"試料を準備し、該試料を、1→4-α-D-グルカン、1→6-β-D-グルカン、および、1→4-α-/1→6-β-D-グルカンからなる群より選択される抗原に結合することができる一次抗体に曝露させ、それによって一次抗体-抗原の複合体を形成し、該一次抗体と抗原との結合度を、二次抗体を用いて検出する、試料中の酵母細胞壁を検出する方法。上記試料が、家畜用飼料、ペット用飼料、一般動物用飼料、完全混合飼料TMR;TotalMixedRation、飼料forage、ペレット状飼料、飼料用濃縮物、飼料用事前混合副産物、穀物、醸造粕、糖蜜、食物繊維、飼料fodder、牧草、乾草、穀粒、葉、粗粉、可溶性飼料、飼料用栄養補助剤、および、これらの製造時に生成する各種中間体からなる群より選択される物質から導出される、請求項1に記載の方法。上記導出が、上記物質を抽出して試料を産生することによって達成される、請求項2に記載の方法。上記抽出が、酸抽出、アルカリ抽出、有機抽出、物理的処理、および、これらの組み合わせからなる群より選択されるステップを用いて実施される、請求項3に記載の方法。上記抽出が、有機溶剤および酸を用いて実施される、請求項4に記載の方法。上記抽出が、ジメチルスルホキシドおよび塩酸を用いて実施される、請求項5に記載の方法。上記抽出のステップにおいて、室温より高い温度でインキュベーションを実施する、請求項4に記載の方法。上記インキュベーションが75°C~85°Cで実施される、請求項7に記載の方法。上記一次抗体が上記抗原に対して単一特異性を有する、請求項1に記載の方法。上記一次抗体が多クローン性抗体である、請求項1に記載の方法。抗体と抗原との結合度の検出が、酵素、蛍光発生物質、発色物質、および、放射標識された同位元素からなる群より選択される物質に接合する二次抗体を補助的に用いて実施される、請求項1に記載の方法。上記二次抗体が、上記一次抗体との複合体を形成することができる、請求項1に記載の方法。上記試料が、硬い支持部上に固定されている、請求項1に記載の方法。硬い支持部が、多壁プレートmultiwallのウェルを備えている、請求項13に記載の方法。上記一次抗体と抗原との結合の検出が、上記一次抗体-抗原の複合体に結合した二次抗体が試料中に存在することに対応するシグナルのレベルを判定することによって達成される、請求項1に記載の方法。上記シグナルが、発色シグナル、蛍光シグナル、サイズに基づいて検出される分子、吸光度に基づいて検出される分子、放射、および、同位体シグナルからなる群より選択される、請求項15に記載の方法。上記検出が、ELISAイムノアッセイを用いて実施される、請求項1に記載の方法。酵母細胞壁を包含する試料を準備し、該試料から、酵母細胞壁の炭水化物を、酸の処理、アルカリ処理、および、物理的処理からなる群より選択される作用を用いて抽出し、該酵母細胞壁の炭水化物を試料から分離し、該酵母細胞壁の炭水化物が、1→4-α-D-グルカン、1→6-β-D-グルカン、および、1→4-α-/1→6-β-D-グルカンからなる群より選択される炭水化物である、酵母細胞壁の炭水化物を包含する免疫原性組成物を調製する方法。上記抽出が、酸処理を用いて実施される、請求項18に記載の方法。上記酸が塩酸である、請求項19に記載の方法。さらに、分離後の酵母細胞壁の炭水化物を精製する、請求項18に記載の方法。上記精製が、サイズに基づく分離、電荷に基づく分離、疎水性に基づく分離、結合分子に対する親和性に基づく分離、および、分子の立体構造に基づく分離からなる群より選択されるステップによって達成される、請求項21に記載の方法。さらに、分離後の酵母細胞壁の炭水化物の軽度な酸化を行う、請求項18に記載の方法。上記軽度な酸化が、酸化剤で処理することによって達成される、請求項23に記載の方法。上記軽度の酸化が、酵母細胞壁の炭水化物をジメチルスルホキシドおよび無水酢酸で処理することによって達成される、請求項24に記載の方法。上記軽度の酸化の結果、酵母細胞壁の炭水化物が活性化される、請求項24に記載の方法。上記活性化が、酵母細胞壁の炭水化物のC6部位で起こる、請求項26に記載の方法。上記活性化の結果、アルデヒド基が形成される、請求項26に記載の方法。活性化後の酵母細胞壁の炭水化物を、さらに、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン、および、ウシサイログロブリンからなる群より選択されるキャリア分子に曝露させる、請求項26に記載の方法。上記キャリア分子がウシ血清アルブミンである、請求項29に記載の方法。タンパク質に共有結合によってリンクする1→4-α-/1→6-β-D-グルカンを包含する免疫原性組成物。上記免疫原性組成物が、Saccharomycescerevisiaeに属する酵母生物から生成される、請求項31に記載の免疫原性組成物。共有結合性リンクが、炭水化物のC6原子を介して発生する、請求項31に記載の免疫原性組成物。1→4-α-D-グルカン、1→6-β-D-グルカン、および、1→4-α-/1→6-β-D-グルカンからなる群より選択される酵母細胞壁の炭水化物に結合することができる抗体を包含する組成物。上記抗体が単クローン性抗体である、請求項34に記載の抗体。上記抗体が多クローン性抗体である、請求項34に記載の抗体。上記抗体が1→4-α-D-グルカンに結合することができる、請求項34に記載の抗体。上記抗体が1→6-β-D-グルカンに結合することができる、請求項34に記載の抗体。宿主動物を請求項31に記載の免疫原性組成物で免疫化する、試料中の酵母細胞壁を検出するための抗体を調製する方法。1→4-α-D-グルカン、1→6-β-D-グルカン、および、1→4-α-/1→6-β-D-グルカンからなる群より選択される酵母細胞壁の炭水化物を放出する抽出ステップを実施するための試薬と、該抽出ステップにおいて抽出される酵母細胞壁の炭水化物に結合することができ、それによって一次抗体-抗原の複合体を形成する一次抗体と、該一次抗体-抗原の複合体に付着することができ、それによって一次抗体-抗原-二次抗体の複合体を形成する二次抗体とを備えた、試料中の酵母細胞壁を検出するためのキット。上記二次抗体が、酵素、蛍光発生物質、発色物質、および、放射標識された同位元素からなる群より選択される物質に接合する、請求項40に記載のキット。試料を準備し、1→4-α-D-グルカン、1→6-β-D-グルカン、および、1→4-α-/1→6-β-D-グルカンからなる群より選択される化合物の存在を検出する免疫アッセイを、該試料に対して実施し、該免疫アッセイの結果を伝達する、試料中における酵母細胞壁の成分の存在を判定するプロセス。上記試料が、家畜用飼料、ペット用飼料、一般動物用飼料、完全混合飼料TMR;TotalMixedRation、飼料forage、ペレット状飼料、飼料用濃縮物、飼料用事前混合副産物、穀物、醸造粕、糖蜜、食物繊維、飼料fodder、牧草、乾草、穀粒、葉、粗粉、可溶性飼料、飼料用栄養補助剤、および、これらの製造時に生成する各種中間体からなる群より選択される物質から導出される、請求項42に記載のプロセス。実施例以下の実施例は、本発明のある好適な実施形態および態様を実証し、さらに説明するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例1食物グレードのSaccharomycescerevisiaeに属する酵母細胞壁β-グルカンからの1→4-α-/1→6-β-D-グルカンの抽出酵母細胞壁のグルカンの調製酵素/アルカリ/熱処理によってS.cerevisiaeから生成した工業グレードの1→6-β-D-グルカンALL-BGY、ALLTECH,Inc.社、Nicholasville、KY、米国を脱イオン水で4回洗浄して、可溶性残留物を全て除去した。フリーズドライした後に、グルカン濃縮物質GEMが得られた。酵母細胞壁のグルカンの酸性消化図1は、各画分の調製を図示している。酵母細胞壁のグルカンの酸性消化を、KwiatkowskietalJInstitBrew115151158に記載されているように実施した該文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする。グルカン濃縮物質GEM70gを、100mMのHClpH値2.2を700ml用いて80°Cで6時間加水分解した。この6時間の加水分解終了後に、混合物を13,500×g/10°C/10分で遠心分離し、上清を収集した。ペレットを150mlの脱イオン水で2回抽出し、凍結乾燥させると、57.9gの白色の非結晶生成物P1が得られた。これら2つの洗浄物を元の上清と合わせ、2NのNaOHで中和してpH値を7.0にした。形成した沈殿物を遠心分離から収集しペレットP1/7凍結乾燥後には1.82gであった、37°C未満の温度でBuchi社の真空ロータリーエバポレーターを用いて、上清を体積450mlまで濃縮した。この溶液を、5kDaAMICON15型限外濾過遠心分離器Millipore社、Delaware、米国を用いてさらに濃縮した。