"非インスリン産生細胞を、Exendin-4、実質的にExendin-4に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、またはそのフラグメントからなる群より選択される増殖因子と接触させる工程を包含するプロセスによって作製される、インスリン産生細胞の集団。本発明の目的は、非インスリン産生細胞と、GLP-1またはExendin-4、GLP-1またはExendin-4に実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子とを接触させる工程を包含するプロセスにより作製されるインスリン産生細胞の集団を提供することによって、先行技術の有する上記の問題を克服または低減することである。さらに、非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞へと分化させる方法が提供され、この方法は、非インスリン産生細胞と、GLP-1またはExendin-4、GLP-1またはExendin-4に実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントとを接触させる工程を包含する。さらに、インスリン産生細胞の細胞集団を富化する方法が提供され、この方法は、細胞集団と、非インスリン産生細胞のインスリン産生細胞への分化を促進する増殖因子とを接触させる工程を包含する。1型糖尿病と診断された被験体において糖尿病を処置する方法もまた提供される。この方法は、少なくとも24時間にわたる連続注入によって、GLP-1またはExendin-4、GLP-1またはExendin-4に実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子を被験体に投与する工程を包含する。本発明はさらに、被験体における糖尿病を処置する方法を提供することにより先行技術を克服し、この方法は、以下を包含する:処置される被験体またはドナーから非インスリン産生細胞を得る工程;この非インスリン産生細胞と、上記の増殖因子とを接触させ、このことにより、非インスリン産生細胞のインスリン産生細胞への分化を促進する工程;および非インスリン産生細胞から分化するように促進されたインスリン産生細胞を、糖尿病被験体に投与する工程を包含する。本発明は、非インスリン産生細胞を、グルカゴン様ペプチド-1GLP-1、exendin-4、または関連したペプチドと接触させることにより、非インスリン産生細胞から分化したインスリン産生細胞の集団に関するものであり、さらに、インスリン産生細胞を得るための方法、および真性糖尿病の処置における治療的用途にも関するものである。それゆえ、本発明は、糖尿病の効果的な処置を提供するものである。特許請求の範囲において使用される場合、aは、1つ以上を意味し得る。本発明は、以下の工程を包含するプロセスにより作製される、インスリン産生細胞の集団を提供する:非インスリン産生細胞を、GLP-1またはExendin-4、実質的にこれらと相同であるアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子と接触させる工程。以前には、GLP-1レセプターを有すると考えられておらず、そしてインスリンを産生し得ると考えられていなかった非インスリン産生細胞一次腺房細胞、腺房細胞株例えば、AR42J、および幹細胞を含むは、GLP-1およびExendin4、実質的にこれらと相同であるアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントに対して、インスリン産生細胞へと分化することによって応答し得る。この効果は、インスリン産生細胞の数を増大することであり、これは、真性糖尿病の処置において望ましい効果である。本明細書中で使用される場合、インスリン産生細胞とは、インスリンを、構成的様式または誘導性様式で、合成するすなわち、インスリン遺伝子を転写し、プロインスリンmRNAを翻訳し、そしてこのプロインスリンmRNAをインスリンタンパク質へと修飾するか、発現するすなわち、インスリン遺伝子により保有される表現型特性を明らかにするか、または分泌する細胞外空間へとインスリンを放出する、細胞を包含する。公知のインスリン産生細胞の例としては、β細胞が挙げられる。このβ細胞は、インビボで膵島に位置する。インスリンを分泌するために、インスリン産生細胞はまた、IDX-1を発現しなければならない。本発明により産生されたインスリン産生細胞の集団は、本発明の方法の使用を伴わずにインスリンを産生する細胞例えば、β細胞または他の細胞型を含み得る。本発明の組成物および方法の新規性は、インスリンを自然に産生する集団の細胞例えば、β細胞の存在によって否定されない。インスリン産生細胞の集団はまた、非インスリン産生細胞も含み得ることもまた、意図される。非インスリン産生細胞とは、構成的または誘導的にインスリンを自然に合成せず、発現せず、もしくは分泌しない、いかなる細胞をも意味する。従って、本明細書中にて使用される用語非インスリン産生細胞は、β細胞を除外する。本発明の方法において使用され得る非インスリン産生細胞の例は、アミラーゼ産生細胞、腺房細胞、管状ductal腺癌細胞株の細胞例えば、CD18、CD11、およびCapan-I細胞Busikら、1997;Schaffertら、1997を参照のことのような膵臓性非β細胞、ならびに幹細胞を含む。非膵臓性細胞例えば、非膵臓性幹細胞および他の内分泌器官の細胞または外分泌器官の細胞例えば、下垂体性細胞が挙げられるもまた使用され得る。この非インスリン産生細胞は哺乳動物細胞であり得るか、またはさらにより具体的にはヒト細胞であり得る。哺乳動物の、膵臓性非島細胞、膵臓性アミラーゼ産生細胞、膵臓腺房細胞、および幹細胞を使用する本発明の方法の例を、本明細書中に提供する。幹細胞は、IDX-1、Beta2/NeuroDおよびE47を生産するように促進された膵臓性幹細胞および非膵臓性幹細胞を包含し得る。膵臓性幹細胞は、島細胞および腺房細胞の両方を生じる管上皮前駆細胞を含む。非インスリン産生細胞は、インスリン産生細胞へと分化させるために、GLP-1レセプターまたは実質的にGLP-1レセプターと類似するレセプターを有さなければならない。好ましくは、この非インスリン産生細胞はまた、増殖因子との接触において、細胞内カルシウムの増加およびERK/MARK活性およびPKCの活性化を示し得る。本願にて使用される場合、増殖因子は、非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞へと分化させ得る物質を意味する。好ましくは、この増殖因子は、インスリン産生性insulinotropic増殖因子の群のうちの1つであり、例えば、GLP-1、exendin-4、βセルリン、HepatocyteScatterFactorHSF、およびアクチビン-Aまたはそれらの組合わせが挙げられるが、βセルリンおよびアクチビンAの一緒の使用ならびにHSFおよびアクチビン-Aの一緒の使用は除外する。好ましくは、この増殖因子との接触において、10よりも多くの非インスリン産生細胞がインスリン産生細胞に分化し、そして、より好ましくは、少なくとも、約20、約30、約40、約50またはそれ以上の非インスリン産生細胞が、インスリン産生細胞に分化する。従って、本方法に従ってインビトロにて生成されるインスリン産生細胞の集団は、11程度の少なさおよび100までのインスリン産生細胞を包含し得る。GLP-1またはexedin-4に実質的に相同なアミノ酸配列とは、非インスリン産生細胞からインスリン産生細胞を分化する能力に関して、機能的活性の消失をほとんど伴わずに、GLP-1またはexedin-4と比較した場合に、GLP-1またはexedin-4のアミノ酸配列において一個以上の付加的アミノ酸、アミノ酸の欠失、または置換を含む、ポリペプチドを意味する。例えば、その欠失は、ここに定義されている分化活性に必要不可欠でないアミノ酸から成り得、そして置換一個または複数は保存的であり得るすなわち、塩基性、親水性または疎水性のアミノ酸が同じ性質をもつアミノ酸に代えて置換される。従って、所望される場合、修飾および変化がGLP-1およびExedin-4のアミノ酸配列にてなされ得、そして類似した特徴を有するタンパク質がなお得られ得ることが、理解される。従って、生物学的な有用性または活性の消失をほとんど伴わず、そしておそらくそのような有用性または活性の増加を伴う種々の変化が、GLP-1のアミノ酸配列またはExedin-4のアミノ酸配列または下線を引いた核酸配列においてなされ得ることが意図される。本明細書にて使用される用語フラグメントとは、GLP-1、Exedin-4またはこれらに実質的に相同的なアミノ酸配列を有する増殖因子に関して、GLP-1、Exedin-4またはそれらに実質的に相同的なアミノ酸配列を有する増殖因子のいずれかの、少なくとも五個連続したのアミノ酸のポリペプチド配列を意味し、ここでそのポリペプチド配列は、本明細書にて記載されるようなGLP-1およびExedin-4の分化機能を有する。このフラグメントは、抗原性、GLP-1レセプターへの結合、DNA結合転写因子の場合のように、RNA結合RNAの安定性または分解を調節する場合のようにを含み得るさらなる機能を有し得る。GLP-1の活性フラグメントとしては、例えば以下が挙げられる:GLP-17~36アミド。GLP-1の他のフラグメントおよび改変された配列は当該分野にて既知である米国特許No.5,614,492;米国特許No.5,545,618;欧州特許出願、公報No.EP0658568Al;WO93/25579。exendin-4の類似したフラグメントおよび改変された配列が、容易に推定され得る。GLP-1上付き文字の残基番号およびexedin-4括弧書きかつ上付き文字の残基番号内の以下の残基がフラグメントに含まれるべきであることが予期される。なぜならこれらの残基は、高度に保存されており、そしてレセプター結合に重要であるためである:H7、G10、F12、T13、D15。従って、さらなるフラグメントまたは改変された配列が、これら5個以外のGLP-1およびexendin-4のアミノ酸を除外または変更して容易に生成され得る。本明細書にて開示されている分化活性を評価するのは容易であるため、フラグメントが本発明の範囲内であることの決定は、慣用的である。本発明は、本明細書中に記載の方法によって作製されるインスリン分泌細胞の集団を提供する。IDX-1発現は、細胞からのインスリン分泌に必要とされるので、インスリン分泌細胞を作製するために使用され得る非インスリン産生細胞は、構成的にか、または増殖因子での刺激の際にか、あるいは非インスリン産生細胞の増殖因子での処理前、処理の間または処理後にIDX-1をコードする核酸を細胞にトランスフェクトすることによって、IDX-1を発現する細胞を含むべきである。本発明はまた、非インスリン産生細胞からインスリン産生細胞を分化させ得る増殖因子を提供する。このような増殖因子としては、GLP-1、Exendin-4、またはそれらに実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。分化は、非インスリン産生細胞の増殖因子との接触の際に、インビボまたはインビトロで生じ得る。この接触は、ボーラスによって1度であり得るか、連続注入によって1度であり得るか、またはボーラスまたは連続注入によって繰り返され得る。本発明はまた、非インスリン産生細胞からインスリン産生細胞を分化させる増殖因子のスクリーニング方法を提供する。より詳細には、このスクリーニング方法は、以下の工程を包含する:1スクリーニングされるべき増殖因子と非インスリン産生細胞とを接触させる工程、2インスリン産生細胞の特徴について、この非インスリン産生細胞を評価する工程、および3非インスリン産生細胞からインスリン産生細胞を分化させる増殖因子を同定する工程。インスリン産生細胞の好ましい特徴としては、インスリン遺伝子を転写する能力、インスリンmRNAを翻訳する能力、インスリンを放出または分泌する能力、インスリンを貯蔵する能力、グルコースレベルを感知する能力、および調節様式でインスリンを放出する能力が挙げられる。転写因子IDX-1、Beta2/NeuroDおよびE47の発現は、インスリンの産生に必要であると考えられるので、これらの因子はまた、本発明のインスリン産生細胞において、代表的に発現される。接触させるとは、生理学的に有効なレベルの物質に対する、細胞の細胞外表面の曝露の例を意味する。細胞は、例えば、増殖因子を培養培地に添加すること連続注入によるか、ボーラス送達によるか、またはその培地を増殖因子を含む培地に変更することによるによって、あるいはインビボで増殖因子を細胞内液体に添加すること局所送達、全身性送達、静脈内注射、ボーラス送達、または連続注入によるによって、増殖因子に接触され得る。細胞または細胞の群との接触の継続時間は、その物質この場合では、増殖因子が、培地中または細胞を浴する細胞外液体中で生理学的に有効なレベルで存在する時間によって、決定される。GLP-1は、数分の短い半減期を有し、そしてExendin-4の半減期は、実質的により長く、数時間のオーダーである。従って、GLP-1のボーラスは、数分間の細胞との接触を有するが、Exendin-4のボーラスは、数時間細胞に接触する。本発明の方法における接触工程は、インビトロで行われ得る。例えば、移植プロトコルにおいて、当該分野で周知の標準的なプロトコルGromadaら、1998を参照のことに従って、エキソビボ方法が使用され得、その結果、非インスリン産生細胞は、ドナー例えば、処置される被験体から除去され、そして体外で維持される。体外で維持される間、細胞は、増殖因子と接触され得、そして細胞は、その後、当該分野で周知の方法を使用して、ドナー被験体またはドナー被験体とは異なる被験体内に、注入例えば、受容可能なキャリア中でまたは移植され得る。あるいは、本発明の接触工程は、インビボで行われ得る。GLP-1、Exendin-4または関連の増殖因子を投与するための方法が、本明細書中に提供される。GLP-1、Exendin-4または関連の増殖因子は全身的に投与され、これには、例えば、以下によるものが含まれる:ポンプ、静脈内ライン、またはボーラス注射Gutniakら、1992;欧州特許出願公開番号0619322A2;米国特許第5,614,492号;米国特許第5,545,618号。ボーラス注射は、皮下経路、筋肉内経路または腹腔内経路を含み得る。