C型肝炎ウイルスの遺伝子であって、それがコードする979番目のアミノ酸がトレオニンであり、1804番目のアミノ酸がロイシンであり、1966番目のアミノ酸がリジンであるC型肝炎ウイルス遺伝子。前記遺伝子がコードするアミノ酸配列が配列番号2に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と95以上の配列同一性を有し、複製能及び感染能を有するC型肝炎ウイルスを構成するアミノ酸配列である請求項1記載の遺伝子。前記遺伝子がコードするアミノ酸配列が配列番号2に示されるアミノ酸配列である請求項2記載の遺伝子。その塩基配列が、配列番号1に示される塩基配列ただしtはuでもよい又は該配列と90以上の配列同一性を有する塩基配列である請求項2記載の遺伝子。その塩基配列が、配列番号1に示される塩基配列ただしtはuでもよいである請求項4記載の遺伝子。遺伝子型が1b型である請求項1~5のいずれか1項に記載の遺伝子。請求項1~6のいずれか1項に記載の遺伝子を持つRNAレプリコン。請求項7記載のRNAレプリコンが感染し、C型肝炎ウイルスを複製する細胞。請求項1~6のいずれか1項に記載の遺伝子を持つC型肝炎ウイルス粒子。上記の通り、本発明者らは、インターフェロン抵抗性を示すC型劇症肝炎患者由来のHCV遺伝子であり、NS4Bタンパク質の領域に2個のアミノ酸変異を有するTPF14BレプリコンRNAが、複製効率が高く、培養上清中に感染性粒子を放出することを見出した特許文献2。しかしながら、より効率的に薬剤探索を行うためのハイスループットスクリーニング系に応用するため、より複製効率が高く再感染効率の高い改良型HCV遺伝子を取得することが求められている。従って、本発明の目的は、特許文献2に記載された公知のHCV遺伝子よりも複製効率が高く再感染効率の高いHCV遺伝子を提供することである。また、本発明の目的は、上記本発明の遺伝子を持つRNAレプリコン、該RNAレプリコンが感染しHCVを複製する細胞及びHCV粒子を提供することである。本願発明者らは、鋭意研究の結果、特許文献2に記載されているTPF14B株の遺伝子に、NS2領域の170番目のアミノ酸であるMetをThrに変異させることにより、複製効率及び再感染効率が有意に高まることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、C型肝炎ウイルスの遺伝子であって、それがコードする979番目のアミノ酸がトレオニンであり、1804番目のアミノ酸がロイシンであり、1966番目のアミノ酸がリジンであるC型肝炎ウイルス遺伝子を提供する。また、本発明は、上記本発明の遺伝子を持つRNAレプリコンを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のRNAレプリコンが感染し、C型肝炎ウイルスを複製する細胞を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の遺伝子を持つC型肝炎ウイルス粒子を提供する。本発明により、invitroでの増殖が可能な特許文献2に記載された公知のHCV遺伝子よりも複製効率が高く再感染効率の高いHCV遺伝子が初めて提供された。本発明のHCV遺伝子を用いることにより、生体内で複製しているHCVゲノムをinvitroで解析することが可能となる。このHCVゲノムを利用することにより、患者肝臓内で複製し、肝炎を重症化させる感染細胞モデルが構築できる。このモデルを利用することにより、肝炎の重症化を抑制、阻害する医薬品の開発、スクリーニングを行うことが可能となる。上記の通り、本発明のHCV遺伝子は、それがコードする979番目のアミノ酸がトレオニンであり、1804番目のアミノ酸がロイシンであり、1966番目のアミノ酸がリジンであることを特徴としている。これらのうち、1804番目のアミノ酸がロイシンであり、1966番目のアミノ酸がリジンであることは、特許文献2に記載されたTPF14B株の遺伝子が持つ特徴であり、これらの2個の変異によって、invitroにおいてHCVの自己複製が可能となり、従って、invitroにおけるHCVの培養が可能になる。