"非ペプチド性リンカーによってポリペプチド薬物との結合体を製造するためのキャリアとしての、IgGFc断片の使用たたし、該結合体は、組換え的な方法によって製造された融合蛋白質でない。。前記IgGFc断片が非糖鎖化されたものである請求項1に記載の使用。前記IgGFc断片がCH1、CH2、CH3及びCH4ドメインよりなる群から選択される1~4個のドメインから構成される請求項1に記載の使用。前記IgGFc断片がヒンジ領域をさらに含む請求項3に記載の使用。前記IgGFc断片がIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、これらの組み合わせ及びこれらのハイブリッドのFc断片よりなる群から選択される請求項1に記載の使用。前記IgGFc断片がIgG4Fc断片である請求項5に記載の使用。前記IgGFc断片がヒト非糖鎖化IgG4Fc断片である請求項6に記載の使用。前記IgGFc断片が配列番号8、10または23のアミノ酸配列を有するFc断片である請求項1に記載の使用。前記IgGFc断片が配列番号4、9または22の塩基配列によってコードされる請求項1に記載の使用。前記IgGFc断片が原核細胞宿主を使用して製造した組換え型IgGFc断片であり、前記ポリペプチド薬物が真核細胞宿主を使用して製造した組換え型ポリペプチド薬物である請求項1に記載の使用。前記IgGFc断片が非糖鎖化されたものであり、前記ポリペプチド薬物が糖鎖化されたものである請求項1に記載の使用。前記IgGFc断片がポリペプチド薬物に対して1:1~1:10のモル比で使用される請求項1に記載の使用。前記非ペプチド性リンカーがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン及びヒアルロン酸よりなる群から選択される請求項1に記載の使用。ところが、このような遺伝子組み換え方法によって生産されたFc融合蛋白質は、免疫グロブリンFc領域の特定の部位、すなわちアミノ末端またはカルボキシル末端でのみ蛋白質融合が可能であり、同種二量体の形態でのみ発現され、単量体の形態では生産が不可能であり、糖鎖化蛋白質間の融合または非糖鎖化蛋白質間の融合のみが可能であって、糖鎖化蛋白質と非糖鎖化蛋白質との融合は不可能であるという欠点がある。また、融合によって新たに発生したアミノ酸配列により免疫反応が誘発されるおそれがあるだけでなく、リンカー部位に対する蛋白質加水分解酵素の敏感性が増加するおそれがあるという問題点を持っている。このような問題を解決するために、本発明者は、前記融合技術の欠点を克服しながら薬物の生体内持続性を向上させ且つ生体内活性の減少を最小化するための方法を研究し、IgGFc断片、より具体的にはIgG2またはIgG4Fc断片が薬物と結合する場合、薬物の生体内持続性を向上させかつ生体内活性の減少を最小化することができることを見出し、本発明を完成した。本発明の一目的は、薬物のキャリアとして有用な免疫グロブリンG断片を提供することにある。本発明の他の目的は、免疫グロブリンG断片を製造するための組み換えベクターを提供することにある。本発明の別の目的は、免疫グロブリンG断片を製造するための組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。本発明の別の目的は、免疫グロブリンG断片を製造するための組み換えベクターで形質転換された形質転換体を培養して免疫グロブリンG断片を製造する方法を提供することにある。本発明の別の目的は、免疫グロブリンG断片を含む薬剤学的組成物を提供することにある。一つの様態として、本発明は、薬物のキャリアとして有用な免疫グロブリンGFc断片に関し、より好ましくはIgG2FcおよびIgG4Fc断片に関するものである。本発明において、キャリアとは、薬物と共に結合する物質を意味し、一般に薬物に結合して薬物の生理活性を増減または除去する。ところが、本発明におけるキャリアは、本発明の目的上、結合する薬物の生理活性減少を最小化すると同時に薬物の生体内安定性は増加させるためのものである。このような薬物のキャリアとして、従来から脂質や重合体など多くの物質が研究されてきたが、免疫グロブリンFc断片を用いた技術は未だ公知となっていない。すなわち、本発明は、結合する薬物の生体内持続性の増進と生体内活性減少の最小化のためのキャリアとして、使用可能な物質の中でも特にIgGFc断片を提供することを特徴とし、より好ましくはIgG2FcおよびIgG4Fc断片を提供することを特徴とする。本発明において、免疫グロブリンG以下、IgGと混用するとは、抗原に選択的に作用して生体免疫に関与する蛋白質の総称であって、ヒトおよび動物から起源することができる。このような免疫グロブリンの一般構造を考察すると、免疫グロブリンは重鎖と軽鎖からなっており、重鎖不変領域はガンマγ、ミューμ、アルファα、デルタδ、エプシロンεタイプを有し、サブクラスとしてガンマ1γ1、ガンマ2γ2、ガンマ3γ3、ガンマ4γ4、アルファ1α1およびアルファ2α2を有する。軽鎖の不変領域はカッパκおよびラムダλタイプを有するColemanetalFundamentalImmunology2ndEd19895573。これらにより、免疫グロブリンは、IgG、IgA、IgD、IgEおよびIgMの亜型に分けられる。IgGはさらにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に分けられる。また、免疫グロブリンは構造的にいろいろの断片が知られているが、その例としてFab、Fab’、Fab’2、Fv、scFv、Fd、Fcなどがある。この中でも、免疫グロブリン断片Fabは、軽鎖および重鎖の可変領域、軽鎖の不変領域および重鎖の第1不変領域CH1を持つ構造であって、1つの抗原結合部位を持つ。免疫グロブリン断片Fab’は、重鎖CH1ドメインのC末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域を持つという点でFabとは差異がある。断片Fab’2は、Fab’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Fvは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを持っている最小の抗体断片であり、scFvは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみがペプチドリンカーで連結された単一ポリペプチド鎖である。また、Fd断片は、重鎖可変領域およびCH1ドメインのみから構成された断片である。すなわち、前記のような公知の様々な免疫グロブリンのタイプおよびその機能的、構造的断片の中でも、本発明は、薬物のキャリアとして有用なIgGFc断片を提供し、特にIgG2FcおよびIgG4Fc断片を提供することを特徴とする。本発明の免疫グロブリンGFc断片以下、IgGFc断片または本発明のFc断片と混用するは、免疫グロブリンGの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域1CH1と軽鎖不変領域1CL1を除いた、重鎖不変領域2CH2および重鎖不変領域3CH3部分を意味し、重鎖不変領域にヒンジ部分を含むこともある。また、本発明のIgGFc領域は、天然型と実質的に同等あるいはより向上した効果を持つ限り、IgGの重鎖と軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体重鎖不変領域1CH1および/または軽鎖不変領域1CL1を含んだ、拡張されたFc断片であり、あるいはCH2および/またはCH3に該当する相当長い一部のアミノ酸配列が除去された断片である。このような本発明のFc断片は、天然型アミノ酸配列だけでなく、この配列誘導体も含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異なる配列を持つものを意味する。例えば、IgGFcの場合、結合に重要であると知られている214~238、297~299、318~322または327~331番のアミノ酸残基が、修飾のための適当な部位として利用できる。また、ジスルフィド結合を形成することが可能な部位が除去されるか、あるいは天然型FcからN末端の幾つかのアミノ酸が除去されるか、あるいは天然型FcのN末端にメチオニン残基が付加されることもあるなど様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能を無くすために、補体結合部位、例えばClq結合部位またはADCC部位が除去されることがある。このような免疫グロブリンFc領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第WO97/34631号、国際特許公開第WO96/32478号などに開示されている。分子の活性を全体的に変更させない蛋白質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野に公知となっているHNeurathRLHillTheProteinsAcademicPressNewYork1979。最も通常的に起こる交換は、アミノ酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly間の交換である。場合によっては、リン酸化、硫化、アクリル化、糖化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などで修飾されることもできる。前述したFc誘導体は、本発明のFc断片と同一の生物学的活性を示すが、熱やpHなどに対するFc断片の構造的安定性を増大させた誘導体である。また、このようなFc断片は、ヒト、および牛や山羊、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離して得られた天然型であり、あるいは形質転換された動物細胞または微生物から得られた組み換え型またはその誘導体である。ここで、天然型から得る方法では、全体免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、蛋白質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理する場合にはFabおよびFcに切断され、ペプシンを処理する場合にはpF’cおよびFab’2に切断される。これらの断片からサイズ排除クロマトグラフィなどを用いてFcまたはpF’cを分離することができる。好ましくは、ヒト由来のFc断片は微生物から収得した組み換え型IgGFc断片である。すなわち、本発明は、微生物から収得したヒト由来の組み換え型IgG2FcおよびIgG4Fc断片が好ましい。また、本発明のFc断片は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が除去された形態である。このようなFc断片の糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法および微生物を用いた遺伝工学的方法などの当該分野における通常の方法が利用できる。ここで、Fcから糖鎖が除去されたFc断片は、補体Clqへの結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性が減少または除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点において、薬物のキャリアとしての本来の目的にさらに符合する形態は、脱糖鎖化免疫グロブリンFc断片、または非糖鎖化免疫グロブリンFc断片である。図18からも明らかなように、糖鎖化Fcは、非糖鎖化FcよりCDCの活性が高くて免疫反応を誘発する危険が高いと言えるので、本発明の目的上、非糖鎖化Fc断片あるいは脱糖鎖化Fc断片が好ましく、非糖鎖化IgG2FcおよびIgG4Fc断片、この組み合わせおよびこのハイブリッドがより好ましい。本発明において、脱糖鎖化はFc断片から酵素によって糖を除去することを意味し、非糖鎖化はFc断片を糖鎖化されていない形態で原核細胞、好ましくは大腸菌で生産することを意味する。一方、本発明において、組み合わせとは、二量体または多量体を形成するとき、同一起源の単鎖免疫グロブリンFc断片を暗号化するポリペプチドが相異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。すなわち、IgG1Fc、IgG2Fc、IgG3FcおよびIgG4Fc断片よりなる群から選択された2つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。本発明において、ハイブリッドとは、単鎖の免疫グロブリンFc断片内に、相異なる起源の2つ以上の免疫グロブリンFc断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、IgG1Fc、IgG2Fc、IgG3FcおよびIgG4FcのCH1、CH2、CH3およびCH4よりなる群から選択された1~4つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジ領域を含むことができる。一方、本発明の図17および図18から分かるように、IgGのいろいろなサブクラスのうち、特にIgG4は、補体Clqに対する結合力が最も低い。このように補体に対する結合力が低下すると、抗体依存性細胞毒性ADCC、Antibodydependentcellcytotoxicityおよび補体依存性細胞毒性が減少または除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しなくなる。このようなClqに対する結合力は、IgG2およびIgG4Fc断片がIgG1より低く、この中でもIgG4Fc断片が最も低いことを確認することができる。したがって、薬物のキャリアとして用いるためには、結合するFc断片の抗体依存性細胞毒性および補体依存性細胞毒性のようなエフェクター機能がより低いものを使用することが好ましいので、本発明の目的上、IgG2FcおよびIgG4Fc断片が好ましく、より好ましくはIgG4Fc断片であり、最も好ましくは配列番号8、10および23のアミノ酸配列を持つFc断片である。本発明の別の様態として、本発明は、IgGFc断片、好ましくはIgG2FcおよびIgG4Fc断片をコードする遺伝子に関するもので、より好ましくは配列番号8、10および23のアミノ酸をコードする遺伝子に関するものである。このような本発明のFcをコードする遺伝子は、天然型核酸配列だけでなく、この配列誘導体も含む。核酸配列誘導体とは、天然核酸配列中の一つ以上の核酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異なる配列を持つものを意味する。本発明の配列番号8のアミノ酸配列をもつFc断片をコードする遺伝子は、好ましくは配列番号4の核酸配列を持つ遺伝子であり、配列番号10のアミノ酸配列を持つFc断片をコードする遺伝子は、好ましくは配列番号9の核酸配列を持つ遺伝子であり、配列番号23のアミノ酸配列を持つFc断片をコードする遺伝子は、好ましくは配列番号22の核酸配列を持つ遺伝子である。