"改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子であって、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号3に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して100未満または100の同一性を有するアミノ酸の配列を含み、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して95未満の同一性を有するアミノ酸の配列を含み、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼに対して62超の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、バレンセンシンターゼポリペプチド中にアミノ酸改変を含み、それによって改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号3に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して100未満の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して95未満の同一性を有するアミノ酸の配列を含み、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼに対して62超の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。改変されたバレンセンポリペプチドが、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼに対して少なくとも82の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。改変を含有しないバレンセンシンターゼまたは配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中の改変の数が、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136または137である、請求項1から2のいずれかに記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、95未満かつ75超、94未満かつ75超、93未満かつ75超、92未満かつ75超、95未満かつ80超、94未満かつ80超、93未満かつ80超、92未満かつ80超、95未満かつ85超、94未満かつ85超、93未満かつ85超および92未満かつ85超の中から選択される配列番号2に示されるバレンセンシンターゼに対する配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項1から4のいずれかに記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼに対して、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76もしくは75未満または約94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76もしくは75の同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項1から5のいずれかに記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号3に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して少なくとも80の同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項1から6のいずれかに記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号3に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくともまたは約81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99の同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項1から7のいずれかに記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子であって、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号289~291、346、347、752、882、883または886のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有せず、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼと比較してアミノ酸改変を含み、それによって、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、100未満の同一性かつ62超の同一性を有するアミノ酸の配列を含む、核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号6~8、14~16および348のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有しない、請求項9に記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号3に示されるアミノ酸の配列を含有しない、請求項9に記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号5に示されるアミノ酸の配列を含有しない、請求項9に記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する、請求項1から12のいずれかに記載の核酸分子。非環式ピロリン酸テルペン前駆体が、ファルネシル二リン酸FPPである、請求項13に記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、同一条件下で、同一宿主細胞において配列番号2に示されるバレンセンシンターゼによってFPPから生成されたバレンセンの量よりも多い量で、宿主細胞においてFPPからバレンセンを生成し、それによって、宿主細胞がFPPを生成する細胞である、請求項1から14のいずれかに記載の核酸分子。宿主細胞が、酵母細胞である、請求項15に記載の核酸分子。生成されたバレンセンの量が、同一条件下、酵母の同一株において、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよび配列番号2に示されるバレンセンシンターゼを発現する酵母細胞を別個に培養することと、生成されたバレンセンの量を比較することとによって評価される、請求項16に記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼによってFPPから生成されたバレンセンの量が、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼによってFPPから生成されたバレンセンの量よりも、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、500もしくはそれ以上多い;または配列番号2に示されるバレンセンシンターゼによってFPPから生成されたバレンセンの量よりも、10~500、10~250、50~250、100~500多いか、もしくは100~250多い、請求項15から17のいずれかに記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドによって生成されたバレンセンの量が、酵母細胞培養培地中、少なくとももしくは約0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L、5.0g/Lもしくはそれ以上である;または酵母細胞培養培地中、0.1g/L~5.0g/L、0.1g/L~3.0g/L、0.5g/L~5.0g/L、1.0g/L~5.0g/Lもしくは1.0~3.0g/Lである、請求項1から18のいずれかに記載の核酸分子。コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号2に示されるアミノ酸位置に関するCVS番号付けによって、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、50、53、54、55、56、57、58、60、62、69、77、78、82、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、111、113、114、116、117、118、120、121、122、124、125、127、129、130、132、135、136、138、139、141、142、144、146、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、162、163、165、166、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、187、188、189、190、191、193、194、195、196、197、198、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、227、228、229、238、252、257、263、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、305、306、307、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、329、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、375、377、378、380、381、382、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、422、423、424、428、429、434、435、436、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、451、452、454、457、465、468、473、474、484、492、495、496、499、500、501、506、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、536および539の中から選択される位置に対応する位置で、バレンセンシンターゼポリペプチド中に少なくとも1つのアミノ酸改変を含む、請求項1から19のいずれかに記載の核酸分子。コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによってM1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、G4Q、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、E5V、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、F7N、T10V、A11T、D12N、S16N、L17I、R19K、R19P、R19G、N20D、H21Q、L23I、L23S、K24A、K24Q、K24Y、K24T、G25Y、A26T、S27P、D28G、D28E、F29D、D33T、H34R、T35A、A36C、T37K、Q38V、Q38A、Q38N、Q38E、R40Q、H41I、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、A85M、I86L、Q87D、K88Q、K88A、K88H、L89I、C90Y、P91N、I92Y、I92N、I92S、Y93H、Y93F、Y93F、I94E、I94H、D95A、S96H、S96C、N97D、N97E、R98K、R98Y、R98D、A99N、A99M、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、I166Y、K117T、V122I、E124N、K125A、K125Q、K127T、D129E、E130R、R132G、S135E、S136A、N139S、Q142R、S146G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、Q178A、D179P、V181L、T182K、P183S、K184R、K184P、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、M212I、M212S、M212V、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、I213Y、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、N214Y、N214Q、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、S215D、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、T216K、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、S217E、S217D、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、D218E、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、H219G、H219Q、H219A、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、L220F、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、Y221H、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、L399S、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506S、D536EおよびA539Vに対応するアミノ酸置換の中から選択されるアミノ酸置換である少なくとも1つの改変を含む、請求項1から20のいずれかに記載の核酸分子。コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、アミノ酸置換である少なくとも1つの改変を含み、少なくとも1つのアミノ酸置換が、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによって1、2、3、4、5、6、7、11、19、20、23、24、28、38、50、53、54、55、56、57、58、60、62、69、78、82、88、93、97、98、102、106、111、113、125、132、152、153、159、163、173、184、188、189、200、202、209、210、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、227、238、252、257、274、279、280、281、282、283、284、292、297、299、307、310、311、313、314、315、316、317、318、319、320、321、323、324、325、326、333、336、337、343、345、347、348、350、357、360、361、362、367、369、370、371、375、377、387、397、399、405、409、410、424、429、436、439、448、465、468、473、474、484、492、495、499、500、501、506、536および539の中から選択される位置に対応する位置である、請求項1から19のいずれかに記載の核酸分子。コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによってM1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、A11T、R19K、R19P、N20D、L23S、K24A、K24Q、K24Y、D28G、Q38V、Q38A、Q38N、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、K88Q、K88A、Y93H、N97D、R98K、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、K125A、K125Q、R132G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、K184R、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、L399S、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506SD536EおよびA539Vに対応するアミノ酸置換の中から選択されるアミノ酸置換である少なくとも1つの改変を含む、請求項1から20のいずれかに記載の核酸分子。コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対する番号付けを用いて60、97、209、212、214、221、238、292、333、345、369、405、429、473および/または536の中から選択される位置に対応する位置でアミノ酸置換を含む、請求項1から23のいずれかに記載の核酸分子。コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによってV60I、V60G、N97D、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、E238D、Q292K、E333D、A345V、A345T、N369I、T405R、N429S、N429G、S473Y、およびまたはD536Eの中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項24に記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号2に示される位置に対する番号付けを用いるCVS番号付けによってN214DS473YT405RA345VD536EY221CE238DF209IN97DE333DN369IN214DT405RN214DA345VT405RD536ER98KN214DN227ST405RV60IN214DA345TT405RN214DT405RN429SN214DQ292KT405RV60GN214DT405RV60IN214DA345TT405RN429SV60IM212RN214DY221VA345TT405RN429Gに対応する置換の中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項9から25のいずれかに記載の核酸分子。コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチド中の位置に対する番号付けを用いるCVS番号付けによって位置60、209、238および292に対応する位置でアミノ酸置換を含む、請求項1から25のいずれかに記載の核酸分子。コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、各々、配列番号2に示される位置に対する番号付けを用いるCVS番号付けによって、V60IまたはV60Gである位置V60での置換、F209I、F209H、F209E、F209LまたはF209Tである位置F209での置換、E238Dである位置E238での置換、Q292Kである位置Q292での置換を含む、請求項27に記載の核酸分子。コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対する番号付けを用いて位置60、125、173、209、238、252および292に対応する位置でアミノ酸置換を含む、請求項1から28のいずれかに記載の核酸分子。コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、各々、配列番号2に示される位置に対する番号付けを用いるCVS番号付けによってV60IまたはV60Gである位置V60での置換、K125AまたはK125Qである位置K125での置換、K173E、K173QまたはK173Aである位置K173での置換、F209I、F209H、F209E、F209LまたはF209Tである位置F209での置換、E238Dである位置E238での置換、K252Qである位置K252での置換およびQ292Kである位置Q292での置換を含む、請求項29に記載の核酸分子。改変されたバレンセンシンターゼが、各々、配列番号2に示される位置に対する番号付けを用いて、K24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QQ292KQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KV320SQ321AE326KE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AR50GK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KV320GQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KL315MQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KV320GQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TG357RN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TN369IE367GS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TN369IQ370DS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KI299YQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TH360LN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KT317SQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KV320DQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38VK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TN369IS377YT405RT409GN429GA436SE495GT501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AP281SQ292KQ321AE333DL337IA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TN369IA375DS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DK336RA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KE311PQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TN369IQ370HS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DL343VA345TH360AN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ282SQ292KQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TN369IK371GS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TN347LN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KE311TQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ282LQ292KQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KS314TQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KQ321AE333DA345TN369IQ370GS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KL310HQ321AE333DA345TV362AN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IF78LK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AQ292KL313CQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ292KI299YL310HE311PQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ282LQ292KL310HQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ282LQ292KI299YE311PQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ292KL313CS314TL315MT317SQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ292KQ321AE333DK336RA345TN347LG357RN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QQ292KL310HE311TL313CS314TL315MT317SV320GQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ292KT317SQ321AE333DK336RL337IA345TN347LG357RN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QQ292KT317SQ321AE333DK336RL337IA345TG357RN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ292KT317SQ321AE333DK336RA345TN347LG357RN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ292KT317SQ321AE333DA345TG357RN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ292KL310HE311TL313CT317SV320GQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ292KL313CS314TL315MT317SQ321AE333DK336RA345TN347LG357RN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QQ292KQ321AE333DA345TN369IQ370DA375DS377YT405RT409GN429GA436SE495GT501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ292KL313CS314TL315MT317SQ321AE333DK336RL337IA345TN347LG357RN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QP281SQ292KL313CS314TL315MT317SQ321AE333DK336RL337IA345TG357RN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536ES2RS3DG4KE5GF7CK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QQ292KQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536ES2ES3GG4NE5ST6VF7QK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QQ292KQ321AE333DA345TN369IS377YT405RF424LN429GA436ST501PD536ES2KS3RG4VE5GT6RF7AK24QQ38NK58QV60IK88QY93HN97DR98KK125QK173QK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252QQ292KQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AD274MQ292KQ321AE333DA345TN369IS377YT405RN429GA436ST501PD536EK24AQ38AK58AV60IK88AY93HN97DR98KK125AK173AK184RF209IM212RN214DH219DY221VE238DK252AD274NQ292KQ321詳細な説明A.定義B.バレンセンシンターゼ1.構造2.機能3.柑橘類バレンセンシンターゼC.改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびコーディング核酸分子1.改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド-例示的アミノ酸置換2.ドメイン交換3.生成物分布突然変異体D.改変テルペンシンターゼおよびコーディング核酸分子を生成する方法E.改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびコーディング核酸分子の生成1.テルペンシンターゼをコードする核酸の単離2.突然変異体または改変核酸の作製3.ベクターおよび細胞4.発現系a.原核細胞b.酵母細胞c.植物および植物細胞d.昆虫および昆虫細胞e.哺乳動物細胞5.精製6.融合タンパク質F.バレンセンシンターゼを使用し、評価する方法1.バレンセンの生成a.バレンセン生成のための例示的細胞b.バレンセン生成のための細胞の培養c.バレンセンの単離および評価2.ヌートカトンの生成G.実施例A.定義別段に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。すべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、GENBANK配列、ウェブサイトおよび本明細書における全開示内容を通じて参照されるその他の公開された材料は、別段記載されない限り、その全体が参照により組み込まれる。本明細書における用語について複数の定義がある場合には、この節におけるものが優先する。URLまたはその他のこのような識別子またはアドレスが参照される場合には、このような識別子は変わり得ることおよびインターネットに関する特定の情報は移り変わる場合があるが、インターネットおよび/または適当なデータベースを検索することなどによって同等の情報を知り、容易にアクセスできることは理解される。それに対する参照によって、このような情報の利用の可能性および一般への普及が証明される。本明細書において、非環式ピロリン酸テルペン前駆体とは、ファルネシル-ピロリン酸FPP、ゲラニル-ピロリン酸GPPおよびゲラニルゲラニル-ピロリン酸GGPPを含めた少なくとも1種のテルペンの生成の前駆体である任意の非環式ピロリン酸化合物であるが、これらに限定されない。したがって、非環式ピロリン酸テルペン前駆体は、テルペンシンターゼの基質である。本明細書において、テルペンは、イソプレン単位C5H8に基づき、一般式C5xH8x、例えば、C10H16を有する不飽和炭化水素である。テルペンへの言及は、非環式、単環式および多環式テルペンを含む。テルペンは、それだけには限らないが、10個の炭素原子を含有するモノテルペン、15個の炭素原子を含有するセスキテルペン、20個の炭素原子を含有するジテルペンおよび30個の炭素原子を含有するトリテルペンを含む。テルペンへの言及はまた、テルペンの立体異性体も含む。本明細書において、テルペンシンターゼは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体、例えば、FPP、GPPまたはGGPPからの1種または複数のテルペンの形成を触媒できるポリペプチドである。本明細書において、バレンセンは、以下の構造を有するセスキテルペンである。バレンセンへの言及は、それだけには限らないが、-バレンセンを含めたその任意の異性体への言及を含む。本明細書において、バレンセンシンターゼまたはバレンセンシンターゼポリペプチドとは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体、通常、ファルネシル二リン酸FPPからのバレンセンの形成を触媒できるポリペプチドである。通常、バレンセンシンターゼは、配列番号2に示されるバレンセンvalenceシンターゼと、63、65、70、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99を超えるまたは、約63、65、70、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99を超える、または63、65、70、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99の配列同一性を有する。バレンセンは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、バレンセンシンターゼとの反応から形成される唯一の生成物である場合も、生成物の混合物の1種である場合もある。バレンセンシンターゼの、非環式ピロリン酸テルペン前駆体との反応から生成されるバレンセンの量は、通常、反応において生成されるテルペンの総量の少なくともまたは少なくとも約1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90またはそれ以上である。一部の例では、バレンセンは、生成される主なテルペンであるすなわち、非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、バレンセンシンターゼとの反応から生成される任意のその他の単一テルペンよりも多い量で存在する。バレンセンシンターゼへの言及は、それだけには限らないが、組換えによって生成されたポリペプチド、合成によって生成されたポリペプチドならびに細胞およびそれだけには限らないが、柑橘類の皮を含めた植物から抽出または単離されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めた任意のバレンセンシンターゼポリペプチドを含む。例示的バレンセンシンターゼポリペプチドとして、柑橘類の果実、ブドウの木の花例えば、ブドウゲヴェルツトラミネール種VitisviniferaL.cv.Gewuerztraminerおよびブドウカベルネソーヴィニヨン種VitisviniferaL.cv.CabernetSauvignonLuckeretal、Phytochemistry65264959およびMartinetal、ProcNatlAcadSci、USA10672457250参照のこと配列番346および347およびシソ属青紫蘇から単離されたものが挙げられる。バレンセンシンターゼの例示として、それだけには限らないが、スイートオレンジCitrussinensisスイートオレンジ配列番号2、289および752およびグレープフルーツCitrusxparadisiグレープフルーツ配列番号2、290および291由来のバレンセンシンターゼを含めた柑橘類バレンセンシンターゼCVSがある。その他の例示的バレンセンシンターゼポリペプチドとして、ブドウゲヴェルツトラミネール種VitisviniferaL.cv.Gewurztraminerおよびブドウカベルネソーヴィニヨン種VitisviniferaL.cv.CabernetSauvignonを含めたブドウの木の花から単離されたバレンセンシンターゼ配列番号346および347およびアラスカヒノキペンデュラChamaecyparisnootkatensispendulaから単離されたバレンセンシンターゼ配列番号882および883が挙げられる。バレンセンシンターゼへの言及は、任意の属または種に由来するバレンセンシンターゼおよび含まれる対立遺伝子または種変異体、スプライシング変異体によってコードされる変異体ならびに配列番号2に示されるバレンセンシンターゼに対して、少なくともまたは少なくとも約40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含めたそれらのその他の変異体を含む。バレンセンシンターゼはまた、バレンセンシンターゼ活性を保持するその断片も含む。本明細書において、バレンセンシンターゼ活性本明細書において、触媒活性とも呼ばれるとは、ファルネシル二リン酸FPPなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する能力を指す。シンターゼの、FPPなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体との反応からのバレンセン形成を評価する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。例えば、シンターゼを、FPPも生成する酵母細胞などの宿主細胞において発現させることができる。次いで、例えば、ガスクロマトグラフィー-質量分析GC-MSを使用して以下の実施例を参照のこと、バレンセンの生成を評価および定量化できる。シンターゼは、反応から生成されたバレンセンの量が、反応において生成されたテルペンの総量の少なくともまたは少なくとも約1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90またはそれ以上である場合に、バレンセンシンターゼ活性またはFPPなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する能力を示すと考えられる。本明細書において、バレンセンシンターゼの活性に関して増大した触媒活性とは、ファルネシル二リン酸FPPなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する能力が増大し、それによって、バレンセンの形成の増大がもたらされることを意味する。本明細書における目的上、バレンセンシンターゼは、改変されたバレンセンシンターゼによってFPPから生成されたバレンセンの量が、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量よりも10~500、10~250、50~250、100~500多いか、または100~250多い、例えば、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量よりも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、500またはそれ以上多い場合に、増大した触媒活性を示す。例えば、バレンセンシンターゼは、改変されたバレンセンシンターゼによってFPPから生成されたバレンセンの量が、同一条件下で配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼによってFPPから生成されたバレンセンの量の少なくともまたはおよそ少なくとも110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、200、250、300、350、400、500、1500、2000、3000、4000、5000である場合に、増大した触媒活性を示す。本明細書において、バレンセンシンターゼに関して野生型または天然のとは、植物を含めた生物中に実際に存在する対立遺伝子変異体を含めた、天然の、または天然に存在するバレンセンシンターゼ遺伝子によってコードされるバレンセンシンターゼポリペプチドを指す。種を考慮しない野生型バレンセンシンターゼへの言及は、任意の種の野生型バレンセンシンターゼを包含するものとする。例示的バレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、配列番号2バレンシアオレンジCitrussinensiscv.Valencia、カラカラオレンジCitrussinensiscv.CaraCaraおよびグレープフルーツCitrusxparadisiから単離された、配列番号289バレンシアオレンジCitrussinensiscv.Valenciaから単離されたおよび配列番号290グレープフルーツCitrusparadisiから単離されたおよび配列番号291グレープフルーツCitrusxparadisiから単離されたに示されている。本明細書において、種変異体とは、スイートオレンジCitrussinensisおよびグレープフルーツCitrusxparadisiのような異なる柑橘類種を含めた、異なる種間のポリペプチドにおける変異体を指す。本明細書において、対立遺伝子変異体とは、同一種のメンバー間のコードされるタンパク質における変動を指す。本明細書において、スプライシング変異体とは、2種以上のmRNAをもたらすゲノムDNAの一次転写物の差次的プロセシングによって生じた変異体を指す。本明細書において、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドとは、非改変または野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、1個または複数のアミノ酸の相違を有するバレンセンシンターゼポリペプチドを指す。1個または複数のアミノ酸の相違は、1個または複数のアミノ酸置換replacements置換substitutions、挿入または欠失などのアミノ酸突然変異である場合も、ドメイン全体の挿入または欠失である場合も、それらの任意の組合せである場合もある。通常、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、非改変または野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、一次配列中に1つまたは複数の改変を有する。例えば、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、非改変バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、少なくとも1、5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135個またはそれ以上のアミノ酸の相違を有し得る。