"ヘリコバクターピロリhelicobacterpyloriに対して抗菌活性があるペプチドであって、式I:Xa-ZA-PPP-Xb-EVF-ZB-XcI[式中、Xaが、長さa残基を有する任意のアミノ酸残基の配列を示し、任意選択であり、Xbが、長さb残基を有する任意のアミノ酸残基の配列を示し、Xcが、長さc残基を有する任意のアミノ酸残基の配列を示し、任意選択であり、aが、0~50の整数であり、bが、6~20の整数であり、cが、0~50の整数であり、ZAが、アミノ酸配列CT配列番号1の残基128~129を示し、任意選択であり、ZBが、アミノ酸配列EYLD配列番号1の残基148~151を示し、任意選択であり、ただしZA及びZBの少なくとも一方が存在し、ペプチドの分子量が、6000Da未満である]による構造を有する上記ペプチド。ZAが存在する、請求項1に記載のペプチド。ZBが存在する、請求項1又は2に記載のペプチド。bが、8~16である、請求項1から3までのいずれか一項に記載のペプチド。bが、10~14である、請求項4に記載のペプチド。bが、11~13である、請求項5に記載のペプチド。bが、12である、請求項6に記載のペプチド。Xbが、配列:KIKNGKHTFSEV配列番号1の残基131~144と少なくとも70の同一性を有するアミノ酸配列を示す、請求項1から3までのいずれか一項に記載のペプチド。Xbが、配列:KIKNGKHTFSEV配列番号1の残基131~144と少なくとも80の同一性を有するアミノ酸配列を示す、請求項8に記載のペプチド。Xbが、配列:KIKNGKHTFSEV配列番号1の残基131~144と少なくとも90の同一性を有するアミノ酸配列を示す、請求項9に記載のペプチド。Xbが、配列:KIKNGKHTFSEV配列番号1の残基131~144を有するアミノ酸配列を示す、請求項10に記載のペプチド。a及びcの両方が0~25である、請求項1から11までのいずれか一項に記載のペプチド。a及びcの両方が0~10である、請求項12に記載のペプチド。a及びcの両方が0~2である、請求項13に記載のペプチド。配列:CTPPPKIKNGKHTFSEVEVFEYLD配列番号1の残基128~151を含む、請求項1から14までのいずれか一項に記載のペプチド。ヘリコバクターピロリhelicobacterpyloriに対して抗菌活性があるペプチドであって、配列番号1のアミノ酸190~216に記載の配列を含むペプチド、配列番号1のアミノ酸190~216又はその部分配列と同一の配列を有する少なくとも8アミノ酸残基を含むペプチド、配列番号1のアミノ酸190~216又はその部分配列と少なくとも50の同一性がある配列を有する少なくとも10アミノ酸残基を含むペプチドから成る群から選択され、ただし前記ペプチドの分子量が6000Da未満である上記ペプチド。天然に存在するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を含まず、前記アミノ酸残基を連結している完全に天然のペプチド骨格を有する、請求項1から16までのいずれか一項に記載のペプチド。1個、又は2個以上のアミノ酸類似体又はアミノ酸模倣体を含む、請求項1から16までのいずれか一項に記載のペプチド。前記骨格が、1個、又は2個以上の非天然の結合を含む、請求項1から16まで又は18のいずれか一項に記載のペプチド。前記非天然の結合が、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-シス又はトランス、-COCH2-、-CHOHCH2-、及び-CH2SO-から成る群から選択される結合を含む、請求項19に記載のペプチド。修飾された末端を有する、請求項1から20までのいずれか一項に記載のペプチド。薬剤として使用する、請求項1から21までのいずれか一項に記載のペプチド。ヘリコバクターピロリhelicobacterpylori感染の治療に使用する、請求項1から22までのいずれか一項に記載のペプチド。経口投与によって使用する、請求項22又は23に記載のペプチド。請求項1から24までのいずれか一項に記載のペプチドを含む医薬組成物。ヘリコバクターピロリhelicobacterpylori感染の治療に使用するヒトCD46ポリペプチド配列番号1の有効な変異体を含む薬剤。前記有効な変異体が、配列番号1のアミノ酸128~151又はその有効な変異体を含むペプチドである、請求項26に記載の薬剤。前記有効な変異体が、配列番号1のアミノ酸190~216又はその有効な変異体を含むペプチドである、請求項26に記載の薬剤。前記有効な変異体が、6000Da未満の分子量を有する、請求項26から28までのいずれか一項に記載の薬剤。前記有効な変異体が、ヒトCD46ポリペプチド配列番号1である、請求項26に記載の薬剤。前記有効な変異体が、ヘリコバクターピロリhelicobacterpyloriに対する殺菌効果を有する、請求項26から30までのいずれか一項に記載の薬剤。前記有効な変異体が、ヘリコバクターピロリhelicobacterpyloriに対する殺菌効果を有し、invitroで、1mMの濃度で細菌生存率を少なくとも50減少させる、請求項31に記載の薬剤。前記有効な変異体が、ヘリコバクターピロリhelicobacterpyloriウレアーゼUreA阻害活性を有する、請求項26から32までのいずれか一項に記載の薬剤。前記有効な変異体が、ヘリコバクターピロリhelicobacterpyloriウレアーゼUreA阻害活性を有し、invitroで、1mMの濃度で少なくとも50阻害する、請求項33に記載の薬剤。医薬として許容される安定剤、担体、賦形剤又は希釈剤を更に含む、請求項26から34までのいずれか一項に記載の薬剤。前記薬剤が経口投与用である、請求項26から35までのいずれかに記載の薬剤。したがって、現在の療法に付随する問題を有さないH.ピロリ感染の薬物療法を提供することが、本発明の目的である。