"EphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する単離された可溶性ポリペプチドであり、該可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド。EphB4蛋白質の球状領域を含有する請求項1の可溶性ポリペプチド。配列番号395により特定されるアミノ酸配列の残基1~522と少なくとも90同一の配列を含有する請求項1の可溶性ポリペプチド。配列番号395により特定されるアミノ酸配列の残基1~412と少なくとも90同一の配列を含有する請求項1の可溶性ポリペプチド。配列番号395により特定されるアミノ酸配列の残基1~312と少なくとも90同一の配列を含有する請求項1の可溶性ポリペプチド。配列番号386又は387により特定される配列を含有する請求項1の可溶性ポリペプチド。エフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する単離された可溶性ポリペプチドであり、該可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド。配列番号396により特定されるアミノ酸配列の残基1~225を含有する請求項7の可溶性ポリペプチド。配列番号388により特定される配列を含有する請求項7の可溶性ポリペプチド。上記可溶性ポリペプチドはエフリンB2及びEphB4間の相互作用を抑制する請求項1又は7の可溶性ポリペプチド。上記可溶性ポリペプチドは、エフリンB2又はEphB4のクラスター化を抑制する請求項1又は7の可溶性ポリペプチド。上記可溶性ポリペプチドは、エフリンB2又はEphB4のリン酸化を抑制する請求項1又は7の可溶性ポリペプチド。上記可溶性ポリペプチドは1以上の改質したアミノ酸残基を含有する請求項1又は7の可溶性ポリペプチド。請求項1又は7の可溶性ポリペプチド及び医薬的に適用可能なキャリアを含有する医薬的組成物。請求項1又は7の可溶性ポリペプチド及び医薬的に適用可能なキャリアを含有する化粧品組成物。請求項1又は7の可溶性ポリペプチド及び医薬的に適用可能なキャリアを含有する診断用キット。請求項1又は7に記載の可溶性ポリペプチドを含む、細胞中のエフリンB2/EphB4経路を通るシグナルの抑制のためのポリペプチド薬。腫瘍の成長速度を減少させるためのポリペプチド薬であり、上記ポリペプチド薬は下記群から選ばれるポリペプチド薬:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド。下記群から選ばれる、癌患者を治療するためのポリペプチド薬:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド。血管形成抑制のためのポリペプチド薬であり、上記ポリペプチド薬は下記群から選ばれるポリペプチド薬:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド。下記群から選ばれる、血管形成関連障害の患者を治療するためのポリペプチド薬:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド。ポリペプチド薬は下記群から選ばれる、癌治療用医薬品の製造におけるポリペプチド薬の使用:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド。ポリペプチド薬は下記群から選ばれる、血管形成関連障害治療用医薬品の製造におけるポリペプチド薬の使用:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド。エフリンB2又はEphB4アンタゴニストでの治療が適切である腫瘍を特定する方法であり、腫瘍細胞中に1以上の下記特徴を検出する方法:aEphB4蛋白質及び/又はmRNAの発現;bエフリンB2蛋白質及び/又はmRNAの発現;cEphB4遺伝子の遺伝子増幅;及びdエフリンB2遺伝子の遺伝子増幅、ここで、1以上の上記特徴a~dを有する腫瘍細胞は、エフリンB2又はEphB4アンタゴニストでの治療が適切であり、エフリンB2又はEphB4アンタゴニストは下記群から選ばれる:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性ポリペプチドは単量体であり、融合蛋白質であり、EphB4及びエフリンB2間の相互作用の結果生じるシグナルを阻害する可溶性ポリペプチド;cEphB4蛋白質の細胞外領域へ結合し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進する抗体;及びdエフリンB2蛋白質の細胞外領域へ結合し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進する抗体。配列番号395により特定されるアミノ酸配列の残基16~522と少なくとも90同一の配列を含有する請求項1の可溶性ポリペプチド。配列番号395により特定されるアミノ酸配列の残基16~412と少なくとも90同一の配列を含有する請求項1の可溶性ポリペプチド。配列番号395により特定されるアミノ酸配列の残基16~312と少なくとも90同一の配列を含有する請求項1の可溶性ポリペプチド。本発明は、血管形成及び腫瘍増殖阻害用の試薬及び治療的処置を提供することを目的とする。本発明の概要本発明では例えば、EphB4又はエフリンB2で仲介される機能を阻害するポリペプチド薬であり、EphB4及びエフリンB2蛋白質の単一のリガンド結合部及び、特別な方法でEphB4又はエフリンB2に結合し、影響する抗体を含むものを提供する。本発明のEphB4及びエフリンB2は、癌及び望ましくない又は過度の血管形成に関する病気等の種々の病状に関与する。従って、本発明の特定のポリペプチド薬は、これらの病気を治療するために使用できる。本発明は更に、しばしば高レベルで種々の腫瘍中で発現されるEphB4及び/又はエフリンB2の発見に基づく。従って、EphB4又はエフリンB2機能をダウンレギュレートするポリペプチド薬は、腫瘍細胞への直接的効果並びに腫瘍により採用される血管形成プロセスへの間接的効果により腫瘍へ影響を与える。例えば、本発明により、EphB4又はエフリンB2機能をダウンレギュレートする試薬での治療に特に適した腫瘍種の特性が提供される。本発明では例えば、EphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性EphB4ポリペプチドを提供する。この可溶性EphB4ポリペプチドは、特異的にエフリンB2ポリペプチドへ結合する。用語可溶性は、これらのポリペプチドが膜貫通領域を含有しないか、生理食塩水中のポリペプチドの溶解度を保つのに充分な膜貫通領域部分を含有しないことを表すために単に使用される。本発明の可溶性ポリペプチドは、好ましくはエフリンB2等のリガンドへ結合するEphB4と競合し、EphB4活性化で引き起こされるシグナルを阻害する単量体として調製される。任意で、本発明の可溶性ポリペプチドは、例えば、Fc融合蛋白質としての発現又は別の多量体形成領域との融合により、多量体形態として調製できる。これら多量体形態は、文脈に応じてアゴニスト的又はアンタゴニスト的効果を有する、複合的活性を有する。例えば可溶性EphB4ポリペプチドは、EphB4蛋白質の球状領域を含有する。可溶性EphB4ポリペプチドは、図65により特定されるアミノ酸配列の残基1~522と少なくとも90同一の配列を含有してもよい。好ましくは可溶性EphB4ポリペプチドは、図65により特定されるアミノ酸配列の残基1~412と少なくとも90同一の配列を含有してもよい。更に好ましくは可溶性EphB4ポリペプチドは、図65により特定されるアミノ酸配列の残基1~312と少なくとも90同一の配列を含有してもよい。又、可溶性EphB4ポリペプチドは、図1又は図2に示される配列を含有してもよい。例えば、可溶性EphB4ポリペプチドは、エフリンB2及びEphB4間の相互作用を阻害してもよい。可溶性EphB4ポリペプチドは、エフリンB2又はEphB4のクラスター化又はリン酸化を阻害してもよい。エフリンB2又はEphB4のリン酸化は、一般的に、これらの蛋白質によりレギュレートされる細胞内シグナル経路を活発化する最初の事象の一つであると考えられる。本発明の可溶性EphB4ポリペプチドは、単量体又は多量体融合蛋白質として調製できる。可溶性ポリペプチドは、1以上の改質したアミノ酸を含有してもよい。これらアミノ酸は、プロテアーゼ消化耐性の増加等の好ましい性質に寄与できる。本発明では例えば、エフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性エフリンB2ポリペプチドを提供する。この可溶性エフリンB2ポリペプチドは、特異的にEphB4ポリペプチドへ結合する。用語可溶性は、これらのポリペプチドが膜貫通領域を含有しないか、生理食塩水中のポリペプチドの溶解度を保つのに充分な膜貫通領域部分を含有しないことを表すために使用される。本発明の可溶性ポリペプチドは、好ましくはEphB4等のリガンドへ結合するエフリンB2と競合し、エフリンB2活性化の結果であるシグナルを阻害する単量体として調製される。任意で、可溶性ポリペプチドは、例えば、Fc融合蛋白質としての発現又は別の多量体形成領域との融合により、多量体形態として調製できる。これら多量体形態は、文脈に応じてアゴニスト的又はアンタゴニスト的効果を有する、複合的活性を有する。可溶性エフリンB2ポリペプチドは、図66により特定されるアミノ酸配列の残基1~225を含有してもよい。又、可溶性エフリンB2ポリペプチドは、図3により特定される配列を含有してもよい。例えば、可溶性エフリンB2ポリペプチドは、エフリンB2及びEphB4間の相互作用を阻害してもよい。可溶性エフリンB2ポリペプチドは、エフリンB2又はEphB4のクラスター化又はリン酸化を阻害してもよい。本発明の可溶性エフリンB2ポリペプチドは、単量体又は多量体融合蛋白質として調製できる。可溶性ポリペプチドは、1以上の改質したアミノ酸を含有してもよい。これらアミノ酸は、プロテアーゼ消化耐性の増加等の好ましい性質に寄与できる。本発明では例えば、EphB4及びエフリンB2に対するアンタゴニスト抗体を提供する。上記抗体は、EphB4蛋白質の細胞外領域へ結合し、EphB4の活性を抑制するように設計できる。上記抗体は、エフリンB2蛋白質の細胞外領域へ結合し、エフリンB2の活性を抑制するようにも設計できる。更に上記抗体は、エフリンB2及びEphB4間の相互作用を阻害するようにも設計できる。本発明のアンタゴニスト抗体は、一般的にEph及び/又はエフリンシグナルに作用する。例えば本発明の抗体は、エフリンB2又はEphB4のクラスター化又はリン酸化を阻害できる。アンタゴニスト抗体は本質的に、例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、ミニボディminibody等抗体の可変部を含有するいずれのポリペプチドでもよい。本発明では又、ポリペプチド試薬及び医薬的に適用可能なキャリアを含有する医薬的配合物を提供する。ポリペプチド試薬は、例えば本発明の可溶性EphB4又はエフリンB2ポリペプチド及びアンタゴニスト抗体を含有してもよい。追加的配合物は、化粧品組成物及び診断用キットを含有してもよい。本発明では例えば、細胞中のエフリンB2/EphB4経路を通るシグナルの阻害方法を提供する。上記方法は、細胞を有効量の下記ポリペプチド薬と接触させるステップを含む:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であり、特異的にエフリンB2ポリペプチドへ結合する;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、高親和でEphB4ポリペプチドへ結合する;cEphB4蛋白質の細胞外領域へ結合し、EphB4の活性を抑制する抗体;又はdエフリンB2蛋白質の細胞外領域へ結合し、エフリンB2の活性を抑制する抗体。本発明は、例えば、腫瘍の成長速度を減少させるのに充分な量のポリペプチド薬を投与する腫瘍の成長速度を減少させる方法であり、上記ポリペプチド薬は下記群から選ばれる方法を提供する:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であり、特異的にエフリンB2ポリペプチドへ結合する;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、高親和でEphB4ポリペプチドへ結合する;cEphB4蛋白質の細胞外領域へ結合し、EphB4の活性を抑制する抗体;及びdエフリンB2蛋白質の細胞外領域へ結合し、エフリンB2の活性を抑制する抗体。任意で、腫瘍は比較用組織の非癌細胞よりも高レベルのEphB4及び/又はエフリンB2を発現する細胞を含有する。本発明では例えば、癌患者の治療方法を提供する。上記方法は、下記群から選ばれるポリペプチド薬を患者へ投与することを含む:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であり、特異的にエフリンB2ポリペプチドへ結合する;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、高親和でEphB4ポリペプチドへ結合する;cEphB4蛋白質の細胞外領域へ結合し、EphB4の活性を抑制する抗体;及びdエフリンB2蛋白質の細胞外領域へ結合し、エフリンB2の活性を抑制する抗体。任意で、上記癌は、比較用組織の非癌細胞よりも高レベルのエフリンB2及び/又はEphB4を発現する癌細胞を含有してもよい。上記癌は、転移性癌でもよい。上記癌は、腸結腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺腫瘍、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、及び白血病の群から選ばれてもよい。任意で、上記癌は血管形成依存性癌又は血管形成独立性癌でもよい。本発明で使用されるポリペプチド薬は、エフリンB2又はEphB4のクラスター化又はリン酸化を阻害してもよい。上記ポリペプチド薬は、ポリペプチド薬と添加的又は相乗的に癌細胞を抑制する、少なくとも1の追加的抗癌化学療法用試薬と共投与されてもよい。本発明では例えば、血管形成阻害方法も提供する。上記方法は、細胞を、血管形成の阻害に充分な量のポリペプチド薬と接触させるステップを含み、該ポリペプチド薬は下記群から選ばれる:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であり、特異的にエフリンB2ポリペプチドへ結合する;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、高親和でEphB4ポリペプチドへ結合する;cEphB4蛋白質の細胞外領域へ結合し、EphB4の活性を抑制する抗体;及びdエフリンB2蛋白質の細胞外領域へ結合し、エフリンB2の活性を抑制する抗体。本発明では例えば、下記群から選ばれるポリペプチド薬を患者へ投与するステップを含む、血管形成関連障害の患者の治療方法を提供する:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であり、特異的にエフリンB2ポリペプチドへ結合する;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、高親和でEphB4ポリペプチドへ結合する;cEphB4蛋白質の細胞外領域へ結合し、EphB4の活性を抑制する抗体;及びdエフリンB2蛋白質の細胞外領域へ結合し、エフリンB2の活性を抑制する抗体。上記可溶性ポリペプチドは、医薬的に適用可能なキャリアと配合されてもよい。上記血管形成関連障害又は、望ましくない血管形成関連障害は、血管形成依存性癌、良性腫瘍、炎症性障害、慢性間接リューマチ及び乾癬、眼性血管形成病、オスラーウェバー症候群、心筋性血管形成、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、繊維血管腫、外傷性顆粒化、創傷治癒、毛細血管拡張乾癬強皮症、化膿性肉芽腫、冠状側副cororanycollaterals、虚血肢血管形成、ルベオーシス、関節炎、糖尿病性新生血管形成、骨折、脈管形成、並びに血液新生の群から選ばれてもよい。本発明のポリペプチド薬は、可溶性ポリペプチドと添加的又は相乗的に血管形成を抑制する、少なくとも1の追加的抗血管形成試薬と共投与されてもよい。本発明では例えば、癌又は血管形成関連障害の治療用医薬品の製造におけるポリペプチド薬の使用も開示し、上記ポリペプチド薬は下記群から選ばれる:aEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であり、特異的にエフリンB2ポリペプチドへ結合する;bエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、高親和でEphB4ポリペプチドへ結合する;cEphB4蛋白質の細胞外領域へ結合し、EphB4の活性を抑制する抗体;及びdエフリンB2蛋白質の細胞外領域へ結合し、エフリンB2の活性を抑制する抗体。本発明では例えば、下記ステップを含有する癌患者の治療方法を提供する:a患者中の、EphB4及び/又はエフリンB2を発現する複数の癌細胞を有する腫瘍を特定するステップ;並びにb下記群から選ばれるポリペプチド薬を患者へ投与するステップ:iEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であり、特異的にエフリンB2ポリペプチドへ結合する;iiエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド、但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、高親和でEphB4ポリペプチドへ結合する;iiiEphB4蛋白質の細胞外領域へ結合し、EphB4の活性を抑制する抗体;及びivエフリンB2蛋白質の細胞外領域へ結合し、エフリンB2の活性を抑制する抗体。本発明の方法は、任意で、患者中のEphB4及び/又はエフリンB2遺伝子の遺伝子増幅を含む複数の癌細胞を有する腫瘍を特定するステップを含有してもよい。本発明では例えば、エフリンB2又はEphB4アンタゴニストでの治療が適切である腫瘍を特定する方法を提供する。上記方法は、腫瘍細胞中に1以上の下記特徴を検出する方法を含有してもよい:aEphB4蛋白質及び/又はmRNAの発現;bエフリンB2蛋白質及び/又はmRNAの発現;cEphB4遺伝子の遺伝子増幅;又はdエフリンB2遺伝子の遺伝子増幅。1以上の上記特徴a~dを有する腫瘍細胞は、本発明のポリペプチド薬等の、エフリンB2又はEphB4アンタゴニストでの治療が適切であってもよい。図面の簡単な説明図1はB4ECv3蛋白質のアミノ酸配列SEQIDNO386を示す非開裂EphB4リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す。図2はB4ECv3NT蛋白質のアミノ酸配列SEQIDNO387を示す非開裂EphB4リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す。図3はB2EC蛋白質のアミノ酸配列SEQIDNO388を示す非開裂エフリンB2リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す。図4はB4ECv3FC蛋白質のアミノ酸配列SEQIDNO389を示す非開裂EphB4リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す。図5は、B2ECFC蛋白質のアミノ酸配列SEQIDNO390を示す非開裂エフリンB2リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す。図6はB4ECFC結合アッセイプロテインAアガロースベースを示す。図7はB4ECFC阻害アッセイ溶液中阻害を示す。図8はB2ECFC結合アッセイプロテインAアガロースベースアッセイを示す。図9はB4Ecv3に応答するHUAEC走化性を示す縦軸は0.8ミクロン径の孔通過移動した細胞数。横軸は添加したB4Ecv3量、ng/ml。図10はB2ECFCに応答するHHECの走化性を示す縦軸は孔通過移動した細胞数。横軸は添加したB2ECFC量、ng/ml。図11はB2ECに応答するHHAECの走化性を示す縦軸は孔通過移動した細胞数。横軸は添加したB2EC量、ng/ml。図12は、HUAEC細管形成に対するB4Ecv3の効果を示す。図13は、HUAEC細管形成に対するB2ECFCの効果を示す。図14はヒトエフリンB2構成の概略図である。ベクター及び詳細は上から、pET15bEColi、pGEXEColi、pEF6ほ乳類、CMVプロモーター、一過性、pAPtag2ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、一過性及び安定、pRK5ほ乳類、CMVプロモーター、一過性、pcDNA3ほ乳類、G418、CMVプロモーター、一過性及び安定、pEF6ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、一過性及び安定、pEF6ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、一過性及び安定、pEF6ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、一過性及び安定、pEF6ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、一過性及び安定、pIGFcほ乳類、CMVプロモーター、一過性である。図15はヒトEphB4構成の概略図である。ベクター及び詳細は上から、pET15bEColi、pET15bEColi、pGEXEColi、pGEXEColi、pEF6ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、pEF6ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、pAPtag2ほ乳類、CMVプロモーター、pAPtag2ほ乳類、CMVプロモーター、pAPtag2ほ乳類、CMVプロモーター、pRK5ほ乳類、CMVプロモーター、pcDNA3ほ乳類、G418、CMVプロモーター、pEF6ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、pEF6ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、pEF6ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、pEF6ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、pEF6ほ乳類、ブラストサイジンS、EF1aプロモーター、pIGFcほ乳類、CMVプロモーター、一過性、pIGFcほ乳類、CMVプロモーター、一過性である。図16は組み換え型可溶性EphB4EC蛋白質の領域構造を示す。領域の表示は下記の通りである:L=リーダーペプチド、G=球状リガンド結合領域、C=Cysリッチ領域、F1、F2=フィブロネクチン型IIIリピート、H=6xHis標識。図17は、EphB4EC蛋白質の精製及びリガンド結合性を示す。図17Aはクマシー染色され精製されたEphB4由来の組み換え型可溶性蛋白質のSDSPAAGゲル電気泳動を示す。図17Bは、NiNTAアガロースビーズ上に固定化したEphB4由来の組み換え型蛋白質へのエフリンB2AP融合体の結合性を示す。三個の複製物の独立した試験結果をそれぞれの蛋白質ごとに示す。縦軸は420nmでの光学密度。図18は、EphB4v3が走化性を抑制することを示す。上のグラフは増殖因子存在下でのB4v3に応答するHUAEC侵襲を示し、縦軸は0.8un径のマトリゲル被覆された孔を通過してウェル間を移動した細胞数、横軸は添加したB4v3量ng/mlを示す。invitro侵襲アッセイ:HUAEC走化性移動及び基底膜能の劣化の測定は、modifiedボイデン商標チャンバートランスウェル膜フィルターインサート;24ウェルプレート、6.5mm直径、8um孔径、10um厚ポリマーカーボネート膜を使用して評価した。トランスウェルの上部表面はマトリゲルで予備コートした。0.25BSAの200ulのEBM溶液中のHUAEC細胞の懸濁液2×105細胞/mlを、上室チャンバーに接種し、B4v3蛋白質を刺激剤VEGF又はbFGFと同時に共にチャンバーの下室へ添加し、100nM~1uM試験化合物の存在又は非存在下で10~20ng/mlのVEGFに応答してそれらのポリカーボネートフィルターを通過する移動を測定した。37°Cで4~24時間インキュベーション後、フィルターの上部表面を綿棒でスクレープし、フィルターを固定してDiffQuick商標で染色した。3個の複製物について行った。200×倍率で10のランダム視野を計測し、結果を視野当りの平均数として示した。図19は、EphB4v3がマトリゲル商標上の細管形成を抑制することを示す。Aは代表的試験でのB4v3による細管形成の強い阻害を示す。Bは、濃度増加するB4v3で得られる、蛋白質なしの細胞と比較しての管長さの減少及び結合数の減少の評価を示す。その結果は、複製ウェルで行われた三個の複製物の独立した試験から得られる平均値±SD標準偏差で示される。HUAEC培養物を800、2000及び4000ng/mlのB4v3で培養し、次に刺激条件の増殖因子を有するSTDマトリゲル上に接種して細管形成を分析した。接種6時間及び24時間後、細胞の画像を20×倍率でとり、ウェル中に形成された細管状ネットワークの合計長さ及び連結部の数を測定した。Aは、代表的実施例でのB4v3による細管形成の強い阻止を示す。Bは、蛋白質のない細胞と比較した、B4v3の濃度増加で得られた管長さの減少及び連結部の数の減少についてAngioSysソフトウェア商標での評価を示す。結果を複製したウェルで実施した3個の独立した試験から得られた平均値±SDとして示す。左側グラフの縦軸は細管合計長さ二量体、右側グラフの縦軸は細管連結部数である。図20は、可溶性EphB4は、MTSアッセイで評価した細胞毒性効果は検出されなかったことを示す。セルタイター96HUAECw/B4v3を蛋白質濃度横軸に対する492nm吸光度を示す細胞生存率アッセイである。細胞生存率は、345ジメチルチアゾール2イル53カルボキシメトキシフェニル24スルホフェニル2Hテトラゾリウム、分子内塩MTSアッセイを使用して製造者の取り扱い説明書に従い決定した。図21は、ネズミマトリゲル商標アッセイにおいてB4v3は、内皮細胞による侵襲及び細管形成を抑制することを示す。B4v350nMをECGS150ng/mlを含有するマトリゲル溶液へ添加し、BalbCnunuマウスへ皮下注射した。6日後、プラグを取り出してパラフィン中で処理した。個々の断片を、ヘマトキシリンA又はトリクローム商標、マッソン社製のいずれかで染色して合計侵襲細胞を検出して20×倍率で画像をとった。AB左上はGFなしのマトリゲルプラグの断片を示し、Aの右上はGFを含むB4IgGを有する断片を示し、左下の断片はGFを含有し、右下はB4v3の存在下でのGFを示す。内皮細胞の顕著な侵襲はGF含有マトリゲルのみで観察された。右上はB4IgGにより誘起され侵襲された多数の細胞を有する区域を示し、それはB4v3の二量体を示す。画像の左上部は、マトリゲルプラグ周囲に形成された細胞層に対応し、そこから細胞が右下隅の方向へ配置されたプラグの中央に向かって侵襲する。マトリゲルプラグの断片中の全細胞はScionImageソフトウェア商標で定量化された。複製したプラグでの2個の複製物の試験から得られた結果を、平均値±SDとして示す。下のグラフは、invivoのB4グループのマトリゲルプラグについて、50nM蛋白質で処理したグループを示す。図22は、EphB4由来の組み換え型可溶性蛋白質の存在下又はその非存在下で、エフリンB2Fc融合での刺激に応答する、PC3細胞中のEphB4レセプターのチロシンリン酸化を示す。図23は、生存能力生存率及び細胞周期に対する可溶性EphB4ECDの効果を示す。Aは、2個のHNSCC15及び4細胞系の3日間細胞生存能力アッセイを示す。Bは、A中で処理されるHNSCC15細胞中の細胞周期のFACS分析を示す。これらの細胞の処理は、矢印により示されるようにサブG0/G1及びS/G2期中の蓄積を生じた。図24は、B4v3は、ネズミ角膜hydron商標マイクロポケットアッセイ中の新血管応答を阻害することを示す。B4v3180ngを、繊維芽細胞増殖因子bFGF100ngの存在又は非存在下でhydron及びスクラルフェート45ugへ添加し、ペレットを形成した。ペレットを選択し、BalbCnunuマウスの角膜中のマイクロポケット中に挿入した。3日後、ペレットを取り出し、化合物を凍結処理した。bFGRスクラルフェートペレット左上のみが、移植3日後に角膜輪部脈管から発生してペレットへ達する激しい血管新生反応を誘起した。bFGF及びスクラルフェートを含有する、B4v3及びBfそれぞれ右上及び左下を有するペレットは、移植3日後にバックグラウンド左下を超える血管形成応答を生成しなかった。図25は、sB4v3とのSCC15左側グラフ、B16右側グラフ及びMCF7中央グラフの共注射は、マトリゲル及び増殖因子の存在下で、これらの細胞のinvivo腫瘍増殖を抑制することを示す。Aは、sB4v3を、マトリゲル製剤中×106細胞で、40mg/kg体重で皮下に共注射した。代表的画像は、PBSコントロール処理右側腹部と比較して、sB4の存在下左側腹部で腫瘍増殖を阻害したことを示す。Bは、sB4v3での処理は、コントロール処理マウスと比較してinvivoヌードマウスで顕著にヒトSCC、B16及びMCF7腫瘍増殖腫瘍サイズを阻害したp<0.05。Cは、sB4v3での処理は、コントロール処理マウスと比較してinvivoで腫瘍重量を顕著に抑制したp<0.05。データは平均±SEM標準偏差として示す。p<0.05。図26は、SCC15の腫瘍組織を示し、可溶性EphB4は3種の腫瘍種、B16黒色腫中央部画像2枚、SCC15頭部癌及び頚部癌、上部画像12枚、及びMCF7乳癌、下部画像2枚でアポトーシス、壊死及び血管形成減少を生じることを示す。腫瘍はマトリゲル商標プラス増殖因子及び可溶性EphB4と予備混合して皮下注射される。10~14日後、マウスにFITCフルオレセインイソチオシアネートレクチン緑を静脈注射して血管かん流を評価した。コントロールPBSで処理された腫瘍は、高い腫瘍密度及び活発な血管形成応答を示した。sEphB4で処理された腫瘍は、腫瘍細胞密度の減少及び生存腫瘍細胞領域での腫瘍血管形成の顕著な阻害、並びに腫瘍壊死及びアポトーシスを示した。図27は、前立腺細胞系でのEphB4の発現を示す。Aは、種々の前立腺癌細胞系、細胞系MLC由来の正常前立腺及び、EphB4モノクローナル抗体でプローブされる急性骨髄芽球性リンパ腫細胞AMLの全細胞溶解産物のウェスタンブロット法を示す。上段はEphB4、下段はβアクチン標準蛋白質。Bは、ウェスタンブロット法により決定されるPC3細胞中のEphB4のリン酸化を示す。左は10PBS、右は血清飢餓状態。