"式を有する単離した化合物であり、210nmで少なくとも98a/aHPLC純度を有する化合物。前記化合物が、210nmで少なくとも98.97a/aHPLC純度を有する、請求項1に記載の化合物。請求項1に記載の前記化合物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。ダイコンソウGeumjaponicumから請求項1に記載の前記化合物を抽出する改善された方法であり、AダイコンソウGeumjaponicumのメタノール性/水溶液を沈殿させかつ濾過して不必要な固体を除去することと、Bジクロロメタン及びTBMEで、前記メタノール/水溶液を相分離抽出することと、Cn-ブタノールで抽出することと、の工程を含む方法。請求項1に記載の化合物組成物を、物質充填に対する樹脂の最適質量比15:1及びメタノール/水の段階濃度を使用する、低圧DiaionHP-20吸着クロマトグラフィーにかけること、続いて物質充填に対する樹脂の最適質量比20:1及びジクロロメタン/メタノールの段階濃度を使用する低圧シリカゲルクロマトグラフィーにかけることを更に含む、請求項4に記載の方法。請求項1に記載の化合物組成物を、濃度勾配プログラムで水性緩衝液及びメタノール移動相を使用する、高圧逆相クロマトグラフィーにかけることを更に含む、請求項5に記載の方法。前記高圧逆相クロマトグラフィーが、Luna登録商標C182カラムを使用することを含む、請求項6に記載の方法。請求項1に記載の化合物を単離する方法であって、AダイコンソウGeumjaponicumのメタノール抽出物から抽出物を得ることと、B前記抽出物をキラル相クロマトグラフィー又は超臨界液体クロマトグラフィーにかけること、の工程を含み、これによって前記化合物が獲得される、方法。前記キラル層クロマトグラフィーが、ChiralakICカラムを使用することを含む、請求項8に記載の方法。C前記化合物を結晶化することを更に含む、請求項8に記載の方法。請求項1に記載の化合物を加水分解することによって得られる単離した無糖体。式を有する単離した無糖体であり、少なくとも92の純度を有する無糖体。請求項12に記載の前記無糖体と薬学的に許容可能な担体とを有する医薬組成物。請求項3に記載の前記医薬組成物を、これを必要とする患者に投与することを含む、心筋を再生するための方法。請求項13に記載の前記医薬組成物を、これを必要とする患者に投与することを含む、心筋を再生するための方法。間葉幹細胞を請求項1又は12に記載の化合物を含む組成物に接触させることを含む、心原性分化を誘導又は増強するための方法。冠動脈疾患のための心筋梗塞は、早期死の主要原因である。1つの解決策は、梗塞した心臓組織を、内因性前駆体プールからの再生した心筋で又は外因的に導入された幹細胞で置き換えることである。ダイコンソウGeumjapnoniumのメタノール性抽出物が、Chenngらによって、このような潜在能力を有することが示された。上述したように、Chengらは、カルジオジェニンの単一の立体異性体の獲得を示唆する方法において彼らの手順を記載しているが、現在の小分子医薬品物質の典型的承認期待値である、210nmで少なくとも95~98a/aのHPLC純度によって特性化されるカルジオジェニン組成物の実用可能な単離には不十分な詳説があった。更には、Chengらは、単離されたカルジオジェニンの純度を記載しなかった。Chengの方法によると、得られた組成物中に不純物が存在したかどうか、及び存在した場合は、このような不純物の範囲が未知である。EGJからカルジオジェニンを抽出する従来の方法の評価の過程中に、抽出した組成物がカルジオジェニンの単一の立体異性体を含むだろうという予想で、抽出したカルジオジェニンの純度を分析するようHPLCアッセイ法が開発された。驚くべきことに、Chengらによって採用されたものに改良を加えたHPLCアッセイ法を使用して、本発明者は、カルジオジェニンを抽出する従来法が、同一の質量を有する接近して溶出する2つの異性体をむしろ生成することを観察した。引き続いて、LC-MS及び1H-NMRスペクトル分析の双方が実施され、それぞれの方法は、Chengの方法を介して生成されたカルジオジェニンが、2つのカルジオジェニン異性体を実際に含むことの発見を個々に立証した。このLC-MSの結果が、図2に示され、1H-NMRスペクトルが図3に示されている。本発明者はまた、Chengの方法に続いて、主異性体に起因し得る約16.78のHPLC不純物を伴い、単離されたカルジオジェニン主異性体のHPLC純度が、210nmで約75.73a/aにすぎない所見を見出した。