この濃縮物約150mlを、同じ限外濾過器を用いて、2つの等しい体積の脱イオン水で遠心分離によって2回洗浄して、酸加水分解が原因となって生じる塩と低分子量成分とを除去した。洗浄済み濃縮物S1を凍結乾燥すると、7.5gの白色の非結晶生成物が得られた。ペレットP1の一部に対して、1回目の0.1NのHClを用いた抽出と同じ試薬比および条件で、2回目の抽出を実施した。これらの生成物を凍結乾燥すると、P2およびS2が得られた。この0.1NのHClを用いた2回目の抽出では、上清を中和した後も沈殿物は生成しなかった。ペレットP2の一部に対して、1回目の0.1NのHClを用いた抽出と同じ試薬比および条件で、3回目の抽出を実施し、生成物を凍結乾燥してP3およびS3を得た。0.1NのHClを用いた3回目の抽出では、上清を中和した後も沈殿物は生成しなかった。0.1NのHClを用いた抽出で得られた可溶性画分および非可溶性画分の炭水化物組成および多糖構造を、1HNMR分光法によって確立した。試料中のマンノースおよびグルコースの含有量を、H2SO4-HPLC組成分析法で分析したDalliesetalYeast1412971306を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする。タンパク質の推定含有量を、LECO燃焼分析法で、窒素の含有量に乗数6.25を乗じることによって算出した。実施例2抗原の調製1→4-α-/1→6-β-D-グルカン調製物のAc2O/DMSO酸化580mgの可溶性グルカンを、磁気攪拌棒を備えゴム製中隔で蓋留めした22mlのガラス製バイアルに仕込んだ。このバイアル中に、10mlの無水DMSOおよび110μlの無水酢酸を、注射筒を用いて室温で攪拌しながら加えた。グルカンの懸濁液は、20°Cで攪拌を4時間続けると完全に溶解した。この混合物の攪拌を24時間継続した後に、反応混合物を40mlの水で希釈した。得られた透明な溶液を、30kDaAmicon登録商標15型限外濾過遠心分離器を用いて濃縮し、フィルタ上の残留物を1回につき12mlの脱イオン水で5回洗浄して、溶媒および反応物の酸化生成物を分離および精製した。遠心分離はどの回も4,750×g/30分/10°Cで実施した。フィルタ上の最終的な残留物を収集しフリーズドライすると、502mgの酸化した1→4-α-/1→6-β-D-グルカンが白色粉末の形態で得られた。この生成物は水には部分可溶性であり、DMSOには完全可溶性であった。元素分析酸化グルカンについて、C40.05、H6.61であった。C6H8O5×H2Oについて、C40.48、H5.66が算出された。BSAを用いた、酸化1→4-α-/1→6-β-D-グルカンの還元的アミノ化酸化1→4-α-/1→6-β-D-グルカンの試料412mgを、20mlの脱イオン水に溶解させ、磁気攪拌しながら2mlの脱イオン水中で256mgのBSAの溶液と合わせた。次に、この混合物を、60mgの固体シアノ水素化ホウ素ナトリウムで処理した。反応用バイアルをゴム製中隔で蓋留めし、混合物を20°Cで24時間攪拌した。この24時間の攪拌終了後に、100mgの水素化ホウ素ナトリウムを加え、混合物をさらに22時間攪拌した。その後、透明な溶液を、30kDaAmicon登録商標15型限外濾過遠心分離器を用いて4,750×g/30分/10°Cで濾過した。残留物をフィルタ上で1回につき12mlの水で4回洗浄し、最終的な濃縮物を凍結乾燥すると、573mgの白色粉末が得られた。元素分析C45.01、H6.40、N2.11であった。1→4-α-/1→6-β-D-グルカン-BSA接合体の、DEAEセルロースイオン交換クロマトグラフィーによる分離未精製の上記接合体400mgを5mMのNa2HPO45mlに溶かした溶液を、5mMのNa2HPO4に溶かした50gのDEAEセルロースを含有する2×55cmのガラス製クロマトグラフィー用カラムの最上部に導入した。溶出には、様々な濃度のNa2HPO4を使用した。具体的には、40.1mgの1→4-α-/1→6-β-D-グルカン220ml、5mMと、132.3mgの純粋1→4-α-/1→6-β-D-グルカン-BSA接合体280ml、55mMと、96.7mgのBSA80ml、100mMとを用いた。純粋1→4-α-/1→6-β-D-グルカン-BSA接合体の溶液を、30kDaAMICON15型限外濾過遠心分離器を用いて体積が2mlになるまで濃縮し、脱イオン水で洗浄し、凍結乾燥すると、132.3mg全収率は24.4の白色粉末状の生成物が得られた。ゲル電気泳動を実施すると、クマシーブルーComassieBlueおよびPAS染色によって、約170kDaを中央にして広いバンドが存在することが示された。電気泳動図では、遊離BSAなどの不純物が全く検出されなかった。元素分析C40.11、H6.23、N3.06BSAの20.44wであった。計算によって求めたβ-グルカン:BSAの比は4:1であった。実施例3多クローン性抗体の調整および精製抗原の調製およびウサギの免疫化実施例2の記載のように調製したBSA接合抗原10mgを凍結乾燥し、4°Cで保存し、3羽のウサギの免疫化に使用した1回の免疫化について抗原200μg。免疫化プロトコールを表1に列挙する。多クローン性抗体の親和相の精製1gのエポキシ活性化アガロースSigma社、E6632を、10mMのNa2HPO427mlに溶かしたBSA2.68gSIGMA社、A2153の溶液中に懸濁し、混合物を氷水浴中で4°Cで4時間攪拌した。この4時間の攪拌終了後に、混合物を2500×g/5分/10°Cで遠心分離し、ペレットを洗浄し、各回について30mlの100mMのNa2HPO4/0.05wのNaN3を用いてさらに4回遠心分離した。BSAでコーティングされた親和相前述の最終回の遠心分離で得られたペレットを、10mMのNa2HPO4/0.05wのNaN320mlに溶かした可溶性グルカン-BSA接合体で免疫済みのウサギから収集した750μlの血清の溶液中に懸濁し、2時間室温で転動tumblingし、そして1500×g/5分/10°Cで遠心分離した。上清を収集し、ペレットを20mlの同じバッファでさらに3回洗浄すると、さらに3つの上清が得られた。これらの上清を、図2に示すように、BSAおよび可溶性グルカンに対する特異性について精査した。多量の量抗体を含有する第1および第2の上清をともにプールし、10kDaAMICONUltra-15CentrifugalFilterDeviceを用いて5000×g/5分/10°Cで遠心分離することによって、体積が2.5mlになるまで濃縮した。濃縮物をフィルタ上で10mMのNa2HPO4/0.05wのNaN3を用いて洗浄し、同じバッファで体積が6ml6gになるまで希釈した。この親和性精製済み抗体を1:800に希釈した溶液を、動物飼料におけるMYCOSORBのELISAアッセイにおいて使用した。得られた較正曲線を図3に示す。実施例4ELISAによる酵母細胞壁の1→4-α-/1→6-β-D-グルカンの検出物質および方法試薬特に明記しないかぎり認められている分析グレードの試薬を、脱イオン化または脱塩した水または等価の純度の水を使用した18,2MΩ/cm、25°C。試薬および試薬液の調製は、以下のようである。塩酸、12.1NのHCl希塩酸、1NのHCl。121NのHCl41.3mlを、400mlの脱イオン水にゆっくりと加え、攪拌プレート上で攪拌棒を用いて冷めるまで混合した。この溶液を500mlのメスフラスコに移し替え、脱イオン水で体積を調整し、その後、室温で保存した。ジメチルスルホキシド。使用したDMSOは高純度であり、分光光度法、液体クロマトグラフィー、および、ガスクロマトグラフィーに適している。抽出用試薬。抽出用試薬を調製するために、900mlのDMSOを、98.75mlの脱イオン水および1.25mlのHCl12,1Nに混合した。この溶液を、攪拌プレート上で攪拌棒を用いて中程度の速度および室温で混合し、その後、20°C以上で保存した。塩化ナトリウムNaCl塩化カリウムKClリン酸水素二ナトリウムNa2HPO4リン酸二水素カリウムKH2PO4リン酸緩衝食塩水PBS10×。10×のPBSを調製するために、80.0gの塩化ナトリウム[NaCl]と、2.0gの塩化カリウム[KCl]と、14.2gのリン酸水素二ナトリウム[Na2HPO4]と、2.4gのリン酸二水素カリウム[KH2PO4]とを、約800mlの脱イオン水に混ぜた。この溶液を、固形物が完全に溶解するまで、攪拌プレート上で攪拌棒を用いて攪拌した。溶液を1000mlのメスフラスコに移し替え、脱イオン水で体積を調整し、その後、室温または2°C~8°Cで保存した。最長保存期間は、2°C~8°Cで無希釈液体として6ヶ月であった。溶液は、使用前に室温まで暖めた。希釈PBS1×。1×のPBSを調製するために、10×、1体積のPBSを9体積の脱イオン水で希釈した。この希釈物を攪拌プレート上で攪拌棒を用いて中程度の速度および室温で混合した。