1種または2種以上の植物病原ウイルスのゲノムRNAまたはそのcDNAの一部断片を保有する組換えリンゴ小球型潜在ウイルスALSV。植物病原ウイルスがズッキーニ黄斑モザイクウイルスZYMVである請求項1の組換えALSV。植物病原ウイルスがキュウリモザイクウイルスCMVである請求項1の組換えALSV。植物病原ウイルスがダイズモザイクウイルスSMVである請求項1の組換えALSV。請求項1の組換えALSVを植物の幼苗に接種することを特徴とする植物病原ウイルスの感染防除方法。請求項1の組換えALSVが幼苗期に接種された病原ウイルス抵抗性植物。前記のとおり、植物の病原ウイルスの感染に対して、弱毒ウイルスの干渉効果を利用した防除が知られているが、弱毒ウイルスを用いた防除法は、弱毒ウイルスが利用できる一部のウイルスに限られており、弱毒ウイルスの自然界からの分離や変異誘導による作製が困難なウイルスには応用の難しい技術である。また、異なるウイルスに対して、弱毒ウイルスによる干渉効果は発揮されないため、各ウイルスごとに弱毒ウイルスが必要とされているが、弱毒ウイルスの作製には長い時間と多くの労力を必要とする。またサテライトRNAの挿入による弱毒ウイルスの場合には、親株ウイルスは病原性であり、植物体内での増殖の過程で強毒ウイルスに回帰する危険性は皆無ではない。本願発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、理論的にはあらゆる病原性ウイルスを対象として、それぞれに干渉効果を発揮するウイルスを作製でき、また増殖の過程での強毒化の危険性のない新しい手段を提供することを課題としている。前記課題を解決するための発明として、1種または2種以上の植物病原ウイルスのゲノムRNAまたはそのcDNAの一部断片を保有する組換えリンゴ小球型潜在ウイルスALSVを提供する。この組換えALSVにおいては、植物病原ウイルスがズッキーニ黄斑モザイクウイルスZYMV、キュウリモザイクウイルスCMV、またはダイズモザイクウイルスSMVであることを好ましい態様としている。さらにこの出願は、前記の組換えALSVを植物の幼苗に感染させることを特徴とする植物病原ウイルスの防除方法と、前記の組換えALSVが幼苗期に接種された病原ウイルス抵抗性植物を提供する。本願発明では、植物病原ウイルスのゲノムRNAまたはそのcDNAの一部断片を組込んだ組換えALSVによって当該病原ウイルスの感染を防除する。対象となる病原ウイルスに制限はなく、あらゆる病原ウイルスの感染を防除することができる組換えALSVの作製が理論的には可能である。組換えALSVの作成は、当該技術分野の通常の知識を有するものであれば、本願明細書の記載に基づき容易に行なうことができ、従来の弱毒ウイルスに比して、極めて少ない時間と労力で作成することができる。また、ALSVは無病徴感染ウイルスであり、このALSVに挿入する病原ウイルスのゲノムRNAまたはそのcDNAの一部断片は、それ自体では病原性を持たないものであるため、組換えALSVが植物体内で毒性を獲得する危険性はなく、安全に使用することができる。本願発明の組換えALSVは、植物病原ウイルスのゲノムRNAまたはそのcDNAの一部断片が挿入されていることを特徴とする。RNAサイレンシングの原理に従い、この組換えALSVが複製すると、挿入断片の配列を含むsiRNAが合成され、それに相補的な病原ウイルスゲノムの領域を破壊する。ALSVは、リンゴから単離したものを使用することもできるが、好ましくは、特許文献2に記載されているALSVのRNA1感染性cDNAクローンpEALSR1、RNA2感染性cDNAクローンpEALSR2L5R5などのALSVベクターを使用することができる図1参照。植物病原ウイルスとしては、実施例に示したキュウリモザイクウイルスCMV、ズッキーニ黄斑モザイクウイルスZYMV、ダイズモザイクウイルスSMVの他、原則的にあらゆるウイルスを対象とすることができる。例えば、CMVやZYMVと同様にアブラムシ類により媒介されるカボチャモザイクウイルスWMV2、ソラマメウイルトウイルスBBWV、カブモザイクウイルスTuMVなど;アザミウマ類により媒介されるトマト黄化えそウイルスTSWV、インパチエンスネクロティックスポットウイルスINSV、アイリスイエロースポットウイルスIYSVなど;コナジラミ類により媒介されるキュウリ黄化ウイルスCuYVなど;土壌伝染するトマトモザイクウイルスToMVなどである。本願発明の組換えALSVは、これらの病原ウイルスの1種または2種以上例えば3種の各々のゲノムRNAまたはcDNAの一部断片を組合わせて例えば、融合ポリヌクレオチドとしてALSVベクターに挿入したものであってもよい。このような2種以上の病原ウイルスに対する組換えALSVは、いわゆる混合ワクチン様の機能を有し、同一植物個体への2種以上の病原ウイルスの感染を防御することができる。例えば、実施例に示したような、キュウリに対するズッキーニ黄斑モザイクウイルスZYMVとキュウリモザイクウイルスCMVの感染防御である。ALSVへの挿入断片は、これらの病原ウイルスのゲノムRNA、もしくはそのcDNAから調製する。挿入断片は病原ウイルスゲノムの任意の領域から選択することができるが、好ましくは、病原ウイルスの生存、増殖、あるいはその病原性に関わる遺伝子領域等から選択することができる。例えば、実施例に示したように、ズッキーニ黄斑モザイクウイルスZYMVの場合はP1、HCPro、P3、Cl、Nla、Nlb、CP好ましくは、P3、Cl、Nla、Nlb、CP、キュウリモザイクウイルスCMVの場合は1a、2a、CP好ましくは2a、ダイズモザイクウイルスSMVの場合はCPをそれぞれコードするゲノムRNAの一部領域またはこの領域に対応するcDNAである。挿入断片のサイズは、例えば、ALSVベクターに挿入した場合に、その植物個体への感染能、あるいは植物個体内での増殖能に影響を及ぼすことのないサイズの範囲内で任意に選択することができる。また、挿入断片のサイズは、挿入断片の配列を含むsiRNAが病原ウイルスゲノムを効果的に破壊し、かつその挿入断片が安定的に維持される範囲を選択する。すなわち、具体的には、挿入断片のサイズは例えば100~300bp、好ましくは150~200bp程度とすることができる。なお、この挿入断片がコードするペプチドが、ALSVペプチドとの融合ペプチドとして発現するようにすなわち、一部断片の挿入によって停止コドンが出現しないように、フレームを一致させることが必要である。ALSVベクターを使用する場合、そのクローニング部位に一致した制限酵素で前記の一部断片を調製し、市販のライゲーションキット等を用いて一部断片をALSVベクターに挿入する。次いで、この組換えALSVベクターをキノアに感染させ、感染葉からウイルスを単離して組換えALSVを作成する。