"正常乳腺上皮細胞に、以下の処理1及び2を施すことにより、腫瘍細胞を作製する方法。1p53の機能損失2v-Src遺伝子の導入サイクリン依存性キナーゼ遺伝子の強制発現がさらに施される、請求項1に記載の方法。前記サイクリン依存性キナーゼ遺伝子が、Cdk4遺伝子である、請求項2に記載の方法。正常乳腺上皮細胞に、以下の処理1~3を施すことにより、腫瘍細胞を作製する方法。1p53の機能損失2EGFR変異遺伝子の導入3c-Myc遺伝子の導入前記腫瘍細胞が、エストロゲン受容体の発現が陰性かつプロゲステロン受容体の発現が陰性かつERBB2の発現が陰性である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記正常乳腺上皮細胞が哺乳類、霊長類またはげっ歯類由来の細胞である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。請求項1~6のいずれか1項に記載の方法により製造された腫瘍細胞。以下の工程を含む、腫瘍の治療剤のスクリーニング方法。a請求項7に記載の腫瘍細胞と候補物質とを接触させる工程b腫瘍細胞の増殖阻害効果を検出する工程請求項7に記載の腫瘍細胞が移植された担癌モデル動物。以下の工程を含む、腫瘍の治療剤のスクリーニング方法。a請求項9に記載の担癌モデル動物と候補物質とを接触させる工程b腫瘍細胞の増殖阻害効果を検出する工程以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2010年7月7日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願特願2010-154744号の明細書及び図面に記載の内容を包含する。1.腫瘍細胞の作製方法本発明は、その第一の態様において、正常乳腺上皮細胞に、以下の処理1及び2を施すことにより、腫瘍細胞を作製する方法を提供する。なお、処理1、2の順番は特に限定されない。1p53の機能損失2v-Src遺伝子の導入上記態様において、本発明の方法は、上記の処理に加え、処理3として、サイクリン依存性キナーゼ遺伝子を強制発現させる工程を含んでいてもよい。本発明は、その第二の態様において、正常乳腺上皮細胞に、以下の処理1~3を施すことにより、腫瘍細胞を作製する方法を提供する。なお、処理1~3の順番は特に限定されない。1p53の機能損失2EGFR変異遺伝子の導入3c-Myc遺伝子の導入本発明の方法は、TERT遺伝子を導入することなく、正常乳腺上皮細胞を腫瘍化させることを特徴とする図2参照。外来遺伝子の発現によって正常細胞から腫瘍細胞を作製する方法において、TERT遺伝子を導入することなく腫瘍細胞の作製に成功した例は、未だ報告されていない。本発明において、正常乳腺上皮細胞とは、乳腺上皮に由来する正常細胞であれば特に限定されるものではない。乳腺はたとえばヒト、サル、マウスなどの哺乳動物で発達していることが知られている。本発明において、正常乳腺上皮細胞とは、好ましくは哺乳類の乳腺上皮又は乳管上皮に由来する正常細胞であり、より好ましくは霊長類又はげっ歯類の乳腺上皮又は乳管上皮に由来する正常細胞であり、さらに好ましくはヒトの乳管上皮又は乳管上皮に由来する正常細胞である。かかる正常細胞のうち、さらに好ましくは、乳管の外層を構成する筋上皮に由来する正常細胞Myoepithelialcellである図1参照。正常細胞とは、健康な状態、即ち、検出可能な疾患又は異常を有しない状態の細胞を意味し、正常ヒト乳腺上皮細胞とは、健常人のヒトの乳腺上皮細胞など検出可能な疾患又は異常を有しない状態にあるヒトの乳腺上皮細胞である。以下において、ヒト乳腺上皮細胞をHME細胞HumanMyoepithelialcellと呼ぶ。HME細胞は、ヒトから採取したものを用いてもよく、あるいは市販の細胞例えば、Lonza社Walkersville,MD,USAから販売される細胞を用いてもよい。p53の機能喪失とは、p53タンパク質がその本来の生物学的機能を有しないことを意味する。p53タンパク質は、TP53遺伝子によりコードされ、TP53遺伝子は、DNA修復タンパク質の活性化、細胞周期の制御、アポトーシスの誘導に関与するp53タンパク質をコードする遺伝子であり、その機能異常が種々の癌の発生と関連しているLane,D.P.1992Nature358:15-16ことが知られている。