最長保存期間は1日であった。ポリソルベート200.05のポリソルベート20pH値7.4を用いた0.01Mのリン酸緩衝食塩水。これを調製するために、1つのパウチの中味を、1000mlの脱イオン水中に溶解させた。この溶液を、完全に溶解するまで攪拌プレート上で攪拌し、その後、室温または2°C~8°Cで保存した。最長保存期間は、2°C~8°Cで無希釈液体として6ヶ月であった。溶液は、使用前に室温まで暖めた。乾燥脱脂乳PBS中の乾燥脱脂乳が3w/vの1×遮断薬。1×の遮断薬を調製するために、使用に先立って、乾燥乳を1×のPBS中に完全に溶解させた。各プレートを遮断するために、10mlの体積が必要であった。最長保存期間は1日であった。ウサギ多クローン性抗体、一次抗体抗体溶液1。本明細書に記載するように調製した親和性精製済み抗体。使用するまで-80°Cで保存した。希釈済みウサギ多クローン性抗体溶液。1μlの抗体溶液1を1×のPBSXiμlに加えることによって、PBS中で1:Xiに希釈した。各マイクロタイタープレートについて、10mlの体積の溶液が必要であった。希釈済み抗体溶液を、使用前によく混合し、過剰な希釈済み抗体を捨てた。最長保存期間は1日であった。ペルオキシダーゼ接合AffiniPureGoat抗RabbitIgGHL、HRP二次抗体、参照番号111-035-045JacksonImmunoResearch,PA,米国、抗体溶液2。1.5mlの脱イオン水で再水和し、完全に透明な溶液が得られるまで遠心分離した。使用するまで、10μlの部分標本として-80°Cで保存した。最長保存期間は、2°C~8°Cで無希釈液体として6週間であった。希釈済みのヤギの抗ウサギ抗体。1μlの抗体溶液2を1×のPBSYiμlに加えることによって、PBS中で1:Yiに希釈した。希釈済み抗体溶液を、使用前によく混合し、過剰な希釈済み抗体を捨てた。最長保存期間は1日であった。SureBlueReserveTMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質。必要な体積を、アンバーNalgeneHDPEおよびLDPEのボトルだけに再分注した。基質は、使用前に室温まで暖めた。蓋はぴったりと閉鎖したままにして、光から保護した。過剰な基質を捨て、試薬を2°C~8°Cで保存した。最長保存期間は、8°Cで保存した場合、製造日から24ヶ月であった。MYCOSORB貯蔵物の試料、バッチ番号285965ALLTECH,Inc.社、KY、米国。均質なMYCOSORB試料を使用した。一般動物用飼料におけるMYCOSORBの希釈物。250mlの遠心分離用ボトル中で、20gの飼料物質とMYCOSORB生成物とを、MYCOSORB生成物の量を増やしながら0.01g、0.02g、0.08g、0.10g、0.12g混合した。これらの混合物は、検量線を生成できるように3部作製した。このボトルを、オービタルシェーカーを用いて400rpmで1時間振盪した。飼料物質の重量を測定する精度は±0.025gに等しく、MYCOSORB生成物については±0.005gに等しかった。一般動物用飼料中の大バッチの希釈済みMYCOSORB。飼料中の希釈済みMYCOSORB生成物の大きな試料を、1.2gのMYCOSORB生成物と300gの飼料物質とを用いて、1000mlの容器中で調製した。ボトルを、オービタルシェーカーを用いて400rpmで1時間振盪した。飼料物質中のMYCOSORB生成物の最終濃度は4.0kg/Tであった。大バッチ300.0gの飼料とMYCOSORB生成物との均質化した混合物20.0gを、250mlの遠心分離用ボトルに移し替えた。この移し替えをさらに9回繰り返して、10個の複製試料を得た。混合物は、3つの部分標本を調製するたびに間欠的に振盪して、生成物がボトルの底に沈殿することを防止した。飼料物質の重量を測定する精度は±0.025gに等しく、MYCOSORB生成物の場合は±0.005gに等しかった。一般動物用飼料中の未知量のMYCOSORBの希釈物。未知量のMYCOSORB生成物と20.0g±0,025gの飼料物質とを5つの遠心分離用ボトル各250mlそれぞれに移し替えることによって、未知の試料を調製した。ボトルを、400rpmで1時間オービタルシェーカーを用いて振盪した。同時に、試料の検量線の試行作成を完了した。試料の配合アッセイが正しく行われるように、3つの飼料物質表4、表5、および、表6を参照を使用した。飼料物質の配合法は、当該技術分野において見られる組成物に合わせて選択した。試料のサイズは、研究室へ送る前に慎重に均質化した飼料物質が合計15kgであった。研究期間全体を通して、試料を2°C~8°Cで保存した。試料の均質性の保証飼料中の大バッチの希釈済みMYCOSORB生成物を、飼料中のMYCOSORB生成物の濃度を中程度の4.0kg/Tとして調製することによって、飼料物質中のMYCOSORB生成物の希釈の均質性を保証した。この試料を10個の副試料に分割し、上記抽出手順にしたがってさらに抽出した。続いて、10個の試料それぞれについてELISAアッセイを4回実施することによって、MYCOSORB生成物を検出するための変動係数を決定した。試料の調製標準試料を本明細書に記載するように調製した。調製法については、検査対象となるMYCOSORB生成物とともに表2に示す。この場合、本明細書に記載するように、最初の貯蔵物を基準とした。未知の試料を前述の通り調製した。飼料の試料は、抽出手順を実施する前に粉砕することが必要であった飼料物質がペレット状で提供されていれば、同様に粉砕することが必要になる。飼料物質を粉砕すると、アッセイの最終的な信頼性に影響することがわかった。抽出手順全ての組のボトルを、オービタルシェーカーを用いて400rpmで1時間振盪した。一度に3本のボトルを取り出し、ボトル最上部の容積測定用ディスペンサーを用いて、抽出用試薬体積80mlを各ボトルに加えた。抽出用試薬がしっかりと完全に混合されるように、全ボトルに蓋をした。全ての試料を手で振盪した。飼料の溶液がしっかりと完全に浸されるように、全ボトルをサーモスタットで80°Cに維持された水浴中に1時間置いた。インキュベーション後に、ボトルを水浴から取り出し、ボトルの中味を、高トルクラボ攪拌機を用いてロッドNALGENE商標で混合した。混合物は完全に均質化された。各MYCOSORB含有レベルおよび各未知試料について、きれいなロッドを1本ずつ使用した。ボトルを、サーモスタットで80°Cに維持された水浴中に1時間置いた。インキュベーション後に、ボトルを水浴から取り出し、ボトル最上部の容積測定用ディスペンサーを用いて各ボトルに80mlの脱イオン水を加え、次に、ボトルに蓋をした。完全に混合するまで、ボトルを手で振盪した。この際、必要に応じて、ロッドNALGENE商標を高トルクラボ攪拌機とともに使用した。ボトルを8,000gで10分間の遠心分離にかけた。ガラス製ピペットを用いて、約10mlの上清を15mlの遠心分離用無菌チューブへ移し替えた。チューブを4,000gで10分間遠心分離し、適切に標識した新しい15mlの遠心分離用無菌チューブに、デカントすることによって移し替えた。ELISAアッセイに使用するまで、チューブを-20°Cで一晩保存した。ELISA手順SureBlueReserveTMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質を使用して、希釈済みHRP二次抗体との反応を介して比色分析反応をトリガーし、さらに、マイクロタイタープレート上に固定された希釈済みMYCOSORB生成物から抽出した、注目している基質と特異的に反応する希釈済み一次抗体自身と反応させた。比色分析反応を最後は20分後に1NのHClを用いて停止させて、吸光度を、プレート読み取り装置を用いて450nmの波長で読み取った。したがって、飼料マトリクスから発生して分光光度計上でバックグラウンドシグナルを与える可能性がある、比色分析のばらつきを考慮するために、飼料物質だけを含有するブランクについて測定を行った。計算には、ブランク値を、各試料から得られる吸光度の値から減じた。先に抽出して一晩保存した試料を解凍し、室温まで暖めた。マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするために、ELISAにおいて使用する前に均質な試料を確実に作製しておけるよう、各試料をボルテックスした。各複製試料について、表3に示すように、96個のウェルを有するマイクロタイタープレート上の3つの各ウェルに、上清を100μlずつ移し替えた。プレート上の試料のランダムな分散配置は、プログラム済みのロボット化されたマイクロタイターウェルディスペンサーを備えた研究室で実施してもかまわない。検量線試料および複製試料を、全て、同じ1つのプレート上に分散配置したつまり、全ての0kg/T複製試料を列/行E1~F10にセットした。未知のMYCOSORB複製試料を同じプレート上に分散配置したつまり、列/行A11~C12にセットした。