"治療上有効量のTLR3と反応する単離抗体を、それを必要とする患者に、II型糖尿病、高血糖症又は高インスリン症を治療するのに十分な時間にわたって投与することを含む、II型糖尿病、高血糖症又は高インスリン症の治療方法。治療上有効量のTLR3と反応する単離抗体を、それを必要とする患者に、心臓血管疾患を治療するのに十分な時間にわたって投与することを含む、心臓血管疾患の治療方法。治療上有効量のTLR3と反応する単離抗体を、それを必要とする患者に、患者の総コレステロールを下げるのに十分な時間にわたって投与することを含む、患者の総コレステロールを下げる方法。治療上有効量のTLR3と反応する単離抗体を、それを必要とする患者に、患者の低密度リポタンパク質LDLを下げるのに十分な時間にわたって投与することを含む、患者の低密度リポタンパク質LDLを下げる方法。治療上有効量のTLR3と反応する単離抗体を、それを必要とする患者に、肝臓の脂肪蓄積を低減させるのに十分な時間にわたって投与することを含む、肝臓の脂肪蓄積を低減させる方法。TLR3抗体と反応する前記単離抗体が、配列番号70、77及び72で示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域1、2及び3HCDR1、HCDR2、HCDR3、並びに配列番号67、68及び78で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域1、2及び3LCDR1、LCDR2、LCDR3を含む、請求項1、2、3、4又は5に記載の方法。TLR3抗体と反応する前記単離抗体が、配列番号82、86及び84で示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域1、2及び3HCDR1、HCDR2、HCDR3、並びに配列番号79、80及び87で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域1、2及び3LCDR1、LCDR2、LCDR3を含む、請求項1、2、3、4又は5に記載の方法。したがって、TLR3に関連する状態を治療するためにTLR3活性を抑制することが求められている。本発明の一つの態様は単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体がtoll様受容体3TLR3の、配列番号2のアミノ酸残基;K416、K418、L440、N441、E442、Y465、N466、K467、Y468、R488、R489、A491、K493、N515、N516、N517、H539、N541、S571、L595、及びK619に結合することを特徴とする。本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体がtoll様受容体3TLR3の、配列番号2のアミノ酸残基;S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、T166、Q167、V168、S188、E189、D192、A195、及びA219に結合することを特徴とする。本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域又はそのフラグメントを有し、重鎖可変領域のChothia残基;W33、F50、D52、D54、Y56、N58、P61、E95、Y97、Y100及びD100b、並びに軽鎖可変領域のChothia残基;Q27、Y32、N92、T93、L94及びS95により、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するTLR3に結合することを特徴とする。本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域又はそれらのフラグメントを有し、重鎖可変領域のChothia残基;N31a、Q52、R52b、S53、K54、Y56、Y97、P98、F99及びY100、並びに軽鎖可変領域のChothia残基;G29、S30、Y31、Y32、E50、D51、Y91、D92及びD93により、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するTLR3に結合することを特徴とする。本発明の別の態様は、TLR3反応性を有し、以下のa~iの特性のうち少なくとも1つを有する、単離された抗体である;a.Kd<10nMでヒトTLR3に結合する;b.インビトロでのポリI:CNF-kBレポーター遺伝子アッセイにおいて、1μg/mLで、ヒトTLR3の生物活性を50超低減させる;c.10μg/mLで、100ng/mL未満のポリI:Cで刺激されたBEAS-2B細胞からのIL-6又はCXCL10/IP-10の産生を60超阻害する;d.0.4μg/mLで、100ng/mL未満のポリI:Cで刺激されたBEAS-2B細胞からのIL-6又はCXCL10/IP-10の産生を50超阻害する;e.5μg/mLで、62.5ng/mLのポリI:Cで刺激されたNHBE細胞からのIL-6の産生を50超阻害する;f.1μg/mLで、62.5ng/mLのポリI:Cで刺激されたNHBE細胞からのIL-6の産生を50超阻害する;g.1μg/mLで、PBMC細胞による、ポリI:Cにより誘導されたIFN-γ、IL-6又はIL-12の産生を20超阻害する;h.インビトロでのNF-kBレポーター遺伝子アッセイにおいて、IC50<10μg/mLで、カニクイザルのTLR3の生物活性を阻害する;又はi.インビトロでのISREレポーター遺伝子アッセイにおいて、IC50<5μg/mLで、カニクイザルのTLR3の生物活性を阻害する。本発明の別の態様は、特定の重鎖相補性決定領域CDR1、2及び3のアミノ酸配列、特定の軽鎖CDR1、2及び3のアミノ酸配列、特定の重鎖可変領域VHのアミノ酸配列、又は特定の軽鎖可変領域VLのアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体とTLR3との結合について競合する、TLR3に対する反応性を有する単離された抗体である。本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有し、TLR3反応性を有する単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖相補性決定領域CDR1、2及び3、並びに特定の軽鎖CDR1、2及び3のアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有する、TLR3反応性を有する単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖可変領域VHのアミノ酸配列、及び特定の軽鎖可変領域VLのアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有する、TLR3反応性を有する単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖のアミノ酸配列、及び特定の軽鎖のアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、単離された抗体重鎖であって、前記抗体重鎖は配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215又は216に示されるアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、単離された抗体軽鎖であって、前記抗体軽鎖は、配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210、211又は225に示されるアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、単離された抗体重鎖であって、前記抗体重鎖は配列番号102、130、131、132、133、134、135、160、204、206、208、220、166又は168に示されるアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、単離された抗体軽鎖であって、前記抗体軽鎖は配列番号155、156、157、158、203、205、207、165、167又は227に示されるアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記抗体重鎖は配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215又は216に示されるアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記抗体軽鎖は配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210、211又は225に示されるアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、抗体重鎖をコードする単離されたポリペプチドであって、前記抗体重鎖は配列番号102、130、131、132、133、134、135、160、204、206、208、220、166又は168に示されるアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号155、156、157、158、203、205、207、165、167又は227に示されるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖をコードする。本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。本発明の別の態様は、少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明の別の態様は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。本発明の別の態様は、本発明のホスト細胞を培養することと、前記ホスト細胞によって産生された抗体を回収することと、を含む、TLR3に対する反応性を有する抗体の製造方法である。本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、炎症性疾患の治療又は予防を必要とする患者に、炎症性疾患を治療又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、炎症性疾患の治療又は予防方法である。本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、全身性の炎症状態を処置又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、全身性炎症性疾患の処置又は予防方法である。本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、II型糖尿病を処置するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、II型糖尿病の処置方法である。本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、高血糖を処置するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、高血糖の処置方法である。本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、インスリン抵抗性を処置するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、高インスリン血症の治療方法である。本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、ウイルス感染を処置又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、ウイルス感染の処置又は予防方法である。特許及び特許出願を含み、それらには限定されない全ての刊行文献は、本明細書への参照により、完全に説明されているごとくに、本願に包含される。本明細書で用いるアンタゴニストなる用語は、何らかの機構によって、受容体又は細胞内メディエーターなどの別の分子の作用を部分的又は完全に阻害する分子のことを意味する。本明細書で用いるとき、TLR3抗体アンタゴニスト又はTLR3反応性の抗体とは、TLR3の生物活性又はTLR3受容体の活性化を直接的又は間接的に実質上相殺、低減、又は阻害する能力を有する抗体のことを言う。例えば、TLR3反応性を有する抗体は、TLR3に直接結合してTLR3の活性を中和することによって、すなわちTLR3のシグナル伝達を遮断することによって、サイトカイン及びケモカインの放出、又はNF-kBの活性化を低減させることができる。用語抗体は、本明細書において広義に用いられ、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト適合化、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、並びに抗体フラグメントを含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。完全な抗体とは、2個の同じ軽鎖と2個の同じ重鎖とからなるヘテロ4量体の糖タンパク質である。通常、それぞれの軽鎖は1個の共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのアイソタイプが異なる重鎖の間で異なる。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は、一方の末端で可変ドメイン可変領域VHを有し、続いて多数の定常性のドメイン定常領域を有する。それぞれの軽鎖は一端に可変領域VLを有し、もう一方の端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第1の定常領域と整列し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列している。あらゆる脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパκ及びラムダλの2つの明確に異なるタイプのうちの1つに分類することができる。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列をもとに、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMの5つの大きなクラスに分類することができる。IgA及びIgGは、イソ型のIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4へと更に細かく分類される。抗体フラグメントなる用語は、完全な抗体の部分、通常は完全な抗体の抗原結合領域又は可変領域を意味する。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab’、Fab’2、Fvフラグメント、ジアボディ、単鎖抗体分子、及び少なくとも2つの損なわれていない抗体から形成された多特異的抗体が挙げられる。免疫グロブリンの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、3つの抗原結合部位を取り囲むフレームワーク領域からなる。抗原結合部位は、様々な用語を次のように使用して定義される:i用語相補性決定領域CDRは配列可変性に基づくWu及びKabat、J.Exp.Med.132:211~250、1970。一般に、抗原結合部位は、6つのCDR、即ちVHに3つHCDR1、HCDR2、HCDR3、及びVLに3つLCDR1、LCDR2、LCDR3を有するKabatら、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、5thEd.PublicHealthService、NationalInstitutesofHealth、Bethesda,Md.、1991。ii用語超可変領域、HVR又はHVとは、Chothia及びLeskにより定義されるように、構造が超可変である抗体可変ドメインの領域を指すChothia及びLesk、Mol.Biol.196:901~917、1987。一般に抗原結合部位は、VH内に3つH1、H2、H3及びVL内に3つL1、L2、L3の6つの超可変領域を有している。Chothia及びLeskは、構造的に保持されているHVをカノニカル構造と呼ぶ。iiiLefrancLefrancら、Dev.Comparat.Immunol.27:55~77、2003により提案されるIMGT-CDRは、免疫グロブリン及びT細胞受容体からのV領域の比較を基にしている。InternationalImMunoGeneTicsIMGTデータベースhttp://www_imgt_orgは、これらの領域の標準化された番号及び定義を提供している。CDR、HV及びIMGTの記述間の対応については、Lefrancら、Dev.Comparat.Immunol.27:55~77、2003に記載されている。iv抗原結合部位は、SpecificityDeterminingResidueUsageSDRUAlmagro、Mol.Recognit.17:132~143、2004を基にして説明することもでき、特異性決定残基SDRとは、抗原接触に直接関与する、免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。SDRUは、抗原-抗体複合体についての結晶構造解析により定義される、異なるタイプの抗原に対するSDRの数及び分布の精密な尺度である。v抗原結合部位を、抗原抗体複合体の結晶構造から同定される抗体パラトープ残基とも定義することもできる。用語複合配列は、本明細書で使用するとき、Kabat、Chothia又はIMGTによって個別に表記されるすべてのアミノ酸残基又は他の任意の好適な抗原結合領域の表記を含むものとして定義される抗原結合部位を意味する。本明細書で使用するとき、Chothia残基は、Al-Lazikaniら、J.Mol.Biol.273:927~48、1997に従って番号付けされた抗体VL残基及びVH残基である。連続的ポリペプチド番号付けに関して最も使用されている2つの番号付けシステム、KabatKabatら、SequencesofImmunologicalInterest、5thEd.PublicHealthService、NIH、Bethesda、MD、1991及びChothiaChothia及びLesk、Mol.Biol.196:901~17、1987間の対応が、本発明の例示的抗体に関する図31に示される。フレームワーク又はフレームワーク配列は、可変領域において、抗原結合部位として定義されている配列以外の配列である。フレームワークは、通常、それぞれの可変領域において、3つの抗原結合部位のための骨格を生成する、4つの領域、FR1、FR2、FR3、及びFR3に分割される。抗原結合部位は上記に述べたような様々な用語によって定義され得るため、フレームワークの正確なアミノ酸配列は抗原結合部位がどのように定義されるかによって決まる。軽鎖可変領域カッパー1Vκ1フレームワーク又はVκ1は、本発明で使用するとき、ヒトVκ1機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされている、アミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトVκ1遺伝子は、IGKV1-501、IGKV1-601、IGKV1-801、IGKV1-901、IGKV1-1201、IGKV1-1302、IGKV1-1601、IGKV1-1701、IGKV1-2701、IGKV1-3301、IGKV1-3701、IGKV1-3901、IGKV1D-801、IGKV1D-1201、IGKV1D-1301、IGKV1D-1601、IGKV1D-1701、IGKV1D-3301、IGKV1D-3701、IGKV1D-3901、IGKV1D-4201、又はIGKV1D-4301である。免疫グロブリン遺伝子の命名法は周知されたものである。軽鎖可変領域ラムダ3Vλ3フレームワーク又はVλ3は、本明細書で使用するとき、ヒトVλ3機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトVλ3遺伝子は、IGLV3-101、IGLV3-901、IGLV3-1001、IGLV3-1201、IGLV3-1601、IGLV3-1901、IGLV3-2101、IGLV3-2201、IGLV3-2501、IGLV3-2701、及びIGLV3-3201である。重鎖可変領域Vh5フレームワーク又はVh5は、本明細書で使用するとき、Vh5機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトVh5遺伝子は、IGHV5-5101及びIGHV5-101である。重鎖可変領域Vh6フレームワーク又はVh6は、本明細書で使用するとき、Vh6機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトVh6遺伝子はIGHV6-101である。軽鎖カッパーJ領域Jκフレームワーク又はJκは、本明細書で使用するとき、ヒトJκ機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトVκ遺伝子は、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4、及びIGKJ5である。軽鎖ラムダJ領域Jλフレームワーク又はJλは、本明細書で使用するとき、ヒトJλ機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトJλ遺伝子は、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6、及びIGLJ7である。重鎖J領域Jhフレームワーク又はJhは、本明細書で使用するとき、ヒトJh機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトJh遺伝子は、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、及びIGHJ6である。生殖細胞系列遺伝子又は抗体生殖細胞系列遺伝子は、本明細書で使用するとき、特定の免疫グロブリンの発現のための遺伝的再配列及び変異につながる成熟プロセスを経ていない非リンパ細胞によってコードされる免疫グロブリン配列である。本明細書で用いられるとき、スカフォールドは、ヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされる軽鎖又は重鎖の可変領域のアミノ酸配列を指す。したがって、スカフォールドは、フレームワークと抗原結合部位の両方を包含する。本明細書で使用される用語抗原は、直接又は間接に抗体を生成する能力を有する任意の分子を意味する。抗原の定義内には、タンパク質エンコーディング核酸が含まれる。用語ホモログは、参照配列との配列同一性が40~100であるタンパク質配列を意味する。ヒトTLR3のホモログには、既知のヒトTLR3配列との配列同一性が40~100であるような他種由来のポリペプチドが含まれる。2つのペプチド鎖の配列の同一性は、VectorNTIバージョン9.0.0Invitrogen,Carlsbad,CAのAlignXモジュールのデフォルト設定を使用して、配列をペアでアライメントすることによって決定することができる。TLR3とは、ヒトTLR3huTLR3及びその同族体を意味する。完全長huTLR3のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1及び配列番号2で示されている。huTLR3の細胞外ドメインECDのヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号3及び配列番号4に示す。実質的に同一のは、本明細書で使用するとき、比較される2つの抗体又は抗体フラグメントのアミノ酸配列が同一であるか、又は実体のない差異を有するということを意味する。抗体又は抗体フラグメントのアミノ酸配列における1、2、3、4、5又は6個のアミノ酸の置換が、実体のない差異として挙げられる。本明細書で開示する配列とほぼ同じアミノ酸配列も本願の一部である。特定の実施形態では、配列の同一性は、約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又はそれよりも高い。同一性は、上記に述べたようにして決定することができる。比較するペプチド鎖の例としては、重鎖又は軽鎖の可変領域がある。用語~と組み合わせては、本明細書で使用するとき、記述の対象である薬剤が、他の薬剤と共に、混合物として一緒に、又は単独薬剤として同時に、又は単独薬剤として順次に任意の順序で、動物に投与され得ることを意味する。