"染色された組織マイクロアレイの画像中の複数のヒストスポットの各々について、位置を同定するための、コンピュータにより実行される方法であって、a該画像から、異常なサイズおよび形状を有するヒストスポットのいずれかを除去する工程;b該複数のスポット内の代表的なスポットに特徴的なサイズおよび形状を有する仮想的マスクを適用して、該画像の他のピクセル強度領域より高いピクセル強度領域を有する画像の領域を覆う工程;c該マスクの下の領域の画像の強度を、一時的に0に設定する工程;dどの領域もヒストスポットとみなされるために充分な強度を有さないと同定されるまで、工程bおよび工程cを繰り返す工程;e該ヒストスポットの各々の参照点を同定する工程;ならびにf各スポットの各々の参照点を、最も近く隣接するヒストスポットまたは該画像の縁部のいずれかにつなげる工程;を包含し、これによって、該画像中の複数のヒストスポットの各々についての位置を同定する方法。前記複数のヒストスポットが、組織マイクロアレイ中に存在する、請求項1に記載の方法。前記組織マイクロアレイが固定されている請求項2に記載の方法。前記組織マイクロアレイがパラフィン包埋されている、請求項3に記載の方法。前記異常なサイズおよび形状を有するスポットが、融合したスポットまたは破片の画像である請求項1に記載の方法。前記染色された組織が、発蛍光団を含む請求項3に記載の方法。光学画像化デバイスを使用して前記画像を得る工程をさらに包含する請求項1に記載の方法。前記画像化デバイスが顕微鏡である請求項7に記載の方法。前記顕微鏡が、垂直光学顕微鏡または倒立光学顕微鏡である請求項8に記載の方法。前記顕微鏡が蛍光顕微鏡である請求項7に記載の方法。要旨1つの局面において、本発明は、細胞含有サンプルを迅速に分析するためのシステムおよび方法を特徴として、細胞内の特定のバイオマーカーを局在化および定量する。1つの実施形態において、本方法は、コンピューターによって実行され、そして、使用者により規定された細胞内の領域の画像に対してバイオマーカーの画像を重ね合わせて、バイオマーカーが使用者により規定された範囲内にあるか否かを決定する。別の局面において、本発明は、画像の不規則さ、歪み、変化するトポロジーおよび1つ以上のエレメントの非存在にもかかわらず、生物学的サンプルのアレイの光学的分析を容易にするアルゴリズムを特徴とする。本明細書中に記載のシステムおよびプロセスに従う患者サンプルの分析は、診断的に特定の疾患を有するか、特定の毒素に曝露されたか、または、特定の治療薬もしくは器官移植によく応答する患者を同定するため、および予後的に例えば、特定の疾患を発症する可能性があるか、特定の治療薬によく応答する可能性があるか、または、特定の器官移植を許容する可能性がある患者を同定するため有用であり得る。疾患の新規かつより良いマーカーがポストゲノム時代において同定されているので、本明細書中に記載されたプロセスこれは、マーカーを定量するだけでなく、細胞内でのそれらの局在を決定するは、適用性を増大する。本明細書中で記載されるような、細胞含有調製物の自動分析は、バイオマーカーの予後的利点の迅速な評価を提供し得る。さらに、これらの自動化技術は、手動技術を使用しては代表的に示されない関連性を同定し得る。また、自動分析は、特に、上端および下端での染色強度の僅かな差異をより良く識別し得る。低レベルの発現を検出する能力、およびそれを発現していないものから区別する能力は、重要な予後情報を提供し得る。さらに、特定のマーカーの細胞下分布の分析は、以前は認識されなかった患者の生存への関連性を解明し得る。本発明の他の特性、目的および利点は、以下の図面、詳細な説明および特許請求の範囲から理解される。詳細な説明一般に、細胞含有サンプル組織および組織マイクロアレイを含むの迅速な自動分析のために使用され得る多くの技術が、本明細書中に記載される。これらの技術は、互いに基づいており、そして、密接したプロセスとして記載されるが、各技術は、広範な適用性を有しており、そして、個々にか、または、以下に記載の技術以外と組合せて使用され得る。1つの実施形態において、画像内のスポットの位置を同定するための技術が特徴とされる。この技術スポットファインダーspotfinderと呼ばれるは、画像の不規則さ、歪み、変化するトポロジーおよび1つ以上のエレメントの非存在にもかかわらず、このような位置を柔軟に同定し得る。このプロセスは、ヒストスポットhistospotの位置を局在化すること、および組織マイクロアレイ画像内の欠如したヒストスポットを同定することについて記載されているが、この技術は、より広範な適用を有する。より詳細には、この技術は、エレメントを局在化し、そして、エレメントの任意の集合において欠如するエレメントを同定するために使用され得る。さらに、このプロセスは、実質的に任意の次元のアレイおよび任意のエレメントの集合を含むアレイにおいて使用され得る。試料は、サイズまたは形状で制限されず、規則正しく間隔を空けられなければならないわけではない。別の実施形態において、単独でか、またはスポットファインダーと組合せて使用して、必要に応じて細胞内のバイオマーカーの局在化および定量し得る技術を、特徴とする。細胞調製物の画像は、代表的に二次元を特色とするが、細胞調製物は、深さを特徴とする。例えば、1つの細胞特性は、別の特性上に存在し得る。この重複は、画像分析ソフトウェアを潜在的に混乱させ得る。本明細書中に記載の技術吹き替えRESARapidExponentialSubtractionAlgorithmは、焦点外の画像エレメントを減算することによって、三次元画像を見積もり得る。従って、画像上のバックグラウンド特性の影響は削減され、より良い画像分析を可能にする。本明細書中に記載の別の技術吹き替えPLACEPixelBasedLocaleAssignmentCompartmentalizationofExpressionは、異なる細胞の特徴付けの間を区別する。例えば、この技術は、個々の細胞内の細胞下分布の位置を決定し得る。この技術を実行するコンピューターは、例えば、ピクセルごとの基準で区画特異的染色から得られる画像の相対強度を測定する。次いで、このコンピューターは、画像内の個々のピクセル、このピクセルが、細胞内の特定の場所または使用者が規定した領域に対応する可能性を決定する。このような分析は、コンピューターが、細胞下区画に対してシグナルを、確立した程度の正確度例えば、95で割り当てることを可能にする。この技術は、細胞の規定された場所の画像と、特定のバイオマーカーに関連するシグナルとを共存させ得る。これらの技術の使用は、自動化マイクロアレイ分析のスピードと正確さとの両方を増強し得る。図1は、蛍光タグ化マーカーでの染色後に撮影され、そして以下のような単一色の画像と合わされた、結腸癌腫の別個の単色画像を示す:DAPI核を可視化するため、青、抗サイトケラチン非腫瘍エレメントから腫瘍を識別するため、緑および抗α-カテニン細胞膜を可視化するため、赤パネルA。これらの細胞下区画間の有意な程度の重複に留意のこと。バイオマーカーβ-カテニンの単色画像が撮影されパネルB、挿入図、そして画像中の各ピクセルの強度は、パネルA中の種々の区画の相対的シグナル強度に従って再分配する青=核、赤=膜、緑=細胞質。この腫瘍におけるβ-カテニンの発現は、主に膜結合であるが、パネルA中の区画における有意な重複は、核に対して有意な量のシグナルを誤って割り当てるマゼンダおよび青のピクセル、パネルB。重複したシグナルの除去を助けるために、核細胞下区画の単色画像は、焦点外の画像から指数関数的に減算される。パネルCは、抗サイトケラチンマスク由来のマスク緑のピクセル上に示された、DAPIおよび抗α-カテニンそれぞれ、青および赤の指数関数的に減算された合成画像を示す。チャネル間であまりに重複したピクセルは、抗サイトケラチン画像から生成されるマスクによって規定されるように、非腫瘍領域なので、打ち消される<5。パネルDにおいて、バイオマーカーの指数関数的に減算された画像β-カテニン、挿入図からのシグナル強度は、次いで、パネルCにおいて規定された区画に従って再分配される。これは、重要な予後の有意性を有し得る、膜区画へのバイオマーカーのより正確な割り当てを生じる。膜結合β-カテニンは、接着複合体の細胞骨格付着を促進することによってカドヘリン媒介性の接着を安定化一方、核結合β-カテニンは、転写因子として作用するこれは、細胞の増殖および侵襲において重要ないくつかの遺伝子をアップレギュレートし、そしてこの能力において癌遺伝子とみなさるので、β-カテニン単独の発現は、予後情報を提供しない。