図28は前立腺癌組織中のEphB4の発現を示す。EphB4モノクローナル抗体で染色された、代表的前立腺癌凍結断片左上又はイソタイプ特異的コントロール左下。隣接するBPH組織良性肥大性前立腺上皮由来のは、EphB4モノクローナル抗体で染色された右上。陽性シグナルは、腫瘍細胞中で茶色である。ストロマ及び正常上皮は陰性である。腫瘍組織中の染色の膜局在化は、EphB4の膜貫通局在化と一致することは注意すべきである。右下グラフは、癌標本右及び隣接するBPH組織左から抽出されたEphB4:βアクチンRNAの代表的QRTPCR定量的RTPCR法を示す。下の表は前立腺組織アレイ中のEphB4染色結果を示す。図29は、腫瘍抑制剤による前立腺癌細胞中のEphB4のダウンレギュレーション及びRXRレチノイドXレセプター発現を示す。Aでは、PC3細胞は、短縮truncatedされたCD4及びp53若しくはPTEN又はベクターのみで共トランスフェクトされた。24時間後、CD4分類された細胞を採取し、溶解し、ウェスタンブロット法でEphB4及び、標準蛋白質としてβアクチンの発現を逐次的に分析した。Bは、種々の安定な細胞系の上記Aのウェスタンブロット法を示す。LNCaPFGFはFGF8の安定なトランスフェクションクローンであり、一方CWR22RRXRはRXRレセプターを安定して発現する。BPH1は、良性肥大性前立腺上皮から確立された。図30は、EGFR及びIGFR1による前立腺癌細胞中のEphB4のダウンレギュレーションを示す。Aは、EGFRを特異的に阻害剤AG14781nMで36時間処理又は処理なしでのPC3細胞のウェスタンブロット法を示す。EphB4シグナルの減少がAG1478処理後に観察された。膜をストリップし、影響を受けていないβアクチンで再プローブした。Bは、IGFR1を特異的に中和する抗体MAB391で2μg/ml;一晩処理し又は処理しないPC3細胞の3個の複製サンプルを試験したウェスタンブロット法を示す。膜を、EphB4、IGFR1及びβアクチン抗体で逐次的にプローブした。IGFR1シグナルは、MAB391処理によるシグナルの予測された抑制を示す。図31は発現及び前立腺細胞機能に対して特別なEphB4ASODNアンチセンスオリゴヌクレオチド及びsiRNAの効果を示す。Aでは、EphB4の完全長構築物を安定して発現する293細胞を、EphB4発現を阻害するためのsiRNA472の能力を評価するために使用した。細胞をリポフェクタミン2000商標を使用して50nMのRNAiでトランスフェクトした。コントロールsiRNA緑蛍光蛋白質;GFPsiRNA又はEphB4siRNA472でトランスフェクション40時間後、EphB4モノクローナル抗体でプローブし、ストリップし、βアクチンモノクローナル抗体で再プローブした細胞溶解産物のウェスタンブロット法を示す。Bは、完全長EphB4を一時的に発現する293中での発現に対するEphB4AS10の効果を示す。細胞をAS10又はセンスODNへ6時間曝露し、上記Aのウェスタンブロット法により分析した。Cは、方法段落記載のようにsiRNAで処理されたPC3細胞の48h生存能力アッセイを示す。三個の複製サンプルの平均±semを示す。Dは、方法段落記載のようにODNで処理したPC3細胞の5日間生存能力アッセイを示す。三個の複製サンプルの平均±semを示す。Eは、上記A中でトランスフェクトされた50nMのsiRNAの存在下でのPC3細胞の移動のスクレープアッセイを示す。スクレープが単層で作成された直後0h及び連続培養で作成された20時間後に得られた代表的20×視野の顕微鏡写真を示す。20時間後のスクレープでは大量の細胞にEphB4siRNA472ではなくコントロールsiRNAで充填されていた。Fは、AS10又はセンスODN両方10μMで処理した細胞と同様のアッセイを示す。Gは、方法段落記載のようにsiRNA又はコントロールsiRNAでトランスフェクトされたPC3細胞のマトリゲル商標侵襲アッセイを示す。下室チャンバー中で5mg/mlフィブロネクチンに応答するマトリゲル商標被覆されたインサートの下側への細胞移動を固定化し、ギムザ染色した。コントロールsiRNA及びsiRNA472処理した細胞の代表的顕微鏡写真を示す。細胞数を5個の高性能視野で計測し、平均±semをグラフに示す右下。図32は、細胞周期及びアポトーシスに関するEphB4siRNA472の効果を示す。Aでは、方法段落記載のようにsiRNAでトランスフェクトされたPC3細胞を、上記トランスフェクション24時間後にフローサイトメトリーにより細胞周期段階について分析した。プロピジウムアイオダイド蛍光強度に対する細胞数のプロットを示す。siRNA472で処理した場合に1のコントロールsiRNAでのものと比べ、7.9の細胞母集団はアポトーシス性であるサブG0ピーク中。Bは、方法段落記載のように細胞死検出ELISAプラスキットにより検出されたPC3細胞のアポトーシスを示す。405nmでの吸光度は、核フリー細胞フラクション中のヒストン及びDNAPOD量に比例して増加した。siRNA472及びGFPsiRNAコントロール表示濃度での三個の複製サンプルの平均±semを示す。図33は、EphB4及びエフリンB2が中皮腫細胞系中で発現されたことをRTPCRA及びウェスタンブロット法Bで確認されることを示す。図34は、中皮腫細胞中でのinsituハイブリダイゼーションによるエフリンB2及びEphB4の発現を示す。チャンバースライド中で培養されたNCIH28中皮腫細胞系は、エフリンB2又はEphB4へのアンチセンスプローブでハイブリッド化されやすかった最上列。それぞれのハイブリダイゼーション用コントロールは、センス最下列である。陽性反応は暗青の細胞質染色である。図35は、中皮腫培養物中のEphB4及びエフリンB2の細胞性発現を示す。悪性中皮腫患者の胸水由来の主な細胞の単離体、並びに細胞系NCIH28、NCIH2373、及びNCIH2052のエフリンB2及びEphB4に対する免疫蛍光染色法である。緑色は、FITC標識化第二抗体の陽性シグナルである。免疫蛍光染色法の特異性により、一次抗体が無い場合シグナルの欠落を示した第一列。細胞核はDAPI青色で対比染色され、全細胞の位置が明らかになった。DAPI及びFITC蛍光の併合画像を示す。オリジナル倍率200×。図36は中皮腫腫瘍中のエフリンB2及びEphB4の発現を示す。悪性中皮腫バイオプシーの免疫組織化学。HE染色された断片は腫瘍構造を明らかに示した;左下パネルは一次抗体の無いバックグラウンドコントロールである。EphB4及びエフリンB2特異的染色法は茶色である。オリジナル倍率200×。図37はH28細胞の増殖に対するEphB4アンチセンスODNプローブの効果Aのグラフ及びH28細胞の増殖に対するEphB4siRNAの効果Bのグラフを示す。いずれも縦軸は生存度、横軸は濃度を表す。図38は、細胞移動に対するEphB4アンチセンスASプローブの効果Aのグラフ及びH28の移動に対するEphB4siRNAの効果ボイデンチャンバー、Bのグラフを示す。図39は、EphB4はHNSCC主要組織及び転移で発現したことを示す。Aは、上段が本発明のEphB4モノクローナル抗体で染色され、腫瘍細胞に局在化したことをDAB茶色で画像化された代表的保存用断片の免疫組織化学を示す。下段は、隣接する断片のヘマトキシリン及びエオシンHE染色を示す。濃紫染色法は腫瘍細胞の存在を表す。右手カラムは、EphB4ポリクローナル抗体で染色され右上、DABで画像化されたリンパ節転移の凍結断片である。コントロール中央はヤギ血清でのインキュベーションであり、HE底部は、染色されないストロマで囲まれた転移性病巣の位置を明らかにする。Bは、ランオフ転写により生成された、DIG標識化EphB4左カラム及びエフリンB2右カラムのアンチセンス又はセンスプローブでプローブされたHNSCCケースの連続凍結断片のinsituハイブリダイゼーションを示す。ハイブリダイゼーションシグナル暗青はアルカリホスファターゼ複合抗DIG抗体を使用して検出され、断片はNuclearFastRed商標で対比染色された。HEで染色された連続断片を、腫瘍構造を示すために示す左下。Cは、腫瘍T、単純な包含されていない正常組織N及びリンパ節バイオプシーLNから構成される患者サンプルの蛋白質抽出物のウェスタンブロット法を示す。サンプルは、4~20トリスグリシンゲル中でポリアクリルアミドゲル電気泳動されて分離され、次にナイロン膜上で電気ブロッティングされた。膜は、EphB4モノクローナル抗体及びβアクチンMoAbで逐次的にプローブされた。化学発光シグナルをオートラジオグラフフィルム上で検出した。120kD位に移動するEphB4特異バンド及び40kD位に移動するβアクチンを示す。βアクチンシグナルをそれぞれのサンプルの担持及び転移のコントロールとして使用した。図40はEphB4はHNSCC細胞系中で発現し、EGFによりレギュレートされることを示す。Aは、SCC細胞系中のEphB4発現の測定を示す。図39Cで示されるように、逐次的にEphB4モノクローナル抗体でプローブされ、ストリップされ、βアクチンモノクローナル抗体で再プローブされた全細胞溶解産物のウェスタンブロット法を示す。Bは、EphB4発現に対する特異的EGFR阻害剤AG1478の効果を示す。SCC15の疎細胞溶解産物のウェスタンブロット法は、10FCSを補充された培地中で0~1000nMAG1478で24時間処理左、又は1mMAG1478で4、8、12又は24時間処理右した。膜は逐次的にEphB4及びアクチンをプローブしたことを示す。Cは、SCC細胞系中のEphB4発現に対するEGFRシグナルの阻害効果を示す。10FCSを含有する増殖培地growthmedia中に保持された細胞を、1μMAG1478で24時間処理し、その後疎細胞溶解産物を、EGFR、EphB4、エフリンB2及びβアクチン抗体で逐次的にプローブした細胞溶解産物のウェスタンブロット法により分析した。EGFRの特異的シグナルが170kD位に検出され、エフリンB2が37kD位に、更にEphB4及びβアクチンが図1C中に示されるように検出された。βアクチンはロード及び移動コントロールとして使用した。図41は、EGFによるEphB4のレギュレーション機構を示す。Aは、EGFRシグナル経路の概略図であり、作用部位及び使用された特別なキナーゼ抑制剤の名前を赤で示す。Bでは、SCC15細胞は、追加的24インキュベーション前に、図示されたようにEGF10ng/ml、3μMU73122、又は5μMSH5、5μMSP600125、25nMLY294002、μMPD098095又は5μMSB203580の存在又は非存在下で24時間血清飢餓状態だった。N/Aは、同体積の希釈剤DMSOのみを加えた培養物を表す。細胞溶解産物をEphB4モノクローナル抗体を使用したウェスタンブロット法で分析した。βアクチンシグナルは、蛋白質ロード及び移動コントロールとして使用した。図42は、特異的EphB4siRNAは、EphB4発現、細胞生存能力を阻害し、細胞周期停止を引き起こすことを示す。Aでは、安定して完全長EphB4を発現する293細胞を、リポフェクタミン2000商標を使用して50nMRNAiでトランスフェクトした。トランスフェクション40時間後、細胞を採取し、溶解してウェスタンブロット法用に処理した。膜をEphB4モノクローナル抗体でプローブし、ストリップし、蛋白質ロード及び移動コントロールとしてβアクチンモノクローナル抗体で再プローブした。スクランブルされた緑蛍光蛋白質GFP配列に対する陰性試薬コントロールはRNAiであり、コントロールはリポフェクタミン2000商標のみでトランスフェクションされる。Bは、方法段落記載のようにsiRNAで48時間処理したSCC細胞系のMTT細胞生存能力アッセイを示す。三個の複製サンプルの平均±semを示す。Cでは、siRNAで上記のようにトランスフェクトされたSCC15細胞を、トランスフェクション24時間後、記載のようにフローサイトメトリーにより細胞周期段階を分析した。プロピジウムアイオダイド蛍光強度に対する細胞数のプロットを示す。上列及び及び中央列は、siRNAトランスフェクション16時間後の細胞のプロットを示し、最下列は、トランスフェクション36時間後の細胞のプロットを示す。特異的siRNA及び濃度は、それぞれのプロットで示される。Lipo=リポフェクタミン商標200mockトランスフェクション。図43は、SCC細胞に対する特別なEphB4ASODNのinvitro効果を示す。Aでは、EphB4完全長発現プラスミドで一時的にトランスフェクトした293細胞を、トランスフェクション6時間後上記アンチセンスODNで処理した。細胞溶解産物をASODN処理24時間後採取してウェスタンブロット法を適用した。Bでは、SCC25細胞を48ウェルプレートへ均一密度で接種し、1、5、及び10μMのEphB4ASODNで2及び4日処理した。細胞生存能力を第5日にMTTアッセイで測定した。三個の複製サンプルの平均値±semを示す。EphB4蛋白質レベル阻害活性を示したASODNも又、SCC15細胞生存能力の効果的抑制剤であった。Cは、未処理細胞上部と比較した36時間AS10で処理したSCC15細胞底部の細胞周期分析を示す。Dは、プラスチックパスツールピペットでスクレープして単層中に3mm幅裂け目を作成したSCC15細胞の融合培養物を示す。EphB4ASODNAS10の阻害及びASODNAS1の非阻害の存在下で細胞の移動能力及び創傷への近接能力を、48時間後評価した。スクランブルされたODNは陰性コントロールODNとして含まれた。標識化未処理培養物はODNへ曝されなかった。試験開始時点で、全培養物は同一幅のスクレープ裂け目を示し、1μMEphB4AS10中で48時間後に観察されるものと類似であった。赤い括弧は、最初のスクレープ幅を表す。Eは、方法段落記載の2室アッセイ中の、20mg/mlEGFでのSCC15細胞の移動を示す。未処理NT、AS6及びAS10処理した細胞並びに、移動阻害の陽性コントロールとしての10ng/mlタキソールの代表的顕微鏡写真を示す。Fでは、細胞数を5個の高性能視野中で計測し、平均±semをグラフ中に示す。図44は、EphB4ASODNはinvivo腫瘍増殖を抑制することを示す。20mg/kg/日で、EphB4AS10処理又はODNスクランブルされたBalbCヌードマウス中へのSCC15皮下腫瘍異種移植の増殖曲線は、5×106細胞の移植の次の日から始まる。コントロールマウスは同体積の希釈剤PBSを投与された。6マウス/グループの平均±semを示す。P=0.0001スクランブルされたODN処理したグループと比較したスチューデントttestによる。図45はEphB4ではなくエフリンB2がKSバイオプシー組織中で発現したことを示す。Aは、エフリンB2及びEphB4用アンチセンスプローブとのinsituハイブリダイゼーション、及び腫瘍構造を示すためにHE染色された対応する断片を示す。ISH中の暗青色は、エフリンB2の陽性反応を表す。EphB4に対するシグナルは、カポジ肉腫バイオプシーでは検出されなかった。反対に、EphB4に対するISHシグナルは、扁平上皮細胞癌腫瘍細胞中で強い。エフリンB2も又EphB4AP融合蛋白質を使用してKS中に検出された左下。Bは、EphB4/Fc融合蛋白質でのエフリンB2の検出を示す。隣接する断片は腫瘍構造を示すためにHEで染色され左、黒い長方形は、方法段落記載のようにFITC標識化抗ヒトFc抗体で検出されたEphB4/Fc処理した断片中央中に示される範囲を表す。コントロールとして、隣接する断片をヒトFcフラグメントで処理した右。その断片へ結合するEphB4/Fcから生じる特別なシグナルは、腫瘍細胞の範囲のみに観察される。Cは、エフリンB2及びHHV8潜伏蛋白質LANA潜伏感染関連核抗原1の共発現を示す。冷凍KSバイオプシー材料のエフリンB2赤、LANA1緑又はEphB4赤に対する抗体での二重標識法共焦点免疫蛍光学顕微鏡分析は、KSバイオプシー中でのLANA1及びエフリンB2の共発現を直接的に示す。共発現は黄色で示される。プロピジウムアイオダイド染色赤された核を有する細胞中のPECAM1緑に対する抗体を有するバイオプシーの二重標識法共焦点画像は、腫瘍の血管の特性を示す図46はHHV8は静脈性内皮細胞中での動脈性マーカー発現を誘起することを示す。Aは、動脈/静脈マーカー及びウィルス性蛋白質用のHUVEC及びHUVEC/BC1の培養物の免疫蛍光を示す。材料及び方法段落中に示されるように、培養物をチャンバースライド中で成長させ、エフリンB2a、e、i、EphB4m、q、u、CD148j、v、及びHHV8蛋白質LANA1b、f、m又はORF59rの免疫蛍光検出用に処理した。同一視野の併合画像中の黄色は、エフリンB2及びLANA又はエフリンB2及びCD148の共発現を示す。生存細胞の位置は、第三カラムc、g、k、o、s、w中のDAPI青での核染色法により明らかになった。顕微鏡写真は、代表的視野である。Bは、HUVEC及び2個のHHV8感染させた培養物HUVEC/BC1及びHUVEC/BC3の、エフリンB2及びEphB4に対するRTPCRを示す。エフリンB2生成物200bpはHUVEC/BC1中で観察され、HUVEC/BC3及びEphB4生成物400bpはHUVEC中で観察される。又インプットRNAの量及び完全性のコントロールとしてβアクチンRTPCRを示す。図47は、HHV8はカポジ肉腫細胞中の動脈性マーカー発現を誘起することを示す。Aは、種々の細胞溶解産物に対するエフリンB2のウェスタンブロット法を示す。SLKvGPCRはHHV8vGPCRを発現するSLKの安定なクローンであり、SLKpCEFLはエンプティ発現ベクターでトランスフェクトされた安定なクローンのコントロールである。LANA又はLANA△440でトランスフェクトされたSLK細胞は、それぞれSLKLANA及びSLK△440である。蛋白質ロード及び移動量をβアクチンモノクローナル抗体での膜の再プローブにより決定した。Bは、発現ベクターpvGPCRCEFLでのKSSLK細胞の一時的トランスフェクションは、FITC緑で示されるように免疫蛍光染色法によるエフリンB2の発現を生じた。一方、コントロールベクターpCEFLは変化がなかった。KSSLK細胞0.8×105/ウェルを0.8μgDNAでリポフェクタミン2000商標を使用してトランスフェクトした。24時間後、方法段落記載のように細胞を固定化し、エフリンB2ポリクローナル抗体及びFITC複合第二抗体で染色した。Cでは、HUVECのvGPCRでの一時的トランスフェクションは、エフリンB2ルシフェラーゼ構築物からの転写を誘導した。グラフ右側の数字は誘導倍率である。24ウェルプレート中の8×103HUVECを、Superfect商標を使用して、翻訳開始部位に関する2941~11、又は記載のような2個の5’欠失の配列を含有する0.8μg/ウェルのエフリンB2プロモーター構築物で、80ng/ウェルpCEFL又はpvGPCRCEFLと共にトランスフェクションした。ルシフェラーゼはトランスフェクション48時間後に測定され、誘導割合はグラフの右側に示される。pGL3Basicはプロモーターの無いルシフェラーゼコントロールベクターである。ルシフェラーゼは、GPCRが共トランスフェクトされたβガラクトシダーゼの発現を誘起したために、蛋白質へ中和された。グラフは、複製物6個の平均±SEMである。3個の複製物の同様な試験の1例を示す。図48は、VEGF及びVEGFCがエフリンB2発現をレギュレートすることを示す。Aでは、抗体中和によるエフリンB2の阻害を示す。細胞は完全増殖培地fullgrowthmedium中で培養され、抗体へ100ng/ml36時間曝されてから採取及びウェスタンブロット法用の溶解が行われた。Bでは、エフリンB2の発現の誘導のために、細胞を、5血清を含有し、増殖因子を欠くEBM増殖培地中で培養した。個々の増殖因子を記載のように添加し、細胞を36時間後に採取した。蛋白質ロード及び移動量を膜のβアクチンモノクローナル抗体の再プローブで測定した。図49は、特異的siRNAでのエフリンB2ノックダウンは、VEGFの存在下であり、IGF、EGF又はbFGFの非存在下でのKS細胞中の生存能力及びHUVEC増殖を抑制することを示す。Aでは、KSSLK細胞を種々のsiRNA、エフリンB2及びコントロールでトランスフェクトした。48時間後、細胞を採取し、疎細胞溶解産物を4~20SDSPAGEでフラクション分離した。ウェスタンブロット法を、インハウスで生成されたエフリンB2に対するモノクローナル抗体で行った。膜をストリップし、βアクチンモノクローナル抗体シグマ社製で再プローブすると等価ロード及び移動が示された。Bは、エフリンB2及びEphB4siRNAの存在下でのKSSLK培養物の3日細胞生存能力アッセイを示す。24ウェルプレート中の1×105細胞/ウェルを0、10及び100ng/mlsiRNAで上記グラフ上の様に処理した。方法段落記載のように、培養物の生存能力をMTTアッセイで測定した。複製したサンプルの平均±標準偏差を示す。Cでは、HUVE細胞をフィブロネクチンで被覆された8ウェルチャンバースライド上に接種した。HUVE細胞を、全成長補充剤を含むEGM2培地中で一晩増殖した。翌日、培地を上記VEGF10ng/ml又はEGF、FGF及びIGFを含有する培地で交換した。37°Cでインキュベーション2時間後、細胞をリポフェクタミン2000商標、インビトロジェン社製を使用して10nMのsiRNA含有OptiMEM培地商標中でエフリンB2、EphB4又はコントロールとしての緑蛍光蛋白質GFPに対しトランスフェクトした。細胞を2時間インキュベートし、次に複数の増殖因子を含有する新しい培地又はVEGF単独をそれぞれウェルへ添加した。48時間後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、直ちにデジタルカメラにより10×倍率で画像を撮った。図50は、可溶性EphB4は、KS及びECコード形成及びinvivo血管形成を抑制することを示す。マトリゲル商標上列中のHUVECのコード形成アッセイを示す。指数関数的成長期の細胞を、マトリゲル商標上にプレートする前に表示濃度のEphB4細胞外領域ECDで一晩処理した。細胞をトリプシン処理し、0.5mlマトリゲル商標を含有する24ウェルプレート中にプレートした1×105細胞/ウェル。記載の試験化合物の連続した存在下でマトリゲル商標上にプレートした8時間後のコード形成の代表的20×フェースのコントラスト視野を示す。オリジナル倍率200×。マトリゲル商標上のコード形成アッセイで同様の方法で処理したKSSLK細胞を示す中央列。最下列はinvivoマトリゲル商標アッセイを示す。即ち、増殖因子及びEphB4ECD又はPBSを含有するマトリゲル商標プラグを、マウスの中央腹部内に皮下移植した。7日後、プラグを除去し、断片化し、HEで染色してマトリックス内への細胞移動を画像化した。大型管腔を有する変化しない脈管がコントロール中に観察される一方、EphB4ECDはほとんど完全にマトリゲル商標中への細胞の移動を阻害した。図51は膀胱癌細胞系中でのEphB4の発現A及びEGFRシグナル経路によるEphB4発現のレギュレーションBを示す。図52は、p53のトランスフェクションは5637細胞中のEphB4の発現を阻害することを示す。図53はEphB4siRNA472での処理による膀胱癌細胞系5637の増殖阻害を示す。縦軸は生存能力を示す。図54はEphB4siRNA472でトランスフェクトされた5637細胞のアポトーシス研究の結果を示す。下のグラフの縦軸は405nmでの吸光度である。図55はEphB4アンチセンスプローブの細胞移動に対する効果を示す。左側から0、6、9時間後の画像である。5637細胞は、EphB4AS1010μMで処理された。図56は、EphB4siRNAの細胞侵襲に対する効果を示す。5637細胞はsiRNA472又はコントロールsiRNAでトランスフェクトされた。図57は、G250及びプルダウンアッセイによるEphB4モノクローナル抗体の比較結果を示す。下にクローン番号を示す。図58は、EphB4抗体はヌードマウスにおいて、VEGFの存在又は非存在下で、SCC15/MG異種移植腫瘍の増殖を阻害することを示す。グラフの縦軸はマトリゲルプラグの大きさmm3である。図59は、EphB4抗体はSCC15、頭部癌及び頚部癌腫瘍種の、アポトーシス、壊死及び血管形成減少を引き起こすことを示す。B4抗体のSCC15腫瘍組織に対する効果を示す。左から、アポトーシス、増殖、血管、MT、HE染色を示す。図60は、EphB4抗体の全身的投与は腫瘍退縮を導くことを示す。SCC15/IPでの、SCB4抗体処理された異種移植腫瘍退縮を示す。上のグラフはinvivoでのSCC15に対するAb47及び138の効果を示し、縦軸は腫瘍の大きさmm3、横軸は移植後日数である。下のグラフはinvivoヌードマウスでのSCC15に対するAb47及び138の効果を示し、縦軸は腫瘍の大きさmm3を表す。図61はヒトEphB4のゲノムヌクレオチド配列SEQIDNO391を示す。図62はヒトEphB4のcDNAヌクレオチド配列SEQIDNO392を示す。図63はヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQIDNO393を示す。図64はヒトエフリンB2のcDNAヌクレオチド配列SEQIDNO394を示す。図65はヒトEphB4のアミノ酸配列SEQIDNO395を示す。図66はヒトエフリンB2のアミノ酸配列SEQIDNO396を示す。本発明の詳細な説明I.概説本発明の一部は、エフリン/エフリンレセプター経路を経由するシグナルが腫瘍生成に貢献することを発見したことに基づいている。発明者らは、腫瘍組織中のエフリンB2及びEphB4の発現を検出し、エフリン/エフリンレセプターを経由するシグナルをブロックする抗腫瘍治療薬を開発した。更に、本発明は、EphB4及び/又はエフリンB2のポリペプチドベースの機能阻害のためのポリペプチド治療薬及び方法を提供する。従って、本発明は例えば、癌並びに血管形成関連障害及び望ましくない血管形成関連障害を治療するために使用できる数多くのポリペプチド化合物薬を提供する。ここで使用される用語エフリン及びEphは、それぞれリガンド及びレセプターとして使用される。それらは種々の動物例えば、ほ乳類/非ほ乳類、脊椎動物/非脊椎動物、ヒト等のいずれかからでも得られる。この分野の命名法は急速に変化しており、ここで使用される用語法は、Eph命名法委員会による作業の結果として提案されたものであり、以前使用されていた名前と共にウェッブサイトhttpwwwephnomenclaturecomでアクセスできる。本発明の研究は、好ましい実施例中ではエフリンB2及びEphB4に関する。しかし、本発明は、腫瘍中で発現されるそれぞれのファミリー中のエフリンリガンド及び/又はEphレセプターのいずれかを意図する。エフリンリガンドは2種の構造的タイプからなり、それは配列関係を基礎として、及び機能的にはそれらが2種の対応するレセプターサブグループを示す選択的結合を基礎として更に分けられる。構造的に、2種のエフリンが存在する。即ち、グリセロホスファチジルイノシトールGPIリンケージにより膜結合するものと、膜貫通領域を通して結合するものである。従来リガンドは、選択的にEphAレセプターへ結合するGPI結合された蛋白質であるエフリンAサブクラス、及び一般的に選択的にEphBレセプターへ結合する膜貫通蛋白質であるエフリンBサブクラスへ分割されている。Ephファミリーレセプターは、レセプター蛋白質チロシンキナーゼのファミリーであり、それはエリスロポエチン生産ヒト肝細胞性癌細胞系中でのその発現のために命名されたEphに関係する。それらはそれらの細胞外領域配列の関連性及びそれらのエフリンA蛋白質又はエフリンB蛋白質へ選択的に結合する能力を基礎として2個のサブグループへ分離される。エフリンA蛋白質と選択的に相互作用するレセプターは、EphAレセプターであり、エフリンB蛋白質と選択的に相互作用するものはEphBレセプターである。Ephレセプターは、リガンド結合球状領域、その次に一対のフィブロネクチンタイプIIIリピートが続くシステインリッチ領域から構成される細胞外領域を有する例えば、図16参照。細胞質領域は、2種の蛋白質チロシンキナーゼ領域、即ち無菌性αモチーフSAM及びPDZ領域結合モチーフの保存されたチロシン残基を含有する膜近傍juxtamembrane領域から構成される。EphB4は膜結合性リガンドエフリンB2に対して特異的であるSakano、Sら1996BrambillaRら1995。エフリンB2は、膜貫通領域及び5個の保存されたチロシン残基及びPDZ領域を有する細胞質領域を有するEphリガンドの種類に属する。Ephレセプターは、クラスター化され、膜へ結合したエフリンの結合により活性化されDavisSら、1994、レセプターを発現している細胞及びリガンドを発現している細胞間を接触することがEph活性化に要求されることを示す。リガンド結合において、Ephレセプターは二量体化し、自己リン酸化して膜近傍チロシン残基を完全活性化させるKaloMSら、1999、BinnsKS、2000。更にEphレセプターを経由するシグナルに加えて、リバースシグナルがエフリンBsを経由して発生できる。エフリンのEph結合engagementは、保存された細胞内チロシンの急速なリン酸化を生じBrucknerK、1997、PDZ結合蛋白質のレクルートメントをいくらか遅延させるPalmerA2002。近年、いくつかの研究でEph/エフリンの高い発現は腫瘍増殖、腫瘍原性、及び転移の可能性の増大に関係することが示されたEastyDJ、1999KiyokawaE、1994TangXX、1999VogtT、1998LiuW、2002StephensonSA、2001SteubeKG1999BerclazG、1996。例えば、本発明はエフリンB2、EphB4、又は両方の活性を阻害するポリペプチド治療薬を提供する。ここで使用される用語ポリペプチド治療薬又はポリペプチド薬は、エフリンB2/EphB4経路を経由するシグナルをブロックするいずれのポリペプチドをも含む総称名である。本発明の好ましいポリペプチド治療薬は、エフリンB2又はEphB4の可溶性ポリペプチドである。本発明の別の好ましいポリペプチド治療薬は、エフリンB2又はEphB4へ結合するアンタゴニスト抗体である。例えば、これらポリペプチド治療薬は、エフリンB2又はEphB4の機能を阻害でき、エフリンB2及びEphB4間の相互作用を阻害でき、エフリンB2又はEphB4のリン酸化を阻害でき、又はエフリンB2のEphB4への結合に対する下流シグナルイベントのいずれかを阻害できる。II.可溶性ポリペプチド例えば本発明は、エフリンB2蛋白質の細胞外領域を含有する可溶性ポリペプチドここでエフリンB2可溶性ポリペプチドと言う又はEphB4蛋白質の細胞外領域を含有する可溶性ポリペプチドここでEphB4可溶性ポリペプチドと言うに関する。好ましくは、本発明の可溶性ポリペプチドは単量体であり、高親和でエフリンB2又はEphB4へ結合できる。特に、本発明のEphB4可溶性ポリペプチドは、EphB4蛋白質の球状領域を含有する。一例としてEphB4可溶性ポリペプチドを図1、2及び15に示す。エフリンB2可溶性ポリペプチドの一例は図3及び14に示す。ここで使用される本発明の可溶性ポリペプチドは、EphB4可溶性ポリペプチド又はエフリンB2可溶性ポリペプチドのフラグメント、機能的変異体及び改質体を含む。これらの本発明の可溶性ポリペプチドのフラグメント、機能的変異体及び改質体は、EphB4、エフリンB2又は両方の機能をアンタゴナイズする。