得られるポリペプチドが、例えば、触媒活性、FPPと結合する能力および/またはFPPからのバレンセンの形成を触媒する能力などの野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと関連する少なくとも1種のバレンセンシンターゼ活性を示す限り、任意の改変が考慮される。本明細書において、野生型バレンセンシンターゼなどの参照バレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量よりも多い量での、FPPからバレンセンを生成する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドへの言及は、改変されたバレンセンシンターゼが、参照バレンセンシンターゼが生成するよりも、FPPから少なくともまたは約10多いバレンセンを生成することを示す。例えば、このような改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、参照バレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量と比較して、FPPから少なくともまたは少なくとも約10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000またはそれより多いバレンセンを生成できる。バレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量は、当技術分野で公知の任意の方法によって評価できる。改変されたバレンセンシンターゼおよび参照バレンセンシンターゼ、例えば、野生型バレンセンシンターゼなどの2種のバレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量を比較する場合には、アッセイは、各シンターゼに対して同一条件下で実施されるということは理解される。一例では、改変されたバレンセンシンターゼおよび参照バレンセンシンターゼなどの2種のバレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量を、FPPも生成する同一株の酵母細胞において、改変されたバレンセンシンターゼおよび参照バレンセンシンターゼを別個にを発現させることここで、発現は、同一発現ベクターからであるおよびバレンセンが生成される同一条件下で細胞を培養することによって評価する。当技術分野で周知の定量化法、例えば、GC-MSを使用して、改変されたバレンセンシンターゼを発現する細胞培養物中で生成されるバレンセンの量を、参照バレンセンシンターゼを発現する細胞培養物中で生成されるバレンセンの量と比較する。本明細書において、CVS番号付けとは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼのアミノ酸番号付けを指す。配列番号2に示されるもの以外のシンターゼ中のアミノ酸残基は、その他のテルペンシンターゼの、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼとのアラインメントによって、CVS番号付けによって同定され得る。このような例では、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼのアミノ酸とアラインするか、または対応するテルペンシンターゼのアミノ酸すなわち、対応する残基が、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼアミノ酸の番号付けによって同定される。図1は、バレンセンシンターゼポリペプチドのCVS番号付けを表す。図4は、例示的なその他のテルペンシンターゼのCVS番号付けを表す。例えば、図1では、図は、配列番号2に基づくCVS番号付けによって、アミノ酸残基24が、配列番号290、291、752、289および886に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドではKLysであり、配列番号3に示されるバレンセンシンターゼではAAlaであり、配列番号4に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドではQであることを表す。図4に関しては、図は、配列番号2に基づくCVS番号付けによって、アミノ酸残基24は、配列番号295または941に示されるTEASではSであり、配列番号942に示されるHPSではSであり、配列番号346または347に示されるブドウ属Vitis由来のバレンセンシンターゼではTであり、配列番号887に示されるV277変異体バレンセンシンターゼではTであることを表す。本明細書において、対応する残基とは、アラインされた遺伝子座で生じる残基を指す。関連ポリペプチドまたは変異体ポリペプチドは、当業者に公知の任意の方法によってアラインされる。このような方法は、通常、マッチを最大にし、手作業によるアラインメントを使用することならびに利用可能な多数のアラインメントプログラム例えば、BLASTPおよび当業者に公知のその他のものを使用することによるなどの方法を含む。ポリペプチドの配列をアラインすることによって、当業者ならば、ガイドとして保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基を使用して対応する残基を同定できる。対応する位置はまた、例えば、コンピュータシミュレーションしたタンパク質構造のアラインメントを使用することによって、構造アラインメントを基にしてもよい。例えば、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼのアミノ酸残基R264、W273、T403、Y404、C441およびD445は、配列番号295に示されるタバコエピアリストロチェンシンターゼのアミノ酸残基R264、W273、T403、Y404、C440およびD444に対応する。別の例では、配列番号2のアミノ酸位置221におけるチロシンY221は、配列番号289のアミノ酸位置221におけるシステインC221に対応する。その他の例では、対応する領域が同定され得る。例えば、バレンセンシンターゼの不定形ループ2配列番号2のアミノ酸53~58は、配列番号295に示されるタバコエピアリストロチェンシンターゼTEASポリペプチドのアミノ酸58~63に対応する図2参照のこと。本明細書における目的上、配列番号2に基づくCVS番号付けを用いる、位置に対応するのような改変への言及または同様の語句は、改変されている同定されたアミノ酸残基が、配列番号2中のアミノ酸番号によって示されるようなアミノ酸残基および別のシンターゼ中のこのような残基とアラインするアミノ酸残基であることを意味する。したがって、例えば、配列番号2中のY221Vに対応するアミノ酸置換などの改変への言及は、配列番号2の位置221のチロシンのバリンでのアミノ酸置換を含み、任意のその他の同様のポリペプチドまたは関連ポリペプチド中の配列番号2の位置221に対応するまたはそれとアラインする位置の内因性アミノ酸残基の、チロシンでの置換も含む。例えば、配列番号289の位置221のシステインの、チロシンでの置換C221Vも含まれる。本明細書において、ドメインまたは領域通常、3個以上、一般に、5または7個以上のアミノ酸の配列とは、分子のその他の部分とは構造的および/または機能的に別個であり、同定可能であるタンパク質またはコーディング核酸などの分子の一部を指す。タンパク質は、1つまたは2つ以上の別個のドメインを有し得る。例えば、ドメインは、その他のテルペンシンターゼなどの関連ファミリーメンバーとの、その中の配列の相同性によって、同定、定義または区別され得る。ドメインは、アミノ酸の直線配列である場合も、アミノ酸の非直線配列である場合もある。多数のポリペプチドが、複数のドメインを含有する。このようなドメインは、当業者によって、公知であり、同定され得る。本明細書における例示のために、定義が提供されるが、名称によって特定のドメインを認識することは、十分に、当技術分野における技術の範囲内であるということは理解される。ドメインを同定するために、必要に応じて、適当なソフトウェアを使用してもよい。例えば、上記で論じたように、当技術分野で周知のツールおよびアルゴリズム例えば、BLASTPを使用してなど、配列アラインメントによって異なるテルペンシンターゼ中の対応するドメインを同定できる。本明細書において、機能性ドメインとは、触媒活性などの機能活性によって認識されるポリペプチドの部分を指す。機能性ドメインは、触媒活性によってなど、その機能によって、または基質結合もしくは金属結合などの生体分子と相互作用する能力によって区別され得る。一部の例では、ドメインは、独立に、生物学的機能または特性を示すことができ、その結果、ドメインは、独立にか、または別の分子と融合して、例えば、触媒活性または基質結合などの活性を実施できる。本明細書において、構造ドメインとは、1つまたは複数の構造モチーフで構成されているタンパク質内で独立にフォールディングされる構造を形成できるポリペプチド鎖の部分を指す。本明細書において、アミノ酸または核酸配列に関して異種とは、天然のポリペプチドには存在しないか、または天然のポリヌクレオチドによってコードされない配列の部分を指す。例えば、バレンセンシンターゼのポリペプチドのアミノ酸の一部、例えば、ドメインまたは領域またはその一部は、このようなアミノ酸が、天然または野生型バレンセンシンターゼ例えば、配列番号2に示されるような中に存在しない場合に、またはそれをコードするポリヌクレオチドによってコードされない場合にそれに対して異種である。このような異種アミノ酸を含有するポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、キメラポリペプチドまたはキメラポリヌクレオチドと呼ばれる。本明細書において、語句改変テルペンシンターゼの特性が、第1のテルペンシンターゼと比較して改善されているとは、改変単数または複数を含有しないテルペンシンターゼと比較した、改変テルペンシンターゼの特性における望ましい変化を指す。通常、特性単数または複数は、基質の、改変テルペンシンターゼとの反応から生成される所望のテルペンの量が、基質の、そのように改変されていないテルペンシンターゼとの反応から生成される所望のテルペンの量と比較して増大されるよう改善される。改変テルペンシンターゼにおいて改善され得る例示的特性として、例えば、テルペン生成、触媒活性、生成物分布、基質特異性、位置選択性および立体選択性が挙げられる。特性が改善されているすなわち、所望のテルペン単数または複数の生成にとってより望ましいものであるよう変更されているかどうかを調べるために、当技術分野で周知の方法を使用して1種または複数の特性を評価できる。本明細書において、テルペン生成テルペン収量とも呼ばれるとは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、テルペンシンターゼとの反応から生成されるテルペンの量重量または重量/容量でのを指す。総テルペン生成への言及は、反応から生成されるすべてのテルペンの総量を指し、一方で、特定のテルペン生成への言及とは、反応から生成される特定のテルペン例えば、バレンセンの量をを指す。本明細書において、改善されたテルペン生成とは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、改変されたテルペンシンターゼとの反応から生成される、同一非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、そのように改変されていないテルペンシンターゼとの反応から生成される量と比較した、テルペンの総量すなわち、改善された総テルペン生成の増大または特定のテルペンの量すなわち、改善された特定のテルペン生成の増大を指す。非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、改変テルペンシンターゼとの反応から生成される総または特定のテルペンの量は、同一非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、同一条件下での、そのように改変されていないテルペンシンターゼとの反応から生成されるテルペンの量と比較して、少なくともまたは少なくとも約5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100またはそれ以上増大させることができる。本明細書において、基質特異性とは、バレンセンシンターゼの、ある標的基質に対する、別のものを上回る、例えば、ある非環式ピロリン酸テルペン前駆体例えば、ファルネシル-ピロリン酸FPP、ゲラニル-ピロリン酸GPPまたはゲラニルゲラニル-ピロリン酸GGPPに対する別のものを上回る優先傾向を指す。基質特異性は、kcat/Kmを算出するものなどの当技術分野で周知の方法を使用して評価できる。例えば、基質特異性は、種々の基質例えば、GPP、FPP、GGPPの酵素の触媒効率の尺度である、相対Kcat/Kmを比較することによって評価できる。本明細書において、変更された特異性とは、改変テルペンシンターゼポリペプチド改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドなどの、そのように改変されていないテルペンシンターゼ例えば、野生型バレンセンシンターゼなどと比較した基質特異性の変化を指す。FPP、GPPまたはGGPPなどの基質に対する改変テルペンシンターゼポリペプチドの特異性例えば、kcat/Kmは、出発バレンセンシンターゼの、同一基質に対する特異性と比較して、少なくともまたは少なくとも約10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100またはそれ以上変更することができる。本明細書において、改善された基質特異性とは、基質特異性の、より所望の特異性への変化または変更を指す。例えば、改善された基質特異性は、改変テルペンシンターゼポリペプチドの、FPP、GPPまたはGGPPなどの所望の基質に対する基質特異性の増大を含み得る。改変テルペンシンターゼポリペプチドの、FPP、GPPまたはGGPPなどの基質に対する特異性例えば、kcat/Kmは、そのように改変されていないテルペンシンターゼの特異性と比較して、少なくともまたは少なくとも約10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100またはそれ以上増大させることができる。本明細書において、生成物分布とは、FPPなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体と、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼの間の反応から生成される種々のテルペンの相対量を指す。生成されたテルペンの量は、テルペンシンターゼによって生成された総生成物のパーセンテージとして表すことができる。例えば、FPPの、バレンセンシンターゼとの反応から得られる生成物分布は、90重量/容量バレンセンおよび10重量/容量ゲルマクレンAであり得る。溶液中のテルペンの種類および量を評価する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されており、これとして、例えば、ガスクロマトグラフィー-質量分析GC-MS以下の実施例を参照のことが挙げられる。本明細書において、変更された生成物分布とは、FPPなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体と、バレンセンシンターゼなどのテルペンシンターゼ間の反応から生成された個々のテルペンの相対量の変化を指す。通常、変化は、第1のシンターゼ例えば、野生型シンターゼを使用して非環式ピロリン酸テルペン前駆体から生成された個々のテルペンの相対量を決定すること、次いで、それを第2のシンターゼ例えば、改変シンターゼを使用して生成された個々のテルペンの相対量に対して比較することによって評価する。変更された生成物分布は、任意の1種または複数のテルペンの相対量が、少なくともまたは少なくとも約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80またはそれ以上増大または減少している場合に起こると考えられる。本明細書において、改善された生成物分布とは、より望ましいもの、すなわち、より望ましい相対量のテルペンを含有するものへの生成物分布の変化を指す。例えば、改善された生成物分布は、増大した量の所望のテルペンおよび減少した量のそのように所望ではないテルペンを含有し得る。改善された生成分布における所望のテルペンの量は、少なくともまたは少なくとも約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80またはそれ以上増大させることができる。改善された生成分布における所望ではないテルペンの量は、少なくともまたは少なくとも約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80またはそれ以上減少させることができる。本明細書において、核酸または核酸分子は、DNA、RNAおよびペプチド核酸PNAを含めたその類似体およびそれらの混合物を含む。核酸は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。所望により、蛍光または放射標識などの検出可能な標識などで標識されていてもよい、プローブまたはプライマーへ言及する場合には、一本鎖分子が考慮される。このような分子は、ライブラリーをプロービングまたはプライミングするために、通常、その標的が統計上独特であるような長さのものであり、低コピー数通常、5未満、一般に、3未満のものである。一般に、プローブまたはプライマーは、対象とする遺伝子に対して相補的または同一である、少なくとも14、16または30個の連続したヌクレオチドの配列を含有する。プローブおよびプライマーは、10、20、30、50、100またはそれより長い核酸長であり得る。本明細書において、用語ポリヌクレオチドとは、5’から3’末端に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、RNAおよびDNAを含み、天然の供給源から単離される場合も、インビトロで合成される場合も、または天然分子および合成分子の組合せから調製される場合もある。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチドntと略されたまたは塩基対bpと略されたの用語で本明細書において与えられている。用語ヌクレオチドは、文脈が許す場合には、一本鎖および二本鎖分子に対して使用される。この用語が、二本鎖分子に適用される場合には、長さ全体を示すよう使用され、用語塩基対と同等であると理解される。当業者ならば、二本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖の長さがわずかに異なる場合もあることおよびその末端がずれている場合もあり、したがって、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが対を形成していない場合もあることは認識されよう。このような不対末端は、一般に、20ヌクレオチド長を超えない。本明細書において、異種核酸とは、それが発現される細胞によって、普通は、インビボで生成されないか、または細胞によって生成されるが異なる遺伝子座にあるか、もしくは異なって発現されるか、または転写、翻訳もしくはその他の調節可能な生化学的プロセスに影響を及ぼすことによって、DNAなどの内因性核酸の発現を変更するメディエーターを媒介するか、もしくはコードする核酸である。異種核酸は、一般に、それが導入されている細胞にとって内因性ではなく、別の細胞から得られたか、または合成によって調製されたものである。異種核酸は、内因性である場合もあるが、異なる遺伝子座から発現されるか、その発現が変更されている核酸である。一般に、必ずしもそうではないが、このような核酸は、普通は、それが発現される細胞によって生成されないか、その細胞では同じ方法で生成されないRNAおよびタンパク質をコードする。異種核酸、例えば、DNAはまた、外来核酸、例えば、DNAとも呼ばれることがある。したがって、異種核酸または外来核酸は、対応物核酸分子、例えば、DNAとして正確な配向または位置で存在しない核酸分子を含み、ゲノム中に見られる。別の生物または種に由来するすなわち、外因性核酸分子を指す場合もある。当業者が、核酸が発現される細胞にとって異種または外来と認識し、考える任意の核酸、例えば、DNAが、異種核酸によって本明細書に包含され、異種核酸は、外因的に添加され、同様に内因的に発現される核酸も含む。異種核酸の例として、それだけには限らないが、薬物耐性を付与するタンパク質などの追跡可能なマーカータンパク質をコードする核酸、治療上有効な物質、例えば、抗癌剤、酵素およびホルモンをコードする核酸およびその他の種類のタンパク質、例えば、抗体をコードするDNAなどの核酸が挙げられる。異種核酸によってコードされる抗体は、異種核酸が導入されている細胞の表面に分泌または発現され得る。本明細書において、ペプチドとは、2~40個のアミノ酸長であるポリペプチドを指す。本明細書において、本明細書において提供されるアミノ酸の種々の配列中に生じるアミノ酸は、その公知の三文字または一文字略語に従って同定される表1。種々の核酸断片中に生じるヌクレオチドは、当技術分野で日常的に使用される標準的な一文字命名を用いて命名されている。本明細書において、アミノ酸とは、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、2個以上のアミノ酸を含有する。本明細書における目的上、アミノ酸は、20種の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体すなわち、α-炭素が側鎖を有するアミノ酸を含む。JBiolChem24335573559に記載され、37C.F.R.§§1.821-1.822に採用された標準ポリペプチド命名法を踏まえて、アミノ酸残基の略語は、表1に示されている。式によって本明細書において表されるすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の従来方向に左から右の配向を有するということは、留意しなくてはならない。さらに、語句アミノ酸残基は、対応表表1に列挙されるアミノ酸および37C.F.R.§§1.821-1.822に参照され、本明細書において参照により組み込まれるものなどの改変されたアミノ酸および普通でないアミノ酸を含むよう広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始めまたは最後のダッシュ記号は、1個または複数のアミノ酸残基のさらなる配列との、NH2などのアミノ末端基との、またはCOOHなどのカルボキシル末端基とのペプチド結合を示すことは留意しなければならない。本明細書において、天然に存在するアミノ酸とは、ポリペプチド中に生じる20種のL-アミノ酸を指す。本明細書において、非天然アミノ酸とは、表1に列挙される天然に存在するアミノ酸のうち1種ではない、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物を指す。したがって、天然に存在しないアミノ酸は、例えば、アミノ酸または20種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸の類似体を含み、それだけには限らないが、アミノ酸のD-イソステレオマーisostereomersを含む。例示的非天然アミノ酸は、当業者に公知であり、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得る。本明細書において、改変は、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子中のヌクレオチドの配列の改変に関連しており、それぞれ、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。本明細書における目的上、アミノ酸置換replacementsまたは置換substitutions、欠失および/または挿入は、本明細書において提供されるバレンセンシンターゼのいずれにおいても行うことができる。改変は、保存的アミノ酸置換およびまた非保存的アミノ酸置換を行うことによって行うことができる。例えば、バレンセンシンターゼの特性を望ましくか、または有利に変更するアミノ酸置換を行うことができる。例えば、得られた改変されたバレンセンシンターゼが、非改変バレンセンシンターゼと比較して、FPPから、より多くのバレンセンを生成できるようなアミノ酸置換を、バレンセンシンターゼに行うことができる。考慮されるアミノ酸置換replacementsまたは置換substitutionsとして、それだけには限らないが、表2に示されるものを含めた保存的置換が挙げられる。アミノ酸の適した保存的置換は、当業者に公知であり、一般に、ポリペプチドのコンホメーションまたは活性を変更することなく行うことができる。当業者ならば、一般に、ポリペプチドの非必須領域中の単一のアミノ酸置換は、生物活性を実質的に変更しないことを認識している例えば、WatsonetalMolecularBiologyoftheGene4thEdition1987TheBenjaminCummingsPubcop224参照のこと。保存的アミノ酸置換は、例えば、以下の表2に示されるものに従って行われる:その他の保存的置換も許容され、経験的にまたは公知の保存的置換に従って決定され得る。このような置換の効果は、Altschulに論じられるPAM120、PAM-200およびPAM-250のような置換スコアマトリックスを使用して算出できる。本明細書において、一次配列とは、ポリペプチド中のアミノ酸残基の配列を指す。本明細書において、2種のタンパク質または核酸間の類似性とは、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列間の関連性を指す。類似性は、それに含有される残基の配列の同一性および/または相同性の程度に基づき得る。タンパク質または核酸間の類似性の程度を評価する方法は、当業者に公知である。例えば、配列類似性を評価する一方法では、2種のアミノ酸またはヌクレオチド配列を配列間で最大レベルの同一性を生じる様式でアラインする。同一性とは、アミノ酸またはヌクレオチド配列が不変である程度を指す。アミノ酸配列およびある程度までは、ヌクレオチド配列のアラインメントも、アミノ酸またはヌクレオチドにおける保存的相違および/または頻繁な置換を考慮し得る。保存的相違とは、関与する残基の物理化学的特性を保つものである。アラインメントは、グローバル配列の全長にわたり、すべての残基を含む比較される配列のアラインメントまたはローカル最も類似した領域または複数の領域のみを含む配列の一部のアラインメントであり得る。本明細書において、用語相同性および同一性とは、ポリペプチドまたはコーディング核酸分子間およびそれらの間の関連性を説明するために使用される。同一性とは、同一な配列を指し、相同性は、保存的アミノ酸変化を含み得る。一般に、対応する位置を同定するために、最高次のマッチが得られるようアミノ酸の配列をアラインするComputationalMolecularBiologyLeskAMedOxfordUniversityPressNewYork1988BiocomputingInformaticsandGenomeProjectsSmithDWedAcademicPressNewYork1993ComputerAnalysisofSequenceDataPartIGriffinAM、およびGriffinHGedsHumanaPressNewJersey1994SequenceAnalysisinMolecularBiologyvonHeinjeGAcademicPress1987ならびにSequenceAnalysisPrimerGribskovMおよびDevereuxJedsMStocktonPressNewYork1991CarilloetalSIAMJAppliedMath481073参照のこと。本明細書において、配列同一性とは、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較における、同一なアミノ酸またはヌクレオチド塩基の数を指す。相同ポリペプチドとは、所定数の同一アミノ酸残基または保存的アミノ酸残基を有する2種以上のペプチドを指す。相同性はまた、コードされるアミノ酸を変化させない置換すなわち、サイレント置換を含む。配列同一性は、各供給業者によって確立されたデフォルトギャップペナルティーを用いて使用される標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムによって決定できる。相同核酸分子とは、所定数の同一または相同なヌクレオチドを有する2種以上のヌクレオチドを指す。実質的に相同な核酸分子は、通常、核酸の長さのすべてに沿ってか、または対象とする全長核酸分子の少なくとも約70、80または90に沿って、中程度のストリンジェンシーで、または高ストリンジェンシーでハイブリダイズする。また、ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子も考慮される。タンパク質の相同性を決定するために、保存的アミノ酸ならびに同一アミノ酸をアラインしてもよい。この場合には、同一性のパーセンテージおよびパーセンテージ相同性は変わる。任意の2種の核酸分子が、少なくとも80、85、90、95、96、97、98または99同一であるヌクレオチド配列を有するかどうかまたは任意の2種のポリペプチドが、アミノ酸配列を有するかどうか、例えば、PearsonetalProcNatlAcadSciUSA852444におけるようなデフォルトパラメータを使用するFASTAプログラムなどの既知コンピュータアルゴリズムを使用して決定できるその他のプログラムとして、GCGプログラムパッケージNucleicAcidsResearch12387、BLASTP、BLASTN、FASTAGuidetoHugeComputersMartinJBishopedAcademicPressSanDiegoおよびCarrilloetalSIAMJAppliedMath481073が挙げられる。例えば、NationalCenterforBiotechnologyInformationデータベースのBLAST関数を使用して同一性を決定できる。その他の市販の、または公的に入手可能なプログラムとして、DNAStarMegAlignプログラムMadison、WIおよびUniversityofWisconsinGeneticsComputerGroupUWGGapプログラムMadisonWIが挙げられる。タンパク質および/または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えば、GAPコンピュータプログラム例えば、SmithおよびWatermanによって修正されたようなNeedlemanetalJMolBiol48443を使用して配列情報を比較することによって決定できる。手短には、GAPプログラムは、2種の配列のうち短いほうの記号の総数によって除された、類似であるアラインされた記号すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸の数として類似性を規定する。GAPプログラムのデフォルトパラメータは:1単項比較マトリックス同一性に対して1および非同一性に対して0の値を含有するならびにSchwartzおよびDayhoffedsAtlasofProteinSequenceandStructureNationalBiomedicalResearchFoundation、pp353358によって記載される、GribskovetalNuclAcidsRes146745の加重比較マトリックス;2各ギャップに対して3.0のペナルティーおよび各ギャップ中の各記号に対してさらなる0.10のペナルティーならびに3末端ギャップに対するペナルティーなしを含む。Clustal分析を使用して、ヌクレオチドまたはタンパク質配列のいずれかをアラインし、その同一性および類似性のレベルをスコア化してもよいebiacukToolsmsaclusalw2またはebiacukebisearchsearchebidbmedlinetclustalで入手可能。したがって、本明細書において、用語同一性とは、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を表す。1つの限定されない例では、と少なくとも90同一であるとは、参照ポリペプチドに対して90~100の同一性パーセントを指す。90またはそれより高いレベルの同一性は、例示目的で、100個のアミノ酸の試験および参照ポリペプチドの長さが比較されると仮定して、試験ポリペプチド中のアミノ酸の10すなわち、100個のうち10個以下が参照ポリペプチドのものとは異なっているという事実を示す。試験および参照ポリヌクレオチド間で同様の比較を行うことができる。このような相違は、アミノ酸配列の全長にわたって無作為に分配された点突然変異として表される場合もあり、または最大の許容可能な、例えば、10/100のアミノ酸の相違およそ90の同一性までの変動する長さの1つまたは複数の位置に密集している場合もある。相違は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約85~90を上回る相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムおよびギャップパラメータセットとは無関係であるはずであり、このような高レベルの同一性は、多くの場合、ソフトウェアに頼らずに容易に評価できる。本明細書において、用語実質的に同一または類似しているは、関連技術分野の当業者によって理解されるように文脈に応じて変わるが、当業者ならばこのようなものを評価できるということも理解される。本明細書において、アラインされた配列とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列において対応する位置をアラインするための、相同性類似性および/または同一性の使用を指す。通常、50以上の同一性によって関連している2種以上の配列がアラインされる。アラインされた配列のセットとは、対応する位置でアラインされている2種以上の配列を指し、ゲノムDNA配列とアラインされた、ESTおよびその他のcDNAなどのRNAに由来するアラインしている配列を含み得る。本明細書において、単離または精製されたポリペプチドまたはタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、タンパク質が由来する組織の細胞に由来する細胞物質もしくはその他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、このような純度を評価するために当業者によって使用される、薄層クロマトグラフィーTLC、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーHPLCなどの分析の標準法によって決定されるように、容易に検出可能な不純物を含まないと思われる場合に、実質的に含まないと決定され得るか、またはさらなる精製が、物質の、タンパク質分解活性および生物活性などの物理的および化学的特性を検出可能に変更しないよう十分に純粋であると決定され得る。実質的に化学的に純粋な化合物を生成するための化合物の精製方法は、当業者に公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。このような例では、さらなる精製は、化合物の比活性を増大し得る。用語、細胞物質を実質的に含まないとは、バレンセンシンターゼまたはテルペンが、それが単離または生成される細胞の細胞成分から分離されているバレンセンシンターゼまたはテルペン生成物の調製物を含む。一実施形態では、用語、細胞物質を実質的に含まないとは、約30、20、10、5乾重で未満lessthatまたはそれより少ない、細胞培養培地を含めた非バレンセンシンターゼまたはテルペンタンパク質または生成物を有する、バレンセンシンターゼまたはテルペン生成物の調製物を含む。本明細書において、組換えDNA法を使用することによる組換え法による生成とは、クローニングされたDNAによってコードされるタンパク質を発現するための分子生物学の周知の方法の使用を指す。本明細書において、ベクターまたはプラスミドとは、異種核酸をその発現または複製いずれかのために細胞中に導入するために使用される別個のDNAエレメントを指す。通常、ベクターは、エピソームのままであるが、遺伝子またはその一部のゲノムの染色体への組み込みを達成するよう設計できる。また、細菌人工染色体、酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体などの人工染色体であるベクターも考慮される。このような媒体の選択および使用は、当業者には周知である。本明細書において、発現とは、核酸がmRNAに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。核酸がゲノムDNAに由来する場合には、発現は、適当な真核細胞宿主細胞または生物が選択される場合には、mRNAのスプライシングなどのプロセシングを含む。本明細書において、発現ベクターは、プロモーター領域などの調節配列と作動可能に連結しているDNAを発現できるベクターを含み、プロモーター領域などの調節配列は、このようなDNA断片の発現を達成できる。このようなさらなるセグメントは、プロモーターおよび終結配列を含むことができ、所望により、1種または複数の複製起点、1種または複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般に、プラスミドまたはウイルスDNAに由来するか、または両方のエレメントを含有し得る。したがって、発現ベクターとは、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは適当な宿主細胞に導入するとクローニングされたDNAの発現をもたらすその他のベクターなどの組換えDNAまたはRNAコンストラクトを指す。適当な発現ベクターは、当業者には周知であり、真核細胞および/または原核細胞において複製可能であるものおよびエピソームのままであるものまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが挙げられる。本明細書において、ベクターはまた、ウイルスベクターまたはウイルス性ベクターを含む。ウイルス性ベクターとは、媒体またはシャトルとして外因性遺伝子を細胞中に移入するよう、外因性遺伝子と作動可能に連結されている操作されたウイルスである。本明細書において、アデノウイルスとは、ヒトにおいて結膜炎および上気道感染を引き起こす、DNAを含有するウイルスの任意の群を指す。本明細書において、裸のDNAとは、ワクチンおよび遺伝子療法のために使用できるヒストンを含まないDNAを指す。裸のDNAは、形質転換またはトランスフェクションと呼ばれる遺伝子移入プロセスの際に細胞から細胞に伝えられる遺伝物質である。形質転換またはトランスフェクションでは、レシピエント細胞によって取り込まれる精製DNAまたは裸のDNAが、レシピエント細胞に新規特徴または表現型をもたらす。本明細書において、DNAセグメントを指す場合に、作動可能にoperablyまたは作動可能にoperatively連結されたとは、セグメントがその意図される目的に合わせて機能する、例えば、転写が、プロモーターで始まり、コーディングセグメントを通って、ターミネーターまで進行するよう配置されていることを意味する。本明細書において、キメラタンパク質または融合タンパク質とは、異なるポリペプチドと作動可能に連結されたポリペプチドを指す。本明細書において提供されるキメラまたは融合タンパク質は、1種または複数のバレンセンシンターゼポリペプチドまたはその一部と、転写/翻訳制御シグナル、シグナル配列、局在性のためのタグ、精製のためのタグ、免疫グロブリンGのドメインの一部および/または標的化薬剤のうちいずれか1種または複数に対する1種または複数のその他のポリペプチドとを含み得る。キメラバレンセンシンターゼポリペプチドはまた、別のポリペプチドと交換されたポリペプチドのその内因性ドメインまたは領域を有するものも含む。これらのキメラまたは融合タンパク質は、融合タンパク質として組換え手段によって生成されたもの、例えば、スルフヒドリル基とのカップリングによる化学的カップリングなどの化学的手段によって生成されたものおよび少なくとも1種のポリペプチドすなわち、バレンセンシンターゼまたはその一部が、リンカー単数または複数によって別のポリペプチドと直接的または間接的に連結される任意のその他の方法によって生成されたものを含む。本明細書において、ポリペプチドがアミノ酸の列挙された配列から本質的になるという列挙は、全長ポリペプチドの列挙された部分またはその断片のみが存在することを意味する。ポリペプチドは、所望により、また、一般に、別の供給源に由来するさらなるアミノ酸を含むか、または別のポリペプチド中に挿入され得る。本明細書において、単数形1つのa、1つのanおよびそのtheは、文脈上、別段の明確な指示のない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、1つのアミノ酸置換を含むポリペプチドへの言及は、1つまたは複数のアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本明細書において、範囲および量は、約特定の値または範囲として表現され得る。約はまた、正確な量も含む。したがって、約5とは、約5および5も意味する。本明細書において、任意選択のまたは所望によりとは、続いて記載される事象または状況が起こるか起こらないことおよび記載が前記事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。例えば、所望により、バレンセンを単離する工程とは、バレンセンが単離されるか、単離されないことを意味する。本明細書において、任意の保護基、アミノ酸およびその他の化合物の略語は、別段の指示のない限り、その一般的な使用、認識されている略語または生化学命名法に関するIUPAC-IUB委員会IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclatureBiochem111726参照のことを踏まえる。B.バレンセンシンターゼバレンセンシンターゼは、ファルネシル二リン酸をセスキテルペンバレンセンに変換する、クラス1植物テルペンシクラーゼまたはテルペンシンターゼ、イソプレノイドシンターゼまたはテルペノイドシクラーゼである。次いで、バレンセンは、酸化によってヌートカトンに変換され得る。バレンセンおよびヌートカトンの両方とも、オレンジおよびグレープフルーツなどのかんきつ油の天然成分であり、香水およびフレーバー工業において広く使用される成分である。バレンセンは、柑橘類の果実、ブドウの木の花、セロリApiumgraveolens、マンゴーMangiferaindica、オリーブOleaeuropeaおよびサンゴにおいて同定されている。今日までに、バレンセンシンターゼは、柑橘類の果実、ブドウの木の花およびシソ属青紫蘇から単離されている。柑橘類バレンセンシンターゼCVSは、スイートオレンジCitrussinensisスイートオレンジのフラベド外皮配列番号2、289、290およびグレープフルーツCitrusxparadisiグレープフルーツ配列番号291および752において同定されているTrendsPlantSci9266SharonAsaetal,ThePlantJournal36664674AF411120および米国特許第7,273,735号;同7,442,785号;同7,790,426号;および国際PCT出願WO2005021705およびWO2003025193参照のこと。アミノ酸置換A517I/I518Vを含有する変異体バレンセンシンターゼが記載されているPhytochemistry65264959およびMartinetalProcNatlAcadSciUSA10672457250参照のこと配列番号346および347。