"少なくとも2つのリジン残基を含むポリペプチド中の特定のリジン残基を修飾する方法であって、a第1の保護基によって保護された標的リジン残基及び少なくとも1つのさらなるリジン残基を含むポリペプチドを用意するステップと、b前記ポリペプチドを処理して、前記1又は2以上のさらなるリジン残基を保護するステップであって、前記さらなるリジン残基の保護基が前記標的リジン残基の保護基とは異なるステップと、c前記標的リジン残基を選択的に脱保護するステップと、dcの脱保護されたリジン残基を修飾するステップとを含む方法。ポリペプチドの作製が、i標的リジンをコードする直交性コドンを含む、前記ポリペプチドをコードする核酸を用意するステップと、ii前記直交性コドンを認識でき且つ第1の保護基によって保護された標的リジン残基を前記ポリペプチド鎖に取り込むことができる直交性tRNAシンセターゼ/tRNA対の存在下において、前記核酸を翻訳するステップとを含む、請求項1に記載の方法。直交性コドンがTAGを含み、tRNAがMbtRNACUAを含み、tRNAシンセターゼがMbPylRSを含む、請求項2に記載の方法。第1の保護基によって保護された標的リジン残基が、Nε-t-ブチルオキシカルボニル-L-リジンである、請求項1~3のいずれかに記載の方法。さらなるリジン残基の保護基が、N-ベンジルオキシカルボニルオキシスクシンイミドCbz-Osuである、請求項1~4のいずれかに記載の方法。ステップbが、ポリペプチドを塩基性DMSO中のN-ベンジルオキシカルボニルオキシスクシンイミドCbz-Osuで処理することを含む、請求項1~5のいずれかに記載の方法。ステップcが、ポリペプチドを、水中のトリフルオロ酢酸TFAで処理することを含む、請求項1~6のいずれかに記載の方法。ステップdの修飾が、iチオエステルを、AgIの存在下におけるN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルへの転換によって活性化するステップと、ii接続されるポリペプチドを標的リジンに加えるステップと、iiiインキュベートして、特異的なイソペプチド結合を形成させるステップとを含む、請求項1~7のいずれかに記載の方法。ステップdの修飾を、標的リジン残基のε-アミノ基上で実施する、請求項1~8のいずれかに記載の方法。ステップdにおいて標的リジンに対して複数の修飾を行う、請求項1~9のいずれかに記載の方法。1又は2以上のさらなるリジン残基を脱保護するステップeをさらに含む、請求項1~10のいずれかに記載の方法。ステップeが、ポリペプチドを、トリフルオロメタンスルホン酸TFMSA:トリフルオロ酢酸TFA:硫化ジメチルDMSの1:3:6の比の混合物で処理することを含む、請求項11に記載の方法。ステップaが、第1の保護基によって保護された標的リジン残基を、ポリペプチド鎖にその翻訳中に遺伝的に取り込むことによって、ポリペプチドを作製することを含む、請求項1に記載の方法。ポリペプチドがユビキチンである、請求項1~13のいずれかに記載の方法。ステップdの修飾が、さらなるポリペプチド鎖の、標的リジンへの共有結合である、請求項1~14のいずれかに記載の方法。さらなるポリペプチド鎖がユビキチンである、請求項15に記載の方法。ステップc~dを繰り返して、リジン残基を介する共有結合によって接続されたポリペプチドの鎖を作製する、請求項10に記載の方法。請求項1~17のいずれかに記載の方法によって作製されたポリペプチド。K-結合ユビキチン鎖を含む、請求項18に記載のポリペプチド。K-結合がK6又はK29結合である、請求項19に記載のポリペプチド。K29脱ユビキチン化酵素としてのTRABIDの使用。K29結合ユビキチンをTRABIDと接触させることを含む、K29結合ユビキチンの切断方法。ポリペプチド中の標的リジンの保護基と1又は2以上の他のリジンの保護基が異なることは、本発明に不可欠である。差次的な脱保護化学反応が、標的残基の特異的又は選択的脱保護、その結果として修飾によってその標的残基を特異的又は選択的に修飾できるのは、これらの保護基の化学的な差異による。好適には、ステップdにおける所望の反応は、リジン残基のε-アミノ基に対して実施する。別の好ましい実施形態において、ステップbで保護すべき他のリジン側鎖もまた、ε-アミノ基である。このような場合、前記方法は、ポリペプチド鎖の末端アミノ基にも適用される。本発明による方法において、前記遺伝的取り込みは好ましくは、リジン側基鎖が保護されている特定のリジン残基をコードするように1又は2以上の特異的な直交性コドンが割り付けられている直交性又は拡張した遺伝子コードを使用し、その結果、直交性tRNAシンセターゼ/tRNA対を用いることによってこのような保護リジン残基を遺伝的に取り込むことができる。直交性tRNAシンセターゼ/tRNA対は原則として、保護リジンをtRNAにチャージでき且つ直交性コドンに応答してその保護リジンをポリペプチド鎖に取り込むことができる、任意のこのような対であることができる。直交性コドンは、直交性のアンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン又は四塩基コドンであることができる。コドンは、保護リジン分子の運搬に用いられる直交性tRNAに対応しさえすればよい。好ましくは、直交性コドンはアンバーコドンである。本明細書中で示す具体例は、アンバーコドン及び対応するtRNA/tRNAシンセターゼを使用していることに留意すべきである。前述のように、これらは多様であることができる。あるいは、保護されたリジンを処理できる代替tRNA/tRNAシンセターゼ対をわざわざ使用又は選択することなく他のコドンを使用するためには、tRNAのアンチコドン領域を、最適のコドンに望ましいアンチコドン領域と単に交換するだけでよい。アンチコドン領域は、tRNAのチャージ機能又は取り込み機能にも、tRNAシンセターゼによる認識にも関与しないので、このような交換は完全に、熟練した操作者の技術の範囲内である。したがって、代替直交性tRNAシンセターゼ/tRNA対は、必要に応じて使用できる。好ましくは、直交性シンセターゼ/tRNA対は、メタノサルシナバーケリMethanosarcinabarkeriMSピロリジンpyrrolysinetRNAシンセターゼMbPylRSとその同族アンバーサプレッサーtRNAMbtRNACUAである。メタノサルシナバーケリPylT遺伝子は、MbtRNACUAtRNAをコードする。メタノサルシナバーケリPylS遺伝子は、MbPylRStRNAシンセターゼタンパク質をコードする。数値アドレスを使用して特定のアミノ酸残基を示す場合、ナンバリングは、参照配列としてMbPylRSメタノサルシナバーケリピロリジルpyrrolysyl-tRNAシンセターゼアミノ酸配列すなわち、公表されている野生型メタノサルシナバーケリPylS遺伝子受入番号Q46E77によってコード化されているを用いて行う:MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKASTDTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNIAKPFRELESELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRDFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPDPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLESLIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL。前記配列には、明細書中、以下において配列番号1を付してある。必要ならば、当業者は、MbPylRStRNAシンセターゼタンパク質を、変異させることによって、使用される特定の保護側鎖を有するリジン種に対して最適化されるように適合させることができる。変異の必要性は、使用されるリジン残基及び保護/ケージ化基caginggroupによって決まる。MbPylRStRNAシンセターゼを変異させる必要がない一例は、ステップaにおいて使用される保護側鎖を有するリジン残基がNε-t-ブチルオキシカルボニル-L-リジンである場合である。MbPylRStRNAシンセターゼを変異させる必要があると考えられる一例は、ステップaのリジン側基鎖が感光性ケージ化基などのより大きい化学基によって保護されている場合である。このような変異は、MbPylRStRNAシンセターゼ中の以下の位置:M241、A267、Y271、L274及びC313の1又は2以上に変異を導入することによって実施できる。好ましくは、変異は、M241F、A267S、Y271C及びL274Mを含むことができる。tRNAシンセターゼ本発明のtRNAシンセターゼは、多様であることができる。例中では特定のtRNAシンセターゼ配列を使用していると考えられるが、本発明を、これらの例にのみ限定することを意図としない。原則として、本発明においては、同じtRNAチャージ機能アミノアシル化を示す任意のtRNAシンセターゼを使用できる。例えば、tRNAシンセターゼは、任意の好適な種、例えば、古細菌、例えば、メタノサルシナバーケリMS、メタノサルシナバーケリ株フサロFusaro、メタノサルシナマゼイMethanosarcinamazeiGol、メタノサルシナアセチボランスMethanosarcinaacetivoransC2A、メタノサルシナサーモフィラMethanosarcinathermophila又はメタノコッコイデスブルトニイMethanococcoidesburtoniiに由来することができる。あるいは、tRNAシンセターゼは、細菌、例えば、デスルフィトバクテリウムハフニエンスDesulfitobacteriumhafnienseDCB2、デスルフィトバクテリウムハフニエンスY51、デスルフィトバクテリウムハフニエンスPCP1、デスルフォトマクルムアセトキシダンスDesulfotomaculumacetoxidansDSM771に由来することができる。これらの微生物の例示的な配列は、公表されている配列である。以下の例を、ピロリジンtRNAシンセターゼの例示的な配列として示す。>M.バーケリMS/1~419/メタノサルシナバーケリMSバージョンQ6WRH6.1GI:74501411MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>M.バーケリF/1~419/メタノサルシナバーケリ株フサロバージョンYP_304395.1GI:73668380MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKASTDTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNIAKPFRELESELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRDFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPDPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLESLIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>M.マゼイ/1~454メタノサルシナマゼイGolバージョンNP_633469.1GI:21227547MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL>M.アセチボランス/1~443メタノサルシナアセチボランスC2AバージョンNP_615128.2GI:161484944MDKKPLDTLISATGLWMSRTGMIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGERLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCRHCRVSDEDINNFLTKTSEEKTTVKVKVVSAPRVRKAMPKSVARAPKPLEATAQVPLSGSKPAPATPVSAPAQAPAPSTGSASATSASAQRMANSAAAPAAPVPTSAPALTKGQLDRLEGLLSPKDEISLDSEKPFRELESELLSRRKKDLKRIYAEERENYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINSDTELSKQVFRIDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIITEFLNHLGIDFEIIGDSCMVYGNTLDVMHDDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRAARSESYYNGISTNL>M.サーモフィラ/1~478メタノサルシナサーモフィラ、バージョンDQ017250.1GI:67773308MDKKPLNTLISATGLWMSRTGKLHKIRHHEVSKRKIYIEMECGERLVVNNSRSCRAARALRHHKYRKICKHCRVSDEDLNKFLTRTNEDKSNAKVTVVSAPKIRKVMPKSVARTPKPLENTAPVQTLPSESQPAPTTPISASTTAPASTSTTAPAPASTTAPAPASTTAPASASTTISTSAMPASTSAQGTTKFNYISGGFPRPIPVQASAPALTKSQIDRLQGLLSPKDEISLDSGTPFRKLESELLSRRRKDLKQIYAEEREHYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPMEYIERMGIDNDKELSKQIFRVDNNFCLRPMLAPNLYNYLRKLNRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIIKDFLDYLGIDFEIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPVPMDRDWGINKPWIGAGFGLERLLKVMHNFKNIKRASRSESYYNGISTNL>M.ブルトニイ/1~416メタノコッコイデスブルトニイDSM6242、バージョンYP_566710.1GI:91774018MEKQLLDVLVELNGVWLSRSGLLHGIRNFEITTKHIHIETDCGARFTVRNSRSSRSARSLRHNKYRKPCKRCRPADEQIDRFVKKTFKEKRQTVSVFSSPKKHVPKKPKVAVIKSFSISTPSPKEASVSNSIPTPSISVVKDEVKVPEVKYTPSQIERLKTLMSPDDKIPIQDELPEFKVLEKELIQRRRDDLKKMYEEDREDRLGKLERDITEFFVDRGFLEIKSPIMIPFEYIERMGIDKDDHLNKQIFRVDESMCLRPMLAPCLYNYLRKLDKVLPDPIRIFEIGPCYRKESDGSSHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENMEALIDEFLEHLGIEYEIEADNCMVYGDTIDIMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGVNKPWMGAGFGLERLLKVRHNYTNIRRASRSELYYNGINTNL>D.ハフニエンス_DCB-2/1~279デスルフィトバクテリウムハフニエンスDCB-2バージョンYP_002461289.1GI:219670854MSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN>D.ハフニエンス_Y51/l~312デスルフィトバクテリウムハフニエンスY51バージョンYP_521192.1GI:89897705MDRIDHTDSKFVQAGETPVLPATFMFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN>D.ハフニエンスPCPl/1~288デスルフィトバクテリウムハフニエンスバージョンAY692340.1GI:53771772MFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEKLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIFDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN>D.