しかし、核におけるその局在は、発癌の重要な指示であり得る。1.スポット-ファインダーspot-finder1つの実施形態において、図3に示されるように、コンピュータは、画像から任意の異常なサイズのスポットB1を除去する。異常な大きさのスポットとしては、例えば、融合したスポットおよび/または破片の画像が挙げられ得る。コンピュータは、このプロセスを自動的に実行するが、他の実施形態において、コンピュータは、このプロセスを容易にするためにユーザの入力の使用を可能にし得る。次いで、コンピュータは、代表的なスポットの大きさおよび形状の不透明な仮想的マスクを作製または利用する。仮想的マスクを使用して、コンピュータは、画像B2をスキャンして、第一のマスクが最高の平均ピクセル強度を有する領域をカバーするB3を決定する。コンピュータは、スキャンの間、画像の合計強度をモニタリングし、そしてマスクは不透明なので、合計画像強度が最小化される場合にマスクの位置を同定する。コンピュータは、この領域を第一のスポットとして同定し、そしてゼロ強度を有するように、この領域内のピクセルB4を設定する。コンピュータはまた、ゼロ強度を有するように、この領域を取り囲む予め規定された領域内のさらなるピクセルを設定する。このことは、重複するスポット間を識別するために役立つ。第一のスポットを同定した後、コンピュータは、最高の平均ピクセル強度を有する次の領域を見出すために、マスクを使用して、再びB2画像をスキャンする。次の領域が見出されると、コンピュータは、これを第二のスポットとして同定し、そしてゼロ強度を有するように、この領域中またはこの領域の周囲のピクセルを設定する。コンピュータは、スポットとして認定されるのに十分な強度を有する画像領域が見出され得なくなるまで、このプロセスを繰り返す。次いで、コンピュータは、参照点B5例えば、中心を各スポットにおいて同定し、そして各スポットの参照点を上下左右の各々の最も近い隣のスポットの参照点に結ぶ線を引く。コンピュータがこれらの方向のいずれにおいても最も近い隣のスポットを同定できないすなわち、スポットがアレイの端にある場合、コンピュータは、スポットの中心から、画像の最も近い端へと線を引く。2.RESAおよびPLACE目的の画像領域の位置が一旦決定されると、光学顕微鏡は、目的の細胞特徴を同定するために適切な波長で、高解像度の画像を入手し得る。これらの特徴としては、バイオマーカーシグナルとも称される、組織切片内の目的の細胞細胞マスクと称されるまたは細胞マスク内のユーザが規定した位置場所と称されるが挙げられる。シグナル、細胞マスクおよび場所は、チャネルと称される。図4を参照して、プロセス50は、細胞マスクチャネルからマスクを作成することによって画像中の目的の領域を決定する工程C1。次に、このプロセスは、場所およびシグナルチャネルにこのマスクを適用する工程C2。次いで、このプロセスは、例えば、偽逆重畳のプロセスにおいて、マスクした画像から焦点外の情報を除去する工程C3。次に、ピクセル割り当て段階において、このプロセスは、画像中の細胞下特徴を同定し、画像中のピクセルを場所に割り当てる工程C4。一旦ピクセルが割り当てられると、コンピュータは、この場所をシグナル画像上にマッピングし工程C5、そして各場所中のバイオマーカーの量を定量する。この段階は、シグナル割り当てと称される。これらの工程は、以下でより詳細に記載される。マスキングこのプロセスの間に、ソフトウェアは、目的の染色された細胞すなわち、細胞マスクチャネルの画像中の目的の領域を同定する。このソフトウェアは、この場所およびシグナルチャネルをマスクして、目的の領域の外側の領域の不要な分析を回避する。目的の領域を同定するために、コンピュータは、細胞マスクチャネルについての閾値強度を決定する。一旦決定されると、コンピュータは、二元リディストリビューション中のピクセル強度を再分配する。言い換えると、コンピュータは、閾値未満の各ピクセルの強度をゼロに設定し、そして残りのピクセルを最大強度を有するように設定する例えば、8ビットの画像の最大強度は、255である。最大強度に設定されたピクセル位置のセットは、マスクと称される。画像スタック中の他の画像に対する引き続く手順は、マスクに対応するピクセル位置に対して実行される。閾値強度は、画像中のバックグラウンドの強度に関連し、これは、コンピュータが、最初にその強度に従って各ピクセルを保存することによって決定する例えば、8ビットの各ピクセルは、0~255の強度を有する。いくつかの実施形態において、このバックグラウンドは、最大のビンすなわち、最も一般的なピクセル強度に対応する。他の実施形態において、このバックグラウンドは、第2の最大ビンに対応する。組織の自己蛍光および最大のビンが、蛍光組織化学染色の代わりに、蛍光組織の領域に対応するいくつかの場合において、これが生じる。いずれの場合においても、コンピュータは、バックグラウンド強度が、最大強度の特定の割合より低いこと例えば、最大強度の半分未満を推定する。ビンの大きさは、ヒストグラムを得るために、強度に対してプロットされる。ヒストグラム中の最大ピークは、最大ビンに対応する。最大ビンがバックグラウンドに対応する実施形態において、コンピュータは、この最大ピーク強度をバックグラウンド強度として割り当てる。他の実施形態において、バックグラウンドが第2の最大ビンに対応する場合、このヒストグラムは、最大ピークよりも低い強度で第二のピークを有する。従って、第二のピークが最大ピークの大きさの少なくとも特定の割合例えば、少なくとも5である場合、コンピュータは、この第二のピーク強度を、画像のバックグラウンド強度として割り当てる。一旦確立されると、コンピュータは、バックグラウンド強度にさらなる因数を加算して、閾値強度を決定する。8ビットの画像について、この因数は、ユーザが規定した入力通常0.5によって乗算されたD1/5/10と等しい。ここで、D1/5は、保存されたピクセルの五分位数分布であり、以下のように決定される。D1/5=I上位20-I下位20、ここで、I上位20は、上位20番内の百分位数の平均ピクセル強度であり、そしてI下位20は、下位20番内の百分位数の平均ピクセル強度である。閾値強度以上の強度を有するピクセルは、マスクに割り当てられる。次いで、このマスクは、ユーザにより規定されたパラメータおよび画像処理技術に従ってさらに調節される。例えば、このマスクは、このマスク領域がユーザにより規定された値に一致するか、またはマスク内の特定のユーザにより規定された大きさの満たされた穴を有するように、拡張または破壊され得る。マスクを作製するためのユーザにより規定されたパラメータは、少数のサンプルヒストスポットhistospot画像を分析した後で、全アレイを実行する前に調整され得る。マスクの作製後、コンピュータは、このマスクを画像スタック中の画像に適用し、これらの画像の各々における目的の領域を、マスクピクセル位置に対応するピクセル位置として同定する。バックグラウンド減少プロセス50は、画像からの焦点外の情報の影響C3を減少させる。例えば、このプロセス50は、偽逆重畳技術を使用し得る。残りの画像のピクセルは、強度が減少されるが、画像情報は、組織の上部を介したより薄い仮想的スライスを示す。さらに、偽逆重畳は、画像のより高い染色強度とより低い染色強度との間の界面領域を、これらの領域間の対比を増大させることによって増強する。コンピュータは、場所細胞区画およびシグナルすなわち、細胞成分チャネルに対する逆重畳を実行する。コンピュータは、最初に、これらのチャネルの画像をマスキングし、分析されるべきピクセルの数を減少させる。コンピュータは、各チャネルの2つの画像を分析する。第一の画像は、焦点が合った画像すなわち、ヒストスポットの上部の画像である。第二の画像は、僅かに焦点の外れた画像であり、これは、組織の下部の僅かに下に焦点面を配置することによって生成される例えば、5ミクロンの厚さのヒストスポットについて、この画像の焦点面は、このヒストスポットの上部の約8ミクロン下に位置される。各ピクセル位置について、コンピュータは、対応する焦点の合った画像のピクセル強度I焦点内から、焦点外の画像のピクセル強度の割合I焦点外を減算する。コンピュータは、四分位数分布D1/4を使用して、焦点の合った画像の調整されたピクセル強度I新ピクセルを以下のように決定する。ここで、I最大は、最大のピクセル強度例えば、8ビットの画像について255であり、そしてψは、以下から計算される。ψ=α×D1/4-βこれは、画像のライブラリーの経験的評価から作成された。