電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で検査するために生体試料を調製する方法であり、前記方法は:-生体試料を準備し、-試料を高圧凍結で凍結固定化し、-凍結切片化で切片を作成し、-切片を電子顕微鏡グリッド上に配置し、-室温で免疫ラベル化し、及び-前記切片を電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡で検査することを含み、-固定化及び/又は染色を前記電子顕微鏡上に設けられる前記切片で実施することを特徴とする、方法。請求項に記載の方法であり、前記固定化及び/又は染色が、凍結温度で実施される、方法。請求項2に記載の方法であり、さらに、前記切片の凍結置換、続いて前記切片を凍結状態から室温へ戻し、続いて再水和させることを含む、方法。請求項2に記載の方法であり、前記凍結置換が、水と、固定化剤を含む有機溶媒の混合物とを置換すること、より具体的には水と、アセトン及び固定化剤との混合物とを置換することを含む、方法。請求項3に記載の方法であり、前記置換が、凍結温度で、より具体的には-90°C未満の温度で、最も具体的には-90°Cで実施される、方法。請求項1に記載の方法であり、前記方法がさらに、前記凍結断片を凍結水系固定化剤上に設け、続いて融解させて前記切片を前記凍結水系固定化剤を融解させることで固定化し、及び前記切片を氷の融解温度で固定化することを含む、方法。請求項1乃至6のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が蛍光ラベル化剤でラベル化することを含む、方法。請求項1乃至7のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が、電子緻密ラベル化剤、より具体的には、金、銀、パラジウム、白金からの重金属でラベル化することを含む、方法請求項1乃至5のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が、量子ドットでラベル化することを含む、方法。請求項1乃至9のいずれか一項に記載の方法であり、前記電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡が1つの装置に組み合わされている、方法。請求項1乃至3のいずれか一項に記載の方法であり、オスミウム含有物が、固定化剤及び/又は電子緻密染色として使用され、及びオスミウムが、-60°C未満で前記凍結置換媒体から除去されそれにより抗原性を防止することを含む、方法。請求項1乃至11のいずれか一項に記載の方法を実施するための取り扱い装置であり、前記装置は:-凍結固定化剤及び/又は凍結置換媒体及び/又はラベル化用流体を保持するための容器、-蓋を含み、前記蓋は前記容器の上部に位置され、前記蓋は、脱着可能に許容するグリッドのためのロク機構を含む、取り扱い装置。請求項12に記載の取り扱い装置であり、グリッドを取り扱うための強化周縁部を設け、前記グリッドが自動的取り扱いのために好適である、取り扱い装置。請求項2乃至5のいずれか一項に記載の方法であり、前記固定化及び/又は染色が、請求項12又は13のいずれか一項に記載の取り扱い装置で実施される、方法。請求項6に記載の方法であり、前記凍結水系固定化剤上に設けられ、及び融解されることが、請求項12又は13のいずれか一項に記載の取り扱い装置で生じる、方法。請求項14又は15のいずれか一項に記載の方法であり、前記ラベル化が請求項12又は13のいずれか一項に記載の取り扱い装置で生じる、方法。本発明者は、より短時間の試料から検査時間を持つ生体試料から染色切片作成のための方法を提供することを意図する。本発明者は、蛍光色素が消光されない方法の提供を意図する。この目的を達成するために、本発明による方法は、固定化及び/又は染色が、電子顕微鏡グリッド上に配置された前記切片上で凍結温度で実施される、ことを特徴とする。本発明は、凍結温度で試料を切片化することで、続く処理が、切片上で起こり、したがって化学物質の浸潤時間及び/又は拡散時間を低減する、という知見に基づく。例えば、凍結置換は、従来方法では2日必要であったが85分で実施される。実験では、本発明の方法により、電子顕微鏡分析用切片が8時間以下で得られることとなり、これは健康管理上重要な短縮である。