"i組換え宿主細胞又は生物において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること;ii前記組換え細胞の遺伝的プロフィールを分析し、前記組換えタンパク質を発現するように修飾されていない宿主細胞又は前記組換えタンパク質を発現していない組換え細胞におけるよりも高いレベルで前記組換え細胞において発現される1又はそれ以上の補償遺伝子又は遺伝子産物を特定すること;及びiii前記組換え細胞における前記特定された補償遺伝子又は遺伝子産物の発現を遺伝子修飾によって変化させ、組換えタンパク質の発現、活性又は溶解度の上昇を達成する修飾組換え細胞を提供すること、を含む、宿主細胞又は生物における組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善する方法。前記修飾組換え細胞において前記タンパク質又はペプチドを発現することをさらに含む、請求項1に記載の方法。a前記修飾組換え細胞において前記組換えタンパク質又はペプチドを発現すること;b前記修飾組換え細胞の遺伝的プロフィールを分析し、前記修飾組換え細胞において区別して発現される少なくとも1つの第二遺伝子又は遺伝子産物を特定すること;c前記修飾組換え細胞における第前記二の特定された遺伝子産物の発現を変化させ、二重修飾された細胞を提供すること;及びd前記二重修飾組換え細胞において前記タンパク質又はペプチドを発現することをさらに含む、請求項1に記載の方法。工程a-dを反復することをさらに含む、請求項3に記載の方法。前記特定された遺伝子又は遺伝子産物の発現を変化させることによって、細胞生存率が影響を受けるまで工程a-dを反復することを含む、請求項4に記載の方法。前記組換えタンパク質又はペプチドの発現が標的エンドポイントに達するまで工程a-dを反復することを含む、請求項4に記載の方法。前記遺伝的プロフィールが、前記組換え細胞の遺伝的プロフィールを前記宿主細胞の第二の遺伝的プロフィールと比較することによって分析される、請求項1に記載の方法。前記遺伝的プロフィールがトランスクリプトームプロフィールである、請求項1に記載の方法。前記トランスクリプトームプロフィールがマイクロアレイを通して決定される、請求項8に記載の方法。前記遺伝的プロフィールがプロテオームプロフィールである、請求項1に記載の方法。前記プロテオームプロフィールが二次元ゲル電気泳動、ICAT又はLC/MSを通して決定される、請求項10に記載の方法。前記プロテオームプロフィールがペプチドアレイを通して決定される、請求項10に記載の方法。前記ペプチドアレイが抗体アレイである、請求項12に記載の方法。前記特定される遺伝子産物が、プロテアーゼ、プロテアーゼのサブユニット、プロテアーゼの補因子、プロテアーゼの発現に影響を及ぼす細胞又は遺伝子調節剤である、請求項1に記載の方法。前記特定される遺伝子産物がプロテアーゼである、請求項14に記載の方法。前記特定される遺伝子産物がプロテアーゼのサブユニットである、請求項14に記載の方法。前記特定される遺伝子産物がプロテアーゼの補因子である、請求項14に記載の方法。前記特定される遺伝子産物が、プロテアーゼの発現に影響を及ぼす細胞又は遺伝子調節剤である、請求項14に記載の方法。前記特定される遺伝子産物が、D-アラニル-メソ-ジアミノピメリン酸エンドペプチダーゼ、亜鉛プロテアーゼ、ミクロソームジペプチダーゼ、細胞外メタロプロテアーゼ前駆体、細胞分裂タンパク質ftsH及び、遺伝子hslV、hslU、clpX、clpA及びclpB由来の遺伝子産物から成る群より選択される、請求項14に記載の方法。前記組換えタンパク質又はペプチドが前記宿主細胞において発現されるとき、特定される遺伝子産物のmRNAレベルが上方調節される、請求項14に記載の方法。前記特定された遺伝子産物を宿主細胞ゲノムから除去する、請求項14に記載の方法。前記特定された遺伝子産物を相同的組換えによって除去する、請求項21に記載の方法。前記特定される遺伝子産物が、フォールディング調節剤、フォールディング調節剤のサブユニット、フォールディング調節剤の補因子、又はフォールディング調節剤の発現に影響を及ぼす細胞又は遺伝子調節剤である、請求項1に記載の方法。前記特定される遺伝子産物がフォールディング調節剤である、請求項23に記載の方法。前記特定される遺伝子産物がフォールディング調節剤のサブユニットである、請求項23に記載の方法。前記特定される遺伝子産物がフォールディング調節剤の補因子である、請求項23に記載の方法。前記特定される遺伝子産物が、フォールディング調節剤の発現に影響を及ぼす細胞又は遺伝子調節剤である、請求項23に記載の方法。前記フォールディング調節剤がシャペロンタンパク質である、請求項23に記載の方法。前記フォールディング調節剤が、遺伝子cbpA、htpG、dnaK、dnaJ、fkbP2、groES及びgroELの遺伝子産物から成る群より選択される、請求項23に記載の方法。前記特定される遺伝子産物の発現が、前記特定遺伝子、特定遺伝子の補因子、又は特定遺伝子の細胞又は遺伝子調節剤の発現を上昇させることによって変化する、請求項23に記載の方法。前記発現上昇が、前記特定遺伝子産物をコードするDNAの組込みによる、請求項30に記載の方法。前記発現上昇が、宿主細胞ゲノムへのプロモーターの挿入による、請求項30に記載の方法。前記発現上昇が、前記宿主細胞への外来性ベクターの組込みによる、請求項30に記載の方法。前記宿主細胞が微生物細胞である、請求項1に記載の方法。前記宿主細胞がシュードモナス菌Pseudomonadである、請求項1に記載の方法。前記宿主細胞がP.フルオレセンスPfluorescence細胞である、請求項1に記載の方法。前記宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項1に記載の方法。前記宿主細胞が、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞及び植物細胞から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。前記マイクロアレイが、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも50に対する結合パートナーの試料を含む、請求項9に記載の方法。前記マイクロアレイ手法が、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも80に対する結合パートナーの試料を含む、請求項9に記載の方法。前記マイクロアレイが、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも90に対する結合パートナーの試料を含む、請求項9に記載の方法。前記マイクロアレイが、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも95に対する結合パートナーの試料を含む、請求項9に記載の方法。前記改善された発現が、組換えタンパク質又はペプチドの量の上昇である、請求項1に記載の方法。前記改善された発現が、前記組換えタンパク質又はペプチドの溶解度の上昇である、請求項1に記載の方法。前記改善された発現が、前記組換えタンパク質又はペプチドの活性の上昇である、請求項1に記載の方法。前記遺伝的プロフィールが、遺伝子ファミリーにおける遺伝子のプロフィールである、請求項1に記載の方法。前記プロフィールが、プロテアーゼ及びフォールディング調節剤を含む、請求項1に記載の方法。前記プロフィールが本質的にプロテアーゼから成る、請求項46に記載の方法。少なくとも2つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物。D-アラニル-メソ-ジアミノピメリン酸エンドペプチダーゼ、亜鉛プロテアーゼ、ミクロソームジペプチダーゼ、細胞外メタロプロテアーゼ前駆体、細胞分裂タンパク質ftsH、及び遺伝子hslV、hslU、clpX、clpA及びclpB由来の遺伝子産物から成る群より選択される少なくとも1つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物。少なくとも1つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された哺乳動物由来の組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物。前記組換えタンパク質がヒト成長ホルモンである、請求項52に記載の宿主細胞又は生物。フォールディング調節剤サブユニットではない少なくとも2つのフォールディング調節剤の発現を上昇させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物。製造コストを低下させ、活性生成物の収率を上昇させるために、改善された組換えタンパク質又はペプチド、活性又は溶解度を示す宿主菌株の開発のための方法が認められている。それ故、宿主における組換えタンパク質発現を改善するための方法を提供することが本発明の1つの目的である。組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞において発現レベルを上昇させる方法を提供することが本発明のさらなる目的である。組換え発現系において生成される可溶性タンパク質のレベルを上昇させる方法を提供することが本発明のもう1つの目的である。組換え発現系において生成される活性タンパク質のレベルを上昇させる方法を提供することが本発明のさらにもう1つの目的である。i宿主細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること;ii前記細胞の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドの発現又は過剰発現時に上方調節される1又はそれ以上の内在性遺伝子産物を特定すること;及びiii細胞を遺伝的に修飾することによって1又はそれ以上の特定された内在性遺伝子産物の発現を変化させることを含む、組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善するための方法を提供する。前記方法は、タンパク質の収率改善によって測定されるように発現の改善を提供し得るか、又は、例えば発現される組換えタンパク質、又は関連タンパク質又はペプチドの溶解度を上昇させることによって、活性タンパク質の回収率を改善させ得る。この方法を用いて、多くの細胞タンパク質のうちのいずれが、異種組換えタンパク質の発現を補償するために細胞によって選択されるかを判定することができ、この情報は、より有効なタンパク質発現系の開発を導くことができる。例えば、典型的には、細胞は過剰発現された組換えタンパク質を分解するために1又はそれ以上のプロテアーゼを選択的に上方調節することが知られている。しかし、所与の組換えタンパク質によって引き起こされるストレスを補償するために細胞がどのプロテアーゼを上方調節するかをあらかじめ予測することはできない。マイクロアレイ又は等価のテクノロジーによる細胞の遺伝的プロフィールの分析は、外来性タンパク質生産に応答して所与の細胞においてどのプロテアーゼが上方調節されるかを特定することができる。この情報は、次に、有用な、さらには細胞ホメオスタシスのために必要な他のタンパク質はそのまま残しながら、これらの特定プロテアーゼの発現を低下させるように細胞を遺伝的に修飾するために使用される。もう1つの例として、細胞は、組換えタンパク質の折りたたみ能力又は溶解度を上昇させるために1又はそれ以上のフォールディング調節剤又は補因子を選択的に情報調節し得る。やはり、特定組換えタンパク質のプロセシングを助けるために所与の系においてどのフォールディング調節剤又は補因子が選択されるかをあらかじめ予測することはできない。マイクロアレイ又は等価のテクノロジーによって遺伝的プロフィールを分析することは、上方調節されたフォールディング調節剤又は補因子の特定を可能にする。この情報に基づき、所与の組換えタンパク質に関して細胞によって優先される選択フォールディング調節剤又は補因子の発現を上昇させるように細胞を遺伝的に修飾する。この修飾は、細胞ホメオスタシスへの有害な影響を最小限に抑えながら、回収される活性タンパク質のパーセントを上昇させることができる。それ故、選択的であり、細胞の他の有益な機構全体を残す方法で、補償タンパク質すなわち所与の細胞ストレスに応答して上方調節されるタンパク質を上昇させる又は低下させることを通して宿主生物を修飾することにより、組換えタンパク質の収率及び/又は活性及び/又は溶解度を高めることができる。前記方法は、活性組換えタンパク質の発現が最適化されるまで繰り返し使用することができる。例えば上述した方法を用いて、宿主細胞又は生物を、1又はそれ以上の特定された補償タンパク質を上方調節、下方調節、ノックイン又はノックアウトするように遺伝的に修飾する。そのように修飾された宿主細胞又は生物を、次に、組換えタンパク質、又は関連タンパク質又はペプチド、及びマイクロアレイ又は等価分析を通して特定された付加的な補償タンパク質を発現するために培養することができる。修飾された宿主細胞又は生物を、その後再び、さらなる選択補償タンパク質を上方調節、下方調節、ノックイン又はノックアウトするように遺伝的に修飾する。この工程は、宿主細胞又は生物を過度に衰弱させずに、活性及び/又は可溶性タンパク質の最大発現を示す宿主細胞又は生物が得られるまで反復することができる。これらの工程は、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10回又はそれ以上反復できる。もう1つの実施形態では、前記方法は、iv遺伝的に修飾された細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること、をさらに含む。さらにもう1つの実施形態では、前記方法は、v組換えタンパク質又はペプチドを発現する遺伝的に修飾された細胞の第二の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドを発現する修飾細胞において区別して発現される1又はそれ以上の付加的な遺伝子産物を特定すること、をさらに含む。さらなる実施形態では、前記方法は付加的に、vi二重修飾された細胞を与えるために1又はそれ以上の特定された付加的な遺伝子産物の発現を変化させること、を含む。場合により、組換えタンパク質又はペプチド、又は関連タンパク質又はペプチドを二重修飾細胞において発現させ得る。修飾細胞において特定された区別して調節される遺伝子産物を、宿主細胞と比較して又は組換えタンパク質又はペプチドを発現しない修飾細胞と比較して、上方又は下方調節することができる。さらにもう1つの実施形態では、前記方法は、iv組換えタンパク質又はペプチドを発現する遺伝的に修飾された細胞の第二の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドを発現しない修飾細胞において区別して発現される1又はそれ以上の付加的な遺伝子産物を特定すること、をさらに含む。さらなる実施形態では、前記方法は付加的に、v二重修飾された細胞を与えるために1又はそれ以上の付加的な特定遺伝子産物の発現を変化させること、を含む。修飾細胞において特定された区別して調節される遺伝子産物を、宿主細胞又は生物と比較して又は組換えタンパク質又はペプチドを発現しない修飾細胞と比較して、上方又は下方調節することができる。1つの特定実施形態では、i宿主細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること;ii前記細胞の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドが発現されるときに上方調節される少なくとも1つのプロテアーゼを特定すること;及びiii上方調節されるプロテアーゼの発現を低下させるように宿主細胞又は生物を遺伝的に修飾することによって特定されたプロテアーゼの発現を変化させること、を含む、組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善するための方法が提供される。さらなる実施形態では、前記方法は、二重にプロテアーゼ修飾された細胞を与えるために修飾細胞において少なくとも第二の特定されたプロテアーゼの発現を変化させることを含む。もう1つの実施形態では、前記方法は、ivプロテアーゼ修飾された細胞において組換えタンパク質又はペプチド、又は関連タンパク質又はペプチドを発現すること、をさらに含む。もう1つの実施形態では、前記方法は、修飾細胞において区別して発現される1又はそれ以上の付加的な遺伝子産物を特定するためにプロテアーゼ修飾細胞の第二の遺伝的プロフィールを分析することをさらに含む。もう1つの実施形態では、i宿主細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること;ii前記細胞の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドの過剰発現後に上方調節される少なくとも1つの上方調節フォールディング調節剤FMを特定すること;及びiiiFM修飾された細胞を与えるように細胞を遺伝的に修飾することによって少なくとも1つの特定されたフォールディング調節剤の発現を変化させること、を含む、組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善するための方法が提供される。さらなる実施形態では、前記方法は、二重にFM修飾された細胞を与えるために修飾細胞において少なくとも第二の特定されたフォールディング調節剤の発現を変化させることを含む。もう1つの実施形態では、前記方法は、ivFM修飾された細胞において組換えタンパク質又はペプチド、又は関連タンパク質又はペプチドを発現すること、をさらに含む。もう1つの実施形態では、前記方法は、修飾細胞において区別して発現される1又はそれ以上の付加的な遺伝子産物を特定するためにFM修飾細胞の第二の遺伝的プロフィールを分析することをさらに含む。ここで使用する遺伝的プロフィールという用語は、ゲノム内の遺伝子、ゲノム内の遺伝子から転写されるmRNA又は等価cDNA、細胞によって修飾された転写産物、例えば真核細胞系における遺伝子のスプライシング変異体、又は細胞によって修飾される又はゲノムから翻訳されたmRNAのスプライシング変異体から翻訳されるタンパク質を含む、ゲノム内の遺伝子から翻訳されるタンパク質又はペプチドの分析を含むことが意図されている。遺伝的プロフィールは、2個以上の遺伝子又は遺伝子産物を含むこと、典型的には分析される少なくとも5、10、50、100又はそれ以上の遺伝子又は遺伝子産物の群を含むことが意図されている。1つの実施形態では、分析する遺伝的プロフィールは、転写プロフィール、すなわちゲノムからの遺伝子の転写産物のプロフィールであり得る。前記方法は、マイクロアレイ又は等価テクノロジーを用いてトランスクリプトームプロフィールを分析することを含み得る。この実施形態では、マイクロアレイは、宿主細胞のトランスクリプトームの少なくとも一部に対する結合パートナーを含むことができ、典型的には生物のゲノムの少なくとも50の遺伝子産物に対する結合パートナーからの試料を含む。より典型的には、マイクロアレイは、宿主細胞のゲノム内の遺伝子産物に対する結合パートナーの少なくとも80、90、95、98、99又は100からの試料を含む。別の実施形態では、マイクロアレイは、組換えタンパク質発現によって影響を受ける産物のクラスを代表する遺伝子又は遺伝子産物に対する結合パートナーの選択サブセットを含み得る。非限定的な例は、推定上の又は公知のプロテアーゼ、プロテアーゼ又はプロテアーゼ様タンパク質の補因子;フォールディング調節剤、タンパク質の折りたたみ又は溶解度を改善し得るフォールディング調節剤又はタンパク質の補因子;転写因子;核酸の安定性又は翻訳開始に関与するタンパク質;キナーゼ;細胞外又は細胞内受容体;代謝酵素;代謝補因子;エンベロープタンパク質;σ因子;膜結合タンパク質;膜貫通タンパク質;膜関連タンパク質及びハウスキーピング遺伝子を含む。遺伝的プロフィールは、組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞の発現遺伝子のマイクロアレイへの結合を測定することによって分析できる。トランスクリプトームプロフィールはまた、非マイクロアレイアッセイ、例えばノーザンブロットアッセイを含むブロットアッセイ、又は結合パートナーで被覆したカラムを用いて分析することもできる。もう1つの実施形態では、分析する遺伝的プロフィールは、プロテオームプロフィール、すなわち所与の生物内の遺伝子から生産されるタンパク質のプロフィールであり得る。本発明の方法は、例えば二次元電気泳動を用いてプロテオームプロフィールを分析することを含み得る。分離ツール、例えば二次元ゲル電気泳動又は多次元液体クロマトグラフィーと組み合わせた質量分析のような手法も、前記方法において使用することができる。二次元電気泳動では、分離されるタンパク質は、生物のプロテオームの少なくとも10からのタンパク質を含み得る。より典型的には、宿主細胞のプロテオーム内のタンパク質の少なくとも20、30、40、60、80又は90からのタンパク質が分離され、タンパク質染色及び/又は質量分析などの手法によって分析される。さらなる実施形態では、プロテオームプロフィールは質量分析法を用いて分析される。タンパク質を特定し、それらの相対存在率を測定するために、質量分析法MS及びタンデム質量分析法MS/MSと組み合わせて液体クロマトグラフィーLCを使用するいくつかの関連手法が存在する。しばしば、1つの試料を、化学的性質を変化させずにもう1つの別の試料と比較することを可能にする重同位体タグで標識する。例えば1つの試料においてアミノ酸システインを、8個の水素原子を含むタグで標識することができる。他方の試料は、その代わりに8個のジュウテリウム重水素原子8ダルトンを含むタグで標識する。MSデータは、8ダルトンのペプチドの対を別々に検出し、その差を数量化するために使用できる。同じペプチドからのMS/MSデータは、おおよその一次配列とタンパク質IDを提供する。他の実験は、重アミノ酸を有する細胞を増殖させることによってインビボでタンパク質を標識する。これらの種類の手法は、単一実験において数千のタンパク質を特定し、両方の試料に存在する場合は相対存在率を推定するために使用できるGoodlettDRandAebersoldRHMassSpectrometryinProteomicsChemRev101269295参照。ICATはMS/MSの一種であり、同位体コードアフィニティータグIsotopeCodedAffinityTagsを表わすQuantitativeanalysisofcomplexproteinmixturesusingisotopecodedaffinitytagsNatBiotech17994999参照。もう1つの実施形態では、本発明の方法は、例えばマイクロアレイを使用して、プロテオームプロフィールを分析することを含み得る。この実施形態では、アレイは、適切な増殖条件下で宿主細胞によって発現されるタンパク質の少なくとも一部に対する結合パートナーを含むことができ、典型的には生物のプロテオームの少なくとも10からのタンパク質に対する結合パートナーを含む。より典型的には、マイクロアレイは、宿主細胞のプロテオーム内のタンパク質の少なくとも20、30、40、60、80又は90からのタンパク質に対する結合パートナーを含む。結合パートナーは抗体であり得、抗体は抗体フラグメント、例えば一本鎖抗体フラグメントであり得る。別の実施形態では、マイクロアレイは、例えば推定上のプロテアーゼタンパク質又は推定上のフォールディング調節剤を含む、プロテオームからのタンパク質の選択サブセットについての結合パートナーを含み得る。マイクロアレイはまた、典型的には対照として使用されるタンパク質に対する結合パートナーのセットを含み得る。遺伝的プロフィールは、組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞のタンパク質の、マイクロアレイ上の結合パートナーへの結合を測定することによって分析できる。プロテオームプロフィールはまた、標準アッセイ様式、例えばElisaアッセイ又は標準ウエスタンブロットアッセイにおいても分析することができる。遺伝的プロフィール中の試料は、個別に分析するか又はクラスターに分類することができる。クラスターは、典型的には遺伝子発現の類似度によって分類できる。特定実施形態では、クラスターは、類似の程度に上方調節される遺伝子又は類似の程度に下方調節される遺伝子として分類することができる。特定される上方調節遺伝子は、典型的には、組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞の遺伝的プロフィールを、組換えタンパク質又はペプチドを発現しない宿主細胞の遺伝的プロフィールと比較することによって特定される。さらなる実施形態では、第一組換えタンパク質に相同なタンパク質を発現する宿主細胞を分析する。組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞のゲノムは、組換えによって、例えば相同的組換え又は非相同的組換えによって修飾することができる。ゲノムはまた、遺伝子、特に特定されたプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレーム内の1又はそれ以上のヌクレオチドの突然変異によっても修飾できる。もう1つの実施形態では、宿主細胞は、特定された遺伝子又は遺伝子産物の阻害剤、例えばプロテアーゼ阻害剤をコードする1又はそれ以上のベクターを含むことによって修飾される。もう1つの実施形態では、宿主細胞はプロモーターの阻害によって修飾され、前記プロモーターは天然プロモーターであり得る。別の実施形態では、宿主細胞は、遺伝子、典型的にはフォールディング調節剤又はフォールディング調節剤の補因子をコードする1又はそれ以上のベクターを含むことによって修飾される。もう1つの実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞ゲノムに外来性プロモーターを付加することを含む、特定されたフォールディング調節剤又はフォールディング調節剤の補因子についてのプロモーターを増強することによって修飾される。宿主細胞は、組換えタンパク質又はペプチドを生産することができるいかなる細胞でもあり得る。1つの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えばエシェリキア属又はシュードモナス属を含むがこれらに限定されない細菌細胞である。宿主細胞は、シュードモナス菌Pseudomonad細胞、例えばP.フルオレセンスPfluorescence細胞であり得る。他の実施形態では、宿主細胞は大腸菌細胞である。もう1つの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えばスポドプテラ属、トリコプルシアドロソフィラ又はエスチグメネ種Estigmenespeciesからの細胞を含むがこれらに限定されない、昆虫細胞、又はマウス細胞、ハムスター細胞、サル、霊長動物又はヒト細胞を含むがこれらに限定されない、哺乳動物細胞である。もう1つの実施形態では、宿主細胞は、タバコ細胞、トウモロコシ、アラビドプシスシロイヌナズナ種からの細胞、ジャガイモ又はイネ細胞を含むがこれらに限定されない、植物細胞である。もう1つの実施形態では、トランスジェニック生物を含むがこれらに限定されない、全生物が本発明の方法において分析される。1つの実施形態では、特定される上方調節補償遺伝子又は遺伝子産物は、1又はそれ以上のプロテアーゼ及び/又は1又はそれ以上のフォールディング調節剤である。ある実施形態では、特定される遺伝子又は遺伝子産物はまた、プロテアーゼ又はフォールディング調節剤のサブユニット又はプロテアーゼの補因子又はフォールディング調節剤の補因子であり得る。1つの実施形態では、特定される遺伝子は、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン酸又はメタロペプチダーゼから選択され得る。ある他の実施形態では、特定される遺伝子又は遺伝子産物は、hslV、hslU、clpA、clpB及びclpXから選択され得る。特定される遺伝子又は遺伝子産物はまた、プロテアーゼの補因子であり得る。もう1つの実施形態では、特定される遺伝子又は遺伝子産物はフォールディング調節剤である。