本発明のFc断片をコードする核酸配列は、一つ以上の塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異できる。前記核酸配列は、天然から分離するか、あるいは人為的に合成または遺伝子組み換え方法によって製造することができる。本発明のFc断片をコードする核酸配列は、これを発現するベクターによって提供される。別の様態として、本発明は、IgGFc断片を含む組み換えベクターを提供する。本発明において、ベクターは、宿主細胞にDNAを導入して抗体または抗体断片を発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、およびアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどがあり、プラスミドベクターが好ましい。本発明の目的上、発現ベクターは、プロモータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーなどの発現調節エレメントの他にも膜標的化または分泌のためのシグナル配列を含むことができる。本発明において、シグナル配列は、蛋白質の細胞質の外への輸送および分泌を可能とする特定のアミノ酸配列を意味する。このようなシグナル配列には、様々な形態が当該分野において公知となっているが、本発明では、好ましくは大腸菌を宿主細胞として用いるため、本発明のシグナル配列は大腸菌で分泌される蛋白質が持つ大腸菌由来のシグナル配列であることが好ましい。一方、大腸菌由来のシグナル配列にはアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、熱安定性エンテロトキシンII、LamB、PhoE、PelB、OmpAまたはマルトース結合蛋白質などがあるが、最も好ましくは熱安定性エンテロトキシンIIである。一方、開始コドンおよび終結コドンは、一般に免疫原性標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列の一部と見なされ、遺伝子作製物が投与されたとき、個体において必ず作用を示さなければならず、コーディング配列とインフレームになければならない。一般なプロモータは、構成的または誘導性である。原核細胞にはlac、tac、T3およびT7プロモータがあるが、これに制限されない。真核細胞には、サルウイルス40SV40プロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルスMMTVプロモータ、ヒト免疫不全ウイルスHIVプロモータ例えば、HIVの長い末端反復部LTRプロモータ、モロニーウイルスプロモータ、サイトメガロウイルスCMVプロモータ、エプスタインバーウイルスEBVプロモータ、ラウス肉腫ウイルスRSVプロモータだけでなく、ヒトβ-アクチン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネインなどヒト遺伝子由来のプロモータがあるが、これに制限されない。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起点を含む。抗生剤または薬物耐性を与える生成物をコードする遺伝子が普遍的な選択性マーカーとして用いられるが、原核細胞の場合、β-ラクタマーゼ遺伝子アンピシリン耐性およびTet遺伝子テトラサイクリン耐性が使用でき、真核細胞の場合、ネオマイシンG418またはジェネティシン、gptミコフェノール酸、アンピシリン、およびハイグロマイシン耐性遺伝子が使用できる。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は、様々な宿主でメトトレキサートによって選択できる。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子生成物をコードする遺伝子、例えばLEU2、URA3およびHIS3は酵母において選択性マーカーとして度々使用される。そして、ウイルス例えば、バキュロウイルスまたはファージベクター、およびレトロウイルスベクターのような宿主細胞のゲノム内に挿入できるベクターも使用可能である。本発明の目的に符合するIgGFc断片を製作するために、配列番号8、10および23のアミノ酸をコードする遺伝子が挿入されたベクターを用いる。本発明では、pT14S1SH-4T20V22Q大韓民国特許第38061号を出発ベクターとして用いて、配列番号23のアミノ酸をコードする配列番号22の遺伝子が挿入されたpSTIIdCG2Fcを製作し、配列番号8のアミノ酸をコードする配列番号4の遺伝子が挿入されたpSTIIdCG4Fcを製作し、前記pSTIIdCG4Fcプラスミドを鋳型としてPCRを行うことにより、前記PCRによって増幅された遺伝子のうち、二量体の形成に必要なヒンジ領域が除去された配列番号10のアミノ酸配列をコードする配列番号9の遺伝子が挿入されたpSTIIG4Moを製作した。別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体に関するものである。宿主細胞に応じて蛋白質の発現量と修飾などが異なるので、目的に最も適した宿主細胞を選択して使用すればよい。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、ストレプトミセス、シュードモナス、プロテウスミラビリスまたはスタヒロコッカスのような原核宿主細胞があるが、これに制限されない。また、真菌例えば、アスペルギルス、酵母例えば、ピキアパストリス、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスアカパンカビなどの下等真核細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物などを含む高等真核生物由来の細胞を宿主細胞として使用することができる。ところが、本発明の目的上、免疫グロブリンFc断片が糖鎖化されないことが有利なので、原核細胞を使用することが好ましく、特に大腸菌を使用することが最も好ましい。本発明において、宿主細胞への形質転換および/またはトランスフェクションtransfectionは、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するいずれの方法も含まれるもので、当該分野で公知となっているように、宿主細胞に応じて適切な標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、エレクトロポレーション、原形質融合、リン酸カルシウムCaPO4沈殿、塩化カルシウムCaCl2沈殿、炭化珪素繊維を用いた攪拌、アグロバクテリアを介した形質転換、PEG、硫酸デキストラン、リポフェクトアミンおよび乾燥/抑制を介した形質転換方法などが含まれるが、これに制限されない。例えば、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理またはエレクトロポレーションは、一般に原核細胞に対して使用される。アグロバクテリウムツメファシエンスを用いたトランスフェクションは、特定の植物細胞の形質転換に使用されるShawetal1983Gene23315;国際公開特許WO89/05859。細胞壁がない哺乳動物細胞の場合、リン酸カルシウム沈殿法を用いることができるGrahametal1978Virology52456457。哺乳動物宿主細胞への形質転換の一般的な方法および特徴は、米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母内への形質転換は、一般にVanSolingenなどの文献JBact1977130946およびHsiaoなどの文献ProcNatlAcadSci1979763829の方法によって行われる。前記本発明に係る発現ベクターが宿主細胞に形質転換された本発明の形質転換体は、HM10932pSTIIdCG4Fc導入形質転換体、HM10933pSTIIG4Mo導入形質転換体およびHM10936pSTIIdCG2Fc導入形質転換体である。別の様態としては、本発明は、IgGFc断片、好ましくはIgG2Fc、IgG4Fc断片、この組み合わせおよびこのハイブリッドを発現することが可能なベクターで形質転換された形質転換体を適切な条件で培養して本発明の免疫グロブリン断片を製造する方法を提供する。前記免疫グロブリン断片の製造において、形質転換体の培養は、当該分野に知られている適当な培地と培養条件に応じて行われる。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。形質転換体を培養して得た本発明の免疫グロブリン断片は、精製していない状態で使用でき、さらに様々な通常の方法、例えば透析、塩沈殿およびクロマトグラフィなどを用いて高純度に精製して使用できる。その中でもクロマトグラフィを用いる方法が最も多用されている。カラムの種類と順序の選択にはいずれの場合にも適用できる法則はなく、目的蛋白質である抗体の特性、培養方法などに応じてイオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、プロテインA親和カラムなどから選択することができる。本発明では、プロテインA親和カラム、SPセファロースFFカラムなどを用いて精製した。こうして得られるFc断片が遊離体の場合には、自体公知の方法またはこれに準ずる方法によって塩に変換することができ、逆にFc断片が塩の場合には、自体公知の方法またはこれに準ずる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。そして、組み換え体が生産するFc断片に、精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えるか、あるいはポリペプチドを部分的に除去することができる。蛋白質修飾酵素としては、例えばトリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが使用される。このように製造された本発明のFc断片は、薬物のキャリアとして作用して薬物と結合体を形成する。本発明において、薬物結合体または結合体は、一つ以上の薬物が一つ以上の免疫グロブリンFcとお互い連結されているものを意味する。本発明において、薬物は、ヒトまたは動物に投与される場合、治療的活性を示す物質を意味し、ポリペプチド、化合物、抽出物、核酸などを含むが、これに制限されない。薬物は、好ましくはポリペプチド薬物である。本発明において、生理活性ポリペプチド薬物、ポリペプチド薬物および蛋白質薬物は同一の意味で使われており、生体内で様々な生理的現象に生理作用を示す生理活性型であることを特徴とする。このようなポリペプチド薬物は、変性し易い、あるいは生体内に存在する蛋白質分解酵素によってよく分解されるといった理由によって、長時間にわたって生理学的活性を持続することができないという欠点がある。しかし、本発明の免疫グロブリンFc断片とポリペプチドを結合させた結合体の場合、薬物の構造的安定性が増加し、分解半減期が増加する。そのうえ、Fc領域の結合によるポリペプチドの生理学的活性の減少は、その他に公知となっている他のポリペプチド薬物製剤に比べて非常に軽微であるといえる。したがって、既存のポリペプチド薬物の生体内利用率に比べて、本発明のポリペプチドおよび本発明のFc断片の結合体は、生体内利用率が著しく増加したことを特徴とする。これは、下記本発明の実施例によっても明白に開示されているところであるが、本発明のFc断片が結合したIFNα、G-CSF、hGHなどが、PEGのみが結合しあるいはPEGとアルブミンが結合した既存の製剤に比べて約2~6倍程度増加したことを確認することができる表8、表9および表10。一方、本発明のFc断片と蛋白質の結合は、従来の組み換え的な方法による融合ではないことを特徴とする。免疫グロブリンFc領域と薬物として用いられる活性ポリペプチドが組み換え的な方法によって融合している形態は、Fc領域のN末端またはC末端にポリペプチドがペプチド結合によって連結された形態であって、これをコードする核酸配列において一つのポリペプチドとして発現されて折りたたまれる。蛋白質の生理学的機能体としての活性が構造によって決定されるという点に基づくとき、これは融合蛋白質活性の急激な減少をもたらす。したがって、ポリペプチド薬物がFcと組み換え的な方法によって融合する場合、構造的安定性が増加したとしても、生体内利用率の面で効果がない。また、このような融合蛋白質は、誤って折りたたまれて凝集体の形態で発現される傾向があるので、蛋白質の製造、分離の収率面で不経済である。また、活性型ポリペプチドが糖鎖化された形態の場合、真核細胞で発現させなければならず、このような場合、Fcも糖鎖化されるので、生体内で不適切な免疫反応を引き起こすおそれもある。すなわち、本発明によってこそ始めて、糖鎖化された活性型ポリペプチドを非糖鎖化された免疫グロブリンFc領域に連結させた結合体を製造することが可能となり、最上のシステムでそれぞれが製造、分離されるので、蛋白質獲得の収率を高めることができるなど、前記の問題点を全て克服することができる。本発明の免疫グロブリンFc断片に連結可能な蛋白質薬物の例としては、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類例えば、インターフェロン-α、-βおよび-γ、水溶性タイプIインターフェロン受容体など、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、グルカゴン様ペプチド類例えば、GLP-1など、G蛋白質共役型受容体、インターロイキン類例えば、IL-1受容体、IL-4受容体など、酵素類例えば、グルコセレブロシダーゼ、イズロネート-2-スルファターゼ、α-ガラクトシダーゼ-A、アガルシダーゼα、アガルシダーゼβ、α-L-イズロニダーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、キチナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、イミグルセラーゼ、リパーゼ、ウリカーゼ、血小板-活性因子アセチルハイドロラーゼ、中性エンドペプチダーゼ、ミエロペルオキシダーゼなど、インターロイキンおよびサイトカイン結合蛋白質類例えば、IL-18bp、TNF-結合蛋白質など、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、B細胞因子、T細胞因子、プロテインA、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ-1アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポ蛋白質-E、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成促進因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子VII、血液因子VIIa、血液因子VIII、血液因子IX、血液因子XIII、プラスミノゲン活性因子、フィブリン-結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、プロテインC、C-反応性蛋白質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、アキソジェネシス因子-1、神経膠由来神経栄養因子、ネトリン、好中球抑制因子、神経栄養因子、ニューチュリンなど、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類例えば、TNFRP75、TNFRP55、IL-1受容体、VEGF受容体、B細胞活性因子受容体など、受容体拮抗物質例えば、IL1-Raなど、細胞表面抗原例えば、CD2、3、4、5、7、11a、11b、18、19、20、23、25、33、40、45、69など、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類例えば、scFv、Fab、Fab’、Fab’2およびFd、ウイルス由来ワクチン抗原など様々な種類を含み、前記例示された種類に限定されない。