"脊椎動物の椎間板髄核から単離された、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性であることを特徴とする、椎間板髄核細胞。表面マーカーが少なくともTie2陽性であり、自己複製能ならびに脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞および神経細胞に分化可能な多分化能を有する幹細胞以下椎間板髄核幹細胞という。であることを特徴とする、請求項1に記載の椎間板髄核細胞。表面マーカーがGD2陰性であり、休眠状態であることを特徴とする、請求項2に記載の椎間板髄核細胞。表面マーカーがGD2陽性であり、活性化された状態であることを特徴とする、請求項2に記載の椎間板髄核細胞。表面マーカーがTie2陰性かつGD2陽性であり、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または神経細胞のいずれかに分化可能な前駆細胞以下椎間板髄核前駆細胞という。であることを特徴とする、請求項1に記載の椎間板髄核細胞。さらに、表面マーカーがCD24陰性、CD44陽性/陰性もしくは陽性、CD271陽性かつFlt1陽性である、請求項2~4のいずれかに記載の椎間板髄核細胞。さらに、表面マーカーがCD24陰性もしくは陽性、CD44陽性、CD271陽性/陰性もしくは陰性かつFlt1陽性/陰性もしくは陰性である、請求項5に記載の椎間板髄核細胞。前記脊椎動物が哺乳動物である、請求項1~7のいずれかに記載の椎間板髄核細胞。前記哺乳動物がヒトまたはマウスである、請求項8に記載の椎間板髄核細胞。脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団またはそれを培養して得られた細胞集団から、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性である細胞を単離することを含むことを特徴とする、椎間板髄核細胞の培養方法。上記単離される細胞が、表面マーカーが少なくともTie2陽性である椎間板髄核幹細胞であることを特徴とする、請求項10に記載の椎間板髄核細胞の培養方法。上記単離される細胞が、表面マーカーがTie2陰性かつGD2陰性である椎間板髄核前駆細胞であることを特徴とする、請求項10に記載の椎間板髄核細胞の培養方法。アンジオポエチンIAng1の存在下に椎間板髄核幹細胞を培養することを含む、請求項11に記載の椎間板髄核細胞の培養方法。請求項1~9のいずれかに記載の椎間板髄核細胞あるいは請求項10~13のいずれかに記載の培養方法により得られた椎間板髄核細胞を分化誘導条件下で培養することを含むことを特徴とする、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または神経細胞の培養方法。請求項1~9のいずれかに記載の椎間板髄核細胞あるいは請求項10~13のいずれかに記載の培養方法により得られた椎間板髄核細胞を含有することを特徴とする、細胞組成物。椎間板障害の治療用または予防用である、請求項15に記載の細胞組成物。請求項1~9のいずれかに記載の椎間板髄核細胞、請求項10~13のいずれかに記載の培養方法により得られた椎間板髄核細胞、あるいは請求項15または16に記載の細胞組成物を椎間板に移植することを含む、脊椎動物ヒトを除くの椎間板障害の治療または予防方法。椎間板にある椎間板髄核幹細胞に対してAng1を投与することを含む、脊椎動物ヒトを除くの椎間板障害の治療または予防方法。脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団中の、椎間板髄核幹細胞の割合を測定することを含むことを特徴とする、椎間板の状態に関する指標を得る方法。近年、多くの臓器でその恒常性維持に内在性幹細胞前駆細胞の役割が注目されている。また幹細胞の可塑性維持やメンテナンスに周囲の微小環境、いわゆるニッチが重要であることも多数報告される89。椎間板組織における内在性幹細胞の詳細な同定、ニッチの局在の報告は現在までに無く、造血系幹細胞が骨芽細胞と相互作用を持つように、間葉系幹細胞でもその局在周囲に各種の細胞間接着や関連パスウェイの関与が予想される。本発明の目的は、椎間板NP内における幹細胞性質を持つ細胞集団を特定するための表面マーカーを探索すること、そしてNP組織中の幹細胞ニッチを同定しヒトにおける椎間板の加齢変化におけるNP内在性幹細胞の意義を見出すことなどを通じて、単離された椎間板NP幹細胞ないし前駆細胞、ならびにその培養方法、用途などの周辺技術を提供することにある。本発明者らは、後記実施例に示すような実験結果に基づき、上記課題を解決しうる本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、脊椎動物の椎間板髄核から単離された、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性であることを特徴とする、椎間板髄核細胞ないし当該細胞を含む細胞集団を提供する。上記椎間板髄核細胞の一つの態様は、表面マーカーが少なくともTie2陽性であり、自己複製能ならびに脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞および神経細胞に分化可能な多分化能を有する幹細胞本発明において椎間板髄核幹細胞とよぶ。である。このような幹細胞のうち、表面マーカーがGD2陰性であるものは休眠状態にあり、GD2陽性であるものは活性化された状態にある。