"1担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌の血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23Fおよび33F由来の莢膜多糖からなる多価の多糖-タンパク質コンジュゲート混合物;ならびに2薬学的に許容され得る担体、を含む、免疫原性組成物。前記担体タンパク質がCRM197である、請求項1に記載の免疫原性組成物。さらにアジュバントを含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。前記アジュバントがアルミニウム系アジュバントである、請求項3に記載の免疫原性組成物。前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項4に記載の免疫原性組成物。前記アジュバントがリン酸アルミニウムである、請求項5に記載の免疫原性組成物。ヒトに免疫学的有効量の請求項1に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖に対する免疫応答の誘発方法。投与される免疫原性組成物が、6Bが4μgである以外は2μgの各糖質;約32μgのCRM197担体タンパク質;0.125mgの元素アルミニウム0.5mgのリン酸アルミニウムアジュバント;150mMの塩化ナトリウムおよび20mMのL-ヒスチジンバッファーを含むように製剤化された0.5mL単回用量である、請求項7に記載の方法。本発明は、1担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌の15種類の異なる血清型由来の莢膜多糖からなる多価の多糖-タンパク質コンジュゲート混合物、および2薬学的に許容され得る担体、を含む免疫原性組成物を提供する。より詳しくは、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌の血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23Fおよび33F由来の莢膜多糖からなる多価の多糖-タンパク質コンジュゲート混合物;ならびに薬学的に許容され得る担体、を含む15価の肺炎球菌コンジュゲートワクチンPCV-15組成物を提供する。具体的な一実施形態において、該免疫原性組成物は血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、1A、19F、22F、23Fおよび33F由来の莢膜多糖を含み、そして担体タンパク質はCRM197である。一部の特定の実施形態では、該組成物は、さらにアジュバントを含む。一部の特定の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムなどのアルミニウム系アジュバントである。本発明の特定の一実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムである。また、本発明は、ヒトに免疫学的有効量の上記の免疫原性組成物を投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖に対する免疫応答の誘発方法を提供する。さらに、本発明は、6Bが4μgである以外は2μgの各多糖;約32μgのCRM197担体タンパク質;0.125mgの元素アルミニウム0.5mgのリン酸アルミニウムアジュバント;150mMの塩化ナトリウムおよび20mMのL-ヒスチジンバッファーを含むように製剤化された0.5mL単回用量として投与される免疫原性組成物を提供する。本発明は、15種類の相違する多糖-タンパク質コンジュゲートを含む、本質的に該コンジュゲートからなる、あるいはまた該コンジュゲートからなる多価の免疫原性組成物を提供し、該コンジュゲートの各々は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた異なる莢膜多糖を含み、該莢膜多糖は、薬学的に許容され得る担体とともに肺炎連鎖球菌の血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23Fおよび33Fから調製される。一部の特定の実施形態では、担体タンパク質はCRM197である。該免疫原性組成物は、さらに、アジュバント、例えば、アルミニウム系アジュバントリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなどを含むものであってもよい。また、本発明は、ヒトに免疫学的有効量の上記の多価の免疫原性組成物を投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫応答の誘発方法を提供する。本実施例後述において実例を示すように、乳児アカゲザルでの前臨床試験により、PCV-15の全15種類の血清型に対して、Prevnar登録商標の7種類の共通する血清型に対する応答と同等の強固な抗体応答が示された。血清型22Fおよび33Fを含む新たな多糖-タンパク質コンジュゲートの追加を含めた15価の肺炎球菌コンジュゲートワクチンにより強固な抗体応答が提供されるという本出願人らの所見は、既存の肺炎球菌ワクチンではカバーされない肺炎球菌の血清型の接種率の拡張の実現可能性を示す。用語~を含むcompriseは、本発明の免疫原性組成物について用いる場合、任意の他の成分該抗原混合物に対する~からなるという文言の制限を受ける、例えばアジュバントおよび賦形剤などの包含をいう。用語~からなるは、多価の多糖-タンパク質コンジュゲート混合物について用いる場合、混合物が該15種類の特定の肺炎連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートを有するが、異なる血清型由来の他の肺炎連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートは有さないことをいう。肺炎連鎖球菌莢膜多糖-タンパク質コンジュゲート肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖は、当業者に公知の標準的な手法によって調製され得る。例えば、多糖は、細菌から単離され得、既知の方法によって、好ましくはマイクロフルイダイゼーションによってある程度までサイジングしてもよい例えば、欧州特許第497524号および同第497525号参照。多糖は、多糖試料の粘度を低下させるため、および/またはコンジュゲート生成物の濾過性を改善するためにサイジングされ得る。本発明では、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌の血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23Fおよび33Fから調製する。一実施形態において、各肺炎球菌多糖の血清型はダイズベースの培地中で培養する。次いで、個々の多糖を、遠心分離、沈殿および限外濾過を含む標準工程によって精製する。例えば、米国特許出願公開第2008/0286838号および米国特許第5,847,112号を参照のこと。担体タンパク質は、好ましくは、無毒性かつ非反応原性であり、そして、充分な量および純度で入手可能なタンパク質である。担体タンパク質は、該多糖の免疫原性を増強するために肺炎連鎖球菌多糖とコンジュゲートまたは連接され得る。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適したものであるのがよい。本発明の特定の一実施形態では、CRM197が担体タンパク質として使用される。一実施形態では、各莢膜多糖を同じ担体タンパク質にコンジュゲートさせる各莢膜多糖分子は、単一の担体タンパク質にコンジュゲートされている。別の実施形態では、莢膜多糖を2種類以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせる各莢膜多糖分子は、単一の担体タンパク質にコンジュゲートされている。