを、配列番号9および配列番号10のプライマーを使用するPCR分析にかけた。正しいPCRプロフィールの場合には、正しい組み込みを検証するために、RKI1-遺伝子のプローブを再度使用して、サザンブロット分析を実施した。サザンブロットで正しいバンドパターンを示した株の1つは、BIE104A2P1と呼ばれる株である。[実施例2][BIE104A2P1cおよびBIE201につながる振盪フラスコ内での適応進化][2.1適応進化好気的]株BIE104A2P1の単一コロニー分離株を使用して、2ガラクトースを加えたYNB-培地Difcoに接種した。この前培養を、30°Cおよび280rpmで約24時間インキュベートした。細胞を回収し、1ガラクトースおよび1アラビノースを含むYNB培地に、0.2という開始OD600で接種した図5。細胞を、30°Cおよび280rpmで増殖させた。600nmにおける光学濃度を定期的に監視した。光学濃度が5という値に達したとき、培養のアリコートを、同じ培地を含む用時調製YNB培地にトランスファーした。細胞添加量は、培養の開始OD600が0.2というものであった。OD600が再度5に達した後、培養のアリコートを、唯一の炭素源として2アラビノースを含むYNB培地にトランスファーした図5の1で表示の事象。唯一の炭素源として2アラビノースを含むYNBへにトランスファーしたとき、約2週間後に増殖を見ることができた。600nmにおける光学濃度が少なくとも1という値に達したとき、2アラビノースを加えた用時調製YNB-培地が入っている振盪フラスコに、0.2という開始OD600で、細胞をトランスファーした図5、28日。図5に提示されている通り、連続トランスファーを3回繰り返した。結果として得られた、アラビノースで急速に増殖できた株をBIE104A2P1cと呼んだ。[2.2適応進化嫌気的]適応後、好気的条件下、アラビノースで増殖したとき、株BIE104A2P1c由来の単一コロニーを、2グルコースを加えたYNB培地に接種した。この前培養を、30°Cおよび280rpmで約24時間インキュベートした。細胞を回収し、2アラビノースを含むYNB培地に、0.2という初期光学濃度OD600で接種した。フラスコをウォーターロックで閉じ、培地およびヘッドスペースから酸素を排出した後、嫌気的増殖条件を確実にした。最低限3というOD600に達した後、培養のアリコートを、2アラビノースを含む用時調製YNB培地に、毎回0.2という初期OD600値で、トランスファーした図6。数回のトランスファー後、結果として得られた株をBIE104A2P1d=BIE201と呼んだ。[実施例3][適応進化がアラビノース転化をもたらした改良したことを示すBAMでの株の性能試験。ガラクトースとの共発酵。]株BIE104、BIE104A2P1cおよびBIE201の単一コロニー分離株を使用して、2グルコースを加えたYNB-培地Difcoに接種した。この前培養を、30°Cおよび280rpmで約24時間インキュベートした。BAMで、細胞を回収し、約2という初期OD600で、合成モデル培地Verduynetal.,Yeast8:501-517,1992;5グルコース、5キシロース、3.5アラビノース、1ガラクトースに接種した。CO2生成を常時監視した。糖転化および産物形成をNMRで分析した。データは、指示された糖類の残量1リットル当たりのグラム数で表した、グルコース、アラビノース、ガラクトースおよびキシロースおよび副産物エタノール、グリセロールの形成を表す。増殖は、600nmにおける、以下の培養の光学濃度によって監視した図7、図8および図9。実験は、約140時間実行していた。参考株BIE104はグルコースを急速に転化したが、アラビノース、キシロースおよび/またはガラクトースを140時間以内に転化できなかったことを、実験は明らかに表す図7。しかし、株BIE104A2P1cおよびBIE201は、アラビノースおよびガラクトースを転化できたそれぞれ、図8および9。ガラクトース利用およびアラビノース利用は、20時間未満後、グルコース枯渇直後に開始した。両糖は同時に転化された。しかし、嫌気条件下でのアラビノース増殖のために改良された株BIE201は、両糖類をさらに急速に消費した図9。全ての発酵で、副産物としてグリセロールのみが生成された。[実施例4][株のリシーケンシングおよびアラビノース発酵に関与するSNPsの同定]実施例1、実施例2および実施例3から結論づけられる通り、アラビノースの利用に必要な、または利用を増進する、酵素をコード化する遺伝子を単に導入しただけでは、唯一の炭素源としてのアラビノースで増殖できるようにするのに十分ではない。実施例2に示す通り、唯一のC源としてアラビノースを利用する細胞を選択するためには、適応進化と呼ばれるプロセスが必要である。多分、ゲノムにおける自然突然変異一塩基変異多型では、SNPsがこの表現型の変化の原因である。あるいは、ゲノムにおけるより大きい変異ヌクレオチド1つの置換、挿入または欠失に限定されないが起こったかもしれない。どの突然変異またはSNPsがこの表現型の変化の原因であるかを学習するために、Solexa登録商標テクノロジーとして知られる技術を使用し、Illumina登録商標GenomeAnalyzerを使用して、その形質転換体のゲノムDNAをリシーケンシングした。この目的を達成するために、株BIE104、一次形質転換体BIE104A2P1、進化した形質転換体BIE104A2P1cおよびさらに進化した形質転換体BIE201由来の染色体DNAを、YEP2グルコース一晩培養から分離した。Illumina登録商標GenomeAnalyzerを使用するリシーケンシング50bpリード、ペアエンドシーケンシングのために、DNAをServiceXSLeiden,theNetherlandsに送った。1株当たり、140という平均ゲノムカバレージに相当する、約1800Mbの配列が得られ、これは平均すると、どの塩基も140回読まれたことを意味する。NextGeneソフトウェアSoftGeneticsLLC,StateCollege,PA16803,USAを使用し、S288cを鋳型として使用してシーケンシングリードを整列させた。NextGeneソフトウェアを使用して突然変異一塩基変異多型および30bpまでの挿入/欠失が検出され、変異レポートに要約した。株間の独特の変異を同定するために、異なる株のアラインメントを互いに比較した。シーケンシングカバレージが低すぎて裏付けることができない区域における、リードのミスアラインメント、シーケンスエラーまたは突然変異コールの可能性を排除するために、変異レポートのあらゆる記載事項を手作業でチェックした。偽陽性突然変異を変異レポートから除去した。一次形質転換体BIE104A2P1の配列は、導入された配列およびプラスミドの組み込みおよびそれに続く組み換えによるマーカーの配列除去によって削除された配列を除き、野生型株BIE104の配列と同一であった。進化した形質転換体、株BIE104A2P1cでは、限られた数のSNPsが導入された。さらなる進化した形質転換体、株BIE201では、上述した4つのSNPsの隣に、1つの追加的SNPが確認された:野生型株BIE104ならびに進化した株BIE104A2P1cおよびBIE201の両者における、SNPsを含む遺伝子の5つのオープンリーディングフレームの配列を、配列番号14、配列番号15SSY1、配列番号16、配列番号17YJR154w、配列番号18、配列番号19CEP3、配列番号20、配列番号21YPL277c、配列番号22および配列番号23GAL80で表す。