"a抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる当該抗原に特異的な制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、T細胞と、前記抗原に結合した両性イオン多糖類とを、又は、b抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる当該抗原に特異的な制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、前記抗原に結合した両性イオン多糖類とを、接触させることを含む、抗原特異的抗炎症制御性T細胞の発生方法。前記多糖類がPSAである、請求項1に記載の発生方法。前記T細胞が制御性T細胞である、請求項1又は2に記載の発生方法。前記bについて、前記抗原提示細胞が、前記抗原に結合した前記両性イオン多糖類と接触した後に、前記抗原提示細胞と制御性T細胞とを接触させることを更に含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の発生方法。前記bについて、前記制御性T細胞の存在下、前記抗原提示細胞と、前記抗原に結合した前記両性イオン多糖類とを接触させる、請求項1に記載の発生方法。同じ小胞上又は小胞内に前記両性イオン多糖類と前記抗原とを含ませることによって、前記両性イオン多糖類が前記抗原に結合する、請求項1~5のいずれか1項に記載の発生方法。前記小胞が、OMVである、請求項6に記載の発生方法。前記両性イオン多糖類が、物理的結合によって前記抗原に結合する、請求項1~7のいずれか1項に記載の発生方法。前記両性イオン多糖類が、直接的又は間接的な共有結合によって、前記抗原に結合する、請求項1に記載の発生方法。前記炎症誘発反応が、細胞介在性炎症反応である、請求項1に記載の発生方法。前記炎症誘発反応が、液性炎症反応である、請求項1に記載の発生方法。前記接触がインビトロで行われる、請求項1に記載の発生方法。前記T細胞が個々の患者から得られる、請求項1~9のいずれか1項に記載の発生方法。前記発生した抗原特異的抗炎症制御性T細胞を、前記個体に注入し返す、請求項13に記載の発生方法。前記接触がインビボで行われる、請求項1に記載の発生方法。前記接触が、前記抗原に結合した前記両性イオン多糖類の局所又は全身投与によって行われ、個体の内臓において、前記抗原特異的Tregを発生させる、請求項15に記載の発生方法。前記抗原が、リウマチ性関節炎、心筋炎症、硬皮症、I型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性肝炎及び重症筋無力症からなる群より選択される疾患に関連する、請求項1に記載の発生方法。個体において、抗原特異的抗炎症制御性T細胞を誘発する時間及び条件で、特異的な抗原に結合した両性イオン多糖類によって前記個体を治療することを含む、前記個体における抗原特異的炎症の抑制方法。前記多糖類がPSAである、請求項18に記載の抑制方法。同じ小胞上又は小胞内に、前記両性イオン多糖類と前記抗原とを含ませることにより、前記両性イオン多糖類が前記抗原に結合する、請求項18又は19に記載の抑制方法。前記両性イオン多糖類が、物理的結合によって前記抗原に結合する、請求項18に記載の抑制方法。前記両性イオン多糖類が、直接的又は間接的な連結によって前記抗原に結合する、請求項18に記載の抑制方法。前記抗原が、リウマチ性関節炎、心筋炎症、硬皮症、I型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性肝炎及び重症筋無力症からなる群より選択される疾患に関連する、請求項18に記載の抑制方法。a抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる当該抗原に特異的な制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、T細胞と、両性イオン多糖類とを、又は、b抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる、当該抗原に特異的な制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、両性イオン多糖類とを、接触させることを含む、抗原特異的抗炎症制御性T細胞の発生方法。前記多糖類が、PSAである、請求項24に記載の発生方法。前記両性イオン多糖類が、小胞内又は小胞の細胞表面上に存在する、請求項24又は25に記載の発生方法。前記小胞がOMVである、請求項26に記載の発生方法。前記両性イオン多糖類が、抗原に結合している、請求項24に記載の発生方法。前記接触が、インビトロで行われる、請求項24に記載の発生方法。前記発生した抗原特異的制御性T細胞が、患者に注射される、請求項24に記載の発生方法。本明細書で提供するのは、抗原特異的制御性T細胞、並びに、関連する組成物、方法及びシステムであり、いくつかの実施形態でこれらは、インビトロ及び/又はインビボにおける抗原特異的炎症誘発細胞介在性及び/又は液性免疫反応を抑制することができる。第1態様に従うと、抗原特異的抗炎症制御性T細胞の発生方法が説明される。該方法は、抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、T細胞と、抗原に結合した両性イオン多糖類と、を接触させることを含む。第2態様に従うと、抗原特異的抗炎症制御性T細胞の発生方法が説明される。該方法は、抗原に対する炎症反応を抑制することのできる抗原特異的制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、T細胞と、本明細書で説明する組換えバクテロイデスフラジリスBacteroidesfragilisと、を接触させることを含む。第3態様に従うと、抗原特異的抗炎症制御性T細胞の発生方法が説明される。該方法は、抗原を提示する抗原提示細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、抗原に結合した両性イオン多糖類と、を接触させることを含む。該方法は、抗原に対する炎症反応を抑制することのできる抗原特異的制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、抗原を提示する抗原提示細胞と、T細胞と、を接触させることを更に含む。第4態様に従うと、抗原特異的抗炎症制御性T細胞の発生方法が説明される。該方法は、抗原を提示する抗原提示細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、本明細書で説明する組換えバクテロイデスフラジリスとを接触させることを含む。該方法は、抗原を提示する抗原提示細胞と、制御性T細胞とを接触させ、抗原に対する炎症反応を抑制することのできる抗原特異的制御性T細胞を発生させることを更に含む。第5態様に従うと、組換えバクテロイデスフラジリスが説明され、組換えバクテロイデスフラジリスは、多糖類Aと結合した異種の抗原を発現する。第6態様に従うと、本明細書で説明される抗原特異的抗炎症制御性T細胞の発生方法によって得ることのできる、抗原特異的抗炎症制御性T細胞が説明される。第7態様に従うと、抗原特異的抗炎症制御性T細胞の発生システムが説明される。該システムは、抗原を発現する組換えバクテロイデスフラジリス、両性イオン多糖類、T細胞及び抗原からなる群より選択される少なくとも2つを含む。第8態様に従うと、個体において抗原特異的炎症を抑制する方法が説明される。該方法は、抗原に特異的な個体において抗原特異的制御性T細胞を誘発する時間及び条件で、抗原に結合した両性イオン多糖類によって、個体を治療することを含む。第9態様に従うと、個体において抗原特異的炎症を抑制する方法が説明され、該方法は、抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、多糖類Aと結合した抗原を発現する組換えバクテロイデスフラジリスによって、個体を治療することを含む。第10態様に従うと、個体における抗原特異的炎症誘発T細胞応答と関連する個体の疾患の治療方法が説明される。該方法は、抗原特異的抗炎症T細胞によって個体を治療することを含み、該抗原特異的抗炎症性T細胞は、抗原特異的炎症誘発T細胞応答の特異的抗原に特異的である。本明細書で説明されるTreg、並びに、関連する組成物、方法及びシステムは、医学、薬学、獣医学用途、並びに、基礎生物学研究及び種々の用途に関連して使用することができ、抗原特異的Tregの発生が望ましい本明細書を読むことにより、当業者によって認識することができる。