"配列番号1のポリペプチド配列に対して少なくとも80の同一性を有するポリペプチドを含むアルファ鎖と、配列番号2のポリペプチド配列に対して少なくとも70の同一性を有するポリペプチドを含むベータ鎖と、配列番号3のポリペプチド配列に対して少なくとも70の同一性を有するポリペプチドを含むガンマ鎖とを含み、該アルファ鎖、該ベータ鎖、および該ガンマ鎖が集合して組換えラミニン-521を構築する、単離された組換えラミニン-521。前記アルファ鎖ポリペプチドが、前記配列番号1のポリペプチド配列に対して少なくとも90の同一性を有する、請求項1に記載の単離された組換えラミニン-521。前記ベータ鎖ポリペプチドが、前記配列番号2のポリペプチド配列に対して少なくとも90の同一性を有する、請求項2に記載の単離された組換えラミニン-521。前記ガンマ鎖ポリペプチドが、前記配列番号3のポリペプチド配列に対して少なくとも90の同一性を有する、請求項3に記載の単離された組換えラミニン-521。a単離された組換えラミニン-521およびb薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物。invitroにおいて成長させた多能性幹細胞の自己再生を可能にする組成物であって、成長培地およびその上のthereoverコーティングを含み、該コーティングが組換えラミニン521ラミニン-11を含む、組成物。成長因子をさらに含む、請求項6に記載の組成物。分化阻害剤、フィーダー細胞、または分化誘導物質のいずれをも欠く、請求項6に記載の組成物。invitroにおいて多能性幹細胞の多能性を維持するための方法であって、成長培地およびその上のコーティングを含む基質を提供するステップであって、該コーティングが、組換えラミニン521ラミニン-11または組換えラミニン511のいずれかのマトリックスを含む、ステップと、多能性幹細胞を単細胞懸濁物へと解離させるステップと、該コーティング上に、該単細胞懸濁物状態の該多能性幹細胞を配置するステップとを含む、方法。組成物が分化阻害剤、フィーダー細胞、または分化誘導物質のいずれをも欠く、請求項9に記載の方法。前記多能性幹細胞が、単層として前記コーティング上に配置される、請求項9に記載の方法。前記多能性幹細胞が、200細胞/mm2以下の密度で前記コーティング上に配置される、請求項9に記載の方法。前記多能性幹細胞が、200細胞/mm2以上の密度で前記コーティング上に配置される、請求項9に記載の方法。前記多能性幹細胞が、2つの幹細胞が互いに接触しないように前記コーティング上に配置される、請求項9に記載の方法。invitroにおいて多能性幹細胞の多能性を維持する方法であって、その上にコーティングを有する基質を得るステップであって、該コーティングが完全なラミニンを含有する、ステップと、該基質上に多能性幹細胞および細胞培養培地を配置するステップと、PI3キナーゼ/Akt経路を活性化するステップと、を含む、方法。前記完全なラミニンがラミニン-521またはラミニン-511である、請求項15に記載の方法。前記細胞培養培地がいかなる成長因子も含有しない、請求項15に記載の方法。前記細胞培養培地がベータ線維芽細胞成長因子bFGFを含有しない、請求項15に記載の方法。前記コーティングがカドヘリンも含有する、請求項15に記載の方法。前記多能性幹細胞が、200細胞/mm2以下の密度で前記コーティング上に配置される、請求項15に記載の方法。組換えラミニン-521を単離する方法であって、組換えラミニン-521を発現する宿主細胞を提供するステップであって、該組換えラミニン-521は:配列番号1のポリペプチド配列に対して少なくとも80の同一性を有するポリペプチドを含む第1の鎖、配列番号2のポリペプチド配列に対して少なくとも70の同一性を有するポリペプチドを含む第2の鎖、および配列番号3のポリペプチド配列に対して少なくとも70の同一性を有するポリペプチドを含む第3の鎖を含み、該第1の鎖、該第2の鎖、および該第3の鎖が集合して組換えラミニン-521を構築する、ステップと、該組換えラミニン-521鎖の発現を刺激するための条件下、細胞培養培地中で宿主細胞を成長させるステップと、該宿主細胞培養培地をカラムに通過させるステップであって、該カラムが、該組換えラミニン-521に結合する化合物を含有する、ステップと、非結合物質を除去するために該カラムを洗浄するステップと、該カラムから、結合した前記組換えラミニン-521を溶離するステップとを含む、方法。前記カラムが、抗体アフィニティーカラム、ゲル濾過クロマトグラフィーカラム、またはイオン交換カラムである、請求項21に記載の方法。プロモーター配列に動作可能に連結された配列番号4の核酸を含む、組換え発現ベクター。ポリリンカー配列、ポリアデニル化シグナル配列、終止配列、選択マーカー、またはエピトープタグをさらに含む、請求項23に記載のベクター。単離された組換えラミニン-521でコーティングされている外表面を有する医療デバイスまたは移植片。単離された組換えラミニン-521と容器とを含む、キット。多能性幹細胞の初期培養物を受けるためのインプットエリアと、該初期培養物から該幹細胞を取り出すための手段と、該幹細胞を単細胞懸濁物中に配置するための手段と、ラミニン-521を含有するマトリックス上に該単細胞懸濁物の状態の該幹細胞を再播種するための手段とを含む、自動化されたロボットシステム。本開示は、単離されたラミニン-521LN-521またはラミニン-11としても公知および単離されたラミニン-521を生成するための方法を提供する。さらなる態様では、本開示は、ラミニン-521鎖を発現し、組換えラミニン-521を分泌する組換え宿主細胞を提供する。他の態様では、本開示は、ヒト細胞療法のための細胞を開発する目的のための、分化および維持のために細胞を培養するためのGMP品質のラミニン-521を提供する。本開示は、薬学的に許容されるキャリアと一緒に、単離されたラミニン-521を含む薬学的組成物を提供する。そのような薬学的組成物は、必要に応じて、他の細胞外マトリックス構成成分と共に提供することができる。本開示は、様々な使用のための、様々な量の単離されたラミニン-521を有効に生成するための方法も提供する。それらの使用についての好ましい実施形態では、組換えラミニン-521が、使用される。その望まれる効果に有効な、ある量の単離されたラミニン-521またはその薬学的組成物と、その使用のための指示とを含むキットも開示される。本開示は、単層培養において幹細胞を培養するための方法であって、細胞の均一性、細胞培養プレートまたは他の細胞支持体から単細胞懸濁物の状態で幹細胞の移動を促進する方法、ならびに単細胞懸濁物になった幹細胞を再播種するための方法であって、幹細胞培養物の増殖およびそのような細胞の大規模産生を可能にするかなりの希釈度で、継代および増殖させる方法を提供する。さらなる態様では、本開示は、単層培養においてラミニン-521上で多能性幹細胞を培養すること、幹細胞を他の細胞支持物質と共に細胞培養プレートから単細胞懸濁物の状態で移動すること、および単細胞懸濁物由来の幹細胞を単細胞としてラミニン-521を含有するマトリックス上に再播種することこのプロセスは、高性能の自動化ロボットシステムにおいて実行することができるようにするを記載する。さらなる態様では、本開示は、改善された医療デバイスおよび移植片であって、改善が、有効量の単離されたラミニン-521を医療デバイスおよび移植片に提供することを含む、改善された医療デバイスおよび移植片を提供する。さらなる態様では、本開示は、改善された細胞培養デバイスならびに細胞付着ならびにその後の細胞静止状態、増殖、分化、および/または遊走のために有効な量の単離されたラミニン-521を細胞培養デバイスに提供することによって、培養中の細胞の成長およびその表現型の維持のために、改善された細胞培養デバイスを調製するための方法を提供する。他の態様では、本開示は、ヒト組換えラミニン-521などの組成物および未分化の状態においてinvitroにおいてヒト胚性幹細胞を培養し、迅速に増殖させるための方法を提供する。方法は、ヒト胚性幹細胞の単細胞への解離および任意のRho結合キナーゼROCK阻害剤なしのたとえばY-27632なしの培地においてラミニン-521をコーティングした細胞培養ディッシュ上にそれらを蒔くことを含むWatanabeら、NatureBiotechnology25巻、681~686頁2007年。その改善により、従来のヒト胚性幹細胞培養においてよりも迅速に、多能性状態でヒト胚性幹細胞を増殖させる可能性を提供する。さらなる態様では、本開示は、単細胞懸濁物への解離の後にヒト胚細胞の生存を可能にする、ヒト組換えラミニン-521などの新しい材料を提供する。その改善により、クローンを単離することたとえば遺伝子操作の後に、または、均一で均質なヒト胚性幹細胞集団を得ることのために有利となり得る、ヒト胚性幹細胞の、クローニングにおけるよりよい生存をもたらす。いくつかの実施形態では、配列番号1のポリペプチド配列に対して少なくとも80の同一性を有するポリペプチドを含むアルファ鎖と、配列番号2のポリペプチド配列に対して少なくとも70の同一性を有するポリペプチドを含むベータ鎖と、配列番号3のポリペプチド配列に対して少なくとも70の同一性を有するポリペプチドを含むガンマ鎖とを含み、アルファ、ベータ、およびガンマ鎖が集合して組換えラミニン-521を構築する、単離された組換えラミニン-521が開示される。さらなる実施形態では、アルファ鎖ポリペプチドが、配列番号1のポリペプチド配列に対して少なくとも90の同一性を有する。ベータ鎖ポリペプチドも配列番号2のポリペプチド配列に対して少なくとも90の同一性を有し得る。ガンマ鎖ポリペプチドも配列番号3のポリペプチド配列に対して少なくとも90の同一性を有し得る。他の実施形態では、アルファ鎖が、配列番号1のポリペプチド配列を有する。さらに、ベータ鎖が、配列番号2のポリペプチド配列を有し得る。さらにより詳細には、ガンマ鎖が、配列番号3のポリペプチド配列を有し得る。ベータ鎖ポリペプチドは、配列番号2のポリペプチド配列に対して少なくとも80の同一性を有し得る。ガンマ鎖ポリペプチドは、配列番号3のポリペプチド配列に対して少なくとも80の同一性を有し得る。実施形態では、a上記に記載される単離された組換えラミニン-521と、b薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物も開示される。invitroにおいて成長させた多能性幹細胞の自己再生を可能にする組成物であって、成長培地およびその上のコーティングを含み、コーティングが組換えラミニン521ラミニン-11を含む、組成物も実施形態において開示される。組成物は、成長因子をさらに含んでいてもよい。組成物は、いかなる分化阻害剤も欠いていてもよい。組成物は、いかなるフィーダー細胞も欠いていてもよい。組成物は、いかなる分化誘導物質も欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、組成物が、いかなる分化阻害剤、フィーダー細胞、または分化誘導物質も欠く。実施形態では、invitroにおいて多能性幹細胞の多能性を維持するための方法であって、成長培地およびその上のコーティングを含む基質を提供するステップであって、コーティングが、上記に記載されるものなどの組換えラミニン521ラミニン-11を含むステップと、多能性幹細胞を単細胞懸濁物へ解離させるステップと、コーティング上に単細胞懸濁物状態の多能性幹細胞を配置するステップとを含む方法も開示される。成長培地は、成長因子複数可を含み得る。例示的な成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子およびインスリン成長因子を含む。時に、成長培地およびコーティングは、いかなる分化阻害剤も欠く。たとえば、白血病インヒビター因子は、存在しない。組成物は、マウス線維芽細胞またはヒト包皮線維芽細胞などのいかなるフィーダー細胞を欠いていてもよい。組成物は、ノギンNogginまたはケラチノサイト成長因子などのいかなる分化誘導物質を欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、組成物が、いかなる分化阻害剤、フィーダー細胞、または分化誘導物質を欠く。多能性幹細胞は、単層として、ラミニン-521コーティング上に配置されてもよい。多能性幹細胞は、200細胞/mm2以下の密度でコーティング上に配置されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、200細胞/mm2以上の密度でコーティング上に配置されてもよい。多能性幹細胞は、あるいは、2つの幹細胞が互いに接触しないように、コーティング上に配置することができる。組換えラミニン-521を発現する宿主細胞を提供するステップであって、組換えラミニン-521が、配列番号1のポリペプチド配列に対して少なくとも80の同一性を有するポリペプチドを含む第1の鎖、配列番号2のポリペプチド配列に対して少なくとも70の同一性を有するポリペプチドを含む第2の鎖、および配列番号3のポリペプチド配列に対して少なくとも70の同一性を有するポリペプチドを含む第3の鎖を含み、第1、第2、および第3の鎖が集合して組換えラミニン-521を構築するステップと、組換えラミニン-521鎖の発現を刺激するための条件下で、細胞培養培地中で宿主細胞を成長させるステップと、宿主細胞培養培地をカラムに通過させるステップであって、カラムが、組換えラミニン-521に結合する化合物を含有するステップと、非結合物質を除去するためにカラムを洗浄するステップと、結合した組換えラミニン-521をカラムから溶離するステップとを含む方法によって生成される単離された組換えラミニン-521も実施形態において開示される。invitroにおいて多能性幹細胞の多能性を維持する方法であって、その上にコーティングを有する基質を得るステップであって、コーティングが完全なラミニンを含有するステップと、基質上に多能性幹細胞および細胞培養培地を配置するステップと、PI3キナーゼ/Akt経路を活性化するステップとを含む方法が、他の実施形態において記載される。完全なラミニンは、ラミニン-521またはラミニン-511であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養培地が、ベータ線維芽細胞成長因子bFGFなどのいかなる成長因子も含有しない。コーティングは、また、カドヘリンを含有してもよい。多能性幹細胞は、200細胞/mm2以下の密度でコーティング上に配置されてもよい。本開示は、多能性状態の幹細胞を維持するために使用することができる細胞培養培地にも関する。0を超える値~3.9ng/mlの塩基性線維芽細胞成長因子bFGFを含む、多能性幹細胞に栄養を提供する細胞培養培地が、様々な実施形態において記載される。細胞培養培地は、0.5~3.5ng/mlのbFGFを含む、3.5ng/ml以下のbFGFを含んでいてもよい。細胞培養培地は、少なくとも1つの無機塩、少なくとも1つの微量ミネラル、少なくとも1つのエネルギー基質、少なくとも1つの脂質、少なくとも1つのアミノ酸、少なくとも1つのビタミン、または少なくとも1つのさらなる成長因子をさらに含んでいてもよい。特定の実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも1つの無機塩、少なくとも1つの微量ミネラル、少なくとも1つのエネルギー基質、少なくとも1つの脂質、少なくとも1つのアミノ酸、および少なくとも1つのビタミンをさらに含む。