明細書中に記載の発明。出願者らは、癌細胞におけるサイクリンG1タンパク質の機能に干渉および/またはこれを阻害することにより、上記癌細胞の増殖および/または生存が阻止、予防または破壊され得ることを発見した。すなわち、本発明は、サイクリンG1タンパク質の機能を阻害することによる異常細胞増殖を伴う病的状態および疾患の処置であって、動物において増殖中の上記細胞に突然変異体サイクリンG1タンパク質を投与することによる処置に関するものである。上記病的状態および疾患には、癌、腫瘍、過形成、再狭窄、角膜混濁および白内障があるが、これらに限定されるわけではない。好ましい態様では、突然変異体または変異体サイクリンG1タンパク質は、突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む発現ビークルの送達により罹患動物に投与される。上記発現ビークルには、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクター、および合成ベクターがあるが、これらに限定されるわけではない。本発明方法により有効に処置され得る動物には、哺乳類、例えばヒトおよび非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシおよびヒツジがあるが、これらに限定されるわけではない。例えば、本発明は以下を提供する。項目1動物における異常細胞増殖が関与する病理学的状態または疾患を処置または予防する方法であり、該動物に変異サイクリンG1タンパク質を投与し、該変異サイクリンG1タンパク質は、該病理学的状態または疾患を処置または予防するのに有効な量で投与される、方法。項目2該変異サイクリンG1タンパク質が、該動物に、該変異サイクリンG1タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む発現媒体を送達させることにより投与される、項目1に記載の方法。項目3該変異サイクリンG1タンパク質が、該動物に、該動物の異常増殖細胞に、該変異サイクリンG1タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む発現媒体を形質導入することにより投与される、項目1に記載の方法。項目4該発現媒体がレトロウイルスベクターである、項目2に記載の方法。項目5該発現媒体がマトリックス-標的化レトロウイルスベクターである、項目4に記載の方法。項目6該マトリックス標的化レトロウイルスベクターを、動物に全身的に投与する、項目5に記載の方法。項目7該発現媒体がアデノウイルスベクターである、項目2に記載の方法。項目8該変異サイクリンG1タンパク質が、アミノ末端切断サイクリンG1タンパク質を含む、項目1に記載の方法。項目9該変異サイクリンG1タンパク質が、ヒトサイクリンG1タンパク質のアミノ酸残基41から249に対応するサイクリンG1タンパク質のアミノ酸残基を含む、項目8に記載の方法。項目10該変異サイクリンG1タンパク質が、ヒトサイクリンG1タンパク質のアミノ酸残基41から249を含む、項目9に記載の方法。項目11該変異サイクリンG1タンパク質が、少なくとも一つのアミノ酸置換を有するサイクリンG1タンパク質を含む、項目1に記載の方法。項目12該置換がヒトサイクリンG1タンパク質の残基61に対応する残基においてである、項目11に記載の方法。項目13該変異サイクリンG1タンパク質がヒトサイクリンG1タンパク質である、項目11に記載の方法。項目14該置換がアラニンである、項目12に記載の方法。項目15該病理学的状態または疾患が、腫瘍、癌、過形成、再狭窄、角膜の濁りおよび白内障からなる群から選択される、項目1に記載の方法。項目16該病理学的状態または疾患が、腫瘍および癌からなる群から選択される、項目15に記載の方法。項目17動物がヒトである、項目1に記載の方法。項目18変異サイクリンG1タンパク質をコードする、遺伝子構築物。項目19変異サイクリンG1が野生型サイクリンG1の優勢な陰性阻害剤である、項目18に記載の遺伝子構築物。項目20該変異サイクリンG1タンパク質が、野生型サイクリンG1のサイクリンボックスに欠失を含む、項目18に記載の遺伝子構築物。項目21該変異サイクリンG1タンパク質が、アミノ末端切断サイクリンG1タンパク質を含む、項目18に記載の遺伝子構築物。項目22該変異サイクリンG1タンパク質が、ヒトサイクリンG1タンパク質の残基41から249に対応するサイクリンG1タンパク質のアミノ酸残基を含む、項目21に記載の遺伝子構築物。項目23該変異サイクリンG1タンパク質が、ヒトサイクリンG1タンパク質の残基41から249を含む、項目22に記載の遺伝子構築物。項目24該変異サイクリンG1タンパク質が、少なくとも一つのアミノ酸置換を有するサイクリンG1タンパク質を含む、項目18に記載の遺伝子構築物。項目25該置換がヒトサイクリンG1タンパク質の残基61に対応する残基においてである、項目24に記載の遺伝子構築物。項目26該変異サイクリンG1タンパク質がヒトサイクリンG1タンパク質である、項目25に記載の遺伝子構築物。項目27該置換がアラニンである、項目26に記載の遺伝子構築物。項目28項目18に記載の遺伝子構築物を含む、発現媒体。項目29該発現媒体がウイルスベクターである、項目28に記載の発現媒体。項目30該発現媒体がレトロウイルスベクターである、項目29に記載の発現媒体。項目31該発現媒体がアデノウイルスベクターである、項目29に記載の発現媒体。項目32細胞に変異サイクリンG1タンパク質を投与し、該変異サイクリンG1タンパク質が細胞分割を防止するのに有効な量で投与される、細胞の分割を防止する方法。項目33該変異サイクリンG1タンパク質が、該細胞に、該変異サイクリンG1タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む発現媒体を送達させることにより投与される、項目32に記載の方法。項目34該変異サイクリンG1タンパク質が、該細胞に、該細胞を該変異サイクリンG1タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む発現媒体を形質導入することにより投与される、項目32に記載の方法。項目35該発現媒体がレトロウイルスベクターである、項目33に記載の方法。項目36該発現媒体がアデノウイルスベクターである、項目33に記載の方法。項目37該変異サイクリンG1タンパク質が、アミノ末端切断サイクリンG1タンパク質を含む、項目32に記載の方法。項目38該変異サイクリンG1タンパク質が、ヒトサイクリンG1タンパク質のアミノ酸残基41から249に対応するサイクリンG1タンパク質のアミノ酸残基を含む、項目37に記載の方法。項目39該変異サイクリンG1タンパク質が、ヒトサイクリンG1タンパク質のアミノ酸残基41から249を含む、項目38に記載の方法。項目40該変異サイクリンG1タンパク質が、少なくとも一つのアミノ酸置換を有するサイクリンG1タンパク質を含む、項目32に記載の方法。項目41該置換がヒトサイクリンG1タンパク質の残基61に対応する残基においてである、項目40に記載の方法。項目42該変異サイクリンG1タンパク質がヒトサイクリンG1タンパク質である、項目40に記載の方法。項目43該置換がアラニンである、項目41に記載の方法。以下、図面に関して本発明を説明する。図1MiaPaca2細胞におけるマトリックス標的レトロウイルスベクターの形質導入効率。β-ガラクトシダーゼ発現性細胞は、青色染色核により示されている。MiaPaca癌細胞における突然変異体サイクリンG1構築物を担うマトリックス標的レトロウイルスベクターの細胞増殖抑制効果。縦軸でプロットされた1ウェル当たりの細胞数は、横軸でプロットされた時間の関数として表されている。D10培地対照、neor遺伝子のみを担うヌルベクター、アンチセンスサイクリンG1構築物を担うAS587およびAS693ベクター、DNT41~249、またはヒトサイクリンG1のN末端に欠失をもつdnG1ベクター。G418選択を伴わないdnG1ベクター‐対ヌルベクター‐形質導入癌細胞におけるヒトサイクリンG1タンパク質発現のウエスタン分析。免疫反応性dnG1は、20kDaの領域における明染色バンドとして検出され、内在性サイクリンG1タンパク質は、~30kDaの領域における強染色バンドとして見られる。図2転移性腫瘍病巣におけるヒトサイクリンG1タンパク質発現。抗ヒトサイクリンG1抗体との免疫反応性サイクリンG1の強度染色により証明されているPBS処置動物の腫瘍病巣および低用量dnG1ベクター処置動物の残留腫瘍病巣における高レベルヒトサイクリンG1タンパク質発現。図3肝臓の組織断片のヘマトキシリン‐エオシン染色は、PBS対照群およびdnG1ベクター処置動物からの腫瘍病巣を表す。PBS対照群およびdnG1ベクター処置動物の腫瘍病巣におけるアポトーシスは、ApopTagPlusペルオキシダーゼ原位置アポトーシス検定において帯赤褐色免疫染色物質として描かれている。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼTdT酵素を伴わない負の染色対照、t=腫瘍病巣、h=肝臓実質における肝細胞。図4ヒトサイクリンG1配列は、ヒトサイクリンI、ヒトサイクリンAおよびSPomCig1の場合と比較して示されている。保存領域は灰色四角により示されている。図5pREXレトロウイルス発現ベクターへのヒトサイクリンG1cDNAのクローニング。図は、pG1PM61A/REXへの点突然変異体サイクリンG1の段階クローニングを示す。図6pREX、アンチセンスおよび突然変異体サイクリンG1構築物の概略図。pREXレトロウイルス発現ベクターの地図および制限クローニング部位アンチセンスサイクリンG1フラグメントの概略図突然変異体サイクリンG1フラグメントの概略図。図7マーカー遺伝子および突然変異体サイクリンG1構築物をもつマトリックス標的レトロウイルスベクターによるラットA10およびサルSMCのプラスミドDNAトランスフェクション、形質導入効率および形質導入のインビトロ試験。突然変異体サイクリンG1プラスミドDNA構築物によりトランスフェクションされたラットA10SMCの増殖。縦軸でプロットされた細胞数は、横軸でプロットされた時間、すなわち形質導入後の日数の関数として表されている。核標的β-ガラクトシダーゼ遺伝子をもつマトリックス標的VSVG偽類型レトロウイルスベクターを用いた単一2時間形質導入後のラットA10細胞培養物における形質導入効率。形質導入効率は、感染多重度の関数として表されている、突然変異体サイクリンG1レトロウイルスベクターにより形質導入されたヒトMiaPaca細胞の増殖、突然変異体サイクリンG1レトロウイルスベクターにより形質導入されたサルSMCの増殖。図8二重エンベロープ立体配置でマトリックス‐ターゲッティングモチーフおよびVSVGタンパク質を表すアンチセンスおよび突然変異体サイクリンG1ベクターの一時的トランスフェクション計画およびビリオン組込み。各々CMVプロモーターから発現された、パッケージング成分gag‐pol、マトリックス標的env、融合誘導性VSVGenv、およびサイクリンG1構築物をもつレトロウイルスベクターが別々のプラスミドに配置されており、各々SV40複製起点を含んでいる、一時的4プラスミド同時トランスフェクションシステムを用いてレトロウイルスストックが作製された。