一実施形態では、抗原特異的抗炎症制御性T細胞の発生方法が提供され、該方法は、a抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、T細胞と、抗原に結合した両性イオン多糖類とを、又は、b抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、抗原に結合した両性イオン多糖類とを、接触させること、を含む。別の実施形態では、抗原特異的抗炎症制御性T細胞の発生方法が提供され、該方法は、a抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、T細胞と、両性イオン多糖類とを、又は、b抗原特異的制御性T細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、両性イオン多糖類とを、接触させること、を含む。本開示の1以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に示される。他の特徴、目的、利点は、本明細書及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかであろう。本明細書に組み込まれ、一部を構成する添付の図面は、発明の詳細な説明及び実施例の項と共に、本発明の1以上の実施形態を説明し、発明の原則及び遂行を説明する役割を果たす。本明細書で説明する方法及びシステム並びに関連する組成物が、以下の例において更に説明され、例は説明を目的として提供され、限定することを意図するものではない。特に、以下の例は、B.フラジリスに特異的な、抗原特異的T制御性細胞の発生に関する。特にここで説明されるのは、B.フラジリス自体に対して宿主によって引き起こされる免疫反応を特異的に阻害することのできるPSA及び/又はB.フラジリスによって発生するTregである。当業者は、B.フラジリスに結合したPSA又はPSAを発現するB.フラジリスについて本明細書で例示する方法及びシステムの、別の抗原他の細菌又は病原体若しくはそれに結合した分子を含むに結合した両性イオン多糖類への適用性について、本明細書の教示を考慮して理解するであろう。更に、当業者は、所定の抗原が疾患を誘発し、抗原に特異的なTregを組み換えて免疫を抑制することができる炎症介在性疾患の治療又は予防のための抗原の投与への本明細書で例示する方法及びシステムの適用性を理解するであろう。以下の物質及び方法は、本明細書で例示する方法及びシステムの全てに使用された。マウス及び細菌生後8~10週間のSPF特定病原体未感染のC57Bl/6マウスを、タコニックファーム社から購入した。タコニック社から購入した生後8~10週間のSPFBalb/cマウスを、結腸炎TNBSモデルに使用した。C57Bl/6バックグラウンドのFoxp3-GFPは、タラルシャティラTalalChatilaカリフォルニア大学ロサンジェルス校からの厚意による寄贈であった。Foxp3-GFPマウスは、ヘリコバクター種を持たなかった。TLR2-/-マウスは、ジャクソン社から購入した。無菌のC57Bl/6及びRag-/-マウスを、カリフォルニア工科大学のプラスチックトレクスラーアイソレータplasticTrexlerisolatorsで飼育し、加圧滅菌処理した食物及び水を与え、毎週、PCR及び微生物プレート法でスクリーンをかけ、確実に無菌にした。無菌C57Bl/6Foxp3-GFP又はFoxp3-DTRの骨髄キメラを得るために、C57Bl/6又はRag-/-無菌マウスに、致死的な放射線を照射し、Foxp3-GFPドナーの骨髄によって、後眼窩注射又は眼窩内注射することによって再形成した。マウスは即座に、新たな加圧滅菌したケージに置かれ、2ヶ月の再形成期間に亘って抗生物質100mg/mlのゲンタマイシン及び10mg/lのエリスロマイシンを含んだ水を与えられた。マウスには、エリスロマイシン及びゲンタマイシンに耐性である、B.フラジリスNCTC9343の株を経口的な強制飼養によって定着させた。移入実験のため、細胞の移入前に24時間、無菌Rag-/-マウスに亜致死的に放射線照射した。ジフテリアトキシン実験のため、マウスに50μg/kgのジフテリアトキシンを腹腔内にi.p.連続2日、その後3日置きに投与した。治療の10~14日後の間にマウスを屠殺した。マウスは全てLbDiet500010の食事を与えられ、カリフォルニア工科大学のIACUCガイドラインの下、世話された。インビトロ抑制評価CD4CD25又はCD4Foxp3細胞を、Tregの供給源として使用した。CD4CD25-細胞を、1mlの5mMCFSEストックによって37°Cで10分間パルスに供した。CFSE標識細胞をPBSで2度洗浄し、すぐに使用した。1x105マイトマイシンCシグマ社処理したCD4欠損脾細胞を、CFSEパルス化CD4CD25-又はFoxp3-応答細胞と混合した。CD4CD25Treg細胞の示した希釈物を丸底の96穴プレート中に滴定し、1μg/mlの抗CD3を添加した。培養物を3~4日間インキュベートした後、フリーサイトメトリーによって分析した。定量的リアルタイムポリメラーゼ鎖反応トライゾルインビトロゲン社を使用して、RNAを、徴候を示した細胞から回収した。cDNAは、製造業者の指示書バイオ-ラッド社により、iSCRIPTcDNAsynインビトロ論文キットを用いて作製した。qRT-PCR反応を、製造業者の指示書バイオラッド社によってIQSYBRグリーンスーパーミックスを使用して行った。反応はバイオ-ラッドIQ5q-PCR機で行った。プライマーは、以下の通りである。ICOSF5TACTTCTGCAGCCTGTCCAT3R5CAGCAGAGCTGGGATTCATA3FOXP3F5GCAATAGTTCCTTCCCAGAGTTCT3R5GGATGGCCCATCGGATAAG3IL10F5CTGGACAACATACTGCTAACCG3R5GGGCATCACTTCTACCAGGTAA3EBI3F5AGCAGCAGCCTCCTAGCCT3R5ACGCCTTCCGGAGGGTC3GITRF5TGCCCAGCTATACCCTTGGT3R5CCGCTCTCATACACCCACTTC3CD25F5AACCATAGTACCCAGTTGTCGG3R5TCCTAAGCAACGCATATAGACCA3L32F5AAGCGAAACTGGCGGAAAC3R5TAACCGATGTTGGGCATCAG3実験的結腸炎生後8週間のBalb/cマウスをタコニック社から購入した。50μgのPSAで動物を、TNBSの投与前の6日間、1日置きに、事前処理した。50エタノール中の0.75~1.5のTNBSシグマ社を、3.5Frシリコーンカテーテルインステックソロモン社を使用して直腸から染みこませた。TNBS投与後5日間、剖検まで毎日マウスの体重を量った。固有層リンパ球抽出結腸は、腸間膜及び残った脂肪を注意深く洗浄し、長手方向に切り裂かれた後、大きな断片1~1.5cmに切り分けられた。断片を50mlのコニカルビーカーに入れ、良く冷えたPBSインビトロゲン社によって十分にゆすいだ。洗浄した腸断片を、15mlの上皮細胞解離溶液5mMEDTA及び10mMHepesを含んだ、Ca及びMgを含まないHBSS中に37°Cで15分間、穏やかな攪拌100rpm下に設置した。この工程をもう一度繰り返した。次いで断片を、カミソリの刃で細かく切り刻み、その後、消化溶液5FBS、3ユニット/mlのディスパーゼ、0.5mg/mlのコラゲナーゼD及び0.5mg/mlのDNAaseI全てワーシントンバイオケミカル社からを含んだHBSS中に設置し、37°Cでゆっくりとした回転によって20分間消化し、十分にボルテックスに供した。上清を40μm細胞ろ過器によってろ過して回収した。消化を更に2回繰り返し、LPLを8mlの40パーコールに再懸濁し、これを80パーコールGEヘルスケア社5mlの上に重ねた。遠心分離の後、LPLを40及び80勾配の界面から回収し、洗浄し、説明される通りに使用した。細胞内での細胞染色Foxp3の細胞内での細胞染色については、0.5~1x106の細胞をまず表面染色した後、100mlの固定及び浸透緩衝液イーバイオサイエンス社中で浸透させ、固定した。IL-10及びIFNγ細胞内サイトカイン染色には、固有層リンパ球を抽出し、750ng/mlのイオノマイシンと50ng/mlのPMAカルバイオケム社によって、0.5μlのゴルジプラグBDバイオサイエンス社の存在下、37°Cで4~5時間、再活性化した。続いて細胞を、表面染色し、2のパラホルムアルデヒドによって固定した。1x106の細胞に、100μlの固定及び浸透緩衝液イーバイオサイエンス社を一晩浸透させた。細胞を0.3μgの抗IL-17A又はIL-10で、4°Cで20分間染色した。抗体は全て、エーバイオサイエンス社から購入した。細菌性抗原の調製細菌培養物を集菌し、PBSで十分に洗浄し、超音波処理に供した。