塩基対211から塩基対1740までのオープンリーディングフレームを有する配列番号1に記載の配列を含む、またはこの上記配列と少なくとも50の同一性を有する、または厳格な条件下でこの上記配列とハイブリダイズする、またはこの上記DNA配列とは遺伝コードが縮重している配列を含む、ことを特徴とするDNA分子であって、該配列がフコシルトランスフェラーゼ活性を有する植物タンパク質をコードするか、あるいはそれと相補的である該DNA分子。配列番号3に記載の配列を含むか、あるいはこの配列と少なくとも85、特に少なくとも95の同一性を有する配列または厳格な条件下でこの配列とハイブリダイズする配列またはこのDNA配列とは遺伝コードが縮重している配列を含むことを特徴とするDNA分子。配列番号1のDNA分子とストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号1に記載の配列と少なくとも80の同一性を有する、サイズが20~200塩基対であることを特徴とするDNA分子。請求項1~3のいずれかに記載のDNA分子、または請求項1~3のいずれかに記載のDNA分子であって、そのプロモーターに対して逆向きに配向するものを含むことを特徴とする生物学的機能性ベクター。リボザイムをコードするDNA分子であって、請求項1~3のいずれかに記載のDNA分子と相補的な、これにより該リボザイムが天然GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼDNA分子によって転写されるmRNAと複合体形成し、該mRNAを切断することを特徴とするDNA分子。GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの産生が抑制されているか、あるいは完全に停止されている組換え宿主細胞、特に植物もしくは昆虫細胞、または植物若しくは昆虫それぞれの調製方法であって、該宿主細胞、または植物若しくは昆虫それぞれに、それぞれ請求項4に記載のベクターまたは請求項5に記載のDNA分子、または欠失、挿入、およびまたは置換突然変異を含む請求項1~3のいずれかに記載のDNA配列を含むベクターのうち少なくとも1つを挿入することを特徴とする方法。組換え宿主細胞、特に植物もしくは昆虫細胞、または植物若しくは昆虫それぞれの調製方法であって、欠失、挿入、およびまたは置換突然変異を含む、フコシルトランスフェラーゼをコードしないが、標的宿主細胞、または植物若しくは昆虫それぞれのゲノムの内因性フコシルトランスフェラーゼ配列とハイブリダイズする、塩基対211から塩基対1740までのオープンリーディングフレームを有する配列番号1に記載の配列を含む、またはこの上記配列と少なくとも80の同一性を有する、または厳格な条件下でこの上記配列とハイブリダイズする、またはこの上記DNA配列とは遺伝コードが縮重している配列を含むDNA分子を、該宿主細胞、または植物若しくは昆虫それぞれのゲノムの突然変異していない相同配列の位置に挿入することを特徴とする方法。請求項6または7に記載の方法によって調製され、そのGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ産生が抑制されているか、あるいは完全に停止されていることを特徴とする組換え植物もしくは植物細胞または昆虫もしくは昆虫細胞。請求項1~3のいずれかに記載のDNA分子の配列と相補的な塩基配列、または請求項1~3のいずれかに記載のDNA分子の配列に対応する塩基配列を含むことを特徴とするPNA分子。GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの発現が転写または翻訳レベルでブロックされている植物若しくは昆虫、または細胞、特に植物もしくは昆虫細胞それぞれの作成方法であって、請求項8または9に記載のPNA分子を細胞に挿入することを特徴とする方法。組換え糖タンパク質の調製方法であって、請求項7に記載の系、または請求項9に記載の方法によって調製される植物若しくは昆虫または細胞それぞれを、その糖タンパク質を発現する遺伝子でトランスフェクトし、組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする方法。試料中のGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子の選択方法であって、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子と結合する、請求項1~3のいずれかに記載のDNA分子を該試料に加えることを特徴とする方法。植物または植物細胞中で組み換え糖タンパク質を製造することを含む組み換え糖タンパク質の製造方法であって、内因性GlcNAcα13フコシルトランスフェラーゼ活性が、天然植物または植物細胞のGlcNAcα13フコシルトランスフェラーゼ活性の50以下に抑制されており、GlcNAcα13フコシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子が、塩基対211から塩基対1740までのオープンリーディングフレームを有する配列番号1に記載のDNA配列を含む、またはこの上記配列と少なくとも50の同一性を有する、または厳格な条件下でこの上記配列とハイブリダイズする、またはこの上記DNA配列とは遺伝コードが縮重している配列を含む、製造方法。内因性α13フコシルトランスフェラーゼ産生が抑制もしくは完全に停止されている植物もしくは植物細胞中で組み換え糖タンパク質を発現させることを含む組み換え糖タンパク質の製造方法であって、配列番号1に記載の配列と配列を比較して内因性α13フコシルトランスフェラーゼを同定し、内因性α13フコシルトランスフェラーゼ産生が抑制されることを含む方法。本発明の目的は、植物フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をクローニングし、配列決定すること、およびこの遺伝子を含むベクター、そのDNA断片、またはその改変DNA若しくはそこから派生したDNAを調製し、植物および昆虫ならびにそれらの細胞にこれらのベクターの1つをトランスフェクトし、正常では存在するα13-コア-フコースを含まない糖タンパク質を産生すること、ならびに相当するそれらの方法を提供することである。本発明の目的は、211塩基対から1740塩基対のオープンリーディングフレームを持つ配列番号:1本明細書では、IUPACコードを用いることもあり、Nはイノシンを意味するに記載の配列、またはこの配列と少なくとも50相同する配列、若しくは以上に示した配列と厳格な条件下でハイブリダイズする配列を含むDNA分子、または上のDNA配列とは遺伝コードが縮重している配列を含むDNA分子であって、該配列はフコシルトランスフェラーゼ活性を持つ植物タンパク質をコードしており、または上記配列に相補しているDNA分子、によって達成される。これまでに開示されていないこの配列は、植物フコシルトランスフェラーゼ活性に関する全ての実験、分析および生産等に関する方法に完全に使用することができる。ここで、DNA配列およびこの配列によってコードされるそのタンパク質も興味深い。しかし、特にそのDNA配列がフコシルトランスフェラーゼ活性の阻害に使用され得る。配列番号1:のオープンリーディングフレームは、510アミノ酸を有し理論分子量568kDaであるタンパク質をコードし、膜貫通部分が恐らくはAsn36およびGly54間の領域に存在する。配列番号1の配列をコード化したタンパク質の理論的pI値は、751である。植物フコシルトランスフェラーゼの活性は、標識したフコースおよび担体例えば、セファロースに結合した受容体例えば、糖タンパク質を含む試料にフコシルトランスフェラーゼを添加する方法および測定によって決定される。反応時間後、その試料を洗浄し、結合したフコースの含有量を測定する。この場合にフコシルトランスフェラーゼの活性は、活性測定値がネガティブコントロールの活性測定値よりも少なくとも10から20、特に少なくとも30から50高い場合は、ポジティブであると考える。