アミノ基及びカルボン酸基を繰り返し単位中に有する両性高分子化合物1~20重量と、分子量1000未満の糖類化合物025M~15Mと、分子量1000未満の非糖類多価アルコール5M~7Mとを溶解させた生理溶液を凍結保存液として用い、該保存液中に細胞のコロニーまたはシングルセルを分散させて、70°Cmin~150°Cminにて冷却を行うことを特徴とする細胞の凍結保存法。アミノ基及びカルボン酸基を繰り返し単位中に有する両性高分子化合物1~20重量と、分子量1000未満の糖類化合物を水酸基モル数ベースの濃度で003M~02Mと、分子量1000未満の非糖類多価アルコールを水酸基モル数ベースの濃度で29~37Mとを溶解させた生理溶液を凍結保存液として用い、該保存液中に細胞のコロニーまたはシングルセルを分散させて、70°Cmin~300°Cminにて冷却を行うことを特徴とする細胞の凍結保存法。前記両性高分子化合物は、ポリアミノ酸の側鎖アミノ基のうちの一部に、無水ジカルボン酸を反応させた形のアミド結合によりカルボン酸基が導入されたものであることを特徴とする請求項1または2に記載の凍結保存法。前記糖類化合物がスクロース、トレハロース、グルコース、ラフィノース、ラクトース、マルトース、マンノース、ガラクトース及びフルクトースからなる群より選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項1~3のいずれかに記載の凍結保存法。前記非糖類多価アルコールが、エチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、マンニトール、ジエチレングリコール及びトリエチレングリコールからなる群より選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項1~4のいずれかに記載の凍結保存法。細胞のコロニーまたはシングルセルを分散させて凍結保存するための凍結保存液であって、アミノ基及びカルボン酸基を繰り返し単位中に有する両性高分子化合物1~20重量と、分子量1000未満の糖類化合物025M~15Mと、分子量1000未満の非糖類多価アルコール5M~7Mとを生理溶液に溶解させてなることを特徴とする凍結保存液。前記両性高分子化合物は、繰り返し単位中にアミノ基側鎖を有するポリアミノ酸について、アミノ基の50~99モルに無水ジカルボン酸を反応させた形のカルボキシル基を導入した部分カルボキシル化ポリアミノ酸であり、前記糖類化合物が、スクロース、トレハロース、グルコース、ラフィノース、ラクトース、マルトース、マンノース、ガラクトース及びフルクトースからなる群より選ばれる少なくとも一種であり、前記前記非糖類多価アルコールが、エチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、マンニトール、ジエチレングリコール及びトリエチレングリコールからなる群より選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項6に記載の凍結保存液。現状の凍結保存法であると、特にヒトESiPS細胞の凍結保存は、解凍後の回復率が低く、手技に熟練が必要で一般化が困難である。また、多くの場合、毒性が高く、分化に影響を及ぼす物質が使用されている。そこで本発明は、解凍後の回復率がこれまでよりも高く、低毒性で分化に影響を及ぼさない成分で構成された凍結保存液を提供するとともに、これを用いることにより手技が簡便で容易に凍結保存が可能であるような凍結保存法を提供することを目的とする。本発明の凍結保存法は、アミノ基及びカルボン酸基を各繰り返し単位中に有する両性高分子化合物1~20重量と、低分子量分子量1000未満の糖類025M~15Mと、低分子量分子量1000未満の非糖類多価アルコール5M~7Mを溶解させた生理溶液を凍結保存液として用い、該保存液中に細胞のコロニーまたはシングルセル個々に遊離した細胞を分散させて、70°Cmin~300°Cminにて冷却を行うことを特徴とする。ここで、両性高分子化合物としては、好ましくは、カルボン酸基及びアミノ基を繰り返し単位中に有するポリアミノ酸またはその誘導体を用いる。