アセトキシダンス/1~277デスルフォトマクルムアセトキシダンスDSM771バージョンYP_003189614.1GI:258513392MSFLWTVSQQKRLSELNASEEEKNMSFSSTSDREAAYKRVEMRLINESKQRLNKLRHETRPAICALENRLAAALRGAGFVQVATPVILSKKLLGKMTITDEHALFSQVFWIEENKCLRPMLAPNLYYILKDLLRLWEKPVRIFEIGSCFRKESQGSNHLNEFTMLNLVEWGLPEEQRQKRISELAKLVMDETGIDEYHLEHAESVVYGETVDVMHRDIELGSGALGPHFLDGRWGVVGPWVGIGFGLERLLMVEQGGQNVRSMGKSLTYLDGVRLNItRNAシンセターゼを変異させることによって特定のtRNAチャージアミノアシル化機能をもたらす場合、別の野生型tRNA配列、例えば、上記から選択されるものを使用するだけでは適切でない場合がある。その場合は、同じtRNAチャージアミノアシル化機能を保存することが重要となる。これは、例示的なtRNAシンセターゼ中の1又は2以上の変異を代替tRNAシンセターゼ主鎖、例えば、上記から選択されるものに転移させることによって行う。このように、選択された変異を、対応するtRNAシンセターゼ配列、例えば、例示的なM.バーケリ及び/又はM.マゼイ配列以外の他の微生物に由来する対応pylS配列に転移させることができるはずである。標的tRNAシンセターゼタンパク質/主鎖は、例示的なM.バーケリ及び/又はM.マゼイ配列などの既知のtRNAシンセターゼとのアラインメントによって選択できる。次に、このテーマを、pylSピロリジンtRNAシンセターゼ配列を参照することによって説明するが、この原理は対象のtRNAシンセターゼに等しく適用される。例えば、図14は、全てのPylS配列のアラインメントを示している。これらは、全体的な配列同一性が低い。したがって、使用されている配列が実際にtRNAシンセターゼであることを確実にするために、既知のtRNAシンセターゼとの配列のアラインメントによるなどして単に低い配列同一性スコアを使用するのではなく、配列を研究することが重要である。したがって好適には、配列同一性を考慮する場合には、図14に示されるようなtRNAシンセターゼ全体にわたって考慮するのが好適である。好適には、同一性は、図14から規定されるものであることができる。図15は、tRNAシンセターゼ間の配列同一性の略図を示している。好適には、同一性は、図15から規定されるものであることができる。触媒領域に的を絞るのが有用であると考えられる。図16は、まさに触媒領域のアラインメントである。これの目的は、同一のtRNAチャージアミノアシル化機能、例えば、新しい又は非天然のアミノ酸認識をもたらすように移植される変異の受容に好適な主鎖骨格backbonescaffoldを捕捉/同定するために、高い同一性を規定できるtRNA触媒領域を提供することである。したがって好適には、配列同一性を考慮する場合には、図16に示されるような触媒領域全体にわたって考慮するのが好適である。好適には、同一性は、図16から規定されるものであることができる。図17は、触媒領域間の配列同一性の略図を示している。好適には、同一性は、図17から規定されるものであることができる。代替tRNAシンセターゼ主鎖への変異の転移transferring又は移植transplantingは、tRNAシンセターゼ主鎖をコードしているヌクレオチド配列の部位特異的変異誘発によって行うことができる。この技術は、当業界で周知である。本質的には、主鎖pylS配列を選択し例えば、前述の活性部位アラインメントを用いて、選択された変異を、対応する/相同的な位置に転移させるすなわち、そのような位置に作る。数値アドレスを使用して特定のアミノ酸残基を示す場合、明白でない限り、ナンバリングは、参照配列としてMbPylRSメタノサルシナバーケリピロリジル-tRNAシンセターゼアミノ酸配列すなわち、公表されている野生型メタノサルシナバーケリPylS遺伝子受入番号Q46E77によってコード化されているを用いて行う:MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKASTDTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNIAKPFRELESELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRDFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPDPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLESLIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNLこれは、対象の残基を位置づけるために当業界でよく理解されているようにして使用すべきである。これは、必ずしも厳密な計数作業ではない-構成又はアラインメントに留意しなければならない。例えば、対象のタンパク質がわずかに異なる長さを有する場合には、例えばL266に相当するその配列中での正しい残基の位置づけには、対象の配列の266番目の残基を単に取るのではなく、配列をアラインメントして、等しい又は相当する残基を選ぶことが必要と考えられる。これは、熟練した解読者の技術の範囲内である。本明細書中で使用する変異の表示法は、当業界における標準である。例えば、L266Mは、野生型配列の266位のLに相当するアミノ酸がMと置き換えられていることを意味する。ここで、代替tRNA主鎖間への変異の移植を、例示的なM.バーケリ及びM.マゼイ配列に関して説明するが、同じ原理が他の主鎖への又は他の主鎖からの移植にも等しく適用される。例えば、MbAcKRSは、AcKの取り込みのための改変シンセターゼである。親タンパク質/主鎖:M.バーケリPylS変異:L266V、L270I、Y271F、L274A、C317FMbPCKRS:PCKの取り込みのための改変シンセターゼ親タンパク質/主鎖:M.バーケリPylS変異:M241F、A267S、Y271C、L274MM.マゼイPylSにこれらの変異を移植することによって、同じ基質特異性を有するシンセターゼを得ることができる。これら2つのシンセターゼの配列相同性は、図18において見ることができる。したがって、Mb主鎖からの変異をMmtRNA主鎖に移植することによって、以下のシンセターゼ:変異L301V、L305I、Y306F、L309A、C348FをM.マゼイPylSに導入するMmAcKRS、及び変異M276F、A302S、Y306C、L309MをM.マゼイPylSに導入するMmPCKRSを作成できる。これらの例示的な移植変異シンセターゼの完全長配列を以下に示す。MbPylS1419MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNLMbAcKRS1419MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSGEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMVAPTIFNYARKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFFQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNLMbPCKRS1419MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERFGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLSPTLCNYMRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNLMmPylS1454MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNLMmAcKRS1454MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMVAPNIFNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNLMmPCKRS1454MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERFGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLSPNLCNYMRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL同じ原理が、他の変異及び/又は他の主鎖にも等しく適用される。このようにして作製された移植ポリペプチドは、有利には、所望の機能/基質特異性が保存されていることを確実にするために試験すべきである。前述の方法のために対象のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを、複製可能な組換えベクターに取り込むことができる。ベクターは、適合宿主細胞中で核酸を複製するのに使用できる。したがって、さらなる一実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクター中に導入し、前記ベクターを適合宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによる、本発明のポリヌクレオチドを作るための方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収できる。好適な宿主細胞としては、大腸菌Ecoli,Escherichiacoliなどの細菌が挙げられる。好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によってコード配列の発現を実現できる制御配列に操作可能に結合される。すなわち、ベクターは発現ベクターである。用語操作可能に結合されるとは、記載された成分が、意図された方法で機能できる関係にあることを意味する。コード配列に操作可能に結合される調節配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方法で連結される。本発明のベクターを、記載したような好適な宿主細胞中に形質転換又は形質移入させて、本発明のタンパク質の発現を実現することができる。この方法は、タンパク質をコードするコード配列のベクターによって発現を実現する条件下で、前述のようにして発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、任意選択で発現タンパク質を回収するステップとを含むことができる。ベクターは、例えば、複製起点、任意選択で前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター及び任意選択で前記プロモーターのレギュレーターを備えているプラスミド又はウィルスベクターであることができる。ベクターは、1又は2以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子を含有することができる。ベクターは、例えば、宿主細胞を形質移入又は形質転換するために使用できる。本発明のタンパク質をコードする配列に操作可能に結合される制御配列としては、プロモーター/エンハンサー及び他の発現調節シグナルが挙げられる。これらの制御配列は、発現ベクターが使用されるように設計されている宿主細胞と適合するように選択できる。用語プロモーターは当業界において周知であり、サイズ及び複雑さが最小のプロモーターから上流の要素及びエンハンサーを含むプロモーターに及ぶ核酸領域を包含する。標的リジンは、保護基によって保護する例えば、この方法のステップa。前記保護基は、1又は2以上のさらなるリジンの保護に使用する保護基とは異なる例えば方法のステップb。方法のステップcにおいて標的リジンから保護基を選択的に除去するのに使用する脱保護方法は、1又は2以上のさらなるリジンを同時に脱保護しないように実施しなければならない。リジン側鎖の化学的保護剤は多様であり、使用する脱保護方法の型に応じて、当業者によって選択されることができる。しかし、前記保護剤は好適には、リジン残基が遺伝的に取り込まれ、したがってそれが直交性シンセターゼ/tRNA対によって細胞中に取り込まれるように、選択する。好適には、ステップaにおいて使用する保護剤は本明細書中に記載する通りである。より好適には、ステップaにおいて使用する保護剤を有するリジンアミノ酸は、Nε-t-ブチルオキシカルボニル-L-リジンである。別の実施形態は、感光性ケージ化基で保護されているリジンアミノ酸を使用する。これは、化学的脱保護より容易であることができる光脱ケージ化脱保護を可能にするという利点を有する。さらなるリジン残基及び任意選択でN末端アミノ基は、それらの側鎖が、標的リジンの特異的な修飾を可能にするように保護されている。これは有利には、保護基がポリペプチド鎖中に存在するさらなるリジン残基の飽和100に達することができるか又は少なくともそれに近づくことができる反応を使用して行う。タンパク質としての性質を失うことなく、容易に変性及び復元できるポリペプチドを使用するのが有利である。その際、本発明によるポリペプチドが小タンパク質であるならば、有利であると考えられる。ポリペプチドは、例えばグリコシル化などの翻訳後修飾をほとんど又は全く有さないのがさらに有利である。修飾される例示的なポリペプチドには、ヒストン及び/又は小さい転写因子が含まれる。好適には、修飾されるポリペプチドは、大きすぎない。大きすぎないとは、長さが好適にはアミノ酸数百個以下、好適にはアミノ酸400個以下、より好適にはアミノ酸約300個以下であることを意味する。多ドメインタンパク質は、1又は2以上の他のドメイン例えば、多タンパク質複合体の他のメンバーとの相互作用に影響を及ぼす可能性が増加するため、修飾にはあまり魅力的でない。好適には、使用する保護基は、本明細書中に記載したものであることができる。さらに好適には、保護剤はN-ベンジルオキシカルボニルオキシスクシンイミドCbz-Osuである。好適には、これは塩基性DMSO中で使用することができる。代替の又は追加の保護基及びそれらの操作例えば、それらの付加/除去のための化学反応については後述する。BocLysは、GeneticincorporationofNεLlysineMultistepengineeringofpyrrolysyltRNAsynthetasetogeneticallyencodeNlysineforsitespecificproteinmodificationChemBiol15118797に記載されている。オフ-トリフルオロ酢酸TFAXが以下の場合にタンパク質アミンに穏やかに付着され得る直交性保護基1.ベンジルオキシカルボニルCbz又はZオン-N-ベンジルオキシカルボニルオキシ-スクシンイミドKawakamiTetalPolypeptidesynthesisusinganexpressedpeptideasabuildingblockforcondensationwithapeptidethioesterapplicationtothesynthesisofphosphorylatedp21MaxproteinJPeptSci7474487オフ-HFDMS、TFMSATFADMS、触媒水素化TAMJHEATHWMERRIFIELDRSN2DEPROTECTIONOFSYNTHETICPEPTIDESWITHALOWCONCENTRATIONOFHFINDIMETHYLSULFIDEEVIDENCEANDAPPLICATIONINPEPTIDESYNTHESISJournaloftheAmericanChemicalSociety10564426455TamJPHeathWFMerrifieldRBMechanismsfortheremovalofbenzylprotectinggroupsinsyntheticpeptidesbytrifluoromethanesulfonicacidtrifluoroaceticaciddimethylsulfideJournaloftheAmericanChemicalSociety10852425251GreenesProtectiveGroupsinOrganicSynthesis2.o-ニトロベンジルオキシカルボニルオン-N-o-ニトロベンジルオキシカルボニルオキシスクシンイミドオフ-hv約365nm、aq.Na2S2041,4-脱離3.p-ニトロベンジルオキシカルボニルオン-N-o-ニトロベンジルオキシカルボニルオキシスクシンイミドオフ-aq.Na2S2041,6-脱離4.