"第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のヒンジ含有ポリペプチド、及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質を調製する方法であって、第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用し、及び第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドが少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されており、該方法が、aヒンジ含有ポリペプチドが発現される条件下で第一のヒンジ含有ポリペプチドをコードする第一の核酸を含む第一の宿主細胞を培養し;bヒンジ含有ポリペプチドが発現される条件下で第二のヒンジ含有ポリペプチドをコードする核酸を含む第二の宿主細胞を培養し;c第一及び第二の宿主細胞の細胞膜を破壊し、第一及び第二の宿主細胞が単一の懸濁液中で一緒に混合され、及びdヘテロ多量体タンパク質を回収する工程を含み、前記方法は還元剤の添加を必要としない方法。第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のヒンジ含有ポリペプチド、及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質を含むヘテロ多量体タンパク質を調製する方法であって、第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用し、及び第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドが少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されており、該方法が、a第一のヘテロ二量体化ドメインを有する精製された第一のヒンジ含有ポリペプチドを提供し;b第二のヘテロ二量体化ドメインを有する精製された第二のヒンジ含有ポリペプチドを提供し;c第一のヒンジ含有ポリペプチドと第二のヒンジ含有ポリペプチドを組合わせ、d単離されたポリペプチドの多量体化を可能にする条件下で、第一のヒンジ含有ポリペプチドを第二のヒンジ含有ポリペプチドとともにインビトロでリフォールディングし、eヘテロ多量体タンパク質複合体を回収する工程を含む方法。第一のヘテロ二量体化ドメインと第二のヘテロ二量体化ドメインが界面で接触し、及び第二のヘテロ二量体化ドメインのインターフェイシング部分が、第一のヘテロ二量体化ドメインのインターフェイシング部分の空洞内に配置可能である突起を含む、請求項1又は2に記載の方法。第二のヘテロ二量体化ドメインが突起を含むFcポリペプチドであるか、又は第一のヘテロ二量体化ドメインが空洞を含むFcポリペプチドであるか、又はその両方である、請求項1又は2に記載の方法。第一のFcポリペプチドと第二のFcポリペプチドが界面で接触し、第二のFc融合ポリペプチドの界面が、第一のFcポリペプチドの界面にある空洞内に配置可能である突起を含み、及び空洞又は突起又はその両方がそれぞれ、第一及び第二のFcポリペプチドの界面中に導入されている、請求項1又は2に記載の方法。第一のヘテロ二量体化ドメイン及び第二のヘテロ二量体化ドメインがロイシンジッパーを含む、請求項1又は2に記載の方法。第一のヘテロ二量体化ドメイン及び第二のヘテロ二量体化ドメインがコイルドコイルを含む、請求項1又は2に記載の方法。鎖間ジスルフィド結合が、抗体のヒンジ領域にある、請求項1又は2に記載の方法。前記鎖間ジスルフィド結合が、ヒンジ領域間である、請求項1又は2に記載の方法。前記ジスルフィド結合が、分子間である、請求項1又は2に記載の方法。前記分子間ジスルフィド結合が、2つの免疫グロブリンのヒンジ含有ポリペプチド鎖のシステイン間である、請求項1又は2に記載の方法。ヒンジ含有ポリペプチドが、CHドメイン又はその変異体を含む、請求項1又は2に記載の方法。ヒンジ含有ポリペプチドが、Fc領域又はその変異体を含む、請求項1又は2に記載の方法。第一のヒンジ含有ポリペプチドが抗体の重鎖である、請求項1又は2に記載の方法。第二のヒンジ含有ポリペプチドが抗体の重鎖である、請求項1又は2に記載の方法。第一のヒンジ含有ポリペプチドが抗体の軽鎖と対合した抗体の重鎖である、請求項1又は2に記載の方法。第二のヒンジ含有ポリペプチドが抗体の軽鎖と対合した抗体の重鎖である、請求項1又は2に記載の方法。ヒンジ含有ポリペプチドが抗体の軽鎖ポリペプチドと対合して標的結合アームを形成する、請求項16又は17に記載の方法。ヒンジ含有ポリペプチドがヒトCH2及び/又はCH3ドメインの少なくとも一部分を含む、請求項1又は2に記載の方法。ヒンジ含有ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの片方対又は両方の対がヒト化されている、請求項1又は2に記載の方法。ヒンジ含有ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドが、別個の発現プラスミド上にコードされている、請求項1に記載の方法。ヒンジ含有ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドが、同じ発現プラスミド上にコードされている、請求項1に記載の方法。宿主細胞が、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、植物細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。宿主細胞が原核細胞である、請求項1に記載の方法。前記原核細胞が大腸菌細胞である、請求項24に記載の方法。前記大腸菌細胞がlpp欠損である、請求項25に記載の方法。宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項1に記載の方法。前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項27に記載の方法。第一の宿主細胞と第二の宿主細胞は別の細胞培養にある、請求項1に記載の方法。工程a及びbの細胞が両方の宿主細胞を含む混合培養にある、請求項1に記載の方法。工程a及びbの細胞が組合わされ、遠心分離され、細胞膜を破壊する前に緩衝液に再懸濁される、請求項29に記載の方法。工程a及びbの細胞が遠心分離され、細胞膜を破壊する前に組合わされる、請求項29に記載の方法。細胞膜を破壊することが、細胞膜を透過処理すること及び細胞膜の崩壊からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。細胞膜を破壊することが、細胞溶解、超音波処理、浸透圧ショック、マイクロフルイダイザーの通過、EDTAの添加、種々の界面活性剤、溶媒例えば、トルエン、ジメチルスルホキシド等、界面活性剤例えば、トリトン-X100、Tween20等、低張緩衝液、凍結/解凍技術の使用、エレクトロポレーション、ステンレス鋼のボールホモジナイザーの通過からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。回収工程が、少なくとも一つの精製工程を更に含む、請求項1又は2に記載の方法。aプロテインAを含むカラム上で前記抗体を捕獲し、b前記抗体を前記カラムから溶出し、及びc前記溶出された抗体をカオトロピック剤又は中性界面活性剤を含有する溶液に希釈する工程を更に含む、請求項1又は2に記載の方法。ヘテロ多量体タンパク質が、抗体、二重特異性抗体、多選択性抗体、ワンアームド抗体、多選択性一価抗体、二重特異性マキシボディ、モノボディ、イムノアドヘシン、ペプチボディ、二重特異性ペプチボディ、一価ペプチボディ、及び抗体からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。ヘテロ多量体タンパク質が抗体である、請求項37に記載の方法。ヘテロ多量体タンパク質が二重特異性抗体である、請求項37に記載の方法。ヘテロ多量体タンパク質が多選択性抗体である、請求項37に記載の方法。ヘテロ多量体タンパク質がワンアームド抗体である、請求項37に記載の方法。前記抗体が、重鎖定常ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、請求項37に記載の方法。