"クラミジア科細菌の感染を治療するために使用される、β-ラクタム。クラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態を治療するために使用される、β-ラクタム。前記β-ラクタムがアモキシシリンではない、請求項1又は2記載のβ-ラクタム。前記β-ラクタムが、アモキシシリン、ベンジルペニシリンペニシリンG、フェノキシメチルペニシリンペニシリンV、クロキサシリン、セファドロキシル、セフィキシム、イミペネム、イミペネムとセフィキシムとの組合せ、メシリナム、クラブラン酸、タゾバクタム及びスルバクタムからなる群から選択される、請求項1~3のいずれか1項に記載のβ-ラクタム。前記β-ラクタムがペニシリンGである、請求項1~4のいずれか1項に記載のβ-ラクタム。前記細菌が持続型である、請求項1~5のいずれか1項に記載のβ-ラクタム。前記治療が、前記細菌において、感染性の不可逆的な喪失を導く、請求項1~6のいずれか1項に記載のβ-ラクタム。前記治療が、前記細菌の分解を導く、請求項1~7のいずれか1項に記載のβ-ラクタム。前記治療が、リソソームと前記細菌との融合を導く、請求項1~8のいずれか1項に記載のβ-ラクタム。前記クラミジア科細菌が、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis、クラミジアスイスChlamydiasuis、クラミジアムリダルムChlamydiamuridarum、クラミドフィラアボルタスChlamydophilaabortus、クラミドフィラシッタシChlamydophilapsittaci、クラミドフィラキャビエChlamydophilacaviae、クラミドフィラペコルムChlamydophilapecorum、クラミドフィラフェリスChlamydophilafelis及びクラミドフィラニューモニエChlamydophilapneumoniaeから選択される種の細菌である、請求項1~9のいずれか1項に記載のβ-ラクタム。前記クラミジア科細菌が、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatisである、請求項1~10のいずれか1項に記載のβ-ラクタム。病態が、眼の病態、生殖器の病態、呼吸器の病態、心血管機能障害又は循環機能障害である、請求項2~11のいずれか1項に記載のβ-ラクタム。眼の病態がトラコーマである、請求項12記載のβ-ラクタム。心血管機能障害がアテロームである、請求項12記載のβ-ラクタム。循環機能障害がアテロームである、請求項12記載のβ-ラクタム。生殖器の病態が、鼠径リンパ肉芽腫、尿道炎、睾丸副睾丸炎、子宮頚膣炎、子宮頚炎、子宮頚内膜炎、子宮内膜炎、肝周囲炎及び卵管炎からなる群から選択される、請求項12記載のβ-ラクタム。前記生殖器の病態が卵管炎である、請求項16記載のβ-ラクタム。β-ラクタムが別の治療剤とともに投与される、請求項1~17のいずれか1項に記載のβ-ラクタム。前記別の治療剤が、別の感染性因子により引き起こされる感染症及び/又は病態を治療するための治療剤である、請求項18記載のβ-ラクタム。前記別の感染性因子が、原生動物とりわけ、トリコモナスバギナリスTrichomonasvaginalis;真菌カンジダアルビカンスCandidaalbicans;嫌気性細菌バクテロイデスBacteroides、ペプトストレプトコッカスPeptostreptococcus、ガードネレラバジナリスGardnerellavaginalis、モビルンカスMobiluncus;ヘモフィルスデュクレイHaemophilusducreyi、マイコプラズマホミニスMycoplasmahominis、ストレプトコッカスStreptococcus、エスケリキアコリEscherichiacoli、スタフィロコッカスStaphylococcus、ナイセリアゴノレアNeisseriagonorrhoeaeなどの他の細菌;及びウイルス、特に単純ヘルペスウイルスの感染から選択される、請求項19記載のβ-ラクタム。前記別の感染性因子が、ナイセリアゴノレアNeisseriagonorrhoeae又はトリコモナスバギナリスTrichomonasvaginalisである、請求項20記載のβ-ラクタム。前記別の治療剤が、セフトリアキソン、セフィキシム、スピラマイシン、スペクチノマイシン、アジスロマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、メトロニダゾール、チニダゾール及びニモラゾールからなる群から選択される、請求項18~21のいずれか1項に記載のβ-ラクタム。従って、クラミジア科感染症、特に持続性のクラミジア科感染症に対する効果的な治療が必要とされている。本発明者らは、驚くべき方法により、持続型のクラミジア科が、β-ラクタムに感受性を示し、それ故、β-ラクタムをクラミジア症の治療に使用できることを発見した。発明の説明現在まで、β-ラクタム、特にペニシリンGが、クラミジア科の持続性を誘起することが通説となっている。ペニシリンGでの治療は、研究所において、持続性を誘導するために使用される好ましい手段の一つでさえあったBeattyetal.,Microbiol.Rev.584:686-699,1994;Hustonetal.,BMCMicrobiol.8:190,2006;Goellneretal.,InfectImmun.748:4801-8,2006;Skilton,R.J.etal.,PLoSOne4:e7723,2009。1970年代、ペニシリンGで感染細胞を治療すると、RB分裂に影響を及ぼし、見かけ上持続性の細菌表現型の生成が導かれることが観察され、このモデルが開発されたMatsumoto,A.andG.P.Manire,JBacteriol101:278-285,1970;Kramer,M.J.andF.B.Gordon,InfectImmun3:333-341,1971;How,S.J.etal.,JAntimicrobChemother15:399-404,1985;Kuo,C.C.etal.,AntimicrobAgentsChemother12:80-83,1977;Huston,W.M.etal.,BMCMicrobiol8:190,2008;Skilton,R.J.etal.,PLoSOne4:e7723,2009;Johnson,F.W.andD.Hobson,JAntimicrobChemother3:49-56,1977;Lambden,P.R.etal.,Microbiology152:2573-2578,2006。