"以下の工程a~dを備えた組織染色方法を用いることを特徴とするがん発症又はがん発症リスクの判定方法。aがんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体を蛍光物質で標識し、該蛍光標識された抗体を組織試料と接触させる工程;b前記抗体が接触した組織部位に励起光を照射し、蛍光画像を取得する工程;c前記蛍光画像と同一視野及び同一焦点における、前記蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域よりも短波長側又は長波長側の近傍領域の自家蛍光画像を取得する工程;d前記蛍光画像の蛍光輝度から、前記自家蛍光画像の蛍光輝度を除く画像処理をし、補正蛍光画像を取得する工程;がんの増殖制御因子又は転移制御因子がPAR1proteaseactivatedreceptor1であることを特徴とする請求項1記載の判定方法。がんが、乳がんであることを特徴とする請求項1又は2記載の判定方法。蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域とその近傍領域の波長の差が100nm以内であることを特徴とする請求項1~3のいずれか記載の判定方法。蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域が近赤外領域であることを特徴とする請求項1~4のいずれか記載の判定方法。励起光の波長が400~700nmであることを特徴とする請求項1~5のいずれか記載の判定方法。蛍光物質が、蛍光粒子であることを特徴とする請求項1~6のいずれか記載の判定方法。蛍光粒子が、量子ドット蛍光粒子であることを特徴とする請求項7記載の判定方法。さらに以下の工程e~gを備えたことを特徴とする請求項7又は8記載の判定方法。e抗体が接触した組織部位の細胞数をカウントする工程;f蛍光画像を基に、蛍光粒子1粒子を特定し、該蛍光粒子1粒子に対応する補正蛍光画像内の蛍光粒子1粒子の平均蛍光輝度を計測する工程;g補正蛍光画像内の全蛍光輝度を、前記蛍光粒子1粒子の平均蛍光輝度で除して蛍光粒子数を求め、該蛍光粒子数を工程eでカウントした細胞数で除し、1細胞あたりの蛍光粒子数を算出する工程;蛍光粒子が有する明滅性を利用して、蛍光粒子1粒子を特定することを特徴とする請求項9記載の判定方法。以下のA~Dを備えたことを特徴とするがん発症又はがん発症リスクの判定システム。A蛍光物質で標識されたがんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体;B励起光照射手段;C蛍光画像取得手段;D蛍光画像取得用バンドパスフィルタ;がんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体がPAR1proteaseactivatedreceptor1であることを特徴とする請求項11記載の判定システム。さらに、E細胞核蛍光画像を取得するバンドパスフィルタ;を備えたことを特徴とする請求項11又は12記載の判定システム。蛍光物質が、蛍光粒子であることを特徴とする請求項11~13のいずれか記載の判定システム。蛍光粒子が、量子ドット蛍光粒子であることを特徴とする請求項14記載の判定システム。量子ドット等の蛍光粒子は、自身が有する光安定性と定量的な解析に威力を発揮することから、蛍光免疫染色における新たなツールとして期待が高まっているが、定量的な解析としては培養細胞に限定されている。その理由として、培養細胞では細胞の自家蛍光が弱いため、量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度を十分高いSシグナル/Nノイズ比として算出できるのに対し、生体組織では培養細胞に比べ非常に強い自家蛍光を有するため、量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度を十分高いS/N比として算出できないことが大きな原因としてある。生体組織の長波長の自家蛍光は、短波長の自家蛍光と比べ量が少ないものの、観察における影響を無視することはできず、生体組織における量子ドット蛍光粒子の定量的な解析は困難であった。本発明の課題は、がん細胞の運動性及び浸潤性を阻害するPAR1抗体等のがんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体を用いた生体組織における定量的な組織染色法により、高精度で且つ定量的ながん発症又はがん発症リスクの判定方法を提供することにある。生体組織染色法における自家蛍光の影響を除く方法として、a励起光照射による自家蛍光褪色法、bコントラスト調整法等が知られている図2参照。上記a励起光照射による自家蛍光褪色法では、量子ドット蛍光粒子が有する光安定性を利用し、長時間光照射することにより量子ドット蛍光粒子由来の輝度は褪色させず、自家蛍光のみを褪色させることは可能だが、完全褪色には長時間必要であり、また照射面のみの自家蛍光しか褪色できないという欠点もある。また上記bコントラスト調整法では、量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度が自家蛍光の輝度と比べ弱い場合、自家蛍光画像を消去させるコントラストの調整により、量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度が消えてしまうことや、さらに、自家蛍光は試料の種類や場所によって大きく異なるため、一定の閾値を決められないという欠点がある。本発明者らは、上記a又はbの方法に代わる自家蛍光の影響を除く方法を鋭意検討する中で、量子ドット蛍光粒子Qdot705で標識されたPAR1抗体PAR1ab-QD705で免疫染色した乳がん組織試料に波長が488nmの励起光を照射し、量子ドット蛍光粒子の蛍光画像量子ドット蛍光粒子の蛍光自家蛍光を、蛍光波長の取得領域が695~740nmのバンドパスフィルタを通して取得した後、かかる蛍光画像と全く同じ焦点面及び同じ視野で自家蛍光のみの自家蛍光画像を、蛍光波長の取得領域が640~690nmのバンドパスフィルタを通して取得し、蛍光静止画像の各ピクセルの蛍光輝度から、自家蛍光画像において相当する各ピクセルの蛍光輝度を引くことによって、蛍光静止画像から自家蛍光画像自家蛍光を引いた量子ドット蛍光粒子の蛍光のみの画像補正蛍光画像を取得できることを見いだした。また、かかる補正蛍光画像に含まれる量子ドット蛍光粒子の粒子数を特定するために、量子ドット特有のブリンキング明滅性を利用した。すなわち、1粒子の量子ドット蛍光粒子であれば、20秒間の励起光照射時間においてoff-state滅状態は約4秒になるため、約4秒間のoff-state滅状態を持つ粒子の平均輝度を量子ドット蛍光粒子1粒子の蛍光輝度として算出したところ、補正蛍光画像において1細胞あたりの量子ドット蛍光粒子の粒子数を算出できることが確認された。さらに、無再発生存乳がん患者組織や再発患者乳がん組織やがん患者の正常乳腺組織を用いて、PAR1ab-QD705で検出される量子ドット蛍光粒子数を算出したところ、がん患者の正常乳腺組織と比べ無再発生存乳がん患者組織や再発患者乳がん組織では、PAR1ab-QD705で検出される量子ドット蛍光粒子数が有意に多いことが認められた。