非インスリン産生細胞は、GLP-1またはExendin-4、それらに実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、あるいはそれらのフラグメントとの約24時間の接触後に、インスリン産生細胞に分化し始める。最大数の細胞のインスリン産生細胞への分化は、通常は、約7日の接触後に生じた。興味深いことに、新しいインスリン産生細胞は、GLP-1またはExendin-4、そのフラグメントあるいは関連する増殖因子との接触が中断された後でさえ、インスリンを産生する能力を示し続ける。新しいインスリン産生細胞は、接触が中断された後少なくとも2週間まで、インスリンを産生する能力を示す。従って、この接触工程は、代表的に少なくとも24時間である。少なくとも24時間とは、24時間以上を意味する。詳細には、非インスリン産生細胞は、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60時間から、3、4、5、6、7日またはそれを越える日数の間、あるいは上記範囲内で数時間または数分の任意の特定の介入時間、増殖因子と接触され得る。好ましくは、非インスリン産生細胞は、7日間増殖因子と接触される。本発明のインビボまたはインビトロの方法およびプロセスにおいて使用されるべき、GLP-1、Exendin-4、それらの活性なフラグメントあるいは関連する増殖因子の用量は、好ましくは、連続投与について、約1pモル/kg/分~約100nモル/kg/分、およびボーラス注射について、約1nモル/kg~約40nモル/kgの範囲である。好ましくは、インビトロ方法におけるGLP-1の用量は、10pモル/kg/分~約100nモル/kg/分、およびインビボ方法において、約0.003nモル/kg/分~約48nモル/kg/分である。より好ましくは、インビトロ方法におけるGLP-1の用量は、約100ピコモル/kg/分~約10ナノモル/kg/分、およびインビボ方法において、約0.03ナノモル/kg/分~約4.8ナノモル/kg/分の範囲である。インビトロ方法におけるExendin-4の好ましい用量は、1pモル/kg/分~約10nモル/kg/分、およびインビボにおいて、ボーラス注射について約1pモル/kg~約400pモル/kgである。インビトロ方法におけるExendin-4のより好ましい用量は、約10pモル/kg/分~約1nモル/kg/分、およびインビボにおいて、ボーラス注射について約10pモル/kg~約40pモル/kgの範囲である。GLP-1またはExendin-4、それらに対して実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子と、非インスリン産生細胞とを接触させることを包含する、非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞に分化させる方法が提供される。非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞に分化させることにより、影響を受けた細胞が、少なくとも、インスリンを産生する表現型特徴を有するような、非インスリン産生細胞の表現型の特徴における変化が意味される。影響を受けた細胞は、β細胞の表現型特徴の全てを有し得るか、あるいはβ細胞の表現型の特徴の全て未満を有し得る。影響を受けた細胞は、インスリンを産生し得るが、それ以外に非インスリン産生細胞の表現型の特徴を維持し得る。例えば、GLP-1またはExendin-4と接触された非インスリン産生細胞例えば、膵アミラーゼ産生細胞すなわち、膵臓の腺房細胞、アミラーゼを発現し続け得るがアミラーゼ産生細胞の典型、代表的なアミラーゼ産生細胞とは異なり、インスリンもまた産生する。従って、完全な表現型の変化と単一の表現型の変化との間の連続性が可能である。実施例は、インスリン産生能が成熟した非インスリン産生細胞例えば、腺房細部に対して付与され得るという驚くべき結果を示す。非インスリン産生細胞の増殖の増加は、インスリン産生細胞への非インスリン産生細胞の分化に先行し得、そして分化は、インスリン産生の表現型への細胞の変化を伴う任意の増殖を除外することを意味しない。インスリンの分泌におけるIDX-1、Beta2/NeuroD、およびE27の重要性のために、本発明はまた、GLP-1、Exendin-4、または同様の増殖因子と非インスリン産生細胞とを接触させる前に、IDX-1、Beta2/NeuroD、および/またはE27をコードする核酸を、非インスリン産生細胞にトランスフェクトするさらなる工程を包含する、非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞に分化させる方法を提供する。あるいは、さらなる工程は、GLP-1またはExendin-4、あるいは同様の増殖因子と既に接触された細胞に、IDX-1、Beta2/NeuroD、および/またはE27をコードする核酸をトランスフェクトすることを包含し得る。この接触された細胞がインビボである場合、トランスフェクションは、膵臓の分泌管中へのIDX-1についてのプラスミドDNAの逆行性の灌流によって達成され得るGoldfineら、1997を参照のこと。さらに、いくつかの場合、IDX-1、Beta2/NeuroD、およびE47の発現は、非IDX発現細胞例えば、幹細胞を含むに対する特定のタンパク質の適用から生じ得る。本発明は、インスリン産生細胞の細胞の集団を富化する方法を提供し、この方法は、非インスリン産生細胞のインスリン産生細胞への分化を促進する増殖因子と上記の細胞の集団とを接触させることを包含する。このプロセスにより産生された細胞の集団は、多数のインスリン産生細胞に拡大され、そして本明細書中に記載される処置方法に使用され得る。本発明はさらに、インスリンおよびアミラーゼの両方を産生する膵アミラーゼ産生細胞を促進する方法を提供し、この方法は、GLP-1またはExendin-4、それらに対して実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子と、膵アミラーゼ産生細胞とを接触させることを包含する。この方法の例は、実施例に提供される。本発明はさらに、I型糖尿病と診断された被検体において、糖尿病を処置する方法を提供し、この方法は、少なくとも24時間の持続性注入によって、GLP-1、それらに対して実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子を被検体に投与することを包含する。あるいは、増殖因子は、Exendin-4、それらに対して実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択され得る。Exendin-4は、GLP-1と比べてかなり長い半減期を有するので、これは、少なくとも1回ボーラスにより投与され得る。この処置方法は、I型糖尿病を患う被検体の糖尿病を処置するために効果的である。なぜなら、増殖因子は、本明細書中に詳細に記載されるように、被検体の非インスリン産生細胞がインスリン産生細胞に分化することを促進するからである。本発明の被検体は、個々のヒト、飼育動物、家畜例えば、ウシ、ウマ、ブタなど、ペット例えば、ネコおよびイヌを含み得る。糖尿病によって、膵臓によるインスリン分泌の不全または非存在により特徴付けられる代謝性疾患である真性糖尿病が意味される。本明細書中で使用される場合には、本明細書中の他の箇所で記されない限り、糖尿病は、1型、2型、3型、および4型の真性糖尿病を含む。本発明はまた、被検体における糖尿病を処置する方法を提供し、この方法は、処置されている被検体からまたはドナーから非インスリン産生細胞を得ること;非インスリン産生細胞を増殖因子とインビトロで接触させ、それによってインスリン産生細胞への非インスリン産生細胞の分化を促進すること;ならびに非インスリン産生細胞から分化するように促進されたインスリン産生細胞を、糖尿病の被検体に投与することを包含する。上記の非インスリン産生細胞がドナー由来である、糖尿病を処置する方法において、このドナーは、死体であり得る。本発明のさらなる実施態様としては、非インスリン産生細胞は、増殖因子との接触の前に、インビトロで増殖することを可能にされ得る。好ましくは、インスリン産生細胞への非インスリン産生細胞の分化の促進は、インスリン産生細胞への非インスリン産生細胞の約20を超える分化を生じる。さらにより好ましくは、処理された細胞のうちの約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、または90よりも多くは、インスリン産生細胞に分化する。インスリン産生細胞への非インスリン産生細胞の分化により得られるインスリン産生細胞の表面抗原の変更は、インスリン産生細胞が免疫応答を引き起こす見込みを減少し得る。次いで、変更された表面抗原を有する細胞は、糖尿病の被検体に投与され得る。これらの細胞表面抗原は、非インスリン産生細胞がインスリン産生細胞へと分化する前、その間、または後に変更され得る。本発明はまた、内皮細胞を平滑筋細胞に分化させる方法を提供し、この方法は、GLP-1またはExendin-4、それらに対して実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子と内皮細胞とを接触させることを包含する。本発明は、ここで、以下の実施例を参照して例示される。培養されたインスリノーマ細胞中のGLP-1は、インスリン分泌、インスリン合成およびインスリンメッセンジャーRNAに陽性の影響を与えることが知られているために、GLP-1のウィスターラットの老化に対する効果を評価した。材料。GLP-1およびexendin[9-39]Ex、GLP-1のペプチドレセプターアンタゴニストをBachemKingofPrussia,PAから購入した。他に記載しない限り、化学試薬はSigmaStLouis,MOから購入した。動物。NIAのWistercolonyBaltimore、MDからの3ヵ月齢若齢および22ヵ月齢老齢ウィスターラットを使用した。それらを、ラット用固形飼料で飼育し、自由に食餌させた。全てのラットは、NIAで保持される10の創始ファミリーの子孫である。プロトコル。老齢の動物が、GLP-1に応答することが可能であることを保証するために、本発明者らは、GLP-1の静脈内ボーラスを用いた急性の実験を行った。6匹の老齢22ヶ月および6匹の若齢3ヶ月のウィスターラットを一晩絶食させた。50mg/kgのペントバルビタールでの麻酔後、血液サンプリングのためにカテーテルを大腿動脈に配置し、GLP-1のボーラス0.2nmol/kgを伏在静脈内に、30秒に渡って投与した。血液2、4、7および10分でとられたをインスリン測定のために採取した。ラットに、肩甲骨間の領域に、48時間の間、Alzetミクロ浸透性ポンプAlzaCorp.,PaloAlto,CAを移植した。処理されるグループにおいて、GLP-1は、1.5pmol/kg1.分1の速度で送達され、そしてExは15pmol/kg1.分1の速度で送達された。GLP-1のインシュリン分泌効果を防ぐために、Exの10倍もの高い濃度が必要であることが示されたWangら,J.Clin.Invest.,1995。対照動物は、それらのポンプで、通常の生理食塩水を受け、そして同じ時間の長さの間、それらの注入を受ける。グルコース耐性試験のために、ポンプを36時間設置した後対照およびGLP-1に対して、それぞれn=6である、ラットを一晩断食させ、50mg/kgペントバルビタールで麻酔し、そしてポンプを除去し、総GLP-1を48時間の注入時間で与えた。カテーテルを、血液サンプリングのために、大腿動脈に配置し、そして血液を、GLP-1測定のために、採取した。ポンプを除去した後、腹腔内ipグルコース耐性試験IPGTT,Ig/KgBWを、120分間実施した。グルコースおよびインスリンレベルを評価するために、血液サンプルを15、30、45、60および90分で得た。血液200μlを、グルコースおよびインスリン決定のためにEDTAを含むヘパリン化された管に吸い出した。インスリンの島細胞内含量のために、14匹のラットを使用した。上記に記載されるように、7匹をGLP-1で処理し、そして7匹を生理食塩水で処理した。48時間後、一晩の絶食後、動物を屠数し、ランゲルハンス島を、先に記載されるように採取したPerfettiら,1995;Eganら,1991。次いで、本発明者らは、個々の膵臓からランダムに採取された50の島内の島細胞内インスリン含量を測定した。採取された島を遠心分離し、いずれの残留媒質も除去し、ペレットを、氷冷した酸-エタノール500μlに懸濁し、そして均質化した。このホモジェネートの遠心分離1400×g、4°C後、上澄みを、細胞内インスリンの測定のために収集した。ペレットを、ギ酸に溶解し、そしてタンパク質含量を決定した。アッセイ。血漿グルコースをグルコースオキシダーゼ法によって測定したEganら、1991。インスリンおよびGLP-1を、先に公開されたようにRIAによって測定したWangら、Endocrinology,1995;Nathanら、1992。細胞タンパク質の量を、ウシγ-グロブリンを標準として使用するBradford法Bio-RadRichmond,CAを使用して測定した。RNA単離および内分泌膵臓mRNAの定量。48時間のGLP-1または生理食塩水の注入に供されたラットの膵臓全体を、全RNAを抽出するために使用した。一晩の絶食後、動物を屠数し、膵臓を除去し、そして液体窒素中で、できるだけ急速に凍結させた。RNAを、グアニジニウムイソチオシアネート中での均質化、続いて、5.7M塩化セシウムクッション上の超遠心分離によって、抽出したGlisinら,1974;Chigwinら,1979。次いで、ポリ-ARNAを、オリゴdTカラムBiolabsINC,Beverly,MAを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、全RNAから調製した。RNAを、260nMでの分光測光法分析によって定量化した。ポリ-ARNAを使用するスロット-ブロット分析を、グルコキナーゼのmRNAレベルの定量化のために使用し、これは、β細胞Matschinsky,1990、3つのヘキソキナーゼ、GLUT2、β細胞の主なグルコーストランスポーターMueckler,1990およびインスリンの主要なグルコースセンサーである。4ミリグラムのポリ-ARNAを、50μlTE緩衝溶液Tris-HCL10mM、EDTA1mM、pH7.4、20μlの37ホルムアルデヒド、および20μlの10xSSCに溶解した。