抗IL6抗体又はその誘導体、及び抗IL23抗体又はその誘導体を含む、二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、モノクローナル抗体であるか、若しくはモノクローナル抗体に由来するものであり、かつ又は前記抗IL23抗体又はその誘導体が、モノクローナル抗体であるか、若しくはモノクローナル抗体に由来するものである、請求項1記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項2記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記モノクローナル抗体がキメラ抗体である、請求項2記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記キメラ抗体がヒト化フレームワーク領域を含む、請求項4記載の二価の二重特異性コンストラクト。抗IL6抗体の誘導体及び又は抗IL23抗体の誘導体を含み、ここで、該誘導体が、可変領域全体、可変領域の重鎖、可変領域の軽鎖、Fab、Fab、F2、Fv、scFv、dAb、又は相補性決定領域を含み得る、請求項1~4のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記誘導体がscFvである、請求項6記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体、及び又は前記抗IL23抗体又はその誘導体が、少なくとも1つの非天然アミノ酸を組み込むように修飾されている、請求項1~8のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列YIYTDX1STX2YANWAKGを含むCDR2領域を含む、請求項1~8のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列RX1STLX2Sを含むCDR5領域を含む、請求項1~9のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号10~15からなる群から選択される、請求項1~10のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体の重鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号10~12からなる群から選択される、請求項1~11のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体の軽鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号13~15からなる群から選択される、請求項1~12のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、配列番号10~15のアミノ酸配列を含む、請求項1~13のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体の重鎖が、配列番号259を含む、請求項1~14のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体の軽鎖が、配列番号261を含む、請求項1~14のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体がscFvである、請求項1~16のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、配列番号10~12からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖及び配列番号13~15からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖を含むscFvである、請求項1~17のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、配列番号259のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号261のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むscFvである、請求項1~18のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号10~15からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99の同一性を有する、請求項1~19のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号10~15からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸付加、欠失、又は置換を含む、請求項1~20のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号10~15からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上の保存的アミノ酸置換を含む、請求項21記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、配列番号10~15のアミノ酸配列に対応するCDRを有する抗IL6抗体と同じエピトープに結合する少なくとも1つのCDR領域を含む、請求項1~22のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、13A8、9H4、9C8、8C8、18D4、及び28D2からなる群から選択されるか、又は該群に由来する、請求項1~23のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列YYAX1WAX2Gを含むCDR2領域を含む、請求項1~24のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列AX1TLX2Sを含むCDR5領域を含む、請求項1~25のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号90~95からなる群から選択される、請求項1~26のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体の重鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号90~92からなる群から選択される、請求項1~27のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体の軽鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号93~95からなる群から選択される、請求項1~28のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、配列番号90~95のアミノ酸配列を含む、請求項1~29のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体の重鎖が、配列番号267を含む、請求項1~30のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体の軽鎖が、配列番号269を含む、請求項1~31のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体がscFvである、請求項1~32のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体が、配列番号90~92からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖及び配列番号93~95からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖を含むscFvである、請求項1~33のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体が、配列番号267を含む重鎖及び配列番号269を含む軽鎖を含むscFvである、請求項1~24のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号90~95からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99の同一性を有する、請求項1~35のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号90~95からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸付加、欠失、又は置換を含む、請求項1~35のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号90~95からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上の保存的アミノ酸置換を含む、請求項37記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体が、配列番号90~95のアミノ酸配列に対応するCDRを有する抗IL23抗体と同じエピトープに結合する少なくとも1つのCDR領域を含む、請求項1~38のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体が、31A12、34E11、35H4、49B7、及び16C6からなる群から選択されるか、又は該群に由来する、請求項1~39のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体が、IL12を阻害することもできる、請求項1~24のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列WX1KGを含むCDR2領域を含む、請求項41記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列YAYX1GDAFDPを含むCDR3領域を含む、請求項42記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列SDYFNX1を含むCDR3領域を含む、請求項42記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列QX1SQX2を含むCDR4領域を含む、請求項41~44のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列ASX1LAを含むCDR5領域を含む、請求項41~45のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、アミノ酸配列QSYYDX1NAGYGを含むCDR6領域を含む、請求項41~46のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号140~145からなる群から選択される、請求項41~47のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体の重鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号140~142からなる群から選択される、請求項41~48のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体の軽鎖が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号143~145からなる群から選択される、請求項41~49のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、配列番号140~145のアミノ酸配列を含む、請求項41~50のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体の重鎖が、配列番号271を含む、請求項41~51のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23抗体又はその誘導体の軽鎖が、配列番号273を含む、請求項41~52のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗ILp40抗体又はその誘導体がscFvである、請求項41~53のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、配列番号140~142からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖及び配列番号143~145からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖を含むscFvである、請求項41~54のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、配列番号271を含む重鎖及び配列番号273を含む軽鎖を含むscFvである、請求項41~55のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号140~145からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、又は少なくとも99の同一性を有する、請求項41~56のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号140~145からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸付加、欠失、又は置換を含む、請求項41~57のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、少なくとも1つのCDR領域を含み、そのアミノ酸配列が、配列番号140~145からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する1以上の保存的アミノ酸置換を含む、請求項58記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、配列番号140~145のアミノ酸配列に対応するCDRを有する抗IL23IL12抗体と同じエピトープに結合する少なくとも1つのCDR領域を含む、請求項41~59のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL23IL12抗体又はその誘導体が、22H8、45G5、14B5、4F3、5C5、及び1H1からなる群から選択されるか、又は該群に由来する、請求項41~60のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体と前記抗IL23抗体又はその誘導体の両方が、1以上の非天然アミノ酸を組み込んでいる、請求項1~61のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記抗IL6抗体又はその誘導体が、各々の抗体又はその誘導体中の非天然アミノ酸間のリンカーを介して、前記抗IL23抗体又はその誘導体に結合している、請求項62記載の二価の二重特異性コンストラクト。リンカーがPEG分子である、請求項63記載の二価の二重特異性コンストラクト。アミノ酸配列YIYTDX1STX2YANWAKGを含むCDR2領域を含む、抗IL6抗体又はその誘導体。アミノ酸配列RX1STLX2Sを含むCDR5領域を含む、IL6抗体又はその誘導体。配列番号10~15又は20~25又は30~35又は40~45又は50~55又は60~65から選択される配列を有する1以上のCDRを有する、抗IL6抗体又はその誘導体。13A8、9H4、9C8、8C8、18D4、及び28D2、若しくはそれらの誘導体からなる群から選択される抗IL6抗体若しくはその誘導体又は該抗体のいずれか1つと同じエピトープに結合する、抗IL6抗体若しくはその誘導体。配列番号259のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号261のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項67記載の抗IL6抗体又はその誘導体。アミノ酸配列YYAX1WAX2Gを含むCDR2領域を含む、IL23抗体又はその誘導体。アミノ酸配列AX1TLX2Sを含むCDR5領域を含む、IL23抗体又はその誘導体。配列番号90~95又は100~105又は110~115又は120~25又は130~135から選択される配列を有する1以上のCDRを有する、抗IL23抗体又はその誘導体。31A12、34E11、35H4、49B7、及び16C6、若しくはそれらの誘導体からなる群から選択される抗IL23抗体若しくはその誘導体又は該抗体のいずれか1つと同じエピトープに結合する、抗IL23抗体若しくはその誘導体。配列番号267記載のアミノ配列を含む重鎖、及び配列番号269記載のアミノ配列を含む軽鎖を含む、請求項72記載の抗IL23抗体又は誘導体。アミノ酸配列WX1KGを含むCDR2領域を含む、抗IL23IL12抗体又はその誘導体。アミノ酸配列YAYX1GDAFDPを含むCDR3領域を含む、抗IL23IL12抗体又はその誘導体。アミノ酸配列SDYFNX1を含むCDR3領域を含む、抗IL23IL12抗体又はその誘導体。アミノ酸配列QX1SQX2を含むCDR4領域を含みかつ又はアミノ酸配列ASX1LAを含むCDR5領域を含みかつ又はアミノ酸配列QSYYDX1NAGYGを含むCDR6領域を含む、抗IL23IL12抗体又はその誘導体。配列番号140~145又は150~155又は160~165又は170~175又は180~185又は190~195から選択される配列を有する1以上のCDRを有する、抗IL23IL12抗体又はその誘導体。22H8、45G5、14B5、4F3、5C5、及び1H1、若しくはそれらの誘導体からなる群から選択される、抗IL23IL12抗体若しくはその誘導体又は該抗体のいずれか1つと同じエピトープに結合する、抗IL23IL12抗体若しくはその誘導体。配列番号271記載のアミノ配列を含む重鎖、及び配列番号273記載のアミノ配列を含む軽鎖を含む、請求項79記載の抗IL23IL12抗体又はその誘導体。PEG化されている、請求項65~81のいずれか一項記載の抗IL6若しくは抗IL23、又はそれらの誘導体。請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの一部をコードするポリヌクレオチド。請求項1~81のいずれか一項記載の抗体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチド。請求項83又は84記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドの核酸配列が、大腸菌での発現に最適化されている、前記ポリヌクレオチド。請求項83~85のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。請求項86記載のベクターを含む宿主細胞。栄養要求性である、請求項87記載の宿主細胞。請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトを産生する方法であって少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている抗IL6抗体又はその誘導体を提供すること少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている、抗IL23抗体又はその誘導体を提供することこれら2つが各部分の非天然アミノ酸間の連結によって結合されるように、該修飾された抗IL6抗体又は修飾されたその誘導体を、該修飾された抗IL23抗体又は修飾されたその誘導体と反応させることを含む、前記方法。前記修飾された抗IL6抗体又は修飾されたその誘導体と修飾された抗IL23抗体又は修飾されたその誘導体の間の連結がリンカー部分を含み、ここで、該リンカー部分の一方の末端が、該修飾された抗IL6抗体又は修飾されたその誘導体の非天然アミノ酸に結合されており、かつ該リンカー部分のもう一方の末端が、該修飾された抗IL23抗体又は修飾されたその誘導体の非天然アミノ酸に結合されている、請求項89記載の方法。前記リンカー部分が、PEG、水溶性ポリマー、ポリビニルアルコール、多糖、ポリアルキレンオキシド、ヒドロキシエチルデンプン、又はポリオール、好ましくはPEGを含む、請求項90記載の方法。前記非天然アミノ酸が、連結の前のアジド、アルキン、アルケン、歪んだシクロオクチン、歪んだシクロアルケン、シクロプロペン、ノルボルネン、又はアリール、アルキル、若しくはビニルハライド、ケトン、アルデヒド、シアノ、ヒドラジン、ケタール、アセタール、ヒドラジド、アルコキシアミン、ボロン酸、有機スズ、有機ケイ素、βシリルアルケニルハライド、βシリルアルケニルスルホネート、ニトリル酸化物、ピロン、テトラジン、ピリダジン、アリールスルホネート、チオセミカルバジド、セミカルバジド、テトラゾール、αケト酸基を含む、請求項89~91のいずれか一項記載の方法。前記非天然アミノ酸が、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ホモアリルグリシン、pブロモフェニルアラニン、pヨードフェニルアラニン、アジドフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン、又はエチニルフェニルアラニン、transクロチルアルケンなどの内部アルケンを含むアミノ酸、セリンアリルエーテル、アリルグリシン、プロパルギルグリシン、又はビニルグリシン、ピロリジン、NσoアジドベンジルオキシカルボニルLリジン、NσプロパルギルオキシカルボニルLリジン、Nσ2アジドエトキシカルボニルLリジン、NσtertブチルオキシカルボニルLリジン、NσアリルオキシカルボニルLリジン、NσアセチルLリジン、NσベンジルオキシカルボニルLリジン、NσシクロペンチルオキシカルボニルLリジン、NσDプロリルLリジン、NσニコチノイルLリジン、NσNMeアントラニロイルLリジン、NσビオチニルLリジン、Nσ9フルオレニルメトキシカルボニルLリジン、NσメチルLリジン、NσジメチルLリジン、NσトリメチルLリジン、NσイソプロピルLリジン、NσダンシルLリジン、NσopジニトロフェニルLリジン、NσpトルエンスルホニルLリジン、NσDL2アミノ2カルボキシエチルLリジン、NσフェニルピルバミドLリジン、NσピルバミドLリジンである、請求項89~92のいずれか一項記載の方法。第一の部分を第二の部分と結合させる反応が、32環状付加若しくはアジドアルキン環状付加反応、シュタウディンガーライゲーション、ヘック反応、薗頭反応、鈴木反応、スティルカップリング、檜山デンマーク反応、オレフィンメタセシス、ディールスアルダー反応、又はヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン、若しくはヒドロキシルアミンとのカルボニル縮合である、請求項89~93のいずれか一項記載の方法。請求項89~94のいずれか一項記載の方法であって少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている抗IL6抗体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を提供すること少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている抗IL23抗体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を提供すること該宿主細胞が、修飾された抗IL6抗体又はその誘導体、及び修飾された抗IL23抗体又はその誘導体を発現するような条件下で、該宿主細胞を成長させること、該抗IL6抗体又はその誘導体、及び該抗IL23抗体又はその誘導体を単離すること該抗IL6抗体又はその誘導体が、各部分の非天然アミノ酸間の連結によって該抗IL23抗体又はその誘導体と結合されるように、該抗IL6抗体又はその誘導体を該抗IL23抗体又はその誘導体と反応させることを含む、前記方法。請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトに含めるのに好適な親抗体を選択する方法であってIL6又はIL23に特異的なB細胞を選択する工程該B細胞の個別の試料を分注する工程該B細胞を培養する工程抗体を含む上清を、各々の分注試料から個別に回収する工程各々の分注試料由来の上清をIL6又はIL23結合についてアッセイする工程該各々の分注試料由来の上清をIL6又はIL23活性の阻害についてアッセイする工程高レベルのIL6若しくはIL23活性の阻害及び又は強いIL6若しくはIL23結合を示したウェルから抗体を選択する工程並びに任意に、IL23分注試料由来の上清をIL12活性の阻害についてアッセイする工程並びに高レベルのIL12活性及び又は強いIL12結合をさらに示すIL23抗体を親抗体として選択する工程を含む、前記方法。治療で使用するための、請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト又は請求項65~82のいずれか一項記載の抗体。TH17媒介性疾患を治療する方法であって、請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの治療有効量を患者に投与する工程を含む、前記方法。TH17によって媒介される疾患の治療で使用するための、請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記TH17によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの使用。TH22媒介性疾患を治療する方法であって、請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの治療有効量を患者に投与する工程を含む、前記方法。TH22細胞によって媒介される疾患の治療で使用するための、請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記TH22細胞によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの使用。TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患を治療する方法であって、請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの治療有効量を患者に投与することを含む、前記方法。前記TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患の治療で使用するための、請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。前記TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項1~64のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクトの使用。TH17媒介性疾患を治療する方法であって、請求項65~69のいずれか一項記載の抗IL6抗体と請求項70~81のいずれか一項記載の抗IL23又は抗IL23抗IL12抗体の組合せの治療有効量を患者に投与することを含む、前記方法。TH17媒介性疾患の治療で使用するための、請求項65~69のいずれか一項記載の抗IL6抗体と請求項70~81のいずれか一項記載の抗IL23又は抗IL23抗IL12抗体の組合せ。TH17媒介性疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項65~69のいずれか一項記載の抗IL6抗体と請求項70~81のいずれか一項記載の抗IL23又は抗IL23抗IL12抗体の組合せの使用。TH22媒介性疾患を治療する方法であって、請求項65~69のいずれか一項記載の抗IL6抗体と請求項70~81のいずれか一項記載の抗IL23又は抗IL23抗IL12抗体の組合せの治療有効量を患者に投与することを含む、前記方法。TH22媒介性疾患の治療で使用するための、請求項65~69のいずれか一項記載の抗IL6抗体と請求項70~81のいずれか一項記載の抗IL23又は抗IL23抗IL12抗体の組合せ。TH22媒介性疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項65~69のいずれか一項記載の抗IL6抗体と請求項70~81のいずれか一項記載の抗IL23又は抗IL23抗IL12抗体の組合せの使用。TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患の治療方法であって、請求項65~69のいずれか一項記載の抗IL6抗体と請求項70~81のいずれか一項記載の抗IL23又は抗IL23抗IL12抗体の組合せの治療有効量を患者に投与することを含む、前記方法。TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患の治療で使用するための、請求項65~69のいずれか一項記載の抗IL6抗体と請求項70~81のいずれか一項記載の抗IL23又は抗IL23抗IL12抗体の組合せ。TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための、請求項65~69のいずれか一項記載の抗IL6抗体と請求項70~81のいずれか一項記載の抗IL23又は抗IL23抗IL12抗体の組合せの使用。前記抗体が抗IL23抗IL12抗体である、請求項107、110、又は113のいずれか一項記載の方法。前記抗体が抗IL23抗IL12抗体である、請求項108、111、又は114のいずれか一項記載の組合せ。前記抗体が抗IL23抗IL12抗体である、請求項109、112、又は115のいずれか一項記載の使用。前記TH17媒介性疾患、TH22媒介性疾患、又はTH17及びTH1媒介性疾患が、炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、尋常性天疱瘡、臓器移植拒絶反応、クローン病、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、及び糖尿病からなる群から選択される、請求項98、101、104、107、110、113、又は116のいずれか一項記載の方法。炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、尋常性天疱瘡、臓器移植拒絶反応、クローン病、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、及び糖尿病からなる群から選択されるTH17媒介性疾患、TH22媒介性疾患、又はTH17及びTH1媒介性疾患の治療で使用するための、請求項99、102、又は105のいずれか一項記載の二価の二重特異性コンストラクト。炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、尋常性天疱瘡、臓器移植拒絶反応、クローン病、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、及び糖尿病からなる群から選択されるTH17媒介性疾患、TH22媒介性疾患、又はTH17及びTH1媒介性疾患の治療で使用するための、請求項108、111、114、又は117のいずれか一項記載の組合せ。前記薬剤が、炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、尋常性天疱瘡、臓器移植拒絶反応、クローン病、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、及び糖尿病からなる群から選択されるTH17媒介性疾患、TH22媒介性疾患、又はTH17及びTH1媒介性疾患の治療用のものである、請求項100、103、106、109、112、115、又は118のいずれか一項記載の使用。本明細書では、特に、IL6及びIL23に結合し、それらの活性を調節する二価の二重特異性コンストラクトが記載される。