また、上記椎間板髄核細胞のもう一つの態様は、表面マーカーがTie2陰性かつGD2陽性であり、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または神経細胞のいずれかに分化可能な前駆細胞本発明において椎間板髄核前駆細胞とよぶ。である。上記椎間板髄核幹細胞は、さらに表面マーカーがCD24陰性、CD44陽性/陰性幹細胞の場合もしくは陽性前駆細胞の場合、CD271陽性かつFlt1陽性でもある。また、上記椎間板髄核前駆細胞は、さらに表面マーカーがCD24陰性もしくは陽性、CD44陽性、CD271陽性/陰性もしくは陰性かつFlt1陽性/陰性もしくは陰性である。上記脊椎動物は、好ましくは哺乳動物であり、たとえば、実施例に示すようにヒトまたはマウスである。本発明は一つの側面において、脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団またはそれを培養して得られた細胞集団から、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性である細胞を単離することを含むことを特徴とする、椎間板髄核細胞ないし当該細胞を含む細胞集団の培養方法を提供する。上記椎間板髄核細胞の培養方法の一つの態様は、単離される細胞が、表面マーカーが少なくともTie2陽性のものである、椎間板髄核幹細胞用の培養方法であり、もう一つの態様は、単離される細胞が、表面マーカーがTie2陰性かつGD2陽性のものである、椎間板髄核前駆細胞用の培養方法である。上記椎間板髄核幹細胞の培養方法は、アンジオポエチンIAngiopoietin1Ang1の存在下にそれらの細胞を培養することを含むものであってもよい。なお、Tie2はアンジオポエチンIの受容体である。さらに本発明は、上記椎間板髄核細胞幹細胞および/または前駆細胞を分化誘導条件下で培養するステップを含む、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または神経細胞の培養方法も提供する。本発明は一つの側面において、上記椎間板髄核細胞幹細胞および/または前駆細胞を含有することを特徴とする細胞組成物を提供する。このような細胞組成物としては、たとえば、椎間板障害の治療用または予防用のものが好適である。本発明は一つの側面において、上記椎間板髄核細胞幹細胞および/または前駆細胞あるいは上記細胞組成物を椎間板に移植することを含む、脊椎動物ヒトを除くの椎間板障害の治療または予防方法を提供する。また本発明は、生体中の椎間板にある椎間板髄核幹細胞に対してAng1を投与することを含む、脊椎動物ヒトを除くの椎間板障害の治療または予防方法を提供する。なお、これらの椎間板障害の治療または予防方法は、ヒトに対して同様に適用することが可能である。本発明は一つの側面において、脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団中の、椎間板髄核幹細胞の割合を測定することを含むことを特徴とする、椎間板の状態に関する指標を得る方法を提供する。なお、本明細書において、椎間板髄核幹細胞および/または前駆細胞を椎間板髄核幹/前駆細胞と表記することがある。また、当該技術分野で慣用されているように、表面マーカーの陽性を、陰性をの記号で表すことがあるたとえば、Tie2GD2はTie2陽性かつGD2陽性を意味する。本発明により、椎間板髄核幹/前駆細胞の単離、培養、増殖、ならびに椎間板障害の治療や予防が可能となる。椎間板髄核幹/前駆細胞本発明の対象となる椎間板髄核細胞は、脊椎動物の椎間板髄核から単離された、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性のものであり、幹細胞および前駆細胞が包含される。なお、Tie2およびGD2がともに陰性であるものは、分化を終えた、成熟した椎間板髄核細胞である。椎間板髄核幹細胞は、表面マーカーが少なくともTie2陽性であり、自己複製能ならびに少なくとも脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞および神経細胞に分化可能な他の細胞への分化可能性を否定するものではない多分化能を有する幹細胞である。休眠状態にある上記幹細胞はGD2陰性であるが、活性化された上記幹細胞はGD2陽性である。休眠状態の幹細胞を活性化するには様々な刺激が考えられるが、たとえば、休眠状態の細胞を組織から分離し、系代培養することが一つの手法として挙げられる。一方、椎間板髄核前駆細胞は、表面マーカーがTie2陰性かつGD2陽性であり、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または神経細胞のいずれかに分化可能な前駆細胞である。なお、このような椎間板髄核幹/前駆細胞を含む椎間板髄核細胞は脊索由来の細胞である。本発明の椎間板髄核細胞が由来する脊椎動物は、椎間板髄核を有するものであれば特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物であり、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物たとえばマウス、ラット、ブタが包含される。椎間板髄核幹細胞は、上記Tie2およびGD2にも、たとえば、CD24陰性、CD44陽性/陰性幹細胞の場合もしくは陽性前駆細胞の場合、CD271陽性かつFlt1陽性といった表面マーカーの特徴を有する。一方、椎間板髄核前駆細胞は、上記Tie2およびGD2にも、たとえば、CD24陰性もしくは陽性、CD44陽性、CD271陽性/陰性もしくは陰性かつFlt1陽性/陰性もしくは陰性であるといった表面マーカーの特徴を有する図7d参照。