"コリスメートピルベートリアーゼChorismatepyruvatelyase活性を有する酵素をコードする遺伝子、及び4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。コリスメートピルベートリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、エシェリキアコリEscherichiacoli由来の遺伝子、シュードモナスプチダPseudomonasputida由来の遺伝子、アシネトバクターバウマンニAcinetobacterbaumannii由来の遺伝子、アゾトバクタービネランジーAzotobactervinelandii由来の遺伝子、クロモハロバクターサレキシゲンスChromohalobactersalexigens由来の遺伝子、シトロバクターコセリCitrobacterkoseri、シトロバクターヤンガエCitrobacteryoungaeのようなシトロバクター属細菌由来の遺伝子、エンテロバクタークロアカエEnterobactercloacae由来の遺伝子、マリノバクターアクアエオレイMarinobacteraquaeolei由来の遺伝子、マリノモナスメディテラネアMarinomonasmediterranea由来の遺伝子、パントエアアナナティスPantoeaananatis由来の遺伝子、シュードアルテロモナスハロプランクティスPseudoalteromonashaloplanktis由来の遺伝子、ラルストニアユートロファRalstoniaeutropha由来の遺伝子、シューワネラプトレファシェンスShewanellaputrefaciens由来の遺伝子、又はチオバチルスデニトリフィカンスThiobacillusdenitrificansである請求項1に記載の形質転換体。4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、バチラスサブチリスBacillussubtilis由来の遺伝子、バチラスアトロファエウス由来の遺伝子、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ由来の遺伝子、シトロバクターコセリ由来の遺伝子、エンテロバクターアエロゲネス由来の遺伝子、エンテロバクタークロアカエ由来の遺伝子、エンテロバクターホルメシェイ由来の遺伝子、エンテロバクターサカザキ由来の遺伝子、エシェリヒアコリ由来の遺伝子、エシェリヒアフェルグニソー由来の遺伝子、パエニバチラスポリミキサ由来の遺伝子、又はパントエアアナナティス由来の遺伝子である請求項1に記載の形質転換体。コリスメートピルベートリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の又はのDNAである請求項1に記載の形質転換体。配列番号31、配列番号34、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、又は配列番号93の塩基配列からなるDNAの何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつコリスメートピルベートリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の又はのDNAである請求項1に記載の形質転換体。配列番号37、配列番号44、配列番号47、配列番号50、配列番号53、配列番号56、配列番号59、配列番号62、配列番号65、配列番号68、配列番号71、又は配列番号74の塩基配列からなるDNAの何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつコリスメートピルベートリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在する4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項1~5の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項1~6の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネ型細菌内でDAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase活性を有する酵素をコードする遺伝子が高発現している請求項1~7の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウムグルタミカムである請求項1~8の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869である請求項1~5の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項1~5の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項1~5の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869において、DAHPシンテターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が高発現しているものである請求項1~5の何れかに記載の形質転換体。コリネバクテリウムグルタミカムPHE18受託番号:NITEBP-995、PHE11、PHE12、PHE13、PHE14、PHE15、PHE16、PHE17、PHE191、PHE192、PHE193、PHE194、PHE195、PHE196、PHE197、PHE198、PHE199、PHE1910、PHE1911、PHE1912、PHE201、PHE202、PHE203、PHE204、PHE205、PHE206、PHE207、PHE208、PHE209、PHE2010、PHE2011、PHE2012、PHE2013、又はPHE2014の形質転換体。請求項1~14の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない請求項15に記載のフェノールの製造方法。還元条件下の反応液の酸化還元電位が-200~-500ミリボルトである請求項15又は16に記載のフェノールの製造方法。糖類がグルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロース、及びマンニトールからなる群より選ばれるものである請求項15~17の何れかに記載のフェノールの製造方法。本発明は、糖類を原料として効率よくフェノールを製造できる微生物、及び糖類を原料として効率よくフェノールを製造できる方法を提供することを課題とする。上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。コリネ型細菌にコリスメート-ピルベートリアーゼ遺伝子、及び4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子を導入した形質転換体は、効率よくフェノールを生産できる。この形質転換体において、宿主のコリネ型細菌の染色体上に存在する4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ遺伝子が破壊又は欠損しているときは、一層効率よくフェノールを生産できる。この形質転換体において、3デオキシDアラビノ-ヘプツロソネート7ホスフェートシンテターゼ遺伝子が、形質転換前の宿主の遺伝子発現レベルに比べて高発現しているときは、一層効率よくフェノールを生産できる。この形質転換体は、還元条件下の反応液中で実質的に増殖しない状態で反応させる場合、特に、フェノール生産効率が高い。本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体及びフェノールの製造方法を提供する。項1.コリスメートピルベートリアーゼChorismatepyruvatelyase活性を有する酵素をコードする遺伝子、及び4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。項2.コリスメートピルベートリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、エシェリキアコリEscherichiacoli由来の遺伝子、シュードモナスプチダPseudomonasputida由来の遺伝子、アシネトバクターバウマンニAcinetobacterbaumannii由来の遺伝子、アゾトバクタービネランジーAzotobactervinelandii由来の遺伝子、クロモハロバクターサレキシゲンスChromohalobactersalexigens由来の遺伝子、シトロバクターコセリCitrobacterkoseri、シトロバクターヤンガエCitrobacteryoungaeのようなシトロバクター属細菌由来の遺伝子、エンテロバクタークロアカエEnterobactercloacae由来の遺伝子、マリノバクターアクアエオレイMarinobacteraquaeolei由来の遺伝子、マリノモナスメディテラネアMarinomonasmediterranea由来の遺伝子、パントエアアナナティスPantoeaananatis由来の遺伝子、シュードアルテロモナスハロプランクティスPseudoalteromonashaloplanktis由来の遺伝子、ラルストニアユートロファRalstoniaeutropha由来の遺伝子、シューワネラプトレファシェンスShewanellaputrefaciens由来の遺伝子、又はチオバチルスデニトリフィカンスThiobacillusdenitrificansである項1に記載の形質転換体。項3.4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、バチラスサブチリスBacillussubtilis由来の遺伝子、バチラスアトロファエウス由来の遺伝子、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ由来の遺伝子、シトロバクターコセリ由来の遺伝子、エンテロバクターアエロゲネス由来の遺伝子、エンテロバクタークロアカエ由来の遺伝子、エンテロバクターホルメシェイ由来の遺伝子、エンテロバクターサカザキ由来の遺伝子、エシェリヒアコリ由来の遺伝子、エシェリヒアフェルグニソー由来の遺伝子、パエニバチラスポリミキサ由来の遺伝子、又はパントエアアナナティス由来の遺伝子である項1に記載の形質転換体。項4.コリスメートピルベートリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の又はのDNAである項1に記載の形質転換体。配列番号31、配列番号34、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、又は配列番号93の塩基配列からなるDNAの何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつコリスメートピルベートリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA項5.4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の又はのDNAである項1に記載の形質転換体。配列番号37、配列番号44、配列番号47、配列番号50、配列番号53、配列番号56、配列番号59、配列番号62、配列番号65、配列番号68、配列番号71、又は配列番号74の塩基配列からなるDNAの何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつコリスメートピルベートリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA項6.宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在する4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項1~5の何れかに記載の形質転換体。項7.宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項1~6の何れかに記載の形質転換体。項8.宿主のコリネ型細菌内でDAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase活性を有する酵素をコードする遺伝子が高発現している項1~7の何れかに記載の形質転換体。項9.宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウムグルタミカムである項1~8の何れかに記載の形質転換体。項10.宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869である項1~5の何れかに記載の形質転換体。項11.宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項1~5の何れかに記載の形質転換体。項12.宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項1~5の何れかに記載の形質転換体。項13.宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869において、DAHPシンテターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が高発現しているものである項1~5の何れかに記載の形質転換体。項14.コリネバクテリウムグルタミカムPHE18受託番号:NITEBP-995、PHE11、PHE12、PHE13、PHE14、PHE15、PHE16、PHE17、PHE191、PHE192、PHE193、PHE194、PHE195、PHE196、PHE197、PHE198、PHE199、PHE1910、PHE1911、PHE1912、PHE201、PHE202、PHE203、PHE204、PHE205、PHE206、PHE207、PHE208、PHE209、PHE2010、PHE2011、PHE2012、PHE2013、又はPHE2014の形質転換体。項15.項1~14の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。項16.反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項15に記載のフェノールの製造方法。項17.還元条件下の反応液の酸化還元電位が-200~-500ミリボルトである項15又は16に記載のフェノールの製造方法。項18.糖類がグルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロース、及びマンニトールからなる群より選ばれるものである項15~17の何れかに記載のフェノールの製造方法。本発明の形質転換体を用いることにより、糖類からフェノールを高効率で製造することができる。一般に微生物はフェノールのような溶剤の細胞毒性により生育が阻害されるため、微生物を用いてフェノールを製造することは困難であったが、本発明方法によれば、微生物を用いて、実用上十分に効率良くフェノールを製造することができる。以下、本発明を詳細に説明する。Iフェノール生産能を有する形質転換体本発明のフェノール生産能を有する形質転換体は、コリスメートピルベートリアーゼChorismatepyruvatelyase活性を有する酵素をコードする遺伝子、及び4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された形質転換体である。宿主コリネ型細菌とは、バージーズマニュアルデターミネイティブバクテリオロジーBergeysManualofDeterminativeBacteriology、Vol8、5991974に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウムグルタミカム、コリネバクテリウムエフィシェンスCorynebacteriumefficiens、コリネバクテリウムアンモニアゲネスCorynebacteriumammoniagenes、コリネバクテリウムハロトレランスCorynebacteriumhalotolerance、コリネバクテリウムアルカノリティカムCorynebacteriumalkanolyticum等が挙げられる。中でも、安全でかつフェノール生産性が高い点で、コリネバクテリウムグルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumR株FERMP18976、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ233FERMBP1497、MJ233AB41FERMBP1498等が挙げられる。中でも、R株FERMP18976、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウムフラバムBrevibacteriumflavum、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentum、ブレビバクテリウムディバリカタムBrevibacteriumdivaricatum、コリネバクテリウムリリウムCorynebacteriumlilium等のコリネ型細菌もコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumに菌名が統一されているLieblWetalTransferofBrevibacteriumdivaricatumDSM20297TBrevibacteriumflavumDSM20411BrevibacteriumlactofermentumDSM20412andDSM1412andCorynebacteriumglutamicumandtheirdistinctionbyrRNAgenerestrictionpatternsIntJSystBacteriol41255260、駒形和男らコリネフォルム細菌の分類発酵と工業45944963。旧分類のブレビバクテリウムラクトファーメンタムATCC13869株、ブレビバクテリウムフラバムのMJ233株FERMBP1497、MJ233AB41株FERMBP1498なども好適なコリネバクテリウムグルタミカムである。ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウムアンモニアゲネスBrevibacteriumammoniagenes例えばATCC6872株等が挙げられる。アースロバクター属菌としては、アースロバクターグロビフォルミスArthrobacterglobiformis例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株等が挙げられる。マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウムボビスMycobacteriumbovis例えばATCC19210株、ATCC27289株等が挙げられる。マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカスフロイデンライヒMicrococcusfreudenreichii例えばNo239株FERMP13221、マイクロコッカスルテウスMicrococcusleuteus、マイクロコッカスウレアエMicrococcusureae例えばIAM1010株、マイクロコッカスロゼウスMicrococcusroseus例えばIFO3764株等が挙げられる。また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート乳酸デヒドロゲナーゼlactatedehydrogenase:LDH、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼphosphoenolpyrvatecarboxylase、マレートデヒドロゲナーゼmalatedehydrogenaseなどの遺伝子の破壊株が挙げられる。このような遺伝子破壊株を宿主として用いることにより、フェノールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウムグルタミカムの、特にRFERMP18976株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、WO2005/010182A1に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。コリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子コリスメートピルベートリアーゼは、コリスメートからピルビン酸を脱離させて4ヒドロキシベンゾエートを生成する反応を触媒する酵素である。コリスメートピルベートリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来は特に限定されないが、エシェリキアコリEscherichiacoli由来の遺伝子、シュードモナスプチダPseudomonasputida由来の遺伝子、アシネトバクターバウマンニAcinetobacterbaumannii由来の遺伝子、アゾトバクタービネランジーAzotobactervinelandii由来の遺伝子、クロモハロバクターサレキシゲンスChromohalobactersalexigens由来の遺伝子、シトロバクターコセリCitrobacterkoseri、シトロバクターヤンガエCitrobacteryoungaeのようなシトロバクター属細菌由来の遺伝子、エンテロバクタークロアカエEnterobactercloacae由来の遺伝子、マリノバクターアクアエオレイMarinobacteraquaeolei由来の遺伝子、マリノモナスメディテラネアMarinomonasmediterranea由来の遺伝子、パントエアアナナティスPantoeaananatis由来の遺伝子、シュードアルテロモナスハロプランクティスPseudoalteromonashaloplanktis由来の遺伝子、ラルストニアユートロファRalstoniaeutropha由来の遺伝子、シューワネラプトレファシェンスShewanellaputrefaciens由来の遺伝子、及びチオバチルスデニトリフィカンスThiobacillusdenitrificans由来の遺伝子が好ましく、シュードモナスプチダ由来の遺伝子がより好ましい。