定義アミノ酸という用語は、タンパク質中に天然に存在するアミノ酸を含み、そのアミノ酸が生物学的起源か非生物学的起源化学的に合成されたものなどかどうかの制限は無い。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、並びに細胞によって翻訳後修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸及びO-ホスホセリンである。その用語は、アミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を含むこともできる。好ましい実施形態の関連において、その用語は天然に存在するアミノ酸だけを意味する。本発明者らは、ヘリコバクターピロリの病原性の原因となる新規な機序を同定し、ヘリコバクターピロリ感染に対する新規な療法を考案することが可能になった。この洞察は、1H.ピロリが生物学的に関連のある、細菌性の胃上皮細胞相互作用及びCD46トランスジェニックマウス例1から成るinvitro及びinvivoモデルにおいて、CD46の下方制御を誘導するという研究結果、2CD46/ペプチドと2つのH.ピロリタンパク質であるUreA及びAhpCとの相互作用の可能性の同定例2、3rCD46とP3ペプチドなどCD46から得られる特定のペプチドの両方が、H.ピロリの増殖並びにウレアーゼ活性を阻害することの発見例3~5、及び4P3ペプチドが、invivo実験モデルにおいて胃から細菌を根絶することの実証例6により得られた。したがって本発明は、ヘリコバクターピロリ感染の治療に使用するヒトCD46配列番号1又はその有効な変異体を含む薬剤を提供する。換言すれば、ヘリコバクターピロリ感染の治療薬の製造に対するヒトCD46配列番号1又はその有効な変異体の使用を開示する。更に換言すれば、本発明は、ヒトCD46配列番号1又はその有効な変異体を、それを必要とする対象に投与することを含む、ヘリコバクターピロリ感染の治療方法を開示する。ヒトCD46タンパク質の多くの変異体が有効であり、本発明の教示によって過度の負担無しに利用できることは、当業者には直ちに理解される。有効性について、当業者の日常的な作業だけが、前記変異体の合成及び試験に必要とされる。有効な変異体という用語は、ヘリコバクターピロリ感染の治療に効果があるヒトCD46の変異体を含む。本発明の範囲で有効な変異体であるためには、その変異体は、以下で詳述する特定の機能的及び構造的特徴を保有する必要がある。ヒトCD46の有効な変異体の機能的特徴有効な変異体は、ヘリコバクターピロリに対する殺菌効果を有する変異体であり得る。有効な変異体は、ヘリコバクターピロリに対する殺菌効果を有し、invitroで1mMの濃度、より好ましくは100μM、更により好ましくは30μM、なお一層好ましくは7μM、最も好ましくは1μMで、細菌生存率を少なくとも50減少させる50~100の減少を意味することができる。当業者は、例えば、例4又は6に開示した方法によって、過度の負担無しに殺菌効果を決定できる。代替的に又は追加的に、有効な変異体は、ヘリコバクターピロリウレアーゼUreA阻害活性を有することができる。有効な変異体はヘリコバクターピロリウレアーゼUreA阻害活性を有し、invitroで1mM濃度、より好ましくは100μM、更により好ましくは30μM、なお一層好ましくは7μM、最も好ましくは1μMで、少なくとも50阻害する50~100の阻害を意味することができる。当業者は、例えば、例5に開示した方法によって、過度の負担無しにヘリコバクターピロリウレアーゼUreA阻害活性を決定できる。ヒトCD46の有効な変異体の構造的特徴以下の文脈において有効なという用語は、前述のヒトCD46ポリペプチド配列番号1の有効な変異体の機能的特徴を保有するものと理解される。有効な変異体という用語は、aヒトCD46の部分配列を含むヒトCD46ポリペプチドの有効な断片、bヒトCD46ポリペプチド又はaで定義したその有効な断片の有効なムテイン、cヒトCD46又はaで定義したその有効な断片若しくはbで定義したその有効なムテインを含むヒトCD46ポリペプチドの有効な融合タンパク質、dヒトCD46又はa、b若しくはcで定義したその有効な変異体の有効なペプチド模倣体、及びeヒトCD46又はa、b、c若しくはdで定義したその有効な変異体の有効な機能的誘導体を包含する。好ましくは、有効な変異体は、少なくとも10アミノ酸残基、より好ましくは15アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも20アミノ酸残基の配列を含むペプチドを含み、前記配列はヒトCD46配列番号1又はその部分配列と同一である。更に好ましくは、その有効な変異体は、少なくとも10アミノ酸残基、より好ましくは15アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも20アミノ酸残基の配列を含むペプチドを含み、前記配列は、ヒトCD46配列番号1又はその部分配列のムテインに対応する。好ましくは、その有効な変異体は、6000Da未満の分子量を有する。ヘリコバクターピロリ感染の治療に有効な配列番号1の可能なムテインの例には、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも少なくとも85、少なくとも87、少なくとも88、少なくとも89、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98若しくは少なくとも99の配列同一性を、又は上述した数字のいずれか2つの組合せによって作成される任意の区間同一性、例えば70~99若しくは80~99の同一性、を有する配列が含まれる。好ましくは、そのムテイン配列は、配列番号1と少なくとも5050~100、より好ましくは少なくとも6060~100、更により好ましくは少なくとも7070~100、なお一層好ましくは8080~100、最も好ましくは9090~100の配列同一性を示す。