更に、単離されたカルジオジェニン主異性体が生物学的に活性であり、不純物が生物学的に不活性であることも見出された。カルジオジェニンの主異性体の単離実質的な純度を有する単離されたカルジオジェニン主異性体を得るために、今まで認められなかったカルジオジェニン副異性体を含む不純物を除去するよう、方法が開発された。Chengら2009によって教示された抽出手順は、水に対するクロロホルム、酢酸エチル及び最終的にn-ブタノール相分離抽出を利用する。n-ブタノール相が、更なる精製のために保持され、他の有機相は廃棄された。カルジオジェニンのかなりの損失が酢酸エチル抽出で見られたので、本発明者は、毒性リスクを考えて、工業的製造スケールではクロロホルムは使用され得ないことを決定した。結果的に、抽出プロセスの最適化は実施されなかった。先ず初めに、EGJ抽出プロセスが、EGJのメタノールレスラリーの導入、それに続く濾過、濃縮及び水での希釈並びにセライト補助濾過の導入によって改善された。これらの工程は、EGJ抽出物から、望ましくない物質である、およそ50の固体を除去し、以下の有機相分離の際の後続のエマルジョン形成を低減するよう補助する。濾過固体が分析される場合、フィルターケーキはカルジオジェニンを含まない。次の水性/メタノール濾液のクロロホルム抽出が、操作者の安全性リスク及び環境的リスクの双方を提示する溶媒である高い毒性のクロロホルムを使用することを回避するために、ジクロロメタンで置き換えられた。TBMEでの抽出が追加され、これは、この抽出が、メタノール/水の濾液からカルジオジェニンを相当量を除去することなく、カルジオジェニンのものに接近した保持時間でのHPLC精製中に溶出する不純物を除去することが示されたためである。水性メタノール性相を飽和塩化ナトリウム溶液に変換し、n-ブタノールで抽出し、これによって、カルジオジェニンの良好な全体の回収率で、水性/メタノール相からカルジオジェニンを除去した。Chengら2009によって教示されたクロマトグラフィー分離は、異性体混合物の全体の純度を増加させるために、低圧DiaionHP-20吸着クロマトグラフィー、これに続いて低圧順相シリカ、及び最終的に高圧逆相クロマトグラフィー含むように組み込まれた。Diaion及び順相シリカクロマトグラフィーは、Chengらによって教示されたように全般的に実行されるが、条件が最適化される。特に、Diaionクロマトグラフィーが、物質充填に対する樹脂の最適質量比15:1の画定によって、並びに10増加量で80のMEOH/水まで増加する、20のMEOH/水で開始する段階濃度の使用によって最適化された。シリカゲルクロマトグラフィーは、物質充填に対する樹脂の最適質量比20:1の画定によって、並びに上記記載の操作者及び環境的安全性の観点のために移動相においてクロロホルムをジクロロメタンに置き換えて、ジクロロメタン/メタノール90:10~ジクロロメタン/メタノール80:20の範囲であるジクロロメタン/メタノールの段階濃度の使用によって、最適化された。このプロセスは、高圧逆相クロマトグラフィーの後に、キラル相クロマトグラフィー又は貯臨界液体クロマトグラフィーのいずれかの導入によって更に改善され、カルジオジェニンの、接近して溶出する2つのエナンチオマーの分離を可能にした。最終的に、分離されたカルジオジェニンの主異性体が、その純度を増加させるためにメタノール/水から結晶化され、HPLC純度法の溶出プロファイル全体を通して見られた低レベルの不純物を除去した。この方法によると、本発明は、Chengらによって報告されたものを超えるカルジオジェニンに対するEGJからの全収率で、少なくとも98HPLC純度でのカルジオジェニンの主異性体を提供する。この点に関して、好適な逆相クロマトグラフィー技術の部類は、非極性固定相を使用する任意のクロマトグラフィー法を包含する。極性化合物は、非極性化合物が保持されている一方で、早期に溶出される。このカラムは、オクタデシル炭素鎖C18が結合したシリカであることができる。溶離液は、ACN及び20mMのNH4OAcpH=7の混合物であることができる。次いで試料がMeOH:緩衝液=50:50v:v中に47g/Lで溶解される。溶出に関する温度は、室温であり得る。移動相濃度勾配は、線形様式で、80の20mM酢酸アンモニウム/アセトニトリル~65の20mM酢酸アンモニウム/アセトニトリルで移行する。カラムの流速は、ID=2cmカラム上で15mL/分であり得る。