エシェリキアコリ由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号31の塩基配列からなるDNAが挙げられ、シュードモナスプチダ由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号34の塩基配列からなるDNAが挙げられ、アシネトバクターバウマンニ由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号81の塩基配列からなるDNAが挙げられ、アゾトバクタービネランジー由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号82の塩基配列からなるDNAが挙げられ、クロモハロバクターサレキシゲンス由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号83の塩基配列からなるDNAが挙げられ、シトロバクターコセリ由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号84の塩基配列からなるDNAが挙げられ、シトロバクターヤンガエ由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号85の塩基配列からなるDNAが挙げられ、エンテロバクタークロアカエ由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号86の塩基配列からなるDNAが挙げられ、マリノバクターアクアエオレイ由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号87の塩基配列からなるDNAが挙げられ、マリノモナスメディテラネア由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号88の塩基配列からなるDNAが挙げられ、パントエアアナナティス由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号89の塩基配列からなるDNAが挙げられ、シュードアルテロモナスハロプランクティス由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号90の塩基配列からなるDNAが挙げられ、ラルストニアユートロファ由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号91の塩基配列からなるDNAが挙げられ、シューワネラプトレファシェンス由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号92の塩基配列からなるDNAが挙げられ、及びチオバチルスデニトリフィカンス由来のコリスメートピルベートリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号93の塩基配列からなるDNAが挙げられる。また、本発明では、配列番号31、配列番号34、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、又は配列番号93の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつコリスメートピルベートリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。本発明においてストリンジェントな条件は、一般的な条件、例えば、MolecularCloningALaboratoryManualSecondEdition1989Vol2p1145に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度より5~10°C低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。コリスメートピルベートリアーゼ活性は、JournalofBacteriology174530953161992MaterialsandMethodsに記載の方法で測定できる。簡単に説明すると、試験用液に被験酵素を添加し、50mMトリスHClpH75、5mMEDTA、10mMβメルカプトエタノール、60μMコリスミ酸と酵素を含む反応液を調製し、240nmにおける吸光度の傾きを測定する。コリスミ酸を添加しない系についても同様に反応を行い、バックグラウンド値とする。両測定値の差をコリスメートピルベートリアーゼ活性とする。また、本発明では、配列番号31、配列番号34、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、又は配列番号93の塩基配列と同一性が90以上、好ましくは95以上、より好ましくは98以上の塩基配列からなり、かつコリスメートピルベートリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYXver8GENETYX株式会社ゼネティックス製により算出した値である。配列番号31、配列番号34、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、又は配列番号93の塩基配列からなるDNAの類縁体は、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができ、これにより高確率でコリスメートピルベートリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが得られる。4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子bsdBCD又はdca4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼは、4ヒドロキシベンゾエートの脱炭酸によるフェノールの生成反応を触媒する酵素である。4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来は特に限定されないが、バチラスサブチリスBacillussubtilis、バチラスメガテリウムBacillusmegaterium、バチラスリッケニフォーミスBacilluslicheniformis、バチラスアトロファエウスBacillusatrophaeus、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイBacillussubtilissubspspizizeniiのようなバチラス属細菌由来の遺伝子、シトロバクターコセリCitrobacterkoseri由来遺伝子、エンテロバクターアエロゲネスEnterobacteraerogenes、エンテロバクタークロアカエEnterobactercloacae、エンテロバクターホルメシェイEnterobacterhormaechei、エンテロバクターサカザキEnterobactersakazakiiのようなエンテロバクター属細菌由来の遺伝子、エシェリヒアコリEscherichiacoli、エシェリヒアフェルグソニーEscherichiafergusoniiのようなエシェリヒア属細菌由来遺伝子、パエニバチラスポリミキサPaenibacilluspolymyxa由来遺伝子、パントエアアナナティスPantoeaananatis由来遺伝子などが挙げられる。中でも、バチルス属細菌特に、バチラスサブチリス由来の遺伝子、エンテロバクター属細菌特に、エンテロバクタークロアカエ由来の遺伝子、シェリヒア属細菌特に、エシェリヒアコリ由来の遺伝子が好ましい。なお、4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子は、由来により異なる種々の略称が用いられている。例えば、バチラスサブチリス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子はbsdBCDと略称されている。本明細書では、4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子を、由来を問わずdcaと略称することがある。バチラスサブチリス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号37の塩基配列からなるDNAが、バチラスアトロファエウス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号44の塩基配列からなるDNAが、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号47の塩基配列からなるDNAが、シトロバクターコセリ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号50の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクターアエロゲネス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号53の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクタークロアカエ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号56の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクターホルメシェイ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号59の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクターサカザキ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号62の塩基配列からなるDNAが、エシェリヒアコリ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号65の塩基配列からなるDNAが、エシェリヒアフェルグソニー由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号68の塩基配列からなるDNAが、パエニバチラスポリミキサPaenibacilluspolymyxa由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号71の塩基配列からなるDNAが、パントエアアナナティスPantoeaananatis由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号74の塩基配列からなるDNAが挙げられる。また、本発明では、配列番号37、配列番号44、配列番号47、配列番号50、配列番号53、配列番号56、配列番号59、配列番号62、配列番号65、配列番号68、配列番号71、又は配列番号74の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性は、Genomics863423512005MaterialsandMethodsに記載の方法で測定できる。簡単に説明すると、試験用液に被験酵素を添加し、100mMMESpH60、1mMDTT、5mM4ヒドロキシベンゾエートと酵素を含む反応液を調製し、270nmにおける吸光度の傾きを測定する。4ヒドロキシベンゾエートを添加しない系についても同様に反応を行い、バックグラウンド値とする。両測定値の差を4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性とする。また、本発明では、配列番号37、配列番号44、配列番号47、配列番号50、配列番号53、配列番号56、配列番号59、配列番号62、配列番号65、配列番号68、配列番号71、又は配列番号74の塩基配列と同一性が90以上、好ましくは95以上、より好ましくは98以上の塩基配列からなり、かつ4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。配列番号37、配列番号44、配列番号47、配列番号50、配列番号53、配列番号56、配列番号59、配列番号62、配列番号65、配列番号68、配列番号71、又は配列番号74の塩基配列からなるDNAの類縁体は、前述した方法で取得できる。形質転換のためのベクターの構築PCRで増幅したコリスメートピルベートリアーゼ酵素をコードするDNA、及び4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ酵素をコードするDNAは、それぞれ、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentum2256由来のpAM330特開昭5867699、MiwaKetalCrypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteriaAgricBiolChem48290129031984及びYamaguchiRetalDeterminationofthecompletenucleotidesequenceoftheBrevibacteriumlactofermentumplasmidpAM330andtheanalysisofitsgeneticinformationNucleicAcidsSympSer162652671985、コリネバクテリウムグルタミカムATCC13058由来のpHM1519MiwaKetalCrypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteriaAgricBiolChem48290129031984及びpCRY30KurusuYetalIdentificationofplasmidpartitionfunctionincoryneformbacteriaApplEnvironMicrobiol577597641991、コリネバクテリウムグルタミカムT250由来のpCG4特開昭57183799、KatsumataRetalProtoplasttransformationofglutamateproducingbacteriawithplasmidDNAJBacteriol、1593063111984、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50特開昭62166890、pEK0、pEC5、pEKEx1EikmannsBJetalAfamilyofCorynebacteriumglutamicumEscherichiacolishuttlevectorsforcloningcontrolledgeneexpressionandpromoterprobingGene10293981991などが挙げられる。好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウムグルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3フォスフェートデヒドロゲナーゼA遺伝子のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子mdhのプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子ldhAのプロモーターPldhAなどが挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnBT1T2ターミネーター、大腸菌のtrpAターミネーター、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentumのtrpターミネーターなどが挙げられ、中でも、rrnBT1T2ターミネーターが好ましい。形質転換形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる。中でも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は、公知の方法KurusuYetalElectroporationtransformationsystemforCoryneformbacteriabyauxotrophiccomplementationAgricBiolChem544434471990及びVertesAAetalPresenceofmrrandmcrlikerestrictionsystemsinCoryneformbacteriaResMicrobiol1441811851993により行うことができる。形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地等を用いることができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質又は糖アルコール;酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸;エタノール、プロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種を単独で使用でき、又は2種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約01~10w/vとすればよい。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミンビタミンB1、ピリドキシンビタミンB6、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。培地のpHは約5~8が好ましい。好ましい微生物培養培地としては、A培地InuiMetalMetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditionsJMolMicrobiolBiotechnol7182196、BT培地OmumasabaCAetalCorynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithoppositeATPdependentregulationJMolMicrobiolBiotechnol891103等が挙げられる。培養温度は約15~45°Cとすればよく、培養時間は約1~7日間とすればよい。宿主染色体遺伝子の破壊又は欠失宿主のコリネ型細菌は、その染色体上に存在する4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより一層効率良くフェノールを製造することができる。また、宿主のコリネ型細菌は、その染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより、一層効率良くフェノールを製造することができる。pobA及びpoxFの双方が破壊され、または欠失していることが特に好ましい。遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある米国特許第6303383号、特開平05007491号。具体的には、実施例1の項目に記載の方法により、4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ酵素遺伝子pobAが破壊又は欠失したコリネ型細菌を得ることができる。また、同様の方法でフェノール2モノオキシゲナーゼ遺伝子poxFが破壊又は欠失したコリネ型細菌を得ることができる。代謝遺伝子の高発現本発明の形質転換体は、DAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase遺伝子aroGが、宿主の本来のレベル、即ち野生型宿主のレベルより高発現していることが好ましい。この高発現は、形質転換による遺伝子導入、又は宿主染色体上の遺伝子のコピー数を高めることにより達成される。形質転換について述べれば、導入するDAHPシンテターゼ遺伝子は、宿主の遺伝子と同じ又は実質的に同じDAHPシンテターゼ遺伝子でもよく、その他のDAHPシンテターゼ遺伝子であってもよい。宿主の遺伝子と同じ又は実質的に同じ、DAHPシンテターゼ遺伝子を導入する方が好ましい。例えば、コリネバクテリウムグルタミカム由来のDAHPシンテターゼ遺伝子としては、配列番号28の塩基配列からなるDNAが挙げられる。その他のコリネ型細菌のDHAPシンターゼ遺伝子としては、コリネバクテリウムエフィシェンスCorynebacteriumefficiens由来の遺伝子配列番号120、日本DNAデータバンク:CE2073、マイコバクテリウムスメグマティスMycobacteriumsmegmatis由来の遺伝子配列番号121、日本DNAデータバンク:MSMEG4244、ロドコッカスオパカスRhodococcusopacus由来の遺伝子配列番号122、日本DNAデータバンク:ROP08400などがある。また、DAHPシンテターゼ遺伝子について実質的に同じ遺伝子としては、当該遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列と90以上、好ましくは95以上、より好ましくは98以上の同一性を有するポリペプチドであって、DAHPシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。また、DAHPシンテターゼ遺伝子について実質的に同じ遺伝子としては、当該遺伝子と90以上、好ましくは95以上、より好ましくは98以上の同一性を有するDNAであって、DAHPシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。DAHPシンテターゼ活性の有無は、ホスホエノールピルビン酸とエリトロース4リン酸を基質として反応させ、生じた3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphateを、チオバルビツール酸を用いた発色法により定量ApplEnvironMicrobiol7454975503することにより検出することができる。宿主染色体上のDAHPシンテターゼ遺伝子のコピー数を高める方法について述べれば、この遺伝子をコリネバクテリウムグルタミカムの染色体DNA上に多コピー導入すればよい。