ある実施形態では、特定される遺伝子又は遺伝子産物は、シャペロンタンパク質、フォルダーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ及びジスルフィド結合イソメラーゼから選択され得る。1つの実施形態では、特定される遺伝子又は遺伝子産物は、htpG、cbpA、dnaJ、dnaK及びfkbPから選択され得る。1つの実施形態では、特定される上方調節遺伝子に相同な遺伝子又は遺伝子産物が宿主のゲノム内で修飾される。本発明の方法は、例えば所与の時点で宿主タンパク質全細胞タンパク質のグラム当りのタンパク質の量を上昇させること、又は細胞又は生物が組換えタンパク質を生産している時間の長さの量を上昇させることによって、宿主細胞における組換えタンパク質又はペプチドの高い生産を導くことができる。高い生産は、例えばエネルギー消費を低下させること、使用可能な供給源の使用を上昇させること、又は増殖培地中の増殖サプリメントについての要求条件を低下させることによって、細胞又は生物の効率を最適化し得る。高い生産はまた、組換えタンパク質のグラム当たり又は宿主細胞タンパク質のグラム当たりに生産される、回収可能なタンパク質又はペプチド、例えば可溶性タンパク質のレベル上昇をもたらし得る。本発明はまた、特許請求する方法によって生産される改善された組換え宿主細胞を含む。i宿主細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること;ii前記細胞の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドの発現時に上方調節される1又はそれ以上のプロテアーゼ又はフォールディング調節剤を含む、1又はそれ以上の内在性上方調節遺伝子産物を特定すること;及びiii細胞を遺伝的に修飾することによって1又はそれ以上の特定された遺伝子産物の発現を変化させること、を含む、組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善するための方法を提供する。もう1つの実施形態では、前記方法は、遺伝的に修飾された細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現することをさらに含む。もう1つの実施形態では、前記方法は、修飾細胞において区別して発現される1又はそれ以上の付加的な遺伝子産物を特定するために遺伝的修飾細胞の第二の遺伝的プロフィールを分析することをさらに含む。さらなる実施形態では、前記方法は、二重修飾された細胞を提供するために修飾細胞において少なくとも第二の特定された遺伝子産物の発現を変化させることを含む。前記方法は、タンパク質の改善された収率によって測定されるように改善された発現を提供することができるか、又は、例えば発現される組換えタンパク質の溶解度を上昇させることにより、活性タンパク質の回収率を改善することができる。より一般には、本発明は、i組換え宿主細胞又は生物において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること;ii組換えタンパク質を発現するように修飾されていない宿主細胞又は組換えタンパク質を発現していない組換え細胞のいずれか1つにおけるよりも高いレベルで組換え細胞において発現される補償遺伝子又は遺伝子産物を特定するために組換え細胞の遺伝的プロフィールを分析すること;及びiii組換えタンパク質の発現、活性又は溶解度の上昇を達成する修飾組換え細胞を提供するために、組換え細胞における特定された補償遺伝子又は遺伝子産物の発現を遺伝子修飾によって変化させることを含む、宿主細胞又は生物における組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善するための方法を含む。本明細書全体を通じて、範囲が提供されるときは、構成要素が独立することを意味すると了解されるべきである。例えば1-6の範囲は、独立して1、2、3、4、5又は6を意味する。本発明の方法の工程を以下でより詳細に説明する。工程I:宿主細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現するための宿主細胞又は生物の遺伝的修飾本発明の方法の第一工程では、宿主細胞を、組換えタンパク質又はペプチドを発現する能力を有するように修飾する。宿主細胞は、当技術分野で公知の何らかの手法を用いて修飾することができる。例えば組換えタンパク質は、細胞のゲノムに内在性であり、細胞にトランスフェクト又は形質転換される発現ベクターから発現することができる。発現ベクターの構築並びにトランスフェクション又は形質転換のための手法を以下で述べる。宿主細胞はまた、以下で述べるようにゲノム挿入物から組換えタンパク質又はペプチドを発現するように修飾することもできる。組換えタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子を、相同的又は非相同的組換えなどの手法によって宿主細胞又は生物のゲノムに挿入することができる。これらの手法を以下で述べる。組換えタンパク質又はペプチドは、細胞のさらなる操作を必要とするエレメントの制御下で発現され得る。例えばタンパク質又はペプチド発現を開始させる又は上昇させるためには細胞の化学的処理が必要であり得る。宿主細胞における組換えタンパク質又はペプチドの発現を支配するプロモーター及びリプレッサーエレメントを以下で説明するが、これらは当技術分野において周知である。これらは、IPTGに応答性の、tacプロモーターに基づくプロモーターエレメントを含み得る。本発明の方法は、真核又は原核生物起源のものを含む、所与の宿主系において使用することができる。前記方法は一般に、特定される遺伝子を特定するための遺伝的プロフィールの分析に十分な遺伝子情報の入手可能性によってのみ制限される。一般に、ゲノムの大きなパーセンテージからの代表的配列、例えばゲノム、トランスクリプトーム又はプロテオームにおいて発現される又は認められる配列の少なくとも50、60、70、80、90、95、98、99又は100が入手可能であることが典型的であるが、本発明は、ゲノム、トランスクリプトーム又はプロテオーム内の配列の一部だけを用いて実施することができる。特に、入手可能な情報が関連配列の群、例えば代謝的連鎖群に関する情報を含む場合、ゲノムからの代表配列の小さな部分だけを本発明の方法のために使用することができる。本発明の方法はまた、方法の鍵となる態様が、組換えタンパク質又はペプチドの発現時に宿主細胞において起こる細胞変化を特定し、当技術分野で公知の手法を用いて宿主細胞を修飾するための手法に基づく、発現系を合理的且つ反復可能に設計する能力であるので、発現される特定組換えタンパク質に限定されない。宿主細胞は、組換えタンパク質又はペプチドを生産することができるいかなる細胞でもあり得る。1つの実施形態では、宿主細胞は微生物細胞、すなわち細菌、真菌、酵母、又は他の単細胞真核生物、原核生物及びウイルスからの細胞である。組換えタンパク質又はペプチドを生産するために最も一般的に使用される系は、それらの比較的安価な増殖必要条件と大規模なバッチ培養においてタンパク質を生産する潜在的能力の故に、ある種の細菌細胞、特に大腸菌を含む。酵母も、特に研究目的のために、生物学的に関連するタンパク質及びペプチドを発現するために使用される。系は、サッカロミセスセレビシエ又はピキアパストリスを含む。これらの系は十分に特性決定されており、一般的に許容されるレベルの総タンパク質発現を提供し、比較的迅速且つ安価である。昆虫細胞発現系も、生物活性形態の組換えタンパク質を発現するための選択肢として浮上してきた。一部の場合には、翻訳後修飾されている正しく折りたたまれたタンパク質が生産できる。哺乳動物発現系、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞も組換えタンパク質の発現のために使用されてきた。小規模では、これらの発現系はしばしば有効である。ある種の生物学的製剤は、特に動物又はヒト医療適用において、哺乳動物タンパク質に由来し得る。もう1つの実施形態では、宿主細胞は、タバコ細胞、トウモロコシ、アラビドプシスシロイヌナズナ種からの細胞、ジャガイモ又はイネ細胞を含むがこれらに限定されない、植物細胞である。もう1つの実施形態では、トランスジェニック生物を含むがこれらに限定されない、多細胞生物が本発明の方法において分析又は修飾される。多細胞生物を分析及び/又は修飾するための手法は、一般に以下で述べる細胞を修飾するために記述されている手法に基づく。1つの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えばエシェリキア属又はシュードモナス属種を含むがこれらに限定されない細菌細胞であり得る。典型的細菌細胞は、例えばURLhttpwwwemcmaricopaedufacultyfarabeeBIOBKBioBookDiversity2htmlにおいてDrMJFarabeeoftheEstrellaMountainCommunityCollegeArizonaUSAによって提供される、BiologicalDiversityBacteriaandArchaeansachapteroftheOnLineBiologyBookに述べられている。ある実施形態では、宿主細胞はシュードモナス属細胞であり得、典型的にはP.フルオレセンス細胞であり得る。他の実施形態では、宿主細胞はまた、大腸菌細胞であり得る。もう1つの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えばスポドプテラ属、トリコプルシアドロソフィラ又はエスチグメネ種からの細胞を含むがこれらに限定されない、昆虫細胞、又はマウス細胞、ハムスター細胞、サル、霊長動物又はヒト細胞を含むがこれらに限定されない、哺乳動物細胞であり得る。ある実施形態では、宿主細胞はシュードモナス属細胞であり、例えばP.フルオレセンス生物であり得る。1つの実施形態では、宿主細胞は、細菌分類群のいずれかの成員であり得る。細胞は、例えば真正細菌のいずれかの種の成員であり得る。宿主は、以下の分類群:アシドバクテリウム門Acidobacteria、放線菌門Actinobacteira、アキフェックス門Aquificae、バクテロイデス門Bacteroidetes、クロロビウム門Chlorobi、クラミジア門Chlamydiae、クロロフレクサス門Chorofexi、クリシオゲネス門Chrysiogenetes、シアノバクテリア門Cyanobacteria、デフェリバクター門Deferribacteres、デイノコックス門Deinococcus、ディクチオグロムス門Dictyoglomi、フィブロバクター門Fibrobacteres、グラム陽性細菌門Firmicutes、フソバクテリウム門Fusobacteria、ゲマティモナス門Gemmatimonadetes、レンティスファエラ門Lentisphaerae、ニトロスピラ門Nitrospirae、プランクトミセス門Planctomycetes、プロテオバクテリア門Proteobacteria、スピロヘータ門Spirochaetes、テルモデスルフォバクテリウム門Thermodesulfobacteria、サーモミクロビア門Thermomicrobia、テルモトガ門Thermotogae、テルムス門Thermales、又はヴェルコミクロビウム門Verrucotnicrobiaのいずれか1つの成員であり得る。真正細菌宿主細胞の1つの実施形態では、細胞は、シアノバクテリア門を除く真正細菌のいずれかの種の成員であり得る。細菌宿主はまた、プロテオバクテリア門のいずれかの種の成員であり得る。プロテオバクテリア宿主細胞は、分類群:アルファプロテオバクテリア綱Alphaproteobacteria、ベータプロテオバクテリア綱Betaproteobacteria、ガンマプロテオバクテリア綱Gammaproteobacteria、デルタプロテオバクテリア綱Deltaproteobacteria又はイプシロンプロテオバクテリア綱Epsilonproteobacteriaのいずれか1つの成員であり得る。加えて、宿主は、分類群:アルファプロテオバクテリア綱Alphaproteobacteria、ベータプロテオバクテリア綱Betaproteobacteria又はガンマプロテオバクテリア綱Gammaproteohacteriaのいずれか1つの成員であり得、ガンマプロテオバクテリア綱Gammaproteobacteriaのいずれかの種の成員であり得る。ガンマプロテオバクテリア綱宿主の1つの実施形態では、宿主は、分類群:エアロモナス目Aeromonadales、アルテロモナス目Alteromonadales、エンテロバクター目Enterobacteriales、シュードモナス目Pseudornonadales又はキサントモナス目Xanthomonadalesのいずれか1つの成員;又はエンテロバクター目Enterobacterial又はシュードモナス目Pseudornonadalesのいずれかの種の成員である。1つの実施形態では、宿主細胞はエンテロバクター目Enterobacterialesであり得、宿主細胞は、腸内細菌科Enterobacteriaceaeの成員、又はエルウィニア属Erwinia、エシェリキア属Escherichia又はセラチア属Serratiaのいずれか1つの成員、又はエシェリキア属Escherichiaの成員である。シュードモナス目Pseudomonadalesの宿主細胞の1つの実施形態では、宿主細胞は、シュードモナス科Pseudomonadaceae、さらにはシュードモナス属Pseudomonasの成員である。ガンマプロテオバクテリア宿主は、大腸菌Escherichiacoli種の成員及びシュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescens種の成員を含む。他のシュードモナス属Pseudomonas生物も有用であり得る。シュードモナス属及び密接に関連する種は、REBuchananandNEGibbonsBergeysManualofDeterminativeBacteriologypp217289以下バージェイ1974によってグラム陰性好気性杆菌及び球菌と表わされる科及び/又は属に属するプロテオバクテリアの群を含む、グラム陰性のプロテオバクテリアサブグループ1を含む。以下の表はこれらの科及び属の生物を示す。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ1はまた、分類で使用される判定基準に従ってこの表題に分類されるプロテオバクテリアを含む。この表題はまた、以前にこの項に分類されていたが現在はもはやそうではない群、例えばアシドボラクスAcidovorax、ブレブンディモナスBrevundimonas、ブルクホルデリアBurkholderia、ヒドロゲノファガHydrogenophaga、オセアニモナスOceanimonas、ラルストニアRalstonia及びステノトロフォモナス属Stenotrophomonas、キサントモナス属Xanthomonasに属する及び以前にキサントモナス属の種と呼ばれていた生物を再分類することによって作られた、スフィンゴモナス属Sphingomonas及びそれに由来するブラストモナス属Blastomonas、バージェイ1974において定義されるアセトバクター属Acetobacterに属する生物を再分類することによって作られたアシドモナス属Acidomonasを含む。加えて、宿主は、シュードモナス属からの細胞、すなわちそれぞれアルテロモナスハロプランクティスAlteromonashaloplanktis、アルテロモナスニグリファシエンスAlteromonasnigrifaciens及びアルテロモナスプトレファシエンスAlteromonasputrefaciensとして再分類された、シュードモナスエナリアPseudomonasenaliaATCC14393、シュードモナスニグリファシエンスPseudomonasnigrifaciensATCC19375及びシュードモナスプトレファシエンスPseudomonasputrefaciensATCC8071を含み得る。同様に、例えばシュードモナスアシドボランスPseudomonasacidovoransATCC15668及びシュードモナステストステローニPseudomonastestosteroniATCC11996は、その後それぞれコマモナスアシドボランスComamonasacidovorans及びコマモナステストステローニComamonastestosteroniとして再分類され;シュードモナスニグリファシエンスPseudomonasnigrifaciensATCC19375及びシュードモナスピスキキダPseudomonaspiscicidaATCC15057は、それぞれシュードアルテロモナスニグリファシエンスasPseudoalteromonasnigrifaciens及びシュードアルテロモナスピスキキダPseudoalteromonaspiscicidaとして再分類された。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ1はまた、以下の科:シュードモナス、アゾトバクター現在はしばしば、シュードモナス科のアゾトバクター群という同義語で呼ばれる、リゾビウム及びメチロモナス現在はしばしばメチロコッカスという同義語で呼ばれるのいずれかに属すると分類されるプロテオバクテリアを含む。その結果、ここで述べる属に加えて、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ1に含まれるさらなるプロテオバクテリア属は、1アゾリゾフィルス属Azorhizophilusのアゾトバクター群細菌;2セルビブリオCellvibrio、オリゲラOligella及びテレディニバクター属Teredinibacterのシュードモナス科細菌;3ケラトバクターChelatobacter、エンシファーEnsifer、リベリバクターLiberibacterカンジダリベリバクターCandidatusLiberibacterとも呼ばれる、及びシノリゾビウム属Sinorhizobiumのリゾビウム科細菌;及び4メチロバクターMethylobacter、メチロカルダムMethylocaldum、メチロミクロビウムMethylomicrobium、メチロサルシナMethylosarcina及びメチロスフェラ属Methylosphaeraのメチロコッカス科細菌を含む。もう1つの実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ2から選択される。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ2は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義されるカタログにリストされており、公的に入手可能な、その寄託菌株の総数を括弧内に示しており、異なる指示があるものを除き、全てATCCに寄託されている:アシドモナスAcidomonas2;アセトバクターAcetobacter93;グルコノバクターGluconobacter37;ブレブンディモナスBrevundimonas23;ベイジェリンキアBeijerinckia13;デルキシアDerxia2;ブルセラBrucella4;アグロバクテリウムAgrobacterium79:ケラトバクターChelatobacter2;エンシファーEnsifer3;リゾビウムRhizobium144;シノリゾビウムSinorhizobium24;ブラストモナスBlastomonas1;スフィンゴモナスSphingomonas27;アルカリゲネスAlcaligenes88;ボルデテラBordetella43;ブルクホルデリアBurkholderia73;ラルストニアRalstonia33;アシドボラクスAcidovorax20;ヒドロゲノファガHydrogenophaga9;ズーグレアZoogloea9;メチロバクターMethylobacter2;メチロカルダムMethylocaldumNCIMBに1;メチロコッカスMethylococcus2;メチロミクロビウムMethylomicrobium2;メチロモナスMethylomonas9;メチロサルシナMethylosarcina1;メチロスフェラMethylosphaera;アゾモナスAzomonas9;アゾリゾフィルスAzorhizophilus5;アゾトバクターAzotobacter64;セルビブリオCellvibrio3;オリゲラOligella5;シュードモナスPseudomonas1139;フランシセラFrancisella4;キサントモナスXanthomonas229;ステノトロフォモナスStenotrophomonas50;及びオセアニモナスOceanimonas4。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ2の例示的な宿主細胞種は、以下の細菌を含むが、これらに限定されないその例示的な菌株のATCC又は他の寄託数を括弧内に示す:アシドモナスメタノリカAcidomonasmethanolicaATCC43581;アセトバクターアセチAcetobacteracetiATCC15973;グルコノバクターオキシダンスGluconobacteroxydansATCC19357;ブレブンディモナスディミヌータBrevundimonasdiminutaATCC11568;ベイジェリンキアインディカBeijerinckiaindicaATCC9039及びATCC19361;デルキシアガモサDerxiagummosaATCC15994;ブルセラメリテンシスBrucellamelitensisATCC23456、ブルセラアボルツスBrucellaabortusATCC23448;アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensATCC23308、アグロバクテリウムラジオバクターAgrobacteriumradiobacterATCC19358、アグロバクテリウムリゾゲネスAgrobacteriumrhizogenesATCC11325;ケラトバクターヘインツィイChelatobacterheintziiATCC29600;エンシファーアドヘレンスEnsiferadhaerensATCC33212;リゾビウムレグミノサルムRhizobiumleguminosarumATCC10004;シノリゾビウムフレディイSinorhizobiumfrediiATCC35423;ブラストモナスナタトリアBlastomonasnatatoriaATCC35951;スフィンゴモナスパウシモビリスSphingomonaspaucimobilisATCC29837;アルカリゲネスフェカリスAlcaligenesfaecalisATCC8750;ボルデテラペルタッシスBordetellapertussisATCC9797;ブルクホルデリアセパシアBurkholderiacepaciaATCC25416;ラルストニアピケッティイRalstoniapickettiiATCC27511;アシドボラクスファシリスAcidovoraxfacilisATCC11228;ヒドロゲノファガフラバHydrogenophagaflavaATCC33667;ズーグレアラミゲラZoogloearamigeraATCC19544;メチロバクタールテウスMethylobacterluteusATCC49878;メチロカルダムグラシルMethylocaldumgracileNCIMB11912;メチロコッカスカプスラツスMethylococcuscapsulatusATCC19069;メチロミクロビウムアジールMethylomicrobiumagileATCC35068;メチロモナスメタニカMethylomonasmethanicaATCC35067;メチロサルシナフィブラタMethylosarcinafibrataATCC700909;メチロスフェラハンソニイMethylosphaerahansoniiACAM549;アゾモナスアジリスAzomonasagilisATCC7494;アゾリゾフィルスパスパリAzorhizophiluspaspaliATCC23833;アゾトバクタークロオコッカムAzotobacterchroococcumATCC9043;セルビブリオミクツスCellvibriomixtusUQM2601;オリゲラウレトラリスOligellaurethralisATCC17960;緑膿菌PseudomonasaeruginosaATCC10145、シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensATCC35858;フランシセラツラレンシスFrancisellatularensisATCC6223;ステノトロフォモナスマルトフィリアStenotrophomonasmaltophiliaATCC13637;キサントモナスカンペストリスXanthomonascampestrisATCC33913;及びオセアニモナスドゥドロフィイOceanimonasdoudoroffiiATCC27123。もう1つの実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ3から選択される。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ3は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブレブンディモナスBrevundimonas;アグロバクテリウムAgrobacterium;リゾビウムRhizohium;シノリゾビウムSinorhizobium;ブラストモナスBlastomonas;スフィンゴモナスSphingomonas;アルカリゲネスAlcaligenes;ブルクホルデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;アシドボラクスAcidovorax;ヒドロゲノファガHydrogenophaga;メチロバクターMethylobacter;メチロカルダムMethylocaldum;メチロコッカスMethylococcus;メチロミクロビウムMethylomicrobium;メチロモナスMethylomonas;メチロサルシナMethylosarcina;メチロスフェラMethylosphaera;アゾモナスAzomonas;アゾリゾフィルスAzorhizophilus;アゾトバクターAzotobacter;セルビブリオCellvibrio;オリゲラOligella;シュードモナスPseudomonas;テレディニバクターTeredinibacter;フランシセラFrancisella;ステノトロフォモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonas;及びオセアニモナスOceanimonas。もう1つの実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ4から選択される。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ4は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブレブンディモナスBrevundimonas;ブラストモナスBlastomonas;スフィンゴモナスSphingomonas;ブルクホルデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;アシドボラクスAcidovorax;ヒドロゲノファガHydrogenophaga;メチロバクターMethylobacter;メチロカルダムMethylocaldum;メチロコッカスMethylococcus;メチロミクロビウムMethylomicrobium;メチロモナスMethylomonas;メチロサルシナMethylosarcina;メチロスフェラMethylosphaera;アゾモナスAzomonas;アゾリゾフィルスAzorhizophilus;アゾトバクターAzotobacter;セルビブリオCellvibrio;オリゲラOligella;シュードモナスPseudomonas;テレディニバクターTeredinibacter;フランシセラFrancisella;ステノトロフォモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonas;及びオセアニモナスOceanimonas。