これらのマイクロタイタープレートをミクロプレート用粘着フィルムで封止し、37°Cで1時間インキュベーションした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートの各ウェル内の溶液を取り除き、250μlのPBS1×に置き換えて、1回洗浄した。このオペレーションを合計でさらに2回繰り返した。マイクロタイタープレートの各ウェルを、PBS溶液に溶かした希釈済み脱脂乳100μlで遮断し、室温で1時間インキュベーションした。インキュベーション後に、各ウェル内の溶液を取り除き、250μlのPBS1×に置き換えて1回洗浄し、続いて、ポリソルベート20を0.05含有する250μlのPBSに置き換えて2回洗浄した。体積が100μlの希釈済み一次抗体を、各ウェルに加えた。マイクロタイタープレートを、室温で1時間インキュベーションした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートの各ウェル内の溶液を取り除き、ポリソルベート20を0.05含有する250μlのPBS1×に置き換えて3回洗浄した。体積が100μlの希釈済み二次抗体を、各ウェルに加えた。マイクロタイタープレートを、室温で1時間インキュベーションした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートの各ウェル内の溶液を取り除き、ポリソルベート20を0.05含有する250μlのPBS1×に置き換えて3回洗浄した。体積が100μlのTMB基質を予め室温まで暖めておき、これを各ウェルに加え、マイクロタイタープレートを室温で20分間インキュベーションした。TMB基質を用いてちょうど20分後に、体積が100μlのHCl1Nをただちに各ウェルに加えて、比色分析反応の進行を停止させた。各マイクロタイタープレートを、マイクロタイタープレート読み取り装置を用いて450nmで読み取った。複製試料からのデータの排除次式で定義されるディクソンのQ検定をパスせず、その結果、異常値であると特定される複製試料を除けば、全ての複製試料が類似性を有することを保証するために、統計学的なデータ解析が必要であった。Qn=|xb-xa|/Rただし、Rは全てのデータ点の範囲であり、xaは異常値ではないかと疑われるデータ点であり、xbはxaに最も近いデータ点である。Qcalculated>Qtableであれば、疑わしい点を95の信頼区間で棄却する。検量線の作成較正曲線を使用して定量化を行った。較正曲線は、上記Councilによる指示96/23に記載されているように、生成物の機能範囲内の少なくとも5つのレベルゼロを含むを用いて、各飼料マトリクスについて作成する。各試料群の場合について、OD450での3個のウェルの吸収度の平均値を算出した。ブランク飼料の試料の場合については、OD450での10個のウェルの吸収度の平均値を算出した。次に、縦軸上で得られる差ΔOD450OD450の試料群-OD450のブランク飼料と、横軸上の互いに異なるMYCOSORB生成物の濃度の各範囲0.5、1.0、4.0、5.0、6.0kg/Tとを用いて、検量線つまり較正曲線を作成した。平均のブランク値によって値を補正した後に、最もよく一致する線ΔOD450=AxMYCOSORBを用いて、OD450での吸収度に対してプロットした含有レベルの回帰係数および等式を、直線回帰にしたがって算出した。較正曲線の受容可能範囲および直線性を、0.95より大きな相関係数r2値によって検証した。次に、較正曲線に対応する等式を解くことによって、未知の試料中のMYCOSORB生成物の含有レベルを求めた。内挿r2>0.95となる相関係数が検量線に見られる場合には、補正した曲線に対応する等式Fx=Axバックグラウンドシグナルから減算され、ゼロと交わるを使用して、未知の試料中のMYCOSORB生成物の含有レベルを求める。MYCOSORB生成物の未知の含有レベルについてのOD450での10個の平均値Cを算出する。先に算出したブランク飼料の試料については、得られた平均値を、OD450での10個のウェルの吸収度の平均値から減じる。次に、OD450での平均値を使用して、補正した曲線の等式F-1yCただし、yC=AxCであり、xC=yC/A。ただし、yCは、未知の試料についてのOD450で得られる平均値CからブランクのOD450で得られる平均値を引いた値であり、xCは、MYCOSORB生成物の対応する含有レベルであり、Aは、kg/TOD450で表した検量線の勾配であるを解く。検出限界および定量化限界検出限界LD=3σblankおよび定量化限界LQ=10σblankを、IUPACの命名法にしたがって測定し、ΔOD450とする。検出限界LDおよび定量化限界LQをマトリクスのブランクの分析から求め、これから、次式にしたがって解いた較正曲線Fx=Axを利用して、平均バックグラウンドOD450値から補正した直線回帰に基づいて濃度を算出した。LD=3σblank/ALQ=3σblank/Aただし、LDは、生成物の最小検出可能濃度、つまり、検出限界であり、LQは、生成物の最小定量化濃度、つまり定量化限界である。均質性均質性の変動係数RSDH=CVHを、同じ日に同じ技師によって同じ設備および方法を用いて同じ試料から得られる、10個の独立した複製試料の平均の変動係数として定義した。精度、反復率ラン内併行精度RSDintra=CVintraを、同じ日に同じ技師によって同じ設備および方法を用いて同じランに対して同じ試料から得られる、反復の平均の変動係数として定義した。ラン間併行精度RSDInter=CVInterとは、異なる日に同じ技師によって同じ設備および方法を用いて異なるランで同じ試料から得られる、独立した複数結果の平均の変動係数である。精度、全体的な精度精度によって、同一量の連続測定間の一致度の分散つまり、近さが評価できる。1組の測定値における分散近さは、通常標準偏差で表現される。したがって、同じ試料から同じ日に同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られる単一の含有レベルにおける個々の単一の実験の標準偏差、および、同じ技師によって同じ設備および方法を用いて個々のランを比較する標準偏差から、次式を用いて、精度を算出した。ただし、σTotalは実験全体の集合の標準偏差であり、σintraは個々の単一の実験の標準偏差であり、σInterは複数の実験間の標準偏差であり、nは複製数である。グループの平均値の分散とグループ内の分散の平均値との間で、F検定p値≦0.05を用いた分散分析一方向ANOVAによって、標準偏差の比較を行った。正確さ正確さとは、検査結果と測定対象である生成物の受容されている基準値との間で見られる一致の近さである。したがって、百分率で表した回収率の測定値から、正確さを評価した。この点で、回収率は、抽出されて測定に利用可能な、分析物中に存在している、または、混合された分析物の量の比率を表している。バイアスとは、検査結果と受容される基準値分析物の添加濃度との差である。計算は次式にしたがって実施した。回収率=100×Xc-Xb/XTHただし、Xcは、添加試料において測定された濃度であり、Xbは非添加試料ブランクにおいて測定された濃度であり、XTHは理論濃度である。検証検査に使用する飼料物質ALLTECH,Inc.社KY、米国にあるCenterforAnimalNutrigenomicsandAppliedAnimalNutritionにおいて、飼料物質と様々な含有レベルのMYCOSORB生成物とを混合した、乳業用飼料配合物、ニワトリ用飼料配合物、および、ブタ用飼料配合物について、検査を実施した。飼料配合物の詳細な説明については後述する。乳業用飼料物質飼料物質は、CoralisVern社VernsurSeiche,France,参照番号111605のSpiritLait2L5という名称の配合物を用意した表4。試料のサイズは、全体で飼料物質が15kgであり、研究室へ送る前に、この飼料物質を慎重に均質化した。試料は、研究期間全体を通して2°C~8°Cで保存した。乳業用飼料物質は、ペレット状の形態で提供した。抽出手順を実施する前に飼料の試料を粉砕する必要はなかった。ニワトリ用飼料物質飼料物質は、UniversityofKentuckyとALLTECH,Inc.社KY、米国との共同研究機関であるColdstreamUniversityofKentuckyにおいて配合した表5。調製は、当該技術分野において見られ、ヨーロッパ共同体、北アメリカ、ラテンアメリカなどにおいて一般に見られる配合物に対して一般化可能な組成物に合わせて行った。試料のサイズは、全体で飼料物質が15kgであり、研究室へ送る前に、この飼料物質を慎重に均質化した。試料は、研究期間全体を通して、2°C~8°Cで保存した。ブタ用飼料物質飼料物質は、UniversityofKentuckyとALLTECH,Inc.