ヒトKDRに結合する実質的に純粋な単一ドメインポリペプチドであって、以下を含む構造構成を有する約80~約150アミノ酸を含み:a少なくとも2つのβシートの間に分布する少なくとも5~7個のβストランドまたはβ様ストランド;およびbβストランドまたはβ様ストランドである2つのストランドを結合する、KDRへの結合に関与する少なくとも1つのループ部分;ここで、1x106M未満の解離定数KDでヒトKDRタンパク質の細胞外ドメインに結合する、単一ドメインポリペプチド。免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項1記載の単一ドメインポリペプチド。免疫グロブリン可変ドメインがヒトVLドメイン、ヒトVHドメイン、およびラクダVHHドメインからなる群より選択される、請求項2記載の単一ドメインポリペプチド。各ループ部分が2つのβストランドを結合する、KDRへの結合に関与する3つのループ部分を含む、請求項2記載の単一ドメインポリペプチド。免疫グロブリン様ドメインを含む、請求項1記載の単一ドメインポリペプチド。免疫グロブリン様ドメインがフィブロネクチンタイプIIIFn3ドメインである、請求項5記載の単一ドメインポリペプチド。Fn3ドメインがN末端からC末端の順に以下を含む、請求項1記載の単一ドメインポリペプチド:aβストランドまたはβ様ストランド、A;bループ、AB;cβストランド、B;dループ、BC;eβストランドC;fループCD;gβストランドD;hループDE;iβストランドF;jループFG;およびkβストランドまたはβ様ストランド、G。ループFGがKDR結合に関与する、請求項7記載の単一ドメインポリペプチド。ループBC、DE、およびFGがKDR結合に関与する、請求項7記載の単一ドメインポリペプチド。各βストランドが本質的にSEQIDNO5の対応するβストランドの配列と少なくとも80同一であるアミノ酸配列からなる、請求項9記載の単一ドメインポリペプチド。ループAB、CD、およびEFのそれぞれが本質的にSEQIDNO5の対応するループの配列と少なくとも80同一であるアミノ酸配列からなる、請求項10記載の単一ドメインポリペプチド。SEQIDNO5の配列と少なくとも60同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単一ドメインポリペプチド。各ループ部分がβストランドまたはβ様ストランドである2つのストランドを結合する、KDRへの結合に関与する3つのループ部分を含む、請求項5記載の単一ドメインポリペプチド。KDR結合に関与するループがSEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、およびSEQIDNO4からなる群より選択される配列を有する、請求項1~13のいずれか一項記載の単一ドメインポリペプチド。哺乳動物におけるポリペプチドの排除速度を未修飾ポリペプチドの13未満に減少させる部分に結合された、請求項1~13のいずれか一項記載の単一ドメインポリペプチド。排除速度を減少させる部分がポリエチレングリコール部分である、請求項15記載の単一ドメインポリペプチド。ポリエチレングリコール部分が2~100kDaの分子量を有する、請求項16記載の単一ドメインポリペプチド。ポリエチレングリコール部分が単一ドメインポリペプチドのチオール部分またはアミン部分に共有結合されている、請求項16記載の単一ドメインポリペプチド。標識部分に結合されている、請求項1記載の単一ドメインポリペプチド。1x107M未満の解離定数KDでヒトKDRタンパク質の細胞外ドメインに結合し、KDR媒介性VEGF活性を阻害する、請求項1~13のいずれか一項記載の単一ドメインポリペプチド。VEGFAのVEGF165アイソフォームと競合的にKDRに結合する、請求項1~13のいずれか一項記載の単一ドメインポリペプチド。VEGFAおよびVEGFDと競合的にKDRに結合する、請求項1~13のいずれか一項記載の単一ドメインポリペプチド。1x106M未満のKDでマウスFlk1の細胞外ドメインとも結合する、請求項1~13のいずれか一項記載の単一ドメインポリペプチド。SEQIDNO192のアミノ酸配列を含むポリペプチド。SEQIDNO193のアミノ酸配列を含む、請求項24記載のポリペプチド。SEQIDNO194のアミノ酸配列を含む、請求項24記載のポリペプチド。ポリエチレングリコール部分が93位のシステイン残基に共有結合されている、請求項26記載のポリペプチド。ポリエチレングリコール部分が約10kDa~約60kDaの分子量を有する、請求項27記載のポリペプチド。KDRに結合し、KDRへの結合においてVEGFAと競合する、SEQIDNO1~4のいずれかの配列と少なくとも85同一であるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なポリペプチド。SEQIDNO6~183、186~197、および199のいずれかの配列と少なくとも85同一であるアミノ酸配列を含む、請求項29記載の実質的に純粋なポリペプチド。SEQIDNO6~183、186~197、および199のいずれかの配列を含む、請求項30記載のポリペプチド。VEGFの生物活性を阻害する、請求項29記載のポリペプチド。50nM以下のKDでKDRと結合する、請求項29記載のポリペプチド。1x107M未満の解離定数KDでヒトKDRタンパク質の細胞外ドメインに結合し、KDR媒介性VEGF活性を阻害する、請求項29記載のポリペプチド。請求項1~13および24~34のいずれか一項記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む治療製剤。細胞を請求項20記載のポリペプチドと、VEGF生物活性を阻害するのに十分な量でおよび十分な時間接触させる段階を含む、VEGF生物活性を阻害する方法。VEGFの生物活性を阻害する請求項20記載のポリペプチドの有効量を対象に投与する段階を含む、VEGFの阻害に応答する病態を有する対象を治療する方法。病態が不適切な血管新生によって特徴づけられる、請求項37記載の方法。病態が過剰増殖性病態である、請求項38記載の方法。病態が、自己免疫疾患、炎症性疾患、網膜症、および癌からなる群より選択される、請求項38記載の方法。以下の段階を含む、試料中のVEGFR2を検出する方法:aポリペプチドVEGFR2複合体が形成され得る条件下で、試料を請求項1~13および24~34のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させる段階;およびb該複合体を検出し、それによって該試料中の該VEGFR2を検出する段階。検出がX線検査、免疫学的アッセイ、蛍光検出、質量分析、または表面プラズモン共鳴からなる群より選択される技法を用いて行われる、請求項41記載の方法。試料が生物試料である、請求項41記載の方法。生物試料がヒトから採取された試料であり、VEGFR2がKDRである、請求項41記載の方法。ポリペプチドが標識部分で検出可能に標識されている、請求項41記載の方法。標識部分が放射性部分、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、およびハプテン部分からなる群より選択される、請求項45記載の方法。ポリペプチドが固体支持体上に固定化されている、請求項41記載の方法。改善された薬物動態特性を有する標的結合10Fn3ポリペプチドであって、以下を含み:a該10Fn3ポリペプチドのドメインの少なくとも1つのループが標的結合に関与する、約80~約150アミノ酸を有する10Fn3ドメイン;およびb共有結合されたポリエチレングリコールPEG部分;ここで、100nM未満のKDで標的と結合し、哺乳動物において30mLhrkg未満の排除速度を有する、Fn3ポリペプチド。PEG部分がチオール基またはアミン基に結合されている、請求項48記載の10Fn3ポリペプチド。PEG部分が部位特異的PEG化によってFn3ポリペプチドに結合されている、請求項48記載の10Fn3ポリペプチド。PEG部分がCys残基に結合されている、請求項50記載の10Fn3ポリペプチド。PEG部分が以下からなる群より選択される10Fn3ポリペプチド上の位置で結合されている、請求項48記載の10Fn3ポリペプチド:aN末端;bN末端と最もN末端側のβストランドまたはβ様ストランドの間;c標的結合部位と反対側のポリペプチド面上に位置するループ;dC末端と最もC末端側のβストランドまたはβ様ストランドの間;およびeC末端。PEG部分が約2kDa~約100kDaの分子量を有する、請求項48記載の10Fn3ポリペプチド。SEQIDNO5と少なくとも60同一であるアミノ酸配列を含む、請求項48記載の10Fn3ポリペプチド。静脈内投与と比較して放出遅延が達成されるように患者に10Fn3ポリペプチドを投与する方法であって、10Fn3ポリペプチドを皮下投与し、それによって静脈内投与と比較して血流への放出遅延が達成される段階を含む方法。10Fn3ポリペプチドの皮下投与により、同等の投与量を静脈内投与することによって達成される最大血清濃度の半分未満である10Fn3ポリペプチドの最大血清濃度が達成される、請求項55記載の方法。10Fn3ポリペプチドが10Fn3ポリペプチドの血中半減期を延長させる部分に結合されている、請求項55記載の方法。部分がポリエチレングリコール部分である、請求項57記載の方法。10Fn3ポリペプチドがSEQIDNO5と少なくとも60同一であるアミノ酸配列を含む、請求項55記載の方法。予め選択されたヒト標的タンパク質および非ヒト種に由来するその相同体と結合する実質的に純粋な単一ドメインポリペプチドであって、以下を含む構造構成を有する約80~約150アミノ酸を含み:a少なくとも2つのβシートの間に分布する少なくとも5~7個のβストランドまたはβ様ストランド;およびbβストランドまたはβ様ストランドである2つのストランドを結合する、予め選択されたヒト標的タンパク質およびその相同体への結合に関与する少なくとも1つのループ部分;ここで、5x108M未満の解離定数KDで、予め選択されたヒト標的タンパク質、および予め選択されたヒト標的タンパク質と少なくとも100アミノ酸の配列にわたって少なくとも80同一であるその相同体と結合する単一ドメインポリペプチド。免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項60記載の単一ドメインポリペプチド。