特に好ましくは、ポリリジンの側鎖アミノ基を部分的に無水カルボン酸付加によりカルボキシル化エステル化したカルボキシル化ポリリジンを用いる。なお、本願において、高分子化合物は、数平均分子量が1000以上の化合物をいうこととし、糖類及び非糖類多価アルコールにおける低分子量とは、ポリグリセリンといった分子量分布を有する化合物である場合、数平均分子量が1000未満を意味することとする。また、カルボン酸基の語は、カルボン酸塩の形態のものを含めたカルボキシレート基を意味することとする。本発明の凍結保存液は、上記の両性高分子化合物1~20重量、糖類025M~15M、及び非糖類多価アルコール5M~7Mを含む。水の再結晶化防止剤としての両性高分子化合物と、低分子量の多価アルコールとからなる凍結保存液を用い、特には多価アルコールとして非糖類多価アルコールと糖類との組み合わせを用いることで、従前のガラス化法よりも緩慢な冷却を行っても、安定なガラス状態を獲得することを可能にする。そのため、クライオチューブやクライオバイアルなどと呼ばれるバイアル、またはその他の容器を液体窒素に直接浸漬することによる急激な冷却を行わなくとも、液体窒素蒸気中またはプログラムフリーザーなどを用いて作成した低温雰囲気下にて凍結することでガラス状態を形成させることが可能となる。また、特には、カルボキシル化ポリリジンなど両性高分子化合物による氷再結晶抑制効果を利用し、保存液のガラス状態を安定化させることで、急冷時および解凍時の結晶化、再結晶化を抑制することから、凍結時および解凍時の細胞へのダメージを低減し、凍結効率を高める効果が期待される。このような凍結技術により、安全で効率の高いヒトiPS細胞その他の細胞の凍結保存技術を提供することができる。すなわち、再生医療に応用可能なヒトiPS細胞などを当該保存液に浸漬して150°C雰囲気または液体窒素中もしくは液体窒素蒸気中でガラス状態とし、凍結保存することで毒性の高いジメチルスルホキシド、安全性に問題のある血清タンパクを使用せずに生存率、分化能を維持したまま保存することが可能である。既存の凍害防御剤であるジメチルスルホキシドを使用しないため、凍結する細胞に対する毒性が低く抑えられ、機能を維持したまま長期間凍結保存することが可能である。また、ウシ胎児血清、アルブミンなどのタンパク質成分を使用しないため感染症などの心配がなく、生物製剤によるロット間格差も影響しない。さらには、安全で効率が高く、実験者の手技に影響されずに、また、自動化が可能なヒトESiPS細胞その他細胞の凍結保存が可能となる。保存対象となる細胞としては、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞などの多能性幹細胞、及び各種の幹細胞の他、膵島から取り出された膵島細胞、膵島前駆細胞などより得られる膵島様細胞、各種の生殖細胞及び生殖器官細胞などが挙げられる。各種の幹細胞には、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞などが挙げられる。また、生殖細胞及び生殖器官細胞には、精子、卵母細胞、子宮内膜細胞、卵管上皮細胞、羊膜細胞、未受精卵細胞及び受精卵細胞などが挙げられる。以上に挙げた細胞種に限らず、場合によっては、内膜細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞などを凍結保存することもできる。すなわち、コロニーまたはシングルセルの状態にて保存液または培養液中に分散させることが可能でありさえすれば、本発明の凍結技術を適用することが可能である。好ましくは、本発明の凍結保存液は、水の再結晶化防止剤として、カチオン性基及びアニオン性基、特にはアミノ基及びカルボン酸基を有する水溶性の両性高分子を実質上1~20含み、その他組成は生理食塩水に糖類を025~1M、エチレングリコールやグリセリン、プロピレングリコールなどの低分子量の多価アルコールを6~8M添加した生理的溶液である。水の再結晶化防止剤としての両性高分子は、特に好ましくはカルボキシル基を導入したεポリLリジンである。