[実施例5][SNPsの確認]上述の実施例で検出されたSNPsを再確認するために、2つの方法を使用した。第1の方法は、SNPsを含む領域の増幅に続いてABI3730XLシーケンサーを用いたシングルリードSinglereadSangerシーケンシングBaseclearBV,Leiden,theNetherlandsに外注を含んでいた。第2の方法は、高解像度融解曲線分析HighResolutionMeltingAnalysisHi-Resで構成されていた。[5.1シングルリードサンガーシーケンシングSinglereadSangersequencing]株BIE104A2P1およびBIE201の培養から分離されたゲノムDNAを、Phusion登録商標High-FidelityDNAPolymeraseFinnzymes,Vantaa,Finlandを使用するPCR反応用の鋳型として使用した。PCR反応は、製造業者によって作成された注意事項に従って実施した。以下のプライマーを使用して、SNPを有すると予期された、以下の遺伝子を増幅した。PCR産物をpTOPOBluntIIベクターInvitrogen,Carlsbad,USAにクローニングした。制限酵素分析に基づいて、正しいクローンを選択した。一本鎖サンガーSangerシーケンシングのために、正しいクローンをBaseClearBVLeiden,theNetherlandsに送った。CEP3フラグメントのTOPOクローニングは成功しなかった。この遺伝子について、Sangerシーケンシングデータは何も得られなかった。YPL277cの配列は、野生型株BIE104の配列と同一のようであった。Sangerシーケンシングの結果から、遺伝子SSY1、YJR154wおよびGAL80におけるSNPsが確認された、すなわち、SNPsは実施例4に記載のものと同じであった。[5.2Hi-Res分析]Hi-Resテクノロジーは、IdahoTechnologiesSaltLakeCity,Utah84108,USAによって商業化された。要するに、PCR産物の突然変異は、LCGreen登録商標色素によって最適に検出されるヘテロ二本鎖の存在によって検出される。変異は、参考試料と比較した融解プロフィールの形状の変化によって同定される。多数の調査研究および臨床応用で、LightScanner登録商標を用いるHi-ResMelting登録商標HRMが突然変異発見に使用されている。SNPまたは野生型配列を含むおよそ100~200bpの領域を増幅するために、各SNPについて、2つのプライマーが設計された。加えて、溶融プロフィールを検出する実験でプローブの役割を果たす第3のプライマーが設計された。後者のプライマーは、SNP領域をカバーし、そして野生型配列に正確に相補的であるように、設計された。SNP配列とのマッチングは不完全である、すなわち、プローブのヌクレオチドの中の1つを除く全てが対象の領域に相補的である。ミスマッチDNA鎖はマッチDNA鎖より早く融解し、野生型およびSNPアンプリコンの異なる融解曲線を生じる結果となり、これはLightScanner登録商標IdahoTechnologies,SaltLakeCity,Utah,USAを使用して検出される。下表に、対象の遺伝子またはORFの増幅に使用されたプライマー配列をまとめてあり、そのSNPは鎖BIE201で検証されるはずである。下表に、株BIE201におけるSNPsの検証に使用されてきた配列番号プローブをまとめる。PCR反応は、プローブがないこと以外はIdahoTechnologiesによって提供された取扱説明書に従い、配列番号24および配列番号25SSY1、配列番号26および配列番号27YJR154w、配列番号28および配列番号29CEP3、配列番号30および配列番号31YPL277cならびに配列番号32および配列番号33GAL80のプライマー対を使用し、株BIE104野生型酵母株および株BIE201アラビノースで嫌気的に増殖できる酵母株の染色体DNAを使用して、実施した。増幅されたフラグメントは、収率および完全性について、2アガロースゲルでチェックした。HiRes分析は、IdahoTechnologiesによって提供されたプロトコールと類似した、下記の通りに実施した:プローブ5μM2μlを、PCRマイクロプレート4titudeFramestart96、黒枠、白壁Bioke,Leiden,theNetherlands中のPCR産物10μlに加えた。混合後、マイクロプレートを遠心沈殿させた。このプレートを99°Cで30秒間インキュベートし、室温約20°Cまで冷却した。その後、開始温度55°C、終了温度94°Cおよび露出設定自動でLightscannerを用いて溶融プロトコールに従った。測定の完了後、データ解析を実施した。蛍光変化を分析する境界温度を、PCR産物からプローブが溶融すると予想された温度間隔に、手動で設定した。融解曲線の一例を図11に表す。図11は、正規化融解曲線融解曲線;最上パネルおよび正規化溶融ピーク曲線下方のパネルの両者の一例を表示する。後者は第1のグラフから導かれ、蛍光シグナルの変換を温度の関数として表している。株BIE104A2P1およびBIE201を表示する。この図で試験された遺伝子はYJR154wである。試験した2株、BIE201とBIE104A2P1との間で、プローブの融解温度の差は明らかである。YPL277cにおける1つを除き、全ての予期されるSNPsが確認された。BIE201におけるこのORFYPL277c配列は、野生型株BIE104の配列と同一のようであった。要約すると、実施例5で、ORFSSY1YDR160w、YJR154w、CEP3YMR168cおよびGAL80YML051wにおけるSNPsが確認された。YPL277cのORFで既に同定されたSNP実施例4は、2つの独立した方法を使用して反証された。[実施例6][染色体VIIの部分増幅][6.1染色体VIIの部分増幅]実施例4に記述の通り、野生型株BIE104、一次形質転換体BIE104A2P1、進化した形質転換体BIE104A2P1cおよびさらなる進化した株BIE201のリシーケンシングにより、幾つかの興味深いSNPを得た。ゲノムのあらゆる一ヌクレオチドのリードデプスを示す、カバレージプロットを使用して、過剰提示または過小提示されたゲノム中の領域を探査してきた。実際に、過剰提示された染色体VII上の領域を同定した図12参照。リードデプスから、セントロメアを囲む、染色体VIIの一部が増幅されたと結論付けられた。染色体VIIの左腕上の領域は3倍増幅された。染色体VIIの右腕上の一部は2倍増幅され、隣接する部分は3倍増幅された図12参照。3倍増幅された染色体VIIの右腕上の部分は、アラビノース発現カセット、すなわち強力な構成的プロモーター類の制御下にある遺伝子araA、遺伝子araBおよび遺伝子araDを含む。第一に、幾つかの遺伝子のコピー数をQ-PCRで確認した。第二に、同一染色体上で増幅が起きたかどうか2倍化cq.3倍化または増幅領域が別の染色体に組み込まれたかどうか転座を調査した。[6.2Q-PCRによるコピー数決定]図12のカバレージプロットにより示される、染色体VIIの一部の増幅を検証するために、Q-PCR実験を実施した。具体的には、この方法は、対象の遺伝子を、既知のコピー数を有する別の遺伝子と比較することによって、対象の遺伝子の相対的コピー数を測定する。この目的を達成するために、Bio-RadBio-RadLaboratories,Hercules,CA,USAのBio-RadiCycleriQシステムを使用した。