生体から採取された血液中に含まれるNK細胞を少なくとも抗CD16抗体、OK432ピシバニール、ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、及びサイトカインを含むNK細胞増殖刺激因子によって刺激する刺激工程、及び刺激工程後に当該血液を生理的細胞温度で培養する培養工程を含むNK細胞強化型血液製剤の製造方法。前記刺激工程において、38°C~40°Cで10時間~30時間保持する高温刺激を加える、請求項1に記載の製造方法。ビスホスホネート誘導体がゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1又は2に記載の製造方法。サイトカインがIL2である、請求項1~3のいずれか一項に記載の製造方法。抗CD16抗体が支持体に固相化されている、請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。培養工程における培養期間が9日~21日である、請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法。前記血液が末梢血、臍帯血又は骨髄液である、請求項1~6のいずれか一項に記載の製造方法。請求項1から7のいずれか一項に記載の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤。抗CD16抗体、OK432、ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、及びサイトカインを含んでなるNK細胞強化用組成物。ビスホスホネート誘導体がゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。サイトカインがIL2である、請求9又は10に記載の組成物。抗CD16抗体、OK432、ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、及びサイトカインを含むNK細胞強化型血液製造用キット。ビスホスホネート誘導体がゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項12に記載のキット。サイトカインがIL2である、請求項12又は13に記載のキット。本発明は、ドナー及び患者に対する侵襲性が低く、かつ生体から採取した血液中のNK細胞を、製造工程が簡便で、迅速に、また多量にNK細胞を増殖活性化できる新たなNK細胞強化型血液製剤の製造方法を開発し、当該方法により得られるNK細胞強化型血液製剤を安全かつ比較的安価で提供することを課題とする。上記課題を解決するため、本発明者らは、NK細胞強化型血液製剤の製造方法について、さらなる研究を重ねた結果、特定温度で特定時間時間保持する活性化工程を要さず、また、本発明者らの前記特許発明に係る先の出願特願2006124630;特許第4275680号以下、本明細書では先の出願とするに係る製造方法でのNK細胞増殖活性をさらに上回る新たなNK細胞強化型血液製剤の方法の開発に成功した。本発明は、前記結果に基づいて完成されたものであり、すなわち以下を提供する。1生体から採取された血液中に含まれるNK細胞を少なくとも抗CD16抗体、OK432ピシバニール、ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、及びサイトカインを含むNK細胞増殖刺激因子によって刺激する刺激工程、及び刺激工程後に当該血液を生理的細胞温度で培養する培養工程を含むNK細胞強化型血液製剤の製造方法。2前記刺激工程において、38°C~40°Cで10時間~30時間保持する高温刺激を加える、1に記載の製造方法。3ビスホスホネート誘導体がゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、1又は2に記載の製造方法。4サイトカインがIL2である、1から3のいずれかに記載の製造方法。5抗CD16抗体が支持体に固相化されている、1から4のいずれかに記載の製造方法。6培養工程における培養期間が9日~21日である、1から5のいずれかに記載の製造方法。7前記血液が末梢血である、1から5のいずれかに記載の製造方法。81から7のいずれかに記載の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤。9抗CD16抗体、OK432、ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、及びサイトカインを含んでなるNK細胞強化用組成物。10ビスホスホネート誘導体がゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、9に記載の組成物。11サイトカインがIL2である、9又は10に記載の組成物。12抗CD16抗体、OK432、及びビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物を含むNK細胞強化型血液製造用キット。13ビスホスホネート誘導体がゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、11に記載のキット。14サイトカインがIL2である、12又は13に記載のキット。本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010025940号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、血液中のNK細胞を従来方法よりも迅速かつ簡便に、また増殖率をさらに向上させることができる。また、本製造方法によれば、末梢血からの製造が可能なためドナー及び患者に対する侵襲性が低いという利点がある。本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、ゾレドロン酸をNK細胞増殖刺激因子の一つに使用することから、NK細胞の増殖のみならず、同時にγδT細胞の増殖も亢進することができる。それによって、細胞免疫療法において、より効果的な血液製剤を提供することができる。本発明のNK細胞強化型血液製剤によれば、サイトカインや抗生物質を原則、含有していないため、従来のサイトカイン療法のような副作用の発生がない又は極めて小さいという利点がある。1.NK細胞強化型血液製剤の製造方法1-1.概要本発明の第一の実施形態は、NK細胞強化型血液製剤の製造方法である。本実施形態では、生体より採取した血液中のNK細胞を増殖刺激因子で刺激し、その後生理的細胞温度で培養することを特徴とする。本発明においてNK細胞強化型血液製剤とは、本実施形態の製造方法によって得られる活性化された多数のNK細胞を含む血液を主成分とする製剤をいう。また、本発明において強化とは、増殖させること及び活性化させること、あるいは増殖させたこと及び活性化されたことを意味する。本明細書において活性化とは、細胞、特にNK細胞が有する機能を亢進又は増強することをいう。例えば、細胞傷害機能が増強されること、NK細胞表面の活性及び/又は増殖に関するレセプターの発現が増強されること等が挙げられる。したがって、本明細書において細胞増殖の活性化は、別途増殖活性化として示す。本発明のNK細胞強化型血液製剤は、単位体積あたり健常者血液の約100倍以上のNK細胞数を包含する。1-2.構成本実施形態のNK細胞強化型血液製剤の製造方法は、刺激工程及び培養工程を含む。以下、各工程の構成について具体的に説明をする。なお、本実施形態において、各操作は、原則として滅菌処理済の試薬、培地、器具等を使用し、培養はクリーンルーム内のクリーンベンチ等の無菌的環境下で行うことを前提とする。これは、血液、及び本実施形態で製造するNK細胞強化型血液製剤への雑菌等のコンタミネーションを防止するためである。1-2-1.刺激工程刺激工程とは、生体から採取された血液中に含まれるNK細胞をNK細胞増殖刺激因子によって刺激する工程である。