"1つ以上の目的のFnIIIドメインFOIに由来する2つのフィブロネクチンIII型FnIII単量体足場を含んでいる組み換え多量体足場であって、ここでa各々のFnIII単量体足場は、複数のループ領域に連結された複数のβ鎖を含んでおり、b前記FnIII単量体足場は、直列して接続され、ここで前記単量体のうちの少なくとも1つは、天然には存在しない分子内ジスルフィド結合を含み、c前記組み換え多量体足場は、少なくとも1つの標的に対して特異的に結合し、かつd前記標的に対する作用は、同族のFnIII単量体足場の作用よりも改善されている、多量体足場。前記多量体足場が、3、4、5、6、7、または8個のFnIII単量体足場を含む、請求項1に記載の多量体足場。前記FnIII単量体足場の全てが、直鎖直列方式で接続される、請求項2に記載の多量体足場。前記少なくとも2つのFnIII単量体足場が、天然には存在しない分子内ジスルフィド結合を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の多量体足場。前記多量体足場が、少なくとも2つの標的に結合する、請求項1~4のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場が、直接、リンカーによって、または異種部分によって、2、3、4、5もしくは6個の他のFnIII単量体足場に接続される、請求項2~5のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも2つのFnIII単量体足場がリンカーによって接続される、請求項6に記載の多量体足場。少なくとも2つのFnIII単量体足場が、FnIII単量体足場の間にリンカーを割り込むことなく直接接続される、請求項1~7のいずれか1項に記載の多量体足場。1つ以上の目的のFnIIIドメインFOIに由来する3つのフィブロネクチンIII型FnIII単量体足場を含む組み換え多量体足場であって、ここでa各々のFnIII単量体足場は、複数のループ領域に連結された複数のβ鎖を含み、b前記組み換え多量体FnIII足場が少なくとも1つの標的に特異的に結合し、かつc前記標的に対する作用が、同族のFnIII単量体足場の作用よりも改善されている、多量体足場。前記多量体足場が、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のFnIII単量体足場を含む、請求項9に記載の多量体足場。前記FnIII単量体足場の全てが、直鎖直列方式で接続される、請求項10に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場が、天然には存在しない分子内ジスルフィド結合を含む、請求項9~11のいずれか1項に記載の多量体足場。前記多量体足場が、少なくとも2つの標的に結合する、請求項9~12のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場が、直接、リンカーによって、または異種部分によって、2、3、4、5もしくは6個の他のFnIII単量体足場に接続される、請求項9~13のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも2つのFnIII単量体足場がリンカーによって接続される、請求項9~14のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも2つのFnIII単量体足場が、FnIII単量体足場の間にリンカーを割り込むことなく直接接続される、請求項9~15のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場における前記複数のβ鎖が、A、B、C、D、E、F、およびGと命名された7つのβ鎖を含む、請求項1~16のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場中の複数のループ領域が、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGと命名された6つのループ領域を含む、請求項1~16のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場について、同族のFnIII単量体足場のものよりも結合が改善されており、前記改善は、結合親和性および/または結合力の改善におけるものである、請求項1~18のいずれか1項に記載の多量体足場。標的に対する結合親和性およびタンパク質安定性が、同族のFnIII単量体足場のものよりも改善されている、請求項19に記載の多量体足場。標的に対する結合力およびタンパク質安定性が、同族のFnIII単量体足場のものよりも改善されている、請求項19に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場が、少なくとも2つの天然には存在しない分子内ジスルフィド結合を含む、請求項1~21のいずれか1項に記載の多量体足場。前記リンカーが、ペプチドリンカーを含む、請求項6、7、14または15のいずれか1項に記載の多量体足場。前記ペプチドリンカーが、可塑性のペプチドリンカーである、請求項23に記載の多量体足場。前記リンカーが、官能性成分を含む、請求項6または14のいずれか1項に記載の多量体足場。前記官能性成分が、免疫グロブリンまたはそのフラグメントである、請求項25に記載の多量体足場。前記FnIII単量体足場のうちの少なくとも1つが異種部分に融合されている、請求項1~26のいずれか1項に記載の多量体足場。前記FnIII単量体足場のうちの3つ以上が、リンカーによって接続され、ここで少なくとも1つのリンカーが他のリンカーとは構造的におよび/または機能的に異なる、請求項6、7、14または15のいずれか1項に記載の多量体足場。前記FnIII単量体足場が分岐方式で接続される、請求項2、4~8、10または12~28のいずれか1項に記載の多量体足場。いくつかのFnIII単量体足場が直鎖直列方式で接続され、いくつかのFnIII単量体足場が、分岐方式で接続される、請求項2、4~8、10または12~28のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも2つのFnIII単量体足場が同一である、請求項1~30のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも2つのFnIII単量体足場が異なる、請求項1~31のいずれか1項に記載の多量体足場。前記多量体足場が、受容体アゴニストである、請求項1~32のいずれか1項に記載の多量体足場。前記多量体足場が受容体アンタゴニストである、請求項1~33のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも2つのFnIII単量体足場が同じ標的に同じエピトープで結合する、請求項1~34のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも2つのFnIII単量体足場が、同じ標的に異なるエピトープで結合する、請求項1~35のいずれか1項に記載の多量体足場。前記異なるエピトープが、重複しないエピトープである、請求項36に記載の多量体足場。前記異なるエピトープが、重複するエピトープである、請求項36に記載の多量体足場。少なくとも1つのFOIが、動物のFnIIIドメイン、細菌のFnIIIドメイン、古細菌のFnIIIドメイン、およびウイルスのFnIIIドメインからなる群より選択される、請求項1~38のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも1つのFOIが、配列番号1~34、59、69のいずれか1つ、および図16に示される任意の配列からなる群より選択される配列を含む、請求項39に記載の多量体足場。少なくとも1つのFOIが、超好熱性古細菌由来のFnIIIドメインである、請求項39に記載の多量体足場。前記動物のFnIIIドメインが、ヒトテネイシンCの第三のFnIIIドメイン配列番号4またはその機能的フラグメントを含む、請求項39に記載の多量体足場。前記動物のFnIIIドメインが、ヒトフィブロネクチンの第14のFnIIIドメイン配列番号69またはその機能的フラグメントを含む、請求項39に記載の多量体足場。前記動物のFnIIIドメインが、ヒトフィブロネクチンの第10のFnIIIドメイン配列番号64またはその機能的フラグメントを含む、請求項39に記載の多量体足場。各々のFnIII単量体のFOIが、ヒトテネイシンCの第3のFnIIIドメイン配列番号4またはその機能的フラグメントを含む、請求項39に記載の多量体足場。前記機能的なフラグメントが、ヒトテネイシンCの第3のFnIIIドメイン配列番号14のN末端短縮型である、請求項42または45のいずれか1項に記載の多量体足場。前記FnIII単量体足場のうちの少なくとも1つのβ鎖が、配列番号4における同族のβ鎖に対して少なくとも90配列同一性を有する、請求項17に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場について、Aβ鎖ドメインが、配列番号41または42を含み、Bβ鎖が、配列番号43を含み、Cβ鎖が配列番号44または131を含み、Dβ鎖が配列番号46を含み、Eβ鎖が配列番号47を含み、Fβ鎖が配列番号48を含み、かつGβ鎖が配列番号52を含む、請求項17に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場について、ABループが、配列番号35を含み、CDループが配列番号37を含み、かつEFループが配列番号39を含む、請求項18に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場について、BCループが、配列番号36を含み、DEループが配列番号38を含み、かつFGループが配列番号39を含む、請求項18に記載の多量体足場。ABループが、配列番号35を含み、BCループが配列番号97、98、99、100、または101を含み、CDループが配列番号37を含み、DEループが配列番号38、102、103、104、または105を含み、EFループが配列番号39を含み、かつFGループが配列番号106、107、108、109、110または111を含む、請求項18に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場について、Aβ鎖が配列番号41または42を含み、Bβ鎖が、配列番号43を含み、Cβ鎖が配列番号45または131を含み、Dβ鎖が配列番号46を含み、Eβ鎖が配列番号47を含み、Fβ鎖が配列番号49、50または51を含み、かつGβ鎖が配列番号52または53を含む、配列番号17に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場のFOIが、配列番号1、配列番号2および配列番号3からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項52に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場が以下のアミノ酸配列を含み:IEVXABnALITWXBCnCELX1YGIXCDnTTIDLXDEnYSIXEFnYEVSLICXFGnKETFTT、ここでXAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGのループに存在するアミノ酸残基を表し、X1は、アミノ酸残基AまたはTを表し、かつここでループの長さnは、2と26との間の整数である、請求項17に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場が以下のアミノ酸配列を含み:IEVXABnALITWXBCnIELX1YGIXCDnTTIDLXDEnYSIXEFnYCVSLISXFGnKECFTT、ここでXAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGのループに存在するアミノ酸残基を表し、X1は、アミノ酸残基AまたはTを表し、かつループの長さnは、2と26との間の整数である、請求項17に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場が以下のアミノ酸配列を含み:IEVXABnALITWXBCnCELX1YGIXCDnTTIDLXDEnYSIXEFnYCVSLICXFGnKECFTT、ここでXAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGのループに存在するアミノ酸残基を表し、X1は、アミノ酸残基AまたはTを表し、かつここでループの長さnは、2と26との間の整数である、請求項17に記載の多量体足場。前記ABループが配列番号35を含み、前記CDループが配列番号37を含み、かつ前記EFループが配列番号39を含む、請求項54~56のいずれか1項に記載の多量体足場。前記BCループが配列番号36を含み、前記DEループが配列番号38を含み、かつ前記FGループが配列番号40を含む、請求項54~56のいずれか1項に記載の多量体足場。前記少なくとも1つのBCループ、DEループまたはFGループがループ変異体である、請求項54~57のいずれか1項に記載の多量体足場。前記BCループが、配列番号97、98、または168を含む、請求項59に記載の多量体足場。前記DEループが、配列番号102または103を含む、請求項59に記載の多量体足場。前記FGループが、配列番号106、108、109、169または170を含む、請求項59に記載の多量体足場。前記少なくとも1つのFnIII単量体足場の増大されたタンパク質安定性は、示差走査熱量測定DSC、円偏光二色性CD、ポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGE、プロテアーゼ耐性、等温熱量測定ITC、核磁気共鳴NMR、尿素変性またはグアニジン変性によって測定される、請求項20または21のいずれか1項に記載の多量体足場。少なくとも1つのFnIII単量体足場が、親和性成熟されている、請求項1~63のいずれか1項に記載の多量体足場。組み換え多量体足場を得るための方法であって、目的の1つ以上の野性型FnIIIドメインFOI由来の2つのフィブロネクチンIII型FnIII単量体足場を発現するか、融合するかまたは複合することを含み、ここでa各々のFnIII単量体足場は、複数のループ領域に連結された複数のβ鎖を含み、bFnIII単量体足場は、直列して接続され、ここで前記FnIII単量体足場のうちの少なくとも1つは、1つの天然には存在しない分子内ジスルフィド結合を含み、c前記組み換え多量体足場は、少なくとも1つの標的に特異的に結合し、かつd前記標的に対する作用は、同族のFnIII単量体足場のものよりも改善されている、方法。目的の1つ以上の野性型FnIIIドメインFOI由来の少なくとも3つのフィブロネクチンIII型FnIII単量体足場を発現するか、融合するかまたは複合することを含む、組み換え多量体足場を得るための方法であって、ここでa各々のFnIII単量体足場は、複数のループ領域に連結された複数のβ鎖を含み、b組み換え多量体FnIII足場は、少なくとも1つの標的に特異的に結合し、かつc前記標的に対する作用は、同族のFnIII単量体足場のものよりも改善されている、方法。前記FOIが、配列番号1~34、54、69のうちのいずれか1つ、および図16に示される任意の配列からなる群より選択される配列を含む、請求項65または66のいずれかに記載の方法。請求項65または66のいずれか1項に記載の方法によって生成される組み換え多量体足場。請求項1~64または68のいずれか1項に記載の多量体足場をコードする単離された核酸分子。請求項69に記載の核酸に対して作動可能に連結された発現ベクター。請求項70に記載のベクターを含む宿主細胞。核酸分子によってコードされる前記多量体足場が発現される条件下で、請求項71に記載の宿主細胞を培養することを含む、組み換え多量体足場を産生する方法。薬学的に許容される賦形剤中に請求項1~64または68のいずれか1項に記載の組み換え多量体足場を含む組成物。治療が必要な患者において、癌、自己免疫障害、炎症性障害、または感染を治療するための方法であって、請求項73に記載の組成物の有効量を投与することを含む、方法。サンプル中のタンパク質を検出する方法であって、請求項1~64または68の多量体FnIII足場または複合体を標識することと、標識された多量体FnIII足場または複合体とサンプルとを接触させることと、多量体FnIII足場または複合体とタンパク質との間の複合体形成を検出することとを含む、方法。前記異種部分が、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬物、毒素、細胞毒性剤、造影剤、放射性核種、放射性化合物、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコールPEG、ビオチン、ヒト血清アルブミンHSA、HSAFcRn結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体フラグメント、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非FnIII足場、エピトープタグ、組み換えポリペプチドポリマー、サイトカインおよび上記部分のうち2つ以上の組み合わせからなる群より選択される組成物を含む、請求項27に記載の多量体足場。発明の詳細な説明定義本発明を詳細に記載する前に、具体的な組成物またはプロセスステップを変更してもよいという理由から、本発明は、これらに限定されないことは理解されたい。本明細書および添付の請求項で使われる単数形a、anおよびtheは、文脈から明確に別義が指示されない限り、複数参照対象を含むことに留意しなければならない。aまたanという用語、ならびに1つまたは複数の、および少なくとも1つのという用語は、本明細書では同義に使用することができる。さらに、および/またはは、本明細書で使用される場合は、他方を含め、または含めない、2つの特定された特徴または要素のそれぞれの特定的開示と解釈すべきである。従って、本明細書の語句、例えば、Aおよび/またはBで使用されるおよび/またはという用語は、AおよびB、AまたはB、A単独、およびB単独を含むことが意図されている。同様に、語句、例えば、A、B、および/またはCで使用されるおよび/またはという表現は、次の実施形態のそれぞれを包含することが意図されている:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A単独;B単独;およびC単独。特に断らなければ、本明細書で使われる全ての技術的科学的用語は、本発明が関連する当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。例えば、theConciseDictionaryofBiomedicineandMolecularBiology、Juo、Pei-Show、2nded.、2002、CRCPress;TheDictionaryofCellandMolecularBiology、3rded.、1999、AcademicPress;andtheOxfordDictionaryOfBiochemistryAndMolecularBiology、Revised、2000、OxfordUniversityPress、は、本発明で使用されている多くの用語の一般的辞書を当業者に提供する。単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系SIで認められた形式で表示される。数値の範囲は、範囲を定める数値を含む。他に指示がない限り、アミノ酸配列は、左から右へアミノからカルボキシの方向へ記述される。本明細書で記載される表題は、本発明の種々の態様または実施形態を限定するものではなく、これら態様または実施形態は明細書全体への参照により理解することができる。従って、すぐ後で定義される用語は、明細書全体への参照によりより完全に定義される。実施形態が、本明細書で用語~を含むcomprisingを用いて記載される場合はいつでも、~からなるconsistingofおよび/または基本的に~からなるconsistingessentiallyofの用語で記載されるそれ以外の類似の実施形態もまた提供されることは理解されよう。アミノ酸は、本明細書では、IUPAC-IUB生化学命名法に関する委員会IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommissionにより推奨されているそれらの一般に知られている3文字記号または1文字記号により参照される。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常受け入れられている単一文字コードにより参照される。本明細書で使われるエピトープという用語は、本発明の足場に結合できるタンパク質決定因子を指す。エピトープは、通常、化学的に活性な表面分子集団、例えば、アミノ酸または糖側鎖からなり、通常は、特異的3次元的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。立体構造および非立体構造エピトープは、変性溶剤の存在下で前者に対する結合が失われ、後者に対しては失われないことから区別される。フィブロネクチンタイプIIIFnIIIドメイン、FnIIIドメインという用語は、ヒトフィブロネクチンタイプIIIドメインに相同なポリペプチドを指し、これは少なくとも7つのベータ鎖を有し、それらのベータ鎖は2つのベータシート間に分布し、それら自信で相互に詰め合わせてタンパク質のコアを形成し、さらに相互にベータ鎖を連結する溶媒露出ループを含む。ベータシートサンドイッチの各エッジに少なくとも3つのこのようなループがあり、このエッジは、ベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である。ある特定の実施形態では、FnIIIドメインは、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGと命名された6つのループ領域に結合したA、B、C、D、E、F、およびGと命名された7つのベータ鎖を含み、ループ領域は、各ベータ鎖を連結している。図16は、3次元構造の分析に基づく多くのFnIIIドメインに対するベータ鎖およびループの一次配列位置を提供する。これらの領域の別の定義が当技術分野で知られていることは留意されるべきである。しかし、これらのFnIIIドメインに対し、A鎖のN末端および/またはG鎖のC末端が切断型である可能性があることがわかることを除いて、別義が明確に指示されていない限り、図16の定義が、本明細書で使用される。フィブロネクチンタイプIIIFnIIIドメインおよびFnIIIドメインという用語はまた、InterProScanプログラムを使って測定して、InterproIPR008957フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むことが認識されている、またはPfam_スキャン、HMMER、もしくはタンパク質配列をFnIIIドメイン記述HiddenMarkovモデルと比較できる当技術分野で既知の他のいずれかのプログラムを使って測定して、PfamPF00041フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むことが認識されているタンパク質ドメインを含む。さらに、この用語は、機能性断片および操作FnIIIドメイン、例えば、コア操作されたFnIIIドメインを含む例えば、Ngetal.、Nanotechnology19:384023、2008参照。フィブロネクチンタイプIIIFnIII足場またはFnIII足場という用語は、FnIIIドメイン、またはその機能的断片を含むポリペプチドを指し、少なくとも1つのループは、対象FnIIIドメイン/足場の非天然変異体であり、さらに前記FnIII足場、またはその機能的断片は、標的に結合できる。またこの本明細書中の結合という用語は、特異的結合に関するのが好ましい。本明細書で使われる非天然変異体は、出発タンパク質配列例えば、対象FnIIIドメイン/足場中の同種の配列由来の少なくとも1つのアミノ酸による欠失、置換または付加により変動してもよく、出発タンパク質配列は、自然FnIIIドメイン配列または以前同定したFnIII足場配列であってもよい。ある特定の実施形態では、Aベータ鎖は、切断されている、例えば、1つまたは複数のAベータ鎖のN末端残基が欠失してもよい。ある特定の実施形態では、Gベータ鎖は切断されている、例えば、1つまたは複数のGベータ鎖のC末端残基が欠失してもよい。ある特定の実施形態では、FnIII足場は、1つまたは複数のベータ鎖の非天然変異体を含む。ある特定の実施形態では、FnIII足場のベータ鎖は、下記のベータ鎖に対して、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超の配列相同性を示す:配列番号1~34、54、もしくは69のいずれかの同種のベータ鎖の一次配列、もしくは図16のFnIIIのいずれかのベータ鎖の一次配列、またはInterProScanプログラムを使って測定して、InterproIPR008957フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャaを含むことが認識されている、もしくはPfamスキャン、HMMER、もしくはタンパク質配列をHiddenMarkovモデルと比較できる他のいずれかのプログラムを使って測定して、PfamPF00041フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むことが認識されているタンパク質ドメインのベータ鎖。DNAという用語は、2つ以上の共有結合で結合した、天然または改変デオキシリボヌクレオチドの配列を指す。融合タンパク質という用語は、i1つまたは複数の本発明の足場、およびこれが結合したii第2の別のタンパク質すなわち異種のタンパク質を含むタンパク質を指す。本明細書で使われる異種の成分という用語は、本発明の足場に対する組成物の追加を示すのに使われ、その組成物は、FnIIIドメインの通常の部分ではない。代表的異種の成分には、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬剤、毒素、造影剤、放射性化合物、有機および無機のポリマー、ならびにFnIIIドメイン自体に固有ではない活性を提供可能な他のいずれかの組成物が含まれ、また、この活性提供可能組成物には、限定されないが、ポリエチレングリコールPEG、細胞障害性の試薬、放射性核種、造影剤、ビオチン、二量体化ドメイン例えば、ロイシンジッパードメイン、ヒト血清アルブミンHSAもしくはそのFcRn結合部分、抗体ドメインもしくは断片例えば、抗体可変ドメイン、CH1ドメイン、Cカッパドメイン、Cラムダドメイン、CH2、またはCH3ドメイン、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、IgG分子、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非FnIII足場、エピトープタグ、組換え型ポリペプチドポリマー、サイトカイン、等、が含まれる。本明細書で使われるリンカーという用語は、2つ以上の足場を結合またはこれらを連結するいずれの分子集合体をも指す。リンカーは、足場のモジュール間のスペーサーとして作用する機能を有する分子であってもよく、また追加の機能すなわち、官能性成分を有する分子であってもよい。異種の成分の定義に含まれる分子もまた、リンカーとして機能することができる。結合されたlinkedおよび融合されたfusedという用語は、同義に使用される。これらの用語は、化学の結合または組換え型手段を含む意味を有する全ての作用により、2つ以上の足場、異種の成分、またはリンカーを結合することを指す。多量体多量体足場および多価足場という用語は、会合している少なくとも2つのFnIII足場を含む分子を指す。多量体足場を形成する足場は、各足場を独立に機能させるリンカーを介して結合できる。多量体および多価は、本明細書では同義に使用できる。多価足場は、単一特異性でも、二重特異性でもよい。ドメインまたはタンパク質ドメインという用語は、多くの場合残りのタンパク質とは無関係に、安定な3次元構造に折り畳み可能なタンパク質の領域を指し、これは特有の機能を備えることができる。この構造は、元のタンパク質内のドメインの機能に関連した、酵素活性、別の分子に対する認識モチーフの形成、等の特異的機能を保持し、またはタンパク質が、タンパク質の特定の環境中で存在するために必要な構造成分を提供する。タンパク質ファミリーおよび関連タンパク質スーパーファミリーの両方の内で、タンパク質ドメインは、進化上保存領域でありうる。多量体足場の成分を記述する場合、ドメイン、モノマー足場、およびモジュールという用語は、同義に使用される。自然FnIIIドメインは、生体によりコードされるいずれかの非組換え型FnIIIドメインを意味する。タンパク質配列に関連した配列相同性という用語は、2つ以上のタンパク質配列間の類似性、すなわち、同一または保存的アミノ酸置換であるアミノ酸残基のパーセンテージを指す。本明細書で使用される配列類似性パーセントおよび相同性パーセントという用語は、等価と見なされ、最大パーセント配列類似性を得るためにアミノ酸配列を整列させ、必要に応じ、候補および/または選択配列中にギャップを導入後の、選択配列中のアミノ酸残基と同一か、またはそれの保存的置換である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。同一性パーセントは、本明細書では、最大パーセント配列同一性を得るためにアミノ酸配列を整列させ、必要に応じ、候補および/または選択配列中にギャップを導入後の、選択配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部とは見なしていない。本明細書で使われる保存的置換という用語は、別の、生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。保存的置換の例には、1つのアミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、またはメチオニンの別の疎水性残基での置換、または1つの極性残基の別の極性残基残基での置換、例えば、アルギニンのリシンによる置換およびその逆、グルタミン酸のアスパラギン酸による置換およびその逆、グルタミンのアスパラギンによる置換およびその逆等が含まれる。相互に置換可能な中性の親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニンが含まれる。保存的置換という用語は、また、ペプチドの生物学的活性が維持されることが前提として、未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用を含む。。アミノ酸残基間の生物学的類似性は、限定されないが、例えば、疎水性、変異頻度、電荷、側鎖長、側鎖容積、pKa、極性、芳香族性、溶解度、表面積、ペプチド結合の幾何学的配置、二次構造性向、平均溶媒露出度、等、の特性間の類似性を指す。相同性パーセントすなわち、配列類似性または同一性パーセントを決めるための整列化は、例えば、公になっている、または独占的アルゴリズムを使って当分野の技術範囲内の種々の方法で行うことができる。例えば、配列類似性は、対での整列化方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、もしくはALIGN-2、または複数の配列整列化方法、例えば、MegalignDNASTAR、ClustalWもしくはT-Coffeeソフトウェアを使って決定可能である。当業者なら、比較される完全長配列に対し最適整列化特性を得るために必要なあらゆるアルゴリズムを含む、適切なスコアリング関数、例えば、整列化測定用ギャップペナルティまたはスコアリングマトリクスを決定することができる。さらに、当業者は、ある特定の折り畳み、例えば、FnIII折り畳みを有するタンパク質を特定する方法、およびこのようなタンパク質のアミノ酸配列を整列させる方法には、配列-配列法、配列-プロファイル法、およびプロファイル-プロファイル法が含まれることを理解しているであろう。さらに、配列整列化は、構造的整列化法例えば、二次または三次構造情報を使って2つ以上の配列を整列させる方法、または配列の、構造的、および系統学的情報を組み合わせて候補タンパク質配列を特定し、これを至適に整列させるハイブリッド法を使って行うことができる。タンパク質配列またはアミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端方向のポリペプチド中のアミノ酸成分の線状表現を意味し、その表現中で相互に隣接している残基は、ポリペプチドの一次構造中で連続している。核酸という用語は、2つ以上の共有結合しているヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体または誘導体のいずれをも指す。本明細書で使われるこの用語には、限定されないが、DNA、RNA、およびPNAが含まれる。核酸およびポリヌクレオチドは、本明細書では同義に使われる。ポリヌクレオチドという用語は、単一核酸ならびに複数核酸を包含することが意図され、単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーRNAmRNAまたはプラスミドDNApDNAを指す。単離核酸またはポリヌクレオチドという用語は、自然環境から取り出された核酸分子、DNAまたはRNAを指すことが意図される。例えば、ベクター中に含まれた本発明の足場をコードする組換え型ポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞中に維持された組換え型ポリヌクレオチドまたは溶液中の部分的にまたは実質的に精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離RNA分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロRNA転写物が含まれる。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸には、合成により産生されたそのような分子がさらに含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであっても、またはこれらを含んでもよい。薬学的に許容可能なという用語は、顕著な医学的有害結果を伴うことなく動物例えば、哺乳動物に投与可能な化合物またはタンパク質を指す。生理学的に受容可能な担体という用語は、治療されている宿主に有意な顕著な影響を与えず、それとともに投与される、化合物の治療特性を維持できる担体を指す。1つの代表的な生理学的に受容可能な担体は、生理的食塩水である。他の生理学的に受容可能な担体およびその製剤は、当業者には既知であり、また、例えば、レミントンの薬学Remington’sPharmaceuticalSciences、18thedition、ed.A.Gennaro、1990、MackPublishingCompany、Easton、Pa.参照により本明細書に組み込まれる、に記載されている。ポリペプチドは、長さ、翻訳後改変、または機能に関わらず、アミド結合ペプチド結合により直鎖状に連結した2つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質は、本明細書では、同義に使用される。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、またはオリゴペプチドは、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれ、また、ポリペプチドという用語は、これらのいずれの用語に替えて、またはそれらと同義的にも用いることができる。ポリペプチドという用語は、また、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、これに限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性開裂、または非天然アミノ酸による修飾、を含む修飾産物を指すことが意図されている。ポリペプチドは、天然生物源由来でも、または組換え型技術によって産生されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はない。ポリペプチドは、化学合成を含むどのような手法によっても生成可能である。また、本発明のポリペプチドには、前出のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびその任意の組み合わせが含まれる。変異体は、天然でも、または非天然でも発生可能である。非天然変異体は、既知の変異誘発技術を使って産生可能である。変異体ポリペプチドは、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含むことができる。また、誘導体には、1つまたは複数の20標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。[例えば、タンパク質またはポリヌクレオチド]由来のという用語は、タンパク質またはポリヌクレオチドが参照タンパク質またはポリヌクレオチドに関連していることを意味する。関連は、例えば、配列類似性または構造的類似性のうちの1つであり得る。タンパク質またはポリヌクレオチドは、1つまたは複数の、例えば、変異欠失または置換、化学操作例えば、足場のPEGまたは別のタンパク質への化学結合、遺伝的融合例えば、2つ以上の足場のリンカー、異種成分、またはそれらの組み合わせへの遺伝的融合、配列または構造的類似性に基づく新規合成、または異種生物体中の組換え型産生を経由した、参照タンパク質またはポリヌクレオチド由来であってもよい。無作為のrandomizedまたは変異したmutatedは、テンプレート配列に比較して、欠失、置換または付加等の、1つまたは複数のアミノ酸変化を含むことを意味する。無作為化randomizingまたは変異mutatingは、配列中へのこのようなアミノ酸変化を導入するプロセスを意味する。無作為化または変異は、一般的には、核酸コード配列の意図的な、盲検法による、または自然の配列変化により達成することができ、任意の技術、例えば、PCR、変異性PCR、または化学DNA合成によって発生させることができる。無作為化、無作為の、変異、変異した等の用語は、本明細書では、同義に使用される。同種のまたは同種の、非変異タンパク質は、変異体タンパク質が無作為化または変異導入されている場合の変異体タンパク質に導入されたアミノ酸変異を除いて、変異体タンパク質に対する配列が同じタンパク質を意味する。RNAは、2つ以上の共有結合した天然または改変リボヌクレオチドの配列を意味する。この用語に含まれる改変RNAの一例は、ホスホロチオエートRNAである。本明細書で使われる本発明の足場または本発明の足場複数という用語は、FnIII多量体足場ならびにモノマー足場を指す。標的という用語は、本発明の特定的な足場により認識される化合物を指す。典型的な標的には、タンパク質、多糖類、ポリヌクレオチドおよび小分子が含まれる。標的および抗原という用語は、本明細書では同義に使用される。例えば、本明細書で使われる特異的に結合または特異的結合という用語中の特異的という用語は、本発明の足場が1つまたは複数の抗原結合ドメインを介して1つまたは複数の抗原に結合する相対的親和性を指し、その結合は1つまたは複数の抗原結合ドメインと1つまたは複数の抗原の間の一定の相補性を必要とする。この定義に従って、ランダムな、非関連エピトープに結合するのに比べてより容易に1つのエピトープに結合する場合に、本発明の足場はそのエピトープに特異的に結合すると言われる。本明細書で使われる親和性という用語は、本発明のある特定の足場の個別エピトープに対する結合の強度の尺度を指す。本明細書で使われる結合力という用語は、本発明の足場集団とある特定のエピトープの間の複合体の全体の安定性、すなわち、機能的に組み合わされた複数の足場の抗原との結合強度を指す。結合力は、個別の抗原結合ドメインの特異的エピトープに対する親和性、および、また本発明の足場の結合価の両方に関連する。標的に対する作用という用語は、本発明の多量体足場の1つまたは複数の標的に対する結合、およびこのような結合から得られた生物学的効果を指す。この点に関しては、多量体足場中の複数の抗原結合ユニットは、種々の標的および/またはエピトープと相互作用でき、例えば、2つの標的を物理的により接近させ、個別の標的との相互作用を通して、代謝カスケードを開始させる、等の作用をする。本明細書で使われる結合価という用語は、可能性のある抗原結合モジュールの数、例えば、多くの本発明の足場中のFnIIIモジュールの数を指す。本発明の足場が2つ以上の抗原結合モジュールを含む場合は、各結合モジュールは、例えば、同じ標的または異なる標的中の、同じエピトープまたは異なるエピトープに特異的に結合できる。本明細書で使われるジスルフィド結合という用語は、2つの硫黄原子間で形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、第2のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。本明細書で使われるTn3モジュールおよびTn3足場という用語は、FnIII足場を指し、ここで、Aベータ鎖は配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45または131を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、およびベータ鎖Gは配列番号52を含み、少なくとも1つのループは、野性型Tn3足場のループの非天然変異体である。ある特定の実施形態では、Cベータ鎖中のシステイン残基例えば、配列番号45または131中のシステインおよびFベータ鎖配列番号49中のシステイン残基は置換されないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は、少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。本明細書で使われる野性型Tn3足場という用語は、配列番号1、すなわち、ヒトテネイシンCの第3FnIII由来の操作FnIII足場を含むFnIII足場を指す。免疫グロブリンおよび抗体という用語は、生化学的に鑑別可能な種々の広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者なら、重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類されることをわかるであろう。抗体のクラスをそれぞれ、IgG、IgM、IgAIgG、またはIgE、として決定するのは、この鎖の性質による。これらのクラスの修正版は、当業者には容易に識別可能である。本明細書で使われる抗体という用語には、限定されないが、無傷抗体、改変抗体、抗体VLまたはVLドメイン、CH1ドメイン、Cカッパドメイン、Cラムダドメイン、Fcドメイン同上参照、CH2、またはCH3ドメインが含まれる。本明細書で使われる改変抗体という用語には、天然に存在しない、例えば、少なくとも2つの重鎖部分を含むが、2つの完全な重鎖を含まない例えば、ドメイン欠失抗体またはミニボディのような抗体となるように変えられた合成型の抗体;2つ以上の抗原または単一抗原の異なるエピトープに結合するように変えられた多選択性型の抗体例えば、二重特異性、三重特異性、等が含まれる。さらに、改変抗体という用語には、多価型抗体例えば、三価、四価、等の同じ抗原の3つ以上のコピーに対する抗体が含まれる例えば、AntibodyEngineering、KontermannDubel、eds.、2010SpringerProtocols、Springer、を参照のこと。TRAILR2またはTRAILR2受容体という用語は、本明細書では同義に使用され、完全長TRAIL受容体配列および可溶の、細胞外ドメイン型の受容体を指す。これは、Sheridanetal.、Science、277:818-8211997;Panetal.、Science、277:815-8181997、米国特許第6、072、047号および同6、342、369号:国際公開第98/51793号、同98/41629号、同98/35986号、同99/02653号、同99/09165号、98/46643号、および同99/11791号;Screatonetal.、Curr.Biol.、7:693-6961997;Walczaketal.、EMBOJ.、16:5386-53871997;Wuetal.、NatureGenetics、17:141-1431997、に記載されている。代表的完全長長さTRAIL受容体配列は、GenBank受入番号AAC51778.1およびO14763.2.で入手可能である。TRAILまたはTRAILポリペプチドは、TRAILR2を含む1つまたは複数のTRAIL受容体に結合するリガンド、ならびに生物学的に活性なその断片を指す。代表的TRAIL配列は、GenBank受入番号AAH32722.1およびP50591.1で入手可能である。CD40Lという用語は、CD40リガンドタンパク質を指し、CD154、gp39またはTBAMとしても知られる。CD40Lは、33kDaのII型膜糖タンパク質である。さらに、より短い18kDaのCD154の可溶型が存在するsCD40Lとしても知られる。代表的なヒトCD40L配列は、GenBank受入番号AAA35662.1およびUniProt受入番号P29965で入手可能である。代表的なマウスCD40L配列は、GenBank受入番号AAI19226.1およびUniProt受入番号P27548で入手可能である。インビボ半減期という用語は、通常の意味、すなわち、ポリペプチドの生物活性の50が身体/標的器官中にまだ存在している時間、またはポリペプチドの活性が初期値の50になる時間の意味で使用される。機能的インビボ半減期を測定する代替法として、血清半減期、すなわち、除去される前に、ポリペプチド分子の50が血漿または血流中を循環する時間を測定可能である。血清半減期の測定は、機能的インビボ半減期を測定するより簡単なことが多く、血清半減期の大きさは、通常、機能的インビボ半減期の大きさの良い指標である。血清半減期の代わりの用語には、血漿半減期、循環circulating半減期、循環circulatory半減期、血清クリアランス、血漿クリアランス、およびクリアランス半減期が含まれる。保持される機能は、通常、凝血促進性、タンパク分解性、補因子結合、受容体結合活性、または特定のタンパク質に関連する他のタイプの生物活性、から選択される。機能的インビボ半減期または血漿半減期に関連する増加したという用語は、参照分子例えば、非改変ポリペプチドに比べて、ポリペプチドの関連する半減期が同等の条件下で測定して、統計的に有意に増加していることを示すために使用される。例えば、関連する半減期は、非改変参照分子に比べて、少なくとも約25、例えば、少なくとも約50、例えば、少なくとも約100、少なくとも約150、少なくとも約200、少なくとも約250、または少なくとも約500増加させることができる。他の実施形態では、半減期は、非改変参照分子に比べて、約少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、または少なくとも50倍増加させることができる。本明細書で使われる発現という用語は、遺伝子が生化学物質、例えば、本発明の足場またはその断片を産生するプロセスを指す。このプロセスは、細胞内の遺伝子の機能的存在のいかなる現れをも含み、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一時的発現および安定発現の両方を含む。それは、限定されないが、遺伝子の1つまたは複数のmRNAへの転写、およびこのようなmRNAの1つまたは複数のポリペプチドへの翻訳を含む。最終目的産物が、生化学物質である場合は、発現は、その生化学物質と任意の前駆物質の生成を含む。発現産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーRNA、またはポリペプチドであってもよい。本明細書記載の発現産物は、さらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を受けた核酸、または転写後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク分解性開裂、等を受けたポリペプチドを含む。本明細書で使われるベクターまたは発現ベクターという用語は、本発明においては、宿主細胞中に導入し、目的の発現産物を発現させるための媒体として使用するベクターを意味するように使われる。当業者には既知であるように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルス、からなる群より容易に選択できる。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、目的核酸のクローニング、および真核または原核細胞中に入る能力、および/または増殖する能力を促進するための適切な制限酵素部位を含む。宿主細胞という用語は、組換DNA技術を使って構築され、少なくとも1つの発現産物をコードするベクターを収容する細胞を指す。組換え型ホストから発現産物を単離するプロセスの記述において、明確に別義が指示されていない限り、細胞および細胞培養物という用語は、同義に使用され、発現産物の源を意味する。すなわち、細胞からの発現産物の回収は、遠心沈殿全細胞からの回収、または培地および懸濁細胞の両方を含む細胞培養物からの回収を意味する。本明細書で使われる治療するtreatまたは治療treatmentという用語は、治療上の処置および予防または防止手段の両方を指し、その目的は、対象の望ましくない生理的な変化または障害、例えば、炎症性疾患または状態の進行、を防ぐか、または遅らせる減らすことである。有益なまたは所望する臨床的結果には、限定されないが、検出可能、不可能に関わらず、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化すなわち、悪化しない状態、疾患進行の遅延化または緩徐化、改善または疾患状態の緩和、および寛解部分または完全が含まれる。治療という用語は、また、治療を受けていない場合に予想される生存に比べての生存の延長を意味する。治療を必要としている人には、既に状態または障害のある人、ならびに状態または障害になる傾向がある人、または状態または障害を予防すべき人が含まれる。対象、個体、動物、患者、または哺乳動物という用語は、診断、予後、または治療が望まれる任意の個体、患者または動物、特に、哺乳類の対象を指す。哺乳類の対象には、ヒト、飼育動物domesticanimal、家畜farmanimal、および例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ、等の、動物園の動物、スポーツ用動物またはペット動物が含まれる。緒言ヒト体液タンパク質で見出される全体の、安定な、可溶性の構造モジュール由来の、および限定されないが、好熱細菌および古細菌を含む他の天然源由来のFnIII足場が、抗体由来断片および非抗体フレームワークの両方より優れたものになるように操作されている。1つの特定の足場操作の例は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合のFnIII足場への導入である。一実施形態では、本発明の多量体足場は、これらのFnIII足場のタンデム反復を含み、少なくとも1つのFnIII足場が1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、タンデム足場はペプチドリンカーにより融合され、それにより、単一構築物としての発現を可能にする。多量体足場を成すFnIII足場は、相互に独立して正確に折り畳まれて、それらの結合特異性および親和性を維持し、また、それぞれの足場ドメインは、その機能特性を保持する。