"エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法において、患者の腫瘍試料中におけるILK、アルファパルビン及びPINCH遺伝子からなる群から選択される1、2又は3の遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるILK、アルファパルビン及びPINCH遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを代表する値と、ILK、アルファパルビン及びPINCH遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるILK、アルファパルビン及びPINCH遺伝子の併せた又は個々の低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示している方法。発現レベルがマイクロアレイ技術により決定される請求項1に記載の方法。エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法において、患者の腫瘍試料におけるILK、アルファパルビン及びPINCHタンパク質からなる群から選択される1、2又は3のタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるILK、アルファパルビン及びPINCHタンパク質の併せた又は個々の活性化レベルを代表する値と、ILK、アルファパルビン及びPINCHタンパク質の併せた又は個々の活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるILK、アルファパルビン及びPINCHタンパク質の併せた又は個々の低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示している方法。エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法において、患者の腫瘍試料におけるILKタンパク質のリン酸化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるILKのリン酸化レベルを代表する値と、ILKタンパク質のリン酸化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるILKタンパク質の種々のリン酸化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示している方法。ILK、アルファパルビン及びPINCHに併せて関する請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。ILKに関する請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。アルファパルビンに関する請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。PINCHに関する請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。癌がNSCLCである請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。癌患者がゲフィチニブを用いた治療に応答しない請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。エルロチニブ塩酸塩治療に対する癌患者の応答性を予測するための、ILK、アルファパルビン及びPINCH遺伝子からなる群から選択される1、2又は3の遺伝子の使用。癌を治療するためのエルロチニブ塩酸塩の使用であって、i患者の腫瘍試料におけるILK、アルファパルビン及びPINCHタンパク質からなる群から選択される1、2又は3のタンパク質の活性化レベルを決定し、iiILK、アルファパルビン及びPINCH遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるILK、アルファパルビン及びPINCH遺伝子の併せた又は個々の発現レベルの代表値と比較し、iiiエルロチニブ塩酸塩を、ILK、アルファパルビン及びPINCH遺伝子の併せた又は個々の発現レベルが低い患者に投与する、使用。ILKに関する請求項11又は12に記載の使用。アルファパルビンに関する請求項11又は12に記載の使用。PINCHに関する請求項11又は12に記載の使用。癌がNSCLCである請求項11から15のいずれか一項に記載の使用。癌患者がゲフィチニブを用いた治療に応答しない請求項11から16のいずれか一項に記載の使用。明細書に記載された発明。本発明は、本発明を例証するものであってその範囲を限定することを意図したものではない以下の実施例においてさらに記載する。細胞培養H292細胞を、10のFBS及びペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミンが補填されたRPMI1640培地Gibco31870に維持した。1108のH292細胞のペレットを、2.5mLのバッファー150mMのNaCl塩化ナトリウム、1mMのCaCl2塩化カルシウム、MgCl2二塩化マグネシウム、1のNP40ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール、完全EDTAエチレンジアミン四酢酸、遊離プロテアーゼ阻害剤、1mMのオルトバナデート、及び50mMのヘペスに溶解させた。氷上で10分インキュベートした後、可溶化液を12000xg、4°Cで15分遠心分離して清澄化させた。