前記抗体がヒト化されている、請求項37に記載の方法。抗体が全長抗体である、請求項37に記載の方法。前記全長抗体が、重鎖及び軽鎖を含む、請求項44に記載の方法。重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの片方又は両方の対がヒト型である、請求項16又は17に記載の方法。前記抗体がヒト型である、請求項37に記載の方法。前記抗体が、ヒトCH2及び/又はCH3ドメインの少なくとも一部分を含む抗体断片である、請求項37に記載の方法。前記抗体断片がFc融合ポリペプチドである、請求項48に記載の方法。抗体が、IgG、IgA及びIgDからなる群から選択される、請求項37に記載の方法。抗体がIgGである、請求項50に記載の方法。抗体がIgG1である、請求項51に記載の方法。抗体がIgG2である、請求項51に記載の方法。抗体が治療用抗体である、請求項37に記載の方法。抗体がアゴニスト抗体である、請求項37に記載の方法。抗体がアンタゴニスト抗体である、請求項37に記載の方法。抗体が診断用抗体である、請求項37に記載の方法。抗体が遮断抗体である、請求項37に記載の方法。抗体が中和抗体である、請求項37に記載の方法。抗体が腫瘍抗原に結合することができる、請求項37に記載の方法。腫瘍抗原が細胞表面分子でない、請求項60に記載の方法。腫瘍抗原がクラスター分化因子でない、請求項60に記載の方法。抗体がクラスター分化因子に結合することができる、請求項37に記載の方法。抗体が細胞生存調節因子に結合することができる、請求項37に記載の方法。抗体が細胞増殖調節因子に特異的に結合することができる、請求項37に記載の方法。抗体が組織発達又は分化に関連する分子に結合することができる、請求項37に記載の方法。抗体が細胞表面分子に結合することができる、請求項37に記載の方法。抗体がリンホカインに結合することができる、請求項37に記載の方法。第一の対及び第二の対の軽鎖が異なる可変ドメイン配列を含む、請求項37に記載の方法。少なくとも45のポリペプチドが前記二重特異性抗体を形成する、請求項37に記載の方法。前記二重特異性抗体が2つの標的分子に特異的に結合することができる、請求項39に記載の方法。第一のアームが第一の標的分子に特異的に結合し、及び第二のアームが第二の標的分子に特異的に結合する、請求項71に記載の方法。少なくとも45のポリペプチドが、第一のヒンジ含有ポリペプチド及び軽鎖対及び第二のヒンジ含有ポリペプチド及び軽鎖対を含む複合体の状態である、請求項1又は2に記載の方法。抗体を精製する工程の前に、わずか10の単離されたポリペプチドが単量体又はホモ二量体として存在する、請求項1又は2に記載の方法。第一の対及び第二の対の軽鎖が異なる可変ドメイン配列を含む、請求項71に記載の方法。第一及び第二の重鎖の対の各々が、お互いにジスルフィド結合した重鎖及び軽鎖を含む、請求項71に記載の方法。第一の対及び第二の対の間のpI値の違いが少なくとも0.5である、請求項71に記載の方法。請求項1-2の何れか一項により産生されたヘテロ多量体タンパク質。ヘテロ多量体タンパク質が多選択性抗体である、請求項78に記載の方法。ヘテロ多量体タンパク質が少なくとも2つの標的分子に結合することができる、請求項78に記載のヘテロ多量体タンパク質。ヘテロ多量体タンパク質が同じ抗原上の少なくとも2つのエピトープに結合することができる抗体である、請求項78に記載のヘテロ多量体タンパク質。請求項1又は2の方法に従って産生された二重特異性抗体。重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの第一の対、及び重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの第二の対を含む二重特異性抗体であって、軽鎖ポリペプチドが異なる可変ドメイン配列を含む、二重特異性抗体。請求項78に記載のヘテロ多量体タンパク質及び担体を含む組成物。請求項78に記載のヘテロ多量体タンパク質を少なくとも10含む組成物。請求項78に記載のヘテロ多量体タンパク質を含む薬学的組成物。第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のヒンジ含有ポリペプチド、及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含み、第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用し、及び第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドが少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されているコンビナトリアルヘテロ多量体タンパク質ライブラリを産生する方法であって、該方法が、a第一の宿主細胞と、少なくとも2つの更なる宿主細胞を培養し、i.第一の宿主細胞は、第一のヘテロ二量体化ドメイン含有ポリペプチドをコードする第一の核酸を含み;及びii.前記更なる宿主細胞は、第二のヘテロ二量体化ドメイン含有ポリペプチドをコードする核酸を含み、b第一及び第二のヘテロ二量体ドメイン含有ポリペプチドが細胞外環境に放出されるように、第一の宿主細胞及び少なくとも2つの更なる宿主細胞の細胞膜を破壊し、第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞が単一の懸濁液中で一緒に組合わされ、及びcヘテロ多量体タンパク質複合体を回収する工程を含み、前記方法が還元剤の添加を必要としない方法。第一のヒンジ含有ポリペプチドが抗体の軽鎖ポリペプチドと対合し、第一の標的結合アームを形成し、第二のヒンジ含有ポリペプチドが抗体の軽鎖ポリペプチドと対合し、第二の標的結合アームを形成する、請求項1又は2に記載の方法。結合アームの各々又は両方が一以上の標的に結合することができる、請求項88に記載の方法。本発明は以下の実施例に更に詳細に記載されるが、これらは特許請求される本発明の範囲を限定することを意図のものではない。添付図面は、本発明の明細書と説明の不可欠な部分と見なされることが意図される。全ての参考文献は、本明細書に記載されている全てにおいて、参照により援用される。以下の実施例は、説明するために提供されるが、請求項に記載の発明を限定するものではない。実施例1:発現ベクターの構築この例では、宿主細胞を形質転換するために使用する核酸コンストラクトを示している。一般的には、重鎖及び軽鎖の両方をコードするDNA配列が、配列の各々に対して別個のプロモーター要素、及び発現プラスミドを含む細菌細胞を選択するための抗生物質耐性を含む、発現プラスミドにクローニングされる。ベクターのコンストラクトは、細菌細胞のペリプラズム空間への抗体ポリペプチドの排出のため、熱安定性エンテロトキシンIISTII分泌シグナルをコード化する。各鎖の転写はphoAプロモーターによって制御され、翻訳制御が、測定された相対的翻訳力について以前に説明されたSTIIシグナル配列の変異体によって与えられ、それは翻訳開始領域TIRにおけるサイレントコドンの変化を含む。ノブ及びホールのプラスミドの模式図を、図2A及び2Bのそれぞれに示す。本発明は、特定の抗体の結合配列に依存しておらず、任意の半抗体の組み合わせに適用可能であるが、本明細書の実施例では、c-Met、EGFR、IL-4及びIL-13を対象としたヘテロ多量体抗体に向けられている。抗c-met抗体の例は、米国特許第7,472,724号、及び米国特許7,498,420第号に与えられる。抗EGFR抗体の例は、米国仮出願第61/210562号2009年3月20日出願、米国特許出願公開第20080274114号2008年11月6日公開及び米国特許5844093号1998年12月1日付与に与えられる。抗IL-13抗体の例は、米国特許第7501121号2009年3月10日付与、米国特許7615213号2009年11月10日付与、国際公開第2006/085938号2006年8月17日公開、米国特許出願公開第20090214523号2009年8月27日公開、及び米国特許7674459号2010年3月9付与に記載されている。抗IL-4抗体の例は、米国特許出願公開第20080241160号2008年10月2日公開、及び米国特許6358509号2002年3月19日付与に記載されている。