本発明のHCVは、TPF14B株に特徴的なこれらの2個の変異を有し、かつ、TPF14B株の遺伝子と比較してNS2領域に1つの変異を有する。すなわち、HCV遺伝子がコードするアミノ酸配列の979番目NS2領域の170番目がトレオニンであるTPF14B株ではメチオニン。そのNS2領域のみを取り出した塩基配列をそれがコードするアミノ酸配列と共に配列番号3に示し、そのアミノ酸配列のみを取り出したものを配列番号4に示す。下記実施例において得られたHCV遺伝子の塩基配列をそれがコードするアミノ酸配列と共に配列番号1に示す。配列番号1中のアミノ酸配列のみを取り出したものを配列番号2に示す。本発明で規定する上記したアミノ酸番号は、配列番号2に示すアミノ酸配列を基準とする番号であり、配列番号2に示すアミノ酸配列は、上記した変異部分以外は通常の1b型HCVのアミノ酸配列と同様の3010アミノ酸から成るので、通常の1b型HCVのアミノ酸配列における番号と同様である。アミノ酸数が3010ではない場合には、配列同一性の算出に用いられる周知のソフトウェア後述を用いて、一致するアミノ酸数が最大になるように配列を配列番号2のアミノ酸配列とアラインすることにより、そのアミノ酸配列における、本発明で規定される上記3つのアミノ酸の位置を容易に特定することができる。その場合には、このように特定された部位のアミノ酸が、上記の3つのアミノ酸であることが必要である。なお、配列番号1に示す塩基配列や他の公知の1b型HCV遺伝子において、5’UTRは第1番目~第341番目の塩基配列、コアは第342番目~第914番目の塩基配列、E1領域は第915番目~第1490番目の塩基配列、E2領域は第1491番目~第2579番目の塩基配列、P7領域は第2580番目~第2768番目の塩基配列、NS2領域は第2769番目~第3419番目の塩基配列、NS3領域は第3420番目~第5312番目の塩基配列、NS4A領域は第5313番目~第5474番目の塩基配列、NS4B領域は第5475番目~第6257番目の塩基配列、NS5A領域は第6258番目~第7598番目の塩基配列、NS5B領域は第7599番目~第9371番目の塩基配列、3’非翻訳領域は第9372番目~第9594番目の塩基配列から成る。従って、本発明の遺伝子が有する変異部位のうち、1804番目のアミノ酸は、NS4B領域の93番目のアミノ酸、1966番目のアミノ酸はNS4B領域の255番目のアミノ酸である。本発明のHCV遺伝子は、RNAから成るもののみならずDNAから成るものをも包含する。RNAの場合、配列番号1及び配列番号3に示す塩基配列中のtはuになる。従って、本明細書及び特許請求の範囲において、塩基配列に言及している配列番号が示す塩基配列は、tがuであるものをも示しているものと解釈する。なお、HCV遺伝子には種々のバリアントが知られていることからも明らかなように、配列番号1に示す塩基配列に対して少数の変異を持つ塩基配列であっても複製能及び感染能を有するC型肝炎ウイルスを構成することは可能であり、それがコードするアミノ酸配列が上記した3つのアミノ酸を有し、かつ、複製能及び感染能を有するC型肝炎ウイルスを構成するものは本発明の範囲に包含される。すなわち、配列番号2に示すアミノ酸配列と95以上、好ましくは99以上の配列同一性を有し、複製能及び感染能を有するC型肝炎ウイルスを構成するアミノ酸配列ただし、979番目のアミノ酸がトレオニンであり、1804番目のアミノ酸がロイシンであり、1966番目のアミノ酸がリジンであるをコードする遺伝子は、本発明の範囲に包含される。ここで、配列同一性は、一致するアミノ酸残基の数が最大となるように必要に応じてギャップを挿入する、2つのアミノ酸配列を並べ、一致したアミノ酸残基の数を完全長の配列のアミノ酸残基2つの配列間で全アミノ酸残基の数が異なる場合、長い方のアミノ酸残基の数で除することよって求めた値を意味する。そのような配列同一性の計算は、BLASTやMacVectorVersion1051、MacVector等の遺伝子解析ソフトウェアのような周知のソフトウェアによって容易に行うことができる。