"動物の腸内共生群単位を用いて酵素を生産する方法動物腸内の個々の共生菌を用いてセルロース分解能力を測定して有益セルラーゼ生成菌を有する動物を選別する方法請求項1において前記の動物腸内共生菌群単位を培養する事によりセルラーゼを生産する方法請求項1において前記の動物は土壌動物のダンゴムシの腸内共生菌群を用いてセルラーゼを生産する方法従来のセルラーゼの生産においては、単一の菌株を用いて培養し、その培養液からセルラーゼを精製するものであるが、本発明では複合生物系という考え方を用いた。自然界の多くの生物は、生物と生物、生物と環境が深く相互に関与し、多様な相互関係を維持しながら共存している。その多くは、単一生物では得られない高度な機能を有していると予想されている。従来では、単一微生物をその対象とし、分離培養が可能な微生物を取り扱うことが主であった。このような方法では利用可能な微生物は1前後にしかすぎず、残りの99以上は取り扱う事が出来ず、多くの生物資源が未利用のまま取り残されていると考えられている。自然界には分離培養が可能な微生物と、それが困難な微生物が共存しており、単体では生きられないが、他の生物動物、植物、昆虫、微生物との相互作用で生育可能な微生物が見いだされ新たな機能性物質が見いだされる可能性、各々の微生物は分離培養可能な微生物であるがその各々の微生物を混合培養したときに新たに機能性物質を生産する可能性があると考えられる。上記の事柄は、自然界においては多様な生物が相互し合い難分解高分子である植物バイオマスを利用していることから植物バイオマスの有効利用を行うにあたって用いるセルラーゼ剤についても同様なことが言えると思われる。基質となる植物バイオマスは、その構造が非常に強固な難分解高分子であるがために分解しにくく、植物バイオマスを分解すること自然界ではいろいろな菌の相互作用により分解資化が行われていることが知られている。混合培養を行うことにより、単一株の培養からのセルラーゼ精製より、混合培養は多数の生物が相互作用で生育することにより単一培養より、多くのセルラーゼのアイソザイムを生産する事が出来るもではないかと考えられる。また、オカダンゴムシは落ち葉の分解に深く関わり合っているが、オカダンゴムシ自体はセルラーゼを持たないと言われており、植物バイオマス消化利用にあたり、条件的共生と考えられているが、大量のバイオマスを処理利用するために腸内セルラーゼ微生物群を常時保持していると言われている。本発明ではオカダンゴムシがどのように効率よく植物バイオマスを分解利用しているかを知るために、オカダンゴムシのフンから腸内細菌と思われる菌を分離し、その微生物群の同定、およびセルロースの分解能等の解明、植物バイオマスを主食とするオカダンゴムシの腸内の共生菌微生物群単位を用いて、複合生物系という観点から、腸内微生物群単位そのものを用いて混合培養し、セルラーゼを生産精製し、得られたセルラーゼの特性等について検討し、新規なセルラーゼ生産方法を提供することを目的とする。本発明は動物の腸内共生群単位を用いて酵素を生産する方法である。動物腸内の個々の共生菌を用いてセルロース分解能力を測定して有益セルラーゼ生成菌を有する動物を選別する方法であり、選抜された動物の腸内共生菌群単位を培養する事によりセルラーゼを生産する方法である。検査結果よりその動物は土壌動物のダンゴムシの腸内共生菌群を用いてセルラーゼを生産する事により新規なセルラーゼ生産方法となる。動物体内共生菌群単位を用いる事で従来からの単一種からのセルラーゼ生産方法と異なり、複数種の腸内共生菌群を用いることにより単数種類のセルラーゼによる植物バイオマスの分解よりも、複数種菌群によるセルラーゼ生産菌によりセルロソームセルラーゼ複合体が生産され従来よりも植物バイオマスに対する分解率を向上させる事が期待される。以下に本発明をさらに具体的に説明する。当該動物は、植物を主食とする食材性動物を対象とする。セルロースは、グルコースがβ-1,4グルコシド結合により高度に重合したグルコースポリマーであり、全ての植物の細胞壁構成成分として存在する。セルラーゼはセルロースを分解する酵素の総称であり、セルラーゼが単体の状態でも、加水分解酵素群のような複数酵素群の状態であってもセルロースの分解活性を有していれば本発明に含まれる。本発明において、セルロースを分解または糖化することとは、セルロースを分解し、オリゴ糖類、二糖類、単糖類およびそれらの混合物にすることをいう。あるいは、言い換えれば、この用語は、セルラーゼによって、多糖類のグリコシド結合を加水分解することをいう。本発明において培養方法としては、液体培養および固体培養が挙げられるが、選択した微生物を培養できるかぎり、これらの方法に限定されない。