さらに、糖タンパク質の構造はHPLC測定によって証明し得る。このようなプロトコールは既に知られているManβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβt-Asn、GlcNAcβ1-2Manα1-3Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-AsnおよびGlcNAcβ1-2Manα1-3Manα1-3Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asnである。さらに、フコースが結合するか否かは、N-グリコシダーゼFに対する非感受性を測定することによって決定でき、それは質量分光測定方法によって検出できる。好ましくは、本発明のDNA分子は、配列番号1の配列と少なくとも70-80、特に好ましくは少なくとも95の相同性を有する。この配列は、特に活性なGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼをコードする。DNA配列は植物または昆虫に応じて多かれ少なかれ変化し得るので、例えば、配列番号1の配列と70の相同性を示す配列もまた、既述のような分析、実験または生産方法に使用するのに十分なフコシルトランスフェラーゼ活性を持つ。更に有利な態様によれば、DNA分子は2150個の塩基対から2250個の塩基対、特に2198個の塩基対を含む。このDNA分子は開始コドンの上流にある100個の塩基対から300個の塩基対、特に210個の塩基対を含み、同様にオープンリーディングフレームのストツプコドン後の下流にある350個の塩基対から440個の塩基対、特に458個の塩基対を含み、好ましくは、そのDNA分子末端は3’-ポリA-テールを含む。この様式では、翻訳レベルにおいて欠陥のない調節が約束され、活性なGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼをコードするうえで、特に効果的かつ確実なDNA分子が提供される。本発明はさらに、配列番号3の配列を含むDNA分子、または以上で特定した配列と少なくとも85、特に好ましくは少なくとも95、とりわけ少なくとも99の相同性を持つ配列を含むDNA分子、または以上で特定した配列と厳格な条件下でハイブリダイズするDNA分子、または以上で特定したDNA配列とは遺伝コードが縮重しているDNA分子に関する。相同性の決定は、好ましくは、挿入および欠失を認識し、それを相同性計算では考慮しないプログラムを用いて行なう。このヌクレオチド配列は保存ペプチドモチーフをコードしており、このことは多数の活性かつ機能性GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼがそれによってコードされるアミノ酸配列を含んでいることを意味する。例えば、その配列は配列番号3の配列と同じ大きさを含んでもよく、もちろん、それより大きいサイズもあり得る。本配列は完全なタンパク質をコードする配列よりも短かいので、組換え、欠失または他の変異に対して感受性が小さい。保存モチーフおよびその高い安定性がおかげで、本配列は特に配列認識試験に有利である。配列番号3は以下の配列:5-GAAGCCCTGAAGCACTACAAATTTAGCTTAGCGTTTGAAAATTCGAATGAGGAAGATTATGTAACTGAAAAATTCTTCCAATCCCTTGTTGCTGGAACTGTCCCT-3’:を含有する。さらなる態様に関して、本発明は既述のDNA分子の1つの部分配列を含み、20塩基対から200塩基対、好ましくは30塩基対から50塩基対の大きさを持つDNA分子に関する。そのDNA分子は、例えばプローブとしてGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの相補的配列に結合することで、それらを試料から選択することができる。この様式では、さらに大部分の変動する植物および昆虫由来のGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼを選択し、単離し、特徴付けることができる。また、任意の所望の配列または幾つかの種々の部分配列、具体的にはすでに既述した保存モチーフの一部を使用し得る。これを行なうにあたり、既述のDNA分子の1つがに検出可能な標識物質と共有結合すれば、特に好都合である。標識物質としては、任意の一般的なマーカー、例えば、蛍光、発光、放射性マーカー、非同位体マーカー例えば、ビオチンを使用することができる。この様式では、ハイブリッド形成法の手段を用いた固体組織試料中例えば、植物から、さらに液体試料中において相当するDNA分子の検出、選択および定量に適した試薬が提供される。本発明のさらなる態様は、既述のDNA分子の1つ、または少なくとも20塩基対を持つ種々の長さであるそれらの部分を含む、生物学的に機能するベクターに関する。宿主細胞中にトランスフェクトするのに関して、独立して増幅可能なベクターが必要であり、宿主細胞、翻訳機構、DNA分子の役割および大きさに依存して、好ましいベクターを使用することができる。多くのベクターが知られているために、それらを列挙することは本明細書の制限を越えることになり得、特にそれらのベクターは当業者には周知であるので、本明細書中では列挙しない本明細書中で使用する全ての技術および用語と同様に、それらのベクターは当業者に周知である、SambrookManiatisも参照のこと。理想的に、ベクターは分子量が小さく、ベクターを含む宿主細胞か、ベクターを含まない宿主細胞かの選択が容易に行なえるよう、細胞中で容易に認識可能な表現型を導入するような選択遺伝子を含ませるべきである。DNAおよび相当する遺伝産物の収量を大量に得るために、ベクターは強力なプロモーターと同様にエンハンサー、遺伝子増幅シグナルおよび調節配列を含ませるべきである。ベクターの自律的増殖とは、さらに複製開始点が重要である。ポリアデニル化部位はmRNAの正確な処理およびRNA転写に関するスプライシング信号を担う。仮にファージ、ウイルスまたはウイルス粒子をベクターとして使用する場合、パッケージ化信号はベクターDNAのパッケージ化を調節し得る。例として、植物中の転写とはTiプラスミドが適しており、昆虫細胞中の転写とはバキュロウイルスが、そして昆虫とは、それぞれPエレメントのようなトランスポゾンが適している。既述の発明ベクターを植物または植物細胞中に挿入すれば、内因性のα13-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現である転写後の抑圧は、それらに相同性のある導入遺伝子またはそれらの部分のセンス方向の転写によって達成される。このセンス技術に関しては、さらに文献としてBaucombe1996PlantMo1Bio19373382およびBrignetietal1998EMB0J1767396746で公表されている。この遺伝子サイレンシングはα13-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑圧する効果的な方法であるWaterhouseetal1998ProcNatlAcadSciUSA951395913964も参照。さらに、本発明は既述の態様の1つのDNA分子、またはプ口モータに対して逆方向に種々の長さを持つそれらの部分を含む生物学的に機能するベクターに関する。このベクターを宿主細胞中にトランスフェクトすれば、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼのmRNAに相補し、後に複合体を形成するアンチセンスmRNAを読むことになるだろう。この結合は正確なプロセッシング、輸送、安定性を阻害し、またはリボソームのアニーリングを妨げることにより、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの転写および正常な遺伝子発現を阻害する。DNA分子はその完全な配列をベクター中に挿入することができるが、それらの部分配列は、大きさが小さいためいに、特定の目的には有利となり得る。