"以下のステップ~を含む、ECSOD測定法、固相化された抗ECSOD抗体を用意するステップ、検体を作用させるステップ、一次抗体として抗ECSODモノクローナル抗体を作用させるステップ、ビオチン標識二次抗体を作用させるステップ、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体を反応させるステップ、前記酵素の基質を反応させ、発色を検出するステップ。ステップが以下のステップ~を含む、請求項1に記載のECSOD測定法、不溶性支持体に抗ECSOD抗体を作用させるステップ、洗浄するステップ、ブロッキングするステップ、ブロッキング液を除去するステップ。固相化された抗ECSOD抗体がポリクローナル抗体である、請求項1又は2に記載のECSOD測定法。前記複合体がストレプトアビジンとビオチン標識酵素との複合体である、請求項1~3のいずれか一項に記載のECSOD測定法。前記酵素がアルカリフォスファターゼである、請求項1~4のいずれか一項に記載のECSOD測定法。前記検体が唾液である、請求項1~5のいずれか一項に記載のECSOD測定法。固相化された抗ECSOD抗体と、一次抗体としての抗ECSODモノクローナル抗体と、ビオチン標識二次抗体と、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体と、を含む、ECSOD測定キット。捕捉用抗ECSOD抗体と、一次抗体としての抗ECSODモノクローナル抗体と、ビオチン標識二次抗体と、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体と、を含む、ECSOD測定キット。従来の測定法は免疫学的手法を応用したものであり、特異性の高い測定が可能である。また、比較的高い感度でECSODを測定できる。しかしながら、診断や治療を初めとした各種用途の今後の発展を考えると、更なる測定感度の向上が望まれる。一方、高感度にECSODを検出できれば、微量分析が可能になることはもとより、ECSODの新たな有用性が見出される可能性があり、即ち、ECSODの新たな用途の創出を期待できる。そこで本発明の課題は、ECSODの高感度測定法を提供することにある。上記課題に鑑み鋭意検討した結果、固相化した抗ECSOD抗体好ましくはポリクローナル抗体に結合させたECSODに一次抗体抗ECSODモノクローナル抗体を反応させた後、ビオチン標識二次抗体、次いでビオチンに結合性を有するストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素例えばアルカリフォスファターゼとの複合体を順に反応させることによって、ECSODを測定定量する方法を見出した。本願発明は以下の通りである。[1]以下のステップ~を含む、ECSOD測定法、固相化された抗ECSOD抗体を用意するステップ、検体を作用させるステップ、一次抗体として抗ECSODモノクローナル抗体を作用させるステップ、ビオチン標識二次抗体を作用させるステップ、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体を反応させるステップ、前記酵素の基質を反応させ、発色を検出するステップ。[2]ステップが以下のステップ~を含む、[1]に記載のECSOD測定法、不溶性支持体に抗ECSOD抗体を作用させるステップ、洗浄するステップ、ブロッキングするステップ、ブロッキング液を除去するステップ。[3]固相化された抗ECSOD抗体がポリクローナル抗体である、[1]又は[2]に記載のECSOD測定法。[4]前記複合体がストレプトアビジンとビオチン標識酵素との複合体である、[1]~[3]のいずれか一項に記載のECSOD測定法。[5]前記酵素がアルカリフォスファターゼである、[1]~[4]のいずれか一項に記載のECSOD測定法。[6]前記検体が唾液である、[1]~[5]のいずれか一項に記載のECSOD測定法。[7]固相化された抗ECSOD抗体と、一次抗体としての抗ECSODモノクローナル抗体と、ビオチン標識二次抗体と、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体と、を含む、ECSOD測定キット。[8]捕捉用抗ECSOD抗体と、一次抗体としての抗ECSODモノクローナル抗体と、ビオチン標識二次抗体と、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体と、を含む、ECSOD測定キット。本発明の第1の局面はECSODの測定法に関する。ECSODEC11511は細胞外に局在するSODアイソザイムである。様々な研究グループによってECSODの研究が行われ、その分子量JClinInvest7413981403、アミノ酸配列及び遺伝子配列ProcNadlAcadSciUSAVol84pp63406344、並びにその機能ProcNatiAcadSciUSAVol84pp66346638などが報告されている。本発明はこのように注目を集めるECSODを高感度に定量可能な手段を提供する。本発明の測定法によれば、微量の検体サンプルを用いた高感度な検出が可能である。本発明の測定法はいわゆるサンドイッチELISA法EnzymelinkedImmunosorbentAssayに分類される方法であり、ECSOD特異的な二種類の抗体で標的ECSODを挟むように捕捉し、酵素反応量を指標として検体中の標的を検出測定する。