各半抗体は、米国特許第7642228号に記載されているように重鎖に操作された、ノブ突起又はホール空洞を有していた。簡単に説明すると、CH3ノブ変異体が最初に生成された。CH3ホール変異体のライブラリーが、その後、パートナーのCH3ドメイン上のノブに近接している残基366、368及び407をランダム化することにより作成された。次の例では、ノブの変異はT366Wであり、ホールはIgG1のバックボーンにおいて変異T366S、L368A及びY407Vを有する。他の免疫グロブリンアイソタイプにおける同等の突然変異は、当業者によって容易に決定される。更に、当業者は、二重特異性のために使用される2つの半抗体が同じアイソタイプであることが好ましいことが容易に分かるであろう。異なるアイソタイプの半抗体が使用され得るが、更なる変異が必要である場合がある。この実施例で説明されるベクターは、抗c-Met又は抗EGFR半抗体どちらかであるが、当業者は、任意の抗体をプラスミド中にコード化することができることを容易に理解するであろう。本明細書で使用される全てのコンストラクトについての開始プラスミドは、以前に記載された、抗組織因子分離シストロンプラスミドのpaTF50であり、相対的TIRが重に対して1及び軽に対して1である592718又は64B4W3110ΔfhuAΔphoAilvGΔprcspr43H1ΔdegPΔmanAlacIqΔompTに導入し、形質転換体をカルベニシリンを含むLBプレート上で選択した。実施例1の発現プラスミドは大腸菌宿主株33D3592718又は64B4W3110ΔfhuAΔphoAilvGΔprcspr43H1ΔdegPΔmanAlacIqΔompTに導入された。そして形質転換体をカルベニシリンを含むLBプレート上で選択した。形質転換体は、その後、カルベニシリンを含むLB種培養液を播種するために使用され、これを30°Cで振とうしながら一晩増殖させた。種培養液はカルベニシリンを含むリン酸塩制限培地C.R.A.P.へ100倍に希釈され、30°Cで24時間震とうして増殖させた。培養液を遠心分離し、細胞ペレットは、抗体精製が開始されるまで凍結した。ペレットを解凍し、塩酸でpH7.5に調整した25mMのトリスベース、125mMのNaCl及び5mMのEDTATEBまたはトリス抽出緩衝液を含み、容積重量比が5グラムの細胞ペレットあたり100mLのTEBである抽出緩衝液に再懸濁し、そしてマイクロフルイディクスコーポレーションモデル110FマイクロフルイダイザーNewton,MAを通して再懸濁した混合物を3回通すことにより、マイクロ流体工学を用いて細胞を破壊することによって抽出した。細菌の細胞抽出液を15,000×gで20分間遠心分離によって清澄化し、上清が収集され、精製前に0.22ミクロンのアセテートフィルターを介してろ過した。各半抗体はプロテインA捕捉により別々に精製され、陽イオン交換クロマトグラフィーが続いた。ノブ半抗体からの清澄化細胞抽出物は、1mLのHiTrapMabSelectSUREカラムGEHealthcarePistcataway,NJ上に2mL/分でロードされた。ロードした後、陽イオン交換カラムによる捕捉を容易にするために、カラムは10カラム体積CVの40mMのクエン酸ナトリウム、pH6.0、125mMの塩化ナトリウム、及び5mMのEDTAで洗浄し、続いて5カラム体積の20mMクエン酸ナトリウム、pH6.0で洗浄した。半抗体捕捉親和性は0.2mMの酢酸pH2-3の10カラム容量CVで溶出し、GEHealthcareからの1mLのHiTrapSP-HPの強陽イオン交換カラム上で直接捕捉した。カラムは25mMの2-N-モルホリノエタンスルホン酸MESpH5.8を含む10CVの緩衝液Aで洗浄した。半抗体を0-50の緩衝液B25mMのMES、pH5.8、1Mの塩化ナトリウムNaClの直線勾配で溶出した。20-40のB、及び280nmのUV吸光度と回収画分の非還元SDS-PAGE解析によって決められた溶出液のピークとの間に溶出されたタンパク質の両方が、ノブ又はホール抗体として別々にプールされた。両タンパク質は、一般的に主要な溶出ピークを示し、お互いに酸化された重鎖種と軽鎖種を含む全ての画分がプールに含まれていた。還元および非還元SDS-PAGEによる、精製ハーフ抗体の分析が図4Bに示される。結果は、発現され捕捉されたタンパク質の大半は、大きさが75kDであることを示している。我々は、図4cに示すように、ESI-TOF質量分析することによって、これを確認した。半抗体の質量は予測された質量であり、ヒンジ領域内の2つのシステイン残基を含む任意のシステインにはジスルフィド付加物がなかったことを示している。ヒンジシステインが還元され反応性の遊離チオールを示すかどうかを判断するため、タンパク質は、質量分析法による分析の1時間前に1mMのN-エチルマレイミドNEMと中性pHで反応させた。タンパク質の質量は変わらず、ヒンジシステインがお互いに酸化され、鎖内ジスルフィド、例えば、環状ジスルフィドのである可能性が高い。これらの二つの半抗体ノブとホールを使用して、完全にインタクトな二重特異性抗体を構築するため、最初に、ヒンジ領域における鎖内ジスルフィドを還元し、システイン遊離チオールを遊離させ、その後、それらが別の重鎖へと酸化され、150kDの二重特異性抗体を形成するようにする必要があった。インタクトな二重特異性分子を形成するため、2つの相補的な半抗体のアニーリング、還元及び再酸化を達成するために、以下の手順が開発された。独立に分離した後、精製したタンパク質は、手順のプール工程でに等しい質量で一緒に結合され図5Aに示す、プールのpHを、1Mトリス、pH7.5の10分の1の体積を追加することにより7.5に調整し、タンパク質を0.5mMのトリス[2-カルボキシエチル]ホスフィンTCEPにより室温で還元した。2時間還元した後、プールされたタンパク質は、5mLのZebaDesaltスピンカラムPierce社、Rockford、ILを用いて、25mMトリス、pH7.5、及び125mMのNaCl中にバッファー交換され、1mg/mLのタンパク質濃度の約4mLsの体積が得られる。タンパク質は、その後、25分間52°Cに混合物を加熱することによりアニールし、続いて約20°Cの室温まで冷却した。アニールされた抗体は、10kDの分子量カットオフスピンコンセントレータを使用して、約8mg/mLのタンパク質濃度で0.5mLの体積まで濃縮され、ジメチルスルホキシドに溶解された100mMのDHAAのストック溶液からの反応混合物への300マイクロモルのデヒドロアスコルビン酸DHAAの添加により酸化された。酸化のために添加されたDHAAの量は、タンパク質モル濃度の約10倍超過である。一晩室温で酸化した後、酸化された物質を、25mMのMES、pH6.0および300mMのNaClを含む緩衝液中でS-200ゲルろ過カラムGEヘルスケアからの22mLのS200Tricornに流した。インタクトな抗体をプールし、水で10倍に希釈した。BsAbタンパク質を、その後、カルボキシメチルCM樹脂1mLののHiTrapCM-FF、GEHealthcareを用いる弱陽イオン交換クロマトグラフィーにより、4.5から9.2へのpH勾配溶出で精製した。緩衝液AとBの組成物は、20mMクエン酸ナトリウム、30mMのMES、20mMのHEPES、20mMのイミダゾール、20mMのトリス、20mMのCAPS、及び25mMのNaClからなり、A緩衝液はHClでpH4.2に調整され、B緩衝液はNaOHを用いてpH9.2または10.4に調整される。CMクロマトグラフィー後に得られた精製された物質は、正確な分子組成を決定するために質量分析法で分析した図4D。質量スペクトル分析は、検出可能なインタクトな抗体生成物のみ分子量が146,051.89であることを示し、これは、理論分子量が145,051.75であるヘテロ二量体ノブ-ホール種の抗EGFR/抗c-metとほぼ同じように一致する。約2mgのノブ及び約2mgのホールで始まるこの手順の収率は、約0.5から1mgであった。インビボでの実験、例えば、非ヒト霊長類における薬物動態学的特性の決定などのための抗体の大量生産については、100mgからグラム規模の量の抗体が必要とされている。我々は、これらの量でインタクトな二重特異性抗体を産生するため、図5Aに示すように、各半抗体について別個の独立した培養を使用する手順を開発した。