p53の機能を喪失させる方法としては、種々の方法が適用でき、p53タンパク質が機能を喪失するのであれば特に限定されないが、例えば、p53タンパク質の中和抗体の添加、前記抗体をコードする遺伝子の細胞導入、p53タンパク質をコードする遺伝子以下、TP53遺伝子というのノックアウト、RNA干渉によるTP53遺伝子のノックダウンSatoMetalCancerRes.66,20062116-2128参照、ドミナントネガティブTP53遺伝子の強制発現等が挙げられる。本発明において好ましいp53の機能を喪失させる方法としては、ドミナントネガティブTP53遺伝子以下、p53CT遺伝子ともいうの遺伝子導入である。ドミナントネガティブTP53遺伝子のヌクレオチド配列は、Shaulian,E.らの文献Mol.Cell.Biol.,Dec1992;12:5581を参照することで得られる。p53タンパク質の機能喪失に際して使用するTP53遺伝子又はp53タンパク質は、好ましくは哺乳動物由来の遺伝子又はタンパク質であり、より好ましくは霊長類由来の遺伝子又はタンパク質であり、さらに好ましくは、ヒト由来の遺伝子又はタンパク質である。なお、p53の機能を喪失させる代わりに、カスパーゼ-3、-8~10、12等他のアポトーシス誘導タンパク質の機能を喪失させてもよい。この場合もp53の機能喪失と同様の方法で当該タンパク質の機能を喪失させることが可能である。v-Src遺伝子は、レトロウィルスの一種であるRoussarcomavirusに由来するがん関連遺伝子として発見されたものであり、その配列はMayerBJetal.JVirol.1986Dec;603:858-67.に記載されている。サイクリン依存性キナーゼCdk遺伝子は、細胞周期の回転に関与するタンパク質をコードする遺伝子であり、そのファミリーは、Cdk1~13から構成される。本発明において正常乳腺上皮細胞に導入するCdk遺伝子は、Cdk1~13のいずれをコードする遺伝子であってもよいが、好ましくは、Cdk4をコードする遺伝子Cdk4遺伝子を用いることができる。Cdk4は、CyclinD1の結合パートナーであり、Cdk4遺伝子の変異が各種腫瘍内で検出されているZuo,L.etal.,1996.NatureGenet.12,97-99。Cdk遺伝子のヌクレオチド配列は、NCBIデータベースに登録されているものを使用すればよい。本発明において、Cdk遺伝子は、好ましくは哺乳動物由来のCdk遺伝子であり、より好ましくは霊長類由来のCdk遺伝子であり、さらに好ましくはヒト由来のCdk遺伝子である。EGFR遺伝子は、上皮成長因子受容体タンパク質をコードする遺伝子であり、EGFR遺伝子の発現上昇は肺がん、乳がん、大腸がん、胃がん、脳腫瘍など多くのがんで認められる。SharmaSVetal.,NatureRevCancer.2007;73:169-81。本発明において、EGFR変異遺伝子は、野生型が変異したEGFR遺伝子であり、例えば、790番目のスレオニン残基がメチオニンに、858番目のロイシン残基がアルギニンに置換されたEGFRT790M.L858R変異タンパク質配列番号10をコードする遺伝子が挙げられる。EGFR変異遺伝子のヌクレオチド配列は、NCBIデータベースに登録されている野生型の遺伝子配列を基に、McCoy,M.S.etalMol.Cell.Biol.,1984,4,1577-1582、Samuels,YetalScience,2004,304,554又はScott、K.D.etalCancerRes,2007,67,5622-5627に記載の方法により作製可能である。本発明において、EGFR遺伝子は、好ましくは哺乳動物由来のEGFR遺伝子であり、より好ましくは霊長類由来のEGFR遺伝子であり、さらに好ましくはヒト由来のEGFR遺伝子である。c-Myc遺伝子は、種々の遺伝子の発現調節及びDNA複製に関与するDNA結合因子タンパク質、即ち転写因子タンパク質をコードする遺伝子であり、c-Myc遺伝子の発現異常は、種々のがんとの関連性が示唆されているDominguez-Sola,D.etal.,2007.Nature448,445-451。c-Myc遺伝子のヌクレオチド配列は、NCBIデータベースに登録されているものを使用すればよい。本発明においては、c-Myc遺伝子は、好ましくは哺乳動物由来のc-Myc遺伝子であり、より好ましくは霊長類由来のc-Myc遺伝子であり、さらに好ましくは、ヒト由来のc-Myc遺伝子である。