培養方法本発明の椎間板髄核幹/前駆細胞ないしそれらの細胞を含む細胞集団は、代表的には、脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団またはそれを培養して得られた細胞集団から、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性であるもの、すなわち、表面マーカーが少なくともTie2陽性である椎間板髄核幹細胞および/またはTie2陰性かつGD2陽性である椎間板髄核前駆細胞を単離することを含む培養方法により培養し、作製することができる。椎間板髄核細胞は、脊椎動物から椎間板の髄核を採取した後、消化、分散、洗浄などの処理を施して当該組織から分離することができる。椎間板髄核細胞の培養方法は公知であり、適切な培地および条件下で培養すればよい。Tie2、GD2、およびその他の表面マーカーが陽性であるか陰性であるかは、それらのマーカーとなるタンパク質に対応する蛍光標識抗体好ましくはモノクローナル抗体、必要に応じて二次抗体を併用してもよいを用いて細胞染色をするなど、公知の方法により判定することができる。フローサイトメーター、セルソーター細胞分離装置などの装置を用いることにより、そのように染色された細胞集団から、所定のマーカーのタイプを有する細胞集団を分画して、椎間板髄核幹/前駆細胞を純化することができる。そのようにして純化された椎間板髄核幹/前駆細胞をさらに培養し増殖させれば、多数の椎間板髄核幹/前駆細胞を含む純度の高い細胞集団を作製することができる。なお、本発明において単離された椎間板髄核幹/前駆細胞集団とは、脊椎動物の体内から取り出されて各種の用途に使用可能になった椎間板髄核幹/前駆細胞集団であって、特に表面マーカー幹細胞:少なくともTie2陽性、前駆細胞:Tie2陰性かつGD2陽性により他の髄核細胞集団と区別可能になったものを意味する。また、本発明の椎間板髄核幹/前駆細胞の細胞を含む細胞集団は、各種の用途増殖のための培養、細胞組成物の調製等に適した純度を有していればよく、それらの細胞集団が他の細胞椎間板髄核幹/前駆細胞から分化して成熟した、Tie2陰性かつGD2陰性になった細胞などを一つも含まないことまでは必ずしも要求されない。たとえば、椎間板髄核幹細胞、椎間板髄核前駆細胞、または椎間板髄核幹細胞および前駆細胞の合計のいずれかについて、生体中の通常の椎間板髄核細胞集団よりも高い純度、好ましくは90以上、より好ましくは95以上の純度を有するものであればよい。上記純度の上限は100に近づけることが可能であるが、99、98または97であってもよい。本発明の椎間板髄核幹細胞の培養方法のもう一つの態様は、それらの細胞をアンジオポエチンIの存在下に培養するステップを含むものである。このような培養方法は、椎間板髄核幹細胞を単離するために脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団を培養する際に適用してもよいし、すでに単離、純化された椎間板髄核幹細胞を培養するために用いてもよい。アンジオポエチンIを細胞培養の環境中に存在させる方法は特に限定されるものではないが、アンジオポエチンI好ましくは水に可溶化したものを培養液に添加するようにしてもよいし、アンジオポエチンIを産生する細胞と共培養するようにしてもよい。十分な濃度のアンジオポエチンIの共存下で椎間板髄核幹細胞を培養すると、その細胞を維持し、増殖させることができる。逆にアンジオポエチンIが培養系内に存在しないと、あるいは存在していてもさらにアンジオポエチンIの活性を阻害する物質ブロッキング抗体等までもが存在していると、椎間板髄核幹細胞を維持することができず、それらの細胞はやがてアポトーシスに向かう。本発明の脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または神経細胞ニューロン、グリアの培養方法は、椎間板髄核幹/前駆細胞を分化誘導条件下で培養するステップを含むものである。脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞および神経細胞への分化誘導条件は公知であり、椎間板髄核幹/前駆細胞からそれらの細胞へと分化させたい場合は、所定の分化誘導物質に曝露させるなど、それぞれ適切な分化誘導条件下で培養すればよい。このようにして作製された脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞は移植に用いることができる。細胞組成物本発明の細胞組成物は、前述したような椎間板髄核幹および/または前駆細胞を含有するものである。このような細胞組成物は、特に椎間板障害腰痛、椎間板変性疾患等の治療用または予防用のものとして好適である。すなわち、損傷ないし変性した椎間板の髄核に上記細胞ないし細胞組成物を移植し、移植された椎間板髄核幹/前駆細胞ならびにそれから分化した細胞がECM2型コラーゲン、プロテオグリカンを産生することにより、椎間板組織の修復や、再構築された組織の維持が可能となる。上記細胞組成物は、用途に応じて、たとえば治療用の薬剤、細胞の培養、増殖、分化に適した成分、すでに分化した脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞のような、椎間板髄核幹/前駆細胞以外の成分、あるいは細胞の足場となる人工的な基質をさらに含有していてもよい。また、細胞組成物に含まれる椎間板髄核幹/前駆細胞の数や純度は、用途に応じて適宜調整することができる。上記細胞組成物は、たとえば、椎間板に注射可能な形態に製剤化した医薬組成物として調製することが好適である。