かかる実施形態において、同じ血清型の各莢膜多糖は、典型的には同じ担体タンパク質にコンジュゲートさせる。CRM197は、ジフテリア毒素の無毒性バリアントすなわちトキソイドである。一実施形態において、これは、カザミノ酸と酵母抽出物ベースの培地中で培養したCorynebacteriumdiphtheria株C7β197の培養物から単離される。別の実施形態では、CRM197は、米国特許第5,614,382号に記載の方法に従って組換えにより調製される。典型的には、CRM197は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーの組合せによって精製される。一部の実施形態では、CRM197は、PfenexExpressionTechnologyTMPfenexInc.,SanDiego,CAを用いて、Pseudomonasfluorescensにおいて調製される。他の好適な担体タンパク質としては、さらなる不活化細菌毒素、例えば、DTジフテリアトキソイド、TT破傷風トキソイドtoxidまたはTTの断片C、百日咳トキソイド、コレラトキソイド例えば、国際公開第2004/083251号に記載のもの、大腸菌LT、大腸菌ST、および緑膿菌由来の外毒素Aが挙げられる。細菌の外膜タンパク質、例えば、外膜複合体cOMPC、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌の表面プロテインAPspA;国際公開第02/091998号参照、肺炎球菌の吸着タンパク質PsaA、A群もしくはB群の連鎖球菌由来C5aペプチダーゼ、またはHaemophilusinfluenzaeのプロテインD、肺炎球菌のニューモリシンKuoら,1995,InfectImmun63;2706-13、例えば、なんらかの様式で無毒化されたply、例えば、dPLY-GMBS国際公開第04/081515号参照またはdPLY-ホルモール、PhtX、例えば、PhtA、PhtB、PhtD、PhtEおよびPhtタンパク質の融合体、例えば、PhtDE融合体、PhtBE融合体国際公開第01/98334号および同第03/54007号参照もまた、使用され得る。他のタンパク質、例えば、オボアルブミン、スカシガイヘモシアニンKLH、ウシ血清アルブミンBSAまたはツベルクリンPPDの精製タンパク質誘導体、PorBN.meningitidis由来、PDHaemophilusinfluenzaeのプロテインD;例えば、欧州特許第0594610号参照、またはその免疫学的機能等価体、合成ペプチド欧州特許第0378881号および同第0427347号参照、熱ショックタンパク質国際公開第93/17712および同第94/03208号参照、百日咳タンパク質国際公開第98/58668号および欧州特許第0471177号参照、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子もしくはホルモン国際公開第91/01146号参照、種々の病原体由来抗原の多数のヒトCD4T細胞エピトープを含む人工タンパク質Falugiら,2001,EurJImmunol31:3816-3824参照、例えばN19タンパク質Baraldoiら,2004,InfectImmun72:4884-7参照、鉄取込みタンパク質国際公開第01/72337号参照、C.difficileの毒素AもしくはB国際公開第00/61761号参照、ならびにフラジェリンBen-Yedidiaら,1998,ImmunolLett64:9参照もまた、担体タンパク質として使用され得る。他のDT変異型、例えば、CRM176、CRM228、CRM45Uchidaら,1973,JBiolChem218:3838-3844;CRM9、CRM45、CRM102、CRM103およびCRM107、ならびにNichollsおよびYoule,GeneticallyEngineeredToxins,編:Frankel,MaecelDekkerInc,1992に記載された他の変異;Glu-148からAsp、GlnもしくはSer、および/またはAla158からGlyへの変異または欠失、ならびに米国特許第4,709,017号または同第4,950,740号に開示された他の変異;残基Lys516、Lys526、Phe530および/またはLys534の少なくとも1つまたはそれ以上の変異、ならびに米国特許第5,917,017号または同第6,455,673号に開示された他の変異;あるいは米国特許第5,843,711号に開示された断片、を使用することもできる。精製した多糖は、糖質が担体タンパク質と反応することができるようにするために化学的に活性化させる。活性化させたら、各莢膜多糖を別々に担体タンパク質にコンジュゲートさせ複合糖質を形成させる。この多糖コンジュゲートは、既知のカップリング手法によって調製され得る。一実施形態において、多糖の化学的活性化およびその後の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、米国特許第4,365,170号、同第4,673,574号および同第4,902,506号に記載の手段によって行われる。簡単には、この化学反応は、末端ヒドロキシル基をアルデヒドに酸化する任意の酸化剤、例えば過ヨウ素酸塩例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または過ヨウ素酸との反応による肺炎球菌多糖の活性化を伴う。この反応により、糖質のビシナルヒドロキシル基のランダムな酸化的切断がもたらされ、反応性アルデヒド基の形成を伴う。タンパク質担体例えば、CRM197とのカップリングは、該タンパク質のリジル基の直接アミノ化を経る還元的アミノ化によるものであり得る。例えば、コンジュゲーションは、活性化させた多糖と担体タンパク質との混合物を還元剤ナトリウムシアノボロヒドリドなどと反応させることにより行われる。次いで、未反応アルデヒドを、強力な還元剤水素化ホウ素ナトリウムなどの添加によってキャッピングする。別の実施形態において、コンジュゲーション方法は、糖質を1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレートCDAPで活性化させ、シアン酸エステルを形成することに依存するものであり得る。活性化させた糖質は、かくして、直接、またはスペーサーリンカー基を介して担体タンパク質上のアミノ基にカップリングされ得る。例えば、スペーサーはシスタミンまたはシステアミンであり得、チオール化多糖が得られ、これは、マレイミド活性化型担体タンパク質例えば、GMBSを使用またはハロアセチル化担体タンパク質例えば、ヨードアセトアミド[例えば、エチルヨードアセトアミドHCl]もしくはブロモ酢酸N-スクシンイミジルもしくはSIAB、もしくはSLA、もしくはSBAPを使用との反応後に得られるチオエーテル結合によって担体にカップリングされ得る。好ましくは、シアン酸エステルCDAP化学反応によって作製したものであってもよいをヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジドADHとカップリングさせ、アミノ誘導体化糖質を担体タンパク質に、タンパク質担体上のカルボキシル基を介するカルボジイミド例えば、EDACまたはEDC化学反応を用いてコンジュゲートさせる。かかるコンジュゲートは、国際公開第93/15760号、同第95/08348号および同第96/29094号;ならびにChuら,1983,Infect.Immunity40:245-256に記載されている。他の適当な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、S--NHS、EDC、TSTUを使用するものである。多くのものが国際公開第98/42721号に記載されている。