哺乳動物の幹細胞又は前駆細胞を培養する方法であって、少なくとも1つの増殖因子を含む持続放出組成物の存在下で前記幹細胞又は前駆細胞をインキュベートする工程を含み、前記持続放出組成物が前記増殖因子を放出し、さらに前記増殖因子の存在が細胞を未分化状態で維持する、前記方法。増殖因子の持続放出が、前記増殖因子の開始濃度の80-100の安定な濃度範囲で増殖因子の濃度を細胞培養物中で維持する、請求項1に記載の方法。増殖因子の持続放出が、前記増殖因子の開始濃度の80-95の安定な濃度範囲で増殖因子の濃度を細胞培養物中で維持する、請求項1に記載の方法。増殖因子の持続放出が、前記増殖因子の開始濃度の80-90の安定な濃度範囲で増殖因子の濃度を細胞培養物中で維持する、請求項1に記載の方法。持続放出組成物が、少なくとも約1日の期間にわたって少なくとも1つの増殖因子を放出する、請求項1に記載の方法。持続放出組成物がポリPLGA微小球である、請求項1に記載の方法。PLGA微小球の濃度が約5から約300ngmLの範囲である、請求項6に記載の方法。持続放出組成物がさらにヘパリン又は硫酸デキストランを含む、請求項1に記載の方法。持続放出組成物がさらにMg2を含む、請求項1に記載の方法。細胞が少なくとも約3日間未分化状態で維持される、請求項1に記載の方法。幹細胞が、胚性幹細胞ESC、人工多能性幹細胞iPSC、神経幹細胞NSC、網膜色素上皮幹細胞RPESC、造血幹細胞HSC、間葉幹細胞MSC、癌幹細胞CSC及び原外胚葉幹細胞から成る群から選択される細胞である、請求項1に記載の方法。幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項1に記載の方法。前駆細胞が神経前駆細胞である、請求項1に記載の方法。幹細胞又は前駆細胞を培養する方法であって、前記方法が、線維芽細胞増殖因子2FGF2を含む持続放出組成物の存在下で幹細胞又は前駆細胞をインキュベートする工程を含み、前記持続放出組成物がFGF2を放出する、前記培養方法。幹細胞又は前駆細胞が少なくとも約3日間未分化状態で維持される、請求項14に記載の方法。持続放出組成物が少なくとも1日の期間にわたってFGF2を放出する、請求項14に記載の方法。持続放出組成物が、幹細胞又は前駆細胞とのインキュベーションの開始時に05wvの濃度でFGF2を含む、請求項14に記載の方法。FGF2の持続放出が、FGF2の開始濃度の80-100の安定な濃度範囲でFGF2の濃度を細胞培養物中で維持する、請求項14に記載の方法。FGF2の持続放出が、FGF2の開始濃度の80-95の安定な濃度範囲でFGF2の濃度を細胞培養物中で維持する、請求項14に記載の方法。FGF2の持続放出が、FGF2の開始濃度の80-90の安定な濃度範囲でFGF2の濃度を細胞培養物中で維持する、請求項14に記載の方法。持続放出組成物がさらに、ヘパリン、硫酸デキストラン、FGF2と複合体を形成する多価陰イオン、Mg2、及びEDTAから成る群から選択される1つ以上の薬剤を含む、請求項14に記載の方法。持続放出組成物がポリPLGA微小球である、請求項14に記載の方法。PLGA微小球の濃度が約5ngmLから約300ngmLの範囲である、請求項16に記載の方法。持続放出組成物がさらに10wvのヘパリン又は10wvの硫酸デキストランを含む、請求項14に記載の方法。FGF2に対するヘパリン又は硫酸デキストランの割合が約2:1である、請求項24に記載の方法。持続放出組成物がさらに3wvのMg2を含む、請求項14に記載の方法。持続放出組成物がさらに1mMのEDTAを含む、請求項14に記載の方法。幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、神経幹細胞、網膜色素上皮幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、癌幹細胞及び原外胚葉幹細胞から成る群から選択される細胞である、請求項14に記載の方法。幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項14に記載の方法。前駆細胞が神経前駆細胞である、請求項14に記載の方法。持続放出組成物がさらに1つ以上の追加される増殖因子を含む、請求項14に記載の方法。1つ以上の追加される増殖因子が、表皮成長因子EGF、血小板由来成長因子PDGF、ソニックヘッジホッグShh、白血病阻害因子LIF及びWntタンパク質から成る群から選択される、請求項14に記載の方法。未分化哺乳動物細胞を培養する方法であって、少なくとも1つの増殖因子を含む持続放出組成物の存在下で前記未分化哺乳動物細胞をインキュベートする工程を含み、前記持続放出組成物が前記増殖因子を放出し、放出される増殖因子が予め定めた濃度範囲内で維持され、さらに放出される増殖因子の前記濃度範囲内での維持が細胞を未分化の状態で維持する、前記方法。哺乳動物の幹細胞又は前駆細胞を培養する方法であって、少なくとも1日の期間にわたって安定な濃度範囲の少なくとも1つの増殖因子の存在下で前記幹細胞又は前駆細胞をインキュベートする工程を含む、前記方法。増殖因子の安定な濃度範囲が、機械的手段を用いる増殖因子の持続的放出によって維持される、請求項34に記載の方法。増殖因子の安定な濃度範囲が、持続放出組成物による増殖因子の持続的放出によって維持される、請求項34に記載の方法。I.定義本明細書で用いられる、幹細胞という用語は、有糸細胞分裂を介して自己を再生する能力を保持し、さらに多様な範囲の特殊化された細胞タイプに分化することができる細胞を指す。幹細胞という用語には、非限定的な例として神経幹細胞NSC、胚性幹細胞ESC、人工多能性幹細胞iPSC、造血幹細胞HSC、癌幹細胞CSC、脊髄幹細胞CSC、間葉幹細胞MSC、網膜色素上皮幹細胞RPESC及び原外胚葉幹細胞が含まれる。本明細書で用いられる、胚性幹細胞ESCという用語は、胚盤胞初期胚の内部細胞塊に由来する幹細胞を指す。ヒト胚は受精後4-5日で胚盤胞期この時期には胚は50-150細胞から成るに達する。本明細書で用いられる前駆細胞という用語は、増殖し1つ以上の種々の細胞系列に分化する能力を有するが、自己再生の能力は全くないか又は限定的であると考えられる未分化細胞を指す。典型的には、幹細胞培養例えばhESC培養又はNSC培養は、幹細胞に加えていくつかの前駆細胞を含むであろう。いくつかの事例では、前駆細胞は幹細胞から誘導され、このプロセスの間に自己再生能力を失うが、1つ以上の種々の細胞系列に分化する能力は維持する。換言すれば、幹細胞は前駆細胞を生じることができる。本明細書で用いられる、神経幹細胞及び神経前駆細胞NPCという用語は、神経系細胞を生じることができる未分化細胞をいう。NSCは自己複製能力を有するが、NPCは、非常に限定的な自己再生能力を有するか又はその能力を全くもたないと考えられる。本明細書で用いられる、網膜色素上皮幹細胞RPESCは、成人網膜色素上皮RPEから活性化される幹細胞である。本明細書で用いられる、人工多能性幹細胞iPSCは、ES細胞の遺伝的特徴及び表現型的特徴の多くを発現する全能性幹細胞であり、分化した細胞例えば体細胞から誘導される。iPSCはES細胞と同じ肉眼的形態、増殖性特性を有し、ヌードマウス移植後に奇形腫を形成し、invitroで3胚葉の全てに分化する能力を有する。主要因子例えばレチン酸及び白血病阻害因子LIFに対するiPSCの応答もまたES細胞で観察されたものと同じである例えば以下を参照されたい:Okitaetal2007Nature448313317。本明細書で用いられる、間葉幹細胞MSCは多能性幹細胞であり、多様な組織から誘導可能で、さらに多様な細胞タイプ骨芽細胞骨細胞、軟骨細胞軟骨の細胞、及び脂肪細胞脂肪の細胞を含むに分化可能で、自己再生能力を有する以下を参照されたい:PittingeretalScience2841437;HerzogBlood102348393。MSCは、以下のリストのマーカーの発現を含む多数の表面マーカーによって特徴付けられている:CD29、CD44、CD73、CD105、CD106、CD166及びSTRO1以下を参照されたい:XuetalCellResearch17240248;SimmonsandTorokStorbBlood785562。造血幹細胞HSCは多能性幹細胞であり、骨髄細胞に由来する全ての血液細胞タイプ単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球血小板、樹状突起細胞及び類リンパ球系列T細胞、B細胞、NK細胞を生じ、さらに自己再生能力を有する。マウス及びヒトHSCは種々のマーカーの組合せによって同定された。マウスHSCは典型的にはcKit及びSca1を発現するが、成熟造血細胞系列のマーカーについては陰性であるLin‐以下を参照されたい:ChallenetalCytometryA2009751424。ヒトHSCはCD34CD133Lin‐の細胞と報告されている以下を参照されたい:Hawleyetal2006MethodsinEnzymol419149179。本明細書で用いられる、癌幹細胞CSCは、具体的な癌サンプルで見出される全ての細胞タイプを生じる能力及び自己再生能力を有する癌細胞典型的には腫瘍又は血液癌で見出されるである。これらの細胞は幹細胞の特性を有することが認められているので、‘腫瘍開始細胞’とも称される。典型的には癌幹細胞は由来組織の幹細胞のマーカーを共有する。したがって、白血病幹細胞はCD34CD38‐と認定でき、乳癌幹細胞はCD24‐CD44と認定できる以下を参照されたい:BonnetandDickNatureMedicine3730737;Reyaetal414105111;KaietalBreastcancer178085;GibsonetalNature201046810959。増殖因子という用語は、天然に存在する内因性または外因性タンパク質、又は組換えタンパク質であり、細胞例えば幹細胞又は前駆細胞の分化を阻害及び/又は刺激することができる。増殖因子という用語はまた、脂質、化学物質及び他の非タンパク質薬剤例えば細胞分化を阻害及び/又は刺激する能力を有する小分子を包含できる。ある種の実施態様では、増殖因子という用語は、例えば有効な量で幹細胞又は前駆細胞培養中に存在するとき、細胞分化を阻害又は刺激することができる任意のポリペプチド又は他の薬剤を指す。本発明の増殖因子ポリペプチドには、天然に存在するタンパク質及び組換えタンパク質の両方が含まれる前記は培養される細胞にとって内因性でも外因性でもよい。さらにまた、本発明の増殖因子は、合成タンパク質例えば融合物又は他のタンパク質構築物、又は天然に存在する増殖因子若しくは他のタンパク質から誘導されたアミノ酸配列の化学的改変物でもよい。そのような増殖因子を組み合わせて用い、例えば本発明の累積的又は相乗的作用を生じることができる。本発明で用いられる好ましい増殖因子は、塩基性増殖因子bFGF或いは線維芽細胞増殖因子2FGF2として公知である。bFGF及びFGF2という用語は同義語であり、完全長タンパク質又はその機能的に活性な任意のフラグメントを指す前記は単離された天然に存在するFGF2型であっても組換え型であってもよい。野生型FGF2の機能的特性特に未分化状態で細胞を維持する能力を保持する活性なフラグメント、変異型及び化学的改変物は、本発明の方法における使用が意図されている。