しかし、同一の研究では、β-ラクタムでの治療は、細菌封入体の増殖動態に影響を及ぼさないが、古典的な持続性細菌よりも大きな5~10μm異常な細菌の形成を導くことも多くの場合示された。さらに、他の研究では、ペニシリンGの除去は、感染性を回復しないことが示されているJohnson,F.W.andD.Hobson,JAntimicrobChemother3:49-56,1977;Wolf,K.etal.,InfectImmun68:2379-2385,2000;Peters,J.etal.,CellMicrobiol7:1099-1108,2005。このような特徴は、持続性の定義と一致していないが、それにも関わらず、β-ラクタムでの抗生物質療法は、invivoにおいて細菌の持続性を導き得ると想定されている。結果として、β-ラクタムを用いた、この抗生物質療法は推奨されなかった。クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatisにおいて持続性を誘起するペニシリンGの役割と一致して、実施された臨床試験では、β-ラクタム治療活性が実証されなかった。著者らは、ペニシリンG及び他のβ-ラクタムは、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatisに対して何ら効果を有さないとさえ結論付けたHeinonenetal.,GenitourinMed62:235-239,1986;RidgwayG.L.,JAntimicrobChemother403:311-4,1997。これは、今日まで一般に受け入れられている見解である。しかし、本発明者らは、ペニシリンGが、クラミジア科に持続性を誘起させることなく、実際にその分解を導くことを初めて実証する。特に、ペニシリンGで治療されたクラミジア科の細菌は、その抗生物質が培地から除去された後でさえ、いずれの感染性も失う。この治療効果は、ペニシリンGに限定されず、少なくとも1つのβ-ラクタムグループで観察され得る。この治療効果は、特定の細菌種に制限されず、クラミジア科のいずれの細菌でも観察され得る。従って、本発明は、クラミジア科細菌の感染をβ-ラクタムで治療する方法に関する。本発明は、クラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態をβ-ラクタムで治療する方法にも関する。本発明の好ましい側面では、前記細菌は、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis種、クラミドフィラニューモニエChlamydophilapneumoniae種又はクラミドフィラシッタシChlamydophilapsittaci種の細菌である。本発明の特に好ましい側面では、前記細菌は、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis種の細菌である。別の側面では、本発明は、クラミジア科細菌による感染を治療するための薬剤を製造するためのβ-ラクタムの使用に関する。さらに別の側面では、本発明は、クラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態を治療するための薬剤を製造するためのβ-ラクタムの使用に関する。本発明の好ましい側面では、前記細菌は、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis種、クラミドフィラニューモニエChlamydophilapneumoniae種又はクラミドフィラシッタシChlamydophilapsittaci種の細菌である。本発明の特に好ましい側面では、前記細菌は、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis種の細菌である。本発明は、クラミジア科細菌による感染の治療に使用するためのβ-ラクタムにも関する。本発明は、クラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態の治療に使用するためのβ-ラクタムにも関する。本発明の好ましい側面では、前記細菌は、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis種、クラミドフィラニューモニエChlamydophilapneumoniae種又はクラミドフィラシッタシChlamydophilapsittaci種の細菌である。本発明の特に好ましい側面では、前記細菌は、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis種の細菌である。本発明との関連で、β-ラクタムとは、分子構造中にβ-ラクタム環を含む抗生物質のいずれをも意味する。従って、本発明のβ-ラクタムには、ペニシリン誘導体、並びにセファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム、及びβ-ラクタマーゼ阻害剤が含まれる。特に、本発明のβ-ラクタムは、ベンジルペニシリンペニシリンG、フェノキシメチルペニシリンペニシリンV、アンピシリンペニシリンA、ベンザチンベンジルペニシリン、メチシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、コ-アモキシクラブアモキシシリンクラブラン酸、ピペラシリン、チカルシリン、アズロシリン、カルベニシリン、セファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セファクロル、セフロキシム、セファマンドール、セフォテタン、クロキサシリン、セファドロキシル、セフィキシム、セフォキシチン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフタジジム、セフェピム、セフピロム、イミペネム、シラスタチンとイミペネムとの組合せ、イミペネムとセフィキシムとの組合せ、メロペネム、メシリナム、エルタペネム、アズトレオナム、クラブラン酸、タゾバクタム又はスルバクタムであってよい。