コンジュゲーションは、カルボニルリンカーを伴うものであってもよく、これは、糖質の遊離ヒドロキシル基とCDIとの反応Bethellら,1979,J.BiolChem.254:2572-4;Hearnら,1981,J.Chromatogr.218:509-18参照、続いて、タンパク質との反応によるカルバメート結合の形成によって形成され得る。これは、アノマー末端の第1級ヒドロキシル基への還元場合により第1級ヒドロキシル基の保護/脱保護を行う、第1級ヒドロキシル基とCDIとの反応によるCDIカルバメート中間体の形成、および該CDIカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを伴うものであり得る。一実施形態において、製剤化の前に、各肺炎球菌莢膜多糖抗原を個々に肺炎連鎖球菌から精製し、活性化させて反応性アルデヒドを形成し、次いで、還元的アミノ化を用いて担体タンパク質CRM197に共有結合によりコンジュゲートさせる。担体タンパク質への莢膜多糖のコンジュゲーション後、多糖-タンパク質コンジュゲートを、さまざまな手法のうちの1つ以上によって精製する多糖-タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する。このような手法の例は当業者に周知であり、濃縮/ダイアフィルトレーション操作、限外濾過、沈殿/溶出、カラムクロマトグラフィーおよびデプスフィルトレーションが挙げられる。例えば、米国特許第6,146,902号を参照のこと。医薬組成物/ワクチン組成物さらに、本発明は、15種類の相違する多糖-タンパク質コンジュゲートを含む、本質的に該コンジュゲートからなる、あるいはまた該コンジュゲートからなる医薬組成物、免疫原性組成物およびワクチン組成物を含む組成物を提供し、ここで、該コンジュゲートの各々は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた異なる莢膜多糖を含み、そしてここで、該莢膜多糖は、薬学的に許容され得る担体およびアジュバントとともに肺炎連鎖球菌の血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23Fおよび33Fから調製される。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別々のプロセスで調製され、単回投与製剤にバルクで製剤化される。本明細書において定義する場合、アジュバントは、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増強する機能を果たす物質である。免疫アジュバントは、単独で投与した場合は免疫原性が弱い例えば、誘発される抗体力価もしくは細胞媒介性免疫応答がない、もしくは弱い抗原に対する免疫応答を増強するもの、抗原に対する抗体力価を増大させるもの、および/または個体において免疫応答を得るのに有効な抗原の用量を低減させるものであり得る。したがって、アジュバントは、多くの場合、免疫応答を押し上げるために与えられ、当業者に周知である。該組成物の有効性を増強するための好適なアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。1アルミニウム塩ミョウバン、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど。2水中油型乳剤配合物ムラミルペプチド下記に定義または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫賦活剤あり、またはなし、例えば、a5スクアレン、0.5Tween80、および0.5Span85を含み種々の量のMTP-PEを含んでいてもよい、マイクロフルイダイザー例えば、Model110YマイクロフルイダイザーMicrofluidics,Newton,MAを用いてサブミクロン粒子に配合されたMF59国際公開第90/14837号、b10スクアレン、0.4Tween80、5プルロニックブロックポリマーL121、およびthr-MDPを含み、サブミクロン乳剤にマイクロフルイダイズされているか、またはボルテックスして大粒径の乳剤が生成されているかのいずれかであるSAF、c2スクアレン、0.2Tween80、ならびに3-O-脱アセチル化モノホスホリルリピドdeaylatedmonophosphorylipidAMPLTM米国特許第4,912,094号に記載、トレハロースジミコレートTDMおよび細胞壁骨格CWS、好ましくはMPLCWSDetoxTMからなる群の1種類以上の細菌細胞壁成分を含むRibiTMアジュバント系RASCorixa,Hamilton,MT;ならびにdMontanideISAなど。3サポニンアジュバント、例えば、QuilAもしくはSTIMULONTMQS-21Antigenics,Framingham,MA例えば、米国特許第5,057,540号参照が使用され得るか、または該アジュバントから生成させた粒子、例えば、ISCOMコレステロール、サポニン、リン脂質、および両親媒性タンパク質の組合せによって形成された免疫賦活性複合体ならびにIscomatrix登録商標ISCOMと本質的に同じ構造を有するが該タンパク質を含まない。4細菌リポ多糖、合成リピドA類似体、例えばアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物AGP、またはその誘導体もしくは類似体、これらは、Corixaから入手可能であり、米国特許第6,113,918号に記載されている;かかるAGPの一例は、2-[R-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]エチル2-デオキシ-4-O-ホスホノ-3-O-[R-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-2-[R-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ}-b-D-グルコピラノシドであり、529としても知られており以前はRC529として公知であった、水性形態または安定な乳剤として配合されたものである。5合成ポリヌクレオチド、例えばCpGモチーフ1つまたは複数を含むオリゴヌクレオチド米国特許第6,207,646号。6サイトカイン、例えば、インターロイキン例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18など、インターフェロン例えば、γインターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF、腫瘍壊死因子TNF、共起刺激分子B7-1およびB7-2など。7補体、例えば、補体成分C3dの三量体別の実施形態では、アジュバントは、上記のアジュバントの2種類、3種類またはそれ以上の混合物、例えば、SBAS23-脱アセチル化モノホスホリルリピドAおよびQS21も含有している水中油型乳剤である。ムラミルペプチドとしては、限定されないが、N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミンthr-MDP、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニン-2-1’-2’ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ-エチルアミンMTP-PEなどが挙げられる。一部の特定の実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンであり得る。アルミニウム塩アジュバントは当該技術分野で周知であり、例えば、Harlow,E.およびD.Lane1988;Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryならびにNicklas,W.1992;Aluminumsalts.ResearchinImmunology143:489-493に記載されている。