例えば、本発明の可溶性ポリペプチドの単離されたフラグメントは、EphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドをエンコードする核酸の対応するフラグメントから組み換え的に生産されるポリペプチドのスクリーニングにより得ることができる。更に、フラグメントは、従来のMerrifield固体相合成法fMoc又はtBoc化学等の公知の技術を使用して化学的に合成できる。フラグメントは組み換え的に又は化学合成により生産され、EphB4又はエフリンB2の機能を阻害するように働くことのできるそれらのペプチジルフラグメントを特定するために、例えば血管形成又は腫瘍増殖を阻害するフラグメントの能力の試験により試験されるてもよい。例えば、EphB4可溶性ポリペプチドの機能的変異体は、図65により特定されるアミノ酸配列の残基1~522、残基1~412、又は残基1~312と少なくとも90、95、97、99又は100相同性を有するアミノ酸配列を有していてもよい。例えば、エフリンB2可溶性ポリペプチドの機能的変異体は、図66により特定されるアミノ酸配列の残基1~225の少なくとも90、95、97、99又は100相同性を有する配列を有する。例えば、本発明は、治療用若しくは予防的効能、又は安定性例えば、exvivoでの貯蔵寿命及びinvivoでの耐蛋白質分解性変質degradationの強化を目的として、本発明の可溶性ポリペプチドの構造を改質することによる機能的変異体の製造も意図する。これら改質可溶性ポリペプチドは天然EphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドの機能的均等物と考えられる。改質可溶性ポリペプチドは、例えばアミノ酸の置換、欠失又は添加により生産できる。本発明では、例えばロイシンをイソロイシン又はバリンと、アスパルテートをグルタメートと、スレオニンをセリンとの単離された置換、又はそのアミノ酸と構造的に関係するアミノ酸との同様な置換例えば、保存的突然変異は分子を生じる生物学的活性へ大きな影響を及ぼさないと理解することは当然である。保存的置換とは、それらの側鎖sidechainに関係するアミノ酸のファミリー内で置換することである。本発明は更に、EphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドの一連の組み合わせ突然変異体の製造方法、並びに突然変異体のトランケーション方法、機能的変異体配列の特定に特に有用である方法を意図する。組み合わせライブラリー等のスクリーニングの目的は、例えば、EphB4、EphB2又は両方のアンタゴニストとして作用する可溶性ポリペプチド変異体の製造にもある。それは、組み合わせ由来の変異体が天然可溶性ポリペプチドに関する選択的能力を有するように生成できる。これら変異体蛋白質は、組み換え型DNA構築物から発現された場合、遺伝子治療法プロトコル中に使用できる。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型可溶性ポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する変異体を生み出すことが出来る。例えば、変異した蛋白質は、蛋白質分解性変質又は本発明の蛋白質例えば、可溶性ポリペプチドの分解さもなければ活性化を生じる他の細胞性プロセスに対してより安定又はより不安定のいずれにも設定できる。これら変異体、及びそれらをエンコードする遺伝子は、それらの半減期の調整により本発明の可溶性ポリペプチドレベルを変えるために使用できる。例えば、短い半減期は、より一時的な生物学的効果を生じ、誘導可能な発現システムの一部である場合には、細胞中の組み換え型可溶性ポリペプチドレベルのより精密なコントロールを可能にする。上記のように、これら蛋白質、及び好ましくはそれらの組み換え型核酸構築物は、遺伝子治療プロトコル中で使用できる。能力のあるpotentialホモログのライブラリーが縮重degenerateオリゴヌクレオチド配列からの生成可能である方法が多く知られている。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動DNA合成機中で実施でき、及び合成遺伝子は次に発現用の適切な遺伝子へライゲートされる。遺伝子の縮重セットの目的は、1の混合物中に能力のある可溶性ポリペプチド配列の目的とするセットをエンコードする全ての配列を提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成法は当分野で公知である例えば、Narang、SA1983tetrahedron393Itakuraら、1981組み換え型DNA、Proc第3回クリーブランドシンポジウム、Macromolecules、AGWalton編、アムステルダムElsevierpp273289Itakuraら、1984AnnuRevBiochem53323Itakuraら、1984Science1981056Ikeら、1983核酸Res11477参照。これら技術は、他の蛋白質の直接的発展に使用されてきた例えば、Scottら、1990Science、249386390Robertsら、1992PNASUSA8924292433Devlinら、1990Science、249404406Cwirlaら、1990PNASUSA8763786382並びに米国特許番号第5223409号、5198346号、及び5096815号参照。又、他の突然変異誘発の形も、組み合わせライブラリーを生成するために使用出来る。例えば、可溶性ポリペプチド変異体例えば、アンタゴニスト体は、合成してライブラリーから下記方法により単離できる:例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発等を使用したスクリーニングRufら、1994Biochemistry3315651572Wangら、1994JBiolChem26930953099Balintら、1993Gene137109118Grodbergら、1993EurJBiochem218597601Nagashimaら、1993JBiolChem26828882892Lowmanら、1991Biochemistry301083210838及びCunninghamら、1989Science24410811085リンカースキャニング突然変異誘発Gustinら、1993Virology193653660Brownら、1992MolCellBiol1226442652McKnightら、1982Science232316飽和突然変異誘発Meyersら、1986Science232613PCR突然変異誘発Leungら、1989MethodCellMolBiol11119又は化学突然変異誘発等のランダム突然変異誘発Millerら、1992細菌遺伝子学短期コースCSHL出版、コールドスプリングハーバー、NY及びGreenerら、1994StrategiesinMolBiol73234合成できる。リンカースキャニング突然変異誘発は、好ましくは組み合わせ的設定で、本発明の可溶性ポリペプチドの短縮された生物活性な形を特定するために魅力的な方法である。点突然変異及びトランケーションにより構築された遺伝子組み合わせライブラリーの遺伝子生成物のスクリーニング、詳しくは所定の性質を有する遺伝子生成物用のcDNAライブラリーのスクリーニング用には広い範囲の技術が当分野で公知である。これら技術は、本発明の可溶性ポリペプチドの組み合わせ突然変異誘発により作成された遺伝子ライブラリーの素早いスクリーニングに一般的に適用できる。最も広く使用されている巨大遺伝子ライブラリーのスクリーニング技術として一般的には、遺伝子ライブラリーの複製可能な発現ベクターへのクローニング、ベクターのライブラリーを生じる適切な細胞の形質変換、及び、目的とする活性の検出がその生成物が検出される遺伝子をエンコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下での組み合わせ的遺伝子の発現が挙げられる。組み合わせ突然変異誘発技術により作成された大量の縮重配列をスクリーンするために必要な、それぞれの下記例示的アッセイが、高スループット分析に適している例えば、本発明の可溶性ポリペプチドは、ペプチド及びペプチドミメティック等の小分子を含む。ここで使用される用語ペプチドミメティックは、化学的に改質ペプチド及び非天然アミノ酸、ペプトイド等を含むペプチド様分子を包含する。ペプチドミメティックは、元のペプチドへ被験者へ投与された際に強化された安定性を含む種々の利点を与える。ペプチドミメティックの特定方法は当分野で公知であり、能力のあるペプチドミメティックのライブラリーを含むデータベースのスクリーニングを含む。例えば、ケンブリッジ構造データベースは、公知の結晶構造を有する300000を超える化合物のコレクションを含むAllenら、ActaCrystallogrセクションB、3523311979。ターゲット分子の非結晶構造が可能な場合、ある構造は例えばプログラムCONCORD商標Rusinkoら、JChemInfComputSci292511989を使用して製造できる。別のデータベース、AvailableChemicalsDirectoryMolecularDesignLimited社製、情報システム;サンレアンドロカリフォルニアは、市販されている約100000の化合物を含有し、それらも又、EphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドの能力のあるペプチドミメティックを特定できる。例示のために、別の蛋白質へ結合している可溶性ポリペプチドのアミノ酸残基をマップする突然変異誘発のスキャニングを採用して、結合中に含まれるそれら残基を擬態するペプチドミメティック化合物が生成できる。例えばこれら残基の非加水分解可能なペプチドアナログは下記を使用して生成できる:ベンゾジアゼピン例えば、Freidingerら、inpeptideChemistryandBiology、GRMarshall編、ESCOM発行者ライデン、オランダ、1988参照、アゼピン例えば、Huffmanら、inpeptideChemistryandBiology、GRMarshall編、ESCOM発行者ライデン、オランダ、1988参照、置換されたγラクタム環、Garveyら、inpeptideChemistryandBiology、GRMarshall編、ESCOM発行者ライデン、オランダ、1988、ケトメチレンプソイドペプチドEwensonら、1986JMedChem29295及びEwensonら、inペプチド構造及び機能第9回米国ペプチドシンポジウムの手続きPierceChemicalCo社、Rockland、IL、1985、bturnジペプチドコアNagaiら、1985tetrahedronLett6647及びSatoら、1986JChemSocPerkinTrans11231、及びbアミノアルコールGordonら、1985BiochemBiophysResCommun126419及びDannら、1986BiochemBiophysResCommun13471。例えば、本発明の可溶性ポリペプチドは、更に翻訳後の改質体を含有してもよい。これら改質として、本発明を限定するものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化が挙げられる。その結果、改質可溶性ポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、ポリ又はモノサッカリド、及びリン酸等の非アミノ酸要素を含有してもよい。これら非アミノ酸要素が可溶性ポリペプチドの機能に与える効果については、EphB4又はエフリンB2機能でのそのアンタゴナイズ的性質、例えばそれが阻害的に血管形成又は腫瘍増殖に影響するか、を試験する。例えば、本発明の可溶性ポリペプチドの機能的変異体又は改質体として、少なくとも可溶性ポリペプチドの一部及び1以上の融合領域を有する融合蛋白質が挙げられる。これら融合領域の公知例として、本発明を限定するものではないが、ポリヒスチジン、GluGlu、グルタチオンSトランスフェラーゼGST、チオレドキシン、プロテインA、プロテインG、免疫グロブリン重鎖定常領域Fc、及びマルトース結合蛋白質MBPが挙げられ、これらはアフィニティクロマトグラフィーによる融合蛋白質の単離に好ましく使用できる。親和性精製の目的のために、グルタチオン、アミラーゼ、及びニッケル又はコバルト複合樹脂等の、アフィニティクロマトグラフィー用に適切なマトリックスが使用される。別の公知の融合領域として、緑蛍光性蛋白質GFPが挙げられる。融合領域として又、特異的抗体が適用可能な、通常短いペプチド配列であるエピトープ標識が挙げられる。特異的モノクローナル抗体が容易に適用できる公知のエピトープ標識として、FLAG、インフルエンザウィルス赤血球凝集素HA、及びcmyc標識が挙げられる。時には、融合領域はファクターXa又はトロンビン等用のプロテアーゼ切断部位を有し、それは適切なプロテアーゼが融合蛋白質を部分的に消化して、それから組み換え型蛋白質を遊離させることを可能とする。遊離された蛋白質は、次にクロマトグラフィー分離により融合領域から単離できる。例えば、本発明の可溶性ポリペプチドは、可溶性ポリペプチドを安定化できる1以上の改質部を含有してもよい。例えば、これら改質は、可溶性ポリペプチドのinvitro半減期を延ばし、可溶性ポリペプチドの循環系半減期を延ばし、又は可溶性ポリペプチドの蛋白質分解性変質を減少させる。例えば、本発明の未改質又は改質可溶性ポリペプチドは、当分野の種々の公知技術により製造できる。例えば、これら可溶性ポリペプチドは、Bodansky、Mペプチド合成原則SpringerVerlag、ベルリン1993及びGrantGA編合成ペプチド使用者ガイドWHFreemanandCompany、ニューヨーク1992等に記載された標準的な蛋白質化学技術を使用して合成できる。更に、自動化ペプチド合成機は市販されている例えば、AdvancedChemTechモデル396MilligenBiosearch社9600。又、可溶性ポリペプチド、フラグメント又はそれらの変異体は、公知の種々の発現系を使用して組み換え的に生産してもよい同様に下記参照。III.可溶性ポリペプチドをエンコードする核酸例えば、本発明はEphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドをエンコードする単離された及び/又は組み換え型核酸に関する。本発明の核酸は、単鎖又は二重鎖、DNA又はRNA分子でもよい。これらの核酸は治療薬として有用である。例えば、これらの核酸は、治療用として細胞又は患者へ投与された組み換え型可溶性ポリペプチドの製造に有用である。又、これら核酸は、遺伝子治療法等の治療用として細胞又は患者へ直接に投与できる。例えば、本発明は、図62又は63中に示されたヌクレオチド配列の領域と少なくとも80、85、90、95、97、98、99又は100同一である単離型又は組み換え型核酸配列を提供する。当業者は、本発明の核酸と相補的な核酸配列及び本発明の核酸の変異体も又本発明の範囲内であることを理解できる。更に、本発明の核酸配列は、単離され、組み換えられ、及び/又は非相同のヌクレオチド配列と融合されてもよく、DNAライブラリ中のものでもよい。例えば、本発明の核酸は又、高い緊縮条件下で図62又は63中に示されたヌクレオチド配列、又はそれらの補体配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。上記のように、当業者はDNAハイブリダイゼーションを促進する適切な緊縮条件は変化できることが容易に理解できる。例えば、6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSC約45°Cでハイブリダイゼーションを行い、次に2.0×SSCで50°Cで洗浄してもよい。例えば、洗浄ステップ中の塩濃度は約2.0×SSCで50°Cの低い緊縮から約0.2×SSCの50°Cでの高い緊縮まで選択出来る。更に、洗浄ステップ中の温度は、室温約22°Cでの低い緊縮条件から、約65°Cでの高い緊縮条件へ増加できる。温度及び塩の両方は変化してもよく、又温度若しくは塩濃度は他の変更可能な因子が変化する間一定に保持されてもよい。例えば、本発明は6×SSC室温での低い緊縮条件下でハイブリダイズされ、次に2×SSC室温で洗浄される核酸も提供する。遺伝暗号中の縮重を原因とする目的の核酸とは異なる単離された核酸も又本発明の範囲内である。例えば、多くのアミノ酸が1を超えるトリプレットにより指定される。同一のアミノ酸を特定するコドン又はそのシノニム例えば、CAU及びCACはヒスチジンに対するシノニムであるは、蛋白質のアミノ酸配列に作用しない沈黙突然変異を生じる。しかし、本発明の蛋白質のアミノ酸配列中の変化へ導くDNA配列多型性はほ乳類細胞間に存在することが予測されている。当業者は、特別な蛋白質をエンコードする核酸の1以上のヌクレオチド約3~5までのヌクレオチド中のこれらの変異は、天然対立遺伝子的変異により所定の種の被験体間に存在することを理解できる。これらヌクレオチド変異及び得られるアミノ酸多型性のいずれか及び全ては本発明の範囲内である。例えば、本発明の組み換え型核酸は、発現構築物中の1以上の調節ヌクレオチド配列へ作動可能なように結合されてもよい。調節ヌクレオチド配列は、発現に使用されるホスト細胞として一般的に適切である。数多くの種類の適切な発現ベクター及び適切な調節配列が、種々のホスト細胞用に当分野で公知である。通常、上記1以上の調節ヌクレオチド配列として、本発明を限定するものではないが、プロモーター配列、リーダー配列又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、並びにエンハンサー又は活性化配列が挙げられる。当分野で公知の構成成分となる又は誘導可能なプロモーターも本発明では意図される。プロモーターは、天然プロモーター又は1を超えるプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれでもよい。発現構築物はプラスミド等のエピソーム上の細胞中に存在しても良く、発現構築物は染色体中に挿入されてもよい。好ましくは、発現ベクターは形質変換されたホスト細胞の選択を可能とするため選択可能なマーカー遺伝子を含有する。選択可能なマーカー遺伝子は当分野で公知であり、使用されるホスト細胞に応じて変化できる。例えば本発明の核酸は、EphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドをエンコードし、作動可能なように少なくとも1の調節配列へ結合されたヌクレオチド配列を含有する発現ベクター中に提供される。調節配列は当分野で認識され、可溶性ポリペプチドの直接的発現のために選択される。従って、用語調節配列は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節要素を含有する。例示的調節配列は、Goeddel遺伝子発現技術:酵素学的方法AcademicPress、サンディエゴ、CA1990に記載されている。例えば、動作可能なように結合された場合にDNA配列の発現を調節する広い範囲の種々の発現調節配列のいずれでも、可溶性ポリペプチドをエンコードするDNA配列を発現するためにこれらのベクター中に使用できる。これら有用な発現調節配列として例えば、SV40の上流early及び下流lateプロモーター、tetプロモーター、アデノウィルス又はサイトメガロウィルス直前プロモーター、lacシステム、trpシステム、TAC又はTRCシステム、その発現はT7RNAポリメラーゼにより誘導されるT7プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、fd被覆蛋白質用調節領域、3ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素用プロモーター、Pho5等の酸ホスファターゼのプロモーター、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウィルスシステムの多面体プロモーター及び原核細胞若しくは真核細胞又はそれらのウィルスの遺伝子の発現を調節することが知られている他の配列、並びにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質変換されるホスト細胞、及び/又は発現されることを目的とする蛋白質の種類等の選択の因子に依存すると考えられる。更に、ベクターのコピー数、コピー数調節能力及び抗生物質マーカー等のベクターによりエンコードされる他の蛋白質の発現を調節する能力も又考慮される必要がある。本発明は又、1以上の本発明の可溶性ポリペプチドのためのコーディング配列を含有する組み換え型遺伝子でトランスフェクトされたホスト細胞に関する。ホスト細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。例えば、本発明の可溶性ポリペプチドは、E.coli等の細菌細胞、昆虫細胞例えばバキュロウィルス発現系を使用、酵母、又はほ乳類細胞中で発現される。他の適切なホスト細胞も当業者に公知である。又、本発明は更に本発明の可溶性ポリペプチドの製造方法に関する。例えば、EphB4可溶性ポリペプチドをエンコードする発現ベクターでトランスフェクトされたホスト細胞は、適切な条件下で培養され、EphB4可溶性ポリペプチドの発現を行うことができる。EphB4可溶性ポリペプチドは、細胞及び可溶性ポリペプチドを含有する培地の混合物から分泌されて単離される。可溶性ポリペプチドは細胞質中又は膜フラクション中に保持され、細胞が採取され、溶解され蛋白質が単離される。細胞培養物はホスト細胞、培地及び他の副成物を含む。細胞培養物用の適切な培地は当分野で公知である。可溶性ポリペプチドは、蛋白質精製用の公知技術を使用して、細胞培養培地、ホスト細胞又はそれら両方から単離できる。その技術としてイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、超ろ過、電気泳動、及び可溶性ポリペプチドの特別なエピトープに特異的な抗体との免疫親和性精製等が挙げられる。好ましくは、可溶性ポリペプチドは、その精製を容易にする領域を含有する融合蛋白質である。本発明の組み換え型核酸は、原核細胞、真核細胞酵母、鳥類、昆虫又はほ乳類又はそれら両方のいずれか中で発現に適切なベクター中にクローンされた遺伝子又はそれらの一部をライゲートすることにより生産できる。組み換え型可溶性ポリペプチドの作成用の発現ビヒクルとして、プラスミド及び他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとして下記種類のプラスミドが挙げられる:E.coli等の原核細胞中の発現用の、pBR322由来プラスミド、pEMBL由来プラスミド、pEX由来プラスミド、pBTac由来プラスミド及びpUC由来プラスミド。好ましいほ乳類発現ベクターは、細菌中のベクターの増殖を促進する原核配列及び真核細胞中で発現された1以上の真核転写単位の両方を含む。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pkoneo及びpHyg由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適切なほ乳類発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかはpBR322等の細菌性プラスミドからの配列で改質されて、原核及び真核細胞の両方での複製及び耐薬品性選択を促進してもよい。又、ウシパピローマウィルスBPV1、又はエプスタインバーウィルスpHEBo、pREP由来及びp205由来等のウィルス誘導体は、真核細胞中の蛋白質の一時的発現に使用出来る。他のウィルス性レトロウィルスを含む発現システムの例は、下記遺伝子治療デリバリーシステムの記載中に示す。プラスミドの作成及びホスト有機体の形質転換で使用される種々の方法は、当分野で公知である。原核及び真核細胞の両方について、他の適切な発現システム並びに一般的組み換え型手順は、分子クローニング実験マニュアル第2版、Sambrook、Fritsch及びManiatis編コールドスプリングハーバー研究所出版、198916及び17章が参照できる。例えば、バキュロウィルス発現システムの使用により組み換え型SLC5A8ポリペプチドを発現することも好ましい。これらバキュロウィルス発現システムの例として、pVL由来ベクターpVL1392、pVL1393及びpVL941等、pAcUW由来ベクターpAcUW1等、並びにpBlueBac由来ベクターpBlueBacIII含有βgal等が挙げられる。融合遺伝子作成技術は公知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のDNAフラグメントの結合は、従来技術に従い行うことができ、例えばライゲーション用のブラントエンド末端又は相補末端staggerendedの採用、適切な末端を得るための制限酵素消化、適切な付着末端の補完、目的外の結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的ライゲーションが挙げられる。又、融合遺伝子は自動化DNA合成機等の従来の技術により合成できる。又、遺伝子フラグメントのPCR増幅は、2個の連続する遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して実施でき、それは次にキメラ遺伝子配列を生成するためにアニールできる例えば、分子生物学の現在のプロトコルAusubelら編、JohnWileySons1992。IV.抗体例えば本発明は、エフリンB2又はEphB4に対するアンタゴニスト抗体を提供する。ここで、用語アンタゴニスト抗体は、エフリンB2又はEphB4の機能を抑制する抗体を言う。好ましくは、アンタゴニスト抗体は、エフリンB2又はEphB4の細胞外領域へ結合する。本発明の抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく;完全体又は短縮されてもよく例えば、Fab’2、Fab、Fv;異種、同種異系、同系、又はそれらの改質体例えば、ヒト化、キメラ化等でもよいのは当然である。例えば、エフリンB2又はEphB4ポリペプチド由来の免疫原を使用して、抗蛋白質/抗ペプチド抗血清又はモノクローナル抗体が、標準プロトコルにより作成できる例えば、抗体:実験マニュアルHarlow及びLane編コールドスプリングハーバー出版:1988参照。マウス、ハムスター又はウサギ等のほ乳類は、ペプチドの免疫原体で免疫化できる例えば、抗体応答を誘導できるポリペプチド若しくは抗原性フラグメント、又は融合蛋白質。蛋白質又はペプチドに対する免疫原性付与技術として、キャリアの結合又は他の公知の技術が挙げられる。エフリンB2又はEphB4ポリペプチドの免疫原性部は、アジュバントの存在下で投与できる。免疫化の過程は、血漿又は血清中の抗体タイターの検出により監視できる。標準ELISA又は他の免疫アッセイも、抗体のレベルを評価するために抗原として免疫原を使用できる。例えば、本発明の抗体は、エフリンB2又はEphB4蛋白質の細胞外部位に特異的でもよい。又、本発明の抗体は、エフリンB2又はEphB4蛋白質の細胞内部位又は膜貫通部位に特異的でもよい。更に、本発明の抗体はエフリンB2又はEphB4蛋白質の細胞外部位に特異的でもよい。エフリンB2又はEphB4ポリペプチドの抗原製剤を使用した動物の免疫化後に、抗血清が得られ、必要ならポリクローナル抗体が血清から単離できる。モノクローナル抗体を生産するために、抗体生産細胞リンパ球が免疫化された動物から採取され、骨髄腫細胞等の不死化細胞との標準的な体細胞融合手順により融合されてハイブリドーマ細胞を生じる。これら技術は当分野で公知であり、例えばハイブリドーマ技術Kohler及びMilsteinにより開発された1975Nature、256495497、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術Kozbarら、1983ImmunologyToday、472及びヒトモノクローナル抗体生産のためのEBVハイブリドーマ技術Coleら、1985モノクローナル抗体及び癌治療法、AlanRLiss、Incpp7796が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、エフリンB2又はEphB4ポリペプチドと特異的に反応する抗体を免疫化学的に作成するためスクリーンされ、モノクローナル抗体がこれらハイブリドーマ細胞等を含有する培養物から単離される。ここで使用される用語抗体は、エフリンB2又はEphB4ポリペプチドと特異的に反応するそのフラグメントも含むことを意図する。抗体は従来の技術を使用してフラグメント化され、そのフラグメントは抗体全体に対して使用するため、上記方法同様にスクリーンできる。例えば、Fab2フラグメントは抗体をペプシンと処理して生成できる。得られたFab2フラグメントは、Fabフラグメントを生産するためにジスルフィド架橋を還元処理出来る。本発明の抗体は更に、抗体の少なくとも1のCDR領域により付与されたエフリンB2又はEphB4ポリペプチドに対する親和性を有する、二重特異性、単鎖、及びキメラ性かつヒト化分子を含むことを意図する。単鎖抗体の製造技術米国特許番号第4946778号も又、単鎖抗体を生産するために適用できる。同様に、遺伝子導入マウス又は他のほ乳類を含む他の有機体も、ヒト化抗体を発現するために使用できる。好ましくは、抗体は更にそれに結合される標識を含有し、検出可能とされる例えば、標識は放射性同位体、蛍光性化合物、酵素又は酵素補因子でもよい。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、例えば本発明は新規な抗体の製造方法を適用可能とする。例えば、特異的にエフリンB2又はEphB4ポリペプチドへ結合するモノクローナル抗体の生産方法は、下記ステップを含有してもよい;検出可能な免疫応答を刺激するために有効なエフリンB2又はEphB4ポリペプチドを含有する免疫原性組成物量をマウスへ投与するステップ;そのマウスから抗体生産細胞例えば脾臓細胞を得てその抗体生産細胞を骨髄腫細胞と融合して抗体生産ハイブリドーマを得すステップ;更に、エフリンB2又はEphB4ポリペプチドへ特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを特定する抗体生産ハイブリドーマを試験するステップ。一旦得られると、ハイブリドーマは細胞培養物中で増殖でき、その培養条件は、ハイブリドーマ由来細胞が、エフリンB2又はEphB4ポリペプチドへ特異的に結合するモノクローナル抗体を生産する条件でもよい。モノクローナル抗体は細胞培養物から精製できる。更に、目的の抗体を特定するための抗体スクリーン技術は、得られた抗体の性質に影響を与える場合がある。例えば、所定の治療用目的に使用される抗体は、好ましくは特別な細胞種をターゲットとできる。従って、この種の抗体を得るためには、目的の抗原を発現する細胞へ結合する抗体を例えば、蛍光活性化した細胞分離によりスクリーンすることが好ましい。同様に、抗体が溶液中の抗原への結合に使用される場合、溶液結合を試験することが好ましい。