"FEAT遺伝子に対するプローブ若しくはFEAT遺伝子の増幅用プライマー、又はFEATタンパク質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の検出用試薬。以下のa若しくはcの物質又はbの細胞を含む、腫瘍の予防用医薬組成物。aFEAT遺伝子の発現若しくはFEATタンパク質の活性を阻害する物質bFEATタンパク質に反応する免疫細胞cFEATタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記aの物質若しくは前記bの細胞を担持した物質FEAT遺伝子の発現を阻害する物質がFEAT遺伝子に対するsiRNAである請求項2に記載の医薬組成物。FEATタンパク質の活性を阻害する物質がFEATタンパク質に対する抗体である請求項2に記載の医薬組成物。免疫細胞がT細胞、B細胞又は樹状細胞である請求項2に記載の医薬組成物。生体から採取された被験試料と請求項1に記載の試薬とを反応させることを特徴とする、腫瘍の検出方法。被験試料が血液、体液又は組織切片である請求項6に記載の方法。FEAT遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物からなる、腫瘍のモデル動物。以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2010年8月16日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願特願2010-181835号の明細書及び図面に記載の内容を包含する。本発明者らは、FEATタンパク質が多種多様な腫瘍組織において過剰発現しており、FEATタンパク質が腫瘍形成に寄与することを見出した。FEAT遺伝子及びタンパク質は、正常組織では殆ど全ての組織で発現が認められず、僅かに精巣、脳、肝臓に弱く発現しているのみである。一方、FEAT遺伝子は、卵巣癌、肺癌、肝癌、直腸癌、子宮頸癌、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、胃癌、咽頭癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌を含む多種多様な腫瘍組織において、普遍的に発現している図5B。本発明者らは、ヒトの癌形成において、FEATタンパク質が、腫瘍性形質変化に先立って生じていることを見出した図13。また、本発明者らは、FEATタンパク質を培養細胞で過剰発現させることにより、発癌経路であるチロシンキナーゼ受容体のシグナル経路及びHedgehogシグナル経路が活性化されることを見出し図5D、更に、FEATタンパク質を過剰発現させたトランスジェニックマウスにおいて、種々の器官で腫瘍組織が形成されることを確認している図7A~図7C。従って、現時点では腫瘍化していない細胞であっても、FEATタンパク質を発現している細胞は、将来腫瘍化する可能性が高い細胞前癌細胞であるといえる。ここで、本発明において腫瘍マーカーとして使用されるFEATについて説明する。FEATタンパク質は、comparativegeneidentification-01CGI-01、KIAA0859又はmethyltransferaselike13METTL13とも呼ばれる遺伝子にコードされるタンパク質である。FEATタンパク質は、カスパーゼ3により切断されるが、カスパーゼ6では切断されない図2B。また、FEATタンパク質は、細胞のアポトーシスを抑制する機能を有する図4C。ヒトFEAT遺伝子のヌクレオチド配列及びヒトFEATタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1AccessionNumber:NM_015935及び2に示す通りである。また、野生型FEATタンパク質配列番号2だけではなく、その変異体、例えば、カスパーゼ3により切断される部位の第274番目配列番号2のアスパラギン酸がアラニンで置換されたD274A変異及びカスパーゼ3により切断される部位の第288番目配列番号2のアスパラギン酸がアラニンで置換されたD288A変異又はこれらの両変異を有する変異体は、カスパーゼ3により切断されにくいため、より強いアポトーシス抑制機能を有する図3B。また更に、完全長FEATタンパク質配列番号2だけではなく、その断片、特にFEATタンパク質のアミノ酸配列の第289~699番目のアミノ酸からなる配列を含む断片は、アポトーシス抑制機能を有する。また、FEATタンパク質は、2つのS-アデノシルメチオニン結合モチーフSAM結合モチーフを含む。SAM結合モチーフは、メチル基転移酵素及びその関連酵素に特徴的なモチーフであるが図1B、FEATタンパク質が、メチル基転移酵素活性を有するかどうかはまだ明らかではない。SAM結合モチーフのコンセンサス配列としては、例えば、以下の配列が挙げられる。上記のFEATタンパク質及びFEAT遺伝子は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。1.腫瘍の検出用試薬本発明は、FEAT遺伝子に対するプローブ若しくはFEAT遺伝子の増幅用プライマー、又はFEATタンパク質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の検出用試薬を提供する。FEAT遺伝子又はFEATタンパク質は、腫瘍細胞又は前癌細胞で広く特異的に発現されており、正常細胞では殆ど発現されていないため、被検細胞からFEAT遺伝子又はFEATタンパク質が検出された場合には、該被検細胞は、腫瘍細胞又は前癌細胞であると判断することができる。ここで、FEAT遺伝子には、上記で述べた配列番号1に示す塩基配列を有するヒトの野生型FEAT遺伝子の他に、ヒト以外の種に由来するFEATホモログ遺伝子並びにこれらの変異型遺伝子が含まれる。具体的には、FEAT遺伝子の例として、以下のa~eからなる群より選択されるいずれか1つのポリヌクレオチドが挙げられる。a配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドb配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドc配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドd配列番号2のアミノ酸配列に対して、60以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドe配列番号1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド上記a~eのポリヌクレオチドのうち、a及びbは、ヒト野生型FEAT遺伝子であり、c~eは、ヒト以外の種に由来するFEATホモログ遺伝子及び変異型FEAT遺伝子である。FEAT遺伝子は、DNA又はRNAメッセンジャーRNAのいずれであってもよい。本明細書中、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、例えば、配列番号1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号2に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、SambrookRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3,ColdSpringHarbor,LaboratoryPress2001及びAusubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。本明細書中、ストリンジェントな条件とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。低ストリンジェントな条件は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5SDS、50ホルムアミド、32°Cの条件である。また、中ストリンジェントな条件は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5SDS、50ホルムアミド、42°Cの条件である。高ストリンジェントな条件は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5SDS、50ホルムアミド、50°Cの条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphosDirectLabellingandDetectionSystemGEHealthcareを用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55°Cの条件下で0.1w/vSDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号2に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドと50以上、60以上、70以上、80以上、85以上、90以上、91以上、92以上、93以上、94以上、95以上、96以上、97以上、98以上、99以上、99.5以上、又は99.9以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。塩基配列の同一性は、FASTAScience2274693:1435-1441,1985や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLASTBasicLocalAlignmentSearchToolProc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268,1990;ProcNatlAcadSciUSA90:5873,1993を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTN、BLASTXやBLASTPと呼ばれるプログラムが開発されているAltschulSF,etal:JMolBiol215:403,1990。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=100、wordlength=12とする。上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。本発明において、FEAT遺伝子に対するプローブ以下、本発明のプローブという又はFEAT遺伝子の増幅用プライマー以下、本発明のプライマーというの例としては、FEAT遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。ストリンジェントな条件は、先に述べたとおりである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、5~500bp、より好ましくは、10~200bp、さらに好ましくは、10~100bpの長さのヌクレオチド鎖を意味する。オリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置例えば、AKTAoligopilotplus10/100GEHealthcareを用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関例えば、Promega社又はTakara社等に委託することもできる。本発明の試薬が、FEAT遺伝子に対するプローブを含む場合、腫瘍を検出するためのアッセイ方法としては、該腫瘍に発現しているFEAT遺伝子に対するノーザンブロッティングSambrook,FritschandManiatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndEdition1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress、マイクロアレイAffymetrix社;米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照又はTaqManPCRSambrook,FritschandManiatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndEdition1989,ColdSpringHarborLaboratoryPressが挙げられる。また、本発明の試薬が、FEAT遺伝子に対するプライマーを含む場合、腫瘍の検出方法としては、該腫瘍に発現しているFEAT遺伝子に対するPCR増幅又はシークエンスSambrook,FritschandManiatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndEdition1989,ColdSpringHarborLaboratoryPressが挙げられる。本発明の試薬は、プローブ及びプライマーの両方を含んでいてもよい。本発明において、FEATタンパク質には、配列番号2に示すアミノ酸配列からなるヒト野生型FEATタンパク質だけではなく、ヒト以外の種に由来するFEATホモログタンパク質並びにこれらの変異型タンパク質が含まれる。また、FEATタンパク質の切断により生じた断片であって、腫瘍促進機能を有する断片も、FEATタンパク質に含まれる。FEATタンパク質の具体例としては、以下のf、g若しくはhのポリペプチド又はその断片が挙げられる。f配列番号2に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドg配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチドh配列番号2に示すアミノ酸配列に対して60以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチド上記g又はhに記載のポリペプチドは、代表的には、ヒト以外の種に由来するFEATホモログタンパク質又は野生型FEATタンパク質の変異タンパク質であるが、これら以外にも、例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをベースに、SambrookRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3,ColdSpringHarborLaboratoryPress2001、Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons1987-1997、Nuc.Acids.Res.,10,64871982、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,64091982、Gene,34,3151985、Nuc.Acids.Res.,13,44311985、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4881985等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるポリペプチドも含まれる。