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。すなわち本発明は、1aがんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体を蛍光物質で標識し、該蛍光標識された抗体を組織試料と接触させる工程;b前記抗体が接触した組織部位に励起光を照射し、蛍光画像を取得する工程;c前記蛍光画像と同一視野及び同一焦点における、前記蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域よりも短波長側又は長波長側の近傍領域の自家蛍光画像を取得する工程;d前記蛍光画像の蛍光輝度から、前記自家蛍光画像の蛍光輝度を除く画像処理をし、補正蛍光画像を取得する工程;を備えた組織染色方法を用いることを特徴とするがん発症又はがん発症リスクの判定方法や、2がんの増殖制御因子又は転移制御因子がPAR1proteaseactivatedreceptor1であることを特徴とする上記1記載の判定方法や、3がんが、乳がんであることを特徴とする上記1又は2記載の判定方法や、4蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域とその近傍領域の波長の差が100nm以内であることを特徴とする上記1~3のいずれか記載の判定方法や、5蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域が近赤外領域であることを特徴とする上記1~4のいずれか記載の判定方法や、6励起光の励起波長が400~700nmであることを特徴とする上記1~5のいずれか記載の判定方法や、7蛍光物質が、蛍光粒子であることを特徴とする上記1~6のいずれか記載の判定方法や、8蛍光粒子が、量子ドット蛍光粒子であることを特徴とする上記7記載の判定方法や、9さらにe抗体が接触した組織部位の細胞数をカウントする工程;f蛍光画像を基に、蛍光粒子1粒子を特定し、該蛍光粒子1粒子に対応する補正蛍光画像内の蛍光粒子1粒子の平均蛍光輝度を計測する工程;g補正蛍光画像内の全蛍光輝度を、前記蛍光粒子1粒子の平均蛍光輝度で除して蛍光粒子数を求め、該蛍光粒子数を工程eでカウントした細胞数で除し、1細胞あたりの蛍光粒子数を算出する工程;を備えたことを特徴とする上記7又は8記載の判定方法や、10蛍光粒子が有する明滅性を利用して、蛍光粒子1粒子を特定することを特徴とする上記9記載の判定方法に関する。また本発明は、11A蛍光物質で標識されたがんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体;B励起光照射手段;C蛍光画像取得手段;D蛍光画像取得用バンドパスフィルタ;を備えたことを特徴とするがん発症又はがん発症リスクの判定システムや、12がんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体がPAR1proteaseactivatedreceptor1であることを特徴とする上記11記載の判定システムや、13さらに、E細胞核蛍光画像を取得するバンドパスフィルタ;を備えたことを特徴とする上記11又は12記載の判定システムや、14蛍光物質が、蛍光粒子であることを特徴とする上記11~13のいずれか記載の判定システムや、15蛍光粒子が、量子ドット蛍光粒子であることを特徴とする上記14記載の判定システムに関する。自家蛍光の影響を除き、量子ドット蛍光粒子で標識したPAR1抗体を用いた本発明の組織染色法により、乳腺組織における1細胞あたりの量子ドット蛍光粒子数PAR1抗体による検出の平均値は、がん患者の正常乳腺組織4検体では0.2に対し、ハーセプテストHER2抗体により検出で陰性だった5年以上無再発生存乳がん患者組織5検体では3.2、ハーセプテストHER2抗体により検出で陰性だった再発患者乳がん組織約1年以内に再発し、4年以内に死亡3検体では14.8と有意な差が得られた。さらに、乳がんの増殖に関係する主要な3つの因子エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体PgR;progesteronerecepter、ヒト上皮成長因子受容体2HER2:humanepidermalgrowthfactorreceptor2とは関係なく乳がんが発生するトリプルネガティブの例が報告されており、トリプルネガティブはハーセプテストでは対処できないために重要な問題であるが、トリプルネガティブ乳がん組織8検体では、細胞あたりの蛍光量子ドット粒子数PAR1抗体による検出の平均値は6.0であり、がん患者の正常乳腺組織と比べ有意な差が得られた。この組織染色法を用いることで、ハーセプテストでは陰性と判定されてしまう乳がん患者であっても、高感度で定量的に乳がんの病理診断を行うことが可能となった。このように本発明によると、がん再発又はがん再発リスクが判定できるだけでなく、がん発症又はがん発症リスクをも判定することができる。本発明のがん発症又はがん発症リスクの判定方法としては、がんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体を蛍光物質で標識し、該蛍光標識された抗体を組織試料と接触させる工程a;前記抗体が接触した組織部位に励起光を照射し、蛍光画像を取得する工程b;前記蛍光画像と同一視野及び同一焦点における、前記蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域よりも短波長側又は長波長側の近傍領域の自家蛍光画像を取得する工程c;前記蛍光画像の蛍光輝度から、前記自家蛍光画像の蛍光輝度を除く画像処理をし、補正蛍光画像を取得する工程d;を備えた組織染色方法を用いる方法但し、医師による診断行為を除く。であれば特に制限されないが、さらに、抗体が接触した組織部位の細胞数をカウントする工程e;蛍光画像を基に、蛍光粒子1粒子を特定し、該蛍光粒子1粒子に対応する補正蛍光画像内の蛍光粒子1粒子の平均蛍光輝度を計測する工程f;補正蛍光画像内の全蛍光輝度を、前記蛍光粒子1粒子の平均蛍光輝度で除して蛍光粒子数を求め、該蛍光粒子数を工程eでカウントした細胞数で除し、1細胞あたりの蛍光粒子数を算出する工程g;を備えることが好ましく、また、本発明のがん発症又はがん発症リスクの判定システムとしては、A蛍光物質で標識されたがんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体;B励起光照射手段;C蛍光画像取得手段;D蛍光画像取得用バンドパスフィルタ;を備えたシステムであれば特に制限されないが、さらに、E細胞核蛍光画像を取得するバンドパスフィルタ;を備えたシステムが好ましく、上記判定の対象となるがんとしては、大腸がん、直腸がん、腎がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん、子宮内膜がん、食道がん、血液がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、肺がん、乳がん等を挙げることができる。