光学逆重畳を、可視的に判断し、そして各々についてのψを焦点内の画像についての四分位数分布に対してプロットした。経験的データの回帰分析により、フィッティングパラメータについての値を得たすなわち、αは約80であり、そしてβは約1.19である。この四分位数分布は、以下から決定される。D1/4=I上位25-I下位25ここで、I上位25は、上位25番内の百分位数の平均ピクセル強度であり、そしてI下位25は、下位25番内の百分位数の平均ピクセル強度である。概念的には、低いD1/4すなわち、ノイズに対する低いシグナル比を有する画像中の低い強度のピクセルは、高いD1/4を有する画像からの低い強度のピクセルよりも、あまり激しく減算されない。ψの値は、マスクされた領域内の偽逆重畳の後に残るシグナル強度の割合を決定し、そしてその値をこのチャネルについて予め規定された値と比較することによって、精緻化され得る。この割合が、例えば、予め規定した値よりも高い場合、偽逆重畳は停止される。そうでない場合には、コンピュータは、シグナル強度の予め規定された割合に達するまで、ψの値を繰り返し増大させる。この予め規定された値は、チャネルによって覆われるマスクの予測された割合である。偽逆重畳後、得られた画像の各ピクセルは、ピクセル割り当てと称される、プロセスにおいて場所に割り当てられる。ピクセルベースの発現の場所割り当て区画化PixelBasedLocaleAssignmentCompartmentationofExpressionPLACEピクセル割り当て段階の間、コンピュータは、場所チャネル画像すなわち、染色された場所の画像の各々におけるピクセル位置の相対強度に基づく同定を割り当てる。例えば、この段階の間、コンピュータは、画像中の各ピクセル位置について、そのピクセル位置が核、膜または細胞質に属するか否かを決定する。コンピュータは、ユーザが規定した程度の確実度例えば、95以内に割り当て得ないピクセルへの割り当てを行わない。より高いレベルの確実度は、この分析からより多くのピクセルを排除する。一般に、2つの場所画像中の各ピクセル位置について、コンピュータは、ピクセル強度を読み取り、そして各強度値を所定の閾値強度値と比較する。1つの場所のみの強度値が閾値よりも高い場合、コンピュータは、このピクセル位置をその場所に割り当てる。両方の強度値が、そのそれぞれの閾値よりも高い場合、コンピュータは、各場所からの強度値を比較し、そしてより高い強度値を有する場所の同一性を、そのピクセル位置に割り当てる。両方のピクセル強度がその閾値よりも低い場合、コンピュータは、そのピクセルを第三の場所に割り当てる。画像中のピクセル位置について上述のことを繰り返した後、コンピュータは、各場所の面積を計算し、そしてその結果を所定の予想された対象部分と比較する。計算された対象部分例えば、核の場所のピクセルの数/マスクされたピクセルの数が、所定の対象部分よりも大きい場合、コンピュータは、この場所から、最も低い強度を有するピクセルを除去する。コンピュータは、対象部分が、ほぼ所定の対象部分に減少するまで、最も低い強度のピクセルを除去し続ける。以下は、このプロセスが如何に作用するかの例である。膜の場所および核の場所の画像は、実行される割り当て分析について、95の信頼区間で選択される。ピクセル位置は、排除によって細胞質の場所に割り当てられる。コンピュータは、膜および核の場所の画像中の各ピクセル位置においてピクセル強度を読み取り、そしてそれらを閾値と比較する。いずれの強度値も閾値よりも低い場合、ピクセル位置は、細胞質の場所に割り当てられる。核強度のみまたは膜強度のみが閾値よりも高い場合、コンピュータは、このピクセル位置を、閾値を上回る場所に割り当てる。両方の強度が閾値よりも高い場合、コンピュータは、一方に対すて強度値の比率を比較し、そして以下のような割り当てを行う。核強度/膜強度>1→ピクセル位置=核の場所核強度/膜強度<1→ピクセル位置=膜の場所核強度/膜強度=1→ピクセル位置=割り当てない。従って、核強度が膜強度よりも高い場合、コンピュータは、このピクセル位置を核の場所に割り当てる。膜強度が核強度よりも高い場合、コンピュータは、このピクセル位置を膜の場所に割り当てる。膜強度が核強度と等しい場合、このピクセル位置は割り当てられない。これを、ピクセル位置について繰り返す。一旦全てのピクセル位置が分析されると、コンピュータは、膜の場所に誤って割り当てられたすなわち、核から膜にこぼれた核強度の量を決定し、その逆も決定する。膜チャネルに誤って割り当てられた核強度の量が、総核強度の5より高い場合、コンピュータは、核強度に因数wで重み付けし、そして重み付けされた核強度の膜強度に対する比を再計算する。この比は互いに比較され、そしてピクセル位置は、以下のように再割り当てされる。w×核強度/膜強度>1→ピクセル位置=核の場所w×核強度/膜強度<1→ピクセル位置=膜の場所w×核強度/膜強度=1→ピクセル位置=割り当てない。コンピュータは、再び、誤って割り当てられた各場所の量を決定する。これがなお5より高い場合、コンピュータは、wの値を増大させ、そして上記の工程を繰り返す。これは、誤って割り当てられた核の場所の量が5未満になるまで続く。コンピュータは、類似の技術を使用して、膜から核へのこぼれを最小化する。コンピュータはまた、細胞質排除の場所の面積を計算し、そしてそれを所定の値と比較する。割り当てプロセスを繰り返すことによって、コンピュータは、生物学に基づいて決定されるように、5未満の細胞質から核または細胞質から膜が存在することを確実にする。次いで、コンピュータは、シグナル割り当てプロセスの間に、各場所中のシグナルの量を評価する。ピクセル割り当て後、コンピュータは、各場所中のシグナルを合計する。コンピュータは、シグナル画像すなわち、細胞成分を選択的に標識する染色の画像のピクセル強度を読み取り、そして同じ細胞下の区画に割り当てられたピクセル位置についてのシグナル強度を一緒に加算する。コンピュータは、その場所に割り当てられた各ピクセル位置のシグナル強度の直接的加算によってその場所のピクセル強度の合計を計算する。コンピュータはまた、シグナル強度および各ピクセル位置についての場所強度の比率を一緒に加算することによって、ピクセル強度比の合計を計算する。ピクセル強度の合計およびピクセル強度比の合計は、次いで、1以上のパラメータを計算する際に使用される。例えば、コンピュータは、各区画内に入るシグナルの相対的な割合例えば、総シグナルの30は膜であり、20は細胞質であり、そして50は核であるを決定する。別の例において、コンピュータは、特定の区画の大きさと比較した、存在するシグナルの量例えば、膜チャネルに割り当てられたピクセルの数によって分割された、膜チャネルに割り当てられたピクセルのシグナル強度を表示する。ユーザは、コンピュータに目的の他のパラメータを評価させるように選択し得る。例えば、どの程度の画像領域がマスクによって覆われているか、どの程度のマスクが各場所によって覆われているかなどを選択し得る。偽逆重畳アルゴリズムこれは、無関係のピクセル強度の大部分を制限するを、強度面積測定値これは、特定の細胞下の場所の面積をさらに規定すると一緒に実行することによって、コンピュータは、細胞下の位置でのピクセル位置の非常に正確な割り当てを行うことができる。いくつかの実施形態において、コンピュータは、カメラのダイナミックレンジをよりよく利用するために、さらなる工程を実行する。これは、その相対強度に基づいて、検出器のダイナミックレンジを超えて画像中のピクセル強度を再分配することによって達成される。再分配の1形態は、正規化再分配であり、これによって、より低い閾値すなわち、マスキングの間に決定されたバックグラウンドのピクセル強度は、画像中の全てのピクセルから減算され、そして得られた負の値を有する任意のピクセルは、ゼロに設定される。正規化再分配は、シグナルチャネルのために使用される。なぜなら、この再分配は、1つのサンプルから次のサンプルへと尺度を保存し、サンプル間の直接的比較が行われるのを可能にするからである。これは、シグナル画像をマスキングした後のいずれかに実行される。二重対数再分配は、画像の上限閾値の50すなわち、画像中のピクセルの50のみがより高い強度を有する値より上の画像中の全てのピクセルを、最大強度値に設定する例えば、8ビットの画像について255。下限閾値未満の強度値を有する全てのピクセルは、0に設定され、そして上限閾値と下限閾値との間の強度値を有する全てのピクセルは、以下の式に従って再割り当てされる。