"ロイコノストックLeuconostoc属菌株由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子が導入されたザイモモナスモビリスZymomonasmobilis形質転換体。前記D-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、またはSEQIDNO:8のアミノ酸配列で表されるペプチドをコーディングする遺伝子である、請求項1に記載の形質転換体。前記D-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、またはSEQIDNO:7の塩基配列で表される、請求項1に記載の形質転換体。前記形質転換体は、寄託番号KCTC11803BPである、請求項1に記載の形質転換体。ザイモモナスモビリス菌株を準備する段階と、前記ザイモモナスモビリス菌株にロイコノストック属菌株由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を導入する段階とを含むザイモモナスモビリス形質転換体製造方法。前記導入は、接合、電気穿孔法、および遺伝子銃方法からなる群より選ばれた方法で行う、請求項5に記載の方法。ロイコノストック属菌株由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナスモビリス菌株に導入してザイモモナスモビリス形質転換体を製造する段階と、前記製造されたザイモモナスモビリス形質転換体を培養する段階とを含む乳酸生産方法。前記培養は、pH3.0乃至pH7.0の条件下で行う、請求項7に記載の方法。請求項7または8の方法によって生産された光学純度が95以上である乳酸。光学純度が99以上である、請求項9に記載の乳酸。そこで、本発明は、前記従来の技術の問題点を解決するために案出されたものであって、pH条件の制限や微生物内の代謝経路の調節なしにも高収率で乳酸を生産することができるだけでなく、別途の乳酸分離精製工程なしにも高い光学純度の乳酸を生産することができる形質転換体、その製造方法およびそれを利用した乳酸生産方法を提供することを目的とする。前記のような課題を解決するために、本発明者らが高光学純度の乳酸を大量生産可能な乳酸生産微生物を研究している中、ロイコノストックLeuconostoc属菌株由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼD-lactatedehydrogenaseをコーディングする遺伝子をザイモモナスモビリスZymomonasmobilis菌株に導入することによって、別途の複雑な工程や生産条件の制約なしに簡便且つ経済的な方法でD-乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を極大化することができ、ひいては高光学純度の乳酸生産を最大化することができることを確認して本発明を完成するように至った。本発明は、ロイコノストック属菌株由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子が導入されたザイモモナスモビリス形質転換体を提供する。また本発明は、ザイモモナスモビリス菌株を準備する段階と、前記ザイモモナスモビリス菌株にロイコノストック属菌株由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を導入する段階とを含むザイモモナスモビリス形質転換体製造方法を提供する。また本発明は、ロイコノストック属菌株由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナスモビリス菌株に導入してザイモモナスモビリス形質転換体を製造する段階と、前記製造されたザイモモナスモビリス形質転換体を培養する段階とを含む乳酸生産方法を提供する。また本発明は、前記乳酸生産方法によって生産された高光学純度乳酸を提供する。以下、本発明をより詳しく説明する。乳酸lactate/lacticacidは、カルボキシ基ヒドロキシ基メチル基水素の4つの原子団が結合した非対称炭素原子を有する有機化合物化学式:C3H6O3であって、D-、L-、DL-型の光学異性質体を全て含み、好ましくはD-型であり得る。前記乳酸の生産収率を高めるために、本発明の一実施形態は、ロイコノストックLeuconostoc属菌株由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子が導入されたザイモモナスモビリスZymomonasmobilis形質転換体を提供する。本発明はまた、ザイモモナスモビリスZymomonasmobilis菌株を準備する段階と、前記ザイモモナスモビリス菌株にロイコノストックLeuconostoc属菌株由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を導入する段階とを含むザイモモナスモビリス形質転換体製造方法を提供する。前記ザイモモナスモビリスZymomonasmobilis菌株は、アルコール発酵菌であって、細胞生長に比べて産物転換率に優れた菌株であるため、D-乳酸デヒドロゲナーゼD-lactatedehydrogenaseをコーディングする遺伝子を導入することに好ましい。前記ザイモモナスモビリスZymomonasmobilis形質転換体を利用することによって、ザイモモナスモビリス菌株の代謝経路中のある特定の代謝経路を遮断して前記特定の代謝経路で生成される一次代謝産物以外の他の一次代謝産物の生産を増加させるなどの複雑な代謝経路の調節工程がなくても非常に簡単且つ容易な工程によって乳酸生産を顕著に向上させることができる。本明細書における形質転換とは、元来の細胞が有していたものとは異なる種類の遺伝子があるDNA鎖切れまたはプラスミドが細胞らの間に浸透して元来の細胞に存在していたDNAと結合、細胞の遺伝型質が変化する分子生物学的な現象を意味する。特に本発明における形質転換とは、前記D-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナスモビリス菌株内に導入することを意味し、形質転換体とは、前記遺伝子が導入されたザイモモナスモビリス菌株を意味し、好ましくは前記SEQIDNO:1の塩基配列で表される遺伝子Dldh-Lmes1801/DlmesC2が導入された寄託番号KCTC11803BPである形質転換体である。前記D-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子はこれに制限されないが、好ましくはロイコノストック属菌株由来のものであり得、より好ましくはSEQIDNO:2のアミノ酸配列で表されるペプチドまたは前記SEQIDNO:2のアミノ酸配列とアミノ酸一致度identity、が40以上であるペプチドをコーディングする遺伝子であり得る。好ましくは、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、またはSEQIDNO:8のアミノ酸配列で表されるペプチドをコーディングする遺伝子であり得る。前記SEQIDNO:2のアミノ酸配列はSEQIDNO:1の塩基配列によって暗号化し、前記SEQIDNO:4のアミノ酸配列はSEQIDNO:3の塩基配列によって暗号化し、前記SEQIDNO:6のアミノ酸配列はSEQIDNO:5の塩基配列によって暗号化し、前記SEQIDNO:8のアミノ酸配列はSEQIDNO:7の塩基配列によって暗号化するものであり得る。したがって、前記D-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子はこれに制限されないが、SEQIDNO:1の塩基配列で表される遺伝子または前記SEQIDNO:1の塩基配列で表される遺伝子と塩基配列類似度similarity、が85以上である遺伝子であり得る。好ましくは前記遺伝子は、SEQIDNO:1の塩基配列で表される遺伝子Dldh-Lmes1801、SEQIDNO:3の塩基配列で表される遺伝子ldhD-ATCC19254、SEQIDNO:5の塩基配列で表される遺伝子ldhD1-LMG18811、またはSEQIDNO:7の塩基配列で表される遺伝子D-ldh-NBRC3426であり得る。