治療方法など本発明による椎間板障害の治療または予防方法は、一つの態様において、前述したような椎間板髄核幹および/または前駆細胞、あるいは細胞組成物を、椎間板に移植することを含むものである。移植に用いる椎間板髄核幹/前駆細胞の数や純度、あるいは細胞組成物の成分やその割合は、治療または予防の態様に応じて適宜調整することができる。本発明による椎間板障害の治療または予防方法は、もう一つの態様において、椎間板髄核にある椎間板髄核幹上記のようにして移植されたものであっても、もともと生体内にあるものであってもよいに対してアンジオポエチンIを投与することを含むものである。このような方法は、いわゆるサイトカイン療法と呼ばれるものに相当する。アンジオポエチンIは、前述したように椎間板髄核幹細胞の維持および増殖に必要なタンパク質サイトカインであり、椎間板組織を構成するほとんど全ての細胞が発現しているが、それらの細胞の減少によりアンジオポエチンI発現量が低減すると、椎間板髄核幹細胞も減少し、やがて椎間板障害を招くおそれがある。したがって、椎間板髄核幹細胞に十分な量のアンジオポエチンIを投与することにより、椎間板髄核幹細胞の減少を防止または減少速度を低減し、椎間板障害を治療または予防できる可能性がある。アンジオポエチンIの投与量は、治療または予防の態様に応じて適宜調整することができる。本発明による、椎間板の状態に関する指標を得る方法は、脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団中の、椎間板髄核幹細胞の割合を測定することを含むものである。椎間板髄核幹細胞の割合は、椎間板変性の程度、ないし加齢の程度にともなって変化し、概してその程度が進むほど割合は低下する傾向がある。したがって、被験者の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団中の、椎間板髄核前駆細胞集団Tie2の割合を、たとえばフローサイトメトリーまたはPCR法を用いた表面マーカー解析を通じて測定し、基準となるデータを用いて統計学的な処理をすることにより、その被験者の椎間板の状態に関する指標を得ることができる。基準となるデータおよび統計学的手法は、分析の態様に応じて適切なものを用意または選択すればよい。たとえば、椎間板の変性の程度に関する基準値ないし年齢層ごとの平均値および標準偏差をあらかじめ決定しておき、あるサンプルについて測定された椎間板髄核幹細胞の割合とその基準値ないし平均値および標準偏差との対比により、椎間板の変性の程度ないしその年齢層の椎間板の状態として正常な範囲かどうかを把握することなどが考えられる。材料および方法[1]マウスP0CreFloxedEGFPマウスおよびWntCreFloxedEGFPマウスの入手は、先の論文で述べた方法に従って入手した14.移植実験のレシピエントとして使用する糖尿病性重症免疫不全マウスマウスは、クレアジャパンより購入した。これらのマウスは、東海大学医学部実験動物部門のアイソレーター内にて飼育され、実験に供された。また、こられのマウスを用いた動物実験は、東海大学動物実験委員会の承認を得て行った。[2]マウス髄核細胞の採取マウスNP組織は、尾部椎間板から外科手術用顕微鏡下にて採取した。簡単には尾部表皮および柔部組織を除去した後、終末板頭部および椎間板の間に切り込みを入れ椎間板を採取した。その後、ゼラチン様のNP組織のみを精密なスプーン器具により採取した。[3]ヒト髄核組織今回の研究を行う上で、ヒトサンプルの使用においては東海大学病院、医の倫理委員会の承認を得て行った。また、髄核組織の提供を受けるに当たり、十分な説明と同意を患者から得た上で実験に供した。症例の内訳は、椎骨の破裂骨折が10例、腰椎間板ヘルニアが8例、脊椎分離症が2例の合計20例である。患者の年齢は18才から70才まで、また、個々の症例における椎間板の変性度合いは、トンプソンらの判定法16に基づいて判定を行った。髄核組織は、外科手術における腰椎間板摘出後、繊維輪を注意深く避けて髄核組織の分離を行った。椎骨の破裂骨折の症例においては、椎骨の上部終末板頭部が骨折し、下部終末板頭部が健常な場合に、健常な終末板頭部側から椎間板は基本的に健常部位と想定し、NP組織を採取した。しかしながら、変性の強い椎間板の場合においては、NP組織と内部繊維輪との識別は困難であり、したがって髄核組織内部の領域のみを髄核組織として採取した。患者骨髄液の採取は、十分な説明と同意得た後、椎間板の手術中に行った。RTPCR解析用の患者骨髄由来間葉系細胞の誘導は、採取された骨髄液から標準的な方法にて行った36。[4]細胞分離および培養採取されたヒトないしはマウス髄核組織は、はさみなどを利用して小片へと細切した。ヒト髄核組織は、タンパク消化酵素であるトリプルエクスプレスTrypLEExpressギブコによる1時間の消化、および025mgmlコラゲナーゼPロッシュによる2時間の消化を行い、その後、αMEM培地ギブコにより2回洗浄し、3000~5000細胞cm2の細胞密度にて播種した。マウス髄核細胞は、上記消化酵素による消化時間をそれぞれ30分とした以外は、ヒト髄核組織と同様の処理を行った。消化、分散および洗浄を経て分離されたヒトおよびマウス髄核細胞はそれぞれ、10FBSセルカルチャーバイオサインス添加同培地にて37°C5CO2および5O2条件下にて培養を開始した。さらに髄核細胞の骨、軟骨および脂肪細胞などへの生体外多分化能の実験法は、後記[13]髄核細胞の多分化能の項を参照されたし。[5]混合培養10FBS添加αMEM培地にて4日間の単層状態で初代培養の終了した髄核細胞を混合培養へ利用した。培養は底部に04μmのポアサイズを持つポリエチレンテレフタレート膜がはられた6穴培養皿用セルカルチャーインサートBDバイオサイエンスおよび6穴培養皿を利用した。