トリフルオロアセチルTFAcオン-トリフルオロ酢酸無水物オフ-K2CO3/水性MeOH、pH>9GreenesProtectiveGroupsinOrganicSynthesis5.フルオレニルメトキシカルボニルFmocオン-N-フルオレニルメトキシカルボニルオキシスクシンイミドオフ-塩基任意の1級アミンによって除去され得るので、この保護基を使用する場合には、条件に適切な注意が払われなければならない。GreenesProtectiveGroupsinOrganicSynthesis6.アリールジチオエチルオキシカルボニルArdecLAPEYREMLEPRINCEJMASSONNEAULDMOULYADIHRENARDPROMIEUATURCATTIGVAUDRYHAryldithioethyloxycarbonylAnewfamilyofamineprotectinggroupsremovableundermildreducingconditionsandtheirapplicationstopeptidesynthesisChemEurJ1236553671オン-N-アリールジチオエチルオキシカルボニルスクシンイミドオフ-穏やかな還元TCEP、DTT、BMENε-トリフルオロアセチル-L-リジンTFAcLysの遺伝的取り込みオフ-K2CO3/水性MeOH、pH>9Xが以下の場合にタンパク質アミンに穏やかに付着され得る直交性保護基1.シトラコニルオン-シトラコン酸無水物/水性緩衝液pH8オフ-pH3~4BLAKEJLICNewsegmentcouplingmethodforpeptidesynthesisinaqueoussolutionapplicationtosynthesisofhumanGly17betaendorphinProcNatlAcadSciUSA78405582.t-ブチルオキシカルボニルBoc,tbutyloxycarbonylオン-N-t-ブチルオキシカルボニルオキシスクシンイミドオフ-TFACbz、光ケージ及びArdecもまた、遺伝的にコードされたTFAc保護と共に使用できる。Nε-o-ニトロピペロニルオキシカルボニル-L-リジンONPOCの遺伝的取り込みGAUTIERANGUYENDPLUSICHANWDEITERSACHINJWGeneticallyencodedphotocontrolofproteinlocalizationinmammaliancellsJournaloftheAmericanChemicalSociety13240868オフ-hv約365nm塩基切断可能な保護基及び穏やかな酸切断可能な保護基と適合するとみなされる。Ardecもまた、本発明に応用できる。Nε-アリルオキシカルボニル-L-リジンAllocLysの遺伝的取り込みYANAGISAWATISHIIRFUKUNAGARKOBAYASHILSAKAMOTOKYOKOYAMASMultistepengineeringofpyrrolysyltRNAsynthetasetogeneticallyencodeNlysineforsitespecificproteinmodificationChemBiol15118797オフ-NiCO4、PdPh3P4/Bu3SnH/AcOHこれは、触媒脱保護以外のすべてと直交性であり且つおそらくHF/TFMSAでないという利点を有する。別の実施形態において、さらなるリジン側鎖を、感光性ケージ化リジンで保護できる。この実施形態において、標的リジンを感光性基によってさらに保護する場合には、1又は2以上の標的リジンの保護は、第2の保護基を放出しない周波数の放射線で放出される感光性基によらなければならない。本方法は、組換え体技術による特異的反応及び化学選択的タンパク質化学反応によって、ポリペプチド鎖の内に存在する1又は2以上の特定のリジンを標的化できる。好適には、この方法はインビトロ法である。有利には、本発明のポリペプチドは、インビトロ又はインビボで適用できる。本発明の利点は、ポリペプチド及びタンパク質中におけるリジンの修飾の効果を研究する方法を提供することである。1又は2以上のリジンのこのような修飾ジメチル化の一例。これは、タンパク質におけるリジンのジメチル化の効果の研究に応用される。別の好ましい例において、ステップdの反応は、リジン残基を別のタンパク質に共有結合させることである。ステップcにおける脱保護後に特定のリジン側鎖はε-アミノを生じるので、反応はペプチド結合形成であるのが好ましい。このような場合、他のタンパク質もリジン側鎖を示す可能性があり、したがって、他のタンパク質が、ステップbの場合と同様にポリペプチド鎖の他のリジン残基と共に保護されれば好ましい。好適には、修飾ポリペプチド全体を、合成後に脱保護する。前述のように、本発明は、1又は2以上のポリペプチドのユビキチン化及び/又はその研究に有用である。したがって、そのポリペプチド及び/又は他のポリペプチドがユビキチンを含むならば、好ましい。ユビキチンは、容易に変性及び復元される小タンパク質であり、本発明の方法による遺伝子組換え及び選択的タンパク質化学反応による作製が容易である。したがって、本方法は、任意のタンパク質を特異的にユビキチン化できる強力なツールである。例えばユビキチンポリペプチドのK48によって結合されたポリユビキチンにタンパク質を結合させることなどにより、このようなユビキチン化の効果が知られる場合、これは、それらのプロテアソーム分解の研究に役立ち得る。別の例において、方法を繰り返して、1つのタンパク質をいくつかのタンパク質に結合させることができる。ポリペプチド鎖とタンパク質が共にユビキチンである場合には、本発明を使用して、例えば均一に及び/又は不均一に結合されたユビキチン鎖を作製することができる。したがって、本発明の別の態様は、本発明による方法から得ることができる、結果として生じるポリペプチド鎖、好適には、イソペプチド結合によってタンパク質に特異的に結合したポリペプチド鎖である。このような一例は、ユビキチン化タンパク質であり、この場合、ステップdの反応は、ペプチド結合の形成によってユビキチンを別のタンパク質に結合させることである。別のこのような例は、この方法によって得られる均一に結合されたユビキチン鎖である。以下に示すように、均一に結合されたユビキチン鎖を、この方法によって得ることができ、共有結合は、6位又は29位のリジンアミノ酸残基と別のユビキチンポリペプチドのC末端との間のイソペプチド結合である。この鎖は、本発明の方法によってさらに得ることができる、さらなる均一の結合によって続けることができることを理解すべきである。本発明の別の態様は、本発明の方法によって得られる、均一に結合したユビキチンであり、共有結合は、6位のリジンアミノ酸残基と別のユビキチンポリペプチドのC末端との間のイソペプチド結合である。結合は、3つ以上が結合されるまで続けることができる。前記ユビキチン鎖は、医薬品として使用できる。これは、DNA損傷への応答の活性化又は促進に使用できる。これらの鎖は、BRCA1/Bard1E3リガーゼ複合体に結合されることが示されている。したがって、これらのユビキチン鎖は、好ましくは癌が早期発症乳癌又は卵巣癌である場合に、癌の予防又は治療に使用できる。したがって、これらのユビキチン鎖は、腫瘍薬とみなすことができ、医薬組成物中に使用でき、腫瘍薬学の分野で周知の手段によって投与できる。以下の非限定的な例は、本発明を例証する。1つのユビキチンドナーのC末端と別のユビキチンアクセプターの特定のリジン残基のアミンとの間にイソペプチド結合を特異的に形成するには、これらの官能基を、両ユビキチン分子中の他のカルボン酸及びアミンと差別化することが必要である図1。アクセプターユビキチンに本発明による方法を適用し、ドナーユビキチンにステップbを適用することによって、これを行った。このアプローチの普遍性を例証するために、ユビキチン二量体を、ドナーユビキチンのC末端とアクセプターユビキチンのリジン残基K6又はK29のいずれかのε-アミノ基との間の特異的なイソペプチド結合を介して結合させることを目指した。各ユビキチンは7個のリジンを含有するので、この系によって、我々のアプローチの特異性は厳しく試験される。本発明の方法によるアクセプターユビキチンの調製本実施例は、アクセプターユビキチン後の逐次イソペプチド結合のためのである本発明の方法によるユビキチン分子の調製である。この方法は、図1の右側によって部分的に示されている。使用したプロトコールは、アクセプターユビキチンUbTAG6-His6及びUbTAG29-His6のクローニングである。NcoI及びXhoI制限部位並びにC末端His6タグとそれに続く終止コドンを導入する、順方向5’-CGCGCGCCATGGAGATCTTCGTGAAGACCCTGACTGG-3’プライマー及び逆方向5’-GCCGGATCTCCGCTCGAGTTAGTGGTGATGATGGTGATGCCCACCTCTGAGACGGAGGAC-3’プライマーを用いて、ヒトUBCユビキチン遺伝子をPCR増幅した。PCR産物をNcoI及びXhoIで消化し、同じように処理したpCDFPylTプラスミドIppプロモーター及びrrnCターミネーター上でMbtRNACUAをコード化し、スペクチノマイシン耐性マーカーを有するNeumannHPeakChewSYChinJWGeneticallyencodingNacetyllysineinrecombinantproteinsNatChemBiol4232234、NeumannHetalAmethodforgeneticallyinstallingsitespecificacetylationinrecombinanthistonesdefinestheeffectsofH3K56acetylationMolCell36153163に連結した。順方向プライマーは第2のユビキチンコドンの変異を押し進め、したがって、第2のユビキチン残基を元のGlnに変異させるには、Quikchange変異誘発が必要であった。次に、第2ラウンドのQuikchange変異誘発を用いて、K6位又はK29位にTAGコドンを導入した。最終プラスミドをそれぞれ、pCDFpylTUbTAG6His6及びpCDFpylTUbTAG29His6と命名した。アクセプターユビキチンUbBocK6及びUbBocK29の調製pBPylS大腸菌GlnRSプロモーター及びターミネーター上にMbPylRSをコード化するカナマイシン耐性プラスミド及びpCDFpylTUbTAG6His6を含有するBL21DE3細胞Merckbiosciences社を終夜増殖させた37°C、230rpm、LB-KSスペクチノマイシン50μgmL-1及びカナマイシン50μgmL-1を含有するLB培地中。培養物を、新鮮なLB-KS2L中で1:50に希釈し、インキュベートした37°C、230rpm。OD600=0.6において、激しく撹拌しながら200mMの12MNaOH水溶液中10mLの溶液を細胞に加え、培養物を5MHCl4mLで直ちに中和した。30分後に、イソプロピル-βD-チオガラクトピラノシドを0.5mMまで加えることによって、タンパク質発現を誘導した。インキュベーション37°C、230rpm、3時間後、遠心分離によって細胞を収集し、50mLの氷冷溶解用緩衝液20mMNa2HPO4pH7.4、25mMイミダゾール中に再懸濁させ、必要になるまで-80°Cで凍結した。細胞を氷上で解凍し、リゾチーム0.5mgmL-1及びDNAseA50μgmL-1を加えた。30分後に、細胞を超音波処理し、遠心分離39000×g、30分によって清澄化した。清澄化された溶解産物lysateを、重力流によって、Ni-NTA樹脂3mL、Qiagen社を含有するカラム上にロードした。樹脂を溶解用緩衝液90mLで洗浄し、タンパク質を溶出緩衝液20mMNa2HPO4pH7.4、250mMイミダゾールで溶出させた。UbBocK6-His6を含有する画分をSDS-PAGEによって決定し、プールし、AmiconUltra153kDaMWCO遠心濾過装置Millipore社で9mL未満まで濃縮した。次いで、試料を10mMTrispH7.6に対して3時間透析した。1mMDTTをUbBocK6-His6試料に加え、続いて、UCH-L3を最終濃度15μgmL-1で加えた。試料を、37°Cで1時間インキュベートして、C末端His6タグを除去した。サイズ-排除クロマトグラフィーによってHiLoad2660Superdex75PrepGradeカラムGELifeSciences社を使用して2mLmin-1の流速で、UbBocK6を単離した。UbBocK6を含有する画分をプールし、2.5mLまで濃縮した。試料を、PD10カラムGELifeSciences社を使用してH2O中に脱塩し、溶出物を凍結乾燥させて、UbBocK6約20mgを得た。細胞を、pCDFpylTUbTAG29His6で形質転換した以外は同様にして、UbBocK29を調製した。UbBocK29の収量は、8mgであった。Cbz-OSuによるUbBocK6及びUbBocK29の全般的保護凍結乾燥UbBocK620mg、2.3μmolをDMSO1.7mL中に溶解させ、続いてDIEA67μLを加えた。撹拌しながら、Cbz-OSu4.81mg、19.3μmolを反応生成物に加えた。25°Cにおいて2時間撹拌後、反応生成物を冷エーテル17mL中に移し、短時間ボルテックスした。沈殿物を遠心分離によって集め、エーテル層を廃棄した。ペレットを氷冷エーテル17mLで洗浄し、次いで風乾した。UbBocK29については、UbBocK29-His6の発現収率の低下を考慮して、この操作と以後の操作を案分して繰り返した。Boc保護基の除去UbBocK610mgから得られた、乾燥全般的保護ペプチド、UbBocK6Cbz7-8を冷TFA:H2O9:61.28mL中に溶解させ、4°Cにおいて1時間インキュベートした。次いで、選択的に脱保護されたペプチドを沈殿させ、氷冷エーテル2×13mLで洗浄した。水層及びエーテル層を除去し、ペプチドを風乾させた。結果保護されたリジンをユビキチンの6位に部位特異的に入れるために、我々は、メタノサルシナバーケリMSピロリジンtRNAシンセターゼMbPylRSとその同族アンバーサプレッサーtRNAMbtRNACUAを利用したSrinivasanGJamesCMKrzyckiJAPyrrolysineencodedbyUAGinArchaeachargingofaUAGdecodingspecializedtRNAScience29614591462。この同族アンバーサプレッサーtRNAは、大腸菌中でアンバーコドンに応答して組換えタンパク質へのNε-t-ブチルオキシカルボニル-L-リジン1の効率的な取り込みを指示するAmbrogellyAetalPyrrolysineisnothardwiredforcotranslationalinsertionatUAGcodonsProcNatlAcadSciUSA10431413146、NeumannHPeakChewSYChinJWGeneticallyencodingNacetyllysineinrecombinantproteinsNatChemBiol4232234、PolycarpoCRetalPyrrolysineanaloguesassubstratesforpyrrolysyltRNAsynthetaseFEBSLett58066956700。我々は、ユビキチン発現コンストラクトを作成した。このコンストラクトにおいて、ユビキチン遺伝子は6位にリジンコドンの代わりにTAGコドンを含有し、ユビキチン遺伝子には3’His6タグコード配列UbTAG6-His6が隣接している。我々は、MbPylRS/MbtRNACUA対及び12mMを含有する細胞中でUbTAG6-His6を発現することによって、UbBocK6-His66位に1を含有するユビキチン-his6を作製した。UbBocK6-His6の作製は、1の添加に厳密に依存する。UbBocK6-His6を、Ni-NTAクロマトグラフィーによって精製し、His6タグをユビキチンC末端ヒドロラーゼ-L3UCH-L3での処理によって除去して、UbBocK6を得た図2。次に、タグなしのUbBocK6をサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製し、脱塩し、凍結乾燥させた。精製した物質を、エレクトロスプレーイオン化質量分析ESI-MSによって特性決定した図3A。この操作により、培養物2Lから精製UbBocK6を17mg得た。Cbz基でUbBocK6中の6個のNε-Lysアミノ基及びN末端アミンを保護するために、我々は、タンパク質を、塩基性DMSO中で7当量のN-ベンジルオキシカルボニルオキシスクシンイミドCbz-OSuと反応させたKawakamiTetalPolypeptidesynthesisusinganexpressedpeptideasabuildingblockforcondensationwithapeptidethioesterapplicationtothesynthesisofphosphorylatedp21MaxproteinJPeptSci7474487。