本発明の方法の実施態様では、前記固定化/染色は凍結温度で実施される。非染色/非固定化切片は、例えば、-150°Cの凍結温度で利用可能であり、前記試料の代わりに切片を染色及び/又は固定化することが可能出る。その違いは、前記切片は薄く、一方試料はずっと厚く、切片の染色/固定化に必要な時間は従って、試料を染色/固定化するために必要な時間よりもずっと短くなる、ということである。本発明による方法のさらなる実施態様では、前記方法は、前記切片の凍結置換を含み、次に前記切片を再水和するために前記切片を凍結状態から室温へ戻される。この方法では、本発明者によりVIS2FIXFSと命名された方法では、FSは自由置換を意味し、前記切片は前記グリッドに付設され、凍結置換に暴露され、かつ加熱される。前記凍結温度から室温へ加熱される際に水はほとんど又は全く存在しないことから、氷結晶は形成されない。好ましくは、前記自由置換が実施される温度は、-90°C以下であり、前記凍結置換がさらに結晶化を避ける買えに結晶形成を避ける。本発明よる方法のさらなる実施態様では、前記自由置換は、水を固定化剤を含む有機溶媒と混合することで交換すること、より具体的には水をアセトンと固定化剤と混合することを含む。水をアセトンなどの有機溶媒と置換することで、前記試料は氷結晶を形成することなく室温まで加熱され得る。また、固定化剤/染色剤は、アセトンなどの有機溶媒中に溶解され得る。本発明の方法による他の実施態様では、前記方法は、前記凍結切片を、凍結水系固定化剤上に置くこと、続いて解凍し前記切片を前記凍結水系固定化剤により前記切片を固定化し、かつ前記切片を氷融解温度で固定化する、ことを含む。この実施態様では、前記切片は、凍結固定化剤上に設け、次に前記固定化剤と共に解凍される。驚くべきことに実験は、この実施態様により試料を処理する場合には氷結晶が全く観察されない、ということである。さらなる実施態様では、前記切片は、蛍光顕微鏡を用いる検査/ナビゲーションを可能にするための蛍光ラベルで、電子顕微鏡のためのラベル化剤としての電子緻密ラベル金、パラジウム、白金からなる群から選択される重金属を含むラベル化などで、又は蛍光及び電子顕微鏡のための両方のラベル化剤として作用することが知られている量子ドットで、好ましくは室温でラベル化される。本発明の好ましい実施態様では、前記切片の検査は、電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡の組合せである装置で実施され、この装置は又、iLEM統合光電子顕微鏡と参照される。本発明の側面は、前記方法を実施するための装置の取り扱いが、凍結固定化剤及び/又は凍結置換媒体及び/又はラベル化のための流体及び蓋を保持するための容器を含み、前記蓋は動作時は前記容器の上部に配置され、前記蓋は脱着可能に受けられる前記グリッドのためのロック機構を含む、ということで特徴付けられる。凍結温度で固定化及び/又は染色することは、前記取り扱い装置で実施され、同様に凍結固定化剤上に配置し続いて解凍される。また、ラベル化はこの取り扱い装置で実施され得る。好ましくは、前記取り扱い装置は、強化グリッド即ち:厚さのある縁部を持つことにより丈夫にされたグリッド、を扱うために装備される。かかるグリッドは、自動化取り扱いのために使用される。本発明は以下、添付図面を参照して説明される。図1は、本発明による方法のフローチャートを模式的に示す。前記の通り、本発明の目的は、水の再結晶化の臨界的温度範囲を通過するのもかかわらず前記試料の損卒を避けるようにして試料の分析を可能にする、ことである。さらには、本発明は、生体試料を、電子顕微鏡画像で良好なコントラストのために必要な重金属が、蛍光顕微鏡による画像のために必要な蛍光色素をほとんど消光しないように生体試料を固定化する方法に関する。本発明者は、現在使用されている方法の欠点を解消するために、2つの異なる、しかし相互に関連する方法VISFIXと呼ばれる、2つの固定化剤へのガラス状切片のためを開発した。両方の方法とも、グリッドへの凍結切片の静的付着により特徴付けられ、続いて前記切片を、前記生体試料の超構造レベルで目に見える凍結損傷を避けるように固定化される。さらに、本発明は、切片固定化により高圧凍結物の免疫ラベル化を可能にし、その結果重金属による蛍光信号の消光を大きく低減するものである。