本明細書中、配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチドとしては、配列番号2に示すアミノ酸配列において、例えば、1~100個、1~90個、1~80個、1~70個、1~60個、1~50個、1~40個、1~30個、1~20個、1~10個、1~9個1~数個、1~8個、1~7個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、又は1個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチドが挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなポリペプチドとしては、配列番号2に示すアミノ酸配列と60以上、65以上、70以上、75以上、80以上、85以上、90以上、91以上、92以上、93以上、94以上、95以上、96以上、97以上、98以上、99以上、99.1以上、99.5以上、又は99.9以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチドが挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。アミノ酸配列の同一性は、FASTAScience2274693:1435-1441,1985や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLASTBasicLocalAlignmentSearchToolProc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268,1990;ProcNatlAcadSciUSA90:5873,1993を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTN、BLASTXやBLASTPと呼ばれるプログラムが開発されているAltschulSF,etal:JMolBiol215:403,1990。アミノ酸配列の解析には、一般的にBLASTPが用いられ、アミノ酸配列の同一性を解析する場合であって、60以上の同一性を有するアミノ酸を検索するときには、パラメーターは、例えばscore=60、wordlength=3とする。被検タンパク質が、腫瘍促進機能を有するかどうかは、被検タンパク質又はその遺伝子を、FEATを発現しない適切な正常宿主細胞例えば、ヒト好中球に導入し、該宿主細胞を適切な培養条件下でインキュベートし、宿主細胞の腫瘍形成を観察することにより、確認することができる。ある態様では、腫瘍促進機能は、アポトーシス抑制機能である。被検タンパク質が、アポトーシス抑制機能を有するかどうかは、被検タンパク質又はその遺伝子を、FEATを発現しない適切な宿主細胞例えば、ヒト好中球に導入し、該宿主細胞を適切な培養条件下でインキュベートし、宿主細胞群に含まれる断片化DNA含有アポトーシス細胞の量をフローサイトメトリーで解析して、アポトーシス細胞数を測定することにより、確認することができる。本発明において、1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加された形態としては、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加が生じていてもよく、欠失、置換及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。また、アミノ酸残基の付加が生じている場合、該アミノ酸残基は、アミノ酸配列中に挿入される態様で付加されていてもよく、あるいはアミノ酸配列のN末端又はC末端に付加されていてもよい。以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン;B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸;C群:アスパラギン、グルタミン;D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸;E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン;F群:セリン、スレオニン、ホモセリン;G群:フェニルアラニン、チロシン。また、上記FEATタンパク質は、Fmoc法フルオレニルメチルオキシカルボニル法、tBoc法t-ブチルオキシカルボニル法等の化学合成法によっても製造することができる。また、AdvancedAutomationPeptideProteinTechnologies社製、PerkinElmer社製、、ProteinTechnologies社製、PerSeptive社製、AppliedBiosystems社製、SHIMADZU社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。FEATタンパク質は、腫瘍細胞又は前癌細胞において発現しているが、アポトーシス細胞死を起こした場合、細胞に内在するカスパーゼ3により切断されるため、腫瘍細胞又は前癌細胞には、FEATタンパク質の断片も含まれることもある。従って、本発明の試薬は、FEATタンパク質の全長または断片を検出する。前記断片は、特に限定されないが、好ましくは、配列番号2に示すアミノ酸配列の第289~699番目のアミノ酸からなる配列を含む断片である。この断片は、全長よりも弱いながらも腫瘍促進機能を有する点で好ましい。FEATタンパク質又はその断片に対する抗体以下、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。1ポリクローナル抗体の作製上記抗体を作製するに当たり、まず、免疫源抗原として用いるFEATタンパク質を調製する。抗原となるFEATタンパク質は、FEATタンパク質のアミノ酸配列に基づいて遺伝子工学的に作製することができる。次に、得られた精製FEATを動物に免疫する。免疫は、FEATタンパク質を含む溶液を、哺乳動物例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ等に投与することにより行う。投与は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入して行う。必要に応じて適宜アジュバントを添加することもできる。続いて、免疫により得られる血清抗血清を採取する。血清の採取は限定されるものではなく、常法に従い、最終投与日から1~28日後に免疫した動物の血液から採取することができる。採取した抗血清の中から、公知の免疫検定法immunoassayを用いて目的の抗血清をスクリーニングする。上記スクリーニングによる目的の抗血清に含まれる抗体はポリクローナル抗体である。当該抗体の精製を必要とする場合は、例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を単独で、又は2種以上を組み合わせることができる。2モノクローナル抗体の作製抗原及びその溶液の調製、並びに免疫方法は、上記ポリクローナル抗体の作製の場合と同様に行うことができる。抗原の最終投与の日から1~14日後に、抗体を産生する細胞抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が好ましく、脾臓細胞がより好ましい。採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことにより、融合細胞ハイブリドーマを得る。ミエローマ細胞としては、例えば、PAI、P3X63-Ag.8.U1P3U1、NS-1などを用いることができる。上記細胞融合は、例えば、RPMI-1640培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合して融合反応させることにより行う。融合反応は、一般には、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で行うことが好ましい。あるいは、エレクトロポレーションを利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。融合反応後の細胞は、例えばHAT選択培地による培養を行う。上記培養後、HAT選択培地での増殖が認められる細胞が融合細胞ハイブリドーマとなる。上記培養により得られたハイブリドーマから、目的のハイブリドーマをスクリーニングする。硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を、単独で、又は適宜組み合わせて用いることで前記ハイブリドーマからモノクローナル抗体を精製することができる。モノクローナル抗体の作製方法については、米国特許第4,816,567号を参照することができる。また、本発明においては、ヒト型化抗体、ヒト抗体、前記抗体の断片も使用することが可能である。ヒト型化抗体は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その超可変領域の相補性決定領域CDRの一部又は全部がマウスモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域のフレームワーク領域FRがヒト免疫グロブリン由来の可変領域のFRであり、かつその定常領域がヒト免疫グロブリン由来の定常領域である抗体である。ヒト抗体とは、免疫グロブリンを構成する全ての領域がヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体をいう。ヒト型化抗体及びヒト抗体の作製方法については、以下の文献を参照できる:RiechmannL.etal.1988Nature3326162:332-323;特許公報第2912618号。3抗体断片抗体断片とは、上記抗体の抗原結合領域を含む部分断片を意味し、具体的にはFab’2、Fab’、Fab、Fvvariablefragmentofantibody、scFvsinglechainFv、dsFvdisulphidestabilisedFv等が挙げられる。本発明の試薬が、FEATタンパク質に対する抗体を含む場合、腫瘍を検出するためのアッセイ方法としては、該腫瘍に発現しているFEATタンパク質に対する免疫組織染色法LoretteC.Javoised.ImmunocytochemicalMethodsandProtocolsMethodsinMolecularBiologyHumanaPress;2ndeditionFebruary15,1999、免疫沈降法、アフィニティークロマトグラフィー、プルダウンアッセイ、EnzymeLinkedImmunosorbentAssayELISA及びウェスタンブロッティングGaryC.HowardandMatthewR.Kasered.MakingandUsingAntibodies:APracticalHandbookCRCPress;1steditionDecember13,2006、抗体マイクロアレイChagaGS2008.Antibodyarraysfordeterminationofrelativeproteinabundances.MethodsMol.Biol.441:129-51;RivasLA,Garc▲i▼a-VilladangosM,Moreno-PazM,Cruz-GilP,G▲o▼mez-ElviraJ,ParroVNovember2008.A200-antibodymicroarraybiochipforenvironmentalmonitoring:searchingforuniversalmicrobialbiomarkersthroughimmunoprofiling.Anal.Chem.8021:7970-9等が挙げられる。2.腫瘍の予防用医薬組成物本発明者らは、腫瘍形成過程において、FEATタンパク質が、極めて早期の段階腫瘍性形質変化前から発現しており、さらにFEATタンパク質の発現が腫瘍形成を促進することを見出した。従って、既に腫瘍化したFEAT発現細胞を破壊すると同時に、前癌段階のFEAT発現細胞も破壊することにより、腫瘍の発達を阻害し、腫瘍形成を予防することが可能である。また、本発明者らは、FEATタンパク質自体がアポトーシス抑制機能を有しており、FEATタンパク質の発現によって癌化シグナル経路が活性化されていることを見出した。従って、FEATタンパク質又はその遺伝子の機能を阻害して、腫瘍細胞又は前癌細胞のアポトーシス細胞死を誘導することにより、腫瘍の形成を予防することも可能である。よって、本発明は、以下のi若しくはiiの物質又はiiiの細胞を含む、腫瘍の予防用医薬組成物を提供する。iFEAT遺伝子の発現若しくはFEATタンパク質の活性を阻害する物質iiFEATタンパク質に反応する免疫細胞iiiFEATタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記iの物質若しくは前記iiの細胞を担持した物質i-1FEAT遺伝子の発現を阻害する物質上記iに記載のFEAT遺伝子の発現を阻害する物質の具体例としては、FEAT遺伝子のメッセンジャーRNAmRNAの発現量を低下させる物質、例えば、低分子化合物、ホルモン、タンパク質及び核酸等が挙げられ、1つの実施態様では、FEAT遺伝子の機能又は発現を抑制する核酸である。このような核酸の例としては、RNA干渉RNAi用のsiRNAsmallinterferingRNAを生じさせる、ヘアピン状のshRNAShortHairpinRNA、二本鎖RNADoubleStrandedRNA:dsRNA、アンチセンス核酸、デコイ核酸、又はアプタマーなどが挙げられる。これらの阻害性核酸により、上記遺伝子の発現を抑制することが可能である。阻害の対象となるFEAT遺伝子の塩基配列は上記の通りであり、それぞれ配列情報を入手することができる。本発明において、FEAT遺伝子の塩基配列は配列番号1に示すものであるが、FEATのコード領域のみならず、非コード領域を使用することも可能である。1RNA干渉本発明者らは、shRNAを用いたRNAiにより宿主細胞のFEAT発現をノックダウンし図3C、該宿主細胞のアポトーシスを促進することに成功している図3D。RNAiは、複数の段階を経て行われるマルチステッププロセスである。最初に、RNAi発現ベクターから発現したdsRNA又はshRNAがDicerによって認識され、21~23ヌクレオチドのsiRNAsに分解される。次に、siRNAsはRNA誘導型サイレンシング複合体RNA-InducedSilencingComplex:RISCと呼ばれるRNAi標的複合体に組み込まれ、RISCとsiRNAsとの複合体がsiRNAの配列と相補的な配列を含む標的mRNAに結合し、mRNAを分解する。標的mRNAは、siRNAに相補的な領域の中央で切断され、最終的に標的mRNAが速やかに分解されてタンパク発現量が低下する。