抗体断片は、特定の抗原に結合することが可能な能力をもったFab、Fab’、Fab’2、FdまたはscFvであり、好ましくはFab’である。特に好ましい生理活性ポリペプチドは、疾病の治療または予防の目的で人体に投与されるとき、投与頻度の高いヒト成長ホルモン、インターフェロン類インターフェロン-α、-β、-γなど、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子EPOおよび抗体断片類などである。また、前記生理活性ポリペプチドの天然型と実質的に同等或いはより増加した機能、構造、活性または安定性を有する限り、任意の誘導体または誘導体も本発明の生理活性ポリペプチドの範囲に含まれる。本発明の最も好適なポリペプチドの薬物はインターフェロン-アルファである。本発明では、ポリペプチド薬物以外に他の薬物も使用可能であり、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、オフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、セファクロール、セフォタキシム、イミペネム、ペニシリン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、バンコマイシンなどの誘導体および混合物から選択される抗生剤;メトトレキサート、カルボプラチン、タクソール、シスプラチン、5-フルオロウラシル、ドキソルビシン、エトポシド、パクリタキセル、カンプトセシン、シトシンアラビノシドなどの誘導体および混合物から選択される抗癌剤;インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ピロキシカム、フルルビプロフェン、ジクロフェナクなどの誘導体および混合物から選択される抗炎症剤;アシクロビル、ロバビンなどの誘導体よび混合物から選択される抗ウイルス剤;およびケトコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、アンホテリシン-B、グリセオフルビンなどの誘導体および混合物から選択される抗菌剤を例示することができるが、これに限定されない。一方、本発明のFc断片は、リンカーを媒介として薬物に連結された結合体を形成することができる。このようなリンカーは、ペプチド性リンカーまたは非ペプチド性リンカーを含むが、好ましくは非ペプチド性リンカーであり、より好ましくは非ペプチド性重合体である。ここで、ペプチド性リンカーとは、アミノ酸、好ましくはペプチド結合で連結された1~20個のアミノ酸を意味し、糖鎖化された形態であってもよい。このようなペプチド性リンカーは、Gly、Ser反復単位を持つペプチドであって、T細胞に対して免疫学的に不活性のペプチドを使用することが好ましい。非ペプチド性重合体の例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエーテル、PLAおよびPLGAのような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸などを挙げることができ、最も好ましくはポリエチレングリコールPEGなどがある。本発明のFc断片-薬物または本発明のFc断片-リンカー-薬物は、様々なモル比の結合が可能である。すなわち、一つのポリペプチド薬物に結合するFc断片および/またはリンカーの数は制限されない。ところが、好ましくは本発明の薬物結合体において薬物とFc断片は、1:1~10:1、好ましくは1:1~2:1のモル比で結合できる。また、本発明のFc断片、任意のリンカーおよび薬物の結合は、遺伝子組み換え方法によってFc断片とポリペプチド薬物が融合蛋白質の形態で発現される場合のペプチド結合を除いた全ての共有結合と、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用のような全ての種類の非共有結合を含む。しかし、薬物の生理活性の面で共有結合であることが好ましい。また、本発明のFc断片、任意のリンカーおよび薬物は、薬物の任意の部位との結合が可能である。一方、本発明のFc断片およびポリペプチド薬物の場合は、N末端、C末端の結合も可能であるが、遊離基と結合することがより好ましく、特にこれらのアミノ末端、リジンのアミノ残基、ヒスチジンのアミノ残基または遊離システイン残基で共有結合がよく形成される。一方、本発明のFc断片、任意のリンカーおよび薬物の結合は、任意の方向に結合できる。すなわち、リンカーと免疫グロブリンFc領域のN末端、C末端または遊離基との結合が可能であり、リンカーと蛋白質薬物のN末端、C末端または遊離基との結合が可能である。リンカーがペプチドリンカーの場合、任意の結合部位における結合が可能である。また、本発明の結合体は、いろいろの架橋剤で結合可能である。このような架橋剤の種類は、当該分野に公知となっており、例えば1,1-ビスジアゾアセチル-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、イミドエステル、例えばジスクシンイミジルエステル、例えば3,3’-ジチオビススクシンイミジルプロピオネートおよび二官能性マレイミド、例えばビス-N-マレイミド-1,8-オクタンを含むが、これに制限されない。一方、本発明に係る新規のFc断片および薬物の結合体は、様々な薬剤学的組成物を製造することができる。本発明において、投与はある適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記結合体は薬物が目的の組織に到達することができる限り、いずれの一般的な経路を介しても投与できる。例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与が可能であるが、これに制限されない。しかしながら、経口投与の際、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコートするか、或いは胃における分解から保護するために剤形化することが好ましい。好ましくは、注射剤の形態で投与できる。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動することが可能な任意の装置によって投与できる。本発明の結合体を含んだ薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。薬剤学的に許容される担体は、経口投与の場合には結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容される担体と混合して様々に製造できる。例えば、経口投与の場合には錠剤、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐方形製剤などに剤形化することができる。一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。本発明において、Fc断片がキャリアとして用いられた薬物の実際投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別並びに体重、および疾患の重症度などのいろいろの関連因子とともに、活性成分である薬物の種類によって決定される。本発明の薬剤学的組成物は、生体内持続性に非常に優れるので、本発明の薬剤学的製剤の投与回数および頻度を著しく減少させることができる。以下、下記の実施例によって本発明をより詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。免疫グロブリンFc断片の製造実施例実施例1ヒト免疫グロブリンIgG4Fc発現ベクターの製作1-1二量体IgG4Fc発現ベクターの製作ヒト免疫グロブリンIgG4のFc遺伝子をクローニングするために、ヒトの血液から収得した血球細胞のRNAを鋳型として次のようにRT-PCRを行った。まず、QiampRNA血液キットQiagen社を用いて約6mLの血液から全体RNAを分離した後、このRNAを鋳型とし、One-StepRT-PCRキットQiagen社を用いて遺伝子を増幅した。この際、前記遺伝子配列を収得するために配列番号1と配列番号2で表わされるプライマー対を使用した。配列番号1は、IgG4ヒンジ領域の12個GluSerLysTyrGlyProProCysProSerCysPro、配列番号:3のアミノ酸配列のうち10番目のアミノ酸配列であるセリンから始まる配列であり、配列番号2は、終結コドンを含むBamHI制限酵素認識部位を挿入したものである。前記プライマー対で増幅された遺伝子は、配列番号4で表わされる塩基配列を持つことが確認され、全体IgG4Fc中のヒンジ領域のセリン-システイン-プロリンで始まるアミノ末端とCH2およびCH3ドメインから構成される。前記増幅されたIgG4Fc遺伝子配列を、大腸菌シグナル配列を含む発現ベクターにクローニングするために、本発明者によって開発された発現ベクターpT14S1SH-4T20V22Q大韓民国特許第38061号を出発ベクターとして用いた。前記発現ベクターは、配列番号5で表わされる塩基配列を持つ大腸菌熱安定性エンテロトキシンシグナル配列誘導体を含む。クローニングを容易にするため、pT14S1SH-4T20V22Qプラスミドの大腸菌熱安定性エンテロトキシンシグナル配列誘導体に配列番号6および7のプライマー対を使用した特定部位の置換突然変異法を行い、シグナル配列の最後のアミノ酸をコードする遺伝子配列を突然変異誘発してStuI制限酵素認識部位を挿入した。塩基配列分析法によって、正確にStuI制限酵素認識部位が生成されたことを確認した。pT14S1SH-4T20V22QプラスミドにStuI制限酵素認識部位が生成されたプラスミドをpmSTIIと命名した。前記のように製作されたプラスミドpmSTIIをStuIおよびBamHI制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、大腸菌熱安定性エンテロトキシンシグナル配列誘導体を含む大きい断片4.7kbを回収した。前記増幅されたIgG4Fc遺伝子断片をBamHI制限酵素で処理した後、前記で回収された発現ベクターの断片に挿入してプラスミドpSTIIdCG4Fcを製作した。このベクターによって発現される蛋白質は、配列番号8のアミノ酸配列を持ち、ヒンジ領域のシステイン残基によるジスルフィド結合によって二量体の形態で存在する。前記製作された発現ベクターを大腸菌BL21DE3に形質転換させて大腸菌形質転換体BL21/pSTIIdCG4FcHM10932を製造し、これらを韓国微生物保存センターKCCMに2004年9月15日付で寄託した寄託番号:KCCM-10597。1-2単量体IgG4Fc発現ベクターの製作単量体の形態で発現されるIgG4Fc断片をクローニングするために、配列番号9および2を用いて、前記実施例1-1で製作したpSTIIdCG4Fcプラスミドを鋳型としてPCRを行った。前記のPCRによって増幅された遺伝子は、IgG4Fc配列で二量体の形成に必要なヒンジ領域が除去されたまま、IgG4CH2-3遺伝子のみが増幅されて単量体の形態で存在する。前記1-1と同一の発現ベクターpmSTIIに同一の過程でクローニングしてプラスミドpSTIIG4Moを製作した。前記発現ベクターを大腸菌BL21DE3に形質転換させて大腸菌形質転換体BL21/pSTIIG4MoHM10933を製造し、これを韓国微生物保存センターKCCMに2004年9月15日付で寄託した寄託番号:KCCM-10598。前記発現ベクターによって発現される蛋白質は、配列番号10のアミノ酸配列を持ち、ヒンジ領域がないため、CH2ドメインから発現されて単量体の形態で存在する。実施例2ヒト免疫グロブリンIgG1Fc発現ベクターの製作2-1二量体IgG1Fc発現ベクターの製作IgG1のFc遺伝子をクローニングするために、前記実施例1-1で行った方法と同様に、ヒトの血液から収得した血球細胞のRNAを鋳型としてOne-StepRT-PCRキットQiagen社を用いてRT-PCRを行った。この際、前記遺伝子配列を収得するために、配列番号11と配列番号12で表わされるプライマー対を使用した。配列番号11は、15個のアミノ酸配列GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysPro;配列番号:13からなるヒンジ領域蛋白質配列のうち13番目のアミノ酸配列であるプロリンから始まる配列であり、配列番号11および12のプライマー対で増幅された遺伝子は、全体IgG1Fc遺伝子配列中のヒンジ領域のプロリン-システイン-プロリンで始まるアミノ末端とCH2、CH3ドメインからなり、配列番号14の遺伝子配列を持つ。前記増幅されたIgG1Fc遺伝子配列を大腸菌シグナル配列を含む発現ベクターにクローニングするために、前述したpmSTIIベクターを使用した。前記実施例1-1で行ったクローニング過程と類似の方法で、プラスミドpmSTIIをStuI/BamHI制限酵素で処理した後、アガロースゲルに電気泳動を行い、大腸菌熱安定性エンテロトキシンシグナル配列誘導体を含む大きい断片4.7kbを回収した。前記で増幅されたIgG1Fc遺伝子をBamHI制限酵素で処理した後、前記で回収された発現ベクターの断片に挿入してpSTIIdCG1Fcを製作した。このように製作された発現ベクターを介して発現される産物は、宿主細胞で発現するときに配列番号15のアミノ酸配列を持ち、ヒンジ領域のシステイン残基間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。