細胞培養培地は、1アルブミン、2インスリンもしくはインスリン代替物、または3トランスフェリンもしくはトランスフェリン代替物のうちのいずれか1つを含有しなくてもよい。細胞培養培地は、アルブミン、インスリン、塩化リチウム、GABA、TGFベータ1、ピペコリン酸、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、およびDMEM/F12溶液をさらに含んでいてもよい。細胞培養培地は、少なくとも1つのさらなる成長因子、少なくとも1つの微量ミネラル、および少なくとも1つの脂質をさらに含んでいてもよい。0を超える値~3.9ng/mlの塩基性線維芽細胞成長因子bFGFを含む細胞培養培地および幹細胞に支持体を提供するための基質を含む、多能性幹細胞を維持するためのシステムも開示される。基質は、ラミニン-521またはラミニン-511を含有し得る。基質は、また、カドヘリンを含有してもよい。これらのおよび本開示の他の非限定的な特徴は、下記により詳しく開示される。本特許または出願包袋は、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面複数可を有する本特許または特許出願公開のコピーは、請求し必要な料金の支払いをすると特許庁によって提供される。下記は、本明細書において開示される例示的な実施形態を限定する目的ではなく、本明細書において開示される例示的な実施形態を例証する目的のために提示される図面の簡単な説明である。本明細書において開示される組成物および方法についてのより完全な理解は、添付図面に対する参照によって得ることができる。これらの図は、単に、本開示を実証することにおける利便性および容易性に基づく略図であり、そのため、例示的な実施形態の範囲を定めるまたは限定するようには意図されない。特定の用語は、明瞭さのために以下の説明において使用されるが、これらの用語は、図面における例証のために選択した実施形態の特定の構造のみを指すように意図され、本開示の範囲を定めるまたは限定するようには意図されない。下記の図面および以下の説明では、同様の数字表示が同様の機能の構成成分を指すことが理解される。本明細書において取り上げられた刊行物、特許、および特許出願はすべて、それらの全体が参照によってこれによって組み込まれる。特に指定のない限り、本出願において利用される技術は、MolecularCloning:ALaboratoryManualSambrookら、1989年、ColdSpringHarborLaboratoryPress、GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology、第185巻、D.Goeddel編、1991年AcademicPress、SanDiego、Calif.、GuidetoProteinPurificationMethodsinEnzymologyM.P.Deutshcer編、1990年AcademicPress,Inc.;PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplicationsInnisら1990年AcademicPress、SanDiego、Calif.、CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique、第2版R.I.Freshney.1987年Liss,Inc.NewYork、N.Y.、GeneTransferandExpressionProtocols、109~128頁、E.J.Murray編、TheHumanaPressInc.、Clifton、N.J.、またはAmbion1998年CatalogAmbion、Austin、Tex.などのいくつかの周知の参考文献のうちのいずれかにおいても見出され得る。本明細書において使用されるように、用語単離された核酸配列は、核酸が由来する生物のゲノムDNA中の核酸に天然に隣接する遺伝子配列すなわち、核酸が由来する生物のゲノムDNA中の単離された核酸nucleic分子についての遺伝子に隣接して位置する遺伝子配列がない核酸配列を指す。しかしながら、単離された配列は、異種プロモーター配列または他のベクター配列などの、列挙される配列に天然では隣接しない他のヌクレオチド配列に連結されてもよい。本開示による核酸配列が、宿主細胞をトランスフェクトするために使用される発現ベクターの一部であってもよいので、単離された核酸配列は、単離されたと見なされるために、他の細胞物質がないことが必要とされるわけではない下記を参照されたい。本開示は、ヒトラミニンβ2鎖の完全長ラミニンβ2鎖核酸配列配列番号4を含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、異種プロモーターすなわち、所定のβ2ラミニン鎖についての天然に存在するプロモーターでないに動作可能に連結された、配列番号4によってコードされる核酸を含む。プロモーターがラミニンβ2鎖DNAのRNAへの発現を駆動することができる場合、プロモーターおよびラミニンβ2鎖核酸配列は、動作可能に連結されている。本明細書において使用されるように、用語ベクターは、それが連結している他の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。あるタイプのベクターは、プラスミドであり、これは、さらなるDNAセグメントがその中にクローニングされ得る環状の二本鎖DNAを指す。他のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ここでは、さらなるDNAセグメントが、ウイルスゲノムの中にクローニングされ得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製が可能であるたとえば、細菌複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター。他のベクターたとえば非エピソーム哺乳動物ベクターは、宿主細胞中への導入に際して宿主細胞のゲノムの中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが動作可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、組換え発現ベクターまたは単に発現ベクターと本明細書において呼ばれる。本開示では、ラミニンポリペプチド配列の発現は、本開示のプロモーター配列を、発現される遺伝子に動作可能に連結することによって、本開示のプロモーター配列によって指示される。一般に、組換えDNA技術において有益な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態をしている。本明細書では、プラスミドがベクターのうちで最も一般に使用されている形態であるので、プラスミドおよびベクターは、区別なく使用されてもよい。しかしながら、本開示は、等価な機能を果たすウイルスベクターたとえば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどの発現ベクターの他の形態を含むように意図される。ベクターは、さらなる核酸配列のサブクローニングのためのポリリンカーまたは転写物の適切なポリアデニル化を達成するためのポリアデニル化シグナルなどのさらなる配列も含有し得る。ポリアデニル化シグナルの性質は、本開示の方法の実施の成功にとって重大であると考えられず、SV40およびウシ成長ホルモンポリ-A部位を含むが、これらに限定されない任意のそのような配列が、用いられてもよい。メッセージレベルを増強し、かつ構築物から他の配列への読み過ごしを最小限にするために果たすことができる終止配列もベクターのエレメントとして企図される。さらに、発現ベクターは、典型的に、これらのベクターを持つ細胞の選択を可能にする、多くの場合、抗生物質耐性遺伝子の形態をした選択マーカーを有する。さらなる実施形態では、本開示は、本明細書において開示されるラミニンβ2鎖発現組換え発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。本明細書において使用されるように、用語宿主細胞は、組換え発現ベクターなどの本開示の核酸が導入されている細胞を指すように意図される。そのような細胞は、たとえば、本開示の大量の発現ベクターを迅速に産生するために使用することができる原核生物であってもよく、または機能的な研究については真核生物であってもよい。用語宿主細胞および組換え宿主細胞は、区別なく本明細書において使用される。そのような用語が、特定の対象の細胞だけでなくそのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解されたい。ある種の修飾が変異または環境上の影響のいずれかのために続く世代において起こり得るので、そのような子孫は、実際に、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書において使用されるような用語の範囲内になお含まれる。宿主細胞は、1つまたは複数の本開示の発現ベクターにより一時的にまたは安定してトランスフェクトすることができる。原核生物細胞および真核生物細胞の中への発現ベクターのそのようなトランスフェクションは、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、またはリポソーム媒介性の、DEAEデキストラン媒介性の、ポリカチオン媒介性の、もしくはウイルス媒介性のトランスフェクションを含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の任意の技術を介して達成することができるたとえばMolecularCloning:ALaboratoryManualSambrookら、1989年、ColdSpringHarborLaboratoryPress;CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique、第2版追補R.I.Freshney.1987年Liss,Inc.NewYork、N.Y.を参照されたい。他の態様では、本開示は、配列番号2のアミノ酸配列からなる、単離された完全長ヒトラミニンβ2鎖ポリペプチドを提供する。本明細書において使用されるように、単離されたポリペプチドは、他のラミニン鎖を含む他のタンパク質ならびにポリアクリルアミドおよびアガロースなどのゲル剤を実質的に含まないポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、単離されたラミニンポリペプチドは、検出可能な混入ラミニン鎖を含まない。したがって、タンパク質は、天然の供給源から単離することができるまたは組換えタンパク質は、上記に開示されるトランスフェクト宿主細胞から単離することができる。他の態様では、本開示は、単離されたラミニン-521を提供する。本明細書において使用されるように、用語ラミニン-521は、α5、β2、およびγ1鎖をともにつなぐことによって形成されたタンパク質を指す。この用語は、組換えラミニン-521および天然に存在する供給源由来のヘテロ三量体ラミニン-521の両方を包含するとして解釈されるべきである。好ましい実施形態では、ラミニン-521は、組換えラミニン-521またはr-ラミニン-521を含む。本明細書において使用されるように、用語r-ラミニン-521は、α5、β2、およびγ1鎖から選択されるラミニン-521鎖をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む1つまたは複数の発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞によって発現される組換えヘテロ三量体ラミニン-521またはそのプロセシング形態もしくは分泌形態を指す。そのようなr-ラミニン-521は、したがって、単一の生物または異なる生物由来のα5、β2、およびγ1配列を含むことができる。様々なラミニン-521鎖のDNA配列は、当技術分野において公知であり、本開示のr-ラミニン-521を調製するための任意のそのような配列の使用が企図されるたとえばPouliot,N.ら、ExperimentalCellResearch261巻2号:360~71頁、2000年;Kikkawa,Y.ら、JournalofCellScience113巻第5部:869~76頁、2000年;Church,HJ.ら、BiochemicalJournal332巻第2部:491~8頁、1998年;Sorokin,LM.ら、DevelopmentalBiology189巻2号:285~300頁1997年;Miner,JH.ら、JournalofBiologicalChemistry270巻48号:28523~6頁1995年;Sorokin,L.ら、EuropeanJournalofBiochemistry223巻2号:603~10頁1994年を参照されたい。好ましい実施形態では、r-ラミニン-521は、組換えヒトα5、β2、およびγ1ポリペプチド鎖から形成される。本開示は、組換えヘテロ三量体ラミニン-521を構成する1つまたは2つの鎖のみが内因性ラミニン-521鎖によってコードされるラミニン分子を包含する。好ましい実施形態では、α5、β2、およびγ1ポリペプチド鎖の各々は、組換えで発現される。ラミニン-521は、完全なタンパク質である。用語完全なは、α-鎖、β-鎖、およびγ-鎖のドメインのすべてから構成され、3つの鎖が、ヘテロ三量体構造を形成するようにともにつながれているタンパク質を指す。タンパク質は、別々の鎖、断片、または機能的ドメインに分解されない。用語鎖は、ラミニンタンパク質のアルファ、ベータ、またはガンマ鎖の全体を指す。用語断片は、他の分子または受容体に対して結合活性を持つ、1つ、2つ、または3つの機能的ドメインを含有する任意のタンパク質断片を指す。しかしながら、鎖が各々、3つを超えるそのようなドメインを持つので、鎖は、断片と考えられるべきではない。同様に、完全なラミニンタンパク質は、断片と考えられるべきではない。機能的ドメインの例として、ドメインI、II、III、IV、V、VI、およびGドメインが挙げられる。ラミニン-521は、分泌タンパク質であり、これは、シグナル配列の結果として、小胞体ER、分泌小胞、および細胞外空間に導かれ得る。分泌タンパク質が細胞外空間に放出される場合、分泌タンパク質は、細胞外プロセシングを受けて、成熟タンパク質を産生することができる。そのようなプロセシング事象は、多様となり得、したがって、最終成熟タンパク質の異なるバージョンをもたらし得る。たとえば、α5、β2、およびγ1鎖の長さは、タンパク質の間で異なり得る。しかしながら、たとえ鎖長が異なっても、最終成熟タンパク質はなお、同じ機能性を有する。本開示の単離されたラミニン-521は、完全長ポリペプチド鎖および任意のそのような天然にプロセシングされたラミニン-521ポリペプチド鎖の両方を含むヘテロ三量体を含む。