最も効力の高いsiRNA二重鎖は、19bpの二重鎖の各3’末端にウリジン残基2個の突出部分を持つ21ヌクレオチド長の配列であることが知られているElbashirS.M.etal.,GenesandDev,15,188-2002001。一般に、mRNA上の標的配列は、mRNAに対応するcDNA配列から選択することができる。但し、本発明においてはこの領域に限定されるものではない。siRNA分子は、当分野において周知の基準に基づいて設計できる。例えば、標的mRNAの標的セグメントは、好ましくはAA、TA、GA又はCAで始まる連続する15~30塩基、好ましくは19~25塩基のセグメントを選択することができる。siRNA分子のGC比は、30~70、好ましくは35~55である。あるいは、RNAiの標的配列は、Ui-TeiK.etal.2004NucleicAcidsRes.32,936-948の記載に沿って適宜選択することができる。例えば、ヒトFEAT遺伝子に対するRNAiを行う場合、FEATcDNAのOpenReadingFrame領域の第183、259、1385、1550、1634、2056番目を始点とする19塩基対の下記塩基配列それぞれ、配列番号3、4、5、6、7、8を標的としてRNAiを行うことにより、FEAT遺伝子の発現を抑制することができる。siRNAを細胞に導入するには、合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、2本鎖RNAをアニールする方法などを採用することができる。また、本発明は、RNAi効果をもたらすためにshRNAを使用することもできる。shRNAとは、ショートヘアピンRNAと呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Aとし、配列Aに対する相補鎖を配列Bとすると、配列A、スペーサー、配列Bの順でこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するように連結し、全体で45~60塩基の長さとなるように設計する。スペーサーの長さも特に限定されるものではない。配列Aは、標的となるFEAT遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Aの長さは19~25塩基、好ましくは19~21塩基である。さらに、本発明は、マイクロRNAを用いてFEAT遺伝子の発現を阻害することができる。マイクロRNAmiRNAとは、細胞内に存在する長さ20~25塩基ほどの1本鎖RNAであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているncRNAnoncodingRNAの一種である。miRNAは、RNAに転写された際にプロセシングを受けて生じ、標的配列の発現を抑制するヘアピン構造を形成する核酸として存在する。miRNAも、RNAiに基づく阻害性核酸であるため、shRNA又はsiRNAに準じて設計し合成することができる。RNAi用の発現ベクターは、pMuniH1プラスミド、pSINsiベクタータカラバイオ、pSIF1-H1システムバイオサイエンス社等をベースに、市販のDNA/RNAシンセサイザー例えば、AppliedBiosystems394型を用いて容易に作製することができる。あるいは、RNAi用の発現ベクターは、コスモバイオ株式会社、タカラバイオ株式会社、Invitrogen社、Promega社等の第三者機関に作製を委託することもできる。2アンチセンス核酸本発明の別の態様において、FEAT遺伝子の発現を阻害するためにアンチセンス核酸を使用することができる。アンチセンス核酸は、FEAT遺伝子のmRNA又はDNA配列に結合できる一本鎖核酸配列RNA又はDNAのいずれかである。アンチセンス核酸配列の長さは、少なくとも14ヌクレオチドであり、好ましくは14~100ヌクレオチドである。アンチセンス核酸は、上記遺伝子配列に結合して二重鎖を形成し、FEAT遺伝子の転写又は翻訳を抑制する。アンチセンス核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、一般的に用いられるDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。3デコイ核酸本発明の別の態様では、デコイ核酸と呼ばれるおとり核酸を使用することにより、FEAT遺伝子の発現を阻害することができる。デコイ核酸は、FEAT遺伝子又はFEAT受容体遺伝子の転写因子に結合してプロモーター活性を抑制することにより、FEAT遺伝子発現を抑制する核酸であって、転写因子の結合部位を含む短いおとり核酸を意味する。この核酸が癌細胞内に導入されると、転写因子がこの核酸に結合する。これにより、転写因子のゲノム結合部位への結合が競合的に阻害され、その結果、転写因子の発現が抑制される。本発明の好ましいデコイ核酸としては、例えばFEAT遺伝子のプロモーターに結合する核酸、あるいはFEATのmRNAやFEATの上流に存在する因子のプロモーターに結合する核酸などが挙げられる。デコイ核酸は、FEAT遺伝子のプロモーター配列をもとに、1本鎖又は2本鎖として設計することができる。デコイ核酸の長さは特に限定されるものではなく、15~60塩基、好ましくは20~30塩基である。デコイ核酸は、DNAでもRNAでもよく、修飾された核酸が含まれていてもよい。本発明で用いられるデコイ核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術に一般的に用いられるDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、PCR法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。さらに、細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、塩基等にアルキル化、アシル化等の化学修飾を付加することができる。なお、デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、一般的に行なわれるルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、RT-PCR等を採用することができる。これらのアッセイを行なうためのキットも市販されている例えばPromegadualluciferaseassaykit。4アプタマーさらに、本発明は、アプタマーを用いてFEAT遺伝子の発現を阻害することができる。アプタマーとは、特異的に標的物質に結合する能力を持つ合成DNA又はRNA分子及びペプチド性分子であり、試験管内において化学的に短時間で合成することができる。従って、配列番号1に示す塩基配列を基準にして、あるいは、invitroselection法又はSELEX法として知られている進化工学的手法により得ることができる。核酸アプタマーは、血流中ではヌクレアーゼにより速やかに分解及び除去されるため、必要に応じてポリエチレングリコールPEG鎖などによる分子修飾を行って半減期を伸ばしておくことが好ましい。i-2FEATタンパク質の活性を阻害する物質上記iに記載のFEATタンパク質の活性を阻害する物質の具体例としては、FEATタンパク質を分解する物質例えば、各種プロテアーゼ及びFEATタンパク質の拮抗物質例えば、低分子化合物、ホルモン、タンパク質、抗体及び核酸等が挙げられ、ある実施態様では、FEATタンパク質に対する抗体である。FEATタンパク質に対する抗体は、検査用試薬の項目で述べたとおりである。iiFEATタンパク質に反応する免疫細胞上記iiに記載のFEATタンパク質に反応する免疫細胞の具体例としては、FEATタンパク質を抗原として認識する免疫細胞が挙げられる。免疫細胞の例としては、ヘルパーT細胞、キラーT細胞、ナチュラルキラー細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような免疫細胞は、遺伝子組換えにより、抗癌剤の遺伝子又は抗癌剤のプロドラッグを活性薬剤に変換するプロドラッグ変換酵素の遺伝子を発現するように形質転換されたものであってもよい。例えば、FEATタンパク質に反応する免疫細胞が抗腫瘍作用を持つ分子以下において、抗癌剤と総称するを発現する細胞である場合、FEATタンパク質は、腫瘍細胞で限定的に発現しているため、このような免疫細胞は、FEATタンパク質を介して腫瘍細胞と接触し、該免疫細胞内に発現する抗癌剤により腫瘍細胞が死滅する。ここで、抗癌剤には、そのプロドラッグも含まれる。抗癌剤の例としては、以下に限定されるものではないが、パラスポリン、POGZ、パニツムマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツマブ、イムノマックス、ベバシツマブ、L-アスパラギナーゼ、ダサチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ、アキシチニブ、スニチニブ、モテサニブ、デノスマブ、ニモツズマブ、イブリツモマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、CS-1008、MORAb-009、MORAb-003、ONO-4538、KW-0761、AMG655、R7159GA101、R1507、CMC-544、GC33、KRN330m、U3-1287等が挙げられる。これらの抗癌剤をコードする遺伝子の塩基配列は、公知である。また、抗癌剤は、癌遺伝子に対するsiRNA、又は該siRNAを生じさせるshRNA若しくはdsRNAであってもよい。癌遺伝子の具体例としては、myelocytomatosisoncogenec-Myc遺伝子、v-Src遺伝子、RAS遺伝子、B-cellleukemia/lymphoma2BCL2遺伝子、phosphatidylinositol3-kinasecatalyticsubunitPIK3CA遺伝子、CyclinD1遺伝子、LiverKinaseB1LKB1遺伝子、c-Abl遺伝子、c-Sis遺伝子、epidermalgrowthfactorreceptorEGFR遺伝子、platelet-derivedgrowthfactorreceptorPDGFR遺伝子、vascularendothelialgrowthfactorreceptorVEGFR遺伝子,HER2/neu遺伝子、Rafキナーゼ遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ遺伝子例えば、Cyclindependentkinase4:Cdk4、及びこれらの変異遺伝子が挙げられる。siRNAについては、RNA干渉の項目で述べたとおりである。本発明の免疫細胞がプロドラッグ変換酵素を発現する場合、前記免疫細胞と抗癌剤のプロドラッグとを患者に投与すると、前記細胞がFEATタンパク質を発現する腫瘍細胞又は前癌細胞以下、腫瘍細胞と総称するを認識して、その腫瘍細胞周囲に局在し、その場で限定的にプロドラッグ変換酵素を生産する。その結果、投与されたプロドラッグは、腫瘍細胞周囲のみで抗癌剤に変換されるため、抗癌剤は、腫瘍細胞に限定的に効力を示し、正常細胞に対する影響を最小限にとどめることができる。プロドラッグ変換酵素の例としては、チミジンキナーゼ、チミジンキナーゼとチミジレートキナーゼthymidylatekinaseとの融合タンパク質及びシトシンデアミナーゼ等が挙げられる。チミジンキナーゼは、ガンシクロビルのプロドラッグ変換酵素であり、チミジンキナーゼとチミジレートキナーゼとの融合タンパク質は、アジドチミジンのプロドラッグ変換酵素であり、シトシンデアミナーゼは、5-フルオロウラシル5-FUのプロドラッグ変換酵素である。これらのプロドラッグ変換酵素をコードする遺伝子の配列は公知である。上記抗癌剤癌遺伝子に対するsiRNAを除く又はプロドラッグ変換酵素の遺伝子以下、抗癌遺伝子は、適切な発現カセットとして発現ベクターに挿入し、該ベクターで宿主細胞例えば、免疫細胞を形質転換すればよい。適切な発現カセットは、少なくとも以下を構成要素として含む。宿主細胞で転写可能なプロモーター;該プロモーターにin-frameに結合した抗癌遺伝子;及びRNA分子の転写終結及びポリアデニル化シグナルをコードする配列哺乳動物由来の免疫細胞を宿主細胞とする場合、該宿主細胞で転写可能なプロモーターの例としては、CMV、CAG、LTR、EF-1α、SV40プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。癌遺伝子に対するsiRNAの発現ベクターについては、RNA干渉の項目で述べたとおりである。前記発現ベクターは、前記発現カセットの他に、形質転換された宿主細胞をセレクションするための選択マーカー発現カセットを有していてもよい。選択マーカーの例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のポジティブセレクションマーカー、LacZ、GFPGreenFluorescenceProtein及びルシフェラーゼ遺伝子などの発現レポーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子HSV-TK、ジフテリア毒素A断片DTA等のネガティブセレクションマーカー等が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換された宿主細胞は、上記マーカーにより容易に選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして導入した細胞であれば、G418を加えた培地中で培養することにより、一次セレクションを行うことができる。また、ターゲティングベクターがGFP等の蛍光タンパク質の遺伝子をマーカーとして含む場合には、薬剤耐性によるセレクションに加えて、FACSFluorescenceActivatedCellSorter等を用いた蛍光タンパク質発現細胞のソーティングを行ってもよい。宿主細胞への抗癌遺伝子の導入に使用可能な発現ベクターは市販されており、例としてpEGFP-C1TMClontech、pCMV-HATMClontech、pMSCVpuroTMClontech、pEF-DEST51TMInvitrogen、pCEP4TMInvitrogen、ViraPowerIILentiviralGatewaySystemTMInvitrogen等が挙げられる。発現ベクターは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ウィルス感染等、公知の遺伝子導入法により宿主細胞へ導入することができる。遺伝子導入法の詳細については、SambrookRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3,ColdSpringHarbor,LaboratoryPress2001等を参照することができる。FEATタンパク質に反応する免疫細胞は、以下の手順により作製することができる。まず、FEATのアミノ酸配列の中で、個々人の組織適合抗原HLAに合った免疫用のペプチドのアミノ酸配列を予測し、そのようなアミノ酸配列を有するペプチドを合成する。