ウエスタン分析は、~70kDaの領域、~64kDaでのVSVGタンパク質、および36および50kDa間のウイルスgagタンパク質対照へ移動する免疫反応性バンドとしてMLVベースのgp70envタンパク質を示す。モック=エンベロープ対照無し、CAE109対照=WTMLVenvを伴う非標的ヌルベクター、Hs2VSVG109対照=二重env立体配置でコラーゲン結合性モチーフおよびVSVGタンパク質を表すMLVenvを伴うマトリックス標的ヌルベクター、CAE587=WTenvを伴う非標的アンチセンスサイクリンG1-587ベクター、Hs2VSVG587=マトリックス標的VSVG偽類型アンチセンスサイクリンG1-587、CAE693=WTenvを伴う非標的アンチセンスサイクリンG1-693ベクター、Hs2VSVG693=マトリックス標的VSVG偽類型アンチセンスサイクリンG1-693、CAED/N=WTenvを伴う非標的突然変異体D/Nベクター、Hs2VSVGD/N=マトリックス標的VSVG偽類型突然変異体D/Nベクター。図9アンチセンスおよび突然変異体サイクリンG1レトロウイルスベクターによる形質導入後のラットA10細胞培養物におけるシンシチウム形成。光学顕微鏡写真は、形質導入されたラットA10細胞の形態学的外見を表し、ヌルベクター、アンチセンスサイクリンG1-693ベクター、突然変異体サイクリンG1ベクターによる場合である。シンシチウムは矢印により示されている。図10突然変異体サイクリンG1ベクターにより形質導入されたサルおよびラットA10細胞におけるサイクリンG1発現のウェスタンブロット分析。形質導入の12、24および48時間後における形質導入細胞の細胞性タンパク質を、ヌル対照ベクターにより形質導入された細胞の場合と比較した。ヌルベクターによる場合と比較した、アンチセンスサイクリンG1-693レトロウイルスベクターにより形質導入されたサルSMC培養物における免疫反応性ヒトサイクリンG1タンパク質の発現減少対照ベクターにより形質導入された細胞には存在しなかった、dnG1レトロウイルスベクターによる形質導入の24および48時間後のラットA10細胞培養物における20kDaでの免疫反応性突然変異体ヒトサイクリンG1の外観。図11バルーン創傷ラット動脈におけるラットサイクリンG1タンパク質の免疫組織化学的染色。ヌルベクター‐PBSおよびdnG1ベクター‐処理動脈切片の新生内膜細胞におけるサイクリンG1核免疫反応性増強。アンチセンスサイクリンG1-693処理動脈切片におけるサイクリンG1免疫反応性の強度減少。図12マトリックス標的VSVG偽類型dnG1ベクターを用いた1ヶ月インビボ効率試験。PBS対照、食塩水、ヌルベクターおよびdnG1ベクターのバルーン創傷および管内滴中の1ヶ月後に採取されたラット頚動脈からのエラスチン染色組織断片。図13Mx-dnG1ベクターの一処理周期による腫瘍増殖の抑止。細胞致死性ベクターを合計7日間毎日尾部静脈へ直接注射した。ノギスを用いて腫瘍体積の測定結果を得た後、8日目に動物を殺した。ただし、図13Aにおける動物の処理開始時における腫瘍体積は、図13Bにおける場合よりもかなり大きかった。しかしながら、両実験とも、Mx-dnG1ベクターによる処理の4日目までに腫瘍サイズのかなりの減少が観察され、腫瘍サイズの漸進的増加が対照Mx-nBgベクターにより処理された動物で認められた。腫瘍体積は、時間の関数として表された。図14Mx-dnG1ベクターを用いた長期効率試験。確立された腫瘍異種移植片をもつマウスに対し無作為に偽薬、非標的CAE-dnG1ベクターまたはマトリックス標的Mx-dnG1ベクターを投与した。200μlベクターまたは等量の偽薬を、10服用期間または2処理周期間毎日または隔日に末梢静脈に直接注射し、合間に2週間休止期間をおいた。腫瘍体積は、時間の関数として表されている。Mx-dnG1ベクター処理マウスにおけるカプラン‐マイヤー生存試験。では動物のカプラン‐マイヤー生存曲線が示されている。偽薬群は連続線により表され、CAE-dnG1群は短い点線により表され、Mx-dnG1群は長い点線により表されている。生存フラクションは、時間の関数として表されている。本発明の一態様によると、異常な細胞増殖を伴う病的状態または疾患に罹患した動物の処置方法が提供される。上記状態および疾患には、腫瘍、癌、過形成、再狭窄、角膜混濁および白内障が含まれる。この方法は、突然変異サイクリンG1タンパク質を動物または動物における病的細胞、組織または臓器に投与することを含む。突然変異サイクリンG1タンパク質は、異常な細胞増殖を低減化または阻害するかまたは病状もしくは疾患を改善、治癒または予防するのに有効な量で投与される。好ましい態様において、本発明方法は、特に腫瘍および癌の処置に関するものである。ここで使用されている腫瘍または癌を処置するの語は、腫瘍または癌細胞の増殖の阻止、予防または破壊がもたらされることを意味する。本発明方法により有益に処置され得る腫瘍および癌には、リンパ腫、白血病、肉腫および癌腫があるが、これらに限定されるわけではない。ここで使用されている過形成の語は、組織または臓器における細胞の異常増殖を伴う非腫瘍性病的状態または疾患を意味する。本発明方法により有益に処置され得る過形成には、脈管濾胞性縦隔リンパ節増殖症、木村病、血管類リンパ組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、キャッスルマン病、セメント質肥大、先天性副腎過形成、先天性脂腺増生症、先天性男性化副腎過形成、嚢胞性増殖症、線維筋過形成、ヘック病、血管内乳頭状内皮過形成、神経過形成、扁平上皮過形成およびゆうぜい性肥厚があるがこれらに限定されるわけではない。ここで使用されている突然変異サイクリンG1タンパク質の語は、真核生物体からの天然サイクリンG1タンパク質を意味するが、1個またはそれ以上のアミノ酸欠失、置換、付加、および/またはそれらの組合わせを伴う。ある種の態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は動物に由来する。好ましい態様において、サイクリンG1タンパク質は処置されている動物と密接に関連した動物種に由来する。最も好ましい態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、処置されている動物と同じ動物種に由来する。ヒトサイクリンG1タンパク質のアミノ酸配列は、図4に示されている。一態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、アミノ末端先端切除サイクリンG1タンパク質を含む。一態様において、サイクリンG1タンパク質のN-末端における初めの117までのアミノ酸残基が欠失され得る。好ましい態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、アミノ酸残基40を含むそれ以下のN-末端欠失を含むサイクリンG1タンパク質である。最も好ましい態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、アミノ酸残基1から40までのN-末端欠失を含むヒトサイクリンG1タンパク質である。実施態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、ヒトサイクリンG1タンパク質のアミノ酸残基41~249により構成される。他の態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、ヒトサイクリンG1タンパク質の残基61に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換を含む完全長または先端切除サイクリンG1タンパク質である。好ましい態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、その残基にアラニン置換を有する。実施態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、残基61にリシンまたはアラニン置換を有する完全長または先端切除ヒトサイクリンG1タンパク質である。突然変異サイクリンG1タンパク質は、当業界における熟練者には公知の技術により製造され得る。例えば、突然変異サイクリンG1タンパク質は、自動ペプチドまたはタンパク質合成装置により製造され得る。別法として、突然変異サイクリンG1タンパク質は、遺伝子工学技術により製造され得る。一態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化する遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドの送達により、病的状態または疾患を発現している動物または細胞、組織または臓器に直接投与される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、適当な発現ビークルを含む。ここで使用されているポリヌクレオチドの語は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、リボヌクレオチド類およびデオキシリボヌクレオチド類を包含する。上記の語はまた、1本および2本鎖DNA、並びに1本および2本鎖RNAを包含する。この語はまた、修飾ポリヌクレオチド、例えばメチル化またはキャップポリヌクレオチド類を包含する。突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化する遺伝子構築物は、適当なプロモーターを機能し得るように随伴した突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化する配列を含む。本発明によると、適当なプロモーターは、処置動物において活性を示すものであればいずれのものでもよい。好ましい態様において、プロモーターは、異常増殖している細胞において高い活性を呈するか、および/またはそれに特異的なものである。しかしながら、本発明の範囲は特異的プロモーターに限定されるわけではないものと理解すべきである。一実施態様においては、プロモーターはサイクリンG1プロモーターである。突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化する配列は、所望の突然変異を有する天然サイクリンG1遺伝子配列または突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化する合成配列を含み得る。好ましい態様において、突然変異サイクリンG1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドは、異常増殖している細胞へ形質導入されている適当な発現ビークルに含まれている。上記発現ビークルには、プラスミド、真核生物ベクター、原核生物ベクターおよびウイルス性ベクターがあるが、これらに限定されるわけではない。一態様において、ベクターはウイルス性ベクターである。使用され得るウイルス性ベクターには、RNAウイルスベクターおよびDNAウイルスベクターが含まれる。ベクターの構築においてRNAウイルスベクターが使用されるとき、突然変異サイクリンG1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドはRNAの形態である。