もう1つの実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ5から選択される。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ5は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:メチロバクターMethylobacter;メチロカルダムMethylocaldum;メチロコッカスMethylococcus;メチロミクロビウムMethylomicrobium;メチロモナスMethylomonas;メチロサルシナMethylosarcina;メチロスフェラMethylosphaera;アゾモナスAzomonas;アゾリゾフィルスAzorhizophilus;アゾトバクターAzotobacter;セルビブリオCellvibrio;オリゲラOligella;シュードモナスPseudomonas;テレディニバクターTeredinibacter;フランシセラFrancisella;ステノトロフォモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonas;及びオセアニモナスOceanimonas。もう1つの実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ6から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ6は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブレブンディモナスBrevundimonas;ブラストモナスBlastomonas;スフィンゴモナスSphingomonas;ブルクホルデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;アシドボラクスAcidovorax;ヒドロゲノファガHydrogenophaga;アゾモナスAzomonas;アゾリゾフィルスAzorhizophilus;アゾトバクターAzotobacter;セルビブリオCellvibrio;オリゲラOligella;シュードモナスPseudomonas;テレディニバクターTeredinibacter;ステノトロフォモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonas;及びオセアニモナスOceanimonas。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ7から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ7は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:アゾモナスAzomonas;アゾリゾフィルスAzorhizophilus;アゾトバクターAzotobacter;セルビブリオCellvibrio;オリゲラOligella;シュードモナスPseudomonas;テレディニバクターTeredinibacter;ステノトロフォモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonas;及びオセアニモナスOceanimonas。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ8から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ8は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブレブンディモナスBrevundimonas;ブラストモナスBlastomonas;スフィンゴモナスSphingomonas;ブルクホルデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;アシドボラクスAcidovorax;ヒドロゲノファガHydrogenophaga;シュードモナスPseudomonas;ステノトロフォモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonas;及びオセアニモナスOceanimonas。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ9から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ9は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブレブンディモナスBrevundimonas;ブルクホルデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;アシドボラクスAcidovorax;ヒドロゲノファガHydrogenophaga;シュードモナスPseudomonas;ステノトロフォモナスStenotrophomonas;及びオセアニモナスOceanimonas。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ10から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ10は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブルクホルデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;シュードモナスPseudomonas;ステノトロフォモナスStenotrophomonas;及びキサントモナスXanthomonas。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ11から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ11は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:シュードモナスPseudomonas;ステノトロフォモナスStenotrophomonas;及びキサントモナスXanthomonas。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ12から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ12は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブルクホルデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;シュードモナスPseudomonas。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ13から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ13は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:ブルクホルデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;シュードモナスPseudomonas;及びキサントモナスXanthomonas。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ14から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ14は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される:シュードモナスPseudomonas及びキサントモナスXanthomonas。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ15から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ15は、シュードモナス属Pseudomonasのプロテオバクテリアの群と定義される。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ16から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ16は、以下のシュードモナスPseudomonas種のプロテオバクテリアの群と定義される例示的な菌株のATCC又は他の寄託数を括弧内に示す:シュードモナスアビエタニフィラPseudomonasabietaniphilaATCC700689;緑膿菌PseudomonasaeruginosaATCC10145;シュードモナスアルカリゲネスPseudomonasalcaligenesATCC14909;シュードモナスアンギリセプティカPseudomonasanguillisepticaATCC33660;シュードモナスシトロネロリスPseudomonascitronellolisATCC13674;シュードモナスフラベセンスPseudomonasflavescensATCC51555;シュードモナスメンドシナPseudomonasmendocinaATCC25411;シュードモナスニトロレドゥセンスPseudomonasnitroreducensATCC33634;シュードモナスオレオボランスPseudomonasoleovoransATCC8062;シュードモナスシュードアルカリゲネスPseudomonaspseudoalcaligenesATCC17440;シュードモナスレシノボランスPseudomonasresinovoransATCC14235;シュードモナスストラミネアPseudomonasstramineaATCC33636;シュードモナスアガリシPseudomonasagariciATCC25941;シュードモナスアルカリフィラPseudomonasalcaliphila;シュードモナスアルギノボラPseudomonasalginovora;シュードモナスアンダーソニイPseudomonasandersonii;シュードモナスアスプレニイPseudomonasaspleniiATCC23835;シュードモナスアゼライカPseudomonasazelaicaATCC27162;シュードモナスベイジェリンキイPseudomonasbeijerinckiiATCC19372;シュードモナスボレアリスPseudomonasborealis;シュードモナスボレオポリスPseudomonasboreopolisATCC33662;シュードモナスブラシカセラムPseudomonasbrassicacearum;シュードモナスブタノボラPseudomonasbutanovoraATCC43655;シュードモナスセルロサPseudomonascellulosaATCC55703;シュードモナスアウランティアカPseudomonasaurantiacaATCC33663;シュードモナスクロロラフィスPseudomonaschlororaphisATCC9446、ATCC13985、ATCC17418、ATCC17461;シュードモナスフラジPseudomonasfragiATCC4973;シュードモナスルンデンシスPseudomonaslundensisATCC49968;シュードモナステトロレンスPseudomonastaetrolensATCC4683;シュードモナスシシコラPseudomonascissicolaATCC33616;シュードモナスコロナファシエンスPseudomonascoronafaciens;シュードモナスジターペニフィラPseudomonasditerpeniphila;シュードモナスエロンガータPseudomonaselongataATCC10144;シュードモナスフレクテンスPseudomonasβectensATCC12775;シュードモナスアゾトフォルマンスPseudomonasazotoformans;シュードモナスブレネリPseudomonasbrenneri;シュードモナスセドレラPseudomonascedrella;シュードモナスコルガタPseudomonascorrugataATCC29736;シュードモナスエクストレモリエンタリスPseudomonasextremorientalis;シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensATCC35858;シュードモナスゲッサルディイPseudomonasgessardii;シュードモナスリバネンシスPseudomonaslibanensis;シュードモナスマンデリイPseudomonasmandeliiATCC700871;シュードモナスマージナリスPseudomonasmarginalisATCC10844;シュードモナスミグレPseudomonasmigulae;シュードモナスムシドレンスPseudomonasmucidolensATCC4685;シュードモナスオリエンタリスPseudomonasorientalis;シュードモナスローデシエPseudomonasrhodesiae;シュードモナスシンキサンタPseudomonassynxanthaATCC9890;シュードモナストラアシイPseudomonastolaasiiATCC33618;シュードモナスベロニイPseudomonasveroniiATCC700474;シュードモナスフレデリクスベルゲンシスPseudomonasfrederiksbergensis;シュードモナスゲニクラータPseudomonasgeniculataATCC19374;シュードモナスギンゲリPseudomonasgingeri;シュードモナスグラミニスPseudomonasgraminis;シュードモナスグリモンティイPseudomonasgrimontii;シュードモナスハロデニトリフィカンスPseudomonashalodenitrificans;シュードモナスハロフィラPseudomonashalophila;シュードモナスヒビシコラPseudomonashibiscicolaATCC19867;シュードモナスハティエンシスPseudomonashuttiensisATCC14670;シュードモナスヒドロゲノボラPseudomonashydrogenovora;シュードモナスジェセニイPseudomonasjesseniiATCC700870;シュードモナスキロネンシスPseudomonaskilonensis;シュードモナスランセオラータPseudomonaslanceolataATCC14669;シュードモナスリニPseudomonaslini;シュードモナスマージナータPseudomonasmarginataATCC25417;シュードモナスメフィティカPseudomonasmephiticaATCC33665;シュードモナスデニトリフィカンスPseudomonasdenitrificansATCC19244;シュードモナスペルタシノゲナPseudomonaspertucinogenaATCC190;シュードモナスピクトラムPseudomonaspictorumATCC23328;シュードモナスプシクロフィラPseudomonaspsychrophila;シュードモナスファルヴァPseudomonasfiilvaATCC31418;シュードモナスモンテイリイPseudomonasmonteiliiATCC700476;シュードモナスモッセリイPseudomonasmosselii;シュードモナスオリジハビタンスPseudomonasoryzihabitansATCC43272;シュードモナスプレコグロシシダPseudomonasplecoglossicidaATCC700383;シュードモナスプチダPseudomonasputidaATCC12633;シュードモナスレアクタンスPseudomonasreactans;シュードモナススピノザPseudomonasspinosaATCC14606;シュードモナスバレアリカPseudomonasbalearica;シュードモナスルテオラPseudomonasluteolaATCC43273;シュードモナススタツェリPseudomonasstutzeriATCC17588;シュードモナスアミグダリPseudomonasamygdaliATCC33614;シュードモナスアヴェラネPseudomonasavellanaeATCC700331;シュードモナスカリカパパイエPseudomonascaricapapayaeATCC33615;シュードモナスシコリイPseudomonascichoriiATCC10857;シュードモナスフィカセレクテPseudomonasficuserectaeATCC35104;シュードモナスファスコバギネPseudomonasfuscovaginae;シュードモナスメリエPseudomonasmeliaeATCC33050;シュードモナスシリンゲPseudomonassyringaeATCC19310;シュードモナスビリディフラバPseudomonasviridiflavaATCC13223;シュードモナスサーモカルボキシドボランスPseudomonasthermocarboxydovoransATCC35961;シュードモナスサーモトレランスPseudomonasthermotolerans;シュードモナスチベルバレンシスPseudomonasthivervalensis:シュードモナスバンクベレンシスPseudotnonasvancouverensisATCC700688;シュードモナスウィスコンシネンシスPseudomonaswisconsinensis;及びシュードモナスキシアメネンシスPseudomonasxiamenensis。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ17から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ17は、例えば以下のシュードモナスPseudomonas種に属するものを含む、蛍光シュードモナス菌として当技術分野で公知のプロテオバクテリアの群と定義される:シュードモナスアゾトフォルマンスPseudomonasazotoformans;シュードモナスブレネリPseudomonasbrenneri;シュードモナスセドレラPseudomonascedrella;シュードモナスコルガタPseudomonascorrugata;シュードモナスエクストレモリエンタリスPseudomonasextremorientalis;シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescens;シュードモナスゲッサルディイPseudomonasgessardii;シュードモナスリバネンシスPseudomonaslibanensis;シュードモナスマンデリイPseudomonasmandelii;シュードモナスマージナリスPseudomonasmarginalis;シュードモナスミグレPseudomonasmigulae;シュードモナスムシドレンスPseudomonasmucidolens;シュードモナスオリエンタリスPseudomonasorientalis;シュードモナスローデシエPseudomonasrhodesiae;シュードモナスシンキサンタPseudomonassynxantha;シュードモナストラアシイPseudomonastolaasii;及びシュードモナスシュードモナスベロニイPseudomonasveronii。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ18から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ18は、例えば以下に属するものを含む、シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescens種の全ての亜種、品種、菌株及び他の特定サブユニットの群と定義される例示的な菌株のATCC又は他の寄託数を括弧内に示す:ビオバル1又はビオバルIとも呼ばれるシュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensバイオタイプ同遺伝子型個体群AATCC13525;ビオバル2又はビオバルIIとも呼ばれるシュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensバイオタイプBATCC17816;ビオバル3又はビオバルIIIとも呼ばれるシュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensバイオタイプCATCC17400;ビオバル4又はビオバルIVとも呼ばれるシュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensバイオタイプFATCC12983;ビオバル5又はビオバルVとも呼ばれるシュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensバイオタイプGATCC17518;シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensビオバルVI;シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensPf0-1;シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensPf-5ATCCBAA-477;シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensSBW25;及びシュードモナスフルオレセンス亜種セルロサPseudomonasfluorescenssubspcellulosaNCIMB10462。宿主細胞は、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ19から選択することができる。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ19は、シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensバイオタイプAの全ての菌株の群と定義される。このバイオタイプの典型的な菌株は、P.フルオレセンスPfluorescens菌株MB101Wilcoxへの米国特許第5,169,760号参照及びその誘導体である。その誘導体の一例は、MB101染色体asdアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子遺伝子座に天然大腸菌PlacI-lacI-lacZYAを挿入することによって構築されるすなわちPlacZが欠失した、P.フルオレセンスPfluorescens菌株MB214である。本発明において使用できるさらなるP.フルオレセンスPfluorescens菌株は、以下のATCC番号を有する、シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensミグラ及びシュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescensロイトキトクを含む:[NCIB8286];NRRLB-1244;NCIB8865菌株CO1;NCIB8866菌株CO2;1291[ATCC17458;IFO15837;NCIB8917;LA;NRRLB-1864;ピロリジン;PW2[ICMP3966;NCPPB967;NRRLB-899];13475;NCTC10038;NRRLB-1603[6;IFO15840];52-1C;CCEB488-A[BU140];CCEB553[IEM15/47];IAM1008[AHH-27];IAM1055[AHH-23];1[IFO15842];12[ATCC25323;NIH11;denDoorendeJong216];18[IFO15833;WRRLP-7];93[TR-10];108[52-22;IFO15832];143[IFO15836;PL];149[2-40-40;IFO15838];182[IFO3081;PJ73];184[IFO15830];185[W2L-1];186[IFO15829;PJ79];187[NCPPB263];188[NCPPB316];189[PJ227;1208];191[IFO15834;PJ236;22/1];194[KlingeR-60;PJ253];196[PJ288];197[PJ290];198[PJ302];201[PJ368];202[PJ372];203[PJ376];204[IFO15835;PJ682];205[PJ686];206[PJ692];207[PJ693];208[PJ722];212[PJ832];215[PJ849];216[PJ885];267[B-9];271[B-1612];401[C71A;IFO15831;PJ187];NRRLB-3178[4;IFO15841];KY8521;3081;30-21;[IFO3081];N;PYR;PW;D946-B83[BU2183;FERM-P3328];P-2563[FERM-P2894;IFO13658];IAM-1126[43F];M-1;A506[A5-06];A505[A5-05-1];A526[A5-26];B69;72;NRRLB-4290;PMW6[NCIB11615];SC12936;A1[IFO15839];F1847[CDC-EB];F1848[CDC93];NCIB10586;P17;F-12;AmMS257;PRA25;6133D02;6519E01;Nl;SC15208;BNL-WVC;NCTC2583[NCIB8194];H13;1013[ATCC11251;CCEB295];IFO3903;1062;又はPf-5。他の適切な宿主は、前記参考文献の他の項に分類されているもの、例えばグラム陽性プロテオバクテリアを含む。1つの実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。大腸菌についてのゲノム配列は、大腸菌MG1655に関して確立されておりThecompletegenomesequenceofEscherichiacoliK12Science277145374、大腸菌K12についてのDNAマイクロアレイはMWGInc,HighPoint,NCが市販されている。大腸菌は、富化培地、例えばルリア-エルタニLB10g/Lトリプトン、5g/LNaCl、5g/L酵母抽出物又は規定最小培地、例えば1グルコースのような適切な炭素源を添加したM96g/LNa2HPO4、3g/LKH2PO4、1g/LNH4Cl、0.5g/LNaCl、pH7.4のいずれかで培養することができる。常套的には、大腸菌細胞の一晩培養物を希釈し、振とうフラスコ又は発酵槽のいずれかにおいて新鮮富化又は最小培地に接種して、37°Cで増殖させる。宿主はまた、哺乳動物起源、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物に由来する細胞であり得る。哺乳動物は、霊長動物、サル、ブタ、ヒツジ、ウシ、げっ歯動物、有蹄動物、ブタ、ヒツジ、子ヒツジ、ヤギ、ウシ、シカ、ラバ、ウマ、サル、類人猿、イヌ、ラット及びマウスを含むが、これらに限定されない。宿主細胞はまた、植物起源でもよい。遺伝子及び調節配列の特定のためにいかなる植物も選択することができる。