IL6とIL23は両方とも、TH17細胞の分化及び活性化において役割を果たすことが知られている。活性化TH17細胞はさらに、種々の下流経路を通じて免疫応答を媒介することに関与する。これら2つのサイトカインは、TH17分化の異なる段階で機能しており、IL6は、TH17経路のT細胞コミットメントのごく初期に作用し、IL23は、コミットしたTH17細胞に対して作用する。したがって、本発明は、TH17活性化経路の2つの異なる点を阻害し、かつTH17産物によって媒介される下流の炎症応答の一部に対してさらなる阻害効果を有する新規の二価の二重特異性コンストラクトを提供する。IL6とIL23の両方を標的とすることによって、該二重特異性分子は、TH17経路内の複数の点でTH17媒介性応答を阻害することができ、また、対応する単一特異性抗体単独よりも大きい効力で作用する可能性がある。当業者は、二価の二重特異性抗体の作製に関わる不確実性を考慮して、その成分抗体の機能的特徴を保持するか、又は改善された機能的特徴を有する安定な二価の二重特異性コンストラクトの産生の成功が、意外かつ予想外の結果を表すものであることを理解するであろう。さらに、本発明の二価の二重特異性コンストラクトは、TH22細胞活性化を調節することができる。TH22は、最近同定された、独特のTヘルパー細胞サブセットを表し、該細胞サブセットは、炎症過程及び創傷治癒過程に関与し、特に、皮膚炎症に関係があるとされている。その活性化及びその後の作用のメカニズムは、引き続き調査の対象となっているが、細胞それ自体は、IL17でもインターフェロンγでもなく、IL22及びTNFαの分泌によって特徴付けられる。Th22細胞は、完全には特徴付けられていないが、乾癬患者から単離することができ、他のT細胞サブセットで見られるものとは異なる遺伝子発現プロファイルを表す。IL22発現は、IL23依存的であると報告されている。ここで実施された研究は、Th22細胞が、成長刺激をIL21に依存するTh17細胞とは対照的に、IL2依存的であることをさらに示唆している。本発明の抗体及び二価の二重特異性コンストラクトは、IL23、又はIL23とIL12の両方のどちらかに特異的であることができる。したがって、本発明は、IL23に結合し、IL12分子も標的とする抗体及び二価の二重特異性コンストラクトのサブセットを提供する。理論に束縛されることを望まないが、抗IL23抗体のこのサブセットは、IL12とIl23の両方に共通するp40サブユニットに結合することができると考えられる。IL23のp40サブユニットを標的とするものは、IL23に加えて、IL12を阻害すると考えられる。さらに、p40に対する抗体は、IL12活性を阻害することなく、IL23活性を弱めるエピトープに結合することができる。対照的に、IL23のp19サブユニットを標的とする抗体は、IL12に結合するとは考えられない。IL12は、TH1媒介性の免疫応答に関与し、したがって、これらの特定の二価の二重特異性コンストラクトは、TH17細胞媒介性の免疫応答だけでなく、TH1細胞媒介性の応答を調節する際にも有用であり得る。これは、その病因に対してTH1媒介性の側面とTH17媒介性の側面の両方を有する状態を治療するのに特に有利であり得る。したがって、ある実施態様では、本発明の二価の二重特異性コンストラクトは、抗IL6抗体又はその誘導体、及び抗IL23抗体又はその誘導体を含む。別の実施態様では、本発明の二価の二重特異性コンストラクトは、抗IL6抗体又はその誘導体、及び抗IL23IL12抗体又はその誘導体を含む。本発明の二価の二重特異性コンストラクト特定の例は、インビトロ法とインビボ法の両方を用いて、IL23活性とIL6活性の両方を調節する際のその有用性についてアッセイすることができる。特に、以下で詳述されているアッセイを用いることができる。二価の二重特異性コンストラクトの成分、並びにその同定及び製造手段は、以下でさらに論じられている。本発明の二価の二重特異性コンストラクトにおいて、抗体、及びその誘導体が基にしている初期抗体を、標準的な実験技術によって同定することができる。これらの抗体は、本明細書において、親抗体と呼ばれる。ある実施態様では、親抗体は、IL6、IL23、又はIL12に結合するその能力に基づいて選択される。親抗体の結合は、そのKd値を決定することによって測定することができる。別の実施態様では、親抗体は、IL6、IL23、又はIL12の活性を調節するその能力に基づいて選択される。好ましい実施態様では、親抗体は、IL6、IL23、又はIL12に結合するその能力、及びIL6、IL23、又はIL12の活性を調節するその能力に基づいて選択される。親抗体は、IL6、IL23、若しくはIl12の生物学的活性を阻害するその能力について選択され得るか、又はそれらは、IL6、IL23、若しくはIL12の生物学的活性を促進するその能力について選択され得る。好ましくは、親抗体は、IL6、IL23、及びIL12を阻害するその能力について選択される。ある実施態様では、親抗体又はその誘導体は、同一の又は別々の動物種から得ることができる。親抗体は、例えば、霊長類、齧歯類、ウサギ目、核脚下目、又は軟骨魚類で産生される抗体から得ることができる。親抗体は、トランスジェニック動物から得ることができる。例えば、それらは、ヒト免疫系を有するように遺伝子改変されているトランスジェニックマウス、例えば、Xenomouseから得ることができる。そのようなトランスジェニック動物で産生される抗体は、外因性の免疫系によって産生される抗体の特徴を有することができ、例えば、Xenomouse由来の抗体は、ヒト抗体とみなすことができる。親抗体の1つ又は複数が齧歯類から得られる場合、齧歯類は、有利には、マウス又はラットである。抗体がウサギ目から得られる場合、ウサギ目は、有利には、ウサギである。親抗体の1つ又は複数が核脚下目から得られる場合、それらは、ラクダ、ラマ、又はヒトコブラクダから得られる。これらの種は、単一の可変ドメインのみの高親和性抗体を産生することが知られているので、そのようなラクダ科抗体のこうした使用は有利であり得る。核脚下目抗体が使用される場合、VHHドメイン又はその修飾変異体を使用することが有利である。親抗体の1つ又は複数が軟骨魚類から得られる場合、軟骨魚類は、有利には、サメである。親抗体の1つ又は複数が霊長類から得られる場合、霊長類は、有利には、サル又は類人猿である。親抗体は、標準的な実験技術によって不死化することができる。したがって、本発明は、本発明による二価の二重特異性コンストラクトへの組込みに好適である親抗体から作製されるモノクローナル抗体を提供する。本発明はまた、抗体及び又はその誘導体の組合せを含む組成物を提供する。該組成物は、IL6抗体又はその誘導体、及びIL23抗体又はその誘導体を含む。IL23抗体又はその誘導体は、IL12にも結合することができる。抗体、及びその誘導体の好ましい組合せは、下で定義されるIL6抗体のうちのいずれか1つを、下で定義される抗IL23又は抗IL23IL12抗体のうちのいずれか1つと組み合わせたもの含む。そのような組合せを含む組成物は、単独で投与されたときの個々の抗体よりも大きい活性を有すると考えられる。抗体又はその誘導体の特に好ましい組合せは、抗IL6抗体の13A8、又は13A8に基づく誘導体、及び抗IL23抗体の31A12、又は31A12に基づく誘導体である。抗体のこの組合せは、どちらかの抗原のみと比べて、より大きいTH17細胞活性の阻害を提供する。該組合せは、当技術分野で公知の抗体よりも大きいTH17細胞阻害活性を有する。さらに、それは、有利に低い用量でこの阻害活性を示す。抗体又はその誘導体の特に好ましい組合せは、PEG化IL6抗体又はその誘導体を、PEG化IL23抗体又はその誘導体と組み合わせたものを含む。IL23抗体又はその誘導体は、IL12にも結合することができる。二価の二重特異性コンストラクトの抗体は、ヒトに投与されたとき、それらが免疫原性の低いものとなるように改変に供することができる。そのような改変は、キメラ化、ヒト化、CDR移植、脱免疫化、及び又は最も近いヒト生殖系列配列に対応するフレームワーク領域アミノ酸の突然変異として一般に知られている技術のうちの1つ又は複数を含むことができる。抗体をそのような改変に供することは、もし改変に供さなければ、宿主免疫応答を誘発することになる抗体を、宿主免疫系にとって、より又は完全に見えないものにし、結果として、そのような免疫応答が起こらないか、又は低減するという利点を有する。したがって、この実施態様によって記載されているように改変されている抗体は、いかなるそのような改変も受けていない対応する抗体よりも長い期間、免疫応答関連の副作用を低下させて、又は該副作用を全く伴わずに、投与可能であり続ける。当業者は、抗体が望まない宿主免疫応答を誘発するのを防ぐために、抗体を改変しなければならないかどうか、又は抗体をどの程度改変しなければならないかを決定する方法を理解しているであろう。したがって、本発明は、ヒト化抗体、又はキメラ抗体が、1以上の生物体由来のアミノ酸配列を含むか、又は合成アミノ酸配列を含むように改変されているヒト化抗体、又はキメラ抗体を提供する。したがって、本発明によれば、特定のヒト化抗IL6、抗IL23、及び抗IL23IL12抗体が提供される。これらの抗体は、両方ともIL6、IL23、又はp40に結合し、かつその生物学的活性を調節する能力を示した親抗体に基づいている。さらに、本発明によって提供される特定の抗体は、不死化及びヒト化の後に、これらの能力を保持するか、又は実質的に保持する。関心対象の特定のヒト化抗体としては、以下のものが挙げられる抗IL6抗体13A89H49C88C818D4並びに28D2。抗IL23抗体31A1234E1135H449B7並びに16C6。抗IL23IL12抗体45G514B54F35C522H8並びに1H1特定の好ましいヒト化抗体は、ヒト化形態の13A8、31A12、及び22H8である。本発明はまた、例えば、二価の二重特異性コンストラクトの成分として、抗体変異体を提供する。該抗体は、結合親和性、及びIL6、IL23、又はIL12の生物学的活性を調節する能力を保持するか、又は実質的に保持する。変異体抗体又はその誘導体は、重鎖及び又は軽鎖の可変ドメインを突然変異させて、抗体の結合特性を改変することによって得ることができる。例えば、突然変異を、CDR領域の1つ又は複数をコードする核酸分子中で生成させ、IL6若しくはIL23に対する抗体のKdを増減させるか、IL6、IL23、若しくはIL12の生物学的活性を調節する抗体の能力を増減させるか、又は抗体の結合特異性を改変することができる。部位特異的突然変異誘発を用いてそのような突然変異を導入する技術は、当技術分野で周知である。さらなる変異体抗体又はその誘導体は、重鎖及び又は軽鎖の可変ドメインを突然変異させて、等電点を改変し、最終製剤のpH3~75の範囲でのタンパク質安定性を高めて、ジスルフィド結合シャッフリングを回避することによって得ることができる。例えば、配列番号332、31A12のpI最適化配列番号334、13A18のpI最適化を参照されたい。さらに、安定性は、重鎖及び又は軽鎖の可変ドメインを突然変異させて、溶液中での生成物の凝集を低下させることによって高めることができ、例えば、溶解性を高め、生成物の凝集を低下させると予想される、配列番号331、31A12のF12S突然変異、及びpI最適化とF12S突然変異が組み合わされた、配列番号333、31A12を参照されたい。別の実施態様では、核酸分子を、フレームワーク領域のうちの1つ又は複数において突然変異させることができる。突然変異をフレームワーク領域又は定常ドメイン中で生成させ、抗IL6又は抗IL23抗体の半減期を増大させることができる。フレームワーク領域又は定常ドメイン中の突然変異を生成させて、別の分子への共有結合若しくは非共有結合のための部位を提供するように抗体の免疫原性を改変するか、又は補体結合のような特性を改変することもできる。したがって、本発明によれば、突然変異を、単一の突然変異抗体中のフレームワーク領域、定常ドメイン、及び可変領域の各々において生成させることができる。或いは、突然変異を、単一の突然変異抗体中のフレームワーク領域、可変領域、又は定常ドメインのうちの1つでのみ生成させることができる。ある実施態様では、本発明は、突然変異前の抗IL6抗体との少なくとも90の配列同一性を有する変異体抗IL6抗体を提供する。好ましくは、変異体抗IL6抗体は、突然変異前の抗IL6抗体との少なくとも95、96、97、98、又は99の配列同一性を有する。ある実施態様では、本発明は、突然変異前の抗IL23抗体との少なくとも90の配列同一性を有する変異体抗IL23抗体を提供する。好ましくは、変異体抗IL23抗体は、突然変異前の抗IL23抗体との少なくとも95、96、97、98、又は99の配列同一性を有する。ある実施態様では、本発明は、突然変異前の抗IL23IL12抗体との少なくとも90の配列同一性を有する変異体抗IL23IL12抗体を提供する。好ましくは、変異体抗IL23IL12抗体は、突然変異前の抗IL23IL12抗体との少なくとも95、96、97、98、又は99の配列同一性を有する。一実施態様では、突然変異前の抗IL6抗体と比べた変異体抗IL6抗体のVH領域又はVL領域のどちらかにおいて10個以下のアミノ酸変化がある。別の実施態様では、突然変異前の抗IL23抗体と比べた変異体抗IL23抗体のVH領域又はVL領域のどちらかにおいて10個以下のアミノ酸変化がある。別の実施態様では、突然変異前の抗IL23IL12抗体と比べた変異体抗IL23IL12抗体のVH領域又はVL領域のどちらかにおいて10個以下のアミノ酸変化がある。より好ましい実施態様では、変異体抗IL6抗体、変異体抗IL23抗体、又は変異体抗IL23IL12抗体のVH領域又はVL領域のどちらかにおいて、5個以下のアミノ酸変化、より好ましくは、3個以下のアミノ酸変化がある。別の実施態様では、突然変異前の抗IL6抗体と比べた変異体抗IL6抗体、突然変異前の抗IL23抗体と比べた変異体抗IL23抗体、又は突然変異前の抗IL23IL12抗体と比べた変異体抗IL23IL12抗体のいずれかの定常ドメインにおいて、15個以下のアミノ酸変化があり、より好ましくは、10個以下のアミノ酸変化、さらにより好ましくは、5個以下のアミノ酸変化がある。抗体誘導体は、当業者に公知の技術及び方法を用いて作製することができる。本発明による抗体誘導体は、それらが由来している抗体の結合親和性、及び該抗体のIL6、IL23、又はp40の生物学的活性を調節する能力を保持するか、又は実質的に保持する。抗体誘導体の例としては、本明細書に開示される抗IL6、抗IL23、及び抗IL23IL12抗体に由来するFab、Fab、F、及びscFvコンストラクト、カッパボディ、ミニボディ、並びにヤヌシンが挙げられる。本発明のある実施態様では、抗IL6抗体又は変異体抗IL6抗体のFab、Fab、F断片が提供される。本発明のある実施態様では、抗IL23抗体又は変異体抗IL23抗体のFab、Fab、F断片が提供される。本発明のある実施態様では、抗IL23IL1223IL126抗体又は変異体抗IL23IL12抗体のFab、Fab、F断片が提供される。本発明のある実施態様では、抗IL6抗体又は変異体抗IL6抗体のscFv誘導体が提供される。本発明のある実施態様では、抗IL23抗体又は変異体抗IL23抗体のscFv誘導体が提供される。本発明のある実施態様では、抗IL23IL12抗体又は変異体抗IL23IL12抗体のscFv誘導体が提供される。単鎖抗体を作出するために、VH配列及びVL配列を、VL領域及びVH領域が柔軟なリンカーで接続された、連続的な単鎖タンパク質として発現することができるように、VH及びVLをコードするDNA断片を、柔軟なリンカーをコードする別の断片に機能的に連結させるScience242423426Hustonらの文献ProcNatlAcadSciUSA8558795883McCaffertyらの文献348552554を参照されたい。単鎖抗体は、単一のVH及びVLのみが使用される場合、一価となり得るし、2つのVH及びVLが使用される場合、二価となり得るし、又は3以上のVH及びVLが使用される場合、多価となり得る。ある実施態様では、単鎖抗体は、抗IL6抗体由来の可変領域の1つ又は複数を用いて調製される。別の実施態様では、単鎖抗体は、抗IL6抗体由来の1以上のCDR領域を用いて調製される。一実施態様では、単鎖抗体は、抗IL23抗体由来の可変領域の1つ又は複数を用いて調製される。別の実施態様では、単鎖抗体は、抗IL23抗体由来の1以上のCDR領域を用いて調製される。一実施態様では、単鎖抗体は、抗IL23IL12抗体由来の可変領域の1つ又は複数を用いて調製される。別の実施態様では、単鎖抗体は、抗IL23IL12抗体由来の1以上のCDR領域を用いて調製される。好ましい実施態様では、抗IL6単鎖抗体は、上記のヒト化抗IL6抗体に由来する。好ましい実施態様では、抗IL23単鎖抗体は、上記のヒト化抗IL23抗体に由来する。好ましい実施態様では、抗IL23IL12単鎖抗体は、上記のヒト化抗IL23IL12抗体に由来する。ある実施態様では、単鎖抗体の軽鎖及び重鎖は、以下のアミノ酸配列を有するリンカー部分によって接続されている。本発明のリンカー部分は、3~5回反復される配列GGGGS、又は非整数反復のGGGGS配列であることができ、例えば、配列番号330を参照されたい。ある実施態様では、本発明の単鎖抗体は、PEGに共有結合されている。別の実施態様では、他の修飾抗体は、抗IL6抗体、抗IL23抗体、又は抗IL23IL12抗体をコードする核酸分子を用いて調製することができる。例えば、カッパボディ、ミニボディ、又はヤヌシン及びTrauneckerらの文献IntJCancerSuppl75152は、標準的な分子生物学的技術を用いて調製することができる。相補性決定領域は、抗原受容体の可変ドメインに見られる、柔軟なループの形状の比較的短いアミノ酸配列である。免疫グロブリンとT細胞受容体の両方のCDRは、それらの特異性を決定し、特異的リガンドと接触するこれらの分子の部分である。CDRは、該分子の最も変化しやすい部分であり、これらの分子の多様性の一因となり、免疫グロブリン及びT細胞受容体が、巨大な抗原レパートリーを認識するのを可能にする。したがって、本発明の二価の二重特異性コンストラクトを構成する抗IL6、抗IL23、及び抗IL23IL12抗体中のこれらの領域は、抗体の特異性を決定する上で重要な役割を果たしており、特定の共通したCDR領域を有する抗体は、同一又は同様の抗原特異性を有すると考えられる。したがって、本発明の一態様では、抗IL6、抗IL23、及び抗IL23IL12抗体、又はそれらの誘導体は、それらが基にしている抗体のCDR領域を含む。CDR領域の中には、抗体特異性に関して他よりも重要な役割を果たすと考えられるものがあることにも留意するべきである。特に、VHドメインの少なくとも3番目の相補性決定領域は、CDR領域全ての結合の特異性及び親和性において主要な役割を果たすことが知られているので、二価の二重特異性コンストラクトに含める抗体又はその誘導体を設計する際に、これらを用いることが有利であることが多い。したがって、本発明は、親抗体のCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、及びCDR6のうちの少なくとも1つを含むように本発明の二価の二重特異性コンストラクトを構成する抗体及び抗体誘導体を提供する。好ましくは、該二価の二重特異性コンストラクトを構成する抗体及び抗体誘導体は、少なくともCDR3を含む。ある実施態様では、突然変異した抗IL6抗体は、突然変異前の抗IL6抗体と比べて変化していない少なくとも1つの相補性決定領域を有する。変化していないCDRは、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、又はCDR6であることができる。別の実施態様では、突然変異した抗IL23抗体は、突然変異前の抗IL23抗体と比べて変化していない少なくとも1つの相補性決定領域を有する。変化していないCDRは、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、又はCDR6であることができる。ある実施態様では、突然変異した抗IL23IL12抗体は、突然変異前の抗IL6抗体と比べて変化していない少なくとも1つの相補性決定領域を有する。変化していないCDRは、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、又はCDR6であることができる。個々のCDRの場合にも、特定の抗体又はその誘導体の特異性を決定する際に特に重要である特定の領域があることが当業者によって理解されるであろう。これらの領域の特異性は、いくつかの因子、例えば、その立体構造及び該領域内での荷電アミノ酸残基の場所によって決定され得る。当業者は、エピトープマッピング、及び同じ標的に結合することが知られている抗体の配列を比較することを含む、当技術分野で公知の技術によって、これらのモチーフを同定することができる。したがって、本発明は、特定のモチーフを有するCDRを含む抗体又はその誘導体を提供する。ある実施態様では、該CDRは、以下の抗体のCDR領域から取られた少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの連続するアミノ酸を含む。別の実施態様では、該CDRは、上述のCDRから取られた置換された連続するアミノ酸配列を含む。特に、該モチーフは、アミノ酸の内容及び位置が、配列中の他のアミノ酸と比べて固定されており、かつ1つ又は2つのアミノ酸が、置換前のCDRの対応するアミノ酸と比べて置換され得る、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5、又は少なくとも6つの残基を含むことができる。好ましくは、該置換は、保存的な置換である。そのようなモチーフの例は、22H8抗IL23IL12抗体のCDR2領域内に見出すことができる。該モチーフは、以下の式によって記載することができるアミノ酸配列の配列WX1KG本発明の抗IL23IL12抗体のCDRに見られる共通モチーフの他の例としては、以下のものが挙げられるアミノ酸配列YAYX1GDAFDPを含むCDR3領域中のモチーフ並びに又はアミノ酸配列SDYFNX1を含むCDR3領域中のモチーフ、並びに又はアミノ酸配列QX1SQX2を含むCDR4領域中のモチーフ並びに又はアミノ酸配列ASX1LAを含むCDR5領域中のモチーフ、並びに又はアミノ酸配列QSYYDX1NAGYGを含むCDR6領域中のモチーフ。本発明のIL23抗体のCDRに見られる共通モチーフの例としては、以下のものが挙げられるアミノ酸配列YYAX1WAX2Gを含むCDR2領域中のモチーフ、並びに又はアミノ酸配列AX1TLX2Sを含むCDR5領域中のモチーフ。本発明のIL6抗体のCDRに見られる共通モチーフの例としては、以下のものが挙げられるアミノ酸配列YIYTDX1STX2YANWAKGを含むCDR2領域中のモチーフ、並びに又はアミノ酸配列RX1STLX2Sを含むCDR5領域中のモチーフ。本発明は、抗IL6、抗IL23、及び抗IL23IL12抗体、又はそれらの誘導体への非天然アミノ酸残基の組込みを提供して、抗IL6抗体又はその誘導体の、抗IL23又は抗IL23IL12抗体、又はそれらの誘導体への付着点を提供する。当業者は、例えば、アジドホモアラニンを含む、いくつかの潜在的に好適な非天然アミノ酸を認識している。さらなる非天然アミノ酸としては、アジドノルロイシン、3アラニン、3アラニン、pエチニルフェニルアラニン、pプロパルギルオキシフェニルアラニン、mエチニルフェニルアラニン、6エチニルトリプトファン、5エチニルトリプトファン、2アミノ3プロパン酸、pブロモフェニルアラニン、pヨードフェニルアラニン、pアジドフェニルアラニン、3アラニン、3アラニン、3アラニン、ホモアリルグリシン、ホモプロパルギルグリシン、及びpクロロフェニルアラニンが挙げられる。好ましい実施態様では、非天然アミノ酸はAhaである。当業者はまた、付着部位を制御するために、これらの非天然アミノ酸が、付着が起こるべき位置にしか配置されないように、抗体又はその誘導体のアミノ酸配列を改変する必要があることを理解するであろう。ある実施態様では、非天然アミノ酸は、本明細書に開示されるような抗体又はその誘導体のN末端に配置することができる。ある実施態様では、非天然アミノ酸は、本明細書に開示されるような抗体又はその誘導体のC末端に配置することができる。ある実施態様では、非天然アミノ酸は、本明細書に開示されるようなscFvのVH部分とVL部分の間のリンカー領域中に配置することができる。ある実施態様では、二価の二重特異性コンストラクトに組み込まれるべき単一の付着点が各々の抗体中にある。抗体若しくはその誘導体、scFv、及び又は本発明の二価の二重特異性コンストラクトの部分の例としては、配列番号287~312が挙げられる。ある実施態様では、非天然アミノ酸の組込みは、メチオニンの代わりに非天然アミノ酸を組み込んでいる栄養要求性宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成される。そこを単一の付着部位とするために、抗体ヌクレオチド配列を改変して、所望の付着部位に配置されない任意の天然に存在するメチオニンのコドンを除去しなければならない。これは、それらを他のアミノ酸のコドンと置換することによって達成することができる。1~2個のメチオニン残基が、免疫グロブリンVH領域のフレームワーク領域及びCDR内にはよく見られ、VL領域内にはあまり見られないので、これらの残基の好適な置換を見出す必要があり、該残基内では、該好適な置換は、所望のタンパク質の発現、安定性、又は機能に影響を及ぼすことなく生じる。その後、このメチオニン不含scFvを、メチオニン要求性細菌株での発現用に最適化し、精製し、再フォールディングさせ、生物学的活性について試験することができる。任意に、2以上の非天然アミノ酸の組込みを可能にするために、2以上のメチオニンコドンを配列中に残すことができる。メチオニンが所望の付着部位に元々存在しない場合、化学反応性のある付着部位を有する非天然アミノ酸の挿入部位として働く単一のメチオニンコドンを導入することができる。非天然アミノ酸を含むように修飾された抗体を、1以上の別々の実体に付着させることができる。これらの実体には、リンカー基及び又は他の同様に修飾された抗体が含まれる。好適なリンカーの例は、当技術分野で公知であり、短いペプチド配列を含む。本発明はまた、リンカーとしてのPEGの使用を提供する。したがって、ある実施態様では、非天然アミノ酸を組み込んでいる抗IL6抗体又はその誘導体を、PEGリンカー基に共有結合させることができ、このPEGリンカー基をさらに、非天然アミノ酸を組み込んでいる抗IL23若しくは抗IL23IL12抗体、又はそれらの誘導体に付着させる。その後、そのような二重特異性、PEG化コンストラクトを精製し、再フォールディングさせて、安定で、生物学的活性のある治療タンパク質を得ることができる。好適には、非天然アミノ酸を含むように修飾された本発明における抗体又はその誘導体を、直接、他の抗体若しくはその誘導体、色素、薬物、又は毒素を含むが、これらに限定されない、他の同様に修飾された分子に結合させることができる。本発明の二価の二重特異性コンストラクト又は抗体を誘導体化するか、又は別の分子に結合させることができる。一般に、二価の二重特異性コンストラクトは、成分抗体又はその誘導体の結合及び生物学的活性が誘導体化又は標識によって悪影響を受けないように、誘導体化される。例えば、本発明の二価の二重特異性コンストラクトを、1以上の他の分子実体、例えば、検出剤、細胞傷害剤、医薬品、及び又は抗体若しくは抗体部分と別の分子との会合を媒介することができるタンパク質若しくはペプチドに機能的に結合させることができる。1つのタイプの誘導体化された二価の二重特異性コンストラクトは、標識された二価の二重特異性コンストラクトである。本発明の二価の二重特異性コンストラクトを誘導体化し得る有用な検出剤としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5ジメチルアミン1ナフタレンスルホニルクロライド、フィコエリスリン、ランタニド燐光体などを含む、蛍光化合物が挙げられる。二価の二重特異性コンストラクトは、検出に有用である酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどで標識することもできる。二価の二重特異性コンストラクトが検出可能な酵素で標識されている場合、それは、該酵素が用いるさらなる試薬を添加して、識別され得る反応生成物を産生することによって検出される。例えば、作用剤の西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素及びジアミノベンジジンの添加は、検出可能である、着色された反応生成物を生じさせる。二価の二重特異性コンストラクトを、ビオチンで標識し、アビジン又はストレプトアビジン結合の間接的な測定によって検出することもできる。二価の二重特異性コンストラクトを、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープで標識することもできる。いくつかの実施態様では、標識を様々な長さのスペーサーアームによって付着させて、潜在的な立体障害を低下させる。二価の二重特異性コンストラクトは、放射性標識アミノ酸で標識することもできる。放射性標識は、診断目的と治療目的の両方のために用いることができる。放射性標識二価の二重特異性コンストラクトは、診断的に、例えば、対象におけるIL6及び又はIL23レベルを決定するために用いることができる。さらに、放射性標識二価の二重特異性コンストラクトは、TH17経路によって媒介される疾患を治療するために治療的に用いることができる。放射性標識の例としては、以下の放射性同位体又は放射性核種が挙げられるが、これらに限定されない3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。放射性同位体は、キレート化部分、例えば、DOTAによる誘導体化によって、抗体又は二重特異性体に結合させることもできる。有用なイメージング用及び治療用放射性同位体のいくつかは、これらのキレート剤に強く結合する。二価の二重特異性コンストラクトは、化学基、例えば、ポリエチレングリコール、メチル若しくはエチル基、又は炭水化物基で誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特徴を改善するために、例えば、血清半減期を増大させるために、又は組織結合を増大させるために有用であり得る。本発明の二価の二重特異性コンストラクト、並びに該二価の二重特異性コンストラクトを構成する抗体、及びその誘導体を、従来の組換え技術を用いて発現させることができる。さらに、該コンストラクト、並びに又は抗体、及びその誘導体が非天然アミノ酸を含む場合、WO2007130453号に記載されているような組換え法を用いることができる。該二価の二重特異性コンストラクト、並びに該抗体、及びその誘導体を発現させるために用いられるヌクレオチド配列、ベクター、宿主細胞などは、本発明の目的である。ある実施態様では、本発明は、二価の二重特異性コンストラクト、並びに上で定義したような二価の二重特異性コンストラクトを構成する抗体、及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を提供する。したがって、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体、本発明によるヒト化抗体、本発明による及びに基づく変異体抗体、本発明による~の抗体の誘導体、並びに本発明による二価の二重特異性コンストラクトをコードするヌクレオチド配列を包含する。ある実施態様では、ヌクレオチド配列は、抗IL6抗体の部分をコードする。そのような配列の例は、13A8と表されたIL6抗体のVH及びVL領域のヌクレオチド配列である、配列番号7及び9に与えられている。ある実施態様では、ヌクレオチド配列は、抗IL23抗体の部分をコードする。そのような配列の例は、31A12と表された抗IL23抗体のVH及びVL領域のヌクレオチド配列である、配列番号87及び89に与えられている。ある実施態様では、ヌクレオチド配列は、抗IL23IL12抗体の部分をコードする。そのような配列の例は、22H8と表された抗IL23IL12抗体のVH及びVL領域のヌクレオチド配列である、配列番号137及び139に与えられている。ある実施態様では、該二価の二重特異性コンストラクトは、単一の産物として発現させることができる。ある実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、プロモーター配列に機能的に連結されている。