ベクターの構築においてDNAウイルスベクターが使用されるとき、突然変異サイクリンG1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドはDNAの形態である。一態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。使用され得るレトロウイルスベクターの例には、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびレトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーヴェイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳腺癌ウイルスから誘導されたベクターがあるが、これらに限定されるわけではない。ベクターは一般的に複製能の無いレトロウイルス粒子である。本発明の意味の中に含まれるレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、例えばHIVウイルスまたは動物レンチウイルスに基いたベクター、例えばBIVベースのベクターを包含する。レンチウイルスベクターの構築は、特に米国特許番号56655777、5994136および6013516に開示されており、出典明示により本明細書の一部とする。一態様において、レトロウイルスベクターは、モロニーネズミ白血病ウイルスから誘導され、LN系列のベクターに属するレトロウイルスプラスミドベクターから作製され得、これらについてはBenderら、JVirol、第61巻、1639-649頁およびMillerら、Biotechniques、第7巻、980-990頁にさらに記載されている。上記ベクターは、マウス肉腫ウイルスから誘導されたパッケージングシグナルの一部および突然変異gag開始コドンを有する。ここで使用されている突然変異の語は、gagタンパク質またはそのフラグメントまたは先端切除形態が発現されないようにgag開始コドンが欠失または改変されていることを意味する。別の態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、少なくとも4つのクローニングまたは制限酵素認識部位を含み得、部位の少なくとも2つは真核生物遺伝子における平均出現頻度が10000塩基対において1回未満である、すなわち制限産物は少なくとも10000塩基対の平均DNAサイズを有する。好ましいクローニング部位は、NotI、SnaBI、SalIおよびXhoIから成る群から選択される。好ましい態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、これらのクローニング部位の各々を含む。上記ベクターについては、米国特許第5672510号にさらに記載されており、出典明示により本明細書の一部とする。上記クローニング部位を含むレトロウイルスプラスミドベクターを使用するとき、レトロウイルスプラスミドベクターにあるNotI、SnaBI、SalIおよびXhoIから成る群から選択された少なくとも2つのクローニング部位と適合し得る少なくとも2つのクローニング部位を含むシャトルクローニングベクターが提供され得る。シャトルクローニングベクターはまた、シャトルクローニングベクターからレトロウイルスプラスミドベクターへ移入され得る突然変異体サイクリンG1タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む。シャトルクローニングベクターは、クローニングまたは制限酵素認識部位を含む1個またはそれ以上のリンカーに連結されている基本的バックボーンベクターまたはフラグメントから構築され得る。上述された適合性または相補的クローニング部位もクローニング部位に含まれる。突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化するポリヌクレオチドおよび/またはシャトルベクターの制限部位に対応する末端を有するプロモーターは、当業界公知の技術を通じてシャトルベクターへ連結され得る。シャトルクローニングベクターは、原核生物系におけるDNA配列の増幅に使用され得る。シャトルクローニングベクターは、原核生物系および特に細菌で常用されるプラスミドから製造され得る。すなわち、例えば、シャトルクローニングベクターは、プラスミド、例えばpBR322、pUC18などから誘導され得る。レトロウイルスプラスミドベクターは、突然変異サイクリンG1タンパク質コーディング配列を発現させるためのプロモーターを含み得る。使用され得る適当なプロモーターには、レトロウイルスLTR、SV40プロモーター、およびMillerら、Biotechniques、第7巻、9号、980-990に記載されたヒトサイトメガロウイルスプロモーター、または他のいずれかのプロモーターがあるが、これらに限定されるわけではない。使用され得る他のウイルスプロモーターには、アデノウイルスプロモーター、TKプロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターがあるが、これらに限定されるわけではない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれている教示内容から当業界の熟練者には明白なものである。突然変異サイクリンG1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドを含むレトロウイルスプラスミドベクターは、gag、polおよびenvレトロウイルスタンパク質をコード化する核酸配列を含むパッケージングセルラインへ形質導入される。上記パッケージングセルラインの例としては、PE501、PA317、Ψ-2、Ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ΨCRE、ΨCRIP、GPE-86、GPenvAm12およびDANセルラインに記載、出典明示により本明細書の一部とする、または293Tセルラインがあるが、これらに限定されるわけではない。ベクターは、当業界公知のいずれかの手段を通じてパッケージング細胞に形質導入し得る。上記手段には、電気穿孔、リポソームの使用およびCaPO4沈澱があるが、これらに限定されるわけではない。上記プロデューサー細胞は、突然変異サイクリンG1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。別法として、突然変異サイクリンG1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド、非レトロウイルスペプチド不含有の第1レトロウイルスエンベロープタンパク質、および修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質、または野生型レトロウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸残基が除去され、所望の分子に結合するターゲッティングタンパク質またはペプチド、例えば細胞性受容体または細胞外成分、例えば細胞外マトリックス成分により置換されたエスコートタンパク質を含むレトロウイルスベクター粒子が生成され得る。ターゲッティングタンパク質またはポリペプチドが結合し得る細胞外マトリックス成分の例には、コラーゲンがあるがこれに限定されるわけではない。かかるレトロウイルスベクター粒子は、突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスプラスミドベクター、および修飾レトロウイルスエンベロープペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む、適当な発現ビークル、例えばプラスミドによりパッケージング細胞、例えば上記のものへ形質導入することにより生成され得る。次いで、生成したプロデューサー細胞は、非レトロウイルスペプチド不含有の第1レトロウイルスエンベロープタンパク質、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質、および突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生産する。別の方法では、突然変異サイクリンG1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドを含むレトロウイルスプラスミドベクターは、gagおよびpolレトロウイルスタンパク質をコード化するポリヌクレオチド、非レトロウイルスペプチド不含有の第1レトロウイルスエンベロープタンパク質をコード化するポリヌクレオチド、および修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含むパッケージング細胞へ形質導入される。生成したプロデューサー細胞は、突然変異サイクリンG1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド、非レトロウイルスペプチド不含有の第1レトロウイルスエンベロープタンパク質および修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質を含むレトロウイルスベクター粒子を生産する。レトロウイルスベクター粒子は、異常増殖している細胞を阻害、防止または破壊するのに有効な量で罹患動物に投与される。本発明の範囲は理論的推論に限定されるわけではないが、突然変異サイクリンG1タンパク質が天然サイクリンG1タンパク質とそのサイクリン依存的キナーゼ結合相手に関して競争することにより、細胞分裂の推進における天然サイクリンG1タンパク質の機能が阻止されると考えられる。レトロウイルスベクター粒子の投与は、全身投与により、例えば静脈内、動脈内または腹腔内投与により、または腫瘍でのレトロウイルスベクターの直接注射により行われ得る。一般的に、レトロウイルスベクターは、少なくとも106cfu/mlの量で投与され、一般に上記の量は1011cfu/mlを越えない。好ましくは、レトロウイルスベクターは、約108cfu/ml~約109cfu/mlの量で投与される。投与すべき正確な用量は、処置される動物または患者の年齢、体重および性別、並びに処置されている病的組織のサイズおよび重症度を含む様々な因子により変化する。レトロウイルスベクターはまた、許容し得る医薬用担体、例えば食塩水溶液、プロタミンスルフェート、水、水性緩衝液、例えば燐酸緩衝液およびトリス緩衝液、またはポリブレンと共に投与され得る。適当な医薬用担体の選択は、本明細書に含まれている教示内容から当業界の熟練者にとっては明白なものであると思われる。従って、本発明はまた、特に腫瘍および癌の処置を目的とする、突然変異サイクリンG1タンパク質の医薬における用途、突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化する遺伝子構築物の用途および本発明の上記遺伝子構築物を含む発現ビークルの用途を提供する。さらに、疾患、例えば腫瘍および癌処置用医薬の製造を目的とする、突然変異サイクリンG1タンパク質の用途、突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化する遺伝子構築物の用途および本発明の上記遺伝子構築物を含む発現ビークルの用途が、本発明により提供される。