崩壊した培養物を10,000Xgで20分間回転させ、上清を回収した。タンパク質濃度の決定のためにブラッドフォードを使用した。使用するまで上清を-20°Cで保存した。細菌のFACSスラックらのプロトコールを使用して、IgAの細菌への結合を直接的に測定したスラックら、2009年。要するに、1mlの細菌培養物を緩衝液PBS1BSA,0.05アジ化ナトリウムで洗浄した。溶解性の結腸内容物を緩衝液中、1:10に希釈し、更に希釈した1:2、1:4、1:6。25μlの抗体溶液と25μlの細菌懸濁液とを混合し、4°Cで1時間インキュベートした。染色前に、モノクローナルPE-amouseIgA1:250;エビオサイエンス社によって細菌を30分間4°Cで洗浄した。細菌を洗浄し、PFA中に固定し、対数モードでFSC及びSSCのパラメータを使用してフローサイトメトリーにより分析した。IgA免疫ブロット細菌培養物1mlをペレット化して十分に洗浄し、PBS1ml中に懸濁し、超音波処理に供した。細菌性の溶菌液を20分間、10,000xgで回転させ、上清をブラッドフォードに供した。等量の溶菌液をSDSポリアクリルアミドゲル上に走らせ、PVDF膜へと移動した。膜を、5のミルクによって室温で一晩塞いだ。等量の溶解性結腸内容物ブラッドフォードによって測定された通りを使用して、これらの膜を一晩、4°Cでプローブした。膜を十分に洗浄した後、ビオチン結合抗マウスIgA及びストレプトアビジン-HRPによってプローブした。結腸IgAの回収及びELISA小腸又は結腸を、長手方向に開き、腸内容物排泄物及び粘液を含むを、プロテイナーゼインヒビターの混合物を含んだ500μLのPSBロシュ社中に回収した。試料の重量を測定し、8000xgで、4°Cで10分回転させた。上清を回収し、使用するまで-20°Cで保存した。細菌特異的なIgAELISAについては、96穴プレートを、B.フラジリス、B.テタイオタオミクロン又はB.バルガトゥスから回収した、PBS100μL/穴中の2μg/mlの溶菌液で、4°Cで一晩、被覆した。プレートを、アッセイ希釈液エーバイオサイエンス社で1時間、室温で塞いだ。10μLの結腸内容物を100μLのアッセイ希釈液に希釈し、連続的に更に1/104倍まで逐次希釈した。試料を4°Cで一晩放置した。ビオチンに結合した抗マウスIgAを室温で1時間、1/1000の希釈で使用し、ストレプトアビジン-HRPサザンバイオテック社を室温で1時間、1/1000の希釈で使用した。統計学データセット間での差を、マン-ホイットニーU試験又はスチューデントt検定によって、マイクロソフトエクセル又はプリズム5.0を使用して分析した。例1.PSAは、炎症の存在又は非存在下でTregの成長及び拡大を誘発し、誘発されたTregは、インビトロ及びインビボで機能的に抑制的である有名なヒト共生生物であるバクテロイデスフラジリスは、カプセル状多糖類、PSAの産生によって、腸炎及び実験的結腸炎を予防する27。実験的腸炎からの保護の間、PSAのFoxp3Tregに対する影響を決定するため、腸炎を誘発し、精製PSAによって経口的に治療した動物の免疫細胞を分析した。著しく体重を失った治療動物は、結腸の著しい肥大、リンパ球の進入及び上皮過形成を示したので、TNBS治療によってT細胞介在性の結腸免疫反応が得られたデータなし、引用文献27。既に報告されているように、疾患は、PSAを与えたTNBS治療動物中では明らかではなかった。ビヒクル処理PBS及びPBS処理TNBS動物TNBSPBSは、腸管膜リンパ節MLN内で同様のTreg細胞割合を有していた図1A。PSAの抗炎症性と一致して、PSAを与えたマウスは、MLNのCD4CD25区画内でFoxp3細胞の割合を、再生可能な方法で10増加させた図1A。更には、MLN中のCD4CD25Foxp3細胞の絶対数は、PBS又はビヒクル治療動物と比較した場合、PSA治療動物中で著しく高かった図1B。MLN中のB細胞の割合は、PBS及びPSAを与えたマウス間では相違は無かったため、Foxp3Treg集団のPSA拡大は特異的であった図1G。PSA治療マウス中のFoxp3細胞の割合の増加に一致して、総MLN中のFoxp3転写産物の発現が増加した図1C。Foxp3発現が、結腸からのPSA介在性の保護の間、CD4CD25細胞において1細胞ごとの基準で、増加したことも見出され図2B、このことは、PSAが、比例的且つ細胞固有のFoxp3発現を上方調節することを立証した。動物のPSA治療が、未知のCD4T細胞の小集団を拡大することも以前に報告されており7、現在の結果は、この集団がCD4CD25Foxp3Treg細胞の可能性があることを示唆する。Treg細胞の主要な機能の1つは、炎症性Tエフェクター細胞の活性化及び増殖を抑制することである。Treg細胞の機能的能力は、蛍光色素分子であるCFSEこの染料の希釈は、細胞分割の期間と比例するによってパルスされた未処理CD4CD25T細胞による、インビトロでの増殖の抑制を測定することによって評価することができる。実験的結腸炎からのPSA介在性保護の間のTregの抑制能力は、ビヒクルのMLNPBSのみでTNBSなし及びPBS-若しくはPSA治療結腸炎マウスから精製した、様々な量のCD4CD25Treg細胞を添加することによって決定された。予想された通り、Tregの非存在下、90を超えるエフェクター細胞が増殖しデータなし、これは、ビヒクル又はPBS治療結腸炎マウスからのTregが培養物に添加されたときに部分的に抑制された図1D。しかしながら、とりわけ、PSAを与えたマウスTNBSPSAのMLNから単離したTregは、未治療動物の細胞と比較して、著しく高いレベルまでT細胞増殖を抑制しTeff:Treg比1:2で43.5増殖細胞対63.5、このことは、PSAによって結腸炎から保護した動物のTregが、機能的に抑制活性を有することを立証する。腸炎応答の間に著しい変化抗原特異的T及びBリンパ球の拡大、自己免疫細胞の活性化、及び、炎症性サイトカインの多量の分泌が含まれるが生ずる。これらの事象は、サイトカイン環境と、免疫経路の数多くの配列に影響を及ぼす能力との複合をもたらす。しかしながら、定常状態の間、これらのサイトカインの多くは発現されず、細胞及び分子的な腸内環境は、免疫の間に見られるのとは大きく異なっている。ホメオスタシスの間共生定着の間等にPSAがTregを拡大させるかを決定するために、マウスにPSAを与え、定常状態の間のMLN内のTregのCD4CD25Foxp3集団をモニターした。PSA治療しマウスは一貫して、MLN中のCD4CD25Foxp3小集団内で増加した割合のFoxp3細胞を有していた図1E。更にはホメオスタシスの間、PSA治療動物から単離したTregは、コントロール動物と比較して、エフェクターT細胞応答を抑制する非常に高い能力を示したTeff:Treg比1:2で28.5の増殖細胞対43.0図1F。本願の例で説明される知見は、腸炎の存在下又は非存在下で、PSAが機能的Tregを誘発することを示す。例2.PSAは、MHCTCR認識によって機能抑制的Tregの成長を誘発することができる微生物叢は、免疫系の発達及び機能に大きな影響を有するマクファーソン及びハリス、2004年。無菌動物へのバクテロイデスフラジリスの定着は、免疫細菌共生関係の研究のモデルシステムを示すマスマニアンら、2005年。最近の研究は、腸のホメオスタシスの維持の間にTreg産生IL10にとって重要な役割を有することを示したのでルトソブら、2008年、B.フラジリスの定着が、Foxp3Tregの成長及びサイトカイン産生にどのように影響を与えるかを理解することが必要である。無菌のC57B1/6マウスを、野生型B.フラジリス又はPSA欠損株B.フラジリスΔPSAに単独定着させた図4,6。最近の研究アタラシら、2008年;イヴァノヴら、2008年と一致して、結腸内のCD4Foxp3Tregの割合は群間で有意な差はなく図6、このことは、微生物叢が、腸内では天然のTreg細胞に影響を及ぼさなかったことを示唆する。興味深いことに、微生物叢の非存在下では、IL-10転写物の産生はなく、更には、B.フラジリスの定着は、結腸内においてPSA依存的様式でIL-10産生を修復する図3A。B.フラジリスの無菌動物への単独定着によって、IL-10産生CD4Foxp3Tregの割合が著しく増加する図3。B.フラジリスΔPSAを定着させた動物からのTregは、無菌マウスと同様のIL-10レベルを有するので、B.フラジリスによるFoxp3T細胞からのIL-10の誘発は、PSAに依存する。B.フラジリスの定着は、ほぼ例外なくFoxp3及びFoxp3-T細胞からのIL-10産生を指揮する図2A,3D。従来法で定着させた動物と比べると、無菌マウスは、CD4Foxp3Tregにより産生された、より低い発現レベルのIL-10、Foxp3及びTGF-β2を示す図2A及び図5C。