なお、創薬スクリーニングに用いる場合、できるだけ天然に実在するHCVに近い方が好ましいので、本発明に特徴的な上記3つのアミノ酸の変異以外の変異は、天然のHCVが持つ変異であることが好ましい。また、その塩基配列は、配列番号1に示す塩基配列ただしtはuでもよい又は該塩基配列と90以上、好ましくは95以上、さらに好ましくは99以上の配列同一性を有するものが好ましい。また、複製能及び感染能を有するかどうかは、Huh7細胞のような肝臓細胞株に感染させ、細胞の培養上清中にHCVが検出できるかどうかにより判定することができ、具体的な手法は下記実施例に記載されている。配列番号1に示す塩基配列を持つHCV遺伝子は、1b型である。1b型は、インターフェロン耐性であるので、創薬スクリーニングの対象として重要である。従って、本発明のHCV遺伝子は、1b型であることが好ましい。HCVのジェノタイプはよく研究されており、ジェノタイピングの手法は、例えば、岡本らVirology1992年、第188巻、p331341やSimmondsらJournalofGeneralVirology1993年、第74巻、p23912399の文献に記載されている。当業者であれば、容易にHCVのジェノタイピングを行うことができる。本発明のHCV遺伝子は、公知のHCV遺伝子、好ましくは公知の1b型HCV遺伝子に、周知の部位特異的変異法等により、それがコードするアミノ酸配列が上記した3つのアミノ酸を有するように変異を導入することにより調製することができる。上記の通り、特許文献2に記載されたTPF14B株は、NS4B領域の2つの変異を有しているので、TPF14B株を出発遺伝子として用いる場合には、これにNS2領域の変異1個を導入することにより本発明のHCV遺伝子を調製することができる。部位特異的変異法は周知であり、そのためのキットも市販されているので容易に行うことができる。例えば、変異の導入は、特異的プライマーを用いたPCRPCRProtocolsAcademicPressを行うことで、NS2領域内にアミノ酸置換を導入することが出来るを用い、メーカーの推奨する方法に従い、RNAを精製した。BcDNAの合成及びPCRによるcDNAの増幅精製したRNAにXR58Rプライマーを加え、SuperSucriptIIreversetranscriptaseにより、メーカーの推奨する方法に従い、42°C、1時間逆転写反応を行わせ、cDNAを得た。得られた反応液にRNaseHInvitrogenを加え、37°C、30分反応させ、RNAを分解した。この反応液を、HCLongA1プライマーと1b9405Rプライマー及びTakaraLATaqDNApolymeraseを用い、94°C、20秒、68°C、9分間からなる30回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクションPCRを行い、cDNAを増幅した。更に、得られた反応液の一部を、HC85FとHC9302Rプライマーを用いてPCRを行い、HCVcDNAを増幅した。CcDNAのクローニング増幅したDNA断片は、07アガロースゲルを用い電気泳動によって分離し、QIAquickgelpurificationkitを用い、メーカーの推奨する方法に従って、DNA断片を回収した。回収したDNA断片は、pGEMTeasyベクターPromega社と連結反応させ、そのプラスミドによりDH5α株を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択し、2YT培地を用いて培養した。培養した菌体からWizardPlusSVMiniprepDNAPurificationSystemを用いプラスミドを精製した。D塩基配列の決定HCVcDNAの塩基配列は、HCVの遺伝子型1bの塩基配列に基づいて設計したプライマー配列番号17~39を用い、決定した。CEQDTCSQuickStartKitベックマンコールターを用い、メーカーの推奨する方法に従い、反応を行い、CEQ2000XLDNAanalysissystemにより解析した。得られたデータをSequencherにより解析した。得られたHCVクローンをpTPF10193と命名した。