尚、ELISA法の原理、操作方法、条件等については数多くの成書や論文に記載されており適宜それらを参照するとよい。本発明の測定法では以下のステップ~を行う。固相化された抗ECSOD抗体を用意するステップ検体を作用させるステップ一次抗体として抗ECSODモノクローナル抗体を作用させるステップビオチン標識二次抗体を作用させるステップストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体を反応させるステップ前記酵素の基質を反応させ、発色を検出するステップステップでは、固相化された抗ECSOD抗体捕捉用抗体を用意する。固相化に用いる不溶性支持体としては、例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂や、ガラス等の水に不溶性の物質が用いられ、特にその材質は限定されない。この不溶性支持体への抗ECSOD抗体の担持は物理吸着又は化学吸着によって行われる。例えば、以下の手順~に従い、固相化された抗ECSOD抗体を用意する。不溶性支持体に抗ECSOD抗体を作用させるステップ洗浄するステップブロッキングするステップブロッキング液を除去するステップに使用する不溶性支持体として例えば、96ウェルイムノプレートや384ウェルイムノプレートなどが用いられる。抗ECSOD抗体は例えば20μgml~50μgmlの濃度に調整した後、各ウェルに添加される。添加後、所定時間例えば2時間~一晩放置する。その際の温度条件は、変性を防止するため、好ましくは低温例えば4°C前後とする。の洗浄には、常法に従い、塩例えばNaCl、界面活性剤例えばTween20、Triton、防腐剤例えばNaN3等を含有した溶液が使用される。洗浄操作は好ましくは複数回行う。例えば2~5回程度繰り返す。のブロッキングは非特異的結合を低減ないし排除するために行うものであり、ウシ血清アルブミンやスキムミルク等の他、塩例えばNaCl、界面活性剤例えばTween20、Triton、防腐剤例えばNaN3等を含有した溶液を使用する。ブロッキング液を添加した状態で使用時まで保存しておくことにしてもよい。保存温度は、変性を防止するため、好ましくは低温例えば4°C前後とする。ブロッキング液を除去した後は、原則、速やかに次のステップステップを行う。抗ECSOD抗体として好ましくはポリクローナル抗体を用いる。ポリクローナル抗体は捕捉能力に優れる。従って、抗ECSODポリクローナル抗体の使用は、ECSODの存在量が微量の検体を使用する際に特に有効な条件といえる。抗ECSOD抗体は免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原ECSOD又はその一部を調製し、これを用いてウサギ等の動物に免疫を施す。抗原としては、ヒトECSODの他、その一部を用いることができる。これらのECSODは、生体試料を精製することにより得ることができる。また、組換えECSODを用いることもできる。組換えヒトECSODは例えば、ECSODをコードする遺伝子遺伝子の一部であってもよいを、ベクターを用いて適当な宿主に導入し、得られた組換え細胞内で発現させることにより調製される。免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としてはKLHKeyholeLimpetHemocyanin、BSABovineSerumAlbumin、OVAOvalbuminなどが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタールアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBSマレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド法などを使用できる。一方、ECSOD又はその一部を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジンHisタグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製し、ポリクローナル抗体とする。一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、抗原に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物例えばマウスの腹腔内に移植し、腹腔内で増殖させて腹水から精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。尚、抗ECSODモノクローナル抗体の調製法の一例はClinicaChimicaActa21289102に示されており、具体的な条件の設定などについては当該文献を参照するとよい。ステップに続くステップでは、用意した固相化抗ECSOD抗体に検体を作用させる。様々な検体を用いることができる。例えば、血清、血漿、硝子体液、尿、汗、唾液、髄液、腹水、胸水、組織抽出液、細胞培養上清、菌体培養上清、細胞抽出液、細胞溶解液などを検体として採用することができる。