"明細書に記載の発明。発明の開示本発明は、改変ノダウイルスRNA1分子を提供し、この改変ノダウイルスRNA1分子は、このRNA1のレプリカーゼORFの下流に異種挿入を含む。この挿入は、好ましくは、上記RNA1のレプリカーゼORFおよびB2ORFの下流である。RNA1分子本発明は、ノダウイルスのRNA1分子に基づく。RNA1は、ノダウイルスゲノムを特異的に複製するRNAレプリカーゼをコードし、そしていくつかのノダウイルス例えば、フロックハウスウイルス登録番号X77156、ゴキブリウイルス登録番号X02396およびK02560、シマアジ神経壊死ウイルスAB025018、パリアコトpariacotoウイルスAF171942、ノダムラウイルスAF174533、ゴキブリウイルスNC_001411およびオヒョウ神経壊死ウイルスAJ401165由来の配列が利用可能である。本発明に関して、ノダウイルスRNA1配列は、天然で見出される配列、ならびにそれら自体の遺伝子を特異的に増幅する能力を保持するレプリカーゼをコードするそのフラグメント、改変体、および変異体を含む。本発明のRNA1分子は、標準的な分子生物学技術を用いることによりノダウイルスから獲得されるRNA1の改変により調製され得るか、あるいは酵素的および/または化学的手段により合成的に組み立てられ得ることが理解される。RNA1分子内のORFノダウイルスの利用可能なRNA1配列上記を参照のことは、レプリカーゼまたはAおよびB2ORFの位置を示す。本発明の分子における挿入は、レプリカーゼORFの下流であり、好ましくはB2ORFの下流でもある。FHVにおいて、RNA1は、3107ヌクレオチド長である。レプリカーゼORFは、ヌクレオチド40~3033によりコードされ、B2ORFは、ヌクレオチド2738~3055によりコードされる。従って、本発明により、FHVのための異種挿入は、ヌクレオチド3033と3107との間、好ましくはヌクレオチド3055と3107との間に置かれる。好ましくは、異種挿入は、レプリカーゼORFの5ヌクレオチドよりも下流すなわち、FHVにおいては、ヌクレオチド3038の下流、例えば、10、15、20、25、30、35、40、45、または50ntよりも下流にある。より好ましくは、B2ORFの5ヌクレオチドよりも下流すなわち、FHVにおいては、ヌクレオチド3060の下流、例えば、このORFの10、15、20、25、30、35、40、45、または50ntよりも下流にある。同様に、好ましくは異種挿入は、RNA1の3’末端の5ヌクレオチドよりも上流すなわち、FHVにおいては、ヌクレオチド3102の上流、例えば、この3’末端の10、15、20、25、30、35、40、45、または50ntよりも上流にある。RNA1のネイティブの3’末端配列の長さを保持することは、RNA1が、自己複製する能力を保持することの保証を手助けするBall1995J.Virol69:720-72。異種挿入が、レプリカーゼまたはB2ORFの最後のコドンの3ヌクレオチド内すなわち、ヌクレオチド3034~3036または3056~3058の間に存在する場合、挿入の5’末端が、ORFのための終止コドンすなわち、レプリカーゼのためにはヌクレオチド3034~3036、またはB2のためには3056~3058における終止コドンを保持することが好ましい。異種挿入本発明の改変RNA1は、異種挿入を保有する。この挿入は、好ましくはそれ自体の開始コドンおよび終止コドンを有する1つ以上のタンパク質コード領域を含む。挿入は、RNA1に対してネイティブな1つ以上のORFの下流に存在する場合、その翻訳において補助するために、異種挿入の5’部分はまた、cap非依存性の翻訳を指向する配列を含み得る。従って、代表的に、異種配列は、タンパク質コード領域に機能的に連結された内部リボソーム侵入部位IRESを含む。C型肝炎ウイルスまたは脳心筋炎ウイルスのIRES、もしくはピコルナウイルス、口蹄疫ウイルス、ECHOウイルス11’、古典的な豚コレラウイルス、c-myc癌原遺伝子など由来のIRESのような任意の適切なIRESが、用いられ得る例えば、Martinez-Salas1999Curr.Opin.Biotechnol.10:458-464。異種挿入は、コードされたレプリカーゼを介して自己複製するRNA1の能力を破壊しない。従って、改変RNA1は、発現のための目的の遺伝子を送達し得、かつそれ自体の複製を指向し得る。改変RNA1のパッケージング改変RNA1を細胞に送達するために、例えば、ウイルス様粒子VLPまたは偽ビリオンpseudovirion中にそれをパッケージングすることが好ましい。RNA2必要に応じて改変されたRNA2から発現されるタンパク質を含むノダウイルス粒子が、用いられ得る。このアプローチが用いられる場合、RNA2は、好ましくは、パッケージされる改変RNA1と同一のノダウイルス由来である。しかし、ノダウイルスは昆虫細胞に自生しているので、哺乳動物細胞への送達が所望される場合、異なるパッケージを用いることが好ましい。好ましいパッケージは、パピローマウイルスVLP例えば、TouzeCoursaget1998Nucl.Acid.Res.26:1317-1323;Kawanaetal.1998J.Virol.72:10298-10300;Mulleretal.1997Virol.234:93-111;Zhaoetal.1998Virol.243:482-491;Unckelletal.1997J.Virol.71:2934-2939;WO97/46693;WO98/02548などであり、これは哺乳動物細胞上のレセプターに結合し得る。HPVVLPを用いることは、様々な利点を提供する。第1に、HPVVLPは広範な細胞型に結合し、高レベルの結合が上皮細胞および間葉細胞で観察され、そして低いレベルの抗VLP抗体のみがヒトにおいて観察されているLeCannetal.1995JClin.Microbiol.33:1380-1382。