E5’非翻訳領域のcDNAの取得と塩基配列の決定更に、前記のAの工程で得られたRNAより、5’RACE法により、5’非翻訳領域の末端のcDNAを取得した。5’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEndsVersion20のキットを用い、添付の指示書に従って、実施した。cDNA合成のためのアンチセンスプライマーは、Chibaasを使用した。SuperScriptIIReverseTranscriptaseInvitrogenでcDNAを合成し、SNAPcolumnで精製後、cDNAにTdTtailing反応を行い、dCTPを付加した。キットに添付の5’RACEAbridgedAnchorプライマー及びKY78プライマーでTakaraLATaqDNApolymerase宝酒造を用いて、1回目のPCRを行った。このPCR産物の一部を鋳型として、キットに添付のUTPプライマーとKM2プライマーで、TakaraLATaqDNApolymerase宝酒造を用いて2回目のPCRを行い、PCR産物を得た。このPCR産物をpGEMTeasyベクターにクローニングし、前記Dの工程に従い、塩基配列を決定した。得られた配列番号1における第1位から第709位までを含むHCVcDNAクローンをpTPF10007と命名した。F3’非翻訳領域のcDNAの取得と塩基配列の決定前記のAの工程で得られたRNAより、3’RACE法により、3’非翻訳領域の末端のcDNAを取得した。まず、患者のRNAにPolyTailingKitAmbionを用いて、添付の指示書に従い、Polyを付加した。XR58Rプライマーの代わりにdTAdpプライマーを、1stPCRのプライマーとして3UTR1Fプライマー及びAdpプライマーを、2ndPCRのプライマーとしてXR58F及びAdpプライマーを用いた以外は、前記工程B~Dの操作を繰り返した。得られたHCVcDNAクローンをpTPF18994と命名した。得られたHCV株をTPF1株と命名した。TPF1株は、全長9594塩基のHCVであり、その塩基配列を配列番号1但し、3277番目のCがTであり、5752番目のTがAであり、6237番目のAがGである。に示した。得られたTPF1株のポリヌクレオチドは、その342番から9374番の間に、3010個の一つながりのアミノ酸をコードする翻訳領域を有するものであった。TPF1株のポリプロテインのアミノ酸配列を配列番号2但し、アミノ酸番号979のアミノ酸TトレオニンがMであり、アミノ酸番号1804のアミノ酸LロイシンがQグルタミンであり、アミノ酸番号1966のアミノ酸KリジンがEである。に示す。以下にクローニング及び塩基配列の決定に用いたプライマーを示す。XR58R配列番号5:5tcatgcggctcacggacctttcacagctag3HCLongA1配列番号6:5atcgtcttcacgcagaaagcgtctagccat31b9405R配列番号7:5gcctattggcctggagtgtttagctc3HC85F配列番号8:5atggcgttagtatgagtgtcgtgcagcct3HC9302R配列番号9:5tcgggcacgagacaggctgtgatatatgtct3Chibaas配列番号10:5tgcacggtctacgagacct3KY78配列番号11:5ctcgcaagcaccctatcagccagt3KM2配列番号12:5aggcattgagcgggtttat3dTAdp配列番号13:5ctagactcgagtcgacatcgtttttttttttttttttt33UTR1F配列番号14:5atcttagccctagtcacggc3Adp配列番号15:5ctagactcgagtcgacatcg3XR58F配列番号16:5ctagctgtaaaggtccgtgagccgcatga3M13PrimerM3配列番号17:5gtaaaacgacggccagt3M13PrimerRV配列番号18:5caggaaacagctatgac3104配列番号19:5aggaagacttccgagcggtc3HC841S配列番号20:5ggaacttgcccggttgctctttctctatcttc3E1配列番号21:5attccatggtggggaactgggctaa3HC2069S配列番号22:5taacaataccttgacctgccccacggactg3HC2430S配列番号23:5aacatcgtggacgtgcaatacctgtacgg3HC2461AS配列番号24:5gaccctacaccgtacaggta3HC2769S配列番号25:5ttggaccgggagatggctgcatcgtg3HC3632F配列番号26:5cacccaaatgtacaccaatgt3HC3928S配列番号27:5tacccgttgagtctatggaaac3HC4016AS配列番号28:5cacttggaatgtctgcggta3HC4498S配列番号29:5agggggggaggcatctcattttctg3HC4888F配列番号30:5tgctatgacgcgggctgtgcttggta3HC5381F配列番号31:5ggtcattgtgggcaggatcat3HC5692S配列番号32:5ctgcctggaaaccccgcgat3HC5858F配列番号33:5tggcagcataggccttgggaaggt3HC6315F配列番号34:5aagacctggctccagtccaag35A1配列番号35:5ttccatgctcaccgacccctc3HC7090S配列番号36:5gtggagtcagagaataaggt3HC7743F配列番号37:5cagaagaaggtcacctttgac3HC8192S配列番号38:5gcagcgggtcgagttcctggtgaat3HC8939F配列番号39:5ctacggggcctgttactccattgaac3サブジェノミックRNAレプリコンの作製C型肝炎ウイルスTPF1株の全長のポリヌクレオチドを、pBluescriptIISKのT7RNAプロモーター配列の下流に挿入した。次に、pTPF1の構造タンパク質をコードする領域と非構造タンパク質をコードする領域であるCoreの一部領域からNS2領域を、ネオマイシン耐性遺伝子及びEMCVIRESと入れ替えて、plasmidDNApRepTPF1を構築した。この構築手順は、既報285pll0113に従った。具体的にはまずpTPF1を制限酵素AgeI及びBsrGIで切断し、その切断部位に、pTPF1由来の5UTRからCore領域におよぶ配列とpcDNA31由来のネオマイシン耐性遺伝子とをPCR増幅により増幅し制限酵素AgeIとPmeIで切断した断片、及びEMCVIRESからNS3領域におよぶ配列をPCR増幅により結合し制限酵素PmeI及びBsrGIで切断した断片を連結挿入し、plasmidDNApRepTPF1を得た。このplasmidDNApRepTPF1に、配列番号1の塩基配列5752番目に相当する核酸がAからT、6237番目に相当する核酸がGからAへ置換される変異をQuickMutagenesisKitを用い、メーカーの推奨する方法に従い、導入した。その結果、配列番号2のアミノ酸番号1804に相当するアミノ酸がQからL、アミノ酸番号1966に相当するアミノ酸がEからKへそれぞれ変異した。このアミノ酸置換を導入したplasmidDNAをpRep4Bと命名した。において作製した完全長HCVDNAを含むplasmidDNApTPF1を制限酵素SfiIで切断し、その切断部位に、pRep4Bを制限酵素SfiIで切断した断片を連結挿入することで、適応変異が挿入された完全長HCVDNAを含むplasmidDNAであるpTPF14Bを作製した。このようにして得られたHCV株をTPF14B株とした。実施例1HCVNS2protease領域内への変異導入pTPF14B遺伝子を鋳型として、AgeIプライマー5accggtgagtacaccggaattgccaggacg3配列番号40およびFseIプライマー5atttgggtgattgggcccttcgggccggcc3配列番号41の存在下で、TakaraLATaqDNApolymerase宝酒造を用い、94°C、20秒、68°C、4分間からなる20回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクションPCRを行うことにより、TPF14BゲノムのNS2protease領域近傍を増幅した。