多量体足場を成すFnIII足場が高結合価多量体足場、例えば、6価または8価足場、に組み上げられる場合、足場は相互に独立して正確に折り畳まれてそれらの結合特異性および親和性を維持し、また、それぞれの足場ドメインは、その機能特性を保持する。構築物の形態が直鎖状でない場合でも、例えば、モノマーFnIIIまたは多量体FnIII足場が複雑な分岐構造例えば、Fc融合体構築物または抗体様構築物に組み上げられる場合でも、高結合価足場例えば、6価または8価を含む多量体足場は、正確に折り畳まれる。自然FnIIIドメイン、例えば、ヒトフィブロネクチンの第10FnIIIドメイン10FnIIIおよび大部分の天然FnIIIドメインは、ジスルフィド結合または遊離システインを含まない。多ドメインタンパク質が複数のシステインの導入により操作される場合、タンパク質発現の欠失、生じたタンパク質の析出、または非機能性タンパク質の産生が頻繁に発生する。これらの有害作用は、分子内のドメイン内および/またはドメイン間ジスルフィド結合の不正確な形成、および/または分子間ジスルフィド結合の不正確な形成に起因し、これは不正確なタンパク質折り畳み構造を生ずる。これらの効果は、通常、システイン、および/またはタンパク質ドメインの数が増加すると増強される。例えば、8つの野性型Tn3足場配列番号1を含む直鎖FnIII足場は、単一ポリペプチドアミノ酸配列に沿って16システインを含むことになるであろう。別の代表的実施形態では、4つのTn3モジュールを含む抗体様構築物2つのTn3モジュールがIgG重鎖に結合し、2つのTn3がIgG軽鎖に結合しているは、4つの異なるポリペプチド鎖の中に分布した32システインを含むことになるであろう。従って、このような数のシステインおよびこのような構造的複雑さを含む多量体FnIII足場が、正確に折り畳まれ、それぞれのFnIIIモノマードメインに比較して、改善された安定性と標的結合特性を示すということは、全く予想できないことである。1つまたは複数の操作されたジスルフィド架橋を含むFnIII足場が高結合価多量体型に組み上げられると、各個別モノマー足場は正確に折り畳まれ、結合特異性および親和性、ならびに機能特性を保持する。さらに、モノマー足場は、安定、機能的、かつ正確に折り畳まれた多量体足場を形成することができる。本発明の多量体足場の利点は、複数のエピトープに結合する能力、例えば、i単一標的中の複数のエピトープへ結合、ii複数標的中の単一エピトープへ結合、iii1つの標的の複数の異なるサブユニット上に位置する複数のエピトープへ結合、またはiv複数の標的の複数のエピトープへ結合する能力、従って、増加していく結合力である。さらに、多量体足場の柔軟性、および複数のFnIIIモジュール間の距離をリンカーを介して変えることができる可能性により、多量体足場は、表面同じ細胞/表面または異なる細胞/表面上の複数の標的分子に結合可能である。2つ以上の標的に同時に結合するそれらの能力の結果として、本発明の多量体足場は、複数の経路を調節し、受容体を交差結合し、別々の細胞上の細胞表面受容体に結合し、および/または標的分子または細胞を基質に結合させるために使用することができる。FnIIIドメインの以前の配列解析から、BCとFGループで大きな変動が認められ、これらのループが安定性に重要ではないことを示唆している例えば、国際公開第2009/058379号を参照。本発明は、改善された安定性を有するFnIII足場を提供し、これは、アミノ酸配列が変動するが、対象FnIIIドメイン/足場よりも短い長さのFGループを含む。FnIIIドメインのアミノ酸配列は、低い配列類似性を示す傾向があるが、それらの全体的に見た3次元構造は類似している。従って、既知の技術、例えば、たとえ全体としての配列類似性が低い場合でも、配列解析および三次構造オーバーレイを使って、異なる種および異なるタンパク質由来のFnIII足場のFGループの特異的位置を特定し変異を受けさせることができる。一部の実施形態では、操作されたFGループは、少なくとも出発FGループの長さより1つのアミノ酸分短いアミノ酸配列長さを有する。FGループの短縮化により安定性の増加した変異FnIII足場が生成されることが観察された。従って、本発明の別の態様では、タンパク質安定性の増加した変異体が提供される。ある特定の実施形態では、本発明の足場は、9アミノ酸、および10アミノ酸のFGループ長さを有する自然のヒトテネイシンC第3FnIIIドメインを含む足場に比べて増加した安定性を有するFGループを含む。さらに、本発明は、対象FnIIIドメイン/足場に比べて安定性の増加したFnIII足場を単離するのに有用な特定したFGループ長さを有する多様なFnIII足場のライブラリーを提供する。さらに、本発明は、2つ以上の異なる標的に結合することのできる多特異性足場、特定的な標的に対する親和性が変異により調節される親和性成熟足場、およびを動物種間の免疫原性および/または交差反応性が変異により調節されている足場を提供する。また、本発明は、本発明の足場の産生方法、ならびに足場を望ましい物理化学的、薬理学的、または免疫学的な特性を有するように操作する方法を提供する。さらに、本発明は、このような足場の使用、および治療、予防、および診断のための使用方法を提供する。FnIII構造モチーフ本発明の足場は、生命体およびウイルスの全ての3つのドメインにわたって、また、多数のタンパク質クラスで広く認められるドメインであるタイプIIIFnIIIフィブロネクチンモジュールの構造に基づいている。FnIIIドメインは、可溶性の形態で血漿中、および不溶性の形態で疎性結合組織および基部タンパク質中で見出された多ドメインタンパク質である、フィブロネクチン中で見出される。このドメインは、現在までに、配列決定された多くのタンパク質中で見つかっている。FnIIIドメインスーパーファミリーは、少なくとも45の異なるタンパク質ファミリーを表し、それらの大部分は、ある方法で細胞表面結合に関与し、または受容体として機能する。FnIIIドメインを含有するタンパク質の具体的な例には、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内の細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体、受容体タンパク質チロシンキナーゼ、および原核生物酵素が含まれるBorkandDoolittle、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:8990-8894、1992;Borketal.、NatureBiotechnol.15:553-557、1997;Meinkeetal.、J.Bacteriol.175:1910-1918、1993;Watanabeetal.、J.Biol.Chem.265:15659-15665、1990。FnIIIドメインを含む天然タンパク質配列には、限定されないが、フィブロネクチン、テネイシンC、成長ホルモン受容体、β-共通受容体、IL-5R、テネイシンXB、およびコラーゲンタイプXIVが含まれる。このドメインは、天然に広く分布しているように見えるが、非常に多岐にわたるFnIIIドメインのアミノ酸配列の間でのアミノ酸配列類似性のパーセンテージは、非常に低い可能性がある。特定的な実施形態では、本発明の足場は、ヒトテネイシンCの第3のFnIIIドメイン配列番号4由来である。1つの特定的な実施形態では、本発明の足場は、Tn3モジュールを含む。このドメインの全体としての3次元折り畳みは、最小の機能的抗体断片である重鎖VH可変領域に密接に関連している。この重鎖VH可変領域は、ラクダおよびラクダ科動物例えば、ラマの単一ドメイン抗体では、完全抗原認識ユニットを含む。本発明のFnIII足場および自然FnIIIドメインは、同じ3次元構造、すなわち、一方の側に3つのベータ鎖A、B、およびEおよびもう一方の側に4つのベータ鎖C、D、F、およびGを有し、6つのループ領域により連結されているベータサンドイッチ構造を特徴とする。これらのループ領域は、各ループのNおよびC末端に連結したベータ鎖に従って命名されている。従って、ABループは、ベータ鎖AとBの間に位置し、BCループは鎖BとCの間に位置し、CDループはベータ鎖CとDの間に位置し、DEループはベータ鎖DとEの間に位置し、EFループはベータ鎖EとFの間に位置し、およびFGループはベータ鎖FとGの間に位置する。FnIIIドメインは、無作為化に耐性のある溶媒暴露ループを有し、これは、特定的な標的に高親和性で結合可能な多様なタンパク質足場プールの生成を促進する。図16の複数配列の整列化により、3次元構造およびアミノ酸配列の分析に基づき、多くの自然FnIIIドメインのベータ鎖およびループの位置が特定される。これらのFnIIIドメインは、実質的にどの標的化合物にも、例えば、どの対象タンパク質にも結合可能であるタンパク質を設計するために利用できる。当業者なら、図16の整列化は代表的なものであり、限定を意味するものではないことを理解するであろう。例えば、図16の整列化は、InterProScanプログラムを使って測定して、InterproIPR008957フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むことがわかっている、またはPfam_スキャン、HMMER、またはいずれかの他のタンパク質配列をHiddenMarkovモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、PfamPF00041フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むとわかっているタンパク質ドメインを組み入れることにより拡張可能である。従って、タンパク質足場操作および設計は、例えば、下記に基づくことができる:i図16に示す整列された配列セット、ii図16由来の整列された配列のサブセット、iii3次元構造が実験的に決定されている例えば、X線回折結晶学またはNMRの使用により、FnIIIドメインのアミノ酸配列を含む別々の整列されたセット、および/またはivFnIIIドメインのアミノ酸配列で、それらの3次元構造がまだ利用できないが、InterProScanプログラムを使って測定して、InterproIPR008957フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むことがわかっている、またはPfam_スキャン、HMMER、またはいずれかの他のタンパク質配列をHiddenMarkovモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、PfamPF00041フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むとわかっている配列。本発明の一態様では、FnIIIドメインは、抗体可変領域の相補性決定領域CDRに類似の1つまたは複数のループを無作為化するように設計されている指向性進化に供される足場として使用される。このような指向性進化手法は、対象標的に対し高親和性を有する抗体様分子の産生をもたらす。さらに、一部の実施形態では、本明細書記載の足場は、確定した露出ループ例えば、以前に無作為化され、標的との結合に基づいて選択されたループを、このような導入ループに結合する分子の進化を指示することを目的として、提示するために使用可能である。このタイプの選択は、いずれかの個別のCDR様ループに対して、認識分子を特定するために、または、その代わりに、2つまたは3つ全ての非線形エピトープ結合成分に組み合わされたCDR様ループの認識のために、行うことができる。一部の実施形態では、本発明の足場は、国際公開第2009/058379号に記載のヒトテネイシンC構造モチーフの第3FnIIIドメインに基づいた分子である。特異的標的結合を付与することができる3つのループBC、DE、およびFGと命名のセットは、それぞれ、BとC鎖;DとE鎖、およびFとGベータ鎖の間をつないでいる。ヒトテネイシンCの第3FnIIIドメインのBC、DE、およびFGループは、それぞれ、9、6、および10アミノ酸残基の長さである。これらループの長さは、抗体重鎖で見つかった同種の抗原認識ループの狭い範囲内、すなわち、それぞれ7~10、4~8、および4~28アミノ酸長さ、に入る。同様に、第2のセットのループのAB、CD、およびEFループそれそれ7、7、および8、アミノ酸長さは、それぞれ、AとBベータ鎖;CとDベータ鎖;およびEとFベータ鎖の間をつないでいる。他の実施形態では、ヒトフィブロネクチン配列番号54由来の第10FnIII10FnIIIドメインに基づいた分子を足場として使用可能である。図16に記載のように、ヒトフィブロネクチンの第10FnIIIドメインでは、ABループは配列番号55に対応し、BCループは配列番号56に対応し、CDループは配列番号57に対応し、DEループは配列番号58に対応し、EFループは配列番号59に対応し、さらにFGループは配列番号60に対応する。これらの領域に対する代替の定義は、当技術分野で既知であることは理解されよう。例えば、Xuetal.ChemistryBiology9:933-942、2002、を参照のこと。これは本明細書で記載されているように使用可能である。さらに他の実施形態では、ヒトフィブロネクチン配列番号69由来の第14FnIII14FnIIIドメインに基づいた分子を足場として使用可能である。図16で定めたように、14FnIIIのABループは配列番号70に対応し、BCループは配列番号71に対応し、CDループは配列番号72に対応し、DEループは配列番号73に対応し、EFループは配列番号74に対応し、さらにFGループは配列番号75に対応する。これらの領域に対する代替の定義は、当技術分野で既知であることは理解されよう。例えば、Cappuccilliら米国特許公開第2009/0176654号を参照のこと。これは本明細書で記載されているように使用可能である。さらに他の実施形態では、テネイシン配列番号256のFnIIIドメイン配列由来のコンセンサス配列に基づいた分子を足場として使用可能である。テネイシンコンセンサスFnIIIループは、表1で定義されており、ABループは配列番号257に対応し、BCループは配列番号258に対応し、CDループは配列番号259に対応し、DEループは配列番号260に対応し、EFループは配列番号261に対応し、FGループは配列番号262に対応する。これらの領域に対する代替の定義は、当技術分野で既知であることは理解されよう。例えば、Jacobsら国際公開第2010/093627号を参照のこと。これは本明細書で記載されているように使用可能である。無作為化を行い、標的に対する高親和性結合で選択されると、FnIIIドメイン中のループは、抗体中の同種のCDRループの接触と同等の標的との接触が可能である。従って、一部の実施形態では、AB、CD、およびEFループは、単独または組み合わせて、無作為化および1つまたは複数の標的に対する高親和性結合について選択される。一部の実施形態では、この無作為化および選択プロセスは、1つまたは複数のBC、DE、およびFGループの無作為化と平行に行うことができ、一方、他の実施形態では、この無作為化および選択プロセスは順次行われる。本発明のモノマー足場本発明は、複数のループ領域に結合した複数のベータ鎖ドメインを含む組換え型、非天然FnIII足場を提供し、ここで1つまたは複数の前記ループ領域が、対象FnIIIドメイン/足場本明細書ではFOIと呼ぶ中の同種のループ由来の少なくとも1つのアミノ酸の欠失、置換または付加により変化しており、また、FnIII足場のベータ鎖が、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99、またはそれ超のFOIの同種のベータ鎖に対する相同性すなわち、配列類似性を有する。FOIは、配列、物理化学的および/または系統的特性を比較するために使われる参照である。本発明の足場の配列をFOIの配列に比較する場合、同じ定義のベータ鎖およびループが利用されることは理解されよう。FOIは、自然FnIIIドメイン、すなわち自然FnIIIドメインを含む足場でも、または非天然FnIII足場でもよい。ある特定の実施形態では、FOIは、少なくとも1つの非天然ループを含む。ある特定の実施形態では、FOIは、少なくとも1つの非天然ベータ鎖を含む。ある特定の実施形態では、FOIは、少なくとも1つの非天然ループおよび少なくとも1つの非天然ベータ鎖を含む。ある特定の実施形態では、FOIは、少なくとも1つの非天然ジスルフィド結合を含む。特定的な実施形態では、FOIは、操作された分子内ジスルフィド結合を含むヒトテネイシンの3FnIIIドメイン由来の足場である野性型Tn3足場配列番号1を含む。特定的な実施形態では、本発明のモノマー足場は、A、B、C、D、E、F、Gと命名された7つのベータ鎖を含み、これらはAB、BC、CD、DE、EF、FGと命名された6つのループ領域に結合し、少なくとも1つのループはFOI中の同種のループの非天然変異体で、さらにベータ鎖は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超のFOIの同種のベータ鎖に対する相同性すなわち、配列類似性を有する。特定的な実施形態では、本発明のモノマー足場は、A、B、C、D、E、F、Gと命名された7つのベータ鎖を含み、これらはAB、BC、CD、DE、EF、FGと命名された6つのループ領域に結合し、少なくとも1つのループはFOI中の同種のループの非天然変異体で、さらにベータ鎖は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超のFOIの同種のドメインに対する相同性すなわち、配列類似性を有する。特定的な実施形態では、FOIは、ヒトテネイシンCの第3のFnIIIドメイン配列番号4を含む。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超のヒトテネイシンCの第3FnIIIドメイン配列番号4に対する相同性すなわち、配列類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超のヒトテネイシンCの第3のFnIIIドメイン配列番号4に対する同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、アミノ酸配列:IEVXABnALITWXBCnCELX1YGIXCDnTTIDLXDEnYSIXEFnYEVSLICXFGnKETFTT、を含み、ここで、XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGループ中に存在するアミノ酸残基を表し、X1はアミノ酸残基AまたはTを表し、また、n=2~26である。別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、アミノ酸配列:IEVXABnALITWXBCnIELX1YGIXCDnTTIDLXDEnYSIXEFnYEVSLISXFGnKETFTT、を含み、ここで、XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGループ中に存在するアミノ酸残基を表し、X1はアミノ酸残基AまたはTを表し、また、n=2~26である。一実施形態では、XABは配列番号35から構成される。一実施形態では、XBCは配列番号36から構成される。一実施形態では、XCDは配列番号37から構成される。一実施形態では、XDEは配列番号38から構成される。一実施形態では、XEFは配列番号39から構成される。一実施形態では、XFGは配列番号40から構成される。一実施形態では、XABは配列番号35を含む。一実施形態では、XBCは配列番号36を含む。一実施形態では、XCDは配列番号37を含む。一実施形態では、XDEは配列番号38を含む。一実施形態では、、XEFは配列番号39を含む。一実施形態では、XFGは配列番号40を含む。ある特定の実施形態では、XABは配列番号35から構成され、XCDは配列番号37から構成され、さらにXEFは配列番号39から構成される。一実施形態では、XBCは配列番号36から構成され、XDEは配列番号38から構成され、さらにXFGは配列番号40から構成される。ある特定の実施形態では、XABは配列番号35を含み、XCDは配列番号37を含み、さらにXEFは配列番号39を含む。一実施形態では、XBCは配列番号36を含み、XDEは配列番号38を含み、さらにXFGは配列番号40を含む。特定的な実施形態では、FOIは、ヒトフィブロネクチン足場の野性型第10フィブロネクチンタイプIIIドメイン10FnIII配列番号54を含む。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超の野性型10FnIII配列番号54に対する類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明のモノマー足場は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超の野性型10FnIII配列番号54に対する同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、アミノ酸配列:LEVXABnLLISWXBCnYRITYGEXCDnQEFTVXDEnATIXEFnYTITVYAXFGnSINYRT、を含み、ここで、XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループ中に存在するアミノ酸残基を表し、n=2~26である。一実施形態では、XABは、10FnIIIのループABのアミノ酸配列配列番号55である。一実施形態では、XBCは、野性型10FnIIIのループBCのアミノ酸配列配列番号56である。一実施形態では、XCDは、野性型10FnIIIのループCDのアミノ酸配列配列番号57である。一実施形態では、XDEは、野性型10FnIIIのループDEのアミノ酸配列配列番号58である。一実施形態では、XEFは、野性型10FnIIIのループEFのアミノ酸配列配列番号59である。一実施形態では、XFGは、野性型10FnIIIのループFGのアミノ酸配列配列番号60である。ある特定の実施形態では、XABは野性型10FnIIIのループABのアミノ酸配列配列番号55であり、XCDは野性型10FnIIIのループCDのアミノ酸配列配列番号57であり、さらにXEFは野性型10FnIIIのループEFのアミノ酸配列配列番号59である。一実施形態では、XBCは野性型10FnIIIのループBCのアミノ酸配列配列番号56であり。XDEは野性型10FnIIIのループDEのアミノ酸配列配列番号58であり、さらにXFGは野性型10FnIIIのループFGのアミノ酸配列配列番号60である。特定的な実施形態では、FOIは、ヒトフィブロネクチン足場の野性型第14タイプIIIフィブロネクチンドメイン14FnIII配列番号69を含む。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超の野性型14FnIII配列番号69に対する類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明のモノマー足場は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超の野性型14FnIII配列番号69に対する同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、アミノ酸配列:ARVXABnITISWXBCnFQVDAVPXCDnIQRTIXDEnYTIXEFnYKIYLYTXFGnVIDAST、を含み、ここで、XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGループ中のアミノ酸残基を表し、n=2~26である。一実施形態では、XABは野性型14FnIIIのループABのアミノ酸配列配列番号70である。一実施形態では、XBCは野性型14FnIIIのループBCのアミノ酸配列配列番号71である。一実施形態では、XCDは野性型14FnIIIのループCDのアミノ酸配列配列番号72である。一実施形態では、XDEは野性型14FnIIIのループDEのアミノ酸配列配列番号73である。一実施形態では、XEFは野性型14FnIIIのループEFのアミノ酸配列配列番号74である。一実施形態では、XFGは野性型14FnIIIのループFGのアミノ酸配列配列番号75である。ある特定の実施形態では、XABは野性型14FnIIIのループABのアミノ酸配列配列番号70であり、XCDは野性型14FnIIIのループCDのアミノ酸配列配列番号72であり、さらにXEFは野性型14FnIIIのループEFのアミノ酸配列配列番号74である。一実施形態では、XBCは野性型14FnIIIのループBCのアミノ酸配列配列番号71であり、XDEは野性型14FnIIIのループDEのアミノ酸配列配列番号73であり、さらにXFGは野性型14FnIIIのループFGのアミノ酸配列配列番号75である。特定的な実施形態では、FOIは、テネイシンコンセンサスFnIII配列番号256を含む。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超のテネイシンコンセンサスFnIII配列番号256に対する類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超のテネイシンコンセンサスFnIII配列番号256に対する同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、アミノ酸配列:LVVXABnLRLSWXBCnFLIQYQEXCDnINLTVXDEnYDLXEFnYTVSIYGXFGnSAEFTT、を含み、ここで、XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれ、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループ中に存在するアミノ酸残基を表し、n=2~26である。一実施形態では、XABはテネイシンコンセンサスFnIIIのABループのアミノ酸配列配列番号257である。一実施形態では、XBCはテネイシンコンセンサスFnIIIのループBCのアミノ酸配列配列番号258である。一実施形態では、XCDはテネイシンコンセンサスFnIIIのループCDのアミノ酸配列配列番号259である。一実施形態では、XDEはテネイシンコンセンサスFnIIIのループDEのアミノ酸配列配列番号260である。一実施形態では、XEFはテネイシンコンセンサスFnIIIのループEFのアミノ酸配列配列番号261である。一実施形態では、XFGはテネイシンコンセンサスFnIIIのループFGのアミノ酸配列配列番号262である。ある特定の実施形態では、XABはテネイシンコンセンサスFnIIIのループABのアミノ酸配列配列番号257であり、XCDはテネイシンコンセンサスFnIIIのループCDのアミノ酸配列配列番号259であり、さらにXEFはテネイシンコンセンサスFnIIIのループEFのアミノ酸配列配列番号261である。一実施形態では、XBCはテネイシンコンセンサスFnIIIのループBCのアミノ酸配列配列番号258であり、XDEはテネイシンコンセンサスFnIIIのループDEのアミノ酸配列配列番号260であり、さらにXFGはテネイシンコンセンサスFnIIIのループFGのアミノ酸配列配列番号262である。別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、IEVXABnALITWXBCnIELX1YGIXCDnTTIDLXDEnYSIXEFnYEVSLISXFGnKETFTT、LEVXABnLLISWXBCnYRITYGEXCDnQEFTVXDEnATIXEFnYTITVYAXFGnSINYRT、ARVXABnITISWXBCnFQVDAVPXCDnIQRTIXDEnYTIXEFnYKIYLYTXFGnVIDAST、およびLVVXABnLRLSWXBCnFLIQYQEXCDnINLTVXDEnYDLXEFnYTVSIYGXFGnSAEFTT、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれ、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループ中に存在するアミノ酸残基を表し、X1はアミノ酸残基AまたはTを表し、n=2~26であり、さらに、XABは、配列番号35、55、70、または257からなる群より選択され、XCDは、配列番号37、57、72、または259からなる群より選択され、およびXEFは、配列番号39、59、74、または261からなる群より選択される。別の実施形態では、本発明のモノマー足場は、IEVXABnALITWXBCnIELX1YGIXCDnTTIDLXDEnYSIXEFnYEVSLISXFGnKETFTT、LEVXABnLLISWXBCnYRITYGEXCDnQEFTVXDEnATIXEFnYTITVYAXFGnSINYRT、ARVXABnITISWXBCnFQVDAVPXCDnIQRTIXDEnYTIXEFnYKIYLYTXFGnVIDAST、およびLVVXABnLRLSWXBCnFLIQYQEXCDnINLTVXDEnYDLXEFnYTVSIYGXFGnSAEFTT、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれ、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループ中に存在するアミノ酸残基を表し、X1はアミノ酸残基AまたはTを表し、n=2~26であり、さらに、XBCは、配列番号36、56、71、または258からなる群より選択され、XDEは、配列番号38、58、73、または260からなる群より選択され、さらにXFGは、配列番号40、60、75、または262からなる群より選択される。他の実施形態では、本発明の足場は、Tn3モジュールを含む。さらに他の実施形態では、本発明の足場は、Tn3モジュール配列番号1を含み、ヒトテネイシンCの第3のFnIIIドメインのベータ鎖C配列番号44がN末端システイを含む変異ベータ鎖C配列番号45、または131により置換され、ヒトテネイシンCの第3FnIIIドメインのベータ鎖F配列番号48がC末端システインを含む変異ベータ鎖F配列番号49により置換されている。一部の実施形態では、本発明の足場は、Tn3モジュールを含み、CおよびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、または131および49中のシステイン残基は置換できないことを除いて、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、本発明の足場は、10FnIIIモジュールの変異体を含み、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、本発明の足場は、14FnIIIモジュールの変異体を含み、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。さらに他の実施形態では、本発明の足場は、テネイシンコンセンサスFnIIIモジュールの変異体を含み、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、天然配列は、追加のヒトテネイシンC由来のFnIIIドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、天然配列は、限定されないが、ヒトテネイシンXB由来の第29FnIIIドメイン配列番号11、ヒトテネイシンXB由来の第31FnIIIドメイン配列番号12、またはヒトテネイシンXB由来の第32FnIIIドメイン配列番号13を含む、別のテネイシンタンパク質由来のFnIIIドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、天然配列は、別の生物体例えば、限定されないが、マウス、ブタ、ウシ、またはウマテネイシン由来のFnIIIドメインに対応するタンパク質配列である。さらなる実施形態では、本発明の足場の生成に使用されるFnIIIドメインには、例えば、動物、植物、細菌、古細菌、またはウイルス由来の関連FnIIIドメインが含まれる。異なる生物および親タンパク質由来の異なるFnIIIドメインは、異なる適用に対し最も適切である可能性がある。例えば、低pHで安定な足場の設計では、低pHで至適に成長する生物体限定されないが、例えば、スルホロブストコダイイ由来のそのタンパク質を生成するのが最も好ましい可能性がある。別の実施形態では、関連FnIIIドメインは、好熱性および超好熱性生物例えば、超好熱性細菌または超好熱性古細菌から特定し、利用することができる。一部の実施形態では、本発明の足場を生成するために使用されるFnIIIドメインは、超好熱性古細菌、例えば、限定されないが、それぞれ70°Cより高い温度で至適増殖を示すアーケオグロブスフルギダスおよびスタフィロサームスマリヌス由来のFnIIIドメインである。他の実施形態では、天然配列は、好熱性生物体、例えば、限定されないが、アーケオグロブスフルギダス、スタフィロサームスマリヌス、スルホロブスアシドカルダリウス、スルホロブスソルファタリカス、およびスルホロブストコダイイ、由来の予測FnIIIドメインに対応する。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95または少なくとも99の上述のような好熱性生物体由来のFnIIIドメインまたは予想FnIIIドメインに対応する配列に由来するいずれかの配列に対する相同性配列類似性を有する配列を含む。一部の実施形態では、好熱性生物由来のFnIIIドメインは、配列番号20~33のアミノ酸配列から選択される。本発明の足場の種々のベータ鎖を結合するループは、長さおよび/または配列多様性に関し無作為化可能である。一実施形態では、本発明の足場は、長さおよび/または配列多様性に関し無作為化された少なくとも1つのループを有する。一実施形態では、足場の少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つのまたは少なくとも6つのループが長さおよび/または配列多様性に関し無作為化される。一実施形態では、本発明の足場の少なくとも1つのループは、一定に保持され、他方、少なくとも1つの別のループは、長さおよび/または配列多様性に関し無作為化される。別の実施形態では、ループAB、CD、EFのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てが一定に保持され、他方、ループBC、DE、FGのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てが長さまたは配列多様性に関し無作為化される。別の実施形態では、ループAB、CD、およびEFのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つ全てが無作為化され、他方、ループBC、DE、およびFGのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てが長さおよび/または配列多様性に関し無作為化される。さらに別の実施形態では、ループAB、CD、EF、BC、DE、およびFGのうちの少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つのループ、少なくとも4つの、少なくとも5つの、または6つ全てのループが長さまたは配列多様性に関し無作為化される。一部の実施形態では、1つまたは複数のループ内の残基が一定に保持され、他方、他の残基が長さおよび/または配列多様性に関し無作為化される。一部の実施形態では、1つまたは複数のループ内の残基が所定の、限られた数の異なるアミノ酸に限定され、他方、他の残基が長さおよび/または配列多様性に関し無作為化される。従って、本発明の足場は、変性したコンセンサス配列および/または1つまたは複数の不変アミノ酸残基を有する1つまたは複数のループを含むことができる。一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:K-X-X-X-X-X-a、を有する無作為化されたABループを含む。ここで、Xは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、aは、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:K-X-X-X-X-X-X-X-a、を有する無作為化されたABループを含む。ここで、Xは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、aは、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:S-X-a-X-b-X-X-X-G、を有する無作為化されたBCループを含む。ここで、Xは、任意のアミノ酸を表し、aは、プロリンまたはアラニンを表し、さらに、bは、アラニンまたはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G、を有する無作為化されたBCループを含み、Xは、任意のアミノ酸を表し、cは、プロリン、セリンまたはグリシンを表す。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G、を有する無作為化されたBCループを含み、Xは、任意のアミノ酸を表し、dは、プロリン、グルタメートまたはリシンを表し、eは、アスパラギンまたはグリシンを表し、さらに、fは、セリンまたはグリシンを表す。一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:Xn、を有する無作為化されたCDループを含み、Xは、任意のアミノ酸を表し、n=6、7、8、9、または10である。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:Xn、を有する無作為化されたCDループを含み、Xは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、n=7、8、または9である。一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:X-X-X-X-X-X、を有する無作為化されたDEループを含み、Xは任意のアミノ酸を表す。一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:X-b-L-X-P-X-c-X、を有する無作為化されたEFループを含み、Xは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、bは、アスパラギン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンを表し、さらに、cは、イソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンを表す。一実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:X-a-X-X-G-X-X-X-b、を有する無作為化されたFGループを含み、Xは、任意のアミノ酸を表し、aは、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表し、さらに、bは、セリンまたはアラニンを表す。別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:X-X-X-X-X-X-X-X-XX9、を有する無作為化されたFGループを含み、Xは、任意のアミノ酸を表す。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:X-a-X-X-X-X-b-N-P-A、を有する無作為化されたFGループを含み、Xは、任意のアミノ酸を表し、aは、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表し、bは、セリンまたはグリシンを表す。特定的な実施形態では、本発明の足場は、次のコンセンサス配列:X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A、を有する無作為化されたFGループを含み、Xは、任意のアミノ酸を表し、aは、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表す。ある特定の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つのFOIの同種のFGループよりも短いアミノ酸残基になるように維持され、1つまたは複数の位置でさらに無作為化されているFGループを含む。例えば、図16で定められたように、ヒトテネイシンCの第3FnIIIドメインの自然FGループは、10アミノ酸残基を含み、従って、FGループは、9以下のアミノ酸残基を保持することとなる。一部の実施形態では、本発明の足場は、複数のFOIから選択される相同ベータ鎖から選択されたアミノ酸配列を含む1つまたは複数のベータ鎖を含むキメラ足場である。一部の実施形態では、本発明の足場は、ループBC、DE、およびFGのうちの少なくとも1つが無作為化されているキメラ足場である。一部の実施形態では、本発明の足場は、ループAB、CD、およびEFのうちの少なくとも1つが無作為化されているキメラ足場である。特定的な実施形態では、ループBC、DE、およびFGのうちの少なくとも1つのループが無作為化され、Aベータ鎖が配列番号41、42、61、62、76、77、248または249を含み、Bベータ鎖が配列番号43、63、78、または250を含み、Cベータ鎖が配列番号44、45、64、79、131、または251を含み、Dベータ鎖が配列番号46、65、80、または252を含み、Eベータ鎖が配列番号47、66、81、または253を含み、Fベータ鎖が配列番号48、49、50、51、67、82、または254を含み、およびGベータ鎖が配列番号52、53、68、83、または255を含み、ABループが配列番号35、55、70、または242を含み、CDループが配列番号37、57、72、または244を含み、さらにEFループが配列番号39、59、74、または246を含む。他の特定的な実施形態では、ループAB、CD、およびEFのうちの少なくとも1つのループが無作為化され、Aベータ鎖が配列番号41、42、61、62、76、77、248または249を含み、Bベータ鎖が配列番号43、63、78、または250を含み、Cベータ鎖が配列番号44、45、64、79、131、または251を含み、Dベータ鎖が配列番号46、65、80、または252を含み、Eベータ鎖が配列番号47、66、81または253を含み、Fベータ鎖が配列番号48、49、50、51、67、82、または254を含み、さらに、Gベータ鎖が配列番号52、53、68、83、または255を含み、BCループが配列番号36、56、71、または243を含み、DEループが配列番号38、58、73、245を含み、さらに、FGループが配列番号40、60、75、または247を含む。足場安定性の強化非天然ジスルフィド結合本発明の足場の安定性は、多くの異なる手法により高めることができる。一部の実施形態では、本発明の足場は、Nおよび/またはC末端領域の伸張により安定化できる。Nおよび/またはC末端領域は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10超のアミノ酸により伸張することができる。他の実施形態では、本発明の足場は、本明細書記載の血清半減期を増加させる変化を導入することにより安定化できる。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、足場の疎水性のコアを安定化させるために、少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含む。本発明の足場は、また、非天然ジスルフィド結合を操作することにより効果的に安定化できる。このように操作された足場は、多量体足場の一部として、効果的に発現させることができる。操作された足場のジスルフィド結合の正確な形成および正確な折り畳みは、足場の生物活の保存により証明される。非天然ジスルフィド結合を含む操作された足場は、少なくとも2つの標的例えば、実施例8参照または3つの標的例えば、実施例12参照に同時に結合できるという事実は、足場の3次元構造は、操作されたジスルフィド結合によって大きく変えられていないこと、および標的結合ループの相対的位置が保存されていることの証明を提供する。一部の実施形態では、本発明の足場は、国際公開第2009/058379号に記載のように、非天然ジスルフィド結合を含む。バイオインフォマティクス手法を利用して、ジスルフィド結合を操作するのに適した候補位置を特定できる。一実施形態では、本発明のモノマー足場は、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、または少なくとも5つの非天然分子内ジスルフィド結合を含む。特定的な実施形態では、本発明は、FOIに比べて安定性の増加した、2つ、3つ、4つ、またはそれ超の操作された分子内のジスルフィド結合を含む足場を得る方法を提供する。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、少なくとも1つの前記非天然ジスルフィド結合がモノマー足場を安定化させる。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの同じモノマー足場内の2つのベータ鎖の間に位置する非天然分子内ジスルフィド結合を含む。例えば、モノマー足場内の、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合がA鎖およびB鎖間、またはD鎖およびE鎖間、またはF鎖およびG鎖間、またはC鎖およびF鎖間のリンクを形成できる。別の実施形態では、非天然ジスルフィド結合は、単一モノマー足場内で、F鎖およびG鎖間の第1のリンク、ならびにC鎖およびF鎖間の第2のリンクを形成できる。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの同じモノマー足場中の2つのループの間に位置する非天然分子内ジスルフィド結合を含む。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの同じモノマー足場のループおよびベータ鎖の間に位置する非天然分子内ジスルフィド結合を含む。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つのモノマー足場中の同じベータ鎖内に位置する非天然分子内ジスルフィド結合を含む。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つのモノマー足場中の同じループ内に位置する非天然分子内ジスルフィド結合を含む。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの多量体足場中の2つの異なるモノマー足場の間に位置する非天然ジスルフィド結合を含む。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然ジスルフィド結合を含み、結合は、2つの異なる多量体足場の間に位置する、すなわち、ジスルフィド結合は、分子間ジスルフィド結合である。例えば、ジスルフィド結合は、異なる足場例えば、2つの分離したモノマー足場、分離したモノマー足場と多量体足場、または2つの多量体足場、足場とリンカー、足場とFnドメイン、または足場と抗体またはその断片、を連結できる。一部の実施形態では、本発明の足場は、足場および分離した異種の成分、足場および同じ足場に融合または複合した異種の成分、または足場および異なる足場に融合または複合した異種の成分を連結する少なくとも1つの非天然分子間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つまたはそれ超の多量体足場を形成するジスルフィド結合を含む。別の実施形態では、本発明の足場は、Nおよび/またはC末端領域の伸張を含んでもよい。一実施形態では、本発明の足場は、本明細書記載の血清半減期を延長するための変化を含む。さらに別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含み、疎水性の足場のコアを安定化させる。一実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、本発明の足場のベータ鎖は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超の、配列番号1~34、54、69、もしくは256のいずれか1つの同種のベータ鎖に対する、図16に示すFnIIIドメインのいずれか1つのベータ鎖に対する、またはInterProScanプログラムを使って測定して、InterproIPR008957フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むことがわかっている、またはPfam_スキャン、HMMER、またはいずれかの他のタンパク質配列をHiddenMarkovモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、PfamPF00041フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むとわかっているタンパク質ドメインのベータ鎖に対する、同一性を示す。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45、または131を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、さらにGベータ鎖は配列番号52を含む。別の特定的な実施形態では、本発明の足場は少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号44を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号50を含み、さらに、Gベータ鎖は配列番号53を含む。さらに別の特定的な実施形態では、本発明の足場は少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは、配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45、または131を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号51を含み、さらに、Gベータ鎖は配列番号53を含む。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは、配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、さらにGベータ鎖は配列番号52から構成される。別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは、配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号44から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号50から構成され、さらにGベータ鎖は配列番号53から構成される。さらに別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号51から構成され、さらに、Gベータ鎖は配列番号53から構成される。別の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは、基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、さらにGベータ鎖は基本的に配列番号52から構成される。別の特定的な実施形態では、本発明の足場は基本的に少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合から構成され、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号44から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号50から構成され、さらに、Gベータ鎖は基本的に配列番号53から構成される。