"式1で示されるヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドであって、式1上記式中、RはH又はR1であり、R1はトリチル、モノメトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル、又はトリメトキシトリチルであり、nは1~100の範囲の整数であり、Bは、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基を示し、各繰り返し単位のBは同一であるか又は異なっており、R2は立体障害のあるシラン構造を有する基を示し、R3はハロゲン原子、ニトロ、又はメトキシを示す、ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチド。R2が、tert-ブチルジメチルシリコメタンtertbutyldimethylsilicomethane基、フェニルジメチルシリコメタン基、tert-ブチルジフェニルシリコメタン基、又はトリイソプロピルシリコメタン基である、請求項1に記載のヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチド。アシルがベンゾイル、イソブチリル、又はアセチルであり、ハロゲン原子がCl又はBrである、請求項1に記載のヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチド。ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの液相合成のための方法であって、縮合剤の存在下且つ縮合反応の条件下で、第1の液体反応溶媒中で式2の化合物と式3の化合物とを接触させて、式4の化合物を得ることを含み、式2式3式4上記式中、R1はトリチル、モノメトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル、又はトリメトキシトリチルであり、xは0~50の範囲の整数であり、yは1~50の範囲の整数であり、B1及びB2は、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基をそれぞれ示し、各繰り返し単位のB1及びB2は同一であるか又は異なっており、R2及びR3の定義は請求項1の定義と同一であり、Aはトリアルキルアンモニウムイオン又はジアルキルアンモニウムイオンを示す、方法。アシルがベンゾイル、イソブチリル、又はアセチルであり、トリアルキルアンモニウムイオン又はジアルキルアンモニウムイオン中のアルキル基が同一であるか又は異なっており、それぞれが1~6個の炭素原子を有する、請求項4に記載の方法。請求項4に記載の方法であって、縮合剤が、1-メシチレン-スルホニル-トリアゾール、1-メシチレン-スルホニル-3-ニトロ-トリアゾール、1-メシチレン-スルホニル-テトラゾール、1-トリイソプロピル-フェニル-スルホニル-トリアゾール、1-トリイソプロピル-フェニル-スルホニル-3-ニトロ-トリアゾール、及び1-トリイソプロピル-フェニル-スルホニル-テトラゾールの1つ又は複数であり、第1の液体反応溶媒が、ピリジン、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジオキサン、及びテトラヒドロフランの1つ又は複数であり、前記縮合反応の条件として、式3の化合物1molに対して、縮合剤の量が2~20molであり、第1の液体反応溶媒の量が2~50Lであり、xが0に等しい場合には式2の化合物の量が1~5molであり、xが1以上の場合には式2の化合物の量が0.3~1.25molであり、反応温度が0~50°Cであり、反応時間が0.5~100時間である、方法。請求項4~6のいずれか1項に記載の方法であって、さらに、第2の液体反応溶媒中で、トリアルキルアミン又はジアルキルアミンの存在下、加水分解反応条件下において、式4の化合物と水とを接触させ、加水分解反応を行ってβ-シアノエチルを取り外した加水分解生成物を得ることを含む、方法。請求項7に記載の方法であって、加水分解反応の条件として、式4の化合物1molに対して、トリアルキルアミン又はジアルキルアミンの量が1~200molであり、第2の液体反応溶媒の量が5~50Lであり、水の量が2~20Lであり、反応温度が0~50°Cであり、反応時間が0.25~2時間である、方法。請求項8に記載の方法であって、第2の液体反応溶媒がピリジン及び/又はアセトニトリルであり、トリアルキルアミン又はジアルキルアミン中の複数のアルキル基が同一であるか又は異なっており、それぞれ1~6個の炭素原子を有する、方法。請求項7に記載の方法であって、さらに、加水分解生成物を式3の化合物として用いて、式2の化合物との間に前記の縮合反応を再度行うことを含む、方法。請求項4~6のいずれか1項に記載の方法であって、さらに、第3の液体反応溶媒中で、有機酸の存在下、置換反応条件下において、式4の化合物中のR1基を水素で置換し、R1基をHで置換することによって生ずる生成物を得ることを含む、方法。請求項11に記載の方法であって、置換反応の条件として、式4の化合物1molに対して、有機酸の量が2~20molであり、第3の液体反応溶媒の量が10~150Lであり、反応温度が-10°C~40°Cであり、反応時間が1~60分であり、有機酸が、メチルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、及びトリフルオロ酢酸の1つ又は複数であり、第3の液体反応溶媒が、ジクロロメタン、トリクロロメタン、アセトニトリル、及びメタノールの1つ又は複数である、方法。請求項11に記載の方法であって、さらに、R1基をHで置換することによって生ずる生成物を式2の化合物として用いて、式3の化合物との間に縮合反応を再度行うことを含む、方法。請求項4に記載の方法であって、さらに、第4の液体反応溶媒中で、第1の脱保護反応条件下で式4の化合物とアンモニア水とを接触させ、複数種類の保護基を取り外し、複数種類の保護基が取り外された生成物を得ることを含み、前記の複数種類の保護基が、アシル、β-シアノエチル、及び式4中の式7の基を指し、式7上記式中、R3の定義は請求項4と同一であり、アンモニア水の濃度は25~28質量である、方法。請求項14に記載の方法であって、第4の液体反応溶媒が、ジオキサン、アセトニトリル、ピリジン、エタノール、及びメタノールの1つ又は複数であり、第1の脱保護反応条件として、式4の化合物1gに対して、アンモニア水の量が0.02~0.5Lであり、第4の液体反応溶媒の量が0.01~0.2Lであり、反応温度が10~60°Cであり、反応時間が5~100時間である、方法。請求項14に記載の方法であって、さらに、第5の液体反応溶媒中、第2の脱保護反応条件下で、複数種類の保護基が取り外された生成物とトリエチルアミン三フッ化水素酸塩TEA3HFとを接触させて、残りの種類の保護基を取り外し、全保護基が取り外された生成物を得ることを含み、前記残りの種類の保護基がR1及びR2であり、R1及びR2の定義が請求項4と同一である、方法。請求項16に記載の方法であって、第5の液体反応溶媒がジメチルスルホキシドであり、第2の脱保護反応条件として、複数種類の保護基が取り外された生成物1gに対してTEA-3HFの量が0.002~0.05Lであり、第5の液体反応溶媒の量が0.002~0.05Lであり、反応温度が40°C~85°Cであり、反応時間が1~5時間である、方法。本発明の課題は、従来のオリゴヌクレオチド合成法の欠点例えば、小スケール及び高コストを克服し、オリゴヌクレオチドの大スケール合成のための方法を提供することである。本発明は、式1で示されるヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドを提供する。式1上記式中、RはH又はR1であり、R1はトリチル、モノメトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル、又はトリメトキシトリチルであり、nは1~100の範囲の整数であり、Bは、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基を示し、各繰り返し単位のBは同一であるか又は異なっており、R2は立体障害のあるシラン構造を有する基を示し、R3はハロゲン原子、ニトロ、又はメトキシを示す。上記式中、立体障害のあるシラン構造を有する基は、tert-ブチルジメチルクロロシリコメタンtertbutyldimethylchlorosilicomethane基、フェニルジメチルクロロシリコメタン基、tert-ブチルジフェニルクロロシリコメタン基、又はトリイソプロピルクロロシリコメタン基であってよい。上記式中、アシルはベンゾイル、イソブチリル、又はアセチルであってよく、ハロゲン原子はCl又はBrであってよい。本発明が提供する式1の化合物において、RがHである場合には式1はxが1以上の次式2に相当し、RがR1である場合には式1は次式4に相当する。本発明はさらに、ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの液相合成のための方法を提供する。この方法はその特徴として、縮合剤の存在下且つ縮合反応の条件下で、第1の液体反応溶媒中で式2の化合物と式3の化合物とを接触させて、式4の化合物を得ることを含む。式2式3式4上記式中、xは0~50の範囲の整数であり、yは1~50の範囲の整数であり、B1及びB2は、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基をそれぞれ示し、各繰り返し単位のB1及びB2は同一であるか又は異なっており、R1、R2、及びR3の定義は式1の通りであり、Aはトリアルキルアンモニウムイオン又はジアルキルアンモニウムイオンを示す。