カルジオジェニンの存在は、210nmでHPLCによって検出され得る。図4に示すデータから計算されることができるように、主異性体の副異性体に対する吸収単位ピーク比は、2つのカルジオジェニン異性体の分離前に、ほぼ4.5:1である。2つのカルジオジェニン異性体は、キラル相クロマトグラフィーによって分離される。この点に関して、キラル相クロマトグラフィー技術の部類は、その中で固定相が、アキラルであるよりはむしろキラル化合物の単一のエナンチオマーを含有する任意のカラムクロマトグラフィーを包含する。キラル固定相の選択は、適切な分離を達成するために重要である。カルジオジェニンの2つの異性体は、キラルカラム固定相に結合される場合、それらの一過的に異なる溶解度特性のために、異なる時間でカラムから溶出する。このカラムは、Chiralpak登録商標IC商標カラムであることができる。溶離液は、IPM:MTBE=50:50v:vの混合物であり得る。試料は、IPA/MTBA=50:50v:v又はニートなIPA中に溶解されることができる。溶出の温度は室温であり得る。カラムの流速は、IPA:MTBE=50:50v:vの無勾配移動相を使用して、分析カラム上では1mL/分であり得るか、又は半分取カラム上ではより速い流速であり得る。カルジオジェニンの存在は、210nmでHPLCによって検出され得る。2つのカルジオジェニン異性体はまた、例えば、AntonBergerによる、SUPERCRITICALFLUIDCHROMATOGRAPHYWITHPACKEDCOLUMUN第1版、1997に記載されるような、超臨界液体クロマトグラフィーによって分離されることも可能である。この点に関して、好適な超臨界液体クロマトグラフィー技術の部類は、キラル化合物を分離するための順相の移動相を包含する。したがって、このカラムは、Chiralpak登録商標IC商標カラム、他のChiralpak登録商標固定相カラム又はC18カラムであることができるが、好ましくはChiralpak登録商標IC商標カラムである。濃度勾配溶離液は、CO2/MeOH又はCO2/ACNであることができる。カルジオジェニンの存在は、210nmでHPLCによって検出され得る。単離したカルジオジェニン主異性体の純度は、結晶化によって更に増加され得る。この点に関して、結晶化の部類は、カルジオジェニン主異性体の固体結晶を形成するための任意の方法を包含するが、典型的には、溶液、溶解物、又は気体から沈殿させることである。好ましい実施形態では、カルジオジェニン主異性体は、40°Cでメタノールの10容量に溶解される。次いで40容量の水が同時に、約50分間の時間にわたって、ゆっくりと添加され、この間、カルジオジェニン主異性体の結晶化が起こる。上述の方法によると、カルジオジェニン主異性体は、210nmで98.97a/aのHPLC純度で、並びに95.50w/wのNMRアッセイによる効力で、EGJから単離されることが可能である。単離したカルジオジェニン主異性体は、MTBE/IPA=50:50中又は固体としてのいずれかで保存される場合、安定な化合物である。これはまた、40°Cでの熱ストレスに耐性である。カルジオジェニン主異性体の構造は、以下に示される。カルジオジェニンの主異性体の無糖体対応する無糖体が、糖部分を分子の多環のコアに連結させるエステル結合の加水分解によって、多環式配糖体である単離されたカルジオジェニン主異性体から変換され得る。このような加水分解は、2つのアプローチのいずれかによって達成され得る:a酸触媒された加水分解であり、これはエステルを効果的に開裂するための鉱酸の希水溶液の使用を含む。得られる生成物は、糖と、カルジオジェニンの遊離カルボン酸形態である。b塩基触媒された加水分解鹸化であり、この中で、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムなどの塩基が、エステルを加水分解するために使用される。典型的には、このような加水分解は、水性媒質中で実行されるか、又は水と適切なアルコールとの混合物である溶媒系が使用される。塩基触媒された加水分解から得られる生成物は、カルジオジェニンのカルボン酸基の塩の形態である。この塩は、鉱酸を使用して、遊離酸に容易に変換され得る。図19は、カルジオジェニン主異性体の対応する無糖体への変換を図示する。このように得られた無糖体の構造は、以下に示される:心原性分化の誘導又は増強カルジオジェニン主異性体及び対応する無糖体は、インビトロ及びインビボの双方で、心原性分化を誘導又は増強するために使用され得る。