ここで、I新は、新しいピクセル強度をいい、I旧は、古いピクセル強度をいい、LTおよびUTは、それぞれ、最大閾値より低いか最大閾値の50であり、そしてI最大は、最大の強度値である。二重対数再分配は、場所チャネルのマスキングの後か、または偽逆重畳の後のいずれかで、これらのチャネルのために使用される。概念的には、これは、50百分位数を超える強度を有する場所画像中のピクセルが、割り当て段階の間にその場所に割り当てられることを確実にする。50番目の百分位数より低いがそれに近い強度を有するピクセルは、より厳しく重み付けされ、そして50番目の百分位数より十分低い強度を有するピクセルよりも、その場所に割り当てられる可能性が高い。他のユーザにより規定される再分配例えば、線形再分配または他の方程式による再分配が、上記の例に加えて使用され得る。上記のアルゴリズムは、組織マイクロアレイの分析に関連するが、これらは、このようなアレイを研究することだけに限定されない。スポットファインダーアルゴリズムは、収集を含む任意のエレメントを同定するために使用され得、そしてRESAアルゴリズムおよびPLACEアルゴリズムは、任意の画像化可能な細胞含有サンプル組織生検を含むおよび細胞含有液体サンプル血液、尿、髄液、唾液、リンパ、胸膜液、腹膜液および心膜液を含む内のバイオマーカーを局在化および定量するために使用され得る。また、任意の光学画像化デバイスまたは非光学画像化デバイス例えば、垂直光学顕微鏡または倒立光学顕微鏡、走査型共焦点顕微鏡、カメラ、操作型電子顕微鏡またはトンネル電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡および画像化赤外線検出器などが使用され得る。上記の実施形態において、コンピュータは、システムの他の構成エレメントを制御し、そして画像を分析してヒストスポットまたは組織マイクロアレイについての所望の情報を引き出すために、ハードウェア、ソフトウェアまたはこれら両方の組み合わせを備え得る。上記の分析は、標準的なプログラミング技術を使用するコンピュータプログラムにおいて実行される。このようなプログラムは、プロセッサ、データ保存システムメモリおよび/または保存エレメントを備える、少なくとも1つの入力デバイス、少なくとも1つの出力デバイス例えば、ディスプレイまたはプリンタをそれぞれ備える、プログラム可能なコンピュータで実行するために設計される。プログラムコードは、入力データ例えば、一緒に綴じられた画像または画像スタックに適用されて、本明細書に記載される関数を実行し、そして情報例えば、シグナルの局在化これは、1以上の出力デバイスに適用されるを生成する。各コンピュータプログラムは、高レベルの手続型プログラム言語またはオブジェクト指向プログラム言語、あるいはアセンブリ言語または機械言語で実施され得る。このようなコンピュータプログラムの各々は、コンピュータによって読み出された場合に、コンピュータ中のプロセッサに本明細書中に記載される分析を実行させ得る、コンピュータ読み出し可能保存媒体例えば、CDROMまたは磁気ディスクに保存され得る。以下は、本明細書に記載される方法に従って組織マイクロアレイの調製および分析の特定の実施形態の詳細な記載を提供するが、類似の工程が、任意の細胞含有サンプルに関して実行され得る。図5を参照して、組織マイクロアレイ100は、代表的には薄い例えば、約5ミクロンのパラフィンブロック130中に通常の間隔で包埋され、一連の行および列を形成するヒストコアhistocoreから調製された、ヒストスポット120の複数のサンプルを含む。ヒストスポットヒストコアの薄い切片120は、実質的にディスク状の形状であり、そして代表的には、パラフィンブロック130と同じ厚さすなわち、約5ミクロンであり、約0.6ミリメートルの直径を有する。代表的には、ヒストスポットの中心は、1ミリメートルの約10分のいくつか離れて間隔を空けられる。パラフィンブロック130およびヒストスポット120は、顕微鏡スライド110上に取り付けられ得る。組織マイクロアレイ100は、任意の数のヒストスポット、代表的には数百から数千程度のヒストスポットを備え得る。図6を参照して、光学顕微鏡ステーションが、組織の適切な画像を獲得するために使用され得る。顕微鏡ステーション200は、組織の画像化のための倒立光学顕微鏡201、および画像を分析するためのコンピュータ290を備える。光学顕微鏡201は、光源220を収容するマウント210、サンプルステージ240、対物レンズ250およびCCDカメラ270を備える。コンピュータ290中のフレームグラッバーは、CCDカメラ270を介して画像を獲得する。光学顕微鏡201はまた、フィルタホイール230および260を備え、これらは、一連のダイクロイックフィルタを収容する。ホイール230中のフィルタは、標準的な顕微鏡または蛍光顕微鏡についての適切な照明スペクトルの選択を可能にする。ホイール260中のフィルタは、蛍光顕微鏡におけるスペクトルシグネチャーの単離のために、伝えられた光をフィルタにかける。サンプルステージ240は、組織マイクロアレイ100を支持するか、または適切に位置付ける。サンプルステージ240は、x方向、y方向およびz方向軸が示されるに直線的に移動され得る。サンプルステージ240は、自動化された移動を可能にするために、モーターを備える。コンピュータ290は、モーターのサーボ制御によって、サンプルステージ240の移動を制御する。組織マイクロアレイ100は、以下のように画像化され得る。ユーザは、このマイクロアレイをサンプルステージ240上に配置する。ユーザは、第一すなわち、左上のヒストスポットがカメラの視野の中心になり、そしてCCDカメラ270の焦点に合うように、サンプルステージ240を調節する。対物レンズ250は、適切な解像度に調整されるべきであり、例えば、0.6ミリメートルのヒストスポットは、10倍の倍率で観察され得る。一般に、種々の手段染色された組織の可視光散乱、組織自己蛍光または蛍光タグに由来するシグナルを含むを介して評価されるように、ヒストスポットは、周りのパラフィンよりも高い光強度の領域に対応する。コンピュータ290は、コンピュータソフトウェアSoftworx2.5、AppliedPrecision、Issaquah、WAおよび画像化プラットホーム例えば、Deltavisionを使用して、低解像度の画像例えば、16ビンの解像度を有する64ピクセル×64ピクセルを獲得し得る。コンピュータ290は、サンプルステージ240を、視野とほぼ等しい量に自動的に変換する。次いで、コンピュータは、第二の低解像度の画像を獲得する。このプロセスは、コンピュータが組織マイクロアレイ全体の画像を獲得するまで繰り返される。次いで、市販のソフトウェアを使用して、コンピュータは、パッチワークのように一連の画像をつなぎ合わせることによって、組織マイクロアレイ全体の複合画像を生成する。本発明に従って検出され得る生物学的マーカーとしては、任意の核酸、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物または細胞の他の成分が挙げられるが、これらに限定されない。特定のマーカーは、特定の細胞に特徴的であるが、他のマーカーは、特定の疾患または状態に関連することが同定されている。公知の予後マーカーの例としては、酵素的マーカー例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼII、ニューロン特異的エノラーゼ、プロトンATPase-2および酸性ホスファターゼが挙げられる。ホルモンマーカーまたはホルモンレセプターマーカーとしては、ヒト絨毛性ゴナドトロピンHCG、副腎皮質刺激ホルモン、癌胎児抗原CEA、前立腺特異的抗原PSA、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、アンドロゲンレセプター、gC1q-R/p33補体レセプター、IL-2レセプター、p75ニューロトロフィンレセプター、PTHレセプター、甲状腺ホルモンレセプターおよびインスリンレセプターが挙げられる。