免疫グロブリン可変ドメインがヒトVLドメイン、ヒトVHドメイン、およびラクダVHHドメインからなる群より選択される、請求項61記載の単一ドメインポリペプチド。各ループ部分がβストランドまたはβ様ストランドであるストランドを結合する、予め選択されたヒト標的タンパク質およびその相同体への結合に関与する3つのループ部分を含む、請求項61記載の単一ドメインポリペプチド。免疫グロブリン様ドメインを含む、請求項60記載の単一ドメインポリペプチド。免疫グロブリン様ドメインがフィブロネクチンタイプIIIFn3ドメインである、請求項64記載の単一ドメインポリペプチド。Fn3ドメインがN末端からC末端の順に以下を含む、請求項65記載の単一ドメインポリペプチド:aβストランドまたはβ様ストランド、A;bループ、AB;cβストランド、B;dループ、BC;eβストランドC;fループCD;gβストランドD;hループDE;iβストランドF;jループFG;およびkβストランドまたはβ様ストランド、G。ループFGが標的タンパク質結合に関与する、請求項66記載の単一ドメインポリペプチド。ループBC、DE、およびFGが標的タンパク質結合に関与する、請求項66記載の単一ドメインポリペプチド。各βストランドまたはβ様ストランドが本質的にSEQIDNO5の対応するβストランドの配列と少なくとも80同一であるアミノ酸配列からなる、請求項66記載の単一ドメインポリペプチド。請求項1記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。SEQIDNO6~183、186~197、199、および241~310のいずれかからなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項70記載の核酸。ストリンジェントな条件においてSEQIDNO184の核酸配列とハイブリダイズし、ヒトKDRと1x106M未満のKDで結合するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸。SEQIDNO184およびSEQIDNO185からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項72記載の核酸。プロモーターと機能的に連結された請求項71記載の核酸を含む発現ベクター。請求項72記載の核酸を含む細胞。請求項1記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸を発現させる段階を含む、KDRと結合するポリペプチドを生成する方法。核酸が、SEQIDNO6~183、186~197、199、および241~310のいずれかからなる群より選択されるポリペプチドをコードする配列を含む、請求項76記載の方法。核酸が、ストリンジェントな条件においてSEQIDNO184の核酸配列とハイブリダイズする配列を含む、請求項76記載の方法。核酸が細胞内で発現される、請求項76記載の方法。核酸が無細胞系で発現される、請求項76記載の方法。発明の詳細な説明1概要本明細書はとりわけ、VEGFR2受容体に結合する新規な単一ドメインポリペプチドの同定および生成について記載する。ヒトではKDRおよびマウスではFLK1とも称されるVEGFR2は、VEGFシグナル伝達の血管新生促進効果の主要なメディエーターである。VEGFR2にはVEGFA、VEGFC、およびVEGFDが結合し、VEGFR2はこれらによって活性化される。血管内皮細胞では、VEGFR2の活性化によって細胞の増殖および遊走が促進され、インビボでは、VEGFR2の活性化によって血管新生が誘発され、また脈管構造の透過性が増加する。血管新生の増大は腫瘍増殖および様々な網膜症の重要な特徴として確立しており、脈管構造の透過性の増加は多くの炎症反応における重要な事象である。本開示は、VEGFR2に結合する何百もの単一ドメインポリペプチドを提供するが、その多くはインビトロおよびまたはインビボVEGFアンタゴニスト活性を示す。VEGFアンタゴニスト活性を有する単一ドメインポリペプチドは、多くの治療用途において有用であると考えられる。抗KDR抗体は、癌および癌に起因する合併症から増殖性網膜症、炎症性疾患、および線維症にわたる疾患および病態に対して、インビボ有用性を有するとして確立されている。本明細書に提示するインビボおよびインビトロデータによれば、単一ドメインポリペプチドは同じ疾患範囲の治療において有用であると考えられる。治療用途に加えて、VEGFR2結合単一ドメインポリペプチドは、VEGFR2を検出することが望ましい任意の状況において使用することができる。例えば、造血系統の特に有用な細胞を含む多くの幹細胞はVEGFR2を発現する。KDR結合ポリペプチドを特に標識形式で使用して、幹細胞を検出することおよび細胞選別を容易にすることができる。インビボでは、標識VEGFR2結合ポリペプチドを用いて、VEGFR2が発現されている組織を画像化することができる。VEGFR2発現の上昇は、特に高レベルの血管新生活性または炎症活性を表している組織に特有である。組織試料の組織学的解析もまた、VEGFR2の検出から恩恵を受け得る。例えば、抗VEGFR2または抗VEGF治療の有効可能性を評価するために、腫瘍生検試料においてVEGFR2発現を検出することが望ましい場合がある。興味深いことに、本明細書に開示するVEGFR2結合タンパク質の多くは、ナノモル濃度の解離定数でVEGFR2に結合するにもかかわらず、VEGFR2媒介性生物学的事象に有意な効果を及ぼし得ない。したがってそのような結合タンパク質は、VEGFR2媒介性事象を有意に撹乱することなくVEGFR2を発現する細胞を選択的に標識することが望ましい場合が多い、インビボ可視化法または細胞標識法において有用であり得る。本開示は、VEGFR2への結合に重要である新規単一ドメインポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定するための、核酸タンパク質融合物RNAタンパク質およびDNAタンパク質融合物を利用する、PROfusion商標と称されるインビトロディスプレイ技術の使用について記載する。核酸タンパク質融合技術とは、タンパク質をそのコード遺伝情報と共有結合させるディスプレイ技術である。PROfuion商標技術を用いて、ヒトフィブロネクチンタイプ3ドメイン10Fn3に基づく骨格を使用して構築された、または抗体軽鎖の可変ドメインから構築された単一ドメインポリペプチドをコードする核酸の集合体をスクリーニングした。発現されるポリペプチドは骨格タンパク質のライブラリーと称されるが、これを高親和性でVEGFR2と結合し得るポリペプチドに関してスクリーニングした。本発明者らは、骨格タンパク質のこのライブラリーから、VEGFR2に結合し、場合によってはVEGF生物活性を阻害する新規な単一ドメインポリペプチドを単離した。さらに、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様骨格内に位置する多くの独立してランダム化したループが、VEGFR2結合に関与する共通配列の関連セットに収束する傾向があることが見出された。したがって、これらの共通配列を有するポリペプチドは、これらが同定されたタンパク質状況から分離された場合でさえも、VEGFR2結合剤として有用であることが予想される。例えば、SEQIDNO1~4を参照されたい。そのようなポリペプチドは、独立した小ペプチドVEGFR2結合剤として使用し得り、または他のタンパク質、特に免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様折りたたみを共有するタンパク質内に位置し得る。上記したように、本開示は、VEGFR2への高親和性結合、VEGFA、VEGFC、またはVEGFDの1つまたは複数に関するアンタゴニスト作用、および薬物動態の改善などの特定の所望の特性を有する単一ドメインポリペプチドが、有効な抗癌剤として使用され得ることを実証する。抗癌剤としてのそのようなポリペプチドの有効性は、癌における血管新生の役割に関連していることが予想されるが、本発明者らは任意の特定の機構に縛られることを望まない。形式上、本単一ドメインポリペプチドが、血管新生過程とは無関係の理由で癌に対して有効であるという可能性もある。本発明者らの知る限り、本開示は、インビボでの治療効果を達成するためにFn3に基づくポリペプチドを使用する、初めて成功した試みである。インビボ有効性を達成するためになされた改善および発見の多くは、Fn3に基づく他のポリペプチドにも広く適用できると考えられる。すなわち、Fn3に基づくポリペプチドのリガンド結合特性は一般に、溶媒接近ループ領域内に位置する比較的少数のアミノ酸によって決定されるが、Fn3に基づくポリペプチドの薬物動態特性などの他の特性は、リガンド結合に直接関与せず、また標的タンパク質にかかわらずタンパク質間で保存されているタンパク質の大部分によって決定される傾向がある。これは、CDR領域と称される少数のループが抗原結合を媒介し、インビボ抗体挙動の他の特性は主として保存されたフレームワーク領域および定常ドメインによって決定される抗体にも当てはまる。阻害するとは、本明細書においては以下のいずれかに関して使用される場合が多い、現象の測定可能な減少を意味する:ポリペプチド処理していない対照試料と比較した、VEGFとVEGFRとの相互作用、VEGFもしくはVEGFR媒介性血管新生、血管新生、血管新生の症状、VEGFR含有細胞の生存度、VEGF依存性BaF3細胞の生存度、またはVEGFもしくはVEGFR媒介性細胞増殖。活性または相互作用の減少が少なくとも10、好ましくは20、30、40、または50、より好ましくは60、70、80、90、またはそれ以上である場合、ポリペプチドはVEGFまたはVEGFR2媒介性活性を阻害することになる。VEGF結合活性とは、任意のVEGF受容体を介して作用する、しかし特にVEGFR2受容体を介してシグナル伝達する任意のVEGFファミリーメンバーの任意の機能を意味する。VEGFファミリーには、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、および胎盤増殖因子PIGF、ならびにVEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、およびVEGF206を含むVEGFの種々の選択的スプライシング型が含まれるTischeretalJBiolChem26611947119541991。