サンプルを、60°Cで15分間インキュベートし、次いで、1mlの氷冷10xSSC1xSSC=0.15MNaCl0.015クエン酸ナトリウムであるに溶解した。スロット-ブロットミニホルダーの各ウェルを、氷冷10xSSCで1回リンスし、次いで、ウェル当たり300μlのサンプルを膜上に3連で充填した。膜を通してサンプルを排出するために、減圧を適用し、続いて、氷冷10xSSCで3回ウェルを洗浄した。最終的に、RNAの架橋のために、膜を、減圧オーブン中、80°Cで2時間焼いた。cDNAプローブDr.S.J.Gidding,WashingtonUniversity,St.Louis,MOからのラットインスリンII;Dr.M.A.Magnuson,VanderbiltUniversity,Nashville,TNからのラットグルコキナーゼ;Dr.M.J.Birnbaum,HarvardMedicalSchool,Boston,MAからのラットGLUT2;およびDr.J.E.Wilson,MichiganStateUniversity,EastLancing,MIからのヘキソキナーゼI,II,IIIとのハイブリダイゼーションを、先に記載されたように実施したWangら,Endocrinology,1995;Wangら,Mol.Cell.Endocrinol.,1996。全てのcDNAプローブを、SequenaseUnitedStatesBiochemical,Cleveland,OHを使用するランダムプライミング手順によって、[32P]dCTPAmershamLifeScience,ArlingtonHeights,ILで標識した。mRNAのポリ-Aテールに相同であるオリゴヌクレオチド5’GATGGATCCTGCAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3’、を、AppliedBiosystemDNAシンセサイザーで合成しそして全細胞mRNAの定量のために使用した。ほぼ等しい量のRNAが、各サンプルに対して使用されたことを確かめるために、オリゴdT20とのハイブリダイゼーションを実施した。オリゴヌクレオチドプローブを、T4ポリヌクレオチドキナーゼNewEnglandBiolabs,Beverly,MAを使用して、[32P]γATPで、末端標識した。オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを上記に記載のように実施しWangら,Endocrinology,1995;Wangら,Mol.Cell.Endocrinol.,1996、そしてBetascope603ブロットアナライザーBetagen,Walthman,MAを使用して定量した。ランゲルハンス島におけるRNAの単離およびmRNAの定量化。全膵臓に見出される変化を確認するために、RNAを上記のようにGLP-1で処理した動物のランゲルハンス島から単離した。島を単離し、そしてRNAを上記Perfettiら、1995のマイクロ方法micromethodを使用して抽出した。約5μgの総島RNAは、1個の膵臓に由来する。スロット-ブロットSlot-Blot分析を実施し、ヘキソキナーゼ、GLUT2、およびインスリンのmRNAレベルを定量化した。統計分析。このデータを平均±SEMとして表現した。IPGTTから得られたインスリンおよびグルコースのデータの重要性を、SASSASInstituteInc.;Cary,NCによる分散の反復測定分析を使用して試験した。有意な相互作用が実証された場合p<0.05、単一時点での値を、片側スチューデントのt‐検定により比較した。他の全てのデータを不対のスチューデントのt‐検定を使用して分析した:p<0.05は、有意と判断した。急性ivGLP-1ボーラスに対する応答。高齢のおよび若齢の絶食した動物は、30秒にわたって送達された0.2nmol/kgのGLP-1のボーラスに対して十分等しく応答した。それらのインスリン応答は、重なり可能であった図1。ボーラス完了2分後において、インスリン応答は、若齢動物373.3±43.7pmol/lおよび高齢動物347.7±25.7pmol/lの両方で最大値であり、両方のグループにおいて、インスリンのレベルは、10分でベースラインまで戻った。グルコース耐性試験。高齢動物は、IPGTTの間、若齢動物と比較した場合、明らかなグルコース不耐性を有する図2。空腹時グルコース空腹内グルコースの直前に取るは、処置した動物とコントロール動物との間に違いがなかった。グルコース耐性試験の間、GLP-1で処置した動物における血液グルコースは、15分9.04±0.92対11.61±0.23mmol/lおよび30分8.61±0.39対10.36±0.43mmol/lの時点でのコントロール動物と比較した場合、十分に低かった図2。高齢動物はまた、若齢動物と比較した場合、もはやグルコース不耐性ではなかった。同じ時間でのインスリン応答を再検討する場合、15分でのインスリン応答は、コントロールと比較してGLP-1で処置した動物において、有意に良好であった図3。特に生理食塩水で処置したラットは、30分にピークのインスリンレベルを有し、一方GLP-1で処置した動物は、15分でピークに達した。この鋭いインスリン応答は、処置した動物において血液グルコースの低下の原因であった図2。一晩絶食したインスリンのレベルは、GPL-1で処置した動物において、より高いが、しかし大きな動物内intranimal変化のために、コントロール192±47対134±45pmol/lと有意に異ならなかった。22月齢のウィスターラットへのGLP-1の48時間の注入は、IPGTTへのインスリン応答を増強する。この現象は、GLP-1注入の完了後さえ観察され、このことは、GPL-1が、インスリン放出の調節に勝る長期間の変化を誘導し得ることを示す。インスリン応答曲線の主な変化は、グルコース充填後の初期のインスリン放出であり、GLP-1処置ラットにおいて、最大インシュリン分泌が、グルコース注入の30分後から唯一15分まで、コントロールで観測されるようにシフトすることにより誘導される。島内インスリン含量。老齢の動物から予想されるように、各々独立した膵臓の島間にインスリンの量の変化が存在する図4。しかし、処置された動物p<0.01の島に一貫してより多いインスリンが存在する。コントロールおよびGLP-1処置したラットのインスリンは、それぞれ、全膵臓のタンパク質1ug当たり5.31±1.19対19.68±3.62ngのインスリンを有した。GLP-1プラスマレベル。本発明者らは、安定状態のGLP-1レベルに達したことの保障、そしてペプチドが正確に注入されたことの確認の両方を行うためにGLP-1注入の開始6時間後の3匹の動物中のプラスマGPL-1を測定した。6時間でのプラスマGLP-1レベルは、106.7±17.6であり、一方48時間では125.0±41.4pmol/lであった。グルコース耐性試験の開始前は、プラスマGLP-1は、アッセイの検出レベル以下であった。コントロールウィスターラットにおける空腹時GLP-1レベルは、10~20pmol/lであった。若齢動物と高齢動物との間のGLP-1の空腹時レベルにおいて、差異はなかった。従って、本発明のGLP-1の注入により、プラスマGLp-1レベルは空腹時レベルの約6倍まで上昇した。ウィスターラットにおける満腹レベルWangら、J.Clin.Invest.1995およびヒトにおける満腹レベルGutniakら、1992は、食事後約2倍になることが報告されているため、ポンプで達成されるプラスマレベルは、薬理学的であった。遺伝子発現に対するGLP-1の効果。本発明者らは、β細胞中のグルコース媒介インスリン放出およびインスリン代謝の初期段階に関与する、インスリンmRNAと他の因子のmRNAレベルとの存在比を測定した。結果を、デンシトメトリーにより定量化し、オリゴdTハイブリダイゼーションを使用して規格化し、若齢ラットを1の値として相対的な関係で表現した。図6は、6匹の若齢動物および12匹の高齢動物における全膵臓のインスリンmRNAのブロット、および図5に示される全動物による組み合わせた結果を示す。図7は、高齢動物の3個の単離した島RNA調製物のブロットを示す。インスリンmRNAのレベルは、高齢動物対若齢動物において約50に増加した図5、p<0.05、および図6。GLP-1は、コントロールと比較して若齢動物と高齢動物の両方においてインスリンmRNAを増加させた図5、p<0.01、および図6。同様の結果が、単離した島調製物において見出され得る図7。この増加は、動物をEX、すなわち自分のレセプターに結合するGLP-1のインヒビターと同時に処置する場合、全体的に妨げられる。Ex単独で、またはGLP-1と共にExで処理した動物において、インスリンmRNAレベルがコントロールp<0.01より低かったという事実は、非常に興味深い。インスリンmRNAレベルは、Ex単独の存在下で平均60下がった。高齢動物でのGLUT-2mRNAレベルは、若齢コントロールと比較して70まで減少し、これにより、GLP-1処置図5B、p<0.001まで全体的に戻された。高齢動物において、GLP-1によるGLUT2mRNAレベルの増加は、両方の島図7および全膵臓調製物図6において見出され得る。若齢動物において、GLP-1は、GLUT2mRNAレベルに有意に影響を及ぼさなかった。このレベルは、Ex単独の存在下で50まで下がった図5B、p<0.05が、ExおよびGLP-1で処置した動物においては下がらなかった図5B。若齢動物と高齢動物間でグルコキナーゼmRNAレベルの差異は存在しなかった図5C。GLP-1は、若齢動物においてグルコキナーゼレベルを有意に増加させた図5、p<0.05が、高齢動物においてさらに多く増加させた図5C、p<0.001、図7。同様の結果が、単離した島調製物での高齢動物において見出された図7。Exは、グルコキナーゼmRNAの増加に導くGLP-1を完全に阻止する。全調製物について、膵臓からの結果が、この島において示された。ヘキソキナーゼI、IIおよびIIImRNAレベルは、全膵臓および島において非常に低く、そしてGLP-1処置によって変化しないようであった。本発明者はまた、高齢ラットn=6へGLP-15dを注入し、そして48時間注入と同じ結果を見出した。GLP-1を用いる続く連続注入により、膵臓は、コントロールの膵臓よりも驚くほどより大きくなった。処置した動物の膵臓は、コントロール動物の膵臓よりも26重くなった。また驚くことに、インスリン分泌は、GLP-1の外因性源の除去後でさえ改善されたままであった。血液中でのGLP-1のインスリン分泌性作用の生物学的な半減期は、6~8分でありElahiら、1994、そしてGLP-1注入は、グルコース耐性試験を実施する前に少なくとも2時間で完了したので、少なくとも短期間での高GLP-1レベルの連続した存在は、老齢のウィスター動物においてグルコース耐性を改良する必要性がなかった。以前に示されたように、GLP-1は、インスリノーマ細胞において、インビボでのインスリン生合成およびインスリンmRNAレベルを増大するWangら、Endocrinology、1995。GLP-1はまた、膵臓において、インスリンのmRNAレベルを正常に維持するために必要なようである。Exのみを与えられた動物において、Exは、GLP-1のインスリンmRNAに対する影響を阻害しただけでなく、インスリンmRNAの減少も引き起こした。Exは、GLP-1のレセプターと結合するGLP-1の競争的なインヒビターであり、GLP-1のインスリン分泌効果を阻害するには10倍高い濃度のExが必要でありWangら、J,Clin.Invest.1995、従っておそらく、Exが、Exのみを受容する動物において、内因性GLP-1の結合を阻害する。これは、GLP-1がインスリンmRNAレベルを生理学的範囲に維持することに影響していることを意味する。2型糖尿病において、インスリンのβ細胞貯蓄は限界レベルより下に下がり、これはグルコース誘発インスリン応答の続く減少を引き起こすことが提案されたHosokawaら、1996。本発明者らのデータが示すように、GLP-1は、膵島内のインスリン含量を増加し得、そして単にボーラスによってよりむしろ、連続的に与えられた場合に、単純なインスリン分泌に対するその影響を越えるβ細胞機能に有利な変化もまた引き起こし得る。exendin-4は、ドクトカゲの唾液腺で産生されるペプチドである。本実施例において、発明者らは、ウイスターラット国立老化研究所NIAで飼育されるにおいて、exendin-4は、いくつかの様式で、GLP-1よりはるかに効能が大きいインスリン分泌薬であることを報告する。本発明者らは、2型糖尿病の齧歯動物モデルおいて、exendin-4は糖尿病制御の持続した改良をもたらすことをさらに報告する。材料。exendin-4およびGLP-1を、BachemKingofPrussia,PAから購入した。他に記載がなければ、化学試薬はSigmaStLouis,MOから得た。動物。NIABaltimore,MDのウィスターコロニーからの4月齢のウィスターラットを、exendin-4およびGLP-1の効果の重要な実験のために使用した実施例1を参照のこと。これらのラットを標準的な実験用食に維持し、そして自由に食物を与えた。長期の実験のために、4週齢のレプチンレセプターを欠く糖尿病のマウスC57BLKS/J-Leprdb/Leprdbならびにそれらの糖尿病でない同腹子を、JacksonLaboratoriesBarHarbor,Maineから購入した。これらを、1ケージに2匹づつ入れ、そして任意に食物を与えた。同じマウスを研究の間、ケージに共に入れた。ウィスターラットを、針金のケージに入れたが、このマウスの床敷は紙製品CarefreshAbsorptionCo.,Bellingham,WAであった。プロトコル。ウィスターラットを一晩絶食させた。50mg/kgのペントバルビタールで麻酔した後、血液採取のために大腿動脈にカテーテルを入れた。exendin-4またはGLP-1のいずれかのボーラスを、12匹の動物に、30秒かけて伏在静脈ivに与え、一方、正常生理食塩水NaClのボーラスを、他の6匹に与えた。注射の順を循環させた。血液-5、0、2、5、15、30、60、120および180分で採取したを、インスリン測定のために、EDTAおよびアプロチニンを含むヘパリン処理したチューブに吸い取った実施例1を参照のこと。動物を、少なくとも2日間、その設備に慣らした。