"フィブロネクチンIII型第10ドメイン10Fn3を含むポリペプチドであって、該10Fn3は、ヒト10Fn3ドメインの対応するループの配列と比較して、改変されたアミノ酸配列を有するループBC、DEおよびFGから選択される少なくとも1つのループを有し、該ポリペプチドは500nM未満のKDでIL-23に結合する、ポリペプチド。フィブロネクチンIII型第10ドメイン10Fn3を含むポリペプチドであって、該10Fn3は、ヒト10Fn3ドメインの対応するループの配列と比較して、改変されたアミノ酸配列を有するループBC、DEおよびFGから選択される少なくとも1つのループを有し、該ポリペプチドはIL-23のp19サブユニットの構造的エピトープに結合する、ポリペプチド。BCループが配列番号:2-11から選択される、請求項1または2に記載のポリペプチド。DEループが配列番号:12-22から選択される、請求項1または2に記載のポリペプチド。FGループが配列番号:23-25から選択される、請求項1または2に記載のポリペプチド。BC、DEまたはFGループアミノ酸配列が、配列番号:2-25のいずれか1つと少なくとも80同一である、請求項1または2に記載のポリペプチド。ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号:27-39のいずれか1つと少なくとも80同一である、請求項1または2に記載のポリペプチド。ポリエチレングリコール、シアル酸、Fc、Fcフラグメント、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質および血清免疫グロブリン結合タンパク質からなる群から選択される1つ以上の薬物動態PK部分をさらに含む、請求項1または2に記載のポリペプチド。PK部分がポリエチレングリコールである、請求項8に記載のポリペプチド。組成物が本質的にエンドトキシンを含まない、請求項1-9のいずれか1つに記載のポリペプチドを含む薬学的に許容される組成物。Th17細胞と内因性IL-23の反応を妨げるために有効な量において請求項1-9のいずれか1つに記載のポリペプチドをIL-23と接触させることを含む、Th17細胞の病原性を調節するための方法。Aストランド前のN-末端領域が標的分子に結合する、フィブロネクチンIII型第10ドメイン10Fn3を含むポリペプチド。N-末端領域がPro5、Arg6およびAsp7を含む、請求項12に記載のポリペプチド。Tyr26、Tyr28、Asp82およびTyr85をさらに含む、請求項12に記載のポリペプチド。発明の詳細な説明定義ポリペプチドによって、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、2つまたはそれ以上のアミノ酸の任意の配列が意味される。ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、本明細書において互換的に使用される。ポリペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸、例えば、出典明示により本明細書に包含させる米国特許第6,559,126号に記載されているものを含むことができる。ポリペプチドはまた、種々の標準化学法のいずれかで修飾することができる例えば、アミノ酸は保護基で修飾することができる;カルボキシ末端アミノ酸は末端アミド基にさせることができる;アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強するための基で修飾することができる;またはポリペプチドは、化学的にグリコシル化、あるいは、安定性もしくはインビボ半減期を増大するように修飾することができる。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの別の構造、例えば、環状化合物または他の分子の結合を含むことができ、また、1つ以上のアミノ酸を変化した立体配置すなわち、RもしくはS;または、LもしくはDで含むポリペプチドを含むことができる。本発明のペプチドは、IL-23に特異的に結合するように修飾されている第10フィブロネクチンIII型ドメインに由来するタンパク質であり、本明細書においてアドネクチンまたは抗IL-23アドネクチンと称される。用語PKは、薬物動態の頭字語であり、一例として、対象による吸収、分布、代謝および排出を含む化合物の特性を含む。PK調節タンパク質またはPK部分は、生物学的に活性な分子と融合されるか、一緒に投与されるとき、生物学的に活性な分子の薬物動態特性に影響する任意のタンパク質、ペプチドまたは部分を示す。PK調節タンパク質またはPK部分の例は、PEG、ヒト血清アルブミンHSAバインダー米国公開第2005/0287153および2007/0003549号に記載されているような、ヒト血清アルブミン、FcまたはFcフラグメントおよび糖例えば、シアル酸を含む。アミノ酸配列同一性パーセントは、本明細書において、配列同一性の一部として保存的置換を何ら考慮することなく、最大配列同一性パーセントをなし遂げるために、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の種々の方法で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2またはMegalignDNASTAR登録商標ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用してなし遂げることができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントをなし遂げるために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定することができる。単離されたポリペプチドは、その天然環境の成分から同定および分離および/または回収されているものである。その天然環境の汚染成分は、ポリペプチドの診断または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク性または非タンパク性溶質を含み得る。好ましい態様において、ポリペプチドは、1ローリー法によって決定されるとき、95重量を超える、より好ましくは99重量を超えるポリペプチドに、2スピニングカップシークエネーターの使用によりN末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも残基を得るために十分な程度に、または3クマシーブルーもしくは、好ましくは、銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEによる均質性に精製される。単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも1種の成分が存在しないため、組換え細胞内でinsituでポリペプチドを含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも1つの精製工程によって調製される。概観本出願は、ヒトIL-23に対するアドネクチンを提供する。IL-23特異的アンタゴニストを同定するために、抗-p40mAbを使用して、IL-23をアドネクチンの大規模合成ライブラリーへ提示した。IL-23に結合するアドネクチンは、ヒトIL-23との結合、IL-23/IL-23R相互作用の競合、およびT-細胞系におけるIL-23誘導シグナル伝達の阻害についてスクリーニングされた。抗IL-23アドネクチンは、標的濃度を低下させ、遅い解離速度で抗IL-23アドネクチンを選択することによるさらなる選択圧に供された。この最適化工程から、アドネクチンのファミリーは、好ましい生化学的および生物物理的特性を有するIL-23特異的インヒビターとして同定された。フィブロネクチンをベースとするスカフォールド本出願の1つの局面は、1つ以上の溶媒接触可能ループがランダム化または変異されているFn3ドメインを含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、Fn3ドメインは、ヒトフィブロネクチンIII型ドメインの野生型第10モジュール10Fn3に由来するFn3ドメイン:VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT配列番号:1である。上記10Fn3配列において、BC、DEおよびFGループには下線が引かれている。種々の変異体10Fn3スカフォールドが報告されている。1つの局面において、Asp7、Glu9および23の1つ以上が、別のアミノ酸、例えば、負の電荷を有さないアミノ酸残基例えば、Asn、Lysなどにより置換されている。これらの突然変異は、野生型形態と比較して、中性pHでの変異体10Fn3のより大きな安定性を促進する効果を有すると報告されているPCT公開WO02/04523参照。有益または中立のいずれかである10Fn3スカフォールドにおける種々のさらなる変化が開示されている。例えば、BatoriらProteinEng1510151020KoideらBiochemistry401032610333参照。変異体および野生型10Fn3タンパク質の両方が、同じ構造、すなわちAからGと表される7つのベータ鎖ドメイン配列および7つのベータ鎖ドメイン配列を接続する6つのループ領域ABループ、BCループ、CDループ、DEループ、EFループおよびFGループにより特徴付けられる。N-およびC-末端の最も近くに位置するベータ鎖は、溶液中でベータ様コンホメーションをとり得る。