この組換えALSVは、そのまま植物に接種して病原ウイルスの感染防除に使用することができる。あるいは、安定剤等を含む緩衝液中で凍結乾燥させて感染防除剤として製品化することもできる例えば、特許文献2など。組換えALSV、または溶解した感染防除剤は、植物の幼苗の葉例えば、キュウリの場合は子葉展開期の子葉、タバコの場合は5葉期の第3から第5本葉などにカーボランダム法など公知の方法で接種することができる。以下、実施例を示して本願発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本願発明は以下の例によって限定されるものではない。ZYMVの遺伝子断片を導入したALSVベクターによる干渉効果1:材料と方法11:実験材料111:供試植物Chenopodiumquinoa以下キノアをALSV増殖用植物として用いた。また干渉効果の検定にはCucumissativus以下キュウリのZYMV抵抗性を持たない3品種青大胡瓜、鈴成四葉、つばさを供試した。112.供試感染性クローン供試感染性クローンは、非特許文献2等に記載されているALSVのRNA1感染性cDNAクローンpEALSR1とRNA2感染性cDNAクローンpEALSR2L5R5図1、および宇都宮大学農学部教授夏秋知英博士より分譲された、強毒株ZYMVisolateZ51accessionnumber:AB188115の感染性cDNAクローンp35SZ5vectorGFPFLを供試した。また、株微生物化学研究所梁宝成博士より分譲された、弱毒株のZYMVisolate2002以下ZYMV2002、accessionnumber:AB188116を供試した。12:ZYMV遺伝子断片のALSVベクターへの導入121:ZYMV遺伝子断片のクローニングp35SZ5vectorGFPFLを鋳型とし、既知のZYMVisolateZ51のP1遺伝子、P3遺伝子およびCP遺伝子配列をもとに設計したプライマーを用いて、P1遺伝子210ntの増幅にはZP1XhoとZP1Bam、P3遺伝子の増幅189ntにはZP3XhoとZP3Bam、CP遺伝子の増幅225ntにはZCPXhoとZCPBam、CP遺伝子117ntの増幅にはZCPXhoとZCP100Bamの組み合わせを用いた表1:配列番号1-7。2μlの鋳型DNA溶液1ngμlを02ml容PCRチューブにとり、滅菌水を35μl、10×ExTaqBufferTaKaRaを5μl、25mMdNTPMixtureTaKaRaを5μl、10μMの各遺伝子断片増幅プライマーを各1μl、TaKaRaExTaqTMTaKaRaを1μl加えて混合し、TaKaRaPCRThermalCyclerDiceVersionIIIModelTP600TaKaRaを使用して94°Cで5分間処理後、94°C、30秒→57°C、30秒→72°C、60秒という反応を30サイクル行い、その後72°Cで5分間処理し、最後に4°Cで5分間処理しPCRを終了した。得られたPCR産物は以下の方法で電気泳動を行った。AgaroseSニッポンジーンを015g、TAE40mMTris40mM酢酸1mMEDTApH80を15ml、エチジウムブロマイドを06μl用いて作成した1アガロースゲルをTAEで泳動槽内を満たしたMupid2plusADVANCEに設置し、2μlのPCR産物に1μlの10×LoadingBufferTaKaRaを混合し、アガロースゲルのウェルにアプライして電気泳動を行い、設計したサイズの断片であることを確認した。サイズの確認を行ったPCR産物はMonoFasDNA精製キットIGLSciencesを用いて以下のように精製した。1アガロースを用いて泳動した20μl分のPCR産物のバンドをメスで切り取り、15ml容マイクロチューブに入れ、ゲルの重量を量った。ゲルの重量と等量のBufferAを加え60°Cで10分間保温し、ゲルを完全に溶解した。コレクションチューブに取り付けたスピンカラムに溶解したゲルサンプル溶液を入れ、10000rpm4°Cで30秒遠心した。遠心後、スピンカラムに500μlのBufferBを入れ、10000rpm4°Cで30秒遠心した。遠心後、スピンカラムを15ml容マイクロチューブに付け替え、20μlのBufferCを入れ10000rpm4°Cで60秒遠心し、得られた溶液をZYMVの各遺伝子断片とした。各遺伝子断片はpGEMTEasyVectorSystemPromegaを用いて、TAクローニングを以下のように行った。15ml容マイクロチューブに4μlのP1遺伝子断片をとり、2×RapidLigationBufferを5μl、pGEMTEasyVectorを1μl、T4DNALigaseを1μl加えて混合後、室温で60分間静置しライゲーション反応を行った。ライゲーション反応を行ったサンプル溶液10μlを、あらかじめ氷上で解凍しておいた100μlの大腸菌DH5αのコンピテントセルに加え、穏やかに混合後氷上で20分間静置した。静置後、42°Cのウォーターバスで45秒間ヒートショック処理を行い、ただちに氷上で2分間静置した。静置後、サンプルに1mlのSOC培地pH751Lあたりbactotryptone20gbactoyeastextract5gNaCl05g1MMgCl210ml1MMgSO410mlを加え、37°Cのシェイカーで60分間振盪培養した。培養後、015の寒天を含むLB培地pH751Lあたりbactotryptone10gbactoyeastextract5gNaCl10gアンピシリン25mgml2mlのプレートにサンプル50μlをスプレッドし、サンプルを塗り広げた。サンプルを塗り広げたプレートは37°Cのインキュベーターに1416時間静置した。プレートに形成されたコロニーをスモールスケールで培養し、煮沸法を用いた以下の方法でプラスミドの抽出を行った。オートクレーブ滅菌済みの爪楊枝を用いて、試験管内に分注した2mlのLB培地に植菌し、37°Cに設定したシェイカーで8時間振盪培養した。培養液を15ml容マイクロチューブに移し、14000rpm室温で1分間遠心した。遠心後、上清をアスピレーターで除去し、350μlのSTET01MNaCl10mMTrisHClpH801mMEDTApH805TritonX100を加えてボルテックスミキサーで沈殿を懸濁した。リゾチーム溶液10mMTrisHClpH8010mgmlリゾチームを25μl加え、3秒間ボルテックスミキサーで混合した。混合後、マイクロチューブを40秒間煮沸し、直ちに氷中に移して5分間冷却した。冷却後、14000rpm室温で10分間遠心し、沈殿をオートクレーブ滅菌済みの爪楊枝で除去した。上清に40μlの3M酢酸ナトリウムpH52と420μlのイソプロピルアルコールを加えて混合し、20°Cの冷凍庫内に5分間静置した。静置後、14000rpm4°Cで遠心し、上清を除去した。