本発明の好ましい側面において、前記β-ラクタムは、アモキシシリンではない。本発明のさらに好ましい側面では、前記β-ラクタムは、アモキシシリン、ベンジルペニシリンペニシリンG、フェノキシメチルペニシリンペニシリンV、クロキサシリン、セファドロキシル、セフィキシム、イミペネム、イミペネムとセフィキシムとの組合せ、メシリナム、クラブラン酸、タゾバクタム及びスルバクタムからなる群から選択される。さらにより好ましい側面において、前記β-ラクタムは、ペニシリンGである。従来技術は、ペニシリンGが持続性を引き起こす因子であると教示するが、本発明者らは、ペニシリンGでの治療により、細菌感染性の不可逆的な喪失が導かれることを示す。特に、ペニシリンGでの治療により、クラミジア科の分解が導かれる。感染細胞をペニシリンGで治療した場合には、細菌の16SリボソームRNArRNAの発現が検出されず、感染細胞が外部のアポトーシス刺激に対して感受性を示すようになる。従って、さらに特定の側面では、本発明は、クラミジア科細菌による感染を治療するため、又はクラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態を治療するための薬剤を製造するためのペニシリンGの使用であって、前記治療が、前記細菌における感染性の不可逆的な喪失を導くことを特徴とする、使用に関する。この感染性は、当業者が発揮することのできる全ての適切な方法により測定され得る。これらの方法は、既に、従来技術で記載されており例えば、Verbeke,P.etal.PLoSPathog2:e45,2006を参照されたい、従って、本明細書において前記方法を詳述する必要はない;このような方法の一例を実施例で提供する。さらに、本発明のペニシリンGでの治療は、リソソームとの融合を介した細菌の分解を導く。従って、本発明の別の特定の側面は、クラミジア科細菌による感染を治療するため、又はクラミジア科細菌の感染により引き起こされる病態を治療するための薬剤を製造するためのペニシリンGの使用であって、前記治療が、前記細菌の分解を導くことを特徴とする、使用に関する。本発明のさらなる特定の側面では、前記細菌の分解は、細菌とリソソームとの融合に起因する。本発明者らは、ペニシリンGが、クラミジア科細菌の分解を誘起できることを示す。本発明との関連で、クラミジア科とは、BushEverett,IntJSystEvolMicrobiol.51Pt1:203-20,2001で定義されるように、クラミジア属及びクラミドフィラ属の2つの属から構成される分類単位を意味する。同様に、本発明との関連で、クラミジア属とは、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis種、クラミジアスイスChlamydiasuis種及びクラミジアムリダルムChlamydiamuridarum種を含む分類単位を意味し、クラミドフィラ属とは、クラミドフィラアボルタスChlamydophilaabortus種、クラミドフィラシッタシChlamydophilapsittaci種、クラミドフィラキャビエChlamydophilacaviae種、クラミドフィラペコルムChlamydophilapecorum種、クラミドフィラフェリスChlamydophilafelis種及びクラミドフィラニューモニエChlamydophilapneumoniae種を含む分類単位を意味するBushEverett,IntJSystEvolMicrobiol.51Pt1:203-20,2001。これらの種が、別個の宿主スペクトルを有することは当業者に周知である:例えば、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis及びクラミドフィラニューモニエChlamydophilapneumoniaeはヒト感染に関与し、クラミジアスイスChlamydiasuisはブタ感染に、クラミドフィラアボルタスChlamydophilaabortusは反芻動物感染に関与する。本発明は、特定の細菌種に制限されるものではなく、クラミジア科のいずれの種にも適用でき、特に、上記のものに適用できる。より具体的には、本発明者らは、ペニシリンGが、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatisの分解を、その生物型又はさらにはその血清型に関わらず、誘起できることを示す。本発明との関連で、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatisとは、トラコーマ生物型の細菌、並びに鼠径リンパ肉芽腫生物型の細菌を意味する。従って、同様に、本発明は、特定の血清型に制限されず、18の公知の血清型A~Lのいずれかによる感染を治療するために使用され得る。特に、本発明は、血清型A~C、並びに血清型D~K及びL1~L3の1つによる感染を治療するために使用され得る。クラミジア科細菌の感染及びクラミジア科感染症という表現は、患者又は動物の体の少なくとも1つの細胞における、前記クラミジア科細菌の存在を意味する。感染は、生殖器感染、眼感染又は肺感染であってよい;内皮細胞又は関節などの他の部位に影響を及ぼすこともあり得る。前記細菌は、EB又はRB形態で存在し得る;持続型でも存在し得る。本発明のさらに特定の側面において、細菌は、患者体内で持続型で存在する。クラミジア科細菌に感染しても、必ずしも、症状は現れないことが公知である。例えば、大半の子宮頚部の感染は無症状性であるか、又は軽度の症状が現れるに過ぎないと推定されているPaavonenandEggert-Kruse,HumReprodUpdate55:433-47,1999。