B.フラジリスの単独感作は、これらの抗炎症性遺伝子の発現、即ち、完全にPSA依存性である表現型を著しく回復させる。CD25等の天然のTregマーカーは変化しない。従って、PSAは、内臓内のFoxp3IL-10Tregの成長を、動物への通常の定着の間に誘発する。PSAは、新たにTreg変換を指揮することができるか否かを調べるため、CD4Foxp3-T細胞をFoxp3-GFP動物から精製しリンら、2007年、無菌Rag-/-リンパ球減少マウスに適合移植した。動物の群を、無菌のまま残すか或いは野生型又はB.フラジリスΔPSAを定着させた。図5Aは、Treg変換が無菌マウスでは起こらなかったのに対し、野生型B.フラジリスによる定着が、著しいレベルのFoxp3Tregを誘発したことを示す。B.フラジリスΔPSAを定着させた動物が無菌動物に匹敵する数のTreg細胞を含んでいたので、PSAは、Treg変換に必要である図5A。更には、B.フラジリス定着動物中のFoxp3T細胞は、IL-10発現を獲得した図5B。総合すると、結腸内のCD4Foxp3IL-10Tregの系統的分化は、内臓細菌を必要とし、このことは、PSAが、Foxp3Tregの成長を調節する腸内微生物叢の第1細菌分子であることを明らかにした。例3.PSAにより誘発されたTregは、特徴的且つPSA特異的な抗炎症性遺伝子発現プロファイルを示すTregは、IL-10、TGF-β及びIL-35の分泌によって炎症反応を強く抑制するコリソンら、2007年;メイナードら、2007年。更には、接触依存性のメカニズムには、パーフォリン及びグランザイムの分泌ゴンデックら、2005年、並びに、抗炎症性表面レセプターGITR及びCTLA-4等の発現ヴィグナリら、2008年によるエフェクターT細胞の細胞溶解が含まれる。Tregの多くの小集団がFoxp3集団内に存在するため、PSAがFoxp3Tregの機能的能力にどのように影響を及ぼすかを理解するべく、PSA治療に応答したTreg関連遺伝子の発現を分析した。Foxp3-GFPマウス緑色蛍光タンパク質がFoxp3タンパク質を示すをPSAによって又はPSBコントロールによって経口的に治療し、MLNからのCD4Foxp3又はCD4Foxp3-T細胞の両方について、遺伝子発現分析を行った。予測したとおり、IL-10、TGF-β2を含んだTreg関連遺伝子は、Foxp3-T細胞と比較して、Foxp3を著しく増加させたPBS試料;図2A。PSAは、CD4Foxp3Tregから8倍を超える増加したレベルのIL-10を著しく誘発したが、CD4Foxp3-T細胞には実質的には何ら影響を及ぼさなかった。従って、PSAは、Foxp3Treg細胞中でTGF-β2の著しい誘発を引き起こした。PSA治療は、グランザイムB、パーフォリン及びCCR6の転写も著しく増加させ、ケモカインレセプターは、Treg細胞の移動に関与していることが示された図2Aヤマザキら、2008年。PSAは、TGF-β1の発現のように、Treg由来のサイトカイン全てに全体的に影響を及ぼすわけではなく、Ebi3は変化せず、このことは、区別可能なTregプロファイルへの特異性を立証する。更には、PSA治療に応答する、天然のTreg結合表面分子CTLA-4、GITR、CD25及びICOSの産生は、Foxp3細胞内では変化しない図2A。総合すると、これらのデータは、PSAが、誘発性のFoxp3iTregを活性化し、Foxp3Treg細胞内での、PSA特異的な遺伝子発現プログラムを明らかにすることを示唆する。別の実験では、Foxp3-GFPマウスを、PSA又はPBSコントロールによって強制飼養し、RNAを、MLNのCD4Foxp3-非Treg又はCD4Foxp3Treg細胞から抽出し、その後FACS精製に供した。予測されるように、Foxp3-及びFoxp3T細胞の小集団での遺伝子発現は、著しく異なっており、Foxp3T細胞中のIL-10、TGF-β1、CD25、GITR、ICOS及びCTLA-4のより高い基礎レベル値を含んでいた図2A。腸炎からのPSA介在性保護には、未知のCD4T細胞集団によるIL-10産生が必要とされることがこれまでに報告されている27。非常に興味深いことには、PSAは、PBS治療細胞中で発現したものと比較して、CD4Foxp3からの8倍を超える増加したレベルのIL-10を誘発する図2A。PSAは、非Treg細胞中でTGF-β2発現をわずかに上方調節するが、Treg細胞中で7倍を超えるTGF-β2の誘発を引き起こす。PSA治療もまた、Foxp3TregからのグランザイムB及びパーフォリンの転写を著しく増加する。PSAは、Treg由来のサイトカインに、Ebi3の発現のように全体的には影響を及ぼさず、TGF-β1は変化せず、このことは、PSA誘発性Tregプロファイルの特異性を立証することは重要である。更には、PSA治療に応答した、天然のTreg結合表面レセプターであるCD25、GITR、ICOS及びCTLA-4の産生は、Foxp3細胞内では変化しない図2A。総合すると、これらのデータは、PSAが、サイトカイン及び細胞溶解性のメカニズムによって炎症を抑制する、誘発性のFoxp3Tregを活性化し、このことはTreg細胞内でのPSA特異的な遺伝子発現プログラムを明らかにすることを示唆する。例4.PSAによって誘発されたTregは、IL10産生及び/又はTh1プロファイルの活性化によってT細胞耐性を活発に生じさせるTregを拡大させるのにPSAのみで十分であるかを決定するべく、従来法で定着させたマウスにPSAを与え、MLN内でのCD4Foxp3Tregの割合をモニターした。PSAによって経口的に治療したマウスは、MLN内でCD4Foxp3T細胞の増加した割合を示す図1A。Treg細胞の主要な機能のうちの1つは、炎症性Tエフェクター細胞の活性化及び増殖を抑制することである。Treg機能は、MLNから精製したCD4CD25T細胞と、未処理CD4CD25-T細胞とを様々な割合で添加することによって決定した。PSA治療動物から単離したTregは、PBS治療コントロール動物と比較してインビトロでT細胞応答を抑制する、相当高い能力を示す例えば、1:2のTreg:Teff比で、28.5の増殖細胞対43.0ことが見出された図1F。これらの知見は、従来法で定着させた動物において、PSAが、増強した抑制能力を有する機能性Foxp3Tregを誘発することを立証する。出願人は、これまでに、無菌動物にPSA産生細菌を定着させることによって、脾臓CD4T細胞内でTh1サイトカインインターフェロン-gIFNγを増加させることを報告したマスマニアンら、2005年。特に、出願人はこれまでに、PSAによって誘発されたTregが、Th1/Th2応答を指揮する能力を有することを示したマスマニアンら、2005年参照。Th1応答は一般的には、転写因子T-betによって調節することができると考えられているが、近年の報告は、Foxp3Tregの小集団は、T-betを発現するが、IFNγ発現を欠くことを明らかにしたコホら、2009年。野生型B.フラジリスを定着させた動物のMLN内のCD4Foxp3T細胞は、PSA依存様式でT-betを発現することが見出された図8B。興味深いことに、これらの細胞は、IFNγを産生しない図8D。しかしながら、同じ動物の脾臓CD4T細胞は、PSA依存様式で非TregからIFNγを発現する図8。脾臓T細胞は、MLNとは異なり、IL-10を産生しない。これらの結果は、防御反応を生じさせるPSA誘発性Tregの能力における区画差を明らかにする。特には、PSA誘発性Tregが脾臓においてTh1プロファイルを誘発することができるが、内臓での対応するTregは、IL-10産生によって耐性を促進することができる。更には、内臓内でFox3IL10Treg細胞の成長を促進するPSAの能力は、更に、PSAが粘膜耐性を活発に生じさせるという考えを裏付ける。例5.マウスへのB.フラジリスの単独感作は、B.フラジリス特異的なPSA依存性Treg応答を生じさせる無菌マウスは、数々の発育上及び機能的欠陥を有し、このことは、微生物叢が、腸内免疫応答に大きな影響を及ぼすことを示唆する4。無菌マウスの単独感作は、個々の細菌種の生理学的寄与を分析し、細菌変異体の比較定着によって分子機能を割り当てる、理想のモデルシステムを提供する。B.フラジリスの定着がTreg細胞の成長にどのように影響を及ぼすかを更に理解するべく、無菌のC57Bl/6マウスを、全ての造血細胞を欠損させるべく致死的に放射線照射し、それらを、Foxp3-GFP動物の骨髄によって再形成した。続いてマウスを、無菌のままにするか、或いは、野生型B.フラジリス又はPSA欠損した株B.フラジリスΔPSAを単独感作させた。マウスを毎週PCRによってモニターし、それらの微生物学的状態を確実にした図3E。