HLAに合った免疫用のペプチドのアミノ酸配列の予測は、BIMAShttp://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/又はSYFPEITHIhttp://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htmのソフトウェアを用いて行うことができる。次に、1前記ペプチドをフロイト不完全アジュバントと混和し、ペプチドワクチンとしてヒトに皮下接種し、ヒトの体内で免疫細胞を作製させるか、又は、2ヒト末梢血より分離した細胞にペプチドおよび各種のサイトカインを加えて培養することで免疫細胞を作製させる。iiiFEATタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記iの物質若しくは前記iiの細胞を担持した物質本発明において、FEATタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記iの物質若しくは前記iiの細胞を担持した物質は、抗腫瘍剤、前記iの物質若しくは前記iiの細胞をFEAT発現細胞に送達可能な物質を意味する。このような物質の例としては、FEATタンパク質に結合可能なペプチド、糖、低分子、高分子、核酸、金属、抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある実施態様では、前記物質は、抗腫瘍剤が結合した抗FEAT抗体である。本発明の医薬組成物の投与経路は、該候補薬剤の投与に一般的に採用されている経路であれば、特に限定はされないが、具体例としては、経口、舌下、経鼻、経肺、経消化管、経皮、点眼、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、局所注射、外科的移殖が挙げられ、好ましくは静脈内注射である。本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、粉末等の固形剤であってもよく、溶液、懸濁液若しくは乳液等の液剤、又は軟膏、クリーム若しくはペースト等の半液体製剤であってもよい。本発明の医薬組成物が細胞を含む場合、適切な剤形の例としては、細胞懸濁液が挙げられる。細胞懸濁液は、細胞の生存に適した培養培地、サイトカイン、血清好ましくは、投与対象である患者から採取した自家血清、非必須アミノ酸、抗生物質等を含んでいてもよい。一方、本発明の医薬組成物が細胞以外の物質を含む場合、適切な剤形の例としては、適切な剤形の例としては、懸濁液又は溶液が挙げられる。懸濁液又は剤形は、前記物質例えば、siRNA、抗体又は抗癌剤等の構造維持に適した緩衝剤、生理食塩水、プロテアーゼ阻害剤、キレート剤EDTA等等を含んでいてもよい。上記有効成分は、単独で使用してもよく、又は薬理学的に許容可能な他の成分と共に調合してもよい。薬理学的に許容可能な他の成分の例としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、抗酸化剤、保存剤、補助剤、滑沢剤、甘味剤、香料等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物は、有効成分であるFEAT阻害物質を治療上有効量で含み得る。ここで、治療上有効量とは、その量の有効成分を対象に投与することにより、腫瘍細胞又は前癌細胞の増殖率を低下させることが可能な量を意味する。例えば、静脈内注射剤の場合、治療上有効量は、0.001~10重量であり、好ましくは、0.01~5重量であり、より好ましくは、0.1~2重量である。本発明の医薬組成物が細胞を含む場合、治療上有効量は、1x103~1010細胞/mlであり、好ましくは、1x104~109細胞/mlであり、より好ましくは、1x105~108細胞/mlである。本発明の医薬組成物の投与量及び投与頻度は、対象の種、体重、性別、年齢、腫瘍疾患の進行度、投与経路といった種々の要因に依存して変化するが、医師、獣医師、歯科医師又は薬剤師等の当業者であれば、それぞれの要因を考慮して投与量を決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物を体重60kgの成人に局所投与する場合、毎日1~4回、好ましくは1又は2回投与してもよく、1回あたりの投与量は、0.1~150mgであり、好ましくは1~50mgである。本発明の医薬組成物が細胞を含む場合、1回あたりの投与量は、1x103~1010細胞であり、好ましくは、1x104~109細胞であり、より好ましくは、1x105~108細胞である。例えば、患者に、活性化リンパ球を1回当たり5X107または2X108個を点滴投与し、樹状細胞を1×107個を皮下注射してもよいが、投与量は、これに限定されるものではない。上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度は、典型的な数値を列挙したものであり、これを超える数値又は下回る数値であっても腫瘍細胞又は前癌細胞の増殖率の増加率が低下する場合も十分に考えられる。従って、上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度を超える数値又は下回る数値であっても、本発明の医薬組成物の治療上有効量、投与量及び投与頻度として包含される。本発明の医薬組成物の対象となる腫瘍の種類は、特に限定されず、良性腫瘍又は悪性腫瘍のいずれでもよい。このような腫瘍の例としては、1骨肉腫や軟部組織肉腫等の肉腫、2乳癌、肺癌、膀胱癌、腎癌、甲状腺癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆嚢癌、子宮癌、大腸癌、直腸癌、精巣癌、子宮頸癌、卵巣癌、皮膚癌、舌癌、咽頭喉頭癌等の癌腫、3ホジキンや非ホジキン型のリンパ腫、4神経芽細胞腫、5メラノーマ、6多発性骨髄腫、7ウィルムス腫瘍、8急性骨髄性白血病AML、慢性骨髄性白血病CML、急性リンパ性白血病ALL及び慢性リンパ性白血病CLL等の白血病、9グリオーマ等の脳腫瘍、10網膜芽細胞腫等が挙げられ、好ましくは、ヒトでFEATタンパク質を発現していることがウェスタンブロッティング、免疫組織的解析、マイクロアレイ解析で既に確認されている腫瘍、例えば、卵巣癌、肺癌、肝癌、直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、胃癌、咽頭喉頭癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫、大腸癌、膀胱癌、網膜芽細胞腫等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物は、腫瘍増殖を抑制することが可能であるので、腫瘍の予防だけではなく、腫瘍の治療用医薬組成物としても使用することができる。本発明の医薬組成物の投与による、患者体内の腫瘍組織の縮小は、X線、CT、MRI磁気共鳴画像、PETポジトロン断層法又はエコー等の診断機器を用いて容易にトレースすることができる。3.検査方法本発明は、生体から採取された被験試料と本発明の試薬とを反応させることを特徴とする、腫瘍の検出方法を提供する。FEAT遺伝子又はFEATタンパク質は、腫瘍細胞又は前癌細胞で限定的に発現されており、正常細胞では殆ど発現されていないため、被検細胞からFEAT遺伝子又はFEATタンパク質が検出された場合には、該被検細胞は、腫瘍細胞又は前癌細胞であると判断することができる。本発明において、生体は、特に限定されず、いずれの生物種の生体であってもよい。好ましくは、生体は哺乳動物であり、例えば、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。被検試料は、組織、細胞、粘膜、血液成分血清、血漿、血球細胞、涙液、鼻汁、喀痰、唾液、胃液、胆汁、膵液等の消化液、尿、糞便、汗、体毛、乳汁等の生体に由来するサンプルであってもよく、又は培養組織若しくは細胞、培養細胞の抽出物、培養上清等の培養組織若しくは細胞に由来するサンプルであってもよい。生体から被検試料を採取する方法は、被検試料の種類に応じて変化するが、一般的には、採血、バイオプシー、吸引細胞診、採尿、採便又は腫瘍の外科的切除が挙げられる。このように採取された腫瘍組織から、細胞抽出物を調製するが、細胞抽出物は、採取した腫瘍に含まれる細胞初代腫瘍細胞から直接調製してもよく、あるいは、採取した腫瘍に含まれる細胞を適切な条件で培養した後に、初代腫瘍細胞から1又は複数回の細胞分裂によって生じた細胞から調製してもよい。初代腫瘍細胞又は初代腫瘍細胞から細胞分裂によって生じた細胞を回収し、超音波破砕、細胞溶解剤の添加、ホモジェナイジング等によって細胞抽出物を得ることができる。細胞抽出物には、核酸又はタンパク質の分解を防ぐために、ヌクレアーゼインヒビター又はプロテアーゼインヒビターが添加されていてもよい。また、細胞抽出物は、冷凍保存好ましくは、-80°C以下の温度でした後に、本発明の方法に用いてもよい。さらに、被検試料は、上記のように調製した細胞抽出物から更なる精製工程を経て得られた精製タンパク質又は核酸であってもよい。細胞抽出物の調製方法並びにタンパク質及び核酸の精製方法の詳細については、以下を参照できる。SambrookRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3,ColdSpringHarborLaboratoryPress2001、Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons1987-1997。本検出方法において、被検試料と本発明の検査用試薬を反応させるには、これらの資料及び試薬を混合すればよい。混合した後に、混合物の組成分布を均一に保つため、混合物をシェーカー又はローター等を用いて穏やかに撹拌することが好ましい。本発明の方法は、サンプルに含まれるFEATタンパク質若しくはFEAT遺伝子及び本発明の試薬に含まれる核酸若しくは抗体の分解を防ぐ観点から、常温25°C前後以下、好ましくは、15°C、10°C、8°C、5°C以下で行われ、最も好ましくは4±1°Cで行われる。また、被検試料と本発明の試薬との反応に先立って、被検試料若しくは本発明の試薬のいずれか又は両方をブロッキング剤と混合してブロッキング処理してもよい。あるいは、被検試料、本発明の試薬及びブロッキング剤を全て混合した混合物中で反応を行ってもよい。ブロッキング剤の例としては、血清含有緩衝溶液又はスキムミルク含有緩衝溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。FEAT遺伝子又はタンパク質を検出するためのアッセイ方法は、腫瘍の検出用試薬の項目で述べた通りである。4.腫瘍のモデル動物本発明者らは、FEAT遺伝子を導入することによりFEATタンパク質を過剰発現するトランスジェニックTg動物を作製した。FEATタンパク質の過剰発現により、Tg動物が複数の器官において腫瘍を形成することが判明した。該Tg動物に形成された腫瘍は、ヒト患者の腫瘍と病理学的特徴及び遺伝子変化が重複することから、該Tg動物は、ヒトの腫瘍を詳細に反映する腫瘍モデルとして有用である。従って、本発明は、FEAT遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物からなる、腫瘍のモデル動物を提供する。本発明において、FEAT遺伝子は、検査用試薬の項目で述べた通りである。また、本発明にかかるトランスジェニック非ヒト動物は、ヒト以外の動物であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物例えば、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギであり、より好ましくは、遺伝子組換及び交配による次世代動物取得の容易性の観点からマウス、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類動物である。4-1.トランスジェニック動物の作製方法FEAT遺伝子の発現ベクターを作製し、これを受精卵に導入する。発現ベクターの種類、宿主細胞への導入方法、形質転換体のセレクション方法は、医薬組成物の項目で述べた通りである。受精卵への導入は、マイクロインジェクション法Hogan,B.etal.ManipulatingtheMouseEmbryoColdSpringHarborLaboratoryPress,1988により行うことができる。マイクロインジェクション法は、FEAT遺伝子の発現ベクターを受精卵に直接注入する方法である。この方法では、動物から採取した受精卵に、マイクロマニピュレーター等を用いてFEAT遺伝子の発現ベクターを顕微鏡下で直接注入する。このようにして作製された受精卵を、仮親偽妊娠動物の子宮に移植して発生させることにより所望のトランスジェニック動物を得ることができる。前記トランスジェニック動物を、さらに同系の野性型動物とあるいはトランスジェニック動物同士で交配させることにより、トランスジェニック動物系統を維持できる。各個体のジェノタイプは、前述したサザンブロッティングやPCR法を利用したジェノタイプ解析によって決定することができる。上記のようにして作製されたFEAT遺伝子トランスジェニック動物の子孫も、FEAT遺伝子が過剰発現されている限り、本発明のモデル動物に含まれる。本発明のモデル動物は、動物の種類や系統を変えることにより、種々の腫瘍のモデルとして有用であると考えられる。例えば、腫瘍の例としては、1骨肉腫や軟部組織肉腫等の肉腫、2乳癌、肺癌、膀胱癌、腎癌、甲状腺癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆嚢癌、子宮癌、大腸癌、直腸癌、精巣癌、子宮頸癌、卵巣癌、皮膚癌、舌癌、咽頭喉頭癌等の癌腫、3ホジキンや非ホジキン型のリンパ腫、4神経芽細胞腫、5メラノーマ、6多発性骨髄腫、7ウィルムス腫瘍、8急性骨髄性白血病AML、慢性骨髄性白血病CML、急性リンパ性白血病ALL及び慢性リンパ性白血病CLL等の白血病、9グリオーマ等の脳腫瘍、10網膜芽細胞腫等が挙げられ、好ましくは、ヒトでFEATタンパク質を発現していることがウェスタンブロッティング、免疫組織的解析、マイクロアレイ解析で既に確認されている腫瘍、例えば、卵巣癌、肺癌、肝癌、直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、胃癌、咽頭喉頭癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫、大腸癌、膀胱癌、網膜芽細胞腫等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のモデル動物は、好ましくは、トランスジェニックマウスである。本発明のモデル動物は、特に肝細胞癌hepatocellularcarcinoma:HCC及び/又は悪性リンパ腫のモデル動物として有用である。以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。<1.実験方法>試薬アゴニスト作用性抗FasIgMモノクローナル抗体CH-11は、MBL名古屋、日本から購入した。