"Streptomyces属放線菌において対数増殖期以降に特異的に遺伝子発現を誘導することができるプロモーター。前記Streptomyces属放線菌が、ε-ポリ-L-リジン生産菌である、請求項1に記載のプロモーター。ε-ポリ-L-リジン生産菌のpls遺伝子の開始コドンATG又はGTGから上流約350bp以内に存在する、請求項2に記載のプロモーター。配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号4のヌクレオチド配列を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のプロモーター。配列番号4のヌクレオチド配列を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のプロモーター。請求項1~5のいずれか一項に記載のプロモーターを含む発現ベクター。ε-ポリ-L-リジン生産菌において目的の遺伝子を発現させるために使用される、請求項6に記載の発現ベクター。前記ε-ポリ-L-リジン生産菌が、Streptomyces属放線菌、Kitasatospora属放線菌、またはEpichloe属糸状菌である、請求項7に記載の発現ベクター。前記Streptomyces属放線菌がSalbulusである、請求項8に記載の発現ベクター。ターミネーターを前記プロモーターの下流にさらに含む、請求項6~9のいずれか一項に記載の発現ベクター。前記ターミネーターのヌクレオチド配列が、配列番号7または配列番号8のヌクレオチド配列を含む、請求項10に記載の発現ベクター。タグ配列を前記プロモーターの制御下にさらに含む、請求項10または11に記載の発現ベクター。前記タグ配列が、配列番号9または配列番号10のヌクレオチド配列を含む、請求項12に記載の発現ベクター。前記プロモーターの制御下に目的の遺伝子を含む、請求項6~13のいずれか一項に記載の発現ベクター。前記目的の遺伝子が前記ε-ポリ-L-リジン生産菌と同種または異種の生物由来の遺伝子または遺伝子クラスターである、請求項14に記載の発現ベクター。前記目的の遺伝子が、pls遺伝子、bpsA遺伝子、hasA遺伝子、mhasA遺伝子、hasB遺伝子、hasBホモログ遺伝子、hasD遺伝子、またはhasDホモログ遺伝子である、請求項15に記載の発現ベクター。配列番号13、配列番号14、または配列番号15のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。請求項1~5のいずれか一項に記載のプロモーターおよびその制御下にある目的の遺伝子、または請求項14~16に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。Streptomyces属放線菌、Kitasatospora属放線菌、またはEpichloe属糸状菌である、請求項18に記載の宿主細胞。ε-ポリ-L-リジン生産菌である、請求項19に記載の宿主細胞。宿主細胞において、請求項1~5のいずれか一項に記載のプロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現させることにより、該遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドを生産することを含む、有用物質の生産方法。請求項14~16のいずれか一項に記載の発現ベクターを、前記宿主細胞に導入することを含む、請求項21に記載の方法。請求項18~20のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、有用物質の生産方法。Salbulus、及びその他のε-ポリ-L-リジン生産菌のpls遺伝子欠損又は破壊株を培養することを含む、請求項21に記載の有用物質の生産方法。請求項14~16のいずれか一項に記載の発現ベクターを、前記pls遺伝子欠損又は破壊株に導入することを含む、請求項24に記載の有用物質の生産方法。前記有用物質が、1段階または多段階の反応により生合成される化合物である、請求項21~25のいずれか一項に記載の有用物質の生産方法。このような背景から、高い物質生産能及び前駆体供給能を有する放線菌例:Streptomyces属において導入遺伝子の特異的な発現制御が可能であり、新規生理活性物質研究や有用生理活性物質生産のツールとなり得る宿主ベクター系の開発が求められている。また、有用物質の大量生産へ応用可能な、より効率的ATP再生系の開発もまた求められている。したがって、本発明は、以下のプロモーター、発現ベクター、宿主細胞、および所望の有用物質の生産方法を提供する。1Streptomyces属放線菌において対数増殖期以降に特異的に遺伝子発現を誘導することができるプロモーター。2上記Streptomyces属放線菌が、ε-ポリ-L-リジン生産菌である、上記1に記載のプロモーター。3ε-ポリ-L-リジン生産菌のpls遺伝子の開始コドンATG又はGTGから上流約350bp以内に存在する、上記2に記載のプロモーター。4配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号4のヌクレオチド配列を含む、上記1~3のいずれか一項に記載のプロモーター。5配列番号4のヌクレオチド配列を含む、上記1~4のいずれか一項に記載のプロモーター。6上記1~5のいずれか一項に記載のプロモーターを含む発現ベクター。7ε-ポリ-L-リジン生産菌において目的の遺伝子を発現させるために使用される、上記6に記載の発現ベクター。8上記ε-ポリ-L-リジン生産菌が、Streptomyces属放線菌、Kitasatospora属放線菌、またはEpichloe属糸状菌である、上記7に記載の発現ベクター。9上記Streptomyces属放線菌がSalbulusである、上記8に記載の発現ベクター。10ターミネーターを上記プロモーターの下流にさらに含む、上記6~9のいずれか一項に記載の発現ベクター。11上記ターミネーターのヌクレオチド配列が、配列番号7または配列番号8のヌクレオチド配列を含む、上記10に記載の発現ベクター。