用語炎症性状態は、本明細書で使用するとき、ほとんどの場合、痛み、発赤、腫れ、及び組織機能の喪失を特徴とし、サイトカイン、ケモカイン、又は炎症性細胞例えば、好中球、単球、リンパ球、マクロファージの活性によりある程度介在される、細胞損傷に対する局所化された応答を意味する。用語炎症性の肺状態は、本明細書で使用するとき、肺を冒す又は肺と関連する炎症状態を意味する。本明細書で用いるモノクローナル抗体mAbとは、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体又は抗体フラグメントを意味する。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、通常、単一の抗原決定基に対して作製される。モノクローナルという修飾語は、抗体のほぼ均質な性質を指して言うものであり、抗体がいずれかの特定の方法によって作製される必要はない。例えば、マウスmAbは、Kohlerら、Nature256:495~497,1975のハイブリドーマ法によって製造することができる。ドナー抗体通常はマウス由来の軽鎖及び重鎖の可変領域を、アクセプター抗体通常、例えばヒトなどの別の哺乳動物種由来の軽鎖及び重鎖の定常領域とともに含むキメラmAbを、米国特許第4,816,567号に開示される方法によって作製することができる。ヒト以外のドナー由来の免疫グロブリン通常はマウスから誘導されたCDRと、1以上のヒト免疫グロブリンから誘導された、抗体分子のその他の免疫グロブリン領域とを有するヒト化mAbを、米国特許第5,225,539号に開示されるような当業者には周知の方法によって調製することができる。ヒト化に有用なヒトフレームワーク配列は当業者であれば関連するデータベースから選別することができる。場合により、Queenら、Proc.Natl.Natl.Acad.Sci.USA、86:10029~10032、1989及びHodgsonら、Bio/Technology、9:421、1991に開示されるもののような方法によって、結合親和性を維持するために、変化させたフレームワーク支持残基を組み込むことによってヒト適合化mAbを更に改変することができる。ヒト以外の配列を全く有さない完全なヒトmAbは、例えば、Lonbergら、Nature368:856~859,1994、Fishwildら、NatureBiotechnology14:845~851,1996、及びMendezら、NatureGenetics15:146~156,1997に参照される方法により、ヒト免疫グロブリンのトランスジェニックマウスから調製することができる。ヒトmAbは、また、ファージディスプレイライブラリを元に、例えば、Knappikら、J.Mol.Biol.296:57~86、2000;及びKrebsら、J.Immunol.Meth.254:67~842001に参照される技法によって調製及び最適化することができる。抗体断片、例えばFab、Fab’2、Fd、及びdAb断片を、抗体の切断又は遺伝子組み換え操作により生成してもよい。例えば、ペプシンなどの酵素により抗体を処理することで、Fab及びFab’2断片を生成することもできる。用語エピトープは、本明細書で使用するとき、抗体が特異的に結合する抗原の部分を意味する。エピトープは通常、アミノ酸及び多糖類側鎖のような化学的に活性な極性、非極性又は疎水性部分の表面における集団からなり、特定の3次元構造特性及び特定の帯電特性を有しうる。エピトープは直線状のものであってもよく、あるいはアミノ酸の直線状の配列によってではなく、抗原の連続していないアミノ酸間の空間的な関係によって形成される不連続エピトープ例えば、立体構造エピトープであってもよい。立体構造エピトープには、抗原の直線状配列の異なる部分のアミノ酸同士が3次元空間で近接するような抗原の折り畳みによって生じるエピトープが含まれる。用語パラトープは、本明細書で使用するとき、抗原が特異的に結合する抗体の一部を指す。パラトープは元来線状であるか、又は不連続であることができ、抗体のアミノ酸の線状構造よりも、隣接していないアミノ酸間の空間的な関係により形成される。軽鎖パラトープ及び重鎖パラトープ又は軽鎖パラトープアミノ酸残基及び重鎖パラトープアミノ酸残基は、それぞれ、抗原と接触する抗体の軽鎖及び重鎖残基を指す。用語特異的結合は、本明細書で使用するとき、抗体が特定の抗原と、他の抗原又はタンパク質に対するよりも高い親和性で結合することを指す。通常、抗体の結合における解離定数KDは107M以下であり、抗体が特定の抗原と結合する際のKDは、特定の抗原以外の非特異的抗原例えば、BSA、カゼイン、又は他の任意の特定のポリペプチドと結合する際のKDと比較して1/2以下である。本明細書では、抗原を認識する抗体及び抗原に特異的な抗体という語句を、抗原と特異的に結合する抗体又は抗原特異的抗体、例えばTLR3特異的抗体という用語と互換可能に用いる。解離定数は後述するような標準的な方法を用いて測定することができる。用語TLR3の生物活性又はTLR3の活性化は、本明細書で使用するとき、リガンドとTLR3との結合によって生ずる任意の活性を指す。TLR3のリガンドには、2本鎖DNA、ポリイノシンポリシチジン酸ポリI:C、及び例えば、壊死細胞から放出される内因性mRNAなどの内因性mRNAが含まれる。TLR3の活性化の一例では、TLR3のリガンドに応じてNF-kBが活性化される。レポーター遺伝子アッセイを用いることで、ポリI:Cによる受容体の誘導に基づき、NF-kBの活性化をアッセイすることができるAlexopoulosら、Nature413:732~738,2001;Hackerら、EMBOJ.18:6973~6982、1999。他の代表的なTLR3受容体の活性化は、TLR3リガンドに対する応答として、インターフェロン応答因子IRF-3、IRF-7の活性化をもたらす。TLR3によって媒介されるIRFの活性化は、インターフェロン刺激応答配列ISREによって制御されるレポーター遺伝子を用いてアッセイすることができる。別のTLR3の活性化の例では、例えばTNF-α、IL-6、IL-8、IL-12、CXCL5/IP-10及びRANTESなどの炎症性サイトカイン及びケモカインが分泌される。細胞、組織からの、又は循環中へのサイトカイン及びケモカインの放出は、ELISA免疫アッセイなどのよく知られた免疫アッセイによって測定することができる。本明細書では、以下の通りの一般的なアミノ酸1文字表記及び3文字表記を用いる。物質の組成本発明はTLR3の生物学的活性を阻害することが可能な抗体アンタゴニスト及びこうした抗体の使用法を提供する。こうしたTLR3アンタゴニストは、TLR3に結合してTLR3の活性化を阻害する性質を有しうる。こうした抗体によってTLR3活性が阻害されうる機序の例としては、TLR3へのリガンドの結合のインビトロ、インビボ、若しくはインサイチューでの阻害、受容体の2量化の阻害、エンドソーム区画へのTLR3の局在化の阻害、下流のシグナル伝達経路のキナーゼ活性の阻害、又はTLR3のmRNAの転写の阻害が挙げられる。他の機序によってTLR3の活性を阻害することが可能な他の抗体アンタゴニストもまた、本発明の異なる態様及び実施形態の範囲に含まれるものである。これらのアンタゴニストは、研究用試薬、診断用試薬及び治療薬として有用である。抗体の多様性は、自然の系では、可変領域をコードする多数の生殖細胞系列遺伝子の使用及びさまざまな体細胞イベントにより作り出される。体細胞イベントとしては、完全なVH領域を作るための多様性D及び接合J遺伝子セグメントを持つ可変遺伝子セグメントの組換え、並びに完全なVL領域を作るための可変及び接合遺伝子セグメントの組換えがある。組み換えプロセスそれ自体は不正確であり、VDJ接合部におけるアミノ酸の喪失又は追加を生じる可能性がある。多様性のこれらの機序は、抗原暴露に先立つB細胞の発生時に起こる。抗原刺激の後、B細胞中で発現された抗体遺伝子は、体細胞変異を受ける。生殖細胞系列遺伝子セグメント、これらのセグメントのランダムな組み換え、及びランダムなVH-VLの対形成の見積り数に基づいて,1.6×107までの異なる抗体が生成可能であるFundamentalImmunology,第3版1993Paul編、RavenPress,NewYork,N.Y.。抗体多様性に寄与する他のプロセス体細胞変異などのを考慮に入れた場合、1010以上の異なる抗体が生成可能であると考えられるImmunoglobulinGenes、第2版1995Jonioら、編、AcademicPress、SanDiego、Calif.。多数のプロセスが抗体多様性の生成において関与するために、同一の抗原特異性を有する独立に由来したモノクローナル抗体が同一のアミノ酸配列を有するということは極めてあり得ないことである。本発明は、新規の抗原結合部位及びヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに由来する免疫グロブリン鎖を提供する。抗原結合部位を担持させるための構造は一般に抗体の重鎖又は軽鎖若しくはそれらの部分であり、抗原結合部位は上記に述べたようにして調べた天然の抗原結合部位に配置される。本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、TLR3反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は表1aに示されるような重鎖の相補性決定領域CDRのアミノ酸配列1、2及び3HCDR1、HCDR2及びHCDR3、及び軽鎖の相補性決定領域CDRのアミノ酸配列1、2及び3LCDR1、LCDR2及びLCDR3を有している。15IMGTにより規定されるCDR15コンセンサスとして規定されるCDR特定の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、TLR3反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号192に示されるようなHCDR2のアミノ酸配列を有し、配列番号192のHCDR2は式Iに示されるように定義される。Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-R-S-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S、I式中、Xaa6は、Arg又はLysであってよく、Xaa7は、Tyr、His又はSerであってよく、Xaa8は、Met、Arg又はTyrであってよく、Xaa9は、Lys又はArgであってよい。他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、TLR3反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号194に示されるようなHCDR2のアミノ酸配列を有し、配列番号194のHCDR2は式IIIに示されるように定義される。I-I-Q-Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S、III式中、Xaa15は、Lys、Thr又はIleであってよく、Xaa16は、Asn又はAspであってよく、Xaa17は、Val又はLeuであってよい。他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、TLR3反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号196に示されるようなHCDR2のアミノ酸配列を有し、配列番号196のHCDR2は式Vに示されるように定義される。Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G、V式中、Xaa24は、Phe又はArgであってよく、Xaa25は、Ala又はSerであってよい。他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、TLR3反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号191に示されるようなLCDR3のアミノ酸配列を有し、配列番号191のLCDR3は式IIに示されるように定義される。Xaa1-S-Y-D-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-T-V、II式中、Xaa1は、Ala、Gln、Gly又はSerであってよく、Xaa2は、Gly、Glu又はSerであってよく、Xaa3は、Asp又はAsnであってよく、Xaa4は、Glu又はSerであってよく、Xaa5は、Phe、Ala又はLeuであってよい。他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、TLR3反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号193に示されるようなLCDR3のアミノ酸配列を有し、配列番号193のLCDR3は式IVに示されるように定義される。Xaa10-S-Y-D-Xaa11-P-Xaa12-Xaa13-Xaa14-V、IV式中、Xaa10は、Gln又はSerであってよく、Xaa11は、Thr、Glu又はAspであってよく、Xaa12は、Val又はAsnであってよく、Xaa13は、Tyr又はPheであってよく、Xaa14は、Ser、Asn又はGlnであってよい。他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、TLR3反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号195に示されるようなLCDR3のアミノ酸配列を有し、配列番号195のLCDR3は式VIに示されるように定義される。Q-Q-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-T、VI式中、Xaa18は、Tyr、Gly又はAlaであってよく、Xaa19は、Gly、Glu又はAsnであってよく、Xaa20は、Ser又はThrであってよく、Xaa21は、Val、Ile又はLeuであってよく、Xaa22は、Ser又はLeuであってよく、Xaa23は、Ile、Ser、Pro又はTyrであってよい。本発明は、また、表1aに示されるような重鎖の相補性決定領域CDRのアミノ酸配列1、2及び3HCDR1、HCDR2及びHCDR3及び軽鎖の相補性決定領域CDRのアミノ酸配列1、2及び3LCDR1、LCDR2及びLCDR3を有する、TLR3反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントも提供するものである。抗原結合部位のアミノ酸配列が表1aのもの配列番号49~121及び191~196と大きく異ならない抗体は本発明の範囲に含まれるものである。一般に、これには1以上のアミノ酸残基を、同様の電荷、疎水性又は立体化学的特性を有するアミノ酸によって置換することが含まれる。抗原結合部位ではなく、フレームワーク領域における更なる置換も、これらの置換が抗体の性質に悪影響を及ぼさない限りは行うことができる。置換は、例えば安定性又は親和性といった抗体の特性を向上させるために行うことができる。1、2、3、4、5又は6個の置換を抗原結合部位に行うことができる。得られる抗体が所望の特性を保持するならば、フレームワーク残基の1、2、3、4、5、10、15、20、25、又は30を置換することができる。保存的な改変では、こうした改変が行われた分子と同様の機能的及び化学的性質を有する分子が生ずる。分子の機能的及び/又は化学的特性における大幅な改変は、1置換領域における分子骨格の構造を例えばシート又はヘリックス立体構造として維持する、2標的部位における分子の電荷又は疎水性を維持する、又は3分子のサイズを維持する効果において大きく異なるアミノ酸配列中の置換を選択することによって実現することができる。例えば、保存的アミノ酸置換では、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんどあるいはまったく影響しないように天然アミノ酸残基を非天然残基と置換することができる。更に、アラニンスキャニング変異導入法についてこれまでに述べられているように、ポリペプチド内の任意の内因性の残基をアラニンで置換することもできるMacLennanら、ActaPhysiol.Scand.Suppl.643:55~67、1998;Sasakiら、Adv.Biophys.35:1~24、1998。当業者であれば、所望のアミノ酸置換保存的又は非保存的であるかによらずを、かかる置換が望ましい時点で決定することができる。例えば、アミノ酸置換を用いることによってその分子の配列の重要な残基を特定したり、又は本明細書で述べる分子の親和性を増大若しくは減少させることができる。アミノ酸置換の例を表1bに示す。特定の実施形態においては、保存的アミノ酸置換には、生物学的システムによって合成されるのではなく、一般的に化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然のアミノ酸残基も含まれる。アミノ酸置換は、例えば、PCR変異誘発米国特許第4,683,195号によって行うことができる。変異型のライブラリーは、周知の方法を使用して、例えば、無作為NNK又は非無作為コドン、例えば、11のアミノ酸ACDEGKNRSYWをコード化するDVKコドンを使用し、実施例1に示されるように、所望の特性で変異型のライブラリーをスクリーニングして生成することができる。表1cは、抗体特性を改善するために、LCDR3及びHCDR2領域内の3つの親TLR3抗体アンタゴニストに対して行われた置換を示す。抗原結合部位の表記に応じて、本発明の抗体の抗原結合部位、次いでフレームワーク残基は、各重鎖及び軽鎖ごとに若干異なりうる。表2a及び2bは、Kabat、Chothia及びIMGTに基づいて表記された本発明の例示的抗体の抗原結合部位の残基及びそれらの複合配列を示したものである。他の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、TLR3反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は重鎖可変領域VH及び軽鎖可変領域VLのアミノ酸配列を有するとともに表3aに示されるようなそれぞれの単離された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を提供する。F17、F18及びF19は、それぞれ、ファミリー17、18及び19のコンセンサスなアミノ酸配列を有する抗体の変異体を表す実施例1を参照。実施例で説明する実施形態は、1つは重鎖に由来し、1つは軽鎖に由来する1対の可変領域を有しているが、当業者であれば代替的な実施形態は、重鎖又は軽鎖の可変領域を単独で有してもよいということを認識するであろう。単一の可変領域を用いることで、例えば、TLR3に結合することが可能な2ドメイン特異的抗原結合フラグメントを形成することが可能な第2の可変ドメインについてスクリーニングを行うことができる。スクリーニングは、例えば、国際特許公開第92/01047号に開示される階層的2重コンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレイスクリーニング法によって実現することが可能である。このアプローチでは、H鎖又はL鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて、他方の鎖L又はHをコードするクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた2鎖特異的抗原結合ドメインを上記に述べたようなファージディスプレイ法に基づいて選別する。他の実施形態では、本発明は、表3aに示されるような可変領域のアミノ酸配列と少なくとも95同一のアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有し、TLR3反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供する。別の態様では、本発明は、表3bに示されるような特定の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有する単離された抗体を提供する。本発明の別の態様は、本発明の抗体又はその補体のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドである。ある種のポリヌクレオチドの例が本明細書に開示されるが、遺伝コードの縮重又は所定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。抗体アンタゴニストの例としては、IgG、IgD、IgG、IgA又はIgMアイソタイプの抗体が挙げられる。更にこうした抗体アンタゴニストは、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又は、ポリエチレングリコール部分の付加ペギレーション及び脂質化など非天然の共有結合修飾などの反応によって翻訳後修飾されてもよい。このような修飾は、生体内あるいは生体外で行われてもよい。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールと複合PEG化することによって薬物動態特性を向上させることができる。複合は当業者に既知の方法によって行うことができる。治療用抗体をPEGと複合させると、機能は低下せずに薬物動態が向上されることが示されている。Deckertら、Int.J.Cancer87:382~390、2000;Knightら、Platelets15:409~418、2004;Leongら、Cytokine16:106~119、2001;Yangら、ProteinEng.16:761~770、2003。本発明の抗体の薬物動態的性質は、当業者には周知の方法により、Fc修飾によって向上させることも可能である。例えば、IgG4アイソタイプの重鎖は、ヒンジ領域に重鎖間又は重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なCys-Pro-Ser-CysCPSCというモチーフを含んでいる。すなわち、CPSCモチーフ内の2個のCys残基が他の重鎖の対応するCys残基とジスルフィド結合する重鎖間か、あるいは特定のCPSCモチーフ内の2個のCys残基が互いにジスルフィド結合しうる重鎖内。生体内のイソメラーゼ酵素は、IgG4分子の重鎖間結合を重鎖内結合に変換し、またその逆反応を行うことが可能であると考えられているAalberse及びSchuurman、Immunology105:9~19,2002。したがって、ヒンジ領域に重鎖内結合を有するこうしたIgG4分子内の重鎖:軽鎖H:Lの各ペアは互いに共有結合していないことからH:Lモノマーに解離し、更に他のIgG4分子に由来するH:Lモノマーと再会合して、2重特異的なヘテロダイマーのIgG4分子を形成する。2重特異的なIgG抗体では、抗体分子の2個のFabはそれらが結合するエピトープが異なる。IgG4のヒンジ領域のCPSCモチーフのSer残基をProで置換することによってIgG1様挙動が生じる。すなわち、これらの分子は重鎖同士の間に安定したジスルフィド結合を形成するために他のIgG4分子とのH:L交換が起きない。一実施形態では、本発明の抗体はCPSCモチーフ内にS→Pの突然変異を有するIgG4のFcドメインを有する。CPSCモチーフの位置は典型的に、成熟した重鎖の残基228に見出されるが、CDRの長さに応じて変化し得る。更に、本発明の抗体のFcRnサルベージ受容体以外のFc受容体への結合に影響する部位を除去することもできる。例えば、ADCC活性に関与するFc受容体結合領域を本発明の抗体において除去することができる。例えば、IgG1のヒンジ領域のLeu234/Leu235のL234A/L235Aへの突然変異、又はIgG4のヒンジ領域のPhe235/Leu236のP235A/L236Aへの突然変異によって、FcR結合が最小となり、補体依存性細胞毒性及びADCCを媒介する免疫グロブリンの能力が低減する。一実施形態では、本発明の抗体は、P235A/L236A変異を有するIgG4のFcドメインを有する。上記で特定したこれらの残基の位置は成熟した重鎖においては典型的なものであるが、CDRの長さに応じて変化しうる。P235A/L236A変異を有する抗体の例としては、配列番号218、219又は220に示される重鎖アミノ酸配列を有する抗体が挙げられる。完全なヒト、ヒト適合化、ヒト化、及び親和性成熟抗体分子又は抗体フラグメントは、融合タンパク質及びキメラタンパク質と同様、本発明の範囲に含まれる。抗原に対する抗体親和性は、ランダム又は部位特異的な突然変異誘発などの周知の方法を用いた合理的設計又はランダムな親和性成熟によるか、あるいはファージディスプレイライブラリを用いることによって高めることができる。