社KY、米国との共同研究機関であるColdstreamUniversityofKentuckyにおいて配合した表6。調製は、当該技術分野において見られ、ヨーロッパ共同体、北アメリカ、ラテンアメリカなどにおいて一般に見られる配合物に対して一般化可能な組成物に合わせて行った。試料のサイズは、全体で飼料物質が15kgであり、研究室へ送る前に、この飼料物質を慎重に均質化した。試料は、研究期間全体を通して、2°C~8°Cで保存した。乳業用飼料物質を用いた検証ALLTECH,Inc.社KY、米国にあるCenterforAnimalNutrigenomicsandAppliedAnimalNutritionにおいて、固形のヨーロッパタイプの乳業用飼料配合物と5つの異なる濃度のMYCOSORB生成物との混合物について、検査を実施した。同じマイクロタイタープレート上に分散配置した場合について、それぞれ0.0kg/T、0.5kg/T、1.0kg/T、4.0kg/T、5.0kg/T、6.0kg/TのMYCOSORB生成物と混合した各乳業用飼料物質を、未知のレベルのMYCOSORB生成物と混合した同じ乳業用飼料物質の試料とともに分析した。適応可能性複合一般動物用飼料におけるMYCOSORB生成物を追跡することを目的とするトレーサビリティのエンドポイント過程として、MYCOSORB生成物および代替物の特異的な分析を実施するために開発されたELISAアッセイの特性を確定するために、検証を行った。検証には、飼料の試料と混合する含有レベル0.0kg/T、0.5kg/T、1.0kg/T、4.0kg/T、5.0kg/T、6.0kg/Tの機能範囲に対応する6つのレベルのMYCOSORB生成物を使用した。希釈済みウサギ多クローン性抗体溶液。一次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。1μlの抗体溶液1を1.2mlのPBS1×に加えることによって、抗体をPBS中で1:2,500まで希釈した。各マイクロタイタープレートには、体積が10mlの溶液が必要であった。希釈済みヤギの抗ウサギ抗体。二次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。1μlの抗体溶液2を20.0mlPBS1×に加えることによって、抗体をPBS中で1:20,000まで希釈した。均質性試料の均質性の検証を、実験計画において、MYCOSORB生成物の含有レベルの中央値4.0kg/Tについて行った。この特定のレベルについてのアッセイを、各試料について4つの複製を用いて、10個の各試料に対して5回繰り返した。表7に詳細を示した算出値によれば、CVHは4.53であった。較正本明細書に記載する既知の標準試料濃度で、0.0kg/T~6.0kg/Tの範囲のMYCOSORB生成物と混合した飼料に対して、アッセイの較正を行った。線形曲線近似linearcurvefity=Axを利用して、濃度と応答性OD450との間の関係を規定した。5回のランから得られた平均検量線を図4に示す。線形性ブランクを減算した後に、OD450での吸収度に対してプロットした含有レベルの等式にしたがって、切片がゼロである最もよく一致する線ΔOD450=AxMYCOSORBを用いて、回帰係数の計算から、検量線の線形性を評価した。r2が0.95を超える場合の相関係数の値を用いて、検量線の線形性を検証する表8。反復率反復率は、反復率の標準偏差の評価による内部分散の尺度である。同一ランの反復中における反復率の評価は、同じ試料から同じ日に同じランに対して同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、1ラン内の検出のばらつきCVintraを表す表9。異なるラン間の反復率の評価は、同じ試料から異なる日に異なるランで同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、ラン間の検出のばらつきCVInterを表す表10。結果は、0.0kg/T~6.0kg/Tの検量線機能範囲に適用される場合、同じ日に得られる検量線も異なる日に得られる検量線もほとんどばらつきがなく、平均日内精度が5.70であり、日間精度が7.86であることを示している。全体的な精度は8.28であった表11。LDおよびLQ感度LD値およびLQ値を表12に記載する。得られた各LQ値は、飼料物質における定量化が可能になる、MYCOSORB生成物の最小推奨含有率2kg/Tより低かった。検出限界LD=0.501±0.103kg/T定量化限界LQ=1.800±0.389kg/T正確さ飼料物質と混合した、濃度が4.0kg/TであるMYCOSORB生成物について、各回につき10個の独立した試料を用いてそれぞれ4つの複製試料において実施した5回の独立した実験から、正確さを測定した。各試料の最終濃度を、上記等式にしたがって、均質性を計算するために得られる観測値を用いて算出した表13。次に、全てのランについて得られる平均の正確さから平均精度を算出し、飼料物質と混合した添加濃度が4.0kg/TのMYCOSORB生成物と比較した。この一連の計算は、上記等式にしたがって実施した。結果は、回収率の評価が、MYCOSORB生成物の添加濃度中における飼料物質の実際の含有率を21過剰評価する原因となったことを示している表14。ニワトリ用飼料物質を用いた検証ALLTECH,Inc.社KY、米国にあるCenterforAnimalNutrigenomicsandAppliedAnimalNutritionにおいて、固形のニワトリ用飼料配合物と5つの異なる濃度のMYCOSORB生成物との混合物について、検査を実施した。同じマイクロタイタープレート上に分散配置した場合について、それぞれ0.0kg/T、0.5kg/T、1.0kg/T、4.0kg/T、5.0kg/T、6.0kg/TのMYCOSORB生成物と混合したニワトリ用飼料物質を、未知のレベルのMYCOSORB生成物と混合した同じニワトリ用飼料物質の試料とともに分析した。適応可能性複合一般動物用飼料におけるMYCOSORB生成物を追跡することを目的とするトレーサビリティのエンドポイント過程として、MYCOSORB生成物および代替物を分析するために開発されたELISAアッセイの特性を確定するために、検証を行った。検証には、飼料の試料と混合する含有レベル0.0kg/T、0.5kg/T、1.0kg/T、4.0kg/T、5.0kg/T、6.0kg/Tの機能範囲に対応する6つのレベルのMYCOSORB生成物参照番号285965を使用した。希釈済みウサギ多クローン性抗体溶液。一次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。1μlの抗体溶液14.15を7.5mlのPBS1×に加えることによって、抗体をPBS中で1:7,500まで希釈した。各マイクロタイタープレートには、体積が10mlの溶液が必要であった。希釈済みヤギの抗ウサギ抗体。二次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。1μlの抗体溶液2を30.0mlのPBS1×に加えることによって、抗体をPBS中で1:30,000まで希釈した。均質性試料の均質性の検証を、実験計画において、MYCOSORB生成物の含有レベルの中央値4.0kg/Tについて行った。この特定のレベルについてのアッセイを、各試料について4つの複製を用いて、10個の各試料に対して5回繰り返した表15。較正既知の標準試料濃度で、0.0kg/T~6.0kg/Tの範囲のMYCOSORB生成物と混合した飼料に対して、アッセイの較正を行った。線形曲線近似y=Axを利用して、濃度と応答性OD450との間の関係を規定した。5回のランから得られた平均検量線を図5にまとめる。線形性ブランクを減算した後に、OD450での吸収度に対してプロットした含有レベルの等式にしたがって、切片がゼロである最もよく一致する線ΔOD450=AxMYCOSORBを用いて、回帰係数の計算から、検量線の線形性を評価した。r2が0.95を超える場合の相関係数の値を用いて、検量線の線形性を検証する。各標準ラン曲線および平均標準ラン曲線について算出した回帰係数を、表16に記載する。反復率反復率は、反復率の標準偏差の評価による内部分散の尺度である。同一ランの反復中における反復率の評価は、同じ試料から同じ日に同じランに対して同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、1ラン内の検出のばらつきCVintraを表す表17。異なるラン間の反復率の評価は、同じ試料から異なる日に異なるランで同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、ラン間の検出のばらつきCVInterを表す表18。結果は、同じ日に得られる検量線も異なる日に得られる検量線もほとんどばらつきがなく、平均日内精度が6.00であることを示している。