増殖因子の安定化のための前記増殖因子の改変は例えば以下に詳細に記載されている:CacciaetalEuropeanJournalofBiochemistry204649655。Cacciaらは、システイン残基を化学的に改変した組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の安定化型を記載している。FGF2を安定化させる処方物もまた米国特許5217954号Fosteretalに記載されている。本明細書で用いられる、変異体及び変異という用語は、遺伝物質例えばDNAにおける任意の検出可能な変化、又はそのような変化の任意のプロセス、メカニズム若しくは結果を指す。前記は、遺伝子の変異遺伝子の構造例えばDNA配列が変更される、任意の変異プロセスから生じる任意の遺伝子又はDNA、及び改変遺伝子又はDNA配列によって発現される任意の発現生成物例えばタンパク質又は酵素を含む。本明細書で用いられる、変異させるという用語は、変異体又は変異をもたらすプロセスを指す。本発明で用いることができるFGF2ポリペプチドの例示的配列は当業界で公知であり、例えばGenBankデータベースから入手できる。例示的なヒトFGF2ポリペプチドのアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号NP001997配列番号:1により入手できるが、一方、例示的マウスFGF2ポリペプチドのアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号AAP92385配列番号:3により入手できる。これらヒト及びマウスFGF2ポリペプチド配列をコードする例示的核酸配列はまた、それぞれGenBankアクセッション番号NM002006配列番号:2及びNM008006配列番号:4により入手できる。本発明で用いることができるFGF2ポリペプチドはまた、市場の供給源、例えばRDSystemsMinneapolisMN;PeprotechRockyHillNJ;BectonDickinsonSanJoseCalifornia;InvitrogenCarlsbadCAから入手できる。組換えFGF2はまた、組換えタンパク質の製造のために当業界で公知の任意の適切な発現系を用いて細胞で発現させることができる。組換え体及び/又は天然に存在するFGF2は、当業界で公知の任意の適切な技術を用いて単離できる。本明細書で用いられる、単離されたという用語は、当該物質が通常見出される環境から取り出されることを意味する。したがって、単離された生物学的物質は、細胞性成分すなわち、前記物質がその中で見出され又は生成された細胞の成分が除去されていることがある。単離された核酸分子には、例えばPCR生成物、単離mRNA、cDNA、又は制限フラグメントが含まれる。単離核酸分子にはまた、例えばプラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列が含まれる。単離核酸分子は、好ましくは前記核酸分子がその中に見出された遺伝子から切り出されてあるか、より好ましくは非調節配列、非コード配列、又は当該遺伝子内に存在するときに当該核酸分子の上流若しくは下流に位置する他の遺伝子とはもはや結合していない。単離されたタンパク質は、前記タンパク質が細胞内で結合していた他のタンパク質又は核酸又はその両方と、または前記が膜結合タンパク質である場合は細胞膜と結合していることがある。発現する及び発現という用語は、対応する遺伝子又はDNA配列の転写及び翻訳に必要とされる細胞性機能を活性化させることによって、遺伝子又はDNA配列内の情報を現出させること、例えば非コード翻訳されないRNA又はタンパク質を生成させることを意味する。DNA配列は、細胞内で又は細胞によって発現されて、発現生成物例えばRNA又はタンパク質を形成する。発現生成物それ自体例えば生じたRNA又はタンパク質はまた、細胞によって発現されたということができる。発現系という用語は、例えばベクターによって運ばれ宿主細胞に導入された外来DNA発現構築物によってコードされるタンパク質を発現させる、宿主細胞及び適切な条件下で適合性を有するベクターを意味する。発現構築物とは、その発現が所望される標的核酸配列を含む核酸配列を意味する前記標的配列は、選択した宿主細胞内での標的核酸配列の適切な転写及び翻訳を提供する発現制御配列エレメントと作動できるように結合されている。そのような配列エレメントには、プロモーター及びポリアデニル化シグナルが含まれ得る。発現構築物はさらにベクター配列を含むことができる。ベクター配列とは、当業界で確立された任意のいくつかの核酸配列を意味し、前記は、発現構築物のクローニング及び増殖を促進するために本発明の組換えDNA技術で有用であり、プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクター及び酵母人工染色体を含むただし前記に限定されない。作動できるように結合されるとは、標的核酸配列及び1つ以上の発現制御配列例えばプロモーターが、標的核酸配列によってコードされるポリペプチドの宿主細胞内での発現を可能にするように物理的に連結されることを意味する。本発明の発現構築物は、発現構築物のクローニング及び増殖を促進するベクター配列を含むことができる。多数のベクタープラスミド及び真菌ベクターを含むが、多様な真核及び原核宿主細胞での複製及び/又は発現のために報告されている。本発明で有用な標準的ベクターは当業界で周知であり、前記にはプラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクター及び酵母人工染色体が含まれるただし前記に限定されない。ベクター配列は、大腸菌Ecoliでの増殖のための複製起点;SV40複製起点;宿主細胞での選別のためのアンピシリン、ネオマイシン又はピューロマイシン耐性遺伝子;及び/又は優性選別性マーカーを増幅させる遺伝子例えばジヒドロホレートレダクターゼ遺伝子及び問題の遺伝子を含むことができる。例えば、FGF2は大腸菌を用いて発現させることができ、活性であるための翻訳後改変を必要としない。本発明に包含される任意の増殖因子は組換えタンパク質として発現させるか、又は天然に存在する供給源から単離するか、又は入手可能なときは市場から購入することができる。本明細書で用いられる、細胞培養の関係では、持続放出組成物からの増殖因子の持続放出という用語は、増殖因子が持続放出組成物から一定の期間にわたって、好ましくは少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日にわたって、又は前記より長い、例えば2週間、3週間、4週間、5週間、又は前記より長い期間にわたって放出されすなわち細胞培養中の細胞にとって利用できるようにされ、さらに放出された増殖因子が細胞培養中で一定の濃度又は相対的に一定の濃度すなわち安定な濃度範囲で維持されることを意味する。安定な濃度範囲は、好ましくは増殖因子開始濃度の約50内である。したがって、細胞培養の関係では、増殖因子は、好ましくは細胞が利用できる増殖因子の濃度又は量が上記に示すように少なくとも1-7日の期間、当該期間の開始時に当該細胞が利用できる増殖因子の量又は濃度の50内であるように持続放出組成物から放出される。さらに好ましい実施態様では、安定な濃度範囲は、増殖因子開始濃度の約60、70、80、90又は95以上である。特に好ましい実施態様では、放出される増殖因子の濃度は、1日以上の期間にわたって、増殖因子の開始濃度の約80-100、80-95、又は80-90の範囲内に留まる。別の好ましい実施態様では、放出される増殖因子の濃度は、3日以上の期間にわたって、増殖因子の開始濃度の少なくとも80-100、80-95、又は80-90の範囲内に留まる。増殖因子例えばFGF2の持続放出は、時間の経過中に細胞培養中の増殖因子レベルを検出することによって確認できる例えばELISAによって。本明細書では、増殖因子の持続放出はまた増殖因子の時間性放出又は増殖因子の安定化と称することができ、例えば細胞培養で放出される増殖因子の安定な濃度範囲を維持する任意の手段または方法を含む。本発明の持続放出組成物は、一定の期間をかけて1つ以上の放出因子例えば増殖因子の安定な濃度範囲の維持をもたらす任意の適切なベヒクルを含むことができる。本明細書で用いられる、持続放出組成物は、未分化細胞例えば幹細胞及び/又は前駆細胞ただしこれらに限定されないとともに培養するために適切である。本発明の持続放出組成物の非限定的な例には、微小球例えばポリPLGA微小球、無水ポリビニルアルコールPVA、ミリシリンダー、アルギネートゲル、生物分解性ヒドロゲル、複合物質、及びナノ粒子が含まれる例えば以下を参照されたい:AshtonetalBiomaterials28365518;DruryJLetalBiomaterials2443374351;米国特許7226617号Dingetal;SimmonsCAetalBone35562569;ZhuGetalNatBiotech185257BiodegradableHydrogelsforDrugDeliveryKParketal1993TechnomicPublishingTransAmOphthalmolSocKDerwentetal200810620613。時間性放出のための機械的手段及び方法にはまた例えば手動添加が含まれ、または機械的装置を用いて増殖因子の継続的又は継続的に近い持続供給を細胞培養に長時間にわたって提供し、したがって安定な増殖因子濃度に曝露することにより幹細胞又は前駆細胞を安定な分化レベルに維持することができる。分解を軽減しそれによって幹細胞培養に曝露される増殖因子の持続的濃度範囲をもたらす、増殖因子の改変または他の手段もまた含まれる。本明細書で用いられる、未分化の状態で細胞を維持するという用語は、細胞分化、例えば培養における自発的分化を予防するか又はその量を最小限にすることを指す。ある種の実施態様では、例えば幹細胞又は前駆細胞を培養するとき、前記用語はまた、幹細胞の1つ以上の成熟した分化細胞系列に分化する能力を増加させる未成熟な状態を維持することを含む。例えば、未分化状態で維持される多能性幹細胞又は前駆細胞は幹細胞又は前駆細胞に密接に関係するマーカーを発現するが、分化中または分化した細胞と密接に関係するマーカーは全く発現しないか低レベルでしか発現せず、さらに1つ以上の異なる細胞系列に分化するその能力はまた維持するであろう。したがって、未分化状態で維持される単能性ケラチノサイト前駆細胞は、例えばケラチノサイトに分化しないであろうすなわち前駆細胞のままであろうが、例えばそのような分化を経るように細胞にシグナルを送る適切な培養条件下でケラチノサイトに分化する能力は維持するであろう。一般的には、幹細胞又は前駆細胞が幹細胞又は前駆細胞として維持されるすなわち未分化状態で維持されるか否かを決定することは、前記がそのような細胞と密接に関係する1つ以上のマーカーを発現し続けるか否かを決定することによって可能である。例えば、ヒト胚性幹細胞のマーカーには、OCT4、NANOG、TRA181、SOX2、SSEA4及び/又はSSEA3が含まれるただしこれらに限定されない。NSC及びNPCのマーカーには、ネスチン、LexCD15、ムサシ、Bmi1、Sox1、Hes1、Hes5、BLBP及びCD133が含まれるただしこれらに限定されない。