好適なプロモーターの例としては、T5Lacプロモーター、T7Lac又は修飾されたT7lacプロモーター、Trc又はtacプロモーター、ファージpL又はpR温度誘導性プロモーター、tetAプロモーターオペレーター、araBADプロモーター、rhaPBADプロモーター、及びlacUV5プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なプロモーターは、TerpeKの文献から特定することができる。好ましい実施態様では、プロモーターは、T5Lacプロモーターである。ある実施態様では、本発明は、任意に、プロモーター配列に機能的に連結された本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。ある実施態様では、本発明は、本発明のベクターでトランスフェクトされ、該ベクター内に含まれるヌクレオチド配列を発現することができる宿主細胞を提供する。任意に、該宿主細胞は、特定の天然アミノ酸の代わりに非天然アミノ酸を組み込むことができる栄養要求性細胞である。該宿主細胞は、原核生物細胞又は真核生物細胞であることができる。好適な真核生物細胞としては、酵母細胞、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞が挙げられる。好ましくは、該宿主細胞は、原核生物、特に、大腸菌B384であり、これはメチオニン要求性細胞である。或いは、該細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましくは、それらはヒト細胞であり、さらにより好ましくは、それらは、ヒト胚性腎細胞又はCHO細胞である。本発明のある実施態様では、抗IL6、抗IL23抗体、及び抗IL23IL12抗体、並びにそれらの誘導体のクローニング及び発現のためのプライマーが提供される。これらのプライマーは、10~40ヌクレオチドで長さが様々であり、好ましくは、それらは、長さが15~30ヌクレオチドである。当業者は、本明細書に開示される抗体、及びその誘導体の核酸配列の開示を考慮して、好適なプライマー配列を決定することができるであろう。関心対象の特定のプライマー配列は、配列番号200~258に与えられており、これらは、本明細書に開示される抗体及びscFvのクローニング及び発現に有用である。部分をペプチドにコンジュゲートさせることを可能にする非天然アミノ酸の使用は、WO2007130453号に開示されている。そのようなタンパク質工学も以下で論じられる。タンパク質工学プロセスの第一の工程は、通常、所望の化学的特性を有する1組の非天然アミノ酸を選択することである。非天然アミノ酸の選択は、所定の化学的特性、及び標的分子又は標的タンパク質中で行なわれることが意図される修飾によって決まる。非天然アミノ酸は、選択されれば、販売元から購入するか、又は化学合成することができる。任意の数の非天然アミノ酸を標的分子内に組み込むことができ、その数は付着させるべき所望の化学的部分の数に応じて様々であり得る。化学的部分は、非天然アミノ酸の全て又はごく一部に付着させることができる。さらに、所望の結果に応じて、同じ又は異なる非天然アミノ酸を分子内に組み込むことができる。ある実施態様では、少なくとも2つの異なる非天然アミノ酸を分子内に組込み、1つの化学的部分、例えば、PEGを一方の非天然アミノ酸残基に付着させ、一方、別の化学的部分、例えば、細胞傷害剤を他方の非天然アミノ酸に付着させる。多種多様な非天然アミノ酸を本発明の方法で用いることができる。通常、本発明で有用な非天然アミノ酸は、20種の天然アミノ酸では得ることができない追加の特徴を提供するように選択又は設計される。例えば、非天然アミノ酸は、例えば、それらが組み込まれる、タンパク質を含む、分子の生物学的特性を修飾するように任意に設計又は選択される。例えば、以下の特性が、分子、例えば、タンパク質に非天然アミノ酸を含めることによって任意に修飾される毒性、生体分布、溶解性、安定性、例えば、熱、加水分解、酸化に対する安定性、酵素分解に対する抵抗性など、精製及び処理の容易さ、構造的特性、分光学的特性、化学的及び又は光化学的特性、触媒活性、ワクチンとして機能する能力、酸化還元電位、半減期、他の分子と、例えば、共有結合的又は非共有結合的に反応する能力など。本明細書で使用されるように、非天然アミノ酸は、セレノシステイン、及び遺伝子にコードされた以下の20種のαアミノ酸アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はアミノ酸類似体を指す。αアミノ酸の一般構造は、式Iによって示される。非天然アミノ酸は、通常、式Iを有する任意の構造である。20種の天然アミノ酸の構造については、例えば、LStryer著生化学第3版1988FreemanandCompanyNewYorkなどの、任意の生化学の教科書を参照されたい。本明細書に開示される非天然アミノ酸は、上記の20種のαアミノ酸以外の天然に存在する化合物であってもよいことに留意されたい。本明細書に開示される非天然アミノ酸は、通常、側鎖のみが天然アミノ酸と異なるので、該非天然アミノ酸は、それらが天然に存在するタンパク質で形成されるのと同じ様式で、例えば、天然又は非天然の、他のアミノ酸とアミド結合を形成する。しかしながら、非天然アミノ酸は、それらを天然アミノ酸と区別する側鎖基を有する。例えば、式IのRは、任意に、アルキル、アリール、アリールハライド、ビニルハライド、βシリルアルケニルハライド、βシリルアルケニルスルホネート、アルキルハライド、アセチル、ケトン、アジリジン、ニトリル、ニトロ、ニトリルオキシド、ハライド、アシル、ケト、アジド、ケタール、アセタール、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオエーテル、エポキシド、スルホン、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボラン、フェニルボロン酸、チオール、セレノ、スルホニル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、ピリジル、ナフチル、ベンゾフェノン、拘束された環、例えば、シクロオクチン、シクロプロペン、ノルボルネンチオエステル、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ、カルボン酸、αケトカルボン酸、α若しくはβ不飽和酸及びアミド、グリオキシルアミド、若しくはオルガノシラン、ピロン、テトラジン、ピリダジン、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコキシアミン、アリールスルホネート、アリールハライド、チオセミカルバジド、セミカルバジド、テトラゾール基など、又はそれらの任意の組合せを含む。非天然アミノ酸の具体例は、限定されないが、pアセチルLフェニルアラニン、OメチルLチロシン、L3アラニン、3メチルフェニルアラニン、O4アリルLチロシン、4プロピルLチロシン、トリOアセチルGlcNAcβセリン、βOGlcNAcLセリン、トリOアセチルGalNAcαトレオニン、αGalNAcLトレオニン、Lドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピルLフェニルアラニン、pアジドLフェニルアラニン、pアシルLフェニルアラニン、pベンゾイルLフェニルアラニン、Lホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、pヨードフェニルアラニン、pブロモフェニルアラニン、pアミノLフェニルアラニン、イソプロピルLフェニルアラニン、ピロリジン、NσoアジドベンジルオキシカルボニルLリジン、NσプロパルギルオキシカルボニルLリジン、Nσ2アジドエトキシカルボニルLリジン、NσtertブチルオキシカルボニルLリジン、NσアリルオキシカルボニルLリジン、NσアセチルLリジン、NσベンジルオキシカルボニルLリジン、NσシクロペンチルオキシカルボニルLリジン、NσDプロリルLリジン、NσニコチノイルLリジン、NσNMeアントラニロイルLリジン、NσビオチニルLリジン、Nσ9フルオレニルメトキシカルボニルLリジン、NσメチルLリジン、NσジメチルLリジン、NσトリメチルLリジン、NσイソプロピルLリジン、NσダンシルLリジン、NσopジニトロフェニルLリジン、NσpトルエンスルホニルLリジン、NσDL2アミノ2カルボキシエチルLリジン、NσフェニルピルバミドLリジン、NσピルバミドLリジン、以下に、又は本明細書の別所に記載されているものなどを含みかつ例えば、pアセチルLフェニルアラニン、OメチルLチロシン、L3アラニン、3メチルフェニルアラニン、O4アリルLチロシン、4プロピルLチロシン、トリOアセチルGlcNAcβセリン、βOGlcNAcLセリン、トリOアセチルGalNAcαトレオニン、αGalNAcLトレオニン、Lドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピルLフェニルアラニン、pアジドLフェニルアラニン、pアシルLフェニルアラニン、pベンゾイルLフェニルアラニン、Lホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、pヨードフェニルアラニン、pブロモフェニルアラニン、pアミノLフェニルアラニン、及びイソプロピルLフェニルアラニンから選択される。アリール置換は、様々な位置、例えば、オルト、メタ、パラで、1以上の官能基をアリール環上に配置させて生じることができる。関心対象の他の非天然アミノ酸としては、光活性化可能なクロスリンカーを含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、色素標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規の官能基を有するアミノ酸、親水性、疎水性、極性、又は水素結合する能力が改変されたアミノ酸、共有結合的又は非共有結合的に他の分子と相互作用するアミノ酸、フォトケージ化された及び又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含むアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、例えば、糖置換セリン、他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコール若しくはポリエーテル、多価アルコール、又は多糖を含むアミノ酸、メタセシスを受けることができるアミノ酸、環状付加を受けることができるアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学切断可能及び又は光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比べて伸張した側鎖、例えば、炭素が約5個よりも多いか又は約10個よりも多い、例えば、ポリエーテル又は長鎖炭化水素を有するアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、薬物部分を含むアミノ酸、並びに1以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。新規の側鎖を含む非天然アミノ酸に加えて、非天然アミノ酸は、任意に、例えば、式II及びIIIx又は天然アミノ酸側鎖から選択されるの構造によって示されるような、修飾された骨格構造も含む。例えば、本明細書に開示される非天然アミノ酸は、任意に、式II及びIIIによって示されるようなアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。このタイプの非天然アミノ酸としては、αヒドロキシ酸、αチオ酸、αアミノチオカルボキシレート、又は例えば、20種の天然アミノ酸若しくは非天然の側鎖に対応する側鎖を有する、ααジ置換アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。それらには、βアミノ酸又はγアミノ酸、例えば、置換されたβアラニン及びγアミノ酪酸も含まれるが、これらに限定されない。さらに、α炭素における置換又は修飾には、任意に、L又はD異性体、例えば、Dグルタメート、Dアラニン、DメチルOチロシン、アミノ酪酸などが含まれる。他の構造的代替物としては、環状アミノ酸、例えば、プロリン類似体、並びに3、4、6、7、8、及び9員環プロリン類似体が挙げられる。いくつかの非天然アミノ酸、例えば、アリールハライドが挙げられるが、これらに限定されず、これには、ホモアリルグリシン、シス又はトランスクロチルグリシン、666トリフルオロ2アミノヘキサン酸、2アミノヘプタン酸、ノルバリン、ノルロイシン、OメチルLチロシン、o、m、又はpメチルフェニルアラニン、O4アリルLチロシン、4プロピルLチロシン、トリOアセチルGlcNAcβセリン、Lドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピルLフェニルアラニン、pアジドフェニルアラニン、pアシルLフェニルアラニン、pベンゾイルLフェニルアラニン、Lホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、pヨードフェニルアラニン、o、m、又はpブロモフェニルアラニン、2、3、又は4ピリジルアラニン、pヨードフェニルアラニン、ジアミノ酪酸、アミノ酪酸、ベンゾフラニルアラニン、3ブロモチロシン、3アラニン、3アラニン、3アラニン、pクロロフェニルアラニン、pエチニルフェニルアラニン、pプロパルギルオキシフェニルアラニン、mエチニルフェニルアラニン、6エチニルトリプトファン、5エチニルトリプトファン、2アミノ3プロパン酸、アジドノルロイシン、アジドホモアラニン、pアセチルフェニルアラニン、pアミノLフェニルアラニン、ホモプロパルギルグリシン、pエチルフェニルアラニン、pエチニルフェニルアラニン、pプロパルギルオキシフェニルアラニン、イソプロピルLフェニルアラニン、3アラニン、3アラニン、3ヨードチロシン、Oプロパルギルチロシン、ホモグルタミン、O4アリルLチロシン、4プロピルLチロシン、3ニトロLチロシン、トリOアセチルGlcNAcβセリン、Lドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピルLフェニルアラニン、pアジドLフェニルアラニン、pアシルLフェニルアラニン、pアセチルLフェニルアラニン、mアセチルLフェニルアラニン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、セレノシステイン、アルキンフェニルアラニン、OアリルLチロシン、OLチロシン、pエチルチオカルボニルLフェニルアラニン、pLフェニルアラニン、pベンゾイルLフェニルアラニン、Lホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ホモプロパルギルグリシン、アジドホモアラニン、pヨードフェニルアラニン、pブロモLフェニルアラニン、ジヒドロキシフェニルアラニン、ジヒドロキシルLフェニルアラニン、pニトロLフェニルアラニン、mメトキシLフェニルアラニン、pヨードフェニルアラニン、pブロモフェニルアラニン、pアミノLフェニルアラニン、及びイソプロピルLフェニルアラニン、トリフルオロロイシン、ノルロイシン、4、5、又は6フルオロトリプトファン、4アミノトリプトファン、5ヒドロキシトリプトファン、ビオシチン、アミノオキシ酢酸、mヒドロキシフェニルアラニン、mアリルフェニルアラニン、mメトキシフェニルアラニン基、βGlcNAcセリン、αGalNAcトレオニン、pアセトアセチルフェニルアラニン、パラハロフェニルアラニン、セレノメチオニン、エチオニン、Sニトロソホモシステイン、チアプロリン、3チエニルアラニン、ホモアリルグリシン、トリフルオロイソロイシン、トランス及びシス2アミノ4ヘキセン酸、2ブチニルグリシン、アリルグリシン、パラアジドフェニルアラニン、パラシアノフェニルアラニン、パラエチニルフェニルアラニン、ヘキサフルオロロイシン、124トリアゾール3アラニン、2フルオロヒスチジン、Lメチルヒスチジン、3メチルLヒスチジン、β2チエニルLアラニン、βDLアラニン、ホモプロパルギルグリシン、並びにアジドホモアラニンなどが含まれる。種々の非限定的な非天然アミノ酸の構造は、例えば、その内容全体が引用により本明細書中に組み込まれている、US20030108885A1号の図29、30、及び31に提供されている。チロシン類似体としては、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、ここで、該置換チロシンは、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、C6C20直鎖又は分岐状炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Oメチル基、ポリエーテル基、ニトロ基などを含む。さらに、多重置換アリール環も企図される。本発明のグルタミン類似体としては、αヒドロキシ誘導体、β置換誘導体、環状誘導体、及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。フェニルアラニン類似体の例としては、メタ置換フェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されず、ここで、その置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アセチル基などを含む。リジン類似体としては、Nσ置換されたもの、例えば、ピロリジン、NσoアジドベンジルオキシカルボニルLリジン、NσプロパルギルオキシカルボニルLリジン、Nσ2アジドエトキシカルボニルLリジン、NσtertブチルオキシカルボニルLリジン、NσアリルオキシカルボニルLリジン、NσアセチルLリジン、NσベンジルオキシカルボニルLリジン、NσシクロペンチルオキシカルボニルLリジン、NσDプロリルLリジン、NσニコチノイルLリジン、NσNMeアントラニロイルLリジン、NσビオチニルLリジン、Nσ9フルオレニルメトキシカルボニルLリジン、NσメチルLリジン、NσジメチルLリジン、NσトリメチルLリジン、NσイソプロピルLリジン、NσダンシルLリジン、NσopジニトロフェニルLリジン、NσpトルエンスルホニルLリジン、NσDL2アミノ2カルボキシエチルLリジン、NσフェニルピルバミドLリジン、NσピルバミドLリジンが挙げられる。さらに、他の例としては、任意に、チロシンアミノ酸の非天然類似体グルタミンアミノ酸の非天然類似体フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体セリンアミノ酸の非天然類似体トレオニンアミノ酸の非天然類似体アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、ケタール、アセタール、歪んだシクロオクチン、歪んだシクロアルケン、シクロプロペン、ノルボルネン、ニトリル酸化物、βシリルアルケニルハライド、βシリルアルケニルスルホネート、ピロン、テトラジン、ピリダジン、アルコキシアミン、アリールスルホネート、アリールハライド、チオセミカルバジド、セミカルバジド、テトラゾール、αケト酸、若しくはアミノ置換アミノ酸、又はそれらの任意の組合せ光活性化可能なクロスリンカーを有するアミノ酸スピン標識アミノ酸蛍光アミノ酸新規の官能基を有するアミノ酸共有結合的又は非共有結合的に別の分子と相互作用するアミノ酸金属結合アミノ酸金属含有アミノ酸放射性アミノ酸フォトケージ化アミノ酸光異性化可能なアミノ酸ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸グリコシル化又は炭水化物修飾されたアミノ酸ケト含有アミノ酸ポリエチレングリコールを含むアミノ酸ポリエーテルを含むアミノ酸重原子置換アミノ酸化学切断可能又は光切断可能なアミノ酸伸張した側鎖を有するアミノ酸毒性基を含むアミノ酸糖置換アミノ酸、例えば、糖置換セリンなど炭素結合糖含有アミノ酸酸化還元活性アミノ酸αヒドロキシ含有酸アミノチオ酸含有アミノ酸ααジ置換アミノ酸βアミノ酸並びに環状アミノ酸が挙げられる。通常、ある実施態様のために本明細書で利用される非天然アミノ酸は、20種の天然アミノ酸では得ることができない追加の特徴を提供するように選択又は設計することができる。例えば、非天然アミノ酸は、例えば、それらが組み込まれるタンパク質の生物学的特性を修飾するように任意に設計又は選択される。例えば、以下の特性が、タンパク質に非天然アミノ酸を含めることによって任意に修飾される毒性、生体分布、溶解性、安定性、例えば、熱、加水分解、酸化に対する安定性、酵素分解に対する抵抗性など、精製及び処理の容易さ、構造的特性、分光学的特性、化学的及び又は光化学的特性、触媒活性、酸化還元電位、半減期、他の分子と、例えば、共有結合的又は非共有結合的に反応する能力などアミノ酸類似体の他の例としては、任意に、チロシンアミノ酸の非天然類似体グルタミンアミノ酸の非天然類似体フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体セリンアミノ酸の非天然類似体トレオニンアミノ酸の非天然類似体アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、ケタール、アセタール、歪んだシクロオクチン、歪んだシクロアルケン、シクロプロペン、ノルボルネン、ニトリル酸化物、βシリルアルケニルハライド、βシリルアルケニルスルホネート、ピロン、テトラジン、ピリダジン、アルコキシアミン、アリールスルホネート、アリールハライド、チオセミカルバジド、セミカルバジド、テトラゾール、αケト酸、若しくはアミノ置換アミノ酸、又はこれらの任意の組合せ光活性化可能なクロスリンカーを有するアミノ酸スピン標識アミノ酸蛍光アミノ酸新規の官能基を有するアミノ酸共有結合的又は非共有結合的に別の分子と相互作用するアミノ酸金属結合アミノ酸金属含有アミノ酸放射性アミノ酸フォトケージ化アミノ酸光異性化可能なアミノ酸ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸グリコシル化又は炭水化物修飾されたアミノ酸ケト含有アミノ酸ポリエチレングリコールを含むアミノ酸ポリエーテルを含むアミノ酸重原子置換アミノ酸化学切断可能又は光切断可能なアミノ酸伸張した側鎖を有するアミノ酸毒性基を含むアミノ酸糖置換アミノ酸、例えば、糖置換セリンなど炭素結合糖含有アミノ酸酸化還元活性アミノ酸αヒドロキシ含有酸アミノチオ酸含有アミノ酸ααジ置換アミノ酸βアミノ酸並びにプロリン以外の環状アミノ酸が挙げられる。本発明の方法で使用するのに好適な非天然アミノ酸としては、アミノ酸側鎖に付着したサッカリド部分を有するものも挙げられる。一実施態様では、サッカリド部分を有する非天然アミノ酸としては、Man、GalNAc、Glc、Fuc、又はGal部分を有するセリン又はトレオニンアミノ酸が挙げられる。サッカリド部分を含む非天然アミノ酸の例としては、例えば、トリOアセチルGlcNAcβセリン、βOGlcNAcLセリン、トリOアセチルGalNAcαトレオニン、αGalNAcLトレオニン、OManLセリン、テトラアセチルOManLセリン、OGalNAcLセリン、トリアセチルOGalNAcLセリン、GlcLセリン、テトラアセチルGlcLセリン、fucLセリン、トリアセチルfucLセリン、OGalLセリン、テトラアセチルOGalLセリン、βOGlcNAcLトレオニン、トリアセチルβGlcNAcLトレオニン、OManLトレオニン、テトラアセチルOManLトレオニン、OGalNAcLトレオニン、トリアセチルOGalNAcLトレオニン、GlcLトレオニン、テトラアセチルGlcLトレオニン、fucLトレオニン、トリアセチルfucLトレオニン、OGalLトレオニン、テトラアセチルOGalLセリン、βNアセチルグルコサミンOセリン、αNアセチルガラクトサミンOトレオニン、蛍光アミノ酸、例えば、ナフチル又はダンシル又は7アミノクマリン又は7ヒドロキシクマリン側鎖を含むもの、光切断可能又は光異性化可能なアミノ酸、例えば、アゾベンゼン又はニトロベンジルCys、Ser、又はTyr側鎖を含むもの、pカルボキシメチルLフェニルアラニン、ホモグルタミン、2アミノオクタン酸、pアジドフェニルアラニン、pベンゾイルフェニルアラニン、pアセチルフェニルアラニン、mアセチルフェニルアラニン、24ジアミノ酪酸などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明には、上記のものの非保護形態及びアセチル化形態が含まれる。というタイトルのWO03031464A2号及びサッカリド組成物、その合成のための方法及び装置というタイトルの米国特許第6331418号Tang及びTirrellの文献1231108911090並びにTangらの文献408も参照されたく、これらは全て、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。上に提供された非天然アミノ酸の多くは、例えば、SigmaAldrichから市販されている。市販されていないものは、任意に、US2004138106A1号の実施例に提供されているように、又は当業者に公知の標準的な方法を用いて合成される。有機合成技術については、例えば、Fessendon及びFessendon著、有機化学March著、最先端有機化学及びCarey及びSundberg著、最先端有機化学、並びにWO02085923号を参照されたく、これらは全て、引用により本明細書に組み込まれる。例えば、メタ置換フェニルアラニンは、WO02085923号に概略が示されているような手順で合成される。通常、NBSをメタ置換メチルベンゼン化合物に添加すると、メタ置換臭化ベンジルが得られ、次に、これをマロネート化合物と反応させると、メタ置換フェニルアラニンが得られる。メタ位に使用される典型的な置換基としては、ケトン、メトキシ基、アルキル、アセチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、3アセチルフェニルアラニンは、NBSを3メチルアセトフェノンの溶液と反応させることによって作製される。さらなる詳細については、下記の実施例を参照されたい。同様の合成を用いて、3メトキシフェニルアラニンを生成させる。その場合の臭化ベンジルのメタ位のR基はOCH3であるを参照されたい。場合によっては、非天然アミノ酸の設計は、シンセターゼ、例えば、末端枝突然変異体tRNAをアミノアシル化するために使用される末端枝突然変異体tRNAシンセターゼの活性部位に関する既知情報によってバイアスがかけられる。例えば、アミドの窒素で置換された誘導体、γ位のメチル基、及びNCy環状誘導体を含む、3つのクラスのグルタミン類似体が提供される。重要な結合部位残基が酵母GlnRSと相同である大腸菌GlnRSのx線結晶構造に基づいて、類似体を、グルタミンの側鎖の10シェル以内の残基の側鎖突然変異の配列を補完するように設計し、例えば、活性部位Phe233の小さい疎水性アミノ酸への突然変異を、GlnのCy位での立体的嵩高さの増加によって補完することができる。例えば、NフタロイルLグルタミン酸15無水物を任意に用いて、アミドの窒素に置換基を有するグルタミン類似体を合成する。Friedman及びChatterrjiの文献Craigらの文献並びにAzoulayらの文献を参照されたく、これらは全て、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。該無水物は、通常、アミンをフタルイミドとしてまず保護した後、酢酸中で還流することによって、グルタミン酸から調製される。次に、該無水物をいくつかのアミンで開裂させると、該アミドで様々な置換基が得られる。ヒドラジンによるフタロイル基の脱保護により、WO2002085923号の図23に示されるような遊離アミノ酸が得られる。γ位における置換は、通常、グルタミン酸のアルキル化によって達成される。を参照されたい。例えば、WO02085923号の図24の化合物番号5によって示されているような保護アミノ酸を、任意に、アミノ部分を9ブロモ9フェニルフルオレンでまずアルキル化しを参照されたい、その後、酸部分を、OtertブチルNNジイソプロピルイソウレアを用いてエステル化することによって調製する。KN32を添加すると、メチルエステルのα位で位置選択的に脱プロトン化されて、エノラートが形成され、次に、これを、任意に様々なアルキルヨウ化物でアルキル化する。tブチルエステル及びPhfl基を加水分解すると、所望のγメチルグルタミン類似体が得られた。WO02085923号の図25の化合物番号3によって示されているようなNCy環状類似体を、任意に、以前に記載されているように、BocAspOtBuから4工程で調製する。、及びSubasingheらの文献を参照されたい。NtBocピロリジノン、ピロリジノン、又はオキサゾリドンのアニオンを生成させた後、図25に示されているような化合物7を添加すると、マイケル付加生成物が得られる。その後、TFAで脱保護すると、遊離アミノ酸が得られる。トリフルオロロイシン及びヘキサフルオロロイシンは、当技術分野で公知の様々な方法によって合成することができる。例えば、555トリフルオロDLロイシンは、まず、市販のトリフルオロメチルクロトン酸をエタノールで希釈し、それを触媒の存在下で水素化することによって段階的に合成することができる。次に、混合物を還流し、エステルを蒸留することができる。次に、αオキシイミノ555トリフルオロイソカプロン酸を、還流及び蒸留によって誘導し、その後、555トリフルオロDLロイシンを再結晶化させることができる。同様に、555555ヘキサフルオロロイシンは、ヘキサフルオロアセトン及びブロモピルビン酸エチルから多工程で調製することができ、該多工程には、パン酵母によるか、又はオキサザボロリジン触媒を用いるカテコールボランによる、αケトエステルのカルボニル基の高度にエナンチオ選択性な還元が含まれる。Zhangらの文献、Rの文献Hendricksonらの文献米国特許出願第20030108885号及び第20030082575号、並びに同時係属の米国仮出願第60571810号を参照されたく、これらは全て、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示の新規な点の1つは、フッ素化非天然アミノ酸が組み込まれた、ロイシンジッパードメインを多く含む分子の熱安定性及び化学的安定性の増大に関する。同様に、ホモプロパルギルグリシン及びアジドホモアラニンを、公表されている方法によって合成することができる。例えば、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる、Mangoldらの文献による。ある実施態様では、本発明の二価の二重特異性コンストラクトは、下記のことを含む、以下の方法よって作製することができる少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている抗IL6抗体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を提供すること少なくとも1つの非天然アミノ酸の組込みによって修飾されている抗IL23抗体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を提供すること該宿主細胞が、該修飾された抗IL6抗体又はその誘導体、及び該修飾された抗IL23抗体又はその誘導体を発現するような条件下で、該宿主細胞を成長させること、該抗IL6抗体又はその誘導体、及び該抗IL23抗体又はその誘導体を単離すること該抗IL6抗体又はその誘導体が、各部分の非天然アミノ酸間の連結によって該抗IL23抗体又はその誘導体と結合されるように、該抗IL6抗体又はその誘導体を該抗IL23抗体又はその誘導体と反応させること。本発明の二重特異性コンストラクトは、当技術分野で公知の方法によって作製することもできる。これらには、体細胞ハイブリダイゼーション、化学的カップリング、及び組換え技術が含まれる。体細胞ハイブリダイゼーションは、2つのハイブリドーマの融合、及び得られるクアドローマによって分泌される二重特異性体の精製を含む。2つの異なる方法が記載されている2つの樹立されたハイブリドーマの融合によって、クアドローマが作製されるSureshらの文献、並びに1つの樹立されたハイブリドーマと、第二の抗原で免疫化されたマウスに由来するリンパ球との融合によって、トリオーマが作製される。bsMAbの開発のための体細胞ハイブリダイゼーションは、ハイブリドーマを調製する方法と類似した方法を含む。しかしながら、1つの細胞内での2つの異なる重鎖及び2つの異なる軽鎖の産生及びランダムな会合は、かなり大きな割合の非機能的分子のアセンブリを生じさせる。必要とされる特異性を有する二重特異性体を精製するために、複雑な精製技術が開発される必要があり、このため、臨床使用のための大規模製造がほとんど不可能になる。