後述する実施例において使用する各遺伝子の各ヌクレオチド配列及びペプチド配列を下記表1に示すが、これらに限定されない。遺伝子導入方法本発明において、遺伝子をHME細胞に導入する場合、当該遺伝子を適切な発現カセットとして発現ベクターに挿入し、該ベクターでHME細胞を形質転換すればよい。適切な発現カセットは、少なくとも以下のi~iiiを構成要素として含む。iHME細胞で転写可能なプロモーター;ii該プロモーターにin-frameに結合した遺伝子;及びiiiRNA分子の転写終結及びポリアデニル化シグナルをコードする配列HME細胞で転写可能なプロモーターの例としては、CMV、CAG、LTR、EF-1α、SV40プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記発現ベクターは、前記発現カセットの他に、形質転換されたHME細胞をセレクションするための選択マーカー発現カセットを有していてもよい。選択マーカーの例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のポジティブセレクションマーカー、LacZ、GFPGreenFluorescenceProtein及びルシフェラーゼ遺伝子などの発現レポーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子HSV-TK、ジフテリア毒素AフラグメントDTA等のネガティブセレクションマーカー等が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換されたHME細胞は、上記マーカーにより容易に選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして導入した細胞であれば、G418を加えた培地中で培養することにより、一次セレクションを行うことができる。また、ターゲティングベクターがGFP等の蛍光タンパク質の遺伝子をマーカーとして含む場合には、薬剤耐性によるセレクションに加えて、FACSFluorescenceActivatedCellSorter等を用いた蛍光タンパク質発現細胞のソーティングを行ってもよい。HME細胞への遺伝子の導入に使用可能な発現ベクターは、例えば細胞へ遺伝子導入可能な発現ベクターが挙げられ、市販されているものを用いてもよい。例としてpEGFP-C1TMClontech、pCMV-HATMClontech、pMSCVpuroTMClontech、pEF-DEST51TMInvitrogen、pCEP4TMInvitrogen、ViraPowerIILentiviralGatewaySystemTMInvitrogen等が挙げられる。発現ベクターは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ウィルス感染等、公知の遺伝子導入法によりHME細胞へ導入することができる。遺伝子導入法の詳細については、SambrookRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3,ColdSpringHarbor,LaboratoryPress2001等を参照することができる。2.腫瘍細胞本発明において腫瘍細胞とは、invivoで自立的に過剰増殖する細胞を意味し、上記の腫瘍細胞の作製方法において作製された腫瘍細胞のみならず、後述する担癌モデル動物から採取される腫瘍細胞であってもよく、あるいは、当該担癌モデル動物から採取される腫瘍細胞をinvitroで培養した細胞であってもよい。腫瘍細胞の例としては、乳がん腫に含まれる細胞が挙げられる。本発明のある実施態様では、腫瘍細胞の好ましい形態として、乳がん細胞が挙げられる。腫瘍細胞は、より好ましくは、エストロゲン受容体EstrogenReceptor:ER、プロゲステロン受容体ProgesteronReceptor:PgR及びERBB2別称はHER2タンパク質の全てのマーカーについて陰性のトリプルネガティブ型乳がん細胞である。細胞の腫瘍化を確認する場合には、被検細胞を適切なモデル動物に皮下注射して腫瘍塊形成を観察することにより確認することができる。モデル動物の例としては、ヒトを除く哺乳動物が好ましく、特に免疫抑制された哺乳動物が好ましい。