ただし、試料間の差は、0.0kg/T~6.0kg/Tの検量線機能範囲に適用される場合、より顕著であり、日間精度は21.52であり、全体的な精度は21.75であった表19。LDおよびLQ感度LD値およびLQ値を表20に記載する。得られた各LQ値は、飼料物質における定量化が可能になる、MYCOSORB生成物の推奨含有率より低かった。検出限界LD=0.547±0.237kg/T定量化限界LQ=1.864±0.806kg/T正確さ飼料物質と混合した、濃度が4.0kg/TであるMYCOSORB生成物について、各回につき10個の独立した試料を用いてそれぞれ4つの複製試料において実施した5回の独立した実験から、正確さを測定した。各試料の最終濃度を、本明細書に記載するように、均質性を計算するために得られる観測値を用いて算出した表21。次に、全てのランについて得られる平均の正確さから平均精度を算出し、飼料物質と混合した添加濃度が4.0kg/TのMYCOSORB生成物と比較した。この一連の計算は、上記等式にしたがって実施した。結果は、回収率が、MYCOSORB生成物の添加濃度中における飼料物質の実際の含有率を18過剰評価する原因となったことを示している表22。ブタ用飼料物質を用いた検証ALLTECH,Inc.社KY、米国にあるCenterforAnimalNutrigenomicsandAppliedAnimalNutritionにおいて、固形のブタ用飼料配合物と5つの異なる濃度のMYCOSORB生成物との混合物について、検査を実施した。同じマイクロタイタープレート上に分散配置した場合について、それぞれ0.0kg/T、0.5kg/T、1.0kg/T、4.0kg/T、5.0kg/T、6.0kg/TのMYCOSORB生成物と混合したブタ用飼料物質を、未知のレベルのMYCOSORB生成物と混合した同じブタ用飼料物質の試料とともに分析した。適応可能性複合一般動物用飼料におけるMYCOSORB生成物を追跡することを目的とするトレーサビリティのエンドポイント過程として、MYCOSORB生成物および代替物を分析するために開発されたELISAアッセイの特性を確定するために、検証を行った。検証には、飼料の試料と混合する含有レベル0.0kg/T、0.5kg/T、1.0kg/T、4.0kg/T、5.0kg/T、6.0kg/Tの機能範囲に対応する6つのレベルのMYCOSORB生成物を使用した。希釈済みウサギ多クローン性抗体溶液。一次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。1μlの抗体溶液1を3.5mlのPBS1×に加えることによって、抗体をPBS中で1:3,500まで希釈した。各マイクロタイタープレートには、体積が10mlの溶液が必要であった。希釈済みヤギの抗ウサギ抗体。二次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。1μlの抗体溶液2を30.0mlのPBS1×に加えることによって、抗体をPBS中で1:30,000まで希釈した。均質性試料の均質性の検証を、実験計画において、MYCOSORB生成物の含有レベルの中央値4.0kg/Tについて行った。この特定のレベルについてのアッセイを、各試料について4つの複製を用いて、10個の各試料に対して5回繰り返した表23。較正既知の標準試料濃度で、0.0kg/T~6.0kg/Tの範囲のMYCOSORB生成物と混合した飼料に対して、アッセイの較正を行った。切片をゼロに設定した線形曲線近似y=Axを利用して、濃度と応答性OD450との間の関係を規定した、5回のランから得られた平均検量線を図6にまとめる。線形性ブランクを減算した後に、OD450での吸収度に対してプロットした含有レベルの等式にしたがって、切片がゼロである最もよく一致する線ΔOD450=AxMYCOSORBを用いて、回帰係数の計算から、検量線の線形性を評価した。r2が0.95を超える場合の相関係数の値を用いて、検量線の線形性を検証する。各標準ラン曲線および平均標準ラン曲線について算出した回帰係数を、表24に記載する。反復率反復率は、反復率の標準偏差の評価による内部分散の尺度である。同一ランの反復中における反復率の評価は、同じ試料から同じ日に同じランに対して同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、1ラン内の検出のばらつきCintraを表す表25。異なるラン間の反復率の評価は、同じ試料から異なる日に異なるランで同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、ラン間の検出のばらつきCVInterを表す表26。結果は、0.0kg/T~6.0kg/Tの検量線機能範囲に適用される場合、同じ日に得られる検量線も異なる日に得られる検量線もほとんどばらつきがなく、平均日内精度が7であり、日間精度が20であることを示している。LDおよびLQ感度LD値およびLQ値を表28に記載する。得られた各LQ値は、飼料物質における定量化が可能になる、MYCOSORB生成物の推奨含有率より低かった。検出限界LD=0.403±0.150kg/T定量化限界LQ=1.363±0.498kg/T正確さ飼料物質と混合した、濃度が4.0kg/TであるMYCOSORB生成物について、各回につき10個の独立した試料を用いてそれぞれ4つの複製試料において実施した5回の独立した実験から、正確さを測定した。各試料の最終濃度を、本明細書に記載するように、均質性を計算するために得られる観測値を用いて算出した表29。次に、全てのランについて得られる平均の正確さから平均精度を算出し、飼料物質と混合した添加濃度が4.0kg/TのMYCOSORB生成物と比較した。この一連の計算は、上記等式にしたがって実施した。結果は、回収率の評価が、MYCOSORB生成物の添加濃度中における飼料物質の実際の含有率を20過剰評価する原因となったことを示している表30。ニワトリ用飼料物質およびブタ用飼料物質を用いた検証飼料のアッセイにおいてMYCOSORBを検出するためのELISAを、ニワトリのマトリクスおよびブタのマトリクスにおいて実施し、独立した研究室で検証し、検証結果と比較した。アッセイは、Alimetrics,Ltd.社Koskelontie19B,Espoo、フィンランドにおいて検証した。アッセイの較正を、0.0kg/T~6.0kg/Tの範囲の既知の標準試料濃度のMYCOSORB生成物と混合した飼料に対して異なる日に2回実施した。切片がゼロであるy=Axを用いた線形曲線近似を利用して、ブタ用飼料およびニワトリ用飼料における濃度と応答性OD450との間の関係を規定した。吸光度、および、その結果として得られる較正はラン毎に大幅に異なったが、既知の試料の絶対濃度および盲検試料の絶対濃度は同じである。線形性ブランクを減算した後に、OD450での吸収度に対してプロットした含有レベルの等式にしたがって、切片がゼロである最もよく一致する線ΔOD450=AxMYCOSORBを用いて、回帰係数の計算から、検量線の線形性を評価した。r2が0.95を超える場合の相関係数の値を用いて、検量線の線形性を検証する。相関係数の範囲は0.991~0.994であった表31。LDおよびLQ感度LD値およびLQ値を、40の塩酸マトリクスにおいて求めた。LD値およびLQ値の各推定値は、それぞれ、ニワトリ用飼料と混合したMYCOSORBの場合は0.35kg/Tおよび1.20kg/T、および、ブタ用飼料と混合したMYCOSORBの場合は0.27kg/Tおよび0.91kg/Tであったそれぞれ表32および表33を参照。既知の試料の正確さおよび精度飼料物質と混合した、濃度が4.0kg/TであるMYCOSORB生成物について、各回につき6つの複製試料において実施した2回の独立した実験から、正確さを測定した。全てのランについて得られる平均の正確さから平均精度を算出し、飼料物質と混合した添加濃度が4.0kg/TのMYCOSORB生成物と比較した。得られた値は、後述するように、正確さおよび精度のどちらの判断基準も満たした。同一ランの反復中における反復率の評価は、同じ試料から同じ日に同じランに対して同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、1ラン内の検出のばらつきCVintraを表す。異なるラン間の反復率の評価は、同じ試料から異なる日に異なるランで同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、ラン間の検出のばらつきCVInterを表す。得られた値は、後述するように、ニワトリ用マトリクスおよびブタ用マトリクスについて、正確さおよび精度のどちらの判断基準も満たした表34および表35。未知の試料の正確さおよび精度飼料物質と混合した、濃度が4.0kg/TであるMYCOSORB生成物について、各回につき3つの複製試料について実施した2回の独立した実験から、盲検検査において正確さを測定した。