低分子量の糖類は、特に好ましくは、スクロースショ糖;非還元性二糖、水酸基8個、トレハロース非還元性二糖、グルコース単糖、ラフィノース非還元性三糖などであり、これらからなる群から選ばれる一種以上を用いることができる。低分子量の糖類としては、ラクトース還元性二糖、マルトース麦芽糖;還元性二糖、マンノース単糖、ガラクトース単糖、フルクトース果糖;単糖なども同様に好適に用いることができ、以上に挙げた糖類化合物からなる群から選ばれる一種以上を適宜に用いることができる。低分子量の糖類としては、これらに限らず、単糖、二糖及び三糖のうちから適宜に選択して用いることができ、場合によっては、オリゴ糖などを部分的に配合することもできる。本発明の凍結保存液中における低分子量の糖類の濃度としては、025M~15Mを適した範囲ということができ、好ましくは05M~1Mであり、06~09Mを特に好ましい範囲として挙げることができる。なお、単糖、二糖及び三糖のいずれであるかにより、水酸基当量が大きく異なるため、これらの濃度範囲は、二糖に換算した濃度とすることができる。すなわち、水酸基モル数ベースの濃度では、003M~02Mを適した範囲ということができ、好ましくは006M~013Mであり、007M~011Mを特に好ましい範囲として挙げることができる。低分子量の多価アルコールとしては、特に好ましくは、上記のエチレングリコール、グリセリン、及びプロピレングリコールからなる群から選ばれる一種以上である。この中でもエチレングリコールを最も好ましいものとして挙げることができる。低分子量の多価アルコールとしては、上記の他、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、マンニトールなどの糖アルコールを好適に用いることができ、また、ジエチレングリコールやトリエチレングリコールを用いることもできる。すなわち、以上に挙げた多価アルコールからなる群から選ばれる一種または二種以上の組み合わせを用いることができる。場合によっては、ポリグリセリンなどの比較的分子量の大きい多価アルコール化合物を部分的に配合することもできる。本発明の凍結保存液中における低分子量の多価アルコールの濃度は、記のエチレングリコール、グリセリン、及びプロピレングリコールを用いる場合、特にはエチレングリコールである場合、約6Mから約7M、特には58~73Mであるのが好ましく、最も好ましくは63M~73Mである。このような濃度範囲とすることにより、一方ではガラス化状態を安定化させるための充分な効果を得るとともに、他方では、高濃度の多価アルコールによる細胞への悪影響を充分に小さくすることができる。但し、特にはソルビトールなどを用いる場合、水酸基当量が大きく異なるため、水酸基モル数ベースの濃度が、約3Mから35Mあまり、特には29~37Mであるのが好ましく、最も好ましくは31M~37Mである。但し、多価アルコールの種類により、水酸基の数が同じでも水和作用などに相違があるため、多少のずれが生じるものと推測される。本発明の凍結保存液をなす生理的溶液には、上記の他に、ポリエチレングリコール、フィコールFicoll;ショ糖とエピクロロヒドリンとの共重合体、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、パーコールPercoll;ポリビニルビロリドンで表面を被覆した粒径15~30nmのコロイダルシリカの水系分散液、アルブミンなどの高分子化合物を添加することも可能である。カルボキシル基を導入したεポリLリジンをはじめとする両性高分子化合物は、それ自体で細胞の凍結保護効果がある。その機序としては凍結時の膜保護等複数の原因が考えられるが、その中に氷の再結晶抑制効果が挙げられる。具体的なデータは省略するが本件発明者らが、種々の割合でカルボキシル基を導入したポリリジンを添加した30スクロース溶液の低温時の氷再結晶を調べたところ、凍結保護活性が得られるカルボキシル基導入割合と氷の再結晶抑制効果に強い相関が見られた。