チロシンキナーゼ受容体のVEGFRファミリーには、VEGFR1Flt1としても知られる、VEGFR2KDRヒト型またはFlk1マウス型としても知られる、およびVEGFR3Flt4としても知られるが含まれる。VEGFリガンドはVEGF受容体に結合し、例えば血管新生、脈管形成、内皮細胞増殖、血管拡張、および細胞遊走を誘導する。VEGFリガンドはまた、同族受容体への結合を介してアポトーシスを抑制し得る。VEGFR2は、血管新生に最も関与しているVEGFRであると考えられている。VEGFR2またはKDR媒介性生物活性とは、VEGFR2またはKDRの拮抗作用によって生物活性の測定可能な減少が起こるような、VEGFR2またはKDRが著しく関与する任意の生物学的機能である。VEGFおよびVEGFRの生物活性は、当技術分野において周知である標準的なアッセイ法によって測定することができる。例には、リガンド結合アッセイ法およびスキャッチャードプロット解析;受容体二量体化アッセイ法;細胞リン酸化アッセイ法;チロシンキナーゼリン酸化アッセイ法例えば、MeyeretalAnnNYAcadSci9952002072003;BrdU標識実験および細胞計数実験などの内皮細胞増殖アッセイ法;VEGF依存性細胞増殖アッセイ法;ならびに血管新生アッセイ法が含まれる。血管新生を測定する方法は標準的であり、例えばJainetalNatRevCancer22662762002に記載されている。血管新生は、非分岐血管区域の数単位面積当たりの区域の数、機能的血管密度単位面積当たりの灌流血管の全長、血管径、脈管の形成、または血管容量密度単位面積当たりの、各区域の長さおよび直径に基づいて計算された全血管容量を測定することにより評価することができる。VEGF媒介性増殖および血管新生の例示的なアッセイ法は、米国特許第6559126号、LydenetalNatureMedicine71194、JacobetalExpPathol151234、およびBaeetalJBiolChem27513588に見出され得る。これらのアッセイは精製受容体もしくはリガンドまたはその両方を用いて行うことができ、またインビトロでもインビボでも行うことができる。これらのアッセイはまた、遺伝子導入されたまたは天然のリガンドもしくは受容体またはその両方を用いて細胞内で行うことができる。VEGFの生物活性を阻害するポリペプチドは、VEGFの生物活性の少なくとも10の減少、好ましくは20、30、40、または50、より好ましくは60、70、80、90、またはそれ以上の減少をもたらす。生物活性の阻害はまた、IC50によって測定され得る。好ましくは、VEGFまたはVEGFR2の生物活性を阻害するポリペプチドは、100nM未満、より好ましくは10nM未満、最も好ましくは1nM未満のIC50を有する。2ポリペプチド本明細書に記載する方法を用いて、2つの関連するタンパク質構造群:免疫グロブリン折りたたみを有するタンパク質および免疫グロブリン様折りたたみを有するタンパク質に由来する単一ドメインVEGFR2結合ポリペプチドを作製することに成功した。ポリペプチドとは、長さ、翻訳後修飾、または機能にかかわらず、2つまたはそれ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質は、本明細書において互換的に用いられる。ポリペプチドは、天然アミノ酸、および参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6559126号に記載されているような非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドはまた、種々の標準的な化学的方法のいずれかで修飾され得る例えば、アミノ酸を保護基で修飾することができる;カルボキシ末端アミノ酸を末端アミド基にすることができる;アミノ末端残基を、例えば親油性を増強させる基で修飾することができる;または安定性もしくはインビボ半減期を増大させるために、ポリペプチドを化学的にグリコシル化するかもしくは別の方法で修飾することができる。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの環式化合物などの別の構造または他の分子の結合を含み得り、また立体配置が変化したすなわち、RもしくはS;またはLもしくはD1つまたはそれ以上のアミノ酸を含むポリペプチドを含み得る。単一ドメインポリペプチドという用語は、対象ポリペプチドの標的結合活性例えば、VEGFR2結合活性が、例えば、抗原結合活性が一般に重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方によってもたらされる抗体および一本鎖抗体とは区別されて、単一構造ドメイン内に存在することを示すために用いられる。結合活性が増加した複合分子を作製するために、本明細書に開示するような複数の単一ドメインポリペプチドを結合し得ることが意図される。同様に、単一ドメインポリペプチドを、蛍光ポリペプチド、標的化ポリペプチド、および異なる治療効果を有するポリペプチドなどの多くの他のポリペプチドに例えば、融合タンパク質として結合することができる。免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様骨格の単一ドメインポリペプチドは、特定の構造特性を共有する傾向がある。例えば、ポリペプチドは約80~約150アミノ酸を含み得り、アミノ酸は一連のβストランドまたはβ様ストランドに構造的に構成されて、βストランドまたはβ様ストランドが介在ループ部分によって結合されたβシートを形成する。重鎖可変ドメインおよび10Fn3ドメインの構造構成の例を図22にす。βシートは単一ドメインポリペプチドの安定な核を形成し、また一方でβストランドまたはβ様ストランドを結合するループから構成される2つの面を形成する。本明細書に記載するように、これらのループを変更して要望に合わせたリガンド結合部位を作製することができ、適切な対照を使用することで、タンパク質の全体的な安定性を破壊することなくそのような変更物を作製することができる。抗体では、これらのループのうちの3つは周知の相補性決定領域またはCDRである。単一ドメインポリペプチドを形成するための骨格は、生理的条件において高度に可溶性であり安定であるべきである。免疫グロブリン骨格の例は、単一ドメインVHもしくはVL骨格および単一ドメインラクダVHHドメインラクダで見出された重鎖可変ドメインの形態、または天然で見出されるもしくは実験室において操作された他の免疫グロブリン可変ドメインである。本明細書に開示する単一ドメイン形式では、免疫グロブリンポリペプチドは、結合活性を獲得するために第2ポリペプチドと二量体を形成する必要がない。したがって、第2タンパク質とのジスルフィド架橋結合を媒介するシステインを天然に含む任意のそのようなポリペプチドは、システインを除去するように変更され得る。または、単一ドメインポリペプチドにPEGなどのさらなる部分を結合するのに使用するため、システインは保持され得る。他の骨格は、非抗体骨格タンパク質であってよい。非抗体骨格タンパク質またはドメインとは、免疫グロブリン様折りたたみを有する非抗体ポリペプチドを意味する。抗体様折りたたみとは、2層の逆平行βシートを含み、2つのβシートの平らな疎水面が相互に向かい合って詰め込まれた約80~150アミノ酸残基のタンパク質ドメインを意味する。そのような骨格の例はフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質であり、これはフィブロネクチンタイプIIIドメインFn3に基づくポリペプチドを意味する。フィブロネクチンは、細胞外基質の形成および細胞間相互作用において重要な役割を果たす大きなタンパク質であり;これは、3つのタイプタイプI、II、およびIIIの小さなドメインの多くの繰り返しからなるBaronetal1991。Fn3自体は、細胞接着分子、細胞表面ホルモン受容体およびサイトカイン受容体、シャペロニン、ならびに糖質結合ドメインの一部を含む大きなサブファミリーの模範例である。総説に関しては、BorkDoolittleProcNatlAcadSciUSA1992Oct18989904;BorketalJMolBiol1994Sep3024230920;CampbellSpitzfadenStructure1994May1523337;HarpezChothiaJMolBiol1994May1323852839を参照されたい。好ましくは、フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質は10Fn3骨格であり、これは、1つまたは複数の溶媒接近ループ、特にBCループアミノ酸20~30、DEループアミノ酸52~56、およびFGループアミノ酸77~87として同定される3つのループの1つまたは複数がランダム化されるまたは変異された、ヒトフィブロネクチンタイプIIIタンパク質の10番目のモジュールに基づくポリペプチド変種を意味する番号付けの図式はヒトフィブロネクチンの10番目のタイプIIIドメインの配列に基づき、アミノ酸ValSerAspValProがアミノ酸番号1~5を表す。ヒトフィブロネクチンタイプIIIドメインの野生型の10番目のモジュールのアミノ酸配列は:である。したがって、野生型BCループはDAPAVTVRの配列を含み;野生型DEループはGSKSTの配列を含み、野生型FGループはGRGDSPASSKPの配列を含む。BC、DE、およびFGループに隣接する配列はまた、例えば表1~3においてフレームワーク1、2、3、および4と称される。様々な改良変異体10Fn3骨格が同定されている。Asp7の改良は、負に荷電していないアミノ酸残基例えば、Asn、Lysなどによって置換される。これらの変異体はいずれも、中性pHにおける変異体10Fn3の、野生型よりも高い安定性を促進する効果を有する。10Fn3骨格における有益であるかまたは中立である種々のさらなる改変が開示されている。例えば、BatorietalProteinEng2002Dec15101520;KoideetalBiochemistry2001Aug28401032633を参照されたい。さらに、10Fn3骨格に対するいくつかの新たな改変を本明細書に開示する。