本明細書において使用されるように、ラミニン-521ポリペプチド鎖は、以下:aR1-R2-R3、R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3、およびR2-R4からなる群から選択されるポリペプチド構造を含むポリペプチド鎖であって、ここで、R1は、アミノ末端メチオニンであり、R2は、ポリペプチドの分泌を指示することができるシグナル配列であって、該シグナル配列が、特定のラミニン鎖についての天然のシグナル配列、他の分泌タンパク質についての天然のシグナル配列、もしくは人工配列であってもよいシグナル配列であり、R3は、α5鎖、β2鎖、およびγ1鎖からなる群から選択される分泌ラミニン鎖であり、R4は、ラミニン鎖アミノ酸配列内の任意の位置に配置することができるエピトープタグ下記に記載されるものなどをさらに含む、分泌α5、β2、もしくはγ1ラミニン鎖である、または、b本明細書において開示される1つもしくは複数の組換えラミニン-521鎖DNA配列配列番号4、配列番号5、配列番号6のコード領域もしくはその部分またはその相補的配列に、高または低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド鎖、または、c1つもしくは複数の開示されるラミニン-521ポリペプチド鎖のアミノ酸配列配列番号1、配列番号2、配列番号3に対して少なくとも70の同一性、好ましくは少なくとも80の同一性、最も好ましくは少なくとも約90の同一性を有するポリペプチド鎖、の1つまたは複数に従うポリペプチド鎖を指す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄条件であって、核酸のハイブリッドがそのもとで安定している洗浄条件を指すために本明細書において使用される。本開示は、本明細書において開示されるラミニン鎖ポリヌクレオチドのコード配列のすべてもしくは部分またはそれらの相補体complementに高ストリンジェンシー条件本明細書において定義される下でハイブリダイズする核酸も含む。ハイブリダイズする核酸におけるハイブリダイズする部分は、典型的に、長さが少なくとも50ヌクレオチドである。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度TMに反映される。TMは、配列相同性が1減少する毎におよそ1~1.5°C減少する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシーの条件下で実行され、様々であるが、より高度なストリンジェンシーの洗浄が後続する。本明細書において使用されるように、高ストリンジェンシーは、50ホルムアミド、5×SSC750mMNaCl、75mMクエン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウムpH7.6、5×デンハルト溶液、10硫酸デキストラン、および20μg/ml変性断片処理済みサケ精子DNAを含む溶液において42°Cで一晩のインキュベーションと、これに後続する、0.1×SSC中、約65°Cでのフィルターの洗浄を指す。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件で本開示のポリヌクレオチドにハイブリダイズするラミニン-521コード核酸配列も企図される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出における変化は、ホルムアミド濃度ホルムアミドのパーセンテージが低いと、ストリンジェンシーの低下をもたらす、塩条件、または温度の操作により主に達成される。たとえば、低ストリンジェンシー条件は、6×SSPE20×SSPE=3MNaCl;0.2MNaH2PO4;0.02MEDTA、pH7.4、0.5SDS、30ホルムアミド、100μg/mlサケ精子遮断DNAを含む溶液における37°Cでの一晩のインキュベーションと、これに後続する、1×SSPE、0.1SDSによる50°Cでの洗浄を含む。さらに、さらに低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの後に実行される洗浄は、より高い塩濃度たとえば5×SSCで行うことができる。ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替の遮断試薬の包含および/または置換を通して上記の条件における変化が達成され得ることに注意されたい。典型的な遮断試薬は、デンハート試薬、BLOTTO、ヘパリン、変性サケ精子DNA、および市販で入手可能な専売の剤proprietaryformulationを含む。特定の遮断試薬の包含は、適合性に関する課題のために、上記に記載されるハイブリダイゼーション条件の改良を必要とし得る。本明細書において使用されるように、2つのアミノ酸または2つの核酸の同一性パーセントは、KarlinおよびAltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA90巻:5873~5877頁、1993年におけるように改変された、KarlinおよびAltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA87巻:2264.2268頁、1990年のアルゴリズムを使用して決定される。そのようなアルゴリズムは、AltschulらJ.Mol.Biol.215巻:403~410頁、1990年のNBLASTおよびXBLASTプログラムの中に組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、本開示の核酸分子に対するヌクレオチド配列同一性を決定するために、NBLASTプログラム、スコア100、およびワード長=12により実行される。BLASTタンパク質検索は、本開示のポリペプチドに対するアミノ酸配列同一性を決定するために、XBLASTプログラム、スコア=50、およびワード長=3により実行される。比較の目的のためのギャップアライメントを得るために、AltschulらNucleicAcids.Res.25巻:3389~3402頁、1997年において記載されるようにGappedBLASTが利用される。BLASTおよびGappedBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムたとえばXBLASTおよびNBLASTのデフォルトパラメーターが、使用される。さらに、本開示の実施形態は、配列番号4、配列番号5、および配列番号6中に含有される1つまたは複数のポリペプチド配列に対して、少なくとも70の同一性、好ましくは少なくとも80の同一性、最も好ましくは少なくとも90の同一性を有するラミニン-521鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書において使用されるように、α5ポリヌクレオチドは、ラミニンα5鎖をコードするポリヌクレオチドを指す。そのようなポリヌクレオチドは、1つまたは複数の以下のものによって特徴付けることができる:a配列番号5の選択される配列と少なくとも70の同一性、好ましくは80の同一性、および最も好ましくは少なくとも90の同一性を共有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、b配列番号5もしくはその相補的配列のコード配列に対して、低もしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはcR1-R2-R3、R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3、およびR2-R4からなる群から選択される一般的な構造を有するラミニンα5鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、R1およびR2が、上記に記載されるとおりであり、R3が、分泌α5鎖であり、R4が、エピトープタグを含む分泌α5鎖である、ポリヌクレオチド。本明細書において使用されるように、β2ポリヌクレオチドは、同じ名称のβ2ラミニン鎖をコードするポリヌクレオチドを指す。そのようなポリヌクレオチドは、1つまたは複数の以下のものによって特徴付けることができる:a配列番号4の配列と少なくとも70の同一性、好ましくは少なくとも80の同一性、および最も好ましくは少なくとも90の同一性を共有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、b配列番号4もしくはその相補的配列のコード配列に対して、低もしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはcR1-R2-R3、R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3、およびR2-R4から選択される一般的な構造を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、R1およびR2が、上記に記載されるとおりであり、R3が、分泌β2鎖であり、R4が、エピトープタグを含む分泌β2鎖である、ポリヌクレオチド。本明細書において使用されるように、γ1ポリヌクレオチドは、同じ名称のγ1ラミニン鎖をコードするポリヌクレオチドを指す。そのようなポリヌクレオチドは、1つまたは複数の以下のものによって特徴付けることができる:a配列番号6の配列と少なくとも70の同一性、好ましくは少なくとも80の同一性、および最も好ましくは少なくとも90の同一性を共有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、b配列番号6もしくはその相補的配列のコード配列に対して、低もしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはcR1-R2-R3、R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3、およびR2-R4から選択される一般的な構造を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、R1およびR2が、上記に記載されるとおりであり、R3が、分泌γ1鎖であり、R4が、エピトープタグを含む分泌γ1鎖である、ポリヌクレオチド。本明細書において使用されるように、用語エピトープタグは、キメラタンパク質の一部として発現されるポリペプチド配列を指し、エピトープタグは、エピトープタグに対して生成される抗体の結合についての、または該タグを含有する配列をアフィニティー精製するために使用することができる他の分子の結合についての認識部位としての役目を果たす。好ましい実施形態では、ラミニンα5、β2、およびγ1鎖またはその断片をコードするcDNAは、発現ベクターの中にサブクローニングされる。あるいは、1つまたは複数のイントロンを含むラミニンα5、β2、および/またはγ1遺伝子配列は、発現ベクターの中にサブクローニングするために使用することができる。他の態様では、本開示は、ラミニン-521のα5、β2、およびγ1鎖からなる群から選択される配列を含む、少なくとも1つのポリペプチド配列をコードする核酸配列に動作可能に連結されたプロモーター配列を含有する発現ベクターによりトランスフェクトされているラミニン-521発現細胞であって、該トランスフェクトされた細胞が、組換えラミニン鎖を含有するヘテロ三量体ラミニン-521を分泌する、ラミニン-521発現細胞を提供する。好ましい実施形態では、細胞が、さらにより好ましくはすべてヒトの鎖であるラミニン-521のα5、β2、およびγ1鎖を含むポリペプチド配列をコードする核酸配列に動作可能に連結されたプロモーター配列を含有する組換え発現ベクターにより系統的にトランスフェクトされる。複数のトランスフェクションの後に、細胞は、ヘテロ三量体r-ラミニン-521を形成する組換えラミニン-521鎖を発現する。真核生物細胞の中への発現ベクターのトランスフェクションは、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、またはリポソーム媒介性の、DEAEデキストラン媒介性の、ポリカチオン媒介性の、もしくはウイルス媒介性のトランスフェクションを含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の任意の技術を介して達成することができる。細菌細胞のトランスフェクションは、標準的な方法によって行うことができる。好ましい実施形態では、細胞は、安定してトランスフェクトされる。適切なトランスフェクトされた細胞の安定したトランスフェクションおよび選択のための方法は、当技術分野において公知である。他の好ましい実施形態では、CMVプロモーターにより駆動される発現ベクターは、ヒト胎児腎293細胞系において使用される。r-ラミニン-521を発現し、分泌することができる任意の細胞を使用することができる。好ましくは、真核生物細胞が使用され、そして最も好ましくは、腎臓および上皮細胞系を含むが、これらに限定されない哺乳動物細胞が使用される。個々の鎖またはr-ラミニン-521の発現を駆動するために使用されるプロモーター配列は、構成的CMV、SV40、RSV、アクチン、EFを含むが、これらに限定されない様々なプロモーターのいずれかによって駆動されるまたは誘導性テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性を含むが、これらに限定されない、多くの誘導性プロモーターのいずれかによって駆動されるであってもよい。炭水化物およびジスルフィドの翻訳後修飾は、ラミニン-521タンパク質のフォールディングおよび機能のために必要とされると考えられる。他の系が、たとえば、抗体産生のための抗原を得るのに有用であるが、これは、真核生物細胞の使用を、機能的なr-ラミニン-521の産生にとって好ましいものにする。最も好ましい実施形態では、哺乳動物細胞は、ラミニンβ2鎖を内因的に発現しない。他の好ましい実施形態では、細胞は、ラミニン-521鎖のすべてを内因的に発現するとは限らない。タンパク質は、エピトープタグおよび輸送シグナルなどの、タンパク質の精製を促すのに有用なさらなる配列を含んでいてもよい。そのようなエピトープタグの例としては、FLAGSigmaChemical、St.Louis、Mo.、myc9E10Invitrogen、Carlsbad、Calif.、6-HisInvitrogen;Novagen、Madison、Wis.、およびHABoehringerManheimBiochemicalsが挙げられるが、これらに限定されない。そのような輸送シグナルの例としては、排出シグナル、分泌シグナル、核移行シグナル、および形質膜局在化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのラミニン鎖ポリペプチド配列またはその断片は、エピトープタグをコードする核酸配列に動作可能に連結され、その結果、少なくとも1つの鎖は、発現されたエピトープタグを有する融合タンパク質として発現される。エピトープタグは、結果として生じるr-ラミニン-521が機能的なままである限り、r-ラミニン-521を含むポリペプチド鎖のいずれに対してもアミノ末端、カルボキシ末端、または内部にあるものとして発現されてもよい。他の実施形態では、r-ラミニン-521鎖の一方は、第1のエピトープタグを有する融合タンパク質として発現され、少なくとも1つの他のr-ラミニン鎖は、第2の異なるエピトープタグを有する融合タンパク質として発現される。これは、複数回の精製が実行されるのを可能にする。あるいは、1つを超えるr-ラミニン鎖を有する融合タンパク質を作り出すために、同じエピトープタグを使用することができる。さらなる実施形態では、エピトープタグは、r-ラミニン-521鎖複数可から切断可能となるように操作することができる。