別の態様において、上記レトロウイルスベクター、または突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化するポリヌクレオチドは、リポソーム内に封入され得る。レトロウイルスベクターまたは突然変異サイクリンG1タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを封入しているリポソームは、上記の医薬用担体と共に宿主に投与され得る。別の態様において、突然変異サイクリンG1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドを含む、レトロウイルスプロデューサー細胞、例えば上記のパッケージングセルラインに由来するものは、動物に投与され得る。上記プロデューサー細胞は、一態様において、病的組織または臓器に極めて近位の箇所で全身的に投与され得るか、またはプロデューサー細胞は病的組織または臓器に直接投与され得る。次いで、プロデューサーセルラインは、インビボで突然変異G1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターを生産し、次いでその結果上記レトロウイルスベクターは病的組織または臓器の異常増殖中の細胞へ形質導入する。本発明に従い処置され得る病的状態および疾患には、非悪性および悪性または癌性腫瘍が含まれる。処置され得る癌性腫瘍には、骨原性肉腫およびユーイング肉腫およびサイクリンG1が発現される他の腫瘍性疾患、例えば神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、乳癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、肝癌、例えば肝細胞癌および腺癌があるが、これらに限定はされない。上記腫瘍処置はまた、腫瘍の他の処置、例えば放射線、化学療法、または負の選択マーカー、例えばウイルス性チミジンキナーゼ遺伝子をコード化するポリヌクレオチドによる腫瘍細胞の形質導入後の、相互作用剤、例えば負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドにより形質導入された細胞を殺すガンシクロビルの投与と組合わせて使用され得る。一態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、上記方法の一つに従い宿主に投与される。薬剤を含む腫瘍細胞の増殖は阻害、防止または破壊される。さらに、腫瘍細胞は、負の選択マーカーまたは自殺遺伝子をコード化するポリヌクレオチドにより形質導入される。負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドは、発現ビークル、例えば上記のものに含まれ得る。一旦腫瘍細胞が負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドにより形質導入されると、相互作用剤が宿主に投与され、そこで相互作用剤が負の選択マーカーと相互作用することにより、腫瘍細胞の増殖が阻害、防止または破壊され得る。使用され得る負の選択マーカーには、チミジンキナーゼ、例えば単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘-帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ、およびシトシンデアミナーゼがあるが、これらに限定されるわけではない。一態様において、負の選択マーカーは、単純疱疹チミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘-帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼから成る群から選択されたウイルス性チミジンキナーゼである。上記ウイルス性チミジンキナーゼが使用されるとき、相互作用または化学療法薬剤は、好ましくはヌクレオシド類似体、例えばガンシクロビル、アシクロビルおよび1-2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル-5-ヨードウラシルから成る群から選択されるものである。上記相互作用剤は、基質としてウイルス性チミジンキナーゼにより有効に利用され、すなわち上記相互作用剤がウイルス性チミジンキナーゼを発現する腫瘍細胞のDNAへ致死的に組込まれることにより、腫瘍細胞の死が誘発される。別の態様において、負の選択マーカーは、シトシンデアミナーゼである。シトシンデアミナーゼが負の選択マーカーであるとき、好ましい相互作用剤は5-フルオロシトシンである。シトシンデアミナーゼは、5-フルオロシトシンを高度細胞傷害性の5-フルオロウラシルに変換する。すなわち、シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞は5-フルオロシトシンを5-フルオロウラシルに変換し、殺される。相互作用剤は、形質導入腫瘍細胞の増殖を阻害、防止または破壊するのに有効な量で投与される。例えば、相互作用剤は、患者に対する全体的毒性により、5mg~10mg/kgの量で投与され得る。相互作用剤は、好ましくは全身投与、例えば静脈内投与、非経口投与、腹腔内投与または筋肉内投与される。負の選択マーカーを含む発現ビークル、例えば上述のものが腫瘍細胞に投与されるとき、傍観者効果が誘発され得る、すなわち、もともと負の選択マーカーをコード化する核酸配列により形質導入されてはいない腫瘍細胞は相互作用剤投与後に殺され得る。出願者らはいかなる理論的推論にも制限されるつもりは無いが、形質導入腫瘍細胞は、相互作用剤に対して細胞外で作用するか、または隣接する非形質導入腫瘍細胞に吸収され、次いで相互作用剤の作用に対して感受性になる負の選択マーカーの拡散性形態を生産することになり得る。また、負の選択マーカーおよび相互作用剤の一方または両方が腫瘍細胞間で通じ合うことも可能である。突然変異サイクリンG1タンパク質はまた、侵襲性血管手術、例えば血管形成術、血管移植、例えば動脈移植、または冠動脈バイパス手術後の血管再狭窄の予防に使用され得る。すなわち、本発明の別の態様によると、動物、または侵襲性血管手術または血管病変部位に突然変異サイクリンG1タンパク質を投与することを含む再狭窄の予防方法が提供される。突然変異サイクリンG1タンパク質は、動物において再狭窄を予防するのに有効な量で投与される。突然変異サイクリンG1タンパク質は、侵襲性血管手術中または後に投与され得る。ここで使用されている侵襲性血管手術の語は、限定的ではないが動脈および静脈を含む血管系の一部の修復、切除、置換および/または再血管方向づけを含むあらゆる手術を包含する。上記手術には、血管形成術、血管移植、例えば動脈移植、血餅の除去、動脈または静脈の一部切除、および冠動脈バイパス手術があるが、これらに限定されるわけではない。好ましい態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、突然変異サイクリンG1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドにより侵襲性血管手術または血管病変部位の血管細胞へ形質導入することにより動物に投与される。上記ポリヌクレオチドは、上記の通り適当な発現ビークルに含まれ得、侵襲性血管手術または血管病変部位の細胞へ形質導入される。一態様において、発現ビークルは、ウイルス性ベクター、例えば上述のものである。一態様において、ウイルス性ベクターは、レトロウイルスベクターであり、上記と同様であり得る。レトロウイルスベクターが使用されるとき、上記レトロウイルスベクターは、上記の量で投与され、血管内投与される。一態様において、レトロウイルスベクターは、侵襲性血管手術または血管病変部位に投与される。ベクターが侵襲性血管手術または血管病変部位の血管細胞へ形質導入することにより、突然変異サイクリンG1タンパク質が上記細胞で生産され、それによって天然サイクリンG1タンパク質の機能が阻害されるため、上記細胞の増殖を阻止することにより再狭窄が予防される。この方法は、限定するわけではないが、心臓血管形成術、動脈移植および冠動脈バイパス手術を含む様々な侵襲性血管手術後における再狭窄の阻止および処置並びに血管病変の阻止または処置に適用可能である。この方法はまた、限定するわけではないが、大腿、頚または腎動脈、特に腎臓透析フィステルに伴う腎動脈の病変を含む、血管病変の阻止および処置に適用される。突然変異サイクリンG1タンパク質はまた、多くの場合角膜実質細胞の増殖により誘発される、角膜ヘーズまたは角膜混濁の予防および/または処置、並びに白内障の処置および/または予防で使用され得る。すなわち、本発明の別の態様によると、角膜ヘーズおよび/または白内障の予防または処置方法であって、突然変異サイクリンG1タンパク質を罹患動物または患部の目に直接投与することを含む方法が提供される。突然変異サイクリンG1タンパク質は、動物における角膜ヘーズまたは白内障の予防または処置に有効な量で投与される。好ましい態様において、突然変異サイクリンG1タンパク質は、突然変異サイクリンG1遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドによる眼の細胞の形質導入により、動物に投与される。上記ポリヌクレオチドは、上記の通り適当な発現ビークルに含まれ得る。発現ビークルは、眼の細胞へ形質導入される。一態様において、発現ビークルは、上記のウイルス性ベクターである。一態様において、ウイルス性ベクターはレトロウイルスベクターであり、上記のものと同じであり得る。レトロウイルスベクターが使用されるとき、上記レトロウイルスベクターは、体重70kgまたはそれ以上の成人の場合一用量当たり血液量の約10、または約500ml~約1000mlの量で全身投与され得る。レトロウイルスベクターはまた、例えば点眼液形態で眼に局所投与され得る。レトロウイルスベクターはまた眼内投与され得る。ベクターは、眼の細胞、例えば角膜実質細胞および/または水晶体上皮細胞へ形質導入することにより、天然サイクリンG1タンパク質の機能を阻害し、そうして角膜実質細胞または水晶体上皮細胞の増殖を阻止することにより角膜ヘーズまたは白内障を予防または処置する。実施例に関して本発明の記載を行うが、本発明の範囲はそれによって制限されるわけではないものとする。実施例1:癌細胞における突然変異サイクリンG1タンパク質の殺細胞および細胞増殖抑制効果。細胞、細胞培養条件、マーカーおよび細胞周期制御遺伝子を担うプラスミドおよびベクター。NIH3T3、293Tおよびヒト膵臓癌MiaPaca2細胞はATCCにより供給された。NIH3T3および293T細胞は、10胎児ウシ血清を補ったダルベッコ修飾イーグル培地で維持された。ウイルス性gagpol遺伝子を含むプラスミドpcgp、および核標的β-ガラクトシダーゼ構築物を発現するレトロウイルスベクターpcnBgは、それぞれパウラキャノンおよびリンリー両博士のご厚意により提供された。水疱性口内炎ウイルスGenvタンパク質を含むプラスミドは、テオドアフリードマン博士のご厚意により提供された。