最近の報告21,23と一致して、MLN又は結腸内に存在するTregCD4Foxp3細胞の割合は、群間で大きな差はなくデータなし、このことは、微生物叢が、腸内の天然Treg細胞の存在の必要条件ではないことを示唆する。しかしながら、腸内のFoxp3TregのIL-10産生は、微生物叢の非存在下では欠損しており、更にはB.フラジリスの定着は、PSA依存様式で結腸内でのIL-10産生を回復させる図3A。無菌動物へのB.フラジリスの単独感作によって、結腸内のIL-10産生Tregの割合の2.5倍を超える増加をもたらす図3B及び3C。B.フラジリスΔPSA定着動物内で分析したTregは、無菌マウスと同様のIL-10レベルを有するので、Foxp3細胞からのB.フラジリスによるIL-10の誘発は、ほぼ完全にPSAに依存している。最近の研究は、Foxp3TregからのIL-10産生が、粘膜表面におけるホメオスタシスを維持するのには非常に重要であることを示している31。従って、B.フラジリスによる共生定着は、腸の区画内の機能的なIL-10-産生Tregの成長を指揮する。Tregの遺伝子発現プロファイルに対する微生物定着の影響を調査するべく、CD4Foxp3T細胞を従来法によって定着させた無菌のB.フラジリス又はB.フラジリスΔPSA単独感作マウスのMLNから精製した。無菌マウスは、従来法で定着させたマウスと比較した場合、CD4Foxp3Treg集団内でのIL-10、Foxp3及びTGF-β2発現の欠損を示した図3D。B.フラジリスの単独感作は、完全に、これらの遺伝子3の全ての発現を回復させた。B.フラジリスΔPSAの動物への単独感作は、これらの抑制遺伝子の発現を向上させないので、IL-10、Foxp3及びTGF-β2の誘発は、B.フラジリスによるPSA産生に完全に依存している。CD25は、恒常性細菌定着によって影響されないので、遺伝子発現の変化は、誘発性Tregマーカーに特異的である。従って、共生細菌による定着が、Treg関連遺伝子のプログラミングに著しい影響を与え、このことは、B.フラジリスが、宿主の共生の間に寛容原性腸内免疫環境を誘発することを実証する。例6.Tregに対するPSA活性は、トール様レセプター2シグナル伝達を必要とする多くの微生物生産物は、トール様レセプターTLR等のパターン認識レセプターによって感知される。TLRシグナル伝達は、歴史的に見て、炎症を誘発すると考えられていたが、一連の研究は、TLRシグナル伝達が、抗炎症反応も促進することができることを示すファンマレンら、2008年に概説される。PSAは、近年、TLR2シグナル伝達によって、自然免疫細胞からのサイトカインの産生と連動していることを示したがワンら、2006、Treg成長におけるTLR2の役割は未知のままである。PSAがTreg生物学と連動しているメカニズムを理解するべく、TLR2欠損動物を、PSAを用いて経口的に治療し、CD4Foxp3T細胞成長について分析した。野生型動物に見られるTreg拡大とは対照的に図7A、PSAによって治療したTLR2-/-マウスにおけるCD4Foxp3T細胞の割合に差が観察されなかった図7。更には、PSAに応答したTregによるIl-10の誘発は、TLR2発現の非存在下では失われる図7B。当該知見は、TLR2ノックアウトマウスがFoxp3Treg細胞を欠損しているという報告と完全に一致しているリウら、2006年;ストミュラーら、2006年。自然免疫シグナル伝達がTregの系統的分化にどのように寄与するかを完全に理解するには、更なる研究が必要であるが、PSA介在性のTregの成長は、TLR2依存的なメカニズムである。例7.PSAの非存在下、B.フラジリスは、B.フラジリス特異的な炎症性免疫応答を誘発するほとんど全ての細菌は、パターン認識レセプターのための微生物リガンド例えば、LPSエンドドキシン、ペプチドグリカン、非メチル化CpG等を共有し、このことは、分子メカニズムが、粘膜免疫系に、共生細菌と病原性細菌とを区別させなければならないことを示唆する。この区別のための現行の理論は、免疫系と微生物叢免疫学的無視との空間分離、及び、自然免疫抑制を含むフーパー、2009年。微生物の感染を制御すべく、免疫系は、炎症誘発Th17細胞の機能を生じさせる。宿主組織への付随的な損傷を予防するため、Tregは、Thl7免疫を制御し、Tregの機能は、無害の非自己及び自己抗原の双方への免疫反応の抑制のに必要である。更には、共生及び病原性細菌は、パターン認識レセプターのための多くの微生物リガンドを共有し、このことは、分子メカニズムが、免疫系に有益細菌と有害細菌とを区別させなければならないことを示唆する。哺乳類の腸の一生の定着の間、B.フラジリス及び考えられる他の共生生物は、宿主における有害な炎症を予防すべく、‘自己’として許容されなければならないと結論付けられた。従って、PSAは、Th17応答を抑制することによって、B.フラジリス抗原に対する免疫耐性を許容するように発達してきた可能性があるという仮説が立てられた。既刊文献21,23とも一致して、無菌動物は、従来法によって定着させた動物と比較した場合、結腸内に実質的にTh17細胞を持たない図4A及び図6C図9A。B.フラジリス単独感作動物は、結腸内でTh17細胞を著しく生じさせないが、PSAの非存在は、実質的に増加した腸内Th17細胞応答をもたらす。B.フラジリスΔPSAに単独感作させた動物から単離した結腸固有層リンパ球は、増加したIL-17Aの分泌図4A図9及び増加したRORytの転写、Th-17特異的な系統的分化因子図4D図7Cを有する。更には、B.フラジリスΔPSA定着動物のMLNから精製したCD4Foxp3-T細胞は、IL-17A及びRORγtのレベルを増加させた図4C及び図4D。増加したTh17細胞を有する動物では結腸炎の徴候は観察されなかった。Th17細胞の分化は、TGF-β及びIL-6の存在下でのT細胞レセプターの刺激に応答して生ずる。特異的に定着させた動物からのT細胞応答の大きさを決定すべく、CD4T細胞をMLNから精製し、IL-17Aを産生する細胞の能力を、インビトロでのTh17スキューイングアッセイ中に評価した。B.フラジリスに単独感作させた動物の細胞は、TGF-β及びIL-6の存在下においてさえ、無菌動物と同等のレベルのIL-17A産生を有する。とりわけ、PSAを欠損したB.フラジリスB.フラジリスΔPSAを定着させた動物のCD4T細胞は、野生型を定着させた動物から回収した細胞と比較して、著しく増加したレベルのIL-17A産生を示す図4E。これらのデータは、B.フラジリスに単独感作した動物から単離したT細胞が、Th17分化に対して本質的に耐性があることを示す。ATPは、近年、腸内の微生物叢がTh17細胞の成長を腸内で開始させることができるメカニズムとして実証された23。増加したレベルの内腔ATPが、従来法によって定着された動物に一貫して見出されるが、無菌及びB.フラジリスにより単独感作した動物は、PSAの非存在によっては変化しない著しく低いレベルのATPを有し、B.フラジリスΔPSA動物に見られる増加したIL-7の原因としてのATP異常調節の役割を排除する図8F。これらのデータは、ヒトミクロビオームの共生細菌が実際に、病原体と同様の腸内免疫応答を誘発し得ることを明らかにする。しかしながら、PSA専用の産生によって、B.フラジリスに対する免疫誘発Th17の成長は、活発に抑制され、このことは、免疫学的無視ではなくPSA介在性耐性が、B.フラジリスに対するTh17応答を防ぐモデルを裏付ける。データは、B.フラジリスが、宿主の免疫系によって単に無視されるのではなく、むしろ、専用のPSA産生によって寛容原性の腸内環境を活発に誘発することを実証する。PSAの非存在下の結果起こる宿主の免疫応答は、非特異的な免疫細胞プライミングを表すか又はBフラジリスを対象とするものではないかと考えられている。この考えを検証するべく、腸細胞による炎症誘発免疫応答を、自家又は異種の共生細菌によって惹起された、B.フラジリス又はB.フラジリスΔPSA単独感作動物から測定した。単離した結腸固有層細胞を、加熱死共生細菌の様々な株によってパルスした抗原提示細胞APCによって活性化し、これらの培養のIL-17産生を分析した。最小のIL-17誘発を、抗原の非存在下細菌なし検出した図4F。更には、バクテロイデステタイオタミクロン又はバクテロイデスバルガトゥスによるAPCのインキュベーションによって提供される抗原の添加は、B.フラジリス又はB.フラジリスΔPSA単独感作動物から単離した細胞によって、基礎レベル値のIL-17のみを誘発した。珍しいことに、B.フラジリス単独感作動物の結腸の固有細胞が、B.フラジリス由来の抗原に応答してほとんどIL-17を誘発しなかったのに対して、B.フラジリスPSAを定着させた後、B.フラジリス他の密接に関係するバクテロイデス種ではなくにより刺激したマウスから単離した細胞は、著しい量のIL-17を誘発した。