iQSYBRGreenSupermixBio-Radを使用した。提供元の説明書で提案された通りに、実験を組み立てた。カバレージプロットリードデプスから、遺伝子SDS23および遺伝子YGL057cは染色体VIIの左腕上の増幅領域部分であると予想されることが推定された。参考一コピー遺伝子として、ACT1遺伝子を選択した。遺伝子YGL057c、遺伝子SDS23および遺伝子ACT1を検出するためのプライマーを下表にまとめる。Q-PCR条件は以下の通りであった:195°Cで3分間40サイクルの場合、工程2~4295°Cで10秒間358°Cで45秒間472°Cで45秒間565°Cで10秒間610秒当たり0.5°Cで95°Cまでの温度上昇融解曲線は、65°Cで10秒間、蛍光を測定し始めることにより決定されている。温度は、95°Cという温度に達するまで、10秒毎に0.5°C上昇させる。リードから、対象の遺伝子のコピー数が算出および/または推定された。結果を下表に示す。実施例6セクション6.1でのリードデプス分析から明らかなように、結果は増幅を裏付ける。観測値は、予想されるコピー数3.0より高い。その差は、Kleinによって既述されている通りKlein,D.2002TRENDSinMolecularMedicineVol.8No.6,257-260、多くの要因に起因する可能性がある。[6.3二倍化の性質の分析]増殖された領域が、その遺伝子がもともと位置している染色体と同じ染色体上、すなわち染色体VII上に位置しているか、または別の染色体に転座されていたかを決定するために、CHEF電気泳動法クランプ均一電場電気泳動法ClampedHomogeneousElectricFieldselectrophoresis;CHEF-DR登録商標IIIVariableAngleSystem;Bio-Rad,Hercules,CA94547,USAを適用した。酵母株のアガロースプラグ以下参照は、製造業者の取扱説明書に従って、CHEFYeastGenomicDNAPlugKitBioRadを使用して調製した。1アガロースゲルPulseFieldAgarose,Bio-Radは、製造業者の取扱説明書に従って、0.5xTBETris-Borate-EDTAで調製した。ゲルは、以下の設定に従って泳動させた:染色体のサイズ決定用マーカーとして、株YNN295Bio-Radのアガロースプラグを実験に含めた。電気泳動法後、1リットル当たり70μgという最終濃度で臭化エチジウムを使用して、30分間、ゲルを染色した。図13に、染色されたゲルの一例を表す。染色後、AmershamHybondN膜GEHealthcareLifeSciences,Diegem,Belgium上にゲルをブロットした。増幅された遺伝子が1つの染色体上に位置するかまたは他の染色体に転座しているかどうかを立証できるために、ブロットされた膜とのハイブリダイゼーション用にプローブを作成した。プローブ下表参照は、製造業者の取扱説明書に従って、PCRDIGProbeSynthesisKitRoche,Almere,theNetherlandsを使用して調製した。以下のプローブを調製した。araA-遺伝子は、BIE104A2P1cおよびBIE201で3倍増幅されると予想される。ACT1-遺伝子は染色体VI上に位置し、増殖されないと予想される。それ故、このプローブは対照の役割をする。PNC1は染色体VIIの左腕上に位置し、BIE104A2P1cおよびBIE201で3倍増幅されると予想される。HSF1は染色体VIIの左腕上に位置し、そして増殖される領域の上流に位置する。それ故、この遺伝子は、試験した株では、単一遺伝子としてゲノム中に存在すると予想される。YGR031wは染色体VIIの右腕上に位置する。この遺伝子は、株BIE104A2P1cおよび株BIE201のゲノム中に2コピーで存在すると予想される。膜は、製造業者の取扱説明書に従って、DIGEasyHybBufferRoche中でプレハイブリダイズさせた。プローブは、99°Cで5分間変性させ、氷で5分間冷やし、プレハイブリダイズした膜に添加した。ハイブリダイゼーションは、42°Cで一晩行った。ハイブリダイズしたプローブ検出を実施する前の、膜の洗浄および膜のブロッキングは、製造業者の取扱説明書に従って、DIGWashandBlockBufferSetRocheを使用して行った。検出は、抗-ジオキシゲニン-APFabフラグメントRocheとインキュベーションし、続いてCDP-Star使用準備済ready-to-useキットRocheを使用して検出試薬を添加することにより行った。化学発光シグナルの検出は、Bio-RadChemidocXRSSystemを使用し、Chemidocapparatusにより提供された適切な設定を使用して実施した。結果を、図13、図14、図15、図16、図17および図18に示す。BIE104からBIE201までの株系統で、染色体のサイズに差があることは、図13から、既に推測できる。BIE104と比較するとき、一次形質転換体、株BIE104A2P1aでは、染色体のサイズに関して大きな差はみられない。しかし株BIE104A2P1cおよび株BIE201では、染色体VIIのサイズは増加していた。株BIE104では、染色体VIIは染色体XVに近い;しかしBIE104A2P1cおよびBIE201では、染色体はサイズが増加しており、染色体IVとほぼ同じ大きさである。遺伝子araAのプローブ図14、遺伝子PNC1のプローブ図16および遺伝子HSF1のプローブ図17とのハイブリダイゼーションは、同じイメージを与える。このことから、増幅が同一染色体内で起こったこと、すなわち、全ての増幅領域がそれまでどおり染色体VII上にあることが、示唆される。転座が起こっていたのであれば、多重信号が予想され、この場合は当てはまらない。株BIE104A2P1aでは、全3プローブで、染色体VIIのバンドの下に、より小さいバンドが観測された。このことから、第2の、より小さいバージョン染色体VIIが存在することが示唆される。より大きいバンドより強度が低いため、細胞の一画分のみに存在する可能性がある。それは、電気泳動人工産物を想定することによっても説明することが可能である。ACT1プローブとのハイブリダイゼーション図15は、予想通り、全株で単一バンドを生じる結果となり、染色体VIを示している。YGR031wプローブとのハイブリダイゼーション図18は最終的に、多くのバンドを生じる結果となった。明らかに、クロスハイブリダイゼーションが起こり、各株で多重信号が生じる結果となった。したがって、この結果は、この実験目的で使用することはできない。株間で若干の強度差が観測されたが、増幅が表されるかどうかをこれらのデータから結論づけることは難しい。信号強度の増加から、ある遺伝子のコピー数増加が示唆されるかもしれないが、ゲルに適用したDNA量、ブロッティング効率、検出飽和等のような、他の要因も信号強度に影響する可能性がある。総合すれば、実施例6の結果は、増幅が染色体VII内で起こっていたことを明らかに示す。遺伝子araA、遺伝子araBおよび遺伝子araD周囲の配列を含むが別の染色体に転座した遺伝学的状況を示す証拠は皆無である。[実施例7][SNPsおよび増幅の表現型的立証]発見されたSNPsおよび増幅、ならびにそうである場合その程度が、導入された同種経路および異種経路は別として酵母細胞によりアラビノースをエタノールに転化する能力の一因となるかどうかを立証するために、交雑育種実験を実施した。