特定的な実施形態では、本発明の足場は基本的に少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合から構成され、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号51から構成され、さらに、Gベータ鎖は基本的に配列番号53から構成される。別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45、または131を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、さらに、Gベータ鎖は配列番号52を含み、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、または131および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は配列番号52から構成され、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、または131および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は基本的に配列番号52から構成され、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、または131および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、さらに、Gベータ鎖は配列番号52を含み、ABループは配列番号35を含み、CDループは配列番号37を含み、さらに、EFループは配列番号39を含む。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は配列番号52から構成され、ABループは配列番号35から構成され、CDループは配列番号37から構成され、さらに、EFループは配列番号39から構成される。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は基本的に配列番号52から構成され、ABループは基本的に配列番号35から構成され、CDループは基本的に配列番号37から構成され、さらに、EFループは基本的に配列番号39から構成される。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、さらに、Gベータ鎖は配列番号52を含み、BCループは配列番号36を含み、DEループは配列番号38を含み、さらに、FGループは配列番号40を含む。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は配列番号52から構成され、BCループは配列番号36から構成され、DEループは配列番号38から構成され、さらに、FGループは配列番号40から構成される。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は基本的に配列番号52から構成され、BCループは基本的に配列番号36から構成され、DEループは基本的に配列番号38から構成され、さらに、FGループは基本的に配列番号40から構成される。別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、さらに、Gベータ鎖は配列番号52を含み、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。別の特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は配列番号52から構成され、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。別の具体的実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45から構成されCベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は基本的に配列番号52から構成され、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、Gベータ鎖は配列番号52を含み、ABループは配列番号35を含み、CDループは配列番号37を含み、さらに、EFループは配列番号39を含み、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、Gベータ鎖は配列番号52から構成され、ABループは配列番号35から構成され、CDループは配列番号37から構成され、さらに、EFループは配列番号39から構成され、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、Gベータ鎖は基本的に配列番号52から構成され、ABループは基本的に配列番号35から構成され、CDループは基本的に配列番号37から構成され、さらに、EFループは基本的に配列番号39から構成され、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、Gベータ鎖は配列番号52を含み、BCループは配列番号36を含み、DEループは配列番号38を含み、さらにFGループは配列番号40を含み、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、Gベータ鎖は配列番号52から構成され、BCループは配列番号36から構成され、DEループは配列番号38から構成され、さらに、FGループは配列番号40から構成され、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明の足場は、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を含み、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43、Cベータ鎖は基本的に配列番号45から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、Gベータ鎖は基本的に配列番号52から構成され、BCループは基本的に配列番号36から構成され、DEループは基本的に配列番号38から構成され、さらに、FGループは基本的に配列番号40から構成され、ここで、Cベータ鎖およびFベータ鎖それぞれ、配列番号45、および49中のシステイン残基が置換できないことを除いて、1つまたは複数のTn3モジュールのベータ鎖は少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。足場安定性の強化:FGループ長発明者はFGループの長さがFnIII足場の安定性に対してある種の役割を果たすことを発見した。特に、FOIのFGループで認められる長さより少なくとも1つのアミノ酸長さ短い非天然変異FGループを含むFnIII足場は、強化された安定性を有することが示されている。従って、本発明は、FOIに比較して、増加した安定性を有するフィブロネクチンタイプIIIFnIII足場変異体を得る方法を提供し、この方法は、FOIの変異体を操作するステップを含み、変異体のFGループが少なくとも1アミノ酸の欠失を含み、さらに変異体がFOIに比較して、増加した安定性を示す。ある特定の実施形態では、本発明の足場は、FOIのFGループより少なくとも1つのアミノ酸残基分が短い非天然変異体FGループを含む。例えば、本明細書で定義したように、ヒトテネイシンC第3FnIIIドメインの自然FGループは、10アミノ酸残基を含む。従って、ヒトテネイシンCの第3FnIIIドメインをFOIとして使って、改善された安定性を有するFnIII足場を特定するために、FGループは、9以下のアミノ酸残基に縮小されることになろう。FnIIIドメインのアミノ酸配列間の配列類似性は、一般的には低いが、全体としての3次元構造は類似している。従って、既知の技術、例えば、配列解析および構造オーバーレイを使って、複数のFOI由来のFnIIIドメインのFGループ例えば、標的に結合するなる種、異なるタンパク質、および異なるFnIII足場由来のFnIIIドメインを測定可能である例えば、図16参照。これらのループは、次に、変異を受けさせて、FOI由来のFGループよりも少なくとも1つのアミノ酸分が短いFGループを得ることができる。従って、一実施形態では、本発明は、どのような特殊なFGループの定義が使われるかにかかわらず、FOIのFGループより少なくとも1つのアミノ酸分短い非天然変異体FGループを含むFnIII足場を包含する。特定的な実施形態では、FOIの安定性は、FOIのFGループの少なくとも1つのアミノ酸の欠失により強化される。別の実施形態では、FOIの安定性は、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも8つ、または少なくとも9つ、または少なくとも10のFGループ中のアミノ酸の欠失により強化される。安定化FOIは、少なくとも1つの非天然ジスルフィド結合を含んでもよいことが特に意図されている。ある特定の実施形態では、FOIは、安定化される前に、非天然分子内ジスルフィド結合を含んでいた。他の実施形態では、安定化FOIは、さらに、操作され、少なくとも1つの非天然分子内ジスルフィド結合を導入される。特定的な実施形態では、本発明は、FOIの変異体を操作することを含む、FOIに比べて増加した安定性を有するFnIII足場変異体を得る方法を提供し、この足場変異体のFGループは、FGループの少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも8つ、または少なくとも9つ、または少なくとも10のアミノ酸欠失を含み、この変異体は、FOIに比べて増加した安定性を示す。ある特定の実施形態では、FnIII足場変異体は、また、長さおよび/または配列に関して無作為化された少なくとも1つのループすなわち、AB、BC、CD、DE、EF、および/またはFGを含む。足場変異体は、少なくとも1つの非天然ジスルフィド結合を含んでもよいことが、特に意図される。ある特定の実施形態では、FOIは、非天然ジスルフィド結合を含む。他の実施形態では、FnIII変異体は、さらに操作され、少なくとも1つの非天然ジスルフィド結合を導入される。ある特定の実施形態では、本発明の足場は、FOIに比べて増加した安定性を有するFnIII足場変異体すなわち、安定化FOIであり、FnIII足場変異体は、少なくとも1つの、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも8つ、または少なくとも9つ、または少なくとも10だけFOIのFGループより短いアミノ酸残基であるFGループを含み、FnIII足場変異体は、少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含む。安定性の測定単離された多量体足場またはその一部としての本発明の安定化FnIII足場の安定性の増加は、当技術分野でよく知られた技術、例えば、熱Tmおよび不安定化変性例えば、尿素、またはグアニジン塩での処理、プロテアーゼ処理例えば、サーモリシンでの処理またはタンパク質の安定性測定のために技術的に受け入れられた別の方法により容易に測定可能である。タンパク質の安定性測定に使用される技術の包括的考察は、canbefound、例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiologyおよびCurrentProtocolsinProteinSciencebyJohnWileyandSons.2007、で見付けることができる。一実施形態では、本発明の安定化FnIII足場は、耐熱性、不安定化変性に対する耐性、プロテアーゼ処理または当技術分野でよく知られた別の安定性パラメータにより測定して、操作前の同じFnIII足場すなわち、FOIに比べて、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、または少なくとも95またはそれ超の安定性の増加を示す。タンパク質の安定性は、変化する条件下でタンパク質により呈される蛍光のレベルにより測定可能である。タンパク質の相対的アンフォールド状態およびタンパク質が応力下示す内部蛍光の変化の間には正相関がある。熱アンフォールディング特性を測定する適切なタンパク質安定性アッセイには、示差走査熱量測定DSCおよび円偏光二色性CDが含まれる。タンパク質がDSCまたはCDで測定されたパラメータで大きなシフトを示す場合は、アンフォールド構造と相関する。このシフトが起こる温度は融解温度またはTmと名付けられる。一実施形態では、本発明の安定化足場は、類似条件下でのFOIに比べて、少なくとも1°C、少なくとも2°C、少なくとも3°C、少なくとも4°C、少なくとも5°C、少なくとも10°C、少なくとも15°C、少なくとも20°C、少なくとも25°C、少なくとも30°C、少なくとも35°C、少なくとも45°C、少なくとも50°C、少なくとも55°C、少なくとも60°C、少なくとも65°C、少なくとも70°C、少なくとも71°C、少なくとも72°C、少なくとも73°C、少なくとも74°C、少なくとも75°C、少なくとも76°C、少なくとも77°C、少なくとも78°C、少なくとも79°C、少なくとも80°C、少なくとも81°C、少なくとも82°C、少なくとも83°C、少なくとも84°C、少なくとも85°C、少なくとも85°C、少なくとも86°C、少なくとも87°C、少なくとも88°C、少なくとも89°C、少なくとも90°C、少なくとも91°C、少なくとも92°C、少なくとも93°C、少なくとも94°C、少なくとも94°C、少なくとも、少なくとも95°C、少なくとも96°C、少なくとも97°C、少なくとも98°C、少なくとも100°C、少なくとも105°C、少なくとも110°C、または少なくとも120°Cの増加した融解温度Tmを示す。別の実施形態では、本発明の安定化FnIII足場は、類似条件下でのFOIに比べて、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、または少なくとも95またはそれ超の融解温度Tmの増加を示す。タンパク質安定性のための別のアッセイには、タンパク質を、不安定化試薬、例えば、タンパク質内の相互作用を不安定化させる作用をする尿素またはグアニジン例えば、グアニジン-HClまたはグアニジンイソチオシナートに露出させることを含む。タンパク質を漸増レベルの尿素またはグアニジンに露出する際、相対的な、固有の蛍光を測定し、50のタンパク質分子がアンフォールドされる値を評価する。この値は、Cm値と名付けられ、タンパク質安定性のベンチマーク値を表す。Cm値が大きければ大きいほど、タンパク質の安定性が高くなる。一実施形態では、本発明の安定化FnIII足場は、類似の条件下の尿素変性実験で測定したFOIに比較して、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、または少なくとも95またはそれ超のCmの増加を示す。別の実施形態では、本発明の安定化FnIII足場は、類似の条件下のグアニジウム-HCl変性実験で測定したFOIに比較して、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、or少なくとも95またはそれ超のCmの増加を示す。タンパク質安定性を試験するために使用される別のアッセイは、プロテアーゼ耐性アッセイである。このアッセイでは、相対的レベルのタンパク質安定性が、経時プロテアーゼ分解に対する耐性と相関される。プロテアーゼ処理に対する耐性が大きければ大きいほど、タンパク質の安定性は高い。一実施形態では、本発明の安定化FnIII足場は、類似条件下でのFOIに比べて、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、または少なくとも95またはそれ超の安定性の増加を示す。多量体足場本発明の一態様では、タンデムに連結された少なくとも2つの本発明のFnIIIモノマー足場を含む多量体足場が提供される。このような多量体足場は、複数の形態に組み上げることができる。一部の実施形態では、モノマー足場は、直鎖状形式で組み上げられ、また、他の実施形態では、足場は、分岐形式で組み上げられる例えば、図1参照。特定的な態様では、本発明は多量体足場を提供し、少なくとも2つのFnIII足場がペプチドリンカーを介してタンデムに連結される。一部の実施形態では本発明の多量体足場中の各FnIII足場は異なる標的に結合し、それにより複数の機能を示し、および/または同じ標的に結合し、それにより標的結合の結合価および/または結合力を増加させる。一部の実施形態では、複数の足場が同じ標的に結合する場合に標的結合の結合価および/または結合力の増加が達成される。一部の実施形態では、結合価の増加により、標的に対する特定の作用、例えば、標的タンパク質の二量体化の増加作用が改善される。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、タンデムに連結された少なくとも2つの本発明のFnIIIモノマー足場を含み、各足場は、少なくとも1つの標的に結合し、各FnIII足場は、複数のループ領域に結合した複数のベータ鎖を含み、少なくとも1つのループは、FOIの同種のループの非天然変異体であり、また、FnIII足場のベータ鎖は、FOIの同種のベータ鎖に対して少なくとも50相同性すなわち、配列類似性を有する。ある特定の実施形態では、各FnIII足場は、同じFOIの同種のベータ鎖に対して少なくとも50相同性すなわち、配列類似性である。特定的な実施形態では、各FnIII足場は、野性型Tn3足場の同種のベータ鎖配列番号1に対して少なくとも50相同性すなわち、配列類似性を有する。各FnIII足場が、異なるFOIに対して少なくとも50相同性すなわち、配列類似性を有してもよいことが特に意図されている。例えば、本発明の多量体足場は、第1FnIII足場および第2FnIII足場を含んでもよく、この場合、第1FnIII足場のベータ鎖は、フィブロネクチンの第14FnIIIドメインの同種のベータ鎖配列番号69に対して少なくとも50相同性すなわち、配列類似性を有し、第2FnIII足場のベータ鎖は、野性型Tn3足場の同種のベータ鎖配列番号1に対して少なくとも50相同性すなわち、配列類似性を有する。一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも2つのFnIIIモノマー足場を含み、FOIは、ヒトテネイシンCの第3FnIIIドメインに対応するタンパク質配列である。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも2つのFnIII足場を含み、FOIは、野性型Tn3足場である。他の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも2つのFnIII足場を含み、FOIは、ヒトテネイシンC由来の別のFnIIIドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも2つのFnIII足場を含み、FOIは、別のテネイシンタンパク質由来のFnIIIドメイン、あるいは、別の生物体例えば、限定されないが、マウス、ブタ、ウシ、またはウマテネイシン由来のテネイシンタンパク質に対応するタンパク質配列である。一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも2つのFnIII足場を含み、FnIII足場のベータ鎖は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99の次記のいずれかの同種のベータ鎖に対して相同性すなわち、配列類似性を有する:ヒトテネイシンXB由来第29FnIIIドメイン配列番号11、ヒトテネイシンXB由来第31FnIIIドメイン配列番号12、ヒトテネイシンXB由来第32FnIII配列番号13、ヒトフィブロネクチンの第3FnIIIドメイン配列番号6、ヒトフィブロネクチンの第6FnIIIドメイン配列番号7、ヒトフィブロネクチンの第10FnIIIドメイン例えば、配列番号5および配列番号54、ヒトフィブロネクチンの第14FnIIIドメイン例えば、配列番号69および配列番号34、ヒト成長ホルモン受容体由来FnIIIドメイン例えば、配列番号8および配列番号15、ベータ共通受容体由来FnIIIドメイン例えば、配列番号9、IL-5受容体由来FnIII例えば、配列番号10、PTPR-F由来FnIII例えば、配列番号16および配列番号17、またはコラーゲンタイプXIV由来FnIIIドメイン例えば、配列番号18。さらに別の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも2つのFnIIIモノマー足場を含み、FOIは、任意の生物体由来FnIIIドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも2つのFnIII足場を含み、天然配列は、好熱性または超好熱性生物体、例えば、限定されないが、アーケオグロブスフルギダス、スタフィロサームスマリヌス、スルホロブスアシドカルダリウス、スルホロブスソルファタリカス、およびスルホロブストコダイイ、由来の予測FnIIIドメインに対応する。一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、配列番号20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、または33のいずれかの同種のベータ鎖に対して、少なくとも2つのFnIII足場を含み、FnIII足場のベータ鎖は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99の相同性すなわち、配列類似性を有する。一実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも2つのFnIIIモノマー足場を含み、FnIII足場のベータ鎖は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99の次記の同種のベータ鎖に対する相同性配列類似性を有する:図16に示されるFnIIIドメインのいずれか1つ、または、InterProScanプログラムを使って測定して、InterproIPR008957フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むことがわかっている、またはPfam_スキャン、HMMER、またはいずれかの他のタンパク質配列をHiddenMarkovモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、PfamPF00041フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むとわかっているタンパク質ドメイン。多量体タンデム足場一実施形態では、本発明の多量体足場は、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、またはそれ超の本発明のFnIIIモノマー足場を含む。一部の実施形態では、一部のFnIIIモノマー足場がタンデムに連結される。さらに別の実施形態では、一部のFnIIIモノマー足場がタンデムに連結され、一部のFnIIIモノマー足場は、タンデムに連結されない。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10またはそれ超のタンデムに連結された本発明の足場を含む例えば、図1および図2参照。一実施形態では、多量体足場は、FnIIIモノマー足場間の共有結合を介して、例えば、直接FnIII足場を連結することにより、またはリンカー、例えば、ペプチドリンカーを組み込む事により、生成される。特定の例では、共有結合足場は、FnIIIモノマー足場をコードする融合遺伝子を構築することにより、あるいは、システイン残基のコドンをモノマーFnIII足場中へ操作して、発現産物間でジスルフィド結合形成を可能とすることにより、生成される。一実施形態では、本発明の多量体足場は、いかなる介在アミノ酸の追加をも必要とせず、相互に直接連結される少なくとも2つのFnIII足場を含む。別の実施形態では、本発明の多量体足場は、リンカー、例えば、ペプチドリンカー経由でタンデムに連結されている少なくとも2つのFnIII足場を含む。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、ペプチドリンカーを介して連結されている少なくとも2つのFnIII足場を含み、ペプチドリンカーは、1~約1000、または1~約500、または1~約250、または1~約100、または1~約50、または1~約25のアミノ酸を含む。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されている少なくとも2つのFnIII足場を含み、ペプチドリンカーは、1~約20、または1~約15、または1~約10、または1~約5のアミノ酸を含む。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結されている少なくとも2つのFnIII足場を含み、リンカーは、官能性成分である。官能性成分は、目的の多量体足場の機能および/または特性に基づき選択される。例えば、精製に有用な官能性成分例えば、ヒスチジンタグは、リンカーとして使用可能である。リンカーとして使用可能な官能性成分には、限定されないが、ポリエチレングリコールPEG、細胞障害剤、放射性核種、造影剤、ビオチン、二量体化ドメイン例えば、ロイシンジッパードメイン、ヒト血清アルブミンHSAまたはそのFcRn結合部分、抗体ドメインまたは断片例えば、抗体可変ドメイン、CH1ドメイン、Cカッパドメイン、Cラムダドメイン、CH2、またはCH3ドメイン、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、IgG分子、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非FnIII足場、エピトープタグ、組換え型ポリペプチドポリマー、サイトカイン、等が含まれる。リンカーとして使用可能な特定のペプチドリンカーおよび官能性成分は、後程開示される。一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、1つまたは複数のリンカーを介して連結されている少なくとも2つのFnIII足場を含み、各FnIII足場間に挿入されるリンカーは、同じリンカーであっても、または異なるリンカーであってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、複数のリンカーを含むことができ、これらは、同じリンカーでも異なるリンカーでもよい。一部の実施形態では、複数のリンカーが鎖状に連結される場合、一部または全部のリンカーが官能性成分であってよい。多量体足場結合化学量論一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、同じエピトープに対し特異的な足場を含む。他の実施形態では、本発明の多量体足場は、異なるエピトープに対し特異的な足場を含み、異なるエピトープは、同じまたは異なる標的上の異なるエピトープであり得る。特定的な実施形態では、多量体足場の足場は、同じ標的分子上の2つ以上の異なるエピトープ例えば、非オーバーラップエピトープに結合する。別の特定的な実施形態では、多量体足場の足場は、異なる標的分子上の2つ以上の異なるエピトープに結合する。さらに別の特定的な実施形態では、多量体足場の足場は、同じ標的上の2つ以上の異なるエピトープに結合し、さらに、1つまたは複数の異なる標的分子上の少なくとも1つのエピトープに結合する。さらに別の特定的な実施形態では、多量体足場の足場は、多量体標的分子上の同じエピトープに結合する。さらに別の実施形態では、多量体足場の足場は、隣接する標的分子上の同じエピトープに結合する。特定の実施形態では、多量体足場の足場は、隣接細胞表面上の標的分子の2つ以上のコピー上の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、多量体足場の足場は、同じまたは異なる結合親和性および/または結合力で、同じ標的または異なる標的中の同じエピトープまたは異なるエピトープに結合することができる。別の実施形態では、本発明の多量体足場中のモノマー足場は、所望の効果を例えば、相乗的に達成する、または強化するように作られた特異的結合パターンに従って特異的標的に結合することができる。例えば、直鎖多量体足場中のFnIII足場は、ある特定のパターンに従って単一標的または複数標的に結合できる。例えば、6モジュール直鎖多価性足場中のFnIII足場は、2つの標的AとBに、AAABBBパターン、AABBAAパターン、ABABABパターン、AAAABBパターン、等に従って結合でき;3つの標的に、AABBCCパターン、ABCABCパターン、およびABCCBAパターン、等に従って結合でき;4つの標的に、ABCDDAパターン、ABCADAパターン、等に従って結合できる;等である。さらに、本発明の多量体足場が、複数の操作された例えば、ジスルフィド操作された、ループ操作された、またはジスルフィドおよびループ両方の操作されたおよび操作されていない足場を含む場合、このようなモノマー足場は、ある特定のパターンに従って配置し、ある特定の生物学的効果を達成する、または強化することができる。モノマー足場のこのような組み合わせは、コンビナトリアルケミストリー的に組み立てられ、その後、当技術分野で既知の方法を使って評価できる。一部の実施形態では、分岐構築物中の多量体足場、例えば、Fc融合体または抗体様形式の多量体足場は、特定のパターンに従って単一標的または複数の標的に結合できる。例えば、ある特定の実施形態では、抗体様形式足場中のIgG重鎖に融合した直鎖形式足場は、第1の標的に結合でき、一方、抗体様形式足場中のIgG軽鎖に融合した多価性の直鎖構築物は、第2の標的に結合できる。別の実施形態では、抗体様形式足場のIgG重鎖に融合した直鎖形式足場は、特定の親和性で標的に結合でき、一方、抗体様形式足場のIgG軽鎖に融合した直鎖形式足場は、異なる親和性で同じ標的に結合できる。一部の実施形態では、抗体のYの左アーム中の鎖に融合した足場は、第1の標的に結合することができ、一方、抗体のYの右側の鎖に融合した足場は、第2の標的に結合することができる。融合体本発明は、少なくとも2つのFnIIIモノマー足場を含む多量体足場をさらに提供し、少なくとも1つのモノマー足場が異種の成分に融合可能である。これに関連して、異種の成分は、スペーサーとして足場の連結に使用されないが、本発明の多量体足場に追加の機能性を与えることができ得る。例えば、一部の実施形態では、細胞表面上の標的に結合する多量体足場を細胞障害剤に融合して、標的特異的細胞殺作用を促進できる。さらなる融合体は、後程開示される。一部の実施形態では、異種の成分は、リンカーとして機能可能である。本発明は、1つまたは複数の異種の成分に複合化した、または融合した本発明の足場の使用を包含し、異種の成分には、限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣薬、合成薬剤、無機分子、および有機分子が含まれる。本発明は、異種のタンパク質またはポリペプチドまたはその断片に組換えにより融合した、または化学的に複合した足場の使用を包含する。複合には、共有結合および非共有結合による複合の両方が含まれる。一部の実施形態では、本発明の足場は、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも500、または少なくとも1000アミノ酸のポリペプチドに融合、または化学的に複合して、融合タンパク質を生成可能である。足場の1つまたは複数の異種の成分に対する融合または複合は、直接、すなわち、足場と異種の成分の間にリンカー無しで、または、1つまたは複数の本明細書記載のリンカー配列を介してであり得る。一部の実施形態では、足場は、インビトロでまたはインビボで、足場を標的細胞中の特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合または複合することにより、異種のポリペプチドに特定の細胞型を標的にさせるのに使用できる。異種のポリペプチドに融合または複合した足場は、また、当技術分野で既知の方法を使ったインビトロイムノアッセイおよび精製法に使用可能である。例えば、国際公開第93/21232号;欧州特許第439、095号;Naramuraetal.Immunol.Lett.39:91-99、1994;米国特許第5、474、981号;Gilliesetal.、PNAS89:1428-1432、1992;およびFelletal.、J.Immunol.146:2446-2452、1991、を参照のこと。これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、足場は、限定されないが、IgGFcの定常領域、等の免疫グロブリンまたはそのドメインに、例えば、NまたはC末端を介して、足場に融合または複合することにより、ヒト免疫応答と一体化することができる。Fc融合分子は、免疫応答の補体成分を活性化し、タンパク質足場の治療効果を高める。同様に、足場と補体タンパク質、例えば、CIqの間の融合体は、細胞を標的化するのに使用可能である。足場と毒素の間の融合体は、本明細書記載のように特定の抗原を含む細胞を特異的に破壊するのに使用可能である。種々の出版物には、FcRn結合親和性が保存されているが、他のFc受容体に対する親和性は大きく減らされている抗体と分子を融合することにより例えば、国際公開第99/43713号参照、または分子を抗体のFcRn結合ドメインと融合することにより例えば、国際公開第00/09560号;米国特許第4、703、039号参照、FcRn結合ポリペプチドの分子中へ導入して、半減期を変更できる生理学的に活性な分子を得る方法に関し記載されている例えば、国際公開第97/43316号;米国特許第5、869、046号;同5、747、035高;国際公開第96/32478号;および同91/14438号を参照。生理的に活性な分子の半減期を延長する具体的な技術と方法は、また、米国特許第7、083、784号で見付けることができる。特に、本発明の足場は、IgG由来のFc領域に融合でき、Fc領域は、アミノ酸残基変異M252Y/S254T/T256EまたはH433K/N434F/Y436Hアミノ酸位置はKabatナンバリングスキーマに従い命名を含むことが意図されている。一部の実施形態では、本発明の多量体足場の半減期は、多量体足場を本質的に不定形の組換え型ポリペプチド例えば、XTEN登録商標ポリペプチドと遺伝的に融合することにより、またはポリエチレングリコールPEGと複合することにより、延長される。一部の実施形態では、本発明の足場は、インビボ、または血清半減期を増加または延長する分子と融合できる。一部の実施形態では、本発明の足場は、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンHSA、その新生児Fc受容体FcRn結合断片、ポリエチレングリコールPEG、多糖類、免疫グロブリン分子IgGまたはその断片、補体、ヘモグロビン、結合ペプチド、リポタンパク質および血流中および/またはその組織浸透中のその半減期を増やす他の因子に融合または複合される。これらのいずれの融合体も、標準的な方法、例えば、公に利用可能な遺伝子配列を使って構築された組換え型融合体遺伝子由来の融合タンパク質の発現により、生成可能である。さらに、本発明の足場は、マーカー配列、例えば、精製促進用ペプチドに融合できる。一部の実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ポリヒスチジンペプチドHisタグ、例えば、他のベクターも多くが市販されているが、例えば、pQE発現ベクターQIAGEN、Inc.、9259EtonAvenue、Chatsworth、Calif、91311で提供されるtagのオクタヒスチジンタグHis-8-tagまたはヘキサヒスチジンタグHis-6-tag等がある。Gentzetal.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824、1989、に記載のように、例えば、ポリ-ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製法を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、限定されないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素HAタグ例えば、Wilsonetal.、Cell37:767、1984を参照、FLAGタグ、Strepタグ、mycタグ、V5タグ、GFPタグ、AU1タグ、AU5タグ、ECSタグ、GSTタグ、またはOLLASタグが含まれる。本発明の足場を含むさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および/またはコドンシャフリングまとめてDNAシャフリングと呼ばれるの技術により生成可能である。DNAシャフリングは、本発明の足場の活性を変えるために採用できる例えば、高い親和性と低い解離速度を有する足場。一般的記述には、米国特許第5、605、793号;同5、811、238号;同5、830、721号;同5、834、252号;および同5、837、458号、ならびにPattenetal.、Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33、1997;Harayama、TrendsBiotechnol.162:76-82、1998;Hansson、etal.、J.Mol.Biol.287:265-76、1999;およびLorenzoandBlasco、1998、Biotechniques242:308-313を参照のことこれらそれぞれの特許と論文は、参照によってその全体が組み込まれる。足場、またはそのコードされた足場は、変異性PCR、無作為ヌクレオチド挿入または組換え前の他の方法を使って無作為変異誘発を受けることにより改変できる。特異的標的に結合する、足場をコードするポリヌクレオチドの1つまたは複数の部分は、1つまたは複数の異種の分子の1つまたは複数の成分、モチーフ、断片、部分、ドメイン、断片、等と組換え可能である。抗体様多量体足場一部の実施形態では、本発明の多量体足場は、少なくとも2つのFnIIIを含み、少なくとも1つの足場は、限定されないが、無傷抗体、抗体可変ドメイン、CHlドメイン、Cカッパドメイン、Cラムダドメイン、Fcドメイン、CH2、またはCH3ドメイン、を含む抗体例えば、IgGのドメインまたは断片に融合されている。一部の実施形態では、本発明の足場は、抗体のドメインまたは断片に融合可能である。抗体のドメインまたは断片は、下記のFcドメインと同様に、本発明の多量体足場の形成を促進する二量体化または多量体化ドメインを提供することにより多量体足場の結合力および/または親和性をさらに増強する。一部の実施形態では、2つのFnIIIドメインを含むただ1つの多量体タンデム足場が抗体のドメインまたは断片に複合または融合される。例えば、単一多量体タンデム足場が、抗体のドメインまたは断片例えば、抗体の重鎖または軽鎖のポリペプチドのN末端に融合できる。一部の実施形態では、多価性の足場が、1つまたは複数のFnIII足場を、抗体のドメインまたは断片例えば、抗体の重鎖および/または軽鎖のポリペプチドのN末端および/またはC末端に融合または複合することにより生成される。一部の実施形態では、抗体のドメインまたは断片に融合した一部または全部の足場は、同じである。一部の他の実施形態では、抗体のドメインまたは断片に融合した一部のまたは全部の足場は、異なる。一部の実施形態では、抗体様多価性の足場生成用に使用する本発明の足場は、同じ数のFnIIIモジュールを含んでもよい。他の実施形態では、抗体様多価性の足場生成用に使用する本発明の足場は、異なる数のFnIIIモジュールを含んでもよい。例えば、四価のFnIII足場は、例えば、直鎖型四価のFnIII足場を単一位置に融合することにより、または1つのFnIIIモノマー足場を1つの位置および3量体直鎖型FnIII足場を別の位置に融合することにより、または2つの2量体FnIII直鎖型足場を2つの異なる位置に融合することにより、または4つのFnIIIモノマー足場をそれぞれ単一位置に融合することにより、形成可能である。特定的な実施形態では、本発明の多量体FnIII足場は、抗体のドメインまたは断片に融合した4つの多量体直鎖足場を含み、各多量体直鎖足場は、リンカーを介してタンデムに連結している2つのFnIIIモノマー足場を含む図1。他の実施形態では、本発明の多量体FnIII足場は、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの、少なくとも6つの、少なくとも7つのまたは少なくとも8つの抗体のドメインまたは断片に融合した本発明のモノマーまたは多量体FnIII足場を含む。1つの特定的な実施形態では、四価のFnIII足場は、1つの足場を抗体のドメインまたは断片のそれぞれの軽鎖および重鎖のN末端に融合することにより生成できる例えば、図2のA9構築物参照。抗体様形式の多価性FnIII足場は、本発明の足場の任意の組み合わせを抗体のドメインまたは断片または改変抗体に融合することにより生成できる。改変抗体の例には、ドメイン欠失した抗体、ミニボディ、例えば、米国特許第5、837、821号参照、四価ミニボディ、四価抗体例えば、ColomaMorrison、NatureBiotechnol.15:159-163、1997;国際公開第95/09917号参照、熱安定化抗体、ヒト化抗体、等が含まれる。図1に従って抗体様多価性の足場の生成に使用されるそれぞれの本発明の直鎖足場は、同じリンカーおよびリンカー分布、または異なるリンカーおよび異なるリンカー分布を含んでもよい。Fc融合多量体足場一部の実施形態では、本発明の多量体足場はFcドメインに結合した複数のモノマーまたは多量体足場を含む。本発明の多量体足場のFcドメインを含む抗体断片への融合は、多量体FnIII足場の二量体の形成を促進する二量体化ドメインを提供することにより、多量体FnIII足場の結合力および/または活性をさらに増強する。一部の実施形態では、ただ1つの多量体FnIII足場がFcドメインに融合される。特定的な実施形態では、本発明の多量体足場は、Fcドメインに融合した2つの多量体FnIII足場を含み、各多量体FnIII足場は、1つまたは複数のリンカーを介して連結された2つ以上のFnIII足場を含む図1。一特定的な実施形態では、Fcドメインに融合した多量体FnIII足場は、直鎖形式足場である。一特定的な実施形態では、2つのタンデムFnIIIドメインを含む2つの直鎖形式FnIII足場がFcドメインに融合され、4の結合価を有する多量体足場を生成する例えば図2のA7構築物参照。別の特定的な実施形態では、2つの直鎖形式足場で、4つのFnIIIモノマー足場を含むそれぞれがFcドメインに融合されて、結合価8のFnIII多量体足場を生成する例えば、図2のA8構築物参照。一部の実施形態では、Fcドメインに融合されたFnIII足場は、同じ数のFnIIIモジュールを含む。一部の実施形態では、Fcドメインに融合されたFnIII足場は、異なる数のFnIIIモジュールを含む。一部の実施形態では、Fcドメインに融合されたFnIII足場は、同じリンカーを含む。他の実施形態では、Fcドメインに融合されたFnIII足場は、異なるリンカーを含む。一部の実施形態では、異なる本発明の多量体FnIII足場が、ヘテロ二量体の形成を助けるFcドメイン変異の使用により二量体化できる。例えば、国際公開第96/27011号参照。これは、第1Fcドメインの界面由来の1つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖例えば、チロシンまたはトリプトファンで置換されている方法について記載している。大きなアミノ酸側鎖を、より小さい側鎖で例えば、アラニンまたはトレオニンで置換することにより、大きな側鎖に対する同じまたは類似のサイズの補償的空洞が第2のFcドメインの界面上に形成される。これが、望ましくない最終産物、例えば、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の生成を増加させる機序を提供する。Fc領域の変異体例えば、アミノ酸置換および/または付加および/または欠失は、抗体のエフェクター機能を強化または低下させる例えば、米国特許第5、624、821号;同5、885、573号;同6、538、124号;同7、317、091号;同5、648、260号;同6、538、124号;国際公開第03/074679号;同04/029207号;同04/099249号;同99/58572号;米国特許公開第2006/0134105号;同2004/0132101号;同2006/0008883号、参照、および抗体の薬物動態学的特性例えば、半減期を変えることができる米国特許第6、277、375号および同7、083、784号参照ことが知られている。従って、特定の実施形態では、本発明の多選択性FnIII足場は、改変されたFc領域を含むFcドメインを含み、多量体FnIII足場の機能的および/または薬物動態学的特性を変えるために、1つまたは複数の変化がFc領域でなされている。エフェクター機能および/または抗炎症性活性を増加、または減少させるようにFc領域のグリコシル化を修飾できることも知られている例えば、Umanaetal.、Nat.Biotechnol.17:176-180、1999;Daviesetal.Biotechnol.Bioeng.74:288-294、2001;Shieldsetal.、J.Biol.Chem.277:26733-26740、2002;Shinkawaetal.、J.Biol.Chem.278:3466-3473、2003;米国特許第6、602、684;6、946、292号;同7、064、191号;同7、214、775号;同7、393、683号;同7、425、446号;同7、504、256号;米国特許公開第2003/0157108号;同2003/0003097号;同2009/0010921号;Potillegent登録商標technologyBiowa、Inc.Princeton、N.J.;GlycoMAb登録商標glycosylationengineeringtechnologyGLYCARTbiotechnologyAG、Zurich、Switzerland;Kenekoetal.、Science313:670-673、2006;Scallonetal.、Mol.Immuno.447:1524-34、2007、を参照のこと。従って、一実施形態では、本発明の多量体FnIII足場のFc領域は、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化を含み、多量体足場の細胞障害性および/または抗炎症性特性が変えられる。多量体足場トポロジー当業者なら、上記図1、図2で、および本明細書全体で考察される多量体足場は、単に説明用の例であることをわかるであろう。図1と図2で示す構築物トポロジーまたは形式は、一部の実施形態では、本発明の足場がFcドメインおよび抗体のポリペプチド成分のN末端に融合されることを示している。本発明の足場は、任意の適切な空間配置のFcドメイン、抗体軽鎖、および抗体重鎖のC末端に融合可能である。例えば、一部の実施形態では、四価の足場は、FnIIIモノマー足場を抗体の各重鎖のN末端およびFnIIIモノマー足場を各軽鎖のC末端ドメインに融合させることにより、FnIIIモノマー足場を抗体の各軽鎖のN末端およびFnIIIモノマー足場を各重鎖のC末端に融合することにより、またはFnIIIモノマー足場を抗体の各重鎖のN末端およびFnIIIモノマー足場を各軽鎖のN末端に融合させることにより、作成できる。モノマーおよび/または多量体FnIII足場は、可変領域および定常領域の両方を含む完全長重鎖および/または軽鎖に融合できる。あるいは、モノマーおよび/または多量体FnIII足場は、定常領域のみを含む切断型重鎖および/または軽鎖に融合できる例えば、図2のA9構築物、等。多量体足場は、図1に示す形式を構成要素として使って、作成できる。例えば、抗体様およびFc融合体形式は、より単純な直鎖形式モジュールを含む組み合わせである。従って、一部の実施形態では、図1の構成要素を組み合わせて、さらに複雑な多量体足場形式を作成できる。図1と2は、また、一部の実施形態で、本発明の多量体足場は、直鎖でも、分岐でもよく、異なるレベルの分岐を示してもよいことを示している。例えば、Fc形式は、一次分岐形式の一例を提供し、一方、抗体様形式は、二次分岐形式の一例を提供する。より高次の分岐構築物は、抗体様形式またはFc融合体形式中の直鎖形式構成要素をFc融合体形式構成要素または抗体様構成要素で置き換え、それらをFcまたは抗体のポリペプチド成分のC末端またはN末端に連結することにより得られる。図1と2、および表1は、一部の実施形態では、多量体足場中のリンカーは、構造的に、および機能的に多様であってよく、複数の結合点を提供することができるという事実を示している。例えば、Gly4-Ser2-Gly-Thr-Gly-Ser-Ala-Met-Ala-Ser-Gly4-Ser1-Alaリンカーにより連結されている第4および第5FnIIIモジュールを除いて、A4およびA5構築物中の全てのFnIIIモジュールは、Gly4-Ser3Alaリンカーにより連結されている。例えば、A7構築物では、第1と第2FnIIIドメインおよび第3と第4FnIIIドメインは、Gly4-Ser3Alaリンカーにより連結されており、一方、第2と第3FnIIIドメインは、官能性成分リンカーとしてFcドメインにより連結されている。図1のFc融合体は、一部の実施形態では、モノマーまたは多量体FnIII足場は、官能性成分リンカーのポリペプチドのN末端に融合できることを例示している。一部の実施形態では、本発明のモノマーまたは多量体FnIII足場は、Fc融合体形式の構築物中のFcドメインのC末端に容易に融合できる。同様に、抗体様形式構築物中の抗体または改変抗体は、また、官能性成分リンカーでもある。この事例では、Gly4-Ser3AlaもしくはGly4-Ser2Gly-Thr-Gly-Ser-Ala-Met-Ala-Ser-Gly4-Ser1-Alaの場合のような2つの結合点の代わりに、またはFcドメインの場合のような4つの可能な結合点の代わりに、図1の抗体様の例に示される抗体は、6つの可能な結合点を提供する。図1の抗体様形式は、一部の実施形態では、官能性成分リンカー中のN末端結合点のみが、本発明のFnIIIドメインにより結合されることを例示している。抗体様形式構築物では、一部または全部の本発明の足場が、抗体または改変抗体ドメインの重鎖および軽鎖のC末端に容易に融合できる。他の場合も融合化学量論が適用でき、すなわち、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、またはそれ超の本発明の足場を、抗体または改変抗体に融合できる。図1と2は、また、一部の実施形態では、多量体FnIII足場は、他のFnIII多量体足場を組み合わせることにより生成できることを示している。例えば、図2のFc形式A6、A7、およびA8足場は、多量体足場が2つのポリペプチド鎖で形成されているホモ2量体FnIII足場であり、ポリペプチド鎖はそれぞれFcドメインに融合した直鎖形式FnIII足場を含み、それらは次いで分子間ジスルフィド結合を介して連結される。図1と2の抗体様形式足場は、ヘテロテトラマーFnIII足場の例であり、2つの異なる型の足場FnIIIモノマー足場をIgG軽鎖定常領域に融合して形成された2つのFnIII足場、およびFnIIIモノマー足場をIgGのCH1-ヒンジ領域-Fc領域に融合することにより形成された2つのFnIII足場に対応する4つのポリペプチドが分子間ジスルフィドを介して連結されている。本発明の足場の生成本明細書記載のFnIII足場は、新しいまたは改良された標的結合タンパク質を進化させるいずれの技術においても使用可能である。一特定例では、標的は、固体支持体、例えば、カラム樹脂またはマイクロタイタープレートウエル、上に固定され、標的は、候補足場ベース結合タンパク質ライブラリーと接触させられる。