さらにまた、未分化状態で維持されるESCは、一般的に分化の指標であるマーカー、例えばブラチュリーBrachyury、Sox17、Foxa2、Pax6、Otx2及びSox1を発現しないか、又は相対的に低レベルで発現するであろう。未分化状態で維持されるNSCは、Tuj1、S100β、ガラクトセレブロシド及び/又はMBPミエリン塩基性タンパク質ただしこれらに限定されないを含むマーカーを発現しないか、分化した細胞と比較して相対的に低レベルで発現するであろう。例えば、本実施例に示すように、増殖因子FGF2はhESCを未分化状態で維持する前記は、SSEA4及びOCT4の高い発現並びに分化マーカーブラチュリー及びSOX17の低い発現によって証明される。例えばSSEA4、OCT4、ブラチュリー及びSox17のようなマーカーは、他の分化及び未分化状態の指標である他のマーカーと同様に公知であり、当業界で日常的に用いられている。未分化状態を維持することは幹細胞の誘導および維持に必須である。本発明に包含される他の未分化細胞もまた、細胞の未分化状態及び/又は分化状態に特徴的な同様な及び/又は異なるマーカーを発現するであろう。そのようなマーカーは公知であり、又は当業者は容易に決定でき、さらにそのようなマーカーの発現を解析して、当該細胞が未分化状態を維持しているか否かを決定できる。本明細書で用いられる、培養細胞に関して持続放出組成物の存在下という用語は、持続放出組成物又は時間経過中に安定な増殖因子濃度を維持する他の方法によって提供される持続濃度の増殖因子又は他の薬剤に細胞を接触させることができることを意味する。細胞及び持続放出組成物は同じウェル又は他の培養容器に含まれることも含まれないこともある。細胞は持続放出組成物の存在下にあり、これには、例えば持続放出組成物及び細胞がトランスウェル又は他の分割手段によって互いに分離されていても、細胞を含む当該分離された領域と持続放出組成物間で液体例えば培養液及び/又は増殖因子が容易に交換され得る限り、このような状態も含まれる。約又はおよそという用語は、統計的に意義のある範囲内の値を意味する。そのような範囲は、1桁内、好ましくはある値又は範囲の50内、より好ましくは20内、さらに好ましくは10内、及びさらに好ましくは5内であり得る。約又はおよそという用語によって包含される許容可能な変動は調べられている具体的な系に左右され、当業者には容易に理解できよう。本発明にしたがって、一般的な分子生物学、微生物学、及び当業界の技量範囲内の組換えDNA技術を用いることができる。そのような技術は文献で完全に説明されている。例えば以下を参照されたい:SambrookFritschManiatisMolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionColdSpringHarborNYColdSpringHarborLaboratoryPress1989本明細書ではSambrooketal1989;DNACloningAPracticalApproachVolumesIandII;OligonucleotideSynthesis;NucleicAcidHybridizationBDHamesSJHigginseds;TranscriptionAndTranslationBDHamesSJHigginseds;AnimalCellCultureRIFreshneyed;ImmobilizedCellsAndEnzymesIRLPress;BPerbalAPracticalGuideToMolecularCloning;AusubelFMetalCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsInc1994。これらの技術は以下の文献に記載されている位置特異的変異導入を含む:KunkelProcNatlAcadSciUSA82488492;米国特許5071743号;FukuokaetalBiochemBiophysResCommun263357360;KimandMaasBioTech28196198;ParikhandGuengerichBioTech24428431;RayandNickoloffBioTech13342346;WangetalBioTech19556559;WangandMalcolmBioTech26680682;XuandGongBioTech26639641;米国特許5789166号及び5932419号;HogrefeStrategiesl437475;米国特許5702931号、5780270号及び6242222号;AngagandSchutzBiotech30486488;WangandWilkinsonBiotech29976978;KangetalBiotech204446;OgelandMcPhersonProteinEngineer5467468;KirschandJolyNucAcidsRes2618481850;RhemandHancockJBacteriol17833463349;BolesandMiogsaCurrGenet28197198;BarrenttinoetalNucAcidsRes22541542;TessierandThomasMethsMolecBiol57229237;及びPonsetalMethMolecBiol67209218。当業界で日常的なこれらの技術及び他の技術は当業者には公知であり、それらを本発明の実施に用いることができよう。II.大要上記で考察したように、未分化細胞例えば幹細胞及び/又は前駆細胞を培養する本方法は少なくとも2つの実質的な困難に直面している。第一に、増殖因子例えばFGF2は頻繁に培養に添加する必要があり、そのためそのような細胞の培養を時間と労力を要する高価な仕事にしている。ESCには毎日、NSCには3日目毎に増殖因子を添加する標準的なプロトコルは、細胞が曝露される増殖因子濃度に顕著な変動を生じる。第二に、未分化細胞例えば幹細胞及び/又は前駆細胞を培養する場合、顕著な量の望ましくない自発的細胞分化が培養中に発生し、そのような分化を阻害するために増殖因子例えばFGF2を毎日添加したときでさえも自発的細胞分化は発生する。したがって、本発明は、未分化細胞を未分化状態で培養し維持するために必要な労力及び骨折りを実質的に軽減するだけでなく、得られた培養で驚くほどに自発的分化は減少し培養の不均質性の低下をもたらす、したがって予期に反して従来利用可能な方法によって培養した細胞と比較して質が改善される。一例として、及び限定ではなく、本明細書に提供する実施例で、増殖因子FGF2の安定形を含む持続放出組成物を用いて、hESC、iPSC、RPESC及びNSCを培養した実験を述べる。前記持続放出組成物は、増殖因子濃度の変動を最小限にすることによって例えば実施例2に示すように、細胞培養中のFGF2濃度はFGF2含有微小球を含む培養で3日間にわたって80‐100の範囲に維持された、7日まで又はそれより長く例えば35日間まで安定なFGF2タンパク質濃度範囲を提供し、未分化hESC、iPSC、RPESC、NSC及びNPCの安定性を顕著に改善した。ある実施例では、FGF2を含む持続放出組成物の存在下で培養したhESCは、MEF又はMEF条件付け培養液の非存在下において未分化状態で維持された。さらにまた、FGF2の持続放出は、分化を経た細胞培養の全能性を大きく改善した実施例6に示す。したがって、ある種の特徴では、標準的な細胞培養方法が達成し得るよりも未分化な状態で細胞を維持するために、本発明は、生物学的に活性な形態の1つ以上の増殖因子の持続的で安定な濃度範囲を、延長期間にわたって、好ましくは1日または数日の期間にわたって、より好ましくは少なくとも1週間維持する新規な方法を提供する。本実施例では、標準的なプロトコル3日目毎ではなく、手作業でNSC培養に直接増殖因子を頻繁に8時間毎投与することによってもまた、未分化NSC培養の安定性が改善されることもまた示されたすなわち、ネスチン及びTuj1の発現によって測定したとき、より多くの細胞が未分化状態で維持された。さらに、産出される細胞の絶対数も顕著に増加した。したがって、ある実施態様では、本発明は、改善された細胞例えばNSCの培養方法を提供し、前記は、未分化状態で細胞を維持するために細胞を固定レベルすなわち安定濃度範囲の増殖因子に曝露することによって達成され、さらに細胞数の増加をもたらした。本発明はいずれの特定の作用理論または作用メカニズムにも限定されないが、本培養方法は、より厳密にinvivo環境を模倣する長時間例えば少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日又はそれ以上の増殖因子の安定な濃度範囲を担保すると考えられる。したがって、好ましい実施態様では、培養プロセスの開始時に1つ以上の増殖因子を持続放出処方物で細胞培養にデリバリーすることができ、更なる培養液交換はこの延長期間例えば数日間、及び好ましくは少なくとも7日間に要求されない。別の実施態様では、増殖因子例えばFGF2は細胞培養に頻繁に、例えば毎日1日3回以上又は継続的に投与できる。目標の成果は、細胞の有意な増加を含む、より均質で未分化な細胞培養すなわちより安定な未分化細胞集団である。好ましい実施態様では、未分化細胞は幹細胞又は前駆細胞であるが、しかしながら、当業者は、本方法が増殖因子又は他の薬剤の頻繁な投与を必要とする任意の未分化細胞の培養に有用であることを理解するであろう。III.幹細胞及び前駆細胞ある種の実施態様では、本方法は、ESCを標準的な培養皿の表面に未分化状態で維持するために有用である。本発明の別の特徴では、本方法は、持続的な安定濃度範囲の増殖因子好ましくはFGF2の存在下でESCを培養することによって、ESC培養を分化からレスキューし、分化したESCを未分化状態へ戻すために有用である。本方法は、任意の哺乳動物ESCヒト、ラット、ブタ、ヒツジ、マウス、又は非ヒト霊長類のESCただしこれらに限定されないの培養に有用である。ESCは、当業界で公知の任意の適切な方法Thomsonetal1998;Amit2000;及びCowanetal2004;並びに米国特許5843780号、6200806号及び7029913号いずれもThomsonによる、又は本明細書に記載した持続的レベルの増殖因子を含むためのプロトコルを改変することによって誘導することができる。ヒトESCは、例えば以下のマーカーの高発現8量体結合タンパク質4Oct4GenBankアクセッション番号NM0011595421SwissProt参照番号Q018601タンパク質;NanogGenBankアクセッション番号NM0248652、AAP495291;SRYbox2GenBankアクセッション番号NM0031063、NP0030971、TRA181、SSEA4及びSSEA3ヒトESCにおけるTRA181、SSEA4及びSSEA3の発現の記載については以下を参照されたい:HendersonJKetalStemCells2032937、及びhESC分化マーカーの低発現例えばブラチュリーGenBankアクセッション番号NM0806461、NM0806471、NM0059921、AAB940181、SRYbox17GenBankアクセッション番号NM0224543、NP0718991、フォークヘッドボックスA2GenBankアクセッション番号NM0217844、NM1536752、及びAAH065452;対合ボックス6GenBankアクセッション番号NM0002803、NM0016044、NM0011276121、及びABB552631;オルトデンティクルホメオボックス2GenBankアクセッション番号NM0217282、NM1723371;NP0683741、NP7588401;及びSRYbox1GenBankアクセッション番号NM0059862、NP0059772によって特徴づけられる。