上述した有効な変異体ペプチドは、好ましくは天然のペプチド骨格を有する、又はペプチド模倣体であり得る。好ましくは、前記ペプチドは天然に存在するアミノ酸だけを含み、又は1、2、3、若しくは4個以上のアミノ酸類似体若しくは模倣体を含むことができる。医薬組成物及び投与本発明の薬剤は、医薬として許容される安定剤、担体、賦形剤又は希釈剤を更に含むことができる。換言すれば、その薬剤は医薬組成物であり得る。薬剤又はその医薬組成物は、好ましくは経口投与用として処方される。ペプチド薬剤は通常、取り込まれる前に消化器系によって分解されるので、経口投与は、通常とは異なるペプチド薬剤の投与法である。ヘリコバクターピロリ感染において、本発明者は、本発明の薬剤が実際に経口投与できることを示した例6を参照のこと。経口投与は利便性という理由で好ましいが、この場合にも、処置するべき感染が主に存在する胃内壁の粘液において有効な濃度を得るために、高濃度の薬剤に全身を曝露する必要がないという利点もある。その薬剤又はその医薬組成物は、好ましくは錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、混合剤などを含めた公知の経口剤形である。用法に関しては、日常の実験によって、当業者はヘリコバクターピロリ感染の治療に有効な用量を決定できる。有効量は、剤形、対象のサイズ、感染の重症度及び対象に感染している特定の細菌株に応じて変化させることができる。その有効量は、好ましくは、0.01~1,000,000nmol/kg、より好ましくは、0.1~100,000nmol/kg、更により好ましくは1~10,000nmol/kg、最も好ましくは100~1000nmol/kgである。新規なペプチド及びその使用本発明は、a配列番号1のアミノ酸128~151に記載の配列を含むペプチド、b配列番号1のアミノ酸190~216に記載の配列を含むペプチド、c配列番号1のアミノ酸128~151と同一の配列又はその部分配列を有する少なくとも8アミノ酸残基を含むペプチド、d配列番号1のアミノ酸190~216と同一の配列又はその部分配列を有する少なくとも8アミノ酸残基を含むペプチド、e配列番号1のアミノ酸128~151と少なくとも50の同一性がある配列又はその部分配列を有する少なくとも10アミノ酸残基を含むペプチド、及びf配列番号1のアミノ酸190~216と少なくとも50の同一性がある配列又はその部分配列を有する少なくとも10アミノ酸残基を含むペプチドから成る群から選択されるペプチドも開示する。好ましくは、上記のc及び/又はdにおいて同一な配列の長さは、少なくとも10アミノ酸、より好ましくは少なくとも12アミノ酸、更により好ましくは少なくとも14アミノ酸、なお一層好ましくは少なくとも16アミノ酸、最も好ましくは少なくとも20アミノ酸である。同一配列の最大の長さは、c及びdについてそれぞれ23及び26である。好ましくは、上記のe及び/又はfにおいて部分的に同一な配列の長さは、少なくとも12アミノ酸、より好ましくは少なくとも14アミノ酸、更により好ましくは少なくとも16アミノ酸も、なお一層好ましくは少なくとも20アミノ酸、最も好ましくは少なくとも23アミノ酸である。部分的に同一な配列の最大長さは、e及びfについてそれぞれ23及び26である。好ましくは、そのペプチドは、6000Da未満の分子量を有する。好ましくは、上記のe及び/又はfにおいて部分的に同一な配列は、前記配列番号1のアミノ酸と少なくとも5050~100、より好ましくは少なくとも6060~100、更により好ましくは少なくとも7070~100、なお一層好ましくは8080~100、最も好ましくは9090~100の配列同一性を示す。前記ペプチドを、薬剤として使用する、好ましくはヘリコバクターピロリ感染の治療に使用することについても開示する。前記ペプチドを含む医薬組成物も開示する。本発明は特定の開示された実施形態について記述されているが、当業者は、特に言及されないがそれでもなお添付の特許請求の範囲内である他の実施形態、変形、又は組合せを予見することができる。本明細書に引用される全ての参照文献は、その全てを参照により本明細書に組み込む。本明細書で使用される含んでいるという表現が、記載された項目を含むがこれに限定されないということは理解されよう。ここで、本発明を以下の非限定的な例によって記述する。以下の例において使用される方法の詳細な説明について、読者は、表題材料及び方法の欄の関連説明を参照されたい。例1H.ピロリは、ヒト胃上皮細胞からのCD46の脱落を誘導するCD46を高レベルで発現するAGS胃上皮細胞並びに3種のH.ピロリ野生型株、J99、HPAG1及び26695を使用して、ヒトCD46とH.ピロリとの相互作用を研究した。感染18時間後、3つ全ての株がAGS細胞に付着した図1A。H.ピロリによる胃上皮細胞の感染がCD46の発現に変化をもたらしたかどうか決定するために、AGS細胞を、H.ピロリ株とMOI100で、又は培地単独と18時間インキュベーションした。フローサイトメトリーによる分析から、H.ピロリの感染により3つ全てのH.ピロリ株の細胞表面でCD46が90以上減少したことが、明らかになった図1B。ELISAアッセイにより、感染細胞から集めた上清中に無感染の対照と比較して、より多量のCD46が実証されたP≦0.01、図1C。これらのデータは、H.ピロリの感染が、ヒト胃上皮AGS細胞からのCD46の脱落を助長することの証拠となる。例2H.ピロリは、組換えCD46rCD46に結合するH.ピロリの感染後にCD46が胃上皮細胞から放出されるので、本発明者らはH.ピロリがCD46を結合する可能性があると仮定した。本発明者らは、組換えチオレドキシン-CD46融合タンパク質rCD46を作製し、精製した図2A。細菌に対するrCD46の結合を、3つの異なる方法、ELISA、フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡検査で算定した。H.