配列番号:1において、ABループは残基15-16に対応し、BCループは残基21-30に対応し、CDループは残基39-45に対応し、DEループは残基51-56に対応し、EFループは残基60-66に対応し、FGループは残基76-87に対応するXuらChemistryBiology9933942。いくつかの態様において、10Fn3ポリペプチドは、配列番号1に示されるヒト10Fn3ドメインと少なくとも40、50、60、65、70、75、80、85または90同一であり得る。可変性の多くは、一般的に、1つ以上のループ中で起こる。10Fn3ポリペプチドのベータまたはベータ様鎖のそれぞれは、このような変異が生理学的条件におけるポリペプチドの安定性を破壊しない条件で、本質的に配列番号:1の対応するベータまたはベータ様鎖の配列と少なくとも80、85、90、95または100同一であるアミノ酸配列からなり得る。いくつかの態様において、本明細書は、第10フィブロネクチンIII型10Fn3ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインは、ループ、AB;ループ、BC;ループ、CD;ループ、DE;ループEF;およびループFGを含み;ヒト10Fn3ドメインの対応するループの配列と比較して改変されたアミノ酸配列を有するループBC、DEおよびFGから選択される少なくとも1つのループを有するポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、BCおよびFGループは変化されており、いくつかの態様において、BC、DEおよびFGループは変化されており、すなわち、Fn3ドメインは非天然ループを含む。変化は、ヒトフィブロネクチンドメインに対応する鋳型配列と比較して1つ以上のアミノ酸配列の変化を意味し、アミノ酸付加、欠失および置換を含む。アミノ酸配列の変化は、一般的に核酸コード配列の意図的な、盲検的なまたは自発的な配列変異によって成し遂げられ得、任意の技術、例えば、PCR、エラープローンPCRまたは化学的DNA合成によって起こり得る。いくつかの態様において、BC、DEおよびFGから選択される1つ以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比較して、長さが伸長または短縮され得る。いくつかの態様において、ループの長さは、2-25アミノ酸によって伸長され得る。いくつかの態様において、ループの長さは、1-11アミノ酸によって減少され得る。したがって、抗原結合を最適化するために、10Fn3のFGループの長さは、抗原結合において最大の起こり得る柔軟性および親和性を得るように、長さならびに配列において変化され得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号:1の非ループ領域と少なくとも80、85、90、95、98、99または100同一であるアミノ酸配列を含むFn3ドメインを含み、BC、DEおよびFGから選択される少なくとも1つのループは変化されている。いくつかの態様において、変化されているBCループは、最大10個のアミノ酸置換、最大4個のアミノ酸欠失、最大10個のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。いくつかの態様において、変化されているDEループは、最大6個のアミノ酸置換、最大4個のアミノ酸欠失、最大13個のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。いくつかの態様において、FGループは、最大12個のアミノ酸置換、最大11個のアミノ酸欠失、最大25個のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。いくつかの態様において、本発明のタンパク質のBCループは、DHDYPYR配列番号:2、DMYYPYS配列番号:3、YHDYPYR配列番号:4、YMHYPYS配列番号:5、YHMYSYR配列番号:6、EHDYPYR配列番号:7、MHDYPYR配列番号:8、DHNYSYR配列番号:9、NHNYSYY配列番号:10およびDHNYTWY配列番号:11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本発明のタンパク質のDEループは、RNIN配列番号:12、KEYD配列番号:13、KDEE配列番号:14、KQHD配列番号:15、RDVD配列番号:16、KDVD配列番号:17、MEED配列番号:18、RHTD配列番号:19、REDS配列番号:20、RGVA配列番号:21およびRGVD配列番号:22からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本発明のタンパク質のFGループは、SSYKYDMQYS配列番号:23、SSYKYDIQYP配列番号:24およびSTLKYDIQYS配列番号:25からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。10Fn3ドメインは、アミノ酸変化で始まってもよい。例えば、さらなるMG配列が、Fn3ドメインのN-末端に配置され得る。Mは、通常、切断除去され、N末端にGが残る。いくつかの態様において、10Fn3ドメインのC末端に、配列が配置されていてもよい。例えば、システイン含有リンカー、例えば、GSGC配列番号:26がC-末端に加えられる、部位特異的ペグ化において。いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号:2-11に示されるBCループ配列からの1つのループ配列、配列番号:12-22に示される1つのDEループ配列および配列番号:23-25に示される1つのFGループ配列を含む。いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号:2-25のいずれか1つと少なくとも70、75、80、85、90、95、98、99または100同一であるBC、DEおよびFGループアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗IL-23アドネクチンは、配列番号:27-39のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗IL-23アドネクチンは、配列番号:27-39のいずれか1つの位置3-96由来のFn3ドメインアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗IL-23アドネクチンは、配列番号:27-39のいずれか1つと少なくとも70、75、80、85、90、95、98、99または100同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗IL-23アドネクチンは、配列番号:40-52のいずれか1つの核酸配列を含む。いくつかの態様において、抗IL-23アドネクチンは、配列番号:40-52のいずれか1つと少なくとも70、75、80、85、90、95、98、99または100同一である核酸配列を含む。フィブロネクチンは、そのインテグリン結合モチーフ、アルギニン-グリシン~アスパラギン酸RGDを介して特定の種類のインテグリンと天然に結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、RGDインテグリン結合モチーフを欠く10Fn3ドメインを含む。薬物動態部分1つの局面において、本出願は、薬物動態PK部分をさらに含む抗IL-23アドネクチンを提供する。改善される薬物動態は、認識される治療的必要性にしたがって評価され得る。しばしば、恐らく、タンパク質が投与後の血清において利用できるままである時間を増大することによって、バイオアベイラビリティを増大すること、および/または用量間の時間を増大することが望ましい。場合によっては、時間とともにタンパク質の血清濃度の連続性を改善すること例えば、投与の直後および次の投与の直前のタンパク質の血清濃度の違いの減少が望ましい。抗IL-23アドネクチンは、未修飾アドネクチンと比較して哺乳動物例えば、マウス、ラットまたはヒトにおいてポリペプチドのクリアランス速度を3倍超低減する部分に結合させてもよい。改善される薬物動態の他の尺度は血清半減期を含むことができ、これは、しばしば、アルファ相およびベータ相に分類される。いずれかの相または両方の相が、適当な部分の付加によって有意に改善され得る。本明細書においてPK部分と呼ばれる血液からのタンパク質のクリアランスを遅延させる傾向がある部分は、ポリオキシアルキレン部分、例えば、ポリエチレングリコール、糖例えば、シアル酸および耐容性良好であるタンパク質部分例えば、Fc、Fcフラグメント、トランスフェリンまたは血清アルブミンを含む。アドネクチンは、米国公開第2007/0048282号に記載されているアルブミンまたはフラグメント部分またはアルブミンの変異体と融合させてもよい。いくつかの態様において、PK部分は、血清アルブミン結合タンパク質、例えば、米国公開第2007/0178082および2007/0269422号に記載されているものである。いくつかの態様において、PK部分は、血清免疫グロブリン結合タンパク質、例えば、米国公開第2007/0178082号に記載されているものである。いくつかの態様において、アドネクチンは、ポリエチレングリコールPEGを含む。1つ以上のPEG分子はタンパク質上の異なる位置に結合され得、このような結合は、アミン、チオールまたは他の適当な反応基での反応によりなし遂げられ得る。アミン部分は、例えば、ポリペプチドのN末端に見られる第一級アミンまたはアミノ酸、例えば、リジンまたはアルギニン中に存在するアミン基であり得る。