バレンセンシンターゼはまた、アラスカヒノキペンデュラChamaecyparisnootkatensispendulaから単離されている例えば、国際PCT公開番号WO2011074954;配列番号882および883およびそれぞれ、配列番号884および885に示されるコーディング核酸を参照のこと。a.構造クラス1植物テルペンシクラーゼは、クラス1テルペノイドシクラーゼフォールドと呼ばれる一般的なαヘリックス構築を共有する単量体テルペンシンターゼの多様な群を含む例えば、ChristiansonDWCurrOpinChemBiol12141150およびBohlmannetalProcNatlAcadSciUSA9541264133参照のこと。比較的に小さい全体の配列類似性しか存在しないが、クラス1植物テルペンシクラーゼは、相同構造およびいくつかの高度に保存されたモチーフおよび/または残基を有する。その触媒部位では、各テルペンシクラーゼは、環化すると、特定の分子内炭素間結合が形成されるような配向およびコンホメーションを有する可動性イソプレノイド基質と結合する鋳型を提供する。したがって、各酵素の触媒部位の構造が、得られる環状モノテルペン、ジテルペンおよびセスキテルペンを決定する。タバコ5-エピ-アリストロチェンシンターゼおよびペンタレネンシンターゼのX線結晶構造から、クラス1植物テルペンシクラーゼは、もっぱら短い接続ループおよびターンによって相互接続されたαヘリックスからなるということが示された例えば、StarksetalScience27718151820およびLesburgetalScience27718201824参照のこと;図2も参照のこと。これらの酵素は、2つの別個の構造ドメイン、その構造が、グリコシルヒドロラーゼhydrolysasesの触媒コアと似ているが、その機能は大部分が未知であるN末端ドメインおよびC末端触媒ドメインを含有する。触媒ドメインは、2つの保存された金属結合モチーフ、すなわち、酵素触媒活性に関与しているアスパラギン酸リッチな領域を含有する。触媒部位は、反対側の壁に位置する2つのアスパラギン酸リッチな領域を有する、ほとんど逆並行のαヘリックスによって形成される大きな中央腔を含有する。アスパラギン酸リッチな領域は、Mg2イオンを架橋することによって二リン酸基質の結合を媒介する。基質のその後の結合は、N末端領域が、活性部位を溶媒に対して封鎖する触媒コア上のキャップを形成するようなコンホメーション変化を誘導し、それによって反応性カルボカチオン中間体を安定化する。保存されたαヘリックスC、D、F、GおよびHは、クラス1植物テルペンシンターゼの触媒部位または活性部位を作り上げる。活性部位は、基質のオレフィン鎖を収容するよう芳香族残基によって裏打ちされた疎水性ポケットである。芳香族残基は、πカチオン相互作用によってカルボカチオン中間体を安定化する。アスパラギン酸リッチな領域1は、ヘリックスD上に位置し、保存された配列DDxxDを特徴とし、また、Mg2と結合するよう機能する例えば、StarksetalScience27718151820参照のこと。第2の保存された金属結合領域は、ヘリックスH上に位置し、保存された配列[N/D]xxx[S/T]xxxEを特徴とし、また、NSE/DTEモチーフとも呼ばれる。これらの2種の保存された金属結合モチーフは、3個のMg2イオンのイソプレノイド二リン酸との結合を調整する。b.機能バレンセンシンターゼは、真菌および動物ではメバロン酸依存性イソプレノイド生合成経路および細菌および高等植物では非メバロン酸依存性イソプレノイド生合成経路の一部として生成される遍在するピロリン酸中間体ファルネシル二リン酸FPPからのバレンセンの形成を触媒する。バレンセン1,2,3,5,6,7,8,8a-オクタヒドロ-7-イソプロペニル-1,8a-ジメチル-ナフタレンは、次いで、酸化によって、ヌートカトン4,4a,5,6,7,8-ヘキサヒドロ-6-イソプロペニル-4,4-a-ジメチル-23H-ナフタレノンに変換される。図3は、生化学経路を表す。バレンセンシンターゼなどのクラス1植物テルペンシクラーゼは、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸およびゲラニル-ゲラニル二リン酸などの直鎖オールトランスイソプレノイド二リン酸を、環状モノテルペン、ジテルペンおよびセスキテルペンへ変換する金属依存性シクラーゼである。環化反応は、新規炭素間一重結合が、高度に反応性の電子欠乏性アリルカルボカチオンと電子の豊富な炭素間二重結合の反応によって形成される求電子アルキル化によって進行する。テルペンシンターゼは、酵素触媒に必要である酵素の活性中心に、二価金属イオン、通常、Mg2イオンまたは時には、Mn2を含有する。より詳しくは、それらは、ピロリン酸離脱に必要である。一般に、酵素は、2個のMg2イオンの結合を調整するアスパラギン酸リッチなDDxxDモチーフおよび3番目のMg2イオンを調製するNSE/DTEモチーフを含めた、触媒部位を裏打ちする2つの保存された金属結合モチーフを含有するStarksetalScience27718151820およびLesburgetalScience27718201824参照のこと。触媒活性部位のアスパラギン酸リッチな領域は、Mg2イオンを架橋することによってプレニル二リン酸の結合を媒介する。Mg23-PPiの結合は、N末端領域が触媒コア上にキャップを形成し、したがって、バルク溶媒を含まない閉鎖されたコンホメーションに活性部位を安定化するようなコンホメーション変化を誘導する。酵素が結合している基質からのピロリン酸PPiの喪失が、高度に反応性のアリルカルボカチオンをもたらし、これがテルペン鎖のさらに先の分子内二重結合を求電子性に攻撃して、閉環を達成する。PPiアニオンは、閉じたシンターゼコンホメーションで結合される場合には、保存された塩基性残基からの水素結合を受容し、芳香族残基によって裏打ちされた疎水性ポケットが、プレニル側鎖を包み込み、恐らくは、特定の基質コンホメーションを強制することおよびπスタッキング相互作用によってカルボカチオンを安定化することによって環化反応の鋳型となるNoeletalACSChemicalBiology5377392。c.柑橘類バレンセンシンターゼ柑橘類バレンセンシンターゼは、オールトランスファルネシル二リン酸FPPを、セスキテルペンバレンセンに変換するオレンジおよびグレープフルーツなどの柑橘類果実において見られるセスキテルペンシンターゼである。今日までに、いくつかの柑橘類バレンセンシンターゼが同定および単離されている。柑橘類バレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、特定の種例えば、スイートオレンジCitrussinensisから単離されたシンターゼが、同一種から単離された別のシンターゼのものと同一または異なる配列を有し得、また、異なる種例えば、グレープフルーツCitrusparadisiから単離されたシンターゼと同一または異なる配列を有し得るので、必ずしも種特異的ではない。今日までに単離および配列決定された柑橘類バレンセンシンターゼとして、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する548アミノ酸のポリペプチドである配列番号1に示されるcDNA配列によってコードされる、バレンシアオレンジCitrussinensiscv.Valenciaバレンシアオレンジから単離され、本明細書に記載されたバレンセンシンターゼが挙げられる実施例1参照のこと。このシンターゼは、グレープフルーツCitrusparadisiグレープフルーツ:米国特許第7,273,735号参照のことから単離されたバレンセンシンターゼと、また、ネーブルオレンジカラカラオレンジCitrussinensiscv.CaraCara;Genbank受託番号ACX70155から単離されたバレンセンシンターゼと100のヌクレオチド配列同一性を共有する。これらのテルペンシンターゼの3種すべてを記載するヌクレオチド配列が、配列番号1また、Genbank受託番号GQ988384に示されている。対応するポリペプチドアミノ酸配列が、配列番号2に示されている。グレープフルーツCitrusparadisi由来の第2のバレンセンシンターゼはまた、米国特許第7,273,735号に記載されており、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼと比較して、4つのアミノ酸置換;I92N、D95H、R98SおよびA99Pを含有する配列番号752、配列番号753に示されるcDNAによってコードされる。バレンシアオレンジCitrussinensiscv.Valenciaのフラベド外皮から単離された別のバレンセンシンターゼは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼと比較して、2つのアミノ酸置換;V123GおよびY221Cを有する配列番号289、配列番号292に示されるcDNAによってコードされる;Genbank受託番号AAQ04608およびAF441124;SharonAsaetalThePlantJournal36664674参照のこと。グレープフルーツCitrusxparadisiから単離されたさらなるバレンセンシンターゼは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼと比較して、2つの異なるアミノ酸置換;Q87LおよびL239Pを有し配列番号290、配列番号293に示されるcDNAによってコードされる;米国特許第7,442,785号参照のこと;グレープフルーツCitrusxparadisiから単離された別のバレンセンシンターゼは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼと比較して、さらに1つの合計3つのアミノ酸置換;Q87L、L239PおよびN493Dを有する配列番号291、配列番号294に示されるcDNAによってコードされる;Genbank受託番号AAM00426およびAF411120参照のこと。上記のように、柑橘類バレンセンシンターゼは、N末端ドメイン配列番号2のaa1~266およびC末端触媒ドメイン配列番号2のaa267~548を含有する。バレンセンシンターゼは、その他のテルペンシンターゼと高いパーセンテージの相同性を必ずしも共有しないが、触媒ドメインは、一般的な3次元構造例えば、米国特許第6,465,772号、同6,495,354号および同6,559,297号に記載されるをその他のテルペンシンターゼと共有する。タバコ5-エピ-アリストロチェンシンターゼTEAS;StarksetalScience27718151820に記載されるの構造とアラインし、比較すると、柑橘類バレンセンシンターゼが、以下の構造ドメイン:不定形ループ1配列番号2のアミノ酸1~29に対応する、αヘリックス1配列番号2のアミノ酸30~39および44~52に対応する、不定形ループ2配列番号2のアミノ酸53~58に対応する、αヘリックス2配列番号2のアミノ酸59~71に対応する、不定形ループ3配列番号2のアミノ酸72~78に対応する、αヘリックス3配列番号2のアミノ酸79~93に対応する、不定形ループ4配列番号2のアミノ酸94~100に対応する、αヘリックス4配列番号2のアミノ酸101~114に対応する、不定形ループ5配列番号2のアミノ酸115~141に対応する、αヘリックス5配列番号2のアミノ酸142~152に対応する、不定形ループ6配列番号2のアミノ酸153~162に対応する、αヘリックス6配列番号2のアミノ酸163~173に対応する、不定形ループ7配列番号2のアミノ酸174~184に対応する、αヘリックス7配列番号2のアミノ酸185~194に対応する、不定形ループ8配列番号2のアミノ酸195~201に対応する、αヘリックス8配列番号2のアミノ酸202~212に対応する、不定形ループ9配列番号2のアミノ酸213~222に対応する、αヘリックスA配列番号2のアミノ酸223~253に対応する、A-Cループ配列番号2のアミノ酸254~266に対応する、αヘリックスC配列番号2のアミノ酸267~276に対応する、不定形ループ11配列番号2のアミノ酸277~283に対応する、αヘリックスD配列番号2のアミノ酸284~305に対応する、不定形ループ12配列番号2のアミノ酸306~309に対応する、αヘリックスD1配列番号2のアミノ酸310~322に対応する、不定形ループ13配列番号2のアミノ酸323~328に対応する、αヘリックスD2配列番号2のアミノ酸329に対応する、不定形ループ14配列番号2のアミノ酸330~332に対応する、αヘリックスE配列番号2のアミノ酸333~351に対応する、不定形ループ15配列番号2のアミノ酸352~362に対応する、αヘリックスF配列番号2のアミノ酸363~385に対応する、不定形ループ16配列番号2のアミノ酸386~390に対応する、αヘリックスG1配列番号2のアミノ酸391~395に対応する、不定形ループ17配列番号2のアミノ酸396~404に対応する、αヘリックスG2配列番号2のアミノ酸405~413に対応する、不定形ループ18配列番号2のアミノ酸414~421に対応する、αヘリックスH1配列番号2のアミノ酸422~428に対応する、不定形ループ19配列番号2のアミノ酸429~431に対応する、αヘリックスH2配列番号2のアミノ酸432~447に対応する、不定形ループ20配列番号2のアミノ酸448~450に対応する、αヘリックスH3配列番号2のアミノ酸451~455に対応する、不定形ループ21配列番号2のアミノ酸456~461に対応する、αヘリックスa-1配列番号2のアミノ酸462~470に対応する、不定形ループ22配列番号2のアミノ酸471~473に対応する、αヘリックスI配列番号2のアミノ酸474~495に対応する、不定形ループ23配列番号2のアミノ酸496~508に対応する、αヘリックスJ配列番号2のアミノ酸509~521に対応する、J-Kループ配列番号2のアミノ酸522~534に対応する、αヘリックスK配列番号2のアミノ酸535~541に対応する、および不定形ループ25配列番号2のアミノ酸542~548に対応するを含有することが明らかである。構造ドメインは、図2に表されている。アスパラギン酸リッチな領域1および2を含有する保存された金属結合部位は、C末端触媒ドメイン内にある。保存されたDDxxDモチーフを含有するアスパラギン酸リッチな領域1は、配列番号2のアミノ酸D301、D302、T303、Y304およびD305に対応する。Asp301およびAsp305は、Mg2との協調によってFPPの二リン酸部分と結合する。NSE/DTEモチーフを含有するアスパラギン酸リッチな領域2は、配列番号2のアミノ酸D445、D446、M447、Q448、G449、H450、E451、F452およびE453と対応する。この領域は、アミノ酸Asp445、Gly449およびGlu453によってさらなるMg2イオンと結合する。上記のように、バレンセンシンターゼの活性部位基質結合ポケットは、疎水性であり、芳香族残基を含有する。アスパラギン酸リッチな領域に由来するアミノ酸残基D301、D305、D445、G449およびE453ならびに配列番号2のアミノ酸残基R264、W273、N294、I296、L297、S298、Y376、C402、C441、R442、L443、D446、Y522、D526およびY528が、バレンセンシンターゼの基質結合ポケットを形成する。これらの残基は、ファルネシル側鎖を包み込み、基質をバレンセンの生成をもたらすコンホメーションに強制する。Mg23-PPi結合の際、バレンセンシンターゼは、開いたから閉じた活性部位に構造変化を受け、それによってN末端領域が活性部位上にキャップまたは蓋を形成する。活性部位蓋残基は、配列番号2のN末端ドメインアミノ酸残基R8、P9、T10、A11、D12、F13、H14およびP15ならびに配列番号2のC末端ドメインアミノ酸残基F452、E453、K455、R456、G457、A460、S461、A462、I463、D525、D526、G527およびY528に対応する。バレンセンシンターゼ活性部位の付近にあり、エレモフィロン型セスキテルペン内に保存されているさらなる残基として、配列番号2のアミノ酸残基L270、Y376、S401、C402、A403、Y404、V407、C441、I518、I521およびT529が挙げられるGreenhagenetalProcNatlAcadSciUSA10398269831および米国特許第7,442,785号参照のこと。これらの残基は、バレンセンが優位に形成される生成物であるように反応中間体の位置決めを補助する。FPPからバレンセンシンターゼによって生成され得るその他の生成物として、それだけには限らないが、ゲルマクレンA、β-エレメンβ-エレメンは、ゲルマクレンAの自然分解によって形成される、β-セリネン、τ-セリネンおよび7-エピ-α-セリネンが挙げられる。配列番号2のアミノ酸残基A517およびI518は、それらのA517I/I518Vへの突然変異が、正常な反応の中断によってゲルマクレンから誘導され得るβ-エレメン反応生成物をもたらしたので、C1-C10環化後の反応の後期において役割を果たすとして同定された例えば、EranEyalComputerModellingoftheEnzymaticReactionCatalysedby5epiaristolochenecyclaseDoctoralDissertationRetrievedfromLibraryCatalogWiezmannInstituteofScienceシステム番号000083214参照のこと。C.改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびコーディング核酸分子改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが本明細書において提供される。また、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子も本明細書において提供される。本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、それだけには限らないが、FPP、GPPおよびGGPPを含めた任意の適した非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンおよび/またはその他のテルペンの形成を触媒する。通常、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、FPPからのバレンセンの形成を触媒する。改変は、提供されるバレンセンシンターゼの任意の領域またはドメインで行うことができ、得られる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、バレンセンシンターゼ活性すなわち、非環式ピロリン酸テルペン前駆体、通常、FPPからのバレンセンの形成を触媒する能力を少なくとも保持する。改変は、単一アミノ酸置換replacements置換substitutions、挿入または欠失などの単一アミノ酸改変であっても、複数のアミノ酸置換、挿入または欠失などの複数のアミノ酸改変であってもよい。一部の例では、全体または部分ドメインまたは領域、例えば、以下に本明細書に記載された任意のドメインまたは領域が、別のテルペンシンターゼに由来する対応するドメインまたは領域またはその一部で交換される。改変の例示として、単一または複数のアミノ酸置換を含めたアミノ酸置換がある。例えば、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、改変を含有しないバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、少なくともまたは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、90、95、100、105、110、115、120またはそれ以上の改変された位置を含有し得る。本明細書に記載された改変は、任意のバレンセンシンターゼポリペプチド中にあり得る。通常、改変は、柑橘類由来の柑橘類バレンセンシンターゼCVSにおいて行われる。例えば、本明細書に記載された改変は、配列番号2、289~291、346、347、752、882または883のいずれかに示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して少なくとも60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99の配列同一性を有する当技術分野で記載されるいずれかのものを含めた、配列番号2、289~291、346、347、752、882または883のいずれかまたはその任意の変異体に示されるようなバレンセンシンターゼにおいてであり得る。変異体バレンセンシンターゼの例示は、配列番号886に示されている。特に、配列番号2、289~291、752または886のいずれかに示されるバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、1つまたは複数の改変を含有する改変された柑橘類由来バレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。また、配列番号3~127、350、351、723~731、732~745、746~751、810~866、887~890、895、944、946、948、950、952,954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996および998に示される変異体のいずれかが、例えば、本明細書に記載された改変のいずれかを含むことによってさらに改変され得るということは理解される。特に、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに関して、アミノ酸置換replacementsまたは置換substitutions、付加または欠失、末端切断またはそれらの組合せを含有する。一般に、アミノ酸置換を含めた改変のための位置およびアミノ酸への言及は、本明細書では、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼに関するCVS番号付けによってである。バレンセンシンターゼポリペプチド、例えば、配列番号2、289~291、346、347、752、882もしくは883またはそれらの任意の変異体に示されるいずれかにおいてこのような改変を行うことは、当業者のレベル内である。例えば、図1および図4は、例示的バレンセンシンターゼポリペプチド間およびそれらの間のCVS番号付けおよび対応する位置を表す。この記載に基づいて、いずれか1つまたは複数の記載された突然変異を含有するバレンセンシンターゼを作製することおよび本明細書に記載されたようにバレンセンシンターゼ活性について各々を試験することは当業者のレベル内である。また、一部の例では、本明細書において提供された改変のいずれかを含有するバレンセンシンターゼポリペプチドの改変された活性断片が、本明細書において提供される。このような断片は、野生型バレンセンシンターゼの1つまたは複数の特性を保持する。一般に、改変された活性断片は、バレンセンシンターゼ活性を示すすなわち、FPPなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する。また、バレンセンシンターゼポリペプチドにおける改変を行って、一次配列の改変およびポリペプチドの一次配列においてではない改変を含めたその他の改変も含有するバレンセンシンターゼポリペプチドにしてもよい。例えば、本明細書に記載された改変は、異なるバレンセンシンターゼポリペプチドまたは異なるテルペンシンターゼポリペプチドのハイブリッド例えば、別のテルペンシンターゼに由来する1つまたは複数のドメインまたは領域を含有するを含めた、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドおよびまた組換えによって調製されたか、または既知ポリペプチドの配列に基づいて当技術分野で公知のその他の方法によって合成もしくは構築された合成バレンセンシンターゼポリペプチドであるバレンセンシンターゼポリペプチドにおいてであり得る。本明細書において提供されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、一般に、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して少なくとも62のアミノ酸配列同一性を示す。例えば、本明細書において提供されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、一般に、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくともまたは少なくとも約65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、95、95、96、97、98または99のアミノ酸配列同一性を示す。特定の例では、バレンセンシンターゼポリペプチドはまた、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して95未満の配列同一性を示す。したがって、例えば、本明細書において提供されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくとも62または62を超える配列同一性を示し、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと、94.7、94.6、94、93、92、91、90、89、88、87、86、84、83、82、8179、78、77、76、74、73、72または71未満または約94.7、94.6、94、93、92、91、90、89、88、87、86、84、83、82、8179、78、77、76、74、73、72または71未満の配列同一性を示す。一般に、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2に示されるアミノ酸の配列に対して、75から95の間もしくはおよそその間、75から94の間もしくはおよそその間、74から93の間もしくはおよそその間、75から92の間もしくはおよそその間、80から95の間もしくはおよそその間、80から94の間もしくはおよそその間、80から93の間もしくはおよそその間、80から92の間もしくはおよそその間、85から95の間もしくはおよそその間、85から94の間もしくはおよそその間、85から93の間もしくはおよそその間または85から92の間もしくはおよそその間各々を含むの配列同一性を示す。一部の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号3に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、100未満または100の同一性を有する。その他の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号4に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、100未満または100の同一性を有する。さらなる例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号5に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、100未満または100の同一性を有する。例えば、配列番号3または配列番号4に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくとも80の同一性、例えば、配列番号3または配列番号4に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくともまたは少なくとも約81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99の同一性などである、アミノ酸の配列を有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。同一性パーセントは、当業者によって、標準アラインメントプログラムを使用して決定できる。例えば、当業者によって、標準アラインメントプログラムを使用して決定できるように、37のアミノ酸置換例えば、K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E、例えば、以下に記載される配列番号5に示されるV75と名づけられた改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼに対して、約93.2の相同性を示す。その他の例では、本明細書において提供された改変バレンセンシンターゼポリペプチドは、少なくとも80、81、82、83または84の置換、挿入および/または欠失を含めた改変を含有し、その結果、得られたポリペプチドは、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドに対して、85未満同一であるか、または85同一であるか、または約85同一である。別の例では、本明細書において提供された改変バレンセンポリペプチドは、少なくとも107、108、109、110または111の改変例えば、置換、挿入および/または欠失を含有し、その結果、得られたポリペプチドは、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドに対して、80未満同一であるか、80同一であるか、または約80同一である。改変は、N末端ドメイン配列番号2のアミノ酸1~266に対応するにおいて、および/またはC末端触媒ドメイン配列番号2のアミノ酸267~548に対応するにおける1つまたは複数の改変であり得る。一部の例では、改変は、アミノ酸置換である。さらなる例では、本明細書において提供された改変バレンセンシンターゼポリペプチドは、不定形ループ1配列番号2のアミノ酸1~29に対応する、αヘリックス1配列番号2のアミノ酸30~39および44~52に対応する、不定形ループ2配列番号2のアミノ酸53~58に対応する、αヘリックス2配列番号2のアミノ酸59~71に対応する、不定形ループ3配列番号2のアミノ酸72~78に対応する、αヘリックス3配列番号2のアミノ酸79~93に対応する、不定形ループ4配列番号2のアミノ酸94~100に対応する、αヘリックス4配列番号2のアミノ酸101~114に対応する、不定形ループ5配列番号2のアミノ酸115~141に対応する、αヘリックス5配列番号2のアミノ酸142~152に対応する、不定形ループ6配列番号2のアミノ酸153~162に対応する、αヘリックス6配列番号2のアミノ酸163~173に対応する、不定形ループ7配列番号2のアミノ酸174~184に対応する、αヘリックス7配列番号2のアミノ酸185~194に対応する、不定形ループ8配列番号2のアミノ酸195~201に対応する、αヘリックス8配列番号2のアミノ酸202~212に対応する、不定形ループ9配列番号2のアミノ酸213~222に対応する、αヘリックスA配列番号2のアミノ酸223~253に対応する、A-Cループ配列番号2のアミノ酸254~266に対応する、αヘリックスC配列番号2のアミノ酸267~276に対応する、不定形ループ11配列番号2のアミノ酸277~283に対応する、αヘリックスD配列番号2のアミノ酸284~305に対応する、不定形ループ12配列番号2のアミノ酸306~309に対応する、αヘリックスD1配列番号2のアミノ酸310~322に対応する、不定形ループ13配列番号2のアミノ酸323~328に対応する、αヘリックスD2配列番号2のアミノ酸329に対応する、不定形ループ14配列番号2のアミノ酸330~332に対応する、αヘリックスE配列番号2のアミノ酸333~351に対応する、不定形ループ15配列番号2のアミノ酸352~362に対応する、αヘリックスF配列番号2のアミノ酸363~385に対応する、不定形ループ16配列番号2のアミノ酸386~390に対応する、αヘリックスG1配列番号2のアミノ酸391~395に対応する、不定形ループ17配列番号2のアミノ酸396~404に対応する、αヘリックスG2配列番号2のアミノ酸405~413に対応する、不定形ループ18配列番号2のアミノ酸414~421に対応する、αヘリックスH1配列番号2のアミノ酸422~428に対応する、不定形ループ19配列番号2のアミノ酸429~431に対応する、αヘリックスH2配列番号2のアミノ酸432~447に対応する、不定形ループ20配列番号2のアミノ酸448~450に対応する、αヘリックスH3配列番号2のアミノ酸451~455に対応する、不定形ループ21配列番号2のアミノ酸456~461に対応する、αヘリックスa-1配列番号2のアミノ酸462~470に対応する、不定形ループ22配列番号2のアミノ酸471~473に対応する、αヘリックスI配列番号2のアミノ酸474~495に対応する、不定形ループ23配列番号2のアミノ酸496~508に対応する、αヘリックスJ配列番号2のアミノ酸509~521に対応する、J-Kループ配列番号2のアミノ酸522~534に対応する、αヘリックスK配列番号2のアミノ酸535~541に対応する、および/または不定形ループ25配列番号2のアミノ酸542~548に対応するなどの構造ドメイン中に1つまたは複数の改変を含有する。本明細書において別の場所に記載されるように、ドメインまたは構造ドメインにおける改変は、別のテルペンシンターゼに由来する対応する異種残基の置換によってであり得る。バレンセンシンターゼ活性を保持するために、改変は、通常、変化に対してあまり寛容でない位置では行われない。このような位置は、FPPからのバレンセンの触媒および/または基質結合にとって必要であるドメインまたは領域内にあり得る。一部の例では、位置は、金属結合性アスパラギン酸リッチモチーフDDxxDなどの高度に保存されている領域中にある。例えば、実施例3.Cにおいて実証されるように、第1の金属結合性アスパラギン酸リッチモチーフの一部であるか、またはそれに隣接する、配列番号2の位置301、302、303、305および306に対応する位置ならびに第2のアスパラギン酸リッチな領域の一部である位置445、446および449に対応する位置は、一般に、改変に対してあまり寛容ではなく、通常、バレンセンシンターゼ活性が低下したポリペプチドとなる。同様に、基質結合ポケットの形成に関与している可能性が高い、配列番号2の267、269、270、271、273、295、298、441および442に対応する位置も、一般に、改変に対してあまり寛容ではなく、通常、バレンセンシンターゼ活性が低下したポリペプチドとなる。実施例3.Cにおいて、変化に対してあまり寛容ではないと示されているその他の位置として、それだけには限らないが、配列番号2の位置8、9、178、203、277、287、312、394、398、401、402、403、404、407、408、454および457に対応する位置が挙げられる。したがって、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド、特に、バレンセン収量の増大を示し、配列番号2のアミノ酸残基8、9、178、203、267、269、270、271、273、277、287、295、298、301、302、303、305、306、312、394、398、401、402、403、404、407、408、441、442、445、446、449、454および457のいずれかで改変単数または複数例えば、アミノ酸置換replacementまたは置換substitutionを含有しない改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。一部の例では、変化に対してあまり寛容ではない可能性が高いその他の位置として、例えば、位置20、264、266、376、436、448、512、515、516、519、520、527、528および529を挙げることができる米国特許公開番号US20100216186。一部の例では、バレンセン収量が増大した本明細書において提供された改変バレンセンシンターゼは、通常、配列番号2の位置20、178、203、264、266、267、269、270、271、273、277、287、295、298、301、302、303、305、306、312、376、394、398、401、402、403、404、407、408、436、441、442、445、446、448、449、454、457、512、515、516、519、520、527、528および529に対応する位置のいずれかに改変を含有しない。これは単に指針であって、これらの位置の改変は、一般に、野生型バレンセンシンターゼと比較して、活性の低下したバレンセンシンターゼをもたらすものの、このような改変が、本明細書において提供された改変バレンセンシンターゼのいずれかの中に含まれる場合があるということは理解される。例えば、当業者ならば、保存的アミノ酸置換、例えば、表2に提供されるものを使用して、野生型バレンセンシンターゼと比較した、FPPから生成されるバレンセンの量の低減などの活性の低下をもたらす改変の可能性を低減することができることは理解している。また、一部の例では、改変が、別のシンターゼポリペプチドの対応するドメインに示されるアミノ酸とのドメインスワップによるものである場合には、改変をこれらの位置のいずれか1つで行うことができる。したがって、例えば、アミノ酸置換replacementまたは置換substitutionによって改変され得る例示的位置として、それだけには限らないが、配列番号2に示されるアミノ酸位置に関するCVS番号付けによって、位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、50、53、54、55、56、57、58、60、62、69、77、78、82、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、111、113、114、116、117、118、120、121、122、124、125、127、129、130、132、135、136、138、139、141、142、144、146、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、162、163、165、166、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、187、188、189、190、191、193、194、195、196、197、198、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、227、228、229、238、252、257、263、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、305、306、307、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、329、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、375、377、378、380、381、382、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、422、423、424、428、429、434、435、436、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、451、452、454、457、465、468、473、474、484、492、495、496、499、500、501、506、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、536および/または539に対応する位置が挙げられる。改変のためのこれらの位置は、単に例示的なものである。バレンセンシンターゼポリペプチド中の多数のその他の位置が、FPPからバレンセンを生成するポリペプチドの能力に悪影響を及ぼすことなく改変され得ることは理解される。例えば、不定形ループ中のその他の位置不定形ループ1から25のいずれかを含むは、バレンセン生成に悪影響を及ぼすことなく改変され得る。改変は、アミノ酸置換、挿入または欠失であり得る。通常、改変は、アミノ酸置換であり、これは表2に示されるものなどの保存的置換である場合も、非保存的置換である場合もある。当業者ならば、一般に、保存的アミノ酸置換は、野生型バレンセンシンターゼと比較して、FPPから生成されるバレンセンの量の低下など、活性に悪影響を及ぼす改変の可能性を低減するということは理解している。反対に、非保存的置換は、一般に、活性に影響を及ぼし、それによって野生型バレンセンシンターゼと比較した、FPPから生成されるバレンセンの量の増大または低減をもたらす可能性がより高い。FPPからのバレンセンの生成の増大をもたらす改変は、本明細書に記載され、当技術分野で周知のアッセイを使用して同定でき、したがって、FPPからバレンセンを生成する能力の改善された改変バレンセンシンターゼポリペプチドの同定が可能となる。提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得る例示的アミノ酸置換substitutionsまたは置換replacementsとして、それだけには限らないが、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによってM1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S2N、S2C、S2G、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3P、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、G4Q、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、E5V、E5R、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、T6I、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、F7N、F7D、F7E、F7V、T10V、A11T、D12N、S16N、L17I、R19K、R19P、R19G、N20D、H21Q、L23I、L23S、K24A、K24Q、K24Y、K24T、G25Y、A26T、S27P、D28G、D28E、F29D、D33T、H34R、T35A、A36C、T37K、Q38V、Q38A、Q38N、Q38E、R40Q、H41I、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、A85M、I86L、Q87D、K88Q、K88A、K88H、L89I、C90Y、P91N、I92Y、I92N、I92S、Y93H、Y93F、Y93F、I94E、I94H、D95A、S96H、S96C、N97D、N97E、R98K、R98Y、R98D、A99N、A99M、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、I116Y、K117T、V122I、E124N、K125A、K125Q、K127T、D129E、E130R、R132G、S135E、S136A、N139S、Q142R、S146G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、Q178A、D179P、V181L、T182K、P183S、K184R、K184P、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、M212I、M212S、M212V、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、I213Y、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、N214Y、N214Q、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、S215D、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、T216K、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、S217E、S217D、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、D218E、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、H219G、H219Q、H219A、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、L220F、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、Y221H、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、L399S、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506S、D536E、またはA539Vに対応するアミノ酸置換が挙げられる。