以下のペプチド配列:NGQFDNTVIVFTSDNGGK配列番号1、FDQTFQVGDNTR配列番号2、及びETEYITDGLSR配列番号3を有するペプチドを含む酵素により、イオタ-カラビオースモチーフをアルファ-カラビオースモチーフに変換する酵素触媒作用を含む、イオタ-カラギーナンのアルファ-カラギーナン変換方法。前記酵素のペプチド配列が、MTFNKKVSTLLWGTLIAISVGNASAADAGQSKADESNEKPNILFVLADDLGYNDVGFNGSTDIKTPNLDGLAKNGMTFDAAYVAHPFCGPSRAAIMTGRYPHKIGAQFNLPEDNSNVGVSADELFIAQTMKSAGYFTGAMGKWHLGEASEYHPNKHGFDEFYGFLGGGHNYFPEQFEAAYNKRVAQGMTNINMYLTPLEHNGKEVRETEYITDGLSREAVNFVDKAAAKKKPFFLYLAYNAPHVPLQAKEEDMAMFSQIKDKKRRTYAGMVYAVDRGVGRIVEQLKKNGQFDNTVIVFTSDNGGKLGQGANNYPLKEGKGSVQEGGFRTPMLVHWPKHMKAGSRFSHPVLALDLYPTFAGLGGAVLPEDKKLDGKDIWADIQANTAPHKDEFIYVLRHRNGYSDAAARRNQFKAVKNHNDDWKLYNIAQDISEDNDISAQHPDILRDMVSSMESWSWNNQQPKWFHQSAEGAQWRLKAMPRFDQTFQVGDNTRSNSKKGH配列番号4である、請求項1に記載の方法。前記酵素が4S-イオタ-カラギーナンスルファターゼである、請求項1又は2に記載の方法。前記酵素が、前記酵素をコードする核酸及び/又は前記酵素をコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞により産生される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。実施例1:シュードアルテロモナスアトランティカPseudoalteromonasatlanticaから得られた新規4S-イオタ-カラギーナンスルファターゼの同定シュードアルテロモナスアトランティカPseudoalteromonasatlanticaのカラギーナンスルファターゼ活性のスクリーニングゲノムが完全に解読されているhttpgenomejgipsforgfinishedmicrobespseatpseathomehtml海洋細菌シュードアルテロモナスアトランティカPseudoalteromonasatlanticaT6cATCCT6c/BAA-1087株を用いてスクリーニングを行った。細菌培養カッパ-カラギーナンカッパフィカスアルベレッチーKappaphycusalvarezii、CPケルコ社製、X6913、1g/l、イオタ-カラギーナンユーシューマデンチキュラタムEucheumadenticulatum、H030058-534、1g/l、又はラムダ-カラギーナンギガルチナスコッツベルギイGigartinaskottsbergiiの胞子体、CPケルコ社製、X7055の存在下、ゾベルZobell培地[バクトペプトンBactopeptoneアムレスコ社Amresco製5g/l、酵母エキスBD、自己消化酵母細胞エキスExtractofAutolysedYeastcells1g/l、脱塩水で1lに調製したろ過海水800ml]中で培養した海洋細菌シュードアルテロモナスアトランティカPseudoalteromonasatlanticaを用いて細菌抽出物を調製した。一次前培養では、-80°Cで保存したP.アトランティカPatlanticaのグリセロールから10mlのゾベルZobell培地を接種した。ニューブランズウィックNewBrunswick型のシェーカーを用いて18°C、180rpmで36時間インキュベートした。二次前培養では、カラギーナンの1つカッパ、イオタ、又はラムダを50mg含む50mlのゾベルZobell培地を、660nmでの吸光度が0.1になるように約1mlの一次前培養を接種した。この二次前培養を660nmでの光学濃度が1~1.2に達するまで、すなわち約8時間、18°Cでインキュベートした。最後の培養では、前と同じカラギーナンを含む950mlのゾベルZobell培地に二次前培養液50mlを接種し、18°Cで36時間インキュベートした。培養上清から細菌ペレットを分離するために、細菌培養液を6200g、4°Cで20分間遠心分離した。細菌抽出物の調製硫酸アンモニウムで90飽和させて沈殿させることにより、培養上清を濃縮するサンプル100ml当たり硫酸アンモニウム61.5g。遠心25分間、10000rpm後に得られたペレットを、50mMトリス-HClバッファーpH8.3溶液中に戻す。次いで、これを膜スペクトラ/ポア、MWCO3500Daを用いて50mMトリス-HClバッファーpH8.3に対して透析する。pH8.3の50mMトリス-HClバッファーシグマ社製に細菌ペレットを再懸濁した。次いで、細胞をフレンチプレス中で溶解させ、得られた溶解物を27000gで2時間45分間超遠心した。得られた上清にアンチプロテアーゼコンプリート、EDTAフリー、ロシュ社製の錠剤の半分を加えた。