特に重要なことには、野生型ヒト10Fn3の最初の8アミノ酸を欠失させることで、VEGFR2結合がおよそ3倍に改善されることが見出された。最初の8アミノ酸は、BC、DE、およびFGループに近接した位置に折りたたまれる傾向があるため、この変異体はまた、異なる標的に対する結合に関して選択される他の10Fn3骨格においても標的結合を改善することが期待される。したがって、最初の8アミノ酸を欠いた10Fn3骨格をコードする核酸のライブラリーを構築して、この改良ライブラリーにおいてスクリーニングを行うことができる。変種および野生型10Fn3タンパク質はどちらも、同じ構造、すなわち7つのβストランドドメイン配列A~と称される、および7つのβストランドドメイン配列を結合する6つのループ領域ABループ、BCループ、CDループ、DEループ、EFループ、およびFGループによって特徴づけられる。N末端およびC末端に近接して位置するβストランドは、溶液中でβ様高次構造をとり得る。SEQIDNO5では、ABループは残基15~16に相当し、BCループは残基22~30に相当し、CDループは残基39~45に相当し、DEループは残基51~55に相当し、EFループは残基60~66に相当し、FGループは残基76~87に相当する。図22に示されるように、BCループ、DEループ、およびFGループはすべて、ポリペプチドの同じ面に位置する。同様に、免疫グロブリンも骨格も、少なくとも7つのβストランドまたはβ様ストランド、しばしば9つのβストランドまたはβ様ストランドを有する傾向がある。本明細書に開示する単一ドメインポリペプチドは、少なくとも2つのβシートの間に分布する少なくとも5~7個のβストランドまたはβ様ストランド、および2つのβストランドまたはβ様ストランドを結合する少なくとも1つのループ部分を有し得り、ループ部分はVEGFR2、特にKDRへの結合に関与し、その結合は1x106M未満、好ましくは1x108M未満の解離定数によって特徴づけられる。本明細書に記載する、5x109M未満の解離定数を有するポリペプチドは、VEGFシグナル伝達を抑制するためのインビボでの治療的使用に特に望ましい。1x106M~5x109Mの解離定数を有するポリペプチドは、VEGFR2タンパク質のエクスビボまたはインビボでの検出または標識に使用するのに望ましいと考えられる。任意に、VEGFR2結合タンパク質は、同じ種に由来する他の関連タンパク質と比較してVEGFR2に特異的に結合する。特異的に結合するとは、標的タンパク質例えば、VEGFR2を認識しこれと相互作用するが、試料、例えば生物試料中の他の分子を実質的に認識せずこれと相互作用しないポリペプチドを意味する。好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、少なくとも500nM程度のKDでVEGFRと特異的に結合する。好ましくは、ポリペプチドは、1pM~500nM、より好ましくは1pM~100nM、より好ましくは1p3000nM結合する、VR28の高頻度変異誘発PCR親和性成熟の産物であるクローン159QL表4を、開始点として選択した。FGループの最初の6アミノ酸を十分にランダム化しNNS、残りの5残基ELFTPは原型のまま残した。Flk1に対して選択を6ラウンド行った後、結合プールをDEループ52~56位において再度ランダム化し、Flk1に対してさらに3ラウンドおよびKDRに対して1ラウンドの選択を行った。このようにして、KDRおよびFlk1の両方に対する多くの高親和性結合分子が得られた表4および図4。例えば、クローンM5FLは、KDRに対する高い結合親和性を維持しつつKd890pM、元のクローンの1000倍の改善である21nMのKdでFlk1に結合し得る。興味深いことに、VR28の変異誘発集団から選択されたFlk1結合分子において認められたERNGRモチーフは、FGループのこの領域を十分にランダム化したにもかかわらず、クローン159QLの変異誘発および選択に由来する複数のクローン中にも同様に存在した。2つの独立したライブラリーから同様の結合分子が単離されたことから、親和性成熟過程は、FGループ内に位置する最適なFlk1結合モチーフを単離するのに強力であることが示唆される。実施例4インビトロにおける細胞表面結合およびVEGF活性の中和大腸菌が産生する結合分子を用いて、細胞培養モデル系におけるKDRおよびFlk1結合分子の機能性を評価した。抗His6タグマウス抗体大腸菌が発現するタンパク質はHisタグと共に発現されたおよび抗マウス蛍光標識抗体からなる検出系を使用して、結合分子が、低いナノモル濃度のEC50でKDRまたはFlk1を発現する哺乳動物細胞に特異的に結合することが示された図7および表8。より重要なことには、エリスロポエチン受容体シグナル伝達ドメインに結合された細胞外KDRまたはFlk1ドメインを発現する組換えBAF3細胞DSMZDeutscheSammlungvonMikoorganismenundZellkulturenGmbHを用いた場合、これらの分子は、KDR発現細胞については3~12nMおよびFlk1発現細胞については2~5nMのIC50を有して、用量依存的様式でVEGF刺激による細胞増殖を抑制した。図8および表9に示すように、抑制の強度は対照抗KDRモノクローナル抗体および抗Flk1モノクローナル抗体と同程度であると考えられる。HUVEC細胞ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖のVEGF阻害に関して、多くのクローンをさらに試験した。HUVEC細胞は、VEGFに反応する体内の細胞と密接に関連した天然のヒト細胞である。図9および表10に示すように、野生型フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質はこのヒト由来細胞系においてVEGF活性の阻害に関して不活性であるのに対し、フィブロネクチンに基づく結合タンパク質はこの系においてもVEGF活性を阻害する活性を有した。実施例5M5FLタンパク質の熱安定性および可逆的リフォールディング示差走査熱量測定DSCにより、KDR結合剤M5FLの熱安定性を明らかにした。標準的なPBS緩衝液条件リン酸ナトリウムpH74、150mMNaCl下では、M5FLは56°Cで単一の不可逆的熱融解転移を有することが判明した。その後、酢酸ナトリウムpH45が、M5FLタンパク質の溶解度に好ましい緩衝液であると同定された。この緩衝液100mM中でのDSC実験から、M5FLはこれらの条件下でより安定でありTm67~77°C、融解転移が可逆的であることが実証された図10。可逆的融解転移を用いてタンパク質治療薬の長期保存を支持する好ましい条件が同定されておりRemmeleetalBiochemistry385241、よってNa酢酸pH45はM5FLタンパク質の保存に最適な緩衝液であると同定された。実施例6PEG化M5FLタンパク質のインビトロ結合および細胞に基づく活性C末端伸長を有するM5FLタンパク質を大腸菌発現系で産生させて、以下のタンパク質配列を得たCys100に斜線を施し、C末端伸長に下線を引いてある;かなりの割合のタンパク質が最初のメチオニンを欠いて産生される:100位のシステイン残基の単一のスルフヒドリルを用いて、標準的なマレイミド化学法によりPEG変種に結合し、2つの異なるPEG化型M5FLを得た。直鎖状20kDPEGおよび分岐型40kDPEGShearwaterCorporationをM5FLと結合して、それぞれM5FLPEG20およびM5FLPEG40を作製した。陽イオン交換クロマトグラフィーにより、未反応のタンパク質およびPEGからPEG化タンパク質形態を精製した。2つのPEG型M5FLの共有結合を、SDSPAGE図11および質量分析によって確認した。BIAcoreチップ上にアミド化学法によって固定化したヒトおよびマウスVEGF受容体標的タンパク質を用いて、表面プラズモン共鳴法SPRBIAcoreによりインビトロ親和性測定を行った。いずれの標的タンパク質に対しても、20kDおよび40kDPEG化M5FL型は未修飾のM5FLよりも遅い結合速度Kaを有し、解離定数kdにはほぼ影響がないことが判明した表11。実施例4に記載したBaF3系を用いて、PEG化M5FL調製物の機能性を試験した。図12は、それぞれの結合剤の濃度の関数としてのA490細胞増殖の程度を表すのプロットを示す。曲線はほぼ同一であり、どちらのPEG化型の生物活性にもPEG化の影響がほぼないことが示された。KDR結合ポリペプチドのサブセットについてKon、koff、およびKDを解析し、BaF3細胞に基づくVEGF阻害アッセイのEC50と比較した。散布図から、konはEC50と十分に相関するが、koffは十分に相関しないことが示された。105s1以上のkonを有するKDR結合タンパク質の90超は、10nM以下のEC50を有した。KDはkonとkoffの比であり、予想通りEC50と中程度の相関を示す。CT01を含む多くのKDR結合タンパク質を、VEGFR1、VEGFR2、およびVEGFR3への結合に関して評価した。タンパク質はVEGFR2に対する高度の特異性を示した。実施例6:KDR結合タンパク質CT01の調製物はヒト内皮細胞においてVEGFR2シグナル伝達を阻害する。上記実施例に記載した方法を受けて、10Fn3に基づくさらなるKDR結合タンパク質を作製した。上記の実施例5でM5FLタンパク質の開発に関して記載したように、BIAcore結合アッセイを用いてヒトKDRおよびマウスFlk1に対するKDについて、およびBaF3アッセイにおけるIC50について試験した。CT01と命名したタンパク質は、これらのアッセイそれぞれにおいて所望の特性を示し、よってさらなる解析に使用した。CT01を導出した最初のクローンは、配列:を有した。FGループ配列に下線を引いてある。上記のような親和性成熟により、CT01のコア型が生成された。上記のCT01分子は最初の8アミノ酸の欠失を有し、N末端またはC末端にさらなるアミノ酸を含み得る。例えば、さらなるMG配列をN末端に置くことができる。Mは通常切断されて、N末端にはGEV...配列が残る。通常の8アミノ酸をN末端に再付加することでも、所望の特性を有するKDR結合タンパク質が生成される。N末端のメチオニンは通常切断されて、配列:が得られる。インビボで使用するには、PEG化に適した形態を作製することができる。例えば、N末端の8アミノ酸を欠く形態について以下に示すように、システインを含むC末端尾部を付加して、これを発現させた。