第2に、異なるHPV型のL1タンパク質が同様に発現され得、VLPの使用により誘導される免疫は大部分は型特異的であるので、予め存在する抗HPV抗体の存在は回避され得、そして複数の免疫化が起こり得る。第3に、ノダウイルスRNA1は小さいので、HPVVLPに伴う公知の制限、すなわちキャプシドに包まれる核酸に対する7~8kbpの上限を克服し得る。従って、ノダウイルスRNAは、他の核酸よりも重要な利点を提供する。パピローマウイルスは、好ましくはHPV-6のようなヒトパピローマウイルスである。VLPキャプシドは、タンパク質L1およびL2を含み得るか、またはL1のみから生成され得る。改変RNA1のパッケージングを容易にするために、パッケージを形成するタンパク質例えば、VLPにおけるキャプシドタンパク質は、改変RNA1と特異的に相互作用し得る配列または構造を含むように改変され得る。DNAプラスミドを用いて遭遇する問題と比較すると、RNA/タンパク質相互作用のインビボでの特異性は、ノダウイルスRNAを用いることのさらなる利点である。特に有用なこの型のパッケージング系は、免疫不全ウイルス例えば、HIV、BIVなどのtat/TAR相互作用に依存する。この系において、パッケージは、改変RNA1においてTARモチーフ例えば、最小TAR配列例えば、最小59マーまたはWO92/02228に記載されるモチーフと特異的に相互作用するtatタンパク質由来のモチーフ例えば、最小tat配列例えば、HIVtatのアミノ酸48~59;Derseetal.1991J.Virol65:7012-15;ChenFrankel1994Biochemistry33:2708-2715;Puglisietal.1995Science270:1200-1202もまた参照のことを含む。従って、本発明の改変RNA1は、TARモチーフをさらに含む。これは、異種挿入内の遺伝子の上流または下流に存在し得るが、好ましくは下流に存在し得る。代替として、TARモチーフは、レプリカーゼORFの上流すなわち、FHVにおいてヌクレオチド40の前に配置され得る。パピローマウイルスに基づくパッケージング系において、tat配列は、L1タンパク質に、好ましくはC末端にかまたはその付近に挿入され得る。この領域はキャプシド形成に必須ではないがPaintsiletal.1996Virology223:238-244、この配列は、VLPの組み立てる能力を破壊するには及ばないMulleretal.1997Virology234:93-111。tatおよびTARの相互作用は、パッケージ中での改変RNA1のパッケージングを生じる。BIV由来のtat/TARの相互作用の使用は、細胞因子を必要としない強力な相互作用なので、この相互作用の使用が好ましい。VLP内への核酸のパッケージングのためのtat/TARの相互作用の使用は、本発明の改変RNA1に限定されないことが理解される。発明のさらなる局面本発明の改変RNA1は、代表的に、正のセンス方向であり、そして一本鎖である。本発明はまた、以下を提供する:i本発明のRNA1に相補的な一本鎖核酸;iiiに相補的な一本鎖核酸;iii本発明のRNA1に相補的な配列を含む一本鎖核酸;iviに相補的な核酸を含む一本鎖核酸;およびv鎖の1つがi、ii、iii、またはivである二本鎖核酸。用語核酸は、RNA、DNA、ならびにPNAペプチド核酸および骨格改変DNAbackbone-modifiedDNAまたはRNA例えば、ホスホロチオエートなどのようなアナログを含む。核酸は、インビトロかまたはインビボでRNAポリメラーゼにより転写されて、本発明の改変RNA1を生成し得ることが理解される。本発明はまた、本発明の核酸を含む例えば、改変RNA1を含むVLPを提供する。このVLPは、好ましくはパピローマウイルスVLPである。本発明はまた、免疫不全ウイルスのtatタンパク質由来のモチーフを含むよう改変されたパピローマウイスルL1タンパク質を提供する。本発明はまた、本発明の改変RNA1分子を生成するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程を包含する:aノダウイルスRNA1配列を含むかまたはコードする核酸を獲得する方法;およびb上記RNA1配列中のレプリカーゼORFおよびB2ORFの下流に異種配列を挿入する工程。FHVが用いられる場合、その複製が28°C未満で最大活性を示すことは、注目されるべきである。本発明はまた、本発明のVLPを生成するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程を包含する:本発明による核酸を用いて細胞をトランスフェクトする工程;VLPキャプシドタンパク質必要に応じて改変RNA1に特異的なモチーフを含むよう改変されたタンパク質をコードする核酸を用いて細胞をトランスフェクトする工程;およびこの細胞からVLPを精製する工程。このプロセスは、好ましくは酵母において実施される。VLPコード核酸およびRNA1コード核酸を同一の酵母に導入するために、一倍体株を接合することが可能である例えば、キャプシドタンパク質を発現する一倍体株が、RNA1を発現する反対の接合型の一倍体株と接合され得る。本発明の核酸特に改変されたRNA1およびVLPはまた、医薬として使用するために提供される。それらは特に、例えば、遺伝子療法における遺伝子送達に有用である。本発明はまた、核酸配列を細胞に送達するためのプロセスを提供する。このプロセスは、本発明のVLPを上記細胞に導入する工程を包含する。このプロセスは、インビトロ培養物中の細胞またはインビボで実施され得る。ノダウイルスノダウイルスは、アルファノダウイルスとベータノダウイルスに分けられ、そしてノダムラウイルス、ゴキブリウイルス、Boolarraウイルス、フロックハウスウイルスFHV、マイマイガウイスル、マナワトゥウイルス、太西洋オヒョウウイルス、トラフグ神経壊死ウイルス、マツカワ神経壊死ウイルス、日本ヒラメ神経壊死ウイルス、Dicentrachuslabrax脳炎ウイルス、パリアコトウイルス、アロワナDragon神経壊死ウイルス、オヒョウ神経壊死ウイルス、Malabaricus神経壊死ウイルス、Redspottedgrouper神経壊死ウイルス、Umbrinacirrosaノダウイルス、およびシマアジ神経壊死ウイスルを含む。