それでもなお、本発明は、体細胞ハイブリダイゼーションを用いて製造される上に開示されたような二価の二重特異性コンストラクトを提供する。当技術分野で知られているような抗体の化学的カップリングは、約40年前に初めて実施された。第一の二重特異性ポリクローナル抗体は、2つの異なるポリクローナル抗体を化学的にカップリングすることによって産生された。この化学的操作は、その内部重鎖ジスルフィド結合での2つの異なる抗体の解離、及び化学的コンジュゲーションによる2つの半分の分子の架橋を含んでいた。bsMAbを調製するために、εアミノ基又はヒンジ領域チオール基との反応性がある多数の二官能性試薬が用いられている。これらのクロスリンカーは、ホモ二官能性試薬又はヘテロ二官能性試薬という2つのカテゴリーに分類することができる。ホモ二官能性試薬は、内部重鎖ジスルフィド結合の還元によって生成される遊離チオールと反応する。55ジチオビス又はoフェニレンジマレイミドは、MAbのFab断片上のチオール基を活性化することができる。DTNBが、2つのFab間のジスルフィド結合を再生するように作用するのに対し、OPDMは、2つのFab間のチオエーテル結合を形成するように作用する。通常、OPDMのチオエーテル結合は、DTNBによって再生されるジスルフィド結合よりも安定であることができる。ヘテロ二官能性試薬は、タンパク質上に、それが第二のタンパク質と反応することを可能にする反応基を導入することができる。Nスクシニミジル3プロピオネートは、第一級アミノ基と反応させて、遊離チオール基を導入するために用いられている。SPDPは、クラス又はアイソタイプを問わず、抗体及びFab断片を含む、露出したアミノ基を有する任意の2つのタンパク質を組み合わせることができる。しかしながら、この手法は、分子のランダムな架橋を引き起こし、そのため、バッチ間のばらつき、並びに望ましくない効果、例えば、タンパク質変性、及び又は抗体活性の喪失を示す。それでもなお、本発明は、化学的カップリングを用いて製造される上に開示されたような二価の二重特異性コンストラクトを提供する。組換え技術を用いて、二重特異性抗体を作製することもできる。遺伝子改変によって得られるそのような二重特異性抗体は、化学的架橋又は2つのハイブリドーマクローンの融合によって作製される従来の二重特異性抗体に優るいくつかの利点を示し、これには、二重特異性体の大きさ及び親和性に対するより大きな制御が含まれる。可変ドメインのみを構成単位として用いることによって、組換え抗体は、抗体のFc領域を欠如し、そのため、Fc媒介性の免疫エフェクター機能を誘導しない。多種多様な異なる組換え二重特異性抗体フォーマットが過去何年にもわたって開発されている。それらのうち、タンデム単鎖Fv分子及びダイアボディ並びにそれらの様々な誘導体は、組換え二重特異性抗体の構築のための最も広く用いられているフォーマットである。1つの共通のテーマとして、これらの分子の構築は、異なる抗原を認識する2つの単鎖Fv断片から始まる。タンデムscFv分子は、2つのscFv分子を追加のペプチドリンカーと単に接続しただけの単純なフォーマットを表す。これらのタンデムscFv分子中に存在する2つのscFv断片は、別々のフォールディング実体を形成する。したがって、様々なリンカーを用いて、2つのscFv断片を接続することができ、最大63残基の長さを有するリンカーが報告されている。親scFv断片は、通常、細菌内で可溶性形態で発現させることができるが、タンデムscFv分子は細菌内で不溶性の凝集体を形成することがよく観察される。したがって、可溶性のタンデムscFv分子を産生するために、再フォールディングプロトコル又は哺乳動物発現系の使用がルーチンに適用される。このようにして、本発明は、上で詳述したような組換え技術を用いて製造される上に開示されたような二価の二重特異性コンストラクトを提供する。上に示したような好ましい製造方法では、非天然アミノ酸は、連結の前のアジド、シアノ、ニトリル酸化物、アルキン、アルケン、歪んだシクロオクチン、歪んだシクロアルケン、シクロプロペン、ノルボルネン、又はアリール、アルキル、若しくはビニルハライド、ケトン、アルデヒド、ケタール、アセタール、ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン、ボロン酸、有機スズ、有機ケイ素、βシリルアルケニルハライド、βシリルアルケニルスルホネート、ピロン、テトラジン、ピリダジン、アリールスルホネート、チオセミカルバジド、セミカルバジド、テトラゾール、αケト酸基を含む。非天然アミノ酸は、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ホモアリルグリシン、pブロモフェニルアラニン、pヨードフェニルアラニン、アジドフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン又はエチニルフェニルアラニン、transクロチルアルケンなどの内部アルケンを含むアミノ酸、セリンアリルエーテル、アリルグリシン、プロパルギルグリシン、又はビニルグリシン、ピロリジン、NσoアジドベンジルオキシカルボニルLリジン、NσプロパルギルオキシカルボニルLリジン、Nσ2アジドエトキシカルボニルLリジン、NσtertブチルオキシカルボニルLリジン、NσアリルオキシカルボニルLリジン、NσアセチルLリジン、NσベンジルオキシカルボニルLリジン、NσシクロペンチルオキシカルボニルLリジン、NσDプロリルLリジン、NσニコチノイルLリジン、NσNMeアントラニロイルLリジン、NσビオチニルLリジン、Nσ9フルオレニルメトキシカルボニルLリジン、NσメチルLリジン、NσジメチルLリジン、NσトリメチルLリジン、NσイソプロピルLリジン、NσダンシルLリジン、NσopジニトロフェニルLリジン、NσpトルエンスルホニルLリジン、NσDL2アミノ2カルボキシエチルLリジン、NσフェニルピルバミドLリジン、NσピルバミドLリジンであってもよい。例えば、上で示したような好ましい製造方法において、非天然アミノ酸は、連結の前のアジド、アルキン、アルケン、又はアリール、アルキル、又はビニルハライド、ケトン、アルデヒド、ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン、ボロン酸、有機スズ、有機ケイ素基を含む。非天然アミノ酸は、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ホモアリルグリシン、pブロモフェニルアラニン、pヨードフェニルアラニン、アジドフェニルアラニン、アセチルフェニルアラニン、又はエチニルフェニルアラニン、transクロチルアルケンなどの内部アルケンを含むアミノ酸、セリンアリルエーテル、アリルグリシン、プロパルギルグリシン、又はビニルグリシンであってもよい。上に示したような好ましい製造方法では、第一の部分を第二の部分にカップリングさせるための反応は、32双極性環状付加若しくはクリック反応、ヘック反応、薗頭反応、鈴木反応、スティルカップリング、檜山デンマーク反応、オレフィンメタセシス、ディールスアルダー反応、又はヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン、若しくはヒドロキシルアミンとのカルボニル縮合である。当技術分野で公知の組換え二重特異性抗体の短所の1つは、体内でのその短い循環時間である。ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、及びタンデムscFv分子は、50~60kDaの分子量を有しており、このため、溢出、タンパク質分解、及び腎排出によるこれらの実体の循環からの迅速なクリアランスが生じることがある。これらの実体の例示的な初期半減期は30分未満である。組換え抗体の薬物動態を改善するために、いくつかの手法が取られている。1つの手法は、これらの分子のサイズを増大させることである。100~115kDaの分子量を有する二量体単鎖ダイアボディ分子は、可変ドメインを接続するリンカーの長さを変えることによって作製することもできる。他の手法は、二重特異性体と、長い半減期を有する血清タンパク質との会合に依存している。これらには、二重特異性抗体と、ヒト血清アルブミン、HSA結合ペプチド、又は本来長い半減期を有するホルモンに由来するペプチドとの融合が含まれる。そのような方法を、本発明の二価の二重特異性コンストラクトに適用することができる。しかしながら、本発明は、ポリエチレングリコールポリマーの使用を提供するものでもあり、該使用は、本発明の二価の二重特異性コンストラクトの半減期を延長する上で特に有利であることが本明細書で初めて示されている。PEGは、最終的な二重特異性生成物において望ましく、かつscFvに固有の問題を解決するいくつかの化学的特性を有する。PEG化は、タンパク質溶解性を改善し、scFv安定性を増大させ、それにより、scFvの凝集及び沈殿を低下させるはずである。さらに、PEGなどの、長くて柔軟なリンカーは、2つの抗体断片の物理的隔離を増大させ、それらが互いに独立に再フォールディングするのを可能にする。これは、遺伝子融合によって連結された二重特異性抗原結合ドメインの再フォールディングでよく起こる問題の1つ、を解決する。PEGポリマーは、従来、リジン、システイン、及びヒスチジン残基などの反応性部位を介して生体分子に共有結合される。しかしながら、最適な安定性を達成するために、標的分子に付着させるポリマーの量は、厳しく制御される必要がある。PEGポリマーとタンパク質中の反応性部位とのコンジュゲーションは、PEG修飾タンパク質の不均一な混合物を生じさせることが多く、これにより、最適でない安定化及び半減期増大、並びにPEG反応性部位がタンパク質活性にとって重要である場合、ポリマー修飾タンパク質の生体活性の潜在的な損失がもたらされることがある。本発明は、特定の場所に非天然アミノ酸を含むように二価の二重特異性コンストラクトの成分抗体を改変し、PEGをこれらの非天然アミノ酸と反応させることによって、この問題に対する解決を提供する。PEGリンカーの使用は、使用し得る化学合成の多用途性のために、上で詳述されたものに対してさらにより多くの利点を提供する。PEGは、scFvタンパク質に組み込まれる任意の非天然アミノ酸との相補的反応パートナーとなるように容易に官能化することができる。PEGは、多価タンパク質ハイブリッドの構築を可能にする複数のコンジュゲーション部位を有するように官能化することもできる。PEG官能化は、所望のコンジュゲーション化学反応に応じてホモ二官能性又はヘテロ二官能性PEGを用いて行なうことができる。さらに、PEGの構造は、薬物動態及び生体活性に影響を及ぼし得る線状又は分岐状のバリエーションに合わせることができる。これらのPEG化二価の二重特異性コンストラクトの調製を以下でさらに論じる。二重特異性scFvは、2つの異なるscFv抗原結合ドメインをリンカーによって互いにコンジュゲートさせることによって構築することができる。この戦略は、各scFvが二官能性リンカーにコンジュゲートされる2工程プロセスで実現される。二重特異性コンジュゲートを含む2つのscFvは、各々、特異的なコンジュゲーション部位の役割を果たす位置で少なくとも1つの非天然アミノ酸を含む。リンカーは、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性であることができ、かつscFvに含まれる非天然アミノ酸と反応性がある相補的官能基を含むことができる。その後、以下の反応スキームを適用して、二重特異性scFvを作製することができる。scFvをリンカーにコンジュゲートさせるために用いられる化学反応は、20種の天然アミノ酸に対して直交性である。scFvPEGコンジュゲート及び二重特異性体の調製において、ここでは、アジドアルキン銅媒介性の環状付加を用いる。典型的なシークエンスにおいて、アジドホモアラニンを含むscFvを、アルキンで官能化された過剰量のホモ二官能性PEGリンカーと反応させる。限界過剰のPEGでの主要生成物は一価のPEG化scFvであり、その後、これを精製する。PEGリンカーの遊離のペンダントアルキンは、Ahaを含む第二のscFとの第二の銅媒介性アジドアルキン環状付加を経て、二重特異性体を生じさせる。アジドアルキン銅媒介性の環状付加、Kolbらの文献、並びにアルケンアリールハライドパラジウム媒介性のヘック反応は、標的タンパク質へのポリマー、毒素、又はペプチドの部位特異的コンジュゲーションに広く適用されている。銅媒介性の環状付加反応は、全ての天然アミノ酸と完全に直交性であり、そのため、非天然アジド又はアルキン含有部分を導入することができない限り、この化学反応を用いて、生物学的分子を修飾することができない。これが行なわれるとき、該化学反応は、そのアジド又はアルキンの位置でしか起こらない。アジド及びアルキンは、天然アミノ酸の類似体としてタンパク質中に導入され、バイオコンジュゲーションのための特異的な位置を提供することができる。別所に注記したように、抗IL6及び抗IL23又はそれらの誘導体をPEG化を介して任意に修飾し、半減期を増大させることができる。抗IL6及び抗IL23又はそれらの誘導体のPEG化は、同様の方法によって達成することができる。好適には、本発明の二重特異性コンストラクト及び抗体において有用なPEG基及びPEGリンカーは、2~100kDa、例えば、5~60kDa、例えば、10~40kDa、例えば、約20kDa又は約40kDaの重量を有する。PEG基及びリンカーは、直鎖であっても分岐状であってもよい。別の態様に従って、本発明は、本発明の二価の二重特異性コンストラクト及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物及びキットを提供する。いくつかの実施態様では、該医薬組成物又はキットはさらに、別の成分、例えば、イメージング試薬又は治療剤を含む。好ましい実施態様では、該医薬組成物又はキットは、診断法又は治療法で用いられる。医薬組成物は、例えば、水性製剤、例えば、従来の賦形剤、例えば、塩化ナトリウム、糖、アミノ酸、界面活性剤などを含む水溶液であってもよい。医薬組成物はまた、水又は食塩水の添加による再構成に好適な凍結乾燥製品であってもよい。別の態様に従って、本発明は、治療における本発明の二価の二重特異性コンストラクトの使用を提供する。特に、本発明は、TH17、TH22、及びTH1媒介性疾患、並びにこれらのTH細胞の組合せによって媒介される疾患の治療を提供する。本発明の二価の二重特異性コンストラクトを用いて治療し得るそのような疾患の例としては、炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、尋常性天疱瘡、臓器移植拒絶反応、クローン病、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、及び糖尿病が挙げられる。TH17媒介性疾患のさらなる例としては、筋萎縮性側索硬化症又はALS、強直性脊椎炎、アスペルガー障害、背部痛、バレット食道、双極性障害、心不整脈、セリアック病、慢性疲労症候群、慢性ライム病、クローン病、尿崩症、I型糖尿病、II型糖尿病、認知症、鬱病、てんかん、線維筋痛、胃食道逆流性疾患、橋本甲状腺炎、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、腎臓結石、レフグレン症候群、エリテマトーデス、躁病、多種化学物質過敏症、片頭痛、モルジェロンズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、ニューロパシー、強迫神経症、変形性関節炎、パニック発作、パーキンソン病、リウマチ性多発筋痛、体位性起立性頻脈症候群、前立腺炎、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群レイノー現象、反応性関節炎、レストレスレッグ症候群、反射性交感神経性ジストロフィー、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、副鼻腔炎、季節性情動障害、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、及びめまいが挙げられる。さらなる疾患としては、敗血症又は出血熱によるサイトカインストーム、胆汁性肝硬変、スティル病、COPD、グレーブス眼症、腹膜炎、ベーチェット病、喘息、アトピー性皮膚炎、汗腺膿瘍、巨細胞性動脈炎、及び心臓線維症が挙げられる。TH22媒介性疾患のさらなる例としては、慢性炎症性疾患、例えば、湿疹、強皮症、喘息、及びCOPDが挙げられる。したがって、ある実施態様では、本発明は、本発明の二価の二重特異性コンストラクトの治療有効量を患者に投与することを含む、TH17媒介性疾患の治療方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、TH17によって媒介される疾患の治療用の本発明の二価の二重特異性コンストラクトを提供する。別の実施態様では、本発明は、TH17によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための本発明の二価の二重特異性コンストラクトの使用を提供する。別の実施態様では、本発明は、本発明の二価の二重特異性コンストラクトの治療有効量を患者に投与することを含む、TH22細胞によって媒介される疾患の治療方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、TH22細胞によって媒介される疾患の治療用の本発明の二価の二重特異性コンストラクトを提供する。別の実施態様では、本発明は、両方のTH22細胞によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための本発明の二価の二重特異性コンストラクトの使用を提供する。別の実施態様では、本発明は、本発明の二価の二重特異性コンストラクトの治療有効量を患者に投与することを含む、TH17細胞とTH1細胞の両方によって媒介される疾患の治療方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、TH17とTH1の両方によって媒介される疾患の治療用の本発明の二価の二重特異性コンストラクトを提供する。別の実施態様では、本発明は、TH17とTH1の両方によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための本発明の二価の二重特異性コンストラクトの使用を提供する。別の実施態様では、本発明は、本発明による抗IL6及び抗IL23抗体又はそれらの誘導体の組合せの治療有効量を患者に投与することを含む、TH17媒介性疾患の治療方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、TH17媒介性疾患の治療用の本発明による抗IL6及び抗IL23抗体又はそれらの誘導体の組合せを提供する。別の実施態様では、本発明は、TH17媒介性疾患の治療用の薬剤の製造のための本発明による抗IL6及び抗IL23抗体又はそれらの誘導体の組合せの使用を提供する。したがって、ある実施態様では、本発明は、本発明による抗IL6及び抗IL23抗体又はそれらの誘導体の組合せの治療有効量を患者に投与することを含む、TH22細胞によって媒介される疾患の治療方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、TH22細胞によって媒介される疾患の治療用の本発明による抗IL6及び抗IL23抗体又はそれらの誘導体の組合せを提供する。別の実施態様では、本発明は、TH22細胞によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための本発明による抗IL6及び抗IL23抗体又はそれらの誘導体の組合せの使用を提供する。したがって、ある実施態様では、本発明は、本発明による抗IL6及び抗IL23抗体又はそれらの誘導体の組合せの治療有効量を患者に投与することを含む、TH17とTH1の両方によって媒介される疾患の治療方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、TH17とTH1の両方によって媒介される疾患の治療用の本発明による抗IL6及び抗IL23抗体又はそれらの誘導体の組合せを提供する。別の実施態様では、本発明は、TH17とTH1の両方によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造のための本発明による抗IL6及び抗IL23抗体又はそれらの誘導体の組合せの使用を提供する。本発明はまた、その原因に対してTH17成分とTH22成分の両方を有する疾患の治療方法を提供する。さらに、本発明によって治療されるべき疾患の原因は、TH17細胞、TH22細胞、及びTH1細胞の3つ全てが関係し得る。上記の実施態様の各々において、抗IL23抗体又はその誘導体は、抗Il23IL12抗体であってもよい。本発明の別の態様では、本発明による治療で使用するための二価の二重特異性コンストラクト、抗体、及び抗体組合せは、当技術分野で現在利用可能な治療と比べて同じ治療効果を達成しながらも、有利に低い用量で患者に投与することができる。この低用量は、本明細書に開示される抗体のより高い活性によって促進されることができ、かつ副作用の発生を低下させる可能性がある。或いは、より大きい活性が望ましい場合、本発明による治療で使用するための二価の二重特異性コンストラクト、抗体、及び抗体組合せは、当技術分野で現在利用可能な治療と比べて等しいか又はそれより高い用量で患者に投与することができる。そのようなより高い投薬量は、患者への二価の二重特異性コンストラクト、抗体、及び抗体組合せの投与の頻度の低下を促進することができる。ある実施態様では、本発明の二価の二重特異性コンストラクト、抗体、及び抗体組合せは、月1回、月2回、週1回、週2回、1日1回、1日2回投与することができる。抗体親和性は、当業者に周知の方法を用いて決定することができる。抗体が、それらを、本発明の二価の二重特異性抗体に含めるのに潜在的に適したものにする所望の親和性を有するかどうかを決定する目的のために、以下の詳細なアッセイ手順を提供するが、方法論を少し変更しても、同じ決定がなされることが可能になることが理解されるであろう。平衡解離定数は、SensiQPioneer、及びアミンカップリングに適したカルボキシル化COOH1センサーを用いて、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。プロテインGは、アミンカップリング試薬、NBエチルカルボジイミド塩酸塩、エタノールアミンStLouisMOを用いるか、又はBiacoreアミンカップリングキットを用いて、COOH1センサーにカップリングされる。簡潔に述べると、カルボキシル化された表面を、2~10分の範囲の接触時間の間、2mMEDC及び5mMNHSで活性化する。20~400ugmLの範囲の可変濃度のプロテインGを、10mM酢酸バッファー、pH43中に希釈し、5~10分の範囲の可変接触時間の間、5~10μL分の範囲の速度で、活性化されたセンサーの上に注入する。COOH1センサーチップに固定化されるプロテインGの量は、400~2000応答単位の範囲である。残りの活性化された部位は、25μL分の流速で100μLのエタノールアミンでキャッピングするべきである。ウサギヒトキメラmAbの平衡定数は、タンパク質GがコーティングされたチップへのmAbの結合と、その後の各分析物のそのそれぞれのmAbへの結合によって決定することができる。物質移動効果を最小限に抑えるために、分析物の結合が飽和に達したときに、その対応するRUが200~300低下するように、各分析物に対するmAbの表面密度を調整するべきである。1~100nMの範囲の3xFLAGIL6、IL6、又はヒト二量体IL23の希釈物をチップ表面の上に注入し、会合速度定数及び解離速度定数を測定する。各々の結合及び解離サイクルのために、チップ表面を15uLの20mMNaOHで再生するべきである。アッセイ温度を25°Cで維持し、分析物の流速を50μL分とし、2分の会合段階及び10~30分の解離段階を含めるべきである。結合解離速度及び解離定数は、上記のフォーマットを擬一次11相互作用モデルソフトウェアとともに用いて決定することができる。scFvの平衡定数は先に記載した通りに決定することができる但し、エピトープタグ化IL6がチップ表面に捕捉され、IL6からの抗IL6scFvの解離がモニタリングされるように、プロトコルを修正するべきである。簡潔に述べると、抗FLAGM2抗体をプロテインGに結合させ、その後、3xFLAGIL6を抗FLAG抗体によって捕捉する。抗IL6scFvは、1~100nMの濃度範囲にわたってアッセイするべきである。二重特異性scFvのSPRを、抗IL6部分の測定について先に記載した通りに実施する但し、二重特異性体の他方の末端での、付着した抗IL23scFv、31A12の結合反応速度も決定するために、プロトコルを修正する。簡潔に述べると、二重特異性体によるIL23結合を、記載したようなIL6を用いて、該二重特異性体を一定密度で固定化することによって実施した。組換えヒト二量体IL23の結合及び解離は、上で詳述したのと同じパラメータを用いて、3~25nMの範囲の濃度でアッセイすることができる。IL6活性を調節する抗体及びその誘導体の能力は、当業者に周知の方法を用いてアッセイすることができる。抗体が、それらを、本発明の二価の二重特異性抗体に含めるのに潜在的に適したものにする所望のIL6活性調節能力を有するかどうかを決定する目的のために、以下の詳細なアッセイ手順を提供するが、方法論を少し変更しても、同じ決定がなされることが可能になることが理解されるであろう。ELISAを用いて、IL6結合を評価することができる。組換えIL6を、100μlのPBS中、025μgmlでELISAプレートに添加する。プレートは、37°Cで1時間、又は4°Cで一晩インキュベートするべきである。ブロッキングするために、10ヤギ血清を含む100μlウェルのPBSを各ウェルに添加するべきである。その後、プレートを室温で1時間インキュベートするべきである。その後、プレートを脱イオン水で5回すすぐべきである。各ウェルに、50μlのPBS10ヤギ血清を添加する。その後、試験試料を50μlウェルで添加する。その後、プレートを室温で1時間インキュベートするべきである。その後、プレートを脱イオン水で5回すすぐべきである。各ウェルに、PBS10ヤギ血清中で15000希釈した100μlのペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギIgGを添加する。その後、プレートを室温で1時間インキュベートし、その後、プレートを脱イオン水で5回洗浄するべきである。TMB基質を100μlウェルで添加する。その後、反応を100μlの1NH2SO4で停止させるべきである。その後、MolecularDevices製のM2プレートリーダーを用いて、吸光度を450nmで測定することができる。IL6依存的マウスB細胞ハイブリドーマ細胞株を用いるバイオアッセイを用いて、IL6阻害を評価することができる。中和活性について試験するべき試料を、96ウェル組織培養プレート中で、100μlのアッセイ培地に希釈するべきである。これに続いて、50μlのIL6含有アッセイ培地を添加し、室温で30分間インキュベートする。その後、B9細胞をフラスコから回収し、180×gで7分間遠心分離し、ペレットをIL6不含培養培地に再懸濁する。細胞を3回遠心分離及び再懸濁して、IL6を除去するべきである。トリパンブルー排除によって生存率を決定した後、細胞を1×105細胞mlに調整するべきである。5×103細胞に相当する、50μlの容量のB9細胞を、IL6不含培地を含む適切な対照ウェルとともに、各ウェルに添加するべきである。その後、プレートを、37°C、5CO2で、48時間インキュベートするべきである。その後、20μlのAlamarBlueを各ウェルに添加し、プレートをさらに18時間インキュベートするべきである。その後、プレートを、570nm及び600nmで、MolecularDevices製のM2プレートリーダー上で読み取ることができる。ELISAアッセイを用いて、IL23結合を評価することができる。ELISAプレートは、IL23直接結合法又はIL23間接結合法のどちらかを用いて、コーティングすることができる。間接結合法のために、抗His抗体を、100mlウェルのPBS中、001~002ugmlでプレートに添加するべきである。その後、プレートを37°Cで1時間又は4°Cで一晩インキュベートするべきである。非特異的結合をブロッキングするために、10ヤギ血清を含む100mlウェルのPBSを各ウェルに添加するべきであり、その後、プレートを脱イオン水で5回すすぐべきである。100mlウェルのPBS10ヤギ血清中の05mgmlのIL23p40p19Hisを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートするべきである。直接結合法のために、IL23p40p19Hisを、100mlのPBS中、05mgmlでELISAプレートに添加するべきである。その後、プレートを37°Cで1時間又は4°Cで一晩インキュベートするべきである。非特異的結合をブロッキングするために、10ヤギ血清を含む100mlウェルのPBSを各ウェルに添加するべきである。その後、プレートを室温で1時間インキュベートするべきである。IL23結合後、プレートを脱イオン水で5回すすぐべきである。各ウェルに、50mlのPBS10ヤギ血清を添加するべきである。その後、試験試料を50mlウェルで添加するべきである。その後、プレートを室温で1時間インキュベートし、脱イオン水で5回すすぐべきである。その後、各ウェルに、PBS10ヤギ血清中で15000に希釈した100mlのペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギIgGを添加するべきである。その後、プレートを室温で1時間インキュベートし、その後、プレートを脱イオン水で5回洗浄するべきである。TMB基質を100mlウェルで添加するべきである。その後、反応を100mlの1NH2SO4で停止させるべきである。その後、MolecularDevices製のM2プレートリーダーを用いて、吸光度を450nmで測定することができる。マウス脾臓細胞によるIL23誘導性IL17発現の検出に基づくバイオアッセイを用いて、IL23受容体に対するIL23結合の抗体媒介性阻害、及び結果として生じる生体活性を検出することができる。5×105個のC57Bl6脾臓細胞を、ヘテロ二量体IL23の希釈物を含む200ml中で、96ウェルプレートのウェル中で培養し、プレートを37°Cで2~3日間インキュベートするべきである。使用される培養培地は、RPMI1640、10FBS、50uM2メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、ピルピン酸塩、ゲンタマイシン、及び10ngmlヒトIL2であるべきである。3日後、培養上清を、下記のように、IL17AについてELISAでアッセイするべきである。ELISAアッセイを用いて、マウスIL17を検出することができる。プレートを、100mlのPBS中1mgmlの抗mIL17Aでコーティングし、4°Cで一晩又は37°Cで1時間インキュベートする。プレートを脱イオン水中で洗浄し、100mlのPBS、10ヤギ血清で1時間ブロッキングするべきである。プレートを洗浄した後、50mlのPBS10ヤギ血清及び50mlの培養上清をプレートに添加し、1時間インキュベートするべきである。その後、プレートを洗浄し、PBS10ヤギ血清中05mgmlで100mlウェルの抗mIL17Aビオチンを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートするべきである。その後、プレートを洗浄し、PBS10ヤギ血清中11000で100mlウェルのストレプトアビジンHRPと反応させるべきである。プレートを再洗浄し、100mlウェルのTMB基質を添加することによって、シグナルを検出するべきである。100mlウェルの1NH2SO4で反応を停止させた後、光学密度を450nMで読み取ることができる。活性の決定さらに、IL23のp40サブユニットも、TH1シグナル伝達経路に関与するIL12の一部を形成することを考慮して、IL12に対するその中和能力を測定するアッセイが、IFNγのレベルを調節するその能力を利用することが本明細書に開示されている。当業者であれば、抗体の中和効果、及びIFNγ産生に対するその効果を決定するための好適なアッセイ法を認識しているであろうが、以下のアッセイを好適なアッセイの一例として提供する。抗体は、IL12応答性細胞株NK92を用いて、p40中和能力についてアッセイすることができる。B細胞クローニングプレートからの50mlの培養上清、又は抗体トランスフェクションからの50mlの上清を96ウェル組織培養プレートに移すべきである。