リンパ球のマーカーとしては、以下が挙げられる:α-1-アンチキモトリプシン、α-1-アンチトリプシン、B細胞マーカー、bcl-2、bcl-6、Bリンパ球抗原36kD、BM1骨髄マーカー、BM2骨髄マーカー、ガレクチン-3、グランザイムB、HLAクラスI抗原、HLAクラスIIDP抗原、HLAクラスIIDQ抗原、HLAクラスIIDR抗原、ヒト好中球デフェンシン、免疫グロブリンA、免疫グロブリンD、免疫グロブリンG、免疫グロブリンM、κ軽鎖、κ軽鎖、λ軽鎖、リンパ球/組織球抗原、マクロファージマーカー、ムラミダーゼリゾチーム、p80未分化anaplasticリンパ腫キナーゼ、プラズマ細胞マーカー、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター、T細胞抗原レセプターJOVI1、T細胞抗原マーカーJOVI3、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、非クラスター化B細胞マーカー。腫瘍マーカーとしては、以下が挙げられる:αフェトプロテイン、アポリポプロテインD、BAG-1RAP46タンパク質、CA19-9シアリルルイスAsialyllewisa、CA50癌腫関連ムチン抗原、CA125卵巣癌抗原、CA242腫瘍関連ムチン抗原、クロモグラニンA、クラスタリンアポリポプロテインJ、上皮膜抗原、上皮関連抗原、上皮特異的抗原、大柄なgross嚢胞性疾患液性タンパク質-15、肝細胞特異的抗原、ヘレグリン、ヒト消化管ムチン、ヒト乳脂肪小球、MAGE-1、マトリクスメタロプロテイナーゼ、メランA、黒色腫マーカーHMB45、メソセリン、メタロチオネイン、ミクロフタルミア症転写因子MITF、Muc-1コア糖タンパク質、Muc-1糖タンパク質、Muc-2糖タンパク質、Muc-5AC糖タンパク質、Muc-6糖タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ、Myf-3横紋筋肉腫マーカー、Myf-4横紋筋肉腫マーカー、MyoD1横紋筋肉腫マーカー、ミオグロビン、nm23タンパク質、胎盤アルカリホスファターゼ、プレアルブミン、前立腺特異的抗原、前立腺酸ホスファターゼ、前立腺インヒビンペプチド、PTEN、腎臓細胞癌腫マーカー、小腸ムチンの抗原、テトラネクチン、甲状腺転写因子-1、マトリクスメタロプロテアーゼ1の組織インヒビター、マトリクスメタロプロテイナーゼ2の組織的インヒビター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質-1、ビリン、フォンビルブラント因子。細胞周期関連マーカーとしては、以下が挙げられる:アポトーシスプロテアーゼ活性化因子-1、bcl-w、bcl-x、ブロモデオキシウリジン、CAKcdk活性化キナーゼ、細胞内アポトーシス感受性タンパク質CAS、カスパーゼ2、カスパーゼ8、CPP32カスパーゼ3、CPP32カスパーゼ3、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリンA、サイクリンB1、サイクリンD1、サイクリンD2、サイクリンD3、サイクリンE、サイクリンG、DNA断片化因子N末端、FasCD95、Fas関連デスドメインタンパク質、Fasリガンド、Fen-1、IPO-38、Mcl-1、ミニクロモソーム維持タンパク質、ミスマッチ修復タンパク質MSH2、ポリADP-リボースポリメラーゼ、増殖細胞核抗原、p16タンパク質、p27タンパク質、p34cdc2、p57タンパク質Kip2、p105タンパク質、Stat1α、トポイソメラーゼI、トポイソメラーゼIIα、トポイソメラーゼIIIα、トポイソメラーゼIIβ。神経組織マーカーおよび腫瘍マーカーとしては、以下が挙げられる:αBクリスタリン、α-インターネキシン、αシヌクレインsynuclein、アミロイド前駆体タンパク質、βアミロイド、カルビンジン、コリンアセチルトランスフェラーゼ、興奮性アミノ酸トランスポーター1、GAP43、グリア線維酸性タンパク質、グルタミン酸レセプター2、ミエリン塩基性タンパク質、神経成長因子レセプターgp75、神経芽細胞腫マーカー、ニューロフィラメント68kD、ニューロフィラメント160kD、ニューロフィラメント200kD、ニューロン特異的エノラーゼ、ニコチン性アセチルコリンレセプターα4、ニコチン性アセチルコリンレセプターβ2、ペリフェリン、タンパク質遺伝子産物9、S-100タンパク質、セロトニン、SNAP-25、シナプシンI、シナプトフィジン、タウ、トリプトファン水酸化酵素、チロシン水酸化酵素、ユビキチン。クラスター分化マーカーとしては、以下が挙げられる:CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CDw93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CDw119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CDw125、CD126、CD127、CDw128a、CDw128b、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CDw150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、およびTCR-ζ。他の細胞マーカーとしては、以下が挙げられる:セントロメアタンパク質-FCENP-F、ジャイアンチンgiantin、インボルクリンinvolucrin、ラミンAおよびラミンC[XB10]、LAP-70、ムチン、核膜孔複合体タンパク質、p180ラメラ体タンパク質、ran、r、カテプシンD、Ps2タンパク質、Her2-neu、P53、S100、上皮マーカー抗原EMA、TdT、MB2、MB3、PCNA、ならびにKi67。細胞含有サンプルを、特定の生物マーカーまたは種々の型の細胞もしくは亜細胞画分と直接反応する、色素もしくは染色液、または組織化学物質を使用して染色し得る。全ての染色が適合するわけではない。従って、使用される染色型およびそれらの適用順序は、十分に考慮されるべきであるが、これは当業者によって容易に決定され得る。このような組織化学物質は、透過顕微鏡によって検出可能な発色団か、または蛍光顕微鏡によって検出可能な発蛍光団であり得る。一般に、細胞含有サンプルは、少なくとも1つの組織化学物質を含む溶液でインキュベートされ得、このサンプルは標的の化学物質の基と直接反応するか、または結合する。いくつかの組織化学物質は、染色を可能にするために、媒染剤または金属と共インキュベートされなければならない。細胞含有サンプルは、目的の成分を染色する少なくとも1つの組織化学物質、および対比染色として作用し、かつ目的の成分の外部領域に結合する別の組織化学物質の混合物でインキュベートされ得る。あるいは、複数のプローブの混合物が染色において使用され得、そして特定のプローブの位置を識別する方法を提供し得る。以下の非限定的なリストが、組織学的染色または対比染色に使用され得る例示的な発色団、およびそれらの標的細胞、亜細胞画分、または細胞成分を提供する:エオシン塩基性細胞成分、細胞質、ヘマトキシリン核酸、オレンジG赤血球、膵臓および下垂体細胞、ライトグリーンSFコラーゲン、ロマノフスキー-ギムザ細胞全体の形態、メイ-グリュンヴァルト色素血液細胞、ブルーカウンターステインTrevigen、エチルグリーンCASアミロイド、フォイルゲン-ナフトールイエローSDNA、ギムザ種々の細胞画分を異なって染色する、メチルグリーンアミロイド、ピロニンpiyronine核酸、ナフトールイエロー赤血球、ニューラルレッド核、パパニコラウ染色代表的には、ヘマトキシリン、エオシンY、オレンジGおよびビスマルクブラウン混合物全体的な細胞形態、レッドカウンターステインBTrevigen、レッドカウンターステインCTrevigen、シリウスレッドアミロイド、フォイルゲン試薬パラローザニリンDNA、ガロシアニンクロムミョウバンDNA、ガロシアニンクロムミョウバンおよびナフトールイエローSDNA、メチルグリーンピロニンYDNA、チオニン-フォイルゲン試薬DNA、アクリジンオレンジDNA、メチレンブルーRNAおよびDNA、トルイジンブルーRNAおよびDNA、アルシアンブルー炭水化物、ルテニウムレッド炭水化物、スーダンブラック脂質、スーダンIV脂質、オイルレッド-O脂質、ヴァンギーソン三色色素酸性フクシンおよびピクリン酸の混合物筋肉細胞、マッソン三色色素ヘマトキシリン、酸性フクシンおよびライトグリーンの混合物コラーゲン、細胞質、仁nucleioliを別々に染色する、アルデヒドフクシンエラスチン繊維ならびにヴァイゲルト染色細網線維および膠原線維を区別する。このような染色の包括的なリスト、これら染色の説明、および一般的な使用は、R.D.LillieConn’sBiologicalStains、第8編、WilliamsandWilkinsCompany、Baltimore、Maryland1969において提供される。