種々の異なる技術が、特に目的とする抗体を特定するための抗体=抗原相互作用を試験するために利用できる。これら技術として、ELISA、表面プラズモン共鳴結合アッセイ例えば、Biacore結合アッセイ商標、BiacoreAB社製、ウプサラ市、スウェーデン、サンドイッチアッセイ例えばIGENインターナショナル社製の常磁性ビーズシステム商標、ゲイザーズバーグ、メリーランド、ウェスタンブロット法、免疫沈殿アッセイ及び免疫組織化学法が挙げられる。Vドラッグスクリーニングアッセイポリペプチド治療薬を、EphB4、エフリンB2又は両方のアンタゴニストとしてスクリーニングする数多くのアプローチがある。例えば、化合物又は分子の高スループットスクリーニングが、血管形成を阻害するか腫瘍増殖を阻害する試薬又はドラッグを特定するために実施できる。試験試薬は、化学合成的に製造され、組み換え型技術により製造され、又は天然原料から単離されたいずれの化学製品元素、分子、化合物、ドラッグでもよい。例えば、試験試薬はペプチド、ポリペプチド、ペプトイド、糖類、ホルモン類、又は核酸分子でもよい。更に、試験試薬は、小分子又は化学的組み合わせにより、例えばライブラリへ組み込まれて製造されたより大きい複合体でもよい。これらのライブラリーとして、例えば、アルコール、アルキルハライド、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテル及び他の有機的化合物種が挙げられる。試験試薬も又、溶解産物又は細胞の増殖培地細菌性、動物又は植物性から単離された天然物若しくは遺伝子的に設計された製品、又は細胞溶解産物若しくは増殖培地自身でもよい。試験系への試験化合物の形態は、単離体又は、特に初期スクリーニングステップ中では、化合物の混合物のいずれでもよい。例えば、アッセイは、エフリンB2リガンドのEphB4レセプターへの結合又はその反対の結合を特異的に阻害する化合物のスクリーンを、例えば、標識化リガンド又はレセプターFc融合蛋白質の不死化細胞への結合の阻害により実施できる。このスクリーニングで特定された化合物は次に、それらのinvivoでの抗血管形成又は抗腫瘍活性を評価するために動物中で試験される。例えば2個の細胞表面分子例えば、エフリンB2及びEphB4の相互作用を妨害する物質を特定するアッセイ例として、ある種の細胞表面分子を発現する細胞のサンプル例えば、EphB4は、標識化リガンド例えば、エフリンB2若しくはその可溶性部分、又は細胞外領域及びIgGのFc領域の融合等の融合蛋白質又は標識化リガンドプラス試験化合物若しくは試験化合物群のいずれかと接触させる。細胞へ結合した標識化リガンドの量が測定される。標識が例えば、放射性同位体、蛍光性又は比色分析用標識の場合試験化合物と接触したサンプル中の標識量がより少なくても、試験化合物が結合を阻害することが示される。リガンド例えば、エフリンB2リガンド又はその可溶体を発現する細胞を使用した相互アッセイは、Ephレセプター又はその可溶性部分の結合に影響する物質を試験するために使用できる。Ephレセプター及びエフリン間の相互作用に影響する物質を特定するアッセイは、試験化合物と競合しない成分例えば、細胞、融合蛋白質及び結合活性部位を含む精製蛋白質を使用して、固体担持体へ結合されて行うことが出来る。固体担持体は、いずれの適切な固体相又はマトリックスでもよく、例えばビーズ、プレート壁又は他の適切な表面等例えば、マイクロタイタープレートのウェル、カラム多孔質ガラスCPG又はウェルの溶液中に浸漬されるピンが挙げられる。細胞又は精製蛋白質の固体担持体への結合は、直接的でも1以上のリンカー分子を介してでもよい。例えば、単離され又は精製された蛋白質例えば、Ephレセプター又はエフリンは、化学架橋の標準技術により、又は単離され又は精製された蛋白質に対して生じる抗体を介して、適切な親和性マトリックス上に固定化され、固体担持体へ結合されてもよい。マトリックスはカラム又は他の適切な容器中に充填され、1以上の試験用化合物例えば、混合物とその化合物の蛋白質への結合に適切な条件下で接触させられる。例えば、化合物含有溶液はマトリックスを通過するようにも調製できる。マトリックスは、結合していない化合物、非特異的に結合した化合物を除去するために、適切な洗浄バッファで洗浄されてもよい。結合を保持する化合物は、適切な溶離バッファにより溶離される。例えば、溶離バッファのイオン強度又はpHの変化は化合物の溶離を引き起こす。又、溶離バッファは、溶離成分又は化合物の結合を切断するように設計された成分例えば、1以上のリガンド若しくはレセプター、適切な場合にはそれらのアナログであって、結合を切断できるか、試験化合物の蛋白質への結合を競合的に阻害できるものを含有してもよい。その性質上、その蛋白質中で発生しない第二成分へ結合された蛋白質例えば、Ephレセプター又はエフリンの全て又は一部を含有する融合蛋白質も、本発明の方法で使用するために作成できる。この目的のために適切な融合蛋白質は、第二成分が親和性リガンド例えば、酵素、抗原、エピトープを含有するようなものを含む。融合蛋白質は、蛋白質例えば、Ephレセプター又はエフリン又はその一部を、親和性リガンドをエンコードする適切な発現ベクター中へ挿入することにより作成できる。発現ベクターは、適切な発現用ホスト細胞中へ導入できる。ホスト細胞は破壊され、融合蛋白質を含有する細胞材料は、融合蛋白質の親和性リガンド部位が親和性マトリックスへ結合するのに適切な条件下で、細胞材料を親和性マトリックスと接触させることにより、適切な親和性マトリックスへ結合できる。本発明では例えば、融合蛋白質は、融合蛋白質の親和性リガンド部位がマトリックスへ結合するのに適切な条件下で適切な親和性マトリックス上に固定化され、その化合物が結合された融合蛋白質のレセプター又はリガンド蛋白質部位へ結合するために適切な条件下で1以上の試験用化合物例えば混合物と接触させられる。次に、結合された融合蛋白質を有する親和性マトリックスは、適切な洗浄バッファで洗浄され、特異的に結合された化合物の結合を非常に破壊せずに、結合していない化合物及び非特異的に結合された化合物を除去してもよい。結合を保持する化合物は、それへ結合している融合蛋白質を有する親和性マトリックスを適切な溶離バッファ化合物溶離バッファへ接触させることにより溶離出来る。この見地から、化合物溶離バッファは親和性マトリックスによる融合蛋白質の保持を可能とするようにも配合できるが、試験する化合物の、融合蛋白質のレセプター又はリガンド蛋白質部位への結合を阻害するように配合してもよい。例えば、溶離バッファのイオン強度又はpHの変化は化合物の溶離を引き起こしてもよく、溶離バッファは溶離成分又は化合物の融合蛋白質のレセプター又はリガンド蛋白質部位への結合を破壊するために設計された成分例えば、化合物の融合蛋白質のレセプター又はリガンド蛋白質部位への結合を破壊できる、1以上のリガンド又はレセプター又はそれらのアナログを含有してもよい。固定化は、融合蛋白質を化合物と接触させる前、同時、又は後に随時行っても良い。本発明の方法は、試験される化合物、選択された親和性マトリックス、及び溶離バッファ配合等の因子に依存して、種々の順序の変更が可能である。例えば、洗浄ステップ後、それに結合した化合物を有する融合蛋白質は、親和性マトリックスから適切な溶離バッファマトリックス溶離バッファにより溶離されてもよい。融合蛋白質がトロンビン切断部位等の開裂可能なリンカーを含有する場合、親和性リガンドからの開裂はそれへ結合した化合物との融合物の一部を溶離できる。結合された化合物は、次に融合蛋白質又はその開裂生成物から抽出等の適切な方法により溶離できる。VI.治療方法例えば、本発明は血管形成阻害方法及び血管形成関連障害治療方法を提供する。又、例えば、本発明は腫瘍増殖阻害又は減少方法及び癌患者治療方法を提供する。これらの方法は、治療的有効量の1以上の上記ポリペプチド治療薬を患者への投与を含む。これらの方法は好ましくは動物、更に好ましくはヒトの治療用及び予防的処置を目的とする。ここで示される血管形成関連障害は、本発明を限定するものではないが、下記が挙げられる;充実性腫瘍等の血管形成依存性癌、白血病等の血液性腫瘍、及び腫瘍転移;良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫;免疫及び非免疫性炎症等の炎症性障害;慢性間接リューマチ及び乾癬;眼性血管形成病、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑改質、角膜移植拒絶、新血管の緑内症、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシス;オスラーウェバー症候群;心筋性血管形成;プラーク新生血管形成;毛細血管拡張症;血友病性関節;繊維血管腫;及び外傷性顆粒化及び創傷治癒;毛細血管拡張乾癬強皮症、化膿性肉芽腫、冠状側副cororanycollaterals、虚血肢血管形成、角膜障害、ルベオーシス、関節炎、糖尿病性新生血管形成、骨折、脈管形成、血液新生。本発明の方法及び組成物は又、いずれの血管形成独立性癌腫瘍を治療するためにも有用である。ここで使用される用語血管形成独立性癌とは、腫瘍組織中に新生血管形成がないかほんの僅かである癌腫瘍を言う。特に、本発明のポリペプチド治療薬は癌腫瘍の治療又は防止に有用であり、その例として本発明を限定するものではないが、腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺癌、膀胱癌、頭部癌及び頚部癌等の扁平上皮細胞癌HNSCC、カポジ肉腫、及び白血病が挙げられる。本発明の方法で例えば1以上のポリペプチド治療薬は、一緒同時に又は異なる時逐次的に投与できる。更に、本発明のポリペプチド治療薬は、別の種類の癌治療用又は血管形成阻害用化合物とともに投与できる。例えば、本発明の方法は単独で実施できる。又、本発明の方法は、増殖性障害例えば、腫瘍の治療又は防止を目的とする他の従来の抗癌治療用アプローチと組み合わせても使用できる。例えば、これら方法は、予防的癌防止、外科手術後の癌再発及び癌転移の防止、及び他の従来の癌治療法の補強剤adjuvantとして使用できる。本発明では従来の癌治療法例えば、化学療法、放射線治療法、光線療法、免疫療法、及び外科的治療の有効性が本発明のポリペプチド治療薬の使用により強化されることを認識できる。広い範囲の従来の化合物が抗新生物性活性を有することが示された。これらの化合物は、化学療法中で充実性腫瘍を縮小させ、転移及び更なる増殖を防止し、又は白血病又は骨髄悪性腫瘍での悪性細胞数を減少させるための医薬的試薬として使用されてきている。化学療法は種々の悪性疾患種の治療に効果的ではあるが、多くの抗新生物性化合物は望ましくない副次的効果を誘起する。2以上の異なる治療が組み合わされた場合に、それらの治療は相乗的に作用してそれぞれの治療の投薬量を減少させることを可能とすることが示され、その結果より高い投薬量ではそれぞれの化合物が発生させる有害な副作用効果を減少させる。又例えば、治療困難な悪性疾患でも2以上の異なる治療の併合治療法が効果を示す場合がある。本発明のポリペプチド治療薬が別の従来の抗新生物性試薬と組み合わせて、併合して又は逐次的に投与される場合、これら治療薬は、抗新生物性試薬の治療的効果を強化するかこれら抗新生物性試薬への細胞の耐性を克服することを示す。これは抗新生物性試薬の投薬の減少を可能とし、その結果目的としない副次的効果を減少させ、耐性細胞中の抗新生物性試薬の効果を回復する。組み合わせ的抗腫瘍治療法に使用できる医薬的化合物として、単に例示のためであるが下記が挙げられる:アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、bcg、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシンcampothecin、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオロキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカンironotecan、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトーテン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツヅマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビン。これらの化学療法の抗腫瘍化合物は、それらの作用機構により、例えば下記グループに分類できる:ピリミジンアナログ5フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン及びプリンアナログ、葉酸アンタゴニスト並びに関連する抑制剤メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び2クロロデオキシアデノシンクラドリビン等の代謝拮抗物質/抗癌試薬;ビンカアルカロイドビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン等の天然生成物、タキサンパクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン及びナベルビン等の微少管破壊剤、エピジepidiポドフィロトキシン系エトポシド、テニポシド、DNA損傷剤アクチノマイシン、アムサクリン、アンスラサイクリン系、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトセシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イフォスファミド、メルファラン、merchlorehtamine、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド及びエトポシドVP16等の抗増殖性/細胞分裂抑制剤;ダクチノマイシンアクチノマイシンD、ダウノルビシン、ドキソルビシンアドリアマイシン、イダルビシン、アンスラサイクリン系、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシンミトラマイシン及びマイトマイシン等の抗生物質;酵素Lアスパラギンを全身的に新陳代謝させ、それら自身アスパラギンの合成能力を有さない細胞を除去するLアスパラギナーゼ;抗血小板試薬;窒素マスタードメクロレタミン、シクロホスファミド及びアナログ、メルファラン、クロラムブシル、エチレンイミン類及びメチルメラミン類ヘキサメチルメラミン及びチオテパ、アルキルスルホネートブスルファン、ニトロソウレア類カルムスチンBCNU及びアナログ、ストレプトゾシン、トラゼンダカルバジニンDTIC等の抗増殖性/細胞分裂抑制アルキル化試薬;葉酸アナログメトトレキサート等の抗増殖性/細胞分裂抑制代謝拮抗物質;白金配位錯体シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトーテン、アミノグルテチミド;ホルモン類、ホルモンアナログエストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド及びアロマターゼ阻害薬レトロゾール、アナストロゾール;抗凝血剤ヘパリン、合成ヘパリン塩及び他のトロンビン阻害薬;フィブリン溶解性試薬組織プラスミノゲン活性化剤、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ等、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ;抗遊走性試薬;抗分泌性試薬breveldin;免疫抑制剤シクロスポリン、タクロリムスFK506、シロリムスラパマイシン、アザチオプリン、ミコフェノレートモフェチル;抗血管形成化合物TNP470、ゲニステイン及び増殖因子抑制剤血管の内皮性増殖因子VEGF抑制剤、繊維芽細胞増殖因子FGF抑制剤;アンギオテンシンレセプターブロッカー;一酸化窒素ドナー類;アンチセンスオリゴヌクレオチド;抗体トラスツヅマブ;細胞周期停止剤及び分化誘起剤トレチノイン;mTOR抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤ドキソルビシンアドリアマイシン、アムサクリン、カンプトセシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシドeniposide、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン、コルチコステロイド類コーチゾン、デキサメタゾン、ハイドロコーチゾン、メチルペドニソロン、プレドニゾン及びプレニソロン;増殖因子シグナル変換キナーゼ抑制剤;ミトコンドリア性機能障害誘起剤及びカスパーゼ活性化剤;及びクロマチンかく乱剤。例えば、組み合わせ抗血管形成治療法に使用できる医薬的化合物として下記が挙げられる。1bFGF基本的繊維芽細胞増殖因子等の血管形成分子の放出抑制剤;2抗βbFGF抗体等の血管形成分子中和剤;並びに3コラゲナーゼ阻害剤、基底膜代謝回転抑制剤、血管新生阻害ステロイド、菌由来血管形成抑制剤、血小板因子4、トロンボスポンジン、Dペニシルアミン及びチオリンゴ酸金塩等の関節炎薬、ビタミンD3アナログ、αインターフェロン等の血管形成刺激への内皮細胞応答抑制剤。更に血管形成抑制剤として、Bloodら、BiochBiophysActa、1032891181990、Mosesら、Science、248140814101990、Ingberら、LabInvest5944511988、及び米国特許番号第5092885号、5112946号、5192744号、5202352号、及び6573256号に記載されているものが挙げられる。更に、血管形成を阻害するために使用できる広い範囲の化合物があり、下記に例示される:VEGF仲介された血管形成経路をブロックするペプチド又は試薬、エンドスタチン蛋白質又は誘導体、アンギオスタチンのリシン結合フラグメント、メラニン又はメラニン促進化合物、プラスミノゲンフラグメント例えばプラスミノゲンのクリングル1~3、トロポインtropoinサブユニット、ビトロネクチンαvβ3のアンタゴニスト、サポシンB由来ペプチド、抗生物質又はアナログ例えば、テトラサイクリン又はネオマイシン、ジエノゲスト含有組成物、ペプチドへ連結されたMetAP2阻害コアを含有する化合物、化合物EM138、カルコン及びそのアナログ、並びにNAALADase抑制剤。例えば、米国特許番号第6395718号、6462075号、6465431号、6475784号、6482802号、6482810号、6500431号、6500924号、6518298号、6521439号、6525019号、6538103号、6544758号、6544947号、6548477号、6559126号、及び6569845号参照。組み合わせ治療法の性質に応じて、本発明のポリペプチド治療薬の投与は、他の治療法の実施中及び/又はその後に続けられてもよい。このポリペプチド治療薬の投与は、単回投与でも複数回投与でもよい。例えば、本発明のポリペプチド治療薬の投与は、従来の治療法の少なくとも数日前に開始されてもよく、又その投与は従来の治療法の直前又はその投与時のいずれかで開始されてもよい。VII.投与方法及び医薬的組成物例えば、本発明のポリペプチド治療薬例えば、可溶性ポリペプチド又は抗体は、医薬的に適用可能なキャリアと共に配合できる。これら治療薬は、単体として又は医薬的配合物組成物の成分として投与できる。化合物は、ヒトへの使用又は動物用医薬に適した方法ですれるために配合できる。ドデシル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム等の、湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、矯味剤及び香料、保存薬及び抗酸化剤も又本発明の組成物中に存在できる。本発明のポリペプチド治療薬の配合物には、経口/経鼻、局所的、非経口腸管外、直腸内、及び/又は膣内投与へ適切なものが含まれる。配合物は単位剤形の形で便利に提供でき、製薬分野で公知の方法により調製できる。単一剤形を生産するためにキャリア材料へ組み合わせできる活性成分量は、治療されるホスト、特別な投与モードに応じて変化できる。単一剤形を生産するためにキャリア材料へ組み合わせできる活性成分量は、一般的に治療的効果を得られる化合物量である。例えば、本発明の配合物又は組成物の調製方法として、異なる種類の抗腫瘍薬又は抗血管形成治療薬及びキャリア、任意で1以上の補助成分を組み合わせてもよい。一般的に、配合物は液体キャリア、又は微細粉砕固体キャリア、又は両方と共に調製し、次に必要な場合には成形して製品化してもよい。経口投与用配合物は、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、ロゼンジ香料ベース、通常スクロース及びアカシア又はトラガカントを使用、粉剤、粒剤の形状でもよく、水性若しくは非水性液体の溶液若しくは懸濁液、水中油型若しくは油中水型の液体エマルジョン、エリキシル剤若しくはシロップ、又は香錠ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシア等の不活性基材を使用及び/又は口内洗浄剤等の形状としてもよく、それぞれ活性成分として所定量の本発明のポリペプチド治療薬を含有する。経口投与用固体剤形カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉剤、粒剤等として、本発明の1以上のポリペプチド治療薬は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム等の1以上の医薬的に適用可能なキャリア及び/又は下記いずれかと混合してもよい:1デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及び/又はケイ酸等の充填剤又は増量剤;2カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び/又はアカシア等の結合剤;3グリセロール等の湿潤剤;4寒天、炭酸カルシウム、ポテト又はタピオカデンプン、アルギン酸、所定のケイ酸塩及び炭酸ナトリウム等の崩壊剤;5パラフィン等の溶解遅延剤;6第四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤;7セチルアルコール、グリセロールモノステアラート等の湿潤剤;8カオリン及びベントナイトクレイ等の吸着担体;9タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチルグリコール、ドデシル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物等の吸収剤;並びに10着色剤。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、本発明の医薬的組成物は又、緩衝剤を含有してもよい。類似種の固体組成物も又、ラクトース又は乳糖類、並びに高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を使用した、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として採用できる。経口投与用液体剤形として、医薬学的に適用可能なエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加え、液体剤形は、当分野で通常使用される不活性希釈剤を含有してもよく、その例として、水又は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾアート、プロピレングリコール、1,3ブチレングリコール、オイル特に、綿実油、ピーナッツ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油及びゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物等の他の溶剤、可溶化剤及び乳化剤が挙げられる。一方、不活性希釈剤、経口組成物も又湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、矯味剤、着色剤、香料及び保存薬等の添加剤を含有してもよい。懸濁液は活性化合物に加え、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタハイドロオキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント並びにそれらの混合物等の懸濁剤を含有してもよい。特に、本発明の方法は、局所的に、子宮頸部及び膣上の皮膚又は粘膜のいずれか上にも投与できる。これは、腫瘍へ直接的に投薬する最も大きな機会であり、かつ副次的効果を誘導する最も低い機会を与える。この局部用配合物は、皮膚に効果的であり、角質層浸透強化剤として公知の、1以上の種々の試薬を更に含有してもよい。これらの例として、2ピロリドン、Nメチル2ピロリドン、ジメチルアセトタミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコール又はイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド及びアゾンazoneが挙げられる。追加的試薬は、配合物を化粧品として適用可能とするためにも更に含有できる。これらの例として、脂肪、ワックス、オイル、染料、香料、保存薬、安定剤及び表面活発な試薬が挙げられる。当分野で公知の角質溶解剤も又含有できる。その例示としてサリチル酸及びイオウが挙げられる。局所的又は経皮的投与用の剤形として、粉剤、スプレー、軟膏、ペースト、スプレー、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が挙げられる。本発明のポリペプチド治療薬は、無菌性条件下で医薬的に適用可能なキャリアと、及び必要ないずれかの保存薬、バッファ又は噴射剤と混合されてもよい。軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、本発明のポリペプチド薬へ加え更に、動物性及び植物性脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン樹脂、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛又はそれらの混合物等の賦形剤を含有してもよい。粉剤及びスプレーは、本発明のポリペプチド治療薬に加え更に、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉、又はこれらの物質の混合物等の賦形剤を含有してもよい。スプレーは更にクロロフルオロ炭化水素並びにブタン及びプロパン等の揮発性非置換炭化水素等の通常の噴射剤を含有できる。非経口腸管外投与用に適切な医薬的組成物は、1以上の医薬学的に適用可能な無菌性等張水又は非水性溶液、分散体、懸濁液若しくはエマルジョン、又は使用直前に無菌性注射用溶液又は分散体内で再構成される無菌性粉剤と組み合わせた1以上のポリペプチド治療薬を含有してもよく、それは抗酸化剤、バッファ、静菌薬、対象とするレシピエントの血液と等張な配合物とする溶質、又は懸濁剤若しくは増粘剤を含有してもよい。本発明の医薬的組成物で使用できる適切な水性及び非水性キャリアの例として、水、エタノール、ポリオールグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等及びそれらの適切な混合物、オリーブオイル等の植物性オイル、並びに、エチルオレアート等の注射用有機的エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング材料の使用、分散体の場合必要な粒子径の維持及び界面活性剤の使用を行うことにより維持できる。本発明の組成物は又、保存薬、湿潤剤、乳化剤及び分散剤等の添加剤を含有してもよい。微生物の活動防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の種々の抗細菌性及び抗真菌剤の含有により確保できる。糖類、塩化ナトリウム等の等張性試薬を本発明の組成物中に含有させることも又好ましい。更に、注射可能な医薬形態の長期間吸収は、アルミニウムモノステアレート及びゼラチン等の吸収遅延剤の包含により達成できる。注射可能な貯蔵体は、ポリラクチドポリグリコリド等の生分解性ポリマー中の1以上のポリペプチド治療薬のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより製造できる。薬のポリマーに対する割合及び使用される所定のポリマーの性質に依存して、薬放出速度が制御できる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリオルソエステル及びポリアンハイドライドが挙げられる。注射可能な配合貯蔵体は又、リポソーム中又は体組織適合性のあるミクロエマルジョン中にドラッグを捕捉することにより調製できる。膣内又は直腸内投与用配合物は、1以上の本発明の化合物を1以上の適切な非刺激性賦形剤又はキャリアと混合して製造される座薬として提供できる。上記賦形剤等として例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、座薬ワックス又はサリチラートが挙げられ、それらは室温で固体であるが体温で液体であるため、直腸内又は膣腔内で溶解して活性化合物を放出する。例えば、本発明のポリペプチド治療薬は、真核プロモーターから細胞内で発現できる。例えば、EphB4又はエフリンB2の可溶性ポリペプチドは、適切なベクターから真核細胞中で発現できる。ベクターは好ましくはDNAプラスミド又はウィルス性ベクターである。ウィルス性ベクターは本発明を限定するものではないが、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、又はアルファウィルスをベースとして構成できる。好ましくは、ベクターは確実にターゲット細胞中に導入されその中で存続する。又、ウィルス性ベクターは一時的発現を起こすためにも使用できる。これらのベクターは必要に応じて繰り返して投与できる。本発明のポリペプチド治療薬をエンコードするベクターのデリバリーは、静脈内又は筋肉内投与により全身的に行える。それは、患者から外植されたターゲット細胞内へ導入してから患者中へ再投入することにより、又は目的とするターゲット細胞を導入することを可能とする他の手段により行えるCoutureら、1996、TIG、12、510参照。例示本発明を上記概説したが、下記実施例により更に容易に理解できる。下記実施例は単に本発明の例示を目的として記載されており、本発明を限定するものではない。実施例1ヒトエフリンB2及びEphB4蛋白質の細胞外領域の可溶性誘導体ヒトエフリンB2及びEphB4蛋白質の細胞外領域の可溶性誘導体は、予測される短縮された完全長のエフリンB2B4ECv3、B2ECの細胞外領域、又はその領域とB2ECFC、B4ECv2FC及びB4ECv3FC等のヒト免疫グロブリンの定常領域IgGlFcフラグメントとの翻訳上のtranslational融合のいずれかを表す。代表的ヒトエフリンB2構築物及びヒトEphB4構築物を図14及び図15に示す。