マイクロチューブ内の沈殿に1mlの70エタノールを加え、14000rpm4°Cで2分間遠心し、上清を除去後、減圧乾燥機でマイクロチューブ内の沈殿を2分間乾燥した。乾燥した沈殿を50μlのRNase溶液10mMTrisHClpH801mMEDTApH8020μgmlDNasefreeRNase懸濁した。懸濁後、37°Cのインキュベーターで20分間静置し、プラスミド溶液とした。抽出したプラスミド溶液を2μl用いて、1アガロースゲルで電気泳動を行い、インサートを保持していると考えられるプラスミドの選抜を行った。選抜したプラスミドはEcoRIを用いた制限酵素処理を以下の方法で行い、インサートの保持を確認した。マイクロチューブに2μlのプラスミドをとり、滅菌水を68μl、10×HBufferTaKaRaを1μl、EcoRITaKaRaを02μl加えて混合し、37°Cのインキュベーターで3時間静置した。静置後、1アガロースゲルで電気泳動を行い、インサートの保持を確認し、TAクローニングを終了した。122:ZYMV遺伝子断片のシークエンスTAクローニングによって得られたプラスミドは以下の方法で精製した。46μlのプラスミドに154μlのTE10mMTrisHClpH801mMEDTApH80、100μlのTE飽和フェノール、100μlのクロロホルムを加えボルテックスミキサーで5分間混合し、14000rpm4°Cで5分間遠心した。遠心後、200μlの水層を新しいマイクロチューブに移し、200μlのクロロホルムを加えボルテックスミキサーで混合し、14000rpm4°Cで5分間遠心した。150μlの水層を新しいマイクロチューブに移し、3M酢酸ナトリウムpH52を15μl、99エタノールを375μl加えボルテックスミキサーで2分間混合し、20°Cの冷凍庫で20分間静置した。14000rpm4°Cで20分間遠心して上清を除去後、沈殿に1mlの70エタノールを加え、14000rpm4°Cで5分間遠心した。遠心後、上清を除去し、減圧乾燥機で2分間乾燥後、50μlのTEに懸濁した。50μlのPEG溶液13polyethyleneglycol800016MNaClを加えて混合し、氷上に1時間静置した。静置後、14000rpm4°Cで20分間遠心し、沈殿に500μlの70エタノールを加え、14000rpm4°Cで2分間遠心した。上清を除去し、沈殿を減圧乾燥機で2分間乾燥した。沈殿を20μlの滅菌水で懸濁し、NanoDropND1000Spectrophotometer旭テクノグラスを用いて吸光度波長260nmを測り、濃度を300ngμlに調整し、精製プラスミドとした。精製プラスミドは以下の方法でシークエンス分析を行った。シークエンス分析に供試する泳動試料はBigDyeTerminatorv31CycleSequencingKitAppliedBiosystemsを用いて以下のように作成した。02ml容PCRチューブに1μlの精製プラスミドをとり、滅菌水を4μl、5×BigDyeSequencingBufferを1μl、プライマーACUNI6745を2μl、Readyreactionmixを2μl加えて混合し、TaKaRaPCRThermalCyclerDiceVersionIIIModelTP600TaKaRaを使用して94°Cで1分間処理後、94°C、30秒→50°C、15秒→60°C、4分という反応を30サイクル行い、その後60°Cで3分間処理し、最後に4°Cで5分間処理し、PCRを終了した。PCR後、15ml容マイクロチューブに試料全量をとり、滅菌水を725μl、3M酢酸ナトリウムを15μl、99エタノールを3125μl加えてボルテックスミキサーで1分間混合し、アルミホイルで包んで遮光し、室温で10分間静置した。静置後、14000rpm4°Cで20分間遠心し、沈殿に1mlの70エタノールを加え14000rpm4°Cで5分間遠心した。遠心後、減圧乾燥機で沈殿を乾燥し、20μlのHiDiFormamidoに懸濁した。これを2分間煮沸し、ただちに氷上で5分間静置したものを泳動試料とした。試料の泳動はABIPRISM3100AvantGeneticAnalyzerのマニュアルに従い行った。20μlの泳動試料をMicroAmp96wellReactionPlateのwellにのせ、プレートアセンブリを組み立て、オートサンプラーに設置した。キャピラリー長は80cm、ポリマーはPOP4、泳動緩衝液は滅菌水で10倍に希釈した10×GeneticAnalyzerBufferwithEDTAを用いた。次にプレートレコードを作成し、サンプル名、泳動条件および解析条件などを設定した。DyeSetはZ、MobilityFileはDT3100POP4BDv3v1mob、BioLIMSProjectは3100Project1、RunModuleはLongseq80POP4DefaultModule、AnalysisModuleはBC3100APOP480cmSeqOffFtOffsazにそれぞれ設定し、泳動を行った。泳動終了後、ABIPRISM3100AvantGeneticAnalyzerのマニュアルに従い、解析データを塩基配列に変換した。得られた塩基配列データは配列情報解析ソフトウェアのDNASISProver209000001HitachiSoftを用いて解析を行い、作成したZYMV遺伝子断片が鋳型と同一であることを確認した。123:ZYMV遺伝子断片のALSVベクターへの導入配列の確認をした各ZYMV遺伝子断片はALSR2L5R5に導入するため、遺伝子断片の精製、BamHIとXhoIを用いた制限酵素処理を以下のように行った。各ZYMV遺伝子断片28μlにTEを72μl、TE飽和フェノールを50μl、クロロホルムを50μl加えボルテックスミキサーで3分間混合し、14000rpm4°Cで10分間遠心した。水層100μlを新しいマイクロチューブに移し、3M酢酸ナトリウムpH52を10μl、99エタノールを250μl加えボルテックスミキサーで2分間混合し、80°Cの冷凍庫で15分間静置した。14000rpm4°Cで15分間遠心し、上清を除去し、沈殿に70エタノールを1ml加え、14000rpm4°Cで5分間遠心した。上清を除去し、減圧乾燥機で沈殿を乾燥した。17μlの滅菌水に懸濁し、10×KBufferTaKaRaを2μl、BamHITaKaRaを05μl、XhoITaKaRaを05μl加え穏やかに混合し、37°Cのインキュベーターで12時間静置した。ALSR2L5R5も同様の方法で制限酵素処理を行った。制限酵素処理を行った各種ZYMV遺伝子断片およびALSR2L5R5はMonoFasDNA精製キットIを用いて前記121の方法で精製し、得られた溶液をそれぞれ精製ZP1遺伝子、精製ZP3遺伝子、精製ZCP200遺伝子、精製ZCP100遺伝子ZYMVインサートDNAおよび精製ALSR2L5R5ベクターDNAとした。