いくつかの態様において、PEG部分は、aN-末端;bN末端と最もN末端側のベータストランドまたはベータ様鎖との間;c標的結合部位と反対側のポリペプチドの面上に位置するループ;dC末端と最もC末端側のベータストランドまたはベータ様鎖との間;およびeC-末端からなる群から選択されるポリペプチド上の位置に結合している。ペグ化は、部位特異的ペグ化によりなし遂げられ得、ペグ化が優先的に起こる部位を作り出すために、適当な反応基がタンパク質に導入され得る。いくつかの態様において、タンパク質は、所望の位置にシステイン残基を導入するように修飾され、システイン上で部位特異的ペグ化が可能となる。PEGは、分子量が大きく変わってもよく、分岐または直鎖であってもよい。いくつかの態様において、アドネクチンは、Fn3ドメインおよびPK部分を含む。いくつかの態様において、Fn3ドメインは10Fn3ドメインである。いくつかの態様において、PK部分は、Fn3ドメイン単独と比較して、ポリペプチドの血清半減期を5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、400、600、800、1000またはそれ以上を増大する。いくつかの態様において、PK部分はポリマー糖である。いくつかの態様において、PK部分はポリエチレングリコール部分である。いくつかの態様において、PK部分は血清アルブミン結合タンパク質である。いくつかの態様において、PK部分はヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、PK部分は血清免疫グロブリン結合タンパク質である。いくつかの態様において、PK部分はトランスフェリンである。いくつかの態様において、PK部分は血清タンパク質に対して特異的な別のアドネクチンである。生物物理学および生化学的特性化本出願は、IL-23に結合するFn3ドメインを含むアドネクチンを提供する。実施例2に示されるとおり、標的分子に結合するポリペプチドは、平衡定数例えば、解離、KDに関して、および速度定数例えば、結合速度定数、konおよび解離速度定数、koffに関して評価され得る。アドネクチンは、一般的に、500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM、100pM未満のKDで標的分子に結合するが、koffが十分に低い、またはkonが十分に高いとき、より高いKD値も許容され得る。本発明の抗IL-23アドネクチンのファミリーのBC、DEおよびFGループ配列は、対応する全長配列番号と共に下記の表1に提示される。表1:抗IL-23アドネクチンファミリー核酸-タンパク質融合技術1つの局面において、本出願は、IL-23に結合するフィブロネクチンIII型ドメインを含むアドネクチンを提供する。特異的結合特性を有するFn3ドメインを、迅速に作り、試験する一つの方法は、AdnexusaBristolMyersSquibbRDCompanyの核酸-タンパク質融合技術である。本出願は、インビトロ発現および核酸-タンパク質融合RNA-およびDNA-タンパク質融合を利用して、タンパク質との結合にとって重要である新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定する、PROfusionと呼ばれるタグ技術を利用する。核酸-タンパク質融合技術は、タンパク質をそのコーディング遺伝情報と共有結合によってカップリングする技術である。RNA-タンパク質融合技術およびフィブロネクチンをベースとするスカフォールドタンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細な説明について、Szostakら米国特許第6,258,558、6,261,804、6,214,553、6,281,344、6,207,446、6,518,018、6,818,418号;およびRobertsらProcNatlAcadSci941229712302これらを出典明示により本明細書に包含させる参照。ベクターおよびポリヌクレオチド態様本明細書に記載されている種々のタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成され得る。コドン使用頻度は、細胞における発現を改善するように選択され得る。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞型に依存する。特定化されたコドン使用頻度パターンが、大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞において開発されている。例えば:MayfieldらProcNatlAcadSciUSA100438442SinclairらProteinExprPurif2696105ConnellNDCurrOpinBiotechnol12446449MakridesらMicrobiolRev60512538およびSharpらYeast7657678、参照。核酸操作の一般的な技術は、例えば、出典明示により本明細書に包含させる、SambrookらMolecularCloningALaboratoryManual2ndEditionVols13ColdSpringHarborLaboratoryPressまたはAusubelFらCurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenPublishingandWileyInterscienceNewYorkおよび定期的更新に記載されている。一般的に、ポリペプチドをコードするDNAは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する適当な転写または翻訳調節要素に作動可能に連結される。このような調節要素は、転写プロモーター、転写をコントロールする任意のオペレーター配列、適当なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結をコントロールする配列を含む。宿主において複製する能力は、通常、複製起点によって付与され、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子をさらに組み込まれる。本明細書に記載されているタンパク質は、直接的にだけではなく、好ましくはシグナル配列または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのN-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしてもまた、組換え的に生産され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され、プロセシングされるすなわち、シグナルペプチダーゼによって切断されるものである。天然シグナル配列を認識およびプロセッシングしない原核生物宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母分泌のために、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダーサッカロミセスおよびクルイベロマイセスアルファ因子リーダーを含む、または酸性ホスファターゼリーダー、C.アルビカンスグルコアミラーゼリーダー、または米国特許第5,631,144号に記載されているシグナルにより置換され得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。このような前駆体領域のDNAを、リーディングフレームでタンパク質をコードするDNAとライゲートしてもよい。発現およびクローニングベクターは両方とも、ベクターが1つ以上の選択される宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。一般的に、クローニングベクターにおいて、該配列は、ベクターが宿主染色体DNAと独立して複製することを可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に対して適当であり、2ミクロンのプラスミド起点は、酵母に対して適当であり、種々のウイルス起点SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPVは、哺乳動物細胞中のクローニングベクターのために有用である。一般的に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターのために必要でないSV40起点は、一般的に、それが早期プロモーターを含むためのみに使用され得る。発現およびクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、a抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、b栄養要求欠損を補完する、またはc複合培地からは利用できない決定的な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、バチルスのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、本発明のタンパク質、例えば、フィブロネクチンをベースとするスカフォールドタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用のために適当なプロモーターは、phoAプロモーター、ベータ-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファンtrpプロモーター系、およびハイブリッドプロモーター、例えば、tanプロモーターを含む。