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法ExperimentsinMolecularGeneticsColdSpringHarborLabにより行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッドリピートが利用できる。また、特開平2109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンと共に転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法特開平2109985号で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。また、コリネ型細菌の染色体上のDAHPシンテターゼ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列をより強力なものに置換することによっても、これらの遺伝子の発現を高めることができる。例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trcプロモーター、trpプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO0018935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文ProkaryoticpromotersinbiotechnologyBiotechnolAnnuRev19951105128等に記載されている。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。さらに、リボソーム結合部位RBSと開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることもできる。上記のような遺伝子置換を行う方法としては、例えば、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある米国特許第6303383号明細書、または特開平05007491号公報。IIフェノールの製造方法上記説明した本発明の形質転換体を、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含む方法によりフェノールを製造することができる。微生物の増殖反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25~38°Cで、約12~48時間培養して増殖させることが好ましい。反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。炭素源として、糖類グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖;スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖;澱粉のような多糖;糖蜜等、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール;酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸;エタノール、プロパノールのようなアルコール;ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約01~10w/vとすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミンビタミンB1、ピリドキシンビタミンB6、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。培地のpHは約6~8が好ましい。具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地InuiMetalMetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditionsJMolMicrobiolBiotechnol7182196、BT培地OmumasabaCAetalCorynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithoppositeATPdependentregulationJMolMicrobiolBiotechnol891103等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。反応液反応液としては、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。炭素源としては糖類を用いる。糖類としては、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖;スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖;澱粉のような多糖;糖蜜等が挙げられる。中でも、単糖が好ましく、グルコースがより好ましい。炭素源として、糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール;酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸;エタノール、プロパノールのようなアルコール;ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。反応液中の糖類の濃度は、約1~20w/vが好ましく、約2~10w/vがより好ましく、約2~5w/vがさらにより好ましい。また、糖類を含む全炭素源の反応液中の濃度は、通常、約2~5w/vとすればよい。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の反応液中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の反応液中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の反応液中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約01~10w/vとすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミンビタミンB1、ピリドキシンビタミンB6、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。培地のpHは約6~8が好ましい。具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、前述したA培地、BT培地等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。反応条件反応温度、即ち反応中の形質転換体の生存温度は、約20~50°Cが好ましく、約25~40°Cがより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くフェノールを製造できる。また、反応時間は、約1~7日間が好ましく、約1~3日間がより好ましい。培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。<還元条件>反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、還元条件で行うことが好ましい。還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖せず、一層効率的にフェノールを生産させることができる。還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約-200mV~-500mVが好ましく、約-250mV~-500mVがより好ましい。反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬還元状態であれば、青色から無色への脱色で推定できるが、正確には酸化還元電位差計例えば、BROADLEYJAMES社製、ORPElectrodesを用いて測定できる。還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法PfennigNet.al1981:ThedissimilatorysulfatereducingbacteriaInTheProkaryotesAHandbookonHabitatsIsolationandIdentificationofBacteria,EdByStarrMP.etalp926940BerlinSpringerVerlag.や農芸化学実験書第三巻、京都大学農学部農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10mmHg以下、好ましくは約5mmHg以下、より好ましくは約3mmHg以下の減圧下で、約1~60分程度、好ましくは約5~40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。また、適当な還元剤例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のpH維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。フェノールの回収上記のようにして培養することにより、反応液中にフェノールが生産される。反応液を回収することによりフェノールを回収できるが、さらに、公知の方法でフェノールを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等が挙げられる。実施例1フェノール生産遺伝子のクローニングと発現微生物からの染色体DNAの抽出コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumRからの染色体DNA抽出は、A培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7gを蒸留水1Lに溶解に、炭素源として、最終濃度4になるように50グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット商品名:GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit、アマシャム社製を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。エシェリキアコリEscherichiacoliK12MG1655からの染色体DNA抽出は、LB培地tryptone10gyeastextract5gNaCl5gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。シュードモナスプチダPseudomonasputidaKT2440ATCC47054からの染色体DNA抽出は、LB培地tryptone10gyeastextract5gNaCl5gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。アシネトバクターバウマンニAcinetobacterbaumanniiJCM6841からの染色体DNA抽出は、JCMMediumNo12培地peptone5gbeefextract3gNaCl5gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。アゾトバクタービネランジーAzotobactervinelandiiATCC9104からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo805培地yeastextract1gMannitol5gK2HPO407gKH2PO401gMgSO47H2O02gNaCl1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。クロモハロバクターサレキシゲンスChromohalobactersalexigensATCCBAA138からの染色体DNA抽出は、NutrientbrothwithNaCl培地NutrientBrothBectonDickinsonandCompany製CatalogNo2340008gNaCl100gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。シトロバクターヤンガエCitrobacteryoungaeATCC29220からの染色体DNA抽出は、Nutrientbroth培地NutrientBrothBectonDickinsonandCompany製CatalogNo2340008gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。マリノバクターアクアエオレイMarinobacteraquaeoleiATCC700491の染色体DNACatalogNo700491D5はATCCAmericanTypeCultureCollectionより入手した。マリノモナスメディテラネアMarinomonasmediterraneaNBRC103028からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo340培地BactoMarineBroth2216BectonDickinsonandCompany製CatalogNo279110374gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで25°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。シュードアルテロモナスハロプランクティスPseudoalteromonashaloplanktisNBRC102225からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo340培地BactoMarineBroth2216BectonDickinsonandCompany製CatalogNo279110374gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで25°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。ラルストニアユートロファRalstoniaeutrophaIAM12368からの染色体DNA抽出は、Nutrientbroth培地NutrientBrothBectonDickinsonandCompany製CatalogNo2340008gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで26°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。シューワネラプトレファシェンスShewanellaputrefaciensJCM20190からの染色体DNA抽出は、Nutrientbroth培地NutrientBrothBectonDickinsonandCompany製CatalogNo2340008gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで25°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。チオバチルスデニトリフィカンスThiobacillusdenitrificansATCC25259JCM20190からの染色体DNA抽出は、JCMMediumNo91培地KNO35gNaHCO305gをS6mediumKH2PO418gNa2HPO412g2SO401gMgSO47H2O01gFeCl36H2O30mgMnSO4xH2O30mgCaCl22H2O40mg10Na2S2O3solution100mlを蒸留水900mlに溶解1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。バチルスサブチリスBacillussubtilisNBRC14144からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。バチラスアトロファエウスBacillusatrophaeusJCM9070からの染色体DNA抽出は、JCMMediumNo22培地peptone10gbeefextract10gNaCl5gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。バチラスサブチリス亜種スピジゼニイBacillussubtilissubspspizizeniiNBRC101239からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。シトロバクターコセリCitrobacterkoseriATCCBAA895の染色体DNACatalogNoBAA895D5はATCCAmericanTypeCultureCollectionより入手した。エンテロバクターアエロゲネスEnterobacteraerogenesNBRC13534からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。エンテロバクタークロアカエEnterobactercloacaeNBRC13535からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。エンテロバクターホルメシェイEnterobacterhormaecheiATCC49162からの染色体DNA抽出は、TrypticSoyBroth培地TrypticSoyBroth30gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。エンテロバクターサカザキEnterobactersakazakiiATCCBAA894の染色体DNACatalogNoBAA894D5はATCCAmericanTypeCultureCollectionより入手した。エシェリヒアコリEscherichiacoliWNBRC13500からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。エシェリヒアフェルグソニーEscherichiafergusoniiNBRC102419からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。パエニバチラスポリミキサPaenibacilluspolymyxaNBRC15309からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。パントエアアナナティスPantoeaananatisLMG20103からの染色体DNA抽出は、BCCMLMGBacteriCultureMediumNo1培地beefextract1gyeastextract2gpeptone5gNaCl5gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。クローニングベクターの構築クローニングベクターpCRB22の構築コリネバクテリウムカゼイJCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点以降、pCASE1oriと記す配列、及びクローニングベクターpHSG298タカラバイオ株式会社製をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、pCASE1ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号1pCASE1ori配列、配列番号2クローニングベクター-pHSG298を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。pCASE1ori配列増幅用プライマーa1;5’ATAGATCTAGAACGTCCGTAGGAGC3’配列番号3b1;5’ATAGATCTGACTTGGTTACGATGGAC3’配列番号4尚、プライマーa1及びb1には、BglII制限酵素部位が付加されている。クローニングベクターpHSG298増幅用プライマーa2;5’ATAGATCTAGGTTTCCCGACTGGAAAG3’配列番号5b2;5’ATAGATCTCGTGCCAGCTGCATTAATGA3’配列番号6尚、プライマーa2及びb2には、BglII制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、JapanCollectionofMicroorganismsより入手したコリネバクテリウムカゼイJCM12072から抽出したトータルDNA及びクローニングベクターpHSG298タカラバイオ株式会社製を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1ori配列の場合約14kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約27kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムカゼイ株由来のプラスミドpCASE1ori配列含む約14kbDNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG298を含む約27kbDNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液とした。得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG298約27kbのDNA断片に加え、pCASEori配列の約14kbDNA断片が認められた。pCASE1ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。