1血液本発明において、血液とは、少なくともNK細胞を含む血液成分をいう。例えば、全血、臍帯血、骨髄液やその成分の一部、例えば単核球等が該当する。好ましくは、単核球である。これは、赤血球や顆粒球等の血液成分がNK細胞強化型血液製剤の製造上、阻害要因となり得る可能性があるためである。末梢血から得られる末梢血単核球PeripheralBloodMononuclearCells:PBMCsは、特に好ましい。これは、末梢血であれば時期を選ばずに生体から容易に採取できる上にドナーへの侵襲性が非常に低い等の理由による。本発明において生体とは、生きている哺乳動物をいう。種類は問わないが、好ましくはヒトである。対象とする生体は、本発明の製造方法で得られたNK細胞強化型血液製剤を投与する動物と同一の種類になるようにする。例えば、本発明のNK細胞強化型血液製剤をヒトに投与する場合、血液はヒトから採取する。最も好ましいのは、本発明のNK細胞強化型血液製剤を投与するその生体自身から採取すること、つまり、養子免疫療法を前提とした血液採取を行うことである。自己の血液由来の血液製剤であれば、投与後の拒絶反応の可能性を限りなく排除することができるからである。養子免疫療法を前提とする場合には、採取する生体が健常体である必要はない。例えば、癌やウイルス感染症に罹患した患者から採取した血液であってもよい。なお、本発明で養子免疫療法とは、以下、断りのない限り前述した広義の養子免疫療法を意味する。生体から採取されたとは、生体由来であることを意味する。したがって、生体から直接採取された血液又は間接的に採取された血液のいずれも包含する。直接採取された血液とは、例えば、末梢血や骨髄液のように注射針等を生体に直接刺して採取されたものや、臍帯血のように分娩後の臍帯から直接採取されたもの等が該当する。また、間接的に採取された血液とは、前記直接採取された血液にヘパリン等を添加して抗凝固処理を施した後、又はさらに単核球を単離した後、それらを一旦冷蔵若しくは冷凍で保存したものから採取された血液をいう。2血液の調製本工程で使用する血液が生体から直接採取された血液である場合、その採取方法は、公知の採血方法に従えばよい。例えば、末梢血であれば、末梢部の静脈等に注射をして採取すればよく、骨髄液であれば骨髄穿刺マルクによって採取すればよく、また、臍帯血であれば分娩後胎盤の娩出前の臍帯に針を刺して採取すればよい。以下、末梢血の採取について具体的に説明をする。末梢全血は、生体の末梢部血管、例えば、静脈又は動脈に注射針を刺してシリンジ内に採取すればよい。採取する容量は、必要とするNK細胞強化型血液製剤の量によって変動するが、例えば、ヒトの大人一人に対して一回投与する前記血液製剤を製造する場合、通常20mL~60mLで足りる。ただし、癌患者のように血中の末梢血単核球数が極端に低下している場合には、成分採血アフェレーシスにより、末梢血単核球だけを必要量選択的に採取してもよい。採取後、血液が凝固しないように、例えば、シリンジ内部等をヘパリン等の血液凝固阻止剤若しくは血液凝固阻害剤で予めコーティングしておくか、又は採取した血液にヘパリン等を添加しておくことが好ましい。また、末梢全血から血漿を分離し、血球成分を使用してもよい。血漿は、例えば、末梢全血を遠心管に移して、2000rpm~4000rpmで5~20分間遠心し、その上清を得ればよい。さらに、それを56°Cにて30分間程度加温して非働化し、さらに2000rpm~4000rpmで5~20分間遠心して、血小板など沈殿物を除去後、細胞培養の栄養原として使用することができる。必要に応じて、末梢全血からさらに末梢血単核球PBMCsを分離してもよい。PBMCsは、フィコールハイパックFicoll-HypaqueやフィコールコンレイFicoll-Conrayを比重液とした密度勾配遠心法を用いて、末梢全血又は血漿分離後の血球成分から得ることができる。これらの比重液は、市販の分離液等を利用すると便利である。例えば、Ficoll-PaquePLUSAmersham社やLYMPHOPREPAXIS-SHIELD社等が利用できる。PBMCsの分離方法については、キット添付のプロトコルに従えばよい。分離後のPBMCsは、比重液を除去するためにPBSや培養細胞用の培地で数回洗浄する。ここで培養細胞用の培地としては、例えば、血清を含まないPBS、RPMI1640培地又は培養に用いる無血清培地等を用いればよい。前記PBS若しくは培地で洗浄後、回収したPBMCsの数を血球計算板でカウントしておくことが好ましい。通常、20mL~60mLの末梢全血から2×107個以上のPBMCsを回収することができる。本工程で使用する血液が生体から間接的に採取された血液である場合、その採取方法は、冷凍又は冷蔵血液を公知の方法によって解凍及び加温処理して使用すればよい。例えば、前記直接採取された血液から得られた後に凍結保存されたPBMCsにRPMI1640培地を添加して解凍後、37°C、5CO2下で3時間インキュベートしたものから得る方法が挙げられる。3NK細胞増殖刺激因子本発明においてNK細胞増殖刺激因子とは、NK細胞の増殖及び/又は活性化を直接的に又は間接的に誘導する因子をいう。直接的に増殖を誘導する因子には、例えば、増殖させるNK細胞表面上の受容体と特異的に結合することによって、そのNK細胞の細胞内に増殖シグナルを伝達させる機能を有する因子が挙げられる。また、間接的に増殖を誘導する因子には、例えば、NK細胞以外の単球等の細胞表面の受容体に結合してサイトカイン等の液性因子の産生放出を誘導する因子が挙げられる。NK細胞の増殖は、放出された液性因子によって間接的に誘導されることとなる。また、直接的に又は間接的にNK細胞の活性化を誘導する因子にも、前記増殖を誘導する因子と同様の機序を有する因子がその例として挙げられる。本発明のNK細胞増殖刺激因子には、少なくとも抗CD16抗体、OK432、ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、及びサイトカインが含まれる。この他、シイタケより抽出されるレンチナンLentinan等のBRM等を含むことができる。抗CD16抗体とは、CD16に対する抗体である。CD16は、NK細胞や顆粒球のマーカーであり、ほとんどのNK細胞の細胞表面上に存在するFcレセプターの構成タンパク質として知られている。抗CD16抗体のNK細胞増殖誘導活性については、先の特許出願において見出されたものであり、それ以前には知られていなかった。抗CD16抗体のNK細胞増殖誘導機構については明らかにされていないが、抗CD16抗体をIL2等のサイトカインと共添加することで、サイトカイン単独で添加した場合と比較して、NK細胞の増殖誘導を飛躍的に増強することができる特願2006124630;特許第4275680号。ビスホスホネート誘導体とは、下記一般式1で示される化合物をいう。上記式中、R1は、水素原子H又は低級アルキル基を表し、R2とR3は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、置換された若しくは置換されていないアリール基、置換された若しくは置換されていないアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基又は複素環式基を表し、又はR2とR3は、それらを含む環状構造の一部を形成し、該環状構造を形成する置換基は、R2とR3において、それぞれ独立して、ハロゲン、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基又は複素環式基に由来する。ビスホスホネート誘導体の具体例としては、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸が挙げられる。本発明においては、一以上のビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物をNK細胞増殖刺激因子として添加することができる。