さらに、前記切片のエピトープのアクセス可能性は、Tokuyasu断片TokuyasuKT、J.CellBiol.1973、51、551-565、furtherreferredtoaTokayasu[3];GeuzeHJetal.J.CellBiol.1981、653-665、furtherreferredtoasGeuze[4]と類似し、効果的ラベル化の機会を増加させる。前記方法の性質により、調製時間は、これまで記載されたいかなる方法に比べても短いものであり、結果は8時間以内に得られ得る。本発明の両方の方法は最初は同じである:ステップ101で、細胞又はその一部、細菌、生検などの形で生体試料として試料が準備される。ステップ102で、前記試料は高圧凍結され、その結果氷結晶を示さないガラス状試料となる。高圧凍結は当業者に知られている。ステップ103で、高圧凍結物質は、例えば-150°Cの凍結温度で凍結切片化される。ステップ104で、前記凍結切片は、次に、好ましくはLeicaCRION静電防止装置の助けを借りて静的にTEMグリッドに接着される。続いて、前記切片は、例えば-90°Cの温度でFS凍結置換チャンバに、好ましくは例えばLeicaAFS2などの自動化凍結置換ユニット内で、移され、固定化剤上に前記切片が面するように配置される。前記凍結切片は次に固定化され、かつ室温へ、好ましくは制御された温度上昇速度で暖められ、従来の免疫ラベル化の準備が完了する。前記切片の固定化は、2つの方法で達成され得る;VIS2FIXFS及びVIS2FIXH方法である。前記第1の切片固定化方法、VIS2FXFS凍結置換は、前記凍結切片の凍結置換を可能にする。ステップ105では、前記凍結切片の水が、固定化剤を含むアセトンなどの有機溶媒で置換される。これは、-90°Cで行われるので、温度が0°Cに上昇した場合、氷結晶を形成するための前記切片中には水はもはや存在しない。凍結置換は生体物質を高圧凍結に続いて通常適用される技術であるが、我々の方法はより小さい切片はほんの80nm厚さことから、ずっと迅速に実施される:即ち、従来の方法の少なくとも2日に比較して85分未満である。温度が上昇すると、前記アセトン中の固定化剤が前記切片の固定化を開始し、それにより0°Cに到達すると切片は安定化されることとなる。ステップ106では、前記試料は段階的にアセトンから水へ再水和され、次のステップ:ステップ109免疫ラベル化及びステップ110:電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡での検査、の準備が整う。VIS2FIXFS方法で、新規構成の1つが、凍結切片で凍結置換を実施する可能性があり、より短時間であるが効果的にア凍結置換方法の開発である。この方法の使用は、前記凍結置換方法の長さを変更でき、それを異なるタイプの生体試料に合せて最適化でき、非常に重要なことに、前記凍結置換媒体中の固定化剤混合物の組成を変更することができる。我々は、前記凍結置換を通じて0.1から0.2の酢酸ウラニウムを使用ししかし再水和の際に除去される、四酸化オスミウム及びグルタルアルデヒドの存在は0.1から0.5の範囲で変更され得る。さらに、-60°Cでオスミウムを前記凍結置換媒体から除去して、前記固定化剤抗原性に対するオスミウムの効果は-60°Cより高い温度で観測されるだけであるにより生じる抗原性への悪影響を防止する。前記第2の切片固定化方法、VIS2FIXHHは水和の意味は、0°Cで疎水性環境PHEM緩衝液中で固定化剤で前記切片を化学的に固定化することを可能にする。ステップ104に続いてステップ107で、-90°Cで、前記グリッドに接着した前記凍結切片が凍結固定化剤上に配置される。ステップ108で、前記固定化剤及び切片は、次に、固定化剤の表面が液化するまで、例えば40°Cまで暖められて溶解される。次に、前記切片は、10分間、光から保護された条件で氷上で固体化される。この固定化期間及び洗浄ステップの後、前記切片はステップ109:免疫ラベル化の準備が整うこととなる。前記VIS2FIXFS方法と同じく、ここで、前記固定化剤の組成は使用者の要求に合せて容易に変更することができる。この具体的な方法の大きな利点の一つは、四酸化オスミウムが固定化剤混合物として使用される場合には前記切片中の脂質の保存が観測される、ということである。TEM試料調製のさらなる従来の方法は通常は脂質を固定化せず例えば前記のTokuyasu方法[3]、又は固定化される前に、凍結置換と共に脂質の抽出が生じる。