クローニングベクターpCRB11の構築コリネバクテリウムグルタミカム内で複製可能なプラスミドpCG1由来のDNA複製起点以降、pCG1oriと記す配列、及びクローニングベクターpHSG398タカラバイオ株式会社製をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、pCG1ori配列、クローニングベクターpHSG398をそれぞれクローン化するべく、配列番号7pCG1ori配列、配列番号8クローニングベクターpHSG398を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。pCG1ori配列増幅用プライマーa3;5’ATAGATCTAGCATGGTCGTCACAGAG3’配列番号9b3;5’ATAGATCTGGAACCGTTATCTGCCTATG3’配列番号10尚、プライマーa3及びb3には、BglII制限酵素部位が付加されている。クローニングベクターpHSG398増幅用プライマーa4;5’ATAGATCTGTCGAACGGAAGATCACTTC3’配列番号11b4;5’ATAGATCTAGTTCCACTGAGCGTCAG3’配列番号12尚、プライマーa4及びb4には、BglII制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、pCG1及びクローニングベクターpHSG398タカラバイオ株式会社製を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCG1ori配列の場合約19kb、クローニングベクターpHSG398の場合、約22kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したプラスミドpCG1由来pCG1ori遺伝子含む約19kbDNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG398を含む約22kbDNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションB液とした。得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG398約22kbのDNA断片に加え、pCG1ori配列の約19kbDNA断片が認められた。pCG1ori配列を含むクローニングベクターをpCRB11と命名した。クローニングベクターpCRB15の構築クローニングベクターpCRB11を含むDNA断片及びpSELECTzeomcsインビトロジェン株式会社製由来のゼオシン耐性遺伝子をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、クローニングベクターpCRB11及びゼオシン耐性遺伝子をそれぞれクローン化するべく、配列番号13pCRB11及び配列番号14ゼオシン耐性遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。クローニングベクターpCRB11配列増幅用プライマーa5;5’ATGATATCCGAAGTGATCTTCCGTTCGA3’配列番号15b5;5’ATGATATCAAGGCAGTTATTGGTGCCCT3’を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB11配列の場合約33kb、ゼオシン耐性遺伝子の場合約05kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したクローニングベクターpCRB11を含む約33kbDNA断片10μl及びpSELECTzeomcsプラスミド由来ゼオシン耐性遺伝子を含む約05kbDNA断片10μlを各々制限酵素EcoRVで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションC液とした。得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、ゼオシン25μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素EcoRVでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB11由来約33kbのDNA断片に加え、ゼオシン耐性遺伝子の場合、約05kbDNA断片が認められた。ゼオシン耐性遺伝子を含むクローニングベクターをpCRB15と命名した。クローニングベクターpCRB207の構築コリネバクテリウムグルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseをコードするgapA遺伝子のプロモーター配列以降、PgapAと記すを含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK2233ファルマシア社製由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列以降、ターミネーター配列と記すを含むDNA断片を以下の方法により増幅した。PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列番号19PgapA配列、配列番号20ターミネーター配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PgapA配列増幅用プライマーa7;5’CTCTGTCGACCCGAAGATCTGAAGATTCCTG3’配列番号21b7;5’CTCTGTCGACGGATCCCCATGGTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG3’配列番号22尚、プライマーa7には、SalI制限酵素部位が、プライマーb7には、SalI、BamHI及びNcoI制限酵素部位が付加されている。ターミネーター配列増幅用プライマーa8;5’CTCTGCATGCCCATGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGA3’配列番号23b8;5’CTCTGCATGCTCATGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG3配列番号24尚、プライマーa8には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマーb8には、SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、コリネバクテリウムグルタミカムRから抽出した染色体DNA及びpKK2233プラスミドファルマシア社製を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、PgapA配列の場合約06kb、ターミネーター配列の場合、約04kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカムR由来PgapA配列を含む約06kbDNA断片10μlとクローニングベクターpCRB22約41kbを各々制限酵素SalIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションD液とした。得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SalIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB22約41kbのDNA断片に加え、PgapA配列の約06kbDNA断片が認められた。PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。上記PCRにより増幅したpKK2233プラスミド由来ターミネーター配列を含む約04kbDNA断片10μlを制限酵素NcoI及びBspHIで、上述のクローニングベクターpCRB2062μlを制限酵素NcoIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションE液とした。得られたライゲーションE液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB206約47kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列の約04kbDNA断片が認められた。rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。クローニングベクターpCRB209の構築コリネバクテリウムグルタミカムR由来のgapAglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseA遺伝子のプロモーター以降、PgapAと記す配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号25pCRB207を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。pCRB207配列増幅用プライマーa9;5’CTCTCATATGCTGTTTTGGCGGATGAGAG3’b9;5’CTCTCATATGGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG3’尚、プライマーa9及びb9にはNdeI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニングベクターpCRB207を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaq宝酒造株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB207配列を含む約51kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したpCRB207由来遺伝子を含む約51kbDNA断片10μlを制限酵素NdeIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼ宝酒造株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションF液とした。得られたライゲーションF液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NdeIで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクタ-をpCRB209と命名した。フェノール生産遺伝子のクローニングDAHPシンテターゼ遺伝子aroGコリネバクテリウムグルタミカム由来のフェノール生産遺伝子のクローニングコリネバクテリウムグルタミカム由来のDAHPシンテターゼをコードするaroG遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、aroG遺伝子をクローン化するべく、配列番号28コリネバクテリウムグルタミカムaroG遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。aroG遺伝子増幅用プライマーa10;5’CTCTCATATGAATAGGGGTGTGAGTTGG3’b10;5’CTCTCATATGTTAATTACGCAGCATTTCTGCAACG3’尚、プライマーa10及びb10には、NdeI制限酵素部位が付加されている。コリスメートピルベートリアーゼ遺伝子ubiCエシェリヒアコリ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエシェリヒアコリ由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号31エシェリヒアコリubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa11;5’CTCTCATATGTCACACCCCGCGTTAA3’配列番号32b11;5’CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGACGCC3’配列番号33尚、プライマーa11及びb11には、NdeI制限酵素部位が付加されている。シュードモナスプチダ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングシュードモナスプチダ由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号34シュードモナスプチダubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa12;5’CTCTCATATGTCGTACGAATCCCCG3’配列番号35b12;5’CTCTCATATGTCAGCGGTTTTCCTCCTTG3’配列番号36尚、プライマーa12及びb12には、NdeI制限酵素部位が付加されている。アシネトバクターバウマンニ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングアシネトバクターバウマンニ由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号81アシネトバクターバウマンニubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa29;5’CTCTCATATGCGTAAACGACAACCAGTAC3’b29;5’CTCTCATATGTCATAGTAATTCCTTGTCGTGCTG3’尚、プライマーa29及びb29には、NdeI制限酵素部位が付加されている。アゾトバクタービネランジー由来のフェノール生産遺伝子のクローニングアゾトバクタービネランジー由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号82アゾトバクタービネランジーubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa30;5’CTCTCATATGACCGCTGCTCCCG3’b30;5’CTCTCATATGTTATAGGGTGTCCGGGTC3’尚、プライマーa30及びb30には、NdeI制限酵素部位が付加されている。クロモハロバクターサレキシゲンス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングクロモハロバクターサレキシゲンス由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号83クロモハロバクターサレキシゲンスubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa31;5’CTCTCATATGTCTCCTGACCGCTTC3’配列番号98b31;5’CTCTCATATGTTAGCGCGATGGCAGCG3’配列番号99尚、プライマーa31及びb31には、NdeI制限酵素部位が付加されている。シトロバクターコセリ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングシトロバクターコセリ由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号84シトロバクターコセリubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa32;5’CTCTCATATGTCACACCCTGCGTTAAC3’b32;5’CTCTCATATGTTAATACAACGGTGATGCGGG3’尚、プライマーa32及びb32には、NdeI制限酵素部位が付加されている。シトロバクターヤンガエ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングシトロバクターヤンガエ由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号85シトロバクターヤンガエubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa33;5’CTCTCATATGCCACACCCTGCGTTAA3’配列番号102b33;5’CTCTCATATGTCAGTACAACGGCGATGCA3’配列番号103尚、プライマーa33及びb33には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エンテロバクタークロアカエ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエンテロバクタークロアカエ由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号86エンテロバクタークロアカエubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa34;5’CTCTCATATGTCACACCCTGCGCTAA3’配列番号104b34;5’CTCTCATATGTCAGTACAACGGCGATGC3’配列番号105尚、プライマーa34及びb34には、NdeI制限酵素部位が付加されている。マリノバクターアクアエオレイ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングマリノバクターアクアエオレイ由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号87マリノバクターアクアエオレイubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa35;5’CTCTCATATGCCGTTAAAGGACTGTGAC3’b35;5’CTCTCATATGTTAACCCCGGTTGGGC3’尚、プライマーa35及びb35には、NdeI制限酵素部位が付加されている。マリノモナスメディテラネア由来のフェノール生産遺伝子のクローニングマリノモナスメディテラネア由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号88マリノモナスメディテラネアubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa36;5’CTCTCATATGACGTTACTCAATAAAAACGCTG3’b36;5’CTCTCATATGCTACAGCTGGCCTATGGTA3’尚、プライマーa36及びb36には、NdeI制限酵素部位が付加されている。パントエアアナナティス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングパントエアアナナティス由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号89パントエアアナナティスubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa37;5’CTCTCATATGACGCAAGACCCGCT3’b37;5’CTCTCATATGTTAACCTTGATCACGATAGAGCG3’尚、プライマーa37及びb37には、NdeI制限酵素部位が付加されている。シュードアルテロモナスハロプランクティス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングシュードアルテロモナスハロプランクティス由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号90シュードアルテロモナスハロプランクティスubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa38;5’CTCTCATATGATTACTTTCCCTGTTTCATTATCTGC3’b38;5’CTCTCATATGTCATGAGTACAAATACGCTCCTG3’尚、プライマーa38及びb38には、NdeI制限酵素部位が付加されている。ラルストニアユートロファ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングラルストニアユートロファ由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号91ラルストニアユートロファubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa39;5’CTCTCATATGAGCGCGCAGTCCG3’b39;5’CTCTCATATGTCATCTCGTGGTCTCTTTCTTG3’尚、プライマーa39及びb39には、NdeI制限酵素部位が付加されている。シューワネラプトレファシェンス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングシューワネラプトレファシェンス由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号92シューワネラプトレファシェンスubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa40;5’CTCTCATATGAATGTGACTAGCTTAAGCTTCC3’b40;5’CTCTCATATGTCACTGGCAAATTGCTCGC3’尚、プライマーa40及びb40には、NdeI制限酵素部位が付加されている。チオバチルスデニトリフィカンス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングチオバチルスデニトリフィカンス由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべく、配列番号93チオバチルスデニトリフィカンスubiC遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。ubiC遺伝子増幅用プライマーa41;5’CTCTCATATGATCGCCACGCGCG3’配列番号118b41;5’CTCTCATATGTCATGGCGTTAATAGGGCG3’配列番号119尚、プライマーa41及びb41には、NdeI制限酵素部位が付加されている。