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、列挙されたアミノ酸置換のうちいずれか1つまたは複数を、任意の組合せで、さらなる改変を伴ってか、または伴わずに含有し得る。一般に、改変されたポリペプチドが、それだけには限らないが、FPP、GPPおよびGGPPを含めた任意の適した非環式ピロリン酸テルペン前駆体からバレンセンおよび/またはその他のテルペンの形成を触媒する能力を保持する限り、当業者によって、本明細書において提供された複数の改変を組み合わせることができる。通常、得られた改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、野生型バレンセンシンターゼと比較して、同様のまたは増大したFPPからのバレンセン生成を示す。一部の例では、得られた改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、野生型バレンセンシンターゼと比較して、FPPからのバレンセン生成の低減を示す。また、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。特定の例では、核酸配列は、例えば、コードされる配列の発現レベルを増大するよう最適化されたコドンであり得る。特定のコドン利用は、改変されたポリペプチドが発現される宿主生物に応じて変わる。当業者ならば、例えば、大腸菌E.coliまたはサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeを含めた細菌または酵母における発現に最適なコドンに精通している。例えば、コドン利用情報は、kazusa.or.jp.codonで入手可能であるCodonUsageDatabaseから入手可能であるデータベースの説明については、RichmondGenomeBiology1241参照のこと。また、ForsburgYeast1010451047BrownetalNucleicAcidsResearch194298SharpetalNucleicAcidsRes1282078211SharpetalYeast,65778も参照のこと。本明細書における例では、本明細書において提供される核酸配列は、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeにおけるコドン利用に基づいて最適化されたコドンである。本明細書において提供される改変されたポリペプチドおよびコーディング核酸分子は、当業者に公知の標準組換えDNA技術によって生成できる。標的タンパク質中の任意の1個または複数のアミノ酸の突然変異を達成するための当技術分野で公知の任意の方法を使用してもよい。方法として、コーディング核酸分子の標準的な部位特異的またはランダム突然変異誘発または固相ポリペプチド合成法が挙げられる。例えば、本明細書に記載されるように、バレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子は、コーディング核酸のエラープローンPCRによるランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、オーバーラップPCR、遺伝子シャッフリングまたはその他の組換え法などの突然変異誘発に付すことができる。次いで、ポリペプチドをコードする核酸を、異種的に発現される宿主細胞中に導入することができる。したがって、また、本明細書において提供される改変されたポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子も、本明細書において提供される。一部の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、固相または溶液相ペプチド合成を使用するなどの合成によって生成される。本明細書において提供された、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、バレンセンシンターゼ活性を示す。コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、以下に記載される任意のものなどの適当なアッセイ同一条件下において試験された場合に、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、FPPからおよそ同じ量または増大した量またはそれ以上のバレンセンを生成できる。例えば、本明細書において提供された改変バレンセンポリペプチドは、一般に、配列番号2で生成される野生型バレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量と比較して、FPPからのバレンセンの量の少なくとも40、例えば、量の少なくとも45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115または120を生成する。通常、本明細書において提供された、改変されたポリペプチドは、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼによる生成と比較して、FPPからのバレンセンの増大した生成を示す。例えば、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、適当なアッセイ同一条件下において試験された場合に、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、FPPからより多くのmoreまたはより多くのgreaterまたは増大したバレンセンを生成する。一部の例では、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2で生成される野生型バレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量と比較して、FPPからのバレンセンの量の110~5000、例えば、150~2000など、150~1000、500~2000または200~500など、その量を超えるものを生成できる。例えば、本明細書において提供された、改変バレンセンポリペプチドは、FPPからバレンセンを、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量より少なくともまたは少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、500またはそれ以上増大している量で生成する。バレンセン生成における10の増大またはそれより多いバレンセン生成は、例えば、改変されたポリペプチドによって生成されるバレンセンのレベルが、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼによって生成されるバレンセンのレベルの110または約110であることを意味するということは理解される。生成されるバレンセンの増大倍数としては、本明細書において提供された、改変バレンセンポリペプチドは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量の少なくとも1.1倍、一般に、少なくとも1.5倍または少なくとも2倍を生成する。例えば、本明細書において提供された、改変バレンセンポリペプチドは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量の、少なくともまたはおよそ少なくともまたは1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍.1.7倍、1.8倍、1.9倍.、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍またはそれ以上の量を生成する。本明細書における記載に基づいて、野生型バレンセンシンターゼから生成されるより多くのバレンセンを生成する改変されたバレンセンシンターゼを同定することは、当業者のレベル内にある。例えば、本明細書に記載されるように、野生型バレンセンシンターゼによる生成と比較して、FPPからのバレンセンの増大した生成をもたらす改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを選択できる。これは、本明細書における実施例において例示されている。例えば、実施例3は、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする突然変異体バレンセンシンターゼ核酸分子の作製および野生型遺伝子を含有するものと比較して、上昇したレベルのバレンセンを生成した形質転換体の選択を記載する。選択した形質転換体から得たDNAを配列決定して、増大した特性を付与した、コードされる変異体バレンセンシンターゼにおけるアミノ酸変化単数または複数を調べた。本明細書に記載されたように変更された特性を有するものを選択するように、突然変異体を作製しスクリーニングすることは当業者のレベルの範囲内である。節Fには、例えば、バレンセンまたはヌートカトンの生成を含めた種々の特性および活性を評価するためのアッセイが記載されている。一部の例では、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、野生型バレンセンシンターゼと比較して、変更された基質特異性および/または生成物選択性、および/または変更された生成物分布すなわち、テルペンの変更された相対量および/または種類を示す。その他の例では、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号3V18または配列番号4V19に示される変異体バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、変更された基質特異性および/または生成物選択性および/または変更された生成物分布すなわち、テルペンの変更された相対量および/または種類を示す。野生型バレンセンシンターゼによって生成されたテルペンの生成物分布は、バレンセンならびに例えば、β-セリネン、τ-セリネン、エレモフィロン、7-エピ-α-セリネン、ゲルマクレンAおよびβ-エレメンを含めたいくつかのその他のテルペン生成物例えば、テルペン副生成物またはそれに由来する生成物を含む。本明細書において実施例8に記載されるように、野生型バレンセンシンターゼによって生成される総テルペンのパーセンテージとしてのテルペン生成物分布の割合は、配列番号3または配列番号4に示される変異体バレンセンシンターゼポリペプチドと同様である。本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、テルペン生成物の総パーセンテージとして、より大きなパーセンテージのバレンセンが生成され、低減したパーセンテージの別のテルペン生成物単数または複数例えば、テルペン副生成物単数または複数またはそれに由来する生成物が生成されるよう変更された生成物分布を示すものを含む。例えば、生成されるテルペンの総量のパーセンテージとして、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼによって生成されるものよりも大きなパーセンテージのバレンセンを生成する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。総テルペンのパーセンテージとして、生成されるバレンセンの量は、0.01~90、例えば、1~10、例えば、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80もしくは90より多く、または約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80もしくは90増大される。一部の例では、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、バレンセン以外のテルペン生成物を、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼまたは配列番号3または4に示される変異体バレンセンシンターゼポリペプチドが生成するものよりも総テルペンのパーセンテージとして少なく生成する。バレンセン以外の生成物のパーセンテージは、0.01~90、1~80、5~80、10~60もしくは0.01~20より多くまたは約0.01~90、1~80、5~80、10~60もしくは0.01~20または0.01~90、1~80、5~80、10~60もしくは0.01~20、例えば、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90もしくはそれ以上より多くまたは約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90もしくはそれ以上、低減され得る。例えば、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、生成される総テルペンのパーセンテージとして、配列番号2、3または4に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドが生成するものよりも低減したパーセンテージのβ-エレメンを生成する。生成される総テルペンのパーセンテージとして、β-エレメンのパーセンテージは、0.01~50より多くまたは約0.01~50または0.01~50すなわち、0.01~50のβ-エレメンの量の減少、0.01~20、例えば、1~10、低減され得る、例えば、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40もしくは50より多くまたは約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40もしくは50低減される。本明細書において、また実施例8における記載に基づいて、このような改変されたバレンセンシンターゼを同定することは当業者のレベルの範囲内である。変更された生成物分布、例えば、β-エレメンの低減された形成を示すこのような改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの例示は、以下の節C.3に示されている。本明細書において提供される改変バレンセンポリペプチドはまた、その他の活性および/または特性を示し得る。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、例えば、増大した触媒活性、増大した基質例えば、FPP結合、増大した安定性および/または増大した宿主細胞における発現を示し得る。このような変更された活性および特性は、FPPからの増大したバレンセン生成をもたらし得る。その他の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、任意の適した基質、例えば、FPP、GPP、GGPPなどからのバレンセン以外のテルペンの形成を触媒し得る。例えば、改変されたバレンセンシンターゼは、1種もしくは複数のモノテルペンもしくはジテルペンまたはバレンセン以外の1種もしくは複数のセスキテルペンを生成し得る。一般に、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、任意のその他のテルペンよりも多くのバレンセンを生成する。以下の小節では、本明細書において提供される例示的な改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびコーディング核酸分子が記載される。1.改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド-例示的アミノ酸置換バレンセンシンターゼポリペプチド中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有し、バレンセンシンターゼ活性を示す改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しないバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、および/または配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、50~5000、例えば、50~120、100~500または110~250のFPPからのバレンセン生成を示し得る。通常、本明細書において提供された、改変バレンセンポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しないバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、例えば、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼと比較して、増大したFPPからのバレンセン生成を示す。例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、同一条件下で配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼによってFPPから生成されるバレンセンの量の少なくともまたはおよそ少なくとも101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、200、250、300、350、400、500、1500、2000、3000、4000、5000である量で、FPPからバレンセンを生成し得る。例えば、バレンセン生成は、少なくともまたはおよそ少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍またはそれ以上増大される。特定の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、バレンセン生成の増大と関連していると同定されている1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含有する。このような位置は、バレンセン生成の増大をもたらす位置を同定するための、突然変異誘発および選択またはスクリーニング法を使用して同定できる。例えば、本明細書において、実施例3に記載されるように、バレンセンシンターゼ突然変異体およびコーディング核酸を、エラープローンPCRによって作製し、スクリーニングして、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼによって生成されるバレンセンと比較して、バレンセンのレベルの上昇をもたらすものを同定した。このような突然変異の組合せを含有するとして作製された変異体V18およびV19は、野生型と比較して、バレンセンの少なくとも10倍多い生成を示す実施例3Bを参照のこと。さらなる例示的突然変異体は、V18およびV19および/または配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、増大したバレンセン生成を示す実施例に記載されている。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、少なくともまたは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、59、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115またはそれ以上のアミノ酸置換を含有し得る。挿入または欠失などのさらなる改変も含まれ得る。改変されたポリペプチドは、一般に、少なくとも29のアミノ酸置換を含有する。アミノ酸置換は、配列番号2、289~291、346、347、752、882もしくは883のいずれかまたはその任意の変異体に示されるバレンセンシンターゼにおいてであり得る。例えば、置換は、任意の柑橘類バレンセンシンターゼポリペプチド、例えば、配列番号2、289~291、752もしくは886またはその変異体のいずれかに示されるいずれかにおいてであり得る。上記のように、本明細書における例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼに対して、95未満の配列同一性、例えば、62~94.9の間またはおよそその間の配列同一性を示し、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくとも75の配列同一性および80、81、82、83、85、85、86、87、88、89、90、91、92、93または94未満の配列同一性を含有し得る。例えば、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼに対して、少なくとも82または約82および95未満の配列同一性を示す。例えば、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2のバレンセンシンターゼの位置1、2、3、4、5、6、7、11、19、20、23、24、28、38、50、53、54、55、56、57、58、60、62、69、78、82、88、93、97、98、102、106、111、113、125、132、152、153、159、163、173、184、188、189、200、202、209、210、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、227、238、252、257、274、279、280、281、282、283、284、292、297、299、307、310、311、313、314、315、316、317、318、319、320、321、323、324、325、326、333、336、337、343、345、347、348、350、357、360、361、362、367、369、370、371、375、377、387、397、399、405、409、410、424、429、436、439、448、465、468、473、474、484、492、495、499、500、501、506、536または539に対応する1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換replacement置換substitutionを含有する。例えば、本明細書において提供された改変バレンセンポリペプチドは、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼに関するCVS番号付けによって、位置M1、S2、S3、G4、E5、T6、F7、A11、R19、N20、L23、K24、D28、Q38、R50、T53、D54、A55、E56、D57、K58、V60、K62、V69、F78、I82、K88、Y93、N97、R98、H102、L106、L111、Q113、K125、R132、Y152、M153、H159、E163、K173、K184、Q188、I189、T200、P202、F209、M210、M212、I213、N214、S215、T216、S217、D218、H219、L220、Y221、N227、E238、K252、T257、D274、F279、E280、P281、Q282、Y283、A284、Q292、N297、I299、Y307、L310、E311、L313、S314、L315、F316、T317、E318、A319、V320、Q321、W323、N324、I325、E326、E333、K336、L337、L343、A345、N347、E348、E350、G357、H360、C361、V362、E367、N369、Q370、K371、A375、S377、Y387、I397、L399、T405、T409、N410、F424、N429、V439、A436、Q448、C465、K468、S473、K474、E484、I492、E495、K499、P500、T501、P506、D536またはA539に対応する1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換replacement置換substitutionを含有する。本明細書において記載された任意のアミノ酸置換は、例えば、配列番号2、289~291、752もしくは886のいずれかに示されるバレンセンシンターゼポリペプチドまたはその変異体を含めた、その他のバレンセンシンターゼポリペプチド中の対応する位置にある天然または内因性残基に行うことができるということは理解される。対応する位置およびアミノ酸置換は、図1に表されるような配列番号2とのアラインメントによって決定できる。任意のアミノ酸残基を使用して、その位置の天然または内因性残基を置換できる。通常、アミノ酸残基は、酵素活性を低減または排除しないものである。一部の例では、アミノ酸置換は、表2に示される置換などの保存的置換である。その他の例では、アミノ酸置換は、保存的置換ではない。例えば、アミノ酸は、アルギニンR、リシンK、グルタミンQ、グルタミン酸E、プロリンP、トレオニンT、ロイシンL、ヒスチジンH、アスパラギン酸D、グリシンG、イソロイシンI、バリンV、アラニンA、アスパラギンN、セリンS、システインC、フェニルアラニンF、メチオニンM、チロシンYまたはトリプトファンWによって置換され得る。提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得る例示的アミノ酸置換substitutionsまたは置換replacementsとして、それだけには限らないが、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによって、M1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、A11T、R19K、R19P、N20D、L23S、K24A、K24Q、K24Y、D28G、Q38V、Q38A、Q38N、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、K88Q、K88A、Y93H、N97D、R98K、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、K125A、K125Q、R132G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、K184R、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、L399S、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506SD536EまたはA539Vが挙げられる。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、列挙されたアミノ酸置換のうち任意の1つまたは複数を、任意の組合せで、さらなる改変を伴ってか、または伴わずに含有し得る。一部の例では、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2に示される位置に関して、位置60、97、209、212、214、221、238、292、333、345、369、405、429、473および/または536に対応する1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含有する。例えば、提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに含まれ得るアミノ酸置換substitutionsまたは置換replacementsとして、それだけには限らないが、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによって、V60I、V60G、N97D、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、E238D、Q292K、N97D、E333D、A345V、A345T、N369I、T405R、N429S、N429G、S473Y、および/またはD536Eが挙げられる。その他のアミノ酸置換もまた、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得る。例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2に示される位置に関して、位置24、38、58、60、88、93、97、98、125、173、184、209、212、214、219、221、238、252、292、321、333、345、369、377、405、429、436、501および/または536に対応する1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含有する。本明細書において実施例3に記載されるように、このようなアミノ酸位置は、突然変異誘発のための標的にされる残基であると経験的にか、またはモデリングによって同定される。例えば、残基は、表面残基として位置している、および/または寛容である例えば、酵素活性に対して中立的効果を有するか、もしくは改善されたバレンセン生成をもたらすのいずれかであると同定される。例えば、提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得るアミノ酸置換substitutionsまたはreplacementsとして、それだけには限らないが、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによって、K24A、K24Q、D28G、Q38V、Q38A、Q38N、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K88Q、K88A、Y93H、N97D、R98K、K125A、K125Q、K173E、K173Q、K173A、K184R、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、N227S、E238D、K252Q、Q292K、Q321A、E333D、A345V、A345T、N369I、S377Y、T405R、N429S、N429G、A436S、T501P、および/またはD536Eが挙げられる。本明細書における一部の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、位置60、209、238および292にアミノ酸置換を含有する。例えば、提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得るアミノ酸置換substitutionsまたは置換replacementsとして、それだけには限らないが、各々、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによって、位置V60での置換、例えば、アミノ酸置換V60IまたはV60G;位置F209での置換、例えば、アミノ酸置換F209I、F209H、F209E、F209L、F209T;位置E238での置換、例えば、アミノ酸置換E238D;および位置Q292での置換、例えば、アミノ酸置換Q292Kが挙げられる。本明細書におけるその他の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、位置60、125、173、209、238、252および292にアミノ酸置換を含有する。例えば、提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得るアミノ酸置換substitutionsまたは置換replacementsとして、それだけには限らないが、各々、配列番号2に示される位置に関して、位置V60での置換、例えば、アミノ酸置換V60IまたはV60G;位置K125での置換、例えば、アミノ酸置換K125AまたはK125Q;位置K173での置換、例えば、アミノ酸置換K173E、K173QまたはK173A;位置F209での置換、例えば、アミノ酸置換F209I、F209H、F209E、F209L、F209T;位置E238での置換、例えば、アミノ酸置換E238D;位置K252での置換、例えば、アミノ酸置換K252Q;および位置Q292での置換、例えば、アミノ酸置換Q292Kが挙げられる。表3は、配列番号2に示されるようなバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸位置に対応する同定された位置の例示的アミノ酸置換の限定されない例を提供する。これらの中には、例示的な単一のおよび組み合わせた突然変異が含まれる。このような突然変異に関して、第1のアミノ酸1文字略語は、置換されているアミノ酸に対応し、数字は、配列番号2に関するバレンセンシンターゼポリペプチド配列中の位置に対応し、第2のアミノ酸1文字略語は、その位置の第1のアミノ酸を置換する選択されたアミノ酸に対応する。これらの突然変異は、例えば、配列番号2、289~291、752もしくは886に示される野生型バレンセンシンターゼまたはそれらの変異体を含めた任意のバレンセンシンターゼ中に組み込むことができる。一部の例では、改変が、配列番号2に示されるバレンセンシンターゼ中に組み込まれる。これは、表中に提供された例示的バレンセンシンターゼ突然変異体およびコーディング核酸分子をもたらす。また、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの例示的アミノ酸配列およびコーディング核酸配列を示す配列識別子配列番号も提供される。2.ドメインスワップその中の1つまたは複数のoneofmoreドメインまたは領域のアミノ酸残基またはその一部の欠失およびアミノ酸の異種配列の挿入によるスワップ欠失および挿入を含有するキメラポリペプチドである、改変テルペンシンターゼポリペプチド、特に、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが本明細書において提供される。一部の例では、異種配列は、アミノ酸のランダム化された配列である。その他の例では、異種配列は、別のテルペンシンターゼポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその一部のアミノ酸の連続配列である。置換または挿入される異種配列は、一般に、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個またはそれ以上のアミノ酸を含む。異種配列が、別のテルペンシンターゼの対応するドメインまたはその一部に由来する例では、異種配列は、一般に、対応するドメインもしくは領域または一部の少なくとも50、60、70、80、90、95またはそれ以上の連続するアミノ酸を含む。このような一例では、異種の対応するドメインもしくは領域またはその一部に隣接する残基もまた、本明細書において提供された改変バレンセンポリペプチド中に含まれ得る。本明細書において提供されたスワップ突然変異体の一例では、バレンセンシンターゼポリペプチドの少なくとも1つのドメインもしくは領域またはその一部が、別のテルペンシンターゼポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその一部のアミノ酸の連続する配列で置換される。一部の例では、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のドメインもしくは領域またはその一部が、別のテルペンシンターゼポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその一部のアミノ酸の連続する配列で置換される。バレンセンシンターゼポリペプチドの任意のドメインもしくは領域またはその一部が、アミノ酸の異種配列、例えば、別のテルペンに由来する対応するドメインまたは領域に由来する異種配列で置換され得る。ドメインまたは領域は、構造ドメインである場合も、機能性ドメインである場合もある。当業者ならば、テルペンシンターゼ中のドメインまたは領域に精通している。機能性ドメインとして、例えば、触媒ドメインまたはその一部が挙げられる。機能性ドメインとしてまた、基質特異性および生成物分布と関連していると同定された機能性ドメイン、例えば、アリストロチェン特異的ドメイン、比率決定ドメイン、ベチスピラジエンVestispiradiene特異的ドメイン、基質結合ドメインまたはヒヨス属特異的ドメインまたはその他のシンターゼ中のその他の類似のドメインなどを挙げることができる例えば、米国特許第5,824,774号参照のこと。構造ドメインは、不定形ループ1、αヘリックス1、不定形ループ2、αヘリックス2、不定形ループ3、αヘリックス3、不定形ループ4、αヘリックス4、不定形ループ5、αヘリックス5、不定形ループ6、αヘリックス6、不定形ループ7、αヘリックス7、不定形ループ8、αヘリックス8、不定形ループ9、αヘリックスA、A-Cループ、αヘリックスC、不定形ループ11、αヘリックスD、不定形ループ12、αヘリックスD1、不定形ループ、αヘリックスD2、不定形ループ14、αヘリックスE、不定形ループ15、αヘリックスF、不定形ループ16、αヘリックスG1、不定形ループ17、αヘリックスG2、不定形ループ18、αヘリックスH1、不定形ループ19、αヘリックスH2、不定形ループ20、αヘリックスH3、不定形ループ21、αヘリックスa-1、不定形ループ22、αヘリックスI、不定形ループ23、αヘリックスJ、J-Kループ、αヘリックスKおよび/または不定形ループ25のすべてまたは一部を含み得る例えば、図2参照のこと。当業者ならば、種々のテルペンシンターゼに精通しており、対応するドメインもしくは領域またはそのアミノ酸の一部を同定できる。以下の表5Bは、例示的テルペンシンターゼの配列を示す。本明細書における特定の例では、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドドメインスワップ突然変異体は、ブドウVitisviniferaバレンセンシンターゼ配列番号346および347、タバコ5-エピ-アリストロチェンシンターゼTEAS;配列番号295または941またはヒオシアムスムチクスHyoscyamusmuticusプレムナスピロジエンシンターゼHPS;配列番号296または942であるテルペンシンターゼポリペプチドの対応するドメインもしくは領域またはその一部に由来する異種配列を含有する。通常、得られた改変されたバレンセンシンターゼは、バレンセンシンターゼ活性およびFPPからバレンセンを生成する能力を示す。例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、改変例えば、ドメインまたは領域のアミノ酸残基のアミノ酸置換またはスワップを含有しないバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、および/または配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、50~5000、例えば、50~120、100~500または110~250のFPPからのバレンセン生成を示す。通常、本明細書における実施例において実証されるように、改変バレンセンポリペプチドは、改変を含有しないバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、例えば、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼと比較して、増大したFPPからのバレンセン生成を示す。例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、同一条件下で、改変を含有しない野生型バレンセンシンターゼによるFPPから生成されるバレンセンの量の、少なくともまたは約101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、200、250、300、350、400、500、1500、2000、3000、4000、5000である量で、FPPからバレンセンを生成できる。例えば、バレンセン生成は、少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍またはそれ以上増大される。本明細書における特定の例では、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、1つまたは複数の構造ドメインのすべてまたは一部が、別のテルペンポリペプチドの対応する構造ドメインで置換されているスワップ突然変異体である。以下の表4Aは、それぞれ、TEASまたはCVSを用いるシンターゼのアラインメントに基づいた、すべてのテルペンシンターゼに対する一般的な番号付けスキームである、TEAS番号付けまたはCVS番号付けに基づいた番号付けを用いて構造ドメインを同定する例えば、図4参照のこと。したがって、その他のテルペンシンターゼ中の対応するドメインを同定できる。本明細書において図2は、例示的テルペンシンターゼ中の構造ドメインおよび領域ならびに各々の対応するアミノ酸残基をさらに表す。表4Bは、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドにおいて置換される例示的構造ドメイン単数または複数またはその一部を示し、また、その他のテルペンシンターゼに由来する例示的な対応する置換残基を同定する。バレンセンシンターゼ中の以下のドメインもしくは領域またはその一部のいずれも、それだけには限らないが、ブドウVitisviniferaバレンセンシンターゼ配列番号346および347、TEAS配列番号295および941またはHPS配列番号296および942を含めた別のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され得る。例えば、本明細書において提供された改変バレンセンポリペプチドでは、バレンセンシンターゼの不定形ループ1およびαヘリックス1配列番号2のアミノ酸3~41に対応するの部分の1つまたは複数が、ブドウVitisviniferaに由来する対応する領域配列番号346のアミノ酸3~51に対応するで置換され得、バレンセンシンターゼの不定形ループ2配列番号2のアミノ酸53~58に対応するが、TEASに由来する対応する領域配列番号295または941のアミノ酸58~63に対応するで置換され得;αヘリックス3の部分配列番号2のアミノ酸85~89に対応するが、HPS配列番号942のアミノ酸残基93~97で置換され;αヘリックス3および不定形ループ4の部分配列番号2のアミノ酸85~99に対応するが、HPS配列番号942のアミノ酸残基93~110で置換され;バレンセンシンターゼの不定形ループ5および隣接する残基配列番号2のアミノ酸115~146に対応するが、ブドウVitisviniferaに由来する対応する領域配列番号346のアミノ酸128~159に対応するで置換され;不定形ループ6および隣接する残基配列番号2のアミノ酸152~163に対応するが、HPSに由来する対応する領域配列番号942のアミノ酸163~174に対応するで置換され;不定形ループ7配列番号2のアミノ酸174~184に対応するが、HPSに由来する対応する領域配列番号942のアミノ酸185~193に対応するで置換され;不定形ループ9および隣接する残基配列番号2のアミノ酸212~221に対応するが、HPSに由来する対応する領域配列番号942のアミノ酸221~228に対応するで置換され;αヘリックスD1配列番号2のアミノ酸310~322に対応するが、HPSに由来する対応する領域配列番号942のアミノ酸317~329に対応するで置換され;および/またはJ-Kループ配列番号2のアミノ酸522~534に対応するが、HPSに由来する対応する領域配列番号942のアミノ酸527~541に対応するで置換される。