以下に記載するインビボ実験では、この分子のPEG化型を使用する。システインの代わりにセリンを有する対照型もまた使用した。同じC末端尾部を、SEQIDNO193に示すN末端8アミノ酸を有するCT01型に付加することもできる。所望のKDR結合特性を有するさらなる変種が単離された。以下のコア配列はいくぶん異なるFGループを有し、例えば、N末端MG配列、欠失された8アミノ酸を回復するN末端配列、およびまたはPEG化用のシステインを提供するためのC末端尾部と共に発現させることができる。別のそのような変種はコア配列:を有する。これらの変種を比較することによって、FGループの共通配列:GXNXRXXIPSEQIDNO3が示される。より詳細には、共通配列はGNRIPSEQIDNO4として表すことができる。実施例7:CT01はヒト内皮細胞においてVEGFR2シグナル伝達を阻害する。図13に示すように、VEGFR2を介したVEGFAシグナル伝達は、VEGFR2の細胞内ドメインのリン酸化、およびその後のホスホリパーゼCγPLCγ、プロテインキナーゼCPKC、Raf1、MEK12、ERK12が関与する経路の活性化によって媒介され、内皮細胞増殖をもたらす。本明細書に開示するKDR結合剤がこのシグナル伝達経路の活性化を抑制するかどうかを評価するため、ヒト微小血管内皮細胞をVEGFR結合ポリペプチド例えば、CT01で30分間処理し、VEGFAで5分間刺激した。ホスホVEGFR2、非ホスホVEGFR2、ホスホERK12、および非ホスホERK12に特異的な抗体を用いて、全細胞溶解物をSDSPAGEおよびウェスタン解析により解析した。図13に示すように、130pMCT01はホスホVEGFR2の形成を抑制し、また下流のリン酸化ERK12の形成を減少させる。リン酸化ERK12は完全には排除されないが、これはおそらく、ERK12は多くのさらなるシグナル伝達経路からシグナルを受け取るという事実による。実施例8:フィブロネクチンに基づくKDR結合タンパク質のVEGFAおよびVEGFDによるシグナル伝達の阻止VEGFR2は3つのVEGF種、VEGFA、VEGFC、およびVEGFDの受容体である。KDRを介するVEGFAおよびVEGFD媒介性シグナル伝達に及ぼすフィブロネクチンに基づくKDR結合タンパク質の影響を評価する実験を行った。Flk1媒介性シグナル伝達に依存するBaF3細胞株を作製した。図14の左側のパネルに示すように、細胞生存度は、著しく高レベルのVEGFDが必要であるものの、細胞をVEGFAまたはVEGFDで処理することにより維持することができた。図14の中央のパネルに示すように、細胞を15ngmlVEGFAの存在下で維持し、本明細書に開示するM5FLもしくはCT01タンパク質、またはDC101抗Flk1抗体と接触させた。試薬はそれぞれVEGFAが媒介する細胞生存度を逆行させ、これにより、Flk1を介したVEGFAシグナル伝達が阻止されたことが示される。図14の右側のパネルに示すように、細胞を300ngmlVEGFDの存在下で維持し、本明細書に開示するM5FLもしくはF10タンパク質、または抗VEGFA抗体と接触させた。M5FLおよびF10はVEGFDが媒介する細胞生存度を逆行させ、これにより、Flk1を介したVEGFDシグナル伝達が阻止されたことが示される。抗VEGFA抗体は影響を及ぼさす、本アッセイの特異性が実証される。実施例9:薬物動態薬物動態研究:未変性CT01またはPEG化型40kDaPEG、CT01PEG40を125Iでヨウ素化した。ヨウ素化タンパク質10~20mCiを成体雄ラットの静脈内または腹腔内に投与し、表示の時間にヨウ素化タンパク質レベルを測定した。組織分布研究では、15分、2時間、および6時間後にラットを屠殺し、放射能レベルを測定した。図15および16を参照されたい。非修飾CT01は、血液から迅速に排除される12kDaタンパク質である。699mLhrkgの排除、最大血清濃度91mgを有して、曲線下面積AUC値は146hrmgmLである。初期半減期αは03時間であり、第二相半減期βは135時間である。これと比較して、静脈内PEG化CT01は、主に初期相の排除の劇的な減少が原因で、血中における存在が著しく増加した。AUCは10倍超増大して193となり、排除速度は110未満に低下して52となり、Cmaxは129mgmlである。α半減期は1時間まで延長され、β半減期は162時間まで延長される。ラットにおけるこれらに薬物動態はヒトにおける週に2回の投与計画に相当し、この投与の程度は十分に許容可能な範囲内にある。PEG化CT01の腹腔内ip投与は貯蔵様薬物動態を有した。CT01の血中濃度の最初の急増は認められなかった。代わりに、CT01の量はよりゆっくりと増加し、ゆっくりと減少した。静脈内投与時のCT01濃度の最初の急増に起因する副作用の問題がある場合、そのような薬物動態は望ましいと考えられる。10Fn3に基づく他の薬剤も、ip投与で同様に挙動を示す可能性が高い。したがって、これは、10Fn3に基づく薬剤による時間遅延投薬を達成するための一般化可能な様式であると考えられる。図16に示すように、肝臓がPEG化型CT01を分泌する主な経路である。CT01の長期蓄積は検出されなかった。20kDAPEG部分に結合したCT01を用いた場合にも、同様の結果が得られた。実施例10:CT01のインビボ有効性図17に概説するMilesアッセイを用いて、腫瘍効果研究のための用量、スケジュール、および投与パラメータを評価する。VEGF投与の4時間前に、Balbc雌マウスの腹腔内に緩衝液または1、5、および20mgkgのCT01PEG40を投与した。背中の皮膚にVEGFAを皮内局所投与することにより、エバンスブルー色素の血管漏出が誘導される図17および18。KDR結合剤で処理したマウスは、VEGF媒介性血管漏出のレベルの統計的に有意な減少を示した。CT01の5mgkgおよび20mgkg用量は有意な結果を示した。したがって、マウス腫瘍モデル研究には5mgkg用量を選択した。実施例11:CT01の腫瘍増殖抑制B16F10マウスメラノーマ腫瘍アッセイ:1日目に、2x106個のB16F10マウスメラノーマ腫瘍細胞をC57BL雄マウスの皮下に移植した。6日目に、触知腫瘤が検出された。腫瘍が測定可能な大きさになった8日目に、媒体対照、5、15、または40mgkgCT01PEG40の腹腔内連日投与を開始した。最低用量である5mgkgは腫瘍増殖を減少させた。18日目に、15および40mgkgで処理したマウスは、腫瘍増殖の50および66の減少を示した。図19を参照されたい。U87ヒト神経膠芽腫アッセイ:5x106個のU87ヒト神経膠芽腫腫瘍細胞を雄ヌードマウスの皮下に移植した。腫瘍体積が約50mm3に到達した時点で、処置を開始した0日目。媒体対照、3、10、または30mgkgCT01PEG40を一日おきにEOD静脈内投与した。抗Flk1抗体DC101を、最適投与計画に関して発表されている通り、40mgkgで週に2回投与した。最低用量である3mgkgは腫瘍増殖を減少させた。12日目に、10および30mgkgで処理したマウスは、腫瘍増殖の50の減少を示した。図20を参照されたい。有効性は抗Flk1抗体の有効性と匹敵する。以下の材料および方法を実施例1~11に記載した実験に使用した。組換えタンパク質:組換えヒトVEGF165、マウスVEGF164、ヒトニューロトロフィン4NT4、ヒトおよびマウス血管内皮増殖因子受容体2FcキメラKDRFcおよびFlk1Fcは、RDsystemsミネソタ州、ミネアポリスから購入した。標的タンパク質のビオチン化は、EZLink商標SulfoNHSLCLCBiotinPierce、イリノイ州の存在において、1xPBS中で4°Cにて2時間行った。1xPBSに対して透析することにより、過剰量のEZLink商標SulfoNHSLCLCBiotinを除去した。ビオチン化のレベルは質量分析によって決定し、標的タンパク質濃度はCoomassieProteinPlusAssayPierce、イリノイ州を使用して測定した。プライマー:ライブラリーの構築および選択されたクローンの突然変異誘発において最終的に使用するため、以下のオリゴヌクレオチドを化学合成により調製した。T7TMVFn:T7TMVN末端欠失:MK1654A20:N末端フォワード:BCDEリバース:BCDEフォワード:DEFGリバース:DEFGフォワード:C末端ポリA:Hu3FLAGSTOP:VR28FG50:F1U2:F2:F3159:F4:F5159:F5X5:F6:F7X6159:F8:C2asaiA20:C2RT:hf01BCリバース:hf01DEリバース:hf01FGリバース:BCDErev:BCDEfor:hf01DEFGフォワード:FrontFGリバース:hf01RTFlagポリAリバース:5RIhKDR1B:3EPOhKDR2312B:5RImKDR1:3EPOmKDR2312:5RIhTrkB1:3EpoRhTrkB1310:5hKDREPO2274B:5mKDREPO2274:3XHOEpoR3066:5hTrkBEpoR1274:緩衝液本明細書に記載する実験では、以下の緩衝液を使用した。緩衝液A100mMTrisHCl、1MNaCl、005Tween20、pH80;緩衝液B1XPBS、002TritonX100;緩衝液C100mMTrisHCl、60mMEDTA、1MNaCl、005TritonX100、pH80;緩衝液Ca100mMTrisHCl、1MNaCl、005TritonX100、pH80;緩衝液D2MNaCl、005Triton;緩衝液E1XPBS、005TrironX100、pH74;緩衝液F1XPBS、005TritonX100、100mMイミダゾール、pH74;緩衝液G50mMHEPES、150mMNaCl、002TritonX100、1mgmlウシ血清アルブミン、01mgmlサケ精子DNA、pH74;緩衝液H50mMHEPES、150mMNaCl、002TritonX100、pH74;緩衝液I1xPBS、002TritonX100、1mgmlウシ血清アルブミン、01mgmlサケ精子DNA、pH74;緩衝液J1xPBS、002TritonX100、pH74;緩衝液K50mMNaH2PO4、05MNaCl、5グリセロール、5mMCHAPS、25mMイミダゾール、1xComplete商標ProteaseInhibitorCocktailRoche、pH80;緩衝液L50mMNaH2PO4、05MNaCl、5グリセロール、25mMイミダゾール、pH80;緩衝液M1xPBS、pH74、25mMイミダゾール、pH74;緩衝液N1xPBS、250mMイミダゾール、pH74;緩衝液O10mMHEPES、150mMNaCl、0005Tween20、pH74。