増幅した断片は、10アガロースゲル電気泳動によって分離し、QIAquickgelpurificationkitQIAGENを用い、メーカーの推奨する方法にてDNA断片を回収した。回収したTPF1断片は、メーカーの推奨する方法に従いpGEMTeasyベクターPromegaと連結反応させ、そのプラスミドによりDH5α株を形質転換させた。アンピシリン耐性で、IPTGとXgalを加えた寒天培地上での平板培養で白色コロニーを形成する形質転換体を選び、アンピシリンを100μgmlとなるよう加えた2YT培地にて培養した。培養した菌体からWizardPlusSVMiniprepDNAPurificationSystemを用いplasmidpTPF1-AgeFseを精製した。精製したプラスミドに組み込まれているTPF1断片の配列は、ベクターおよびHCV配列に適合する適宜準備したプライマーを用い、CEQDTCSQuickStartKitベックマンコルターにより、メーカーの推奨する方法に従い反応を行い、CEQ2000XLDNAanalysissystemSoftwareversion400、ベックマンコールターにより解析した。得られたデータを基に、SequencherVersion412、GeneCodesCorporationを用い配列データの統合、解析を行いpTPF1-AgeFseの塩基配列を確認した。次に、前記で作製したpTPF1-AgeFseにNS2proteaseのアミノ酸番号170MからTの変異をQuickMutagenesiskitStratageneを用いメーカーの推奨する方法に従い、導入した。このアミノ酸置換を導入したプラスミドをpTPF1-AgeFseNproとした。さらに、pTPF14Bを制限酵素AgeI及びFseIで切断し、その切断部位に、pTPF1-AgeFseNpro由来の制限酵素AgeI及びFseIで切断した断片を連結挿入した。このプラスミドをpTPF1-Mとした。2HCVRNAの複製に対するアミノ酸変異の効果1において作製したアミノ酸変異を有するpTPF1-M及び変異を引き起こす配列を有しないpTPF14Bを制限酵素XbaIで切断したものを鋳型に、MegascriptT7kitAmbionまたはAmpliScribeT7-FlashtranscriptionkitEpicentreを用いてRNAを合成した。メーカーの推奨する方法にてRNAを精製した。ヒト肝がん細胞Huh7、JCRB0403はDulbeccosmodifiedEaglemediumD-MEMIWAKIに10ウシ胎仔血清FBS、ペニシリンとストレプトマイシンをそれぞれ50UmL、50μgmLとなるように加えたものを培養液として、5二酸化炭素付加、37°Cで培養を行った。コンフルエントになる前の細胞をトリプシン、EDTA処理により培養皿から剥離させ、血清添加培地に再懸濁することによりトリプシンを不活化した。PBSで2回洗浄後、125DMSOを添加したCytomix120mMPotassiumchloride、10mMPotassiumphosphate、5mMMagnesiumchloride、25mMHEPES、015mMCalciumchloride、2mMEGTA、pH76に再懸濁し、ギャップ04cmのエレクトロポレーションキュベットに移した。10μgのRNAを細胞に加えた後、5分間氷上で十分冷却した。エレクトロポレーターBio-Radで、960μF、250Vにてパルスを加えた。トランスフェクションを行った細胞は、直ちに10mLの培地に再懸濁し、12wellプレートに直径221mmに1mLずつ播き培養を開始した。4時間、24時間、48時間及び72時間に培養上清を回収した。回収した培養上清は、2krpmで10分間遠心し上清を回収した。上清100μLをHCVコア抗原のキット富士レビオ、ルミパルスを使用し測定した。図1に示すように、エレクトロポレーターを用いて細胞内にRNAを導入したpTPF1-M及びpTPF14Bにおけるコア抗原の測定値は、エレクトロポレーション後72時間で最大であり、pTPF1-Mのコア抗原の分泌量はpTPF14Bの28倍を示した。