得られる改変は、アミノ酸挿入、欠失またはアミノ酸置換であり得る。例えば、例示的アミノ酸置換として、それだけには限らないが、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによって、S3T、G4Q、E5V、T6K、F7N、T10V、D12N、S16N、L17I、R19G、N20D、H21Q、L23I、K24T、G25Y、A26T、S27P、D28E、F29D、D33T、H34R、T35A、A36C、T37K、Q38E、R40Q、H41I、T53L、D54A、A55T、E56G、D57R、A85M、I86L、Q87D、K88H、L89I、C90Y、P91N、I92Y、I92N、I92S、Y93F、Y93F、I94E、I94H、D95A、S96H、S96C、N97E、R98Y、R98D、A99N、A99M、I116Y、K117T、V122I、E124N、K127T、D129E、E130R、S135E、S136A、N139S、Q142R、S146G、Q178A、D179P、V181L、T182K、P183S、K184P、M212I、M212S、M212V、I213Y、N214Y、N214Q、S215D、T216K、S217E、S217D、D218E、H219G、H219Q、H219A、L220F、Y221KまたはY221Hが挙げられる。例示的スワップ改変、すなわち、バレンセンシンターゼ中のドメインまたは領域の欠失および別のテルペンシンターゼに由来する対応するドメインまたは領域の異種アミノ酸の挿入が、表4Cに示されている。配列番号2に示されるバレンセンシンターゼ中の残基に対応する置換される欠失されるアミノ酸ならびにその他のテルペンシンターゼの対応するドメインまたは領域に由来する挿入されるアミノ酸が示されている。この表は、配列番号2に示されるCVS番号付けによってバレンセンシンターゼのアミノ酸位置を参照するが、対応するアミノ酸残基および領域を同定することによって、その他のバレンセンシンターゼにおいて、特に、その他の柑橘類由来バレンセンシンターゼにおいて、同様のスワップを行うことができるということは理解される例えば、図1および図2参照のこと。したがって、野生型バレンセンシンターゼ、例えば、配列番号2、289~291、346、347、752、882もしくは883またはその任意の変異体に示される任意のものにおいてこのような改変を行うことができる。例えば、上記の表3中に示される任意のバレンセンシンターゼポリペプチドにおいてスワップを行うことができる。例えば、配列番号3~66、68~127、348、723~731、734~742、746~751、810~832または857に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれかにおいて、上記のドメイン置換を行うことができる。一例では、配列番号4に示される改変されたシンターゼに、上記のドメイン置換を行う。キメラポリペプチドを作製するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して、第1のテルペンシンターゼのorドメインのすべてまたは連続する部分を、第2のシンターゼの対応するドメインのすべてまたは連続する部分で置換することができる。例えば、任意の2種のテルペンシンターゼの対応するドメインまたは領域を、当技術分野で公知の任意の適した組換え法を使用して、またはインビトロ合成によって交換できる。組換え法の例示として、実施例3.Dに記載されるものなどの2段階オーバーラップPCR法が挙げられる。このような方法では、第1のテルペンシンターゼ中の標的とされるドメインまたはその一部をコードする核酸中の複数のコドン位置に突然変異を導入するプライマーを使用でき、これでは、突然変異は一緒になって異種領域すなわち、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する領域を形成する。あるいは、例えば、ランダム化されたアミノ酸を用いて、特定のドメインまたは領域を置換できる。クローニングまたは組換え法におけるプライマーエラー、PCRエラーおよび/またはその他のエラーが、得られたスワップまたは置換された領域またはドメインが、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する領域と同一であるアミノ酸配列を示さないようなエラーをもたらし得ることは理解される。例示的なPCRに基づく方法では、第1段階のPCRは、i置換されている領域の下流とアニーリングする下流プライマー例えば、実施例5に記載されるプライマー7-10.4;配列番号339を、標的遺伝子中に移入される予定の領域の両端に位置する、交換またはランダム化される予定のドメインまたは領域の各々の側の相同配列のおよそ15のヌクレオチドまたはアニーリングを達成するのに有効な数、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25のヌクレオチドまたはそれ以上を含む変異原性プライマーとともに、ii置換されている領域の上流とアニーリングする上流プライマー例えば、実施例5に記載されるプライマー7-10.3;配列番号338を、同様に、標的遺伝子中に移入される予定の領域の両端に位置する交換またはランダム化される予定のドメインまたは領域の各々の側の相同配列のおよそ15のヌクレオチドまたはアニーリングを達成するのに有効な数、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25のヌクレオチドまたはそれ以上を含む反対の鎖の変異原性プライマーと一緒に使用する。第1のテルペンシンターゼ遺伝子のドメインまたは領域が、第2のテルペンシンターゼに由来する対応するドメインまたは領域で置換される置換が実施される場合には、第1のテルペンシンターゼに由来するそれぞれの両端に位置する領域の間の変異原性プライマー中のヌクレオチドは、第2のテルペンシンターゼの対応する領域のコドンを含有する。ドメインまたは領域中のアミノ酸がランダム化される例では、第1のテルペンシンターゼに由来するそれぞれの両端に位置する領域の間の変異原性プライマーのヌクレオチドは、ランダムヌクレオチドを含有する。次いで、オーバーラップPCRを実施し、上流および下流オリゴ例えば、プライマー7-10.3および7-10.4を使用して2つの断片を接続する。次いで、改変されたテルペンシンターゼの発現のために、得られたPCR産物を任意の適したベクター中にクローニングしてもよい。さらに、本明細書におけるスワップ突然変異を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれも、1つまたは複数のさらなるアミノ酸置換を含有し得る。提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得る例示的アミノ酸置換substitutionsまたは置換replacementsとして、それだけには限らないが、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによってM1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、A11T、R19K、R19P、N20D、L23S、K24A、K24Q、K24Y、D28G、Q38V、Q38A、Q38N、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、K88Q、K88A、Y93H、N97D、R98K、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、K125A、K125Q、R132G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、K184R、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、L399S、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506S、D536E、またはA539Vが挙げられる。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、本明細書において上記に記載されるスワップ改変に加えて、列挙されたアミノ酸置換のうち任意の1種または複数を、任意の組合せで含有し得る。以下の表5Aは、1つまたは複数のスワップ改変を含有する例示的な改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを示す。第1のアミノ酸1文字略語は、配列番号2に関するバレンセンシンターゼポリペプチド配列中の位置に対応するCVS番号付けを用いて置換されるアミノ酸に対応し、第2のアミノ酸1文字略語は、その位置の第1のアミノ酸を置換する選択されたアミノ酸に対応する。新規ドメインまたは領域のスワップおよび挿入によって、改変されたバレンセンシンターゼは、スワップを含有しない非改変バレンセンシンターゼと比較して、より多いか、またはより少ないアミノ酸を有し得るということは理解される。したがって、置換のためのアミノ酸番号付けは、変更され得る。本明細書における目的上、アミノ酸置換への言及は、CVS番号付けに関してである例えば、図4参照のこと。したがって、例えば、V239と表される突然変異体では、表5A中、F209→I210と表されるアミノ酸置換は、配列番号743に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに関して突然変異F210IまたはCVS番号付けによるF209Iを有する。また、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの例示的アミノ酸配列およびコーディング核酸配列を示す配列識別子配列番号も提供される。3.生成物分布突然変異体上記のように増大したバレンセン生成を達成することの代わりに、またはそれに加えて、本明細書において提供される改変バレンセンポリペプチドは、その他の変更された特性を示し得る。例えば、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼと比較して、変更された基質特異性および/または生成物選択性および/または変更された生成物分布すなわち、変更されたテルペンの相対量および/または種類を示す改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。その他の例では、配列番号3V18または配列番号4V19に示される変異体バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、変更された基質特異性および/または生成物選択性および/または変更された生成物分布すなわち、変更されたテルペンの相対量および/または種類を示す改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。このような改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、例えば、その他のテルペン生成物と比較してバレンセンの生成物分布を増大することによって、バレンセンの生成および/または作製を改善するための方法において使用され得る。これは、増大または改善した純度のバレンセン組成物、反応培地からのバレンセンの増大または改善した回収率および/またはバレンセンを単離する方法の容易さをもたらす方法をもたらし得る。また、これは、バレンセンの酸化による、ヌートカトンの増大した回収率ももたらす方法をもたらし得る。例えば、配列番号2、3または4に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドによる総テルペンのパーセンテージとしての、生成されるβ-エレメンと比較して、総テルペンのパーセンテージとして減少したβ-エレメンを生成する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。β-エレメンは、ゲルマクレンAの分解生成物であり、生成されるゲルマクレンAの尺度となる。したがってまた、配列番号2、3または4に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドによる総テルペンのパーセンテージとしての、生成されるゲルマクレンAと比較して、総テルペンのパーセンテージとして減少したゲルマクレンAを生成する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼによって生成されるものよりも、95、80、70、60、50、40、30、20、10またはそれより少ないレベルのβ-エレメン、ひいては、ゲルマクレンAを生成する。総テルペン生成物のパーセンテージとしてのβ-エレメン、ひいては、ゲルマクレンAのパーセンテージは、0.01~90、例えば、1~80、5~80、10~60もしくは0.01~20より多く、または約0.01~90、例えば、1~80、5~80、10~60もしくは0.01~20または0.01~90、例えば、1~80、5~80、10~60または0.01~20減少し得る。例えば、総テルペンのパーセンテージとしてのテルペンβ-エレメン生成物、ひいては、ゲルマクレンAのパーセンテージは、少なくともまたは少なくとも約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90もしくはそれ以上減少する。本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼは、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼと比較して、反応において生成される総テルペンのパーセンテージとして、増大または改善したバレンセンの生成をもたらす。生成または回収されるバレンセンの重量によるパーセンテージは、68を超える、例えば、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80もしくはそれ以上を超えるか、少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80もしくはそれ以上である。このような改変バレンセンポリペプチドの例示として、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによって、残基281、313、314、315、317、336、337および/または357に対応する位置にアミノ酸改変を含有するポリペプチドがある。例えば、アミノ酸置換は、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I、N347Lおよび/またはG357Rである上記の位置のいずれかでの置換であり得る。例示的アミノ酸置換substitution単数または複数または置換replacement単数または複数は、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによって、P281S、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I、N347Lおよび/またはG357Rに対応する。例えば、減少または低減したβ-エレメン形成を示す、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによって、P281S、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337IおよびG357Rに対応するアミノ酸置換substitutions置換replacementsを含有する。一部の例では、減少または低減したβ-エレメン形成を示す本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号2に示される位置に関するCVS番号付けによって、P281S、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I、N347LおよびG357Rに対応するアミノ酸置換substitutions置換replacementsを含有する。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、変更された生成物分布を示す限り、さらなるまたは追加のアミノ酸改変が含まれ得ることは理解される。例えば、変更された生成物分布および低減したβ-エレメン形成を示す例示的バレンセンシンターゼポリペプチドは、以下に示されるものを含む。したがって、例示的バレンセンシンターゼポリペプチドはまた、より少ないゲルマクレンAを生成する。例えば:K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/A345T/N347LG357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/N347L/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536EK24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/N347L/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;R19K/K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→R213/N214→D215/H219→D220/Y221→V222/E238→D239/K252→Q253/P281→S282/Q292→K293/L313→C314/S314→T315/L315→M316/T317→S318/Q321→A322/E333→D334/K336→R337/L337→I338/A345→T346/G357→R358/N369→I370/S377→Y378/T405→R406/N429→G430/A436→S437/E484→D485/T501→P502/D536→E537;および/またはS3T/G4Q/E5V/---→S6/---→A7/---→S8/---→S9/---→L10/---→A11/---→Q12/---→I13/---→P14/---→Q15/---→P16/T6→K17/F7→N18/T10→V21/D12→N23/S16→N27/L17→I28/R19→G30/N20→D31/H21→Q32/L23→I34/K24→T35/G25→Y36/A26→T37/S27→P38/D28→E39/F29→D40/T31→---/D33→T43/H34→R44/T35→A45/A36→C46/T37→K47/Q38→E48/R40→Q50/H41→I51/T53→L63/D54→A64/A55→T65/E56→G66/D57→R67/V60→I70/A85→M95/I86→L96/Q87→D97/K88→H98/L89→I99/C90→Y100/---→R101/---→A102/---→D103/I92→Y105/Y93→F106/I94→E107/D95→A108/S96→H109/N97→E110/R98→Y111/A99→N112/K125→Q138/K173→Q186/L175→---/V176→---/Q178→A189/D179→P190/V181→L192/T182→K193/P183→S194/K184→P195/F209→I220/M212→V223/I213→Y224/N214→---/S215→---/T216→Q225/S217→D226/D218→E227/H219→A228/L220→F229/Y221→H230/E238→D247/K252→Q261/P281→S290/Q292→K301/L313→C322/S314→T323/L315→M324/T317→S326/Q321→A330/E333→D342/K336→R345/L337→I346/A345→T354/G357→R366/N369→I378/S377→Y386/T405→R414/N429→G438/A436→S445/E484→D493/T501→P510/D536→E545。このようなポリペプチドの例示として、配列番号5、61、63、350、351、744または887に示される任意のもの、または配列番号130、197、198、352、353、714または891のいずれかに示される核酸の配列もしくはそれらの縮重コドンによってコードされる任意のものが挙げられる。D.改変されたテルペンシンターゼおよびコーディング核酸分子を生成する方法改変されたテルペンシンターゼポリペプチドを生成する方法が提供される。本方法を使用して、それだけには限らないが、FPP、GPPまたはGGPPなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体との反応の際の増大したテルペン生成、変更された生成物分布、変更された基質特異性および/または変更された位置選択性および/または立体選択性を含めた、所望の特性を有するテルペンシンターゼを作製できる。改変されたテルペンシンターゼは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して生成し、所望により、所望の特性についてスクリーニングできる。特定の例では、本明細書に例示される方法に従って突然変異によって所望の特性を有する改変されたテルペンシンターゼを作製する。したがって、本明細書に記載された方法を使用して生成される、改変されたテルペンシンターゼおよび改変されたテルペンシンターゼをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。本明細書において提供される方法の例示として、改変されたテルペンシンターゼが、第1のテルペンシンターゼの1つまたは複数の内因性ドメインまたは領域を、第2のテルペンシンターゼに由来する対応するドメイン単数または複数または領域単数または複数すなわち、異種ドメインまたは領域で置換することによって生成されるものがある。さらなる例では、第1のテルペンシンターゼの2以上の内因性ドメインまたは領域が、2以上のその他のテルペンシンターゼ、例えば、第2、第3、第4、第5,第6、第7、第8、第9または第10のテルペンシンターゼに由来する対応する異種ドメイン単数または複数または領域単数または複数で置換される。したがって、得られる改変されたテルペンシンターゼは、1、2、3、4、5、6、7、8、9種またはそれ以上の異なるテルペンシンターゼに由来する異種ドメインまたは領域を含み得る。さらなる例では、本方法はまた、または代わりに、第1のテルペンシンターゼの1以上のドメインまたは領域の、ランダム化されたアミノ酸残基との置換を含む。本明細書において提供される方法において、任意のテルペンシンターゼを使用できる。第1のテルペンシンターゼすなわち、改変される予定のテルペンシンターゼは、第2のまたは第3、第4、第5などテルペンシンターゼすなわち、異種ドメイン単数または複数または領域単数または複数が由来するテルペンシンターゼ単数または複数と同一または異なるクラスのものであり得る。例えば、改変される予定のテルペンシンターゼが、モノテルペン、ジテルペンまたはセスキテルペンシンターゼであり、1つまたは複数の異種ドメインまたは領域が由来するテルペンシンターゼ単数または複数が、モノテルペン、ジテルペンまたはセスキテルペンシンターゼであるものが、本明細書において提供される方法の中に含まれる。一部の例では、本明細書において提供される方法において使用されるテルペンシンターゼのすべてが、セスキテルペンシンターゼである。例示的セスキテルペンシンターゼとして、それだけには限らないが、バレンセンシンターゼ、TEAS、HPSおよびサンタレンシンターゼが挙げられる。本明細書における方法において使用できる例示的テルペンシンターゼは、その例示的アミノ酸および核酸配列を含めて、それだけには限らないが、表5Bに示される任意のものを含む。本明細書において提供される方法では、第1のテルペンシンターゼの内因性ドメインのすべてまたは連続する部分が、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する異種ドメインのすべてまたは連続する部分で置換され得る。例えば、第1のシンターゼ中のドメインまたは領域に由来する3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の連続するアミノ酸が、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する領域に由来する3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の連続するアミノ酸で置換されてもよい。一部の例では、第1のテルペンシンターゼの内因性ドメインに隣接する1個または複数のアミノ酸残基も置換され、および/または異種ドメインに隣接する1個または複数のアミノ酸残基も置換に使用される。さらに、本明細書において提供される方法はまた、第1のドメインのすべてまたは連続する部分および第2の隣接するドメインのすべてまたは連続する部分が、別のテルペンシンターゼに由来する対応するドメインまたはその一部で置換される方法も含む。置換され得るドメインまたは領域として、機能性ドメインまたは構造ドメインが挙げられる。本明細書に記載された方法を使用して、テルペンシンターゼ中の置換され得る例示的ドメインまたは領域として、それだけには限らないが、不定形ループ1配列番号2のアミノ酸1~29に対応する、αヘリックス1配列番号2のアミノ酸30~39および44~52に対応する、不定形ループ2配列番号2のアミノ酸53~58に対応する、αヘリックス2配列番号2のアミノ酸59~71に対応する、不定形ループ3配列番号2のアミノ酸72~78に対応する、αヘリックス3配列番号2のアミノ酸79~93に対応する、不定形ループ4配列番号2のアミノ酸94~100に対応する、αヘリックス4配列番号2のアミノ酸101~114に対応する、不定形ループ5配列番号2のアミノ酸115~141に対応する、αヘリックス5配列番号2のアミノ酸142~152に対応する、不定形ループ6配列番号2のアミノ酸153~162に対応する、αヘリックス6配列番号2のアミノ酸163~173に対応する、不定形ループ7配列番号2のアミノ酸174~184に対応する、αヘリックス7配列番号2のアミノ酸185~194に対応する、不定形ループ8配列番号2のアミノ酸195~201に対応する、αヘリックス8配列番号2のアミノ酸202~212に対応する、不定形ループ9配列番号2のアミノ酸213~222に対応する、αヘリックスA配列番号2のアミノ酸223~253に対応する、A-Cループ配列番号2のアミノ酸254~266に対応する、αヘリックスC配列番号2のアミノ酸267~276に対応する、不定形ループ11配列番号2のアミノ酸277~283に対応する、αヘリックスD配列番号2のアミノ酸284~305に対応する、不定形ループ12配列番号2のアミノ酸306~309に対応する、αヘリックスD1配列番号2のアミノ酸310~322に対応する、不定形ループ13配列番号2のアミノ酸323~328に対応する、αヘリックスD2配列番号2のアミノ酸329に対応する、不定形ループ14配列番号2のアミノ酸330~332に対応する、αヘリックスE配列番号2のアミノ酸333~351に対応する、不定形ループ15配列番号2のアミノ酸352~362に対応する、αヘリックスF配列番号2のアミノ酸363~385に対応する、不定形ループ16配列番号2のアミノ酸386~390に対応する、αヘリックスG1配列番号2のアミノ酸391~395に対応する、不定形ループ17配列番号2のアミノ酸396~404に対応する、αヘリックスG2配列番号2のアミノ酸405~413に対応する、不定形ループ18配列番号2のアミノ酸414~421に対応する、αヘリックスH1配列番号2のアミノ酸422~428に対応する、不定形ループ19配列番号2のアミノ酸429~431に対応する、αヘリックスH2配列番号2のアミノ酸432~447に対応する、不定形ループ20配列番号2のアミノ酸448~450に対応する、αヘリックスH3配列番号2のアミノ酸451~455に対応する、不定形ループ21配列番号2のアミノ酸456~461に対応する、αヘリックスa-1配列番号2のアミノ酸462~470に対応する、不定形ループ22配列番号2のアミノ酸471~473に対応する、αヘリックスI配列番号2のアミノ酸474~495に対応する、不定形ループ23配列番号2のアミノ酸496~508に対応する、αヘリックスJ配列番号2のアミノ酸509~521に対応する、J-Kループ配列番号2のアミノ酸522~534に対応する、αヘリックスK配列番号2のアミノ酸535~541に対応する、および不定形ループ25配列番号2のアミノ酸542~548に対応するに対応する構造ドメインまたは領域が挙げられる。これらのドメインまたは領域のうちいずれか1種または複数またはその一部は、本明細書において提供される方法を使用して別のテルペンシンターゼに由来する対応するドメインで置換され得る。これらのドメインは、当技術分野で周知の方法を使用して、例えば、当業者に公知の方法を使用するアラインメントなどによって、任意のテルペンシンターゼ中で同定できる領域である例えば、図2参照のこと。このような方法は、通常、マッチを最大にし、手作業によるアラインメントを使用することならびに利用可能な多数のアラインメントプログラム例えば、BLASTPおよび当業者に公知のその他のものを使用することによるなどの方法を含む。配列番号2に示されるバレンセンシンターゼの配列をアラインすることによって、任意のその他のテルペンシンターゼ、上記で列挙されたドメインまたは領域のいずれも、任意のテルペンシンターゼ中で同定できる。本明細書において提供される方法の一部の例では、第1のテルペンシンターゼ中のバレンセンシンターゼの不定形ループ1およびαヘリックス1の一部配列番号2のアミノ酸3~41に対応するに対応する領域が、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され;第1のテルペンシンターゼ中の不定形ループ2配列番号2のアミノ酸53~58に対応するに対応する領域が、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され;第1のテルペンシンターゼ中のαヘリックス3の一部配列番号2のアミノ酸85~89に対応するに対応する領域が、第2のテルペンシンターゼ中の対応する領域で置換され;第1のテルペンシンターゼ中のαヘリックス3および不定形ループ4の一部に対応する領域配列番号2のアミノ酸85~99に対応するが、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され;第1のテルペンシンターゼ中の不定形ループ6および隣接する残基配列番号2のアミノ酸152~163に対応するに対応する領域が、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され;第1のテルペンシンターゼ中の不定形ループ7配列番号2のアミノ酸174~184に対応するに対応する領域が、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され;第1のテルペンシンターゼ中の不定形ループ9および隣接する残基配列番号2のアミノ酸212~221に対応するに対応する領域が、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され;第1のテルペンシンターゼ中のαヘリックスD1配列番号2のアミノ酸310~322に対応するに対応する領域が、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され;および/または第1のテルペンシンターゼ中のJ-Kループ配列番号2のアミノ酸522~534に対応するに対応する領域が、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される。例えば、バレンセンシンターゼの不定形ループ1およびαヘリックス1の一部配列番号2のアミノ酸3~41に対応するが、配列番号346に示されるブドウVitisviniferaのアミノ酸3~51で置換される;第1のテルペンシンターゼの不定形ループ2配列番号2のアミノ酸53~58に対応するに対応する領域が、配列番号295または941に示されるTEASポリペプチドのアミノ酸58~63で置換される;αヘリックス3の一部配列番号2のアミノ酸85~89に対応するに対応する領域が、配列番号942に示されるHPSのアミノ酸残基93~97で置換される;第1のテルペンシンターゼのαヘリックス3および不定形ループ4の一部配列番号2のアミノ酸85~99に対応するに対応する領域が、配列番号942に示されるHPSのアミノ酸残基93~110で置換される;第1のテルペンシンターゼの不定形ループ6および隣接する残基配列番号2のアミノ酸152~163に対応するに対応する領域が、配列番号942に示されるHPSのアミノ酸163~174で置換される;第1のテルペンシンターゼの不定形ループ7配列番号2のアミノ酸174~184に対応するに対応する領域が、配列番号942に示されるHPSのアミノ酸185~193で置換される;第1のテルペンシンターゼの不定形ループ9および隣接する残基配列番号2のアミノ酸212~221に対応するに対応する領域が、配列番号942に示されるHPSのアミノ酸221~228で置換される;第1のテルペンシンターゼのαヘリックスD1配列番号2のアミノ酸310~322に対応するに対応する領域が、配列番号942に示されるHPSのアミノ酸317~329で置換される;および/または第1のテルペンシンターゼのJ-Kループ配列番号2のアミノ酸522~534に対応するが、配列番号942に示されるHPSのアミノ酸527~541で置換される方法が、本明細書において提供される。本明細書において提供される方法では、第1のテルペンシンターゼの内因性ドメインのすべてまたは連続する部分が、節C.2において上記で論じられるように当技術分野で公知の適した組換え法を使用して、第2のテルペンシンターゼに由来する対応する異種ドメインのすべてまたは連続する部分で置換され得る。E.改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびコーディング核酸分子の生成バレンセンシンターゼポリペプチドおよびその活性断片を含めたテルペンシンターゼポリペプチドおよびその活性断片は、組換えタンパク質作製および発現のための当技術分野で周知の方法によって得ることができる。このようなポリペプチドを使用して、シンターゼが発現される宿主細胞において、または、シンターゼの精製後に、インビトロで、FPP、GPPまたはGGPPなどの任意の適した非環式ピロリン酸テルペン前駆体からバレンセンを生成できる。所望の遺伝子をコードする核酸を同定するための当業者に公知の任意の方法を使用して、テルペンシンターゼ、例えば、バレンセンシンターゼをコードする核酸を得ることができる。例えば、非改変または野生型バレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、植物供給源、例えば、柑橘類例えば、オレンジまたはグレープフルーツから周知の方法を使用して得ることができる。次いで、本明細書に記載された任意の方法、例えば、エラープローンPCRによるコーディング核酸のランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、オーバーラップPCRまたはその他の組換え法を含めた、非改変または野生型バレンセンシンターゼに突然変異を導入するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して、改変バレンセンポリペプチドを操作することができる。次いで、ポリペプチドをコードする核酸を、異種的に発現される宿主細胞中に導入できる。一部の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めた本明細書において提供されるテルペンシンターゼが、固相または溶液相ペプチド合成などを使用して合成的に生成される。1.テルペンシンターゼをコードする核酸の単離バレンセンシンターゼなどのテルペンシンターゼをコードする核酸は、核酸分子をクローニングおよび単離するための当技術分野で公知の任意の利用可能な方法を使用してクローニングまたは単離できる。このような方法として、核酸のPCR増幅および核酸ハイブリダイゼーションスクリーニングを含めた、ライブラリーのスクリーニングが挙げられる。一部の例では、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCR法を含めた、核酸を増幅するための方法を使用して、バレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子を単離できる。核酸を含有する物質を、バレンセンシンターゼをコードする核酸分子がそれから単離され得る出発物質として使用できる。例えば、それだけには限らないが、オレンジスイートオレンジCitrussinensisおよびグレープフルーツCitrusparadisiを含めた柑橘類果実から得たDNAおよびmRNA調製物を使用して、バレンセンシンターゼ遺伝子を得ることができる。核酸ライブラリーも、出発物質の供給源として使用できる。プライマーは、バレンセンシンターゼをコードする分子などのテルペンシンターゼをコードする分子を増幅するよう設計できる。例えば、プライマーを、テルペンシンターゼ、例えば、バレンセンシンターゼをコードする公知の核酸配列、例えば、配列番号1および292~294に示されるものに基づいて、またはバレンセンシンターゼアミノ酸配列の逆翻訳から設計できる。増幅によって作製された核酸分子は、配列決定し、バレンセンシンターゼポリペプチドをコードすると確認できる。合成遺伝子をベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コーディングDNA配列の増幅のために設計されたベクター中にクローニングする目的で、バレンセンシンターゼをコードする核酸分子に、制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を含めたさらなるヌクレオチド配列をつなげることができる。さらに、機能的DNAエレメントを特定するさらなるヌクレオチド配列を、バレンセンシンターゼをコードする核酸分子に作動可能に連結することができる。さらに、その他の部分またはドメインをコードする核酸も含まれる場合があり、その結果、得られるシンターゼは、融合タンパク質である。例えば、FPPシンターゼなどのその他の酵素またはHisタグなどのタグをコードする核酸。2.突然変異体muantまたは改変された核酸の作製改変されたテルペンシンターゼ、例えば、改変されたバレンセンシンターゼをコードする核酸は、突然変異を達成するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して調製または作製できる。改変のための方法は、コーディング核酸分子の標準的な合理的および/またはランダム突然変異誘発を含む例えば、エラープローンPCR、ランダム部位特異的飽和突然変異誘発、または合理的部位特異的突然変異誘発、例えば、突然変異誘発キット例えば、Stratageneから入手可能であるQuikChangeなどを使用して。さらに、日常的な組換えDNA技術を使用して、異種アミノ酸を含有するポリペプチドをコードする核酸を作製できる。例えば、異種アミノ酸配列を含有するキメラポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を、上記および実施例5において記載されるものなどの2段階PCR法を使用して、ならびに/または所望のキメラポリペプチド成分の日常的なサブクローニングのための制限酵素およびクローニング法を使用して作製できる。作製すると、核酸分子を、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、細胞において発現させて、改変されたテルペンシンターゼポリペプチドを作製することができる。改変されたテルペンシンターゼポリペプチド、例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを、次いで、所望の特性または活性についての、例えば、基質からテルペンを生成する能力についてのスクリーニングによって評価できる。特定の例では、所望の特性を有する改変されたテルペンシンターゼを突然変異によって作製し、本明細書に例示された例に従って特性についてスクリーニングする。通常、改変されたバレンセンシンターゼが作製される場合には、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、FPPからバレンセンを生成する。したがって、上記および本明細書に記載された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれかを含めた、本明細書に記載された改変されたテルペンシンターゼのいずれかをコードする核酸が、本明細書において提供される。本明細書において提供される核酸分子のいずれも、当技術分野で周知の方法を使用して単離または精製でき、またはベクターもしくは細胞中に含めることができる。本明細書において提供される核酸分子の例示として、表3または5Aに示されるいずれか、またはその縮重配列がある。例えば、本明細書において提供される核酸分子の例示として、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードするいずれか、例えば、配列番号3~127、350、351、723~731、732~745、746~751、810~866、887~890および895のいずれかに示されるポリペプチドをコードするいずれか、またはその縮重配列がある。一実施形態では、本明細書において提供される核酸分子は、少なくとも50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95または99の配列同一性を有するか、または本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする任意の核酸の全長の少なくとも70に沿って、中または高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。例えば、本明細書において提供される核酸分子は、配列番号1に示される核酸配列に対して、少なくともまたは少なくとも約少なくとも50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95または99の配列同一性を有する。別の実施形態では、核酸分子は、本明細書において提供されるバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれかをコードする縮重コドン配列を有するものを含み得る。表3および5Aは、本明細書において提供される例示的な改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの例示的核酸配列を示す。3.ベクターおよび細胞1種または複数の本明細書において提供される、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めた、改変されたテルペンシンターゼポリペプチドの組換え発現のために、シンターゼをコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含有する核酸を、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入できる。