アルミニウム塩としては、限定されないが、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物ATH、アルミニウム水和物、アルミニウム三水和物、アルハイドロゲル、Superfos、Amphogel、水酸化アルミニウムIII、硫酸ヒドロキシリン酸アルミニウムリン酸アルミニウムアジュバントAPA、非晶質アルミナ、三水和アルミナ、またはトリヒドロキシアルミニウムが挙げられる。APAは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。APAは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムを1:1の容量比でブレンドし、ヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることにより製造されたものである。ブレンドプロセス後、その物質をハイシェアミキサーを用いてサイズリダクションし、2~8μmの範囲の目的の凝集体粒径を得る。次いで、生成物を生理食塩水に対してダイアフィルトレーションし、蒸気滅菌する。一部の特定の実施形態では、市販のAlOH3例えば、Denmark/AccurateChemicalandScientificCo.,Westbury,NYのAlhydrogelまたはSuperfosを使用し、タンパク質を、50~200gのタンパク質/mg水酸化アルミニウムの比率で吸着させる。タンパク質の吸着は、別の実施形態において、タンパク質のpI等電pHおよび媒体のpHに依存性である。pIが低いタンパク質は、pIが高いタンパク質よりも強力に正荷電アルミニウムイオンに吸着される。アルミニウム塩は、2~3週間の期間にわたってゆっくり放出されるAgの貯蔵部を構築し、マクロファージの非特異的活性化および補体活性化に関与し、および/または先天性免疫機構を刺激するおそらく、尿酸の刺激によってことがあり得る。例えば、Lambrechtら,2009,CurrOpinImmunol21:23を参照のこと。一価のバルク水性コンジュゲートは、典型的には一緒にブレンドし、6Bでは目標の16μg/mLまで希釈した以外は、すべての血清型を目標の8μg/mLまで希釈する。希釈したら、バッチを濾過滅菌し、等容量のリン酸アルミニウムアジュバントを目標最終アルミニウム濃度250μg/mLまで無菌的に添加する。アジュバントを加えた製剤バッチを、単回使用の0.5mL/用量バイアル内に充填する。一部の特定の実施形態では、アジュバントはCpG含有ヌクレオチド配列、例えば、CpG含有オリゴヌクレオチド、特に、CpG含有オリゴデオキシヌクレオチドCpGODNである。別の実施形態では、アジュバントはODN1826であり、これは、ColeyPharmaceuticalGroupから取得され得る。CpG含有ヌクレオチド、CpG含有オリゴヌクレオチド、CpGオリゴヌクレオチドおよび類似した用語は、非メチル化CpG部分を含む6~50ヌクレオチド長のヌクレオチド分子をいう。例えば、Wangら,2003,Vaccine21:4297を参照のこと。別の実施形態では、該用語の任意の他の当該技術分野で認知された定義が意図される。CpG含有オリゴヌクレオチドは、任意の合成ヌクレオシド間結合を用いた修飾オリゴヌクレオチド、修飾塩基および/または修飾糖鎖を含むものである。CpGオリゴヌクレオチドの使用方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Surら,1999,JImmunol.162:6284-93;Verthelyi,2006,MethodsMolMed.127:139-58;およびYasudaら,2006,CritRevTherDrugCarrierSyst.23:89-110に記載されている。投与/投薬量本発明の組成物および製剤は、ワクチンを全身経路または粘膜経路によって投与するという手段によって肺炎球菌感染に易感染性のヒトを保護または処置するために使用され得る。一実施形態において、本発明は、ヒトに免疫学的有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫応答の誘発方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヒトに免疫学的immunogically有効量の本発明の免疫原性組成物を投与する工程を含む、ヒトに肺炎球菌感染に対するワクチンを接種する方法を提供する。本発明の組成物の有効量は、後の抗原刺激の際に肺炎連鎖球菌の感染infectivitiyの尤度または重症度を有意に低減させる抗体を誘起するに必要とされる用量をいう。本発明の方法は、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる主要な臨床症候群侵襲性感染髄膜炎、肺炎、および菌血症と、非侵襲性感染急性中耳炎、および副鼻腔炎の両方を含むの予防および/または低減のために使用され得る。本発明の組成物の投与は、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路による注射;または口道/消化管、呼吸道もしくは尿生殖路への粘膜投与のうちの1つまたはそれ以上を含むものであり得る。一実施形態では、鼻腔内投与が肺炎または中耳炎の処置に使用される肺炎球菌の鼻咽頭通過がより有効に抑制され得、したがって、初期の段階で感染が減弱されるため。各ワクチン用量中のコンジュゲートの量は、有意な有害効果なく免疫防御応答を誘発する量として選択される。かかる量は、肺炎球菌の血清型に応じて異なり得る。一般的に、各用量は、0.1~100μg、特に0.1~10μg、より特別には1~5μgの各多糖を含む。例えば、各用量は、100、150,200、250、300、400、500、もしくは750ngまたは1、1.5、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、30、40、50、60、70、80、90、もしくは100μgを含み得る。特定のワクチンのための諸成分の最適量は、被検体における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な試験によって確認され得る。例えば、別の実施形態では、ヒトへのワクチン接種のための投薬量は、動物試験をヒトデータに外挿することによって決定される。別の実施形態では、該投薬量は経験的に決定される。一実施形態において、アルミニウム塩の用量は、10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、300、500もしくは700μg、または1、1.2、1.5、2、3、5mgもしくはそれ以上である。また別の実施形態では、上記のミョウバン塩の用量は、組換えタンパク質1μgあたりのものである。本発明の特定の一実施形態では、PCV-15ワクチンは、CRM197に個々にコンジュゲートさせた血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23Fおよび33Fの肺炎球菌莢膜多糖の滅菌された液状製剤である。各々0.5mL用量が、6Bが4μgである以外は2μgの各糖質;約32μgのCRM197担体タンパク質例えば、32μg±5μg、±3μg、±2μg、または±1μg;0.125mgの元素アルミニウム0.5mgのリン酸アルミニウムアジュバント;ならびに塩化ナトリウムおよびL-ヒスチジンバッファーを含むように製剤化される。塩化ナトリウム濃度は約150mM例えば、150mM±25mM、±20mM、±15mM、±10mM、または±5mMであり、L-ヒスチジンバッファーは約20mM例えば、20mM±5mM、±2.5mM、±2mM、±1mM、または±0.5mMである。本発明のいずれかの方法によれば、一実施形態において、被検体はヒトである。一部の特定の実施形態では、ヒト患者は乳児1歳未満、よちよち歩きの子供およそ12~24ヶ月、または幼児およそ2~5歳である。他の実施形態では、ヒト患者は高齢患者>65歳である。