前記遺伝子の導入はこれに制限されないが、好ましくは接合conjugation、電気穿孔法electroporation、および遺伝子銃方法genegunからなる群より選ばれた方法を用いることができる。前記接合conjugationは、細胞間donorcell、recipientcellの細胞表面の接合性繊毛conjugativepiliをよるDNA伝達機作を通じて遺伝子を導入する方法であるLederbergandTatum,Nature.Oct19;1584016:pp.558.1946。前記電気穿孔法electroporationは、細胞に電気衝撃を与えて細胞膜に一時的に小さい孔ができるようにして細胞のDNA吸収を増加させる方法でありNeumannetal.,TheEMBOJoumalVol.1No.7pp.841-845、1982;CellularandMolecularBiologyLetters,pp849-858,2002参照、前記遺伝子銃方法は、遺伝子を金属タングステンまたは金粒子にコーティングした後、高圧ガスの力で発射して遺伝子を導入する方法であるCellularandMolecularBiologyLetters,pp849-858,2002参照。前記遺伝子のザイモモナスモビリス菌株内の導入位置は特に制限されず、導入される位置と関係なく高光学純度の乳酸を高い収率と効率で生産することができる。したがって、非常に簡単で便利なだけでなく、費用節減の効果がある。つまり、ザイモモナスモビリス菌株の代謝経路と関連がない遺伝子またはその周辺地域に導入できることはもちろんであり、本発明によれば、ザイモモナスモビリス菌株の代謝経路の調節が不要であり、代謝経路に対する影響有無とも関係がないため、代謝経路と関連した遺伝子位置に導入することも可能である。例えば、ザイモモナスモビリス菌株のゲノム内、ORFZMO270-ZMO263、ORFZMO0087~ZMO0089、ORFZMO0381~ZMO0384、ORFZMO0390~ZMO0394またはORFZMO1786~ZMO1789部位に導入することができ、または代謝経路関連遺伝子であるL-乳酸デヒドロゲナーゼZMO0256遺伝子、D-乳酸デヒドロゲナーゼZMO1237、アルコールデヒドロゲナーゼIZMO1236遺伝子、またはアルコールデヒドロゲナーゼIIZMO1596遺伝子位置に導入することもできる。前記D-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、ザイモモナスモビリス菌株のプロモーターと共にベクターに挿入して前記ザイモモナスモビリス菌株内に導入させることができる。使用可能なベクターとしては、公知の全ての種類のベクターを含み、例えばpGMC、pZY507、pZY500、およびpZymoのようなザイモモナスモビリス遺伝子発現ベクターだけでなく、pUCseries、pBluescriptseries、pGEMseriesなどのような一般クローニング用ベクターであり得る。好ましくは前記ベクターは、ザイモモナスモビリスで調節可能なプロモーターを含み、選別マーカ、コンジュゲーターconjugatorなどをさらに含むことができる。ザイモモナスで強力に発現するプロモーターは、通常の組み換え蛋白質の発現に使用される全ての種類のプロモーターであり得、またはザイモモナスモビリスZM4由来のプロモーターを使用することもできる。例えばZM4由来のadhIadhA、ZMO1236、pdcpdc、ZMO1360またはadhII遺伝子adhB、ZMO1596のプロモーターがあり、それ以外にもザイモモナスモビリスZM4のそれぞれの遺伝子の上流配列500bpがプロモーターとして作用が可能である。一方、大腸菌で強力に発現するtacプロモーターもまたザイモモナスで使用することができるZhangetal.,Science.1995.Jan13;2675195:pp.240-243。選別マーカは、抗生剤耐性遺伝子であり得、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などが使用され得るが、これに限定されない。またベクターは、宿主細胞に形質転換されてエピソーマルepisomal状態で存在する場合、複製に必要な複製オリジンreplicationoriginが要求される。複製オリジンとしては大部分のグラム-バクテリアで作用するOriVoriginがあり、前記originに作用するrepA、repB遺伝子がさらに要求され得る。前記ベクターは、微生物に形質導入の際、微生物の染色体に挿入integrationされたりプラスミド形態で細胞質内に存在することができ、これはベクターの種類によって適切に調節することができる。染色体内にベクターが挿入される場合は、ベクター内にザイモモナス菌株で複製に必要な複製オリジンがない場合として、染色体内にプラスミドと相同性を有する部分がある場合、相同性がある部分に挿入homologousrecombinationされて同一の遺伝子が連続的に2copy存在singlecrossover、geneintegrationしたり相同性部位がプラスミドの相同性部位に代替されるようになるdoublecrossover、genedisruption。もし染色体内にプラスミドと相同性がある部分が存在しないならば、無作為的な挿入Randomrecombinationが起こるようになる。また本発明は、ロイコノストック属菌株由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナスモビリス菌株に導入してザイモモナスモビリス形質転換体を製造する段階と、前記製造されたザイモモナスモビリス形質転換体を培養する段階とを含む乳酸生産方法を提供する。前記培養は、正常発酵条件であるpH5.0ではもちろん、酸性発酵条件やその他pH非調節条件でも制限なしに行うことができる。例えば、pH3.0乃至pH7.0、より具体的にはpH2.0乃至pH6.0、またはpH3.0乃至pH5.0のような酸性条件下でも乳酸の生産が可能である。一般に微生物の生存条件は、中温30-37°Cと中性pHneutralpH7.0条件であり、微生物は特にpHに非常に敏感であり、狭いpH範囲だけで活発な生存性と生産性を示す特性があるが、弱酸性を有する乳酸を生産する乳酸生産工程では、乳酸の生産自体で酸度を低下させて酸性化する特性があるため、最適のpHを維持するために、NaOH、NH4OH、CaOH2のような塩基baseまたは炭酸塩CaCO3を持続的に添加することによって中性発酵pHを維持することが要求された。しかし、本発明の乳酸生産方法は、このようなpH条件の制限なしにいかなるpH条件でも高い光学純度の乳酸を高収率で生産すること前記乳酸方法によって、好ましくは70以上、高い場合は100以上の顕著に高い生産収率で光学純度が高い優れた乳酸を大量生産することができる。したがって、本発明は前記乳酸生産方法によって生産された高光学純度の乳酸を提供する。前記乳酸生産方法によって生産される乳酸は、光学純度が95以上であり、高い場合は99、より高い場合は99.9以上の顕著に優れた光学純度を有することができる。本発明によって、pH条件など生産条件の厳しい制限や微生物内の代謝経路の複雑な調節なしにも簡便に高光学純度の乳酸を高収率で生産することができるザイモモナスモビリスZymomonasmobilis形質転換体、その製造方法、およびそれを利用した乳酸生産方法が提供される。前記形質転換体を利用すれば、別途の付加的な乳酸分離精製工程が不要であるため、乳酸生産段階を顕著に減少させることができて生産費用を大幅に節減することができるだけでなく、沈澱廃棄物による環境的な問題を排除することができて環境保護効果も得ることができる。以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を通じてより詳しく説明する。ただし、下記の実施例は本発明を予告するものに過ぎず、本発明の範囲はこれに限定されない。実施例1.D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子DlmesC2が導入されたZM形質転換体の製造実施例1-1.