このようなライブラリーは、これに限定されないが、Tn3モジュールを含むFnIIIドメインから、CDR様ループの配列および/または長さの無作為化を使って構築されたクローンから構成できる。一実施形態では、ライブラリーは、ファージ、ファージミド、ウイルス、細菌性、酵母、もしくは哺乳動物細胞ディスプレイであっても、リボソームディスプレイライブラリーであってもよい。所望により、このライブラリーは、例えば、Szostaketal.、米国特許第6、258、558号;同6、261、804号;同5、643、768号;および同5、658、754号、に記載された技術により生成されるRNAタンパク質融合体ライブラリーであってもよい。あるいは、それは、DNAタンパク質ライブラリー例えば、国際公開第2000/032823号に記載のであってもよい。この点については、バクテリオファージファージディスプレイは、よく知られた技術の1つであり、大きなオリゴペプチドライブラリーを選別し、標的に特異的に結合することができるこれらのライブラリーの成員を特定することを可能とする。ファージディスプレイは、バクテリオファージ粒子表面のコートタンパク質への融合体として、変異体ポリペプチドが提示される技術であるScott、J.K.andSmith、G.P.1990Science249:386。ファージディスプレイの有用性は、選択的に無作為化されたタンパク質変異体または無作為にクローン化されたcDNAの大きなライブラリーから、高親和性で標的分子に結合する配列を素早く、かつ、効率的に選別できるという事実にある。ペプチドCwirla、S.E.etal.1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87:6378またはタンパク質Lowman、H.B.etal.1991Biochemistry、30:10832;Clackson、T.etal.1991Nature、352:624;Marks、J.D.etal.1991、J.Mol.Biol.、222:581;Kang、A.S.etal.1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:8363のファージディスプレイライブラリーが、特異的結合特性を有するものを目的として、数百万のポリペプチドまたはオリゴペプチドを選別するために使用されてきたSmith、G.P.1991CurrentOpin.Biotechnol.、2:668。ランダム変異体のファージライブラリーの選別には、大量の変異体を構築し増殖させる戦略、標的受容体を使った親和性精製手法、および結合濃縮の結果を評価する手段が必要である例えば、米国特許第5、223、409号、同5、403、484号、同5、571、689号、および同5、663、143号、参照。大抵のファージディスプレイ方法は、繊維状ファージを使っているが、ラムダ形ファージディスプレーシステム国際公開第95/34683号;米国特許第5、627、024号、T4ファージディスプレーシステムRenetal.、Gene、215:4391998;Zhuetal.、CancerResearch、5815:3209-32141998;Jiangetal.、InfectionImmunity、6511:4770-47771997;Renetal.、Gene、1952:303-3111997;Ren、ProteinSci.、5:18331996;Efimovetal.、VirusGenes、10:1731995およびT7ファージディスプレーシステムSmithandScott、MethodsinEnzymology、217:228-2571993;米国特許第号5、766、905号も知られている。今や、基本的ファージディスプレイ概念に関し、多くの他の改良と変形物の開発が進められている。これらの改善は、選択標的分子への結合に関して、ディスプレーシステムのペプチドライブラリーを選別する能力、およびこれらのタンパク質を所望の特性に関し選別する潜在力を有する機能的タンパク質を提示する能力を強化する。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応デバイスが開発され国際公開第98/14277号、さらに、ファージディスプレイライブラリーが、二分子相互作用国際公開第98/20169号;同98/20159号および制約を受けたらせん状ペプチドの特性を解析し制御する国際公開第98/20036ために使用されている。国際公開第97/35196号には、親和性リガンドを単離する方法が記載され、これは、ファージディスプレイライブラリーが、その中でリガンドが標的分子に結合する1つの溶液、およびその中で親和性リガンドが標的分子に結合しない第2の溶液と接触させ、選択的に結合リガンドを単離する方法である。国際公開第97/46251号には、ランダムファージディスプレイライブラリーをアフィニティー精製した抗体でバイオパニングし、次に、結合ファージを単離した後、マイクロプレートウエルを使ってマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法が記載されている。また、黄色ブドウ球菌タンパク質Aの親和性タグとしての使用が、報告されているLietal.1998MolBiotech.、9:187。国際公開第97/47314号には、コンビナトリアルライブラリーファージディスプレイライブラリーでもよいを使った酵素特異性を鑑別するための基質サブトラクションライブラリーの使用について記載されている。ファージディスプレイを使った洗浄剤としての使用に適した酵素の選択方法が国際公開第97/09446号に記載されている。特異的結合タンパク質を選択するさらなる方法が、米国特許第5、498、538号、同5、432、018号、および国際公開第98/15833号に記載されている。ペプチドライブラリーの生成およびこれらのライブラリーの選別方法は、また、米国特許第5、723、286号、同5、432、018号、同5、580、717号、同5、427、908号、同5、498、530号、同5、770、434号、同5、734、018号、同5、698、426号、同5、763、192号、および同5、723、323号に記載されている。バイオインフォマティクス手法は、天然FnIIIドメインのループ長さおよび多様性の優先傾向を測定するために使用可能である。この分析を使って、ループ長さおよび配列多様性に対する優先傾向を、制限された無作為化手法の開発に採用できる。この制限された無作為化では、相対的ループ長さおよび配列の優先傾向が、ライブラリー戦略の開発に組み込まれる。ループ長さおよび配列多様性分析をライブラリー開発に一体化することが、制限された無作為化すなわち、アミノ酸が入ることができる無作為化ループ内の特定の位置が限定されているにつながる。本発明は、また、本発明の非天然FnIII足場の多様な集団を含む組換え型ライブラリー以降、本発明のライブラリーと呼ぶを提供する。一実施形態では、本発明のライブラリーは、複数のループ領域に連結した複数のベータ鎖ドメインを含む非天然FnIII足場を含み、1つまたは複数の前記ループが、FOI中の同種のループ由来の少なくとも1つのアミノ酸の欠失、置換または付加により変化し、さらに、FnIII足場のベータ鎖が、FOIの同種のベータ鎖配列に対し少なくとも50の相同性すなわち、配列類似性を有する。組換え型ライブラリーの生成に有用なFOI配列の非制限的例は、表1および図16に提供されている。一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然FnIII足場を含み、FOIは、ヒトテネイシンCの第3FnIIIドメインに対応するタンパク質配列である。一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然FnIII足場を含み、FOIは、ヒトフィブロネクチンの第10FnIIIドメインに対応するタンパク質配列である。一部の実施形態では、本発明のライブラリー非天然FnIII足場を含み、FOIは、ヒトフィブロネクチンの第14FnIIIドメインに対応するタンパク質配列である。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然FnIII足場を含み、FOIは、野性型Tn3足場である。他の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然FnIII足場を含み、FOIは、ヒトテネイシンC由来の追加のFnIIIドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然FnIII足場を含み、FOIは、別のテネイシンタンパク質由来のFnIIIドメイン、あるいは、別の生物体例えば、限定されないが、マウス、ブタ、ウシ、またはウマテネイシン由来のテネイシンタンパク質に対応するタンパク質配列である。さらに別の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然FnIII足場を含み、FOIは、任意の生物体由来のFnIIIドメインに対応するタンパク質配列である。他の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然FnIII足場を含み、天然配列は、好熱性または超好熱性生物体由来の予測FnIIIドメインに対応する。例えば、超好熱性生物体は、超好熱性古細菌、例えば、アーケオグロブスフルギダス、スタフィロサームスマリヌス、スルホロブスアシドカルダリウス、スルホロブスソルファタリカス、およびスルホロブストコダイイ、であってもよい。一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、非天然FnIII足場を含み、FnIII足場のベータ鎖は、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95または少なくとも99の次記のベータ鎖に対する相同性配列類似性を有する:配列番号1~34、54、69または図16に示された配列のいずれかの同種のベータ株ドメイン、またはPfam_スキャン、HMMER、またはいずれかの他のタンパク質配列をHiddenMarkovモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、PfamPF00041フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むとわかっているタンパク質ドメインのベータ鎖。上で詳細に説明したように、足場の種々のベータ鎖を連結するループは、長さおよび/または配列多様性に関し無作為化できる。一実施形態では、本発明のライブラリーは、長さおよび/または配列多様性に関し無作為化されている少なくとも1つのループを有するFnIII足場を含む。一実施形態では、FnIII足場の少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つのまたは少なくとも6つのループが、長さおよび/または配列多様性に関して無作為化されている。一実施形態では、少なくとも1つのループが、一定に保持され、一方、少なくとも1つの追加のループが、長さおよび/または配列多様性に関して無作為化されている。別の実施形態では、ループAB、CD、およびEFのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てが一定に保持され、ループBC、DE、およびFGのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てが長さまたは配列多様性に関し無作為化されている。別の実施形態では、ループAB、CD、およびEFのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つ全てが無作為化され、ループBC、DE、およびFGのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つ全てが長さおよび/または配列多様性に関して無作為化されている。上で詳細に説明したように、驚くべきことに、FOIのFGループ中のものより、少なくとも1つのアミノ酸分短い長さのFGループが、安定性の増加を示すということが明らかになった。従って、本発明は、FnIII足場を含む本発明のライブラリーを提供し、ここで、FGループの長さが少なくとも1つのアミノ酸分だけ、FOIの同種のFGループよりも短く保持されていることを除いて、少なくとも1つのループが長さおよび/または配列多様性に関し無作為化される。例えば、図16で定義されているように、ヒトテネイシンCの第3FnIIIドメインの自然FGループは、10アミノ酸残基を含み、従って、ヒトテネイシンCの第3FnIIIドメインがFOIの場合、FGループの配列は無作為化されてもよいが、FGループは、9アミノ酸残基以下に保持されることになる。一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、FnIII足場を含み、各足場は、A、B、C、D、E、F、およびGと命名された、6つのループ領域に結合した7つのベータ鎖を含み、ループ領域は、各ベータ鎖を連結し、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGと命名されている;また、少なくとも1つのループは、FOIループの非天然変異体であり、FGループは、FOIの同種のFGループよりも少なくとも1つのアミノ酸分短い。一実施形態では、本発明のライブラリーは、FnIII足場を含み、FGループの長さが、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも8つ、または少なくとも9つ、または少なくとも10のアミノ酸残基分FOIの同種のFGループより短く維持されていることを除いて、1つまたは複数のループすなわち、AB、BC、CD、DE、EF、FGのアミノ酸配列が、長さおよび/または配列多様性に関し無作為化される。特定の実施形態では、本発明のライブラリーは、FnIII足場を含み、各ベータ鎖は、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99またはそれ超の下記のベータ鎖に対する相同性配列類似性を有する:配列番号1~34、54、69のいずれか1つの同種のベータ鎖、図16に示されたFnIIIドメインのいずれかのベータ鎖、またはPfam_スキャン、HMMER、またはいずれかの他のタンパク質配列をHiddenMarkovモデルに比較可能なプログラムを使って測定して、PfamPF00041フィブロネクチンタイプIIIドメインシグネチャを含むとわかっているドメインのベータ鎖。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、FnIII足場を含み、Aベータ鎖は、配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45、または131を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、さらに、Gベータ鎖は配列番号52を含む。別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖は配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号44を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号50を含み、さらに、Gベータ鎖は配列番号53を含む。さらに別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖は配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45、または131を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号51を含み、さらに、Gベータ鎖は配列番号53を含む。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖は配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は配列番号52から構成される。別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖は配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号44から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号50から構成され、さらに、Gベータ鎖は配列番号53から構成される。さらに別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖は配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号51から構成され、さらに、Gベータ鎖は配列番号53から構成される。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖は基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は基本的に配列番号52から構成される。別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖は基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号44から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号50から構成され、さらに、Gベータ鎖は基本的に配列番号53から構成される。さらに別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖は基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号51から構成され、さらに、Gベータ鎖は基本的に配列番号53から構成される。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、FnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、さらに、Gベータ鎖は配列番号52を含み、ABループは配列番号35を含み、CDループは配列番号37を含み、さらにEFループは配列番号39を含む。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は配列番号52から構成され、ABループは配列番号35から構成され、CDループは配列番号37から構成され、さらにEFループは配列番号39から構成される。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、さらにGベータ鎖は基本的に配列番号52から構成され、ABループは基本的に配列番号35から構成され、CDループは基本的に配列番号37から構成され、さらに、EFループは基本的に配列番号39から構成される。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、さらに、Gベータ鎖は配列番号52を含み、BCループは配列番号36を含み、DEループは配列番号38を含み、さらに、FGループは配列番号40を含む。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は配列番号52から構成され、BCループは配列番号36から構成され、DEループは配列番号38から構成され、さらに、FGループは配列番号40から構成される。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、さらに、Gベータ鎖は基本的に配列番号52から構成され、BCループは基本的に配列番号36から構成され、DEループは基本的に配列番号38、さらに、FGループは基本的に配列番号40から構成される。別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖は配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45、または131を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、さらにベータ鎖Gは配列番号52を含み、また、Cベータ鎖配列番号45、または131中のシステイン、およびFベータ鎖配列番号49中のシステインが置換できないことを除いて、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖は配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、さらに、ベータ鎖Gは配列番号52から構成され、また、Cベータ鎖配列番号45、または131中のシステイン、およびFベータ鎖配列番号49中のシステインが置換できないことを除いて、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖は基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、さらに、ベータ鎖Gは基本的に配列番号52から構成され、また、Cベータ鎖配列番号45、または131中のシステイン、およびFベータ鎖配列番号49中のシステインが置換できないことを除いて、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45、または131を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、Gベータ鎖は配列番号52を含み、ABループは配列番号35を含み、CDループは配列番号37を含みさらに、EFループは配列番号39を含み、また、Cベータ鎖配列番号45、または131中のシステイン、およびFベータ鎖配列番号49中のシステインが置換できないことを除いて、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、Gベータ鎖は配列番号52から構成され、ABループは配列番号35から構成され、CDループは配列番号37から構成され、さらに、EFループは配列番号39から構成され、また、Cベータ鎖配列番号45、または131中のシステイン、およびFベータ鎖配列番号49中のシステインが置換できないことを除いて、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、Gベータ鎖は基本的に配列番号52から構成され、ABループは基本的に配列番号35から構成され、CDループは基本的に配列番号37から構成され、さらに、EFループは基本的に配列番号39から構成され、また、Cベータ鎖配列番号45、または131中のシステイン、およびFベータ鎖配列番号49中のシステインが置換できないことを除いて、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42を含み、Bベータ鎖は配列番号43を含み、Cベータ鎖は配列番号45、または131を含み、Dベータ鎖は配列番号46を含み、Eベータ鎖は配列番号47を含み、Fベータ鎖は配列番号49を含み、Gベータ鎖は配列番号52を含み、BCループは配列番号36を含み、DEループは配列番号38を含み、さらに、FGループは配列番号40を含み、また、Cベータ鎖配列番号45、または131中のシステイン、およびFベータ鎖配列番号49中のシステインが置換できないことを除いて、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは配列番号42から構成され、Bベータ鎖は配列番号43から構成され、Cベータ鎖は配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は配列番号46から構成され、Eベータ鎖は配列番号47から構成され、Fベータ鎖は配列番号49から構成され、Gベータ鎖は配列番号52から構成され、BCループは配列番号36から構成され、DEループは配列番号38から構成され、さらに、FGループは配列番号40から構成され、また、Cベータ鎖配列番号45、または131中のシステイン、およびFベータ鎖配列番号49中のシステインが置換できないことを除いて、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーはFnIII足場を含み、Aベータ鎖ドメインは基本的に配列番号42から構成され、Bベータ鎖は基本的に配列番号43から構成され、Cベータ鎖は基本的に配列番号45、または131から構成され、Dベータ鎖は基本的に配列番号46から構成され、Eベータ鎖は基本的に配列番号47から構成され、Fベータ鎖は基本的に配列番号49から構成され、Gベータ鎖は基本的に配列番号52から構成され、BCループは基本的に配列番号36から構成され、DEループは基本的に配列番号38から構成され、さらに、FGループは基本的に配列番号40から構成され、また、Cベータ鎖配列番号45、または131中のシステイン、およびFベータ鎖配列番号49中のシステインが置換できないことを除いて、1つまたは複数のベータ鎖が少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。上で詳細に説明したように、ループ内の1つまたは複数の残基が一定に保持でき、一方、他の残基は、長さおよび/または配列多様性に関して無作為化される。任意選択で、または、代わりに、ループ内の1つまたは複数の残基が、所定の、限られた数の異なるアミノ酸に限定でき、一方、他の残基は、長さおよび/または配列多様性に関して無作為化される。従って、本発明のライブラリーは、変性したコンセンサス配列および/または1つまたは複数の不変のアミノ酸残基を有する1つまたは複数のループを含むことができるFnIII足場を含む。一実施形態では、本発明のライブラリーは、ABループを有するFnIII足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する:K-X-X-X-X-X-a、ここで、Xは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、また、aは、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、ABループを有するFnIII足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する:K-X-X-X-X-X-X-X-a、ここで、Xは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、また、aは、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、BCループを有するFnIII足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する:S-X-a-X-b-X-X-X-G、ここで、Xは、任意のアミノ酸を表し、aは、プロリンまたはアラニンを表し、また、bは、アラニンまたはグリシンを表す。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、BCループを有するFnIII足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する:S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G、ここで、Xは、任意のアミノ酸を表し、また、cは、プロリン、セリンまたはグリシンを表す。さらに別の実施形態では、本発明のライブラリーは、BCループを有するFnIII足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する:A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G、ここで、Xは、任意のアミノ酸を表し、dは、プロリン、グルタメートまたはリシンを表し、eは、アスパラギンまたはグリシンを表し、また、fは、セリンまたはグリシンを表す。一実施形態では、本発明のライブラリーは、CDループを有するFnIII足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する:Xn、ここでXは、任意のアミノ酸を表し、また、n=6、7、8、9、または10である。別の実施形態では、本発明の足場は、CDループを含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する:Xn、ここで、Xは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、また、n=7、8、または9である。一実施形態では、本発明のライブラリーは、DEループを有するFnIII足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する:X-X-X-X-X-X、ここで、Xは、任意のアミノ酸を表す。一実施形態では、本発明のライブラリーは、EFループを有するFnIII足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する:X-b-L-X-P-X-c-X、ここで、Xは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、bは、アスパラギン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンを表し、また、cは、イソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンを表す。一実施形態では、本発明のライブラリーは、FGループを有するFnIII足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する:X-a-X-X-G-X-X-X-b、ここで、Xは、任意のアミノ酸を表し、aは、アスパラギン、トレオニンまたはリシンを表し、また、bは、セリンまたはアラニンを表す。別の実施形態では、本発明のライブラリーは、FGループを有するFnIII足場を含み、このループは無作為化された次のコンセンサス配列を有する:X-X-X-X-X-X-X-X-XX9、ここで、Xは、任意のアミノ酸を表す。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、FnIII足場を含み、FnIII足場は、Tn3モジュールを含む。別の特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、FnIII足場を含み、FnIII足場は、Tn3モジュールを含み、Cベータ鎖配列番号45、または131中のシステイン、およびFベータ鎖配列番号49中のシステインが置換できないことを除いて、Tn3モジュールの1つまたは複数のベータ鎖が、少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。特定的な実施形態では、本発明のライブラリーは、FnIII足場を含み、足場が、アミノ酸配列:IEVXABnALITWXBCnCELX1YGIXCDnTTIDLXDEnYSIXEFnYEVSLICXFGnKETFTT、を含み、ここで、XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれ、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループ中に存在するアミノ酸残基を表し、X1は、アミノ酸残基AまたはTを表し、また、n=2~26およびm=1~9である。本発明は、本発明のライブラリー、特に、FGループが同種のFOIのFGループに比較して少なくとも1つのアミノ酸分短くなるように維持されているFnIII足場を含むライブラリーを選別することにより、標的に結合し、FOIに比較して増加した安定性を有する組換え型FnIII足場を特定する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、FOIに比べて増加したタンパク質安定性を有し、特異的に標的に結合する組換え型FnIII足場を特定する方法は、以下を含む:a.足場:標的リガンド複合体形成に適切な条件下、標的リガンドを本発明のライブラリーと接触させ、ライブラリーが、FOIの同種のFGループよりも少なくとも1つのアミノ酸分短く維持されているFGループを有するFnIII足場を含む;b.その複合体から標的リガンドに結合する足場を得る;c.ステップbで得られた足場の安定性がFOIのそれより大きいかどうかを測定する。一実施形態では、ステップaで、本発明の足場ライブラリーを固定化標的と共にインキュベートする。一実施形態では、ステップbで、足場:標的リガンド複合体を洗浄して非特異的結合物質binderを除去し、最も強固な結合物質を極めてストリンジェントな条件で溶出し、PCRにかけて配列情報を取り出す。ステップcの安定性の測定に有用な方法は、上に記載した。ステップbで得られた結合物質および/または配列情報は、本明細書に開示の方法または当業者に既知の方法を使って新しいライブラリーの構築に使用可能であり、さらなる配列の変異誘発を行って、または行わないで、選択プロセスを反復するめに使用可能できることが特に意図されている。一部の実施形態では、いくつかの選択のラウンドを、抗原に対する充分な親和性を有する結合物質が得られるまで行うことができる。本発明のさらなる実施形態は、本発明および上述の足場を含むライブラリーをコードする単離核酸分子コレクションである。本発明の足場は、国際公開第2009/058379号に記載のNHTコドンスキームによりコードされたコドンを含んでも、あるいは、NNK混合コドンスキームによりコードされたコドンを含んでもよい。本発明の足場は、親和性成熟に供してもよい。この当技術分野で受け入れられたプロセスでは、特定の結合タンパク質が、特定の標的に対する増加した親和性に対して選択されるスキームににさらされるWuetal.、ProcNatlAcadSciUSA.9511:6037-42、参照。結果として得られる本発明の足場は、親和性成熟前の足場と比べて少なくとも同等の大きさの結合特性を示しうる。本発明は、また、足場:標的複合体を形成するために、標的に結合可能なタンパク質足場のアミノ酸配列を特定する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、以下を含む:a固定された、または分離可能な標的と本発明のライブラリーを接触させる;b遊離足場から足場:標的複合体を分離する;c低下した多様性を有することにより、また、標的に結合可能な提示足場の濃縮によって、aにおけるものとは区別される新規ポリペプチドディスプレイライブラリーを生成するために、bの分離した足場を複製させる;d任意選択で、a、およびbのステップをcの新規ライブラリーを使って、繰り返す;およびed由来の種の提示足場をコードする領域の核酸配列を決定し、それにより、標的に結合できるペプチド配列を推定する。別の実施形態では、本発明の足場は、ライブラリー選別による特定後に、さらに無作為化できる。一実施形態では、本発明の方法は、本明細書記載の方法を使ってライブラリーから特定された足場の少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つのまたは少なくとも6つのループのさらなる無作為化を含む。別の実施形態では、さらに無作為化された足場が、その後の標的に結合できる足場を特定する方法に供される。この方法は、a前記のさらに無作為化された足場を固定された、または分離可能な標的と接触させること、bさらに無作為化された足場:標的複合体を遊離足場から分離すること、cbの分離された足場の複製をさせ、さらに、任意選択でa~cステップを繰り返すこと、およびd前記のさらに無作為化された足場をコードする領域の核酸配列を決定し、それにより、標的に結合できるペプチド配列を推測すること、を含む。さらなる実施形態では、さらに無作為化された足場は、最初のライブラリーで以前無作為化されている、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの、または少なくとも6つの無作為化されたループを含む。別のさらなる実施形態では、さらに無作為化された足場は、最初のライブラリーで以前無作為化されていない、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの、または少なくとも6つの無作為化されたループを含む。本発明は、また、少なくとも1つまたは複数の標的に結合する少なくとも2つのFnIII足場を得る方法を提供する。この方法は、協動して特定の応答を誘発するように作用する試薬の選別を可能とする。2つ以上の足場の協動が必要なアゴニスト活性が要求される場合例えば、限定されないが、TNF受容体ファミリーに属する受容体のアゴニズム、このような選別を使用するのは、好都合であろう。この方法は、多量体複合体を形成するためにライブラリーを再編成することなく協動試薬の選別を可能とする。一実施形態では、本発明の方法は、足場:標的リガンド複合体の形成を可能とする条件下、標的リガンドを本発明のライブラリーと接触させること、前記足場を架橋試薬少なくとも2つの同じまたは異なる足場を近接近状態に結合させる試薬と定義されると結合させ、足場の架橋を検出可能な応答を誘発すること、および複合体から、前記標的に結合する足場を得ること、を含む。さらなる実施形態では、架橋試薬は、足場特異的抗体、またはその断片、エピトープタグ特異的抗体、またはその断片、二量体化ドメイン、例えば、Fc領域、コイルドコイルモチーフ例えば、これに限定されないが、ロイシンジッパー、化学架橋剤、または当技術分野で既知の別の二量体化ドメイン、である。本発明は、また、本発明の足場を利用して、化合物を検出する方法を提供する。ライブラリー選別により得られた足場の結合特異性に基づいて、例えば、診断法のために、このような足場をアッセイに使用し、検体中の特異的標的を検出することが可能である。一実施形態では、化合物の検出方法は、化合物:足場複合体を形成可能とする条件下で、検体中の前記化合物を本発明の足場に接触させること、さらに、前記足場を検出し、それにより、検体中の前記化合物を検出する、を含む。さらなる実施形態では、足場は、標識すなわち、放射標識、蛍光、酵素結合または比色標識して、化合物の検出を促進する。本発明は、また、本発明の足場を利用して、化合物を捕捉する方法を提供する。ライブラリー選別から得られた足場の結合特異性に基づいて、例えば、精製の目的で検体中の特異的標的を捕捉するために、アッセイ中でこのような足場の使用が可能である。一実施形態では、検体中の化合物の捕捉方法は、化合物:足場複合体の形成を可能とする条件下で、試料中の前記化合物を本発明の足場を接触させること、および前記複合体を試料から取り出し、それにより、前記検体中の前記化合物を捕捉すること、を含む。さらなる実施形態では、足場が固定され、化合物:足場複合体の取り出しを促進する。一部の実施形態では、本発明のライブラリーから単離された足場は、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの、少なくとも6つの、またはそれ超の無作為化ループを含む。一部の実施形態では、単離足場ループ配列は、ドナー足場から受け側足場の任意のループと入れ替えできる例えば、ドナー足場由来のFGループ配列は受け側足場の任意のループに移すことができる。特定的な実施形態では、単離ループ配列は、受け側足場の同種のループに移すことができる例えば、ドナー足場由来のFGループ配列は、FGループ位置の受け側足場に移すことができる。一部の実施形態では、単離ループ配列は、種々の受け手足場とランダムに組み合わせてmixandmatched使うことができる。他の実施形態では、単離足場配列は、ループ配列により特定できる。例えば、ライブラリーは、特定の標的に対し選別するために使用され、特異的結合物質のコレクションが単離される。無作為化ループ配列は、足場背景とは独立して特異的配列として特徴付け出来るすなわち、標的Xに結合する足場で、前記足場は配列番号XのFGループ配列を含む。別の代替の実施形態では、足場が標的Xに結合する2つのループ配列を示す場合は、ループ配列は、足場配列が無い場合の結合標的Xとして特徴付け出来る。言い換えれば、特定の標的に結合するライブラリーから単離された足場は、足場骨格とは独立した標的に結合する可変ループ配列として発現できることが意図されている。この過程は、抗体の可変領域のCDRの概念と類似であろう。タンデム反復の生成タンデム構築物の結合は、限定されないが、II型およびIIS型制限酵素を含む当技術分野で既知の制限酵素を使って、制限酵素部位でのオリゴヌクレオチドの連結反応により形成できる。II型制限酵素は、それらの認識配列内で切断し、一方、IIS型制限酵素は、それらの認識配列の外側で切断し片側を残す。一実施形態では、タンデム反復を生成するため、切断によりそれらの認識部位が切り離され、2つのサブユニットの接合部で認識部位を生成しないで連結できる末端を残すように、IIS型酵素が配置される。連結反応の後に、II型およびIIS型部位の両方は末端に残る。再度IIS型制限酵素で切断して連結することにより別のサブユニットを付加できる。あるいは、クローンをII型制限酵素で切断し、ベクターに連結できる。本発明の多量体足場は、C末端および/またはN末端の位置に、および/または本明細書記載のドメイン間にリンカーを含んでもよい。さらに、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つのポリペプチド足場を含む本発明の足場は、二量体化ドメインに融合または複合してもよい。二量体化ドメインには、限定されないが、以下から選択される抗体成分が含まれる:iVL、CL、VHおよびCH1ドメインを有するFab断片;iiCH1ドメインのC末端に1つまたは複数のシステイン残基を有するFab断片であるFab’断片;iiiVHおよびCH1ドメインを有するFd断片;ivVHおよびCH1ドメインならびにCH1ドメインのC末端に1つまたは複数のシステイン残基を有するFd’断片;v抗体単一アームのVLおよびVHドメインを有するFv断片;viVHドメインから構成されるdAb断片Wardetal.、Nature341、544-5461989;vii単離CDR領域;viiiヒンジ部でのジスルフィド架橋により連結された2つのFab’断片を含むを含む二価の断片であるFab’2断片;ix単鎖抗体分子例えば、単鎖Fv;scFvBirdetal.、Science242:423-4261988;およびHustonetal.、PNASUSA85:5879-58831988;x同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメインVLに連結した重鎖可変ドメインVHを含む、2つの抗原結合部位を有するダイアボディ欧州特許第404、097号;国際公開第93/11161号;およびHollingeretal.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:6444-64481993を参照;xi相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムFdセグメントVH-CH1-VH-CH1を含む直鎖抗体Zapataetal.ProteinEng.810:1057-10621995;および米国特許第5、641、870号;xii完全長抗体;およびxiiiCH2-CH3を含み、さらに全ての、または一部のヒンジ部および/またはCH1領域を含むFc領域。種々の結合価、親和性、および空間配向スキームが、以下の実施例で例示されている。足場の産生本発明の足場の組み換え体発現には、足場をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの作成が必要である。足場をコードするポリヌクレオチドが得られると、足場産生用ベクターが当技術分野でよく知られた技術を使って組換えDNA技術により産生可能である。従って、ヌクレオチド配列をコードする足場を含むポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質調製方法が本明細書で記載される。当業者によく知られた方法を使用して足場ポリペプチドコード配列および適切な転写および転写調節シグナルを含むベクターを構築できる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換DNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝的組換え技術が含まれる。本発明は、従って、本発明の足場をコードするヌクレオチド配列を含み、プロモーターに機能的に連結された複製可能なベクターを提供する。発現ベクターを従来の技術を使って宿主細胞に導入し、その後、形質移入された細胞を従来の技術により培養して本発明の足場を産生する。従って、本発明は、本発明の足場をコードし、異種のプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。適切な宿主細胞には、限定されないが、細菌例えば、大腸菌および枯草菌等の微生物が含まれる。種々の宿主発現ベクター系が本発明の足場の発現に利用可能である。このような宿主発現系は、対象のコード配列を産生し、その後精製できるように使われる媒体を表すが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換された、またはこれを形質移入された場合は、本発明の足場をその場発現可能な細胞も表す。これらには、足場コード配列を含む組換え型バクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された微生物、例えば、細菌例えば、大腸菌および枯草菌;足場コード配列を含む組換え型酵母発現ベクターで形質転換された酵母例えば、サッカロマイセス、ピキア;足場コード配列を含む組換え型ウイルス発現ベクター例えば、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞系;組換え型ウイルス発現ベクター例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMVに感染した、または足場コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター例えば、Tiプラスミドで形質転換された植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノム例えば、メタロチオネインプロモーター由来の、または哺乳類ウイルス例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクチニアウイルス7.5Kプロモーター由来のプロモーターを含む組み換え体発現構築物含有哺乳動物細胞系例えば、COS、CHO、BHK、293、NSO、および3T3細胞、が含まれるこれらに限定されない。本発明の足場をコードする遺伝子の挿入物を含む発現ベクターは、次の3つの一般的手法により特定できる:a核酸ハイブリダイゼーション、bマーカー遺伝子機能の存在または非存在、およびc挿入された配列の発現。一つ目の手法では、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする遺伝子の発現ベクター中の存在が、それぞれ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする挿入された遺伝子に相同な配列を含むプローブを使って、核酸ハイブリダイゼーションにより検出可能である。2つ目の手法では、ベクター中への抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の挿入により生じた特定のマーカー遺伝子機能例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス中の封入体形成、等の存在または非存在に基づいて、組換えベクター/宿主系を、特定または選択できる。例えば、足場をコードするヌクレオチド配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、足場をコードする遺伝子を含む組換え体挿入物は、マーカー遺伝子機能の非存在により特定可能である。3つ目の手法では、組み換え体発現ベクターは、組換え型により発現した遺伝子産物例えば、足場またはその多量体をアッセイすることにより特定できる。このようなアッセイは、例えば、インビトロアッセイ系におけるタンパク質物理的または機能的特性、例えば、結合特性、アゴニストまたはアンタゴニスト足場特性、に基づいてもよい。本発明の足場の産生に有用な方法が、例えば、国際公開第2009/058379号に開示されている。足場の精製本発明の足場が組み換え体発現により産生されると、当技術分野で既知のタンパク質のいずれかの精製方法、例えば、クロマトグラフィー例えば、金属キレートクロマトグラフィー、イオン交換、親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー、遠心分離、差示溶解度differentialsolubility、またはタンパク質精製用のいずれかの他の標準的な方法により精製できる。本発明の足場の非常に安定な性質により、様々な精製スキームが可能となる。例えば、本発明の足場により示される熱安定性は、足場を含む未精製ライセートを加熱して変性により宿主細胞タンパク質を取り出すことを可能とする。本発明の足場により示される高プロテアーゼ耐性は、いずれかの精製ステップの前に、未精製ライセート中の宿主細胞タンパク質の急速分解を可能とする。また、一部の本発明の足場により示されるpH耐性は、いずれかの精製ステップの前に、pHを下げるか、または上げることにより、未精製ライセート中の宿主細胞タンパク質の選択的析出を可能とする。上記のいずれかの組み合わせは、未精製ライセートから大部分の宿主細胞タンパク質を取り出すために使用可能である。研究室での本発明の足場の産生は、米国特許公開第2010/0298541A1号に記載のように、分析的規模のリアクターまたは生産規模のリアクターで足場を産生できるように、スケールアップできる。分泌足場の拡張可能な産生本発明の足場は、細胞内で、または分泌型として産生できる。一部の実施形態では、分泌足場は、正しく折り畳まれ、完全に機能する。分泌足場の産生は、PtacプロモーターおよびoppAシグナルの使用を含む。原核生物宿主細胞中で発現した足場は、原核生物宿主細胞の細胞周辺腔や培地中に分泌される。本発明の足場は、原核細胞の細胞培地または細胞周辺腔中へのペプチドおよび/またはタンパク質の分泌のための担体分子として作用可能である。大量に足場を得るために、本発明の足場は、拡張可能プロセス以降、本発明の拡張可能プロセスと呼ぶにより産生出来る。一部の実施形態では、足場は、本発明の足場をスケールアップして分析規模のバイオリアクター例えば、限定されないが、5L、10L、15L、30L、または50Lバイオリアクターで産生可能な、本発明の拡張可能プロセスにより研究室で産生出来る。他の実施形態では、本発明の足場をスケールアップして生産規模のバイオリアクター例えば、限定されないが、75L、100L、150L、300L、または500Lで産生可能な、本発明の拡張可能プロセスにより研究室で産生出来る。一部の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、研究室で行った産生プロセスに比べて、生産効率の低下をほとんど、または全く生じない。一部の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、約10mg/L、約20mg/L、約30mg/L、約50mg/L、約75mg/L、約100mg/L、約125mg/L、約150mg/L、約175mg/L、約200mg/L、約250mg/L、約300mg/Lまたはそれ超の生産効率で多量体足場を産生する。