本発明において、特に好ましいビスホスホネート誘導体は、ゾレドロン酸又はNK細胞の増殖及び/又は活性化以下、増殖/活性化と表すを有するゾレドロン酸誘導体又はその塩若しくはその水和物である。ゾレドロン酸商品名ゾメタ登録商標、ノバルティスファーマ社は、骨吸収抑制活性を有するビスホスホネートで、悪性腫瘍による高カルシウム血症又は多発性骨髄腫による骨病変及び固形癌骨転移による骨病変に対する治療薬として知られている。また、その化学構造の中に窒素含有ビスホスホネートを包含するため、細胞内でFarnesylPyrophosPhateの合成を抑制して、その結果、前駆体であるIsoPentenylPyrophosphateが蓄積する。それによって、その生体の免疫反応を活性化できることが報告されているvanBeekEetal1999BiochemBiophysResCommun26410811GoberHJetal2003JExpMed1971638。しかしながら、ゾレドロン酸がNK細胞の増殖/活性化を有することについては一切報告がない。したがって、ゾレドロン酸は、本発明者らによって新たに見出された新規のNK細胞増殖刺激因子である。その塩とは、前記ビスホスホネート誘導体、好ましくはゾレドロン酸の塩基性付加塩をいう。塩基性付加塩としては、例えば、ナトリウム塩若しくはカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩若しくはマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩若しくはブロカイン塩のような脂肪族アミン塩、NNジベンジルエチレンジアミンのようなアラルキルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩若しくはイソキノリン塩のような複素環芳香族アミン塩、アルギニン塩若しくはリジン塩のような塩基性アミノ酸塩、アンモニウム塩又はテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩若しくはテトラブチルアンモニウム塩のような第4級アンモニウム塩が挙げられる。OK432ピシバニール:Picibanilとは、溶連菌ストレプトコッカスピオゲネスA群3型Su株をペニシリン処理したものを有効成分とする抗腫瘍剤である。OK432は免疫アジュバントとして、単球などの細胞表面TLRと結合して、単球細胞を活性化し、免疫反応を活性化できることが知られているRyomaYetal2004AnticancerRes243295301。本発明のNK細胞増殖刺激因子として適当なサイトカインには、例えば、IL2、IL12、IL15、IL18等が挙げられる。このうち特に好ましいサイトカインは、IL2である。4刺激付加の方法刺激するとは、上記NK細胞増殖刺激因子をNK細胞に接触させることによって、そのNK細胞の増殖/活性化を誘導することをいう。具体的な刺激の付加方法としては、まず、生体から採取した血液、例えば、PBMCsを、例えば、細胞密度1~3×106個mLとなるように培地で調製する。ここで用いる培地は、細胞培養用の適当な培地に、非働化処理をしたヒト血清若しくは血漿を容量比VVで5~10程度添加したものを用いればよい。前記養子免疫療法での投与を前提とする場合には、前記培地は、OpTmizerのような養子免疫療法用の無血清培地に自己血漿を添加したものを用いることが望ましい。自己血漿は、血液採取工程後に得られる血液から調製すればよい。例えば、採取した末梢全血を室温10°C~30°C:以下同じ。にて3000rpmで10分間程度遠心して得た上清を自己血漿とすることができる。また、培地には必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン、カナマイシン、ゲンタマイシン等の抗生物質を添加してもよい。次に、予備調製したPBMCsを含む培養液にNK細胞増殖刺激因子を添加する。抗CD16抗体による刺激は、例えば、終濃度で50μgmL~200μgmL、好ましくは70μgmL~150μgmL、より好ましくは100μgmLとなるように培地に直接に添加するか、又はその抗体を支持体に固相化した状態で添加すればよい。好ましくは、支持体に固相化した状態での添加である。これは、抗CD16抗体を固相化することによってNK細胞との一定方向からの接触頻度が高まり、遊離状態よりも効率よくNK細胞に増殖刺激を与えることができるからである。ここでいう支持体とは、抗体を固定する足場である。支持体の材質は、抗体を安定した状態で固定できる材質であれば、特に限定はしない。例えば、プラスチック等の合成樹脂、ガラス、金属等が利用できる。支持体の形状は特に限定はしないが、当該支持体に固相化された抗体とNK細胞との接触頻度がより高くなるように培養液との接触表面積が大きな形状のものが好ましい。例えば、球状ビーズやリンパ球大の孔を有する多孔質キューブ等が挙げられる。抗CD16抗体を支持体に固相化する方法は、支持体の材質がプラスチック等のように抗体と親和性の高いものであれば、単に抗体溶液と支持体を接触浸漬、塗布、流通、噴霧等を含むさせて、所定の温度と時間で保持するだけで固定できる。抗CD16抗体溶液は、例えば、無菌蒸留水又は細胞培養用培地で抗CD16抗体を溶解した後、必要に応じて、例えば、ポアサイズ022μmのフイルタでろ過滅菌し、終濃度1μgmLになるように無菌蒸留水又は培地で調整することによって得ることができる。抗CD16抗体を支持体に固相化する場合、固相化する支持体の表面積等を勘案した液量の抗CD16抗体溶液を使用することが好ましい。例えば、内壁表面積150cm2のプラスチックフラスコに固相化する場合であれば、1μgmLの抗CD16抗体溶液を15mL程度使用すればよい。また、25cm2及び75cm2の培養フラスコの場合であれば、それぞれ5mL及び10mL使用すればよい。その後、37°Cで12~24時間インキュベートすれば、抗CD16抗体は支持体に付着する。あるいは、市販の抗体固定化キット等を用いてもよい。例えば、CarboLinkPIERCE社等が利用できる。このような固定化キットは、支持体が抗体の付着しにくい材質の場合には有用である。抗CD16抗体を支持体に固相化した後は、必要に応じて、抗CD16抗体を固相化させた支持体を洗浄し、抗CD16抗体溶液を除去することもできる。洗浄は、例えば、支持体を適量のPBSで数回、例えば、2~5回程度洗えばよい。このように支持体に抗CD16抗体を固相化させた培養容器は、0°C~8°C、好ましくは3°C~6°Cに保存することによって約1月間、抗体活性能を減少又は失活させず使用することができる。ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物による刺激として、ここではその具体例であるゾレドロン酸水和物注射液ノバルティスファーマ社4mgバイアルを使用した場合について説明する。このゾレドロン酸を水例えば、注射用水で溶解し、294μmolmLのゾレドロン酸溶液を調製する。必要に応じて、その後、例えば、ポアサイズ022μmのフィルタで濾過滅菌してもよい。得られたゾレドロン酸溶液は、例えば、終濃度で1μMmL~10μMmL、好ましくは3μMmL~7μMmL、より好ましくは5μMmLとなるように培地に添加すればよい。OK432による刺激は、PBMCsを含む培養液に、例えば、OK432溶液を、例えば、終濃度で0005KEmL~002KEmL、好ましくは0008KEmL~0015KEmL、より好ましくは001KEmLとなるように添加すればよい。OK432溶液の調製は中外製薬社ピシバニール5KE本を水例えば、注射用水2mLで溶解して調製することができる。サイトカインによる刺激は、単独で添加してもよいし、複数種類を組み合わせて添加して行えばよい。コスト面等を勘案するとIL2のみの添加が好ましい。添加する量は、例えば、IL2であれば、終濃度で100ユニット/mL~2000ユニット/mLの範囲が好ましい。