その後、11匹の糖尿病の動物および10匹の糖尿病でない動物は、24nmol/kgのexendin-4を腹腔内に毎日午前7~9時受け、一方、10匹の糖尿病の動物および10匹の糖尿病でない動物は、腹腔内にNaClを受けた。続いて、マウスにおいて、後眼窩洞から採取した全血のグルコースレベルを、GlucometerEliteBayerを使用して測定した。このレジメを、12~13週間続けた。8日目に、2匹の糖尿病でないマウスケージメイトが、そして14日目に1匹の糖尿病マウスが、exendin-4を受けた直後に死んだ。動物を毎週計量した。このレジメの1週間後、インスリンおよびグルコースレベルを測定するために、再び血液サンプルを後眼窩洞から採取した。このレジメの終了時に、グルコースおよびインスリンレベルのために空腹時の血液サンプルを4グループから得、そして同日に、EDTAを含む全血をヘモグロビンA1cHbA1cについてアッセイした。別のグループの14週齢の8匹の糖尿病のマウスにおいて、本発明者らは、その各グループの4匹に、5日間毎日、24nmol/kgのexendin-4およびNaClを腹腔内に与えた。cAMP測定。ランゲルハンス島をウィスターラットから収集しPerfettiら、1995、次いで25島のバッチを、37°Cで1時間、140mMNaCl、5mMKCl、1mMNaPO4、1mMMgSO4、5mMグルコース、2mMCaCl2、20mMHEPES、緩衝液pH7.4および0.1ウシ血清アルブミンを含有する緩衝液中でインキュベートした。この後、これらを、GLP-11nMまたはexendin-41nMの存在下、同じ緩衝液中で1時間インキュベートした。次いで、島のバッチのいくつかを氷冷リン酸緩衝生理食塩水PBSで3回洗浄し、そして氷冷した0.6mM過塩素酸1mLで溶解した。他のバッチを37°Cの緩衝液で3回洗浄してペプチドを除去し、さらに15分間放置し、その後、氷冷PBSで3回洗浄し、続いて過塩素酸で溶解した。次いで、この溶解物950μlをマイクロ遠心分離管に移し、cAMP[3H]アッセイキットAmershamを使用して、上記のように実施例1を参照のことcAMPを測定した。細胞タンパク質を、基準としてウシy-グロブリンを使用するブラッドフォード法Bio-Rad,Richmand,CAを使用してアッセイした。アッセイ。血漿グルコースを、グルコースオキシダーゼ法によって測定したWangら、1997。インスリンを、上記に記載のように、RIAによって測定した実施例1を参照のこと。HbAlcを、溶血した血液由来のヘモグロビンサブタイプおよび変異体を分離するために、勾配溶出と組み合わせて、低圧陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する、BIO-RADHerculasCADiaSTAT器機を使用して、アッセイした。これらの分離したヘモグロビン画分を、415nmでの光の吸収によってモニターした。統計的方法。全ての結果を、平均±SEMとして得る。T検定は、2つの平均の分散の同等性を見るF検定の結果に基づいた。これらの分散が、統計的に有意に異なる場合、t検定は、等しくない分散に基づいた。EC50の決定のために、基底の血漿インスリンレベルを、減算し、そして各濃度で残存する活性を、最大活性過剰のペプチドによって達成されるの割合として表現した。次いで、これを、logit形式へ変換しここで、logit=ln活性/[100-活性]、そしてこの化合物のlog濃度の関数としてプロットした。WistarラットにおけるExendin-4の効果。Exendin-4は、静脈へ与えられた場合、GLP-1よりも数レベル強力なインスリン分泌剤であった。本発明者らのWistarラットにおける最大インスリン応答は、0.4nmol/kgGLP-1で見られるDeOreら、1997。この同一exendin-4濃度での最大インスリン応答は、約2倍である図8。インスリンレベルは、GLP-1を用いると10分までにベースラインへ戻るが、exendin-4を用いると、ベースラインより下へ実際に下がり、そして60分までにベースラインへ戻った。インスリン放出のためのEC50濃度は、GLP-1を用いた場合よりも、低く、そしてexendin-4によって分泌されるインスリンの最大量は、GLP-1を用いた場合よりも高い。EC50は、exendin-4対GLP-1実施例1を参照について、それぞれ、0.019図9対0.19nmol/kgであった。exendin-4を与えた動物は、この研究の期間、尿排出が明らかに増加し本発明者らは、尿の容量を定量しなかった、なぜならば、これらの動物は、循環する血液量を減少させる貧血にもかかわらず、この研究の間、頻繁に排尿し続けたからであり、一方GLP-1で処置された動物は、この研究の間、もしも有るならば、微量だけ排尿した。単離された島におけるcAMPレベルに対するexendin-4およびGLP-1の効果。exendin-4は、等モル濃度のGLP-1よりも、単離された島においいて、cAMPレベルをより増加させた。GLP-1は、濃度依存様式でcAMPを増加し、最大cAMP応答は1nMのときであった。exendin-4のこの濃度で、cAMPレベルは、GLP-1を用いた場合よりも、約3倍図10高かった。このことは、おそらく、exendin-4がGLP-1よりも高い最大インスリン放出を生じる理由を説明する。exendin-4またはGLP-1がGLP-1レセプター上に残存し得、従って緩衝溶液からのペプチド除去後もcAMPが増加し続けるかどうかを理解するための試みにおいて、本発明者らは、新鮮な緩衝液中での3回の洗浄によっていくつかの島からペプチドを除去し、次いで、15分後にcAMPを測定した。両方のペプチドを用いた場合、cAMPレベルは、少なくとも15分までにはベースラインへ戻った。マウスにおけるexendin-4を用いた慢性的処置の効果。exendin-4の生物学的活性血糖を低下させるその能力によって測定したは、糖尿病の動物の腹腔または皮下に与えた場合、本発明者が予想したよりもはるかに長かった。予備的実験において、本発明者らは、exendin-4で処置した糖尿病のマウスは、腹腔内ip注射および皮下sc注射後24時間、より低い血糖を有していたが、GLP-1注射では、血糖はベースラインへ戻るということを見出した。このことは、本発明者らを、exendin-4での長時間の実験を設計させた。マウスにおける毎日の皮下ipexendin-4レジメの開始で、空腹時血中グルコースは、非糖尿病マウスにおいては145±51mg/dl、そして糖尿病マウスにおいては232±38mg/dlであった。処置の1週間後、exendin-4で処置した非糖尿病マウスにおける空腹時グルコースレベルは、70±25mg/dlであり、NaClで処置した非糖尿病動物おける空腹時グルコースレベル135±5mg/dlp<0.05よりも有意に低かった。これらの糖尿病の動物は、exendin-4への非常に有意な応答を有した。グルコースレベルは、NaClで処置した動物における238±51mg/dlp<0.002から、exendin-4で処置した動物における90±11mg/dlへ降下した表1。本発明者らは、NaClまたはexendin-4を受容した糖尿病の動物における空腹時インスリンレベルを測定した。これらのレベルは、exendin-4を受容した動物においての方がより高かったp<0.002。これらのデータに基づいて、本発明者らは、動物を毎日exendin-4で処置し続けた。床敷きbeddingは、排尿が増加すると次第に暗く変化するペーパーベース製品であったので、exendin-4で処置した糖尿病の動物のケージは、NaClで処置した糖尿病の動物のケージよりも、交換後24時間、常に明らかに乾燥していたことは明らかであったしかし、非糖尿病のケージがそうであったように完全に乾燥はしていなかった図11、処置後9週間で撮った写真。本発明者らは、exendin-4で処置した糖尿病のマウスにおける減少した排尿が、より低い血中グルコースを原因とするより少ない浸透圧利尿に起因したと結論付けた。糖尿病の動物は、非糖尿病の動物よりも明らかに重い。9週間後、非糖尿病の動物の体重は、約28グラムgのプラトーに達し、一方、糖尿病の動物は、体重が増加し続けた。処置の13~14週で、NaClで処置した動物は、体重が減少し始め38.7g、一方、exendin-4で処置した動物は、それらの体重を維持した46.7g。本発明者らは、HbAlc決定のために、生理食塩水で処置した動物の全血およびexendin-4で処置した動物の全血をアッセイし、そして本発明者らは、一晩の絶食後の、グルコース濃度およびインスリン濃度について血漿を測定した図12。これら全てのパラメータは毎日のexendin-4での処置によって有意に変化したことが分かり得る。HbAlcは、NaClで処置した糖尿病の動物において8.8であったのに対して、exendin-4で処置した動物において4.7であったp<0.0001。HbAlcはまた、非糖尿病の動物においてより低かったexendin-4で処置した非糖尿病の動物対NaClで処置した非糖尿病の動物において、それぞれ、3.5対3.1p=0.0002。グルコースレベルは、exendin-4で処置した糖尿病の動物において、有意により低く278.7±30.0対517±59mg/dl、p<0.005、そしてインスリンレベルは有意により高かった4,600±1,114対707.2±169.7pmol/l、p<0.02図13。グルコースおよびインスリンにおける傾向は、顕著ではなかったが、exendin-4で処置された非糖尿病の動物における傾向と同一であった図13。それらの処置を始めたときに14週齢であった8匹の糖尿病のマウスにおいて、5日後、血糖は、NaClで処置した動物においては640±37mg/dlであり、そしてexendin-4で処置した動物において355±21mg/dlであった。これらのインスリンレベルは、exendin-4処置対NaCl処置において、それぞれ、6,904±705対1,072±54pmol/lであった。皮下および腹腔内exendin-4に続いて、糖尿病マウス中の血糖は、さらに良好な延長した生物学的応答ここで、血糖は、ivexendin-4に対するインスリン応答から期待したよりも低く長いままであった腹腔内投薬後、24時間までを有し、腹腔内注射のグルコース低下効果は、皮下よりも変動が低かった。これはおそらく、皮下技術のより大きな変動が原因であり、そして幾つかの場合において注射の間にペプチドの損失までも起こり得た。1週間、毎日、exendin-4腹腔内を腹腔内注射することに関する研究において、1日に1回のみの注射の結果としての空腹時血糖は、実際、糖尿病でない動物の血糖よりも低かった。これは、ケージが常により乾燥していたので、糖尿病の動物がexendin-4を受容した各朝にこれらのケージを見れば明らかでもあった。この効果はまた、exendin-4を受領した非糖尿病の動物においても見られた。平均血糖が640mg/dlであった糖尿病の動物にexendin-4を毎日、5日間与えた実験において、血糖を下げる顕著な影響もあり、そしてインスリンレベルは明らかに増加した。これは、おそらく、β細胞塊の増殖に起因する見込みはなく、そしてこのような顕著な高血糖の局面においてでさえ、糖尿病ラットのβ細胞が依然としてexendin-4に対して応答することを示唆する。exendin-4の12週間後でさえも、血糖はNaCl-処置動物における血糖よりも低かった。典型的な一次抗体は、14~21日まで続けた腹腔内注射後に応答し、そして、exendin-4は、いずれの評価rateにおいても弱いハプテンである。従って処置の最初の数週間、exendin-4の生物学的効果は抗体によって中和されることが期待されない。この事に関連して、exendin-4の生物学的効果は、非常に低い濃度においてであり、従って、おそらく、ペプチドは、その特定の抗体に関する親和性よりも、GLP-1レセプターに関してより高い親和性を有し、その結果、抗体によって全体的に中和されなくてもよい。exendin-4が中和されない理由に関する他の可能性は、まだ同定されていないげっし歯類において産生されるexendin-4様ペプチドが存在すること、またはexendin-4型分子がげっ歯類において製作されることであり、これによってexendin-4耐性成熟動物を得る。本研究者らは、exendin-4を低濃度1nmol/Kgで、糖尿病マウスの腹腔内に1週間、与えた。これは、この実施例において報告される大量での効果と同程度に血糖を下げる点で効果的であった。マウスの挙動に対する、毎日の注射の有害作用は観察されなかった。本研究者等は、exendin-4の注射の最初の3~4日間に、動物の体重が減少することを観察したのだが、それは第7日目までであり、NaCl処置動物と同程度まで戻った。本研究者等の長期研究において、週毎に重量を測ったので、その初期の減少を逃した。明らかに乾燥している敷き藁beddingを除いて、各朝処置される糖尿病動物において、本研究者らは、exendin-4の、これらの動物に対する、顕著な有害な効果を全く検出することができなかった。従って、本研究者らは、exendin-4がヒトにおける2型糖尿病に対する処置としてGLP-1よりも優れているかもしれないことを示唆する。実施例1のプロトコルを使用して、GLP-1を連続的に注射することによって、1~5日間、若年および老年のラットに投与し、対して、コントロールラットは比較として生理食塩水注射を受けた。対照的に、exendin-4を1日に1回、5日間、実施例2のプロトコルに従って、腹腔内に投与した。GLP-1で処置した膵臓における細胞の約20は、5日間でPCNAに対してポジティブであった。同時点で、小島において細胞が増殖した。さらに、菅を裏打ちする増殖細胞が存在し、そしてさらに驚くべきことに、腺房組織において、ある領域は一般に、幹細胞が全くないと考えられる。また、驚くべきことに、多数のインスリン陽性細胞が、腺房組織の中でも小島の外側で発見された。ここでは、インスリン陽性細胞は期待されない。これらの結果は、GLP-1の連続注射、または少なくとも2日間のExendin-4の繰り返し腹腔内注射によって、インスリン陽性細胞の全体数が増加し、かつ、インスリンIDX-1陽性細胞への腺房細胞の分化が生じることを示す。これらの結果は、GLP-1およびexendin-4によって細胞の増殖が増加すること、特に、腺房組織におけるインスリン産生細胞の増殖の増加をさらに示唆する。