アンチセンス態様に関しては、例えばそのトランスフェラーゼmRNAに結合し得る十分に大きいアンチセンスmRNAを形成させるのに、DNA分子は十分な大きさであることが重要である。天然に生じるアンチセンスRNA分子がおおよそ100ヌクレオチドであることがよく知られているので、アンチセンスmRNA分子は例えば50から200ヌクレオチドを含むことが好ましい。活性α13-フコシルトランスフェラーゼの発現阻害に特に効果的であるので、センス技術およびアンチセンス技術を組み合わせることが好ましいWaterhouseeta11998ProcNatlAcadSciUSA951395913964。素早くハイブリダイズするRNA分子を使用のが都合良い。50ヌクレオチド以上の大きさを持つアンチセンスRNA分子の効率は、invitroでのアニーリング反応速度論に依存する。従って、例えば素早くアニーリングするアンチセンスRNA分子は、ゆっくりハイブリダイズするRNA分子よりタンパク質発現を阻害することが顕著である。そのように素早くハイブリダイズするアンチセンスRNA分子は、特に多くの外部塩基、多くの構造上のサブドメインおよび低度の輪状構造を含む。アンチセンスRNA分子の仮説上の2次構造を、例えばコンピュータープログラムを使用して決定することができ、それに応じて好ましいアンチセンスRNADNA配列を選ぶ。DNA分子の種々の配列領域をベクター中に挿入し得る。可能性の1つとしては、例えばリボソームがアニーリングするその部分のみをベクター中に挿入することがある。mRNAのこの領域を遮断すれば、翻訳全体を停止させるのに十分である。また、特に高効率のアンチセンス分子は、遺伝子の5および3非翻訳領域に関する結果である。好ましくは、本発明のDNA分子は、欠失、挿入およびまたは置換変異から成る配列を含む。変異ヌクレオチドの多くは可変であり、単一ヌクレオチドから幾つかの欠失、挿入および置換したヌクレオチドに変わる。また、リーディングフレームが変異によってずれることもあり得る。そのようなノックアウト遺伝子の場合は、単にGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの発現を妨害するのに重要なだけであり、活性、機能性酵素の形成を防ぐ。これを行なうにあたり、変異の位置は可変であるので、酵素の活性クンパク質の発現を阻止する。好ましくは、酵素のC末端領域にある触媒領域中の変異である。DNA配列に変異を挿入する方法は当業者に周知であり、従って種々の突然変異生成の可能性をここで詳細に記載する必要はない。偶然一致する変異と同様に、具体的には特異的突然変異、例えば、部位特異的突然変異、オリゴヌクレオチド制御突然変異、または制限酵素を用いた変異を、この例として用いる。さらに本発明は、既述の本発明DNA分子の部分配列と相補的である少なくとも各々が10から15塩基対の部分配列2つを含むリボザイムをコードするDNA分子を提供し、該リボザイムは天然GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼDNA分子から転写されたmRNAと複合体形成し、開裂させる。そのリボザイムはGlcNAc-αl3-フコシルトランスフエラーゼのmRNAの相補的な塩基対合によって、そのmRNAを認識するのだろう。続いて、そのリボザイムは、酵素が翻訳される前に配列特異的様式によりRNAを分解し、破壊する。開裂させた基質から解離した後、そのリボザイムはRNA分子と繰り返しハイブリダイズし、特定のエンドヌクレアーゼとして作用しする。一般に、リボザイムはタンパク質をコードする全DNA配列が知られていなくても、特定のmRNAを不活性化するために個別に調製することができる。リボソームがmRNAに沿ってゆっくり移動する場合、リボザイムは特に効果的である。この場合、リボザイムはmRNA上のリボソームがくっついていない部位を見つけることが容易である。この理由により遅いリボソームの変異体もリボザイムに適した系として好ましい。このDNA分子は植物GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの発現の下方調節および阻害それぞれに、特に都合がよい。可能な方法の1つに、リボザイムの多様型を使用することもある。ミニザイムは大きいmRNA分子の開裂に特に効果的である。ミニザイムはステムループIIの代わりに短いオリゴヌクレオチドリンカーを持つハンマー状頭のリボザイムである。二量体-ミニザイムは特に効果的である。そういった訳で、本発明は最後に挙げた2つのDNA分子の内1つを含む生物学的機能性ベクターにも関するものである。以上のベクターに関して述べたことは、この場合に適用する。そのようなベクターは、例えば微生物中に挿入することができ、既述の高濃度DNA分子の製造に使用することができる。さらに、そのようなベクターは、植物および昆虫体中、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼを下方調節または完全に阻害する目的で、この生体中へ特定のDNA分子を挿入することに期待できる。本発明は本発明のDNA分子を含むcDNAの調製方法を提供するものであり、それは、RNAを昆虫または植物細胞、特に胚軸細胞から分離し、逆転写酵素およびプライマーを混合した後、逆転写を行なうことである。本方法の各段階は、本質的に既知手順に従って行なわれる。一方で、逆転写についてオリゴプライマーを使用して全長のmRNAのcDNAを生成することができ、その後ただGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むDNA分子を調製するために選択したプライマーを用いてPCRをすることができる。もう一方で、その選択したプライマーを、短く、特定のcDNAを得るために逆転写に直接用い得る。その好ましいプライマーは、例えばトランスフェラーゼのcDNA配列パターンに従って合成的に調製することができる。本方法を用いることで、大分子量の発明cDNA分子を単純な方法で、失敗もほとんどなく、素早く製造することができる。さらに、本発明はGlceNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼをクローニングする方法に関するものであり、本発明DNA分子を、後に宿主細胞および宿主中それぞれヘトランスフェクトするベクターに組換え、活性GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼを発現するトランスフェクト宿主細胞、細胞株を選択し、増幅することを特徴とする。そのDNA分子は、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いてベクター中に挿入する。そのベクターに関しては、既に以上で述べたことを適用する。本方法では効果的な宿主-ベクター系を選ぶことが重要である。活性酵素を得るためには、真核宿主細胞が持に好ましい。可能な方法の1つに、昆虫細胞中にそのベクターをトランスフェクトすることがある。そうする場合、特に昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルスをベクターとして使用しなければならないだろう。ヒトまたは他の脊椎動物細胞にもトランスフェクトすることができるのは当然であり、その場合、後者は外来の酵素を発現するだろう。好ましくは、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ生産を抑圧または完全に停止させた組換え宿主細胞、特に植物細胞若しくは昆虫細胞または植物若しくは昆虫それぞれの調製方法を提供し、それは、本発明のベクター、即ち本発明DNA分子、変異DNA分子またはリボザイムをコードしたDNA分子を含むもの、若しくはプロモーターに対して逆向きのDNA分子を含むものの少なくとも1つを宿主細胞または植物若しくは昆虫へ挿入することを特徴とする。トランスフェクションに関して以上に述べたことは、本件中にも適応する。宿主細胞として、例えば植物細胞を使用する場合、例えばアグロバクテリアを用いるTiプラスミド系が適格である。