セルラーゼ生産菌の培養セルラーゼ生産菌は、下記の実施例において具体的に記載されるように培養することが可能である。本発明において、炭素源として培地に加える粉末セルロールの量は、それぞれ、10~1000g/L等の濃度帯で培養を行う事が好ましいが、条件によりセルロース濃度の変更をする事もあり、上記濃度に限定されるものではない。培養温度および培養時間は、セルラーゼ生産菌の種類によって異なるが、通常、25~60°C、48時間~10日ほどの条件で培養を行う。培養に用いることができる発酵槽としては、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型などが挙げられる。上記培養液から、遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去し上清液を得る。この上清液は、このまま粗酵素液として使用することが可能である。次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例1粘度の測定毛細管粘度計を用いて行った。これは最も代表的な粘度計で,全体がガラス製でできており、毛細部位に一定の体積の液を入れ給水後、自然流下させる.液面が通過する時間を測定する。また、粘度の測定においては落球粘度計および回転粘度計等の粘度計を用いても構わない。セルラーゼの検出Congoredを用いてセルロース寒天培地上の微生物由来のセルラーゼの検出を行った。セルラーゼは菌体外酵素であり、培地上に分泌される。Congoredはその分泌されたセルラーゼと反応し、培地上にセルラーゼが分泌されているとその分泌されている部分は赤く染まる。動物体内および体外保有セルラーゼ生産菌能力試験野外から植物を主食とする各種土壌動物昆虫類を捕獲しセルロースを分解を有する能力を持つ微生物を個々個別に分離しスラントとし、昆虫土壌動物から分離出来た腸内共生菌自体のセルロース分解能力の試験を行った。以下当該実験手順を記す。野外から植物を主食とする各種土壌動物昆虫類を採取し、フンまたは、供試動物全体をすり潰し、5ml滅菌済みH2Oに入れ混合する約30秒程度。1セルロース寒天培地に白金耳を用いて植種する。インキュベーターを用いて30°C、5日間培養する。セルロース寒天培地に形成されたコロニーを分離し、スラントとして保持する。各スラントより白金耳を用いて5ml貧栄養カルボキシメチルセルロースCMC1水溶培養液に入れ、3日間30°Cで振動培養する。3日後、各溶液それぞれ1mlを、粘度計を用いて粘度の測定をする。得られた、結果より、セルロース分解能力ランキング表を作成する。表1から明らかなように、実験の結果としてバッタ類よりもダンゴムシ等から強いCMC分解率を得られた。供試動物名については予備実験的に身近なところから採集できたものを用いたため、種名が明らかにできないものが多く、分類群のレベルも不統一になっている。ここではダンゴムシの成績が粘度を下げているものが比較的多いことに注目した。上記より、強いセルラーゼ生成能を持つ菌がダンゴムシの腸内に存在する可能性が示唆された。バッタ類は非常に良く大量の植物を食するが、しかし、フンを見ると植物構造等はほとんど利用しておらず、植物の原形質内にある栄養豊富な、タンパク質脂質貯蔵炭水化物等を利用して生命を営んでいると推測される。しかし、等脚目類は枯葉を主食とし、植物の原形質類を生命の営みに利用するバッタ類とは異なった植物構造体の利用をしていると思われ、CMCを用いた粘度セルロース分解能力測定実験からも難分解性高分子であるセルロースを利用しているものと推測される。実施例2次にオカダンゴムシの腸内共生菌数およびその組成を調べた。段階希釈法試料としてオカダンゴムシのフン5粒程度を滅菌済み09濃度食塩水以下生理食塩水と記す10ml中に入れ混合し、当該試料1mlを滅菌済み生理食塩水9mlに入れ、試験管を振って混合する約1分程度放置する。希釈試料10mlから1ml採取し、新しい9ml生理食塩水に入れ、よく混合し、順次、10分の1ずつ希釈していき希釈完了後、試料から1ml採取し、9mlブイヨン液体培地に加える。各希釈段階の3本一組の試験管を30°C、3日~5日程度培養を行う。各希釈段階の3本一組の試験管において何本が濁るか数え菌数測定を行う。菌体数の測定段階希釈法を用いてオカダンゴムシの腸内および主食とするクスノキ枯葉自身の菌体数を求めた。オカダンゴムシ腸内からは1g当たり227×107の菌数を得られ、クスノキの微生物数1g当たり24×104と比較するとオカダンゴムシ腸内においては微生物の活動が活発であることがわかり、オカダンゴムシの腸内環境は微生物にとって生活しやすい環境条件下であることが伺える。