2時間の保護後図3A、エレクトロスプレーイオン化質量分析は、7又は8個のCbz基がUbBocK6に付加されていることを示している。7個のCbz基の付加は、UbBocK6中の全ての遊離アミノ基の保護に相当する。観察される追加のCbz基は、ユビキチン内の1つのヒスチジンhis68残基の部分保護に相当する可能性が高かった。この保護はその後の脱保護条件下で可逆的であるので、過剰保護は問題にならない。我々は、沈殿及び冷エーテルでの洗浄並びに風乾によって、Boc及びCbz保護ユビキチンを効率的に回収した。イソペプチド結合形成のために、所望に応じてK6の1つの遊離Nε-lysアミノ基を露出させるために、我々は、1に存在するBoc保護基を、水中のトリフルオロ酢酸TFAで除去し、Cbz保護をそのまま残した図3A。UbBocK6からのこのすぐ連結できる物質UbK6Cbz7-8の全収率は、約85であった。本発明の方法のステップbによるドナーユビキチンの調製前述のように、他のタンパク質この場合、ドナーユビキチンがリジン側鎖も示し、反応が別のタンパク質へのポリペプチド鎖の結合に関与する場合には、タンパク質上に存在するリジン側鎖を保護するのが有利である。この方法は、図1の左側によって、部分的に示されている。ドナーユビキチンUb1-76-チオエステルのクローニングそれぞれNdeI及びSapI制限部位を導入する順方向5’-GGTGGTCATATGCAGATCTTCGTCAAGACGTTAACC-3’プライマー及び逆方向5’-GGTGGTTGCTCTTCCGCACCCGCCACGCAGTCTTAAGACCAGATG-3’プライマーを用いて、Ub1-75を含有するプラスミドからユビキチン遺伝子をPCR増幅した。逆方向プライマーはまた、Gly76のコドンを挿入した。PCR産物を、NdeI制限酵素及びSapI制限酵素で二重消化し、同様に処理したpTXB1ベクターNEB社に連結して、pTXB1Ub176を作成した。ドナーユビキチンUb1-76-チオエステルの調製ER2566大腸菌細胞50μLNEB社をpTXB1Ub176で形質転換し、S.O.B.培地250μLで回収した。細胞を37°Cで1時間インキュベートし、次いで、回収した細胞200μLを、アンピシリン100μgmL-1を含有するLB培地100mLに接種し、培養物を37°Cにおいて振盪しながら230rpm終夜インキュベートした。終夜インキュベートした培養物60mLを、アンピシリン100μgmL-1を含有するLB培地2Lに接種し、37°Cで振盪しながら230rpmインキュベートした。OD600約0.4において、細胞を25°Cのインキュベーターに移し、30分後に細胞をIPTG0.5mMで誘導した。5時間後、細胞を収集し、溶解用緩衝液20mMNa2HPO4pH7.2、200mMNaCl、1mMEDTA60ml中に懸濁させ、凍結した。融解した細胞を、氷上で超音波処理することによって溶解させ、遠心分離39000×g、30分によって清澄化した。空のXK2620カラムにキチンビーズ20mLNEB社を充填し、溶解用緩衝液で平衡化した。4°Cにおいて、清澄化した溶解液を、AKTAFPLCシステムを用いてカラムにロードした流速0.5mLmin-1。次いで、カラムを溶解用緩衝液約400mLで洗浄し、切断用緩衝液20mMNa2HPOP4pH6、200mMNaCl、100mMMESNa、1mMEDTA60mLで平衡化させた。次いで、流れを止め、カラムを4°Cにおいて66時間インキュベートして、ユビキチンチオエステルUbSRを切断させた。切断されたUbSRを、溶出緩衝液20mMNa2HPO4pH6、200mMNaCl、1mMEDTAで溶出した。UbSRを含有する画分をSDS-PAGEによって決定し、次いでプールし、AmiconUltra15遠心濾過装置Millipore社で約5mLまで濃縮した。次いで、タンパク質を、Phenomenex250mm×10mm、C18、300Å、10μmカラムを用いて半分取RP-HPLCによってさらに精製した。10緩衝液Aから75緩衝液Bへの勾配を、30分にわたって5mLmin-1の流速で適用した緩衝液A=H2O中0.1TFA、緩衝液B=MeCN中10緩衝液A。ユビキチンチオエステルを含有する画分を、ESI-MSによって検証し、凍結乾燥させた。Cbz-OSuによるUb-MESチオエステルの全般的保護凍結乾燥UbSR10mg、1.15μmolをDMSO833μL中に溶解させ、続いてDIEA17μLを加えた。撹拌しながら、Cbz-OSu2.75mg、11.5μmolを反応生成物に加えた。反応生成物を、25°Cにおいて2時間撹拌し、次いで冷エーテル8.5mL中に移し、短時間ボルテックスした。沈殿物を遠心分離によって集め、エーテル層を廃棄した。ペレットを氷冷エーテル8.5mLで洗浄し、風乾した。結果ドナーユビキチン分子を、インテイン融合によるチオリシスChatterjeeCMcGintyRKPelloisJPMuirTWAuxiliarymediatedsitespecificpeptideubiquitylationAngewChemIntEdEngl4628142818によって生合成的にC末端チオエステルUbSRとして、培養物1L当たり6mgの精製収量で調製した図3B、オレンジ色。イソペプチド結合形成への、UbSR中の7個のリジン残基又はN末端アミンの関与を回避するために、我々は、UbBocK6に関して記載した条件を用いて、遊離アミンを8当量のCbz-OSuで保護した。エレクトロスプレーイオン化質量分析図3B、青色によって判断すると、保護は2時間以内に完了し、UbSRCbz8-9を得た。これをエーテル沈殿によって単離した。ドナー及びアクセプターユビキチン間における特異的なイソペプチド結合の形成UbK6Cbz7-82.1mg、220nmol及びUbSRCbz7-83.3mg、336nmolを、DMSO90μL中に溶解させた。DIEA4μL、H-OSu0.39mg、3.36μmol及びAgNO357μg、336nmolを加えた。反応生成物を、暗所で25°Cにおいて16時間インキュベートした。粗混合物を冷エーテル1mLで沈殿させ、冷エーテル1mLで洗浄し、風乾した。タンパク質を、55TFA、35DMS及び10TFMSAからなる氷冷カクテル5mg/mL中に溶解させた。0°Cで90分間撹拌後、タンパク質を、10倍容量の冷エーテルで、続いて0.5volピリジンで沈殿させた。重い沈殿物が形成され、これを冷エーテルで洗浄し、集め、乾燥させた。乾燥沈殿物を緩衝液100mMNa2HPO4pH7.4、8M尿素、500mMNaCl中に約0.5mg/mLのタンパク質濃度で溶解させ、3kDaMWCO膜SpectrumLabs社を用いて、同じ緩衝液1Lに対して終夜透析した。次いで、試料を新鮮な透析膜に移し、フォールディング用緩衝液20mMNa2HPO4pH7.4、100mMNaClに対して終夜透析した。タンパク質を、AmiconUltra153kDaMWCO遠心濾過装置Millipore社を用いてIEX緩衝液A酢酸アンモニウムpH4.5に緩衝液交換した。試料を濾過し0.45μM、AKTAFPLCシステムを用いて0.5mL/分の流速で、予め平衡化させたMonoS550GLカラムGELifeSciences社にロードした。流量を2mL/分まで増加させ、10分間にわたって60IEX緩衝液B酢酸アンモニウムpH4.5、1MNaClに達する勾配を適用した。画分0.5mLを集め、K6-結合ジユビキチンを含有する画分を、SDS-PAGEによって決定した。それらの画分をプールし、遠心濾過装置を用いて、再びIEX緩衝液Aに交換した。試料を、平衡化されたMonoSカラムに再適用し、2mL/分の流速で、45分にわたって60緩衝液Bに達する勾配を適用した。画分を1mLの容量で集め、純粋なK6-結合ジユビキチンを含有する画分をプールし、1mg/mLまで濃縮した200~300μg、収率5~8。次いで、K6-結合ジユビキチンを、DispoBiodialyzer5kDaMWCOTheNestGroupIncを用いて保存用緩衝液10mMTris-HClpH7.6に対して終夜透析した。K6-結合ジユビキチン試料を、保存のために-20°Cにおいて凍結させた。イソペプチド結合形成反応においてUbK29Cbz7-8を用いる以外は、K6-結合ジユビキチンに関して記載したようにして、K29-結合ジユビキチンの調製を実施した。結果チオエステルは、AgIの存在下におけるその場での活性化及びN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルへの転換が可能であり、アミンによる選択的アシル化を可能にするAimotoSPolypeptidesynthesisbythethioestermethodBiopolymers51247265、TanZShangSHalkinaTYuanYDanishefskySJTowardHomogeneousErythropoietinNonNCLBasedChemicalSynthesisoftheGlnArgGlycopeptideDomainJAmChemSoc13154245431。我々は、この化学反応を、UbK6Cbz7-8とUbSRCbz8-9との間の特異的イソペプチド結合の形成に適用できることに気付いた。我々は、DMSO中、DIEA、硝酸銀AgNO3、3.75mM及びN-ヒドロキシスクシンイミドH-OSu、37.5mMの存在下において、ドナーユビキチンチオエステルUbK6Cbz7-8をUbSRCbz8-9とモル比1:1.5で混合した図4A。室温で16時間後、粗連結反応生成物を沈殿させ、冷エーテルで洗浄した。SDS-PAGEによる分析により、ユビキチンモノマーUbK6Cbz7-8UbSRCbz8-9を含有するタンパク質バンドの約30が、Cbzで保護された連結生成物に相当するより高分子量の種に転換されていることが明らかである。Cbz基を除去するために、我々は、1:3:6のトリフルオロメタンスルホン酸TFMSA:トリフルオロ酢酸TFA:硫化ジメチルDMSからなる切断用カクテルを0°Cにおいて1時間使用したTamJPHeathWFMerrifieldRBMechanismsfortheremovalofbenzylprotectinggroupsinsyntheticpeptidesbytrifluoromethanesulfonicacidtrifluoroaceticaciddimethylsulfideJournaloftheAmericanChemicalSociety10852425251。脱保護されたユビキチン鎖を沈殿させ、洗浄し、8M尿素を含有するPBS緩衝液中に再懸濁させて、折り畳まれていないユビキチン鎖を形成した。ユビキチンは可逆的に折り畳め、酵素的に合成されたK48-及びK68-結合ユビキチン鎖はインビトロで変性物質から精製され、再び折り畳まれるPickartCMRaasiSControlledSynthesisofPolyubiquitinChainsMethodsinEnzymology3992136ので、我々が非定型のユビキチン鎖を再び折り畳めることは妥当であると思われた。したがって、我々は、タンパク質を、尿素を含まないPBS緩衝液中に透析して、結合ジユビキチンをゆっくり復元させた。その後の陽イオン交換により、残りのモノユビキチン種を除去でき、高純度のK6-結合ジユビキチンが得られた図4B、図5AB。K29-結合ユビキチンを合成するために、我々は、UbTAG6-His6の代わりに、29位にアンバーコドンが存在するUbTAG29-His6を用いる以外は、前記操作を単純に繰り返した。UbBocK29の調製の場合は、2Lの培養物から8mgの収量が得られた。K6-結合ジユビキチンの特性決定構造本発明による方法を用いて合成した精製K6-及びK29-結合ジユビキチンが、遺伝的に指示された部位においてイソペプチド結合を介して結合され、完全に脱保護されたことを実証するために、我々は、ESI-MS及びMS/MSシーケンシングを使用した。エレクトロスプレーイオン化方式のLCT飛行時間型質量分析計Micromass社でタンパク質の総質量を決定した。試料を、1蟻酸を含有する1:1のアセトニトリル/H2Oに溶解させた。Cbz保護ペプチドの場合には、試料を4:3:3の酢酸/アセトニトリル/H2Oに溶解させた。試料は10μlmin-1で注入し、較正は、ウマ心臓ミオグロビンを用いて正イオンモードで行った。30回の走査を平均し、MassLynxバージョン4.1Micromass社を用いて最大エントロピー解析maximumentropydeconvolutionによって分子質量を得た。Protparamhttpusexpasyorgtoolsprotparamhtmlを用いて野生型タンパク質の理論的質量を算出し、非天然アミノ酸含有タンパク質の理論的質量を手動で調整した。MS/MS分析のために、試料を、37°Cにおいてトリプシンで終夜消化した。次いで、試料を脱塩し、LTQOrbitrapMassSpectrometerThermoScientific社を用いてLC-MS/MSによって分析した。標的ペプチドを、衝突活性化解離法によって断片化した。ESI-MSは、精製タンパク質の単一の質量ピークを示している。このピークは、イソペプチド結合され、定量的に脱保護されたジユビキチンに相当する。K6-結合ジユビキチンの観測質量=17113Da、K29-結合ジユビキチンの観測質量=17111Da,ジユビキチンの計算質量=17112Da、図4C4D。イソペプチド結合がK6位及びK29位に形成されることを実証するために、我々は、結合ジユビキチンについてMS/MSシーケンシングを行った。これは、95を超えるフィデリティfidelityで、K6及びK29イソペプチド結合図4E及び4Fの特異的形成を検証する。我々は、X線結晶構造解析によって、K6-結合ジユビキチンの構造を解析することができた。K6ジユビキチンは、19~20のPEG3350、0.2M酢酸亜鉛に対して平衡化された懸滴中で、1~2mgmL-1のタンパク質濃度で立方の形態で結晶化した。窒素クリオ流cryostream中で凍結させる前に、結晶を、15PEG400を補充した母液中に浸漬した。最大結晶30μmを、EuropeanSynchrotronRadiationFacilityESRFにおいてビームラインID14-2で3Åまで回折した。初期位相は、K63ジユビキチン構造の登録座標depositedcoordinateからの1つのユビキチン部分を用いて分子置換によって得たpdb-id2JF5、KomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473。PHENIXを用いて構造精密化を行いAdamsPDetalPHENIXbuildingnewsoftwareforautomatedcrystallographicstructuredeterminationActaCrystallogrDBiolCrystallogr5819481954、COOT内でモデル構築を行ったAdamsPDetalPHENIXbuildingnewsoftwareforautomatedcrystallographicstructuredeterminationActaCrystallogrDBiolCrystallogr5819481954。最終回の精密化において、TLS温度因子精密化を行った。PHENIXにおける幾何学的重量最適化により、最低R/Rfree因子を有するモデルが得られた。データ収集及び精密化の統計値を、表1に示す。結晶を、20PEG3350及び200mMZnAcから成長させ、立方空間群cubicspacegroupP4332で形成し、3.0Åの解像度で回折した。K6-結合ジユビキチンの構造を、分子置換によって解析し、その後に精密化し精密化に関する統計値を表1に示す、非対称単位中の1つのK6-結合ジユビキチン分子が示された。各ユビキチンは天然のコンフォメーションを取り、GOPALにおける再折り畳みステップの成功を裏付けている。ESI及びMS/MSは、K6イソペプチド結合の形成を実証したが、電子密度図では柔軟なイソペプチド結合は十分に解像されず、Gly76は識別可能な電子密度を示してない。このことは、ポリユビキチン構造において、結合の柔軟性が高いために、以前に観察されている。K6-結合ジユビキチンの構造は、K6-結合ジユビキチンが前述のユビキチン鎖構造とは異なる非対称のコンパクトなコンフォメーションを取ることを明らかにしている図6a6e。