あるいは、エピトープタグは、r-ラミニン-521鎖のいずれにも融合されず、r-ラミニン-521は、ラミニン-521特異的抗体または他のラミニン-521結合分子を使用する、アフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない標準的な技術によって単離される。単一のラミニン鎖によりトランスフェクトされた細胞から得られる培地は、ラミニン鎖特異的抗体を使用して、ウエスタンブロット上で最初に分析される。トランスフェクションの後の単一のラミニン鎖の発現は、一般的に、細胞内でのものある。個々のトランスフェクトされた鎖複数可に対する反応性を示すクローンは、トランスフェクトされた遺伝子の組み込みを確認するために、PCR、逆転写-PCR、または核酸ハイブリダイゼーションなどの、任意の適切な方法によって検証される。好ましくは、そのようなクローン由来のゲノムDNA調製物の分析は、ラミニン鎖特異的プライマー対を使用して、PCRによって行われる。3つの鎖をすべて産生する、トランスフェクトされたクローンから得られる培地は、ウエスタンブロット解析および細胞結合アッセイを含む、任意の適切な方法によって、r-ラミニン-521分泌および/または活性についてさらに分析される。好ましい実施形態では、r-ラミニン-521の精製は、トランスフェクトされた細胞から得られる培地を抗体アフィニティーカラムに通過させることによって達成される。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの組換え鎖上に発現されたペプチドエピトープに対する抗体は、アフィニティーカラムに付着され、培地中に分泌されたr-ラミニン-521に結合する。r-ラミニン-521は、カラムに過剰量のペプチドを通過させることによってカラムから取り出される。溶離した画分は、ゲル電気泳動およびウエスタンブロット解析を含む任意の適切な方法によって分析される。さらなる実施形態では、ペプチドエピトープは、精製後に切断することができる。他の実施形態では、それぞれ異なるエピトープタグを有する2つまたは3つの別々のr-ラミニン鎖が、融合タンパク質として発現され、2または3回の精製およびr-ラミニン-521の二重または三重の単離を可能にする。エピトープタグは、精製後に、r-ラミニン-521鎖複数可から切断可能となるように操作することができる。あるいは、エピトープタグは、r-ラミニン-521鎖のいずれにも融合されず、r-ラミニン-521は、ラミニン-521特異的抗体または他のラミニン-521結合分子を使用して、アフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない標準的な技術によって単離される。他の実施形態では、r-ラミニン-521の精製は、トランスフェクトされた細胞から得られる培地をゲル濾過クロマトグラフィーカラムに通過させることによって達成される。溶離した画分は、ゲル電気泳動およびウエスタンブロット解析を含む任意の適切な方法によって分析される。r-ラミニン-521を含有する画分は、収集され、被検物の純度は、ゲル電気泳動およびウエスタンブロット解析を含む任意の適切な方法によって評価される。いくつかの実施形態では、タンパク質溶液は、より高純度のタンパク質を得るために再びゲル濾過クロマトグラフィーカラムに通過させることができる。いくつかの実施形態では、より高純度のr-ラミニン-521溶液を達成するために、前の精製ステップから得られる培地またはr-ラミニン-521溶液は、イオン交換カラムに通過させることができる。溶離した画分は、ゲル電気泳動およびウエスタンブロット解析を含む任意の適切な方法によって分析される。r-ラミニン-521を含有する画分は、収集され、被検物の純度は、上記に挙げられるものを含む任意の適切な方法によって評価される。本開示のラミニン-521ポリペプチド鎖は、i1つもしくは複数の非保存アミノ酸残基による置換であって、置換アミノ酸残基が、遺伝子コードによってコードされるものであってもよいかもしくはそれでなくてもよい置換、またはii置換基を有する1つもしくは複数のアミノ酸残基による置換、またはiiiポリペプチドの安定性および/もしくは溶解性を増加させるための化合物たとえばポリエチレングリコールなどの他の化合物との、成熟ポリペプチドの融合、またはivIgGFc融合領域ペプチドもしくはリーダーもしくは分泌配列もしくは精製を促進する配列などのさらなるアミノ酸との、ポリペプチドの融合も含む。そのような変異体ポリペプチドは、本明細書における教示から当業者の範囲内にあると考えられる。たとえば、他の荷電または中性アミノ酸との荷電アミノ酸のアミノ酸置換を含有するポリペプチド変異体は、凝集がより少ないなど改善された特徴を有するタンパク質を産生し得る。薬学的製剤の凝集は活性を低下させ、また、凝集体の免疫原性活性によりクリアランスを増加させもする。Pinckardら、Clin.Exp.Immunol.2巻:331~340頁1967年;Robbinsら、Diabetes36巻:838~845頁1987年;Clelandら、Crit.Rev.TherapeuticDrugCarrierSystems10巻:307~377頁1993年。特定の実施形態では、単離されたラミニン-521は、3つの鎖を含む。第1の鎖は、配列番号1のポリペプチド配列すなわちα5ラミニン鎖に対して少なくとも80の同一性を有するポリペプチドを含む。第2の鎖は、配列番号2のポリペプチド配列すなわちβ2ラミニン鎖に対して少なくとも70の同一性を有するポリペプチドを含む。第3の鎖は、配列番号3のポリペプチド配列すなわちγ1ラミニン鎖に対して少なくとも70の同一性を有するポリペプチドを含む。これらの第1、第2、および第3の鎖は、集合して、組換えラミニン-521を構築する。より特定の実施形態では、第1の鎖のポリペプチドが、配列番号1のポリペプチド配列に対して少なくとも80の同一性を有し、第2の鎖のポリペプチドが、配列番号2のポリペプチド配列に対して少なくとも80の同一性を有し、第3の鎖のポリペプチドが、配列番号3のポリペプチド配列に対して少なくとも80の同一性を有する。より特定の実施形態では、第1の鎖のポリペプチドが、配列番号1のポリペプチド配列に対して少なくとも90の同一性を有し、第2の鎖のポリペプチドが、配列番号2のポリペプチド配列に対して少なくとも90の同一性を有し、第3の鎖のポリペプチドが、配列番号3のポリペプチド配列に対して少なくとも90の同一性を有する。特定の実施形態では、第1の鎖が、配列番号1のポリペプチド配列を含み、第2の鎖が、配列番号2のポリペプチド配列を含み、第3の鎖が、配列番号3のポリペプチド配列を含む。特定の実施形態では、第1の鎖が、配列番号1のポリペプチド配列であり、第2の鎖が、配列番号2のポリペプチド配列であり、第3の鎖が、配列番号3のポリペプチド配列である。本開示は、単離されたラミニン-521および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物をさらに提供する。好ましい実施形態では、薬学的組成物が、単離されたr-ラミニン-521を含む。本開示のこれらの態様によれば、他の作用物質は、処理されている状態に依存して、薬学的組成物中に含むことができる。薬学的組成物は、コラーゲン、他のラミニン型、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、インテグリン、α-ジストログリカン、エンタクチン/ナイドジェン、α-ジストログリカン、糖タンパク質、プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、上皮成長因子、血管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子、もしくは神経成長因子またそれらのペプチド断片を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数の他の化合物をさらに含み得る。単離されたラミニン-521を含む薬学的調製物は、任意の適した形態で調製することができ、一般的に、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせた単離されたラミニン-521を含む。キャリアは、注射用のキャリア、局所用のキャリア、経皮的なキャリアなどとすることができる。調製物は、有利には、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、噴霧剤、分散剤、懸濁剤、または泥膏などの局所投与のための形態をしていてもよい。調製物は、有利には、従来どおりの組成および量で、保存剤、抗菌薬、抗真菌薬、酸化防止剤、浸透圧剤、および同様の材料をさらに含んでいてもよい。本開示に従う使用に適した溶液は無菌であり、提唱された適用について有害ではなく、無菌化などの従来の薬学的作業にかけることができそして/または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などのような従来のアジュバントを含有し得る。本開示の組成物の製剤化を助けるために、Remington’sPharmaceuticalSciences、第15版、MackPublishingCo.、Easton、Pa.1975年が参照されてもよい。さらなる態様では、本開示は、生体適合性が改善された医療デバイスであって、デバイスの外表面が、単独でまたはデバイス表面の生体適合性を増加させる役目を果たす他のタンパク質または作用物質と組み合わせて、単離されたラミニン-521またはその薬学的組成物によりコーティングされる医療デバイスを含む。コーティングされたデバイスは、細胞付着内皮細胞付着などを促進し、デバイスの侵入の部位での炎症および/または感染の減少をもたらす。そのような医療デバイスは、身体への移植に使用される任意の材料とすることができ、好ましくは、ステンレス鋼またはチタンなどの生体適合性金属からできているまたはそれによりコーティングされている。あるいは、デバイスは、セラミックス材料またはポリエステル、ポリグリコール酸、もしくはポリガラクトース-ポリグリコール酸コポリマーなどのポリマーからできているまたはそれによりコーティングされている。デバイスが、メッシュ、シート、または布の形態をした天然または合成の生分解性材料からできている場合、単離されたラミニン-521またはその薬学的組成物は、その表面に直接適用され得る。適切な細胞は、その後、単離されたラミニン-521によるコーティングが望ましい歯の橋脚歯部分、針、金属ピンまたは棒、留置カテーテル、人工肛門形成チューブ、外科用メッシュ、および任意の他の器具を含む、移植できるまたは植え込み型のデバイスを形成するために、そのマトリックス上で培養されてもよい。あるいは、デバイスは、移植されてもよく、細胞は、invivoにおいて付着させてもよい。単離されたラミニン-521のカップリングは、非共有結合であってもよい吸着によってなどまたは共有結合の手段によるものであってもよい。デバイスは、単離されたラミニン-521またはその薬学的組成物中に浸してもよく、インキュベートしてもよく、またはそれを噴霧してもよい。本開示の単離されたラミニン-521を使用する様々な処置についての投薬レジメンは、外傷または状態のタイプ、年齢、体重、性別、個人の医学的な状態、状態の重症度、および投与のルートを含む、様々な因子に基づく。したがって、投薬レジメンは、広く異なり得るが、標準的な方法を使用して、医師によって日常的に決定することができる。ラミニンは、非常に有力な分子であり、細胞当たり1つまたは少数の分子により効果をもたらすことができる。したがって、送達が最適化される場合、ミリリッターの範囲当たりピコグラムの有効用量が、可能である。他の態様では、本開示は、単細胞懸濁物への解離の後にヒト胚性幹細胞の生存を可能にする、新しい材料である、単離されたラミニン-521を提供する。幹細胞は、トリプシン-EDTA処理によって単細胞懸濁物へと解離させ、遠心分離によってペレットにし、O3培地に再懸濁し、40μmのふるいで濾過し、単離されたラミニン-521、ラミニン-511、またはMatrigelのいずれかによってあらかじめコーティングした細胞培養ディッシュに30000細胞/cm2の密度で蒔いた。1日培養した後に、Matrigel上に蒔いた細胞は、当技術分野において公知のように死滅した。ラミニン-521上に蒔いたヒト胚性幹細胞は生存し、また、ラミニン-511上に蒔いたヒト胚性幹細胞はほとんどの場合生存し、増殖し始め、多能性細胞の小さなコロニーを形成した。さらなる態様では、本開示は、多能性状態のヒト胚性幹細胞を増殖させるための方法を提供する。ラミニン-521上に単細胞懸濁物で蒔いたヒト胚性幹細胞は、生存し、当技術分野において公知の古典的な方法よりも速い速度で増殖することが示された。3回の継代1か月後に、単細胞懸濁物で継代された細胞は、20回の継代3か月後にMatrigel上で分けて継代された細胞培養物のそれと同数の細胞分裂を行った。そのため、新しい方法は、時間および労力の点から有利であり、これは、著しい経済的利益をもたらし得る。ラミニン-521は、通常、ヒト多能性胚性幹細胞によって発現され、かつ分泌され、腎臓、神経筋接合部、肺、および胎盤に見出すことができる。純粋なラミニン-521の利用可能性は、細胞の分化に対するタンパク質の効果および細胞の表現型の維持に関する研究を可能にすることになる。したがって、組織に対する外傷の処置、細胞付着を促すこと、増殖および遊走、exvivo細胞療法、医療デバイスの生体適合性の改善、ならびに改善された細胞培養デバイスおよび培地の調製を含むが、これらに限定されない多数の研究および治療の目的は、純粋な完全な単離されたラミニン-521が利用可能であるならば、進展することになる。また、幹細胞に対する純粋なラミニン-521の効果は、このタンパク質が初期哺乳動物胚において発現されるので、研究することは重要であろう。したがって、研究および治療の目的のための単離されたラミニン-521ならびに単離されたラミニン-521を作製するための方法についての必要性が当技術分野において存在するる。ラミニン-521は、十分に化学的に特定されている、フィーダーなしで、かつ動物タンパク質がない異種由来成分不含条件下で、解離されたヒトESおよび人工多能性幹iPS細胞の長期自己再生および迅速な増殖のためのマトリックスとして果たすことができる。LN-521ベースのシステムは、使用するのが容易であり、自動化するのが容易であり、また、ヒトES/iPS培養の迅速なスケールアップを可能にする。本開示は、細胞、特に幹細胞に栄養を提供するために使用することができる細胞培養培地にも関する。この点に関して、幹細胞は、典型的に、培養される2つのものを必要とする:1幹細胞に構造的支持体を提供する基質またはコーティングおよび2幹細胞に栄養を提供するための細胞培養培地。基質またはコーティング1は、たとえばペトリディッシュまたは他のある容器上に一般的に配置される。本明細書において使用されるように、用語自己再生は、幹細胞が多数のサイクルの細胞分裂を経て、未分化すなわち多能性のままである能力を指す。多能性はそれ自体、幹細胞があらゆる細胞型に分化する能力を指す。用語増殖は、幹細胞が分裂する能力を指す。生存は、分化していても未分化であっても幹細胞の生育する能力を指し、幹細胞が、分裂するまたは分化するその能力を維持することを必要としない。本開示の細胞培養培地は、ラミニン-521および/またはラミニン-511を含有する基質と共に使用されるのに特に適している。