遺伝子及び調節配列の単離のための適切な植物標的の例は、アルファルファ、リンゴ、アプリコット、シロイヌナズナ、アーティチョーク、ルッコラ、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、カノーラ、マスクメロン、ニンジン、カッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、サクランボ、チコリ、コリアンダー、柑橘類、クレメンタイン、クローバー、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、綿、クランベリー、キュウリ、ダグラスモミ、ナス、エンダイブ、キクヂシャ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、ニンニク、ウリ、ブドウ、グレープフルーツ、ハネデューメロン、葛芋、キウイフルーツ、レタス、リーキ、レモン、ライム、テーダマツ、アマニ、マンゴー、メロン、マッシュルーム、ネクタリン、木の実、カラスムギ、油ヤシ、アブラナ、オクラ、オリーブ、タマネギ、オレンジ、観賞植物、ヤシ、パパイヤ、パセリ、アメリカボウフウ、エンドウマメ、モモ、落花生、洋ナシ、コショウ、カキ、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、ラジアタマツ、radiscchio、ラディッシュ、ナタネ、ラズベリー、イネ、ライ麦、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝、カブ、ブドウの木、スイカ、コムギ、山芋及びズッキーニを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の方法において有用な植物は、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、ダイズ及び綿である。組換えタンパク質又はペプチドの発現のため、又は特定された補償遺伝子の調節のために、いかなる植物プロモーターも使用できる。プロモーターは、植物RNAポリメラーゼIIプロモーターであり得る。植物プロモーターに含まれるエレメントは、典型的には転写開始部位の約25-35塩基対上流に位置する、TATAボックス又はゴールドバーグホグネスボックス、及び70-100塩基対上流に位置するCCAATボックスであり得る。植物では、CCAATボックスは、哺乳動物プロモーターの機能的類似配列とは異なるコンセンサス配列を有し得る。加えて、実質的に全てのプロモーターが、転写開始部位の約-100bpから-1000bp又はそれ以上の上流に及ぶ、付加的な上流活性化配列又はエンハンサーを含む。組換えタンパク質又はペプチドの発現以下で述べるように、宿主細胞又は生物は、標準手法を用いて組換えタンパク質又はペプチドを発現するように工作することができる。例えば組換えタンパク質は、宿主のゲノムに挿入したベクターから又は外来性遺伝子から発現することができる。外来性タンパク質を発現するために使用できるベクターは当技術分野において周知であり、以下で述べる。組換えタンパク質又はペプチドを発現するための遺伝子はまた、以下で述べるように、相同的又は非相同的組換えなどの手法を用いてゲノムに挿入することができる。組換えタンパク質又はペプチドは、化合物による誘導後又は外来性遺伝子又は遺伝子産物の発現時に発現され得る。組換えタンパク質はまた、宿主細胞を特定環境に置いたときにも発現され得る。詳細なプロモーターエレメントを以下で述べる。これらは、化学物質、例えばIPTG、安息香酸塩又はアントラニル酸塩で細胞を処理したときに誘導され得るプロモーターを含むが、これらに限定されない。組換えタンパク質/ペプチド宿主細胞は、組換えタンパク質又はペプチドを発現するように設計されてきた。これらはいかなる種及びいかなる大きさでもあり得る。しかし、ある実施形態では、組換えタンパク質又はペプチドは、治療上有用なタンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、タンパク質は、哺乳動物タンパク質、例えばヒトタンパク質であり得、例えば増殖因子、サイトカイン、ケモカイン又は血液タンパク質であり得る。組換えタンパク質又はペプチドは、主として宿主細胞において不活性形態で発現され得る。ある実施形態では、組換えタンパク質又はペプチドは、100kD未満、50kD未満又は30kD未満の大きさである。ある実施形態では、組換えタンパク質又はペプチドは、少なくとも5、10、15、20、30、40、50又は100アミノ酸のペプチドである。大腸菌における組換えタンパク質生産を可能にする発現ベクターが存在する。これらのタンパク質発現系全てに関して、先に記述されているような常套的クローニング手法に従うことができるMolecularcloningAlaboratorymanualthirdeditionColdSpringHarborNewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress。Champion商標pET発現系は高レベルのタンパク質生産を提供する。発現は、強力なT7lacプロモーターから誘導される。この系は、対象遺伝子の高レベル転写のためにバクテリオファージT7RNAポリメラーゼの高い活性と特異性を利用する。プロモーター領域内に位置するlacオペレーターは、伝統的なT7に基づくベクターよりも厳密な調節を提供し、プラスミドの安定性と細胞の生存率を改善するUseofbacteriophageT7RNApolymerasetodirectselectivehighlevelexpressionofclonedgenesJournalofMolecularBiology18911330RosenbergetalVectorsforselectiveexpressionofclonedDNAsbyT7RNApolymeraseGene5612535。T7発現系は、対象遺伝子の高レベル転写のためにT7プロモーターとT7RNAポリメラーゼT7RNAPを使用する。T7RNAPは天然大腸菌RNAPよりもプロセシング能力が高く、対象遺伝子の転写専用であるので、T7発現系における高レベル発現が達成される。特定された遺伝子の発現は、宿主細胞においてT7RNAPのソースを提供することによって誘導される。これは、T7RNAP遺伝子の染色体コピーを含むBL21大腸菌宿主を使用することによって達成される。T7RNAP遺伝子は、IPTGによって誘導され得るlacUV5プロモーターの制御下にある。誘導時にT7RNAPが発現されて、対象遺伝子を転写する。pBAD発現系は、特定炭素源、例えばグルコース、グリセロール及びアラビノースの存在を通して組換えタンパク質の厳密に制御された、測定可能な発現を可能にするTightregulationmodulationandhighlevelexpressionbyvectorscontainingthearabinosePBADpromoteJournalofBacteriology177412130。pBADベクターは、発現レベルの正確な調節を与えるように独自に設計される。pBADベクターからの異種遺伝子発現はaraBADプロモーターで開始される。前記プロモーターは、araC遺伝子の産物によって正と負の両方に調節される。AraCは、L-アラビノースと複合体を形成する転写調節剤である。L-アラビノース不在下では、AraC二量体は転写をブロックする。最大転写活性化のためには2つの事象が必要である;iL-アラビノースがAraCに結合して転写の開始を可能にする、iicAMP活性化因子タンパク質CAP-cAMP複合体がDNAに結合して、AraCのプロモーター領域の正しい位置への結合を刺激する。trc発現系は、trcプロモーターからの大腸菌における高レベルの調節された発現を可能にする。trc発現ベクターは、大腸菌における真核細胞遺伝子の発現のために最適化された。trcプロモーターは、トリプトファンtrp及びラクトースlacプロモーターに由来する強力なハイブリッドプロモーターである。lacOオペレーター及びlacIQ遺伝子の産物によって調節されるToxicityofanoverproducedforeigngeneproductinEscherichiacolianditsuseinplasmidvectorsfortheselectionoftranscriptionterminatorsGene2716172。本発明はまた、特許請求する方法によって生産される改善された組換え宿主細胞を含む。1つの実施形態では、本発明は、記述する方法によって生産される細胞を含む。もう1つの実施形態では、本発明は、少なくとも2つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物を含む。他の実施形態では、本発明は、hslV、hslU、clpX、clpA及びclpB遺伝子の産物から成る群より選択される少なくとも1つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物を含み、ある小実施形態では、細胞又は生物は、HslV又はHslUの発現を低下させるように修飾されている。ある実施形態では、修飾された宿主細胞又は生物は、組換え哺乳動物由来タンパク質を発現し、ヒト成長ホルモンであり得る、組換えヒト由来タンパク質を発現し得る。細胞は、当技術分野で公知の何らかの手法によって、例えば少なくとも1個のプロテアーゼ遺伝子をゲノムからノックアウトする手法によって、又はプロテアーゼの発現を低下させるように少なくとも1個のプロテアーゼ遺伝子を突然変異させることによって、又はプロテアーゼの発現を低下させるように少なくとも1個のプロテアーゼ遺伝子の少なくとも1個のプロモーターを変化させることによって、修飾することができる。もう1つの実施形態では、少なくとも1個、少なくとも2個のフォールディング調節剤、又は少なくとも3個のフォールディング調節剤の発現を上昇させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主又は生物が提供される。ある小実施形態では、フォールディング調節剤はフォールディング調節剤サブユニットではない。フォールディング調節剤は、cbpA、htpG、dnaK、dnaJ、fkbP2、groES及びgroEL遺伝子の産物から成る群より選択でき、ある小実施形態では、htpG又はcbpAであり得る。宿主細胞又は生物は、非限定的な例では、哺乳動物タンパク質、例えばヒトタンパク質を発現する。前記タンパク質はヒト成長ホルモンであり得る。フォールディング調節剤は、例えばここで述べる発現ベクターを細胞に含めることによって、上昇させ得る。フォールディング調節剤発現はまた、例えばフォールディング調節剤又はフォールディング調節剤サブユニットのプロモーターを突然変異させることによって上昇させ得る。組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物はまた、少なくとも1個のフォールディング調節剤の発現を上昇させ、少なくとも1個のプロテアーゼ又はプロテアーゼタンパク質の発現を低下させるように遺伝的に修飾することができる。ここで述べる方法によって生産される1又はそれ以上の細胞を含む生物も、本発明に包含される。工程II:組換え細胞においてより高レベルで発現される補償遺伝子又は遺伝子産物を特定するために遺伝的プロフィールを分析すること本発明の方法は、組換えタンパク質を発現するように修飾されていない宿主細胞又は組換えタンパク質を発現しない組換え細胞よりも高いレベルで組換え細胞において発現される補償遺伝子又は遺伝子産物を特定するために、組換え細胞の遺伝的プロフィールを分析することを含む。ここで使用する遺伝的プロフィールは、ゲノム内の遺伝子、ゲノム内の遺伝子から転写されたmRNA又はゲノム内の遺伝子から転写されたmRNAに由来するcDNAを含み得る。遺伝的プロフィールはまた、細胞によって修飾された転写産物、例えば真核細胞系における遺伝子のスプライシング変異体、又は細胞によって修飾される又はゲノムから翻訳されたmRNAのスプライシング変異体から翻訳されるタンパク質を含む、ゲノム内の遺伝子から翻訳されるタンパク質を含み得る。遺伝的プロフィールは、もっぱら、複数同時ブロット分析又はパッキングに結合した多数の結合パートナーに関するカラムクロマトグラフィーを含む、アレイ又は他の多重システムにおけるような、複数の実体の同時分析を指すことが意図されている。本発明によれば、少なくとも5、10、25、50、70、80、90又は100又はそれ以上の遺伝子又は遺伝子産物が同時に分析される。トランスクリプトーム1つの実施形態では、分析する遺伝的プロフィールはトランスクリプトームプロフィールである。完全なトランスクリプトームとは、一度にゲノムによって生産されるmRNA転写産物の完全なセットを指す。ゲノムと異なり、トランスクリプトームは動的であり、遺伝子発現の異なるパターンの故に異なる状況においてはかなり変化する。トランスクリプトームの研究であるトランスクリプトミクスは、遺伝子発現パターンを特定する包括的な手段である。分析するトランスクリプトームは、転写される遺伝子の公知の完全なセット、すなわち宿主細胞又は宿主生物のmRNA含量又は対応するcDNAを含み得る。cDNAは、ヌクレオチドの鎖、単離ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸分子、又は組換え又は合成によって創出される何らかのフラグメント又はその相補物であり得、二本鎖又は一本鎖、コード及び/又は非コードであり得、ゲノムDNA分子のエクソン又はイントロンであり得、炭水化物、脂質、タンパク質又は無機元素又は物質と結合し得る。ヌクレオチド鎖は、少なくとも5、10、15、30、40、50、60、70、80、90又は100ヌクレオチドの長さであり得る。トランスクリプトームはまた、遺伝子転写産物の公知のセットの一部だけを含み得る。例えばトランスクリプトームは、宿主における公知の転写産物の98、95、90、85、80、70、60又は50未満を含み得る。トランスクリプトームはまた、遺伝子の特定セットを標的することができる。1つの実施形態では、スクリーニング方法は、遺伝的プロフィールを特定するためにアレイ又はマイクロアレイを使用するスクリーニングを含み得る。もう1つの実施形態では、トランスクリプトームプロフィールは、公知の方法、例えばブロットアッセイにおけるハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロット法におけるハイブリダイゼーションを使用することによって分析できる。もう1つの実施形態では、前記方法は、PCRに基づく方法、例えば特定セットの遺伝子の発現を定量することができるRT-PCRを含み得る。本発明の1つの実施形態では、特定される遺伝子、例えばフォールディング調節剤タンパク質FM又はプロテアーゼタンパク質、すなわちプロテアーゼ、ペプチダーゼ又は関連ポリペプチド又は補因子を、高流量スクリーニング工程によって特定する。前記方法は、マイクロアレイ又は等価手法を用いてトランスクリプトームプロフィールを分析することを含み得る。この実施形態では、マイクロアレイは、宿主細胞の転写ゲノムの少なくとも一部を含むことができ、典型的には生物の転写遺伝子の少なくとも50の遺伝子からの試料に対する結合パートナーを含む。より典型的には、マイクロアレイ又は等価手法は、宿主細胞のゲノム内の転写遺伝子の少なくとも80、90、95、98、99又は100からの試料についての結合パートナーを含む。しかし、別の実施形態では、マイクロアレイは、推定上のプロテアーゼ遺伝子又は推定上のフォールディング調節剤遺伝子を含むがこれらに限定差ない、ゲノムからの遺伝子の選択サブセットに対する結合パートナーを含み得る。マイクロアレイ又は等価手法はまた、典型的には対照として使用される遺伝子、例えばハウスキーパー遺伝子のセットに対する結合パートナーを含み得る。マイクロアレイ又は等価手法はまた、群にクラスター化された遺伝子、例えば分解性タンパク質、フォールディング調節剤及び補因子、代謝性タンパク質、例えばグルコース代謝又はアミノ酸又はヌクレオ塩基合成に関与するタンパク質、転写因子、核酸安定化因子、細胞外シグナル調節遺伝子、例えばキナーゼ及び受容体又は骨格タンパク質をコードする遺伝子を含み得る。マイクロアレイは一般に、ポリヌクレオチド、アプタマー、化学物質、抗体又は他のタンパク質又はペプチドを含み得る、多数の別個の結合パートナーを、規定されたパターンで固体支持体、例えばマイクロチップ、スライドガラス等に連結することによって形成される。マイクロアレイを対象細胞から得た試料と接触させ、チップ上の配列にハイブリダイズする、細胞において発現される結合パートナーの結合を検出することにより、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによって形成されるパターンは、細胞において発現される遺伝子又は遺伝子のクラスターの特定を可能にする。さらに、固体支持体に結合した各々の成員が公知である場合は、核酸試料からのハイブリダイズパートナーの同一性を特定することができる。マイクロアレイテクノロジーの1つの長所は、単にハイブリダイゼーションのパターンを比較することによって識別的な遺伝子発現の特定を可能にすることである。高流量スクリーニング方法の例は、ハイブリダイズ可能なアレイ又はマイクロアレイへの、宿主細胞のmRNA又は実質的に対応するcDNAのハイブリダイゼーションを含む。アレイ又はマイクロアレイは、核酸又は核酸類似体オリゴマー又はポリマーの1又はそれ以上のアレイであり得る。1つの実施形態では、アレイ又はマイクロアレイは、独立して又は集合的に、そのヌクレオチド配列が、宿主細胞菌株においてFMをコードすることが公知であるか又はFMをコードすると予測される全ての遺伝子又は宿主細胞菌株においてプロテアーゼをコードすることが公知であるか又はプロテアーゼをコードすると予測される全ての遺伝子の代表的部分にハイブリダイズし得る、核酸又は核酸類似体オリゴマー又はポリマーの個体群を含む、宿主細胞ゲノム全域hostcellgenomewideのアレイ又はマイクロアレイである。ゲノム全域のマイクロアレイは、宿主のmRNA又は対応するcDNAからのような、公知の又は予測上のオープンリーディングフレームORF配列全部の代表的部分に結合する配列を含む。アレイ内のオリゴヌクレオチド配列又は類似体は、典型的には宿主細胞からのmRNA又は対応するcDNA配列にハイブリダイズし、典型的には宿主のmRNA又はcDNA配列の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列又は宿主のmRNA又はcDNA配列に相同な配列を含む。相補的配列を有する一本鎖DNAは、互いに対合して、二本鎖分子を形成することができる。マイクロアレイは一般に、ハイブリダイゼーション原理を高度に平行な様式で適用する。特定された1個の代わりに、数千の異なる潜在的特定物を微小な固体支持体上に整列することができる。ユニークな標識DNAプローブの代わりに、特定細胞型又は組織のRNAから作製された、標識DNA分子の複雑な混合物を使用する。この複雑なプローブ中の個々の標識DNA分子の存在率は、典型的には対応する遺伝子の発現レベルを反映する。単純化した方法では、アレイにハイブリダイズしたとき、豊富な配列は強力なシグナルを生成し、まれな配列は弱いシグナルを生成する。シグナルの強さは、もとの試料における遺伝子発現のレベルを表わすことができる。1つの実施形態では、ゲノム全域アレイ又はマイクロアレイを使用する。1つの実施形態では、アレイは、宿主のゲノム内のオープンリーディングフレームの50より多く、又はゲノム内の公知のオープンリーディングフレームの55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100より多くを提示する。アレイはまた、宿主細胞内のタンパク質をコードすることが知られる配列の少なくとも50の少なくとも一部を提示することができる。別の実施形態では、アレイは、宿主細胞の遺伝子又は推定上の遺伝子の50以上、公知の遺伝子又は推定上の遺伝子の55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100より多くを提示する。1つの実施形態では、各々の遺伝子又は推定上の遺伝子の配列又はオープンリーディングフレームについて2個以上のオリゴヌクレオチド又は類似体を使用することができる。1つの実施形態では、これらの複数のオリゴヌクレオチド又は類似体は、公知の遺伝子又は推定上の遺伝子の配列の種々の部分を表わす。各々の遺伝子又は推定上の遺伝子の配列に関して、約1-約10000又は1-約100又は1-約50、45、40、35、30、25、20、15、10又はそれ以下のオリゴヌクレオチド又は類似体をアレイ上に提示することができる。マイクロアレイ又は完全なゲノム全域アレイ又はマイクロアレイは、宿主細胞ゲノムの配列又はゲノム内の提案されるコード配列の知識に基づき、あるいは宿主細胞又は宿主生物において発現されるmRNA配列の知識に基づき、当技術分野で公知の何らかの方法に従って作製し得る。様々な種類の宿主細胞に関して、同じタイプのマイクロアレイを適用することができる。マイクロアレイの種類は、相補的DNAcDNAマイクロアレイQuantitativemonitoringofgeneexpressionpatternswithacomplementaryDNAmicroarrayScience27046770及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイExpressionmonitoringbyhybridizationtohighdensityoligonucleotidearraysNatBiotechnol14167580を含む。cDNAマイクロアレイについては、オープンリーディングフレームの部分又は全体のDNAフラグメントがスライドにプリントされる。分子の異なる部分は異なる位置にプリントされ得るので、ハイブリダイゼーション特性はスライド全体にわたって異なり得る。オリゴヌクレオチドアレイについては、20-80マーオリゴをインサイチューでチップ上で又は従来の合成とそれに続くチップ上固定化によって合成することができるが、一般に全てのプローブはハイブリダイゼーション温度及び結合親和性に関して同様に設計されるTheuseandanalysisofmicroarraydataNatRevDrugDiscov195160。トランスクリプトームプロフィールを分析するとき、核酸又は核酸類似体オリゴマー又はポリマーは、RNA、DNA、あるいはRNA又はDNAの類似体であり得る。そのような核酸類似体は当技術分野において公知であり、例えば以下のものを含む:ペプチド核酸PNA;アラビノース核酸;アルトリトール核酸;架橋核酸BNA、例えば2’-O,4’-C-エチレン架橋核酸及び2’-O,4’-C-メチレン架橋核酸;シクロヘキセニル核酸;2’,5’-結合ヌクレオチドに基づく核酸;モルホリノ核酸例えばホスホロジアミデート結合によって連結されたヌクレオ塩基置換モルホリノ単位;骨格置換核酸類似体、例えばオリゴ糖又は多糖型核酸又は類似体の2’炭素原子の少なくとも1個が、独立して、例えばハロ、チオ、アミノ、脂肪族、オキシ脂肪族、チオ脂肪族又はアミノ脂肪族基脂肪族は、典型的にはC1-C10脂肪族であるのいずれか1つで置換されている、2’置換核酸。アレイ内のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、均一な大きさであり得、1つの実施形態では、約10-約1000ヌクレオチド、約20-約1000、20-約500、20-約100、約20、約25、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90又は約100ヌクレオチド長であり得る。オリゴヌクレオチドプローブのアレイは、約100以上、又は約1,000以上、又はそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイであり得る。そのような高密度アレイは、約60以上、より一般的には約100以上、最も一般的には約600以上、しばしば約1000以上、より頻繁には約5,000以上、最も頻繁には約10,000以上、典型的には約40,000以上、より典型的には約100,000以上のプローブ密度を含むことができ、一部の場合にはcm2当り約400,000個以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブ異なるオリゴヌクレオチドとは、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを指すである。オリゴヌクレオチドプローブは、約5-約500、又は約5-50、又は約5-約45ヌクレオチド、又は約10-約40ヌクレオチド、最も典型的には約15-約40ヌクレオチドの長さにわたる。特定アレイは、約20-約25オリゴヌクレオチドの長さにわたるプローブを含む。アレイは、各々の特定される遺伝子に特異的な10以上、又は50以上、又は100以上、典型的には1000以上のオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。1つの実施形態では、アレイは、各々の遺伝子について少なくとも10個の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。もう1つの実施形態では、アレイは、各々の遺伝子に相補的な20又はそれ以下のオリゴヌクレオチドを有する。平面のアレイ表面が典型的であるが、アレイは、実質的にいかなる形状の表面でも、さらには多数の表面上でも作製し得る。アレイは、ミスマッチ対照プローブをさらに含み得る。そのようなミスマッチ対照が存在する場合、定量工程は、オリゴヌクレオチドプローブの各々とその対応するミスマッチ対照プローブの間のハイブリダイゼーションシグナルの強度の差を算定することを含み得る。定量は、各々の遺伝子に関してオリゴヌクレオチドプローブの各々とその対応するミスマッチ対照プローブの間のハイブリダイゼーションシグナルの強度の差の平均を算定することをさらに含み得る。一部のアッセイ形式では、オリゴヌクレオチドプローブは、例えば共有結合によって、固体支持体に固定され得る。オリゴヌクレオチドアレイは、平行固定化ポリマー合成法によって又は例えはスライドガラスなどのポリ-L-リシン基質上での、光指向ポリマー合成法によって化学合成することができる。化学合成されたアレイは、プローブの作製がクローニング、核酸増幅工程又は酵素合成を必要としないという点で好都合である。前記アレイは、各々が、その発現を検出すべき遺伝子又はmRNA又は対応するアンチセンスcRNAの1個のサブ配列に相補的な配列を有する、オリゴヌクレオチドプローブである試験プローブを含む。加えて、アレイは、ここで述べるような基準化対照、ミスマッチ対照及び発現レベル対照を含み得る。アレイは、ゲノム内の公知の遺伝子につき1個のハイブリダイズオリゴヌクレオチドを含むように設計し得る。オリゴヌクレオチド又は等価結合パートナーは、エポキシ被覆スライドへの共有結合を支持するように5’アミノ修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチド間の配列同一性を25未満に低下させることによって、クロスハイブリダイゼーションを低減するように設計することができる。一般に、一貫したGC含量とTmを保証するためにアレイの設計前にオリゴヌクレオチドの融解温度を分析し、オリゴヌクレオチド結合パートナーの二次構造を最適化する。トランスクリプトームプロファイリングに関しては、二次構造は、典型的には最小化される。1つの実施形態では、精度を高めるために各々のオリゴヌクレオチドをスライド上の少なくとも2つの異なる位置にプリントする。対照オリゴヌクレオチドも、バックグラウンド結合を示すために宿主細胞又は生物とは異なる種からの配列に基づいて設計することができる。遺伝的プロフィールにおける試料は、個別に分析するか又はクラスターに分類することができる。クラスターは、典型的には遺伝子発現の類似度によって分類することができる。1つの実施形態では、クラスターは、宿主細胞において類似の程度に調節される遺伝子として個々に分類し得る。クラスターはまた、組換え宿主細胞において類似の程度に調節される遺伝子の群、例えば宿主細胞あるいは修飾又は非修飾細胞と比較して類似の程度に上方調節又は下方調節される遺伝子の群を含み得る。クラスターはまた、遺伝子又はタンパク質の構造、機能によって、又はトランスクリプトームアレイの場合は、宿主のゲノム内の遺伝子に対する結合パートナーの位置又は分類によって、関連する群を含み得る。