プラスミドpGEM-T-DlmesC2の製造キムチから分離されたロイコノストックメセンテロイデスLeuconostocmesenteroides菌株からD-乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするDlmesC2遺伝子1,068bpSEQIDNO:1をPCR方法96°Cで5分間にかけて前変性pre-denaturation;96°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで1分間にかけて総25cycles;72°Cで7分間にかけて後伸張postextensionで0.1UnitのHigh-FidelityPlatinumTaqDNAPolymeraseRocheと以下に記載されたプライマーを用いて選択的に増幅、分離した。前記PCR工程で使用されたプライマーは次のとおりである。正方向プライマーDLmesC2FSEQIDNO:95-TGGAGGATCCCATGGTAAAGATTTTTGC-3逆方向プライマーDLmesC2RSEQIDNO:105-TGTTTGATTATTCCTGCAGAAACCCCTC-3以降、pGEM-TEasyvectorPromegaにクローニングしてDlmesC2遺伝子がクローニングされたプラスミドpGEM-T-DlmesC2を製造し、塩基配列を確認した。PCR増幅とクローニングは製造会社の実験方法に従って行った。実施例1-2.BS-del-270::sp-DlmesC2::263ベクターの製造前記実施例1-1で製造されたプラスミドpGEM-T-DlmesC2を制限酵素NcoINEBとPstINEBで切断した後、ザイモモナスモビリスアルコールデヒドロゲナーゼadhII遺伝子adhB、ZMO1596のプロモーター部位SEQIDNO:11とスペクチノマイシン耐性spectinomycinresistant遺伝子specR、1,142bpSEQIDNO:12を有するpBS-sp-P1596-specRベクターマクロゼンに同一の制限酵素シートでクローニングしてD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子DlmesC2を含むpBS-sp-DlmesC2ベクターを得た。D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子DlmesC2をザイモモナスモビリス遺伝体に導入するために、相同性組み換えhomologousrecombinationAlbertsetal.,2002.Chapter5:DNAReplication,Repair,andRecombination.MolecularBiologyoftheCell4thed..NewYork:GarlandScience.p.845を利用した。相同性組み換えに使用された遺伝子は、ザイモモナスモビリスATCC31821の遺伝体情報から選別し、具体的にORFZMO0263からZMO0270までの8個の反復された遺伝子らSEQIDNO:13~SEQIDNO:20を選別した。ORFZMO0263からZMO0270までの反復された遺伝子らは、特定の代謝酵素をコーディングしない遺伝子らであり、全体約10kbに達する部位である。これら遺伝子らの上流相同部位の4,468bp遺伝子SEQIDNO:21と下流相同部位の4,935bp遺伝子SEQIDNO:22のそれぞれを実施例1と同一な実験方法を用いてそれぞれ選択的に増幅、分離した後、HindIIINEB、PstINEB、PvuINEB、ScaINEBで切断した後、同一の制限酵素で切断されたpBluescriptIIvectorStratageneにクローニングして最終的にpBS-de-270::263ベクター図2を製造した。使用されたプライマーは次のとおりである。上流遺伝子正方向プライマーL-270FSEQIDNO:235-GGAAAGTCAAGCTTATCATCTAG-3上流遺伝子逆方向プライマーL-270RSEQIDNO:245-GTGAGTTGTTAACCAATTTTATACTCCATTCATC-3下流遺伝子正方向プライマーR263FSEQIDNO:255-GACAATACAAAGTACTGATAAAGGA-3下流遺伝子逆方向プライマーR263RSEQIDNO:265-ATAAGCCTGTTAACTTAccCATCTTGTCCGACG-3上記で製造されたpBS-sp-DlmesC2ベクターを制限酵素NotINEBとPstINEBで切断して、specR-DlmesC2遺伝子切片だけを回収し、T4DNApolymeraseNEBとT4polynucleotidekinase酵素NEB処理を通じて平滑末端bluntendのspecR-DlmesC2遺伝子切片を作製した。作製された平滑末端のspecR-DlmesC2を前記製造されたpBS-del-270::263ベクターの制限酵素HpaIシートにT4DNAligaseNEB酵素でライゲーションligationおよびクローニングしてpBS-del-270::sp-DlmesC2::263ベクター図3を製造した。実施例1-3.D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子DlmesC2が導入されたZM形質転換体の製造前記実施例1-2で製造されたpBS-del-270::sp-DlmesC2::263ベクターをザイモモナスモビリスZM4菌株ATCC31821に電気穿孔法electroporationNeumannetal.,TheEMBOJoumalVol.1No.7pp.841-845,1982で形質転換し、RM培地グルコース、20g/l;酵母抽出物DIFCO、10g/l;MgSO4、1g/l;NH42SO4、1g/l;KH2PO4、2g/l;agar、15g/l;pH5.0にスペクチノマイシンを添加してpBS-del-270::sp-DlmesC2::263ベクターが形質転換された菌株を選別し、最終的にORFZMO0263からZMO0270反復遺伝子らが相同性組み換えられ、sp-DlmesC2遺伝子が導入された形質転換体をZymomonasmobilisMG6106と命名し、2010年11月5日付で韓国生命工学研究院微生物資源センターに寄託して寄託番号KCTC11803BPを付与された。実施例2.多様なD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された乳酸生産ZM菌株の製造ロイコノストッククレモリスLeuconostoccremorisATCC19254、ロイコノストックメセンテロイデスLeuconostocmesenteroidesLMG18811、およびロイコノストックメセンテロイデスLeuconostocmesenteroidesNBRC3426菌株由来のD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であるldhD-ATCC19254、ldhD1-LMG18811、およびD-ldh-NBRC3426を実施例1と同様な方法と材料を用いてPCR増幅、分離した。前記多様なD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅に使用されたプライマーは次のとおりである。[ldhD-ATCC19254遺伝子増幅プライマー]ATCC19254FSEQIDNO:275-CATATGAAGATTTTTGCTTACGGCATTCGT-3ATCC19254RSEQIDNO:285-TTAATATTCAACAGCAATAGCT-3[ldhD1-LMG18811遺伝子増幅プライマー]LMG18811FSEQIDNO:295-CATATGAAAATTTTTGCTTACGGCATACG-3LMG18811RSEQIDNO:305-CTGCAGTCAGTATTTAACAGCGATTGCA-3[D-ldh-NBRC3426遺伝子増幅プライマー]NBRC3426FSEQIDNO:315-CATATGAAGATTTTTGCTTACGGCATTCG-3NBRC3426RSEQIDNO:325-CTGCAGTTAATATTCAACAGCAATAGCT-3個別に増幅されたPCR産物は、制限酵素NcoINEBとPstINEBで切断して同一の制限酵素で切断されたpBS-sp-P1596-specRベクターマクロゼンに同一の制限酵素シートにT4DNAligase酵素NEBでライゲーションligationおよびクローニングし、NBRC3426菌株のD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターであるpBS-sp-D-NBRC3426lベクター、LMG18811菌株のD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターであるpBS-sp-D-LMG18811、そしてATCC15294菌株のD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターであるpBS-sp-D-ATCC15294ベクターをそれぞれ作製した。