これらの組み換え型蛋白質をエンコードするcDNAフラグメントは、材料及び方法段落に詳細に記載されるように下記参照、ほ乳類発現ベクターへサブクローンされ、一時的に発現するか、ほ乳類細胞系を確実にトランスフェクトして、精製されて均質となった。蛋白質の推定アミノ酸配列を図1~図5に示す。高純度の単離された蛋白質及びそれらの認識を、対応する抗エフリンB2及び抗EphB4モノクローナル又はポリクローナル抗体により確認した。組み換え型蛋白質は、予測される高親和性結合、結合競合及びそれらの対応する結合パートナーとの特異性性質を示し、それらは生物化学的アッセイにより確認された例えば図6~8参照。これら可溶性誘導体蛋白質ヒトエフリンB2及びEphB4は、数個の細胞ベースアッセイ及び血管形成又は抗癌活性を測定するinvivoアッセイによる生物学的活性の能力を示し、従ってそれは抗血管形成及び抗癌治療用の将来性のあるドラッグ候補である。B4ECv3並びにB2EC及びB2ECFC蛋白質は、ヒト内皮細胞の走化性をブロックしへその緒及び肝臓性AEC又はVECで試験した、細胞外マトリックスマトリゲル、商標の変質の減少及び増殖因子刺激に対する応答における移動を減少させた図9~11。B4ECv3及びB2ECFC蛋白質はそれらの内皮細胞管形成阻害により示される抗血管形成効果の能力を有する図12~13。材料及び方法1エフリンB2及びEphB4の組み換え型可溶性誘導体生産用のほ乳類発現ベクター;エフリンB2及びEphB4の組み換え型可溶性誘導体を発現するためのプラスミドベクターは、pEF6/V5HisTOPOベクターインビトロジェン社製、pIGNovagen社製又はpRK5をベースとした。pEF6/V5HisTOPOは、ヒト延長因子1aエンハンサー/プロモーター及びブラストサイジン耐性マーカーを含有する。pIGベクターは、CMVプロモーター調節下でヒトIgG1のFc部位との高レベル発現の蛋白質融合をするように設計され、pRK5は一般的目的CMVプロモーター含有ほ乳類発現ベクターである。プラスミド構築物pEF6B4ECNTを生成するために、ヒトEphB4のcDNAフラグメントを、オリゴプライマー5’GGATCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCT3’SEQIDNO1及び5’TGGATCCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCATCCA3’SEQIDNO2を使用してPCR法で増幅し、pEF6/V5HisTOPOベクターへTOPOクローン化した。pEF6hB4ECv3は、pEF6B4ECNTに由来し、プラスミドDNAをEcoRV及びBstBIで消化して、Klenow酵素及びリライゲートベクターで末端を補完した。pEF6B4ECNTによりエンコードされた組み換え型EphB4誘導体は、エピトープ又は精製標識を含有しない一方、pEF6hB4ECv3によりエンコードされた類似のB4ECv3蛋白質は、そのC末端にV5エピトープ標識及び6xHis標識を含有し、条件付けした培地からの精製を促進する。プラスミド構築物pEF6hB2ECを、オリゴプライマー5’TGGATCCACCATGGCTGTGAGAAGGGAC3’SEQIDNO3及び5’ATTAATGGTGATGGTGATGATGACTACCCACTTCGGAACCGAGGATGTTGTTC3’SEQIDNO4を使用した、エフリンB2cDNAのPCR増幅をし、pEF6/V5HisTOPOベクター中へのTOPOクローニングにより製造した。プラスミド構築物pIGhB2ECFCを、オリゴプライマー5’TAAAGCTTCCGCCATGGCTGTGAGAAGGGAC3’SEQIDNO5及び5’TAGGATCCACTTCGGAACCGAGGATGTTGTTCCC3’SEQIDNO6を使用した、エフリンB2cDNAのPCR増幅をし、それに続くTOPOクローニングにより製造し、次に得られたPCRフラグメントをBamHI及びHindIIIにより切断したpIGhIgG1Fc融合発現ベクター内でサブクローニングして塩基配列決定した。同様に、pIGhB2EC及びpIGhB4ECv3をオリゴプライマー5’ATAAGCTTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTG3’SEQIDNO7及び5’TTGGATCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCATC3’SEQIDNO8を使用して、EphB4ECDcDNAのPCR増幅部位を製造し、次にBamHI及びHindIIIにより切断したpIGhIgG1Fc融合発現ベクター内へ続いてサブクローニングした。上記ベクターによりエンコードされた蛋白質の推定配列を図1~5に示す。2ほ乳類細胞培養及びトランスフェクション;HEK293Tヒト胎児腎臓系細胞を10半透膜ろ過したdialyzedウシ胎仔血清及び1ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン抗生物質と共にDMEM中に保持した。細胞を5CO2/95空気湿生雰囲気下37°Cで保持した。トランスフェクションをリポフェクタミン2000試薬商標、インビトロジェン社製を使用して製造者のプロトコルに従い行った。トランスフェクション1日前、293T細胞をトランスフェクション時に80接触confluenceとなるように高密度で接種した。プラスミドDNA及びリポフェクタミン商標試薬1:3比をOptiMEMI血清使用量低減培地商標、インビトロジェン社製中で5分間稀釈し、一緒に混合してDNA;リポフェクタミン商標複合体を形成した。10cm培養皿それぞれには、10μgのプラスミドDNAを使用した。20分後、上記複合体を培養培地中の細胞へ直接添加した。トランスフェクション16時間後、培地を吸引し、血清フリーDMEMで1回洗浄し、血清フリーDMEMで置換した。分泌された蛋白質を48時間に後条件付き培地を採集することにより採取した。条件付き培地を10000gで20分間遠心分離して清澄化し、0.2μmフィルターを通してろ過して精製用に使用した。3安定な細胞系の構築;EphB4ECv3及びEphB4ECntHEK293又はHEK293Tを生産する安定な細胞系を構築するために、細胞を、pEF6B4ECv3又はpEF6B4ECNTプラスミド構築物のいずれかで上記のようにトランスフェクトし、抗生物質ブラストサイジンを使用して選択した。トランスフェクション24時間後、細胞を低密度で接種した。翌日、細胞を10μg/mlのブラストサイジンで処理した。ドラッグ選択2週間後、生存細胞をプールし、更に単一細胞クローン展開を選択した。安定細胞確立後、それらを4μg/mlブラストサイジン中で維持した。条件付け培地を試験して、組み換え型蛋白質それぞれの発現及び分泌を確認した。発現の特異性を、抗B4モノ又はポリクローナルABを使用したウェスタンブロット法及びB2ECAP試薬結合競合アッセイで確認した。4蛋白質精製;HEK293細胞をEphB4外部ドメインB4ECv3の分泌型をエンコードするプラスミドで一時的にトランスフェクトした。条件付き培地を採取し、10mMイミダゾール、0.3MNaClを補充し、20000gで30分間遠心分離して細胞片及び不溶性粒子を除去した。80mlの得られた上澄みを、1mlのNiNTAアガロースQIAGEN社製を有する予め平衡化したカラム上に流速10ml/hで添加した。カラムを10mlの50mMTrisHCl、0.3MNaCl及び10mMイミダゾール、pH8で洗浄後、残っている蛋白質を3mlの0.25Mイミダゾールで溶離した。溶離した蛋白質を20mMTrisHCl、0.15MNaCl、pH8に対して一晩透析した。B4ECv3の純度及び特性を、PAGE/クマシーG250法及び抗EphB4抗体を使用したウェスタンブロット法により評価した。最後に、B4ECv3の濃度を測定し、蛋白質をアリコートにして70°Cで保存した。B4ECFC蛋白質及びB2ECFC蛋白質も同様に精製した。5生物化学的アッセイ;A.結合アッセイ:10μlのNiNTAアガロースをマイクロ遠心機用試験管中で、結合バッファBB20mMTrisHCl、0.15MNaCl、0.1ウシ血清アルブミンpH8中で稀釈した50μl表示量のB4ECv3を使用してインキュベートした。振とう台上でのインキュベーション30分後、NiNTAビーズを1.4mlのBBで2回洗浄し、次に50μlのB2APを使用して最終濃度50nMとした。結合を30分間振とう台上で行い、次に試験管を遠心分離し、1.4mlのBBで1回洗浄した。沈降したAP量をPNPP処理後に比色分析で測定した。B.阻害アッセイ;溶液中の阻害50μlのBB中に稀釈された異なる量のB4ECv3を、50μlの5nMB2ECAP試薬で予備インキュベートしたエフリンB2外部ドメインの胎盤性アルカリホスファターゼとの蛋白質融合。1時間インキュベーション後、結合していないB2ECAPを膜結合した完全長EphB4を発現するHEK293細胞5000と共に20分間沈降させた。結合反応を1.2mlのBBで希釈して停止し、次に10分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、採取された細胞に関するアルカリホスファターゼ活性をパラニトロフェニルホスフェートPNPP基質を添加して測定した。細胞ベースの阻害B4ECv3を20mMTrisHCl、0.15MNaCl、0.1BSA、pH8中に連続的に稀釈し、膜結合した完全長エフリンB2を発現するHEK293細胞5000と混合した。インキュベーション1時間後、50μlの5nMB4ECAP試薬EphB4外部ドメインと胎盤性アルカリホスファターゼとの蛋白質融合をそれぞれの試験管中へ30分間添加し、未結合のエフリンB2結合部位を検出した。結合反応を1.2mlのBBでの希釈により停止し、遠心分離した。細胞沈降したAPの比色分析的反応をPNPP基質で展開した。C.B4ECFC結合アッセイ;プロテインAアガロースベースアッセイ10μlのプロテインAアガロースをエッペンドルフ型試験管中で、結合バッファBB20mMTrisHCl、0.15MNaCl、0.1BSA、pH8中に稀釈した50μlの表示量のB4ECFCと共にインキュベートした。振とう台上でインキュベーション30分間後、プロテインAアガロースビーズを1.4mlのBBで2回洗浄し、次に50μlのB2ECAP試薬を適用して最終濃度50nMとした。結合を30分間振とう台上で行い、次に試験管を遠心分離し、1.4mlのBBで1回洗浄した。沈降したAPの比色分析的反応をPNPPの適用後に測定した図6。ニトロセルロースベースのアッセイB4ECFCを連続的に20mMTrisHCl、0.15MNaCl、50μg/mlBSA、pH8中に稀釈した。2μlのそれぞれのフラクションをニトロセルロースストリップ上に適用し、スポットを3分間乾燥させた。ニトロセルロースストリップを5無脂肪乳で30分間ブロックし、次に5nMB2ECAP試薬でインキュベーションした。結合用インキュベーション45分後、ニトロセルロースを20mMTrisHCl、0.15MNaCl、50μg/mlBSA、pH8で2回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質シグマFastシグマ社製を適用して色を展開した。D.B4ECFC阻害アッセイ;溶液中阻害B4ECv3について記載した上記参照。結果を図7に示す。細胞ベースの阻害B4ECv3について記載した上記参照。E.B2ECFC結合アッセイ;プロテインAアガロースベースアッセイB4ECFCについて記載した上記参照。結果を図8に示す。ニトロセルロースベースのアッセイB4ECFCについて記載した上記参照。6細胞ベースのアッセイ;A.増殖阻害アッセイ:ヒトへその緒静脈内皮細胞HUVEC1.5×103を100μlのEBM2Clonetic社製、番号CC3162を含む96ウェルプレート中にプレートする。24時間後第0日、試験用組み換え型蛋白質100μlをそれぞれのウェルへEBM2培地中に2×目的濃度5~7濃度レベルで添加する。第0日に、1のプレートを20メタノール中0.5クリスタルバイオレットで10分間染色し、水で洗浄し、空気乾燥する。残っているプレートを72時間37°Cでインキュベートする。72時間後、プレートを20メタノール中0.5クリスタルバイオレットで染色し、水で洗浄し、空気乾燥する。染色は、エタノール:0.1Mクエン酸ナトリウム1:1溶液で溶離し第0日プレートを含む、吸光度540nmでELISAリーダーDynatechラボラトリーズ社製を使用して測定する。第0日吸光度を72時間プレート結果から減じ、データをコントロール増殖ビヒクル処理した細胞割合としてプロットする。IC5050阻害を発生する薬剤濃度をプロットしたデータから算出する。B.コード形成アッセイ内皮細胞管形成アッセイ;マトリゲル商標60μlの10mg/ml;CollaborativeLab社製、番号35423を氷冷96ウェルプレートのそれぞれのウェル中に配置した。プレートを室温で15分間放置し、次に37°C30分間インキュベートし、マトリゲルをポリマー化した。その間に、HUVECをEGM2Clonetic社製、番号CC3162中に濃度2×105細胞/mlで調製する。試験化合物を2×目的濃度5濃度レベルで同一の培地中に調製する。細胞500μl及び2×ドラッグ500μlを混合し、200μlのこの懸濁液をポリマー化したマトリゲル上で複製配置する。インキュベーション24時間後、三個の試験画像をBioquant画像分析システムを使用してそれぞれの濃度で得る。未処理のコントロールと比較した薬剤効果IC50を、形成されたコードの長さ及び結合数を測定して評価する。C.細胞移動アッセイ;移動を、48ウェルボイデンチャンバー商標及び8μm孔径のコラーゲン被覆された10μg/mlラット尾コラーゲン;CollaborativeLab社製ポリカーボネートフィルターOsmonics、Incを使用して評価する。底部チャンバーウェルに27~29μlのDMEM培地のみベースライン又は化学走性誘因物質含有培地bFGF、VEGF又はスイス3T3細胞条件付け培地を配置する。上部チャンバーに試験化合物を含む又は含まないDMEM1BSA中で調製される45μlのHUVEC細胞懸濁液1×106細胞/mlを配する。37°Cで5時間インキュベーション後、膜をPBS中で洗浄し、DiffQuick溶液中に固定化して染色する。フィルターをガラススライド上に、移動した細胞を下向きに配置し、上部の細胞をKimwipe商標を使用して除去する。試験は4~6複製物及びそれぞれのウェルからの5視野を計測して行う。陰性無刺激コントロール値を刺激されたコントロール及びドラッグ処理した値から除き、データを平均移動細胞±SDとしてプロットする。IC50をプロットしたデータから算出する。実施例2EphB4レセプターの細胞外領域フラグメントは、血管形成及び腫瘍増殖を阻害する。A.EphB4の球状領域が内皮性管形成アッセイ中で、エフリンB2結合のために、及びEphB4由来の可溶性蛋白質活性を測定するために必要である。レセプターの可溶性組み換え型誘導体の抗血管形成活性に必要十分なEphB4の異所性部位のサブドメインを特定するために、EphB4ECの4種の組み換え型欠失変異体を生産し、試験した図16。EphB4の細胞外部位は、EphB及びEphAレセプターファミリーの他の構成員と同様に、N末端リガンド結合球状領域、次にシステインリッチ領域及び2個のフィブロネクチン型IIIリピートFNIIIを含有する。EphB4の完全異所性部位を含有する組み換え型B4GCF2蛋白質に加え、球状領域及びCysリッチ領域B4GCを含有するEphB4ECの3個の欠失変異体を構築した;即ち、球状、Cysリッチ及び第一のFNIII領域GCF1並びに削除された球状領域CF2を有するECD変異体。球状領域のみを含有する短縮されたEphB4EC蛋白質の数個のバージョンを生産するための試みは成功せず、その理由はこれら全ての構築物から発現した蛋白質の分泌の欠如、及び細胞内で発現された組み換え型蛋白質により結合されたリガンドの不存在であった。更に、B4GCF2の非標識化体GCF2Fというは、追加的に融合されたアミノ酸を有さないEphB4の完全な細胞外領域を含有するものであり、発現され、精製され、ここで記載される実験の幾つかで使用された。4個全てのC末端6xHis標識化組み換え型蛋白質を一時的にトランスフェクトされた培養ほ乳類細胞中で予備的に発現し、条件付けした増殖培地からNi2キレート樹脂上のクロマトグラフィーを使用して親和性精製して均質化した図17。明らかにそれらのグリコシル化を原因として、この蛋白質は34.7kDaGC、41.5CF2、45.6kDaGCF1及び57.8kDaGCF2のそれらの予測分子量により示唆されるよりもいくらか高くSDSPAAG上を移動する。ヒトEphB4の細胞外領域の配列は、Cysリッチ領域中の、第一フィブロネクチン型IIIリピート中にあり第一及び第二フィブロネクチンリピート間に位置する、3個の予測Nグリコシル化部位NXS/Tを含有する。エフリンB2へ結合される精製された組み換え型蛋白質の能力を確定するために、それらをinvitro結合アッセイで試験した。予測されるように、CF2ではなくGC、GCF1及びGCF2は同系のリガンドエフリンB2を結合し、それはエフリンB2アルカリホスファターゼエフリンB2AP融合蛋白質とNi2樹脂又はニトロセルロース膜上に固定化されたB4蛋白質との相互作用により確認される図17。4個全ての蛋白質も又、それらの、リガンド依存性二量体化、及びPC3細胞中のEphB4レセプターキナーゼの活性化をブロックする能力も試験された。PC3ヒト前立腺癌細胞系は、上昇したレベルのヒトEphB4を発現することは公知である。PC3細胞のエフリンB2IgGFc融合蛋白質による刺激は、レセプターのチロシンリン酸化の急速な誘導を導く。しかし、リガンドのCF2ではなくGCF2、GCF1又はGC蛋白質とのプレインキュベーションは、その次に続くEphB4自動リン酸化を抑制する。蛋白質単独のPC3細胞への添加又は細胞の蛋白質とのプレインキュベーション及び次の培地交換及びリガンド添加は、EphB4リン酸化段階に作用しない。更に、EphB4の球状領域は、内皮性管形成アッセイ中のEphB4由来の可溶性蛋白質の活性に必要であることが発見された。B.HUV/AECの可溶性EphB4のinvitro効果;可溶性EphB4が血管形成経路中の主要な3段階に作用したか否かを決定するために、初期実験を行った。これらは、HUV/AECによるinvitroの移動/侵襲、増殖及び細管形成への可溶性EphB4の効果を確定することにより実施した。可溶性EphB4への曝露は、投薬量依存性挙動でのボイデンチャンバー商標アッセイ中のbFGF及びVEGF両方の誘起移動を非常に阻害し、nMでの重要性を確定した図18。マトリゲル商標被覆されたウェル上の、HUV/AECSによる細管形成は、bFGF及びVEGFの不存在及び存在のいずれでも可溶性EphB4により投薬量依存性挙動で非常に阻害された図19。又invitroで可溶性EphB4のnMはHUVECSへ細胞毒性であったか否かを評価した。MTSアッセイで評価したように、可溶性EphB4のこれらの投薬量では細胞毒性効果が検出されなかった図20。C.可溶性EphB4レセプターは、マトリゲル商標プラグのinvivo血管形成を抑制する;可溶性EphB4がinvivo血管形成を直接に阻害することを示すために、ネズミマトリゲルプラグ実験を行った。bFGF及びVEGFを可溶性EphB4の存在又は非存在下で補充したマトリゲル商標をBalbCnunuマウスへs.c.注射し、半固体プラグを6日間で形成した。増殖因子無しのプラグは、6日後に実質的に血管形成又は脈管構造が生じなかった図21。反対に、bFGF及びVEGFを補充されたプラグは、プラグ全体に充分な血管形成及び脈管を生じた。μgの可溶性EphB4で処理したマウスから取り出されたプラグでは、増殖因子なしのプラグと比較してプラグの血管形成が顕著に減少した図21。更に、プラグの組織試験は脈管染色が減少したことを示した図21。μg/投薬量での治療は、コントロールと比較してマトリゲルプラグ中への湿潤を非常に阻害した図21。可溶性EphB4処理した細胞からの溶解産物及びリン酸phosphorチロシンに対する抗体を使用してウェスタンブロット法分析を実施して、HUVEC中のEphB4レセプターリン酸化を試験した。血清飢餓状態にしたHUVECの可溶性EphB4処理は、エフリンB2Fc、EphB4リガンド二量体の存在下で、リン酸化EphB4のレベルの急速及び一時的な減少を刺激した。可溶性EphB4蛋白質なしのエフリンB2Fcは、EphB4レセプターのリン酸化を誘起した図22。D.腫瘍増殖に対する可溶性EphB4のinvitro効果;可溶性EphB4はBalbCnunuマウス中のSCC15腫瘍の増殖を抑制することが発見された図23。E.可溶性EphB4は角膜新生血管形成を阻害した;可溶性EphB4のinvivo抗血管形成活性を更に検討するために、bFGFで誘起されたマウス角膜中の新生血管形成に対する可溶性EphB4投与の阻害的効果を試験した。角膜マイクロポケット中へ移植されたHydron商標ペレットは、通常の血管面積中の血管形成を増殖因子の存在下で誘起できる。マウス角膜中の血管形成応答は中程度であり、血管芽の発生は遅れ、新しい毛細血管はまばらでゆっくりとしか成長しなかった。コントロールグループと比べて、移植7日目に、bFGFによりマウス角膜中で誘起された新生血管形成は、可溶性EphB4処理したグループ中で顕著に阻害された図24。F.腫瘍増殖に対する可溶性EphB4のinvivo効果;同一のモデルを、可溶性EphB4のinvivo効果を決定するために使用した。SCC15腫瘍をマトリゲルと共に増殖因子有り又は無しでプレインキュベートして皮下移植し、又sc単独で移植し、マウスを一日1~5ugの可溶性EphB4でsc又はip処理して実験した。コントロールグループ中の腫瘍は、処理期間中連続して着実に増殖し、最終腫瘍体積mm3に達した。しかし、可溶性EphB4を注射した動物では増殖速度が非常にp<0.0/減少し、最終腫瘍体積はたったmm3であった図25。類似の結果が更に2個のこれら腫瘍保持マウスの集団でも得られた。可溶性EphB4の投与は、動物の体重又は一般的健康に対する非常な効果を示さないでinvivoで耐薬物性に優れることが明らかになった昏睡、断続的な背中の曲げ、震え又は不安定な呼吸パターンの不存在により決定された。G.腫瘍組織に対する可溶性EphB4の効果;組織分析は、通常腫瘍細胞の生存縁部um幅で囲まれている、全SCC15腫瘍中の壊死の中心面積の存在を明らかにした。中心壊死面積はしばしば大きく接触性confluentであり、細胞詳細部の喪失を示した。腫瘍断片面積の割合として評価した壊死は、可溶性EphB4処理したグループで非常にp<0.02多かったコントロールに対する処理体の壊死。可溶性EphB4処理した腫瘍体積の減少はこの蛋白質の腫瘍血管供給に対する効果によるのか否かを決定するために、血管中の内皮細胞を、腫瘍断片中で抗血小板細胞付着分子PECAM1;CD31抗体を使用した免疫染色法を使用して特定し、微細血管の密度を評価した図26。微細血管密度は、コントロール中及び可溶性EphB4処理した腫瘍中の、腫瘍細胞の外側の生存縁部よく区別される核を有する腫瘍の周辺部へ隣接する細胞の均一層と類似した。微細血管密度は非常に内側にあり、コントロール腫瘍より可溶性EphB4処理した壊死性中心面積に接触する腫瘍細胞の生存領域がより少なかった。マッソン社製トリクローム商標染色で特定されるように、繊維素沈着はコントロール腫瘍より、内側生存縁部中の血管中及び周囲並びに可溶性EphB4処理した中心壊死性コアで増加した。可溶性EphB4処理した腫瘍の生存縁部の外側では、脈管管腔は空腔を保持し、赤血細胞を含有するが、繊維素沈着は多くの脈管周囲で顕著であった。可溶性EphB4は、試験された正常組織肺、肝臓及び腎臓中の内皮に対してはこれらの効果が無いことが発見された。H.材料及び方法;1発現構築物;可溶性用発現ベクターを生産するために、6xHis標識化EphB4ECD変異体、クローン化された完全長ヒトEphB4cDNAを下記オリゴプライマーを使用してPCR法で増幅した:TACTAGTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCTSEQIDNO9通常のEphB4N末端プライマー及びGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGATGATGAGCCGAAGGAGGGGTGGTGCASEQIDNO10B4GC、AGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGATGATGGACATTGACAGGCTCAAATGGGASEQIDNO11B4GCF1又はTGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGATGATGCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCATSEQIDNO12B4GCF2。得られたPCRフラグメントを、EF1αプロモーター調節下でほ乳類発現ベクターpEF6/V5HisTOPOインビトロジェン社製中でTAクローン化した。発現した組み換え型蛋白質は、ヒトEphB4の成熟細胞外部の下記フラグメントをエンコードする:アミノ酸位置1~522GCF2、1~412GCF1及び1~312GC。pEF6クローニング用のB4CF2欠失δアミノ酸13183PCRフラグメントを生成するために、EphB4cDNAを下記オリゴプライマーを使用して2ステップオーバーラップPCR法により増幅した:TACTAGTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCTSEQIDNO13、CAGCTGAGTTTCCAATTTTGTGTTCSEQIDNO14、GAACACAAAATTGGAAACTCAGCTGACTGTGAACCTGACSEQIDNO15及びGCGGCCGCCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTSEQIDNO16。分泌されたヒトエフリンB2アルカリホスファターゼB2AP試薬の生産用ベクターは、下記プライマーを使用してヒトエフリンB2cDNAのPCR増幅により構成された:TAAAGCTTCCGCCATGGCTGTGAGAAGGGACSEQIDNO17及びTAGGATCCTTCGGAACCGAGGATGTTGTTCCCSEQIDNO18:得られたフラグメントをクローニングし、HindIII及びBamHIで消化して、HindIIIBg1II消化されたpAPTag2ベクターGenHunter、Inc社製とする。それぞれの場合、発現ベクター中の挿入部分は、完全塩基配列決定により確認した。2抗体及び他の試薬;抗EphB4モノクローナル抗体mAB79及びmAB23をマウス中で、成熟ヒトEphB4のGCF2蛋白質含有アミノ酸1~522に対して増殖し、プロテインAクロマトグラフィーによりハイブリドーマ上澄みから精製した。抗ホスホチロシン抗体4G10はUBI社レイクプラシッド、NYから得た。プロテインGHRP複合体はBioRad社から購入した。3EphB4由来の組み換え型蛋白質の発現及び精製;EphB4ECD可溶性蛋白質を生産するために、培養されたヒト胎児腎臓細胞HEK293Tを対応するプラスミド構築物で、標準リン酸カルシウム又はリポフェクタミン2000試薬商標、インビトロジェン社製プロトコルを使用してトランスフェクトした。12~16時間トランスフェクション後、増殖培地DMEM10胎児ウシ血清を吸引し、細胞を血清フリーDMEMで1回洗浄し、血清フリーDMEMで置換した。分泌された蛋白質を含有する条件付け培地を72~96時間後採取し、遠心分離で清澄化し、NiNTAアガロースQIAGEN社製を使用してHis標識化蛋白質の精製に使用した。純度及び組み換え型蛋白質の量を、クマシーブルー又は銀染色法を使用したSDSPAAG電気泳動、ウェスタンブロット法及びUV分光法により試験した。精製された蛋白質を、20mMTrisHCl、0.15MNaCl、pH8に対し透析し、70°Cで貯蔵した。蛋白質のリガンド結合性を試験するために、10μlのNiNTAアガロースQIAGEN社製をマイクロ遠心機用試験管中で、0.5mlの結合バッファBB20mMTrisHCl、0.15MNaCl、0.1ウシ血清アルブミン、pH8中に稀釈した10~500ngサンプルのB4ECD蛋白質でインキュベートした。振とう台上でインキュベーション30分間後、NiNTAビーズを1.4mlのBBで2回洗浄し、次にB2AP融合蛋白質を濃度50nMで添加した。結合を振とう台上で30分間行った。試験管を遠心分離し、1.4mlのBBで1回洗浄した。沈降したAP量を、pニトロフェニルホスフェートPNPP処理及び530分間インキュベーション後420nmで比色分析で測定した。4免疫沈殿;全溶解産物を4°Cで処理した。細胞を、20mMHepespH7.4、100mM塩化ナトリウム、50mMフッ化ナトリウム、2mMのEDTA、2mMのEGTA、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、1v/vNP40、0.5w/vデオキシコール酸ナトリウム、1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド新規に添加及び100Uトラジロール商標を含有する1mlのバッファ中で溶解した。溶解産物をエッペンドルフ型試験管中へスクレープし、50μlの煮沸した、ホルマリン固定化した黄色ブドウ球菌を添加したCalbiochem社製、サンディエゴ。混合30分後、溶解産物を5分間、25000gでminifuge商標中で遠心分離し、上澄みを適切な抗体を含有する新しい試験管中へ移した。溶解産物を抗体と1時間混合し、その後50μlのプロテインASepharose商標ビーズを添加し、試験管の内容を1時間混合して免疫沈降物を収集した。プロテインAビーズを25000gで30秒の遠心分離で採取した。上澄みを廃棄し、ビーズを1mlの溶解バッファマイナスデオキシコレートで3回洗浄した。5細胞ベースのEphB4チロシンキナーゼアッセイ;ヒト前立腺癌細胞系PC3細胞を10半透膜ろ過したウシ胎仔血清及び1ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン抗生物質混合物と共にRPMI培地中で維持した。細胞を5CO2/95空気湿生雰囲気下37°Cで保持した。通常、細胞を接触するまで60mmディッシュ中で増殖し、10分間1μg/mlのRPMI中でマウスエフリンB2Fc融合で処理してEphB4レセプター活性化するか、コントロールとして単純plain培地で処理した。EphB4レセプター活性化に対する可溶性EphB4ECD蛋白質の異なる誘導体の効果を試験するために、3セットの細胞を使用した。第一のセットで、細胞を種々の蛋白質5蛋白質;GC、GCF1、GCF2、GCF2F、CF2で5μg/ml20分間処理した。第二セットの細胞では、適用前に、蛋白質を1:5EphB4蛋白質:B2Fcモル比でエフリンB2Fcと予備混合し、20分間インキュベートし、細胞上に10分間適用した。第三セットの細胞では、細胞を最初に蛋白質と20分間5μg/mlで処理し、培地を1μg/mlのエフリンB2Fcを含有する新しい培地で置換し、更に10分間インキュベートした。