また、本発明の組成物は、年長児、青年および成人例えば、年齢18~45歳または18~65歳での使用にも適している。本発明の方法の一実施形態では、本発明の組成物は単回接種物として投与される。別の実施形態では、ワクチンは、2回、3回または4回またはそれ以上、充分に間隔をあけて投与される。例えば、該組成物は、1、2、3、4、5もしくは6ヶ月間隔で、またはその任意の組合せの間隔で投与され得る。免疫化スケジュールは、肺炎球菌ワクチン用に設計されたものに従ったスケジュールであり得る。例えば、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる侵襲性疾患に対する乳児およびよちよち歩きの子供での常套的なスケジュールは、年齢が2、4、6、および12~15ヶ月のときである。したがって、好ましい実施形態では、該組成物は、年齢が2、4、6、および12~15ヶ月のときに一連の4回の用量で投与される。また、本発明の組成物は、肺炎連鎖球菌由来の1種類以上のタンパク質も含んでいてもよい。含めるのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際公開第02/083855号および同第02/053761号において特定されるものが挙げられる。製剤本発明の組成物は、被検体に当業者に公知の1種類以上の方法、例えば、非経口、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、腹腔内にて投与され得、それに応じて製剤化され得る。一実施形態において、本発明の組成物は、液状製剤の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、動脈内、皮下注射、または呼吸粘膜内注射によって投与される。注射のための液状製剤としては液剤などが挙げられる。本発明の組成物は、単回投与バイアル、複数投与バイアルまたは充填済シリンジとして製剤化され得る。別の実施形態では、本発明の組成物は、経口投与され、したがって、経口投与に適した形態、すなわち、固形または液状の調製物として製剤化される。固形経口製剤としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられる。液状経口製剤としては、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、油性剤などが挙げられる。液状製剤用の薬学的に許容され得る担体は、水性もしくは非水性の溶液、懸濁液、乳液または油類である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用有機エステルオレイン酸エチルなどである。水性担体としては、水、アルコール性/水性の溶液、乳液または懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。油類の例は、動物、植物または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、または乳汁もしくは卵に由来する脂質である。医薬組成物は、等張性、低張性、または高張性であってよい。しかしながら、多くの場合、注入または注射用の医薬組成物は、投与されるとき本質的に等張性であることが好ましい。したがって、保存の際、医薬組成物は、好ましくは等張性または高張性であり得る。医薬組成物が保存の際に高張性である場合、投与前に等張性溶液となるように希釈するのがよい。等張性薬剤は、イオン性等張性薬剤塩などであっても非イオン性等張性薬剤糖類などであってもよい。イオン性等張性薬剤の例としては、限定されないが、NaCl、CaCl2、KClおよびMgCl2が挙げられる。非イオン性等張性薬剤の例としては、限定されないが、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールが挙げられる。また、少なくとも1種類の薬学的に許容され得る添加剤はバッファーであることが好ましい。ある目的の場合では、例えば、医薬組成物が注入または注射を意図したものである場合、たいていは該組成物にバッファーを含めることが望ましく、バッファーは、溶液を4~10の範囲5~9など、例えば、6~8のpHに緩衝する能力を有するものである。バッファーは、例えば、TRIS、酢酸バッファー、グルタミンバッファー、乳酸バッファー、マレイン酸バッファー、酒石酸バッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、炭酸バッファー、グリシン酸バッファー、ヒスチジンバッファー、グリシンバッファー、コハク酸バッファーおよびトリエタノールアミンバッファーからなる群から選択され得る。さらに、バッファーは、例えば、特に、医薬製剤が非経口使用のためのものである場合、非経口使用のためUSP適合バッファーから選択されるものであり得る。例えば、バッファーは、一塩基酸酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸および乳酸など;二塩基酸アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ、コハク酸および酒石酸など、多塩基酸クエン酸およびリン酸など;ならびに塩基アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミンおよびTRISなどからなる群から選択されるものであり得る。非経口ビヒクル皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液および揮発油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、体液補給液および栄養補給液、電解質補給液例えば、リンゲルデキストロース主体のものなどが挙げられる。例は、界面活性剤および他の薬学的に許容され得るアジュバントの添加を伴うまたは伴わない、滅菌液状物水および油類などである。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、グリコールプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど、ならびにポリソルベート-80が好ましい液状担体である特に、注射用液剤に。油類の例は、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、または乳汁もしくは卵に由来する脂質である。また、本発明の製剤に界面活性剤を含めてもよい。好ましい界面活性剤としては、限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤一般的にはTweenと称される、特に、ポリソルベート20およびポリソルベート80;エチレンオキシドEO、プロピレンオキシドPOおよび/またはブチレンオキシドBOのコポリマー商標名DOWFAXTMで販売、例えば、直鎖EO/POブロックコポリマー;オクトキシノールこれは、反復エトキシオキシ-l,2-エタンジイル基の数が種々であり得、オクトキシノール-9TritonX-100、またはt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールが特に重要である;オクチルフェノキシポリエトキシエタノールIGEPALCA-630/NP-40;リン脂質、例えばホスファチジルコリンレシチン;ノニルフェノールエトキシレート、例えばTergitolTMNPシリーズ;ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪族エーテルBrij界面活性剤として知られている、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテルBrij30;ならびにソルビタンエステル一般的にはSPANとして公知である、例えばソルビタントリオレエートSpan85およびソルビタンモノラウレートが挙げられる。