例えば、大部分がフレームワーク領域中に存在するバーニア残基又は親和性決定残基、ADRに対して置換を行うことで、抗体の親和性を調整することができる米国特許第6,639,055号、国際特許公開第10/045340号。安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又はタンパク質の所望の生物学的若しくは生物物理学的性質を高めるように改変された完全なヒト、ヒト適合化、ヒト化、親和性成熟抗体分子又は抗体フラグメントは本発明の範囲に含まれる。抗体の安定性は、1内在的な安定性に影響する個々のドメインのコアパッキング、2重鎖と軽鎖とのペアリングに影響するタンパク質/タンパク質の界面相互作用、3極性及び荷電残基の埋め込み、4極性及び荷電残基の水素結合ネットワーク、及び5分子内及び分子間力の中でも特に表面電荷及び極性残基の分布、などの多くの要因によって影響されるWornら、J.Mol.Biol.、305:989~1010、2001。残基を不安定化させる可能性のある構造は、抗体の結晶構造に基づいて、あるいは場合によっては分子モデリングによって識別することが可能であり、抗体の安定性に対するこれらの残基の影響を、識別された残基中で変異を有する変異体を生成及び評価することにより試験することができる。抗体の安定性を高める方法の1つは、示差走査熱量測定法DSCによって測定される熱転移中点Tmを高くすることである。一般に、タンパク質のTmはその安定性との相関を示し、溶液中でのアンフォールディング及び変性のしやすさ、並びにそのタンパク質のアンフォールドのしやすさに依存する分解プロセスと負の相関を示すRemmeleら、Biopharm.,13:36~46,2000。数多くの研究により、DSCにより熱安定性として測定される製剤の物理的安定性の順位付けと他の方法により測定される物理的安定性との間に相互関係があることがわかったGuptaら、AAPSPharmSci.5E8、2003;Zhangら、J.Pharm.Sci.93:3076~3089、2004;Maaら、Int.J.Pharm.、140:155~168、1996;Bedu-Addoら、Pharm.Res.、21:1353~1361、2004;Remmeleら、Pharm.Res.、15:200~208、1997。これらの配合物の研究は、FabのTmが対応するmAbの長期の物理的安定性と密接な関係があることを示唆している。フレームワーク中又は抗原結合部位内のアミノ酸の差は、Fabドメインの熱安定性に著しい影響を及ぼす可能性があるYasuiら、FEBSLett.353:143~146、1994。本発明の抗体アンタゴニストは、約107、108、109、1010、1011又は1012M以下のKdでTLR3と結合することができる。抗体などの特定の分子のTLR3に対する親和性は、任意の適当な方法によって実験的に求めることができる。このような方法は、当業者に既知のBiacore又はKinExA装置、ELISA又は競合的結合アッセイを利用し得る。特定のTLR3ホモログと所望の親和性で結合する抗体アンタゴニストは、抗体親和性成熟などの方法によって変異体又はフラグメントのライブラリから選択することができる。抗体アンタゴニストは、任意の適当な方法を用いてTLR3の生物学的活性の阻害に基づいて同定することができる。かかる方法では、周知の方法を使用した、本出願に記載されるようなレポーター遺伝子アッセイ又はサイトカイン産生を測定するアッセイを利用し得る。本発明の別の実施形態は、少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってよい。本発明の別の実施形態は、配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215又は216に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域、又は配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210、211又は225に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを有するホスト細胞である。本発明の別の実施形態は、配列番号102、130、131、132、133、134、135、160、204、206、208、220、166又は168に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域、又は配列番号155、156、157、158、203、205、207、165、167又は227に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するホスト細胞である。このような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってよい。真核細胞の例としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものが挙げられる。哺乳動物真核細胞としては、SP2/0AmericanTypeCultureCollectionATCC,Manassas,VA,CRL-1581、NS0ECACCEuropeanCollectionofCellCultures,Salisbury,Wiltshire,UK,ECACCNo.85110503、FOATCCCRL-1646及びAg653ATCCCRL-1580マウス細胞株などのハイブリドーマ又はミエローマなどの不死化細胞株が挙げられる。ヒトミエローマ細胞株の一例としては、U266ATTCCRL-TIB-196が挙げられる。他の有用な細胞株としては、CHO-K1SVLonzaBiologics,Walkersville,MD、CHO-K1ATCCCRL-61、又はDG44などの、チャイニーズハムスターの卵巣CHO細胞に由来するものが挙げられる。本発明の別の実施形態は、本発明のホスト細胞を培養することと、前記ホスト細胞によって産生された抗体を回収することとを含む、TLR3と反応性を有する抗体の製造方法である。抗体を製造して精製する方法は、当該技術分野で周知である。本発明の別の実施形態は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。本発明の別の実施形態は、toll様受容体3TLR3の、配列番号2のアミノ酸残基;K416、K418、L440、N441、E442、Y465、N466、K467、Y468、R488、R489、A491、K493、N515、N516、N517、H539、N541、S571、L595、及びK619に結合する、単離された抗体又はそのフラグメントである。別の実施形態は、toll様受容体3TLR3の、配列番号2のアミノ酸残基;S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、T166、Q167、V168、S188、E189、D192、A195、及びA219に結合する、単離された抗体又はそのフラグメントである。幾つかの周知の方法を用いて本発明の抗体の結合エピトープを決定することができる。例えば、両方の個別の構成成分の構造が知られている場合、インシリコでタンパク質-タンパク質のドッキングを行って、適合する相互作用部位を特定することができる。抗原抗体複合体において水素-重水素H/D交換を行うことによって抗体が結合しうる抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点突然変異誘発を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。TLR3のような大きなタンパク質では、最初にドッキング、セグメント突然変異誘発、又はH/D交換などによって結合部位の位置をそのタンパク質の特定の領域に限定することで点突然変異誘発によるマッピングが単純化される。両方の個別の要素の構造が分かっている場合、インシリコでタンパク質-タンパク質のドッキングを行って適合する相互作用の部位を同定することができる。抗体-抗原複合体の共結晶構造を使用して、エピトープ及びパラトープに寄与する残基を同定することができる。本発明の別の実施形態は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、重鎖可変領域のChothia残基;W33、F50、D52、D54、Y56、N58、P61、E95、Y97、Y100及びD100b、並びに軽鎖可変領域のChothia残基;Q27、Y32、N92、T93、L94及びS95により、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するTLR3に結合することを特徴とする。重鎖パラトープ及び軽鎖パラトープChothia残基は、重鎖残基の配列番号216のW33、F50、D52、D55、Y57、N59、P62、E99、Y101、Y104及びD106並びに軽鎖残基の配列番号41のQ27、Y32、N92、T93、L94及びS95に対応する。本発明の別の実施形態は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、重鎖可変領域のChothia残基;N31a、Q52、R52b、S53、K54、Y56、Y97、P98、F99及びY100、並びに軽鎖可変領域のChothia残基;G29、S30、Y31、Y32、E50、D51、Y91、D92及びD93により、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するTLR3に結合することを特徴とする。重鎖パラトープ及び軽鎖パラトープChothia残基は、重鎖残基の配列番号214のN32、Q54、R56、S57、K58、Y60、Y104、P105、F106及びY107並びに軽鎖残基の配列番号211のG28、S29、Y30、Y31、E49、D50、Y90、D91及びD92に対応する。例えば、パラトープ残基を好適な骨格にグラフトし、作製した骨格を完全な抗体に組立て、得られた抗体を発現させ、及びTLR3への結合又はTLR3の生物活性に及ぼす影響について抗体を試験することにより、TLR3を結合する特定のパラトープ残基を有する単離された抗体を作製することができる。代表的な骨格は、ヒト生殖細胞系列遺伝子によりコードされたヒト抗体可変領域のアミノ酸配列である。例えば、全体配列同一性、パラトープ残基間の同一性、又は骨格及びmAb15EVQ又はmAb12QVQ/QSVなどの代表的な抗体との間の正準構造クラス同一性に基づいて、骨格を選択することができる。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子は、例えば、Tomlinsonら、J.Mol.Biol227:776~798,並びにInternationalImMunoGeneTicsIMGTデータベースhttp_://_www_imgt_orgに開示されている。例えば、米国特許第6,300,064号で述べられているように、コンセンサスなヒトフレームワーク領域も使用することができる。好適な骨格の選択は、例えば、国際特許公開第10/045340号に述べられている方法に従って行うことができる。パラトープ残基をグラフトする骨格として使用可能な代表的なヒト生殖細胞系列遺伝子は、Vκ1、Vλ3、Vh5、Vh6、Jκ、Jλ、及びJhフレームワークによりコードされた遺伝子である。この生殖細胞系列J領域は、FR4配列を選択するために、その全体又は一部を使用される。例えば、mAb15EVQ軽鎖パラトープ残基を、IGκJ1によりコードされたJ領域配列に直接連結されている、IGKV1-3901によりコードされたVκ1フレームワークにグラフトすることができる。他のVκ1遺伝子由来の配列を使用することもでき、IGκJ1の代わりに、他のJκ遺伝子のFR4配列を置換することもできる。mAb15EVQ重鎖パラトープ残基と、続いて、HCDR3及びIGHJ1によりコードされたFR4配列を構成する約11~13個の残基、例えば、12個の残基を、IGHV5-5101によりコードされたVh5フレームワークにグラフトすることができる。11~13個の残基は、FR3領域CARの終端とFR4領域大部分のJH領域に対するWGQの初端の間に懸り、mAb15EVQVh由来の4個の規定されたパラトープ残基を含む。他のVh5遺伝子由来の配列を使用することもでき、IGJH1の代わりに他のJh遺伝子のFR4配列を置換することもできる。別の例では、mAb12QVQ/QSV軽鎖パラトープ残基を、IGJL2によりコードされたJ領域配列に直接連結したIGLV3-101によりコードされたVλ3フレームワークにグラフトすることができる。他のVλ3及びJλ遺伝子の配列を使用することもできる。LCDR3の長さは、約9~11個の残基、例えば、10個の残基で維持される。これらの約9~11個の残基は、FR3領域大部分のVラムダ骨格に対するYYCの終端とFR4領域大部分のJL領域に対するFGGの初端との間に懸り、mAb12QVQ/QSV由来の3個の規定されたパラトープ残基を含む。mAb12QVQ/QSV重鎖パラトープ残基と、続いてHCDR3及びIGJH1によりコードされたFR4配列を構成する約9~11個の残基、例えば、10個の残基を、IGHV6-101によりコードされたVh6フレームワークにグラフトすることができる。これらの約9~11個の残基は、FR3領域CARの終端とFR4領域大部分のJH領域に対するWGQの初端との間に懸り、mAb12QVQ/QSVVhからの4個の規定されたパラトープ残基を含む。IGHJ1の代わりに他のJh遺伝子のFR4配列を置換することもできる。TLR3への結合及び得られた抗体の生物活性を、標準的な方法を用いて評価することができる。mAb15EVQ及びmAb12QVQ/QSV軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と、代表的なVκ1、Vh5、Vλ3、Vh6、Jκ、Jλ又はJh遺伝子とのアライメントを、図32~35に示す。ラトープをグラフトした、作製された抗体を、バーニア残基又は親和性決定残基の置換により更に改変して、抗体の特性、例えば、上述のように親和性を改善することができる。パラトープをグラフトした抗体がTLR3への結合を保持する限り、パラトープをグラフトした抗体中のフレームワークアミノ酸配列は、mAb15EVQ又は12QVQ/QSVフレームワーク配列と70、75、80、85、90、95、96、97、98、又は99同一であってもよい。標準的な方法を用いて、パラトープ残基に追加して抗原結合部位由来の配列をグラフトすることもできる。例えば、完全なHCDR3又はLCDR3をグラフトしてもよい。本発明の別の態様は、特定の重鎖相補性決定領域CDR1、2及び3のアミノ酸配列、特定の軽鎖CDR1、2及び3のアミノ酸配列、特定の重鎖可変領域VHのアミノ酸配列、又は特定の軽鎖可変領域VLのアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体とTLR3との結合について競合する、TLR3に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントである。本発明のモノクローナル抗体の例としては、配列番号216に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号41に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する単離された抗体、並びに配列番号214に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号211に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体がある。TLR3との結合についての競合は公知の方法によってインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識抗体の存在下でのMSDSulfo-Tag商標NHS-エステル標識抗体のTLR3への結合を、ELISAによって評価することができる。本発明の抗体の例としては、mAb12、mAb15及びmAbc1811がある表3aを参照。先述の抗TLR3抗体c1068及びその誘導体国際特許公開第06/060513A2号、TLR3.7eBiosciences、カタログ番号14-9039、並びにImgenexIMG-315AImgenexIMG-315A;ヒトTLR3アミノ酸55~70VLNLTHNQLRRLPAANに対して生成されたは、実施例5に示されるようにmAb12、15、又はc1811のいずれともTLR3に対する結合について競合しない。本発明の別の態様は、TLR3反応性を有し、以下のa~iの特性のうち少なくとも1つを有する、単離された抗体である;a.Kd<10nMでヒトTLR3に結合する;b.インビトロでのポリI:CNF-kBレポーター遺伝子アッセイにおいて、1μg/mLで、ヒトTLR3の生物活性を50超低減させる;c.10μg/mLで、100ng/mL未満のポリI:Cで刺激されたBEAS-2B細胞からのIL-6又はCXCL5/IP-10の産生を60超阻害する;d.0.4μg/mLで、100ng/mL未満のポリI:Cで刺激されたBEAS-2B細胞からのIL-6又はCXCL5/IP-10の産生を50超阻害する;e.5μg/mLで、62.5ng/mLのポリI:Cで刺激されたNHBE細胞からのIL-6の産生を50超阻害する;f.1μg/mLで、62.5ng/mLのポリI:Cで刺激されたNHBE細胞からのIL-6の産生を50超阻害する;g.1μg/mLで、PBMC細胞による、ポリI:Cにより誘導されたIFN-γ、IL-6又はIL-12の産生を20超阻害する;h.インビトロでのNF-kBレポーター遺伝子アッセイにおいて、IC50<10μg/mLで、カニクイザルのTLR3の生物活性を阻害する;i.インビトロでのISREレポーター遺伝子アッセイにおいて、IC50<5μg/mLで、カニクイザルのTLR3の生物活性を阻害する。治療方法本発明のTLR3アンタゴニスト、例えば、TLR3抗体アンタゴニストは、免疫系を調節する目的で使用することができる。何らのかの特定の理論に束縛されることも望むものではないが、本発明のアンタゴニストは、TLR3へのリガンドの結合、TLR3の2量化、TLR3の細胞内移行、又はTLR3の輸送を防止又は低減することによって免疫系を調節し得るものと考えられる。本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。かかる動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜等の哺乳動物が挙げられる。例えば、本発明の抗体は、TLR3活性の中和、炎症、炎症性及び代謝性疾患の治療に有用であるだけでなく、更にこうした治療のための薬剤の調製においても有用であり、その場合、薬剤は本明細書で定義する用量で投与されるように調製される。一般的に、本発明のTLR3抗体アンタゴニストの投与によって予防又は治療することが可能な炎症状態、感染にともなう状態、又は免疫介在性炎症性疾患には、サイトカイン又はケモカインによって媒介されるもの、及びTLR3の活性化又はTLR3経路を介したシグナル伝達に全体的又は部分的に起因する状態が含まれる。こうした炎症性状態の例としては、敗血症にともなう状態、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、及び感染にともなう状態が挙げられる。更に、本発明のTLR3抗体アンタゴニストの投与によって癌、心血管及び代謝性の状態、神経病及び線維症の状態を予防又は治療することも可能であると考えられる。炎症は組織を冒し、全身性の症状となりうる。罹患する組織の例としては、気道、肺、消化管、小腸、大腸、結腸、直腸、心血管系、心組織、血管、関節、骨及び滑膜組織、軟骨、上皮、内皮、肝又は脂肪組織が挙げられる。全身性の炎症状態の例としては、サイトカインストームすなわち高サイトカイン血症、全身性炎症反応症候群SIRS、移植片対宿主病GVHD、急性呼吸窮迫症候群ARDS、重症急性呼吸器症候群SARS、劇症型抗リン脂質症候群、重篤なウイルス感染、インフルエンザ、肺炎、ショック、又は敗血症がある。炎症は、侵入する病原体を撃退するための生物による防御反応である。炎症は、多くの細胞性及び体液性のメディエーターが関与するカスケードイベントである。一方で炎症反応の抑制はホストを免疫的に無防備状態にし、炎症を放置した場合には慢性炎症性疾患例えば、喘息、乾癬、関節炎、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患など、敗血性ショック、及び多臓器不全などの重篤な合併症を引き起こし得る。重要な点として、これらの多様な疾患状態は、サイトカイン、ケモカイン、炎症細胞、及びこれらの細胞によって分泌される他のメディエーターなどの共通の炎症性メディエーターを共有している。リガンドであるポリI:C、2本鎖RNA又は内因性のmRNAによってTLR3が活性化されるとシグナル伝達経路が活性化され、これにより炎症性サイトカインの合成及び分泌、マクロファージ、顆粒球、好中球及び好酸球などの炎症細胞の活性化及び動員、細胞死、並びに組織の破壊が引き起こされる。TLR3は、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、MIP-1、CXCL5/IP-10及びRANTES、並びに免疫細胞の動員及び活性化に関わる他の炎症性サイトカイン及びケモカインの分泌を誘導することにより、自己免疫疾患及び他の炎症性疾患における組織の破壊に寄与する。TLR3のリガンドである内因性のmRNAは炎症時に壊死細胞から放出され、ポジティブフィードバックループを引き起こすことによってTLR3を活性化し、炎症及び更なる組織破壊を持続させる。TLR3抗体アンタゴニストのようなTLR3アンタゴニストはサイトカインの分泌を正常化し、炎症細胞の動員を低減し、組織破壊及び細胞死を低減させると考えられる。したがって、TLR3アンタゴニストは炎症及び広範な炎症性状態を治療するうえで治療上の可能性を有するものである。炎症性状態の1つの例は、全身性炎症反応症候群SIRS、敗血性ショック又は多臓器不全症候群MODSが含まれうる、敗血症にともなう状態である。ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫感染によって、及び壊死細胞によって放出される2本鎖RNAは敗血症の発症に寄与しうる。特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、TLR3アンタゴニストによる治療は、敗血症にともなう炎症状態を有する患者における生存時間を延ばすか又は局所的な炎症性イベント例えば、肺のが広がって全身症状となることを防止することにより、あるいは内在的な抗微生物活性を強化することにより、あるいは抗微生物剤と組み合わされる場合に相乗的な活性を示すことにより、あるいは病状に寄与する局所的炎症状態を抑制することにより、あるいは上記の任意の組合わせにより、所定の治療効果を与えうるものと考えられる。こうした介入は、患者の生存を確実にするために必要な更なる治療例えば、潜在する炎症の治療又はサイトカインレベルの低減を可能とするうえで充分なものとなり得る。敗血症はD-ガラクトサミン及びポリI:Cを投与することによってマウスなどの動物でモデル化することができる。こうしたモデルにおいて、D-ガラクトサミンは、敗血症感作物質として機能する肝臓毒素であり、ポリI:Cは2本鎖RNAを模倣してTLR3を活性化させる敗血症誘導分子である。TLR3アンタゴニストによる治療は敗血症のマウスモデルにおける動物の生存率を高めうるものであり、したがってTLR3アンタゴニストは敗血症の治療に有用であると考えられる。消化管の炎症は消化管の粘膜走の炎症であり、急性及び慢性の炎症状態が含まれる。急性炎症は、短時間の発症及び好中球の浸潤又は流入によって一般的に特徴付けられる。慢性炎症は、比較的長期の発症及び単核球の浸潤又は流入によって一般的に特徴付けられる。粘膜層は、腸小腸及び大腸を含む、直腸、胃胃部壁、又は口腔の粘膜であってよい。慢性の消化管炎症状態の例としては、炎症性腸疾患IBD、外界からの刺激によって誘導される大腸炎例えば、化学療法、放射線療法などの投与のような治療レジメンによって引き起こされるかあるいはこれにともなう例えば、副作用として消化管炎症例えば、大腸炎、感染性大腸炎、虚血性大腸炎、膠原性又はリンパ性大腸炎、壊死性腸炎、慢性肉芽腫症又はセリアック病などの状態における大腸炎、食品アレルギー、胃炎、感染性胃炎又は小腸結腸炎例えば、ヘリコバクターピロリの感染による慢性活動性胃炎、及び感染性病原体によって引き起こされる消化管炎症の他の形態がある。炎症性腸疾患IBDには、例えば、潰瘍性大腸炎UC及びクローン病CDなどの、一般に病因が不明の一群の慢性炎症性疾患が含まれる。臨床的及び実験的証拠は、IBDの病因が感受性遺伝子及び環境因子が関与する多因子的なものであることを示唆している。炎症性腸疾患では、組織の傷害は、腸内の微生物叢の抗原に対する不適切又は過剰な免疫反応によってもたらされる。炎症性腸疾患の幾つかの動物モデルが存在している。