これらのウイルスのいずれか由来のRNA1分子が、本発明に従い用いられ得る。しかし、分子レベルで最も研究されているノダウイルスであるという理由で、FHVおよびノダムラウイルスが好ましい。ノダウイルスのさらなる詳細は、GarzonCharpentierAtlasofinvertebratevirusesAdamsBonami編の351-370頁、CRCpress1992およびHendryVirusesofinvertebratesKurstak編の227-276頁、MarcelDeker1991に見出され得る。本発明は、例えば以下の項目を提供する。項目1RNA1のレプリカーゼORFの下流に異種挿入を含む、改変ノダウイルスRNA1分子。項目2前記異種挿入がまた、前記RNA1のB2ORFの下流でもある、項目1に記載のRNA1分子。項目3前記異種挿入が、前記レプリカーゼORFおよびB2ORFの5ヌクレオチドよりも下流である、項目2に記載のRNA1分子。項目4前記異種挿入が、RNA1の3’末端の5ヌクレオチドよりも上流である、項目1~3のいずれかに記載のRNA1分子。項目5前記異種挿入が、タンパク質コード領域を含む、項目1~4のいずれかに記載のRNA1分子。項目6前記異種挿入が前記タンパク質コード領域の上流にIRESを含む、項目5に記載のRNA1分子。項目7前記RNA1がタンパク質配列と特異的に相互作用し得る配列を含む、項目1~6のいずれかに記載のRNA1分子。項目8前記タンパク質配列と特異的に相互作用し得る配列がTAR配列である、項目7に記載のRNA1分子。項目9前記TAR配列が前記異種挿入内に存在する、項目8に記載のRNA1分子。項目10項目1~9のいずれかに記載のRNA1分子を含む、VLP。項目11前記VLPがパピローマウイルスVLPである、項目10に記載のVLP。項目12前記VLPL1タンパク質がtat配列を含み、キャプシドに包まれたRNA1分子が項目6~8のいずれか1項に記載のRNA1分子である、項目11に記載のVLP。項目13tatおよびTARがHIVまたはBIV由来である、項目12に記載のVLP。項目14項目1~9のいずれか1項に記載のRNA1に相補的である、一本鎖核酸。項目15項目14に記載の核酸に相補的である、一本鎖核酸。項目16項目1~9のいずれか1項に記載のRNA1に相補的である配列を含む、一本鎖核酸。項目17二本鎖核酸であって、該鎖のうちの1つが項目14~16のいずれか1項に記載の一本鎖核酸である、二本鎖核酸。項目18項目1~9のいずれか1項に記載のRNA1を産生するためのプロセスであって、aノダウイルスRNA1配列を含むかまたはこれをコードする核酸を得る工程;およびb該RNA1配列内のレプリカーゼORFの下流に異種配列を挿入する工程を包含する、プロセス。項目19項目18に記載のプロセスであって、工程bが、前記RNA1配列内の前記レプリカーゼおよびB2ORFの下流に異種配列を挿入する工程を包含する、プロセス。項目20項目10~13のいずれか1項に記載のVLPを産生するためのプロセスであって、該プロセスは、細胞を項目14~17のいずれか1項に記載の核酸でトランスフェクトする工程;細胞をVLPキャプシドタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトする工程であって、該タンパク質は、必要に応じて改変されて改変RNA1に特異的なモチーフを含む、工程;ならびにVLPを該細胞から精製する工程を包含する、プロセス。項目21目的の核酸配列を細胞に送達するためのプロセスであって、該プロセスは、項目10~13のいずれか1項に記載のVLPを該細胞に導入する工程を包含し、該目的の核酸配列は、該VLP中に含まれる改変RNA1分子である、プロセス。項目22医薬としての使用のための、項目1~9のいずれか1項に記載のRNA1。項目23医薬としての使用のための、項目10~13のいずれか1項に記載のVLP。項目24項目10~13のいずれか1項に記載のVLPを前記細胞に導入する工程を包含する、核酸配列を細胞に送達するためのプロセス。項目25インビトロで実行される、項目23に記載のプロセス。項目26インビボで実行される、項目23に記載のプロセス。項目27VLP内に核酸をパッケージングするための、tat/TAR相互作用の使用。項目28ノダウイルス由来のRNA1配列を含むRNAであって、該RNA1配列がそのレプリカーゼORFの下流に異種挿入を含むという点で特徴的である、RNA。項目29前記異種挿入がB2ORFの下流である、項目28に記載のRNA。発明を実施するための様式FHVのRNA1FHVゲノム由来のRNA1の配列は、GenBankにおいて登録番号X77156として与えられる。このRNA1に対応する二本鎖cDNA3107bpが、図1に示される。このcDNAは、BallJ.Virol.199569:720-727により記載されるプラスミドpFHV[1,0]中に存在し、引き続く実験に用いられた。pFHV[1,0]はまた、以下を含む:RNA1配列から上流の18bpのT7プロモーターこのプロモーターとRNA15’末端との間に単一のGが存在する;RNA1配列の下流に位置するデルタ肝炎ウイルスリボザイム89bpその結果、リボザイムの開裂は、RNA1のネイティブな3’末端を生じる;およびリボザイム活性を補助すると考えられる136bpのT7転写終結因子。これは、図2に示される。クローニング目的のためのRNA1の改変クローニングを容易にするために、RNA1に対して種々の変更がなされた。BssHII部位の除去図3に示されるように、ネイティブのRNA1配列は、2つの近接するBssHII制限部位ヌクレオチド1270および1278を含む。これらの中の1つを、レプリカーゼアミノ酸配列に影響を与えない静的な変異を導入することにより除去した。RNA1のSphI/BsshIIフラグメントを、プライマーRI900-fおよびRI1272M-r表Iを用いて生成されたPCRフラグメントにより置換した。