供給源となる多様な種のESCの適切なマーカーは公知であり、当業者によって容易に決定され得る。本発明のある特徴では、本方法はまた、培養で神経幹細胞及び/又は前駆細胞を未分化状態で維持するために有用である。本発明の別の特徴では、本方法は、持続的な濃度範囲の増殖因子好ましくはFGF2の存在下で神経幹細胞及び/又は前駆細胞を培養することによって、前記細胞培養を分化からレスキューするために有用である。本明細書に記載の方法にしたがって培養できるNSC及びNPCは、一定のマーカー、例えば以下のマーカーの1つ以上の発現:ネスチンGenBankアクセッション番号NM0066171、NP0066081;フコシルトランスフェラーゼ4フコシルトランスフェラーゼ、骨髄系特異的GenBankアクセッション番号NM0020333、NP0020241;ムサシGenBankアクセッション番号AB0128511、BAA339621;ポリクーム複合体タンパク質Bmi1GenBankアクセッション番号NM0051808、NP0051714;Sox1GenBankアクセッション番号NM0059862、NP0059772;SRYbox2GenBankアクセッション番号NM0031063、NP0030971;Hes1GenBankアクセッション番号Y075721、CAA688571;Hes5GenBankアクセッション番号DQ2726601、ABB838291;脂肪酸結合タンパク質、脳GenBankアクセッション番号NM0014463、NP0014371;及びCD133GenBankアクセッション番号NM0060172、NM0011458471、NM0011458481、NM0011458521、NM0011458511、NM0011458501、NM0011458491、NP0060081、NP0011393201、NP0011393241、NP0011393231、NP0011393221、及びNP0011393211、及び、以下を含むマーカーただしこれらに限定されないの無発現又は相対的に分化細胞と比較して低レベルの発現によって同定することができる:Tuj1S100βGenBankアクセッション番号、例えばNM0062722、NP006263他のアイソフォームもまた報告されてあり、GenBankから入手できる、ガラクトセレブロシドGenBankアクセッション番号NM0001533、NP0001442及び/又はMBPGenBankアクセッション番号NM0010250811、及びNP001020252他のアイソフォームもまた報告されてあり、GenBankから入手できる。本明細書で用いられる神経は神経系を意味し、神経膠細胞及びニューロンを含む。NPCはまた高レベルのヘリックス‐ループ‐ヘリックス転写因子NeuroD、Atoh1並びにニューロゲニン及びニューロゲニン2を発現できる。NSC培養は、典型的にはNSC及びNPCの混合物を含むことができ、両細胞は本発明の方法にしたがって培養できる以下を参照されたい:AbramovaetalDevelopmentalBiology200528326981;BeckervordersandforthCellStemCell7744758;ShoemakeretalPlosOne5e9121。NSC及びNPCは、神経細胞、例えばニューロン、神経膠細胞、星状神経膠細胞、網膜ニューロン、光受容体、稀突起神経膠細胞、嗅覚細胞、毛細胞、支持細胞などに分化する潜在能力を有する。ある種の特徴では、本発明は、未分化細胞例えばESC、NSC及びNPC並びに関連する細胞タイプの培養に有用な方法を提供する。例えば、胚盤胞は原外胚葉幹細胞として知られる幹細胞を生じる部分を含み、神経系はNSCのいくつかのサブタイプを含む。毎日又は3日目毎の投与に勝る本発明の持続放出方法のこれらのサブタイプに対する利点は、ESC、NSC及びNPCに対するものと同じであると期待される。他の特徴では、本発明は、他の未分化細胞例えば未成熟神経細胞を培養する方法を提供し、この場合細胞は未分化状態で維持される。いくつかの特徴では、ESC、NSC及びNPC並びにiPSC、MSC及びCSC以外に、未分化細胞には、皮膚、毛、腸及び血液の幹細胞及び/又は前駆細胞が、他の幹細胞及び前駆細胞多くの中で取り分け脂肪組織、腎、原外胚葉幹細胞及び骨髄幹細胞及び/又は前駆細胞を含むと同様に含まれるただしこれらに限定されない。他の特徴では、本発明は、未分化細胞例えばiPSC、RPESC、HSC、MSC及びCSCの培養に有用な方法を提供する。REESCはinvitroで何倍にも増大させることができ、多様な発生系列中胚葉及び外胚葉を含むに由来する極めて多様な子孫を生じることができる。RPESCは網膜細胞を生じる能力を有し、それらはまた極めて広範囲のレパートリーの子孫骨、筋肉及び脂肪細胞を含むを生じることができる。これらの細胞並びにそれらの同定及び/又は単離の仕方は、米国特許出願公開公報20090274667号Templeetalに詳細に記載されている。そのような細胞もまた本発明の方法にしたがって培養できる。iPSC細胞は、幹細胞例えば幹細胞分化を制御する因子のinvitro研究及び疾患の治療にiPSCを応用するための研究の両方で有用である。iPSCは、4つの特異的な転写因子、SOX2GenBankアクセッション番号NM0031063、NP0030971、OCT4GenBankアクセッション番号NM0011595421、SwissProt参照番号Q018601、クルッペル様因子4GenBankアクセッション番号NM0042354及びNP0042263及びmycプロトオンコジーンタンパク質GenBankアクセッション番号NM0024674及びNP0024582をウイルスによる形質導入によって線維芽細胞に導入することによって、マウス線維芽細胞及びヒト線維芽細胞から誘導することができる以下を参照されたい:LowryWEetalProcNatlAcadSciUSA10528832888;MaheraliNetalCellStemCell15570;ParketalNature451141146;TakahashiKandYamanakaSCell126663676;TakahashiKetalCell131861872;YuJetalScience31819171920;StadtfeldandHochedlingerGenesDev2422392263;HochedlinerandPlath136509523。また、OCT4、SOX2、NANOG及びLIN28GenBankアクセッション番号NM0246744及びNP0789501が、ヒト体細胞を全能性幹細胞に再プログラムするために十分であると報告された。重要なことには、FGF2はまた線維芽細胞の全能性状態への再プログラミングプロセスすなわち線維芽細胞からiPSCを誘導するために用いられる。さらにまた、iPSCは、未分化状態で維持されるために培養時にFGF2に依存する以下を参照されたい:TakahashietalCellVolume131Issue586187230November2007。MSCは、胚から成人までの多様な組織から入手できる。例えば、それらは、臍帯組織すなわちウォートンゼリー及び臍帯血又は羊水から抽出できる。MSCはまた、下顎第三大臼歯の発育中の歯芽から、骨髄、骨格筋、骨膜、肺、皮膚及び脂肪組織から入手できる。MSCは成人に広く存在し、極めて多様な組織から抽出できる以下を参照されたい:LuetalHaematologica200691101726;ZeddouetalCellBiolInt2010vol34693701;LeeetalCellPhysiolBiochem200414311324;Rosenbaumetal2008Organogenesis423027。Rosenbaumらは、MSCの同定に用いることができる表面マーカーを記載している。癌幹細胞CSCは腫瘍形成性であり、幹細胞の自己再生プロセス及び多数の細胞タイプへの分化の間に腫瘍を発生させ得る。CSCは、新規な腫瘍を生じることによって再発及び転移を引き起こし得る別個の集団として腫瘍を存続させると考えられる。CSCを標的とする特異的な治療法の開発が、例えば癌の治療のために所望される。したがって、これらの細胞を調べそのような治療法を開発するためにこれらの細胞を培養することは有用である。しかしながら、CSCは原発性腫瘍サンプルから培養することはしばしば非常に困難で、invivoで見出される増殖因子環境にそれらが依存していることを示唆している。したがって、それらの培養のための改善方法が所望される。CSCは、それらを未分化状態で維持するために、本発明にしたがって持続濃度範囲の増殖因子の存在下で培養できる。多様な供給源から得られる原発性腫瘍はしばしばFGF2依存性であり、いくつかの事例では、FGF2下で優れた増殖を示す以下を参照されたい:LeeetalCancerCellvol9391403;RicciVitianietalNature445pp111115;NewYeomanJCellOPhysiol150320326。造血幹細胞HSCは骨髄または末梢血から単離できる。HSCの単離方法は例えば以下に記載されている:HawleyetalMethodsEnzymol2006419149179;及びChallenetalCytometryA2009751424。HSCを体外で培養することは非常に困難である。しかしながら、FGF2はそれらの自己再生の保全に役立ちえる以下を参照されたい:YeohetalStemCells20062415641572。本発明の方法にしたがって培養できる幹細胞及び関連する前駆細胞の非限定的な例には、例えば皮膚幹細胞、精原幹細胞、毛嚢幹細胞、癌幹細胞、骨髄幹細胞、消化管幹細胞、造血幹細胞、脂肪組織幹細胞、マウス胚幹細胞、ヒト胚幹細胞、網膜色素上皮幹細胞、間葉幹細胞、原外胚葉幹細胞、腎幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞、内皮幹細胞、神経冠幹細胞が含まれる。上記幹細胞に関連する前駆細胞すなわちそのような幹細胞から誘導されるもまた本発明にしたがって培養できる。全ての幹細胞が未分化状態の維持に増殖因子を要求する。現在公知の又は将来発見されるいずれの幹細胞又は前駆細胞もまた本発明の方法にしたがって培養できる。当業者は幹細胞及び前駆細胞を誘導することができ、そのような方法は当業界では公知である。多くの幹細胞はまた市場で入手可能であるか、又は細胞バンク例えばWiCellReseachInstituteNationalStemCellBankMadisonWIから入手できる。IV.細胞培養方法本発明は、未分化細胞例えば幹細胞及び/又は前駆細胞ただしこれらに限定されないの培養のための新規で改善された方法を提供する。幹細胞及び/又は前駆細胞の培養のために適切な培養液は公知であり当業界で報告されている例えば以下を参照されたい:Amitetal2000上掲書;Fasanoetal2010上掲書;Ludwigetal2006上掲書;Bendalletal2007上掲書;Qianetal1997上掲書;Fasanoetal2007上掲書;及びShenQetalScience304133840。