前記ベクターらを制限酵素NotINEBとPstINEBで切断して、specR-D-NBRC3426l、specR-D-LMG18811、そしてspecR-D-ATCC15294遺伝子切片を回収し、T4DNApolymeraseNEBとT4polynucleotidekinase酵素NEB処理を通じて平滑末端bluntendの遺伝子切片それぞれを作製した。作製された平滑末端の遺伝子切片を前記実施例1で製造されたpBS-del-270::263ベクターの制限酵素HpaIシートにクローニングしてpBS-del-270::sp-D-NBRC3426l::263ベクター、pBS-del-270::sp-D-LMG18811::263ベクター、そしてpBS-del-270::sp-D-ATCC15294::263ベクターをそれぞれ製造した。上記で製造されたベクターらをザイモモナスモビリスZM4菌株ATCC31821に電気穿孔法electroporationで形質転換し、RM培地グルコース、20g/l;酵母抽出物DIFCO、10g/l;MgSO4、1g/l;NH42SO4、1g/l;KH2PO4、2g/l;agar、15g/l;pH5.0にスペクチノマイシンを添加して形質転換された菌株を選別し、最終的にORFZMO0263からZMO0270反復遺伝子らが相同性組み換えられ、ロイコノストッククレモリスATCC19254菌株からD-乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするldhD-ATCC19254遺伝子996bpSEQIDNO:3が導入された菌株をMG6115、ロイコノストックメセンテロイデスLMG18811菌株からD-乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするldhD1-LMG18811遺伝子996bpSEQIDNO:5が導入された菌株をMG6116、そしてロイコノストックメセンテロイデスNBRC3426からD-乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするD-ldh-NBRC3426遺伝子996bpSEQIDNO:7が導入された菌株をMG6117とそれぞれ命名した。実施例3.遺伝体内の代謝経路と無関係な遺伝子または部位を除去し、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したZM菌株の製造D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の菌株内導入位置およびこれによる乳酸生産程度に対する影響を調べてみるために、ザイモモナスモビリス菌株ATCC31821内の代謝経路と無関係な特定の遺伝体位置に該当する遺伝子または部位を除去すると同時に、SEQIDNO:1の塩基配列を有するDlmesC2遺伝子を導入した菌株を製造した。具体的に、ザイモモナスモビリス遺伝体で特定酵素をコーディングせず、いかなる遺伝子情報を有していない遺伝子部位4種類を選別してそれぞれ除去すると同時に、DlmesC2遺伝子が導入された菌株を製造した。菌株製造は実施例1と同様な方法を用い、代謝経路と無関係な遺伝子のそれぞれの上流相同部位および下流相同部位約3,000bp以上を相同性組み換え部位にクローニングして用いた。実施例3-1.ZMO0087~ZMO0089の3種類のORF部位を除去し、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造ZMO0087~ZMO0089の3種類のORFopenreadingframeらを5’末端側に5’末端から上流相同部位の3,168bpSEQIDNO:33と3’末端側に3’末端から下流相同部位の3,159bpSEQIDNO:34をそれぞれ正方向プライマー87Fと逆方向プライマー89R対を用いて実施例1と同様な方法と条件でPCR増幅し、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマー87FSEQIDNO:355-TGAAATGGCCTCTGCGATATATCGAATA-3逆方向プライマー89RSEQIDNO:365-GTAAGGGTATCGCTCCGCTCTTTATGGCGGA-3増幅されたPCR産物は、制限酵素NotINEBで処理した後、同一の制限酵素で切断されたpBluescriptIIベクターStratageneにクローニングしてpBS-ZMO008789ベクターを作製した。以降、逆方向reversePCR方法を応用してORF遺伝子ZMO0087~ZMO0089らを除いてpBluescriptIIベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にPCR増幅した。逆方向PCR反応に使用されたプライマーらdel89Fおよびdel87Rは次のとおりであり、PCR増幅反応は、実施例1と同様な方法と条件を用い、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマーdel89FSEQIDNO:375-TAACCCGTTTACCTCTATCATATAATTATA-3逆方向プライマーdel87RSEQIDNO:385-CATAAAATTCCTACAAATATGATCTTTTTA-3増幅されたPCR産物を制限酵素PmeINEBで処理して得た遺伝子切片と実施例1のsp-DlmesC2遺伝子断片をT4DNAligaseNEB酵素でライゲーションligationしてpBS-Del87::sp-DlmesC2::89ベクターを作製した。実施例3-2.ZMO0381~ZMO0384の4種類のORF部位を除去し、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造ZMO0381~ZMO0384の4種類のORFらを5’末端側に5’末端から上流相同部位の3,140bpSEQIDNO:39と3’末端側に3’末端から下流相同部位の3,212bpSEQIDNO:40をそれぞれ正方向プライマー381Fと逆方向プライマー384R対を用いて実施例1と同様な方法と条件でPCR増幅し、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマー381FSEQIDNO:415-GAAGAAGCGCAGACCCTATCTCAACGATCTTT-3逆方向プライマー384RSEQIDNO:425-CCAAACTGTCCCTTGGCCAGCTTTCAAAAAAAC-3増幅されたPCR産物は、制限酵素NotINEBで処理した後、同一の制限酵素で切断されたpBluescriptIIベクターStratageneにクローニングし、pBS-ZMO0381384ベクターを作製した。以降、逆方向PCR方法を応用してORF遺伝子ZMO0381~ZMO0384らを除いてpBluescriptIIベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にPCR増幅した。逆方向PCR反応に使用されたプライマーらdel384Fおよびdel381Rは次のとおりであり、PCR増幅反応は、実施例1と同様な方法と条件を使用し、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマーdel384FSEQIDNO:435-TGTAGTTTATACGCTGCATTAAATGAAAAGG-3逆方向プライマーdel381RSEQIDNO:445-TATTTATCCAATGCGCCCCCTGCTTTG-3増幅されたPCR産物を制限酵素PmeINEBで処理した後、実施例1のsp-DlmesC2遺伝子断片をT4DNAligaseNEB酵素でライゲーションligationしてpBS-Del381::sp-DlmesC2::384ベクターを作製した。