他の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、少なくとも約10mg/L、少なくとも約20m/L、少なくとも約30mg/L、少なくとも約50mg/L、少なくとも約75mg/L、少なくとも約100mg/L、少なくとも約125mg/L、少なくとも約150mg/L、少なくとも約175mg/L、少なくとも約200mg/L、少なくとも約250mg/L、少なくとも約300mg/Lまたはそれ超の生産効率で多量体足場を産生する。他の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、約10mg/L~約300mg/L、約10mg/L~約250mg/L、約10mg/L~約200mg/L、約10mg/L~約175mg/L、約10mg/L~約150mg/L、約10mg/L~約100mg/L、約20mg/L~約300mg/L、約20mg/L~約250mg/L、約20mg/L~約200mg/L、20mg/L~約175mg/L、約20mg/L~約150mg/L、約20mg/L~約125mg/L、約20mg/L~約100mg/L、約30mg/L~約300mg/L、約30mg/L~約250mg/L、約30mg/L~約200mg/L、約30mg/L~約175mg/L、約30mg/L~約150mg/L、約30mg/L~約125mg/L、約30mg/L~約100mg/L、約50mg/L~約300mg/L、約50mg/L~約250mg/L、約50mg/L~約200mg/L、50mg/L~約175mg/L、約50mg/L~約150mg/L、約50mg/L~約125mg/L、または約50mg/L~約100mg/Lの生産効率で多量体足場を産生する。一部の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、約1g/L、約2g/L、約3g/L、約5g/L、約7.5g/L、約10g/L、約12.5g/L、約15.0g/L、約17.5g/L、約20g/L、約25g/L、約30g/L、またはそれ超の生産効率で多量体足場を産生する。他の実施形態では、本発明の拡張可能プロセスは、少なくとも約1g/L、少なくとも約2g/L、少なくとも約3g/L、少なくとも約5g/L、少なくとも約7.5g/L、少なくとも約10g/L、少なくとも約12.5g/L、少なくとも約15g/L、少なくとも約17.5g/L、少なくとも約20g/L、少なくとも約25g/L、少なくとも約30g/L、またはそれ超の生産効率で多量体足場を産生する。リンカー本発明の足場は、タンパク質および/または非タンパク質リンカーにより連結され、各リンカーは、少なくとも2つの本発明の足場に融合される。2つ以上の本発明の足場が連結される場合の特定のケースに対する適切なリンカーの選択は、種々のパラメータに依存し、これには、例えば、FnIIIモノマードメインの性質、タンパク質分解および酸化に対するペプチドリンカーの安定性、ガイド多量体折り畳みのガイドに対する立体構造による制約、および/または足場の所望する生物活性に関連する立体構造による制約が含まれる。適切なリンカーは、タンパク質リンカー、非タンパク質リンカー、およびそれらの組み合わせから構成できる。リンカーの組み合わせは、ホモマーであっても、ヘテロマーであってもよい。一部の実施形態では、本発明の多量体FnIII足場は、複数の本発明のFnIII足場を含み、全てのリンカーは同じである。他の実施形態では、本発明の多量体FnIII足場複数の本発明のFnIII足場を含み、少なくとも1つのリンカーは、残りのリンカーとは機能的にまたは構造的に異なる。一部の実施形態では、リンカーは、標的に対する結合に直接関与することにより、それ自体で、多量体FnIII足場の活性に寄与できる。一部の実施形態では、タンパク質リンカーは、ポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーポリペプチドは、主に、Gly、Ser、AlaおよびThrからなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。例えば、一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、ペプチドリンカー中に存在するアミノ酸残基の合計数に基いて計算して少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85または少なくとも90のGly、Ser、AlaおよびThrからなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、Gly、Ser、Alaおよび/またはThr残基のみから構成される。リンカーポリペプチドは、2つ以上の本発明のモノマー足場または2つ以上の本発明の多量体足場を、目的活性を保持できるように、相互に対し正しい立体構造を呈するような方法で連結するのに適する長さを持たねばならない。一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、1~約1000アミノ酸残基、1~約50アミノ酸残基、1~25アミノ酸残基、1~20アミノ酸残基、1~15アミノ酸残基、1~10アミノ酸残基、1~5アミノ酸残基、1~3アミノ酸残基を含む。本発明は、ポリペプチドリンカー配列をコードする核酸、例えば、DNA、RNA、または両方の組み合わせをさらに提供する。ポリペプチドリンカーに組み入れるために選択されるアミノ酸残基は、本発明の多量体足場の活性または機能と大きく干渉しない特性を有すべきである。従って、ポリペプチドリンカーは、全体として、本発明の多量体足場の活性また機能と一致しない、または内部折り畳みと干渉する、または本発明の多量体足場の特異的標的に対する結合を大きく妨害する可能性のあるFnIIIモノマードメインの1つまたは複数のアミノ酸残基と結合を形成する、または他の相互作用を形成する電荷を示すべきではない。一部の実施形態では、多量体足場の最大の安定性および/または活性を与えるリンカーを得るために無作為化が使われる。このプロセスでは、最初に、立体構造的に、柔軟なリンカーを使用して、適切な本発明の足場の組み合わせを見つけ出し、得られた多量体足場は、その後、ポリペプチドリンカーアミノ酸残基を無作為化することにより最適化される。ポリペプチドを新規連結融合体ポリペプチドに連結するための、天然ならびに人工ペプチドリンカーの使用は、文献でよく知られているHallewelletal.1989、J.Biol.Chem.264、5260-5268;Alfthanetal.1995、ProteinEng.8、725-731;RobinsonSauer1996、Biochemistry35、109-116;Khandekaretal.1997、J.Biol.Chem.272、32190-32197;Faresetal.1998、Endocrinology139、2459-2464;Smallshawetal.1999、ProteinEng.12、623-630;米国特許第5、856、456号。従って、2つ以上の本発明の足場を融合しているリンカーは、天然リンカー例えば、GeorgeHeringa、ProteinEng.11:871-879、2002、を参照、人工リンカー、またはこれらの組み合わせである。一部の実施形態では、本発明の多量体足場中に存在する全ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、同じである。他の実施形態では、本発明の多量体足場中に存在するペプチドリンカーの少なくとも2つのアミノ酸配列は異なる。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、立体構造の柔軟性を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、1~25のグリシン残基、5~20のグリシン残基、5~15のグリシン残基または8~12のグリシン残基を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも50のグリシン残基、少なくとも75のグリシン残基、少なくとも80のグリシン残基、または少なくとも85のグリシン残基を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、グリシン残基のみを含む。特定的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、G-G-G-G-Sxアミノ酸配列を含み、xは正の整数である。別の特定的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、G-Ax配列を含み、xは正の整数である。別の特定的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、G-G-G-T-P-Tx配列を含み、xは正の整数である。さらに別の特定的な実施形態では、ポリペプチドリンカー配列は、G-G-G-G-S-G-T-G-S-A-M-A-Sx配列を含み、xは、正の整数である。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、本質的に構造不定の天然または人工ポリペプチドである例えば、Schellenbergeretal.、NatureBiotechnol.27:1186-1190、2009、を参照;また、Sickmeieretal.、NucleicAcidsRes.35:D786-93、2007、も参照のこと。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列中に1つまたは複数のプロリンアミノ酸残基を含むことにより、ポリペプチドリンカーの立体構造の柔軟性が制限される。従って、本発明の別の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列中に少なくとも1つのプロリン残基を含むことができる。例えば、ポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列を有し、そのアミノ酸残基の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、は、プロリン残基である。本発明の一特定実施形態では、ポリペプチドリンカーは、プロリン残基のみを含む。一部の実施形態では、アルファらせん形成リンカー、例えば、Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Lysn-Ala直鎖リンカーn=2~5例えば、Araietal.、ProteinEng.14:529-532、2001、を参照、またはアルファらせんバンドルリンカー例えば、Maedaetal.、Anal.Biochem.249:147-152、1997、を参照を使用可能である。他の実施形態では、Serリッチリンカー、例えば、Ser4-Glynn>1またはX4-Glyn2つまでのXはThrで、残りのXはSerであり、n>1である米国特許第5、525、491号参照を使用可能である。他の実施形態では、Gly-Sern、Gly-Gly-Ser-Glyn、またはGly-Ser-Ala-Thrリンカーが使われる。ペプチドリンカーは、非ポリペプチド成分に結合させる基を含むアミノ酸残基が導入されるように修飾可能である。そのようなアミノ酸残基の例は、システイン残基であってよく非ポリペプチド成分が、その後、それに対し結合される、またはアミノ酸配列がインビボN-グリコシル化部位を含んでもよいそれにより、糖成分インビボでをペプチドリンカーに結合させる。さらなる選択肢は、進化したtRNAおよびtRNAシンテターゼを使って、非天然アミノ酸をモノマードメインまたはリンカー中に遺伝的に組み込むことである例えば、米国特許公開第2003/0082575号参照。例えば、ケトチロシンの挿入は、発現モノマードメインまたは多量体に対する部位特異的カップリングを可能にする。一部の実施形態では、ポリペプチド多量体中に存在する全ペプチドリンカーのアミノ酸配列は同じである。あるいは、ポリペプチド多量体中に存在する全ペプチドリンカーのアミノ酸配列は異なる。足場の標識または複合本発明の足場は、非複合型で用いられてもよいし、あるいは、標的検出を容易にするために、または画像化もしくは治療のために、種々の異種部分のうちの少なくとも1つに対して複合されてもよい。足場は、精製が行われるとき、精製の前にまたは後のいずれに標識されてもまたは複合されてもよい。多くの異種部分は、本発明の足場が連結され得る適切な官能基を欠く。従って、いくつかの実施形態では、エフェクター分子が、リンカーを通じて足場に結合され、ここでこのリンカーは、複合体のための反応性基を含む。いくつかの実施形態では、本発明の足場に対して複合された異種部分は、リンカーとして機能し得る。他の実施形態では、この部分は、切断可能または切断不能であり得るリンカーを介して足場に複合される。一実施形態では、切断可能な連結分子は、酸化還元切断可能連結分子であり、その結果その連結分子は、細胞質および他の領域と遊離スルフヒドリル基を有する高濃度の分子のような、より低い酸化還元電位で、環境中で切断可能である。酸化還元電位における変化に起因して切断され得る連結分子の例としては、ジスルフィドを含有する分子が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の足場は、複合体のための反応性基を得るように操作される。このような足場では、N末端および/またはC末端はまた、複合のための反応性基を提供するように機能し得る。他の実施形態では、N末端は、1つの部分例えば、限定されるものではないが、PEGに複合され得るが、C末端は、別の部分例えば、限定されるものではないが、ビオチンに複合され、または逆もまた真である。ポリエチレングリコールまたはPEGという用語は、ポリエチレングリコール化合物またはその誘導体を意味し、ここでカップリング剤、カップリングまたは活性化部分を有する場合と有さない場合がある例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、N-ヒドロキシスクシンイミジンまたはマレイミド部分。PEGという用語は、500~150,000Daの間の分子量のポリエチレングリコールその類似体を含むを意図し、そこで、例えば、末端のOH基が、メトキシ基mPEGと呼ばれるで置換されている。本発明の足場は、ポリエチレングリコールPEGで誘導体化され得る。PEGは、2つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンオキシド反復ユニットの直線の水溶性ポリマーである。PEGは、典型的には約500ダルトン~約40,000ダルトンにおよぶそれらの分子量によって分類される。特定の実施形態では、使用されるPEGは、5,000ダルトン~約20,000ダルトンにおよぶ分子量を有する。本発明の足場に結合されるPEG類は、分岐されてもまたは未分岐であってもよい例えば、Monfardini,C.ら、1995BioconjugateChem6:62-69を参照のこと。PEG類は、NektarInc.,SigmaChemicalCo.および他の会社から市販される。このようなPEG類としては限定されるものではないが、モノメトキシポリエチレングリコールMePEG-OH、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシナートMePEG-S、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシンイミジルスクシナートMePEG-S-NHS、モノメトキシポリエチレングリコール-アミンMePEG-NH2、モノメトキシポリエチレングリコール-トレシレートMePEG-TRES、およびモノメトキシポリエチレングリコール-イミダゾリル-カルボニルMePEG-IMが挙げられる。簡潔に述べると、使用される親水性ポリマー、例えば、PEGは、メトキシ基またはエトキシ基のような非反応性の基によって末端でキャップされる。その後、ポリマーは、適切な活性化剤、例えば、ハロゲン化シアヌル例えば、塩化シアヌル、臭化シアヌルまたはフッ化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、無水物試薬例えば、ジハロコハク酸無水物、例えば、ジブロモコハク酸無水物、アシルアジド、p-ジアゾニウムベンゾイルエーテル、3-p-ジアゾニウムフェノキシ-2-ヒドロキシプロピルエーテルなどとの反応によってその末端で活性化される。この活性化ポリマーは次いで、本明細書に記載のようなポリペプチドと反応されて、ポリマーで誘導体化されたペプチドが生成される。あるいは、本発明の足場中の官能基は、ポリマーとの反応のために活性化されてもよく、または2つの基は、公知のカップリング方法を用いて共同カップリング反応で連結されてもよい。本発明のポリペプチドは、当業者に公知であってかつ用いられる無数の他の反応スキームを用いてPEGで誘導体化され得る。他の実施形態では、本発明の足場、その類似体または誘導体は、診断剤または検出剤に複合され得る。このような足場は、臨床試験手順の一部として疾患の発生または進行をモニタリングまたは診断するために、例えば、特定の治療の有効性を決定するために有用であり得る。このような診断および検出は、限定されるものではないが、種々の酵素、例えば、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含む検出可能物質;補欠分子族、例えば、限定されるものではないが、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチン;蛍光物質、例えば、限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン、フルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリン;発光物質、例えば、限定されるものではないが、ルミノール;生物発光物質、例えば、限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン;放射性物質、例えば、限定されるものではないが、ヨウ素131I、125I、123I、121I、炭素14C、イオウ35S、トリチウム3H、インジウム115In、113In、112In、111In、およびテクネチウム99Tc、タリウム201Ti、ガリウム68Ga、67Ga、パラジウム103Pd、モリブデン99Mo、キセノン133Xe、フッ素18F、サマリウム153Sm、ルテチウム177Lu、ガドリニウム159Gd、153Gd、プロメチウム149Pm、ランタン140La、イッテルビウム175Yb、169Yb、ホリミウム166Ho、イッテリウム90Y、スカンジウム47Sc、レニウム186Re、188Re、プラセオジウム142Pr、ロジウム105Rh、ルテニウム97Ru、ゲルマニウム68Ge、コバルト57Co、亜鉛65Zn、ストロンチウム85Sr、リン32P、クロム51Cr、マンガン54Mn、セレニウム75Se、スズ113Sn、およびインジウム117In;陽電子放出金属ポジトロン放出断層撮影を用いる、非放射性常磁性金属イオン、および特定の放射性同位体に対して放射線標識または複合される分子を含む検出可能な物質対して足場をカップリングすることによって達成され得る。本発明はさらに、治療部分に複合させた足場の使用を包含する。足場は、細胞毒素例えば細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤、治療剤または放射性金属イオン例えばα線放射体などの治療部分に複合されてもよい。細胞毒素または細胞傷害剤としては、細胞にとって有害である任意の因子が挙げられる。治療部分としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる:代謝拮抗物質例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、デカルバジン、アルキル化剤例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシルthioepachlorambucil、メルファラン、カルムスチンBCNUおよびルムスチンCCNU、シクロトスファミドcyclothosphamide、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、ならびにシスジクロロジアミン白金IIDDPシスプラチン、アントラサイクリン例えば、ダウノルビシン従来名はダウノマイシンおよびドキソルビシン、抗生物質例えば、ダクチノマイシン従来名はアクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシンAMC、オーリスタチン分子例えば、オーリスタチンPHE、ブリオスタチン1、およびソラスタチンsolastatin10;Woykeら,Antimicrob.AgentsChemother.46:3802-82002、Woykeら,Antimicrob.AgentsChemother.45:3580-42001、Mohammadら,AnticancerDrugs12:735-402001、Wallら,Biochem.Biophys.Res.Commun.266:76-801999、Mohammadら,Int.J.Oncol.15:367-721999それらは全て、参照により本明細書に組み入れられるものとするを参照のこと、ホルモン例えば、グルココルチコイド、プロゲステロン、アンドロゲンおよびエストロゲン、DNA修復酵素阻害剤例えば、エトポシドまたはトポテカン、キナーゼ阻害剤例えば、化合物ST1571、メシル酸イマチニブKantarjianら,ClinCancerRes.87:2167-762002、細胞傷害剤例えば、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオンdihydroxyanthracindione、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または同族体、ならびに、米国特許第6,245,759号、同第6,399,633号、同第6,383,790号、同第6,335,156号、同第6,271,242号、同第6,242,196号、同第6,218,410号、同第6,218,372号、同第6,057,300号、同第6,034,053号、同第5,985,877号、同第5,958,769号、同第5,925,376号、同第5,922,844号、同第5,911,995号、同第5,872,223号、同第5,863,904号、同第5,840,745号、同第5,728,868号、同第5,648,239号、同第5,587,459号に開示される化合物;ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤例えば、R115777、BMS-214662、および、例えば米国特許第6,458,935号、同第6,451,812号、同第6,440,974号、同第6,436,960号、同第6,432,959号、同第6,420,387号、同第6,414,145号、同第6,410,541号、同第6,410,539号、同第6,403,581号、同第6,399,615号、同第6,387,905号、同第6,372,747号、同第6,369,034号、同第6,362,188号、同第6,342,765号、同第6,342,487号、同第6,300,501号、同第6,268,363号、同第6,265,422号、同第6,248,756号、同第6,239,140号、同第6,232,338号、同第6,228,865号、同第6,228,856号、同第6,225,322号、同第6,218,406号、同第6,211,193号、同第6,187,786号、同第6,169,096号、同第6,159,984号、同第6,143,766号、同第6,133,303号、同第6,127,366号、同第6,124,465号、同第6,124,295号、同第6,103,723号、同第6,093,737号、同第6,090,948号、同第6,080,870号、同第6,077,853号、同第6,071,935号、同第6,066,738号、同第6,063,930号、同第6,054,466号、同第6,051,582号、同第6,051,574号および同第6,040,305号に開示されるもの、トポイソメラーゼ阻害剤例えば、カンプトテシン;イリノテカン;SN-38;トポテカン;9-アミノカンプトテシン;GG-211GI147211;DX-8951f;IST-622;ルビテカン;ピラゾロアクリジン;XR-5000;サイントピンsaintopin;UCE6;UCE1022;TAN-1518A;TAN-1518B;KT6006;KT6528;ED-110;NB-506;ED-110;NB-506;およびレベッカマイシン;ブルガレインbulgarein;Hoescht色素33342およびHoechst色素33258などのDNAマイナーグルーブ結合物質;ニチジンnitidine;ファガロニンfagaronine;エピベルベリン;コラリンcoralyne;β-ラパコン;BC-4-1;ならびにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、包接体およびプロドラッグ例えば、Rothenberg,M.L.,AnnalsofOncology8:837-8551997;およびMoreau,P.,ら,J.Med.Chem.41:1631-16401998を参照のこと、ビホスホネート例えば、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オルパンドロネートolpandronate、リセドロネート、ピリドロネートpiridronate、パミドロネート、ゾレンドロネート、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤、スタチン例えば、ロバスタチン、シムバスタチン、アトロバスタチンLipitor商標、プラバスタチン、フルバスタチンLescol商標、セリバスタチンおよびアトロバスタチン、アンチセンスオリゴヌクレオチド例えば、米国特許第6,277,832号、第5,998,596号、第5,885,834号、第5,734,033号および第5,618,709号に開示されるもの、免疫調整物質例えば、抗体およびサイトカイン、抗体、ならびにアデノシンデアミナーゼ阻害剤例えば、リン酸フルダラビンおよび2-クロロデオキシアデノシン。さらに、足場は、所与の生物学的応答を改変させる治療部分または薬物成分と複合させることができる。治療部分および薬物成分は、古典的な化学治療剤に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質としては、例えば、酵素、抗体、毒素例えば、アブリン、リシンA、シュードモナスpseudomonas外毒素、コレラ毒素もしくはジフテリア毒素;腫瘍壊死因子例えば、TNFα、TNFβ、インターフェロン例えば、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス誘発剤apoptoticagent例えば、TNF-α、TNF-β、AIMI国際公開WO97/33899号を参照のこと、AIMII国際公開WO97/34911号を参照のこと、FasリガンドTakahashiら,1994,J.Immunol.,6:1567-1574およびVEGI国際公開WO99/23105号を参照のこと、血栓症剤thromboticagentもしくは抗血管新生剤antiangiogenicagent、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンもしくは凝集経路の成分例えば、組織因子;または生物学的応答調節物質、例えばリンホカイン例えば、インターロイキン-1IL-1、インターロイキン-2IL-2、インターロイキン-6IL-6、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSFおよび顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、成長因子例えば、成長ホルモンGH;または凝集剤、例えば、カルシウム、ビタミンK、組織因子例えば、限定するものではないが、ハーゲマンHageman因子第XII因子、高分子キニノゲンHMWK、プレカリクレインPK、凝集タンパク質-II因子プロトロンビン、第V因子、第XIIa因子、第VIII因子、第XIIIa因子、第XI因子、第XIa因子、第IX因子、第IXa因子、第X因子、リン脂質、フィブリノーゲンのα鎖およびβ鎖由来のフィブリノペプチドAおよびB、フィブリンモノマーを挙げることができる。さらに、足場は、α線放射体例えば213Biなどの放射性金属イオンのような治療部分に、または放射性金属イオン限定されるものではないが、131In、131LU、131Y、131Ho、131Smなどを含むをポリペプチドと複合させるのに有用な大環状キレート剤に複合させてもよい。特定の実施形態では、その大環状キレート剤は、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N’,N’’,N’’’-四酢酸DOTAであり、これはリンカー分子を介して足場に結合させることができる。そのようなリンカー分子は当該分野で一般に公知であり、Denardoら,1998,ClinCancerRes.410:2483-90;Petersonら,1999,Bioconjug.Chem.104:553-7;およびZimmermanら,1999,Nucl.Med.Biol.268:943-50それぞれ、参照によりそれらの全体が援用されるに記載されている。治療部分を抗体に複合させるための技術は周知であり、例えば、MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeldら編,p.p.243-56AlanR.Liss,Inc.1985のArnonら,MonoclonalAntibodiesorImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy;ControlledDrugDelivery第2版,Robinsonら編,p.p.623-53MarcelDekker,Inc.1987のHellstromら,AntibodiesForDrugDelivery;MonoclonalAntibodies84:BiologicalAndClinicalApplications,Pincheraら編,p.p.475-5061985のThorpe,AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview;MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwinら編,p.p.303-16AcademicPress1985のAnalysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy;およびThorpeら,1982,Immunol.Rev.62:119-58に記載されている。同様のアプローチが本発明の足場での使用について適合され得る。本発明の足場に複合される治療部分または薬物は、対象の特定の障害に対して所望の予防効果または治療効果を達成するように選択すべきである。医師または他の医療従事者は、足場に複合させようとする治療部分または薬物を決定する際に、以下を考慮すべきである:疾患の性質、疾患の重症度、および対象の状態。足場のアッセイ本発明の足場は、当該分野で公知の任意の方法によって標的に対する特異的な結合についてアッセイされ得る。用いられ得る代表的なアッセイとしては限定されるものではないが、ほんの数例を挙げれば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA酵素連結免疫吸着アッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイのような技術を用いる、競合的および非競合的アッセイ系が挙げられる。そのようなアッセイは、当技術分野で通常行われ、かつ公知である例えば、Ausubelら編,1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1,JohnWileySons,Inc.,NewYorkを参照のこと。抗原に対する足場の結合親和性および他の結合特性は、当該技術分野において公知の種々のインビトロアッセイ法によって決定することができ、これには、例えば、平衡法例えば、酵素結合免疫吸収アッセイELISA、またはラジオイムノアッセイRIA、または速度論例えば、BIACORE登録商標分析、および他の方法、例えば、間接結合アッセイ、競合結合アッセイ、ゲル電気泳動、およびクロマトグラフィー例えば、ゲル濾過が挙げられる。これらのおよび他の方法では、色素生産、蛍光、発光、または同位体標識が含まれるが、これらに限定されない、検査されている1つ以上の成分に対する標識を利用し、および/または種々の検出方法を使用してもよい。結合親和性および速度論についての詳細な説明は、Paul,W.E.,編集,FundamentalImmunology,第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia1999に見出すことができる。いくつかの実施形態では、本発明の足場は、特定の反応速度で標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の足場は、1×10-2M、1×10-3M、1×10-4M、1×10-5M、1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M、1×10-13M、1×10-14M未満、または1×10-15M未満という解離定数すなわちKdkoff/konを有し得る。特定の実施形態では、本発明の足場は、BIAcoreアッセイ登録商標によって、または当該分野で公知の他のアッセイによって決定して、500μM、100μM、500nM、100nM、1nM、500pM、100pM、またはそれより小さいKdを有する。別の実施形態では、本発明の親和性は、会合定数Kaを単位として記載され、この定数は、少なくとも1×102M-1、1×103M-1、1×104M-1、1×105M-1、1×106M-1、1×107M-1、1×108M-1、1×109M-1、1×1010M-11×1011M-11×1012M-1、1×1013M-1、1×1014M-1、1×1015M-1、または少なくとも5×l015M-1というkon/koff比として算出される。ある特定の実施形態では、本発明の足場が、標的エピトープから解離する速度が、KdまたはKaの値よりも適切であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の足場は、10-3s-1未満、5×10-3s-1未満、10-4s-1未満、5×10-4s-1未満、10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、10-6s-1未満、5×10-6s-1未満、10-7s-1未満、5×10-7s-1未満、10-8s-1未満、5×10-8s-1未満、10-9s-1未満、5×10-9s-1、または10-10s-1未満というkoffを有する。ある特定の他の実施形態では、本発明の足場が標的エピトープと会合する速度が、KdまたはKaの値よりも適切であり得る。この場合、本発明の足場は、少なくとも105M-1s-1、少なくとも5×105M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5×106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5×107M-1s-1、または少なくとも108M-1s-1、または少なくとも109M-1s-1というkon速度で標的に結合する。本発明の足場はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に結合され得る。このような固体支持体としては限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。可溶性の分泌されたポリペプチドを検出するためのアッセイ特定の実施形態では、本発明は、培養培地で分泌される可溶性組み換えポリペプチドを検出するための改善されたELISA法を提供する。いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、組み換えFnIII型変異体である。一実施形態では、可溶性の組み換えフィブロネクチンIII型変異体を検出するための方法は以下を包含する:a発現されたポリペプチドを含有する培養培地と、ポリペプチドに結合する固定化された抗体とを反応させることと、bポリペプチドと酵素に複合された標的とを結合に関して安定な条件下で反応させることと、c結合した複合標的をシグナルが生成される基質に対して反応させることと、dシグナル強度を測定することと。別の実施形態では、この方法は以下を包含する:a発現された変異体を含む培養培地と、変異体に結合する抗体とを反応させることであって、ここでこの抗体は固体支持体に固定されていることと;bこの固定された支持体を緩衝液で洗浄することと;cこの変異体と、結合対の第一の成員に複合された標的とを反応させることと;d固定された支持体を緩衝液で洗浄することと;eこの第一の成員と結合対の第二の成員とを反応させることであって、ここでこの第二の成員が酵素に複合されることと;f上記酵素と基質とを反応させることであって、ここでシグナルが生じることと;gこのシグナルの強度を測定することであって、ここでシグナル強度が結合親和性と関連することと。一実施形態では、この方法は、分泌されたポリペプチドまたは分泌された変異体を粗培養培地中で検出することを包含する。特定の実施形態では、この方法は、粗培養培地中で分泌されたポリペプチドまたは分泌された変異体を検出することを包含する。特定の実施形態では、シグナル強度は、40未満まで、30未満まで、20未満まで、または19未満まで変化する。一実施形態では、ELISA法は、少なくとも96ウェルのアッセイプレートを用いて、ハイスループットまたは超ハイスループットの形式で行う。特定的な実施形態では、384ウェルのアッセイプレートまたは1536ウェルアッセイプレートを用いる。別の実施形態では、この方法は、限定されるものではないが、以下を含む、異種アミノ酸配列を含む変異体を検出する:ポリhisタグ、ヘマグルチニンHAタグ、FLAGタグ、Strep-タグ、mycタグ、またはV5タグ。さらに別の実施形態では、結合対の第一の成員は、ビオチンであり、結合対の第二の成員はストレプトアビジンまたはアビジンである。医薬組成物別の態様では、本発明は、組成物、例えば、限定されるものではないが、薬学的に許容される担体と一緒に処方された、本発明の足場または多量体足場の1つまたは組み合わせを含んでいる医薬組成物を提供する。このような組成物は、例えば、限定されるものではないが、本発明の2つ以上の異なる足場のうちの1つまたは組み合わせを含んでもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的な活性を有する足場の組み合わせを含んでもよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、本発明の多量体足場を含む。本発明の医薬組成物はまた、他の薬剤との組合せなどの併用療法において投与してもよい。例えば、併用療法は、免疫療法、化学療法、放射線治療、または薬物療法であってよい、少なくとも1つの他の療法と組合わせた本発明の足場を含んでもよい。本発明の医薬化合物は、1種以上の薬学的に許容される塩を含んでもよい。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などのような非毒性の無機酸から誘導されるもの、ならびに脂肪族モノ-およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような非毒性の有機酸から誘導されるものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのようなアルカリ土類金属から誘導されるもの、ならびにN,N’-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのような非毒性の有機アミンから誘導されるものが挙げられる。本発明の医薬組成物はまた、薬学的に許容される酸化防止剤を含んでもよい。薬学的に許容される酸化防止剤の例としては、1アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性抗酸化剤;2パルミチン酸アスコルビル、酪酸ヒドロキシアニソールBHA、酪酸ヒドロキシトルエンBHT、レシチン、プロピルガラート、α-トコフェロールなどのような油溶性抗酸化剤;ならびに3クエン酸、エチレンジアミン四酢酸EDTA、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート化剤が挙げられる。本発明の医薬組成物中で使用され得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオールグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど、およびその好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散物の場合、必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用により維持してもよい。これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の存在の防止を、滅菌手順によって、ならびに様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有によって両方で確保することができる。また、糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を前記組成物中に含有させることが望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬製剤の吸収の延長を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の含有によりもたらしてもよい。医薬組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で滅菌され、かつ安定でなければならない。組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度にとって好適な他の秩序構造として処方してもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど、ならびにその好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合、必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持してもよい。多くの場合、前記組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを含有させるのが好適であろう。注射可能な組成物の吸収の延長は、この組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含有させることによりもたらすことができる。滅菌注射可能溶液を、好適な溶媒中の必要な量の活性化合物を、上記に列挙された成分の1つまたは組合せと混合した後、必要に応じて、滅菌微小濾過することにより調製することができる。一般的には、分散物を、基本的な分散媒体および上記に列挙されたものに由来する必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を包含させることにより調製する。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過されたその溶液から、活性成分の粉末と、任意のさらなる所望の成分とをもたらす減圧乾燥および凍結-乾燥凍結乾燥である。一実施形態においては、本発明の組成物例えば、液体処方物は、内毒素および/または関連する発熱物質を実質的に含まない無発熱処方物である。内毒素としては、微生物内に限定され、微生物が破壊されるか、または死んだ場合に放出される毒素が挙げられる。発熱物質としては、細菌および他の微生物の外膜に由来する熱誘導性温度安定性物質糖タンパク質も挙げられる。これらの物質は両方とも、ヒトに投与した場合、発熱、低血圧およびショックを引き起こすことがある。可能性のある有害な効果に起因して、静脈内投与された薬剤溶液から、少量の内毒素でも除去するのが有利である。食品医薬品局FDAは、静脈内薬剤適用のために、1時間に体重1キログラムあたり、1用量あたり5内毒素単位EUの上限を設定しているTheUnitedStatesPharmacopeialConvention,PharmacopeialForum261:2232000。治療タンパク質を、体重1キログラムあたり、数百~数千ミリグラムの量で投与する場合、微量の内毒素でも除去するのが有利である。一実施形態においては、前記組成物中の内毒素および発熱物質レベルは、10EU/mg未満、または5EU/mg未満、または1EU/mg未満、または0.1EU/mg未満、または0.01EU/mg未満、または0.001EU/mg未満である。別の実施形態においては、前記組成物中の内毒素および発熱物質レベルは、約10EU/mg未満、または約5EU/mg未満、または約1EU/mg未満、または約0.1EU/mg未満、または約0.01EU/mg未満、または約0.001EU/mg未満である。薬学的な用法および用量本発明の足場を含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、足場を、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合する。治療剤および診断剤の処方物は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液、ローション、または懸濁液の形態で、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより調製してもよい例えば、Hardmanら2001GoodmanandGilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,McGraw-Hill,NewYork,N.Y.;Gennaro2000Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Lippincott,Williams,およびWilkins,NewYork,N.Y.;Avisら編、1993PharmaceuticalDosageForms:ParenteralMedications,MarcelDekker,NY;Liebermanら編、1990PharmaceuticalDosageForms:Tablets,MarcelDekker,NY;Liebermanら編、1990PharmaceuticalDosageForms:DisperseSystems,MarcelDekker,NY;WeinerおよびKotkoskie2000ExcipientToxicityandSafety,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.を参照のこと。治療剤のための投与計画の選択は、実体の血清もしくは組織回転率、症状のレベル、実体の免疫原性、生体マトリックス中の標的細胞の接近性などのいくつかの要因に依存する。ある特定の実施形態においては、投与計画は、許容し得るレベルの副作用と一致する患者に送達される治療剤の量を最大化する。従って、送達される生物製剤の量は、部分的には、特定の実体および治療される症状の重篤度に依存する。抗体、サイトカイン、および小分子の好適な用量を選択する際の指針が利用可能である例えば、Wawrzynczak1996AntibodyTherapy,BiosScientificPub.Ltd,Oxfordshire,UK;Kresina編1991MonoclonalAntibodies,CytokinesandArthritis,MarcelDekker,NewYork,N.Y.;Bach編1993MonoclonalAntibodiesandPeptideTherapyinAutoimmuneDiseases,MarcelDekker,NewYork,N.Y.;Baertら2003NewEngl.J.Med.348:601-608;Milgromら1999NewEngl.J.Med.341:1966-1973;Slamonら2001NewEngl.J.Med.344:783-792;Beniaminovitzら2000NewEngl.J.Med.342:613-619;Ghoshら2003NewEngl.J.Med.348:24-32;Lipskyら2000NewEngl.J.Med.343:1594-1602を参照のこと。適切な用量の決定は、例えば、処置に影響することが当該分野で公知であるかもしくは疑われるか、または処置に影響すると予測される、パラメーターまたは要因を用いて、医師が行う。一般的には、用量は最適用量をいくらか下回る量で始まり、その後、任意の負の副作用と比較して所望の、または最適な効果が達成されるまで、用量を少しずつ増加させる。重要な診断尺度としては、例えば、炎症または産生される炎症性サイトカインのレベルの症状の尺度が挙げられる。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルを、患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を取得するために変化させてもよい。選択される用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と共に用いられる他の薬剤、化合物および/もしくは物質、処置される患者の年齢、性別、体重、症状、一般的な健康および以前の病歴、ならびに医学界で周知の同様の要因などの様々な薬物動態要因に依存するであろう。本発明の足場は、連続注入により、または例えば、1日、1週間、もしくは週に1~7回の間隔の用量により提供してもよい。用量を、静脈内、皮下、局所、経口、鼻内、直腸内、筋肉内、脳内的に、または吸入により提供してもよい。特定的な1つの用量プロトコールとは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または用量頻度を含むプロトコールである。合計週用量は、体重1kgあたり少なくとも0.05μg/kg、少なくとも0.2μg/kg、少なくとも0.5μg/kg、少なくとも1μg/kg、少なくとも10μg/kg、少なくとも100μg/kg、少なくとも0.2mg/kg、少なくとも1.0mg/kg、少なくとも2.0mg/kg、少なくとも10mg/kg、少なくとも25mg/kg、または少なくとも50mg/kgであってよい例えば、Yangら2003NewEngl.J.Med.349:427-434;Heroldら2002NewEngl.J.Med.346:1692-1698;Liuら1999J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456;Portieljiら20003CancerImmunol.Immunother.52:133-144を参照のこと。低分子治療剤、例えば、ペプチド模倣物質、タンパク質足場、天然生成物、または有機化合物の望ましい用量は、体重に基づいてモル/kgとして、抗体またはポリペプチドとほぼ同じである。低分子または足場治療剤の望ましい血漿濃度は、体重に基づいてモル/kgとして、抗体とほぼ同じである。この用量は、少なくとも15μg、少なくとも20μg、少なくとも25μg、少なくとも30μg、少なくとも35μg、少なくとも40μg、少なくとも45μg、少なくとも50μg、少なくとも55μg、少なくとも60μg、少なくとも65μg、少なくとも70μg、少なくとも75μg、少なくとも80μg、少なくとも85μg、少なくとも90μg、少なくとも95μg、または少なくとも100μgであってよい。