例えば、細胞は、無血清DMEMN2及びB27溶液並びに増殖因子補充高グルコース中で培養できる。典型的には細胞は、組織培養処理ウェルで37°C及び5CO2にてインキュベートされる。場合によって、細胞は、フィーダー細胞例えばマウス胚線維芽細胞MEFの存在下で培養できる。しかしながら、本実施例で示すように、本発明は、フィーダー細胞の必要性を排除する持続放出組成物を提供する。そのような方法は当業界では周知である以下を参照されたい:Amitetal2000;Fasanoetal2010;Ludwigetal2006;Bendalletal2007;Qianetal1997;Fasanoetal2007;及びShenetal2004。具体的な培養条件は当業者により容易に決定及び調節される。典型的には、ESCは、研究者が実施している該当実験に適切と思われる密度まで増殖させる典型的には1週間。この時点で、ESCは単一細胞として又は細胞凝集物としてMEFフィーダー上で、又は細胞外マトリックスで被覆した組織培養処理プラスチック皿で継代されるFasanoetal2007。典型的には、NSC及び/又はNPCは、研究者が実施している該当実験に適切と思われる密度まで増殖させる典型的には1週間。この時点で、NSC及び/又はNPCは、単一細胞、分離細胞又は細胞凝集物として、細胞外マトリックス被覆組織培養処理プラスチック皿で、又は浮遊NSC神経球培養が所望される時は細胞外マトリックスが存在しない非組織培養処理プレートで継代されるFasanoetal2007。幹細胞例えばiPSC、MSC、CSC及びSCSCただしこれらに限定されないの標準的な培養方法は当業界では公知である。例えばiPSCの培養方法は、例えば以下に詳細に記載されている:MaheraliandHochedlingerCellStemCell20083595605。MSCの培養方法は以下に記載されている:SotiropoulouPAetalStemCells2006Feb2446271。CSCの培養方法は例えば以下に記載されている:CaoLetalBMCGastroenterol2011Jun141171;及びWakimotoetalCancerRes2009Apr1569347281。SCSCの培養方法は例えば以下に記載されている:LowryetalExpNeurol2008Feb20951022;YanJetalPLoSMed2007Feb4e39;及びYeohetalstemcells20062415641572。本方法では、未分化細胞は持続的濃度の増殖因子の存在下でインキュベートされる。ある種の実施態様では、未分化細胞は、持続放出組成物例えばPLGA微小球の存在下でインキュベートされる。いくつかの特徴では、未分化細胞は、同じ又は異なる増殖因子を含む同じ又は異なる組成物である2つ以上の持続放出組成物とともにインキュベートできる。ある種の特徴では、細胞は、増殖因子を頻繁にフィードすることによって例えば継続的、又は2、4、6、若しくは8時間毎、1つ以上の増殖因子の定常的存在下で培養される。好ましくは、細胞は所望の増殖因子を8時間毎よりも頻繁にフィードされる。本発明にしたがえば、増殖因子の安定な濃度範囲は、細胞例えば幹細胞又は前駆細胞を未分化状態で維持するために有用であり、前記はまた生産される子孫の数の増加、均質性及び質の向上に有効である。細胞培養へ増殖因子を頻繁にフィードする例えば増殖因子が培養に数時間毎又は継続的に添加されるために、増殖因子を任意の適切な方法によって、例えばピペット又はドリッパーによって細胞培養に投与するか、または自動細胞フィーディング系によってすなわち機械的に滴下してもよい。V.持続放出組成物本発明は持続放出組成物を提供し、前記組成物は、延長された期間にわたって例えば数日、好ましくは少なくとも7日の期間にわたって、細胞培養で増殖因子の持続的濃度又は濃度範囲を維持する。本発明は、具体的ないずれか1つの持続放出組成物又はいくつかの持続放出組成物例えば本明細書に記載されるものには限定されないことは理解されるべきである。本発明の方法は、任意の適切な持続放出組成物又は調製物例えば組織培養プレートコーティングを用いて実施できるが、ただし持続放出組成物又は調製物によって提供される増殖因子が、本明細書に記載するように増殖因子の持続的で安定な濃度範囲を生じる態様で提供されることを条件とする。他の実施態様では、増殖因子は、例えば1日に複数回又は継続的に細胞培養に直接添加できる。具体的な実施態様では、FGF2は、1日に3回、8時間毎にNSC培養に直接投与され、標準的な培養方法FGF2を3日目毎に細胞にフィードすると比較して分化状態及び細胞の数において予期しない顕著な改善を引き起こした。本発明の方法で用いることができる持続放出組成物の非限定的な例には、例えば微小球例えばポリPLGA微小球、無水ポリビニルアルコールPVA、ミリシリンダー、アルギネートゲル、生物分解性ヒドロゲル、リポソーム、複合物質、持続的極小ポンプ、ナノ粒子、及び持続的期間にわたって増殖因子を放出する任意の生物適合性材料が含まれる例えば以下を参照されたい:AshtonetalBiomaterials28365518;DruryJLetalBiomaterials2443374351;米国特許7226617号Dingetal;SimmonsCAetalBone35562569;ZhuGetalNatBiotech185257BiodegradableHydrogelsforDrugDeliveryKParketal1993TechnomicPublishingTransAmOphthalmolSocKDerwentetal200810620613。さらにまた。公開されている米国特許出願公開公報20100021422号を参照されたい。本実施例では、微小球は、標準的なダブルエマルジョン技術を用いて改変を施した、文献ZhuGetalNatBiotech185257記載の方法により調製した。いくつかの特徴では、本発明の微小球又はミクロ粒子はPLGA及びPVAの組合せを含むことができる以下を参照されたい:EdlundetalAdvancesinPolymerScienceVol157200267。Edlundらは、薬剤の制御デリバリーに利用するために精査した多くの多様な分解性ポリマー例えばポリグリコリド、ポリラクチドを前記の77ページに列挙している。したがって、本発明で有用である適切な持続放出組成物は、これらの分解性ポリマー又は他の分解性ポリマーを用いて作製できよう。PVAは、エマルジョン溶媒蒸発技術によって製造される微小球の安定化のために用いることができる物質の想定可能な範囲内の1つである。PVAは安定化剤乳化剤として用いられる。PVAの濃度を変更することによって微小球のサイズを変化させることができ、前記は順繰りに放出プロフィールに影響を与えることができる例えば以下を参照されたい:ZhaoetalBioMagneticResearchandTechnology52。本発明のPLGA微小球のサイズは10‐40μmの範囲であり、平均直径は20μmであり得る。サイズはホモジナイザーの速度を変化させることなどによって制御できる。ある種の実施態様ではより大きなサイズを用いることができる。微小球のサイズの変更は、培養条件の斟酌、所望される放出の動力学、積載効率及び増殖因子放出量を指標とすることができる。いくつかの実施態様では、培養細胞への増殖因子の時間性放出のために、PLGAミリシリンダーを本発明の持続放出組成物として用いることができる。本明細書で用いられるミリシリンダーは、直径が約08-15mmの円筒形単一移植物である以下を参照されたい:ZhuGetalNatBiotech185257。本発明のさらに別の特徴は、培養細胞例えば未分化細胞への増殖因子の時間性放出のためにナノ粒子の使用を含む。本明細書で用いられるナノ粒子は、典型的には1-100ナノメートルnmの範囲のサイズであるが、1-1000nmの範囲を包含するより大きな粒子とともに1ミクロン以下も含む小粒子と定義される例えば以下を参照されたい:YaPingLietalJofControlledRelease200171203211;MuLandFengSJofControlledRelease2003863348;及びGovenderetalJofControlledRelease199957171185。本発明の別の特徴はヒドロゲル中の微小球の懸濁物を含む。前記は生物適合性、生物分解性と考えられ、細胞培養の細胞例えば幹細胞及び/又は前駆細胞に適合する。ヒドロゲルマトリックスは以下を含むただしこれらに限定されない多くの有用性を有する:未分化細胞例えば幹細胞及び/又は前駆細胞のinvivo適用の安定化、三次元細胞培養の発生、並びに薬剤、増殖因子及び他の物質の細胞培養へのデリバリー。生物活性因子はヒドロゲルに存在する微小球から放出される。したがって、その放出速度は、ヒドロゲルが存在しないときと同じ態様で例えば微小球の作製に用いられるポリマーの組成分子量の変更、微小球へのタンパク質積載の変更、微小球サイズなどによって調節することができる。アルギネートリアーゼを含有する微小球のヒドロゲルへの取り込みはこの酵素の制御放出を可能にし、前記は順繰りにヒドロゲルの分解速度に対する制御を提供することがAshtonらの文献上掲書で示された以下を参照されたい:Ashtonetal上掲書;Piantinoetal2006ExpNeurol20135967;米国特許7226617号Dingetal。本発明の持続放出組成物の別の例は、非晶質炭水化物ガラスマトリックスPCT公開公報WO9310758に詳細に記載されているを含み、前記マトリックスでは、生物活性物質例えばFGF2は炭水化物ガラスマトリックスに取り込まれ、制御放出又は分解は疎水性物質の添加によって調節される。本発明はまた、持続的態様で増殖因子を放出するマトリックスによるプラスチック又はガラスの培養皿のコーティングを提供する。例えば、前記組織培養プレートは、前記組織培養プレート又は他の容器の表面を被覆するか又は表面に含まれるFGF2又は他の増殖因子を、約3、4、5、6、又は7日にわたって時間放出をする。細胞培養用持続放出組成物例えばPLGA微小球の典型的な濃度は、約1から約300ngmL、好ましくは約1から約200ngmL、より好ましくは約1から約100ngmL、さらに好ましくは約1から約50ngmL、もっとも好ましくは約1から約10ngmL、又は約1から約5ngmLの範囲である。典型的には必然的というわけではないが、培養液1mL当たり約7μLのPLGA微小球調製物調製物1μL当たり1000微小球の濃度が培養に添加される。本発明は、未分化状態で細胞を維持するために有用な任意の増殖因子を本発明の持続放出組成物で使用することを意図する。さらにまた、本発明の持続放出組成物は2つ以上の増殖因子を含むことができる。本発明で使用できる好ましい増殖因子はFGF2である。しかしながら、適切な増殖因子又は他のサイトカインのその他の非限定的な例には例えば以下が含まれる:表皮成長因子EGF、血小板由来成長因子PDGF、ソニックヘッジホッグShh、白血病阻害因子LIF及びWntタンパク質例えばWnt1又はWnt3、又は幹細胞を未分化状態で維持する任意の成長因子。例えば、脊髄幹細胞SCSCはShhによって増大する以下を参照されたい:LowryNetalExpNeurol2008Feb20951022。