さらに、同培養上清中に分泌されたHCVRNA量は、コア抗原と同様にエレクトロポレーション後72時間で最大であり、pTPF1-MのHCVRNA量はpTPF14Bの3倍を示した図2。このことは本発明のNS2protease領域内に変異を導入したpTPF1-M遺伝子が、細胞中においてpTPF14B遺伝子に比べ効率良く複製し、コア抗原及びHCVRNAを上清中に分泌していることを示している。pTPF1-M遺伝子の複製効率が、pTPF14Bに比べ優れていることを示したものである。3HCV粒子の培養細胞に対する感染2において培養上清中に分泌されたコア抗原およびHCVRNAがウイルス粒子を形成し、invitroにおいて再感染可能か検討した。具体的には、pTPF1-MおよびpTPF14B遺伝子より合成された完全長HCVRNAをHuh7細胞にトランスフェクションし、経時的に培養上清を回収した。回収した培養上清は、15000rpmで10分間遠心後、フィルター濾過045μm、Milliporeを行い破砕した細胞等を除去した。フィルター濾過を行った上清は、12wellプレート直径221μmに培養したnaiveなHuh7細胞と6時間、37°Cの条件下で反応させた。反応後、PBSで細胞を3回洗浄し、新しい増殖培地を加え5二酸化炭素付加、37°Cのインキュベーター内において培養を行った。ウイルス感染価は細胞内に蓄積されたコア抗原を免疫染色法により可視化し、コア抗原陽性細胞数をカウントすることで培養上清中に含まれる感染性ウイルス粒子の数をフォーカス形成単位FFUmLとして示した。具体的には、感染後96時間の細胞をメタノールにより固定し、固定後の細胞を2BSAPBSを用いて2時間室温でインキュベーションすることでブロッキングを行った。次いで、1次抗体として抗コアモノクローナル抗体1μgmLを添加後1時間室温でインキュベーションした。細胞を十分に洗浄した後、FITC標識2次抗体を添加し1時間室温でインキュベーションした。HCV感染細胞は、倒立型蛍光顕微鏡を用いて細胞内のコア抗原陽性細胞数をカウントした。図3に示すように、NS2protease領域内に変異導入したpTPF1-Mにおいて、HCVRNA導入後48時間の培養上清中に最も多く感染性ウイルス粒子が放出300FFUmLされていることを確認した。一方、アミノ酸変異を有しないpTPF14Bでは、HCVRNA導入後48時間の培養上清中に最も多く放出75FFUmLされていることを確認したが、その値はpTPF1-Mの4分の1と低値であった。よって、pTPF1-M遺伝子を導入した細胞は、pTPF14B遺伝子を導入した細胞に比較し、より多くの感染性ウイルス粒子を放出していることが示された。このことは本発明のNS2protease領域内における変異が、ウイルスRNAの増殖効率及び感染効率を改善することを示している。4モノクローン化Huh7細胞におけるウイルス増殖ヒト肝がん細胞Huh7、JCRB0403を限界希釈法によりモノクローン化し、ALS32細胞を新規に樹立した。ALS32細胞におけるpTPF1Mの増殖性能について、エレクトロポレーション法を用い評価を行った。ヒト肝がん細胞Huh7、JCRB0403はD-MEMに10FBS、ペニシリンとストレプトマイシンをそれぞれ50UmL、50μgmLとなるように加えたものを培養液として、5二酸化炭素付加、37°Cで培養を行った。コンフルエントになる前の細胞をトリプシン、EDTA処理により培養皿から剥離させ、血清添加培地に再懸濁することによりトリプシンを不活化した。細胞数を測定後、96wellプレートの1well当たり1個の細胞になるように増殖培地を用いて調整し、同プレートに播種した。播種後約1ヶ月間培養を続けALS32細胞を樹立した。ALS32細胞及びHuh7細胞JCRB0403は、D-MEMに10FBS、ペニシリンとストレプトマイシンをそれぞれ50UmL、50μgmLとなるように加えたものを培養液として、5二酸化炭素付加、37°Cで培養を行った。コンフルエントになる前の細胞をトリプシン、EDTA処理により培養皿から剥離させ、血清添加培地に再懸濁することによりトリプシンを不活化した。