前述の適切な媒染剤および組成物は、当業者に周知である。以下の非限定的なリストは、例示的な蛍光組織化学染色、およびそれらの標的細胞、亜細胞画分、または適用可能な細胞成分を提供する:4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPI核酸、エオシン塩基性細胞成分、細胞質、ヘキスト33258およびヘキスト333422つのビスベンズイミド核酸、ヨウ化プロピジウム核酸、スペクトラムオレンジ核酸、スペクトラムグリーン核酸、キアナクリンquianacrine核酸、フルオレセインファロイジンアクチン繊維、クロモマイシンA3核酸、アクリフラビンフォイルゲン反応核酸、オーラミンO-フォイルゲン反応核酸、臭化エチジウム核酸、ニッスル染色ニューロン、高親和性DNA発蛍光団例えば、POPO、BOBO、YOYO、およびTOTO、ならびにその他およびDNA結合性タンパク質例えば、ヒストンと融合された緑色蛍光タンパク質、ACMA、キアナクリン、ならびにアクリジンオレンジ。広範な種々の、独自の蛍光性のオルガネラ特異的プロープは、MolecularProbesEugene,ORより利用可能であり、これらとしては、ミトコンドリア特異的プローブMitoFluor色素およびMitoTracker色素、小胞体ERおよびゴルジ体のプローブER-Trackerおよび種々のセラミド結合体、ならびにリソソームプローブLysoTracker色素が挙げられる。これらのプローブ、ならびに多くの一般の蛍光性組織化学物質は、HandbookofFluorescentProbesandResearchProducts第8版2001MolecularProbes,Eugene,ORから利用可能から利用可能であり、そしてそこに広範に記載されている。各々の細胞含有サンプルは、目的の細胞成分である酵素に対して適切な基質、および酵素活性の部位で有色沈殿物を生成する適切な試薬と共に、共インキュベートされる。このような酵素組織化学染色は、特定の標的酵素に特異的である。酵素組織化学染色での染色を使用して、亜細胞成分または特定の型の細胞を規定し得る。あるいは、酵素組織化学染色を診断上で使用して、細胞内の酵素活性量を定量し得る。種々の広範な酵素基質および検出アッセイは、当該分野で公知であり、そして記載されており、そしていくつかの選択される方法が以下に例示される。酸性ホスファターゼはいくつかの方法により検出され得る。酸性ホスファターゼについてのGomoriの方法において、細胞調製物をグリセロリン酸と共にインキュベートし、そしてニトロ化を導く。酵素がホスフェートを遊離させて、これがリードと結合してリードホスフェートの無色沈殿物を生じる。次いで、この組織を硫酸アンモニウムの溶液に浸し、これは、リード硫化物の黒色沈殿物を形成するリードホスフェートと反応する。あるいは、細胞をパラロサニリン塩酸、亜硝酸ナトリウム、ナフトールnaptholASB1ホスフェート基質およびベロナール酢酸緩衝液を含む溶液でインキュベートし得る。この方法は、酸性ホスファターゼ活性の領域に赤色沈殿物を形成する。酸性ホスファターゼの特徴的な含有量に起因して、リソソームは、このアッセイの使用により他の細胞質顆粒およびオルガネラと区別され得る。デヒドロゲナーゼは、細胞を、デヒドロゲナーゼの種に対する適切な基質、およびテトラゾールと共にインキュベートすることによって位置付けられ得る。この酵素は、基質から水素イオンをテトラゾールに移動させて、テトラゾールをホルマザンの暗色沈殿物に還元する。例えば、NADHデヒドロゲナーゼは、呼吸鎖の複合体Iの成分であり、そしてミトコンドリアに大部分が配置される。周知の染色技術が開発された他の酵素、およびそれら酵素の本来の細胞内位置または活性としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ATPase筋肉線維、コハク酸デヒドロゲナーゼミトコンドリア、チトクロムcオキシダーゼミトコンドリア、ホスホリラーゼミトコンドリア、ホスホフルクトキナーゼミトコンドリア、アセチルコリンエステラーゼ神経細胞、ラクターゼ小腸、ロイシンアミノペプチダーゼ肝細胞、ミオデニレートmyodenylateデアミナーゼ筋細胞、NADHジアフォラーゼ赤血球、およびスクラーゼ小腸。免疫組織化学は、最も感度良くかつ特異的な組織化学的技術の1つである。各々の組織スポットは、特異的な結合プローブを含む、標識された結合組成物と結合され得る。種々の標識例えば、フルオロフォア、または光もしくは蛍光を吸収する生成物を生成する酵素が使用され得る。単独の結合事象に関係して強力なシグナルを提供する、広範な種々の標識が公知である。染色に使用される複数のプローブは、1つ以上の識別可能な蛍光標識で標識され得る。これらの色の差異は、特定のプローブの位置を識別する方法を提供する。フルオロフォアとタンパク質例えば、抗体の結合体を調製する方法は、文献に広範に記載されており、そして本明細書で例示を必要としない。少なくとも120,000個の市販の抗体が存在するが、以下は、細胞成分に特異的に結合することが公知であり、そして研究のために、そして限定される場合において種々の疾患の診断のために使用される免疫組織化学的染色における成分として現在使用される、いくつかの例示的な1次抗体を列挙する。抗エストロゲンレセプター抗体乳癌、抗プロゲステロンレセプター抗体乳癌、抗p53抗体複数の癌、抗Her-2/neu抗体複数の癌、抗EGFR抗体上皮増殖因子、複数の癌、抗カテプシンD抗体乳癌および他の癌、抗Bcl-2抗体アポトーシス細胞、抗E-カドヘリン抗体、抗CA125抗体卵巣癌および他の癌、抗CA15-3抗体乳癌、抗CA19-9抗体結腸癌、抗c-erbB-2抗体、抗P-糖タンパク質抗体MDR、多種薬剤耐性、抗CEA抗体癌胎児性抗原、抗レチノブラストーマタンパク質Rb抗体、抗ras腫瘍性タンパク質oneoproteinp21抗体、抗ルイスXまたはCD15とも呼ばれる抗体、抗Ki-67抗体細胞増殖、抗PCNA抗体複数の癌、抗CD3抗体T細胞、抗CD4抗体ヘルパーT細胞、抗CD5抗体T細胞、抗CD7抗体胸腺、未成熟T細胞、NKキラー細胞、抗CD8抗体サプレッサーT細胞、抗CD9/p24抗体ALL、抗CD10またはCALLAとも呼ばれる抗体一般に急性リンパ芽球性白血病、抗CD11c抗体、単球、顆粒球、AML、抗CD13抗体骨髄性単球細胞、AML、抗CD14抗体成熟単球、顆粒球、抗CD15抗体ホジキン病、抗CD19抗体B細胞、抗CD20抗体B細胞、抗CD22抗体B細胞、抗CD23抗体活性化B細胞、CLL、抗CD30抗体活性化T細胞および活性化B細胞、ホジキン病、抗CD31抗体脈管新生マーカー、抗CD33抗体骨髄性細胞、AML、抗CD34細胞上皮性幹細胞、間質腫瘍、抗CD35抗体樹状細胞、抗CD38抗体プラズマ細胞、活性化T細胞、活性化B細胞、および骨髄性細胞、抗CD41抗体血小板、巨核球、抗LCA/CD45抗体白血球共通抗原、抗CD45RO抗体ヘルパーT細胞、インデューサーT細胞、抗CD45RA抗体B細胞、抗CD39、CD100抗体、抗CD95/Fas抗体アポトーシス、抗CD99抗体ユーイング肉腫マーカー、MIC2遺伝子産物、抗CD106抗体VCAM-1;活性化内皮細胞、抗ユビキチン抗体アルツハイマー病、抗CD71トランスフェリンレセプター抗体、抗c-myc腫瘍性タンパク質およびハプテン抗体、抗サイトケラチントランスフェリンレセプター抗体、抗ビメンチン内皮細胞抗体B細胞およびT細胞、抗HPVタンパク質ヒトパピローマウイルス抗体、抗κ軽鎖抗体B細胞、抗λ軽鎖抗体B細胞、抗メラノソームHMB45抗体黒色腫、抗前立腺特異的抗原PSA抗体前立腺癌、抗S-100抗体黒色腫細胞、軟骨salvary細胞、グリア細胞、抗タウ抗原抗体アルツハイマー病、抗フィブリン抗体上皮細胞、抗ケラチン抗体、抗サイトケラチン抗体腫瘍、抗α-カテニン細胞膜、ならびに抗Tn抗原抗体結腸癌、腺癌、および膵臓癌。1次抗体と結合体化され得るフルオロフォアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、Cy2、Cy3、Cy5、VECTORRed、ELF.TM.