近位ユビキチン部分アクセプターユビキチンから生じ、イソペプチド結合に寄与するLys6を含有するは、Ile44及びVal70を取り囲む疎水性表面を介して遠位ユビキチンC末端をイソペプチド結合に関与させるドナーユビキチンから生じるに結合する。Leu71、Ile36及びLeu8を含有する第2の異なる疎水性パッチ以下、Ile36パッチと称するは、遠位ユビキチン分子上で疎水性カウンターパートとして作用する。拡張された非対称界面が、コンパクトなジユビキチン分子をもたらす図6b。さらなる界面残基は、相互作用面に寄与する近位ユビキチン中のArg42、及び遠位ユビキチン中のGln49と水素結合を形成する近位ユビキチン中のThr9である図6c。K6ユビキチン-ユビキチン相互作用界面は、前述されていないいくつかの特徴を示す。Ile44-パッチは、ユビキチン結合ドメイン及び脱ユビキチン化酵素との相互作用の大部分において観察される、一般的なユビキチン相互作用界面であるDikicIWakatsukiSWaltersKJUbiquitinbindingdomainsfromstructurestofunctionsNatRevMolCellBiol10659671、KomanderDClagueMJUrbeSBreakingthechainsstructureandfunctionofthedeubiquitinasesNatRevMolCellBiol10550563。この相互作用において、パッチVal70及びLeu8は、中央のIle44残基に隣接し、拡張された疎水性界面を提供している図6d。K6-結合ジユビキチンにおいては、Ile44-パッチはこれより小さい。これは、Leu8がコンフォメーション変化を受けて、異なる、ほぼ垂直な界面に関与するためである。この新規界面はまた、Leu71及びIle36を含有し、それらは一緒になって、約480Å2の無極性表面を形成し我々はこれをIle36パッチと称する、近位分子のIle44/Val70残基と相互作用する。次に、この非対称相互作用は、遠位分子のIle44/Val70パッチを露出したまま、K6を介する鎖伸長のために又はユビキチン結合ドメインとの結合のために利用できる状態で残す図6b。我々は、1つの二量体の近位ユビキチン部分を第2の二量体の遠位ユビキチン上に反復して重ねてCootEmsleyPCowtanKCootmodelbuildingtoolsformoleculargraphicsActaCrystallogrDBiolCrystallogr6021262132において新しい遠位部分を生成することによって、非対称K6二量体からモデル六量体を構築することができた図6f。六量体中のユビキチン分子に立体的な衝突は観察されない。むしろ、PISAサーバーにおける分析によって明らかなように、n2ユビキチン分子とn-2ユビキチン分子との間すなわち、図5gのA-C及びC-Eの分子間の新規なより小さい相互作用約83Å2が促進される。より重要なことに、生成されるK6-六量体モデルは、5回対称らせんフィラメントに折り畳める図6g。6個の分子が、2回転のらせんを形成し、分子Aと分子Fは、相対的配向性が等しく、らせん軸に沿って62Åで翻訳される。この対称性は結晶又は格子の接触によっては生成されないので、我々のモデルは、K6-結合ユビキチン鎖が対称な生体分子を形成する可能性があることを示唆している。K6-K29-結合ユビキチンに対する脱ユビキチン化酵素のプロファイリングDUBの生成及び脱ユビキチン化酵素アッセイpRSETUCHL3プラスミドは、KeithDWilkinsonから惜しみなく寄贈されたものであり、これを用いて、以前に記載されたようにして純粋なUCH-L3を調製したLarsenCNPriceJSWilkinsonKDSubstratebindingandcatalysisbyubiquitinCterminalhydrolasesidentificationoftwoactivesiteresiduesBiochemistry3567356744。OTUB1発現ベクターは、BenediktKesslerOxfordによって快く提供されたものであり、タンパク質は、EdelmannMJetalStructuralbasisandspecificityofhumanotubain1mediateddeubiquitinationBiochemJ418379390に従って精製した。USP21は、SylvieUrbeLiverpoolによって快く提供されたプラスミドからクローン化した。残りの脱ユビキチン化酵素の精製については、KomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473に記載されている。USP2、USP15及びBAP1は、ENZOLifeSciences社又はBostonBiochem社から購入した。DUBアッセイは、以前に記載されたようにして行ったKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473。結果脱ユビキチン化酵素は、特定の鎖結合を優先し得るKomanderDClagueMJUrbeSBreakingthechainsstructureandfunctionofthedeubiquitinasesNatRevMolCellBiol10550563。しかし、大部分のユビキチン鎖型は合成されていないので、脱ユビキチン化酵素特異性プロファイリングは不完全である。遠位及び近位分子中に他のリジン残基をアルギニンに変異させる、K6-結合ジユビキチン分子とK29-結合ユビキチン分子との混合物が、OTUファミリーの脱ユビキチン化酵素、hOtu1及び2つのJAMM脱ユビキチン化酵素複合体による切断について調べられたWangTetalEvidenceforbidentatesubstratebindingasthebasisfortheK48linkagespecificityofotubain1JMolBiol38610111023、CooperEMetalK63specificdeubiquitinationbytwoJAMMMPNcomplexesBRISCassociatedBrcc36andproteasomalPoh1EMBOJ。これらの脱ユビキチン化酵素はいずれの鎖型も切断しないことがわかったが、変異したユビキチン鎖が天然の鎖の性質を反映するか否かは不明であるので、これらの実験は問題を含んでいる。脱ユビキチン化酵素は、特に遠位ユビキチン分子上の大きい表面積をカバーしKomanderDClagueMJUrbeSBreakingthechainsstructureandfunctionofthedeubiquitinasesNatRevMolCellBiol10550563、表面Lys残基のArgへの変異が、脱ユビキチン化酵素の結合を妨げる可能性がある。我々は、既知のヒト脱ユビキチン化酵素の約10に相当し、4つの脱ユビキチン化酵素ファミリー-ユビキチンC末端ヒドロラーゼUCH,ubiquitinCterminalhydrolase、ユビキチン特異的プロテアーゼUSP,ubiquitinspecificprotease、卵巣腫瘍OTU,ovariantumor脱ユビキチン化酵素及びJAMM/MPN脱ユビキチン化酵素-を包含する12種の脱ユビキチン化酵素を、インビトロ脱ユビキチン化酵素アッセイにおいてK6-及びK29-結合ジユビキチンを切断する能力について分析したKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473。対照実験において、我々は、同じアッセイを用いて、酵素的に構築したK63-結合ジユビキチンを切断した。UCH酵素は、ユビキチンのC末端からの小さい不定形のunstructuredペプチド例えば、His-タグ、図2の切断において高効率であり、又は不定形のタンパク質/ループからユビキチンを加水分解するが、天然のK63-、K48-及び直鎖状ユビキチン鎖は加水分解しないKomanderDClagueMJUrbeSBreakingthechainsstructureandfunctionofthedeubiquitinasesNatRevMolCellBiol10550563、PoppMWArtavanisTsakonasKPloeghHLSubstrateFilteringbytheActiveSiteCrossoverLoopinUCHL3RevealedbySortaggingandGainoffunctionMutationsJBiolChem28435933602。UCH-L3及びBAP1は、K6-及びK29-結合ジユビキチン分子を切断できなかった図7。このことは、これらの結合を有するユビキチンポリマーがこれらのUCH酵素の基質である可能性がないことを実証している。UCH酵素とは対照的に、USP脱ユビキチン化酵素は、ユビキチンポリマーの切断において高活性であるが、明らかな結合特異性がないことが多いKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473。例外は、腫瘍抑制因子CYLDであり、そのUSPドメインは、K48-結合よりK63-結合を優先するKomanderDetalThestructureoftheCYLDUSPdomainexplainsitsspecificityforLys63linkedpolyubiquitinandrevealsaBboxmoduleMolCell29451464。K6-結合ジユビキチンを用いて試験すると、4つのUSPドメインUSP2、USP5、USP15、USP21は、K63-結合鎖と同程度に効率的にこの鎖型を分解した図7。K29-結合ユビキチンは、USP5によって急速に切断されたが、K6-及びK63-結合ユビキチンよりも、USP2、USP15及びUSP21による加水分解に対してかなり高い抵抗性を示した。USP5は、乱雑なpromiscuousDUBであり、遊離ユビキチン鎖のC末端を特異的に認識しReyesTurcuFEetalTheubiquitinbindingdomainZnFUBPrecognizestheCterminaldiglycinemotifofunanchoredubiquitinCell12411971208、非付着性のユビキチン鎖を加水分解することによってユビキチンプールを補充する働きをするKomanderDClagueMJUrbeSBreakingthechainsstructureandfunctionofthedeubiquitinasesNatRevMolCellBiol10550563。これに対して、CYLDは、その好ましいK63-結合と比較して、K6-及びK29-結合に対して著しく低下した活性を示した。これは、CYLDが、K6-及びK29-結合並びにK48-結合よりも、K63-結合を優先することを実証している図7。OTUドメイン脱ユビキチン化酵素はポリユビキチン鎖を加水分解するが、いくつかのメンバーはK48-及びK63-結合間において顕著な選択性を示す。A20及びOTUB1は、K48-結合鎖に特異的であって、K63-結合鎖又は直鎖状鎖を加水分解しないKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473、WangTetalEvidenceforbidentatesubstratebindingasthebasisfortheK48linkagespecificityofotubain1JMolBiol38610111023が、TRABIDは、K63-結合特異的であるKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473、TranHHamadaFSchwarzRomondTBienzMTrabidanewpositiveregulatorofWntinducedtranscriptionwithpreferenceforbindingandcleavingK63linkedubiquitinchainsGenesDev22528542。試験したOTUドメインA20、TRABID、Cezanne及びOTUB1は、K6-結合ジユビキチンを切断せず、A20、Cezanne及びOTUB1はまた、それらがその優先する鎖型を完全に加水分解する濃度でK29-結合を切断しなかった図7が、より高い酵素濃度では、全ての結合に対してはっきりと認識できる活性が観察された。これは、以前に報告されたこれらの酵素に関する特異性を、K6-結合及びK29-結合に関する特異性に拡張する。興味深いことに、TRABIDは、K63-結合と比較して高くないにせよ類似の活性で、K29-結合を切断する。これは、この酵素が二重特異性を持つ、すなわち、K29及びK63結合をK48及びK6結合より優先することを示している。OTUドメインが結合のサブセットに対して本質的に特異的であるようであることを考慮すると、他のファミリーメンバーが、特に他の非定型のユビキチン鎖を切断し得る可能性がある。我々のアプローチの拡張により、これらの活性を発見できるはずである。JAMMドメイン脱ユビキチン化酵素もまた、K63-結合特異的であることが報告されておりCooperEMetalK63specificdeubiquitinationbytwoJAMMMPNcomplexesBRISCassociatedBrcc36andproteasomalPoh1EMBOJ、McCulloughJClagueMJUrbeSAMSHisanendosomeassociatedubiquitinisopeptidaseJCellBiol166487492、K63-結合を認識するための分子的基盤が、K63-結合ジユビキチンと複合したAMSHの最近の結晶構造において明らかになったSatoYetalStructuralbasisforspecificcleavageofLys63linkedpolyubiquitinchainsNature455358362。AMSHは、伸長されたK63-結合ジユビキチン分子と結合し、Lys63を取り囲む残基と特異的に接触する。我々は、AMSHはK6-及びK29-結合ジユビキチンに対して不活性であるが、同一反応条件下でK63-結合ジユビキチンを高い活性で切断することに気付いている。改変ユビキチン合成は、OTU脱ユビキチン化酵素のLys29-イソペプチド特異性を明らかにする。ユビキチン化は、無数の真核生物機能を調節する可逆的な翻訳後修飾である。ユビキチン化の効果を研究する我々の能力は、均一にユビキチン化されたタンパク質にアクセスしにくいことによって制限されることが多い。特に、ユビキチンポリマーの大部分を占める、いわゆる非定型のユビキチン鎖Lys48-又はLys63-結合ユビキチン以外の鎖の役割の解明は、それらの生合成のための酵素が知られていないため、難しい。ここで、我々は、遺伝子コードの拡張、インテインの化学反応及び化学選択的連結を組み合わせて、非定型のユビキチン鎖を合成する。我々は、構造的に特徴づけられたユビキチン鎖とは異なるLys6-結合ジユビキチンの結晶構造を解析して、この結合が調節し得る種々の生物学的機能の分子的基盤を提供する。さらに、我々は、Lys6-及びLys29-結合ユビキチンに対して、既知のヒト脱ユビキチン化酵素の10を含むパネルをプロファイリングし、TRABIDがLys29結合を、Lys63結合の40倍効率的に切断することを発見する。ユビキチン化は、可逆的な翻訳後修飾であり、アクセプタータンパク質中の特定のリジン残基がユビキチンドナーのC末端とイソペプチド結合を形成する。プロテアソーム標的化によるタンパク質安定性の調節におけるユビキチン化の役割は確立されており、一方、ユビキチンは、細胞シグナリング、細胞内輸送及びDNA損傷に対する応答を含む生物学のほぼすべての態様に関与することが明らかになりつつあるChenZJSunLJNonproteolyticfunctionsofubiquitinincellsignalingMolCell33275286、KomanderDTheemergingcomplexityofproteinubiquitinationBiochemSocTrans37937953。ユビキチンは、その7個のリジン残基Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48又はLys63の各々を介して又はそのN-末端を介して共有結合鎖を形成する。多様な生物学的プロセスにおいてユビキチンによって媒介される異なる機能は、種々のユビキチン鎖の異なる性質においてコードされる可能性があることが提唱されているKomanderDTheemergingcomplexityofproteinubiquitinationBiochemSocTrans37937953、IkedaFDikicIAtypicalubiquitinchainsnewmolecularsignalsProteinModificationsBeyondtheUsualSuspectsreviewseriesEMBORep9536542。