得られた値は、後述するように、正確さおよび精度のどちらの判断基準も満たした表36および表37。耐久性測定方法が持つ、環境および過程に関連する変数が微量な変化をした場合に結果に生じ得る変化に抵抗する能力を、耐久性分析によって評価する。一次抗体の希釈物および二次抗体の希釈物を変化させることによって、ELISAアッセイ法の安定性を調べ、さらに、検査対象となる異なる試料のマイクロタイタープレート上での分散配置を変更することによって、一次抗体の安定性を調べた測定する全ての試料、ブランク試料、標準試料、および、未知の試料を備えた単一のプレートと、分析する試料1つ当たりにより多くの反復を備えているが、ブランク試料、標準試料、および、未知の試料が異なるマイクロタイタープレート上にある、複数のマイクロタイタープレート。表38にばらつきを示す。この表は、たとえ変更を実施しても結果には一貫性があることを示しており、特に抗体の希釈におけるばらつきに対して上記検査方法が強力な耐久性を有すること示唆している。実施例5単クローン性抗体特異性検査方法17個の化合物をPBS中で50μg/mlの濃度で検査し、酵母1→4-α-D-グルカン/1→6-β-D-グルカン-BSA接合体に対して産生させた単クローン性抗体による交差反応性について判定した。検査した化合物は、可溶性澱粉ジャガイモ、澱粉米、澱粉コムギ、澱粉トウモロコシ、BSA、ウサギからのグリコーゲン、カキからのグリコーゲン、ウシのグリコーゲン、マンナン、ラミナリン、ザイモシンZymosinA、マルトリンQD、パン酵母から得られるグルカン、Eug.gracilisから得られる1→3-β-D-グルカン、Torula酵母、Ycw-02ビーズピータービーズピーターで調製した酵母細胞壁画分、オオムギから得られるβグルカンであった。さらに、酵母細胞壁抽出物MYCOSORB、バッチ番号08FS001と、単クローン性抗体を産生させるために使用した1→4-α-D-グルカン/1→6-β-D-グルカン-BSA抗原とを、1μg/ml、2μg/ml、および、5μg/mlの濃度で検査した。どちらの単クローン性抗体513A161.1および513A431.1も、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:1500、および、1:2000の希釈範囲でアッセイした。96個のウェルを備えたNunc社のマイクロタイタープレートロット番号0702013を使用した。各プレートを100μl/ウェルの化合物でコーティングし、指先で8回~10回はじくことによって攪拌した。これらのプレートを封止用テープで被覆し、37°Cで1時間インキュベーションした。溶液を取り除いて、多チャンネルピペットを用いて1回につき200μlのPBSで、プレートを3回洗浄した。洗浄溶液を各回において取り除く前に、プレートを指先8回~10回はじいた。各回の洗浄の次の回の洗浄との間には、プレートを紙タオルの上ではじくことによって、過剰な流体を取り除いた。ブロッキングするために、100μl/ウェル3の遠心分離にはかけていない乳を加えた。各プレートを室温で1時間インキュベーションした。ブロッキング溶液を取り除き、ウェルを200μlのPBSで1回、200μlのPBSと0.05のポリソルベート20とで2回洗浄した。洗浄溶液を各回において取り除く前に、指先で8回~10回はじくことによって、プレートを攪拌した。各回の洗浄の次の回の洗浄との間には、プレートを紙タオルの上ではじくことによって、過剰な流体を取り除いた。適切な血清の希釈物を各ウェルに100μlずつ加えた。ブランクウェルには、PBS100μl/ウェルを使用した。プレートを被覆した状態で、室温で1時間インキュベーションした。溶液を取り除き、ウェルを1回につき200μlのPBSと0.05のポリソルベート20とで3回洗浄した。洗浄物を各回において取り除く前に、プレートを指先で8回~10回はじいて攪拌した。各回の洗浄の次の回の洗浄との間には、プレートを紙タオルの上ではじくことによって、過剰な流体を取り除いた。二次抗体1:10,000のヤギ抗マウス、IgG-ペルオキシダーゼ接合体を各ウェルに100μlずつ加えた。プレートを被覆した状態で、室温で1hインキュベーションした。溶液を取り除き、ウェルを1回につき200μlのPBSと0.05のポリソルベート20とで3回洗浄した。洗浄物を各回において取り除く前に、プレートを指先で8回~10回はじいて攪拌した。各回の洗浄の次の回の洗浄との間には、プレートを紙タオルの上ではじくことによって、過剰な流体を取り除いた。室温のTMB基質を各ウェルに100μlずつを加えた。5分後に、100μl/ウェルの1NのHClを用いて反応を停止させた。プレートの底部を、指紋を残さないようにきれいに拭いた。さらに、10秒間振盪した後に、マイクロタイタープレート読み取り装置を用いて、450nmにおける吸光度を読み取った。結果ELISAデータの棒グラフを図9~図14に示す。513A161.1と513A431.1とはどちらも、1μg/mlという低い濃度でも抗原499-73-3と非常に激しく反応し、2μg/mlで最も高い吸光度読み取り値を示した。抗体は、1μg/ml~5μg/mlの範囲の濃度で08FS001を認識することもでき、5μg/mlで最も高い吸光度読み取り値を示した。ただし、08FS001の場合には、抗原499-73-3の場合に比べて、吸光度が大幅に低かった。抗体513A161.1はラミナリンを認識し、これとかなり反応したが、513A431.1は認識しなかった。どちらの抗体も、ザイモシンZymosinAに対しては非常に高い吸光度読み取り値を示した。これは、抗原499-73-3の場合に見られる吸光度と同程度であり、時にはより高い吸光度であった。驚くべきことに、各抗体は、ザイモシンZymosinA、マルトリンQD、パン酵母から得られるグルカン、Eug.gracilisから得られる1→3-β-D-グルカン、Torula酵母、および、Ycw-02ビーズピーターペレットに対してかなりの交差反応を示したので、定量ELISAアッセイのために該抗体を使用することは制限された。実施例6飼料から抽出された抗原が検出できるように、単クローン性抗体ELISAアッセイ条件を最適化する試みPBSにおける希釈とPBS3脱脂乾燥乳との比較単クローン性抗体513A161.1実施例5を使用して、飼料から抽出された抗原を定量ELISAアッセイにおいて検出しようとすると、吸光度読み取り値が低かった。PBSではなく、3の乳において抗体を希釈したことが吸光度読み取り値に影響したかどうかを例えば、飼料抽出物成分と組み合わせた場合に過度なブロッキングを引き起こすことによって判定するために、以下のプロトコールを実施した。酵母細胞壁抽出物MYCOSORB、バッチ番号08FS001を、0.5のHClを含有する溶液にして、実施例4に記載の化学抽出プロセスにかけた。ELISAアッセイを、実施例5に記載のように、単クローン性抗体513A161を1:400の希釈度で一次抗体として用い、さらに、PBSまたは3の乳のいずれかにおいて希釈したヤギ抗マウスIgG-HRP抗体1:10,000を二次抗体として用いて実施した。マイクロタイタープレートを、酵母細胞壁抽出物100μl/ウェルまたはPBSで1:1に希釈した抽出物200μl/ウェルでコーティングした。図15に示した結果によって、抗体希釈液の持つ、軽微であって統計学的には有意でない効果が観察されることが確認された。また、試しに単クローン性抗体を使用して、抗原を3組、0.5のHClで抽出した飼料標準品中において検出してみようとすると、複製間の読み取り値のばらつきが大きく、標準偏差が大きく、吸光度読み取り値が異常に増大した。抗原コーティングステップ、温度と時間試しに単クローン性抗体513A161.1を使用実施例5して、飼料から抽出した抗原を定量ELISAアッセイにおいて検出すると、吸光度読み取り値が低かった。マウスの単クローン性抗体513A161.1を用いてELISAの吸光度読み取り値を大きくするために、後述の実験を実施し、抗原コーティングインキュベーションステップの時間および温度を変更することによって、バックグラウンド/非特異的結合を増加させずに、飼料から抽出した抗原の検出を改善できるかどうかを判断した。プロトコールには、飼料抽出を上述のように実施して分析用試料を生成することを含めた。試料の部分標本は、プレート上でただちにコーティングするか、または、-25°Cで一晩保存するかのいずれかの処理を行った。試料の調製を3回繰り返して、3組の抽出物を生成した。ニワトリ用飼料調製物において抗原を使用して、6点からなる検量線0kg/T、0.4kg/T、0.8kg/T、1.2kg/T、1.8kg/T、2.4kg/Tを作成した。プレートを飼料抽出物でコーティングして放置して、4°Cで一晩安置、4°Cで一晩振盪、または、37°Cで1時間安置インキュベーションした。ELISAアッセイを、実施例5に記載のように、3の乳で1:400に希釈した単クローン性抗体513A161.1を一次抗体として用い、さらに、3の乳で希釈したヤギ抗マウスIgG-HRP抗体1:10,000を二次抗体として用いて実施した。