これまでの本件発明者らの研究経過からカルボキシル基の導入割合は50~80molが凍結保護効果および氷再結晶抑制効果が高く、最も適した導入率は60mol~70molである。一般の動物培養細胞、樹立細胞、ガン細胞などを保存するための冷却工程においては、緩慢凍結法といわれる凍結法が一般に採用されている。緩慢凍結法では10重量程度の凍結保護剤の存在下において1°Cmin程度の冷却速度にて凍結する。このことにより細胞内の自由水を脱水し、細胞内の微細構造を破壊することなく凍結保存が可能となる。しかし、ヒトES細胞やiPS細胞はこの方法での凍結効果が低いため、コンセプトの全く異なる凍結法であるガラス化法が推奨されている。ガラス化法Vitrification法は溶液の溶質濃度を高めたガラス化液中に細胞を懸濁させ、液体窒素中にバイアルごと浸漬することにより例えば約300°Cminにて急速に凍結することで水の結晶化を防ぎ、ガラス状態で固化させる方法である。この方法により水の膨張などによる細胞への毒性が抑制される。ガラス化保存の問題点の一つとして、溶解時にも急速に解凍しないと、再結晶化が起こり、細胞にダメージが与えられることが挙げられる。そこで、一般には溶解時には液体窒素から出したあと、37°Cに暖めた培地でできるだけ急激に溶解することが推奨されている。しかし、このときに再結晶化をなるべく起こさないためには熟練した技術が必要とされてきた。本発明によるとカルボキシル化ポリリジンなど両性高分子化合物による氷再結晶抑制効果を利用し、保存液のガラス状態を安定化させることで、急冷時および解凍時の結晶化、再結晶化を抑制することから、凍結時および解凍時の細胞へのダメージを低減し、凍結効率を高める効果が期待される。また、ガラス化液は通常溶質濃度が6M以上という非常に濃厚な水溶液であるため、浸透圧による細胞毒性が強いという問題がある。そのため、DAP213などの既存のESiPS細胞のガラス化では凍結前の撹拌を15秒程度で行わなければ細胞が死滅してしまうなどの問題が生じ、ここでも実験者の手技が大きく影響してくる。本発明では例えばカルボキシル化ポリリジンとスクロースの添加により溶液の粘度を上げることと、細胞膜保護効果により、浸透圧が与える影響が軽減されることを確認した。この結果から、懸濁に要する時間に余裕が生じ、実験者の手技にほとんど左右されることなく安定したガラス化保存が行える。さらに、凍結時に液体窒素に直接浸漬する方法では自動化などが困難であるが、本発明では当該保存液を用いることによりプログラムフリーザーなどであらかじめ作成しておいた150°C~90°Cの雰囲気下にバイアルを入れ同雰囲気温度を維持することにより得られるある程度緩慢な冷却速度下でもガラス化を起こし、効果の高い保存が行われることを示した。すなわち、バイアルを液体窒素に直接投入する際の冷却速度が200°Cmin程度であるのと比較して、その半分の冷却速度においてもガラス状態で固化することが確認された。従って本発明の保存液と保存のための凍結条件を用いれば、安全で効率が高く、実験者の手技に影響されずに、また、自動化が可能なヒトESiPS細胞の凍結保存が可能となる。前述のように、本発明の凍結保存液は、生理的溶液に、カルボキシル化ポリリジンなどの、繰り返し単位中にカチオン性基及びアニオン性基を有する水溶性高分子化合物が1~50ww溶解されてなる。好ましくは2~20ww、特に好ましくは3~15ww溶解されてなる。また、エチレングリコールなどの多価アルコールが3M~9M、好ましくは5M~8M、さらに好ましくは6M~7M溶解されてなる。また、スクロースなどの糖類が025M~15M、好ましくは05M~1M含まれてなる。生理的溶液としては、生理食塩水の他、各種の細胞または組織用の一般的な培養液を用いることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグルMEM培地DMEMを好ましいものとして挙げることができる。凍結保護成分である両性高分子化合物は、好ましくは数平均分子量が1000~100000、より好ましくは1000~2万である。好ましい両性高分子化合物であるカルボキシル化ポリアミンポリマーは、ポリアミンポリマーの繰り返し単位に含まれるアミノ基側鎖に、部分的にカルボキシル基が導入されたものである。