分析する結合パートナーの群あるいは遺伝子又はタンパク質の群は、推定上又は公知のプロテアーゼ、プロテアーゼ又はプロテアーゼ様タンパク質の補因子;フォールディング調節剤、フォールディング調節剤の補因子又はタンパク質の折りたたみ又は溶解度を改善し得るタンパク質;転写因子;核酸の安定性又は翻訳開始に関与するタンパク質;キナーゼ;細胞外又は細胞内受容体;代謝酵素;代謝補因子;エンベロープタンパク質;σ因子;膜結合タンパク質;膜貫通タンパク質;膜関連タンパク質及びハウスキーピング遺伝子、をコードする遺伝子から選択される遺伝子を含み得るが、これらに限定されない。プロテオームもう1つの実施形態では、分析する遺伝的プロフィールはプロテオームプロフィールである。宿主のプロテオームは、一度にゲノムによって生産されるタンパク質の完全なセットである。プロテオームは、各々のタンパク質が合成後に化学修飾され得るので、一般にゲノム又はトランスクリプトームよりもはるかに複雑である。多くのタンパク質は、宿主細胞に依存して、生産の間に切断されたり、リン酸化、アセチル化、メチル化されたり、又はそれらに付加された炭水化物基を有する。プロテオームはまた、非常に動的である。プロテオームの研究であるプロテオミクスは、タンパク質構造、タンパク質発現及び機能の数多くの異なる態様をカバーし得る。プロテオーム分析のための手法は、トランスクリプトミクスにおいて使用されるものほど直接的ではない。しかし、プロテオミクスの利点は、細胞の機能的分子が検討されることである。本発明の方法は、タンパク質の発現レベル、タンパク質-タンパク質相互作用、タンパク質-低分子相互作用又は酵素活性を測定する手法を含み得る。1つの実施形態では、プロテオームは、ある種のタンパク質の大きさの測定を含むスクリーニング方法を使用して、典型的には質量分析法を用いて分析される。1つの実施形態では、プロテオームプロフィールを分析するための手法は、対象タンパク質への抗体のハイブリダイゼーションを含む。例えば前記方法は、当技術分野で公知のウエスタンブロット法を含み得るか又はカラムクロマトグラフィーを含み得る。方法はまた、標準方法、例えば当技術分野で公知のElisaスクリーニングを含み得る。方法はまた、アプタマーであり得るか、又はプロテオーム内のタンパク質あるいはタンパク質又はペプチドフラグメントについての化学結合パートナーであり得る、核酸修飾結合パートナーの結合を含むことができ、スクリーニング工程は核酸の増幅を含み得る。方法はまた、プロテオーム内のタンパク質又はタンパク質のフラグメントに結合する化合物を含むことができ、その工程は化学的手段による結合の測定を含み得る。前記測定はまた、化学反応における反応産物の測定又は発蛍光団の活性化による測定を含み得る。分離ツール、例えば二次元ゲル電気泳動又は多次元液体クロマトグラフィーと組み合わせた質量分析のような手法も、前記方法において使用することができる。典型的には、本発明の方法は高流量スクリーニング手法を含む。本発明の方法は、例えば二次元電気泳動を用いてプロテオームプロフィールを分析することを含み得る。これは、互いに直角に方向付けた二次元の移動による試料中のタンパク質の分離と特定のための方法である。これは、試料をより広い領域にわたって分離することを可能にし、各々の成分の分離度を上昇させる。一次元目は、典型的には特定分子の電荷に基づき、二次元目は分子の大きさに基づき得る。一次元目には、タンパク質は、固定化pH勾配電気泳動IPGE、等電点電気泳動IEF又は非平衡pH勾配電気泳動を用いてそれらの等電点に従って分離される。温度及び尿素濃度の標準条件下では、タンパク質の大部分の観察される等電点は、タンパク質のアミノ酸組成から算定される予測等電点に極めて近似する。一般に、宿主試料の調製後の最初の工程は、等電点電気泳動として知られる方法である、pH勾配に対して試料を泳動させることを含む。pH勾配は、アクリルアミドゲルに両性電解質を添加することによって生成され得る。これらは、一連のpH値を有する両性種の混合物である。pH勾配はまた、両性電解質に類似するが、ポリアクリルアミドゲル内に固定化されている、インモビリンを添加することによっても生成でき、前焦点化する必要のない固定化pH勾配を生じる。二次元電気泳動の二次元目は、タンパク質の大きさによる分離であり得る。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド電気泳動SDS-PAGEを用いて、タンパク質をそれらのおおよその分子量に従って分離し得る。その手法は広く使用されており、当技術分野において公知である。基本概念は、試料中の全てのタンパク質を被覆し、それらを負に荷電させる、界面活性剤SDSでタンパク質を被覆することである。タンパク質を、次に、ゲル電気泳動に供する。ゲルは、典型的にはアクリルアミドゲルであり、密度の勾配であり得る。ゲル上に位置する電荷は、大きさに基づきゲルを通ってタンパク質を移動させる。二次元電気泳動では、分離されるタンパク質は、生物のプロテオームの少なくとも10からのタンパク質を含み得る。より典型的には、宿主細胞のプロテオーム内のタンパク質の少なくとも20、30、40、60、80又は90からのタンパク質が分離され、タンパク質の染色及び/又は質量分析などの手法によって分析される。本発明の方法はまた、マイクロアレイを用いてプロテオームプロフィールを分析することを含み得る。この実施形態では、マイクロアレイは、適切な増殖条件下で宿主細胞によって発現されるタンパク質の少なくとも一部に対する結合パートナーを含むことができ、典型的には生物のプロテオームの少なくとも5からのタンパク質に対する結合パートナーを含む。より典型的には、マイクロアレイは、宿主細胞のプロテオーム内のタンパク質の少なくとも10、20、30、40、60、80又は90からのタンパク質に対する結合パートナーを含む。結合パートナーは抗体であり得、抗体は抗体フラグメント、例えば一本鎖抗体フラグメントであり得る。結合パートナーはまた、特定タンパク質又はタンパク質の部分に結合する核酸を含む分子である、アプタマーを含み得る。別の実施形態では、マイクロアレイは、例えば推定上のプロテアーゼタンパク質又は推定上のフォールディング調節剤を含む、プロテオームからのタンパク質の選択サブセットについての結合パートナーを含み得る。マイクロアレイはまた、典型的には対照として使用されるタンパク質に対する結合パートナーのセットを含み得る。遺伝的プロフィールは、組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞のタンパク質の、マイクロアレイ上の結合パートナーへの結合を測定することによって分析できる。最も簡単なタンパク質アレイ様式は、一般に平面支持物質状の規定スポットに結合した数多くのタンパク質捕獲試薬から成る。このアレイを、次に、複雑なタンパク質試料に暴露する。その後、種々のアプローチを用いて個々のスポットへの特定分析物タンパク質の結合を観測することができる。分析物が蛍光染料であらかじめ標識されている場合は、蛍光スキャナーを使用して結合を直接観測できる。しばしば古典的な抗体サンドイッチ型様式が使用され、この様式では、2つのタンパク質結合試薬を同時に同じ抗原に結合させる:1つの抗体は表面上に固定化され、他方は、蛍光標識されるか又は適切な基質が供給されたとき蛍光、発酵又は着色産物を生じることができる酵素に複合される。モノクローナル抗体又はそれらの抗原結合フラグメントは、現在、それらの高い特異性、親和性及び安定性の故に捕獲試薬のための1つの選択である。それらは、1970年代以後様々な古典的単一分析物タンパク質プロファイリングアッセイにおいて、例えば固相酵素免疫検定法ELISAにおいて使用されてきた。加えて、抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリーは、プロテオーム規模での抗体生産のための潜在的可能性を提供する。これらのライブラリーは、免疫に基づく方法で可能であるよりも有意に短い時間枠内で、特定されるタンパク質に対する高親和性結合物質を単離するために使用できる。リボソームディスプレイ及びmRNAディスプレイは、ライブラリータンパク質を、それらをコードするmRNA配列に物理的に結びつけることに基づく、付加的な、完全にインビトロでの方法である。そのような方法は、特定されたタンパク質に対する高親和性結合試薬を選択するために使用され、成功を収めたTheuseofmRNAdisplaytoselecthighaffinityproteinbindingpeptidesProcNatlAcadSdUSA9837503755。いくつかのグループは、タンパク質バイオチップのための高親和性タンパク質捕獲試薬を開発するために異なるアプローチをとってきた。例えば、タンパク質に対して高い親和性を有する、インビトロ選択実験SELEX:試験管内人工進化法systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichmentと称されるから生じる一本鎖RNA又はDNA分子である、アプタマーが使用されてきた。アプタマーテクノロジーのさらなる進展がいわゆるフォトアプタマーである。これらの分子は、タンパク質捕獲試薬としてのそれらの有用性を高める付加的な属性を有する。それらは、紫外線によって活性化されたとき、結合特定タンパク質と共有結合架橋を生じさせることができる、光活性化架橋基5’-ブロモデオキシウリジンを担持するDimensionalityistheissueuseofphotoaptamersinproteinmicroarraysCurrOpinBiotechnol13309314。光架橋事象は、サンドイッチ免疫検定法における二次検出抗体の結合に類似した二次元目の特異性を提供する。多種多様な表面基質及び結合化学が、タンパク質マイクロアレイへの捕獲試薬の固定化のために評価されてきた。固体支持体にタンパク質を固定化するための1つの方法は、疎水性又はファンデルワールス相互作用、水素結合又は静電力に基づく非共有結合相互作用を基礎とする。静電固定化の例は、ニトロセルロース及びポリリシン又はアミノプロピルシラン被覆スライドなどの物質の使用を含む。タンパク質マイクロアレイはまた、96穴プレートのプラスチック表面への物理的吸着によって作製された。前記表面へのタンパク質の共有結合の一例がMacBeathandSchreiberによって記述されているPrintingproteinsasmicroarraysforhighthroughputfunctiondeterminationScience28917601763。ストレプトアビジンのビオチンへの非常に高い親和性の故に、ストレプトアビジン表面へのビオチニル化タンパク質の固定化はほとんど共有結合とみなすことができるOptimizingantibodyimmobilizationstrategiesfortheconstructionofproteinmicroarraysAnalBiochem312113124。さらなる戦略も記述されているXrayphotoelectronspectroscopyandradiometrystudiesofbiotinderivatizedpolygraftedpolymonolayersonmetaloxides73137322RuizTaylorLAetalMonolayersofderivatizedporygraftedpolyonmetaloxidesasaclassofbiomolecularinterfacesProcNatlAcadSciUSA200198852857EspejoABedfordMTProteindomainmicroarraysProcessesMolBiol26417381ZhuHetalGlobalanalysisofproteinactivitiesusingproteomechipsScienceExpress。遺伝的プロフィールにおける試料は、個別に分析するか又はクラスターに分類することができる。クラスターは、典型的には遺伝子発現の類似度によって分類できる。1つの実施形態では、クラスターは、宿主細胞において類似の程度に調節されるタンパク質として個別に分類し得る。クラスターはまた、組換え宿主細胞において類似の程度に調節されるタンパク質の群、例えば宿主細胞あるいは修飾又は非修飾細胞と比較して類似の程度に上方調節又は下方調節されるタンパク質の群を含み得る。クラスターはまた、タンパク質の構造、機能又はプロセシングによって関連する群を含み得る。アレイにおけるタンパク質結合パートナーの群、又は異なるアッセイにおいて、例えば二次元電気泳動において分析するタンパク質の群は、推定上又は公知のプロテアーゼ、プロテアーゼ又はプロテアーゼ様タンパク質の補因子;フォールディング調節剤、フォールディング調節剤の補因子又はタンパク質の折りたたみ又は溶解度を改善し得るタンパク質;転写因子;核酸の安定性又は翻訳開始に関与するタンパク質;キナーゼ;細胞外又は細胞内受容体;代謝酵素;代謝補因子;エンベロープタンパク質;及びハウスキーピング遺伝子から選択され得るが、これらに限定されない。メタボロームプロテオーム分析法は、多くのタンパク質の存在率と分布を同時に測定することを可能にする。しかし、プロテオームへの変化の機能的影響は間接的にしか報告されない。もう1つのアプローチは、これらの低分子又は代謝産物のレベルを測定することである。本発明の方法において分析する遺伝的プロフィールは、それ故、メタボロームプロフィールを含み得る。特定宿主のメタボロームを分析するための方法は、様々な化学的及び物理的性質に従って代謝産物を分離するための、ガスクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー及びキャピラリー電気泳動を含む。その後、質量分析などの方法を用いて分子を特定することができる。検出/分析本発明の方法は、組換え細胞においてより高いレベルで発現される補償遺伝子又は遺伝子産物を特定するために遺伝的プロフィールを分析することを含む。一般に、この工程は、多数の遺伝子又は遺伝子産物の発現の観測例えば発現を検出すること及び/又は定量することを含む。発現は一般に、上述したようなトランスクリプトーム、プロテオーム又はメタボロームプロフィールへの宿主細胞遺伝子産物の結合を検出することによって観測される。結合の分析は、組換えタンパク質又はペプチドを発現する組換え宿主細胞とナイーブ宿主細胞又は前記タンパク質又はペプチドを発現しない組換え宿主細胞の間の結合の比較を含み得る。検出この工程は、多数の遺伝子又は遺伝子産物の発現の観測例えば発現を検出すること及び/又は定量することを含む。発現は一般に、上述したようなトランスクリプトーム、プロテオーム又はメタボロームプロフィールへの宿主細胞遺伝子産物の結合を検出することによって観測される。典型的には、少なくとも約10個の遺伝子、又は少なくとも約100個、又は少なくとも約1000個、及び/又は少なくとも約10,000個の異なる遺伝子を一度に検定することができる。前記方法は、前記遺伝子の1又はそれ以上のRNA転写産物を含む特定された核酸又はRNA転写産物に由来する核酸のプールを提供すること;核酸のプールを、表面に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイにハイブリダイズすること、但し、前記アレイは100個以上の異なるオリゴヌクレオチドを含み、各々の異なるオリゴヌクレオチドは前記表面のあらかじめ定められ領域に位置し、各々の異なるオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの共有結合を通して表面に結合しており、オリゴヌクレオチドプローブはRNA転写産物又はRNA転写産物に由来する核酸に相補的である;及びアレイ内のハイブリダイズした核酸を定量すること、を含み得る。2つの試料の間の遺伝子産物の発現を観測するための1つの手法の絵画的表示を図12に示す。本発明の方法はまた、細胞タンパク質のプールを提供することを含み得る。これらは、洗浄剤又は界面活性剤を使用して;浸透圧溶解を用いて;熱変化、例えば凍結-解凍サイクルを用いて;機械的手段又は圧変化を用いて、細胞を溶解することによって作られる細胞溶解産物から誘導することができる。典型的には、タンパク質の分解を制限するために、ある種のタンパク質、例えばプロテアーゼ、特に非特異的プロテアーゼを阻害する化学物質を、細胞又は細胞系を溶解する工程に含める。加えて、細胞溶解産物は処理の間4°C又はそれ以下に保持され、0°C又はそれ以下あるいは20°C又はそれ以下に保持することができる。細胞溶解産物は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換又は例えばHPLCを用いたアフィニティーマトリックスクロマトグラフィーによって、さらなるプロセシングの前に分離することができる。典型的には、特定される遺伝子産物、mRNA、cDNA、タンパク質又は代謝産物は、検出可能なマーカー又はプローブで標識される。マーカー又はプローブは、1又はそれ以上の蛍光分子又は発蛍光団であり得る。これらは、例えばスクリーニングのための検出可能な分子を提供するために逆転写されたcDNAに組み込まれ得る特定ヌクレオチドに結合した市販の分子、例えばCy3及びCy5であり得る。1つの実施形態では、第一発蛍光団は宿主から試料中に組み込まれ、第二発蛍光団は、組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主から試料に組み込まれる。1つの実施形態では、第一発蛍光団と第二発蛍光団は異なる波長の光を発する。この実施形態では、宿主からの試料の結合と組換えタンパク質を発現する宿主細胞からの試料の結合を同じアッセイにおいて観測することができる。もう1つの実施形態では、発蛍光団を異なる波長の光で励起する。もう1つの実施形態では、第一と第二の発蛍光団は、同じ波長の光で励起されるか又は同じ波長の光を発する。この実施形態では、宿主からの試料と組換えタンパク質を発現する宿主細胞からの試料を、典型的には異なるアッセイにおいて観測する。前記方法は、特定された核酸又はタンパク質又は化学的代謝産物のハイブリダイゼーションを定量する工程を付加的に含み得る。定量は、1又はそれ以上の遺伝子の転写のレベルの測定を含み得る。典型的には、例えば特定された核酸のプールは、特定された核酸プレmRNA転写産物、mRNA転写産物又はRNA転写産物に由来する核酸の濃度がそれらの特定された核酸をコードする遺伝子の発現レベルに比例する定量である。トランスクリプトーム分析については、ハイブリダイゼーションの前、ハイブリダイゼーションの間又はハイブリダイゼーション後に核酸のプールを標識し得るが、典型的にはハイブリダイゼーションの前に核酸を標識する。蛍光標識が典型的に使用され、しばしば単一発蛍光団であり、蛍光標識を使用する場合は、ハイブリダイズした核酸の定量は、ハイブリダイズした蛍光標識核酸からの蛍光の定量によってであり得る。そのような定量は、アレイの自動操作を可能にする自動化工程を備え得る、及び自動測定記録及びその後の蛍光強度情報の処理のためのデータ獲得システムを備え得る、共焦点レーザースキャナー又は蛍光顕微鏡、例えば共焦点蛍光顕微鏡の使用によって容易となる。そのようなアレイを読み取るための装置は、Biodiscovery,Inc.,ElSegundo,Calif.より入手可能な、CloneTracker商標、ImaGene商標、GeneSight商標モジュール及びGeneDirector商標データベース、又はAffymetrix,Inc.ofSantaClara,Calif.より入手可能な、GeneChip商標リーダーを含む。1つの実施形態では、ハイブリダイゼーションは低ストリンジェンシー例えば約20°C-約50°C、又は約30°C-約40°C、又は約37°Cで起こる。ハイブリダイゼーションは、所望レベルのハイブリダイゼーション特異性が達成されるまで漸増ストリンジェンシーでのその後の洗浄を含み得る。ハイブリダイゼーションシグナルの定量は当業者に公知のいかなる手段によってでもあり得る。しかし、1つの実施形態では、定量は共焦点蛍光スキャナーの使用によって達成される。データは、典型的には各々のオリゴヌクレオチドプローブとその対応するミスマッチ対照プローブの間のハイブリダイゼーションシグナル強度の差を算定することによって評価される。典型的には、この差は各々の遺伝子について算定し、評価することができる。一部の分析方法をここで提供する。適切な細菌ハイブリダイゼーションプローブを作製するための手法が開発されている例えばChoietalAppEnvirMicrobio6947374742参照。例えば細胞は、RNA安定化剤、例えばRNAlaterAmbion,Austin,TX中で保存することができる。RNAは一般に3段階で精製される:1全RNAの単離、2汚染DNAの除去及び3全RNAの清浄化。全RNAを単離し、次にランダムな六量体プライマー及び逆転写酵素と混合してcDNAを作製することができる。典型的には、少なくとも1個の蛍光プローブをcDNAに組み込む。1つの実施形態では1個の蛍光プローブを組み込み、別の実施形態では2個以上のプローブ、例えば2、3、4、5又はそれ以上の蛍光プローブを同じか又は異なるcDNAの試料に組み込む。真核生物宿主では、特定される核酸のプールはまた、生物学的試料から単離された全ポリAmRNA、又はRNAの逆転写によって作製されたcDNA又は二本鎖cDNA中間体から転写された2番目のcDNA又はRNAであり得る。典型的には、逆転写反応の間に蛍光染料をcDNA分子に組み込む。原核生物細菌と真核生物酵母、哺乳動物細胞等の間ではmRNA構造が異なるため、異なるプライマーを使用することができるが、ランダムプライマーはどちらの場合にも使用でき、オリゴ-dTプライマーは、ポリA尾部を有する真核生物において使用できる。選択的方法は、シグナル強度を高めるためのアミノ-アリル標識である。この方法は、逆転写反応後に蛍光染料が結合し得る化学反応基を特徴とするヌクレオチド類似体を含むComparisonofdifferentlabelingprocessesfortwochannelhighdensitymicroarrayexperimentsPhysiolGenomics1016979。特定された核酸のプールは、試料の複雑さを低減し、それによってハイブリダイゼーションで得られるバックグラウンドシグナルを低下させるように処理することができる。バックグラウンド又はバックグラウンドシグナルという用語は、標識特定核酸とオリゴヌクレオチドアレイの成分例えばオリゴヌクレオチドプローブ、対照プローブ、アレイ基質等の間の非特異的結合又は他の相互作用から生じるハイブリダイゼーションシグナルを指す。1つのアプローチでは、生物学的試料に由来するmRNAのプールを、アレイ内に存在するオリゴヌクレオチドプローブを含むオリゴヌクレオチドのプールとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズした核酸のプールを、次に、一本鎖領域を消化するRNアーゼAで処理する。その後、残りの二本鎖ハイブリダイゼーション複合体を変性し、オリゴヌクレオチドプローブを除去して、アレイ内のオリゴヌクレオチドプローブに相補的なmRNAが強化されたmRNAのプールを残す。バックグラウンド低下へのもう1つのアプローチは、生物学的試料に由来するmRNAのプールを、対合する特定された特異的オリゴヌクレオチドが、アレイ内のオリゴヌクレオチドプローブに相補的なmRNAのサブ配列に隣接する領域に相補的である、前記の対合する特定された特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズした核酸のプールを、ハイブリダイズした二本鎖核酸配列を消化するRNアーゼHで処理する。その後、対合する特定された特異的オリゴヌクレオチドによって隣接される領域にほぼ等しい長さを有する残りの一本鎖核酸配列を単離し例えば電気泳動によって、遺伝子発現を観測するための核酸のプールとして使用する。バックグラウンド低下への3番目のアプローチは、特定のあらかじめ選択された同定mRNAメッセージ例えば試料において特徴的に過剰発現されるメッセージのプールにおける提示を排除又は低減することを含む。この方法は、あらかじめ選択された同定mRNAメッセージに相補的なオリゴヌクレオチドプローブを、生物学的試料に由来するポリAmRNAのプールにハイブリダイズすることを含む。オリゴヌクレオチドプローブは、それが相補的である特定のあらかじめ選択されたポリAmRNAとハイブリダイズする。ハイブリダイズした核酸のプールを、二本鎖ハイブリダイズした領域を消化し、それによってメッセージをそのポリA尾部から分離する、RNアーゼHで処理する。その後、プール中のポリAmRNAを単離するか又は増幅すること例えばオリゴdTカラムを使用してによって、あらかじめ選択された同定mRNAメッセージの提示が低下した又は排除されたプールが得られる。分析特定される遺伝子は、典型的には組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞の遺伝的プロフィールを、組換えタンパク質又はペプチドを発現しない宿主細胞の遺伝的プロフィールと比較することによって特定される。反復実施形態では、修飾すべき特定遺伝子は、修飾すべき細胞第二細胞の遺伝的プロフィールを、それが修飾された細胞第一細胞と比較することによって特定される。特定される遺伝子は、第二細胞の遺伝的プロフィールを第一細胞の遺伝的プロフィールと比較すること及び第二細胞において発現が上昇している1又はそれ以上の遺伝子を特定することによって特定される。cDNAマイクロアレイは、2つの試料の間の相対的mRNA存在率を測定する。一連の誘導後時点の試料を、同じ菌株についての誘導前試料と比較することができ一時的発現プロフィール、又は誘導後試料を同じ時点の異なる菌株と比較することができる。比較は、コンピュータプログラム、例えばGeneSight商標を通してであり得る。例えば蛍光標識を用いたマイクロアレイを使用するときは、アレイに結合した各々の試料例えばDNA配列についてスポット強度を測定することができる。次に、スポット強度をバックグラウンドに関して補正し、宿主と組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主からの試料に関して、又は組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主を組換えタンパク質又はペプチドを発現する修飾された宿主と比較して、強度の比を測定することができる。前記比は、特定される遺伝子の特定を可能にする、組換えタンパク質又はペプチドの発現時に又は宿主細胞の修飾時に上方調節される又はその発現が上昇する遺伝子を特定するための測定を提供する。遺伝子が上方調節されるかどうかを特定するために、標準又はカットオフ比を確立する。カットオフ比は、特定アッセイに関連するバックグラウンドノイズの影響を克服するように設計し得る。一般に、測定値の間の1より大きい比率は、上方調節された遺伝子を示すことができる。しかし、アッセイ間の変動は、1より高い比率、例えば1.5、又は2以上、又は2.5以上、又は3以上、又は3.5以上、又は4以上、又は4.5以上、又は5以上、又は6以上、又は7以上、又は8以上、又は9以上、又は10以上の比率を必要とすることがある。標準は、当技術分野で公知の標準に基づき、工程の前に確立し得るか、又は対照遺伝子又は遺伝子産物、例えばハウスキーパー遺伝子のレベルの比を比較することによって測定の間に確立し得る。工程III:組換えタンパク質の発現、活性又は溶解度の上昇を実現する修飾組換え細胞を提供するために、細胞を遺伝的に修飾することによって特定された補償遺伝子又は遺伝子産物の発現を変化させること特定される補償遺伝子工程iiにおいて特定される補償遺伝子又は遺伝子産物、又はその相同的類似体、補因子又はサブユニットは、1又はそれ以上の特定された遺伝子の発現を上昇させる、低下させる、ノックイン又はノックアウトするように細胞を遺伝的に修飾するための戦略を設計するために使用される。公的データベースにおいて特定される遺伝子配列が、上述した手法によって遺伝子の発現を調節するための戦略を設計する、特にそのための構築物を設計するために使用できる。そのような手法は周知である。1つの実施形態では、特定される遺伝子は、少なくとも1個の推定上のプロテアーゼ、プロテアーゼ様タンパク質、プロテアーゼの補因子又はサブユニットである。他の実施形態では、特定される遺伝子は、少なくとも1個のフォールディング調節剤、推定上のフォールディング調節剤、フォールディング調節剤の補因子又はサブユニットである。ある実施形態では、特定される遺伝子はプロテアーゼのサブユニットである。1つの実施形態では、特定される遺伝子は、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン酸又はメタロペプチダーゼであり得る。