12タグ配列を上記プロモーターの制御下にさらに含む、上記10または11に記載の発現ベクター。13上記タグ配列が、配列番号9または配列番号10のヌクレオチド配列を含む、上記12に記載の発現ベクター。14上記プロモーターの制御下に目的の遺伝子を含む、上記6~13のいずれか一項に記載の発現ベクター。15上記目的の遺伝子が上記ε-ポリ-L-リジン生産菌と同種または異種の生物由来の遺伝子または遺伝子クラスターである、上記14に記載の発現ベクター。16上記目的の遺伝子が、pls遺伝子、bpsA遺伝子、hasA遺伝子、mhasA遺伝子、hasB遺伝子、hasBホモログ遺伝子、hasD遺伝子、またはhasDホモログ遺伝子である、上記15に記載の発現ベクター。17配列番号13、配列番号14、または配列番号15のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。18上記1~5のいずれか一項に記載のプロモーターおよびその制御下にある目的の遺伝子、または上記14~16に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。19Streptomyces属放線菌、Kitasatospora属放線菌、またはEpichloe属糸状菌である、上記18に記載の宿主細胞。20ε-ポリ-L-リジン生産菌である、上記19に記載の宿主細胞。21宿主細胞において、上記1~5のいずれか一項に記載のプロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現させることにより、該遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドを生産することを含む、有用物質の生産方法。22上記14~16のいずれか一項に記載の発現ベクターを、上記宿主細胞に導入することを含む、上記21に記載の方法。23上記18~20のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、有用物質の生産方法。24Salbulus、及びその他のε-ポリ-L-リジン生産菌のpls遺伝子欠損又は破壊株を培養することを含む、上記21に記載の有用物質の生産方法。25上記14~16のいずれか一項に記載の発現ベクターを、上記pls遺伝子欠損又は破壊株に導入することを含む、上記24に記載の有用物質の生産方法。26上記有用物質が、1段階または多段階の反応により生合成される化合物である、上記21~25のいずれか一項に記載の有用物質の生産方法。本発明のプロモーター、発現ベクター、宿主細胞、または有用物質生産方法を使用することにより、従来実現することができなかった組換えε-ポリ-L-リジン合成酵素組換えPlsを効率的に生産蓄積することができる。本発明により、ε-ポリ-L-リジン高生産が実現される。また、本発明のプロモーター、発現ベクター、宿主細胞、または有用物質生産方法を使用することにより、所望の有用物質の効率的生産が可能になる。1.本発明のプロモーター本発明は、1つの実施形態において、Streptomyces属放線菌において、二次代謝産物生産に適した対数増殖期以降に、特異的に遺伝子の発現を誘導するプロモーターを提供する。本発明のプロモーター配列は、典型的には、Streptomyces属放線菌のゲノムに由来し、pls遺伝子の開始コドンATGから上流約350bp以内の領域に存在する。本発明のプロモーターには、典型的には、配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号4のヌクレオチド配列を含むプロモーターが含まれるがこれに限定されず、その機能的等価物、すなわち、ε-ポリ-L-リジン生産菌に由来し、対数増殖期以降に特異的にε-ポリ-L-リジン合成酵素遺伝子の発現を誘導する任意のプロモーターが含まれる。本発明のプロモーター配列は、pls遺伝子のクラスター周辺領域を、例えば、後述の実施例において具体的に示すようなプロモーター予測プログラムを使用して、またはそれに準じる方法を利用して探索することによって特定することができる。必要に応じて、後述の実施例において具体的に示すような方法を用いたpls遺伝子の発現解析の方法またはそれに準じる方法を用いることによって、本発明のプロモーター領域を特定しうる。本発明のプロモーターを利用することによって、対数増殖期以降における放線菌、典型的にはε-ポリ-L-リジン生産菌、特にSalbulusの高い二次代謝産物生産能および強力かつ持続的なATPの再生能力前駆体供給能力を利用できるため、任意の導入遺伝子産物による有用物質の生産が可能となるという利点がある。任意の有用物質を生産するために、本発明のプロモーターとその下流制御下に配置された任意の目的遺伝子が、発現ベクターに担持されてε-ポリ-L-リジン生産菌例:Salbulus内に導入され得る。あるいは、発現ベクターを使用せずに任意の目的遺伝子が該プロモーターの下流に配置されるように、ε-ポリ-L-リジン生産菌例:Streptomyces属放線菌例:Salbulus染色体上に相同組換え等によって挿入されてもよい。ε-ポリ-L-リジン生産菌としては、例えばSalbulusのような、対数増殖期以降での高い二次代謝産物生産能および強力かつ持続的なATP再生能力前駆体供給能力を有する菌体を使用すると有利である。本明細書中、プロモーターとはmRNA合成転写開始時にRNAポリメラーゼが結合する領域を指す。plsプロモーターとはpls遺伝子上流343bpの領域を指す。本明細書中、pls遺伝子とは、ε-ポリ-L-リジン合成酵素をコードする遺伝子を指すYamanakaetalNatChemBiol2008Dec476672Epub2008Nov9,特許文献1:特開2008263868を参照。本明細書中、有用物質または有用化合物という用語は、例えば、ε-ポリ-L-リジンのような産業上有用な物質、またはε-ポリ-L-リジンを合成する酵素タンパク質等の産業上有用な物質であって、本発明の有用物質生産法によって直接または間接に生産し得る物質を意味する。本明細書中、所望の有用物質または有用化合物について高生産株とは、該所望の有用物質または有用化合物を高効率で大量に生産する菌株のことをいうものとする。