第1のプライマーは、クローニングに必要なSphI部位を含んだ。一方、逆方向プライマーの配列は、1271位におけるGからAへの置換を含み、それによって、レプリカーゼORFを変更することなく、2つのBssHII制限部位の1つを除去した図4。得られたプラスミドをpFHV-BsshIIΔを呼んだ図5。付加的な部位の導入異種配列をRNA1に挿入するために、以下の2つの付加的な制限部位を導入した:3062位にSacII部位、3072位にNotI部位レプリカーゼおよびB2ORFの翻訳終止コドンから下流。さらに、唯一のSalI部位を、pFHV[0,1]のT7転写終結因子よりも下流ヌクレオチド3337に挿入した。これらの部位を、以下のようにPCR増幅により導入した図6:-プライマーApaI-fおよびDRS-r表Iは、ApaI部位2349位と3101位との間のRNA1のフラグメントを増幅した。SacIIおよびNotI制限部位の導入を、DRS-rプライマー中に2つの配列を導入することにより達成した図6a。-プライマーDRS-fDRS-rの相補鎖およびRI-KpnI-rは、ヌクレオチド3039からKpnI部位3368位までの領域にわたるフラグメントを増幅した図6a。2つのDNAフラグメントの融合物を、等量の2つの増幅産物を変性および混合することにより獲得した。これらは、2つのPCRフラグメント中に存在する62bpの相補的領域によりアニールした。dNTPのみの存在下でのTaqポリメラーゼを用いた伸長サイクルおよびTaqならびにプライマーApaI-fおよびRI-KpnI-rの存在下での増幅サイクルの後、平滑末端のDNA融合フラグメントを獲得し図6b、次いで、このフラグメントをpCR2.1ベクターにクローン化してDNA配列を調べた。ApaI-KpnIフラグメントをpCR2.1から切り取り、pFHV[1,0]およびpFHV-BsshIIΔの異種フラグメントを置換するために用いて、pFHV-Mut示されていないと名付けられたプラスミドおよびpFHV-MutΔ図6cと名付けられたプラスミドを獲得した。これらのプラスミドは、唯一のBsshII部位および新規のSacII、NotI、およびSalI制限部位を有するRNA1cDNA全体を含んだ。酵母ベクターへのRNA1のクローニング酵母においてRNA1およびその改変バージョンを発現させるために、cDNAを酵母ベクターの、酵母特異的プロモーターの下流にクローン化した。このベクターは、レプリカーゼをコードし、そしてリボザイム開裂後に自己複製に適合する5’および3’末端を有するRNA1分子の転写を指向する。全体的なアプローチは、図7に示される。pBluescriptSKにおけるADH2/GAPのクローニング発現に用いられたプロモーターは、ADH2/GAPプロモーターであった。このプロモーターの供給源として、酵母発現ベクターpBS24.1-6L1図8;WO00/09699もまた参照のことを用いた。DNAフラグメントADH2/GAP-6L1を、SacIおよびSalIによる消化により、プラスミドpBS24.1-6L1から抽出し、そして同一の酵素で消化したpBluescript-SKStratagene中にクローン化した。得られた構築物を、pSK-ADH-6L1と名付けた。酵母ADH2/GAPプロモーターのPCR増幅酵母プロモーターの一部を、SacI部位において酵母プロモーターにアニールするプライマーADH/Sac表I、および付加的にRNA1由来の13ヌクレオチドを含む6L1遺伝子との融合物においてプロモーターにアニールする逆方向プライマーP-R1revを用いてpSK-ADH-6L1上で実施したPCRにより増幅した図7a。RNA1/SphのPCR増幅pFHV[1,0]由来のRNAcDNAの一部を、RNA1の5’末端1位置でアニールするプライマーRNA1-f、およびヌクレオチド1021の唯一のSphI制限部位でアニールする逆方向プライマーRNA1-rを用いて増幅した図7b。ADH2-RNA1/Sph融合物この融合物を、図7aおよびbの等量の2つの増幅産物を変性および混合し、これによって両方のPCRフラグメントにおいて存在する13bpの相補的領域のアニーリングを助けることにより獲得した図7c。dNTPのみの存在下でのTaqを用いた伸長サイクルおよびTaq、ならびに、プライマーADH/SACおよびRNA1-rの存在下での増幅サイクルの後、融合平滑末端のDNAフラグメントを獲得した。pCR2.1におけるADH2-RNA1/Sphのクローニングこの平滑末端のPCR産物をpCR2.1Invitrogen中にクローン化し、プラスミドpCR-ADH2/RNA1を得た図7d。そのDNA配列を調べて、そして期待されるプロモーター/RNA1融合配列TAAATCTA/GTTTCGAAAを確認したが、いくつかの変異が、増幅産物の他の領域に存在した。しかし、正確な増幅配列を有する唯一のクローンが、さらなる工程に必要なSphI部位を除去された変異を有した図7d。pSK-ADH2-6L1におけるADH2/RNA1融合産物のクローニングこの問題を克服するために、この融合産物をSacI-SpeフラグメントとしてpCR2.1から切り取り、同一の制限酵素で消化されたpSK-ADH2-6L1中にクローン化し図7e、それによって最終産物pSK-ADH2-RNA1/SpeIを獲得した図7f。酵母ベクターへの改変RNA1の導入pFHV-BsshIIΔ図5由来のEagI-KpnIフラグメントを、pSK-ADH2-RNA1/SpeI図7fの対応するフラグメントと置き換えて挿入し、pSK-ADH2-RNA1-BsshIIΔと名付けられた構築物を作製した。この構築物におけるBsshII-KpnIフラグメントを、pFHV-MutΔ図6c由来の対応するフラグメントで置換し、pSK-ADH2-RNA1-MutΔと名付けられたプラスミドを生成した図9。異種配列の挿入異種挿入をRNA1配列の内部に作製した。