これらのラミニンは、α6β1インテグリンを活性化し、これは、順番に、PI3K/Akt経路の活性化につながる。これは、幹細胞の多能性、自己再生、および/または増殖を増大させる。基質が、完全な、別々の鎖としての、またはその断片としてのラミニン-521またはラミニン-511からなってもよいことが企図される。組換えラミニン-521および組換えラミニン-511は、市販で入手可能である。多くの様々な分子が、様々な効率によってであるが、PI3K/Akt経路を活性化することができる。たとえば、TGFベータ1およびbFGFは、この経路を活性化する。ラミニン-521および/またはラミニン-511の使用により、そのような分子の量を細胞培養培地において低減させることができる。ラミニン-521は、α6β1インテグリンを介して最大量のシグナルを伝達し、PI3K/Akt経路を活性化する。ラミニン-521の使用は、単細胞への酵素学的解離の後に、細胞生存を増大させるために、細胞に有害なrhoキナーゼROCK阻害剤の添加をせずに、単細胞懸濁物を継代するのを可能にする。以前は、人工アポトーシス阻害剤を使用しないヒトES細胞の単細胞への酵素学的継代は、不可能であった。継代手順の単純さは、実験的変動が低下し、プロセスがハイスループット細胞培養用に自動化されることを可能にし、その結果として、細胞培養スタッフの広範囲なトレーニングおよびコストを伴わないことを意味する。さらに、ラミニン-521またはラミニン-511上に蒔かれたヒトES細胞およびヒトiPS細胞は、単層として成長し、細胞がマトリックスおよび細胞培養培地に等しく曝露されるので、これにより培養物が均一になる。ラミニン-521上で化学的に特定されている、異種由来成分不含の環境において成長し、ROCK阻害剤の非存在下で単細胞として継代されたそのようなヒトES細胞培養物は、Matrigel上で成長し、凝集塊として継代された細胞と比較して、さらによりよい成長速度で継続的に数か月間も増殖する。これらの多能性で長期間増殖された細胞は、Oct4を均一に発現し、核型は正常なままである。したがって、生存および増殖能力が保持されたヒトES細胞およびヒトiPS細胞を得ることができる。平均接触面積および拡散の均一性は、他の利用可能な基層と比較して、ラミニン-511上で培養された細胞についてはるかに大きい。3か月間を超えてラミニン-511上で成長させたヒトES細胞は、多能性を維持し、SCIDマウスへの移植後に奇形腫を生成し得る。ラミニン-511はまた、他の公知のマトリックスが2週間よりも長く支持することができないにもかかわらず、LIFまたはフィーダー細胞の不在下において、5か月間を超える期間、マウスES細胞の自己再生を支持する。この細胞培養培地により成長する幹細胞は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、胎児幹細胞、羊膜幹細胞、および一般的にあらゆる多能性幹細胞であり得る。典型的に、細胞培養培地は、分化を阻害し、かつ増殖を改善するために、多数のかつ多量の様々な成長因子およびサイトカインを含む。本開示の細胞培養培地の1つの利点は、それほど多くのまたはそのような多量の成長因子またはサイトカイン含有していないということである。最も一般的には、本開示の細胞培養培地は、典型的に使用されるものよりも低量の塩基性線維芽細胞成長因子bFGFを必要とする。細胞培養培地は、1ミリリッター当たり0を超える値~3.9ナノグラムng/mLのbFGFを含んでいてもよいことが企図される。bFGFは、ヒトbFGFであり、それにより細胞培養培地は、完全に、ヒト型の限定培地humananddefinedである。いくつかのより詳細な実施形態では、細胞培養培地は、3.5ng/mL以下のbFGFを含み得る。他の実施形態では、細胞培養培地は、0.5~3.5ng/mLのbFGFを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ゼロのbFGFを有し得る、すなわち、bFGFは、存在しない。一般的に、細胞培養培地は、少なくとも1つの無機塩、少なくとも1つの微量ミネラル、少なくとも1つのエネルギー基質、少なくとも1つの脂質、少なくとも1つのアミノ酸、少なくとも1つのビタミン、および少なくとも1つの成長因子bFGFに加えてが溶解している液相を含む。下記の表1は、本開示の細胞培養培地中に存在してもよい様々なそのような成分のリストならびにその成分が存在する場合、最小濃度および最大濃度を含む。値は、科学的表記法で提示する。たとえば、4.1E-01は、4.1×10-01として解釈されるべきである。細胞培養培地の液相は、水、血清、またはアルブミンであってもよい。表1において上記に列挙される成分または構成成分の多くは、必要ではないかまたはより低濃度で使用することができる。細胞培養培地がインスリンまたはインスリン代替物を含有し得ることが企図される。同様に、細胞培養培地は、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物を含有し得る。より詳細な実施形態では、細胞培養培地が、1アルブミンを含有せずともよい、2インスリンもしくはインスリン代替物を含有せずともよい、3トランスフェリンもしくはトランスフェリン代替物を含有せずともよい、またはこれらの3つの構成成分の任意の組み合わせを含有せずともよいことが企図される。他の細胞培養培地が、インターロイキン-1ベータIL-1βもしくはカタボリンcatabolin、インターロイキン-6IL6、または色素上皮由来因子PEDFなどの成長因子を含有してもよいことに注意されたい。そのような成長因子は、本開示の細胞培養培地中に存在しない。細胞培養培地の1つの詳細な組成を表2に提供する。この点に関して、MEM非必須アミノ酸溶液は、100×濃縮物において典型的に提供される。表2のMEMは、1×に希釈を戻した後に使用され、表3において列挙される以下の濃度の以下のアミノ酸を含有する。DMEM/F12は、表4において記載される以下の成分を含有する。本開示の細胞培養培地との、ラミニン基質の組み合わせは、より安価になり得る細胞培養系をもたらすが、多能性幹細胞を維持する際に、より高い効率をもたらす。本質的に、必要とされるのは、ラミニンおよび最小量の栄養だけである。この細胞培養培地と組み合わせて使用されるラミニンは、LN-511またはLN-521のいずれかであることが特に企図される。以下の実施例は、本開示をさらに例証する目的のためのものである。実施例は、単に例証であり、そこに記載される材料、条件、またはプロセスパラメーターに対する開示に従って作製されたデバイスを限定するようには意図されない。実施例1ヒトラミニンβ2cDNAのクローニングヒトラミニンβ2cDNAの5.6kb断片は、プライマー5’-GTGGTACCCACAGGCAGAGTTGAC-3’配列番号7および5’-GCTCTAGAGCTCTTCAGTGCATAGGC-3’配列番号8を使用して、ヒト肝臓cDNAライブラリーBDBiosciencesからPCR増幅し、それにより、断片の端末上に人工のXbaIおよびKpnI切断部位を導入した。PCR増幅の間のエラー率を減少させるために、Phusion商標高忠実度PCRキットFinnzymesを使用した。続いて、断片は、XbaIおよびKpnIにより消化し、同じ制限エンドヌクレアーゼにより消化したpSKベクターpSKHLAMB2プラスミドへとサブクローニングした。配列の完全性を検証するために、pSKHLAMB2プラスミドのいくつかのクローンについて配列決定した。配列決定は、ABIPRISM登録商標BigDye商標TerminatorCycleSequencingkitPEAppliedBiosystemsを使用して、ABIPRISM商標310GeneticAnalyzerPerkinElmerで実行した。NCBIデータベースのヒトラミニンβ2配列と完全にマッチするもののみを、さらなるクローニングのために選択した。発現構築物ヒトラミニンβ2鎖の発現のために、pSKHLAMB2プラスミドは、XbaIおよびKpnIにより消化し、XbaI-KpnI処理pcDNA3.1ベクターInvitrogenへとサブクローニングした。ヒトラミニンα5HLN5Full.pcDNA構築物およびγ1HG1構築物の発現に使用された構築物は、以前に記載されているDoi,M.ら、J.Biol.Chem.277巻15号、12741~8頁2002年。抗体抗ラミニンβ2MAB2066モノクローナル抗体mAbは、RDSystemsから購入した。抗ラミニンα5mAb2F7は、Abnovaから購入した。抗ラミニンβ1mAbMAB1921は、Chemiconから購入した。抗ラミニンγ1H-190ウサギポリクローナル抗体は、SantaCruzBiotechnology、Inc.から購入した。組換えラミニン-521の産生および精製r-ラミニン-521は、37°Cの加湿5CO2大気中で、DMEM、10FCSで培養したヒト胎児腎臓細胞HEK293、ATCCCRL-1573において産生した。野生型細胞は、標準的なリン酸カルシウム法を使用してHG1構築物でトランスフェクトし、安定したコロニーは、100mg/mlハイグロマイシンCaylaを使用して選択した。すべてのさらなる細胞培養およびクローンの増殖は、適切な選択抗生物質の継続的な存在下において実行した。その後、高度に発現するクローンは、ヒトラミニンβ2構築物によりトランスフェクトし、安定したクローンは、500mg/mlG418LifeTechnologiesを使用して選択した。ラミニンγ1およびラミニンβ2の両方を高度に発現するクローンは、最終的に、HLN5Full.pcDNA構築物によりトランスフェクトし、安定したコロニーは、200mg/mlゼオシンCaylaを使用して選択した。最も高度な分泌を示すクローンは、さらに増殖させた。r-ラミニン-521の産生のために、コンフルエントな細胞は、5日間までDMEM中で培養した。r-ラミニン-521は、抗FLAGM2マトリックスSigmaを使用してアフィニティー精製した。収集した培地は、撹拌しながら、4°Cで、一晩、マトリックスと共にバッチモードでインキュベートした。結合したr-ラミニン-521は、室温で、TBS/E50mMTris-Cl、pH7.5、150mMNaCl、1mMEDTA中で50mg/mlFLAGペプチドSigmaにより競合的に溶離した。溶離物は、濃縮し、緩衝液は、30kDカットオフ限外濾過Milliporeを使用して、PBSと交換した。最終的に、濃縮溶液は、0.2mmフィルターを通過させ、自己凝集ポリマーを除去した。組換えラミニン-521の特徴付け培地中の分泌ラミニン、および精製後の分泌ラミニンは、3~8勾配SDS-PAGEを使用して特徴付けた。タンパク質は、Sypro染色Bio-Radを使用して可視化するかまたは、PVDF上に移した図3。膜は、上記に記載される抗体によりプローブした。洗浄後に、膜は、HRP結合体化ヤギ抗体と共にインキュベートした。免疫反応性は、製造業者の指示に従って、化学発光キットLifeScienceProductsによって検出した。方法ヒトES細胞培養物ヒトES細胞は、5CO2中、37°Cにおいて、化学的に特定されているO3培地Rodinら、NatureBiotechnol.、第28巻、611~615頁2010年に記載を含む、r-ラミニン-521でコーティングした実験室用ディッシュlaboratorydish上で培養した。細胞は、10~12日間ごとに1回、常習的に通過させ、37°Cで5分間トリプシン-EDTA溶液GIBCOInvitrogenに曝露させた。それらは、その後、穏やかにピペッティングして、単細胞懸濁物へとばらばらにし、特定されているトリプシン阻害剤GIBCOInvitrogenを添加した。細胞懸濁物は、4分間、遠心分離し、上清は廃棄し、細胞ペレットは、あらかじめ温めたO3培地中に再懸濁し、細胞は、その後、40μmのふるいに通過させた。その後、細胞は、30000細胞/cm2の濃度1:25~1:30の分割比で新しいr-ラミニン-521をコーティングしたディッシュ上に蒔いた。ほんの数滴の新鮮な培地を加えるときには、継代後の第1日を除いて、1時間インキュベーター中であらかじめ温めた新鮮な培地を1日に1回、細胞に与えた。同じ系統の対照細胞は、Rodinら、NatureBiotechnol.、第28巻、611~615頁2010年において記載されるように、O3培地中のMatrigelBDBiosciences上で培養した。対照細胞は、分けて継代した。細胞培養ディッシュのコーティング96ウェル組織細胞培養プレートは、すべて30μg/ml5μg/cm2の濃度のECMタンパク質である、マウスLN-111Invitrogen、ヒト組換えLN-511、およびヒト組換えLN-521の無菌溶液により、4°Cで一晩コーティングした。対照細胞については、hESCに適したBDMatrigel商標BDBiosciencesを製造業者の指示に従って使用した。細胞接着アッセイアッセイは、記載されるように実行したExtracellularMatrixProtocols、2000年。手短に言えば、96ウェルプレートは、上記に記載されるように細胞外マトリックスタンパク質によってコーティングし、ウシ血清アルブミンを含有するO3培地によってブロッキングした。ES細胞は、細胞外マトリックスをコーティングしたプレート上で600細胞/mm2の細胞密度で蒔き、細胞インキュベーターで1時間または1日間接着させた。非接着細胞は、洗い流し、接着細胞は、5グルタルアルデヒドによって20分間固定し、0.1クリスタルバイオレットによって染色した。mRNAのリアルタイムPCRによる定量化全RNAを単離し、cDNAは、Rodinら、NatureBiotechnol.、第28巻、611~615頁2010年において記載されるように合成した。リアルタイム定量的RT-PCRTaqmanアッセイは、AppliedBiosystems7300Real-TimePCRSystemを使用して実行した。反応はすべて、対象のmRNAについてのプライマーおよびプローブを含有する以前に開発された遺伝子発現アッセイミックスAppliedBiosystemsにより4連で行った。各実験についての追加の反応は、RNAインプットを標準化するために使用した、GAPDHについての以前に開発された遺伝子発現アッセイミックスを含んだ。データはすべて、7300SystemSDSSoftwareバージョン1.4により分析した。FACS分析OCT4発現は、Ludwig,T.E.らDerivationofhumanembryonicstemcellsindefinedconditions.Nat.Biotechnol.24巻、185~187頁2006年において記載されるように分析した。細胞をFACSCaliburFlowCytometerBectonDickinsonに流した。データは、CellQuestソフトウェアBectonDickinsonにより分析した。実施例1についての結果異なる細胞培養コーティングがいかなる添加剤もなしで、O3培地におけるヒトES細胞の単細胞の生存にどのように影響を及ぼすかを調べるために、本発明者らは、HS181細胞を完全に解離し、Matrigel、マウスラミニン-111、ヒトr-ラミニン-511、ヒトr-ラミニン-521、またはr-ラミニン-511およびr-ラミニン-521の混合物上にそれらを蒔いた。結果は図4に認められる。予想されたように、蒔いてから後24時間の間に、Matrigelおよびマウスラミニン-111に付着し続けた細胞は、ほとんどなかった。