本発明の方法によって得られる、保護基が取り除かれたオリゴヌクレオチドは、生物活性を有することが可能であり、種々の用途RNA干渉等に用いることができる。ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの液相合成のための本発明の方法には、ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの複数の保護基を組み合わせる方法が含まれる。立体障害のあるシラン構造を有する基によって2OHが保護された前提条件で、固相担体を使用せずに、ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの3’リン酸基をβシアノエチルによって直接的に保護する。その結果、βシアノエチル基を除去した後に、式4の化合物はそのまま次の合成ラウンドに関与できる。合成生成物は固相合成法の脱保護法の場合と一致しているが、純度はより高い。本発明によれば、反応は液相で起こるのでいかなる固相担体も必要でなく、数倍過剰量の基質が必要でないので原料が節約され、コストが削減される。本発明は保護されたヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチド塩を原料として採用しており、その合成反応は反応フラスコ又は反応釜中で起こり、固体担体又は合成装置の制限が無く、ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの大スケール合成が達成できる。本発明は、式1で示されるヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドを提供する。式1中、RはH又はR1である。R1は保護基であって、5’-OHを保護可能な任意の基であってよく、好ましくはトリチル、モノメトキシトリチル、4,4’-ジメトキシトリチル、又はトリメトキシトリチルであってよく、nは理論上は任意の正の整数であってよく、好ましくは1~100の範囲の整数であり、より好ましくは1~50の範囲の整数であり、更により好ましくは1~30の範囲の整数であってよく、Bは、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基を示し、各繰り返し単位のBは同一であるか又は異なっており、R2は立体障害のあるシラン構造を有する基を示し、R3はベンゼン環上の置換基好ましくはハロゲン原子、ニトロ、又はメトキシを示し、各繰り返し単位のR3は同一であるか又は異なってよく、ベンゼン環上におけるR3の位置は限定されず、オルト位、メタ位、又はパラ位であってよい。式1において、n=1の場合には式1はヌクレオチドを示し、nが1よりも大きい整数の場合には式1はオリゴヌクレオチドを示す。式1において、立体障害のあるシラン構造を有する基は、立体障害と保護機能とを有するシラン基であってよい。好ましくは、tert-ブチルジメチルクロロシリコメタンtertbutyldimethylchlorosilicomethane基、フェニルジメチルクロロシリコメタン基、tert-ブチルジフェニルクロロシリコメタン基、又はトリイソプロピルクロロシリコメタン基であってよい。より好ましくは、tert-ブチルジメチルクロロシリコメタン基であってよい。各繰り返し単位のR2は同一でも異なっていてもよい。式1において、保護基としての各アシルは同一でも異なっていてもよく、それぞれベンゾイル、イソブチリル、又はアセチルであってよい。式1において、ハロゲン原子はF、Cl、Br、又はIであってよく、好ましくはCl又はBrであってよく、より好ましくはClであってよい。本発明が提供する式1の化合物において、RがHである場合には式1はxが1以上の後述の式2に相当し、RがR1である場合には式1は後述の式4に相当し、RがR1である場合には式1は後述の式6に相当する。本発明はさらに、ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの液相合成の方法を提供する。この方法はその特徴として、縮合剤の存在下且つ縮合反応の条件下で、第1の液体反応溶媒中で式2の化合物と式3の化合物とを接触させて、式4の化合物を得ることを含む。式2、3、又は4において、xは理論上は任意の負でない整数であってよく、好ましくは0~50の範囲の整数であってよく、より好ましくは0~25の範囲の整数であってよく、更により好ましくは0~15の範囲の整数であってよい。yは理論上は任意の正の整数であってよく、好ましくは1~50の範囲の整数であってよく、より好ましくは1~25の範囲の整数であってよく、更により好ましくは1~15の範囲の整数であってよい。B1及びB2は、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基をそれぞれ示し、各繰り返し単位のB1及びB2は同一であるか又は異なっている。アシルの定義は式1の通りである。R1、R2、及びR3の定義は式1の通りである。Aはトリアルキルアンモニウムイオン又はジアルキルアンモニウムイオンを示す。前記イオン中の複数のアルキル基は同一でも異なっていてもよく、それぞれが1~6個の炭素原子好ましくは1~4個の炭素原子を有してもよい。前記縮合反応に用いる縮合剤及び前記縮合反応の条件は、当業者には公知であって、本発明では特に限定されない。例えば、縮合剤は、1-メシチレン-スルホニル-トリアゾール、1-メシチレン-スルホニル-3-ニトロ-トリアゾール、1-メシチレン-スルホニル-テトラゾール、1-トリイソプロピル-フェニル-スルホニル-トリアゾール、1-トリイソプロピル-フェニル-スルホニル-3-ニトロ-トリアゾール、及び1-トリイソプロピル-フェニル-スルホニル-テトラゾールの1つ又は複数であってもよい。第1の液体反応溶媒としては、ピリジン、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジオキサン、及びテトラヒドロフランの1つ又は複数を用いてもよい。前記縮合反応の条件には、次が含まれる。xが0に等しい即ち式2の化合物が3-ヒドロキシプロピオニトリルである場合、式3の化合物1molに対して、式2の化合物の量は1~5molであってよく、好ましくは1.2~3mol、より好ましくは1.5~2molであってよい。xが1以上の場合、式2の化合物の量は0.3~1.25molであってよい。式3の化合物1molに対して、縮合剤の量は2~20molであってよく、好ましくは2~5molであってよい。式3の化合物1molに対して、第1の液体反応溶媒の量は2~50Lであってよく、好ましくは2~30Lであってよい。反応温度は0~50°Cであってよく、好ましくは20~40°Cであってよい。反応時間は0.5~100時間であってよく、好ましくは1~10時間であってよい。縮合反応が完了した後、縮合反応を停止してもよく、生成物を分離する。縮合反応の停止方法及び生成物の分離方法は当業者に公知であり、本発明では特に限定されない。縮合反応の停止方法としては、例えば反応溶液と水とを0~15°Cで5~30分間混合してよい。第1の液体反応溶媒1Lに対して、水の量は0.05~0.2Lであってよい。縮合反応の停止方法としては、反応溶液と飽和炭酸水素ナトリウム溶液とを混合し、混合溶液を0~50°Cで5~10分間撹拌してもよい。飽和炭酸水素ナトリウム溶液と第1の液体反応溶媒との容積比は0.05~0.2:1であってよい。式4の化合物に対して後述の置換反応を行う必要がある場合、分離方法としては、反応を停止した後にロータリーエバポレーションによって反応溶液から溶媒を除去し、残渣を有機溶媒に溶解し、酸を用いてpH値を3~5に調節し、水で1回以上洗浄してもよい。第1の液体反応溶媒1Lに対して、有機溶媒の量は2~20Lであり、洗浄水の量は2~20Lである。無水硫酸ナトリウムを用いて有機相を乾燥した後、再度ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去し、常圧カラムによる分離後に生成物を得る。有機溶媒は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、及び酢酸エチルの1つ以上であってよい。酸は、1~10wtのシュウ酸及び/又は酢酸であってよい。式4の化合物に対して後述の加水分解反応を行うか全保護基を除去する必要がある場合、分離方法としては、反応を停止した後にロータリーエバポレーションによって反応溶液から溶媒を除去し、残渣を有機溶媒と混合し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加して洗浄し、乾燥、ろ過、濃縮し、常圧カラムで有機相を分離して生成物を得てもよい。有機溶媒は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、及び酢酸エチルの1つ以上であってよい。有機溶媒と第1の液体反応溶媒との容積比は2~20:1であってよい。洗浄は1回以上行ってよい。洗浄に用いる飽和炭酸水素ナトリウム溶液の総容積と第1の液体反応溶媒の容積との比は2~20:1であってよい。乾燥、ろ過、濃縮、及び常圧カラムによる分離の方法は当業者に公知であり、本明細書では詳しく説明しない。従って本発明の第1の実施形態においては、ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの本発明の液相合成法にはさらに次が含まれてもよい。第2の液体反応溶媒中で、トリアルキルアミン又はジアルキルアミンの存在下、加水分解条件下において、式4の化合物と水とを接触させ、加水分解反応を行ってβ-シアノエチルを取り外し、β-シアノエチルを取り外した加水分解生成物を得る。加水分解反応の条件としては、式4の化合物1molに対して、トリアルキルアミン又はジアルキルアミンの量は1~200mol好ましくは40~150molであってよく、第2の液体反応溶媒の量は5~50L好ましくは5~40Lであってよく、水の量は2~20L好ましくは2~15Lであってよい。