これらの検体は常法に従い調製すればよい。本発明によれば極めて高感度にECSODを検出可能であることから、ECSODが微量でしか存在しない検体は本発明に特に適したものといえる。この観点より、例えば唾液、ECSOD産生量が少ない細胞の抽出液、溶解液、培養上清などは、好適な検体である。予めブロッキング液で希釈した検体を固相化抗ECSOD抗体に作用させるとよい。非特異的な結合を低減させるためである。作用時間は特に限定されないが、例えば30分~一晩とする。温度条件も特に限定されず、低温例えば4°C前後乃至室温例えば15°C~25°Cで放置すればよい。検体を除去した後、原則として数回例えば3~5回の洗浄操作を行い、続いて一次抗体である抗ECSODモノクローナル抗体を作用させるステップ3。洗浄操作には、これに限定されるものではないが、ステップで使用する洗浄液と同じものを使用すればよい。上記の通り、ECSODを特異的に認識するモノクローナル抗体は常法に従って調製可能であるが、好ましくは、上掲の文献ClinicaChimicaActa21289102に記載の方法、即ち、50μgの組換えECSODを2週間の間隔で4回BALBcマウスに免疫した後、50ポリエチレングリコール4000を使用して脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合する方法を採用するとよい。一次抗体を作用させる際の条件は特に限定されないが、例えば、室温で所定時間例えば1~10時間とする。次に、一次抗体を除去した後、原則として数回例えば3~5回の洗浄操作を行い、続いてビオチン標識二次抗体を作用させるステップ4。洗浄操作には、これに限定されるものではないが、ステップで使用する洗浄液と同じものを使用すればよい。ビオチン標識二次抗体は、一次抗体抗ECSOD抗体を認識する抗体をビオチンで標識したものである。一次抗体がマウスIgGクラスの抗体であれば、ビオチン標識二次抗体として、ビオチンで標識した抗マウスIgG抗体を使用する。このような標識化抗体は市販もされておりで使用する洗浄液と同じものを使用すればよい。本発明では、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体酵素複合体を使用する。当該酵素複合体を作用させると、ビオチンとストレプトアビジン又はアビジンとの結合を介して、酵素複合体が二次抗体ビオチン標識二次抗体に結合するとともに、酵素複合体同士の結合が生じる。その結果、固相化抗ECSOD抗体と一次抗体でサンドイッチされた抗原ECSODが二次抗体を介して大量の酵素で標識されることになり、高感度の検出が可能になる。酵素にはアルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼなど、汎用的なものを用いることができる。好ましくは、非特異的結合が少なくなるという理由から、ストレプトアビジンとビオチン標識酵素との複合体を使用する。酵素複合体を作用させる際の条件は、使用する酵素の種類や酵素複合体の特性等を考慮して設定すればよい。アルカリフォスファターゼを採用した場合にあっては例えば室温で10分~1時間、好ましくは室温で20分~40分とする。酵素複合体を除去した後、原則として数回例えば3~5回の洗浄操作を行い、続いて酵素の基質を反応させる。所定時間例えば5分~20分が経過した後に発色を検出するが、通常は、検出に先立って酵素反応を停止させる。例えば、酵素としてアルカリフォスファターゼを採用した場合には、所定濃度のNaOHを添加して酵素反応を停止すればよい。発色の検出には、酵素としてアルカリフォスファターゼを、その基質としてpニトロフェニルリン酸を採用した場合には、例えば415nmの吸光度を測定すればよい。尚、洗浄操作には、これに限定されるものではないが、ステップで使用する洗浄液と同じものを使用すればよい。標準試料所定の濃度のECSODを用いて検量線を作成しておけば、吸光度の測定値に基づき検体中のECSOD量を求めることができる。後述の実施例に示す通り、本発明の測定法によれば、5pgmlという最小測定感度を実現可能であり、ECSODが微量しか存在しない検体を用いた場合であっても、高い精度でECSODを定量することができる。尚、各ステップを実施する際の最適な条件の例は、以下の実施例の欄に示される。また、当業者であれば、以下の実施例の欄に示した実験の内容に基づき、予備実験などを通して、最適な条件を設定することが可能である。本発明の第2の局面は、本発明のECSOD測定法に使用されるキットECSOD測定キットに関する。本発明のキットの一態様では、必須の構成要素として、固相化された抗ECSOD抗体と、一次抗体としての抗ECSODモノクローナル抗体と、ビオチン標識二次抗体と、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチン標識酵素との複合体と、を含む。別の態様では、捕捉用抗体として使用される、固相化された抗ECSOD抗体の代わりに、固相化されていない抗ECSOD抗体がキットに含まれる。このキットの場合は、使用の際、最初に抗ECSOD抗体の固相化を行うことになる。各操作や反応に必要な試薬及び/又は装置ないし器具をキットに含めてもよい。