刺激後、細胞を直ちに、20mMTrisHCl、pH7.4、150mMNaCl、1v/vTritonX100商標、1mMのEDTA、1mMのPMSF、1mMバナジン酸ナトリウムを含有する蛋白質抽出バッファで採取した。蛋白質抽出物を、14000rpm、20分間4°C遠心分離で清澄化した。清澄化蛋白質サンプルを抗EphB4モノクローナル抗体予備コートされたプロテインA/G結合したアガロースビーズと共に一晩インキュベートした。IP複合体を同じ0.1TritonX100商標を含有する抽出バッファで2回洗浄した。免疫沈降した蛋白質を1XSDSPAGEサンプルローディングバッファ中で可溶化し、10SDSPAGEで分離した。EphB4レセプター活性化試験のために、電気ブロッティングした膜を1:1000希釈の抗pTyr特異的抗体4G10、次に1:5000希釈のプロテインGHRP複合体でプローブした。6細胞培養;正常HUVECはCambrex商標、BioWhittaker社として得て、0.1mg/ml内皮性成長補充物ウシ脳からの疎抽出物、ペニシリン50U/ml、ストレプトマイシン50U/ml、2mmol/lグルタミン及び0.1mg/mlヘパリンナトリウムを補充したEBM2培地中で維持した。細胞のアリコートをパッセージ継代1及び3間は冷凍保存した。全実験中、HUVECはパッセージ4以下で使用し、接触性ディッシュから採取した。7内皮細胞管形成アッセイ;マトリゲル商標60μlの10mg/ml;CollaborativeLab社製、カタログ番号35423を氷冷96ウェルプレートのそれぞれのウェル中に設置した。プレートを室温で15分間放置し、次に37°Cで30分間インキュベートしてマトリゲル商標をポリマー化した。その間に、ヒトへその緒の静脈内皮細胞を、EGM2Clonetic社製、カタログ番号CC3162中、濃度2×105細胞/mlで調製した。試験蛋白質を同じ培地中の2×目的濃度5濃度レベルで調製した。細胞500μl及び2×蛋白質500μlを混合し、200μlのこの懸濁液をポリマー化したマトリゲル商標の複製物中に加えた。インキュベーション24時間後、三個の試験画像をそれぞれの濃度でBioquant商標画像分析システムを使用して取った。蛋白質添加効果IC50を形成されたコード長さ及び結合数を測定して、未処理のコントロールと比較して評価した。8細胞移動アッセイ;HUVECのVEGFへの走化性を、modifiedボイデンチャンバー商標、マトリゲルでコートしたトランスウェル膜フィルターインサート;24ウェルプレート、6.5mm直径、8μm孔径、10μm厚ポリカーボネート膜BDBiosciences社製を使用して評価した。200μlのEBM中のHUVEC細胞の懸濁液2×105細胞/mlを、上室チャンバーに接種し、可溶性EphB4蛋白質を刺激剤VEGF又はbFGFと同時にチャンバーの下室へ添加し、100nM~1μM試験化合物の存在又は非存在下で10~20ng/mlのVEGFに応答してポリカーボネートフィルターを通過するそれらの移動を測定した。37°Cで4~24時間インキュベーション後、フィルターの上部表面を綿棒でスクレープし、フィルターを固定してDiffQuick商標で染色した。200×倍率で10のランダム視野を計測し、結果を視野当りの平均数として示した。刺激されたコントロール及び蛋白質処理したサンプル値から陰性無刺激コントロール値を除き、データを平均移動した細胞±SDとしてプロットした。IC50をプロットしたデータから算出した。9増殖阻害アッセイ;HUVEC1.5×103細胞を100μlのEBM2Clonetic社製、カタログ番号CC3162を含む96ウェルプレート中にプレートした。24時間後第0日、試験用組み換え型蛋白質100μlをそれぞれのウェルへEBM2培地中に2×目的濃度5~7濃度レベルで添加した。第0日に、1のプレートを20メタノール中0.5クリスタルバイオレットで10分間染色し、水で洗浄し、空気乾燥した。残っているプレートを72時間37°Cでインキュベートした。72時間後、プレートを20メタノール中0.5クリスタルバイオレットで染色し、水で洗浄し、空気乾燥した。染色は、エタノール:0.1Mクエン酸ナトリウム1:1溶液で溶離し第0日プレートを含む、吸光度540nmでELISAリーダーDynatechラボラトリーズ社製を使用して測定した。第0日吸光度を72時間プレート結果から減じ、データをコントロール増殖ビヒクル処理した細胞割合としてプロットした。IC50値をプロットしたデータから算出した。10ネズミマトリゲル商標プラグ血管形成アッセイ;Invivo血管形成をマウス中の皮下組織からマトリゲルプラグ含有試験サンプル中への血管の成長としてアッセイした。マトリゲル商標は急速に体温で固体ゲルを形成し、因子をトラップして除放及び周囲の組織への長期間の曝露を可能とする。4°Cで液状のマトリゲル商標8.13mg/ml、0.5mlを内皮細胞成長補充物ECGS、試験蛋白質プラスECGS又はマトリゲル商標プラスビヒクル単独PBS含有0.25BSAと混合した。マトリゲル商標0.5mlをメスnunuマウス6週齢の腹部皮下組織へ腹膜中心線に沿って注射した。それぞれのグループに3マウスを使用した。動物は、慣習及びNIHガイドラインに従って取り扱った。6日目に、マウスを犠牲にし、プラグを回収し、組織を処理した。通常表面の皮膚を除去し、ゲルをサポート用に腹膜ライニングを保持したまま取り出し、10緩衝ホルマリンのPBS溶液中で固定化してパラフィン中に包埋した。3μmの断片に切断し、HE又はマッソン社製トリクローム商標染色で染色し、光学顕微鏡で試験した。11マウス角膜マイクロポケットアッセイ;マウス角膜マイクロポケットアッセイをKenyonら、1996の詳細に従い行った。簡潔には、90ngのbFGFRD又は180ngのVEGFRDシステムズ社製、ミネアポリス、MN、米国のいずれか及び40μgのスクロース硫酸アルミニウムシグマ社製を含有するhydronペレットポリヒドロキシエチルメタクリレート[ポリHEMA]、InterferonSciences社製、ニューブランズウィック、NJ、米国を作成した。手術用顕微鏡を使用して、間質性直線状角膜切開を外科用ブレード商標、BardParker社製、no15を使用して麻酔した動物の外側直筋の挿入物と平行に行った。基質内のマイクロポケットを、改良フォングレーフェ刀2’30mmを使用して切開した。1個のペレットを移植し、一時的temporal角膜輪部bFGFペレット用に0±7±1±0mm及びVEGFペレット用に0±5mm内に対して進め、それぞれの増殖因子用のペレット位置内での相違は、このモデル内でVEGFの比較的弱い血管形成刺激を生じるために必要であるように決定された。次に抗生物質軟膏エリスロマイシンを手術した目へ適用し、感染を防止し表面不規則性を減少させた。次に角膜輪部脈管構造からペレットに向かって延びる血管の応答を測定した。ここで示される新生血管形成の隣接した外周部のデータ及び臨床性写真はペレット移植後6日目に得られ、その日は最大血管形成応答日であることが明らかになった。12Invitro侵襲アッセイ;マトリゲル商標マトリックス被覆された9mm細胞培養インサート孔径8μm;ベクトンディッキンソン社製、フランクリンレイクス、NJを24ウェルプレート中に配置した。HUVEC細胞を密度5×103/ウェル細胞で培養インサートの上層中に接種し、24時間EphB4ECDの存在下で血清フリーEBMで培養した。コントロールグループを同じ培地中にEphB4無しに培養した。次に0.5mlのヒトSCC15細胞系、条件付け培地を、培養インサートの下層中に化学走性誘因物質として充填した。細胞を24時間インキュベートし、次に上層中に残っている細胞を綿棒でかきとり下層中の通過した細胞を5グルタルアルデヒドで固定化し、DiffQuick商標で染色した。マトリゲル商標マトリックス及びそれぞれの8μm孔径の培養インサートを通過した細胞合計数を光学的顕微鏡を使用して測定し、侵襲インデックスとして規定した細胞数/面積。13マウス中のSCC15腫瘍の成長;対数的に増殖するSCC15頭部及び頚部扁平上皮細胞癌細胞系を5×106細胞密度で、EphB4ECDの存在又は非存在下で、ヒトbFGFの存在又は非存在下で、胸腺欠損マウスBalbcヌードマウス中に、マトリゲル商標、BDBiosciences社製合成基底膜1:1v/vと共に皮下注射し、2週間腫瘍を検査した。EphB4ECDグループ中の腫瘍体積は、ビヒクルグループ中のそれよりも移植後の増殖因子の存在及び不存在で3倍小さかった。グループ間に体重の違いはなかった。切除された腫瘍の横断面の免疫組織化学試験及びTUNEL陽性アポトーシス又は壊死、CD34免疫染色法、及びBrdU増殖速度試験を、脱パラフィン化後、再水和し、内因性ペルオキシダーゼ活性のためにクエンチし、プロテアーゼKでの透過化処理で10分後行った。血管密度の量的評価も又行った。局部的腫瘍内デリバリー又はEphB4ECDのIVデリバリーも又、週2回行った。30胸腺欠損ヌードマウス、BALB/cnunuへ、0.1mlマトリゲルと混合した0.1mlPBS中の1×106B16黒色腫細胞をそれぞれ注射し、又は200μlのDMEM血清フリー培地中に再懸濁した1.5×106SCC15細胞を0日目にマウスの右肩領域へ皮下注射した。蛋白質を、開始1日目にローディング投薬量4μg/mgで腫瘍周囲に静脈内又は皮下注射し、2ug/mgの注射を週間毎に行い10μg/g、50μg/kg/日、接種後2週間検査した。マウスは14日目に犠牲にされた。コントロールマウスはPBS50μlを毎日投与された。14ヌードマウス中の腫瘍形成;全動物は動物愛護協会組織に承認されたプロトコルに従って取り扱った。癌細胞5×106をヌードマウスの背中皮膚に皮下接種した。腫瘍が約100mm3の大きさまで増殖した時に通常12日かかった、sEphB4を腹膜内又は皮下に1回/日注射し、腫瘍発生を2週間監視した。腫瘍体積を式a2×bに従って算出した、但しa及びbはそれぞれ最小及び最大直径である。スチューデントt試験を腫瘍体積を比較するために使用し、P<0.05は優位であるとみなした。15微細血管密度の定量化;腫瘍を4ホルムアルデヒド中に固定化し、パラフィン中に包埋し、5μmに断片化し、ヘマトキシリンエオシンで染色した。脈管密度をコンピュータベースの画像分析機を使用して半定量化したそれぞれのグループのマウス3頭からの断片当たり5視野。実施例3EphB4は、アップレギュレートされて前立腺癌に成長促進を付与する。A.前立腺癌細胞系中のEphB4の発現;最初にウェスタンブロット法により種々の前立腺癌細胞系中でEphB4蛋白質の発現について試験した。前立腺癌細胞系は顕著な変異体を120kDEphB4中に豊富に示すことが見いだされた。レベルはPC3中で比較的高く、PC3MPC3の転移性クローンでさえ高い。一方、正常前立腺由来の細胞系MLCはEphB4の発現を僅か又は全く示さない図27A。次にPC3細胞中のEphB4の活性化段階をリン酸化試験により確認した。正常培養条件下でさえ、EphB4はそのリガンド、エフリンB2により更に誘起されるにもかかわらず、ホスホリル化されることが明らかになった図27B。B.臨床性前立腺癌サンプル中のEphB4の発現;EphB4が臨床性前立腺サンプル中で発現したか否かを決定するために、前立腺癌外科的標本からの腫瘍組織及び隣接した正常組織を試験した。前立腺標本中のEphB4の組織的分布を免疫組織化学法により決定した。明らかに、EphB4発現は新生物性上皮に限定され図28、左上、間質性及び正常前立腺上皮では存在しない図28、右上。前立腺組織アレイ中、試験された32前立腺癌の24が陽性であった。量的RTPCRによりEphB4mRNAは、臨床性サンプルの正常及び腫瘍組織の両方で発現したことが明らかになった。しかし、腫瘍EphB4mRNAレベルは、このケースでは正常な場合よりも少なくとも3倍高かった図28、右下。C.p53及びPTENはPC3細胞中のEphB4の発現を阻害した;PC3細胞は、PTEN発現Davisら、1994、Science266816819及び野生型p53機能Galeら、1997、CellTissueRes290227241を欠如することは当分野で公知である。EphB4の比較的高い発現はp53及び/又はPTENに関係するか否かを、野生型p53及び/又はPTENのPC3細胞の再導入により検討した。トランスフェクション効率及び希釈効果を補填するために、トランスフェクトされた細胞は共トランスフェクトされた短縮されたCD4マーカーについて分類された。PC3細胞中のEphB4の発現は、野生型p53又はPTENのいずれかの再導入により減少した。p53及びPTENの共トランスフェクションは、EphB4の発現を更に阻害しなかった図29A。D.レチノイドXレセプターRXRαはEphB4の発現をレギュレートする;発明者らは以前にRXRαは前立腺癌細胞系中でダウンレギュレーションされることを発見したがZhongら、2003、CancerBiolTher2:179184、EphB4発現は、正常前立腺MLC、前立腺癌PC3及び転移性前立腺癌PC3Mを検討した時には逆の発現パターンを有することを今回発見し図27A、RXRαはEphB4の発現をレギュレートするのではないかと考えた。この関係を確認するために、EphB4の発現を構成的にRXRαを発現するCWR22R及びCWR22RRXRα間で比較した。RXRα過発現細胞系でのEphB4発現の適度な減少が発見された一方、FGF8はEphB4発現に効果がなかった。初期結果に適合するように、EphB4は正常良性前立腺肥大性細胞系BPH1中に発見されなかった図29B。E.EGFR及びIGF1Rの増殖因子シグナル経路はEphB4発現をレギュレートする;EGFR及びIGF1Rは両方共PC3細胞増殖に対するオートクリン及びパラクリン作用を有することを示した。EphB4発現はより悪性の細胞系ではより高いために、EphB4発現はこれらのpro生存増殖因子と相関関係を有することが予測された。独立してEGFR及びIGF1Rシグナルをブロッキングすることによりその関係を試験した。EphB4は、EGFRキナーゼ阻害剤AG1478を使用したEGFRシグナルのブロッキング後図30A又はIGF1R中和抗体を使用したIGF1Rシグナル経路のブロックにおいて図30Bダウンレギュレーションされた。F.EphB4siRNA及びアンチセンスODNはPC3細胞生存能力を阻害する;前立腺癌モデル中のこのEphB4過発現の有意性を確定するために、比較的高いEphB4の発現を示すPC3細胞に研究を集中した。EphB4発現を減少させる2つのアプローチは、siRNA及びASODNであった。EphB4コーディング領域の異なるセグメントを相補する多くの異なるホスホロチオアート改質ASODNについて、EphB4阻害の特異性及び効率を試験した。完全長EphB4発現ベクターAS10で一時的にトランスフェクトされた293細胞を使用すると、最も効果的であることが発見された図31B。類似のアプローチを特異的siRNAの選択へ適用した。EphB4siRNA472は、EphB4蛋白質発現を効果的にノックダウンした図31A。siRNA472及びアンチセンスAS10ODNの両方は、投薬量依存性挙動でPC3細胞の生存能力を減少した図31C、D。関係のないsiRNA又はセンスオリゴヌクレオチドは生存能力に効果がなかった。G.EphB4siRNA及びアンチセンスODNはPC3細胞の移動性を阻害する;PC3細胞は、マウス内へ同所的に注射した場合に局部的に進行的に増殖し、リンパ節転移を形成できる。PC3細胞のInvitro移動に対するEphB4の機能を検討するために創傷治癒アッセイを行った。創傷がPC3細胞の単層中に導入された場合、次の20時間のコースで、細胞はクリアな領域中へ進行的に移動した。しかし、細胞がsiRNA472でトランスフェクトされ、創傷が導入された場合、この移動は非常に阻害された図31E。PC3細胞の10μMのEphB4AS10による12時間の予備処理は、同じ効果を生じた図31F。更に、siRNA472を有するPC3細胞中EphB4発現のノックダウンは、コントロールsiRNAと比べてこれらの細胞のマトリゲル商標侵入能力を激しく減少させたことがダブルチャンバー侵襲アッセイにより評価された図31G。H.EphB4siRNAは、PC3細胞中で細胞周期停止及びアポトーシスを誘起する;EphB4のノックダウンは細胞生存能力減少を生じたために図31C、これが細胞周期に対する効果に起因するのかを検討した。コントロールsiRNAトランスフェクトした細胞との比較において、siRNA472はコントロールsiRNA処理した細胞と比べてサブG0及びS期フラクション中の細胞の蓄積を生じた。コントロールsiRNA処理した細胞と比べてsiRNA472処理細胞中で、サブG0フラクションは1から7.9へ増加し、S期フラクションは14.9から20.8へ増加した図32A。サブG0及びG2での細胞周期停止はアポトーシスを表す。EphB4ノックダウンの結果としてのアポトーシスは、ELISAアッセイにより確認された。アポトーシスの投薬量依存性増加は、PC3細胞がコントロールsiRNAではなくsiRNA472でトランスフェクトされた場合に確認された図32B。100nMで、siRNA472トランスフェクトされた細胞中ではコントロールsiRNAトランスフェクトされたPC3細胞中よりも15倍多くアポトーシスを生じた。I.材料及び方法1試薬中和IGF1R抗体はRDシステム社ミネアポリス、MNから購入した。抗IGF1Rβ、EGFR、EphB4C16はサンタクルスバイオテック社サンタクルス、CAから購入した。βアクチンモノクローナル抗体はシグマ化学社セントルイス、MOから購入した。培地及びウシ胎仔血清FBSはインビトロジェン社カールスバッド、CAから購入した。AG147843’クロロアニリノ6,7ジメトキシキナゾリンはカルビオケム社サンディエゴ、CAから購入した。2アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド及びEphB4siRNAEphB4特異的アンチセンスホスホロチオアート改質オリゴデオキシヌクレオチドODN及びセンスODNは、Qiagen社アラメダ、CAにより合成され精製された。配列は下記の通りセンス、5’TCCTGCAAGGAGACCTTCAC3’SEQIDNO19;AS1:5’GTGCAGGGATAGCAGGGCCAT3’SEQIDNO20;AS10:5’ATGGAGGCCTCGCTCAGAAA3’SEQIDNO21。siRNAは、USCNorrisComprehensiveCancerCenterMicrochemicalCorelaboratory社により合成された。EphB4siRNAの配列は、siRNA472の5’GGUGAAUGUCAAGACGCUGUU3’SEQIDNO22及びsiRNA2303の5’cucuuccgaucccaccuacuu3’SEQIDNO23である。スクランブルされたGAPDHに対する陰性コントロールsiRNAは、Ambion社オースチン、TXから購入した。3細胞系及び培養物前立腺癌細胞系、PC3、PC3M、DU145、ALVA31、LAPC4、LNCaP、CWR22R及び大人ヒト正常前立腺上皮細胞系MLCSV40及びBPH1を得て、上記記載のように培養した7。安定な細胞系CWR22RRXR、LNCaPFGF8を確立して、上記記載のように培養した7、33。4EphB4モノクローナル抗体の発生;EphB4の細胞外領域ECDをpGEX4T1中でクローン化し、GST融合ECDGSTECDを生成した。BL21E.coli中でGST融合蛋白質として発現したEphB4ECDを、アフィニティクロマトグラフィーにより精製し、GST領域をトロンビンにより開裂した。モノクローナル抗体を生成し、抗体の感応性及び特異性を、確実にEphB4でトランスフェクトされた293細胞の全細胞溶解産物を使用してウェスタンブロット法により再確認した。5ワンステップRTPCR及び量的RTPCR;合計RNAをRNASTAT60商標、TelTest、Inc社製、フレンズウッド、TXを使用して前立腺癌標本及び隣接した正常標本から抽出した。量的RTPCR用にファーストストランドcDNAを5μgの合計RNAからSuperScriptIII商標、インビトロジェン社製、カールスバッド、CAを使用して合成した。量的RTPCRをStratageneMX3000Pシステム商標、Stratagene社製、ラホーヤ、CAでSYBRGreenIBrilliantMastermix商標、Stragene社製を使用して製造者の取り扱い説明書に従い行った。EphB4及びβアクチン正常化遺伝子として使用用の最適化反応は、150nMのフォワードプライマーβアクチン、5’GGACCTGACTGACTACCTA3’SEQIDNO24;EphB4、5’AAGGAGACCTTCACCGTCTT3’SEQIDNO25及びリバースプライマーβアクチン5TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT3’SEQIDNO26;EphB4、5’TCGAGTCAGGTTCACAGTCA3’SEQIDNO27それぞれを使用して95°Cで10分間、次に95°Cで30秒、60°Cで1分間、72°Cで1分間のサイクル40回によるポリメラーゼのDNA変性/活性化であった。遺伝子特異的増幅の特異性を、単一解離ピークの存在により確認した。全反応を三個の複製物の試験においてRTでテンプレートなしの陰性コントロールを使用して行った。6免疫組織化学法;OCT包埋した組織を5μmに断片化し、リン酸緩衝4パラホルムアルデヒド中で固定化した。断片を3×5分間PBS中で洗浄し、内因性ペルオキシダーゼを0.3H2O2のPBS溶液中10分間室温でインキュベーションすることによりブロックした。断片をEph4C16抗体1:50と共に1時間室温でインキュベートし、次にPBSで3回洗浄し、ロバ抗ヤギ第二抗体サンタクルスバイオテック社製で1時間室温でインキュベーションした。3回のPBSでの洗浄後、ペルオキシダーゼ活性をDAB基質溶液ベクターラボラトリーズ社製、バーリンガム、CA中10分間室温でインキュベーションすることにより局在化した。断片をヘマトキシリンで20秒間対比染色し、脱水してマウントした。染色用の陰性コントロールは、一次抗体用の正常ヤギ血清の代用であった。前立腺アレイBioMeda社製、フォスターシティ、CAの免疫組織化学染色を、製造者の取り扱い説明書に従いヤギABC染色法システム商標、サンタクルスバイオテック社製を使用して行った。7ウェスタンブロット法;全細胞溶解産物を、特記しない限り、プロテアーゼ阻害剤カクテルPierce社製、ロックフォード、ILを補充した細胞溶解バッファGeneHunter社製、Basgvukke、TNを使用して調製した。合計蛋白質をDC試薬システム商標、BioRad社製、Hercules、CAを使用して決定した。通常、20μg全細胞溶解産物を4~20トリスグリシン勾配ゲル上で測定した。サンプルをPVDF膜へ電子転移させ、非特異的結合を5脱脂乳を含有するTBSTバッファ0.5mMTrisHCl、45mMNaCl、0.05Tween20商標、pH7.4中でブロックした。膜を一次抗体で一晩最初にプローブし、Restoreウェスタンブロットストリッピングバッファ商標、Pierce社製、ロックフォード、ILでストリップし、βアクチンで再プローブして等価ロード及び蛋白質の移動を確認した。シグナルをスーパーシグナルウェストフェムト最大感応性基質商標、Pierce社製を使用して検出した。8リン酸化分析;60mmディッシュ中で成長する細胞を血清飢餓状態1FBS補充したRPMI1640、24時間又は正常条件10FBS中で培養し、次に1μg/mlマウスエフリンB2/Fcの存在又は非存在下で10分間処理してEphB4レセプターを活性化した。清澄化細胞溶解産物をEphB4モノクローナル抗体で一晩4°Cでインキュベートした。抗原抗体複合体を、20mMリン酸ナトリウム、pH7.0中の100μlのプロテインGSepharose、を添加して、一晩4°Cでインキュベーションして免疫沈降させた。免疫沈降物を1:1000希釈したpTyr特異的抗体Upstate社製、クローン4G10を使用したウェスタンブロット法により分析し、次に1:5000希釈したプロテインGHRPBioRad社製でインキュベーションした。免疫沈殿効率を監視するために、複製した膜をEphB4特異的モノクローナル抗体でプローブした。9一時的トランスフェクション及びトランスフェクトされた細胞の分類;PC3細胞をCD4をコードするpMACS4.1及び野生型p53pC53SN3若しくはPTENベクター又は両方を、製造者の取り扱い説明書に従いリポフェクタミン2000商標、インビトロジェン社製を使用して共トランスフェクトした。CD4のp53又はPTEN又はベクターに対するモル比は1:3であり、合計プラスミドは90接触性細胞の10cm2ディッシュ当たり、60μlのリポフェクタミン2000商標を使用して24μgであった。トランスフェクション24時間後、単一細胞懸濁液を作成し、短縮されたCD4MiltenylBiotec社製、ドイツ国を製造者のプロトコルに従い表面マーカーとして使用して分類した。分類された細胞を1×SDSサンプルバッファ中に溶解し、ウェスタンブロット法により分析した。10EphB4の発現におけるIGF及びEGFシグナル経路の研究;PC3細胞を6ウェルプレート中に接種し、80接触するまで培養し、2μg/ml中和IGF1Rモノクローナル抗体、MAB391Haileyら、2002、MolCancerTher113491353、又は1nMAG1478、強いEGFR阻害剤Liuら、1999、JCellSci112Pt1424092417と共に24時間処理した。疎細胞溶解産物をウェスタンブロット法により分析した。バンド密度をBioRad社製QuantityOneシステムソフトウェア商標により定量化した。11細胞生存能力アッセイ;PC3細胞を48ウェルプレート上に密度約1×104細胞/ウェルで合計体積200mlで接種した。培地を細胞が接触した後交換し、細胞を種々の濃度1~10μMのEphB4アンチセンスODN又はコントロールとしてのセンスODNで処理した。培地交換3日後、新しいODNを添加した。更に48時間インキュベーション後、細胞生存能力をMTTにより上記のように評価した36。EphB4siRNA10~100nMを2×104PC3細胞/ウェル、48ウェルプレートで製造者の取り扱い説明書に従い2μlのリポフェクタミン2000商標を使用して導入した。4時間トランスフェクション後、細胞を増殖培地10FBSを補充されたRPMI1640へ戻した。生存能力をMTTでトランスフェクション48時間後にアッセイした。12創傷治癒移動アッセイ;PC3細胞を6ウェルプレート中に接種し、接触するまで培養した。10μMのAS10又はコントロールとしてのセンスODNを、それを無菌性ピペットチップでスクレープすることにより単層を創傷する12時間前に、生存能力アッセイでウェル中へ記載されたように導入した。培地を5FBS補充されたRPMI1640及び新しいODNへ交換した。創傷12時間前に、50nMのsiRNA472又はGAPDH陰性コントロールsiRNAでトランスフェクトした接触性培養物も又試験した。治癒プロセスを動的に試験し、顕微鏡アダプター付きのニコン社製Coolpix5000商標デジタルカメラで記録した。13侵襲アッセイ;PC3細胞をリポフェクタミン2000商標を使用してsiRNA472又はコントロールsiRNAでトランスフェクトし、6時間後、0.5×105細胞を8μmマトリゲル商標プレコートされたインサートBDBiosciences社製、パロアルト、CA中に移動させた。インサートを5FBSを補充されたRPMI及び化学走性誘因物質として5μg/mlフィブロネクチンを含有するコンパニオンウェル中に設置した。22時間インキュベーション後、インサートを除去し、上部表面上の非侵襲細胞も綿棒で除去した。膜の下側表面上の細胞を100メタノール中で15分間固定化して空気乾燥し、ギムザ染色で2分間染色した。細胞を光学顕微鏡によりそれぞれの膜について5個のそれぞれ高性能視野で計測した。アッセイを、それぞれの処理グループの三個の複製物において行った。14細胞周期分析;6ウェルプレート中のPC3細胞の80接触性培養物をsiRNA472100nMで、リポフェクタミン2000商標を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション24時間後、細胞をトリプシン処理し、PBS中で洗浄し、1時間4°Cで、50g/mlプロピジウムアイオダイド、0.1クエン酸ナトリウム、0.1TritonX100商標及び20μg/mlDnaseフリーRnaseAを含有する1mlの低張性溶液中でインキュベートした。細胞をUSCフローサイトメトリー設備で直線状モード中で分析した。結果を細胞周期の異なる期、即ちサブG0ピークアポトーシス、G0/G1DNA合成無し、S活発なDNA合成、G2前有糸分裂及びM有糸分裂中に検出された要素の割合として表した。15アポトーシスELISA;アポトーシスを、製造者の取り扱い説明書に従い細胞死検出ELISAプラスキット商標、Roche社製、ピスカタウェイ、NJを使用して試験した。簡潔には、24ウェルプレート中のPC3の80接触性培養物を、リポフェクタミン2000商標を使用して種々の濃度の0~100nMsiRNA472又は100nMコントロールsiRNAでトランスフェクトした。16時間後、細胞を分離し、1×104細胞を200μl溶解バッファ中でインキュベートした。核を遠心分離によりペレット化し、モノ又はオリゴヌクレオソームを含有する20μlの上澄みをELISA分析のために採取した。簡潔には、上澄みをストレプトアビジン被覆された96ウェルプレート中の抗ヒストンビオチン及び抗DNAPODで2時間室温でインキュベートした。色をABSTで展開し、405nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーMolecularDevices社製、サニーベイル、CAで測定した。実施例4中皮腫中のEphB4の発現:治療のターゲット候補悪性中皮腫MMは、稀な新生物であり、最もしばしば胸膜性及び腹腔性漿液表面から生じる。胸膜腔は、最もしばしば患部となる部位であり>90、次が腹膜である6~10Carboneら、2002、SeminOncol.29:217。これはアスベスト暴露とは強い関連性があり、約80の悪性中皮腫病はアスベストを摂取又は吸入した患者に生じる。この腫瘍は、現在に至るまで従来の治療法ではあまり効き目がなく、これらの患者の予後は非常に不良であるLeeら、2000、CurrOpinPulmMed6:26774。悪性中皮腫の診断及び処理に関するいくつかの臨床性問題は、未だ解決されていない。胸膜又は腹部流体からの中皮腫の診断は非常に困難であり、しばしば胸腔鏡又は腹腔鏡又は開胸バイオプシー並びにこの腫瘍に選択的に発現するmeosthelin等の所定のマーカー用の免疫組織化学染色法を必要とする。現在まで、攻撃的な化学療法養生法及び長期間の放射線治療法であっても介入が治療効果のあるものとは証明されていない。多くのケースで生存平均値は、診断後たったの12~18月である。新規な診断用マーカー及び新しい診断用及び治療用アプローチに使用される標的を特定するために、中皮腫細胞及び臨床性サンプル系中のEphB4及びそのリガンドエフリンB2の発現を評価した。A.EphB4及びエフリンB2は中皮腫細胞系中で発現した;悪性中皮腫細胞系中のエフリンB2及びEphB4の発現を、種々の方法によりRNA及び蛋白質レベルで決定した。