これによりリピドミクス分野の研究者のとって、この具体的な方法が、大きな興味の対象となり得る。前記切片は、-150°Cから約0°Cへ、凍結保護又は前もっても固体化をすることなく、温度が変化されることから、前記切片内に氷結晶により誘導された障害の超構造効果が見られるものと予想し得る。前記拡のヘテロクロマチンは凍結障害により細胞内に最も最初に影響を受けやすい構造であるが、前記方法の使用はこの部分及び細胞の他の部分でも何らの損傷も見られない。この驚くべき予想できない知見に対する現在の説明は、おそらく、形成される氷結晶が非常に小さく、細胞構造に影響又は損傷を与えなかった、ということである。ステップ110で、前記切片は次に蛍光顕微鏡、電子顕微鏡又は蛍光顕微鏡及び電子顕微鏡の組合せiLEM統合化光電子顕微鏡で検査され得る。両方のVIS2FIX方法は、高圧凍結試料及び/又は高圧凍結装置、凍結ミクロトーム及び凍結切片化関連製品、グリッドへの接着のためのLeicaCRION静電防止装置又はこの接着を達成するための同様の装置、自動化凍結置換ユニットAFS及び備品を必要とするか、又はあれば好ましい。現在、これらの装置は統合化されておらず、各処理を個人的に観察し、手動で実施しなければならない。しかし、当業者には明らかなことは、切片の高圧凍結から始まって最終的固定化まで、統合化し自動化するものが開発され得る、とういうことである。留意すべきことは、前記試料を凍結ミクロトームの代わりにまた、焦点化イオンビームFIBで凍結切片化することができる、ということである。図2aには、本発明による方法を実施するための取り扱い装置の断面を模式的に示す。図2aは、容器201を示し、これは凍結固定化剤及び/又は凍結置換媒体及び/又はラベル化用流体、及び蓋202を含み、前記蓋は動作位置で前記容器に上部に配置され、前記蓋は脱着可能なグリッド209a209bのロック機構203a203bを含む。前記蓋は、第1の側を持ち、この上に1以上のグリッドが設けられ、好ましくはインデント204a、204bであるが、必須ではない。凍結温度で、前記切片が接着される1以上のグリッドは前記蓋上に設けられる。前記蓋は、脱着可能な形で前記グリッドを保持する構造を持つ。この例では前記構造は、バネ203aとして示され、これは回転可能であり、軸203bに沿って可動である。一つの回転位置で、バネは前記グリッドを保持/ラッチし、他の回転位置では前記バネは前記蓋202に対して静止し、かつ前記グリッドは落下することが可能となり前記インデントが下方向に向いている場合、又はグリッドが負荷され得る前記インデントが上向きの場合。留意すべきことは、動きグリッドの脱着又は負荷は、前記インデントからグリッドに向かい吹き込むか又は内側に吸い込むカナル図示されていないを通じる圧力差により緩和され得る。前記容器は、凍結置換媒体又は固定化剤などの流体が入口205を介して満たされ得る。前記容器に温度は、これを凍結流体エタン、液体窒素内に置くことで凍結温度へ低下させ得る。留意すべきことは、容器は、凍結流体がこの目的で循環し得るチャンネルを含み得る、ということである。前記容器は、一連のインデント208a、208bを含み、これは前記インデント204a及び204bに対応する。これらのインデントが固定化剤又は凍結置換媒体で満たされ、温度が凍結温度に調節されると、その結果、インデント208a、208bが凍結温度で凍結置換媒体又は凍結固定化剤を保持し、前記蓋は前記容器上に配置され前記グリッドは前記蓋から離される。前記グリッドは次に前記凍結置換媒体又は凍結固定化剤の上に落下する。前記装置は次に、制御されて室温まで暖められる。前記温度の制御は、統合加熱装置206、又は前記取り扱い装置を温度制御環境下に置くことで達成され得る。好ましくは前記容器は温度測定装置207を含む。前記グリッドは、前記グリッドを前記蓋に対してフラッシュすること、及びロック機構403a403bを活性化することで元に戻る。室温及び氷溶融温度に到達した後、前記ラベル化は、ラベル化剤を前記グリッドに添加することで実施され得る。これは、前記取り扱い装置でその場でインシチュ実施され得るが、他の場所でもエクスシチュ実施され得る。前記ロック機構は、例えば個々の酵素をクランプ又はラッチすることで、グリッド対グリッドにより作用し得るものであり、又はグリッドの完全な数で作用し得る。