100ユニット/mLよりも少ない場合は増殖刺激を誘導する上で不十分であり、また2000ユニット/mLよりも多い場合にはIL2の濃度の増加に応じたNK細胞の増殖が認められないためである。好ましくは、700ユニットmL~2000ユニットmLの範囲である。前記各NK細胞増殖刺激因子を添加後、PBMCsに十分な刺激を与えるために当該血液を生理的細胞温度通常は37°Cに1~3日保持することが好ましい。この期間は、次の培養工程と重複して行なうことが可能で、刺激を付与しながらNK細胞等を培養することができる。また、上記生理的細胞温度での保持期間内に、38°C~40°Cで10時間~30時間の期間で高温刺激を加えてもよい。この高温刺激により、NK細胞をより一層活性化させることができる。これは、先の出願の実施例で示されるように、37°Cよりも低い温度ではリンパ球を活性化させるには不十分であり、また40°Cよりも高い温度ではリンパ球が熱により変性や損傷を受ける可能性が高くなるからである。また、10時間よりも短い時間では一層の活性化には不十分であり、また30時間よりも長い時間では血液が変性や損傷を受ける可能性が高くなるからである。所定の温度に保持させる手段は、血液を一定温度に保持できれば、特に限定はしない。例えば、CO2インキュベーターを用いて、当該血液の入った容器ごと所定の温度にする手段が挙げられる1-2-2.培養工程培養工程とは、刺激工程後に当該血液を生理的細胞温度で培養する工程である。本工程では、NK細胞の増殖/活性化を維持しながら、その細胞数を増加させることを特徴とする。生理的細胞温度とは、血液を培養する上で至適な温度をいう。通常は37°Cであるが、当該温度を中心に05°C未満の範囲内で前後しても構わない。恒温器内の温度は、前記温度範囲内で前後する可能性があるからである。本工程は、前記刺激工程を経た培養液を生理的細胞温度で培養することで達成できる。本工程の初期では、刺激工程で付与されたNK細胞増殖刺激因子でNK細胞を十分に刺激する期間を確保することとそれらの細胞の培養を兼ねることができる。その後、培地から一旦NK細胞増殖刺激因子を除去し、刺激工程を解除することが好ましい。サイトカインのような因子の多くは、培養工程でもNK細胞に対して増殖/活性化誘導刺激を与え続けることができるが、抗CD16抗体、OK432及び/又はゾレドロン酸等の長期に渡るNK細胞への刺激は、NK細胞の強化に望ましくない影響、例えば、アポトシースなどの細胞死を与える可能性があるためである。このような刺激因子の除去方法は、例えば、刺激工程後に培養液から一旦PBMCsを回収した後、抗CD16抗体、OK432及びゾレドロン酸等を含まない新たな培養液に移せばよい。前記因子の除去は、刺激工程を経た血液に遠心処理を行い、上清を除去することで達成させる。具体な方法は、以下に述べる培地交換の方法に準じて行えばよい。培養は、生理的細胞温度条件下にある5CO2インキュベーター内において、7日~21日以下の期間で行う。これは、6日以下の培養ではNK細胞の増殖が不十分なためであり、また、22日以上ではNK細胞の増殖が静止状態に達してしまうことや、長期培養により細胞の劣化老化等の障害が発生する可能性が高くなるからである。培養期間内は、2日から5日間隔で定期的に新しい培地を加えていく又は新しい培地に交換することが望ましい。培地交換の具体例は、まず、滅菌済み遠心チューブに刺激工程後のPBMCsを含む培養液を移す。続いて、約1200rpmで8分間ほど室温にて遠心した後に上清を除き、PBMCs若しくはNK細胞である沈殿物を回収する。回収されたPBMCs若しくはNK細胞は、細胞密度が06~10×106mLになるようにIL2及び血漿を含む新たな培養液に移す。このとき添加するIL2等のサイトカインは、終濃度で300ユニットmL~700ユニットmL程度でよい。これは、刺激工程後にはNK細胞が既に活性化されており、NK細胞自身がIL2等のサイトカインを産生しているからである。培養に用いる培地は、細胞培養で使用するいずれの一般的な培地も原則として使用することができる。好ましくはOpTmizer培地である。培養後は培養液中に細菌やエンドトキシンのコンタミネーションがないことを確認する。菌の有無はコロニー形成アッセイ法によって、またエンドトキシンの有無は市販のELISA等の比色法やリムルステスト等の懸濁法によって調べればよい。1-3.効果本実施形態のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、生体から採取した血液からNK細胞を強化した血液製剤を製造することができる。特に当該製造方法によれば、先の出願のNK細胞強化型血液製剤の製造方法で得られるNK細胞の活性を維持しながら、高い増殖率をさらに上回るNK細胞強化型血液製剤を提供することができる。本実施形態のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、先の出願で必須の工程であった所定の温度に所定の時間保持する工程活性化工程。本発明における刺激工程中の高温刺激に相当する。が必須ではなくなった。これにより、活性化工程に必要であった所定の温度に設定したインキュベーターを必ずしも必要としなくなったことから、本発明を実施する研究施設での設備面や実施者の操作管理面での負担を大幅に軽減することができる。当該製造方法によれば、ゾレドロン酸を使用することで、後述する実施例6で示すように、γδT細胞を同時に増殖させることができる。γδT細胞は、NK細胞と共に細胞免疫療法において有効な細胞である。したがって、当該製造方法では、先の出願の製造では成しえなかったNK細胞とγδT細胞の増殖という相乗効果を得ることができる。また、当該製造方法によれば、生体から採取する血液は、末梢血であってもよいことから、ドナーに対する身体的負荷を最小限に留めることができる。当該製造方法によれば、特段の専用機器等を必要とせず、細胞培養を行う一般的な検査施設や研究施設等に常備されている機器等がそのまま利用でき、必要とする試薬等はいずれも容易に入手ができる。したがって、クリーンルーム等の無菌で作業のできる研究施設であれば、初期設備投資等をほとんど必要とすることなく本実施形態の製造方法を実施できる利点がある。本実施形態の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤によれば、実際の臨床治療において、癌の再発予防や進行阻止の効果を有する。また、当該血液製剤の投与では副作用が認められていない等、安全な血液製剤を提供できる。2.NK細胞強化型血液製剤2-1.概要本発明の第二の実施形態は、実施形態1の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤である。2-2.構成本実施形態のNK細胞強化型血液製剤は、前記第一の実施形態において培養工程を経た培養液から得ることができる。ただし、NK細胞強化型血液製剤において培養で用いた培地や当該培地に添加した増殖刺激因子は不要である。したがって、NK細胞強化型血液製剤を使用するに当たっては、培養液から培地や増殖刺激因子を可能な限り除去し、増殖/活性化されたNK細胞等を得ておくことが好ましい。培地や増殖刺激因子の除去方法は、まず、増殖/活性化されたNK細胞を含む培養液を滅菌済み遠心チューブに移し、1200rpmにて8分間ほど室温にて遠心し、増殖刺激因子を含む上清の培地を除去する。NK細胞は、沈殿物として回収できる。回収されたNK細胞は、2回以上PBSで洗浄することが好ましい。洗浄後のNK細胞は、血球計算板を用いて細胞数をカウントし、10mL~200mLの乳酸リンゲル液又は生理食塩水で調整する。こうして、本実施形態のNK細胞強化型血液製剤を得ることができる。必要に応じて当該血液製剤にサイトカイン等を添加することも可能である。本実施形態の血液製剤を用いて十分な効果を得るためには、含有するNK細胞のがん細胞傷害活性が70以上にあることが望ましい。