RTPCRは全ての4個の細胞系はエフリンB2及びEphB4を発現することを示した図33A。これらの細胞系中の蛋白質発現をウェスタンブロット法により決定した。EphB4の特異的バンドは120kDに見られた。更に、エフリンB2を、ウェスタンブロット法で試験された全細胞系中に37kDバンドとして検出した図33B。エフリンB2の特異的バンドは、陰性コントロールとして試験された293ヒト胎児腎臓細胞中に観察されなかった。中皮腫細胞中のEphB4転写の存在を確認するために、insituハイブリダイゼーションをチャンバースライド上で培養されたNCIH28細胞系に対して実施した。EphB4に対する特異的シグナルをアンチセンスプローブを使用して検出した。エフリンB2転写物も又同じ細胞系中に検出した。EphB4及びエフリンB2両方用のセンスプローブは陰性コントロールとして働き、細胞とハイブリダイズしなかった図34。EphB4及びエフリンB2蛋白質の発現は、免疫蛍光分析により細胞系中に確認された図35。3個の細胞系は強いEphB4の発現を示し、一方エフリンB2の発現はH28及びH2052中に存在し、H2373中では弱く検出可能であった。B.臨床性サンプル中のEphB4及びエフリンB2の発現の証拠;胸膜の悪性中皮腫と診断された患者の胸水から培養された腫瘍細胞を単離し、パッセージ1でEphB4及びエフリンB2の両方について陽性染色を示した図35、最下列。これらの結果は、中皮腫細胞系中でのEphB4及びエフリンB2の共発現を確認する。腫瘍細胞系中で見られるこれらの結果が、病状において発現を真に反映するかどうかを決定するために、腫瘍バイオプシーサンプルをEphB4及びエフリンB2のために免疫組織化学染色した。両方の蛋白質に対する抗体は、腫瘍細胞中で陽性染色を示した。代表的データを図36に示す。C.EphB4は中皮腫の細胞増殖及び移動に関係する;EphB4の細胞増殖中の作用を、EphB4特異的消毒antisepsesオリゴヌクレオチド及びsiRNAを使用して試験した。培養されたH28のEphB4アンチセンスによる処理は、細胞生存能力を減少した。最も有効なEphB4発現阻害剤は、EphB4AS10図37Aであった。EphB4siRNA472のトランスフェクションは、同じ効果を生じた図37B。MMは局部的に進行する病気であり、しばしば拡張し胸壁、心臓及び食道等の隣接する重要器官中へ成長する。このinvitroプロセスを研究する試みにおいて、発明者らは以前に記載した技術を使用して創傷治癒アッセイを実施した3:36。創傷がサブ接触性H28細胞中へ導入された場合に、次の28時間の間、細胞は創傷範囲内へ進行的に移動する。しかし、細胞をEphB4AS10で24時間予備処理してから創傷が導入された場合、この移動は実質的に完全に防止される図38A。ボイデンチャンバー商標アッセイによりEphB4siRNAを使用した移動研究は、EphB4発現の阻害と共に細胞移動が非常に阻害されたことを示した図38B。D.材料及び方法;1細胞系及び試薬;NCIH28、NCIH2052、NCIH2373、MSTO211H中皮腫細胞系及び293ヒト胎児腎臓細胞をATCC社マナサス、VAから得た。細胞を10熱不活性化胎児ウシ血清FBS;LifeTechnologies社製、ゲイザーズバーグ、MD及び抗生物質を補充したRPMI1640培地中に維持した。一次細胞を中皮腫患者の胸水から得た。大量のEphB4ホスホロチオアート改質アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成した。同様に多くのEphB4特異的siRNAを生成した。EphB4に対して生産されたモノクローナル抗体をウェスタンブロット法に使用した。エフリンB2及びEphB4C16に対するポリクローナル抗体免疫組織化学染色法用はサンタクルス社から得た。2RTPCR;合計RNAをランダム六量体インビトロジェン社製を使用して逆転写した。EphB4及びエフリンB2用プライマーをプライマー3ソフトウェアで設計した。全プライマー用配列は下記の通りである:EphB4フォワードプライマー及びEphB4リバースプライマー例えば、実施例2参照;エフリンB2フォワードプライマー及びエフリンB2リバースプライマー例えば、実施例6参照;G3PDHフォワードプライマー、5’GGAGCCAAAAGGGTCATCAT3’SEQIDNO28;G3PDHリバースプライマー、5’GGCATTGCTGCAAAGAAAGAG3’SEQIDNO29;Clonetics商標キットをPCR用に使用した。PCRをABIPCRシステム2700商標、AppliedBioシステム社製を使用して行った。PCR条件は95°C5分間、次に95°Cで30秒間、60°Cで30秒間及び72°Cで1分間のサイクル35回であった。3ジゴキシゲニン標識化RNAプローブ調製;エフリンB2及びEphB4PCR生成物を、製造者の取り扱い説明書に従いpGEMTEasyシステム商標、Promega社製、マジソン、WIを使用してクローン化した。プライマー及びPCR生成物は、5’tccgtgtggaagtactgctg3’SEQIDNO30フォワード、5’tctggtttggcacagttgag3’SEQIDNO31リバースではエフリンB2用に、296bp生成物を生成し、5’ctttggaagagaccctgctg3’SEQIDNO32フォワード、5’agacggtgaaggtctccttg3’SEQIDNO33ではEphB4用に297bp生成物を生成した。DNA塩基配列決定により確実性及びインサート方向を再確認した。ヒトエフリンB2又はEphB4遺伝子のPCR生成物を含有するpGEMTEasyプラスミドをSpeI又はNcoIで直鎖化した。アンチセンス又はセンスジゴキシゲニンDIG標識化RNAプローブを、T7又はSP6プロモーターから、DIGRNAラベリングキット商標、Roche社製、インディアナポリス、INを使用してランオフ転写により転写した。RNAプローブを、DIGRNAラベリングキット取り扱い説明書に従いスポットアッセイにより定量化した。4Insituハイブリダイゼーション;細胞をLabtechII4ウェルチャンバースライド商標、NalgeNuncインターナショナル社製、ナパービル、IL中で培養した。細胞をPBS37°C中で洗浄し、次に30分間25°Cで4w/vホルムアルデヒド、5v/v酢酸及び0.9w/vNaClの溶液中で固定化した。固定化後、スライドをPBSで洗浄し、70エタノール4°C中に使用するまで貯蔵した。insituハイブリダイゼーション前に、細胞を脱水し、100キシレンで洗浄して残っている脂質を除去し、次に再水和し、最後にPBSを加えた。細胞を、37°Cで0.1w/vペプシンの0.1NHCl溶液で20分間インキュベートすることにより透過化し、1ホルムアルデヒド中10分間、後固定化処理をした。プレハイブリダイゼーションを、30分間37°Cで50v/v脱イオン化ホルムアミドを含有する4×SSC溶液中で行った。スライドを一晩42°Cで、25ngアンチセンス又はセンスRNAプローブの40脱イオン化ホルムアミド、10デキストラン硫酸塩硫酸エステル、1×Denhardt溶液、4×SSC、10mMのDTT、1mg/ml酵母tRNA及び1mg/ml変性化及びせん断したサケ精子DNAの合計体積40μlを使用してハイブリッド化した。スライドを次に37°Cで下記の通り洗浄した:2×15分の2×SSC、2×15分の1×SSC、2×15分の0.5×SSC及び2×30分の0.2×SSC。ハイブリダイゼーションシグナルを製造者の取り扱い説明書に従いアルカリホスファターゼ複合抗DIG抗体Roche社製を使用して検出した。着色を0.1MTrisHCl、1mMのEDTA、pH8.0中で10分間2回洗浄して停止した。細胞を核酸のNuclearFastRed商標、ベクターラボラトリーズ社製、バーリンガム、CAを使用した対比染色法により画像化し、スライドをIMMUMOUNT商標、Shandon社製、アストムーア、UKでマウントした。5ウェスタンブロット法;疎細胞溶解産物を細胞溶解バッファ10mMトリス、pH7.5、1mMのEDTA、150mMNaCl、1TritonX100商標、1mMのDTT、10グリセロール中のインキュベーションにより調製した。溶解産物を10000×gで10分間の遠心分離により清澄化した。合計蛋白質をBradfordアッセイ商標、BioRad社製により決定した。サンプル20μg蛋白質を420トリスグリシンポリアクリルアミドゲル上でフラクション分離化し、ポリビニリデンジフルオライドPVDT膜BioRad社製へ電気ブロッティング法により移動させた。膜を、5無脂肪乳でブロックし、次にEphB4に対する抗体1:5000希釈で4°C、16時間のインキュベーションした。ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合している第二抗体1:100000希釈を1時間25°Cで適用した。膜を製造者の取り扱い説明書に従いスーパーシグナルウェストフェムト最大感応性化学発光基質Pierce社製、ロックフォード、ILを使用して展開した。6免疫組織化学法;ホルマリン固定化した組織断片を脱パラフィン化し、10ヤギ血清で70°Cで10分間インキュベートし、更にエフリンB2又はEphB4のいずれかへのウサギ一次抗体サンタクルス、Biotechnologies;1:100で4°C一晩インキュベートした。イソタイプ特異的ウサギIgGをコントロールとして使用した。これらのレセプター用の免疫活性を、アビジンビオチンキットベクターラボラトリーズ社製を使用して測定した。ペルオキシダーゼ活性をジアミノベンジジンシグマ社製細胞化学反応により測定した。スライドを次にHEで対比染色した。7免疫蛍光研究;細胞をLabtechII商標4ウェルチャンバースライド上で培養し、4パラホルムアルデヒドのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水pH7.4PBS溶液中で30分間固定化した。スライドをPBSで2回洗浄し、ブロッキングバッファ0.2TritonX100商標、1BSAのPBS溶液で20分間プレインキュベートした。スライドを次にブロッキングバッファ中EphB4又はエフリンB2への抗体1:100希釈PBS溶液で4°Cで16時間インキュベートした。洗浄3回後、スライドを適切なフルオレセイン複合第二抗体シグマアルドリッチ社製、セントルイス、MOを使用してインキュベートした。核を4’,6ジアミジノ2フェニルインドール塩酸塩DAPIで対比染色し、充分にPBSで洗浄し、Vectasheildantifademounting溶液商標、ベクターラボラトリーズ社製でマウントした。画像をオリンパスAX70蛍光学顕微鏡及びSpotv222商標、DiagnosticInstrumentsInc社製、スターリングハイツ、MIデジタル画像化システムを使用して得た。8細胞生存能力アッセイ;細胞を密度5×103/ウェル48ウェルプレートで0日目に2ウシ胎仔血清FCSを含有する適切な増殖培地中に接種した。翌日、培地を交換し、細胞を種々の濃度1~10μMのEphB4アンチセンスで処理した。第4日目に、生存能力を34,5ジメチルチアゾール2イル2,5ジフェニルテトラゾリウムブロマイドMTTを使用して最終濃度0.5mg/mlで評価した。細胞を2時間インキュベートし、培地を吸引し、細胞を酸性イソプロパノール90イソプロパノール、0.5SDS及び40mMHCl中に溶解した。光学密度はELISAリーダーで490nmで、イソプロパノールMolecularDevices社製、CAをブランクとして使用して測定した。9細胞移動;Invitro創傷治癒アッセイを採用した。簡潔には、細胞を完全培養培地中6cmプレート上に24時間接種し、次に5FBS含有培地へスイッチした。EphB4アンチセンス1010μMも又処理したウェルへ添加した。24時間後、p200ピペットマン商標のチップを使用して創傷を作った。即ち、プレート中央を貫通する線を引いた。プレートを0、12、24時間後に画像化した。実験は3回繰り返した。実施例5EphB4は頭部癌及び頚部癌の扁平上皮細胞癌中で発現した:表皮増殖因子シグナル経路によるレギュレーション及び成長効果頭部癌及び頚部癌の扁平上皮細胞癌HNSCCは、世界で最も頻度の高い第6位の癌であり、毎年900000病例が診断されると見積もられる。それはいくつかの発展途上国では全悪性疾患のほとんど50である。米国では、50000人の新患者及び8000人の死亡が毎年報告されている。タバコ発癌物質は、重要因子としてアルコール消費、年齢、性別及び民族的背景と共にこの病気の主要な病因性要因であると考えられる。上部気管消化管の正常上皮及びその組織から生じる癌細胞間の相違は、特定の遺伝子中の突然変異及びそれらの発現の変更の結果である。これらの遺伝子は、DNA修復、増殖、不死化、アポトーシス、侵襲及び血管形成を調節する。頭部癌及び頚部癌に関して、3個のシグナル経路の変更は充分な頻度で発生し、この病気の決定的な形質変換事由であると考えられる劇的な表現型変化を生じる。これらの変化として、p53腫瘍サプレッサーの突然変異、表皮増殖因子レセプターEGFRの過発現及びサイクリン依存性キナーゼインヒビターp16の不活性化が挙げられる。他の変化として、Rb突然変異、ras活性化、サイクリンD増幅、及びmyc過発現等は、HNSCC中ではより頻度が低い。高いEphB4の発現は血液性悪性疾患、乳癌、子宮内膜癌及び腸癌中で報告されているが、EphB4蛋白質レベルに対しては限られたデータしかなく、HNSCC等のこの蛋白質の腫瘍生物学に対する生物学的有意性データは完全に欠落している。A.HNSCC腫瘍はEphB4を発現する;免疫組織化学法insituハイブリダイゼーション及びウェスタンブロット法によりヒト腫瘍組織中でEphB4の発現を研究した。12個の採取された有望な腫瘍組織を、IRB認定に従って、EphB及びEphAファミリーの他の構成員と反応しない特異的EphB4モノクローナル抗体と評価した。EphB4発現を染色強度を変化させて全ケースで観察する。図39A左上は代表的ケースを示し、HE腫瘍構造で明らかなように、EphB4は腫瘍領域中のみで発現したことを示す図39A左下。ストロマ中のEphB4の着色がないことに注目すべきである。第二に、リンパ節中の転移性腫瘍部位は陽性染色法を示し、一方リンパ節の残りの部分は陰性のままである図39A、右上。Insituハイブリダイゼーションを、腫瘍組織中のEphB4転写物の存在及び位置を決定するために実施した。EphB4特異的アンチセンスプローブに対する強いシグナルは、転写物の存在の表示を検出した図39B、左上。腫瘍構造を示すHE染色図39B、左下との比較は、シグナルが腫瘍細胞に局在化し、間質性領域には存在しないことを示す。エフリンB2転写物も又、EphB4と共に腫瘍サンプル中に検出され、そのシグナルは腫瘍細胞に局在化した図39B、右上。EphB4又はエフリンB2センスプローブのいずれも、断片に対してハイブリッドせず、シグナルの特異性を示した。B.HNSCCの主要な転移性部位での高いEphB4の発現;主要な腫瘍リンパ節転移からの組織及び包含されていない組織のウェスタンブロット法を実施して、これらの部位中のEphB4発現の相対的なレベルを決定した。20症例の腫瘍及び正常な隣接組織を採取し、陽性腫瘍のリンパ節でこれらの20症例中の9例を採取した。代表的症例を図39Cに示す。EphB4発現をそれぞれの腫瘍サンプルで観察した。同様に、全腫瘍陽性リンパ節は主要な腫瘍以上のEphB4発現を示した。正常な隣接組織中には発現は無いか最小で観察された。C.HNSCC細胞系中のEGFR活性によるEphB4発現及びレギュレーション;腫瘍細胞に限定されるEphB4の発現を示した後、次にHNSCC中のEphB4発現のinvitroモデルがあるかどうかの決定を試みた。6個のHNSCC細胞系をEphB4蛋白質発現についてウェスタンブロット法により検討した図40A。これらの大部分は強いEphB4発現を示し、その結果次の研究の基礎を確立した。EGFRは強くHNSCCと関係するために、EphB4発現はEGFRの活性化と関係するかを検討した。EGFR陽性細胞系であるSCC15でのパイロット実験は、最適時間は24時間であり濃度1mMの特異的EGFRキナーゼ阻害剤AG1478図40BがEphB4の発現を阻害することを確認した。全細胞系を試験して、全体で活発なEGFR発現があるが、SCC4では検出可能であるが強くないことをが示された図40C、上段。EGFR阻害剤AG1478への応答において、EphB4合計量の顕著な損失が所定の細胞系SCC15及びSCC25で観察された一方、他では効果は観察されなかったSCC9、12、13及び71。従って、SCC15及び25は、EGFR活性によりレギュレートされるEphB4のモデルとして使用できる一方、SCC9、12、13及び71は、EGFR活性とは関係のないHNSCC中のEphB4のレギュレーションのモデルであり、その場合、p53、PTEN、IL6等の他の因子からインプットされてもよい、又、試験された全ての細胞系中でEphB4のリガンド、即ちエフリンB2の発現を表した。いくつかの系でEphB4と共に、エフリンB2発現はEGFR活性によりレギュレートされる一方、それは他の細胞系とは関係ないことを示した。明らかに、構成的EGFRシグナルの阻害はSCC15細胞中のEphB4レベルを抑制した。次にEGFはEphB4を誘起できるかを試験した。その結果、図41Bに示すようにEphB4レベルは、10ng/mlEGFでの24時間処理の前に24時間血清飢餓状態にされたSCC15細胞中で誘起された列1及び2。図41Aに示されるEGFR活性化用に公知の下流シグナル経路参考としてYardenSlikowski2001参照について、次にEGF仲介されたEphB4の誘導へのそれらのインプットを検討した。特異的キナーゼ抑制剤U73122、SH5及びSP600125での、PLCg、AKT及びJNKリン酸化のブロッキングはそれぞれ基底レベルを減少し、EGF刺激されたEphB4の誘導をブロックした図41B、列3~8。反対に、ERK1/2のPD098095での阻害及びP13KのLY294002又はウォルトマニンでの阻害は、EphB4レベルのEGF誘導に対する検出可能な効果を示さなかった。しかし、ERK1/2リン酸化が阻害された時に、EphB4基底レベルは減少した。興味深いことには、SB203580でのp38MAPK活性の阻害は基底を増加したが、EGFはEphB4レベルを誘起しなかった。類似の結果がSCC25細胞系でも見られたデータは記載しない。D.高発現細胞系中のEphB4の阻害は生存能力を減少させ細胞周期停止を生じる;次に、siRNA又はASODN法を使用して発現除去効果を検討して、HNSCCにおけるEphB4発現作用を研究した。EphB4配列への数個のsiRNAを展開し表1、それは、図42Aで表示したように程度を変化させるEphB4発現をノックダウンした。siRNA50及び472でトランスフェクトされたSCC15、25及び71細胞系で、生存能力は減少し、それはEphB4発現のブロッキングに最も効果的であった図42B。EphB4siRNA1562及び2302又はエフリンB2siRNA254では生存能力への影響はほとんど観察されなかった。EphB4を発現しないSCC4中では参照図40A、細胞生存能力の減少は生じなかった。siRNA50及び472処理で見られた細胞生存能力減少はサブG0での細胞の蓄積のせいであり、アポトーシスを示す。この効果は、時間及び投薬量両方に依存する図42C及び表2。反対に、EphB4レベルを減少するのに効果的でなかく、生存能力にわずかな影響しか示さなかったsiRNA2302は、mockリポフェクタミン2000商標トランスフェクションと比べて細胞周期中の変化を全く生じなかった。表1はEphB4及びsiRNA類を示す。表2は異なるEphB4siRNAの細胞周期に対する効果を示す。更に、ヒトEphB4コーディング配列へ相補的な50を超えるホスホロチオアートASODNを合成し、完全長EphB4発現プラスミドで一時的にトランスフェクトされた293細胞中でそれらのEphB4発現阻害能力を試験した。図43Aは、これらASODNのいくつかのEphB4発現に対する効果の代表的例を示す。AS10で発現は完全に阻止され、AS11はわずかな効果のみを示したことは重要である。SCC15細胞中の細胞生存能力への効果は、図43Bに示されるようにEphB4発現の阻害に最も効果的であるASODNで最も顕著であった。AS10用のIC50は約1μMであった一方、10μMのAS11でさえ生存能力の50減少を達成するためには充分ではなかった。AS10が細胞周期に対して有する効果を検討すると、サブG0フラクションは未処理細胞と比較して1.9から10.5まで増加してアポトーシスを示したことが明らかになった図43C。E.EphB4は細胞移動をレギュレートする;次にEphB4がHNSCCの移動に作用するかを決定しようとした。移動への寄与は、成長及び転移と関係する。移動は、創傷治癒/スクレープアッセイを使用して評価した。接触性SCC15及びSCC25培養物を、無菌性プラスチックパスツールピペットを使用した単回スクレープにより創傷し、境界を明確に定める3mm帯を残した。試験化合物の存在下での細胞の清澄化領域中への移動を、24、48及び72時間後に評価して定量化した。図43Dに示されるように、細胞移動はEphB4発現をブロックするAS10へ応答して顕著に減少した一方、不活性化合物のAS1及びスクランブルされたODNは効果が無いかほとんどなかった。AS10による移動の阻害も又ボイデンダブルチャンバー商標アッセイを使用して示された図43E。F.EphB4AS10のinvivo抗腫瘍活性;細胞生存能力及び運動性を減少するEphB4AS10の効果を、BalbCヌードマウス中のSCC15腫瘍異種移植で決定した。マウスへ毎日20mg/kgAS10、センスODN又は同体積のPBSをI.P.注射する処理を、腫瘍細胞移植の翌日から開始した。AS10を投与されるマウス中の腫瘍の成長は、センスODN又はPBS希釈剤単独のいずれかを投与されるマウスと比較して非常に遅滞した図44。センスODN処理した及びPBS処理したグループ間に相違がないため、ODNを原因とする非特異的効果は観察されなかった。G.材料及び方法;1細胞系及び試薬;HNSCC4、9、12、13、15、25及び71並びに293ヒト胎児腎臓細胞はATCC社マナサス、VAから得られた。細胞を、10熱不活性化胎児ウシ血清FBS;インビトロジェン社製、カールスバッド、CA及び抗生物質を補充したRPMI1640培地中に維持した。EGFR、EphB4C16ポリクローナル抗体はサンタクルスバイオテック社サンタクルス、CAから得た。βアクチンモノクローナル抗体はシグマ化学社セントルイス、MO社から購入した。エフリンB2及びEphB4ポリクローナル抗体及びそれらの対応するブロッキングペプチドはサンタクルスバイオテクノロジー社サンタクルス、CAから得た。AG147843’クロロアニリノ6,7ジメトキシキナゾリンをCalbiochem社サンディエゴ、CAから得た。キナーゼ抑制剤SH5及びSP600125をA.G.サイエンティフィック社サンディエゴ、CAから得た。PD98095、U73122、SB203580、LY294002及びウォルトマニンをシグマ社から得た。2ジゴキシゲニン標識化RNAプローブの調製;例えば、実施例3参照。3insituハイブリダイゼーション例えば、実施例3参照。4免疫組織化学法;ホルマリン固定化した組織断片を脱パラフィン化し、10ヤギ血清で70°C10分間インキュベートし、EphB4モノクローナル抗体で4°C一晩インキュベートした。イソタイプ特異的ウサギIgGをコントロールとして使用した。これらのレセプター用の免疫活性は、ベクターラボラトリーズ社製アビジンビオチンキットを使用して測定した。ペルオキシダーゼ活性はジアミノベンジジンシグマ社製細胞化学反応により測定した。次にスライドを0.12メチレンブルー又はHEで対比染色した。凍結断片用にOCT包埋した組織を5μmに断片化し、リン酸緩衝4パラホルムアルデヒド中に固定化した。断片を3×5分PBS中で洗浄し、内因性ペルオキシダーゼを0.3H2O2のPBS溶液中10分間室温でのインキュベーションによりブロックした。断片をEph4C16抗体1:50で1時間室温でインキュベートし、次にPBSで3回洗浄し、ロバ抗ヤギ第二抗体サンタクルスバイオテック社製で1時間室温でインキュベーションした。PBSでの3回の洗浄後、ペルオキシダーゼ活性をDAB基質溶液ベクターラボラトリーズ社製、バーリンガム、CA中10分間室温でインキュベーションにより局在化した。断片をヘマトキシリンで20秒間、対比染色し、脱水し、マウントした。染色法の陰性コントロールを一次抗体用正常ヤギ血清の代用とした。前立腺アレイBioMeda社製、フォスターシティ、CAの免疫組織化学染色法を、製造者の取り扱い説明書に従いヤギABC染色法システム商標、サンタクルスバイオテック社製を使用して行った。5ウェスタンブロット法;例えば、上記実施例3参照。6EphB4siRNAのinvitro転写による合成;サイレンサーsiRNA構築キット商標、Ambion社製、オースチン、TXをsiRNAをEphB4へ合成するために使用した。簡潔には、19bp下流の5’AAジヌクレオチドを含有する21bpターゲット配列を、GenBankデータベース中の他の配列と明らかな相同性を示さないことを特定した。センス及びアンチセンスsiRNA29マーDNAオリゴヌクレオチドテンプレートを、USCNorrisMicro化学コア設備において合成した。アンチセンステンプレートはターゲット配列へ対応し、次に8bp5’CCTGTCTC3’をサイレンサーsiRNA構築キット商標により提供されたT7プロモータープライマーと相補的な3’末端部位へ添加した。センステンプレートは上記のように、5’AA、次にターゲット19bpの補体、更に次にT78bp配列の補体を含有する。分離反応中、2個のsiRNAオリゴヌクレオチドテンプレートをハイブリッド化してT7プロモータープライマーとした。ハイブリッド化されたオリゴヌクレオチドの3’末端を、DNAポリメラーゼのKlenowフラグメントにより延長して二重鎖siRNA転写テンプレートを形成した。センス及びアンチセンスsiRNAテンプレートをT7RNAポリメラーゼにより転写し、得られたRNA転写物をハイブリッド化してdsRNAを形成した。リーダー配列は、単鎖を有する特異的リボヌクレアーゼによるdsRNAの消化により除去され、オーバーハングUUジヌクレオチドを残した。DNAテンプレートはRNaseフリーデオキシリボヌクレアーゼによる処理と同時に除去された。得られたsiRNAは、ガラス繊維フィルター結合により精製され、反応中の過剰のヌクレオチド、短いオリゴマー、蛋白質及び塩を除去した。最終生成物表3に示す。は、細胞中にトランスフェクトされた場合にターゲットmRNAの発現を効果的に減少できる3’末端ウリジンで二重鎖となった21マーsiRNAであった。多くのホスホロチオアートASODNも又EphB4発現の阻害試験用に合成したオペロン社製、バレンシアCA表3。表3はEphB4アンチセンスODNを示す。7細胞生存能力アッセイ;細胞を、0日目に密度5×103/ウェル48ウェルプレート中の2ウシ胎仔血清FCSを含有する適切な増殖培地中に接種した。細胞を種々の濃度1~10μg/mlのODNで2及び4日目に処理した。5日目に、文献に記載されたようにMasoodら、03、34,5ジメチルチアゾール2イル2,5ジフェニルテトラゾリウムブロマイドMTTを使用して、生存能力を評価した。siRNAとの生存能力では、SCC4、15、25又は71の2×104細胞/ウェル48ウェルプレート中が、製造者の取り扱い説明書に従い2μlのリポフェクタミン2000商標を使用してsiRNA10~100nMと共にトランスフェクトされた。4時間トランスフェクション後、細胞を増殖培地10FBSを補充されたRPMI1640へ戻した。トランスフェクション後、MTT48時間により生存能力をアッセイした。8細胞周期分析;SCC15細胞の80接触性培養物6ウェルプレート中を、リポフェクタミン2000商標を使用してsiRNA472100nMとトランスフェクトした。トランスフェクションの16又は36時間後、細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、1時間4°Cで、50μg/mlプロピジウムアイオダイド、0.1クエン酸ナトリウム、0.1TritonX100商標及び20μg/mlDNaseフリーRNaseAを含有する1mlの低張性溶液中でインキュベートした。細胞をUSCフローサイトメトリー設備で直線状モードで分析した。結果を、異なる期の細胞周期、即ちサブG0ピークアポトーシス、G0/G1DNA合成無し、S活発なDNA合成、G2前有糸分裂及びM有糸分裂、中で検出した要素の割合として表した。ASODN実験として、細胞をプロセシング36時間前に5μMODNへ曝した。9創傷治癒移動アッセイ;SCC15細胞を6ウェルプレート中に接種し、接触するまで培養した。10μMのAS1、AS10又はコントロールとしてのセンスODNを、それを無菌性ピペットチップでスクレープすることにより単層を創傷して、記載されたような12時間生存能力アッセイでウェル中へ導入した。培地を5FBS及び新しいODNを補充されたRPMI1640へ交換した。治癒プロセスを動的に試験し、顕微鏡アダプター付きのニコン社製Coolpix5000商標デジタルカメラで記録した。10移動のボイデンチャンバー商標アッセイ;細胞移動アッセイを、1μMのAS10又はAS6を上室チャンバーへ加えた以外は文献MasoodANUPpaper‘99に記載されたように行った。EGF20ng/mlを下室チャンバー中の化学走性誘因物質として使用した。10ng/mlのタキソールを陰性コントロールとして使用した。11Invivo研究;SCC155×106細胞を5週齢オスBalbCNu/nuA胸腺欠損マウスの背中下部へ皮下注射した。ODN合計体積100μl中20mg/kg又は希釈剤PBSを毎日腹腔内注射することからなる処理を、腫瘍細胞移植の翌日から開始し、2週間続けた。マウス中の腫瘍増殖を、文献に記載されたようにMasoodCCR’01測定した。実験終結時にマウスを犠牲にした。全マウスは実験用マウス管理用の南カリフォルニア大学動物管理使用協会ガイドラインに従い取り扱った。実施例6カポジ肉腫中でのエフリンB2発現はヒトヘルペスウィルスタイプ8により誘起される:静脈性から動脈性内皮へのフェノタイプ変換カポジ肉腫KSは多病巣性血管増殖性病として、最も通常は皮膚及び粘膜に現れ、次に内蔵器官への拡大する1。この病気の典型的特徴は、血管形成、水腫、リンパ単球核細胞の湿潤及び紡錘体腫瘍細胞の成長である。病理学上の、確立された障害は、スリット状空間の高密度の血管網を示す。KS血管網は、その基底膜の欠損及びこれらの脈管内部を覆う異常な紡錘体内皮細胞腫瘍細胞により正常な脈管からは明らかに区別できる。不良な脈管構造は、障害中のアルブミン、赤血球及び単核細胞を含む血液成分の蓄積を生じる1。KS腫瘍は内皮性起源であり;腫瘍細胞は多くの内皮性マーカーを発現し、マーカーとして例えば、Ulexeuropeaus凝集素1UEA1用レクチン結合部位、CD34、EN4、PALE2、及び内皮細胞特異的チロシンキナーゼレセプター、VEGFR1Flt1、VEGFR2Flk1/KDR、VEGFR3Flt4、Tie1及びTie23、RMPSG未公開データが挙げられる。