この有用性は、カルジオジェニン主異性体又はその無糖体を含む組成物の存在下で培養されたMSCsが、心臓ミオサイトへの実質的に増強された分化を呈するという事実によって立証される。これに加えて、MSCsがカルジオジェニン主異性体又はその無糖体の存在下で心臓ミオサイトと共に共培養される場合、拍動する心臓ミオサイトがMSCsから分化する。医薬組成物及び投与量単離されたカルジオジェニン主異性体及び/又はその対応する無糖体は、単独で、又は同様な又は異なる生物学的活性を有する他の化合物と共に投与され得る。例えば、本発明の化合物及び医薬組成物は、併用療法で投与され得、すなわち、単一又は別個の投与形態で同時に投与されるか、又は別個の投与形態で互いに数時間又は数日以内に投与され得る。このような併用療法の例としては、脳卒中、骨格筋再生、創傷治癒、又は心臓疾患の問題を治療するために、カルジオジェニン主異性体及び/又はその対応する無糖体の化合物を、脳卒中、他の薬剤と共に投与することが挙げられる。したがって、一実施形態では、本発明は、薬学的に許容可能な担体で混合された、カルジオジェニン主異性体、その加水分解遊離酸生成物すなわち、無糖体、又はこの遊離酸の薬学的に許容可能な塩、並びにその溶媒和物、互変異性体、多形体、水和物、構造誘導体又はプロドラッグを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、この組成物は、医薬品配合の一般的に受容されているやり方に従って、1つ以上の追加的治療薬剤、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、アジュバント、安定化剤、乳化剤、防腐剤、着色剤、緩衝剤、風味付与剤、吸収増強剤、錯化剤、可溶化剤、湿潤剤及び界面活性剤を更に含有する。一実施形態では、医薬組成物は、カルジオジェニン主異性体の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、互換異性体、多形体、水和物、構造誘導体又はプロドラッグ、並びに薬学的に許容可能な担体を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、カルジオジェニン主異性体の無糖体又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、互換異性体、多形体、水和物、構造誘導体又はプロドラッグ、並びに薬学的に許容可能な担体を含む。本発明の組成物は、投与単位処方物で、経口的、非経口的、吸入又は噴霧、経皮的、膣内、又は直腸から投与され得る。本明細書で使用するとき、用語非経口的とは、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、クモ膜下、心室内、腹膜、心臓内注射又は灌注技術並びに任意の多数の追加的組織又は臓器への直接注射を介することを包含する。経口的使用に好適な本発明の組成物は、医薬組成物の製造のために当該技術分野で既知の任意の方法により調製され得る。例えば、本発明の組成物の液体処方物は、薬学的に有効かつ口当たりがよい異性体の調製物をもたらすために、甘味剤、可溶化剤、分散剤、風味剤、着色剤及び防腐剤からなる群から選択される1つ以上の薬剤を含有する。錠剤組成物については、非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤との混合物での活性成分が、錠剤を製造するために使用される。このような賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マンニトール、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤;造粒剤又は崩壊剤、例えばコーンスターチ、又はアルギン酸;結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアカシア;及び滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクが挙げられるが、これらに限定されない。この錠剤はコーティングされなくてもよく、又は胃腸管内での崩壊又は吸収を遅延させるために既知のコーティング技術によってコーティングされてもよく、これによって、所望の時間にわたる持続的治療効果をもたらすことができる。