実施例3-3.ZMO0390~ZMO0394の4種類のORF部位を除去し、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造ZMO0390~ZMO0394の5種類のORFらを5’末端側に5’末端から上流相同部位の3,280bpSEQIDNO:45と3’末端側に3’末端から下流相同部位の3,008bpSEQIDNO:46をそれぞれ正方向プライマー390Fと逆方向プライマー394F対を用いて実施例1と同様な方法と条件でPCR増幅し、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマー390FSEQIDNO:475-ATGATCCGATGGCTGGAAATAATGCGGATATG-3逆方向プライマー394RSEQIDNO:485-TAGCGGTCTGAGGCTGTGCCTCCGATGTA-3増幅されたPCR産物は、制限酵素NotINEBで処理した後、同一の制限酵素で切断されたpBluescriptIIベクターStratageneにクローニングし、pBS-ZMO0390394ベクターを作製した。以降、逆方向PCR方法を応用してORF遺伝子ZMO0390~ZMO0394らを除いてpBluescriptIIベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にPCR増幅した。逆方向PCR反応に使用されたプライマーらdel394Fおよびdel390Rは次のとおりであり、PCR増幅反応は、実施例1と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマーdel394FSEQIDNO:495-CATCCATTTTGGATATTATTTTTAAATTAATCC-3逆方向プライマーdel390RSEQIDNO:505-CGGTAAGTGCCTTTCACCGCTTCCACGACAG-3増幅されたPCR産物を制限酵素PmeINEBで処理した後、実施例1のsp-DlmesC2遺伝子断片をT4DNAligaseNEB酵素でライゲーションligationしてpBS-Del390::sp-DlmesC2::394ベクターを作製した。実施例3-4.ZMO1786~ZMO1789の4種類のORF部位を除去し、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造ZMO1786~ZMO1789の4種類のORFらは5’末端側に5’末端から上流相同部位の3,450bpSEQIDNO:51と3’末端側に3’末端から下流相同部位の3,100bpSEQIDNO:52をそれぞれ正方向プライマー1786Fと逆方向プライマー1789R対を用いて実施例1と同様な方法と条件でPCR増幅しており、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマー1786FSEQIDNO:535-ACCAAAGCCGAAAAAAGGTCATCAAAAATACC-3逆方向プライマー1789RSEQIDNO:545-GTTCAATTGCCACGCTTGAGGCTTTTGAAAATGC-3増幅されたPCR産物は、制限酵素NotINEBで処理した後、同一の制限酵素で切断されたpBluescriptIIベクターStratageneにクローニングし、pBS-ZMO17861789ベクターを作製した。以降、逆方向PCR方法を応用してORF遺伝子ZMO1786~ZMO1789らを除いてpBluescriptIIベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にPCR増幅した。逆方向PCR反応に使用されたプライマーらdel1789Fおよびdel1786Rは次のとおりであり、PCR増幅反応は、実施例1と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマーdel1789FSEQIDNO:555-TATCTCGCTTGCAATAAAACATATTTTCAGG-3逆方向プライマーdel1786RSEQIDNO:565-AGATTTTATCCGACAAAATCAATTCTATAAG-3増幅されたPCR産物を制限酵素PmeINEBで処理した後、実施例1のsp-DlmesC2遺伝子断片をT4DNAligaseNEB酵素でライゲーションligationしてpBS-Del1786::sp-DlmesC2::1789ベクターを作製した。実施例3-5.代謝経路と無関係な遺伝子または部位がD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で置換されたZM菌株の製造前記実施例3-1乃至実施例3-4により製造されたベクターらをザイモモナスモビリスZM4菌株ATCC31821に電気穿孔法electroporationで形質転換して代謝と無関係な遺伝子らが除去され、sp-DlmesC2遺伝子が挿入された菌株らを次のとおり作製した。実施例3-1のpBS-Del87::sp-DlmesC2::89ベクターをザイモモナスモビリスZM4菌株に形質転換し、抗生剤スペクチノマイシンが含まれているRM培地グルコース、20g/l;酵母抽出物DIFCO、10g/l;MgSO4、1g/l;NH42SO4、1g/l;KH2PO4、2g/l;agar、15g/l;pH5.0に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じてORF遺伝子ZMO0087~ZMO0089がsp-DlmesC2遺伝子で置換されたZ.mobilisΔZMO8789::sp-DlmesC2菌株を製造し、これをMG6118菌株と命名した。これと同様に、実施例3-2乃至実施例3-4により製造されたpBS-Del381::sp-DlmesC2::384ベクター、pBS-Del390::sp-DlmesC2::394ベクターおよびpBS-Del1786::sp-DlmesC2::1789ベクターで形質転換されてそれぞれの遺伝子部位がsp-DlmesC2遺伝子で置換されたZ.mobilisΔZMO381384::sp-DlmesC2菌株MG6119菌注、Z.mobilisΔZMO390394::sp-DlmesC2菌株MG6120菌注、およびZ.mobilisΔZMO390394::sp-DlmesC2菌株MG6121菌株を製造した。実施例4.代謝経路関連遺伝子を除去し、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したZM菌株の製造菌株内D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入と菌株の代謝経路調節間の関係およびその乳酸生産に対する影響を調べてみるために、菌株内の他の代謝経路遺伝子らを除去すると同時にSEQIDNO:1の塩基配列を有するDlmesC2遺伝子を導入した菌株を製造した。具体的にザイモモナスモビリス菌株の中心代謝回路に該当するエタノールethanolと乳酸lacticacid生産遺伝子が除去された菌株と、ここにDlmesC2遺伝子が導入された菌株を製造した。菌株製造方法は、実施例1と同様な方法を用い、代謝経路遺伝子のそれぞれの上流相同部位および下流相同部位約3,000bp以上を相同性組み換え部位でクローニングして用いた。実施例4-1.