ピロリ溶菌液及びCD46抗体を使用するELISAにより、全ての株がrCD46に結合することが実証された図2B。大腸菌E.coliの溶菌液又はチオレドキシン単独では、かなり低下したレベルで結合したので、その結合はH.ピロリに特異的だったデータ不掲載。反対に、rCD46とカンピロバクタージェジュニCampylobacterjejuniとの相互作用は、検出されなかったデータ不掲載。フローサイトメトリー分析から、株の間で結合レベルは少し変化したが、3つ全てのH.ピロリ株がrCD46に結合することが実証された図2C。更に、増殖培地のpHの変化は、H.ピロリとrCD46との相互作用に影響を及ぼさなかったデータ不掲載。これらデータにより、H.ピロリとrCD46との相互作用が特異的であることが実証される。細胞表面に堆積した後、C3bは高い親和性でCD46を結合する。CD46-H.ピロリの相互作用の特異性を更に確認するために、C3bを使用する競合アッセイを計画した。J99株が強いrCD46結合を示したので、これらの研究用として選択した図2D。組換えCD46を、C3b又は抗CD46抗体と1時間プレインキュベーションし、更に細菌と2時間インキュベーションした。フローサイトメトリー分析により、C3bとCD46抗体の両方が、H.ピロリに対するrCD46の結合を著しく遮断することが示された。これらデータにより、C3b及びH.ピロリが、重複している又は密接に関連したCD46ドメインを認識することが確認される。CD46中のC3b結合に関与する部位が、C末端補体制御タンパク質ドメインであるCCP-3及びCCP-4にマップされた。ここでその結果は、H.ピロリもこれらのドメインに結合することを支持している図2D。H.ピロリに対するrCD46の結合は、抗CD46抗体を使用する免疫蛍光顕微鏡観察によっても実証された図2E。予想外に、CD46の結合は、細菌の形態の変形、つまり細菌のらせん形状の消失、細菌の凝集の増大、及び細菌の溶菌をもたらした図2F。例3CD46は、H.ピロリの増殖を阻害するH.ピロリJ99をrCD460~100μgと6時間インキュベーションすることにより、H.ピロリに対するrCD46の殺菌効果を更に評価した。rCD46を用いる治療は用量依存的に細菌生存を損なったが、対照タンパク質のチオレドキシンTrxは殺菌効果を有さなかった図3A。H.ピロリをrCD46と共に0、6、24時間インキュベーションすることにより、細菌生存を経時的に調査した。細菌生存は長いインキュベーション時間によって明らかに減少した図3B。したがって、rCD46は、用量及び時間依存的にH.ピロリの増殖を阻害する。rCD46の殺菌効果の機序を理解するために、H.ピロリをrCD46と2時間プレインキュベーションし、ヨウ化プロピジウムPIで染色し、フローサイトメトリーで分析した。PIは通常、細胞透過性ではなく、死細菌のDNAだけを染色する。rCD46を用いて前処理した細菌は陽性PI染色を示したので、膜の透過化が示唆された図3C。チオレドキシンと共にインキュベーションした細菌の場合、又はrCD46がC3bと共にプレインキュベーションされたとき、PI-染色は観察されなかったP≦0.001。H.ピロリに結合しているrCD46が細菌膜漏出をもたらし、C3bがこの殺菌効果を遮断できることが、これらのデータから実証される。例4CD46の24アミノ酸ペプチドは、H.ピロリの増殖を阻害するH.ピロリに対して阻害活性があるCD46ドメイン単数又は複数を同定するために、親水性であり潜在的に露出されたCD46のCCP領域に対応する4つのペプチド、CCP1P1:37~56、CCP2P2:81~104、CCP3P3:128~151、及びCCP4P4:190~216配列番号1に対応して示される間隔を合成した図3D。H.ピロリを各ペプチドと6時間混合し、殺菌効果を評価した。P1とP2は細菌生存に検出可能な効果がなかった図3Eが、ペプチドP3とP4の両方が細菌の増殖を阻害した。P3は、最も効果的な阻害剤であり80の細菌が死滅した。P3が媒介する殺菌効果の速度論を調査するために、本発明者らは、異なる濃度のP3と共に細菌を6時間インキュベーションした。ペプチドP3は、5μMで40の殺菌、7μMで50の殺菌、30μMで80の用量依存的殺菌効果を見せた図3F。これらのデータは、H.ピロリとCD46との接触点がCD46のCCP-3領域内に位置し、その領域が以前に報告されたC3bに対する結合領域でもあることを示唆している。合わせて考えると、H.ピロリの増殖を阻害する能力がある24アミノ酸のペプチドP3が同定された。P3ペプチドの異なる断片及び変異体配列番号22~32を使用するマッピング実験を実施して、抗菌効果に重要な配列モチーフを更に特定した。P3-21配列番号27及びP3-22配列番号29などいくつかの短い変異体は抗菌効果を示したが、親P3配列番号18より有効でなかった図6を参照のこと。EVF-配列P3-25の残基19~21に対応するが取り除かれたとき、P3-21の抗菌活性は失われたP3-21をP3-18[配列番号28]と比較のこと。PPPのモチーフP3-25の残基4~6に対応するの削除により、P3-22が抗菌活性を全て失ったことも明らかであった。したがって、PPPとEVFモチーフの両方の存在が抗菌活性に不可欠であると結論できる。P3とP3-25との比較から、これらペプチドの両方に同程度の効果があったので、P3-25上のN末端のLは抗菌効果に必要でないことが明らかになる。反対に、P3-22とP3-25との比較から、CT-モチーフP3-25の残基2~3が抗菌活性の改善に著しく寄与したことが示される。同様に、P3-21とP3-25との比較から、C末端のEYLF-モチーフ残基22~25P3-25が抗菌活性の改善に著しく寄与したことが明らかになった。P3-15配列番号26とP3-19配列番号30の両方は、それぞれN末端CTPPP又はC末端EVFEYLDモチーフを含むにもかかわらず、測定可能な抗菌活性を有さない点に留意されたい。