反応温度は0~50°Cであってよく、好ましくは10~35°Cであってよい。反応時間は0.25~2時間であってよく、好ましくは0.25~1時間であってよい。好ましい第2の液体反応溶媒は、ピリジン及び/又はアセトニトリルである。トリアルキルアミン又はジアルキルアミン中の複数のアルキル基は同一でも異なっていてもよく、それぞれが1~6個の炭素原子を有する。例えば、トリアルキルアミンはトリメチルアミン、トリエチルアミン、及びジイソプロピルエチルアミンの1つ以上であってよく、ジアルキルアミンはジメチルアミン、ジエチルアミン、及びジイソプロピルアミンの1つ以上であってよい。加水分解の完了後、加水分解反応で得られた生成物を分離することができる。分離法は当業者には公知であって、本発明においては特に限定されない。例えば、分離法には次が含まれてもよい。ロータリーエバポレーションによって反応溶液の溶媒を除去し、残渣を有機溶媒に溶解し、洗浄溶液を添加して洗浄し、分液によって有機相を得る。無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した後、ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去して生成物を得る。有機溶媒は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、又は酢酸エチルの1つ以上であってよい。有機溶媒と第2の液体反応溶媒との容積比は1~10:1であってよい。洗浄溶液は0.1~1mol/Lの炭酸水素トリエチルアミンTEAB水溶液又は飽和炭酸水素ナトリウム溶液であってよい。洗浄は1回以上実施してよい。洗浄に用いるTEAB水溶液の総容積と第2の液体反応溶媒との比は、1~10:1であってよい。次に、分離した加水分解生成物を式3の化合物として用いて、式2の化合物との間に前記の縮合反応を再度行う。本発明の第2の実施形態においては、ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの本発明の液相合成法にはさらに次が含まれてもよい。第3の液体反応溶媒中で、有機酸の存在下、置換反応条件下において、式4の化合物中のR1基を水素で置換し、R1基をHで置換することによって生ずる生成物を得る。置換反応の条件としては、式4の化合物1molに対して、有機酸の量は2~20mol好ましくは2~10molであってよく、第3の液体反応溶媒の量は10~150L好ましくは10~130Lであってよい。反応温度は-10~40°Cであってよく、好ましくは-10~30°Cであってよい。反応時間は1~60分であってよく、好ましくは1~20分であってよい。有機酸は、好ましくはメチルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、及びトリフルオロ酢酸の1つ以上であってよい。第3の液体反応溶媒は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、アセトニトリル、及びメタノールの1つ以上であってよい。置換反応の完了後、R1基をHで置換することによって生じる生成物を分離することができる。分離法は当業者には公知であって、本発明においては特に限定されない。例えば、分離精製法には次が含まれてもよい。置換反応で得られた混合物を水溶性アルカリを用いて中和し、分液によって有機溶媒を得、水溶性アルカリで1回以上洗浄する。乾燥、ろ過、濃縮を行い、常圧カラムで有機相を分離して、置換反応後の生成物を精製したものを得る。第3の液体反応溶媒1Lに対して、洗浄に用いる水溶性アルカリの量は0.2~1Lであってよい。水溶性アルカリは飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素カリウム水溶液、又は飽和炭酸ナトリウム溶液であってよい。乾燥、ろ過、濃縮、及び常圧カラムによる分離の方法は当業者に公知であり、本明細書では詳しく説明しない。次に、R1基をHで置換することによって生じる生成物を分離したものを式2の化合物として用いて、式3の化合物との間に前記の縮合反応を再度行う。xが1以上である場合、式6の化合物中のR1基をHで置換することによって、式2の化合物を得ることができる。式6上記式中、x、B1、R2、及びR3の定義は式2の通りであるが、xは1以上である。R1の定義は式3の通りである。式6の化合物中のR1基をHで置換する方法は、式4の化合物中のR1基をHで置換する方法と同一であるが、式4の化合物の代わりに式6の化合物を用いる。式6の化合物を合成する方法には、次が含まれる。式5の化合物を式3の化合物として用い、xが0に等しい式2の化合物即ち3-ヒドロキシプロピオニトリルとの間に前記の縮合反応を行う。式5上記式中、x、B1、R2、及びR3の定義は式2の通りであるが、xは1以上である。R1及びAの定義は式3の通りである。式3中のyが式5中のxに等しい場合には、式3は式5に等しい。式3の化合物及び/又は式5の化合物を合成する方法は、開示文書PCT/CN2009/074101に詳しく記載されており、本明細書ではこれ以上説明しない。長い断片の低分子核酸に関しては、本発明はモジュール式の合成計画を提供する。例えば、21量体の核酸鎖を並列な4つの断片5量体~6量体に分割し、それらをさらに短い並列な断片2量体~3量体に分割する。短い2量体断片の合成後、それを用いて3量体を合成し、n量体nは標的長であるのオリゴヌクレオチド鎖に至ることが可能である。即ち理論上は、本発明が提供する方法によって、任意の長さのオリゴヌクレオチド鎖を合成することができる。以下の実施形態では、最長の42量体のみを挙げて本発明を説明する。本発明が提供する方法によれば、式4の完全に保護されたヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドを合成することができる。完全に保護されたヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの全保護基としては、アシル、β-シアノエチル、式7の基、式4のR1、及びR2が挙げられる。式7上記式中、R3の定義は式4と同一である。完全に保護されたヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの全保護基は、2ステップで除去することができる。ステップ1:第4の液体反応溶媒中で、第1の脱保護反応条件下で式4の化合物とアンモニア水とを接触させ、複数種類の保護基を取り外し、複数種類の保護基が取り外された生成物を得る。前記の複数種類の保護基とは、アシル、β-シアノエチル、及び式4中の式7の基を指す。第4の液体反応溶媒は、ジオキサン、アセトニトリル、ピリジン、エタノール、及びメタノールの1つ以上であってよい。第1の脱保護反応条件には、次が含まれる。式4の化合物1gに対して、アンモニア水の量は0.02~0.5L好ましくは0.05~0.3Lであってよく、第4の液体反応溶媒の量は0.01~0.2L好ましくは0.02~0.1Lであってよい。反応温度は10~60°Cであってよく、好ましくは10~30°Cであってよい。反応時間は5~100時間であってよく、好ましくは10~60時間であってよい。アンモニア水の濃度は25~28質量である。第1の脱保護反応が完了した後、減圧濃縮を行って溶媒を除去し、完全に乾燥してもよい。得られた固体は、複数種類の保護基が取り外された生成物である。ステップ2:第5の液体反応溶媒中、第2の脱保護反応条件下で、複数種類の保護基が取り外された生成物とトリエチルアミン三フッ化水素酸塩TEA3HFとを接触させて、残りの種類の保護基を取り外し、全保護基が取り外された生成物を得る。残りの種類の保護基とは、R1及びR2である。R1及びR2の定義は、式4の定義と同一である。第5の液体反応溶媒はジメチルスルホキシドである。第2の脱保護反応条件には、次が含まれる。複数種類の保護基が取り外された生成物1gに対して、TEA3HFの量は0.002~0.05L好ましくは0.005~0.03Lであり、第5の液体反応溶媒の量は0.002~0.05L好ましくは0.005~0.03Lである。反応温度は40~85°Cであり、好ましくは50~75°Cである。反応時間は1~5時間であり、好ましくは2~4時間である。脱保護反応の完了後、脱保護反応で得られた生成物を分離することができる。分離法は当業者には公知であって、本発明においては特に限定されない。例えば、分離法としては、予冷却したn-ブタノールを反応溶液に添加し、ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドを沈殿させ、遠心によって沈殿物を回収し、ヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの粗生成物を得てもよい。得られたヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの粗生成物は精製することができる。精製法は当業者には公知であって、本発明においては特に限定されない。例えば精製法としては、オクタデシルシランを結合した逆相シリカゲル充填ODSクロマトグラフにヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドの粗生成物を注入し、溶出物を回収し、凍結乾燥して標的生成物を得てもよい。本発明の方法によって得られる保護基を取り外したオリゴヌクレオチドは、生物活性を有し、種々の用途RNA干渉等に用いることができる。本発明で用いる気体及び液体の容積とは、1標準気圧20°Cにおける容積を指す。以下、実施形態によって本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲は実施形態の実施例に限定されるものではない。