例えば、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートなどの徐放化物質が使用されてもよい。活性成分の遅延浸出をもたらす追加的錠剤処方物は、ヒドロゲル、浸透圧ポンプ錠剤、ワックスマトリックスの使用を含む、徐放性をもたらすよう使用され得る。経口使用のための処方物はまた、活性成分が、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、乳糖、マンニトール、メチルセルロース又はその誘導体、若しくはカオリンと混合されている硬質又は軟質ゼラチンカプセルとして、あるいは活性成分が水又は油媒質、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン又はオリーブ油と混合されている軟質ゼラチンカプセルとして存在することができる。水性懸濁液については、本発明の化合物が、安定な懸濁液を維持するために安定である賦形剤と混合される。このような賦形剤の例としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムが挙げられるが、これらに限定されない。経口懸濁液もまた、レシチン、又は脂肪酸との酸化アルキレンの縮合生成物例えば、ポリオキシエチレンステアレート、又はヘプタデカエチレンオキシセタノールなどの長鎖脂肪族アルコールとの酸化エチレンの生成物、若しくはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート又はポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの化合物などの分散剤又は湿潤剤を含むことができる。水性懸濁液はまた、1つ以上の防腐剤、例えば、エチル又はn-プロピルp-ヒドロキシベンゾエート、並びに1つ以上の着色剤、1つ以上の風味剤、並びにショ糖又はサッカリンなどの1つ以上の甘味剤を含有してもよい。上述したものなどの甘味剤、及び風味剤は、口当たりの良い経口調製物をもたらすよう添加され得る。これら組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって、保存されることが可能である。水の添加によって水性懸濁液の調製に好適である分散性粉末又は顆粒は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び1つ以上の防腐剤と混合された活性成分をもたらす。好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤は、既に上記で述べられたものによって例示される。甘味剤、風味剤及び着色剤などの追加的賦形剤もまた存在してもよい。本発明の医薬組成物は、水中油エマルジョンの形態であってもよい。この油相は、植物油、例えば、オリーブ油、ゴマ油、ピーナッツ油又はアラキス油、若しくは鉱油、例えば液体パラフィン又はこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤としては、天然ゴム、例えば、アカシアゴム又はトラガカントゴム、他の天然化合物、例えば、ダイズ、レシチン、Tween、並びに脂肪酸及びヘキシトールに由来のエステル又は部分的エステル、無水物、ソルビタンモノオレエート及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられるが、これらに限定されない。シロップ及びエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はショ糖で処方され得る。このような処方物はまた、粘滑剤、防腐剤、並びに風味剤及び着色剤を含有してもよい。この医薬組成物は、無菌の注射可能な水性懸濁液又は油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、上記で述べたこれら好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、既知の技術により処方され得る。無菌の注射可能な調製物もまた、非毒性の非経口の許容し得る希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液、例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液であり得る。使用され得る許容可能なビヒクル又は溶媒の中には、水、Ringerの溶液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。