4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子bsdBCDdcaバチラスサブチリス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングバチラスサブチリス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするbsdBCD遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、bsdBCD遺伝子をクローン化するべく、配列番号37バチラスサブチリスbsdBCD遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。bsdBCD遺伝子増幅用プライマーa13;5’CTCTCATATGAAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG3’b13;5’CTCTCATATGGATCAAGCCTTTCGTTCCG3’尚、プライマーa13及びb13には、NdeI制限酵素部位が付加されている。バチラスアトロファエウス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングバチラスアトロファエウス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号44バチラスアトロファエウスdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa16;5’CTCTCATATGAAACTCGTTGTCGGGATG3’b18;5’CTCTCATATGTTAACGCTTATCTTCCGCCAG3’尚、プライマーa18及びb18には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エンテロバクターアエロゲネス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエンテロバクターアエロゲネス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号53エンテロバクターアエロゲネスdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa19;5’CTCTCATATGAAACTGATTATTGGGATGACCG3’配列番号54b19;5’CTCTCATATGTTAACGCTTATCTGCCGCC3’配列番号55尚、プライマーa19及びb19には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エンテロバクタークロアカエ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエンテロバクタークロアカエ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号56エンテロバクタークロアカエdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa20;5’CTCTCATATGAGATTGATCGTGGGAATGAC3’配列番号57b20;5’CTCTCATATGTTACAGCAATGGCGGAATGG3’配列番号58尚、プライマーa20及びb20には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エンテロバクターホルメシェイ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエンテロバクターホルメシェイ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号59エンテロバクターホルメシェイdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa21;5’CTCTCATATGAGATTGATTGTGGGAATGAC3’配列番号60b21;5’CTCTCATATGGAGTCTGGTTTAGTTCTCTGC3’配列番号61尚、プライマーa21及びb21には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エンテロバクターサカザキ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエンテロバクターサカザキ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号62エンテロバクターサカザキdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa22;5’CTCTCATATGAGGCTAATTGTCGGAATGAC3’配列番号63b22;5’CTCTCATATGTTAACGCTTACCATCCGCC3’配列番号64尚、プライマーa22及びb22には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エシェリヒアコリ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエシェリヒアコリ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号65エシェリヒアコリdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa23;5’CTCTCATATGAAACTGATCGTCGGGATG3’配列番号66b23;5’CTCTCATATGTTAGCGCTTACCTTCCGC3’配列番号67尚、プライマーa23及びb23には、NdeI制限酵素部位が付加されている。エシェリヒアフェルグソニー由来のフェノール生産遺伝子のクローニングエシェリヒアフェルグソニー由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号68エシェリヒアフェルグソニーdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa24;5’CTCTCATATGAGACTGATCGTCGGGAT3’配列番号69b24;5’CTCTCATATGTTAGCGCTTATCTGCCGC3’配列番号70尚、プライマーa24及びb24には、NdeI制限酵素部位が付加されている。パエニバチラスポリミキサ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングパエニバチラスポリミキサ由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号71パエニバチラスポリミキサdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa25;5’CTCTCATATGAAGAAAATCATTGTAGGAATATCGG3’b25;5’CTCTCATATGCTATATCCGCTCTGGAATAGG3’尚、プライマーa25及びb25には、NdeI制限酵素部位が付加されている。パントエアアナナティス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングパントエアアナナティス由来の4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号74パントエアアナナティスdca遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。dca遺伝子増幅用プライマーa26;5’CTCTCATATGAGTAGATTACTGTTAATTTCATTCGTAC3配列番号75b26;5’CTCTCATATGTTACTTAGCTAACAGAGGAGGG3’配列番号76尚、プライマーa26及びb26には、NdeI制限酵素部位が付加されている。条件鋳型DNAは、コリネバクテリウムグルタミカムは、コリネバクテリウムグルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。エシェリヒアコリは、エシェリヒアコリK12MG1655から抽出した染色体DNAを用いた。シュードモナスプチダは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したシュードモナスプチダATCC47054から抽出した染色体DNAを用いた。アシネトバクターバウマンニは、JapanCollectionofMicroorganismsJCMより入手したアシネトバクターバウマンニJCM6841から抽出した染色体DNAを用いた。アゾトバクタービネランジーは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したアゾトバクタービネランジーATCC9104から抽出した染色体DNAを用いた。クロモハロバクターサレキシゲンスは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したクロモハロバクターサレキシゲンスATCCBAA138から抽出した染色体DNAを用いた。シトロバクターヤンガエは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したシトロバクターヤンガエATCC29220から抽出した染色体DNAを用いた。マリノバクターアクアエオレイAmericanTypeCultureCollectionより入手したマリノバクターアクアエオレイ染色体DNAcatalogNo700491D5を用いた。マリノモナスメディテラネアは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したマリノモナスメディテラネアNBRC103028から抽出した染色体DNAを用いた。シュードアルテロモナスハロプランクティスは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したシュードアルテロモナスハロプランクティスNBRC102225から抽出した染色体DNAを用いた。ラルストニアユートロファは、InstituteofAppliedMicrobiologyCultureCollectionより入手したラルストニアユートロファRalstoniaeutrophaIAM12368の染色体DNAを用いた。シューワネラプトレファシェンスは、JapanCollectionofMicroorganismsJCMより入手したシューワネラプトレファシェンスJCM20190から抽出した染色体DNAを用いた。チオバチルスデニトリフィカンスは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したチオバチルスデニトリフィカンスATCC25259から抽出した染色体DNAを用いた。バチラスサブチリスは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したバチラスサブチリスNBRC14144から抽出した染色体DNAを用いた。バチラスアトロファエウスは、JapanCollectionofMicroorganismsJCMより入手したバチラスアトロファエウスJCM9070から抽出した染色体DNAを用いた。バチラスサブチリス亜種スピジゼニイは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したバチラスサブチリス亜種スピジゼニイNBRC101239から抽出した染色体DNAを用いた。シトロバクターコセリは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したシトロバクターコセリ染色体DNAcatalogNoBAA895D5を用いた。エンテロバクターアエロゲネスは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したエンテロバクターアエロゲネスNBRC13534から抽出した染色体DNAを用いた。エンテロバクタークロアカエは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したエンテロバクタークロアカエNBRC13535から抽出した染色体DNAを用いた。エンテロバクターホルメシェイは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したエンテロバクターホルメシェイATCC49162から抽出した染色体DNAを用いた。エンテロバクターサカザキは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したエンテロバクターサカザキ染色体DNAcatalogNoBAA894D5を用いた。エシェリヒアコリWは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したエシェリヒアコリNBRC13500から抽出した染色体DNAを用いた。エシェリヒアフェルグソニーは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したエシェリヒアフェルグソニーNBRC102419から抽出した染色体DNAを用いた。パエニバチラスポリミキサは、NITENationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenterNBRCより入手したパエニバチラスポリミキサNBRC15309から抽出した染色体DNAを用いた。パントエアアナナティスは、BCCMLMGBelgianCoordinatedCollectionsofMicroorganismsLaboratoryforMicrobiologyUniversityofGentより入手したパントエアアナナティスLMG20103から抽出した染色体DNAを用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。コリネバクテリウムグルタミカムaroG遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、エシェリヒアコリubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、シュードモナスプチダubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、アシネトバクターバウマンニubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、アゾトバクタービネランジーubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、クロモハロバクターサレキシゲンスubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、シトロバクターコセリubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、シトロバクターヤンガエubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、エンテロバクタークロアカエubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、マリノバクターアクアエオレイubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、マリノモナスメディテラネアubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、パントエアアナナティスubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、シュードアルテロモナスハロプランクティスubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、ラルストニアユートロファubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、シューワネラプトレファシェンスubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、チオバチルスデニトリフィカンスubiC遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、バチラスサブチリスbsdBCD遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、バチラスアトロファエウスdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa16とb16の組み合わせ、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa17とb17の組み合わせ、シトロバクターコセリdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa18とb18の組み合わせ、エンテロバクターアエロゲネスdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa19とb19の組み合わせ、エンテロバクタークロアカエdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa20とb20の組み合わせ、エンテロバクターホルメシェイdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa21とb21の組み合わせ、エンテロバクターサカザキdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa22とb22の組み合わせ、エシェリヒアコリWdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa23とb23の組み合わせ、エシェリヒアフェルグソニーdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa24とb24の組み合わせ、パエニバチラスポリミキサdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa25とb25の組み合わせ、パントエアアナナティスdca遺伝子を増幅する場合はプライマーa26とb26の組み合わせで行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウムグルタミカムaroG遺伝子の場合約14kb、エシェリヒアコリubiC遺伝子の場合約05kb、シュードモナスプチダubiC遺伝子の場合約06kb、アシネトバクターバウマンニubiC遺伝子の場合約05kb、アゾトバクタービネランジーubiC遺伝子の場合約06kb、クロモハロバクターサレキシゲンスubiC遺伝子の場合約06kb、シトロバクターコセリubiC遺伝子の場合約50kb、シトロバクターヤンガエubiC遺伝子の場合約05kb、エンテロバクタークロアカエubiC遺伝子の場合約05kb、マリノバクターアクアエオレイubiC遺伝子の場合約06kb、マリノモナスメディテラネアubiC遺伝子の場合約05kb、パントエアアナナティスubiC遺伝子の場合約05kb、シュードアルテロモナスハロプランクティスubiC遺伝子の場合約05kb、ラルストニアユートロファubiC遺伝子の場合約07kb、シューワネラプトレファシェンスubiC遺伝子の場合約06kb、チオバチルスデニトリフィカンスubiC遺伝子の場合約06kb、バチラスサブチリスbsdBCD遺伝子の場合約23kb、バチラスアトロファエウスbsdBCD遺伝子の場合約23kb、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイdca遺伝子の場合約23kb、シトロバクターコセリdca遺伝子の場合約23kb、エンテロバクターアエロゲネスdca遺伝子の場合約23kb、エンテロバクタークロアカエdca遺伝子の場合約23kb、エンテロバクターホルメシェイdca遺伝子の場合約24kb、エンテロバクターサカザキdca遺伝子の場合約23kb、エシェリヒアコリWdca遺伝子の場合約23kb、エシェリヒアフェルグソニーdca遺伝子の場合約23kb、パエニバチラスポリミキサdca遺伝子の場合約23kb、パントエアアナナティスdca遺伝子の場合約23kbのDNA断片が検出できた。フェノール生産遺伝子発現プラスミドの構築フェノール生産遺伝子のpCRB209へのクローニング上記項に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子を含む約14kbDNA断片、エシェリヒアコリ株由来ubiC遺伝子を含む約05kbDNA断片、シュードモナスプチダ株由来ubiC遺伝子を含む約06kbDNA断片、アシネトバクターバウマンニ株由来ubiC遺伝子を含む約05kbDNA断片、アゾトバクタービネランジー株由来ubiC遺伝子を含む約06kbDNA断片、クロモハロバクターサレキシゲンス株由来ubiC遺伝子を含む約06kbDNA断片、シトロバクターコセリ株由来ubiC遺伝子を含む約50kbDNA断片、シトロバクターヤンガエ株由来ubiC遺伝子を含む約05kbDNA断片、エンテロバクタークロアカエ株由来ubiC遺伝子を含む約05kbDNA断片、マリノバクターアクアエオレイ株由来ubiC遺伝子を含む約06kbDNA断片、マリノモナスメディテラネア株由来ubiC遺伝子を含む約05kbDNA断片、パントエアアナナティス株由来ubiC遺伝子を含む約05kbDNA断片、シュードアルテロモナスハロプランクティス株由来ubiC遺伝子を含む約05kbDNA断片、ラルストニアユートロファ株由来ubiC遺伝子を含む約07kbDNA断片、シューワネラプトレファシェンス株由来ubiC遺伝子を含む約06kbDNA断片、チオバチルスデニトリフィカンス株由来ubiC遺伝子を含む約06kbDNA断片、バチラスサブチリス株由来bsdBCD遺伝子を含む約23kbDNA断片、バチラスアトロファエウス株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、シトロバクターコセリ株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、エンテロバクターアエロゲネス株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、エンテロバクタークロアカエ株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、エンテロバクターホルメシェイ株由来dca遺伝子を含む約24kbDNA断片、エンテロバクターサカザキ株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、エシェリヒアコリW株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、エシェリヒアフェルグソニー株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、パエニバチラスポリミキサ株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片、パントエアアナナティス株由来dca遺伝子を含む約23kbDNA断片のそれぞれ10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB2092μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションG液、H液、I液、AA液、AB液、AC液、AD液、AE液、AF液、AG液、AH液、AI液、AJ液、AK液、AL液、AM液、J液、O液、P液、Q液、R液、S液、T液、U液、V液、W液、X液、及びY液とした。