実施例に用いた原料は次の入手方法によって得た。保護された4種類のリボヌクレオチドアデニンリボヌクレオチドA、ウラシルリボヌクレオチドU、シトシンリボヌクレオチドC、及びグアニンリボヌクレオチドG。塩基の環外アミノをベンゾイルで保護し、2’OHをtert-ブチルジメチルシリコメタン基で保護し、5’OHを4,4’-ジメトキシトリチルで保護したもの:保護されたヌクレオチドの全4種類は、上海吉瑪製薬技術有限公司ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd.より購入。トリエチルアミン:天津市北方天医試薬工場より購入。1,2,4-トリアゾール:アルファエイサー社AlfaAesarより購入。2-フェニルジクロロホスフェート:アルファエイサー社AlfaAesarより購入。1-メシチレン-スルホニル-3-ニトロ-トリアゾールMSNT:シグマアルドリッチ社SigmaAldrichより購入。本実施例では、オリゴヌクレオチドを合成する。合成標的:完全に保護された21量体オリゴリボ-オリゴヌクレオチド配列:DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OE注:鉤括弧内の4文字A、U、C、及びGは、保護された4種類のリボヌクレオチドを示す。それらの環外アミノ基はベンゾイルを用いて保護されており、2’OHはtert-ブチルジメチルシリコメタン基で保護されている。それらの保護基、リン酸基、及び塩基間のフェノール-リン酸エステルは省略している。鉤括弧の左側にある基は5’末端にある保護基4,4’-ジメトキシトリチルDMTrを示すが、OHであってもよい。鉤括弧の右側にある基は3’末端にある保護基リン酸プロピオニトリルOEを示すが、リン酸基POであってもよい。本実施形態の合成には、図4に示す合成計画の30ステップが含まれる。1式3の化合物のモノマーDMTr[A]POの合成1Lの丸底フラスコに、1,2,4-トリアゾール13.8g、200mmolと無水ピリジン31.6g、400mmolとを加えて、ジクロロメタン130mlに溶解する。氷浴条件下で2-フェニルジクロロホスフェート19.6g、80mmolのジクロロメタン溶液65mlを滴下して、攪拌しながら0.5時間反応させる。保護されたアデニンリボヌクレオチド39.4g、50mmolのジクロロメタン溶液150mlを滴下して、氷浴条件下で攪拌しながら2時間反応させる。その後、1MのTEAB溶液150mlを添加して、攪拌を10分間継続する。1MのTEAB溶液で3回洗浄した後1回当たり90ml、無水Na2SO4を用いて全有機相を乾燥する。ろ過し、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、54.0gの生成物が得られる。収率は100である。この収率は、保護されたアデニンリボヌクレオチドに基づいて計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトルを検出し、31PNMRCDCl3,121Mδ-6.09を得る。これは5価のホスホジエステルが有する31PNMRの理論値テトラヒドロンTetrahedron、第36巻、p.3075-30851980年参照の範囲に当てはまっており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。ESI-MSで検出された生成物のMは976.2915であり、標的生成物の理論M値と十分に一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。2式3の化合物のモノマーDMTr[U]POの合成ステップ1と同じ方法によって合成されるが、保護されたアデニンリボヌクレオチドの代わりに保護されたウラシルリボヌクレオチドを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的生成物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。3式3の化合物のモノマーDMTr[G]POの合成ステップ1と同じ方法によって合成されるが、保護されたアデニンリボヌクレオチドの代わりに保護されたグアニンリボヌクレオチドを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的生成物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。4式3の化合物のモノマーDMTr[C]POの合成ステップ1と同じ方法によって合成されるが、保護されたアデニンリボヌクレオチドの代わりに保護されたシトシンリボヌクレオチドを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的生成物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。5式2の化合物のモノマーHO[A]OEの合成250mLの丸底フラスコに、ステップ1で得られたDMTr[A]PO17.3g、16mmolを加えて、無水ピリジン100mlに溶解する。3-ヒドロキシプロピオニトリル1.70g、24mmolを添加した後、MSNT13.3g、44.8mmolを添加する。反応を20°Cで2時間継続する。薄層クロマトグラフィーTLCにより反応完了が示された後、水10mlを添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、CH2Cl2200mlに再溶解する。適当量の5wtシュウ酸水溶液を添加してpH値を3~4に調節する。分液によって有機相を得て、水100mlで1回洗浄する。有機相を無水Na2SO4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を再度除去する。2wtのp-トルエンスルホン酸TsOHを含むCH2Cl2/CH3OHv:v=7:3溶液700mlを添加し、0°Cで5分間激しく撹拌する。次に、この溶液を飽和NaHCO3溶液を用いて直ちに中和する。分液によって有機相を得、飽和NaHCO3溶液300mlでもう1回洗浄する。有機相を無水Na2SO4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー溶出剤はCH2Cl2/CH3OHv:v=10:1による精製後、生成物10.9gが得られる。収率は93.4である。この収率は、DMTr[A]POに基づいて計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトルを検出し、31PNMRCDCl3,121Mδ-7.66、-7.79を得る。これらは5価のホスホジエステルが有する31PNMRの理論値に当てはまっており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。ESI-MSで検出された生成物のMは728.1956であり、標的生成物の理論M値と十分に一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。6式2の化合物のモノマーHO[U]OEの合成ステップ5と同じ方法によって合成されるが、ステップ1で得られたDMTr[A]POの代わりにステップ2で得られたDMTr[U]POを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的生成物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。7式2の化合物のモノマーHO[G]OEの合成ステップ5と同じ方法によって合成されるが、ステップ1で得られたDMTr[A]POの代わりにステップ3で得られたDMTr[G]POを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的生成物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。8式2の化合物のモノマーHO[C]OEの合成ステップ5と同じ方法によって合成されるが、ステップ1で得られたDMTr[A]POの代わりにステップ4で得られたDMTr[C]POを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的生成物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。9式4の2量体DMTr[AA]OEの合成100mLの丸底フラスコに、ステップ1で得られたDMTr[A]PO2.59g、2.40mmolとステップ5で得られたHO[A]OE1.46g、2.00mmolとを加える。無水ピリジン10mlに溶解した後、MSNT1.66g、5.60mmolを添加する。反応を室温で2時間継続する。TLCにより反応完了が示された後、2mlの飽和NaHCO3溶液を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をCH2Cl250mlに再溶解し、飽和NaHCO3溶液で2回洗浄する1回当たり30ml。有機相を無水Na2SO4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー溶出剤はCH2Cl2/CH3OHv:v=10:1による精製後、生成物3.26gが得られる。生成物の31PNMRスペクトルを検出し、31PNMRCDCl3,121Mδ-7.36、-7.46、-7.55、-7.90を得る。これらは5価のホスホジエステルが有する31PNMRの理論値に当てはまっており、生成物が実際に式4の構造を有することを示している。ESI-MSで検出された生成物のMは1687.64であり、標的生成物の理論M値と一致しており、生成物が実際に式4の構造を有することを示している。