これらの調製物について、10リットルの発酵が、十分な量の抗体を持つ細胞ペレット又は全ブロスを生成するために必要とされたSimmonsetal2002JImmunolMethods263133147,及び米国特許第6979556号。実験の過程で、細胞ペレットまたは全ブロスのいずれかが、発現された抗体を含むバイオマスために使用された。いくつかのケースでは、抗体のかなりの割合が培地に漏れ出しており、ここでは全ブロスが高収率を与えた。細胞ペレットについては、材料を25mMのトリス、pH7.5、5mMのEDTA、125mMのNaClを含む抽出緩衝液に再懸濁し、マイクロフルイディクスMicrofluidicsNewton,MAからモデルHC80003Aのマイクロフルイダイザーを使用してマイクロ流動化することによって溶解した。全ブロスは、添加剤を添加することなく、直接マイクロ流動化された。どちらのケースでも、測定器を通す材料の3回の通過が行われた。この例では、サイトカインのインターロイキン-4ノブ及びインターロイキン-13ホールを標的とする二重特異性抗体の2つの型を500mg調製した。二重特異性体の第一の型では、ノブ変異とホール変異のみを有するヒトIgG1aFcを含んでおり、第二の型は、2箇所の変異、T307Q及びN434Aで更に改変されたFcを含んでおり、それは新生児Fc受容体FcRnに対する高い親和性を引き起こした。第二の型は、抗体の遅いクリアランスと長い半減期を付与することが期待される。ホール抗体IL-4を標的とノブ抗体IL-13を標的FCの両方の型前者について野生型Fc、後者についてFcRn改変体におけるを、両方とも10リットル発酵で個別に増殖させ、増殖培地及び細菌細胞をを含む全ブロスをホモジナイズし、独立して精製した。全ブロスのマイクロ流動化後、遠心分離による清澄のための抽出液を調製するため、抽出液を0.4ポリエチレンイミンPEIpH9.0の等量で処理した。混合物を室温で3時間又は4°Cで一晩撹拌した。PEIは、抽出物の大規模な沈殿を引き起こし、これは45分間15000×gでの遠心分離により清澄化した。上清はその後、100mLのMabSelectSUREプロテインA捕獲カラムにロードする前に、0.22ミクロンのフィルターでろ過した。抽出液を20ml/分でロードし、280でのUV吸光度が安定したベースライン、一般的に約10カラム容量CVに達するまで、40mMのクエン酸ナトリウム、pH6.0、100mMのNaClで洗浄した。洗浄緩衝液が20mMクエン酸ナトリウム、pHを6.0に変更され、およそ2CVで洗浄した。捕捉半抗体を0.2M酢酸を用いて溶出した。プロテインAによる分離後、不純物や凝集物を除去するために、抗体を、S-FF樹脂GEHealthcareを用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより、又はS200樹脂GEHealthcareを使用するゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。図5Bに示すように、精製された半抗体は主に75kDの種であった。第二の分離工程の後に、500mgの各半抗体を1mg/mLの濃度で一緒にプールし、pHを、1Mのトリス、pH7.5を用いて7.5に調整した。混合物をインキュベーター中で37°Cに加熱し、150kDの抗体種の出現についてゲルろ過によって監視した。2時間後、アニール処理が完了し、二量体150kDの種への完全な変換を示し、混合物を室温まで冷却した。タンパク質は、24°Cで2時間、2mMのDTTの添加により還元され、その後10kDのカットオフスピンフィルターを用いて20mg/mLに濃縮した。濃縮液は、25mMトリス、pH8.0をのみを含む緩衝液中で一晩透析することによって酸化した。酸化された物質は、その後、純度および凝集について分析した。インタクトな抗体の種は、インタクトな、完全に酸化されたヘテロ二量体重特異性分子であることが質量分析により決定されたが、ゲルろ過法、及びSDS-PAGE分析は、かなりの量の凝集体の存在を示し、そのうちのいくつかは、明らかにジスルフィド結合多量体の結果であったデータは示していない。インビボでの実験のために二重特異性抗体を更に精製するため、抗体を、トリス、pH7.5及び125mMのNaCl中でS-200ゲルろ過カラムで分離した。精製された材料は、導入された凝集体の除去のために、材料の30を超える損失を示した。調製の最終段階において、タンパク質を陽イオン交換カラムに接着させ、夾雑エンドトキシンを除去するため、50mM酢酸ナトリウム、pH5.0中の0.1TX114で洗浄し、そして50mMのトリス、pH8.0を含有する高pHの緩衝液で溶出した。溶出されたタンパク質は、その後、インビボでの実験に適する緩衝液に透析によって処方され、4°Cで保管された。野生型FcおよびFcRn変異体からなる最終的な材料は、SDS-PAGE、質量分析法、夾雑エンドトキシンレベルを決定するためのLALアッセイ、及びゲルろ過分析により分析された。SDS-PAGEの結果が図5cに示され、主要種は150kDのインタクトな二重特異性抗体であることを示している。図6Aは、サイトカインIL-4及びIL-13の中和を試験するTF-2細胞増殖アッセイにおける抗体の生物学的活性を示す。このアッセイのため、抗IL-4/IL-13二重特異性抗体、抗IL-4抗体及び抗IL-13抗体は、25μg/mlのの出発濃度で使用され、96ウェル培養プレートFalcon,カタログ番号353072中で、アッセイ培地rhGM-CSFのない培養培地中、又は0.4ng/mlのヒトIL-4RDSystems、カタログ番号204-ILプラス20ng/mLのヒトIL-13ジェネンテックを50ul/ウェルの最終体積で含むアッセイ培地中で、0.025pg/mlの最終濃度になるまで、連続的に10倍希釈された。希釈抗体は、37°Cで30分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、RPMI1640ジェネンテック社、10ウシ胎児血清Hyclone、カタログ番号SH300071.03、2mMのL-グルタミン、100単位/mLのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンGibco、カタログ番号10378、及び2ng/mLのrhGM-CSFRDSystems、カタログ番号215-GMで培養されたTF-1細胞は、アッセイ培地に再懸濁され、2×105細胞/mlの最終濃度を得た。50μlの細胞を、希釈抗体、アッセイ培地プラスIL-4サイトカイン及びIL-13サイトカイン最大増殖コントロール又はアッセイ培地のみバックグラウンドコントロールのいずれかを含有する各ウェルに添加した。全てのサンプルは重複して蒔かれた。プレートを37°Cで5のCO2で4日間インキュベートした。1uCi3HのチミジンPerkinElmer,カタログ番号NET027005MCがインキュベーションの最後の4時間の間、各ウェルに添加した。プレートはPackardFiltermateを使用してUnifilter-96GF/CPerkinElmer、カタログ番号6005174上に回収され、3Hチミジンの取込みをTopCountNXTPerkinElmerを使用して測定した。データは、カレイダグラフKaleidaGraphを使用してプロットした。結果は、野生型抗Il-4/抗IL-13二重特異性抗体は、IL-4及びIL-13の活性を中和することにおいて、IL-4及びIL-13のIgG抗体の組み合わせと同程度に有効であることを示す。2抗体野生型抗IL-4/抗IL-13及びFcRn変異体抗IL-4/抗IL-13を、カニクイザルでそれらの薬物動態PK特性について試験した。単回投与の注射を使用し、20mMのヒスチジン-酢酸、pH5.5、240mMスクロース、及び0.02Tween20中に、10.8mg/mL及び1mg/mLで処方された野生型分子、及び20mMリン酸ナトリウム、pH7.5、240mMスクロース、及び0.02のTween20中に、0.5mg/mLで処方されたFcRn変異体が、静脈注射によって投与された。投与量は2つの野生型濃度について20mg/kgと2mg/kgで、FcRn変異体については20mg/kgであった。3つの処方を注射された2匹のメスサル及び2匹のオスサルからの血清サンプルを、42日間かけて定期的に採取した。血清サンプルを、ELISAによってインタクトな二重特異性抗体についてアッセイし、ここで、IL4又はIL3の何れか一抗原をプレート上にコーティングし、その抗体は、その後血清から捕獲された。