一次ライブラリーの構築:骨格としてヒトフィブロネクチンの10番目のドメインを使用するライブラリーの構築は、以前に記載されているXuetal2002、前記。それぞれ23~29位、52~55位、および77~86位に相当する3つのループ領域を、コード計画としてNNS標準的なヌクレオチド混合物、式中、NA、G、T、Cの等モル混合物;SGおよびCの等モル混合物を用いてランダム化した。23~29位および77~86位2ループライブラリーまたは77~86位1ループライブラリーでのみランダム化した領域を含む同様のライブラリーも構築した。これらのライブラリーをほぼ等モル量で混合した。この混合ライブラリーは約1x1013個のクローンを含み、VR28が同定されたKDR選択で用いられた。変異誘発ライブラリーの構築:高頻度変異誘発PCR。VR28クローンにおける骨格の変異TIをPCRによって野生型配列に修正したが以下を参照、KDRに対するVR28結合剤の結合特性に変化は認められなかった。以前に記載された条件を用いて、VR28のループ領域に変異を導入したVartanianetalNucAcidRes24262726311996。各ループ隣接するプライマー対N末端フォワードBCDEリバース、BCDEフォワードDEFGリバース、DEFGフォワードC末端ポリAを用いて、VR28鋳型において3ラウンドの高頻度変異誘発PCRを行った。重複伸長ならびに隣接プライマーT7TMVFnおよびMK1654A20を使用したPCRにより、得られた断片を組み立てた。最終PCR反応によるクローンのDNA配列を決定し、ライブラリーが正しく構築されていることを確認した。骨格領域では15の変異誘発率であるのに対し、ループ領域では最大で30の変異誘発率が認められた。オリゴ突然変異誘発。PCRによるVR28のFGループのオリゴ突然変異誘発には、VR28FG50プライマー、DEFGリバースプライマー、および隣接プライマーを使用した。FGループをコードする各ヌクレオチドの位置において、プライマーVR28FG50は、VR28ヌクレオチド50、および4つの全ヌクレオチドNまたはGもしくCSの等量混合物50を含んだ。この計画は、VR28FGループのアミノ酸の約67が別のアミノ酸でランダムに置換されるように設計されたもので、これはDNA配列決定によって確認された。159ランダム化サブライブラリー。クローン159クローンのFGループのオリゴ突然変異誘発、3段階伸長、および増幅を行った。一次伸長では、プライマー対a:F1U2F2、b:F3159F4、c:F5159F6、d:F7X6159F8を等濃度各100pmolで混合し、10サイクル増幅した。二次伸長では、一次反応物の120を組み合わせabおよびcd、増幅をさらに10サイクル継続した。完全に相補的な断片の再アニーリングよりも伸長の方に増幅を偏らせるため、断片ab用のF1U2フォワードプライマーまたは断片cd用のC2asaiA20リバースプライマー50pmolを用いて、半構築物産物各05pmolの線形増幅をさらに20サイクル行った。最後に、伸長された半構築物断片abおよびcdを組み合わせて、さらなる成分を含めずに20サイクル増幅した。プライマーF7X6159は、クローン159の最初の6コード位置それぞれにおいてNNSを含み、それ以外はクローン159と同一であった。最終PCR反応によるクローンのDNA配列を決定して、ライブラリー159FGX6が正しく構築されていることを確認した。サブライブラリーは約1x109個のクローンを含んだ。159FGX6ライブラリーを6ラウンド選択した後のプールPR6のDEループをランダム化するため、プライマーF1U2F4およびF5X5C2asaiA20を用いてPCRにより2つの半構築物断片を調製した。F5X5プライマーは、DEループの4つの位置および56位においてNNSを含んだ。次いで、伸長された断片abおよびcdを組み合わせて、さらなる成分を含めずに20サイクル増幅した。フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質への点突然変異、欠失、およびランダムNNSループ配列の導入:VR28クローンを鋳型として使用した2段階PCRで、VR28結合剤の骨格変異TIを野生型配列に修正した。プライマーN末端フォワードDEFGリバースおよびDEFGフォワードC末端ポリAを用いて得られた半構築物断片を組み合わせて、プライマーT7TMVFnおよびMK1654A20を用いてVR28クローン全体本文中ではVR28と表すを構築した。クローン159におけるN末端変異の修正は、プライマーN末端フォワードC末端ポリAを用いたPCR、およびその後のプライマーT7TMVFnおよびMK1654A20を用いた伸長によって行った。フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質のN末端への欠失Δ18の導入は、プライマーT7TMVN末端欠失およびMK1654A20を用いた増幅によって行った。NNSループ配列を含むEクローンのキメラの構築を、2段階PCRで行った。プライマーT7TMVN末端欠失BCDEreva:EクローンのBCループ;N末端フォワードhf01BCリバースb:BCNNS;BCDEforFrontFGリバースc:EクローンのDEループ;BCDEforhf01DEリバースd:DENNS;hf01DEFGフォワードhf01RTFlagポリAリバースe:EクローンのFG;hf01DEFGフォワードhg01FGリバースf:FGNNSを用いて、ループ領域を増幅した。断片bce、ade、acfを組み合わせ、伸長、ならびにプライマーT7TmvN末端欠失およびhf01RTFlagポリAリバースを用いる増幅によって、プール全体を構築した。構築物はすべてDNA配列決定により確認およびまたは解析した。すべての構築物および変異誘発ライブラリーは、インビトロでのRNAタンパク質融合生成および精製のため、5隣接領域にT7TMVプロモーターおよび3隣接領域にFlagタグまたはHis6タグ配列を含んだ。RNAタンパク質融合生成選択の各ラウンドでは、MegaScript転写キットAmbionを用いてPCRDNAを37°Cで4時間転写した。37°Cで20分間DNaseIAmbion消化することによって、鋳型DNAを除去した。フェノールクロロホルム抽出、およびその後のNAP25カラムAmershamでのゲルろ過により、RNAを精製した。ピューロマイシンリンカーPEG6105PsouagcggaugcXXXXXXCCPu3、式中、PsoC6ソラレン、u、a、g、c2OMeRNA、C標準的アミダイト、X:スペーサーホスホアミダイト99Oジメトキシトリチルトリエチレングリコール1ホスホアミダイト;PuピューロマイシンCPGは、以前に記載されている通りに合成したKurzetalNucAcidRes28832000。リンカーを、01MNaCl、25mMTrisHCl、pH70中で85°Cから4°Cに徐々に温度を下げていくことで、ライブラリーRNAとアニーリングさせた。次いで、リンカーとRNAをUV光365nmに15分間曝露して架橋した。架橋された混合物600pmolRNAを、35S標識メチオニンの存在下で、ウサギ網状赤血球溶血液翻訳キットAmbionを用いるインビトロ翻訳反応物中に含め、30°Cで60分間インキュベートした。融合形成を増強するため、05MKClおよび005MMgCl2を反応物に添加し、4°Cで30分間インキュベートした。オリゴdTセルロースSigmaクロマトグラフィーを用いて、融合分子を以下のように精製した。翻訳および融合混合物を緩衝液A100mMTrisHCl、1MNaCl、005Tween20、pH80に希釈して、オリゴdTセルロースに添加した。スラリーを4°Cで1時間回転し、スピンカラムに移した。オリゴdTセルロースビーズをカラム上で10カラム体積の緩衝液Aで洗浄し、3カラム体積のH2Oで溶出した。逆転写反応は、プライマーHu3FLAGSTOPを使用して、SuperScriptIIReverseTranscriptionキットInvitrogenを用いて42°Cで1時間行った。別法として選択の過程で、反応性システインを介した非特異的結合の可能性を減少させるため、チオール基を1mM2ニトロ5チオシアナト安息香酸NTCBまたはNエチルマレイミドNEMと反応させた。反応は室温で1時間行った。融合分子を、M2アガロースSigmaを用いて抗FLAGアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した。M2ビーズを反応物に添加し、緩衝液B1XPBS、002TritonX100中で4°Cで1時間回転した。次いで、ビーズをスピンカラムに供し、5カラム体積の緩衝液Bで洗浄し、3カラム体積の緩衝液Gに溶解した100μMFlagペプチドDYKDDDDKSigmaで融合分子を溶出した。試料中の35Sメチオニンのシンチレーション計測によって測定した比放射能に基づいて、融合物の収量を算出した。159ランダム化ライブラリーに関しては、Kingfisher商標ThermoLabSystemsでの合理化半自動化手順によりRNAタンパク質融合物を調製した。工程は、以下に記載する数段階を除いて、上記の手順と同様であった。RNAタンパク質融合分子の精製は、磁性オリゴdTビーズGenoVisionにおいて、緩衝液C100mMTrisHCl、60mMEDTA、1MNaCl、005TritonX100、pH80中で行った。ビーズを10反応体積の緩衝液Ca100mMTrisHCl、1MNaCl、005TritonX100、pH80で洗浄し、融合タンパク質を1体積のH2Oで溶出した。逆転写RTは、プライマーCR2Tを使用して行った。融合タンパク質は、NiNTA磁気ビーズQiagenを用いて、Hisタグアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した。RT反応物を緩衝液D2MNaCl、005Triton中でNiNTAビーズと共に室温で20分間インキュベートし、次いでビーズを10反応体積の緩衝液E1XPBS、005TrironX100、pH74で洗浄し、融合分子を1体積の緩衝液F1XPBS、005TritonX100、100mMイミダゾール、pH74で溶出した。