得られた28種のライゲーションG液、H液、I液、AA液、AB液、AC液、AD液、AE液、AF液、AG液、AH液、AI液、AJ液、AK液、AL液、AM液、J液、O液、P液、Q液、R液、S液、T液、U液、V液、W液、X液、及びY液それぞれを、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約51kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子ライゲーションG液の場合、長さ約14kbの挿入断片が、エシェリヒアコリ株由来ubiC遺伝子ライゲーションH液の場合、長さ約05kbの挿入断片が、シュードモナスプチダ株由来ubiC遺伝子ライゲーションI液の場合、長さ約06kbの挿入断片が、アシネトバクターバウマンニ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAA液の場合、長さ約05kbが、アゾトバクタービネランジー株由来ubiC遺伝子ライゲーションAB液の場合、長さ約06kbが、クロモハロバクターサレキシゲンス株由来ubiC遺伝子ライゲーションAC液の場合、長さ約06kbが、シトロバクターコセリ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAD液の場合、長さ約05kbが、シトロバクターヤンガエ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAE液の場合、長さ約05kbが、エンテロバクタークロアカエ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAF液の場合、長さ約05kbが、マリノバクターアクアエオレイ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAG液の場合、長さ約06kbが、マリノモナスメディテラネア株由来ubiC遺伝子ライゲーションAH液の場合、長さ約05kbが、パントエアアナナティス株由来ubiC遺伝子ライゲーションAI液の場合、長さ約05kbが、シュードアルテロモナスハロプランクティス株由来ubiC遺伝子ライゲーションAJ液の場合、長さ約05kbが、ラルストニアユートロファ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAK液の場合、長さ約07kbが、シューワネラプトレファシェンス株由来ubiC遺伝子ライゲーションAL液の場合、長さ約06kbが、チオバチルスデニトリフィカンス株由来ubiC遺伝子ライゲーションAM液の場合、長さ約06kbが、バチラスサブチリス株由来bsdBCD遺伝子ライゲーションJ液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、バチラスアトロファエウス株由来dca遺伝子ライゲーションO液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ株由来dca遺伝子ライゲーションP液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、シトロバクターコセリ株由来dca遺伝子ライゲーションQ液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、エンテロバクターアエロゲネス株由来dca遺伝子ライゲーションR液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、エンテロバクタークロアカエ株由来dca遺伝子ライゲーションS液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、エンテロバクターホルメシェイ株由来dca遺伝子ライゲーションT液の場合、長さ約24kbの挿入断片が、エンテロバクターサカザキ株由来dca遺伝子ライゲーションU液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、エシェリヒアコリW株由来dca遺伝子ライゲーションV液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、エシェリヒアフェルグソニー株由来dca遺伝子ライゲーションW液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、パエニバチラスポリミキサ株由来dca遺伝子ライゲーションX液の場合、長さ約23kbの挿入断片が、パントエアアナナティス株由来dca遺伝子ライゲーションY液の場合、長さ約23kbが認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子を含むプラスミドをpCRB209aroGCG、エシェリヒアコリ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCEC、シュードモナスプチダ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCPP、アシネトバクターバウマンニ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCACB、アゾトバクタービネランジー株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCAVN、クロモハロバクターサレキシゲンス株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCCSA、シトロバクターコセリ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCCKO、シトロバクターヤンガエ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCCIT、エンテロバクタークロアカエ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCECL、マリノバクターアクアエオレイ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCMAQ、マリノモナスメディテラネア株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCMME、パントエアアナナティス株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCPAM、シュードアルテロモナスハロプランクティス株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCPHA、ラルストニアユートロファ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCREH、シューワネラプトレファシェンス株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCSPC、チオバチルスデニトリフィカンス株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209ubiCTBD、バチラスサブチリス株由来bsdBCD遺伝子を含むプラスミドをpCRB209bsdBCDBS、バチラスアトロファエウス株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaBAE、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaBSS、シトロバクターコセリ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaCKO、エンテロバクターアエロゲネス株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaEAE、エンテロバクタークロアカエ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaECL、エンテロバクターホルメシェイ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaEHO、エンテロバクターサカザキ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaESA、エシェリヒアコリW株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaECK、エシェリヒアフェルグソニー株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaEFE、パエニバチラスポリミキサ株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaPPY、パントエアアナナティス株由来dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209dcaPAMとそれぞれ命名した。コリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子を含むプラスミドpCRB209aroGCG、エシェリヒアコリ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドpCRB209ubiCEC、シュードモナスプチダ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドpCRB209ubiCPP、バチラスサブチリス株由来bsdBCD遺伝子を含むプラスミドpCRB209bsdBCDBSの構築を図1に示す。フェノール生産遺伝子のpCRB1へのクローニング上述のプラスミドpCRB209ubiCEC、pCRB209ubiCPP、pCRB209ubiCACB、pCRB209ubiCAVN、pCRB209ubiCCSA、pCRB209ubiCCKO、pCRB209ubiCCIT、pCRB209ubiCECL、pCRB209ubiCMAQ、pCRB209ubiCMME、pCRB209ubiCPAM、pCRB209ubiCPHA及びpCRB209ubiCSPCを制限酵素SalIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquickGelExtractionKit株式会社キアゲン社製によって回収したgapAプロモーターとエシェリヒアコリ株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約15kbのDNA断片、gapAプロモーターとシュードモナスプチダ株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約16kbのDNA断片、gapAプロモーターとアシネトバクターバウマンニ株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約15kbのDNA断片、gapAプロモーターとアゾトバクタービネランジー株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約16kbのDNA断片、gapAプロモーターとクロモハロバクターサレキシゲンス株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約16kbのDNA断片、gapAプロモーターとシトロバクターコセリ株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約15kbのDNA断片、gapAプロモーターとシトロバクターヤンガエ株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約15kbのDNA断片、gapAプロモーターとエンテロバクタークロアカエ株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約15kbのDNA断片、gapAプロモーターとマリノバクターアクアエオレイ株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約16kbのDNA断片、gapAプロモーターとマリノモナスメディテラネア株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約15kbのDNA断片、gapAプロモーターとパントエアアナナティス株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約15kbのDNA断片、gapAプロモーターとシュードアルテロモナスハロプランクティス株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約15kbのDNA断片、gapAプロモーターとシューワネラプトレファシェンス株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約16kbのDNA断片とSalIで切断したクローニングベクターpCRB1NakataKetalVectorsforthegeneticsengineeringofcorynebacteriainSahaBCFermentationBiotechnologyACSSymposiumSeries862WashingtonAmericanChemicalSociety175191約41kbを70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させたDNA断片を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションK液、L液、AN液、AO液、AP液、AQ液、AR液、AS液、AT液、AU液、AV液、AW液及びAX液とした。また、同様に、上述のプラスミドpCRB209ubiCREH及びpCRB209ubiCTBDを制限酵素BamHIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquickGelExtractionKit株式会社キアゲン社製によって回収したgapAプロモーターとラルストニアユートロファ株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約17kbのDNA断片、gapAプロモーターとチオバチルスデニトリフィカンス株由来ubiC遺伝子とターミネーター配列を連結した約16kbのDNA断片とBamHIで切断したクローニングベクターpCRB1NakataKetalVectorsforthegeneticsengineeringofcorynebacteriainSahaBCFermentationBiotechnologyACSSymposiumSeries862WashingtonAmericanChemicalSociety175191約41kbを70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させたDNA断片を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションAY液及びAZ液とした。得られたライゲーションK液、L液、AN液、AO液、AP液、AQ液、AR液、AS液、AT液、AU液、AV液、AW液、AX液、AY液及びAZ液を用い、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SalIまたはBamHIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB1約41kbのDNA断片に加え、エシェリヒアコリ株由来ubiC遺伝子ライゲーションK液の場合、長さ約15kbの挿入断片、シュードモナスプチダ株由来ubiC遺伝子ライゲーションL液の場合、長さ約16kbの挿入断片、アシネトバクターバウマンニ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAN液の場合、長さ約15kbの挿入断片、アゾトバクタービネランジー株由来ubiC遺伝子ライゲーションAO液の場合、長さ約16kbの挿入断片、クロモハロバクターサレキシゲンス株由来ubiC遺伝子ライゲーションAP液の場合、長さ約16kbの挿入断片、シトロバクターコセリ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAQ液の場合、長さ約15kbの挿入断片、シトロバクターヤンガエ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAR液の場合、長さ約15kbの挿入断片、エンテロバクタークロアカエ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAS液の場合、長さ約15kbの挿入断片、マリノバクターアクアエオレイ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAT液の場合、長さ約16kbの挿入断片、マリノモナスメディテラネア株由来ubiC遺伝子ライゲーションAU液の場合、長さ約15kbの挿入断片、パントエアアナナティス株由来ubiC遺伝子ライゲーションAV液の場合、長さ約15kbの挿入断片、シュードアルテロモナスハロプランクティス株由来ubiC遺伝子ライゲーションAW液の場合、長さ約15kbの挿入断片、ラルストニアユートロファ株由来ubiC遺伝子ライゲーションAY液の場合、長さ約17kbの挿入断片、シューワネラプトレファシェンス株由来ubiC遺伝子ライゲーションAX液の場合、長さ約16kbの挿入断片、チオバチルスデニトリフィカンス株由来ubiC遺伝子ライゲーションAZ液の場合、長さ約16kbの挿入断片が認められた。エシェリヒアコリ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCEC、シュードモナスプチダ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCPPとそれぞれ命名した図2。アシネトバクターバウマンニ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCACB、アゾトバクタービネランジー株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCAVN、クロモハロバクターサレキシゲンス株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCCSA、シトロバクターコセリ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCCKO、シトロバクターヤンガエ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCCIT、エンテロバクタークロアカエ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCECL、マリノバクターアクアエオレイ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCMAQ、マリノモナスメディテラネア株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCMME、パントエアアナナティス株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCPAM、シュードアルテロモナスハロプランクティス株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCPHA、ラルストニアユートロファ株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCREH、シューワネラプトレファシェンス株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCSPC、チオバチルスデニトリフィカンス株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1ubiCTBDとそれぞれ命名した。フェノール生産遺伝子のpCRB15へのクローニング上述のプラスミドpCRB209aroGCGを制限酵素BamHIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquickGelExtractionKit株式会社キアゲン社製によって回収したgapAプロモーターとコリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子及びターミネーター配列を連結した約24kbのDNA断片とBamHIで切断した上述のプラスミドpCRB15約38kbを70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させたDNA断片を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションM液とした。