NK細胞のがん細胞傷害活性は、K562白血病細胞株を用いた測定は公知である。または、リンパ球活性化マーカー、例えばCD69等の公知のマーカーが利用できる。2-3.効果本実施形態のNK細胞強化型血液製剤によれば、20mL~60mLの末梢全血から5×107個~4×109個もの活性化されたNK細胞強化型血液製剤を得ることができる。本実施形態のNK細胞強化型血液製剤において、NK細胞の約90が活性化されている。これは、健常な大人の血液と比較して10倍以上に相当する。本実施形態のNK細胞強化型血液製剤は、製造後直ちに使用することも、また0°C~8°Cの温度下で所定の期間、又は保存液等を加えて超低温下約80°C若しくは液体窒素中で数年に渡る長期間保存することも可能である。前記保存液としては、市販の活性化リンパ球保存液を用いると便利である。例えば、バンバンカー日本ジェネティックス社、ケーエムバンカーIIコスモバイオ社等が利用できる。3.NK細胞強化用組成物3-1.概要本発明の第三の実施形態は、NK細胞強化用組成物である。本実施形態は、本発明で新たに見出されたビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、特にゾレドロン酸を含むNK細胞増殖刺激因子を包含することを特徴とする。本実施形態のNK細胞強化用組成物を血液、好ましくはPBMCsを含む培地に添加することによって、培地中のNK細胞を簡便かつ効率的に増殖/活性化させることができる。3-2.構成NK細胞強化用組成物とは、培地に添加することで、その培地中に存在するNK細胞を増殖/活性化させることのできる組成物をいう。本実施形態のNK細胞強化用組成物は、前記第一の実施形態で説明した抗CD16抗体、OK432、前記式1で示されるビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物及びサイトカインを含んでなる。ビスホスホネート誘導体は、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸及びエチドロン酸からなる群から選択される化合物が好ましく、ゾレドロン酸がより好ましい。また、サイトカインは、IL2、IL12、IL15及びIL18からなる群から選択される化合物が好ましく、IL2がより好ましい。この他、RPMI1640のようなリンパ球用培地の成分、pH安定剤、抗生物質等が包含されていてもよい。組成物における各構成成分の量は、所定量の培地に添加したときに、それぞれが所定の終濃度になるように混合されていればよい。具体的には、抗CD16抗体が終濃度で50μg/mL~200μg/mL、好ましくは70μg/mL~150μg/mL、より好ましくは100μg/mLとなるように、ビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物好ましくはゾレドロン酸が終濃度で1μMmL~10μMmL、好ましくは3μMmL~7μMmL、より好ましくは5μMmLとなるように、OK432が終濃度で0005KEmL~002KEmL、好ましくは0008KEmL~0015KEmL、より好ましくは001KEmLとなるように、そしてサイトカイン好ましくはIL2が500UmL~2000UmL、好ましくは700UmL~1500UmL、より好ましくは1000UmLとなるように混合されていればよい。組成物の剤形は特に問わない。適当なバッファに溶解した液体状態、粉末状態、粉末を適当な賦形剤等を添加し錠剤化したものとすることができる。あるいは異なる状態の混合物、例えば、OK432、前記式1で示されるビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物及びサイトカインは液体に溶解された状態であり、その溶液中にプラスチックビーズ等の支持体に固相化された抗CD16抗体が混合されているような剤形であってもよい。3-3.効果本実施形態のNK細胞強化用組成物によれば、NK細胞を含有する所定量の適当な細胞培養液中に添加して、培養するだけでNK細胞を活性化し、また増殖させることができる。4.NK細胞強化型血液製造用キット4-1.概要本発明の第四の実施形態は、第一の実施形態で説明した抗CD16抗体、OK432、前記式1で示されるビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物及びサイトカインを含むNK細胞強化型血液製造用キットである。本実施形態は、本発明で新たに見出されたビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物、特にゾレドロン酸を含むNK細胞増殖刺激因子を構成要素として包含し、血液、好ましくはPBMCsを培養する際に使用することで、簡便かつ容易にNK細胞強化型血液製剤を製造することができる。4-2.構成本実施形態のNK細胞強化血液製造用キットは、前記第一の実施形態で説明した抗CD16抗体、OK432、前記式1で示されるビスホスホネート誘導体又はその塩若しくはその水和物及びサイトカインを含んでなる。この他、各NK細胞増殖刺激因子を溶解するために滅菌水やバッファ、使用説明書等を包含することができる。ビスホスホネート誘導体は、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イパンドロン酸、インカドロン酸及びエチドロン酸からなる群から選択される化合物が好ましく、ゾレドロン酸がより好ましい。また、サイトカインは、IL2、IL12、IL15及びIL18からなる群から選択される化合物が好ましく、IL2がより好ましい。それぞれのNK細胞増殖刺激因子は、単独又は二以上を組み合わせた状態でキット内に包含させることができる。例えば、抗CD16抗体以外のNK細胞増殖刺激因子は、一つにまとめた状態でキット内に包含しておいてもよい。また、各NK細胞増殖刺激因子の状態は、特に限定しない。一のNK細胞増殖刺激因子が液体状態で、他のNK細胞増殖刺激因子が固体状態であってもよい。特に、抗CD16抗体はプラスチックビーズ等の適当な支持体に固相化した状態で包含されていることが好ましい。5.疾患を治療する細胞免疫療法5-1.概要本発明の第五の実施形態は、第一の実施形態で製造されたNK細胞強化型血液製剤を生体に投与して免疫力を高め、疾患を治療する細胞免疫療法に関する。5-2.構成本実施形態は、第一の実施形態の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤を生体に投与する細胞免疫療法である。本実施形態でいう細胞免疫療法とは、前記第一の実施形態の製造方法で得られるNK細胞強化型血液製剤を生体に投与することで、その生体の免疫力を高めて疾患を治療する方法である。特に、本実施形態の細胞免疫療法は、養子免疫療法を前提としたものである事が好ましい。これは、前述のように養子免疫療法が拒絶反応の危険性がほとんどないからである。前記投与されるNK細胞強化型血液製剤は、癌、ウイルス感染症、若くは真菌感染症に対する免疫力を有するリンパ球が単位体積あたりの通常血液平均値よりも多く含まれている血液製剤である。ここでいう癌とは、悪性腫瘍全般を意味する。例えば、上皮性腫瘍や肉腫、白血病、骨髄腫等が該当する。ウイルス感染症は、ウイルス感染による疾患全般を指すが、特に治癒が難治の慢性ウイルス感染症や急性ウイルス感染症の予防が該当する。当該難治な慢性ウイルス感染症としては、例えば、AIDSを引き起こすHIV感染症、ウイルス性慢性肝炎、子宮頸癌を引き起こすヒトパピローマウイルス感染症が挙げられる。また、急性ウイルス感染症としてはインフルエンザ等のウイルス性呼吸器感染症や免疫不全状態での急性ウイルス感染症が挙げられる。真菌感染症とは、糸状菌や酵母等による感染症である。例えば、カンジダ感染症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症等が挙げられる。免疫力を有するリンパ球とは、免疫系における機能が強化されたリンパ球を意味する。