アグロバクテリア系とは、直接植物にトランスフェクトすることができる。傷つけた植物にアグロバクテリアを感染させた場合、そのバクテリア自身はその植物中に入り込まず、輪状の染色体外の腫瘍誘導Ti-プラスミドから派生する組換えDNA部分を植物細胞中へ挿入する。そのT-DNA、およびそこに挿入されたDNA分子もまた、細胞の染色体に安定な様式で組み込まれ、植物中でそのT-DNA遺伝子を発現する。種々の宿主系に関して、既知の効果的なトランスフェクト機構が多数存在する。その例の幾つかは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション、リポソーム法である。続いて、トランスフェクトした細胞を、例えばベクターが持つ抗生物質耐性遺伝子、または他のマーカー遺伝子に基づいて選択する。その後、トランスフェクトした細胞株を小規模、例えばぺトリ皿にて、または大規模、例えば発酵槽にて増幅する。さらに、植物は特異な特性を持っており、即ち1つのトランスフェクトされた細胞またはプロトプラストから発育させることのできる完全な植物体へと再生することができる。使用するベクターに応じた過程が宿主中に生じる結果、酵素発現が抑圧または完全に停止され得る:欠失、挿入または置換変異のあるDNA分子を含むベクターをトランスフェクトした場合、相同組換えが生じる:その変異DNA分子はその変異にも関わらず、宿主細胞のゲノム中の同一配列を認識し、その場所に完全に挿入される結果、ノックアウト遺伝子が形成される。この様式では、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの完全な発現を阻害し得る変異を、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの遺伝子中に導入する。以上で説明したように、この技術を用いることで、その変異が活性タンパク質の発現を遮断するのに十分であることは重要である。選択し、増幅した後、さらに相同組換えまたは変異度のそれぞれを決定するために、その遺伝子を調べるように配列決定し得る。リボザイムをコードするDNA分子を含むベクターをトランスフェクトした場合、その活性リボザイムを宿主細胞中で発現させ得る。そのリボザイムは、GleNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの相補mRNAと少なくとも特定の部位で複合体を形成し、この部位を開裂し、この様式でその酵素の翻訳を阻害することができる。この宿主細胞および細胞株、それから派生した任意に植物では、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼは発現し得ない。そのベクターがプロモーターに対してセンスまたは逆方向に本発明DNA分子を含む場合、センスまたはアンチセンスmRNAがトランスフェクト細胞または、植物、それぞれ中で発現し得る。そのアンチセンスmRNAは、少なくともGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼのmRNAの一部と相補的であり、同様にその酵素の翻訳を阻害し得る。アンチセンス技術による遺伝子発現の抑圧方法の例としては、文献Smithetal1990MolGenGenet224447481によって公表され、この文献中において、トマトの成熟過程に関わる遺伝子の発現が阻害されるとある。上記すべての系において、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの発現は、少なくとも抑圧され、好ましくは更に完全に停止される。遺伝子発現の妨害の程度は、そのゲノムの領域内における複合体形成度、相同組換え頻度、後に同時発生し得る突然変異、および他の過程に依存し得る。そのトランスフエクト細胞をGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ活性に関して調べ、選択する。その上、既述したベクターの挿入に加えて、哺乳類のタンパク質、例えばβ14-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むベクターを宿主中に導入することで、α13-フコシルトランスフェラーゼの発現の抑圧を、既述するよりもより強めることができる。他の哺乳類の酵素作用、本発明ベクターおよび特に効果的な哺乳類の酵素ベクターを用いた活性α13-フコシルトランスフェラーゼの発現の阻害の組み合わせによって、フコシル化を減少させることができる。あらゆる植物型、例えばマングビーン、タバコ植物、トマトおよびまたはポテト植物をトランスフェクションに使用することができる。組換え宿主細胞、特に植物細胞若しくは昆虫細胞、または植物若しくは昆虫のそれぞれを作成する他の有利な方法は、突然変異を含むDNA分子を宿主細胞、または植物若しくは昆虫のそれぞれのゲノム中、突然変異のない相同配列の個所に挿入することである:11951206。従って、この方法はベクターではなく、純粋なDNA分子によって機能する。そのDNA分子を宿主中へ、例えば遺伝子照射、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションによって挿入する。すでに既述したように、DNA分子は宿主のゲノム中の相同配列に結合することで、相同組換えした後、欠失、挿入または置換変異のそれぞれをゲノム中で受けることになる:GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの発現は、それぞれ抑圧または完全に遮断され得る。さらに本発明の他の態様は、天然の植物または植物細胞それぞれ、および昆虫または昆虫細胞それぞれに生じるGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ活性が50以下、特に20以下、特に好ましくは0である植物または植物細胞それぞれ、および昆虫または昆虫細胞それぞれのGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ活性に関する。これらの植物または植物細胞それぞれの利点は、それらによって産生される糖タンパク質が、あらゆるα13-結合フコースをほとんどまたは完全に含まないことである。これらの植物または昆虫それぞれの産物をヒト人体または脊椎動物体に用いた場合、α13-フコースエピトープに対して免疫反応を示さないだろう。好ましくは、既述の方法の1つを用いて作成した組換え植物または植物細胞のそれぞれを提供し、それらのGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ生産は、それぞれ抑圧または完全に遮断している。また、本発明は既述の方法の1つを用いて作成した昆虫または昆虫細胞それぞれに関するものであり、それらのGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ生産は、それぞれ抑圧または完全に遮断している。また、この例としては、α13-結合フコース残基を持たない糖タンパク質を産生すること、α13-フコースエピトープに対して同様に免疫反応を示さなくなるまた、本発明は、本発明に基づくDNA分子配列、およびそれらの部分配列と相補的な塩基配列を含むPNA分子に関する。PNAペプチド核酸はDNA様の配列であり、その核酸塩基はシュードペプチド骨格に結合する。PNAは一般に、ワトソン-クリツク型塩基対合およびヘリツクス形成によって相補的なDNA-、RNA-またはPNA-オリゴマーとハイブリダイズする。そのペプチド骨格は、酵素分解に対して耐性が増強されている。従って、PNA分子は改善されたアンチセンス物質である。ヌクレアーゼもプロテアーゼもPNA分子を攻撃できない。PNA分子の安定性には、相補配列に結合する場合における、DNAおよびRNAポリメラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼおよびリボソームに対する十分な立体障害が含まれる。