この目的を達成するために、以下の実験を実施した:株BIE201の交配型スイッチ、交配型スイッチBIE201と非進化親株BIE104A2P1との交雑育種、2倍体株の胞子形成に続く4子嚢胞子の解剖、1倍体子孫での、唯一の炭素源およびエネルギー源としてアラビノースを利用する能力の決定、Hi-Resを使用した1倍体子孫におけるSNP検出、およびこれらのデータセットの解析。進化した、交配型スイッチBIE201を非進化一次形質転換体BIE104A2P1と交雑することによって、同定される遺伝子の変化SNPsおよび増幅を除けば、完全にホモ接合である2倍体細胞が構築される。その後、この2倍体細胞の胞子形成に続いて子嚢胞子を解剖することにより、適応進化中に導入されたゲノムの変化を何も持たない、あるいは若干または全て有する1倍体細胞が得られるであろう。4つの1倍体誘導体全体で、SNP、DIPまたは増幅1つ当たり、2:2分離が予想されるが、1つの2倍体細胞の4つの1倍体誘導体全体のゲノム変化の分布はランダムである。それ以上の理論的背景については、たとえばMortimerR.K.andHawthorneD.C.1975GeneticMappinginYeast.MethodsCellBiol.11:221-33を参照されたい。[7.1株BIE201の交配型]プラスミドpGal-HOKANは、プラスミドpGAL-HOの誘導体であるHerskowitz,I.andJensen,R.E.1991MethodsinEnzymology,194:132-146。pGAL-HOにおけるURA3-マーカーは、pGAL-HOをEcoRVで切断し、続いてpUG6由来のkanMXフラグメントに連結することにより、kanMXマーカーに置換されているGueldener,U.etal1996NucleicAcidsResearch24:2519-2524。S.セルビシエS.cerevisiaeでG418選択を可能にする、kanMXマーカーを、制限酵素XbaIおよび制限酵素XhoIでpUG6から切断し、続いて突出末端にKlenowポリメラーゼを満たした。結果として生じるプラスミドはpGal-HOKANである。プラスミドpGal-HOKANを用いるGietzandWoods2002の方法に従って、株BIE201この実験に関して関連遺伝子型:matAを形質転換した。形質転換体は、グルコース2およびG418100μg/mlを含むYEP/寒天プレート上で選択した。コロニーは、30°Cで2日間インキュベートした後出現した。コロニー8個を、グルコースおよびG418を含む用時調製YEP/寒天プレート上に再画線した。各形質転換のコロニー2個を使用して、1ガラクトースおよび0.1グルコースを含むYEP-培地20mlに接種した。30°Cおよび280rpmで2日間インキュベートした後、細胞をYEPDプレート上に再画線した。プレートを、30°Cで2日間ずっとインキュベートするとコロニーが目に見えた。交配型を決定するために、配列番号55および配列番号56のプライマーmatA細胞の同定の場合、および配列番号55および配列番号57のプライマーmatαアルファ細胞の同定の場合を使用して、PCR反応を実施した。BIE201のmatαアルファ変異形数個が得られた。こうした誘導体がその交配型を本当にスイッチしたかどうかを試験するために、それらを用時調製YEPDプレート上に再画線した。また、株BIE104A2P1一次形質転換体、この実験における関連遺伝子型:matAを、別個の用時調製YEPDプレート上に再画線した。その後、白金耳量の各株を用時調製YEPD-寒天プレート上で混合することにより、両株を交配させた。30°Cで6時間インキュベートした後、顕微鏡下で交配を点数化した。若干の分離株が接合体、すなわち反対の交配型の2細胞が融合して2倍体株を形成した構造を、本当に形成しているようであった。こうしたBIE201誘導体は本当に、交配型をmatαアルファに変えた。[7.2交配型スイッチBIE201と非進化親株BIE104A2P1との交雑育種]ハイブリッド接合体の形成が顕微鏡で確認された調製物セクション7.1を、YEPD-寒天プレート上にプレーティングした。プレートを、30°Cで2日間インキュベートした。より大きいコロニーを摘み取り、用時調製YEPDプレート上に再画線した。その後、配列番号55および配列番号56ならびに配列番号55および配列番号57のプライマーを使用して、コロニーPCRを実施した。2倍体は、両プライマー対を有するPCR産物を形成するであろう。こうしたコロニーの幾つかを獲得し、2グルコースを含むYEP-培地への接種に使用した30°C、280rpm。[7.32倍体株の胞子形成および子嚢胞子の解剖]30°Cおよび280rpmで一晩増殖させた後、2.5mlを、滅菌水道水中1.5のKAc25mlにトランスファーした。インキュベーションは、30°Cおよび280rpmで続けた。毎日、胞子形成度を顕微鏡でチェックした。子嚢と栄養細胞の比率が2より大きいとき、SingerMSMSystem著作権シリーズ300Somerset,UK装置を使用し、製造業者の取扱説明書およびプロトコールを使用して、子嚢60個を解剖した。解剖は、YEPDプレート上で行った。プレートを、30°Cで2日間インキュベートした。結果の一例を図19に提示する。図19は、解剖された10個の子嚢を表す。子嚢由来の子嚢胞子を互いに分離し、区別できる距離で、寒天プレート上に置いた。一列のコロニー10列を表示は1個の子嚢に由来する。図19から明らかなように、あらゆる場合に全4個の胞子が生育可能とは限らない。少数の事例では、3個だけ、時には2個だけの子嚢胞子が生育可能コロニーに成長する。また、1個の子嚢胞子に由来するコロニー間でコロニーサイズに若干の差が認められた。[7.41倍体子孫における、唯一の炭素源およびエネルギー源としてアラビノースを利用する能力の決定]1個の子嚢から4個の生育可能な胞子が得られた場合である、1倍体誘導体の完全なセット全部を、96ウェルマイクロプレート内のYEPD-寒天に接種した。対照BIE104A2P1および対照BIE201を、少なくとも二重に、対照として各マイクロプレート上に含めた。プレートを、30°Cで2日間インキュベートした。こうしたプレートはマスタープレートと呼ばれる。1回の移動で、マイクロプレート内の全96株の細胞物質をトランスファーできる、使い捨てピンツールを使用して、200μlのVerduyn培地および2グルコースが入っている96ウェルマイクロプレートに、マスタープレートからコロニー物質を接種した。2グルコースを含むVerduyn液体培地が入っているマイクロプレートを、湿度80のInforsマイクロプレートシェーカー内、30°Cおよび550rpmで2日間増殖させた。その後、グルコース増殖マイクロプレート培養10μを、炭素源として2アラビノースを含むVerduyn培地200μlが入っているマイクロプレートにトランスファーした。30°C、550rpmおよび湿度80のInforsシェーカー内でのインキュベーションは4日間続いた。毎日、BMGFLUOstarマイクロプレートリーダーBMG,Offenburg,Germanyを使用して、620nmでの光学濃度を測定することにより増殖を監視した。アラビノースを利用できる能力は、唯一の炭素源としてのアラビノースで4日間インキュベートした後の最終光学濃度を、同一マイクロプレートの初期光学濃度で割ることによって表した。結果の一例を表8にまとめる。予想される通り、2つの対照株BIE104A2P1およびBIE201の間に大きな差があることが、表8から明らかである。