本乳剤に含めるのに好ましい界面活性剤はTween80ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。界面活性剤の混合物例えば、Tween80/Span85混合物を使用することもできる。また、ポリオキシエチレンソルビタンエステルポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTween80などとオクトキシノールt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールTritonX-100などの組合せも好適である。別の有用な組合せは、ラウレス9ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび/またはオクトキシノールを含むものである。界面活性剤の好ましい量重量は:ポリオキシエチレンソルビタンエステルTween80などが0.01~1、特に約0.1;オクチル-またはノニルフェノキシポリオキシエタノール例えば、TritonX-100、またはTritonシリーズの他の洗浄剤が0.001~0.1、特に0.005~0.02;ポリオキシエチレンエーテルラウレス9などが0.1~20、好ましくは0.1~10、特に0.1~1または約0.5である。別の実施形態では、医薬組成物は制御放出系にて送達される。例えば、該薬剤は、静脈内注入、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式を用いて投与され得る。別の実施形態では、ポリマー物質が、例えばマイクロスフィアまたはインプラントにおいて使用される。また、本発明には、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリンのような水溶性ポリマーの共有結合によって修飾された化合物も包含される。かかる修飾は、水溶液中での化合物の溶解性を増大させるもの、凝集を解消するもの、化合物の物理的および化学的安定性を増強するもの、ならびに化合物の反応原性を大きく低減させるものであり得る。別の実施形態では、かかるポリマー-化合物付加体abductの、非修飾化合物よりも少ない頻度または少ない用量での投与によって所望のインビボ生物学的活性が得られる。好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、塩化ナトリウムを含むL-ヒスチジンバッファーを用いて製剤される。添付の説明文および図面に関して本発明の種々の実施形態を記載したが、本発明は、詳述した該実施形態に限定されないこと、および当業者には、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲または精神から逸脱することなく種々の変更および修正が行われ得ることを理解されたい。以下の実施例により本発明を例示するが、本発明を限定するものではない。実施例実施例1:肺炎連鎖球菌莢膜多糖の調製肺炎球菌の培養方法は当該技術分野で周知である。例えば、Chase,1967,MethodsofImmunologyandImmunochemistry1:52を参照のこと。また、肺炎球菌莢膜多糖の調製方法も当該技術分野で周知である。例えば、欧州特許第0497524号を参照のこと。肺炎球菌サブタイプの分離菌はATCCから入手可能である。該細菌は、莢膜を有し、非運動性であり、グラム陽性であり、ランセット形状の双球菌これは、血液寒天上でα-溶血性であるとして特定される。サブタイプは、特異的抗血清を用いたQuelling反応に基づいて識別される。例えば、米国特許第5,847,112号を参照のこと。細胞バンクPCV-15に存在させる各肺炎連鎖球菌血清型に相当する細胞バンクを、MerckCultureCollectionRahway,NJから凍結バイアルにて入手した。接種解凍した種培養物を、予備滅菌した適切な増殖培地を入れた種醗酵槽に移した。種醗酵培養物は、温度とpHを制御した種醗酵槽内で培養した。種醗酵槽内の全容量を、予備滅菌した増殖培地を入れた醗酵生産槽に移した。醗酵生産醗酵生産は、当該プロセスの最終細胞増殖段階とした。温度、pHおよび撹拌速度を制御した。不活化醗酵プロセスは、不活化剤の添加によって終了させた。不活化後、バッチを不活化槽に移し、このとき、該槽は、制御された温度および撹拌下に保持した。精製遠心分離と濾過の組合せを用いて細胞残屑を除去した。バッチを限外濾過し、ダイアフィルトレーションした。次いで、バッチを溶媒での分別に供し、これによって不純物を除去し、多糖を回収した。実施例2:肺炎球菌多糖-CRM197コンジュゲートの調製活性化プロセス異なる血清型の糖質を、個々に精製CRM197担体タンパク質に、一般的なプロセスフローを用いてコンジュゲートさせる。このプロセスでは、糖質を溶解させ、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化させ、限外濾過によってバッファー交換する。次いで、精製CRM197に、この活性化糖質をコンジュゲートさせ、得られたコンジュゲートを限外濾過によって精製した後、膜濾過によって最終0.2μmにする。各工程におけるいくつかのプロセスパラメータpH、温度、濃度、および時間などは、この実施例に記載のように、血清型特異的である。工程1:溶解精製多糖を水に2~3mg/mLの濃度まで溶解させた。溶解多糖を、圧力を0~1000バールに予め設定した機械式ホモジナイザーに通した。サイズリダクション後、この糖質を濃縮し、滅菌水を用いて10kDaMWCO限外濾過器でダイアフィルトレーションした。透過液を廃棄し、保持液を、酢酸ナトリウムバッファー終濃度50mMでpH4.1に調整した。血清型4および5では、pH5.0の100mMの酢酸ナトリウムを使用した。血清型4では、溶液を50±2°Cでインキュベートした。20~24°Cまで冷却することにより加水分解を停止させた。工程2:過ヨウ素酸反応肺炎球菌の糖質の活性化に必要とされる過ヨウ素酸ナトリウムのモル当量を、総糖質含量を用いて決定した。充分な混合により、5、7Fおよび19Fでは温度を2~6°Cとした以外はすべての血清型で20~24°Cにて、酸化を3~20時間進行させた。工程3:限外濾過酸化させた糖質を濃縮し、pH6.4の10mMのリン酸カリウム血清型5ではpH4.3の10mMの酢酸ナトリウムを用いて10kDaMWCO限外濾過器でダイアフィルトレーションした。透過液を廃棄し、保持液を3Mリン酸カリウムバッファーの添加によってpH6.3~8.4に調整した。コンジュゲーションプロセス工程1:コンジュゲーション反応濃縮した糖質を、CRM197担体タンパク質と0.2~2対1の電荷比で混合した。ブレンドした糖質-CRM197混合物を0.2μmフィルターに通して濾過した。コンジュゲーション反応は、糖質1モルあたりナトリウムシアノボロヒドリドが1.8~2.0モルとなるようにナトリウムシアノボロヒドリド溶液を添加することにより開始させた。反応混合物を20~24°Cで48~120時間インキュベートした血清型3、5、6A、7F、19Aおよびl9Fでは8~12°C。工程2:ボロヒドリド反応コンジュゲーションインキュベーションの終了時、反応混合物を4~8°Cに、そして1.2M重炭酸ナトリウムバッファーまたは3Mリン酸カリウムバッファー血清型5以外のいずれかでpHを8~10に調整した。糖質1モルあたり水素化ホウ素ナトリウム0.6~1.0モル血清型5では、0モルのボロヒドリドを添加となるように水素化ホウ素ナトリウム溶液を添加することにより、コンジュゲーション反応を停止させた。反応混合物を45~60分間インキュベートした。工程3:限外濾過工程反応混合物を、最小限の20容量の100mMのリン酸カリウム、pH8.4バッファーを用いて、100kDaMWCO限外濾過器でダイアフィルトレーションした。100kDa限外濾過器での保持液を、最小限の20ダイア容量diavolumeの150mMの塩化ナトリウムを用いて300kDaMWCO限外濾過器で、20~24°Cにてダイアフィルトレーションした。透過液は廃棄した。