図2bは、動作中に前記容器に面する側から見た前記蓋の図面を示す。図2bは模式的に8つのインデント204-iを持つ蓋202を模式的に示す。インデントの1つにグリッド209が置かれ、前記バネ203aが前記軸203bにより、前記バネが前記インデント内に前記グリッドを保持する位置へ回転される。留意するべきことは、前記インデント内に前記酵素をよりよく維持するために、前記バネの端部がより好適な形状、例えばループ形状であり得るということであり、及び他のかかる手段は、当業者に明らかなものであって、よりよく及び/又は他の保持機構として採用され得る、ということである。また、前記機構の動きは、異なる原理に基づくものであってもよく、例えば機械的駆動装置、磁気駆動装置、圧電駆動装置などである。本発明のこの側面による取り扱い装置の利点は、これが自動化取り扱いステーションの部分であり得るものであるか又は自動化試料取り扱いのために好適にするような制御装置及び駆動装置を含み得る。好ましくは、前記装置は次に、米国特許第7、034、316号に記載されるような、強化周縁部を持つ丈夫なグリッドを扱うために好適化される。その使用例非限定的として本発明による方法以下の例を提供する。初期段階の疾患、特に癌及び心臓血管疾患のためのマーカーとしての循環細胞循環血液細胞は、ヒト及び動物の体の他の組織の全てのタイプの細胞と遭遇する。これらの遭遇の際には、前記循環細胞と身体細胞の間に情報の交換が生じる。この情報交換は、身体細胞により送られる分子シグナルにより促進され、分子は循環細胞でレセプタータンパク質として認識され、又は身体細胞で生成された分子又はエキソソームが前記循環細胞により捕捉される。両方のプロセスは、循環細胞でのシグナル処理において変化を生じる結果となり、これらのシグナル処理プロセスはこれらのシグナルプロセスにより制御される遺伝子転写物のアップ及びダウンレギュレーションを生じる結果となる。しばしばこれらのプロセスは、循環細胞のタンパク質プロフィールに変化を与える結果となる。さらに、シグナル分子は、前記循環細胞に補足され内部化されHofmanE、Thesis、Chapter1、2008、ISBN978-90-393-4905、これはまた循環細胞のタンパク質プロフィールを変化させる。これらのタンパク質プロフィールの変化はしばしば、循環細胞及び細胞表面抗原の形態に影響を与える。また、細胞表面のタンパク質複合体の、二量化などの変化が起こり、その結果細胞外レセプターの活性化又は不活性化が生じ得る。タンパク質プロフィールの変化は、プロテオミック技術でモニターされ得る一方、形態変化は、例えば細胞中で新たな複合体の形成や分解などのようなタンパク質プロフィールの明らかな違いを示さずに生じる。現在最小侵襲的方法で少量の血液試料を採取することは可能である。少量の試料は、局所で生じている生体プロセスを多かれ少なかれ反映するサンプリングの位置及び時。収集された循環細胞の量は、従って、前記サンプル取得領域で、ある細胞がその恒常性状態からの変動を予測するプロセスが生じているかどうかについての統計的に有意な答えを得るために十分である。これまで、かかる試料は主にタンパク質を研究し細胞数測定のためであったが、循環細胞の形態変化又はタンパク質複合体での変化が生じる場合についてはほとんど研究されてこなかった。本発明者は、これらの細胞内及び表面で複合体の変化と同様に形態の変化について分析することを可能にする。実験結果高圧凍結、切片化及びAFSへのグリッド移動白血病細胞株からのTHP-1ヒト単球細胞はATCCLGCStandardsGmbH、Wesel、ドイツから入手し、供給者の指示書に従い培養した。高圧凍結のために、前記細胞を遠心5分、1200rpmし、得られたペレットをデキストラン最終濃度15中に再懸濁した。銅試料管をデキストラン中の前記懸濁液で満たし、LeicaEMPACTを用いて約2000バールで高圧凍結した。凍結管は切片化に先立ち液体窒素中で保存した。前記管をトリムし、LeicaCRION静電防止装置を放電に設定して、-150°CでLEIcaEMUC6/FC6ウルトラムミクロトーム内でダイヤモンドナイフを用いて切片化した。切片化の再、60から80ナノメートルの厚さで、長い光沢のあるように見える切片のリボンをTEMグリッド上に整列させた。formvar膜を持ち、カーボンコーティングされグロー放電される前記グリッドは前記Leicaミクロ操作装置のナイフエッジの近くに保持された。