この観察は更に、PPPとEVF-モチーフの両方が不可欠であるという結論を支持する。例5rCD46及びペプチドP3は、H.ピロリのウレアーゼ活性を阻害するCD46に結合する細菌のリガンドを見つけるために、プルダウンアッセイを実施した。細菌抽出物全部を、rCD46を事前に結合させたTalon親和性カラムに通した。溶出画分を、SDS-PAGEで分離し、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した図4A。質量分析法によって、分子量21kDa及び26kDaの2本の顕著なバンドを、UreA及びアルキルヒドロペルオキシド還元酵素AhpCはahpC遺伝子にコードされるとして同定した。H.ピロリのウレアーゼは、胃感染の発生及び胃粘膜における損傷の誘導に重要な毒性因子である。その酵素は、UreAとUreBの2つのサブユニットから成り、細胞質、ペリプラズム及び膜に見られる。ウレアーゼ活性の阻害がH.ピロリに致死的であることは公知である。rCD46は、細菌に結合することによってH.ピロリに対して殺菌性なので、我々はrCD46がウレアーゼ活性を遮断できるかどうか試験した。これを決定するために、H.ピロリJ99の総タンパク質抽出物をrCD46の有り無しでインキュベーションし、ウレアーゼ活性を分析した。rCD46と20分間プレインキュベーションすることにより、対照と比較してウレアーゼ活性が95以上阻害された図4B。ahpCによってコードされるAhpCは、有機ヒドロペルオキシドの還元においてはペルオキシドレダクターゼとして、及び酸化的ストレス下ではタンパク質の誤った折り畳みを防ぐための分子シャペロンとして機能する。UreA及びAhpCがCD46のリガンドであることを更に確認するために、本発明者らは、J99株のΔureA変異株及びΔureA/ΔahpC二重変異株を作製したが、本発明者らはΔahpCA単一変異株を作製できなかった材料及び方法の欄を参照のこと。ΔureA変異株はrCD46結合能が著しく損なわれ、二重変異株とrCD46との相互作用は完全に破壊された。これはUreA/AhpCがCD46との相互作用に重要な役割を果たすことを示唆している図4C。P3ペプチドもUreA及びAhpCを結合することを検証するために、P3-FITC及びP1-FITCを野生型J99、ΔureA、ΔahpC及びΔureA/ΔahpCと共にインキュベーションし、フローサイトメトリーで分析した。P1ペプチド及びランダムなペプチドは野生株又は変異株に結合しなかったが、P3ペプチドはrCD46と類似の様式でH.ピロリに結合した。すなわち、P3と比較して、ΔureAは47結合し、ΔahpCは55結合したが、ΔureA/ΔahpCは結合しなかった図4D。データを更に強化するために、本発明者らはureA及びahpC変異株を相補した。その後、その変異株はペプチドP3結合能を回復した。rCD46とP3ペプチドが相当する殺菌様式を有したので、本発明者らは、P3ペプチドもウレアーゼ活性を阻害できるかどうか試験した。P3ペプチドはJ99のウレアーゼ活性を阻害したがP1ペプチドはしなかった図4E。これらのデータは、rCD46及びペプチドP3が不可欠な毒性特性、すなわちウレアーゼ活性を、多分UreAを直接標的にすることによって阻害することの証拠となる。例6P3ペプチドの経口投与は、マウスにおいてH.ピロリ感染を除去する酸性の胃粘膜における細菌生存にはウレアーゼ活性が不可欠なので、次にペプチドP3によるウレアーゼ活性の阻害がinvivoでH.ピロリのコロニー形成に影響力がある可能性があるかどうかを評価した。H.ピロリ67:21株はマウスの胃粘膜に定着するので、この株をinvivo実験に使用した。67:21株は、J99と比較して、rCD46及びペプチドP3と類似の結合及び相互作用を示したデータ不掲載。加えて、J99株のureA変異株と同様に、67:21株のureA変異株がP3に対する結合を減少させることを実証した。CD46トランスジェニックマウスに、H.ピロリ67:21株を1日に1回、3日間、経口感染させた。感染8週間後、治療前にH.ピロリのコロニー形成を確認した。マウスにP3ペプチド20μgを1日1回、2週間、経口的に与え、対照群マウスには同じ方法でH2Oを与えた。胃組織中の生存細菌数を、生菌数を算定することにより決定した。無処理のマウスは高い細菌負荷を示したが、P3処理したマウスにH.ピロリを検出できなかったことは、ペプチドP3を用いる治療によりマウス胃からH.ピロリが一掃されたことを示している図5A。H.ピロリに誘導されるCD46の脱落へのP3ペプチドの影響力を評価するために、処理、無処理及び対照のマウスの胃から得た組織切片を、H.ピロリ及びCD46抗体を用いて免疫染色することにより検査した。H.ピロリは、無処理マウスの胃表面粘膜に存在した;しかし、P3処理及び対照マウスは検出可能なH.ピロリを示さなかった図5B。無処理マウスにおけるCD46の強度は、P3処理したマウスより著しく低かったP≦0.01図5C。胃粘膜中のIL-6、TNF-α、及びIL-10を含めたサイトカインの応答をELISAで測定することにより、H.ピロリによって誘発される宿主応答を更に調査した。P3処理したマウス中のIL-10レベルは無処理マウスより高かったが、IL-6及びTNF-αのレベルは群の間で著しい違いがなかった。処理マウスの胃組織中にIL-10レベルの著しい増加があったという発見は、P3の補充により炎症応答を減少できることを示唆している図5D。合わせて考えると、これらデータから、CD46ペプチドP3がinvivoで殺菌効果を示し、P3の補充により宿主での抗炎症応答を増強できることが明らかになる。材料及び方法細菌株、細胞系、及び増殖条件H.ピロリJ99株ATCC700392及び266995株ATCC700824を、アメリカンタイプセルコレクションATCCから得た。H.ピロリHPGA1は、以前に記載されているOh,J.D.