102量体DMTr[AA]POの合成ステップ9で精製したDMTr[AA]OEを、60mlのピリジン/トリエチルアミン/水v:v:v=3:1:1に溶解し、室温で30分間撹拌する。TLCにより反応完了が示された後、ロータリーエバポレーションによって反応溶液から溶媒を除去する。残渣をCH2Cl2100mlに再溶解し、1MのTEAB溶液で3回洗浄する1回当たり50ml。分液によって有機相を得る。無水Na2SO4による乾燥後に、有機相から溶媒を除去し、生成物3.20gを得る。ステップ9及びステップ10の反応の総収率は、93.9である。この収率は、HO[A]OEから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。112量体DMTr[GG]POの合成ステップ9及びステップ10と同じ方法によって合成されるが、ステップ1で得られたDMTr[A]POの代わりにステップ3で得られたDMTr[G]POを用い、ステップ5で得られたHO[A]OEの代わりにステップ7で得られたHO[G]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。122量体DMTr[AC]POの合成ステップ9及びステップ10と同じ方法によって合成されるが、ステップ5で得られたHO[A]OEの代わりにステップ8で得られたHO[C]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。132量体HO[AU]OEの合成500mLの丸底フラスコに、ステップ1で得られたDMTr[A]PO16.2g、15mmolを加える。無水ピリジン100mlに溶解した後、ステップ6で得られたHO[U]OE7.53g、12.5mmolを添加する。MSNT10.4g、35mmolを添加する。反応を室温で2時間継続する。TLCにより反応完了が示された後、10mlの水を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をCH2Cl2300mlに再溶解する。適当量の5シュウ酸水溶液を添加してpH値を3~4に調節する。分液によって有機相を得て、水150mlで1回洗浄する。有機相を無水Na2SO4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を再度除去する。2wtのトルエンスルホン酸TsOHを含むCH2Cl2/CH3OHv:v=7:3溶液700mlを添加し、0°Cで5分間激しく撹拌する。次に、飽和NaHCO3溶液を用いて直ちに中和する。分液によって有機相を得、飽和NaHCO3溶液300mlでもう1回洗浄する。有機相を無水Na2SO4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー溶出剤はCH2Cl2/CH3OHv:v=10:1による精製後、生成物12.9gが得られる。収率は81.8である。この収率は、HO[U]OEから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。142量体HO[CU]OEの合成ステップ13と同じ方法によって合成されるが、ステップ1で得られたDMTr[A]POの代わりにステップ4で得られたDMTr[C]POを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。152量体HO[GA]OEの合成ステップ13と同じ方法によって合成されるが、ステップ1で得られたDMTr[A]POの代わりにステップ3で得られたDMTr[G]POを用い、ステップ6で得られたHO[U]OEの代わりにステップ5で得られたHO[A]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。162量体HO[UC]OEの合成ステップ13と同じ方法によって合成されるが、ステップ1で得られたDMTr[A]POの代わりにステップ2で得られたDMTr[U]POを用い、ステップ6で得られたHO[U]OEの代わりにステップ8で得られたHO[C]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。172量体HO[UU]OEの合成ステップ13と同じ方法によって合成されるが、ステップ1で得られたDMTr[A]POの代わりにステップ2で得られたDMTr[U]POを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。183量体DMTr[CCU]POの合成100mLの丸底フラスコに、ステップ4で得られたDMTr[C]PO3.17g、3.00mmolとステップ14で得られたHO[CU]OE3.09g、2.50mmolとを加える。無水ピリジン20mlに溶解した後、MSNT2.08g、7.00mmolを添加する。反応を室温で2時間継続する。TLCにより反応完了が示された後、2mlの飽和NaHCO3溶液を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をCH2Cl2100mlに再溶解し、飽和NaHCO3溶液50mlで洗浄する。分液によって有機相を得、無水Na2SO4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー溶出剤はCH2Cl2/CH3OHv:v=10:1による精製後、精製された生成物が得られる。精製された生成物を、60mlのピリジン/トリエチルアミン/水v:v:v=3:1:1に溶解し、室温で30分間撹拌する。TLCにより反応完了が示された後、ロータリーエバポレーションによって反応溶液から溶媒を除去する。残渣をCH2Cl2100mlに再溶解し、1MのTEAB溶液で3回洗浄する1回当たり50ml。有機相を分離し、無水Na2SO4で乾燥した後、溶媒を除去する。生成物4.89gが得られる。収率は88.5である。この収率は、HO[CU]OEから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。193量体HO[UGA]OEの合成250mLの丸底フラスコに、ステップ2で得られたDMTr[U]PO10.0g、10.5mmolとステップ15で得られたHO[GA]OE12.0g、8.76mmolとを加え、無水ピリジン50mlに溶解する。MSNT7.31g、24.5mmolを3回に分けて添加する。反応を室温で2時間継続する。TLCにより反応完了が示された後、5mlの水を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をCH2Cl2200mlに再溶解する。適当量の5シュウ酸水溶液を添加してpH値を3~4に調節する。有機相を分離して、水100mlで1回洗浄する。有機相を無水Na2SO4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を再度除去する。2TsOHを含むCH2Cl2/CH3OHv:v=7:3溶液550mlを添加し、0°Cで5分間激しく撹拌する。次に、飽和NaHCO3溶液を用いて直ちに中和する。有機相を分離し、飽和NaHCO3溶液200mlで1回洗浄する。有機相を無水Na2SO4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー溶出剤はCH2Cl2/CH3OHv:v=10:1による精製後、生成物13.0gが得られる。収率は78.0である。この収率は、HO[GA]OEから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。203量体HO[CAU]OEの合成ステップ19と同じ方法によって合成されるが、ステップ2で得られたDMTr[U]POの代わりにステップ4で得られたDMTr[C]POを用い、ステップ15で得られたHO[GA]OEの代わりにステップ13で得られたHO[AU]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。213量体HO[UUC]OEの合成ステップ19と同じ方法によって合成されるが、ステップ15で得られたHO[GA]OEの代わりにステップ16で得られたHO[UC]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。223量体HO[AUU]OEの合成ステップ19と同じ方法によって合成されるが、ステップ2で得られたDMTr[U]POの代わりにステップ1で得られたDMTr[A]POを用い、ステップ15で得られたHO[GA]OEの代わりにステップ17で得られたHO[UU]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。236量体DMTr[CCUUGA]POの合成100mLの丸底フラスコに、ステップ18で得られたDMTr[CCU]PO4.18g、1.89mmolとステップ19で得られたHO[UGA]OE3.00g、1.58mmolとを加え、無水ピリジン10mlに溶解する。MSNT1.31g、4.42mmolを添加する。反応を室温で3時間継続する。TLCにより反応完了が示された後、2mlの飽和NaHCO3溶液を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、生成物をカラムクロマトグラフィー溶出剤はCH2Cl2/CH3OHv:v=10:1によって精製する。精製された生成物を60mlのピリジン/トリエチルアミン/水v:v:v=3:1:1に溶解し、この溶液を室温で30分間撹拌する。TLCにより反応完了が示され、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をCH2Cl2100mlに再溶解し、1MのTEAB溶液で3回洗浄する1回当たり50ml。