オカダンゴムシのフンからの微生物群の分離縦23cm×横27cmの台所用メッシュに、一晩50°Cで乾燥させた枯葉とオカダンゴムシ3匹を入れ、15cm滅菌済みシャーレ内に入れる。ただし、メッシュがシャーレの上下底に当たらないようにする下皿にフンのみ回収出来るようにするため。暗所、25°C前後で静止しておく。1~2日後にフンを採取。フン採取後、フン3粒を滅菌済み5mlH2O内に入れ混合約30秒程度。1セルロース寒天培地に接種する、30°Cにて培養。5日経過後、出てきたコロニーをスラントにして保持する。腸内微生物群の構成クスノキを主食とするオカダンゴムシのフンを滅菌済み生理食塩水5ml内に懸濁し懸濁液を用いて1セルロース寒天培地に発生する微生物を分離し、その微生物の同定を行った。その結果が表2である。その結果から、Bacillus34、Enterobacteriaceae17、Vibrionaceae10の順で菌株が分離された。スラントの構成を見ると、バクテリアが84、真菌類が16の構成比率となった。またオカダンゴムシが餌としているクスノキ枯葉1gを用いて乳鉢である程度小さくした後、滅菌済み5ml内に懸濁しクスノキ枯葉自体からも菌の分離を試みた。その結果として、Pseudomonadaceae38、Nocardia15、Curvularia15の順で菌株が分離された。微生物の構成を見ると、バクテリアが53、真菌類が47の構成比率となった。クスノキ枯葉からの菌の分離ではバクテリアの分離株の種類は少なく、真菌類の分離株がある程度多様性を見せた。オカダンゴムシのフンから分離した微生物群相とクスノキ枯葉自体から分離された微生物群相はその構成が異なっていることがわかる。オカダンゴムシのフンの微生物群とクスノキ枯葉の微生物群を比較すると、フンのほうには圧倒的にバクテリアが多く、クスノキからは多く真菌類が分離された。オカダンゴムシの腸内においてはバクテリアの活性が高いために真菌類の働きが抑制されたのではないかと考えられる。そのためにフンからの微生物相ではバクテリアが多く、クスノキ自体からではバクテリアと真菌類の分離の割合が半々程度となったと考えられる。このことよりフンから分離されたカビはコナラ自体に付着していた可能性が高い。細菌類の腸内垂直伝播について社会性昆虫として顕著な集団を作るシロアリは、共生微生物としてバクテリア以外にアメーバと原生動物がセルロース質を分解し、その代謝物をシロアリが利用することはよく知られており、また食材性の甲虫類の幼虫のカミキリムシ科の後腸は大変大きく、後腸内でバクテリアの作用によりセルロース質が分解され、共生微生物の作用により植物バイオマスを利用している。上記のような共生関係から判断すると、オカダンゴムシの腸内でのセルロース分解消化の主役としてはバクテリアの活性が高く、またある程度のバクテリアにおける多様性を持っているため、バクテリアがその主役をなしているのではないかと考えられる。また、オカダンゴムシの腸内には多様性を持った微生物群が生息している事が今回の実験において判明した。オカダンゴムシの腸内微生物群の調査を行い、セルラーゼを分泌しない腸内微生物群とセルラーゼを分泌する菌群との割合がほぼ同程度の割合で存在する事が判明した。オカダンゴムシ自体はセルラーゼを分泌する能力を持たないと言われているので、腸内微生物群が半分程度存在する事はオカダンゴムシ腸内において微生物群およびオカダンゴムシそれぞれが共生関係を形成して難分解性高分子であるセルロースを分解吸収利用しているものと思われる。比較例1ダンゴムシ腸内共生菌単位を用いた混合培養によるセルラーゼ生産等脚目は摂食や生殖行動と直接の関係がないにも関わらず、常時集団を形成して生活している。しかもその集合現象はフェロモンにより誘発されて、集合フェロモンはフン中に含まれている。食材性昆虫として有名なシロアリはフンを介して効率よくセルロースを分解できる菌群を垂直伝播しており、等脚目はシロアリのような社会性昆虫ではないが常時集団で生活しているためにフンを介して等脚目の腸内の微生物群効率よくセルロースを分解できる菌群を垂直伝播しているのではないかと考えられた。腐食性土壌動物であるオカダンゴムシ自体がセルラーゼを分泌しないのであれば腸内の共生微生物群の力によってセルロース基質を分解しそれを利用しているものと考えられ、オカダンゴムシの腸内共生微生物単位そのものを用いる事によって活性の高いセルラーゼ剤が生産されるのではないかと考えた。そこで、フンを培養液を用いて培養し得られたセルラーゼ粗酵素液とそれと比較する為に畑の土を用いて同様の実験操作を行いセルラーゼの比活性を比較を行った。