ら、ThecompletegenomesequenceofachronicatrophicgastritisHelicobacterpyloristrain:evolutionduringdiseaseprogression.、ProcNatlAcadSciUSA、103巻、9999~10004ページ2006。細菌を、8ウマ血液SVA及び8ウマ血清SVAを補充したコロンビア血液寒天プレートBectonDickinson上で、10CO2及び5O2雰囲気中で、37°Cで培養した。液体培養を調製するために、細菌を血液寒天から集め、8ウマ血清及び5ml/LイスオビトクスisovitoxBectonDickinsonを含むブルセラ菌培養液BectonDickinsonに懸濁し、24時間インキュベーションした。分光光度計Bio-radを使用して600nmで光学密度を測定することにより、細菌の濃度を決定した。ヒト胃細胞系AGSATCCCRL-1739を、アメリカンタイプセルコレクションATCCから入手した。10の熱非働化ウシ胎仔血清FBS、Sigma、2mMのL-グルタミンInvitrogenを補充したRPMIGibco中で、細胞を維持した。付着アッセイAGS細胞を24穴細胞培養プレート中に抗生物質無しで増殖させ、感染させる前に細胞培地を交換した。H.ピロリ株をブルセラ菌培養液中で終夜増殖させ、PBSで洗浄し、細胞培地に再懸濁し、AGS細胞に添加して感染多重度MOI100:1を得て、細菌を18時間付着させておいた。細胞をPBSで3回洗浄して結合していない細菌を取り除いた。次いで、細胞を1サポニンと5分間インキュベーションし、連続希釈し、コロンビア血液寒天プレート上に広げた。平板培養3~5日後に、コロニー形成単位を数えた。フローサイトメトリーアッセイAGS細胞を6穴ディッシュ中に80~90のコンフルエントまで増殖させ、感染させる前に細胞培地を新鮮な培地に交換した。以前に記述されている通り細菌を調製し、MOI100:1で添加した。感染18時間後に、細胞をトリプシン処理によって集め、PBSで2回洗浄し、1000xgで5分間遠心した。ペレットを、CD46に対するポリクローナル抗体H-294、SaintCruse、1:200希釈を含むPBSに再懸濁し、4°Cで45分間インキュベーションした。細胞をPBSで洗浄し、PBS中の抗ウサギIgG二次抗体Alexa488、Invitrogen、1:400希釈に再懸濁し、氷上で45分間インキュベーションした。細胞をPBSで2回洗浄し、4パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄してフローサイトメトリーで分析した。データをCellquestProソフトウェアBectonDickinsonで更に加工した。rCD46結合のフローサイトメトリー。対数期のH.ピロリをrCD46と最終濃度30μg/mlで、37°Cで2時間プレインキュベーションした。結合していないrCD46をPBSで洗浄して取り除き、rCD46の結合を上述の通り分析した。FITC-P3ペプチド30μMとH.ピロリとの相互作用に関して行い、rCD46結合として分析した。細胞培養上清の調製AGS細胞を6穴ディッシュ中に80~90のコンフルエントまで増殖させ、感染させる24時間前に細胞培地を交換した。以前に記述されている通り細菌を調製し、MOI100:1で添加した。感染及び無感染の細胞の上清を24時間後に集め、濃縮し、100mM重炭酸緩衝液pH9.5に再懸濁した。その後、各懸濁液100μlを、ELISAプレートNunc、Roskilde、Denmarkのウェルに添加し、4°Cで終夜インキュベーションした。ウェルを5のスキムミルクでブロッキングし、PBSで洗浄した。CD46に対するポリクローナル抗体H-294、SantaCruzBiotechnologies、1:5000希釈、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼHRP結合ヤギ抗ウサギ抗体170-6515、BioRad、1:4000希釈とインキュベーションすることにより、CD46を同定した。添加後に、基質を添加し、A450を測定した。実験を3つ組で2回繰り返し、平均及び標準偏差を算出した。rCD46の精製及び親和性クロマトグラフィー配列番号1のアミノ酸1~293を含む組換えCD46を、大腸菌で発現させ精製した。簡潔には、チオレドキシン及びCD46の細胞外領域から成る融合タンパク質を、使用説明書に従ってカラムGEhealthcare、Swedenにかけて精製した。CD46-BC1アイソフォームの完全な細胞外領域を、フォワードプライマーとリバースプライマーを用いてPCR増幅し、TOPO発現ベクターpET102Dにライゲーションした。組換えtrx-CD46-6xhisタンパク質を、BL21DE3大腸菌株で産生させ、使用説明書に従ってTalon金属親和性樹脂を用いて精製した。簡潔には、細胞を200μg/mlアンピシリンを含むLB培地中で、37°Cで4~6時間培養した。OD600=0.6~0.8のときに、0.5mMのIPTGによって、培養物を更に4時間誘導した。細菌を回収し、50mMトリス、50mMNaCl、10mMMgCl2、5mMイミダゾール及び5mg/mlリゾチームを含む溶菌緩衝液中で、室温で20分間インキュベーションした。混合物を0.1mMPMSF及び1U/mlDNase中、室温で5分間インキュベーションし、超音波処理し、15000gで1時間遠心した。タンパク質をTalon樹脂カラムにかけて精製し、200mMイミダゾールを用いて溶出した。チオレドキシン対照タンパク質を、pET32aベクターを含むBL21DE3宿主細胞によって産生し、精製した。タンパク質の純度をSDS-PAGEゲルで確かめた。親和性クロマトグラフィー以前に記述されている通り、H.ピロリJ99株108細菌/mlの細胞抽出物を調製したNagata,K.、Satoh,H.、Iwahi,T.、Shimoyama,T.及びTamura,T.