免疫抑制された哺乳動物の例としては、ヌードラット及びヌードマウスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細胞の腫瘍化を確認するための別の方法としては、被検細胞をソフトアガー上で培養し、そのコロニー形成を観察する方法ソフトアガーコロニー形成アッセイが挙げられる。具体的には、TP53変異遺伝子及びv-Src遺伝子を導入したHME細胞を一定の細胞濃度に調製した上でソフトアガー培地に播種し、細胞増殖速度を観察する方法が挙げられる。ソフトアガーコロニー形成アッセイの詳細については、以下の文献を参照できる:Tanaka,S.etal.,Proc.natl.Acad.Sci.USA.94:2356-2361,1997。本発明において得られる腫瘍細胞以下、本発明の腫瘍細胞は、非常に高い増殖能を有することを特徴とする。図4Aに示すように、本発明の腫瘍細胞は、ヒト乳がん細胞株MDA-MB231細胞ATCCHTB-26と比べて顕著に高い増殖能を有する。また、ある実施態様において、本発明の腫瘍細胞をモデル動物に移植して得られる腫瘍組織は、ER-、PgR-、ERBB2-であり、たとえばヒト由来の乳腺上皮細胞を用いた場合にはER-、PgR-、HER2-であり、トリプルネガティブ型の乳がん細胞の形態を示す図5、6及び8。ヒトのトリプルネガティブ型の乳がんで観察される腫瘍細胞では、ホルモン受容体であるER及びPgRが発現しておらず、また、受容体型チロシンキナーゼであるHER2も発現していないため、ホルモン療法又は化学療法による治療効果が期待できず、最も治療が困難な種類の乳がんであると考えられている。本発明の腫瘍細胞は、いずれも腫瘍形成率及び増殖能が高い。特に、モデル動物に本発明の腫瘍細胞を移植して腫瘍を形成させた場合、乳腺管上皮細胞が属する動物種において自然発生し得る腫瘍組織と病理学的に酷似した腫瘍をモデル動物で形成する。例えば、ヒト由来の乳腺上皮細胞を移植した場合には、ヒトであるがん患者から採取されたがん組織、特に、トリプルネガティブ型乳がん組織と病理学的に酷似した腫瘍をモデル動物で形成する。従って、本発明の腫瘍細胞は、トリプルネガティブ型乳がんの治療法又は治療薬の開発に非常に有用である可能性を有している。3.担癌モデル動物本発明において担癌モデル動物とは、前記腫瘍細胞をヒトを除くモデル動物に移植して腫瘍塊が形成された動物を意味する。モデル動物の例としては、ヒトを除く哺乳動物が好ましく、マウス、ラット、ブタ、イヌ、サル、ハムスター、ウサギなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。このようなモデル動物のうち、哺乳動物が好ましく、さらに霊長類又はげっ歯類に属する動物が好ましい。これらのうち、特に免疫抑制された哺乳動物が好ましく、さらには免疫抑制された霊長類又はげっ歯類に属する動物が好ましい。免疫抑制された哺乳動物は、通常の哺乳動物にシクロスポリン等の免疫抑制剤を投与することにより作製することもできるが、好ましくは、遺伝的バックグラウンドにより先天的に免疫が抑制された哺乳動物が好ましい。先天的に免疫が抑制された哺乳動物の例としては、ヌードラット及びヌードマウスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。モデル動物への前記腫瘍細胞の移植方法は特に限定されない。移植されるモデル動物に応じて従来から利用されている方法を適宜選択すればよい。マウス以外に移植した事例として例えば、GeneticinductionoftumorigenesisinSwineOncogene26,1038-104511September2006等を参照できる。移植した腫瘍細胞の再摘出の容易性の観点からは、皮下注射又は腹腔内注射による移植が好ましく、一方で、解剖学的な観点からは、同所移植が好ましい。4.抗腫瘍剤のスクリーニング方法本発明は、腫瘍の治療剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法の第一の態様として、以下の工程を含む、腫瘍の治療剤のスクリーニング方法を提供する。a本発明の腫瘍細胞と候補物質とを接触させる工程b腫瘍細胞の増殖阻害効果を検出する工程また、本発明のスクリーニング方法の第二の態様として、以下の工程を含む、腫瘍の治療剤のスクリーニング方法を提供する。