各種ZYMVインサートDNAとベクターDNAにDNALigationKitVer21TaKaRaを用いてライゲーション反応を以下の方法で行った。マイクロチューブに4μlの各種インサートDNAをとり、それぞれにベクターDNAを1μlとI液を5μlずつ加え、穏やかに混合し、16°Cのウォーターバスで4時間ライゲーション反応を行った。各ライゲーション産物を用いて前記121と同様の方法で、大腸菌DH5αの形質転換とスモールスケール培養および煮沸法によるプラスミドの抽出を行った。抽出したプラスミドは1アガロースで電気泳動し、インサートを保持していると考えられるものを選抜した。選抜したプラスミドはBamHIとXhoIを用いた制限酵素処理を以下の方法で行い、インサートの保持を確認した。マイクロチューブに2μlのプラスミドをとり、滅菌水を66μl、10×KBufferを1μl、BamHIを02μl、XhoIを02μl加えて混合し、37°Cのインキュベーターで3時間静置した。静置後、1アガロースゲルで電気泳動を行い、各プラスミドのインサートの保持を確認した。インサートを保持したクローンはラージスケール培養を行い、QIAGENPlasmidMidiKitQIAGENを用いて、遠心機にはRPR16ローターHITACHIを設置した高速冷却遠心機himacCR20GHITACHIを使用し、以下の方法で精製した。500ml容の坂口フラスコに100mlのLB培地を分注し、コロニーをオートクレーブ滅菌済みの爪楊枝で植菌し、37°Cのシェイカーを用いて180rpmで1416時間振盪培養した。培養液を50ml容の遠心管に移し、7500rpm4°Cで15分間遠心した。上清を除去し、残りの培養液を移して7500rpm4°Cで15分間遠心した。上清を除去し、沈殿を4mlのBufferP1に懸濁した。懸濁液に4mlのBufferP2を加えて転倒混和し室温で4分間静置した。直ちに4mlのBufferP3を加えて転倒混和し、氷上で20分間静置した。13000rpm4°Cで30分間遠心し、上清を新しい50ml容の遠心管に移し、さらに13000rpm4°Cで15分間遠心した。4mlのBufferQBTでカラムを平衡化したQIAGENtip100に遠心上清を移し、自然落下でカラムにプラスミドDNAを吸着させた。QIAGENtip100を10mlのBufferQCで2回洗浄し、QIAGENtip100を新しい50ml容スミロンチューブに設置し、5mlのBufferQFでDNAを溶出した。溶出したDNA溶液にイソプロピルアルコールを35ml加えて混合し、直ちに15ml容のCOREXチューブに移し、11000rpm4°Cで30分間遠心した。上清を除去し、沈殿に2mlの70エタノールを加え11000rpm4°Cで10分間遠心した。上清を除去し、減圧乾燥機で沈殿を乾燥した。沈殿を200μlのTEに懸濁し、NanoDropND1000Spectrophotometerを用いて吸光度波長260nmを測り、濃度を1μgμlに調整した。各プラスミドはそれぞれALSVR2L5R5ZP1、ALSVR2L5R5ZP3、ALSVR2L5R5ZCP200、ALSVR2L5R5ZCP100とした図2。124:ALSVベクターの接種とウイルス化精製した各プラスミドALSVR2L5R5ZP1、ALSVR2L5R5ZP3、ALSVR2L5R5ZCP200、ALSVR2L5R5ZCP100は、前記123の方法で精製したpEALSR1と等量ずつ混合し、DNA溶液とした。作製したDNA溶液を7葉期のキノアの第3から第6本葉に本葉1枚につき8μlずつ、カーボランダム法で接種した。接種後、退緑症状の現れた上葉をサンプリングし、2倍容のALSV磨砕緩衝液01MTrisHClpH7801MNaCl5mMMgCl2で磨砕し、8葉期のキノアの第3から第8本葉にカーボランダム法で接種した。接種後、退緑症状の現れた上葉をサンプリングし、各ウイルスをそれぞれALSVZP1、ALSVZP3、ALSVZCP200、ALSVZCP100とし、以後の接種試験の接種源とした。また、ALSVR2L5R5も同様の方法でウイルス化し、得たウイルスをwtALSVとし、以後の接種試験の接種源とした。13:キュウリへの接種法と一次接種および二次接種131:キュウリへの一次接種キュウリへの一次接種は各ALSVALSVZP1、ALSVZP3、ALSVZCP200、ALSVZCP100、wtALSVおよびZYMV2002を用いて以下の方法で行った。各ALSV感染キノア葉を、それぞれ2倍容のALSV磨砕緩衝液で磨砕した。各ALSV磨砕液と、ZYMV2002感染カボチャ葉を2倍容の01Mリン酸緩衝液pH70で磨砕して調整したZYMV磨砕液を、子葉展開期のキュウリの子葉2枚にカーボランダム法で接種した。キュウリは25°Cの長日条件で育成した132:キュウリへの二次接種一次接種したキュウリに、p35SZ5vectorGFPFLを以下の方法で金粒子にコーティングし、HeliosGeneGunシステムBIORADを用いて二次接種した。15ml容マイクロチューブに径16μmの金粒子BIORADを10mg量りとり、50μlの50グリセロールを加えてボルテックスミキサーで混合した。超音波洗浄機で2分間ソニケーションを行い、ボルテックスミキサーで混合しながら25μlのp35SZ5vectorGFPFLを加え、次に150μlの1MCaCl2を加え、さらに150μlの005Mスペルミジンを加えて混合した。室温で15分間静置し、上清をピペットマンで除去した。沈殿を崩さないように1mlの99エタノールを加えて洗浄し、ピペットマンで上清を除去した。同様の洗浄を3回行い、洗浄後、沈殿に500μlの99エタノールを加え、指ではじいて懸濁し、金粒子の分散を確認した。懸濁した金粒子を全て15ml容チューブに移し、25mlの99エタノールを加え混合した。調整した金粒子懸濁液はHeliosGeneGun簡易操作マニュアルに従い、以下の方法でゴールドコート用チューブにコーティングし、接種を行った。チュービングプレップステーションで035040LPMlitersperminuteのN2ガスを用いてチューブ内を20分間乾燥したゴールドコート用チューブに、シリンジ付き懸濁液ローディング用チューブを取り付け、このシリンジを用いて金粒子懸濁液をゴールドコート用チューブに装填し、5分間静置した。静置後、シリンジ付き懸濁液ローディング用チューブを取り除き、エタノール除去用シリンジ付きチューブを取り付け、ゴールドコート用チューブ内のエタノールを全て除去した。除去後、直ちにゴールドコート用チューブを180°回転し、チュービングプレップステーションの回転スイッチを作動した。ゴールドコート用チューブ内に035040LPMのN2ガスを通気しチューブ内を乾燥した。