存在する二重特異性抗体の捕獲された量は、IL13又はIL14の何れかである第二のビオチン化リガンド何れのリガンドもプレート上にコーティングされてない、及び酵素結合ストレプトアビジンによる検出で決定された。図6bの結果は、3つのサンプルの予想される2つのコンパートメントクリアランスを示す。抗体の2つの異なる型のPK特性を、CHO産生宿主に由来し、Fc-グリコシル化を含む2つの他の抗体アバスチンとハーセプチンと比較して、表2に示す。大腸菌が産生する二重特異性抗体は、標準的なプロセスからのCHO由来の抗体に類似しており、及びFcRn変異体が長い半減期を有することが明らかである。方法2-別々のすなわち独立した培養におけるノブ半抗体及びホール半抗体の産生、半抗体の精製に先立つ全ブロスの混合、及びインタクトなBsAbを形成するための還元剤の添加無しでの溶解。この方法は、ノブ半抗体及びホール半抗体を同時に精製することにより、プロセスの工程数を減らすための試みであった。従って、発酵ブロスは、ペレット化及び抽出バッファーへの再懸濁の前に、混合される。各宿主細胞は、ヒンジ領域内に環状ジスルフィドを含む発現された半抗体を、細胞膜破壊によって抽出緩衝液中に放出すると考えられていた。その後、両方の半抗体の精製を同時に行うことができ、酸化還元アニーリング工程が続き、インタクトなBsAbを形成する驚くべきことに、我々は、ノブ-ホール抗体がヘテロ二量体化し自ら酸化し、インタクト及び半抗体~75kDの組み合わされた合計の20以上で、全長抗体~150kDを形成することを発見した表3を参照。ハーフ抗体及びホール半抗体を発現する宿主細胞を増殖させ、上記の方法1で説明したプロセスを使用し、別々の培養で誘導された。各培養物からの全細胞発酵ブロスは、3つの異なる体積比で他と混合され、次いで遠心分離し、単一細胞ペレットを形成した。比較的等しい存在比での2つの抗体の回収を一致させる意図で、及び抗EGFR半抗体は同じ条件下でcMet抗体に類似して発現されることを知って、全細胞発酵ブロスは、抗c-MET:抗EGFRの比が1:1、2:1又は1:2で、500mLの最終体積に一緒に混合した。各細胞ペレットを抽出緩衝液に再懸濁し、溶解した。タンパク質は、実施例2の方法1に記載のように、ロテインAクロマトグラフィー、続いて陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。抽出緩衝液は、25mMトリス、pH7.5、125mMのNaCl及び5mMのEDTAを含んでいた。別々に精製された時、ノブーハーフ抗体とホール-ハーフ抗体の各々は、そのヒンジ領域内に環状ジスルフィド、すなわち、鎖内ジスルフィドを形成し、ノブ重鎖及びホール重鎖の共有結合を防いでいる。しかし、第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞は、共培養した後、または遠心分離前に全発酵ブロスを混合した後の何れかで一緒に溶解され、インタクトな抗体種への若干量の会合体が存在することが分かった。図7は、3つの比率で観察されたインタクトな抗体種を示す。これは、本手順への変更は、追加の化学工程の必要性を実質的に排除することができるインタクトな二重特異性抗体の自発的形成につながる可能性を示唆した。2つのタンパク質種の定量は、Novex4-20トリスグリシンゲルInvitrogen,CarlsbadCAを使用して、5マイクログラムのタンパク質をSDS-PAGEにより分離することにより行った。電気泳動後、ゲルを、150mMの硫酸アンモニウム、1.74M酢酸、10メタノール及び水に0.4グラム/Lのクマシー色素R250を含むコロイド状クーマシー染色で染色した。ゲルは10酢酸を含む水で脱色し、Gel-DryDryingSolutionInvitrogenで平衡化し、2枚のセロファンシートの間で乾燥させた。ゲルを乾燥させた後、タンパク質のバンドは700nmにおけるオデッセイIRイメージングシステムLI-CORBiosciences,Lincoln,NEで定量した。方法3-独立して培養し、独立して遠心分離し、ペレットを混合され再懸濁され、続いて溶解し、そして還元剤の添加無しでBsAbの精製によるノブ半抗体及びホール半抗体の産生この方法は、ノブ及びホールを同時に精製することにより、プロセスの工程数を減らすための試みである。細胞を独立して培養し、遠心分離によってペレット化する。ペレットを混合し、抽出緩衝液中に一緒に再懸濁する。細胞膜の破壊によって、半抗体は抽出緩衝液中に放出され、そして、類似した産物のプロファイルが上記の方法2と同じように見られるであろうと考えられている。実施例3:単一混合細胞培養を用いたヘテロ多量体タンパク質の生産この例では、2つの宿主細胞の集団を含む培養物からのヘテロ多量体タンパク質の形成を示し、ここで該プロセスにおいて還元は添加しない。方法4-還元剤を添加せずにインタクトなBsAbを形成するための、同じ培養中の異なる細胞集団からのノブ半抗体及びホール半抗体の産生。最初に、ノブ又はホール半抗体の何れかを含む二つの異なる大腸菌形質転換体を含む、0.5リットル振とうフラスコ中で共培養実験が行われた。この実験では、ノブ抗EGFR半抗体とホール抗CMET半抗体の両方のスターター培養液は、30°Cで5mLの培養液中で、LB-メディア100μg/mlのカルベニシリンで一晩培養することにより生産された。OD600に等しい一晩の培養液が、500mlの完全CRAP培地100μg/mlのカルベニシリンを3つの異なる比率抗EGFR:抗CMET;1.5:1、1:1及び1:1.5で、全播種量を培養液の1/100に保って播種するために使用された。細胞を30°C、200rpmで24時間増殖させた。次いで細胞を遠心分離6750×g、10分間、4°Cによってペレット化し、精製に使用した。細胞を、25mMトリス、pH7.5、5mMのEDTA、及び125mMのNaClを、10グラムの細胞ペレットあたり100mlの割合で含む抽出緩衝液に再懸濁した。実施例2に記載のように、マイクロ流動化による抽出及びクロマトグラフィー用に調製した後で、3つの異なる比率の細胞抽出物は、最初に、MabSelectSURE1mLのHiTrapカラムGEHealthcare,S.SanFrancisco,CA上に二重特異性抗体を捕獲し、pH6でわずか40mMクエン酸ナトリウムを含有するカラムの洗浄用緩衝液を用いて精製した。実施例2に記載のように、洗浄および溶出した後、プロテインAの捕獲プールは、SP-HP陽イオン交換カラムにロードし、実施例2に記載のように精製した。陽イオン交換により分離した後、3精製の各々からのクロマトグラムのピークをプールし、約15mg/mLのタンパク質濃度を持つ約50-100マイクロリットルの体積まで濃縮した。初回播種率は、インタクトな抗体の最終量に違いが生じるように見え、これは、細胞ペレットを37°Cで一晩培養した後に一緒に混合した場合に観察されるより、低分子量型に対するインタクトな二重特異性抗体の高い比率であった。表4を参照。共培養を、10リットルの発酵規模に拡張することができるかどうかを判断するため、このことはスケールアップの手順において重要であるが、いくつかの実験が、抗EGFR半抗体及び抗CMET半抗体を用いて行われた。10リットル発酵については、播種開始培養物は、抗EGFRと抗cMetの1:1の細胞比を含むものを使用した。10リットルの共培養液は実施例2に記載の単一半抗体培養用として同一条件下で増殖させた。細胞ペレット又は全ブロスのどちらかを、上述したように、抗体物質の抽出と単離のために使用した。細胞ペレットからの物質の抽出において、約2.5キロのペレットが、1つの10リットル発酵から生成された。細胞ペレットを、25mMトリス、pH7.5、125mMのNaClを含む緩衝液の5リットルに再懸濁した。ペレットはペレットを再懸濁する前に、ポリトロンミキサーで2分間処理した後、マイクロ流動化し、清澄化し、実施例2に記載のようにプロテインAの捕獲物を調製した。発酵実験は2回以上繰り返され、10リットル発酵槽からの共培養の分離の結果を図8Cに示す。質量分析法が、分子成分を決定するために、約150kDのタンパク質と約75kDのタンパク質を特徴付けるために使用された。私たちが驚いたことに、差発現プロファイルに起因して、優位な上位の分子量のタンパク質は、二重特異性抗体であり、約75kDのタンパク質は主にcMet半抗体であった。