先端切除サイクリンG1構築物は、レトロウイルス発現ベクターpREXにクローン化された。突然変異体サイクリンG1構築物を担うマトリックス標的レトロウイルスベクターの製造。パッケージング成分gag-pol、およびCMVプロモーターから発現されたフォンビルブラント因子誘導コラーゲン結合性モチーフを担うキメラMLVベースのenvが別々のプラスミドに配置され、各々SV40複製起点を含む、一時的3または4プラスミド同時トランスフェクションシステムを用いて、高力価ベクターを製造した。WTenvを伴わずに発現されたベクターは、Bv1またはHs2と命名された。ウイルス力価をさらに高めるため、融合誘導性VSVGenvタンパク質が、4プラスミド同時トランスフェクションプロトコルにおいてBv1またはHs2envタンパク質と共に発現された。ネズミNIH3T3細胞におけるウイルス力価は、β-ガラクトシダーゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性、neor遺伝子の発現に基き前記要領で測定された。ウイルス力価は、G418耐性コロニー形成単位/mlの数として表され、トランスフェクションプロトコルで使用されたプラスミドDNAの性質および量により、106~108cfu/mlの範囲で変化した。インビトロ効率試験。dnG1ベクターの殺細胞/細胞増殖抑制効果を評価するため、G418選択を伴わない形質導入後連続間隔で各培養において生存できる細胞の数を数えることにより、増殖可能性について形質導入細胞を評価した。内在性および突然変異体サイクリンG1タンパク質発現のウエスタン分析は、前記要領で遂行された。インビボ効率試験は、ユニバーシティーオブサザーンカリフォルニアインスティテューションアニマルケアアンドユースコミッティーにより是認されたプロトコルに従って行なわれた。インビボでのdnG1ベクター処置の抗腫瘍効果に基いた標的遺伝子送達の効率を評価するため、ヒト結腸癌の転移経路をシミュレーションする肝臓転移モデルをヌードマウスで確立した。簡単に述べると、14日間定位置に設置した内在型カテーテルにより、7×105腫瘍細胞をゆっくりと門脈へ注入した。低または高用量dnG1ベクターまたは等量の燐酸緩衝食塩水のカテーテル内注入を3日後に開始し、全部で9日間続行した。処置完了の1日後頚部脱臼によりマウスを殺した。組織学的および形態計測分析。肝臓葉を切除し、10ホルマリンに固定し、右および尾状葉にはA、左葉にはBおよび中葉にはCと標識し、別々に処理して、パラフィンブロックに埋封した。dnG1ベクター処置の抗腫瘍効果は、次の要領で評価された。HおよびE染色組織薄片を光学顕微鏡により調べ、代表的肝臓部分およびA、BおよびC葉からの腫瘍フォーカスの表面領域を、オプティマス画像分析システムを用いた形態計測分析により測定した。レトロウイルスの安全性の評価は、肝臓構造の完全性の評価、肝細胞腫大または壊死、炎症性浸潤、胆汁うっ滞および/または血栓症の存在に関する検査を含んでいた。また、組織薄片をサイトケラチン、ヒトサイクリンG1、アポトーシス、PAS、ビメンチンおよびCD68に関して免疫染色した。統計分析。インビボ効率試験のために、3処置群を比較した:低用量Bv1/dnG1、高用量Hs2/VSVG/dnG1およびPBS対照。ヌルベクターは、インビトロ殺細胞活性の不存在に基いたインビボ試験については使用されず、その後ヌルベクターは結局臨床試験でも使用されない。最初に、8匹のマウスを試験した。4匹を高用量dnG1ベクターで処置し、そして4匹をPBSで処置した。それに続いて、4匹の追加マウスを低用量dnG1ベクターで処置した。応答変数、肝臓の総表面積、腫瘍の総SA、腫瘍SA対肝臓SA比、および平均SA腫瘍フォーカスを、形式分析前に対数変換した。反復測定因子として葉を用いた反復測定分析を用いて、この処置が応答変数の各々に対する効果を有したか否かを測定した。また、ペアワイズ比較をアウトカム変数に関して遂行し、群間では全体的p-値<005であった。突然変異体ヒトサイクリンG1は、サイクリンボックスにおける欠失、Cdk活性化を誘導するサイクリン-Cdk結合を部分的に決定するサイクリン間の保存領域により作製された。予備試験は、dnG1が血管平滑筋細胞において抗増殖特性を呈することを立証した。それらの発見は、dnG1が野生型サイクリンG1の機能を阻害すべく、または標的Cdk分子との不活性複合体を形成すべく作用し得ることを示唆している。このため、一連の殺細胞性突然変異体サイクリンG1構築物の性能をインビトロで試験することにより、さらなるインビボ試験に最適な構築物を決定した。膵臓に由来するヒト未分化癌セルラインを、転移性胃腸癌の始原型として選択した。これらの癌細胞におけるレトロウイルス形質導入効率は優秀であり、感染多重度により26~85の範囲に及んだ。最適な治療遺伝子を選択するため、様々なサイクリンG1構築物を担うベクターを用いて細胞増殖試験を形質導入細胞で行った。図1Bは、形質導入癌細胞における突然変異体およびアンチセンスサイクリンG1レトロウイルスベクターの殺細胞/細胞増殖抑制効果を示す。標準条件下では、dnG1ベクターは、一貫して最大の抗増殖効果を呈し、dnG1タンパク質を表す20kDa領域における免疫反応性サイクリンG1の出現を伴った。これらの結果に基づき、dnG1ベクターは、後続のインビボ効率試験用に選択された。PBSまたは低用量dnG1ベクターで処置されたマウスからの転移性腫瘍フォーカスの組織学的および免疫細胞化学的評価を遂行し、オプティマスイメージングシステムにより評価した。PBS処置動物、およびdnG1ベクター処置動物の残留腫瘍フォーカスでの高いサイクリンG1核免疫反応性により証明されたように、図2は、ヒトサイクリンG1タンパク質が転移性腫瘍フォーカスで高度発現されることを示す。対照動物からの肝臓薄片の組織学的試験は、血管形成および支質形成の付随領域を伴うかなりの腫瘍フォーカスを表しており、上皮成分はサイトケラチンについて陽性染色し、付随した腫瘍支質/内皮細胞はビメンチンおよびFLK受容体について陽性染色した。対照的に、低用量dnG1処置動物における腫瘍フォーカスの平均サイズはPBS対照と比べて顕著に低減化され、同時にPBS対照群と比べてアポトーシス核の密度における焦点増加を表した。さらに、PAS、CD68およびヘモシデリン‐積載マクロファージによる浸潤が、dnG1ベクター処置動物の残留腫瘍フォーカスで観察されたことから、肝臓細網内皮系による変性している腫瘍細胞および腫瘍屑の能動的クリアランスが示唆された。腫瘍フォーカスの形態計測分析は、高用量マトリックス標的dnG1ベクターの門脈注入が、全応答変数に基いた対照動物の場合と比べたとき腫瘍フォーカスサイズの劇的な低減化を誘発するという点で、治療遺伝子送達に関するターゲッティング戦略が有効であることを確認した。3アウトカム変数に関するペアワイズ比較では、dnG1ベクター処置に対する用量依存的腫瘍応答が明白であり、腫瘍縮小対腫瘍フォーカスの完全消滅に関して様々なベクター用量に対するより良い腫瘍応答性を測定し、I/II期遺伝子療法試験において所望の腫瘍応答を達成し得る最少有効ベクター用量を予測するための追加試験は現在進行中である。重要なことに、肝細胞損傷、壊死、血栓症または胆汁うっ滞の証拠は、dnG1ベクター処置動物からの組織薄片からは全く検出されなかったことから、マトリックス標的dnG1ベクターが広く余裕のある安全性を有し得ることが示された。インビボ効率および安全性試験は、肝臓転移の特有なヌードマウスモデルで行われ、対照動物の場合と比べてdnG1ベクター処置マウスにおける腫瘍フォーカスサイズの統計的に有意な低減化により証明されたように、治療遺伝子送達が、殺細胞性突然変異体サイクリンG1構築物を担うマトリックス標的レトロウイルスベクターの反復門脈注入により達成され得ること、および付随する肝細胞壊死、血栓症または胆汁うっ滞の不存在により示されたように、マトリックス標的dnG1ベクターが広く余裕のある安全性を伴って全身投与され得るという原理の証拠を確立した。まとめて考え合わせると、これらの発見は、転移性癌に対する標的注射可能遺伝子治療ベクターの開発に向けた明確な進歩を表している。実施例2細胞致死性サイクリンG1構築物を有するマトリックスターゲッテッドレトロウイルスベクターの内腔内注入による、バルーン損傷ラット動脈における新生内膜形成の長期阻害この実施例はラット血管再狭窄モデルにおける変異サイクリンG1タンパク質による新生内膜形成の阻害を証明する。材料および方法細胞および細胞培養条件ラット大動脈平滑筋A10細胞を、密集前の単層として20ウシ胎児血清を添加した血清ダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。マウス胚NIH3T3細胞、ヒト293T細胞胎児腎臓293細胞をSV40大型T抗原で形質転換し、ヒト膵臓腫瘍MiaPaca2細胞を、10FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したDMEM中で同様に維持した。サル平滑筋一次細胞を、バルーン損傷後7日に回収した左総頚動脈から、30FBSを添加したWilliamsE培地中の2mm動脈切片を培養することで調製した。細胞が移動して組織培養ディッシュで接着単層細胞として増殖した後に動脈切片を除去し、細胞をさらにWilliamsE培地-20FBS中で維持した。マウスモノクローナル抗ヒトα平滑筋アクチンでの免疫染色では、一次培養から回収した細胞の95が平滑筋αアクチンに対して陽性であった、これはその起源を示すものである。プラスミド構築物アミノ酸41~249をコードするサイクリンG1cDNAの630bpC末端断片をはじめとするサイクリンG1変異構築物をPCRにより作製し、TAベクターへクローニングし、シーケンシングにより確認し、pG1XSvNaレトロウイルスベクターに再びクローニングした。pG1XsvNaおよび挿入サイクリンC1cDNAからなる成分配列をパッケージングするレトロウイルスを含む得られた構築物を消化することでKpnI断片を得、pRV109ヘクローニングしてSV40起源の複製物およびCMVプロモーターを含んだレトロウイルス発現プラスミドpG1DNT41~249/REXを得た。gag、pol、envおよびb-ガラクトシダーゼタンパク質の発現プラスミドpcgpは、MLVgagおよびpolを発現するCMV由来プラスミドである。pcnBgは、HanetalJVirolVol71pgs8103-8108に記載されているpG1XsvNa、次いでpRV109中での段階的構築により作製したpREXレトロウイルスベクター中のβ-gal発現構築物である。pcgpおよびpcnBgは双方とも厚意によりDrPaulaCannonから提供されたものであった。プラスミドpCVGは、pCEEのEcoRI断片を、VSV-GをコードするcDNAを含有するpHCMV-GのEcoRI断片で置換して作出した水疱性口内炎ウイルスG糖タンパク質を発現するCMV由来プラスミドである。CAEPはマトリックス標的モチーフを含む両種性4070AMLVgp70を発現するCMV由来プラスミドである。CAEPは、ヒトフォンヴィレブランド因子由来の最小コラーゲン結合ドメインを、レトロウイルス外被タンパク質の、成熟タンパク質のN末端ドメインへ導入した特有のPstIクローニング部位へ挿入して作製した。メチオニン残基を最少CBD内の野生型システイン残基の場所へ保存的に挿入した。