対照的に、ヒトr-ラミニン-521、上記混合物、および程度は少ないがヒトr-ラミニン-511上の細胞は、生存した。実験は、ROCK阻害剤のY-27632により処理したO3培地中のヒトES細胞について繰り返した。これらの結果は図5に認められる。幹細胞は、5つすべてのコーティング上に付着したままであった。この効果を定量化するために、本発明者らは、蒔いてから1時間および1日後に前述のすべてのコーティング上で細胞接着実験を実行した。すなわち、Y-27632ありおよびなしの5つのコーティングの各々。図6は、Y-27632なしのLN-521、LN-511、およびMatrigelMGについての1時間の実験についての結果を示す。いかなる添加剤もないO3培地におけるヒトES細胞の接着は、この時点でほぼ同じであった。図7は、すべてのコーティングについての1日間の実験についての結果を示す。Y-27632阻害剤を含有するプレートは、コーティングと共にInと表示する。蒔いてから1日後に、幹細胞は、添加剤なしのMatrigelに比べ20倍良好に、添加剤なしのLN-521に接着した。さらに、結果は、添加剤なしのLN-521に対する細胞の接着が、ROCK阻害剤を含むすべてのディッシュ上の細胞の接着と同様であったことを示した。言い換えれば、ROCK阻害剤は、ROCK阻害剤を含有するコーティングと同様の結果を得るために、LN-532コーティングに必要とされない。本発明者らは、ヒトr-ラミニン-521上でヒトES細胞を培養し、1:25~1:30の比で10~12日ごとに単細胞懸濁物へと完全に解離させた後にそれらを継代した。細胞は、少なくとも9回の継代3か月間の間、安定した速い速度で強健に増殖した。さらに、3回の継代1か月間後に、それらは、従来の方法を使用して培養された20回の継代100日間後の幹細胞と同数の細胞倍加を遂げた。これは、時間に対する細胞の数の増加を示す図8に示される。LN-521上の細胞は、Matrigel上のものよりもはるかに迅速な速度で増加した。したがって、新しいr-ラミニン-521hES細胞培養方法は、時間および労力の点から有利であった。いかなる添加剤もなしでO3培地中のヒトr-ラミニン-521上での数回の単細胞懸濁物を継代した後のhES細胞の同一性を確認するために、本発明者らは、多能性のマーカーであるOct4についてのFACS分析を実行した。図9は、r-LN-521上で成長させた細胞についての結果を示し、一方、図10は、Matrigel上で成長させた細胞についての結果を示す。陽性細胞のパーセンテージを括弧内に記載する。R-LN-521は、はるかに高いパーセンテージの多能性細胞を有した。さらに、多能性マーカーであるOct4およびNanogのmRNAの転写物の数を定量化した。図11はこれらの結果を示す。両方のマーカーについて、LN-521上の細胞は、より多数の転写物を示した。両方の方法は、新しい方法が、細胞培養ディッシュコーティング材料としてMatrigelを使用し、小さな凝集塊で細胞を継代する現在の方法と同じまたはそれよりもよい品質のhES細胞をもたらすことを示した。実施例2本実施例2において、多能性hES細胞においても発現される、発現させ、精製した組換えLN-521を、培養したhES細胞およびiPS細胞に対するその効果について研究した。結果は、LN-521が、単独で、多能性hES細胞およびiPS細胞の自己再生を強く支持することを示した。そして、重要なことには、それは、高い希釈度のLN-521上の単細胞懸濁物におけるトリプシン処理幹細胞を蒔いてから後に、多能性幹細胞の生存を可能にする。LN-521の効果は、hES細胞遊走およびPI3K/Akt経路活性化の誘導を通じての、α6β1インテグリンを介したシグナル伝達によって媒介されることが示された。結果は、多能性hES細胞およびiPS細胞の大規模産生のための有効で、さらに自動化された増殖方法ならびに多能性幹細胞の自己再生のための新しい培地剤の開発に適用され得る。ここで記載された新しいhES/hiPS細胞培養方法は、たとえば、線維芽細胞を培養するために使用される標準的な細胞培養方法に密に類似しており、そのため、それは特殊技能を必要としない。それは、1回の細胞分裂あたりに消費する細胞コーティング物質が著しくより少なく、時間効率的であり、したがって、hES/hiPS細胞を培養するための以前の手順と比較して著しい経済的利益をもたらす。以前は純粋な形態で入手可能ではなかったヒト組換えLN-521は、完全長ラミニンβ2cDNAをクローニングし、ヒトラミニンα5、β2、およびγ1鎖によるHEK293細胞のトリプルトランスフェクションを実行することによって産生した。ヒト組換えLN-111およびLN-121は、完全長α1およびβ2鎖のcDNAのクローニングならびにそれぞれヒトα1、β1、およびγ1鎖ならびにα1、β2、およびγ1鎖のcDNAによるHEK293細胞のトリプルトランスフェクション後に、同様に生成した。精製したLN-521、LN-111、およびLN-121タンパク質は、それぞれ、タンパク質染色およびウエスタンブロット解析によって示されたように、純粋なα5、β2、およびγ1鎖、α1、β1、およびγ1鎖、ならびにα1、β2、およびγ1鎖を含有することが示された。方法ヒトES細胞培養物およびヒトiPS細胞培養物HS181およびHS401のヒトES細胞は、37°C、5CO2で、O3培地Rodinら、NatureBiotechnol.、第28巻、611~615頁2010年に記載、pHは7.35に調整した、mTeSR1STEMCELLTechnologies、および化学的に特定されており、異種由来成分不含のTeSR2STEMCELLTechnologies中、LN-521をコーティングした培養ディッシュ上で培養した。最初に、その系統の細胞を、無菌のナイフを使用して注意深く掻いて剥がして、続いてトリプシン処理することによって、ヒトフィーダー細胞層からLN-521コーティング上に移すか、または細胞は、LN-511コーティングから単細胞懸濁物へとトリプシン処理した。ほんの数滴の新鮮な培地を加えたときに、蒔いてから後の第1日を除いて、1時間インキュベーター中であらかじめ温めた新鮮な培地を1日に1回、細胞に提供した。細胞は、10~12日間に1回、常習的に通過させ、37°C、5CO2で5分間Trypsin/EDTAGIBCOInvitrogenCorporation、Paisley、Scotlandに曝露させた。それらは、その後、穏やかにピペッティングして単細胞懸濁物へとばらばらにし、特定されているトリプシン阻害剤GIBCOInvitrogenを加えた。細胞懸濁物は、4分間、25rcfで遠心分離し、上清は、廃棄し、細胞ペレットは、あらかじめ温めたO3培地に再懸濁し、細胞は、その後、40μmのふるいに通過させた。続いて、細胞は、1:25~1:30の分割比で30,000細胞/cm2の濃度で新しいLN-521でコーティングしたディッシュ上に蒔いた。同じ系統の対照細胞は、以前に記載されるようにO3培地において、MatrigelSTEMCELLTechnologiesおよびLN-511上で培養した9。特定された、かつ異種由来成分不含の培養については、TeSR2STEMCELLTechnologies培地および特定されており、いかなる動物由来の構成成分も含まないTrypLE商標SelectGIBCOInvitrogenCorporation、Paisley、Scotland酵素を使用した。細胞は、10~14日間ごとに通過させ、37°C、5CO2で4~5分間TrypLE商標Selectに曝露させた。その後、酵素を注意深く吸引し、あらかじめ温めたTeSR2培地を加えた。その後、細胞は、穏やかにピペッティングして単細胞懸濁物へとばらばらにし、遠心分離し、上清は、廃棄し、細胞ペレットは、あらかじめ温めたTeSR2に再懸濁した。細胞は、その後、40μmのふるいに通過させ、新鮮なLN-521をコーティングしたディッシュ上に蒔いた。組織細胞培養プレートは、すべて30μg/ml5μg/cm2の濃度の、ヒト組換えLN-521などのECMタンパク質の無菌溶液により、4°Cで一晩コーティングした。対照プレートは、STEMCELLTechnologiesの指示に従ってMatrigelによりコーティングした。使用に先立って、ディッシュを1時間、インキュベーター中であらかじめ温め、その後に、あらかじめ温めたO3培地を、ディッシュをさらに洗浄することなく、加えた。新しいディッシュに新鮮なLN-521溶液を適用した後に、残りのLN-521溶液は、少なくとももう1回使用することができた。生存実験における接着、生存、および阻害はすべて、新鮮なコーティング材料を使用して実行した。ヒトiPS細胞のChiPSW系統は、Oct-4/SOX2/NANOG/LIN28リプログラミング遺伝子を用いてレンチウイルスによりlentivirally形質導入されたヒト包皮線維芽細胞HFFに由来した。ChiPSW系統は、様々な継代時点における繰り返しの試験において、正常な男性核型、46,XYを有した。細胞培養および継代実験に先立って、細胞は、多能性マーカーの発現について最初にinvitroで特徴付けた。Oct3/4SC-5279、NanogSC-33759、TRA-1-60SC-21705、およびSSEA4sc-21704に対する抗体を用いる免疫蛍光検査による調査により、細胞が多能性のそれらのマーカーをすべて発現したことが示された。RT-PCR分析により、細胞がウイルス性の導入遺伝子の発現を欠くことを確認した。ChiPSW細胞の多能性は、invitro胚様体形成および免疫蛍光検査による調査およびinvivoSCIDベージュマウスへの皮下注射実験によって確認した。ChiSW系統の細胞は、拍動する心筋細胞にさらに分化することができた。それらは、造血分化を遂げることもできた。本発明のフィーダーなしの培養を始める前に、iPS細胞は、照射ヒト包皮線維芽細胞上で維持し、増殖させた。ノックアウト血清KSR、Invitrogenの補充培池は、8ng/mlの塩基性線維芽細胞成長因子bFGF、RDSystemsを補充して、増殖に使用した。細胞は一日単位で養分を与え、必要とされる場合に、コラゲナーゼIV1mg/ml、Rocheを使用してまたは手作業による解離により毎週継代した。これらの実験に先立って、CutB1.2細胞は、多能性マーカーのOct4/Nanog/Sox2/TRA-1-60/TRA-1-81を発現し、ウイルス性の導入遺伝子の発現を欠くことが示され、細胞の多能性は、invivoおよびinvitroの両方における分化の調査によって確認した。ラミニン-521および他のコーティング材料BioLamina、AB、Stockholmwww.biolamina.comから入手可能なヒト組換えLN-521は、ヒト胎児腎臓細胞HEK293;ATCCCRL-1573において産生され、本質的に以前に記載されるように、完全長ラミニンγ1、β2、およびα5構築物により逐次的にトランスフェクトした。タンパク質産生のために、HEK293細胞は、6日間まで、GlutaMaxIを補充したダルベッコ改変イーグル培地DMEMにおいて培養した。LN-521分子は、抗FLAGマトリックスSigmaを使用してアフィニティー精製し、その後、還元および非還元条件下で3~8および4~15の勾配SDS-PAGEを使用して特徴付けた。タンパク質は、ポリビニリデンジフルオリド膜上の鎖の、SyproRubyBio-Radタンパク質染色および免疫染色を使用して可視化した。タンパク質をさらに特徴付けるために、ラミニンα5、β2、およびγ1鎖に対する抗体を用いるウエスタンブロット解析を実行した。ヒト組換えラミニン-111およびラミニン-121は、LN-521と同様に産生され、ウエスタンおよびSDS-PAGEによって予測分子サイズの正確な鎖を含有することが示された。その他に指定されない限り、対応するマウスラミニン-111Invitrogenは、LN-111として示された。試薬および抗体InSolutionTMLY294002特異的Akt阻害剤、InSolutionTMウォルトマニン特異的PI3K阻害剤、およびInSolutionTM98059特異的MEK1/Erk阻害剤は、Calbiochemから購入した。ホスホAkt4060、全Akt9272、ホスホErk9101、および全Erk9102に対する抗体は、CellSignalingTechnologyから得た。PathScanホスホAkt1サンドイッチELISAキット7160、PathScan全Akt1サンドイッチELISAキット7170、PathScanホスホAkt2サンドイッチELISAキット7048、およびPathScan全Akt2サンドイッチELISAキット7046もCellSignalingTechnologyから購入した。カルネキシンab10286に対する抗体は、Abcamから得た。様々なインテグリンサブユニットに対する機能遮断抗体、マウスアイソタイプ抗体およびα-ジストログリカンは、Milliporeから購入した。αVに対する機能遮断抗体MAB1980およびα6に対する機能遮断抗体MAB1378は、アジ化ナトリウムを有する溶液中で提供されたので、生存実験における阻害の前に、アルファインテグリンサブユニットに対する抗体はすべて、毎回、2時間、O3培地に対して3回透析した。Lutheran受容体およびα-フェトプロテインに対する抗体ならびにラットアイソタイプ対照抗体は、RDSystemsから得た。Oct4、Nanog、SSEA-4、平滑筋アクチン、およびMAP-2に対する抗体は、Milliporeから購入した。免疫蛍光検査免疫蛍光検査による調査のために、ES細胞は、培養し、4パラホルムアルデヒドによって、8ウェルスライドチャンバーBDBiosciencesまたは96ウェルプレートウェルにおいて固定し、0.1Triton-Xによって透過処理し、1時間、0.1Tween-20Sigma-Aldrich、St.Louis、http://www.sigmaaldrich.comを含有するリン酸塩-食塩水緩衝液PBS中10ウシ胎仔血清GIBCOInvitrogenCorporationによってブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションは、室温で1.5時間実行した。二次抗体および4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPI、MolecularProbesとのインキュベーションは、40分間実行した。インキュベーションの間、被検物は、PBS緩衝液中0.1Tween-20により3~5回洗浄した。被検物は、蛍光封入剤Dako、Glostrup、Denmark、http://www.dako.com中に保持し、蛍光顕微鏡Leica、Heerbrugg、Switzerland、http://www.leica.com下で観察した。様々なmRNAのリアルタイムPCRによる定量化全RNAは、製造業者の指示に従って、AbsolutelyRNAMicroprepKitStratagene、LaJollaCA、www.stratagene.comを使用して単離した。cDNAは、製造業者の指示に従って、oligodT12-18プライマーおよびSuperscriptII逆転写酵素GIBCOInvitrogenCorporationを含有する20μl反応混合物中の0.2μgの全RNAを使用して合成した。リアルタイム定量的RT-PCRTaqmanアッセイは、AppliedBiosystems7300Real-TimePCRSystemAppliedBiosystems、FosterCity、CAを使用して実行した。