50mlのヒトIL12を各ウェルに4ngmlで添加するべきである。その後、プレートを室温で30~60分間インキュベートするべきであり、その後、5×104個のNK92細胞を100ml中で各ウェルに添加するべきである。その後、培養物を37°Cで3日間インキュベートし、その上清をヒトインターフェロンγ産生についてアッセイするべきである。アッセイ培地は、RPMI1640、10FBS、NEAA、ピルピン酸塩、50mM2メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及び10ngmlヒトIL2であるべきである。ELISAアッセイを用いて、ヒトインターフェロンγを検出することができる。プレートを、100mlのPBS中1mgmlの抗ヒトインターフェロンgで、4°Cで一晩又は37°Cで1時間コーティングする。その後、プレートを脱イオン水中で洗浄し、100μlのPBS、10ヤギ血清で1時間ブロッキングするべきである。プレートを洗浄した後、50mlのPBS10ヤギ血清及び50mlの培養上清をプレートに添加し、1時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、PBS10ヤギ血清中05mgmlで100mlウェルの抗ヒトインターフェロンγビオチンを添加し、その後、プレートを室温で1時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、PBS10ヤギ血清中11000で100mlウェルのストレプトアビジンHRPと反応させるべきである。その後、プレートを再洗浄し、100mlウェルのTMB基質を添加することによって、シグナルを検出するべきである。100mlウェルの1NH2SO4で反応を停止させた後、光学密度を450nMで読み取ることができる。に対する反応性霊長類インターロイキンに対するアッセイは、霊長類バージョンのサイトカインの使用がアッセイされることを除いて、ヒトアッセイに対する活性の測定用のものと同一である。ヒト治療用の任意のサイトカインアンタゴニストの開発の成功は、初期の毒性試験を必要とする。毒性は、非ヒト種において最も効率的に証明される。初期の毒性研究を容易にするために、本発明の抗体を、研究が検討されている種に由来するIL6を中和するその能力についてスクリーニングすることができる。以下の用語は、特に示さない限り、以下の意味を有することが理解されるものとする免疫グロブリンは四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、各四量体は、2つの同一のポリペプチド鎖対から構成されており、各々の対は、1つの軽鎖及び1つの重鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約100~110個又はそれより多くのアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、K軽鎖及びX軽鎖と分類される。重鎖は、又はEと分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれ、IgM、IgD、IgG、IgA、及びIgEと規定する。軽鎖及び重鎖内で、可変領域及び定常領域は、約12個又はそれより多くのアミノ酸のJ領域によって接続され、重鎖は、約10個又はそれより多くのアミノ酸のD領域も含む。一般には、基礎免疫学第7章を参照されたい。各軽鎖重鎖対の可変領域は、無傷の免疫グロブリンが2つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。免疫グロブリン鎖は、比較的保存されたフレームワーク領域が、相補性決定領域又はCDRとも呼ばれる3つの超可変領域によって接続されているという同じ一般構造を示す。各々の対の2つの鎖に由来するCDRは、フレームワーク領域に並置されており、特異的エピトープへの結合を可能にしている。N末端からC末端に向かって、軽鎖と重鎖は両方とも、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割当ては、Kabatの文献、又はChothia及びLeskの文献Chothiaらの文献の定義に従う。抗体は、無傷の免疫グロブリン、又は特異的結合を無傷の抗体と競合するその抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えDNA技術によるか、又は無傷の抗体の酵素的若しくは化学的切断によって生成させることができる。抗原結合部分としては、特に、Fab、Fab、F2、Fv、dAb、及び相補性決定領域断片、単鎖抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、並びにポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。Fab断片は、VL、VH、CL、及びCHIドメインからなる一価断片でありF2断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された2つのFab断片を含む二価断片でありFd断片は、VHドメイン及びCH1ドメインからなりFv断片は、抗体の単一のアームのVLドメイン及びVHドメインからなりかつdAb断片は、VHドメインからなる。単鎖抗体は、VL領域及びVH領域が対合し、それらを単一のタンパク質鎖として生成させることを可能にする合成リンカーを介して一価分子を形成する抗体である、及びHustonらの文献。抗体は、1以上の結合部位を有することができる。2以上の結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、2つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体又はFab断片は、1つの結合部位を有し、一方、二重特異性抗体は、2つの異なる結合部位を有する。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はFab断片の連結を含む、種々の方法によって産生することができる。例えば、Songsivilai及びLachmannの文献、Kostelnyらの文献を参照されたい。単離された抗体は、その天然状態でそれに付随する、他の天然に関連する抗体を含む、天然に関連する成分と関連していないか、同じ種由来の他のタンパク質を含まないか、異なる種由来の細胞によって発現されるか、又は天然では生じない、抗体である。単離された抗体の例としては、IL6を用いて親和性精製された抗IL6抗体、ハイブリドーマ又は他の細胞株によってインビトロで合成された抗IL6抗体、及びトランスジェニックマウスに由来するヒト抗IL6抗体が挙げられる。ヒト抗体という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する1以上の可変領域及び又は定常領域を有する全ての抗体を含む。これらの抗体は、種々の方法で調製することができ、一例として、2つが以下に記載されている。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する抗体であり、該抗体では、重鎖及び軽鎖のフレームワーク及び定常ドメイン中の特定のアミノ酸は、ヒトでの免疫応答を回避又は無効にするように突然変異させられている。或いは、ヒト化抗体は、ヒト抗体由来の定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインと融合することによって産生することができる。ヒト化抗体の作製方法の例は、米国特許第6054297号、第5886152号、及び第5877293号に見出すことができる。キメラ抗体という用語は、1つの抗体由来の1以上の領域、及び1以上の他の抗体由来の1以上の領域を含む抗体を指す。Koffという用語は、抗体抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数を指す。Kdという用語は、特定の抗体抗原相互作用の解離定数を指す。エピトープという用語は、免疫グロブリン又はT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性のある表面分子集団からなり、通常、特定の3次元構造特性、及び特定の電荷特性を有する。解離定数が、好ましくは10nM未満、最も好ましくは0nMであるとき、抗体は、抗原に特異的に結合すると言われる。抗体又は免疫グロブリン分子の断片又は類似体は、本明細書の教示に従って、当業者によって容易に調製され得る。断片又は類似体の好ましいアミノ末端及びカルボキシ末端は、機能ドメインの境界付近で生じる。構造ドメイン及び機能ドメインは、ヌクレオチド及び又はアミノ酸配列データと公的な又は専用の配列データベースとの比較によって同定することができる。IL12は、ジスルフィド結合で連結された、2つのサブユニットp35及びp40からなるヘテロ二量体である。主にミエロイド系統の抗原提示細胞はIL12を発現し、IL12は、T細胞又はナチュラルキラー細胞の表面に発現される受容体複合体との結合によって細胞性免疫に関与する。IL12のp40サブユニットがIL12受容体ベータ1受容体に結合し、p35サブユニットが第二の受容体鎖に結合して、細胞内シグナル伝達を生じさせると考えられている。IL23は、p19タンパク質と共有結合した、IL12の同じp40タンパク質サブユニットからなるヘテロ二量体である。IL23は、IL12Rと関連する受容体に結合し、IL12Rは、IL12Rβ1鎖を共有し、かつ固有のIL23R鎖も有する。IL6は、造血、炎症、及び腫瘍形成を含む、免疫調節における様々な生物学的活性を有する多面的サイトカインである。IL6は、IL6受容体及びシグナル伝達受容体サブユニットgp130からなる受容体複合体を活性化する。IL6Rは、膜貫通形態と可溶性形態の両方で存在する。IL6は、これらの形態の両方に結合し、これはその後、gp130と相互作用して、下流のシグナル伝達及び遺伝子発現を誘発することができる。TH1細胞は、哺乳動物免疫応答に関与するT調節性細胞である。それらは、IFNγの産生を特徴とする。TH17細胞は、哺乳動物免疫応答に関与するT調節性細胞である。それらは、IL17の産生を特徴とする。TH17媒介性疾患は、TH17細胞が、該疾患の病因において役割を果たす疾患である。TH22細胞は、哺乳動物免疫応答に関与するT調節性細胞である。それらは、IL22の産生を特徴とする。TH22媒介性疾患は、TH22細胞が、該疾患の病因において役割を果たす疾患である。好ましくは、コンピュータによる比較方法を用いて、既知の構造及び又は機能の他のタンパク質に生じる配列モチーフ又は予測されるタンパク質立体構造ドメインを同定する。既知の3次元構造にフォールディングされるタンパク質配列を同定するための方法が公知である。Bowieらの文献を参照されたい。好ましいアミノ酸置換はタンパク質分解に対する感受性を低下させ、酸化に対する感受性を低下させ、タンパク質複合体を形成する結合親和性を変化させ、結合親和性を変化させ、かつそのような類似体の他の物理化学的又は機能的特性を付与又は修飾する置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々なムテインを含むことができる。例えば、単一又は多重アミノ酸置換は、天然に存在する配列中の外側のポリペプチドの部分で行なうことができる。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変化させるべきではない。当技術分野で認識されているポリペプチド二次構造及び三次構造の例は、タンパク質、構造、及び分子原理タンパク質構造入門並びにThorntonらの文献に記載されており、これらの文献は各々、引用により本明細書中に組み込まれる。本明細書で使用されるように、20種の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の用法に従う。引用により本明細書中に組み込まれる、免疫学合成を参照されたい。20種の従来のアミノ酸の位置異性体、非天然アミノ酸、例えば、aaジ置換アミノ酸、Nアルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来的なアミノ酸も、本発明のポリペプチドの好適な構成要素であることができる。非従来的なアミノ酸の例としては4ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタメート、sN、N、Nトリメチルリジン、sNアセチルリジン、Oホスホセリン、Nアセチルセリン、Nホルミルメチオニン、3メチルヒスチジン、5ヒドロキシリジン、sNメチルアルギニン、及び他の同様のアミノ酸及びイミノ酸が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記法では、標準的な用法及び慣習に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。本明細書で言及されるポリヌクレオチドという用語は、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのどちらかの、長さが少なくとも10塩基のヌクレオチドのポリマー形態、又はどちらかのタイプのヌクレオチドの修飾形態を意味する。本用語は、DNAの一本鎖形態及び二本鎖形態を含む。本明細書で使用される単離されたポリヌクレオチドという用語は、ゲノム起源、cDNA起源、若しくは合成起源、又はそれらのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源によって、単離されたポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドが天然において見出されるポリヌクレオチドの全て若しくは一部と関連していないか、天然において連結されていないポリヌクレオチドと機能的に連結されているか、又はより大きな配列の一部として天然に存在していない。本明細書で言及されるオリゴヌクレオチドという用語は、天然に存在するオリゴヌクレオチド連結、及び天然に存在しないオリゴヌクレオチド連結によって一緒に連結された、天然に存在するヌクレオチド、及び修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、通常、200塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが10~60塩基であり、最も好ましくは、長さが12、13、14、15、16、17、18、19、又は20~40塩基である。オリゴヌクレオチドは、通常、例えば、プローブの場合、一本鎖であるがオリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子突然変異体の構築に使用する場合、二本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのどちらかであることができる。本明細書で言及される天然に存在するヌクレオチドという用語は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。本明細書で言及される修飾ヌクレオチドという用語は、修飾又は置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書で言及されるオリゴヌクレオチド連結という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド連結を含む。例えば、LaPlancheらの文献Stecらの文献Steinらの文献Zonらの文献Zonらの文献pp87108Stecらの文献Uhlmann及びPeymanの文献を参照されたく、これらの開示は、引用により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドは、所望の場合には、検出用の標識を含むことができる。特に明示しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は5末端であり二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は5方向と呼ばれる。新生RNA転写物の5から3への付加の方向は転写方向と呼ばれRNAと同じ配列を有し、かつRNA転写物の5末端に対して5側であるDNA鎖上の配列領域は、上流配列と呼ばれRNAと同じ配列を有し、かつRNA転写物の3末端に対して3側であるDNA鎖上の配列領域は、下流配列と呼ばれる。機能的に連結された配列には、関心対象の遺伝子に隣接している発現制御配列と、トランス位置又は少し離れたところで作用して関心対象の遺伝子を制御する発現制御配列の両方が含まれる。本明細書で使用される発現制御配列という用語は、それらが連結されているコード配列の発現及びプロセッシングをもたらすのに必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、及びエンハンサー配列効率的なRNAプロセッシングシグナル、例えば、スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナル細胞質内mRNAを安定化する配列翻訳効率を高める配列タンパク質の安定性を高める配列並びに所望の場合には、タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。そのような制御配列の性質は、宿主生物によって異なり原核生物では、そのような制御配列は、通常、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み真核生物では、通常、そのような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。制御配列という用語は、最低でも、その存在が発現及びプロセッシングに不可欠である全ての構成要素を含むことが意図され、かつその存在が有利である追加の構成要素、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を含むこともできる。本明細書で使用されるベクターという用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。1つのタイプのベクターは、プラスミドであり、これは、その中に追加のDNAセグメントを連結することができる、環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターは、追加のDNAセグメントをウイルスゲノム中に連結することができるウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる。他のベクターは、宿主細胞中に導入されたときに宿主細胞のゲノム中に組み込まれることができ、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において、組換え発現ベクターと呼ばれる。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。プラスミドは、ベクターの形態で最もよく使用されるので、本明細書において、プラスミド及びベクターは、互換的に使用されることができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすような他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクターを含むことが意図される。本明細書で使用される組換え宿主細胞という用語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指すことが意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されることを理解するべきである。突然変異又は環境の影響のどちらかが原因で、後続の世代においてある種の修飾が生じる場合があるので、そのような子孫は、実際は、親細胞と同一でない場合があるが、それでもなお、本明細書で使用される宿主細胞という用語の範囲内に含まれる。本明細書で言及される選択的にハイブリダイズするという用語は、検出可能にかつ特異的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及びそれらの断片は、非特異的な核酸への検出可能な結合の感知可能な量を最小化するハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー又は高度にストリンジェントな条件を用いて、当技術分野で公知であり、かつ本明細書で考察されている、選択的ハイブリダイゼーション条件を達成することができる。高ストリンジェンシー又は高度にストリンジェントな条件の一例は、あるポリヌクレオチドを別のポリヌクレオチドとともに、6×SSPE又はSSC、50ホルムアミド、5×デンハルト試薬、05SDS、100pgmlの変性させ、断片化したサケ精子DNAのハイブリダイゼーションバッファー中、42°Cのハイブリダイゼーション温度で12~16時間、インキュベートし、次いで、1×SSC、05SDSの洗浄バッファーを用いて、55°Cで2回洗浄する方法である。Sambrookらの文献も参照されたい。2つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的な又は完全な同一性がある場合、相同である。例えば、85相同性は、2つの配列を最大限一致するように整列させたときに、アミノ酸の85が同一であることを意味する。ギャップは、一致を最大化する際に容認され5以下のギャップ長が好ましく、2以下がより好ましい。或いは、及び好ましくは、2つのタンパク質配列は、それらが、突然変異データマトリクス及び6以上のギャップペナルティを用いるプログラムALIGNを用いて、5を上回るアラインメントスコアを有する場合、この用語が本明細書で使用されるように、相同である。DayhoffMOの文献、タンパク質配列及び構造のアトラスpp101110、及びこの巻の補遺2pp110を参照されたい。2つの配列又はそれらの部分は、より好ましくは、それらのアミノ酸が、ALIGNプログラムを用いて最適に整列されたときに、50以上同一である場合、相同である。に対応するという用語は、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全て若しくは一部と同一であること、又はポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために本明細書で使用される。対照的に、に相補的なという用語は、相補的配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全て又は一部と同一であることを意味するために本明細書で使用される。説明のために、ヌクレオチド配列TATACは、参照配列TATACに対応するものであり、かつ参照配列GTATAに相補的なものである。以下の用語は、2以上のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列間の配列関係性を説明するために使用される参照配列、比較ウィンドウ、配列同一性、配列同一性のパーセンテージ、及び実質的な同一性。参照配列は、配列比較のための基準として用いられる規定の配列であり参照配列は、例えば、配列表に示された全長cDNA若しくは遺伝子配列のセグメントとしての、より大きい配列のサブセットであってもよく、又は完全なcDNA若しくは遺伝子配列を含んでいてもよい。通常、参照配列は、長さが少なくとも18ヌクレオチド又は6アミノ酸であり、長さが少なくとも24ヌクレオチド又は8アミノ酸であることが多く、また、長さが少なくとも48ヌクレオチド又は16アミノ酸であることが多い。2つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列は、各々、2つの分子間で類似している配列を含むことができ、かつ2つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列間で相違する配列をさらに含むことができるので、2つの分子間の配列比較は、通常、2つの分子の配列を比較ウィンドウ上で比較し、配列が類似する局所領域を同定し、かつそれらを比較することによって行なわれる。本明細書で使用される比較ウィンドウは、少なくとも18個の連続するヌクレオチドの位置又は6アミノ酸の概念的セグメントを指し、ここで、ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、少なくとも18個の連続するヌクレオチド又は6アミノ酸配列の参照配列と比較することができ、また、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列と比較して20以下の付加、欠失、置換、及び同様のものを含むことができる。比較ウィンドウを整列させるための最適な配列アラインメントは、Smith及びWatermanの文献の局所相同性アルゴリズムによるか、Needleman及びWunschの文献の相同性アラインメントアルゴリズムによるか、Pearson及びLipmanの文献852444の類似性検索方法によるか、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行、Geneworks、若しくはMacVectorソフトウェアパッケージによるか、又は検査によって行なうことができ、様々な方法によって生成される最良のアラインメントが選択される。配列同一性という用語は、比較ウィンドウ上で2つのポリヌクレオチド又はアミノ酸の配列が同一であることを意味する。配列同一性のパーセンテージという用語は、比較ウィンドウ上で2つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基又は残基が両方の配列中で生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得、この一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に100を乗じることによって、配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。本明細書で使用される実質的な同一性という用語は、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の特徴を示し、ここで、該ポリヌクレオチド又はアミノ酸は、少なくとも18ヌクレオチドの位置の比較ウィンドウ上で、多くの場合、少なくとも24~48ヌクレオチドの位置の比較ウィンドウ上で参照配列と比較したときに、少なくとも90~95の配列同一性、より好ましくな少なくとも98の配列同一性、より一般的には少なくとも99の配列同一性を有する配列を含み、ここで、この配列同一性のパーセンテージは、参照配列と、比較ウィンドウ上で参照配列の合計20以下である欠失又は付加を含み得る配列とを比較することによって算出される。参照配列は、より大きい配列のサブセットであってもよい。ポリペプチドに対して適用される場合、実質的な同一性という用語は、2つのペプチド配列が、デフォルトのギャップウェイトを用いるGAPプログラム又はBESTFITプログラムなどによって最適に整列されたときに、少なくとも80の配列同一性、好ましくは少なくとも90の配列同一性、より好ましくは少なくとも95の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも98の配列同一性、最も好ましくは99の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリン及びトレオニンでありアミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギン及びグルタミンであり芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンでありかつ硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換のグループはバリンロイシンイソロイシン、フェニルアラニンチロシン、リジンアルギニン、アラニンバリン、グルタメートアスパルテート、及びアスパラギングルタミンである。本明細書で論じられているように、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列のわずかな変動は、該アミノ酸配列の変動が、少なくとも90、より好ましくは95、最も好ましくは99の配列同一性を維持する場合、本発明によって包含されることが企図される。特に、保存的なアミノ酸置換が企図される。保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で生じるものである。遺伝子にコードされるアミノ酸は、通常、以下のファミリーに分類される酸性=アスパルテート、グルタメート塩基性=リジン、アルギニン、ヒスチジン非極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン及び非荷電極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは、以下のものであるセリン及びトレオニンは、脂肪族ヒドロキシファミリーでありアスパラギン及びグルタミンは、アミド含有ファミリーでありアラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンは、脂肪族ファミリーでありかつフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンとイソロイシン又はバリンとの単独の置換、アスパルテートとグルタメートとの単独の置換、トレオニンとセリンとの単独の置換、又はあるアミノ酸と構造的に関連するアミノ酸との同様の置換が、特に、該置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、得られる分子の結合又は特性に対してそれほど大きな影響を及ぼさないと考えるのは妥当である。アミノ酸変化が機能的ペプチドを生じさせるかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。アッセイは、本明細書で詳細に記載されている。本明細書で使用されるように、標識又は標識されたという用語は、抗体中への別の分子の組込みを意味する。一実施態様では、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射性標識アミノ酸の組込み、又はマークを付けたアビジンによって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの付着である。別の実施態様では、標識又はマーカーは、治療薬、例えば、薬物コンジュゲート又は毒素であることができる。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、かつ使用可能である。標識の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない放射性同位体又は放射性核種、蛍光標識、酵素標識、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ、磁性物質、例えば、ガドリニウムキレート、毒素、例えば、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、及びそれらの類似体又は相同体。いくつかの実施態様では、標識を様々な長さのスペーサーアームによって付着させ、潜在的な立体障害を低下させる。患者という用語は、ヒト及び獣医学的対象を含む。本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、含むという単語、又は含む若しくは含むなどの変化形は、記載された整数又は整数の群の包含を意味するが、任意の他の整数又は整数の群の除外を意味しないことが理解されるであろう。抗原結合ドメインは、過免疫化ウサギから、クローニングされた抗原特異的B細胞から作製される。抗原特異的B細胞は、抗原パニングによってウサギ血液から選択され、活性化B細胞の拡大に有利に働く培養条件下でクローニングされる。ヒトIL6を3xFLAGIL6Avi融合体として発現させた。発現コンストラクトを、2工程のポリメラーゼ連鎖反応増幅によって作製した。生成物を、CMVプロモーターの下流で、プレプロトリプシンリーダー配列及び三連FLAGタグとインフレームにして、プラスミドp3xFLAGCMV23に挿入した。発現されたIL6は、アミノ末端三連FLAGタグ及びカルボキシル末端Aviタグを含んでいた。