BIE104A2P1は、実際には増殖が何も得られなかったことを意味する、レベル5に達する。係数5は若干の増殖が起こったことを示唆するが、これは前培養からの栄養の持ち越しに残余グルコース、エタノール起因する可能性が最も高いであろう。株BIE201は、株BIE104A2P1より著しく高い、増殖比25に達する。1倍体誘導体は、低増殖BIE104A2P1同様から高レベルの増殖BIE201同様およびBIE201のレベルを超えるまで、広範な増殖表現型を示す。また、中間の増殖レベルを有する株も得られた。たとえば、第1の子嚢、子嚢Aでは、4つの1倍体株A1、A2、A3およびA4を生じる結果となり、アラビノース増殖表現型の2:2分離が得られる。得られた低増殖レベルと高増殖レベルの間の分離が2:2パターンに従わない子嚢もある。たとえば、子嚢Bでは、高レベル増殖表現型株1つ、中間レベル9という値を有する株1つ、および低増殖表現型を有する1倍体2つが得られる。他の子嚢に由来する1倍体株から、同様の観察が行える。[7.5Hi-Resを使用した、1倍体子孫におけるSNP検出]2グルコースを加えたYEP-培地が入っている96ウェルマイクロプレートに、マスタープレートからコロニー物質を接種したセクション7.4。細胞を、Inforsシェーカー内、30°C、550rpmおよび湿度80で2日間、増殖させた。対照として、株BIE104A2P1および株BIE201を含めた。染色体DNAは、小規模化した様式で上記プロトコールを使用して、分離した。染色体DNAは、セクション5.2に記述されている通り、Hi-Res分析用の鋳型の役割をする。Hi-Res分析は、交雑BIE201matαXBIE104A2P1matA由来の各1倍体分離個体におけるSNPの同定を可能にする。同様に、染色体VII上の増殖領域の存在は、セクション6.2に記述されている方法に従って決定された。SNPsおよび増幅に関して、各1倍体分離個体の遺伝子型が決定された。結果を表9に示す。大抵の子嚢で、SNPsおよび増幅の2:2分離が観察される。これには若干の例外があり、たとえば減数分裂遺伝子変換に起因する可能性がある。[7.6これらのデータセットの解析]セクション7.4および7.5それぞれ表8および9のデータセットを組み合わせることにより、下表、表10を生じる。しかし、表Zでは、結果を、アラビノースでの高増殖から低増殖まで、分類されている。表10の結果から、増幅は、アラビノースで比較的高い増殖速度で増殖する能力を決定する、重要事象であることが強く示唆される。増幅を有する株のほとんどが、表10の上位9つにある。こうした株の3分の2はGAL80遺伝子中にSNPも有し、GAL80遺伝子におけるSNPの存在と増幅の存在との間の相互作用が示唆される。統計学的に、どの因子が高増殖と関連しているか、また相乗効果があるかどうかを決定するために、分散分析ANOVAを適用した。その設計は不均衡であるが、データの統計学的検定に基づけば、増幅の存在p<<0.01が増殖に対してプラス効果があることは明かである。結果から、GAL80SNPと増幅の存在との間に強い相互作用が存在するp<<0.01が、その他のSNPには有意な作用がないp>0.01ことも明らかである。増幅がない場合には、8.4という中央値増殖が推定されるが、増幅が存在する場合には中央値増殖は17.6である。GAL80SNPも増幅もない場合には8.7という中央値増殖が推定されるが、両者が存在する場合には中央値増殖は26.8である。また、CEP3SNPの存在と増幅の存在との相互作用には、相乗効果があるようであるが、GAL80SNPの存在と増幅の存在との間の相互作用より程度は低い。要するに、SNPsおよび/または増幅の存在に起因する、増殖に対する効果および効果の有意性を決定することができた。増幅は、増殖に対して有意な効果を有する。この効果は、増幅とGAL80SNPの組合せを介して増強する。増幅とCEP3SNPの組合せならびに増幅、GAL80SNPおよびCEP3SNPの組合せで、小さな相互作用効果が検出された。[実施例8][GAL80の欠失は、さらに良いアラビノース転化につながる]染色体VIIの一部の増幅も存在する場合、GAL80遺伝子中で同定されたSNPは、アラビノースでの増殖に対してプラスの相加効果を有することが、実施例7で証明された。GAL80は、ガラクトースに応答して転写制御に関与する転写リプレッサーをコード化するTimsonDJ,etal.2002BiochemJ363Pt3:515-20。Gal80pは、Gal4pおよびGal3pと併せて、GAL代謝遺伝子GAL1、GAL10、GAL2、およびGAL7を含む、プロモーターUAS-GALにおけるGAL上流活性化部位を含む遺伝子の発現を協調的に制御するLohrD,etal.1995FASEBJ99:777-87で概説。gal80に対するヌル細胞は、非誘導培地中であっても、GAL遺伝子を構成的に発現するTorchiaTE,etal.1984MolCellBiol48:1521-7。仮説は、GAL80遺伝子で同定されたSNPは、Gal80p、Gal3pおよびGal4pの間の相互作用に影響を及ぼすということである。それ故、ガラクトースパーミアーゼをコード化するGAL2を含む、ガラクトース代謝遺伝子の発現が変更され、かつ野生型GAL80対立遺伝子を有する酵母細胞と比較されるであろう。Gal2pガラクトースパーミアーゼはアラビノースの主要糖輸送体であるKouetal1970JBacteriol.1033:671-678;BeckerandBoles2003ApplEnvironMicrobiol.697:4144-4150。明らかに、GAL80遺伝子中のSNPは、L-アラビノースを転化する能力に対してプラスの効果を有する。アラビノース増殖表現型をさらに改良できるかどうかを調査するために、PCR-介在遺伝子置換戦略を使用して、GAL80遺伝子のコード配列をそっくりそのまま削除した。[8.1GAL80遺伝子の破壊]配列番号58および配列番号59のプライマーそれぞれ、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、プラスミドp427-TEFDualsystemsBiotech,Schlieren,Switzerland由来のkanMX-マーカーの増幅に使用した。プライマーの隣接領域は、GAL80遺伝子の5’-領域および3’-領域と相同であった。WachWachetal1994Yeast10,1793-1808による記述と同様に、同種組み換えの際に、GAL80遺伝子のORFはkanMXマーカーと置換されるであろう。得られたフラグメントは、GAL80::kanMXフラグメントと呼ばれる。株BIE252の酵母形質転換は、GietzandWoods2002,MethodsinEnzymology350:87-96により記述されたプロトコールに従って、精製GAL80::kanMXフラグメントを用いて実施された。株BIE252の構築は、欧州特許第10160622.6号明細書に記述されている。株BIE252は、S.セルビシエS.cerevisiaeのキシロースおよびアラビノース発酵株であり、BIE201の誘導体である。株BIE252はまたGAL80SNPも含む。選択のため、形質転換細胞を、100μg/mlG418を含むYEPD-寒天上にプレーティングした。コロニーが目に見えるまで、このプレートを30°Cでインキュベートした。プラスミドp427-TEFを陽性対照として含め、多くのコロニーを生じた。