それにも関わらず、クラミジア科細菌の存在は、本明細書中で説明の必要がない当業者に周知の全ての手段により検出され得る。特に、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR及びリガーゼ連鎖反応LCRなどの核酸増幅に基づく診断試験の使用は、間違いなくクラミジア科細菌に感染した人と感染していない人とを区別できると言及すれば足りる。さらに、16S及び23SリボソームRNA発現の測定は、細菌が代謝的に活性であり、それ故生存することを立証する。クラミジア科感染症を研究するためのこれらの試験は、研究所で一般に使用されており、それ故、本明細書中で詳述することはないMpigaandRavaoarinoro,MicrobiolRes.1611:9-19,2006。従って、本発明は、特定の側面において、クラミジア科を検出する工程を含む、クラミジア科感染症又はクラミジア科感染症により引き起こされる病態をβ-ラクタムで治療する方法に関する。とりわけ、前記検出工程は、細菌の核酸をPCR、LCR又はRT-PCRにより増幅することを含む。クラミジア科細菌種が、別個の宿主スペクトルを有することは当業者に周知である。同様に、生物は、前記種の各々に感染することも当業者に公知である:例えば、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis及びクラミドフィラニューモニエChlamydophilapneumoniaeはヒト感染に関与し、クラミジアスイスChlamydiasuisはブタ感染に、クラミドフィラアボルタスChlamydophilaabortusは反芻動物感染に関与する。従って、本発明は、ヒト及び動物における、クラミジア科により引き起こされる感染に適用され得る。同様に、本発明では、ヒト及び動物において、クラミジア科感染症をβ-ラクタムで治療することが可能である。クラミジア科により引き起こされる感染症の大多数は無症状性であるが、それにも関わらず、前記感染は、患者又は動物において重篤な病態を引き起こす。本発明の関連で、クラミジア科感染症により引き起こされる病態という表現は、クラミジア科細菌の感染により直接的に又は間接的に誘発される病態のいずれをも意味する。本発明の関連で、クラミジア科感染症により引き起こされる病態には、クラミジアスイスChlamydiasuis、クラミジアムリダルムChlamydiamuridarum、クラミドフィラアボルタスChlamydophilaabortus、クラミドフィラシッタシChlamydophilapsittaci、クラミドフィラキャビエChlamydophilacaviae、クラミドフィラペコルムChlamydophilapecorum及びクラミドフィラフェリスChlamydophilafelisにより動物において引き起こされる病態が含まれる。従って、本発明の関連で、クラミジア科感染症により引き起こされる前記病態には、とりわけ、クラミドフィラアボルタスChlamydophilaabortusにより引き起こされる流産及び新生児死亡、並びにクラミジアスイスChlamydiasuisにより引き起こされる結膜炎、角結膜炎、化膿性鼻炎、腸炎、気管支肺炎及び肺炎が含まれる。ヒトにおいて、これらの病態は、特に、生殖器の病態又は眼の病態であり得るが、これらはまた、呼吸器の病態でもあり得る。それ故、クラミドフィラニューモニエChlamydophilapneumoniaeによる感染は、肺炎の形態を引き起こし、クラミドフィラシッタシChlamydophilapsittaciは、オウム病に関与することが公知である。また、クラミジア科細菌による感染は生物全体に広がっており、心血管機能障害及び循環機能障害アテロームなどの多数の非定型感染症及び病態を引き起こすことが公知である。クラミジア科細菌により引き起こされる心血管機能障害及び循環機能障害のうち、それぞれ、弁狭窄及びアテロームを挙げてよい。さらに、前記クラミジア科細菌は、重度の関節炎も引き起こし得る。しかし、本発明の好ましい側面において、クラミジアの感染により引き起こされる病態は、眼の病態又は生殖器の病態である。本発明のさらに特に好ましい側面では、クラミジアの感染により引き起こされる眼の病態としてトラコーマが挙げられる。さらに特に好ましい別の側面では、クラミジアにより引き起こされる生殖器の病態として、鼠径リンパ肉芽腫デュランドニコラファブル病が挙げられる。本発明のさらに特に好ましい別の側面では、クラミジアにより引き起こされるヒト生殖器の病態として、男性の妊性の低下を導き得る、尿道炎及び睾丸副睾丸炎などの病態が挙げられる。本発明のさらに特に好ましいさらに別の側面では、女性におけるクラミジアの感染は、数ある中でも、卵管を全体的に閉塞する卵管留膿腫及び卵管留水腫の形成へと進行し得る上部生殖管感染症特に卵管炎などの合併症を引き起こし得る、生殖器の病態子宮頚膣炎cervico-vaginites、子宮頚炎、子宮頚内膜炎、尿道炎、子宮内膜炎又は肝周囲炎などを引き起こす。従って、卵管炎は、女性において、卵管性不妊症及び子宮外妊娠の主要なリスクファクターである。ドキシサイクリンのみが、卵管炎の部分的な改善を提供するのに対し、本発明のペニシリンGでの治療は、生殖器のクラミジア感染により引き起こされる卵管留水腫の発現を予防する。本発明のペニシリンGでの治療は、クラミジア感染に起因する組織ダメージを予防することができる。従って、本発明のペニシリンGでの前記治療は、ヒトにおける現在の標準治療であるドキシサイクリンでの治療と比較して、非常に効果的であることを実証する。生殖器の病態は、クラミジア感染単独により引き起こされ得る;しかし、それらはまた、クラミジア感染と、別の感染性生物の感染との組合せによっても引き起こされ得る。