上記工程aにおけるがんの増殖制御因子又は転移制御因子のうち、がんの増殖制御因子としては、例えば表皮増殖因子、EGF受容体、血小板由来増殖因子、PDGF受容体、インスリン様増殖因子IGF:insulinlikegrowthfactor、IGF受容体、線維芽細胞増殖因子、FGF受容体、血管内皮増殖因子、VEGF受容体、肝細胞増殖因子、HGF受容体、神経栄養因子、形質転換増殖因子βファミリー、ヒト上皮成長因子受容体1、2、3若しくは4HER1、2、3若しくは4:humanepidermalgrowthfactorreceptor123or4、マクロファージコロニー刺激因子CSF1:macrophagecolonystimulatingfactor1、CSF1受容体CSF1R等の細胞増殖を調節する因子、又は、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼCDK:cyclindependentkinase、サイクリンA、サイクリンB、サイクリンD、サイクリンE、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、p16INK、p15、p21、p27、RBretinoblastoma等の細胞周期を調節する因子を挙げることができ、がんの転移制御因子としては、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ1、マトリックスメタロプロテアーゼ2、PAR1proteaseactivatedreceptor1、CXCR4chemokineC-X-Cmotifreceptor4、CCR7chemokineC-Cmotifreceptor7等を挙げることができ、これらの中でもPAR1を好適に例示することができる。上記工程aにおけるがんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体としては、増殖制御因子や転移制御因子を特異的に認識する抗体が好ましく、抗体の種類としてはモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を例示することができる。また上記抗体のクラスやサブクラスは特に制限されず、クラスとしては、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM等を挙げることができ、サブクラスとしては、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等を挙げることができる。また、ここでいう抗体という用語は、任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、例えば、Fab、Fab’2、CDR、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体ScFvなどを含む。かかる抗体は、公知の方法で製造することができる例えば、HarlowELaneDAntibodyColdSpringHarborLaboratoryPressを参照が、市販品を用いることもできる。例えば、上記PAR1を認識する抗体としては、PAR1のN末領域を認識する市販のPAR1抗体や、国際公開第09/119455号パンフレットに開示されているPAR1抗体を挙げることができる。上記工程aにおける蛍光物質としては、選択された波長の紫外光、可視光等の放射線による照射に応答して蛍光を発する物質であれば特に制限されないが、例えば、有機蛍光物質としてはフルオレセイン、ローダミン、Cy-5、Cy-3、アレクサ等が挙げられ、無機蛍光物質としては、蛍光シリカナノ粒子、量子ドット蛍光粒子等の蛍光粒子を挙げることができる。そして、長波長側の方が自家蛍光の影響は少ないため、近赤外領域側、特に近赤外領域の蛍光を発する蛍光物質を用い、該蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域が近赤外領域側570~800nm、特に近赤外領域700~800nmであることが好ましい。上記有機蛍光物質は、励起光による褪色が急速に生じ、長時間励起光を照射する解析には不向きであるため、光安定性に富み、長時間励起光を照射しても安定である蛍光粒子、中でも量子ドット蛍光粒子を用いることが好ましい。蛍光粒子としては、励起光の照射により蛍光を発する粒子であればよく、その素材等も制限されず素材自体が蛍光を発するものでも、蛍光物質が含まれた粒子や蛍光物質がコーティングされたことにより、蛍光を発することができる粒子でもよい。また、蛍光粒子の形やサイズは特に限定されず、方形、円盤状、多面体、球状等を挙げることができるが、球状が好ましく、そのサイズは、直径0.00001nm~1mm、好ましくは直径0.001nm~100μm、更に好ましくは直径0.01nm~10μmであり、蛍光粒子が発する蛍光の波長も適宜選択することができる。蛍光粒子は特開平9-241634や特開2010-242059などに開示された方法により作製することもできるが、ポリスチレン粒子をポリスチレンコア粒子の存在下で適切な蛍光色素またはスチレンの蛍光色素の重合により染色することで調製されたSPHERO蛍光粒子ベイバイオ社製や、蛍光粒子Estapor登録商標標準マイクロ粒子MerckChime社製等の市販品を入手することもできる。蛍光粒子の中でも、コロイド状量子ドットQD:QuantumDotとも呼ばれる量子ドット蛍光粒子が、蛍光粒子は非常に鋭い発光スペクトルと高い量子効率を併せもつという特性を有することから好ましい。量子ドット蛍光粒子は発光性の半導体ナノ粒子で、直径の範囲は1~20nmであり、生物学および医学診断の分野における蛍光イメージングに利用されている。量子ドット蛍光粒子には、輪郭が明確で3次元かつナノサイズの半導体結晶に電子が量子的に閉じ込められており、量子ドット蛍光粒子のサイズが小さくなると半導体のバンドギャップが大きくなるため、サイズによって半導体の光ルミネセンス発光波長を可視スペクトル全体にわたって調節することが可能である。本発明にける量子ドット蛍光粒子としては、発光性の半導体ナノ粒子であればよく、そのサイズは、励起光及び蛍光の波長から、粒子サイズを適宜調節することが好ましい。かかる量子ドット蛍光粒子としては、例えば、半導体シェルZnSで被覆された半導体素材CdSeのナノクリスタルである、Qdot登録商標525、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot625、Qdot655、Qdot705、Qdot800全てInvitrogen社製等を利用することができる。取得する蛍光波長が800nmを越えるとカメラの感度が落ちるため、近赤外領域の蛍光を発する量子ドット蛍光粒子のうち、705nmの蛍光を発する量子ドット蛍光粒子Qdot705を用いることが好ましい。上記工程aにおいて、抗体を蛍光物質で標識する方法としては、該抗体に対して特異的な親和性を有する抗体二次抗体を介する方法、ビオチン-アビジン法、チオール基-マレイミド基のカップリング反応、既存の化学リンカーを用いる方法、架橋剤EDC等を用いた架橋反応、イオン結合等を挙げることができる。例えば、抗体と量子ドット蛍光粒子との結合は、QdotAntibodyConjugationKitInvitrogen等を用いて製造業者の取扱説明書に従い行うことができる。