製作された発現ベクターを大腸菌BL21DE3に形質転換させて大腸菌形質転換体BL21/pSTIIdCG1FcHM10927を製造し、これらを韓国微生物保存センターKCCMに2004年9月15日付で寄託した寄託番号:KCCM-10588。2-2単量体IgG1Fc発現ベクターの製作単量体の形態で発現されるIgG1Fcを製造するために、配列番号16および12のプライマー対を用いて、前記実施例2-1で製作したプラスミドpSTIIdCG4Fcを鋳型として遺伝子を増幅した。増幅された遺伝子の断片を実施例2-1と同様の方法で発現ベクターpmSTIIに挿入し、配列番号17で表わされる塩基配列を含有するPSTIIG1Moを製作した。前記発現ベクターを大腸菌BL21DE3に形質転換させて大腸菌形質転換体BL21/pSTIIG1MoHM10930を製造し、これを韓国微生物保存センターKCCMに2004年9月15日付で寄託した寄託番号:KCCM-10595。前記発現ベクターによって発現される蛋白質は、二量体の形成を可能とするシステイン残基を含有するヒンジ領域が除去されたため、CH2ドメインから発現されて単量体の形態で存在し、配列番号18で表わされるアミノ酸配列を持つ。実施例3ヒト免疫グロブリンIgG2Fc発現ベクターの製作ヒトIgG2のFc遺伝子をクローニングするために、前記実施例1-1で行った方法と同様に、ヒトの血液から収得した血球細胞のRNAを鋳型としてOne-StepRT-PCRキットQiagen社を用いてRT-PCRを行った。この際、前記遺伝子配列を収得するために、配列番号19と配列番号20で表わされるプライマー対を使用した。配列番号19は12個のアミノ酸配列GluArgLysCysCysValGluCysProProCysPro;配列番号:21からなるヒンジ領域蛋白質配列のうち10番目のアミノ酸配列であるプロリンから始まる配列であり、配列番号19および20のプライマー対で増幅された遺伝子は、全体IgG2Fc遺伝子配列中のヒンジ領域のプロリン-システイン-プロリンで始まるアミノ末端とCH2、CH3ドメインからなり、配列番号22の遺伝子配列を持つ。前記増幅されたIgG2Fc遺伝子配列を大腸菌シグナル配列を含む発現ベクターにクローニングするために、前述したpmSTIIベクターを使用した。前記実施例1-1で行ったクローニング過程と類似の方法で、プラスミドpmSTIIをStuI/BamHI制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、大腸菌熱安定性エンテロトキシンシグナル配列誘導体を含む大きい断片4.7kbを回収した。前記増幅されたIgG2Fc遺伝子をBamHI制限酵素で処理した後、前記回収された発現ベクターの断片に挿入してpSTIIdCG2Fcを製作した。このように製作された発現ベクターによって発現される産物は、宿主細胞で発現するときに配列番号23のアミノ酸配列を持ち、ヒンジ領域のシステイン残基間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。それぞれ製作された発現ベクターを大腸菌BL21DE3に形質転換させて大腸菌形質転換体BL21/pSTIIdCG2FcHM10936を製造した。実施例4免疫グロブリンFcの発現および精製4-1免疫グロブリンFcの発現の確認前記実施例1、2および3で収得した微生物形質転換体を発酵器Marubishi社に接種して発酵させた後、免疫グロブリンFc断片の発現の有無を確認した。まず、LB培地100mLに前記形質転換体をそれぞれ一晩中振盪培養した後、発酵器に接種して本培養を行った。発酵器の温度は、35°Cあるいは30°Cを維持し、嫌気性状態になることを防止するために、空気を20vvmで投入しながら500rpmで攪拌した。発酵の間、微生物の成長のために足りないエネルギー源を補うために、葡萄糖と酵母抽出液とを微生物の発酵状態に応じて投与した。吸光度600nmでOD値が80~110となる時期に誘導物質IPTGを20μM~4mMとなるように投与して発現を誘導した。これを、さらに40~45時間高濃度で培養して吸光度600nmでのOD値が100~120となるようにした。前記大腸菌形質転換体から免疫グロブリンFcの発現の有無、発現場所、水溶性および二量体形成の有無を確認するために、下記のような試験を行った。発現産物が前記発現ベクターに融合しているシグナル配列によって発酵液またはペリプラスム空間に発現されるかを確認するために、発酵液を遠心分離して、細胞を除去した発酵液溶液を収得し、且つ細胞を回収した。前記細胞を除去した発酵液溶液と、前記回収した細胞に浸透圧ショックをかけることによって得られたペリプラスム空間溶液とをウエスタンブロットによって解析し、免疫グロブリンFcの発現の有無を確認したが、その量は極めて少量であった。前記細胞をウルトラ-ソニケーションMisonix社を用いて破砕して細胞溶解液を得、その細胞溶解液を遠心分離して水溶性物質と不溶性物質を分離した後、水溶性物質を次のような方法でウエスタンブロットした。前記水溶性物質をDTTまたはβ-メルカプトエタノールのような還元剤を含まない蛋白質サンプルバッファと混ぜた後、15SDS-PAGECriterionGel、Bio-Rad社に電気泳動した。電気泳動済みのゲルをニトロセルロース膜に転写した後、HRPが融合している抗ヒトFc抗体Sigmaを用いて検出を行った。図1に示すように、免疫グロブリンFcは、大腸菌の細胞質内に水溶性の状態で過量に発現されることが分かるとともに、ヒンジ領域の一部が挿入された形質転換体から発現された産物は二量体を形成することが分かる。図1のレーン1、2、3はそれぞれ形質転換体HM10927、HM10932、HM10936で発現された産物であり、レーン4は動物細胞で生産された免疫グロブリンをパパイン処理して生成されたFcであって、糖が存在するため、大腸菌で生成されたものよりやや大きく展開されることが分かる。4-2N末端配列の確認前記実施例において大腸菌の細胞質内で水溶性二量体の形態で発現されるFcは、シグナル配列が融合しているために分泌されず、細胞質内に存在するとき、シグナル配列のプラセシングなしで融合したままで存在するかを確認するために、N末端アミノ酸配列の分析を基礎科学支援研究所のソウル分所に依頼した。分析する試料は下記のように準備した。まず、PVDF膜Bio-Rad社をメタノールに約2~3秒間浸漬して活性化させた後、ブロッキングバッファ170mMグリシン、25mMTris-HClpH8、20メタノールに十分濡らした。実施例4-1で展開した非還元条件のSDS-PAGEゲルを、前記のように準備されたPVDF膜に、ブロッティングキットHoeferSemi-DryTransferunit、Amershamを用いて約1時間の転写を行った。PVDF膜に転写された蛋白質を蛋白質染色薬であるCoomassieBlueR-250Amnesco社を用いてしばらく3~4秒間染色した後、脱色溶液水:酢酸:メタノールが5:1:4で洗浄した。洗浄済みの膜から、蛋白質が含まれている部位をハサミで切断してN末端配列の分析を依頼した。IgG1Fc蛋白質のN末端配列はPro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Glyであり、IgG4Fc蛋白質のN末端配列はSer-Cysl-Pro-Ala-Pro-Glu-Phe-Leu-Gly-Glyである。また、IgG2Fc蛋白質のN末端配列はPro-Cys-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Ala-Gly-Proと確認された。以上のようなアミノ酸配列の分析結果から明らかなように、本発明の大腸菌形質転換体から発現されるFc断片は、正確なN末端配列を持つものと確認された。また、シグナル配列を融合させて発現させる際に、細胞外膜またはペリプラスムに分泌されず、細胞質内に過発現されてもシグナル配列が正確にプロセシングされて水溶性の形態で存在するという新しい事実が確認された。4-3免疫グロブリンFcの精製免疫グロブリンに強い親和性があると知られているプロテインA親和性カラムを用いて下記のような方法で精製した。遠心分離によって発酵液から回収された大腸菌細胞をMicrofluizerMicrofludics社を用いて破砕して細胞溶解液を得、細胞質内に存在する組み換え免疫グロブリンFc断片を2段階カラムクロマトグラフィによって精製した。プロテインA親和性カラムPharmacia社5mLをPBSで平衡化させた後、細胞溶解液を5mL/分の流速で負荷した。結合していない分画はPBSで洗浄した後、100mMのクエン酸溶液pH3.0で溶出させた。溶出した分画を脱塩カラムdesaltingcolumnHiprep26/10、Pharmacia社を用いて10mMTris緩衝液pH8.0で交換した。QHP26/10カラムPharmacia社50mLを用いて2次陰イオン交換カラムクロマトグラフィを行った。1次精製された組み換え免疫グロブリンFc分画を前記カラムに結合させた後、10mMTris緩衝液pH8.0条件下で直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.2M法によって溶出し、高純度の分画を得ることができた。各産物をプロテインAカラムを用いて部分精製した後、組み換え免疫グロブリンFc断片の発現量が下記に示したように決定された。前記のように収得された免疫グロブリンFcは、重鎖の二量体あるいは単量体の形態なので、還元条件のSDS-PAGEと非還元条件のSDS-PAGEにおいて蛋白質の移動様相が異なる。発現された産物を精製した後、純度を確認するために行ったSDS-PAGE結果を、図2および図3に示した。図2および図3は、このように精製された二量体の形態と単量体の形態の免疫グロブリンFc蛋白質を15クライテリオンゲルcriteriongel、Bio-Rad社を用いて非還元条件のSDS-PAGEゲルと還元条件のSDS-PAGEゲルに展開させてその移動様相を比較したものである。図2のAは非還元条件でSDS-PAGEゲルに展開したもので、Bは還元条件でSDS-PAGEゲルに展開したものである。レーンMは予め染色された低範囲標準蛋白質マーカーprestainedlowrangestandardmarker、Bio-Rad社であり、レーン1~4はそれぞれ形質転換体HM10927、HM10928韓国微生物保存センターに2004年9月15日付で寄託した。寄託番号:KCCM-10589、HM10929韓国微生物保存センターに2004年9月15日付で寄託した。寄託番号:KCCM-10594およびHM10932によって生産された免疫グロブリンFc試料である。図2に示すように、還元条件のSDS-PAGEでは、免疫グロブリンFc断片は、ヒンジ領域のシステイン残基によるジスルフィド結合が還元されて、それぞれ単量体の形態で存在するので、単量体の大きさだけ移動した。一方、非還元条件のSDS-PAGEでは、免疫グロブリンFc断片は、それぞれの単量体がジスルフィド結合で連結された二量体の形態で存在し、その結果、約42kDaの移動距離を持つことを確認した。図3のAは、非還元条件で、蛋白質をSDS-PAGEゲルに展開したものであり、Bは還元条件で、蛋白質をSDS-PAGEゲルに展開したものである。レーンMは、前記標準蛋白質マーカーであり、レーン1および2は、形質転換体HM10930およびHM10933によって生産された免疫グロブリンFc試料である。図3に示すように、還元条件と非還元条件とにおける移動距離はあまり差異がなく、分子内ジスルフィド結合の還元有無によって移動距離に若干の差異があることを確認した。免疫グロブリンFcおよび薬物の結合体製造実施例5インターフェロンアルファIFNα-PEG-免疫グロブリンFc領域Fc結合体の製造I段階1免疫グロブリンを用いた免疫グロブリンFc領域の製造免疫グロブリンFc領域を製造するために、10mMのリン酸塩緩衝液に溶解された分子量150kDaの免疫グロブリンGImmunoglobulinG;IgG、緑十字200mgを、蛋白質加水分解酵素パパインPapain、Sigma社2mgを用い、37°Cで2時間徐々に攪拌しながら処理した。酵素反応後、生成された免疫グロブリンFc領域を精製するために、Superdexカラム、プロテインAカラムおよび陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィを順次行った。具体的には、反応液を、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液PBS、pH7.3によって平衡化させたSuperdex200カラムPharmacia社に滴下し、同一の緩衝液を用いて1mL/分の流速で溶出させた。免疫グロブリンFc領域より分子量が相対的に大きい未反応免疫グロブリンIgGやFab’2などは、早く溶出するので、これを先に除去した。免疫グロブリンFc領域と類似の分子量を持つFabは、次のように、プロテインAカラムクロマトグラフィを行って除去した図4。20mMのリン酸塩緩衝液pH7.0で平衡化させたプロテインAカラムPharmacia社にSuperdex200カラムから溶出した免疫グロブリンFc領域含有分画を5mL/分の流速で負荷した後、カラムに結合していない蛋白質を除去するために同一の緩衝液で十分洗浄した。次に、100mMのクエン酸ナトリウムNacitrate、pH3.0緩衝液を流して高純度の免疫グロブリンFc領域を溶出させた。最後に、プロテインAカラムで精製されたFc分画を陽イオン交換樹脂カラムpolyCAT、PolyLC社を用いて精製した。プロテインAカラムで精製されたFc分画を滴下した前記陽イオン交換樹脂カラムは、10mMの酢酸塩緩衝液pH4.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.4M法によって溶出し、高純度のFc分画を得た。前記高純度のFc分画を12SDS-PAGEによって解析した図5のレーン2。段階2IFNα-PEG連結体の製造両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量3.4kDaのポリエチレングリコールALD-PEG-ALDShearwater社を、ヒトインターフェロンアルファ-2bhIFNα-2b、分子量20kDaが5mg/mLの濃度で溶解された100mMのリン酸塩緩衝液に、IFNα:PEGのモル比が1:1、1:2.5、1:5、1:10および1:20となるように添加した。ここに還元剤のナトリウムシアノボロハイドライドNaCNBH3、Sigma社を最終濃度が20mMとなるように添加し、4°Cで徐々に攪拌しながら3時間反応させた。インターフェロンアルファのアミノ末端部位に選択的にPEGを連結され、PEGとインターフェロンアルファが1:1で結合した連結体を得るために、前記反応混合物をSuperdexRカラムPharmacia社を用いたサイズ排除クロマトグラフィにかけた。