これに加えて、無菌の不揮発性油が、溶媒又は懸濁溶媒質として通常使用される。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の不揮発性油が使用されてもよい。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射可能な調製物における使用に有用である。実施例-カルジオジェニン主異性体及び対応する無糖体の単離及び活性1.抽出図5は、EGJからカルジオジェニン主異性体を生成するプロセスの概略概要を示す。それからEGJメタノール抽出物を調製する全植物を、中国の貴州省から収集した。この植物は、日本、韓国、及び北アメリカの地域の固有種としても知られていて、これらの地域から収集した材料は、本発明に記載の精製プロセスを介して、高純度のカルジオジェニンをもたらすことが可能なEGJの供給源として好適であるカルジオジェニンのレベルを同様に含有することが期待される。収集した材料を乾燥し、室温で3回、それぞれを6日間ずつ、メタノールで浸透させた。EGJ抽出物を、スプレー乾燥手順を使用して、減圧下で乾燥して、粉末残渣を生成した。500gのEGJ抽出物を、メタノール中で、Ti=41°Cで1時間攪拌した。室温までゆっくりと冷やした後に、懸濁液を濾別し、200mlのメタノールで濯いだ。フィルターケーキを、1.5Lのメタノール中に、Ti=41°Cで1時間再懸濁し、室温で更に20時間攪拌した。濾過後に、フィルターケーキを750mlのメタノールで濯いだ。合わせたメタノール濾液を濃縮し、280gの粗生成物1を得た。粗生成物1を、1LのTBME1.2Lの水中で攪拌し、濃厚なエマルジョンを得た。この濃厚なエマルジョンを、0.5Lのメタノールで希釈し、濾過して、フィルターケーキを0.5Lのメタノールで集中的に濯ぎ、合わせた濾液3.2Lを2Lの最終容量まで濃縮した。この時点で、微細な水性メタノール性懸濁液が形成され、これを、圧力を加えることなく、紙フィルター上を通して濾過し、透明な暗色の均質溶液に仕上げることができた。次いで、この水性メタノール性溶液を、0.3Lのジクロロメタンで3回抽出した。残留する水性メタノール性層を0.9Lのn-ブタノールで、続いて0.8Lの水で希釈し、良好な相分離1をもたらした。次いでこの水性層を0.3Lのn-ブタノールで洗浄した。合わせたn-ブタノール層およそ3.5Lを、0.5Lの食塩水で洗浄し、1.4Lの水性層と2.5Lのn-ブタノール層とに仕上げた。このn-ブタノールをロータリーエバポレータで濃縮し、およそ0.5Lの溶媒を除去した。残留するn-ブタノール層およそ2Lを、0.3Lの塩水で2回抽出した。n-ブタノール層の完全な濃縮によって、最終的に36.4gの粗生成物2に仕上げた。________________________________________良好な相分離1:あるいは、水性メタノール性懸濁液を、セライトの補助で、洗浄されたケーキで濾過することができる。次に、この水性メタノール性相を0.3~0.6Lのジクロロメタンで3回抽出し、0.3~0.6LのTBME部分で5回抽出する。この水性メタノール性相は、塩化ナトリウム飽和溶液に加えられ、最終的にn-ブタノールで抽出される。このプロセスは、DCM抽出中のエマルジョン形成を低減し、激しい発泡を回避しつつ、メタンールを除去しようとする場合に、水性メタノール性相を濃縮する必要性を回避する。2.HP-20吸着クロマトグラフィー545gの量の乾燥HP-20樹脂粗生成物2当たり、およそ15質量等価物の乾燥樹脂をメタノール中でスラリー化し、カラム7.5cm×21cm=927mlのカラム容量に移し、20メタノール/水に交換した。粗生成物2を、1~1.5容量の20メタノール/水に再懸濁させて、カラムにかけた。これを水中メタノールの増加する濃度10段階で溶出させた。20~30メタノール/水の段階については、2Lの2つフラクションを採取し、40~70メタノール/水の段階については、1Lの4つのフラクションを採取した。フラクションをHPLCにより分析した。ほとんどのカルジオジェニン含量は、フラクション9~17中にある。フラクション9及び10をプール-1として一緒にプールし、フラクション11~17をプール-2としてプールし、フラクション1~8及び18~20は廃棄した。濃縮乾固後に、プール-1は、およそ370mgのカルジオジェニンを含有する3.17gの固体を産生し、一方プール-2は、およそ1.2gのカルジオジェニンを含有する5.48gの固体を産生した。