したがって、ある実施態様では、SCSCは、未分化状態でSCSCを維持するために、安定濃度範囲のShhの存在下で培養される。ある実施態様では、SCSCは、持続放出組成物がShhを含む持続放出組成物例えばPLGA微小球又は他の組成物例えば本明細書に記載されたものであるが、ただしこれらに限定されないの存在下で培養される。さらにまた、持続放出組成物は、Mg2、ヘパリン、硫酸デキストラン及びEDTAの1つ以上を含むことができる。本発明の持続放出組成物中の増殖因子の濃度は、約5wvから約0001、約3から約005、約2から約01、及び約10から約01の範囲であり得る。具体的な実施態様では、持続放出組成物は約05wvのFGF2を含む。しかしながらそれより多い又は少ないFGF2も具体的な培養条件に応じて用いることができる。本発明の持続放出組成物はさらに、当該組成物に含まれる1つ以上の増殖因子を安定化させるか又は複合体を形成する薬剤を含むことができる。例えば、組成物はさらにヘパリンを含むことができるヘパリンはFGF2を安定化させることが示された以下を参照されたい:CaldwellMetalExpNeurol188405420。ヘパリンの代わりに又はヘパリンに加えて当該組成物に含まれ得る別の薬剤は硫酸デキストランである。へパリン及び/又は硫酸デキストランの濃度は、約5wvから約0001、約3から約005、約2から約01、及び約10から約01の範囲であり得る。具体的な実施態様では、持続放出組成物は約10wvのヘパリン及び/又は硫酸デキストランを含む。しかしながらそれより多い又は少ないヘパリン又は硫酸デキストランも具体的な培養条件に応じて用いることができる。さらにまた、FGF2と複合体を形成する他の多価陰イオン分子も本発明の部分であり得るJMedChem200043pp25912600。分解を緩和する増殖因子の共有結合改変もまた含まれる。幹細胞増殖培養液における増殖因子の持続的濃度をもたらす全ての改変が、増殖の改善、幹細胞のより均質な未分化集団、及び幹細胞分化の低下という同様な予期に反する驚くべき結果をもたらすと期待される。本発明の持続放出組成物はさらに、持続放出組成物のpHを改変する薬剤を含むことができる。例えば、具体的な実施態様では、Mg2が組成物に添加され、例えばPLGA微小球の酸性環境を中和する。Mg2の濃度は、約15wvから約005、約10から約01、及び約5から約10の範囲であり得る。具体的な実施態様では、持続放出組成物は約30wvのMg2を含む。しかしながらそれより多い又は少ないMg2も具体的な培養条件に応じて用いることができる。本発明の組成物はまた場合によって薬剤、例えばEDTA、アラビアゴム、シュクロース、MgCO3及びBSAを含むことができる。本発明の具体的な実施態様では、持続放出組成物はPLGA微小球であり、約10-50ミクロンの直径を有し、05のFGF2、3のMg2、10ヘパリン及び1mMEDTAを含む。別の実施態様では、持続放出組成物はPLGA微小球であり、約10-50ミクロンの直径を有し、05のFGF2、3のMg2、10硫酸デキストラン及び1mMEDTAを含む。どちらかの実施態様でも、前記持続放出組成物は、少なくとも約1、2、3、4、5、6又は7日又は前記より長い、例えば2週間、3週間、4週間、5週間、又は前記より長い期間にわたってFGF2を放出する。持続放出組成物からの増殖因子の放出の動力学および量は、当該持続放出組成物の具体的な組成及びサイズ、積載効率、非放出貯蔵容器、増殖因子の分解速度、並びに組成物に含まれる増殖因子の濃度及び他の薬剤に左右されるであろう。放出動力学及び放出される例えば細胞培養中に増殖因子の量は当業者には容易に決定されるであろう。好ましくは、FGF2を放出する持続放出組成物は、天然のFGF2を少なくとも3から7、4から7又は5から7日間にわたって約10ngmLのFGF2を放出するであろうただしFGF2の安定化型についてはもっと少ない量が必要とされる。例えば、1mLのPBS02Tween20、1BSA、10ugmLヘパリン及び1mMEDTAを含む中に1mgのFGF2が与えられ、さらに02のタンパク質放出を基準にすると、1日当たり培養液に10ngmLのFGF2が少なくとも約3日間の期間にわたって達成されるであろう。未分化細胞を安定化させるすなわち、それらを未分化の状態で維持するために必要なFGF2及び他の増殖因子のレベルは放出動力学及び分解動力学に左右され得る。しかしながら好ましくは、培養液中のFGF2濃度は、約1ngmLから約10ngmL又はそれ以上、例えば15ngmL又は20ngmL又はそれ以上の範囲で、約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、又はそれより長い、例えば2週間、3週間、4週間、5週間又はそれより長い期間にわたって維持されるであろう。VI.細胞分化のアッセイ多様な方法を利用して、未分化細胞が未分化細胞として維持されていたか否かを決定することができる。例えば、hESC培養の細胞を、未分化細胞のマーカー例えばOCT4、NANOGTRA181、SSEA4及び/又はSSEA3ただしこれらに限定されないの発現について調べることができる。NSC及びNPCは、1つ以上のマーカー例えばネスチン、Lex、Sox1、Sox2、CD133、ムサシ、Bmi1、Hes1及び/又はHes5ただしこれらに限定されないの発現について調べることができる。そのような細胞はまた、分化進行又は分化済み細胞のマーカー、例えば以下のものただしこれらに限定されないの発現について調べることができる:ブラチュリー、Sox17、Foxa2、Otx2、Sox1及び/又はSSEA1hESCの場合;及びTuj1、S100β、O4及びミエリン塩基性タンパク質NSC及びNPCの場合。そのようなマーカーの遺伝子及び/又はタンパク質発現を、例えば定量的PCR、FACS解析及び/又はELISAによって決定することができる。そのような方法は当業界で周知である。そのようなマーカーはまた、他の非ヒト種起源の分化進行細胞の性状決定のために有用であり、適切なマーカーは公知で当業者はそれらを容易に決定できる。本発明の方法は、任意の種に由来する多くのタイプの未分化細胞、例えば幹細胞、前駆細胞、神経細胞例えば未熟な神経細胞などただしこれらに限定されないの培養に用いることができることは理解されよう。当業者は、培養された具体的な細胞の性状決定にどのマーカーが適切かを容易に決定できる。幹細胞のためには特に、幹細胞分化又は未分化状態での幹細胞の維持の判定はまた幹細胞の形態学的特徴の解析によって決定できる。hESCは高い核対細胞質比を示して核仁が目立ち、球形であり、典型的には一緒に堅固にまとまったコロニーとして増殖する。これらのコロニーの境界は非常に密で堅固で範囲は明瞭である。NSCは、平坦でいくつかの事例では敷石を敷き詰めたような形態を示す。NSCは、クローンとして又は非常に堅固にまとまった群として増殖する傾向があり、この場合それらは四角か又は大雑把に三角形の外観を採ることがあるTemple1989Thomsonetal1998。さらにまた、NSCは、培養で神経球として知られる浮遊凝集物として存在し得る。1週間後、これらの神経球は分離して単一細胞になり、同じ状態で再度プレートされる。適切に維持されているNSC株は、前の継代と同じ速度またはそれよりも速い速度で新しい球体を形成し続ける。NSCの維持の欠損は、継代後の神経球形成低下をもたらすであろうFasanoetal2007。VII.キット本明細書に記載する未分化細胞例えば幹細胞及び/又は前駆細胞培養用持続放出組成物はキットとして提供され得る。本キットは、そのような細胞を未分化状態で維持するために適切な1つ以上の増殖因子を含む、1つ以上の本発明の持続放出組成物例えばPLGA微小球、及び場合によってb情報資料を含むことができる。2つ以上の組成物が含まれる場合は、各持続放出組成物は本キット中で別々に提供されるか、又はそれらは種々の持続放出組成物の1つ以上の混合物として提供され得る。活性化合物例えば増殖因子に加えて、キットの持続放出組成物は、他の成分例えば溶媒又は緩衝液、安定化剤、保存料、及び/又は細胞を未分化状態で培養及び維持するための追加の薬剤例えば増殖因子を本明細書に記載するように含むことができる。持続放出組成物は、即席物としてキットで提供され得る。すなわち、前記は、細胞培養への添加時に含まれるべき全ての薬剤例えばpH安定化剤例えばMg2、増殖因子安定化剤例えばヘパリン、及び活性薬剤例えば増殖因子を含む。或いは、キットは、最終的な持続放出組成物の成分のいくつか又は各々を、使用前にそれら成分を組み合わせる仕方を指示するものとともに別々に提供してもよい。前記情報資料は、本明細書に記載の方法及び/又は本明細書に記載の方法における持続放出組成物の使用に関連する説明資料、指示資料、市場資料又は他の資料であり得る。例えば、前記説明資料は、未分化細胞例えば幹細胞及び/又は前駆細胞の培養のためにキットとして提供される持続放出組成物の使用に関連する。キットはまた1つ以上の化合物を細胞に投与するための調剤備品例えばピペット、ドロッパーなどを含むことができる。キットの情報資料はその形態に制限を受けない。多くの事例では、前記情報資料例えば指示書は、印刷物として、例えば印刷された冊子、図面及び/又は写真例えばラベル又はプリントシートとして提供される。しかしながら、情報資料はまた、他の様式例えば点字、コンピュータ読み出し可能資料、ビデオ記録物、又はオーディオ記録物でも提供できる。もちろん、情報資料は複数の様式の任意の組合せで提供することもできる。キットは持続放出組成物のための1つ以上の容器を含むことができる。いくつかの実施態様では、キットは組成物及び添付説明資料のために別々の容器、仕切り物又は区画を含むことができる。例えば、組成物はビン、チューブ又はバイアルに収納され、情報資料はプラスチックスリーブ又はポケットに収納され得る。他の実施態様では、キットの別々の成分は1個の仕切りの無い容器を用いて収納される。例えば、持続放出組成物は、ラベルの形で前記組成物に添付された情報資料を有するビン、チューブ又はバイアルとして収納される。本発明はまた以下の実施例により説明及び論証を提供する。しかしながら、本明細書のいずれかの箇所におけるこれらの実施例又は他の実施例の使用は例示であり、本発明又はいずれの実証項目の範囲及び意味をいかなる態様でも制限するものではない。同様に、本発明は、ここに記載したいずれの特定の好ましい実施態様にも限定されない。実際、本発明の多くの改変及び変型は本明細書を読んだときに当業者には明白であり、そのような変型は本発明の範囲から逸脱することなく実施し得る。本発明は、したがって添付の特許請求の範囲及びそれら特許請求の範囲が権限を与える完全な等価物によってのみ制限を受ける。hESCの標準的培養条件下でのFGF2の変動本実施例は、標準的なhESC培養条件下でFGF2濃度が激しく変動することを示す。WA09hESCWiCellResearchInstituteNationalStemCellBankMadisonWIを、織培養処理培養皿又はプレートに標準的なマウス胚線維芽細胞MEFフィーダーGlobalStemIncRockvilleMD条件又は無MEFマトリゲル:BDBiosciencesBedfordMA条件下で、10ngmLのFGF2を含む完全培養液、又は10ngmLのFGF2を含むMEF条件付け培養液MEFCMを用いプレートした。