最も広く用いられているモデルは、結腸に慢性炎症及び潰瘍形成を誘発する2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸/エタノールTNBS誘発大腸炎モデル又はオキサゾロンモデルであるNeurathら、Intern.Rev.Immunol19:51~62、2000。別のモデルでは、血性下痢、体重減少、結腸の短縮、及び好中球の浸潤をともなう粘膜の潰瘍形成として発現する急性大腸炎を誘発する硫酸デキストランナトリウムDSSを使用する。DSS誘発大腸炎は、リンパ組織過形成、陰窩傷害、及び上皮潰瘍形成をともなう、基底膜内への炎症細胞の浸潤によって組織学的に特徴付けられるHendricksonら、ClinicalMicrobiologyReviews15:79~94,2002。別のモデルは、ナイーブなCD45RBhighCD4T細胞をRAG又はSCIDマウスに養子移入することを含む。このモデルでは、ドナーのナイーブT細胞がレシピエントの腸を攻撃することにより、ヒトの炎症性腸疾患に似た慢性腸炎症及び症状を引き起こすRead及びPowrie、Curr.Protoc.Immunol.Chapter15ユニット15.13、2001。これらのモデルのいずれかにおいて本発明のアンタゴニストの投与を用いることによって、これらのアンタゴニストが、炎症性腸疾患等の腸内の炎症に伴う症状を改善し、疾患の経過を変化させる潜在的な有効性を評価することができる。IBDに対しては幾つかの治療選択肢が存在し、例えば、抗TNFα抗体による治療法が、クローン病を治療する目的で10年前から用いられているVanAsscheら、Eur.J.Pharmacol.EpubOct2009。しかしながら、かなりの割合の患者が現在の治療法に応答しないHanauerら、Lancet359:1541~1549,2002;Hanauerら、Gastroenterology130:323~333,2006ことから、難治性の患者集団を標的とした新たな治療法が求められている。炎症状態の別の一例は炎症性の肺状態である。炎症性の肺状態の例としては、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫又はプリオンによる感染にともなうものなどの感染により誘発される肺状態、アレルゲンにより誘発される肺状態、アスベスト症、珪肺症、又はベリリウム肺症などの汚染物質により誘発される肺状態、胃吸引により誘発される肺状態、嚢胞性線維症などの遺伝的素因にともなう免疫調節不全炎症状態、及び人工呼吸器傷害などの物理的外傷により誘発される肺状態が挙げられる。これらの炎症状態には更に、喘息、気腫、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患COPD、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシス、リンパ管筋腫症、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、慢性肺疾患、気管支肺異形成症、院外感染性肺炎、院内肺炎、人工呼吸器関連肺炎、敗血症、ウイルス性肺炎、インフルエンザ感染、パラインフルエンザ感染、ロタウイルス感染、ヒトメタニューモウイルス感染、呼吸系発疹ウイルス感染、及びアスペルギルス又は他の真菌感染も含まれる。感染にともなう炎症性疾患の例としては、重症肺炎、嚢胞性線維症、気管支炎、気道増悪、及び急性呼吸窮迫症候群ARDSを含むウイルス又は細菌性肺炎が挙げられる。こうした感染にともなう状態は、一次ウイルス感染及び二次ウイルス感染のように複数の感染をともなう場合がある。喘息は、気道過敏症AHR、気管支収縮、喘鳴、好酸球又は好中球性炎症、粘液分泌過多、上皮下線維症、及び高いIgEレベルによって特徴付けられる肺の炎症性疾患である。喘息の患者は、最も一般的には気道の微生物感染例えば、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、ヘモフィルスインフルエンザなどにより症状の悪化である増悪を経験する。喘息の発作は、環境因子例えば、回虫、昆虫、動物例えば、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット及び鳥、真菌、空気汚染物質例えば煙草の煙、刺激性ガス、フューム、蒸気、エアゾール、化学物質、花粉、運動、又は冷気によって誘発される。喘息とは別に、肺を侵すいくつかの慢性炎症性疾患は、例えば、慢性閉塞性肺疾患COPD、細菌性肺炎及び嚢胞性線維症など、気道への好中球浸潤により特徴付けられLindenら、Eur.Respir.J.15:973~977、2000;Rahmanら、Clin.Immunol.115:268~276、2005COPD、アレルギー性鼻炎、及び嚢胞性線維症などの疾患は、気道過敏性により特徴付けられるFahy及びO’Byrne、Am.J.Respir.Crit.CareMed.163:822~823、2001。喘息及び気道炎症の一般的に用いられる動物モデルとしては、オボアルブミンチャレンジモデル及びメタコリン感作モデルが挙げられるHesselら、Eur.J.Pharmacol.293:401~412、1995。培養したヒト気管支上皮細胞、気管支線維芽細胞又は気道平滑筋細胞からのサイトカイン及びケモカインの産生の阻害をインビトロモデルとして用いることもできる。本発明のアンタゴニストをこれらのモデルのいずれかに投与することによって、喘息、気道炎症、COPDなどの症状を改善し、経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。本発明の方法によって予防又は治療しうる他の炎症状態及び神経障害は、自己免疫疾患によって引き起こされるものである。これらの状態及び神経障害としては、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、並びに、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、双極性疾患、及び筋萎縮性側索硬化症ALSを含む神経変性及び中枢神経系CNS疾患、原発性胆汁性硬変、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝疾患/脂肪性肝炎、線維症、C型肝炎ウイルスHCV、及びB型肝炎ウイルスHBV等の肝臓疾患、糖尿病及びインスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、脳出血、脳卒中、及び心筋梗塞等の心血管疾患、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び若年性関節リウマチJRA、骨粗鬆症、変形性関節症、膵炎、線維症、脳炎、乾癬、巨細胞動脈炎、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、ヒト免疫不全ウイルスHIV、炎症性皮膚状態、移植、癌、アレルギー、内分泌疾患、創傷治癒、他の自己免疫性疾患、気道過敏症、並びに、細胞、ウイルス又はプリオンによって介在される感染症又は疾患が挙げられる。変形性関節症、関節リウマチ、怪我による関節炎を有する関節などを含む関節炎は、本発明のアンタゴニストのような抗炎症性タンパク質の治療的使用によって利するところのある一般的な炎症状態である。例えば、関節リウマチRAは全身を冒す全身性疾患であり、関節炎の最も一般的な形態の1つである。関節リウマチは組織の傷害を引き起こすため、TLR3リガンドが炎症部位に存在しうる。TLR3シグナル伝達の活性化によって、炎症を起こした関節の炎症及び更なる組織傷害が持続しうる。関節リウマチの幾つかの動物モデルが当該技術分野において知られている。例えばコラーゲン誘発関節炎CIAモデルでは、ヒト関節リウマチとよく似た慢性炎症性関節炎をマウスに発症させる。本発明のTLR3アンタゴニストをCIAモデルマウスに投与することによって、疾患の症状を改善して疾患の経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。真性糖尿病すなわち糖尿病は、複数の原因因子によって誘導され、高血糖によって特徴付けられる疾患プロセスのことを指すLeRoithら編、DiabetesMellitus,Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia,Pa.U.S.A.1996、及びそれにおいて引用されるすべての参考文献。制御されない高血糖は、腎障害、神経障害、網膜障害、高血圧、脳血管疾患及び冠状動脈性心疾患などの微小血管及び大血管性疾患のリスクが増大するために死亡率が増加し、若年死をともなう。したがって、グルコースホメオスタシスの制御は糖尿病の治療にとって極めて重要なアプローチである。基礎となる欠陥により、糖尿病は、患者の膵線にインスリンを産生するβ細胞が存在しない場合に発症する1型糖尿病インスリン依存性糖尿病、IDDMと、β細胞のインスリン分泌不全及び/又はインスリンの作用に対する抵抗性を有する患者において発症する2型糖尿病インスリン非依存性糖尿病、NIDDMの2つの大きなグループに分類される。2型糖尿病は、絶対的ではなく、相対的なインスリン欠乏をともなうインスリン抵抗性によって特徴付けられる。インスリン抵抗性の患者では、身体はこの欠陥を補償するために異常に高量のインスリンを分泌する。インスリン抵抗性を補償し、血糖値を適正に制御するために不適切な量のインスリンが存在すると、境界型糖尿病の状態が現れる。多くの患者でインスリン分泌は更に低下し、血漿グルコース濃度が上昇し、糖尿病の臨床状態がもたらされる。肥満症にともなう炎症は、インスリン抵抗性、II型糖尿病、脂質代謝異常、及び心血管疾患の発症に深く関わっていることが示唆されている。肥満脂肪はマクロファージを動員及び維持し、TNF-α及びIL-6などの炎症性サイトカイン、遊離脂肪酸及びアディポカインを過剰に産生する場合があり、インスリンシグナル伝達を妨害してインスリン抵抗性を誘発し得る。マクロファージのTLR3活性化は、こうした脂肪の炎症誘発状態に寄与しうる。インスリン抵抗性の幾つかの動物モデルが知られている。例えば、食餌誘発肥満モデルDIOでは、動物は体重増加をともなう高血糖症及びインスリン抵抗性を発症する。DIOモデルに本発明のTLR3アンタゴニストを投与することによって、2型糖尿病にともなう合併症を改善して疾患の経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。脂肪性肝疾患は肝疾患の範囲を包含し、通常は、アルコール性又は非アルコール性のいずれかで分類される。どちらの場合も、脂肪性肝疾患は、単なる肝脂肪変性脂質の蓄積及び堆積からアルコール性及び非アルコール性の脂肪性肝炎ASH又はNASHまでの範囲に及ぶが、これは肝線維症、肝硬変、及び恐らくは肝細よ胞がんまで進行することが多い。アルコール性AFLD及び非アルコール性脂肪性肝疾患NAFLDは、組織学的に見て区別がつかないが、定義にると、NAFLDは、アルコールをほとんど又は全く摂取しない患者で発症する。その代わりに、NAFLDは、肥満症、メタボリック症候群、及び2型糖尿病の個人で頻繁に見られ、インスリン抵抗性と密接に関連しているUtzschneiderら、JClinEndocrinolMetab91:4753~4761、2006。肥満症及びインスリン抵抗性の有病率における近年の劇的な増加とともに、NAFLDは、最もよく見られる慢性肝疾患として、AFLD及びウイルス性の肝炎誘発性肝疾患を上回っている。肥満症の人のおよそ75がNAFLDを有し、20もの人がNASHを有する可能性があると推定されているClark,JClinGastroenterol40Suppl1:S5~S10、2006;Lazoら、SeminLiverDis28:339~350、2008。アテローム性冠状動脈硬化性心疾患CHDは、西洋社会における死及び心血管罹患率の主な原因である。アテローム性冠状動脈硬化性心疾患の危険因子には、高血圧、真性糖尿病、家族歴、男性であること、喫煙、血清コレステロールの上昇、低比重リポタンパクLDLコレステロールレベルの上昇及び高比重リポタンパクHDLコレステロールレベルの低下が挙げられる。一般に、約225~250mg/dlを超える総コレステロールレベルは、CHDの危険性の大幅な上昇に関係する。様々な臨床研究により、総コレステロールレベル及びLDLコレステロールレベルの上昇がヒトのアテローム性動脈硬化を促進させることが立証されている。疫学的調査は、血管罹患率及び死亡率が総コレステロール及びLDLコレステロールのレベルと直接関係して変化することを立証している。癌の例としては、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病ALL、B細胞又はT細胞のALL、急性骨髄性白血病AmL、慢性骨髄性白血病CmL、慢性リンパ球性白血病CLL、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群MDS、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、乳癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群/高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、扁平上皮細胞癌、肉腫、悪性黒色腫、特に転移性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、及び癌関連骨痛を含むただし、これらに限定されない、細胞、組織、臓器、動物、又は患者における少なくとも1つの悪性疾患が挙げられる。心血管疾患の例としては、心臓性昏倒症候群、心筋梗塞、鬱血性心不全、卒中、虚血性卒中、出血、動脈硬化症、アテローム性硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化疾患、高血圧、動脈高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、心臓不整脈、心房異所性収縮、心房粗動、心房細動持続性又は痙攣性、潅流後症候群、心肺バイパス炎症反応、多源性chaotic又はmultifocal心房頻拍、規則的で狭いQRS頻拍、特異的不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性障害、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁疾患、心内膜炎、心臓周囲疾患、心臓腫瘍、大動脈及び抹消動脈瘤、大動脈解離、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分枝の閉塞、抹消血管障害、閉塞性動脈障害、抹消性アテローム硬化疾患、閉塞性血栓血管炎、機能性抹消動脈障害、レイノー現象及び障害、先端チアノーゼ、先端紅痛症、静脈疾患、静脈血栓症、静脈瘤血管、動静脈瘤、リンパ水腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再潅流傷害、ポンプ後症候群、及び虚血性再潅流傷害を含むただし、これらに限定されない、細胞、組織、臓器、動物又は患者における心血管疾患が挙げられる。代表的な神経性疾患の例としては、神経変性疾患、多発性硬化症、偏頭痛、AIDS痴呆複合症、例えば、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎などの髄鞘脱落性疾患;例えば、皮質脊髄系の病変などの錐体外路及び小脳疾患;基底核の疾患又は小脳疾患;脳幹神経節の障害;例えば、ハンチントン舞踏病及び老年舞踏病などの運動亢進性運動障害;例えばCNSドーパミンレセプターを遮断する薬物によって誘導される運動障害などの薬物誘導性運動障害;例えばパーキンソン病などの運動低下性運動障害;進行性核上性麻痺;小脳の構造的病変;例えば脊髄性運動失調、フリードライヒ運動失調、小脳皮質変性、多発性系変性Mencel、Dejerine-Thomas、Shi-Drager及びMachado-Josephなどの脊髄小脳の変性;全身性疾患Refsum’s疾患、無β-リポタンパク血症、麻痺、毛細管拡張症及びミトコンドリア性多系疾患;例えば多発性硬化症、急性横断性脊髄炎などの髄鞘脱落性コア疾患;及び神経性筋萎縮などの運動ユニットの障害例えば筋委縮性測索硬化症、小児性脊髄性筋委縮及び若年性脊髄性筋委縮などの前角細胞変性;アルツハイマー病;中年のダウン症候群;びまん性レビー小体病;レビー小体型の老年性認知症;ウェルニッケ-コルサコフ症候群;慢性アルコール中毒;クロイツフェルトヤコブ病;亜急性硬化性全脳炎、ハラーフォルデンシュパッツ病;ボクサー痴呆を含むただし、これらに限定されない細胞、組織、臓器、動物又は患者における神経疾患が挙げられる。線維症状態の例としては、肝臓線維症アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己免疫性肝炎を含むがこれらに限定されない;肺線維症強皮症、特発性肺線維症を含むがこれらに限定されない;腎臓線維症強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎を含むがこれらに限定されない;皮膚線維症強皮症、肥厚性及びケロイド瘢痕、火傷を含むが、これらに限定されない;骨髄線維症;神経線維腫症;線維腫;腸線維症;及び外科手術による線維化付着などが挙げられる。このような1つの方法において、線維症は器官特異性線維症又は全身性線維症のいずれであってもよい。器官特異性線維症は、肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、心臓線維症、血管線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨髄線維症、又はその他の線維症のうち少なくとも1つに関連し得る。肺線維症は、特発性肺線維症、薬剤誘発性肺線維症、喘息、サルコイドーシス、又は慢性閉塞性肺疾患のうち少なくとも1つに関連し得る。肝臓線維症は、肝硬変、住血吸虫症、又は胆管炎のうち少なくとも1つに関連し得る。肝硬変は、アルコール性肝硬変、C型肝炎後肝硬変、原発性胆汁性肝硬変の中から選択され得る。胆管炎は硬化性胆管炎である。腎線維症は、糖尿病性腎障害又はループス糸球体腎炎にともないうる。心線維症は、心筋梗塞にともないうる。血管線維症は、血管形成術後動脈再狭窄、又はアテローム性動脈硬化にともないうる。皮膚線維症は、火傷瘢痕化、肥厚性瘢痕化、ケロイド、又は腎性線維性皮膚症にともないうる。眼線維症は、後眼窩線維症、白内障手術後又は増殖性硝子体網膜症にともないうる。骨髄線維症は、特発性骨髄線維症又は薬剤誘発性骨髄線維症にともないうる。他の線維症は、ペイロニー病、デュピュイトラン拘縮又は皮膚筋炎から選択され得る。全身性線維症は、全身性硬化症及び移植片体宿主病から選択されうる。投与/医薬組成物TLR3活性の抑制が所望される病態の治療又は予防に効果的な剤の治療上の有効量は、標準的な研究技術により判定され得る。例えば、喘息、クローン病、潰瘍性大腸炎又は関節リウマチなどの炎症状態の治療又は予防において有効となる薬剤の用量は、本明細書に述べるモデルのような関連する動物モデルに薬剤を投与することによって決定することができる。更に、場合によりインビトロアッセイを用いて最適な用量範囲を特定することができる。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの因子の考慮に基づいて例えば臨床試験によって決定することができる。こうした因子には、治療又は防止しようとする疾患、関与する症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には周知の他の因子が含まれる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿することができる。本発明の方法では、TLR3アンタゴニストは単独で、又は少なくとも1種類の他の分子と組み合わせて投与することができる。こうした更なる分子は、他のTLR3アンタゴニスト分子か、又はTLR3受容体のシグナル伝達によって媒介されない治療効果を有する分子であってよい。抗生剤、抗ウイルス剤、緩和剤、及びサイトカインのレベル又は活性を低減する他の化合物はこうした更なる分子の例である。本発明の薬剤の治療上の使用のための投与方法は、薬剤をホストに送達する任意の好適な経路でよい。これらの薬剤の医薬組成物は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、又は鼻腔内などの非経口投与に特に有用である。本発明の薬剤は、有効量の薬剤を薬学的に許容される担体中の有効成分として含有する医薬組成物として調製することができる。用語キャリアは、活性化合物と共に投与される希釈剤、助剤、賦形剤、又は溶媒のことを指す。こうした医薬用賦形剤は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成物由来の水及び油などの液体であってよい。例えば、0.4生理食塩水及び0.3グリシンを使用することができる。これらの溶液は滅菌液であり、粒子状物質を含まない。これらの溶液は、従来の公知の滅菌法例えば濾過によって滅菌することができる。組成物には、生理学的条件に近づけるために必要とされるpH調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などの製薬学的に許容され得る補助物質を含有させることができる。こうした製薬学的組成物に含まれる本発明の薬剤濃度は、重量にして約0.5未満、通常は約1又は少なくとも約1から、最大で15又は20までと大きく異なってよく、選択される投与方法に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度などに基づいて選択される。したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、1mLの滅菌緩衝水、及び約1ng~約100mg、例えば約50ng~約30mg、又はより好ましくは約5mg~約25mgの本発明のTLR3アンタゴニストを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、250mLの滅菌リンゲル溶液、及び約1mg~約30mg、好ましくは5mg~約25mgの本発明のアンタゴニストを含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は周知であり、例えば、レミントン製薬科学第15版マック出版ペンシルベニア州イーストンに、より詳細に記載されている。本発明の抗体アンタゴニストは凍結乾燥して保存することができ、使用の前に適切な溶媒中で還元することができる。この手法は、これまでに、従来の免疫グロブリン及びタンパク製剤に有効であることが示されており、周知の凍結乾燥及び溶解法を用いることができる。ここで、以下の具体的及び非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。実施例1抗huTLR3アンタゴニストmAbの同定及び誘導MorphoSysHumanCombinatorialAntibodyLibraryHuCAL登録商標GoldファージディスプレイライブラリMorphosysAG,Martinsried,Germanyをヒト抗体フラグメントの供給源として使用し、C末端にポリヒスチジンタグを有するヒトTLR3huTLR3配列番号4のアミノ酸1~703を発現させることによって生成した精製TLR3抗原に対してパニングさせ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。アミノ酸1~703は、huTLR3の予想される細胞外ドメインECDと一致している。huTLR3ECDと特異的に結合するFabフラグメントFabを、多様な抗体フラグメント群を固有のものとして同定、配列決定及び確認できるように様々な方法でTLR3タンパク質を提示することによって選択した。異なるパンニングの手法により、62種類の候補物質V領域配列が異なるがhTLR3のECDに結合する固有の物質として同定された。huTLR3のECD結合物質として同定されたこれら62種類の候補物質を、抗炎症活性の特定に関するさまざまな細胞アッセイにより中和活性についてスクリーニングした。予備活性データ下記実施例2を参照を用いて、ファミリー16~19を形成する4種類の候補物質Fab16~19を、重鎖CDR2HCDR2及び軽鎖CDR3LCDR3のCDR成熟の親として62種類の候補物質から選択した。これらの親候補物質の1つ候補物質19でHCDR2にN結合型グリコシル化部位が認められたため、この候補物質にSer→AlaS→Aの突然変異を導入してこの部位を除去した。4種類の親候補物質のCDR成熟の後、全部で15種類の子孫候補物質候補物質1~15が同定され、これを下記実施例2で述べるように更なる特性評価に供した。19種類の候補物質のそれぞれに存在する軽鎖及び重鎖の可変領域のリストを上記表3に示した。