MilliQすなわちDNAなしを陰性対照として含め、コロニーは何も生じなかった。GAL80::kanMXフラグメントは多くのコロニーを生じた。正しい組み込みを検証するために、2つの独立したコロニーをサザンブロット法で試験した不掲載データ。GAL80遺伝子の正しい欠失を有する1コロニーは、BIE252ΔGAL80と呼ばれた。[8.2BAMにおける性能に対するGAL80遺伝子置換の影響]BAMBiologicalActivityMonitor;HalotecBV,Veenendaal,theNetherlands実験を実施した。株BIE252および株BIE252ΔGAL80kanMXマーカーによってGAL80遺伝子のORFが正しく置換された形質転換体の単一コロニー分離株を使用して、2グルコースを加えたVerduyn培地Verduynetal.,Yeast8:501-517,1992に接種した。この前培養を、30°Cおよび280rpmで約24時間インキュベートした。細胞を回収し、培地1kg当たり約1グラム乾燥重量という細胞密度で、合成モデル培地5グルコース、5キシロース、3.5アラビノース、1ガラクトースおよび0.5マンノースを加えたVerduyn培地、pH4.2に接種した。CO2生成を常時監視した。糖転化および産物形成をNMRで分析した。データは、指示された時点の糖類の残量1リットル当たりのグラム数で表した、グルコース、アラビノース、ガラクトース、マンノースおよびキシロースおよび副産物エタノール、グリセロール等の形成を表す。増殖は、600nmにおける、培養の光学濃度を追跡することによって監視した。実験は、約72時間実行されていた。グラフを、図20BIE252および図21BIE252ΔGAL80に示す。実験は、参考株BIE252がグルコースおよびマンノースを急速に転化することを明らかに表す。グルコース枯渇約10時間後、キシロースおよびアラビノースの転化が始まった。約10時間の時点で幾らかのガラクトースは既に発酵されており、それはグルコースとガラクトースの部分的同時利用を可能にしたであろう、この株のGAL80SNPに起因する可能性があった。約72時間の実験の終わりに、ほぼ全ての糖類が転化された。糖1グラム当たりエタノール0.37グラムというエタノール収率が得られた。株BIE252ΔGAL80は株BIE252より速い糖転化能力を示す。また、この株の場合には、発酵の最初の数時間に、マンノースおよびグルコースが転化される。しかし、株BIE252とは対照的に、この形質転換体では、アラビノースおよび特にキシロースと共に、グルコース、ガラクトースおよびマンノースが幾らか共消費される。概して、糖消費は速く、全ての利用可能な糖類の、より完全な使用につながる。このことは、時間内のCO2発生からも明らかである。BIE252の場合には、基本的にグルコースおよびマンノースから形成されるCO2である、第1のピークが観測される。10ml/時間のすぐ上という最低値に達した後図20、第2の、より平たいピークが観測される。しかしBIE252ΔGAL80の場合には図21、NMRによる糖分析から明らかなように、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノースおよびガラクトースの共使用増強のため、第2のピークは第1のピークの尾部として現れる。親株BIE252では、異なる糖類の使用はより逐次的である。それ故、株BIE252ΔGAL80の収率は、実験の終わり72hに、より高い:糖1グラム当たりエタノール0.40グラム。要するに、GAL80遺伝子のORFの欠失は、株BIE252で試験された通り、さらなる改良された性能を生じる結果となった。[実施例9][株BIE201におけるアジピン酸生成][9.1DNA2.0で注文した合成DNAフラグメント]効率的発現のために、アジピン酸経路に関与する9つのオープンリーディングフレームを含む9つのDNAフラグメント2011年3月28日出願の欧州特許出願第11160000.3号明細書参照およびS.セルビシエS.cerevisiaeプロモーターおよびターミネーターの合成をDNA2.0MenloPark,CA94025,USAで注文した。場合により、BIE201に形質転換後、経路のインビボ組み換えのために、アジピン酸経路の隣接部分との相同性を合成フラグメントに加えた。DNA2.0は、標準クローニングベクター中のクローン化挿入物として、合成フラグメントを納品した。この結果として以下のプラスミドが得られた括弧内は省略形、pADI141Adi21、pADI142Adi22、pADI143Adi23、pADI199Adi8、pADI145Adi24、pADI146Adi25、pADI149SucC、pADI150SucDおよびpADI200Acdh67。表11は経路に関与する遺伝子、使用された省略形、起源、Uniprotコードおよび経路への関与を表す。[9.2BIE201への形質転換のためのPCRフラグメントの調製]インビボ同種組み換えを使用して、完全なアジピン酸経路を組み立ててBIE201に組み込んだ。完全な経路50~250bpの組み換えに必要な相同性は、合成フラグメントの合成中に加えるか、またはフラグメントの増幅に使用されるプライマーにその配列を付加することによって、加えた。プライマー配列を表12に記載する。完全なアジピン酸経路をBIE201のゲノムに組み込むためには、アジピン酸経路に属する遺伝子発現カセットを含む9つのPCRフラグメント配列番号84~92、G418に耐性を与えるkanMX-マーカーを含む1つのPCRフラグメント配列番号93、および最後にINT1LFINTegrationLeftFlankおよびINT1RFINTegrationRightFlank組み込み隣接領域それぞれ配列番号94および配列番号95の、総計で12のフラグメント図22参照が必要だった。全てのフラグメントは、二重交差によって経路をゲノムに組み込むために、INT1LFおよびINT1RFへの経路内および経路外の各隣接フラグメントと重複する相同性を備えて、作成された。経路の同種組み換え事象、完全な組み立ておよび組み込みを、図22の図面に示す。形質転換に使用された、作成されたPCRフラグメントを、表13に記載する。その配列は、配列番号84から配列番号95まで、として本明細書に含まれる。表13は、形質転換用フラグメントを作成するためのPCR増幅反応で使用された遺伝子およびプライマーに使用されたプロモーターおよびターミネーターに関する情報を表す。全てのPCR反応は、説明書に従って、Phusion登録商標ポリメラーゼFinnzymesを用いて実施した。DNA2.0で注文したプラスミドは、9つのアジピン酸経路遺伝子を増幅するための鋳型として使用された。kanMX-マーカーは、マーカー配列を担持するプラスミドpUG7から増幅された。pUG7は以下の通りに構築された:プラスミドpUG6Gueldener,U.etal1996NucleicAcidsResearch24:2519-2524のloxP部位は、改変loxP-部位lox66およびlox71を含むリンカーをクローニングすることにより、2工程で置換されたArakietal1997NucleicAcidsResearch,1997,Vol.25,No.4,pp868-872。正しい置換を確認するために、切断解析およびシーケンシングを実施した。INT1遺伝子座における組み込みのためのINT1LFおよびINT1RFそれぞれ左隣接領域および右隣接領域は、BIE104から分離された染色体DNAを鋳型として使用して増幅された。