カスパーゼ阻害剤のベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-AspOMe-fluoromethylketonezVAD-fmkは、EnzymeSystemsDublin,California,USAから購入した。プラスミドHisタグ化DNAfragmentationfactorDFF40及びDFF45Liu,X.1999J.Biol.Chem.274,13836-13840は、Dr.XiaodongWangHowardHughesMedicalInstituteandDepartmentofBiochemistry,UniversityofTexasSouthwesternMedicalCenter,Dallas,Texasから提供して頂いた。プラスミドpcDL-SRα-procaspase-3は、Dr.FumikoToyoshima-MorimotoInstituteforVirusResearch,KyotoUniversity,Kyoto,Japanから提供して頂いた。組換えカスパーゼの精製pET-16bプラスミドNovagen,MerckKgaA,Darmstadt,GermanyにコードされるHisタグ化組換えカスパーゼ3及びカスパーゼ6を、大腸菌BL21DE3pLys株Novagen,MerckKGaAから以下の手順で精製した。1mMのイソプロピル-β-DチオガラクトピラノシドIPTGを添加してカスパーゼ発現を1時間誘導した後に大腸菌をリン酸緩衝食塩水PBSで洗浄し、その後、溶解バッファー50mMTrisHClpH8.0,0.5mMスクロース,5グリセロール,1mMフェニルメチルスルホニルフルオリドPMSF,1v/vアプロチニンSigma,SaintLouis,MO,CLAPキモトリプシン、リューペプチン、アンチパイン及びペプスタチンを1μg/ml含む中で超音波破砕することにより、細胞を溶解させた。その後、以下の工程を4°Cにて行った。細胞溶解物を遠心し、上清に10mMのβ-メルカプトエタノール及び5mMのイミダゾールを添加し、これを溶解バッファーで平衡化させておいたNi2-NTAアガロースカラムQiagen,Hilden,Germanyにアプライした。次いで、カラムを洗浄バッファー50mMTrisHClpH8.0,0.5mMスクロース,5グリセロール,10mMβ-メルカプトエタノール,60mMイミダゾール,400mMNaCl,0.04v/vNonidetP-40NP-40で十分に洗浄した。Hisタグ化カスパーゼを溶出バッファー50mMTrisHClpH8.0,0.5mMスクロース,5グリセロール,500mMイミダゾール,1mMPMSF,1v/vアプロチニン,1μg/mlCLAPで溶出し、KPMバッファー50mMKCl,50mMPIPES,pH7.0,10mMEGTA,1.92mMMgCl2,1mMジチオトレイトールDTT,20μMサイトカラシンB,100μMPMSF,1μg/mlCLAPに対して透析を行った。ラット由来FEATタンパク質の精製ラットの肝臓の細胞質抽出物6匹のWisterラットから採取して、100,000xgで遠心した上清のうち4gを陽イオン交換クロマトグラフィーSP-セファローズFF;GEHealthcareBio-Sciences、硫安分画、疎水性相互作用クロマトグラフィーフェニルセファローズHP;GEHealthcareBio-Sciences、硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィーDE52;Whatman,GEHealthcareBio-Sciences、金属キレートクロマトグラフィー亜鉛HiTrapchelating,FPLC;GEHealthcareBio-Sciences及びゲルろ過Superdex200,FPLC;GEHealthcareBio-Sciencesの順に精製した。上記の各精製工程で得られた分画は、脱塩カラムEcono-Pac10DGカラム又はBio-Spinクロマトグラフィーカラム;Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CAにアプライして、溶媒をKPMバッファーに交換した。各分画を、Hisタグ化カスパーゼ3及びカスパーゼ6、単離した核Lazebnik,Y.A.etal1993J.CellBiol.123,7-22及びATP再生系ATPregenerationsystemTakahashi,A.etal1997Exp.CellRes.231,123-131と共に37°Cで2時間インキュベートした。核を1μg/mlの4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPIで染色し、蛍光顕微鏡Olympus,東京、日本を用いて形態を観察した。また、各分画に含まれるタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動SDS-PAGEBIOCRAFT,東京、日本で分離し、2DsilverstainingkitIIDaiichiPureChemicals,東京、日本を用いて染色した図1A、上段パネル。精製したタンパク質をSDS-PAGEで分離し、フッ化ポリビニリデンPVDF膜ProBlott;AppliedBiosystems,LincolnCentreDriveFosterCity,Californiaに転写し、0.2PonceauS及び1酢酸で染色した。これを切り取ってトリプシン消化した後に質量分析を行った。タンパク質は、マイクロシークエンスに十分な量を回収できていないことが分かった。収量を増加させるため、上記の精製工程を以下のように変更する工夫を加えた。陽イオン交換クロマトグラフィーSP-セファローズFF、硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィーDE52、再度の陽イオン交換クロマトグラフィーSP-セファローズHP,FPLC;GEHealthcareBio-Sciences、及びゲルろ過Superdex200,FPLC。このように精製工程を変更することにより、精製タンパク質を複数種類の内部オリゴペプチドとしてマイクロシークエンスすることができた。ヒトFEATcDNAのクローニングJurkatT細胞、KB上皮がん細胞及びHeLa細胞からRNAを回収した。ヒトFEATのexpressedsequencetagESTの配列に基づいて作製したプライマーを用いて、逆転写PCR反応RT-PCRを行った。全ての細胞株で検出された2.5kbのcDNA断片を、サブクローニングし、シークエンスした後に[32P]-ラベルプローブとして用いて、ヒト皮膚λZAPIIcDNAライブラリーStratagene,LaJolla,CATakahashi,K.etal1994J.CellBiol.127,505-520に対して製造元の使用説明に基づいてスクリーニングを行った。抗体の作製プラスミドpET-16bNovagen,MerckKGaAにコードされるHisタグ化FEATアミノ末端N末端タンパク質第1-274番目のアミノ酸aa配列;His-FEATΔC及びHisタグ化カルボキシル末端C末端タンパク質第288-699番目アミノ酸配列;His-FEATΔNを、大腸菌BL21DE3pLys株Novagen,MerckKGaAにて発現させた。発現タンパク質を、Ni2-NTAカラムQiagenを用いて、製造元の使用説明に従って変性条件下で精製した。精製したタンパク質をPBSで希釈し、これをウサギに注射した。ウサギの抗血清を、His-FEATΔCタンパク質及びHis-FEATΔNタンパク質を用いてアフィニティー精製したOperonBiotechnologies,東京、日本。トランスフェクション哺乳動物細胞発現プラスミドを、FuGENE6Roche,Indianapolis,Indianaを用いて、COS-7、293、HeLa又はMCF-7の各細胞にトランスフェクトした。また、同プラスミドを、DMRIE-CRocheを用いて、Karpas299細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、トランスフェクション試薬の製造元の使用説明に従って行った。免疫沈降以下の全ての工程は、4°Cで行った。1mMPMSF、1v/vアプロチニン及び1μg/mlCLAPを添加したTNEバッファー10mMTrisHClpH7.8,150mMNaCl,1NP-40,1mMEDTAで15分間かけて溶解させ、15000rpmで30分間遠心した。上清に各抗体を添加して30分間インキュベートした。TNEバッファーで平衡化させておいてProteinGセファローズGEHealthcareBio-Sciencesを添加し、得られた混合物を2時間ローターで混和させた。ビーズをTNEバッファーで3回洗浄した。ビーズを95°CのSDS-PAGE用サンプルバッファー中に3分間インキュベートすることにより、ビーズに結合したタンパク質を溶離させた。メチル基転移酵素活性アッセイプラスミドpcDL-SRα-myc及びpcDL-SRα-HAを用いて、Mycタグ化又はHAタグ化したヒト由来のFEAT、FEATΔC及びFEATΔNをCOS-7細胞中で過剰発現させ、抗ヒトc-Mycモノクローナル抗体9E10;sc-40:SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz,CA及び抗HAモノクローナル抗体Y-11;sc-805:SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz,CAを用いて免疫沈降を行った。免疫沈降物をメチル基転移酵素バッファー25mMTrisHCl,pH7.5,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMEGTAで平衡化させた。Hisタグ化FEAT及びFEAT変異体をコードするpET-16bプラスミドを含む大腸菌BL21DE3pLys株を1mMIPTGの存在下で16°Cで16時間でインキュベートして発現を誘導し、発現タンパク質をNi2-NTAカラムQiagenを用いて、製造元の使用説明に従って変性条件下で精製した。次に、精製タンパク質を透析バッファー50mMリン酸バッファーpH7.4,50mMNaCl,10グリセロール,5mMDTTに対して透析した。健康な成人ボランティアから採取した末梢血から、先の文献Takahashi,A.etal1992Eur.J.Haematol.48,196-201の記載に沿って、PercollGEHealthcareBio-Sciencesを用いて単核球を単離した。Jurkat細胞、Karpas299細胞及びヒト末梢血単核球を溶解バッファー25mMTrisHClpH7.5,0.1NP-40,1mMEDTA,1mMEGTA,1mMPMSF,1v/vアプロチニン,1μg/mlCLAPで溶解したものを基質として使用した。組換えFEAT80ng/μl、免疫沈降FEAT又はその変異体を、メチル基転移酵素バッファー中で細胞溶解物1μl当たり4μgのタンパク質を含む及び5nCi/μl[14C]-S-アデノシルメチオニンと混合し、37°Cで60分間インキュベートした。放射性同位体標識メチル化タンパク質を12.5SDS-PAGEで分離し、イメージアナライザーFujiPhotoFilmCo.,Ltd.,東京、日本を用いて可視化した。スペルミン/スペルミジン合成活性大腸菌BL21DE3pLys株を、1mMIPTGで37°Cにて4時間又は16時間処理することにより、pET-16bプラスミドにコードされるHisタグ化FEAT及びその変異体の発現を誘導した。大腸菌におけるスペルミン及びスペルミジンの生成量を測定するため、スペルミン/プトレシン比及びスペルミジン/プトレシン比を測定した。invitroでのスペルミン及びスペルミジン合成酵素活性を測定するため、組換えFEAT30μg/ml、免疫沈降FEAT又はその変異体を、1mMプトレシンジヒドロクロリドWakoPureChemicalIndustries,大阪、日本及び0.2mM脱カルボキシル化S-アデノシルメチオニンDepartmentofPharmaceuticalSciences,JosaiUniversity,Saitama,JapanのDr.AkiraShirahataから提供を添加した反応バッファー100mMTrisHClpH7.5,5mMDTT,1mMEDTA,1mMEGTAと混合し、37°Cで30分間インキュベートした。5w/vトリクロロ酢酸を添加して反応を停止させた。サンプルを14000rpm、4°Cで10分間遠心し、上清をスペルミン及びスペルミジンについて解析した。ポジティブコントロールとしてNicotianasylyvestris由来のスペルミジン合成酵素cDNAは、DivisionofMolecularBiology,NaraInstituteofScienceandTechnology,Nara,JapanのDr.TakashiHashimotoから提供を用いた。ユビキノン生合成の酵母相補性試験N末端にSAM結合モチーフを有することは、ユビキノン合成酵素にも共通する特徴であるので、ヒトFEATをコードする2.6kbの完全長cDNA若しくはオープンリーディングフレームORF又はFEATΔCのcDNAをpENTR3CベクターInvitrogenCorp.,Carlsbad,Californiaにサブクローニングした。GatewayクローニングシステムのリーディングフレームカセットAが酵母発現用プラスミドpDR196Rentsch,D.etal1995FEBSLett.370,264-268のSmaI部位に組み込まれたpDR196GWベクターCarnegieInstitution,WashingtonDCのDr.W.Frommerから提供とLR組換えすることにより、pDR196GW-FEATfull-length、pDR196GW-FEATORF及びpDR196GW-FEATΔCのプラスミドを作製した。これらのプラスミドは、酵母内で強力な恒常的遺伝子発現を可能にする細胞膜ATPase1プロモーターの制御下でFEAT又はFEATΔCをコードするものである。これらのプラスミドを、出芽酵母SaccharomycescerevisiaeW303-1A-Δcoq5株UniversityofCalifornia,LosAngeles,CaliforniaのDr.C.F.Clarke及びDr.P.Ginからの提供に導入した。同株は、COQ5遺伝子が破壊されているBarkovich,R.J.etal1997J.Biol.Chem.272,9182-9188。上記FEAT発現ベクターを導入した酵母株を、中間対数期OD600~2.0に達するまでSD-ウラシル液体培地中で培養した。次いで、この培養物5μlを、唯一の炭素源としてグルコースコントロール又はグリセロールのいずれかを含む基礎培地を含有するSD-ウラシルアガープレート上にスポッティングした。ユビキノンは、非発酵性炭素源を消費する必要があるため、C-メチル基転移酵素活性を欠損した出芽酵母ΔCOQ5株は、グリセロールプレート上では、増殖障害を示す。これらのプレートを30°Cで24時間グルコース又は48時間グリセロールインキュベートし、グリセロールプレート上での増殖能の回復を指標としてCOQ5遺伝子の相補性を評価した。