a本発明の腫瘍細胞が移植された担癌モデル動物と候補物質とを接触させる工程b腫瘍細胞の増殖阻害効果を検出する工程上記において、腫瘍細胞と候補物質とを接触させるまたは腫瘍細胞が移植された担癌モデル動物と候補物質とを接触させるとは、該候補物質が、腫瘍細胞表面の分子と相互作用を生じさせる程度に接近するか、該分子と結合するか、又は該腫瘍細胞内に取り込まれる条件を調整することを意味する。腫瘍細胞が、たとえば培養細胞などの腫瘍細胞である場合、該細胞が接している培養培地に該候補物質を一定濃度以上で添加することにより、該細胞と候補物質とを接触させることができる。一方、腫瘍細胞が動物体内に移植されている場合、すなわち、腫瘍細胞が移植された担癌モデル動物の場合、該動物に候補物質を一定量で投与することにより、該腫瘍細胞と候補物質とを接触させることができる。この場合、投与経路は、候補物質の投与に一般的に採用されている経路であれば、特に限定はされないが、具体例としては、経口、舌下、経鼻、経肺、経消化管、経皮、点眼、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、局所注射、外科的移植が挙げられ、好ましくは経口投与、腹腔内注射及び静脈内注射である。候補物質の例としては、既に抗腫瘍効果が確認されている薬剤及び抗腫瘍作用の可能性がある化合物、ポリペプチド、核酸、抗体及び低分子化合物等が挙げられる。このような候補物質の具体例としては、代謝拮抗剤例えば、5-フルオロウラシル5-FU、葉酸代謝拮抗薬例えば、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ阻害薬であるスルファジアジン及びスルファメトキサゾール、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬DHFR阻害薬であるメソトレキセート、トリメトプリム、ピリメタミン、ピリミジン代謝阻害薬例えば、チミジル酸シンターゼ阻害薬である5-FU、フルシトシン5-FC、プリン代謝阻害薬例えば、IMPDH阻害薬である6-メルカプトプリン及びそのプロドラッグであるアザチオプリン、アデノシンデアミナーゼADA阻害薬例えば、ペントスタチン、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬であるヒドロキシウレア、ヌクレオチドアナログプリンアナログであるチオグアニン、リン酸フルダラビン及びクラドリビン、ピリミジンアナログであるシタラビン及びゲムシタビン、L-アスパラギナーゼ、アルキル化剤例えば、ナイトロジェンマスタードであるシクロホスファミド、メルファラン及びチオテパ、白金製剤であるシスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン、ニトロソウレアであるダカルバシン、プロカルバシン及びラニムスチン抗腫瘍性構成物質ザルコマイシン、マイトマイシンC、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、トポイソメラーゼ阻害剤イリノテカン、ノギテカン、ドキソルビシン、エトポシド、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、微小管重合阻害剤ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、コルヒチン、微小管脱重合阻害薬パクリタキセル、ドセタキセル、分子標的剤トラスツズマブ、リツキシマブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、エルロチニブ、デキサメサゾン等のステロイド薬、フィナステリド、アロマターゼ阻害剤及びタモキシフェン並びにこれらの組合せが挙げられるが、以上に限定されるものではない。腫瘍細胞の増殖阻害効果については、同一の細胞数を同一の細胞密度で培養ディッシュに播種した同一条件の培養系、あるいは同一の細胞数を同一の細胞密度で移植した同一系統の担癌モデル動物を2系用意し、一方の系サンプルの細胞に前記候補物質を接触させ、他方の系コントロールの細胞には前記候補物質を接触させずに、両系の腫瘍細胞の増殖を観察し、一定期間経過後に前記2系のそれぞれに含まれる腫瘍細胞数を測定し、比較することで増殖阻害効果を確認することができる。