乾燥したゴールドコート用チューブをチュービングプレップステーションから取り出し、チュービングカッターを用いて切断し、サンプルカートリッジとした。サンプルカートリッジをHeliosGeneGunのカートリッジホルダーに取り付け、1葉期のキュウリの第1本葉に180PSIpoundspersquareinchで1shot接種し、第1本葉二次接種区とした。上記の方法で2葉期の第2本葉のみに二次接種したものを第2本葉二次接種区、3葉期の第3本葉のみに二次接種したものを第3本葉二次接種区とした。二次接種後、キュウリは一次接種後と同様に25°Cの長日条件で育成した。なお、二次接種の接種源であるp35SZ5vectorGFPFLは、使用する培地をLB培地から2×YT培地pH75[1Lあたりbactotryptone16gbactoyeastextract10gNaCl5gアンピシリン25mgml2ml]に変更したラージスケール培養で前記123と同様の方法で精製し、NanoDropND1000Spectrophotometerで濃度を測定後、400ngμlに調整し、80°Cで保存しておいたものを使用した。14:病徴観察とウイルス検定141:病徴の観察病徴の観察は二次接種後毎日行い、二次接種後21日目にデジタルカメラFinePixS1ProFUJIFILMを用いて病徴の撮影を行った。142:GFP蛍光の観察GFP蛍光の観察は二次接種後7日目、14日目、21日目に蛍光顕微鏡システムVBシリーズKEYENCEと顕微鏡デジタルカメラDP70OLYMPUSを用いて行い、同時に撮影した。143:ウエスタンブロット法一次接種後7日目にキュウリの子葉2枚を採取し、各一次接種ウイルスの感染を以下の方法で確認した。採取した子葉2枚の重量を量り、3倍容のALSV磨砕緩衝液とともに乳鉢と乳棒で磨砕し、100μlの磨砕液を15ml容マイクロチューブに移した。100μlの2×サンプルバッファー01MTrisHClpH804SDS30スクロース005BPB2メルカプトエタノールを加え、ボルテックスミキサーで1分間混合し、その後5分間煮沸し、直ちに氷上で5分間静置した。静置後、14000rpm4°Cで5分間遠心し、上清を泳動試料とした。泳動試料は10μl使用し、stackinggel5アクリルアミドゲルとrunninggel125アクリルアミドゲルおよび泳動バッファー06Tris28グリシン01SDSを用いて泳動160V20mA90分間室温を行った。泳動後、転写バッファー01MTris0192Mグリシン20メタノールを用いてセミドライエレクトロブロッティングを行い、PVDF膜MILIPOLEにタンパク質の転写を行った。転写後、PVDF膜をブロッキング液002MTrisHClpH7505MNaCl2Tween202スキムミルク2PVPに浸し、37°Cのインキュベーターで60分間静置した。静置後、TTBS002MTrisHClpH7505MNaCl2Tween20で25倍希釈したALSVおよびZYMVに対する吸収抗体を用いて、一次抗体処理を37°Cのインキュベーター内で60分間行った。一次抗体処理後、PVDF膜をTTBSで満たしたタッパーに浸し、シーソーで5分間洗浄した。TTBSを新しいものに交換し、同様の方法でさらに2回洗浄を行った。洗浄したPVDF膜はTTBSで2000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識坑ウサギ免疫グロブリンヤギ血清CellSignalingTECHNOLOGY用いて、二次抗体処理を37°Cのインキュベーター内で60分間行った。二次抗体処理後、PVDF膜をTTBSで3回洗浄し、発色基質液02MTrisHClpH823mgmlFastRedTRsalt1mgmlNaphtholASMXphosphateを用いて発色処理を行った。十分に発色した後、PVDF膜を蒸留水で洗浄し、反応を停止した。なお、吸収抗体はあらかじめ以下の方法で作成した。まず、5倍容のTTBSで磨砕した供試植物の磨砕液を3000rpm4°Cで5分間遠心し、上清を粗汁液とした。15ml容のマイクロチューブに10μlの一次抗体各種ウイルス抗血清をとり、粗汁液90μlを加えて混合し、37°Cで60分間静置した。静置後、14000rpmで5分間遠心し、上清100μlを新しい15ml容のマイクロチューブに移した。上清に磨砕液を100μl加えて混合し、37°Cで60分間静置した。静置後、14000rpmで5分間遠心し、上清200μlを新しい15ml容のマイクロチューブに移した。上清に磨砕液を200μl加えて混合し37°Cで60分間静置した。14000rpmで5分間遠心し、上清400μlを新しい15ml容のマイクロチューブに移した。上清に400μlの100グリセロールを加えボルテックスミキサーで十分混合し吸収抗体とした。吸収抗体は20°Cの冷凍庫で保存し適宜使用した。144:ELISA法ALSVとZYMVの蓄積量は直接ELISA法を用い、GFPの蓄積量は間接ELISA法を用いて以下の方法で定量した。検定試料は二次接種後21日目にコルクボーラーを用いて次のように採取した。第1本葉接種区では第3から第6本葉の各本葉を、第2本葉接種区では第4から第7本葉の各本葉を、第3本葉接種区では第5から第8本葉の各本葉をそれぞれ採取し、採取した本葉の基部、中心部、周辺部から太い葉脈を避けて直径1cmのリーフディスクを2枚ずつくりぬき、本葉1枚から計6枚のリーフディスクを採取した図3。採取した6枚のリーフディスクは1つのステンレスビーズSUB50TOMYとともに2ml容凍結保存チューブアシストに入れ、液体窒素で凍結し、MicroSmashMS100RTOMYを用いて2500rpmで30秒間破砕した。破砕後、18mlのPBST137mMNaCl81mMNa2HPO4268mMKCl147mMKH2PO4005Tween20を加え、MicroSmashMS100Rを用いて2500rpmで30秒間混合した。その後、14000rpm4°Cで5分間遠心し、得られた上清を検定試料とした。ALSVの定量は直接ELISA法を用いて以下の方法で行った。ELISAプレートのウェルにコーティングバッファー005M炭酸緩衝液pH96で1000倍に希釈したALSV抗体溶液を150μl入れ、プレートカバーを被せ37°Cのインキュベーターで2時間静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを3回洗浄し、ブロッキング溶液137mMNaCl81mMNa2HPO4268mMKCl147mMKH2PO42スキムミルクをウェルに150μl入れ、プレートカバーを被せ37°Cのインキュベーターで1時間静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを3回洗浄し、1検定試料当り2つのウェルに150μlずつ検定試料を入れ、プレートカバーを被せ4°Cの冷蔵庫に一晩静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを10回洗浄し、PBSTで1000倍に希釈した酵素標識をしたALSV抗体溶液をウェルに150μl入れ、プレートカバーを被せ37°Cのインキュベーターで3時間静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを10回洗浄し、基質液10ジエタノールアミンpH98067mgmlpニトロフェニルリン酸を150μl入れ、室温に静置して色を呈するまで反応させた。