次いで、4°Cで一晩撹拌しながらpH8.5の50mMトリス-HClバッファーに対して抽出物を透析したスペクトラ/ポア、MWCO3500Da。放出された硫酸塩のアッセイ細菌抽出物存在下で種々のカラギーナンをインキュベートした後に放出された硫酸塩の量を測定することにより、スルファターゼ活性の産生を評価した。アッセイは、濃縮した培養上清及び細菌ペレットを用いて行った。分析した各サンプルについて、酵素抽出物を予め100°Cで約15分間失活させた後、同様な方法でブランクを用意した。ミリQ水ミリポア社製で反応培地を2倍希釈した後、カットオフが10kDaのマイクロコンアミコン中で遠心した。この遠心は、3300g、室温で90分間行った。次いで、得られたろ液を、ダイオネクス社Dionexのシステムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーHPAEC:高性能陰イオン交換クロマトグラフィーでアッセイした。20μlのサンプルを自動インジェクターAS3000、サーモ社製を用いて注入した。AG-11プレカラム4×50mm、ダイオネクス社製を取り付けたイオン-パックAS11カラム4×200mm、ダイオネクス社製を用いて、サンプル中に存在する陰イオンの分離を行った。12mMNaOHに関してシステムを平衡化した。流速1ml/分GP40ポンプ、ダイオネクス社製でNaOH均一濃度勾配を用いて溶出を行った。電流198mAで作動するASRSウルトラ-IIサプレッサー4mm、ダイオネクス社製を取り付けたED40検出器ダイオネクス社製を用いた電気伝導度測定により、陰イオンの検出を行った。データの取得及び処理に用いたソフトウェアはクロメレオンChromeleon6.8ソフトウェアである。較正曲線を用い、硫酸塩ピークの面積を百万分率ppmに変換した。サンプルとブランクの値の間の差から、酵素による脱硫酸化反応中に放出された硫酸塩の量ppmが得られた。結果を以下の表1に示す。新規4S-イオタ-カラギーナンスルファターゼの精製及びタンパク質配列細菌抽出物の調製スルファターゼ活性を有する、イオタ-カラギーナンで誘導した培養液から得られた及び前述したように得られた細菌ペレットを、pH7.5の50mMトリス-HClバッファーシグマ社製に再懸濁した。次いで、フレンチプレスを用いて細胞を溶解し、得られた溶解物を27200gで2時間45分間超遠心した。タンパク質の分解を抑えるために、得られた上清にアンチプロテアーゼコンプリート、EDTAフリー、ロシュ社製の錠剤の半分を加えた。抽出物から小サイズ分子特に遊離硫酸塩を除去するために、抽出物を4°Cで一晩撹拌しながら50mMトリス-HClバッファーpH7.5に対して透析したスペクトラ/ポア、MWCO3500Da。精製イオタ-カラギーナンに作用するスルファターゼの精製実験を行った。精製ステップはアクタ精製システムAktaPurifierSystemを用いて行った。溶解物を、50mMトリス-HClバッファーpH7.5で事前に平衡化した弱陰イオン交換クロマトグラフィーカラムDEAEセファロースファストフローSepharoseFastFlowGEヘルスケア社製-45×1cmに入れた。スーパーループ又はインジェクションループを用いてサンプル約35mlを流速2ml/分でロードした。次いで、280nmでの吸光度が無視できるほど小さくなるまで、樹脂をこの同じバッファーで洗浄した。タンパク質の溶出は分割した漸増する0~1MのNaCl勾配10カラム体積の0~500mMNaCl及び2カラム体積の500mM~1MNaClで流速2ml/分にて行った。体積5.5mlの回収画分を、イオタ-カラギーナンを脱硫酸化する能力について試験した。次いで、最大のスルファターゼ活性を含む画分を、4°Cで撹拌しながら50mMトリス-HClバッファーpH7.5に対して48時間透析したスペクトラ/ポア膜、MWCO3500Da。この画分1mlを、50mMトリス-HClバッファーpH7.5で予め平衡化した強陰イオン交換樹脂QファストフローQFastFlowGEヘルスケア社製-ハイトラップHitrap1mlに入れた。樹脂をこの同じバッファーで洗浄し、以下のようにした0~1Mの漸増NaCl勾配でタンパク質を溶出した:15カラム体積の0~500mMNaCl及び5カラム体積の500mM~1MNaCl、流速1ml/分。スルファターゼ活性を測定するために、回収画分1mlをイオタ-カラギーナン存在下でインキュベートした。SDS-PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動で画分の純度の程度を可視化した。SDS-PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動バイオラッド社製、クライテリオンCriterionXT12ビス-トリスで活性画分の純度を分析した。15μlのサンプルに、2SDSアムレスコ社製と、5β-メルカプトエタノール98、シグマ社製と、20グリセロールカルロエルバ社CarloErba製と、62.5mMトリス-HClpH6.8と、0.5ブロモフェノールブルーシグマ社製とを含む5μlのローディングバッファーを加えた。次いで、タンパク質を変性させるためにサンプルを沸騰温度で3分間加熱した。