上記工程aにおける組織試料としては、ホルマリン固定パラフィン切片や凍結切片等の固定組織試料切片を例示することができ、病理組織試料、末梢血組織試料、組織から分離された細胞や体液から分離された細胞のセルブロック試料、末梢血白血球又は細胞の浮遊試料を沈降又は遠沈して作成されるセルブロック試料、組織の捺印試料、末梢血、体液、滲出液、細胞を含む液体の塗沫試料等を挙げることができる。上記工程aにおいて、前記蛍光標識された抗体を組織試料と接触させる方法としては特に制限されず、前記接触により抗原-抗体反応が生じることから、接触時の温度は、0~40°Cが好ましい。また接触時間は、用いる組織試料の種類、抗体の濃度、タイターの高さ、上記接触反応温度、標的因子抗原の量、局在部位等により異なり、特に限定されず適宜選択されるが、10分~12時間、好ましくは10分~2時間を挙げることができる。また、抗体の非特異的な結合を防ぐために、抗体と組織試料とを接触させる前に、FBS、BSA、IgG等でブロッキング処理を行うことができる。上記工程bにおける励起光の励起波長としては、蛍光物質が発光する蛍光波長よりも短波長であり、人体に対する安全性の面から好ましくは400~700nm、より好ましくは450~650nm、特に一般的な励起波長に用いられる488nm、532nm、又は635nmを具体的に挙げることができる。上記工程bにおける蛍光画像としては、蛍光静止画像や、蛍光静止画像及び該蛍光静止画像に対応する蛍光動画像を挙げることができる。上記蛍光静止画像は、一般的なPC等のコンピュータをコントローラとして用い、CCDカメラの撮影条件の制御、取得蛍光静止画像の画像化と表示、光源の光量の制御等を行うことができる蛍光顕微鏡を用いて取得することができる。蛍光物質が発光する蛍光輝度が飽和しないように、励起光側のフィルター、ダイクロイックミラー等の必要な設定を行い、さらには励起光の露光時間が0.0003から30~60秒になるように設定するのが好ましい。蛍光物質の蛍光各画素輝度が飽和していないかどうか確認する方法として、予め指定した輝度値又は輝度値の最大値に対する予め指定した割合の輝度値例えば8ビット画像ならば255が最大値であるので、220という数値や、輝度の最大値の90を設定し、その値を越えたときに飽和していると判断してもよい。また、このとき1つの画素のみでなく、画像全体の予め指定した割合の複数の画素を用いて判断してもよい。蛍光静止画像における蛍光物質の蛍光輝度が1粒子由来であるかどうかを特定する場合に、必要に応じて蛍光動画像を取得することができる。上記蛍光動画像としては、上記蛍光静止画像と同一視野及び同一焦点における動画像を2~500msecの分解能で50~200フレーム取得するのが好ましい。上記蛍光画像を取得するバンドパスフィルタとして、蛍光物質が発する赤、シアン、オレンジ、緑、青等の特定の波長の蛍光のみを透過するように選択されるバンドパスフィルタを用い、上記蛍光物質の全蛍光輝度の25以上、好ましくは50以上、より好ましくは75以上を取得できるバンドパスフィルタを使用するのが望ましい。さらに、上記蛍光画像を取得するバンドパスフィルタは、上記蛍光物質の蛍光輝度の30を30nm以内、好ましくは15nm以内、より好ましくは5nm以内の波長領域で取得できるバンドパスフィルタを使用するのが望ましい。例えば705nmの蛍光を発する蛍光物質を使用する場合、上記蛍光画像を取得するバンドパスフィルタは、蛍光波長の取得領域が695~740nmであるバンドパスフィルタであることが好ましい。上記工程cにおいて、自家蛍光画像を取得する方法としては、蛍光物質が発する蛍光波長を取得するために用いたバンドパスフィルタを、該バンドパスフィルタよりも短波長側又は長波長側の近傍領域、好ましくは短波長側の近傍領域の波長を取得できるバンドパスフィルタに代え、上記蛍光静止画像と同一視野及び同一焦点条件下で画像を取得し、蛍光物質の蛍光を含まず、自家蛍光のみが含まれた画像を取得する方法を挙げることができる。長波長の蛍光は、短波長の蛍光と比べ屈折が小さく、短波長の蛍光よりも遠くで焦点を結ぶため、上記蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域と自家蛍光画像を取得する波長領域の波長が大きく異なると、上記蛍光静止画像に含まれる自家蛍光の焦点と、自家蛍光画像の自家蛍光の焦点とのずれが大きくなってしまう。このため、上記蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域とその近傍領域の波長の差は、130nm以内、好ましくは120nm以内、より好ましくは110nm以内の領域、特に100nm以内を好適に例示することができる。本発明の蛍光画像や自家蛍光画像を取得するために用いるバンドパスフィルタとしては、具体的に蛍光波長の取得領域が505~545nm、565~595nm、585~630nm、640~690nm、695~740nm、760~800nm等のバンドパスフィルタを挙げることができ、例えば蛍光波長の取得領域が695~740nmのバンドパスフィルタを用いて上記蛍光静止画像を取得する場合、自家蛍光画像を取得するバンドパスフィルタは、蛍光波長の取得領域が640~690nmであるバンドパスフィルタが好ましい。上記自家蛍光画像を取得するための撮影条件は、上記蛍光静止画像と該自家蛍光画像の同じ領域の自家蛍光の輝度を比較し、任意のROI、例えば25×25ピクセルの自家蛍光の最大値が蛍光静止画像よりも自家蛍光画像の方が1.1~1.3倍、好ましくは1.2倍になるように設定する。すなわち、自家蛍光画像の方が蛍光静止画像よりも10~30、特に20程度自家蛍光の輝度を高い値にすることが好ましい。上記工程dにおいて、補正蛍光画像を取得する方法としては、蛍光静止画像及び自家蛍光画像をJPEGやTIF等の画像ファイルに変換した後、ImageJhttprsbinfonihgovij、PhotoshopAdobe社製、AfterEffectAdobe社製、GCount株式会社ジーオングストローム社製等の画像解析ソフトを用いて、自家蛍光画像の輝度を基に蛍光静止画像の輝度から自家蛍光の輝度を除く処理を挙げることができる。なお、画像ファイルに変換する際、すべての蛍光分布が入るように閾値を選択するのが好ましい。上記工程eにおいて、抗体が接触した組織部位の細胞数をカウントする方法としては、DAPI、ヘキスト、PIPropidiumIodide等のDNAに結合して蛍光を発する核酸染色剤で細胞核を染色した後、蛍光画像と同一視野における染色された細胞核数の総数をカウントする方法を挙げることができるが、蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域が近赤外領域である場合、蛍光特性が類似している赤色の蛍光を発するPIよりも青色の蛍光を発するDAPI、又はヘキストを用いることが好ましい。上記工程fにおいて、蛍光粒子1粒子を特定する方法としては、例えば蛍光画像における蛍光粒子の蛍光輝度を測定し、蛍光1粒子が発する蛍光の輝度情報を基に上記蛍光粒子が何粒子に相当するか求める方法や、蛍光粒子が有するブリンキング明滅性を利用する方法等を挙げることができるが、蛍光粒子が量子ドット蛍光粒子である場合、ブリンキング明滅性を利用する方法が好ましい。