前記リボンが十分に長い場合、LeicaCRION静電防止装置で前記グリッドへ静的に接着された。ここで、非常に重要なことは、前記接着が良好かどうかを、前記切片をグリッドから持ち上げられるかどうかでチェックされることであるが、持ち上げ可能であってはならない。VIS2FIXFS方法を用いる場合、前記切片は、有効な固定化を達成するには少なくとも80nmの厚さを必要とする、ということが見出された。切片化に続いて、前記グリッドは、-150°Cに冷却された前記UC6のミクロトームチャンバ内に存在するLeicaサファイアディスクSDホルダーこれはSD凍結置換ユニットの一部分内に置かれた。前記SDホルダーは24のサファイアディスクを保持することができ、又はこの応用ではグリッドを保持することができる。グリッドの必要量を切片化後、前記グリッドを保持するSDホルダーを、前記ミクロトームチャンバからAFS2Leica自動凍結置換ユニットのFSチャンバへ移動させた。ここで、前記グリッドは冷却が維持され、前記切片に氷結晶を形成し得る湿気から保護される必要がある。予冷却された缶Leicaユニバーサル容器が、前記底上に1つの冷却リングLeica底板を含む前記ミクロトームチャンバ内に存在する。前記グリッドを持つSDホルダーが前記缶内に置かれ、ドーナツ形状Aclarホイル200μmAclar埋め込みフィルムElectronMicroscopySciencesから切り出したAclar膜の外部直径は3.5cmであり、中心部に直径9mmの穴を持つ。さらに2つのリングを上部、最終的にディスク形状Aclarホイル直径3.5cmに配置した。前記缶を迅速にかつ慎重に、-90°Cに冷却されたAFS2へ移動した。前記SDホルダー密閉ペトリ皿内に置かれた、前記缶、前記冷却リング及びAclarは、切片化の前に前記ミクロトームと共に冷却された。部分的に折りたたまれたテープの小片が前記Aclarホイル表面に及びペトリ皿蓋に付着させ、持ち上げ及び移動を容易にするためのハンドルとして作用させた。VIS2FIXFSLeica試薬浴最小高さを±1cmに最小化するために切断内に、Leicaフロースルーリング最小高さを±6mmに最小化するために切断を設けた。前記フロースルーリングを含む試薬浴は、前記AFS2内の-90°Cでの缶Leicaユニバーサル容器内の3つの冷却リングLeica底板上に設けられた。この温度で、-90°Cの固定化剤を含む乾燥アセトンSigma-Aldrich、StLouis、Missouri、アメリカ3mLを前記フロースルーリングにピペットで入れて、Aclarホイル直径3.5cmでカバーした。アセトンは、前記試料中のリン脂質の保持がメタノールよりも高いことから、FS媒体として選択された。使用された固定化剤は、アセトン中の0.1酢酸ウラニウム、0.1から0.5グルタルアルデヒド及び0.2から0.5の四酸化オスミウムであった。切片化に続いて、前記SDホルダー内のグリッドは前記の通り前記FSチャンバへ移動した。予冷却された曲げられた微細先端ピンセットカバースリップピンセットと類似を用いて、それぞれのグリッドは注意深く、前記リングの1つのフロースルー区画内の固定化剤の表面に切片を浮遊させた。1つのフロースルーリングは最大10のグリッドを保持するが、前記の通り、固定化剤と共に3つまでのフロースルーリングが前記AFS2に配置され得る。前記アセトンの低表面張力により、前記グリッドは最終的には前記フロースルー区画の底部に溶液中に沈む。前記最後のグリッドを配置すると直ぐに、前記凍結置換プログラムを開始した。望ましい場合、前記固定化剤組成は前記凍結置換の際いつでも変更され得る。これを達成するため、固定化剤の大部分を前記フロースルーリングの中心から除去するが、いくらかの洗浄ステップを続けてもよい。ここで重要なことは前記グリッドを乾燥させないことである。続いて前記新たな固定化剤を前記グリッドと共にフロースルーリングへ添加され得る。前記固定化剤が、-90°Cから-60°Cで、アセトン中0.1酢酸ウラニウムと0.2の四酸化オスミウムから、続いてアセトン中0.1酢酸ウラニウムと0.2の四酸化オスミウム及び0.2グルタルアルデヒドと交換する場合に、良好な形態が達成された。温度が0°Cに到達して凍結置換プログラムが終了した時点で、前記グリッドを5回以上、乾燥アセトン中の0.2グルタルアルデヒドで前記の通り洗浄する。