酵素標識フルオレセイン、Cy0、Cy0.5、Cy1、Cy1.5、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy7、FluorX、カルセイン、カルセイン-AM、CRYPTOFLUOR.TM.’S、オレンジ42kDa、タンジェリン35kDa、ゴールド31kDa、レッド42kDa、クリムゾン40kDa、BHMP、BHDMAP、Br-オレゴン、ルシファーイエロー、アレクサ色素ファミリー、N-[6-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾル-4-イルアミノ]カプロイル]NBD、BODIPY.TM.、ホウ素ジピロメテン二フッ化物、オレゴングリーン、MITOTRACKER.TM.Red、DiOC.sub.73、DiIC.sub.18、フィコエリスリンPhycoerythrin、フィコビリプロテインPhycobiliproteinBPE240kDaRPE240kDaCPC264kDaAPC104kDa、スペクトラムブルー、スペクトラムアクア、スペクトラムグリーン、スペクトラムゴールド、スペクトラムオレンジ、スペクトラムレッド、NADH、NADPH、FAD、赤外線IR色素、サイクリックGDP-リボースcGDPR、カルコフルオロホワイト、リサミン、アンベリフェロンUmbelliferone、チロシン、およびトリプトファン。広範な種々の他の蛍光プローブが、HandbookofFluorescentProbesandResearchProducts第8版2001MolecularProbes,Eugene,ORから利用可能ならびに多くの他の製造業者から利用可能であり、そして/またはそれらに広範に記載される。シグナルのさらなる増幅は、抗抗体が標的の抗体プローブの定常領域に結合する場合、特に、その抗体が異なる種由来である場合、特異的な結合メンバーの組み合せ例えば、抗体と抗抗体を使用することによって、達成され得る。あるいは、リガンド-レセプター対の特異的な結合例えば、ビオチン-ストレプトアビジンが、1次抗体がその対の一方のメンバーと結合体化されて、そしてその他のメンバーが検出可能なプローブで標識される場合、使用され得る。従って、当業者は、第1のメンバーが細胞成分と結合して、第2の結合を提供するよう役割を果たす場合、第2の結合メンバーは標識を含んでも含まなくてもよい場合、結合メンバーのサンドイッチを効果的に構築し、このことはさらに、三次的な結合メンバーが標識を提供する場合、三次結合を提供し得る。二次抗体、アビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンは、それぞれ独立して検出可能な部分で標識されて、この検出可能な部分は、実質的に不溶性発色反応生成物、蛍光性色素染料、発光性色素または非蛍光性色素を有する基質の発色反応に関する酵素であり得る。これらの選択肢のそれぞれに関する例を以下に列挙する。原理的に、酵素は、i1次抗体と結合体化され得るか、または1次抗体と間接的に例えば、結合体化されたアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、2次抗体を介して結合し得、そしてii不溶性産物沈殿物を提供する可溶性基質を使用する、任意の酵素が使用され得る。使用される酵素は、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、および/またはグルコースオキシダーゼであり得;そして基質は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼまたはグルコースオキシダーゼのそれぞれの基質であり得る。アルカリフォスファターゼAPの基質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:AP-ブルー基質青色沈殿物、Zymedカタログ;AP-オレンジ基質オレンジ、沈殿物、Zymed、AP-レッド基質赤色、赤色沈殿物、Zymed、5-ブロモ,4-クロロ,3-インドリルホスフェートBCIP基質、turquoise沈殿物、5-ブロモ,4-クロロ,3-インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム/ヨードニトロテトラゾリウムBCIP/INT基質、黄褐色沈殿物、Biomeda、5-ブロモ,4-クロロ,3-インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウムBCIP/NBT基質、青色/紫色、5-ブロモ,4-クロロ,3-インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム/ヨードニトロテトラゾリウムBCIP/NBT/INT、茶色沈殿物、DAKO、ファーストレッド赤色、Magenta-phosマゼンタ、ナフトールAS-BI-ホスフェートNABP/ファーストレッドTR赤色、ナフトールAS-BI-ホスフェートNABP/NewFuchsin赤色、ナフトールAS-MX-ホスフェートNAMP/NewFuchsin赤色、NewFuchsinAP基質赤色、p-ニトロフェニルホスフェートPNPP、黄色、水溶性、VECTORTMBlack黒色、VECTOR.TM.Blue青色、VECTOR.TM.Red赤色、VegaRedラズベリー赤色。西洋ワサビパーオキシダーゼHRP、時々POと略されるの基質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:2,2’-アジノ-ジ-3-エチルベンズ-チアゾリンスルホネートABTS、緑色、水溶性、アミノエチルカルバゾール、3-アミノ,9-エチルカルバゾールAEC3A9EC、赤色、α-ナフトールピロニン赤色、4-クロロ-1-ナフトール4C1N、青色、暗青色、3,3’-ジアミノベンジジン四水素化物、DAB、茶色、オルト-ジアニシジン緑色、o-フェニレンジアミンOPD、茶色、水溶性、TACSBlue青色、TACSRed赤色、3,3’,5,5’テトラメチルベンジジンTMB、緑色または緑/青色、TRUEBLUE.TM.青色、VECTOR.TM.VIP紫色、VECTOR.TM.SGくすんだ青灰色、およびZymedBlueHRP基質鮮やかな青色。グルコースオキシダーゼGOの基質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ニトロブルーテトラゾリウムNBT、紫色沈殿物、四ニトロブルーテトラゾリウムTNBT、黒色沈殿物、2-4-ヨードフェニル-5-4-ニトロフェニル-3-フェニルテトラゾリウムクロリドINT、赤色またはオレンジ色沈殿物、テトラゾリウムブルー青色、ニトロテトラゾリウムバイオレット青紫色、および3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドMTT、紫色。全てのテトラゾリウム基質は、グルコースを補基質として必要とする。そのグルコースは酸化され、そしてテトラゾリウム塩は還元され、そして有色沈殿物を生成する不溶性ホルマザンを形成する。β-ガラクトシダーゼ基質としては、以下が挙げられるが、これに限定されない:5-ブロモ-4-クロロ,3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシドX-gal、青色沈殿物。列挙された各々の基質に関連する沈殿物は、特有の検出可能なスペクトルサイン成分を有する。この酵素はまた、基質の発光反応を触媒すること例えば、ルシフェラーゼおよびアクオリンであるが、これらに限定されないに向けられ得、この基質は、発光し得るか、または発光生成物を有する第2の基質例えば、ルシフェリンおよびATP、またはコエレンテラジンcoelenterazineおよびCa.sup.であるが、これらに限定されないの第2反応を導き得る、不溶性反応性生物を実質的に有する。以下の参考文献は、本明細書中で援用され、そしてさらなる例を提供する。J.M.Elias1990Immunohistopathology:Apracticalapproachtodiagnosis.ASCPPressAmericanSocietyofClinicalPathologists,Chicago;J.F.McGinty,F.E.Bloom1983Doubleimmunostainingrevealsdistinctionsamongopioidpeptidergicneuronsinthemedicalbasalhypothalamus.BrainRes.278:145-153;およびT.Jowett1997TissueInsituHybridization:MethodsinAnimalDevelopment.JohnWielySons,Inc.,NewYork;JHistochemCytochem1997年12月4512:1629-1641。