本発明の腫瘍細胞を培養細胞など腫瘍細胞の形態でスクリーニングに用いる場合、上記サンプル細胞に候補物質を接触させた後に、サンプル細胞の細胞数とコントロール細胞の細胞数とをセルカウンター等で測定し、それぞれの細胞数を比較して腫瘍増殖効果を確認することができる。本発明の腫瘍細胞をモデル動物に移植した形態でスクリーニングに用いる場合、すなわち、腫瘍細胞が移植された担癌モデル動物の形態でスクリーニングに用いる場合、サンプル系のモデル動物に候補物質を投与した後に、サンプル系及びコントロール系の動物から腫瘍組織を取り出し、該サンプル系及びコントロール系の腫瘍組織に含まれる細胞数を測定及び比較することができる。あるいは、前記腫瘍組織を取り出して、該腫瘍組織の体積をサンプル系とコントロール系の間で比較して、腫瘍増殖効果を確認することもできる。腫瘍の体積は、以下の式により求めることができる。腫瘍体積=ab2/2a:横幅、b:長さあるいは、サンプル系及びコントロール系の動物に候補物質を投与した後に、腫瘍細胞の移植箇所に対し、計測可能な腫瘍塊が形成された割合をサンプル系とコントロール系の間で比較して、腫瘍増殖効果を確認することもできる。モデル動物は、項目3.担癌モデル動物で述べたモデル動物と同様である。モデル動物への移植方法は特に限定されないが、移植した腫瘍細胞の再摘出の容易性から、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。サンプル系の腫瘍細胞の増加率が、コントロール系の腫瘍細胞の増加率よりも小さい場合には、用いた候補物質は、抗腫瘍効果を有するものと判断することができる。あるいは、本発明の腫瘍細胞に関し、既に一定の条件下での増加率について複数のデータが存在する場合には、そのデータを統計処理して得られる平均値、標準偏差等から導き出される基準値と比較して判断してもよい。腫瘍の増殖率の平均値、標準偏差等は、種々の統計方法によって得ることができるが、具体的には、培養細胞であれば、播種した時点の初期細胞数及び細胞密度をパラメーターとし、あるいは移植細胞であれば使用したモデル動物の移植時の体重及び移植した腫瘍細胞の細胞数をパラメーターとして、IBMSSPSStatistics18SSPS等の統計解析ソフトでtwo-wayANOVA解析することにより求めることができる。本発明の方法の実施により得られた腫瘍細胞の増殖率を新たなデータとして統計解析用の母集団に加えて母数を大きくすることにより、さらに解析の精度を向上させることができる。本発明の腫瘍細胞は、患者から採取された乳がん細胞と病理学的に酷似した特徴を示すことから、本発明のスクリーニング方法で腫瘍細胞の増殖抑制効果が確認された抗腫瘍剤は、実際にがん患者、特に乳がん患者例えば、トリプルネガティブ型乳がんの治療に用いた場合にも抗腫瘍効果を奏すると期待される。以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。本実施例では、正常HME細胞に、表1に示す遺伝子の組合せを導入することにより腫瘍細胞を作製した。以下の記載において、HME細胞に導入した遺伝子の種類に応じて、作製した各腫瘍細胞を下記の表に示すように表記する。以下に、本実施例で行った実験の手順を記載する。細胞培養HME細胞は、30歳の白人女性に由来する正常ヒト乳腺上皮細胞をLonza社Walkersville,MD,USAから購入した。この細胞を、コラーゲンコーティングしたディッシュ上で、Lonza社から提供された種々の増殖因子を添加した血清不含MEGMmediumMEGMBulletKit;Lonza中にて培養した。細胞は、湿潤インキュベーター内で低酸素環境下3O2及び5CO2で37°Cにて維持し、これを本実施例において使用するHME細胞として使用した。レトロウィルスベクターの作製及び該レトロウィルスベクターのHME細胞への導入表1に示した遺伝子のうち、v-Src、Cdk4、ドミナントネガティブTP53、EGFRT790.L858R及びc-Mycをそれぞれ以下の表に示すベクターに組み込むことにより、レトロウイルス発現用ベクターを作製した。上記のレトロウイルス発現用のベクターと、TakaraBio社Shiga,Japanより購入したpGPおよびpE-ecoプラスミドを293T細胞に導入することで、ウイルスベクターを作製した。