完全培養液はDMEMF12InvitrogenCarlsbadCAを含み、前記は、LグルタミンInvitrogen、最少必須アミノ酸Invitrogen、20ノックアウト血清代替物Invitrogen及び2メルカプトエタノールInvitrogenを含んでいた。MEFCMは同じ完全培養液であるが、使用前に24時間MEFを浸したものである。標準的なhESC培養技術にしたがい前記培養液は毎日交換された以下を参照されたい:Fasanoetal2010。それぞれの再フィード培養液交換の前に、培養液サンプルを収集し、サイトカインビーズキット及びFACSを製造業者のプロトコルBDCat558327にしたがって用いてFGF2レベルを定量した。培養5時間後に、MEF及びマトリゲルの両条件で、FGF2レベルは50より大きく低下し、次の培養液交換までに24時間後FGF2レベルは検出不能であった図1A及び図1B。これらの結果は、培養でhESCを維持する標準的な方法は、増殖因子の不安定性のために最適に達していないことを示した。FGF2含有微小球はhESC培養でFGF2レベルを持続させる組織培養処理培養皿又はプレートのDMEMF12InvitrogenCarlsbadCALグルタミンInvitrogen、最少必須アミノ酸Invitrogen、20ノックアウト血清代替物Invitrogen、2メルカプトエタノールInvitrogen及び10ngmLのFGF2を含むを含む標準的hESC培養液中の標準的MEFGlobalStemIncに、WA09hESCWiCellResearchInstituteを1日目にプレートした。生物分解性PLGA微小球は、05FGF2RDSystems、3のMg2、ヘパリン対FGF2の重量比が1:1のヘパリン及び1mMのEDTAを用いて作製したFGF2微小球。時間経過の間のhESC培養中のFGF2培養を測定するために、プレートしたhESCの培養液を0日目に交換し、10ngmLのFGF2を含む新しい完全培養液に置き換えた。培養液交換直後に、0日目のFGF2の濃度開始濃度を決定するためにサンプルを収集した。培養サンプルを収集したすぐ後に、FGF2含有微小球を1つのグループに添加したFGF2微小球。培養液1mLにつき7μLのFGF2微小球調製物調製物μLにつき1000微小球を用いた。6時間後、続いて24時間毎0日目の培養液交換から算出に培養液サンプルを収集し、サイトカインビーズキット及びFACSを製造業者のプロトコルBDCat558327にしたがって用いて各培養のFGF2レベルを定量した。上記実施例1と一致して、可溶性FGF2培養のFGF2レベルは急速に下降し、培養1日後にはFGF2は検出できなかった。しかしながら、FGF2微小球培養では、FGF2レベルは安定で、FGF2開始レベルの20が3日目に減少しただけであった図2。これらのデータは、持続放出組成物例えばPLGA微小球を用いて細胞培養で安定な増殖因子レベルを維持でき、それによって幹細胞培養の標準的方法が有する従来の問題すなわち急速なFGF2レベルの変動及び下降に対する解決を提供できることを示している。FGF2含有PLGA微小球とのhESCの培養上記実施例1に記載したように標準的なマウス胚線維芽細胞MEF及び無MEF条件下のDMEMF12InvitrogenCarlsbadCALグルタミンInvitrogen、最少必須アミノ酸Invitrogen、20ノックアウト血清代替物Invitrogen、2メルカプトエタノールInvitrogen及び10ngmLのFGF2を含むを含む標準的hESC培養液に、WA09hESCを1日目にプレートした。5日間の実験中に細胞培養液は交換しなかった。05の可溶性ヒトFGF2RDSystems、3のMg2、ヘパリン対FGF2の重量比が1:1のヘパリン及び1mMのEDTAを含む生物分解性PLGA微小球FGF2微小球、又は3のMg2、ヘパリン対FGF2の重量比が1:1のヘパリン及び1mMのEDTAを含むがFGF2は含まないコントロール微小球空の微小球を0日目プレートから24時間後に細胞培養のいくつかに添加し、続いて前記培養液を10ngmLFGF2補充完全hESC培養液を用いhESCを含むウェルで直接又はhESCの上方にあるトランスウェルで交換した。培養液1mLにつき7μLのFGF2微小球調製物調製物μLにつき1000微小球を用いた。コントロールグループでは、10ngmLの可溶性ヒトFGF2を毎日培養に添加した可溶性FGF2。5日後、細胞をSSEA4発現についてFACSにより評価した。FACS染色に用いたSSEA4抗体は市場BDBioscienceから入手した。期待したように、空の微小球条件下で培養した細胞は、毎日可溶性FGF2を投与した細胞と比較して5日後のSSEA4発現は低下した図3。しかしながら、FGF2微小球とともに培養した細胞はSSEA4のわずかな増加を示し、これらの細胞は、毎日可溶性FGF2処理を受けたものよりさらに低い自発的分化を経たことを示した図3。さらにまた、細胞の未分化形態が、可溶性FGF2又はFGF2微小球で処理した細胞で観察され、分化形態は陰性コントロール空の微小球で観察された。FACS解析に加えて、OCT4未分化hESCマーカー並びに分化マーカーブランチュリー及びSox17のmRNAの発現レベルを定量的RTPCRによって決定した。実証済みのTaqManプローブAppliedBioSystemsTMFosterCityCAを用いて遺伝子発現を評価した。培養では、典型的には標準的幹細胞培養方法すなわち可溶性FGF2の毎日の添加により、hESCは低レベルの自発的分化を経る。驚くべきことに、毎日の可溶性FGF2処理と比較して、PLGA微小球によって提供される安定な濃度範囲のFGF2の存在下で培養されたhESCは極めて少ない具発的分化を示した。前記は、ブラチュリー及びSox17のmRNA発現レベルの低下並びにOCT4のmRNAの高い発現レベルによって示された図4。同様な結果は、FGF2微小球をhESCの上方のトランスウェルに置いたときに観察され、微小球と幹細胞との直接接触は要求されないことを示した。OCT4、ブラチュリー及びSox17のmRNA発現解析結果は形態学的な培養均質性と一致した。したがって、本実施例で用いた培養方法は、hESC培養において安定なFGF2濃度範囲の維持及びhESCの自発的分化の驚くべき低下をもたらした自発的分化は標準的培養方法すなわち、培養液に可溶性FGF2を毎日直接添加するに付随する問題である。本実施例に記載した方法は、培養hESCの有用性を高め、さらにそれらを増殖させるために要求される労力を顕著に緩和するという利点を提供する。長期hESC培養におけるFGF2の持続放出上記実施例1に記載したように、WA09hESCを標準的MEF上にプレートし、10ngmLのFGF2を含む完全hESC培養液で培養した。生物分解性PLGA微小球は、05FGF2RDSystems、3のMg2、ヘパリン対FGF2の重量比が1:1のヘパリン及び1mMのEDTAを用いて作製したFGF2微小球。培養液1mLにつき7μLのFGF2微小球調製物調製物μLにつき1000微小球を用いた。細胞に10ngmLの可溶性FGF2を毎日、3日目毎又は1回フィードするか、又は細胞にFGF2微小球を3日目毎又は1回フィードした。7日後に、hESCを標準的方法にしたがって継代しFasanoetal2010、上掲書、いくつかの細胞をFACSで解析して、全能性のマーカーSSEA4及びSSEA3並びに分化マーカーSSEA1の発現を評価した。細胞を7日毎に5週間継代した。35日後に、SSEA1、SSEA3及びSSEA4について陽性に染色される細胞のパーセンテージを各グループで決定した。発現データは、FGF2微小球を1回又は3日目毎にフィードした細胞について類似していた。FGF2微小球をフィードされた細胞は、全能性マーカーSSEA3及びSSEA4の高い発現及び分化マーカーSSEA1の低い発現を維持し、細胞が長期培養において未分化状態で維持されたことを示した図5A。前記に加えて、14日目及び21日目に、RNAを培養細胞から単離し、全能性マーカーNANOGのmRNA発現をqRTPCRによって定量した。驚くべきことに、可溶性FGF2を毎日フィードした細胞と比較して、両時点でNANOGのより高い発現がFGF2微小球で培養した全ての細胞グループで認められた。したがって、これらの結果は、FGF2微小球の存在下で長期培養した細胞は、一定の全能性マーカーの発現を、さらにいくつかのアッセイでは標準的培養方法を用いて培養した細胞よりも高い全能性マーカーの発現レベルを有することを示した図5B。持続放出組成物例えばFGF2微小球によって提供される安定なFGF2レベルは、したがって培養へのフィード回数を最小限にし、さらにより未分化状態でhESCを維持できる。持続されるFGF2濃度範囲は、フィーダー細胞又は条件付けフィーダー培養液の非存在下でhESCをより未分化の状態で維持するhESCをMEFフィーダーの非存在下で、MEF条件付けhESC培養液のみの存在下で、又は非常に高レベルのFGF2を含む高価な特別培養液で増殖させることができる。本実施例では、FGF2微小球によって提供される持続的FGF2レベルは、MEFフィーダー、MEF条件付けhESC培養液又は特別培養液の非存在下でのhESCの培養に十分であるか否かを決定した。WA09hESCを実施例1に記載したようにhESC培養液中のマトリゲル上で増殖させた。05のFGF2、3のMg2、ヘパリン対FGF2の重量比が1:1のヘパリン及び1mMのEDTAを含むPLGA微小球FGF2微小球をいくつかの細胞培養ウェルに添加し、持続的FGF2レベルを提供した。培養液1mLにつき7μLのFGF2微小球調製物調製物μLにつき1000微小球を用いた。コントロールグループ標準的方法を用いて処理では、培養液の交換時に新しい培養液に10ngmLの可溶性ヒトFGF2を毎日添加した。他のグループでは、FGF2微小球を1週間に1回又は2回培養液に添加した。細胞を5日間増殖させ、続いて全能性マーカーOCT4及び分化マーカーSOX17のmRNA発現レベルを定量的RTPCRによって決定した。FGF2微小球の存在下で培養した細胞は、可溶性FGF2で毎日処理した細胞よりも高いOCT4レベルを発現した図6。驚くべきことに、FGF2微小球の存在下で培養した全てのグループで、分化マーカーSOX17のmRNA発現は検出不能であった図6。これらのデータは、持続放出組成物例えばFGF2微小球によって提供される安定で持続的なFGF2レベルは、上記に記載したMEFフィーダー、MEFフィーダー条件付け培養液又は特別培養液の非存在下で、hESCをより未分化な状態で維持できることを示している。持続的FGF2レベルは分化したhESC培養の全能性を改善したFGF2を含まない培養液で培養すると、hESCはゆっくりと分化し始め、徐々に全能性が低下していく。本実施例では、持続的FGF2レベルは分化可能に置かれたhESCの全能性を回復させ、hESCの培養物をより均質に全能性にするか否かを試験した。プレート時に実施例1に記載した10ngmLのFGF2を含む完全培養液をhESCにフィードし、続いてFGF2を毎日FGF2毎日フィードするか又は再度のフィーディングを実施せずFGF2無し、さらに7日間培養を続けた。7日目に、標準的方法にしたがって上掲書Fasanoetal2010参照細胞を継代し、いくつかの細胞を全能性マーカーSSEA3及びSSEA4のタンパク質発現について評価した。