カルボキシル基を導入するにあたり、無水ジカルボン酸を反応させるのが好ましいが、場合によっては、カルボキシメチル化などであっても良い。ポリアミンのうち、ポリリジンが最も好ましい。ポリリジンは、εポリLリジンもしくはεポリDリジン、αポリLリジン、αポリDリジンのいずれであっても良い。これらのうち、最も好ましい高分子種として、微生物または酵素により生産される数平均分子量が1000~2万、特には1000~1万のεポリLリジンを挙げることができる。εポリLリジンは、ストレプトマイセス属Streptomycesに属する放線菌により生産されてもっぱら食品添加物として用いられておりhttpwwwchissocojpfinejppolylisinindexhtml、重合度15~35のものの他、重合度が20以下のものの生産も試みられている例えば、特開2003171463、特開2005318815。数平均分子量または数平均重合度の測定は、SDSPAGE法により、例えば、アトー製の電気泳動装置及びデンシトグラフAE6920V型を用いて容易に測定することができる。このとき、標準タンパクマーカーを用いる。なお、ポリリジンその他のポリアミノ酸は、加熱処理による高分子量化により分子量3万以上として用いることもできる。しかし、粘度の上昇を防ぐ等の観点から上記の分子量範囲が好ましい。末端のみにフリーのカルボキシル基を有するポリリジンは、側鎖に1級アミノ基のみを有しているが、後述するように無水カルボン酸を用いて部分的にアミド化することで、優れた混和性能ないし可溶化性能を発揮するものと考えられる。特には、無水ジカルボン酸などを反応させて部分的にカルボキシル化することで、優れた性能を発揮することができる。ポリリジンその他のポリアミンのアミノ基は、好ましくは、部分的に、無水コハク酸によってカルボキシル化される。この際、ポリアミンのアミノ基について、好ましくは50~99モル、特には50~93、より好ましくは50~90モル、さらに好ましくは55~80モル、最も好ましくは58~76モルをカルボキシル化する。ここで用いられる無水コハク酸に代えて、無水クエン酸、無水グルタル酸、無水リンゴ酸、無水フマル酸、及び無水マレイン酸などの無水ジカルボン酸でも可能である。これらのうち、無水コハク酸を特に好ましいものとして挙げることができる。また、ここで、ポリリジンに代えて、ポリアルギニンやポリアスパラギン酸などといった、アミノ基側鎖を有するアミノ酸からなるポリアミノ酸を用いることもできる。また、場合によっては、キトサンを用いることもできる。さらには、上記のようなカルボキシル化ポリアミノ酸に代えて、ポリグルタミン酸のカルボン酸側鎖を、部分的にアミノ化したものを用いることもできる。また、場合によっては、ポリアリルアミンのアミノ基を、上記のポリリジンの場合と同様に部分的にカルボキシル化したポリアリルアミンを用いることもできる。すなわち、高分子化合物の繰り返し単位が、アミノ基及びカルボキシル基を共に有するのが特に好ましい。特に好ましい態様において、カルボキシル化またはアミノ化により側鎖にアミド結合部が導入されている。なお、ポリアミンポリマーに対するカルボキシル基の導入に代えて、またはカルボキシル基の導入とともに、スルホネート基などの他のアニオン基を導入することもできる。本発明の凍結保存液には、必要に応じて、抗酸化剤その他の添加剤が添加することができる。細胞が凍結から解凍される際に酸化ストレスによるダメージを受けると言われており、抗酸化剤を添加することで効果が高まることも期待される。抗酸化剤は例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ビタミンE、ビタミンC、エピガロカテキンガレートなどのポリフェノール類またはグルタチオンなどが挙げられる。次に、本発明の凍結保存法の好ましい実施形態によると、上記の凍結保存液に細胞のコロニーまたはシングルセルを分散させ、クライオチューブまたはクライオバイアルと呼ばれる円筒状または円筒の先端側がコニカル状のバイアル中に入れて密栓した後、プログラムフリーザー等の温度調節機器を用いて作成した150°C~90°Cの雰囲気下にバイアルを入れ、同雰囲気温度を維持する。