PNA分子が既述の配列を含む場合、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼをコードするDNAまたはDNAの部位それぞれに結合し、この方法でこの酵素の転写を阻害することができる。転写および翻訳せさないようなPNA分子は、例えばt-Boc技術によって合成的に調製し得る。有利なことに、本発明DNA分子の配列およびそれらの部分配列に相当する塩基配列を含むPNA分子を提供する。このPNA分子はGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼのmRNAまたはmRNAの部分と複合体を形成することで、その酵素の翻訳を阻害し得る。アンチセンスRNAについて記載する同様の議論は、この場合に適用する。従って、例えば特に効果的な複合体形成領域は、mRNAの翻訳開始領域、または5’-非翻訳領域でもある。本発明の更なる態様は転写または翻訳レベルそれぞれで、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの発現の遮断を含む植物若しくは昆虫または細胞それぞれ、特に、植物細胞または昆虫細胞の作成方法に関するものであり、それは本発明PNA分子を細胞中に挿入することを特徴とする。PNA分子またはPNA分子それぞれの細胞中への挿入には、再び従来の方法、例えばエレクト口ポレーションまたはマイクロインジェクションを使用する。PNAオリゴマーが細胞侵入ペプチド、例えばトランスポゾンまたはpAntpに結合する場合、特に効率的であるのは挿入であるPoogaetal1998NatureBiotechnology16857861。本発明は、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ生産がそれぞれ抑圧または完全に遮断された本発明組換え植物または植物細胞それぞれおよび昆虫または昆虫細胞それぞれ、または本発明方法によって、PNA分子が挿入された植物若しくは昆虫または細胞それぞれに、糖タンパク質を発現する遺伝子をトランスフェクトすることで組換え糖タンパク質を発現させることを持微とする、糖タンパク質の製造方法を提供する。これを行なう場合、すでに既述したように、所望のタンパク質に対する遺伝子を含むベクターを宿主または宿主細胞中それぞれに、すでに既述したようにトランスフェクトする。トランスフェクト植物細胞または昆虫細胞が所望のタンパク質を発現するようになり、それらはほとんどまたは完全にα13-結合フコースを持たない。従って、それらがヒト人体または脊椎動物体で、既述の免疫反応を引き起こすことはない。あらゆるタンパク質を、これらの系で産生し得る。有利なことに、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ生産が抑圧または完全に遮断された組換え植物または植物細胞それぞれおよび組換え昆虫または昆虫細胞それぞれ、または本発明方法によって、PNA分子が挿入された植物若しくは昆虫、または細胞それぞれに、糖タンパク質を発現する遺伝子をトランスフェクトすることで組換え糖タンパク質を発現することを特徴とする組換えヒト糖タンパク質の製造方法を提供する。この方法によって、植物体中でヒトタンパク質を産生させることができるようになり、それをヒト人体に用いた場合、α13-結合フコース残基に対して直結する全ての免疫反応を引き起こすことはない。そこで、組換え糖タンパク質を産生するために食料品として出す植物類、例えばバナナ、ポテトおよびまたはトマトを利用することができる。この植物組織は組換え糖タンパク質を含むので、例えばその組織から組換え糖タンパク質を抽出し、続いて処理する、または直接植物組織を摂食することそれぞれによって、ヒト人体に組換え糖タンパク質を取り込む。好ましくは、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ生産がそれぞれ抑圧または完全に遮断された本発明の組換え植物または植物細胞それぞれと同様に組換え昆虫または昆虫細胞それぞれ、または本発明方法によって、PNA分子が挿入された植物若しくは昆虫、または細胞それぞれに糖タンパク質を発現する遺伝子をトランスフェクトすることで、組換え糖タンパク質を発現する医療に適した組換えヒトタンパク質の製造方法を提供する。これを行なうにあたり、医療的に関心のあるあらゆるタンパク質を使用することができる。その上、本発明は既述の方法によって、組換え糖タンパク質を植物系または昆虫系中で調製し、それらのペプチド配列が、フコシルトランスフェラーゼを縮減させていない植物系または昆虫系で発現されたタンパク質に生じるα13-結合フコシル残基の50以下、特に20以下、特に好ましくは0を含む組換え糖タンパク質に関する。α13-結合フコース残基を含まない糖タンパク質が当然好ましい。α13-結合フコースの量は、既述のGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの抑圧の程度に依存し得る。好ましくは、本発明は既述の方法によって、植物系または昆虫系で産生された組換えヒト糖タンパク質に関するものであり、それらのペプチド配列はフコシルトランスフェラーゼを縮減させていない植物系または昆虫系で発現されたクンパク質に生じるα13-結合フコシル残基の50以下、特に20以下、特に好ましくは0を含む。具体的に好ましい態様は既述の方法によって、医療使用に適した組換えヒト糖タンパク質に関するものであり、それらのペプチド配列はフコシルトランスフェラーゼを縮減させていない植物系または昆虫系で発現されたクンパク質に生じるα13-結合フコシル残基の50以下、特に20以下、特に好ましくは0を含む。本発明の糖タンパク質は、持定の植物または昆虫それぞれで異なるオリゴ糖結合単位を含むことができ、それによってヒト糖タンパク質の場合、それはこの天然糖タンパク質と異なる。それにもかかわらず、本発明に基づく糖タンパク質によって、ヒト人体においてわずかな免疫反応しか引き起こさず、または全く免疫反応を引き起こすことはなく、それは、本明細書の導入部分ですでに述べたように、α13-結合フコシル残基が植物および昆虫糖タンパク質に対する免疫反応または交差免疫反応それぞれに対する主要な要因だからである。更なる態様は、本発明の糖タンパク質を含む製薬的な組成を含む。本発明の糖タンパク質に加え、さらに製薬的な組成はそのような組成に一般的な添加物を含む。これらは、例えば種々のバッファー内容物例えば、トリスーHCl、酢酸塩、リン酸塩、pH、およびイオン強度、添加剤、例えば、界面活性剤および可溶化剤、防腐剤、補助剤、酸化防止剤、乳化剤、充填剤、共有結合ポリマー、例えばポリエチレングリコール、タンパク質に対する多因子化合物の粒子組成における物質の取り込み、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など、またリポソームにおいて、それぞれの処置に好ましい助剤およびまたは担体物質である。そのような組成は、物理的条件、安定性、本発明の糖タンパク質のinvivoでの遊離速度およびinvivoでの分泌速度が影響し得る。また、本発明は、試料中に標識した本発明のDNA分子を混合し、それがGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子に結合することで、試料中のGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子を選択する方法も提供する。そのハイブリダイズしたDNA分子を検出し、定量し、かつ選択することができる。標識したDNA分子は一本鎖DNAを含む試料に対してハイブリダイズすることができ、その試料を例えば加熱によって変成させる。可能な方法の1つとして、エンドヌクレアーゼを添加した後に、アガロースゲルを用いたゲル電気泳動によってDNAを分離し、アッセイすることができる。ニトロセルロース膜に移行させた後、本発明の標識したDNA分子を混合し、相当する相同DNA分子にハイブリダイズさせる。他の可能な方法には、本発明のDNA分子配列から派生した特定のおよびまたは縮重したプライマーを使用するPCRによる方法によって他種から相同遺伝子を見つけることがある。