緑色蛍光タンパク質GFPを発現するための遺伝子Chalfieetal.1994Science263:802-806を、HIV由来のTAR配列と共に、レプリカーゼおよびB2のオープンリーディングフレームの下流に挿入した。異種挿入物を作製するために、開始点は、BsrgIおよびNotIで消化されたプラスミドpEGFP-1Clontechであった。BsrgI5’およびNotI3’粘着末端を有し、かつ、HIV-1TAR配列HIV-1ゲノムのヌクレオチド454~520、登録番号K03455を含むdsDNA配列を、2つの相補的なオリゴヌクレオチドTAR-fおよびTAR-rをアニールさせることにより獲得し、そしてこれを消化されたpEGFP-1中に挿入して、pEGFP-1/TAR図10を形成した。TARオリゴはEGFPORFを保持し、そしてこれはまた、BsrgI部位からすぐ下流その直後に新規BstEIIおよびNheI制限部位が続くに翻訳終止コドンを含んだ。TAR配列はまた、首尾よくレプリカーゼORFの上流に挿入された。HIV-1TAR配列の前にGFPコード配列を含む、pEGFP-1/TAR由来のSacII-NotIフラグメントを同一の制限酵素で消化したpFHV-Mutにクローン化し、pFHV-EGFP-1/TARと名付けられたプラスミドを獲得した図11。このプラスミドのSphI/SacIIフラグメントを、pFHV-MutΔ由来の対応するフラグメントで置換し図6c、唯一のBsshII制限部位を有するpFHV-EGFP-1/TARΔ図12を生成した。異種挿入物の発現の促進ポリシストロン性RNAは、目的の2つの遺伝子間への内部リボソーム侵入部位IRESの挿入によって哺乳動物において翻訳され得Parksら1986J.Virol.60:376-384、これによって、第2の下流遺伝子のcap非依存性翻訳を可能にする。従って、異種挿入からの発現を促進するために、脳心筋炎ウイルス由来のIRESを、EGFP-1遺伝子の前に挿入した。このIRESは、代表的に、哺乳動物細胞においてのみEGFPタンパク質の翻訳を提供する。なぜなら、IRES媒介翻訳は、酵母において選択的に阻害されるからである。Venkatesanら1999Nucl.AcidsRes.27:562-572。プラスミドpCMV-IRES/EGFP-1図13を、EcoRIで消化し、klenow酵素を用いてこの部位を平滑末端にし、この酵素の不活化後、NotIを用いて消化して、EGFP-1遺伝子に融合したEMCVIRESを含む5’平滑化-3’NotIフラグメントを作製した。同様に、プラスミドpFHV-MutΔ図6cを、SacIIで消化し、klenow酵素で処理し、次いで、NotIを用いて消化した。IRES-EGFP-1フラグメントを、消化したこのプラスミドにクローン化し、pFHV-IRES-EGFP-1図13を得た。この構築物から発現されるRNAのパッケージングを補助するために、BIV由来のTARヌクレオチド5~30のBIVゲノム、登録M32690を、EGFP遺伝子の下流に挿入した。TAR配列を、NotI適合性の粘着末端を有する2つの相補オリゴヌクレオチドb-TAR-fおよびb-TAR-rをアニーリングすることによって構築した。これはまた、2つの新規な制限部位BstEII5’NotI部位の隣およびXhoI3’NotI部位の隣を導入した。二本鎖NotIフラグメントを、NotI消化したpFHV-IRES-EGFP-1にクローン化し、pFHV-IRES-EGFP-1/b-TAR図14を得た。NotIフラグメントの正確な向きを、確認した。酵母発現ベクターへのクローニング4つの酵母発現プラスミドを、以下の基本的な5’から3’の配置を用いて構築した:酵母特異的プロモーター;改変RNA1;HDVリボザイム;T7ターミネーター;酵母ポリA部位。最初に、SacI-BsshIIフラグメントのpBS24.1-6L1図8を、pSK-ADH2-RNA1/BsshIIΔ由来の対応するフラグメントと置換し、プラスミドpBS-ADH2-RNA1/BsshIIΔ-6L1を得、ここで、RNA1cDNAの一部は、L1遺伝子配列の3’末端に融合されていた示さず。これを、以下のように操作した:1.BsshII-SalIL1フラグメントを、pFHV-EGFP-1/TARΔ由来のBsshII-SalIフラグメントと置換して、pBS-ADH2-RNA1-EGFP-1/TARΔ図15を得た。2.BsshII-SalIL1フラグメントを、pFHV-MutΔ由来のBsshII-SalIフラグメントと置換して、pBS-ADH2-RNA1-MutΔ図16を得た。3.pBS-ADH2-RNA1-MutΔ中の特有のBsshII部位1273を充填しレプリカーゼORFの妨害を伴う、pBS-ADH2-RNA1-MutΔ-図17を作製した。4.pBS-ADH2-RNA1-MutΔ中のBsshII-SalIフラグメント改変RNA1cDNA配列の一部を含むの、pFHV-IRES-EGFP-1/b-TAR由来の対応するBsshII-SalIフラグメントIRES-EGFP-1/b-TARを含むでの置換によって、pBS-ADH2-RNA1-IRES-EGFP-1/b-TAR図18という名のプラスミドを作製した。酵母の形質転換プラスミドpBS-ADH2-RNA1-EGFP-1/TARΔ、pBS-ADH2-RNA1-MutΔ、pBS-ADH2-RNA1-MutΔ-およびpBS-ADH2-RNA1-IRES-EGFP-1/b-TAR図15~18を、実験室において以前に得たHPV-16L2タンパク質を発現するAB110菌株WO00/09699に形質転換することによって導入した。生じた菌株を、それぞれ、pBS-RI-G/TΔ選択したクローン4および5、pBS-RI-MutΔ選択したクローン1および3、pBS-RI-MutΔ-選択したクローン5および7およびpBS-RI-IRES-G/b-TAR選択したクローン5および9と命名した。自己複製の確認RNA複製の確認総RNAを、菌株pBS-RI-MutΔ、pBS-RI-MutΔ-およびpBS-RI-IRES-G/b-TARから抽出して、それぞれ、RepA、RepA-およびRepA-GFPと標識した。