乳酸デヒドロゲナーゼZMO0256遺伝子を除去し、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子DlmesC2を導入したベクターの製造ザイモモナスモビリスZM4ATCC31821のゲノム遺伝子AE008692から乳酸デヒドロゲナーゼZMO0256遺伝子5’末端側に5’末端から上流相同部位の4,879bpSEQIDNO:57と3’末端側に3’末端から下流相同部位の4,984bpSEQIDNO:58をそれぞれ正方向プライマーldhAFと逆方向プライマーldhAR対を用いて実施例1と同様な方法と条件でPCR増幅し、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマーldhAFSEQIDNO:595-TGGCAGTCCTCCATCTAGATCGAAGGTGC-3逆方向プライマーldhARSEQIDNO:605-GTGATCTGACGGTGAGCTCAGCATGCAGG-3増幅されたPCR産物は、制限酵素NotINEBで処理した後、同一の制限酵素で切断されたpBluescriptIIベクターStratageneにクローニングし、pBS-ZMO0256ベクターを作製した。以降、逆方向PCR方法を応用して乳酸デヒドロゲナーゼZMO0256遺伝子を除いてpBluescriptIIベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にPCR増幅した。逆方向PCR反応に使用されたプライマーらldhA-PmeI-2FおよびldhA-PmeI-2Rは次のとおりであり、PCR増幅反応は、実施例1と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマーldhA-PmeI-2FSEQIDNO:615-AACTAGTTTAAACAAGAGCGAAGAATAGCAAAGAAT-3逆方向プライマーldhA-PmeI-2RSEQIDNO:625-CTCTTGTTTAAACTAGTTATGGCATAGGCTATTACG-3増幅されたPCR産物を制限酵素PmeINEBで処理した後、実施例1のsp-DlmesC2遺伝子断片をT4DNAligaseNEB酵素でライゲーションligationしてpBS-DelZM0256::sp-DlmesC2ベクターを作製した。実施例4-2.D-乳酸デヒドロゲナーゼZMO1237遺伝子を除去し、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子DlmesC2を導入したベクターの製造ザイモモナスモビリスZM4ATCC31821のゲノム遺伝子AE008692から乳酸デヒドロゲナーゼZMO1237遺伝子5’末端側に5’末端から上流相同部位の3,656bpSEQIDNO:63と3’末端側に3’末端から下流相同部位の3,848bpSEQIDNO:64をそれぞれ正方向プライマーDldh-Fと逆方向プライマーDldh-R対を用いて実施例1と同様な方法と条件でPCR増幅しており、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマーDldh-FSEQIDNO:655-TGTTTCAGGCGGCCGCTATTTTAAGTC-3逆方向プライマーDldh-RSEQIDNO:665-TCTTTATCGCGGCCGCATCAATCACAA-3増幅されたPCR産物は、制限酵素NotINEBで処理した後、同一の制限酵素で切断されたpBluescriptIIベクターStratageneにクローニングし、pBS-ZMO1237ベクターを作製した。以降、逆方向PCR方法を応用してD-乳酸デヒドロゲナーゼZMO1237遺伝子を除いてpBluescriptIIベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にPCR増幅した。逆方向PCR反応に使用されたプライマーらDel-DldFおよびDel-DldRは次のとおりであり、PCR増幅反応は、実施例1と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマーDel-DldFSEQIDNO:675-TTTCTTTTGCAGTTAACTGTCAGCCTGAA-3逆方向プライマーDel-DldRSEQIDNO:685-TGATCCTGTATGGTTAACAATTGTTGCC-3増幅されたPCR産物を制限酵素PmeINEBで処理した後、実施例1のsp-DlmesC2遺伝子断片をT4DNAligaseNEB酵素でライゲーションligationしてpBS-DelZM01237::sp-DlmesC2ベクターを作製した。実施例4-3.アルコールデヒドロゲナーゼIZMO1236遺伝子を除去し、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子DlmesC2を導入したベクターの製造ザイモモナスモビリスZM4ATCC31821のゲノム遺伝子AE008692からアルコールデヒドロゲナーゼIZMO1236遺伝子5’末端側に5’末端から上流相同部位の3,844bpSEQIDNO:69と3’末端側に3’末端から下流相同部位の3,861bpSEQIDNO:70をそれぞれ正方向プライマーAdh1-Fと逆方向プライマーAdh1-R対を用いて実施例1と同様な方法と条件でPCR増幅しており、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマーAdh1-FSEQIDNO:715-ACTCAATGGAACTGCAGCATGATCTGA-3逆方向プライマーAdh1-RSEQIDNO:725-ACCAAAGTAACATCTGCAGTGTTGATAATGGー-3増幅されたPCR産物は、制限酵素NotINEBで処理した後、同一の制限酵素で切断されたpBluescriptIIベクターStratageneにクローニングし、pBS-ZMO1236ベクターを作製した。以降、逆方向PCR方法を応用してアルコールデヒドロゲナーゼIZMO1236遺伝子を除いてpBluescriptIIベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にPCR増幅しており、逆方向PCR反応に使用されたプライマーらDel-Adh1FおよびDel-Adh1Rは次のとおりであり、PCR増幅反応は、実施例1と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマーDel-Adh1FSEQIDNO:735-TTGCGAATATAGTTTAAACGATTGC-3逆方向プライマーDel-Adh1RSEQIDNO:745-ACCAGAAAGGTTTAAACTTTGTCGTC-3増幅されたPCR産物を制限酵素PmeINEBで処理した後、実施例1のsp-DlmesC2遺伝子断片をT4DNAligaseNEB酵素でライゲーションligationしてpBS-DelZM01236::sp-DlmesC2ベクターを作製した。実施例4-4.アルコールデヒドロゲナーゼIIZMO1596遺伝子を除去し、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子DlmesC2を導入したベクターの製造ザイモモナスモビリスZM4ATCC31821のゲノム遺伝子AE008692からアルコールデヒドロゲナーゼIIZMO1596遺伝子5’末端側に5’末端から上流相同部位の3、986bpSEQIDNO:75と3’末端側に3’末端から下流相同部位の3,868bpSEQIDNO:76をそれぞれ正方向プライマーAdh2-Fと逆方向プライマーAdh2-R対を用いて実施例1と同様な方法と条件でPCR増幅し、ただし、伸張時間を10分に調節した。正方向プライマーAdh2-FSEQIDNO:775-CATAACCGACCTGCAGAATAGCCA-3逆方向プライマーAdh2-RSEQIDNO:785-TGTACCCACTGCAGAAGAATGATG-3増幅されたPCR産物は、制限酵素NotINEBで処理した後、同一の制限酵素で切断されたpBluescriptIIベクターStratageneにクローニングし、pBS-ZMO1596ベクターを作製した。以降、逆方向PCR方法を応用してアルコールデヒドロゲナーゼIIZMO1596遺伝子を除いてpBluescriptIIベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にPCR増幅した。逆方向PCR反応に使用されたプライマーらDel-Adh2FおよびDel-Adh2Rは次のとおりであり、PCR増幅反応は、実施例1と同様な方法と条件を用い、伸長時間を10分に調節した。