選択:KDRに対する一次選択。プロテインAビーズおよびFcタンパク質への非特異的結合を減少させるため、選択前に、融合ライブラリー1ml中に約1013クローンを、200nMヒトIgG1を予め固定化したプロテインAビーズDynal150μlと共に30°Cで1時間インキュベートした前排除。次いで、上清を緩衝液G50mMHEPES、150mMNaCl、002TritonX100、1mgmlウシ血清アルブミン、01mgmlサケ精子DNA、pH74中で、KDRFcキメラと共に反転回転させながら30°Cで1時間インキュベートした。KDRFcの最終濃度は、ラウンド1では250nM、ラウンド2~4では100nM、ならびにラウンド5および6では10nMであった。標的をプロテインAビーズ300μlラウンド1またはプロテインAビーズ100μlラウンド2~6上に、反転回転させながら30°Cで30分間捕獲し、緩衝液G50mMHEPES、150mMNaCl、002TritonX100、pH741mlで5回洗浄した。結合した融合分子を、01MKOH100μlで1MTrisHCl、pH8050μl中に溶出した。隣接プライマーT7TMVFnおよびMK1654A20を用いて、PCRにより溶出物からDNAを増幅した。KDR結合剤VR28の親和性および特異性成熟。上記したように、高頻度変異誘発PCRまたはオリゴ特異的突然変異誘発によりクローンVR28に変異を誘発し、融合サブライブラリーを構築した。プロテインAビーズによる前排除の後、上記の手順に従って緩衝液I1xPBS、002TritonX100、1mgmlウシ血清アルブミン、01mgmlサケ精子DNA、pH74中で選択を4ラウンド行った。プライマーT7TMVFnおよびMK1654A20を用いて、PCRにより溶出物からDNAを増幅した。オリゴ突然変異誘発に由来するライブラリーでは、低い標的濃度選択の最初の4ラウンドでは01nMKDRを使用し、次いで選択のさらなる3ラウンドについては1nMマウスVEGFR2Flk1を導入した。最後の3ラウンドでは、PCRにプライマーT7TMVN末端欠失およびMK1654A20を使用した。KDR結合剤159の特異性成熟では、クローン159QLのFGループの最初の6つの位置を、上記のようにPCRによってランダム化した。ビオチン化マウスVEGFR270nMに対する融合サブライブラリーの結合は、緩衝液I中で室温で30分間行った。選択手順の残りは、Kingfisher商標ThermoLabSystemsで継続した。ビオチン化標的をストレプトアビジンコーティング磁気ビーズDynal50μl上に捕獲し、ビーズを10倍量の緩衝液Iおよび1倍量の緩衝液J1xPBS、002TritonX100、pH74で洗浄した。結合した融合分子を、01MKOH100μlで1MTrisHCl、pH8050μl中に溶出した。プライマーF1U2およびC2asaiA20を用いて、PCRにより溶出物からDNAを増幅した。4ラウンドの選択の後、さらなる2ラウンドには、以下の通りに7nMFlk1に対する解離速度再結合選択を適用した。ビオチン化マウスFlk1との結合反応を30分進行させた後、100倍過剰量の非ビオチン化Flk1を添加し、弱い結合剤の解離を見越して反応をさらに6時間継続した。ビオチン化標的をストレプトアビジンビーズDynal50μl上に捕獲し、緩衝液J1mlで5回洗浄した。結合した融合分子を、75°Cで5分間インキュベートすることにより溶出した。上清を7nMFlk1への再結合に供し、標準的な選択手順を継続した。最終溶出プールに由来するDNAをDEループランダム化上記を参照に供し、融合サブライブラリーを7nMマウスVEGFR2に対して3ラウンド選択した。4ラウンド目に、1nMヒトVEGFR2への再結合による解離速度選択に供した。プライマーF1U2およびC2asaiA20を用いて、PCRにより溶出物から最終DNAを増幅した。放射性平衡結合アッセイ解析用に35S標識結合タンパク質を調製するため、リンカーの連結段階を除くこと以外はRNAタンパク質融合精製に関して上記した通りにmRNAを調製した。35S標識Metの存在下でウサギ網状赤血球溶血液翻訳キットAmbionを使用して、mRNAを30°Cで1時間発現させた。発現されたタンパク質を、上記のようにM2アガロースFlagビーズSigmaで精製した。この手順によって、核酸尾部を含まないコードタンパク質が生成された。直接結合アッセイでは、0~200nMの濃度のVEGFR2Fc融合物を一定濃度の精製タンパク質02または05nMに添加し、緩衝液B中で30°Cで1時間インキュベートした。Kingfisher商標を使用して、室温でさらに10分間、プロテインA磁気ビーズにより受容体結合剤複合体を捕獲した。ビーズを6反応体積の緩衝液Bで洗浄した。01MKOH100μLでビーズからタンパク質を溶出した。50μLの反応混合物および溶出液をLumaPlate96Packard上で乾燥させ、プレート上の35Sの量をTopCountNXT装置Packardで測定した。標的に結合したフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質の量を、反応混合物中の放射能に対する、プロテインA磁気ビーズから溶出された放射能の割合として評価した。KDRFcの非存在下での結合を測定することによって、ビーズに対するフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質の非特異的結合を決定したが、非特異的結合は投入量の1~2未満を示した。特異的結合は全結合から非特異的結合を減算することによって得た。GraphPadPrizmソフトウェアGraphPadSoftwareInc、カリフォルニア州、サンディエゴを用いてデータを解析し、一部位非線形結合方程式により適合化した。フィブロネクチンに基づく可溶性骨格タンパク質結合剤の発現および精製:大腸菌で発現させるため、各クローンの残基1~101およびその後に続くHis6タグをpET9d由来ベクターにクローニングし、大腸菌BL21PlysS細胞Invitrogenで発現させた。一晩培養液20mlを用いて、50μgmLカナマイシンおよび34μgmLクロラムフェニコールを含むLB培地1リットルに接種した。培養液をA600が04~06になるまで37°Cで培養した。培養物を1mMイソプロピルβチオガラクトシドIPTG、Invitrogenで誘導した後、37°Cでさらに3時間培養し、4°Cにて3000gで30分間遠心分離することにより回収した。細胞ペレットを50mLの溶解緩衝液K50mMNaH2PO4、05MNaCl、5グリセロール、5mMCHAPS、25mMイミダゾール、1xComplete商標ProteaseInhibitorCocktailRoche、pH80緩衝液Lに再懸濁し、氷上で80Wにて10秒間休止させながら15秒間のパルスで4回超音波処理した。4°Cにて30000gで30分間遠心分離することにより、可溶性画分を分離した。洗浄緩衝液L50mMNaH2PO4、05MNaCl、5グリセロール、25mMイミダゾール、pH80で予め平行化したTALON商標SuperflowTMMetalAffinityResinClontech10mLと共に、上清を4°Cで1時間回転した。次いで、10カラム体積の緩衝液Lおよび30カラム体積の緩衝液M1xPBS、pH74、25mMイミダゾール、pH74で樹脂を洗浄した。タンパク質を5カラム体積の緩衝液N1xPBS、250mMイミダゾール、pH74で溶出し、1xPBSに対して4°Cで透析した。沈殿物は022μmでろ過することでMillipore除去した。フィブロネクチンに基づく可溶性骨格タンパク質のBIAcore解析:標的に対するフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質結合タンパク質の結合速度論を、BIAcore2000バイオセンサーPharmaciaBiosensorを用いて測定した。ヒトおよびマウスVEGFR2FC融合物をCM5センサーチップ上に固定化し、可溶性結合タンパク質を緩衝液O10mMHEPES、150mMNaCl、0005Tween20、pH74中の0~100nMの濃度で注入した。各濃度でセンサーグラムを取得し、プログラム、BIAEvaluation20BIAcoreを用いて評価して、速度定数kakonおよびkdkoffを決定した。速度定数koffkonの比から親和定数KDを算出した。阻害実験では、ヒトVEGF165をCM5チップの表面上に固定化し、0~100nMの様々な濃度の可溶性結合タンパク質の存在下で、20nM濃度のKDRFcを注入した。チップへのKDRFc結合が50のみ観察された時の濃度で、IC50を決定した。VEGFR結合ポリペプチドの可逆的リフォールディング:100mM酢酸ナトリウム緩衝液pH45中のM5FLタンパク質において、示差走査熱量測定DSC解析を行った。最初のDSC実行スキャン1は、NDSCII熱量計CalorimetrySciencesCorpで1分間に1°Cの速度で温度に5~95°Cの傾斜をつけ、続いて10°Cまで逆スキャンすることによって表示せず行い、その後2回目を実行したスキャン2。これらの条件下で、データは2つの転移モデルを用いて最適に適合化されたOriginソフトウェアOriginLabCorpを使用して、Tm77°Cおよび67°C。図10を参照されたい。M5FLタンパク質のPEG化:C100型のM5FLタンパク質は、100位のSerがシステインに変異されたM5FLの完全な配列を有し、タンパク質を精製するために用いられるさらなるC末端Hisタグを含む。精製されたM5FLタンパク質を、様々なマレイミド誘導体化PEG形態Shearwaterを結合することによって、単一のシステイン残基の位置で修飾した。反応して得られたタンパク質を、4~12ポリアクリルアミドゲルで泳動した図11。細胞株の作製:プラスミドの構築。KDR、Flk1、またはヒトTrkBの細胞外ドメインに融合されたヒトエリスロポエチン受容体EpoRの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインから構成されるキメラ受容体をコードするプラスミドを、2段階PCR手順によって構築した。