得られたライゲーションM液を用い、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、ゼオシン25μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BamHIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB15約38kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子ライゲーションM液の場合、長さ約24kbの挿入断片が認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子を含むプラスミドをpCRB15aroGCGと命名した図3。コリネバクテリウムグルタミカムの染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウムグルタミカム株pobA遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウムグルタミカム株の染色体上pobA遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際してコリネバクテリウムグルタミカムRの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。pobA1領域増幅用プライマーa14;5’CTCTTCTAGAGAAACGATCAAGTGCACCAG3’b14;5’GACACGAGCGTTTATACCTCTAATTGCCACTGGTACGTGG3’尚、プライマーa14には、XbaI制限酵素部位が付加されている。pobA2領域増幅用プライマーa15;5’GAGGTATAAACGCTCGTGTC3’配列番号42b15;5’CTCTGAGCTCGAGAACACGAACCATACGAG3配列番号43尚、プライマーb15には、SacI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、コリネバクテリウムグルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウムグルタミカムコリpobA1領域の場合約10kb、pobA2領域の場合約10kbのDNA断片が検出できた。次に、上記のPCRにより増幅したpobA1領域断片とpobA2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。さらに、得られたpobA1及びpobA2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpobA欠失断片の増幅を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、pobA欠失断片約20が検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカムR由来pobA欠失配列約20DNA断片10μlと約44kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725JMolMicrobiolBiotechnol、Vol8、243254、特開20061244402μlを各々制限酵素XbaI及びSacIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションN液とした。得られたライゲーションN液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaI及びSacIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約44kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来pobA欠失遺伝子ライゲーションN液の場合、長さ約20kbの挿入断片が認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来pobA欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725pobACGと命名した。コリネバクテリウムグルタミカム株poxF遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウムグルタミカム株の染色体上poxF遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際してコリネバクテリウムグルタミカムRの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。poxF1領域増幅用プライマーa27;5’CTCTTCTAGATACGTCCTAAACACCCGAC3’を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウムグルタミカムpoxF1領域の場合約08kb、poxF2領域の場合約08kbのDNA断片が検出できた。次に、上記のPCRにより増幅したpoxF1領域断片とpoxF2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。さらに、得られたpoxF1及びpoxF2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpoxF欠失断片の増幅を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、poxF欠失断片約16kbが検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカムR由来poxF欠失配列約17kbDNA断片10μlと約44kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725JMolMicrobiolBiotechnolVol8243254、特開20061244402μlを各々制限酵素XbaIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションZ液とした。得られたライゲーションZ液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約44kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来pheA欠失遺伝子ライゲーションZ液の場合、長さ約17kbの挿入断片が認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来poxF欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725poxFCGと命名した。4ヒドロキシベンゾエート分解に関わる遺伝子破壊株の構築マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウムグルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725pobACGを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムRを形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地A液体培地、および15寒天に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10スクロース含有BT寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2mlを蒸留水1Lに溶解、および15寒天に塗付した。プラスミドpCRA725pobACGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725pobACG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラスサブチリスBacillussubtilisのsacRsacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725pobACG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacRsacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウムグルタミカムR株pobA遺伝子マーカーレス破壊株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumΔpobAと命名した。コリネバクテリウムグルタミカム株pobA、poxF遺伝子破壊株の構築マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウムグルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725poxFCGを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムΔpobA株を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地A液体培地、および15寒天に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10スクロース含有BT寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2mlを蒸留水1Lに溶解、および15寒天に塗付した。プラスミドpCRA725poxFCGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725poxFCG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラスサブチリスBacillussubtilisのsacRsacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725poxFCG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacRsacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウムグルタミカムΔpobA株poxF遺伝子マーカーレス破壊株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumΔpobAΔpoxFと命名した。フェノール生産遺伝子導入株の構築コリネバクテリウムグルタミカム野生株、及びΔpobA株の形質転換上述のプラスミドpCRB1ubiCEC及びpCRB209bsdBCDBSを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムR株及びコリネバクテリウムグルタミカムΔpobA株を形質転換し、クロラムフェニコール5μgml及びカナマイシン50μgmlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら2種類のプラスミドは、コリネバクテリウムグルタミカム内で共存可能なプラスミドである。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB1ubiCEC及びpCRB209bsdBCDBSの導入が認められた。R株に導入した株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE11、ΔpobA株に導入した株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE13と命名した。上述のプラスミドpCRB1ubiCEC、pCRB209bsdBCDBS及びpCRB15aroGCGを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムR株及びコリネバクテリウムグルタミカムΔpobA株を形質転換し、クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら3種類のプラスミドは、コリネバクテリウムグルタミカム内で共存可能なプラスミドである。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB1ubiCEC、pCRB209bsdBCDBS及びpCRB15aroGCGの導入が認められた。R株に導入した株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE12、ΔpobA株に導入した株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE14と命名した。上述のプラスミドpCRB1ubiCPP及びpCRB209bsdBCDBSを用いて、電気パルス法AgricBiolChemVol54、443447及びResMicrobiolVol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムR株及びコリネバクテリウムグルタミカムΔpobA株を形質転換し、クロラムフェニコール5μgml及びカナマイシン50μgmlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら2種類のプラスミドは、コリネバクテリウムグルタミカム内で共存可能なプラスミドである。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB1ubiCPP及びpCRB209bsdBCDBSの導入が認められた。R株に導入した株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE15、ΔpobA株に導入した株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE17と命名した。上述のプラスミドpCRB1ubiCPP、pCRB209bsdBCDBS及びpCRB15aroGCGを用いて、電気パルス法AgricBiolChemVol54443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムR株及びコリネバクテリウムグルタミカムΔpobA株を形質転換し、クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら3種類のプラスミドは、コリネバクテリウムグルタミカム内で共存可能なプラスミドである。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB1ubiCPP、pCRB209bsdBCDBS及びpCRB15aroGCGの導入が認められた。R株に導入した株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE16、ΔpobA株に導入した株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE18と命名した。コリネバクテリウムグルタミカムΔpobAΔpoxF株の形質転換上述のプラスミドpCRB1ubiCPP、pCRB209bsdBCDBS、pCRB209dcaBAE、pCRB209dcaBSS、pCRB209dcaCKO、pCRB209dcaEAE、pCRB209dcaECL、pCRB209dcaEHO、pCRB209dcaESA、pCRB209dcaECK、pCRB209dcaEFE、pCRB209dcaPPY、pCRB209dcaPAM及びpCRB15aroGCGをそれぞれ用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムΔpobAΔpoxF株を形質転換し、クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら3種類のプラスミドpCRB1、pCRB209及びpCRB15は、コリネバクテリウムグルタミカム内で共存可能なプラスミドである。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB1ubiCPP、pCRB209bsdBCDBS、pCRB209dcaBAE、pCRB209dcaBSS、pCRB209dcaCKO、pCRB209dcaEAE、pCRB209dcaECL、pCRB209dcaEHO、pCRB209dcaESA、pCRB209dcaECK、pCRB209dcaEFE、pCRB209dcaPPY、pCRB209dcaPAM及びpCRB15aroGCGの導入が認められた。ΔpobAΔpoxF株においてpCRB1ubiCPP、pCRB209bsdBCDBS及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE191、pCRB1ubiCPP、pCRB209dcaBAE及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE192、pCRB1ubiCPP、pCRB209dcaBSS及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE193、pCRB1ubiCPP、pCRB209dcaCKO及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE194、pCRB1ubiCPP、pCRB209dcaEAE及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE195、pCRB1ubiCPP、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE196、pCRB1ubiCPP、pCRB209dcaEHO及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE197、pCRB1ubiCPP、pCRB209dcaESA及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE198、pCRB1ubiCPP、pCRB209dcaECK及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE199、pCRB1ubiCPP、pCRB209dcaEFE及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE1910、pCRB1ubiCPP、pCRB209dcaPPY及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE1911、pCRB1ubiCPP、pCRB209dcaPAM及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE1912と命名した。上述のプラスミドpCRB1ubiCEC、pCRB1ubiCACB、pCRB1ubiCAVN、pCRB1ubiCCSA、pCRB1ubiCCKO、pCRB1ubiCCIT、pCRB1ubiCECL、pCRB1ubiCMAQ、pCRB1ubiCMME、pCRB1ubiCPAM、pCRB1ubiCPHA、pCRB1ubiCREH、pCRB1ubiCSPC、pCRB1ubiCTBD、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムΔpobAΔpoxF株を形質転換し、クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら3種類のプラスミドpCRB1、pCRB209及びpCRB15は、コリネバクテリウムグルタミカム内で共存可能なプラスミドである。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB1ubiCEC、pCRB1ubiCACB、pCRB1ubiCAVN、pCRB1ubiCCSA、pCRB1ubiCCKO、pCRB1ubiCCIT、pCRB1ubiCECL、pCRB1ubiCMAQ、pCRB1ubiCMME、pCRB1ubiCPAM、pCRB1ubiCPHA、pCRB1ubiCREH、pCRB1ubiCSPC、pCRB1ubiCTBD、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた。ΔpobAΔpoxF株においてpCRB1ubiCEC、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE201、pCRB1ubiCACB、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE202、pCRB1ubiCAVN、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE203、pCRB1ubiCCSA、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE204、pCRB1ubiCCKO、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE205、pCRB1ubiCCIT、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE206、pCRB1ubiCECL、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE207、pCRB1ubiCMAQ、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE208、pCRB1ubiCMME、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE209、pCRB1ubiCPAM、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2010、pCRB1ubiCPHA、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2011、pCRB1ubiCREH、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2012、pCRB1ubiCSPC、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2013、pCRB1ubiCTBD、pCRB209dcaECL及びpCRB15aroGCGの導入が認められた株をコリネバクテリウムグルタミカムPHE2014と命名した。