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも適当である。細菌系における使用のためのプロモーターもまた、本発明のタンパク質をコードするDNAに作動可能に連結したシャイン-ダルガノS.D.配列を含む。真核生物のためのプロモーター配列が使用されている。実質的にはすべての真核細胞遺伝子は、転写が開始される部位から約25から30塩基上流に位置するAT-リッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写の開始から70から80塩基上流に見出される別の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT領域である。ほとんどの真核細胞遺伝子の3’末端は、コード配列の3’末端へのポリAテールの付加のためのシグナルであり得るAATAAA配列である。これらの配列のすべてが、真核発現ベクターに適当に挿入される。酵母宿主とともに使用するために適当なプロモーター配列の例は、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼに対するプロモーターを含む。哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、宿主細胞系と適合性である場合、例えば、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス例えば、アデノウイルス2、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよびより好ましくはサルウイルス40SV40のゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、ヒートショックプロモーターから得られるプロモーターによりコントロールすることができる。高等真核生物による本発明のタンパク質をコードするDNAの転写は、しばしば、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増加される。多数のエンハンサー配列は、現在、哺乳動物遺伝子グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ-フェトプロテインおよびインスリンから知られている。一般的に、しかしながら、1つは、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例は、複製起点の後ろ側のSV40エンハンサーbp100-270、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核細胞プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントにおいて、YanivNature2971718も参照。エンハンサーは、ペプチドをコードする配列の5’または3’側の位置でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターの5’側に位置する。真核宿主細胞例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物体に由来する有核細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結のために、およびmRNAを安定化するために必要な配列を含む。このような配列は通常、真核またはウイルスDNAまたはcDNAの5’および場合により、3’非翻訳領域から利用することができる。これらの領域は、本発明のタンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。1つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026およびそこに記載されている発現ベクター参照。組換えDNAはまた、タンパク質を精製するために有用であり得る任意の種類のタンパク質タグ配列を含むことができる。タンパク質タグの例は、限定はしないが、ヒスチジンタグ、FLAGタグ、mycタグ、HAタグまたはGSTタグを含む。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主とともに使用するために適当なクローニングおよび発現ベクターは、CloningVectorALaboratoryManualElsevierNewYork中に見ることができ、この関連記載を出典明示により本明細書に包含させる。発現構築物は、当業者に明らかである宿主細胞に適当な方法を使用して、宿主細胞に導入される。核酸を宿主細胞に導入するための種々の方法は、当分野で知られており、限定はしないが、エレクトロポレーション;塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション;微粒子銃;リポフェクション;および感染ベクターが感染因子であるを含む。適当な宿主細胞は、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞を含む。適当な細菌は、グラム陰性またはグラム陽性生物体、例えば、大腸菌またはバチルス種を含む。好ましくはサッカロミセス種に由来する酵母、例えば、サッカロミセスセレビシエもまた、ポリペプチドの生産のために使用され得る。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために使用することができる。昆虫細胞における異種タンパク質の生産のためのバキュロウイルス系は、LuckowらBiotechnology647に総説されている。適当な哺乳動物宿主細胞系の例は、内皮細胞、CO8-7サル腎臓細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣CHO、ヒト胚腎細胞、HeLa、293、293TおよびBHK細胞系を含む。精製ポリペプチドは、組換えタンパク質を発現するために適当な宿主/ベクター系を培養することにより調製される。多数の適用のために、本明細書に記載されているポリペプチド中の多くの小さいサイズのポリペプチドは、発現のための好ましい方法として大腸菌において発現させる。次に、タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。タンパク質生産宿主細胞は、タンパク質生産のための本明細書に記載されている発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または、所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に修飾された慣用の栄養素培地において培養される。本明細書に示される実施例において、ハイスループットタンパク質生産HTPPおよび中規模生産のために使用される宿主細胞は、BL21DE3plysS細菌株であった。培養条件、例えば、温度、pHなどは、発現のために選択される宿主細胞と共に以前に使用されているものであり、当業者には明らかである。本明細書に記載されているタンパク質もまた、細胞翻訳系を使用して生産することができる。このような目的のため、ポリペプチドをコードする核酸は、インビトロ転写を可能にしてmRNAを生産し、使用されている特定の無細胞系真核、例えば、哺乳動物または酵母無細胞翻訳系または原核、例えば、細菌無細胞翻訳系におけるmRNAの無細胞翻訳を可能にするように修飾されなければならない。本発明のタンパク質はまた、化学合成により例えば、SolidPhasePeptideSynthesis2ndEditionThePierceChemicalCoRockfordILに記載されている方法により生産することができる。タンパク質に対する修飾も、化学合成により生成することができる。本発明のタンパク質は、タンパク質化学の分野で一般に知られているタンパク質に対する単離/精製方法により精製することができる。非限定的な例は、抽出、再結晶化、塩析例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムで、遠心分離、透析、限外ろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配またはこれらの任意の組合せを含む。精製後、限定はしないが、濾過および透析を含む、当分野で公知の種々の方法のいずれかにより、ポリペプチドを異なるバッファーに交換してもよく、および/または濃縮してもよい。精製されたポリペプチドは、好ましくは少なくとも85純粋、好ましくは少なくとも95純粋、より好ましくは少なくとも99純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは、医薬品として使用するために十分に純粋である。治療的インビボ使用1つの局面において、本出願は、自己免疫疾患、例えば、狼瘡例えば、エリテマトーデス、狼瘡腎炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病例えば、インスリン依存性糖尿病、I型糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患例えば、リウマチ性関節炎、多発性筋炎、強皮症および混合性結合組織疾患の処置において有用な抗IL-23アドネクチンを提供する。本出願はまた、対象に抗IL-23アドネクチンを投与するための方法を提供する。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、抗IL-23アドネクチンは、哺乳動物、特にヒトに対して薬学的に許容される。