レトロウイルスベクターの作製ヒト293T細胞をトランスフェクションの前日に3x106細胞/ディッシュの密度で10cm細胞培養ディッシュにプレーティングした。pcgp15mg、pCVG10mg、CAEP5mgおよびpcnBgまたはpG1DNT41~249/REXのいずれか15mgを用い、リン酸カルシウム/DNA共沈殿法によって一時的同時トランスフェクションを行った。トランスフェクション細胞を37°Cで16時間インキュベートし、10mM酪酸ナトリウムを含有する培地6mlに移してウイルス粒子の形成を促進させた。約10~12時間後、産生細胞培養培地を新鮮培地85mlと交換し、さらに24時間インキュベートしてベクター産生を行った。得られたレトロウイルスの上清を回収し、045mMフィルターで濾過し、アリコートに分け、使用まで70°Cで保存した。レトロウイルスベクター力価の決定NIH3T3細胞を形質導入の前日に25x104細胞/ウェルの密度で6ウェル培養プレートにプレーティングした。細胞の形質導入のため、8μg/mLポリブレンを含むレトロウイルス上清の連続希釈物を細胞培養物に加えた後、37°Cで2時間インキュベートし、新鮮培地2mlを添加した。24時間後、細胞を800μg/mLG418を含有する新鮮培地と交換し、この培地を3日毎に交換した。形質導入後10日目に10ホルマリンで固定し、100メタノール中の1メチレンブルーで染色してG418耐性コロニーを計数した。レトロウイルスベクターの力価は、生存コロニー総数に個々の細胞培養に用いたレトロウイルス上清の希釈倍率を掛けることで求めた。ラットA10細胞における形質導入効率の決定A10SMCを形質導入の前日に3x104細胞/ウェルの密度で6ウェル培養プレートにプレーティングした。β-gal発現構築物および8mg/mLポリブレンを含むレトロウイルス上清の連続希釈物を細胞に加えた。72時間後、細胞を2ホルムアルデヒド、02グルタルアルデヒド中で固定し、4mMフェリシアン化カリウム、4mMフェロシアン化物、2mMMgCl2および400mg/mLX-galで染色した。青く染まった核を示す細胞の割合によって形質導入効率を求めた。ベクターにより形質導入した細胞培養物における細胞増殖アッセイA10細胞を14x104細胞/ウェルの密度で12ウェル培養ディッシュにプレーティングした。接着させ、一晩インキュベートした後、8μg/mLポリブレンを含むレトロウイルス上清それぞれ05ml中、37°Cで2時間、細胞をインキュベートし、次いで新鮮培地1mLを加えた。細胞の形質導入後連日、各処置群の生存細胞数を測定した。サルSMCおよびMiaPaca2細胞を、3x103細胞/ウェルの密度で24ウェル培養プレートに同様にプレーティングした。上記の通り、細胞を8μg/mLポリブレンを含むレトロウイルス上清02mlとともにインキュベートし、2時間後、新鮮培地05mlを加え、連日、細胞培養物を回収して生存細胞数を測定した。抗体の作製および精製特異的抗サイクリンG1抗体を作製するため、ヒトサイクリンG1のC末端の端にある18残基を表す合成ペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシアニンと共役させ、ウサギで免疫原として用いてポリクローナル抗体を作製した。システイン残基CをペプチドのN末端に付加してKLHとの単一部位の結合容易にした。免疫ウサギ血清由来のポリクローナル抗サイクリンG1抗体を以下のようにアフィニティークロマトグラフィーでさらに精製した:濾過したウサギ血清を、サイクリンG1免疫ペプチドを共有結合的させたAffi-Gel10カラムに添加した。十分洗浄した後、結合抗体を溶出バッファーから回収し、PBS中1MTrisHClで1:10希釈することで中和した。アフィニティー精製された抗サイクリンG1抗体を含有するピーク画分をプールし、使用まで-70°Cで保存した。ウェスタンブロット解析形質導入細胞由来の界面活性剤溶解物として得た約15mgの可溶性タンパク質をSDS-PAGEにより分離した。次いでこのゲルをTris-グリシンバッファー系を用いて、フッ化ポリビニリデンメンブランに室温にて120mAで15時間移した。このメンブランをPBS中3ウシアルブミンでブロックし、1時間後に、ウェスタンブロット法バッファー中に希釈した一次抗体とともに30分間インキュベートした。メンブランをPBSで3回洗浄した後、アルカリ性ホスファターゼ共役2次抗体とともに30分間インキュベートした。さらにPBSで3回洗浄した後、不溶性の反応生成物を、基質バッファー中の025mg/mL5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸および05mg/mLニトロブルーテトラゾリウムの存在下で顕色させた。血管再狭窄のラット頚動脈損傷モデルにおけるサイクリンG1変異構築物のレトロウイルスを介した導入全身麻酔下で、USCInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeにより承認された遺伝子療法プロトコールに従い、2FIntimax動脈塞栓摘出用カテーテルを用いて350~450gのウィスターラットの頚動脈内皮を剥いだ。末端を結紮した頚動脈ヘカテーテルを挿入し、総頸動脈へ通した。バルーンを直径~7ユニットまで膨らませて、頚動脈に沿って3回通した。バルーン損傷後、塞栓摘出用カテーテルを除去し、頚動脈を一次的にクランプし、レトロウイルスベクターに30分間曝した。ラット群に生理食塩水、変異サイクリンG1構築物を有するレトロウイルスベクター、または対照ベクターのいずれか~30mlを注入し、さらに実験対照として非処理ラット群を用意した。ちょうど4週間後にラットを過剰量のペントバルビタールナトリウムで犠牲にした。ホルマリンで固定した非処理頚動脈およびベクターで処理した頚動脈の双方の切片をVerhoeffのエラスチン染色剤で染色し、組織学的切片を光学顕微鏡で調査し、Optimas画像解析システムを用いて培地表面域に対する新生内膜の形態計測評価を行なった。脈管内膜の肥厚程度をI:M比で表す。非処理動脈、PBS処理動脈およびベクター処理動脈の間のI:M比の有意差を両側t検定で求めた。結論サイクリンG1構築物の設計および操作ヒトサイクリンG1配列由来の数個のアンチセンス断片を、全長および/または上流配列の組み込みを変化させて構築した。さらに、一連の変異サイクリンG1発現構築物に操作を加え、ドミナントネガティブ様式で機能する可能性を評価した。図5Cで模式的に示すように、これらの発現構築物は、サイクリンとCDKとの結合に関与する保存されたサイクリンボックスドメインを包含する領域において変異したか、または末端切断されたものであった。PM61K/AおよびPM92E/Aでそれぞれ示された2つの点突然変異体は、サイクリンA-CDK2との接触に重要であると予測され;JeffreyetalNatureVol376pgs313-320、ヒトサイクリンG1内で保存されている残基の改変を示している。複雑なクローニング戦略を用い、PCR産物として製造した種々のアンチセンスおよび変異サイクリンG1構築物を、pBSKIIのNotI/SalI部位へクローニングしてpG1/BSKII構築物を作出し、次ぎに、これらを切り出し、これらのクローニング部位で、線状化したpG1XSvNaレトロウイルスベクターへ連結してpG1G1SvNa構築物を作出した。これらのpG1G1SvNa発現プラスミドをKpnIで消化し、LTRプロモーターとPsi包膜配列でフランクされた実験用のサイクリンG1構築物をはじめ、得られたpG1G1SvNaセグメントをpRV109レトロウイルスベクターに連結して合成レトロウイルス発現ベクターpG1/REXを作出した。得られたpG1/REXベクターは、SV40ori配列および抗生物質耐性遺伝子に加えて、治療遺伝子を駆動する強力なハイブリッド5CMV/LTRプロモーターを含み、これがベクター産生を促進する。代表的なサイクリンG1点突然変異体であるPM61K/AのpREXへのクローニングが図6に示されている。サイクリンG1構築物の細胞増殖抑効力の比較平滑筋の細胞増殖に対する種々のアンチセンスおよび変異G1構築物の相対的効力を調べるため、個々のDNA断片の各々をpREXレトロウイルス発現ベクターに適当な配向でクローニングし、これをスクリーニング研究のトランスフェクト可能なプラスミドとして最初に用いた。リン酸カルシウムトランスフェクション実験をラットA10平滑筋細胞培養物で3回行なって次の動物実験で用いるのに最適なサイクリンG1ノックアウト構築物を決定した。これらの実験では、AS587およびAS693で示される適度な長さのアンチセンス構築物が、それより短いAS423構築物よりも大きな細胞致死活性を示した。これまでの研究では、アンチセンス方向のヒトサイクリンG1全長コード配列は比較的効果がないことが示されていない。これらの比較評価に基くと、AS587と同じコード領域にわたってなお、さらに5配列を含む構築物であるAS693が最も有効なアンチセンスデザインであると考えられた。試験した変異サイクリンG1構築物のうちで、ある特定の変異構築物DNT41~249、および点突然変異構築物であるPM61K/Aが、平滑筋細胞の増殖抑制において少なくともアンチセンス構築物と同程度の効力があることがわかった。点突然変異体PM61K/Aの効力には、このアミノ酸Lys-61が推定されるサイクリンG1会合キナーゼとの物理的結合に重要であるとことが示唆されることから関心が持たれている。これらの比較スクリーニング研究を基に、DNT41-249およびPM61K/Aもまた、さらなる研究対象として選択された。選択されたサイクリンG1構築物を有するマトリックスターゲッテッドレトロウイルスベクターの同定それぞれCMVプロモーターによって駆動されるパッケージング成分のgag-pol、マトリックスターゲッテッド-env、融合誘導VSVGenv、および指定のサイクリンG1構築物を有するレトロウイルスベクターを個別のプラスミドに配置した、一時的4プラスミド同時トランスフェクション系を用いてヒト293T細胞上清からレトロウイルスの保存株を作製した。ウエスタン解析は、MLVgp70envおよびVSV-Gタンパク質免疫反応性の状態を精製ベクター調製物中のレトロウイルスgagタンパク質に対してノーマライズしたもので示されるように、レトロウイルス産生細胞中で2つの外被タンパク質の均一な発現およびウイルス粒子への安定した組み込みを証明した。この外被構造を用いて、ネオマイシン耐性またはβ-ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の発現により求められる、感染力のある力価107を常に達成した。ラットA10SMC中のマトリックスターゲッテッドVSVG偽型レトロウイルスベクターの形質導入効率を決定するため、細胞を種々のMOIで形質導入したところ、著しい濃度依存を示し、SMCの75~96がこれらのマトリックスターゲッテッドベクターによりそれぞれ50から500までのMOIで形質導入されたことを示した。サイクリンG1構築物の細胞傷害性と作用機構これまでのレトロウイルスに媒介されるアンチセンスサイクリンG1の細胞傷害性の研究では、細胞周期の休止および明白なアポトーシスに加えて、形質導入された細胞におけるシンシチウム形成が記載されている。