上記相補性試験のポジティブコントロールとして、COQ5遺伝子を発現する酵母を以下の手順で作製した。RNeasyPlantMinikitQiagenを用いて野生型出芽酵母W303-1A株からtotalRNAを抽出した。2.0μgのtotalRNAとSuperscriptIIIRNaseH-Invitrogenとを用いて、逆転写反応を行った。得られたcDNA、KOD-Plus-DNAポリメラーゼTOYOBOCo.,Ltd.,大阪、日本及び以下のプライマーを用いて、COQ5遺伝子のコード領域をPCR増幅した。上記プライマーの下線部は、それぞれKpnI及びXhoI認識部位である。得られたPCT産物924bpをpENTR3CベクターにサブクローニングしてpENTR3C-COQ5を作製した。次に、pENTR3C-COQ5をpDR196GWとのLRれコンビネーションに用いて、pDR196GW-COQ5を作製した。ウェスタンブロッティング氷上で細胞を氷温の10w/vトリクロロ酢酸/PBSに30分間浸して固定した。15000rpm、37°Cにて5分間遠心した後、150mMTrisHClpH8.8を添加したSDS-PAGEサンプルバッファーにペレットを再懸濁し、95°Cで3分間インキュベートした。以下の全ての工程は室温で行った。SDS-PAGEで分離したタンパク質は、NA-1512semidryelectrictransferapparatusesNihonEido,Tokyo,Japan及びトランスファーバッファー175mMTris,1.344Mglycine,and5methanolを用いて、180mAで45分間かけてImmobilon-PPVDF膜Millipore,Billerica,Massachusettsに転写した。膜をブロッキングバッファーPBS、0.1Tween-20Bio-Rad、5脱脂粉乳DifcoSkimMilk;DifcoLaboratories,BDBiosciences,SanJose,Californiaで15分間ブロッキングし、次いで、1次抗体を含むブロッキングバッファーで45分間インキュベートすることで染色を行った。PBS/0.1Tween-20PBS-Tweenで5分間の洗浄を3回行い、ブロッキングバッファーで1:10000希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合2次抗体ヒツジ由来抗ウサギIgGsc-2004:SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz,California又は抗マウスIgGsc-2005:SantaCruzBiotechnologyと15分インキュベートして、膜をプローブした。膜に対し、PBS-Tweenで5分間の洗浄を4回行い、ECLdetectionsystemGEHealthcareBio-Sciencesを用いて可視化した。用いた1次抗体は、以下の通りである:抗アクチン抗体A5060;Sigma;抗ヒトc-Myc抗体Anti-MycTag,06-549;Upstate,Millipore。INSTA-BlotmembraneIMB-105IMGENEX,SanDiego,Californiaは、以下のヒト細胞株の細胞溶解物を含む1レーン当たり10μgのタンパク質量:HeLa子宮頸癌、JurkatT細胞白血病、DaudiBurkittリンパ腫、2935型アデノウィルスで形質転換した胎児腎臓細胞、Rh30横紋筋肉腫、A375悪性メラノーマ、T98Gグリオブラストーマ、HCT-116大腸癌、Hep-2咽頭癌。MultipleTissueBlotヒトWB46及びHumanTumorTissueBlotWB51は、CalbiochemMerckKGaAから購入した。WB46は、種々の正常組織に由来するタンパク質を含む1レーン当たり75μgのタンパク質量。WB51は、以下の癌細胞に由来するタンパク質を含む1レーン当たり50μgのタンパク質量:卵巣間質肉腫ovarystromalsarcoma、肺腺癌、肝細胞癌、直腸腺癌、頸部扁平上皮癌、皮膚悪性メラノーマ、精巣胚性癌腫、濾胞性甲状腺癌、子宮腺癌、胃腺癌、咽喉頭扁平上皮癌、乳管癌、前立腺肥大、膵臓腺癌。カスパーゼ切断部位の決定カスパーゼは、一般的には基質のアスパラギン酸残基のカルボキシル側を切断することが知られているEarnshaw,W.C.etal1999Annu.Rev.Biochem.68,383-424。pBluescriptSK-プラスミドStratageneに挿入したFEATcDNAにコードされる、切断項部位候補となるアスパラギン酸を、GeneEditorinvitroSite-DirectedMutagenesisSystemPromega,Madison,Wisconsinを用いてアラニンに変異させた。cDNAのinvitroでの転写/翻訳は、TNTT7/T3CoupledReticulocyteLysateSystemPromega及びTran35S-labelMPBiomedicals,Irvine,Californiaを用いて行った。[35S]-標識組換え野生型又は変異型FEATタンパク質を、精製した組換えカスパーゼ-3と共に37°Cで2時間インキュベートし、生成物をSDS-PAGEで分離し、autoradiographyで可視化した。悪性リンパ腫細胞株のRT-PCR解析悪性リンパ腫患者からは、以下の細胞株が樹立されているAkasakaetal.,1996:Satoh風土病性Burkittリンパ腫細胞株、KS-Bu3散発性Burkittリンパ腫細胞株、DL-4t8;14転座を有するDLBL細胞株、KIS-1t9;14染色体転座を有するDLBL細胞株、Yoshikawa精巣DLBL細胞株、MuranakaT細胞リンパ腫細胞株、Karpast2;5染色体トランスロケーションを有するALCL細胞株、DLBLびまん性巨大B細胞リンパ腫diffuselargeB-celllymphoma、ALCL未分化巨大細胞リンパ腫anaplasticlargecelllymphoma。TRIzolInvitrogenを用いてtotalRNAを単離した。SuperscriptIIreversetranscriptaseInvitrogen及びオリゴdTプライマーを用いてcDNAの1stストランドを合成した。KODDashDNApolymeraseTOYOBO及び以下のプライマーを用いてPCR反応を行った:EnhancedGreenFluorescentProteinEGFP発現細胞におけるアポトーシス性DNA切断の解析細胞に野生型FEAT若しくは変異型FEATタンパク質をコードするプラスミド及びpEGFPClontechLaboratories,Inc.,TakaraBioIncをコトランスフェクトし、スタウロスポリンSTSSigmaで処理した。断片化DNA含有を有するEGFP発現アポトーシス細胞を、Lammetal.,1997の記載に沿って定量した。即ち、細胞を、穏やかな固定溶液2パラホルムアルデヒド、100mMNaCl、300mMスクロース、3mMMgCl2、1mMEGTA、10mMPIPESpH7.0を用いて室温で30分間固定し、次いでエタノール固定を行い、ヨウ化プロピジウムPI:Calbiochem,MerckKGaA染色し、フローサイトメトリー解析を行った。好中球の単離、タンパク質導入及び自発的アポトーシスの解析Takahashi,A.etal.1992Eur.J.Haematol.48,196-201の記載に沿って、two-stepPercoll濃度勾配による分離GEHealthcareBio-Sciencesを行い、健康な成人ボランティアから採取した末梢血から好中球を単離した。Hisタグと野生型又は変異型FEATタンパク質のN末端との間に、タンパク質を細胞膜透過性に変化させるPTD-4配列YARAAARQARA:配列番号15Ho,A.etal2001CancerRes.61,474-477を導入した。好中球は、10ウシ胎児血清FBSGIBCO,Invitrogen、50unit/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンGIBCO,Invitrogenを補充したRPMI-1640Sigma培地FBS-RPMIに懸濁し、1μMの精製タンパク質で37°Cにて15分間処理した。その後、細胞をFBS-RPMIで希釈し、37°Cで24時間インキュベートした。細胞をFITC結合annexinV及びPIApoAlertannexinVApoptosisDetectionkit,ClontechLaboratories,TakaraBioで染色し、断片化DNA含有細胞の量をフローサイトメトリー解析することにより好中球のアポトーシス率を測定した。RNA干渉RNAi.pMuniH1プラスミドは、Dr.ArasambattuK.MunirajanUniversityofMadras,Teramani,Indiaから提供して頂いた。pMuniH1プラスミドには、H1RNAプロモーターにより発現されるshorthairpinRNAshRNAとネオマイシン選択マーカーがコードされている。Ui-Tei,K.etal.2004NucleicAcidsRes.32,936-948に記載される基準に沿って、FEATcDNAのうちRNAiに適切な部位を選択した。選択の結果、ORF内の第183、259、1385、1550、1634、2056番目を始点とする21塩基対を標的とするオリゴヌクレオチドを合成し、pMuniH1にライゲーションした。shRNAプラスミドを、Mycタグ化FEATをコードするプラスミドと共にHeLa細胞にコトランスフェクションし、各プラスミドによるmyc-FEAT発現の抑制能力を、抗ヒトc-Mycポリクローナル抗体抗Mycタグを用いたウェスタンブロッティングにより評価した。RNAi活性を有するプラスミドを選択してHeLa細胞にトランスフェクトした。400μg/mlG418Sigmaの存在下で10日間セレクションを行った後にコロニーピックアップを行い、内在性FEATタンパク質の発現が抑制されたクローンのスクリーニングを行った。免疫蛍光法特記しない限り、下記の全ての工程は室温で行った。35mmガラス底ディッシュMatsunamiGlass,大阪、日本に接着させた細胞を、3.7ホルムアルデヒド/PBSで10分間固定し、0.5w/wTritonX-100/PBSで30分間透過処理し、次いで、3ウシ血清アルブミンBSA/PBSでブロッキングした。PBSで洗浄した後、細胞を、3BSA-PBSで希釈した抗FEATΔN抗体他のタンパク質と最も交差反応性が低い:図4A及び図5A参照と1時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、AlexaFluor488又は588と結合した抗ウサギ抗体MolecularProbes,Invitrogen及び1μg/mlDAPIと1時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、ガラス底ディッシュにカバースリップを乗せ、ProlongGoldAntifadeReagentMolecularProbes,Invitrogenでマウントした。染色細胞をDMIRE2蛍光顕微鏡LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germanyで観察し、LeicaQFluorosoftwareLeicaMicrosystemsImagingSolutions,Cambridge,UKで制御可能なDC350FカメラLeicaMicrosystemsを用いて画像撮影を行った。アクチンを可視化させるため、AlexaFluor488結合phalloidinMolecularProbes,Invitrogenを2次抗体と共に添加した。ミトコンドリアを可視化させるため、生細胞を固定化する前に、MitotrackerRedMolecularProbes,Invitrogenと37°Cで30分間インキュベートした。小胞体ERを可視化させるため、細胞を4パラホルムアルデヒド/PBSで15分間固定し、0.1TritonX-100/PBSで10分間透過化させ、ER染色試薬SubcellularStructureLocalizationKit;ChemiconInternational,Milliporeと37°Cで30分間インキュベートした。次いで、ブロッキングを行い、更にFEAT染色を行った。マイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリングヒトFEATのORFのcDNAを、GatewayクローニングシステムInvitrogenのエントリーベクターpENTR3Cにサブクローニングした。pEF-DEST51ベクターInvitrogenとのLRリコンビネーションにより、elongationfactor1αプロモーター制御下でFEATが発現されるpEF-DEST51-FEATを作製した。HilyMaxDojindoLaboratories,熊本、日本を用いてpEF-DEST51-FEATをNIH3T3細胞にトランスフェクトした。10μg/mlのブラストサイジンSKakenPharmaceuticalCo.,Ltd.,東京、日本の存在下で7日間セレクションを行った後に、コロニーピックアップを行い、FEATタンパク質を過剰発現するクローンを選別した。pEF-DEST51ベクターのccdB遺伝子を切除してpEF-DEST51-ΔccdBプラスミドを作製した。pEF-DEST51-ΔccdBプラスミドを、NIH3T3細胞に安定にトランスフェクトすることで、コントロール細胞株ΔccdB-1、-2及び-3を作製した。RNeasyMinikitInvitrogenを用いたコントロール細胞並びにFEAT強制発現NIH3T3細胞株FEAT-3、-15及び-20からtotalRNAを抽出した。ResearchSupportCenter,GraduateSchoolofMedicalSciences,KyushuUniversityが所有するSentrixMouseWG-6v2BeadChipArrayIlluminaInc.,SanDiego,CAを用いて遺伝子発現プロファイルの解析を行った。最初に、BeadStudio3.0softwareを用いて遺伝子発現の生データを正規化した。検出p値>0.01Illuminareplicategeneprobeに基づくの平均シグナルは、解析から除外した。以下のURLから入手可能なソフトウェアを用いてGeneSetEnrichmentAnalysisGSEAを行った。http://www.broadinstitute.org/gsea/FEATトランスジェニックTgマウスの作製全ての動物実験は、千葉県がんセンターの動物実験委員会の承認に基づいて行った。ヒトFEATORFのcDNAをpKCR-H-2KdベクターNishi,M.etal1988Nature331,267-269Dr.T.Honjo及びDr.I.Chung-OkazakiKyotoUniversity,Kyoto,Japanから提供のBamHI部位に挿入した。Nagy,A.,Gertsenstein,M.,Vintersten,C.,andBehringer,R.eds.2003.ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual.,3rdEditionCSHLaboratoryPressの記載に従って、H-2KdMHCクラスIプロモーター、FEATORF、βグロビンのイントロン及びSV40ポリAシグナルを含むKpnI/SphI断片を精製した。Tgマウス及び同腹のトランスジーン陰性マウス非トランスジェニック:non-Tgは、千葉県がんセンター研究局のSPFspecificpathogenfree動物施設で飼育した。メスのTgマウスの子孫は殆ど生まれてくることがなく、ホモ接合Tgマウスを作製することはできなかった。従って、オスのTgマウスを正常メスC57BL/6マウスCharlesRiverLaboratories,Inc.,Wilmington,Massachusettsと交配させることにより、Tgマウス系統を維持した。マウスは、定期的に腫瘍及び他の疾患の兆候について検査した。腫瘍を患ったマウス又は瀕死状態のマウスは、楽死させて死体解剖を行った。Tgマウスの副睾丸から精子を回収し、九動株式会社鳥栖、日本に凍結保存を委託した。マウス臓器内でのタンパク質発現6ヶ月齢のTgマウス及びnon-Tg同腹子を二酸化炭素で安楽死させた後に解剖した。各臓器を液体窒素で凍結させ、ハンマーで破砕した。破砕した組織をRIPAバッファー50mMTrisHClpH7.4,150mMNaCl,1v/vNP-40,1デオキシコレートSigma、0.05SDSに懸濁し、液体窒素と氷上での凍結融解を3回繰り返すことで完全に溶解させた。15000rpm、0°Cで10分間遠心して上清を回収した。抽出物に含まれるタンパク質の濃度をBio-RadProteinAssaykitBio-Radを用いて測定し、SDS-PAGEミニゲルに1レーン当たり30μgの総タンパク質量となるようにサンプルをローディングし、これを抗FEATΔN抗体でウェスタンブロッティングした。マウス胸腺細胞のアポトーシス性細胞死胸腺を切除して、37°Cにて10FBSを添加したRPMI-1640培地Sigmaと共に1ml滅菌シリンジを用いて粉砕することにより胸腺細胞を単離した。次いで、5CO2インキュベーターで、細胞をFasリガンドrhsSuperFasLigand:Alexis,Lausen,Switzerland又はデキサメタゾンNacalaiTesque,京都、日本のいずれかで処理するか、あるいは未処理で維持した。細胞をannexinV-CFSRDSystems,Inc.,Minneapolis,Minnesota及びPIで染色し、次いでフローサイトメトリー解析することにより、細胞死を測定した。マウス組織の顕微鏡解析マウスの各臓器を切除した後、3.7ホルムアルデヒド/PBSで固定し、2mm厚に切り出し、組織カセットTissue-TekUni-Cassette;サクラファインテックジャパン株式会社、東京、日本にセットした上で、新たな固定液に浸潤させた。更なる加工及び病理組織学的検討は、奈良病理研究所奈良、日本において行った。固定した組織をエタノールの段階希釈液20~100及びキシレン溶液を用いて脱水し、自動組織プロセッサーを用いて組織をパラフィン包埋し、マイクロトームで切片化し、脱パラフィン化して、再水和させ、ヘマトキシリンエオジン染色HEを行った。AutostainerDAKO,Glostrup,Denmarkを用いて、以下のマーカーについて免疫組織化学染色を行った:CD45RB220B細胞マーカー;CD3T細胞マーカー。免疫組織化学パラフィン包埋した切片をClear-AdvantagePolysciences,Inc.,Warrington,Pennsylvaniaで脱パラフィン化し、再水和させ、Citrate-basedAntigenUnmaskingSolutionVectorLaboratoriesInc.,Burlingame,Californiaで処理し、ImmPRESSkitVectorLaboratories及びImmPACTChromogenVectorLaboratoriesを製造元の使用説明に従って用いて染色を行った。スライドをMayer’sHematoxylinMerckKGaAで対比染色し、Gel/MountaqueousmountingmediumBiomeda,Corp.,FosterCity,Californiaを用いてカバースリップをマウントした。以下の1次抗体を用いた:抗アルブミンウサギポリクローナル抗体A0001;DakoCytomationDenmarkA/S,Glostrup,Denmark、抗prosurfactantproteinCproSP-C:2型肺胞上皮細胞のマーカーウサギポリクローナル抗体AB3786;ChemiconInternational,Millipore;抗αフェトプロテインAFPマウスモノクローナル抗体AB3786;VectorLaboratories及び抗βカテニンマウスモノクローナル抗体610153;BDTransductionLaboratories,BDBiosciences。MDM2は、抗MDM2マウスモノクローナル抗体sc-965;SantaCruzBiotechnology、M.O.MimmunodetectionkitVectorLaboratories及びDABペルオキシダーゼ基質溶液VectorLaboratoriesを用いて染色した。抗FEATΔN抗体及び抗FEATΔC抗体は、それぞれ、FEATタンパク質の別の部位を認識する抗体であり、そのエピトープは、重複しない。これらの抗体で染色を行った結果、マウスの脳及び精巣において同一の領域が染色され、FEAT染色の特異性が示唆された。アレイCGH用のゲノムDNAの調製Tomiokaetal.,2008の記載に沿って、マウス組織からゲノムDNAを調製した。即ち、2mlマイクロチューブ内で粉砕した組織を1mlの氷冷TENバッファー50mMTrisHClpH8.0,1mMEDTA,pH8.0,100mMNaClに懸濁し、50μlの10SDSと共に穏やかに撹拌した。20mg/mlのプロテイナーゼKを25μl添加し、組織を50°Cで一晩インキュベートした。次に、1mlTE飽和フェノールNIPPONGENECo.,Ltd.,東京、日本を添加し、サンプルを室温にて1時間ローターで混和した後に8000rpm、15°Cで15分間遠心して水層を回収した。上記のフェノール抽出を繰り返した後、水層を回収し、1mlのクロロホルムイソアミルアルコールを添加した。混合物を室温にて1時間ローターで混和し、3000rpm、15°Cで10分間遠心して水層を回収した。事前に-20°Cに冷却しておいたエタノールを2ml添加し、穏やかに撹拌するとゲノムDNAの沈殿が生じた。パスツールピペットを用いてこの沈殿物を1mlの70エタノールの入った1.5ml微小遠心管に写し、15000rpm、4°Cで5分間遠心した。ペレットを200μlのTEバッファー10mMTrisHClpH8.0,1mMEDTAで再懸濁し、ローターで室温にて一晩混和させて溶解させた。DU800spectrophotometerBeckmanCoulter,Inc.,Fullerton,Californiaを用いて260nm吸光度を測定してDNA濃度を測定した。DNAの純度は、0.5μg/mlのエチジウムブロマイドを含有する0.8アガロースゲルを用いて200ngのDNAを電気泳動することにより評価した。スメアの生じなかったDNA試料のみを次の工程に用いた。アレイ-CGHアレイ-CGH用の244kスライドフォーマット60-merオリゴヌクレオチドマイクロアレイAgilentMouseGenomeCGHMicroarrayKit244Aに対し、以下のDNAを用いてDNA標識及びハイブリダイゼーションを行った:マウス肝細胞癌由来ゲノムDNA実験サンプル;正常C57BL/6マウス肝臓由来ゲノムDNA対照サンプル。AgilentTechnologies社SantaClara,Californiaの使用説明に従い、MicroArrayScannerを用いてマイクロアレイをスキャンし、FeatureExtractionソフトウェアを用いてデータ抽出を行い、CGHanalytics3.4ソフトウェアを用いてデータ解析を行った。組織アレイホルマリン固定パラフィン包埋された種々の正常組織及び腫瘍組織断片スポットされた組織アレイBlow,2007をUSBiomax,Inc.Ijamsville,Marylandから購入した。以下のマイクロアレイを用いた:MC5001複数器官の癌及び正常組織の高密度マイクロアレイ;BR721同一個体の癌隣接正常組織及び正常組織コントロールを含む乳癌組織マイクロアレイ;BC05021大腸腺癌悪性及び正常試料の組み合わせ;LV803肝臓癌癌組織、癌隣接組織及び正常組織の組み合わせ。マウス肝細胞癌におけるp53及びβカテニンの変異の解析RNeasyMinikitQiagenを用いて切除直後のマウス肝細胞癌組織からtotalRNAを単離した。KOD-Plus-DNAポリメラーゼを用いてPCRを行った。p53のORFの増幅には、以下の2セットのプライマーを用いた:増幅産物に対しダイレクトシークエンスを行った。さらに遺伝子変異の確認を行うため、ゲノムDNAと以下のプライマーセットを用いてマウスp53遺伝子のシークエンスを行った:KOD-Plus-DNAポリメラーゼ、アレイ-CGH用に調製した肝細胞癌ゲノムDNA及び以下のプライマーセットを用いてマウスβカテニン遺伝子のエキソン1~3の領域をPCR増幅した。この領域に含まれるエキソン2は、変異が頻繁に生じるホットスポットであるdeLaCoste,A.etal.1998Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,8847-8851。さらにKOD-Plus-DNAポリメラーゼと以下のプライマーを用いてNestedPCRを行った:得られた増幅産物に対し、ダイレクトシークエンスを行った。統計解析MicrosoftExcelのアドインパッケージであるStatcel2オーエムエス出版、所沢、日本を用いて統計解析を行った。<2.実験結果>FEATタンパク質の生化学的精製無細胞系を用いた核アポトーシスの制御分子の解析から、活性分画の中央においてアポトーシス促進活性の減弱が見られると共に、見かけの分子量がそれぞれ74kDa及び66kDaの2種類のペプチドが出現していることを見い出した図1A。これらのペプチドを精製したところ、66kDaのタンパク質は、SWAP-70と呼ばれるB細胞のアポトーシスを制御する分子であった。74kDaのタンパク質は、comparativegeneidentification-01CGI-01Lai,C.H.etal.,2000GenomeRes.10,703-713、KIAA0859又はmethyltransferaselike13METTL13と呼ばれるタンパク質のラットホモログであることが判明した。その発現パターン及び機能から、FEATfaintexpressioninnormaltissues,aberrantoverexpressionintumorsと命名した。FEATは、S-アデノシルメチオニン結合モチーフSAM結合モチーフを2つ含んでいる。SAM結合モチーフは、メチル基転移酵素及びその関連酵素に特徴的なモチーフであるKagan,R.M.,andClarke,S.1994Arch.Biochem.Biophys.310,417-427。種間においてFEATの構造は高度に保存されている図1B。図1Bに示すアライメントの上部の棒線I、postI、II及びIIIは、SAM結合モチーフを示す。また、アライメント上の矢印は、カスパーゼ3の切断部位を示す。アライメントは、ClustalW及びBoxshadeソフトウェアを用いて作製した。完全長又は切断型のいずれのタイプのFEATタンパク質においても、タンパクメチル基転移酵素活性又はスペルミジン/スペルミン合成活性は認められなかったデータ非公開。酵母を用いた相補性試験では、FEATは、ユビキノン合成酵素ではないことが示唆された図1C。カスパーゼ3によるFEATの切断スタウロスポリンSTSでCOS-7細胞のアポトーシスを誘導したところ、トランスフェクションで発現させたFEATが切断されていた図2A。invitroで転写/翻訳されたFEATは、カスパーゼ3では切断されたが、カスパーゼ6では切断されなかった図2B。カスパーゼ3欠損のMCF-7細胞では、FEATは殆ど切断されていなかったが、プロカスパーゼ3を共発現させると、FEATは効率的に切断された図2C。部位特異的変異導入試験を行い、ヒトFEATタンパク質のカスパーゼ切断部位を同定した図2D。Fas及びSTSでアポトーシス誘導したJurkatT細胞では、内在性FEATは切断されていた図2E。これらの結果から、FEATは、アポトーシス細胞死においてカスパーゼ3によって切断されることが示された図2F。FEATによるアポトーシス細胞死の抑制ヒトFEAT遺伝子は、染色体の1q24.3に位置するが、この部位は、悪性リンパ腫において高頻度で増幅されており、予後不良と関連している。リンパ腫細胞株において、FEATmRNAの発現量は、STS誘導性アポトーシスの抑制と相関していた図3A。カスパーゼによる抗アポトーシス性キナーゼ及びホスファターゼの切断により、生存系のシグナルが遮断され、アポトーシス誘導ペプチド断片が生じることにより、アポトーシスが誘導されることが知られているKurokawa,M.,andKornbluth,S.2009Cell138,838-854。FEAT又はカスパーゼ3により切断されたFEAT断片がアポトーシスに影響するかどうかを確かめるため、カスパーゼ3切断部位に変異を有するFEAT又は有しないFEATをコードするcDNAをKarpas299細胞に導入した。D274A/D288A変異体を発現するKarpas299細胞では、STS誘導性アポトーシスが有意に減少していた図3BMean±SEM,P<0.01;,P<0.025,n=3;pairedt-test。D274A/D288A変異体に更にD112A変異を導入することにより、D274A/D288A変異体がアポトーシスを抑制する能力が消失したD112A/D274A/D288A。これにより、D112が、抗アポトーシス機能に不可欠であることが示唆された。ウェスタンブロッティングを行ったところ、Karpas299細胞は、内在的にFEATを発現していることが判明したデータ非公開。FEATを発現しない細胞を探索したところ、殆ど全ての癌由来細胞株はFEATを発現していたため図4A、好中球を用いることにした図4B:急性リンパ性白血病患者から採取した末梢血単球ALL及び健常ボランティアから採取した好中球normal-1~4。野生型FEATFEATwt及びFEATΔNアミノ酸aa289-699:カスパーゼ3に切断された断片に相当のタンパク質導入により、好中球の自発的アポトーシスが有意に抑制された図4Cmeans±SEM;,P<0.002,n=9;,P<0.0002,n=9;,P<0.02,n=4;,P<0.02,n=4;pairedt-test。D274A/D288A変異体では、FEATwt又はFEATΔNと比べてより強力な抑制効果が認められた。一方、FEATΔCaa1-274は、アポトーシスに対する抑制効果が認められないが、FEATΔNの抗アポトーシス効果に干渉することが判明した図4CのFEATΔNC。