プロテオミクス研究により、全ての鎖型がインビボで存在することが明らかにされているがPengJetalAproteomicsapproachtounderstandingproteinubiquitinationNatBiotechnol21921926、XuPetalQuantitativeproteomicsrevealsthefunctionofunconventionalubiquitinchainsinproteasomaldegradationCell137133145、我々が知っているのは、ほとんどが、プロテアソームの分解及び細胞シグナリングにおいてそれぞれ重要なLys48-結合鎖及びLys63-結合鎖についてであるChenZJSunLJNonproteolyticfunctionsofubiquitinincellsignalingMolCell33275286、HershkoACiechanoverATheubiquitinsystemAnnuRevBiochem67425479。その一方、他のいわゆる非定型の結合についてはほとんど知られていないが、それらが、モデル微生物サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeで見出されるユビキチン結合の過半数を占めるXuPetalQuantitativeproteomicsrevealsthefunctionofunconventionalubiquitinchainsinproteasomaldegradationCell137133145。特定のユビキチン鎖の役割研究における中心的な課題は、規定された結合を有する均一な鎖を合成することである。実際に、インビトロにおける特異的な生合成を可能にする細胞機構E1、特異的E2及びE3酵素の同定によるLys48-及びLys63-結合ユビキチンへのアクセスが、それらの生物学的役割の特性決定を可能にしたKomanderDTheemergingcomplexityofproteinubiquitinationBiochemSocTrans37937953。これらの鎖の構造は異なる特徴を示しており、それらは、種々の鎖を特異的な脱ユビキチン化酵素又はユビキチン結合ドメインによって認識する分子的基盤を提供できるKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473、DikicIWakatsukiSWaltersKJUbiquitinbindingdomainsfromstructurestofunctionsNatRevMolCellBiol10659671。さらに、均一な鎖へのアクセスは、結合特異的な抗体の生成を容易にしWangHetalAnalysisofnondegradativeproteinubiquitylationwithamonoclonalantibodyspecificforlysine63linkedpolyubiquitinProcNatlAcadSciUSA1052019720202、NewtonKetalUbiquitinchaineditingrevealedbypolyubiquitinlinkagespecificantibodiesCell134668678、特異的な鎖型の役割をインビボで究明することが可能になった。全般的に見れば、Lys48-及びLys63-結合ユビキチン鎖を合成できることにより、これらの鎖型が特異的に認識及び調節されて、異なる生物学的プロセスを媒介する仕組みについての我々の理解が大いに増し、我々は最近、Lys11-結合鎖の生合成を報告した。これは、この結合へのさらなる洞察を与えるはずであるChatterjeeCMcGintyRKPelloisJPMuirTWAuxiliarymediatedsitespecificpeptideubiquitylationAngewChemIntEdEngl4628142818。残念ながら、非定型のユビキチン結合の合成に必要な特異的酵素は全く知られておらず、これらの鎖型の構造及び機能を研究する我々の能力をひどく制限している。原理上は、化学的連結アプローチを使用して、ユビキチン鎖が合成される可能性もある。実際に、連結補助剤を含有するリジン誘導体が、隣接残基を変異させずにヒストンとユビキチンとの間に天然のイソペプチド結合を生成させるのに使用されているMcGintyRKimJChatterjeeCRoederRMuirTChemicallyubiquitylatedhistoneH2BstimulateshDot1LmediatedintranucleosomalmethylationNature、YangRPasunootiKLiFLiuXLiuCDualNativeChemicalLigationatLysineJournaloftheAmericanChemicalSociety。しかし、このストラテジーは、複数回の天然の化学的連結及び選択的脱保護を伴い、得られる物質量が少なく、標的タンパク質の末端に近い連結部位には最適である。イソペプチド結合を生じる他の連結補助剤も報告されているがAjishKumarKSHajYahyaMOlschewskiDLashuelHABrikAHighlyefficientandchemoselectivepeptideubiquitylationAngewChemIntEdEngl4880908094、LiXFeknerTOttesenJJChanMKApyrrolysineanalogueforsitespecificproteinubiquitinationAngewChemIntEdEngl4891849187、天然のイソペプチド結合を介するタンパク質全体の連結に対するそれらの有用性は、実証されていない。さらに、これらの補助剤は、一般に、ドナーユビキチンのC末端において、痕跡型nontracelessの連結反応を介して、グリシンのアラニンへの変異又はグリシンのシステインへの変異を引き起こすAjishKumarKSHajYahyaMOlschewskiDLashuelHABrikAHighlyefficientandchemoselectivepeptideubiquitylationAngewChemIntEdEngl4880908094、HodginsRREllisonKSEllisonMJExpressionofaubiquitinderivativethatconjugatestoproteinirreversiblyproducesphenotypesconsistentwithaubiquitindeficiencyJBiolChem26788078812。これらの変異は一部の研究にとっては重要でないと考えられるが、脱ユビキチン化酵素の作用を抑止することが知られておりTranHHamadaFSchwarzRomondTBienzMTrabidanewpositiveregulatorofWntinducedtranscriptionwithpreferenceforbindingandcleavingK63linkedubiquitinchainsGenesDev22528542、予測不可能な方法で結合の構造及び動態を変える可能性がある。ここで、我々は、特定のユビキチン鎖をその合成のための細胞機構がない場合に特定の鎖を合成できる、均一に連結されたユビキチン鎖の合成のための新しいアプローチを報告する。我々のアプローチは、我々がGOPAL遺伝的コード化直交性保護及び活性化連結と称する、遺伝子コードの拡張と化学選択的タンパク質化学反応との強力な組み合わせを使用する。我々は、酵母中のユビキチン結合の10及び3をそれぞれ構成するLys6-及びLys29-結合ユビキチン鎖の調製によってGOPALの普遍性を実証するXuPetalQuantitativeproteomicsrevealsthefunctionofunconventionalubiquitinchainsinproteasomaldegradationCell137133145。我々は、GOPALによって合成されるLys6-結合ジユビキチン分子の結晶構造を解析し、この分子が、Lys48-又はLys63-結合鎖の構造とは異なるコンパクトなコンフォメーションを取ることを明らかにする。さらに、Lys6-及びLys29-結合ジユビキチンへのアクセスにより、我々は、11種の脱ユビキチン化酵素ヒト脱ユビキチン化酵素の約10を構成するのパネルをこれらの結合を切断する能力に関してプロファイリングすることが可能になる。卵巣腫瘍OTUファミリー脱ユビキチン化酵素TRABIDは、Lys48-結合ユビキチンよりもLys63-結合ユビキチンに対して高い特異性を有することが以前に示されているがSrinivasanGJamesCMKrzyckiJAPyrrolysineencodedbyUAGinArchaeachargingofaUAGdecodingspecializedtRNAScience29614591462、我々は、定量的脱ユビキチン化酵素アッセイを用いて、TRABIDがLys29結合に対してLys63結合の40倍の特異性を有することを明らかにする。結果特異的なイソペプチド結合形成に対するストラテジー1つのユビキチンドナーのC末端と別のユビキチンアクセプターの特定のリジン残基のアミンとの間にイソペプチド結合を特異的に形成するには、これらの官能基を、両ユビキチン分子中の他のカルボン酸及びアミンと差別化することが必要である図8。我々は、特異的なイソペプチド結合の形成を、一連のステップで、iドナーユビキチン上の全てのリジン及びN末端並びにアクセプターユビキチン上の1つを除く全てのリジン及びN末端を保護して、アクセプターユビキチン上に1つの遊離アミンを生じるステップと、iiドナーユビキチンのC末端をチオエステルとして特異的に活性化するステップと、iii前記遊離アミンと前記チオエステルとを選択的にカップリングさせることによって、ドナーユビキチンとアクセプターユビキチンとの間に特異的なイソペプチド結合を形成するステップと、iv全ての保護基を除去して、ユビキチンコンジュゲートを露出させるステップと、vユビキチン鎖を再び折り畳むステップとによって達成できることに気付いた。このアプローチの普遍性を例証するために、我々は、ユビキチン二量体を、ドナーユビキチンのC末端とアクセプターユビキチン上のリジン残基のε-アミノ基Lys6又はLys29のいずれかとの特異的なイソペプチド結合によって結合させることを目指した。各ユビキチンが7個のリジン及びN末端アミノ基を含有するので、この系によって、我々のアプローチの特異性は厳しく試験される。ユビキチン連結前駆体の生成タンパク質中の1つを除く全てのリジン残基の保護には、化学的に同一のアミノ酸側鎖の差別化が必要である。実際に、1つの型の残基に特異的ないくつかの反応が知られているが、多くの化学的に同一の残基の存在下において1つの残基上でタンパク質を部位特異的に修飾することは難しい。この課題は、保護されたリジンの部位特異的取り込みを遺伝的にコードすることによって解決できることに、我々は気付いた。その後にタンパク質中の他の全てのアミンを、化学的に直交する保護基で保護し、遺伝的にコードされた保護基を特異的に除去することにより、保護リジンが遺伝的にコード化された部位に遊離アミンを有するリジンが得られるはずである図8。保護されたリジンをユビキチンの6位に部位特異的に設置するために、我々は、メタノサルシナバーケリMSピロリジンtRNAシンセターゼMbPylRSとその同族アンバーサプレッサーtRNAMbtRNACUAを利用したAmbrogellyAetalPyrrolysineisnothardwiredforcotranslationalinsertionatUAGcodonsProcNatlAcadSciUSA10431413146。この同族アンバーサプレッサーtRNAは、大腸菌中でアンバーコドンに応答して組換えタンパク質へのNε-t-ブチルオキシカルボニル-L-リジン1の効率的な取り込みを指示するNeumannHPeakChewSYChinJWGeneticallyencodingNacetyllysineinrecombinantproteinsNatChemBiol4232234、PolycarpoCRetalPyrrolysineanaloguesassubstratesforpyrrolysyltRNAsynthetaseFEBSLett58066956700、KawakamiTetalPolypeptidesynthesisusinganexpressedpeptideasabuildingblockforcondensationwithapeptidethioesterapplicationtothesynthesisofphosphorylatedp21MaxproteinJPeptSci7474487。我々は、ユビキチン発現コンストラクトを作製した。このコンストラクトにおいて、ユビキチン遺伝子は6位にリジンコドンの代わりにTAGコドンを含有し、ユビキチン遺伝子には3’His6タグコード配列が隣接しているUbTAG6-His6。我々は、MbPylRSとMbtRNACUAの対及び12mMを含有する細胞中でUbTAG6-His6を発現することによって、UbBocLys6-His66位に1を含有するユビキチン-His6を作製した。UbBocLys6-His6の作製は、1の添加に厳密に依存したデータは示さず。UbBocLys6-His6を、Ni-NTAクロマトグラフィーによって精製し、His6タグを、ユビキチンC末端ヒドロラーゼ-L3UCH-L3での処理によって除去して、UbBocLys6を得た補足図1。次に、タグなしのUbBocLys6をさらに、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、脱塩し、凍結乾燥させた。精製された物質を、ESI-MSによって特性決定した図9a。この操作により、2リットルの培養物から17mgの精製UbBocLys6を得た。Cbz基でUbBocLys6中の6個のNε-Lysアミノ基及びN末端アミンを保護するために、我々は、タンパク質を、塩基性DMSO中で7当量のN-ベンジルオキシカルボニルオキシスクシンイミドCbz-OSuと反応させたAimotoSPolypeptidesynthesisbythethioestermethodBiopolymers51247265。2時間の保護後図9a、ESI-MSを行い、7又は8個のCbz基がUbBocLys6に付加されていることが示された。7個のCbz基の付加は、UbBocLys6中の全ての遊離アミノ基の保護に相当する。観察される追加のCbz基は、ユビキチン内の1つのヒスチジンHis68残基の部分保護に相当する可能性が高かった。この保護はその後の脱保護条件下で可逆的であるので、過剰保護は問題にならない。我々は、沈殿及び冷エーテルでの洗浄並びに風乾によって、Boc-及びCbz-保護ユビキチンを効率的に回収した。Lys6において、イソペプチド結合形成に望ましい1つの遊離Nε-Lysアミノ基を露出させるために、我々は、水中でトリフルオロ酢酸TFAによって、1に存在するBoc保護基を除去し、Cbz保護を未変化のまま残した図9a。UbBocLys6からのこのすぐ連結できる物質UbLys6Cbz7-8の全収率は、約85であった。ドナーユビキチン分子を、インテイン融合のチオリシスMcGintyRKimJChatterjeeCRoederRMuirTChemicallyubiquitylatedhistoneH2BstimulateshDot1LmediatedintranucleosomalmethylationNatureによってC末端チオエステルUbSRとして、培養物1L当たり6mgの精製収量で生合成的に調製した図9b、オレンジ色及び補足図2。イソペプチド結合形成への、UbSR中の7個のリジン残基又はN末端アミンの関与を回避するために、我々は、UbBocLys6に関して記載した条件を用いて、遊離アミンを8当量のCbz-OSuで保護した。ESI-MS図9b、青色によって判断すると、保護は2時間以内に完了し、UbSRCbz8-9を得た。これをエーテル沈殿によって単離した。特異的な、酵素非依存的イソペプチド結合形成チオエステルは、AgIの存在下におけるその場での活性化及びN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルへの転換が可能であり、アミンによる選択的アシル化を可能にするTanZShangSHalkinaTYuanYDanishefskySJTowardHomogeneousErythropoietinNonNCLBasedChemicalSynthesisoftheGlnArgGlycopeptideDomainJAmChemSoc13154245431、TamJPHeathWFMerrifieldRBMechanismsfortheremovalofbenzylprotectinggroupsinsyntheticpeptidesbytrifluoromethanesulfonicacidtrifluoroaceticaciddimethylsulfideJournaloftheAmericanChemicalSociety10852425251。