工程4:滅菌濾過300kDaMWCOダイアフィルトレーションでの保持液を0.2μmフィルターに通して濾過し、放出試験、プロセス内対照、および製剤血清型19F以外に適切な容量でホウケイ酸ガラス製容器内に充填した。血清型19Fコンジュゲートは、0.2μmフィルターに通して保持槽に入れ、20~24°Cでインキュベートした。インキュベーション後、コンジュゲートを最小限の20ダイア容量の150mMの塩化ナトリウムを用いて300kDaMWCO限外濾過器で、20~24°Cにてダイアフィルトレーションした。透過液を廃棄し、保持液を0.2μmフィルターに通して濾過し、放出試験、プロセス内対照、および製剤に適切な容量でホウケイ酸ガラス製容器内に充填した。最終バルク濃縮物を2~8°Cで保存した。実施例3:15価の肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤化必要とされるバルク濃縮物の容量を、バッチ容量およびバルク糖質濃度に基づいて計算した。合わせた15種類のコンジュゲートを、塩化ナトリウムおよびL-ヒスチジンpH5.8含有バッファーの添加によって、目標吸着濃度までさらに希釈した。充分に混合した後、このブレンド物を0.2μm膜に通して滅菌濾過した。この滅菌製剤バルクを、バルクのリン酸アルミニウムとのブレンド中およびブレンド後に、静かに混合した。この製剤化ワクチンを2~8°Cで保存した。別のプロセスにおいて、合わせた15種類のコンジュゲートを、塩化ナトリウムおよびL-ヒスチジンpH5.8含有バッファーの添加によって目標濃度までさらに希釈した。ポリソルベート80を終濃度0.005まで添加し、希釈緩衝コンジュゲート混合物にした後、滅菌濾過した。滅菌濾過後、製剤化ワクチンを2~8°Cで保存した。表1は、PCV-15のアジュバント添加形態およびアジュバント無添加形態の最終組成を示す。実施例4:免疫原性試験多種類の肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤の免疫原性を乳児アカゲザルIRMおよびニュージーランド白ウサギNZWR動物モデルにおいて評価するための実験を設計した。乳児アカゲザルでの実験は、米国における肺炎球菌コンジュゲートワクチンに対する推奨スケジュールに充分適合するように設計し、年齢が取得時に2ヶ月、4ヶ月および6ヶ月の一連の乳児サルを使用した。したがって、乳児アカゲザルには、年齢が2~3ヶ月のときに免疫処置を開始し、2ヶ月間隔でワクチンを投与した。4回目の投与これも、米国の小児に対する推奨スケジュールの一部であるは行わなかった。成体ウサギNZWRは、多種類のワクチン製剤を評価するために使用した。NZWR試験は、2つのワクチン用量を用いて行い、加速2週間隔免疫化レジメにて行われた。免疫応答の前臨床評価のため、ヒト用量の全量をウサギに送達し、一方、乳児サルにはヒト用量の半分を与えた。乳児サルに対してヒト用量の半分を選択した理論的根拠は、乳児アカゲザルの単一の筋肉内部位に投与してもよい容量の制限によるものであった。血清型特異的IgG応答の評価電気化学的刺激を受けると発光するSULFO-TAGTM標識を利用したメソスケールディスカバリーMSD技術を用いるヒトアッセイに基づいた、ウサギおよびアカゲザル血清での使用のための多重電気化学的発光ECLアッセイを開発した。Marcheseら,2009,ClinVaccineImmunol16:387-96参照。専用のECLプレートリーダーを使用し、プレート付属電極に電流を流して一連の電気誘導性反応をもたらし、発光シグナルを生じさせる。開発および確認に使用した多スポット構成は、96ウェルプレート形式で10スポット/ウェルのものとし、各ウェルに5ngの肺炎球菌Pn多糖Ps/スポットをコートした。2プレート形式は、交差反応性の多糖すなわち、6Aと6B、および19Aと19Fが別々のプレート内で試験されることを確実にするために使用した。プレートフォーマット1には、血清型3、4、6B、9V、14、18C、19F、および23Fを含め、一方、プレートフォーマット2には、血清型1、5、6A、7F、19A、22Fおよび33Fを含めた。また、各ウェルに、2つのウシ血清アルブミンBSAスポットも含め、これは、アッセイのバックグラウンド反応性すなわち、PnPsの非存在下での血清および標識二次抗体に関連する応答を評価するために使用した。アッセイ標準89SF-2、対照、および試験血清を、0.05のTween20、1のBSA、5μg/mlのC-多糖CPs、10μg/mlの血清型25多糖PnPs25および10μg/mlの血清型72多糖PnPs72を含有するリン酸緩衝生理食塩水PBS中で適切なレベルに希釈し、4°C2~8°Cで一晩または周囲温度で45分間インキュベートした。乳児サル試料を試験する場合はヒト抗体試薬および標準を使用し、一方、ウサギ血清試料を試験する場合では、SULFO-TAGTM標識抗ウサギIgGを二次抗体として使用した。各抗原コートプレートを、ブロック剤を伴って振盪機プラットフォームで周囲温度にて1時間インキュベートした。プレートを0.05PBS-Tで洗浄し、予備吸着させて希釈した25μL/ウェルの試験血清を添加し、振盪機プラットフォームで周囲温度にて45分間インキュベートした。プレートを0.05PBS-Tで洗浄し、次いで、MSDSULFO-TAGTM標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体アカゲザル血清の場合および標識ヤギ抗ウサギIgG二次抗体ウサギ血清の場合を各ウェルに添加し、振盪機プラットフォームで周囲温度にて1時間インキュベートした。プレートを0.05PBS-Tで洗浄し、水で1:4に希釈した150μLのMSDReadBuffer-T4×界面活性剤を含むを各ウェルに添加した。MSDSectorImagerModelNo.2400または6000を用いてプレートの読み値を得た。ウサギ試験については、結果を力価の幾何平均GMTまたはGMTの比で示す。乳児アカゲザル試験については、結果を、ヒト参照標準89SF-2に帰属させた血清型特異的IgG濃度を用いた標準曲線からの濃度の読み値の幾何平均で表示した。機能性オプソニン作用性応答の評価乳児アカゲザル試験2の試料を4重MOPAアッセイMOPA-4において試験した。Burtonら,2006,ClinVaccineImmunol13:1004-9参照。このアッセイでは、アッセイの第一部分化HL-60細胞内におけるオプソニン作用および取込みが一度に4種類までの血清型を用いて行われ得るように、4種類の抗生物質のうち1種類に耐性であるように選択した細菌株を使用する。細菌死滅の読出しは、各特異的血清型の死滅力価を調べるため、対応する株が耐性である4種類の各抗生物質の存在下でパラレルで行う。結果を、50の死滅が観察された希釈度の逆数で表示する内挿後。前臨床試験のための統計学的方法論どちらの動物モデルも、標本サイズに関して制限を有する。一般に、試験群あたり8匹の乳児サルまたは8匹のウサギを使用した。8匹の動物/群では、処置群間の力価の幾何平均の臨界差の倍数が2.5倍を意義のある応答閾値とみなした。2.5倍の差は、各血清型について、処置群における自然対数変換力価の標準偏差はln2という仮定に基づいて決定した。はi番目の処置群におけるIn変換力価の平均、niはi番目の処置群の動物の数、σi2はi番目の処置群の動物間のIn変換力価の既知分散を表すとし、すべてのiについて、ni=8およびσi2=ln22と設定すると、を解くことにより2.5の値が得られ、このとき、であり、Z0.995は、標準的な累積正規分布の逆関数を表し、確率は0.995すなわち、Z0.995=2.576である。計算値2.44は、丸めを行って2.5にしていることに注意のこと2.5では、簡便な0.4という逆数が得られるためでもある。PCV-15に対する乳児アカゲザルIRMの血清型特異的IgG応答免疫原性のパイロット試験IRM-1を行い、乳児アカゲザルIRMが、Pn多糖CRM197コンジュゲートワクチンを評価するための良好なモデルとなり得るかどうかを調べた。