ここで各候補物質は、Fabであるか完全長の抗体鎖としてクローニングされた実施例3ものであるかに応じてmAb1~19又はFab1~19と呼ぶものとする。発現ベクターの設計のため、すべての候補物質について可変領域の成熟したアミノ末端は重鎖ではQVEであり、軽鎖ではDIであった。これらの末端の好ましい配列は、候補配列と高い相同性を有するそれぞれの生殖細胞遺伝子内の配列である。ファミリー17及び18では、生殖細胞系の配列はVHでQVQ、VLでSYである。ファミリー19ではこの配列はVHでEVQ、VLでDIである。SY配列はλサブグループ3に固有であり、アミノ末端残基としてのS又はYは種間で異なることが報告されている。したがって、有名なλサブグループ1からのQSVコンセンサス末端は、ファミリー17及び18のVLのDIEのより好適な置換になるものと考えられる。これらの改変を、ファミリー18から候補物質9、10及び12に、ファミリー19から候補物質14及び15に導入した。このプロセスでは、これらの抗体のVH及びVL領域のコドンを最適化した。候補物質9、10及び11の軽鎖可変領域のN末端生殖細胞変異体のアミノ酸配列を配列番号209~211に示し、候補物質9、10、12、14及び15の重鎖可変領域のN末端生殖細胞変異体のアミノ酸配列を配列番号212~216にそれぞれ示す。これらの候補物質のN末端変異体をここでは、候補物質/mAb/Fab9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、12QVQ/QSV、14EVQ又は15EVQと呼ぶ。これらのN末端生殖細胞変異体をmAbとして発現させたところ、それぞれの親候補物質と比較した場合にTLR3への結合についても、TLR3の生物学的活性を阻害する能力においても何らの影響を示さなかったデータは示されていない。実施例2インビトロでのTLR3アンタゴニスト活性の判定上記に述べた15種類のCDR成熟させた候補物質を潜在的なヒトの治療物質として選択し、広範な結合及び中和活性を調べた。4種類の親FabであるFab16~19及び15種類のCDR成熟であるFab1~15又はこれらの非生殖細胞V領域変異体について、活性のアッセイ及び結果を下記に述べる。NF-kB及びISREシグナル伝達カスケードの阻害熱で不活化したFBSを添加したDMEM及びGlutaMax培地インビトロジェン社Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド中で293T細胞を増殖させ、30ngのpNF-kB又はISREホタルルシフェラーゼレポータープラスミド、13.5ngのpcDNA3.1ベクター、5ngのphRL-TK、及び1.5ngのFLTLR3をコードしたpCDNA配列番号2をトランスフェクトした。phRL-TKプラスミドは、HSV-1チミジンキナーゼプロモーターによって制御されるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有しているプロメガ社Promegaウィスコンシン州マディソン。TLR3抗体を30~60分インキュベートした後、ポリI:Cジーイーヘルスケア社GEHealthcareニュージャージー州ピスカタウェイを加えた。各プレートを37度で6時間又は24時間インキュベートした後、DualGloルシフェラーゼ試薬を加えて各プレートをFLUOstarプレートリーダーで読み取った。ホタルの相対発光量RLUをウミシイタケのRLUで割ることによって正規化された値ルシフェラーゼ比を求めた。ホタルルシフェラーゼの産生を刺激するNF-kB又はISREシグナル伝達カスケードは、TLR3アゴニストであるポリI:C1μg/mLによる刺激前に、細胞を抗TLR3抗体0.4、2.0及び10μg/mLとインキュベートすることによって特異的に阻害された。NF-kBアッセイの結果を図1に示し、5465をポジティブコントロール抗ヒトTLR3mAbを中和するとして、また抗ヒト組織因子mAb859をヒトIgG4アイソタイプコントロールとして、ホタル/ウミシイタケ比の阻害率として表した。0.4~10μgのmAb濃度で50よりも高い阻害率が得られた。c1068及びTLR3.7は、10μg/mlでTLR3の生物学的活性の約38及び8を阻害した。同様の結果がISREレポーター遺伝子アッセイで得られたデータは示されていない。BEAS-2B細胞におけるサイトカイン放出BEAS-2B細胞SV-40で形質転換した正常なヒト気管支上皮細胞を、I型コラーゲンをコーティングした培養皿に播種し、抗ヒトTLR3抗体の存在下又は非存在下でインキュベートした後、ポリI:Cを加えた。処理の24時間後に上清を回収し、カスタム多重ビーズアッセイを用いてサイトカイン及びケモカインレベルについてアッセイして、IL-6、IL-8、CCL-2/MCP-1、CCL5/RANTES及びCXCL10/IP-10を検出した。結果を、0.4、2.0及び10μg/mLのmAbで処理した後の、サイトカイン/ケモカインの個別の阻害率として図2に示す。5465はポジティブコントロールであり、859はアイソタイプコントロールである。NHBE細胞におけるサイトカイン放出サイトカインの放出を、正常なヒト気管支上皮NHBE細胞ロンザ社Lonza、メリーランド州ウォーカーズビルにおいてもアッセイした。NHBE細胞を増殖させ、コラーゲンコーティングした培養皿に移して48時間インキュベートした後、培地を除去して0.2mlの新鮮な培地を補充した。次いで細胞を抗ヒトTLR3mAbの存在下又は非存在下で60分間インキュベートした後、ポリI:Cを加えた。24時間後に上澄み液を回収し、-20°Cで保存するか、又は直ちにIL-6のレベルについてアッセイした。結果を、投与量0.001~50μg/mLでのmAb処理後の、IL-6分泌の阻害率として図3にグラフで示す。5465はポジティブコントロールであり、859はアイソタイプコントロールである。大部分のmAbは1μg/mLでIL-6の産生の少なくとも50を阻害し、5μg/mLで阻害率75を達成した。PBMC細胞におけるサイトカイン放出サイトカインの放出を、ヒト末梢血単核球細胞PBMCにおいてもアッセイした。ヒトドナーから全血をヘパリン回収試験管に回収し、これにFicoll-PaquePlus溶液を下側に層を形成するようにゆっくりと加えた。試験管を遠心してFicollの直ぐ上に白色の層を形成しているPBMCを回収して播種した。この後、PBMCを抗ヒトTLR3mAbの存在下又は非存在下でインキュベートした後、25μg/mlのポリI:Cを加えた。24時間後に上澄み液を回収し、Luminex技術を用いて、サイトカインレベルを求めた。5465をポジティブコントロールとし、hIgG4をアイソタイプコントロールとして用い、mAbの単回用量0.4μg/mLによるIFN-γ、IL-12及びIL-6の累積阻害率として、結果を図4にグラフ化して示す。HASM細胞におけるサイトカイン放出簡潔に言うと、500ng/mlのpolyI:C及び10ng/mlのTNF-αの相乗的組み合わせを加える前に、ヒト気道平滑筋HASM細胞を、抗ヒトTLR3mAbで、又はそれを用いずにインキュベートした。24時間後、上清を収集し、Luminex技術を用いてサイトカインのレベルを測定した。結果を、mAbの3つの用量0.4、2及び10μg/mlを用いてCCL5/RANTESのレベルとして図5にグラフで示す。5465はポジティブコントロールであり、hIgG4はアイソタイプコントロールである。ヒト細胞におけるインビトロアッセイからの結果によって、huTLR3に結合することによりサイトカイン及びケモカインの放出を低減させる本発明の抗体の能力が確認された。実施例3完全長の抗体コンストラクト4種類の親Fab候補物質番号16~19及び15種類の子孫Fab候補物質番号1~15の重鎖をS229PFc突然変異を有するヒトIgG4バックグラウンド上にクローニングした。候補物質9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、12QVQ/QSV、14EVQ又は15EVQを、F235A/L236及びS229PFc突然変異を有するヒトIgG4バックグラウンド上にクローニングした。成熟した完全長の重鎖アミノ酸配列を以下のように配列番号90~102及び218~220に示す。発現のため、これらの重鎖はMAWVWTLLFLMAAAQSIQA配列番号103のようなN末端のリーダー配列を有してもよい。リーダー配列を有する候補物質14EVQ及び15EVQの重鎖、及び成熟型リーダー配列を有さないをコードするヌクレオチド配列の例を、配列番号104及び105にそれぞれ示す。同様に、発現のために、本発明の抗体の軽鎖の配列は、MGVPTQVLGLLLLWLTDARC配列番号106のようなN末端のリーダー配列を有してもよい。リーダー配列を有するコドン最適化された候補物質15の軽鎖、及び成熟型リーダー配列を有さないをコードするヌクレオチド配列の例を、配列番号107及び108にそれぞれ示す。実施例4抗TLR3mAbの結合の特性評価ヒトTLR3の細胞外ドメインECDに対するmAbの結合のEC50値をELISAによって求めた。ヒトTLR3のECDタンパク質をPBSで2μg/mlに希釈し、100μlの一定分量を96穴プレートコーニング社CorningInc.、マサチューセッツ州アクトンの各ウェルに分配した。4°Cで一晩インキュベートした後、PBSに0.05のTween-20シグマアルドリッチ社Sigma-Aldrichを加えた洗浄緩衝液中で3回プレートを洗った。ウェルは、2のI-BlockAppliedBiosystems、FosterCity、CA及び0.05のTween-20からなる、200μlのPBS中のブロッキング溶液でブロックされた。室温で2時間ブロッキングした後、プレートを3回洗浄し、次いで、抗TLR3mAb候補物質1~9をブロッキング緩衝剤中で段階的に希釈した。この抗TLR3mAbを室温で2時間インキュベートして3回洗った。この後、ブロッキング緩衝液で1:4000に希釈したペルオキシダーゼ接合ヒツジ抗ヒトIgGジーイーヘルスケア社GEHealthcareニュージャージー州ピスカタウェイを加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄緩衝液中で3回洗った。結合は、TMB-Sフィッツジェラルドインダストリーズインターナショナル社FitzgeraldIndustriesInternationlIncマサチューセッツ州コンコード中で10~15分間インキュベートすることによって検出した。反応を25μLの2NH2SO4で停止させ、SPECTRAMax分光光度計MolecularDevicesCorp.、Sunnyvale、CAを用いて、吸光度を450nmで読み取り650nmでの値を差し引いた。EC50値をGraphPadPrismプリズムソフトウェアグラフパッドソフトウェア社GraphPadSoftwareInc、カリフォルニア州サンディエゴを使用して非線形回帰によって求めた。mAbを2.5μg/mL~0.6pg/mLまで4倍ずつ希釈した100μLの連続希釈液とインキュベートすることにより、huTLR3に対する結合についてEC50値を求めた表4。抗ヒト組織因子mAb859及びhuIgG4κをネガティブコントロールとして含めた。huTLR3ECDに対する結合親和性もBiacore分析によって求めた。データ示されていないは、mAb1~19ではhuTLR3ECDに対するKdが108M未満であることを示した。実施例5競合的エピトープ結合抗TLR3抗体競合グループ又はエピトープビンを決定するためにエピトープ結合実験を行った。競合的ELISAを行うため、実施例1に述べるようにして作製した5μL20μg/mLの精製ヒトTLR3ECDタンパク質を、MSDHighBindプレートMesoScaleDiscovery,Gaithersburg,MDの各ウェルに室温で2時間コーティングした。150μlの5MSDブロッカーA緩衝液メソスケールディスカバリー社MescoScaleDiscoveryを各ウェルに加えて室温で2時間インキュベートした。プレートを0.1MHEPES緩衝液pH7.4で3回洗った後、標識した抗TLR3mAbと異なる競合物質との混合液を加えた。標識した抗体10nMを、濃度を増加させた1nM~2μM非標識抗TLR3抗体とインキュベートし、次いで25μLの量の混合液を、指定されたウェルに加えた。室温で穏やかに振盪しながら2時間インキュベートした後、プレートを0.1MHEPES緩衝液pH7.4で3回洗った。MSDRead緩衝液Tを蒸留水で希釈し4倍、150μl/ウェルの量で分配してSECTORImager6000によって分析した。抗体を製造者MesoScaleDiscoveryの使用説明書に従ってMSDSulfo-Tag商標NHS-エステルで標識した。以下の抗TLR3抗体を評価した。すなわち、MorphoSysヒト組み換え抗体ライブラリより入手したmAb1~19表3に示すもの;c1068国際特許公開第06/060513A2号に述べられるもの、c1811マウスTLR3タンパク質で免疫性を与えられたラットから作製されるハイブリドーマにより産生されるラット抗マウスTLR3mAb、TLR3.7eBiosciences,SanDiego,CA,カタログ番号14~9039、及びIMG-315AImgenex,SanDiego,CAより入手したヒトTLR3アミノ酸55~70VLNLTHNQLRRLPAANに対して生成したもの。mAb9、10、12、14及び15については、変異体9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、12QVQ/QSV、14EVQ、又は15EVQをこの実験で使用した。競合アッセイに基づき、抗TLR3抗体を5つの異なるビンに割り当てた。ビンA:mAb1、2、13、14EVQ、15EVQ、16、19;ビンB:mAb3、4、5、6、7、8、9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、11、12QVQ/QSV、17、18;ビンC:抗体ImgenexIMG-315A;ビンD:抗体TLR3.7、c1068;及びビンE:抗体c1811。実施例6エピトープマッピング実施例5で述べた異なるエピトープビンからの代表的な抗体を更なるエピトープマッピングのために選択した。エピトープマッピングは、TLR3分節スワッピング実験、突然変異誘発、H/D交換、及びインシリコタンパク質-タンパク質ドッキングを含む各種のアプローチを用いて行ったTheEpitopeMappingProtocols、MethodsinMolecularBiology、Volume6、GlenE.Morris編、1996。TLR3セグメントスワッピング。TLR3ヒト-マウスキメラタンパク質を用いてTLR3上の全体の抗体結合ドメインの位置を特定した。ヒトTLR3タンパク質の細胞外ドメインを3つのセグメントに分割したGenBankAcc.No.NP_003256のヒトTLR3アミノ酸配列に基づくアミノ酸番号によるaa1~209aa210、~436、aa437~708。ヒトTLR3のアミノ酸210~436及び437~708を対応するマウスのアミノ酸マウスTLR3、GenBankAcc.No.NP_569054、アミノ酸211~437及び438~709と置き換えることによって、MT5420キメラタンパク質を生成した。ヒトアミノ酸の位置437~708をマウスTLR3のアミノ酸マウスTLR3、GenBankAcc.No.NP_569054、アミノ酸438~709で置き換えることによって、MT6251キメラを生成した。すべてのコンストラクトを、標準的なクローニング手法を用いてpCEP4ベクターLifeTechnologies,Carslbad,CAで生成させた。各タンパク質をHEK293細胞内でV5-His6C末端融合タンパク質として一過性に発現させ、実施例1で述べたようにして精製した。mAbc1068。mAbc1068は、高親和性のヒトTLR3ECDに結合したが、マウスTLR3にはよく結合しなかった。c1068は、MT5420及びMT6251の両方に結合する能力をなくし、これは、結合部位が、WTヒトTLR3タンパク質のアミノ酸437~708内に位置することを示していた。mAb12QVQ/QSV。mAb12QVQ/QSVは両方のキメラに結合したが、このことはmAb12QVQ/QSVの結合部位が配列番号2に示される配列を有するヒトTLR3タンパク質のアミノ酸1~209内に位置していることを示している。インシリコタンパク質-タンパク質ドッキング。mAb15EVQ以下参照の結晶構造及び公開されたヒトTLR3構造Bellら、J.EndotoxinRes.12:375~378、2006は、ドッキングのための出発モデルとして使用するために、CHARMm中でエネルギー最小化されたBrooksら、J.Computat.Chem.4:187~217、1983。タンパク質ドッキングは、ZDOCK2.1Chen及びWeng、Proteins51:397~408,2003と同様のZDOCKpro1.0アクセルリス社Accelrys、カリフォルニア州サンディエゴにより6°の角度グリッドで行った。ヒトTLR3Asn52、70、196、252、265、275、291、398、413、507及び636における既知のN結合型グリコシル化部位Asn残基Sunら、J.Biol.Chem.281:11144~11151、2006は、ZDOCKアルゴリズムのエネルギー項により抗体-抗原複合インターフェースに加わることを阻止された。2000個の最初のポーズを出力してクラスター化し、ドッキングポーズをリファインしてRDOCKで再スコアリングを行ったLiら、Proteins53:693~707,2003。最初のZDOCKスコアが最も高かった200個のポーズ及びRDOCKの上位200個のポーズを視覚的に調べた。Fab15EVQの結晶化を20°Cで蒸気拡散法によって行ったBenvenuti及びMangani、NatureProtocols2:1633~51、2007。最初のスクリーニングは、96穴プレートでHydraロボットを使用してセットアップした。実験は、0.5μlのタンパク質溶液を0.5μlのリザーバ溶液と混合した液滴で構成した。液滴は90μlのリザーバ溶液に対して平衡化した。50mMのNaClを含む20mMTris緩衝液pH7.4中のFab溶液をAmiconUltra-5kDaセルを使用して14.3mg/mlにまで濃縮した。スクリーニングは、WizardIIIエメラルドバイオシステムズ社EmeraldBiosystems、ワシントン州ベインブリッジアイランド及びインハウス結晶化スクリーンによって行った。Fab12QVQ/QSVを類似の方法で結晶化させた。X線回折データを収集し、Osmic商標VariMax商標共焦光学系、Saturn944CCD検出器、及びX-stream商標2000低温冷却システムを備えたRigaku、MicroMax商標-007HFs微小焦点X線発生装置Rigaku,Woodlands,TXを使用して処理した。回折強度を、1/2°の像当たり120秒の露光時間で270°結晶回転にわたって検出した。X線データをDTREKプログラムリガク社Rigakuにより処理した。構造は、Phaser又はCNXプログラムアクセルリス社Accelrys、カリフォルニア州サンディエゴを使用して分子置換法によって決定した。すべてのデータを用いて、原子位置及び温度因子をREFMACによりFab15EVQに対して15~2.2Å及びFab12QVQ/QSVに対して50~1.9Åの分解能範囲で精密化した。水分子は、3σのカットオフレベルを使用して、Fo-Fcの電子密度ピークにて加えられた。全ての結晶学的計算は、CCP4プログラムスイートCollaborativeComputationalProject、Number4.1994.CCP4suite:programsforproteincrystallography、ActaCrystallogr.D50:760~763で行われた。COOTプログラムEmsleyら、ActaCrystallogr.D60:2126~2132、2004を使用して、モデル調整を行った。解像されたmAb15EVQの結晶構造は、抗体結合部位が重鎖の多数の負に帯電した残基D52、D55、E99、D106及びD109によって特徴付けられることを示すものであった。したがってmAb15EQVとTLR3との間の認識には、正に帯電した残基が関与している可能性が高いと考えられた。行ったタンパク質-タンパク質ドッキングシミュレーションは、複数の正に帯電した残基を含むTLR3上の2個の大きなパッチが、抗体に対して優れた相補性を示すことを示唆するものであった。シミュレートしたTLR3-抗TLR3抗体複合体の界面内のTLR3上の残基は、R64、K182、K416、K467、Y468、R488、R489及びK493であった。突然変異誘発実験単一及び組合わせの突然変異をTLR3ECDの、上記でmAb12及びmAb15EVQのエピトープを含んでいることが特定された領域内の表面残基に導入し、突然変異タンパク質を抗体結合について試験した。ヒトTLR3のアミノ酸1~703ECDをコードするヌクレオチド配列配列番号4、GenBank受諾番号NP_003256を標準的なプロトコールを用いてクローニングした。表5aに示されるオリゴヌクレオチドを用い、製造者のプロトコールに従ってStrategeneQuickchangeIIXLキットStratagene,SanDiego,CAを使用して、すべての変異体を、部位特異的な変異の誘導によって作製した。突然変異はDNAの配列決定によって確認した。タンパク質はCMVプロモーターの制御下で、HEK293細胞内でC末端HIs-タグ融合タンパク質として発現させ、実施例1で述べたようにして精製した。結合アッセイヒトTLR3に対するmAb12QVQ/QSV及びmAb15EVQの結合活性及び生成された変異体をELISAによって評価した。プロセスを促進するため、mAb15EVQの結合が予想される部位についての変異体を、mAb12QVQ/QSVと共にC末端Hisタグを含むTLR3ECD変異体と、HEK細胞にコトランスフェクトすることで同時発現させた後、金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。回収された試料は、TLR3突然変異体とmAbとの複合体であった。このアプローチは、mAb12QVQ/QSV及びmAb15EVQの結合部位が互いに離れており、したがって一方の部位における点変異が他方の部位のエピトープに影響する可能性が低いことから実行可能であった。これらの複合体をELISA結合アッセイで使用した。PBSに加えた20μg/ml野生型TLR3ECD又は突然変異タンパク質を各ウェル当たり5μlずつ、MSDHighBindプレートメソスケールディスカバリー社MesoScaleDiscovery、メリーランド州ゲイザースバーグにコーティングした。プレートを室温で60分間インキュベートし、ブロッキングした。MSDBlockerA緩衝剤MesoScaleDiscovery、Gaithersburg、MD中で4°Cにて一晩。翌日、プレートを洗浄し、MSDSulfo-タグ標識したmAb15EVQを500pM~1pMの濃度で1.5時間添加した。洗浄後、MSDRead緩衝液Tを使用して標識抗体を検出し、SECTORImager6000を使用してプレートを読み取った。ヒトTLR3及び変異体に対するmAb12QVQ/QSVの結合活性を評価するため、mAb15EVQと同時発現させ、検出抗体を標識mAb12QVQ/QSVとした以外はmAb15EVQについて述べたのと同様にして結合ELISAを行った。mAb12QVQ/QSV:mAb12QVQ/QSVの結合部位は、セグメント交換実験において決定されたようにヒトTLR3タンパク質のアミノ酸1~209内に位置が特定された。以下のTLR3突然変異体について評価を行った。すなわち、D116R、N196A、N140A、V144A、K145E、K147E、K163E、及びQ167A。野生型TLR3及びV144A変異体は、mAb12QVQ/QSVに対して同等の結合性を示した図6A。抗体はTLR3D116R突然変異体には結合せず、K145E突然変異体に対しては大幅に低い結合親和性を示した。したがって、TLR3上で近接して配置されている残基D116及びK145は、mAb12QVQ/QSVに対する中心的なエピトープ部位と特定された図7A。mAb12QVQ/QSV結合エピトープの2つの重要な残基は、TLR3のエクトドメインのN末端セグメントの本差RNA結合部位の面の近くに位置が特定されているPirherら、NatureStruct.Mol.Biol.、15:761~763、2008。完全なエピトープは隣接領域に、実施した突然変異分析によっては明らかにされなかった他の残基を含むと考えられる。いずれの理論に束縛されることも望むものではないが、mAb12QVQ/QSVがそのTLR3エピトープに結合すると、TLR外部ドメインへの2本鎖RNAの結合に直接的又は間接的に干渉することにより、受容体の2量化及び下流のシグナル伝達経路の活性化が妨害されるものと考えられる。