ショートヘアピンRNAによりFEAT発現をノックダウンしたところ図3C、HeLa細胞のSTS誘導性アポトーシスが増加した図3DMean±SEM,P<0.01;,P<0.025,n=3;pairedt-test。これにより、内在性のFEATによってもアポトーシス細胞死が抑制されていることが示された。一方、FEATをノックダウンしても、細胞周期及び細胞増殖には影響が認められなかった。以上を考慮すると、FEATにはアポトーシス抑制能があり、この抑制能は、カスパーゼがFEATのD274及びD228を切断することにより失われることが導き出される。図3Aは、リンパ腫細胞株のRT-PCRの結果を示すものであり、この結果は、FEAT発現量が、アポトーシス発生率と逆相関することを示している。免疫染色を行ったところ、FEATは、びまん性に細胞質、核、及び部分的にERに局在していた図3E。PSORTII解析において得られた、34.8の確率でERに存在するという予測と一致するものであった。FEATは、アクチン及びミトコンドリアとは共局在していなかった図3E:拡大率x400。ヒト癌細胞におけるFEATの発現異常FEATは、一連のヒトの遺伝子発現のSAGEトランスクリプトーム実験にて使用されるTGACCTCCAGタグVelculescu,V.E.etal.1999Nat.Genet.23,387-388に相当することが判明した。TGACCTCCAGタグは、正常組織よりもヒトの大腸癌、脳腫瘍、乳癌、肺癌、メラノーマにおいて発現レベルが上昇している。ヒトの正常細胞をウェスタンブロット解析したところ、FEATは、精巣、脳及び肝臓において弱い発現が見られる程度であった図5A。このウェスタンブロット解析の結果は、メッセンジャーRNAの発現と一致しているLai,C.H.etal.,2000GenomeRes.10,703-713。正常細胞とは対照的に、殆どの種類のヒト癌組織においてFEATタンパク質の中程度~強い発現が観察され図5B、FEATが腫瘍発達に関与する遍在タンパク質であることが示された。腫瘍形成においてFEATが何らかの機能を有するか否かを調べるため、FEATタンパク質の発現量が低いNIH3T3細胞内でFEATを過剰発現させ、マイクロアレイにより転写プロファイルの変化を網羅的に解析した。図5CにコントロールプラスミドΔccdB-1、ΔccdB-2及びΔccdB-3並びにヒトFEATcDNA発現プラスミドFEAT-3、FEAT-15及びFEAT-20が導入されたNIH3T3細胞の抗FEAT抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す。GeneSetEnrichmentAnalysisGSEASubramanian,A.etal.2005Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102,15545-15550を行ったところ、FEATの過剰発現に伴って、チロシンキナーゼ受容体receptortyrosinekinase:RTK及びHedgehogシグナル経路のシグナルの上昇が認められた図5D左パネル、エンリッチメントプロット;右パネル、ヒートマップ及び表1。これらのシグナル経路は、腫瘍の発生及び維持に重要な役割を果たすことが知られているVogelstein,B.,andKinzler,K.W.2004Nat.Med.10,789-799;Rubin,L.L.,anddeSauvage,F.J.2006Nat.Rev.DrugDiscov.5,1026-1033。これらの結果は、FEATが、腫瘍促進タンパク質としてのポテンシャルを有することを示唆している。図5Dは、ヒトFEATcDNAをトランスフェクトされたNIH3T3細胞のゲノムワイド発現プロファイルのGSEA解析結果を示す。図5Dの左パネル及び右パネルは、それぞれエンリッチメントプロット及びヒートマップを示し、これらには、エンリッチメントスコアenrichmentscore:ES>0.5及びフォルスディスカバリーレートfalsediscoveryrate:FDRq-value<0.25の遺伝子セットがリストされている。FEATの上方制御によるinvivoでの腫瘍形成促進性FEATの発現量の上昇の腫瘍形成への寄与を評価するため、ヒトFEATを発現するトランスジェニックTgマウスを作製したHanahan,D.etal2007GenesDev.21,2258-2270。ヒトFEATは、種々のヒト組織で活性を示すプロモーターの制御下で発現させた。Tgマウスは、メンデルの法則に従った比率で出生した。新生Tgマウスの約15に先天性の白内障が認められたこと以外は、月齢9ヶ月に成長するまで他の器官は正常に発達し、組織学的にも異常は認められなかった。初代Tgマウス6匹のうち、1匹のメスライン10及び一匹のオスライン14については、複数の正常C57BL/6マウスと交尾させたところ、生殖能を有していないものと判断した。1匹の初代Tgオスマウスライン23の1世代目の子孫、及び1匹の初代Tgオスマウスライン18の2世代目の子孫は、生殖能を有していなかった。2世代目Tgマウスライン1、16及び18の精子を顕微鏡観察したところ、同腹の非トランスジェニックnon-Tgマウスと比べて精子の運動性が低下していた。ウェスタンブロット解析では、Tgマウスの胸腺、脾臓、肝臓及び肺においてヒトFEATの発現が認められた図6A:左パネル、non-Tgマウス;右パネル、Tgマウス。Tgマウス由来の胸腺細胞では、Fasリガンド誘導性細胞死及びグルココルチコイド誘導性細胞死が有意に減少しており図6BFasリガンド左パネル;means±SEM、,P<0.025;,P<0.05;,P<0.025,n=5;pairedt-test:デキサメタゾン右パネル;means±SEM、,P<0.04;,P<0.05,n=6;pairedt-test、Tgマウス内でのFEATの発現により、アポトーシスが抑制されたことが示された。初代、第1世代及び第2世代FEATTgマウスに発生した腫瘍を図6Cに示すHCC:肝細胞癌。Tgマウスが月齢12ヶ月に達すると、肝臓内で肝細胞癌hepatocellularcarcinoma:HCC図7A:矢印及び悪性リンパ腫の発生が観察され始めた図7C:矢印。対照的に、同腹のnon-Tgマウスでは、肝細胞癌の発症は認められず、リンパ腫についても、非常に低い発症率18、17匹中3匹しか認められなかった。従って、Tgマウスは、同腹のnon-Tgマウスと比べて腫瘍を形成しやすいか、あるいは寿命が短かった図8A:Tgマウス赤線:n=40及び同腹non-Tgマウス青線:n=17の非担癌生存率tumor-freesurvivalのKaplan-MeierプロットP<0.04,log-ranktest。Tgマウスの肝細胞癌及びリンパ腫は、4匹の異なる初代Tgマウスの子孫ラインにおいて観察された図6C。このことは、内在性の癌遺伝子に導入遺伝子が挿入されて活性化された結果として腫瘍が形成されたという可能性を否定するものである。肝細胞癌は、ヒトにおいて男性に頻繁に発症するがNaugler,W.E.etal.,2007Science317,121-124、マウスにおいても同様の傾向が認められた図6C。ヒトの肝細胞癌と同様、殆どのマウス肝細胞癌は、高分化腫瘍であった図8Bの上段パネル。また、マウス肝細胞癌では、明細胞型図8Bの左下段パネル及び細胞質封入体図8Bの右下段パネルといった変異型も観察された。2匹の肝細胞癌マウスでは、肺への転移も観察された図8C。殆どのリンパ腫は、胚中心芽球性centroblastic又は免疫芽球性immunoblasticのびまん性B細胞リンパ腫及び、いわゆる星空像starry-skyappearanceを示すBurkitt様B細胞リンパ腫に属するものであった図9A。いずれの変異型もCD45RB220を発現し100,15匹中15匹図9Aの挿入図、イムノグロブリン遺伝子のクローン性再構成を示した83、6匹中5匹。これらの特徴は、ヒトのリンパ腫患者に最もよく見られるB細胞型リンパ腫の特徴と一致する。実験に用いたリンパ腫のいずれもCD3陽性を示さなかった0、7匹中0匹。巨細胞を伴うCD45R及びCD3陰性の変異型も観察された図9B。これらのリンパ腫は、浸潤性が強く、高頻度で膵臓に浸潤していた図9C。2匹のマウスは、リンパ腫及び肝細胞癌の両方を患っており図9D、そのうち1匹は肺腺癌も患っていた図9E。肝細胞癌で発現するFEAT導入遺伝子をシークエンスしたところ、突然変異は認められなかった0、5匹中0匹。このことは、腫瘍形成において、FEATの構造変化が必要とされないことを示している。CF-1及びC3H純系マウスとは異なり、C57BL/6純系マウスでは肝細胞癌は殆ど発症しないことが知られているAnisimov,V.N.etal.,2005Nat.Rev.Cancer5,807-819。従って、FEATTgマウスは、C57BL/6純系種において肝細胞癌及びリンパ腫の両方を高い浸透度で発症するユニークなマウスモデルである。肝細胞癌及び悪性リンパ腫を患うFEATTgマウスの初代、第1世代及び第2世代マウスの肉眼写真をそれぞれ図7A及び図7Cに示す。図7Aの矢印は、肝臓に発生した腫瘍を示し、図7Cの矢印は、悪性リンパ腫によって腫大した腸間膜リンパ節、縦隔リンパ節及び腋窩リンパ節並びに肝臓及び脾臓を示す。図7Bに示す写真は、精子保存のために解剖した際に偶然初期の肝細胞癌を発見された月齢9ヶ月のオスTgマウス図8Bの左下段パネルの写真であり、肝臓に微小な腫瘍矢印を有する。これにより、肝臓癌の発生は、月齢12ヶ月よりも早期に起こることが分かった。図7Dは、同じTgマウスに同時に生じたリンパ腫上段パネル及び横紋筋肉腫下段パネルの顕微鏡写真を示すHE染色:x400拡大率。図7Eは、肝細胞癌を患うTgマウス赤線及びリンパ腫を患うTgマウス青線の非担癌生存率tumor-freesurvivalのKaplan-Meierプロットである。図10は、マウス染色体のうち、増幅個所赤色及び欠失個所緑色を示すGraphicalAberrationである。該GraphicalAberrationは、6匹のFEATTgマウスの肝細胞癌HCC、1匹のTgマウスの正常な肝臓、及び1匹のnon-Tgマウスの正常な肝臓由来のDNAをCGHAnalytics3.4softwarez-scorethreshold:2.5AgilentTechnologiesで解析した結果である。ヒト肝細胞癌モデルとしてのFEATTgマウスヒト癌患者と生理学的及び分子レベルでの特徴が酷似する癌を生じるモデルマウスを用いれば、ヒトの癌の原因を決定し、癌の予防方法を開発し、新たな治療法を開発及び試験することができる。そこで、FEATTgマウスの肝細胞癌が、ヒト肝細胞癌と同様の遺伝子変化を有するかどうかを評価した。マウス肝細胞癌が、ヒト患者と同様の染色体変化を有するかどうかを調べるため、マイクロアレイを用いた比較ゲノムハイブリダイゼーションarraycomparativegenomichybridizationarray-CGH、アレイCGHにより、ゲノム領域の増幅gain及び欠失lossコピー数変化:copynumberalterationsCNAを解析した。巨視的に、マウス肝細胞癌では、ゲノムの状態が不安定であり、欠失よりも増幅が多く観察された図10。この結果は、ヒトの肝細胞癌と類似するものであったZender,L.etal.2006Cell125,1253-1267。一方、肝細胞癌を患っていないTgマウスに由来する肝臓では、著しいコピー数変化は認められなかった。以上の結果から、ゲノムの不安定性は、FEAT導入遺伝子による直接的な影響によるものではなく、肝癌形成過程を通じて生じたものであることが示された。最近の研究において、ヒト乳癌のゲノムでは、3kb~1Mbの微小な領域のタンデム重複が、構造上の変化として共通して観察されることが報告されているStephens,P.J.etal.2009Nature462,1005-1010。今回の高分解能アレイCGHでも、マウス肝細胞癌において、染色体の微小な領域の増幅及び欠失が認められた。微小な領域のコピー数変化には、以下の18種類のがん関連遺伝http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/が含まれていた:MDS1,PDGFRA,PIK3R1,JAZF1,WHSC1L1,HOOK3,PCM1,MLLT3,PTEN,CBL,ERCC5,ERCC4,CYLD,CBFB,BRIP1,MLLT1,TMPRSS2,NF2表2。がん関連遺伝子として登録されていないTTN、SKP2、EED1及びPVT1も腫瘍形成に寄与するものと考えられている。マウス肝細胞癌及びヒト肝細胞癌の微小な領域のコピー数変化を直接比較するため、マウス肝細胞癌に共通するコピー数変化領域に対応するヒト染色体上のシンテニー領域に含まれる遺伝子をリストアップした表2。図8Dは、FEATTgマウス肝細胞癌n=6のアレイCGHで検出されたコピー数変化に対応するヒト染色体のシンテニー領域に存在する遺伝子数を示す図である。図8Dにおいて示されたシンテニー領域は、ヒト肝細胞癌に関与することが示唆されている染色体変異領域Farazi,P.A.,andDePinho,R.A.2006Nat.Rev.Cancer6,674-687の殆どすべてを含む。しかも、マウス肝細胞癌のアレイCGHの結果は、既に報告されているヒト肝細胞癌のarray-CGHの結果Zender,L.etal.2006Cell125,1253-1267と非常に類似するものであった。このように種間を超えて共通の遺伝子領域のコピー数変化が確認されたことにより、これらのTgマウスの肝細胞癌は、ヒト患者の肝細胞癌を忠実に再現したものであり、FEATTgマウスが、ヒト肝細胞癌の有用なモデル動物であることが示唆されたと言える。種々のヒト癌組織におけるFEAT発現の上昇FEATがヒトのどれだけの種類の癌の発生に寄与するかを見積もるため、組織アレイを用いてヒトの正常組織、種々の癌及びその亜型におけるFEATの発現レベルを調べた。大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌及び非小細胞性肺癌において、正常組織に比べてFEATの有意な発現上昇が確認された図11、図12、表3。FEATは、がん細胞では発現上昇していたが、癌組織に隣接する非腫瘍性間質細胞又は正常細胞では、発現上昇は見られなかった。従って、FEATの発現上昇は、ヒトの癌において広く共通する特徴であり、殆どの癌の発達において不可欠な過程であることが示唆される。驚くべきことに、ヒト肝細胞癌において、FEATの過剰発現が、腫瘍性形質変化に先立って起こっている:肝硬変組織中の肝細胞癌に隣接する肝細胞では、高レベルのFEAT発現が確認された図13。図13において、図中の数字は患者の年齢を示し、Mは、患者の性別男性:Maleを示す。この結果から、これらの肝硬変組織において、癌形成が進行していることを反映しているものと考えられる。また、乳管内癌早期進行性浸潤においてもinsituで著しいFEAT過剰発現が観察された図12A。以上の結果から、FEATは、多種多様なヒトの癌において、前癌段階又は早期腫瘍形成段階から関与するものと考えられる。"