その後に、EcotropicreceptorEcoVRを発現させたHME細胞に上記ウイルスベクターを感染させた。上記ウィルスベクターに感染した細胞は、puromycin、bleocineの存在下で2週間培養することによりセレクションを行った。いずれの薬剤でセレクションを行う場合でも、培養細胞は、感染細胞のポリクローナルな増殖集団から選択した。なお、EcotropicreceptorEcoVRを発現させたHME細胞は以下の手順で作製した。以下のプライマーを用いてMouseEcotropicretrovirusreceptorSlc7al,NM_007513の全コーディング領域を含むcDNAをRT-PCRによりクローニングした。上記RT-PCRの増幅産物をpCX4hygベクターGenBankAccessionNo:AB086387に組み込んだ。該ベクターと、TakaraBio社Shiga,Japanより購入したpGP及びpE-Amphoプラスミドとを293T細胞に導入することで、ウイルスベクターを作製し、該ウィルスベクターをHME細胞に感染させ、hygromycinの存在下で2週間培養することにより感染細胞のセレクションを行った。イムノブロット法タンパク質の測定、SDS-PAGE及びイムノブロッティングは、先の文献Akagi,T.etal.,2002.Mol.CellBiol.22,7015-7023の記載に従って行った。免疫反応陽性タンパク質のシグナルは、SuperSignalWestFemtoreagentPierce社を用いてケミルミネセンスにより可視化した。抗Src抗体、抗リン酸化SrcTyr416抗体及び抗p53抗体は、CellSignalingTechnology社より、抗リン酸化チロシン抗体4G10はMillipore社より入手した。異種移植片増殖実験マウスを用いて異種移植片増殖実験を行った。具体的には、表1に示す遺伝子の組合せを発現させたHME細胞を1x106個含む細胞懸濁液single-cell-suspensionを、50MATRIGELTMBDBioscience,SanJose,CA,USAに懸濁し、週齢6又は7のメスの胸腺欠損ヌードマウスBALB/cnu/nu;JapanSLC,Hamamatsu,Japanまたは、NOD-SCIDマウスのわき腹に皮下注射した。移植後、目視で腫瘍塊の形成の有無を確認した。腫瘍塊の形成に際しては、移植後12週経過時に指でつまめる程度の体積の腫瘍塊の形成が認められない場合には、陰性と判断した。また、移植後、ノギスを用いて腫瘍の寸法を測定し、以下の式に基づいて腫瘍の体積を計算し、造腫瘍能として見積もった。腫瘍体積=ab2/2a:横幅、b:長さまた、各がん関連遺伝子が導入されたHME細胞の移植箇所に対し、計測可能な腫瘍塊が形成された割合を腫瘍形成率として算出し、造腫瘍能として見積もった。組織学的分析及び免疫組織化学染色異種移植片増殖実験において、移植した異種移植片を、移植後20日目に取り出した。当該移植片を、ホルマリン固定及びパラフィン包埋した後に切片化し、通常のプロトコルに従ってヘマトキシリンエオジンHE染色を行った。先の文献Sasai,K.etal.,2008.Am.J.Surg.Pathol.32,1220-1227の記載に従い、以下の抗体を用いて免疫組織化学染色を行った:サイトケラチン5/6CK5/6;DAKO,M7237、エストロゲン受容体ER;DAKO,M7040、プロゲステロン受容体PgR;DAKO,M3569、HER2DAKO,K5204。具体的には、以下の手順で免疫組織化学染色を行った。厚さ4μmの組織切片をキシレンで脱パラフィン化した後にエタノールで脱水した。圧力鍋にて、10mMクエン酸バッファーpH6.0中で2分間加熱することにより、抗原を賦活させた。0.01Tween20含有リン酸干渉生理食塩水PBSTで組織切片を再水和させ、0.3過酸化水素とインキュベートさせることで、内在性のペロキシダーゼを不活化させた。組織切片を、適切な希釈濃度の1次抗体で4°Cにて一晩インキュベートし、PBSTで洗浄した後、室温にてEnvisionDualLinksolutionDako,Glostrup,Denmarkで30分間インキュベートした。次に、ジアミノベンジジンDakoで切片を処理して抗原抗体反応部位を可視化させ、ヘマトキシリン処理を90秒間行って核染色を行った。