具体的には10x104のNP細胞を、単層飽和状態のAHESS5細胞が膜の裏側に存在するセルカルチャーインサートの中に入れ、髄核細胞およびAHESS5細胞との膜を隔てた細胞と細胞の接触培養を行った。AHESS5細胞とは、造血幹細胞を支持する能力のあるマウス骨髄間葉系細胞を、遺伝子工学的手法によってヒトアンジオポエチンIを産生するようにした細胞である424344。また、可溶性アンジオポエチンIもAHESS5の変わりに使用した。また、AHESS5由来のアンジオポエチンIの影響を検証する目的にて、10μgmlの濃度にてヤギ由来の抗Tie2ポリクローナル中和抗体またはコントロールとしてヤギ由来の正常血清IgRDシステムを利用した。7日間の混合培養の後、NP細胞はトリプルエクスプレスによって分散、コロニーアッセイおよびフローサイトメトリー法による解析に供した。[6]コロニー形成試験一定個数のヒトないしはマウスの細胞をメソカルトH4230メチルセルロース培地ステムテクノロジー、増殖因子無添加に浮遊させた後、35mm直径の培養皿に入れ、37°C5CO2および5O2条件下にて10日間の培養を行い、コロニーを形成させた。形成されたコロニーは、倒立位相差顕微を用いてその数を計測した。なおコロニーは10以上の細胞から成るものをコロニーとした。[7]フローサイトメトリー解析および髄核細胞の純化髄核細胞は、FACSキャリバーフローサイトメーターBDバイオサインスを用いて細胞表面抗原の解析、またFACSバンテージ細胞分離装置BDバイオサインスを用いて細胞分離を行った。ヒトNP細胞は、PE標識マウス由来抗ヒト特異的モノクローナル抗体であるVEGFR1RDシステム49560CD271ミルテニーME2041H4CD44BDバイオサイエンス515CD49fBDバイオサイエンス、GoH3CD56ベックマンコールターN901CD73BDバイオサイエンスAD2CD90BDバイオサイエンス5E10CD105ベックマンコールター1G2CD166BDバイオサイエンス3A6を使用して染色した。染色洗浄後、NP細胞はFACSキャリバーフローサイトメーターBDバイオサイエンスを使用して解析した。また、細胞の純化では、ヒト髄核細胞をマウス由来抗ヒト特異的ディシアロガングリオシドGD2抗体GD2モノクローナル抗体BDファミンジェン、14G2aを30分間反応、引き続きヤギ由来FITC標識抗マウス二次抗体BDバイオサイエンスを4°C30分間反応させた。洗浄後アロピコエリシンAPC標識抗ヒトTie2モノクローナル抗体RDシステム、83715およびPE標識抗ヒトCD24モノクローナル抗体BDバイオサイエンス、ML5を反応させた。マウスNP細胞では、ヒトと同様に抗GD2モノクローナル抗体、ヤギ由来ビオチン化抗マウスTie2ポリクローナル抗体およびPE標識抗マウスCD24モノクローナル抗体BDバイオサイエンス、M169を利用して染色した。洗浄後APCストレプトアビヂンBDバイオサイエンスなど、それぞれに対応する二次抗体を用いて二次染色を行った。染色の終了したヒトないしマウス髄核細胞は、FACSバンテージ細胞分離装置BDバイオサイエンスを利用して細胞を純化した。[8]免疫組織染色髄核組織などの免疫蛍光染色は、先の論文で記載された方法37にて行った。組織免疫染色として髄核組織は、以下に示す一次抗体を反応させた:抗ヒトTie2TEKモノクローナル抗体アップステートAb33ヤギ由来ビオチン化抗マウスTie2TEKポリクローナル抗体RDシステムantihumandisialogangliosideGD2mAbBDBiosciences14G2a抗ヒトCD24モノクローナル抗体BDバイオサインスM169抗タイプIIコラーゲンモノクローナル抗体生化学工業II4C11ウサギ由来抗アンジオポエチンIポリクローナル抗体アクラス抗ヒト軟骨プロテオグリカンモノクローナル抗体ケミコンMAB2015抗グリア細胞線維性酸性タンパク質モノクローナル抗体ケミコンGA5抗腺腫性多発結腸ポリープ遺伝子産物モノクローナル抗体ジェネテックスCC1抗βチュブリンモノクローナル抗体シグマアルドリッチ2G10ウサギ由来抗Tauポリクローナル抗体ダコラビット由来抗ネスチンポリクローナル抗体Abカムヤギ由来抗ナノグポリクローナル抗体RDシステムウサギ由来抗Oct4Aモノクローナル抗体セルシグナリングテクノロジーC52G3ウサギ由来抗cMycrabbitポリクローナル抗体サンタクルズウサギ由来抗Sox2rabbitポリクローナル抗体ケミコンウサギ由来抗klf4ポリクローナル抗体サンタクルズ。次に二次抗体としてヤギ由来アレクサフルオロ488標識抗マウスIgGヤギ由来アレクサフルオロ594標識抗マウスIgGヤギ由来アレクサフルオロ350標識抗ラビットIgGヤギ由来アレクサフルオロ488標識抗ラビットIgG、ヤギ由来アレクサフルオロ594標識抗ラビットIgGロバ由来アレクサフルオロ350標識抗ヤギIgGの各二次抗体モレキュラープローブを使用した。標本は同時にDAPIベクターラボラトリーによる核染も行った。ウサギ由来アレクサフルオロ488標識抗緑色蛍光タンパク質ポリクローナル抗体は、EGFP遺伝子標識された移殖細胞の蛍光増強に、またアレクサフルオロ594標識ファロイジン各モレキュラープローブは、アクチン繊維の染色用に使用した。さらに馬由来ビオチン標識抗マウス抗体ベクターラボラトリーは、ABCコンプレックスストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼ染色法と共に、DAB染色はヘマトキシリンとの対比染色として使用した。各免疫染色の陰性コントロールとしてウサギまたはヤギIgGを使用した。さらに髄核細胞の骨分化、脂肪細胞分化は、フォンコッサ染色およびオイルレッドO染色により確認した。