mAb15EVQ:以下のTLR3突然変異体について評価を行った:R64E、K182E、K416E、Y465A、K467E、R488E、R489E、N517A、D536A、D536K、Q538A、H539A、H539E、N541A、E570R、K619A、K619E、2重突然変異体K467E/Y468A、3重突然変異体T472S/R473T/N474S、及び3重突然変異体R488E/R489E/K493E。野生型TLR3、R64E、K182E、K416E突然変異体及び3重突然変異体T472S/R473T/N474Sは、mAb15EVQに対して同等の結合性を示した図6B及び表5b。抗体は、TLR3突然変異体K467E、R489E、K467E/Y468A及びR488E/R489E/K493Eには結合しなかった図6B及び6C。残りの変異体は中間的な結合性を示し、R488Eが最も高い作用を示した。これらの変異体のすべてがmAb12QVQ/QSVに結合した。これらの結果は、残基K467及びR489がmAb15EVQエピトープの重要な決定因子であることを示すものである。残基R488もエピトープに寄与した。これらの残基は、TLR3の同じ表面上に近接して配置されていた図7A。この結果はまた、いずれもK467、R488及びR489と同じ表面上に位置する残基Y465、Y468、N517、D536、Q538、H539、N541、E570、及びK619がエピトープに寄与することを示している。この結果は、mAb15EVQを用いたH/D交換実験によって更に支持された。図7Aは、mAb12QVQ/QSV及び15EVQ黒に対する結合エピトープ部位と、C1068mAb灰色に対する結合エピトープ部位とがヒトTLR3の構造上で重なっていることを示している。mAb15EVQに対するエピトープは、残基Y465、K467、Y468、R488、R489、N517、D536、Q538、H539、N541、E570、及びK619の範囲にわたっている。H/D交換実験H/D交換に関して、抗体摂動を解析するのに使用される手順は、いくつかの変更を加えて先述のものHamuroら、J.Biomol.Techniques14:171~182、2003;Hornら、Biochemistry45:8488~8498、2006と類似していた。組換えTLR3ECDC末端Hisタグを付加してSf9細胞で発現させて精製したものを重水素化水溶液中で所定の時間インキュベートして、交換可能な水素原子に重水素を取り込ませた。重水素化TLR3ECDを、固定されたmAb15EVQを含むカラムで捕捉した後、水性緩衝液で洗った。逆交換したTLR3ECDタンパク質をカラムから溶出し、重水素含有フラグメントの局在性をプロテアーゼ消化及び質量分析により調べた。基準コントロールとして、TLR3ECD試料を、抗体カラムで捕捉した後に重水素化水と接触させてから実験試料と同様にして洗浄及び溶出した点を除いて同様に処理した。抗体と結合する領域は比較的交換から保護される部位であり、そのため、基準TLR3ECD試料と比較して高い割合の重水素を含むものと推測された。タンパク質の約80を特定のペプチドにマッピングすることができた。mAb15EVQによるTLR3ECDのH/D交換の攪乱のマップを図7Bに示す。分かりやすさのために、TLR3の、mAb15EVQに影響される部分の周囲のセグメントのみを示した。TLR3ECDのアミノ末端及びカルボキシル末端に延びるタンパク質の残りの部分は大きく影響されなかった。H/D交換実験により、配列番号2のペプチドセグメント465YNKYLQL471、514SNNNIANINDDmL526及び529LEKL532が、mAb15EVQとの結合によってTLR3上の交換が特に変化する領域として特定された。その性質上、H/D交換は線形マッピング法であり、ペプチド内のどの残基が抗体結合によって最も影響されるかを定義することは通常できない。しかしながら、H/D交換と変異の結果が大きく重なっていることは、図7Aに示される表面がmAb15の結合部位であることの更なる確証を与えるものである。この結合部位は、mAbc1068について過去に述べられているもの国際公開特許第06/060513A2号と同じ直線状アミノ酸配列領域内にあったが、まったく重ならない表面図7A上に位置することが判明し、これらの抗体間で交差競合が見られないことと一致する。mAb15EVQ結合エピトープは、TLR3上のC末端セグメントにてdsRNA結合部位に空間的に近位であったBellら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:8792~8797、2006;Ranjith-Kumarら、JBiolChem、282:7668~7678、2007;Liuら、Science、320:379~381、2008。いずれの特定の理論に束縛されることも望むものではないが、mAb15EVQがそのTLR3エピトープと結合すると、リガンドである2本鎖RNA分子及び/又は2量体のもう一方との立体障害を生じ、リガンドの結合及びリガンドによって誘導される受容体の2量化が妨げられるものと考えられる。実施例7熱安定性が向上した変異体の作製結晶構造に基づいた機能改変を行って高い熱安定性を有する抗体の変異体を作製すると同時に、生物学的活性を維持して免疫原性を最小に抑えることを試みた。mAb15EVQを機能改変用に選択した。免疫原性を最小に抑えるため、構造的考慮に基づいて有益であることが予想される生殖細胞の突然変異のみを行った。mAb15EVQのVL及びVHの配列それぞれ配列番号41及び配列番号216を、BLASTサーチを使用してヒト生殖細胞の遺伝子と並べた。識別された一番近い生殖細胞系配列は、VH及びVLに関して、それぞれGenBankAcc.No.AAC09093及びX59318であった。生殖細胞のVH及びVLとmAb15EVQのVH及びVL配列との間で以下の違いが特定された。すなわち、VHV34I、G35S、F50R、A61S、及びQ67H;VLG30S、L31S、及びA34N。特定された配列の違いをmAb15EVQの結晶構造上にマッピングし、パッキング及び界面相互作用を変化させることが予測される残基を機能改変用に選択した。抗体の結晶構造実施例6を参照に基づいて、構造を不安定化させる可能性のある残基を特定した。1VHのコア内のV34の近くに小さな包囲空洞が特定された。この空洞は、Ile等のわずかに大きい側鎖に対応するのに十分大きかった。2VHCDR3のE99は、H結合ネットワークなしに、VH/VL界面にて埋め込まれていた。E99の負に帯電したカルボキシレート基は概ね疎水性環境にあり、周囲の残基と主としてファンデルワールスvds接触状態にあった。荷電基を埋め込むことは、通常はエネルギー的に好ましくなく、したがって不安定化作用をもたらす。3VHのF50は、VH/VLの界面残基である。その芳香族側鎖は嵩張るため、ペアリングに悪影響を及ぼしうる。Fvの水素結合及びvdwパッキングネットワークを計算し、Pymolにより視覚的に調べたwww://_pymol_org。VH及びVLドメイン内の埋め込まれた空洞はCaverPetrekら、BMCBioinformatics,7:316,2006によって計算した。分子のグラフィック図はすべてPymolで作製した。QuickChangeIIXL部位特異的突然変異誘発キットストラタジーン社Stratagene、カリフォルニア州サンディエゴ、Change-IT多重突然変異部位特異的突然変異誘発キットユーエスビー社USBCorporation、オハイオ州クリーブランド、又はQuickChangeII部位特異的突然変異誘発キットストラタジーン社、カリフォルニア州サンディエゴを使用し、標準的なクローニング法によって実施例3で述べたようにして作製したFabフラグメント又はIgG4完全ヒト抗体をコードした発現ベクターに突然変異を導入した。反応を、それぞれの製造者の推奨に従って行った。得られたクローンの配列を、確認のために配列決定し、得られた機能改変された変異体を、改変された重鎖又は軽鎖に従ってmAbs15-1-15-10と命名した。各変異鎖H又はLは、野生型mAb15EVQL又はH鎖で発現して抗体を生成したが、mAb15-10の重鎖は、mAb15-6からであった。CDRの配列番号、軽鎖及び重鎖の可変領域、並びにmAb15EVQの完全重鎖及び軽鎖並びにその人工変異体のリストを、表6に示す。表7は、各変異体の作製用のプライマーを示す。TLR3に対するmAb15-1~15-9の結合性をELISA免疫アッセイによって評価した。ヒトTLR3ECD100μLの2μg/mLTLR3ECDを黒色のMaxisorbプレートeBioscienceに4°Cで一晩結合させた。プレートを洗ってブロッキングし、希釈した抗体をウェル上に各ウェル当たり50μlで2重に一定分量に分配した。プレートを穏やかに振盪しながら室温で2時間インキュベートした。発光POD基質RocheAppliedScience、Mannheim、Germany、Cat.No.11582950001及びヤギの抗ヒトFc:HRPJacksonImmunoResearch、WestGrove、PA、Cat.No.109-035-098を使用して結合が検知され、SpectraMaxプレート読取器MolecularDevices、Sunnyvale、CAでプレートを読み取った。DSC実験を、MicroCalの自動VP-キャピラリーDSCシステムMicroCal,LLC,Northampton,MAで行って、基準細胞と試料細胞との間の温度差を継続的に測定して出力単位に較正した。試料は10°C~95°Cまで60°C/時の加熱速度で加熱した。前走査時間は15分とし、フィルタリング時間は10秒間とした。DSC実験で使用した濃度は約0.5mg/mlである。得られたサーモグラムの分析はMicroCalOrigin7ソフトウェアマイクロカル社MicroCalLLCを用いて行った。作製した変異体の熱安定性TmをDSCによって測定した表8。TLR3に対する抗体の変異体の結合性は親抗体の結合性と同等であった。実施例8代理抗TLR3抗体の作製実施例1で作製したヒト化抗体がマウスTLR3に対して充分な特異性もアンタゴニスト活性も有さなかったことから、ここではmAb5429と命名するキメラアンタゴニストであるラット/マウス抗マウスTLR3抗体を作製して様々なインビボモデルにおいてTLR3シグナル伝達を阻害する作用について評価を行った。この代理キメラmAb5429及びその親ラット抗マウスTLR3抗体c1811はインビトロ及びインビボでマウスのTLR3シグナル伝達を阻害し、いくつかのマウスの疾患モデルにおいて発症機構を改善した。以下に考察するデータは、有害な炎症の誘発及び持続化におけるTLR3の役割を示唆するものであり、例えば、高サイトカイン血症、喘息及び気道炎症、炎症性腸疾患及び関節リウマチ、ウイルス感染、及びII型糖尿病などの急性及び慢性の炎症状態におけるTLR3アンタゴニスト及びTLR3抗体アンタゴニストの治療的使用の根拠を与えるものである。代理mAb5429の作製通常の方法を用いて生成させた、遺伝子組み換え型マウスTLR3の外部ドメイン配列番号162のアミノ酸1~703、GenBankAcc.No.NP_569054により、CDラットに免疫性を与えた。マウスTLR3に特異的な抗体力価を示す2匹のラットのリンパ球を、FO骨髄腫細胞に融合させた。マウスTLR3に反応性のモノクローナル抗体のパネルを識別し、マウスルシフェラーゼレポーター及びマウス胎仔線維芽細胞アッセイにおいてインビトロアンタゴニスト活性に関して試験した。ハイブリドーマ株C1811Aを更なる研究のために選択した。機能する可変領域遺伝子をハイブリドーマによって分泌されるmAbc1811から配列決定した。次いで、クローニングされた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子をプラスミド発現ベクターにそれぞれ挿入し、mAb5429と表示されるキメララット/BalbCmuIgG1/κmAbを常法によって作製するためのコード配列を得た。抗体を実施例3で述べたようにして発現させた。mAb5429の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号164及び配列番号163にそれぞれ示し、重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号166及び配列番号165にそれぞれ示す。mAbc1811の重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号168及び配列番号167にそれぞれ示す。mAb5429の特性評価mAb5429を、TLR3シグナル伝達に対する中和能力について一連のインビトロアッセイにおいて特性評価した。活性のアッセイ及び結果を以下に述べる。マウスルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイマウスTLR3のcDNA配列番号161、GenBankAcc.No:NM_126166をマウス脾臓cDNABDBiosciences,Bedford,MAからPCRによって増幅し、標準的な方法を用いてpCEP4ベクターLifeTechnologies,Carslbad,CAにクローニングした。200μLのHEK293T細胞を、完全DMEM中、4×104細胞/ウェルの濃度で96穴白色透明底プレートに播種し、30ngのpNF-kBホタルルシフェラーゼStratagene,Carslbad,CA又は30ngのpISREホタルルシフェラーゼBDBiosciences,Bedford,MA、5ngのphRL-TKコントロールウミシイタケルシフェラーゼPromegaCorp.,Madison,WIレポータープラスミド、1.5ngの完全長マウスTLR3をコードするpCEP4、及び13.5ngの空のpcDNA3.1ベクターLifeTechnologies,Carslbad,CAを使用して、翌日Lipofectamine2000InvitrogenCorp.,Carslbad,CAを用いて全DNA量を50ng/ウェルとし、トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの24時間後、細胞を37°Cで30分~1時間、抗マウスTLR3抗体と新鮮な無血清DMEM中でインキュベートした後、0.1又は1μg/μlのポリI:Cを加えた。24時間後にDual-Gloルシフェラーゼアッセイシステムプロメガ社Promega、ウィスコンシン州マディソンを使用してプレートを収穫した。相対的な光量単位を、FLUOstarOPTIMA多重検出リーダーを使用し、OPTIMALソフトウェアベーエムゲーラブテック社BMGLabtechGmbH、ドイツにより測定した。標準化された値ルシフェラーゼ比はホタルの相対光量単位RLUをウミシイタケのRLUで割ることによって得た。mAb5429、並びにその親mAbc1811及びmAb15表3aは、用量依存的にポリI:C誘発NF-kB及びISRE活性化を低下させ図8A及び8B、TLR3の活性を中和するこれらの抗体の能力が実証された。ISREアッセイにおいて測定されたIC50は、mAb5249、mAb15及びmAbc1811についてそれぞれ0.5、22、及び0.7μg/mlであった。マウス胚性線維芽細胞MEFアッセイC57BL/6MEF細胞をアーティスオプティマス社ArtisOptimusより入手したOpti-MEF商標C57BL/6-0001。細胞を、200μlのMEF培地glutamax、10熱失活FBS、1×NEAA、及び10μg/mlゲンタマイシンを加えたDMEM中、96穴平底プレートビーディーファルコン社BDFalconに20000細胞/ウェルで播種した。インキュベーションはすべて、37°C/5CO2で行った。播種の24時間後に、mAb5429又はmAbc1811を各ウェルに加えた。プレートをmAbと1時間インキュベートした後、各ウェルにポリI:Cを1μg/mlで加えた。24時間のインキュベーションの後、上清を回収した。ビーズキットInvitrogenCorp.,Carslbad,CAを用い、サイトカインレベルを定量して、CXCL10/IP-10を製造者のプロトコールに従って検出した。結果をGraphPadPrismソフトウェアを使用してグラフ化した。いずれの抗体もポリI:C誘発CXCL10/IP-10レベルを用量依存的に低下させ、これらの抗体が内因性のTLR3を中和してTLR3シグナル伝達を阻害する能力が実証された図9。フローサイトメトリー-表面染色各群10匹ずつのC57BL/6及びTLR3ノックアウトマウスTLR3KOC57BL/6バックグラウンド;雌、8~12週齢、エースアニマルズ社AceAnimal,Inc.に1mlの3チオグリコレート培地シグマ社Sigmaを腹腔内投与し、96時間後にマウスを安楽死させ、各マウスからの腹膜を10mlの滅菌PBSで洗浄した。チオグリコレートにより腹膜に誘導されたマクロファージをPBS中に再懸濁し、細胞の生存率をTrypanBlue染色によって評価した。細胞を遠心してペレットとし、250μlのFACS緩衝液PBS-Ca2-Mg2、1熱失活FBS、0.09アジ化ナトリウムに再懸濁し、濡れた氷上に保持した。CD16/32試薬イーバイオサイエンス社eBioscienceを10μg/106細胞で10分間使用してマクロファージ上のFc受容体をブロッキングした。細胞を100μl/ウェル中、106細胞で分配して表面染色を行った。Alexa-Fluor647モレキュラープローブズ社MolecularProbes-接合mAbc1811及びmAb1679TLR3特異性を有さないことからアイソタイプコントロールとして用いられるラット抗マウスTLR3抗体を0.25μg/106細胞で加え、氷上、暗所で30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、250μLのFACS緩衝液に再懸濁した。生存率染色として7-AADビーディーバイオサイエンシーズ社BDBioscience、マサチューセッツ州ベッドフォードを5μl/ウェルで30分を超えないように加えた後、FACSCaliburで試料を取得して死細胞集団を検出した。試料はCellQuestProソフトウェアを使用してFACSCaliburによって採取した。FCSExpressを使用して収集したデータをヒストグラムを作成することによって分析した。C57BL/6及びTLR3KOマウスからのマウスチオグリコレート誘発腹腔マクロファージへのmAbc1811の結合がフローサイトメトリーにより評価されて、結合特異性が判定された。このキメラ抗体のマウスFc領域は非特異性結合に寄与することが予想されたため、mAb5429は、このアッセイには使用されなかった。mAbc1811は、TLR3KOマクロファージへの結合を示さず、C57BL/6腹腔マクロファージの組織表面への結合が増大したが、これは、TLR3に対するmAbの特異性を示唆する表10。mAbc1811と同じ結合領域を有するmAb5429は、mAbc1811と同じ結合特異性を有することが推測される。実施例9TLR3抗体アンタゴニストはTLR3媒介性全身性炎症から防御する。モデルポリI:C誘発全身性サイトカイン/ケモカインモデルをTLR3媒介性全身性炎症のモデルとして用いた。このモデルでは、腹腔内投与したポリI:CPICにより、TLR3によって一部媒介される全身性のサイトカイン及びケモカイン応答を誘導した。雌C57BL/6マウス8~10週齢又は雌TLR3ノックアウトマウスC57BL/6バックグラウンド;8~10週齢、エースアニマルズ社AceAnimalsIncに、mAb5429を0.5mlのPBS中、10、20又は50mg/kgで、mAbc1811を、0.5mlのPBS中、2、10又は20mg/kgで、又は0.5mlのPBSを単独溶媒コントロールで皮下に投与した。抗体投与の24時間後、マウスに、0.1mlのPBSに加えた50μgのポリI:Cアマシャム社Amershamカタログ番号26-4732、ロット番号IH0156を腹腔内投与した。ポリI:Cチャレンジの1及び4時間後に後眼窩より血液を採取した。全血より血清を調製してLuminexによりサイトカイン及びケモカインの濃度について分析した。結果腹腔内投与されたポリI:Cは、TLR3ノックアウト動物においてケモカイン及びサイトカイン群の産生が大幅に低減されたことによって示されるように、TLR3によって一部介在される全身性のサイトカイン及びケモカイン応答を誘導した表9A。TLR3依存性のポリI:C誘導型メディエーターは、ポリI:Cポストチャレンジ1時間では、IL-6、KC、CCL2/MCP-1及びTNF-αであり、ポリI:Cポストチャレンジ4時間では、IL-1α、CCL5/RANTES及びTNF-αであった。mAbc181及びmAb5429は両方とも、これらのTLR3依存性メディエーターのレベルを大幅に下げたが、これは、抗体がインビボでTLR3シグナル伝達を下げる能力を立証するものである表9B。表9の値は、6つの動物/群の平均サイトカイン又はケモカイン濃度±標準誤差をpg/mlで示している。これらのデータは、TLR3の拮抗作用が、サイトカインストーム又は致死的ショックなどの状態における過剰なTLR3介在サイトカイン及びケモカインレベルを低減させるうえで有用となり得ることを示唆するものである。実施例10TLR3抗体アンタゴニストは気道過敏症を軽減する。モデル気道過敏症をポリI:Cによって誘発させた。雌C57BL/6マウス12週齢又は雌TLR3ノックアウトマウスC57BL/6バックグラウンド;12週齢、AceAnimals,Inc.をイソフルランで麻酔し、50μLの滅菌PBS中のポリI:Cを数回投与量10~100μgで鼻腔内投与した。各投与の間に24時間の休止時間を置いてポリI:C又はPBSを3回マウスに投与した。最後のポリI:C又はPBSの投与の24時間後に、全身プレチスモグラフィーブクスコシステム社BUXCOsystemを用いて肺機能及びメタコリンに対する気道過敏症を測定した。マウスを全身プレチスモグラフチャンバに入れ、少なくとも5分間順応させた。ベースラインの読み取りの後、増加する量の霧状化したメタコリンシグマ社、ミズーリ州セントルイスにマウスを暴露した。霧状化メタコリンを2分間投与した後、5分間のデータ収集時間、その後、10分間の休止時間を置いた後、メタコリンの用量を増大させた後続のチャレンジを行った。空気流の抵抗の増加をエンハンストポーズEnhancedPausePenhとして測定し、5分間の記録時間にわたった平均のPenh値として表したブクスコシステム社。肺機能の測定の後、マウスを安楽死させ、肺にカニューレを挿管した。肺に1mlのPBSを注入し、流出液を回収することによって気管支肺胞洗浄BALを行った。肺組織を切除して凍結した。BAL液を遠心1200rpm、10分し、細胞を含まない上澄み液を回収して、解析を行うまでの間-80°Cで保存した。細胞ペレットを200μlのPBSに再懸濁して全細胞計数及び分画別の細胞計数を行った。製造者のプロトコール及びMultiplexImmunoassayキットMillipore,Billercia,MAに従って多重アッセイを行った。結果過去の観察により、ポリI:Cの鼻腔内投与はマウスの肺機能にTLR3によって介在される障害を誘発し、全身プレチスモグラフィーBUXCOにおけるベースラインのエンハンストポーズPenH測定値が高くなり、霧状化されたメタコリンに対する応答性が高くなることが示されている国際特許公開第06/060513A2号。肺機能のこうした障害は、肺への好中球の動員、及び肺における炎症性サイトカイン/ケモカインのレベルの上昇をともなった。この実験では、肺機能におけるポリI:C誘発障害におけるmAb1811及びmAb5429の作用を、ポリI:Cチャレンジに先立ってそれぞれの抗体を50mg/kgで皮下投与することによって評価した。TLR3によって媒介される肺機能の障害は、ポリI:Cチャレンジに先立って動物をTLR3抗体アンタゴニストで処置することによって大幅に軽減された。抗TLR3抗体で処置された動物ではTLR3によって介在される、ベースラインPenH及びメタコリンに対する気道の感受性の増大を防止した図11。更に、抗TLR3抗体で処置した動物ではTLR3によって介在される、マウスの肺への好中球の動員及び気道におけるケモカインの生成を低減した。好中球の数図12及びCXCL10/IP-10のレベル図13は、回収した気管支肺胞洗浄液BALFから測定した。この実験を少なくとも3回繰り返して同様の結果を得た。図11、12、及び13に示されるデータは、1つの代表的な実験からのものである。各記号は1匹のマウスからのデータポイントを表し、横棒線は群の平均を示す。この実験によって、使用したモデルにおいて全身投与されたTLR3抗体アンタゴニストが肺に達し、TLR3によって媒介される肺機能の障害、気道内への好中球の浸潤、ケモカインの生成及び気道の炎症を軽減したことが示された。したがって、TLR3アンタゴニストは、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患COPD、及び嚢胞性線維症などの、気道過敏症によって特徴付けられる呼吸器疾患の治療又は予防に有用でありうる。実施例11TLR3抗体アンタゴニストは炎症性腸疾患から防御する。モデルDSS大腸炎モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。