溶出液として10mMのリン酸カリウム緩衝液pH60を用いてIFNα-PEG連結体を精製し、PEGと結合していないインターフェロンアルファ、未反応PEGおよび2つのインターフェロンアルファがPEGと連結された二量体副産物を除去した。精製されたIFNα-PEG連結体を5mg/mLの濃度に濃縮した。これより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないIFNα:PEGの最適反応モル比は1:2.5~1:5であることを確認した。段階3IFNα-PEG-Fc結合体の形成前記段階2で精製されたIFNα-PEG連結体に免疫グロブリンFc領域のN末端に結合させるために、段階1で準備された免疫グロブリンFc領域約53kDaを10mMのリン酸塩緩衝液に溶解させた後、IFNα-PEG連結体:Fcのモル比がそれぞれ1:1、1:2、1:4および1:8となるように、IFNα-PEG連結体と混合して反応させた。反応液を100mMのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加し、4°Cで20時間徐々に攪拌しながら反応させた。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないIFNα-PEG連結体:Fcの最適反応モル比は1:2であることを確認した。段階4IFNα-PEG-Fc結合体の分離および精製前記段階3の結合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体を精製するためにSuperdexサイズ排除クロマトグラフィを行った。反応混合物を濃縮した後、10mMのリン酸塩緩衝液pH7.3を用いて流速2.5mL/分でカラムを通過させ、結合していないFcおよび未反応物質を除去し、IFNα-PEG-Fc蛋白質結合体分画を得た。得られたIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体分画には不純物として少量の未反応Fcおよびインターフェロンアルファ二量体が混在しているので、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。IFNα-PEG-Fc蛋白質結合体分画を10mMの酢酸ナトリウムpH4.5で平衡化させたPolyCATLPカラムPolyLC社に仕込み、1Mの塩化ナトリウムNaClを含む10mMの酢酸ナトリウムpH4.5緩衝液を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.5M法で溶出してさらに精製した。最後に、陰イオン交換カラムを用いてIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体を精製した。PolyWAXLPカラムPolyLC社を10mMのTris-HClpH7.5緩衝液で平衡化させた後、精製されたIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体分画を負荷し、1Mの塩化ナトリウムを含む10mMのTris-HClpH7.5緩衝液を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.3M法で溶出して純粋なIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体を精製した。実施例6IFNα-PEG-Fc結合体の製造II段階1Fc-PEG連結体の製造両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量3.4kDaのポリエチレングリコールALD-PEG-ALDShearwater社を、前記実施例5の段階1で準備された免疫グロブリンFc領域が15mg/mLの濃度で溶解された100mMのリン酸塩緩衝液に、免疫グロブリンFc:PEGのモル比がそれぞれ1:1、1:2.5、1:5、1:10および1:20となるように添加した。還元剤のNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで徐々に攪拌しながら3時間反応させた。免疫グロブリンFc領域のアミノ末端部位に選択的にPEG:Fcが1:1で結合した連結体を得るために、前記反応混合物を持ってSuperdexSuperdexR、Pharmacia社サイズ排除クロマトグラフィを行った。溶出液として10mMのリン酸カリウム緩衝液pH60を用いてFc-PEG連結体を精製し、PEGと結合していない免疫グロブリンFc領域、未反応PEGおよび2つの免疫グロブリンFc領域がPEGに連結された二量体副産物を除去した。精製されたFc-PEG連結体を約15mg/mLの濃度で濃縮した。これより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないFc:PEGの最適反応モル比は1:3~1:10であることを確認した。段階2Fc-PEG連結体とインターフェロンアルファの結合体の形成および精製前記段階1で精製されたFc-PEG連結体をIFNαのN末端に結合させるために、10mMのリン酸塩緩衝液に溶解されたインターフェロンアルファを使用し、Fc-PEG連結体:IFNαのモル比がそれぞれ1:1、1:1.5、1:3および1:6となるように添加して反応させた。反応液を100mMのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで20時間徐々に攪拌しながら反応させた。反応後、実施例5の段階4と同一の方法で精製して未反応物質および副産物を除去し、これから生成されたFc-PEG-IFNα蛋白質結合体を純粋に分離した。実施例7ヒト成長ホルモンhGH-PEG-Fc結合体の製造インターフェロンアルファの代わりにヒト成長ホルモンhGH、分子量22kDaを使用し、hGH:PEGのモル比を1:5とする以外は、実施例5と同一の方法でhGH-PEG-Fc蛋白質結合体を製造および精製した。実施例8ヒト顆粒球コロニー刺激因子G-CSF-PEG-Fc結合体の製造インターフェロンアルファの代わりにヒト顆粒球コロニー刺激因子G-CSFを使用し、G-CSF:PEGのモル比を1:5とする以外は、実施例5と同一の方法でG-CSF-PEG-Fc蛋白質結合体を製造および精製した。一方、天然型G-CSFの17番目のアミノ酸がセリンで置換された誘導体17S-G-CSFを用いて前記と同一の方法で17S-G-CSF-PEG-Fc蛋白質結合体を製造および精製した。実施例9ヒト赤血球生成因子EPO-PEG-Fc結合体の製造インターフェロンアルファの代わりにヒト赤血球生成因子Erythropoietin;EPOを使用し、EPO:PEGのモル比を1:5とする以外は、実施例5と同一の方法でEPO-PEG-Fc蛋白質結合体を製造および精製した。実施例10反応基の種類を異にするPEGを用いた蛋白質結合体の製造両末端の反応基が全てスクシンイミジルプロピオネートSuccinimidylpropionate;SPAであるPEGを用いてIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体を次のように製造した。インターフェロンアルファ10mgが溶解された100mMのリン酸塩緩衝液に、両末端にSPA反応基を持つ分子量3.4kDaのポリエチレングリコールSPA-PEG-SPAShearwater社をIFNα:PEGのモル比がそれぞれ1:1、1:2.5、1:5、1:10および1:20となるように添加し、常温で徐々に攪拌しながら2時間反応させた。インターフェロンアルファのリジン残基のアミノ基部位に選択的にPEGが1:1で結合したPEG-IFNα連結体を得るために、反応混合物をもってSuperdexサイズ排除クロマトグラフィを行った。溶出液として10mMのリン酸カリウム緩衝液pH60を用いてIFNα-PEG連結体を精製し、PEGと結合していないインターフェロンアルファ、未反応PEG、およびPEGの両末端に2つのインターフェロンアルファが連結された二量体副産物を除去した。IFNα-PEG連結体を免疫グロブリンFcのリジン残基のアミノ基部位に結合させるために精製されたIFNα-PEG連結体を約5mg/mLの濃度で濃縮した後、実施例5の段階3および4と同一の方法でIFNα-PEG-Fc結合体を製造および精製した。これより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないインターフェロンアルファ:PEGの最適反応モル比は1:2.5~1:5であることを確認した。一方、前記と同一の方法を行うが、両末端の反応基が全てN-ヒドロキシスクシンイミジルNhydroxysuccinimidyl;NHSであるPEGNHS-PEG-NHS;Shearwater社、または両末端の反応基が全てブチルアルデヒドであるPEGBUA-PEG-BUA;Shearwater社を用いてIFNα-PEG-Fc結合体の生成を確認した。実施例11分子量の異なるPEGを用いた蛋白質結合体の製造両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量10kDaのポリエチレングリコールALD-PEG-ALDShearwater社を用いて実施例5の段階2と同一の方法でIFNα-10KPEG連結体を製造および精製した。この際、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないインターフェロンアルファ:10KPEGの最適モル比は1:2.5~1:5であることが確認された。精製されたIFNα-PEG連結体を約5mg/mLとなるように濃縮した後、これを用いて実施例5の段階3および4と同一の方法によってIFNα-10KPEG-Fc蛋白質結合体を製造および精製した。実施例12Fab’-S-PEG-N-Fc結合体の製造-SH基段階1Fab’の発現および精製抗腫瘍壊死因子-アルファFab’を発現する大腸菌形質転換体BL21/poDLHF寄託番号:KCCM-10511をLB培地100mLに接種して一晩中振盪培養した後、5Lの発酵器Marubishiに接種して温度30°C、空気投入量20vvm、攪拌速度500rpmの条件下で培養した。発酵が進むにつれて、微生物の成長のために足りないエネルギー源を補うために、葡萄糖と酵母抽出液とを微生物の発酵状態に応じて投与し、吸光度600nmでのOD値が80となる時期にIPTGを投与して蛋白質の発現を誘導した。これを40~45時間高濃度で培養して吸光度600nmでのOD値が120~140となるようにした。得られた発酵液を遠心分離20,000g、30分して沈殿物は捨て、上澄み液のみを取った。得られた上澄み液から次の3段階のカラムクロマトグラフィを経て抗腫瘍壊死因子-アルファFab’を純粋に精製した。20mMのリン酸塩緩衝液pH7.0で平衡化させたHiTrap蛋白質Gカラム5mL、Pharmacia社に前記上澄み液を滴下した後、100mMのグリシンGlycine、pH3.0緩衝液を用いて溶出させた。溶出したFab’分画を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.3で平衡化させたSuperdex200カラムSuperdex200Pharmacia社に滴下し、同一の緩衝液で溶出させた。溶出したFab’分画をpolyCAT21×250カラムPolyLC社を用いて最終精製したが、10mMの酢酸塩緩衝液pH4.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.4M法で溶出して純粋な抗腫瘍壊死因子-アルファFab’分画を得た。段階2Fc-PEG連結体の製造および精製免疫グロブリンFcのN末端のアミノ基にリンカーPEGを結合させるために、前記実施例5の段階1と同一の方法で製造された免疫グロブリンFcを100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0に5mg/mLの濃度で溶解させ、ここにNHS-PEG-MAL3.4kDa、Shearwater社をFc:PEGのモル比が1:10となるように添加した後、4°Cで徐々に攪拌しながら12時間反応させた。反応終了後、反応緩衝液を20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0で交換しながら、反応していないNHS-PEG-MALを除去した。緩衝液の交換後、反応物をpolyCATカラムPolyLC社に負荷し、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0を直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.5M方法で流して免疫グロブリンFc-PEG連結体を先に溶出させて得た後、反応していない免疫グロブリンFcを溶出させて除去した。段階3Fab’-S-PEG-N-Fc結合体-SH基の製造および精製Fab’の遊離システイン基に免疫グロブリンFc-PEG連結体を結合させるために、段階1で精製されたFab’を100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.3に2mg/mLの濃度で溶解させた後、同一の緩衝液に段階2で準備された免疫グロブリンFc-PEG連結体をFab’:連結体のモル比が1:5となるように入れた。最終蛋白質の濃度が50mg/mLとなるように濃縮し、4°Cで徐々に攪拌しながら24時間反応させた。カップリング反応の終了後、反応液を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.3で平衡化させたSuperdex200カラムSuperdex200、Pharmacia社に滴下し、同一の緩衝液を1mL/分の流速で流して溶出させた。カップリングされたFab’-S-PEG-N-Fc結合体は、分子量が大きいので先に溶出し、反応していない免疫グロブリンFc-PEG連結体およびFab’は後で溶出するため、除去することができた。残存する未反応免疫グロブリンFcを完全に除去するために、溶出したFab’-S-PEG-N-Fc結合体分画をさらにpolyCAT21×250カラムPolyLC社に滴下し、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.5M法で溶出し、Fc-PEG連結体がFab’のC末端付近の-SH基に連結されたFab’-S-PEG-N-Fc結合体を純粋に得た。実施例13Fab’-N-PEG-N-Fc結合体の製造N末端段階1Fab’-PEG連結体N末端の製造および精製前記実施例12の段階1で得た、精製されたFab’40mgを100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0に5mg/mLの濃度で溶解させた後、ブチルALD-PEG-ブチルALD3.4kDa、Nektar社をFab’:PEGのモル比が1:5となるように添加した。還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで徐々に攪拌しがら2時間反応させた。