1つの実施形態では、特定される遺伝子は、hslV、hslU、clpA、clpB及びclpXから選択され得る。特定される遺伝子はまた、プロテアーゼの補因子であり得る。もう1つの実施形態では、特定される遺伝子はフォールディング調節剤である。一部実施形態では、特定される遺伝子は、シャペロンタンパク質、フォルダーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ及びジスルフィド結合イソメラーゼから選択され得る。一部の実施形態では、特定される遺伝子は、htpG、cbpA、dnaJ、dnaK及びfkbPから選択され得る。細菌遺伝子は、強調機能、例えば所与のアミノ酸の生合成を実施するために必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスターである、オペロンに組織化される。それ故、1つの実施形態では、特定される遺伝子はオペロンの一部である。特定実施形態では、特定される遺伝子は、単独で又は組合せとしてプロテアーゼ活性を有する1又はそれ以上のタンパク質をコードするオペロン内にあるか、又はフォルダーゼ、シャペロン及びイソメラーゼを含む、フォールディング調節剤活性を有する1又はそれ以上のタンパク質をコードするオペロン内にある。プロテアーゼ本発明の1つの実施形態では、ゲノムからの少なくとも1個のプロテアーゼの発現を低下させる、前記少なくとも1個のプロテアーゼを阻害する又は除去することによって宿主細胞を修飾する。修飾はまた、一部の実施形態では、2個以上のプロテアーゼに対してであり得る。関連実施形態では、プロテアーゼ補因子又はプロテアーゼタンパク質の発現を低下させることによって細胞を修飾する。もう1つの実施形態では、天然プロモーターであり得る、プロテアーゼ又は関連タンパク質についてのプロモーターの阻害によって宿主細胞を修飾する。遺伝子修飾は、特定された遺伝子に対して相同なタンパク質を修飾するためであり得る。MEROPSデータベースでは、ペプチダーゼを族clansとファミリーに分類している。ファミリーは、密接に関連する機能的に類似のペプチダーゼの群である。ファミリーはそれらの触媒型によって分類される:S、セリン;T、トレオニン;C、システイン;A、アスパラギン酸;M、メタロ及びU、不明。セリンプロテアーゼの20以上のファミリーS1-S27と表わされるが特定されており、これらは、構造的類似度及び他の機能的証拠に基づいて6つの族SA、SB、SC、SE、SF及びSGに分類される。族のうちの4つSA、SB、SC及びSEについては構造が公知である。トレオニンペプチダーゼは、成熟酵素のN末端のトレオニン求核試薬によって特徴付けられる。この族についての型例は、サーモプラスマアシドフィルムの古細菌プロテアソームβ成分である。システインペプチダーゼは特徴的な分子トポロジーを有し、求核試薬がシステイン残基のスルフヒドリル基であるペプチダーゼである。システインプロテアーゼは、それらの触媒2残基又は3残基の構造に基づいて、族進化的に関連するタンパク質に分けられ、さらにファミリーに細分される:CA族は、パパインC1、カルパインC2、ストレプトパインC10及びユビキチン特異的ペプチダーゼC12、C19のファミリー、並びにウイルスシステインエンドペプチダーゼの多くのファミリーを含む。CD族は、クロストリパインC11、ギンギパインRC25、レグマインC13、カスパーゼー1C14及びセパリンC50のファミリーを含む。これらの酵素は、S1サブサイトの相互作用に支配される特異性を有する。CE族は、アデノウイルスからのアデナインC5、真核生物Ulp1プロテアーゼC48及び細菌YopJプロテアーゼC55を含む。CF族は、ピログルタミルペプチダーゼIC15だけを含む。PA族は、おそらくセリンペプチダーゼから進化した、この族内の酵素の大部分を形成する、ピコルナインC3を含む。PB及びCH族は、自己分解性システインペプチダーゼを含む。脊椎動物、真菌及びレトロウイルス起源のアスパラギン酸エンドペプチダーゼが特性決定されている。アスパラギン酸エンドペプチダーゼは、触媒残基が特定された全ての例においてAsp残基が活性化水分子のリガンドであるためそのように称されるが、少なくとも1個のウイルス酵素は、その触媒2残基としてAspとAsnを有すると考えられる。全ての又は大部分のアスパラギン酸ペプチダーゼはエンドペプチダーゼである。これらの酵素は族進化的に関連するタンパク質に割り当てられており、主としてそれらの三次構造に基づいて、さらにファミリーに細分されている。メタロプロテアーゼは4つの主要タイプのプロテアーゼのうちで最も多様であり、現在までに30以上のファミリーが特定されている。これらの酵素では、二価陽イオン、通常は亜鉛が、水分子を活性化する。金属イオンは、通常は3個の、アミノ酸リガンドによって正しい位置に保持される。公知の金属リガンドはHis、Glu、Asp又はLysであり、求電子的役割を果たし得る、少なくとも1個の他の残基が触媒のために必要である。公知のメタロプロテアーゼのうちで、ほぼ半数が、結晶学試験において金属結合部位の一部を形成することが示された、HEXXHモチーフを含む。HEXXHモチーフは比較的一般的であるが、メタロプロテアーゼに関しては、より厳密にはabXHEbbHbc[式中、aは、ほとんどの場合バリン又はトレオニンであり、サーモリシン及びネプリリシンにおけるS1’サブサイトの一部を形成し、bは無電荷残基であり、cは疎水性残基である]と定義される。プロリンは、おそらくメタロプロテアーゼにおいてこのモチーフによって採用されるらせん構造を破壊するために、この部位では絶対に認められない。U-族に関連するペプチダーゼについては、活性部位ドメインのタンパク質折りたたみ及び活性部位残基が報告されていないので触媒機構は不明である。ある種のプロテアーゼ例えばOmpTは、封入体の表面に吸着することができ、再生されている間に所望タンパク質を分解し得る。それ故、ある種の特定されるタンパク質は、封入体に接着するプロテアーゼ又はプロテアーゼタンパク質であり得、これらは、例えば接着を低下させるように、修飾することができる。プロテアーゼ又はプロテアーゼタンパク質はまた、アミノペプチダーゼ;ジペプチダーゼ;ジペプチジル-ペプチダーゼ及びトリペプチジルペプチダーゼ;ペプチジル-ジペプチダーゼ;セリン型カルボキシペプチダーゼ;メタロカルボキシペプチダーゼ;システイン型カルボキシペプチダーゼ;ωペプチダーゼ;セリンプロテイナーゼ;システインプロテイナーゼ;アスパラギン酸プロテイナーゼ;メタロプロテイナーゼ;又は未知の機構のプロテイナーゼと分類することができる。アミノペプチダーゼは、サイトゾルアミノペプチダーゼロイシルアミノペプチダーゼ、膜アラニルアミノペプチダーゼ、シスチニルアミノペプチダーゼ、トリペプチドアミノペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、アルギニルアミノペプチダーゼ、グルタミルアミノペプチダーゼ、x-proアミノペプチダーゼ、細菌ロイシルアミノペプチダーゼ、好熱菌アミノペプチダーゼ、クロストリジウムアミノペプチダーゼ、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、x-trpアミノペプチダーゼ、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、d-立体特異性アミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼeyを含む。ジペプチダーゼは、x-hisジペプチダーゼ、x-argジペプチダーゼ、x-メチル-hisジペプチダーゼ、sys-glyジペプチダーゼ、glu-gluジペプチダーゼ、x-proジペプチダーゼ、met-xジペプチダーゼ、非立体特異性ジペプチダーゼ、サイトゾル非特異性ジペプチダーゼ、膜ジペプチダーゼ、β-ala-hisジペプチダーゼを含む。ジペプチジル-ペプチダーゼ及びトリペプチジルペプチダーゼは、ジペプチジル-ペプチダーゼi、ジペプチジル-ペプチダーゼii、ジペプチジル-ペプチダーゼiii、ジペプチジル-ペプチダーゼiv、ジペプチジル-ペプチダーゼ、トリペプチジル-ペプチダーゼI、トリペプチジル-ペプチダーゼIIを含む。ペプチジル-ジペプチダーゼは、ペプチジル-ジペプチダーゼa及びペプチジル-ジペプチダーゼbを含む。セリン型カルボキシペプチダーゼは、リソソームpro-xカルボキシペプチダーゼ、セリン型D-ala-D-alaカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼC、カルボキシペプチダーゼDを含む。メタロカルボキシペプチダーゼは、カルボキシペプチダーゼa、カルボキシペプチダーゼB、リシンアルギニンカルボキシペプチダーゼ、gly-Xカルボキシペプチダーゼ、アラニンカルボキシペプチダーゼ、ムラモイルペンタペプチドカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼh、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼM、ムラモイルテトラペプチドカルボキシペプチダーゼ、亜鉛d-ala-d-alaカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼA2、膜pro―xカルボキシペプチダーゼ、チューブリニル-tyrカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼtを含む。ωペプチダーゼは、アシルアミノアシル-ペプチダーゼ、ペプチジル-グリシンアミダーゼ、ピログルタミル-ペプチダーゼI、β-アスパルチル-ペプチダーゼ、ピログルタミル-ペプチダーゼII、n-ホルミルメチオニル-ペプチダーゼ、プテロイルポリ-[γ]グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、γ-glu-Xカルボキシペプチダーゼ、アシルムラモイル-ala-ペプチダーゼを含む。セリンプロテイナーゼは、キモトリプシン、キモトリプシンc、メトリジン、トリプシン、トロンビン、第Xa血液凝固因子、プラスミン、エンテロペプチダーゼ、アクロシン、α溶解プロテアーゼ、グルタミルエンドペプチダーゼ、カテプシンG、第VIIa血液凝固因子、ブラキウリン、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、膵臓エラスターゼ、白血球エラスターゼ、第XIIa血液凝固因子、キマーゼ、補体成分c1r55、補体成分c1s55、古典的補体経路c3/c5コンバターゼ、セレビシン、ハイポダーミンC、リシルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ1a、γ-レニ、ベノンビンab、ロイシルエンドペプチダーゼ、トリプターゼ、スクテラリン、ケキシン、サブチリシン、オリジン、エンドペプチダーゼk、サーモミコリンthermomycolin、サーミターゼthermitase、エンドペプチダーゼSO、T-プラスミノーゲン活性化因子、プロテインC、膵臓エンドペプチダーゼE、膵臓エラスターゼii、IgA特異的セリンエンドペプチダーゼ、U-プラスミノーゲン活性化因子、ベノンビンA、フューリン、ミエロブラスチン、セメノゲラーゼ、グランザイムA又は細胞傷害性Tリンパ球プロテイナーゼ1、グランザイムB又は細胞傷害性Tリンパ球プロテイナーゼ2、ストレプトグリシンA、トレプトグリシンB、グルタミルエンドペプチダーゼII、オリゴペプチダーゼB、カブトガニ凝固因子、カブトガニ凝固酵素、オンプチン、リプレッサーLexa、細菌リーダーペプチダーゼI、トガビリン、フラビリンを含む。システインプロテイナーゼは、カテプシンB、パパイン、フィシン、キモパパイン、アスクレパイン、クロストリパイン、ストレプトパイン、アクチニド、カテプシンl、カテプシンH、カルパイン、カテプシンt、グリシルエンドペプチダーゼ、癌凝血原、カテプシンS、ピコルナイン3C、ピコルナイン2A、カリカイン、アナナイン、幹ブロメライン、果実ブロメライン、レグマイン、ヒストリサインhistolysain、インターロイキン1-β変換酵素を含む。アスパラギン酸プロテイナーゼは、ペプシンA、ペプシンB、ガストリシン、キモシン、カテプシンD、ネオペンテシン、レニン、レトロペプシン、プロオピオメラノコルチン変換酵素、アスペルギロペプシンI、アスペルギロペプシンII、ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン、ムコロペプシン、カンジダペプシン、サッカロペプシン、ロドトルラペプシン、フィサロペプシン、アクロシリンドロペプシン、ポリポロペプシン、ピクノポロペプシン、シタリドペプシンa、シタリドペプシンb、キサントモナペプシン、カテプシンe、バリアペプシン、細菌リーダーペプチダーゼI、シュードモナペプシン、プラスメプシンを含む。メタロプロテイナーゼは、アトロリシンa、微生物コラゲナーゼ、ロイコリシン、間質コラゲナーゼ、ネプリリシン、エンベリシン、IgA特異的メタロエンドペプチダーゼ、プロコラーゲンN-エンドペプチダーゼ、チメットオリゴペプチダーゼ、ニューロリシン、ストロメリシン1、メプリンA、プロコラーゲンC-エンドペプチダーゼ、ペプチジル-lysメタロエンドペプチダーゼ、アスタシン、ストロメリシン2、マトリリシンゲラチナーゼ、アエロモノロシン、シュードリシン、サーモリシン、バシロリシン、アウレオリシン、コッコリシン、ミコリシン、β-溶解メタロエンドペプチダーゼ、ペプチジル-aspメタロエンドペプチダーゼ、好中球コラゲナーゼ、ゲラチナーゼB、リーシュマノリシン、サッカロリシン、自己溶解素、ジュウテロリシン、セラリシン、アトロリシンB、アトロリシンC、アトロキサーゼ、アトロリシンE、アトロリシンF、アダマリシン、ホリリシン、ルベルリシンruberlysin、ボトロパシン、ボトロリシン、オフィオリシン、トリメレリシンI、トリメレリシンII、ムクロリシン、ピトリリシン、インスリシン、O-シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ、ラッセルリシン、ミトコンドリア中間体ペプチダーゼ、ダクチルリシン、ナルジリシン、マグノリシン、メプリンB、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、マクロファージエラスターゼ、コリオリシン、トキシリシンを含む。未知の機構のプロテイナーゼは、サーモプシン及び多機能性エンドペプチダーゼ複合体を含む。P.フルオレセンスの一部のプロテアーゼを表Aに列挙する。表A大腸菌起源の一部のプロテアーゼを表Bに列挙する。表BS.セレビシエ起源の一部のプロテアーゼを表Cに列挙する。表Cフォールディング調節剤特定される上方調節遺伝子又は遺伝子産物は、1又はそれ以上のフォールディング調節剤であり得る。フォールディング調節剤は、例えばHSP70タンパク質、HSP110/SSEタンパク質、HSP40DNAJ関連タンパク質、GRPE様タンパク質、HSP90タンパク質、CPN60及びCPN10タンパク質、サイトゾルシャペロニン、HSP100タンパク質、低分子HSP、カルネキシン及びカルレティキュリン、PDI及びチオレドキシン関連タンパク質、ペプチジル-プロリルイソメラーゼ、シクロフィリンPPIアーゼ、FK-506結合タンパク質、パーブリンParvulinPPIアーゼ、個々のシャペロニン、タンパク質特異的シャペロン又は細胞内シャペロンであり得る。フォールディング調節剤は、GuidebooktoMolecularChaperonesandProteinFoldingCatalystsedMGethingMelbourneUniversityAustraliaにおいて一般的に記述されている。大腸菌の細胞質において最もよく特性付けられている分子シャペロンは、ATP依存性DnaK-DnaJ-GrpE及びGroEL-GroES系である。インビトロ試験及び相同性検討に基づき、多くの付加的な細胞質タンパク質が大腸菌における分子シャペロンとして機能すると提案されてきた。これらは、DnaK-DnaJ-GrpE及びGroEL-GroESと同様に、ストレスレギュロンに属する熱ショックタンパク質Hspである、ClpB、HtpG及びIbpA/Bを含む。X-Pro結合のトランス配座は新生タンパク質鎖においてエネルギー的に有利に働く;しかし、天然タンパク質では全てのプロリルペプチド結合の~5がシス配座で認められる。X-Pro結合のトランスからシスへの異性化は、多くのポリペプチドの折りたたみにおいて速度制限的であり、インビボではペプチジルプロリルシス/トランスイソメラーゼPPIアーゼによって触媒される。現在までに3つの細胞質PPIアーゼ、SlyD、SlpA及びトリガー因子TFが大腸菌において特定されている。50Sリボソームサブユニットと結合する48kDaタンパク質であるTFは、新たに合成されたタンパク質の正しい折りたたみを保証するために大腸菌内のシャペロンと協力すると推定されてきた。少なくとも5個のタンパク質それぞれtrxA、trxC、grxA、grxB及びgrxC遺伝子の産物である、チオレドキシン1及び2、及びグルタレドキシン1、2及び3が、細胞質酵素において一過性に生じるジスルフィド結合の還元に関与する。それ故、特定される遺伝子は、正しいジスルフィド結合形成を可能にするジスルフィド結合形成タンパク質又はシャペロンであり得る。P.フルオレセンスにおける一部のフォールディング調節剤を表Dに列挙する。大腸菌における一部のフォールディング調節剤を表Eに列挙する。S.セレビシエScervisiaの一部のフォールディング調節剤を表Fに示す。表F遺伝子操作工程iiiにおいて、本発明の方法は、修飾組換え細胞を提供するために遺伝子操作によって組換え細胞内の特定された補償遺伝子又は遺伝子産物の発現を変化させることを含む。1又はそれ以上の上方調節遺伝子、タンパク質又は代謝工程の特定後に、宿主のゲノムを修飾し得る。ある種の遺伝子又は遺伝子産物は、上方調節されると特定されても、細胞に必須であるか若しくは細胞又は生物に必須であり得る他の工程に影響を及ぼすことが知られているために、調節のために使用可能でないことがある。ゲノムは、発現ベクターを用いてゲノム内又は宿主内に外来性遺伝子又はプロモーターエレメントを含めることによって、特定された遺伝子のmRNA又はタンパク質を生産する能力を高めることによって、又は遺伝子又はプロモーターエレメントを欠失させる又は破壊することによって、又は遺伝子のmRNA又はタンパク質を生産する能力を低下させることによって修飾し得る。遺伝暗号を変化させることができ、それによって、例えば置換、欠失ノックアウト、共発現又は挿入ノックイン手法を通して、遺伝子の転写及び/又は翻訳に影響を及ぼし得る。所望タンパク質についての付加的な遺伝子又は既存配列の転写を調節する調節配列も挿入することができる。組換え組換えタンパク質を発現する宿主細胞のゲノムは、挿入又は組換え、例えば相同的組換えによってであり得る、遺伝子ターゲティング事象を通して修飾することができる。相同的組換えとは、配列相同性に基づくDNA組換えの過程を指す。相同的組換えは、内在性遺伝子における部位特異的修飾を可能にし、それ故ゲノム内に新規変化を工作することができる。相同的組換えにおける1つの工程はDNA鎖交換であり、これは、ヘテロ二本鎖DNAを含む中間体組換え構造を形成するための、相補的配列を含む少なくとも1本のDNA鎖とDNA二本鎖の対合を含む例えばRaddingCMAnnRevGenet16405USPatNo4888274参照。ヘテロ二重鎖DNAは、1本の相補鎖がDNA二本鎖に侵入している三重鎖形態を有する三本鎖DNAを含む、いくつかの形態をとり得ることができHsiehetalGenesandDevelopment41951RaoetalPNAS882984、2本の相補的DNA鎖がDNA二本鎖と対合するときは、古典的オリデイ組換え連結又はχ構造あるいは二重Dループが形成され得る。ひとたび形成されると、ヘテロ二本鎖構造は、侵入DNA鎖の全部又は一部が受容DNA二本鎖にスプライシングされて、受容DNA二本鎖のセグメントを付加する又は置換するように、鎖切断と交換によって分割することができる。あるいは、ヘテロ二本鎖構造は、侵入鎖の配列が、侵入鎖を鋳型として用いるミスマッチ塩基の修復機構によって受容DNA二本鎖に導入される、遺伝子変換をもたらし得るLewinBJohnWileyNewYorkNYLopezetalNucleicAcidsRes155643。切断と再連結の機構によるか又は遺伝子交換の機構によるかに関わらず、相同的に対合する連結部でのヘテロ二本鎖DNAの形成は、1個のDNA分子から別のDNA分子に遺伝子配列情報を導入するのに役立ち得る。相同的組換えでは、導入されるDNAは、実質的に相同なDNA配列を含むゲノム内の部位と相互作用して、そこに組み込まれる。非相同的ランダム又は不正illicit組込みでは、導入されるDNAは、ゲノム内の相同的配列においてではなく別の場所、数多くの潜在的位置の1つで組み込まれる。多くの論文が哺乳動物細胞における相同的組換えの使用を述べている。特定された遺伝子座での相同的組換えのために様々な構築物を作製することができる。通常は、構築物は、特定遺伝子座と相同な少なくとも10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、70bp、100bp、500bp、1kbp、2kbp、4kbp、5kbp、10kbp、15kbp、20kbp又は50kbpの配列を含み得る。特定されたDNA配列の相同性の程度を決定するには、様々な検討、例えば特定された遺伝子座の大きさ、配列のアベイラビリティー、特定遺伝子座での二重交差事象の相対効率及び特定された配列と他の配列の類似性が含まれ得る。標的DNAは、実質的に同質遺伝子のDNAが、修飾すべきゲノム内の対応する特定配列を有する所望配列修飾に隣接している配列を含み得る。実質的な同質遺伝子配列は、対応する特定配列に少なくとも約95、97-98、99.0-99.5、99.6-99.9又は100同一であり得る所望配列修飾を除いて。標的DNAと特定DNAは、100同一である少なくとも約10、20、30、50、75、150又は500塩基対にわたるDNAを共有し得る。DNA構築物は、内在性の特定された遺伝子産物を修飾するように設計することができる。構築物を特定するための相同的配列は、生じる遺伝子産物の機能を破壊するように設計された1又はそれ以上の欠失、挿入、置換又はそれらの組合せを有し得る。1つの実施形態では、変化は、特定された遺伝子の上流配列と読み枠内で融合した選択マーカー遺伝子の挿入であり得る。ゲノムはまた、挿入欠失を用いて修飾することができる。この実施形態では、遺伝子産物形成を阻害する遺伝子内の配列を組み換えることによってゲノムを修飾する。この挿入は、別のエレメントを挿入することによって遺伝子を破壊するか、又は遺伝子の必須部分を除去することができる。1つの実施形態では、挿入欠失は、特定ストレス因子、例えば抗生物質に対する耐性、又は特定培地中での増殖、例えば必須アミノ酸の生産をコードする遺伝子の挿入を含む。ゲノムはまた、相同的組換えとは無関係な機構によって原核生物ゲノム内の部位に挿入することができる遺伝因子である、トランスポゾンの使用によっても修飾できる。トランスポゾンは、例えば大腸菌におけるTn7、黄色ブドウ球菌SaureusのTn554、パラ結核菌Mparatuberculosisヨーネ菌のIS900、シュードモナスアトランティカPseudomonasatlanticaからのIS492、ストレプトミセスStreptomycesからのIS116及びパラ結核菌MparatuberculosisからのIS900を含み得る。転位に関与すると考えられる工程は、3’OHを生じるトランスポゾンの末端の切断;トランスポザーゼがトランスポゾンの3’OH露出末端と特定配列を結合させる、鎖転移;及びトランスポゾンの特定DNAへの共有結合を生じる1段階エステル結合転移反応を含む。トランスポザーゼによって実施される鍵となる反応は、一般にニッキング又は鎖交換であると思われ、残りの工程は宿主酵素によって行われる。1つの実施形態では、特定された遺伝子又はそのホモログをコードする遺伝子配列を組換えによってゲノムに組み込むことにより、前記遺伝子又はホモログのレベルを上昇させるための方法が提供される。もう1つの実施形態では、特定された遺伝子又はホモログの発現を高めるためにプロモーターをゲノムに挿入する。別の実施形態では、不活性遺伝子との組換えによって特定された遺伝子又はそのホモログの発現を低下させるための方法が提供される。もう1つの実施形態では、細胞において別の機能を有し得る又はレポーター遺伝子、例えば耐性マーカー又はさもなければ検出マーカー遺伝子であり得る、異なる遺伝子をコードする配列を、組換えを通してゲノムに挿入することができる。さらにもう1つの実施形態では、1又はそれ以上の位置で突然変異した特定遺伝子の少なくとも一部のコピーを、組換えを通してゲノムに挿入することができる。突然変異型の特定遺伝子はタンパク質をコードすることができないか、又は突然変異遺伝子によってコードされるタンパク質は不活性になり得るか、活性が変化し得る上昇又は低下するか、又は突然変異型タンパク質は天然タンパク質と比較して異なる活性を有し得る。一般に大腸菌で例示されてきた、細菌において遺伝子をノックアウトするための戦略がある。1つの経路は、遺伝子内部のDNAフラグメントを、抗生物質例えばアンピシリン耐性遺伝子を含むベクターにクローニングすることである。細胞を接合伝達、化学的形質転換又は電気穿孔によって形質転換する前にAdvancedMolecularGeneticsNewYorkHeidelbergBerlinTokyoSpringerVerlag、複製起点、例えば植物プラスミド複製の起点oriV遺伝子座を切り出し、残りのDNAフラグメントを再連結して精製するMolecularcloningAlaboratorymanualthirdeditionColdSpringHarborNewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress。あるいは、DNA複製起点を有する抗生物質耐性プラスミドを使用することができる。形質転換後、細胞を、例えば適切な抗生物質例えば200μg/mLアンピシリンを含むLB寒天プレートに塗布する。抗生物質を含むプレートで増殖するコロニーは、おそらく、相同的遺伝子座でのゲノム内へのDNAフラグメント全体の組込みを導く単一組換え事象MolecularGeneticsofBacteriaWashingtonDCASMPressを受けている。所望遺伝子のノックアウトが所望遺伝子座で起こったことを確認するための抗生物質耐性細胞のさらなる分析は、例えば診断PCRによるPCRAPracticalApproachNewYorkOxfordUniversityPress。この場合は、少なくとも2個のPCRプライマーを設計する:遺伝子ノックアウトの構築のために使用したDNA領域の外側でハイブリダイズする1個;及び残りのプラスミド骨格内でハイブリダイズする1個。正しい大きさを有するDNAフラグメントのPCR増幅の成功とそれに続くDNA配列分析により、遺伝子ノックアウトが細菌染色体の正しい位置で起こったことが確認される。新たに構築された突然変異株の表現型を、次に、例えばSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析することができるProteinsandProteomicsALaboratoryManualColdSpringHarborNewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress。遺伝子ノックアウトを作製するための選択的経路は、遺伝子置換を促進するための温度感受性レプリコン、例えばpSC101レプリコンの使用によるNewprocessforgeneratingdeletionsandgenereplacementsinEscherichiacoliJournalofBacteriology171461722。この方法は、染色体上の遺伝子とDNA複製に関して温度感受性のプラスミド上に担持される相同的配列の間での相同的組換えによって進行する。適切な宿主へのプラスミドの形質転換後、44°Cで染色体へのプラスミドの組込みに関して選択することができる。これらの共組込み体の30°Cでのその後の増殖は第二の組換え事象を導き、それらの分解を生じさせる。