ここで用いるバイアルは、一般に、ポリプロピレンなどのプラスチック製であって壁の厚みが例えば02~04mmであるが、内径が2~5mmといった急速凍結用のストロー状のバイアルの他、上記の緩慢凍結法でのバイアルを用いることができる。すなわち、径が10~20mm、例えば12~17mmであって、容量が例えば1~10mLのものを用いることができる。そのため、急速凍結用のバイアルを用いる場合に比べて大量の細胞を効率よく凍結保存することができる。特には、プログラムフリーザー等により、細胞分散液について、好ましくは70°Cmin~150°Cmin、特に好ましくは80°Cmin~120°Cminでの冷却を容易に行うことができる。この範囲の冷却速度であれば、比較的穏やかにガラス化が進むため均一に固化し、またガラス化が両性高分子化合物の添加により安定化されていることから溶解時の再結晶化によるダメージも抑制することができる。特には、幹細胞などといった、凍結時及び解凍時にダメージを受け易い細胞について、良好な保存を実現することができる。すなわち、上記の本発明の凍結保存液を用いるとともに、プログラムフリーザー等の温度調節機器を用いて作成した150°C~90°Cの雰囲気下にバイアルを入れ同雰囲気温度を維持することにより、安定したガラス化が得られ、半自動化、自動化凍結法を開発することが可能である。ここで、プログラムフリーザーは、予め設定された冷却プログラムにしたがって自動冷却を行う装置であり、一般に液体窒素に浸漬するなどの冷却浴が不要で複数のバイアルを設置しての自動冷却が可能であることから、凍結保存にかかるコスト及び手数を低減することができる。例えば大陽日酸株式会社のプログラムフリーザーCMシリーズについて、使用状況に合わせた適宜の改変を加えて用いることができ、バイブレーション機能などを用いて非常に均一な冷却を行うことができる。なお、上記の本発明の凍結保存液を用いるならば、バイアルを液体窒素に直接浸漬する方法などにより、従来のガラス化法と同様の200°Cmin~300°Cminの冷却速度で冷却を行っても、かなりの凍結保存効果を得ることができる。したがって、本発明の凍結保存液は、70°Cmin~300°Cminの冷却速度での凍結保存に用いることができる。以下、この発明の実施例及び比較例を示す。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。<実施例1凍結保存溶液の調整>εポリLリジンチッソ社製、分子量4000は25水溶液のものを用い、分子中のアミノ基に対し、モルで0~100の無水コハク酸和光純薬工業製を添加することでカルボキシル基導入率の異なるポリリジンを作成した。ポリリジン分子中のアミノ基のカルボキシル基への置換率はTNBS法トリニトロベンゼンスルホン酸法によるアミノ基の定量法により求めた。なお、以降、たとえばポリリジンのアミノ基のうち65モルをカルボキシル基に置換した場合、PLLと表示することとする。PLL溶液をダルベッコ改変培地DMEM、シグマアルドリッチ製に0~20wwとなるように添加した。このPLL溶液に、添加物としてエチレングリコール和光純薬を5~75M、スクロースを075Mとなるように添加した。この際、pHが64~80の範囲内になるように1Nもしくは5N水酸化ナトリウム水溶液で中和した。一方、比較例の凍結保存溶液としてDAP213を作成した。この際、DMSO、アセトアミド、プロピレングリコールはすべて和光純薬工業製を用い、それぞれ、2M、1M、3Mを生理食塩水に溶解し作成した。<実施例2温度降下速度測定>エチレングリコール65M、スクロース075M、PLL75のガラス化液を1mLクライオバイアルSimportPlasticsに熱電対を入れ、そのバイアルを液体窒素中に浸漬、もしくは、あらかじめ150°Cにチャンバー内を冷却しておいたプログラムフリーザー大陽日酸内に投入、もしくは室温のチャンバーに投入後、液体窒素蒸気を吹き付けて150°Cに急冷した時の温度降下速度を定量した。