続く再水和ステップは、0°CでAFS2内で実施され、1から2分の7連続ステップ:水中で95アセトン中0.2GA、90アセトン中0.2GA、80アセトン中0.2GA、70アセトン中0.2GA、50アセトン中0.2GA、30アセトン中0.2GA、及び最後に10アセトン中0.2GA、で行われた。再水和の後前記フロースルーリング内のグリッドは3回水で洗浄された。前記グリッドは、前記フロースルーリングから、微細先端ピンセットを用いて除去し、前記グリッドの背側をやや湿らせた濾紙で乾燥させた。最後に前記グリッドは、パラフィン片上に置かれた水滴上に浮遊させて1分で7回洗浄した。この点で前記グリッドは、免疫ラベル化又は後の使用のための保存の準備が整った。これらの切片はTokuyasu切片と同様に保存され得る。保存のために、前記グリッドは、氷上の0.1MPHEM緩衝液60mMPEPES、25mMPEPES、10mMEGRA及び2mMMgCl2、pH6.9へ調節中のメチルセルロース及び2.3Mスクロースの1:1混合物の一滴上で短時間インキュベートされた。前記グリッドは次にゆっくりと前記粘性滴から引き上げパラフィンでカバーされた前記切片を含むガラススライド上に前記滴を下向きにして置かれた。前記グリッドを含むガラススライドは、ガラスペトリ皿に入れてパラフィンで密閉し4°Cで保存された。VIS2FIXH0.05から0.5の四酸化オスミウム、0.2酢酸ウラニウム及び0.2のグルタルアルデヒドを含む固定化剤の2mLが、氷状で0.1MPHEM緩衝液中で調製された。800μmlの最終容積を、前記浴の底をカバーする試薬浴最小高さ1cmに切断内に配置された。前記試薬浴は、次にAFS2-90°Cに設定へ移動され、Aclarホイル直径3.5cmでカバーされた缶内の3つの冷却リングの上部に配置された。固定化剤は直ぐに凍結された。前記グリッドは前記の通りAFS2へ移動され、予冷却された微細先端ピンセットで、静かに切片を前記凍結固定化剤表面に上に下向きに置いた。前記グリッドを含む試薬浴は次に、空気から保護するために冷却されたペトリ皿内に移された。その後AFS2から取り出されてガラスペトリ皿に直径9cmでカバーされた40°Cのホットプレート上に置かれた。前記ホットプレート上のペトリ皿を静かに回しながら前記固定化剤を溶融させた。約4から5分間で前記固定化剤の表面が液化するとすぐに前記グリッドは浮遊を始めた。前記固定化剤及びグリッドを含むペトリ皿は次に迅速に氷上に移して、光から保護し、さらに10分間固定化させた。最後に、前記グリッドを固定化剤から除去して10回1分間水滴上で洗浄され、免疫ラベル化又は保存前記のようなのために整った。透過電子顕微鏡TEM及び統合化レーザー及び電子顕微鏡iLEMのための免疫ラベル化免疫TEMのために、VIS2FIX固定化切片での遊離アルデヒド基は、0.1MPHEM緩衝液中0.02Mグリシンで、2分間5回洗浄することで失活させた。前記切片は、前記抗体の非特異的結合から、15分間、0.1MPHEM緩衝液中で1体積/重量BSAウシ血清アルブミンを含むブロック緩衝液でインキュベートすることでブロックし、続いて、ブロック緩衝液で希釈した第1の抗体マウスモノクローナル抗PDI、1:199、StressgenBiotechnologiesCorp.、BritishColumbia、カナダで1時間インキュベートした。0.1MPHEM緩衝液中0.1体積/重量BSAで5回洗浄後、切片を、20分間、ブリッジング抗体ウサギ抗マウスIgブロック緩衝液中1:200、Dako、Glostrup、デンマークでインキュベートした。前記切片を、PHEM緩衝液中0.1BSAで2分間で5回洗浄し、続いてタンパク質A金ブロック緩衝液中で20分間インキュベート、CellMicroscopyCentre、UniversityMedicalCentreUtrechtでラベル化した。0.1MPHEM緩衝液で15分間10回洗浄後、前記ラベル化は5分間1グルタルアルデヒドインキュベートで安定化された。前記緩衝液及びグルタルアルデヒドを除去するために、前記切片は、水滴上で1分間10回洗浄され、水中pH72シュウ酸ウラニウムで5分間染色した。その後切片は水上で短時間2回洗浄された。最後に、切片は、氷上で1.8メチルセルロース内に0.4酢酸ウラニウム中に埋め込まれた。