受容体遺伝子全体をコードするプラスミドから、細胞外ドメインをコードするPCR産物を増幅した:KDRアミノ酸1~764は、プライマー5RIhKDR1B3EPOhKDR2312Bを用いてクローンPR1371H11OriGeneTechnologies、メリーランド州、ロックビルから導出し、Flk1アミノ酸1~762は、プライマー5RImKDR13EPOmKDR2312を用いてクローン4238984IMAGEから導出し、ヒトTrkBアミノ酸1~430は、プライマー5RIhTrkB13EpoRhTrkB1310を用いてクローンX75958InvitrogenGenestormから導出した。EpoR膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインアミノ酸251~508をコードするPCR産物は、共通プライマー3XHOEpoR3066、ならびに受容体断片PCR産物の末端に相補的な短い配列相補性を付加した3つの遺伝子特異的プライマー5hKDREPO2274BKDR、5mKDREPO2274Flk1、および5hTrkBEpoR1274ヒトTrkBのうちの1つを用いてクローンM60459InvitrogenGenestormから増幅した。次いで、キメラ遺伝子の半分をコードするPCR産物を混合し、3XHOEpoR3066および増幅の前のサイクルで使用した各遺伝子に特異的な5プライマー5RIhKDR1B、5RImKDR1、および5RIhTrkB1を用いて増幅した。得られたPCR産物をEcoRIおよびXhoIで消化し、pcDNA31Invitrogenにクローニングして、プラスミドphKE8ヒトKDREpoR融合物、pmKE2flk1EpoR融合物、およびphTETrkBEpoR融合物を作製した。フローサイトメトリー用の細胞株の作製。Lipofectamine2000Invitrogenを使用して、CHOK1細胞AmericanTypeCultureCollection、バージニア州、マナッサスに、pcDNA31Invitrogenのみ、pmKE2のみ、またはpcDNA31と全長ヒトKDRをコードするプラスミドOrigeneInc、クローンPR1371H11の混合物を安定にトランスフェクションした。安定なトランスフェクタントを選択して、05mgmlジェネティシンInvitrogenの存在下で維持した。トランスフェクションされた集団を抗KDRポリクローナル抗血清RDSystemsで染色した後に蛍光活性化細胞選別することによって、CHOKDRと称するヒトKDR発現クローンおよびCHOFlkと称するマウスVEGFR2EpoRキメラ発現集団を取得した。CHOKDRおよびCHOFlk細胞株は、日常的に、10vvウシ胎児血清FBC、05mgmlジェネティシン、100Umlペニシリン、025μgmlアンホテリシンB、100μgmlストレプトマイシン、および2mMLグルタミンを添加したダルベッコ変法イーグル培地DMEM;Gibcoで培養した。BaF3細胞株の作製。前B細胞株BaF3DSMZ、ドイツ、ブラウンシュワイクに、ヒトエリスロポエチン受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに融合されたヒトまたはマウスVEGFR2の細胞外ドメインからなる受容体キメラ上記を参照であるphKE8またはpmKE2をトランスフェクションすることにより、VEGFR2によるVEGF結合に応答して増殖する細胞株を作製した。BaF3細胞は、WEHI3B細胞の10馴化培地DSMZ;イスコフ改変ダルベッコ培地Gibco10FBS25μMβメルカプトエタノールで培養を必須増殖因子の供給源として添加した最小BaF3培地10FBS、100Umlペニシリン、025μgmlアンホテリシンB、100μgmlストレプトマイシン、および2mMLグルタミンを含むRPMI1640Gibcoで維持した。プラスミドpmKE2またはphKE8をエレクトロポレーションした後、安定なトランスフェクタントを075mgmlジェネティシン中で選択した。ジェネティシン耐性集団を、100ngmlヒトVEGF165RDSystemsを含む最小BaF3培地に移し、得られたVEGF依存性集団をBaF3FlkおよびBaF3KDRと命名した。NT4による刺激に応答性であるキメラTrkB受容体を発現する対照細胞株BaF3TrkBも同様に、プラスミドphTEおよびヒトNT4RDSystemsを用いて作製した。フィブロネクチンに基づく骨格タンパク質の細胞表面結合の解析:細胞表面KDRおよびFlk1に対するフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質の結合を、フローサイトメトリーによりVEGFR2発現細胞および対照細胞において同時に解析した。CHOpcDNA細胞対照をトリプシンEDTAを用いてディッシュから解離し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコPBSDPBS;Invitrogenで洗浄し、15μMCMTMR5ベンゾイルアミノテトラメチルローダミンMolecularProbesで37°Cで30分間染色した。細胞をDPBSで洗浄し、37°Cでさらに30分間インキュベートし、次に氷上でブロッキング緩衝液DPBS10ウシ胎児血清に再懸濁した。CHOKDRまたはCHOFlk細胞を、CMTMRを省くこと以外は同様に処理した。V底96ウェルプレートの各ウェル中で、75000個のCMTMR染色CHOpcDNA3細胞を、同数の非染色CHOKDRまたはCHOFlk細胞と混合した。抗体およびフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質はすべて、25μlウェルのブロッキング緩衝液で希釈し、各処理は4°Cで1時間行った。His6をタグ化したフィブロネクチンに基づく骨格タンパク質で細胞混合物を染色し、冷DPBSで2回洗浄し、次いで25μgml抗His6MAbRDSystemsで処理し、洗浄し、4μgmlAlexaFluor488結合抗マウス抗体MolecularProbesで染色した。抗KDRマウスモノクローナル抗体AccurateChemical、ニューヨーク州、ウェストベリーまたは抗flk1ヤギポリクローナル抗体RDSystemsで処理する細胞については、抗His6段階を省略し、抗体結合は種に適したAlexaFluor488結合二次抗体MolecularProbesで検出した。染色後、細胞を200μlウェルのDPBS1FBS1μgml7アミノアクチノマイシンD7AAD;MolecularProbesに再懸濁し、488nMレーザーを備えたFACSCaliburBectonDickinson、カリフォルニア州、サンノゼでフローサイトメトリーにより解析した。死細胞7AAD陽性を排除するためにゲートをかけた後、CMTMR陰性または陽性集団にそれぞれゲートをかけて、VEGFR2発現細胞およびCHOpcDNA3細胞をAlexaFluor488蛍光について独立して測定した。対照実験から、CMTMRによる染色は染色細胞の表面上におけるAlexaFluor488結合抗体の検出を妨げないことが示された。細胞表面結合はまた、上記の二次抗体を用いて蛍光顕微鏡により評価した。これらの研究のため、抗体をカルシウムおよびマグネシウムを含むDPBSDPBS10FBSで希釈した。細胞は24ウェルまたは96ウェルプレートで培養し、倒立蛍光顕微鏡で観察するために染色後はDPBS中で保存した。BaF3細胞増殖アッセイ:BaF3細胞を最小BaF3培地で3回洗浄し、158ngmlの増殖因子BaF3KDR、BaF3flk、またはBaF3TrkB細胞それぞれについてヒトVEGF165、マウスVEGF164、またはhNT4を含む同じ培地に再懸濁し、96ウェル組織培養プレートのウェル当たり、5x104個のBaF3KDR細胞、または2x104個のBaF3flkもしくはBaF3TrkB細胞を含む95μlを添加した。試験タンパク質のPBSによる段階希釈物5μlを各ウェルに添加し、最終量をBaF3培地5PBS15ngml増殖因子100μlとした。37°Cで72時間インキュベートした後、各ウェルにCellTiter96登録商標AqueousOneSolutionReagentPromega20μlを添加して37°Cで4時間インキュベートし、マイクロタイタープレートリーダーMolecularDynamicsを用いて490nmの吸光度を測定することにより、増殖を測定した。HUVEC細胞増殖アッセイ:継代2~6代目のHUVEC細胞Clonetics、メリーランド州、ウォーカーズビルをEGM2培地Cloneticsで培養した。5000細胞ウェルを200μlの飢餓培地02ウシ胎児血清および1xペニシリンストレプトマイシンファンギゾン溶液Gibcoを添加した等量のDMEMGibcoおよびF12K培地ATCCに再懸濁し、96ウェル組織培養プレートにプレーティングして、48時間インキュベートした。フィブロネクチンに基づく結合タンパク質をウェルに添加して37°Cで1時間インキュベートし、次いでヒトVEGF165を最終濃度16ngmlになるように添加した。48時間インキュベートした後、19mgmlCellTiter96登録商標AQueousMTS試薬Promegaと44μgmlフェナジンメトサルフェートSigmaの混合物を30μlウェル添加し、BaF3細胞について上記したように490nmの吸光度を測定することにより、細胞生存度を測定した。実施例12:抗体軽鎖に基づくVEGFR結合ポリペプチド図21Aおよび21Bは、抗体軽鎖可変領域VLフレームワーク骨格に基づくVEGFR結合ポリペプチドSEQIDNO241~310のアミノ酸配列を示す。軽鎖可変ドメインタンパク質は、10Fn3由来タンパク質との使用について記載した通りに、PROfusion商標システムを用いて作製した。本明細書で引用した参考文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。表1好ましい特異的ペプチド配列表2KDRFLK結合剤表3KDR結合剤表4特徴づけられたVEGFR2結合クローンの配列表5放射性平衡結合アッセイで決定されたKDRFcに対するトリネクチンtrinectin結合剤の親和性表6放射性平衡結合アッセイで決定されたKDRおよびFlk1に対するトリネクチン結合剤の親和性表7BIAcoreアッセイによるka、kd、およびKdの決定表8KDRCHOKDRおよびFlk1CHOFlk1発現細胞に対する結合表9KDRBaF3KDRおよびFlk1BaF3Flk発現細胞のVEGF誘導性増殖の抑制表10HUVEC細胞のVEGF誘導性増殖の抑制表11