特に、前記病態を引き起こす可能性のある感染性生物は、トリコモナスバギナリスTrichomonasvaginalisを含む原生動物;カンジダアルビカンスCandidaalbicansを含む真菌;例えば、細菌性膣炎の間に増殖する嫌気性細菌[バクテロイデスBacteroides、ペプトストレプトコッカスPeptostreptococcus、ガードネレラバジナリスGardnerellavaginalis、モビルンカスMobiluncus];ヘモフィルスデュクレイHaemophilusducreyi、マイコプラズマホミニスMycoplasmahominis、ストレプトコッカスStreptococcus、エスケリキアコリEscherichiacoli、スタフィロコッカスStaphylococcus、ナイセリアゴノレアNeisseriagonorrhoeaeなどの他の細菌;及び単純ヘルペスウイルスなどのウイルス感染である。本発明のより特定の側面では、上記のような生殖器の病態を引き起こし得る感染性生物は、ナイセリアゴノレアNeisseriagonorrhoeaeである。本発明のより特定の別の側面では、上記のような生殖器の病態を引き起こし得る感染性生物は、トリコモナスバギナリスTrichomonasvaginalisである。従って、本発明は、クラミジア科細菌の感染により引き起こされる生殖器の病態をβ-ラクタムで治療する方法であって、前記β-ラクタムが、別の治療剤とともに投与されることを特徴とする、方法にも関する。本発明の特定の側面では、前記の別の治療剤は、ナイセリアゴノレアNeisseriagonorrhoeaeによる感染の治療剤から選択される。本発明の特定の別の側面では、前記の別の治療剤は、トリコモナスバギナリスTrichomonasvaginalisによる感染の治療剤から選択される。前記の別の治療剤は、セフトリアキソン、セフィキシム、スピラマイシン、スペクチノマイシン、アジスロマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、メトロニダゾール、チニダゾール及びニモラゾールからなる群から特に選択される。本発明は、活性成分としてβ-ラクタムを含む医薬組成物にも関する。前記β-ラクタムは、単独で、又は上記のような別の治療剤と組み合わせて使用され得る。これらの組成物は、経口、経直腸若しくは非経口経路により、又は皮膚及び粘膜上への局所適用により局所的に投与され得るが、好ましい投与経路は経口である。それらは、固体又は液体であってよく、ヒト用の薬で一般に使用される剤形、例えば、錠剤、コーティングされたもの又は非コーティングのもの、ゼラチンカプセル剤、顆粒剤、坐剤、注射製剤、点眼薬、ポマード、クリーム及びゲルなどで提供され得、これらは常法に従って調製される。活性成分は、これらの医薬組成物で一般に使用される賦形剤、例えば、タルク、アラビアゴム、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性又は非水性のビヒクル、動物性又は植物性の油、パラフィン誘導体、グリコール、種々の湿潤剤、分散剤及び乳化剤、並びに保存料とともに組み込まれてよい。これらの組成物は、適切なビヒクル、例えば、非発熱性滅菌水に使用直前に溶解することを意図した粉末形態で提供されてもよい。投与量は、治療される疾患、問題の対象、投与経路及び検討される化合物に応じて変動し得る。投与量は、例えば、成体において、経口投与により1日当たり50μgと300mgとの間であってよい。1.材料1.1.抗体及び試薬培地DMEM、Ham’sF-12、Ham’sF-12K、RPMI-1640、FCS及びゲンタマイシン溶液はInvitrogenCarlsbad,CA,USAから得た。組換えヒトIFN-γ、シクロヘキシミド、3-メチル-アデニン3-MA、スタウロスポリン及びペニシリンGは、Sigma-AldrichSt.Louis,MO,USAから得た。LysoTrackerプローブもInvitrogenCarlsbad,CA,USAから得た。クラミジア属に対する2つのFITC標識マウスモノクローナル抗体混合物はArgeneBiosoftVarilhes、Franceから得た。カテプシンDに対するウサギポリクローナル抗体IgG及びテキサスレッド標識ヤギ抗ウサギ抗体は、SantaCruzBiotechnologySantaCruz,CA,USAから得た。コントロールウサギIgGは、プロテインA-セファロースを用いて、ウサギ血清から精製した。1.2.細胞培養及び細菌株全ての細胞タイプHeLa、RL-95.2、THP-1は、AmericanTypeCultureCollectionATCC;Manassas,VA,USAの推奨に従って、維持のために75cm2培養フラスコ中で培養し、実験のために、カバーのある12若しくは24ウェルプレート、又はLab-Tek商標培養チャンバ中で培養した。培地中、0.25μMのPMAを使用して、THP-1細胞のマクロファージへの分化を達成させた。細菌感染性に対するペニシリンGの効果が、細菌株又は血清型に依存するかどうかを検証するために、ATCC血清型L2及びC.トラコマチス血清型D[Dr.deBarbeyracUniversityofBordeauxII,Bordeaux,Franceによりご提供頂いたもの]を使用した。C.ムリダルムは、Dr.RogerRankUniversityofArkansas,LittleRock,AR,USAから得た。細菌は、上記のように、HeLa細胞においてルーチンにより増殖させ、使用前まで-80°Cで保存したScidmore,M.A.CurrProtocMicrobiolChapter11:Unit11A11,2005。封入体形成単位IFU数は、上記のようにVerbeke,P.etal.PLoSPathog2:e45,2006、免疫蛍光検査により測定した。2.方法2.1.感染及びペニシリンGでの処理クラミジア感染細胞に対するペニシリンGの効果を調べるために、宿主細胞を最大70コンフルエントまで抗生物質を添加せずに培養し、次いで、C.トラコマチス株L2若しくはD、又はC.ムリダルム1IFUに感染させた。感染は、遠心分離しながら、37°Cで90分間実施し、それに続いて、細胞外の細菌を洗浄した。3hpiにおいて、洗浄後、25μg/mLゲンタマイシン又は1~100IU/mLペニシリンGのいずれかを含む培地に培地交換した。