本明細書中、二次代謝産物という用語は、当該分野で通常使用される意味で使用される。すなわち、一次代謝primarymetabolizmは、多くの生物に共通してみられる生化学反応例:エネルギー代謝、アミノ酸タンパク質核酸等の生合成をいうのに対して、生命の維持の上で重要な役割をもたず、各種の動植物または微生物でアルカロイドテルペノイドフェノール類抗生物質色素などが大量に蓄積されることがあり、これらの生合成反応を二次代謝といい、それによって産生される上記アルカロイド等の物質を二次代謝産物という。二次代謝産物の多くは個体の発生の特定の時期、あるいは特定の組織だけで生成される岩波生物学事典第4版1996年3月21日第1刷発行を参照。本明細書中、目的の遺伝子または目的遺伝子とは、生産することが望まれる所望の任意のタンパク質もしくはポリペプチド、所望の有用物質を合成する酵素タンパク質等をコードする遺伝子を指す。目的の遺伝子には、例えば、後述の実施例において示すpls遺伝子、bpsA遺伝子、hasA遺伝子、mhasA遺伝子、hasB遺伝子、hasBホモログ遺伝子例:sav5025、hasD遺伝子、hasDホモログ遺伝子例:sav3561等が含まれるが、これらに限定されず、εポリLリジン生産菌と同種または異種の生物由来の任意の遺伝子および複数の遺伝子のクラスターが含まれる。2.本発明の発現ベクター本発明は、さらなる実施形態において、本発明のプロモーターを担持した発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、放線菌、好ましくはStreptomyces属放線菌、より好ましくはε-ポリ-L-リジン生産放線菌において所望の目的遺伝子を発現させるために使用することができる。ε-ポリ-L-リジン生産菌には、ε-ポリ-L-リジンを生産することが知られている任意の菌体が含まれる。例えば、Streptomyces属放線菌例:Salbulus、Smashuense、Sroseoverticillatus、Slavendulae、Kitasatospora属放線菌例:Kkifnense、糸状菌Epichloesp等が含まれるが、これらに限定されない。本発明の発現ベクターは、上記プロモーターの下流にさらにターミネーター配列を含んでいてもよい。ターミネーター配列は、典型的には、配列番号7または配列番号8のヌクレオチド配列の一部または全部を含むものであるが、これに限定されず、その機能的等価物、すなわち、上記プロモーターの制御下に配置された目的遺伝子の発現において、ターミネーター転写終了のシグナルとして機能する任意のヌクレオチド配列も含まれる。本発明の発現ベクターにおいて使用されるターミネーター配列は、例えば、SalbulusのεポリLリジン生合成遺伝子クラスター下流に見出され得る。ターミネーター配列を本発明の発現ベクターに含ませることによって、目的遺伝子の転写翻訳の安定化および/または効率化を図ることができる。本発明の発現ベクターを用いて産生されるタンパク質は、アフィニティー精製に便利なように、タグタンパク質との融合タンパク質として生産されてもよい。そのために、本発明の発現ベクターは、目的の遺伝子に加えて、タグ配列を含んでいてもよい。タグ配列の具体例としては、後述する実施例に示される配列番号9または配列番号10のヌクレオチド配列が含まれる。融合させるタグの例としては、Histag、GSTtag等が含まれるが、これらに限定されない。タグ融合タンパク質として発現させることによって、組換えタンパク質の生産回収において、例えば、アフィニティー精製を利用することができるという利点が提供される。本発明の発現ベクターの非限定的な具体例は、本発明の実施例に、配列番号13、配列番号14、または配列番号15の発現ベクターとして示されている。3.本発明のプロモーターまたは発現ベクターを導入した宿主細胞本発明は、さらなる実施形態において、上記本発明のプロモーターの制御下に目的の遺伝子が配置されるように遺伝子導入された、または目的の遺伝子を上記プロモーターの制御下に含む上記本発明の発現ベクターを導入した宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞として使用されうる細胞には、Streptomyces属、Kitasatospora属、Rhodococcus属を含む放線菌細胞などが含まれるが、これらに限定されない。典型的には、ε-ポリ-L-リジン生産菌細胞が本発明の宿主細胞として使用されうる。任意の有用物質の生産に本発明の宿主細胞を用いる場合、例えば、後述の参考例および実施例に示す、Salbulus△pls株のような、その宿主細胞が元々有するpls遺伝子を予め破壊したものを使用すると、対数増殖期以降での二次代謝産物生産能およびATP再生能が、その菌体の主生産物であるε-ポリ-L-リジン生産に消費されなくなるため、より効率的な有用物質生産を実現しうるため有利である。4.有用物質の生産方法本発明はまた、さらなる実施形態において、本発明のプロモーターまたは本発明の発現ベクターを利用した有用物質の効率的な生産方法を提供する。この方法は、放線菌、典型的には、ε-ポリ-L-リジン生産菌において、上述の本発明のプロモーター制御下で目的の遺伝子を発現させることを含む。代替的に、上記本発明の発現ベクターを、当業者に周知の技術を用いて上記ε-ポリ-L-リジン生産菌に導入することによって、目的の遺伝子のコードする目的のタンパク質を生産してもよい。代替的に、上記本発明の発現ベクターを導入した宿主細胞を培養することによって、任意の有用物質を生産してもよい。培養条件培養液組成、培養期間等は、目的に応じて当業者が適宜設定できる。以下、実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。[参考例]εポリLリジンの発酵生産過程においてSalbulusは、対数増殖期以降の自身の生育には適さない酸性条件下でのみ、著量のεポリLリジンを生産するという特徴的性質を示す。この特性は、εポリLリジン生産過程では、前駆体Lリジン及びエネルギー物質としてのATPを、自身の生育一次代謝より二次代謝産物であるεポリLリジンの生産に優先的に利用している事を意味する。