我々は、この化学反応を、UbLys6Cbz7-8とUbSRCbz8-9との間の特異的イソペプチド結合の形成に適用できることに気付いた。我々は、DMSO中で、N,N-ジイソプロピルエチルアミンDIEA、硝酸銀AgNO3、3.75mM及びN-ヒドロキシスクシンイミドH-OSu、37.5mMの存在下において、ドナーユビキチンチオエステルUbLys6Cbz7-8をUbSRCbz8-9とモル比1:1.5で混合した補足図2。室温で16時間後、粗連結反応生成物を沈殿させ、冷エーテルで洗浄した。SDS-PAGEによる分析により、ユビキチンモノマーUbLys6Cbz7-8UbSRCbz8-9を含有するタンパク質バンドの約30が、Cbzで保護された連結生成物に相当する、より高分子量の種に転換されていることが明らかになった補足図2。Cbz基を除去するために、我々は、1:3:6のトリフルオロメタンスルホン酸TFMSA/トリフルオロ酢酸TFA/DMSからなる切断用カクテルを0°Cにおいて1時間使用したPickartCMRaasiSControlledSynthesisofPolyubiquitinChainsMethodsinEnzymology3992136。脱保護されたユビキチン鎖を沈殿させ、洗浄し、8M尿素を含有するPBS緩衝液中に再懸濁させて、折り畳まれていないユビキチン鎖を形成した。ユビキチンは可逆的に折り畳まれ、酵素的に合成されたLys48-及びLys68-結合ユビキチン鎖はインビトロで変性物質から精製され、再び折り畳まれるKomanderDClagueMJUrbeSBreakingthechainsstructureandfunctionofthedeubiquitinasesNatRevMolCellBiol10550563ので、我々が非定型のユビキチン鎖を再び折り畳めることは妥当であると思われた。したがって、我々は、タンパク質を、尿素を含まないPBS緩衝液中に透析して、結合ジユビキチンをゆっくり復元させた。その後の陽イオン交換により、残りのモノユビキチン種を除去でき、高純度のLys6-結合ジユビキチンが得られた補足図2。Lys29-結合ユビキチンを合成するために、我々は、UbTAG6-His6の代わりに、29位にアンバーコドンが存在するUbTAG29-His6を用いる以外は、前記操作を単純に繰り返した。UbBocLys29の調製の場合は、2Lの培養物から8mgの収量が得られた。Lys29-結合ジユビキチンの生成におけるその後のステップは、Lys6-結合ジユビキチンの調製のために詳述したステップに匹敵する効率で進行した。Lys6-及びLys29-結合ジユビキチンの特性決定GOPALを用いて合成された精製Lys6-及びLys29-結合ジユビキチンが、遺伝的に指示された部位でイソペプチド結合を介して結合され、完全に脱保護されたことを実証するために、我々は、ESI-MS及びMS/MSシーケンシングを使用した。ESI-MSは、イソペプチド結合され、定量的に脱保護されたジユビキチンに相当する、精製タンパク質の単一質量ピークを示したLys6-結合ジユビキチン、観測質量=17,113Da;Lys29-結合ジユビキチン、観測質量=17,111Da;ジユビキチン計算質量=17,112Da;図9c、d。イソペプチド結合がLys6位及びLys29位で形成されることを実証するために、我々は、結合ジユビキチン分子について、MS/MSシーケンシングを行った。これは、Lys6及びLys29イソペプチド結合の特異的な形成図9e、fを、95を超える忠実度で検証する方法である。Lys6-結合ジユビキチンの結晶構造我々は、X線結晶構造解析によってLys6-結合ジユビキチンの構造を決定することができた。結晶を、20PEG3350及び200mMZnAcから成長させ、立方空間群P4332で形成し、3.0Åの解像度で回折した。Lys6-結合ジユビキチンの構造を、分子置換によって解析し、その後に精密化し統計値については補足表1を参照のこと、非対称単位中の1つのLys6-結合ジユビキチン分子が示された。各ユビキチンは天然のコンフォメーションを取り、再折り畳みステップの成功を裏付けている。ESI-MS及びMS/MSは、Lys6イソペプチド結合の形成を実証したが、電子密度図では柔軟なイソペプチド結合は十分に解像されず、Gly76は識別可能な電子密度を示してない。このことは、ポリユビキチン構造において、結合の柔軟性が高いために起こることが以前に観察されている補足図3a。Lys6-結合ジユビキチンの結晶構造は、前述のユビキチン鎖構造とは異なる非対称のコンパクトなコンフォメーションを示している図10。近位ユビキチン部分アクセプターユビキチンから生じ、イソペプチド結合に寄与するLys6を含有するは、Ile44及びVal70を取り囲む疎水性表面を介して遠位ユビキチンC末端がイソペプチド結合に寄与するドナーユビキチンから生じるに結合する。Leu71、Ile36及びLeu8を含有する第2の異なる疎水性パッチ以下、Ile36パッチと称するは、遠位ジユビキチン分子上で疎水性カウンターパートとして作用する。拡張された非対称界面が、コンパクトなジユビキチン分子をもたらす図10b、c。さらなる界面残基は、近位ユビキチン中のArg42及びGln49、並びに近位ユビキチン中のGln40及びThr9である。Thr9とGln49との間に水素結合が形成される図10d。Lys6ユビキチン-ユビキチン相互作用界面は、前述されていないいくつかの特徴を有する。Ile44を取り囲んでいる疎水性パッチは、ユビキチン結合ドメイン及び脱ユビキチン化酵素との相互作用の大部分において観察される、一般的なユビキチン相互作用界面であるDikicIWakatsukiSWaltersKJUbiquitinbindingdomainsfromstructurestofunctionsNatRevMolCellBiol10659671、EmsleyPCowtanKCootmodelbuildingtoolsformoleculargraphicsActaCrystallogrDBiolCrystallogr6021262132。この相互作用パッチにおいて、Val70及びLeu8は、中央のIle44残基に隣接し、拡張された疎水性界面を提供している図10e。Lys6-結合ジユビキチンにおいては、Ile44-パッチはこれより小さい。これは、Leu8がコンフォメーション変化を受けて、異なる、ほぼ垂直な界面に関与するためである。この新規界面はまた、Leu71及びIle36を含有し、それらは一緒になって、約480Å2の無極性表面Ile36パッチと称するを形成する。これが、近位分子のIle44及びVal70残基と相互作用する。次に、この非対称相互作用は、遠位分子のIle44及びVal70パッチを露出したまま、ユビキチン結合ドメインとの結合のために利用できる状態で残す図10b、10d。加えて、このジユビキチンモデルは、非対称界面を介する鎖伸長を可能にする。ジユビキチン構造に基づくより長いLys6-結合ユビキチン鎖の反復モデル化は、伸長されたLys6-結合ポリマーのらせんフィラメントの形成を示唆している補足図3。Lys6-結合ジユビキチンの構造は、以前に観察されたジユビキチンの構造とは異なり図10f、界面の両側にIle44表面を伴う対称相互作用を仮定する、最近示唆された計算モデルWangTetalEvidenceforbidentatesubstratebindingasthebasisfortheK48linkagespecificityofotubain1JMolBiol38610111023とも異なる。しかし、溶液中におけるポリユビキチン鎖の動的な性質のため、異なる界面及び/又はそれほどコンパクトでないコンフォメーションを取ることが可能である。Lys6-結合ポリユビキチンの構造的特徴をさらに理解するためには、核磁気共鳴による、単一分子レベルでの今後の研究が必要となる。Lys6-及びLys29-結合ユビキチンに対する脱ユビキチン化酵素のプロファイリング脱ユビキチン化酵素は、特定の鎖結合を優先し得るEmsleyPCowtanKCootmodelbuildingtoolsformoleculargraphicsActaCrystallogrDBiolCrystallogr6021262132。しかし、大部分のユビキチン鎖型は合成されていないので、脱ユビキチン化酵素特異性プロファイリングは不完全である。以前の研究では、遠位分子及び近位分子中に存在するさらなるリジン残基をアルギニンに変異させる、Lys6-結合ジユビキチン分子とLys29-結合ジユビキチン分子との混合物が、hOtu1、OTUファミリーの脱ユビキチン化酵素及び2つのJAMM/MPN脱ユビキチン化酵素複合体による切断について調べられたCooperEMetalK63specificdeubiquitinationbytwoJAMMMPNcomplexesBRISCassociatedBrcc36andproteasomalPoh1EMBOJ、PoppMWArtavanisTsakonasKPloeghHLSubstrateFilteringbytheActiveSiteCrossoverLoopinUCHL3RevealedbySortaggingandGainoffunctionMutationsJBiolChem28435933602。これらの脱ユビキチン化酵素はいずれの鎖型も切断しないことがわかったが、変異したユビキチン鎖が天然の鎖の性質を反映するか否かは不明であるので、これらの実験は問題を含んでいる。大部分の脱ユビキチン化酵素は、遠位ユビキチン分子と広範に相互作用しEmsleyPCowtanKCootmodelbuildingtoolsformoleculargraphicsActaCrystallogrDBiolCrystallogr6021262132、表面リジン残基のアルギニンへの変異が、脱ユビキチン化酵素の結合を妨げる可能性がある。我々は、既知のヒト脱ユビキチン化酵素の約10に相当し、4つの脱ユビキチン化酵素ファミリー-ユビキチンC末端ヒドロラーゼUCH、ユビキチン特異的プロテアーゼUSP、OTU脱ユビキチン化酵素及びJAMM/MPN脱ユビキチン化酵素-を包含する11種の脱ユビキチン化酵素を、インビトロ脱ユビキチン化酵素アッセイにおいてLys6-及びLys29-結合ジユビキチンを切断する能力について分析したKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473。対照実験において、我々は、同じアッセイを用いて、酵素的に構築したLys63-結合ジユビキチンを切断した。Lys63-、Lys48-若しくはLys11-結合又は直鎖状鎖に優先してLys6-又はLys29-ジユビキチンを切断する酵素を発見するために、我々は、酵素がこれらの以前に分析した鎖型のうち1つを効率的に切断する条件下でアッセイを行った。これらの条件下でLys6-又はLys29-結合ジユビキチンを切断しない酵素は、基質のレパートリー内にこれらの結合を有する可能性がない。しかし、Lys6-又はLys29-結合ジユビキチンがこれらの条件下で効率的な基質であるならば、酵素の基質特異性は、さらなる検討に値する。UCH酵素は、ユビキチンのC末端からの小さい不定形のペプチド例えば、Hisタグ、補足図1の切断又は不定形のタンパク質若しくはループからのユビキチンの加水分解において高効率であるが、天然のLys63-、Lys48-若しくはLys11-結合又は直鎖状ユビキチン鎖は加水分解しないChatterjeeCMcGintyRKPelloisJPMuirTWAuxiliarymediatedsitespecificpeptideubiquitylationAngewChemIntEdEngl4628142818、EmsleyPCowtanKCootmodelbuildingtoolsformoleculargraphicsActaCrystallogrDBiolCrystallogr6021262132、KomanderDetalThestructureoftheCYLDUSPdomainexplainsitsspecificityforLys63linkedpolyubiquitinandrevealsaBboxmoduleMolCell29451464。UCH-L3及びBAP1は、Lys6-及びLys29-結合ジユビキチン分子を切断できなかった図11及び補足図4。このことは、これらの結合を有するユビキチンポリマーがこれらのUCH酵素の基質である可能性がないことを裏付けている。UCH酵素とは対照的に、USP脱ユビキチン化酵素は、ユビキチンポリマーの切断において高活性であるが、明らかな結合特異性がないことが多いKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473。USP2は、Lys6-及びLys63-結合ジユビキチンをLys29-結合ジユビキチンよりも速く切断した図11並びに補足図5及び6。USP5は、乱雑な脱ユビキチン化酵素であり、遊離ユビキチン鎖のC末端を特異的に認識しReyesTurcuFEetalTheubiquitinbindingdomainZnFUBPrecognizestheCterminaldiglycinemotifofunanchoredubiquitinCell12411971208、非付着性のユビキチン鎖を加水分解することによってユビキチンプールを補充する働きをするEmsleyPCowtanKCootmodelbuildingtoolsformoleculargraphicsActaCrystallogrDBiolCrystallogr6021262132。USP5は、試験した全ての鎖型を急速に切断し、我々は、この酵素のアッセイにおいてほとんど識別を観察していない図11並びに補足図5及び6。同様に、USP21も試験全ての鎖型を急速に切断する図11並びに補足図5及び6。これに対して、腫瘍抑制因子CYLDは、そのUSPドメインが、Lys48結合よりLys63結合を優先することが知られおりMcCulloughJClagueMJUrbeSAMSHisanendosomeassociatedubiquitinisopeptidaseJCellBiol166487492、Lys6及びLys29結合に対してはほとんど又は全く活性を示さないが、その好ましいLys63結合を効率的に切断する。これは、CYLDが、Lys6及びLys29結合よりもLys63-結合ユビキチンを優先することを実証している図11。JAMMドメイン脱ユビキチン化酵素もまた、Lys63-結合特異的であることが報告されておりPoppMWArtavanisTsakonasKPloeghHLSubstrateFilteringbytheActiveSiteCrossoverLoopinUCHL3RevealedbySortaggingandGainoffunctionMutationsJBiolChem28435933602、SatoYetalStructuralbasisforspecificcleavageofLys63linkedpolyubiquitinchainsNature455358362、Lys63結合を認識するための分子的基盤が、Lys63-結合ジユビキチンと複合したAMSH-LPの最近の結晶構造において明らかになったWuBaerFLagrazonKYuanWBaerRTheBRCA1BARD1heterodimerassemblespolyubiquitinchainsthroughanunconventionallinkageinvolvinglysineresidueK6ofubiquitinJBiolChem2783474334746。AMSHは、伸長されたLys63-結合ジユビキチン分子と結合し、Lys63を取り囲む残基と特異的に接触する。我々は、AMSHはLys6-及びLys29-結合ジユビキチンに対して不活性であるが、同一反応条件下でLys63-結合ジユビキチンを高い活性で切断することに気付いている。OTUドメイン脱ユビキチン化酵素はポリユビキチン鎖を加水分解するが、いくつかのメンバーはLys48結合及びLys63結合間において顕著な選択性を示す。