PCRフラグメントのサイズは、標準アガロース電気泳動技術でチェックした。PCR増幅DNAフラグメントは、説明書に従って、QiagenのPCR精製キットを用いて精製し濃縮した。DNA濃度は、ThermoscientificのNanodropを使用して測定したA260/A280吸光度。[9.3酵母形質転換]S.セルビシエS.cerevisiaeの形質転換は、GietzandWoods2002,MethodsinEnzymology350:87-96により記述されている通りに実施した。BIE201を、12の増幅され精製されたPCRフラグメント各1μgで形質転換した。形質転換混合物を、1ml当たり100μgのG418SigmaAldrichを含むYPD-寒天1リットル当たり:酵母エキス10g、1リットル当たり20gのペプトン、1リットル当たり20gのデキストロース、寒天20g上にプレーティングした。2~4日後、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照すなわち、形質転換実験でDNA無添加は空のYPD/G418-プレートに終わった。形質転換プレートから、単一コロニーを、1ml当たり100μgのG418を含む新しいYPD-寒天プレートにトランスファーした。プレートを、30°Cで2日間インキュベートした。[9.4アラビノースでのアジピン酸生成]4つの形質転換体株1、株2、株3および株4の単一コロニーおよび対照株としてのBIE201の単一コロニーを、1ウェル当たり、2アラビノースおよび0.05グルコースを含むVerduyn培地200μlが入っているハーフディープウェルMTPマイクロプレートに、二重に接種した。このMTPを、マイクロプレート用Inforsシェーカー内、30°C、550rpmおよび湿度80で、48時間インキュベートした。48時間インキュベートした後、各培養40μlを、1ウェル当たり、2アラビノースを含むVerduyn培地2.5mlが入っている2つの24ウェルプレートにトランスファーした。この24ウェルプレートを標準MTP蓋で覆い、30°C、550rpmおよび湿度80で、24時間インキュベートした。24時間インキュベートした後、この24ウェルプレートを、Heraeus遠心分離機内、2750gで10分間遠心分離した。上澄を除去し、細胞ペレットが入っている各ウェルに、2アラビノースを含む用時調製Verduyn培地4.5mlを加えた。この細胞ペレットを、ピペットで再懸濁させた。1つのプレートでは、通気を改良するために、標準MTP蓋をエアポアシートairporesheetQiagenと取り換えた。第2の24ウェルプレートでは、微好気的環境を作るBugStopperTMCapmatWhatmanと取り換えた。この24-ウェルプレートを、InforsMicrotronインキューベーター内、30°C、350rpmおよび湿度80で、72時間インキュベートした。インキュベーション後、このプレートを、Heraeus遠心分離機内、2750gで10分間遠心分離した。上澄のアジピン酸濃度を、LC-MSで測定した。結果を表14に示す。株2、株3および株4は、アラビノースを唯一の炭素源として含むVerduyn培地でアジピン酸を生成する。エアポアシートを用いたプレートと比較するとき、酸素制限条件下で、すなわちバグストッパー蓋を用いて、より高いレベルが得られた。参考株BIE201はアラビノースで増殖するが、アジピン酸を生成しない。[9.5UPLC-MS/MS分析ESI陰性モード]以下の仕様を有するカラムを用いて、試料を分析したWatersAcquityUPLCHSST3,1.8μm,100mm2.1mmI.D.。フルループfullloopを使用した注入量は5μlであり、カラム流量は0.250ml/分であり、カラム温度は40°Cであった。表15は、移動相Aおよび移動相Bに使用された勾配を表す。移動相Aは水中0.1のギ酸を含み、移動相Bはアセトニトリル中0.1のギ酸を含む。図23は、10mg/L、5mg/Lアジピン酸を含むスタンダード、および3mg/lアジピン酸を含む、バグストッパーを用いたアラビノースでの株3生成で、株3により生成された試料の、MRMクロマトグラムを表す。[実施例10][コハク酸生成][10.1発現構築物]アクチノバチルスサクシノゲネスActinobacillussuccinogenes由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼPCKaE.C.4.1.1.49、およびトリマノソーマブルセイTrypanosomabrucei由来のグリコソーム性フマル酸レダクターゼFRDgE.C.1.3.1.6を含む発現構築物pGBS414PPK-3、ならびにリゾプスオリゼRhizopusoryzae由来のフマラーゼE.C.4.2.1.2.、およびペルオキシソーム性リンゴ酸デヒドロゲナーゼMDH3E.C.1.1.1.37を含む発現構築物pGBS415FUM3は、国際公開第2009/065778号パンフレットの19~20ページ、および22~30ページ図および配列表を含む参照により本明細書に含めるに既述の通りに作成した。ラクトバチルスプランタムLactobacillusplantarumに由来する遺伝子araA、遺伝子araBおよび遺伝子araDを含む発現構築物pGBS416ARAABDは、プラスミドpPWT018由来のaraABD発現カセットを含むPCR産物を、プラスミドpRS416にクローニングすることによって構築した。PCRフラグメントは、Phusion登録商標DNAポリメラーゼFinnzymesおよび本明細書で配列番号96および配列番号97と定義されたPCRプライマーを使用して生じさせた。このPCR産物を、プラスミドpRS416と同様、制限酵素SalIおよびNotIで切断した。大腸菌E.coliTOP10の連結および形質転換の後、制限酵素分析に基づいて、正しい組み換えを選択した。プラスミドpGBS416ARAABDの物理地図を図24に提示する。[10.2S.セルビシエS.cerevisiae株]プラスミドpGBS414PPK-3、プラスミドpGBS415-FUM-3を、S.セルビシエS.cerevisiae株CEN.PK113-6BMATAura3-52leu2-112trp1-289に形質転換した。加えて、プラスミドpGBS416ARAABDをこの酵母に形質転換して、原栄養性酵母株を作る。発現ベクターを、エレクトロポレーションにより酵母に形質転換した。形質転換混合物を酵母窒素原基礎培地YNBw/oAADifco2グルコース上にプレーティングした。1つのこのような形質転換体はSUC595と呼ばれた。対照として、株CEN.PK113-6Bは、プラスミドpGBS416ARAABDのみで形質転換させた。1つのこのような形質転換体はSUC600と呼ばれた。株を、唯一の炭素源としてのアラビノースで増殖するための適応進化実施例2、セクション2.1参照にかけた。実施例2では、アラビノースを含むYNB-培地を使用したが、実施例では、2アラビノースを含むVerduyn培地を使用した。適応進化振盪フラスコから分離された単一コロニー分離株を、唯一の炭素源としてのアラビノースで増殖できる能力について特性化した。適応進化を介したSUC595の誘導体である、SUC689は、唯一の炭素源としてのアラビノースでの増殖速度0.1h-1を有する。適応進化を介したSUC600の誘導体である、SUC694は、唯一の炭素源としてのアラビノースでの増殖速度0.09h-1を有する。