GLP-1の連続注射によって、24時間より長期にわたって非インスリン産生細胞とGLP-1を接触させると、非インスリン産生細胞のインスリン産生細胞への分化が促進される。この効果は早くも1日目に観測され、そして早くも7日目に最大の効果であった。このような分化は驚くべきことであった。なぜなら、先行技術はβ細胞においてインスリン向性の結果insulinotropicresultのみを示したからであった。さらに、本発明は驚くべきものであった。なぜなら、腺房細胞これは、インスリンを産生し得ることは全く分かっていなかったが促進されて、GLP-1との接触時にインスリンを分泌する。インスリン産生細胞の増加数は、処置を止めた後、少なくとも2週間の間、変化しないままである。インスリン産生細胞への分化は、ターミナルイベントterminaleventであるので、さらに後の時点で、非インスリン産生細胞へ戻る脱分化de-differentiationは起こりそうもない。従って、この効果は、永久的である。Exendin-4は、本発明において、非インスリン産生細胞からインスリン産生細胞からインスリン産生細胞を分化する際に、GLP-1と同様の効果を有することを示す。驚くべきことに、Exendin-4は、GLP-1よりも長い半減期を有することが示される。インスリン産生細胞数の増加は、従って、2日間にわたるExendin-4の連続注射によってではなくて、毎日のボーラス注射によって達成され得る。注射の2日後、小島の外側にインスリン産生細胞が観測される。最大効果は7日間までに達成される。GLP-1に関して、この効果は少なくとも2週間、おそらくは、永久的に持続し、Exedin-4との接触後でさえ、停止する。GLP-1またはExendin-4に対して実質的に相同性であるアミノ酸配列およびそのフラグメントを有する増殖因子は、インビボおよびインビトロでの非インスリン産生細胞の分化に影響を及ぼす。さらに、幹細胞および腺房細胞を含む種々の非インスリン産生細胞が促進されて、インスリン産生細胞へと分化し得る。先行技術を凌ぐこれらの利点によって、糖尿病を処置するための方法が提供され、従って、インスリン産生細胞は、患者への成長因子の投与によって、またはインビトロで非インスリン産生細胞を接触させることによって数が増加する。本研究の目的は、GLP-1および島ホルモン、グルカゴンおよびインスリンが腺房組織に影響を及ぼすかどうかを決定することであった。本発明者は、腺房組織のモデルとして、ラット膵臓外分泌腫瘍由来のAR42J細胞Christophe,1994を使用した。次いで本発明者は、GLP-1がすでにβ細胞内で作用することが公知であるGokeら,1993;Holzら、1995;Yadaら、1993、シグナル伝達系の幾つかの局面を調べた。材料。GLP-1、グルカゴン、exendin-4およびexendin9-39をBachemTorranceCAから得た。コレストキニンCholecytokininCCK、インスリン、ゲネスチンgenesteinおよびバナジン酸塩をSigmaChemicalCoSt.Louis,MOから得た。ラット膵臓細胞株、AR42JをAmericanTypeCultureCollectionRockville,MDから得た。抗チロシン抗体をUpstateBiotechnology,IncLakePlacid,NYから購入した。細胞培養。AR42J細胞を、10ウシ胎仔血清、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび2mMグルタミンで補充したDulbeccoの修飾Eagle培地中で維持した。継代23-36からの細胞を本研究を通して使用した。細胞を、12ウェルクラスターディッシュ内で約105細胞/mlで慣用的にプレートし、37°Cの、95空気および5CO2を含む加湿したインキュベーター内でインキュベートした。AR42J細胞がCCKに対して不十分に応答したため、本発明者は、これが濃度依存様式でCCK応答性を誘発することが公知であったためLogsdonら、1987、使用前に、慣用的に10nMデキサメタゾンと共に細胞を48時間インキュベートした。アミラーゼアッセイ。アミラーゼ分泌のために、細胞を2mlリン酸緩衝生理食塩水PBSで媒体なして洗浄した。次いで、インキュベーションを、15mMHEPES、0.2ウシ胎仔血清アルブミンBSAおよび0.01大豆トリプシンインヒビターを含むDMEM中で実施した。目的のホルモンおよび薬剤を50分間37°Cで加えた。次いで、インキュベーション媒体をアミラーゼ定量のために即座に除去し、そしてこの細胞を再び2ml氷冷PBS中で洗浄した。130mMのTris-HCl、10mMのCaCl2、75mMのNaClおよび0.2TritonX-100を含む溶解物緩衝液pH8.0を細胞に加え、次いでこの溶解物を全アミラーゼ活性のために収集したCeskaら、1969。放出したアミラーゼを、細胞の全アミラーゼ活性のパーセンテージとして表した。cAMPの測定。細胞を12ウェルディッシュ内で増殖し、上記のようにホルモンおよび薬剤±IBMXで処理した。次いでそれらを氷冷PBS中で3回洗浄し、1mlの氷冷した0.6mM過塩素酸で溶解した。この溶解物950μlをミクロ遠心分離管に移し、5MK2CO3を使用してpHを7.0に調節した。104rpmでの5分間の遠心分離後、上清を真空乾燥し、次いで200μlのTris/EDTA緩衝液中で回復させた。0.15mMのNa2CO350μlおよび0.15mMのZnSO450μlの添加後、氷上で15分間インキュベーションし、塩沈降物を3.5×103rpmにおける15分間の遠心分離によって除去し、50μlの上清をcAMP[3H]アッセイキットAmershamCorp.,ArlingtonHeights,IL、Steinerら、1972を使用してアッセイした。細胞タンパク質を、標準としてウシγグロブリンを用いるBradford法Bio-Rad,Richmond,CAを使用して測定したBradford,1976。細胞内カルシウム[Ca2]Iの測定。AR42J細胞を、蛍光性Ca2プローブであるindo-1アセトキシメチルエステルindo-1/AMで負荷した。この負荷溶液は、50μgのindo-1/AMMolecularProbesInc.、30μlのジメチルスルホキシドDMSOおよび5μlの25w/w、DMSO中PluronicF-127BASFWyandottCorp.から構成された。この混合物を、2.0mlのハンクス平衡塩類溶液中の細胞に添加しindo-1の最終濃度25μM、そして振盪プレートshakingplate上で1時間、穏やかに混合した。次いで、これらの細胞を400×gで60秒間遠心分離し、mMで137NaCl;5KCl;1.3MgSO4;5CaCl2;20HEPESpHをNaOHで7.4に調節するからなる標準浴溶液standardbathingsolutionに再懸濁させ、そして使用前に少なくとも1時間、貯蔵した。indo-1による負荷および実験の両方を、室温22~24°Cで実施した。この細胞懸濁液を、倒立蛍光顕微鏡のステージ上のチャンバに置いたSpurgeonら、1990。発光場を、単一の細胞に制限した。indo-1を350±5nmで5msごとに励起させ、そして蛍光発光を410±5nmおよび490±5nmの波長帯域に分離した。自己蛍光について補正した、410:490の蛍光比比F410/F490を、当該分野において周知の方法論を使用して、[Ca2]Iの指標として使用したSpurgeonら、1990。細胞の自己蛍光を、同じバッチからの多数のindo-1非負荷細胞において評価した。代表的な実験において、標準浴溶液を、細胞に近く接近して置かれたマイクロピペットから注入される試験溶液の1つと素早く<200ms交換したJanczewskiら、1993;Konnerthら、1986。慣用的に、これらの細胞を、試験溶液に240~300秒間曝露した。その後、試験溶液を洗浄によって除去し、一方で[Ca2]Iをさらに120~180秒間モニタした。これらの試験溶液は、ホルモンを標準浴溶液に添加することによって、この実験の直前に調製した。GLP-1結合。AR42J細胞を、上述のようにプレートし、そして培養した。結合実験の開始時に、細胞を無血清DMEMと共に37°Cで2時間インキュベートした。次いで、細胞を、mMで120NaCl、1.2MgSO4、13酢酸ナトリウム、5KCl、10Tris、pH7.6を含有する結合緩衝液0.5mlで2回洗浄した。次いで、細胞を、2BSA、500U/mlアプロチニン、10mMグルコース、ある範囲の濃度のGLP-10.03nM~100nMおよび30,000cpm125I-GLP-12,000Ci/mmol、Peninsula、Belmont、CAを補充した0.5mlの結合緩衝液と共に、4°Cで一晩インキュベートした。本発明者らは、参照日から2週間以内の、新たに調製した125I-GLP-1のみを使用した。インキュベーションの終了時に、補充物を処分して、細胞を氷冷PBSで3回洗浄した。細胞を、0.5ml0.5NNaOH/0.1SDSで、30分間室温で溶解した。放射能を、溶解液中で、ICNApecシリーズγ線計数器で測定した。特異的結合を、500nMGLP-1に存在する非特異的結合を全結合から減算することによって、決定した。この方法は、以前には、GLP-1レセプターを過剰発現するCHO細胞において、および3T3-L1脂肪細胞において、GLP-1結合を特徴付けるために、使用されてきたMontrose-Rafizadehら、J.Biol.Chem.、1997;Montrose-Rafizadehら、J.Cell.Physiol.、1997。GLP-1レセプターのRT-PCR。相補のDNAを、全細胞RNAから、マロネイマウス白血病ウイルス逆トランスクリプターゼBethesdaResearchLaboratories、Gaithersburg、MDおよびランダムヘキサヌクレオチドhexanucleotideプライマーPharmaciaLKBBiotechnologyInc.、Piscataway、NJを使用して、合成した。PCR増幅30サイクルを、第一鎖cDNAから、組換えTaqDNAポリメラーゼAmplitaq、Perkin-Elmer、Cetusを使用して実施したSaikiら、1997。オリゴヌクレオチドプライマーは、膵臓GLP-1レセプター配列の5’末端および3’末端であったThorens、1992それぞれ、5ACAGGTCTCTTCTGCAACC3および5AAGATGACTTCATGCGTGCC3。次いで、PCR産物を1アガロースゲルで分離し、そしてエチジウムブロミドを使用して可視化した。これらのPCR産物を、pBluescriptベクターにサブクローニングし、そして鎖終結技術およびSequenase2.0キットUnitedStatesBiochemicals、Cleveland、OHを使用して、配列決定した。このPCR産物の特異性をまた、Bstxl制限酵素によって決定した。GLP-1レセプターの免疫沈降およびウェスタンブロット。AR42J細胞およびインスリノーマ細胞株RIN1046-38細胞を、上述のように60mmディッシュで増殖させた。これらの細胞が80コンフルエンスに達したら、これらの細胞を、115mMNaCl、5mMKCl、2.5mMCaCl2、1mMMgCl2、24mMNaHCO3、および25mMHEPESを含有するクレブス-リンガー緩衝液で2回洗浄し、そして液体窒素で凍結させた。この凍結した細胞を切屑して、20mMTris-HCl:pH8.0、137mMNaCl、1TritonX-100、0.5デオキシコレート、0.1SDS、0.2mMPMSF、10μg/mlロイペプチン、20μg/mlアプロチニン、1mMNa-オルトバナジン酸塩、1mMベンズアミジンを含有するRIPA緩衝液に溶解した。不溶性物質を、15,000×gで15分間4°Cで遠心分離することにより除去し、そして免疫沈降およびウェスタンブロットのために上澄みを回収した。N末端に対する抗GLP-1-R抗体Dr.JoelHabener、MassachusettsGeneralHospital、MAにより提供を、1:250で、40μlのタンパク質Aおよびタンパク質Gと共に各チューブに添加した。免疫沈降を、4°Cで一晩実施し、そして免疫複合体を、RIPA緩衝液で2回洗浄し、洗浄用緩衝液25mMHepes、0.1TritonX-100、および1mMNa-オルトバナジン酸塩でさらに2回洗浄し、次いで免疫複合体ペレットを、50μlのSDS-PAGEサンプル緩衝液で、70°Cで10分間可溶化した。免疫沈降したタンパク質を、小型樹脂カラムで溶出し、そして4~20SDS-ポリアクリルアミドゲルに供した。このゲルをPVDF膜に電気移動electrotransferさせた後、ブロットをTBST緩衝液20mMTris-HCl[pH7.5]、137mMNaClおよび0.1Tween20中5脱脂乳で、室温で1時間ブロックし、次いで1:1500でGLP-1-レセプターに対する抗体と共に室温で1時間インキュベートした。PVDF膜を、TBSTで3回洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体化抗ウサギ二次抗血清と共に、室温で1時間インキュベートした。TBST中での一連の洗浄の後、ブロットを、ECl化学発光検出システムを使用して現像した。オートラジオグラフを、MolecularDynamicsレーザー濃度計のImage-QuantTMソフトウェア第3.3版を使用して、定量した。この実験において、インスリン産生細胞株RIN1046-38細胞を、GLP-1レセプターの存在のポジティブコントロールとして使用した。清澄な細胞溶解液のアリコート20μlを使用してタンパク質濃度を決定し、ブラッドフォード法Bradford、1976によって評価した。チロシンのリン酸化の研究。AR42J細胞を、115mMNaCl、5mMKCl、2.5mMCaCl2、1mMMgCl2、24mMNaHCO3、および25mMHEPESを含有するクレブス-リンガー平衡緩衝液KRBB中、37°Cで2時間、前インキュベートした。次いで、培地を除去し、そして新しいKRBBを添加し、細胞を37°Cのホットプレート上に5分間置いた。5分間にわたって様々な試薬図24を参照のことを添加した後に、これらのディッシュを液体窒素に浸漬することによって、この反応を終結させた。凍結した細胞を切屑し、RIPA緩衝液に溶解した。不溶性物質を、15,000×gで15分間遠心分離することによって除去し、そして免疫沈降および免疫ブロット法のために、上澄みを回収した。