その結果を表1に示した。液体窒素直接投入では2948°Cminという冷却速度であったが、150°C雰囲気下投入及び液体窒素吹きつけでは冷却速度が13~14程度小さくなることがわかった。<実施例3各冷却条件での各種ガラス化液のガラス化状態評価>エチレングリコール5~75M、スクロース075M、PLL0~75の各ガラス化液と、比較例としてDAP213ガラス化液を15mLマイクロチューブに200μL添加した状態で実施例2にて得られた3種の冷却条件で冷却し、ガラス化が起きるかどうかを検討した。また、解凍時に室温で放置し、再結晶化が起きるかも評価した。評価法は、目視で判定し、透明なままであればガラス化および再結晶化が起こらなかったとして○評価、白濁すれば結晶化が起きたとみなし×評価、ひび割れや一部白濁などを△評価とした。その結果を表2に示した。DAP213は2948°Cminの冷却速度ではガラス化が起きたが、993°Cminでは不完全なガラス化となり、727°Cminの冷却速度ではガラス化が起きなかった。また、室温放置では再結晶化が進行し、白濁することが確認された。一方、エチレングリコールの濃度を変えたガラス化液の系では、5MではPLLを添加しない系では液体窒素に直接投与条件で一部白濁、その他の緩慢ガラス化条件では白濁し、ガラス化されなかった。また、再結晶化はいずれの条件でも起こり、白濁した。しかし、PLLを添加することでガラス化が安定し、75添加系においてはいずれの条件でもガラス化することが確認された。しかしながらそのEG濃度ではPLLの添加条件下でも再結晶化を防ぐことはできなかった。また、EGの濃度を高めることによりガラス化が安定となることが見て取れ、いずれの条件でもPLLの添加濃度依存的にガラス状態の安定化が見られた。特にEG6MではPLLの添加効果が顕著であり、無添加ではいずれの条件でも再結晶化が起こるにもかかわらず、75添加することによりいずれの条件でもガラス化が起こり、再結晶化が起こらないことが確認できた。また、EG7M以上ではガラス状態がかなり安定となり、75MではPLLの添加にかかわらずすべての条件でガラス状態の安定化が見られた。<実施例4各ガラス化条件によるヒトiPS細胞の凍結保存>凍結保存実験に供したヒトiPS細胞は京都大学iPS研究所より供与された253G1株、継代数20~70までを用いた。SNL細胞をフィーダー細胞として培養したヒトiPS細胞1mgmLコラーゲナーゼタイプIV、1mMCaCl2、025トリプシンPBS溶液で5分間処理し、コロニーの状態で回収した。回収したiPS細胞コロニー懸濁液を試験区分の遠心管に分注し、一つは凍結を行わない未凍結区とし、フィーダー細胞上に播種し、培養を行った。また、試験区はそれぞれDAP213および、EG濃度、PLL濃度を変化させたスクロース075M含有ガラス化液200μLにて30秒間懸濁を行い、上記3種の冷却速度条件にてガラス化保存を行った。解凍はそれぞれ37°Cに暖めた培地を1mLバイアルに添加し、素早く撹拌して溶解後、9mLの培地にて洗浄し、フィーダー細胞上で培養を行った。評価は4日間培養を行った時の各条件ごとの総細胞数を、同じ実験群の中の未凍結区の4日間培養を行ったときの総細胞数で除したものを回復率として比較した。その結果を図1に示す。その結果、DAP213では294°Cminの場合に20程度の回復率が得られたが、それ以下の冷却速度ではかなり低い回復率となった。一方、EG系ではすべての濃度でDAP213よりも高い回復率が得られ、また、PLLの添加濃度依存的に高い値が得られた。しかしEGが75Mの様な高濃度では細胞への毒性が高いため回復率が低下した。興味深いことに、EG65Mでは294°Cminに比べ、99°Cminの方が回復率が高い系が特にPLL添加系で見られた。これは液体窒素に浸漬することであまりに急激な温度変化による体積変化によりひび割れることが多く、そのため、iPS細胞が物理的ダメージを受けることが原因の一つと考えられる。