セルラーゼの精製セルラーゼは、上記上清液より、タンパク質精製に用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒エタノール、メタノール、アセトン等による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理など、を1つまたは複数組み合わせて用いて精製することが可能である。セルラーゼ活性の測定セルラーゼ活性は、上記上清液または精製したセルラーゼに、濾紙、カルボキシメチルセルロースCMC、微結晶セルロースAvicel、サリシンおよびセロビオースなどの基質を加えて、一定時間酵素反応を行わせた後に、生じた還元糖をSomogyNelson法およびDNS法などにより発色させ所定の波長で比色定量して測定することが可能である。セルラーゼβglucosidaseの検出基質として4methylumbelliferylβDcellobiosideを用いる事が出来る、酵素反応によりグリコシド結合が切れて4-MUが遊離すると塩基性下で強い青色の蛍光440nmを発するので、高感度でグリコシダーゼ活性を測定することができる。タンパク質の定量LowryFolinmethodを用い、下記1~4までの試薬を用意した。101NNaOHにNaCO35H2Oを終濃度2に溶解したもの22酒石酸ナトリウムにCuSO45H2Oを終濃度1に溶解した3アルカリ性試薬=試薬1、50mlと試薬2、1mlを直前に混合したもの。および4、フォリン試薬:フェノールフタレインを用いた。タンパク質を含む試料溶液をとり、試薬4、を5ml加えてよく混合し、室温に10分間放置する。次に試薬3、を05ml加えてすばやく混合後、30~120分の間に分光光度計を用いて吸光度750nmを測定する。別とに子牛血清アルブミンBSAを用いて作成したタンパク質標準曲線を作成し、定量を行う。グルコースの定量DNS法により35Dintrosalicylicacidの還元反応を利用した方法を用いた。DNS試薬:45NaOH溶液に、1DNS溶液およびロッセル塩を加える。別に10NaOH溶液22mlに結晶フェノールを加えて溶解し、100mlとする。このアルカリ性フェノール液69mlにNaHCO369gを加えて溶かし、前記のDNS液を注いでロッセル塩が充分に溶解するまでかきまぜる。試料1mlに蒸留水2mlを加え3mlにする。005M酢酸緩衝液pH471mlを加え、DNS試薬2mlを加え、沸騰水浴中に5分間保った後、水冷し、蒸留水を15ml加え20mlとする。分光光度計の波長540nmで吸光度を測定し、グルコース量を算出した。また、SomogyNelson法においてもグルコースを測定する事が出来る。セルラーゼの測定以下の各基質を用いて酵素比活性を求めた疎水性セルロース1mlAvicel1に酵素溶液05mlを入れ40°C、60分反応終了後、11ml025NNaOHを入れ、遊離したグルコースをDNS試薬を用いて測定する。1酵素単位の定義は、1分間に、1μmol量のグルコースを生成する酵素量とする。親水性セルロース1mlCMC1に酵素溶液05mlを入れ40°C、30分反応終了後、11ml025NNaOHを入れ、遊離したグルコースをDNS試薬を用いて測定する。1酵素単位の定義は、1分間に、1μmol量のグルコースを生成する酵素量とする。β―グルコシターゼ2mlpNPG003に酵素溶液02mlをいれ40°C30分反応終了後、2ml1MNaCO4を入れ、遊離したpnitrophenolを分光時計400nmの波長を用いて測定する。1酵素単位の定義は、1分間に、1μmol量のpnitrophenolを生成する酵素量とする。オカダンゴムシを野外より採取し、実施例2の方法を用いてフンを採取し、当該フンを3粒程度を貧栄養セルロース培地表2を用いて30°C、3日間、振動培養したものを遠心分離器12000rpm、10分にて処理し、上澄み液を採取し、セルラーゼを精製し、各酵素比活性を求めたものが表3となる。オカダンゴムシのフンを培養し得られたセルラーゼ粗酵素液と土を用いたセルラーゼ粗酵素液を得てセルラーゼの比活性を比較してみたところ、Avicelase、CMCase、Cellobiase、ともにオカダンゴムシのフン由来のセルラーゼ粗酵素液の方が良いセルラーゼの比活性を得られた。このことは、オカダンゴムシの腸内には比較的セルロースを良く分解できる腸内微生物群が常時存在しているのではないかと推測される。腐食性動物等脚目オカダンゴムシの腸内にはセルロースを比較的良く分解できる微生物群が存在することが証明できたものと思われる。"