これらのRNAを、c-と標識したAB110菌株由来のネガティブコントロールRNAと一緒に、プライマーApaI-fおよびrepA-Revを用いてpFHV[1,0]に対して実行したPCRによって得た非放射性DNAプローブBrighStarPsoralen-Biotin標識キット,Ambion600bpを用いて、ノーザンブロットによって分析した。図19は、結果を示し、高いハイブリダイゼーションシグナルは、レプリカーゼORFを発現するように設計された酵母クローンから抽出されたRNAでのみRNA1配列が挿入を有さない場合レーン2および3およびIRES-EGFP/bTAR配列がレプリカーゼおよびB2ORFの下流に導入されるされる場合レーン6の両方において検出されることを示す。かなり弱いシグナルが、レプリカーゼORFが妨害されたプラスミドを用いて形質転換された酵母クローン由来のRNAレーン4および5を用いて検出され、一方、ネガティブコントロールRNAを用いてシグナルは、検出されない。これらの結果は、レプリカーゼが、異種挿入物外来遺伝子が野生型RNA1配列に導入されたとしても、RNA1の自己複製を維持し得ることを確認する。自己複製する改変RNA1がIRES-EGFP/b-TAR配列を含んでいたことを確認するために、ノーザンブロットを、全EGFP領域の非放射性DNAプローブを用いて実行した。この実験によって、24、48、および72時間における組換えRNA1の発現を確認した図20。タンパク質発現の確認RNAレベルでの自己複製の確認と同様に、タンパク質発現をまた、抗レプリカーゼ抗体を用いてアッセイした。抗レプリカーゼ抗体を得るために、レプリカーゼのC末端部分RepApepと称されるDVWEK...SNNRKを、E.coli中で発現させた。このタンパク質は、完全B1タンパク質を含み、従って有利に、抗RepApep抗体が、B1発現ならびにレプリカーゼを検出するはずである。同じ領域をまた、1フレームシフトさせて発現させ、細菌で発現されるB2タンパク質を得た。B1およびB2タンパク質の検出によって、自己複製を確認した。レプリカーゼORFのRepApep部分を、NheI5’およびXhoI3’制限部位を含むプライマーRepA-dirおよびRepA-revを用いてPCR増幅した。PCR平滑末端産物を、pCR-BluntII-TOPOInvitrogenにクローニングし、そして異なるクローン由来の挿入物の配列を、確認した。NheI5’-XhoI3’フラグメントを、2つの制限酵素を用いた消化によって正確なクローンのうちの1つから抽出し、そしてpTrc-HisAInvitrogenにクローン化し、ORFを含むpTrc-RepApep-His6と命名されたプラスミドここで、RepApepはヘキサヒスチジンタグとインフレームであった図21aを作製した。全B2ORFを、同じNheI部位およびXhoI部位を含むプライマーであるB2-dirおよびB2-revを用いたPCRによって増幅した。PCR産物を、2つの酵素を用いて消化し、pTrc-HisAInvitrogenに直接クローン化し、ORFを含むpTrc-B2-His6と命名されたプラスミドここで、B2は、ヘキサヒスチジンタグとインフレームであった図21bを作製した。2つの組換えタンパク質のいずれかを発現する細菌クローン由来の総可溶性タンパク質の抽出物を、Ni-NTA樹脂Hoffmann-LaRocheを用いてIMACに供し、RepApepおよびB2タンパク質が富化された画分を、収集した図22。RepApepタンパク質は、SDS-PAGEにおいて予期せぬ移動プロフィールを示し、そして精製したタンパク質を、質量分析法に供し図23、これによって予期した15~16kDaのMWを確認した。富化されたタンパク質を含む分画をプールし、PBSに対して透析し、そしてタンパク質含量を、BCA試験Pierceを用いて測定した。このタンパク質を、5匹のマウスの群を、3回repApep、50μg/用量または4回タンパク質B2、25μg/用量のいずれかで2週間間隔で免疫するために使用した。ワクチンを、200μlの抗原および同じ容量のMF59を用いて腹腔内IP投与した。[Ottら1995Vaccinedesignの277~296頁。ThesubunitandadjuvantapproachPowellNewman編PlenumPress]。免疫前血清を、免疫の前に収集し、そして血清サンプルを、各免疫後に2週間で採取した。RepApepを用いて免疫した5匹のマウスの血清サンプルを、酵母菌株pBS-RI-G/TΔクローン4から調製した総タンパク質抽出物に対して1:5000希釈で試験し、約110kDaのタンパク質の検出を、これらの全てにおいて観察し、これは酵母によって発現されるレプリカーゼの存在と一致した図24。図24のレーン4に使用した同じ希釈の血清を、変化させた期間、誘導条件下で増殖させた異なる酵母菌株由来の総タンパク質抽出物に対するウエスタンブロット分析に使用した。この実験によって、RNA1レプリカーゼが、改変RNA1を発現する菌株において、24、48、および72時間目に存在することを確認した図25。図24のレーン4で使用した血清を、pBS-RI-G/TΔを保有する酵母菌株から、24、48、および72時間の誘導で調製された総タンパク質抽出物に対するウエスタンブロット分析に使用した図26。タンパク質のバンドレーン2および3を、20kDaのMWマーカーと7kDaのMWマーカーとの間で検出した。これは、ネガティブコントロール抽出物レーン1および誘導後72時間で調製された抽出物レーン4において存在しない。これは、酵母におけるB1タンパク質の合成と一致し、再び、改変RNA1の自己複製が確認された。72時間目におけるB1タンパク質の非存在は、哺乳動物細胞において以前に得られたB1およびB2発現データと一致する[JohnsonBall1999J.Virol.73:7933-7942]。