清澄な溶解液からのホスホチロシン含有タンパク質を、モノクローナル抗ホスホチロシン抗体と共に免疫沈降させ、還元条件下4~12SDS-ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動によって分離し、次いでPVDF膜に電気移動させ、そしてポリクローナル抗ホスホチロシン抗体によって免疫ブロット法を行った。これらのブロットを、ECL化学発光検出システムAmershamを使用して現像した。清澄な細胞溶解液中の全タンパク質含有量を、ブラッドフォード法を使用してアッセイしたBradford、1976。統計的分析。ここでは、適用可能な結果は、平均±SEMとして表現され、独立スチューデントt検定に供される。群内で、比較を、一元one-way分散分析ANOVAを使用して分析した。p<0.05を統計的に有意とみなした。アミラーゼ放出。CCKは、アミラーゼ放出の強力な刺激物であった。最大刺激は、10nMで見られた図14。グルカゴン10nMまたは100nMは、単独ではアミラーゼ放出に対して効果を有しないが、CCKと組み合わされた場合、グルカゴンはCCK誘発アミラーゼ放出を阻害したが、完全には無くさなかった図15;n=20、p<0.01。GLP-1およびインスリンは、単一でもCCKと組み合わせても、アミラーゼ放出に影響を与えなかった図15。本発明者らはまた、exendin-410pM~10nMの濃度範囲を、アミラーゼ放出に対する潜在的効果について調べ、GLP-1と同様、exendin-4はアミラーゼ放出に影響しないようであった。GLP-1およびグルカンは、AR42J細胞のcAMPレベルを上げると予期され得るので、本発明者らは、特異的cAMP効果を探すためにcAMPアナログである8-ブロモ-cAMP8-Br-cAMPのアミラーゼ放出に対する効果を観察した。単独で与えられる場合、8-Br-cAMPはアミラーゼ放出に効果を有しないようである一方で、8-Br-cAMPはCCK誘発アミラーゼ放出を減少させた図16。本発明者らはまた、タプシガーギンおよびリアノジン、リアノジンレセプター/ERCa2放出チャネルの特異的インヒビターおよびERCa2ポンプの特異的インヒビターをそれぞれ、単独でおよびCCKと組み合わせて使用し、アミラーゼ放出に対する細胞内カルシウムの上昇の役割を調べた。タプシガーギンおよびリアノジンの組み合わせはCCK誘発アミラーゼ放出を減少させたが、完全には阻害しなかった図17;n=3、P<0.01。NaF腺房組織のアミラーゼ放出に対するCCKの効果を模倣するVajanaphanichら、1995は、AR42J細胞においてと同様であった。チロシンキナーゼインヒビターであるゲネスタインGenestein300μMは、CCK媒介アミラーゼ放出を、特にCCK処理の初期の時点において減少させたが、一方で、チロシンホスファターゼインヒビターであるバナジン酸塩は、基底アミラーゼ放出およびCCK媒介アミラーゼ放出を有意に増加させた図18。本発明者らは、膵臓のβ細胞をGLP-1で24時間処理した場合、グルコース媒介インスリン放出およびGLP-1媒介インスリン放出の増加があることを示したWangら、Endocrinology、1995。従って、本発明者らは、GLP-1がアミラーゼ放出に対して有し得る任意の長期の効果を探した。GLP-110nMおよびインスリン100nMを用いた8、24、48または72時間のAR42J細胞のプレインキュベーションは、基底アミラーゼ放出もCCK1nM誘発アミラーゼ放出も増加させなかった。AR42J細胞におけるCCKに対する[Ca2]I応答。この実験の条件下では、AR42J細胞の大部分85;n=35が、1nMCCKに応答して[Ca2]Iを一時的に増加させた。図6Aは、CCK誘発[Ca2]Iトランジエントtransientの代表的な例を示し、CCKへの暴露後5~25秒後に始まり、次の5~15秒でピークとなる。ピークインド-1indo-1蛍光比IFRから評価したピーク[Ca2]Iは、静止IFRを2.5~3.5倍超えた。[Ca2]Iトランジエントの緩和は、ピークに続いてすぐに始まり、通常、初期の素早いフェーズ、引き続くプラトーフェーズおよびよりゆっくりとした最終フェーズからなっていた。[Ca2]Iトランジエントの後、ベースライン[Ca2]Iが静止[Ca2]Iのレベルより下に減少し、CCKに対する暴露の前に測定された図19A。引き続く静止の間、ベースライン[Ca2]Iは、漸進的な増加を示したが、通常、10分以内でコントロールレベルには完全には回復しなかった。静止[Ca2]Iの完全な回復の前にCCKに対して繰り返される暴露によって誘発される[Ca2]Iトランジエントは、先の[Ca2]Iに対して30~40減少した。CCK誘発[Ca2]Iトランジエントは、10μMリアノジンおよび500μMタプシガーギンで前処理された細胞中でほとんど完全に消滅した図19B;N=7。これらの結果は、腺房細胞において、ERがCCKによって誘発される[Ca2]Iの変化の主要な源であるという考えを支持するMuallemら、1988;Ochsら、1983。この考えと一致して、名目上、CA2の無い灌流溶液に添加されるCCKに対する暴露図19は、[Ca2]Iトランジエントの上昇率または大きさに明らかには影響しなかったn=5。しかし、図19Cに示されるように、細胞外Ca2の減少は、[Ca2]Iトランジエントの期間を短くした。このことは、以前Muallcmら、1998;Ochsら、1983に示されるように、細胞外Ca2がCCK誘発ERCa2放出によって開始される[Ca2]Iトランジエントの遅延した成分の維持において役割を演じ得ることを示唆する。AR42J細胞のGLP-1に対する[Ca2]I応答。GLP-1に対する暴露は、AR42J細胞の約50n=27の[Ca2]I応答を誘発した。GLP-1誘発トランジエント図20Aは、かなりの変動性を示したが、通常、CCKに対する[Ca2]I応答よりも遅い速度で発生し、そしてCCKに対する[Ca2]I応答よりも小さな大きさ静止IFRに対して1.5から2.5倍の増加で得られた。さらに、GLP-1誘発[Ca2]Iトランジエントが、CCKによって誘発される速度よりも遅い速度で緩和した図20A対19Aおよび20B、C。図20Bは、同じ細胞内のGLP-1に対する暴露の後10分未満で適用されるCCKの[Ca2]Iに対する効果を示す。この種の実験において、CCK誘発トランジエントは、その特徴的配置を保持するが図19Aに示されるように、より小さな大きさに達した。後者の効果は、ベースラインIFRの減少、および/またはERCa2含有量の部分的枯渇によって示され、[Ca2]I含有量の減少に少なくとも部分的に起因し得る図19を参照のこと。二回目のCCKへの暴露では、大きさはより小さくさえなった図20C。リアノジン100μMおよびタプシガーギン500μMでの前処理は、GLP-1に対する[Ca2]I応答を実質的に消滅させた。まとめると、これらの結果は、CCKおよびGLP-1がCa2の同じ細胞内プールおそらくERにアクセスしているが、多分異なるメカニズムでCa2を放出することを示す。ヒーラモンスター由来のGilamonsterGLP-1ホモログであるexendin-4は、[Ca2]IのGLP-1と同じ効果を有したが、大きさが約1桁強力であった。GLP-1アンタゴニストであるexendin9-39Gokeら、1993は、GLP-1よりも10倍高い濃度で使用される場合、GLP-1誘発カルシウムトランジエントを阻害した。[Ca2]IAR42J細胞に対するグルカゴンおよび8-ブロモ-cAMPの効果。グルカゴン10nMへの暴露は、AR42J細胞の70n=12の[Ca2]I応答を誘発した。[Ca2]Iトランジエントは、グルカゴンへの暴露のすぐあとに始まり、比較的ゆっくりした速度で発生し、静止IFRレベルの200~250でピークとなり、延長されたゆっくりした緩和を示した図21A。グルカゴンで処理したすぐ後でCCKによって誘発されたまたは同時に添加された両方の処理での[Ca2]Iトランジエントは、減少した上昇速度および非常に遅い緩和速度を示した図21B。同様に、cAMPの膜透過性形態である0.1μM8-ブロモ-cAMPに対して短い60~300秒暴露は、通常、CCK誘発[Ca2]Iトランジエントの上昇速度に顕著には影響しないが、それらの緩和速度を顕著に遅くした図21C。CCK存在下でのジブチリルcAMPのアセトキシメチルエステルを用いる細胞内動員の減少は、以前に腺房細胞において示されているKimuraら、1996。GLP-1結合。500μM非標識GLP-1の存在による合計の結合の置換によって決定される場合の、特異的な125I-GLP-1は、添加された放射能の合計のうちの0.64±0.16n=9、特異的な結合の量は、ゼロより有意に大きかった、p<0.01であり、結合の合計のうちの27±3.2n=9であった。低い特異的結合のために、全体のスキャッチャード分析を行わなかった。cAMPレベル。細胞内cAMPレベルは、AR42J細胞において、CCK1nMの存在下または非存在下で、GLP-10.1~100nMまたはIBMX100nMでの1時間処理、あるいはCCK0.1~100nMのみでの1時間の処理では変わらなかった。IBMXは、cAMPレベルのわずかな増加を引き起こしたが、これは3つの実験において、非IBMX処理細胞と統計的に異ならなかった。グルカゴン10nMは、CCKの存在下および非存在下でcAMPレベルの2倍の増加を引き起こした図22。exendin-40.1~10nMは、cAMPレベルを変化させなかった。GLP-1レセプターのRT-PCR。GLP-1レセプターmRNAの存在は、RT-PCRを用いることによってAR42J細胞において検出された。図23は、公知の膵臓GLP-1レセプター配列Thorens,1992と同一のプライマーを用いて、推定された大きさのPCR産物bp928;Eganら,1994を参照のことがAR42J細胞およびラット膵臓において検出され得るが、水コントロールのPCRにおいては検出されないことを示す。ゲノムDNA混入が全く存在しないことは、本発明者らのプライマーが1.8K塩基のPCRバンドを生じるイントロン配列に及ぶことから証明される。混入しているゲノムDNAPCRに対応するさらなるバンドは本発明者らのPCR反応において観察されなかった。このPCR反応物をクローニングし、部分的に配列決定し、そしてβ細胞GLP-1レセプターであると同定された。GLP-I発現のウェスタンブロット分析。GLP-1レセプターのN末端領域に対する抗体を用いて、特異的バンドが、ポジティブコントロール細胞であるRIN1046-38細胞において、およびAR42J細胞において65kDaおよび45kDaで得られた。これらはそれぞれ、成熟GLP-1レセプターおよびコアグリコシル化GLP-1レセプターに対応することが示された図24。チロシンリン酸化研究。何の刺激も存在しない場合、いくつかのタンパク質が、CCKおよびNaFの存在下では増加したがGLP-1の存在下では増加しなかった基底レベルのリン酸化を示した図25。4つのタンパク質46kDa、66kDa、120kDaおよび190kDaは、CCKの存在下で最も明らかに影響を受け、これらのタンパク質のリン酸化レベルは少なくとも2倍増加した。ゲニステインは、図18において既に示したように、CCKによって誘導されるチロシンリン酸化を減少させ、そしてCCK媒介アミラーゼ放出を減少させた。AR42J細胞は、濃度依存様式でのアミラーゼ放出の誘導、および細胞内カルシウムの増加によって実証されるように、CCKに対して生理学的様式で応答する。CCKはまた、以前に示されたLutzら,1993ように、タンパク質チロシンリン酸化を誘導した。CCKは、SDSポリアクリルアミドゲルで分離した場合の見かけの分子量に基づいて190kDa、120kDa、66kDaおよび46kDaのチロシンリン基質phosphosubstrateのかなりの増加を誘導した。これらのリン酸化のうちの2つである120kDaおよび66kDaは、既に記載されている同書。ゲニステインによるチロシンリン酸化の阻害は、アミラーゼ放出を阻害し、そしてまたチロシンリン酸化事象を減少させた。このことは、AR42J細胞においては、腺房細胞においてのように、チロシンリン酸化が、調節されたアミラーゼ分泌に関与することを示唆する。インスリンは、それ自体のレセプターβサブユニットである可能性が最も高い97kDaでのリン酸化を誘導した。周知のGタンパク質のアクチベーターであるNaFRivardら,1995は、腺房細胞においてアミラーゼ放出を増加させ、そしてチロシンキナーゼ活性を増加させる同書という点で、腺房細胞におけるCCKの効果を模倣することが以前に示されている。NaFは、AR42J細胞におけるチロシンリン酸化事象に対するCCKの効果を模倣し、それゆえ、CCKレセプターとチロシンリン酸化との間の変換器として機能するフッ化物感受性Gタンパク質が存在するという仮説同書に信頼性を与える。GLP-1は、AR42J細胞中で単独でまたはCCKとともに用いたとき、細胞内カルシウムを明らかに増加させたが、アミラーゼ放出を増加させないようであった。cAMPの増加は、GLP-1の存在下では実証されなかったが、グルカゴンを用いた場合は明らかであった。Malhotraら1992は、ラット腺房細胞を用いて、GLP-1に相同であるドクトカゲGilamonster毒であるexendin-4が、CCK誘導性アミラーゼ放出を増強し、そして細胞cAMPを増加させたと述べたが、Malhotraら1992はGLP-1効果については考察しなかった。しかし、cAMPの増加は、108Mのexendin-4が用いられるまでは観察されず、その濃度では、exendin-4は、他のレセプターを介して相互作用してい得る同書。同様に、CCK誘導性アミラーゼ放出を増強することに対する効果CCK単独によって放出される総アミラーゼの12から、それに対してexendin-4およびCCKを一緒に用いる場合の16が108Mのexendin-4を用いて見られ、そしてCCKに1時間暴露した時間経過のうちの15分間の時点でのみ統計学的有意に達したp<0.02。この方法は、生じたとしてもGLP-1またはexendin-4のこのような非常に小さくかつ時間特異的な効果を捕らえるのに充分になほど感受性ではないかもしれず、そして再度、Malhotraらによって示された分泌に対する効果は、他のレセプターとの相互作用に起因し得る。膵臓のβ細胞では、exendin-4は、1010M程度の低い濃度で、cAMPおよびインスリンの分泌を増加させるGokeら,1993。