第二組換え事象がどこで起こるかに依存して、染色体は、遺伝子置換を受けるか又はもとのコピーの遺伝子を保持する。特定遺伝子産物の発現を阻害するための他の戦略が開発されている。例えば、特に低分子干渉RNAsiRNAを使用する、RNA干渉RNAiは、特定遺伝子産物の発現を低下させる、さらには排除するために広汎に開発されてきた。siRNAは、分解のために相補的mRNAを標的することができる短い二本鎖RNA分子である。RNAiは、二本鎖RNAの導入が相同的遺伝子の発現を抑制する現象である。二本鎖RNA分子は、インビボで、RNAi作用のメディエイタである21-23ヌクレオチドのsiRNAに低減される。導入後、二本鎖RNAは、ダイサーと呼ばれるRNアーゼIII様酵素によって20-25ヌクレオチドのsiRNAにプロセシングされる開始段階。次に、siRNAは、工程においてほどける、RNA誘導沈黙化複合体RISCとして知られるエンドリボヌクレアーゼ含有複合体に構築される。siRNA鎖はその後RISCを相補的RNA分子へと導き、そこで開裂して、コグネイトRNAを破壊するエフェクター段階。コグネイトRNAの切断は、siRNAによって結合される領域の中央近くで起こる。RNAiは、ゼブラフィッシュ、線虫C.エレガンスCelegans、昆虫キイロショウジョウバエDrosophilamelanogaster、プラナリア、刺胞動物、トリパノソーマ、マウス及び哺乳動物細胞を含む様々な生物において遺伝子発現を低下させるために成功裏に使用されてきた。突然変異ゲノムはまた、特定された遺伝子、特に特定されたプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレーム内の1又はそれ以上のヌクレオチドの突然変異によって修飾することができる。遺伝子突然変異のための手法、例えば位置指定突然変異誘発は、当技術分野において周知である。一部のアプローチは、染色体DNAにおけるランダム突然変異の生成、例えばX線及び化学物質によって誘導されるものを焦点とする。DNAの規定領域を標的する突然変異誘発は多くの手法を含み、普及度は様々である。位置指定突然変異誘発へのインビトロアプローチは一般に3つのカテゴリーに分けられる:iDNAのフラグメントを再構築する方法、例えばカセット突然変異誘発;ii局在化ランダム突然変異誘発;及びiiiオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発。オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発は、所望突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを対象DNAの一本鎖にアニーリングし、DNA合成の開始のためのプライマーとして使用するという概念に基づく。このようにして、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを新しく合成された鎖に組み込む。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは少なくとも1個の塩基変化を組み込むが、多数の置換、挿入又は欠失を生成するように設計することができる。例は、PCRに基づく方法及び今日使用されている実際上全ての非PCRベースの方法を含む。これらの手法は、陽性抗生物質選択NuclAcidsRes183439BohnsackRNMethMolBiol571VavraSandBrondykWHPromegaNotes5830AlteredSitesIIinvitroMutagenesisSystemsTechnicalManualTM001PromegaCorporation、ユニーク制限部位選択AnalBiochem20081、ウラシル組込みProcNatlAcadSdUSA82488KunkelTARobertsJDandZakourRAMethEnzymol154367、及びホスホロチオエート組込みNuclAcidsRes138764NakamayeKandEcksteinFNuclAcidsRes149679を含む。オリゴヌクレオチドはまた、化学合成の間に部位の塩基組成をランダム化することによって縮重又はドープしたオリゴヌクレオチドを生じる突然変異のライブラリーをコードすることができる。突然変異を局在化し、指定する能力は、DNA挿入物を含むプラスミドベクターにハイブリダイズした合成オリゴヌクレオチドの使用によって大きく上昇する。部位指定突然変異誘発の一般的様式は:一本鎖領域を生成するための、対象鋳型cDNA、プロモーター等を含むプラスミドDNAの変性;合成突然変異型オリゴヌクレオチド特定鎖へのアニーリング;例えばT4DNAポリメラーゼを用いた、新しい相補鎖の合成;及び例えばT4DNAリガーゼを用いた、新しい鎖の末端とオリゴヌクレオチドの間で生じたニックの密封、である。生じたヘテロ二本鎖を、例えば大腸菌において、形質転換によって伝搬する。突然変異鎖の回収効率を大きく改善するために選択と富化の方法が突然変異誘発工程に組み込まれており、80-90に近い率が可能である。種々のタイプの突然変異を生成し、突然変異体の選択を上昇させるための数多くの方法が存在する。突然変異体の選択を上昇させるための方法の例は、インビボで選択的に分解され得るウラシル含有DNA鎖を使用した、突然変異鎖の陽性抗生物質選択、及びヘテロ二本鎖DNAの1本の鎖を消化に対して不浸透性にすることができる、dNTP類似体組込みを含む。小さな定義された領域内のランダム突然変異のライブラリーを作製するために、一部のアプローチ、例えばカセット突然変異誘発とドープしたオリゴヌクレオチドの使用を組み合わせることができる。部位指定突然変異誘発のいわゆる標準方法の拡大は、DNA増幅、特にポリメラーゼ連鎖反応PCRに基づくものを含む。部位指定突然変異誘発における主要な共通点は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの使用である。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは、鋳型に効率的にハイブリダイズするべきである。効率的ハイブリダイゼーションのために、例えば二次構造の形成を伴わない、特定された配列のいずれかの末端での100塩基対合が存在し得るが、100未満の同一性もあり得、例えば配列の98、95、92、90、85、80、70又はごく一部だけが同一であり得る。小さな置換に関しては、ミスマッチのいずれかの側でハイブリダイズする10-15塩基で通常は十分である。ポリメラーゼは、典型的にはミスマッチ又はハイブリダイズ不良の3’末端からは伸長しないので、プライマーの3’末端の組成は特に重要である。陽性抗生物質選択のための部位指定等誘発のための基礎は、抗生物質耐性遺伝子を修復するために、選択オリゴヌクレオチド1又はそれ以上が突然変異誘発性オリゴヌクレオチドと同時にアニーリングすることである10-13。突然変異鎖の選択は、突然変異型DNAの抗生物質耐性及び非突然変異鎖の感受性によって可能である。このアプローチは、実際上ほとんど時間をかけずに無限の数の所望突然変異を生成する非常に効率的な手段を提供する。ユニーク制限部位の使用による部位指定突然変異誘発は、DengとNickoloffの方法に基づくAnalBiochem20081。このアプローチでは、ユニーク制限部位についての突然変異配列を含む選択オリゴヌクレオチドを突然変異誘発性オリゴヌクレオチドと同時にアニーリングする。選択オリゴヌクレオチドは、必須でない部位を対応する酵素による制限に対して免疫性にする。生じたプラスミドのプールをユニーク制限酵素で消化することによって突然変異鎖についての選択が上昇する。消化は親プラスミドを線形化し、それによって細菌を形質転換するその能力を有効に低下させる。デオキシウリジン組込みによる部位指定突然変異誘発は、チミジンTの代わりにウラシルUを含む鋳型DNAを分解する宿主菌株の能力に基づく。dUTPアーゼdut-及びウラシルN-デグリコシダーゼung-活性を欠く宿主においてdTTPの代わりに少数のdUTPを鋳型鎖に組み込む。ウラシル自体は突然変異誘発性ではなく、アデニンと塩基対合する。正常であれば、dUTPアーゼはデオキシウリジンを分解し、ウラシルN-デグリコシダーゼは組み込まれたウラシルを除去する。dutung菌株での突然変異後複製が、その後、非特定鎖DNAを分解するために使用される。このアプローチは、1本の鎖だけが分解に対して感受性のUを含むように、一本鎖DNAを使用することを必要とする。部位指定突然変異誘発へのホスホロチオエート組込みアプローチは、チオール基を含むdNTP類似体が、ヘテロ二本鎖DNAを制限酵素消化に対して耐性にする能力に基づく。突然変異鎖を、dCTPαSの存在下で突然変異誘発性オリゴヌクレオチドから伸長し、合成する。使用されなかった鋳型DNAはエキソヌクレアーゼでの消化によって除去する。理論的には、環状のヘテロ二本鎖DNAだけが残る。次に、制限部位でヘテロ二量体にニックを入れるが、切断しない。エキソヌクレアーゼIIIを使用してニックを入れた鎖を消化し、その後残りのフラグメントを再重合のためのプライマーとして使用して、突然変異型ホモ二本鎖を作製する。DNAにおいて突然変異を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応PCRに基づくアプローチでは、1個のオリゴヌクレオチド、又は多数の増幅を用いるプロトコールではそれ以上が、所望突然変異を含むことを除いて、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーのセットを使用して鋳型を増幅する。変法は、オーバーラップ内に突然変異を有する多数のオーバーラップPCRフラグメントを生成するようにオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位を変化させること、及び3個のオリゴヌクレオチドと2回の増幅を使用し、第一増幅からの産物の鎖を第二増幅におけるプライマーとして使用する、メガプライマーアプローチを含む。オーバーラップ伸長アプローチでは、重複末端を有する2個のDNAフラグメントを生成するために相補的オリゴデオキシリボヌクレオチドオリゴプライマーとポリメラーゼ連鎖反応を使用する。これらのフラグメントを、重複末端をアニーリングして、各々の鎖の3’重複を相補鎖の3’伸長のためのプライマーとして使用することを可能にする、その後の融合反応において組み合わせる。生じた融合産物をPCRによってさらに増幅する。ヌクレオチドnt配列内の特異的変化は、オーバーラップオリゴプライマーにヌクレオチド変化を組み込むことによって導入できる。ベクター構築物別の実施形態では、特定された遺伝子、典型的にはフォールディング調節剤又はフォールディング調節剤の補因子をコードする1又はそれ以上のベクターを含めることによって宿主細胞を修飾する。もう1つの実施形態では、外来性プロモーターを宿主細胞ゲノムに付加することを含む、フォールディング調節剤又はフォールディング調節剤の補因子についてのプロモーターを増強することによって宿主細胞を修飾する。もう1つの実施形態では、特定された補償遺伝子の阻害剤、例えばプロテアーゼ阻害剤をコードする1又はそれ以上のベクターを含めることによって宿主細胞を修飾する。そのような阻害剤は、特定された補償遺伝子、特定された遺伝子の補因子又は特定された遺伝子のホモログの発現を制限するアンチセンス分子であり得る。アンチセンスは一般に、特定された遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸分子を表わすために使用される。加えて、阻害剤は、干渉RNA又は干渉RNAをコードする遺伝子であり得る。真核生物では、そのような干渉RNAは、例えばFireAetalNature39180611ElbashiretalGenesDevelopment15188200ElbashiretalNature4114948、CarnegieInstituteへの米国特許第6,506,559号、Benitecへの米国特許第6,573,099号、WhiteheadInst.への米国特許出願第2003/0108923号及び同第2003/0114409号、PCT国際公開公報第WO03/006477、同第WO03/012052号、同第WO03/023015号、同第WO03/056022号、同第WO03/064621号及び同第WO03/070966号に述べられているような、低分子干渉RNA又はリボザイムであり得る。阻害剤はまた、もう1つ別のタンパク質又はペプチドであり得る。阻害剤は、例えばプロテアーゼ又はプロテアーゼタンパク質についてのコンセンサス配列を有するペプチドであり得る。阻害剤はまた、宿主においてプロテアーゼ又はプロテアーゼタンパク質についての直接又は間接阻害性分子を生産することができるタンパク質又はペプチドであり得る。プロテアーゼ阻害剤は、アマスタチン、E-64、アンチパイン、エラスタチナール、APMSF、ロイペプチン、ベスタチン、ペプスタチン、ベンズアミジン、1,10-フェナントロリン、キモスタチン、ホスホルアミドン、3,4-ジクロロイソクマリン、TLCK、DFP、TPCKを含み得る。100以上の天然に生じるタンパク質プロテアーゼ阻害剤がこれまでに特定されている。それらは細菌から動物及び植物までにわたる多種多様な生物において単離された。それらは、立体障害を通して基質の活性部位へのアクセスを妨げるプロテアーゼの密接結合可逆性又は偽不可逆性阻害剤として行動する。それらの大きさも、50残基例えばBPTI:ウシ膵トリプシン阻害剤から400残基例えばα-1PI:α-1プロテイナーゼ阻害剤まで極めて多様である。それらは、分子捕捉機構を通して大部分のプロテアーゼに結合し、阻害するα-マクログロブリンファミリー例えばα-2マクログロブリンのタンパク質を除いて、厳密にクラス特異的である。外来性ベクター又はDNA構築物は、宿主細胞にトランスフェクト又は形質転換することができる。真核及び原核細胞をそれぞれ外来性核酸でトランスフェクトする及び形質転換するための手法は当技術分野において周知である。これらは、脂質小胞を介した取り込み、リン酸カルシウムを介したトランスフェクションリン酸カルシウム/共沈、ウイルス感染、特に改変ウイルス、例えば改変アデノウイルスを用いたウイルス感染、微量注入及び電気穿孔を含み得る。原核細胞形質転換に関しては、手法は、熱ショックを介した取り込み、無傷細胞との細菌プラトプラスト融合、微量注入及び電気穿孔を含み得る。植物形質転換のための手法は、アグロバクテリウムAgrobacterium、例えばA.トゥメファシエンスAtumefaciensを介した導入、急速推進タングステン又は金マイクロプロジェクタイル、電気穿孔、微量注入及びポリエチレングリコールを介した取り込みを含む。DNAは、一本鎖又は二本鎖、線状又は環状、弛緩型又は超コイルDNAであり得る。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための様々な手法に関しては、例えばKeownetalProcessesinEnzymologyVol185pp527537参照。組換え事象のために、構築物は、1又はそれ以上の核酸配列を異なる配列に挿入する又は転位することができる、1又はそれ以上の挿入配列を含み得る。しかし、構築物は、既存の細胞DNA/ゲノム内への組込みを伴わない、特定された補償遺伝子又はそのホモログの外来性発現のために設計することができる。構築物は、1又は2以上のリボソーム内部進入部位internalribosomeentrysiteIRESを含み得る。構築物はまた、特定された遺伝子の少なくとも一部、又は特定された遺伝子の補因子、特定された補償遺伝子の少なくとも一部の突然変異型、又はプロテアーゼの場合は、特定された遺伝子の阻害剤をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。あるいは、構築物はプロモーターレスであり得る。構築物が細胞DNA/ゲノムに組み込まれるように設計されていない場合、ベクターは、典型的には少なくとも1個のプロモーターエレメントを含む。前記核酸配列に加えて、発現ベクターは選択マーカー配列を含み得る。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、及び/又はリボソーム結合部位をさらに含み得る。特定された構築物を、細菌細胞、例えばP.フルオレセンスPfluorescens又は大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、例えばCHO細胞、又は植物細胞を含むが、これらに限定されない、何らかの原核又は真核細胞において発現することができる。クローニングベクターは、例えばプラスミドpBR322、pUCシリーズのプラスミド、pBluescript、pACYC177及びpACYC184を含み得る。そのような構築物における使用のための外来性プロモーターは、ファージλPLプロモーター、大腸菌lac、大腸菌trp、大腸菌phoA、大腸菌tacプロモーター、SV40初期、SV40後期、レトロウイルスLTR、PGKI、GALI、GALIO遺伝子、CYCI、PH05、TRPI、ADHI、ADH2、リン酸フォルグリムアルデヒドforglymaldehydeデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、リン酸トリオースイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼα-接合因子フェロモン、PRBI、GIT2、GPDIプロモーター、メタロチオネインプロモーター、及び/又は哺乳動物ウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス及びワクシニアウイルス由来のものを含むが、これらに限定されない。他のプロモーターは当業者に公知である。外来性ベクターのためのプロモーター、又はゲノムに挿入するように設計された外来性プロモーターは、細胞における特異的応答エレメントに基づき得る。例えばプロモーターは、PCT国際公開公報第WO2004/005221号に述べられているように、化合物、例えばアントラニレート又はベンゾエートに応答性であり得る。構築物は1又はそれ以上のプロモーターを含み得る。これらは独立しているか又は縦列であり得る。例えばプロモーターは、特定された補償遺伝子が、特定時間枠内で組換えタンパク質又はペプチドによって上方又は下方調節されるように設計することができる。例えば特定された遺伝子がフォールディング調節剤である場合、そのフォールディング調節剤又は補因子を、組換えタンパク質又はペプチドの誘導の直前に誘導することができる。プロモーターは、以下を含むがこれらに限定されない:構築物は、修飾された細胞を特定するための選択マーカーを含み得る。適切な選択マーカー遺伝子は以下を含むが、これらに限定されない:ある種の培地基質で増殖する能力を付与する遺伝子、例えばHAT培地ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンで増殖する能力を与えるtk遺伝子チミジンキナーゼ又はhprt遺伝子ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ;MAX培地ミコフェノール酸、アデニン及びキサンチンでの増殖を可能にする細菌gpt遺伝子グアニン/キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ。例えばSongKYetalProcNatIAcadSciUSA8468206824SambrookJetalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNYChapter16参照。選択マーカーの他の例は、化合物、例えば抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子、選択基質で増殖する能力を付与する遺伝子、検出可能なシグナル、例えば発光を生じるタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質eGFPをコードする遺伝子を含む。例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子neoJMolApplGenet1327341;及びハイグロマイシン耐性遺伝子hygNucleicAcidsResearch1168956911andTeRieleHetalNature348649651を含む、多種多様なそのようなマーカーが公知であり、入手可能である。他の選択マーカーは、アセトヒドロキシ酸シンターゼAHAS、アルカリホスファターゼAP、βガラクトシダーゼLacZ、βグルクロニダーゼGUS、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT、緑色蛍光タンパク質GFP、赤色蛍光タンパク質RFP、黄色蛍光タンパク質YFP、シアン蛍光タンパク質CFP、ホースラディッシュペルオキシダーゼHRP、ルシフェラーゼLuc、ノパリンシンターゼNOS、オクトピンシンターゼOCS、及びそれらの誘導体を含む。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を付与する、多重選択マーカーが入手可能である。本発明において有用なさらなる選択マーカー遺伝子は、例えば米国特許第6,319,669号;同第6,316,181号;同第6,303,373号;同第6,291,177号;同第6,284,519号;同第6,284,496号;同第6,280,934号;同第6,274,354号;同第6,270,958号;同第6,268,201号;同第6,265,548号;同第6,261,760号;同第6,255,558号;同第6,255,071号;同第6,251,677号;同第6,251,602号;同第6,251,582号;同第6,251,384号;同第6,248,558号;同第6,248,550号;同第6,248,543号;同第6,232,107号;同第6,228,639号;同第6,225,082号;同第6,221,612号;同第6,218,185号;同第6,214,567号;同第6,214,563号;同第6,210,922号;同第6,210,910号;同第6,203,986号;同第6,197,928号;同第6,180,343号;同第6,172,188号;同第6,153,409号;同第6,150,176号;同第6,146,826号;同第6,140,132号;同第6,136,539号;同第6,136,538号;同第6,133,429号;同第6,130,313号;同第6,124,128号;同第6,110,711号;同第6,096,865号;同第6,096,717号;同第6,093,808号;同第6,090,919号;同第6,083,690号;同第6,077,707号;同第6,066,476号;同第6,060,247号;同第6,054,321号;同第6,037,133号;同第6,027,881号;同第6,025,192号;同第6,020,192号;同第6,013,447号;同第6,001,557号;同第5,994,077号;同第5,994,071号;同第5,993,778号;同第5,989,808号;同第5,985,577号;同第5,968,773号;同第5,968,738号;同第5,958,713号;同第5,952,236号;同第5,948,889号;同第5,948,681号;同第5,942,387号;同第5,932,435号;同第5,922,576号;同第5,919,445号;及び同第5,914,233号に述べられている。欠失は、少なくとも約5bp、10bp、20bp、30bp、40bp又は50bp、普通は少なくとも約100bp、一般には約20kbp以上であり得、その場合、欠失は通常、1又はそれ以上のエクソン又はその一部、1又はそれ以上のイントロン又はその一部を含むコード領域の少なくとも一部であり得、隣接する非コード領域、特に5’非コード領域転写調節領域の一部を含み得るか又は含まない。それ故相同領域は、コード領域を超えて5’非コード領域まで、あるいは3’非コード領域までに及び得る。挿入は、一般には10kbpを超えることができず、通常名5kbpを超えず、一般には少なくとも50bpであり、より通常は少なくとも200bpである。相同の領域は突然変異を含むことができ、そこでは突然変異は、フレームシフトを与えるか又は鍵となるアミノ酸を変化させて、特定された遺伝子をさらに不活性化し得るか、又は突然変異は機能不全遺伝子を矯正し得る、等である。通常、突然変異は、相同なフランキング配列の約5を超えないわずかな変化であり得る。構築物は、当技術分野で公知の方法に従って作製することができ、様々なフラグメントを一緒にして、適切なベクターに導入し、クローニングして、分析し、その後所望構築物が達成されるまでさらに操作することができる例えば図5-11参照。制限分析、切り出し、プローブの特定等を可能にするために、配列に様々な修飾を施すことができる。所望に応じて、沈黙突然変異を導入することができる。様々な段階で、制限分析、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅、プライマー修復、インビトロ突然変異誘発等を用いることができる。抗生物質耐性遺伝子及び陰性選択因子の組込みのための方法は当業者によく知られている例えばWO9915650USPatentNo6080576USPatentNo6136566NiwaetalJBiochem113343349andYoshidaetalTransgenicResearch4277287参照。構築物は、原核細胞複製系、例えば原核細胞、例えばP.フルオレセンスPfluorescens又は大腸菌によって認識され得る起点を含む、細菌ベクターを使用して作製できる。挿入のために使用するマーカーと同じか又は異なる、マーカーを使用することができ、特定細胞への導入の前に除去することができる。ひとたび構築物を含むベクターが完成すれば、例えばある種の配列の欠失、線形化、あるいは相同配列に突然変異、欠失又は他の配列を導入することによって、前記ベクターをさらに操作することができる。最終的な操作後に、構築物を細胞に導入することができる。本発明の方法は反復することができる。1つの実施形態では、宿主の修飾及び修飾した宿主における組換えタンパク質の発現後、その発現が修飾宿主細胞において変化している1又はそれ以上のさらなる特定遺伝子を特定するために、修飾宿主細胞の遺伝的プロフィールを分析する。特に、補償遺伝子は、組換えタンパク質又はペプチドを発現する修飾宿主細胞と比較したとき、又は非修飾宿主細胞と比較したとき、組換えタンパク質を発現する修飾宿主において高い発現を示すものであり得る。前記方法は、さらなる特定された遺伝子の発現を変化させること及び二重修飾された細胞において前記タンパク質又はペプチドを発現させることをさらに含む。これらの工程は、タンパク質発現を改善するために反復でき、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は少なくとも10回繰り返すことができる。タンパク質の生産本発明の方法は、最適には宿主細胞における組換えタンパク質又はペプチドの生産上昇を導く。生産上昇は、所与の時間での宿主タンパク質のグラム当りのタンパク質の量の上昇を含み得るか、又は宿主細胞が組換えタンパク質又はペプチドを生産している時間の長さの上昇を含み得る。生産上昇は、組換え宿主細胞の増殖のために必要条件の改善を含み得る。生産上昇は、完全長タンパク質又はペプチドの生産上昇であり得る。改善がタンパク質レベルの上昇である場合は、タンパク質又はペプチドは、宿主細胞内の1又はそれ以上の封入体において生産され得る。生産上昇は、あるいは、生産されるタンパク質のグラム当り又は宿主タンパク質のグラム当りの活性タンパク質又はペプチドのレベル上昇であり得る。生産上昇はまた、組換えタンパク質のグラム当り又は宿主細胞タンパク質のグラム当りに生産される、回収可能なタンパク質又はペプチド、例えば可溶性タンパク質のレベル上昇であり得る。生産上昇はまた、タンパク質の総レベルの上昇と活性又は可溶性レベルの上昇の何らかの組合せであり得る。生産上昇は、典型的には、修飾細胞における一定期間の誘導後の生産のレベルを、非修飾細胞における同じ誘導後の生産レベルと比較することによって測定される。可溶性/不溶性組換えタンパク質の改善された発現は、タンパク質の溶解度の上昇であり得る。