有機相を分離し、無水Na2SO4で乾燥した後、溶媒を除去して生成物5.00gが得られる。収率は79.3である。この収率は、HO[UGA]OEから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。245量体DMTr[ACUUC]POの合成ステップ23と同じ方法によって合成されるが、ステップ18で得られたDMTr[CCU]POの代わりにステップ12で得られたDMTr[AC]POを用い、ステップ19で得られたHO[UGA]OEの代わりにステップ21で得られたHO[UUC]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。255量体HO[GGCAU]OEの合成250mLの丸底フラスコに、ステップ11で得られたDMTr[GG]PO5.72g、3.36mmolとステップ20で得られたHO[CAU]OE5.30g、2.80mmolとを加え、無水ピリジン15mlに溶解する。MSNT2.34g、7.84mmolを添加する。反応を室温で2時間継続する。TLCにより反応完了が示された後、1.5mlの水を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をCH2Cl2100mlに再溶解する。適当量の5シュウ酸水溶液を添加してpH値を3~4に調節する。有機相を分離して、水50mlで1回洗浄する。有機相を無水Na2SO4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を再度除去する。2TsOHを含むCH2Cl2/CH3OHv:v=7:3溶液170mlを添加し、0°Cで激しく撹拌する。この溶液を飽和NaHCO3溶液を用いて直ちに中和する。有機相を分離し、飽和NaHCO3溶液80mlで1回洗浄する。有機相を無水Na2SO4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー溶出剤はCH2Cl2/CH3OHv:v=10:1による精製後、生成物5.3gが得られる。収率は59.6である。この収率は、HO[CAU]OEから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。265量体HO[AAAUU]OEの合成ステップ25と同じ方法によって合成されるが、ステップ11で得られたDMTr[GG]POの代わりにステップ10で得られたDMTr[AA]POを用い、ステップ20で得られたHO[CAU]OEの代わりにステップ22で得られたHO[UUC]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。2711量体DMTr[CCUUGAGGCAU]POの合成100mLの丸底フラスコに、ステップ23で得られたDMTr[CCUUGA]PO4.86g、1.20mmolとステップ25で得られたHO[GGCAU]OE3.18g、1.0mmolとを加え、無水ピリジン10mlに溶解する。MSNT0.83g、2.80mmolを添加する。反応を室温で4時間継続する。TLCにより反応完了が示された後、1mlの飽和NaHCO3溶液を添加して反応を停止する。CH2Cl2100mlを添加し、50mlの飽和NaHCO3溶液で1回洗浄し、50mlの水で1回洗浄する。無水Na2SO4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー溶出剤はCH2Cl2/CH3OHv:v=10:1による精製後、精製された生成物を40mlのピリジン/トリエチルアミン/水v:v:v=3:1:1に溶解し、この溶液を室温で30分間撹拌する。TLCにより反応完了が示され、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をCH2Cl2100mlに再溶解し、1MのTEAB溶液で3回洗浄する1回当たり50ml。有機相を分離し、無水Na2SO4で乾燥した後、溶媒を除去して生成物2.89gが得られる。収率は42.7である。この収率は、HO[GGCAU]OEから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。2810量体HO[ACUUCAAAUU]OEの合成100mLの丸底フラスコに、ステップ24で得られたDMTr[ACUUC]PO4.86g、1.43mmolとステップ26で得られたHO[AAAUU]OE3.70g、1.19mmolとを加え、無水ピリジン10mlに溶解する。MSNT0.99g、3.33mmolを添加する。反応を室温で4時間継続する。TLCにより反応完了が示された後、1mlの飽和NaHCO3溶液を添加して反応を停止する。CH2Cl2100mlを添加し、50mlの飽和NaHCO3溶液で1回洗浄し、50mlの水で1回洗浄する。無水Na2SO4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去する。カラムによる分離後、得られた生成物に2TsOHを含むCH2Cl2/CH3OHv:v=7:3溶液150mlを添加し、0°Cで10分間激しく撹拌する。この溶液を飽和NaHCO3溶液を用いて直ちに中和する。有機相を分離し、飽和NaHCO3溶液50mlで1回洗浄する。有機相を無水Na2SO4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー溶出剤はCH2Cl2/CH3OHv:v=10:1による精製後、生成物4.6gが得られる。収率は63.5である。この収率は、HO[AAAUU]OEから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。2921量体DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OEの合成50mLの丸底フラスコに、ステップ27で得られたDMTr[CCUUGAGGCAU]PO2.80g、0.39mmolとステップ28で得られたHO[ACUUCAAAUU]OE2.17g、0.36mmolとを加え、無水ピリジン10mlに溶解する。MSNT321mg、1.08mmolを添加する。反応を室温で10時間継続する。1mlの飽和NaHCO3溶液を添加して反応を停止する。CH2Cl2100mlを添加し、50mlの飽和NaHCO3溶液で1回洗浄し、50mlの水で1回洗浄する。無水Na2SO4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー溶出剤はCH2Cl2/CH3OHv:v=10:1による精製後、生成物2.48gが得られる。収率は50.1である。この収率は、HO[ACUUCAAAUU]OEから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式4の構造を有することを示している。以上で、完全に保護された21量体RNAであるDMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OEが液相合成法によって得られる。30脱保護ステップ29で得られた、完全に保護された21量体RNAであるDMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OE10mgをジオキサン0.5mlに溶解する。25質量アンモニア水1mlを添加し、この溶液を振とうして均一に混合し、室温に40時間静置する。反応完了後、溶液を減圧濃縮して溶媒を除去し、完全に乾燥する。固体残渣を100μlのジメチルスルホキシドに再溶解し、125μlのTEA3HFを添加する。均一に混合した後、溶液を65°Cに加熱して2.5時間反応させる。-20°Cに予冷却したn-ブタノール1mlを添加する。オリゴヌクレオチドが沈殿する。遠心によって沈殿物を回収し、粗生成物3mgを得る。逆相ODSカラムクロマトグラフによって純化精製する。具体的な操作手順については文献を参照されたいモレキュラークローニングMolecularCloning、実験室マニュアルALaboratoryManual、第3版、サイエンスプレス社2002年9月出版。凍結乾燥し、標的化合物1.6mgを得る。島津製作所のAXIMACFRplus型MALDITOF質量分析計を用いて、ステップ30で得られた標的化合物の質量を分析する。得られた質量スペクトルを図1に示す。質量分析の結果から、ステップ30で得られたオリゴヌクレオチドが2つのピークそれぞれ、m/z6701.97及び3351.22を有することが示される。2つのピークは前記オリゴヌクレオチドの電荷数1のピーク及び電荷数2のピークであり、理論上の電荷数のピークm/z6702及び3351と一致している。質量スペクトル中にその他の不純物ピークは存在しなかった。従って質量分析の結果から、ステップ30で得られたオリゴヌクレオチドが正しい質量及び高純度を有することが示される。ステップ30で得られた生成物300ng、RNA固相合成装置ABI3900による固相合成で得られた生成物標的配列5CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU3を有する。上海ジーンファーマShanghaiGenePharma社300ng、及び上記の2つの生成物を等量ずつ混合した試料300ngを、PAGEで検出する。検出結果を図2に示す。この結果から、同一配列を有するオリゴヌクレオチドを異なる2種類の方法で合成したものは、PAGE上で同じバンド位置を有することが分かる。これら2種類の試料を混合した後もバンド位置は同じであって、明らかな混入バンドは存在しなかった。この結果から、同一の標的配列を有するオリゴヌクレオチドを異なる2種類の方法で合成したものは、同じ電気泳動度を有することが分かる。低分子RNAクローニング技術及びシーケンシング技術D.P.