組織切片のスライドをEntellanNeureagentMerck,WhitehouseStation,NJでマウントした後にカバーガラスで封入し、観察に供した。実験結果[1]HME細胞へ導入した遺伝子の発現確認イムノブロッティングを行い、HME細胞へ導入された遺伝子の発現を確認した。HME/453/v-Src細胞及びHME/53/v-Src細胞に導入したドミナントネガティブTP53遺伝子及びv-Src遺伝子が発現していることを、抗リン酸化Src抗体及び抗p53抗体を用いた抗体抗原反応により確認したそれぞれ図3A及び図3B。また、v-Src遺伝子の機能により、チロシンのリン酸化が増強していることを抗リン酸化チロシン抗体により確認し、目的とする遺伝子が導入され、かつ発現していることを確認した図3C。[2]作製された腫瘍細胞の造腫瘍能の確認作製された腫瘍細胞をヌードマウスに皮下移植し、移植された腫瘍片の造腫瘍能を確認した図4、7及び8。図7に示すように、HMEC細胞に対してドミナントネガティブTP53遺伝子の導入が行われた細胞HME/53細胞及びドミナントネガティブTP53遺伝子及びCdk4遺伝子の導入が行われた細胞HME/53/Cdk4細胞では、腫瘍塊の形成が確認されなかった。図4及び7に示すように、HMEC細胞に対してドミナントネガティブTP53遺伝子及びv-Src遺伝子の導入が行われた細胞HME/53/Cdk4/v-Src細胞及びHME/53/v-Src細胞では、指でつまめる程度以上の腫瘍塊の形成が確認され、100の腫瘍形成率を示した。また、図4A及び図4Bに示すように、HME/53/Cdk4/v-Src細胞及びHME/53/v-Src細胞は、従来利用されているヒト乳がん細胞株MDA-MB231細胞と比べて短期間でより大きな腫瘍を形成することから、高い増殖能を有することが明らかになった。図7に示すように、ドミナントネガティブTP53遺伝子が導入されたHMEC細胞HME/53細胞に対し、EGFRT790.L858R遺伝子又はc-Myc遺伝子のいずれかを単独で導入したHME/53/EGFRT790.L858R及びHME/53/c-Myc細胞では、腫瘍塊が形成されなかった。一方、ドミナントネガティブTP53遺伝子、EGFRT790.L858R遺伝子及びc-Myc遺伝子の組み合わせを導入したHME/53/EGFRT790.L858R/c-Myc細胞では、腫瘍塊の形成が確認され、100の腫瘍形成率を示した。[3]作製された腫瘍細胞の表現型の確認異種移植片増殖実験により得られた腫瘍組織の表現型を確認するために種々のがんマーカーで免疫染色し、観察した。HME/53/v-Src細胞の皮下移植により形成した腫瘍の組織切片を、臨床で診断に使用されているマーカーで染色したところ、図5で示したようにER-,pgR-,HER2-であり、且つベーサル型の乳癌のマーカーであるCK5/6であったことから、HME/53/v-Src細胞は、最も治療の困難な種類の乳癌であるトリプルネガティブ型且つベーサル型の乳癌と病理学的に酷似した腫瘍を形成することが判明した。また、HME/53/Cdk4/v-Src細胞の皮下移植により形成した腫瘍の組織切片も、図6に示すようにER-,pgR-,HER2-であったことから、同様にトリプルネガティブ型の乳癌と病理学的に酷似した腫瘍を形成することが示された。また、HME/53/EGFRT790.L858R/c-Myc細胞の皮下移植により形成した腫瘍の組織切片も、図8に示すように、ER-,pgR-,HER2-であり、且つベーサル型の乳癌のマーカーであるCK5/6であったことからHME/53/EGFRT790.L858R/c-Myc細胞は、最も治療の困難な種類の乳癌であるトリプルネガティブ型且つベーサル型の乳癌と病理学的に酷似した腫瘍を形成することが判明した。以上の結果が示すように、正常な乳腺上皮細胞に、TP53変異遺伝子とv-Src遺伝子の組み合わせ、TP53変異遺伝子とv-Src遺伝子とCdk4遺伝子の組み合わせ又はTP53変異遺伝子とEGFR2変異遺伝子とc-Myc遺伝子の組み合わせを遺伝子導入することにより、従来では腫瘍細胞の作成に必須とされていたhTERT遺伝子を用いずに腫瘍細胞を作製することが可能となった。また、本発明では、ヒト乳がん患者から採取される乳がん組織と酷似したヒト乳がんモデル、特にトリプルネガティブ型乳がんモデルを作製することが可能となった。"