反応終了後、反応緩衝液を20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0で交換した。緩衝液の交換後、反応物をpolyCATカラムPolyLC社に負荷し、20mMの酢酸塩緩衝液pH4.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.4M法で溶出し、Fab’のN末端にリンカーPEGが結合したFab’-PEG連結体分画を先に溶出させて得た後、反応していないFab’を溶出させて除去した。段階2Fab’-N-PEG-N-Fc結合体の製造および精製段階1で精製されたFab’-PEG連結体を免疫グロブリンFcのN末端に結合させるために、100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0に10mg/mLの濃度で溶解させた後、同一の緩衝液に溶解された免疫グロブリンFcをFab’-PEG連結体:Fcのモル比が1:5となるように入れた。最終蛋白質の濃度が50mg/mLとなるように濃縮し、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで徐々に攪拌しながら24時間反応させた。カップリング反応の終了後、反応液を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.3で平衡化させたSuperdex200カラムSuperdex200、Pharmacia社に滴下し、同一の緩衝液を1mL/分の流速で流して溶出させた。カップリングされたFab’-N-PEG-N-Fc結合体は、分子量が大きいので先に溶出し、反応していない免疫グロブリンFcおよびFab’-PEG連結体は後で溶出するため除去することができた。残存する未反応免疫グロブリンFcを完全に除去するために、溶出したFab’-N-PEG-N-Fc結合体分画をさらにpolyCAT21×250カラムPolyLC社に負荷し、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.5M法で溶出し、免疫グロブリンFc-PEG連結体がFab’のN末端に連結されたFab’-N-PEG-N-Fc結合体を純粋に得た。実施例14脱糖鎖化免疫グロブリンFcの製造および精製前記実施例5と同一の方法で製造した免疫グロブリンFc200mgを、100mMのリン酸塩緩衝液pH7.5に2mg/mLの濃度となるように溶解した後、脱糖鎖化酵素PNGaseFNEB社を300U/mgとなるように添加した。反応混合物を37°Cで24時間徐々に攪拌しながら反応させた。反応終了後、脱糖鎖化免疫グロブリンFcを精製するために、反応物をSPセファロースFFカラムPharmacia社に負荷し、10mMの酢酸塩緩衝液pH4.5条件で1MのNaClを使用した直線濃度勾配0.1M→0.6M法で溶出させ、天然型免疫グロブリンFc分画を先に溶出させた後、脱糖鎖化免疫グロブリンFcdeglycosylatedFC:DGFcを溶出させて得た。実施例15IFNα-PEG-DGFc結合体の製造前記実施例5の段階2で精製されたIFNα-PEG連結体に、前記実施例14で製造された脱糖鎖化免疫グロブリンFcを結合させるために、IFNα-PEG連結体を10mMのリン酸塩緩衝液に溶解されたDGFcにIFNα-PEG連結体:DGFcのモル比がそれぞれ1:1、1:2、1:4および1:8となるように添加して反応させた。反応液を100mMのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで20時間徐々に攪拌しながら反応させた。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないIFNα-PEG連結体:DGFcの最適反応モル比は、1:2であることを確認した。結合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたIFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体を精製するために、反応混合物を用いてSuperdexSuperdexR、Pharmacia社サイズ排除クロマトグラフィを行った。リン酸塩緩衝液pH7.3を用いて流速2.5mL/分でカラムに通過させ、結合していないDGFcおよび未反応物質を除去し、IFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体分画を精製した。得られたIFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体分画には、不純物として少量の未反応DGFcおよびIFNα-PEG連結体が混在しているので、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。IFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体分画を10mMの酢酸ナトリウムpH4.5で平衡化させたPolyCATLPカラムPolyLC社に仕込み、1MのNaClを含んだ10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.6M法で溶出してさらに精製し、最後に陰イオン交換カラムを用いてIFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体を純粋に獲得した。PolyWAXLPカラムPolyLC社を10mMのTris-HCl緩衝液pH7.5で平衡化させた後、精製されたIFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体分画を負荷し、1Mの塩化ナトリウムを含んだ10mMのTris-HCl緩衝液pH7.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.3M法で溶出して純粋なIFNα-PEG-DGFc蛋白質結合体を精製した。実施例16IFNα-PEG連結体と組み換えAGFc誘導体の結合体の製造前記実施例5および15と同一の方法により、実施例1で製造されたAGFc誘導体であるIgG4delta-CysのN末端にIFNα-PEG連結体を結合させた。実施例1で製造されたAGFc誘導体であるIgG4delta-CysをIFNα-PEG連結体と結合させた。結合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたIFNα-PEG-AGFc蛋白質結合体Iを精製するために、QHP26/10カラムPharmacia社50mLを用いて1次精製した後、高圧カラムのpolyCAT21.5×250カラムPolyLC社で高純度の結合体を精製した。カップリング反応液を脱塩カラムHiPrep26/10Pharmacia社を用いて10mMのTris緩衝液pH8.0で交換した後、QHP26/1050mLカラムに8mL/分の流速で負荷して結合させた後、直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.2M法によって所望の分画を得た。溶出した分画を10mMの酢酸塩緩衝液pH5.2で平衡化されたpolyCAT21.5×250カラムに15mL/分の流速でさらに結合させた後、直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.1M→0.3M法で溶出させて高純度の分画を得ることができた。同一の方法により、実施例12で製造された別のAGFc誘導体であるIgG4単量体を用いてIFNα-PEG-AGFc蛋白質結合体IIを製造した。実施例17ヒト赤血球生成因子EPO-PEG-組み換えAGFc誘導体の結合体の製造前記実施例16と同一の方法により、EPO-PEG連結体とAGFc誘導体であるIgG4delta-Cysとが連結された結合体を製造した。比較例1IFNα-40KPEG連結体の製造100mMのリン酸カリウム緩衝液pH6.0にインターフェロンアルファ5mgを溶解して最終体積が5mLとなるように調製した後、PEGの分子量40kDaの活性化メトキシ-PEG-アルデヒドShearwater社をインターフェロンアルファ:40KPEGのモル比が1:4となるように前記溶液に添加した。前記反応溶液に還元剤NaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで18時間徐々に攪拌させながら反応させた。インターフェロンアルファに反応していないPEGを不活性化させるために、エタノールアミンを最終濃度が50mMとなるように添加した。未反応PEGの分離および緩衝液の交替のためにSephadexG-25カラムPharmacia社を用いた。まず、2カラム体積columnvolume;CVの10mMTris-HCl緩衝液pH7.5を用いてカラムを平衡化させた後、反応混合物を滴下した。溶出画分は、紫外部吸光計により波長260nmの吸収を測定することによって検出した。前記カラムを同一の緩衝液で溶出させると、大きさが更に大きいPEGによってN末端に:挿入KYM修飾されたインターフェロンアルファが先に溶出し、未反応PEGは時差をおいて後で溶出するため、IFNα-40KPEGのみを分離することができる。前記で得た溶出液からIFNα-40KPEG連結体をさらに純粋に分離、精製するために、次のようにクロマトグラフィを行った。3mLのPolyWAXLPカラムPolywax社を10mMのTris-HCl緩衝液pH7.5で平衡化させた。PEG-IFNα連結体を含有する溶出液を1mL/分の流速でカラムに負荷した後、15mLの平衡緩衝液で洗浄した。30mLの1MNaCl緩衝液を用いた0~100の塩濃度勾配法を用いてトリ-、ジ-およびモノ-PEGが結合したインターフェロンアルファを順序とおりに溶出させた。さらに純粋なモノ-PEG結合インターフェロンアルファを分離するために、前記で収得したモノ-PEGとインターフェロンアルファとの連結体溶出分画をサイズ排除クロマトグラフィにかけた。10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0で平衡化させたSuperdex200Superdex200、Pharmacia社に前記溶出液を濃縮して滴下した後、同一の緩衝液で溶出させた。この際、1mL/分の流速で緩衝液を流した。トリ-およびジ-PEGが結合したインターフェロンアルファは、モノ-PEGが結合したインターフェロンアルファより溶出時間が相対的に早いので、これを除去して、モノ-PEGが結合したインターフェロンアルファのみを純粋に分離した。同一の方法により、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子およびその誘導体のアミノ末端に40KPEGが結合したhGH-40KPEG、G-CSF-40KPEGおよび40KPEG-17S-G-CSF誘導体の連結体を製造した。比較例2IFNα-PEG-アルブミン結合体の製造実施例1の段階2で精製されたIFNαF-PEG連結体をアルブミンのアミノ末端に結合させるために、10mMのリン酸塩緩衝液に溶解されたヒトアルブミンhumanserumalbumin、HSA、約67kDa、緑十字をIFNα-PEG連結体:アルブミンのモル比が1:1、1:2、1:4および1:8となるように添加した後、反応させた。反応液を100mMのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてNaCNBH3を最終濃度が20mMとなるように添加した後、4°Cで20時間徐々に攪拌しながら反応させた。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないIFNα-PEG連結体:アルブミンの最適反応モル比は、1:2であることを確認した。結合反応の後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたIFNα-PEG-アルブミン蛋白質結合体を精製するために、Superdexサイズ排除クロマトグラフィを行った。各反応混合物を濃縮した後、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液を2.5mL/分の流速でカラムに通過させ、結合していないアルブミンおよび未反応物質を除去し、IFNα-PEG-アルブミン蛋白質結合体のみを精製した。得られたIFNα-PEG-アルブミン蛋白質結合体分画には、不純物として少量の未反応アルブミンおよびインターフェロンアルファ二量体が混在しているので、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。IFNα-PEG-アルブミン蛋白質結合体分画を10mMの酢酸ナトリウム溶液pH4.5で平衡化させたカラムSP5PW、Waters社に負荷し、1Mの塩化ナトリウムNaClを含んだ10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0M→0.5M法で溶出してさらに精製し、IFNα-PEG-アルブミン蛋白質結合体を純粋に獲得した。同一の方法により、ヒト成長ホルモン、G-CSFおよびその誘導体にそれぞれアルブミンが結合したhGH-PEG-アルブミン、G-CSF-PEG-アルブミンおよび17S-G-CSF-PEG-アルブミン結合体を製造した。比較例3Fab’-S-40KPEG連結体の製造実施例8の段階1で精製されたFab’に存在する遊離システイン基を活性化させるために、活性化緩衝液20mMの酢酸ナトリウムpH4.0、0.2mMのDTTに1時間放置した。PEG修飾緩衝液である50mMのリン酸カリウムpH6.5で緩衝液を交換した後、マレイミド-PEG分子量40kDa、Shearwater社をFab’:40KPEGのモル比が1:10となるように添加した後、4°Cで徐々に攪拌しながら24時間反応させた。反応終了後、反応液を10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.3で平衡化させたSuperdex200カラムSuperdex200、Pharmacia社に滴下し、同一の緩衝液を1mL/分の流速で流して溶出させた。40KPEGが修飾されたFab’-40KPEG連結体は、分子量が大きいので、反応していないFab’よりも早く溶出し、Fab’は後で溶出するため、除去することができた。完全に除去されていないFab’を除去するために、溶出したFab’-40KPEG連結体分画をpolyCAT21×250カラムPolyLC社を用いて最終精製した。20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH4.5を用いた直線濃度勾配塩化ナトリウムの濃度0.15M→0.5M法で溶出し、Fab’の-SH基に40KPEGが連結されたFab’-S-40KPEG連結体を純粋に得た。