ペニシリンGでの処理後一定の間隔で、共焦点顕微鏡検査のために調製するために4中性緩衝PFA中で培養物を30分間固定するか、又は以前に記載された方法Verbeke,P.etal.PLoSPathog2:e45,2006に従って子孫細菌の感染性を測定するために培養物を集めるかのいずれかを行った。2.2.IFN-γでの処理により誘起される持続性上記のようにVerbeke,P.etal.PLoSPathog2:e45,2006、スライド上に単層で培養したHeLa細胞に、1IFUで血清型L2を感染させた。感染3時間後に、培地を除去し、500IU/mL最終濃度の組換えヒトIFN-γを含む培地に交換した。IFN-γの存在下、感染細胞をさらに100時間インキュベートし、その後、以下に記載のように共焦点顕微鏡検査のために調製した。2.3.再活性化試験上記のように、スライド上に単層で培養したHeLa細胞を、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis血清型L2に感染させ、ペニシリンGで処理した。感染20時間後に、培養物を洗浄し、ペニシリンGを含まない培地に培地交換した。48hpiと100hpiとの間に、様々な間隔で細胞及び培地を集め、従来技術の方法Scidmore,M.A.CurrProtocMicrobiolChapter11:Unit11A11,2005に従って、力価試験を実施した。ペニシリンGでの処理が、細菌持続性に影響を及ぼし得るかどうかを調べるために、HeLa細胞をL2に感染させ、IFN-γ及びペニシリンG500IU/mLで、48hpiすなわち、IFN-γでの処理後24時間から72hpiすなわち、IFN-γでの処理後48時間まで処理した。次いで、スライドを固定し、2セットの検出フィルターヘキスト360/40nmBP-425nmLP;FITC480/40nmBP-527/30nmBPを備え、CCDカメラCCCと連結した落射蛍光顕微鏡LeicaDM,Leica,Mannheim,Germanyを用いて観察した。2.4.アポトーシスに対する感受性クラミジアの抗アポトーシス活性に対するペニシリンG処理効果を測定した。スライド上に単層で培養したHeLa細胞に血清型L2を感染させ、3hpi又は29hpiにおいて、ペニシリンGで処理した。25hpi又は32hpiにおいて、それぞれ、細胞を1μMのスタウロスポリンとともにインキュベートし、40hpi又は48hpiにおいて固定し、落射蛍光顕微鏡検査のために調製した。アポトーシス核を含む感染細胞の割合を計測した。2.5.共焦点顕微鏡検査スライド上に単層で培養したHeLa細胞を血清型L2に感染させた。3hpiにおいて、細胞をペニシリンGで処理するか、又は処理しなかった。次に、24hpiにおいて細胞を固定し、透過処理し、PBS/1BSA中の抗カテプシンD抗体1/50とともにインキュベートした2時間、室温。数回洗浄後、テキサスレッド標識ヤギ抗ウサギIgG1/200をスライドに添加した1時間、室温。次に、細胞をFITC標識抗クラミジア抗体1/800で1時間、ヘキスト1/2000で5分間、対比染色した。次いで、スライドをマウントし、2つのダイオードレーザー1mW及び25mW:それぞれ405nm及び561nmで放射及びアルゴンレーザー100mW:488nmで放射を備えた共焦点顕微鏡を用いて観察したTCSSp5AOBSTandem,Leica,Mannheim,Germany。ヘキストについては411~481nmで放射シグナルを回収し、FITCについては493~555nm、テキサスレッドについては591~703nmで放射シグナルを回収した。各実験は、同様の方法で実施、取得及び分析し、3回繰り返した。2.6.LysoTrackerRedでの細胞培養物の標識Lab-Tek商標培養チャンバThermoFisherScientific,Roskilde,Denmarkで増殖させた細胞を感染させ、3hpiにおいて、ペニシリンGで処理するか、又は処理しなかった。22hpiにおいて、DMEMで希釈した10μMのLysoTrackerRedとともに細胞をインキュベートした30分間、37°C。タンデムスキャナを備えたLeica共焦点顕微鏡を用いて、ビデオ顕微鏡タイムラプスにより、5CO2下、37°Cでスライドを観察した。励起は、レーザーダイオード1mWで561nmであり、565nmと641nmとの間の放射シグナルを回収した。最大4時間までの間、2分間ごとに画像を得た。2.7.RNA調製及び遺伝子発現分析上記のように、およそ1×105のHeLa細胞を感染させ、ペニシリンGに曝露するか、又は曝露しなかった。100hpiにおいて、RNeasyPlusMiniKitQiagen,Hilden,Germanyを用いて、totalRNAを単離した。37°Cで1時間、サンプルをDNaseIで処理した。次いで、70°Cで10分間、酵素を変性させた。RT-PCRのために、製造者の指示に従って、ランダムヘキサマープライマー及びAffinityScriptMultipleTemperatureReverseTranscriptaseAgilent,SantaClara,CA,USAを用いて、RNAをcDNAに逆転写した。TaqポリメラーゼInvitrogen,Carlsbad,CA,USAを用いてPCRによりcDNA及びRNAを増幅して、DNA汚染がないことを確認した。16SrRNAを増幅するために使用したプライマーは、配列番号1:CGCCTGAGGAGTACACTCGC配列番号2:CCAACACCTCACGGCACGACである。真核生物18SrRNAを増幅するために使用したプライマーは、配列番号3:ATGGCCGTTCTTAGTTGGTG配列番号4:CGCTGAGCCAGTCAGTGTAGである。PCR産物の半定量分析は、アガロースゲル電気泳動及びUV検出により実施した。2.8.統計分析データは、n回の実験の平均±標準偏差として示す。平均±標準偏差は、図面に示す;p値は、スチューデントのペアt検定を用いて計算する。0.05未満のp値を統計的に有意であると見なす。