また、サフラニンO染色またはヘマトキシリン-エオジン染色は、明視野での構造観察用に使用した。免疫蛍光染色された標本は、LSM510共焦点レーザー顕微鏡カールツャアイスにより、画像採取、画像解析を行った。また、画像処理には、アドビフォトショップ70ソフトウェアーアドビシステムを利用した。[9]レンチウイルスを利用した遺伝子標識髄核細胞の遺伝子標識には、EGFPレポーター遺伝子をコードする高力価レンチウイルスを利用して行った。MOI条件は10に設定、24時間の感染培養後、髄核細胞をαMEM培地にて2回洗浄し、さらに24時間の培養を行い、実験に供した。[10]髄核細胞移植マウス皮下移植;PBS100μlに浮遊した純化ヒト髄核細胞浮遊液を、レシピエントNODSCIDマウスの腹部皮下に注射し移植を行った40。移殖8週間後、腹部皮下に形成された髄核細胞シストは、レシピエントマウスを麻酔にかけて摘出した。摘出されたシストは、4パラフォルムアルデヒド和光純薬により固定後、各種組織学的検討に使用した。マウス尾椎への移殖;EGFP標識された純化ヒト髄核細胞50x105は、50μlのPBSに浮遊後、27ゲージ針付きインシュリン注射器に注入した。その後、同様の27ゲージ針にて髄核組織を吸引し障害を与えたNODSCIDマウス尾椎へ上記細胞浮遊約10μlずつ注入し、移殖を行った。これら尾椎への移殖は、全て外科手術用顕微鏡下にて行った。移植髄核細胞の生存ないし生着は、生物化学発光測定法BLI法により測定した。BLI測定は冷却されたIVISシステムゼノゲンを利用して測定し、イメージ解析にはゼノゲン社製ソフトウェアーゼノゲンを利用した。移殖後8~12週間後、移殖部位の椎間板は、レシピエントマウスを麻酔にかけて摘出し、解析を行った。具体的には、イソフルランを使用した麻酔下のレシピエントマウスは、遮光された箱の中に置かれ、移殖ヒト髄核から放出されるピーク時のEGFP蛍光を、CCDカメラにより検出し記録した。EGFP蛍光は、1秒間当たりの蛍光量として表した。[11]アポトーシス測定ヒト髄核細胞のアポトーシス測定は、ヤギ由来ポロクローナル抗ヒトTie2中和抗体の添加培養により行った。また、コントロールとしてヤギコントロールIgを利用した。抗体添加48時間後、細胞はPIおよびFITC標識抗アネキシンV抗体により染色後ベックマンコールター、FACSキャリバーを用いたフローサイトメトリーにより解析した。[12]RTPCT目的髄核細胞は溶解緩衝液で溶解後、RNアクエアスマイクロスケールRNA分離キットアンビオン社を利用して、RNAを分離した。分離されたmRNAは、高効率RNAtoDNAキットアプライドバイオサイエンスを利用して、逆転写してcDNAを作製した。リアルタイムPCR法による9つの標的遺伝子増幅法は、先の論文にて報告した45。簡単には、逆転写されたcDNAは標的遺伝子用プライマーおよびタックマンプローブを含むタックマン遺伝子検出キットアプライドバイオサインスを利用して増幅した表1。アンジオポエチンImRNAの定量は、比較CT法ABIプリズム、アプライドバイオサイエンスにより、18SリボソームRNAを内部コントロールとして測定した。遺伝子発現のレベルは、純化した髄核Tie2GD2細胞分画を基準として、Tie2GD2Tie2GD2Tie2GD2そしてTie2GD2CD24細胞それぞれの発現量を換算した。純化したNP細胞Tie2GD2またはTie2GD2細胞および骨髄間葉系細胞からのRNA抽出は、先に述べた方法にて行った37。40サイクルの増幅後のPCR産物は、3アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドシグマアルドリッチを用いて可視した。また、コントロールとして18SリボゾーマルRNAを内部標準として使用した。[13]髄核細胞の多分化能ヒト髄核細胞の体外での多分化能を調べる目的にて、先に論文に報告した方法によって、骨、脂肪細胞および軟骨細胞への分化誘導を行った1。また、神経方向への分化を調べる方法として、10x104ml濃度のTie2GD2髄核細胞をインシュリントランスフェリンプロゲステロン亜セレン酸ナトリウムプトレッシン2HCL遺伝子組み換え型ヒトEGFヒト塩基性FGFそしてB272を添加したDMEMF12無血清培地に浮遊し、37°C5CO2、5O2条件下にて14日間の培養を行った。培養終了後、細胞はトリプシン分散し、10x103の細胞をメチルセルロース培地であるメソカルトH4230倍地ステムセルテクノロジー、増殖因子は含まずに浮遊後、35mm培養皿に撒きさらに37°C5CO2、5O2条件下にて7日間の培養を行った。[14]統計処理それぞれの結果は、平均値±標準偏差にて示す。また、統計学的有意差は、スチューデントのT検定を利用した。リアルタイムPCR法において、マンウィットニーのU試験を利用した。有意差は、p値が005以下の時を有意とした。相関関係は、ピアソン相関係数を利用して算出した。結果1球状コロニー形成髄核細胞のクローン形成能クローン形成能と球状コロニー形成能は造血幹細胞、神経幹細胞、ES細胞の特徴である111213。このような特徴を持つ細胞集団が椎間板髄核内に存在するか否かを検証するため、C57BL6マウス尾椎椎間板より採取したNP細胞をメチルセルロース上で培養したところ複数の付着型と球状型コロニーの導出を認めた。10日間の培養で大多数のコロニーが付着型であり、付着型:球状型の比率は35:1であった図1a。我々はこの球状型コロニーをCFUNPと命名した。球状型コロニーを構成する細胞集団を特定するために数多くの表面マーカーにつきフローサイトメトリーを用いて検討したところ、DisialogangliosideGD2とTie2と呼ばれるマーカーを発現する少数の細胞集団に細胞増殖能が高いことが判明した。