薬学的に許容されるポリペプチドは、例えば、本質的にエンドトキシンを含まない、または極めて低いエンドトキシンレベルを有する、有意な有害な医学的結果なしに動物に投与されるポリペプチドを示す。製剤および投与本出願はさらに、本明細書に記載されている抗IL-23アドネクチンを含む薬学的に許容される組成物であって、本質的にエンドトキシンを含まない組成物を提供する。抗IL-23アドネクチンを含む治療製剤は、所望の程度の純度を有する記載されているアドネクチンを、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤OsolAedRemingtonsPharmaceuticalSciences16thEditionと混合することにより、水溶液、凍結乾燥された、他の乾燥された製剤の形態で、保存用に調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸;抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン;防腐剤例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール;低分子量約10残基未満ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン;単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースまたはデキストラン;キレート化剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体例えば、Zn-タンパク質複合体;および/または非イオン性界面活性剤、例えば、Tween、プルロニック登録商標またはポリエチレングリコールPEGを含む。本明細書において製剤はまた、処置される特定の適応のために必要とされる2つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含み得る。このような分子は、意図される目的に対して有効である量の組合せで適当に存在する。インビボ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過により容易に成し遂げられる。当業者は、それぞれの治療剤の用量が、薬剤の独自性に依存することを理解する。治療的適応のために、抗IL-23アドネクチンは、薬学的に許容される投与形態において対象に投与される。それらは、ボーラスとして、もしくは期間にわたって連続的な注入により静脈内に、または皮下経路により投与することができる。適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は、よく知られており、臨床状況が必要とする際に、当業者により決定することができる。適当な担体、希釈剤および/または賦形剤の例は、1ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、20.9塩水0.9w/vNaC1、および35w/vデキストロースを含む。本発明の方法は、インビトロ、インビボまたはエキソビボで実施することができる。共投与されるか、または連続して投与されるにかかわらず、抗IL-23アドネクチンおよび1つ以上のさらなる治療剤の投与は、治療的適応のために上記されるとおりに起こり得る。共投与のために適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は、投与される特定の治療剤の独自性に依存することが当業者により理解される。凍結乾燥されるよりもむしろ水性投与形態において存在するとき、タンパク質は、一般的に、約0.1mg/mlから100mg/mlの濃度で製剤化されるが、これらの範囲の外側の広い変動も許容される。疾患の処置のために、抗IL-23アドネクチンの適当な用量は、処置される疾患の型、疾患の重症度および経過、アドネクチンが予防または治療目的のために投与されるのか、以前の治療過程、患者の病歴およびアドネクチンに対する応答、ならびに担当医の判断に依存する。タンパク質は、1回で、または一連の処置にわたって、患者に適当に投与される。抗IL-23アドネクチン/IL-23タンパク質複合体の構造IL-23結合アドネクチンの構造の分析は、該アドネクチンおよびその標的間の分子相互作用への多数の見識を生む。標的結合が野生型配列から突然変異された一連のアドネクチンループ残基により媒介されることを考慮すると、これらの残基中の多くが標的に接触することが観察されることは驚かない。ライブラリー中で多様化されており、非野生型残基として選択されたBC、DEおよびFGループにおける残基全てが、アドネクチン/標的接合面にて、または該接合面付近で見られるとは限らないことに、より興味がある。逆に、多様なループBC、DE、FGの外側のいくつかの野生型残基は、標的タンパク質と相互作用する。標的結合アドネクチンの主鎖構造と野生型10Fn3を比較すると、違いは、3つの多様なループのそれぞれにおいて野生型から観察され、N-末端は標的タンパク質の表面に結合するために構造変化を起こし得る。実施例3に記載されているとおり、アドネクチン由来の以下の残基は、IL-23と接触していることが見られる:N-末端領域:Pro5、Arg6、Asp7、BC-ループ:Glu23、His24、Asp25、Tyr26、Pro27、Tyr28、Arg30、C-ストランド:Tyr31;CD-ループ:Gly40、Asn42、Val45;F-ストランド:Tyr73、Val75;FG-ループ:Thr76、Ser77、Ser78、Tyr79、Lys80、Tyr81、Asp82、Met83、Gln84、Tyr85、Ser86、Pro87。これらの接触する残基は、多くの非分散残基を含むことに注意。特に、Tyr26、Tyr28、Asp82およびTyr85は、これらのアミノ酸が重要であることを示すアドネクチンの該セットにおいて完全に保存されており、これらのアミノ酸の他の19個の天然アミノ酸のいずれかでの置換は、IL-23への結合を大幅に減少または除去する可能性がある。コンセンサス配列は、BCループにおけるTyr26およびTyr28ならびにFGループにおけるSer77、Lys80、Tyr81、Asp82、Gln84およびTyr85を含む。これらのアミノ酸の組合せは、IL-23への1454B08の高親和性結合において重要な役割を果たす可能性があるが、これらの位置において1つまたは2つの変異を有するクローンはいくつかの結合を保持する可能性がある。N-末端がアドネクチンにおいてフレキシブルであることに注意すべきである。10Fn3において、該位置は、9Fn3へのリンクにより決まる。実施例3に記載されている結晶構造は、1454B08のN-末端が、おそらくIL-23との衝突を回避するために、10Fn3N-末端と比較して折り畳まれていること、および、Aストランドの前のN-末端領域におけるPro5、Arg6、Asp7が標的と接触していることを示す。実施例3に記載されているエネルギー計算およびアラニン変異誘発の組合せにより、1454B08に対する最小のエネルギーパラトープが、少なくともBCループからのTyr28、FGループからのTyr81、およびFGループのC-末端からの非分散残基であるPro87からなると同定された。アドネクチンとのIL-23複合体の構造は、標的タンパク質と相互作用する残基が、アドネクチンの多様なループのはるかに外側に伸長し得ることを示す。明らかに、結合ループの外側の残基の重要性は、結合親和性を増加または減少させる能力を示す相互作用エネルギー計算および標的化変異誘発実験により証明された。アラニンへのいくつかの接触残基の変異誘発は、分子間相互作用に対する疎水性相互作用の重要性を示す。多様なループの外側の残基が標的と相互作用する能力に加えて、該構造はいくつかの他の特徴を示す。IL-23/1454B08構造は、多数の残基が相互作用に関与するにもかかわらず、アドネクチン上の3つの多様なループにおける残基全てがIL-23と直接接触するとは限らないことを示す。さらに、ループおよびN-末端は、野生型10Fn3構造に見られるもの以外の構造を採用し得る。おそらく、ループは若干フレキシブルであるが、特定の構造のみが標的と生産的に相互作用することができ、これが複合体において見られる。アドネクチンは、小さいサイズおよび凸形状の理由で、抗体に近づきにくい表面、例えば、IL-23のp40およびp19ドメイン間の凹面結合点への結合を可能にし得る。最終的に、アドネクチンは抗体Fvドメインダイマーのサイズの半分未満であるが、それらはそれらの標的を有する表面をほとんど完全に覆い隠すことができる。全てのこれらの能力は、アドネクチンがタンパク質治療薬を開発するための非常に成功したプラットホームであることを証明し得ることを示唆する。構造座標の記載および位置アドネクチンとの複合体におけるIL-23の結晶構造の構造座標は、RCSBProteinDataBankwwwpdborgBermanHMらTheProteinDataBankNucleicAcidsResearch28235242andwwwwwpdborgBermanHMらAnnouncingtheworldwideProteinDataBankNatureStructuralBiology1098で2011年2月29日に預けられ、PDBID:3QWRを与えられた。実施例1:本明細書において使用される材料および方法ハイスループットタンパク質生産HTPP選択されたバインダーを、pET9dベクターにクローニングし、形質転換された大腸菌BL21DE3plysS細胞を、24ウェルフォーマットにおいて50mg/mLのカナマイシンを含む5mlのLB培地に播種し、37°Cで一晩培養した。