A20及びOTUB1は、Lys48-結合鎖に特異的であって、Lys63-結合鎖又は直鎖状鎖を加水分解しないKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473、CooperEMetalK63specificdeubiquitinationbytwoJAMMMPNcomplexesBRISCassociatedBrcc36andproteasomalPoh1EMBOJが、TRABIDは、Lys63結合を優先するKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473、SrinivasanGJamesCMKrzyckiJAPyrrolysineencodedbyUAGinArchaeachargingofaUAGdecodingspecializedtRNAScience29614591462。同様に、Cezanneは、Lys48及びLys63結合よりもLys11結合を優先するChatterjeeCMcGintyRKPelloisJPMuirTWAuxiliarymediatedsitespecificpeptideubiquitylationAngewChemIntEdEngl4628142818。試験したOTUドメインA20、TRABID、Cezanne及びOTUB1は、Lys6-結合ジユビキチンを切断せず、A20、Cezanne及びOTUB1はまた、これらの酵素がその優先する鎖型を完全に加水分解するアッセイ条件下Lys29-結合を切断しなかった図11。これは、以前に報告されたこれらの酵素の特異性を、Lys6結合及びLys29結合に関して拡張する。我々の定性的測定図11は、TRABIDが、Lys63結合よりもLys29結合を急速に切断することを示した。TRABIDによるユビキチン鎖加水分解の動態TRABIDの特異性をより定量的に検討するために、我々は、定量的脱ユビキチン化酵素アッセイを開発した。以前の研究は一般に、種々の酵素濃度での一定濃度のジユビキチンの切断NishikawaHetalBRCA1associatedprotein1interfereswithBRCA1BARD1RINGheterodimeractivityCancerRes69111119、又は時間の関数としての高濃度のユビキチン鎖の切断VenkitaramanARCancersusceptibilityandthefunctionsofBRCA1andBRCA2Cell108171182を追跡している。これらの実験は、特異性の定性的な基準を提供するが、定量的な動態パラメーターの抽出には適合しない。ジユビキチンに関する動力学的パラメーターの抽出方法は報告されているが、ユビキチン鎖の125I標識を必要とするAlHakimAKetalControlofAMPKrelatedkinasesbyUSP9XandatypicalLysLyslinkedpolyubiquitinchainsBiochemJ411249260、ChastagnerPIsraelABrouCItchAIP4mediatesDeltexdegradationthroughtheformationofK29linkedpolyubiquitinchainsEMBORep711471153。TRABIDの特異性を特性決定するために、Lys63-及びLys29-結合ジユビキチンの切断後に、我々は、各基質に対してTRABIDのKm未満の基質濃度で定量的ウェスタンブロット法を行った図12及び補足図7。我々は、Lys63-結合ジユビキチンのTRABID切断のkcat及びKmを独立して、蛍光標識Lys63-結合ジユビキチンの異方性の変化を用いて初速度法によって決定した。Lys29-結合ジユビキチンのTRABIDの切断のKmは、競合実験によって得られる。補足的方法及び補足図8を参照のこと。このアプローチにより、我々は、Lys63-結合ジユビキチンのTRABID切断に関する特異性定数kcat/Kmを2.5±0.4×103M-1s-1蛍光異方性によって独立して得られたもの、1.7±2.0×103M-1s-1に匹敵すると、Lys29-結合ジユビキチンのTRABID切断に関する特異性定数を1.0±0.2×105M-1s-1と決定できた。これらのデータは、Lys29-結合ジユビキチンが、Lys63-結合ジユビキチンより40倍良好な、TRABIDの基質であることを実証し、Lys29-結合ユビキチンがインビボでTRABIDの好ましい基質であり得ることを示唆している。TRABID以外のOTUドメイン含有タンパク質が結合のサブセットに本質的に特異的であるようであることを考慮すると、他のファミリーメンバーが、Lys6-結合鎖を含む他の非定型のユビキチン鎖を特異的に切断し得る可能性もある。我々のアプローチの拡張により、これらの活性を発見できるはずである。実施例6に関する考察我々は、GOPAL、遺伝子コードの拡張と化学選択的化学反応との強力な組み合わせを用いて、特異的なイソペプチド結合によって結合されるタンパク質を合成できることを実証した。我々は、この方法を用いてLys6-及びLys29-結合ジユビキチンを合成し、Lys6-結合ジユビキチンの構造的特性決定及びLys6-及びLys29-結合ユビキチン切断特異性に関する脱ユビキチン化酵素のプロファイリングを初めて可能にした。総合すれば、これらの脱ユビキチン化酵素アッセイは、Lys6-及びLys29-結合ジユビキチンが、USPファミリー脱ユビキチン化酵素によって認識され、効率的に加水分解されることを実証している。これらのデータは、脱ユビキチン化酵素特異性の特性決定を拡張し、他のこれまで合成可能な結合例えば、OTUB1、A20よりもLys48に特異的な脱ユビキチン化酵素が、Lys6-及びLys29-結合ジユビキチンに関してこの特異性を保持することを実証している。しかし、我々は今回、TRABIDは、Lys63-結合ユビキチンよりもLys29-結合ユビキチンに対して40倍活性であるが、Lys6結合に対しては不活性であることを明らかにしている。これは、Wntシグナリングなどの生物学的経路におけるLys29結合の役割の研究に弾みを与えるSrinivasanGJamesCMKrzyckiJAPyrrolysineencodedbyUAGinArchaeachargingofaUAGdecodingspecializedtRNAScience29614591462。TRABIDがLys29-修飾基質を有するかどうかについて分析することは、興味深い。OTUドメインに加えて、TRABIDはまた、Lys63-結合及び直鎖状ユビキチン鎖に結合する3つのN末端Npl4-型ZnFNZFドメインを含有するKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473。NZFドメインはまた、インビボで、Lys29-結合鎖と結合するか、又はLys63結合とのTRABID相互作用を調節することが可能である。全般的に見れば、脱ユビキチン化酵素プロファイリングからの観察は、脱ユビキチン化酵素の特異性が本質的に高いという見解を裏づけている。Lys6-及びLys29-結合ジユビキチンは、これらの結合に対するさらなる脱ユビキチン化酵素を特定するのに重要なツールとなる。Lys6-及びLys29-結合ユビキチン鎖へのアクセスにより、我々は、それらの細胞内役割をさらに理解するためにこれらの新しい結合に対する抗体を生成するWangHetalAnalysisofnondegradativeproteinubiquitylationwithamonoclonalantibodyspecificforlysine63linkedpolyubiquitinProcNatlAcadSciUSA1052019720202、NewtonKetalUbiquitinchaineditingrevealedbypolyubiquitinlinkagespecificantibodiesCell134668678ことが可能になると考えられる。種々のユビキチン鎖を識別する特異的なユビキチン結合ドメインUBDは記載されているDikicIWakatsukiSWaltersKJUbiquitinbindingdomainsfromstructurestofunctionsNatRevMolCellBiol10659671。Lys6及びLys29結合を合成できることにより、これらの結合を特異的に認識できるUBDの発見が促進されるはずである。Lys6-結合ジユビキチンの結晶構造は、近位ユビキチン部分と遠位ユビキチン部分が異なった残基を介して相互作用する新しいコンパクトな非対称のコンフォメーションを明らかにしている図10。このコンフォメーションは、結合ユビキチン分子のIle44パッチが互いに相互作用する、Lys48-結合ユビキチンのコンパクトな対称のコンフォメーションとは異なりHermansonGTBioconjugateTechniques2nded図10f、Ile44領域に関与しない、Lys11-結合ジユビキチンのコンパクトな非対称のコンフォメーションとも異なるChatterjeeCMcGintyRKPelloisJPMuirTWAuxiliarymediatedsitespecificpeptideubiquitylationAngewChemIntEdEngl4628142818。Lys6-結合ジユビキチンの結晶構造は、個々のユビキチン分子間に相互作用がない開いたコンフォメーションを取る、Lys63-結合又は直鎖状ユビキチン鎖の結晶構造とも異なるKomanderDetalMoleculardiscriminationofstructurallyequivalentLys63linkedandlinearpolyubiquitinchainsEMBORep10466473図10f。しかし、この結晶構造は動的なジユビキチン分子の静的画像を示し、Lys6結合は、他の結合NeumannHetalAmethodforgeneticallyinstallingsitespecificacetylationinrecombinanthistonesdefinestheeffectsofH3K56acetylationMolCell36153163と同様に、溶液中でさらなるコンフォメーションを取り得る。それでも、Lys6-結合ユビキチン鎖の独特な構造によって、細胞におけるこの結合型の、提唱されている独特の生物学的機能が説明され得るLarsenCNPriceJSWilkinsonKDSubstratebindingandcatalysisbyubiquitinCterminalhydrolasesidentificationoftwoactivesiteresiduesBiochemistry3567356744、EdelmannMJetalStructuralbasisandspecificityofhumanotubain1mediateddeubiquitinationBiochemJ418379390。GOPALは、SUMO化及びNEDD化されたタンパク質標的を含む、他のイソペプチド-結合タンパク質の合成に適用し得るが、この方法は、現在の形態では、タンパク質が可逆的に再折り畳まれ得ることを必要とする。より広く見れば、保護アミノ酸の部位特異的コード化、他に存在するアミノ酸の化学的保護及びコード化された保護アミノ酸の脱保護によってタンパク質中の化学的に同一の残基を差別化するストラテジーにより、長年にわたって開発されてきた、タンパク質及びペプチドの化学の一連の残基選択的及び化学選択的反応AdamsPDetalPHENIXbuildingnewsoftwareforautomatedcrystallographicstructuredeterminationActaCrystallogrDBiolCrystallogr5819481954を、部位選択的タンパク質修飾に応用できるようになる。この方法は、遺伝的コード化を使用して修飾又は連結の部位を規定するので、それは、タンパク質中の任意の部位の修飾に適用できる。方法Cbz-OsuによるUbBocLys6及びUbBocLys29の全般的保護。凍結乾燥UbBocLys620mg、2.3μmolをDMSO1.7ml中に溶解させ、DIEA67μlを加えた。混合物を撹拌しながら、Cbz-OSu4.81mg、19.3μmolを反応生成物に加えた。25°Cにおいて2時間攪拌後、反応生成物を冷エーテル17mlに移し、短時間ボルテックスした。遠心分離によって沈殿物を集め、エーテル層を廃棄した。ペレットを氷冷エーテル17mlで洗浄し、次いで風乾した。UbBocLys29については、UbBocLys29-His6の発現収率の低下を考慮してこの操作と以後の操作を案分して繰り返した。Boc保護基の除去。UbBocLys610mgから得られた、乾燥全般的保護ペプチド、UbBocLys6Cbz7-8を冷9:6TFA:H2O1.28ml中に溶解させ、4°Cにおいて90分間インキュベートした。次いで、選択的に脱保護されたペプチドを沈殿させ、氷冷エーテル2×13mlで洗浄した。水層及びエーテル層を除去し、ペプチドを風乾させた。Cbz-OSuによるUb-MESチオエステルの全般的保護。凍結乾燥UbSR10mg、1.15μmolをDMSO833μl中に溶解させ、DIEA17μlを加えた。混合物を撹拌しながら、Cbz-OSu2.75mg、11.5μmolを反応生成物に加えた。反応生成物を、25°Cにおいて2時間撹拌し、次いで冷エーテル8.5ml中に移し、短時間ボルテックスした。沈殿物を遠心分離によって集め、エーテル層を廃棄した。ペレットを氷冷エーテル8.5mlで洗浄し、風乾した。特異的なイソペプチド結合形成。UbLys6Cbz7-82.1mg、220nmol及びUbSRCbz7-83.3mg、336nmolを、DMSO90μl中に溶解させた。DIEA4μl、H-OSu0.39mg、3.36μmol及びAgNO357μg、336nmolを加えた。反応生成物を、暗所で25°Cにおいて16時間インキュベートした。粗混合物を冷エーテル1mlで沈殿させ、冷エーテル1mlで洗浄し、風乾した。タンパク質を、55TFA、35DMS及び10TFMSAからなる氷冷カクテル5mgml-1に溶解させた。0°Cで90分間撹拌後、タンパク質を、10倍容量の冷エーテル及び0.5v/vピリジンで沈殿させた。重い沈殿物が形成され、これを冷エーテルで洗浄し、集め、乾燥させた。乾燥沈殿物を緩衝液100mMNa2HPO4pH7.4、8M尿素、500mMNaCl中に約0.5mgml-1のタンパク質濃度で溶解させ、3kDaMWCO膜SpectrumLabs社を用いて、同じ緩衝液1リットルに対して終夜透析した。次いで、試料を新鮮な透析膜に移し、フォールディング用緩衝液20mMNa2HPO4pH7.4、100mMNaClに対して終夜を透析した。タンパク質を、AmiconUltra153kDaMWCO遠心濾過装置Millipore社を用いてIEX緩衝液A酢酸アンモニウム、pH4.5に緩衝液交換した。試料を濾過し0.45μM、AKTAFPLCシステムを用いて0.5mlmin-1の流速で、予め平衡化させたMonoS550GLカラムGELifeSciences社にロードした。流量を2mLmin-1まで増加させ、10分間にわたって60IEX緩衝液B酢酸アンモニウムpH4.5、1MNaClに達する勾配を適用した。画分0.5mLを集め、Lys6-結合ジユビキチンを含有する画分を、SDS-PAGEによって決定した。それらの画分をプールし、遠心濾過装置を用いて、再びIEX緩衝液Aに交換した。試料を、平衡化されたMonoSカラムに再適用し、2mlmin-1の流速で、45分にわたって60緩衝液Bに達する勾配を適用した。画分を1mlの容量で集め、純粋なLys6-結合ジユビキチンを含有する画分をプールし、1mgmin-1まで濃縮した200~300μg、収率5~8。次いで、Lys6-結合ジユビキチンを、DispoBiodialyzer5kDaMWCOTheNestGroupIncを用いて保存用緩衝液10mMTris-HCl、pH7.6に対して終夜透析した。Lys6-結合ジユビキチン試料を、保存のために-20°Cにおいて凍結させた。イソペプチド結合形成反応においてUbLys29Cbz7-8を用いる以外は、Lys6-結合ジユビキチンに関して記載したようにして、Lys29-結合ジユビキチンの調製を実施した。他の方法。アクセプターユビキチンUbTAG6-His6及びUbTAG29-His6のクローニング、ドナーユビキチンUbl-76-チオエステルのクローニング、ドナーユビキチンUbl-76-チオエステルの調製、脱ユビキチン化酵素生成及びLys63二量体生成、並びにアクセプターユビキチンUbBocLys6及びUbBocLys29の調製のための詳細な方法は、補足的方法中に見出すことができる。これは、銀染色と定量的ウェスタンブロット並びに動態データを分析するための分析操作を用いる、定性的及び定量的脱ユビキチン化酵素アッセイであることができる。UbLys62結晶化、構造の決定及び精密化並びにタンパク質の質量分析のための方法も同様に、補足的方法中に見出すことができる。"