更には、B.フラジリスPSA定着動物からの細胞によるIL-17産生は、野生型B.フラジリスによってAPCをパルスした場合に、より低く、このことは、これまでに報告されていた通り27、PSAが、インビトロでの抗炎症性を有することを示す。B.フラジリスΔPSA細胞による増強したIL-17産生は、MLNでも観察される図4E。従って、当該知見は、PSAの非存在下、宿主が、とりわけB.フラジリスに対する炎症反応を増加させることを明らかにし、このことは、この共生細菌がPSAを進化させ、宿主-細菌の共生の間にそれ自体に対する炎症を抑制することを示唆する。例8.B.フラジリスに対するTh17細胞応答は、抗原特異的であるPSAの非存在の結果として生ずる宿主炎症反応は、非特異的T細胞活性化を表すか又はB.フラジリスの抗原を対象とするのではないかと考えられている。これらの2つの可能性のあるメカニズムを区別するべく、T細胞によるIL-17産生を、B.フラジリス又はB.フラジリスΔPSA定着動物から種々の共生細菌の抗原まで測定した。抗原提示細胞APCを細菌抽出物でパルスし、B.フラジリス又はB.フラジリスΔPSA定着動物から採取した固有層リンパ球によって共培養した。更なる刺激を加えず、抗原特異的応答を正確に測定する。最小のIL-17誘発を、細菌非存在下で検出した図9A。バクテロイデステタイオタミクロン又はバクテロイデスバルガトゥス抗原によってパルスしたAPCは、B.フラジリス及びB.フラジリスΔPSA単独感作動物両方の細胞によって基礎レベル値のIL-17のみを生じさせた。更には、両方のグループの同等のIL-産生によって、B.フラジリスΔPSA定着マウスの細胞は、非B.フラジリス抗原への反応性が低いことが示される。驚くべきことに、野生型B.フラジリス単独感作動物の細胞は、無視できる程度の応答を誘発するが、B.フラジリスΔPSAを定着させた後、B.フラジリスをパルスしたAPC他の密接に関連したバクテロイデス種ではないによって共培養したマウスは、著しい量のIL-17を誘発した。これまでの研究と一致して、APCが野生型B.フラジリスによってパルスされる場合、B.フラジリスΔPSAと比較して応答はより低く、このことは、PSAが、インビトロ細胞培養の間、抗炎症性活性を有することを示すマスマニアンら、2008年。B.フラジリスΔPSA動物からの増強したIL-17産生は、同様にMLNからの細胞中でも観察される図9A。これらの知見は、宿主が、B.フラジリス抗原への炎症性IL-17応答を、PSAの非存在下で選択的に開始することを明らかにする。データは、B.フラジリス抗原に対するTh17細胞の応答が、PSAの非存在下で発展することを示唆する。インビボでこの考えを試験するべく、無菌マウスを、Foxp3-GFP動物からの骨髄によって再形成し、無菌のままとするか、或いは、B.フラジリス又はB.フラジリスΔPSAにより単独感作させた。このアプローチは、PSAの存在下又は非存在下、Th17細胞の誘発を生じさせる。CD4Foxp3-エフェクターT細胞を、3つの定着した群から精製し、B.フラジリスΔPSAを単独定着させたRag欠損動物へと移動した。Th17細胞応答を、B.フラジリス抗原に対するT細胞反応性の指標として分析した。B.フラジリスに単独感作させた動物由来のエフェクターT細胞は、B.フラジリスΔPSAを定着させた動物へと移動した場合に、Th17の最小の発現を有し図5A、このことは、B.フラジリス抗原への無視できる程度の反応性を示す。しかしながら、B.フラジリスΔPSAを定着させたドナーからの細胞を受容したマウスは、B.フラジリス抗原への再曝露によってTh17細胞の割合に著しい増加をもたらした。これらのデータは、B.フラジリス抗原に対するインビボでのTh17細胞成長は、PSAによって妨げられることを示す。例9.PSAは、B.フラジリスに対する抗原特異的IgA応答を抑制する粘膜免疫グロブリンAIgAは、定着の間に内臓細菌に対して産生されるのでスラックら、2009年、PSAもまた抗B.フラジリス抗原産生の発達を妨げているのではないかと考えられている。B.フラジリス特異的なIgAのレベルは、B.フラジリス、B.フラジリスΔPSA又は密接に関連した種であるB.テタイオタオミクロン及びB.バルガトゥスに単独感作させた動物において測定した。無菌、B.テタイオタミクロン又はB.バルガトゥスを単独定着させた動物から単離した結腸の抗原が、B.フラジリス抗原に対して反応性を持たないので、腸内の抗体反応は、非常に特異的である図4F。更には、B.フラジリスを単独感作させた動物の腸内IgAは、B.テタイオタミクロン又はB.バルガトゥスからの抗原とは反応しなかった図11D。増加したT細胞応答の知見と一致して、B.フラジリスΔPSAを定着させた動物は、PSAを発現するB.フラジリスとは反対に、B.フラジリス特異的なIgAの増加したレベルを示す図11C。B.フラジリスΔPSA定着動物中で宿主によって認識される性質及び抗原を決定するため、細菌抽出物を、ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、B.フラジリス又はB.フラジリスΔPSA単独感作動物からのIgAによって調べた。B.フラジリス定着動物から単離したIgAは、B.テタイオタオミクロン又は大腸菌からの抗原に対しては反応性が観察されないので、種特異的である図4F。B.フラジリス抽出物が、B.フラジリスΔPSA単独感作動物から単離したIgAによって検査される場合、野生型定着マウスと比較して、より多い数且つより高い強度の抗原性の種が検出された図10C。更には、総IgAのレベルは、B.フラジリス又はB.フラジリスΔPSA定着動物の間で大きな差がなく図12、このことは、B.フラジリス抗原のみに対する特異的な反応性の特異的な増加を実証する。総合すると、これらのデータは、宿主-細菌共生の間に、B.フラジリスがPSAを発達させて、抗原特異的適応免疫を抑制すること、及び、PSAによって誘発されるTreg活性化は、B.フラジリスに特異的であることを実証する。例10.PSAは、他の共生細菌ではなくB.フラジリスに対するIgA応答を阻害し、抗原特異的粘膜耐性を活発に生じさせる単独感作試験は、免疫応答の抗原特異性を決定するのに有益である。該知見は、PSAが、B.フラジリスに対する適応免疫を抑制することを示すが、それらは、1PSAが、特異的にB.フラジリス抗原への耐性を誘発し、2PSAが、他の細菌の抗原に対して耐性のある免疫環境を誘発すると解釈することができる。これらの2つの可能性を区別するべく、動物にB.フラジリス及びB.バルガトゥスを共定着させ、同じ微生物叢に存在する両方の微生物に対するIgA応答を測定した。B.フラジリス及びB.バルガトゥスは、同等のレベルで動物に定着する図12。B.フラジリス抗原に対する抗体レベルは、共定着の間にPSAによって再度抑制されたが、PSAの存在又は非存在が、B.バルガトゥスに対するIgA反応性には効果がなかった図13。無菌又はB.フラジリス単独感作動物から単離した溶解性の結腸内容物は、B.バルガトゥス由来の抗原と反応しないので、抗体応答は特異的である図13。定量的フローサイトメトリーに基づく評価を使用して、B.フラジリスΔPSAを定着させた動物が、B.フラジリス表面抗原に対して著しく多いIgAを発生させることが確定された図12B及び12C。表面抗原の位相変化のために低いレベルの結合が起こる可能性があるリウら、2008年。B.バルガトゥス抗原に対する結合における差異は、野生型又はフラジリスΔPSAの共定着の間には観察されず図12B,12C及び13、このことは、PSAが、同じ微生物叢に存在する他の共生細菌の抗原に対する耐性を促進することができないことを実証する。これらの結果は、PSAが、恒常的定着の間に、内臓の一般的な寛容原性免疫環境を誘発しないことを立証する。Foxp3Tregは、優勢寛容によって抑制を行う。PSAがB.フラジリス抗原への耐性を介在するTregを誘発する場合、次に野生型細菌が、B.フラジリスΔPSAの抗原への反応を妨げるTregを誘発するべきである。珍しいことに、動物が野生型及びB.フラジリスΔPSAを同じ数保持している場合図11、B.フラジリス抗原に対するIgA反応性の増加は観察されず図12、このことは、PSA産生細菌が、PSAを欠いたB.フラジリス細胞への反応を妨げることを示す。共定着の間のB.フラジリス特異的なIgAのレベルは、野生型を単独定着させた動物のものと同等であり、総IgAレベルが変化しないので、特異的である図11。更には、B.フラジリス抗原のIgA認識は、定量的FC評価を使用した共定着の間には増加しない図12E。この証拠に基づいて、B.フラジリスによって発現したPSAは、その抗原に対する優勢な耐性を媒介するが、同じ微生物叢に見出されるB.