対象に投与される用量の回数は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12以上であってよい。本発明の足場については、患者に投与される用量は、患者の体重1kgあたり0.0001mg~100mgであってもよい。用量は、患者の体重1kgあたり、0.0001mg~20mg、0.0001mg~10mg、0.0001mg~5mg、0.0001~2mg、0.0001~1mg、0.0001mg~0.75mg、0.0001mg~0.5mg、0.0001mg~0.25mg、0.0001~0.15mg、0.0001~0.10mg、0.001~0.5mg、0.01~0.25mg、または0.01~0.10mgであってもよい。本発明の足場の用量は、キログラムkgで表した患者の体重に、mg/kgで表した投与される用量をかけたものを用いて算出してもよい。本発明の足場の用量は、患者の体重1kgあたり、150μg以下、125μg以下、100μg以下、95μg以下、90μg以下、85μg以下、80μg以下、75μg以下、70μg以下、65μg以下、60μg以下、55μg以下、50μg以下、45μg以下、40μg以下、35μg以下、30μg以下、25μg以下、20μg以下、15μg以下、10μg以下、5μg以下、2.5μg以下、2μg以下、1.5μg以下、1μg以下、0.5μg以下、または0.5μg以下であってもよい。本発明の足場の単位用量は、0.1mg~20mg、0.1mg~15mg、0.1mg~12mg、0.1mg~10mg、0.1mg~8mg、0.1mg~7mg、0.1mg~5mg、0.1~2.5mg、0.25mg~20mg、0.25~15mg、0.25~12mg、0.25~10mg、0.25~8mg、0.25mg~7mg、0.25mg~5mg、0.5mg~2.5mg、1mg~20mg、1mg~15mg、1mg~12mg、1mg~10mg、1mg~8mg、1mg~7mg、1mg~5mg、または1mg~2.5mgであってもよい。本発明の足場の用量は、対象中で少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも175μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも225μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも275μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも325μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも375μg/ml、または少なくとも400μg/mlの血清力価を達成してもよい。あるいは、本発明の足場の用量は、対象中で少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも175μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも225μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも275μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも325μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも375μg/ml、または少なくとも400μg/mlの血清力価を達成してもよい。本発明の足場の用量を反復してもよく、投与を少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2ヶ月、75日、3ヶ月、または少なくとも6ヶ月離してもよい。特定の患者のための有効量は、処置する状態、患者の全体の健康、投与の方法、経路および用量、ならびに副作用の重篤度などの要因に応じて変化してもよい例えば、Maynardら1996AHandbookofSOPsforGoodClinicalPractice,InterpharmPress,BocaRaton,Fla.;Dent2001GoodLaboratoryandGoodClinicalPractice,UrchPubl.,London,UKを参照のこと。本発明の組成物はまた、当該分野で公知の種々の方法のうちの1つ以上を用いて1つ以上の投与経路を介して投与されてもよい。当業者によって理解されるとおり、投与の経路および/または方式は、所望の結果に依存して変化する。本発明の足場についての選択される投与経路としては、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、脳内、眼内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病巣内心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入、または持続放出系もしくはインプラントが挙げられる例えば、Sidmanら1983Biopolymers22:547-556;Langerら1981J.Biomed.Mater.Res.15:167-277;Langer1982Chem.Tech.12:98-105;Epsteinら1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-3692;Hwangら1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030-4034;米国特許第6,350466号および第6,316,024号を参照のこと。あるいは、本発明の組成物は、非経口投与を介して、例えば、局所、表皮または粘膜の投与経路、例えば、経鼻的、口腔内、経膣的、直腸的、舌下または局所的に投与されてもよい。必要に応じて、この組成物は、可溶化剤および注射部位の疼痛を緩和するためのリドカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。さらに、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を含む処方物の使用による、肺投与を使用してもよい。例えば、米国特許第6,019,968号、第5,985,320号、第5,985,309号、第5,934,272号、第5,874,064号、第5,855,913号、第5,290,540号、および第4,880,078号;ならびにPCT公開WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346、およびWO99/66903それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとするを参照のこと。一実施形態においては、本発明の抗体、併用療法、または組成物を、AlkermesAIR商標肺薬剤送達技術Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.を用いて投与する。本発明の足場を制御放出系または持続放出系で投与する場合、ポンプを用いて制御放出または持続放出を達成してもよいLanger、Chem.Tech.12:98-105、1982;Sefton,1987,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwaldら、1980,Surgery88:507;Saudekら、1989,N.Engl.J.Med.321:51Aを参照のこと。ポリマー材料を用いて、本発明の治療剤の制御放出または持続放出を達成してもよい例えば、MedicalApplicationsofControlledRelease,LangerおよびWise編,CRCPres.,BocaRaton,Fla.1974;ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,SmolenおよびBall編,Wiley,NewYork1984;RangerおよびPeppas,1983,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61を参照のこと;また、Levyら、1985,Science228:190;Duringら、1989,Ann.Neurol.25:351;Howardら、1989,J.Neurosurg.71:105も参照のこと;米国特許第5,679,377号;米国特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;米国特許第5,128,326号;PCT公開WO99/15154;およびPCT公開WO99/20253も参照のこと。持続放出処方物中で用いられるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリル酸、ポリエチレン-コ-ビニル酢酸、ポリメタクリル酸、ポリグリコリドPLG、ポリ無水物、ポリN-ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリラクチドPLA、ポリラクチド-コ-グリコリドPLGA、およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態においては、持続放出処方物中で用いられるポリマーは、不活性であり、滲出し得る不純物を含まず、保存の際に安定であり、無菌性であり、生分解性である。制御放出系または持続放出系を、予防または治療標的の近くに置いて、このようにして、ほんの少量の全身用量が必要となるようにしてもよい例えば、Goodson,MedicalApplicationsofControlledRelease、上掲、vol.2,pp.115-1381984を参照のこと。制御放出系は、Langer1990,Science249:1527-1533による概説において考察されている。当業者には公知の任意の技術を用いて、本発明の1種以上の足場を含む持続放出処方物を製造することができる。例えば、米国特許第4,526,938号、PCT公開WO91/05548、PCT公開WO96/20698、Ningら、1996、IntratumoralRadioimmunotheraphyofaHumanColonCancerXenograftUsingaSustained-ReleaseGel、RadiotherapyOncology39:179-189、Songら、1995、AntibodyMediatedLungTargetingofLong-CirculatingEmulsions、PDAJournalofPharmaceuticalScienceTechnology50:372-397、Cleekら、1997、BiodegradablePolymericCarriersforabFGFAntibodyforCardiovascularApplication、Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854、ならびにLamら、1997、MicroencapsulationofRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyforLocalDelivery、Proc.Int’l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用されるを参照のこと。本発明の足場を局所投与のために、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンの形態、または当業者には周知の他の形態で処方してもよい。例えば、Remington’sPharmaceuticalSciencesandIntroductiontoPharmaceuticalDosageForms、第19版、MackPub.Co.,Easton,Pa.1995を参照のこと。噴霧不可能な局所剤形については、局所適用と適合する担体もしくは1種以上の賦形剤を含み、いくつかの例においては、水より高い力学的粘性を有する、粘性から半固体もしくは固体の形態を典型的には使用する。好適な処方物としては、限定されるものではないが、必要に応じて、滅菌されるか、または例えば、浸透圧などの様々な特性に影響させるための補助剤例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液、もしくは塩と混合される溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏ointments、粉末、塗布剤、軟膏salvesなどが挙げられる。他の好適な局所剤形としては、活性成分を、いくつかの例においては、固体または液体の不活性担体と共に、加圧された揮発性物質例えば、フロンなどの気体推進剤との混合物中、またはスクイーズボトル中に充填した噴霧可能なエアロゾル調製物が挙げられる。必要に応じて、湿潤剤または保湿剤を、医薬組成物および剤形に添加することもできる。そのような追加成分の例は、当該分野で周知である。本発明の足場を鼻内投与する場合、それをエアロゾル形態、スプレー、ミストまたは液滴の形態で処方してもよい。特に、本発明に従う使用のための予防剤または治療剤を、好適な推進剤例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体の使用と共に、加圧包装またはネブライザーからエアロゾルスプレー提供物の形態で都合良く送達してもよい。加圧エアロゾルの場合、投与単位を、一定量を送達するための弁を設けることにより決定してもよい。化合物の粉末混合物とラクトースまたはスターチなどの好適な粉末基剤とを含む、吸入器または通気器における使用のためのカプセルおよびカートリッジ例えば、ゼラチンから構成されるを処方してもよい。第2の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射性物質との同時投与または治療のための方法は、当該分野で周知である例えば、Hardmanら編、2001GoodmanandGilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第10版、McGraw-Hill,NewYork,N.Y.;PooleおよびPeterson編2001PharmacotherapeuticsforAdvancedPractice:APracticalApproach,Lippincott,WilliamsWilkins,Phila.,Pa.;ChabnerおよびLongo編2001CancerChemotherapyandBiotherapy,Lippincott,WilliamsWilkins,Phila.,Pa.を参照のこと。有効量の治療剤は、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、または少なくとも50まで症状を低減し得る。本発明の足場と共に投与してもよいさらなる療法例えば、予防剤または治療剤を、対象に同時に投与してもよい。同時にという用語は、正確に同時的な療法例えば、予防剤または治療剤の投与に限定されず、むしろ本発明の足場を含む医薬組成物を、順次に、および本発明の足場が他の療法単数または複数と一緒に作用して、それらを別の方法で投与した場合よりも増加した利益を提供し得るような間隔内で対象に投与することを意味する。例えば、それぞれの療法を、同時に、または異なる時点で任意の順序で順次に対象に投与してもよい;しかしながら、同時に投与しない場合、それらを十分に近い間隔で投与して、所望の治療効果または予防効果を提供するべきである。それぞれの療法を、任意の好適な形態で、および任意の好適な経路により、別々に対象に投与してもよい。様々な実施形態においては、療法例えば、予防剤または治療剤を、15分未満、30分未満、1時間未満空けて、約1時間空けて、約1~2時間空けて、約2~3時間空けて、約3~4時間空けて、約4~5時間空けて、約5~6時間空けて、約6~7時間空けて、約7~8時間空けて、約8~9時間空けて、約9~10時間空けて、約10~11時間空けて、約11~12時間空けて、24時間空けて、48時間空けて、72時間空けて、または1週間空けて対象に投与する。2種以上の療法を、1回の同じ患者訪問内で投与してもよい。本発明の足場および他の療法を、周期的に投与してもよい。周期的療法は、一定の期間、第1の療法例えば、第1の予防剤もしくは治療剤を投与した後、一定の期間、第2の療法例えば、第2の予防剤もしくは治療剤を投与し、必要に応じて、一定の期間、第3の療法例えば、予防剤もしくは治療剤などを投与し、この順次投与、すなわち、サイクルを繰り返して、療法の1つに対する耐性の発生を低下させ、療法の1つの副作用を回避するか、もしくは低下させ、および/または療法の効力を改善することを包含する。ある特定の実施形態においては、本発明の足場を、インビボでの適切な分布を確保するように処方してもよい。例えば、血液脳関門BBBは多くの親水性の高い化合物を排除する。本発明の治療用化合物がBBBを通過するそれが所望される場合ことを確保するために、それらを例えば、リポソーム中で処方してもよい。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第4,522,811号;第5,374,548号;および第5,399,331号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送される1個以上の部分を含み、かくして、標的化された薬剤送達を増強してもよい例えば、V.V.Ranade1989J.Clin.Pharmacol.29:685を参照のこと。標的化部分の例としては、葉酸もしくはビオチン例えば、Lowらの米国特許第5,416,016号を参照のこと;マンノシドUmezawaら、1988Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038;抗体P.G.Bloemanら1995FEBSLett.357:140;M.Owaisら1995Antimicrob.AgentsChemother.39:180;サーファクタントプロテインA受容体Briscoeら1995Am.J.Physiol.1233:134;p120Schreierら1994J.Biol.Chem.269:9090が挙げられる;また、K.Keinanen;M.L.Laukkanen1994FEBSLett.346:123;J.J.Killion;I.J.Fidler1994Immunomethods4:273も参照のこと。併用療法の予防剤または治療剤を、同じ医薬組成物中で対象に投与してもよい。あるいは、併用療法の予防剤または治療剤を、別々の医薬組成物中で対象に同時に投与してもよい。予防剤または治療剤は、同じ投与経路によって対象に投与してもよいし、または異なる投与経路によって対象に投与してもよい。足場の使用方法本発明の足場は、インビトロまたはインビボにおいて、診断上および治療上の有用性を有する。例えば、これらの分子を、培養物中の細胞に、例えば、インビトロもしくはエキソビボで、または対象中に、例えば、インビボで投与して、様々な障害を治療、予防または診断してもよい。本発明はまた、本発明の足場を用いる方法も提供する。本発明はまた、単独で、または他の療法と組合わせた、限定されるものではないが、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患、感染性疾患などの疾患、疾患の障害または障害に関連する1つ以上の症状の予防、診断、管理、処置または改善のための本発明の足場の使用を包含する。本発明はまた、単独で、または他の療法と組合わせた、限定されるものではないが、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患、感染性疾患を含む、疾患、障害または感染に関連する1つ以上の症状の予防、管理、処置または改善のための部分例えば、治療剤または薬物と複合されるかまたは融合された本発明の足場の使用も包含する。また、多くの細胞表面受容体は、サブユニットの交差結合の結果として活性化または不活性化する。本発明のタンパク質を用いて、細胞表面受容体の交差結合によって標的細胞中での応答を刺激または阻害してもよい。別の実施形態においては、本発明の本発明の足場を用いて、複数の細胞表面受容体と抗原との相互作用を遮断してもよい。別の実施形態においては、本発明の足場を用いて、複数の細胞表面受容体と抗原との相互作用を強化してもよい。別の実施形態においては、同じ抗原に対する特異性を共有するか、または2個の異なる抗原に結合する結合ドメインを含んでいる本発明の足場を用いて、細胞表面受容体のホモまたはヘテロ二量体を架橋することが可能な場合がある。別の実施形態においては、本発明のタンパク質を用いて、特定の細胞表面受容体にリガンド、またはリガンド類似体を送達してもよい。本発明はまた、伝統的な抗体では容易に達成されないエピトープを標的化する方法も提供する。例えば、一実施形態においては、本発明の足場を用いて、隣接する抗原を最初に標的してもよく、結合の間、別の結合ドメインが潜在的cryptic抗原に関与してもよい。本発明はまた、異なる細胞型を一緒にするために足場を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明のタンパク質は、1個の結合ドメインを有する標的細胞に結合し、別の結合ドメインを介して別の細胞を動員してもよい。別の実施形態においては、第1の細胞は癌細胞であり得、第2の細胞はNK細胞などの免疫エフェクター細胞である。別の実施形態においては、本発明の足場を用いて、おそらく免疫応答を増進する、抗原提示細胞とT細胞のような2種の異なる細胞間の相互作用を強化してもよい。本発明はまた、癌またはその症状を改善、処置、または予防するために足場を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明の方法は、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸、皮膚、骨、肺、結腸、直腸、結腸直腸、胃、脾臓、腎臓、骨格筋、皮下組織、転移性メラノーマ、子宮内膜、前立腺、乳房、卵巣、精巣、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、脳、または中枢神経系の癌の治療において有用である。本発明はまた、細胞集団を枯渇させるために足場を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明の方法は、以下の細胞型の枯渇において有用である:好酸球、好塩基球、好中球、T細胞、B細胞、肥満細胞、単球および腫瘍細胞。本発明はまた、サイトカインを不活性化、阻害または枯渇させるために足場を用いる方法を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、以下のサイトカインのうちの少なくとも1つのの不活性化、阻害または枯渇において有用である:TNF-α、TGF-β、C5a、fMLP、インターフェロンαサブタイプ1、2a、2b、4、4b、5、6、7、8、10、14、16、17および21、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、インターロイキンIL-1-33、CCL1-28、CXCL1-17、およびCX3CL1.本発明はまた、ウイルス、真菌、真核微生物、および細菌などの様々な感染性因子を不活性化するために足場を用いる方法も提供する。いくつかの実施形態においては、本発明の足場を用いて、RSV、hMPV、PIV、またはインフルエンザウイルスを不活性化してもよい。他の実施形態においては、本発明の足場を用いて、限定されるものではないが、ナグレリアNaegleria、アスペルギルスAspergillus、ブラストミセスBlastomyces、ヒストプラズマHistoplasma、カンジダCandidaまたはチネアTinea属の成員などの真菌の病原体を不活性化してもよい。他の実施形態においては、本発明の足場を用いて、限定されるものではないが、ジアルジアGiardia、トキソプラズマToxoplasma、プラスモジウムPlasmodium、トリパノソーマTrypanosoma、およびエントアメーバEntamoeba属の成員などの真核微生物を不活性化してもよい。他の実施形態においては、本発明の足場を用いて、限定されるものではないが、スタフィロコッカスStaphylococcus、ストレプトコッカスStreptococcus、シュードモナスPseudomonas、クロストリジウムClostridium、ボレリアBorrelia、ビブロVibroおよびナイセリアNeiserria属の成員などの細菌病原体を不活性化してもよい。本発明はまた、診断試薬として足場タンパク質を用いる方法も提供する。本発明のタンパク質は、異なる抗原を同時に効率的に捕捉する必要があるキットまたは試薬において有用であり得る。本発明のタンパク質およびそれを含む組成物は、多くの目的のために、例えば、限定されるものではないが、癌などの広範な種々の慢性および急性の疾患および障害に対する治療剤として有用である。本発明の方法に従って予防、管理、処置または改善され得る癌の例としては、限定されるものではないが、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、および脳の癌が挙げられる。さらなる癌としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる:限定されるものではないが、急性白血病、急性リンパ球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病および骨髄異形成症候群などの急性骨髄性白血病、限定されるものではないが、慢性骨髄性顆粒球性白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病などの慢性白血病;真性赤血球増加症;限定されるものではないが、ホジキン病、非ホジキン病などのリンパ腫;限定されるものではないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫などの多発性骨髄腫;ヴァルデンストレームマクログロブリン血症;意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症;良性モノクローナル免疫グロブリン血症;重鎖疾患;骨の癌ならびに限定されるものではないが、骨肉腫、骨髄腫骨疾患、多発性骨髄腫、真珠腫誘導性骨肉腫、骨のパジェット病、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫angiosarcomahemangiosarcoma、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫などの結合組織肉腫;限定されるものではないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、上衣腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、および原発性脳リンパ腫などの脳腫瘍;限定されるものではないが、腺癌、小葉小細胞癌、腺管内癌、髄様性乳癌、粘液乳癌、管状乳癌、乳頭癌、パジェット病若年性パジェット病を含むおよび炎症性乳癌などの乳癌;限定されるものではないが、褐色細胞腫および副腎皮質癌などの副腎癌;限定されるものではないが、甲状腺乳頭癌もしくは濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様癌および未分化甲状腺癌などの甲状腺癌;限定されるものではないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドもしくは島細胞腫瘍などの膵臓癌;限定されるものではないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症、および尿崩症などの下垂体癌;限定されるものではないが、虹彩黒色腫、脈絡膜メラノーマ、および毛様体メラノーマ、および網膜芽細胞腫などの眼メラノーマなどの眼の癌;扁平上皮細胞癌、腺癌、およびメラノーマなどの膣癌;扁平上皮細胞癌、メラノーマ、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病などの外陰癌;限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌、および腺癌などの頸部癌;限定されるものではないが、子宮内膜癌および子宮肉腫などの子宮癌;限定されるものではないが、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質性腫瘍などの卵巣癌;限定されるものではないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、メラノーマ、形質細胞腫、いぼ状癌、および燕麦細胞小細胞癌などの食道癌;限定されるものではないが、腺癌、菌状肉芽腫ポリープ性、潰瘍性、表在拡大型、びまん性、悪性のリンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫などの胃癌;結腸癌;直腸癌;限定されるものではないが、肝細胞癌および肝芽腫などの肝臓癌、腺癌などの胆嚢癌;限定されるものではないが、乳頭状、結節性、および広範性などの胆管癌;非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌類表皮癌、腺癌、巨細胞癌および小細胞肺癌などの肺癌;限定されるものではないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的典型的、精母細胞性、非精上皮腫、胎生期癌、奇形腫、絨毛癌卵黄嚢腫瘍などの精巣癌;限定されるものではないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫などの前立腺癌;陰茎癌;限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌などの口腔癌;基底細胞癌;限定されるものではないが、腺癌、粘膜表皮癌、および腺様嚢胞癌などの唾液腺癌;限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌、およびいぼ状癌などの咽頭癌;限定されるものではないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌およびメラノーマ、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫などの皮膚癌;限定されるものではないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌腎盂および/もしくは尿管などの腎臓癌;ウィルムス腫瘍;限定されるものではないが、移行上皮癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫などの膀胱癌。さらに、癌としては、粘液肉腫、骨肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑液腫瘍、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌が挙げられるそのような障害に関する概説については、Fishmanら、1985,Medicine、第2版、J.B.LippincottCo.、PhiladelphiaおよびMurphyら、1997,InformedDecisions:TheCompleteBookofCancerDiagnosis,Treatment,andRecovery,VikingPenguin,PenguinBooksU.S.A.,inc.,UnitedStatesofAmericaを参照のこと。また、アポトーシスの異常により引き起こされる癌を本発明の方法および組成物により治療することもできることが企図される。そのような癌としては、限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、p53突然変異を有する癌、乳腺、前立腺および卵巣のホルモン依存的腫瘍、ならびに家族性大腸腺腫症などの前癌病変、ならびに骨髄異形成症候群が挙げられる。本発明のタンパク質およびそれを含む組成物は、多くの目的にとって、例えば、限定されるものではないが、自己免疫疾患および/または炎症性疾患などの、様々な慢性および急性の疾患および障害に対する治療剤として有用である。本明細書に記載の本発明の組成物および方法は、自己免疫障害および/または炎症性障害の予防または治療のために有用である。自己免疫障害および/または炎症性障害の例としては、限定されるものではないが、抗リン脂質症候群、関節炎、アテローム性動脈硬化症、アナフィラキシーショック、自己免疫アジソン病、円形脱毛症、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、慢性炎症、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、角膜および他の組織の移植、CREST症候群、クローン病、嚢胞性線維症、糖尿病性網膜症、円板状ループス、心内膜炎、内毒素性ショック、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、血管腫、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、IgAニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、1型もしくは免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、血管新生緑内障、臓器虚血、尋常性天疱瘡、腹膜炎、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群、ライター症候群、再還流傷害、水晶体後部線維増殖症、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、敗血症、腐敗症、シェーグレン症候群、脊髄損傷、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞動脈炎、甲状腺過形成、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、例えば、疱疹状皮膚炎血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫が挙げられる。炎症性障害の例としては、限定されるものではないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患COPD、アレルギー障害、敗血性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性のウイルスもしくは細菌感染の結果生じる慢性炎症が挙げられる。本発明の組成物および方法を、上記疾患を予防、管理または治療するのに用いられる1種以上の従来の療法と共に用いてもよい。本発明のタンパク質およびそれを含む組成物は、多くの目的のために、例えば、限定されるものではないが、ウイルス、細菌および真菌の疾患を含む感染性疾患を含む、広範な慢性および急性の疾患および障害に対する治療剤として多くの目的について有用である。ウイルス病原体の例としては、限定されるものではないが、アデノウイルス科例えば、マストアデノウイルスおよびアビアデノウイルス、ヘルペスウイルス科例えば、単純ヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス2、単純ヘルペスウイルス5、および単純ヘルペスウイルス6、レビウイルス科例えば、レビウイルス、腸内細菌相MS2、アロレウイルス、ポックスウイルス科例えば、コルドポックスウイルス科、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モラシポックスウイルスおよびエントモポックスウイルス科、パポバウイルス科例えば、ポリオーマウイルスおよびパピローマウイルス、パラミクソウイルス科例えば、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス1、モビリウイルス例えば、麻疹ウイルス、ルブラウイルス例えば、ムンプスウイルス、肺炎ウイルス科例えば、肺炎ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、およびメタニューモウイルス例えば、トリ肺炎ウイルスおよびヒトメタニューモウイルス、ピコルナウイルス科例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス例えば、ヒトA型肝炎ウイルス、カルジオウイルスおよびアプトウイルス、レオウイルス科例えば、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、サイポウイルス、フィジウイルス、ファイトレオウイルスおよびオリザウイルス、レトロウイルス科例えば、哺乳動物B型レトロウイルス、哺乳動物C型レトロウイルス、トリC型レトロウイルス、D型レトロウイルス群、BLV-HTLVレトロウイルス、レンチウイルス例えば、ヒト免疫不全ウイルス1型およびヒト免疫不全ウイルス2型、スプマウイルス、フラビウイルス科例えば、C型肝炎ウイルス、ヘパドナウイルス科例えば、B型肝炎ウイルス、トガウイルス科例えば、アルファウイルス例えば、シンドビスウイルスおよびルビウイルス例えば、風疹ウイルス、ラブドウイルス科例えば、ベシクロウイルス、リッサウイルス、エファメロウイルス、サイトラブドウイルスおよびネクレオラブドウイルス、アレナウイルス科例えば、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イッピイウイルスおよびラッサ熱ウイルス、ならびにコロナウイルス科例えば、コロナウイルスおよびトロウイルスが挙げられる。細菌病原体の例としては、限定されるものではないが以下が挙げられる:限定されるものではないが、アクアスピリルム科Aquaspirillum、アゾルピリルム科Azospirillum、アゾトバクテリア科Azotobacteraceae、バクテロイデス科Bacteroidaceae、バルトネラ種Bartonella、ブデロビブリオ科Bdellovibrio、カンピロバクター種Campylobacter、クラミジア種Chlamydia例えば、クラミジアニューモニアChlamydiapneumoniae、クロストリジウムclostridium、腸内細菌科Enterobacteriaceae例えば、シトロバクター種Citrobacter、エドワードシエラEdwardsiella、エンテロバクターエロジェネスEnterobacteraerogenes、エルウィニア種Erwinia、大腸菌Escherichiacoli、ハフニア種Hafniaspecies、クレブシエラ種Klebsiella、モルガネラ種Morganella、プロテウスバルガリスProteusvulgaris、プロビデンシアProvidencia、サルモネラ種Salmonella、セラチアマルセッセンスSerratiamarcescens、およびシゲラフレクスネリShigellaflexneri、ガルジネラ科Gardinella、ヘモフィルスインフルエンザHaemophilusinfluenzae、ハロバクテリウム科Halobacteriaceae、ヘリコバクター科Helicobacter、レジオネラ科Legionallaceae、リステリア種Listeria、メチロコッカス科Methylococcaceae、マイコバクテリアmycobacteria例えば、マイコバクテリウムツベルクロシスMycobacteriumtuberculosis、ナイセリア科Neisseriaceae、オセアノスピリルム科Oceanospirillum、パスツレラ科Pasteurellaceae、ニューモコッカス種Pneumococcus、シュードモナス種Pseudomonas、リゾビウム科Rhizobiaceae、スピリルム科Spirillum、スピロソマセア科Spirosomaceae、ブドウ球菌Staphylococcuss例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌methicillinresistantStaphylococcusaureusおよびパイロゲネスブドウ球菌Staphylococcuspyrogenes、連鎖球菌Streptococcus例えば、腸炎連鎖球菌Streptococcusenteritidis、ファシエ連鎖球菌Streptococcusfasciaeおよび肺炎連鎖球菌Streptococcuspneumoniae、バンピロビブリオVampirovibrio、ヘリコバクター科Helicobacter、ならびにバンピロビブリオ科Vampirovibrio。真菌の病原体の例としては、限定されるものではないが:アブシディア種例えば、アブシディアコリンビフェラAbsidiacorymbiferaおよびアブシディアラモサAbsidiaramosa、アスペルギルス種例えば、アスペルギルスフラブスAspergillusflavus、アスペルギルスフミガツスAspergillusfumigatus、アスペルギルスニドゥランスAspergillusnidulans、アスペルギルスニガーAspergillusnigerおよびアスペルギルステレウスAspergillusterreus、バシディオボールスラナルムBasidiobolusranarum、ブラストミセスデルマチチジスBlastomycesdermatitidis、カンジダ種例えば、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、カンジダグラブラータCandidaglabrata、カンジダケルCandidakerr、カンジダクルゼイCandidakrusei、カンジダパラプシローシスCandidaparapsilosis、カンジダシュードトロピカリスCandidapseudotropicalis、カンジダクイレルモンディCandidaquillermondii、カンジダルゴーサCandidarugosa、カンジダステラトイデアCandidastellatoideaおよびカンジダトロピカリスCandidatropicalis、コクシジオイデスイミティスCoccidioidesimmitis、コニジオボルスConidiobolus種、クリプトコッカスネオフォルムスCryptococcusneoforms、カニンガメラCunninghamella種、皮膚糸状菌dermatophyte、ヒストプラズマカプスラツムHistoplasmacapsulatum、石膏状小胞子菌Microsporumgypseum、ムコールプシルスMucorpusillus、パラコクシジオイデスブラジリエンスParacoccidioidesbrasiliensis、シュードアレシェリアボイディPseudallescheriaboydii、ライノスポリジウムセーベリRhinosporidiumseeberi、ニューモシスティスカリニPneumocystiscarinii、クモノスカビ種例えば、リゾプスアリズスRhizopusarrhizus、リゾプスオリザRhizopusoryzaeおよびリゾプスミクロスポルスRhizopusmicrosporus、サッカロミセスSaccharomyces種、スポロトリクスシェンキSporothrixschenckiiならびに接合菌Zygornycetes、子嚢菌Ascomycetes、担子菌Basidiomycetes、不完全菌Deuteromycetes、および卵菌Oomycetesなどの分類が挙げられる。別の実施形態においては、本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染性疾患またはその1つ以上の症状を予防、管理、処置または改善する方法であって、それを必要とする対象に、予防上または治療上有効用量の本発明の1種以上の足場を、外科手術と組合わせて、単独で、または標準的もしくは実験的化学療法、ホルモン療法、生物療法/免疫療法および/もしくは放射線療法の投与とさらに組合わせて投与することを含む上記方法を提供する。これらの実施形態に従えば、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染性疾患またはその1つ以上の症状を予防、管理、処置または改善するのに利用される本発明の足場を、部分例えば、治療剤もしくは薬剤に複合させるか、または融合させてもさせなくてもよい。本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染性疾患またはその1つ以上の症状をまたは1つ以上の症状を予防、管理、処置または改善する方法であって、それを必要とする対象に、本発明の1つ以上の足場を、癌治療剤ではない1種以上の治療剤非癌治療剤とも言うと組合わせて投与することを含む上記方法を提供する。そのような薬剤の例としては、限定されるものではないが、制吐剤、抗真菌剤、抗細菌剤、例えば、抗生物質、抗炎症剤、および抗ウイルス剤が挙げられる。制吐剤の非限定例としては、メトピマジンおよびメトクロプラミドが挙げられる。抗真菌剤の非限定例としては、アゾール剤、イミダゾール、トリアゾール、ポリエン、アンホテリシンおよびリリミジンが挙げられる。抗細菌剤の非限定例としては、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン、ミトラマイシン、セファロスポリン、イミペネム、アクストレオナム、バンコマイシン、シクロセリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、ノルフロキサシン、レファンピン、ポリミキシン、アンホテリシンB、ナイスタチン、ケトカナゾール、イソニアジド、メトロニダゾールおよびペンタミジンが挙げられる。抗ウイルス剤の非限定例としては、ヌクレオシド類似体例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスリジン、トリフルリジンおよびリバビリン、フォスカレット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、インターフェロンIFN-α、βまたはγおよびAZTが挙げられる。抗炎症剤の非限定例としては、非ステロイド系抗炎症剤NSAID、ステロイド系抗炎症剤、β-アゴニスト、抗コリン剤およびメチルキサンチンが挙げられる。別の実施形態においては、本発明は、癌細胞表現型を阻害し得る組成物を含む。一実施形態においては、癌細胞表現型は、細胞増殖、細胞接着、細胞接着の喪失、受容体発現の減少例えば、限定されるものではないが、Eph受容体など、受容体発現の増大例えば、限定されるものではないが、Eph受容体、転移能力、細胞周期阻害、受容体チロシンキナーゼ活性化/阻害などである。一実施形態においては、本発明は、慢性炎症を処置し得る組成物を含む。上記組成物は、破壊または脱活性化のための免疫細胞の標的化において用いられ得る。この組成物は、活性化T細胞、休止T細胞、B細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、または樹状細胞の標的化において有用である。上記組成物は、免疫細胞機能を低下または除去し得る場合もある。別の実施形態においては、本発明は、血管形成を阻害するか、または低下させることができる組成物を含む。別の実施形態においては、血管形成は、腫瘍増殖、慢性関節リウマチ、SLE、シェーグレン症候群などに関連する。別の実施形態においては、本発明は、胃腸管の疾患の処置にとって有用な組成物を含む。本発明の足場は、低いpH条件下で高レベルの安定性を示す。低いpHでの安定性によって、上記組成物が、過敏性腸症候群、胃食道逆流、腸偽閉塞、ダンピング症候群、難治性悪心、消化性潰瘍、虫垂炎、虚血性大腸炎、潰瘍性大腸炎、胃炎、ヘリコバクターピロリ疾患、クローン病、ウイップル病、セリアック病、憩室炎、憩室症、嚥下障害、裂孔ヘルニア、感染性食道障害、しゃっくり、反芻などのような様々な胃腸障害のための経口投与にとって好適であることが示唆される。本発明はさらに、組み合わせ併用、combinatorialの組成物および疾患またはその症状の予防、処置、軽減、または改善におけるそのような組成物の使用方法を提供する。本発明の足場を、疾患またはその症状の予防、処置、軽減または改善にとって好適な従来の療法と組合わせてもよい。例示的な従来の療法を、Physician’sDeskReference第56版、2002および第57版、2003に見出すことができる。いくつかの実施形態においては、本発明の足場を、化学療法、放射線療法、外科手術、生物剤抗体もしくはペプチドを用いる免疫療法、低分子、または当該分野で公知の別の療法と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、組み合わせの両方は一緒に行われる。他の実施形態においては、組み合わせ療法を別々に投与する。本発明はまた、疾患を診断する方法も提供する。疾患と関連する特定の標的に結合する本発明の足場を、上記疾患を診断するために用いられる方法に組み入れることができる。一実施形態においては、本発明の足場を、対象における疾患を診断するための方法において用い、その方法は、該対象からサンプルを取得し、標的:足場相互作用を形成させる条件下でこのサンプル中で標的と足場とを接触させ、標的:足場複合体を特定し、それによってサンプル中の標的を検出することを含む。いくつかの実施形態においては、標的は疾患と関連する抗原である。別の実施形態においては、標的はサイトカイン、炎症メディエーター、および細胞内抗原、自己抗原、非自己抗原、核内抗原、細胞表面抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌の抗原である。他の実施形態においては、診断しようとする疾患は、本明細書に記載のものである。本発明はまた、特定の標的を画像化する方法も提供する。一実施形態においては、緑色蛍光タンパク質、他の蛍光タグCy3、Cy5、ローダミンなど、ビオチン、または放射性核種などの画像化剤に複合された本発明の足場を、特定の標的の存在、位置、または進行を画像化するための方法において用いてもよい。いくつかの実施形態においては、本発明の足場を含む標的を画像化する方法を、インビトロで行う。他の実施形態においては、本発明の足場を含む標的を画像化する方法を、インビボで行う。他の実施形態においては、本発明の足場を含む標的を画像化する方法を、MRI、PET走査、X線、蛍光検出により、または当該分野で公知の他の検出方法により行う。本発明はまた、本発明の足場を用いて疾患の進行、再発、処置、または改善をモニターする方法も提供する。一実施形態においては、疾患の進行、再発、処置、または改善をモニターする方法を、本明細書に提供されるように、本発明の足場で画像化すること、診断すること、または化合物/標的と本発明の足場とを接触させる方法により達成する。キットまた、本発明の組成物例えば、足場と使用説明書とを備えるキットも、本発明の範囲内に含まれる。このキットはさらに、少なくとも1種の追加試薬、または1種以上の追加の本発明の足場を含んでもよい。キットは、典型的には、キットの内容物の意図される用途を指示するラベルを含む。ラベル標識という用語は、キット上で、もしくはキットと共に供給されるか、またはさもなければキットに付随する、任意の文書、もしくは記録された資料を包含する。等価物当業者であれば、日常的なものを超えない実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されるものとする。本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に援用されると示されるのと同程度まで、参照により本明細書に援用されるものとする。本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に援用される、2010年4月13日出願の米国特許仮出願第61/323,708号に対する優先権の恩典を請求する。