ここでブリンキング明滅性とは、励起光を照射したときの照射時間もしくは照射量に対して発光強度が突然殆どゼロOFFとなる滅時間消滅時間が数msec~5sec近く続き、再び元の発光強度を得ることを繰り返す性質のことをいう。また、ブリンキング明滅性を利用した蛍光粒子1粒子を特定する方法とは、蛍光静止画像又は蛍光動画像を基に、励起光を任意の時間、例えば10~100秒照射した場合の蛍光粒子の消滅時間を測定し、該蛍光粒子が1粒子であるかの評価を行い、蛍光粒子1粒子を特定する方法のことをいう。例えば蛍光粒子として705nmの蛍光を発する量子ドット蛍光粒子を用いる場合、励起光を20秒間照射した場合の量子ドット蛍光1粒子の消滅時間は約4秒となり、すなわち消滅時間が約4秒である蛍光粒子を1粒子由来の量子ドット蛍光粒子であると特定できる。ここで量子ドット蛍光粒子が消滅したかどうかを判断するために、量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度の閾値を適宜設定することができ、例えば量子ドット蛍光粒子の最大蛍光輝度の0~30、好ましくは5~15、より好ましくは10を閾値として設定する。特定した1粒子に対応する補正蛍光画像内の蛍光輝度を、ImageJ、Photoshop、AfterEffect、GCount等の画像解析ソフトを用いて測定する。上記測定により1粒子の平均蛍光輝度の算出は、労力と正確性を考慮すると、2~200蛍光粒子、好ましくは5~10蛍光粒子を用いて行う。上記工程gにおいては、1細胞あたりの蛍光粒子数を算出する。1細胞あたりの蛍光粒子数は、上記補正蛍光画像から得られた量子ドット蛍光粒子の全蛍光輝度の値画面内の全蛍光輝度、上記細胞核染色画像から得られた細胞数、及び量子ドット蛍光粒子1粒子あたりの平均蛍光輝度の値1粒子蛍光輝度を、式[画面内の全蛍光輝度/1粒子蛍光輝度/細胞数=画像内の全蛍光粒子数/細胞数=蛍光粒子数/細胞]に入力することにより算出することができる。上記工程a~dを備えた本発明の判定方法により、判定対象の組織試料と正常組織試料の補正蛍光画像をそれぞれ取得し、両補正蛍光画像内の蛍光輝度を比較して、判定対象の組織試料の補正蛍光画像における蛍光輝度の方が高い場合、判定対象の組織試料のがん増殖制御因子又は転移制御因子タンパク質量が多いことが示唆されるため、かかる判定対象の組織において、がんが発症している,又はがん発症リスクがあると判定することができる。また、上記工程a~gを備えた本発明の判定方法により、判定対象の組織試料と正常組織試料の1細胞あたりの蛍光粒子数をそれぞれ算出し、両者を比較して、判定対象の組織試料における1細胞あたりの蛍光粒子数の方が多い場合、判定対象の組織試料のがん増殖制御因子又は転移制御因子タンパク質量が多いことが示唆されるため、かかる判定対象の組織において、がんが発症している、又はがん発症リスクがあると判定することができる。例えば、乳がんのマーカー因子を検出する抗PAR1抗体を量子ドット蛍光粒子で標識し、かかる量子ドット蛍光粒子標識抗体を用いて、1細胞あたりの抗PAR1抗体により検出される蛍光粒子数を算出し、その数を指標にして、乳がんのがん発症又はがん発症リスクの病理診断を行うことができる。前記本発明の判定システムにおける励起光照射手段としては、水銀ランプ100V、水銀ランプ200V、キセノンランプ75V、キセノンランプ150V、ハロゲンランプ12V100W、タングステンランプ6V30W、キセノンランプ[波長250~1,000nm]、タングステンランプ[波長250~1,000nm]、Cr:LiSAFランプ[波長430nm]、ヘリウム-カドミニウムレーザー[波長325、442nm]、UVアルゴンレーザー[波長351、364nm]、アルゴンイオンレーザー[波長488、514nm]、ヘリウムネオンレーザー[波長543、594、633nm]、クリプトンイオンレーザー[波長568、647nm]、LD励起CW/Q-CW連続発振/準連続発振固体レーザー波長375nm、405、440、473、488、505、515、532、561、594、635、785、1064nm等を挙げることができ、これら中でも、人体に対する安全性の面から400~700nmの励起波長、好ましくはLD励起CW/Q-CW固体レーザー[波長488、532、635nm]を好適に例示することができる。また、本発明の判定システムにおける蛍光画像取得手段としては、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡等を挙げることができる。かかる蛍光画像取得手段により、取得できる蛍光画像としては、蛍光静止画像と自家蛍光画像、必要に応じて蛍光動画像を挙げることができる。また、本発明の判定システムにおける蛍光画像取得用バンドパスフィルタとしては、蛍光静止画像蛍光動画像及び自家蛍光画像の取得用バンドパスフィルタを挙げることができ、また、細胞核蛍光画像を取得するバンドパスフィルタとしては、使用する核酸染色剤の蛍光特性によって異なり、例えばDAPIの最大蛍光波長が461nm、ヘキスト33342、及びヘキスト33258の最大蛍光波長が465nm、PIPropidiumIodideの最大蛍光波長が617nmであることから、それら波長を十分カバーするバンドパスフィルタを用いることが好ましい。以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により制限されるものではない。[免疫染色した組織試料の作製法]ハーセプテストHER2抗体により乳がん組織を検出との差別化をはかるため、ヒト乳がん病理組織として、全てハーセプテスト陰性組織試料を使用した。他方、乳がんの増殖に関係する主要な3つの因子とは関係なくがんが発生している例があり、このトリプルネガティブの乳がんは、一般的に予後が悪いとされ、治療が困難であると考えられている。そこで、トリプルネガティブの乳がん組織試料についても検討を行った。具体的には、再発患者乳がん組織約1年以内に再発し、4年以内に死亡4検体うち1検体はトリプルネガティブ再発患者のうち、20~25がトリプルネガティブであるため、4検体中1検体に無作為にトリプルネガティブ標本を加えた。、トリプルネガティブの再発患者乳がん組織4年以内に再発し、6年以内に死亡8検体上記1検体を含む、5年以上無再発生存乳がん患者組織5検体の計16検体であり、これら組織について一般的な病理組織診断に用いる方法で、組織試料を調製した。すなわち、がん患者検体をホルマリンを用いて固定し、アルコールで脱水処理をした後、キシレン処理を行い、高温のパラフィン中に浸しパラフィン包埋を行い、組織試料を作製した図1a。なお、コントロールとしてがん患者の正常乳腺組織4検体を用いた。上記20検体の組織試料を2~4μmの切片にし、キシレンで脱パラフィン処理を行い、アルコール処理を行った後、脱イオン水で洗浄した。PAR1抗体が効率的に固定組織内のPAR1抗原部位へアクセスできるようにするために、上記試料の賦活化を10mMクエン酸溶液pH6.0中で121°C、15分間条件下で行い、固定組織構造を緩める処理を施した。続いて上記試料を脱イオン水、リン酸緩衝生理食塩水PBSで順次洗浄した後、非特異的なPAR1抗体の結合を防ぐために、該試料を50mMNH4Cl/PBS溶液中で25°C、30分間、10FBS/PBS中で25°C、60分間、及び10FBS1μMマウスIgG/PBS溶液中で25°C、3時間、順次浸し、ブロッキング処理を行った。