反応はすべて、対象のmRNAについてのプライマーおよびプローブを含有する以前に開発された遺伝子発現アッセイミックスAppliedBiosystemsを使用して4連で行った。各実験についての追加の反応は、RNAインプットを標準化するためのGAPDHについての以前に開発された遺伝子発現アッセイミックスを含んだ。データはすべて、7300SystemSDSSoftwarev1.4により分析した。FACS分析細胞は、トリプシン/EDTAにより培養ディッシュから取り出し、単細胞懸濁物へと解離させ、氷冷FACS緩衝液ハンクス緩衝液中2ウシ胎仔血清、0.1アジ化ナトリウムsodiumazid中に再懸濁させた。SSEA-4に対する一次抗体Millipore、Billerica、MA、http://www.millipore.comからのとのインキュベーションは、氷上で1時間実行した。その後、細胞は、氷冷FACS緩衝液により3回洗浄した。続いて、細胞は、暗所中、30分間、AlexaFluor抗マウス二次抗体GIBCOInvitrogenCorporationの1:400希釈物により、FACS緩衝液中でプローブし、4回洗浄した。対照細胞は、マウス免疫グロブリン、続いて上記に記載される二次抗体と共にインキュベートした。細胞をFACSCaliburFlowCytometerBectonDickinsonで分析した。データは、CellQuestソフトウェアBectonDickinson,San,Jose,CAにより分析した。核型分析細胞系の核型分析は、標準的なQバンド技術を使用して実行した。細胞の試料は、4時間まで、コルセミドKaryoMAX0.1μg/ml;GibcoInvitrogenCorporationにより処理し、その後、トリプシン/EDTA溶液GibcoInvitrogenCorporationにより解離させた。細胞は、遠心分離を介してペレットにし、あらかじめ温めた0.0375MKCl低張溶液中に再懸濁し、10分間インキュベートした。遠心分離の後に、細胞は、固定液3:1メタノール:酢酸中に再懸濁した。分裂中期スプレッドmetaphasespreadは、ガラス製顕微鏡用スライドグラス上で調製し、トリプシンに対する短時間の曝露によってGバンド染色し、4:1Gurr/Leishmann染色Sigma-AldrichCo.により染色した。最低10個の分裂中期スプレッドを分析し、さらに20個を集計した。奇形腫形成奇形腫形成実験は、若い7週齢重症複合免疫不全SCIDマウスの睾丸被膜下におよそ106細胞を移植することによって実行した。各細胞系当たり3匹の動物を使用した。奇形腫成長は、毎週の触診によって観察し、マウスは、移植の8週間後に犠牲にした。奇形腫は、固定し、切片は、ヘマトキシリンおよびエオシンHEによりまたはヘマトキシリン、エオシン、およびPASHE-PASにより染色した。3つの胎児性生殖系列層すべての組織構成成分の存在が、染色した切片から分析されるように実証された。動物実験はすべて、倫理委員会の承認に従って、KarolinskaUniversityHospitalの感染のない動物施設で実行した。胚様体形成LN-521をコーティングした細胞培養ディッシュからのES細胞は、37°C、5CO2で1分間、TrypLE商標Selectに曝露し、培地により2回洗浄し、多くの小片へとばらばらにし、低接着プレート中で懸濁培養した。これに使用した培地は、2mML-グルタミン、20ウシ胎仔血清GIBCOInvitrogenCorporation、0.1mMβ-メルカプトエタノールGIBCOInvitrogenCorporation、および1非必須アミノ酸GIBCOInvitrogenCorporationを補充したノックアウトDMEMGIBCOInvitrogenCorporationとした。懸濁物で1~2週間経った後、胚様体は、ゼラチンをコーティングした組織細胞培養96ウェルプレートSarstedtに移し、1~2週間培養し、その後、固定し、3つの胎児性生殖系列層すべてのマーカー平滑筋アクチン、MAP-2、およびα-フェトプロテインに対する抗体により染色し、免疫蛍光検査について上記に記載されるように分析した。細胞接着アッセイ手短に言えば、96ウェルプレートは、上記に記載されるように細胞外マトリックスタンパク質によってコーティングし、ウシ血清アルブミンを含有するO3培地によってブロッキングした。ES細胞は、細胞外マトリックスでコーティングしたプレート上に50,000細胞/cm2の細胞密度で蒔き、細胞インキュベーター中で1時間接着させた。その後、プレートは、非接着細胞を除去するために培地により3回洗浄し、その後、接着細胞は、5グルタルアルデヒドによって20分間固定し、0.1クリスタルバイオレットによって染色したKeboLab、Spanga、Sweden、http://www.kebolab.se。水による1時間および3回の洗浄後に、クリスタルバイオレットは、10酢酸により抽出し、570nmでの光学濃度を測定することによって定量化した。実験はすべて、4連で実行した。生存アッセイにおける細胞生存および阻害細胞を24時間、細胞インキュベーター中に置いておいた以外は、上記の細胞接着アッセイについて記載されるように、生存アッセイを実行した。生存アッセイにおける阻害については、製造業者によって推奨される濃度の機能遮断抗体またはテキストに示される濃度の経路阻害剤と共に、細胞を、30分間、培地中に保ち、その後、コーティングしたディッシュ上に蒔いた。実験はすべて、4連で実行した。ウエスタンブロッティングおよびELISAHS181細胞は、上記に記載されるように、単細胞懸濁物へとトリプシン処理した。阻害実験については、細胞は、30分間、遮断抗体または経路阻害剤と共にO3培地中に保ち、その後、450Kの細胞は、適切なマトリックスコーティングによりあらかじめコーティングした35mmディッシュ上に蒔いた。他の実験については、同数の細胞を、トリプシン処理後に直接蒔いた。すべての場合において、37°C、5CO2で1時間、細胞を拡散させた。氷冷PBSでの2回の洗浄の後に、細胞を有するプレートは、液体窒素中で急速凍結し、-80°Cで保存した。ウエスタンブロットおよびELISAのための試料を調製するために、プレートは、ゆっくり解凍し、上に100~150μlの溶解緩衝液50mMTris-HCl、pH7.5、150mMNaCl、0.5デオキシコレート、0.5SDS、1TritonX-100、1Igepal、Complete商標Roche、およびPhospho-Stop商標Rocheを乗せて、氷上で保った。その後、細胞は、こすり取り、ピペットで移し、27G3/4針により煎断した。その後、細胞ペレットは、4°Cで15分間、16,100rcfで遠心分離することによって澄明にした。ウエスタンブロットについては、4~12勾配ゲルをSDS電気泳動に使用し、タンパク質はPVDF膜に移した。膜は、製造業者の指示に従って対象の抗体とハイブリダイズさせた。AmershamBiosciencesからの化学発光HRP基質を視覚化に使用した。デンシトメトリー分析については、フィルムは、2,400dpiでスキャンし、ChemiImager5500プログラム1D-MultiLineデンシトメトリーモードによって分析した。ELISAについては、試料は、製造業者の指示に従ってウェルに適用した。invivo画像処理および遊走アッセイ24ウェルプレートは、細胞外マトリックスタンパク質によってコーティングし、ウシ血清アルブミンを含有するO3培地によってブロッキングした。ES細胞は、細胞外マトリックスでコーティングしたプレート上に30,000~40,000細胞/cm2の細胞密度で蒔き、細胞インキュベーター中で30分間接着させた。その後、プレートは、37°C、5CO2に保つのを可能にする環境制御ユニットを装備したハイコンテントイメージングシステムOperettaPerkinElmerの中に移した。作製した2つの動画について、HarmonyソフトウェアPerkinElmerを使用して、蒔いた後24時間の間に、15分間に1回、明視野画像を撮り、エクスポートし、ImageJソフトウェアNIH、USを使用して分析した。遊走アッセイについては、蒔いた後18時間の間に7分ごとに画像を撮った。蒔いた後5~7時間目に得られる画像は、MTrackJプラグインUniversityMedicalCenter、Rotterdam、TheNetherlandsを使用して分析した。各コーティング上の100の付着細胞を、追跡し、現在の位置から以前の位置までの進路の平均距離を計算した。誤差のバーは、平均値の標準誤差、s.e.m.を示すn=100。統計統計的有意性は、不等分散について、スチューデントの両側t検定によって決定した。実施例2の結果についての議論多能性hES細胞は、α1、α5、β1、β2、およびγ1ラミニン鎖を発現する。単様々なコーティング基層に蒔いた細胞懸濁物由来のhES細胞の接着およびクローン性生存を比較するために、LN-511上で単層としてまたはフィーダー層上でクラスターとして成長しているhES細胞を、O3培地中で単細胞懸濁物へとトリプシン処理し、ROCK阻害剤Y-27632の非存在下または存在下において、Matrigel、LN-111、LN-511、LN-521、またはLN-511およびLN-521の混合物でコーティングした細胞培養ディッシュ上に蒔き、24時間後に分析した。細胞は、MatrigelまたはLN-111上で生存しなかったが、それらは、ヒト組換えLN-511およびLN-521ならびに上記2つの混合物上で単細胞として生存した。しかしながら、LN-521上の細胞の生存は、LN-511よりも下記のように数で比較して有意に高かった。ヒト組換えLN-111またはLN-121上に蒔いた細胞は、24時間後に生存せずデータ示さず、これは、ラミニン三量体中のβ2鎖の存在が、そのため、効果を支持するのに十分ではないことを実証する。ROCK阻害剤Y-27632の存在下において、hES細胞は、すべての表面上で生存した。しかしながら、蒔いてから24時間後に、ROCK阻害剤の非存在下または存在下においてLN-521上で成長する細胞の間で細胞形状に関して明確な差異があった。ROCK阻害剤の非存在下において、蒔いてから24時間後に、LN-521上で成長している細胞は、円形であったが、ROCK阻害剤の存在下において成長している細胞は、アクチン細胞骨格の再配列によっておそらく引き起こされた、紡錘体または三日月形様の形状をとっていた。ヒト多能性細胞の長期の自己再生のための細胞コーティング材料としてLN-521を使用することができるかどうかを試験するために、HS181細胞、HS401細胞、H1細胞、ならびにヒトiPSChiPSW細胞およびCutB1.2細胞を、O3培地、mTeSR1培地、またはTeSR2培地中の上記タンパク質上で培養した。O3培地またはTeSR1培地において成長している細胞は、10~14日間ごとに、単細胞浮懸濁物の状態で1:20~1:30の比で通過させた。多能性hES細胞は、小さな凝集塊の状態で通過させた場合に、LN-511またはMatrigel上で成長させた細胞と同様のまたはそれよりも速い、安定した速度で増殖した。したがって、LN-521上での1回の継代は、凝集塊の状態で2回通過させた対照細胞のそれと同数のまたはそれよりも多数の細胞分裂をもたらした。HS181細胞、HS401細胞、およびH1細胞は、O3培地において、それぞれ少なくとも24、5、および15回の継代9、2、および6か月間の間に増殖した。CutB1.2iPS細胞およびChiPSW細胞は、それぞれ、mTeSR1中で5および3回の継代にわたって培養した。興味深いことには、解離させたhES細胞は、TeSR2培地およびTrypLESelect酵素を使用して、完全に特定されかつ異種由来成分不含条件下で、LN-521上で培養することができた。継代後の播種の有効性は、O3培地またはmTeSR1培地中の細胞のそれよりもわずかに低く、解離させた細胞は、通常10~14日間ごとに1:15~1:20比で通過させた。H1細胞およびHS401細胞は、TeSR2において、それぞれ12および4回の継代にわたって5および1.5か月間培養した。hES細胞は、通常、LN-521でコーティングした培養ディッシュの1cm2当たり30,000細胞の単細胞懸濁物で蒔き、この後、個々の細胞は、互いにあらゆる直接的な接触を欠いた。蒔いてから8時間後に、hES細胞は、多能性マーカーのOct4、Nanog、およびSox2を発現する単細胞として観察することができた。蒔いてから24時間後に、細胞は、ウェルの大部分を覆う単層の大きな島へと最終的に組み合わせられる、小さな単層コロニーを形成した。LN-521上で成長させた細胞は、多能性マーカーのOct4、Nanog、およびSSEA4の安定した発現レベルを示し、これは、Matrigel上に蒔き、小さな凝集塊として通過させた細胞におけるそれと同様であった。LN-521培養物およびMatrigel培養物における自発的な分化のレベルを比較するために、Matrigel培養物およびLN-521培養物において発現された分化マーカーのPAX6、SOX17、およびSOX7についてのmRNAの量を、1回10日間および10回の継代4か月間後に比較した。定量的RT-PCRは、継代数に非依存的に、LN-521培養物における分化の3つのマーカーすべてについて、同様のまたはより少ないレベルの発現を明らかにした。核型は、O3培地において、LN-521上で、それぞれ12および10回の継代後の、hES細胞系であるHS181およびH1について、ならびにTeSR2培地において7回の継代後のH1について正常であることを確認した。O3培地において、LN-521上で、それぞれ13および12回の継代にわたって培養したHS181およびH1細胞、ならびにTeSR2においてLN-521上で7回の継代にわたって培養したH1細胞の注射後にSCIDマウスにおいて形成された奇形腫の組織学的検査は、ヒト胚の3つの胚系列をすべて含有する組織の発生を明らかにした。invitroにおける分化も明らかにした。3つの場合すべてにおける細胞が、中胚葉平滑筋アクチン、外胚葉MAP-2、および内胚葉α-フェトプロテインのマーカーを発現する胚様体を形成する完全性を保持した。コーティング基層の有効性を定量化するために、Matrigel、LN-111、LN-511、LN-521、ならびにLN-511およびLN-521の同じ割合の混合物上の解離hES細胞の1時間後の接着および24時間後の生存について研究した。興味深いことには、1時間後に、ほぼ同じ75~80の細胞が、すべてのコーティングに接着したが、細胞の拡散は、MatrigelまたはLN-111上よりもLN-521およびLN-511上で明らかによかった示さず。24時間後、細胞が、MatrigelまたはLN-111上でほとんど生存しておらず、またLN-511上では極めて僅か生存した。対照的に、LN-521上のhES細胞の生存は、Matrigelのおよそ20倍高く、LN-511の3倍高かった。LN-521およびROCK阻害剤Y-27632の効果を定性的に比較するために、本発明者らは、10μMのY-27632を含有する培地において同じ播種密度1cm2当たり40,000細胞で同じ単細胞懸濁物由来の細胞を蒔き、様々なコーティング上でのそれらの生存を研究した。LN-521上の未処理細胞およびMatrigel上のY-27632処理細胞は、蒔いてから24時間後に同様の生存率を示した。興味深いことには、さらに、Y-27632処理ヒトES細胞は、Matrigel上でよりもLN-521上でよりよく生存した。