細胞調製物は、インサイチュハイブリダイゼーションISHに供され得る。一般に、核酸配列プローブは、合成されて、そして蛍光性プローブまたはリガンド:レセプター対例えば、ビオチン/アビジンの1メンバー検出可能な部分で標識されるのいずれかで標識される。例示的なプローブおよび部分は、前述の節に記載される。この配列プローブは、細胞中の標的ヌクレオチド配列に相補的である。標的ヌクレオチド配列を含む、各々の細胞または各々の細胞成分は、標識されたプローブに結合し得る。分析に使用されるプローブは、DNAのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはRNAのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのいずれかであり得、そして天然に存在するヌクレオチド以外にも、それらのアナログ例えば、ジオキシゲニンdCTP、ビオチンdcTP7-アザグアノシン、アジドチミジン、イノシンまたはウリジンを含み得る。他の有用なプローブとしては、ペプチドプローブおよびそのアナログ、分枝の遺伝子DNA、ペプチド模倣物、ペプチド核酸、および/または抗体が挙げられる。プローブは、標的核酸配列とプローブとの間に安定かつ特異的な結合が生じるような、目的の標的核酸配列に対して十分な相補性を有する。安定なハイブリダイゼーションのために必要とされる相同性の程度は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーで変動する。ISH、ハイブリダイゼーションおよびプローブの選択についての従来の方法論は、Leitchら、InSituHybridization:apracticalguide,OxfordBIOSScientificPublishers,MicroscopyHandbooksv.271994;およびSambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress1989に記載される。本発明はさらに、以下の実施例によって例示され、これらは何らかの目的に限定するように構築されるべきではない。掲載される全ての参考文献の内容は、本明細書によって明確に参考として援用される。実施例1.エストロゲンレセプターERおよびHER2/neuの生存分析および核会合β-カテニンの分析に関する組織マイクロアレイの構築組織マイクロアレイの設計:結節陽性の侵襲性乳癌腫の345症例由来のパラフィン包埋されたホルマリン固定化切片を識別した。インサイチュで、病変および正常上皮から離れた侵襲性癌腫の領域を同定して、そして3つの0.6cmパンチの生検中心を別々の領域から取り出した。各々の中心を、別々のレシピエントブロックに整列させて、そして厚さ5ミクロンの切片を薄切して先に示したように処置したKonenen,J.ら、Tissuemicroarraysforhigh-throughputmolecularprofilingoftumorspecimens,1987Nat.Med.4:844-7。同様に、結腸癌腫の310症例を入手して、そして先に記載されるように整列させたChung,G.G.ら、Clin.CancerRes.。免疫組織化学:予め薄切したパラフィンコーティングされた組織マイクロアレイスライドをパラフィン除去し、そして圧力をかけて加熱してpressue-cooking、抗原賦活化させたKatoh,A.K.ら、1997BiotechHistochem.F2:291-8。スライドを、3つの標的抗原のうちの1つに対する抗体モノクローナル抗E.R.マウス、DakoCorporation,Carpinteria,CA、ポリクローナル抗HER/neuウサギ、DakoCorp.、モノクローナルマウスクローン14、BDTransductionLabs,SanDiegoCA抗β-カテニン、またはポリクローナルウサギ抗βカテニンを用いて染色した。1次抗体を4°Cで一晩インキュベートした。次いで、デキストランポリマーの骨格で修飾された西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化された、対応するヤギ抗マウス2次抗体または抗ウサギ2次抗体Envision,DAKOCorp.を、1時間適用した。標的抗原を、視覚分析のために、可視光クロマジェンchromagenジアミノベンジジン、DAKOか、または蛍光性クロマジェンCy-5-チラミドtyramide、NENLifeScienceProducts,Boston,MAのいずれかを用いて可視化した。自動化された分析のために設計されたスライドを、核の可視化のためにDAPIで対比染色し、そして腫瘍細胞とストローマ細胞を区別するために、ポリクローナルウサギ抗サイトケラチンZymed,So.SanFrancisco,CAまたはウサギ抗α-カテニンのいずれかを、ならびに細胞膜を視覚化するために使用した。多くの場合において、抗サイトケラチンで染色されたヒストスポットの、指数関数的に減算された画像は、腫瘍細胞においてサイトケラチンの膜下の融合に起因して、細胞膜に受容可能なマーカーを提供する。これらの抗体は、Cy3またはAlexa488のいずれかで結合体化されたヤギ抗マウス2次抗体または抗ウサギ2次抗体Amersham、Piscataway、NJおよびMolecularProbes、Eugene、ORを使用して可視化される。目視検査のために設定されたスライドを、ヘマトキシリンで酸性化した水酸化アンモニウムで対比染色した。E.R.、HER2/neuおよびβ-カテニンのレベルについてのマイクロアレイの手動検査は、これまでに記載されているSnead,D.R.ら、1993Histopathology23:233-8。画像分析:マイクロアレイの画像を、自動化X,Y,Zステージ移動を備えるTE200倒立蛍光顕微鏡上の10×NikonSuper-Fluorレンズを通して、付属の水冷式Photometricシリーズ300カメラを備える、DeltavisionのプラットフォームおよびソフトウェアSoftWorx2.5AppliedPrecision,Issaquah,WAを使用して獲得した。マイクロアレイの複数約1500枚の低解像度画像64×64ピクセルを一緒に使用して、マイクロアレイの低い強度の画像を構築stichした。各々の位置を決定するために、本明細書中で記載されるソフトウェアアルゴリズムによって、これらの画像を分析した。続いて、モノクロの高解像度1024×1024ピクセルの画像を、各々、平面焦点およびその8ミクロン下の両方で獲得した。各々の蛍光色素についてのイメージ対を獲得した。簡潔に以下に述べると、以下のように、さらなるアルゴリズムを使用して、画像を分析した。遍在的に発現される上皮特異的抗原サイトケラチンまたはα-カテニンのいずれかに由来するマスクを使用して、目的の領域腫瘍を同定した。蛍光性に標識される膜および核の区画の画像を、設定された量の画像強度が残るまで指数関数的に減算した。次いで画像を組み合わせると、その結果、ある区画から次の区画までのシグナルの最小限の重複部分が存在した。有意な程度の重複部分が存在するピクセルを、さらなる分析から無効にした。標的抗原の指数関数的に減算された画像のピクセル強度を、3つの区画核、膜または核でも膜でもない細胞質のうちの1つに割り当てた。標的の強度を以下のように分析した。E.R.については、核に局在するシグナルのみを使用し、HER2/neuについては膜に局在するシグナルのみを分析した。β-カテニンの総量のシグナルについては、核対膜のシグナル比、および核対総量のシグナル比を分析した。データ分析:乳癌からの染色スコアは、2つのスコア付け可能なヒストスポットからの、平均化した結果ERについてまたは最大化された結果HER2/neuについてを示す。その後の研究は、単独のヒストスポットの分析が結果を判定するのに統計的有意力を提供することを示し、その結果、結腸癌のアレイからの染色スコアはただ1つのヒストスポットの結果を示す。Kaplan-Meierの分析を使用して、そして統計的有意性を評価するためにMantel-Coxの対数階級スコアを使用して、総合的な生存分析を評価した。一変量のCox比例危険モデルCoxproportionalhazardmodelを使用して、相対的な危険性を評価した。分析を、Statview5.0.1SASInstitute,Cary,NCを使用して実施した。"