好ましくは、以上で定義した本発明方法に関する試料は、植物または昆虫組織の染色体DNAを含む。この方法によって、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の存在に関して、多くの植物または昆虫を、とても素早くかつ効率的な様式でアツセイできる。この様式では、この遺伝子を含まない植物または昆虫をそれぞれ選択することができ、または既述の本発明方法によって、この遺伝子を含む植物および昆虫中でのGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの発現をそれぞれ抑圧または完全に遮断することによって、続いてそれらをトランスフェクトし、ヒト糖タンパク質の産生に使用し得る。また、本発明は最後に挙げた2つの方法によって選択し、続いて試料中から単離したGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子に関する。これらの分子は更にアツセイに使用することができる。それらの配列を決定し、次々にGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼを探すDNAプローブとして使用することができる。これらの-1aと標識された-DNA分子は生体に対して機能し、生体から単離したDNA分子は生体に共通し、本発明のDNA分子よりもプローブとしてより効率的である。本発明の更なる態様は、本発明に基づいてクローニングされ、pI値が60から90の間、好ましくは68から82の間であるアイソマーを含むGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの調製に関する。タンパク質におけるpI値は、そのタンパク質の総電荷であるpHが0となるものであり、アミノ酸配列、グリコシル化パターンと同様にタンパク質の立体構造に依存する。GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼは、pI値がこの範囲で少なくとも7つのアイソマーを含む。トランスフェラーゼの種々のアイソマーに関する理由は、例えば異なるグリコシル化およびタンパク質限定加水分解がある。検査は、種々の植物であるマングビーンの種形成において、アイソマーは種々の関係を持つことを示している。タンパク質のpI値は、当業者に周知である等電点電気泳動によって決定することができる。本酵素の主なアイソフォームは見かけ上54kDaの分子量を持つ。特に、本発明の調製は、pI値が68、71および76を持つアイソフォームを含む。また、本発明はフコース単位および既述のDNA分子によってコードされたGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼを、炭水化物単位または糖タンパク質それぞれを含む試料中に混合することで、フコースのα13-位置をGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼによって炭水化物単位または糖クンパク質それぞれに結合する、ヒトおよび他の脊椎動物糖タンパク質の植物化plantified炭水化物単位の製造方法に関する。GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼをクローニングすることに関して本発明に基づく方法により、精製した酵素を大量に産生することができる。完全な活性トランスフェラーゼを得るために、適した反応条件を提供する。トランスフェラーゼは、バツファーとして2-N-モルホリノ-エタン硫酸-HClを使用する場合、おおよそpH7で、特にトランスフエラーゼ活性が高いことが示された。二価陽イオン、特にMn2の存在下で、組換えトランスフェラーゼの活性が亢進される。炭水化物単位を、タンパク質に対して非結合型または結合型のいずれかである試料に混合する。その組換えトランスフェラーゼはいずれの型に対しても活性がある。本発明は以下の実施例および図式の方法によってより詳細に説明するが、勿論それに制限されない。コア-α13-フコシルトランスフェラーゼの単離すべての工程は4°Cで行った。リョクトウ実生をミキサーでホモジナイズマメ1kg当たり075容量の抽出バッファーを用いるした。次いで、ホモジネートを二層の綿布を通してろ過し、ろ液を30000xgで40分間遠心した。上清を廃棄し、ペレットを一晩攪拌しながら、溶解バッファーで抽出した。次いで30000xgで40分間遠心し、トリトン抽出物を得た。トリトン抽出物を以下のように精製した:工程1:あらかじめバッファーAで平衡化しておいたWhatmanのミクロ顆粒状ジエチルアミノエチルセルロースアニオン交換DE52セルロースカラム5x28cmにトリトン抽出物をアプライした。非結合フラクションをさらに工程2で処理した。工程2:この試料をバッファーAで平衡化したAffiGelBlueカラム25x32カラムにアプライした。カラムをこのバッファーで洗浄した後、吸着したタンパク質を05MNaClを含むバッファーAで溶出した。工程3:工程2の溶出液をバッファーBに透析した後、これを、同バッファーで平衡化したS-セファロースカラムにアプライした。結合タンパク質をバッファーB中の0~05MNaClの直線状濃度勾配で溶出した。GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼを含むフラクションをプールし、バッファーCに透析した。工程4:透析した試料を、バッファーCで平衡化したGnGn-セファロースカラムにアプライした。結合タンパク質をMnCl2のかわりに1MNaClを含むバッファーCで溶出した。工程5:次いで、酵素をバッファーDに透析し、GDP-ヘキサノールアミン-セファロースカラムにアプライした。カラムをバッファーDで洗浄した後、MgCl2およびNaClを05mMGDPで置換してこのトランスフェラーゼを溶出した。活性フラクションをプールし、20mMトリス-HClバッファーpH73に透析し、凍結乾燥した。2-エタンスルホン酸-HClバッファー、トリトンX-100、MnCl2、GlcNAcおよびAMPの存在下、それぞれ基質濃度05および025のGnGnペプチドおよびGDP-L-U-14C-フコースを用いて、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの酵素活性を測定したStaudacheretal1998GlycoconjugateJ15355360Staudacheretal1991EurJBiochem199745751にしたがう。bicinchoninicacid法Pierceを用いることによって、または酵素精製の最終工程においてアミノ酸分析を用いてAltmenn1992AnalBiochem204215219タンパク質濃度を測定した。図1aおよび1bでは、溶出液の各フラクションにおけるタンパク質の測定量および測定された酵素活性を曲線で示す。図1aは上記S-セファロースカラムでの分離を示し、図1bはGnGn-セファロースカラムでの分離を示す。円はタンパク質を表し、黒い完全な円はGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼを表し、四角はN-アセチル-β-グルコサミニダーゼを表す。1Uは、1分間当たり1mmolのフコースをアクセプターに転移する酵素量と定義する。表1はトランスフェラーゼ精製の各工程を示す。表1抽出バッファー:05mMジチオスレイトール1mMEDTA05ポリビニルポリピロリドン025Mスクロース50mMトリス-HClバッファー、pH73溶解バッファー:05mMジチオスレイトール1mMEDTA15トリトンX-10050mMトリス-HCl、pH73バッファーA:25mMトリス-HClバッファー、pH73、以下を含む:01トリトンX-100および002NaN3バッファーB:25mMクエン酸Naバッファー、pH53、以下を含む:01トリトンX-100および002NaN3バッファーC:25mMトリス-HClバッファー、pH73、以下を含む:5mMMnCl2nd002NaN3バッファーD:25mMトリス-HCl、pH73、以下を含む:10mMMgCl201MNaClおよび002NaN3SDS-PAGEおよび等電点電気泳動BioradMiniproteancellにおいて、125アクリルアミドおよび1ビスアクリルアミドを含むゲルでSDS-PAGEを行った。