PBSで2回洗浄後、125DMSOを添加したCytomixに再懸濁し、ギャップ04cmのエレクトロポレーションキュベットに移した。実施例3において合成したpTPF1-MRNA10μgのRNAをALS32細胞及びHuh7細胞JCRB0403に加えた後、5分間氷上で十分冷却した。エレクトロポレーターBio-Radで、960μF、250Vにてパルスを加えた。トランスフェクションを行った細胞は、直ちに10mLの培地に再懸濁し、12wellプレート直径221mmに1mLずつ播き培養を開始した。24時間、48時間72時間96時間及び120時間後に培養上清を回収した。回収した培養上清は、2krpmで10分間遠心し上清を回収した。上清100μLをHCVコア抗原のキット富士レビオ、ルミパルスを使用し測定した。図4に示すように、エレクトロポレーターを用いてpTPF1-MRNAを導入後の両細胞におけるコア抗原の測定値は、エレクトロポレーション後72時間~96時間で最大であり、ALS32細胞のコア抗原の分泌量はエレクトロポレーション後72時間においてHuh7細胞JCRB0403の175倍を示した。さらに、同両培養上清中に分泌されたHCVRNA量は、エレクトロポレーション後72時間で最大であり、ALS32細胞のHCVRNA量はHuh7細胞JCRB0403の134倍を示した図5。このことはモノクローン化されたALS32細胞では、本発明のNS2protease領域内に変異を導入したpTPF1-M遺伝子が親細胞に比べ効率良く複製可能であることを示している。5.HCV粒子のモノクローン化培養細胞に対する感染4において培養上清中に分泌されたコア抗原およびHCVRNAがウイルス粒子を形成し、invitroにおいて再感染可能か検討した。具体的には、pTPF1-M遺伝子より合成された完全長HCVRNAをALS32細胞及びHuh7細胞JCRB0403にトランスフェクションし、経時的に培養上清を回収した。回収した培養上清は、15000rpmで10分間遠心後、フィルター濾過045μm、Milliporeを行い破砕した細胞等を除去した。フィルター濾過を行ったALS32細胞由来培養上清及びHuh7細胞由来培養上清は、12wellプレート直径221μmに培養したnaiveなALS32培養細胞及びnaiveなHuh7培養細胞とそれぞれ6時間、37°Cの条件下で反応させた。反応後、PBSで細胞を3回洗浄し、新しい増殖培地を加え5二酸化炭素付加、37°Cのインキュベーター内において培養を行った。ウイルス感染価は細胞内に蓄積されたコア抗原を免疫染色法により可視化し、コア抗原陽性細胞数をカウントすることで培養上清中に含まれる感染性ウイルス粒子の数をフォーカス形成単位FFUmLとして示した。具体的には、感染後96時間の細胞をメタノールにより固定し、固定後の細胞を2BSAPBSを用いて2時間室温でインキュベーションすることでブロッキングを行った。次いで、1次抗体として抗コアモノクローナル抗体1μgmLを添加後1時間室温でインキュベーションした。細胞を十分に洗浄した後、FITC標識2次抗体を添加し1時間室温でインキュベーションした。HCV感染細胞は、倒立型蛍光顕微鏡を用いて細胞内のコア抗原陽性細胞数をカウントした。図6に示すように、ALS32細胞に同細胞より得られたウイルス粒子を感染させた場合、HCVRNA導入後96時間の培養上清中に最も多く感染性ウイルス粒子が放出1500FFUmLされていることを確認した。一方、Huh7細胞JCRB0403では、HCVRNA導入後48時間~72時間の培養上清中に最も多くの感染性ウイルス粒子が放出250FFUmLされていることを確認したが、その値はALS32細胞の6分の1と低値であった。よって、モノクローン化されたALS32細胞は、親細胞であるHuh7細胞JCRB0403に比較し、より多くの感染性ウイルス粒子を放出していることが示された。このことはNS2protease領域内における変異を有するウイルスRNAの増殖効率及び感染効率は、Huh7細胞JCRB0403のモノクローン化細胞であるALS32細胞を用いることにより改善することを示している。