使用される発現系に応じて、必要な転写および翻訳シグナルはまた、バレンセンシンターゼ遺伝子の天然プロモーターおよび/またはそのそれぞれの両端に位置する領域によって供給され得る。したがって、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターも本明細書において提供される。ベクターを含有する原核および真核細胞を含めた細胞も提供される。このような細胞として、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が挙げられる。特定の例では、細胞は、FPPなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体を発現するサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeなどの酵母である。細胞は、細胞によってコードされるバレンセンシンターゼが発現される条件下で上記の細胞を増殖させることによって、バレンセンシンターゼポリペプチドまたは改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドなどのテルペンシンターゼを生成するために使用される。一部の例では、発現されたシンターゼを精製する。その他の例では、発現されたシンターゼ、例えば、バレンセンシンターゼが、宿主細胞でFPPを1種または複数のテルペン例えば、バレンセンに変換する。DNA断片をベクター中に挿入するための当業者に公知の任意の方法を使用して、適当な転写/翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法は、インビトロ組換えDNAおよび合成技術およびインビボ組換え体遺伝子組換えを含み得る。バレンセンシンターゼポリペプチドまたは改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドまたはドメイン、その誘導体、断片または相同体をコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはその断片が、組換えDNA分子単数または複数で形質転換された宿主において発現されるように第2の核酸配列によって調節され得る。例えば、タンパク質の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター/エンハンサーによって制御され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、バレンセンシンターゼタンパク質の遺伝子の天然のものではない。使用され得るプロモーターとして、それだけには限らないが、原核生物、酵母、哺乳動物および植物プロモーターが挙げられる。プロモーターの種類は、以下により詳細に記載される使用される発現系に応じて変わる。特定の実施形態では、バレンセンシンターゼポリペプチドまたは改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドまたはドメイン、その断片、誘導体または相同体、1つ以上の複製起点および所望により、1種または複数の選択マーカー例えば、抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有するベクターが、使用される。バレンセンシンターゼポリペプチドの発現のためのベクターおよび系が記載されている。4.発現系バレンセンシンターゼポリペプチド改変されたおよび改変されていないを含めたテルペンシンターゼポリペプチドは、インビトロおよびインビボ法、例えば、インビボ生成またはインビトロでのテルペンシンターゼ例えば、バレンセンシンターゼをコードする核酸分子からの発現のための、テルペンシンターゼ例えば、バレンセンシンターゼをコードする核酸分子を宿主細胞または宿主植物への導入などを含めた、タンパク質生成のための当技術分野で公知の任意の方法によって生成できる。バレンセンシンターゼおよび改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドなどのテルペンシンターゼは、必要な量および形態のシンターゼポリペプチドを生成するのに適した任意の生物において発現させることができる。発現宿主として、原核および真核細胞生物、例えば、大腸菌E.coli、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含めた哺乳動物細胞が挙げられる。発現宿主は、そのタンパク質生成レベルならびに発現されたタンパク質に存在する翻訳後修飾post-translationalmodificationの種類において異なり得る。発現宿主の選択は、これらおよび法的考察および安全性考察、生成コストおよびニーズおよび精製方法などのその他の因子に基づいて行うことができる。真核生物宿主における発現は、サッカロミセスSaccharomyces属例えば、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeおよびピキアPichia属例えば、ピキアパストリアPichiapastoriaに由来するものなどの酵母、ショウジョウバエDrosophila細胞および鱗翅目細胞などの昆虫細胞、柑橘類、タバコ、トウモロコシ、コメ、藻類およびアオウキクサ属などの植物および植物細胞における発現を含み得る。発現のための真核細胞としてまた、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞またはベビーハムスター腎臓BHK細胞などの哺乳動物細胞株が挙げられる。真核生物発現宿主としてまた、例えば、血清、乳および卵における生成を含めた、トランスジェニック動物における生成が挙げられる。バレンセンシンターゼなどのテルペンシンターゼの発現のために、多数の発現ベクターが、利用可能であり、当業者に公知である。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって影響を受ける。このような選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび所望により、エンハンサー、翻訳シグナルならびに転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定な形質転換に使用される発現ベクターは、通常、形質転換された細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを有する。いくつかの場合には、複製起点を使用して、細胞中のベクターのコピー数を増幅できる。バレンセンシンターゼおよび改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼはまた、タンパク質融合物として利用または発現させてもよい。例えば、ポリペプチドにさらなる機能性を加えるために融合物を作製してもよい。融合タンパク質の例として、それだけには限らないが、シグナル配列、局在性などのためのタグ、例えば、his6タグもしくはmycタグまたは精製のためのタグ、例えば、GST融合物ならびにタンパク質分泌および/または膜会合を指示するための配列の融合物が挙げられる。その他の例では、バレンセンシンターゼまたは改変されたバレンセンシンターゼなどのセスキテルペンシンターゼポリペプチドを、Brodeliusetal26935703579に記載されるFPPシンターゼと融合してもよい。バレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼポリペプチドを生成する方法は、宿主細胞におけるFPPなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体の同時発現を含み得る。一部の例では、宿主細胞は、天然に、FPPを発現する。このような細胞は、より多量のFPPを発現するよう改変され得る例えば、US6531303参照のこと。その他の例では、FPPを天然に生成しない宿主細胞が、FPPを生成するよう遺伝子改変される。a.原核細胞原核生物、特に、大腸菌E.coliは、多量の、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを生成する系を提供する。大腸菌E.coliの形質転換は、当業者に周知の簡単で、迅速な技術である。大腸菌E.coli細胞の形質転換のための例示的発現ベクターとして、例えば、pGEM発現ベクター、pQE発現ベクターおよびpET発現ベクターが挙げられる米国特許第4,952,496号参照;NOVAGEN,Madison,WIから入手可能;この系を説明するNovagenから公開された文献も参照のこと。このようなプラスミドとして、T7lacプロモーター、T7ターミネーター、誘導性大腸菌E.colilacオペレーターおよびlacレプレッサー遺伝子を含有するpET11a;T7プロモーター、T7ターミネーターおよび大腸菌E.coliompT分泌シグナルを含有するpET12a-c;ならびにHisカラムを用いる精製において使用するためのHis-Tag商標リーダー配列およびカラムでの精製後の切断を可能にするトロンビン切断部位、T7-lacプロモーター領域およびT7ターミネーターを含有する、pET15bおよびpET19bNOVAGEN,Madison,WIが挙げられる。大腸菌E.coliのための発現ベクターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するのに、また、宿主細胞に対して幾分かの毒性を示すタンパク質を発現させるのに有用である誘導プロモーターを含有し得る。例示的原核生物プロモーターとして、例えば、β-ラクタマーゼプロモーターProcNatlAcadSciUSA785543およびtacプロモーターが挙げられるScientificAmerican2427994中のUsefulProteinsfromRecombinntBacteriaも参照のこと。誘導プロモーターの例として、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7およびSP6RNAプロモーターならびに温度によって調節されるλPLプロモーターが挙げられる。バレンセンシンターゼを含めたテルペンシンターゼは、大腸菌E.coliの細胞質環境において発現させることができる。細胞質は、還元環境であり、一部の分子にとっては、このことが、不溶性の封入体の形成をもたらし得る。ジチオトレイトールおよびβ-メルカプトエタノールなどの還元剤ならびに変性剤例えば、グアニジン-HClおよび尿素などを使用して、タンパク質を再可溶化することができる。代替アプローチとして、可溶性タンパク質の生成につながる、酸化環境ならびにシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供する、細菌の細胞膜周辺腔におけるバレンセンシンターゼの発現がある。通常、タンパク質を周辺質に向けるリーダー配列が、発現される予定のタンパク質に融合される。次いで、リーダーは、周辺質の内側のシグナルペプチダーゼによって除去される。原形質周辺をターゲッティングするリーダー配列の例として、ペクチン酸リアーゼ遺伝子に由来するpelBリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーが挙げられる。一部の場合には、原形質周辺の発現によって、発現されるタンパク質の培養培地への漏出が可能となる。タンパク質の分泌によって、培養上清からの迅速な簡単な精製が可能となる。分泌されないタンパク質は、浸透圧性溶解によって周辺質から得ることができる。細胞質発現と同様に、タンパク質が不溶性になり得る場合には、変性剤および還元剤を使用して、可溶化および再折りたたみを促進することができる。誘導および増殖の温度もまた、発現レベルおよび溶解度に影響を及ぼし得る。通常、25°Cから37°Cの間の温度が使用される。また、突然変異を使用して、発現されたタンパク質の溶解度を高めることもできる。通常、細菌は、グリコシル化されていないaglycosylatedタンパク質を生成する。b.酵母細胞サッカロミセスSaccharomyces属に由来するもの例えば、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、シゾサッカロミセスポンベSchizosaccharomycespombe、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica、クロイベロミセスラクチスKluyveromyceslactisおよびピキアパストリスPichiapastorisなどの酵母を使用して、テルペンシンターゼ、例えば、本明細書において提供される、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現させることができる。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いて、または相同組換えによる安定な染色体組込みによって形質転換できる。一部の例では、遺伝子発現を調節するために誘導プロモーターが使用される。酵母におけるバレンセンシンターゼポリペプチドの発現のための例示的プロモーター配列として、中でも、メタロチオニンmetallothionine、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーターHitzemanetalJBiolChem2552073、1980またはエノラーゼ、グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどのその他の解糖酵素が挙げられる。酵母発現において使用するためのその他の適したベクターおよびプロモーターは、HitzemanEPA73657に、またはFleeretal,Gene107285195およびvandenBergetalBioTechnology8135139にさらに記載されている。別の代替法として、それだけには限らないが、RusselletalおよびBeieretalに記載されたグルコース抑制可能なADH2プロモーターまたは改変されたADH1プロモーターが挙げられる。酵母および大腸菌E.coliの両方で複製可能なシャトルベクターは、例えば、大腸菌E.coliにおける選択および複製のためのpBR322に由来するDNA配列Ampr遺伝子および複製起点を、上記のに酵母ベクター中に挿入することによって構築できる。酵母シャトルベクターの例示として、以下の実施例1に記載されるYEp-CVS-uraがある。酵母発現ベクターは、形質転換されたDNAの選択および維持のためにLEU2、TRP1、HIS3およびURA3などの選択マーカーを含み得る。酵母において発現されたタンパク質は、可溶性であることが多く、Bipなどのシャペロニンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時発現によって、発現レベルおよび溶解度が改善され得る。さらに、酵母において発現されたタンパク質は、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisae由来の酵母交配型α-因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合およびAga2p交配接着受容体またはアークスラアデニニボランスArxulaadeninivoransグルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合を使用して分泌に向けることができる。プロテアーゼ切断部位例えば、Kex-2プロテアーゼを、分泌経路を出るときにポリペプチドから融合された配列を除去するよう操作することができる。酵母は、メバロン酸依存性イソプレノイド生合成経路のための、FPPシンターゼFPPを生成できるを含めた必要なタンパク質を天然に発現する。したがって、酵母細胞における、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めた改変されたテルペンシンターゼの発現は、FPPからのバレンセンなどのテルペンの生成をもたらし得る。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼの発現のための例示的酵母細胞として、増大したレベルのFPPを発現するよう改変された酵母が挙げられる。例えば、酵母細胞を、より少ないスクアレンシンターゼまたはより少ない活性スクアレンシンターゼ例えば、erg9突然変異体;例えば、米国特許第6,531,303号および同6,689,593号参照のことを生成するよう改変してもよい。これは、野生型酵母細胞と比較して高レベルでの宿主細胞におけるFPPの蓄積をもたらし、これが、次いで、テルペン例えば、バレンセンの収率の増大をもたらし得る。例示的な改変された酵母細胞として、それだけには限らないが、改変されたサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株CALI5-1ura3、leu2、his3、trp1、Δerg9::HIS3、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1、sue、ALX7-95ura3、his3、trp1、Δerg9::HIS3、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1sue、ALX11-30ura3、trp1、erg9def25、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1、sueおよび米国特許第6,531,303号、同6,689,593号に記載されるものおよび米国特許出願US20040249219に公開されるものが挙げられる。c.植物および植物細胞改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼの発現のために、トランスジェニック植物細胞および植物を使用できる。発現コンストラクトは、通常、微粒子銃およびプロトプラストへのPEG媒介性移入などの直接DNA移入を使用して、またアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて植物に移入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、シロイヌナズナArabidopsisおよびタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシおよびコメなどの単子葉植物宿主間で分かれている。発現のために使用される植物プロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターならびにユビキチンおよびUBQ3プロモーターが挙げられる。形質転換された細胞の選択および維持を容易にするために、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択マーカーが使用される。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集体カルス組織として培養で維持される場合も、全植物体に再生される場合もある。トランスジェニック植物細胞としてまた、タンパク質を生成するよう操作された藻類を挙げることができる例えば、MayfieldetalPNAS100438442参照のこと。形質転換される植物として、例えばfoeexample、タバコNicotiana属、ナスSolanum族、モロコシSorghum属、シロイヌナズナArabidopsis属、ウマゴヤシMedicago属アルファルファ、ワタGossypium属ワタ、アブラナBrassica属セイヨウアブラナから選択される植物が挙げられる。一部の例では、植物は、タバコNicotianatabacumの種に属し、米国特許公開番号20090123984号に記載されるものなどのバレンセンシンターゼおよびファルネシル二リン酸シンターゼを過剰発現するベクターで形質転換される。d.昆虫および昆虫細胞改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼを発現するために、特に、バキュロウイルス発現系を使用する昆虫および昆虫細胞を使用できる例えば、MunetaetalJVetMedSci6521923参照のこと。血リンパにおける発現を含めた昆虫細胞および昆虫幼虫は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物によって使用される翻訳後修飾のほとんどが可能である。バキュロウイルスは、真核細胞発現の安全性を改善し、規制上の懸念を低減する制限的宿主域を有する。通常、発現ベクターは、高レベル発現のためのバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用する。よく使用されるバキュロウイルス系として、オートグラファカリフォルニカAutographacalifornica核多核体病ウイルスAcNPVおよびボンビックスモリBombyxmori核多核体病ウイルスBmNPVなどのバキュロウイルスならびにスポドプテラフルギペルダSpodopterafrugiperda由来Sf9、ヨトウガPseudaletiaunipunctaA7SおよびオオカバマダラDanausplexippusDpN1などの昆虫細胞株が挙げられる。高レベル発現のためには、発現される分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合する。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞において正確にプロセシングされ、発現されたタンパク質を培養培地中に分泌するために使用できる。さらに、細胞株ヨトウガPseudaletiaunipunctaA7SおよびオオカバマダラDanausplexippusDpN1は、哺乳動物細胞系と同様のグリコシル化パターンを有するタンパク質を生成する。昆虫細胞における代替発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。シュナイダーSchnieder2S2およびKc細胞キイロショウジョウバエDrosophilamelanogasterおよびC7細胞ヒトスジシマカAedesalbopictusなどの細胞株を発現のために使用できる。ショウジョウバエDrosophilaメタロチオネインプロモーターを使用して、カドミウムまたは銅を用いる重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導できる。発現ベクターは、通常、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択マーカーの使用によって維持される。e.哺乳動物発現哺乳動物発現系を使用して、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼを発現させることができる。発現コンストラクトを、アデノウイルスなどのウイルス感染によって、またはリポソーム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランなどの直接DNA移入によって、またエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段によって哺乳動物細胞に移入することができる。哺乳動物細胞の発現ベクターは、通常、mRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列コザックコンセンサス配列およびポリアデニル化エレメントを含む。このようなベクターは、高レベル発現のための転写プロモーター-エンハンサー、例えば、SV40プロモーター-エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルスCMVプロモーターおよびラウス肉腫ウイルスRSVの長い末端反復配列を含むことが多い。これらのプロモーター-エンハンサーは、多数の細胞種において活性である。組織および細胞種プロモーターおよびエンハンサー領域も、発現のために使用できる。例示的プロモーター/エンハンサー領域として、それだけには限らないが、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α1アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2および性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御などの遺伝子に由来するものが挙げられる。選択マーカーを使用して、発現コンストラクトを有する細胞を選択および維持できる。選択マーカー遺伝子の例として、それだけには限らないが、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジンキナーゼが挙げられる。TCR-ζおよびFcεRI-γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合によって、細胞表面で活性な状態でタンパク質の発現を指示できる。哺乳動物発現には、マウス、ラットヒト、サルおよびニワトリおよびハムスター細胞を含めて多数の細胞株が利用可能である。例示的細胞株として、それだけには限らないが、BHKすなわち、BHK-21細胞、293-F、CHO、CHOExpressCHOX;Excellgene、Balb/3T3、HeLa、MT2、マウスNS0非分泌性およびその他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、293T、2B8およびHKB細胞が挙げられる。細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を促進する血清不含培地に適応された細胞株もまた、利用可能である。このような一例として、血清不含EBNA-1細胞株があるBiotechnolBioeng8433242。5.精製宿主細胞からの、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたバレンセンシンターゼなどのテルペンシンターゼの精製方法は、選択される宿主細胞および発現系に応じて異なる。分泌された分子については、タンパク質は、一般に、細胞を除去した後に、培養培地から精製される。細胞内発現については、細胞を溶解させ、抽出物からタンパク質を精製できる。トランスジェニック植物および動物などのトランスジェニック生物が、発現に使用される場合には、組織または臓器を、溶解された細胞抽出物を生成するための出発材料として使用できる。さらに、トランスジェニック動物生成は、乳または卵におけるポリペプチドの生成を含む場合があり、これは集めることができ、必要に応じて、当技術分野における標準方法を使用して、タンパク質を抽出し、さらに精製できる。バレンセンシンターゼを含めたテルペンシンターゼは、SDS-PAGE、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、キレートクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを含めた当技術分野で公知の標準タンパク質精製技術を使用して精製できる。また、発現コンストラクトを、タンパク質に、mycエピトープ、GST融合物またはHis6などのアフィニティータグを加えるよう操作し、それぞれ、myc抗体、グルタチオン樹脂およびNi樹脂を用いてアフィニティー精製してもよい。純度は、ゲル電気泳動および染色および分光光度的技術を含めた当技術分野で公知の任意の方法によって評価できる。6.融合タンパク質改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めた改変されたテルペンシンターゼおよび1種または複数のその他のポリペプチドを含有する融合タンパク質も提供される。テルペンシンターゼポリペプチドと別のポリペプチドとの連結は、直接的にか、またはリンカーを介して間接的に達成できる。一例では、連結は、例えば、ヘテロ二官能性薬剤を介する化学的連結またはチオール連結またはその他のこのような連結によってであり得る。融合はまた、組換え手段によっても達成され得る。バレンセンシンターゼポリペプチドなどのテルペンシンターゼの、別のポリペプチドとの融合は、バレンセンシンターゼポリペプチドのN末端またはC末端にであり得る。融合タンパク質は、標準組換え技術によって生成され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするDNA断片を、例えば、連結、制限酵素消化に、平滑末端の、またはねじれ型末端の末端を使用して適当な末端を提供すること、必要に応じて付着末端を埋めること、望ましくない接続を避けるためのアルカリホスファターゼ処理および酵素的連結によって、従来技術に従ってインフレームに一緒に連結できる。別の実施形態では、自動化DNAシンセサイザーを含めた従来技術によって融合遺伝子を合成できる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅は、2種の連続した遺伝子断片間に相補的なオーバーハングを生じさせ、続いて、これらがアニーリングされ、再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成させるアンカープライマーを使用して実施できる例えば、AusubeletalCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySons、1992参照のこと。さらに、融合部分例えば、GSTポリペプチドをすでにコードする多数の発現ベクターが市販されている。バレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、融合部分がバレンセンシンターゼタンパク質にインフレームで連結されるような発現ベクターにクローニングできる。F.テルペンシンターゼを使用し、評価する方法本明細書において提供される改変されたテルペンシンターゼを使用し、その能力について評価して、それだけには限らないが、ファルネシル二リン酸FPP、ゲラニル二リン酸GPPまたはゲラニル-ゲラニル二リン酸GGPPを含めた適した非環式ピロリン酸テルペン前駆体からモノテルペン、ジテルペンおよびセスキテルペンを含めたテルペンを生成することができる。通常、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、FPPからのバレンセンの形成を触媒する。当業者に公知の任意の方法を使用して、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼなどの改変されたテルペンシンターゼを用いてバレンセンを含めたテルペンを生成できる。本明細書において提供される改変されたシンターゼのFPPまたはその他の基質からのバレンセンまたはその他のテルペンの形成を触媒する能力は、これらの方法を使用して評価され得る。一部の例では、改変されたシンターゼを使用してFPPまたは別の基質から生成されたバレンセンなどのテルペンの量を、野生型または非改変シンターゼを使用して、同じ基質から生成されたバレンセンなどのテルペンの量と比較する。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドなどの改変されたテルペンシンターゼのその他の活性および特性はまた、当技術分野で周知の方法およびアッセイを使用して評価できる。改変されたシンターゼの活性およびテルペンの形成を触媒するその能力を評価することに加えて、反応の速度論、改変された位置化学または立体化学、野生型または非改変テルペンシンターゼと比較して変更された基質利用および/または変更された生成物分布すなわち、FPPまたは別の基質から生成される種々のテルペンの変更された量を、当技術分野で周知の方法を使用して評価できる。例えば、改変されたテルペンシンターゼポリペプチドによってFPP、GPPまたはGGPPから生成される種々のテルペンの種類および量は、以下および実施例5に記載されるものなどのガスクロマトグラフィー法例えば、GC-MSによって評価できる。一部の例では、FPPから改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドによって生成され得るテルペンとして、それだけには限らないが、バレンセン、ゲルマクレンA、β-エレメン、β-セリネン、τ-セリネンおよび7-エピ-α-セリネンが挙げられる。本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼを使用してFPPからバレンセンおよびヌートカトンを生成する方法が、以下に提供される。このような方法を、本明細書において提供されるその他の改変されたテルペンシンターゼによって、FPP、GPPおよび/またはGGPPからその他のテルペンを生成および評価するよう、当業者によって適応させることができる。1.バレンセンの生成改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを使用して、FPPなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒することができる。一部の例では、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼは、FPPを生成または過剰生成する細胞において発現され、その結果、バレンセンが上記の経路によって生成される。その他の例では、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼが、節Dに記載されたものなどの任意の適した宿主細胞から発現および精製される。次いで、精製されたシンターゼをインビトロでFPPと組み合わせてバレンセンを生成する。一部の例では、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼは、上記の節Dに記載されたように過剰発現および精製される。次いで、改変されたバレンセンシンターゼを基質ファルネシル二リン酸とともにインキュベートし、バレンセンを生成する。FPPおよびバレンセンシンターゼを含有する溶液のpHは、生成されるバレンセンの量に影響を及ぼし得る例えば、米国特許公開番号20100216186号参照のこと。分析のために、バレンセンを有機相に分配するために有機溶媒を加える。次いで、内部標準を使用するガスクロマトグラフィー例えば、GC-MSなどの本明細書において提供される任意の方法を使用して、バレンセンの生成および生成物の量の定量化が決定される。あるいは、改変されたバレンセンシンターゼは、同様にFPPを生成し、バレンセンの生成をもたらす宿主細胞において発現される。次いで、バレンセンを有機溶媒を用いて細胞培養培地から抽出し、続いて、カラムクロマトグラフィーまたはHPLCなどの任意の公知の方法によって単離および精製してもよく、回収されたバレンセン量および純度を評価する。一部の例では、バレンセンは、精製前または精製後のいずれかで、酸化によってヌートカトンに変換される。a.バレンセン生成のための例示的細胞メバロン酸依存性イソプレノイド生合成経路例えば、酵母細胞を含めた真菌および動物細胞またはメバロン酸非依存性イソプレノイド生合成経路例えば、細菌および高等植物の一部としてFPPを生成する細胞株において、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現させることによって、バレンセンを生成できる。特定の例では、FPPを過剰生成するよう改変されている細胞株において、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現させることによってバレンセンを生成する。このような細胞の例示として、改変された酵母細胞がある。例えば、より少ないスクアレンシンターゼまたはより少ない活性スクアレンシンターゼを生成するよう改変されている酵母細胞例えば、erg9突然変異体;例えば、米国特許第6,531,303号および同6,689,593号参照のことが、本明細書において提供される方法においてバレンセンを生成するのに有用である。低減されたスクアレンシンターゼ活性は、野生型酵母細胞と比較して高レベルでの宿主細胞におけるFPPの蓄積をもたらし、次いで、これが、バレンセン生成の収量の増大をもたらし得る。例示的な改変された酵母細胞として、それだけには限らないが、改変されたサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株CALI5-1ura3、leu2、his3、trp1、Δerg9::HIS3、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1、ALX7-95ura3、his3、trp1、Δerg9::HIS3、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1、sue、ALX11-30ura3、trp1、erg9def25、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1、sueならびに米国特許第6,531,303号および同6,689,593号および公開された米国特許公開番号US20040249219に記載されるものが挙げられる。サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株CALI5-1は、それ自体は野生型株ATCC28383MATaに由来する、SW23B74米国特許第6,531,303号および同6,689,593号ならびにTakahashietal170181に記載されるの誘導体である。CALI5-1は、Dpp1ホスファターゼの低下した活性を有するよう作製された例えば、米国公開出願US20040249219参照のこと。サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株CALI5-1は、その他の突然変異の中でも、erg9突然変異Δerg9::HIS3対立遺伝子ならびに好気的ステロール取り込み増強を支援する突然変異sueを含有する。また、およそ8コピーの末端切断型HMG2遺伝子も含有する。HMG2の末端切断型は、GPDプロモーターによって駆動され、したがって、もはや厳しい調節下にはなく、FPPへの炭素流動の増大を可能にする。ジアシルグリセロールピロリン酸DGPPホスファターゼ酵素dpp1をコードする遺伝子に欠失も含有し、これが、FPPの脱リン酸化を制限する。ALX7-95およびALX11-30.1は、CALI5-1の誘導体である。ALX7-95は、ロイシンが培地に供給される必要がないように、機能的leu遺伝子を用いてCALI5-1のΔleu2の欠乏を補正することによってCALI5-1から誘導された例えば、US2010/0151519参照のこと。ALX11-30は、以下の実施例2に記載される数段階で、CAL5-1から構築された。b.バレンセン生成のための細胞の培養例示的方法では、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼは、ファルネシル二リン酸を過剰発現するよう改変されている宿主細胞株において発現され、それによって、改変されたバレンセンシンターゼが発現されると、ファルネシル二リン酸が、バレンセンに変換される。宿主細胞を、当技術分野で周知の任意の適した方法を使用して培養する。一部の例では、種々の改変されたバレンセンシンターゼを発現する細胞のハイスループットスクリーニングなどのために、改変されたバレンセンシンターゼを発現する細胞を、96ウェルプレートの個々のウェルで培養する例えば、以下の実施例3Cを参照のこと。宿主細胞が酵母であるその他の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびFPPを発現する細胞を、以下の実施例に記載されたものなどの発酵法を使用して培養する。本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現する酵母細胞からのバレンセンの生成のために、種々の発酵法を使用できる。例えば、バッチまたは連続発酵のいずれかによって、大規模生成を達成できる。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が、発酵の開始時に設定され、発酵の間は人為的な変更に付されない閉鎖系である。したがって、発酵の開始時に、培地に所望の微生物単数または複数を播種し、発酵が栄養分のさらなる追加を伴わずに起こることが可能となる。通常、バッチ発酵における炭素供給源の濃度は制限され、pHおよび酸素濃度などの因子は管理される。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマス組成は、発酵が停止される時間まで絶えず変わる。バッチ培養内では、細胞は、通常、静止遅滞期staticlagphaseから高増殖対数期highgrowthlogphaseへ、最後に、定常期に変調し、ここで、増殖速度が減少または停止される。未処理の場合には、定常期にある細胞は、最終的に死滅する。標準バッチ系の変法として、発酵が進行するにつれて栄養分が添加される点を除いて通常のバッチ系と同様であるフェドバッチ系がある。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合および培地中に制限された量の基質を有することが望ましい場合には、フェドバッチ系は有用である。また、栄養分を与える能力は、バッチ発酵プロセスと比較して、フェドバッチ発酵プロセスにおいてより高い細胞密度をもたらすことが多い。フェドバッチ発酵では、pH、溶存酸素、栄養分濃度およびCOなどの廃ガスの分圧などの因子が、通常、測定および制御される。バレンセンの生成はまた、連続発酵を用いて達成することもできる。連続発酵は、処理のために、バイオリアクターに規定の発酵培地が継続的に添加され、同時に等量のコンディショニング培地が除去される開放系である。この系は、一般に、培養物を一定の高密度で維持し、これでは、細胞は主にその増殖の対数期にある。連続発酵は、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす任意の数の因子の調節を可能にする。例えば、1つの方法は、炭素供給源または窒素レベルなどの制限的栄養分を固定された割合に維持し、すべてのその他のパラメータを調節することを可能にする。その他の系では、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に維持しながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの因子を絶えず変更することができる。連続系は、定常状態増殖条件を維持することを目的とし、したがって、培地除去による細胞喪失は、発酵における細胞増殖速度に対してバランスがとられなければならない。連続発酵プロセスのために栄養分および増殖因子を調節する方法ならびに生成物形成速度を最大化する技術は、当技術分野で周知である。細胞培養後、次いで、細胞培養培地を回収して生成されたバレンセンを得ることができる。1つの例示的方法では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現する宿主細胞例えば、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株CALI5-1、ALX7-95またはALX11-30を、0および1g/Lの間でグルコースを維持しながら、3Lの発酵タンク中、28°C、pH4.5でおよそ132時間増殖させる実施例2参照のこと。発酵後、硫酸ナトリウムを10~15の最終濃度に添加する。ダイズ油も添加し、撹拌し、遠心分離によってバレンセンおよびその他のテルペンを含有する油を回収する。c.バレンセンの単離および評価本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを用い、上記の方法を使用して生成されたバレンセンを、当技術分野で公知の任意の方法によって単離および評価できる。