あるいは、低いレセプター親和性に起因して、GLP-1を用いてのcAMPレベルの小さく急な変化は検出されていないかもしれない。AR42J細胞の応答は、末梢細胞肝臓、脂肪および骨格筋において見られる応答と類似する。この応答はどちらでも、cAMPレベルの上昇を示さないValderdeAndVillanueva-Penacarrillo,1996。GLP-1は、β細胞におけるGタンパク質サブタイプとは異なるGタンパク質サブタイプまたは他のGタンパク質サブタイプのいずれかと共役し得るようである。CCKレセプターは、腺房細胞においてGiサブタイプならびにGqサブタイプと共役していることが示されたSchnefelら,1990。AR42J細胞では、GLP-1は、少なくとも1つのGiサブタイプ、およびおそらく他のGタンパク質αサブユニットと共役し得る。3T3-L1脂肪細胞では、GLP-1が脂質合成およびグルコース取り込みを増加させており、このGLP-1レセプターがGiサブタイプに共役している可能性が最も高いことMontrose-Rafizadehら,J.Biol.Chem.,1997およびGLP-1レセプターを過剰発現するCHO細胞では、このGLP-1レセプターが他のαサブユニットと共役していることMontrose-Rafizadehら,Diabetes,1997が示されている。CCKと同様に、GLP-1によって誘導される細胞内カルシウムの上昇は、小胞体に由来した。しかし、カルシウム勾配のパターンは、CCKを用いた場合と同じではなかった。このことは、CCKによるカルシウムの放出へのシグナル伝達が、グルカゴンおよびGLP-1によるものとはおそらく異なることを意味する。GLP-1は、チロシンリン酸化事象を増加させなかった。このことは、調節されたアミラーゼ放出についてのチロシンリン酸化の重要性を再度実証する。これはまた、細胞内カルシウムの上昇とは独立した経路が、アミラーゼの分泌に重要であることを実証する。これはさらに、タプシガーギンおよびリアノジンの存在下で得られた結果によって強調される。これらは、これらが減少させた細胞内カルシウムの上昇を全て防止したが、CK誘導性アミラーゼ放出を完全には防止しなかった。それゆえ、細胞内カルシウムの上昇が、CCK誘導性アミラーゼ放出の完全発現に必要であるが、それ自体の上昇は明らかに、AR42J細胞におけるアミラーゼ放出を誘導するためには充分ではない。任意の細胞型が、GTP結合タンパク質の多様なβサブユニットを含み得るvonWeizsackerら,1992。このことは、活性化されるサブタイプすなわち、CCKもしくはGLP-1によるGq、グルカゴンもしくはGLP-1によるGs、またはCCKおよびGLP-1の両方によるGiに依存して、異なるGβyサブユニットが放出され得ることを意味し得る。次いで、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化について既に記載されたようにHawesら,1995、特異的Gβyが、AR42J細胞において観察されるチロシンリン酸化事象のために必要とされ得る。これはまた、2つの異なるGβyサブユニットが1つのホルモンの作用によって放出されるならば、これらは種々の下流の事象に対して相加的なまたは拮抗的な効果を有し得るという可能性を生じる。GLP-1レセプターは、AR42J細胞に存在する。GLP-1およびexendin-4によるそれらの活性化は、おそらくERからの、細胞内カルシウムの増加を導く。しかし、それらの活性化は、アミラーゼ放出の増加を導かず、そしてCCK誘導性アミラーゼ放出は増強されない。実施例4に議論されるように、GLP-1レセプターは、AR42J細胞上に存在し、そしてGLP-1によるAR42J細胞の急性処理は、細胞中の細胞内カルシウムを増大させる。さらに、以前の研究により、デキサメタゾンはAR42J細胞が腺房様細胞となることを促進したChristophe、1994が、βセルリンおよびアクチビンAはAR42J細胞の約10をインスリン産生細胞に転換するMashimaら、J.Clin.Invest.1996ことが示された。同様に、肝細胞増殖因子HGF、肝細胞heptocyte錯乱因子HSFとしても知られるへの曝露後、AR42J細胞の約3がインスリンポジティブであった;それに対して、HGFおよびアクチビンAへの曝露は、約10のインスリンポジティブ細胞を生じたMashimaら、Endocrinology、1996。GLP-1またはexendin-4のいずれかに関しては上記研究のいずれについて何も述べられていない。さらに、GLP-1またはExendin-4のいずれも、アクチビンAおよびβセルリンによる組み合わせ処置あるいはHGFおよびアクチビンAによる組み合わせ処置よりもはるかに大多数で、AR42J細胞をインスリン産生細胞に変換し得る。GLP-1またはexendin-4による効果の機構は、ERK活性化の阻害がインスリンおよびグルカゴン産生を防止したので、最終工程としてERK/MAPK経路の活性化に関与し得る。材料。AR42J細胞は、ATCCRockville、MDから得られた。GLP-1、exendin-4およびexendin-9-39GLP-1レセプターアンタゴニストは、BachemTorrance、CAからであった。抗インスリン抗体および抗グルカゴン抗体は、LincoCharles、MOからであった。抗ラットERK1/2抗体ERK1-CTおよびミエリン塩基性タンパク質MBPは、UpstateBiotechnologyIncorporatedLakePlacid、NYから購入された。インスリンラジオイムノアッセイ試薬は、PeninsulaLaboratoriesBelmont、CAからであった。タンパク質測定試薬は、Bio-RadHercules、CAから得られた。ペルオキシダーゼABCキットは、VectorLaboratoriesBurlingame、CAから得られた。TianTMOneTubeRT-PCRシステムは、BoehringerMannheimIndianapolis、INから購入された。デオキシリボヌクレアーゼIは、GibcoBRLGaithersburg、MDから得られた。ガラス製カバーガラスは、VWRScientificBaltimore、MDからであった。タンパク質キナーゼCPKCインヒビター1-o-ヘキサデシル-2-o-メチル-rac-グリセロールPKI、およびMAPキナーゼキナーゼMAPKKインヒビター、PD98059は、CalbiochemSanDiego、CAからであった。細胞培養。AR42J細胞を、10胎児仔牛血清FBS、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび2mMグルタミンで補充したダルベッコ改変イーグル培地DMEM中に維持した。継代23~35からの細胞を、この研究に使用した。細胞を、慣用的に、約105細胞/mlの濃度で、12ウェルのクラスターディッシュまたはカバーガラスにプレートし、そして95空気および5CO2、37°Cで加湿インキュベーター中にてインキュベートした。免疫細胞化学分析。細胞を、ガラス製カバーガラス上で培養し、リン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄し、血清を除去し、そしてPBS中の0.5グルタルアルデヒドで固定した。細胞を、0.2TritonX-100で5分間、透過させ、残りの手順を加湿チャンバ中、室温で行った。吸引を、各工程間の試薬を除去するために使用したが、標本の乾燥は避けた。十分な試薬を、各標本をカバーするために使用した約1または2滴が通常、適切である。カバーガラスを、PBS中の0.3H2O2中で30分間、インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、そしてPBS3回洗浄し、続いて、PBS中の2ヤギ血清とともに30分間、インキュベートし、IgGの非特異的結合をブロックした。過剰の血清を、ブロッティングによって除去した。特異的1次ポリクローナル抗血清抗インスリン1:300;抗グルカゴン1:300を使用した。抗体を、1ヤギ血清を含有するPBS中に希釈した。これを、カバーガラスに付与し、そして室温で1時間、インキュベートした。カバーガラスをPBSで3回洗浄し各回5分間、次いで、ビオチン標識した2次抗体とともに1時間インキュベートし、そしてPBSで3回洗浄した。PBS中のアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体を、30分間適用した。イムノペルオキシダーゼ標識を、VectostainABCキットVectorLabs、Burlingame、CAを用いて行った。PBS中の広範囲の洗浄を4~5回各5分間した後、カバーガラスを、PBS中のジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドDAB中で、0.01過酸化水素とともに、3分間、インキュベートした。この反応を、カバーガラスをPBS中で洗浄することによって停止させ、そして光学顕微鏡で検査した。特異的染色を確かめるために、予め吸収された1次抗体とともにインキュベートしたサンプルを、ネガティブコントロールとして使用し、そしてインスリン産生細胞株RIN1046-38細胞を、本発明者らの実験のためのポジティブコントロールとして使用した。アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼABC手順を、当該分野において公知の方法Hsuら、1981に従って行った。免疫反応性インスリンの測定。AR42J細胞を、12ウェルのクラスタープレート中で、既に述べたように培養した。細胞が60集密に達したとき、これらをGLP-1で3日間、処理した。実験開始時に、培地のアリコートを、培地中のインスリン蓄積をアッセイするために、採取した。次いで、この細胞を、Krebのリンガーバランス緩衝液KRBBで2回、洗浄し、そして10mMグルコースを含有する同じ緩衝液において、さらに1時間、インキュベートした。この培地を回収し、そしてインスリンレベルをRIAによってアッセイするまで、-20°Cに保った実施例1;Wangら、Endocrinology、1995を参照のこと。この細胞を、PBSで洗浄し、そして0.25チプシンtypsinおよび0.02EDTAを用いて分離detachさせた。細胞ペレットを回収し、そして標準物質としてウシ-グロブリンを使用するBradford法Bradford、1976によるタンパク質測定のために、ギ酸で溶解させた。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR。総RNAを、処理されたAR42J細胞から、ChomczynskiおよびSacchi1987の方法によって単離した。総RNAサンプルを、20mMTris-HClpH8.4、2mMMgCl2および50mMKCl中のDNAseによって予め処理し、微量の汚染ゲノムDNAを除去した。RT-PCRを、50mMKCl、10mMTris-HCl、3.5mMMgCl2、200μMの各dNTP、ラットインスリンIおよびIIに対する0.4μMの各センスおよびアンチセンスプライマーインスリンセンスプライマー=5’TGCCCAGGCTTTTGTCAAACAGCACCTT3’;インスリンアンチセンスプライマー=5’CTCCAGTGCCAAGGTCTGAA3’を含有する緩衝液容量50μl中で実施した。増幅を、変性温度94°C1分間、アニーリング温度60°C45秒間および伸長温度72°C1分間、25サイクルで行った。RIN1046-38細胞由来のmRNAを、ポジティブコントロールとして使用した。グルカゴンRT-PCRの場合において、変性および伸長の温度は、アニーリング温度が65°Cで1分間グルカゴンセンスプライマー=5’GTGGCTGGATTGTTTGTAATGCTGCTG3’;アンチセンスプライマー=5’CGGTTCCTCTTGGTGTTCATCAAC3’であることを除いては、インスリンに類似していた。RT-PCR手順を、2アガロースゲル上の臭化エチジウム染色によって視覚化した。MAPキナーゼ活性。処理後、80集密細胞の60mmディッシュを、溶解緩衝液mMで示す:50TRIS-HCl、PH8、150NaCl、5EDTA、1NP-40、0.25デオキシコール酸ナトリウム、1NaF、10ピロリン酸ナトリウム、0.1PMSF、1オルトバナジン酸ナトリウム、20μg/mlアプロチニン、および10μg/mlロイペプチン中4°Cで溶解した。この細胞溶解液を、16,000×g、4°Cで20分間遠心分離により清澄化した。この清澄化した細胞溶解液を、4.5μgのERK1-CT抗体および40μlのパックされたプロテインGプロテインAアガロース樹脂OncogeneResearchProduct、Cambridge、MAとともに回転しながら、4°Cで一晩免疫沈降した。この免疫ペレットを、基質としてMBPを用いてMAPK活性についてアッセイした。MBP18.6μgを、20mMHepes、PH7.4、10mMMgCl2、1mMDTT、20μM非標識ATPおよび40μCi3,000Ci/mmol[32P]-ATPを含む60μlの最終容量中10分間20°Cでリン酸化した。この反応は、25μlの3×Laemmli試料緩衝液の添加、および70°Cで10分間加熱することにより停止した。MAPK活性は、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより評価した。このオートラジオグラムをデンシトメトリーにより定量化した。アミラーゼアッセイ。アミラーゼ測定のために、細胞を、2mlPBSで培地のないように洗浄した。次いで、インキュベーションを、15mMHEPES、0.2BSAおよび0.01大豆トリプシンインヒビターを含むDMEM中で実施した。CCK1nMを、37°Cで50分間添加した。次いでこのインキュベーション培地を、アミラーゼ測定のために即座に取り出し、そしてこの細胞を再び2mlの氷冷PBS中で洗浄した。mMで示す130Tris-HCl、10CaCl2、75NaCl、および0.2TritonX-100pH8.0を含む溶解物緩衝液を細胞に添加し、次いで溶解物を総アミラーゼのために集めたCeskaら、1969。放出されたアラーゼは、細胞中の総アミラーゼの百分率として表した。統計学。すべてのデータ値は、平均±SEMとして示され、そして処理された群間の差異は、1因子ANOVA分析により分析した。