さらに、2008年10月10日に出願され、国際公開番号WO2009/058379として公開された、PCT出願PCT/US2008/012398号は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に援用される。例示的実施形態1.直列に接続された少なくとも2つのフィブロネクチンIII型FnIII足場を含む多量体足場であって、ここで各々のFnIII足場は、標的に結合し、ここで各々のFnIII足場が以下を含む:I.A、B、C、D、E、FおよびGと命名された7つのβ鎖ドメイン;II.6つのループ領域に連結され、ここでループ領域は、各々のβ鎖に接続し、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGと命名される;ここで各々のβ鎖は、目的のFnIIIドメインFOIの同族のβ鎖に対して少なくとも50の相同性を有し、かつ少なくとも1つのループは、FOI中の同族のループの天然には存在しない変異体であり、かつここでこの標的に関する結合親和性および/または結合活性、ならびに/あるいは多量体足場の生物学的活性は、対応する単量体FnIII足場のものよりも改善される。2.上記標的に対する結合親和性および/または結合活性が改善されている、実施形態1の多量体足場。3.上記標的に対する結合親和性および/または結合活性、ならびに多量体足場の生物学的活性が改善されている、実施形態1の多量体足場。4.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも50の相同性を有する。5.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つのFnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも60の相同性を有する。6.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも70の相同性を有する。7.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも80の相同性を有する。8.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも90の相同性を有する。9.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16、1~15、30~48または63に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも95の相同性を有する。10.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~15、30~48または63のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも98の相同性を有する。11.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも60の相同性を有する。12.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも70の相同性を有する。13.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも80の相同性を有する。14.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも90の相同性を有する。15.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも95の相同性を有する。16.実施形態1、2または3の多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場の各々のβ鎖が、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかにおける同族のβ鎖ドメインに対して少なくとも98の相同性を有する。17.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場について、Aβ鎖ドメインは、配列番号41、42、61、62、76または77を含み、Bβ鎖は、配列番号43、63、または78を含み、Cβ鎖は、配列番号44、64、または79を含み、Dβ鎖は、配列番号46、65、または80を含み、Eβ鎖は、配列番号47、66、または81を含み、Fβ鎖は、配列番号48、67、または82を含み、かつGβ鎖は、配列番号52、68、または83を含む。18.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで少なくとも2つの上記FnIII足場について、Aβ鎖は、配列番号41、42、61、62、76または77を含み、Bβ鎖は、配列番号43、63、または78を含み、Cβ鎖は、配列番号44、64、または79を含み、Dβ鎖は、配列番号46、65、または80を含み、Eβ鎖は、配列番号47、66、または81を含み、Fβ鎖は、配列番号48、67、または82を含み、Gβ鎖は、配列番号52、68、または83を含む。19.実施形態17または18の多量体足場であって、ABループは、配列番号35、55、または70を含み、CDループは、配列番号37、57、または72を含み、かつEFループは配列番号39、59、または74を含む。20.実施形態17または18の多量体足場であって、BCループは、配列番号36、56、または71を含み、DEループは、配列番号38、58、または73を含み、かつFGループは配列番号39、59、または73を含む。21.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで少なくとも1つの上記FnIII足場について、Aβ鎖ドメインは、配列番号41または42を含み、Bβ鎖は、配列番号43を含み、Cβ鎖は、配列番号45、または131を含み、Dβ鎖は、配列番号46を含み、Eβ鎖は、配列番号47を含み、Fβ鎖は、配列番号49または51を含み、かつGβ鎖は、配列番号52または53を含む。22.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで少なくとも2つの上記FnIII足場について、Aβ鎖は、配列番号41または42を含み、Bβ鎖は、配列番号43を含み、Cβ鎖は、配列番号45、または131を含み、Dβ鎖は、配列番号46を含み、Eβ鎖は、配列番号47を含み、Fβ鎖は、配列番号49または51を含み、かつGβ鎖は、配列番号52または53を含む。23.配列番号1~16、21または22のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つは、以下のアミノ酸配列を含み:IEVXABnALITWXBCnCELX1YGIXCDnTTIDLXDEnYSIXEFnYEVSLICXFGnKETFTT、ここでXAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGはそれぞれ、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループに存在するアミノ酸残基を表しし、ここでX1は、アミノ酸残基AまたはTを表し、かつここでn=2~26である。24.実施形態1~16、21、22または23のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも2つは、アミノ酸配列:IEVXABnALITWXBCnCELX1YGIXCDnTTIDLXDEnYSIXEFnYEVSLICXFGnKETFTTを含み、ここでXAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGはそれぞれ、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループに存在するアミノ酸残基を表し、ここでX1は、アミノ酸残基AまたはTを表し、かつここでn=2~26である。25.実施形態21~24のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記ABループは、配列番号35を含み、上記CDループは、配列番号37を含み、かつ上記EFループは配列番号39を含む。26.実施形態21~24のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記BCループは、配列番号36を含み、上記DEループは、配列番号38を含み、かつ上記FGループは配列番号40を含む。27.実施形態21~25のいずれか1つの多量体足場であって、ここでXFGnn=1、2、3、4、5、6、7、8、または9である。28.実施形態1~19、21、22、23、24、25または27のいずれか1つの多量体足場であり、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つのBCループは、以下の配列を含み:S-X-a-X-b-X-X-X-G、ここでXは、任意のアミノ酸を表し、ここでaは、プロリンまたはアラニンであり、かつここでbは、アラニンまたはグリシンである。29.実施形態1~19、21、22、23、24、25または27のいずれか1つの多量体足場であり、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つのBCループは、以下の配列を含み:S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G、ここでXは、任意のアミノ酸を表し、かつここでcは、プロリン、セリンまたはグリシンを表す。30.実施形態1~19、21、22、23、24、25または27のいずれか1つの多量体であり、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つのBCループは、以下の配列を含み:A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G、ここでXは、任意のアミノ酸を表し、ここでdは、プロリン、グルタミン酸塩またはリジンを表し。ここでeは、アスパラギンまたはグリシンを表し、かつここでfはセリンまたはグリシンを表す。31.実施形態1~19、21、22、23、24、25または28~30のいずれか1つの多量体足場であり、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つのFGループは、以下の配列を含み:X-a-X-X-G-X-X-X-b、ここでXは、任意のアミノ酸を表し、ここでaは、アスパラギン、トレオニン、またはリジンを表し、かつここでbは、セリンまたはアラニンを表す。32.実施形態1~19、21、22、23、24、25または28~30のいずれか1つの多量体足場であり、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つのFGループは、以下の配列を含み:X-a-X-X-X-X-b-N-P-A、ここでXは、任意のアミノ酸を表し、ここでaは、アスパラギン、トレオニンまたはリジンを表し、かつここでbは、セリンまたはグリシンを表す。33.実施形態1~19、21、22、23、24、25または28~30のいずれか1つの多量体足場であり、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つのFGループは、X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-Aの配列を有する11アミノ酸を含み、ここでXは、任意のアミノ酸を表し、かつここでaは、アスパラギン、トレオニンまたはリジンを表す。34.実施形態1~19、21、22、23、24、25または27~33のいずれか1つの多量体足場であり、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つのDEループは、以下の配列を含み:X-X-X-X-X-X、ここでXは、任意のアミノ酸を表す。35.実施形態1~18、20、21、22、23、24、または26のいずれか1つの多量体足場であり、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つのABループは、以下の配列を含み:K-X-X-X-X-X-a、ここでXは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、かつここでaは、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。36.実施形態1~18、20、21、22、23、24、または26のいずれか1つの多量体足場であり、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つのABループは、以下の配列を含み:K-X-X-X-X-X-X-X-a、ここでXは、アスパラギン、アスパラギン酸,ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、かつここでaは、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。37.実施形態1~18、20、21、22、23、24、26または35~36のいずれか1つの多量体足場であり、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つのCDループは、7、8または9残基を含み、ここでCDループ中の各々の残基は、無作為であり、かつここで各々の残基は、アスパラギン、アスパラギン酸,ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであってもよい。38.実施形態1~18、20、21、22、23、24、26または35~37のいずれか1つの多量体足場であり、ここで上記FnIII足場のうちの少なくとも1つのEFループは、配列X-b-L-X-P-X-c-Xを有する8残基を含み、ここでXは、アスパラギン、アスパラギン酸,ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、ここでbは、アスパラギン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはグリシンを表し、かつここでcは、イソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンを表す。39.前述の実施形態1~38のいずれか1つの多量体足場であって、ここで多量体足場が少なくとも3つのFnIII足場を含む。40.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、少なくとも4つのFnIII足場を含む。41.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、少なくとも5つのFnIII足場を含む。42.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、少なくとも6つのFnIII足場を含む。43.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、少なくとも7つのFnIII足場を含む。44.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、少なくとも8つのFnIII足場を含む。45.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、8つを超えるFnIII足場を含む。46.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記FnIII足場の少なくとも1つが、異種部分に融合される。47.実施形態46の多量体足場であって、ここで上記異種部分が、以下からなる群より選択される:ポリエチレングリコールPEG、細胞毒性剤、放射性核種、画像化剤、ビオチン、ヒト血清アルブミンHSAまたはそのFcRn結合部分、抗体のFc領域、抗体の軽鎖定常領域、アルブミン結合ドメイン、IgG分子、トランスフェリン、結合ペプチド、非FnIII足場、エピトープタグ、核酸、組み換えポリペプチドポリマー、またはサイトカイン。48.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、上記標的が、細胞表面抗原、可溶性抗原、固定化抗原、イムノサイレント抗原、細胞内抗原、核内抗原、自己抗原、非自己抗原、癌抗原、細菌抗原、またはウイルス抗原である。49.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、受容体アンタゴニストである。50.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、標的と500μM未満のKDで結合する。51.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、標的と100μM未満のKDで結合する。52.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで2つ以上のFnIII足場が同じ標的に同じエピトープで結合する。53.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、2つ以上のFnIII足場が同一である。54.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、2つ以上のFnIII足場が同一でない。55.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記多量体足場が、同じ標的上の少なくとも2つの異なる非重複性エピトープで結合する。56.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで2つ以上のFnIII足場が、同じ標的に非重複のエピトープで結合する。57.実施形態1~52のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記FnIII足場は、細胞表面上の標的分子の2つ以上のコピー上の同じエピトープに結合する。58.実施形態1~51、または54のいずれか1つの多量体足場であって、ここで2つ以上のFnIII足場が異なる標的に結合する。59.実施形態1~51、または54のいずれか1つの多量体足場であって、ここで多量体足場が、少なくとも2つの異なる標的に結合する。60.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここでFnIII足場のうちの少なくとも2つが、ペプチドリンカーによって直列で接続される。61.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、上記リンカーが、1~約1000アミノ酸を含む。62.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、1~約50アミノ酸を含む。63.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、1~25アミノ酸を含む。64.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、1~15アミノ酸を含む。65.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、1~5アミノ酸を含む。66.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、可塑性ペプチドリンカーであり、これが少なくとも50グリシン残基を含んでいる。67.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記リンカー配列は、以下からなる群の1つ以上の配列を含み:G-G-G-Sx、G-G-G-G-Sx、G-G-G-G-S-Ax、G-Ax、G-G-G-T-P-Tx、およびG-G-G-G-S-G-T-G-S-A-M-A-Sx、ここでxは、正の整数である。68.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで上記リンカーが、官能基である。69.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場であって、ここで少なくとも1つのFnIII足場が、IgGドメインまたは全長のIgG軽鎖または重鎖に対して作動可能に連結される。70.実施形態69の多量体足場であって、ここで上記IgGドメインは、以下からなる群より選択される:I.Fc領域;II.CH1領域;III.CH2領域;IV.CH3領域;V.ヒンジ領域;VI.Cカッパ領域;VII.Cラムダ領域;VIII.CH1-ヒンジ-CH2-CH3領域;およびIX.可変領域。71.前述の実施形態のいずれか1つの多量体足場をコードする単離された核酸分子。72.実施形態71の核酸に対して作動可能に連結された発現ベクター。73.実施例72のベクターを含んでいる宿主細胞。74.核酸分子によってコードされる多量体足場が発現される条件下で実施形態73の宿主細胞を培養することを包含する、多量体足場を製作する方法。75.発現される多量体足場が培養培地中に分泌される、実施形態74の方法。76.培養培地からタンパク質を得ることをさらに包含する、実施形態75の方法。77.薬学的に許容される賦形剤中に実施形態1~70のいずれか1つの多量体足場を含んでいる組成物。78.実施形態77の組成物の有効量を投与することを包含する、患者における癌の増殖を処置または阻害するための方法。79.実施形態78の方法であって、上記癌が、以下からなる群より選択される:扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、芽細胞腫、消化管癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、頭部および頸部癌、肺癌、腺癌、腎細胞癌、または肝細胞癌。80.実施形態77の組成物の有効量を投与することを包含する、患者において自己免疫障害、炎症性障害、または呼吸器感染を処置するための方法。81.上記呼吸器感染が、ウイルスまたは細菌によって生じる、実施形態80の方法。82.前記ウイルスが呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルスまたはヒトメタ肺炎ウイルスである実施形態81の方法。83.実施形態80の方法であって、上記炎症性障害は、ぜんそく、慢性のウイルスまたは細菌の感染から生じる慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患;脳炎、炎症性腸疾患、炎症性骨溶解、肺線維症、敗血性ショック、未分化関節症または未分化脊椎関節症である。84.実施形態80の方法であって、前記自己免疫障害は、加齢性黄斑変性症、同種移植片拒絶、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、関節炎、アテローム性動脈硬化症、アナフィラキシーショック、自己免疫アジソン病、円形脱毛症、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、慢性炎症、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、角膜および他の組織の移植、CREST症候群、クローン病、嚢胞性線維症、糖尿病性網膜症、円板状ループス、心内膜炎、内毒素性ショック、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、血管腫、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、IgAニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、1型もしくは免疫媒介性糖尿病、重症筋無力症、血管新生緑内障、臓器虚血、尋常性天疱瘡、腹膜炎、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群、ライター症候群、再灌流傷害、水晶体後部線維増殖症、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、敗血症sepsis、腐敗症septicemia、シェーグレン症候群、脊髄損傷、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞動脈炎、甲状腺形成不全、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫などの血管炎である。85.多様なフィブロネクチンIII型FnIII足場のライブラリーであって以下を含み:I.A、B、C、D、E、F、およびGと命名される7つのβ鎖ドメイン;II.6つのループ領域に連結され、ここでループ領域は、各々のβ鎖に接続し、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGと命名され;ここで各々のβ鎖は、目的のFnIIIドメインFOIの同族のβ鎖に対して少なくとも50の相同性を有し、かつ少なくとも1つのループは、FOI中の同族のループの天然には存在しない変異体であり、かつここでこのFGループは、FOI中の同族のFGループよりも少なくとも1アミノ酸短い。86.多様なフィブロネクチンIII型FnIII足場のライブラリーであって以下を含む:I.A、B、C、D、E、F、およびGと命名される7つのβ鎖ドメイン;II.6つのループ領域に連結され、ここでループ領域は、各々のβ鎖に接続し、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGと命名される;ここで各々のβ鎖ドメインは、目的のFnIIIドメインFOIの同族のβ鎖に対して少なくとも50の相同性を有し、かつ少なくとも1つのループは、FOI中の同族のループの天然には存在しない変異体であり、かつここでこのFGループは、9より多くないアミノ酸からなる。87.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも50の相同性を有する。88.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも60の相同性を有する。89.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも70の相同性を有する。90.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも80の相同性を有する。91.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも90の相同性を有する。92.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで天然のFnIIIドメインの各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも95の相同性を有する。93.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも98の相同性を有する。94.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも60の相同性を有する。95.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも70の相同性を有する。96.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも80の相同性を有する。97.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも90の相同性を有する。98.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも95の相同性を有する。99.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで各々のβ鎖は、配列番号1~34、54、69、または表16図16に示される配列のいずれかに対して少なくとも98の相同性を有する。100.実施形態85または86のライブラリーであって、ここでAβ鎖ドメインが、配列番号41、42、61、62、76または77を含み、Bβ鎖が、配列番号43、63または78を含み、Cβ鎖が、配列番号44、64、または79を含み、Dβ鎖が、配列番号46、65または80を含み、Eβ鎖が、配列番号47、66、または81を含み、Fβ鎖が、配列番号48、67、または82を含み、かつGβ鎖が、配列番号52、68、または83を含む。101.実施形態100のライブラリーであって、ABループが配列番号35、55、または70を含み、CDループが配列番号37、57または72を含み、かつEFループが配列番号39、59、または74を含む。102.実施形態100のライブラリーであって、BCループが配列番号36、56、または71を含み、DEループが配列番号38、58または73を含み、かつFGループが配列番号40、60、または75を含む。103.実施形態85または86のライブラリーであって、Aβ鎖ドメインが配列番号41または42を含み、Bβ鎖が配列番号43を含み、Cβ鎖が配列番号45または131を含み、Dβ鎖が配列番号46を含み、Eβ鎖が配列番号47を含み、Fβ鎖が配列番号49または51を含み、かつGβ鎖が配列番号52または53を含む。[この実施形態はTn3β鎖について配列番号を列挙する]104.実施形態85または86のライブラリーであって、ここで上記FnIII足場が、以下のアミノ酸配列を含み:IEVXABnALITWXBCnCELX1YGIXCDnTTIDLXDEnYSIXEFnYEVSLICXFGnKETFTT、ここでXAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGループに存在するアミノ酸残基を表し、ここでX1は、アミノ酸残基AまたはTを表し、かつここでn=3~26であり、かつm=1~9である。105.実施形態103または104のライブラリーであって、ここで上記ABループが配列番号35を含み、上記CDループが配列番号37を含み、かつ上記EFループが配列番号39を含む。106.実施形態103または104のライブラリーであって、ここで、上記BCループがBCループが配列番号36を含み、上記DEループが配列番号38を含み、かつ上記FGループが配列番号40を含む。107.実施形態85、86、100、101、103または105のうちのいずれか1つのライブラリーであって、ここで上記FnIII足場のBCループのアミノ酸配列が以下の配列を含み:S-X-a-X-b-X-X-X-G、ここでXは、任意のアミノ酸を表し、ここでaは、プロリンまたはアラニンであり、かつここでbは、アラニンまたはグリシンを表す。108.実施形態85、86、100、101、103または105のうちのいずれか1つのライブラリーであって、ここで上記FnIII足場のBCループのアミノ酸配列が以下の配列を含み:S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G、ここでXは、任意のアミノ酸を表し、かつここでcは、プロリン、セリンまたはグリシンを表す。109.実施形態85、86、100、101、103または105のうちのいずれか1つのライブラリーであって、ここで上記FnIII足場のBCループのアミノ酸配列が以下の配列を含み:A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G、ここでXは、任意のアミノ酸を表し、ここでdは、プロリン、グルタミン酸塩またはリジンを表し、ここでeは、アスパラギンまたはグリシンを表し、かつここでfは、セリンまたはグリシンを表す。110.実施形態85、86、100、101、103または105のうちのいずれか1つのライブラリーであって、ここで上記FnIII足場のFGループのアミノ酸配列が以下の配列を含み:X-X-X-X-X-X-X-X-X、ここでXは、任意のアミノ酸を表す。111.実施形態85、86、100、101、103または105のうちのいずれか1つのライブラリーであって、ここで上記FnIII足場のFGループのアミノ酸配列が以下の配列を含み:X-a-X-X-G-X-X-X-b、ここでXは、任意のアミノ酸を表し、ここでaは、アスパラギン、トレオニン、またはリジンを表し、かつここでbは、セリンまたはアラニンを表す。112.実施形態85、86、100、101、103または105のうちのいずれか1つのライブラリーであって、ここで上記FnIII足場のDEループのアミノ酸配列が以下の配列を含み:X-X-X-X-X-Xであり、ここでXは、任意のアミノ酸を表す。113.実施形態85、86、100、101、103または106のうちのいずれか1つのライブラリーであって、ここで上記FnIII足場のABループのアミノ酸配列が以下の配列を含み:K-X-X-X-X-X-a、ここでXは、アスパラギン、アスパラギン酸,ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、かつここでaは、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。114.実施形態85、86、100、101、103または106のうちのいずれか1つのライブラリーであって、ここで上記FnIII足場のABループのアミノ酸配列が以下の配列を含み:K-X-X-X-X-X-X-X-aであり、ここでXは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、かつここでaは、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンを表す。115.実施形態85、86、100、101、103または106のうちのいずれか1つのライブラリーであって、ここで上記FnIII足場のCDループのアミノ酸配列が7、8または9残基を含み、ここで上記CDループ中の各々の残基が、無作為化され、かつここで各々の残基が、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであってもよい。116.実施形態85、86、100、101、103または106のうちのいずれか1つのライブラリーであって、ここで上記FnIII足場のEFループのアミノ酸配列が以下の配列を含み:X-b-L-X-P-X-c-X、ここでXは、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンを表し、ここでbは、アスパラギン、リジン、アルギニン,アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンを表し、かつここでcは、イソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンを表す。117.実施形態85~116のいずれか1つのライブラリーであって、ここで上記ライブラリーは、リボソーム、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、酵母または哺乳動物細胞の表面に提示される。118.実施形態85~117のいずれか1つのライブラリーからフィブロネクチンIII型FnIII足場を特定するための方法であって、ここで上記FnIII足場は、FOIに比較して増大したタンパク質安定性を有し、かつ標的に結合し、以下を包含する:I.標的リガンドと、実施形態85~117のいずれか1つのライブラリーとを、足場:標的リガンド複合体を形成するのに適切な条件下で接触させることと;II.上記複合体から、標的リガンドに結合する足場を得ることと;III.工程IIで得られた足場の安定性がFOIのものより大きいか否かを決定することと;を包含する。119.実施形態118の方法であって、工程IIで得られた足場のうちの少なくとも1つのループを無作為化する工程と、さらに無作為化された足場を用いて工程IおよびIIを繰り返す工程とをさらに包含する。120.対象のFnIII足場FOIに比較して安定性の増大したフィブロネクチンIII型FnIII足場変異体を得るための方法であって、FOIの変異体を操作することであって、ここで上記変異体のFGループが少なくとも1アミノ酸の欠失を含み、この変異体が、FOIに比較して安定性の増大を示すことを包含する。121.実施形態120の方法であって、ここで、上記FGループの長さおよび配列が、FOIのアミノ酸配列と、少なくとも1つの天然のFnIIIドメインのアミノ酸配列とを整列させることによって操作の前に決定される。122.実施形態120の方法であって、ここで上記FGループの長さおよび配列は、FOIのアミノ酸配列上の少なくとも1つの天然のFnIIIドメインの三次元構造をモデリングすることによって操作の前に決定される。123.実施形態118~122のいずれか1つの方法であって、上記タンパク質安定性は、融点、示差走査熱量測定DSC、円偏光二色性CD、ポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGE、プロテアーゼ耐性、等温熱量測定ITC、核磁気共鳴NMR、内部蛍光および/または生物学的活性によって測定される。124.実施形態118~123のいずれか1つの方法であって、ここで安定性が、FOIに比較してCmで少なくとも10まで増大する。125.実施形態118~124のいずれか1つの方法であって、ここで安定性が、FOIに比較してCmで少なくとも20まで増大する。126.実施形態118~125のいずれか1つの方法であって、ここで安定性が、尿素変性によって測定される。127.実施形態118~125のいずれか1つの方法であって、ここで安定性が、グアニジン変性によって測定される。128.実施形態118~127のいずれか1つの方法であって、ここで上記足場が、FOIに比較してプロテアーゼ感受性で少なくとも10の減少を示す。129.実施形態118~128のいずれか1つの方法であって、ここで上記足場が、FOIに比較して増大した融点を示す。130.実施形態118~129の組み換え足場であって、ここで上記融点が、FOIに比較して少なくとも2度まで上昇されている。131.実施形態118~130のいずれか1つの方法であって、ここでFOIが、配列番号1~34、54、69または表16図16に示される配列のいずれかを含む。132.実施形態118~131のいずれか1つの方法であって、ここでFOIが、配列番号1を含む。133.実施形態118~131のいずれか1つの方法であって、ここで、FOIが配列54または69。134.実施形態118~133のいずれか1つの方法によって生成される、増大したタンパク質安定性を有するフィブロネクチンIII型足場であって、ここで上記足場は、以下の安定性の増大を示す:a尿素変性実験で測定して、Cmで少なくとも10の増大;bグアニジン変性実験で測定して、Cmで少なくとも10の増大;cプロテアーゼ感受性の少なくとも10の増大、またはdFOIの融点に比較して、増大した融点。ここで本発明を、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、例示に過ぎず、本発明は、決してこれらの実施例に限定されるものではなく、本明細書に示される技術の結果として証明される任意のかつ全ての変形を包含すると解釈されるべきである。実施例1種々の多価Tn3形式フォーマットのデザインTn3足場の多価形式が設計された。この多価形式は、それら自体に融合されるか、オリゴマー形成し得る他のタンパク質モチーフに融合されるか、またはそれら自体におよびオリゴマー形成し得る他のタンパク質モチーフに融合される、1つ以上のTn3モジュールを含むことが図1に示される。各々の場合に、得られた分子実体は、少なくとも2つのTn3モジュールを含む。お互いに対する、または他のタンパク質モチーフに対するTn3モジュールを接続するポリペプチドリンカーが構築されても、または未構築であってもよく、機能はある場合とない場合がある。多価Tn3足場タンパク質のこれらの例示的な分類が、特に提供される:i直線のL多価タンパク質であって、ポリペプチドリンカーを介してお互いに対して融合されたTn3モジュールを含有する多価タンパク質;ii抗体様Ig多価タンパク質であって、抗体または抗体フラグメントの軽鎖および重鎖に融合された1つ以上の直鎖的に融合されたTn3モジュールを含む多価タンパク質;ならびにiiiFc含有多価タンパク質であって、抗体Fc領域に融合された1つ以上の直鎖状に融合されたTn3モジュールを含む、多価タンパク質図1。実施例2多価TRAILR2特異的なTn3含有タンパク質の発現および精製ヒトTRAILR2の結合特異性を有する一連の8つの多価Tn3モジュール足場タンパク質を含むTn3タンパク質またはTn3足場とも呼ばれるを調製した。実施例は、実施例1に記載の3つの多価形式の各々から調製し、これらのタンパク質の全てが、2つ以上のTRAILR2-結合Tn3モジュールA1クローン1E11、G6または1C12を示した。TRAILR2特異的な多価Tn3タンパク質については、TRAILR2に結合しなかった対応する対照のTn3タンパク質クローンD1、Synagis登録商標抗体に特異的なTn3ドメインも生成され、これは、成分Tn3モジュールの配列および結合特異性においてのみ異なる。Tn3クローンD1は、Tn3タンパク質であって、ここで1E11クローンのBC、DE、およびFGループは、そえぞれ配列番号99、38、および107に対応する配列を有する別のループで置き換えられる表4を参照のこと。発現された多価Tn3タンパク質構築物の配列同一数を表2に示しており、全ての可能な構築物は、表3および図2に模式的に示される。クローンのループ配列を表4に示す。発現構築物の調製:用いられた酵素は、NewEnglandBiolabsIpswich,MAのものであり、DNA精製キットは、QiagenGermantown,MDのであり、DNAプライマーは、IDTCoralville,IAのであった。2つ以上の直鎖状に融合されたT3モジュールをコードする発現構築物の調製は、以下のとおりであった。TRAILR2特異的なTn3モジュールをコードするDNA例えば、1E11、配列番号134;G6,配列番号138;などは、プライマーTn3gly4ser1モジュールフォワード配列番号112およびTn3gly4ser2モジュールリバース配列番号113表5を用いるPCRによって増幅した。PCR産物の浄化後、増幅されたDNAを2つに分け、ここで、半分はBpmIで消化し、残りの半分はAcuIで消化した。消化したサンプルを、PCR浄化キットを用いて精製し、T4DNAリガーゼで連結して、2つのTn3モジュールA2をコードするDNA産物を作製した。この物質を、アガロースゲル電気泳動によって精製して、再度2つに分けた。NcoIおよびKpnIでの消化、続いてNcoI/KpnI消化したpSec-oppAL25Mへの連結によってWO2009/058379A2,実施例18に記載、タンパク質A2についての細菌発現構築物を得た。pCR2.1-TOPOベクターInvitrogen,Carlsbad,CAへの未消化生成物の連結によって、より高次の融合物の生成のための遺伝物質を得た。4つのTn3モジュールA3をコードするDNAフラグメントを作製するために、TOPOクローニングされたA2のDNAを、プライマーモジュールampフォワード配列番号114およびモジュールampリバース配列番号115表5でPCR増幅し、精製して、AcuIまたはBpmIでの消化のために2つに分けた。A3発現構築物を作製するためのプロセスの残りは、A2構築物を作製するために用いたものと同じであって、ここでA3をコードするDNAを、A2構築ブロックからアセンブルした。再度、pCR2.1-TOPO中にアセンブルされたA3のDNAの同時的なクローニングによって、より高次の融合物の生成のための遺伝物質を得た。A4およびA5細菌発現構築物の調製のために、アダプターモジュールを、A3発現構築物内のマルチ-Tn3コード配列の3’末端に導入した。この目的を達成するために、A3発現ベクターを最初に、KpnIおよびEcoRIで消化して、切り出したフラグメントを、オリゴヌクレオチドpSecフォワード中のインサートBamHIinsertBamHIinpSecforward配列番号116およびpSecリバース中のインサートBamHIinsertBamHIinpSecreverse配列番号117表5を含有する二重カセットで置き換えた。対応するpCR2.1TOPO構築物由来のA2およびA3配列のPCR増幅を、プライマーモジュールインサートBamHIフォワードモジュールinsertBamHIforward配列番号118およびモジュールampリバースモジュールampreverse配列番号115表5で行った。増幅された生成物を、BamHI/KpnIで二重消化して、同時に消化したA3発現構築物中にクローニングした。タンパク質A6-A9を、WO2009/058379A2の実施例16に記載されるように、293F細胞の一過性のトランスフェクションによって発現した。簡潔に述べると、発現ベクターを、細菌発現構築物からTn3モジュール単数または複数をPCR増幅すること、ならびにFc融合物もしくは抗体タンパク質の発現のために、Fc領域、カッパ軽鎖定常領域および/またはCH1ヒンジCH2-CH3重鎖定常領域をコードする自家ベクター中にこれらをクローニングすることによって生成した。タンパク質A9については、Tn3モジュールは、ヒトのIgG1重鎖およびカッパ軽鎖中の抗体可変領域を置き換える。タンデム構築物のFc融合物を作製するための適合するNheIおよびKasI部位を付加するプライマーを表5に示す。タンパク質の発現および精製:多価または直鎖状のTn3タンパク質は、BL21DE3E.coliEMD/Novagen,Gibbstown,NJ中で発現され、His-タグ化タンパク質は、NiNTASuperflow樹脂Qiagenを用いて培養培地から精製した。驚くべきことに、分子量の大きな相違にもかかわらず、E.coli中で中レベルから高レベルで発現されるこれらの構築物の全てが、培地中に効率的に分泌された表6および図3。Fc融合および抗体様タンパク質A6-A9を発現するために、293F細胞を、適切な発現構築物で一過的にトランスフェクトした。上清の回収は、6日および10日に行い、タンパク質は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。全ての精製したタンパク質を、SDS-PAGEによって、NuPageNovexで、MES緩衝液中の4~12のビストリスゲル上で還元剤なしで分析し、SimplyBlueSafeStainInvitrogen,Carlsbad,CAを用いて可視化した。サイズ排除クロマトグラフィーもまた用いて、精製されたタンパク質を分析し、必要に応じて、凝集した物質を、Superdex7510/300GLまたはSuperdex20010/300GLカラムGEHealthcare,Piscataway,NJのいずれかで除去し、総タンパク質の10未満の最終レベルにした。MustangE膜を備えるAcrodiscユニットPallCorporation,PortWashington,NYを、製造業者が示すとおり用いて、細菌発現したタンパク質調製物からエンドトキシンを除去した。実施例3一価および多価のTn3タンパク質についてのTRAILR2結合親和性一連のTRAILR2特異的Tn3タンパク質の結合親和性に対するTn3の価数の影響を測定するために、競合的ELISA実験を行った。96ウェルのNUNCMaxiSorpプレートThermoFisher,Rochester,NYを、A91C12配列番号154配列番号145TRAILR2特異的な足場を用いて、抗体様の形式で、PBS中で、2μg/mlで、4°Cで一晩コーティングした。プレートを、PBS0.1Tween2010mg/mlのBSAでブロックした。A11E11単量体、および線形方式のA21E11二価またはA31E11四価多量体足場の希釈物を、このコーティングしたプレート上で0.75nMのビオチニル化TRAILR2-Fcとともに、2時間室温で、PBS0.1Tween201mg/mlBSAn中でインキュベートして、洗浄した。結合したビオチニル化TRAILR2Fcを、ストレプトアビジンHRP、TMBで検出して、酸で中和した。吸光度は、450nmで読み取った。データを図4に示す。結合親和性IC50を、表7に示しており、ビオチニル化TRAILR2-Fcの最大結合を50まで減少するために必要な競合するタンパク質の濃度として算出した。A2およびA3についてのIC50値は、モノマーA1のものよりも少なくとも30倍低く、かつこのアッセイの限界であるすなわち、ビオチニル化TRAILR2-Fcの濃度にほぼ等しい。固定されたTRAILR2特異的なTn3に対するビオチニル化TRAILR2-Fcの結合は、TRAILR2結合構築物によって置き換えた。単量体のA1タンパク質に対して、二価および四価のA2およびA3タンパク質は、30~40倍高い親和性でTRAILR2-Fcに結合し、これは、多重Tn3モジュールがその結合活性を保持し、かつ結合活性効果を通じて高い親和性に寄与することを示すものである。一価および二価または四価のTn3タンパク質の間の親和性における真の差異は、A2およびA3についてのIC50値がこのアッセイで用いられるビオチニル化TRAILR2-Fcの濃度とほぼ等しかったと仮定すれば0.75nM、30~40倍大きいものであり得る。実施例4細胞結合の確認のためのフローサイトメトリーフローサイトメトリーを用いて、H2122細胞の表面上で発現される内因性TRAILR2に対する多価TRAILR2特異的なTn3タンパク質の結合の特異性を確認した。付着性のH2122細胞非小細胞細胞肺癌腺癌細胞株を、AccutaseInnovativeCellTechnologies,SanDiego,CAを用いて組織培養フラスコから剥がした。細胞を、完全培地10FBSを補充したRPMI1640培地ですすぎ、PBS/2FBS中に約2×106細胞/mLで再懸濁した。Tn3タンパク質A91E11配列番号158配列番号159、四価抗体様の形式の多量体足場、または形式の適合した対照のTn3タンパク質B9クローンD1を、40nMの濃度でPBS中で/2FBS中で調製した。細胞を、1ウェルあたり75μlで96ウェルのU底丸底プレートに播いて、タンパク質試料を、1ウェルあたり25μlで添加した10nMの最終濃度まで。プレートを、4°Cで約1時間インキュベートし、次いでPBS/2FBSで3回洗浄した。抗ヒトIgGAlexaFluor488複合した添加された二次抗体を添加して100μl/ウェル、プレートを4°Cで約30分間インキュベートして、上記のように洗浄した。細胞を、100μlのPBS/2FBS中に再懸濁して、フローサイトメトリー分析を、BDLSRII血球計算器BDBiosciences,SanJose,CAを用いて行った。TRAILR2特異的なTn3タンパク質とインキュベートした場合の傾向的に標識したH2122細胞での対照に対するシフト増大によって、TRAILR2特異的なTn3タンパク質が、細胞性TRAILR2に結合し得ることが確認された図5。実施例5TRAILR2特異的なTn3タンパク質によるH2122細胞のアポトーシスに対する価数および形式フォーマットの効果アポトーシス性の細胞死は、細胞表面TRAILR2の架橋によって、癌細胞株で誘導され得る。この効果は、生存細胞の数を測定する細胞アッセイで決定され得る。この目的を達成するために、肺癌細胞株H2122細胞を、96ウェルプレート中に、10,000細胞/ウェルの密度で、75μlの完全培地10FBSを補充したRPMI1640培地中でプレートした。一晩37°Cでインキュベーションした後、培地に、連続希釈のTRAILR2特異的なクローン1E11または負の対照クローンD1Tn3タンパク質を含有する25μlの追加の培地を補充した。全ての処置は、二重のウェルで行った。