実験例1蛋白質結合体の確認および定量1-1蛋白質結合体の確認前記実施例で製造した蛋白質結合体は、4~20の濃度勾配ゲルおよび12のゲルを用いた非還元性SDS-PAGEおよびELISARDsystem社法で確認した。図6に示すように、SDS-PAGEの結果から、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体であるPEGおよび免疫グロブリンFc領域のカップリング反応によって、IFNα-PEG-Fc結合体A、17Ser-G-CSF-PEG-Fc結合体BおよびEPO-PEG-Fc結合体Cが生成されたことを確認した。また、前記実施例10で製造したDGFcを確認するために非還元性12SDS-PAGEを行った結果、図9bに示すように、天然型Fcに比べて除去された糖鎖分子量だけ減少した位置でDGFcバンドが検出された。1-2蛋白質結合体の定量前記実施例で製造したそれぞれの蛋白質結合体の量は、SuperdexカラムHiLoad26/60Superdex75、Pharmacia社と10mMのリン酸カリウム緩衝液pH6.0を溶出液として用いるサイズ排除クロマトグラフィでのピーク面積を対照と比較して換算する方法によって計算した。既に定量されているIFNα、hGH、G-CSF、17S-G-CSF、EPOおよびFcを用いてそれぞれサイズ排除クロマトグラフィを行った後、濃度とピーク面積間の換算係数を測定した。各蛋白質結合体の一定量を使用して同一のサイズ排除クロマトグラフィを行い、ここから得られたピーク面積から免疫グロブリンFc領域に該当するピーク面積を差し引いた値を、各蛋白質結合体に存在する生理活性蛋白質の定量値として決定した。図7は精製されたIFNα-PEG-Fc結合体のサイズ排除クロマトグラフィカラムの分析結果を示すもので、二量体以上の多量体不純物がない単一ピークを確認した。Fcが生理活性ポリペプチドに結合すると、生理活性ポリペプチドの抗体でその量を定量するとき、抗体と前記ポリペプチドとの結合が阻害され、クロマトグラフィによって計算される実際値より少なく定量される。ELISA分析の結果から、IFNα-PEG-Fcの場合には、ELISAによって測定された値が大略実際値の約30程度であると確認された。1-3蛋白質結合体の純度および質量確認それぞれの実施例で得た蛋白質結合体に対してサイズ排除クロマトグラフィを行い、280nmの吸光を測定した。その結果、IFNα-PEG-Fc、hGH-PEG-Fc、G-CSF-PEG-Fcおよび17Ser-G-CSF-PEG-Fcは、分子量70~80kDaの物質の滞留時間帯で単一ピークを示した。一方、実施例5、15および16で獲得した蛋白質結合体IFNα-PEG-Fc、IFNα-PEG-DGFcおよびIFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体試料の純度を分析するために、逆相HPLCを行った。逆相カラムVydac社、259VHP54カラムを用いて分析し、0.5TFAの存在下のアセトニトリル溶媒を用いた濃度勾配40~100法によって溶出した。純度は、280nmの吸収を測定することによって解析された。その結果、図11から分かるように、結合していないインターフェロンまたは免疫グロブリンFcは存在しておらず、IFNα-PEG-Fc結合体A、IFNα-PEG-DGFc結合体BおよびIFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体Cのいずれも96以上の純度で純粋に精製された。各精製された試料の正確な分子量を確認するために、各試料の質量をMALDI-TOFVoyagerDE-STR、AppliedBiosystems社超高速質量分析器を用いて分析した。マトリックスとしてはシナピン酸を使用し、それぞれの試験用試料0.5μLを試料スライドに塗布して自然乾燥させた後、同量のマトリックス溶液を添加し、その後さらに自然乾燥させてイオン源に導入した。検出はポジティブ方式でリニアモードTOF方式の装置を用いて行った。イオンは、遅延したイオン抽出DEを用いる分割抽出供給源で、遅延した抽出時間を750nsec/1500nsecとして、約2.5kVの全体電位差によって加速化した。表1は前記実施例で得たそれぞれのFc蛋白質結合体のMLADI-TOF質量分析結果を数値化して示したものであり、図8はEPO-PEG-Fc結合体、図10はIFNα-PEG-FcおよびIFNα-PEG-DGFc結合体のMALDI-TOF質量分析結果を示したものである。その結果、収得されたEPO-PEG-Fc蛋白質結合体の純度は95以上であり、理論値と非常に近い分子量を示した。また、免疫グロブリンFc領域に赤血球生成因子EPOが1:1で結合した形態であると確認された。また、MALDI-TOF質量分析法により、実施例14で製造されたFcおよびDGFcの分子量を測定した結果、DGFcの分子量は天然型Fcより3kDa程度小さい50kDaと確認された図9a。減少した3kDaは理論的糖鎖サイズに該当する分子量であって、糖鎖が完全に除去されたことを確認することができた。下記表2は、前記実施例11で製造されたIFNα-PEG-DGFc結合体と、実施例16で製造されたIFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体IおよびIIのMALDI-TOF質量分析結果を示したものである。IFNα-PEG-Fc結合体の分子量75.9kDaと比較したとき、IFNα-PEG-DGFc結合体は約3kDa程度小さい分子量を示し、IFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体Iは約3~4kDa程度小さい分子量を示した。Fc単量体に連結されたIFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体IIは、Fc単量体分子量に該当する24.5kDaが減少した分子量を示した。実験例2薬物動態学的な調査I各群当たり5匹のSDラットにおいて、天然型生理活性蛋白質対照群と前記実施例および比較例で製造した-40KPEG連結体、-PEG-アルブミン結合体、-PEG-Fc結合体、-PEG-DGFc結合体、および-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体の血液内安定性および薬物動態学的係数を比較した。対照群および-40KPEG連結体、-PEG-アルブミン結合体、-PEG-Fc結合体、-PEG-DGFc結合体、および-PEG-組み換えAGFc誘導体結合体試験群を各100μg/kgずつ皮下注射した後、対照群は注射してから0.5.1、2、4、6、12、24、30、48、72および96時間後に採血し、試験群は注射してから1、6、12、24、30、48、72、96、120、240および288時間後に採血した。ヘパリンを含有するチューブに血液試料を集めて凝固を防止し、エッペンドルフ高速マイクロ遠心分離機で5分間遠心分離して細胞を除去した。血漿内の蛋白質量は、各生理活性蛋白質に対する抗体を用いてELISA方法によって測定した。IFNα、hGH、G-CSFまたはEPOの天然型蛋白質、これらの-40KPEG連結体、-PEG-アルブミン結合体、-PEG-Fc結合体、および-PEG-DGFc結合体の薬物動態の分析結果を下記表3~表7に示した。下記表において、Tmaxは最高薬物濃度に到達する時間を、T1/2は薬物の血中半減期を、MRTは薬物分子の平均的な体内滞留時間をそれぞれ意味する。前記表3および図12の薬物動態グラフから分かるように、IFNα-PEG-Fc蛋白質結合体の場合、血中半減期は90.4時間であって天然型に比べて約50倍増加した。これは比較例1で製造したIFNα-40KPEGの半減期である35.8時間より約2.5倍増加したものである。また、IFNα-PEG-アルブミンの半減期である17.1時間に比べても、本発明のIFNα-PEG-Fc蛋白質結合体が著しく優れた血中半減期を示すことを確認した。一方、表3および図14に示すように、IFNα-PEG-DGFc結合体の場合には、血中半減期が71.0時間であって、IFNα-PEG-Fc結合体とほぼ同等なので、糖鎖がなくても生体内安定性には大きい影響がなく、組み換え方法で生産された組み換えAGFc誘導体を用いた結合体も天然型由来のDGFcと同一の効果を示すことを確認した。ところが、Fc単量体を使用した結合体の場合には、正常的なFc二量体の結合体と比較したとき、約半分に減少した血中半減期を示した。ヒト成長ホルモンの場合も、表4に示すように、本発明の蛋白質結合体が示す血中半減期の増加効果を確認することができる。すなわち、天然型1.1時間に比べてhGH-40KPEG連結体およびhGH-PEG-アルブミン結合体の半減期が7.7時間および5.9時間と多少増加した反面、本発明のhGH-PEG-Fc蛋白質結合体の場合には血中半減期が11.8時間と画期的に増加した。表5および表6における顆粒球コロニー刺激因子とその誘導体に対する薬物動態の分析結果においても、天然型、-40KPEG連結体および-PEG-アルブミン結合体に比べて本発明のG-CSF-PEG-Fcおよび17S-G-CSF-PEG-Fc結合体が一層長い血中半減期を示した。蛋白質の血中持続性を増加させる免疫グロブリンFc領域の効果は、天然型生理活性蛋白質だけでなく、一部のアミノ酸を変形させた誘導体においても天然型とほぼ同一の程度であることを確認することができ、このような結果により、本発明の方法が他の蛋白質の誘導体においても類似の効果を示すことを容易に予想することができる。表7および図13に示すように、糖鎖化されている天然型蛋白質としての赤血球生成因子に対しても本発明の蛋白質結合体の血中半減期増加効果が確認された。すなわち、天然型赤血球生成因子の血中半減期が9.4時間であり、EPOを高糖鎖化させて血中安定性を高めたダーベポエチン-αDarbepoetinα、Aranesp、Amgen社の場合は半減期が18.4時間と増加することが分かる。赤血球生成因子に免疫グロブリンFc領域を結合させた本発明のEPO-PEG-Fc結合体の場合には、血中半減期がおおよそ61.5時間と画期的に増加し、糖鎖が除去された大腸菌由来の組み換えAGFc誘導体を使用した結合体の場合には87.9時間まで半減期の増加を示し、糖鎖が除去されても、血中安定性には影響を及ぼすことなく、抗体機能がない結合体を製造することができることを確認した。前記結果から分かるように、本発明によって免疫グロブリンFc領域および非ペプチド性重合体と共有結合した蛋白質結合体は、天然型蛋白質に比べて数倍~数十倍以上増加した血中半減期を示した。また、免疫グロブリンFcを遺伝子組み換え法によって大腸菌で生産し、あるいは酵素処理によって糖鎖を除去しても、これを用いて製造された蛋白質結合体における血中半減期の増加効果はほぼ同様に維持された。特に、既存の蛋白質血中持続性を増加させるためのPEG剤形のうち持続性が最も高い40kDaPEGを修飾した蛋白質との比較においても、免疫グロブリンFc蛋白質結合体が著しく高い血中安定性を示した。また、免疫グロブリンFcの代わりにアルブミンを結合させた蛋白質結合体との比較試験においても、本発明の蛋白質結合体が、卓越した血中安定性を示すことから、本発明の蛋白質結合体が持続型蛋白質薬物製剤の開発に効果的であることを確認することができた。点突然変異によるコロニー刺激因子誘導体まで広範囲な範囲の蛋白質において従来のPEG結合蛋白質またはアルブミン蛋白質結合体より卓越した血中安定性と平均滞留時間MRTを示す結果からみて、本発明の蛋白質結合体による安定性および持続性増加効果は他の生理活性ポリペプチドにも適用可能であることが分かる。一方、非ペプチド性重合体として10kDaPEGを使用したIFNα-10KPEG-Fc蛋白質結合体実施例11を用いて前記と同一の方法で血中半減期を測定したとき、血中半減期は48.8時間であって、分子量3.4kDaのPEGを使用した蛋白質結合体の血中半減期である79.7時間より多少減少した。また、非ペプチド性重合体PEGの分子量の増加に伴って血中半減期はむしろ多少減少したが、このような結果から、蛋白質結合体の血中安定性および持続性の増加の主な要因が非ペプチド性重合体の分子量よりは結合した免疫グロブリンFc領域による効果であることが確認できる。PEGの反応基をアルデヒド反応基以外の反応基に変化させた場合でも、見掛け分子量と血中半減期が、アルデヒド反応基を持つPEGを使用した場合と類似の様相を示した。実験例3薬物動態学的な調査II実施例12および13で製造されたFab’-S-PEG-N-Fc、Fab’-N-PEG-N-Fc結合体および比較例3で製造されたFab’-S-40KPEG連結体の血中半減期を測定するために、Fab’を対照群として前記結合体または連結体を用いて実験例2と同一の方法で薬物動態学的な調査を行い、その結果を図15に示した。図15より、Fab’-S-PEG-N-FcおよびFab’-N-PEG-N-Fc結合体が、Fab’またはFab’-S-40KPEG連結体に比べて2~3倍延長された血中半減期を示すことが分かる。実験例4細胞内活性の測定4-1インターフェロンアルファ蛋白質結合体の細胞内活性比較インターフェロンアルファ蛋白質結合体の細胞内活性比較のために、IFNα-PEG-Fc実施例5、IFNα-PEG-DGFc実施例15、IFNα-PEG-組み換えAGFc誘導体実施例16、IFNα-40KPEG比較例1およびIFNα-PEG-アルブミン比較例2の抗ウイルス活性を水泡性口内炎ウイルスで飽和させたMDBKMadinDarbyBovineKidney、ATCCCCL-22を使用する細胞培養生検で測定した。この際、PEGが結合していないインターフェロンアルファ-2bNIBSC国際標準品を標準物質として使用した。MDBK細胞を、MEMminimumessentialmedium:JBI社に10FBSおよび1ペニシリン/ストレプトマイシンが添加された培地で37°C、5CO2の条件で培養した。測定しようとする試料および標準物質を一定の濃度で細胞培養培地に希釈して96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ分注した。前記培養された細胞を回収し、試料が分注されているプレートに100μLずつ加えた後、37°C、5CO2の条件で約1時間程度培養した。1時間後、ウイルスの濃度が5~7×103PFUとなるように調節されたVSVを50μLずつプレートに添加し、37°C、5CO2の条件で約16~20時間さらに培養した。試料および標準物質を入れないで細胞とウイルスのみを入れたウェルを陰性対照群として使用し、ウイルス希釈溶液を入れないで細胞のみを入れたウェルを陽性対照群として使用した。培養液を除去し、生きている細胞を染色するために、ニュートラルレッド溶液を100μLずつ添加した後、37°C、5CO2の条件で2時間培養した。上澄み液を除去した後、100のエタノールと1の酢酸とを1:1の比率で混ぜた溶液100μLを各ウェルに入れた。染色された細胞をよく振って溶解させた後、540nmで吸光度を測定した。