注目すべきことに、変異サイクリンG1構築物の細胞増殖抑制性効力にもまた、pG1DNT41~249/REXベクターによる形質導入後t=48時間で見られるラットA10細胞培養物におけるシンシチウム形成が伴い、アンチセンス構築物で見られたものと形態学上類似する大型の多核細胞を呈した。これに対して、対照とする形質導入法でもヌルベクターでもラットA10細胞でシンシチウム形成を誘導することはなく、これは変異体およびアンチセンス構築物が同様に細胞の生存力に影響していることを示唆する。サイクリンG1ノックアウト構築物の抗増殖作用はヒト膵臓癌細胞およびサルSMCで確認し、ここでもDNT41-249発現変異体の相対的効力がほとんどの強力なアンチセンス構築物よりも大きいことが分かった。個々のサイクリンG1構築物の作用機構を実証するため、サイクリンG1タンパク質発現のダウンレギュレーションを、AS693/REXアンチセンスベクターにより形質導入した平滑筋細胞のウエスタン解析により証明した。図10Aに示す通り、サイクリンG1発現のダウンレギュレーションは、対照ベクターに比べてアンチセンスベクターにより形質導入されたサルSMC培養物で観察され、最大阻害は形質導入後t=48時間で見られた。逆に、変異発現ベクターによる形質導入後24時間および48時間に見られる形質導入細胞培養物中の、適宜、~20kDaの免疫応答バンドの出現により示されるように、サイクリンG1変異構築物の強制発現が、ベクターによって形質導入されたA10細胞において確認された。タンパク質発現を指示するという点ではベクターの性能の証明は有意義であるが、ある時点における推定表現型を一時的に発現する細胞の割合は小さいであろう。インビボでのバルーン損傷動脈についての急性研究では、サイクリンG1タンパク質発現のアップレギュレーションが新生内膜SMCで見られる。この特徴的なサイクリンG1タンパク質発現のアップレギュレーションはヌルベクター、PBS対照、または変異発現ベクターのいずれかで処理したバルーン損傷動脈では減退しなかった。これに対して、アンチセンスサイクリンG1ベクターで処理した動脈においては、サイクリンG1発現の著しいダウンレギュレーションが明白であった。これらを総合すると、これらのデータはサイクリンG1構築物の細胞致死作用が形質導入細胞でのサイクリンG1発現の直接調節によるものであることを示す。ラット動脈再狭窄モデルにおけるpDNTG1/REXの評価最後に、制御下の2つの1ヶ月のインビボ効力研究において、サイクリンG1のN末端欠失変異を有するマトリックスターゲッテッドVSVG偽型ベクターの、バルーン損傷ラット動脈内への内腔内注入が、ヌルベクター、生理食塩水対照、および損傷/未処理群と比較した場合、新生内膜損傷の形成を阻害した。脈管に大量の傷および変形を生じる細胞傷害性HStkベクター戦略とは違い、DNT41-249/REXベクター処理された動脈で動脈壁の壊死、繊維形成または変形の証拠はなく、このアプローチが比較的安全であることを証明している。さらに、長期の効力データは、DNT41-249/REXベクター処理された動物において新生内膜損傷内でSMC増殖の巻き返しがほとんど発生しなかったことを示し、活性化SMCにおける標的形質導入および細胞致死性サイクリンG1変異タンパク質の発現が動脈再狭窄の後遺症の原因である細胞力学にかなりの影響力を持つであろうと示唆される。1対照群の脈管内膜:媒体比に有意な差はなかった。2dnG1ベクター処理群を3つの対照群と比較した。結果の変数に関して両側検定を行った。1対照群の脈管内膜:媒体比に有意な差はなかった。2dnG1ベクター処理群を3つの対照群と比較した。結果の変数に関して両側検定を行った考察本開示は、変異サイクリンG1タンパク質を用いて優性様式でその正規の対応部分の機能を阻害することの有用性を証明する。かかる変異タンパク質の適用には、密接に関連するエレメントの機能をブロックし、かつ、検出可能な遺伝子産物を産生するという2重の利点がある。ここで、サイクリンG1の欠失変異体および点突然変異体は明白な抗増殖特性を示し、これは最も強力なアンチセンスサイクリンG1構築物と少なくとも同程度の作用であった。選択した変異サイクリンG1構築物を含むマトリックスターゲッテッドレトロウイルスベクターをまずインビトロで試験したところ、細胞増殖の著しい阻害が見られた。アンチセンスサイクリンG1構築物に匹敵する様式で、ドミナントネガティブサイクリンG1構築物は形質導入されたSMCにおいてシンシチア形成およびプログラムされていないアポトーシスを引き起こし、機構上の類似性を示唆した。治療用遺伝子構築物に加え、ベクターのバイオアベイラビリティの向上に役立つウイルス粒子へのマトリックステーゲッティング技術の組み込みにより、レトロウイルスを媒介とする損傷動脈への遺伝子送達効率に著しい改良がなされた。レトロウイルスベクターターゲッティング技術における最近の進展は、フォンヴィレブランド因子の一次構造に内在する生理学的監視機能;GinsburgDetalProcNatAsalSciVol86pgs3723-3727;RuggeriZimmermanBloodVol70pgs895-904をマトリックスターゲッテッドレトロウイルスベクターの開発に採用し得ることが証明されている;AndersonNatureVol392pgs25-30。vWF由来マトリックスターゲッティングモチーフの操作およびレトロウイルス外被への挿入は、都合のよい機能獲得表現型、すなわちバルーンカテーテル損傷に曝された細胞外マトリックス成分との高親和性結合を有するMLVに基づくベクターを利用することによって、インビボでの遺伝子送達を向上させる。これらの研究に用いたマトリックスターゲッテッド両種性外被は、2週間のアンチセンスサイクリンG1の効力研究において血管損傷部位に集積することと内在SMCの効果的な形質導入を可能にすることがこれまでに示されている本来のエコトロピックベクターに取って代わる。損傷後1時間以内に平均的なSMCの活性化および増殖が始まる限り、新生内膜への移動は4日目までに起こりClowesetalCircResVol56pgs139-145、複製は次の2週間にわたり著しく増加し、ベクター浸潤および細胞の形質導入は、バルーン損傷時および新生内膜内でのSMCの移動および増殖が最大となる血管形成後7日の時点でのマトリックスターゲッテッド両種性ベクターの内腔内注入によってさらに至適化される。本開示では、Soneokaetal1995から採用した一時的トランスフェクション系を用いて高力価レトロウイルスベクターを作製したが、ここでは、パッケージング成分ならびに治療遺伝子の発現は強力なCMVプロモーターによって駆動し、各構築物がヒト293T産生細胞におけるプラスミド発現を助ける働きをするSV40複製起点を含む。これらの試薬を用いて3x106~3x108cfu/mlの範囲のウイルス力価を常に達成した。さらに、融合誘導VSVGenvタンパク質の同時発現;LaitinenetalHumGeneTherVol8pgs1645-1659;YuetalGeneTherapyVol6pgs1876-1883が、ベクターをさらに濃縮せずともウイルス力価をさらに向上させたことから、ベクター作製および予測治療構築物の同定が容易となった。総合すると、レトロウイルスベクターの設計、操作、および展開におけるこれらの改良点により、至適化された遺伝子療法プロトコールの開発およびバルーン血管形成ラットモデルでの新生内膜形成の阻害における長期作用の達成が可能となった。2例の制御下の1ヵ月の効力研究において、マトリックスターゲッテッドdnG1レトロウイルスベクターのバルーン損傷ラット頚動脈への内腔内送達は、他の唯一の薬剤であるタンパク質キナーゼC阻害剤および一酸化窒素シンターゼ構築物を有するアデノウイルスベクターにより誘導される応答の大きさとしての、SMC増殖の巻き返しと混同することなく新生内膜損傷形成の~50阻害を生じた。動脈組織学を都合悪く歪曲させるHStKベクターとは異なり、dnG1ベクター処理された動脈で動脈壁の壊死、繊維形成または変形は明らかに存在せず、インビボ臨床使用におけるこのアプローチの安全性を証明している。結論として、この研究は、血管再狭窄の治療のための細胞致死性遺伝子療法の有用性を拡大するため、治療サイクリンG1構築物における著しい改良とマトリックスターゲッティング技術、ベクター作製方法、および点滴注入法プロトコールにおける進歩とを組み合わせたものである。実施例3マトリックスターゲッテッドレトロウイルスベクターの全身投与はマウスにおける癌遺伝子療法に有効である材料および方法細胞、細胞培養条件、マーカーを含むプラスミドおよびベクター、ならびに細胞周期制御遺伝子NIH3T3、293Tおよびヒト膵臓癌MiaPaca2細胞をATCCから入手した。NIH3T3および293T細胞を、10ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地で維持した。ウイルスgagpol遺伝子を含むプラスミドpcgp、および核ターゲッテッドb-ガラクトシダーゼ構築物を発現するレトロウイルスベクターpcnBgは厚意によりそれぞれDrsPaulaCannonおよびLingLiより提供されたものであった。末端切断したサイクリンG1構築物を、G1XSvNaのレトロウイルスパッケージング成分配列を含むようにpHIT109を改変したレトロウイルス発現ベクターpREXへクローニングした。変異サイクリンG1構築物を有するマトリックスターゲッテッドレトロウイルスベクターの作製パッケージング成分gag-pol、およびCMVプロモーターから発現したフォンヴィレブランド因子由来のコラーゲン結合モチーフを有するキメラ両種性モロニーネズミ白血病ウイルスに基づくenv、およびレトロウイルスベクターを、各々SV40複製起点を有する個々のプラスミドに配置した、3または4プラスミドの一時的同時トランスフェクション系を用いて高力価ベクターを作製した。ベクターは、用いる特定の外被を表すMx-nBg、Mx-dnG1、およびCAE-dnG1と呼び、遺伝子発現構築物を各ベクターに組み込んだ。Mx-nBgはその外被にマトリックスターゲッティングモチーフおよび核ターゲッテッドb-ガラクトシダーゼ遺伝子を有するMuLVに基づく改変型ベクターである。Mx-dnG1はN末端欠失変異サイクリンG1構築物を有するマトリックスターゲッテッド細胞致死性ベクターである。CAE-dnG1は野生型の両種性MulVに基づく外被およびMx-dnG1と同じ細胞致死性サイクリンG1構築物を有する非ターゲッテッドベクターである。ウイルス力価ネズミNIH3T3細胞中のウイルス力価は、βガラクトシダーゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性、neor遺伝子の発現を基に、これまでに記載されたようにして求めた。ウイルス力価はG418耐性コロニー形成単位の数/mlとして表し、107ないし108cfu/mlの範囲であった。インビボ効力研究これらの研究は、theUniversityofSouthernCaliforniaInstitutionAnimalCareandUseCommitteeに承認されたプロトコールに従って行った。インビボMx-dnG1ベクター治療の抗腫瘍作用に基づいた標的遺伝子送達効率を評価するため、1~9x107のヒトMiaPaca2癌細胞を胸腺欠損nu/nuマウスに皮下移植することで皮下腫瘍異種移植を行なった。