KaharらJBiosciBioeng2001911904によれば、SalbulusS410株SalbulusNBRC14147の誘導株は、8日間の培養で、実に483glのεポリLリジンを培養液中に生産蓄積する。従って、Salbulus又はその誘導株は、εポリLリジン高生産株であると同時に、前駆体であるLリジンの高生産株であると言える。更に、もう一方の前駆体であるATPは、εポリLリジン合成反応に伴ってAMPへと変換されるため特開2008263868、εポリLリジン生産菌細胞内において、一部新生されるATPもあろうが、AMPからATPへの再生系が持続的且つ強力に機能していることも明らかである。εポリLリジン中の1リジン残基あたりの質量数は128であり、従って、483glのεポリLリジン中のLリジン残基は≒038mollとなる。εポリLリジンの平均重合度は30merであるため、1分子中のペプチド結合数は301=29である。Plsは1回のリジン同士のペプチド結合形成縮合反応あたりATP1分子を要求するので、消費したATPは038moll×2930037mollとなる。そうすると、SalbulusS410株では8日間の培養中に037mollのATPを消費して、483glのεポリLリジンを生産していることになり、前述の耐熱性ポリリン酸キナーゼにより再生されるATP量よりはるかに多い。ATP2Na塩として実に2039glに相当する。従って、εポリLリジン生産菌SalbulusNBRC14147又はその誘導株を宿主とする遺伝子発現系であれば、Salbulusが有する酸性条件下での高い二次代謝産物生産能及び強力且つ持続的ATP再生能力を利用することができ、課題である有用物質の大量生産へ応用可能な効率的ATP再生、及び放線菌による任意の有用物質生産の双方を同時に解決する強力な手段になると考えられた。また、宿主Salbulusが有するpls遺伝子を予め破壊しておくことでSalbulus△pls株、酸性条件下での二次代謝産物生産能及びATP再生能が、本菌の主生産物であるεポリLリジン生産に消費されなくなるため、より効率的な任意の有用物質生産を達成できると考えられた。Salbulusが元々有している環状プラスミドpNO33を元に、Salbulusを含むStreptomyces属放線菌において利用可能な大腸菌放線菌シャトルベクターpLAE001が既に開発されている特開2005237335。また、その誘導体で汎用性の高い薬剤耐性マーカーを有するpLAE003HamanoetalJBiosciBioeng2005Jun9963641及びpLAE003に恒常発現プロモーターを付加したSalbulusにおける遺伝子発現ベクターpLAE006HamanoetalApplMicrobiolBiotechnol2007Sep7687382Epub2007Jul5が構築されており、その有効性も確認されている。従って、宿主としてSalbulus△pls株特開2008263868、遺伝子発現ベクターとしてpLAE006を用いることで、課題である任意の有用物質工業生産が可能と考えられた。この可能性を検証するために、本発明者らは遺伝子発現ベクターとして前述のpLAE006を利用することで、宿主Salbulus△pls株のATP供給特性を最大限に利用できる酸性条件下で、実際に目的遺伝子を活性型タンパク質、酵素として発現し、二次代謝産物生産が可能か否かを検証した。検証は、pls遺伝子を挿入したpLAE006をSalbulus△pls株に形質転換し、酸性条件下で培地中に生産されるεポリLリジンの有無から挿入遺伝子産物εポリLリジン合成酵素、Plsの発現を確認することで行った。以下にその方法を説明する。pLAE006のBamHIHindIIIサイトにpls遺伝子ORF上流にリボソーム結合領域、終止コドン直下にHisx8tagを含むを挿入して構築したpLAE006plsを、特許文献1に記載の方法に従って大腸菌S171株との接合によりSalbulus△plsに形質転換した。得られた形質転換体Salbulus△plspLAE006plsを、25μgmlアプラマイシン及び50μgmlネオマイシンを含むεポリLリジン生産培地KaharetalJBiosciBioeng2001911904中で30°C48h好気的に培養した。培養終了後、培養上清のεポリLリジン生産量を特開2008263868に記載のHPLC法にて測定したところ、εポリLリジンの生産は認められたが、その量は極めて少なく、痕跡量程度でしかなかった。また、定法に従ってNiアフィニティークロマトグラフィーにより、組換えPlsの精製を試みたが、その発現量が極めて微量であったため、精製Plsを得ることはできなかった。本法を用いて、一部Plsの機能解析も行なわれたが平成21年度日本生物工学会大会P194、以上の結果は、pLAE006が有しているermEのような恒常発現プロモーター誘導下では、対数増殖期以降の酸性条件下では、自身の遺伝子であっても殆ど発現せず、課題である微生物による有用物質高生産を達成できないことを示している。従って、Salbulusにおいて物質生産に適した対数増殖期以降の酸性条件下で特異的に遺伝子発現を誘導するプロモーターの探索が必要であった。[実施例1]RTPCRによるpls遺伝子発現プロファイルの解析Salbulusが対数増殖期以降の酸性条件下で著量のεポリLリジンを生産するという事実から、pls遺伝子の発現は、この特徴的な条件下でのみ特異的に誘導される可能性が考えられた。そこでRTPCR法によりSalbulusにおけるpls遺伝子の発現時期の特定を試みた。特開2008263868に記載の方法に従い、SalbulusNBRC14147を3L容Jarfermentorで30h好気的に培養した図1a。また、培養に伴うpH低下後は、適宜10アンモニア水を添加して培養液pHをεポリLリジン生産に適した42に維持した。培養中、適宜培養液の一部をサンプリングし、菌体から定法に従って全RNAを抽出した図1b。この全RNAから、下記に示すεPLNRPSRプライマー及びTOYOBO社製の逆転写酵素ReverTraAceを用いてpls遺伝子を逆転写した。