従って99°Cminの冷却速度であれば比較的穏やかにガラス化が進むため均一に固化し、またガラス化がPLLの添加により安定化されていることから溶解時の再結晶化によるダメージも抑制することが可能となり、既存の凍結保存液および方法よりもすぐれた技術であるといえる。<実施例5凍結保存ヒトiPS細胞の性質評価>本発明の手法で凍結保存したヒトiPS細胞がiPS細胞としての機能を解凍後も示すことを確認する必要がある。そこで、まず、EG65M、スクロース075M、PLL75で凍結し、解凍した後のヒトiPS細胞がinvitroにて未分化マーカーを発現しているかを免疫染色法およびアルカリホスファターゼ染色により調べた結果を図2に示す。確認した未分化マーカーはアルカリホスファターゼ、Oct4、SSEA3、SSEA4、TRA160、TRA181である。アルカリホスファターゼはシグマのアルカリホスファターゼ活性キットを用い、赤色発色を光学顕微鏡で観察した。その他の5つの未分化マーカーに関してはそれぞれの一次抗体で処理した後、各抗体に適した二次抗体の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。二次抗体に結合した蛍光色素の関係でOct4、SSEA3、TRA160陽性細胞は緑色蛍光、SSEA4、TRA181陽性細胞は赤色蛍光を発する。図2には、蛍光顕微鏡により得られたカラー画像をRGB分解後、緑色蛍光のものは緑色成分のみ、赤色蛍光のものは赤色成分のみを示す。図2より、すべてのマーカーが陽性であり、本発明法で凍結保存したヒトiPS細胞は未分化能を保っていることが確認された。また、invitroでの多能性評価として、ヒトiPS細胞から胚様体を形成させ、その後分化誘導をかけることで、三胚葉由来のタンパク発現を確認した。その結果を図3に示した。図3も、図2と同様に、蛍光顕微鏡により得られたカラー画像をRGB分解後、緑色蛍光のものNestin及びαSMAは緑色成分のみ、赤色蛍光のものAFPは赤色成分のみを示す。αフェトプロテインAFPは肝臓由来のタンパクであり、内胚葉への分化を示している。Nestinは神経由来のタンパク質であり、外胚葉への分化を示している。また、α平滑筋アクチンαSMAは筋肉のマーカーであり、中胚葉への分化を示している。これらすべてのマーカーが陽性であることから、invitroにおいて本発明手法で凍結したiPS細胞は多能性を維持しているということができる。しかし、さらに多能性幹細胞としての分化能を評価する方法としてiPS細胞をマウスに埋植し、奇形腫の形成を見る方法がある。これは、iPS細胞がinvivoにおいても多能性を発揮するかどうかを確認する方法で、ESやiPS細胞の多分化能を確認する上でよく用いられる手法である。本発明保存手法で凍結解凍したヒトiPS細胞を約1×106個を100μLの生理食塩水に懸濁し、SCIDマウス日本クレア、5週齢雌、n5の背部皮下に注射により移植した。10週間後、移植部位に形成された腫瘍を取り出し、ヘマトキシリン-エオジン染色により組織学的に評価を行った。その結果が図4である。図4は、顕微鏡による画像をRGB分解後、緑色成分のみを示す。図4より、形成された腫瘍に中胚葉の軟骨Cartilage、外胚葉の神経上皮Neuroepithelium、内胚葉の内胚葉性上皮endodermalepitheliumが確認され、三胚葉由来の組織が混在する奇形腫であることが確認された。すべてのマウスN5で同様の結果であった。これらの未分化能、多能性評価の結果より、本発明の凍結保存用組成物および冷却条件で保存したヒトiPS細胞は多能性幹細胞としての機能が維持されることが確認された。<実施例6ヒトiPS細胞の染色体異常評価>ヒトiPS細胞は移植される可能性があるため、操作技術などにより遺伝子異常が起こることは望ましくない。簡易に遺伝子異常を調べる手段として、染色体異常を評価する手法がある。これにより染色体の欠失や重複などの異常が判別できる。本発明保存液および手法で凍結保存したヒトiPS細胞の形状をGBand法により調べた結果を図5に示した。この結果より、すべての染色体に異常は見られなかったことから、本発明手法によりヒトiPS細胞は遺伝子異常を引き起こさずに凍結保存可能であった。