これは、二重特異性抗体は、追加の化学工程を必要とせずに完全に形成されたことを示している。二重特異性抗体は、ノブ半抗体とホール半抗体の1:1の化学量論の組み合わせであるため、わずか75kDのタンパク質の存在は、限定的半抗体の大半は自発的にインタクトな二重特異性抗体に組み込まれていたことを示している。図8Dに示すように、この観察は、簡略化した発現及び精製スキームの開発につながった。プロテインA捕獲後に、抗体を、1.5M硫酸アンモニウム及び25mMリン酸ナトリウム、pH6.5を含む緩衝液で1:1に希釈しまし、疎水性相互作用カラムHICDionexProPacHIC-104.6mmx100mmSunnyvale,CAにロードした。30-60のBの勾配は、25mMリン酸ナトリウム、pH6.95、および1.5M硫酸アンモニウムからなるA緩衝液、及び25mMリン酸ナトリウム、pH6.95、25イソプロピルアルコールからなりB緩衝液による。タンパク質は15CVの勾配で分離した。タンパク質は、2つの主要な種へと分離し、その一つは二重特異性抗体を含み、他方は過剰な抗EGFR半抗体を含む、クロマトグラフ分離の結果を図8Eに示す。インタクトな抗体を含む画分をプールして、残りの汚染されたエンドトキシンを除去するため、pH5.0で25mMの酢酸ナトリウム緩衝液中のS-FFカラムへ付着させ、0.1のトリトンXを含有する同じ酢酸緩衝液で洗浄し、その後始めの酢酸緩衝液で洗浄して界面活性剤を除去することによって、処理した。タンパク質は、25mMトリス、pH8.0を用いてS-FFカラムから溶出し、プールし、SDS-PAGE、質量分析及びエンドトキシンについてのLALアッセイにより分析した。タンパク質は、最終調製物中に0.076EU/mgのエンドトキシンを含有しており、インビボでの適用に適していることを示している。最後の特性評価を、図8fに示す。SDS-PAGE分析は、タンパク質の大部分が最終的なインタクトな二重特異性抗体であることをを示しており、質量スペクトル分析は、二重特異性抗体の予想分子量、および任意の汚染種の欠如、特に存在する可能性があるホモ二量体型の欠如を示している。アニーリングと酸化還元化学を必要とする手順に比べた、共培養を使用する改変された手順の比較が図8Gに示されている。方法5-異なるノブ:ホールの比率を使用してインタクトなBsAbを形成するための、同じ培養中におけるノブ半抗体及びハーフ半抗体の産生。この例では、類似した発現コンストラクト発現される半抗体においてのみ異なるを使用する宿主細胞が互いに成長せず、そしてインタクトなBsAbを生成しないことを示している。実験では、いずれかの鎖の比を制御することは、増殖及び発現の前に播種率を調整することによって容易に行われることを明らかにした。2つの菌株はお互いを越えて成長しない。播種の割合が、共培養の発酵を通して保持されているかどうかを確認するため、異なる細胞比率を持つ共培養液の24時間発行の終了時に存在していたノブ又はホールの重鎖の量を測定するため、一つの実験が実施された。ノブ抗EGFRプラスミド又はホール抗c-Metプラスミドの何れかを保持する細胞を、30°Cで一晩LB培地100μg/mlのカルベニシリンで別々に増殖させた。開始培養液が、異なる比率の一晩培養液により、組み合わされた播種体積をその最終培養液の1:100で保ちつつ、完全CRAP培地100μg/mlのカルベニシリンを播種するために使用された。抗EGFR:抗cMetについて試験された比率は、10:1,5:1,2:1,1:1,1:2,1:5,及び1:10であった。24時間30°Cで培養した後、細胞のサンプルが得られ、非還元SDS-PAGE12TrisGlycineによって分析され、その後、ヤギ抗ヒトIgG-Fc抗体HRPコンジュゲートBethylLaboratories,Inc.,Montgomery,TXによるウェスタンブロッティングが続いた。2種の重鎖は、SDS-PAGEで分離し、その結果を図8Bに示す。各半抗体の量は、共培養の播種比率と相関し、異なる半抗体をコードするプラスミドを保持する細胞は共培養でお互いを越えて成長ししないことを示している。方法6-インタクトなBsAbを形成するための、同じ培養中におけるノブ半抗体及びハーフ半抗体の産生-膜透過処理。この例では、膜透過が培地に半抗体を放出し、更なる化学反応例えば、酸化還元、またはカップリングを必要とせずに、インタクトなBsAbをその後形成することを示している。リポタンパク質合成の損失につながる変異は大腸菌の細胞膜を変化させ、ペリプラズム蛋白質の培地中への漏出を付与し、またEDTAに対して大腸菌を過敏性にすることが知られている。EDTAの添加のある場合ない場合における、菌株65G4W3110ΔfhuAΔphoAilvGΔprcspr43H1ΔdegPΔmanAlacIqΔompTΔlppからの発現抗体の放出が比較された。IL-4ホール又はIL-13ノブのどちらかを発現する細胞が方法4記載のように1:1の比率で共培養され、インキュベーター振とう機中で、30°Cで20時間、200rpmで増殖させた。インキュベーションの終了時に、培養液を、次の3つの等しいアリコートに分割した。一つのサンプルをEDTAの添加無しのコントロールとして使用した。他の2つのサンプルには、EDTA、pH8.0を、10mMの最終濃度まで添加した。インキュベーションを全てのサンプルについて30分間続け、その後、EDTAで処理したサンプルの一つにMgCl2を、20mMの最終濃度まで添加した。全てのサンプルはインキュベーター振とう機でさらに30分間インキュベートし、遠心分離9200×g、20分間、4°Cにより細胞を除去し、そしてGF/FフィルターWhatman、Piscataway、NJと0.2μmのPESフィルターNalgene、Rochester、NYを介して上清をろ過した。DNaseI、ウシ膵臓Sigma,St.Louis,MOが、ろ過を改善するために4mg/lまで追加することができる。前述したように、ろ過した上清はその後直接1mLのプロテインA、MabSelectSUREたHiTrapカラムGEHealthcare上にロードされた。捕獲されたタンパク質は上述のように酢酸で溶出され、タンパク質のピークの回復が図9Aに見られる。結果は、EDTAで処置されたサンプルの総UV吸光度が増加したことを示している。この吸光度はインタクトな二重特異性抗体と過剰な半抗体である。図9B及び9Cを参照。別の実験では、抗IL-4半抗体及び抗IL-13は半抗体は、別々に、あるいは65G4細胞の1:1の共培養として発現させた。細胞を、完全CRAP培地をSiliconeAntifoamFluka,Buchs,Switzerlandにより0.02v/vまで補充することを除き、上記のように方法4培養した。細胞を、インキュベーター振とう機で24時間、30°Cで、200rpmで培養後、pH8.0のEDTAを、10mMの最終濃度まで添加し、インキュベーションを1時間続け、MgCl2を20mMまで添加した。細胞を遠心分離6750×g、10分間、4°Cにより回収し、上清をろ過し0.2μPES,Nalgene,Rochester,NY、及び抗体は、上述のプロテインAによって捕獲され、SDS-PAGEおよび質量分析法により分析した。図9Dに示す結果は、インタクトな二重特異性抗体の形成は、二重特異性の両方の半分の存在下においてのみ観察されていることを示している。更に、75kDのタンパク質バンドは主に抗IL-4半抗体であったことを質量スペクトル分析が示した場合、抗IL-13抗体の大部分は、更なる酸化還元化学処理無しに、二重特異性抗体に組み込まれている。プロテインAで精製した二重特異性抗体は、硫酸アンモニウム緩衝液で1:1に希釈し、更に、実施例3に記載したのと同じ手順を用いて、7.5mmX150mmProPacHIC-10カラムDionex,Sunnyvale,CAにより精製した。インタクトな二重特異性抗体は、99.68の保持時間で溶出することが分かった。このピークをプールし、非還元条件下でSDS-PAGEにより分析し、ほぼ完全にインタクトな抗体種から成ることが判明した。このタンパク質が純粋なヘテロ二重特異性分子であったことを確認するために、我々は、ESI-TOFLC/MSによりタンパク質を分析した。二重特異性抗体の約10マイクログラムを、PLRP-S300A3マイクロメーター50x2.1mmの逆相カラムPolymerLaboratoriesに注入し、Agilent1200SeriesHPLCを使用して0.05TFA及びアセトニトリル、34-45の4.3分間の勾配により、及び0.5μL/分の流量及び80°Cのカラム加熱により分離した。