RNA3発現の確認総RNAを、24時間および48時間増殖させたプラスミドpBS-ADH2-RNA1MutΔ-、pBS-ADH2-RNA1MutΔおよびpBS-ADH2-RNA1-IRES-EGFP-1/b-Tarを発現する酵母菌株から抽出し、そしてそれぞれ、RepA-、RepAおよびRepAIGFP/b-Tarと標識した。これらのRNAを、図19のような非放射性二本鎖DNAプローブを用いたノーザンブロット分析によって分析した。図30は、フィルムを過剰に露光することによって、移動するRNA種に対応する弱いシグナルが明らかになることを示し、これは、RNA3が菌株RepAの24時間および48時間レーン4~7の両方で検出されることを予想する。ノーザンブロットを、レーン6由来のRNAを用いて長期間アガロースゲル上で実行し、そのフィルターを、RNA3が存在した領域のみを含むように、ハイブリダイゼーション前に切断した図31。これによって、RNA3の存在を確認する。菌株RepAIGFP/b-Tar由来のRNAの場合図30、レーン8および9、挿入に起因してよりゆっくりと移動する対応するRNA3は、おそらく、強いRNA1ハイブリダイゼーションシグナルによってマスクされ、観察され得なかった。RNAマイナス鎖の確認24時間および48時間増殖させた菌株RepA-、RepAおよびRepAIGFP/b-Tarから抽出したRNAを、鎖特異的非放射性プローブBrightStarPsoralen-Biotin標識キット、Ambionを用いたノーザンブロットによって分析し、RNAマイナス鎖を検出した。鎖特異的プローブは、SacIIで直鎖にされたプラスミドpFHV-MutΔを用いることによって得たインビトロ転写物であった。図32は、予期したサイズのRNAに対応する強いハイブリダイゼーションシグナルが、レプリカーゼタンパク質を発現するクローンにおいてのみRNA1配列が挿入を有さない場合レーン4および5およびIRES-EGFP/b-Tar配列がB2ORFの下流に導入されている場合レーン6および7の両方において検出されることを示す。コントロールRNAレーン1およびレプリカーゼORFが妨害されている場合レーン2および3、シグナルは検出されない。RNA1のプライマー伸長およびS1マッピング分析標準的なプライマー伸長分析を、菌株RepA-、RepAおよびRepAIGFP/b-Tar由来の総RNAに対してAMV逆転写酵素およびT4キナーゼ標識したオリゴヌクレオチドRl-120を用いて実行した。同じプライマーを用いてプラスミドpSK-ADH2-RNA1/SpeI図7fに対して実行したコントロール配列と共に、伸長産物を8変性ポリアクリルアミド/尿素ゲル上で泳動した。図33は、より短い伸長産物が検出され得ることを示す。S1マッピング分析を、同じRNAを用いて実行した。プローブは、オリゴAZ15-forプラスミド中のnt6285およびR1-120を用いてプラスミドpSV40-FHV[0,0]から得た二本鎖PCRフラグメントであった。このPCRフラグメントを、T4キナーゼを用いて標識し、NcoIを用いて消化し、検出されるmRNAの同じ極性を有する鎖から放射性標識を、取り除き、そしてゲル精製した。放射性プローブのアリコートを、総RNAにハイブリダイズさせ、そしてS1ヌクレアーゼを用いた消化を、標準的な条件下で実行した。コントロールとして、pFHV[1,0]由来のT7でインビトロ転写されたRNA1をまた、このプローブに対してハイブリダイズさせ、そしてS1消化した。S1処理された産物を、プライマーR1-90revを用いて獲得しかつRNA1に相補的であるDNA配列と共に、8変性ポリアクリルアミド/尿素ゲル上で泳動した。図34に示されるように、全長RNAに対応するバンドを、GFPおよびIRES-GFP挿入を有さないかまたは有するレプリカーゼAを発現するサンプルで検出し得たレーン3、4および5。RNA1の5’末端のクローニングおよび配列決定菌株RepA-IGFP/b-Tar由来の総RNAを使用して、RNA1種の5’末端をクローン化した。クローニングは、AmbionFirstChoiceTMRLM-RACEKitこれは、キャップされたmRNA分子の選択的なクローニングを可能にするを用いることによって実行した。使用したプライマーは、以下であった:1R1-revを用いた逆転写2キットで供給される外部RNAアダプタープライマーおよび逆方向プライマーAZ-9revRNA1上のnt426を用いた外部PCR3キットで供給される内部RNAアダプタープライマーおよびR1-120を用いた内部PCR。最終PCR産物のクローニングを、pZero平滑ベクターInvitrogen中に実行した。10個のクローンの配列決定によって、これら全てのクローン化された配列が、AAAACAGRNA1配列のヌクレオチド16で始まることが明らかになった。これは、図33において示される産物cに対応する。従って、図33のバンドbは、cの分解産物を示し得、そしてバンドbは、キャップされた形態であり得る。RNA3の5’末端のクローニングおよび配列決定同じ実験手順を使用することによって、RNA3の5’領域を、同じ酵母クローンからクローン化した。使用したプライマーは以下であった:1AZ-5revRNA1のnt3101を用いた逆転写2キットで供給される外部RNAアダプタープライマーおよび逆方向プライマーAZ-5revを用いた外部PCR3キットで供給される内部RNAアダプタープライマーおよびR3-2809revRNA1上のnt2830を用いた内部PCR。最終PCR産物を、NcoIRNA1上のnt2801およびBamHI内部アダプタープライマー内を用いて消化し、そして同じ酵素を用いて消化したpTRC-HisBInvitrogenにクローン化した。RepA菌株由来のRNAを用いて実行したRT-PCRからの10個のクローンの配列決定によって、各場合での同じ配列RNA1のヌクレオチド2721で始まるGTTACCAA...が明らかになった。これは、文献ですでに報告されたRNA3開始部位に対応する。RepA-IGFP/b-Tar菌株由来のRNAを用いて実行したRT-PCRからの18個のクローンの配列決定によって、いずれもRNA3転写開始部位に対応しないが、これらの全てが、RNA1に属する上流の配列で開始することが明らかになった。