新鮮な5mlのLB培地50mg/mLのカナマイシン培養物を、一晩培養物から200mlの吸引および適当なウェルに分配することにより、誘導発現のために調製した。培養物をA6000.6-0.9まで37°Cで培養した。1mMのイソプロピル-b-チオガラクトシドIPTGで誘導後、培養物を30°Cで6時間培養し、4°Cで2750gで10分間遠心分離により回収した。細胞ペレット24ウェルフォーマット中を、450mlの溶解バッファー50mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1x完全プロテアーゼインヒビターカクテル-EDTAフリーRoche、1mMのPMSF、10mMのCHAPS、40mMのイミダゾール、1mg/mlのリゾチーム、30mg/mlのDNAse、2mg/mlのアプロチニン、pH8.0に再懸濁し、室温で1-3時間振盪することにより溶解した。溶解物を浄化し、96ウェル、1.2mlのキャッチプレートを備えた97ウェルWhatmanGF/DUNIFILTER登録商標に移すことにより96ウェルフォーマットに再び入れ、陽圧により濾過した。浄化された溶解物を、平衡バッファー50mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、40mMのイミダゾール、pH8.0で平衡化された96ウェルNi-キレートプレートに移し、5分間インキュベートした。結合していない物質を真空により除去した。樹脂を、真空により除去したそれぞれの洗浄物を有する洗浄バッファー150mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、5mMのCHAPS、40mMのイミダゾール、pH8.0で2×0.3ml/ウェルで洗浄した。溶離の前に、それぞれのウェルを50mlの溶離バッファーPBS20mMのEDTAで洗浄し、5分間インキュベートし、該洗浄物を真空により捨てた。さらなる100mlの溶離バッファーをそれぞれのウェルに適用することにより、タンパク質を溶離した。室温で30分インキュベーション後、プレートを200gで5分間遠心し、溶離されたタンパク質を、溶離前に溶離キャッチプレートの底に加えた5mlの0.5MのMgCl2を含む96ウェルキャッチプレートに回収した。溶離されたタンパク質を、タンパク質標準としてSGEを用いるBCAアッセイを使用して定量した。不溶性フィブロネクチンをベースとするスカフォールドタンパク質バインダーの中規模発現および精製発現のため、HIS6タグが続く選択されたクローンを、pET9dベクターにクローニングし、大腸菌BL21DE3plysS細胞において発現させた。20mlの種菌培養物単一のプレートコロニーから作製されたを使用し、50mg/mlのカナマイシンおよび34mg/mlのクロラムフェニコールを含む1リットルのLB培地またはTB-一晩発現培地自己誘導に播種した。LB培地中の培養物を、37°CでA6000.6-1.0までインキュベートし、その時間で1mMのイソプロピル-b-チオガラクトシドIPTGで誘導し、0°Cで4時間増殖させた。TB-一晩発現培地で増殖させた培養物を、37°Cで5時間インキュベートし、その時間で温度を19時間18°Cへ下げた。培養物を、4°Cで≧10,000gで30分間遠心分離により回収した。細胞ペレットを-80°Cで凍結させた。細胞ペレットを、氷上でULTRA-TURRAX登録商標ホモジェナイザーIKAworksを使用して、25mlの溶解バッファー20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1x完全プロテアーゼインヒビターカクテル-EDTAフリーRoche、pH7.4に再懸濁した。細胞溶解を、ModelM-110SMICROFLUIDIZER登録商標Microfluidicsを使用して、高圧ホモジナイゼーション≧18,000psiによりなし遂げた。不溶性画分を、4°Cで≧23,300gで30分間の遠心分離により分離した。溶解物の遠心分離から回収された不溶性ペレットを、20mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、pH7.4で洗浄した。ペレットを、超音波処理を用いて20mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaClpH7.4中6.0Mの塩酸グアニジンに再可溶化し、次に、37度で1-2時間インキュベーションした。再可溶化されたペレットを0.45mmで濾過し、20mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、6.0MのグアニジンpH7.4バッファーで平衡化されたHISTRAP登録商標カラム上に負荷した。負荷後、カラムを、同じバッファーでさらなる25CVに対して洗浄した。結合したタンパク質を、20mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、6.0Mのグアニジン-HClpH7.4中50mMのイミダゾールで溶離した。精製されたタンパク質を、50mMの酢酸ナトリウム、150mMのNaClpH4.5またはPBSpH7.2に対する透析によりリフォールディングした。可溶性フィブロネクチンをベースとするスカフォールドタンパク質バインダーの中規模発現および精製不溶性バインダーの精製の代替として、可溶性バインダーの精製も使用され得る。発現のため、HIS6タグが続く選択されたクローンを、pET9dベクターにクローニングし、大腸菌BL21DE3plysS細胞において発現させた。20mlの種菌培養物単一のプレートコロニーから作製されたを使用し、50mg/mlのカナマイシンおよび34mg/mlのクロラムフェニコールを含む1リットルのLB培地またはTB-一晩発現培地自己誘導に播種した。LB培地中の培養物を、37°CでA6000.6-1.0までインキュベートし、その時間で1mMのイソプロピル-b-チオガラクトシドIPTGで誘導し30°Cで4時間増殖させた。TB-一晩発現培地で増殖させた培養物を、37°Cで5時間インキュベートし、その時間で温度を19時間18°Cへ下げた。培養物を、4°Cで≧10,000gで30分間遠心分離により回収した。細胞ペレットを-80°Cで凍結させた。細胞ペレットを、氷上でULTRA-TURRAX登録商標ホモジェナイザーIKAworksを使用して、25mlの溶解バッファー20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1x完全プロテアーゼインヒビターカクテル-EDTAフリーRoche、pH7.4に再懸濁した。細胞溶解を、ModelM-110SMICROFLUIDIZER登録商標Microfluidicsを使用して、高圧ホモジナイゼーション≧18,000psiによりなし遂げた。可溶性画分を、4°Cで≧23,300gで30分間の遠心分離により分離した。上清を、0.45mmフィルターを介して浄化する。浄化された溶解物を、20mMのリン酸ナトリウム、500MのNaClpH7.4で前平衡化されたHISTRAP登録商標カラムGE上に負荷した。次に、カラムを、25カラム容量の同じバッファー、次に、20カラム容量の20mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、25mMのイミダゾール、pH7.4、次に、35カラム容量の20mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、40mMのイミダゾール、pH7.4で洗浄した。タンパク質を、15カラム容量の20mMのリン酸ナトリウム、500MのNaCl、500mMのイミダゾール、pH7.4で溶離し、画分をA280での吸光度に基づいてプールし、1xPBS、50mMのTris、150mMのNaCl、pH8.5または50mMのNaOAc、150mMのNaCl、pH4.5に対して透析する。あらゆる沈殿を0.22mmで濾過することにより除去する。実施例2:インビトロ特性化結合定数の決定抗-His抗体、mAb050RnDSystems、MNを酢酸中20mg/mL、pH5.0に希釈し、製造業者の指示にしたがって、CM5チップ表面GEHealthcare、Piscataway、NJのフロー細胞1および2上に~9000RUに固定する。全ての表面プラズモン実験は、HBS-EP10mMのHepes、150mMのNaCl、3mMのEDTA0.05の界面活性剤P20中で25°Cで行った。IL-23を抗-HismAb捕捉アドネクチンに2分間で注射し、次に、10分相分離した。T100Biaevalutionを使用して、速度論的パラメーターを計算した。表2:結合定数Kit225細胞でのSTAT3リン酸化ParhamらAreceptorfortheheterodimericcytokineIL23iscomposedofIL12Rbeta1andanovelcytokinereceptorsubunitIL23RJImmunol16856995708は、ヒトIL-2依存性T-細胞系、Kit225からIL-23Rをクローン化した。これらの細胞は、IL-12RB1および1L-23Rの両方の発現ならびにpSTAT3の刺激によるIL-23およびpSTAT4の刺激によるIL-12に対する応答に対して、FACS分析により特徴づけた。Kit225細胞を96-ウェルプレートに播種し、37°Cで3時間、FBSおよびIL-2の非存在下で静置した。該インキュベーションに続き、ヒト組換えIL-23または、1時間アンタゴニストでプレインキュベートしたIL-23を適用し、細胞を37°Cで15分間インキュベーターへ戻し、STAT3のリン酸化p-STAT3と略されるを刺激した。