LCから溶出するタンパク質はAgilent6210TOFにより解析された。タンパク質を含有する単一のピークが観察され、アジレントマスハンターソフトウェアAgilentMassHunterバージョンB.02.00、50,000-160,000の質量範囲、1.0Daのステップ、30.0S/Nのしきい値、平均質量が90、無制限の質量範囲、及び自動に設定された同位体の幅を用いて、このピークがデコンボリューションされた。シグナルの大半は二重特異性分子の予想質量を表している。アミノ酸配列から計算されるインタクトなヘテロ二重特異性抗体の質量は144044であり、これは、測定された質量の1ー2ダルトンの範囲内であるが、ホモ二量体タンパク質の可能性のある計算質量は、抗IL-4について144,954.6、抗IL-13について145,133.4であった。異なる播種率が、この組の抗体の培養を通じて、また65G4のlpp欠失に関連して再び存続するかを試験した。OD600に等しい、抗IL-4ホール又は抗IL-13ノブの何れかによるシード培養液が、500mlのCRAP培地を2:1及び1:2の比率で播種するために用いられ、培養し、以前に記載のように、発酵の最後に透過処理された方法6を参照。2つの異なる培地の調製物がプロテインA捕獲により精製され、続いて、HICのA及びB緩衝液のpHを6.5に下げたことを除いて、上記のようにHIC分離された。二つの異なる出発培養物の比率の結果を図9Eに示す。タンパク質の大部分がインタクトな二重特異性抗体であることが観察される。他のピークは、質量分析法によって特徴付けされ、図9Eにおいて標識された。抗IL-13抗体が半若干検出され、かなりの量の多くの抗IL-4が見られる。抗IL-13に対する抗IL-4が33/66の割合で、より多くの抗IL-13がわずかな量の抗IL-4の残りとともに観察される。ここでは、播種の割合は培養を通して維持されること、及びプロセスの最適化が、開始時の培養比を操作することを通じて、発現された抗体の半分の比率のバランスをとることにより達成できることがわかった。我々は多くの異なった抗体変異体において、デルタLPP細胞における共培養発現のこのプロセスを試験し続けてきた。図9Fに、いくつかの例示的な半抗体のHIC後のクロマトグラフィー処方後の最終的な精製タンパク質を示す。実施例4:ヘテロ多量体タンパク質ライブラリーこの例では、ヘテロ多量体タンパク質ライブラリーの構成を示している。二重特異性抗体の混合物をスクリーニングするために使用することができる特定の方法、または本方法を使用して、二重特異性抗体の大規模なアレイを迅速に生成するために使用され得る特定の方法が説明される。方法7いくつかのケースでは二重特異性抗体の選択は知られていないが、多くの異なる半抗体の組み合わせの結果であるかもしれない。あるいは、特定の標的の組み合わせ、例えば、抗IL-4/抗IL-13が望まれるが、中から選択される数多くの候補の半抗体が存在する。最良の結合又は効果をもたらす特定の半抗体の組み合わせを見つけることは、マトリックス形式で半抗体を組み合わせることによって達成することができ、多くの二重特異性抗体変異体を迅速に生成することができる。この実験では、抗CD3などの抗体は、スクリーニングのために必要な抗体の量の約10倍またはそれ以上過剰で産生することができる。この分子は、その後アニールし、例1に記載された手順を用いて酸化することができる。第一の抗体の総量の約10分の1は、図10に図解したように、異なる抗原例えば、抗CD19、抗CD20、等を標的とする約10の半抗体の等しい量と組合わせるために使用できる。更なる一次半抗体が、第二の半抗体レパートリーと組み合わせるために必要とされる場合に、これは、一組のスクリーニング分子を生成するために行うことができる。方法の第2の改変では、一次抗体例えば、抗CD3は通常の大腸菌宿主細胞を用いた共培養として、又は非機能的リポ蛋白質の表現型を有する変異株により増殖させることができる。この半抗体を系統的に可変半抗体の各々に追加することができ、全てが一次標的半抗体を含む二重特異性分子配列を生成する。方法8一次半抗体は、半抗体が結合した他の抗体のすべてを結合するのに十分な量で、この半抗体を産生することからなる方法で半抗体と提携する代替の宿主と組み合わせることができる。バルクアニーリングは、一次半抗体が重鎖のノブ型またはホール型のいずれかであって、二次標的半抗体の組が相補的変異体であるように、単一の反応で実行できる。ここでは、抗体の複合体混合物を、組合わせとして疾患を治療することに有用であり得るように産生することができる。また、上記実施例に記載の方法を用いる共培養アプローチは、一次半抗体と可変二次半抗体による二重特異性抗体の複合体混合物を産生するために使用することができる。このような混合物は、二重特異性変異体のプール内の陽性結果を、活性な二重特異性抗体種を決定するために、後にデコンボリューションすることができるように、又は組み合わせた混合物を、より効果的な治療用混合物として使用することができるように、その後大量に単離され、スクリーニング物質として使用することができる。実施例5:インビトロでの活性この例では本明細書に記載の二重特異性抗体はインビトロ系での活性を有する。二つの細胞株はが、この実施例5および以下の実施例6で用いられた。これらの実験では、KP4、膵管癌細胞株、及びA431、表皮癌細胞株は、それぞれ強くMetまたはEGFRによって駆動され、従って、これらは、各標的に対して独立してbsAbの有効性を探るために良好な細胞株及び腫瘍異種移植片である。KP4細胞株は理化学研究所バイオリソースセンター細胞バンクから入手した細胞株:RCB1005;3-1-1Koyadai,Tuskuba-shi,Ibaraki305-0074Japan。A431細胞株CRL-1555は、アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC,Manassas,VA、から入手した。癌細胞、A431をPBSで1回洗浄し、無血清培地に再懸濁し、カウントし、その後96ウェルプレート2500細胞/ウェルに添加された。次いで、細胞をヒトHGF0.5nMおよびTGFα0.05nm単独で、又は、1抗EGFR、2抗c-Met抗体ワンアームドc-Met、3抗EGFRと抗c-Met抗体の組合わせ、又は4二重特異性抗EGFR/抗c-met抗体の何れかの用量範囲で処置した。三日間のAlamarBlueTMアッセイが、製造業者の推奨に従って行われたBioSourceInternational;Camarillo,CA。IC50値は4パラメータモデルによる非線形回帰分析により決定したKaleidaGraphver.3.6,SynergySoftware;Reading,PA。インビトロ及びインビボでMet依存性であるKP4細胞アッセイにおいて、TGF-αおよびHGFを用いた処置によって刺激された増殖は、抗c-Met抗体、抗c-Met抗体と抗EGFRの組合わせ、及び二重特異性抗体によって阻害することができる。抗EGFRによる処置は、これらの細胞において単剤のような限定的な活性を示す。しかし、単独の抗c-met又は別々に添加された抗c-Metプラス抗EGFRAbsよりも、KP4細胞においては二重特異性抗体により、より強力な阻害があった。A431細胞において、それはEGFRによって主に駆動されるが、抗EGFR抗体又は抗c-Met抗体単独の何れも、細胞増殖を有意に阻害することができなかった。両分子の組み合わせは細胞増殖の若干の阻害を示したが、しかし、二重特異性抗体は、同じ濃度で高い活性を示した。また、細胞は、抗増殖に加えて、アポトーシスを示した。これらのアッセイでは、二重特異性抗体は、他の抗体単独または別個に添加される抗-Met抗体と抗EGFR抗体組合わせと比較し、改善された性能を示した。これらのデータは、二重特異性抗体を優れたものにするのは、一つの抗体における抗Met抗体と抗EGFR抗体の配置であることを示唆している。結果を図11に示す。実施例6:インビボでの活性この例では、本明細書に記載の二重特異性抗体はインビボモデルでの活性を有することを示す。6-8週齢で体重22-30グラムの雌ヌードマウスはCharlesRiverLaboratories,Inc.Hollister,CAから得られた。