反応後、モデル550マイクロプレートリーダーBIORADでウェルの吸光度を測定し、ALSVの蓄積量とした。ZYMVの定量は直接ELISA法を用いて以下の方法で行った。ELISAプレートのウェルにコーティングバッファーで500倍に希釈したZYMV抗体日本植物防疫協会研究所溶液を150μl入れ、プレートカバーを被せ37°Cのインキュベーターで3時間静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを3回洗浄し、ブロッキング溶液をウェルに150μl入れ、プレートカバーを被せ37°Cのインキュベーターで1時間静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを3回洗浄し、1検定試料当り2つのウェルに150μlずつ検定試料を入れ、プレートカバーを被せ4°Cの冷蔵庫に一晩静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを10回洗浄し、PBSTで1000倍に希釈した酵素標識をしたZYMV抗体日本植物防疫協会研究所溶液をウェルに150μl入れ、プレートカバーを被せ37°Cのインキュベーターで4時間静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを10回洗浄し、基質液10ジエタノールアミンpH981mgmlpニトロフェニルリン酸を150μl入れ、室温に静置して色を呈するまで反応させた。反応後、モデル550マイクロプレートリーダーでウェルの吸光度を測定し、ZYMVの蓄積量とした。GFPの定量は以下の方法で行った。ELISAプレートのウェルに1検定試料当り2つのウェルに150μlずつ検定試料を入れ、プレートカバーを被せ37°Cのインキュベーターに2時間静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを5回洗浄し、ブロッキング溶液をウェルに150μl入れ、プレートカバーを被せ37°Cのインキュベーターで1時間静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを5回洗浄し、PBSTで1000倍に希釈したGFP抗体Clontechを150μlいれ、プレートカバーを被せ37°Cの冷蔵庫に一晩静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを10回洗浄し、PBSTで2000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識坑ウサギ免疫グロブリンヤギ血清をウェルに150μl入れ、プレートカバーを被せ37°Cのインキュベーターで3時間静置した。溶液を捨て、PBSTでウェルを10回洗浄し、基質液10ジエタノールアミンpH981mgmlpニトロフェニルリン酸を150μl入れ、室温に静置して色を呈するまで反応させた。反応後、モデル550マイクロプレートリーダーでウェルの吸光度を測定し、GFPの蓄積量とした。145:RNA抽出法とRTPCR法二次接種後21日目にキュウリの最上位展開葉を採取し、80°Cの冷凍庫で凍結し検定試料とした。01gの検定試料を乳鉢と乳棒で磨砕し、1mlのTriPureIsolationReagentRocheを加えさらに磨砕した。磨砕液1mlを15ml容マイクロチューブに移し、室温で5分間静置した。静置後、200μlのクロロホルムを加えボルテックスミキサーで20秒間混合し、室温で10分間静置した。静置後、14000rpm4°Cで15分間遠心し、500μlの水層を新しい15ml容マイクロチューブに移した。水飽和フェノールを250μl、クロロホルムを250μl加えボルテックスミキサーで5分間混合し、14000rpm4°Cで5分間遠心した。遠心後、500μlの水層を新しいマイクロチューブに移し、420μlのイソプロピルアルコールを加えボルテックスミキサーで混合し、室温で10分間静置した。静置後、14000rpm4°Cで10分間遠心し、上清を除去し70エタノールを14ml加えボルテックスミキサーで5分間混合した。14000rpm4°Cで5分間遠心し、上清を除去後、沈殿を20μlの滅菌水に懸濁し、NanoDropND1000SpectrophotometerでRNA濃度を測定し、500ngμlに調整しRNA溶液とした。逆転写反応は以下の方法で行った。02ml容PCRチューブにRNA溶液を2μl、滅菌水を6μl、5×RTBufferTOYOBOを4μl、25mMdNTPmixtureTaKaRaを8μl、10μMOligodT12プライマーを1μl、RNaseInhibitorWakoを05μl、ReverTraAceTOYOBOを05μl混合し、TaKaRaPCRThermalCyclerDiceVersionIIIModelTP600TaKaRaを使用して42°Cで50分間処理し、その後95°Cで5分間処理し、最後に4°Cで5分間処理し、獲られた産物をRT産物とした。PCRにはALSVRNA2ベクターの外来遺伝子導入サイトを含む配列を増幅できる10μMR2ALS13635’GCGAGGCACTCCTTA3’:配列番号8と10μMR2ALS15115’GCAAGGTGGTCGTGA3’:配列番号9をそれぞれプラス鎖プライマーおよびマイナス鎖プライマーとして用いた。1μlのRT産物を02ml容PCRチューブにとり、滅菌水を49μl、10×ExTaqBufferTaKaRaを1μl、25mMdNTPMixtureTaKaRaを1μl、10μMR2ALS1363と10μMR2ALS1511を各1μl、TaKaRaExTaqTMTaKaRaを01μl加えて混合し、TaKaRaPCRThermalCyclerDiceVersionIIIModelTP600TaKaRaを使用して94°Cで5分間処理後、94°C、30秒→58°C、30秒→72°C、60秒という反応を30サイクル行い、その後72°Cで5分間処理し、最後に4°Cで5分間処理しPCRを終了した。