2.9.Invivoモデルマウス及びモルモットに感染するクラミジア種であり、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatisと遺伝的に近縁なクラミジアムリダルムChlamydiamuridarumをC57B1/6マウスに感染させた。プロゲステロン注射によりマウス発情周期を開始させ、次いで、3日後、経膣的にマウスに感染させた107IFU。感染10日後、マウスを3つのグループに分け、ネガティブコントロールグループにはいずれの抗生物質も受けさせず、ポジティブコントロールグループには、ドキシサイクリン5mg/mLを受けさせ、試験グループにはペニシリンG5mg/mLを受けさせた。処理期間は20日間であった;抗生物質であるドキシサイクリン及びペニシリンGをマウスの飲用水に添加した。処理後、持続性細菌に自己のサイクルを再開させ、後遺症sequellesを発症させるために、マウスを60日間隔離した。次いで、マウスを屠殺し、生殖管の外観を分析し、卵管留水腫の存在を探索した。各種臓器も採取した。3.結果3.1.クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis血清型L2に感染した細胞のペニシリンGでの処理は、持続性ではない異常な封入体の形成を導く従来技術の研究では、クラミジア持続性モデルとして、培養宿主細胞をペニシリンGで処理することを示していた。しかし、この抗生物質での処理によりもたらされる細菌形態の特徴、及び培地からペニシリンGを除去した後に感染性の子孫が得られることをめぐる議論により、本発明者らはこの疑問を再度検証することにした。クラミジア感染細胞をゲンタマイシン、ペニシリンG又はIFN-γで処理した。後者は持続性誘導剤として周知である。IFN-γでの処理により生成される細菌封入体の大きさは、細胞を4日間培養した場合に一定のままである図1。この増殖の欠如は、2週間を超える期間、観察された。前記封入体の持続型の平均直径は、2~3μmであった。これらの2つの特徴封入体が増殖しないこと、及び中規模のサイズであることは、持続性クラミジアの典型である。他方、ペニシリンGで処理した感染細胞の封入体は、ゲンタマイシン処理細胞のものと同程度に急速に増殖することがビデオ顕微鏡により観察された。感染後120時間hpiにおいて、ペニシリンGで処理した感染細胞は溶解し、それらの構造物を培地に放出した。封入体に存在するこれらの構造物の直径5~10μmは、IFN-γでの処理により得られる持続性細菌体のもの2~3μmよりも非常に大きかった。第2の一連の実験において、異常な細菌粒子を含むこのような封入体の生成及び成長は、使用するクラミジア細菌の宿主細胞タイプ、血清型、生物型、又はさらにはクラミジアの種とも無関係であることが示された図6。さらに、感染後の様々な時間で感染細胞をペニシリンGで処理した。細菌サイクルの第1段階でペニシリンGを添加した場合のみ24hpi前、封入体における異常に拡張した構造の出現をペニシリンGが導くことが観察された。これは、ペニシリンGがRBの成長に影響を及ぼすが、EBの成長には影響を及ぼさないことを示す。全体として、これらの結果は、ペニシリンGでの処理が、非持続性封入体における拡張した細菌形態の形成を導くことを示す。3.2.ペニシリンGでの宿主細胞の処理は、細菌感染性の不可逆的な喪失を引き起こす細胞を連続して100IU/mLのペニシリンGで処理した場合、48hpiで集めた細菌は、ゲンタマイシンで処理した細胞から集めた細菌よりも、数百倍低い感染性であった図2。同一条件下、100hpiにおいては、ペニシリンGで処理した宿主細胞により放出される細菌は、完全に非感染性であった。持続性の別の特徴によれば、持続性の刺激が培地から除去された場合に、封入体は、再び増殖できる。同時に、持続性の細菌体は、網様体RBに変換される。従って、24hpi又はペニシリンGでの処理開始から21時間後においてペニシリンGを除去することにより、感染性細菌が回復し得るかどうかを検証した。この実験において、感染細胞での正常な成長サイクルは、ビデオ顕微鏡により、いずれも観察されなかった。さらに、いずれの感染性の向上も実証されなかった図2。最大1IU/mLの濃度のペニシリンGを用いた場合でも、同じ感染性の不可逆的な喪失が観察された図7。これらの結果は、感染細胞をペニシリンGとともに一時的に又は連続的にインキュベートすることにより、クラミジアの感染性が完全に失われることを示す。3.3.ペニシリンGでの処理は、感染細胞にアポトーシスを起こしやすくさせる細胞外刺激により誘起される宿主細胞アポトーシスを制御及び阻害する能力は、クラミジアサイクルの主な特性である。従って、ペニシリンGで処理した感染細胞の、アポトーシス誘発経路を阻害する能力を試験した。21hpiにおいて、感染細胞を4μMのスタウロスポリンで処理した場合、非感染コントロール細胞が全てアポトーシスを起こす一方、48hpiにおいて、11.83のみが、アポトーシス細胞の典型的な特徴を呈するという結果を示す図3。他方、同一条件下、ペニシリンGで処理した感染細胞では70.39がアポトーシスシグナルを示した。アポトーシスに対する耐性の喪失についてペニシリンG効果のスピードを評価するために、2hpi又は29hpiのいずれかで、感染細胞をペニシリンGで処理した。次いで、31hpiで、処理細胞をスタウロスポリンとともにインキュベートした。8時間後に細胞を観察した図8。おおよそ38の細胞が、両方の条件下でアポトーシスを起こしたことから、ペニシリンGが非常に急速な効果を有することが示される。この結果は、ペニシリンGで処理した細菌が、宿主細胞アポトーシス開始に対する制御を非常に急速に喪失することを示す。3.4.ペニシリンGでの処理は、16SリボソームRNA発現の喪失を導くクラミジアの網様体及び持続型はともに、細菌にとって必須の16SリボソームRNArRNAを発現することが公知である。16SrRNAの発現を、ペニシリンGにより誘起される異常な細菌形態で調べた。100hpiにおいて、ペニシリンG、ゲンタマイシン又はIFN-γで処理した感染細胞からRNAを抽出し、RT-PCRにより16SrRNAの発現を調べた。