IL6コード領域をPCRで増幅し、p3xFLAGCMV23に挿入して、3xFLAGIL6及び3xFLAGIL6myc融合体を発現させた。アカゲザルIL6のコード領域を、オリゴマーの重複及びPCRによって作製した。合成された配列は、アミノ末端シグナル配列及びカルボキシル末端FLAGタグを含むmmIL6をコードする。このコンストラクトを、CMVプロモーターの下流で、哺乳動物発現ベクターpCEP4に挿入した。ヒトIL23サイトカインは、p19タンパク質及びp40タンパク質の機能的ヘテロ二量体である。該IL23二量体を、個々のタンパク質がエラスチンリンカーアミノ酸配列VPGVGVPGVG配列番号352をコードする、gttcctggagtaggggtacctggggtgggcで隔てられたp40p19融合体として発現させた。2工程のPCR増幅戦略を用いて、p40p19遺伝子融合体を作製し、該ドメインの各々に6xHISタグも導入した。p40p196xHIS及びp406xHISp19をコードする得られたコンストラクトを哺乳動物発現プラスミドpCEP4に導入した。霊長類IL23ヘテロ二量体を、2つのタンパク質の間にエラスチンリンカーを有し、36xHISタグを含むp40p19融合体として発現させた。該コンストラクトをオリゴマーの重複及びPCRによって合成し、CMVプロモーターの下流で、プレプロトリプシンシグナル配列とインフレームにして、p3xFLAGCMV13プラスミドにクローニングした。哺乳動物サイトカインの発現をHEK293又はHEK293c18細胞で実施した。トランスフェクションを、およそ200000細胞cm2の密度でプレーティングされた細胞に対して3μlμgDNAのlipofectamine2000、又は293fectinを用いて、100万個の細胞当たり2~25μgのDNAを用いて実施した。細胞を、10胎仔ウシ血清を含むDMEM中で、37°Cで3~4日間インキュベートし、成長培地を標的タンパク質の精製のために回収した。精製のために、6xHISタグ化タンパク質、110量の10×結合バッファーを培養培地に添加し、PBSに対して4°Cで一晩透析した。NiNTAビーズを抽出物に4°Cで2~3時間添加し、回転混合した。ビーズを遠心分離によって回収し、NiNTA洗浄バッファー中で洗浄した。NiNTAビーズに結合したタンパク質を溶出バッファーによって溶出させた。標的タンパク質を含む画分をSDSPAGE及びクマシーブルー染色によって同定し、デンシトメトリーによって定量した。ピーク画分を合わせ、PBSに対して透析し、インビトロアッセイ又はSPR解析で直接用いた。FLAGタグ化タンパク質を、M2コンジュゲートビーズを用いて、発現培地から精製した。手短に言えば、M2ビーズを発現培地に直接添加し、4°Cで4~16時間インキュベートした。該ビーズをFLAG洗浄バッファー中で洗浄し、結合タンパク質を、01Mグリシンで洗浄するか、又は3xFLAGペプチドを用いて回収した。酸溶出物を、120量の1Mトリス塩基を用いて、すぐに中和した。ピーク画分をSDSPAGE及びクマシーブルー染色によって同定し、プールした。これらをPBSに対して透析し、インビトロアッセイ又はSPR解析に直接用いた。平衡解離定数は、SensiQPioneer、及びアミンカップリングに適したカルボキシル化COOH1センサーを用いて、表面プラズモン共鳴によって決定した。プロテインGを、アミンカップリング試薬、NBエチルカルボジイミド塩酸塩、エタノールアミンStLouisMOを用いるか、又はBiacoreアミンカップリングキットを用いて、COOH1センサーにカップリングさせた。簡潔に述べると、カルボキシル化された表面を、2~10分の範囲の接触時間の間、2mMEDC及び5mMNHSで活性化する。20~400ugmLの範囲の可変濃度のプロテインGを、10mM酢酸バッファー、pH43中に希釈し、5~10分の範囲の可変接触時間の間、5~10μL分の範囲の速度で、活性化されたセンサーの上に注入した。COOH1センサーチップに固定化されるプロテインGの量は、400~2000応答単位の範囲である。残りの活性化された部位を、25μL分の流速で100μLのエタノールアミンでキャッピングした。ウサギヒトキメラmAbの平衡定数を、タンパク質GがコーティングされたチップへのmAbの結合と、その後の各分析物のそのそれぞれのmAbへの結合によって決定した。物質移動効果を最小限に抑えるために、分析物の結合が飽和に達したときに、その対応するRUが200~300低下するように、各分析物に対するmAbの表面密度を調整した。1~100nMの範囲の3xFLAGIL6、IL6、又はヒト二量体IL23の希釈物をチップ表面の上に注入し、会合速度定数及び解離速度定数を測定した。各々の結合及び解離サイクルのために、チップ表面を15uLの20mMNaOHで再生した。アッセイ温度を25°Cで維持し、分析物の流速を50μL分とし、2分の会合段階及び10~30分の解離段階を含めた。結合解離速度及び解離定数を、上記のフォーマットを擬一次11相互作用モデルソフトウェアとともに用いて決定した。scFvの平衡定数を先に記載した通りに決定したしかしながら、エピトープタグ化IL6がチップ表面に捕捉され、IL6からの抗IL6scFvの解離がモニタリングされるように、プロトコルを修正した。簡潔に述べると、抗FLAGM2抗体をプロテインGに結合させ、その後、3xFLAGIL6を抗FLAG抗体によって捕捉した。抗IL6scFvを、1~100nMの濃度範囲にわたってアッセイした。二重特異性scFvのSPRを、抗IL6部分の測定について先に記載した通りに実施したしかしながら、抗IL23scFv、31A12の結合反応速度を決定するために、プロトコルの修正が必要であった。簡潔に述べると、二重特異性体によるIL23結合を、記載したようなIL6を用いて、該二重特異性体を一定密度で固定化することによって実施した。組換えヒト二量体IL23の結合及び解離を、上で詳述したのと同じパラメータを用いて、3~25nMの範囲の濃度でアッセイした。1匹のニュージーランドホワイトウサギを、SigmaAdjuvantSystem中で、0、21、及び42日目に、100μgのIL6タンパク質から入手したで免疫化した。採血の10日以上前に、ウサギに追加免疫した。ウサギを、NIH、USDA、及びIACUCガイドラインに従って、RRResearchLaboratoriesで維持した。30mlの血液を静脈穿刺により各ウサギから回収した。末梢血単核細胞を密度遠心分離により調製した。ヒトIL6に対する免疫ウサギ血清の中和活性を3回の免疫化の後にアッセイした。ヒトIL6を、免疫ウサギ血清の13200希釈物を用いて又はそれを用いないで、1ngmlから力価測定する。IL6に特異的なB細胞を選択するために、6cmの組織培養ペトリ皿を以下のように、IL6でコーティングしたHisタグ化ヒトIL6を、抗His抗体がコーティングされたプレート上で捕捉した。PBS中2μgmlの抗His抗体を、4°Cで一晩、又は37°Cで1時間、6cmのプラスチックペトリ皿中でインキュベートした。その後、抗体溶液を除去し、4mlのPBS5BSAを1時間添加した。PBS中2μgmlの3mlのHisIL6を1時間インキュベートすることによって、IL6を捕捉し、その後、PBSで4回洗浄した。PBMCを、5BSAを含む2mlのPBSに懸濁し、抗原がコーティングされた皿に、4°Cで40分間プレーティングした。その後、プレートをPBSで4~8回洗浄し、軽く擦ることによって、接着細胞を除去した。これらの細胞を、完全培地に、100~500×103細胞mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液を、5×105細胞ウェルのマイトマイシンc処理したEL4B5細胞、20ngmlの組換えヒトIL2、及びウサギ脾臓細胞からの5馴化培地を含む100μlの完全培地に加えて、96ウェルプレートの各ウェルに添加した。簡潔に述べると、EL4B5細胞を、1×107細胞mlの密度で、50μgmlマイトマイシンcを含むRPMIに40分間懸濁し、完全培地中で6回洗浄した。ウサギ馴化培地を以下のように調製したウサギ脾臓細胞を機械的に解離させ、70μmメッシュに通して濾過し、1×106細胞mlで、完全培地に再懸濁した。細胞を、500ngmlのイオノマイシンと、5μgmlのコンカナバリンA又は40ngmlのPMAのどちらかとで、CO2インキュベーター中、37°Cで48時間刺激した。馴化培地を滅菌濾過し、後の実験のために20°Cで保存した。いくつかの実験については、マイトマイシンc処理した正常ウサギ脾臓細胞を、クローニングプレートに1~2×105細胞ウェルで添加した。抗原選択された細胞を含むプレートを、37°C、5CO2で7~10日間インキュベートした。その後、培養上清を回収し、IL6結合及びIL6活性の阻害についてアッセイした。ELISAを用いて、IL6結合を評価した。組換えIL6を、100μlのPBS中、025μgmlでELISAプレートに添加した。プレートを、37°Cで1時間、又は4°Cで一晩インキュベートした。ブロッキングするために、10ヤギ血清を含む100μlウェルのPBSを各ウェルに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを脱イオン水で5回すすいだ。各ウェルに、50μlのPBS10ヤギ血清を添加した。その後、試験試料を50μlウェルで添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを脱イオン水で5回すすいだ。各ウェルに、PBS10ヤギ血清中で15000希釈した100μlのペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギIgGを添加した。プレートを室温で1時間インキュベートし、その後、プレートを脱イオン水で5回洗浄した。TMB基質を100μlウェルで添加した。反応を100μlの1NH2SO4で停止させた。MolecularDevices製のM2プレートリーダーを用いて、吸光度を450nmで測定した。IL6依存的マウスB細胞ハイブリドーマ細胞株を用いるバイオアッセイを用いて、大腸菌又はCHO細胞由来ヒトIL6に応答するB9細胞増殖を測定することによって、IL6阻害を評価した。中和活性について試験するべき試料を、96ウェル組織培養プレート中で、100μlのアッセイ培地に希釈した。これに続いて、50μlのIL6含有アッセイ培地を添加し、室温で30分間インキュベートした。B9細胞をフラスコから回収し、180×gで7分間遠心分離し、ペレットをIL6不含培養培地に再懸濁した。細胞を3回遠心分離及び再懸濁して、IL6を除去した。トリパンブルー排除によって生存率を決定した後、細胞を1×105細胞mlに調整した。5×103細胞に相当する、50μlの容量のB9細胞を、IL6不含培地を含む適切な対照ウェルとともに、各ウェルに添加した。プレートを、37°C、5CO2で、48時間インキュベートした。その後、20μlのAlamarBlueを各ウェルに添加し、プレートをさらに18時間インキュベートした。プレートを、570nm及び600nmで、MolecularDevices製のM2プレートリーダー上で読み取った。図1は、さらなる特徴付けに好適な抗体を産生する細胞を選択するために実施された例示的実験を示しており各々の上清は、IL6結合とIL6中和の両方について試験された。さらなる特徴付けに好適な上清は、両方のアッセイで陽性であった。V領域レスキューのプロセスを図2にまとめる。簡潔に述べると、IL6中和試験とIL6結合試験の両方について陽性の上清由来のIgG可変重鎖及び軽鎖を、逆転写酵素連動型ポリメラーゼ連鎖反応を用いる増幅によって取得した。このようにして得られたVH及びVLcDNAをクローニングし、最終的なcDNAコンストラクトが、図3に示すようなキメラウサギヒトIgGをコードするように、ヒト定常領域コンストラクトに連結した。活性化されたウサギB細胞から免疫グロブリンV領域をレスキューするためのプライマーを、細胞溶解後に取得されたmRNAからのcDNA合成及びその後のPCR増幅工程の両方のために設計した。該PCR増幅工程では、最後のPCRによって、発現ベクターにクローニングするための制限酵素部位が付加される。1匹のウサギはb9アロタイプバックグラウンドを有するので、Jカッパ領域及びCカッパ領域の利用がウサギアロタイプ間で異なる場合、様々なcDNAプライマー及び入れ子型J領域プライマーを設計する必要があった。RT工程とPCR工程の両方で使用される選択されたDNAオリゴヌクレオチドプライマーのリストを表1に示し、その重鎖軽鎖特異性を右側の欄に示す。選択された陽性のB細胞を溶解させ、Dynabeads製のmRNADIRECTMicroKitを製造者の指示に従って用いて、mRNAを調製した。v領域を回収するために、単一の抗原陽性ウェルから生成されたmRNAを、重鎖と軽鎖の両方について、1工程RTPCR反応で用いる。該反応のために、ウサギIgG分子の重鎖及び軽鎖の定常領域に位置する遺伝子特異的プライマーを用いて、一本鎖cDNAを生成させ、その後、ウサギ可変領域の第一ラウンドのPCR生成のために、入れ子型J領域プライマーをリーダーペプチド特異的プライマーとともに用いる。ヒトIgG1の重鎖又は軽鎖のどちらかの定常領域を含むベクターにサブクローニングするために、第二ラウンドのPCRを実施して、レスキューされたV領域に制限部位を付加する。重鎖及び軽鎖について、別々のPCRを実施する。該V領域に付加される制限部位は、重鎖及び軽鎖について、それぞれ、HindIIIXhoI及びNcoIBsiW1である。定常領域を含むベクターは、InvivoGenから入手した。両方のベクターをサブクローニング戦略用に自前で修飾した。制限部位を付加した後、PCR生成物を適切な制限酵素消化に供し、ゲル精製し、適切なベクターに連結した。サブクローニング後、連結されたDNAをDH5α大腸菌に形質転換した。形質転換混合物全体を、適切な抗生物質耐性を含む培地中で一晩培養した。培養された細菌を回収し、キメラ抗体の一過性HEK293発現で使用するために、プラスミドDNAを単離し、精製した。選択されたウェルは、1以上の異なるB細胞クローンを含み得るので、この時、単離されたDNAは、1つの特定のV領域について均一であっても均一でなくてもよい。キメラ抗体を作製するために、HEK293細胞に、選択されたウェルからの重鎖と軽鎖の両方のDNAをコトランスフェクトした。上清を細胞培養の3~5日後に回収し、ELISAによるIgGと抗原の結合、及びIL6中和についてアッセイした。トランスフェクション上清中のIgGの存在を検出するために、ELISAプレートにコーティングされた抗ヒトIgGFc捕捉抗体、次いで、上清及びヒトIgG標準を用いるELISA免疫アッセイを行なう。Fcによって捕捉された抗体の検出は、抗ヒトIgGHRP試薬及びTMB基質を用いて得られる。1ウェル当たり2種以上の固有のクローンがおそらく存在するであろうという前提の下、どれだけ多くの固有の重鎖と軽鎖の組合せがレスキューされるかを決定するために、DNAシークエンシングを用いて、各ELISA陽性ウェルをスクリーニングした。DNAシークエンシングのために、先にトランスフェクション用に単離されたDNAをDH5α大腸菌に再び形質転換し、適切な抗生物質を含む寒天プレート上にプレーティングする。各形質転換からの複数のコロニーを採取し、製造者の指示に従ってローリングサイクルDNA増幅キットを用いて、DNA生成用に処理する。Templiphy反応から生成されたDNAをシークエンシングし、その後、解析して、各ウェルについて、V領域の複雑さを決定する。この時、各DNAは固有のクローンを表すので、DNAの作製に加えて、Templiphy反応に用いた細菌を、その後のDNA単離のために取っておく。配列解析後、Templiphy反応から取っておいた細菌を用いて、重鎖と軽鎖の両方について、レスキューされた各ウェルから、各々の固有のV領域のDNAを得た。重鎖及び軽鎖を一致させ、HEK293に一過性にトランスフェクトした。2以上の考えられる重鎖と軽鎖の組合せが存在するとき、固有の重鎖と軽鎖の対のあらゆる考えられる組合せをトランスフェクトした。3~5日後、上清を回収し、ELISAによるIgGと抗原の結合、及びIL6中和についてアッセイした。この解析工程の後、所望の活性を保持する重鎖と軽鎖の組合せをヒト化用に選択した。以下の抗体クローンは、抗原結合及び抗原中和についての基準を満たし、さらなる開発のために選択された配列番号6のアミノ酸配列配列番号7のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖配列番号8のアミノ酸配列配列番号9のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。13A8クローンは、34pgmlのEC50を有する高い効力、並びにSPR解析で決定される高親和性抗原結合特性Kd138×104Ka633×105、及びKD218pMを示した。配列番号16のアミノ酸配列及び配列番号17のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。配列番号18のアミノ酸配列及び配列番号19のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。28D2クローンは、65pgmlのEC50を有する高い効力を示した。配列番号26のアミノ酸配列及び配列番号27のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。配列番号28のアミノ酸配列及び配列番号29のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖18D4クローンは、54pgmlのEC50を有する高い効力、並びにSPR解析で決定される高親和性抗原結合特性Kd849×105Ka666×105、及びKD128pMを示した。配列番号36のアミノ酸配列及び配列番号37のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。配列番号38のアミノ酸配列及び配列番号39のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖8C8クローンの最初のトランスフェクション上清は、生体活性の阻害についての高い効力を示した。その後、scFvをウサギIgGから直接誘導体化し、これらは、510pgmlのEC50を有する高い効力を示した。配列番号46のアミノ酸配列及び配列番号47のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。配列番号48のアミノ酸配列及び配列番号49のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖9H4クローンは、109pgmlのEC50を有する高い効力、並びにSPR解析で決定される高親和性抗原結合特性Kd475×105Ka816×105、及びKD58pMを示した。配列番号56のアミノ酸配列及び配列番号57のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。配列番号58のアミノ酸配列及び配列番号59のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖9C8クローンは、400pgmlのEC50、及びKd317×105Ka765×105、及びKD42pMを有する、高い活性及び抗原結合特性を示した。ヒト治療用の任意のサイトカインアンタゴニストの開発の成功は、初期の毒性試験を必要とする。毒性は、非ヒト種において最も効率的に証明される。毒性研究を実施するために、研究が検討されている種に由来するIL6を中和する抗体の能力を示すことがまず必要である。非ヒト霊長類IL6活性の中和について試験された抗IL6キメラ抗体のいくつかを図3に示す。1匹のニュージーランドホワイトウサギ及び1匹のB9ウサギを、0、21、及び42日目に、SigmaAdjuvantSystem中で、100μgのIL23タンパク質で免疫化した。免疫化の少なくとも10日後に、該動物から採血した。ウサギを、NIH、USDA、及びIACUCガイドラインに従って、RRResearchLaboratories及びSpringValleyLaboratoriesで維持した。NZWウサギ及びB9ウサギは、異なる免疫グロブリン遺伝子アロタイプを発現しており、該アロタイプは、フレームワーク領域及びCDR領域の違いに対応し、また、単離されるmAbの構造の違いに対応している。b9アロタイプウサギは、V領域中にCys残基が存在しないために、mAbのファージディスプレイクローニングでの使用により優れていることが報告されている。抗IL6mAbは全てNZWウサギからクローニングされ、V領域中にCys残基を示すものはなかった。ヒトIL23で免疫化されたB9ウサギ及びNZWウサギ由来の高力価血清のIL23中和活性を測定した。免疫ウサギ由来の血清は、マウス脾細胞から600pgmlのヒトIL23によって誘導されるIL17A分泌を、ほぼ110000に等しい希釈で完全に中和することができる。IL23に特異的なB細胞を実施例3と同様に選択した。末梢血単核細胞を、各ウサギから密度遠心分離により調製した。IL23がコーティングされたプレートを、PBS中2μgmlのIL23を4°Cで一晩、又は37°Cで1時間インキュベートすることにより作製し、PBSで4回洗浄し、B細胞を捕捉するのに用いた。PBMCを、5BSAを含む2mlのPBSに懸濁し、抗原がコーティングされた皿に、4°Cで40分間プレーティングした。その後、プレートをPBSで4~8回洗浄し、軽く擦ることによって、接着細胞を除去した。細胞をウサギ脾臓細胞馴化培地及びEL4B5細胞中にプレーティングし、37°C、5CO2で、7~10日間インキュベートした。その後、培養上清を回収し、IL23結合、及びIL23活性の阻害について試験した。ELISAアッセイを用いて、IL23結合を評価した。ELISAプレートを、IL23直接結合法又はIL23間接結合法のどちらかを用いて、コーティングした。間接結合法のために、抗His抗体を、100μlウェルのPBS中、001~002ugmlでプレートに添加した。プレートを37°Cで1時間、又は4°Cで一晩インキュベートした。非特異的結合をブロッキングするために、10ヤギ血清を含む100μlウェルのPBSを各ウェルに添加し、その後、プレートを脱イオン水で5回すすいだ。100μlウェルのPBS10ヤギ血清中の05μgmlのIL23p40p19Hisを添加し、室温で1時間インキュベートした。直接結合法のために、IL23p40p19Hisを、100μlのPBS中、05μgmlでELISAプレートに添加した。プレートを37°Cで1時間、又は4°Cで一晩インキュベートした。非特異的結合をブロッキングするために、10ヤギ血清を含む100μlウェルのPBSを各ウェルに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。IL23結合後、プレートを脱イオン水で5回すすいだ。各ウェルに、50μlのPBS10ヤギ血清を添加した。その後、試験試料を50μlウェルで添加した。プレートを室温で1時間インキュベートし、脱イオン水で5回すすいだ。各ウェルに、PBS10ヤギ血清中で15000に希釈した100μlのペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギIgGを添加した。プレートを室温で1時間インキュベートし、その後、脱イオン水で5回洗浄した。TMB基質を100μlウェルで添加した。反応を100μlの1NH2SO4で停止させた。MolecularDevices製のM2プレートリーダーを用いて、吸光度を450nmで測定した。マウス脾臓細胞によるIL23誘導性IL17発現の検出に基づくバイオアッセイを用いて、IL23受容体に対するIL23結合の抗体媒介性阻害、及び結果として生じる生体活性を検出した。5×105個のC57Bl6脾臓細胞を、ヘテロ二量体IL23の希釈物を含む200μl中で、96ウェルプレートのウェル中で培養し、プレートを37°Cで2~3日間インキュベートした。培養培地は、RPMI1640、10FBS、50uM2メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、ピルピン酸塩、ゲンタマイシン、及び10ngmlヒトIL2である。3日後、培養上清を、下記のように、IL17AについてELISAでアッセイした。IL23阻害についてアッセイするために、試験mAb試料を、150~1200pgmlのIL23を含むマウス脾臓細胞の培養物に様々な希釈で添加し、IL17Aの分泌を、mAbで処理していない培養物と比較した。ELISAアッセイを用いて、マウスIL17を検出した。プレートを、100μlのPBS中1μgmlの抗mIL17Aで、4°Cで一晩又は37°Cで1時間コーティングした。プレートを脱イオン水中で洗浄し、100μlのPBS、10ヤギ血清で1時間ブロッキングした。プレートを洗浄した後、50μlのPBS10ヤギ血清及び50mlの培養上清をプレートに添加し、1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、PBS10ヤギ血清中05μgmlで100μlウェルの抗mIL17Aビオチンを添加し、プレートをRTで1時間インキュベートし、洗浄し、PBS10ヤギ血清中11000で100μlウェルのストレプトアビジンHRPと反応させた。プレートを再洗浄し、100μlウェルのTMB基質を添加することによって、シグナルを検出した。100μlウェルの1NH2SO4で反応を停止させた後、光学密度を450nMで読み取った。データをプロットし、Graphpadソフトウェアで解析した。B細胞をIL23免疫化ウサギからクローニングし、B細胞クローン上清をIL23中和及びIL23結合について試験した。図7は、各上清をIL23結合とIL23中和の両方について試験した実験からの例となる96ウェルプレートを示す。さらなる特徴付けに好適な上清は、両方の試験で陽性であった。IL23中和アッセイとIL23結合アッセイの両方について陽性のB細胞由来のIgG可変重鎖及び軽鎖を、本質的に実施例3と同様のRTPCRで取得した。図5A~Iは、得られたいくつかの抗IL23中和mAbによるヒトIL23中和活性の例を示す。いくつかの抗体を、図6に示すように、霊長類IL23に対するその結合に関してさらに特徴付けた。IL23を中和するモノクローナル抗体を、図8Aに示すように、ヒトIL12の中和についてさらに試験した。mAb31A12は、IL23を特異的に中和し、一方、45G5及び22H8は、IL23とIL12の両方を中和する。本発明の抗体によって認識されるエピトープのマッピングは、交差競合結合アッセイ、又は線状ペプチドに対する結合などの、いくつかの実験方法によって達成することができる。詳細なエピトープマッピングは、モノクローナル抗体又はその抗体断片と抗原の複合体の共結晶化によって得ることができる。代替法は、mAbの存在下で、重水素で標識した後、抗原ペプチドの液体クロマトグラフィーマススペクトロスコピー解析を用いる。重水素化されていない残基は、mAbによって保護された残基を表す。抗原結合、抗原中和、及びIL23の選択的結合についての基準を満たした以下のモノクローナル抗体を、さらなる開発のために選択した配列番号86のアミノ酸配列配列番号87のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖配列番号88のアミノ酸配列配列番号89のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。31A12mAbは、3286pgmlのEC50、並びにSPR解析で決定される高親和性抗原結合特性Kd202×104Ka479×105、及びKD422pMを有する、高い効力及び抗原結合特性を示した。配列番号96のアミノ酸配列及び配列番号97のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。配列番号98のアミノ酸配列及び配列番号99のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。49B7mAbは、988pgmlのEC50を有する高い効力を示した。配列番号106のアミノ酸配列及び配列番号107のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。配列番号108のアミノ酸配列及び配列番号109のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖16C6mAbは、219pgmlのEC50を有する高い効力を示した。配列番号116のアミノ酸配列及び配列番号117のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。配列番号118のアミノ酸配列及び配列番号119のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖34E11クローンは、50pgmlのEC50を有する高い効力を示した。配列番号126のアミノ酸配列及び配列番号127のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。配列番号128のアミノ酸配列及び配列番号129のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。35H4クローンは、同じB細胞クローニング実験で単離された他のmAbと比べて、クローニングされたmAbのトランスフェクション上清中で高い効力を示した。図8Aに示すように、IL23を中和する抗体を、IL23に特異的であるものと、IL23とIL12の両方を中和するものとに細かく分けることができる。IL12及びIL23は、共通のp40ポリペプチドを共有しており、p40に共有結合する第二の鎖が異なる。IL23のp19鎖及びIL12のp35鎖は両方とも、4ヘリックスバンドル型のサイトカイン様ポリペプチドである。p19サブユニット及びp40サブユニットは、ジスルフィド結合によって共通のp40サブユニットに連結される。IL12とIL23の両方を中和する抗体は、この2つの分子間でのp40鎖の共有のために生じる。IL12受容体及びIL23受容体は、共通の鎖を共有し、さらに各々、固有の受容体成分を有する。これらの違いは、標的細胞、並びにIL12及びIL23によって用いられるシグナル伝達経路の顕著な差をもたらす。これらの受容体は、STAT活性化のためにJAK2又はTYK2チロシンキナーゼと対をなす膜貫通シグナル伝達ドメインを有する。IL23とIL12の両方に結合する抗体を、組換えIL23で免疫化したウサギから単離した。IL23とIL12の両方に対する結合活性及び機能的活性を示すB細胞クローンをさらなる特徴付けのために選択した。B細胞由来のキメラIgGの一次レスキュートランスフェクションをIL23の中和について試験した。IL23の中和に成功したものをシークエンシングし、サブクローニングし、再びトランスフェクトし、mAbをトランスフェクション上清中で定量した。これらのmAbを抗IL23活性について確認し、その後、IL12及び霊長類IL23の中和について試験した。抗原結合、抗原中和、並びにIL12及びIL23の選択的結合についての基準を満たした以下のモノクローナル抗体を、さらなる開発のために選択した配列番号136のアミノ酸配列配列番号137のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖配列番号138のアミノ酸配列配列番号139のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。mAb22H8は、603pgmlのEC50、並びにSPR解析で決定される高親和性抗原結合特性Kd894×105Ka403×105、及びKD221pMを有する、高い効力及び抗原結合特性を示した。配列番号146のアミノ酸配列配列番号147のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖配列番号148のアミノ酸配列配列番号149のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。mAb45G5は、385pgmlのEC50を有する、高い効力及び抗原結合特性を示した。配列番号156のアミノ酸配列配列番号157のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖配列番号158のアミノ酸配列配列番号159のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。mAb1H1は、603pgmlのEC50を有する、高い効力及び抗原結合特性を示した。