それぞれの条件は、96-ウェルプレートにてデュプリケートにおいてアッセイした。刺激は、氷上に細胞を置き、氷冷PBSの添加により停止した。最後に、細胞を標準プロトコールにしたがってペレット化および溶解し、pSTAT3生産をELISAにより検出した。IL-23誘導性pSTAT3の阻害は、抗-p19ポリクローナル抗体AF1716の滴定により証明された。クローン1241A05は、~31nMのIC50で抗-p19ポリクローナル抗体と同様の活性を有した表3。表3:抗IL-23アンタゴニストによるIL-23誘導性STAT3リン酸化の阻害実施例3:抗IL-23アドネクチン/タンパク質複合体の構造共結晶化試験のための抗IL-23アドネクチンの発現および精製アドネクチンを、ベクターpET9dNewEnglandBiolabsIpswichMAにクローニングされたアドネクチンをコードする遺伝子で、コンピテントBL21DE3細胞Calbiochemを形質転換することにより発現させた。形質転換体を、カナマイシンを補った自己誘導培地EMDBiosciencesにおいてエアーレイションで、37°Cで6時間、次に20°Cで18時間培養した。細胞を遠心分離により回収し、-80°Cで凍結した。凍結した細胞を解凍し、50mMのリン酸ナトリウム、300mMの塩化ナトリウム、10mMのイミダゾール、pH7.5に再懸濁した。可溶化されたら、DNAse20ng/μLを混合物に加えた。細胞を機械的に溶解しAvestinEmulsiflex-C3、遠心し、上清をIMACカラムQiagen、Ni-NTA、30mL上に負荷した。アドネクチンを、50mMのリン酸ナトリウム、300mMの塩化ナトリウム、30mMのイミダゾール、pH7.5で洗浄し、50mMのリン酸ナトリウム、300mMの塩化ナトリウム、400mMのイミダゾール、pH7.5で溶離されたイミダゾール工程勾配を使用して溶離した。溶離プールをリン酸緩衝食塩水PBS、pH7.4にて透析した。1454B08は、3.7nMのKDで固定されたIL-23に結合し、生化学的競合アッセイにおいて1nMのIC50でIL-23/IL-23R相互作用と競合した。アドネクチンアフィニティーカラムの調製CNBr-活性化セファロース登録商標4高速流樹脂GECat17-0987-01を、公開された指示GEHealthcare71500015ADにしたがって調製した。アドネクチンを樹脂と4°Cで一晩震盪しながらインキュベートした。カップリング効率は>98であったA280により決定した。ヒトIL-23の発現/精製ヒトIL-23を、p40およびp19サブユニットに対する二シストロン構築物を使用することにより、Sf9細胞において発現させた。分泌IL-23を含む培地を濃縮し、タンジェンシャルフロー濾過によりPBSまたはTBSのいずれかにバッファー交換した。濃縮物を、20cm/時の流速でアドネクチンアフィニティーカラムに負荷した異なるサイズカラムを、異なる調製のために使用した。カラムをTFFバッファーで5カラム容量で洗浄し、次に0.1Mの酢酸、pH4.0、1.0MのNaClで工程溶離した。溶出液を、TrisHCl、pH8.01/10容量;最終Tris濃度は0.1Mであったで中和し、プールし、濃縮した。サンプルをさらに精製し、予備規模SUPERDEX登録商標200サイズ排除クロマトグラフィーSECカラムにてHBSにバッファー交換した。IL-23/1454B08複合体の調製ヒトIL-23およびアドネクチンを1:3モル比で混合し、4°Cで一晩インキュベートした。1:1複合体を、25mMのHEPES、pH7.0、200mMのNaClを含むランニングバッファーにおいてSUPERDEX登録商標200カラムGEHealthcareでサイズ排除クロマトグラフィーにより単離した。遊離IL-23が存在しないことを保証するために、カラムで分離される1倍モル過剰の遊離アドネクチンを、複合体に加えた。最終複合体が12mg/mLに濃縮された。IL-23/1454B08複合体の結晶化ヒトIL-23/1454B08複合体を、1mLのタンパク質複合体を1Mのクエン酸三ナトリウム、0.2Mの塩化ナトリウム、0.1MのTris、pH7.0を含む1mLの貯蔵溶液と混合することによるsittingdrop蒸気拡散方法を使用して、20°Cで結晶化した。結晶の質を播種により改善した。データ回収および処理IL-23/1454B08複合体に対するデータを、ArgonneNationalLaboratoryでAdvancedPhotonSourceでIMCACATでビームライン17IDで回収した。使用された波長は1.0Åであり、検出器は200mmの距離でMAR165CCDであった。0.5°の回転イメージを、150°の範囲のためにそれぞれ3秒間回収した。データを指数化し、統合し、dTREKPflugrathThefinerthingsinXraydiffractiondatacollectionActaCrystallogrSectD5517181725でスケール化した。空間群、単位格子パラメーターおよびデータ回収統計値を、以下の表4に記載する。表4:データ回収統計値分子置換アドネクチンのモデルは、残基1416-1437、1444-1466、1470-191および1502-1509すなわちBC、EFおよびFGループを欠失しているを使用して、PDB1FNFから得た。IL-23のモデルは、文献において公開されているもの3DUH、3D87由来の異なる結晶型V.RamamurthyandS.Sheriff、非公開において、BMSで決定された構造であった。それぞれのピースを加えるとき、並進関数Z-スコアおよびLogLikelihoodGainに注意して、PHASERMcCoyらPhasercrystallographicsoftwareJApplCrystallogr40658674を分子置換に使用した。PHASERがIL-23/1454B08複合体においてアドネクチンを見つけることができないとき、AMoRe並進関数を使用する6次元サーチを成功裏に使用したSheriffらImplementationofasixdimensionalsearchusingtheAMoRetranslationfunctionfordifficultmolecularreplacementproblemsJApplCrystallogr3298101NavazaAMoReanautomatedpackageformolecularreplacementActaCrystallgrSectA50157163NavazaらOnthefasttranslationfunctionsformolecularreplacementActaCrystallgrSectA51445449CCP4TheCCP4SuiteprogramsforproteincrystallographyActaCrystD50760763。モデル構築、精密化およびグラフィック表示COOTEmsleyら2004CootmodelbuildingtoolsformoleculargraphicsActaCrystallogrSectD6021262132EmsleyらFeaturesandDevelopmentofCOOTActaCrystallogrSectD66486501を、構造のモデル構築および一般的な観察のために使用した。精密化は、Globalphasing、Ltd.からのautoBUSTERBricogneら2009BUSTERversion280CambridgeUnitedKingdomGlobalPhasingLtdで行った。グラフィック表示は、PyMOLDeLano2002ThePyMolMolecularGraphicsSystemDeLanoScientificSanCarlosCAUShttpwwwpymolorgで作成した。精密化統計値は、以下の表5に記載されている。表5:精密化統計値覆われた表面積を、Gelinら、SidechaintorsionalpotentialseffectofdipeptideproteinandsolventenvironmentBiochemistry1812561268により定義される1.7Åプローブ範囲拡張原子半径を使用して、プログラムMSConnollyAnalyticalMolecularSurfaceCalculationJApplCrystallogr16548558で計算した。接触残基は、Gelinら1979により定義される拡張原子半径を使用した、SheriffらStructureofMyohemerythrinintheAzidometStateat1713ÅResolutionJMolBiol197273296およびSheriffSomemethodsforexaminingtheinteractionsbetweentwomoleculesImmunomethods3191196、により定義された。残基自由エネルギーおよび相互作用エネルギーの概算タンパク質複合体を、MAESTRO9.0.211SchrodingerLLC2009におけるタンパク質調製物WIZARD登録商標ワークフローを使用して最適化した。該プロセス中、ヒスチジン、アスパラギンおよびグルタミン側鎖に関する側鎖プロトン化状態、ヒスチジン互変異性体および末端Chi回転異性体を最適化する。ワークフローにおける最終工程は、複合体の最小化0.3ÅRMSDを抑え、これが、OPLS_2005力場内の複合体の微妙な最適化を可能にする。タンパク質モデルを、PRIME側鎖精密化プロトコール、次に2つの最小化工程を使用して、それぞれの変異体タンパク質に対して作成した。第1の最小化を、変異部位の5Å以内である残基のサブセットに対する側鎖のみに適用した。