KS細胞はLYVE及びポドプラニン等のリンパ性内皮細胞関係蛋白質と共発現する4。ヘルペスウィルスHHV8はこの病気の病因性要因であると考えられている。この新しいヘルペスウィルス中の1994配列がKS腫瘍組織中で特定され5、それに続き分子疫学研究によりほとんど全KS腫瘍がウィルス性ゲノムを含有することが示された。血清疫学研究は、KSでHIV感染した患者は最高のHHV8有病率を有すること、及び第二にHIV感染しているがKSに罹患していない患者は、同様にHHV8血清陽性である場合、それ以降の数年にわたりKS発生のリスクが増加することを示した6。HHV8のKSへの作用の直接的証拠は、HHV8感染後の骨髄内皮細胞の形質転換改質である7。多くのHHV8エンコードする遺伝子は、細胞性形質転換改質をもたらす8参照。しかし、最大の証拠は、この役割におけるGプロテイン結合レセプターvGPCRについて蓄積された9。KS腫瘍細胞は動脈性又は静脈性内皮由来かを検討した。更に、HHV8はKSモデル中で動脈性又は静脈性マーカーの発現に対して効果を有するかを検討した。KS腫瘍細胞は、エフリンB2動脈性マーカーを発現することが発見された。更に、エフリンB2発現は、KS及び内皮細胞系中のHHV8vGPCRにより誘起された。エフリンB2は、エフリンB2発現又はシグナルの阻害は、KS細胞の生存能力及び機能に有害であるため、KS処理用の可能なターゲットである。A.KS腫瘍は、EphB4ではなくエフリンB2を発現する;KS障害の非常な血管関連性及び腫瘍細胞の可能性のある内皮細胞起源は、それぞれ静脈性及び動脈性内皮細胞のマーカーである、EphB4及びエフリンB2の発現の検討に寄与した。EphB4転写物ではなくエフリンB2は、KSバイオプシーの腫瘍細胞中にinsituハイブリダイゼーションにより検出された図45A。エフリンB2アンチセンスプローブ及びHE染色で示される腫瘍細胞との陽性シグナルの比較は、エフリンB2発現は腫瘍細胞を含有するバイオプシーの面積に限られていることを示す。EphB4アンチセンスプローブでのKS中のシグナルの欠如は、プローブの欠陥のせいではなく、この蛋白質を発現することが示されてた扁平上皮細胞癌中の転写物を検出したせいである18。KS腫瘍組織中のエフリンB2の発現の追加的証拠は、FITC複合抗ヒトFc抗体により検出された、EphB4/Fcシグナルの腫瘍細胞への局在化により与えられる。エフリンB2はEphB4用のたった一つのリガンドであるために、この試薬はエフリンB2の発現に特異的である図45B、左。第二試薬のみで処理した隣接する断片は、特異的シグナルを示さない。二色共焦点顕微鏡は、エフリンB2陽性細胞中にHHV8潜伏蛋白質LANA1の存在を表し図45C、左、それは腫瘍細胞であり、腫瘍脈管ではなくこの動脈性マーカーを発現していることを示した。腫瘍バイオプシーのPECAM1抗体での染色は、この腫瘍の高度な血管的性質を明らかにした図45C、右。KSバイオプシーに対するエフリンB2及びEphB4発現パターンの有病率のパイロット研究はRTPCR分析により行った。6例のサンプル全部がエフリンB2に陽性であった一方、ただ2例がEphB4に弱陽性であったデータは記載しない。B.静脈性内皮細胞のHHV8での感染は動脈性マーカーへのフェノタイプ変換を生じる;次にKSの病因性要因と思われるHHV8は、それ自身で内皮細胞中でのエフリンB2の発現を誘起しEphB4発現を抑制できるかを検討した。HUVEC及びHHV8と有効感染させたBC1リンパ腫細胞の共培養は、内皮細胞の効果的感染を生じた16。充分な洗浄後に残っている内皮細胞の付着単層を、エフリンB2及びEphB4についてRTPCR及び免疫蛍光により試験した。HUVECは、EphB4静脈性マーカーをRNAレベルで強く発現したが、エフリンB2は発現しなかった図46B。反対に、HHV8感染させた培養物HUVEC/BC1及びHUVEC/BC3はエフリンB2を発現する一方、EphB4転写物はほとんど見られなかった。HUVEC及びHUVEC/HHV8の培養物の、動脈/静脈マーカー及びウィルス性蛋白質についての免疫蛍光分析を、RNA中に見られるものを反映する蛋白質発現中に変化があるかを決定するために行った。更に、蛋白質の細胞性局在化も決定できた。RTPCRデータに適合するように、HUVECはエフリンB2陰性及びEphB4陽性であった図46Aam。予測されるように、それらは核抗原LANA1と関連するHHV8潜伏を全く発現しなかった図46Ab、n。HHV8で有効に感染させたBC1細胞の共培養は、ウィルス性蛋白質LANA1及びORF59の存在で示されるようにHUVECの感染を生じた図46Af、r。HHV8感染させたHUVECは、今やエフリンB2を発現するがEphB4を発現しない図46Aそれぞれe、q、u。エフリンB2及びLANA1共クラスターの発現は、併合画像中に黄色シグナルで示される図46Ah。エフリンB2陽性でEphB4陰性のHHV8感染させたHUVECは、同様に動脈性マーカーCD148を発現する19図46Aj、v。エフリンB2及びCD148共クラスターの発現は、併合画像中に黄色シグナルで示される図46Al。未感染の、EphB4発現HUVECはCD148に陰性であった記載せず。C.HHV8vGPCRはエフリンB2発現を誘起する;個々のウィルス性蛋白質は全体のウィルスで観察されるエフリンB2の発現を誘起できるかを試験するために、KSSLK細胞をHHV8LANA、又はLANA△440又はvGPCRで確実にトランスフェクトした。安定なクローンのウェスタンブロット法で、vGPCRでトランスフェクトされたKSSLK中では、SLKLANA又はSLKLANA△440と比較してエフリンB2が5倍誘導されることが明らかになった図47A。ベクター単独pCEFLでトランスフェクトされたSLKを、コントロールとして使用した。SLKvGPCR及びSLKpCEFL細胞も又、一時的にトランスフェクトされたKSSLK細胞中で、エフリンB2及びEphB4発現を免疫蛍光により試験した。図47Bは、SLKpCEFLと比較してSLKvGPCR細胞中でより高いエフリンB2発現を示す。SLKpCEFLと比較してSLKvGPCR中ではEphB4について変化は観察されなかった。これは明らかにSLKvGPCR細胞はSLKpCEFL細胞と比較して高レベルのエフリンB2を発現したことを示す。これは、HHV8のvGPCRは、KS中でエフリンB2の誘導及び動脈性フェノタイプ変換に直接含まれることを示唆する。HHV8はHUVEC中のエフリンB2の発現を誘起することは上記に示されているので、次にこれは、転写的効果により仲介されるかどうかを試験した。エフリンB25’フランキングDNAルシフェラーゼレポータープラスミドは、下記材料及び方法欄に示されるように構成され、HUVEC中に一時的にトランスフェクトされた。エフリンB25’フランキングDNA配列2491/11は、HUVEC細胞中で最小活性を有する図47C。これは、エフリンB2は動脈性であり静脈性マーカーではないことに適合する。しかし、培養物中のHUVECはいくつかのエフリンB2をRNAレベルで発現することが示された。HHV8vGPCRの共トランスフェクションは、コントロール発現ベクターpCEFLと比較してエフリンB2転写を約10倍誘起する。だいたい同等な誘導がエフリンB2配列2491/11、1242/11、又は577/11で観察され、それは、最大活性は1242/11ルシフェラーゼ構築物で観察されるにもかかわらず、577及び11間の要素がvGPCRへの応答を媒介するのに充分であることを表す。D.エフリンB2の発現はVEGF及びVEGFCによりレギュレートされる;次に公知のKS増殖因子はエフリンB2発現のvGPCR仲介された誘導中に含まれるかを検討した。SLKvGPCR細胞をオンコスタチンM、IL6、IL8、VEGF又はVEGFCの中和抗体で36時間処理した。図48Aは、VEGFの中和は、SLKvGPCR細胞中でエフリンB2の発現を完全にブロックしたことを示す。より少ないが、非常なエフリンB2の減少も、VEGFC及びIL8の中和で観察された。オンコスタチンM又はIL6の中和で測定可能な効果は観察されなかった。VEGF及びVEGFCはエフリンB2発現の誘導に必須であることを確認するために、HUVECをVEGF、VEGFC又はEGFで処理した。HUVECは、2種の異なる濃度の個々の増殖因子10ng、100ng/mlを有する5FBSを含有するEBM2培地中で48時間増殖した。VEGFA又はVEGFCのみが投薬量依存性挙動でエフリンB2発現を誘起した図48B。反対に、EGFはエフリンB2の発現に効果がなかった。E.エフリンB2siRNAはKS中のエフリンB2発現を抑制する;3個のエフリンB2siRNAを方法段落記載のように合成した。KSSLK細胞をsiRNAでトランスフェクトして48時間後、エフリンB2発現をウェスタンブロット法により決定した。エフリンB2siRNA137又は254は、siRNAEphB450又はsiRNAGFP等のコントロールsiRNAと比較して、エフリンB2発現を約70阻害した。エフリンB263siRNAは、上記2種のsiRNAエフリンB2よりも効果が低かった図49A。F.エフリンB2は完全KS及びEC生存能力、コード形成及びinvivo血管形成活性に必要である;最も効果的エフリンB2siRNA254を、次にエフリンB2の発現阻害がKSSLK又はHUVEC細胞の成長に効果を及ぼすかを決定するために使用した。KSSLK細胞の生存能力は、エフリンB2蛋白質レベルを阻害するのと同じsiRNAにより減少した図49B。KSSLKは高レベルのエフリンB2を発現し、その結果、エフリンB2発現の維持はこの設定では細胞生存能力に必須であることが示された。図48Bに示されるように、HUVECはVEGFにより刺激された場合以外はエフリンB2を発現しない。エフリンB2siRNA264は、単独の増殖因子としてVEGFと共に培養されたHUVECの成長を劇的に減少した。反対に、HUVECをIGF、EGF及びbFGFと共に培養した場合は、顕著な効果を示さなかった。コントロールとしてEphB4siRNA50は、どちらの培養条件下でもHUVECへ有害な効果を示さなかった図49C。KS及び主要な内皮細胞の生存能力の阻害に加えて、EphB4ECDはHUVEC及びKSSLK中のコード形成及びマトリゲルプラグ商標アッセイ中のinvivo血管形成を抑制する図50。G.方法及び材料;1細胞系及び試薬ヒト血管内皮細胞HUVECをClonetic社サンディエゴ、CAから入手し、EGM2及びEGM2MV培地中でそれぞれ維持した。T1ヒト繊維芽細胞系は、PeterJones博士から提供され、USC.BC1及びBC3ヒト胸水リンパ腫細胞系及び、LANA1及びORF59に対するモノクローナル抗体はDharamAblashi博士AdvancedBiotechnologiesInc社、コロンビア、MDから贈与された。KSSLKを典型的カポジ肉腫患者から単離した15。EphB4、エフリンB2、CD148、PECAM1に対するポリクローナル抗体をサンタクルスバイオテクノロジー社サンタクルス、CAから得た。マウスEphB4/Fc’並びに、ヒト血管の内皮性増殖因子VEGFに対するモノクローナル抗体、VEGFC、インターロイキンIL6、IL8及びオンコスタチンMはRDシステムズ社ミネアポリス、MNから購入した。発現ベクターpKSvGPCRCEFL及びpCEFLはEnriqueMesri博士コーネル大学、ニューヨーク、NYから贈与された。HHV8潜伏関連核抗原LANA用発現ベクターはMatthewRettig博士Veteran’sAdministrationGreaterLosAngelesHealthcareSystem社から提供された。2ヒト組織の採取及び調製;ヒト皮膚性カポジ肉腫バイオプシー材料を、IRB承認承諾書を使用したインフォームドコンセントを行ってLAC/USC医療センターの患者から局部的麻酔下で得た。バイオプシーを合計RNAパラフィンブロック又はOCT中の冷凍組織ブロックのいずれかに処理した。合計RNAをグアニジンイソチオシアナートRNAzol商標:TelTest、Inc社、フレンズウッド、TX中の均一化により抽出した。cDNAを、逆転写酵素によりランダム6量体プライマーSuperscriptII、商標、インビトロジェン社製、カールスバッド、CAを使用して合成した。3ジゴキシゲニン標識化RNAプローブの調製;表4に示されたinsituハイブリダイゼーション用プライマーからのエフリンB2及びEphB4PCR生成物を、製造者の取り扱い説明書に従いpGEMTEasyシステム商標、Promega社製、マジソン、WIを使用してクローン化した。確実性及びインサート方向をDNA塩基配列決定により再確認した。ヒトエフリンB2又はEphB4遺伝子のPCR生成物を含有するpGEMTEasyプラスミドをSpeI又はNcoIで直鎖化した。アンチセンス又はセンスジゴキシゲニンDIG標識化RNAプローブを、T7又はSP6プロモーターから、DIGRNAラベリングキット商標、Roche社製、インディアナポリス、INを使用してランオフ転写により転写した。RNAプローブを、DIGRNAラベリングキット取り扱い説明書に従いスポットアッセイにより定量化した。表4はエフリンB2及びEphB4用のプライマーを示す。4insituハイブリダイゼーション;例えば、上記実施例3参照。5HUVEC及びBC1の共培養;HUVEC細胞をゼラチン被覆されたLabtechII4ウェルチャンバースライド商標、NalgeNuncインターナショナル社、ナパービル、IL上でEGM2と50~70接触まで増殖した。BC1又はBC3との共培養は、本質的にSakuradaら16により示されたように行った。簡潔には、BC1又はBC3細胞をTPA20ng/mlで予備処理し、48時間ウィルス誘起し、次にHUVEC培養物へ10:1の割合で添加し、共培養を2日間行った。HUVECを充分にPBSで洗浄して付着したBC1又はBC3細胞を除去した。6cDNA及びRTPCRの調製;チタニウムワンステップRTPCRキット商標、Clontech社、パロアルト、CAを1×105細胞からRTPCR用に使用した。EphB4増幅用のプライマー対、エフリンB2及びβアクチンを表4に示す。それぞれのPCRサイクルは、94°Cで30秒間の変性、60°Cで30秒間のプライマーアニール及び72°Cで30秒間の延長化extensionから構成される。サンプルを30サイクル間増幅した。PCR生成物を1.5アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した。7細胞生存能力アッセイ;KSSLK細胞を密度1×104/ウェル48ウェルプレートで0日目に2ウシ胎仔血清FCSを含有する適切な増殖培地中に接種した。翌日、培地を交換し、細胞を0、10又は100nMsiRNAで処理した。3日目に、生存能力を34,5ジメチルチアゾール2イル2,5ジフェニルテトラゾリウムブロマイドMTTを使用して文献に記載されたように評価した17。8免疫蛍光研究;LabtechII4ウェルチャンバースライド上で培養した細胞又は、KSバイオプシー材料の凍結断片を、4パラホルムアルデヒドのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水pH7.4PBS溶液中で30分間固定化した。スライドを2回PBSで洗浄し、ブロッキングバッファ0.2TritonX100、1BSAのPBS溶液で20分間プレインキュベートし、次にEphB4、エフリンB2、CD148、LANA1又はORF591:100希釈のPBS溶液に対する抗体で、ブロッキングバッファ中、4°Cで16時間インキュベーションした。洗浄3回後、スライドを適切なフルオレセイン又はローダミン複合第二抗体商標、シグマアルドリッチ社製、セントルイス、MOでインキュベートした。核を4’,6ジアミジノ2フェニルインドール塩酸塩DAPIで対比染色し、充分にPBSで洗浄してVectasheildantifademounting溶液商標、ベクターラボラトリーズ社製、バーリンガム、CAでマウントした。画像をオリンパス社製AX70蛍光学顕微鏡及びSpotv222商標、DiagnosticInstruments社、スターリングハイツ、MIデジタル画像化システムを使用して得た。エフリンB2のEphB4Fcでの免疫蛍光検出を下記の通り行った。4パラホルムアルデヒド中で固定化し、20FBSでブロックした凍結断片を、5μg/mlのEphB4/FcRDシステムズ社製で1時間室温でインキュベートした。次に断片を、10μg/mlウサギ抗ヒトIgGFITCのPBS溶液JacksonImmunoResearchラボラトリーズ社製、ウェストグローブ、PAで室温で1時間インキュベートした。核をDAPIで対比染色し、断片を上記のようにマウントした。ヒトFcJacksonImmunoResearch社製を陰性コントロールとして使用した。9ウェスタンブロット法;上記のように、疎細胞溶解産物を調製し、定量化し、フラクション分離化して膜へ移した17。膜を5無脂肪乳でブロックした後に、エフリンB2に対する抗体と1:5000希釈4°Cで16時間インキュベーションした。ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合している第二抗体1:100000希釈を、1時間25°Cで適用した。膜を製造者の取り扱い説明書に従いスーパーシグナルウェストフェムト最大感応性化学発光基質商標、Pierce社製、ロックフォード、ILを使用して展開した。膜をRestoreウェスタンブロット法ストリッピングバッファ商標、Pierce社製を使用してストリップし、EphB4又はβアクチンで再プローブした。10コード形成アッセイ;マトリゲル基底膜マトリックス商標、BDBiosciences社製、DiscoveryLabware、ベッドフォード、MAを氷上の増殖培地3:1及び24ウェルプレート中に配置した0.5ml液体と混合した。プレートを37°Cで15分間インキュベーションしてマトリゲル商標を重合させた。指数関数的成長をするHUVEC又はKSSLKを、2又は8μg/mlのEphB4ECD又はコントロールとしてのPBSで16時間処理し、その後トリプシン処理してマトリゲル商標上にプレートした。マトリゲル商標上の培養を、組み換え型融合蛋白質の存在下で6時間続けた。培養物を4パラホルムアルデヒド中で30分間固定化し、倒立型位相差光学顕微鏡により評価した。11エフリンB2及びEphB4siRNAのinvitro転写による合成;サイレンサーsiRNA構築キット商標、Ambion社、オースチン、TXを使用してエフリンB2及びEphB4へのsiRNAを合成した。簡潔には、19bp下流の5’AAジヌクレオチドを含む3個の21bpターゲット配列が、エフリンB2cDNA登録番号NM004093内で特定され、それはGenBankデータベース中の他の配列と顕著な相同性を示さなかった。センス及びアンチセンスsiRNA29マーDNAオリゴヌクレオチドテンプレートは、USCNorrisMicro化学コア設備で合成された。アンチセンステンプレートはターゲット配列に対応し、その次に、サイレンサーsiRNA構築キット商標として提供されるT7プロモータープライマーと相補的な、3’末端部位の8bp添加物5’CCTGTCTC3’が続く。センステンプレートは、上記のように5’AA、次にターゲット19bpの補体、次にT78bp配列を含む。分離反応において、2個のsiRNAオリゴヌクレオチドテンプレートを、T7プロモータープライマーに対してハイブリッド化した。ハイブリッド化されたオリゴヌクレオチドの3’末端をDNAポリメラーゼのKlenowフラグメントにより延長し、二重鎖siRNA転写テンプレートを生成した。センス及びアンチセンスsiRNAテンプレートをT7RNAポリメラーゼにより転写し、得られたRNA転写物をハイブリッド化してdsRNAを生成した。dsRNAは、5’末端単鎖リーダー配列、19ntターゲット特異性dsRNA、及び3’末端UUから構成される。リーダー配列は、dsRNAを単鎖特異的リボヌクレアーゼで消化して除去された。DNAテンプレートは、同時にRNAseフリーデオキシリボヌクレアーゼでの処理により除去された。得られたsiRNAは、ガラス繊維フィルター結合により精製され、反応中の過剰のヌクレオチド、短いオリゴマー、蛋白質及び塩を除去した。最終生成物二重鎖21マーsiRNAを表5に示す。同様に、EphB4及び緑蛍光蛋白質GFPsiRNAも合成した。表5は、エフリンB2及びEphB4のsiRNAを示す。12エフリンB2又はEphB4siRNAのトランスフェクション;HUVECをフィブロネクチンで被覆された8ウェルチャンバースライド上に接種し、EGM2商標、Cambrex社、ウォーカースビル、MD中で一晩増殖した。16時間後、培地を5ウシ胎仔血清FCS並びに製造者により提供された濃度のEGM2Bulletキット商標補充剤bFGF、hEGF及びR3IGFIを補充されたEBM2、又は5FCS及び10ng/mlrhVEGF商標、RDシステムズ社製を補充されたEBM2のいずれかで交換した。37°Cでインキュベーション2時間後、細胞をリポフェクタミン2000商標、インビトロジェン社製、1μg/mlを使用して10nMの特異的siRNA含有OptiMEM1血清フリー培地商標、インビトロジェン社製中でトランスフェクトした。2時間OptiMEM1でトランスフェクション後、上記のように補充した培地を適切なウェル中で交換した。48時間後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、直ちに10×倍率で画像を撮った。13エフリンB2レポータープラスミドの構築;ヒトエフリンB25’フランキングDNAの翻訳開始部位に関して2491~11を、BACPACクローンRP1129716商標、BacPacResources小児病院、オークランド、CAから、アドバンテージGCゲノムPCRキット商標、Clontech社、パロアルト、CAを使用して、ターゲット面積中のCGリッチ配列の広い領域を覆うように増幅した。プライマーをクローニング用MluI部位を含有する様に設計した。増幅した生成物をMluIで消化し、ゲル精製し、pGL3Basic商標、Promega社製、マジソン、WI中の複数のクローニング部位中のMluI部位中へライゲートした。得られたクローンの方向は、制限消化分析により確認した。正確なクローンはpEFNB2249111lucを表示した。このクローンのKpnI又はSacIいずれかとの消化、その次の再環化は、それぞれpEFNB2124211luc及びpEFNB257711lucを生じた。一時的トランスフェクションに使用されるプラスミドDNAは、MegaPrepキット商標、QIAGEN社製、バレンシア、CAを使用して精製した。14一時的トランスフェクション;EGM2培地中に維持されたHUVEC細胞0.8×104細胞/ウェル、24ウェルプレート中は、0.5μg/ウェルエフリンB2プロモータールシフェラーゼ構築物と、50ng/ウェルのpCEFL又はpKSvGPCRCEFLのいずれかと一緒に、製造者の取り扱い説明書に従いSuperfect試薬商標、QIAGEN社製を使用して一時的に共トランスフェクトされた。細胞をトランスフェクション48時間後に採取し、ルシフェラーゼ細胞溶解バッファPromega社製で溶解した。ルシフェラーゼ活性を製造者の取り扱い説明書に従いルシフェラーゼアッセイシステムPromega社製を使用してアッセイした。pCEFLvGPCRがpCMVSportβgal商標、インビトロジェン社製からβガラクトシダーゼ発現を誘起したために、ルシフェラーゼを蛋白質に対して正規化した。15EphB4細胞外領域ECD蛋白質の構築及び精製;上記例えば実施例1参照。実施例7膀胱癌中のEphB4の発現:本発明の治療法の候補ターゲット図51は膀胱癌細胞系中でのEphB4の発現A及びEGFRシグナル経路によるEphB4発現のレギュレーションBを示す。図52は、p53のトランスフェクションは5637細胞中のEphB4の発現を阻害することを示す。図53はEphB4siRNA472での処理による膀胱癌細胞系5637の増殖阻害を示す。図54はEphB4siRNA472でトランスフェクトされた5637細胞のアポトーシス研究の結果を示す。図55はEphB4アンチセンスプローブの細胞移動に対する効果を示す。5637細胞は、EphB4AS1010μMで処理された。図56は、EphB4siRNAの細胞侵襲に対する効果を示す。5637細胞はsiRNA472又はコントロールsiRNAでトランスフェクトされた。実施例8EphB4アンチセンスプローブ及びRNAiプローブによるEphB4遺伝子発現の阻害EphB4を発現する細胞系を合成ホスホロチオアート改質オリゴヌクレオチドで処理し、24時間後に採取した。細胞溶解産物を調製し、ウェスタンブロット法分析により、EphB4の相対的量を未処理のコントロール細胞と比較してプローブした。細胞増殖の阻害に関する研究は、発現EphB4発現を特徴とするHNSCC細胞系中で行った。細胞生存能力の損失は、EphB4発現のノックダウンにより示された。細胞はinvitro処理され、48ウェルプレート中で培養され、10000細胞/ウェルで接種された。試験化合物を添加し、細胞生存能力を3日目に試験した。EphB4アンチセンスプローブに対する結果を下記表6にまとめた。EphB4RNAiプローブに対する結果を下記表7にまとめた。表6はEphB4アンチセンスプローブによるEphB4遺伝子発現の阻害を示す。表7はEphB4RNAiプローブによるEphB4遺伝子発現の阻害を示す。実施例9エフリンB2アンチセンスプローブ及びRNAiプローブによるエフリンB2の遺伝子発現阻害KSSLK;内因性高レベルのエフリンB2を発現する細胞系。細胞生存能力を、一定の投薬量のそれぞれのオリゴヌクレオチド5UMを使用して試験した。遺伝子発現ダウンレギュレーションを、完全長エフリンB2を安定して発現するように設計された細胞系293を使用して行った。エフリンB2を発現するKSSLKも又一定の投薬量50nMで試験されたRNAiプローブへの応答である生存能力を試験するために使用した。蛋白質発現レベルを完全長エフリンB2を安定して発現する293細胞を使用して、一定のfixed50nMのRNAiプローブで24時間処理後の細胞溶解産物中で測定した。エフリンB2アンチセンスプローブについての結果は、下記表8にまとめた。エフリンB2RNAiプローブについての結果は、下記表9にまとめた。表8は、エフリンB2アンチセンスODNを示す。表9は、エフリンB2RNAiプローブを示す。実施例10EphB4抗体は腫瘍増殖を阻害する。図57は、G250及びプルダウンアッセイによるEphB4モノクローナル抗体の比較結果を示す。図58は、EphB4抗体はマトリゲル及び増殖因子の存在下でSCC15細胞のinvivo腫瘍増殖を阻害することを示す。BaIbCヌードマウスへ2.5×106の生存腫瘍細胞SCC15を皮下注射した。SCC15は、頭部及び頚部扁平上皮細胞癌系である。腫瘍は、nunuマウス中に、マトリゲル及び増殖因子並びにAb’と予備混合した2.5~5×106細胞を皮下注射して開始され、腫瘍異種移植が開始された。マウスを注射14日後に解剖した。SCC15は頭部及び頚部扁平上皮細胞癌系であり、B16は黒色腫細胞系であり、MCF7は乳癌系である。これらの処理に対する腫瘍の応答を、PBS注射を受けたコントロール処理マウスと比較した。動物の腫瘍増殖を毎日観察し、皮下腫瘍をカリパスを使用して毎2日に測定した。抗体番号1及び23は、コントロールと比較して、特に追加的増殖因子添加なしのコントロールではSCC15腫瘍サイズの顕著な退縮を示した。図59は、EphB4抗体は、SCC15頭部癌及び頚部癌腫瘍種の、アポトーシス、壊死及び血管形成減少を引き起こすことを示す。血管形成をCD31免疫組織化学法により評価した。処理及び未処理のマウスからの腫瘍組織断片をCD31用に染色した。アポトーシスを免疫組織化学TUNNEL法により評価し、BrdUアッセイにより増殖した。外科的除去に続き、腫瘍を標準手順に従い直ちに2mm連続断片へスライスし、パラフィン中に包埋した。パラフィン包埋した組織を5μmへ断片化し、ワックスを除去し、組織を再水和した。再水和した組織に、抗原賦活retreival液中でマイクロ波を照射した。スライドをPBSで洗浄し、TUNNEL法反応混合物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びフルオレセイン標識化ヌクレオチド溶液及びBrdUを完全に光を遮断した湿性チャンバー中に加えた。次にTUNNEL及びBrdU反応混合物を除去し、スライドを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合している抗フルオレセイン抗体を添加した。インキュベーション及び洗浄後、3,3’ジアミノベンジジンを添加した。マッソン社製トリクローム商標及びヘマトキシリン及びエオシンも又スライドを染色して形態を画像化するために使用した。マッソン社製トリクローム商標は、壊死及び線維症の画像化を可能とした。腫瘍は腫瘍/皮膚、筋肉境界から血液サポートを得た。腫瘍が成長するに従い、内側領域は栄養が欠乏した。これは壊死細胞死を、好ましくは腫瘍中央で導く。細胞死後、腫瘍組織は、繊維芽細胞組織で置換される。スライドを、得られたデジタル画像を20倍拡大して画像化した。SCC腫瘍の、投与された抗体それぞれで異なる形態が得られた。Ab番号1は、アポトーシスではなく壊死及び線維症の増加部分を示した。Ab番号23は、アポトーシス、壊死及び線維症の増加及び脈管湿潤物の減少を示した。Ab番号35は、壊死及び線維症の増加、並びにアポトーシスのわずかな増加並びに脈管湿潤物の減少を示した。Ab番号79はアポトーシス、ネクローシス及び線維症の大きな増加を示した。Ab番号91は、アポトーシスに変化は無く、増殖の増加を示した。Ab番号138は、アポトーシス、壊死、線維症の増加並びに増殖及び脈管湿潤物の減少を示した。コントロールPBSで処理した腫瘍は、高い腫瘍密度及び活発な血管形成応答を示した。EphB4抗体で処理した腫瘍は、生存腫瘍細胞の領域中の腫瘍細胞密度の減少及び腫瘍血管形成の顕著な阻害、並びに腫瘍壊死及びアポトーシスを示した。図60は、異種移植における抗体の全身的投与は、異種移植でのSCC15腫瘍の腫瘍退縮を導くことを示す。又、EphB4モノクローナル抗体又はコントロールとして同体積のPBSでの隔日治療は、第4日、腫瘍が確立された後に開始して14日間連続した。IP又はSCのいずれかの全身的投与を投与したが顕著な違いは無かった。全実験を実験者の先入観を除くためにダブルブラインド手順で実施した。マウスを2週間の治療期間終結時に犠牲にした。腫瘍を死後直ちに採取し、固定化し、免疫組織化学的に処理した。EphB4抗体40mg/kg体重を投与した。EphB4抗体での処理は、コントロール処理マウスと比べてヒトSCC腫瘍の増殖を非常に阻害したp<0.05。EphB4抗体での処理は、コントロール処理マウスと比べて腫瘍重量を非常に阻害したp<0.05。資料の組み込みここで挙げた全ての刊行物及び特許は、それぞれの個々の刊行物又は特許が資料として使用されるものとして特別に、別々に表されたように、その全体をここで資料として使用する。本発明が所定の例示で示されていても、上記例示は説明のためであり本発明を限定するためではない。特許請求の範囲及び明細書の記載を基にして、本発明の多くの変形が当業者には理解できる。本発明の範囲は特許請求の範囲に従い定められ、それらの全ての均等物をも含むものである。"