外因性bFGFをO3培地から除去した場合、細胞は、なお、Matrigel上でよりもLN-521上で20倍高い生存を示した。さらに、hES細胞は、TeSR1剤の成長因子のすべてbFGF、LiCl、γ-アミノ酪酸GABA、ピペコリン酸、およびTGFβ16を欠く培地においてでさえ、蒔いてから24時間後にLN-521上で生存し、このことは、生存メカニズムが、それらの因子によって誘導されるシグナル伝達に非依存性であることを示唆する。形質膜上の、LN-521の潜在的受容体に対する機能遮断抗体を使用する、細胞生存の阻害についてのアッセイは、インテグリンα6に対する抗体および程度がわずかにより低いが、β1に対する抗体が、LN-521上でのヒトES細胞の生存を阻害することを示した。他の試験したインテグリンサブユニットならびにLutheran受容体およびα-ジストログリカンに対する機能遮断抗体は、LN-521上のヒトES細胞生存に対する効果を、たとえあったとしてもほとんど示さなかった。最近、ROCK阻害剤およびブレビスタチンが、ミオシン軽鎖MLCのリン酸化によって媒介されるアクチン-ミオシン収縮性の抑止により作用することが示された。LN-521が同様の活性を有するかどうかを試験するために、リン酸化MLCのレベルを、蒔いてから1時間および6時間後の、Matrigel、LN-111、LN-511、およびLN-521上の解離細胞間で比較した図12および図13。興味深いことには、ウエスタンブロットは、MLCのリン酸化が、MatrigelおよびLN-111上の細胞におけるそれよりもLN-511およびLN-521上の細胞においてさらに高度いことを示した。アクチン-ミオシン再配列が、収縮だけでなく細胞の運動性にとっても不可欠であるので、本発明者らは、細胞遊走が、LN-521とそのインテグリン受容体α6β1との間の相互作用によって引き起こされ得ると推測した。MatrigelおよびLN-521上の細胞のinvivoにおける画像処理は、細胞が、後者においてはるかに迅速に遊走し、小さな、動きの速いコロニーへの凝集によって生存したことを明らかにした。4つのコーティング上のhES細胞の遊走も、細胞がなおすべての場合において付着しているときの、蒔いてから5および7時間目の間でも比較した図14。LN-521上のhES細胞の運動性は、他のコーティング上の細胞のそれよりも高く、それらの上で生存する能力と相関した。インテグリンβ1に対する機能遮断抗体による処理は、LN-521上の細胞の運動性図15および接着データ示さずを有意に低下させた。広範囲なデータにより、インテグリンによるMEK1/ErkまたはPI3キナーゼ/Akt経路の活性化が、アノイキスを遮断することができることを示した。それぞれAktおよびMEK1の特異的阻害剤であるLY294002およびPD98059の効果は、LN-521上のhES細胞生存におけるこれらの経路の潜在的な役割を調査するために検査した。LY294002によるAkt活性化の遮断は、脱離およびhES細胞死を促進することが分かり、LN-521上に蒔いてから24時間後に生存した細胞はなかった図16。対照的に、PD98059による処理は、生存にそれほど激しく影響を及ぼさなかった。他のPI3K/Akt特異的阻害剤、ウォルトマニンにより処理したhES細胞もLN-521上に蒔いてから24時間後に生存せず、このことから、PI3K/Aktの活性化が、LN-521上の細胞生存に必要であることが確認された。bFGFがMEK1/Erk経路の有力な活性化因子であることが公知であり、その影響は、PD98059によって完全に阻害することはできないので、本発明者らは、外因性bFGFなしのO3培地において、同様の実験を実行し、同様の結果を得た図17。LY294002およびPD98059処理の有効性は、LN-521上に蒔いてから1時間後に収集した処理細胞および対照細胞のウエスタンブロット分析によって確認した図18および図19。ホスホ-Aktに対する抗体による、MatrigelおよびLN-521上で成長する細胞の抽出物のウエスタンブロット解析は、両方の場合においてPI3K/Akt経路が活性であったことを示したデータ示さず。異なるコーティング上の細胞におけるAkt活性化のレベルを決定するために、ELISAを、細胞がまだ互いに直接接触していないときに、Matrigel、LN-111、LN-511、およびLN-521上に蒔いてから1時間後に収集した細胞溶解産物で実行した図20および図21。異なるコーティング上の細胞におけるAkt2リン酸化のレベルは、それらのコーティング上での生存性と相関した。α6およびβ1インテグリンが、それぞれ、アルファサブユニットおよびベータサブユニットの中で、ヒトES細胞において最も豊富に発現されるインテグリンアイソフォームであることが実証された。インテグリンα6β1は、様々なラミニンに対して広範囲の特異性を示すが、LN-521またはLN-511に対する結合親和性は、LN-111に対する結合親和性よりも高い。最近、β2ラミニンがβ1ラミニンよりもインテグリンに対するより高い親和性を有することが確立された。インテグリンに対して最も高い親和性を有するので、LN-521は、遊走に対して最良の足場をもたらすことができ、α6β1インテグリンを介して最大量のシグナルを伝達することができ、その結果、解離した多能性hES細胞の最良の生存性をもたらすことができるが、たとえばLN-511も程度がより低いが、最良の生存性をもたらすことができる。この研究の結果は、一般に、多能性ヒト幹細胞の培養および増殖を促進し得、さらに、臨床的適用を目的とする細胞を含むそのような細胞の自動化された増殖を可能にする。LN-521上の解離したhES細胞の生存は、遊走に依存性であるようであり、そのため、細胞は、超低密度での播種後に生存することができない。ここで記載される新しいhES細胞培養方法は、ROCK阻害剤またはブレビスタチン処理がするように細胞骨格を損傷しない、天然に存在するLN-521接着タンパク質のみを利用する。したがって、LN-521は、おそらく、細胞表面上の正確なインテグリンプロファイルによってのみ細胞の生存に有利に働く。これらの結果は、1cm2当たり20,000~30,000細胞の比較的低密度でLN-521上に蒔いたhES細胞が、生存することができ、他のhES培養物系における増殖と少なくとも同じように効率的に増殖することができることも示した。新しい方法は、標準的な細胞培養手順、たとえば線維芽細胞の培養に密に類似しており、そのため、LN-521上のhES細胞培養は、特別に訓練された人材を必要としない。hES細胞を培養することが技術的な難題であったので、特別に訓練された人材は、以前の主要な問題であった。ヒト多能性幹細胞の自己再生のための、広く使用されるTeSR1剤は、Matrigelとの使用のために最初に開発され、それは、ほとんどMEK1/Erk経路を標的にする、多能性hES細胞に対し有益な効果を有するとは広くは考えられていない、高用量のbFGFを含有する。本発明の結果は、コーティング材料としてのLN-521の利点を利用する、詳細には、ヒトES細胞の自己再生にとって重要である経路を標的にする、新しい培地剤の開発につながることができる。要約すれば、本発明の研究は、多能性hESによって通常分泌されるLN-521が、LN-511と同様に、培養におけるヒト多能性幹細胞の自己再生を、単独のコーティング材料として支持することができることを実証した。両方のラミニンは、invitroにおいて均質の単層として細胞の成長を促進した。しかしながら、上記2つのラミニンの間の重要な差異は、Matrigelまたはフィーダー細胞上で成長させたhES/iPS細胞の増殖のために現在必要とされるような、細胞クラスターの手作業による分割とは対照的に、hES/hiPS細胞を単細胞懸濁物へとトリプシン処理し、蒔いて、LN-521上で単細胞から有効に増殖させることができたということである。この研究の結果は、多能性ヒト幹細胞の培養を促進し、そのような細胞の自動化された増殖を促進し得る。実施例3ヒト胚性幹細胞を、2つの異なる細胞培養培地においてラミニン-521基質上で培養した。2つの細胞培養培地は、bFGFの量、3.9ng/mlおよび100ng/mlが異なった。図22は、5回の継代40日間後にラミニン-521基質と共に、3.9ng/mlのbFGFを含むO3培地中で培養したHS181hES細胞の成長曲線を黒い実線で示す。O3培地は、唯一の動物由来構成成分としてウシ血清アルブミンを有する、市販の化学的に特定されているmTeSR1培地の変形であった。ラミニン-521基質と共に、100ng/mlのbFGFを含むO3培地中で培養したHS181hES細胞の成長曲線は、破線で示す。細胞は、継代のために単細胞懸濁物へと解離させた。ここで見出されるように、より低量のbFGFについての成長曲線は、より高量のbFGFと同様であったまたはそれよりも良好であった。図23は、リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR分析を使用して得られた、両方の培地についての、5回の継代40日間後の多能性マーカーであるOct4およびNanogについてのmRNAの転写物の相対量を示す。さらに、同様の量が、両方の細胞培養培地において得られ、このことから、より低量のbFGFにおける幹細胞が多能性を維持したことが示された。したがって、より低量のbFGFは、使用することができ、そして、なお、特にラミニン-521基質と組み合わせて、好結果を得ることができる。実施例4実施例1および2において、解離した幹細胞は、LN-521上での活性な運動性および小さな、有効に成長し、遊走する単層の、島へと会合することを介してほとんど生存した。非常に低いクローニング密度で蒔いた細胞は、プログラム細胞死の特殊な形態であるアノイキスにより死滅した。通常、細胞外マトリックス分子、たとえばラミニンからのインテグリン関連性のシグナル伝達およびカドヘリン関連性の細胞間シグナル伝達は、アノイキスを予防することができる。ヒトES細胞表面上の最も豊富なカドヘリンアイソフォームは、上皮カドヘリンE-カドヘリンである。実施例3における実験は、LN-521およびE-カドヘリンの組み合わせが、アノイキスからヒトES細胞を保護することができ、細胞のクローン性生存を可能にすることができるかどうかを調べるために実行した。hES細胞は、1cm2当たり250細胞の密度で様々なコーティング上のmTeSR1培地に蒔き、アルカリホスファターゼ染色キットを使用して、培養の5日後にモニターした。ラミニン-521のみもE-カドヘリンのみも、個々に区別されたhES細胞の効率的なクローン性生存を可能にしなかった。次に、ラミニン-521およびE-カドヘリンの組み合わせは、組み合わせにより細胞のクローン性生存を保持することができるかどうかを決定するために試験した。固定量のラミニン-521を、滴定したE-カドヘリンと組み合わせて、細胞培養ディッシュのコーティングに使用した。細胞のクローン性生存は、約1:10w/w~約1:5w/wを含む、ラミニン-521に対するE-カドヘリンの様々な比で達成された。mTeSR1培地に対する様々な改変の効果を試験するために追加の試験を実行した。約1:10w/wの比の、ラミニン-521に対するE-カドヘリンの混合物を、プレートをコーティングするために使用した。予想外に、アルブミン濃度における2×の増加が、ラミニン-521/E-カドヘリンマトリックス上でのhES細胞のクローン性生存を著しく改善したことが発見された。これらの条件下での、個々に区別されたhES細胞生存の率は、10~15であり、mTeSR1培地およびアルブミンをさらに有するmTeSR1培地の両方において、Matrigelのみの上、ラミニン-521のみの上、またはE-カドヘリンのみの上の細胞のそれよりも少なくとも1桁高かった。細胞の経時的写真法により、ラミニン-521/E-カドヘリンコーティングが、様々な細胞の凝集を介してではなく単細胞の増殖を介して細胞生存を促進したことを確認した。ラミニン-521/E-カドヘリンは、同様に、組換えヒト血清アルブミンrHSAを追加した、十分に化学的に特定され、かつ異種由来成分不含TeSR2培地において細胞のクローン性生存を保持した。追加の試験で、hES細胞系が誘導された。24ウェル組織細胞培養ディッシュプレートを、ダルベッコリン酸塩緩衝食塩水により2回洗浄した。次に、ディッシュプレートは、ラミニン-521/E-カドヘリンマトリックスを生成するための、48μLの100μg/mlラミニン-521BioLaminaAB、Stockholm、6μLの82μg/mlE-カドヘリンRDSystems、ならびにカルシウムおよびマグネシウムを有する300μLのDPBSGIBCOを含有する無菌溶液により37°Cで2時間コーティングした。hES細胞系を誘導するために使用した寄贈の胚は、両者のパートナーの同意および倫理の承認が得られた後に、公認のインビトロ受精クリニックから得た。不妊治療に使用することができない新鮮なまたは冷凍の胚のみを誘導手順に使用した。1つまたは2つの細胞は、この目的のために設計されたレーザー装置により透明帯に小さな穴を作製した後にマイクロピペットを使用して8細胞段階の胚から単離した。この手順は、着床前遺伝子診断PGDにおいて臨床的使用するために公認されている。細胞は、rHSAをさらに有するTeSR2培地中のラミニン-521/E-カドヘリンマトリックス上に配置した。細胞は、付着に成功し、増殖し始めた。親の胚を、胚盤胞段階まで成長させ、凍結した。胚の培養は、37°Cおよび5O2/10CO2で、オイル下の液滴中の異種由来成分不含標準化インビトロ受精培養培地を使用して実行した。透明帯の除去後に、5つのヒト胚盤胞の内部細胞塊を、機械的に単離し、4ウェル培養プレートNunc中のラミニン-521/E-カドヘリンマトリックス上に蒔いた。培養の最初の48時間後に、培養培地は、一日単位で交換した。10~14日後に、増殖物を機械的に単離し、ラミニン-521/E-カドヘリンマトリックス上に再播種した。機械的な継代を、続く2~3回の継代にわたって使用し、その後、コロニーを、TrypLESelectGIBCOを使用して継代した。ウシアルブミンをさらに含むmTeSR1培地と共に、上記に記載されるラミニン-521/E-カドヘリンマトリックスを使用すると、3つの新しいhES細胞系が、6つの培養胚盤胞から誘導された。蒔いてから4日後に、内部細胞塊は、幹細胞様の増殖物を生じた。図24は、ラミニン-521/E-カドヘリンマトリックス上での新しいヒト胚性幹HS841細胞系の早期の誘導を示す。内部細胞塊の機械的な単離およびラミニン-521/E-カドヘリンマトリックス上に蒔いてから4日後に、1日に6つの胚盤胞の内部細胞塊から成長する、形態学的に典型的なヒト胚性幹細胞を示す。予想外に、細胞培養系および方法は、6つの胚のうち3つの胚50において安定したhES細胞系を生じ、誘導率は、標準的な方法のそれよりも高かった。ラミニン-521/E-カドヘリンマトリックス、およびrHSAをさらに有する、十分に化学的に特定されかつ異種由来成分不含環境を有するTeSR2培地の使用は、新しいhES細胞系の誘導において同様の結果をもたらした。上記に開示されるものの変形物ならびに他の特徴および機能またはその代替物は、他の多くの様々な系または適用に組み合わせられてもよいことが十分に理解される。様々な現在予知されていないまたは予期されていない代替物、改変、変更、または改善は、続いて当業者によって成されてもよく、これらも以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。"