処理細胞と非処理細胞との間の差異は、Studentのt検定を用いて分析した。p<0.05は、有意な差異であると考えられた。インスリンおよびグルカゴンの発現に対するGLP-1の影響。GLP-1またはexendin-4処理の後、AR42J細胞は、インスリン含有細胞に変換する.抗インスリン抗体を用いると、強い免疫染色がAR42J細胞中に存在した。対照的に、GLP-1で処理されなかったAR42Jでは免疫染色が観察されなかった。過剰のインスリンおよびグルカゴンでの抗体の予備吸収は染色を防いだ図26。1nMGLP-1で、3日後に、約10が、インスリン陽性細胞に転換した。10nMGLP-1または0.1nMexendin-4を3日間用いた場合、約25のAR42J細胞が、インスリン陽性細胞に転換した。スライドのいくつかの領域で、隣接する細胞の全体のシートがインスリンについて陽性になった。24時間程度の早期にグルカゴン陽性細胞が時々出現した。48時間までに、すべての処理されたAR42J細胞の20がグルカゴン陽性であり、約6の細胞がインスリン陽性であった。72時間までにすべての処理された細胞の半分には十分の細胞がグルカゴンを含んでいた。グルカゴンを含んだ細胞の数は、その後減少したが、少なくとも7日間の間、なお約25の細胞がインスリン陽性のままであった図27。培養培地中のデキサメタゾンの存在または不在は、GLP-1の存在下で内分泌細胞に転換した細胞の数にいかなる方法によっても影響しなかった。ERKをリン酸化および活性化するMEKの選択的インヒビターであるPD9805950μM、またはPKI300μMがGLP-1と同時に添加されたとき、細胞の転換は生じなかった。インスリン放出。1nMGLP-1でAR42J細胞を処理する3日の期間の後、インスリンは、ラジオイムノアッセイにより培養培地中で容易に検出された。3つの別の培養にわたって、5.1±0.4pgインスリン/μgタンパク質平均±SDが、60~72時間の期間から細胞培養培地中に存在した。グルコースが、3日-GLP-1-処理および非処理細胞からインスリン分泌を誘導し得るか否かを調査するために、培地を除去し、そして細胞をグルコースを含まないKRBBで3回洗浄した。これに続いて、10mMグルコースを含むKRBBを1時間添加し、そしてこの細胞を37°Cで維持した。インキュベーション緩衝液を集め、そしてインスリンを測定した。コントロール細胞からはインスリンはゼロであった。その一方、GLP-1の3日に先に見られた細胞の緩衝液中には0.65±0.15pgインスリン/μgタンパク質が存在した。インスリン分泌は、200μMPKIの存在下、またはPD9805950μMの存在下でわずかに検出された。RT-PCR分析。RT-PCR分析は、3日の間、GLP-1処理AR42J細胞において、187bpのラットインスリンIおよびIImRNAを示した。RIN細胞を陽性コントロールとして用いた。この実験では、RNAは、DNAseで前処理し、推定された長さをもつインスリンIおよびIIのmRNAフラグメントのみを増幅し、それ故、187bpに出現したバンドは、特異的なインスリンmRNA産物であった図28A。対照的に、陰性コントロール中または非-GLP-1-処理細胞中ではRT-PCR産物は検出されなかった。GLP-1-刺激AR42J細胞のノザンブロット分析は、かすかに陽性であり、そしてそれ故このバンドは乏しく走査された。236bpのグルカゴンmRNAは、48時間のGLP-1-処理AR42J細胞中で検出された図28B。MAPキナーゼ活性。ERK活性化はAR42J細胞中で容易に検出された。その活性は、GLP-1で顕著に増加し、アメリカドクトカゲ毒液ペプチドであるexendin-4は、これはGLP-1に対して52相同であり、そしてインスリンの分泌促進物質であることが示されたGokeら、1993。exendin-4は、GLP-1に比べ約100倍より能力があった図29Aおよび29B。PKI300μM単独は、MAPK活性をコントロール細胞のそれより少なく減少させた。アミラーゼ変化。AR42Jをデキサメタゾンと72時間インキュベートすることは、非デキサメタゾン処理細胞1.88U/lと比較して、細胞においてアミラーゼ含量を6.6倍12.57U/l増加させた。GLP-1をデキサメタゾンと一緒に添加したとき、総アミラーゼ含量は、デキサメタゾンン処理単独に比べて減少した7.76U/l。CCK1nMに対する急性応答はまた、GLP-1で72時間前処理した細胞中で減少した図30。GLP-1は、膵臓内分泌細胞に、またはまさに少なくとも、内分泌形質を有する細胞に分化するようにAR42J細胞を誘導する。この所見と共に、同じパターンが、発生中の胎性膵臓で生じるGuzら、1995。グルカゴンが、検出された第一のホルモンであるRallら、1973。グルカゴンを含有する細胞は、種々の他のタイプの島内分泌細胞の前駆細胞であること、およびそれらは、順に、管上皮から生じたことが仮定されるGuzら、1995。しかし、膵臓ホルモン産生細胞の形成および分化を調節する機構は、なお大部分は未決定である。GLP-1は、AR42J細胞において非常に早期にグルカゴン産生を開始させ、そしてこれは、次いで、インスリン産生へと密に続く。最終的に、内分泌AR42J細胞の大部分は、グルカゴン産生が弱まるのでインスリン産生細胞である。Exendin-4は、AR42J細胞におけるインスリン産生のための因子としてGLP-1よりずっと強力であった。いくつかのインスリン含有細胞を、1011モル濃度程度の濃度のexendin-4の存在下で見られた。GLP-1および/またはGLP-1様ペプチド、おそらくexendin-4に類似するは、島のための胚における分化因子であり得る。このようなペプチドは、膵臓が原始腸管から形成するので、高濃度で局所的に存在することが予期される。グルカゴンは、細胞増殖の減少および巨大分子合成の変化に至るcAMPを増加し、β細胞表現型に達することにより、β細胞の分化のためのシグナルであると仮定されている。Rallら、1973。これはなお、AR42J細胞中に適用可能であり得る。グルカゴンが本発明者らの系で最初に見られたホルモンであるので、それは、インスリン産生のためのシグナルであり得る。原始腸管で産生されたGLP-1は、グルカゴン発現および続くインスリン発現のためのシグナルであり得、これは、内分泌細胞のさらなる形成および島様構造に至る。AR42J細胞ならびに他の細胞型における内分泌細胞分化への最終の共通経路は、ERK/MAPK経路を通ってであるようである。GLP-1またはExendin-4は、AR42J細胞においてほとんどまたは全くインスリン染色を生じず、そしてERK活性が阻害されるとき培地中にインスリンを生じない。GLP-1およびPKCインヒビターの存在下でほとんどまたは全くインスリンがないことが、観察される。GLP-1レセプターはGタンパク質結合性であり、AR42J細胞に存在し、そしてAR42J細胞中に細胞内カルシウムを上昇させることが知られているので実施例4を参照のこと、リガンド結合によるその活性化は、おそらく、PKC活性化、および未だ決定されていない下流の事象のような他の事象に至るNishizuka、1984;Zamponiら、1997。PKCは、順に、MAPK経路を活性化する因子の1つであることが示されているOffermannsら、1993;Siddhantiら、1995。従って、GLP-1によるPKC活性化のブロッキングは、おそらく、MAPK活性の消失に至り、そして内分泌細胞表現型の発生を防止した。さらに、全ての細胞が、7日程度のインキュベーションを伴ってでさえ、GLP-1を有する内分泌細胞に変換するわけではない。処理されたAR42J細胞は、未処理AR42J細胞について記載されるように、外分泌特性および神経内分泌特性の両方を有するChristophe、1994を参照のこと。形態学的には、処理細胞の種々の集団は、同じではないようである。従って、細胞の亜集団は、未処理AR42J細胞に存在し得る。詳細には、これらの集団のいくつかは、GLP-1レセプターを有するかもしれず、そして他は有さないかもしれない。AR42J細胞の全集団から作製された細胞集団は、ウェスタンブロッティング、PCR分析、および部分配列決定によってGLP-1レセプターを有する。配列決定の際に、レセプターは、β細胞に見出され、そして既に十分に特徴付けられているものと同一である実施例4を参照のこと。さらに、AR42J細胞の少なくとも50は、GLP-1に応答して細胞内カルシウムを増大させる。従って、GLP-1は、おそらく、細胞内カルシウムの増加、および今のところ他のこれまで未知の因子これは、AR42J細胞に明確に存在し、そしてそれらが内分泌細胞になるように方向付けるを必要とする一連の事象を活性化する。1型糖尿病と診断された被験体は、GLP-1またはexendin-4での処置について選択され得る。Gutniakら、1992の処置方法は、GLP-1が肘前静脈中にカニューレによって少なくとも24時間投与されるように改変され得る。カニューレは、0.03~4.80nmol/kg/分GLP-1の間でポンプ注入するインスリン注入システムに接続され得る。血中グルコースレベルが、当該分野で周知の方法を用いて、GLP-1の投与の間およびGLP-1投与の24時間の期間後、定期的にモニタリングされ得る。GLP-1注入の24時間後、被験体は、正常レベルに接近し、そしてインスリン療法の必要性を減少させた血中グルコースのレベルを示す。あるいは、1型糖尿病を有する被験体は、単回の皮下注射によって、または0.01nmol/kg~0.4nmol/kgの毎日の繰り返し皮下注射によって、exendin-4で処置され得る。血中グルコースレベルは、exendin-4の投与後、定期的にモニタリングされ得る。インスリン置換療法の必要性が減少し、そして血中グルコースレベルは正常なレベルに近づく。前述の実施例は、本発明を例証することを意図するが、限定することは意図しない。それらは、用いられ得る発明の典型ではあるが、当業者に公知の他の手順は、代替的に使用され得る。上記のように、細胞をGLP-1またはExendin-4と接触させることにより、GLP-1またはExendin-4の両方、実質的に相同な配列、またはそれらのフラグメントがともに使用され得ることが理解される。本願を通して、種々の刊行物が言及されている。これらの刊行物の開示は、その全体が、本発明が属する技術分野の水準をより十分に記載するために、本明細書によって本願に参考として援用される。参考文献REFERENCES1.Arveretal.1991.Differentaetiologiesoftype2non‐insulin‐dependentdiabetesmellitusinobeseandnon‐obesesubjects.Diabetologia.34:483‐487.2.Bradford.1976.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein‐dyebinding.Annal.Biochem.72:248‐254.3.Bressler,R.andJohnson,G.G.1997.Pharmacologicalregulationofbloodglucoselevelsinnon‐insulindependentdiabetes.Arch.Int.Med.157:836‐848.4.Busiketal.1997.Glucose‐SpecificRegulationofAldoseReductaseinCapan‐1HumanPancreaticDcustCellsInVitro.J.Clin.Invest.100:1685‐1692.5.Ceskaetal.1969.Anewandrapidmethodfortheclinicaldeterminationofalpha‐amylaseactivitiesinhumanserumandurine.Clin.Chim.Acta26:437‐444.6.ChenandDrucker.1997.Tissue‐specificexpressionofuniquemRNAsthatencodepro‐glucagon‐derivedpeptidesorexendin‐4inthelizard.J.Biol.Chem.272:4108‐4115.7.bChigwinetal.1979.Isolationofbiologicallyactiveribonucleicacidfromsourcesenrichedinridonuclease.Biochemistry.18:5294‐5299.8.ChomczynskiandSacchi.1987.Single‐stepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanate‐phenol‐chloroformextraction.Analyt.Biochem.162:156‐159.9.Christophe.1994.PancreatictumoralcelllineAR42J:anamphicrinemodel.Am.J.Physiol.266:G963‐971.10.DeOreetal.1997.TheeffectsofGLP‐1oninsulinreleaseinyoungandoldratsinthefastingstateandduringanintravenousglucosetolerancetest.J.Geront.52:B245‐249.11.Druckeretal.1987.Glucagon‐likePeptide1stimulatesinsulingeneexpressionandincreasescyclicAMPinaratisletcelllineProc.Natl.Acad.Sci.USA.84:3434‐3438.12.Eganetal.1994.Glucagon‐likepeptide‐17‐36amideGLP‐1enhancesinsulin‐stimulatedglucosemetabolismin3T3‐L1adipocytes:oneofseveralpotentialextrapancreaticsitesofGLP‐1action.Endocrinology135:2070‐2075.13.Eganetal.1991.Glucosestimulatedinsulinreleasebyindividualbetacel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