3.順相フラッシュクロマトグラフィープール-2固体5.4gを、30mlの出発溶離液DCM/メタノール90:10中でスラリー化し、供給物を調製した。DCM/メタノール90:10v:vで平衡化した100gのシリカゲルおよそ20質量等価物上で、分離を実施した。150mlの前溶出液を溶出させた後に、フラクションを50mlのアリコートで、フラクション32まで採取し、次いで溶離液をDC/メタノール85:15に変更して、100mlサイズのフラクションを採取した。フラクション42で、溶離液をDCM/メタノール80:20に変更した。フラクション38及び39を、プール-11として一緒にプールし、フラクション40~44をプール-22としてプールし、並びにフラクション45~51をプール-33としてプールした。濃縮乾固後に、プール-11は、およそ21mgのカルジオジェニン18.9w/wを含有する0.11gの固体を産生し、プール-22は、およそ391mgのカルジオジェニン58.4w/wを含有する0.67gの固体を産生し、並びにプール-33は、およそ775mgのカルジオジェニン57.0w/wを含有する1.36gの固体を産生した。4.逆相クロマトグラフィーカルジオジェニンの全体の純度を増加させるために、以下のパラメータを使用して、逆相分離を実施した。単離手順は、ACNをロータリーエバポレータで40°C及び減圧で蒸発させること、引き続いて残留溶液を凍結乾燥することからなる。単離された泡状物を、ACN/水中におよそ1:2v:vで再懸濁し、再度凍結乾燥して、NH4OAcの残留痕跡を除去した。プール-22及びプール33を合わせて、60ランで分離し、1.29gの白色泡状物を産生した。図4に示すように、1.29gの混合物は、92.6a/aの合わせたHPLC純度を有する2つの異性体を含む。5.キラル相クロマトグラフィー1.29gの混合物中の2つの異性体を分離するために、以下のパラメータを使用して、キラル相分離を実施した。フラクション3及び4は、主としてカルジオジェニンの主異性体を含むが、フラクション1及び2は、主としてカルジオジェニンの副異性体を含む。フラクションを蒸発乾固し、同様な方法で再処理し、最大収率を確保した。フラクション1及び2並びにフラクション3及び4をそれぞれ合わせて、ワークアップした。このワークアップは、再度の蒸発乾固、これに続く、水:ACN=75:25v:v中の溶解後の凍結乾燥工程で構成された。このワークアップは、主異性体96.49a/aについては900mgの白色粉末を、副異性体については180mgの白色粉末をもたらした。6.負荷試験互いから分離された2つのカルジオジェニン異性体が安定でありかつ互いに変換することがないかどうかを決定するために、負荷試験を実施した。具体的には、2つのカルジオジェニン異性体は、MTBE/IPA=50:50中に、又は40°Cで固体として24時間保存されることで主異性体が溶液中又は固体として、副異性体が溶液中のみで保存、ストレス負荷された。カルジオジェニン異性体の全ての単一の不純物ピーク及び2つの異性体の比もまた、測定の精度内で同一であった。組成物における変化も、方法の精度内で認められなかった。2つのカルジオジェニン異性体は安定な化合物であり、熱的ストレスに十分に耐えることとを結論付けることができた。7.結晶化単離された白色固体としてのカルジオジェニン主異性体900mgを、透明な溶液が得られるまで、To=40°Cで10容量のメタノール中で攪拌した。水40容量を、To=40°Cで、50分以内にゆっくりと加えた。水を約6滴加えた後に、結晶化が開始した。添加が完了後、濃厚な白色懸濁液を室温に冷やし、濾過して、残留固体を少量の母液でフラスコから流出させた。フィルターケーキを、メタノール/水1:4で洗浄し、ロータリーエバポレータで乾燥して、756mgのカルジオジェニンを白色固体結晶として供給した。結晶化後の単離したカルジオジェニン主異性体の純度は、210nmでのHPLCによって示すように図6参照、98.97a/aであり、その同一性は1H-NMRスペクトル分析図7参照によって確認される。精製したカルジオジェニン主異性体の構造は、X線結晶解析法によって確認され、図8に図示する。これに加えて、1H-NMRアッセイは、精製したカルジオジェニン主異性体の効力が95.50w/wであることを示す。8.鹸化単離したカルジオジェニン主異性体を、図19に示すように、過剰のNaOHを使用して、MeOH:H2O1:1中で鹸化を受けさせた。