一例では、細胞培養培地を、有機溶媒を用いて抽出して、生成されたバレンセンおよび任意のその他のテルペンを有機層に分配する。バレンセン生成は、例えば、ガスクロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の任意の方法を使用して、評価でき、および/またはバレンセンをその他の生成物から単離できる。例えば、内部標準としてセドレンおよびヘキサデカンを使用してガスクロマトグラフィーによって有機層を分析できる。この方法は、以下の実施例2に例示される。生成されるバレンセンの量は、有機化合物を分離および分析するのに有用な任意の公知の標準的なクロマトグラフィー技術によって決定できる。例えば、バレンセン生成は、それだけには限らないが、ガスクロマトグラフィー質量分析GC-MS、フレームイオン化検出器を使用するガスクロマトグラフィーGC-FID、キャピラリーGC-MS、高性能液体クロマトグラフィーHPLCおよびカラムクロマトグラフィーを含めた、バレンセンおよびその他のテルペンなどの炭化水素の検出および定量化にとって有用な任意の公知のクロマトグラフィー技術によってアッセイできる。通常、これらの技術は、生成されたテルペンの量を定量化するために使用される既知内部標準、例えば、セドレンまたはヘキサデカンの存在下で実施される。例えば、バレンセンなどのセスキテルペンを含めたテルペンは、質量分析検出を伴うガスクロマトグラフィーにおいて標品のものと、保持時間および質量スペクトルを比較することによって同定できる。通常の標準として、それだけには限らないが、セドレンおよびヘキサデカンが挙げられる。その他の例では、定量化は、既知量の標品を用いるフレームイオン化検出を用い、較正曲線に基づくガスクロマトグラフィーおよび内部標準のピーク面積に対する正規化によって達成できる。これらのクロマトグラフィー技術によって、有機層中に存在する任意のテルペン、例えば、ゲルマクレンA、β-セリネン、τ-セリネンおよび7-エピ-α-セリネン例えば、実施例8を参照のことを含めた、例えば、改変されたバレンセンシンターゼによって生成されるその他のテルペンの同定が可能となる。特定の例では、FPPから本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドによって生成されるバレンセンの量は、配列番号2に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドによってFPPから生成されるバレンセンの少なくともまたは約110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000またはそれ以上である。通常、上記および以下の実施例において例示される方法を使用して生成されるバレンセンの量は、少なくともまたは約0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/Lまたは5.0g/Lまたはそれ以上である。一部の例では、バレンセン生成の動力学は、3HFPPまたは14CFPPなどの放射性イソプレノイド基質が種々の濃度のシンターゼとともに使用されるシンターゼアッセイによって決定できる。生成物を有機層に抽出し、放射能を液体シンチレーションカウンターを使用して測定する。速度定数は、データに対するミカエリスメンテン方程式の直接フィットから決定される。2.ヌートカトンの生成本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼは、バレンセンを生成し、次いで、これが、ヌートカトンに酸化され得る。優勢なグレープフルーツの芳香であるヌートカトンは、バレンセンの酸化生成物である。バレンセンは、位置選択的水酸化を受けて、2-ヒドロキシバレンセンを形成し得、これがさらに酸化されて、ヌートカトンを形成する。バレンセンの酸化は、化学的手段または生合成手段によって実施できる例えば、米国特許第5,847,226号、欧州特許番号EP1083233;GirhardetalMicrobCellFact836FraatzetalApplMicrobiolBiotechnol833541FurusawaetalChemPharmBull5315131514SalvadoretalGreenChemistry4、352356を参照。生化学的酸化は、ラッカーゼ、ヒドロキシラーゼまたはその他の酸化酵素によって達成され得る。一部の例では、バレンセンは、三酸化クロムまたはリン酸シリカによって固定されたクロムIII触媒を使用してヌートカトンに変換される例えば、実施例7参照のこと。ヌートカトン形成は、本明細書に記載されたクロマトグラフィー技術のいずれかによって確認および/または定量化できる。G.実施例以下の実施例は、単に例示目的で含まれるのであって、本発明の範囲を制限しようとするものではない。野生型バレンセンシンターゼのクローニング米国特許第7,442,785号の実施例1に先に記載された手順を使用して、新たに収穫されたバレンシアオレンジの果汁小胞から単離したRNAから、バレンシアオレンジCitrussinensiscv.Valenciaバレンシアオレンジに由来するバレンセンシンターゼ遺伝子CVSをクローニングした。まず、attR1-CmR-ccdB遺伝子-attR2の形態GenomeRes1017881795を有するgatewayクローニングカセットRfBを、URA3選択マーカー、ADH1プロモーターおよび2つのBamHI部位一方は、ADH1プロモーターの5’、もう一方は、ADHターミネーターの3’の両端に位置するADH1ターミネーター、2-ミクロンori、アンピシリン耐性遺伝子およびcolE1複製起点を含有するYEp352-URA配列番号692、Bio-TechnicalResourcesのSmaI制限部位に挿入することによって、Yep-GW-URATakahashietalBiotechnolBioeng97170181を作製した。得られたベクターは、YEp-CVS-URAと指定した。次いで、CVS遺伝子配列番号1に示される、配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードするを、酵母シャトル発現ベクターYep-GW-URAへのサブクローニングのための制限部位を含有するよう新たに収穫されたバレンシアオレンジの果汁小胞から単離したRNAから増幅した。Yep-GW-URAをEcoRIおよびXbaIで消化した後、増幅産物を酵母シャトル発現ベクターYEp-GW-URAにクローニングした。YEp-CVS-uraベクターは、28°Cでウラシルを欠くSD最小培地で選択することによってS.セレビシエcerevisiae中で維持した。ベクターはまた、100μg/mLアンピシリンを含有するLB培地でアンピシリンに対する耐性を選択することによって大腸菌Escherichiacoli中でも維持した。バレンセンの生成バレンセンの生成についてスクリーニングするために、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae酵母細胞株CALI5-1ura3、leu2、his3、trp1、Δerg9::HIS3、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1、sue、ALX7-95ura3、his3、trp1、Δerg9::HIS3、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1、sueまたはALX11-30ura3、trp1、erg9def25、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1、sueを使用した。CALI5-1株米国公開出願US20040249219;米国特許第6,531,303号および同6,689,593号を参照のことは、Δleu2欠失を有し、その培地へのロイシンの導入を必要とした。ALX7-95は、CALI5-1のΔleu2欠失を機能的LEU2遺伝子を用いて補正することによってCALI5-1から導いた米国公開出願US2010/0151519参照のこと。ALX11-30は、US2010/0151519に記載されるようにALX7-175.1から、いくつかの工程でCALI5-1から構築した。手短には、ヒオシアムスムチクスHyoscyamusmuticusプレムナスピロジエンシンターゼHPSを含有するプラスミドを、ALX7-95株に形質転換することによって、ALX7-95HPSを得た。HPSの遺伝子をYep-GW-URAにクローニングして、YEp-HPS-uraYEp-HPSを得ることによってYEp-HPSプラスミドを得た。次いで、ERG9遺伝子のエラープローンPCR反応を実施し、得られたDNAをYEpHPSを有するALX7-95に形質転換した。形質転換体をエルゴステロールを欠くYP培地にプレーティングし、プレムナスピロジエン生成についてスクリーニングした。高レベルのプレムナスピロジエンを生成したものを保存した。1種の株、ALX7-168.25[ura3、trp1、his3、erg9def25、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1、sue、YEpHPS]を、完全HIS3遺伝子のPCR断片で形質転換して、機能的HIS3遺伝子を作製した。培地中のヒスチジンの不在下で増殖できる形質転換体を単離した。この形質転換から、ALX7-175.1を単離した[ura3、trp1、erg9def25、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1、sueYEpHPS]。最後に、ALX7-175.1を、YPD10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン、20g/Lグルコース中で数世代増殖させることおよび細胞をYPDプレートにプレーティングすることによって、プラスミドYEpHPSを除去した。ウラシルを含まないSD培地0.67のアミノ酸を含まないBacto酵母窒素源基礎培地、2グルコース、0.14のウラシルを含まない酵母合成ドロップアウト培地で増殖できなかったコロニーを同定した。この株は、ALX11-30と指定した。バレンセンシンターゼまたは突然変異体によるバレンセンの生成についてのスクリーニングのために、CVS遺伝子またはCVS遺伝子の改変された形を含有するYEp-CVS-uraプラスミドを、酢酸リチウム酵母形質転換キットSigma-Aldrichを使用して上記の酵母株に形質転換した。ALX7-95およびALX11-30株は、全般的に、CALI5-1株よりも多くのバレンセンを生成した。CALI5-1を、バイアルにおける最初のスクリーニング実施例3に記載されるおよび発酵槽における生成のために使用した。続いて、ALX7-95またはALX11-30を、バイアルおよび発酵槽におけるスクリーニングのために使用した。通常、ALX7-95を、バイアルにおけるスクリーニングのために使用し、ALX11-30を発酵槽のために使用した。形質転換体を、SDE-ura培地0.67の、アミノ酸を含まないBacto酵母窒素源基礎培地、2グルコース、0.14のウラシルを補給されていない酵母合成ドロップアウト培地および必要に応じて40mg/Lエルゴステロールで選択した。コロニーを選び、以下に記載したミクロ培養アッセイを使用してバレンセン生成についてスクリーニングした。バレンセンの生成は、3-L発酵タンクNewBrunswickBioflow110で実施した。1リットルの発酵培地を調製し、発酵タンク中でオートクレーブ処理した20gのNH42SO4、20gのKH2PO4、1gのNaCl、MgSO47H2O、4gのソルリスコーンスティープソリッドSolulyscornsteepsolidsRoquette。次いで、以下の成分を添加した:20mlの無機溶液0.028のFeSO47H2O、0.029のZnSO47H2O、0.008のCuSO45H2O、0.024のNa2MoO42H2O、0.024のCoCl26H2O、0.017のMnSO4H2O、1mLのHCl;10mLの50グルコース;30mLのビタミン溶液0.001のビオチン;0.012のパントテン酸カルシウム、0.06のイノシトール、0.012のピリドキシン-HCl、0.012のチアミン-HCl;10mLの10CaCl2および20mLのオートクレーブ処理したダイズ油地方の食料品店から購入した。CALI5-1およびALX7-95を含めたステロール要求株に対しては、培地に、50mg/Lのコレステロールまたは40mg/Lのエルゴステロールを含めた。50mLのSDE-ura-trp培地実施例3.C.2.参照のことに、YEp-CVS-uraプラスミドを含有する、CALI5-1、ALX7-95またはALX11-30を播種することによって、発酵培地に播種するための種培養物を調製した。この培養物を、定常期初期24~48時間まで28°Cで増殖させた。この培養物1mLを、500mLのSDE-ura-trp培地に播種し、28°Cで24時間増殖させた。50-mLのアリコート5播種材料を使用して、発酵タンク中の培地に播種した。発酵槽は、28°Cで維持した。エアフローは、1vvmとし、dO2は、撹拌を調整することによって30超で維持した。pHは、リン酸およびNaOHまたはNH4OHを使用して4.5で維持した。グルコース濃度が1g/L未満に低下した時点で、発酵槽中のグルコースが、0から1g/Lの間で維持されるよう供給計画を開始した。グルコース供給は、60グルコースw/vからなっていた。発酵の最後、一般に、播種の約132時間後に、硫酸ナトリウムを10~15の最終濃度に、さらなる50mLのダイズ油も同様に添加し、発酵槽の内容物を1時間撹拌した。発酵容器の内容物を沈降させた後、遠心分離によって油を回収し、油中のバレンセン含量を決定した。バレンセンをアッセイするために、バイアルに3mLの懸濁液を入れ、それに、20mg/Lのセドレンを含有するアセトン3mLを添加した。ボルテックス処理した後、10mg/Lのヘキサデカンを含有するヘキサン6mLを用いて混合物を抽出し、続いて、さらにボルテックス処理した。それぞれ、抽出効率および注入のために、セドレンおよびヘキサデカンを内部標準として使用するガスクロマトグラフィーによる分析のために、有機相を第2のバイアルに移した。Yep-CVS-uraを含有し、バレンセンシンターゼを発現する、CALI5-1、ALX7-95またはALX11-30S.セレビシエcerevisiaeは、バレンセンを生成するとわかった。バレンセンシンターゼ突然変異体の作製バレンセンシンターゼ遺伝子のエラープローンPCRepPCRによってバレンセンシンターゼ突然変異体を作製した。次いで、ハイスループットスクリーニングアッセイを使用して、突然変異体を、そのバレンセンを生成する能力についてスクリーニングした。A.epPCRによるバレンセンシンターゼ突然変異体の作製CVS遺伝子のエラープローンPCRのために、全YEp-CVS-uraプラスミドまたはプラスミドから切り出し、ゲル精製した、CVS遺伝子を含有する3kbのBamHIDNA断片のいずれかを使用した。GeneMorphIIランダム突然変異誘発キットStratageneを使用し、270から360ngの間のCVS遺伝子に相当するDNAを、エラープローンPCRの鋳型として使用した。PCR条件は、フォワードプライマーCVSpcrF15’-CATTCACGCACACTACTCTCT-3’、配列番号344およびリバースプライマーCVSpcrR15’-GCCGACAACCTTGATTGGAG-3’、配列番号345を使用する、96°C、1分間、55°Cでのアニーリング1分間、72°Cでの伸長2分間の30サイクルとした。EcoRIおよびXbaIを使用するPCR反応生成物の消化によって、突然変異誘発されたCVS遺伝子のライブラリーが提供され、これを使用し、同一制限エンドヌクレアーゼを使用してYEp-CVS-uraの野生型CVS遺伝子を置換した。大腸菌E.coliを介してDNAを継代することによって、プラスミドライブラリーを調製した。次いで、このDNAライブラリーを使用して、酵母株CALI5-1またはALX7-95を形質転換した。酵母形質転換体を、実施例2に記載したようにスクリーニングした。野生型遺伝子を含有する形質転換体と比較して、上昇したレベルのバレンセン>110を生成した形質転換体野生型レベルの110、すなわち、野生型に対して10増大を、バイアル、振盪フラスコおよび発酵培養において再試験して、バレンセンのより高いレベルの生成を確認した。より高いレベルのバレンセンを生成すると確認された株から得たプラスミドDNAを単離し、配列決定して、変異体バレンセンシンターゼ酵素におけるアミノ酸変化を調べた。表6は、エラープローンPCRを使用して生成されたバレンセンシンターゼ突然変異体を示す。表は、ヌクレオチド突然変異および得られたアミノ酸突然変異あるとすればおよび野生型バレンセンシンターゼと比較した、バレンセンの生成における増大パーセンテージシェーカーフラスコ中で培養された形質転換体を使用して評価されたを含む。シェーカーフラスコ中で培養された場合は、クローンV8は、野生型CVSよりも287多いバレンセンを生成した。次いで、表7に示されるさらなるバレンセンシンターゼ突然変異体を、さまざまな方法を使用して生成した。第1の方法では、標準的な組換えDNAおよびPCR法を使用して、突然変異体V1およびV2におけるアミノ酸突然変異を組み合わせて、V9と指定される変異体を生成した。同様に、変異体V10を、V1、V2およびV3における突然変異の組換えによって作製した。V9およびV10のいずれも、V1に見られたS473Y突然変異を含有していなかったが、これは、V1を、V2またはV3と組み合わせるために使用された制限消化の際に、この突然変異が排除されたからである。次いで、変異体V9から得たプラスミドDNAを、上記の方法を使用するエラープローンPCRに付して、変異体V12、V13、V14およびV15を生成した。次いで、変異体V12から得たプラスミドDNAを、位置429での飽和突然変異誘発に付して、変異体V16を生成し、変異体V16から得たプラスミドDNAを、続いて、位置221での飽和突然変異誘発に付して変異体V17を生成した。表7は、組み合わせた突然変異を有するバレンセンシンターゼ突然変異体を示し、ヌクレオチド突然変異および得られたアミノ酸突然変異あるとすればおよび野生型バレンセンシンターゼと比較した、またはV9およびV10についてはV1変異体と比較したシェーカーフラスコ中で培養された形質転換体を使用して評価された、または変異体V16についてはV12と比較した、または変異体V17についてはV16と比較したバレンセンの生成における増大パーセンテージを含む。シェーカーフラスコ中で培養された場合は、クローンV10は、クローンV1よりも88多いバレンセンを生成した。以下の表8は、3L発酵槽における野生型CVSおよび発酵について上記で同定されたいくつかのCVS変異体のg/Lでの発酵力価を示す。各実験について、変異体は、CALI5-1において発現され、発酵条件は同一とした。したがって、同一実験内で、バレンセン発酵収量において観察された相違は、発現されているバレンセンシンターゼ遺伝子における相違に起因するものであり得る。表8に示されるように、すべてのCVS変異体が、野生型CVSと比較して増大した量のバレンセンを生成した。突然変異体バレンセンシンターゼ遺伝子を含有する酵母形質転換体による増大したバレンセン生成は、アミノ酸位置60、97、209、212、214、221、238、292、333、345、369、405、429、473および536での突然変異は、単独または組合せで、許容されるか、または改善されたバレンセン生成をもたらすのいずれかであるということを示した。これらの位置の一部は、独立した変異体中で複数回同定された。例えば、野生型酵素の位置60のバリンは、変異体V12におけるイソロイシンまたは変異体V15におけるグリシンで置換されており;位置345のアラニンは、変異体V12におけるトレオニンまたは変異体V3におけるバリンのいずれかで置換されており;位置221のチロシンは、変異体V4におけるシステインまたは変異体V17におけるバリンのいずれかで置換されている。位置60、97、209、212、214、221および238は、グリコシルヒドロラーゼに対して相同性を有する、酵素の非触媒ドメイン中に位置している。B.突然変異の組合せを有するバレンセンシンターゼ突然変異体の作製上記の実施例3.A.において、および同様の上記のエラープローンPCR実験同定されたアミノ酸変更を、単一の酵素において組み合わせた。また、バレンセンシンターゼの三次元構造のモデルに従って、タンパク質の表面上にある配列番号2に示されるバレンセンシンターゼの位置24、38、58、88、125、173および252での突然変異も含まれた。各々29のアミノ酸変化を有する2種の変異体酵素を合成した。変異体CVSV18配列番号3およびCVSV19配列番号4は、エラープローンPCRによって、酵素活性に対して有益または中性の効果を有すると先に同定された22種の突然変異およびまた表面残基における7種の突然変異を各々含有していた。V18は、表面残基の各々のアラニンへの突然変異を含有しており、V19は、表面残基の各々のグルタミンまたはアスパラギンへの突然変異を含有していた。表9は、標的とされた位置でのアミノ酸残基を示す。表10は、野生型CVSと比較したCVSV19におけるアミノ酸およびヌクレオチド変化を示す。表11は、野生型CVS配列番号1と比較した、コドン最適化されたCVSV19配列番号129におけるサイレントヌクレオチド変化を示す。コドン最適化されたCVSV18配列番号128およびCVSV19配列番号129遺伝子を、YEp-CVS-uraプラスミドにクローニングし、ALX11-30S.セレビシエcerevisiaeに形質転換した。上記の実施例2に記載されるように、発酵後、各形質転換体によるバレンセン生成を評価した。各形質転換体は、バレンセンを変異体V12に匹敵するレベルで生成した。変異体V12によるバレンセン生成は、CALI5-1細胞において実施されたが、ALX7-95細胞における生成は、2種の株における唯一の相違がleuマーカーの存在下にあるので、同様であると予測される。各形質転換体はまた、野生型バレンセンシンターゼを発現するALX7-95S.セレビシエcerevisiaeよりもおよそ10倍多い力価でバレンセンを生成した。通常、突然変異体によるバレンセンの生成は、野生型CVSの生成レベルの10~20倍である。C.CVSV18およびV19の飽和突然変異誘発CVSV18遺伝子を、N末端ドメインおよびC末端触媒ドメインの一部アミノ酸267~462の種々の残基の飽和突然変異誘発に付し、変更を受け入れられ、バレンセンの生産性によって測定されるような、活性に対して陽性または中性の効果を提供するアミノ酸を同定した。突然変異誘発後、突然変異体遺伝子を含有するプラスミドDNAを、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株ALX7-95に形質転換した。次いで、形質転換体コロニーを、バレンセン生成についてスクリーニングした。次いで、CVSV18遺伝子を含有する形質転換体からのバレンセン生成よりも110より多いバレンセン生成を示した形質転換体に由来するプラスミドDNAを配列決定した。1.突然変異誘発オーバーラップPCRを使用して、遺伝子の種々の位置で突然変異を作製した。突然変異させる各位置について、一対の相補的変異原性プライマーを合成し、各々、突然変異させるアミノ酸位置の各側で相同性の各々15塩基対および突然変異誘発のために標的にされるコドンでランダムヌクレオチドを含有する。所望のコドン変化のための変異原性プライマーを、上流プライマー11-157.75’-AAGGTACCATTTAAAAAAATGTC-3’;配列番号297または下流プライマー11-157.85’-TTTCTCTAGATTAAAATGGAACA-3’;配列番号298のいずれかを用いるPCR反応において使用して、各々、所望のコドンでランダムヌクレオチドを含有する2種のPCR産物を作製した。2種のPCR断片を、2種の断片を等モル比で混合し、5サイクルのプライマーを含まないPCR増幅に付すオーバーラップPCR反応を使用してつなげた。PCR条件は、96°Cで2分間の1サイクル、次いで、94°Cで30秒、38°Cで30秒および72°Cで2分間の5サイクルとした。次いで、20~30のさらなるサイクルを、プライマー11-157.7および11-157.8の存在下、同一PCR条件下で実施した。PCR反応物を、0.1容積の3M酢酸ナトリウムpH4.8および2容積の100エタノールを混合し、微量遠心管中で15分間遠心することによってエタノール沈殿させた。得られたDNAペレットを70エタノールで洗浄した。DNAを、16μLのミリQ精製水に溶解し、その後、1μLのKpnI、1μLのXbaIおよび2μLの10×消化バッファーと組み合わせた。次いで、消化反応物37°Cでインキュベートした。完了した後、制限消化物を1アガロースゲルで流し、ゲルから1.6kbの断片を切り出した。次いで、FreezenSqueeze溶出カラムBio-Radを使用してDNAを溶出した。DNA断片をYEp-CVS-uraのKpnIおよびXbaI部位にライゲーションし、得られたプラスミドをDH10B大腸菌E.coli細胞Invitrogen中にエレクトロポレーションした。形質転換培養物の1/10容積を、LBアンピシリンプレート100μg/mL上にプレーティングし、残りの細胞を、プラスミドDNAの調製のために液体LBアンピシリン100μg/mLに播種した。プレートおよび培養物を、37°Cで一晩増殖させた。LBアンピシリンプレート上で200を超えるコロニーを有する形質転換について、プラスミドDNAの抽出のために3mlのLB培養物を遠心分離した。得られたプラスミドDNA調製物の各々は、変異体遺伝子のプールを含有しており、各プールは、同じ単一のコドンのヌクレオチドにおいてランダム突然変異を有する。各プールから得たプラスミドDNAを、Sigma-Aldrich製の酢酸リチウム酵母形質転換キットを使用してサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株ALX7-95に形質転換した。形質転換体を、28~30°Cで3日増殖させた後、SDE寒天培地0.67の、アミン酸を含まないBacto酵母窒素源基礎培地、2グルコース、0.14のウラシル、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファンを含まない酵母合成ドロップアウト培地、40mg/Lのエルゴステロール上で選択した。2.スクリーニング形質転換体を、バレンセン生成についてスクリーニングするために、マイクロバイアル培養を使用するハイスループットスクリーニング手順を使用した。形質転換体酵母コロニーを、200μLのSDEで満たした、96ウェルのマイクロタイタープレートの個々のウェルに播種した。プレートを28°Cで2~3日間増殖させた。飽和まで増殖させた後、各ウェルから得た10μLを使用して、250μLの増殖およびバレンセン生成に適した培地を含有する2mLのガラスバイアルに播種した。バイアルを血清ストッパー付きキャップで密閉し、次いで、振盪しながら、28°Cで2~3日間インキュベートした。生成物をまず、250μLのアセトンを血清ストッパーを通して入れることおよびボルテックス処理することと、続いて、500μLのn-ヘキサンを添加することおよびボルテックス処理することによって抽出した。相分離後、バイアルをガスクロマトグラフィーオートサンプラーのサンプルトレイに入れ、これがセスキテルペンの分析のために1マイクロリットルの有機相を除去した。抽出のために使用されたアセトンおよびヘキサンは、各々、サンプルの定量化に役立つよう内部標準を添加した。抽出されたサンプルを、ガスクロマトグラフィーによって分析し、ピーク面積からバレンセンの量を算出した。CVSV18に対して>110のバレンセンを生成した突然変異体をまた、振盪フラスコにおいてスクリーニングした。10mLのSDE培地中の種培養を、24時間増殖させ、2.5mLを使用して、250バッフルなしフラスコ中の、50mLの発酵培地2硫酸アンモニウム、2リン酸カリウム、0.1NaCl、0.6MgSO47H2O、0.4酵母抽出物、1mL無機溶液[FeSO47H2O0.028、ZnSO47H2O0.029、CuSO45H2O0.008、Na2MoO42H2O0.024、CoCl26H2O0.024、MnSO4H2O0.017、HCl1mL]、0.5mlの50グルコース、1.5mlのビタミン溶液[ビオチン0.001、パントテン酸Ca0.012、イノシトール0.06、ピリドキシン-HCl0.012、チアミン-HCl0.012]、0.5ml10CaCl2に播種した。培養物を28°Cで増殖させた。16時間インキュベートした後、培養物に3.6mlの50グルコースおよび0.667mlの12.5酵母抽出物を供給した。供給は、最初の供給の24毎後に行った。培養物のpHを、24時間毎に、30NaOHを添加して4.5に調整した。およそ88時間インキュベーションした後、0.1mlのIGEPALCA-630を添加し、培養物を振盪しながらインキュベートして、植物油を十分に乳化させた。30分後、2mLの培養サンプルを採取した。サンプルを、2mLのアセトン/セドレン溶液を用いて抽出し、次いで、4mLのヘキサン/ヘキサデカン溶液を用いて抽出した。アリコートを、GCによって分析し、バレンセンの量を決定した。3.結果a.突然変異に対する許容性についての最初のスクリーニング以下の表12は、アミノ酸位置およびそのバレンセン生成によって決定されるような、突然変異に対するその一般的な許容度のまとめを提供する。表12は、突然変異したアミノ酸の位置、各アミノ酸の存在する二次構造ならびに親CVSV18によって生成されたバレンセンのパーセンテージと比較して、<30のバレンセンおよび>90のバレンセンを生成したサンプルのパーセンテージを示す。親CVSV18と比較して、サンプルの≧50が<30または>90バレンセンを生成した生成したアミノ酸位置を強調した。例えば、アミノ酸位置271では、親CVSV18によるバレンセンの生成と比較して、試験された96サンプルのうち72サンプル75が、<30のバレンセンを生成し、試験された96サンプルのうち3サンプル3.13が、>90のバレンセンを生成した。したがって、この位置を不変またはほぼ不変と考えた。対照的に、アミノ酸位置282では、サンプルの91.5688サンプルが、親CVSV18と比較して、>90のバレンセンを生成し、4.17のみが<30のバレンセンを生成した。この位置は、変化に対して中程度に耐容性であると考えた。したがって、以下の表12に示されるように、アミノ酸位置267、269、270、271、273、295、298、301、302、303、305、306、312、403、404、407、442、445および446は、低活性の変異体の占める割合が高く、これらの位置は、比較的不変であると考えた。対照的に、アミノ酸位置92、166、171、184、202、218、281、282、293、320、333、337、344、347、352、353、355、357、360、361、362、363、364、366、367、386、415および428は、高活性を有する変異体の割合が高く、これらの位置は、変化に対して特に許容性であると考えた。b.不変および許容性アミノ酸のさらなる分析ランダム化の全体的な有効性を調べるために、アミノ酸270で突然変異した19種の独立した細菌クローンを、無作為に選択し、配列決定して突然変異を同定した。これらの19種の独立した細菌単離物のうち、1種も元のコドンを保持していなかった。2種の単離物が、変化したコドンによって野生型アミノ酸ロイシンをコードしておりサイレント突然変異、1種の単離物がアミノ酸270に停止コドンを有していた。残りのクローンは、種々のその他のアミノ酸をコードしていた。アミノ酸残基270、不変であるかまたはほぼ不変であると決定されたアミノ酸での、個々の突然変異体単離物をさらに分析した。上記の表に示されるように、アミノ酸270では、11.46の単離物しか、親CVSV18レベルと比較して30を超えるバレンセンを生成しなかった。これらのサンプルのうち2種は、2種のCVSV18対照であった。したがって、94種の突然変異体サンプルのうち10種10.63しか、有意なレベルのバレンセンを生成しなかった。これらの単離物および1種のバレンセンを生成しない単離物を、その突然変異体プラスミドのDNA配列決定に付した。バレンセンを生成する単離物のうち99種が、ロイシンをコードしていたが、元のコドンは、TTGから、CTC、CTA、CTTまたはTTAに突然変異していた。唯一のその他のバレンセンを生成する単離物は、野生型Leu270をコードしていたが、アミノ酸269に、DNAプライマー配列内の明らかなエラーによる、またはPCR増幅の際に導入された突然変異を有していた。配列決定した、バレンセンを生成しない単離物は、突然変異L270Eを含有していた。飽和突然変異誘発スクリーニングにおいて変化に対して中程度の許容性と同定された5種のアミノ酸位置から得た個々の突然変異体単離物をさらに分析した。アミノ酸位置274、279、281、282および284について同定された最高にバレンセンを生成する突然変異体単離物を、マイクロバイアル培養において再増殖させ、上記の実施例3.C.2に記載されるようにそのバレンセン生成を調べた。さらに、最大24種の独立したクローンを配列決定して、正確なアミノ酸突然変異を調べた。表13は、同定された突然変異体を示す。これらの突然変異の各々は、CVSV18に存在する29種の突然変異上記の実施例3.Bに記載されるに加えて存在する。最初のミクロ培養において生成されたバレンセンの量およびCVSV18によって生成されたレベルに対する、バレンセン生成レベル3以上のマイクロバイアル培養の平均から得たも、表に含まれている。一部の例では、野生型アミノ酸コドンが維持されていた。その他の例では、核酸突然変異はサイレントであり、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、CVSV18のものと同一であった。サイレント突然変異は、イタリック体で示されている。その他の例では、突然変異は、標的とされる突然変異に加えて観察され、PCR増幅の際に導入されたエラーによる可能性が高い。最初のスクリーニングでは、アミノ酸残基274でスクリーニングされた94種の突然変異体のうち67.71が、親のCVSV18によるバレンセンの生成と比較して>90のバレンセンを生成した。同定された突然変異体の多数が、親のCVSV18突然変異体で形質転換された細胞から生成されたバレンセンの正常より低い量の結果である可能性が高かった。CVSV18で形質転換した細胞から生成されたバレンセンの量が、より通常である反復スクリーニングを実施し、より少ない突然変異体が同定された。反復試験では、同定された14種の独立した突然変異体単離物を配列決定することによって、親のCVSV18と比較して>90のバレンセン生成を有する単離物のみが、野生型残基D274を含有するものであることを示した例えば、突然変異体V84およびV92参照のこと。全体で、7種の異なる突然変異が同定され、14種の突然変異体単離物のうち8種が、突然変異D274M、D274NまたはD274Gを含有する。最初のスクリーニングでは、アミノ酸残基279でスクリーニングされた94種の突然変異体のうち54.17が、親のCVSV18によるバレンセンの生成と比較して>90のバレンセンを生成した。24種の独立した突然変異体単離物の反復試験および配列決定によって、11種の異なるアミノ酸をコードする23種の反復培養のうち19種が、親のCVSV18と比較して>90のバレンセンを生成することが示された。最初のスクリーニングでは、アミノ酸残基281でスクリーニングされた94種の突然変異体のうち88.54が、親のCVSV18によるバレンセンの生成と比較して>90のバレンセンを生成し、変化に対して中程度に許容性であると考えられた。20種の独立した突然変異体単離物の反復試験によって、すべての突然変異体単離物が親のCVSV18と比較して≧90のバレンセンを生成することが示された。20種の突然変異体単離物のうち1111種が、突然変異P281A、P281L、P281SまたはP281Kを含有していた。最初のスクリーニングでは、アミノ酸残基282でスクリーニングされた94種の突然変異体のうち91.67が、親のCVSV18によるバレンセンの生成と比較して>90のバレンセンを生成した。18種の独立した突然変異体単離物の配列決定によって、18種の突然変異体単離物のうち11種が、アミノ酸突然変異Q282S、Q282A、Q282R、Q282PまたはQ282Lを含有していることが示された。最初のスクリーニングでは、アミノ酸残基284でスクリーニングされた94種の突然変異体のうち40.63が、親のCVSV18によるバレンセンの生成と比較して>90のバレンセンを生成した。23種の独立した突然変異体単離物の反復試験および配列決定によって、11種の異なるアミノ酸をコードする23種の反復培養物のうち14種が、親のCVSV18と比較して>90のバレンセンを生成することが示された。3種の単離物は、野生型アミノ酸A284をコードしていた。c.増大したバレンセンを生成する単離物CVSV18遺伝子を含有する形質転換体に対して110超のバレンセンを生成するすなわち、CVSV18に対して10増大と、上記の実験において同定された形質転換体からプラスミドDNAを抽出し、CVS遺伝子の核酸配列を調べた。以下の表14は、この基準を満たす単離された突然変異体の結果を示す。表14は、配列決定によって見られたアミノ酸およびヌクレオチド変化を示す。これらの突然変異の各々は、CVSV18において存在する29種の突然変異に加えて存在する上記の実施例3.Bに記載される。CVSV18によって生成されたレベルに対するバレンセン生成レベル振盪フラスコにおける培養から測定されたも、表中に含まれている。一部の例では、核酸突然変異は、サイレントであり、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、CVSV18のものと同一であった。サイレント突然変異は、イタリック体で示されている。その他の例では、突然変異は、標的とされる突然変異に加えて観察され、PCR増幅の際に導入されたエラーによる可能性が高い。クローンV40は、アミノ酸突然変異A38Vを含有する。親遺伝子CVSV18は、突然変異Q38Aを含有する。したがって、クローンV40中の突然変異は、野生型CVSのQ38Vに対応する。組合せ突然変異体この例では、実施例3で同定された突然変異の組合せを含有するCVS変異体を作製した。さらに、種々のさらなる突然変異体を作製した。A.飽和突然変異誘発によって同定された有益な突然変異の組合せ上記の実施例3に記載されるように同定された有益な突然変異を、オーバーラップPCR法XiongetalNucleicAcidsResearch32e98を使用して、鋳型としてCVSV19を用いて組み合わせた。表15は、上記の表14において同定された位置に突然変異を含有する作製された一連の38種のオリゴを示す。表15に列挙されたオリゴは、ユニークな内部NdeI制限部位から始まりユニークなBglII制限部位までのV19遺伝子の領域に及ぶ。各オリゴは、8種の重複する配列群のうちの1種に属する。配列群は、以下の表16に示されている。単一の配列群内の各オリゴは、示されたアミノ酸の野生型コドンまたは突然変異体コドン単数または複数のいずれかを提供する。群間の配列重複は、40~50°Cの融点を生じるよう設計した。NdeIおよびBglII領域の完全な突然変異誘発されたDNA断片を得るために、8種の配列群各々に由来する1種または複数のオリゴを、種々のPCR反応において組み合わせた。各PCR反応では、群1および8に由来するオリゴ単数または複数を、50μLの反応物あたり30pmolの総濃度で使用した。群2から7のオリゴは、オリゴ群あたり、50μLの反応物あたり1.5pmolの総濃度で使用した。最初の変性サイクルは、95°Cで2分とした。タッチダウンPCR熱サイクリングプロトコールを使用し、これでは、46°Cの最初のアニーリング温度を、38°Cの最後のアニーリング温度が達成されるまで、2サイクル毎に2°C低下させた。38°Cのアニーリング温度を用いる22サイクルを含めた合計30のPCRサイクルを完了した。各サイクルは、30秒の変性工程、30秒のアニーリング工程および2分間の伸長工程からなっていた。PCRプロトコールは、7分の伸長工程で終了した。完了したPCR反応生成物を、Qia-quickゲル抽出カラムQiagenまたはFreezeandSqueezeカラムBio-Radのいずれかを使用して1.2アガロースゲルからゲル精製した。浄化したPCR産物を制限酵素NdeIおよびBglIIで消化し、YEp-CVS-UVAのNdeIおよびBglII部位にライゲーションした。ライゲーションを、上記の実施例3.C.2に記載されるように大腸菌E.coliDH10B細胞にエレクトロポレーションした。上記の実施例3.C.2に記載されるマイクロバイアル法を使用して突然変異体をスクリーニングし、V19の>110のバレンセン生産性を有する突然変異体を、振盪フラスコ培養においてさらにスクリーニングした。上記の実施例3.C.2に記載されるマイクロバイアル法を使用し、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeのALX11-30ura3、trp1、erg9def25、HMG2cat/TRP1::rDNA、dpp1、sue株を使用して、種々の突然変異をさらにスクリーニングした。以下の表17は、核酸およびアミノ酸突然変異を含めた同定された突然変異体ならびにCVSV19遺伝子を含有する形質転換体のバレンセン生成に対する振盪フラスコ培養におけるバレンセン生成を示す。表中に示される突然変異は、上記の実施例3.Bに記載される、CVSV19中に存在する29種の突然変異に加えたものである。一部の例では、核酸突然変異はサイレントであるので、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、CVSV19のものと同一である。サイレント突然変異は、イタリック体で示されている。例えば、ALX7-95細胞では、変異体V58は、CVSV19のバレンセン生成と比較して99.91のバレンセンを生成する。配列決定の結果、V180およびV181の部分的な配列データのみが得られた。B.さらなるバレンセンシンターゼ突然変異体の作製次いで、標準的な組換えDNAおよびPCR法を使用して、表19に示されるさらなるバレンセンシンターゼ突然変異体を生成した。表に示される突然変異は、上記の実施例3.Bに記載されるCVSV19中に存在する29種の突然変異に加えたものである。突然変異体V46、V43およびV41上記の表14参照のことにおいて同定されたアミノ酸突然変異を、標準的な組換えDNAおよびPCR法を使用して組み合わせて、V184およびV185と指定される変異体を生成した。V184およびV185を作製するために、プライマー21-73.39および7-10.4以下の表18参照のことを、鋳型として突然変異体V41に由来するプラスミドDNAを用いる単一のPCR反応において使用した。変異体V73およびV74は、V62およびV66における突然変異の組換えによって作製した。変異体V75およびV76は、V62およびV67における突然変異の組換えによって作製した。変異体V73、V74、V75およびV76はすべて、以下の例外を入れて、実施例3Cに記載されるオーバーラップPCR技術を使用して作製した。第1の段階では、プライマー7-10.3および21-71.42を、一反応において使用してV62の部分を増幅し、部分PCRsectionPCRにおいてプライマー21-71.41および7-10.4を使用して、V66またはV67いずれかの部分を増幅した。次いで、プライマー7-10.3および7-10.4を使用して、2種の第1段階産物から全長遺伝子を作製した。上記の実施例3.C.2に記載されたマイクロバイアル法を使用し、ALX7-95またはALX11-30のいずれかにおいて突然変異体をスクリーニングし、V19の>110のバレンセン生産性を有するすなわち、野生型より10多いバレンセンが生成された突然変異体を、振盪フラスコ培養においてさらにスクリーニングした。以下の表19は、核酸およびアミノ酸突然変異を含めた同定された突然変異体ならびにCVSV19遺伝子を含有する形質転換体のバレンセン生成に対する振盪フラスコ培養におけるバレンセン生成を示す。