例えば、細胞傷害活性が活性化された状態にあるNK細胞、γδT細胞、キラーT細胞、NKT細胞が該当する。また、ここでいう単位体積あたりの通常血液平均値とは、健常な個体の血液で一般に観察される癌、ウイルス感染症、若しくは真菌感染症に対する免疫力を有した血中細胞数の単位体積あたりの平均値を意味する。例えば、NK細胞であれば、健常者の大人の血液1mLあたり平均して約5×105個程度のNK細胞が存在している。本実施形態で用いるNK細胞強化型血液製剤は、癌、ウイルス感染症、若しくは真菌感染症に対する免疫力を有するリンパ球、例えば、NK細胞、T細胞、γδT細胞、NKT細胞のいずれか一、又は二以上が、培養に用いた血液量と同じ液量で比較した場合、単位体積あたりの通常の各血球数の平均値よりも100倍以上であることを特徴とする。5-3.方法本実施形態の細胞免疫療法におけるNK細胞強化型血液製剤の投与方法について、養子免疫療法を行う場合を例として以下で説明をする。当該投与方法は、実施形態1のNK細胞強化型血液製剤を投与する点を除けば、従来の養子免疫療法で知られる方法と基本的に同様である。したがって、投与方法に関しては公知の養子免疫療法における投与方法に準じて行えばよい。例えば、患者から採取した血液から実施形態1のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によって製造された当該血液製剤を、その患者の体内に約2週間後に静脈注射又は点滴等を用いて投与する方法等が挙げられる。本実施形態におけるNK細胞強化型血液製剤の1回あたりの投与量は、ヒトの場合には細胞数にして5×107個から4×109個の範囲のNK細胞を含む容量であればよい。ただし、これは一般的な大人への投与量である。実際の投与では、当該血液製剤を投与する者の年齢、性別、体重、疾患の状態、体力等を勘案して適宜調節することが好ましい。本実施形態における細胞免疫療法の一例として、前記投与方法を1サイクルとして、約2週間間隔で1クール6サイクル以上投与を継続する方法が挙げられる。養子免疫療法でない場合も、自己でない生体から得られたNK細胞強化型血液製剤を投与する点を除いては、同様の方法で当該細胞免疫療法を行えばよい。5-4.効果本実施形態の細胞免疫療法によれば、従来の多くの免疫療法、特に養子免疫療法と比較して、癌等の疾患に対する治癒に高い有効性を有する。また、従来の養子免疫療法と基本的な操作技術等は同様であることから、養子免疫療法の技術を有する者であれば特段の技術習得をすることなく実施できる。以下の実施例をもって本発明を具体的に説明する。なお、以下の実施例は単に例示するのみであり、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。また、本実施例で使用された温度、量、時間等の数値に関して、実験上の多少の誤差及び偏差は斟酌される。実施例1<健常者ドナーの血液を用いたNK細胞強化型血液製剤の製造方法>本発明の第一実施形態について、養子免疫療法で用いる当該血液製剤の製造方法についての具体例を挙げて説明をする。1自己血漿の調製まず、培養用自己血漿を生体であるドナーから調製した。ドナーは、健常者30~40代の男性4名、ドナー1、2、3及び4とするとした。採血管にヘパリンを50ユニット/mL加えて、ドナーの静脈から50mLの末梢全血を採取した。採取した末梢全血を無菌コニカル遠心管に移して、3000rpmで10分間遠心した後、上清を血漿として分離した。血漿を採取した残りの血球成分に、血漿分離前の全血量3倍量の無菌PBS又は培養用培地を添加して血球成分溶液とし、以下の末梢血単核球の調製に使用した。血漿は、56°Cで30分間処理して非働化し、さらに3000rpmで10分間遠心して、血小板等を除去した。その後、血漿を4°C保存した。この血漿は、細胞培養培地添加用として、培地調製の都度、必要量を使用した。2末梢血単核球PBMCsの調製血球成分溶液に比重液に重層して、密度勾配遠心法を用いて赤血球や顆粒球を除去し、PBMCsを分離した。比重液は、FicollPaquPLUSAmersham社を用い、手順は、添付のプロトコルに従った。回収したPBMCsに30mLの血清を含まないPBS又は培養細胞用の培地を加え、2~3回洗浄した。培養細胞用培地には、例えば、血清を含まないRPMI1640培地を用いた。洗浄後、得られたPBMCs混濁液から一部サンプリングを取って、チルク染色後、血球計算板を用いてその数をカウントした。50mLの末梢全血から、PBMC細胞数4×107個を回収した。回収後の末梢血単核球は、5VVの上記自己血漿を加えたOpTmizer培地に、細胞密度が1×106個mLになるように加えて懸濁した。3刺激工程1mLの無菌蒸留水に02mgの抗CD16抗体Clone3GB、BeckmanCoulterを溶解した。この抗CD16抗体は無菌製品ではないため、溶解後022μmフイルターでろ過滅菌した。無菌蒸留水で最終濃度が1μgmLになるように199mLを添加して混合した。濾過後、抗CD16抗体溶液を25cm2培養フラスコに5mL入れて、37°Cで一晩静置して抗CD16抗体溶液をフラスコ内面に固相化させた。その後、前記溶液を廃棄し、無菌PBSによって2回洗浄した。前記調製したPBMCsの懸濁液5mLを、前記フラスコ内に移した。続いて、17μLmLのゾレドロン酸ゾメタ:ノバルティスファーマ社水溶液を85μL、4μLmLのOK432ピシバニール:中外製薬水溶液を20μL、及び900ユニットμLのIL2Proleukin:Chiron社溶液4μLを前記PBMCsの懸濁液に添加し、十分に撹拌した。前記各NK細胞増殖刺激因子でPBMCsを十分に刺激するため、予め庫内を37°Cに設定した5CO2インキュベーターに培地を移し、3日間保持しした。4培養工程その後、NK細胞増殖刺激因子を培養液から除去するため、5mLの培養液をコニカ遠心管に回収して、1200rpmで8分間遠心した。遠心後、上清の培地を除去し、細胞ペレットを700ユニットμLのIL2を含有する5VVの自己血清を含有する4mLのOpTmizer培地に懸濁して回収し、抗CD16抗体の固相化されていない新たなフラスコに移した後、再び37°Cに設定した5CO2インキュベーターで13日間培養した。2~4日毎に5VVの自己血清を含有するOpTmizer培地を交換した。以上により、本発明の第二実施形態のNK細胞強化型血液製剤を作製した。実際に、NK細胞強化型血液製剤として使用する場合には、コンタミネーションテストや前処理を行う必要がある。以下、それらについて簡単に説明をする。コンタミネーションテスト培養液中のエンドトキシンの有無についての検証は、LimulusESIIWako社を用いて、添付のプロトコルに従って確認した。また、細菌やカビの有無については寒天培地に培養液の一部を塗布し、コロニー形成アッセイ法によって確認した。NK細胞強化型血液製剤前処理培養後2週間の培養液を遠心チューブに移し、1200rpmで10分間遠心を行った後、上清を廃棄した。PBSをNK細胞のフラクション、X2及びX4をCD3陽性Tリンパ球のフラクション、そしてX3CD3CD56をB細胞など上記以外の細胞のフラクションとしてそれぞれ区分けしている。また、各分画内の数値は、測定した培養細胞中における当該分画に含まれる細胞の割合を表す。図2は、上記A~Cサンプルそれぞれの培養期間に経過と培養液中の細胞数の関係を示している。表1は、サンプルA及びBについて、培養0日目及び13日目の総細胞数0日目の総細胞数は、PBMC総数に相当する、総細胞数に対するNK細胞の割合NKNK細胞増殖率等を示している。いずれのサンプルも5日目あたりまでは、ほとんど差異はない。サンプルAは、先の出願と同じNK細胞増殖刺激因子を添加しているものの特定の温度で特定時間処理する活性化工程を経ていないことから、その後のNK細胞の増殖も低かった。一方、NK細胞増殖刺激因子以外同一培養条件で培養したサンプルBでは、9日目~13日目にNK細胞の著しい増加が見られ、13日目ではサンプルAのNK細胞の増殖率の約9倍に達した。