[10.3増殖実験およびコハク酸生成]形質転換体SUC689および形質転換体SUC694の単一コロニー分離株を、YNBDifco、4ガラクトースおよび2寒天が入っている96ウェルマイクロプレートに接種した。1株当たり4つの独立したコロニーを接種した。30°Cで2日間増殖させた後、ピンツールを用いて、コロニー物質を、4ガラクトースw/vを含むVerduyn培地Verduynetal.,1992,Yeast.Jul;87:501-17からなる前培養培地200μlが入っている96ウェルマイクロプレートにトランスファーし、30°C、550rpmおよび湿度80のInfors振盪インキュベーター内で、好気的条件下で増殖させた。約48時間後、4ガラクトースを加えた用時調製Verduyn培地2.5mlが入っている24ウェルマイクロプレートに細胞を二重にトランスファーした。30°Cで約72時間インキュベートした後、細胞を培地から分離するために、このプレートをマイクロプレート遠心分離機内で遠心沈殿させた。上澄を傾瀉した。この細胞を、8アラビノースを含むVerduyn培地4ml中に再懸濁させた。48時間マイクロプレート1および72時間マイクロプレート2という、二通りの時間間隔で、細胞を沈降させることによってインキュベーションを停止した。上澄を使用して、セクション10.4に記述した通り、NMRでコハク酸レベルを測定した。[10.4NMR分析]両試料中の有機酸および糖類を測定するために、NMRを実施した。結果を表16および表17に示す。株SUC689の場合、株SUC694と比べてコハク酸の量が多いことが、表16および表17から明らかである。後者はほぼ全てのアラビノースを転化し、そして産物として、主にバイオマスおよびエタノールが形成された。株SUC689の場合、より少量のエタノールが形成されるが、SUC694と比べて3~4倍多い、有意に多量のコハク酸が形成される。コハク酸収率を算出し、下表に示した。要するに、株SUC689ではアラビノースからコハク酸が生成されたが、コハク酸経路を発現しない株である、株SUC694では、有意に少なかった。[実施例11][araA遺伝子、araB遺伝子およびaraD遺伝子の特別なコピーの導入][11.1araABD-カセットの増幅]araA遺伝子、araB遺伝子およびaraD遺伝子の特別なコピーをゲノムに導入するために、鋳型としてプラスミドpPWT018を、またプライマーとして配列番号98および配列番号99を含むオリゴヌクレオチドを用いて、Phusion登録商標DNAポリメラーゼFinnzymesを使用してPCR反応を実施した。これらのプライマーを用いると、araABD-カセットが増幅される。プライマー設計は、PCRフラグメントの隣接領域が、酵母トランスポゾンTy-1のδ配列のコンセンサス配列と相同であるというものであった。こうした配列は、NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/から得ることができ、またたとえばアラインメントを可能にする、CloneManager9ProfessionalEditionScientificEducationalSoftware,Cary,USAのようなソフトウェアパッケージを使用して、アライニングできる。araABD-カセットは、ゲノムへの組み込みを選択できる、選択可能マーカーを含まない。形質転換頻度を推定するために、kanMX-マーカーを用いて第2の対照形質転換を実施した。この目的を達成するために、プラスミドp427TEFDualsystemsBiotech由来のkanMX-カセットを、配列番号100および配列番号101に対応するプライマーを使用したPCR反応で増幅した。[11.2BIE104A2P1の形質転換]BIE104A2P1は、エレクトロポレーションプロトコール上記の通りに従い、araABD-カセットTy1::araABDと呼ばれる30μgまたはkanMX-カセット10μgのいずれかを含むフラグメントを用いて、形質転換した。kanMX-形質転換混合物を、1ml当たり100μgのG418SigmaAldrichを含むYPD-寒天1リットル当たり:酵母エキス10g、1リットル当たり20gのペプトン、1リットル当たり20gのデキストロース、寒天20g上にプレーティングする。2~4日後、コロニーがプレート上に出現しているが、陰性対照すなわち、形質転換実験でDNA無添加は空のYPD/G418-プレートに終わる。形質転換頻度は、kanMX-カセット1μg当たり600コロニーより高い。Ty1::araABD形質転換混合物を使用して、2アラビノースを加えたVerduyn培地100mlが入っている振盪フラスコに接種した。対照として、形質転換の陰性対照すなわち、形質転換実験でDNA無添加を使用する。振盪フラスコを、オービタルシェーカー内、30°Cおよび280rpmでインキュベートした。増殖は、600nmの光学濃度を定期的に測定することによって追跡する。約25日後、Ty1::araABD振盪フラスコの光学濃度は上昇するが、陰性対照における増殖はまだない。25日目に、2アラビノースを加えた用時調製Verduyn培地が入っているフラスコに、Ty1::araABD培養から、600nmにおける開始光学濃度0.15まで接種する。この培養は直ちにかつ急速にアラビノースで増殖し始める。たぶん、この培養は継代培養の混合物からなるため、したがって、Ty1::araABDカセットのコピー数およびアラビノースでの増殖速度に差がある細胞からなるため、単一コロニー分離株を入手するために、細胞をmilliQ水で希釈し、YPD-寒天プレート上にプレーティングする。単一コロニー分離株を、様々な炭素源を利用できる能力について試験する。[11.3より優れたアラビノース転化株の選択]他の重要な糖類グルコース、およびガラクトースを利用する能力を失わずに、唯一の炭素源としてのアラビノースでの改良された増殖を獲得した株を選択するために、適応進化培養の単一コロニー分離株10株を、YPD-寒天上に再画線する。その後、2グルコースを加えたYPD-培地で前培養を行う。10の培養は、30°Cおよび280°Cで一晩インキュベートする。各培養のアリコートを使用して、2グルコース、または2アラビノースまたは2ガラクトースのいずれかを加えた用時調製Verduyn培地に、初期光学濃度0.15で、接種する。対照として、株BIE201、株BIE104A2P1および混合個体群これから10の単一コロニー分離株が回収されるを実験に含める。細胞を、オービタルシェーカー内、30°Cおよび280rpmで増殖させる。増殖は、600nmにおける光学濃度測定値に基づいて評価する。結果は、混合培養も10の単一コロニー分離株も、600nmでより高い最終光学濃度を示すことを表している。コロニーコロニーT1つが、唯一の炭素源としてのアラビノースでの増殖に基づいて選択される。このコロニーは、2アラビノースを加えたVerduyn培地に接種されると、親株BIE104A2P1より高い増殖速度を表している。その増殖速度は、株BIE201の増殖速度に匹敵する。Q-PCRは、株BIE201、株BIE104A2P1およびコロニーTの染色体DNAを用いて行われる。araABDカセットのコピー数は、BIE104A2P1の場合には1であると決定され、コロニーTの場合にもBIE201の場合にも2より大きいと決定される。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