HPVVLPにおけるパッケージングTAR挿入物を保有する改変RNA1のパッケージングを促進するために、HPV-6のL1コートタンパク質を、相補的なtatモチーフをそのC末端に含むように改変した。これを達成するための酵母発現ベクターの構築は、いくつかの工程を含んだ図27。最初に、プラスミドpBS24.1-6L1図8を、BsshIIおよびSalIを用いて消化し、このようにしてL1タンパク質の最後の4アミノ酸を排除した。このプラスミドは、酵母においてHPV-6L1キャプシドタンパク質を発現する。相補的なオリゴヌクレオチド6L1Δ4および6L1Δ4invをアニーリングすることによって得た短いBsshII-SalIdsDNAを挿入し、これによって、L1ORFを再構築し、これに翻訳終止コドンおよび新しいNotI制限部位を与えた。生じた酵母発現プラスミドを、pBS24.1-6L1Δ4と命名した。tatのHIV-1TAR-結合ドメインアミノ酸36~72のPCR増幅を、プライマーTat-dirおよびTat-revを用いることによってHIV-1菌株IIIBのcDNAを含むプラスミドに対して実行し、これはまた、5’末端にBsshII部位を、そして3’部位にNotIおよびSalI部位を含んだ。生じた平滑末端のフラグメントを、pCR2.1プラスミドにクローン化し、そして配列決定した。BsshII-SalIフラグメントを、pCR2.1から抽出し、そして同じ制限酵素を用いて消化したpBS24.1-6L1Δ4に連結した。生じたプラスミドを、pBS24.1-6L1Δ4-Tatと命名した。pBS24.1-6L1Δ4-Tatを、実験室で以前に獲得しかつHPV-6L2タンパク質を発現するJSC310菌株WO00/09699への、形質転換によって導入した。形質転換実験からの異なるクローンを、6L1Δ4-Tat発現に関して分析し、クローン2を、更なる実験のために選択した。クローン2を、誘導条件下で増殖させ、VLPの塩化セシウムCsCl勾配精製を、WO00/09699に記載されるように実行した。1.28~1.29g/cm3の密度に対応するCsCl分画を、非還元条件下のSDS-PAGEで泳動し、抗6L1抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した図28。115kDaのMwのタンパク質マーカーよりもゆっくりと移動したバンドの検出は、異なるL1/Tat単量体間でジスルフィド結合が形成されることを示し、これは、HPVVLPの効率的な自己アセンブリの公知の必要条件であるSappら1998J.Virol.72:6186-89。レプリカーゼの発現、TAR挿入物を保有する改変RNA1の自己複製、L1-Tatの発現、および改変RNA1のパッケージングが、図29に示される。全ての工程は、同じ酵母細胞で起こり、目的の遺伝子を哺乳動物細胞に送達するための感染性VLPを生じる。プラスミドpBS24.1-6L1Δ4-Tatを含む酵母菌株JSC310クローン2を、プラスミドpBS-ADH2-RNA1-EGFP-1/TARΔを含む菌株AB110と接合させ、組換えRNA1誘導体GFP遺伝子およびヒトTAR配列を含むおよび組換えHPV6L1/hTATタンパク質を同時発現する二倍体クローンを得た。接合実験からの異なるクローンを、L1およびレプリカーゼAタンパク質発現に関して試験し、そしてRNA1-EGFP-1/TAR転写レベルに関して試験した。1つの二倍体クローンを選択し、そして誘導条件下で増殖させた。VLPのCsCl勾配精製を、WO00/09699に記載されるように実行した。1.28~1.29g/cm3の密度に対応するCsCl分画をプールし、そしてPBSに対して透析した。透析したVLPを、以下の異なる手順に従って実行した異なる実験に使用し、そして図35に報告する。図35Aにおいて、VLPを、フェノール沈澱、フェノール-クロロホルム沈澱、クロロホルム沈澱、およびエタノール沈澱で処理し、タンパク質を欠く材料を得た。水中に懸濁した最終核酸ペレットのアリコートを、さらなる処理をいずれも行わずに、OneStepRT-PCRキットQiagenを用いてこのキットの指示書に従ってRT-PCRに供した。使用したプライマーは、R1-235forRNA1上のnt235およびR1-1272M-rであり、予期した1037ntのバンドを生じたレーン2および4、これらは、2つの異なるRT-PCR分析で繰り返した同じサンプルである。関連しない酵母RNAを、コントロールとして含めた。図35Bにおいて、プールしたVLPの100μlのアリコートを、フェノールfenol/クロロホルム抽出前に、25単位のBenzonaseMerckを用いて37°Cで24時間の処理に供した。最終核酸ペレットを、前のものと同じプライマーを用いてRT-PCRに供した。VLPを事前にBenzonaseで処理した場合レーン2およびいずれのBenzonase処理も行わない場合の両方において、1037ntのバンドを観察した。図35Cにおいて、プールしたVLPの100μlのアリコートを、フェノール/クロロホルム抽出前に、1μgRNAseAを用いて37°Cで1時間の処理に供した。総マウスRNAを、RNAse処理の内部コントロールとしてこのサンプルに含めた。フェノール/クロロホルム抽出後、最終核酸ペレットを、2つの異なるセットのプライマー図35Aにおいて使用した2つのRNA1プライマーおよびマウスGAPDHmRNAに対応する約600nt長のバンドを増幅する2つのプライマーを用いてRT-PCRに供した。VLPを事前にRNAseで処理した場合レーン2およびいずれのRNAse処理も行わなかった場合レーン3の両方において、RNA1のバンド白い矢印が目に見えたが、GAPDHmRNAが未処理サンプルから増幅され得黒い矢印レーン3、これはRNAse処理後はほとんど見えない。本発明は例によってのみ記載され、そして本発明の範囲および精神内で維持しながら改変がなされ得ることは、理解される。"