バルガトゥス抗原に対しては媒介しないことが結論付けられた。まとめると、当該研究は、PSAが抗原特異的粘膜耐性を活発に生じさせることを確認した。例11.Foxp3Tregは、B.フラジリスに対する適応免疫の抑制に必要であるFocp3Tregが適応免疫反応のPSA介在性の抑制のためのメカニズムを提供することを立証すべく、B.フラジリスを定着させた後、CD4Foxp4T細胞の特異性を除去して、Th17及びIgAの応答を試験した。Foxp3-DTRマウスは、Foxp3プロモータの制御下、ジフテリアトキシンレセプターDTRを発現する。ジフテリアトキシンDTによるマウスの治療は、Foxp3T細胞の除去をもたらし、インビボでのTregの機能分析を可能にするキムら、2007年。これまでの知見図14におけると一致して、Foxp3-DTRによって再形成した、B.フラジリスΔPSAを定着させた無菌動物は、野生型のB.フラジリスを定着させた動物と比較した場合、増加したTh17細胞を、結腸LP及びMLNの両方に保持する図14A及び14B;左のパネル、-DT。同じ組織に由来するCD4T細胞を産生するIFNgに対する効果が無かったため、この相違は、Th17特異的である図14C。最も重要なことであるが、B.フラジリス単独感作動物におけるTregの除去は、結腸固有層及びMLN中でのTh17細胞を著しく増加させるが、B.フラジリスΔPSA動物中のTh17応答は増強しない図14B;右のパネル、DT。DT治療の後、両方の群のマウスにおけるIFNg産生は、MLNで増加し図14B、また、Th17応答への特異性を示す。Th17細胞のレベルは、B.フラジリスΔPSA定着マウスで実際に減少した。この異常な表現型については説明できないが、CD4IL-17細胞の割合は、その後DT投与を行ったこの群だけで増加するので、結果は、野生型細菌についてTh17の特異的増加を明確に示す図14A。ジフテリアトキシンDTによるマウスの治療は、動物中のFoxp3T細胞のほぼ完全な除去を裏付ける図14A。従って、結腸LPにおけるIL-17A転写物の発現は、DT治療した動物中で著しく増加する図14D。これらのデータは、PSAが、共生的定着の間にB.フラジリスに対するTh17応答を活発に抑制する、機能的Foxp3Tregを誘発することを明らかにする。最終的には、Tregの存在下又は非存在下でのB.フラジリス特異的な抗原産生を決定した。B.フラジリス単独感作動物は、回腸及び結腸の両方でB.フラジリス特異的抗体を産生する図15。Foxp3Treg除去によって、B.フラジリス特異的IgAは、小腸及び大腸の全体に亘って著しく増加し、結腸中で最も高い10倍を超える増加を有する図15。腸全体に亘ってPSA特異的及び総IgA抗体産生の両方がTregの非存在によって影響されないので、これは、抗原特異的反応性における定量的増加を反映する図15。まとめると、B.フラジリスが、内臓においてTreg細胞を誘発する免疫調節分子を産生することが示され、抗原特異的適応免反応を抑制する。これらの知見は、哺乳類が、どのように宿主-細菌片利共生の間、共生細菌分子を許容するかについて、新規な細胞機構及び分子機構を明らかにする。例12:免疫調節カプセル状多糖類PSAは、B.フラジリスのOMVに積極的に仕分けされるEDL強化B.フラジリスの極薄の部分は、材料と方法で記載される通りに調製され、透過型電子顕微鏡法によって撮像される。図16に説明される結果は、OMVが細菌によって豊富に産生され、細菌のエンベロープからの発芽を確認できたことを説明する図17A、より大きな拡大図。出願人のこれまでの研究は、PSAの除去が、B.フラジリスの免疫調節能力を無効にすることを示しているマスマニアン、リウ、チアナボス及びカスパー2005年,共生細菌の免疫調節分子が、宿主の免疫系の成熟を指揮するAnImmunomodulatoryMoleculeofSymbioticBacteriaDirectsMaturationoftheHostImmuneSystem、Cell1221第107118頁マスマニアン、ラウンド及びカスパー2008年,細菌共生因子が、腸の免疫疾患を予防するAmicrobialsymbiosisfactorpreventsintestinalinflammatorydisease,Nature453第620625頁。PSA変異株の電子顕微鏡写真は、OMV合成の欠損を説明せず、生成したOMVの大きさ、形状及び存在量は、野生型細菌と区別がつかない図17A。特には、図17Aで説明する結果は、小胞が、細菌の表面から活発に発芽していることを明らかにする。PSAが、B.フラジリスのOMVと結合しているか否かを決定するべく、野生型及びΔPSA細菌から精製した小胞を、材料と方法の項で説明する通り、免疫ブロット分析に供した。図16Bに説明する結果は、野生型からの小胞が、B.フラジリスPSAからのOMVとは異なり、PSAに対して免疫反応を示したことを示す。B.フラジリスは、PSA-PSHと名付けられる細菌細胞の表面を被覆する少なくとも8つの別々のカプセル状の多糖類を産生する。小胞の調製においてPSBもまた検出されるが、PSGは、存在せず、このことは、OMVと共にパッケージされる特定の多糖類への選択性を実証する図17B。従って、図17Bの結果は、PSA及びPSBが、小胞に結合しており、一方PSGのみが細胞表面に見出されることを示す。カプセル状多糖類の欠失変異体は、各々の抗血清の特異性を裏付ける。免疫ブロット分析の結果は、材料と方法の項に記載される通りに行われる免疫金標識の試験によって確認された。図17Cに説明する精製した小胞の免疫金標識の結果は、PSAが、OMVと物理的に結合すること、及び、野生型B.フラジリス株のOMVの大部分がPSAについて陽性に染色するデータなしことを確認する。PSAの非存在が、OMVの分子組成を変化させないことを立証するべく、質量分析計によってプロテオーム解析を行い、野生型又はPSA変異体細菌の小胞間でタンパク質組成に主要な定性的又は定量的差異がないことを明らかにしたデータなし。PSAは、繰り返しサブユニットの異種ポリマーである。細胞抽出物全体からクロマトグラフィーによって回収したPSAのサイズ分離は、材料と方法で示した細胞全体及び精製OMVのカプセル状多糖類の調製の抗PSAによって免疫ブロット分析と同様に行われた。図16Dに説明される関連結果は、驚くべきことに、低分子量種のみがOMVと結合することを示し、PSAの小胞中へのパッケージングの特異性を説明する。特には、図16Dの結果は、細菌細胞のエンベロープに結合したままである高分子量H-PSA種とは異なり、低分子量PSALPSAのみが、小胞にパッケージされることを示す。総合すると、上記結果は、免疫調節カプセル状多糖類PSAが、積極的にB.フラジリスのOMVへと仕分けされることを明らかにする。例13:PSAは、T細胞上の直接的なTLR2シグナル伝達によってIL-10産生を生じさせるPSAは、図17A~17Dに説明する一連の実験において脾臓から精製したCD4T細胞とともに培養した脾臓細胞又は樹状細胞由来の骨髄BMDCと接触させた。結果は、PSAがT細胞上のTLR2シグナル伝達によってIL-10産生を生じさせ得るという結論を裏付ける。例14:PSAは、APCの非存在下、TLR2によってT細胞へ直接的にシグナルを伝達することができ、これはTLR1又はTLR6を必要としない図18A及び18Bに説明する実験セットにおいて、野生型WTTLR1-/-、TLR2-/-、TLR6-/-又はCD14-/-動物から単離したT細胞とPSAとを接触させた。結果は、PSAが、APCの非存在下T細胞を直接刺激し、IL-10を誘発し得ることを示す。PSAによるIL-10の誘発は、TLR2を必要とするが、TLR1もTLR6も必要としない。TLR2は、ホモ二量体としては作用せず、TLR1及びTLR6とヘテロ二量化することが知られているため、このことは、PSAがTLR2によってIL-10を誘発するように特異的に作用していることを示す。PSAを、図18に説明する実験セットにおいて、WT、TLR-/-、TLR2-/-、TLR6-/-及びCD14-/-動物のBMDC、並びに、WTマウスの精製CD4細胞とも接触させた。結果は、実験条件下、IL-10産生を生じさせる精製PSAの能力が、TLR1、TLR2又はTLR6による樹状細胞上のシグナル伝達に依存しないことを示す。しかしながら、これらの結果に従うと、IFN-γ産生は、樹状細胞上のTLR1及びTLR2両方のシグナル伝達を必要とする。例15:PSAは、独特なTLR2リガンドであるPSA、TLR1/TLR2リガンドPAM3CysK及びTLR2/6リガンドFSL1を、図19に説明する実験セットにおいてCD4Foxp3-細胞と接触させた。結果は、PSAが、非Treg細胞を直接刺激してIL-10を産生し得ることを示す。