組換えタンパク質又はペプチドは、宿主細胞の細胞質、ペリプラズム又は細胞外媒質から生産し、回収することができる。前記タンパク質又はペプチドは、不溶性又は可溶性であり得る。タンパク質又はペプチドは、1又はそれ以上の標的配列又は精製を助けるための配列を含み得る。ある実施形態では、本発明は、宿主細胞における組換えタンパク質又はペプチドの溶解度を改善するための方法を提供する。ここで使用する可溶性という用語は、タンパク質が、生理的条件下に緩衝液中で10-30分間遠心したとき約5,000-20,000xgの遠心分離によって沈殿しないことを意味する。可溶性の活性タンパク質は、機能を発揮することができ、封入体又は他の沈殿塊の一部ではない。本発明はまた、活性組換えタンパク質又はペプチドの回収率を改善することができる。例えば特定されたポリペプチドと親ポリペプチドの間の相互作用、ポリペプチド変異体、セグメント置換ポリペプチド及び/又は残基置換ポリペプチドは、何らかの好都合なインビトロ又はインビボアッセイによって測定できる。例えば、特定されたポリペプチドと親ポリペプチドの間、例えば酵素と基質の間、ホルモンとホルモン受容体の間、抗体と抗原の間、等の検出可能な相互作用を測定するためにインビトロアッセイが使用できる。そのような検出は、比色変化、放射能の変化、溶解度の変化、ゲル電気泳動及び/又はゲル排除法によって測定される分子量の変化、等の測定を含み得る。インビボアッセイは、生理的作用、例えば体重増加、電解質平衡の変化、血液凝固時間の変化、血餅溶解及び抗原応答の誘導の変化を検出するためのアッセイを含むが、これらに限定されない。一般に、特定されたポリペプチドと対象ポリペプチドの間の相互作用の変化を検出するための可変パラメータが存在する限り、いかなるインビボアッセイも使用できる。例えば米国特許第5,834,250号参照。細胞質/ペリプラズム/分泌ある実施形態では、タンパク質はまた、適切なシグナル分泌配列に融合している場合、ペリプラズム内に分泌され得る。1つの実施形態では、シグナル配列は、リン酸結合タンパク質、Lys-Arg-Orn結合タンパク質LAObp又はKRObp分泌シグナルペプチド、外膜ポーリンEOprE分泌シグナルペプチド、アズリン分泌シグナルペプチド、鉄III結合タンパク質[FeIIIbp]分泌シグナルペプチド、又はリポタンパク質BLprB分泌シグナルペプチドであり得る。1つの実施形態では、修飾宿主細胞あるいは二重又は多重修飾細胞から活性な可溶性形態のジスルフィド結合を含む特定ポリペプチドを回収するために、付加的なジスルフィド結合促進条件又は試薬は必要としない。1つの実施形態では、トランスジェニックペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はそれらのフラグメントは、その活性状態で折りたたまれた分子内立体配座を有する。細胞質において可溶性の複雑な哺乳動物タンパク質は、その後のペリプラズム内でのジスルフィド結合形成のためにチオール基の正しい位置づけによって適切に配置され得ることが認められた。1つの実施形態では、トランスジェニックペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はフラグメントは、その活性状態で少なくとも1つの分子内ジスルフィド結合を含み、おそらく2、4、6、8、10、12、14、16、18又は20まで又はそれ以上のジスルフィド結合を含む。1つの実施形態では、生産されて発現されるトランスジェニックペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はそれらのフラグメントの50以上は、細胞質又はペリプラズムにおいて可溶性活性形態又は不溶性で容易に再生される形態の単一機能性ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はそれらのフラグメントとして生産される。もう1つの実施形態では、発現されるタンパク質の約60、70、75、80、85、90、95が活性形態で又は容易に活性形態に再生される形態で得られる。実施例本試験において使用した細菌株を表1に列挙する。P.フルオレセンスPfluorescensの菌株を振とうフラスコにおいて30°Cで増殖させた。様々な時点で各々の菌株についてOD575を記録した。表1細菌株の概略以下の実験で使用したプラスミドを表2に列挙する。表2プラスミドの概略試料の収集及びRNA単離全ての試料を200ml標準振とうフラスコ実験から収集した。試料は、図に示すような種々の時点で採取した。各々の時点で、振とうフラスコから細胞培養10mlを収集し、RNAを安定化するためにRNAlaterAmbion,Austin,TX試薬10mlと混合した。マイクロアレイハイブリダイゼーション及びデータ解析各々のRNA試料について、蛍光ヌクレオチドCy3-dUTP又はCy5-dUTPAmershamPharmacia,Piscataway,NJを、ランダム六量体プライマーAmershamを用いた逆転写RT反応においてcDNAに組み込んだ。2つの標識cDNAプールを一緒にし、マイクロアレイスライドに適用した。マイクロアレイスライドは、P.フルオレセンスPfluorescensの各々のORFである50量体アミノ修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドオリゴを含む。各々のオリゴを、SDDC-2ロボットVirtek,Toronto,Canada-現在はBio-RadLaboratories,Hercules,CAを通して配給されている及びSMP3ピンTeleChemInternationalInc.,Sunnyvale,CAを使用して異なる位置の2つのスポットに関して2回プリントした。使用した顕微鏡スライドは、効率的なDNA結合のために正に荷電したエポキシ樹脂で被覆したMWGInc,Alameda,CA。プリント後、スライドをMWGの仕様書に従って後処理した。データ解析をようにするためにBioDiscoveryInc.ElSegundo,CAからのソフトウエアパッケージを使用した。このパッケージは、CloneTracker商標、ImaGene商標、GeneSight商標モジュール及びGeneDirector商標データベースから成る。各々のハイブリダイズしたスライドを、マイクロアレイに結合したCy3及びCy5標識cDNAの蛍光を測定するためにScanArray5000PackardBioScience,Billerica,MAを用いて走査した。獲得した画像をImaGene商標で数量化し、生データをGeneSight商標で処理した。データ作成の間に、各遺伝子についてのスポット強度をバックグラウンド補正した;アレイ全体についての総シグナル強度を使用して、Cy5チャネルについてのシグナルをCy3チャネルに基準化した;各遺伝子についてのCy5対Cy3の基準化した比をlog2変換し、複製を一緒にした。SDS-PAGEによるタンパク質発現分析IPTG誘導後様々な時点で培養アリコートを収集し、10のOD600に基準化した。細胞溶解産物を11,000gで5分間の遠心分離によって可溶性と不溶性の分画に分けた。2.5μlのアリコートを2XNuPAGELDS試料緩衝液Invitrogen,SanDiego,CA、50μMDTTと混合し、H2Oを加えて10μlにして、その後95°Cで5分間加熱した。タンパク質を分離し、SimplyBlueSafestainInvitrogen,SanDiego,CAを用いてクマシーブルーで染色した12Nupageゲル上で視覚化した。蛍光活性測定緑色蛍光タンパク質COPとヒト成長ホルモンhGHの融合物の蛍光活性によってタンパク質収率も測定した。hgh::COP融合構築物を野生型又はhslU突然変異型菌株に形質転換し、ウラシルを含まないM9グルコース寒天プレートで選択した。IPTG誘導細胞培養を5のOD600に基準化した。SpectramaxGeminiマイクロプレート分光蛍光計MolecularDevices,Sunnyvale,CAを適切な設定Ex485、Em538530バンドパスフィルター下で使用して相対蛍光RF活性を測定した。細胞質及びペリプラズムタンパク質を生産する菌株の遺伝子発現分析-種々の時点の比較異種タンパク質の生産の間のFM及びプロテアーゼ遺伝子発現を検討するため、P.フルオレセンスPfluorescens菌株DC206、280、240及び271を初期マイクロアレイ実験において使用した。DC206は宿主菌株であり、細胞増殖についての対照として使用した;DC280はベクターだけのプラスミドであり、マイクロアレイ実験についての対照として使用した;DC240は、可溶性である細胞質ニトリラーゼ酵素をコードするプラスミドを有するDC206である;DC271は、部分的に不溶性であるペリプラズムヒト成長ホルモンpbp::hGHをコードするプラスミドを有するDC206である。菌株を振とうフラスコ培地200ml中で増殖させ、OD575を測定することによって細胞増殖を観測した。接種後24時間目にIPTG誘導を実施した。全ての菌株が同様に増殖し、RNA単離及びDNAマイクロアレイを用いた転写プロファイリングTxPのための誘導の直前0時間目と4時間後に培養試料を採取した図1。遺伝的プロフィール、すなわち転写プロフィールは、誘導後4時間目の時点の試料と0時間目の試料の比較に基づき、2つの試料をCy3-dUTP又はCy5-dUTPのいずれかの蛍光染料で標識し、各々の菌株について同じスライドに共ハイブリダイズした。各々のハイブリダイゼーションを染料交換実験によって2回実施したすなわち試料をCy3-dUTP又はCy5-dUTPで標識した表3、スライド1-6。ハイブリダイズしたスライドを、共焦点レーザースキャナーを用いて走査した。各々の遺伝子についてのシグナル強度を測定し、BiodiscoveryElSegundo,CAからのマイクロアレイソフトウエアパッケージを用いて処理した。各々の遺伝子についての2つの時点の発現比を算定し、菌株全体にわたる全ての遺伝子についての比を、3つの菌株DC280、DC240及びDC271の間での比の数値と傾向に基づいてクラスター化した図2。表3実施例1-3において実施したマイクロアレイ実験の要約高レベルの組換えタンパク質生産によって課せられるストレス下でのP.フルオレセンスPfluorescensにおけるFM及びプロテアーゼ遺伝子発現に焦点を当てるために、FM及びプロテアーゼ遺伝子のリストをクラスター分析と比較した。DC280、DC240及びDC271からの全ての遺伝子の階層的クラスター化分析後、2つのクラスターにおいてFMとプロテアーゼが特定されたクラスター6及び7内の直線;図2。クラスター7内の4個の遺伝子は、可溶性細胞質ニトリラーゼを生産するDC240又はいかなるタンパク質も過剰生産しないDC280と比較して、主として不溶性のペリプラズムヒト成長ホルモンを発現するDC271において有意に高い発現を示す。4個の遺伝子は、HslVをコードするrxf01961、HslUをコードするrxf01957、CbpAをコードするrxf03987及びHtpGをコードするrxf05455である。大腸菌HslVClpQとHslUClpYは共に細胞質プロテアーゼを形成する。小さなサブユニット、HslVは、真核生物のプロテアソームαサブユニットに関連するペプチダーゼである。大きなサブユニット、HslUは、他のClpファミリーのATPアーゼ、例えばClpA及びClpXに相同性を有するATPアーゼである。大腸菌のCbpAは、その構造だけでなくその機能からも判断されるように、広く特性決定されているコシャペロンDnaJの類似体である。DnaJにおける損傷の表現型、例えば増殖についての温度感受性は、多コピープラスミドへのcbpA遺伝子の導入後に修復される。大腸菌のHtpGは、インビトロでATP非依存性分子シャペロンとして機能する。非天然フォールディング中間体を認識し、一過性に結合して、溶液中のそれらの遊離濃度を低下させ、それ故非特異的凝集を予防する。図2のクラスター6内の遺伝子を、あまり顕著でない作用を特定するために再び階層的クラスター化を用いて分類した。図3は、FM及びプロテアーゼが2つの主要クラスタークラスター6及び8における直線において特定されたことを示す。クラスター8内の2個のFMは、数多くのタンパク質を折りたたむために共に働くことが広く知られている2個の主要シャペロン、DnaKとDnaJである。クラスター6からの遺伝子の発現値のさらなる分析は、付加的なFM、ニトリラーゼを生産するDC240又はいかなるタンパク質も過剰生産しないDC280と比較したときpbp::hGHを生産するDC271においてより高く発現されるClpXを特定した。大腸菌ClpX熱ショックタンパク質は、原核及び真核生物HSP100/ClpATPアーゼファミリーの成員に相同である。大腸菌のClpXを、ClpPプロテアーゼサブユニットによるタンパク質分解に関してコンピテントな形態のある種のポリペプチドを保持する、ATP依存性Clpプロテアーゼの特異的成分として単離した。ClpXは、ClpPの不在下で、DNA複製に関与する開始タンパク質を活性化することにより、分子シャペロンとして働くことができる。ペリプラズムhGH生産のために重要な、特定されたFM及びプロテアーゼを表4に列挙する。表4定常状態mRNA比のレベルがDC240及びDC280と比較してDC271においてより高いFM及びプロテアーゼ遺伝子のリスト。列記した数値は、IPTG誘導後4時間目対0時間目の比である。dnaKに関しては、2個のプローブがマイクロアレイチップ上に存在し、それ故2つの遺伝子発現値が示されている。細胞質及びペリプラズムタンパク質を生産する菌株の遺伝子発現分析-種々の菌株の直接比較上記で得た結果を確認するため、2つの菌株DC271とDC240の直接比較によって付加的なマイクロアレイ実験を実施した表3のスライド7-10。誘導後4時間目の時点での2つの菌株の比較は、部分的に可溶性のpbp::hGHを発現する細胞においてほとんど同一のセットのFM及びプロテアーゼ遺伝子が上方調節されることを確認した表5。表5に列記する全ての遺伝子が、完全に可溶性のニトリラーゼを生産する細胞と比較したとき、部分的に不溶性のhGHを生産する菌株において有意にすなわち≧2倍高く発現される。DC271とDC240の直接比較において、部分的に不溶性のhGH生産の間に有意に高い遺伝子発現値を示した時点比較に比べて表4参照数個の付加的なタンパク質が特定された。それらの遺伝子は、ClpBをコードするrxf08347、ClpAをコードするrxf04587、及びFkbPをコードするrxf05753を含んだ。大腸菌ClpBホモログは、DnaKJ-GrpEと共に封入体の再活性化に関与する。大腸菌からのClpAはシャペロン機能を有し、ClpPと一緒になったとき、タンパク質を分解する。大腸菌において、FkbPはペプチジル-プロリルイソメラーゼとして機能する。表5定常状態mRNAレベルがDC240と比較してDC271においてより高いFM及びプロテアーゼ遺伝子のリスト。列記した数値は、IPTG誘導後4時間目のDC271対DC240の比である。dnaKに関しては、2個のプローブがマイクロアレイチップ上に存在し、それ故2つの遺伝子発現値が示されている。不溶性細胞質タンパク質を生産する菌株の遺伝子発現分析DC271は部分的にペリプラズムヒト成長ホルモンpbp::hGHを発現するので、主として不溶性の細胞質hGHを発現する菌株において類似の又は異なるFM及びプロテアーゼ遺伝子が上方調節されるかどうかを検討した。DC369をこの実験で使用した。誘導後4時間目の試料を0時間目の時点の試料と比較し、表3スライド11及び12に示すようにマイクロアレイ実験を実施した。やはり、類似のFM及びプロテアーゼ遺伝子が上方調節されることが認められ、特定された遺伝子がペリプラズムフォールディング及びタンパク質分解ではなく細胞質フォールディング及びタンパク質分解に関与することを示唆した表6。実験において特定された遺伝子の要約を、上方調節の倍数と共に図4のベン図に示す。表6定常状態mRNAレベルが0時間目の時点と比較して誘導後4時間目にDC369においてより高いFM及びプロテアーゼ遺伝子のリスト。列記した数値は、IPTG誘導後4時間目対0時間目誘導の直前の比である。dnaKに関しては、2個のプローブがマイクロアレイチップ上に存在し、それ故2つの遺伝子発現値が示されている。P.フルオレセンスDC206におけるhslU突然変異型菌株の生成2個の遺伝子hslVUが、最も高く上方調節される特定遺伝子の中に認められた。HslUは細胞質ATPアーゼである。大腸菌における相同タンパク質は、大腸菌のエネルギー依存性タンパク質分解を促進する第二タンパク質と共同して働くことができる。HslUは、プロテアソームのαサブユニットに相同性を有するタンパク質、HslVと相互作用する。大腸菌HslVUホモログは、MissiakasDetalIdentificationandcharacterizationofHsIVHsIUproteinsinvolvedinoverallproteolysisofmisfoldedproteinsinEscherichiacoliEmboJ156899909の中で、折りたたみ異常タンパク質の全体的タンパク質分解に関与することが報告された。DNA塩基配列分析は、P.フルオレセンスhslVU遺伝子が2シストロン性オペロンの一部である可能性が高いことを示唆した図5。HslVUが実際にhGHの分解に関与することを確認するため、hslUノックアウト菌株を構築した。そのような菌株は、hslUの挿入不活性化によって生成した図6。hslUに対して内側の約550bpDNAフラグメントをカナマイシン耐性pCR2.1-TOPOベクターにクローニングした。このベクターは、大腸菌において機能性であるがP.フルオレセンスPfluorescensでは機能性でない複製起点ColE1を有するので、カナマイシン耐性を付与するために相同的組換えを通して構築したプラスミドをDC206の染色体に組み込む。カナマイシン耐性コロニーについての正しい挿入部位を、最初に増幅された領域の外側で且つプラスミド骨格内にハイブリダイズするプライマーを使用した診断コロニーPCRによって確認した表3。構築したhslU突然変異型菌株をDC370と称した。hslU遺伝子の~550bpの内側領域を増幅するプライマーを設計した表7。内側フラグメントを、TaqポリメラーゼPromegaを用いて増幅し、精製して、pCR2.1-TOPOベクターInvitrogen,SanDiego,CAにクローニングした。プラスミドをコンピテントP.フルオレセンスPfluorescensDC206に形質転換し、250μg/mlウラシル及び50μg/mlカナマイシンを添加したM9グルコース寒天プレートで選択した。表7プライマーSDS-PAGE分析によるタンパク質発現の比較hslU遺伝子ノックアウトの影響を検討するため、2個の外来性タンパク質発現を、親菌株DC206と新たに構築した突然変異型菌株DC370の間で比較した。pbp::hGHpDOW1323及びhGHpDOW1426をコードする遺伝子を担持するプラスミドを各々コンピテントDC370細胞に形質転換し、それぞれ菌株DC373及びDC372を生じた。4つの菌株に関して標準振とうフラスコ増殖実験を実施した。図7は、野生型と突然変異型菌株が同様の増殖速度を有することを示す。試料をSDS-PAGEゲルで泳動させた図8及び9。結果は、プロテアーゼサブユニットHslUの欠失の故に突然変異型がより高い量のタンパク質を生産したことを示唆する。蛍光活性によるタンパク質発現の比較認められたHslUの欠如のhGHの収率への影響はSDS-PAGE分析を用いて定量することが困難であるので、COP緑色蛍光タンパク質とhGHの間の融合タンパク質の蛍光によってタンパク質生産の一時的プロフィールを観測した。hGH::COP融合物を含むプラスミドを構築し、親菌株DC206及びhslU遺伝子欠失菌株DC370に形質転換して、菌株HJ104及びHJ105を生成した表1。標準振とうフラスコ増殖実験を実施し、蛍光測定のために様々な時点で試料を採取した図10。蛍光光度計からの読み取りは、hslUプロテアーゼ突然変異型菌株が親菌株と比較して有意に高いタンパク質発現レベルを有することを明らかに示した図11。この所見はSDS-PAGE分析によって得られた結果を裏付ける。野生型菌株と比較して、hslU突然変異型は、誘導後24時間目に相対蛍光の33.05を上昇させた図11の挿入図参照。hslUV完全ノックアウト菌株の構築Hslプロテアーゼは2つのサブユニット:hslUによってコードされるATP結合サブユニット及びhslVによってコードされるプロテアーゼサブユニット、から成る。先に構築したHslプロテアーゼノックアウト菌株はhslU遺伝子の挿入不活性化である。HslVが、もう1つ別のプロテアーゼのATP結合サブユニットと結合できることによってまだプロテアーゼとして機能し得るという懸念を取り除くため、hslUとhslV遺伝子の両方が染色体から除去された欠失菌株を構築した。図13に示すように、hslUV領域に隣接する2個のDNAフラグメントのPCR増幅によってプラスミドpDOW2050を構築し、その後オーバーラップ伸長によるスプライシングSOEPCR法HoSNMethodforgenesplicingbyoverlapextensionusingthepolymerasechainreactionApplicationUSpatent893920955023171参照を用いて2個のフラグメントを融合した。次に、融合DNAフラグメントをベクターpDOW1261-2のSrfI部位に連結した。挿入物をDNA塩基配列決定によって確認した後、欠失プラスミドをpDOW2050と命名した。プラスミドpDOW2050をDC206に電気穿孔し、1グルコースと15μg/mlテトラサイクリンを添加したM9寒天プレートに塗布した。テトラサイクリン耐性は、ゲノム内の2つの相同領域の1つでプラスミド全体を染色体内に組み換える組込み事象によるものである図13。組み込まれたプラスミドと染色体内の相同DNA領域の間の第二相同的組換えから生じるhslUV遺伝子の欠失を有する細胞を選択するために、250μg/mlウラシルを添加したLB培地でテトラサイクリン耐性コロニーを定常期まで増殖させた。その後、500μg/ml5-フルオロオロト酸5-FOAを添加したLB寒天プレートに細胞を塗布した。第二組換え事象によって組み込まれたプラスミドを喪失した細胞は同時にpyrF遺伝子も喪失しており、それ故5-FOAに耐性であり、DC417と称する所望の染色体hslUV欠失菌株を生じる。hslUV欠失菌株の表現型分析hGHタンパク質を発現するhslUV欠失菌株菌株HJ115のSDS-PAGE分析は、hslU挿入突然変異型菌株DC372を使用して先に認められたものと同様にデータは示していない、野生型菌株DC369よりもはるかに高いタンパク質収率を示した。タンパク質収率を、先に述べたのと同じ方法を用いてhGH::COP融合物の蛍光活性によっても測定した。hGH::COP融合物を含むプラスミドpDOW1349を野生型及び突然変異型菌株に形質転換し、それぞれ菌株HJ104及びHJ117を生じた。標準振とうフラスコ増殖実験を実施し、相対蛍光測定のために様々な時点で試料を採取した図14。蛍光光度計からの読み取りは、hslUVプロテアーゼ欠失菌株が野生型菌株と比較して有意に高いタンパク質発現レベル約50の収率上昇を有することを示した。この結果は、hslUノックアウト菌株に関して先に認められたのと同様である。新しいセットのプロテアーゼがhslUVプロテアーゼ欠失菌株において上方調節されるかどうかを調べるために、DNAマイクロアレイ実験を実施した。野生型DC369及びhGHを発現する突然変異型菌株HJ115を使用して標準振とうフラスコ増殖実験を実施した。各々の菌株について、誘導後4時間目の試料を0時間目の時点の試料異種タンパク質誘導の直前と比較し、DNAマイクロアレイ実験を実施した。野生型と突然変異型菌株の間で2つの時点の比を比較して、hslUVプロテアーゼ欠失菌株において上方調節されるプロテアーゼ遺伝子の新しいリストを特定した表8。プロテアーゼをコードするこれらの新たに特定された遺伝子は、今や、異種タンパク質生産の収率をさらに改善するための2回目の遺伝子欠失事象の標的であり得る。表8IPTG誘導後4時間目対0時間目誘導の直前の比に基づき、その定常状態mRNAレベルが野生型菌株DC369と比較してhslUVプロテアーゼ欠失菌株HJ115においてより高いプロテアーゼ遺伝子。フォールディング調節剤の共過剰発現は標的タンパク質hGHの溶解度を上昇させる図4に示す転写プロファイリングデータに基づき、フォールディング調節剤FMDnaK及びDnaJの発現は、対照菌株と比較して組換えタンパク質を生産する菌株において上昇した表4及び5参照。hGHと共にGrpE、DnaK及びDnaJを共過剰生産した菌株を生産し、これが可溶性hGHのレベル上昇の蓄積を生じさせるかどうかを特定するために試験した。hGHとの共過剰発現のためのgrpE-dnaKJ含有プラスミドの構築P.フルオレセンスPfluorescensgrpE-dnaKJ遺伝子を、MB214DNeasy;Qiagen,Valencia,CAから単離した染色体DNAを鋳型とし、RC1995’-ATATACTAGTAGGAGGTAACTTATGGCTGACGAACAGACGCA-3’及びRC2005’-ATATTCTAGATTACAGGTCGCCGAAGAAGC-3’をプライマーとして使用して増幅し、PfuTurboStratagene,LaJolla,CAを製造者の指示に従って使用した。生じたPCR産物4kbをSpeI及びXbaI上記プライマーにおいて下線を付した制限部位で消化し、pDOW2236に連結して、tacプロモーターの制御下にgrpE-dnaKJ遺伝子を含むpDOW2240を作製した。プラスミドpDOW2240をSpeI及びHindIIIで消化し、生じたgrpEdnaKJを含む4.0kbフラグメントを、QiaquickQiagenを用いてゲル精製し、同じくSpeIとHindIIIで消化したpDOW2247に連結した。マンニトールプロモーターの制御下にgrpE-dnaKJを含む、生じたプラスミド、pDOW3501を、250μg/mlウラシルを添加したM9グルコースプレート上で選択することによってDC388に形質転換した。最後に、pDOW1426を上記菌株DC462に電気穿孔し、M9グルコースプレートで選択して、2個の誘導的プラスミド:1PtachGHを担持するpDOW1426及び2PmtlgrpE-dnaKJを担持するpDOW3501、を有する菌株DC463を生じた。振とうフラスコ発酵、試料収集及び分析DC463の2つの培養を振とうフラスコで増殖させた。誘導後24時間目にhGHについては0.1mMIPTG及びGrpE-DnaKJについては0.5マンニトールを添加してタンパク質誘導を実施した。誘導後0、4、8、24及び48時間目に試料を収集した。各々の時点で、1mLに基準化した20個のOD600細胞を採集し、EasyLyse商標Epicentre,Madison,WIを用いて溶解して、14,000rpmで30分間の遠心分離によって可溶性と不溶性の分画に分けた。等容量の試料をBioRadHercules,CA2xレムリ緩衝液と混合し、95°Cで5分間加熱して、30μLを、1xトリスグリシンSDSランニング緩衝液BioRadを用いてBioRad15トリスHClCriterionゲルに負荷した。図15に示すようにSimplyBlueSafestainInvitrogen,Carlsbad,CAでタンパク質を視覚化した。生じたクマシー染色ゲルをMolecularDevicesPersonalDensitometerMolecularDevices,Sunnyvale,CAを用いて走査し、ImageQuantとエクセルを用いて解析を行った。図15に示すように、GrpE、DnaKJの共過剰発現はhGHの溶解度を有意に上昇させ、総タンパク質収率はより低かったが、標的タンパク質のほぼ100を可溶性分画に変換した。IPTGとマンニトールの同時添加を用いてDC463の増殖と誘導を反復する付加的な実験は、GrpEDnaKJが共過剰生産されたとき、hGH溶解度の度合は様々であったが50-100:データは示していない、ここで示す結果を厳密に模倣した。これらの所見は、転写プロファイリングに基づく標的菌株遺伝子操作が、組換えタンパク質の溶解度及び/又は収率を高めるための合理的菌株設計を導き得ることをさらに明らかにする。ある種の実施形態と非限定的実施例を参照して本発明を説明した。本発明の他の実施形態も可能であることは当業者には明白である。"