配列番号166のアミノ酸配列配列番号167のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖配列番号168のアミノ酸配列配列番号169のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。mAb4F3は、2339pgmlのEC50を有する、高い効力及び抗原結合特性を示した。配列番号176のアミノ酸配列配列番号177のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖配列番号178のアミノ酸配列配列番号179のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。mAb5C5は、1907pgmlのEC50を有する、高い効力及び抗原結合特性を示した。配列番号186のアミノ酸配列配列番号187のヌクレオチド配列として同定された可変領域重鎖配列番号188のアミノ酸配列配列番号189のヌクレオチド配列として同定された可変領域軽鎖。mAb14B5は、767pgmlのEC50を有する、高い効力及び抗原結合特性を示した。抗体を、IL12応答性細胞株NK92を用いて、IL12中和能力についてアッセイした。B細胞クローニングプレートからの50μlの培養上清、又は抗体トランスフェクションからの50μlの上清を96ウェル組織培養プレートに移した。50μlのヒトIL12を各ウェルに4ngmlで添加した。プレートを室温で30~60分間インキュベートし、その後、5×104個のNK92細胞を100μl中で各ウェルに添加した。培養物を37°Cで3日間インキュベートし、上清をヒトインターフェロン産生についてアッセイした。アッセイ培地は、RPMI1640、10FBS、NEAA、ピルピン酸塩、50μM2メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及び10ngmlヒトIL2である。ELISAアッセイを用いて、ヒトインターフェロンγを検出した。プレートを、100μのPBS中1μgmlの抗ヒトインターフェロンγで、4°Cで一晩又は37°Cで1時間コーティングした。プレートを脱イオン水中で洗浄し、100μlのPBS、10ヤギ血清で1時間ブロッキングした。プレートを洗浄した後、50μlのPBS10ヤギ血清及び50μlの培養上清をプレートに添加し、1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、PBS10ヤギ血清中05μgmlで100μlウェルの抗ヒトインターフェロンγビオチンを添加し、プレートをRTで1時間インキュベートし、洗浄し、PBS10ヤギ血清中11000で100μlウェルのストレプトアビジンHRPと反応させた。プレートを再洗浄し、00μlウェルのTMB基質を添加することによって、シグナルを検出した。100μlウェルの1NH2SO4で反応を停止させた後、光学密度を450nMで読み取った。ウサギ免疫グロブリン可変領域を免疫化ウサギ由来の末梢血B細胞から単離されたmRNAから取得する。これらのウサギB細胞を低密度で96ウェルプレートにプレーティングし、先に記載したように活性化した。定常領域由来の遺伝子特異的プライマーを第一鎖合成用に、及びその3末端の入れ子型J領域特異的プライマーを5リーダープライマーとともにPCR工程用に用いる、逆転写酵素PCRを用いて、V領域cDNAを各ウェルのmRNAから増幅する。その後、V領域を、ヒトIgG重鎖ベクターカセット、カッパ軽鎖ベクターカセット、又はラムダ軽鎖ベクターカセットのいずれかにクローニングし、HEK293細胞で一過性に発現させ、72時間後のトランスフェクション上清を、全体のIgG発現とそれぞれの標的の中和の両方について試験する。その後、強力な中和作用物質をシークエンシングし、それらがサブクローニングされたウェル中に存在する複雑さのレベルを決定した。固有の軽鎖及び重鎖の数を決定した後、存在する全ての考えられる組合せをHEK293に再び一過性に発現させ、中和及びIgG含量についてアッセイした。その後、強力な中和作用物質を、他の望ましい活性についてさらにアッセイした。抗ヒトIL6抗体を非ヒト霊長類由来のIL6の中和について試験した。IL12二量体とIL23二量体は両方とも同じp19鎖を共有するので、抗ヒトIL23抗体を、非ヒト霊長類IL23の中和だけでなく、ヒトIL12の中和についてもアッセイする。本発明者らは2つの戦略に従った本発明者らは、配列glyglyglyglyserの4つのタンデム反復から構成される20アミノ酸のリンカーを2つのドメインの間に導入することによって、重鎖V領域と軽鎖V領域をVLVH方向又はVHVL方向のどちらかで遺伝子融合するPCRにより、選択された重鎖及び軽鎖から直接ウサギscFvを構築した。ウサギscFvは、キメラ抗体からscFvフォーマットへの変換がV領域対の機能的又は生物物理的特性に悪影響を及ぼしたかどうかを評価するのに役立つ。その後、scFvをHEK293で一過性に発現させ、図12Aに示すような機能についてアッセイした。強力な中和作用物質をヒト化用に選択した。或いは、ウサギV領域をscFvフォーマットで直接ヒト化した。免疫グロブリンV領域は、全長抗体と単鎖Fvの両方を含む、多くの異なるフォーマットでヒト化することができる。記載した発明は、原核生物組換えタンパク質発現に依存しているので、全長抗体構造は望ましくない。しかしながら、本発明は、抗体フォーマットでのウサギV領域の良好なヒト化を実際に記載する。フォーマットを問わず、本発明は、任意の天然に存在するメチオニン残基の除去を含み、それにより、それらを他のアミノ酸と置換する。メチオニン残基は、免疫グロブリンV領域のフレームワーク領域及びCDR内に見出されることが多いので、これらの残基の好適な置換を見出す必要があり、その場合は、該置換が、所望のタンパク質の発現、安定性、又は機能に影響を及ぼすことなく生じる。その後、このメチオニン不含scFvを、メチオニン要求性細菌株での発現用に最適化し、精製し、再フォールディングさせ、生物学的活性について試験することができる。良好なヒト化及びその後のメチオニン置換は、活性化PEG部分などの他の相補的分子と共有結合させるための化学反応性の高い部位を有する非天然アミノ酸の挿入部位として役立つ単一のメチオニンコドンの挿入によって化学的に修飾することができる治療的ビヒクルの一部を提供する。その後、このPEG化scFvを、PEGポリマーの残りの末端での同様に反応性の高い基を介した別のそのようなscFvへの共有結合によってさらに修飾することができる。その後、この二重特異性、PEG化生成物を精製し、再フォールディングさせて、安定で、生物学的に活性のある治療タンパク質を生じさせることができる。ウサギヒトキメラモノクローナル抗体を全長抗体としてヒト化することができる。これは、ヒトのVHフレームワーク領域及びVLフレームワーク領域を、ウサギCDRを保持したままウサギフレームワークと交換することを必要とし、多くの場合、特定のウサギフレームワーク残基を保持することを含む。齧歯類V領域をヒト化する戦略も多数あるし、ウサギヒトキメラ抗体を部分的に又は完全にヒト化し得る他の方法も考えられる。ここでは、本発明者らは、抗ヒトIL6クローン9C8を抗体フォーマットでヒト化するために用いられる方法を記載する。高親和性かつ高効力のキメラmAbである9C8を、VH及びVLのフレームワーク領域をヒトフレームワーク配列に変化させることによってヒト化し、ウサギフレームワーク配列への復帰突然変異を制限した。NZWウサギV領域のヒト化は、まず、その一次アミノ酸配列をヒトV領域中に見られるものと比較することによって遂行された。適合する可能性があるヒトV領域フレームワークを、フレームワーク領域内の配列類似性、相補性決定領域内の配列の長さ及び内容、並びにIgVのカノニカルループ構造を支持するのに極めて重要であることが知られている重要なFR残基に基づいて作製した。これらのデータを用いて、ヒトフレームワークを、軽鎖V領域と重鎖V領域の両方について選択し、ウサギCDRを、図15に示すように、重複するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRによって、これらのフレームワーク上に移植した。9C8のヒト化のために、ウサギのVカッパフレームワークをヒトフレームワークDPK8VK1に変化させ、一方、ウサギのVHフレームワークをヒトのDP42VH353フレームワークに変化させた。CDRは全てウサギのものである。重鎖の2つのバージョンを作製した。これら2つのバージョンは、CDR1VH近くのフレームワーク領域が異なる。ここで、内在性9C8ウサギフレームワーク領域は、アミノ酸配列TVSGIDLSであり、これをv2に用いた。v1については、この配列の最初の2つのフレームワーク残基を、相同なヒトVH3フレームワーク位置で高度に保存されているAAに変化させた。親キメラ9C8mAbを、ヒト化バージョンの9C8mAbv1及びmAbv2と並べて比較した。両バージョンとも完全な活性を保持していた。9C8v1及びv2におけるフレームワーク及びCDR1VHバリエーション9C8v1FWVH復帰突然変異AASGIDLSCDR1VHSYDMS9C8v2FWVH復帰突然変異TVSGIDLSCDR1VHSYDMS図9Bは、親キメラ9C8mAbと、VH領域のCDR1の近くに2つの異なるウサギ復帰突然変異を含むヒト化9C8mAbとの並列比較を示す。ヒト化モノクローナル抗体9C8mAbv1及び9C8mAbv2を、先に記載したように、重鎖DNAと軽鎖DNAの両方のHEK293細胞への一過性コトランスフェクションにより発現させた。ヒト化モノクローナル抗体を、示したように、50pgmlIL6の中和について試験した。これらの変化、TVSGIDLS又はAASGIDLSは、機能的活性に影響を及ぼさない。9C8mAbv1を、図9Cのヒト化mAb18D4とさらに比較した。ヒト化V領域を増幅するために用いられるプライマーは、先の実施例でウサギV領域を取得するために用いられ、図10に示されているものと同一の制限酵素部位をコードする。この方法で、ヒト化軽鎖を、Cカッパを含む発現ベクターに連結し、ヒト化重鎖V領域を、Cガンマ1を含む発現ベクターに連結し、先に記載したように、大腸菌に形質転換した。その後、単離されたコロニーをスクリーニングし、シークエンシングした。ヒト化9C8scFvをヒト化mAbv1及びmAbv2から得た。得られたscFvは、VH1CDR1近くにウサギフレームワーク1残基を保持していた。これらのscFvは、H34及びH82に内在性メチオニン残基も保持していた。その後、9C8のヒト化scFvの最終バージョンをこれらのscFvから作製したが、新しいフレームワークDPK56DP47に置換した。これらの新しいヒト化scFv、9C8HumscFvv31及び9C8HumscFvv32は、強力な抗IL6中和活性を示した。ウサギV領域は、scFvフォーマットで直接ヒト化することもできる。用いられるヒト化方法は、一般に、モノクローナル抗体をヒト化するのに用いられるものと同じであり得るが、全てのヒト化抗体が容易にscFvに変換されるわけではない。さらに、抗体のヒト化は、移植されたCDRとの定常領域相互作用を説明する必要条件を備えている。重鎖V領域と軽鎖V領域の両方の配列をヒト生殖系列比較し、実施例61に記載されているようなVベース及びIgBLASTの両方を用いて、配列を発現させた。クローニングされたウサギVH領域及びVL領域の大部分は、それぞれ、ヒトIGVH3ファミリー及びIGVK1ファミリーのメンバーと厳密に一致したが、位置L4のメチオニンが存在しないために、DPK8を軽鎖フレームワークとして用いた。5のNotI制限酵素部位に続いて、コザックボックス、IgVK3リーダー、ヒトVK1JK4フレームワーク、20アミノ酸の柔軟な4リンカー、ヒトVH3JH4フレームワーク、及びVH3FR4のC末端の最後の2つのセリン残基内で入れ子になっている3のXhoI制限部位をコードするように、ヒト化scFvを設計した。scFvDNAは全て、重複するDNAオリゴヌクレオチド伸張を用いるデノボのDNA合成によって構築し、NotI及びXhoIで消化し、1アガロースTAEゲルで単離し、ゲルから切り出し、製造者の指示を用いて、MinEluteGelExtractionキットを用いて精製した。このDNAを、T4DNAリガーゼを用いて、NotIXhoI消化されたpcDNA31に連結した。pcDNA31ベクターカセットは、プロリンに富む短いリンカーに続いて、6XHisタグをscFvのC末端とインフレームでコードするように修飾されたものであった。連結されたpcDNA31613A8をコンピテント大腸菌TOP10に形質転換し、LB寒天100μgmlカルベニシリンプレート上で37°Cで一晩選択した。これらのプレートから、単離されたコロニーを採取し、2mlのYTブロス100μgmlカルベニシリンに播種し、振盪インキュベーター内で、37°Cで一晩成長させた。PureLinkQuickPlasmidMiniprepカラムを用いて、いくつかのクローンからDNAを単離し、その後、制限消化により、08KbpのscFv断片の存在についてスクリーニングした。その後、正確な制限パターンを与えるクローンを、製造者の指示に従ってBigDyeTerminatorv31キットを用いるPCRサイクルシークエンシングの後に、AppliedBiosystems3130GeneticAnalyzerでシークエンシングした。得られたDNA配列を解析し、VNTIv10を用いて、その参照ヌクレオチド配列及び参照アミノ酸配列と比較した。配列を確認した後、各scFvを、製造者のプロトコルを用いてLipofectamine2000を用いて、HEK293細胞にトランスフェクトした。簡潔に述べると、トランスフェクションの前日に、対数期のHEK293細胞を、完全培地中、1ウェル当たり500000細胞の密度で、12ウェル培養プレートにプレーティングし、37°CのCO2インキュベーター内で一晩インキュベートした。細胞が約80コンフルエントになったとき、4μgのscFvDNAを100μLのOptiMEMに希釈し、4μLのLipofectamine2000を100μLのOptiMEMに希釈し、その後、これら2つの希釈物を合わせて、トランスフェクションミックスとし、室温で20分間インキュベートした。その後、12ウェルプレートから培地を除去し、1mlウェルのSFM4Transfectx293無血清培地と交換し、トランスフェクションミックスを各ウェルに滴加した。トランスフェクションプレートを37°CのCO2インキュベーターに戻して、3日間成長させ、先の実施例で記載したような機能的活性について試験した。1工程法を用いてヒト化された抗IL6scFvは、13A8、28D2、及び9C8v31について示したように、哺乳動物細胞で発現させたとき、IL6中和活性を保持していた。表面プラズモン共鳴による結合親和性の測定もまたは、13A8及び9C8抗IL6scFvの良好なヒト化を示した。親和性試験に用いられたヒト化13A8及び9C8scFvは、6xヒスチジンタグを含んでおり、トランスフェクトされたHEK上清から精製され、本質的に実施例2に記載したように実施されたSPRによって試験された。哺乳動物細胞で発現された抗IL2331A12ヒト化scFvは、ヒトIL23と霊長類IL23の両方に対して親mAbと同程度のIL23中和活性を保持していた。さらに、31A12scFvは、親キメラmAbと少なくとも同じくらい良好なピコモル濃度の親和性を保持している。45G5ヒト化scFvは、図13に記載したようなIL23に対する強力な生物学的活性を保持していた。ヒト免疫グロブリンV領域は、VHFR3の比較的保存された残基、及びカッパ軽鎖の位置L4で、軽鎖と重鎖の両方のCDR1にメチオニン残基を含むことが多い。これらのヒト化scFvは、メチオニン類似体を用いて最終的に共有結合されるので、成熟scFv内の全てのメチオニン残基は、別の天然に存在するアミノ酸に置換されなければならない。このアミノ酸置換は、得られるscFvの機能又は安定性に対して、最小限の影響しか及ぼさないもの、又は全く影響を及ぼさないものでなければならない。軽鎖アミノ酸の位置L4でのメチオニン残基を回避するために、CDRを、その位置にロイシン残基を有するヒト生殖系列フレームワークDPK8に移植した。位置H82の重鎖のメチオニン残基を置換するために、メチオニンをイソロイシン、ロイシン、バリン、又はフェニルアラニンのいずれかに変化させるような、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これら4つのアミノ酸は、他の種由来のIgVH領域内の位置H82で、及びいくつかの発現されたヒト抗体において見出すことができる。これらの新しいメチオニン不含scFvをHEK293細胞で一過性に発現させ、その後、中和活性をその親scFvのものと比較した。効力及び発現に基づいて、メチオニンを含まないDNA配列を、翻訳効率に干渉し得るコドン使用及び潜在的二次構造を変化させることによって、大腸菌内での発現用に最適化した。VHの位置H82Mで代わりのアミノ酸に置換するために、フランキングプライマーを伴うPCRによって、ロイシン、バリン、イソロイシン、又はフェニルアラニンを位置H82に導入するように、重複する縮重プライマーを設計した。PCR生成物を上記のようにクローニングし、DNAをシークエンシングして、各々の選択されたクローンによってどのアミノ酸がコードされているかを決定した。ヒト化抗IL6scFv13A8は、VHの位置H34及びH82に2つのメチオニン残基を有している。これらの残基を、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRにより置換し、メチオニンと上記のようなロイシン、イソロイシン、バリン、又はフェニルアラニンのいずれかとの置換を生じさせた。その後、これらのメチオニン不含scFvを、製造者のプロトコルを用いて、HEK293細胞にトランスフェクトし、得られた72時間の上清を、野生型親scFv対照上清と比べたIL6中和についてアッセイした。ほとんど全ての置換によって、活性の完全な保持が得られた。H34Lは、一般に、十分に許容される置換であった。抗IL23ヒト化scFvの31A12において、H34Lと組み合わせて、H82を異なるアミノ酸と置換することによって、Metを含む親scFvと比べて、活性の完全な保持が得られた。同様のやり方で、H34Lと組み合わせて、45G5H82をL又はVと置換することによって、もとのキメラmAbと比べて、活性の完全な保持が得られた。H82L及びH34Lを有するように9C8ヒト化scFv中のMetを置換することによっても、強力な活性が保持された。22H8scFvは、本来、位置H82にMet残基を持たない。H34のMetをL又はVのどちらかと置換することによって、強力なIL23中和活性の完全な保持が得られた。各々のリード候補VH領域の特異的なVH突然変異が表25Xに示されており、これは、H23~30、及びH49でのウサギ復帰突然変異、並びにH34及びH82メチオニン置換を示している。最終的なリードscFv候補の各々について、位置H82と位置H34の両方で置換されるアミノ酸としてロイシンを選んだ。リード候補scFvDNA配列を、大腸菌が好むものに従ってコドン使用を修飾することにより、大腸菌内での発現用に最適化した。この時点で、Ahaなどのメチオニン類似体によるインビボでの置換を表す単一のMet残基の配置を調べた。DNAをPCRによって合成し、pQEベクターなどの適切な発現ベクターにクローニングした。発現ベクター中の合成DNA遺伝子配列をDNA配列により確認した。最後に、発現ベクター内の合成遺伝子を、組換えタンパク質産生のために、B834などのメチオニン要求性大腸菌宿主に形質転換した。scFvは、非天然アミノ酸が大腸菌内でのタンパク質産生時に組み込まれ得る位置に導入される単一のMet残基を有さなければならない。このNNAAは、特異的なバイオコンジュゲーション部位になる。これらの生成物に好まれるNNAAはアジドホモアラニンであり、これは、銅によって触媒される環状付加バイオコンジュゲーションの使用を可能にする。1つのAha残基を含むscFvを産生するために、単一のメチオニンコドンを含むscFvDNAを、大腸菌発現用にコドン最適化し、合成し、B384などのメチオニン要求性大腸菌株中にクローニングした。細胞を対数期まで成長させ、Ahaを含むメチオニン不含培地に移し、1mMのIPTGを添加してscFv発現を誘導した。その後、所望の場所に機能的Aha基を有する所望のscFvを含む封入体を単離した。単一のメチオニン残基を、限定されないが、N末端及びC末端、又はVLドメインとVHドメインを接続するリンカー中を含む、多くの可能な位置で、scFvに導入し得ることが明らかにされた。3つの単一のMet形態は全て、ヒト化28D2から構築されており、これを、AhaNNAAがメチオニン残基の代わりに導入されている大腸菌で発現させ、機能的活性について試験した。3つの形態全てが、完全な生物学的活性を保持していた。さらに、それらは全て、高い親和性を保持していた。二重特異性scFvは、2つの異なるscFv抗原結合ドメインをリンカーによって互いにコンジュゲートさせることにより構築される。この戦略は、各scFvが二官能性リンカーにコンジュゲートされる2工程プロセスで実現される。二重特異性コンジュゲートを含む2つのscFvは、各々、特異的なコンジュゲーション部位の役割を果たす位置で単一の非天然アミノ酸を含む。リンカーは、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性であることができ、scFvに含まれる非天然アミノ酸と反応性がある相補的官能基を含む。反応スキームは、以下の実施例で詳述されているように、本発明者らによって、いくつかの二重特異性scFvの良好な作製にうまく適用されている。これらの実施例で利用されるリンカーは、PEGである。PEGは、最終的な二重特異性生成物で望ましく、かつscFvに特有の問題を解決するいくつかの化学的特性を有する。PEG化は、タンパク質溶解性を向上させ、scFv安定性を増大させ、scFvの凝集及び沈殿を低下させる。さらに、PEG化は、scFv二重特異性生成物の血清半減期を増大させることが示されている。PEGなどの長くて柔軟なリンカーは、2つの抗体断片の物理的隔離を増大させ、それらが互いに独立に再フォールディングするのを可能にする。これは、遺伝子融合によって連結された二重特異性抗原結合ドメインの再フォールディングで起こり、そのために、2つのドメインの無制御でかつ望ましくない架橋が生じる傾向がよくある、極めて重大な問題の1つを解決する。PEGリンカーの使用は、化学合成の柔軟性のために、さらなる利点を有する。PEGは、scFvタンパク質に組み込まれる任意の非天然アミノ酸との相補的反応パートナーとなるように容易に官能化することができる。PEGは、多価タンパク質ハイブリッドの構築を可能にする複数のコンジュゲーション部位を有するように官能化することもできる。PEG官能化は、所望のコンジュゲーション化学反応に応じてホモ二官能性又はヘテロ二官能性PEGを用いて行なうことができる。PEGの構造は、薬物動態及び生体活性に影響を及ぼし得る線状又は分岐状のバリエーションに合わせることができる。scFvをリンカーにコンジュゲートさせるために用いられる化学反応は、20種の天然アミノ酸に対して直交性である。scFvPEGコンジュゲート及び二重特異性体の調製において、ここでは、アジドアルキン銅媒介性の環状付加を用いる。典型的なシークエンスにおいて、アジドホモアラニンを含むscFvを、アルキンで官能化された過剰量のホモ二官能性PEGリンカーと反応させる。一価のPEG化材料を精製し、その後、PEGリンカーの遊離のペンダントアルキンは、Ahaを含む第二のscFとの第二の銅媒介性アジドアルキン環状付加を経て、二重特異性体を生じさせる。二重特異性体の調製の第一工程は、アジドホモアラニンなどの非天然アミノ酸を含むscFvのPEGによる部位特異的PEG化であり、該PEGは、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性のどちらかである。一価のPEG化scFvを、このプロセスの第二工程の前に、一連のCHTクロマトグラフィー及びSECクロマトグラフィーによって精製する。また、一価材料を、再フォールディングされるその能力について評価する。最後に、再フォールディングされた材料を活性についてバイオアッセイにより評価する。非天然アミノ酸のアジドホモアラニンを含むscFvのPEG化は、過剰のPEGビスアルキンで進める。種々のPEG分子量が使用されている。コンジュゲーションに使用されるアジドアルキン環状付加は、CuIなどの銅供給源に由来するか、又は銅供給源を、DTT、システイン、βメルカプトエタノール、グルタチオン、シスタミン、トリスカルボキシエチルホスフィンなどの還元剤で還元することによって得られる銅によって媒介される。トリスメチルアミン、TBTAなどの配位子も反応混合物に含まれる。TBTAなどの配位子は、反応性の銅種を安定化し、反応収率を改善することが示されている。反応pHは、リン酸ナトリウムバッファー、トリス、又はHEPESなどの緩衝化試薬の添加によって、3~10、又は場合により、6~9に保持される。SDSなどのさらなる添加剤を用いて、反応条件及びタンパク質動力学を向上させることができる。Ahaなどの非天然アミノ酸をscFv配列の骨格のどこかに組み込む能力は、後に、PEG化がこの所定の場所で起こることを可能にする。これらの実施例では、PEG化は、scFvのC末端、及びN末端で示されているが、さらなるプログラムされた場所でも同様に起こり得る。この一般化された手順は、いくつかの抗IL6scFv及び抗IL23scFvをPEG化するのにうまく利用されている。。反応後、一価のPEG化scFvを未反応のscFv及びPEGから分離することができる。これは、後の二重特異性体調製工程における副生成物の形成を防ぐ。その目的のために、通常、混合物を遠心分離又は濾過して、固体微粒子を除去し、溶液を過剰の還元剤、例えば、DTTで処理する。その後、該溶液は、一連のクロマトグラフィー工程を経る。一価scFvPEGの精製の第一工程は、還元された反応混合物をCHTカラムに充填することであり、このカラムは、反応中のscFv及びscFvPEG生成物を捕捉するが、未反応PEGには全く結合しない。反応中のscFv及び生成物scFvPEGは、CHTカラムからのリン酸塩溶出によって部分的に又は完全に分割することができる。所望の画分をプールし、その後、残りの未反応のscFvを分離することができるサイズ排除カラムに充填する。SECの後、材料は、次の工程で使用されるか、又は再フォールディング実験を経るのに十分に純粋である。磁気撹拌棒を備えた250mLのガラスビーカーに、リン酸ナトリウムバッファー及びSDSの溶液を入れた。28D2cAhaの溶液及び30KPEGアルキンの溶液を添加した。TBTAトリアゾール配位子及びヨウ化銅のDMSO溶液を速やかに添加すると、沈殿が生じた。混合物を5分間静置させておき、その後、撹拌を開始した。該混合物を一晩撹拌し、その後、SDSPAGE及びレーザーデンシトメトリーでアッセイすると、56の収率が示された。該反応混合物を50mLの遠心分離チューブに注ぎ入れ、遠心分離した。上清をDTTに注ぎ入れ、窒素下で1時間撹拌した。CHTクロマトグラフィー及びSECクロマトグラフィーの組合せによって、精製を達成した。磁気撹拌子を備えた50mLの丸底フラスコに、水、及び28D2cAhaの溶液を添加した。この溶液に、20KPEGビスアルキンの溶液を添加した。TBTAトリアゾール配位子を添加し、溶液を数分間静置させておいた。ヨウ化銅のDMSO溶液を添加し、丸底フラスコに蓋をして、混合物を一晩撹拌した。反応混合物をSDSPAGE及びデンシトメトリーで解析すると、42の収率が示された。該反応混合物を50mLの遠心分離チューブに注ぎ入れ、遠心分離した。上清をDTTに添加し、窒素下で1時間撹拌した後、20°Cで保存した。磁気撹拌棒を備えた400mLのガラスビーカー中に、リン酸ナトリウムバッファー、ドデシル硫酸ナトリウムの溶液、及びジチオスレイトールの溶液を入れた。13A8nAhaの溶液及び20KPEGビスアルキンの溶液を添加した。TBTAトリアゾール配位子を添加し、混合物を撹拌しないで静置させておいた。硫酸銅溶液を添加し、ビーカーをアルミ箔で覆った。混合物を室温で一晩撹拌した。該混合物を、レーザーデンシトメトリーによるゲル解析を伴うSDSPAGEで評価すると、69の収率が示された。図16A。該反応混合物を遠心分離ボトルに注ぎ入れ、遠心分離した。上清を250mLのボトルに注ぎ入れ、DTTを添加し、窒素下で1時間撹拌した。セラミックハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーによって、さらなる精製を達成した。スクリューキャップ及び磁気撹拌子を備えた1000mLのガラスボトル中に、リン酸ナトリウムバッファー、SDSの溶液、及びジチオスレイトールの溶液を入れた。scFv13A8cAhaの溶液及び20KPEGビスアルキンの溶液を該ボトルに添加した。TBTAトリアゾール配位子を添加し、混合物を撹拌しないで静置させておいた。5分後、硫酸銅の溶液を添加し、該ボトルに蓋をして、混合物を適度な速度で一晩撹拌した。青灰色の溶液をSDSPAGE及びレーザーデンシトメトリー解析で評価し、反応物が70の収率を有することを明らかにした。該反応混合物を1対の遠心分離ボトルに注ぎ入れ、遠心分離した。上清をスクリューキャップ付きの2Lのガラスボトルに注ぎ入れた。DTTを添加し、容器に窒素を行き渡らせ、1時間撹拌した。反応混合物の精製を、実施例713と同様に、CHTクロマトグラフィー及びSECクロマトグラフィーの組合せにより達成した。スクリューキャップ及び磁気撹拌棒を備えた500mLのポリカーボネート遠心分離ボトルの中に、scFv13A8cAHAの溶液、リン酸ナトリウムバッファーの溶液、及びSDSの溶液を入れた。40KPEGビスアルキンを該撹拌溶液に固体として添加した。混合物を全てのPEGが溶解するまで撹拌し、TBTAトリアゾール配位子を添加し、該混合物を撹拌しないで5分間静置させておいた。撹拌を再開し、新鮮なシステインの溶液を添加した。硫酸銅の溶液を添加し、混合物に窒素を行き渡らせ、適度な撹拌で4時間撹拌した。該反応混合物をレーザーデンシトメトリーによるゲル解析を伴うSDSPAGE用にサンプリングして、反応収率を決定した。撹拌棒を反応容器から取り出し、混合物を高速で遠心分離した。上清を500mLのポリカーボネートボトルに注ぎ入れた。DTTを添加し、容器に窒素を行き渡らせ、1時間撹拌した。反応混合物の精製を、先の実施例と同様に、CHTクロマトグラフィー及びSECクロマトグラフィーの組合せによって達成した。磁気撹拌子を備えた250mLの丸底フラスコ中に、極めて純粋な水、SDSの溶液、及びscFv13A8LAHAの溶液を入れた。20KPEGビスアルキンの溶液を該反応混合物に添加した。TBTAトリアゾール配位子を添加し、混合物を撹拌しないで静置させておいた。撹拌を再開し、ジチオスレイトールの溶液、次いで、硫酸銅の溶液を添加した。丸底をセプタムで閉じ、一晩撹拌した。翌日、反応混合物をSDSPAGEで評価した。得られたゲルをレーザーデンシトメトリー解析で解析すると、60の反応収率が示された。該反応混合物を遠心分離ボトルに移し、遠心分離した。上清を250mLのボトルに注ぎ入れ、DTTを添加した。容器に窒素を行き渡らせ、固体が溶解するまで撹拌した。反応混合物の精製を、先の調製と同様に、CHTクロマトグラフィー及びSECクロマトグラフィーの組合せによって達成した。スクリューキャップ及び磁気撹拌子を備えた1000mLのガラスボトルに、リン酸ナトリウムバッファーの溶液、SDSの溶液、及びジチオスレイトールの溶液を入れた。該溶液を穏やかに撹拌し、IL2331A12cAhaの溶液及び20KPEGビスアルキンの溶液を添加した。撹拌を中断し、TBTAを添加した。該材料を沈殿させておき、硫酸銅の溶液を添加し、撹拌を再開した。ボトルに蓋をし、混合物を室温で16時間撹拌した。該反応混合物をSDSPAGEで解析し、得られたゲルをデンシトメトリーで解析すると、出発材料の所望のPEG化生成物への59変換が示された。該反応混合物を遠心分離ボトルに移し、遠心分離した。得られた上清を滅菌ポリカーボネートボトルに移し、ジチオスレイトールを添加し、該溶液を窒素下で1時間撹拌した。さらなる精製を、実施例713で実施されたようなCHTクロマトグラフィー及びSECクロマトグラフィーによって達成した。磁気撹拌子を備えた250mLの丸底フラスコ中に、リン酸ナトリウムバッファーを入れ、撹拌を開始し、ジチオスレイトールの溶液を添加した。scFv45G5cAhaの溶液及び20KPEGビスアルキンの溶液を該撹拌溶液に添加した。撹拌を中断し、TBTAトリアゾール配位子を添加し、混合物を5分間静置させておいた。硫酸銅溶液を添加し、フラスコにゴム製のセプタムで蓋をした。