上述の遺伝子組換えの概要を、以下の表1にまとめて示す。コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE18は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足258郵便番号2920818の独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託した受託日:2010年10月21日、受託番号:NITEBP-995。<遺伝子起源略語>BS;バチラスサブチリスEC;エシェリキアコリPP;シュードモナスプチダCG;コリネバクテリウムグルタミカムBAE;バチラスアトロファエウスBSS;バチラスサブチリス亜種スピジゼニイCKO;シトロバクターコセリEAE;エンテロバクターアエロゲネスECL;エンテロバクタークロアカエEHO;エンテロバクターホルメシェイESA;エンテロバクターサカザキECK;エシェリヒアコリWEFE;エシェリヒアフェルグソニーPPY;パエニバチラスポリミキサPAM;パントエアアナナティスACB;アシネトバクターバウマンニAVN;アゾトバクタービネランジーCSA;クロモハロバクターサレキシゲンスCIT;シトロバクターヤンガエMAQ;マリノバクターアクアエオレイMME;マリノモナスメディテラネアPHA;シュードアルテロモナスハロプランクティスREH;ラルストニアユートロファSPC;シューワネラプトレファシェンスTBD;チオバチルスデニトリフィカンス<遺伝子名>ubiCコリスメートピルベートリアーゼChorismatepyruvatelyase遺伝子bsdBCD4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子aroGDAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase遺伝子pobA4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ遺伝子dca4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子poxFフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase遺伝子実施例2コリネバクテリウムグルタミカムフェノール生産遺伝子導入株及び副生経路破壊株のフェノール生成実験実施例1において作製したコリネバクテリウムグルタミカムフェノール遺伝子導入株PHE11-PH18に関して、フェノールの生産比較を行った。各々のコリネバクテリウムグルタミカムフェノール遺伝子導入株PHE11-PH18を、表2に示す抗生物質を含むA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムフェノール遺伝子導入株を、表2に示す各抗生物質を含むA液体培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40gを蒸留水1Lに溶解10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムフェノール生産遺伝子導入株を、各抗生物質を含むA液体培地10mlに植菌し、33°Cにて24時間、好気的に振盪培養を行った。フェノールの定量は、24時間後にサンプリングした反応液を遠心分離4°C、15000×g、10分し、得られた上清液を液体クロマトグラフィーで分析することにより行った。なお、野生株コリネバクテリウムグルタミカムについても同様の方法でフェノール生産を試みたが、フェノール生成は検出されなかった。各菌株によるフェノール生産量を以下の表2に示す。<遺伝子起源略語>BS;バチラスサブチリスEC;エシェリキアコリPP;シュードモナスプチダCG;コリネバクテリウムグルタミカム<培地添加抗生物質>Aクロラムフェニコール5μgmlBカナマイシン50μgmlCゼオシン25μgml<遺伝子名>ubiCコリスメートピルベートリアーゼChorismatepyruvatelyase遺伝子bsdBCD4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子aroGDAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase遺伝子pobA4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ遺伝子表2に示されるように、コリネバクテリウムグルタミカムPHE11は、04mMのフェノールを、PHE12は、09mMのフェノールを、PHE13は、08mMのフェノールを、PHE14は、18mMのフェノールを、PHE15は、11mMのフェノールを、PHE16は、35mMのフェノールを、PHE17は、16mMのフェノールを、PHE18は、63mMのフェノールを培養液中に生産していた。この結果から、以下の事項が導かれる。ubiC遺伝子とbsdBCD遺伝子をコリネバクテリウムグルタミカムに導入することにより、初めて、実用的なグルコースからフェノール生成が可能となった。ubiC遺伝子として、エシェリキアコリ由来遺伝子を用いるよりも、シュードモナスプチダ由来遺伝子を用いる方が、フェノール生産性が高かった。ubiC遺伝子とbsdBCD遺伝子の導入に加えて、aroG遺伝子を導入することによりフェノール生成量が増大した。pobA遺伝子を破壊することにより、フェノール生産性が一層向上した。実施例3コリネバクテリウムグルタミカムフェノール生産遺伝子導入株及び副生経路破壊株のフェノール生成実験実施例1において作製したコリネバクテリウムグルタミカムフェノール遺伝子導入株PHE191~PHE1912に関して、フェノールの生産比較を行った。各々のコリネバクテリウムグルタミカムフェノール遺伝子導入株PHE191~PHE1912を、抗生物質クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含むA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムフェノール遺伝子導入株を、抗生物質クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含むA液体培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40gを蒸留水1Lに溶解10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムフェノール生産遺伝子導入株を、抗生物質クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含むA液体培地10mlに植菌し、33°Cにて24時間、好気的に振盪培養を行った。フェノールの定量は、24時間後にサンプリングした反応液を遠心分離4°C、15000×g、10分し、得られた上清液を液体クロマトグラフィーで分析することにより行った。各菌株によるフェノール生産量を以下の表3に示す。<遺伝子起源略語>BS;バチラスサブチリスEC;エシェリキアコリPP;シュードモナスプチダCG;コリネバクテリウムグルタミカムBAE;バチラスアトロファエウスBSS;バチラスサブチリス亜種スピジゼニイCKO;シトロバクターコセリEAE;エンテロバクターアエロゲネスECL;エンテロバクタークロアカエEHO;エンテロバクターホルメシェイESA;エンテロバクターサカザキECK;エシェリヒアコリWEFE;エシェリヒアフェルグソニーPPY;パエニバチラスポリミキサPAM;パントエアアナナティス<遺伝子名>ubiCコリスメートピルベートリアーゼChorismatepyruvatelyase遺伝子bsdBCD4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子aroGDAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase遺伝子pobA4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ遺伝子dca4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子poxFフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase遺伝子表3の結果と、表2のPHE18のフェノール生産性結果を比較することにより、pobA遺伝子の破壊に加えて、poxF遺伝子の破壊を重ねると、より生産性が向上することがわかった。さらに、バチルスサブチリス由来のbsdBCD遺伝子の代わりに、バチラスアトロファエウス由来のdca遺伝子、又は、バチラスサブチリス亜種スピジゼニイ由来のdca遺伝子、又は、シトロバクターコセリ由来のdca遺伝子、又は、エンテロバクターアエロゲネス由来のdca遺伝子、又は、エンテロバクタークロアカエ由来のdca遺伝子、又は、エンテロバクターホルメシェイ由来のdca遺伝子、又は、エンテロバクターサカザキ由来のdca遺伝子、又は、エシェリヒアコリ由来のdca遺伝子、又は、エシェリヒアフェルグソニー由来のdca遺伝子、又は、パエニバチラスポリミキサ由来のdca遺伝子、又は、パントエアアナナティス由来のdca遺伝子を、ubiC遺伝子及びaroG遺伝子と共にコリネバクテリウムグルタミカムΔpobAΔpoxF株に導入しても、同等あるいはそれ以上のフェノール生産性が観察された。実施例4コリネバクテリウムグルタミカムフェノール生産遺伝子導入株及び副生経路破壊株のフェノール生成実験実施例1において作製したコリネバクテリウムグルタミカムフェノール遺伝子導入株PHE196及びPHE201~PHE2014に関して、フェノールの生産比較を行った。各々のコリネバクテリウムグルタミカムフェノール遺伝子導入株PHE196及びPHE201~PHE2014を、抗生物質クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含むA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムフェノール遺伝子導入株を、抗生物質クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含むA液体培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40gを蒸留水1Lに溶解10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムフェノール生産遺伝子導入株を、抗生物質クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含むA液体培地10mlに植菌し、33°Cにて24時間、好気的に振盪培養を行った。フェノールの定量は、24時間後にサンプリングした反応液を遠心分離4°C、15000×g、10分し、得られた上清液を液体クロマトグラフィーで分析することにより行った。各菌株によるフェノール生産量を以下の表4に示す。<遺伝子起源略語>PP;シュードモナスプチダECL;エンテロバクタークロアカエCG;コリネバクテリウムグルタミカムEC;エシェリキアコリACB;アシネトバクターバウマンニAVN;アゾトバクタービネランジーCSA;クロモハロバクターサレキシゲンスCKO;シトロバクターコセリCIT;シトロバクターヤンガエMAQ;マリノバクターアクアエオレイMME;マリノモナスメディテラネアPAM;パントエアアナナティスPHA;シュードアルテロモナスハロプランクティスREH;ラルストニアユートロファSPC;シューワネラプトレファシェンスTBD;チオバチルスデニトリフィカンス<遺伝子名>ubiCコリスメートピルベートリアーゼChorismatepyruvatelyase遺伝子aroGDAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase遺伝子pobA4ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ遺伝子dca4ヒドロキシベンゾエートデカルボキシラーゼ遺伝子poxFフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase遺伝子表4の結果より、シュードモナスプチダ由来のubiC遺伝子の代わりに、エシェリキアコリ由来のubiC遺伝子、アシネトバクターバウマンニ由来のubiC遺伝子、アゾトバクタービネランジー由来のubiC遺伝子、クロモハロバクターサレキシゲンス由来のubiC遺伝子、シトロバクターコセリ由来のubiC遺伝子、シトロバクターヤンガエ由来のubiC遺伝子、マリノバクターアクアエオレイ由来のubiC遺伝子、マリノモナスメディテラネア由来のubiC遺伝子、パントエアアナナティス由来のubiC遺伝子、シュードアルテロモナスハロプランクティス由来のubiC遺伝子、ラルストニアユートロファ由来のubiC遺伝子、シューワネラプトレファシェンス由来のubiC遺伝子、又はチオバチルスデニトリフィカンス由来のubiC遺伝子を、dca遺伝子及びaroG遺伝子と共にコリネバクテリウムグルタミカムΔpobAΔpoxF株に導入しても、有意なフェノール生産性が観察された。実施例5コリネバクテリウムグルタミカムPHE18を用いた還元条件下におけるフェノール生成実験実施例1で創製したコリネバクテリウムグルタミカムPHE18フェノール生成株を、クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含有したA寒天培地に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムPHE18フェノール生成株を、クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28°Cにて10時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムPHE18フェノール生成株を、クロラムフェニコール5μgml、カナマイシン50μgml及びゼオシン25μgmlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、33°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、終濃度OD61060となるようにBT液体培地07硫酸アンモニウム、005リン酸二水素カリウム、005リン酸水素二カリウム、005硫酸マグネシウム7水和物、00006硫酸鉄7水和物、000042硫酸マンガン水和物、000002ビオチン、000002チアミン塩酸塩に懸濁した。このそれぞれの菌体懸濁液60mlを容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下酸化還元電位;450mV、グルコースを初発5、12時間後にさらに5を添加し、33°Cで攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが70を下回らないように25Nのアンモニア水を用いてpHコントローラーし、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。この結果、コリネバクテリウムグルタミカムPHE18フェノール生成株は、還元条件下における反応において、24時間後に92mMのフェノールを生成していた。本発明の形質転換体が、還元条件下で一層効率良くフェノールを生成することが分かる。実施例6フェノール生産用宿主としての適性試験1フェノールによる好気増殖への影響コリネバクテリウムグルタミカム、エシェリヒアコリおよびシュードモナスプチダについて、好気培養におけるフェノールの生育阻害試験を行った。尚、本試験に用いたシュードモナスプチダS12は、溶媒耐性菌として報告されており、これまでに唯一フェノール生産の宿主として用いられた技術が開示されている。コリネバクテリウムグルタミカムRをA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、33°C、15時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムRを、A液体培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40gを蒸留水1Lに溶解10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムRを、A液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノールが終濃度0、016、02、024、032mMとなるように添加し、33°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。エシェリヒアコリJM109をLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布し、37°C、15時間暗所に静置した。上記プレートで生育したエシェリヒアコリJM109を、LB液体培地1ポリペプトン、05酵母エキスおよび05塩化ナトリウム10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、37°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したエシェリヒアコリJM109をLB液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、016、020mMとなるように添加し、37°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。シュードモナスプチダF1およびS12をLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布し、30°C、15時間暗所に静置した。上記プレートで生育したシュードモナスプチダF1およびS12を、LBグルコース液体培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウムおよび04グルコース10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、30°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したシュードモナスプチダF1およびS12株をLBグルコース液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、010、020mMとなるように添加し、30°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。培地中へのフェノール添加による好気増殖への影響の解析結果を図4に示す。エシェリヒアコリは、016フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け、020フェノールでは完全に増殖が阻害された。シュードモナスプチダF1及び溶剤耐性菌として報告されていたシュードモナスプチダS12は、ほぼ同じ傾向を示し、010フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け020フェノールでは完全に増殖が阻害された。これに対して、コリネバクテリウムグルタミカムは、エシェリヒアコリが顕著な増殖阻害を受けた016のフェノール存在下においても増殖への影響はほとんどなく、エシェリヒアコリやシュードモナスプチダでは完全に増殖を阻害された020のフェノール存在下においても良好な生育を示した。さらに024のフェノール存在下において増殖が可能であった。このように、コリネバクテリウムグルタミカムはエシェリヒアコリおよびシュードモナスプチダと比較して、フェノールに対し高い耐性を有し、フェノール生産の宿主として高い適性を有することが示された。により回収した。得られた菌体を、10wvとなるようにBT液体培地07硫酸アンモニウム、005リン酸二水素カリウム、005リン酸水素二カリウム、005硫酸マグネシウム7水和物、00006硫酸鉄7水和物、000042硫酸マンガン水和物、000002ビオチン、000002チアミン塩酸塩に懸濁した。このそれぞれの菌体懸濁液60mlを容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下酸化還元電位;450mV、グルコースを8、フェノール濃度を0、024、038、046mMとなるように添加し、33°Cに保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが70を下回らないように25Nのアンモニア水を用いてpHコントローラーエイブル株式会社製、型式:DT1023でコントロールしながら反応した。コリネバクテリウムグルタミカムRの還元条件下における糖代謝に及ぼすフェノールの影響を検討した結果を図5に示す。還元条件下においては、好気培養において増殖阻害が認められた024フェノール存在下でも、フェノールによる影響は全く見られず、フェノール未添加と同等の糖消費を示した。さらに、038のフェノール存在下でも糖消費を認められ、046のフェノール存在下においても僅かながら糖消費を示した。このように、好気培養と比較して、還元条件ではフェノールに対して高い耐性を示し、還元条件下におけるコリネバクテリウムグルタミカムを宿主としたフェノール生産が、好気条件下における生産と比較して優位であることが示された。"