バーテルBartel著、セルCell、第116巻、p.2812004年を適用し、タカラ社のスモールRNAクローニングキット製品番号DRR065を用いて、ステップ30で得られた生成物のオリゴヌクレオチドをクローニングする。具体的な操作手順についてはキットの仕様書を参照されたい。首尾よくクローニングした後、インビトロジェン社に送付して塩基配列を決定する。操作手順については文献を参照されたいM.J.ポスPothら著、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリーJournalofBiologicalChemistry、第260巻、p.93261985年。クローニング及びシーケンシングの結果は5CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU3であり、ステップ30で得られた生成物の塩基配列が実際に標的配列であることが示される。本実施例では、標的配列5UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU3を有する脱保護されたオリゴヌクレオチドを合成する。この標的配列と実施例1の生成物の塩基配列とは、部分的に逆相補的である。本実施例の合成には、図5に示す合成計画の19個のステップが含まれる。1式2の2量体HO[AA]OEの合成実施例1のステップ13と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ6で得られたHO[U]OEの代わりに実施例1のステップ5で得られたHO[A]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。22量体DMTr[GU]POの合成実施例1のステップ9及びステップ10と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ1で得られたDMTr[A]POの代わりに実施例1のステップ3で得られたDMTr[G]POを用い、実施例1のステップ5で得られたHO[A]OEの代わりに実施例1のステップ6で得られたHO[U]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。32量体DMTr[AU]POの合成実施例1のステップ9及びステップ10と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ5で得られたHO[A]OEの代わりに実施例1のステップ6で得られたHO[U]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。42量体DMTr[CC]POの合成実施例1のステップ9及びステップ10と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ1で得られたDMTr[A]POの代わりに実施例1のステップ4で得られたDMTr[C]POを用い、実施例1のステップ5で得られたHO[A]OEの代わりに実施例1のステップ8で得られたHO[C]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。52量体DMTr[UC]POの合成実施例1のステップ9及びステップ10と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ1で得られたDMTr[A]POの代わりに実施例1のステップ2で得られたDMTr[U]POを用い、実施例1のステップ5で得られたHO[A]OEの代わりに実施例1のステップ8で得られたHO[C]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。62量体DMTr[AG]POの合成実施例1のステップ9及びステップ10と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ5で得られたHO[A]OEの代わりに実施例1のステップ7で得られたHO[G]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。73量体DMTr[UUU]POの合成実施例1のステップ18と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ4で得られたDMTr[C]POの代わりに実施例1のステップ6で得られたDMTr[U]POを用い、実施例1のステップ14で得られたHO[CU]OEの代わりに実施例1のステップ17で得られたHO[UU]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。83量体HO[GAA]OEの合成実施例1のステップ19と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ2で得られたDMTr[U]POの代わりに実施例1のステップ3で得られたDMTr[G]POを用い、実施例1のステップ15で得られたHO[GA]OEの代わりに実施例1のステップ1で得られたHO[AA]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。93量体HO[AUG]OEの合成実施例1のステップ19と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ2で得られたDMTr[U]POの代わりに実施例2のステップ3で得られたDMTr[AU]POを用い、実施例1のステップ15で得られたHO[GA]OEの代わりに実施例1のステップ7で得られたHO[G]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。103量体HO[UCA]OEの合成実施例1のステップ19と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ5で得られたDMTr[U]POの代わりに実施例2のステップ5で得られたDMTr[UC]POを用い、実施例1のステップ15で得られたHO[GA]OEの代わりに実施例1のステップ5で得られたHO[A]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。113量体HO[GUU]OEの合成実施例1のステップ19と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ2で得られたDMTr[U]POの代わりに実施例1のステップ3で得られたDMTr[G]POを用い、実施例1のステップ15で得られたHO[GA]OEの代わりに実施例1のステップ17で得られたHO[UU]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。126量体DMTr[UUUGAA]POの合成実施例1のステップ23と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ18で得られたDMTr[CCU]POの代わりに実施例2のステップ7で得られたDMTr[UUU]POを用い、実施例1のステップ19で得られたHO[UGA]OEの代わりに実施例2のステップ8で得られたHO[GAA]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。135量体HO[GUAUG]OEの合成実施例1のステップ25と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ11で得られたDMTr[GG]POの代わりに実施例2のステップ2で得られたDMTr[GU]POを用い、実施例1のステップ20で得られたHO[CAU]OEの代わりに実施例1のステップ9で得られたHO[AUG]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。145量体DMTr[CCUCA]POの合成実施例1のステップ23と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ18で得られたDMTr[CC]POの代わりに実施例2のステップ4で得られたDMTr[CC]POを用い、実施例1のステップ19で得られたHO[UGA]OEの代わりに実施例2のステップ10で得られたHO[UCA]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。155量体HO[AGGUU]OEの合成実施例1のステップ25と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ11で得られたDMTr[GG]POの代わりに実施例2のステップ6で得られたDMTr[AG]POを用い、実施例1のステップ20で得られたHO[CAU]OEの代わりに実施例2のステップ11で得られたHO[GUU]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。1611量体DMTr[UUUGAAGUAUG]POの合成実施例1のステップ27と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ23で得られたDMTr[CCUUGA]POの代わりに実施例2のステップ12で得られたDMTr[UUUGAA]POを用い、実施例1のステップ25で得られたHO[GGCAU]OEの代わりに実施例2のステップ13で得られたHO[GUAUG]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式3の構造を有することを示している。