マウスは、標準的なげっ歯類マイクロアイソレーターケージ内でジェネンテックで飼育し、腫瘍細胞移植の前に少なくとも3日間、条件を研究するために順応させた。健康的に見え、明らかに異常の無い動物のみを研究に使用した。すべての実験手順は、アメリカ生理学会の指針に準拠し、ジェネンテックの施設内動物のケアと使用委員会によって承認された。マウスは、ヒトKP4膵臓癌細胞マウスあたりHank’sBalancedSaltSolutionHBSSプラスマトリゲルBDBiosciences中に500万個の細胞またはヒトA431表皮癌細胞HBSSプラスマトリゲル/マウスに5万個の細胞のいずれかを皮下注射した。腫瘍が約150立方ミリメートルに達したときに、マウスが無作為化され、ビヒクルまたは二重特異性EGFR/c-MetbsEGFR/c-Metの50mg/kg、IP、1x/週で2週間処置した。腫瘍体積はUltraCal-IVキャリパーモデル54-10-111;FredV.FowlerCo.;Newton,MAを使用して2つの寸法長さと幅で測定し、エクセルのバージョン11.2MicrosoftCorporation;RedmondWAを用いて解析した。腫瘍抑制グラフは、カレイダグラフバージョン3.6SynergySoftware;Reading,PAを使用してプロットした。腫瘍体積は、次の式で算出した:腫瘍サイズmm3=長い測定×短い測定2×0.5データは以下に記述される混合モデリング手法により解析した。ここでは、厳密な平均値及び標準偏差は算出されない。ばらつきを考慮するために標準偏差を提供するのではなく、信頼区間が使用される。これらは、表において、AUC/日TGIの横に括弧内に上限値と下限値として報告されている。動物の体重はAdventuraProAV812スケールOhausCorporation;PineBrook,NJを用いて測定した。グラフはカレイダグラフバージョン3.6を使用して生成された重量変化の割合は、次の式で算出した:グループパーセントの体重変化=新しい重量-初期重量/初期重量×100時間をかけて同じ動物からの腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデリングアプローチを用いたRパッケージバージョン3189。このアプローチは、反復測定と研究終了前の動物の任意の無処置関連死による適度な脱落率の両方を扱う。キュービック回帰スプラインが、各投与量についてlog2腫瘍体積の経時変化に非線形プロファイルを適合するために使用された。これらの非線形プロファイルは、次いで混合モデルの中で用量に関連するものであった。ビヒクルの割合TGIとしての腫瘍増殖阻害は、以下の式を用いて、ビヒクルとの関係で一日あたり各用量群に対する近似曲線下面積AUCの割合として算出した:TGI=100x1-AUC用量/AUCビヒクルTGIについて不確か間隔UIを決定するために、近似曲線と近似共分散行列が、TGIの分布に対する近似値としてランダムサンプルを生成するために使用された。ランダムサンプルはフィット混合モデルの1000のシミュレートされた実現化で構成され、ここでTGIは各実現化に対して再計算されている。報告されたUIは、時間の95に対して、TGIの再計算された値が、与えられた近似モデルのこの領域に落ちるだろうする値であった。シミュレートされた分布の2.5パーセンタイル及び97.5パーセンタイルが、上下のUIとして使用された。作図が行われ、R、バージョン2.8.1RDevelopmentCoreTeam2008;RFoundationforStatisticalComputing;Vienna,Austria及びエクセル、バージョン12.0.1MicrosoftCorporationを使用して生成されたデータはR、バージョン2.8.1を使用して分析し、および混合モデルはnlmeパッケージ、バージョン3.1Pinheiroetal.,2008を使用してRに収まるようにした。図12と13は、それぞれ、KP4膵移植モデル及びA431表皮癌異種移植モデルにおける抗EGFR/c-met二重特異性抗体のインビボ活性を示す。二重特異性抗体は、処置としてビヒクルのみ受け取ったコントロール動物と比較して、両方のモデルに対して、インビボで腫瘍の増殖を阻害することができた。グラフは、KP4異種移植において処置後20日での線形混合効果LME適合腫瘍体積が、ビヒクルだけのアームにおいての1710mm3と比較して505mm3であり、及びビヒクルだけのコントロールにおいての495mm3と比較して、A431異種移植において20日後で328mm3であり、腫瘍体積が二重特異性抗体の投与により減少したことを示している。全体として、TGIとして表現されたAUC/日に有意な変化があった。KP4異種移植片における二重特異性抗体治療において、85パーセントの腫瘍成長阻害TGIがあり、A431異種移植モデルでは68TGIがあった。実施例7:CHO細胞培養を用いたヘテロ多量体タンパク質の生産この例では、2つの宿主CHO細胞集団を含む培養液からのヘテロ多量体タンパク質の形成を示す。ノブ変異又はホール変異のいずれかを含有する半抗体は、当該技術分野において周知であるコンストラクト及び技術を用いて、重鎖及び軽鎖を一時的に発現させることによって、別々の培養で生成された。例えば、YeetalBiotechnolBioeng2009Jun1510354251を参照。細胞は、1リットルの培地で培養し2295322963を参照、14日後に回収した。各抗体は、5mLのMabSURESELECTカラムに捕獲された。次いで、カラムを平衡化緩衝液の10カラム容量CVで洗浄し、続いて10CVのクエン酸ナトリウム低導電率緩衝液平衡化緩衝液は50mMトリスpH8.0、150mMのNaCl、0.05トリトンX-100、0.05トリトンX-114から成り;低導電率洗浄緩衝液は25mMのクエン酸ナトリウムのpHは6.0から成るで洗浄した。各アームは、0.15M酢酸ナトリウム、pH2.7で溶出した。各半抗体を、一晩室温で、50mMトリス、pH8.0、150mMのNaCl、1~300の比率での1mMのEDTAに透析した。各アームは、その後、遠心分離し、0.22ミクロンの酢酸セルロースフィルターを用いてろ過し、2本のアームは、1対1の割合で混合した総濃度は2mg/mL未満であった。次いで、この混合物を、2つの方法のいずれか一で以下のように処理した:酸化還元ウォーターバスあり:次いで、混合物を37°Cの水浴中で加熱した。1時間後、酸化還元混合物を水浴から取り出し、室温まで放冷した。混合物が室温に達したら、新たに調製された還元剤、ジチオスレイトールDTTが添加され、2mMのDTTの最終濃度を達成した。混合物を、2時間室温で放置し、次にアミコンUltracell遠心フィルター10Kを使用して、11mg/mlに濃縮し、そして50mMトリス、pH8.0、150mLのNaCl1:300に一晩透析した。酸化還元ウォーターバス無し:混合物を3時間室温で放置し、その後、新たに調製された還元剤、ジチオスレイトールDTTが添加され、2mMのDTTの最終濃度を達成した。混合物を、2時間室温で放置し、アミコンUltracell遠心フィルター10Kを使用して、11mg/mlに濃縮し、そして50mMトリス、pH8.0、150mLのNaCl1:300に一晩透析した。酸化還元の後、構築された物質は、前節と同様の20CVの勾配を用いて15mLのHICProPac10カラムで精製した。ランニング緩衝液は、25mMのリン酸カリウム、0.7M硫酸アンモニウム液pH6.5、及び溶出バッファーは25mMのリン酸カリウムpH6.5、25イソプロパノールであった。1mLの画分を集め、ピーク画分を、純度を分析するための4-20トリス-グリシンSDSPAGEにより分離し、それに応じて、プールした。プールは、アミコンUltracell遠心フィルター10Kを使用して約1.5mg/mlに濃縮され、50mMトリス、pH8.0、150mMのNaClに透析し、0.22μmでフィルタリングした。各々の構築された二重特異性の同一性は質量分析法によって確認された。純度は4~20のトリス-グリシンSDS-PAGEゲル及びバイオアナライザーで分析した。凝集体の量は、SEC-MALSにより測定した。結果を図14-19に示す。この例では、二重特異性抗体がCHO宿主細胞を用いて生成され得ることを実証している。当業者であれば、本方法は他のヘテロ多量体タンパク質を生成するために使用することができることを認識するであろう。"