得られたPCR産物2μlに1μlの10×LoadingBufferTaKaRaを混合し、1アガロースゲルを用いた電気泳動を行い、各種ALSVのインサート配列の保持を確認した。2:結果21:ZYMV遺伝子を導入したALSVベクターのZYMVに対する干渉効果ZYMV遺伝子断片を導入したALSVベクターのZYMVに対する干渉効果を調べるため、wtALSVおよびZYMVのCP遺伝子断片を導入したALSVALSVZCP200を一次接種したキュウリ青大胡瓜におけるZYMVの病徴、GFP蛍光、ウイルス量を調べた。p35SZ5vectorGFPFLのみを接種した試験区ZYMVのみ区では、接種後12日前後に第3本葉の基部周辺で退緑斑点や脈間退緑などの病徴が観察された。その後展開した第4本葉で葉のモザイク症状が見られ、第5本葉以上の葉では葉全面で激しいモザイク症状が観察された図4A。さらに、第6本葉以上の葉では激しいモザイク症状とともに葉の奇形や萎縮が観察され図4B、植物体全体も矮化を示した図4C。wtALSVを一次接種後にp35SZ5vectorGFPFLを二次接種した試験区wtALSVZYMV区では、第3から第5本葉での病徴の現れ方はZYMVのみ区とほとんど同じであったが、症状はZYMVのみ区に比べ軽く、植物体全体の矮化は観察されなかった図4。これに対して、ALSVZCP200を一次接種後にp35SZ5vectorGFPFLを二次接種した試験区ALSVZCP200ZYMV区では、非接種区およびALSVのみを接種した試験区ALSVのみ区と同様に、全ての上葉において病徴が全く観察されなかった図4。蛍光顕微鏡でGFP蛍光を観察したところ、ZYMVのみ区では、第1本葉の接種部位周辺でスポット状の蛍光や葉脈上に蛍光が観察された。第2本葉では葉脈で観察された蛍光が葉の展開とともに拡大した。第3本葉から第5本葉では葉の全体が蛍光で埋め尽くされていた。第6本葉では葉全体で蛍光が観察されたが、葉の所々に蛍光のない領域が観察された図5。第7葉より上位の葉では蛍光の観察される領域と観察されない領域がモザイク状に混在していた。wtALSVZYMV区では各葉位でZYMVのみ区とほぼ同じ蛍光が観察された図6。これに対して、ALSVZCP200ZYMV区の第1葉では、ZYMVのみ区やwtALSVZYMV区と同様に、接種部位周辺でスポット状の蛍光や葉脈上に蛍光が観察されたが、第2本葉では葉脈で観察された蛍光の拡がる範囲がZYMV区やwtALSVZYMV区に比べ狭い領域に限定されていた。さらに、第3本葉では数箇所に蛍光が観察されるのみで、第4葉より上位の葉では蛍光が観察されなかった図7。続いて、ZYMVの定量を行った結果、第3本葉から第6本葉全てでwtALSVZYMV区ではZYMVのみ区と同程度のZYMVが蓄積していたのに対し、ALSVZCP200ZYMV区ではZYMVの蓄積は認められなかった図8。また、ALSVを定量したところ、wtALSVZYMV区ではALSVのみ区に比べ約2倍のELISA値を示し、ALSVZCP200ZYMV区ではALSVのみ区に比べやや減少していた図8。一次接種に用いたALSVZCP200のインサートチェックを行ったところ、全てのキュウリ個体でALSVのインサートが保持されていることが確認された。第2本葉二次接種区の各試験区における病徴は第1本葉二次接種区のものとほぼ同じで、病徴の現れる葉位が1枚ずつ上位にずれていた。GFP蛍光の観察では、ALSVZCP200ZYMV区で接種葉の第2本葉のみで接種部位周辺でスポット状の蛍光や葉脈の一部に蛍光が観察され、第3本葉以降に展開した本葉では蛍光が観察されなかった。これに対し、ZYMVのみ区やwtALSVZYMV区では、第1本葉二次接種区の各試験区と同様に葉全体でGFP蛍光が観察された。直接ELISA法によりZYMVの蓄積を調べたところ、各試験区で第1本葉二次接種区とほとんど同じようにZYMVが蓄積していた図9。一次接種に用いたALSVZCP200のインサートチェックでは、全てのキュウリ個体でALSVのインサートは保持されていた。第3本葉二次接種区の各試験区の病徴の様子やGFP蛍光の分布では、ALSVZCP200ZYMV区において接種葉を含む全ての本葉で蛍光が観察されなかったこと意外は、第1本葉二次接種区とほぼ同じであった。ただし、病徴やGFP蛍光は2枚上位にずれて観察された。直接ELISA法によるZYMVおよびALSVの定量では、ALSVZCP200ZYMV区で、ALSVのみ区より若干多くALSVが蓄積していることが明らかになり、それ以外の試験区では第1本葉二次接種区および第2本葉二次接種区とほぼ同じ結果が得られた図10。ALSVZCP200のインサート保持も確認された。予備試験で行ったp35SZ5vectorGFPFL接種によるZYMVの病徴観察をキュウリ3品種青大胡瓜、鈴成四葉、つばさで比較したところ、青大胡瓜が最も激しい症状を示し、鈴成四葉では軽度の症状が、つばさではほとんど病徴が現れなかった。よって、以後の全ての試験では青大胡瓜を用いることにした。22:異なるZYMV遺伝子断片を導入したALSVベクターの干渉効果ZYMV遺伝子の異なる領域を組み込んだALSVベクターによって誘導される干渉効果を比較するため、ALSVZP1、ALSVZP3およびALSVZCP200をキュウリの子葉に一次接種し、第1本葉にp35SZ5vectorGFPFLを二次接種した。ALSVZCP200ZYMV区では前記21に示した通りである。ALSVZP3を一次接種後p35SZ5vectorGFPFLを二次接種した試験区ALSVZP3ZYMV区では、ALSVZCP200ZYMV区と同様に病徴は観察されず図11、蛍光は第1本葉に接種部位周辺でスポット状の蛍光と葉脈上の蛍光が観察された。第2本葉では葉脈上に観察された蛍光が狭い範囲で拡大した。第3本葉および第4本葉では数箇所で蛍光が観察されるのみであり、第5本葉より上位の葉では蛍光が観察されなかった図12。一方、ALSVZP1を一次接種後にp35SZ5vectorGFPFLを二次接種した試験区ALSVZP1ZYMV区では、第3本葉に葉の周辺部に弱い退緑症状が観察され、この症状はその後に展開した上葉全てで観察された。退緑症状は観察されたものの、ZYMVのみ区に観察された激しいモザイク症状や葉の矮化、植物体全体の矮化は観察されなかった図11。GFP蛍光について見ると、第1本葉煮接種部位周辺でスポット状の蛍光と葉脈上の蛍光が観察され、第2葉本では葉脈上の蛍光が狭い範囲で拡大した。また、第3本葉より上葉では、葉脈の蛍光や葉脈の周辺部でのスポット状の蛍光、葉の周辺部や先端部における蛍光が観察された図13。直接ELISA法によりZYMV量を測定したところ、ALSVZCP200ZYMV区とALSVZP3ZYMV区では第3本葉から第6本葉全てにおいて、ZYMVの蓄積は認められなかった。一方、ALSVZP1ZYMV区ではZYMVのみ区やwtALSVZYMV区の約半分程度蓄積していた図14。