次に、上記試料を705nmの蛍光を発する量子ドット蛍光粒子Qdot705で標識されたPAR1抗体PAR1ab-QD7054.5nMを含む溶液10FBS1μMマウスIgG/PBS中で25°C、1.5時間抗体反応を行った。なお、コントロールとして705nmの蛍光を発する量子ドット蛍光粒子Qdot705で標識されたマウスIgGマウスIgG-QD705を用いた。PBS溶液で4回洗浄した後、細胞数をカウントするためにDAPI染色2μg/mlPBSを25°C、10分間行うことで細胞核を染色した。PBSで3回洗浄した後、封入し、免疫染色した組織試料を作製した。[蛍光免疫組織染色法の問題点]上記実施例1で作製した免疫染色した組織試料について、共焦点ユニット横河電機社製、蛍光顕微鏡オリンパス社製、ElectronMultiplierCCDカメラAndor社製を組み合わせた装置を用い、488nmの励起光で照射した後、695-740nmのバンドパスフィルタを用いて量子ドット蛍光粒子PAR1ab-QD705により検出の蛍光画像蛍光静止画像を取得した。図1bには、再発乳がん患者の組織試料の蛍光静止画像を例として示しているが、一見してすぐに量子ドット蛍光粒子PAR1ab-QD705により検出の蛍光が分からないほど自家蛍光が強かった。実際に、自家蛍光と量子ドット蛍光粒子PAR1抗体により検出の蛍光輝度を比較した場合、2~3倍程度の差しか認められなかった。また、自家蛍光は組織試料の種類や組織試料内の場所によって大きく異なるため、一定の閾値を決められない。従って、量子ドット蛍光粒子PAR1抗体により検出の蛍光輝度を正確に計測するためには、自家蛍光を排除する必要がある。生体組織染色における自家蛍光の影響を除く方法として、a励起光照射による自家蛍光褪色法、又はbコントラスト調整法等が知られている図2。上記a励起光照射による自家蛍光褪色法に関して、量子ドット蛍光粒子が有する光安定性により、長時間光照射しても量子ドット蛍光粒子由来の輝度は褪色させず、自家蛍光のみを褪色させることは可能だが、自家蛍光の完全褪色には長時間必要であり、また照射面のみの自家蛍光しか褪色できないという欠点もある。また上記bコントラスト調整法では量子ドット蛍光粒子PAR1ab-QD705の蛍光輝度が自家蛍光の輝度と比べ十分強い場合は自家蛍光のみの輝度を消すことは可能だが、量子ドット蛍光粒子PAR1ab-QD705の輝度が自家蛍光の輝度と十分差が無い場合、コントラストの調整により量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度が消えてしまうことが考えられる。さらに、自家蛍光は試料の種類や場所によって大きく異なるため、一定の閾値を決められない。[自家蛍光を除いた補正蛍光画像の作成]必要なのは、バックグラウンドである自家蛍光の蛍光強度がゼロ0の蛍光静止画像である。そうすれば、蛍光静止画像内の全蛍光を量子ドット蛍光粒子由来の蛍光として計算することができる。上記実施例2のコントラスト調整法は、蛍光強度の割り算であるため、割り算ではゼロ0は作れず、したがってゼロ0を作り出せる引き算を用いた画像処理方法が必要となる。そこで、蛍光静止画像の自家蛍光を除く画像処理方法として、以下に示す方法を考案した。まず、励起波長が488nmの励起光レーザーを量子ドット蛍光粒子で免疫染色した乳がん組織試料に照射し、量子ドット蛍光粒子の蛍光画像量子ドット蛍光粒子の蛍光自家蛍光を蛍光波長の取得領域が695~740nmのバンドパスフィルタを用いて取得した後、かかる蛍光画像と全く同じ焦点面及び同じ視野で自家蛍光のみの自家蛍光画像を、蛍光波長の取得領域が640~690nmのバンドパスフィルタを用いて取得する。続いて、かかる蛍光画像量子ドット蛍光粒子の蛍光自家蛍光及び自家蛍光画像を512×512ピクセルで取り込み、256階調のJPEG画像に変換した後図3a、蛍光静止画像量子ドット蛍光粒子の蛍光自家蛍光の各ピクセルに含まれる輝度情報0-255の値から自家蛍光画像自家蛍光に含まれる輝度情報0-255の値を引くことで、量子ドット蛍光粒子の蛍光のみの画像補正蛍光画像を作成する方法である。かかる補正蛍光画像を作成するために、まず様々な波長範囲における自家蛍光の蛍光波長特性を調べた。量子ドット蛍光粒子で免疫染色しないがん組織試料に488nmの励起波長の励起光を照射した後、蛍光波長の取得領域が505~545nm、565~595nm、585~630nm、640~690nm、695~740nm、及び760~800nmのバンドパスフィルタ計6種類を用いて、同一視野及び同一焦点の自家蛍光画像を取得した。かかる6種類のバンドパスフィルタで取得したそれぞれの自家蛍光画像の、同一領域の512×512ピクセルの画像をJPEG画像へ変換し、かかるJPEG画像において、同一領域の512×420ピクセルトータル210540ピクセルの画像を切り出した後、かかる画像内の蛍光輝度の平均値を求め、自家蛍光画像の蛍光輝度平均値/ピクセルを算出した値1。また、上記6種類のバンドパスフィルタで取得したそれぞれの自家蛍光画像において、自家蛍光が存在しない背景バックグラウンドの画像を背景蛍光画像として取得し、かかる背景蛍光画像の蛍光輝度を測定した。かかる測定では、25×25ピクセルの背景蛍光画像における蛍光輝度を任意の3領域で求め、背景蛍光画像の蛍光輝度平均値/ピクセルを算出した値2。なお、かかる3領域は、上記6種類のバンドパスフィルタで取得した各自家蛍光画像において、同一領域を測定した。上記1及び2の値を用い、背景蛍光の蛍光輝度を除いた自家蛍光の蛍光輝度平均値以下、単に自家蛍光の蛍光輝度というは、式×ピクセル数=×ピクセル数を基に算出した。上記6種類のバンドパスフィルタそれぞれの自家蛍光の蛍光輝度を算出し、それぞれのバンドパスフィルタが取得する蛍光波長幅505~545nm:40nm、565~595nm:30nm、585~630nm:45nm、640~690nm:50nm、695~740nm:45nm、760~800nm:40nmで除することにより、波長幅あたりの自家蛍光の蛍光輝度平均値を算出した。かかる波長あたりの自家蛍光の蛍光輝度を、それぞれのバンドパスフィルタが取得する蛍光波長の中心にプロットし、点線で結ぶことにより、自家蛍光の蛍光波長特性を示す図を作成した図3b。次に、上記自家蛍光の蛍光波長特性に量子ドット蛍光粒子の蛍光波長特性を対応付けるために、上記実施例1に記載の方法により量子ドット蛍光粒子で免疫染色した乳がん組織試料を、488nmの励起光で励起し、蛍光波長の取得領域が695~740nmのバンドパスフィルタを用いて蛍光静止画像量子ドット蛍光粒子自家蛍光を取得した。続いて、かかる蛍光静止画像量子ドット蛍光粒子自家蛍光と同一視野及び同一焦点の蛍光動画像を取得し、かかる蛍光動画像を用いて下記の実施例4で示す方法量子ドット蛍光粒子が有する明滅反応を利用する方法により量子ドット蛍光粒子の1粒子を特定した。その後、蛍光静止画像を用いて、特定した量子ドット蛍光粒子の1粒子の蛍光輝度を測定した。すなわち、自家蛍光と重なっていない量子ドット蛍光粒子の1粒子に注目し、かかる1粒子の蛍光が全て網羅されるようなピクセル範囲についての蛍光輝度を求め、蛍光静止画像の蛍光輝度/ピクセルを算出した値3。