単離したカルジオジェニン主異性体の得られた無糖体は、HPLCによる少なくとも92の純度を有する。9.生物学的活性MSCsの心原性分化を誘導することの活性に関して試験されたものは、5つの化合物であり、これは単離したカルジオジェニン主異性体HUYA-1、単離したカルジオジェニン副異性体HUYA-2、カルジオジェニン副異性体の無糖体HUYA-3、カルジオジェニン主異性体の無糖体HUYA-4、及びChengら、2009の方法に従って調製されたカルジオジェニン組成物Carであった。図9~13のそれぞれで、C18逆相クロマトグラフィープロファイルが、これら化合物に関して示されている。試験は、以下に記載される手順に従って実施された:ラットの頸骨/大腿骨を除去し、αIMDM培養基でBM骨髄を骨から流出させた。このBMを十分に混合し、1,500rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを3mlの培養基で懸濁させて、形成した細胞懸濁液を、撹乱を最小限に抑えて、4mlのFicoll溶液上に注意深く配置し、次いで200rpmで30分にわたって遠心分離した。第2層を管に移し、PBSで二回洗浄してFicollを除去した1,200rpmで5分間。得られた細胞ペレットを、10の熱不活性化FBCGIBCO及び1のペニシリン/ストレプトマイシン抗生剤混合物を含有するIMDM培養基中に再懸濁させて、これを試験用に使用した。24時間の培養後に、非接着細胞を廃棄した。培地を3日毎に交換して、接着細胞を培養した。この細胞は、14日間の培養後に、ほぼ集密状態になった。心原性形態学的移行を活性化するために、MSCsをHUYA-1、HUYA-2、HUYA-3、HUYA-4又はCarIMDM培養基中10μg/mlの存在下で7日間培養した。処置時間依存的形態学的移行を、位相差顕微鏡で、経時的ベースで評価した。HUYA-1、HUYA-2、HUYA-3、HUYA-4又はCarIMDM培養基中10μg/mlを有する培養中のMSCsの3日又は7日処置後に、それぞれで、インビトロでの処置されたMSCsの心原性分化を立証するために、処置後3日では初期心原性分化因子2MEF2aに特異的な抗体を使用して、並びに処置後7日では収縮タンパク質ミオシン重鎖βMEF2aβ蛍光免疫細胞化学法を実施した。蛍光免疫染色に関する方法が簡単に概説される:培養した細胞をPBS中4のパラホルムアルデヒドで15分間固定化し、0.5のTritonX-100で15分間、透過性にした。抗体の希釈物は以下のようである:ラットMEF2aに特異的なウサギポリクローナル抗体1:500及びMHCに特異的なマウスモノクローナル抗体1:500両抗体はabcam登録商標から入手。二次抗体は、フルオロホアFITC496/528及びCy5650/667、abcam登録商標の製品と複合化した、それぞれヤギ抗-マウス及びウサギ抗-IgG抗体であった。核はDAPIで染色された。蛍光顕微鏡で検証されたものは、培養されたMSCsの心原性分化に関連する形態学的移行及び特異的マーカータンパク質の発現であった。骨髄GFP-MSCsを、GFP-遺伝子導入マウスの脛骨/大腿骨から単離した。このGFP-MSCsを、HUYA-1IMDM培養基中10μg/mlの存在下で、新生児SDラットから単離した心臓ミオサイトと共培養し、心臓の微細環境を疑似した。この培養を、蛍光顕微鏡下で毎日観察し、拍動するGFP-陽性細胞を同定し、培養したGFP-MSCsの形態学的移行を測定した。図14及び15に示すように、単離したカルジオジェニン主異性体HUYA-1が最も活性な化合物であって、これは培養したMSCsの20以上を、細胞培養において心原性分化へと誘導した。HUYA-1は、Chengら2009により生成されたカルジオジェニン組成物Carよりも活性であった。カルジオジェニン主異性体の無糖体HUYA-4もまた、MSCsを心原性分化へと誘導した。HUYA-1と比較されるこの低い活性は、HUYA-4の細胞培養基中のより低い溶解度のためであり得る。HUYA-4の溶解度を増加させるために、DMSO濃度が5から10まで増加された。これらと比較して、単離されたカルジオジェニン副異性体HUYA-2及びその無糖体HUYA-3は、本質的に不活性であって、心原性MSC分化の観察された誘導のみに関しては、本質的に不活性であった。図18は、共培養系において、HUYA-1がGFP-MSCsの心原性分化を誘導し、拍動する心臓ミオサイトを形成することを立証する。"