これまでglycosylphosphatidylinositolanchorproteinCD24が分化型NP細胞のマーカーとして報告されている13。GD2がCD24陽性細胞の一部に発現し、GD2CD24から球状型コロニーの導出を確認、GD2CD24細胞からの導出は認められなかった図1b。さらに34の少数のNP細胞がtyrosinekinasereceptorTie2陽性であり、のちにGD2細胞へと分化した。フローサイトメトリーの結果をまとめるとTie2GD2細胞が102±29のTie2GD2細胞を導出し、やがてTie2GD2CD24cellsへと最終分化するという分化傾向にヒエラルキーが存在することが判明した図1b,cおよび図8。2Tie2細胞は脊索由来NP細胞から派生するTie2NP細胞の起源を調べるべく、我々はいずれも神経堤由来細胞が遺伝的にマーキングされたダブルトランスジェニックマウスであるWnt1およびP0CreFloxedEGFPを用いて検索を行った。この2つのトランスジェニックマウスはWnt1またはP0遺伝子が発現した細胞においてEGFPが発現し免疫染色で検出できるモデルである。これまでの報告によるとP0creにおいてのみ神経堤由来細胞だけでなく脊索にも発現しているとされている15。これら2系統のマウスの椎間板を免疫染色したところP0creのNP細胞においてのみ陽性であったことから、EGFP陽性細胞は脊索由来であると示唆された図2a。さらに、メチルセルロース上で球状コロニーを導出させると図2b、導出されたコロニーを構成したTie2細胞のほとんどとTie2細胞の半分がEGFP陽性であり図2c、クローン形成能力に優れたTie2細胞は脊索由来であると考えられた。3ヒトNPにおけるTie2およびGD2細胞、Tie2Ang1ニッチの同定マウスNP細胞での傾向がヒト椎間板においても認められるか否かを手術時に採取されたヒト椎間板細胞を用いて検証した図3a,b。ヒト椎間板組織は採取時にその変性変化を評価し、比較的変性変化が軽度なThompsongradeIからIIIを用いた16。免疫組織染色による評価ではごく少数のTie2がNP中心部とAFとの境界領域に認められたが、GD2細胞は複数の細胞からなる細胞塊に認められることが多く、NP全体的に散って存在していた図3c,d。フローサイトメトリーによる解析の結果、表面マーカーで分離できる細胞の分化傾向はマウスのそれと同様のパターンであった図9~12。Tie2は神経、血管、造血などの未分化細胞に発現することが報告されている17。造血幹細胞ではTie2と結合するAngiopoietin1を分泌し、造血幹細胞を骨髄内ニッチにおいて分化停止状態で保存するといった役割を担っている18。このような制御機構がTie2NP細胞にも存在するのか否かを検証するためにNP組織中のAng1の発現を免疫組織化学的に評価した。Ang1蛋白は椎間板組織を構成する殆どすべての細胞に濃密に発現しており、Tie2細胞やGD2細胞にも発現していた図3e,f。さらに無血清培地下にメチルセルロース上で培養したNP細胞に分泌型Ang1を添加したところ導出される球状型コロニー数が増加し、逆にAng1をブロックする抗体を添加したところ減少した図3g。またヒトAng1を強制発現させたAHESS5細胞と共培養したところ球状型コロニーは同様に増加した図13。一方Ang1ブロッキング抗体存在下ではTie2NP細胞はアポトーシスに向かうことなども判明し図3h,i、Tie2NP細胞を維持するためにはTie2Ang1シグナル伝達機構が必須であることが示唆され、AHESS5を用いた共培養系によりTie2細胞を増幅できることが明らかとなった。4ヒトTie2GD2NP細胞における単細胞解析単細胞からの自己複製能は幹細胞形質の重要な因子である。我々はヒトTie2GD2NP細胞の単細胞培養からでも球状型コロニーが導出され図4a、二次コロニーも導出できることを証明した図4b。NP細胞の主要な役割は主に2型コラーゲンとプロテオグリカンで構成されるECMの産生である。Tie2GD2細胞から導出した球状型コロニーの免疫染色を行った結果、球状型コロニーは2型コラーゲンとプロテオグリカンに加えて図4c神経幹細胞のマーカーであるnestin陽性であり図4d、Tie2GD2NP細胞の未分化性を示唆した。5Tie2GD2NP細胞の組織維持、再構築能Tie2GD2NP細胞が椎間板組織の維持及び再構築能力を有するか否かを調べる目的でまず免疫不全マウスの皮下に細胞を注入した図5a。すると8週間で皮下に軟骨基質で染色される組織構築をTie2GD2NP細胞を注入した群にのみ認めた図5b。さらにEGFPにより遺伝的にマーキングしたTie2GD2細胞とTie2GD2CD24細胞を椎間板に傷害を加えた免疫不全マウス尾椎椎間板に移植し図5c、Bioluminescenceimagingを用いて評価した1920。その結果、Tie2GD2細胞を移植した群においてのみ12週間経ても組織内に認め、移植細胞が2型コラーゲンを産生し、組織維持、再構築する能力の高さを証明した図5d。6ヒトTie2GD2NP細胞の多分化能InVitroにおいてTie2GD2NP細胞は脂肪、骨、軟骨への分化能力を示した図6a。RTPCRの結果、Tie2GD2細胞は骨髄間質細胞に比べNanogOct34NestinMusashi1などの未分化マーカーを強く発現図6b、蛋白レベルにおいてはOct34NanogcMycSox2klf4などのES細胞マーカーも他の細胞集団に比べて高く発現していた図6c。NestinとMusashi1は神経幹細胞のマーカーと知られている為21、神経分化能力も検証した。