基質を30分間インキュベーションし、450nmにおける吸光度を求めた。図16に示す結果は、抗原をプレート上にコーティングする時間および温度を変更しても、吸光度を最適な範囲に達するまでには増加させなかったこと、さらに、このような変更が検量線の線形性に影響しなかったことを示唆している。また、バックグラウンドはインキュベーション時間からは独立的に増加した。実施例7多クローン性抗体の選択性干渉検査干渉度を求めるために、MYCOSORB生成物参照番号285965を1kg/Tで含む本明細書に記載のニワトリ用飼料物質と、これを含まない該ニワトリ用飼料物質とを用いて、1セットのアッセイを実施した。なお、このMYCOSORB生成物を1kg/Tで含むニワトリ用飼料物質については、飼料配合物中に見られる炭水化物または副生成物に属する、考え得る干渉物を複数の比率MYCOSORB生成物の含有レベルに対して50、100、200w/wで含んだものと含んでいないものとを用意した。この点において、以下の各生成物について調査および検査して、以下に規定する方法でMYCOSORB生成物の検出に対する影響を評価した。アミロースジャガイモ澱粉。比が30:1の1→4:1→6-α-D-グルカンマルトデキストリンおよびコーンシロップの固形物。自然のトウモロコシ澱粉から生成される、容易に消化可能な炭水化物、ブドウ糖の重合体ウシの肝臓から得られるIX型のグリコーゲン。比が10:1の1→4:1→6-α-D-グルカンLaminariadigitataから得られるラミナリン。比が3:1の1→3:β1→6-β-D-グルカン乾燥醸造粕。トウモロコシからバイオエタノールを生成する際の副生成物Saccharomycesbayanusから得られるRedStar登録商標パスツールシャンパーニュ活性乾燥ワイン酵母。酵母および酵母細胞壁1→3:β1→6-β-D-グルカン、タンパク質にリンクした1→4:1→6-α-D-ポリマンノース、1→2:1→4-β-N-アセチルグルコスマミンacetylglucosmamineから形成される複合糖質。図7および図8に示すように、MYCOSORB生成物の場合に得られたシグナルと、50、100、200w/wの干渉物質と混合したMYCOSORB生成物の場合に得られたシグナルとの間の差の合計は、約OD450値で0であった。この結果は、干渉が欠如していることを説明しており、したがって、様々な炭水化物系干渉物質を含む複合飼料マトリクスにおいてMYCOSORB生成物を検出するためのアッセイが有する特異的な特徴を説明している。個々の干渉物質に関する詳細な結果、および、一方向ANOVA検査信頼区間は95の制約については、表39~表44に示す。なお、表39~表44中では、標準偏差および変動係数だけではなく、光学濃度450nmの平均値および試料間の差も算出した。各干渉物質における分散の均等性を、レーベン検定、オブライエン検定、および、ブラウンフォーサイス検定によって評価した。非一定の分散の場合には、ノンパラメトリックなクラスカルワーリスの一方向ANOVA法を、非正規性に対してより強力で異常値に対する耐性が高い検定を実現するランク変換とともに使用した。分析は、検査対象の干渉物質の濃度ごとに別々のプレート上で、または、単一の個々のプレート上で実施した。2つのプレートの調製物について、同一の結果が得られた。本明細書に記載の全ての出版物および特許文献は、参照によって本明細書に引用されるものとする。本発明の上記方法およびシステムの各種の変更および変形例は、当業者には明らかであり、本発明の技術的範囲および精神から逸脱するものではない。本発明については、特定の好適な実施形態との関連において記載してきたが、クレームに規定した本発明がこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際に、炭水化物化学分野、微生物学、動物飼料および栄養学、免疫学、または、これらに関連する分野の当業者には自明な、本発明を実施するための上記モードの各種変更は、以下に記す請求項の範囲内にあることを意図している。グルカン画分P1、P2、P3、および、S1、S2、および、S3の生成の概略図を示している例えば、実施例1を参照。元のウサギの抗血清の応答性、および、親和性精製済み抗血清の4つの上清の応答性を示している。親和性精製済み抗血清は、β-1,6-グルカンに特異的なGab1~Gab4抗体を、BSAでコーティングされたマイクロウェルプレートに分離することによって得られた例えば、実施例3を参照。本明細書記載する方法で生成した、精製済みの抗1→4-α-/1→6-β-D-グルカン-BSA多クローン性ウサギ抗体を使用して作成した較正曲線を示している例えば、実施例2および3を参照。MYCOSORBの6つの含有レベルを用いて乳業用飼料物質において実施した、5つのアッセイから得られた平均検量線を示している。右側のy軸は、検量線に対する、日内CVintra併行精度および日間CVinter併行精度を示す。MYCOSORBの6つの含有レベルを用いてニワトリ用飼料物質において実施した、5つのアッセイから得られた平均検量線を示している。右側のy軸は、検量線に対する、日内CVintra併行精度および日間CVinter併行精度を示す。MYCOSORBの6つの含有レベルを用いてブタ用飼料物質において実施した、5つのアッセイから得られた平均検量線を示している。右側のy軸は、検量線に対する、日内CVintra併行精度および日間CVinter併行精度を示す。複数のマイクロタイタープレートを分散配置した場合において、干渉物の平均の光学濃度読み取り値ΔOD450の差を、ニワトリ用飼料において得られるMYCOSORB生成物のシグナルから減じた値を示している実施例7。干渉物は、MYCOSORB生成物100、1.0kg/Tとともに、50、100、200w/wの割合で加えた。単一のマイクロタイタープレートを配置した場合において、干渉物の平均の光学濃度読み取り値ΔOD450の差を、ニワトリ用飼料において得られるMYCOSORB生成物のシグナルから減じた値を示している実施例7。干渉物は、MYCOSORB生成物100、1.0kg/Tとともに、50、100、200w/wの割合で加えた。濃度が1:100である場合の、単クローン性抗体513A161.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。濃度が1:200である場合の、単クローン性抗体513A161.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。濃度が1:500である場合の、単クローン性抗体513A161.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。濃度が1:1000である場合の、単クローン性抗体513A161.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。濃度が1:1500である場合の、単クローン性抗体513A161.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。濃度が1:2000である場合の、単クローン性抗体513A161.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。濃度が1:100である場合の、単クローン性抗体513A431.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。濃度が1:200である場合の、単クローン性抗体513A431.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。濃度が1:500である場合の、単クローン性抗体513A431.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。濃度が1:1000である場合の、単クローン性抗体513A431.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。濃度が1:1500である場合の、単クローン性抗体513A431.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。濃度が1:2000である場合の、単クローン性抗体513A431.1の交差反応性を示唆する、ELISAアッセイの結果を示している。希釈せずに、または、PBSもしくはPBS3脱脂乾燥乳で1:1に希釈してプレートにセットした、平均のELISAアッセイ吸光度読み取り値と、3つの酵母細胞壁抽出標準品の標準偏差とを示している実施例6。実施例6に記載のELISAミクロプレート用コーティング時間および温度によって実施したインキュベーションについて、飼料抽出物の検量線のグラフを示している。"