正方向プライマーDel-Adh2FSEQIDNO:795-CCTACATACTAGTTTAAACCAACAAC-3逆方向プライマーDel-Adh2RSEQIDNO:805-CTGTCTTGATGTTTAAACAAACAATGC-3増幅されたPCR産物を制限酵素PmeINEBで処理した後、実施例1のsp-DlmesC2遺伝子断片をT4DNAligaseNEB酵素でライゲーションligationしてpBS-DelZM01596::sp-DlmesC2ベクターを作製した。実施例4-5.代謝経路関連遺伝子がD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で置換されたZM菌株の製造前記実施例4-1乃至実施例4-4により製造されたベクターらをザイモモナスモビリスZM4菌株ATCC31821に電気穿孔法electroporationで形質転換して代謝経路関連遺伝子らが除去され、sp-DlmesC2遺伝子が挿入された菌株らを次のとおり作製した。前記実施例4-1により製造されたpBS-DelZM0256::sp-DlmesC2ベクターをザイモモナスモビリスZM4菌株に形質転換し、抗生剤スペクチノマイシンが含まれているRM培地グルコース、20g/l;酵母抽出物DIFCO、10g/l;MgSO4、1g/l;NH42SO4、1g/l;KH2PO4、2g/l;agar、15g/l;pH5.0に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じて乳酸デヒドロゲナーゼZMO0256遺伝子がsp-DlmesC2遺伝子で置換されたZ.mobilisΔZMO0256::sp-DlmesC2菌株をMG6111菌株と命名した。前記実施例4-2により製造されたpBS-DelZM01237::sp-DlmesC2ベクターを実施例4-1により乳酸デヒドロゲナーゼZMO0256遺伝子が除去されたザイモモナスモビリス菌株Z.mobilisΔZMO0256::tetに形質転換して、乳酸デヒドロゲナーゼZMO0256遺伝子およびD-乳酸デヒドロゲナーゼZMO1237が全て除去され、DlmesC2遺伝子が導入されたZ.mobilisΔZMO0256::cm、ΔZMO1237::sp-DlmesC2菌株MG6112菌株を、前述のように抗生剤スペクチノマイシンが含まれているRM培地に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じて製造した。前記実施例4-3により製造されたpBS-DelZM01236::sp-DlmesC2ベクターをザイモモナスモビリスZM4菌株に形質転換し、前記抗生剤スペクチノマイシンが含まれているRM培地に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じてアルコールデヒドロゲナーゼIZMO1236遺伝子がsp-DlmesC2遺伝子で置換されたZ.mobilisΔZMO1236::sp-DlmesC2菌株MG6113菌株を製造した。最後に、前記実施例4-4により製造されたpBS-DelZM01596::sp-DlmesC2ベクターをザイモモナスモビリスZM4菌株に形質転換し、前記抗生剤スペクチノマイシンが含まれているRM培地に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じてアルコールデヒドロゲナーゼIIZMO1596遺伝子がsp-DlmesC2遺伝子で置換されたZ.mobilisΔZMO1596::sp-DlmesC2菌株MG6114菌株を製造した。実験例1.D-乳酸デヒドロゲナーゼの活性enzymeactivity試験前記実施例1乃至3で製造されたD-乳酸デヒドロゲナーゼ導入菌株が、pyruvateを基質で利用してD-lacticacidを生産する酵素反応を促進するD-乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を示すのか確認するために酵素活性測定実験を行った。対照群としては野生型ザイモモナスモビリス菌株ZM4ATCC31821を用い、前記野生型ZM4菌株とD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されたZM菌株MG6106、MG6115、MG6116、MG6117およびMG6118のそれぞれをRM培地グルコース、20g/l;酵母抽出物DIFCO、10g/l;MgSO4、1g/l;NH42SO4、1g/l;KH2PO4、2g/l;pH5.0で対数増殖期までインキュベータincubatorで定置培養して生長させた後、各細胞を回収した12,000rpm、5min、4°C。回収された各細胞らを高周波破砕sonication方法で破砕した後、遠心分離15,000rpm、10min、4°Cして上澄液supernatantを回収して酵素活性測定に用いた。D-乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性は2種類のキットLacticacidassaykitMegazyme、Sigmaを利用して製造会社の方法に従って測定し、その結果を下記表1に示した。前記表1に示されているように、対照群である前記野生型ZM4菌株の酵素活性は、0.012U/mgofproteinに過ぎない反面、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されたZM菌株MG6106、MG6115、MG6116、MG6117およびMG6118のそれぞれの酵素活性は、全て1U/mgofproteinを超え、高い場合は1.556U/mgofproteinまで現れてD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された形質転換体の酵素活性が野生型菌株に比べて顕著に優れていることを確認することができた。実験例2.乳酸D-lacticacid/D-lactate生産能力試験実験例2-1.乳酸D-lacticacid/D-lactate生産能力試験方法前記実施例1乃至4で製造されたD-乳酸デヒドロゲナーゼ導入菌株らのD-lacticacid/D-lactate生産能力を試験するために、前記菌株らをそれぞれpHを5.0に調節したRM液体培地グルコース、20g/l;酵母抽出物DIFCO、10g/l;MgSO4、1g/l;NH42SO4、1g/l;KH2PO4、2g/lで、それぞれ30°Cで20時間培養した後、前記培養した培養液から細胞を除去して得た培養上澄液を以下のような条件でHPLChighperformanceliquidchromatographyを用いて代謝産物を測定した。対照群としては前記実験例1で使用された野生型ザイモモナスモビリス菌株ZM4ATCC31821を用い、比較例としてはS.cerevisiaeDequinandBarre,BiotechnologyNewYork.1994.Feb;122:173-177および/またはS.cerevisiaeOC2菌株Ishidaetal.,J.Biosci.Bioeng.2006.Feb;1012:172-177を用いた。<HPLC測定条件>HPLCシステム:HitachiHPLCシステムmodelD-7000カラム:AminexHPX-87H300mmX7.8mmカラム温度:60°C流速:0.6ml/min移動床溶媒:0.0025Nsulfuricacid検出器:D-lacticacid/D-lactateおよびその他有機酸-UV検出器HitachiD-4200215nm糖およびエタノール-RIrefractiveindex検出器D-3300実験例2-2.