その結果Tie2GD2NP細胞は特別な誘導をかけずにニューロン、グリア系のマーカーを複数発現し神経方向への分化能力も合わせ持っていることが判明図6d、Tie2GD2細胞の多分化能力の高さを証明した。7ヒトTie2NP細胞の臨床的意義脊索由来NP細胞が成人になると殆ど消失するといわれる6ヒト椎間板手術検体においてTie2細胞の割合をフローサイトメトリーで検証した。その結果20代を境に著明にTie2細胞が減少し図7a,b、ドナーの年齢と負の相関関係を示した図7c。さらに球状型コロニーの導出数も年齢と負の相関関係を示しており、Tie2NP細胞の椎間板変性における病態生理と診断における有用性を示した。考察今回、invitro並びにinvivo研究において我々は初めて椎間板髄核内に球状型コロニーを形成し、自己複製能、多分化能などの幹細胞性質を有するTie2陽性集団をマウスおよびヒトで同定した。そしてこの細胞集団は脊索より派生していた。またAngiopoietin1が抗アポトーシス、この細胞集団のメンテナンスに重要な役割を担っていることも判明、Angiopoietin1によるニッチ環境の存在とAngiopoietin1を用いた治療法開発の可能性を示した。そして最後にこの細胞集団がヒト椎間板において20代という比較的早期に減衰することを突き止め、椎間板における老化、変性と密接な相関関係にあることを示した。球状型コロニー形成は多分化能を持つ幹細胞集団を分離する手法として使用されてきた101222。過去には骨髄中の球状型コロニー形成細胞が神経幹細胞マーカーnestinを発現、ニューロン、骨格筋細胞、心筋細胞に分化しうることが報告されている11。本研究で同定した球状型コロニー形成細胞も椎間板髄核細胞の主要ECMである2型コラーゲンとプロテオグリカンだけでなくnestinを発現した。さらに球状型コロニー形成細胞集団を純化する為の細胞マーカーとしてTie2およびGD2を多くの幹細胞関連表面マーカー中より同定した。GD2は間養系幹細胞を単一マーカーで分離できる数少ない表面マーカーである23。これまでに臍帯血内のGD2陽性間葉系幹細胞がGD2陰性間葉系幹細胞に比べてOct4、Sox2、Nanog、SSEA4などのES細胞マーカーがより高く発現していたとの報告がある24。一方Tie2は造血幹細胞や神経幹細胞においてニッチ環境との接着を介した幹細胞制御についてより多くの報告がある1825。我々の結果は髄核細胞においてこれら表面マーカーの新たな役割を足す結果となった。Invitroにおけるいくつもの反復実験において髄核細胞の非可逆的分化傾向を証明図1cおよび図9~11、さらにヒト、マウスの髄核細胞において髄核細胞分化におけるヒエラルキーを示し、それを制御するニッチ因子の一つとしてAng1を挙げた図7d。最近、多分化能、自己複製能を持つ神経堤由来幹細胞がマウスの骨髄、後根神経節、ウィスカーパッドに存在することがWnt1とP0CreFloxedEGFPトランスジェニックマウスを用いて報告された14。先の研究において椎間板は調べられておらず、我々は神経堤由来間葉系幹細胞が椎間板に存在し得ないかにつき調べた26。今回、球状型コロニーを形成するTie2GD2陽性髄核細胞が脊索由来であったことは、これまでヒト椎間板髄核では脊索由来細胞が20代までに消失し、椎間板の加齢、変性に深く関わることに相関する36。脊索由来髄核細胞がほかの髄核細胞に対し様々な刺激を与え、恒常性維持に役立っているという報告はこれまでに多数存在する2728。脊索由来髄核細胞の減少は髄核の含水量を低下させる。従い脊索由来髄核細胞を維持することは椎間板変性に対する予防治療戦略を立てる上で究極のゴールである。Tie2Ang1シグナル伝達がTie2陽性髄核細胞のニッチ環境の一つとして細胞の運命を制御できる事実は治療戦略上有益である。サイトカイン療法によりTie2陽性細胞は増幅維持することが可能となる。組織工学的手法による治療線楽からもニッチ環境を認知しておくことも重要である。Tie2Ang1ニッチは椎間板再生の上で必須な要素である。細胞移植療法が椎間板の変性抑制の治療法として動物モデルを経て臨床治験に入っている2932。軟骨形質を示す様々な細胞、例えば椎間板の軟骨様細胞、関節軟骨細胞、脂肪または骨髄由来幹細胞などである3034。動物モデルでは有効な手法であるが、実際のヒトでの臨床治験ではどの程度有効かは依然不明である。これまでに脊索由来髄核細胞やそれと同様の性質を持つ細胞を用いた研究は報告がない。我々の研究結果からはTie2GD2細胞のほうがTie2GD2細胞よりも傷害を与えられた椎間板でより修復能力が高く、細胞移植を考えた場合、これまで治験で試用されている細胞種よりも優れたドナー細胞となりうると考えられた。髄核細胞の栄養はほとんどすべて上下の終板軟骨経由の拡散に頼っているため、加齢に伴う周辺環境の悪化は脊索由来髄核細胞が減衰する一因と考えられる。その為、細胞移植療法は周囲環境が比較的保持された変性初期から中期にかけてのみ適応があると考えられている。脊索由来髄核細胞とそのニッチを含む微小環境をさらに解析することでこういった諸問題を克服できる可能性がある。最後に我々は本研究の様々な結果から推定される髄核細胞の分化カスケードを提示する。この情報は臨床現場における診断と治療に有用な情報となる。例えば、加齢に伴い変化するTie2陽性細胞集団の割合は椎間板変性、加齢の程度を示す指標として使用可能である。我々は手術後に生じる椎間板変性をターゲットとした細胞移植療法の臨床治験中であり29、このような確立された表面マーカーの存在は細胞のポテンシャルと品質を評価する上で大変有用である。本研究結果は椎間板の生物学における新知見を報告するとともに不可逆的に進行する椎間板障害の新規治療法に今後役立つものと考えられた。"