よって、本発明の製造方法によれば、活性化工程を必要とすることなくNK細胞を効率的に増殖できることが明らかとなった。さらに、図2Cから、ゾレドロン酸とIL2の添加のみでは細胞数の増殖は不十分であった。この結果から、本発明の製造方法におけるNK細胞の効率的な増殖には、抗CD16抗体、OK432、ゾレドロン酸及びIL2のいずれもが必要であることがわかった。実施例3<NK細胞の増殖2>先の出願に係るNK細胞強化型血液製剤の製造方法におけるゾレドロン酸の効果を確認するために、実施例1に記載の健常者ドナー2及び3由来の血液を用いてNK細胞の増殖率について検証した。方法以下の2つのサンプルについてNK細胞の増殖率を検証した。サンプルD:NK細胞増殖刺激因子として、終濃度1μgmLの抗CD16抗体、001KEmLのOK432及び700ユニットmLのIL2を使用した。サンプルE:NK細胞増殖刺激因子として、終濃度1μgmLの抗CD16抗体、001KEmLのOK432、5μMmLのゾレドロン酸及び700ユニットmLのIL2を使用した。上記のように、本実施例でサンプルD及びEに添加するNK細胞増殖刺激因子は、前記実施例2のサンプルA及びBとそれぞれ同じであるが、本実施例では、原則として先の出願に係るNK細胞強化型血液製剤の製造方法に従った点が前記実施例2と異なる。すなわち、増殖刺激因子添加工程本発明では刺激工程に相当後に培地を39°Cに一晩保持する高温刺激を行った。NK細胞数の測定は、実施例2と同様にフローサイトメトリー解析法を用いた。結果表2に結果を示す。この表では、各ドナーのサンプルD及びEに関する培養0日目及び13日目の総細胞数、それに対するNK細胞の割合NK、NK細胞の増殖率等を示している。サンプルDでは、NK細胞の増殖率は、13日目で培養前の245倍2及び160倍3に達した。一方、ゾレドロン酸を添加したサンプルEでは、13日目で培養前の約325倍2及び290倍3に達した。この結果から、先の出願に係る製造方法と同一の反応条件下であっても、ゾレドロン酸を添加する本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法の方が、約13~18倍高いNK細胞増殖率を有することが明らかとなった。すなわち、本発明によれば、活性化工程を行なうことで先の出願に係る製造方法よりも、さらに高いNK細胞増殖率を得ることができる。実施例4<凍結血液由来のNK細胞強化型血液製剤によるNK細胞の増殖>凍結血液を用いたときの、本発明の製造方法のNK細胞の増殖について、健常者ドナー4由来の凍結血液を用いてNK細胞強化型血液製剤を製造し、その効果を検証した。方法NK細胞強化型血液製剤の製造方法の基本手順は、前記実施例1と同様であるが、ドナー4から血液を採取した後、その血液をそのまま又は適当な処理、例えばPBMCsを分離して一旦凍結したものを前記製造方法に用いる点で異なる。そこで、実施例1と相違する点を以下で具体的に説明し、その他の同じ手順については省略する。まず、採血管にヘパリンを50ユニットmL加えて、ドナー4の静脈から50mLの末梢全血を採取した。採取した末梢全血を無菌コニカ遠心管に移して、3000rpmで10分間遠心した後、上清を血漿として分離した。血漿を採取した残りの血球成分から実施例1と同様の方法によりPBMCsを調製した。そのまま凍結するか又はPBMCsに凍結剤バンバンカー;日本ジェネティックス社を1mL加え、凍結チューブに入れて、80°Cのディープフリーザー内で保存した。解凍作業は、凍結した細胞を急速解凍後、遠心にて凍結用溶液を洗浄除去し、培養液を加えることにより行なった。サンプルA~Cについて、以降の方法は、原則として実施例1に記載した3刺激工程以降と同じである。結果図3及び表3に結果を示す。図3は、実施例2と同様に、サンプルA、B、Cのフローサイトメトリーによる解析結果の一例として、培養11日目のサイトグラムを示している。各サイトグラムにおける4つの分画X1~X4は、実施例2と同様である。表3は、血液ドナー4におけるサンプルA及びBについて、培養0日目及び12日目のNK細胞の絶対数、増殖率等を示している。図3の各区画に分布する細胞のパターンは、サンプルA~Bのいずれも図1で示した細胞の分布のパターンとほとんど同じであった。表3では、血液ドナー4のサンプルA及びBについて、培養0日目及び12日目のNK細胞の絶対数、増殖率等を示している。サンプルAでは、NK細胞の増殖率は、12日目で培養0日目の150倍に達した。一方、ゾレドロン酸を添加したサンプルBでは、12日目で培養0日目の約380倍に達した。すなわち、本発明の製造方法によれば、凍結血液を用いた場合であっても、新鮮な血液を用いた場合と同様に、先の出願に係る製造方法よりも高いNK細胞増殖率を得ることができることが判明した。実施例5<健常者ドナー血液由来の活性化NK細胞の測定:K562を用いた細胞傷害活性>本発明のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞の活性化をNK細胞の標的であるK562細胞株に対する細胞傷害活性として測定した。方法まず、白血病細胞系株化細胞であるK562細胞を蛍光色素CalceinAMで標識した。標識は、RPMI1640培地10ウシ胎児血清を含有に、100分の1容量のCalceinAM溶液同仁化学研究所を加えて37°Cで30分間インキュベートして行なった。標識後、当該細胞をPBSで洗浄し、標的K562細胞として用いた。次に、前記実施例2の方法で製造したサンプルA及びB由来のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞それぞれ、後述する図4のA及びBに対応及びNK細胞株KHYG1、並びに前記実施例3の方法で製造したサンプルD及びE由来のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞を、それぞれエフェクター細胞Eとして用い、標的K562細胞ターゲット細胞:Tとの比ET比が所定の値となるよう調整した後、それぞれを96ウェルプレートに入れ、37°CにてCO2濃度5で2時間反応させた。反応後、蛍光を保持している、すなわち生きているターゲット細胞の量をTerascanVPミネルバテック社を用いてその蛍光強度によって検出した。K562の細胞傷害活性値は、傷害前のコントロール、すなわち、エフェクター細胞を加えない状態の蛍光強度との比較により算出した。結果前記実施例2の方法で製造した健常者ドナー1におけるNK細胞の細胞傷害活性を表1に、前記実施例3の方法で製造した健常者ドナー2及び3におけるNK細胞の細胞傷害活性を表2に、前記実施例4の方法で製造した健常者ドナー4におけるNK細胞の細胞傷害活性を図5に、それぞれ示す。使用したET比は、それぞれの表又は図中に示した。表1及び2並びに図5から、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法と先の出願に係るNK細胞強化型血液製剤の製造方法のそれぞれで得られたNK細胞の細胞傷害活性は、ほとんど変わらないことが明らかとなった。したがって、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法は、先の出願に係る製造方法で得られたNK細胞の細胞傷害活性を維持しつつ、NK細胞数の増加により、NK細胞における細胞傷害活性を高めることができることが明らかとなった。実施例6<γδT細胞の増殖>本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法で使用するゾレドロン酸は、γδT細胞の増殖活性を亢進させることが知られているSatoKetal2005IntJCancer1169499KondoMetal2008Cytotherapy10842856。