陰性対照群をブランクとし、陽性対照群を細胞成長100と見なして50細胞成長時の濃度ED50を計算した。その結果、図8に示すように、IFNα-40KPEGは、その活性度が天然型の4.8水準に低下することが確認できる。特に、修飾されたPEGの大きさが大きいほど、血中安定性は増加し、相対的に活性度は徐々に減少したが、インターフェロンアルファの場合、12kDaPEGが修飾された場合には25、40kDaPEGが修飾された場合には約7程度の試験管内活性を持つと報告されたことがあるPBailonetalBioconjugateChem121952022001。すなわち、PEGの分子量が増加すると、血中半減期は長くなるが、相対的に活性は急激に減少するので、血中半減期が長いながら活性も優れた蛋白質結合体の開発が要求されている。また、IFNα-PEG-アルブミン結合体も天然型に比べて約5.2程度と低い活性を示したが、本発明のIFNα-PEG-Fc結合体およびIFNα-PEG-DGFc結合体は、天然型に比べて相対的活性度が28.1および25.7と画期的に高くなることを確認することができ、組み換えAGFc誘導体を使用した結合体においても類似の活性増加効果を示した。このような結果から、血中半減期の画期的増加に伴ってインターフェロンアルファと免疫グロブリンFc領域の結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待される。4-2ヒト成長ホルモン蛋白質結合体の細胞内活性比較ヒト成長ホルモン蛋白質結合体の細胞内活性を比較するために、hGH-PEG-Fc、hGH-40KPEGおよびhGH-PEG-アルブミンの細胞内活性を比較試験した。ヒト成長ホルモン依存的に分裂を行う細胞としてのラット結節リンパ腫細胞株であるNb2細胞EuropeanCollectionofCellCultures97041101を用いて細胞内活性度を試験管内の分析によって確認した。Nb2細胞を、培養液Fisher’smediumに10の牛胎児血清FBS、fetalbovineserum、0.075のNaCO3、0.05mMの2-メルカプトエタノールおよび2mMのグルタミンを添加した培地で培養した後、10の牛胎児血清を除いた同一の培地で24時間さらに培養した。培養液で培養された細胞の数を数えて約2×104個の細胞を96ウェルプレートの各ウェルに入れた後、hGH-PEG-Fc、hGH-40KPEG、hGH-PEG-アルブミン、対照群である国際標準品NationalInstituteforBiologicalStandardsandControls、NIBSCおよび天然型ヒト成長ホルモンHM-hGHをそれぞれ希釈して濃度別に添加した。その後、37°C、CO2の培養器で48時間培養した。その後、細胞の成長程度各ウェルの細胞数を測定するために、細胞染色薬CellTiter96AqueousOneSolution、Promega社を各ウェルに25μLずつ入れた後、4時間培養した。その後、490nmの吸光度を測定して各試料の力価を計算し、その結果を下記表9に示した。表9から分かるように、ヒト成長ホルモンの場合も、hGH-40KPEGの活性度は天然型の約7.6と低下し、hGH-PEG-アルブミン結合体の試験管内活性は天然型に比べて約5.2程度と低い活性を示した。ところが、本発明のhGH-PEG-Fc結合体は、相対的活性度が天然型に比べて28以上画期的に増加した。このような結果より、血中半減期の画期的増加に伴ってヒト成長ホルモンと免疫グロブリンFc領域の蛋白質結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待することができる。また、本発明の免疫グロブリンFc蛋白質結合体の活性増加は、免疫グロブリンFcによる血中安定性の増加および受容体との結合力保存、または非ペプチド性重合体によって形成された空間的余裕によるものと把握される。このような作用は、他の生理活性蛋白質の免疫グロブリンFc蛋白質結合体においても類似であるものと期待される。4-3顆粒球コロニー刺激因子蛋白質結合体の細胞内活性比較顆粒球コロニー刺激因子誘導体の蛋白質結合体の細胞内活性を比較するために、天然型G-CSFFilgrastim、第一薬品株、17Ser-G-CSF誘導体、20KPEG-G-CSFNeulasta社、40KPEG-17S-G-CSF、17Ser-G-CSF-PEG-アルブミンおよび17S-G-CSF-PEG-Fcの細胞内活性を測定した。まず、ヒト骨髄由来の細胞株であるHL-60ATCCCCL-240、Promyelocyticleukemiapatient36yroldCaucasianfemaleを10の牛胎児血清を含むRPMI1640倍地で培養してから、細胞の数を約2.2×105細胞/mLとなるように調整した後、DMSOdimethylsulfoxide、culturegrade、Sigma社を最終1.25v/vとなるように添加した。前記の細胞株を96ウェルプレートに90μLずつ入れてウェル当たり細胞が約2×104個となるようにした後、5のCO2が供給される37°Cの培養器で約72時間培養した。G-CSFELISAキットRDsystems社を用いて、濃度が決定された各試料を同一の濃度となるようにRPMI1640で希釈し、最終濃度が10μg/mLとなるようにし、これをさらにRPMI1640で1/2に希釈することを19回繰り返し行った。こうして作られた試料を培養中のHL-60細胞株の各ウェルに10μLずつ加え、最終濃度が1μg/mLから連続的に半減するようにした。前記で製造した蛋白質試料を処理した細胞株は、37°Cの培養器で72時間、さらに培養した。培養後、細胞株の増加程度を調べるために、CellTiter96TMCat.No.G4100、Promega社を用いて分析し、増加した細胞株の数は、670nm波長における吸光度を測定することによって決定した。その結果、表10から分かるように、G-CSFのアミノ酸を置換させた17Ser-G-CSF誘導体の免疫グロブリンFc蛋白質結合体も天然型蛋白質の蛋白質結合体と類似の効果を示した。17Ser-G-CSF-PEGの場合には、PEGで修飾されていないものに比べて、血中半減期は増加するが活性度は低下すると既に報告されたことがある大韓民国特許公開第2004-83268号。特に、修飾されたPEGの大きさが大きいほど、血中安定性は増加するが、相対的に活性度は徐々に低下することが分かり、17Ser-G-CSF-40KPEGは天然型に比べて約10以下の非常に低い活性度を示した。すなわち、PEGの分子量が増加すると、血中半減期は長くなるが相対的に活性は急激に減少するので、血中半減期が長くて活性も優れた蛋白質結合体の開発が要求されている。17Ser-G-CSF-PEG-アルブミンも天然型に比べて約23程度と低い活性を示したが、17Ser-G-CSF-PEG-Fcは天然型に比べて相対的活性度が51以上と高くなることを確認することができた。これにより、血中半減期の画期的増加に伴って免疫グロブリンFc領域と17Ser-G-CSF誘導体の結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待することができる。4-4Fab’結合体の細胞毒性中和試験実施例8および9で製造されたFab’-S-PEG-N-Fc、Fab’-N-PEG-N-Fc結合体、および比較例3で製造されたFab’-S-40KPEG連結体の試験管内活性実験を行った。マウス繊維亜細胞株L929ATCCCRL-2148を用いてTNFαの細胞毒性を測定する実験を基本骨格として、Fab’がTNFαの細胞壊死活性をどれくらい中和させるかを測定した。Fab’-S-PEG-N-Fc、Fab’-N-PEG-N-Fc結合体およびFab’-S-40KPEG連結体をそれぞれ2倍ずつ順次希釈して96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ分注した後、rhTNF-αRDsystems社およびRNA合成の阻害剤として用いられるアクチノマイシンDactinomycinD、Sigma社をそれぞれ最終濃度が10ng/mLおよび1μg/mLとなるように添加し、37°C、5CO2で30分間反応させた後、分析用マイクロプレートに移した。プレートの各ウェルにL929細胞株を5×104個/50μL培地となるように添加し、37°C、5CO2の培養器で24時間培養した。マイクロプレート内の培養液を除去した後、PBSに5mg/mLの濃度で溶けているMTTSigma社を50μLずつ入れた。約4時間37°C、5CO2の培養器で培養した。150μLのDMSOを添加した後、540nmの吸光度を測定して細胞毒性中和の度合いを確認した。対照群としては、実施例8の段階1で精製したFab’を使用した。その結果、図16に示すように、実験に使用した全ての蛋白質結合体は、Fab’と類似の力価を示しており、このような結果から、Fab’のN末端またはC末端近くの遊離システイン残基にPEGを介して免疫グロブリンFcを結合させた蛋白質結合体は、Fab’の血中半減期を画期的に増加させることは勿論のこと、生体内活性度も高く維持させることが分かる。4-5CDC活性の測定前記実施例で製造した誘導体と大腸菌形質転換体から発現されて精製された免疫グロブリン不変領域蛋白質とがヒトClqに結合するか否かを確認するために、下記のように固相酵素免疫検定法ELISAを行った。実験群として、形質転換体HM10932およびHM10927から生産された免疫グロブリン不変領域試料と前記実施例で製造した誘導体とを使用し、比較群として、糖が結合している免疫グロブリンIVIG-グロブリンS、緑十字PBMを始めとして、商業化されて治療用抗体として使われているいろいろの抗体を使用した。前記実験群と比較群の試料を10mMのカーボネート緩衝液pH9.6に1μg/mLの濃度で調製した。準備された試料を96ウェルプレートNuncにウェル当たり200ngの量で分注した後、4°Cで一晩中コートし、その後ウェルプレートをPBS-T溶液137mMのNaCl、2mMのKCl、10mMのNa2HPO4、2mMのKH2PO4、0.05のツイン20で3回洗浄した。牛血清アルブミンを1の濃度でPBS-T溶液に溶解させて準備したブロッキングバッファ250μLを各ウェルに添加した後、常温で1時間放置し、同一のPBS-T溶液で3回洗浄した。標準液と試料を適切な濃度でPBS-T溶液によって希釈した後、抗体がコートされたウェルに加えて常温で1時間放置させて反応させ、その後さらにPBS-T溶液で3回洗浄した。ブロッキング反応が完了したプレートに2μg/mLのClqRDsystems社、米国を添加した後、2時間常温で反応させ、反応済みのプレートを前記PBS-T溶液で6回洗浄した。ヒトの抗ヒトClq抗体とペルオキシダーゼとの結合体Biogenesis社、米国をブロッキングバッファに1000:1に希釈して各ウェルに200μLずつ加えた後、1時間常温で反応させた。反応が完了した後、各ウェルをPBS-T溶液で3回洗浄した後、発色溶液AとBカラーA-安定化ペルオキシダーゼColorAStabilizedperoxide溶液およびカラーB-安定化クロモゲンColorBstabilizedchromogen溶液、DY999、RDsystems社を同量で混合し、当該混合液を各ウェルに200μLずつ添加し、30分間放置した。その後、反応停止溶液である2Mの硫酸を50μLずつ添加して反応を停止させた。反応済みのウェルプレートは、マイクロプレートリーダーMolecularDevice社を用い、標準液と検液の450nmの波長の吸光度を測定し、その結果を図17、図18にそれぞれ示した。免疫グロブリンのFc領域における補体活性をサブクラスによって比較した結果、ヒト免疫グロブリンIgG1Fitzgerald、IgG2Fitzgerald、IgG4Fitzgeraldの順にClqに対する高い結合力を持っていることが確認でき、これにより補体活性もサブクラス間に差異があることが分かった。前記実験に使用したIVIGの場合、IgGサブクラスの集合体であるが、IgG1がほぼ大部分を占めているので、分離精製されたIgG1とほぼ類似の親和度を示した。このような対照群と比較するとき、非糖鎖化によるClqの親和度の変化は、補体活性が最も強いIgG1Fcで著しく減少することが分かり、既に補体反応がないものと知られているIgG4FcではClqに対する結合力が殆どないので、補体活性のない優れた組み換えキャリアであることが分かった図17。Clq親和度が除去されたキャリアの特性が生理活性ペプチドと結合体を作った後にも依然として維持されるか否かを調べるために、IFNαをモデルとして、糖鎖化Fc、酵素を用いた脱糖鎖Fcおよび非糖鎖化組み換えFcをキャリアとして用いて各結合体を作った後、Clqに対する結合力を検討した。糖鎖化FcとIFNα結合体IFNα-PEG-Fc:GlycosylatedIgG1Fcは、Clqに対して依然として高い親和度を維持するが、ここにPNGaseFなどを用いて脱糖鎖化させたインターフェロン結合体IFNα-PEG-DGFc:DeglycosylatedIgG1Fcは、結合力が著しく低くなることを確認し、その程度は大腸菌由来の非糖鎖化Fc結合体と同様の水準のClqに対する結合力を示した。それだけでなく、IgG1の非糖鎖化Fcを用いたインターフェロン結合体IFNα-PEG-AGFcG1:AglycosylatedIgG1FcをIgG1からIgG4に変えたインターフェロン結合体IFNα-PEG-FcG4誘導体1:AglycosylatedIgG4Fcの場合、Clqに対する親和度が完全に除去されることを確認することができ、結合体を非糖鎖化IgG4Fc単量体に変えた結合体IFNα-PEG-FcG4誘導体2:AglycosylatedIgG4Fcの場合にも、やはりClqに対する結合能力は完全に除去されることからみて、抗体断片のエフェクター機能がない良いキャリアであることを確認することができた図18。本発明は、以下の態様でも提供され得る:[1]非ペプチド性リンカーを使用して薬物との結合体を形成するための薬物キャリアとして、薬物とは独立的に組換え的な方法によって製造されたものである、IgGFc断片。[2]前記IgGがIgG2またはIgG4である1に記載のFc断片。[3]前記IgGがIgG4である2に記載のFc断片。[4]非糖鎖化された1に記載のFc断片。[5]非糖鎖化されたIgG4Fc断片である4に記載のFc断片。[6]ヒト由来の非糖鎖化されたIgG4Fc断片である5に記載のFc断片。[7]配列番号8、10または23のアミノ酸配列を持つ1に記載のFc断片。[8]1のFc断片をコードする遺伝子。[9]配列番号4、9または22である8に記載の遺伝子。[10]9の遺伝子の中から選択される配列を持つ組み換えベクター。[11]10の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。[12]11の形質転換された組み換え微生物を培養してFc蛋白質を収得する方法。[13]1のFc断片をキャリアとして含む薬剤学的組成物。"