最終最小化工程を、残基の同じサブセットに適用したが、それは、最小化において該残基の骨格を含んだ。Gibbs自由エネルギーの概算は、以前に記載されているとおりに計算したNovotnyらOntheattributionofbindingenergyinantigenantibodycomplexesMcPC603D13andHyHel5Biochemistry2847354749KrystekらAffinityandspecificityofserineendopeptidaseproteininhibitorinteractionsJMolBiol234661679andimplementedinapythonscriptusingMAESTRO。IL-23とアドネクチン1454B08の特異的相互作用アドネクチンおよびIL-23間の相互作用は、極めて大きく、アドネクチン表面における~1320Å2およびIL-23表面における~1390Å2を覆う。覆われる表面積は、多数の抗体/抗原相互作用よりも大きく、おそらく、IL-23上の結合部位の凹性質を反映する。大きな相互作用表面にもかかわらず、IL-23に対する1454B08のアフィニティーは、それらのタンパク質抗原に対する抗体と同程度の大きさである。該複合体に対するSc統計値は0.73であり、これは、LawrenceらShapeComplementarityatProteinProteinInterfacesJMolBiol234946950により試験された抗体/抗原複合体よりも、さらに相補的であるということを示唆する。主な相互作用は、FG~540Å2およびBC~300Å2ループを介して起こるが、二次構造の多数のセグメントは、相互作用により覆われる少なくともある程度の表面積を有する。アドネクチン由来の以下の残基が、IL-23と接触することが見出される:N-末端領域:Pro5、Arg6、Asp7、BC-ループ:Glu23、His24、Asp25、Tyr26、Pro27、Tyr28、Arg30、C-ストランド:Tyr31;CD-ループ:Gly40、Asn42、Val45;F-ストランド:Tyr73、Val75;FG-ループ:Thr76、Ser77、Ser78、Tyr79、Lys80、Tyr81、Asp82、Met83、Gln84、Tyr85、Ser86、Pro87図4。4つの点が、このリストから目立つ。第1には、相互作用する残基の数は多数であり、それらはβ-ストランドおよびループ中の多くに由来する。第2には、多様なDE-ループおよびIL-23間の接触は存在しない。第3には、多く7のチロシン残基が相互作用に関与する。チロシンの頻繁な存在は、抗原と相互作用する抗体に対して観察されておりPadlanOnthenatureofantibodycombiningsitesUnusualstructuralfeaturesthatmayconferonthesesitesanenhancedcapacityforbindingligandsProteinsStructureFunctionandGenetics7112124MianStructureFunctionandPropertiesofAntibodyBingdingSitesJMolBiol217133151KossiakoffらUnderstandingmechanismsgoverningproteinproteininteractionsfromsynthesisbindinginterfacesCurrOpinStructBiol18499506KoideらTheimportanceofBeingTyrosineLessonsinMolecularRecognitionfromMinimalistSyntheticBindingProteinsACSChemBiol4325334、おそらく、チロシン残基が寄与することができる広い表面積と比較して固定されるようになる比較的小さい二面角による比較的低いエントロピーの喪失が原因と考えられ、これはこの場合、合計~420Å2に達する。第4には、多数9の多様でない残基は、IL-23との直接相互作用に関与する。この第4のカテゴリーの残基は、7個のTyr残基のうちの2個およびN-末端の残基を含む。電子密度はN-末端の部分のみに対して説明できるが、N-末端が野生型10Fn3においてBC、DEおよびFGループの方向を示すため、N-末端はBC、DEおよびFGループの方向を示さず、むしろ方向を逆転し、分子の反対側の方へ向けることが明らかである。方向のこの変化は、p40およびp19サブユニット間の接合点での狭い領域においてIL-23との衝突からN-末端を防ぐ。インターロイキン-23競合ELISAアドネクチン変異体を、天然IL-23受容体IL-23Rの結合部位と競合する様式において、IL-23に結合する能力についてELISAにより試験した。組換えヒトIL-23R-FcRDSystemsMinneapolisMNを、PBS中4μg/mLで50μLで、NUNC登録商標MaxisorpプレートThermoFisherScientificDenmark上に4°Cで一晩被覆した。全ての洗浄は、自動プレート洗浄機BiotekVTを使用して、PBST0.05w/vTweenを含むPBSで行った。OptEIAバッファーBDBioscienceCAを、ブロックおよびアッセイ希釈剤として使用した。200nMから28pMのアドネクチン希釈物を1時間1nMのIL-23でプレインキュベートし、30分間でブロックされたIL-23R-Fc被覆プレートに移した。結合したIL-23を、抗IL-23GeneTexCAおよび抗マウス-HRPRDSystemsMN、次にTMB3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンBDBioscienceCA添加を介して検出した。典型的な展開時間は10分であった。阻害パーセントは、100阻害を定義するために既知のIL-23アドネクチン中和標準およびネガティブコントロールとして非結合アドネクチン標準を使用することにより計算した。IC50を、社内の曲線適合適用で4回の平均から生成した。Tyr28、Tyr73、Tyr81およびPro87は、アラニンへ突然変異された4つの重要なアミノ酸であり、本発明者らがエネルギー的に重要な残基と予測することができることを証明した。チロシン残基は全て、IL-23接合面で覆われた表面積の75以上を有し、Pro87は、接合面で覆われた表面の約70を有する。エネルギー計算は、これらの位置でのアラニンへの変異が結合を減少させることを示唆した。これは、アラニンへ突然変異されたときほとんど効果がなかったTyr73に対してでなく、Tyr28、Tyr81およびPro87に対する場合であることを証明した表6。表6:IL-23IC50Tyr28は、BC-ループの中心に位置し、IL-23p19ドメインA-ヘリックスの末端であるアミノ酸との重要な接触、例えば、Trp26およびHis29とのエッジツーフェイス相互作用を形成する。同様に、FG-ループの中心に位置するTyr81は、IL-23p40サブユニット、例えば、Ser204との重要な接触を有する。FG-ループのC-末端に位置するPro87は、FG-ループ構造を保持するために必要であり得、IL-23p40サブユニットの残基Gly100およびPro101と接触する。相互作用に対して、それぞれ~16および~13寄与するTyr28およびTyr81と比較して、Tyr73は~6kcalのみ寄与することが予期され、最小化構造において、側鎖はIL-23p40サブユニットLys99カルボニル酸素と水素結合を形成する。部位特異的変異の効果アラニン変異誘発は、置換されるそれぞれの側鎖に対する官能基により作られる寄与を強調するが、他のアミノ酸での置換が、新規分子間相互作用への見識を得るために使用され得る。本発明者らはまた、1454B08上の部位を見つけることを試み、本発明者らは、新規接触の追加により、結合活性を増強することができた。多くのこれらの変異によって、わずかに活性が変化した。しかしながら、好ましいと予期された1つThr35→Aspが、活性を大幅に減少させた。他方では、Tyr73→Glnは、活性において穏やかな増加を生じた。アラニン変異誘発およびエネルギー計算の組合せにより、本発明者らは、1454B08に対する最小エネルギーパラトープを、少なくともBCループのTyr28、FGループのTyr81、およびFG-ループのC-末端での多様でない残基のPro87からなるものと、定義することができた。10Fn3と1454B08の構造の比較構造比較は、1454B08が、核β-シートおよび多様であるものから離れた3つのループの2つABおよびDEの優れた重ね合わせを含む標的分子へ結合しているとき図5、野生型分子10Fn3;1FNF残基1416-1509が1454B08と非常に類似のトポロジーを有することを示す図5A、右側。1454B08の全3つの多様なループ、BC、DEおよびFGループは、野生型と長さにおいて同一であり、構造において、短いDEループが最小変異を示す。他方では、BCループは、10Fn3構造と比較したとき、さらなる変異を示す。最も大きな変異はFGループにおいてであり、1FNF結晶構造において、天然RGDモチーフは結晶接触に関与し、接触は、構造における方向性に関与するようである。1454B08において、FGループは、IL-23に結合するとき、異なる構造を採用する。最後に、N-末端はアドネクチンにおいてフレキシブルであることに注意すべきである。10Fn3において、該位置は、9Fn3とのリンクにより決定される。他方では、1454B08のN-末端は、おそらくIL-23との衝突を回避するために、10Fn3N-末端と比較して折り畳まれている。"