また、対照として下記に示すAskC4プライマーを用いてLリジン合成の鍵酵素、アスパルトキナーゼ遺伝子も逆転写により同様に調製した。εPLNRPSF5’GGGGGATCCTCGTCGCCCCTTCTCGAATCG3’配列番号16εPLNRPSR5’ACCAAGCTTTCACGCGGCCGCACCTCCCTC3’配列番号17AskC45’ACCAAGCTTTCATCGCCCGGTGCCGCCGTA3’配列番号18AskN45’GGGGGATCCGGCCTTGTCGTGCAGAAGTAC3’配列番号19得られた逆転写産物を鋳型にεPLNRPSFおよびεPLNRPSRのプライマーを用いてPCRを行った。また、同様にAskC4およびAskN4プライマーを用いて、対照の逆転写産物ask遺伝子に対してもPCRを行った図1c。その結果、対照として用いたask遺伝子は、培養の初期から発現しており、培養液pHが低下し始める対数増殖期後期以降は、その発現量が顕著に低下することが確認された。AskはLリジン合成の鍵酵素であるため、細胞増殖との密接に関連するask遺伝子の発現挙動は合理的なものといえる。一方、pls遺伝子はask遺伝子とは対照的に、培養液pHが低下し始める対数増殖期後期以降から発現が認められ、εポリLリジン生産が認められるpH42付近で最大となった。また、細胞増殖が殆ど認められない24時間後にも高いレベルの発現が維持されていた。以上のRTPCR解析の結果から、pls遺伝子は、細胞増殖が鈍化する対数増殖期後期から定常期、且つ二次代謝産物生産に適した低いpH環境下で特異的に発現誘導されることが確認された。通常、このような細胞増殖が認められない定常期付近では、遺伝子発現タンパク質の新生は殆ど起こらない。しかしpls遺伝子は、この時期に特異的且つ持続的に発現していることから本遺伝子の発現制御は極めて特殊であると言える。また、前述のように数種の放線菌及び一部の糸状菌がεポリLリジンを生産することが知られているが、これらは何れも共通して培養に伴うpH低下後pH45にのみεポリLリジンを生産する。従って、これらの生産菌においても、Plsは培養液pHの低下に伴って特異的に発現誘導されると考えられる。この結果から、この特徴的発現挙動を与えるpls遺伝子発現を制御しているプロモーターを有する遺伝子発現ベクターと、εポリLリジン生産菌を宿主として用いることで、課題である任意の有用物質の生産に応用できると考えられた。[実施例2]pls遺伝子のプロモーター領域の特定とこれを有する組換えベクターpDC007の構築pls遺伝子の発現制御に関わるプロモーター領域の特定を試みた。pls遺伝子を含む33kbのDNA配列が既に明らかとなっているGeneBankaccessionNoAB385841。また、pls遺伝子下流にトランスレーションカップリングしているメタロプロテアーゼ遺伝子がSalbulusにおける主要なεポリLリジン分解酵素であることも確認されていることから平成20年度日本生物工学会大会講演要旨集p206、plsおよびpldII遺伝子はεポリLリジン生合成遺伝子クラスターを形成しているといえる。本遺伝子クラスター周辺領域をNeuralNetworkPromoterPredictionプログラムを用いて解析したところ、有意なスコアー>08を与えるプロモーター領域は見出されなかった。そこで、下限スコアーを更に下げて>04再度検索を行なったところ、図2に示す3箇所の推定プロモーター領域が見出されたが、何れもスコアーは低く、プロモーター領域の特定には至らなかった。また、本遺伝子クラスター周辺領域を詳細に解析した結果、本遺伝子クラスター直下にはターミネーター配列は見出されたが、制御遺伝子などは見出されなかった。しかしながら、本クラスター周辺領域には他にプロモーター候補領域が存在しなかったことから、本クラスターのプロモーター領域は上記3つの推定領域のいずれかであると予想された。そこで、この3箇所の推定領域のいずれかに本クラスターのプロモーターが含まれることを次の方法で確認した。3箇所の推定領域の何れもpls遺伝子開始コドンから上流350bp以内の比較的近い領域に集中していたため、下記に示すeplPFおよびeplPRプライマーを用い、Salbulus染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、3つの推定プロモーター領域全てを含む343bpを増幅した。このPCR増幅断片を前述のpLAE003のFseIBamHIサイトに挿入し、図3に示すpDC007を構築した。次に、本ベクターの機能及び有効性を、以下のpls遺伝子を用いた発現検討により確認した。下記のplsndeFおよびplshindRプライマーを用い、Salbulus染色体DNAを鋳型としたPCRによりpls遺伝子をPCR増幅後、増幅断片を制限酵素NdeI及びHindIIIで消化した。plsndeF5’GGAATTCCATATGTCGTCGCCCCTTCTCG3’配列番号22下線部はNdeIサイトplshindR5’ACCCAAGCTTTCACGCGGCCGCACCTCC3’配列番号23下線部はHindIIIサイト制限酵素消化後のpls遺伝子をpDC007の推定plsプロモーター下流に位置するNdeIHindIIIサイトに挿入してpDC007plsを構築し、これを参考文献4に記載の方法に従って大腸菌S171株との接合によりSalbulus△plsに形質転換した。得られた形質転換体Salbulus△plspDC007plsを、25μgmlアプラマイシン及び50μgmlネオマイシンを含むεポリLリジン生産培地中で、特開2008263868に記載の方法に従い、3L容Jarfermentorで30°C30h好気的に培養した。培養終了後、培養上清のεポリLリジン量を定量した結果、本組換えベクターのみpls遺伝子の挿入なしを導入したSalbulus△plspDC007株は当然ながらpls遺伝子の破壊によりεポリLリジン生産能を欠質していたが、pDC007plsを導入したSalbulus△plspDC007pls株の培養液中には著量のεポリLリジン生産蓄積が認められた。