、PotentinhibitoryactionofthegastricprotonpumpinhibitorlansoprazoleagainstureaseactivityofHelicobacterpylori:uniqueactionselectiveforH.pyloricells.、AntimicrobAgentsChemother、37巻、769~774ページ1993。rCD46と結合させたTalon親和性カラムに細胞抽出物を載せ、洗浄後に、画分をrCD46精製方法に従って溶出した。タンパク質画分を、12SDS-PAGEで分離し、クーマシーブルーを用いて染色した。分子量20及び28kDaの2本バンドをゲルから切り出し、質量分析で同定した。rCD46とH.ピロリとの相互作用のELISA分析H.ピロリをブルセラ菌培養液中で終夜増殖させ、遠心によって細胞を回収し、PBSで3回洗浄し、107cfu/mlになるように100mM重炭酸緩衝液pH9.5に再懸濁した。その後、各懸濁液100μlをELISAプレートNunc、Roskilde、Denmarkのウェルに分注し、4°Cで終夜インキュベーションした。ウェルを5のスキムミルクでブロッキングし、PBSで洗浄し、組換えCD462.5μg/ml100μlと共に1時間インキュベーションし、続いてCD46に対するポリクローナル抗体H-294、SantaCruzBiotechnologies、1:5000希釈とインキュベーションした。一次抗体とのインキュベーションの後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼHRP結合ヤギ抗ウサギ抗体170-6515、BioRad、1:4000希釈を続けた。PBSで洗浄した後、基質を添加し、450nmで吸光度を決定した。実験を3つ組で2回繰り返し、平均及び標準偏差を算出した。蛍光顕微鏡検査顕微鏡分析のために、rCD46をH.ピロリ株とインキュベーションし、フローサイトメトリー用の手順に従って染色した。倒立蛍光顕微鏡ZeissCellobserverAxiovertを用いて、63x倍率で、CCDカメラで画像を撮影した。画像を、セルビジョンcellvisionソフトウェア及びadobephotoshopソフトウェアで更に加工した。殺菌性アッセイ寒天プレート上のH.ピロリJ99を、ブルセラ菌培養液に懸濁し、約105cfu/mlに希釈した。200μLの細菌懸濁液を、rCD46最終濃度30μg/mlと共に軽く振盪させながら0、6又は24時間インキュベーションした。チオレドキシン及びPBSを対照として使用した。細菌を連続希釈し、コロンビア血液寒天プレート上で平板培養し、4~7日間インキュベーションした後に数えた。H.ピロリを30μMのCD46ドメインCCP1~4とインキュベーションし、又は他の実験において、H.ピロリを様々な濃度の様々なCD46由来合成ペプチドとインキュベーションし、バクテリアの増殖を上述の通りモニタリングした。競合アッセイH.ピロリ株を終夜増殖させ、約106cfu/mlに希釈した。rCD46最終濃度30μg/mlを、2.5μg/mlC3bCalbiochem、CA、USA、又は2μg/mlCD46抗体H-294、SantaCruzBiotechnologiesと1時間プレインキュベーションし、続いてH.ピロリと更に2時間インキュベーションした。対照として、H.ピロリを、最終濃度30μg/mlのrCD46単独とインキュベーションした。サンプルを固定し、CD46抗体を用いて染色し、前述の通りフローサイトメトリーで分析した。細菌の透過化を評価するために、rCD4630μg/mlを2.5μg/mlC3bと1時間プレインキュベーションし、続いてH.ピロリと更に2時間インキュベーションした。生産者の手順に従ってBD、Biosciences細菌を、PIを用いて染色し、フローサイトメトリーFACSAriaで分析した。無処理の集団及び/又はチオレドキシンを使用して、死細胞の基礎レベルを定義した。次いで、処理した集団の割合から無処理の集団の細胞の割合を減算することによって、透過化された細胞の割合を決定した。ウレアーゼ活性アッセイウレアーゼ活性を測定するために、以前に記述されている通り、我々は使用した40。簡潔には、J99株を108cfu/mlまで終夜増殖させた。細菌を回収し、洗浄し、脱気した氷冷20mMリン酸ナトリウムpH6.8で再懸濁した。懸濁液を氷冷しながら30秒のパルスで3分間超音波処理し、10000gで20分間遠心して細胞残屑を取り除いた。その上清をウレアーゼ活性アッセイに使用した。1μgのタンパク質を、最終濃度30μg/mlのrCD46又はP3ペプチドと37°Cで2時間インキュベーションした。インキュベーションの後に、50mM尿素、0.02フェノールレッドを含む50mMリン酸緩衝液pH6.8100μlを、各ウェルに添加した。色の変化を、マイクロプレートリーダを用いて560nmでモニタリングした。阻害率を以下の方程式によって決定した:阻害=[rCD46無しの活性]-[rCD46有りの活性]/[rC46無しの活性]x100。CD46ドメインのペプチド合成CCP-1内の領域32~56配列番号1に関連するアミノ酸、CCP-2内の81~105、CCP-3内の128~151、CCP-4内の190~216、FITC-32~56、CCP1、及びCCP-3内のN末端FITC-CCP-1128~151に対応するCD46ドメインを、Peptide2.0,Inchttp://www.peptide20.comで合成した。N末端に追加のロイシンLを有するペプチドP3P3-25の変異体も合成した。P3-25の様々な誘導体を合成し、そのアミノ酸配列を図6に示した。全てのペプチドは、純度90~95だった。ペプチドをPBSに再懸濁し、使用前に-20°Cで貯蔵した。その後ペプチドを、使用濃度までブルセラ菌培養液又は水に希釈した。動物及び実験手順hCD46Geトランスジェニックマウス系CD46/C57BL/6を、B6C3F1雑種を使用して作成した。