雌C57BL/6マウス8週齢未満又は雌TLR3ノックアウトマウスC57BL/6バックグラウンド;8週齢未満で体重16.5g~18g、AceAnimals,Incにγ線照射した餌を1日目から与えた。DSS硫酸デキストランMPBiomedicals,Aurora,OH,カタログ番号160110;35~50kDa;18~20イオウ,ロット番号8247Jを、オートクレーブにかけた酸性化した飲料水中で5の最終濃度まで希釈した。DSS水を5日間投与し、その後DSS水をただの水に置き換えた。マウスには実験全体を通じて自由に水を飲ませた。すべての水ボトルの重量を毎日測定して水の消費量を記録した。0、2、及び4日目にマウスに5mg/kg0.1mLPBSに0.1mgを加えたのmAb5429、マウス抗TNF-α抗体、又はコントロールとしてのPBSを腹腔内投与した。マウスを実験の全体を通じて毎日監視し、0~4日目及び7日目に体重を測定した。マウスを実験の2日目及び7日目に安楽死させた。腹腔を開き、上行結腸を盲腸と接合する位置で切断した。結腸を採取し、10中性緩衝ホルマリン中で固定した。結腸をパラフィンに埋め込み、薄片にスライスし、HE染色カルテックモレキュラーラブズ社QualtekMolecularLabs、カリフォルニア州サンタバーバラした。下記に述べるように獣医病理学者によって盲検により結腸の組織病理学的評価を行ったパソメトリクス社PanthoMetrixカリフォルニア州サンホセ。組織病理学的評価大腸、結腸、及び直腸の2つの切片を評価し、以下の変化についてスコア化した。すなわち、i単一の細胞の壊死、ii上皮の潰瘍形成、iii上皮の脱落、iv陰窩腫瘍、v細胞増殖、vi陰窩細胞増殖、vii粘膜固有層における肉芽組織形成、viii粘膜下組織における肉芽組織、ix粘膜下炎症細胞の浸潤物、好中球優勢、及びx粘膜下浮腫。重篤度の単一の全体的スコアを以下の基準に基づいて与えた。すなわち、0-所見を認めず。1-軽度、限局性、又は時折認められる。2-軽度、多病巣である。3-中度、頻繁だが限定された領域に認められる。4-重度、提供された組織の多くの領域又は広範囲に頻繁に認められる。5-極めて重度、提供された組織の大部分に拡がっている。結果過去の観察によれば、TLR3ノックアウト動物は、DSSの摂取によって誘発された炎症性腸疾患のモデルにおいて野生型マウスと比較して大幅に軽減された組織病理学的所見を示すことが実証されており国際特許公開第06/60513A2号、このことはTLR3シグナル伝達がこのモデルにおける病因に一定の役割を果たすことを示唆するものである。壊死細胞から放出される片利共生的細菌性RNA又は哺乳類RNAが内因性リガンドとして作用して、TLR3シグナル伝達を刺激し得ることが報告されておりKarikoら、Immunity23165~2311752005;Karikoら、J.Biol.Chem.279:12542~125502004、したがって、胃腸内の内因性リガンドによるTLR3刺激は、DSS大腸炎モデルにおける炎症を増進持続させ得る。化合物組織病理学スコア図14によって評価されるように、DSSに曝露した動物における疾患重篤度は、抗TLR3抗体による処置によって改善された。図14は、疾患重篤度スコアについて平均、標準偏差及び95信頼区間を横棒線として示している。抗TLR3抗体で処置した野生型のDSS曝露動物では、非処置の野生型動物と比較してスコアの有意な低下が認められたp<0.05。DSSに曝露したTLR3ノックアウト動物は、DSSによって誘発される変化から防御された。抗マウスTNF-αmAbを投与したDSS曝露動物では、DSSモデルにおいて組織病理学的所見の改善は認められなかった。したがって、DSSモデルは、抗TNF-αによる治療に応答しないヒト患者集団を対象とする治療法の評価において有用であり得、抗TLR3抗体を中和することは、抗TNF-αによる治療に応答しない炎症性腸疾患の患者にとって利益となる可能性を有すると考えられる。モデルT細胞移植モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。このモデルでは、免疫応答能のあるマウスから得た制御性T細胞を含まないナイーブT細胞腸粘膜の抗原提示細胞を攻撃するの集団を移植することによって、SCIDマウスに腸の炎症を誘発した。ナイーブT細胞CD4CD45RBhighT細胞をSCIDレシピエントに腹腔内注射することによって慢性大腸炎を誘発した。マウスに、PBS500μL/マウス、腹腔内投与;溶媒コントロール、mAb54290.1mg/マウス、腹腔内投与、又は抗TNF-α抗体0.05mg/マウス、腹腔内投与;ポジティブコントロールのいずれかを、T細胞の移植48時間後から開始して毎週2回、8週間の実験期間全体を通じて投与した。T細胞の移植から8週間後又はマウスが初期の体重の15以上を失った時点に、動物を安楽死させて結腸を取り出した。結腸を固定し、パラフィンに埋め込んでHE染色した。組織病理学的所見細胞浸潤、陰窩腫瘍、上皮びらん、杯細胞喪失、及び腸壁の肥厚を盲検的に定量的に評価した。結果コントロール動物と比較した場合の組織病理学的スコアの合計の有意な低下p<0.05図15Aによって評価されるように、疾患重篤度は、T細胞移植を受けた動物において抗TLR3抗体による処置に応じて改善された。スコアの合計には、陰窩腫瘍、潰瘍形成、好中球流入、杯細胞喪失、異常陰窩、粘膜固有層の炎症、及び経壁併発を評価した。陰窩腫瘍、潰瘍形成、及び好中球流入では有意な低下が認められたいずれもp<0.05図15B。抗TNFα抗体を、最適な効果を与えることが知られている用量でポジティブコントロールとして用いた。DSS及びT細胞移植モデルという2つの広く知られた炎症性腸疾患のモデルを用いた実験により、全身投与されたTLR3抗体アンタゴニストは腸粘膜に達し、2つの異なる病因機構によって誘発された消化管の炎症を軽減させることが実証された。したがって、TLR3アンタゴニストは、抗TNFα不応性の症例及び消化管の他の免疫介在性の病態を含む炎症性腸疾患の治療に有益であると考えられる。実施例12TLR3抗体アンタゴニストはコラーゲン誘発関節炎から防御する。モデルコラーゲン誘発関節炎CIAモデルを関節リウマチのモデルとして用いた。雄B10RIIIマウス6~8週齢、ジャクソンラボラトリーズ社JacksonLabsを1群当たり15匹関節炎群及び1群当たり4匹コントロール群の群に分けた。関節炎群をイソフルランで麻酔し、II型コラーゲン、及び結核菌Difcoを添加したフロイントの完全アジュバントを0及び15日目に投与した。12日目にII型コラーゲン誘導関節炎を発症したマウスを体重により治療群にランダム化し、mAb542925mg/kg、ネガティブコントロール抗体としてCVAMマウスに既知の特異性を示さない組換えmAb5mg/kg、又は抗TNF-α抗体5mg/kg、ポジティブコントロールを、12、17、及び22日目d12、d17、d22に皮下投与SCした。更に、マウスのコントロール群に溶媒PBS又はデキサメタゾン0.5mg/kg、Dex、基準化合物を12~25日目まで毎日QD皮下投与SCした。動物を12~26日まで毎日観察した。前足及び後足を臨床スコアシステム下記に示すによって評価した。実験26日目に動物を安楽死させ、組織病理学的所見を盲検的に評価した下記にスコアシステムを述べる。有効性評価は、動物の体重及び臨床的関節炎スコアに基づいて行った。すべての動物が実験終了時まで生存した。前足及び後足の臨床的スコア基準0-正常1-後足又は前足関節が冒されるか、わずかなびまん性紅斑及び腫脹。2-後足又は前足関節が冒されるか、軽度のびまん性紅斑及び腫脹。3-後足又は前足関節が冒されるか、中度のびまん性紅斑及び腫脹。4-顕著なびまん性紅斑及び腫脹又は4本の指の関節が冒される。5-足全体に重篤なびまん性紅斑及び重篤な腫脹、指を曲げられない。II型コラーゲン関節炎を有するマウス関節の組織病理学的スコアリング方法II型コラーゲン関節炎の病変を有するマウスの足又は足関節をスコア化する場合、変化の重篤度及び冒された個々の関節の数を考慮する。中手骨/中足骨/指又は足根骨/脛足根骨の多数の関節の可能性のうち、1~3個のみの足又は足関節の関節が冒されている場合には、変化の重篤度に応じて下記のパラメータの1、2又は3の最大スコアが任意に与えられる。2個よりも多い関節が関与している場合には、最も重く冒された/大多数の関節に下記の基準を適用する。足スコアの臨床データは、1~15日目についてAUCによて分析し、コントロールからの阻害率を計算した。炎症0-正常1-冒された関節の滑膜及び関節周囲組織への炎症細胞の最小の浸潤。2-足の場合には冒された関節に限定された軽度の浸潤。3-足の場合には冒された関節に限定された中度の浸潤。4-大部分の領域を侵す、顕著な浮腫をともなう顕著な浸潤。5-重篤な浮腫をともなう重篤なびまん性浸潤。パンヌス0-正常1-軟骨及び肋軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤。2-冒された関節の硬組織の周辺帯の破壊をともなう浸潤。3-冒された関節の中度の高組織破壊をともなう中度の浸潤。4-大部分の関節で顕著な関節構造の破壊をともなう顕著な浸潤。5-全体的又はほぼ全体的な関節構造の破壊をともなう重篤な浸潤がすべての関節を冒す。軟骨の傷害0-正常1-冒された関節に明らかな軟骨細胞の損失もコラーゲン破壊も認めない、トルイジンブルー染色の最小~軽度の損失。2-トルイジンブルー染色が軽度に損傷を受けている。冒された関節に限局性の軽度表在性の軟骨細胞の損失及び/又はコラーゲン破壊が認められる。3-冒された関節に多病巣性の中度深部又は中間層の軟骨細胞の損失及び/又はコラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の中度の損失。4-大部分の関節に多病巣性の顕著な深部~深層軟骨細胞の損失及び/又はコラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の顕著な喪失。5-すべての関節に多病巣性の重度深部~タイドマークの軟骨細胞の損失及び/又はコラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の重度の喪失。骨吸収0-正常1-小さい範囲の吸収が認められ、最小の程度に生じている。低倍率では容易に確認できず、冒された関節に破骨細胞をほとんど認めない。2-より多くの範囲の吸収を認める軽度。低倍率では容易に確認できず、冒された関節により多くの破骨細胞を認める。3-皮質の厚さ全体の欠損をともなわない髄様骨梁medullarytrabecular及び皮質骨の明らかな吸収が、中度に生じている。一部の髄様骨梁が損傷し、病変が低倍率で明瞭に確認できる。冒された関節により多くの破骨細胞が認められる。4-残存する皮質表面の断面の歪みをしばしばともなう、皮質骨の厚さ全体の欠損が、顕著な程度に生じている。髄様骨の顕著な損失、多数の破骨細胞が認められる。大部分の関節が冒されている。5-皮質骨の厚さ全体の欠損及びすべての関節の関節構造の破壊が認められる。重度。結果デキサメタゾンDex及び抗マウスTNF-α抗体をポジティブコントロールとして用い、PBSを溶媒コントロールとして用い、CVAMをネガティブコントロール抗体として用いた。すべての処置は、実験の12日目の関節疾患が進行する間に開始した。溶媒で処置した疾患コントロール動物では疾患発症率は実験22日目までに100となった。溶媒又はCVAM抗体で処置したネガティブコントロール群では臨床スコアは最も高かった。Dexd18~d26についてp<0.05、5mg/kgの抗TNF-α抗体d18~26についてp<0.05、又は25mg/kgのmAb5429d18~d23及びd25~d26についてp<0.05で処置した各群では有意に低い臨床スコアが認められた図16。曲線下面積AUCとして表した臨床的関節炎スコアは、25mg/kgのmAb5429低下率43、5mg/kgの抗TNF-α抗体52、又はDex69による処置により、溶媒コントロールと比較して有意に低下した。図17は、各群についてAUCの平均及び標準偏差を示す。各処置の組織病理学的作用についても評価を行った。足の骨吸収は、25mg/kgのmAb5429低下率47による処置によって溶媒コントロールと比較して有意に低下した。5mg/kgの抗TNF-α抗体で処置したポジティブコントロールマウスでは、足の炎症33、軟骨傷害38、及び合計した足スコア37は有意に低下した。Dexによる処置によって、足の組織病理学的パラメータのすべてが有意に低下した合計スコアにおいて73の低下率。これらのデータは、TLR3抗体アンタゴニストが、CIAモデルにおいて臨床的及び組織病理学的疾患症状を改善することを示すものであり、関節リウマチの治療におけるTLR3アンタゴニストの使用を示唆するものである。実施例14TLR3抗体アンタゴニストは急性致死性ウイルス感染から防御する。モデルインフルエンザAウイルスチャレンジモデルを急性致死性ウイルス感染のモデルとして使用した。1、4、8及び12日目に雌C57BL/6マウス12週齢又は雌TLR3ノックアウトマウスC57BL/6バックグラウンド;12週齢、ACEAnimals,Inc.、1群当たり15匹のマウスに20mg/kgのmAb5429、又はPBS単独を皮下投与した。0日目にイソフルランでマウスを麻酔し、インフルエンザA/PR/8/34ウイルスATCC、Rockland、MD、ロット番号218171を25μLのPBSに加えたもの10555CEID50に相当を鼻腔内投与した。動物を体重変化及び生存率について1日2回、14日間の期間にわたって観察した。臨床的スコアリングシステムを用いて疾患の進行のレベル及びインフルエンザAウイルス治療に対するわずかな改善を評価した。臨床スコア0-正常、機敏で反応性があり、目に見える病気の兆候が認められない。1-毛皮が逆立っている、歩行のわずかな低下が認められるか、又は認められない。2-歩行時に背中が曲がっている、歩行をいやがる、呼吸困難である。3-毛皮が逆立っている、呼吸困難である、運動失調、震えが生じている。4-毛皮が逆立っている、そっと突いても歩行不可能、意識不明、触れると冷たく感じる。5-死亡。結果この実験では、生存率、毎日の臨床スコア、及び体重変化を評価した。mAb542920mg/kgを投与したインフルエンザA感染野生型マウス及びmAb5429を投与しないインフルエンザA感染TLR3ノックアウトマウスのいずれも、インフルエンザウイルスを接種したC57BL/6マウスと比較して生存率が統計的に有意に増大したそれぞれp<0.001及びp<0.01が、このことは、TLR3の阻害又は欠損がインフルエンザによって誘発される死を予防しうることを示すものである図18。臨床スコアは、20mg/kgのmAb5429を投与した群、及びTLR3ノックアウト群において有意に低下した図19。マウスの体重をインフルエンザウイルス投与後14日間にわたって観察した。インフルエンザAウイルスを投与したC57BL/6マウスでは体重は安定的に減少した。しかしながら、20mg/kgのmAb5429を投与したC57BL/6マウス及びTLR3ノックアウトマウスのいずれも、インフルエンザウイルスを接種した野生型C57BL/6マウスに対して有意に大きな体重を示した図20。これらの結果は、TLR3抗体アンタゴニストが急性致死性インフルエンザウイルス感染モデルにおける臨床症状及び死亡率を低下させることを示すものであり、TLR3アンタゴニストが急性の感染状態にあるヒトに防御を与えることを示唆するものである。実施例15TLR3抗体アンタゴニストは高血糖を改善し、血症インスリンを低下させる。モデル食餌誘発肥満DIOモデルを高血糖及びインスリン抵抗性、並びに肥満のモデルとして用いた。C57BL/6野生型動物約3週齢、ジャクソンラボラトリーズ社JacksonLabs及びTLR3ノックアウト動物C57BL/6バックグラウンド;約3週齢、エースアニマルズ社AceAnimalIncを高脂肪の食餌に12~16週間維持した。TLR3ノックアウト及び野生型C57BL/6マウスの両方に、通常の固形飼料又は60.9kcalの脂肪及び20.8kcalの炭水化物からなる高脂肪食餌PurinaTestDietカタログ番号58126のいずれかを与えた。マウスは、水及び食餌を自由摂取させ、12時間/12時間の明暗サイクルに維持した。各群の各マウスの体重を毎週測定した。mAb5429を第1週に週2回、その後は週1回全体で7週間腹腔内投与した。空腹時に後眼窩から採取した血清試料を、示した時点でのインスリンの測定に用いた。7週目に一晩絶食させた後、1.0mg/g体重のグルコースを腹腔内投与することによって耐糖試験を行った。更に、空腹時のインスリン及びグルコースレベルを測定した。以下の式を用いて、空腹時グルコースレベル及びインスリンレベルに基づきHOMA-IRを式から求めた。すなわち、HOMA-IR=空腹時グルコースmmol/l×空腹時インスリンmU/l/22.5Wallaceら、DiabetesCare27:1487~1495,2004。空腹時血中グルコース血糖値BGをグルコースオキシダーゼアッセイによって求めた。空腹時インスリンレベルをインスリンラット/マウスELISAキットCrystalChem、cat.No.90060を使用して求めた。結果12~16週間の高脂肪の食餌の後、野生型DIO動物は高血糖及び高インスリンとなった。mAb5429による処置により、野生型DIO動物では耐糖能が改善したがTLR3ノックアウトDIO動物では改善が見られなかった。グルコースチャレンジの60、90、120及び180分後に、mAb5429で処置した動物においてコントロールPBSのみと比較して有意に低い血中グルコースレベルが観察された図21A。mAb5429で処置した野生型DIO動物では、mAbを投与しない野生型DIOマウスと比較してAUCの約21の低下が観察された。mAb5429で処置した野生型DIO動物では空腹時インスリンレベルも低下した図22。TLR3ノックアウトDIO動物では、mAb5429による処置により空腹時インスリンに改善は認められなかった。インスリン抵抗性指数HOMA分析は、mAb5429で処置した野生型DIO動物においてインスリン感受性の改善を示したが、TLR3ノックアウトDIO動物では改善を示さなかった。HOMA-IR価は、WTDIO、5mg/kgのWTDIOmAb5429、及び20mg/kgのWTDIOmAb5429動物に関して、それぞれ14.0±9.8、8.7±4.9、9.0±3.0であった。TLR3ノックアウトDIO動物では何らの効果も認められなかった。この実験により、TLR3抗体アンタゴニストがDIOモデルにおいて体重の損失をともなわずにインスリン抵抗性を改善し、空腹時グルコースを低下させることが示されたが、このことは、TLR3アンタゴニストが高血糖症、インスリン抵抗性、及びII型糖尿病の治療に有用でありうることを示唆するものである。実施例16TLR3抗体アンタゴニストは細菌及びウイルス誘発炎症反応から防御する。試薬細菌性増悪のCOPD患者から単離された分類不能型ヘモフィラスインフルエンザHNTHi株35をDr.T.F.MurphyBuffaloVAMedicalCenter、Buffalo、NYより入手した。ヒトライノウイルス16をアメリカ培養細胞系統保存機関ATCCよりTCID50=2.8×107/mlのものを入手した。NTHi刺激アッセイNHBE細胞ロンザ社Lonza、メリーランド州ウォーカーズビルをMicrotest96穴組織培養プレートビーディーバイオサイエンシーズ社、マサチューセッツ州ベッドフォードに1×105/ウェルで播いた。寒天プレート上で16~20時間増殖させたNTHiを増殖培地に約2×108cfu/mlで再懸濁し、100μg/mlのゲンタマイシンで30分間処理してから約2×107/ウェルでNHBEを含む96穴プレートに加えた。3時間後に上澄み液を除去し、抗体0.08~50μg/mLの最終濃度を添加又は非添加の新鮮な増殖培地に交換した。更に24時間インキュベートした後、細胞上澄み液中のサイトカイン及びケモカインの存在を、Luminex100IS多重蛍光分析器及びリーダーシステムLuminexCorporation,Austin,TXでサイトカイン25重ABビーズキット、ヒトIL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL12p40p70、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、エオタキシン、RANTES及びMCP-1を含むによって3重にアッセイした。ライノウイルス刺激アッセイNHBE細胞をMicrotest96穴組織培養プレートビーディーバイオサイエンシーズ社、マサチューセッツ州ベッドフォードに1×105細胞/ウェルで播いた。翌日、抗体0.08~50μg/mlの最終濃度をNHBE又はBEAS-2B細胞に加えて1時間インキュベートした後、10μl/ウェルのライノウイルスを加えた。更に24時間アッセイした後、細胞上清中のサイトカイン及びケモカインの存在について上記に述べたようにluminexアッセイによってアッセイを行った。結果mAb15EVQが、NTHiにより誘導されたIP-10/CXCL10及びRANTES/CCL5の産生を用量依存的に阻害したのに対して、コントロール抗体であるヒトIgG4シグマ社ミズーリ州、セントルイスはNTHiによる刺激に対して阻害作用を示さなかった図23A。mAb15EVQは、ライノウイルスにより誘導されたCXCL10/IP-10及びCCL5/RANTESの産生も阻害した図23B。実施例17TLR3抗体アンタゴニストは星状細胞における炎症反応を抑制する。方法2人のドナーから得た正常なヒト星状細胞ロンザ社Lonza、メリーランド州ウォーカーズビルを24穴プレートに75,000細胞/ウェルで播き、一晩付着させた。翌日、星状細胞を200ng/mLのポリI:C及び/又は10μg/mLのmAb18で24時間処理した。サイトカインをLuminexによって測定した。結果表10に示すように、ポリI:Cにより誘導されたIL-6、IL-8、IL-12、IFN-α、IFN-γ、CXCL9/MIG、CCL3/MIP-1a、CCL4、CCL5/RANTES及びCXCL10/IP-10の産生はmAb18によって阻害された。実施例18TLR3抗体アンタゴニストは上皮細胞における炎症反応を抑制する。方法HUVEC細胞ロンザ社、メリーランド州ウォーカーズビルをロンザ社の推奨する血清含有増殖培地中で培養した。細胞を無血清培地ロンザ社、メリーランド州ウォーカーズビルに再懸濁し、96穴プレートに3×105細胞/mlで播き、37°C、5CO2で24時間インキュベートした。ポリI:CGEHealthcare、Piscataway、NJを増大する濃度1.5~100μg/mlで加え、37°Cで更に24時間培養した。サイトカイン阻害アッセイに関しては、mAb15EVQを様々な濃度0~50μmlで細胞に加え、30分間培養し、その後、20μg/mlのポリI:Cを24時間加えた。細胞上澄み液を回収し、ヒトサイトカイン30重キット及びLuminexMAP技術InvitrogenCorp.,Carslbad,CAを用いてサイトカインレベルを測定した。sICAM-1の発現を測定するため、HUVEC細胞を20μg/mlのポリI:C及び異なる濃度のmAb15EVQ0.8~50μg/mlで処理した。細胞上清をELISAアールアンドディーシステムズ社RDSystemsによりsICAM-1の発現について分析した。細胞の生存率をCellTiterGloキットプロメガ社、ウィスコンシン州マディソンにより測定した。結果HUVEC細胞は、ポリI:Cに応答して次のサイトカインを産生した:IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-6、IL-7、CXCL8/IL-8、IL-12p40/p70、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CXCL10/IP-10、CCL5/RANTES、CCL2/MCP-1、VEGF、G-CSF、FGF-basic、及びHGF表11。mAb15EVQは、ポリI:Cにより誘導される全サイトカインのレベルを用量依存的に低下させた表12。ポリI:Cにより誘導されるTNF-α、CCL2/MCP-1、CCL5/RANTES、及びCXCL10/IP-10の産生を低下させるmAb15EVQの能力は、TLR3により媒介される活性の阻害が、アテローム性動脈硬化症につながりうる白血球及びT細胞の浸潤に対する防御を与えうることを示唆するものである。更に、mAb15EVQによるVEGFの阻害は、各種の癌及び加齢性黄斑変性などの眼疾患における脈管形成を含む、VEGFによって媒介される病態におけるTLR3の遮断の潜在的な効果を示唆するものである。TNF-α及びIFN-γは白血球の動員において機能するとともに、活性化された内皮上の接着分子の発現を増大させるDoukasら、Am.J.Pathol.145:137~47、1994;Poberら、Am.J.Pathol.133:426~33、1988。CCL2/MCP-1、CCL5/RANTES及びCXCL10/IP-10は、単球及びT細胞の動員に関与していることが示されており、アテローム性動脈硬化症の発症に寄与するLundgergら、Clin.Immunol.2009。