市販のTRAILリガンドChemicon/Millipore,Billerica,MAを、TRAIL受容体-誘導性の細胞死の正の対照として用いた。72時間後、PromegaのCellTiter-GloキットMadison,WIを、製造業者の指示に従って用いて、培養中の生存細胞の数の指標であるATPレベルをアッセイした。アッセイの発光は、EnvisionPlateリーダーPerkinElmer,Waltham,MAで測定した。細胞生存の阻害は、処理した細胞についての発光の値を未処理の生存細胞についての平均の発光で除すことによって決定した。阻害対化合物濃度の用量応答プロットを作製し、細胞殺傷力価EC50は、細胞生存度の50を阻害するのに必要なタンパク質の濃度として決定した。多価TRAILR2特異的なTn3タンパク質のプロアポトーシス性の活性に対する価数の影響を試験するために、H2122細胞を、一価のTn3タンパク質A1クローン1E11、および一連の直鎖状に融合されたTn3タンパク質A2-A5各々のクローン1E112、4、6または8のTn3モジュールを含むで処理した。一価および二価のTn3タンパク質は、殺傷活性をまったくまたはほとんど示さなかったが、4、6および8のTn3モジュールを含有するタンパク質は、H2122細胞生存度を強力に阻害し、ここで力価は、価数の関数として増大した図6A;表8。タンパク質A3四価は、TRAIL、天然のTRAILR2リガンドに対して類似の力価を有するが、タンパク質A4六価およびA5八価は、1~2対数強力であった。このアッセイから、所定の分子フォーマットについて、細胞殺傷は、アッセイがもはや識別できない点まで高い価数で改善することが明らかである。細胞生存度の阻害が、TRAILR2結合に依存することを示すため、100pMのタンパク質A5クローンG6すなわち、167×EC50を、H2122細胞と共に、可溶性のTRAILR2-Fcタンパク質の存在下でインキュベートした。可溶性のTRAILR2-Fcによる細胞殺傷の用量依存性の抑制は、細胞殺傷が、細胞表面TRAILR2に対するタンパク質A5結合に依存することを示すものである図6B。クローン1E11ループを含むタンパク質A5で同様の結果が示されたデータ示さず。結合モジュールの数に加えて、多価Tn3タンパク質の活性はまた、個々の結合単位を示すために用いられる分子フォーマットによって影響され得る。活性に対する分子フォーマットの効果を試験するために、H2122細胞を、同じ数のTn3結合モジュールの同じ数を提示する種々のTRAILR2特異的なTn3タンパク質で処理した。四価タンパク質A3、A7およびA9各々クローン1E11が、H2122細胞の殺傷を誘導する能力を、細胞生存度アッセイで試験し、同様に、八価のTn3タンパク質A5およびA8各々クローン1E11の対も試験した。不活性な一価および二価のタンパク質を、負の対照ルとして、およびTRAILを正の対照として含めた図7;表9および表10。図7Aでは、4の価数で試験した3つの構築物について、A3直鎖状フォーマットおよびA7Fc融合物フォーマットが、それらの細胞殺傷活性において同様であり、かつA9よりもH2122細胞を殺傷するのに強力であることが明らかである抗体様の融合形式。これによって、Tn3モジュールの空間的配向が、生理活性にかなりの影響を有し得、ここでA3は、H2122細胞生存度を阻害するのにおいてA9タンパク質よりも約150倍強力であることが明確に示される表9。図7Bによって、八価のTRAILR2結合性Tn3タンパク質、A5直鎖状およびA8Fc融合物の両方の形式とも、H2122細胞の生存度を阻害するのに同様の有効性を有することが示される。これらの構築物についてのEC50データを、表9に示す。親和性、価数および空間的定位を繊細に調節する能力によって、所望の治療結果を正確に操作する能力に関してかなりの柔軟性が得られる。実施例6細胞株Colo205およびJurkatにおける用量依存性の細胞殺傷多価TRAILR2特異的なTn3タンパク質が、H2122以外の癌細胞株を殺傷し得ることを示すために、他のTRAILR2発現性の細胞株も試験した。結腸直腸腺癌細胞株Colo205図8AおよびJurkatT細胞白血病株図8Bを、それらが、タンパク質A3四価、直鎖状形式配列番号143およびA5八価、直鎖状フォーマット配列番号145各々クローンG6によって殺傷され得る能力について試験した。各々の細胞株を、A3、A5、正の対照TRAIL、または負の対照タンパク質B5配列番号148これは、TRAILR2に結合しないとともにインキュベートして、細胞生存度アッセイを、H2122について記載されるとおり行った。これらの細胞株の各々において、A5は、細胞生存度の極度に強力な阻害を示す。より低い価数のA3タンパク質はまた、A5よりも低い価数ではあるが、細胞殺傷を誘導する。従って、構築物の価数が高いほど、大きい活性を示す。予想どおり、TRAILはまた、細胞生存度を阻害し得るが、八価の負の対照タンパク質B5TRAILR2に結合しないは阻害し得ない。実施例7マウスのCD40L特異的な二価のタンデム足場のデザイン、発現および活性二価のマウスCD40L特異的なTn3タンパク質表13を、一対の同一のTn3モジュールを融合することによって調製した。M13は、マウスCD40Lに特異的に結合するTn3タンパク質である。M13配列は、Tn3の配列に対応し、ここでは、BC、DE、およびFGループの配列が、それぞれ、配列番号100、104および110に対応する配列を有する別のループで置き換えられる表4を参照のこと。Gly4SerGSユニットの1構築物C1M13、3構築物C2M13、5構築物C3M13、または7構築物C4M13コピーを含むリンカーを用いて、13~43アミノ酸の総リンカー長を得た図9Aおよび表3を参照のこと。簡潔に述べると、発現構築物を、以下のとおり生成した:フラグメントAは、Tn3遺伝子の上流のpSecベクターに特異的なプライマー、およびプライマー1-3GSリンカーリバース配列番号123を用いる、実施例1に記載されるpSec-oppAL25Mベクター中にクローニングされたマウスCD40L結合因子pSec-M13のPCR増幅によって生成した用いられるTn3特異的プライマーの配列については表14を参照のこと。フラグメントB1GSおよびB3GSは、それぞれ、プライマー1GSリンカー配列番号121または3GSリンカー配列番号122、およびTn3遺伝子の下流のpSecベクターに特異的なプライマーを用いて同じテンプレートのPCR増幅によって生成した。フラグメントをゲル精製して、フラグメントAおよびB1GS、またはフラグメントAおよびB3GSを混合して、タンデム構築物を、2つのpSecベクター特異的なプライマーを用いてPCR反応において重複PCRによって生成した。この生成物を、NcoIおよびKpnIで消化して、pSec-oppAL25Mベクター中に、実施例1に記載のようにクローニングして戻し、2つの構築物を得た:C1M13およびC2M13。5および7のGSリンカー構築物を生成するために、プライマーGSLAmpフォワード配列番号126およびGSLAmpリバース配列番号127を用いて、それぞれ、オリゴヌクレオチド5GSリンカー配列番号124および7GSリンカー配列番号125のPCR増幅によって生成されたリンカー挿入物を、PstIおよびXmaIで消化して、PstIおよびXmaIを用いてpSecM13-1GS-M13を切断することによって生成したベクターフラグメント中にクローニングして、構築物C3M13およびC4M13を得た。同一のTn3足場を含む一価および二価のタンデム構築物を、実施例2に記載のように、組み換え的に発現して、E.coliから精製した。図9Bは、還元条件および非還元条件下での精製タンパク質調製物のSDS-PAGE分析を示す。二価タンデムM13-M13構築物の結合有効性を試験して、それらを、一価のM13足場と比較するために、それらが、バイオセンサーチップ上に固定されたマウスCD40受容体に対するマウスCD40L結合の競合的阻害を試験した。簡潔に述べると、IgG1のFc領域とのキメラ融合の形態であるマウスCD40受容体のフラグメントを、約3000という応答ユニットの密度でGLCチップBio-Rad上に固定した。競合結合アッセイについて、一価のM13または異なるリンカー長を有するM13のタンデム二価構築物の3倍連続希釈を、20分間、0.1v/vTween-200および0.5mg/mLのBSAを含有するPBS中に含まれる固定濃度のE.coli生成組み換えマウスCD40L0.5μg/mlとともにインキュベートした。次いで、これらの試料を、30μL/分の流速でGLCチップ上に300秒間注入して、結合したCD40Lのレベルをセンサーグラム内で固定の時点で記録して、任意の競合因子の非存在下で、結合したタンパク質の対応するレベルと比較した。各々の結合測定の後、残りのCD40Lを、10mMグリシン-HClpH2.0を注入することによってチップ表面から脱着させた。非特異的な結合の効果を、チップのインタースポットからセンサーグラムを差引きすることによって修正した。マウスCD40Lの50を置き換えるのに必要なTn3構築物の濃度に対応するIC50値は、GraphPadPrismを用いて算出した。図9Cに示されるとおり、M13単量体についての最大半減阻害濃度IC50は71nMであったが、二価タンデム構築物C1M13についてのIC50は29nMであった。5または6nMという同様のIC50値が、より長いリンカーを含む二価構築物について得られたそれぞれ、構築物C2M13、C3M13およびC4M13。このアッセイで用いられるCD40Lの濃度に起因して、これは、このアッセイで観察できるIC50の下限である。この二価構築物は全てが、一価の構築物に比較して低いIC50値を有し、このことは、単一のM13Tn3モジュールに比較して二価タンデム構築物の結合活性の増強を示した。これらの二価構築物におけるリンカー長は、アッセイ力価に対してある程度の効果を示し、ここでは最短のリンカー長の構築物が中間の力価を有するが、23以上のアミノ酸のリンカーを有するこれらの構築物は、このアッセイで等価である。細胞に基づいた活性において二価タンデムTn3構築物の活性を試験し、それらを一価のM13足場と比較するために、B細胞上のマウスCD40L-誘導性のCD86発現の阻害を試験した。対照として、市販の抗マウスCD40L特異的な抗体MR1を、平行して試験した。このアッセイは、健常なボランティア由来の血液から調製したPBMCを利用する。簡潔に述べると、新鮮に吸引した血液を、ヘパリンを含むBDVacutainer登録商標CPT商標細胞調製試験管中に収集した。遠心分離後、PBMCを含有する細胞層を、収集して、PBSを用いて2回、およびRPMI1640培地を用いて1回洗浄した。細胞を、完全RPMI1640培地10熱不活化ウシ胎仔血清を補充、1P/S中に、5×106細胞/mlの濃度で再懸濁した。マウスCD40L-発現性のTh2細胞株D10.G4.1を、洗浄して、完全RPMI160培地中に、1×106細胞/mlの濃度で再懸濁した。M13、M13-M13タンデム二価構築物C1-C4、またはMR1抗体BioLegendカタログ番号106508を、完全RPMI1640培地中で連続希釈した1:3。各々の希釈物の50μlサンプルを、96ウェル丸底組織培養プレート中のウェルに添加した。次いで、各々のウェルに50μlのD10.G4.1細胞5×104を入れて、混合後、プレートを、37°Cで1時間インキュベートした。次いで、100μlの再懸濁したPBMC5×105細胞を、各々のウェルに添加して、37°Cで20~24時間インキュベートした。PBMCを収集して、APC抗ヒトCD86BDbioscience,カタログ番号555660およびFITC抗ヒトCD19BDbioscience,カタログ番号555412が含有されるFACS緩衝液PBSpH7.4,1BSA,0.1アジ化ナトリウム4°Cで30分間、暗所で染色した。FACS緩衝液中での2回洗浄後、次に試料を、FACSLSRIIBectonDickinsonによって分析した。CD19ゲートしたB細胞上のCD86発現を評価した。CD86発現の分析は、試験タンパク質の関数として、GraphPadPrismソフトウェアを用いて行った。図9Dに示されるとおり、二価M13-M13タンデム構築物は全てが、MR1抗体100pMのIC50に匹敵する、100~200pMというIC50でCD86発現を阻害し、M13一価足場自体よりも約3対数強力であった。生化学的アッセイとは異なり、この細胞に基づいたアッセイでは、リンカー長の効果は観察されず、そして、13~43アミノ酸長におよぶリンカーを有する二価構築物は全てが、一価のタンパク質に対して等価な増強された力価を示す。実施例8二重特異性のタンデム足場の発現TRAILR2およびヒトCD40LHuCD40Lに特異性を有する二重特異性のTn3構築物を生成するために、2つのTn3モジュール1つは、TRAILR2に特異性を有するものクローン1E11、および1つは、ヒトCD40Lに特異性を有するものクローン79を2つのモジュールを分ける可変長のリンカーと一緒に融合した表3および表15。クローン79タンパク質の配列配列番号184は、Tn3モジュールの配列に対応し、ここでBC、DE、およびEFループは、それぞれ、配列番号101、105および111に対応する別のループで置き換えた。1および3個のGly4SerGSリピートを有するリンカーを含む、タンデム二重特異性の足場についての発現構築物それぞれ、構築物C6およびC8は、Tn3変異体A1および79を担持するプラスミドを、最初にPCRテンプレートとして用いたこと以外は、実施例7に記載のとおり生成した。構築物C5ヒトテネイシンCにおける第二および第三のFnIIIドメインを連結する天然の配列由来の短いリンカーを含み、これは、第三のFnIIIドメインのAβ鎖の一部と解釈され得るが、足場結合には必要ではない、および構築物C7は、0GSリンカーリバースを、1-3GSリンカーリバースの代わりにC5に用いたこと以外は、表17に列挙される追加のプライマーを用いて、C6およびC8と同様の方法で生成した。一価、ならびにタンデム二重特異性のTn3足場を、実施例2に記載のようにE.coli培地で組み換え的に発現させた。可溶性構築物の発現レベルは、SDS-PAGEを用いて分析した。図10は、試験した構築物について許容できる発現レベルを示す。実施例9二重特異性のタンデム足場の特異的な結合CD40LおよびTRAILR2に対する二重特異性のTn3構築物の結合を測定するために、捕獲ELISAアッセイを使用した。簡潔に述べると、8×His-タグ化タンパク質構築物:A1、79、C5、C6、C7またはC8詳細に関しては、表15を参照のことを、E.coli培地から、抗His抗体コーティングしたウェル上に以下のとおり捕捉した。96-ウェルのMaxiSorbプレートを、Qiagen抗His抗体を用いて2μg/mlで一晩コーティングした。コーティングしたプレートを、0.1v/vのTween-20および4w/vの脱脂粉乳PBST4乳を含有するPBSで1.5時間ブロックした。コーティングしたプレートを、PBSTで洗浄して、可溶性の発現されたタンパク質を含有する希釈した細菌培地30倍希釈を添加して、プレートを室温で2時間インキュベートした。PBSTでの洗浄後、捕捉された構築物を含有するウェルを、種々の濃度のビオチニル化TRAILR2図11AまたはE.coli産生のHisタグ化HuCD40Lとビオチニル化抗His抗体とのプレインキュベーションによって生成された複合体図11Bのいずれかとともに1.5時間インキュベートした。PBSTでの洗浄後、結合したTRAILR2またはHuCD40L/抗His抗体複合体を、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼRPN1231V;GEHealthcare;1000×ワーキング希釈液を用いて20分間検出し、PBSTで洗浄し、TMB基質Pierceの添加によって比色分析によって検出した。吸光度は、450nmで読んだ。TRAILR2に対する二重特異性のタンデムTRAILR2-HuCD40L特異的な足場の結合、およびHuCD40Lに対する二重特異性のタンデムTRAILR2-HuCD40L特異的な足場の結合を、それぞれ図11Aおよび図11Bに示す。HuCD40L特異的なTn3ドメインに融合されるTRAILR2特異的なTn3ドメインを含む、C5~C8と命名された二重特異性のタンデム足場は、TRAILR2およびHuCD40Lに結合した;しかし、単量体の/一価特異的なTn3構築物A1および79は、それらの既知の特異性に従ってTRAILR2またはHuCD40Lのいずれかに結合したが、両方の標的には結合しなかった。TRAILR2およびHuCD40Lに対するタンデムTRAILR2-HuCD40L特異的構築物の同時結合は、AlphaScreen商標アッセイを用いて決定した。タンパク質A1、79、C5、C6、C7およびC8を含有するE.coli培地の希釈物を、10nMのTRAILR2-Fc融合タンパク質、50nMのビオチニル化HuCD40LE.coliで産生、ストレプトアビジンAlphaScreenドナービーズ0.02mg/mlおよびプロテインAAlphaScreenアクセプタービーズ0.02mg/mlが含有されるPBS0.01Tween0.1BSAとともにインキュベートした。試料を、PerkinElmerEnvisionリーダー中での読み取りの前に暗所で1時間インキュベートした。ドナービーズ集団を、680nmのレーザーで励起して、一重項酸素の放出を生じた。一重項酸素は、寿命が限られており、基底状態に戻る前に拡散によって最大200nmまで移動することを可能とする。一重項酸素は、アクセプタービーズを励起させて、520~620nmの光の放射を生じるこれは、Envisionリーダーで測定される。ドナーおよびアクセプタービーズが近位である場合のみ、シグナルが生成される。従って、シグナルの増大は、2種のビーズが、2つの標的と同時に相互作用する分子によって一緒にされる場合に観察される。いずれの標的に対する結合も存在しなければ、シグナルは検出されないはずである。図12に示すとおり、タンデム二重特異性構築物は、TRAILR2およびHuCD40Lに同時に結合して、強力なAlphaScreenシグナルを生成した;しかし、一価のTn3足場、A1および79は、シグナルを生成せず、このことは、それらが、両方の標的を同時に結合することによってドナーおよびアクセプタービーズを近位にし得ないことを示す。実施例109アミノ酸長のFGループを有するTn3足場の安定性の増大Tn3安定性に対するFGループ長の影響を測定するために、pH7.0での塩酸グアニジンGuHClによる6つのHuCD40L特異的なTn3足場の折り畳みを、内因性のトリプトファン蛍光によって評価した。これらのTn3単量体の足場は、9、10または11アミノ酸のFGループ長を含んだ。種々の濃度の塩酸グアニジンを含有する0.05mg/mLのTn3足場のサンプルを、pH7.0で50mMのリン酸ナトリウム中で調製した。蛍光放射スペクトルは、HoribaFluoromax-4スペクトロフルオロメーターで、280nmの励起波長で得た。360nmの相対的な蛍光放射強度を、各々のタンパク質についてGuHCl濃度の関数としてプロットした。各々の足場は、固有のBC、DE、およびFGのループ配列を含んだ。クローンA3配列番号185;本実施例のA3単量体足場は、表3に提供されるようにA3と命名された構築物とは別であることに注意、71配列番号186、79配列番号184、127配列番号187、252配列番号188、および230配列番号189は、pH7.0で3.0MのGuHCl親のTn3の50未折り畳みを発揮するのに必要なGuHCl濃度Cmである中で50を超えて未折り畳みであった。クローンA3,79、127、252および230のCm値は、それぞれ、2.2M、2.7M、2.4M、2.7M、2.4Mであった。これらのクローンについてのFGループ長は、それぞれ、11、11、11、10および11アミノ酸であるが、親のTn3のFGループ長は、10アミノ酸である。驚くべきことに、クローン719アミノ酸というFGルループ長を有する唯一の変異体は、親のTn3足場、または試験した他の5つの変異体よりも有意に高い安定性である、4.2MというCmを示した。結果を図13に示す。Tn3クローン71の安定性の増強が、その配列に内因性であるか、または短縮されたFGループ長の結果であるかを決定するため、このクローンおよび2つの通過の単量体のTn3足場タンパク質、A6配列番号190;本実施例におけるA6単量体の足場は、表3に提供されるようにA6と命名された構築物とは別であることに注意およびP1C01配列番号191、であって9アミノ酸のFGループ長を有するただし、異なるBC、DEおよびFGループ配列を、示差走査熱量測定DSCによって分析し、10アミノ酸長さであるFGループを含む親のTn3足場と比較した。Tn3タンパク質サンプルは、1mg/mLでPBSpH7.2中で分析した。全ての場合に、熱未折り畳みの中点は、10残基のFGループを有する親WTTn3に比較して9残基FGループを有するクローンについて高かった。熱未折り畳みは、同じサンプルを冷却して再加熱した場合、上書き可能なサーモグラムによって証明されるとおり、可逆性であるか、または部分的に可逆性クローンA6であった。図14に示されるとおり、親のTn3についての融点Tmは72.1°Cであって、P1C01については、Tmは75.2°Cであって、A6については、Tmは77.5°Cであって、かつ71については、Tmは74.4°Cであった。これらの知見を、塩酸グアニジン安定性実験において同じTn3タンパク質変異体を試験することによって、裏付けた。pH7.0での塩酸グアニジンGuHClによる親のWTTn3、P1C01、A6、および71の未折り畳みを、上記のように内因性のトリプトファン蛍光によって評価した。図15に示されるとおり、図14のDSCデータと一致して、Tn3クローンA6、71、およびP1C01は全てが、親のWTTn3足場よりも有意に高いGuHCl濃度で未折り畳みの中点を有し、このことは、9アミノ酸長であるすなわち、親のTn3足場の長さよりも短いFGループを有するTn3タンパク質の安定性が増強されることを示す。実施例11FGループ長の安定性分析上記のように、予備的分析によって、9残基というFGループ長を有するTn3分子が、それより長いFGループを有するTn分子よりも有意に安定であることが示された。これらの研究では、本発明者らは、1セットのランダムなTn3で安定性分析を行って、熱安定性に対するFGループ長の効果を評価した。Tn3ライブラリーを、pSEC発現ベクター中にサブクローニングした。このライブラリーは、種々の配列であって同様に種々のただし規定の長さのBC、DE、およびFGループを有するTn3をコードする。これらの研究の焦点であるFGループは、9、10または11残基長であってもよい。BCループは、9、11、または12残基長であってもよい。このライブラリーのDEループは、6残基という固定長を有する。サブクローニングされたライブラリーを用いて、DH5αコンピテント細胞を形質転換して、これからプラスミドプールを精製して、BL21DE3細胞を形質転換するのに用いた。BL21コロニーを、配列決定して、全長Tn3をコードする96クローンを特定した。この最終の96クローンを、96ディープ-ウェルプレート中に500μlのスケールで、標準のMagicMedia発現接種後24時間37°Cで振盪するを用いて増殖して、SDS-PAGEで分析した。中度~高度の発現レベルを有する29個のランダムなクローンを、50mL規模の発現までスケールアップして、標準的な固定金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。全てのタンパク質が何であるかは、質量分析法によって確認した。ランダムなクローンを、DSCによって安定性に関して分析した。簡潔に述べると、DSC測定は、VP-CapillaryDSCMicroCalで行った。タンパク質を、十分な透析を通じてPBSpH7.2に交換して、DSC分析のために0.25~0.5mg/mlの濃度に調節した。サンプルを、20~95°Cで、90°C/時間のスキャン速度で、反復スキャンなしで、スキャンした。結果を表18に示す。この研究では、ループ長FG9またはFG10および11を有するTn3の熱安定性を比較した。この傾向は、長さ9のFGループを有するTn3ドメインが、ループ長FG10または11を有するものよりも熱安定性であることを示す。対照の野生型Tn3ドメイン10残基のFGループを有するは、上記のサンプルと平行して行った場合、72°CのTmを有した。各々のループ長で見られるTm値の範囲によって、他の要因もまた、Tn3ドメイン熱安定性を決定するのにある役割を果たすことが示される。実施例12三重特異性のTn3の生成および特徴付けこれらの実験では、3つの異なる標的に結合特異性を有するTn3分子を生成して、特徴付けた。D1、Synagis登録商標抗体に特異的なTn3ドメインは、それぞれ、1E11TRAIL受容体2に特異的なTn3ドメイン、および79CD40Lに特異的なTn3ドメインに連結された図17A。この構築物は、BL21DE3E.coli細胞で発現され、標準的な方法を用いて精製された図17Bを参照のこと。三重特異性の構築物が、同時に3つ全ての標的の対に結合し得るかを確認するために、AlphaScreenおよびELISA実験の両方を行った。AlphaScreen実験については、三重特異性のTn3、3つの総標的分子のうちの2つのサブセット1つは、ビオチニル化、他方は、抗体Fc領域を含む、プロテインAドナービーズ、およびストレプトアビジンアクセプタービーズを、上記のように、384ウェルのホワイトオプティプレートwhiteOptiplate中で合わせた。AlphaScreenシグナルは、ストレプトアビジンドナービーズおよびプロテインAアクセプタービーズがお互いに近位にあるお互いに200nmである場合にのみ観察され得、近位であることは、このアッセイでは、三重特異性の分子による架橋を通じて達成される。D1-1E11-79が同時に、huCD40LおよびTRAILR2-Fcに図18A、ならびに同時にhuCD40LおよびSynagis登録商標に図18B結合する能力は、以下のようにAlphaScreenによって確認された:384-ウェルのホワイトオプティプレート中で、以下の成分を総容積30μl中で合わせた:20mMの精製したD1-1E11-79、50mMのビオチニル化-huCD40L,0、1、2.5、5、10、または42nMTrailR2-Fc図18Aまたは0、1、2.5、5、10、または42nMSynagis登録商標図18B、5μlの各々の1/50希釈のAlphaScreenプロテインAアクセプタービーズおよびストレプトアビジンドナービーズ。暗所での1時間のインキュベーション後、プレートを、Envisionプレートリーダー上で、AlphaScreenモードで読んだ。Synagis登録商標およびTRAILR2-Fcは両方とも、Fcドメインを含むので、AlphaScreenアッセイを用いても、三重特異性の構築物に対するこれらの分子の同時の結合を示すことはできなかった。その代わり、ELISA実験を行った。MaxiSorpプレートを、TRAILR2-Fc1μg/mlで100μlでコーティングして、4ミルクでブロックし、次いで、種々の濃度の三重特異性構築物を添加した。ビオチニル化Synagis登録商標、第二の標的リガンドを、添加して、HRP-ストレプトアビジンの添加によって検出した図19。D1-1E11-79はまた、図19のELISAの結果によって示されるように、同時にTRAILR2-FcおよびSynagis登録商標の両方に結合し得ることが示された。従って、この構築物は、同時にその標的の3つ全ての対に結合し得ると本発明者らは、結論し得る。実施例13リードの単離アゴニストTn3を開発する最初の工程は、TRAILR2に結合し得、かつ多価形式に連結された場合アポトーシス経路に関与するように2つ以上のTRAILR2細胞外ドメインに結合し得るTn3単量体を単離することである。全ての結合因子がアゴニストとして機能し得るのではないので、本発明者らは、結合因子のパネルを最初に単離することを決め、次いで、インビトロの細胞殺傷アッセイで二次的に作用薬についてスクリーニングした。本発明者らは、最初に、結合因子の最初のパネルを単離するために、組み換えTRAILR2-Fc上で、BC、DE、およびFGループに変化を有するTn3の大きいファージ提示ライブラリーをパニングした。このライブラリーの基礎として選択したTn3足場は、テネイシンCからの天然の3番目のFnIIIドメインではないが、安定性を改善するために操作されたジスルフィドを有するバージョンであった。自家のTn3/遺伝子3融合ファージディスプレイライブラリーを構築したこれは、BC、DE、およびFGループ中に無作為化を含んでいた。複数の結合因子が、ファージELISAによって見出され、ここでは、TRAILR2を直接、プレート上にコーティングして、1:3希釈したファージのPBS0.1Tween20PBST1ミルク中での結合を、抗M13-ペルオキシダーゼ複合抗体GEHealthcareBiosciences,Piscataway,NJによって検出した。ほとんどの結合因子は、ループの1つの望ましくない遊離のシステインを有し、さらなる研究については選択されなかった。不対のシステインを欠くクローンのサブセットを、Fc融合物または抗体様構築物のいずれかを生じる発現ベクター中にクローニングし図1、細胞殺傷のために腫瘍細胞株H2122において試験したデータ示さず。Fc融合形式では、その融合したTn3にかかわらず、細胞を殺傷することができなかったが、抗体様の形式では、2つ以上の結合因子について応答を引き出した。実施例14親和性成熟クローン1C12配列番号132図20を参照のことは、最初のスクリーニングアッセイにおける最高の細胞殺傷を示し、従って、親和性成熟のために選択された。親和性成熟は、Kunkel突然変異誘発または無作為化を含むオリゴヌクレオチドによるPCRのいずれかを用いるループの一部の飽和突然変異誘発、アセンブリおよびファージディスプレイベクターへの連結によって行った。1回目および3回目は、それぞれBCおよびFGループの一部の飽和突然変異誘発から構成され、2回目は、3つ全てのループの一部の別個の飽和突然変異誘発、パニング、遺伝子シャッフリング、次いでシャッフリングされた変異体のパニングを組み合わせて、最高の親和性のアウトプットクローンを得た。親和性成熟したクローンのプールは、ファージから直接PCRによって、またはQiagenキットQiagen,Valencia,CAを用いて一本鎖DNAを調製することおよび次いでPCRよってパニング後に回収した。PCR産物を、NcoI~KpnINewEnglandBiolabs,Ipswich,MA消化して、本発明者らの自家の発現ベクターpSEC中にクローニングした。これらのクローンを、MagicMediaInvitrogen,Carlsbad,CA中で発現させて、ゲル上で泳動して、発現がクローンの間で大きく異ならなかったことを確認した。改善されたクローンを、競合ELISAによって特定し、ここではプレートを、四価の抗体様の1C12配列番号154および155でコーティングして、MagicMedia中で、Tn3の希釈の存在下で0.75nMのTRAILR2ビオチンの結合の阻害を、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼGEHealthcareBiosciences,Piscataway,NJを用いて測定した。TMBKPL,Gaithersburg,MDを添加して、酸で中和した。吸光度は、450nmで読み取った。親和性測定は、GLCセンサーチップを備えるProteOnXPR36タンパク質相互作用アレイシステムBio-Rad,Hercules,CAで25°Cで行った。0.005Tween20,pH7.4を含有するProteOnリン酸緩衝化生理食塩水PBS/Tweenを泳動緩衝液として用いた。TRAILR2を、チップ上に固定し、Tn3結合因子1C12配列番号132、1E11配列番号134、G3配列番号133、C4配列番号135、およびG6配列番号138の2倍の12ポイントの連続希釈を、36μM~700nMにおよぶ出発濃度で、PBS/Tween/0.5mg/mlBSA,pH7.4中で調製した。各々の濃度の試料を、6つの分析物チャネル中に、30μl/分の流速で300秒間注入した。Kdは、ProteOnソフトウェア中で平衡分析設定を用いることによって決定した。各々の回の最良のクローンの配列を図20に示す。3回の親和性成熟後の親和性の総改善は、ほぼ2ケタの大きさであって、最良のクローンは、40~50nMの範囲の親和性を有した表19。実施例15抗体様の形式での力価に対するTn3親和性の効果力価に対する個々のTN3サブユニットの親和性の効果を評価するため、表19のクローンの全てを、図1に示される抗体様の構築物中に再フォーマットした。抗体様のタンパク質を発現するために、293F細胞を、適切な発現構築物で一過的にトランスフェクトした。上清の回収を、6日目および10日目に行って、タンパク質を、プロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製した。全ての精製したタンパク質を、SDS-PAGEによって、NuPageNovex4-12ビストリスゲル上で、MES緩衝液中で、還元剤なしで分析し、SimplyBlueSafeStainInvitrogen,Carlsbad,CAを用いて可視化した。サイズ排除クロマトグラフィーも用いて、精製したタンパク質を分析し、必要に応じて、凝集した物質を、Superdex7510/300GLまたはSuperdex20010/300GLカラムGEHealthcare,Piscataway,NJ上で取り除いて、10未満の総タンパク質という最終レベルにした。MustangE膜を備えるAcrodiscユニットPallCorporation,PortWashington,NYを、製造業者が示したとおり用いて、細菌が発現したタンパク質調製物から内毒素を取り除いた。次いで、H2122細胞を、CellTiter-Glo細胞生存度アッセイを用いて、アゴニストの抗体様の構築物に対する感度について試験した。このアッセイでは、蛍光は、96ウェルプレートの所定のウェル内のATPのレベルに対して直接比例し、これが次に、代謝的に活性な生存細胞の量と直接比例する。H2122細胞株については、細胞を、96ウェルプレート中に、10,000細胞/ウェルの密度で、75μlの完全培地10FBSを補充したRPMI1640培地中でプレートした。37°Cでの一晩のインキュベーション後、培地に25μlの追加の培地TRAILR2特異的なまたは負の対照のタンパク質の連続希釈を含有を補充した。全ての処理は、二重のウェルで行った。市販のTRAILリガンドChemicon/Millipore,Billerica,MAを、TRAIL受容体誘導性の細胞死についての正の対照として用いた。72時間後、CellTiter-Gloキットを、製造業者の指示に従って用いた。アッセイの発光は、EnvisionPlateリーダーPerkinElmer,Waltham,MAで測定した。細胞生存度の阻害は、処理した細胞についての発光の値を未処理の生存細胞についての平均の発光で除すことによって決定した。2つの可変量が効力を決定する:ある構築物が細胞の生存度を50まで阻害する濃度EC50および細胞生存度の最大阻害。図21は、一般的な傾向として、Tn3単量体の親和性が大きいほど、抗体様構築物のEC50が低くなることを示す。なぜなら、G6は、1E11よりも低いEC50を有し、かつ1E11は、1C12よりも低いEC50を有するからである。実施例16直鎖状のTn3の薬物動態1つのタンデム直列あたりのTn3モジュールの数の関数として直鎖状のTn3タンデム半減期を決定するため、G6単量体配列番号138、G6タンデム4配列番号143、G6タンデム6配列番号192、およびG6タンデム8配列番号145を、マウスに注射し、Tn3の血清濃度をELISAによってモニターした。投与の経路は、腹腔内IP注射であった。実験デザインを、表20に示す。マウスを、1時点あたり150μL採血した。Tn3を、ELISAによって血清中で検出し、ここでは自家で生成したTRAILR2コーティングしたプレートを、PBST1ミルク中で希釈した血清とともにインキュベートした。最初のELISAを行って、所定の時点について、アッセイの動的な範囲内にシグナルがあるように正確な希釈範囲を決定した。結合したTn3を、PBST1ミルク中のウサギからのポリクローナル抗Tn3血清の1,000希釈中の1Covance,Princeton,NJで、続いて、ロバ抗ウサギHRPのPBST1ミルク中の10,000希釈中の1JacksonImmunoResearch,WestGrove,PAで検出した。各々の構築物について、標準曲線を作製し、統計学的分析を、自家の統計学的プログラムを用いて行った。最大血漿濃度Cmaxという用語は、患者に対する試験物質の投与後、血漿中のタンデムTn3の最高の観察された濃度を指す。Tmaxという用語は、最大血漿濃度Cmaxまでの時間を指す。曲線下面積AUCという用語は、時間に対する血漿中のタンデムTn3の濃度のプロットにおける曲線下の面積である。AUCは、時間間隔の間の即時的血漿濃度Cpの積分の指標であり得、質量時間/容積の単位を有する。しかし、AUCは通常は、時間間隔ゼロから無現まで示される。従って、本明細書において用いる場合、AUCinfとは、無限の時間間隔にまたがるAUCを指す。生物学的半減期T1/2という用語は、タンデムTn3の血漿濃度がそのもとの値の半分になるのに必要な時間として規定される。CL/Fという用語は、用量/AUCinfとして算出される見かけの総身体クリアランスを指す。生物学的半減期T1/2は、直鎖状分子についてタンデムTn3の数が増大するとともに増大する。7つのTn3を付加して単量体からタンデム8を作製することで、半減期はほぼ50まで増大した。価数の増大は、Tmaxには影響しなかった。しかし、価数が1から8へ増大することによって、それぞれ、CmaxおよびAUCinfにおいて、約10倍および7倍の増大が生じた。さらに、価数が1から8まで増大する場合、クリアランスにおける約7倍の低下CL/Fが観察された。実施例17cyno交差反応性の操作された増強カニクイザルMacacafascicularisでの前臨床毒性試験のために、カニクイザルcynomolgusTRAILR2cynoTRAILR2と交差反応する抗TRAILR2-Tn3を開発することが所望される。本発明者らの最初の親和性成熟したリードクローンは、cynoTRAILR2との交差反応が乏しいが、ヒトTRAILR2に対する相同性は88である。交差反応性は、クローンF4配列番号137に基づくライブラリーを作製することによって増強されたが、このクローンは、親和性成熟から生じたクローンの間で最高のcyno交差反応性を有するクローンであった。2つのライブラリーを、飽和突然変異誘発によって作製した:1つは、FGループ単独に多様性を有し、1つは、BCおよびFGループに多様性を有した。低誤差率変異原性PCRをまた用いて、増強されたcynoTRAILR2結合に有益であり得るループの外側の変異を可能にした。4回のファージパニングを、自家で製造したcynoTRAILR2で行い、アウトプットを、pSEC発現ベクター中にクローニングした。ELISAフォーマットにおける最初のヒットのスクリーニングのために、Tn3は、MagicMediaInvitrogen,Carlsbad,CA中に分泌され、抗hisタグ抗体RandDSystems,Minneapolis,MNを用いて上清から捕捉された。捕捉されたTn3に対する、溶液中のヒトまたはcynoTRAILR2-Fcのいずれかの結合を、抗ヒト-Fc-HRPによって検出した。cynoTRAILR2-Fcに対する有意な結合を有し、かつヒトTRAILR2-Fcに対する結合を失うと思われなかったクローンを、引き続くスクリーニングELISAのために選択して、ここではヒトまたはcynoTRAILR2-Fcのいずれかを、プレート上にコーティングして、Tn3上清を、滴定し、次いで抗hisタグHRPで検出した。クローンからクローンへの発現レベルの変化のレベルが低いため、およびまた溶液中に有する二価TRAILR2-Fcからの結合活性は、Tn3親和性における相違をマスクできなかったので、このELISAによって、親和性識別が可能になった。1つの変異、DEループの前のDからGの2つのアミノ酸の変異は、全ての操作されたcyno交差反応性クローンに存在したことが見出された図23A。このDからGへの変異を、もとのF4に操作して、F4mod1という名称のクローン配列番号193を作製し、cynoについての交差反応性は、ヒトTRAILR2に対する犠牲的結合なしに大きく改善された図23B。このELISAでは、精製されたF4またはF4mod1による、F4mod1コーティングしたプレートに対する0.75nMのヒトまたはcynoのTRAILR2-Fcの結合の阻害を測定した。cynoのTRAIL-R2-Fcに対するcynoの交差反応性の増強クローンの結合は、ヒトTRAILR2-Fcに対するその結合の10倍内であることが望ましい。また、cynoのTRAIL-R2-Fcに対するcynoの交差反応性の増強クローンの結合は、ヒトTRAILR2-Fcに対するF4の結合の10倍内であることも望ましい。cynoTRAILR2に対するF4mod1結合についてのIC50は、ヒトTRAILR2に対するF4mod1結合についてのIC50よりも3倍未満異なる。さらに、ヒトTRAILR2に対するF4mod1結合についてのIC50は、ヒトTRAILR2に対するF4結合についてのIC50よりも6倍強い。従って、F4mod1は、意図される交差反応性の要件を満たす。実施例18増強されたcyno交差反応性クローンの生殖細胞系列の操作クローンF4mod1をさらに操作して可能性のある免疫原性の危険性を低減するために生殖細胞系列から本質的でない変異を排除した。12の異なる改変のパネルを作製して、ヒトおよびcynoの両方のTRAILR2に対する結合に対して所定の変異からの効果があったか否かを決定した。図24Aは、最終クローンF4mod12配列番号194の比較を示しており、これは、他の構築物に対して、結合に影響しない全ての試験した生殖細胞系列変異を組み込む、すなわち、Tn3生殖細胞系列、もとのF4親、およびクローンF4mod1最初の増強された操作されたcyno交差反応性。F4mod12のアミノ酸配列は、天然のTn3配列SQで開始して、Lで終わり、AからTへのフレームワーク2変異の逆転を有し、かつDEループの最後の2つのアミノ酸のTAからNQの逆転を有する。図24Bは、F4、F4mod1、およびF4mod12が全て、ヒトTRAILR2に対するそれらの結合においてお互いの6倍内であることを示す。F4mod1およびF4mod12は、cynoのTRAILR2に対するそれらの結合においてお互いの2倍内であることも示される。F4mod12は、タンデム6配列番号167およびタンデム8配列番号166構築物中に再フォーマットされて、試験されたG6タンデム6配列番号144およびタンデム8配列番号145に対する力価の損失がないことが確認された。図24Cおよび図24Dによって、遺伝子操作された生殖細胞系列について、Colo205細胞株におけるG6タンデムと比較して増強されたcyno交差反応性F4mod12タンデムは力価の損失がないことが示される。実施例19TRAIL耐性細胞株におけるG6タンデム8の活性複数の細胞株が、TRAILによる殺傷に耐性である。従って、本発明者らは、TRAIL感受性細胞株におけるTRAILに対するG6タンデム8構築物の力価の増強が、TRAIL耐性細胞株におけるG6タンデム8の力価に現れるか否かを評価した。いくつかの癌細胞株におけるApo2L/TRAILに対する感受性は、CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssayPromega,Madison,WIで決定した。簡潔に述べると、細胞を、96-ウェルプレート上にプレートして、一晩接着させ、次いで、種々の濃度の組み換えヒトApo2L/TRAILおよびTRAIL模倣G6タンデム8が含まれる培地10FBS含有で処理した。48~72時間後、細胞生存度を、製造業者のプロトコールに従って決定した。図25は、TRAIL耐性細胞株HT29について、G6タンデム8が、強力な細胞殺傷活性を示すが、TRAILは示さないことを示す。表22は、G6タンデム8が細胞殺傷活性を多くの、ただし全てではない試験したTRAIL耐性細胞株で有することを示す。実施例20TRAILR2結合単量体の免疫原性研究免疫原性は、いずれの治療タンパク質にとっても、それがヒト由来である場合でさえ、あり得る問題である。免疫原性応答は、炎症をもたらし得る中和抗体を通じて有効性を限定し得る。免疫応答の発達における最も重要な要因の1つは、CD4T細胞増殖を刺激し得るエピトープの存在である。EpiScreen試験Antitope,Cambridge,UKでは、CD8T細胞を欠く末梢血単核細胞PBMCを、試験タンパク質とともにインキュベートして、CD4T細胞増殖およびIL-2分泌をモニターするBakerJones,Curr.Opin.DrugDiscoveryDev.10:219-227,2007;JaberBaker,J.Pharma.Biomed.Anal.43:1256-1261,2007;.Jonesら、J.ThrombosisおよびHaemostasis3:991-1000,2005;Jonesら、J.InterferonCytokineRes.24:560-72,2004。PBMCは、世界の集団で発現されるHLA-DRアロタイプを表すドナーのプールから単離される。図26に示されるTn3単量体を、発現しGGGGHHHHHHHHリンカー-Hisタグ、精製し、SECによって単量体であることを確認し、上記のように内毒素除去のために濾過した。試験した全ての非野生型クローンは、cyno交差反応性を増強するための操作の回からであった図23A。しかし、これらのクローンは、F4mod1バックグラウンドにおける結合に影響を示さなかった生殖細胞系列に対して変異を有した。これらのクローンをELISAで試験して、生殖細胞系列の変異が結合に影響しなかったことを確認した。T細胞増殖アッセイおよびIL-2分泌アッセイの両方で、2を超える刺激指数stimulationindexSIが、所定のドナーについての陽性応答として以前に確立された。平均のSI,または陽性応答集団のSIの平均は、応答の強度の指標である。強力な応答を誘導することが公知の対照タンパク質である、キーホールリンペットヘモシアニンKLHを両方のアッセイに含んだ。表23は、全ての試験タンパク質についての平均SIを示しており、これは、KLHについて有意に低く、かつ陽性平均SIについての2というカットオフよりもそれほど高くなかった。さらに、試験タンパク質についての応答の頻度は、極めて低かった90という過剰で応答した対照を除けば、全ての試験したタンパク質について10以下。Antitopeによる以前の研究では、10未満というEpiScreen応答は、臨床の免疫原性の危険性が低い指標であることが明らかになった。従って、試験した全てのTn3が10以下の応答頻度を有するという本発明者らの観察によって、臨床上の免疫原性のリスクが低いことが示される。実施例21未精製および精製したG6タンデム8Tn3の凝集状態複数のシステインを含むタンパク質、例えば、内部ジスルフィド結合を含むタンデムリピートからできたタンパク質は、適切なジスルフィド対合を示さない場合が多いことは当該分野で公知である。ジスルフィドのスクランブリングは、培地中への発現を減少または排除し得る。タンパク質が培地中へ発現する場合、これは不適切に折り畳まれたタンパク質と、分子間の、ならびにミスマッチの分子間のジスルフィド対凝集をもたらすとの混合物である場合がある。本発明者らのSECデータによって、細菌発現培地中のタンデムタンパク質のほとんどが、単量体の適切に折り畳まれた状態であることが明らかになった。Hiタグ化G6タンデム8タンパク質のNi-NTA精製後、タンパク質のうち約15が凝集した。観察された凝集は、2mMのDTTによる還元によって、4まで低下し図27A、このことは、ほとんどの凝集がジスルフィド媒介性であったことを示す。凝集物のほとんどを、上記のように、SEC精製によって除去した図27B。実施例22Colo205結腸直腸癌異種移植片モデルにおけるTRAIL模倣物、G6TN6およびG6TN8の腫瘍増殖阻害の決定TRAILTn3模倣物、G6タンデム6G6TN6配列番号144およびG6タンデム8G6TN8配列番号145の抗腫瘍活性を、Colo205、すなわちヒト結腸直腸癌異種移植片モデルで評価した。Colo205細胞を、10ウシ胎仔血清FBSを含むRoswellParkMemorialInstituteRPMI1640培地中で、5CO2下で37°Cで半接着単層培養物として維持した。トリプシン処理によって回収した細胞を、ハンクス平衡塩溶液Hank’sbalancedsaltsolutionHBSS中で3×107細胞/mLという最終濃度に再懸濁した。無胸腺雌性ヌードマウスに各々、右わき腹の皮下にSC3×106個のColo205細胞を注射した。本研究は、腫瘍が平均で約177mm3に達した時点で開始した。研究デザインは、表24にまとめる。TRAILを、ストック溶液から20mMのTris-HCl300mMのアルギニン-HClpH7で希釈して、体重に応じて10mL/kg全部で5用量を毎日、表24に示す用量で、静脈内にIV投与した。G6タンデム6G6TN6およびG6タンデム8G6TN8を、各々ストック溶液からPBSで希釈して、体重に応じて10mL/kg全部で5用量を毎日、表24に示す用量で、静脈内にIV投与した。腫瘍容積および体重の測定を記録した。腫瘍の測定は、電子カリパスを用いて行い、そして腫瘍容積mm3は、腫瘍容積=[長さmm×幅mm2]/2という式を用いて算出した。腫瘍増殖阻害TGIは、TGIパーセント=1-T/C×100として算出し、ここでT=最終投与後の処置群の最終腫瘍容積であり、かつC=最終投与後の対照群の最終腫瘍容積である。投与段階dosingphaseDPの間図28、3mg/kgおよび30mg/kgのG6TN6は、それぞれ、92p<0.0001および93p<0.0001の有意なTGIを生じた表25。同様に、最終濃度のための等モル調節後、2.25mg/kgおよび25.5mg/kgのG6TN8によって、それぞれ93p<0.0001および94p<0.0001という有意なTGIが生じた表25。30mg/kgのTRAILは、60のTGIを生じたp<0.001、表25。再増殖段階regrowthphaseRPの34日まで図28、3mg/kgのG6TN6は、なんらCRcompleteregression:完全退縮を生じなかったが、2.25mg/kgのG6TN8は、90のCRを生じた。30mg/kgというより高用量では、G6TN6は、50のCRを達成した。他方では、25.5mg/kgのG6TN8は、100のCRを生じた表26。両方の用量からの結果によって、G6TN8は、G6TN6に比較して大きい有効性を生じたことが示唆される。しかし、両方とも特定の用量で有効性を示した。さらに重要なことに、両方の構築物とも、なんらPRもCRも生じなかったTRAILを有意にしのいだ。図29に示すとおり、この研究の投与および再増殖段階の間、全ての用量でG6TN6およびG6TN8の両方にいかなる体重減少も観察されなかった。実施例23追加の標的の結合特定の標的に結合するFnIII足場は、本明細書に記載されるか、および/または当該分野で公知の方法によって生成され得る例えば、WO2009/058379を参照のこと。あるいは、本明細書に記載される足場は、ループグラフティングloopgraftingに供され、ここでは、公知の結合特異性の足場のループ配列を、所望の足場のβ鎖配列にグラフトする例えば、Tn3足場のβ鎖配列、または図16に示される配列。表27は、所望のβ鎖に対するグラフトのためのループ配列、例えば、表1に示されるものの非限定的な例を提供する。前述の実施例は、本発明および本発明の方法の実施の種々の態様を例示説明する。実施例は、本発明の多くの異なる実施形態の網羅的な説明を提供することを意図していない。従って、前述の本発明は、理解の明確化の目的で例示説明および実施例によってある程度詳細に記載してきたが、当業者には、それに対して多くの変化および改変が、添付の特許請求の趣旨からも範囲からも逸脱することなくなされ得ることが容易に理解される。本明細書に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によって本明細書に援用されると詳細にかつ個々に示されるかのように、本明細書に参照によってここに援用される。"