次いで、混合物20μlをゲルにアプライした。サイズマーカーバイオラッド社製、プレシジョンプラスプロテインPrecisionPlusProtein5μlをアプライして、10~250kDaのタンパク質分子量を評価できるようにした。200mMMOPSシグマ社製と、250mMトリスpH8.1と、5g/lSDSとで構成される泳動バッファー中で、室温、1つのゲルにつき110ボルトで、2時間泳動を行った。コロイドクーマシーブルー染色を用いてゲルの可視化を行ったCandianoetalElectrophoresis25132713332004[5]。精製タンパク質の分子量は約55kDaと推定された図4。タンパク質及び核酸配列ゲルからタンパク質バンドを切り出し、トリプシンで消化して、得られたペプチドを、ナントNantesのINRAにあるバイオポリマーBiopolymersRIOプラットフォームで質量分析法によりシークエンシングした。決定された3つの配列[NGQFDNTVIVFTSDNGGK配列番号1、FDQTFQVGDNTR配列番号2、及びETEYITDGLSR配列番号3]をTrEMBLライブラリーと比較した。3つのペプチドは、その遺伝子Patl_0889がスルファターゼに分類されるシュードアルテロモナスアトランティカPseudoalteromonasatlanticaT6cCopelandetal2006、前述[4]のQ15XH3タンパク質図5、配列番号4に100対応する。このタンパク質は、システインをホルミルグリシンFGlyに変換するために必要な12アミノ酸のコンセンサス配列C/S-X-P-S/X-R-XXX-L/X-G/X-R/X、配列番号5及び保存配列G-Y/V-X-S/T-XXX-G-K-X-X-H、配列番号6中に存在する触媒アミノ酸を有する。新規スルファターゼの遺伝子のゲノム環境は、このタンパク質がイオタ-カラギーナンの分解に関与することを示している図6。実際、Q15XH3の遺伝子は、他のスルファターゼQ15XH3に41の同一性を有するQ15XG7を含むを含む遺伝子クラスター中に位置し、クラスター中、2個は未知のタンパク質であるが、特にクエン酸回路糖の酸化及びD-ガラクトース代謝のための複数の遺伝子が明確に同定されている。このクラスター中に存在するスルファターゼの機能は、おそらく、イオタ-及び/又はアルファ-カラギーナンの脱硫酸化に関連付けられる。スルファターゼ活性スルファターゼ活性を測定するために、アッセイする100μlのサンプルを、50mMトリス-HClバッファーpH7.5中1のイオタ-カラギーナンCPケルコ社製、No.1256溶液100μlに接触させた。酵素反応はウォーターバス中で34°Cにて48時間行った。各サンプルについて、酵素抽出物を予め100°Cで15分間失活させ、同様な条件でブランクを用意した。切断された硫酸基の位置、及び、結果として酵素加水分解中に形成された生成物の同定をNMRで行った。この分析では、300μlの細菌抽出物の存在下で700μlの1イオタ-カラギーナンCPケルコ社製、No.1256をインキュベートすることにより脱硫酸化反応を行った。反応混合物をウォーターバス中で34°Cにて72時間インキュベートした後、凍結乾燥した。次いで、サンプルをD2O中で2回交換した後、700μlの99.97D2Oに再度溶解し、適切な濃度である10mg/mlにした。NMR部門ブレストのブルターニュオクシダンタル大学により、ブルカーアバンセBrukerAvanceDRX500分光光度計を用いて1HNMRスペクトルが70°Cで記録された。カラギーナンのアノマープロトンはおよそ5~5.6ppmに特徴的な化学シフトdを示す。結果は、純粋なタンパク質によるイオタ-カラギーナンの脱硫酸化によってアルファ-カラギーナンが生成することを示しており図7A、これは最初の精製4S-イオタ-カラギーナンスルファターゼの場合と同様であるが、最初の精製4S-イオタ-カラギーナンスルファターゼの分子量は115kDaであった仏国特許出願第09/52642号、前述[3]。したがって、イオタ-カラギーナンをアルファ-カラギーナンに変換できる新規スルファターゼが同定された。これは、アミドヒドラーゼのファミリーに属する、これまでに公知の唯一の4S-イオタ-カラギーナンスルファターゼとは識別可能である。新規カラギーナンスルファターゼQ15XH3の配列は、これがFGly-スルファターゼのファミリーに属することを示している。このFGly-スルファターゼは、炭水化物に作用する他の酵素を含むこのファミリーの最初のカラギーナンスルファターゼである。グリコサミノグリカンすなわちヘパリン及びセレブロシドに作用するスルファターゼを説明した。参照文献一覧1BixleretalFoodHydocolloids1561963020012BixlerandPorseJApplPhycol2010online3FrenchpatentapplicationFR09526424CopelandetalCompletesequenceofPseudoalteromonasatlanticaT6cEMBLACCESSIONNoCP000388PROTEINJDABG39415120065CandianoetalElectrophoresis25132713332004