多様なD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株らのD-lacticacid/D-lactate生産能力試験前記実施例1および実施例2で製造された菌株らMG6106、MG6115、MG6116、およびMG6117のD-lacticacid/D-lactate生産能力を前記実験例2-1に記載された方法で比較してみた結果、下記表2に示されているように、DlmesC2遺伝子が導入された菌株であるMG6106だけでなく、これと遺伝子一致度が95以上であるLeuconostoccremorisATCC19254菌株から分離されたD-乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするldhD-ATCC19254遺伝子996bpSEQIDNO:3、LeuconostocmesenteroidesLMG18811菌株から分離されたD-乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするldhD1-LMG18811遺伝子996bpSEQIDNO:5、およびLeuconostocmesenteroidesNBRC3426から分離されたD-乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするD-ldh-NBRC3426遺伝子996bpSEQIDNO:7がそれぞれ導入された菌株MG6115、MG6116、およびMG6117も非常に高い収率および生産性で乳酸を生産できることが分かった。したがって、前記D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、DlmesC2以外にもこれと遺伝子一致度が95以上である多様なD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を使用可能であることを確認することができた。実験例2-3.D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入位置および代謝経路調節によるD-lacticacid/D-lactate生産能力に対する影響試験前記実施例3および実施例4で製造された菌株らのD-lacticacid/D-lactate生産能力を前記実験例2-1に記載された方法で比較してみた結果、下記表3に示されているように、DlmesC2遺伝子が導入される特定の遺伝体位置に該当する遺伝子または部位と関係なく、乳酸を、低い場合は約95.0、高い場合は99.9以上の顕著に高い収率と効率で生産することが分かった。また下記表4に示されているように、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子DlmesC2が導入された各菌株の乳酸生産は他の代謝経路流れに依存したりまたは促進されることもないことが分かった。このようにD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株の乳酸生産は、前記遺伝子が導入される遺伝体の位置geneorregionまたは代謝経路流れに依存したりまたは促進されず、したがってD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入位置または代謝経路調節と関係なくD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の存在自体に独立依存的に行われることを確認することができた。反面、S.cerevisiaeの場合、代謝経路と関係がなかったり核心産物代謝例:エタノール生産経路ら経路が除去されない状態の独立的なD-lactatedehydrognaseはD-lacticacid/lactate生産に効率的ではないため、代謝経路調節に依存的であることを確認することができた。したがって、代謝経路調節と関係なく独立的にD-lacticacid/lactateを効率的に生産できるD-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株の乳酸生産能力が顕著に優れていることを確認することができた。実験例2-4.pH条件による乳酸D-lacticacid/D-lactate生産比較前記実施例1で製造されたMG6106菌株のpH条件による乳酸生産能力を試験するために、前記実験例2-1に記載された方法と同様な方法でD-lacticacid/D-lactate生産能力を測定し、ただし、pH非調節によるD-lacticacid/D-lactate生産能力は、塩基添加によるpH調節なしに最終発酵pHを3.0にしたRM液体培地で前記菌株を30°Cで20時間培養した後、前記培養した培養液から細胞を除去して得た培養上澄液を用いて測定した。その結果を下記表5に示した。前記表5に示されているように、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株の場合、pH5.0の条件はもちろん、pH非調節酸性条件発酵条件下でも乳酸D-lacticacid/D-lactate生産収率がそれぞれ99.9以上および99.7に非常に高く現れ、ひいてはpH5.0条件およびpH非調節の全ての発酵条件でD-lacticacid生産効率が優れていると報告されたS.cerevisiaeOC2と比較してみた結果、S.cerevisiaeOC2の場合、同一の条件でD-lacticacid/lactate生産収率がそれぞれ61および53に過ぎないと示され、前記D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株は、pH条件の制限なしにいかなるpH条件でも顕著に優れたD-lacticacid/lactate生産収率を有することを確認することができた。実験例3.pH条件によるD-lacticacid/D-lactateの光学純度opticalpurity比較前記実施例1で製造されたMG6106菌株のpH条件によるD-lacticacid/D-lactateの光学純度を比較分析するために、前記菌株を塩基base添加を通じてpHを5.0に調節したRM液体培地グルコース、20g/l;酵母抽出物DIFCO、10g/l;MgSO4、1g/l;NH42SO4、1g/l;KH2PO4、2g/lと、塩基添加によるpH調節なしに最終発酵pHを3.0にしたRM液体培地で30°Cで20時間培養した後、前記培養した培養液から細胞を除去して得た培養上澄液を以下のような条件でHPLChighperformanceliquidchromatographyを行ってD-lacticacid/D-lactateの光学純度opticalpurity、または光学超過数値enantiomericexcess、eevalue、を分析してその結果を下記表6に示した。前記実験例2と同様に、対照群としては野生型ザイモモナスモビリス菌株ZM4ATCC31821を用い、比較例としてはS.cerevisiaeOC2菌株Ishidaetal.,J.Biosci.Bioeng.2006.Feb;1012:172-177を用いた。<HPLC測定条件>HPLCシステム:HitachiHPLCシステムmodelD-7000カラム:Chirex3126カラムPhenomenex250mmX4.6mmカラム温度:25°C流速:1.5ml/min移動床溶媒:1mMcoppersulfateCuSO4溶液検出器:UV検出器HitachiD-4200254nm具体的に標準試薬D--lacticacidL0625、Sigma、L-lacticacidL1750、Sigma、そしてDL-lacticacidL1250、Sigmaを用いてD-lacticacidとL-lacticacidの光学異性体を区分、分離し、光学純度と光学超過数値はそれぞれ以下の数式1および2により計算した。[数式1]D-lacticacidの光学純度=D/DL100[数式2]eevalue=DL/D-L100前記表6に示されているように、対照群である前記野生型ZM4菌株により生産された乳酸の光学純度は約33.3と低く示された反面、D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株により生産された乳酸の光学純度はS.cerevisiaeOC2と同等な程度である99.9の非常に高い光学純度を示すことを確認することができた。ただし、前記S.cerevisiaeOC2の場合、前記実験例2-3で考察したように代謝経路調節に依存した乳酸生産効率を示す反面、D-乳酸デヒドロゲナーゼが導入された形質転換菌株の場合、代謝経路調節がなくてもpH条件の制限なしに非常に高い収率と非常に高い光学純度で乳酸を生産することができるため、対照群である前記野生型ZM4菌株はもちろん、前記S.cerevisiaeOC2に比べても顕著に優れていることを確認することができた。"