また、その生産量はSalbulus△plsの親株特開2005237335、SalbulusNBRC14147から前述のpNO33を脱落させて構築された株であり、SalbulusNBRC14147と同等のεポリLリジン生産性を示す。が30時間の培養で132glであったのに対し、驚くべきことにSalbulus△plspDC007pls株は273glと野生株NBRC14147の約2倍の生産性を示した。以上の結果から、εポリLリジン生合成遺伝子クラスターの発現を制御する領域が、pls遺伝子開始コドンから上流343bpの範囲にあることを特定した。従って、以下、本明細書中ではpls遺伝子開始コドンから上流343bpの領域をplsプロモーター配列番号4と呼ぶ。また、この結果によってプロモーター領域を特定したと同時に、これを利用することで課題であったSalbulusにおいて二次代謝産物合成前駆体の供給が高まる対数増殖期以降の酸性条件下で、特異的に目的遺伝子の発現を誘導する遺伝子発現ベクターpDC007の構築にも成功した。この結果は、plsプロモーター支配下で発現した組換えPlsが、Salbulus△pls株の細胞内で再生一部新生も含むされるATPを利用して、目的化合物であるεポリLリジンを合成したことを実証するものであり、Salbulus及びplsプロモーターを有する遺伝子発現ベクターの有用物質生産のツールとしての有効性が確認された。また、上記ベクターを利用することで、期待を上回るεポリLリジン高生産株の樹立にも成功した。この生産量向上の理由は、元来染色体上に1コピーしか存在しないpls遺伝子が、ベクターとして形質転換したことで、pls遺伝子が宿主細胞内に複数コピー存在することになり、その結果、翻訳産物であるPlsの蓄積量、更にはPls反応産物であるεポリLリジンの生産量が向上したものと考えられる。従って、本実施例の結果はplsプロモーター及び任意有用物質生産宿主としてのSalbulusの有効性を示すものであり、組換えベクターのplsプロモーター以外のベクター領域は、宿主であるεポリLリジン生産菌内で安定に自立複製され得るものであれば、本実施例で用いたpNO33の自立複製領域を有したpLAE001、又は003の誘導体でなくても良いと考えられる。また、同じ理由で、宿主内での組換えベクターのコピー数は高い方が、plsプロモーターの効果が顕著に得られると考えられる。更に、発現ベクターを用いなくても、任意の目的遺伝子がplsプロモーター下流に配置されるように、Salbulus染色体上に相同組換えによって挿入しても、コピー数効果が得られないため若干目的化合物の生産量は低下するであろうが、同様の効果を得ることができると考えられる。また、前述のように数種の放線菌及び一部の糸状菌がεポリLリジンを生産することが知られており、これらの生産菌においても、Plsは培養液pHの低下に伴って特異的に発現誘導されると考えられる。従って、Salbulus以外のεポリLリジン生産菌に由来するεポリLリジン生合成遺伝子クラスターのプロモーター領域を用いても同様の効果が得られると考えられる。近年のゲノム解析により、種々の放線菌から新規二次代謝産物を生合成すると考えられる遺伝子及び遺伝子群クラスターが多数見出されている。これらの遺伝子クラスターは、潜在的に弱い又は機能しないプロモーター支配下にあるため、実際には二次代謝産物を生産せず、世界中で精力的に行なわれてきた有用生理活性物質探索研究の網を潜り抜けてきた。従って、これらの新規に見出された二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの潜在プロモーターに換えて本発明のplsプロモーターを利用して、これら遺伝子クラスターを強制的に発現させ、Salbulus内の豊富な前駆体を利用して実際に二次代謝産物を生産させることで、新規生理活性物質探索及びその生産研究にも新たな道を切り開くであろう。その意味でも本発明の遺伝子誘導発現システムは、有効である。[実施例3]pDC007誘導体の構築続いて、本発明のplsプロモーターを有する遺伝子発現ベクターを、有用物質生産のツールとしてだけではなく、組み換えタンパク質生産にも応用するためにpDC007誘導体を構築した。RNAポリメラーゼによるリードスルーを抑制し、転写翻訳の安定化及び効率化を図るために、下記方法によりpDC007のマルチクローニングサイト下流に、εポリLリジン生合成遺伝子クラスター下流に見出されたターミネーター配列を導入した。クラスター直下に見出されたターミネーター配列下記配列下線部分に基づき、下記に示すTermF及びTermRの2つの互いに相補する一本鎖オリゴDNAを合成した。これらを混合後、加熱冷却して二本鎖DNAとし、pDC007のPstIHindIIIサイトに挿入して図3に示すpDC008を構築した。TermF5’GGCATGCAAGCTTGAGCGCTCCGCGTGCCCGGTGGCGGACGGTACCCCGTCCGCCACCGGGCACGGCCGGC3’配列番号5TermR5’AGCTGCCGGCCGTGCCCGGTGGCGGACGGGGTACCGTCCGCCACCGGGCACGCGGAGCGCTCAAGCTTGCATGCCTGCA3’配列番号6glycerol、05MNaCl、2TritonX100、5mMDTTから成る破砕緩衝液に懸濁し、特開2008263868に記載の方法に従い超音波破砕、続いて遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。これを定法に従い、Histag融合タンパク質精製用クロマトグラフィー担体NiSepharose6fastflowを用いてHistag融合組換えPlsを精製した。その結果、図4のSDSPAGE分析結果に示すように、高純度の精製組換えPlsが得られ、特開2008263868に記載の方法に従って測定した精製組換えPlsの収量タンパク量は18mgであった。従来、Plsは6回膜貫通型酵素であるため、その精製には多くの工数を要し、収量も70gの菌体から約29mgのPls精製標品を得られる程度である特開2008263868。従って、収量は約3倍に向上したことになる。組換え膜貫通型タンパク質の構築が容易ではないことは良く知られている。