1710量体HO[ACUUCAAAUU]OEの合成実施例1のステップ28と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ24で得られたDMTr[ACUUC]POの代わりに実施例2のステップ14で得られたDMTr[CCUCA]POを用い、実施例1のステップ26で得られたHO[AAAUU]OEの代わりに実施例2のステップ15で得られたHO[AGGUU]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式2の構造を有することを示している。1821量体DMTr[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OEの合成実施例1のステップ29と同じ方法によって合成されるが、実施例1のステップ27で得られたDMTr[CCUUGAGGCAU]POの代わりに実施例2のステップ16で得られたDMTr[UUUGAAGUAUG]POを用い、実施例1のステップ28で得られたHO[ACUUCAAAUU]OEの代わりに実施例2のステップ17で得られたHO[ACUUCAAAUU]OEを用いる。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的化合物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分一致しており、生成物が実際に式4の構造を有することを示している。以上で、完全に保護された21量体RNAであるDMTr[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OEが液相合成法によって得られる。19脱保護脱保護は、実施例1のステップ30と同じ方法によって実施する。ただし、実施例1のステップ29で得られたDMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OEの代わりに、実施例2のステップ18で得られたDMTr[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OEを用いる。質量分析、電気泳動の結果、及びシーケンシングの結果は何れも、ステップ19の生成物の塩基配列が実際に標的配列であることを支持している。本実施例では、本発明の液相合成法で得られた生成物と固相合成法で得られた同一配列の生成物との間にある生物活性の一貫性を、RNA干渉試験によって検出する。実施例1の生成物と実施例2の生成物とを等量5nmol混合し、75°Cに加熱し、温度を10分間維持する。次に、自然に且つ徐々に室温まで冷却し、次の配列を有する二本鎖siRNAを得る。5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU-3’|||||||||||||||||||3’-UUGGAACUCCGUAUGAAGUUU-5’既知の配列CCUUGAGGCAUACUUCAAAを有するsmallinterferenceRNAsiRNAの標的遺伝子は、B型肝炎ウィルスXタンパク質HBVXである。即ち理論的には、前記の二本鎖siRNAはHBX遺伝子の発現を阻害する活性を有する。本発明の液相合成法で得られた生成物と固相合成法で得られた同一配列の生成物とが、HepG2.2.15細胞におけるHBVX遺伝子発現に対して示す阻害活性を、定量PCRによって検出する。1HepG2.2.15細胞の培養DMEM完全培地10ウシ胎児血清、2mMのLグルタミン、及び380μg/mlのG418を添加したものを用いて、24穴培養プレートにHepG2.2.15細胞北京大学人民病院から購入を1×105細胞/ウェルの濃度で接種し、インキュベータ内で培養する温度37°C、CO2濃度5。2siRNAのトランスフェクションインビトロジェン社から購入したリポフェクタミンTM2000リポソームを用いて、実施例7で得られた二本鎖siRNA、固相合成法で合成した同一配列の二本鎖siRNA上海ジーンファーマ社から購入、文献で報告された陽性効果を有する二本鎖siRNAPC配列5UCACCAUACUGCACUCAGG3、ウーインWuYingら著、RNA干渉の応用によるマウス急性B型肝炎ウィルス感染の治療ApplyRNAinterferencetotreatacutehepatitisBvirusinfectionofmice2005年、及び無関係な二本鎖siRNANCいずれも上海ジーンファーマ社から購入を比較する。これらを、本実施例のステップ1のHepG2.2.15細胞にトランスフェクションするトランスフェクション量=0.06nmol/ウェル。siRNAトランスフェクションのブランクコントロールとしては、滅菌した脱イオン水を用いる。具体的な実施手順については、リポフェクタミンTM2000の仕様書及び文献ウーインら著、RNA干渉の応用によるマウス急性B型肝炎ウィルス感染の治療2005年を参照されたい。3本実施例のステップ2でsiRNAをトランスフェクションしたHepG2.2.15細胞におけるHBX遺伝子のmRNA発現レベルを、リアルタイムPCR法によって検出する。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼGAPDHを内部コントロールの遺伝子とした。用いたプライマーの配列は次の通りである。具体的な実施手順については文献を参照されたいモレキュラークローニングMolecularCloning、第3版、サイエンスプレス社2002年9月出版。siRNAの阻害活性は、次式を用いて計算する。siRNAの阻害活性=1-siRNAトランスフェクション後のHBV遺伝子のコピー数/siRNAトランスフェクション後のGAPDHのコピー数/ブランクコントロールにおけるHBV遺伝子のコピー数/ブランクコントロールにおけるGAPDHのコピー数細胞に対するsiRNA干渉試験の結果を図3に示す。HBVX遺伝子のmRNAレベルは、無関係なsiRNAのネガティブコントロールNC群では低下しない。しかし、液相合成生成物のsiRNA及び固相合成生成物のsiRNAは、HBVX遺伝子発現の阻害に関してポジティブコントロールPCと同じ性能を有する。これは、実施例2で得られた液相合成生成物のsiRNAと固相合成生成物のsiRNAとが標的遺伝子の発現阻害に関して同じ生物活性を有することを示している。本実施例では、42量体オリゴヌクレオチドDMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUUUUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OEを合成する。1DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]POの合成実施例1のステップ29で得られたDMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OEの3.18g0.24mmolを、10mlのピリジン/トリエチルアミン/水v:v:v=3:1:1に溶解し、室温で30分間撹拌する。TLCにより反応完了が示され、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をCH2Cl2100mlに再溶解し、1MのTEAB溶液で3回洗浄する1回当たり50ml。有機相を分離し、無水Na2SO4で乾燥する。溶媒を除去した後、生成物2.64gが得られる。2HO[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OEの合成実施例2のステップ18で得られたDMTr[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OEの2.84g0.2mmolを、2TsOHを含むCH2Cl2/CH3OHv:v=7:3溶液25mlに添加し、0°Cで10分間激しく撹拌する。飽和NaHCO3溶液を用いて直ちに中和する。有機相を分離し、25mlの飽和NaHCO3溶液で1回洗浄する。有機相を無水Na2SO4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー用いる溶出剤はCH2Cl2/CH3OHv:v=10:1による精製後、生成物2.56gが得られる。342量体DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUUUUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OEの合成実施例1のステップ29と同じ方法で合成する。ただし、実施例1のステップ27で得られたDMTr[CCUUGAGGCAU]POの代わりに実施例4のステップ1で得られたDMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]POを用い、実施例1のステップ28で得られたHO[ACUUCAAAUU]OEの代わりに実施例4のステップ2で得られたHO[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OEを用いる。生成物1.21gが得られ、収率は30.1である。この収率は、HO[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OEに基づいて計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。生成物の31PNMRスペクトル及びMを検出する。標的生成物が有する31PNMRスペクトル及びMの理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式4の構造を有することを示している。以上で、完全に保護された42量体RNAのDMTr[CUUGAGGCAUACUUCAAAUUUUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OEが液相合成によって得られる。"