具体的には、洗浄用バッファー、反応用バッファー、検体希釈用バッファー、基質又は基質溶液、反応停止液、標準物質ECSOD、マイクロプレート等をキットに含めることができる。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。酸化ストレス防御酵素であるECSODの超高感度微量測定法の創出を目指して検討を重ね、以下に示す測定法を開発した。1.抗体試薬抗ECSODポリクローナル抗体:常法に従い、ウサギに300μgのヒトECSODを2週間の間隔で5回、免疫した。十分な抗体価が得られたことを確認した後、採血し、イオン交換カラムクラマトグラフィーで精製した後、抗ECSODポリクローナル抗体とした。抗ECSODモノクローナル抗体:上掲の文献ClinicaChimicaActa21289102に記載の方法、即ち、50μgの組換えヒトECSODを2週間の間隔で4回BALBcマウスに免疫した後、50ポリエチレングリコール4000を使用して脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合する方法によって、抗ECSODモノクローナル抗体を得た。ビオチン標識抗マウスIgG抗体:市販のビオチン標識抗マウスIgG抗体ストレプトアビジン/ビオチン標識アルカリフォスファターゼ複合体:市販のストレプトアビジン/ビオチン標識アルカリフォスファターゼ複合体洗浄液:015MNaCl,005Tween20,005NaN3を含むリン酸緩衝生理食塩水ブロッキング液:1ウシ血清アルブミン,015MNaCl,005Tween20,005NaN3を含むリン酸緩衝生理食塩水アルカリフォスファターゼ活性測定用基質溶液:05mMMgCl2002NaN3を含む01Mジエタノールアミン緩衝液に使用直前にpニトロフェニルリン酸を3mMになるように溶解した。2.操作法96ウェルイムノプレートの各ウェルに20μgmLの濃度の抗ECSODポリクローナル抗体を80μLずつ添加し、4°Cにて一晩放置する。次の日にプレートを洗浄液にて3回洗浄した後、ブロッキング液を300μLずつ添加し、使用時まで4°Cにて保管する。ECSOD標準液と検体は予めブロッキング液にて適宜希釈する。イムノプレートのブロッキング液を除去した後、希釈したECSOD標準液、検体を70μLずつウェルに添加し、室温にて3時間または4°Cにて一晩反応させる。プレートを洗浄液にて5回洗浄した後、抗ECSODモノクローナル抗体を80μLずつ添加し、室温にて3時間反応させる。プレートを洗浄液にて5回洗浄した後、ビオチン標識抗マウスIgG抗体を80μLずつ添加し、室温にて3時間反応させる。プレートを洗浄液にて5回洗浄した後、ストレプトアビジン/ビオチン標識アルカリフォスファターゼ複合体を80μLずつ添加し、室温にて30分反応させる。プレートを洗浄液にて5回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ活性測定用基質溶液を150μLずつ添加し、室温にて10分反応させた後、5NNaOH溶液を50μLずつ添加し酵素反応を停止させ、415nmの吸光度を測定する。3.測定及びその結果上記測定法の有効性を検証した。検量線の作成検量線を作成し、比較した結果、従来法図1の白丸では50pgmLの最小測定感度であったのに対し、新規測定法図1の黒丸は5pgmLの最小測定感度であり、10倍高感度であることを確認した。ECSOD高発現細胞の培養上清希釈曲線ミドリザル腎尿細管上皮細胞COS7はECSODを高濃度に発現している細胞である。本細胞の培養上清を希釈して測定した結果、その希釈曲線図2の黒ダイヤは検量線図2の白丸とほとんど重なっていた。この結果より、新規測定法は、細胞の培養上清を正確に測定できることが判明した。ECSOD低発現細胞の培養上清測定結果ヒト単球細胞U937はECSOD発現量が少ない細胞である。本細胞をシグナル経路活性化試薬Aにて24時間或いは48時間処理した後、その培養上清を回収し、新規測定法によって測定した結果、図3に示すように、ECSODの発現が試薬Aにより低下していることが明らかとなった。また、このECSOD濃度は、従来法では検出できない低濃度である。ヒト唾液中ECSODの測定結果生体成分には夾雑物が多量に含まれるため、特定の成分を測定する場合、サンプルの希釈あるいは目的物質の分離が必要となる。従来法では生体成分を20倍希釈してECSODを測定している。生体成分のうち、血清、尿、硝子体などのECSOD含量は比較的高く、従来法でも測定可能であった図4。しかし、より非侵襲的であり、随時、簡便に採取できる唾液を検体として測定する場合、従来法では検出が困難な低濃度であった。これに対して新規測定法では、図4に示す通り、20倍希釈した唾液中のECSODを測定することが可能であった。4.結論新規測定法は従来法より格段に高感度であることが示された。新規測定法によれば、ECSODの発現が非常に低い細胞を用いなければならない実験においてもECSOD発現量を正確に測定することが可能であり、疾病予防に向けた有用化合物探索研究におけるスクリーニング法として有用性が高い。また、生体成分のうち、より非侵襲的に随時、簡便に入手できる半面、低濃度である唾液等を検体として測定する場合、高感度の測定が可能な新規測定法によりはじめて定量が可能である。従って、新規測定法は唾液等を用いる診断にも適応可能であるといえる。"