化合物合成と固定エルロチニブ塩酸塩とゲフィチニブを化学的に変性させ、エポキシ活性化セファロース6BビーズGEHealthcareに共有結合させた。エポキシ活性化セファロース6Bへの誘導体のカップリングを、暗所で室温にて一晩、10mMの水酸化ナトリウムNaOHの存在下、50のジメチルホルムアミドDMF/0.1Mの炭酸ナトリウムNa2CO3、pH11において実施した。50のジメチルホルムアミドDMF/0.1Mの炭酸ナトリウムNa2CO3で3回洗浄した後、残存した反応基を1Mのエタノールアミンでブロックした。続いて洗浄工程を製造者の使用説明書に従って実施した。結合効率を、最大吸収波長247及び330nmでカップリング前後に化合物溶液の光学密度を比較することにより推定した。競合実験及びアフィニティークロマトグラフィー500μgの各タンパク質を、濃度を増大させた0、0.0856、0.2862、0.957、3.2、10.7、35.78、119.6及び400μMの最終濃度エルロチニブ塩酸塩又はゲフィチニブと共に、回転させつつ4°Cで1時間プレインキュベートした。ついで、試料を、固定化エルロチニブ塩酸塩又はゲフィチニブを伴う平衡化させたエポキシ活性化セファロースビーズと、回転させつつ4°Cで3時間、混合した。ついで、溶解バッファーでビーズを3回洗浄し、最終的に100μLのSDS充填バッファーに再懸濁させ、85°Cで5分沸騰させ、12000xgで5分、遠心分離した。SDSPAGE溶出試料を4-20のトリスグリシンSDSPAGEInvitrogenEC6025BOXで分離させた。ゲルを40のエタノールと10の酢酸に1時間固定し、クーマシーブルーを使用して一晩染色したInvitrogenLC6025。質量分析ゲル内消化について、Shevchenkoら1996の適合化プロトコルを使用した。簡潔に述べると、ゲルの各レーンを9スライスに切断し、96ウェルProxeonプレートに載せた。ついで、ゲル片をミリQ水及びアセトニトリルで洗浄し、ジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化した。十分に洗浄した後、小片を50ngのトリプシンPromegaV5111と共にインキュベートし、一晩消化させた。消化物の上清を収集し、25mMの重炭酸アンモニウムで1回交換し、続いて5ギ酸で2回交換し、ゲル片からペプチドを抽出した。全ての上清をプールし、乾燥させ、2のアセトニトリル、5のギ酸に再懸濁させ、イオンスプレートラップ質量分析計VelosLTQOrbitrapThermoScientificに連結したナノフロー液体クロマトグラフィーProxeonEASYnLCにより分析した。ペプチド分離を、60分、アセトニトリル勾配に対して、AQUA100ミクロントラップカラムに連結したReproSilPURC18AQUA3μMカラムで実施した。配列同定生データファイルを、SEQUESTサーチアリゴリズム27SEQUESTバージョン270改訂12ThermoElectronを使用して処理した。サーチは、親イオンについては/-10ppm、フラグメントイオンについては/-1.0Daの質量許容差を用い、SwissProtヒトデータベースバージョン48219024エントリーに対して実施した。メチオニン還元/酸化;15.49949Daは差次的修飾と考え、システインは完全にカルバミドメチル化していると考えた58.0133Da。データ解析に対しては、ミス切断が一つ以下の完全なトリプシン性ペプチドのみを考慮した。それらのXCorrスコアが、それぞれ1重、2重及び3重荷電イオンについて、2.0、2.5又は3.0を超え、対応するdCnスコアが0.1より大きい場合に、ペプチドは一義的に同定されたと考えた。この報告において、少なくとも2の異なるペプチドが同定されたタンパク質のみを、定量目的でさらに処理した。GenedataRefinerMS5.2.6による質量分析データ処理各化合物と各バンドについて独立して、それぞれのサーモ生ファイルを、GenedataRefinerMS5.2.6によってロードした:セントロイドデータを破棄してメモリ使用量を減らした。一つのみのスペクトルで生じているシグナルを除去した;試料の全てのデータ表示=クロマトグラフは一般的な2Dm/zRTグリッドで与えた。適切なピーク発見パラメーターに依存するクロマトグラムアラインメントの前に、ピーク発見パラメーターを視覚的に調べた。クロマトグラムアラインメントは、見出された共通のピークに基づくクロマトグラムとトリビアルツリーアルゴリズムの間の保持時間を修正する。この操作の成功は視覚的に調べた。RTレンジ制限はクロマトグラフィーの23-52minの情報リッチ領域の外側のシグナルとデータを破棄する。クロマトグラム平均活性は、全ての入力クロマトグラムの仮想平均クロマトグラムを計算する。ノイズのレベルは、1000au閾値以下のシグナルを除去する強度閾値ワークフローステップにより低減される。RT及びm/z方向のピーク及びそれらの境界が見出されピーク包囲スクエアとして可視化される。スクエアは各クロマトグラムに投影され、eXtractedイオンカウントXICがこれらの境界内で決定される。ピーク当たりの横1列とクロマトグラム当たりの縦1列での得られるスプレッドシートが次のワークフローステップにおけるファイルとしてセーブされる。これらのシグナル境界内に見出されるMS/MSスキャンのスキャンIDが同様にしてセーブされる。ワークフローステップ、それらのオーダーパラメーター及びステップからの診断情報例えば、試料当たりの局所クロマトグラフィーシフトの度合い、見出されたシグナルの数を要約するレポートが作成される。さらなる処理各化合物と各バンドについて独立して、QuantileアプローチSmyth2003を使用して各試料を基準化した。RefinerMSで見出されるピークに、それぞれの測定におけるスキャンIDを介し配列情報を割り当てる。