同様に、Plsは、6回膜貫通型酵素であるため、大腸菌や酵母、更には放線菌Streptomyceslividans等の微生物を宿主とする汎用遺伝子発現システムの何れを用いても、組換えPlsの構築を構築することはできなかった。しかし、対数増殖期後期以降の低いpH環境下で特異的に遺伝子発現を誘導するplsプロモーター支配下において持続的にpls遺伝子を発現させることで、εポリLリジンの高生産株を樹立できるばかりでなく、従来不可能であった組換えPlsを効率的に生産蓄積させることにも成功した。以上のように、本発明のplsプロモーター及びこれを有する遺伝子発現ベクターの有効性はpls遺伝子を用いて示したが、産業上重要な遺伝子を同様に本ベクターに挿入し、Salbulus△plsに形質転換することで、本菌の高い二次代謝産物生合成の前駆体供給能を最大限に生かした任意有用物質生産を行なうことも当然可能である。この場合、ATP以外の前駆体が不足する場合は、系外から添加することも可能である。また、本発明のSalbulus及びplsプロモーターを有する遺伝子発現ベクターを用いる遺伝子誘導発現システムは、大腸菌におけるpETシステムのような、いわゆる高発現システムではない。しかし、一般に二次代謝産物は、培養の後期の限られた条件下で生産されるものが多いため、課題とする二次代謝産物の組換え微生物生産においては培養の初期から構成的恒常的、且つ大量に遺伝子を発現させることは、必ずしも好ましいものではない。また、遺伝子発現の誘導制御が可能なシステムであっても、タンパク質新生が殆ど起こらない二次代謝産物生産に適した培養後期では、充分に機能しない場合も多い。その意味でも本発明の遺伝子誘導発現システムは、有効である。実施例5εポリLリジン以外の任意化合物の生産1本発明のプロモーター及びそれを有する組換えベクター、さらにSalbulusを宿主として用いる任意有用物質生産法の有効性を、次の方法で確認した。Dサイクロセリン生産放線菌Streptomyceslavendulaeに特異的に存在するbpsA遺伝子は、単一モジュール型の非リボソームペプチド合成酵素をコードしており、青色素indigoidine生合成遺伝子として機能するTakahashietalJBiolChem2007Mar23282907381Epub2007Jan19;特開2007189969。当該遺伝子産物BpsAは、2分子のLグルタミンと2分子のATPを基質として、indigoidine1分子を生成する反応を触媒する。従って、bpsA遺伝子を本発明の宿主ベクター系で発現させ、生産される青色素量を定量、更に色素量から反応に消費したATP量を算出することで、本発明の遺伝子誘導発現システムの有効性を容易に確認できる。そこで、本発明の遺伝子誘導発現システムが、異種放線菌由来遺伝子を用いた任意の物質生産にも有効であることを、SlavendulaeNBRC12340907381Epub2007Jan19及び特開2007189969に記載のATCC11924と同一株由来のbpsA遺伝子を用いて確認した。下記のbpsAndeF及びbpsAhindRプライマーを用い、Slavendulae染色体DNAを鋳型としたPCRによりbpsA遺伝子を増幅後、増幅断片を制限酵素NdeI及びHindIIIで消化した。bpsAndeF;5’GGAATTCCATATGACTCTTCAGGAGACCAGCGTGCTCGAG3’配列番号26bpsAhindR;5’CCCAAGCTTCTCGCCGAGCAGGTAGCGGATGTGC3’配列番号27もTakahashietal907381Epub2007Jan19に記載のindigoidineの測定値とよく一致したことから、Salbulus△plspDC009bpsAによって生産された青色素がindigoidineであることを確認した。また、生産されたindigoidine量の測定は、DMF中における600nmの分光光度測定により行なったlogε437。その結果、培養液pHが42付近に低下後、急速なindigoidine生産蓄積が認められ、その生産量は僅か21時間の培養で113glに達した。また、indigoidine合成に消費された培地1LあたりのATP量indigoidine生産量から算出は、Salbulus△plspDC009pls株においてεポリLリジン生産に消費されたそれと同等であった。この結果は、異種生物由来の遺伝子であっても、本発明の宿主ベクター系を用いることで、二次代謝産物生産に適した対数期後期に特異的且つ効率よく発現させることが可能であり、更にSalbulus細胞内で強力に再生一部新生も含むされる理論上の利用可能ATPをほぼ100利用して、目的化合物であるindigoidineを合成したことを示している。また、驚くべきことに、Salbulus△pls株は前駆体であるLグルタミンを系外から添加することなく著量のindigoidineを生産した。このことは、Salbulusがindigoidine生産に必要な著量のLグルタミンをも自ら合成したことを示している。この理由は明らかではないが、SalbulusはATPのみならず、消費されたアミノ酸などの化合物の菌体内プールを一定に保つ機構を有している可能性が考えられる。実施例6εポリLリジン以外の任意化合物の生産2εポリLリジン及びIndigoidineといったATPを直接的に且つ1段階の反応で要求する化合物生産においては、本発明のプロモーター及びそれを有する組換えベクター、さらにSalbulusを宿主として用いる任意有用物質生産法の有効性が確認された。しかし、天然有用化合物の多くは、多段階の反応により生合成され、その生合成に間接的にATPを要求するケースも多い。そこで、本発明のプロモーター及びそれを有する組換えベクター、さらにSalbulusを宿主として用いる任意有用物質生産法が、多段階反応により生合成され、且つその生合成に間接的にATPを要求する任意化合物生産にも適用可能であるか否かを次の方法で検証した。