その結果、ゲンタマイシン図4又はIFN-γで処理した感染細胞からは16SrRNAに特異的な配列が増幅された。他方、ペニシリンGで処理した感染細胞は、細菌RNAを生成しない。しかし、全ての感染細胞は、真核生物の18SrRNAを同一レベルで発現しており、これにより、RNAの抽出及びRT-PCTが有効であることが示された。さらに、抽出されたRNAのPCRにより、いずれのDNAの汚染も観察されなかった。全体として、これらの結果は、クラミジアのRB及び持続型が16SrRNAを生成することを示す。他方、ペニシリンGで処理した細菌は、この必須のRNAを発現する能力を失っていた。3.5.感染細胞のペニシリンGでの処理は、リソソームと異常な封入体との融合を導く宿主細胞におけるアポトーシス機能に対する制御の喪失と、必須の細菌遺伝子の発現の欠如を伴う、ペニシリンGで処理した細菌の異常な表現型は、ペニシリンGが、クラミジアの分解を導くことを示唆する。小胞内に閉じ込められた細胞内粒子は、リソソームへと送られ、崩壊される。従って、異常な封入体とリソソームとの融合の可能性を調べた。カテプシンは、リソソームによるタンパク質分解において重要な役割を担うプロテアーゼである。特に、カテプシンDは、リソソームのアスパラギン酸プロテアーゼである。IFN-γ及びペニシリンGで処理するか、又は未処理の感染細胞において、カテプシンDの局在を調べた。24hpiにおいて、異常な細菌形態の大半がカテプシンDを有した図5A。予期されたとおり、このマーカーは、正常及び持続性の封入体からは排除されていた。コントロールアイソタイプを用いた実験において、いずれの印も観察されなかった。これらの結果は、ペニシリンGで処理するか、又は未処理の感染細胞のLysoTracker染色研究により確認した図5B。LysoTrackerは、リソソームなどの酸性コンパートメントを検出するために使用されるプローブである。LysoTrackerの保持メカニズムは、そのプロトン化を使用しており、それにより、オルガネラ膜におけるその局在化が導かれるHaugland,R.P.TheHandbook,Aguidetofluorescentprobesandlabelingtechnologies,10thedition2005.InvitrogenCorp,SpenceM.T.Z.ed.pp580-588。このプローブでの感染細胞の標識は、異常な封入体における複雑な管状ネットワークreseautubulairecomplexeを明らかにし、それは、異常な封入体のみであった。さらに、これらの異常な封入体の大部分で、非常に高強度の点が観察された図5B、囲み。これらの点は、異常な封入体に侵入したリソソームであり得た。この仮説を調べるために、感染細胞におけるリソソームの挙動を共焦点ビデオ顕微鏡により調べた。その結果、LysoTrackerプローブで染色されたコンパートメントが異常な封入体に侵入することが実証された図5C。さらに、血清型L2に感染させたRL95-2細胞、又は血清型Dに感染させたHeLa細胞において生成される異常な封入体は、カテプシンDも含む図9。全体として、これらの結果は、ペニシリンGが、リソソームと異常なクラミジア封入体との融合を誘起することを示す。3.6.持続性細菌のペニシリンGでの処理は、クラミジア封入体とリソソームとの融合、及びそれらの子孫の破壊を誘起するペニシリンGの効果を持続性の感染について試験した。細胞を感染させ、次いで、3hpiにおいてIFN-γで処理した。顕微鏡下で持続性封入体の出現が観察された時点で、IFN-γの存在下で培養した感染細胞にペニシリンGを添加した。その結果、封入体増殖の急速な再開が観察され、同時に、前記封入体における細菌粒子の異常な拡張が観察された。ペニシリンGの添加から24時間後、異常な細菌形態の大部分がカテプシンDを有した。最終的に、ペニシリンGでの処理開始から70時間後に細胞は溶解し、溶解は、非感染性細菌の放出を伴った。この結果は、ペニシリンGでの処理が、持続型のクラミジアの分解を導くことを示す。3.7.感染マウスのペニシリンGでの処理は、卵管留水腫の欠如を導くペニシリンGの効果を、生殖器感染マウスモデルにおいて試験した。このモデルでは、子宮角に卵管留水腫の形成が観察される。これらの炎症性嚢胞は、クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatisの骨盤内感染症と関連して哺乳動物で高い頻度で観察され、壁の結合及び液体の貯留によって生じる。未処理マウスネガティブコントロールが、子宮角の長さを超える非常に大きな卵管留水腫を有するのに対し、ドキシサイクリンで処理した感染マウスポジティブコントロールは、卵管中に小さな卵管留水腫を有する図10。ペニシリンGで処理したマウスの生殖管は、とりわけ、正常な外観を有しており、ペニシリンGでの処理が、クラミジア感染に起因する組織ダメージを予防できることが示唆された。これらのデータは、現在ヒトでの標準治療であるドキシサイクリン治療と比較して、ペニシリンG治療によるより高い有効性を初めて示すものである。3.8.クラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis血清型L2感染細胞の他のβ-ラクタムでの処理は、ペニシリンG処理と同一の異常形態及び感染性の喪失を導くβ-ラクタムファミリーの他の分子が、invitroにおいて、ペニシリンGの存在下で生成されたものと同一のクラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatis異常形態及び非感染性形態を誘起し得るかどうかの検証を初めて試みた。異なるβ-ラクタムで処理した感染細胞由来の細菌の感染能について力価実験を実施した。これら分子の各々について、細胞毒性及び最小殺菌濃度MBCを測定した。これらのβ-ラクタムの全てが、IFN-γの影響下でinvitroで生成されるクラミジアトラコマチスChlamydiatrachomatisの持続型に対して、殺菌作用を有するかどうかも検証した。これらの実験結果を以下の表1に示す。結論として、全てのβ-ラクタムは、ペニシリンGと同一の効果を発揮する。"