PAM3CysKのような他のTLR2リガンドは、この同じ集団の非Treg細胞からIL-10産生を誘発しないので、非常に独特である。更には、他のTLR2リガンドが、T細胞によってIFN-γ産生を実際に抑制し、T細胞を活性化するPSAの独特の能力を更に示す。TLR2リガンド、PSA、PAM3CysK又はFSL1は、図20で説明する実験セットでCD4T細胞と接触させた。PSAは、他の既知のTLR2リガンドと比較して、APCの非存在下、T細胞からより多くのIL-10産生を生じさせることを示す。図20に説明する実験セットにおいて、PSAを、WT又はTLR2-/-動物のCD4CD25-T細胞と接触させた。結果は、PSAによる、非Treg細胞によるIL-10の誘発が、T細胞上のTLR2シグナル伝達に依存することを示す。例16:PSAは、Tregを直接的に誘発し、IL-10を生産させ、インビトロ培養でのTregの生存を増強することができる図21に説明する実験セットにおいて、CD4Fox3T細胞を、TGF-βの存在下、抗CD-3によって刺激し、PSA有り及び無しでインキュベートした。結果は、PSAが直接的に、TregにIL-10の遺伝子発現を誘発させることができることを示す。CD4Fox3T細胞を、BMCDによってインキュベートし、培養物を、図21で説明する実験セットで抗CD3及びTGF-βにより刺激した。結果は、PSAが、T制御性細胞をインビトロで発現するFoxp3の生存又は増殖を増強させ得ることを示す。例13~16で説明する結果は、1PSAが、T細胞中のTLR2に作用し、IFNyγではなくIL-10を誘発する、2PSAが、IL-10産生にT細胞上でTLR1又はTLR6を必要としない、3PSAが、T細胞に直接的に作用し、IL-10を誘発することができAPCは必要ない、PSAは他のTLR2リガンドとは異なる様式で作用するようである2及び3は、トールリガンドとして、PSAの独特の性質を際立たせるのに重要である、4IL-10をT細胞上で直接的に誘発するPSAの能力は、TLR2に依存する、51つの実験が、PSAがインビトロで高いレベルで変換され得る及び絶対数の両方で、6PSAは、精製TregからもIL-10を誘発することができ、cd4foxp3の多い集団を維持/拡大するようである、という結論を裏付ける。バクテロイデスフラジリスは、宿主の免疫を調節し、それ自体の抗原に対する炎症反応を抑制することのできる細菌分子を産生することによって、宿主耐性をもたらす。B.フラジリスの多糖類APSAは、機能的に抑制性のFoxp3制御性T細胞において、特異的な遺伝子発現プロファイルを誘発し、寛容原性の免疫環境の確立を調整する。最も注目すべきは、B.フラジリスΔPSAを定着させた動物から回収した宿主細胞は、B.フラジリスに対してより反応性が高いが、他の密接に関連した共生細菌に対してはそうではないことである。これらのデータは、宿主免疫系が、B.フラジリスの存在を無視するわけではなく、むしろPSAがこれらの炎症反応を活発に抑制していることを実証する。共生細菌は、免疫学的に無視されず、炎症の誘発は、在外微生物共生的及び病原性の双方に対するデフォルトの応答であると考えられる。病原体によって採用される毒性因子とよく似ているが、共生細菌は、共生因子を発達させ、免疫系をプログラミングし、内臓定着の間に抗原特異的応答を阻害することにより、宿主免疫を制御すると考えられる。PSAが実験的結腸炎から動物を保護するので、病原体とは反対に、B.フラジリスによる定着は実際に、宿主の健康に有益な結果をもたらす26。従って、B.フラジリスは、それ自体の耐性を積極的に誘発するだけでなく、生存のために定着する適所の完全性も保存する。先に示した例は、Tregの実施形態の製造及び使用方法に関する完全な開示及び説明、並びに、本開示のシステム及び方法を当業者に提供するために示され、発明者らが開示とみなす範囲を制限することを意図しない。開示を実施するために先に説明した様式の変更は、当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書で述べた特許及び公開公報の全ては、本開示が属する分野の当業者の技術水準を示す。本開示において言及される全ての参考文献は、各々の参考文献の全体が引用によって個別に組み込まれているのと同じレベルで、引用によって組み込まれる。背景技術、要約、詳細な説明及び実施例において言及される各々の文献特許、特許出願、学術論文、摘要、実習手引書、書籍又は他の開示を含むの全体的開示は、引用により本明細書に組み込まれる。更には、本明細書に添付して提出される配列表のハードコピー及びコンピュータ可読の対応する形態はどちらも、その全体を引用によって本明細書に組み込まれる。本開示は、特定の組成物又は生物系に限定されるものではなく、当然のことながら変化するものと理解される。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的とすると解釈され、限定するこことを意図しない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形1a,1an及びそのtheには、内容が明確に反対の意味を指示しない限り、複数の指示対象が含まれる。複数の語には、内容が明確に反対の意味を指示しない限り、2以上の指示対象が含まれる。特に示さない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する分野の一当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるのと同様又は同等の任意の方法及び材料を、具体的な実施例の試験の実施に使用することができるが、適当な材料及び方法が本明細書で記載される。本開示に関する多数の実施形態が説明される。それにもかかわらず、本開示の精神及び範囲を逸脱することなく種々の変更が行われてもよいことが理解される。従って、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。参考文献1.AtarashiKNishimuraJShimaTUmesakiYYamamotoMOnoueMYagitaHIshiiNEvansRHondaKetalATPdriveslaminapropriaT17celldifferentiationNature455第808812頁2.BarnesMJandPowrieFRegulatoryTcellsreinforceintestinalhomeostasisImmunity31第401411頁3.BetteUiECarrierYGaoWKornTStromTBOukkaMWeinerHLandKuchrooVKReciprocaldevelopmentalpathwaysforthegenerationofpathogeniceffectorTH17andregulatoryTcellsNature441第235238頁4.BouskraDBrezillonCBerardMWertsCVaronaRBonecaIGandEberlGLymphoidtissuegenesisinducedbycommensalsthroughNODIregulatesintestinalhomeostasisNature456第507510頁5.BrunkowMEetalNatGenet27686.CashHLWhithamCVBehrendtCLandHooperLVSymbioticbacteriadirectexpressionofanintestinalbactericidallectinScience313112611307.ChowJandMazmanianSKGettingthebugsoutoftheimmunesystemdobacterialmicrobiotafixintestinalTcellresponsesCellHostMicrobe58128.CollisonLWWorkmanCJKuoTTBoydKWangYVignaliKMCrossRSehyDBlumbergRSandVignaliDATheinhibitorycytokineIL35contributestoregulatoryTcellfunctionNature450第566569頁9.CoombesJLSiddiquiKRArancibiaCarcamoCVHallJSunCMBelkaidYandPowrieFAfunctionallyspecializedpopulationofmucosalCD103DCsinducesFoxp3regulatoryTcellsviaaTGFbetaandretinoicac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