全てのマウスを、ストックホルム大学の動物施設において標準的な条件の下で飼育した。動物の世話及び実験は組織ガイドラインに従い、全国倫理委員会によって認可されている。6~8週齢マウスn=24に、H.ピロリ67:210.1ml108cfu/mlを1日に1回、3日間隔で経口投与した。無感染対照マウスn=10には、同様の方法でPBS0.1mlを与えた。感染8週間後に、感染させたマウスを2群に分けた、一方の群には20μMP3ペプチド100μlを、他方の群にはPBS100μlを、1日に1回、2週間経口的に接種した。治療の2週間後に、全てのマウスに麻酔をかけ、屠殺した。正中切開で開腹し、胃を摘出し、大彎に沿って切開した。胃内容物を、食塩水を用いて穏やかに洗い流した。3~5mm幅で2つの縦長片を切り取った、一方はH.ピロリ培養用、他方は組織学的評価用である。胃組織をブルセラ培養液中でホモジナイズし、200μg/ml及びナリジキシン酸10μg/mlを含む血液寒天培地プレート上で希釈物を平板培養することによってコロニー形成を決定した。プレートを4~7日間インキュベーションし、H.ピロリのコロニーをその形態とウレアーゼによって同定した。組織学的評価のために、胃組織を4パラホルムアルデヒドに固定し、パラフィン包埋した。H.ピロリ及びCD46レベルを検出するために、組織切片をH.ピロリに対するマウス抗体sc-65454、1:50希釈及びCD46に対するウサギ抗体H94、SantaCruz、1:50希釈と60分間、続いて二次抗体としてAlexa488抗マウスIgG及びAlexa593結合ヤギ抗ウサギIgG1:50希釈;invitrogenとインキュベーションした。切片をカールツァイスアクシオビジョンCarlZeissAxioVision2.05画像処理及び分析システムZeissを用いて視覚化した。胃組織中のインターロイキンIL-6、IL-10及びTNF-αの測定胃をブルセラ培養液中でホモジナイズし、上清を集め、分注し、-80°Cに貯蔵した。IL-6、IL-10及びTNF-αのレベルを、市販のELISAキット、InvitrogenIL-6,CMC0063、IL-10,CMC0103、及びTNF-α,CMC3013を使用して、製造業者の指示に従って測定した。各サンプルを2回測定した。H.ピロリΔureA変異株の作製クロラムフェニコール抵抗性遺伝子CATを、プライマーを使用してpACY184からPCR増幅した。48時間プレートからかき集めた細胞を洗浄することによって、H.ピロリJ99のゲノムDNAを単離し、製造業者の指示に従ってQiagenGenomicDNAキット2.0mlに再懸濁した。2対のureA特異的プライマーを使用して、各標的遺伝子の上流及び下流領域をそれぞれPCR増幅した。Qiagenゲル精製キットを使用してPCR産物を精製した。末端で重複する相同性を考慮してプライマーを設計した。いずれのプライマーも添加せずに5サイクル、続いて2つのプライマーと共に30サイクルする二段階PCR反応で、異なるPCR断片をライゲーションした。形質転換によって構造物をH.ピロリJ99に導入し、48時間後にブルセラ菌培養液BectonDickinson0.2mlに細胞をかき集め、コロンビア血液寒天プレート上に100μl1x108細菌/mlをスポットした。精製したDNA産物150ngとインキュベーションした後に、形質転換された細胞の混合物をプレートに広げ、更に24時間インキュベーションした。次いで、15μgクロラムフェニコール/mlを含む選択コロンビア血液寒天プレート上に細胞をかき集め、3~7日間インキュベーションした。そのクローンを、PCR、ウエスタンブロット及びウレアーゼ活性試験によって確認した。H.ピロリΔureA/ΔahpC変異株アルキルヒドロペルオキシド還元酵素遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子を用いて不活性化し、それを使用してH.ピロリJ99のΔureA欠損変異株を形質転換した。カナマイシン耐性遺伝子を、プライマーkan-fwdとkan-revを用いてpDONR、P4-P1Rから増幅した。ahpC遺伝子の上流領域を、プライマーahpCups-fwdとahpCups-revを用いて増幅した。遺伝子の下流領域を、プライマーahpCds-fwdとahpCds-revを用いて増幅した。重複する末端を有するようにプライマーを設計した。一段階で行うPCR:iいずれのプライマーも添加せずに7サイクル、続いてiiプライマーahpCups-fwdとahpCds-revと共に35サイクル、で異なる3つのPCR断片をライゲーションした。上述の通り、選択プレート10μg/mlカナマイシン及び10μg/mlクロラムフェニコールを用いて、得られた断片をΔureA欠損H.ピロリに組み込んだ。陽性の形質転換体を、プライマーahpC-fwdとahpC-revを使用するPCRによって確認した。H.ピロリΔahpC変異株及びその補体の作製上記の通り、ahpC遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で不活性化し、それを使用してH.ピロリを形質転換した。相補のために、プライマーを用いて下流領域を含む完全なahpC遺伝子を増幅した。aphCの上流領域を、プライマーを用いて増幅し、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子を、pACY184からプライマーを使用して増幅した。重複する末端を有するようにプライマーを設計し、上述の通り一段階で行うPCRにより互いに融合させた。上述の通り、15μg/mlクロラムフェニコールを含む選択プレートを用いて、得られた断片をΔahpC欠損H.ピロリに組み込んだ。陽性の形質転換体を、ahpCプライマーを使用するPCRによって確認した。統計分析ANOVA一元配置分析を使用して有意性を算定した。全ての実験は独立した少なくとも2回の実験セットの3つ組で実施した。"