腫瘍が~50mm3の大きさに達したところで、Mx-dnG1ベクター、同様の力価のMx-nBg対照ベクター、非ターゲッテッドCAE-dnG1ベクター、またはリン酸緩衝生理食塩水プラセボ対照のいずれか200μlを尾の静脈に7~10日間毎日直接注射した。腫瘍の大きさをノギスで2~4日ごとに測定し、楕円対象物の容積を算出する公式:腫瘍体積、mm3=4/3pr1r2r3を用いた。マウスをそれぞれ、1または2治療周期が終わった翌日または1週間後に頸椎脱臼により犠牲にした。アポトーシスアッセイ腫瘍小節由来の組織片を、Apoptagキットを用いてアポトーシスの誘導について評価した。急速凍結した腫瘍小節をパラホルムアルデヒドで固定し、膜をエタノールおよび酢酸で透過処理した。TdT酵素を加えた後、抗ジドキシゲニンペルオキシダーゼコンジュゲートを加えた。次いでこれらの組織片をペルオキシダーゼ基質で染色し、メチルグリーンで対比染色した。統計分析経時的な腫瘍容積の変化を簡約するため、最少二乗直線を対数変換値に当てはめた。すなわち、各マウスについて、最初の経時的な5回の測定値を用いて傾きを推定した。計算したこれらの傾きを真数を用いて元の倍率に変換し直し、一日あたりの平均腫瘍増殖率とする。3回の実験の各々の中で異なるベクターを比較するには、分散の荷重分析を独立変数として推定した傾きとともに用いた。各マウスに対し、加重は傾きの推定値の標準誤差の和の逆数に3回全ての実験に基づく傾き間の分散の推定値を加えたものである。実験IおよびIIに関しては、分散分析に基づくF検定を用いてMx-nBgおよびMx-dnG1ベクターを比較し、実験IIIに関しては、F検定の後に多重比較の最少有意差法を用いてMx-dnG1とCAE-dnG1ベクターおよびプラセボ処置を比較した。解析したデータを組み合わせた結果を表3に示す。カプランマイヤープロダクトリミット法を用いて腫瘍が4倍になる確率を時間の関数として推定した。傾向に関するタロン検定を用いてプラセボ-処置群、非ターゲッテッドCAE-dnG1ベクター処置群、およびマトリックスターゲッテッドMx-dnG1ベクター処置群が4倍になる時間を比較した。結果短期の効力研究では、Mx-nBg対照ベクター、非ターゲッテッドCAE-dnG1ベクターまたはMx-dnG1細胞致死性ベクター、かまたは同量のPBSプラセボのいずれかの静注を1~9x107のヒトMiaPaca2膵臓癌細胞の移植後6日目に開始し、マウスの部分集合に総計7ベクターの注入を毎日継続した。Mx-nBgベクター、非ターゲッテッドCAE-dnG1ベクターおよびプラセボPBSで処置したマウスでは、腫瘍サイズに進行性の増殖が見られた。これに対して、Mx-dnG1ベクターで処置した動物では腫瘍退縮が見られた。免疫組織化学染色では、対照ベクター処置マウスの大型腫瘍で発現したヒトサイクリンG1タンパク質に対する核の強い免疫反応性が明らかとなったが、一方でMx-dnG1ベクターで処置した動物の残存腫瘍にサイクリンG1発現の減少が認められた。マトリックスターゲッテッドレトロウイルスベクターによる固形腫瘍への遺伝子送達の効率を評価するため、7種のベクター用量を投与した後に2群の動物の部分集合を犠牲にした。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した、Mx-nBg対照ベクターで処置した動物から得た腫瘍組織切片の組織病理学検査により、腫瘍小節が腫瘍および腫瘍関連細胞、すなわち薄い結合組織被膜に囲まれた活性脈管形成介在域を持ち比較的分裂速度の速い優勢な悪性類上皮細胞集団からなることが明らかとなった。これに対して、Mx-dnG1ベクターで処置した動物から得た腫瘍小節では、大量の腫瘍破壊、残存腫瘍細胞内でのアポトーシスの多発、および反応性間質の肥厚化の形跡が見られた。多くの腫瘍小節が、大きな中央壊死域、活性腫瘍の中間域、および多数のアポトーシス細胞を含む末梢域を示した。消散している他の腫瘍小節はほぼ完全に緻密な結合組織に囲まれているが、これにより、かなりの割合の残存腫瘍が明白なアポトーシス細胞の小領域を示し、また、急性および慢性炎症の程度が多様であることが説明される。形質導入効率は、b-ガラクトシダーゼ抗原に対するマウスモノクローナル抗体を用いる腫瘍小節の免疫組織化学染色と、その後のOptimas画像解析システムを用いる解析により求めた。腫瘍小節あたり3つの高電場でb-ガラクトシダーゼ陽性細胞の数を計数し、細胞総数で割って×100倍することで形質導入効率を求めた。高レベルの細胞の形質導入がMx-nBgベクターで処置した動物の腫瘍小節のいたるところで認められた。この腫瘍小節に見られた高い形質導入効率をさらに調べるため、犠牲にする1時間前および24時間前にMx-nBgベクターを静注してベクター分布試験を行なった。83A25ラットモノクローナル抗体を用いるレトロウイルス外被タンパク質の免疫組織化学染色は、1時間では、ベクター粒子の集積は腫瘍小節全体に絡み合う脈管形成域において顕著であったが、24時間では、ベクター粒子の免疫反応は見られず、このことは腫瘍および腫瘍関連細胞へのウイルスの侵入が起こったことを示している。腫瘍小節のマッソントリクローム染色は、脈管形成血管床が内皮細胞に完全には覆われていないことから、細胞外マトリックス成分は循環血液成分に曝されていることを明らかにした。考えうるところでは、透過性の腫瘍脈管構造内でのコラーゲンが露出していることがマトリックスターゲッテッドレトロウイルス粒子の局所濃度を高め、それが腫瘍小節内で見られた高い分裂指数とあいまって、腫瘍細胞および関連する脈管構造の効果的な形質導入を促進した。マッソントリクローム染色で、豊富なコラーゲン沈着を含む活発な繊維形成が、実際の腫瘍塊に対してかなりの割合の残存小節を構成していたことが確認された。アポトーシスは腫瘍性細胞においても増殖性の血管細胞においても、サイクリンG1阻害の結果であることが知られている。従って、Mx-dnG1ベクターで処置した腫瘍の免疫組織化学染色では、対照ベクターで処置した動物のものと比較した場合、TUNEL陽性アポトーシス細胞の発生率が著しく増加することが明らかになった。アポトーシスは対照ベクターで処置したマウスの脈管形成の血管では認められなかった。これに対して、間質コンパートメントと同様に脈管形成域の内皮細胞の多数のアポトーシスがMx-dnG1ベクターで処置した動物において見られた。特に、アポトーシス発生の増加は、腫瘍小節の周辺表層に限らず、腫瘍小節の奥深くの多くの細胞層にまで及んでいた。Mx-dnG1ベクターの腫瘍小節への浸透能は、コラーゲン沈着および/または露出、ならびに固形腫瘍の中心部内の血管浸透性によって明らかに促進された。この観点はベクター粒子の集積が脈管形成域で最も顕著であることを示した免疫組織化学研究結果と一致する。さらに、認められた増殖性内皮細胞および間質細胞の破壊はそれ自身、血管供給の枯渇によりまたは増殖因子の刺激により、不均衡な量の腫瘍細胞死を誘発し得るものであった。Mx-dnG1ベクター、同等の用量の非ターゲッテッドCAE-dnG1ベクター、または等量のPBSプラセボを用いる、休止期を挟んで2回の治療サイクルからなる長期効力研究で、治療効率が両種性MLV外被タンパク質の一次構造内に組み込まれたコラーゲンターゲッティングペプチドモチーフに依存していることが確認された。プラセボ処置したマウスでは腫瘍サイズの急速な増大が見られたが、非ターゲッテッドCAE-dnG1ベクター処置した動物では、PBS対照と比較した場合に腫瘍増殖の下限阻害が認められた。これに対して、非ターゲッテッドCAE-dnG1ベクター処置マウス、対照ターゲッテッドMx-nBgベクター処置マウス、およびPBS処置マウスと比較すると、Mx-dnG1ベクター処置マウスにおける腫瘍増殖は有意に阻害された。さらに、Mx-dnG1ベクター処置マウスにおける腫瘍増殖率は、~7週間の追跡期間を通して非ターゲッテッドCAE-dnG1ベクター処置動物のものより常に低く維持されていた。カプランマイヤー生存研究は、PBSプラセボ、非ターゲッテッドCAE-dnG1ベクターまたはマトリックスターゲッテッドMx-dnG1ベクターで処置したマウスで行った。倫理上の理由から、実際に動物を死亡させるではなく、生存のエンドポイントを実際の対象の死亡の代わりに、腫瘍が4倍になった時点と定めた。もし腫瘍容積が47日で4倍に増えなかった場合、その動物を犠牲にし、4倍増殖時間を47日で打ち切った。カプランマイヤープロダクトリミット法を用いて腫瘍が4倍になる確率を時間の関数として推定した。傾向に関するタロン検定を用いてプラセボ-処置群、非ターゲッテッドCAE-dnG1ベクター処置群、およびマトリックスターゲッテッドMx-dnG1ベクター処置群の4倍増殖時間を比較した。ログランク検定を用いると、3つ全ての群を同時に比較する総合的なP値は0003であり、傾向を含めるとその有意水準は0004であった。これらのデータは、長期の腫瘍増殖制御の可能性は、非ターゲッテッドCAE-dnG1ベクターまたはPBSプラセボよりもマトリックスターゲッテッドMx-dnG1ベクターを用いる方が有意に高いことを示している。マトリックスターゲッテッドベクターの潜在的毒性を評価するため、1または2回の治療サイクルの終了時に非標的臓器を回収した。血清化学プロフィールは正常で、骨髄、肺、心臓、脳、肝臓、腎臓、精巣、結腸および皮膚の組織検査では臓器損傷の形跡はなかった。これらの結果はMx-dnG1レトロウイルスベクターの静注が広範囲の安全性を持つようであるとの考えをさらに裏付けるものである。注:3つの別々の実験の結果を合わせた。3つの実験中の異なるベクターを比較するために、分散の重量分析を、独立分散としての概算した傾斜と共に使用した。実験IおよびIIに関して、分散の分析に基づいたF検定を使用して、Mx-nBgおよびMx-dnG1ベクターを比較し、実験IIIに関して、F検定、続く複数の比較の最小有意差法を使用して、Mx-dnG1を、CAE-dnG1ベクターおよびプラセボ処置と比較した。分析データの合わせた結果を上記に示す。注:Mx-nBgレトロウイルスベクターによる固体腫瘍内への遺伝子送達の効果を、7種のベクター投与量を投与した後に二つのサブセットの動物で評価した。形質導入効率は、腫瘍小瘤の免疫組織化学的染色により、b-ガラクトシダーゼ抗原に対するマウスモノクローナル抗体、続くOptimas造影システムを使用して測定した。形質導入効率は、腫瘍小瘤当たりの3つのハイパワー場におけるb-ガラクトシダーゼ陽性細胞を計数し、細胞の総数で割り、100を掛けて測定した。考察実施例3の結果は、末端静脈注射により分散させたマトリックス標的化レトロウイルスベクターが、1時間以内に血管形成性腫瘍血管構造に蓄積される、腫瘍細胞が高レベルの効率で形質導入される、そして目に見える毒性を誘発することなく、治療的遺伝子送達および長期効果を促進することを証明する。一緒にして、これらの結果は、末梢静脈に直接注射したマトリックス標的化レトロウイルスベクターが、固体腫瘍内への治療的遺伝子送達を改善するという原則の最初の決定的証拠を提供する。全ての特許、刊行物、データベース受け入れ番号および受託所受け入れ番号の記載は、各特許、刊行物、データベース受け入れ番号および受託所受け入れ番号が個々に特記され、個々に出展明示により本明細書に包含されるのと同程度に出展明示により本明細書に包含させる。しかし、本発明の範囲は、上記の具体的実施態様に限定されないことは理解すべきである。本発明は、特別に記載されているのと異なって実施し得、まだ特許請求の範囲の範囲内である。