このゲルをCoomassieBrilliantBlueR250またはSilverで染色した。フコシルトランスフェラーゼの等電点電気泳動は、既成のpI範囲6~9を有するゲルServalytprecotes69Servaで行った。製造元のプロトコルにしたがってこのゲルを銀で染色した。二次元電気泳動用に、レーンを泳動ゲルから切り出し、S-アルキル化剤およびSDSで処理し、上記のようにSDS-PAGEに付した。図2はGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの電気泳動ゲルの例を示す。二次元電気泳動を左側に示し、一次元SDS-PAGEを右側に示す。Aと記されたレーンは標準であり、Bと記されたレーンはGnGn-セファロースカラム由来のGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼであり、Cと記されたレーンは精製GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ、すなわちGDPヘキサノールアミンセファロースカラムのフラクションである。54および56kDaの2つのバンドはトランスフェラーゼのイソ型を表す。図3は等電点電気泳動の結果を示す。レーンAは銀で染色し、レーンBでは、トランスフェラーゼのイソ型の活性を試験した。この活性はGDP-フコースから基質に転移されたフコースので示す。ペプチド配列決定タンパク質の配列決定用に、Coomasieで染色したSDS-ポリアクリルアミドゲルからバンドを切り出し、カルボキシアミド-メチル化し、トリプシンで分解したGoergetal1988Electrophoresis9681692にしたがう。このトリプシンペプチドを、10x250mmVydacC18での逆相HPLC40°C、流速005mL/分、HP1100装置HewlettPackardを用いるで分離した。製造元のプロトコルにしたがい、単離されたペプチドをHewlettPackardG1005Aタンパク質配列決定系で分離した。さらに、このペプチド混合物をMALDITOFMSを用いるIngel消化によって分析した以下を参照。図4は4トリプシンペプチド1~4のN末端配列を示す配列番号5~8。最初の3ペプチドから出発し、プライマーS1、A2およびA3を調製した配列番号9~11。3日生育させたリョクトウ胚軸から、PromegaのSV全RNA単離系theSVTotalRNAIsolatingSystemを用いて完全RNAを単離した。第一鎖cDNAを調製するため、完全RNAを48°Cで1時間、AMV逆転写酵素およびオリゴdTプライマーとインキュベートした。ここではPromegaの逆転写系theReverseTranscriptionSystemを用いた。第一鎖cDNAをPCRに付し、ここではセンスおよびアンチセンスプライマーを組み合わせて用いた:逆転写反応混合物10μLに以下のものを加えた:各プライマー01mmol、01mMdNTPs、2mMMgCl2、10mMトリス-HClバッファー、pH90、50mMKClおよび01トリトンX-100を含む50μL。95°Cで2分間の最初の変性工程の後、95°Cで1分間、49°Cで1分間および72°Cで2分間を40サイクル経過した。最後の伸展extension工程は72°Cで8分間行った。InvitrogenのTAクローニングキットを用いて、PCR産物をpCR21ベクターにサブクローニングし、配列決定した。このPCRの産物は、長さ744bpおよび780bpの2つのDNA断片であり、両DNA断片は同一5’末端を有していたまた図7も参照。これらの2つのDNA断片から出発し、RACEキットGibcoBRLを用いるcDNA末端の5’および3’高速増幅RACEによってcDNAの喪失5’および3’領域を得た。アンチセンスプライマーとしてはキットのユニバーサル増幅プライマーを用い、センスプライマーとしては5’-CTGGAACTGTCCCTGTGGTT-3’配列番号12または5’-AGTGCACTAGAGGGCCAGAA-3’配列番号13のいずれかを用いた。センスプライマーとして、また、キットの短くされたアンカープライマーを用い、アンチセンスプライマーとして5’-TTCGAGCACCACAATTGGAAAT-3’配列番号14または5’-GAATGCAAAGACGGCACGATGAAT-3’配列番号15を用いた。このPCRは、上記条件下、アニーリング温度55°Cで行った。5’および3’RACE産物をpCR21ベクターにサブクローニングし、配列決定した:サブクローン化断片の配列はジデスオキシヌクレオチド法ABIPRISMDyeTerminatorCycleSequencingReadyreactionKitおよびABIPRISM310Geneticanalyserを用いて決定した。ベクターpCR21にクローニングされた生成物の配列決定用にはT7およびM13正方プライマーを用いた。コーディング領域の両鎖をtheViennaVBCGenomicsSequencingService赤外線ラベルプライマーおよびLICORLongReadIR4200Sequencerを用いるによって配列決定した。図5aおよび5bは、サイズが2198bpで、1530bpのオープンリーディングフレームを有する完全cDNAを示す配列番号1。このオープンリーディングフレーム出発コドン塩基対211-213、終止コドン塩基対1740-1743は、分子量568kDA、理論的pI値751を有する510アミノ酸のタンパク質をコードする。図6aおよび6bは、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼのcDNA由来のアミノ酸配列を示す配列番号2。アスパラギン結合グリコシル化部位はAsn346およびAsn429である。図7では、GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ-cDNAの模式図上および得られたコード化タンパク質の疎水指数下を示す。正の疎水指数は疎水性の増加を意味する。その間には、完全cDNAとの関連において2つの上記PCR産物のサイズを示す。コーディング領域は帯によって示し、Cは推定の細胞質内領域をコードし、Tは推定の膜貫通領域をコードし、そしてGはトランスフェラーゼの推定のゴルジルーメン触媒領域をコードする。TMpredEMBnetSwitzerlandによってこのDNA配列を分析したところ、Asn36とGly54間の推定の膜貫通領域がわかった。この酵素のC末端領域はおそらく触媒領域を含み、その結果、ゴルジ装置のルーメン内へ指向するはずである。このことから、このトランスフェラーゼは、これまでに分析された、糖タンパク質の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼのすべてJoziasse1992Glycobiology2271277と同様にII型膜貫通タンパク質であると思われる。グレー領域は4つのトリプシンペプチドを表し、六角形は潜在的N-グリコシル化部位を表す。NCBIを介してアクセス可能なすべてのデータバンクにおけるBLASTPサーチによりGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼと他のα13/4-フコシルトランスフェラーゼ、例えばヒトフコシルトランスフェラーゼVIの類似性が示された。18~21SIMLALNVIEWExpaseSwitzerlandにおいて、トータルの類似性は任意の有意さを超えた。それにもかからわず、35アミノ酸の配列領域配列番号4は他のα13/4-フコシルトランスフェラーゼと非常に高い相同性を示す図8。この配列領域は配列番号2のGlu267とPro301間に位置する。