また、蛍光静止画像において、自家蛍光も量子ドット蛍光粒子の蛍光も存在しない背景バックグラウンドの画像を背景蛍光画像として取得し、かかる背景蛍光画像の蛍光輝度を測定した。かかる測定では、量子ドット蛍光粒子1粒子の蛍光輝度を測定したときと同じピクセル数を有する任意の3領域の蛍光輝度を求め、背景蛍光画像の蛍光輝度平均値/ピクセルを算出した値4。上記値3及び値4を用いて、背景蛍光の蛍光輝度を除いた量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度以下、単に量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度というは、式×ピクセル数=×ピクセル数を基に算出した。さらに、蛍光静止画像量子ドット蛍光粒子自家蛍光において、量子ドット蛍光粒子の蛍光を含まない自家蛍光のみの領域から、量子ドット蛍光粒子1粒子の蛍光輝度を測定したときと同じピクセル数を有する任意の3領域の蛍光輝度を求め、自家蛍光画像の蛍光輝度平均値/ピクセルを算出した値5。かかる値5を用い、自家蛍光の蛍光輝度に対する量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度は、式量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度/[自家蛍光画像の蛍光輝度平均値/ピクセル]×ピクセル数=[値3値4]×ピクセル数/[値5値4]×ピクセル数を基に算出した。以上の操作を15の異なる蛍光静止画像量子ドット蛍光粒子自家蛍光に対して行い、得られた計15蛍光粒子分の値から、その平均値自家蛍光の蛍光輝度に対する量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度平均値を求めた結果、1.88±0.10平均値±semとして算出された。量子ドット蛍光粒子Qdot705の蛍光輝度変化は、例えばインビトロジェンのホームページhttpwwwinvitrogenjpqdotindexshtmlに掲載されているパンフレットファイル名:200820CBQdotの記載を参考にし、Qdot705の蛍光輝度を示す面積/自家蛍光の蛍光輝度を示す面積比が、1.88になるように量子ドット蛍光粒子や自家蛍光の蛍光輝度を示す面積を決定し、自家蛍光とともにQdot705の蛍光波長特性を示す図を作成した図3b。なお、かかる面積の決定には、便宜的に蛍光波長が695~740nmの自家蛍光の蛍光輝度を示す面積を四角形とみなして行った。Qdot705の蛍光輝度を示す面積/自家蛍光の蛍光輝度を示す面積比が1.88であることは、蛍光静止画像において全蛍光輝度量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度自家蛍光の蛍光輝度のうち、バックグランドとなる自家蛍光の蛍光輝度が占める割合は50を超えることを示しており、量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度を定量するためには、自家蛍光の蛍光輝度を除く必要があることが再確認された。自家蛍光を除いた補正蛍光画像は、以下の手順にしたがって作成した。すなわち、PAR1ab-QD705で染色を行った組織試料に対して488nm励起光で20秒間照射し、蛍光波長の取得領域が695~740nmのバンドパスフィルタにより取得した蛍光静止画像量子ドット蛍光粒子自家蛍光、及び上記蛍光静止画像と同一視野及び同一焦点で蛍光波長の取得領域が640~690nmのバンドパスフィルタにより取得した自家蛍光画像を得た。また、細胞数をカウントするために、400nm励起光で組織試料を励起し、蛍光波長の取得領域が420~500nmのバンドパスフィルタにより取得した細胞核画像DAPIより検出を得た図4右から1番目。蛍光静止画像量子ドット蛍光粒子自家蛍光と自家蛍光画像内の同じ領域の自家蛍光を比較し、任意のROI例25×25ピクセルの自家蛍光の最大値が蛍光静止画像量子ドット蛍光粒子自家蛍光×1.2倍=自家蛍光画像になるようにする。すなわち、自家蛍光画像の方が蛍光静止画像量子ドット蛍光粒子自家蛍光と比べ、約20程度自家蛍光の輝度が高い値になるようにする。このように自家蛍光由来の輝度を調整した状態でJPEG像に変換する図4左から1番目、及び左から2番目。なお、JPEG像へ変換する際、すべての蛍光が取り込まれるように閾値を設定した。自家蛍光を除き、量子ドット蛍光粒子のみの蛍光静止画像を取得するために、蛍光静止画像量子ドット蛍光粒子自家蛍光-自家蛍光画像の処理をPhotoshopの画像解析ソフトを用いて行った。この際、量子ドット蛍光粒子1個分の輝度が消えていないこと、また自家蛍光部分の蛍光強度が引き算後、ゼロ0になっていることを任意の複数領域で確認した。がん組織試料の自家蛍光を効果的に除くことができたので、次にがん細胞組織と正常細胞組織とが近接して存在する組織試料においても、同様に自家蛍光を除くことができるかどうかを調べた。量子ドット蛍光粒子PAR1ab-QD705により検出で、がん細胞組織特異的に染色できることを確認した後図5b、自家蛍光を除く画像処理を行うと、がん細胞組織及び正常細胞組織の自家蛍光のみが効果的に除かれることにより、がん細胞組織の量子ドット蛍光粒子のみの蛍光静止画像補正蛍光画像を取得できることがわかった図5c。この結果は、補正蛍光画像を取得するための蛍光静止画像は、図4で示されるような視野全体ががん組織の蛍光静止画像に限られないことを示している。[量子ドット蛍光粒子1粒子あたりの平均蛍光輝度の算出法]量子ドット蛍光粒子の1粒子あたりの平均蛍光輝度を算出するために、蛍光輝度が1粒子由来であるかどうかを決定する必要があるが、ここでは量子ドット特有のブリンキング明滅性を利用した。ブリンキング明滅の境界となる閾値として、量子ドット蛍光粒子の最大蛍光輝度の10を設定すると図6の矢頭参照、1粒子の量子ドット蛍光粒子であれば、20秒間の照射時間においてoff-state滅状態は約4秒になる。そのため、約4秒間のoff-state滅状態を持つ粒子の平均強度を測定すれば、1粒子蛍光輝度が得られる。そこで、蛍光静止画像に対応する蛍光動画像を取得するために、励起光で照射した後に200ミリ秒の分解能で100枚の連続した蛍光静止画像を蛍光波長の取得領域が690~730nmのバンドパスフィルタを用いて取得し、蛍光動画像200ms/frame×100枚を得た。上記蛍光動画像を用いて、約4秒間のoff-stateを持つ粒子を蛍光粒子1粒子として特定した後、静止画像において対応する粒子の蛍光輝度をImageJ画像解析ソフトを用いて決定した。これを5~10個の粒子に対して行ない、1粒子あたりの平均蛍光輝度を算出した。[1細胞あたりの粒子数の算出法]補正蛍光画像から得られた量子ドット蛍光粒子の全蛍光輝度の値画面内の全蛍光輝度と、細胞核染色画像DAPIより検出から得られた細胞数と、さらには量子ドット蛍光粒子1粒子あたりの平均蛍光輝度の値1粒子蛍光輝度を、式[画面内の全蛍光輝度/1粒子蛍光輝度/細胞数=画像内の全蛍光粒子数/細胞数=蛍光粒子数/細胞]に入力することで、1細胞あたりの量子ドット蛍光粒子数を算出することができる。