内皮細胞によるVEGFの生成は、各種の癌において脈管形成時の異常な組織増殖又は腫瘍との関連が示されているLivengoodら、Cell.Immunol.249:55~62、2007。可溶性細胞内接着分子1sICAM-1はタンパク質切断によって生成し、内皮細胞活性化のマーカーである。ICAM-1は白血球の遊走及び活性化において重要な役割を有し、炎症時に内皮細胞及び上皮細胞において発現が上昇して、インテグリン分子LFA-1及びMac-1を介した白血球への接着を媒介する。ポリI:Cは、内皮細胞を活性化してsICAM-1の発現を上昇させたが、この発現上昇はmAb15EVQによる処理によって低減した図24A。このことは、TLR3抗体アンタゴニストが白血球のトラフィッキング、したがって炎症細胞の流入によって引き起こされる組織障害を阻害しうることを示すものである。生存率アッセイを行うため、上記で述べたようにHUVECを培養、播種し、ポリI:Cで刺激した。mAb15EVQはポリI:Cにより誘導されたHUVEC細胞の生存率の低下を用量依存的に回復させた図24B。内皮細胞の活性化の下方調節は、過剰な免疫細胞の浸潤を抑制し、炎症状態において増加するサイトカインによって引き起こされる組織障害を低減させうる。炎症及び内皮細胞におけるサイトカイン及び接着分子の過剰発現は、アテローム性動脈硬化症及び高血圧の発症の主要な寄与因子である。これらのデータは、脈管炎及び内皮機能不全をともなう血管疾患などの血管の疾患におけるTLR3アンタゴニストの使用の潜在的な有用性を探求することの根拠を与えるものである。炎症及び過剰発現したサイトカインによって引き起こされる別の疾患として、免疫抑制患者及びHIV感染患者において一般的に見られ、カポジ肉腫ヘルペスウイルスKSHVによって引き起こされるカポジ肉腫KSがある。VEGF及びサイトカインの産生は、KS細胞の生存に寄与するLivengoodら、CellImmunol.249:55~62、2007。TLR3アンタゴニストは、KS及び他の腫瘍にともなう血管新生のリスクを低減するうえで有用であるばかりでなく、細胞生存率の低下を防止し、内皮バリアの完全性を保護することによって、臓器不全及び敗血症などの重篤な炎症状態にともなう潜在的に重大な状態である血管漏出を防止するうえでも有用であり得る。TLR3拮抗作用はまた、フラビウイルス科例えば、デング、黄熱病、フィロウイルス科エボラ、マールブルグ、ブニヤウイルス科例えば、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス、及びアレナウイルス科例えば、ルジョ出血熱、ラッサ出血熱、アルゼンチン出血熱、ボリビア出血熱、ベネズエラ出血熱Sihibamiyaら、Blood113:714~722、2009の要素が原因となるウイルス性出血熱などの内皮細胞の病変に関与するウイルス性感染症においても有益であり得る。実施例20TLR3抗体アンタゴニストのカニクイザル及びマウスTLR3との交叉反応性実施例2で述べたようにISREレポーター遺伝子アッセイを用いて、カニクイザル又はマウスTLR3に対する活性を評価した。カニクイザルのTLR3cDNA配列番号217及びマウスのTLR3cDNA配列番号161は、全血から増幅され、pCEP4ベクトルClontechにクローン化され、上述のように発現される。mAb15EVQは、ヒトTLR3NF-kBアッセイ及びISREアッセイにおけるそれぞれ0.44μg/ml及び0.65μg/mlのIC50と比較して、cynoNF-kBアッセイ及びISREアッセイにおいてそれぞれ4.18μg/ml及び1.74μg/mlのIC50を有していた。アイソタイプコントロール抗体はこれらのアッセイでは何らの作用も示さなかった。実施例21TLR3抗体アンタゴニストの治療用投与は、急性の致命的なウイルス感染症を防御する。実施例14は、インフルエンザA感染症に対するTLR3抗体アンタゴニストによる予防的な治療1、4、8、及び12日目に投与について述べている。この実施例は、TLR3抗体アンタゴニストの治療用投与インフルエンザA感染後臨床症状の発症3日後が生存率の向上において効果的であるということを実証している。モデル動物へのmAb5249の投与をインフルエンザAの感染後3日後に行ったこと、及び投与した動物が8週齢であったことを除いて、インフルエンザAウイルスチャレンジモデルを、実施例14に述べたように急性の致命的なウイルス感染症のモデルとして使用した。抗マウスIgG1アイソタイプコントロールmAbはBioLegendからのものであった。インフルエンザAの感染後3、7及び11日に動物に投与した。この実験では、生存率、毎日の臨床スコア、及び体重変化を評価した。mAb5249を投与したC57Bl/6マウス及びTLR3KOマウスは、抗マウスIgG1アイソタイプコントロールmAb及びインフルエンザウイルスを接種したC57BL/6マウスと比べて、両方とも生存率の統計的に有意な増加p<0.028及びp<0.001を示した図25。抗マウスIgG1アイソタイプコントロールmAb及びインフルエンザAを投与したC57BL/6マウスと比較した場合、mAb5249を投与したC57BL/6マウス及びTLR3KO動物において臨床的なスコアは低下し図26、体重は増加した図27。これらの結果は、TLR3抗体アンタゴニストが急性致死性インフルエンザウイルス感染モデルにおける臨床症状及び死亡率を低下させることを示すものであり、TLR3アンタゴニストが急性の感染状態にあるヒトに防御を与えることを示唆するものである。実施例22X線結晶法によるTLR3抗体アンタゴニストのエピトープ及びパラトープ。ヒトTLR3細胞外ドメインを、mAb15EVQ、mAb12QVQ/QSV及びmAbc1068のFabsと複合体の状態で結晶化させた。方法タンパク質の発現及び精製。TLR3ECD配列番号2のアミノ酸1-703の3つのFabの発現及び精製は上述の通りであった。TLR3ECDの3つのFabの四次複合体の作製1TLR3ECD:1.1Fabのモル比に対応させて、4mgのヒトTLR3ECDを2.4mgのそれぞれのFabと混合し、4°Cで3.5時間インキュベートした。複合体をアニオン交換クロマトグラフ法により20mMのTrispH8.5、10のグリセロール緩衝液Aで平衡化したMonoQ5/50GLカラムGEHealthcare,Piscataway,NJで精製し、20mMのTrispH8.5、10のグリセロール、1MのNaCl緩衝液Bにより溶離した。1.74mL中のほぼ2.48mgの複合体を緩衝液Aにより10mLまで希釈し、カラム上に1mL/minで充填し、B濃度の0~40の直線的な勾配により40カラム容積にわたって溶離した。5回の連続的な精製操作を行った。ピーク1由来の区分をプールし、Amicon-15mLのUltra-30000MWCO及びMicrocon30000MWCOにより20mMのTrispH8.5/27mMのNaCl/10グリセロール中に、14.49mg/mLまで濃縮した吸光係数:A2801mg/mL=1.31。結晶化Corningプレート3550CorningInc.,Acton,MAを用いて等容量のタンパク質及びリザーバ溶液を、シッティングドロップ法で分注するOryx4自動タンパク質結晶化ロボットDouglasInstrumentsを用いて、自動化結晶化スクリーニングを行った。初期のスクリーニングは、HamptonCrystalScreenHTHR2-130,HamptonResearch,AlisoViejo,CAにより実施した。いくつかの条件から、小さい結晶を使用してシードを生成し、次いでこれをMicroseed-MatrixScreeningMMSで使用した。小さい結晶を与える初期のスクリーニング条件に基づき、何回かの精密化を行った。MMSに使用するリザーバ条件は、精密化後に小さい結晶を与えた条件に基づくものであった:18~28のポリエチレングリコールPEG3350、1MのLiCl、pH4.5及び2.0~2.9MのNH42SO4、5のPEG400、pH4.5、及び探索したpH及び異なる添加物。成分を1タンパク質溶液:0.25シード原料:0.75リザーバ溶液の容量比で分注することにより、Oryx4自動タンパク質結晶化ロボットDouglasInstrumentsを用いて、MMS結晶化スクリーニングを行った。~10Åの分解能で回折する結晶は、0.1Mの酢酸NapH4.5、2.9MのNH42SO4、5メチル-ペンタン-ジオールMPD及び0.1Mの酢酸NapH4.5、26のPEG3350、1MのLiClから成長させたものであった。結晶の分解能を改善するための試みとして、上記の条件を有するMMSを、HamptonAdditiveScreenHR2-428HamptonResearch,AlisoViejo,CAから選択された成分を容積比:1タンパク質溶液:0.125シード原料:0.2添加物溶液:0.675リザーバ溶液で用いる、添加物スクリーニングと組み合わせた。MMSと、0.1Mの酢酸NapH4.5、28のPEG3350、1MのLiCl、及び30mMのGly-Gly-Glyを含有する溶液からの添加物スクリーニングとの組み合わせを適用した後、Fabと複合体形成し、約5Åの分解能で回折する、TLR3ECDのX線品質の結晶を得た。TLR3ECD四次複合体のX線データ収集X線データを収集するために、結晶サイズ約1.0×0.5×0.1mm3を、合成母液0.1Mの酢酸NapH4.5、28PEG3350、1MのLiCl、16グリセロール中に数秒浸漬し、窒素流中100Kで瞬間凍結した。X線回折データを収集し、Osmic商標VariMax商標共焦光学系、Saturn944CCD検出器、及びX-stream商標2000低温冷却システムを備えたRigakuMicroMax商標-007HF微小焦点X線発生装置Rigaku,Woodlands,TXを使用して処理した。回折強度を、1/2度の像当たり1minの露出時間、5Åの最大分解能で250°結晶回転にわたって検出した。X線データを、プログラムDTREKPflugrath,ActaCrystallographicaSectionD,55:1718~1725,1999により処理した。この結晶は、単位セルパラメータ:a=214.90Å、b=142.08Å、c=125.04Å、及びβ=103.17の単斜晶系空間群C2に属する。この非対称ユニットには1分子の複合体を含む。X線データ統計値を表13に示す。構造決定TLR3ECD-Fab15EVQ-Fab12QVQ/QSV-Fabc1068の結晶構造を、PhaserRead、ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.57:1373~1382、2001を用いて分子置換により決定した。探索モデルはTLR3ECDすべてのグルカンを取り除いた、タンパク質データバンクPDB構造番号1ziw,Choeら、Science309:581~585,2005であり、3つのFabの高分解能結晶構造を決定したこれらのFab構造に対する結晶データ及び精密化統計値の要約としては表13を参照のこと。Fab12QVQ/QSVのエルボー角度は、遊離形態におけるものから著しくはずれていることが判明した。エルボー角度を約5°間隔で調整することにより、一連のFab12QVQ/QSVモデルを生成し、その1つが電子密度とよく一致することが判明した。構造精密化は、PHENIXで行われたAdamsら、J.SynchrotronRadiat.11:53~55、2004。TLR3ECDに対して構造を、Fab及び13個の剛体セグメント精密化で使用される定義:30~60、61~108、109~156、157~206、207~257、258~307、308~363、364~415、416~464、465~514、515~570、571~618、619~687に対する剛体ドメイン各V又はCドメインとして、それぞれのFab剛体に対する1つのB因子及びTLR3ECD全体に対する単一のB因子によって精密化した。Fab剛体のそれぞれに対して並進/回転/回転を伴った並進TLS精密化を導入し、配列番号2の残基330において、TLR3ECDを2つのTLSセグメントに分割した。グリカン密度は15個のN-グリコシル化部位の10個に対して目視可能であった。次いで、ヒトTLR3細胞外ドメインChoeら、Science309:581-585,2005,PDB構造番号1ziwの結晶構造からの炭水化物モデルを付加した。TLR3ECD中の短い見えないセグメント配列番号2の残基337~342に対する密度が剛体の精密化後に目視可能となり、それは、TLR3細胞外構造2a0zからの対応するセグメントで充填されたBellら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:10976~10980、2005、PDB構造ID:2a0z。TLR3ECDのC末端は、2a0zの密度に一致する更なる密度を含んでいた。次いで、このセグメント配列番号2の647~703を2a0wの残基647~687により置き換えた。このように、TLR3ECDモデルは、TLR3構造体1ziwと2a0zとの間のハイブリッドであり、13個の剛体セグメントアミノ酸範囲:30~60、61~108、109~156、157~206、207~257、258~307、308~363、364~415、416~464、465~514、515~570、571~618、619~687として精密化されたものであった。Fab12QVQ/QSVのLCDR3は、遊離形態と異なる立体配置を見掛け上とっていた。マルチスタートシミュレーションアニーリングをPHENIXの標準的なパラメータにより行った。このLCDR3のモデルを電子密度マップで目視的に検査し、最もよく合う立体配置を元のモデル上に接合した。精密化のプロセスを、計算開始の前に脇に置いておいた反射の5に対してRfreeによりモニターした。最終回では、それぞれの残基に対して1つのB因子を含めた。モデル検査、並びにFab及びタンパク質-タンパク質界面における側鎖のエルボー領域の手動による再組立てを、COOTEmsleyら、ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:2126~32、2004を用いて行った。最終のRcryst及びRfreeは、5.0Å対する全15,792個の独立の反射のそれぞれについて26.8及び30.0であった。精密化統計値を表13及び14に示す。結果TLR3ECD-3つのFab四次複合体の分子構造複合体の全体的な分子構造を図28に示す。非対称単位中に1つのTLR3ECD及びそれぞれのFabの1分子が存在する。TLR3ECDに対する構造モデルは、huTLR3配列番号2の30~687個のすべての残基を含む。3つのFabに対しては、それぞれの非結合形からのすべての残基を、溶媒イオン及び水分子を除いて含めた。TLR3ECD分子は、全体のトポロジー1ziwに対して0.79Åのrms、613Cα’、及び2a0zに対して1.37Å、595Cα’において以前に報告された構造と極めて類似している。このFab構造は、方法に記載のFab12QVQ/QSVのLCDR3、並びにTLR3ECD/Fab界面におけるエルボー領域及び一部の側鎖を除いて、それぞれの非結合形とすべて同一である。エピトープ及びパラトープTLR3ECDと3つのFabとの間の結合に関与する残基を、図28Bに示す。Fab12QVQ/QSVはTLR3ECDのN末端近くで結合した。立体配置エピトープは、TLR3LRR3~7からの残基配列番号2のアミノ酸100~221から構成されるものであった。Fab12QVQ/QSVの結合は、抗原及び抗体上でそれぞれほぼ928Å2及び896Å2を埋め込んだ。Fab12QVQ/QSVに対しては、結晶構造は、次のTLR3配列番号2エピトープ残基:S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、T166、Q167、V168、S188、E189、D192、A195、及びA219を同定した。Fab12QVQ/QSVに対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基:軽鎖配列番号211:G28、S29、Y30、Y31、E49、D50、Y90、D91及びD92、重鎖配列番号214:N32、Q54、R56、S57、K58、Y60、Y104、P105、F106及びY107を同定した。Fab15EVQ及びFabc1068は、C末端近くのLRR15~23配列番号2のアミノ酸406~635に懸る、非折りたたみ型エピトープを結合していた図28。Fab15EVQは、抗原及び抗体上でそれぞれ1080Å2及び1064Å2を埋め込み、Fabc1068は抗原及び抗体上でそれぞれ963Å2及び914Å2を埋め込んでいた。Fab15EVQに対するエピトープは、配列番号2で示されるTLR3の残基K416、K418、L440、N441、E442、Y465、N466、K467、Y468、R488、R489、A491、K493、N515、N516、N517、H539、N541、S571、L595及びK619を覆う。Fab15EVQに対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基:軽鎖配列番号41:Q27、Y32、N92、T93、L94及びS95、重鎖配列番号216:W33、F50、D52、D55、Y57、N59、P62、E99、Y101、Y104及びD106を同定した。Fabc1068に対しては、結晶構造は、TLR3配列番号2上の次のエピトープ残基:E446、T448、Q450、R453、R473、N474、A477、L478、P480、S498、P499、Q503、P504、R507、D523、D524、E527、E530、及びK559を同定した。Fabc1068に対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基、軽鎖:H30、N31、Y32、N50、E66、S67、G68glyc、重鎖:T30、T31、Y32、W33、H35、E50、N52、N54、N55、R57、N59、V99、M102、I103、及びT104を同定した。中和の機構及びTLR3機能との関連mAb15EVQ:mAb15EVQエピトープは、TLR3残基N517、H539及びN541を含み、これらはC末端二本鎖RNA結合部位と重複するBellら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、103:8792~7、2006。いかなる特定の理論からも束縛されることを望むものではないが、このように、mAb15EVQは、リガンドに対して結合するTLR3に対して競合し、及びシグナル伝達単位の形成に必要とされる、リガンドにより誘起される受容体二量体化を防止すると考えられる。Liuら、Science320:379~81,2008。図29は、mAb15EVQに対するこの直接の競合機構を図示する。抗体濃度に依存して、この機構は、ポリI:Cの全阻害又は二本鎖RNAにより誘起されるTLR3活性化を生じる。mAb12QVQ/QSV及びmAbc1068:図30に示すように、これらの2つの抗体は二本鎖RNAリガンドとの直接的な衝突を持たない。したがって、これらがTLR3機能をmAb15EVQのそれに類似の機構で中和することはありえない。Fabフラグメントもリガンドから離れて配向する図30。構造的に、mAb12QVQ/QSV及びFabc1068は、両方とも機能を損なわずにシグナル伝達単位SUに結合することができる。立体的に、mAb分子の2つのFabフラグメントが、2つのTLR3分子を1つのSU中で同時に結合し、ひいては二本鎖RNA介在型TLR3二量体化を防止し得るということはありえない。いかなる特定の理論からも束縛されることを望むものではないが、TLR3へのmAb12QVQ/QSV又はmAbc1068の結合が、抗体と隣接するシグナル伝達単位との間の立体的な衝突により、シグナル伝達単位のクラスター形成を防止すると考えられる。二本鎖RNAへのTLR3の結合は、二本鎖RNA:TLR3複合体により定義されるシグナル伝達単位に限定されないLiuら、Science320:379~81,2008。多数のSUのクラスター形成がシグナル伝達の増強を生じる得、又は効率的なTLR3シグナル伝達がこのクラスター形成を必要とし得る。mAb12QVQ/QSV及びmAbc1068の配置が、クラスター形成をブロックし、TLR3活性の中和を生じることができる。それゆえ、抗体の最大中和効果は、抗体結合によるSUの分離の度合いに依存する。図30に図示するように、mAb12QVQ/QSVは、mAbc1068よりも大きい分離を引き起こし、このことがmAb12QVQ/QSVのより大きい効能に転換する可能性がある。このことは、mAbc1068及びmAb15EVQが、飽和濃度においてそれぞれ約50及び100のTLR3中和を生じることができ、mAb12QVQ/QSVが中間の活性を呈するという観察と一致する。このように、複合構造及びTLR3中和に関する研究は、dsRNA:TLR3シグナル伝達ユニットがクラスター化して効率的なシグナル伝達を達成するTLR3シグナル伝達モデルを示唆する。mAb12QVQ/QSV及びmAbc1068はまた、リガンド結合又は受容体の2量化を妨げずにある程度TLR3シグナル伝達を調節することができる抗体の部類を特徴付ける。実施例23TLR3が欠如すると、脂質のプロファイル及び肝臓脂肪症が改善される。モデルTLR3マウスは、Dr.RichardA.FlavellYaleUniversityから入手し、前述してあるShulman、J.Clin.Invest.106:171~6、2000。TLR3及び野生型WTの対照マウスC57BL/6の両方に、普通の餌、又は60.9kcalの脂肪及び20.8kcalの炭水化物からなる高脂肪食HFDPurinaTestDiet58126のいずれかを与えた。マウスは、水及び食餌を自由摂取させ、12時間/12時間の明暗サイクルに維持した。各マウスの重量は毎週測定され、データは、平均値±SDで示された。RNA単離及び組織学的分析のために、肝臓のサンプルを採った。臨床化学計器AlfaWassermannDiagnosticTechnologies、WestCaldwell、NJを使って、総コレステロールTC、HDL、LDL、及びトリグリセリドTGの血漿レベルを測定した。NEFAキットWakoChemicals、Richmond、VAを使って、遊離脂肪酸FFAレベルを測定した。製造者の推奨に従って、サンプルの調製及びアッセイを行った。TaqMan逆転写試薬キットLifeTechnologies、Carlsbad、CAを使って製造者のプロトコルに従い、総肝臓RNAをランダムへキサマーで逆転写した。TaqManプローブ及びプライマーは、LifeTechnologies、Carlsbad、CAから購入された。脂質及びグルコース代謝並びに炎症に関与した合計35の遺伝子が、遺伝子発現分析のために試験された。遺伝子発現の相対定量は、2-DeltaDeltaCt計算を用いて行われたArochoら、Diagn.Mol.Pathol.15:56~61、2006。組織学のために、肝臓を単離し、湿重量を測定した。肝臓サンプルを10の中性緩衝ホルマリン中に固定し、所定のパラフィン切片のために処理し、HE染色した。組織学的評価により、肝臓脂肪症のレベルを測定した。Mann-Whitney試験を用いて、統計的分析を行った。結果HFDを与えられた動物は、26週間のHFD後、高インスリン血症及び高血糖性であった14週間のデータ地点に関して実施例15を参照。脂質プロファイルは33週間で検査された。通常食のTLR3マウスは、WT対照と比較して、血漿TGは著しく下がったが、TC、HDL、LDL、表15及びFFAのレベルは、類似していた。33週間の高脂肪食では、WT対照動物の血漿TC、HDL、及びLDLレベルは上がったが、TLR3マウスはある程度保護された表15。肝臓の重量対応する体重に正規化されたは、HFDを与えられたWT動物のものと比較して、HFDを与えられたTLR3マウスではおよそ16、p<0.05減少した。組織学的分析は、WT動物と比較したときに、HFDを与えられたTLR3動物の脂質蓄積も肝実質において著しく減少したことを示した。脂質及びコレステロール代謝に関与する主要遺伝子、LXRα及びPPARδの肝臓発現は、WT動物と比較すると、HFDを与えられたTLR3マウスでは上方調節されそれぞれ30、p<0.05及び186、p<0.001、これは、TLR3が欠乏しているマウスにおける低脂質レベルと一致していた。LXRα標的遺伝子であるABCA1及びSREBP1も、これらの動物において上方調節されたそれぞれ71、p<0.01及び131、p<0.001。TLRシグナル伝達とLXRとの間のクロストークが報告されているCastrilloら、Mol.Cell.4:805~15、2003。コレステロール輸送体であるABCA1の上方調節は、HFDを与えられたTLR3マウスにおいてコレステロール輸送が改善されたことを示唆する。この実施形態で報告された研究により、野生型動物と比較すると、肥満症のTLR3が欠乏した動物の脂質及びコレステロールレベルが改善されたことが立証され、抗TLR3シグナル伝達が心臓血管疾患及び代謝性疾患のための有効な治療手段であることを示す。"