表中に示される突然変異は、上記の実施例3.Bに記載される、CVSV19中に存在する29種の突然変異に加えたものである。一部の例では、核酸突然変異はサイレントであり、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、CVSV19のものと同一である。サイレント突然変異は、イタリック体で示されている。V75変異体は、生成物分布の改善を有し、その結果、β-エレメンとして測定される副生成物ゲルマクレンAの生成のおおよそ50の低減をもたらすとわかった。C.さらなるバレンセンシンターゼ突然変異体の作製種々の方法を使用して、さらなる追加のバレンセンシンターゼ突然変異体を生成した。突然変異体は、小節a-eにおいて以下に記載されるように作製した。作製された突然変異体のすべてを、上記の実施例3.C.2に記載したマイクロバイアル法を使用して、ALX7-95においてスクリーニングし、CVSV19の>110のバレンセン生産性すなわち、CVSV19に対してバレンセンの10増大を有する突然変異体を、振盪フラスコ培養においてさらにスクリーニングした。一部の例では、V19力価の少なくとも90を有していた突然変異体または酵素特異性の増大などのその他の望ましい特徴を有していた突然変異体を、振盪フラスコ培養においてスクリーニングした。同定された突然変異体を配列決定した。以下の表20~24は、核酸およびアミノ酸突然変異を含めた同定された突然変異体ならびにCVSV19遺伝子を含有する形質転換体のバレンセン生成に対する最初のミクロ培養および振盪フラスコ培養におけるバレンセン生成パーセントを示す。示される場合には、表中に示される突然変異は、上記の実施例3.Bにおいて記載されたCVSV19中に存在する29種の突然変異に加えたものである。一部の例では、核酸突然変異はサイレントであり、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、CVSV19のものと同一であった。さらに、突然変異体CVSV19をコードする核酸配列番号129は、酵母に対してコドン最適化されている。したがって、サイレント突然変異の一部は、野生型CVSのものと同一であるコドンをもたらした。例えば、突然変異体V182では、ロイシン293は、野生型CVSコドンTTAによってコードされているが、親CVSV19コドンは、TTGであった。すべてのサイレント突然変異は、イタリック体で示されている。いくつかの突然変異体は、突然変異Q58Kを含有する。親の遺伝子CVSV19は、突然変異K58Qを含有する。したがって、この突然変異は、野生型CVSと比較して、核酸コドンの変化を有するとしても野生型CVSではAAG、突然変異体CVSではAAAサイレントである。a.V186、V77、V187、V78、V188、V189、V190、V79、V191、V192、V193、V194およびV195CVS変異体V186、V77、V187、V78、V188、V189、V190、V79、V191、V192、V193、V194およびV195を、フォワードオリゴmutCVS2-7配列番号337およびリバースオリゴ7-10.4配列番号339を使用して、CVSV19遺伝子から単一PCR反応によって作製した。PCR精製、制限消化、ライゲーション、形質転換および試験は、上記の節Aに記載したように実施した。突然変異は、上記の実施例3.Bにおいて記載したCVSV19配列番号4中に存在する29種の突然変異に加えたものであった。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表20に示されている。b.V196、V197、V198、V200、V201、V202、V203、V204、V205、V206、V207、V212、V213、V214、V215、V216およびV217CVS変異体V196、V197、V198、V200、V201、V202、V203、V204、V205、V206、V207、V212、V213、V214、V215、V216およびV217は、L106、R132、M153、H159、Q188、I189、P202、I213、H219、I397およびK474を含めた種々のアミノ酸で突然変異を含有する。これらの突然変異体を、それぞれ、プライマー11-157.7および11-157.8の代わりに、アウタープライマー7-10.3および7-10.4表18参照のことを使用した点を除いて、実施例3C.1に記載したように、CVSV19遺伝子のアミノ末端非触媒ドメインの単一アミノ酸位置の飽和突然変異誘発によって作製した。PCR精製、制限消化、ライゲーション、形質転換および試験は、上記の節Aに記載したように実施した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表21に示されている。突然変異は、変異体V202を除いて、上記の実施例3.Bにおいて記載したCVSV19配列番号4中に存在する29種の突然変異に加えたものであった。以下の表21に示されるように、野生型CVSは、残基219にヒスチジンを含有し、CVSV19は、残基219にアスパラギン酸を含有するのに対し、V202は、残基219にアラニンを含有する。c.V199、V208、V209、V210およびV211CVS変異体V199、V208、V209、V210およびV211は、アミノ酸53から58に突然変異を含有し、フォワードオリゴ21-108-1配列番号340およびリバースオリゴ21-108-2配列番号341表18を参照のことを使用して、CVSV19遺伝子から単一PCR反応によって作製した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表22に示されている。V209は、PCR増幅の際に導入された、L106の突然変異をさらに含有する。d.V220、V221、V222、V223、V224、V225およびV226CVS変異体V220、V221、V222、V223、V224およびV225を、V75遺伝子を鋳型として使用して、実施例4.C.aにおけるものと同様の、2段階オーバーラップPCRプロトコールによって作製した。V226は、鋳型としてV75を使用して生成した変異体に対する比較として、鋳型としてV19遺伝子を使用した。第1段階PCR反応は、アウタープライマー7-10.4とともの変異原性プライマー21-140.1またはアウタープライマー7-10.3とともの変異原性プライマー21-140.2のいずれかを使用した表18参照のこと。これらの変異原性プライマーは、V75を含めたCVSV19のアミノ酸212~221のコドンまたはその誘導体を同時にランダム化する。第2段階PCR反応は、プライマー7-10.3および7-10.4を使用した。PCR精製、制限消化、ライゲーション、形質転換および試験は、上記の節Aに記載したように実施した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表23に示されている。V223は、V75に見られたP281S突然変異を含有せず、V224は、A319Tのさらなる突然変異を有する。これらの突然変異は、PCR増幅の際に導入された。e.CVS変異体V227CVS変異体V227を、アミノ酸残基F209に突然変異を導入するフォワードおよびリバースプライマーを使用して、V75遺伝子から単一のPCR反応によって作製した。野生型CVSおよびCVSV19両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化を含めたCVS変異体V227ならびにCVSV19に対するバレンセン生成が、以下の表24に示されている。その他のテルペンシンターゼに由来するドメインまたは領域を含有する変異体この例では、タバコNicotianatabacumから得た5-エピ-アリストロチェンシンターゼTEAS、配列番号941、ヒオシアムスムチクスHyoscyamusmuticusに由来するプレムナスピロジエンシンターゼHPS、配列番号942またはブドウVitisviniferaに由来するバレンセンシンターゼ配列番号346に由来する異種アミノ酸を含有するCVS変異体を作製した。突然変異体を、以下および小節a-kに記載したように作製した。一般に、CVS変異体は、複数のコドン位置に突然変異を同時に導入するプライマーを使用して、上記の実施例3.C.1.に記載されたようなPCR法の改変によって作製した。オーバーラップPCRを使用して、V75、V19の特定の表面ループに複数の突然変異またはこれらの変異体のうち後者の誘導体を作製した。突然変異させる各ループについて、一対の相補的変異原性プライマーを合成し、各プライマーは、スワップされるアミノ酸位置の各側で配列同一性の15~20塩基対を含有していた。一部の例では、突然変異誘発の標的とされるループ中にランダムヌクレオチドが存在していた。所望のループ変化のための変異原性プライマーを、上流プライマー11-154.3配列番号928または下流プライマー11-154.4配列番号927のいずれかを用いるPCR反応において使用して、各々、所望のコドンで異種バレンセンシンターゼ遺伝子に由来するランダムヌクレオチドまたはコドンのいずれかを含有する2種のPCR産物を作製した。PCR条件は、96°Cで2分間の1サイクル、次いで、94°Cで30秒、50°Cで30秒および72°Cで2分間の20~30サイクルとした。各反応に対して、一段階のPCRのみを実施した。得られたPCRによって作製された遺伝子断片は、各々、外側末端でYEp-CVS-uraベクターとの、また内側末端で適合するPCR産物との重複の30~200ヌクレオチドを有していた。PCR反応物を1アガロースゲルに流し、設計された断片の大きさを含有するバンドをゲルから切り出した。次いで、QiaquickカラムQiagenを使用してDNAを溶出した。YEp-CVS-uraベクターを、制限酵素KpnIおよびXbaIで消化し、1アガロースゲルで精製し、約6.4kbの断片を含有するバンドをゲルから切り出した。次いで、DNAを、QiaquickカラムQiagenを使用して溶出した。およそ250ngの他の物質が入っていない、消化されたプラスミドDNAおよび他の物質が入っていないPCR産物各々の250ngを混合し、混合物を、Sigma-Aldrich製の酢酸リチウム酵母形質転換キットを使用して、直接、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株Alx7-95に形質転換した。酵母相同組換えによって完全なプラスミドを作製した形質転換体を、SDE寒天培地0.67の、アミノ酸を含まないBacto酵母窒素源基礎培地、2グルコース、0.14の、ウラシル、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファンを含まない酵母合成ドロップアウト培地、40mg/Lエルゴステロールで、28~30°Cで3日間増殖させた後、選択した。作製された突然変異体のすべてを、上記の実施例3.C.2に記載されたマイクロバイアル法を使用してALX7-95においてスクリーニングし、CVSV19の>110のバレンセン生産性すなわち、CVSV19に対してバレンセンの10増大を有する突然変異体を、振盪フラスコ培養においてさらにスクリーニングした。同定された突然変異体を配列決定した。以下の表26~37は、核酸およびアミノ酸突然変異を含めた同定された突然変異体ならびにCVSV19遺伝子を含有する形質転換体のバレンセン生成に対する、最初のミクロ培養および振盪フラスコ培養におけるバレンセン生成パーセントを示す。一部の例では、核酸突然変異はサイレントであり、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、CVSV19のものと同一であった。さらに、突然変異体CVSV19をコードする核酸配列番号129は、酵母に対してコドン最適化されている。CVSV19において見られるものとは異なるサイレント突然変異表11参照のことは、イタリック体で示されている。いくつかの突然変異体は、突然変異Q58Kを含有する。親遺伝子CVSV19は、突然変異K58Qを含有する。したがって、この突然変異は、野生型CVSと比較して、核酸コドンの変化を有するとしても野生型CVSではAAG、突然変異体CVSではAAAサイレントである。以下の表では、ダッシュ記号は、欠失または挿入を示す。例えば、L175およびV176に対応するヌクレオチドは、V232では欠失しており、したがって、得られる変異体は、野生型CVSよりも2アミノ酸短い。反対に、V239は、残基R91、A92およびD93で3アミノ酸の挿入を含有する。a.V228、V229、V230およびV231CVS変異体V228、V229、V230およびV231では、プライマー7-10.4および7-10.3表25参照のことを用いて、上記のように、CVSのアミノ酸53~58を、TEAS配列番号295のアミノ酸58~63によって置換した。CVS変異体V229は、標準的な組換えDNAおよびPCR法を使用して、変異体V228およびV73における突然変異の組換えによって作製した。CVS変異体V230およびV231は、変異体V228およびV75における突然変異の組換えによって作製した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表26~27に示されている。b.V232、V233、V234、V235、V236、V237およびV238CVS変異体V232、V233、V234、V235、V236、V237およびV238では、アミノ酸174~184を、アウタープライマー11-154.3および11-54.4とともに変異原性プライマー21-134.9および21-134.10を使用して表25参照のこと、上記の直接酵母組換え法によって、HPSに由来する同等なアミノ酸配列番号942のアミノ酸185~193によって置換した。CVS変異体V232、V233、V234、V235およびV236は、鋳型としてV75配列番号130を使用して作製した。CVS変異体V237は、V235およびV236における突然変異の組換えによって作製した。この変異体は、ランダムPCRエラーによって生じたE484での突然変異をさらに含有していた。V237を、Alx7-95から単離し、配列決定した。並行して、V237を、Alx11-30における試験のために、その株に形質転換した。V238を、Alx11-30から再度単離した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表28に示されている。HPSの対応する配列は、CVSのものよりも2アミノ酸短いので、これらのCVS変異体のすべてが、2個のアミノ酸の欠失を含有する。c.V239、V240およびV241CVS変異体V239、V240およびV241では、上記のような直接酵母組換えによって、アミノ酸53~58を、TEAS配列番号941のアミノ酸58~63によって置換し、アミノ酸85~99を、HPS配列番号942のアミノ酸93~110によって置換し、アミノ酸174~184を、HPS配列番号942のアミノ酸185~193またはTEAS配列番号941の177~185によって置換した表25参照のこと。HPSのアミノ酸185~193は、TEASのアミノ酸177~185と同一である。これらの突然変異体は、2種のPCR断片から作製した。第1の断片を作製するために、オリゴ11-154.3および変異原性プライマー21-130.4を用い、V228変異体を鋳型として使用した。第2の断片を作製するために、アウターオリゴ11-154.4および変異原性プライマー21-130.3を用い、V237/V238を鋳型として使用した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表29に示されている。アミノ酸85~99および174~184を置換するためのHPSループの使用は、それぞれ、3個のアミノ酸残基の付加および2個のアミノ酸残基の欠失をもたらし、結果として、野生型CVSよりも1個のアミノ酸長いタンパク質が得られる。V228およびV237/V238に由来する設計された突然変異に加えて、V239は、PCRエラーの結果であると思われる、L111での突然変異を含有する。同様に、V240もまた、R19での突然変異を有する。d.V242CVS変異体V242では、アミノ酸212~222を、上記の直接酵母組換えによってHPSのアミノ酸221~228によって置換した表25参照のこと。このCVS変異体は、変異原性プライマー21-141.6を用い、アウタープライマー11-154.3を使用して、変異原性プライマー21-141.5を用い、11-154.4を使用して、鋳型としてのV75から作製した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表28に示されている。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表30に示されている。HPSの対応する配列が、CVSのものよりも2アミノ酸短いので、この変異体は、2個のアミノ酸欠失を含有する。多数のクローンのスクリーニングによって、V242以外のすべてが、V19の約77の力価を有するのに対し、V242は、V19力価の95の力価を有することが示された。配列決定によって、突然変異体V242は、配列IYEEEGFKを含有するのに対し、HPSのアミノ酸221~228は、IYEEEEFKであることが示された。この矛盾は、オリゴ合成の際に生じる可能性が最も高かった。e.V243、V244、V245およびV255CVS変異体V243、V244、V245およびV255では、上記のような直接酵母組換えによって、アミノ酸53~58を、TEAS配列番号941のアミノ酸58~63によって置換し、アミノ酸85~99を、HPS配列番号942のアミノ酸93~110によって置換し、アミノ酸174~184を、HPS配列番号942のアミノ酸185~193またはTEAS配列番号295の177~185によって置換した表27参照のこと。これらの変異体は、V75からの突然変異をさらに含有する。さらに、アミノ酸212~221を、1TEASのアミノ酸213~221または2ブドウVitisviniferaバレンセンシンターゼ配列番号346のアミノ酸223~230によって置換した。これらのCVS変異体は、上記の表25に示されるプライマーを用い、V240を鋳型として使用して作製した。V243およびV244は、変異原性プライマー21-145.1および21-145.5を、アウターオリゴ11-154.3および11-154.4と一緒に用い、V240を鋳型として使用して作製した表25参照のこと。V245およびV255CVS変異体は、上記の表25に示されるような、変異原性プライマー21-145.3および21-145.4を用い、V240を鋳型として使用して作製した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表31に示されている。V244は、おそらくは、PCRの際に導入された、V243には見られない突然変異I325Tを含有する。各々、CVS位置212~221にブドウVitisviniferaバレンセンシンターゼ配列を有する変異体V245およびV255は、おそらくは、PCRの際に生じた単一ヌクレオチド変化によって異なり、これは、V255において予期しないQ448からL447への突然変異をもたらす。f.V246、V247、V248、V249、V250、V251、V252、V253、V254およびV272CVS変異体V246、V247、V248、V249、V250、V251、V252、V253、V254およびV272では、上記のように、アミノ酸53~58を、TEAS配列番号941のアミノ酸58~63によって置換し、アミノ酸85~99を、HPS配列番号942のアミノ酸93~110によって置換し、アミノ酸174~184を、HPS配列番号942のアミノ酸185~193またはTEAS配列番号941の177~185によって置換した。さらに、アミノ酸212~222を、ランダムアミノ酸によって置換した。CVS変異体V246、V247、V248、V249、V250、V253およびV254を、V240およびV19を、上記の表25に示されるオリゴを用いる2つのPCR反応の鋳型として使用して、実施例4C.d.に記載されたように作製した。例えば、V246は、アミノ酸位置212~221を改変するために、アウターオリゴ11-154.3および11-154.4を用い、ランダム変異原性オリゴ21-140.1および21-140.2を使用して生成した。11-154.3および21-140.2を用いるPCR反応は、V240を鋳型として使用したが、第2の反応は、V19を鋳型として使用した。CVS変異体V251およびV252は、V241およびV19を2つのPCR反応の鋳型として使用して、実施例4.C.a.に記載されたように作製した。V272は、V240を両PCR反応における鋳型として使用した以外は、実施例4C.d.におけるように作製した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表32に示されている。CVSV19のバレンセン力価のおよそ77を生成するが、多量のb-エレメンをさらに生成するいくつかのさらなる単離物を同定した。g.V256、V257、V258、V259、V261、V263、V264、V262、V260、V265、V266およびV273CVS変異体V256、V257、V258、V259、V261、V263、V264、V262、V260、V265、V266およびV273では、上記のように、アミノ酸53~58を、TEAS配列番号941のアミノ酸58~63によって置換し、アミノ酸85~99を、HPS配列番号942のアミノ酸93~110によって置換し、アミノ酸174~184を、HPS配列番号942のアミノ酸185~193またはTEAS配列番号941の177~185によって置換した。V243またはV244を鋳型として使用して作製した一部の変異体はまた、TEASのアミノ酸213~221によって置換されたアミノ酸212~221を含有していた。これらの変異体は、V75からの突然変異をさらに含有する。さらに、アミノ酸2~7を、ランダムアミノ酸によって置換した。これらのCVS変異体は、変異原性プライマーmutCVS2-7およびrevAA2-7rnd表18参照のことを使用する直接酵母組換えによって、V240、V243またはV244を鋳型として使用して作製した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表33に示されている。h.V267、V268、V269、V270およびV271CVS変異体V267、V268、V269、V270およびV271では、上記のように、アミノ酸53~58を、TEAS配列番号941のアミノ酸58~63によって置換し、アミノ酸85~99を、HPS配列番号942のアミノ酸93~110によって置換し、アミノ酸174~184を、HPS配列番号942のアミノ酸185~193またはTEAS配列番号941の177~185によって置換した。これらの変異体は、L106V267またはF209V268~V271でのランダム突然変異をさらに含有する。CVS変異体V267、V268、V269、V270およびV271は、上記の表25に示されるプライマーを用い、V240を鋳型として使用して作製した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表34に示されている。i.V274およびV277CVS変異体V274およびV277では、アミノ酸3~41を、ブドウVitisvinafera配列番号346のアミノ酸3~51によって置換し、アミノ酸53~58を、TEAS配列番号941のアミノ酸58~63によって置換し、アミノ酸85~99をHPS配列番号942のアミノ酸93~110によって置換し、アミノ酸174~184をHPS配列番号942のアミノ酸185~193またはTEAS配列番号941の177~185によって置換した。CVS変異体V274は、上記の表25に示されるプライマーを用い、V240を鋳型として使用する直接酵母組換えによって作製した。CVS変異体V277は、上記の表25に示されるプライマーを用い、V245を鋳型として使用する直接酵母組換えによって作製した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表35に示されている。j.V275およびV276CVS変異体V275およびV276では、上記のように、アミノ酸85~99を、ブドウVitisvinifera配列番号346のアミノ酸96~113によって置換した表25参照のこと。CVS変異体V275およびV276は、V75を鋳型として使用する直接酵母組換えによって作製した。上記の表25に示されるオリゴを用い、オリゴ11-154.4を用いる単一のPCR反応において変異原性オリゴ21-141.7を使用し、オリゴ11-154.3を用いる単一のPCR反応において変異原性オリゴ21-141.8を使用した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表36に示されている。V275およびV276は、1つの突然変異、V276におけるY387→C389で異なる。k.V278、V279、V280およびV281CVS変異体V278、V279、V280およびV281を、以下の例外を入れて、実施例3.aに記載されたように、V240およびV245を鋳型として使用してエラープローンPCRによって作製した。第1に、プライマー11-154.3および11-154.4表25参照のことを、PCR反応において使用した。第2に、実施例5.1におけるような直接酵母組換えによってクローニングを達成した。変異体が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表37に示されている。さらなるバレンセンシンターゼ突然変異体の作製およびスクリーニングなおさらなるバレンセンシンターゼ突然変異体を、種々の方法を使用して生成した。突然変異体を、小節a~fにおいて以下に記載されるように作製した。上記の実施例3.C.2において記載したマイクロバイアル法を使用し、ALX7-95において突然変異体をスクリーニングし、CVSV19の>110のバレンセン生産性すなわち、CVSV19に対してバレンセンの10増大を有する突然変異体を、振盪フラスコ培養においてさらにスクリーニングした。以下の表38~40は、設計された配列に基づくアミノ酸変化を示し、突然変異体を配列決定しようと試みたが、成功しなかった。表はまた、CVSV19遺伝子を含有する形質転換体のバレンセン生成に対する、最初のミクロ培養および振盪フラスコ培養におけるバレンセン生成パーセントも示す。a.V282CVSV19配列番号129を鋳型として使用してV282を作製した。CVS変異体V282では、上記のように、アミノ酸53~58を、TEAS配列番号941のアミノ酸58~63によって置換し、アミノ酸85~99を、HPS配列番号942のアミノ酸93~110によって置換し、アミノ酸174~184を、HPS配列番号942のアミノ酸185~193またはTEAS配列番号941の177~185によって置換し、アミノ酸212~221を、ランダムアミノ酸によって置換した表27参照。この突然変異体は、実施例5fにおいて上記で記載されるように調製した。b.V283CVS変異体V283を、V241を鋳型として使用し、CVS変異体V246について上記の実施例5fに記載されたように作製した。CVSV19と比較して>77のバレンセンを生成するが、多量のb-エレメンをさらに生成するいくつかのさらなる単離物を同定した。c.V284およびV285CVS変異体V284およびV285を、V240を鋳型として使用し、CVS変異体V246について実施例5fにおいて記載したように作製した。CVSV19のバレンセン力価のおよそ77超を生成するが、多量のb-エレメンをさらに生成するいくつかのさらなる単離体を同定した。d.アミノ酸212~221からランダム化された残基を含有する変異体CVSV19およびV75を鋳型として使用して、アミノ酸212~221からランダム化された残基を含有するさらなるCVS変異体を作製した。これらの突然変異体は、上記の実施例5fにおいて先に記載したように作製した。CVSV19を鋳型として使用して作製した8種の単離物を、CVSV19と比較して>80のバレンセンを生成すると同定した。V75を鋳型として使用して作製した12種の単離物を、CVSV19と比較して>74のバレンセンを生成すると同定した。e.定方向点突然変異を含有する変異体上記の表25に示されるフォワードおよびリバースオリゴを使用して鋳型遺伝子から単一PCR反応によって以下に示されるように位置L310、H360またはQ370に点突然変異を含有するさらなるCVS変異体を作製した。点L310Hを含有する変異体を作製し、それによって、V75およびV240を、突然変異L310Hを有するよう改変した。それらの変異体を、バレンセンの生成についてミクロ培養で試験した。結果は、V75L310Hは、変異体V19のバレンセン生成の平均95.5であるのに対し、V240L310Hは、変異体V19のバレンセン生成の平均77.7であるということを示した。結果は、L310H突然変異は、V240バックグラウンドにおいてプラスの影響を有さないことを示唆した。さらに、V19を鋳型として使用して、アミノ酸H360またはQ370で点突然変異を作製し、8種の個々の単離物を、CVSV19と比較して68~100のバレンセンを生成すると同定した。f.N末端にスワップを含有する変異体CVSの最N末端にスワップを含有するさらなるCVS変異体を、CVSの残基1~15をコードするヌクレオチドを、3種の異種テルペンシンターゼ遺伝子の各々に由来する対応する配列で置換することによって作製した。3種の異種テルペンシンターゼ遺伝子は、タバコNicotianatabacum由来のtr5-エピ-アリストロチェンシンターゼTEAS、配列番号941、ヒオシアムスムチクスHyoscyamusmuticus由来のプレムナスピロジエンシンターゼHPS、配列番号942またはブドウVitisvinifera由来のバレンセンシンターゼ配列番号346とした。CVS変異体V240、V243およびV245を鋳型として使用して、突然変異体を作製した。バレンセンの生成を調べたところ、結果は、突然変異体は、V19と比較してバレンセンの生成の減少をもたらすことを示した。ヌートカトンNookatoneの生成実施例2に記載されたように発酵によって生成されたバレンセンを含有するダイズ油を、100°Cおよび350mTorrでのワイプドフィルムwiped-film蒸留を使用して濃縮し、精製して、およそ68重量のバレンセンを含有する油を作製した。この物質を、以下に記載される2つの異なる方法によってヌートカトンに変換した。A.三酸化クロムを使用するバレンセンのヌートカトンへの酸化上記のように生成されたバレンセン留出物を、以下のように、三酸化クロムおよびジクロロメタン中のピリジンを使用してヌートカトンに酸化した。5Lのジクロロメタン中のピリジン584g、7.4mol、44当量の溶液に、三酸化クロム369g、3.69mol、22当量を少しずつ添加した。混合物を10分間撹拌し、50グラムのバレンセン留出物68w/w、0.167mol、1当量を、4分かけて添加し、混合物を22°Cで18時間撹拌した。酒を容器から排出し、固体を2Lのメチルt-ブチルエーテルMTBEで2回洗浄した。合わせた有機層を2LのMTBEでさらに希釈し、続いて、1.25Lの5水酸化ナトリウムで3回、2Lの5塩酸で2回、2Lのブラインで1回洗浄した。有機相を200グラムの無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、蒸発によって濃縮すると、36.8グラムの粗ヌートカトンが得られた48w/w、0.081mol、収率48。B.リン酸シリカ固定化クロムIII触媒を使用するバレンセンのヌートカトンへの酸化リン酸シリカクロムIII樹脂48.9g、PhosphonicS、Ltd.を、冷却器、サーモウェル、オーバーヘッドスターラーおよびスパージ管を備えた、5Lの丸底フラスコに入れた。22Lのt-ブタノールおよびバレンセン留出物68、500g、1.67モル、1当量を添加し、内容物を45°Cに加熱し、不均一な懸濁液を、酸素が溶液中をスパージされるように約1.5L/分攪拌させ、窒素をヘッドスペース上に流した。溶液に、水中、70のt-ブチルヒドロペルオキシドTBHP、315g、2.45モル、1.47当量を2時間かけて添加し、その間反応物の温度を60±5°Cに加熱し、維持した。バレンセンの>90が消費されたとガスクロマトグラフィーによって決定されるまで、反応物を攪拌させた。次いで、反応物を室温に冷却し、濾過によってシリカ触媒を除去した。フラスコおよび樹脂を、500mLのイソプロパノールで洗浄した。合わせた有機溶液t-ブタノールおよびイソプロパノールに、11Lの脱イオン水を添加し、蒸発によって混合物を減圧下で濃縮すると、コハク色の油が得られた。油を3Lのトルエンに溶解し、激しく撹拌しながら、3.125Lの15硫酸で15分間洗浄した。水層を除去し、1Lのトルエンを用いて再抽出した。次いで、合わせたトルエン層を、2.5Lの1M水酸化ナトリウムで3回、500mLの飽和塩化ナトリウムで2回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水した。濾過後、溶媒を蒸発によって減圧下で除去すると、378gの粘稠性のコハク色の油33重量ヌートカトン、0.57モル、収率34が得られた。CVS変異体のテルペン生成物分布の分析この例では、ガスクロマトグラフィーGCを使用して、変異体バレンセンシンターゼによって生成されたテルペンの生成物分布を調べた。ガスクロマトグラフィーによる、バレンセンシンターゼを発現する酵母株によって生成された生成物の分析は、酵素がバレンセンを主生成物として生成することを示す。ピーク1暫定的に、β-セリネンと同定される、ピーク2暫定的に、τ-セリネンと同定される、ピーク3エレモフィレンとして同定される、ピーク47-エピ-α-セリネンとして同定されるおよびピーク5未同定と呼ばれる化合物、ならびにβ-エレメンおよびいくつかの微量のさらなる生成物を含めた、いくつかの副生成物も生成された。β-エレメンは、ほぼ間違いなく、Cope再配列によって形成される、機構的中間体ゲルマクレンAの分解生成物であるdeKrakeretalPlantPhysiol12519301940。結果は、以下の表41および42に示されており、これは、GCピーク面積によって測定される、バレンセン、β-エレメンおよびピーク1から5の量の合計として本明細書において定義される、生成されたテルペンの総量のパーセンテージとしてのテルペン生成物の分布を示す。以下の表41は、振盪フラスコ培養から生成された変異体CVSV19、V71、V73、V75、V229およびV231上記の表19および27を参照のことの生成物の分布を示す。変異体V71、V73およびV75では、テルペンの総量のパーセンテージとしての生成されたバレンセンの量は、変異体CVSV19の66と比較して、約71であった。これらの変異体において形成されるβ-エレメンの量の対応する低減が観察され、これは、変異体酵素は、ゲルマクレンA中間体で停止することよりも、反応を完了に推し進めることにおいてより効率的であることを示唆した。バレンセンシンターゼ変異体から得られた残りの副生成物の分布は、変異体酵素間で類似していた。変異体V229およびV231では、バレンセンは、再び、変異体CVSV19によって生成されたもの67.66よりも生成物混合物の大きな割合に相当した72.8。V229およびV231を用いた場合には、β-エレメンおよびピーク3両方のパーセンテージの減少が観察された。以下の表42は、3L発酵培養において増殖させたバレンセンシンターゼ変異体を発現する酵母株の同様の比較を示す。発酵槽培養において、変異体CVSV19から得られた生成物分布は、振盪フラスコ培養において見られた生成物分布と同様であるが、同一ではないことが観察された。変異体V73およびV75は、総生成物の大きなパーセンテージがバレンセンに相当することにつながる、変更された生成物分布を有していた。これらの各変異体では、観察されたβ-エレメンの量は、変異体CVSV19について観察されたものよりも少なく、やはり、酵素は、中間体ゲルマクレンAで停止することよりも、反応を完了に推し進めることにおいてより効率的であることを示唆した。これらの変異体によって生成されたピーク1から4の量は、CVSV19変異体とすべて類似していた。興味深いことに、より多くのピーク5化合物が、変異体CVSV19と比較して変異体V75によって生成されたが、V73によって、より少ないピーク5生成物が生成された。これは、培養条件の変動も、この同定されていない副生成物に関する生成物分布に影響を及ぼす可能性があることを示唆した。概して、いくつかの変異体バレンセンシンターゼによって生成された生成物の割合は、野生型酵素またはその生成物プロフィールが野生型バレンセンシンターゼと類似している変異体V18およびV19によって生成されたものとは異なっていることが観察された。特に、いくつかの変異体によって生成されたバレンセンの割合は、V19において観察されたものよりも高かった。これらのデータは、バレンセンシンターゼに突然変異を導入することによって、生成物選択性が変更された変異体が生成され得ることおよびいくつかの変異体が、生成物混合物中に高い割合のバレンセンを生成することを示した。さらなるバレンセンシンターゼ突然変異体突然変異を複数のコドン位置に同時に導入するプライマーを使用する、上記のものと同様のエラープローンPCRおよびオーバーラップPCR法を使用して、上記のバレンセンシンターゼをさらなるアミノ酸置換またはスワップをを導入するための鋳型として使用して、さらなるバレンセンシンターゼ突然変異体を生成した。例えば、バレンセンシンターゼV19、V240またはV245を、表25に示されるプライマーを使用するPCR反応単数または複数において鋳型として使用して、いくつかのさらなる突然変異体を作製した。作製した突然変異体を、上記のようにバレンセン生成についてスクリーニングした。以下の表は、作製した変異体を、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化、ならびにCVSV19に対するバレンセン生成を含めて示す。CVS変異体V293、V299、V300、V304、V305、V306、V307およびV308は、鋳型配列としてV240から、変異体が、上記のように、TEAS配列番号941のアミノ酸58~63によって置換されたアミノ酸53~58、HPS配列番号942のアミノ酸93~110によって置換されたアミノ酸85~99、HPS配列番号942のアミノ酸185~193またはTEAS配列番号941の177~185によって置換されたアミノ酸174~184を有するよう作製した。さらに、変異体はすべて、V240と比較して、M1T、S2A、S3G、G4E、E5A、F7G、A11T、N20D、L23S、Y152HY152→H155、E163DE163→D166、K173EK173→E176、M210TM210→T211、C361RC361→R362、Q448LQ448→L449、C465SC465→S466、K468QK468→Q469、K499EK499→E500、P500LP500→L501および/またはA539VA539→V540などの1つまたは複数のその他のアミノ酸置換を含有するよう作製した。CVS変異体V292は、鋳型配列としてV245から、上記のように、TEAS配列番号941のアミノ酸58~63によって置換されたアミノ酸53~58、HPS配列番号942のアミノ酸93~110によって置換されたアミノ酸85~99、HPS配列番号942のアミノ酸185~193またはTEAS配列番号941の177~185によって置換されたアミノ酸174~184、ブドウVitis配列番号346のアミノ酸223~230によって置換されたアミノ酸212~221を有するよう作製した。さらに、変異体は、V245と比較して、アミノ酸置換V439LV439→L438を含有するよう作製したCVS変異体V311およびV312は、鋳型配列としてV19から作製した。さらに、変異体では、鋳型としてV19を使用し、上記のように、直接酵母組換えによって、CVSのアミノ酸90~99を、配列番号346に示されるブドウVitisviniferaのアミノ酸101~113によって置換した表25参照のこと。オリゴ11-154.4を用いる単回PCR反応において、変異原性オリゴ21~141.3を使用し、オリゴ11-154.3を用いる、上記の表25に示されるオリゴを用いる単回PCR反応において変異原性オリゴ21-141.4を使用した。V311およびV312は、2つの突然変異、V312中のI82VおよびL399→S401で異なっている。CVS変異体V314では、上記のように、直接酵母組換えによって、アミノ酸3~41がブドウVitis配列番号346のアミノ酸3~51によって置換され、アミノ酸53~58がTEAS配列番号941のアミノ酸58~63によって置換され、アミノ酸85~99がブドウVitis配列番号346のアミノ酸96~112によって置換され、アミノ酸174~184がHPS配列番号942のアミノ酸185~193またはTEAS配列番号941の177~185によって置換され、アミノ酸212~221がブドウVitis配列番号346のアミノ酸223~230によって置換された表25参照のこと。CVS変異体V297およびV313を、それぞれ鋳型としてV240またはV314を使用し、アミノ酸115~146をブドウVitisvinifera配列番号346のアミノ酸128~159によって置換することによって作製した。3種のPCR断片を、上記のように、直接組換えによって組み合わせた表25参照のこと。第1のPCR断片は、鋳型としてV240またはV314のいずれかを用い、オリゴ11-154.3および変異原性プライマー21-145.30を使用した。第2のPCR断片は、鋳型としてブドウVitisvinifera配列番号346を用い、変異原性プライマー21-145.29および21-145.40を使用した。第3のPCR断片は、鋳型としてV240を用い、オリゴ11-154.4および変異原性オリゴ21-145.39を使用した。したがって、CVS変異体V313については、V314について上に記載したスワップに加えて、V313では、上記のような、直接酵母組換えによって、アミノ酸114~146が、ブドウVitis配列番号346のアミノ酸128~159によって置換された表25参照のこと。さらに、V314と比較してアミノ酸置換H102YH102→Y114を含有するよう変異体を作製した。鋳型配列としてV240から作製したCVS変異体V297は、TEAS配列番号941のアミノ酸58~63によって置換されたアミノ酸53~58、HPS配列番号942のアミノ酸93~110によって置換されたアミノ酸85~99、ブドウVitis配列番号346のアミノ酸128~159によって置換されたアミノ酸114~146およびHPS配列番号942のアミノ酸185~193またはTEAS配列番号941の177~185によって置換されたアミノ酸174~184を有する。V260V259、V263およびV277を鋳型として使用して、アミノ酸196、197、198、200、348または399で点突然変異を作製して、CVS変異体V287、V288、V289、V290、V294、V295、V296、V298、V301、V302、V303、V309、V310、V315を作製した。設計された突然変異戦略によって作製された得られた同定された突然変異の一部は、鋳型からの相違をもたらさなかったか、サイレント突然変異または野生型配列への復帰をもたらした。上記の変異体の各々が、野生型CVSおよびCVSV19の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびに振盪フラスコ培養において評価されるCVSV19に対するバレンセン生成を含めて、以下の表43に示されている。変異体V299、V300、V304、V305、V306、V307、V308のバレンセン生成についてのデータが提供されていないが、これは、これらの変異体を、バレンセン生成のための振盪フラスコではなく、ミクロ培養においてのみ試験したからである。改変は当業者には明白であるので、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されると意図される。"