さらに、コントロールである量子ドット蛍光粒子で標識されたマウスIgGを用いた場合でも同様に行ない、PAR1抗体により検出された量子ドット蛍光粒子数/細胞-マウスIgGにより検出された量子ドット蛍光粒子数/細胞を行うことにより、量子ドット蛍光粒子数PAR1抗体により検出から非特異的な粒子数を除き、PAR1抗体で検出される1細胞あたりの真の蛍光粒子数を算出した。かかる蛍光粒子数の算出は、表1に記載の各試料Sample1~20について、それぞれ300~1000細胞で行い、PAR1抗体で検出される真の粒子数の平均値を求めた。その結果を表1PAR1ab-QDsスコアと表示に示す。[乳がん組織細胞あたりのPAR1抗体により検出される粒子数の算出]PAR1抗体で検出される真の粒子数表1中にPAR1ab-QDsスコアと表示は、再発患者乳がん組織約1年以内に再発し、4年以内に死亡3検体Sample10~12、表1参照の平均値は14.8であり、5年以上無再発生存乳がん患者組織5検体Sample5~9、表1参照の平均値3.2よりも多く、他方、がん患者の正常乳腺組織4検体Sample1~4、表1参照の平均値は0.2であり、乳がん組織と比べて著しく少なかった表1、図7a。さらに、トリプルネガティブ乳がん組織における粒子数を算出するために、トリプルネガティブの再発患者乳がん組織4年以内に再発し、6年以内に死亡8検体Sample13~20、表1参照について粒子数の平均を算出したところ、6.0とがん患者の正常乳腺組織や5年以上無再発生存乳がん患者組織と比較しても高い値を示した表1、図7a。トリプルネガティブはハーセプチンでは対処できない重要な問題であり、本発明のPAR1抗体を用いた免疫組織染色方法はこの解決策となる可能性を秘めている。さらに、再発患者乳がん組織試料Sample10~20、表1参照を基に、PAR1抗体で検出される真の粒子数と乳がん再発までの年数に関連性があるかどうか検証したところ、PAR1抗体で検出される真の粒子数が高くなると乳がん再発までの期間が短くなることが、強い相関性を有して示された図7b相関係数R=0.75。ここで、トリプルネガティブの再発患者乳がん組織に限定して検証しても、同様の結果が得られた図7c相関係数R=0.71。これらの結果から、本発明のPAR1抗体を用いた免疫組織染色方法は、トリプルネガティブを含めた乳がんの再発期間を予測できる可能性を秘めていることを示している。[励起波長の条件検討]さらに、励起光の励起波長が488nm以外でも応用可能かどうかを532nmの励起波長で検証したところ、Sample13組織試料の細胞当たりのPAR1抗体で検出される粒子数は488nmの励起波長では15.5であるのに対し、532nmの励起波長では15.8であり図8、両者の間で算出される細胞当たりのPAR1抗体で検出される粒子数の値に大きな違いは見られなかった図8。このことは、励起光の波長は、488nmに限定されないことを示している。[自家蛍光波長を除く波長特性に関する検討]さらに、自家蛍光画像を取得するバンドパスフィルタの波長領域に関して、励起光の励起波長が488nmの場合図9、蛍光波長の取得領域が640~690nmのバンドパスフィルタに加えて、505~545nm、585~630nm、640~690nm、又は760~840nmのバンドパスフィルタを、励起光の励起波長が532nmの場合図10、の蛍光波長の取得領域が640~690nmのバンドパスフィルタに加えて、585~630nm、640~690nm、若しくは760~840nmのバンドパスフィルタを検討した。488nm、532nm励起光いずれの場合でも、蛍光波長の取得領域が635~685nmのバンドパスフィルタよりも短波長側の波長領域で取得した自家蛍光画像を基に補正蛍光画像を取得すると、矢頭で示したように自家蛍光が残ってしまった。これは、蛍光静止画像を取得した波長領域からより離れた波長領域で自家蛍光画像を取得すると、焦点面のずれた自家蛍光が検出されてしまい、自家蛍光の引き算をした後も焦点面のずれた自家蛍光が残ってしまうためである。また、逆に長波長側の760~840nmで取得した自家蛍光画像を基に補正蛍光画像を取得すると、自家蛍光は差し引けるが画面にフォーカス面のずれに伴う蛍光が観られた。蛍光波長の取得領域が505~545nm、又は585~630nmのバンドパスフィルタほどフォーカスにズレが観られなかったのは、使用しているカメラ感度が800nmを境として急激に落ちるため、蛍光波長の取得領域が760~840nmのバンドパスフィルタを使用しても、実際に検出した自家蛍光は760-800nm若干の800nm以上であったためと考えられる。結論としては、蛍光粒子の蛍光波長に対して短波長側及び長波長側のどちらでも自家蛍光を差し引くことはできるが、色収差の問題のため、蛍光粒子の蛍光波長の近傍波長で差し引きを行った方が良いと考えられる。本発明による量子ドットの粒子数を算出する免疫組織染色法が実際にDAB染色法と比べどの程度違いがあるかどうかを検証するために、DAB染色法との比較実験を行った。表1で示したSample12組織試料及びSample14組織試料を上記実施例1に示した方法により脱パラフィン処理までの処理工程を行った後、脱イオン水で洗浄した。該組織試料の内因性ペルオキシダーゼを除去するために、30過酸化水素水H2O2を含むメタノール溶液で10分間処理した後、蒸留水で3回洗浄した。PAR1抗体が効率的に固定組織内のPAR抗原部位へアクセスできるようにするために、該試料の賦活化を10mMクエン酸溶液pH6.0中で121°C、15分間条件下で行い、固定組織構造を緩める処理を施した。続いて該試料を脱イオン水、リン酸緩衝生理食塩水PBSで順次洗浄した後、非特異的なPAR抗体の結合を防ぐために、該試料を50mMNH4Clを含むPBS溶液中で25°C、30分間処理し、さらに10FBSを含むPBS溶液中で25°C、2時間処理し、ブロッキング反応を行った。次に、該試料を33nMPAR1抗体を含む10FBS/PBS溶液中で25°C、2時間、1次抗体反応を行った。PBS溶液で4回洗浄した後、22nMマウス抗体用2次抗体を含む10FBS/PBS溶液中で、25°C、1時間、2次抗体反応を行った。PBS溶液で4回洗浄した後、DAB発光はペルオキシダーゼ染色DABキットを用いて発色時間25°Cにて5分間行った。該組織試料を水道水で洗浄した後、ヘマトキシリン染色を行った。該組織試料を水道水で洗浄した後、透徹、脱水し、封入しDAB染色した組織試料を完成させ、顕微鏡による観察した結果を図10に示す。量子ドットの粒子数が多かったSample12組織試料では、核、細胞質、膜に染色が観られた図11a。一方、量子ドットの粒子数が少なかったSample14組織試料には特異的な染色も少なかった図11b。また、EvenRametalNatureMed4909914にも示されているように、PAR1抗体を用いたDAB法により乳がん細胞を染色すると図11c及びd、PAR1の高発現株では核まで染色されてしまい、すなわち非特異的なDAB法による染色が問題となっていた。他方、本発明の組織染色方法を用いると、DAB法と相関して乳がん細胞を染色することができるとともに、従来技術のDAB法に比べ、より高精度で定量的に乳がん細胞を特定することができた。本発明の組織染色方法では、がん細胞の核内に非特異的なPAR1のシグナルはほとんど検出されないが、それは自家蛍光を適切に除去するとともに、明滅性を利用して真の量子ドット蛍光粒子を特定することを可能する本発明の技術的特徴によるものであると考えられる。"