FACS解析によって決定したSSEA3及びSSEA4の両発現は、毎日FGF2をフィードした細胞FGF2毎日の当該マーカーの発現と比較して毎日FGF2を投与されなかった細胞FGF2無しグループで低下することが判明した図7A。この時点で、両グループの細胞を再プレーティングし、通常のFGF2含有完全培養液又はFGF2微小球を含む完全培養液05FGF2、3のMg2、ヘパリン対FGF2の重量比が1:1のヘパリン及び1mMのEDTAを含むを前記培養に添加した。培養液1mLにつき7μLのFGF2微小球調製物調製物μLにつき1000微小球を用いた。10ngmLのFGF2を毎日毎日条件又はFGF2微小球を1回0日目又は2回0日目及び2日目それぞれビーズ1回又はビーズ週2回条件細胞にフィードした。再プレーティングに続いてさらに7日間培養した後、SSEA3の発現レベルをもう一度決定した。SSEA3発現レベルは、毎日可溶性FGF2をフィードした細胞毎日条件と比較して、FGF2微小球の存在下で培養した全てのグループビーズ1回又はビーズ週2回条件で高かった。FGF2無しのグループでは、再プレーティングに続く可溶性FGF2の毎日のフィードは、SSEA3をコントロールレベルへ回復させなかったがすなわち、さらに7日間の培養中に可溶性FGF2を毎日フィードしたFGF2毎日グループのSSEA3細胞のパーセンテージ、FGF2微小球を1回フィードした細胞グループで、全能性は部分的にレスキューされ、1週間に2回FGF2微小球をフィードしたグループでは、分化細胞の全能性SSEA3の発現はコントロールレベルと比較してほぼ完全にレスキューされた図7B。NSCのFGF2PLGA微小球との培養マウスNSCは胚の脳皮質から単離して培養し、以前に記載されたようにQianetal1997上掲書又は前記プロトコルに下記に記載する改変を加えて維持した。簡単に記せば、いくつかのウェルで、10ngmLのFGF2を補充した基本培養液中で細胞をプレートし、培養液を3日目毎に交換した。前記は標準的条件であった。他のウェルでは、空の微小球単独の存在下で可溶性FGF2を含まない基礎培養液中でNSCを培養し実施例3のようにFGF2無し、微小球単独は有糸分裂誘発性ではないことを示した。他のウェルでは、可溶性FGF2を含まない基礎培養液中の細胞を、PLGA微小球05FGF2、3のMg2、ヘパリン対FGF2の重量比が1:1のヘパリン及び1mMのEDTAを含むの存在下で培養し、それ以上のものはこれらのウェルの培養中に一切添加されなかった培養液は交換されず、微小球の添加後培養には何も添加されなかった。7日間の処理に続いて、標準的技術を用いて細胞をネスチンDSHB及びβチューブリンSigmaAldrich特異的抗体で染色した以下を参照されたい:Fasanoetal2007上掲書;及びFasanoetal2009GenesDevMar12356174。標準的条件では、期待したように細胞クローンはNSC及びNPC並びにニューロン分化細胞の混合物とともに生じた前記はネスチンの陽性染色NSC及びNPC又はβチューブリン陽性染色ニューロン分化細胞によって示された。具体的には、3日目毎に可溶性FGF2をフィードした細胞は、380のNSC及びNPCネスチン及び170のニューロンβチューブリンを含む混合クローンを生じた図8。空の微小球を含むウェルは細胞総数が減少し、ネスチン染色がほとんどなくNSC及びNPCが失われ極めて低い生存率を示した図8。対照的に、FGF2含有微小球FGF2微小球を直接添加したウェルはより多くのクローンの増殖を示し、ネスチン細胞の数は劇的に増加してより良好なNSC及びNPC増殖を示した。具体的には、FGF2含有微小球によるある処理は、細胞数とともにNSC及びNPCの割合を増加させた1440ネスチン:120ニューロンβチューブリン図8。標準的すなわち通常の幹細胞培養方法を用いるとき、ゆっくりと一定に進行するNSCの分化はそれら細胞の有用性を制限する。しかしながら、本明細書に記載した発見された新規な方法PLGA微小球を用いて安定したFGF2濃度範囲が幹細胞培養物中で長時間維持されたは、培養NSCの自発的分化の驚くべき低下をもたらし、それによってこれら細胞の有用性を高め、さらにそれらを増殖させるために要求される労力を顕著に軽減した。ある実験では、さらに別のウェルの細胞を標準的条件下で培養し空の微小球を追加して、微小球が細胞に何らかの毒性を与えるか否かを決定した。標準条件下で培養した細胞への空微小球の添加は、標準的条件と比較して細胞に影響を与えなかったすなわち有害ではなかった。これらのデータは、PLGA微小球のFGF2の安定的なデリバリーによる定常的FGF2曝露は、標準的培養方法より驚くほど良好にNSC及びNPCを未分化状態で維持することを示している。NSCへのFGF2の頻繁投与本実施例では、NSCに10ngmLの可溶性ヒトFGF2を8時間毎にフィードし、6日間にわたってFGF2の定常的供給を達成した。NSC及びNPCは、細胞対細胞の相互作用によって幹細胞又は前駆細胞の一生を維持するすなわち未分化状態で存続する。細胞対細胞接触の消失は分化応答を開始させる。したがって、より堅固なコロニーはより分化度の低いNSC及びNPCの指標である。6日間のNSCへの頻繁なフィーディング8時間毎の後、NSCは、未分化細胞の指標であるより堅固な外観を有する細胞を含んでいた。前記NSC培養はまたより強いネスチン染色を示し、Tuj1染色によって測定したとき標準方法FGF2を3日目毎にフィードと比較してより低い分化度を示した図9。このデータは、定常的なFGF2供給例えば頻繁なフィーディングは、標準的プロトコルよりも低い分化状態でNSC培養を維持できることを明らかにした。持続レベルのFGF2の存在下でのヒトRPESCの培養本実施例は、ヒト網膜色素上皮幹細胞RPESCを培養で増殖させるために持続レベルのFGF2を使用することを示す。RPESCは以下のように単離した。精密切り分け22歳から99歳のドナーに由来するヒトの眼を施設EyeBankforSightRestorationIncNewYorkNY;及びNationalDiseaseResearchInterchangePhiladelphiaPAから入手した。眼を鋸状縁で切開し、後方部分を廃棄した。RPE層を露出させたまま硝子体及び網膜を取り出した。RPEの精密切り分け及び単一細胞分離は以前に記載されたように実施した以下を参照されたい:米国特許公開公報20090274667号Temple;BurkeCMetal1996ExpEyeRes6263;及びMaminishkisAetal2006InvestOphthalmolVisSci473612。洗眼用カップ内でブルーフ膜が維持されるように慎重にすり潰して、杆状体外側部分、血液又は他の細胞タイプによる夾雑が最小限のRPE細胞懸濁物を得た。RPEシートの精密切り分け及びコッブルストーン培養上記のように硝子体及び網膜を分離した後、洗眼用カップを無菌的PBSで洗浄し、続いて無酵素ハンクス系細胞分離緩衝液GibcoInvitrogenCarlsbadCAとともに37°Cで10分間インキュベートした。静かに分離緩衝液を除去し、このカップに20のPBSGibcoInvitrogenを補充したDMEMF12培養液を満たした。鈍端を有し急角度の二重刃スプーンブレード30mmを用いて穏やかにこすり落とすことによって、RPEの小シート1mm2をブルーフ膜から取り出した。マトリゲルBDBiosciences前処理組織培養プレートにRPEを静置し、RPE培養液で培養した。REE培養液:MEMα改変培養液SigmaAldrich、2mMLグルタミン、ペニシリンストレプトマイシン1:100、1ピルビン酸ナトリウム、10のFBSウシ胎児血清;記載DeSetalArchOphthalmol2007May1256415;Burkeetal1996上掲書;及びMaminishkisAetal2006上掲書にしたがってTHTタウリンヒドロコーチゾン、トリヨードサイロニン及びN1SigmaAldrichが補充され、さらに10ngmLのFGF2及び1ngmLのEGFGibcoInvitrogenが含まれる。培養MEMα改変培養液SigmaAldrich、2mMLグルタミン、ペニシリンストレプトマイシン1:100、1ピルビン酸ナトリウム、10のFBSウシ胎児血清を含み、THTタウリンヒドロコーチゾン、トリヨードサイロニン及びN1SigmaAldrichが補充され、さらに培養液1mL当たり約7μLのFGF2含有PLGA微小球05FGF2、3のMg2、ヘパリン対FGF2の重量比が1:1のヘパリン及び1mMのEDTAを含むが補充された規定の増殖培養液を用いて、RPESCを5日間増殖させた。細胞は、米国特許出願公開公報20090274667Templeetalに詳細に記載された方法にしたがって増殖させた。5日後、細胞の写真を撮影した。細胞は、可溶性FGF2を含む培養液と比較して正常な形態及び増殖パターンを示した図10。FGF2存在下でのiPSCの作製本実施例は、人工多能性幹細胞iPSCの作製のためにFGF2持続レベルを使用することを示す。タカハシらTakahashiKetalCell13186187210の記載した方法にしたがって、成人線維芽細胞をOCT4、KLF4、cMYC及びSOX2を含むレトロウイルス上清で感染させた。感染10日後に、細胞をトリプシン処理して計数し、105細胞をDMEM10FBS中のMEF上にプレートした。その次の日に、培養液を標準的hESC培養液DMEMF12InvitrogenCarlsbadCALグルタミンInvitrogen、最少必須アミノ酸Invitrogen、20ノックアウト血清代替物Invitrogen及び2メルカプトエタノールInvitrogenを含む4ngmlFGF2、又はhESC培養液FGF2含有PLGA微小球05FGF2、3のMg2、ヘパリン対FGF2の重量比が1:1のヘパリン及び1mMのEDTAを含むFGF2微小球グループで交換した。可溶性FGF2グループでは、培養液は毎日交換し、一方、FGF2含有PLGA微小球を含む培養液は1週間に2回交換した培養液交換時に培養に添加される新しい培養液はFGF2微小球を含んでいた。写真は細胞をプレートしてから9日後に撮影された。可溶性FGF2を毎日フィードする条件では、細胞は区別し得るコロニーサイズ又はコロニー形成を示さなかった図11、左パネル。対照的に、FGF2微小球の存在下で培養した細胞は、ヒト胚性幹細胞コロニーの特徴を示すコロニーを生じ図11、右パネル、持続レベルのFGF2の存在下でのiPSCの培養はiPSC生成効率を増加させることを論証した。本発明は本明細書に記載した特定の実施態様によって範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書に記載した実施態様以外に本発明の多様な改変が、前述の記載から当業者には明白となろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲内に包含されよう。本明細書に引用した全ての特許、刊行物、試験方法、文献及び他の資料は、実際に本明細書に存在するかのように、及びその各々が個々に参照によって取り込まれたかのように、参照によりその全体が本明細書に含まれる。しかしながら、そのような資料のいかなる引用も本発明の背景技術を考察する場合でさえも、前記資料が、本発明にとって従来技術として利用可能であったこと、または利用可能であることの容認と解されるべきではない。