同定されなかった又はより曖昧に同定されたピークは除去される。定量情報はlog2変換される。プロセスコントロールでは、定量データがプリンシパルコンポーネント解析に供される:最初の4つのプリンシパルコンポーネントのスコアを、化合物濃度及びプロセスパラメーター、例えばゲルレーン数、LCMSバッチID又はLCMS実施数と相関させた。マハラノビス距離異常値は、最初の2つのプリンシパルコンポーネントのスコアに基づき推定される;95信頼区間外の試料を異常値とみなし、さらなる解析から除外した。タンパク質代替物にペプチド強度の組合せペプチドをそれらの潜在的タンパク質前駆体に割り当てる。タンパク質前駆体の見出された各組合せに、典型的には唯一のタンパク質メンバー、又はタンパク質及びそのスプライスバリアントの、別のタンパク質定量群を付与する。Irizarryら2003に従い、各タンパク質定量群についての相対的存在量を、基準化されlog変換されたeXtractedイオンカウントXICから得、線形加算モデルに適合させる:XICijn=μinαjnεijnここで、αjはペプチド効果、μiはタンパク質定量群のlogスケール相対的存在量、εijは平均0の独立で同一の分布に従う誤差項である。Irizarryら2003及びHolderら2001に記載されているようにして、メディアンポリッシュを使用してモデルパラメーターを確実に推定する。有意な用量応答の検出ヒロツHirotsuコントラスマトリックスを、番号付けした化合物濃度Bretzら2001を参照から誘導し、最初及び最後のコントラストを除外する。調整統計TSCを各コントラスト及びタンパク質定量群から得るSmythら2004を参照。各タンパク質定量群について、TMC=最大値TSCを得るBretzら2001を参照。P値を、Westfall及びYoung1993によって考案され、Geら2003に基づく1000順列を用い、ステップダウン最大T調節p値についてのアルゴリズムに基づいて得る。|T|ではなくTを選択することにより、統計の一方性に対して修正する。可視化と任意の計算はR2.10.1引用Rで実施する。タンパク質シグナル減少率ゲフィチニブエルロチニブ塩酸塩ILK00773PINCH00877アルファパルビン00795他のNSCLC細胞株における結合プロファイルの確認H292、H441、H460及びH1299細胞を、10の仔ウシ血清及び2mmol/LのLグルタミンが補填されたRPMI1640培地に維持した。化合物合成、固定及びアフィニティークロマトグラフィーは上述したようにして実施した。ThermoFinniganLCQDecaXに連結したLCシステムLCPackingsで質量分析を実施した。簡潔に述べると、ペプチド抽出物5のアセトニトリル、0.5の酢酸、0.012のHFBAヘプタフルオロ酪酸、1のギ酸中をトラップカラムPepMapTMC18、5μmLCPackings、内径5mm×300mmに20μL/分で充填した。続いて、ペプチドを分析用カラムMagicC18TM、5μmSpectronex、内径10cm×75μmにおいて溶媒A5のアセトニトリル、0.5の酢酸、0.012のHFBAに移した。溶離は、8分の5から15の溶媒B80v/vのアセトニトリル中、0.5の酢酸、0.012のHFBA、65分の15から38の溶媒B、及び25分の38から80の溶媒Bの3ステップの線形勾配で実施した。カラム溶離液は質量分析計のESI源に直接導入した。質量分析計はポジティブイオンモードで操作し、親イオンをデータ依存方式でフラグメント化のために選択した。生のMS/MSデータを、SEQUESTversion27を使用してヒトSwissProtデータベースに対して探索した。パラメーターは、一つの切断ミスと1.5Daのペプチド質量許容を含んでいた。TGFベータ3治療時に上皮から間葉系状態にスイッチすることが以前に記載されているモデルNSCLC細胞株H358を使用したThomson2008。結果は、TGFベータ3処理の13日後にEカドヘリンの減少を示しており、細胞が実際に転移していることが示されている図5a。TGFベータ3及びエルロチニブで処理されたH358細胞中のEカドヘリンのレベルは、TGFベータ3及びゲフィチニブで処理された細胞における場合とは異なり、未変化のままであった。ウエスタンブロットシグナルの定量は、未処理細胞と、TGFベータ3で13日間処理された細胞の間でEカドヘリンのレベルが1/3以上低減していることを示している図6b。エルロチニブを用いた処理はこの減少を防止しているが、ゲフィチニブはEカドヘリンレベルのTGFb3媒介性減少の阻害に失敗している図5b。ILK及びPINCH発現に対する効果は、TGFb3処理後に双方のタンパク質のレベルが増加することを示している図5c及びd。ILK及びPINCH発現レベルは、細胞がエルロチニブで処理されても変化せず、ゲフィチニブ処理時においても明白な効果はなかった。よって、このEMTモデルは、エルロチニブが、Eカドヘリンの損失を阻害することによってEMTの程度を低減することを示しており、ILK及びPINCHのTGFb3媒介性の増加が防止されることが示唆される。複合体ILK、アルファパルビン及びPINCHの3つの成分を、個々の基準に基づいて研究し、複合体全体の発現の可能性がEMT状態に相関していることに取り組んではいない。8つのEGFR野生型NSCLC細胞株を、この状態に基づいて選択しThomson2005;Thomson2008、上皮マーカーとしてEカドヘリン、間葉系マーカーとしてビメンチンの発現によって評価した。全てのIPPタンパク質を、H358におけるアルファパルビンを除き、8つ全ての細胞株で様々な強度で検出した図6a。定量及び基準化の後、IPP複合体強度の全合計は、上皮細胞に対して間葉系は1.8倍高かった。