病原性乳酸菌Streptococcuszooepidemicusに存在するhasA遺伝子はヒアルロン酸合成酵素をコードしており、当該遺伝子産物のHasAは、UDPNアセチルグルコサミンとUDPグルクロン酸を基質として、グルクロン酸とNアセチルグルコサミンの繰り返し構造からなるポリマー構造のヒアルロン酸を合成するJMolEvol2008Jul671322Epub2008Jun13。また、図6に示すように、グルコースから最終生産物ヒアルロン酸の構成糖であるグルクロン酸とNアセチルグルコサミンの二糖単位合成には、間接的に3分子のATPを要求する。そこで、本発明の有効性をヒアルロン酸生産により検証した。HasAは膜結合型酵素であること、更に放線菌遺伝子が平均GC含量約70であるのに対し乳酸菌遺伝子は約40前後と使用コドンが大幅に異なることから、Streptococcuszooepidemicus由来hasA遺伝子はSalbulus内で機能的に発現しない可能性が考えられた。そこで先ず初めにhasA遺伝子をSalbulus内で機能的に発現させるため、乳酸菌Streptococcuszooepidemicus由来のhasA遺伝子を放線菌固有のコドン使用頻度を考慮して改変40GC→63GCし、人工遺伝子mhasA配列番号28を合成した。また、Salbulus内でヒアルロン酸を効率よく生産させるには、ヒアルロン酸合成前駆体となるUDP-グルクロン酸及びNアセチルグルコサミンが十分量供給される必要がある。したがってUDPグルクロン酸合成活性を有する酵素であるUDPグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子hasB及びUDPNアセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ遺伝子hasDをhasA遺伝子と下記方法により共発現させた。データベース検索により見出されたStreptomycesavermitilis由来のhasBホモログ遺伝子を、StreptomycesavermitilisNBRC14893染色体DNAを鋳型としてsav5025assembleF及びsav5025hindRプライマーを用いてPCR増幅した。sav5025assembleF;5’CTCGCATGAGCCTCAAGATCACCGTGATCGGCACCGG3’配列番号29sav5025assembleR;5’ATGGCGCTCATGCGGTGGCCTCCCCCATCGCGCGGTACGTCCAGC3’配列番号30また、同様にデータベース検索により見出されたStreptomycesavermitilis由来のhasDホモログ遺伝子sav3561を、StreptomycesavermitilisNBRC14893染色体DNAを鋳型としてsav3561assembleF及びsav3561hindRプライマーを用いてPCR増幅した。sav3561assembleF;5’CGATGGGGGAGGCCACCGCATGAGCGCCATCCGCCCGGCAGCCGT3’配列番号31sav3561hindR;5’CCCAAGCTTTCAGTCTTCGCCTTCCGGCTTCCGGGAA3’配列番号32。また、ヒアルロン酸合成に消費された培地1LあたりのATP量ヒアルロン酸生産量から算出は、Salbulus△plspDC009pls株においてεポリLリジン生産に消費されたそれとほぼ同等であった。また、この結果はSalbulus細胞内で強力に再生一部新生も含むされる理論上の利用可能ATPを効率的に利用して、目的化合物であるヒアルロン酸を合成したことを示している。以上の結果から、本発明が、多段階反応により生合成される有用物質生産、また生合成に間接的にATPを要求する化合物生産においても非常に有効であることが証明された。ポリリジン、indigoidin、ヒアルロン酸に限らず、本発明のプロモーター及びそれを有する組換えベクター、さらにSalbulusを宿主として用い、更に必要に応じて導入遺伝子のコドン改変及び前駆体供給遺伝子強化など上記の実施例と同様の手法をとることで、あらゆる任意の有用化合物を大量に生産することが可能である。また、ここに示した物質生産性に関する実施例では、培養発酵生産過程において、糖質を補給することなく比較的短時間で評価しているが、消費される糖質を持続的にフィードすることで、本発明の有用物質生産法においてもKaharetalJBiosciBioeng2001911904に記載のεポリLリジン生産と同じく8日間程度、目的化合物の生産蓄積を持続することが可能である。実施例7plsプロモーターの宿主適合性plsプロモーターがSalbulusだけでなく、他の放線菌、特にεポリLリジン非生産菌に於いても機能することを次の方法で検証した。実施例4で構築済みのpDC009plsを参考資料PracticalStreptomycesGenetics2000P301302に記載の方法に従い、StreptomyceslividansTK23株εポリLリジン非生産放線菌に導入した。得られた形質転換体を650μgmlのネオマイシンを含むεポリLリジン生産培地3L容Jarfermentor中で30°C30h好気的に培養した。培養終了後、実施例4と同様に遠心分離にて回収した菌体15g湿重量からHistag融合タンパク質精製用クロマトグラフィー担体NiSepharose6fastflowを用いて精製を行い、Histag融合組換えPlsの発現の有無を確認したところ、Salbulusを宿主とした場合と同じく約1mgの組換えPlsを得ることができた。このように、plsプロモーターを有する発現ベクターは、Salbulus以外の放線菌、且つεポリLリジン非生産放線菌に於いても充分に機能し、組換えタンパク質生産に利用可能であった。また、培養上清のεポリLリジン量を特開2008263868に記載のHPLC法にて定量した結果、培養液中へのεポリLリジンの生産蓄積も認められたが、その量は極めて少なく、30h培養で01glの生産性であった。これは宿主として用いたSlividansの前駆体Lリジン又はATP供給能が充分ではないためと考えられる。この結果から任意の有用物質生産においては、宿主としてε-ポリ-L-リジン生産菌例:Salbulusを用いることで、より効率的に導入遺伝子産物による有用物質の生産を達成できることが確認された。"