昆虫細胞における組換えGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの発現細胞質内および膜貫通領域を含む、推定のGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼのエンコーディング領域を、theExpandHighFidelityPCRSystemにより、正方forwardプライマー:5’-CGGCGGATCCGCAATTGAATGATG-3’配列番号16および逆方reverseプライマー:5’-CCGGCTGCAGTACCATTTAGCGCAT-3’配列番号17を用いて増幅した。このPCR産物をPatIおよびBamHIで二重消化し、あらかじめPstIおよびBamHIで消化されたアルカリホスファターゼ処理バキュロウイルストランスファーベクターpVL1393にサブクローニングした。相同組換えを確実にするために、トランスファーベクターをBaculoGoldviralDNAとともに、リポフェクチンを含むIPL-41培地のSf9昆虫細胞に同時トランスフェクションした。27°Cで5日間インキュベートした後、組換えウイルスを含む種々の容量の上清をSf21昆虫細胞の感染に用いた。5FCSを含むIPL-41培地中27°Cで4日間インキュベートした後、Sf1細胞を収穫し、リン酸緩衝化塩溶液で2回洗浄した。2トリトンX-100を含む25mMトリスHClバッファーpH74にこの細胞を再懸濁し、氷上で超音波処理して破砕した。GlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ活性に関するアッセイホモジネートおよび細胞上清をGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼに関してアッセイした。盲検試料は、タバコ-GlcNAc-トランスフェラーゼIStrasseretal1999Glycobiologyintheprocessofprintingをコードする組換えバキュロウイルスを用いて実行した。図9は組換えGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼおよび負のコントロールの酵素活性の測定値を示す。同時トランスフェクションされた細胞およびその上清の酵素活性は、最大で、負のコントロールの酵素活性より30倍高かった。組換えトランスフェラーゼの不存在下で測定可能なこの内因性の活性は、実質的に昆虫-α16-フコシルトランスフェラーゼ由来であり、そのうち低いパーセンテージのみがGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼ由来である。したがって、組換えバキュロウイルス由来のGlcNAc-α13-フコシルトランスフェラーゼの増加は100倍を大きく超える。活性を2--エタンスルホン酸-HClバッファー中で測定した場合、この酵素はpH70付近で広い最大活性を示した。表2において明らかであるように、2価のカチオン、特にMn2を加えると組換えトランスフェラーゼの活性が高められる。表2表3は、標準的試験条件下では、用いられるアクセプターのうち、GnGn-ペプチドが最も高い包含率を示し、次いでGnGnF6eptideおよびM5Gn-Asnがそれにせまることを表す。3-結合マンノースの還元GlcNAc末端を含まないMMペプチドへの転移は見られなかった。この構造はコアのフコシルトランスフェラーゼに必要であると思われる。さらに、組換えトランスフェラーゼは、一般に用いられるアクセプター、血液型の決定に用いられるα3/4-フコシルトランスフェラーゼこれはフコースをオリゴ糖の非還元末端のGlcNAcに転移させると比較して不活性であった。アクセプター基質GnGn、GnGnF6ペプチド、M5Gn-Asnおよびドナー基質GDPフコースに関する見かけのKm-値はそれぞれ、019、013、023および011であると評価された。この分子の構造を図10aおよび10bに示す。表3フコシルトランスフェラーゼ生成物の質量分析ダブシル化GnGnヘキサペプチド2nmolを、組換えGlcNAc-α3-フコシルトランスフェラーゼ008mUを含む昆虫細胞のホモジネートと、非放射能性GDP-L-フコース10nmol、2-エタンスルホン酸-HClバッファー、トリトンX-100、MnCl2、GlcNAcおよびAMPの存在下でインキュベートした。負のコントロールは盲検試料に関する感染昆虫細胞のホモジネートを用いて行った。試料を37°Cで16時間インキュベートし、MALDITOF質量分析法によって分析した。質量分析はDYNAMO、動的抽出dynamicextraction、後期抽出lateextractionの同義語を可能にするMALDI-TOFMSで行った。2つのタイプの試料マトリックス調製物を用いた:ペプチドおよびダブシル化糖ペプチドを5ギ酸に溶解し、部分試料を標的にアプライし、空気乾燥し、1α-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸を注いだ。ピリジルアミノ化グリカン、還元オリゴ糖および非誘導化糖ペプチドを水で希釈し、標的にアプライし、空気乾燥した。225-ジヒドロキシ安息香酸を加えた後、減圧して試料を直ちに乾燥した。図11はこれらの試料の質量スペクトルを示し、Aは負のコントロールであり:メインのピークSはダブシル-Val-Gly-Glu-Asn-Arg-Thr基質を示し、計算されたMH値は22623である。この基質はまた、ナトリウム添加産物として、ならびにダブシル基のAzo官能基の断片化によって形成されたより小さいイオンとしてS★で現れる。小さい生成物の量P、MH=24084は内因性α16-フコシルトランスフェラーゼの結果である。m/z=24240のピークは基質の不完全な脱ガラクトシル化を示す。質量スペクトルBは組換えα13-フコシルトランスフェラーゼを含む試料を示す。メインのピークPはフコシル化産物を表し、P★はその断片化イオンを表す。さらに両試料の部分試料を互いに混合し、同様の濃度の基質および生成物を得た試料A。この混合物を、10mUのN-グリコシダーゼA試料Bを含む01M酢酸アンモニウム、pH40または100mU1Uは1分当たり基質1mmolを加水分解するのN-グリコシダーゼF試料Cを含む50mMトリス/HCl、pH85で希釈した。2および20時間後、これらの混合物の少量の部分試料を採り、MALDI-TOFMSによって分析した。図12では、試料A、BおよびCの3つの質量スペクトルを示す。未消化試料Aは2つのメインピークを示す:基質は22614m/z、フコシル化産物は24077m/z。真ん中の曲線は試料Bの質量スペクトルを示す。これは両糖ペプチドを加水分解するN-グリコシダーゼAで処理されたものである。96332のピークは脱グリコシル化産物を構成する。下の曲線は試料Cの質量スペクトルを示す。N-グリコシダーゼFはα13-フコシル化基質を加水分解することができないので、スペクトルは、24067m/zのフコシル化産物のピークを有し、一方、加水分解された基質のピークは96308m/zに現れる。ピリジルアミノ化フコシルトランスフェラーゼ生成物のHPLC-分析上記2つの試料フコシル化産物および負のコントロールをN-グリコシダーゼAで消化した。得られたオリゴ糖をピリジル-アミノ化し、逆相HPLCによって分析したWilsonetal1998glycobiology8651661Kubelkaetal1994ArchBiochemGiophys308148157Haseetal1984JBiochem95197203。図13中、上の図Bは負のコントロールを表し、残留基質GnGn-ペプチドに加えてα16-フコシル化産物が見られる。Aは実質的に保持時間がより短い時点でのピークを有し、これはGlcNAc-α13と結合フコースの減少を示すものである。下の図では、N-アセチル-βグルコサミニダーゼNacetylβglucosaminidaseによる消化前曲線Aおよび後曲線Bの単離されたトランスフェラーゼ生成物をMMF3ミツバチホスホリパーゼA2曲線Cと比較した。