PINCH1は最も高く発現したタンパク質であり上皮及び間葉系細胞それぞれにおいて、全IPP発現の56及び58、ついでILK25及び22、アルファパルビン19及び20であった図6b。Eカドヘリン及びILK発現IPPとEMTに関与するより広範囲の遺伝子との間の潜在的関連性を評価した。特に、エルロチニブに対して臨床的利益を有する患者及び有さない患者におけるそれらの発現プロファイル間の差である。全体で21の事前選択された遺伝子のうち16のみが、検出されたプローブセットで同定され、統計的に解析された。31のプローブセット16の独特な遺伝子に対応のなかで、臨床的利益を有する患者及び有さない患者からの腫瘍試料において、2つが統計的に有意な差次的に発現された。2つの対応する遺伝子はILKとCDH1Eカドヘリンであり、これらは、臨床的利益を有する患者においてそれぞれダウンレギュレート0.93倍、p=0.011され、アップレギュレート1.38倍、p=0.033されている。EGFR及びILK結晶タンパク質構造のアラインメントEGFR結合エルロチニブ又はゲフィチニブの公的に入手可能な結晶構造pdbファイル及びアデノシン三リン酸ATPと複合したILKの結晶構造を結晶データベースPDBBerman2000pdbコード1M17、2ITY、3KMW;Stamos2002;Yun2007;Fukuda2009からダウンロードした。3つのキナーゼ構造を、ATP結合部位を形成する残基サブセットのCα原子からの座標を使用して構造的に整列させたEGFR番号付けに基づく残基番号691-693、701-703、719-72191、751、766-772、820-823、831-832。アラインメント及び距離測定はPyMOL可視化パッケージを用いて実施した。H358NSCLC細胞株でのEMT転移試験H358細胞を、3、6、10及び13日間、組換え10ng/mLのTFGβ3PeprotechNewYorkNYUSA及びエルロチニブ又はゲフィチニブ5μMで処理した。細胞培養培地は3日毎に新しくした。細胞溶解を1のNP40及びプロテアーゼ阻害剤を含むPBSで実施した。4°Cで12000gで15分、遠心分離によって清澄化させた後、タンパク質をSDSPAGEにより分離させ、ウエスタンブロット分析で処理した。コンパクトデジタルカメラLuminescentImageAnalyzerFujifilmTokyoJapanを使用して画像を得、ImageQuantTLGEHealthcareWaukeshaWIUSAを用いて定量した。MERITデータの解析遺伝子発現プロファイルを、エルロチニブで治療150mg/日したステージIIIb/IVの102名のNSCLC患者からの腫瘍バイオプシー試料で測定した。腫瘍バイオプシーを、AffymetrixGeneChipHumanGenomeU133A2.0ArrayAffymetrixSantaClaraCAUSAを用いた遺伝子発現プロファイリングを使用して解析した。ここに記載された全ての遺伝子発現結果倍数変化及びp値は既に報告されている統計的解析からのものであるTan2010。我々は、エルロチニブからの臨床的利益を有するか又は有さない患者の遺伝子発現プロファイル間の差異を特に調べた。EMTの転写調節又はIPP複合体に潜在的に関与している次の21のタンパク質を、対応する遺伝子及びマイクロアレイプローブセットにマッピングした:Twist,Snail[Sma1],Zeb[TCF8],Lef1,E12/E47塩基性ループヘリックス[bHLH],Slug[Sma2],E-カドヘリン[CDH1],Nカドヘリン[CDH2],Myc,ビメンチン,カテニンベータ,カテニンデルタ,フィブロネクチン,エピモルフィン,インテグリン結合キナーゼ[ILK],Parvinアルファ,パルビンベータ,PINCH1,PINCH2,転移関連タンパク質3[MTA3],Yボックス結合タンパク質1[YB-1]。文献ShevchenkoA;WilmM;VormO;MannMMassspectrometricsequencingofproteinssilverstainedpolyacrylamidegelsAnalChem1996;6885058SmythGK及びSpeedTP2003NormalizationofcDNAmicroarraydataMethods31p265273SmythGKMichaudJ及びScottH2005TheuseofwithinarrayreplicatespotsforassessingdierentialexpressioninmicroarrayexperimentsBioinformatics21920672075IrizarryRAHobbsBCollinFBeazerBarclayYDAntonellisKJScherfUSpeedTP2003ExplorationnormalizationandsummariesofhighdensityoligonucleotidearrayprobeleveldataBiostatisticsApr4224964HolderDRaubertasRFPikounisVBSvetnikVandSoperK2001StatisticalanalysisofhighdensityoligonucleotidearraysaSAFERapproachProceedingsoftheASAAnnualMeeting2001AtlantaGABretzFHothornLA2001TestingdoseresponserelationshipswithaprioriunknownpossiblynonmonotoneshapesJBiopharmStat113193207SmythGK2004LinearmodelsandempiricalbayesmethodsforassessingdifferentialexpressioninmicroarrayexperimentsStatApplGenetMolBiol;3Article3Epub2004Feb12BretzFHothornLA2002DetectingdoseresponseusingcontrastsasymptoticpowerandsamplesizedeterminationforbinomialdataStatMed20022122332535PHWestfall及びSSYoung1993ResamplingbasedmultipletestingExamplesandmethodsforpvalueadjustmentJohnWileySonsAlgorithm41p116117RDevelopmentCoreTeam2009RAlanguageandenvironmentforstatisticalcomputingRFoundationforStatisticalComputingViennaAustriaISBN3900051070URLhttpwwwRprojectorgGeYら2003ResamplingbasedmultipletestingformicroarraydataanalysisTest121177Thomsonら;2005;CancerRes;65;94559462TakanamiI;2005;BMCCancer;5;17BermanHMWestbrookJFengZGillilandGBhatTNWeissigHShindyalovINandBournePE2000TheProteinDataBankpp235242StamosJSliwkowskiMX及びEigenbrotC2002Structureoftheepidermalgrowthfactorreceptorkinasedomainaloneandincomplexwitha4anilinoquinazolineinhibitorJBiolChem2774626546272YunCHBoggonTJLiYWooMSGreulichHMeyersonM及びEckMJ2007StructuresoflungcancerderivedEGFRmutantsandinhibitorcomplexesmechanismofactivationandinsightsintodifferentialinhibitorsensitivityCancerCell11217227FukudaKGuptaSChenKWuC及びQinJ2009ThepseudoactivesiteofILKisessentialforitsbindingtoalphaParvinandlocalizationtofocaladhesionsMolCell36819830TanEHRamlauRPluzanskaAKuoHPReckMMilanowskiJAuJSFelipEYangPCDamyanovDOrlovSAkimovMDelmarPEssiouxLHillenbachCKlughammerBMcLoughlinP及びBaselgaJ2010AmulticentrephaseIIgeneexpressionprofilingstudyofputativerelationshipsbetweentumourbiomakersandclinicalresponsewitherlotinibinnonsmallcelllungcancerAnnOncol21217222YauchRLJanuarioTEberhardDACavetGZhuWFuLPhamTQSorianoRStinsonJSeshagiriSModrusanZLinCYONeillV及びAmlerLC2005EpithelialversusmesenchymalphenotypedeterminesinvitrosensitivityandpredictsclinicalactivityoferlotinibinlungcancerpatientsClinCancerRes1186868698CabodiSDelPilarCamachoLealMDiStefanoP及びDefilippiP2010IntegrinsignallingadaptorsnotonlyfigurantsinthecancerstoryNatRevCancer10858870ThomsonSBuckEPettiFGriffinGBrownERamnarineNIwataKKGibsonN及びHaleyJD2005EpithelialtomesenchymaltransitionisadeterminantofsensitivityofnonsmallcelllungcarcinomacelllinesandxenograftstoepidermalgrowthfactorreceptorinhibitionCancerRes6594559462ThomsonSPettiFSujkaKwokIEpsteinD及びHaleyJD2008KinaseswitchinginmesenchymallikenonsmallcelllungcancerlinescontributestoEGFRinhibitorresistancethroughpathwayredundancyClinExpMetastasis25843854SinghA及びSettlemanJ2010EMTcancerstemcellsanddrugresistanceanemergingaxisofevilinthewaroncancerOncogene2947414751OloumiAMcPheeT及びDedharS2004RegulationofEcadherinexpressionandbetacateninTcftranscriptionalactivitybytheintegrinlinkedkinaseBiochimBiophysActa1691115"