そこで、本発明の前記製造方法においてもNK細胞の増殖活性を向上させると共にγδT細胞を増殖できるか否かについて検証した。方法血液は、健常者ドナー2及び3から採取された新鮮血及びそれを処理して一旦冷凍保存した凍結PBMCsをそれぞれ用いた。これらの血液サンプルPBMCs中には、対象とするγδT細胞も混在していることから、基本的な操作手順は、前記実施例3及び4に準じて行なった。γδT細胞数の測定は、NK細胞のときと同様に、フローサイトメトリー解析法を用いた。蛍光物質で標識されたモノクローナル抗体PC5標識抗PNAγδT抗体、ECD標識抗CD3抗体Immunotech社の組み合わせを用いて血液製剤中のγδT細胞を免疫染色した。免疫染色は、細胞浮遊液に各抗体の添付文書で推奨されている抗体量を加え、遮光室温にて15分間染色し、その後遠心して蛍光抗体を含む上清を洗い流すことで行った。続いてγδT細胞の動態をフローサイトメトリーにCytomicFC500Beckman社よって、上記の抗体の組み合わせで測定した。測定データはCXP解析によって解析した。結果結果を図6及び7並びに表4に示す。図6は新鮮血を用いたときの、図7は凍結PMBCsを用いたときの、健常者ドナー2のサンプルA、B、Cそれぞれ図6及び7のA、B、Cに対応のフローサイトメトリーによる解析結果一例として、培養11日目のみのサイトグラムを示している。図6及び7において、横軸はECD標識抗CD3抗体の、また縦軸はPC5標識抗PANγδT抗体の蛍光強度をそれぞれ対数スケールで示している。各サイトグラムにおける4つの分画Y1~Y4は、前記2種類の蛍光強度に基づいてY1を未染色本染色では該当する細胞なしのフラクション、Y2をγδT細胞のフラクション、Y4をαβT細胞のフラクション、そしてY3CD3PANをT細胞以外の細胞フラクションNK細胞を包含するとしてそれぞれ区分けしている。また、各分画内の数値は、測定した培養細胞における当該分画に含まれる細胞の割合を表す。また、表4は、新鮮血を用いたときの健常者ドナー2及び3におけるサンプルA及びBについて、培養0日目の総細胞数、それに対するγδT細胞の割合γδT、及び13日目の総細胞数とそれに対するγδT細胞の割合γδT、増殖率等を示す。図6及び7からγδT細胞のフラクションY2における細胞は、ゾレドロン酸とIL2を添加したサンプルCでは、約40と高いのに対して、ゾレドロン酸を添加していないサンプルAでは、わずか数に過ぎなかった。一方、本発明の製造方法に相当するサンプルBでは、Y2における細胞が12及び19あり、サンプルAと比較して高かった。これは、表4のサンプルA及びBにおけるγδT細胞の増殖率からも明らかである。したがって、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法は、ゾレドロン酸のγδT細胞増殖亢進作用を損なうことなく、同時にNK細胞の増殖を亢進できることが明らかとなった。γδT細胞は、NK細胞と同様にMHCクラスIを標的とすることなく標的細胞を殺傷することができることから、細胞免疫療法に用いることができる。それ故、本発明の製造方法は、NK細胞の増殖と同時に先の出願に係るNK細胞強化型血液製剤の製造方法では成し得なかったγδT細胞の増殖を行なうことができるという利点を有している。実施例7<癌患者ドナーの血液を用いたNK細胞強化型血液製剤の製造方法と各種検証>前記実施例1~6では、健常者由来の血液を用いて、本発明の方法によるNK細胞強化型血液製剤の製造、及びその方法におけるNK細胞の増殖率、NK細胞傷害活性、γδT細胞の増殖率等について検証し、従来の方法や先の出願に係る製造方法よりも高いNK細胞の増殖率や傷害活性が得られた。しかし、癌患者由来の血液を用いて、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法を実施した場合にも、健常者由来の血液と同様の上記効果が得られるとは限らない。そこで、様々な癌を様々なステージで有する癌患者10名からインフォームドコンセントを得て、これらの癌患者由来の血液を用いて上記実施例と同様の方法によって、NK細胞強化型血液製剤を製造し、NK細胞の増殖率、NK細胞傷害活性、γδT細胞の増殖率等について検証検証した。1NK細胞強化型血液製剤の製造方法培養用自己血漿を提供する血液ドナーは、表5に記載の10名ドナー1p~10pとした。表5に示すように、これらの癌患者は、年齢、性別、原発癌種、そして癌ステージ、いずれも様々である。製造方法は、実施例1に記載の方法と同様の手順で行った。2NK細胞の増殖癌患者由来の血液を用いた場合でもゾレドロン酸の効果が得られることを確認するために、本実施例上記1に記載の癌患者全員の血液を用いてNK細胞の増殖率について検証した。方法基本的な手順は、上記実施例3に記載した方法に準ずるが、本実施例では、NK細胞増殖刺激因子として実施例3に記載のサンプルEと同じNK細胞増殖刺激因子を使用して高温刺激を行い、患者ごとに12、17、19又は21日のいずれかの日数で培養した。培養終了後に培養液の一部を回収し、それぞれの培養液中におけるNK細胞数を測定した。結果表6に結果を示す。表6では、培養0日目及び培養終了後の、各患者における総細胞数、培養日数、総細胞数に対するNK細胞率NK、及びNK細胞の増殖率等の10名の平均値及び標準偏差を示している。培養日数は、患者によって12~21日と幅はあるものの、NK細胞の平均増殖率は、培養前の約450倍に達した。3活性化NK細胞の測定:K562を用いた細胞傷害活性癌患者由来の血液より製造したNK細胞の活性化をNK細胞の標的であるK562細胞株に対する細胞傷害活性として測定した。方法基本的な手順は、上記実施例5に記載した方法に準ずる。エフェクター細胞として、本実施形態の前記2で製造した癌患者10名の各血液由来のNK細胞強化型血液製剤におけるNK細胞を用いた。結果表6に結果を示す。本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、癌患者の血液由来のNK細胞であっても細胞障害活性は、平均値で846標準偏差57と非常に高い活性が見られ、NK細胞の増殖活性を高めることができることが明らかとなった。4γδT細胞の増殖癌患者由来の血液を用いた場合であっても、本発明のNK細胞強化型血液製剤製造方法によれば、健常者由来の血液と同様に製剤中のγδT細胞を増殖できるか否かについて検証した。方法血液は、表5に示した癌患者10名から採取した新鮮血のみを用いた。基本的な手順は、前記実施例6に準じ、サンプルEと同じNK細胞増殖刺激因子を使用して高温刺激を行い、患者ごとに12、17、19又は21日のいずれかの日数で培養した。結果結果を表7に示す癌患者の培養0日目及び培養終了後の、各患者における総細胞数、培養日数、総細胞数に対するγδT細胞率γδT、及びγδT細胞の増殖率等の10名の平均値及び標準偏差を示している。本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法によれば、癌患者由来の血液由来のNK細胞強化型血液製剤であっても、γδT細胞増殖亢進作用を有することが判明した。本実施例の結果から、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法及びNK細胞強化用組成物によれば、癌患者由来の血液を使用した場合であっても、ドナーの年齢、性別、癌種及びステージ如何にかかわらず、健常者由来の血液を使用した場合と同様の効果が得られることが明らかとなった。これにより、本発明のNK細胞強化型血液製剤の製造方法は、癌患者自身から採取した血液を使用することも可能であり、製造されたそのNK細胞強化用組成物を再びその患者の体内に戻すことで、自己細胞故に拒絶反応もなく、細胞傷害活性が強化されたNK細胞やγδT細胞を多量に体内に導入できる。したがって、癌治療上、極めて望ましい養子免疫療法が可能となる。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。