iLEMのための関連するラベル化も類似の手順で実施された。第1抗体としてマウスモノクローナル抗LAMP2が使用された1:150、BDBiosciencesPharmingen、SanDiego、California、アメリカ。タンパク質A金インキュベートステップに続いて、前記グリッドを0.1MPHEM緩衝液中0.1BSAで2分間5回線上し、続いてAlexa488蛍光共役ヤギ抗ウサギ抗体1:200、Invitrogen、Carlsbad、California、アメイカで45分間インキュベートした。前記切片を0.1MPHEM緩衝液で2分間5回洗浄し、4ホルムアルデヒド固定化剤としてグルタルアルデヒドの使用は、前記切片の自動蛍光が増加し得るで15分間固定化された。これは続いて、水で1分間10回洗浄され、2シュウ酸ウラニウム及び続いて2酢酸ウラニウムで染色された。前記切片は、前記染色ステップの間に短く水で2回洗浄された。最後に前記切片は洗浄されて、氷上で1.8メチルセルロース内に埋め込まれた。画像化前記切片は、統合化レーザー及び電子顕微鏡iLEM;Tecnai12120kV透過電子顕微鏡FEIcompany、Eindhoven、オランダを用いて画像化された。前記ILEMは、カスタム設計の、前記試料ステージに直接面する側の1つに設けられるレーザー走査蛍光顕微鏡を持つ。TEM操作の際に、蛍光顕微鏡は前記TEMカラムからやや傾けられてTEM画像化や操作を妨げない。前記TEM画像は、底部に設けられるTEMCam-F214Tietzビデオ及び画像処理システム、Gauting、ドイツCCDカメラで80keVで記録された。前記レーザー走査顕微鏡は、400nm青色光子シングルモードレーザーOmicronLaserageLaserprodukteGmbH、Rodgau-Dudenhofen、ドイツ及びアバランチ光ダイオードAPD検出装置を備えている。前記iLEMの蛍光顕微鏡は、LabView8.0に基づきA.V.Agronskaia博士が独自に設計したソフトウェアを用いて操作された。図3及び4の説明図3は、VIS2FIX方法及び免疫金ラベル化PDIの超構造的側面を示す。aは、脂質液滴LDの中性脂質コアが、VIS2FIXFS固定化後で失われていることを示す。bは、VIS2FIXH後に、脂質コアが、液滴内部に存在する密度して観察される。cは、VIS2FIXFSでER残留タンパク質PDIの免疫金15nmラベル化を示す。dはVIS2FIXH切片上でのPDIの免疫金15nmラベル化を示す。ここで留意すべきは、c及びdでの全細胞質及び核内に保存されたヘテロクロマチンである。ここで、Ly:リソソーム;G:ゴルジ体;M:ミトコンドリア;Mv:多胞体を示す。倍率を示す線は、aとbでは300nm、及びcとdでは500nmである。図4は、LAMP2のためにラベル化されたVIS2FXFS切片のiLEM画像を示す。aは、免疫金及び免疫蛍光オンライン方法参照でのLAMP2のための切片ラベル化の50μm2領域の蛍光画像を示す。bは、aで示された領域の蛍光シグナルを、前記同じ領域のTEM画像と重ねたものである。cbで示された領域のより高倍率のTEM画像である。前記リソソームの過剰ラベル化に留意すること。倍率を表す線は、aでは10μm、bでは1μm及びcでは500nmである。参考文献[1]D.Ripperetal.、Cryosectionimmunolabellingofdifficulttopreservespecimens:advantagesofcryofixation、freeze-substitutionandrehydration、Biol.Cell2008pp109-123[2]M.K.Morphew、PracticalMethodsinHigh-PressureFreezing、Freeze-Substitution、EmbeddingandImmunocytochemistryforElectronMicroscopy.Laboratoryfor3-DFineStructure、Dept.ofMCDBiology、UniversityofColorado、Boulder、Colorado[3]K.T.Tokuyasu、Atechniqueforultracryotomyofcellsuspensionsandtissues、JCellBiol.1973May1;572:551-565