実験の主な目的は、IRMヒト乳児と類似が、遊離Pn多糖には非応答性であるが、コンジュゲートワクチンには良好に応答し得るかどうかを調べることであった。5匹のIRMの群に、Pn多糖であるPrevnar登録商標またはPCV-15のいずれかの注射を、年齢が2~3ヶ月のときに開始した。3つの用量のワクチンを2ヶ月間隔で筋肉内IM投与し、血清型特異的IgG応答を、初回投与前ならびに2回目の投与の1ヶ月後および3回目の投与の1ヶ月後にマルチアレイ電気化学発光ECLアッセイを用いて測定したデータ表示せず。その結果により、IRMは、遊離Pn多糖に対して応答するとしても不充分であるが、コンジュゲートワクチンには非常に良好に応答することが示された。結果は、乳児アカゲザルにおけるPn多糖に対するIgG応答の誘発が担体タンパク質に対する多糖のコンジュゲーションに依存性であり、したがって、古典的T細胞依存性応答であることを示していた。したがって、IRMモデルは、PCV-15製剤の評価に適していると判定した。遊離非コンジュゲート多糖および非コンジュゲートCRM197を最小限にするバルクコンジュゲーションプロセスを使用したPCV-15製剤を評価するため、第2の試験IRM-2を行った。図1は、Prevnar登録商標4、6B、9V、14、18C、19F、23Fに含まれた7種類の血清型についての、2回目の投与後PD-2および3回目の投与後PD-3のPrevnar登録商標対比に対するPCV-15のIgG応答を示す。PCV-15に対するPD-2応答は、Prevnar登録商標の対応する応答と同等であるか、または若干低かったが、PCV-15に対するPD-3応答は、ほぼすべての血清型で、Prevnar登録商標によって誘起されるものよりもいくぶん高かった。PCV-15中の非Prevnar血清型に対するIRM応答を図2に示す。PCV-15中の非Prevnar血清型に対するPD-2応答はすべて、ベースラインワクチン接種前IgG濃度よりも少なくとも10倍高く、PD-3では力価が上昇し続けた。結果は、PCV-15およびPrevnar登録商標に対する抗体応答が、7種類の共通の血清型では同等であったこと、ならびに追加した8種類の血清型では、PCV-15に対するワクチン接種後の応答がベースラインよりも>10倍高かったことを示す。PCV-15に対するIRMの機能性オプソニン作用性免疫応答乳児サルにおいてPCV-15によって機能性抗体応答が誘発されるかどうかを調べるため、オプソニン作用性死滅OPAアッセイを、IRM-2での血清において行った。ワクチン接種前、PD-2、およびPD-3でのPCV-15およびPrevnar登録商標に対する応答を表2に示す。示した結果は、二連でアッセイした各時間点における7~8匹のサル由来の血清試料でのGMTである。また、PD-3の時間点での応答動物すなわち、OPA力価が≧8のものの割合も示す。PCV-15により、1型および33F型以外のすべての血清型で高いPD-2GMTが誘発された。3回のワクチン投与後、PCV-15により、各血清型に対して高いOPAGMT、およびワクチンに含まれた全15種類の血清型で100のOPA応答率が誘導された。また、注目すべきことに、PCV-15により、ワクチン中に入れていない血清型6Cに対して良好な交差反応性のOPA応答も誘発された。Prevnar登録商標では、ワクチンに含まれたすべての血清型で高いOPA力価および100応答率が誘導されたが、サル画分中の血清型6Aおよび6Cに対して誘発された交差反応性の応答は弱いものにすぎなかった。ニュージーランド白ウサギでのPCV-15製剤の評価PCV-15製剤を、成体ニュージーランド白ウサギNZWRでの4つの試験において、圧縮免疫処置レジメを用いて評価し、ここで、このレジメでは、ウサギに、ヒト用量の全量のワクチンを0日目と14日目に与え、解析のために血清を0、14および28日目に収集した。試験はすべて、Prevnar登録商標を比較の基準とし、表3NZWR実験1~4にまとめる。表3には、両ワクチンに共通する血清型について、MerckPCV-15に対するIgG応答の幾何平均をPrevnar登録商標に対する比で示した、ニュージーランド白ウサギの2回目の投与後の応答の結果を示す。血清型特異的IgG応答は、一般的に、Prevnar登録商標の対応する応答の2.5倍以内であった。例外は血清型23Fであり、これは、4つの実験のうち2つで、Prevnar登録商標に対するものよりも>2.5倍低かった。0日目から28日目まで2回目の投与後,PD-2の非Prevnar登録商標血清型に対する抗体レベルの上昇倍数を表4にまとめる。NZWRにおける免疫原性に対する多糖コンジュゲートワクチン用量の効果また、増大用量倍用量,2×の多糖コンジュゲートの免疫原性も、PCV-15に含まれるすべての血清型について、計画したヒト用量1×のワクチンと比較して評価した。2×多糖コンジュゲート製剤では、ほとんどのコンジュゲートがアルミニウムアジュバントに結合され得ることを確実にするため、APA濃度を1.5×に増大した。表5に示されるように、ワクチン中の多糖-コンジュゲートの量の増加に有意な有益性はないようであった。すべての血清型間での差は2倍以内であり、比率の倍数1×PCV-15/2×PCV-151.5×APAの幾何平均は1.1であった。NZWRにおけるPCV-15の免疫原性に対するアルミニウムアジュバントの効果抗体応答に対するアルミニウムアジュバントAPAの影響を一例のウサギ試験において評価した。計画したヒト用量のAPAPCV-151×APAを配合した、2倍の計画したヒト用量のAPAPCV-152×APAを配合し、そしてアルミニウムアジュバントは全くなしのPCV-150×APAPCV-15を試験した。また、Prevnar登録商標群も試験に含めた。PD-2の結果により、APAの濃度の倍加は、PCV-15に対する血清型特異的IgG応答に対してほとんど影響がないことが示された。力価の差の倍数1×APA/2×APAは0.6血清型6B~2.3血清型22Fの範囲であり、15種類の血清型間の比率の倍数の幾何平均は1.1であった。アルミニウムアジュバントがない場合では、抗体力価は、多くの血清型で、1×APAを含むPCV-15と比べて低いようであった。力価の差の倍数1×/0×は0.5血清型5~2.9血清型23Fの範囲であり、15種類の血清型間の比率の倍数の幾何平均は1.4であった。全体的に、アルミニウムアジュバントのレベルを倍加することは純然たる利点にはならないようであり、この動物モデルにおいてアジュバントを除外すること表6は不都合なようである。PD-2の結果により、リン酸アルミニウムアジュバントAPAを含まない群の多くの血清型で、APA含有PCV-15と比べて抗体力価の低減がみとめられ図3、これは、ウサギにおける最適なPCV-15の免疫原性にはアルミニウムアジュバントを含めることが要件であることを示すことが示された。また、倍加量のAPAをワクチンに含めた場合、有益性は見られなかったデータ表示せず。考察および結論前臨床データは、PCV-15製剤APAを配合が2つの種乳児アカゲザルおよびウサギにおいて高度に免疫原性であることを示す。PCV-15に対する血清型特異的応答は、両ワクチンに共通する7種類の血清型で、Prevnar登録商標によって誘起されるものと同等であった。PCV-15の新たな8種類の血清型では、乳児アカゲザルとウサギの両方において強固な応答が誘起され、両方の種において2回のワクチン投与後、すべての血清型でIgG応答≧10倍上昇した。限界用量範囲での実験で、多糖コンジュゲートの量の2倍増により抗体応答の増大はもたらされないことが示された。同様に、アルミニウムアジュバント濃度の2倍増でも、PCV-15の免疫原性プロフィールは有意に改善されないようであった。しかしながら、アジュバントを除外すると一部の血清型に対して応答の低下がもたらされ、これは、ヒトにおいてアジュバントが必要である可能性を示唆する。ワクチン中の全15種類の血清型ならびにPCV-15の成分でない血清型6Cに対してPCV-15による機能性OPA抗体応答が誘起された。"