混合物を設定を最低にして一晩撹拌した。反応をSDSPAGEでアッセイし、ゲルをデンシトメトリーで解析すると、40の収率が示された。該反応混合物を遠心分離ボトルに移し、ティルトローターで遠心分離した。上清を新しいポリカーボネートボトルに注ぎ入れ、撹拌棒及びDTTを添加し、窒素下で1時間撹拌した。精製を、実施例713で実施されたようなCHTクロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーによって達成した。フォールディングは、変性したscFvPEGを取り、それを酸化還元系を含む部分変性バッファー中に交換し、その後、それを非変性バッファー中に交換することによって生じることができる。30kDaの線状PEGビスアルキンがC末端にコンジュゲートされたscFv28D2をフォールディングさせた。28D2cPEGをまず精製し、バッファーを9M尿素及びジチオスレイトールを含むバッファー、pH72に交換した。その後、28D2cPEGを005~1mgmLタンパク質の出発濃度にまで希釈した。その後、出発材料を、室温で一晩、3M尿素、30mMトリスpH85、2~6mMシステイン、及び1~3mMシスチンからなる第一のフォールディングバッファー中に透析した。その後、該材料を、室温で一晩、20mMリン酸ナトリウム及び150mMNaCl、pH74からなる最終的なバッファー中に透析した。再フォールディングした材料は、非還元SDSPAGEとSECの両方により、単量体と見られる。単量体28D2cPEGの回収は、005~025mgmLタンパク質のタンパク質フォールディング濃度で最も良好であった。同様の結果は、61~23mMの範囲のシステインシスチン濃度で達成された。具体的な例として、材料を01mgmLタンパク質、3mMシスチン、及び2mMシステインでフォールディングさせたとき、SECによる単量体回収は37であり、生成物のEC50は116pgmLであり、SPRで測定された結合親和性を表27に示す。フォールディングは、変性したscFvPEGを取り、それを部分変性バッファー中に速やかに希釈し、その後、それを非変性バッファー中に交換することによって生じることもできる。この方法のための出発材料は、尿素若しくはグアニジン中で変性させたか、又はSDS中で変性させたscFVPEGを含むことができる。9M尿素及びDTTを含むバッファー、pH72中の28D2cPEG、1mgmLを、3M尿素、30mMトリスpH85、2~6mMシステイン、及び1~3mMシスチンからなる第一のフォールディングバッファー中に005~01mgmLになるまで速やかに希釈し、その後、同じバッファー中で、室温で一晩透析した。その後、該材料を、20mMリン酸ナトリウム及び150mMNaClからなる最終的なバッファー、pH74中に、室温で一晩透析した。具体的な例として、材料を、2mMシステイン及び2mMシスチンを用いて、01mgmLでフォールディングさせたとき、SECによる単量体回収は38であり、生成物のEC50は138pgmLであった。01SDS及びDTTを含むバッファー、pH725中、052mgmLタンパク質の28D2cPEGを、3M尿素、30mMトリスpH85、2~6mMシステイン、及び1~3mMシスチンからなる第一のフォールディングバッファー中に速やかに希釈し、その後、同じバッファー中で一晩透析した。200倍希釈を用いて、最終SDS濃度を00005にまで低下させた。任意に、該フォールディングバッファーは、400mMアルギニン及び又は150mMNaClも含んでいた。或いは、該フォールディングバッファーは、システインシスチンの代わりに、2mMグルタチオン及び2mM酸化グルタチオンを含んでいた。その後、該材料を、5°Cで3日間、20mMリン酸ナトリウム及び150mMNaClからなる最終的なバッファー、pH74中に透析した。その後、該材料を、MilliporeCentriprep濃縮装置を用いて20倍濃縮した。具体的な例として、材料を3mMシスチン及び2mMシステインでフォールディングさせたとき、SECによる単量体回収は20であり、生成物のEC50は256pgmLであった。これらの試料によるIL6結合反応速度をSPRで決定した。これを表28に示す。フォールディングは、グアニジン中で変性させた出発材料からの交換及び又は希釈によって生じることもできる。6M塩酸グアニジン及びDTTを含むバッファー、pH80中で28D2cPEGを調製した。その後、該材料を、フォールディングバッファー中に透析するか、又は速やかに希釈した後、該バッファー中に透析し、その後、PBS中に透析した。フォールド中のタンパク質濃度は005~025mgmLであり、フォールドバッファーは、3M尿素、30mMトリスpH85、2mMシステイン、及び2mMシスチンからなっていた。任意に、フォールドバッファーは、400mMアルギニンも含み、任意に、150mMNaClも含んでいた。具体的な例としては、タンパク質濃度が025mgmLであるとき、SECによる単量体回収は22であり、生成物のEC50は150pgmLであった。線状PEG20kDaがN末端又はC末端にコンジュゲートされたscFvの13A8n、13A8c、13A8L、及び31A12cも同様の方法でフォールディングさせた。これらのscFvPEGを8M尿素及びDTTを含むバッファー中で調製し、005~05mgmLの総タンパク質になるまで希釈した。その後、それらを、室温で、3M尿素、30mMトリスpH85、2~6mMシステイン、及び1~3mMシスチンを含むフォールドバッファー中に透析した。交互に、pH8若しくは9、4M若しくは2M尿素、1ポリソルベート80、及び又は4°Cでの透析も用いた。タンパク質は、ポリソルベート80を添加した、又はポリソルベート80を添加していない、尿素を含まないフォールドバッファー中への透析によってフォールディングさせることもできた。フォールディングを、PBS、又は酸化還元系を含むPBS中への透析によって完了させた。具体的な例を表29に示す。回収は、005~01mgmLでのタンパク質フォールディングの場合に最も良好であった。フォールドバッファー中での尿素の非存在下での31A12cPEGのフォールディングによって、生成物中のジスルフィド結合がより多い高分子量種が得られた。PEG化scFvを、異なる温度での安定性について評価し、哺乳動物で発現させた非PEG化scFvと比較した。2つのPEG化種、13A8cPEG及び31A12cPEGは、13~20日間の期間にわたって、その全ての活性を保持していた。PEG化scFvのTm測定によって、これらの分子の安定性がさらに確認された。31A12PEGは、699°CのTmを有することが分かった。13A8PEGは、661°CのTmを有することが分かった。同様のフォールディング方法を、非PEG化scFv例えば、13A8c及び22H8cをフォールディングさせるために用いることができた。これらの方法は、望ましい場合、コンジュゲーションの前にタンパク質をフォールディングさせるのに有用であり得た。具体的な例として、3つのバッチの13A8cを、3M尿素、4mMシステイン、2mMシスチン、30mMトリスを含むバッファー、pH85中、01mgmLの総タンパク質でフォールディングさせ、その後、PBS中に透析した。この再フォールディングプロトコルは再現性があり、SDSPAGEによる3つのバッチからの単量体13A8c回収収率は、それぞれ、37、35、及び44であった。再フォールディングされた非PEG化22H8cscFvは、親mAbと比べて高い効力を保持していた。抗IL6抗IL23scFvPEGコンジュゲートの作製の次の工程は、Ahaなどの非天然アミノ酸を含むscFvの、実施例7で調製されたscFvPEGアルキンコンジュゲートへのコンジュゲーションである。コンジュゲーション反応後、混合物をクロマトグラフィーの組合せによって精製し、その後、再フォールディングプロセスを経ると、所望のscFvPEGscFv二重特異性体が得られる。最終的な材料を、生体活性及び薬物動態特性、並びに疾患モデルにおける効力について評価する。二重特異性体調製における第二の化学工程は、精製された一価体の第二のscFvへのコンジュゲーションである。カップリングは、銅媒介性のヒュスゲン環状付加を介した第二のscFvのAhaに対する一価scFvPEGの遊離のペンダントアルキンの反応によって達成される。いくつかの一価scFvPEGコンジュゲートが良好に作製されており、抗IL6scFvPEG又は抗IL23scFvPEGのどちらかを用いることができる。同様に、Aha含有タンパク質は、抗IL6scFv又は抗IL23scFvのどちらかであることができる。第二の反応については、反応条件が、第一の工程の銅媒介性の環状付加とは異なる。工程1では、反応条件は、反応を助けるために、過剰のPEGビスアルキン及びSDSなどの添加物を用いた。しかしながら、過剰のアルキンの使用は、経済的に実現可能でもないし、精製の観点から望ましくもない。それゆえ、第二の工程は、はるかに厳しい比率のアルキン対アジド反応成分を用いる。さらに、第二の工程のコンジュゲーションは、より大きい希釈で最もうまく行くことが分かった。さらに、このプロセスの第一の工程で利用されるTBTAトリアゾール配位子を最終的に省いた。反応混合物の精製は、実施例7で用いたものと同様の、クロマトグラフィーの混合によって進める。反応混合物をまずCHTカラムに充填し、リン酸塩勾配を用いて溶出させる。所望の画分をプールし、その後、SECカラムに充填する。その後、この材料を、再フォールディング条件用に、さらに処理することができる。上記のプロセスにおいて、コンジュゲーションは、フォールディングに先行する。PEGリンカーの存在は、その後の再フォールディング工程を容易にし、scFvは、最小限の鎖間架橋で独立に再フォールディングする。鎖間架橋は、遺伝子融合によって連結され、かつPEGリンカーを持たない二重特異性コンストラクトでよく生じる重大な障害であり、抗原結合ドメインの相互作用を妨げる。磁気撹拌棒を備えた1Lのガラスビーカー中に、リン酸ナトリウムバッファーを入れた。28D2cAhaの溶液及び31A12cPEGの溶液を添加した。TBTAトリアゾール配位子及びヨウ化銅の溶液を添加すると、沈殿が形成した。混合物を一晩撹拌した。反応混合物をSDSPAGE及びデンシトメトリーで解析した。該反応混合物を2つの遠心分離ボトルに分けて、遠心分離し、上清を捨てた。1つのボトルに、SDSの溶液及びTPPTSの溶液及びリン酸ナトリウムバッファーを添加した。材料が溶解するか又は完全に懸濁されるまで、該ボトルを転頭運動及び旋回させた。中身を第二の遠心分離ボトルペレットに移し、第一の遠心分離ボトルから2部のリン酸ナトリウムバッファーですすぎ落とした。第二の遠心分離ボトルを、ペレットが溶解するまで、旋回させた。該材料を遠心分離した。上清をさらなる精製のために保持した。スクリューキャップ及び小型撹拌棒を備えた2000mLのガラスボトルに、水、及びジチオスレイトールの溶液を添加し、穏やかに撹拌した。scFv13A8cAhaの溶液、次いで、31A12cPEGコンジュゲートの溶液を添加した。MESバッファーの溶液及び硫酸銅を添加した。該ボトルに蓋をし、混合物を最低撹拌速度で一晩撹拌した。反応をSDSPAGE及びデンシトメトリーで解析すると、51の収率が示された。2つのさらなる1000mL反応を同時に実施すると、同様の収率であった。プール反応混合物の一部を遠心分離ボトルに注ぎ入れ、スピニングバケット遠心分離器中で遠心分離した。上清を捨てた。さらなるプール反応混合物をペレットに添加し、再び遠心分離した。該反応混合物が全て処理されてしまうまで、このシークエンスを繰り返した。ペレットに、600mLの以下のバッファー、10mMリン酸塩pH=74、2SDS、及び250mMDTTを添加した。撹拌棒を加え、混合物を30分間撹拌し、次いで50°Cまで5分間温め、その後、室温でさらに撹拌した。固体をガラス棒で破壊した。TPPTSを添加し、混合物を1時間撹拌し、その時点で、固体は全て溶解した。該材料をさらなる精製に回した。セラミックハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組合せを用いて、二重特異性生成物を精製した。磁気撹拌子を備えたスクリューキャップ付きの2000mLのガラスボトル中に、水を入れ、ジチオスレイトールの溶液を添加しながら、この溶液を穏やかに撹拌した。scFv31A12cAhaの溶液及びコンジュゲート13A8cPEGの溶液を添加した。MESバッファー及び硫酸銅の溶液を添加し、ボトルに蓋をした。一晩穏やかに撹拌し続ける。反応混合物のSDSPAGE解析及びデンシトメトリーにより、48の収率が示された。反応を、2つのさらなる1L反応及び7つのさらなる500mL反応を用いて同時に実施すると、49の平均収率であった。プールした6500mLの反応容量を以下のように処理した。2つの遠心分離ボトル中に、各ボトルに、およそ450mLの反応混合物を入れた。スイングバケット遠心分離器中で遠心分離した。上清を捨て、さらなる反応混合物を各回収遠心分離ボトルに添加し、材料を再び遠心分離した。プールした反応容量が全て遠心分離されてしまうまでシークエンスを繰り返し、ペレットを保持した。各ボトルに、撹拌棒、及び以下のバッファー250mMDTT、2SDS、10mMリン酸ナトリウムバッファーを添加した。室温で30分間撹拌した。水浴中に入れ、10分間撹拌した。さらに30分間撹拌し、その時点で、固体は残っていなかった。2つの溶液をプールした後、CHTカラムに充填した。リン酸塩勾配による溶出。所望の画分を、サイズ排除カラムによるさらなる精製によってプールする。小型磁気撹拌子を備えたスクリューキャップ付きの2000mLのガラスボトル中に、水及びDTTの溶液を入れた。この混合物に、31A12cAhaの溶液及び13A8cPEGコンジュゲートの溶液を添加した。MESバッファー及び硫酸銅溶液を添加し、ボトルに蓋をした。混合物を、最低撹拌速度で、一晩穏やかに撹拌した。SDSPAGE及びデンシトメトリーによって、47の収率が示された。2つのさらなる反応を先に記載したのと同じように調製すると、ゲル解析によって、それぞれ、51及び47の収率が得られた。3つの反応容量を合わせ、以下のように処理した。2つの遠心分離ボトル中に、各ボトルに、およそ200mLの反応混合物を入れた。スイングバケット遠心分離器中で遠心分離した。上清を捨て、さらなる反応混合物を各回収遠心分離ボトルに添加し、材料を再び遠心分離した。3つの反応からの反応混合物が全て遠心分離されてしまうまでシークエンスを繰り返し、ペレットを保持した。各ボトルに、撹拌棒、及び以下のバッファー250mMDTT、2SDS、10mMリン酸ナトリウムバッファーを添加した。室温で30分間撹拌した。水浴中に入れ、10分間撹拌した。固体が残った。水浴から取り出し、TPPTS溶液を添加した。撹拌し、その時点で、固体は残っていなかった。溶液をプールした後、CHTカラムに充填した。リン酸塩勾配による材料の溶出によって、二重特異性体及びさらなるタンパク質成分の半精製混合物が得られた。SECによるさらなる精製によって、所望の二重特異性生成物が得られた。大きい磁気撹拌棒を備えた2000mLのガラスビーカー中に、水及びDTTの溶液を入れた。45G5cAhaの溶液及び13A8nPEGの溶液を添加した。硫酸銅溶液を添加し、混合物を一晩撹拌した。第二の同一の反応を先に記載した反応と並行して実施した。反応混合物をSDSPAGE及びデンシトメトリーで評価した。およそ400mLの反応混合物を遠心分離ボトルに注ぎ入れた。スイングバケット遠心分離器中に入れ、遠心分離した。上清を捨てた。反応混合物が全て処理されるまでシークエンスを繰り返し、ペレットだけが残る。該ペレットに、以下のバッファー20mMリン酸ナトリウムバッファー、2SDS、250mMDTTを添加した。30分間穏やかに撹拌した。撹拌しながら、水浴中で10分間温めた。室温に戻し、固体が溶解するまで撹拌した。還元された材料をプールし、さらなる精製をCHTクロマトグラフィー及びSECクロマトグラフィーによって達成した。スクリューキャップ及び磁気撹拌子を備えた2000mLのボトル中に、水及びDTTの溶液を入れて、穏やかに撹拌した。この撹拌溶液に、scFv22H8cAhaの溶液及び13A8cPEGコンジュゲートの溶液を添加した。MESバッファー及び硫酸銅の溶液を添加し、該ボトルに蓋をして、混合物を一晩撹拌した。SDSPAGE解析及びデンシトメトリーによって、60の収率が示された。同じ割合のさらに5つの1150mL反応を同時に実施すると、54の平均収率であった。合わせた6900mLの反応容量を先に記載したのと同様に処理した。2つの500mLの遠心分離ボトルに、およそ450mLの反応容量を入れた。混合物をスイングバケット遠心分離器中で遠心分離した。上清を捨て、さらなる反応混合物を各回収遠心分離ボトルに添加し、材料を再び遠心分離した。6900mL全体が処理されるまで、このシークエンスを繰り返した。各ペレットに、以下のバッファー250mMDTT、2SDS、10mMリン酸ナトリウムバッファーを添加した。室温で30分間撹拌した。固体をへらで粉砕し、撹拌をさらに1時間再開した。2つの溶液を合わせ、CHTカラムに充填し、リン酸塩勾配により溶出させた。半純粋な二重特異性体のさらなる精製をSECクロマトグラフィーによって達成した。磁気撹拌子を備えたスクリューキャップ付きの5000mLのガラスボトル中に、リン酸ナトリウムバッファーを入れた。一価の中間体13A8c40KPEGの溶液及びscFv31A12cAHAの溶液を添加した。該溶液を穏やかに撹拌しながら、MESバッファー及びジチオスレイトールの溶液を添加した。硫酸銅の溶液を添加し、該ボトルに蓋をして、一晩穏やかに撹拌し続けた。反応混合物のSDSPAGE解析及びデンシトメトリーによって、58の収率が示された。反応を、2つのさらなる25L反応及び1つのさらなる10L反応を用いて同時に実施すると、58の平均収率であった。プールした8500mLの反応容量を遠心分離して、固体を全て回収した。該固体を以下の後処理バッファー250mMDTT、2SDS、10mMリン酸ナトリウムバッファーに溶解させた。最終的な溶液をCHTクロマトグラフィー及びSECクロマトグラフィーの組合せによって精製した。磁気撹拌子を備えた8×30mMのバイアル中に、水及びMESバッファーを入れた。これに、31A12c20KPEGの溶液及びscFv13A8LAHAの溶液を添加した。DTTの溶液及び硫酸銅の溶液を添加し、バイアルに蓋をし、室温で一晩撹拌させておいた。翌日、反応混合物をSDSPAGE用にサンプリングした。得られたゲルをレーザーデンシトメトリーで解析し、37の二重特異性体の収率が示された。線状の20kDaPEGリンカーを介して13A8にコンジュゲートされた31A12を、上に示したものと同様の方法でフォールディングさせた。二重特異性分子を、8M尿素及びDTTを含むバッファー、pH73中、005~01mgmLの総タンパク質で調製した。材料は、この段階で、二重特異性分子の他に、若干量の残留未反応31A12PEGscFvを含んでいる可能性があった。その後、該材料を、3M尿素、30mMトリスpH85、4mMシステイン、2mMシスチン中に、室温で一晩透析することによってフォールディングさせた。任意に、1ポリソルベート80、500mMトリス、又は500mMアルギニンも、該フォールドバッファーに添加したか、又はフォールディングを4°Cで実施することができた。フォールディング反応物を20mMリン酸ナトリウム、150mMNaCl、pH74中にさらに透析した。具体的な例としては、4つのバッチの01mgmLの31A12cPEG13A8cを、3M尿素、30mMトリスpH85、4mMシステイン、2mMシスチン中、室温で再フォールディングさせ、その後、PBS中に透析した。この再フォールディングプロトコルは再現性があり、同様の単量体二重特異性scFv回収収率及びEC50をもたらした。単量体タンパク質を回収し、得られた分子は、親分子と比べて高い生体活性を保持していた。重要なことに、フォールディングは、大量の31A12cPEGscFvの存在下でもうまく行った。さらに、表面プラズモン共鳴データによって、IL6標的とIL23標的の両方に対する二重特異性体の両方の末端の生体活性がさらに確認された。20kDa線状PEGリンカーを用いて作製された、二重特異性体のインビボ薬物動態を、裸のscFvのPKと比較した。scFv単体は極めて迅速に排泄され、約2時間の終末t12、500pgmlのCmax、1~2時間のtmaxを有し、8時間までにほぼ完全に除去された。該二重特異性体は、はるかにより長いインビボ半減期を示し、約24時間の終末t12、1500pgmlのCmax、24時間のtmax、及び100時間での血清中での検出可能なレベルを有していた。二重特異性scFvの薬物動態挙動のこの改善により、それは、単純なscFvよりもはるかに強力でかつ効果的な治療薬になる。同じフォールディング方法をPEG化二重特異性13A8nPEG2031A12cに用いることができた。2つのバッチの01mgmLのタンパク質を、3M尿素、30mMトリスpH85、4mMシステイン、2mMシスチン中でフォールディングさせ、その後、PBS中に透析した。両方のバッチから、SECによる>95の単量体回収、哺乳動物由来の13A8scFvの場合の59pgmlというEC50と比べて、それぞれ、二重特異性体によるIL6の中和についての1674pgmL及び1691pgmLのEC50、並びにそれぞれ、IL23の中和についての4956pgmL及び3249pgmLのEC50が得られた。単量体タンパク質は、良好な収率で回収された。13A8nPEG45G5cを、31A12に基づく二重特異性体についての方法と同様の方法でフォールディングさせた。01mgmLのタンパク質を、3M尿素、30mMトリスpH85、4mMシステイン、2mMシスチン中でフォールディングさせ、その後、PBS中に透析した。これにより、SECによる29の単量体回収、並びにIL6に対する933pgmLのEC50、及びIL23に対する5662pgmLのEC50が得られた。13A8cPEG22H8cを上と同様の方法でフォールディングさせた。13A8cPEG22H8cを、8M尿素及びDTTを含むバッファー中で調製し、005~01mgmLの総タンパク質になるまで希釈した。その後、それらを、室温で、3M尿素、30mMトリスpH85、2~6mMシステイン、及び1~3mMシスチンを含むフォールドバッファー中に透析した。交互に、pH8若しくは9、001~1ポリソルベート80、及び又は4°Cでの透析も用いた。フォールディングをPBS中への透析により終了させた。具体的な例としては、01mgmLの13A8cPEG22H8cを、3M尿素、30mMトリスpH85、4mMシステイン、2mMシスチン、005ポリソルベー80中で、室温でフォールディングさせ、その後、005ポリソルベート80を含むPBS中に透析した。これにより、SECによる35の単量体回収、並びにIL6の中和についての246pgmLのEC50、及びIL23の中和についての234pgmLのEC50が得られた。13A8c40KPEG31A12cを、20K二重特異性体についての方法と同様の方法でフォールディングさせた。01mgmLのタンパク質を、3M尿素、30mMトリスpH85、4mMシステイン、2mMシスチン中で、4°Cでフォールディングさせ、その後、4°CでPBS中に透析した。これにより、SECによる563回収、並びにIL6に対する1375pgmLのEC50及びIL23に対する2699pgmLのEC50が得られた。さらに、13A8c40KPEG31A12cを、室温と4°Cの両方の温度での、05M塩酸グアニジンを含む再フォールディングバッファー中への透析によって、より高い濃度で再フォールディングさせることもできた。13A8c40KPEG31A12c二重特異性体のインビボ薬物動態を、13A8c20KPEG31A12c、13A8cPEG、及び裸の28D2のPKと比較した。被験物質をラットの皮下に1mgkg又は05mgkgで投与した。投与後に時間間隔を空けて採血し、血清を、B9IL6中和アッセイを用いて、被験物質の存在についてアッセイした。結果は、裸のscFvが速やかに排除される一方で、二重特異性体及び13A8cPEGが、有意により大きい半減期及びAUCを有することを示している。13A8c40KPEG31A12cもまた、13A8c20KPEG31A12cと比べて有意に増大したAUCを示している。再フォールディングした二重特異性コンジュゲートは、4°Cで最大6カ月間の優れた安定性を示した。13A8PEG31A12二重特異性体は、抗IL6アッセイと抗IL23アッセイの両方で一貫した効力を示した。SDSPAGE解析でもSECクロマトグラフィーでも、分解はほとんど観察されなかった。Th17T細胞サブセット及びTh22T細胞サブセットは、抗CD3抗CD28を用いた全PBMC若しくは純化T細胞の刺激によるか、又は混合リンパ球培養物中の同種異系細胞によるかのどちらかによって、インビトロで分化させることができる。そのようなT細胞の分化は、Th17細胞について特に十分に特徴付けられているいくつかの重要な調節性サイトカインの添加をさらに必要とする。これらの調節性サイトカインは、主に骨髄性細胞に由来しており、該調節性サイトカインの添加は、骨髄性細胞をその調節性サイトカインを放出するように刺激する化合物と併せた該骨髄性細胞の添加と置き換えることができる。LPSを抗CD3とともに用いて、Th17細胞へと分化するように全PBMCを刺激した。多くの研究者により、骨髄性細胞に由来するこれらのサイトカインが、純化されたナイーブT細胞からのTh17の分化を促進することが以前に示されているように、最も良好な結果は、IL1及びTGFβも添加したときに得られた。Th17T細胞及びTh22T細胞は、骨髄性細胞をその調節性サイトカインを放出するように誘導する刺激物質を添加して、同種異系混合リンパ球培養物中で分化させることもできる。ペプチドグリカンは、IL1、IL6、TNF、並びに他の調節性サイトカイン及び炎症促進性サイトカインの分泌を誘導することが知られているので、ペプチドグリカンをその刺激物質としてMLCに添加した。Th22細胞の誘導を研究することが目的である場合、IL2の添加も必要であった。PBMCを抗CD328LPS及びTGFβで刺激した。5日後、それらをPMAイオノマイシンで再刺激して、サイトカイン分泌を誘導し、IL17の発現についてフローサイトメトリーで解析した。PBMC培養物中のTh17細胞のパーセンテージは、これらの培養条件の結果として3倍になった。IL23アンタゴニストと組み合わせてIL6を含めると、Th17細胞の3倍化が妨げられた。Th22細胞は、抗CD328刺激でも見られる。同種異系白血球を用いるインビトロのヒトT細胞のインビトロ刺激もまた、高レベルのIL17産生T細胞を誘導した。個々のIL6アンタゴニスト及びIL23アンタゴニストの添加は、抗CD328培養系でのTh17分化及びTh22分化を阻害した。2つのアンタゴニスト、31A12scFv及び13A8scFvの組合せは、どちらかのアンタゴニスト単独よりも効果的であった。これは、先の実験と同じアンタゴニストによるMLC中でのTh17の阻害の場合にも当てはまる。13A8c20kPEG31A12c二重特異性体は、親キメラmAbである13A8及び31A12の組合せよりも活性があり、どちらかのmAb単独よりも、MLC中でのTh17細胞の阻害が良好であった。これは、本発明の二価の二重特異性コンストラクトを用いることによって得られる有益な効果を示している。インビボでのTH17及びTH22分化の阻害を評価するために、異種移植片モデルを使用した。このモデルでは、ヒト造血幹細胞が免疫不全マウスに移植され、それにより、ヒト免疫系が獲得されている。これらのヒト化NODscidIL2rgnullマウスに、マウスに存在するヒト免疫細胞と同種異系のヒト皮膚を移植する。その後、それらを、IL6及びIL23のPEG化scFvアンタゴニストの混合物で処置する。その後、ヒト免疫系は、ヒトT細胞のエフェクター細胞への分化を介して、この同種異系ヒト皮膚を拒絶する。IL6アンタゴニスト及びIL23アンタゴニストは、同種異系皮膚移植の1つの結果であるTh17細胞の分化を阻害したが、これらのアンタゴニストは、皮膚同種移植片の拒絶を阻害せず、その狙いを定めた免疫抑制効果を反映した。簡潔に述べると、新生NSGマウスに放射線照射し、臍帯血由来のヒト造血幹細胞を注射し、その後、12週での末梢血中の生着レベルをスクリーニングした。生着に成功したマウスに、ヒト同種異系皮膚を移植し、100μgの抗IL6及び抗IL23を2日おきに投与した。皮膚移植から30日後、脾臓を摘出し、単一細胞懸濁液をPMAイオノマイシンで刺激し、細胞内サイトカインについてアッセイした。CD3CD4細胞を、IL17及びIL22産生についてフローサイトメトリーで解析した。サイトカインアンタゴニストで処置していないマウスでは、フローサイトメトリープロファイル、及び各サブセット中のTh細胞の数を表す収集データに示すように、極めて顕著なレベルのTH17細胞及びTH22細胞が発達した。皮膚移植後、マウスを、抗IL6と抗IL23の組合せで30日間処置した。処置マウスにおけるTH17細胞及びTH22細胞の分化は、完全に阻害された。これらのデータは、IL6及びIL23が、これらのTH17細胞及びTH22細胞のインビボ分化に必要であることを初めて明確に示している。さらに、これらのデータは、この動物モデルが、ヒトT細胞分化の誘導及び調節をすることができるモデルであることを示している。最後に、これらのデータは、これらのサイトカインの作用をインビボで完全に阻害するためにここで用いられているIL6アンタゴニスト及びIL23アンタゴニストの有効性を示している。同様の結果は、13A8c20kPEG31A12c抗IL6抗IL23二重特異性体についても得られた。図32A~Cに示すように、この二重特異性分子は、一価の抗IL23試薬よりもTh17分化を阻害するのに効果的である。しかしながら、TH1722以外の細胞型の白血球マーカーが有意には低下しなかったので、図32D~Lは、該二重特異性体が、一般に免疫抑制性であるわけではないことを示している。炎症部位でのTh17エフェクター機能の阻害を評価するために、ヒトの乾癬皮膚が免疫不全scidマウスに移植されているscidhu乾癬モデルを用いた。皮膚移植片及び乾癬炎症は、最大2カ月間存続する。このマウスを薬物で2週間処置し、炎症に対する効果を、図33に示すような組織学的解析で測定する。この解析では、13A8c20kPEG31A12c抗IL6抗IL23二重特異性体の効果を、表皮厚の有意な低下に明白に見ることができる。この効果は、組織学的切片から定量することもできる。13A8c20kPEG31A12cとその一価抗IL6阻害剤成分、又はIL6アンタゴニストmAbのトシリズマブとの比較は、移植片がまだマウス表面に存在する間の、病理学者による半定量的臨床スコアリング、又は上記のような組織学的切片における表皮厚の定量的測定のどちらかによって測定される、どちらかのIL6アンタゴニスト単体に対する13A8c20kPEG31A12cの有意な優位性を示している。さらに、13A8c20kPEG31A12cは、TNFアンタゴニストのEnbrelよりも素速く炎症を阻害するように作用する。ヒトIL23はマウスIL23受容体に作用することができるので、ヒトIL23をマウスの耳に皮内注射すると、該IL23は炎症を引き起こす。耳に4日間毎日IL23を注射することにより、ヒトIL23によって誘導される耳の炎症を阻害する13A8cPEG31A12cの能力を測定した。その後、耳の腫脹を測定した。IL23処置が始まる前日に始めて、IL23処置が始まった翌日に、マウスを処置し、この処置は、耳の腫脹を効果的に阻止した。13A8cPEG31A12cは、図35Cに示すように、IL1223アンタゴニストmAbのSteleraと少なくとも同じくらい効果的であった。重要なことに、20kDaPEG又は40kDaPEGのどちらかを用いて作製された13A8cPEG31A12cによるマウスの処置は、IL23処置が始まる前日にしか投与されない場合でも、耳の腫脹の非常に効果的な阻害剤となった。31A12mAbは、これまでに記載されていない独特のエピトープに結合する。使用されたmAbは全て、ヒトIL12に結合するが、31A12及び49B7は、IL23阻害に特異的であり、ヒトIL12を阻害しない。これらのデータは、これらのmAbがp40鎖に結合することを明白に示している。31A12及び49B7は、IL12も阻害する22H8と比べて、比較的弱くヒトIL12に結合する。しかしながら、3つのmAbは全て、サルIL12に強く結合し、かつサルIL12生体活性も阻害する。したがって、31A12及び49B7は、ヒトIL12活性とサルIL12活性を識別する。31A12及び49B7は、ヒトIL12で部分的にマスクされ、サルIL12、及び両方の種由来のIL23で露出しているp40エピトープを認識するようである。さらに、AZ17は、ヒトIL12とヒトIL23の両方を阻害するp40特異的mAbである、ウステキヌマブの結合を阻害しない。