ALSVは、wtALSVZYMV区でALSVのみ区の約2倍蓄積していたが、ALSVZP1ZYMV区、ALSVZP3ZYMV区およびALSVZCP200ZYMV区では、ALSVのみ区よりもやや多い程度であった図14。一次接種に用いたZYMVの各遺伝子断片を導入したALSVALSVZP1、ALSVZP3、ALSVZCP200のインサートチェックを行ったところ、全てのキュウリ個体でALSVのインサートが保持されていた。なお、ZYMVの他の遺伝子領域HCPro、Cl、Nla、Nlbの断片180201ntについても干渉効果を同様に試験した。その結果、Cl、NlaおよびNlbの各断片は、前記のCP200断片およびP3断片と同様の効果を示した。一方、HCPro断片の効果は前記P1断片の効果とほぼ同一であった。23:異なるキュウリ品種における干渉効果青大胡瓜とは異なる2つの品種鈴成四葉、つばさにおいてALSVZCP200がZYMVに対する干渉効果を誘導するか検討した。鈴成四葉では、ZYMVのみ区やwtALSVZYMV区で、退緑症状のみが現れ、激しいモザイクや葉の萎縮、植物体の矮化は観察されなかった。また、ALSVZCP200ZYMV区では、病徴が全く観察されなかった。つばさでは、全ての試験区でZYMVの症状は観察されなかった。鈴成四葉のZYMVのみ区やwtALSVZYMV区においては、第1本葉から第5本葉で青大胡瓜の第1本葉二次接種区場合と同様のGFP蛍光の分布が観察され。第6本葉では、基部において蛍光のない領域が一部観察されたが、それ以外では蛍光が観察された。第7葉以降に展開した葉ではスポット状の蛍光が葉の周辺部から中心部に多く観察され、基部では蛍光が観察されなかった。ALSVZCP200ZYMV区では、第1本葉の接種部位周辺部にスポット状の蛍光のみが僅かに観察され、第2本葉においても数個の蛍光スポットが観察されるのみであった。第3本葉より上位の葉では蛍光は観察されなかった。つばさのZYMVのみ区やwtALSVZYMV区では、第1本葉から第5本葉で青大胡瓜や鈴成四葉の場合と同様のGFP蛍光の分布が観察され。第6本葉では基部において蛍光のない領域が一部観察されたが、それ以外では蛍光が観察された。第7本葉より上位の葉ではスポット状の蛍光が葉の周辺部を縁取るように観察され、それ以外の部分では蛍光が観察されなかった。ALSVZCP200ZYMV区では第1本葉の接種部位周辺でスポット状の蛍光が僅かに観察されるのみで、第2本葉においても数個の蛍光スポットが観察されるのみだった。第3本葉より上葉では蛍光は観察されなかった。直接ELISA法でZYMVを定量したところ、鈴成四葉およびつばさのALSVZCP200ZYMV区では第3本葉から第6本葉でZYMVが蓄積しないことが明らかになった図15、図16。また、鈴成四葉およびつばさの両品種において、ALSVのみ区に比べwtALSVZYMV区ではALSVの蓄積量が増加し、ALSVZCP200ZYMV区では若干減少していた。図15、図16。ALSVZCP200のインサートチェックを行ったところ、両品種のキュウリ個体でALSVのインサートは保持されていた。24:異なる長さのZYMV遺伝子断片を導入したALSVベクターの干渉効果ALSVベクターに導入したZYMV遺伝子断片の長さが干渉効果へ影響するかどうか調べるため、約100ntと約200ntのZYMVCP遺伝子断片を挿入したALSVALSVZCP100、ALSVZCP200の干渉効果を調べた。ALSVZCP200ZYMV区における病徴は前記21の第1本葉二次接種区と同様で、全ての上葉に病徴が観察されなかったのに対し、ALSVZCP100を一次接種後p35SZ5vectorGFPFLを二次接種接種した試験区ALSVZCP100ZYMV区では、葉の一部に弱い退緑の症状が観察された図17。ALSVZCP200ZYMV区では、第1本葉の接種部位周辺でスポット状のGFP蛍光と葉脈上の蛍光が観察され、第2本葉で葉脈上の蛍光が狭い範囲で拡がった。第3本葉では数箇所で蛍光が観察されるのみで、第4本葉より上位の葉では蛍光が観察されず、前記21の第1本葉二次接種区と同様であった。これに対し、ALSVZCP100ZYMV区では、第1本葉の二次接種部位周辺でスポット状の蛍光と葉脈上の蛍光が観察された。第2本葉では、葉脈上に蛍光が観察され、葉の展開とともに蛍光も拡大した。第3本葉では、葉の全体が蛍光で埋め尽くされていることが観察された。第4本葉では、スポット状の蛍光が葉全体で観察され、特に葉の周辺部で多数観察された。第5本葉では、葉の周辺部の葉脈上に蛍光が観察された。第6本葉より上位の葉では、葉の先端部でのみ蛍光が観察された図18。直接ELISA法でZYMVを定量したところ、ALSVZCP200ZYMV区の第3本葉から第6本葉でZYMVが蓄積されないのに対し、ALSVZCP100ZYMV区では、ZYMVのみ区やwtALSVZYMY区に比べやや少ないがZYMVが蓄積していることが明らかになった図19。ALSVの定量をしたところ、ALSVのみ区に比べwtALSVZYMV区では蓄積量が増加し、ALSVZCP200ZYMV区では同程度蓄積していた。これに対して、ALSVZCP100ZYMV区では、ALSVのみ区と比較すると、第3本葉から第5本葉ではALSVの蓄積量が増加していたが、第6本葉では同程度であった図19。一次接種に用いた異なる長さのZYMVのCP遺伝子断片を導入したALSVALSVZCP100、ALSVZCP200のインサートチェックを行ったところ、全てのキュウリ個体でALSVのインサートが保持されていた。なお、同様にして、ZYMVCP遺伝子の66nt断片と33nt断片をそれぞれ挿入したALSVの干渉効果を調べた。その結果、挿入遺伝子断片のサイズが小さくなるにつれて干渉効果が弱まることが確認された。25:ZYMV遺伝子断片導入ALSVと弱毒系統ZYMVの干渉効果の比較ウイルス製剤として市販されているZYMV2002による干渉効果と、ZYMV遺伝子断片を導入した3種のALSVによる干渉効果を比較するために、各試験区の病徴、GFP蛍光の分布およびウイルス蓄積を調べた。ZYMV2002を一次接種後p35SZ5vectorGFPFLを二次接種した試験区ZYMV2002ZYMV区では接種葉および上葉において病徴は観察されなかった図20。また、ALSVZP1ZYMV区、ALSVZP3ZYMV区およびALSVZCP200ZYMV区では前記22のようにそれぞれ接種葉および上葉においてGFP蛍光が観察されたのに対し、ZYMV2002ZYMV区では接種葉および上葉においてGFP蛍光は観察されなかった図21。GFP抗体を用いた間接ELISA法で強毒ZYMVの蓄積を調べたところ、ZYMVのみ区とwtALSVZYMV区においてGFPが蓄積したのに対し、ALSVZP3ZYMV区、ALSVZCP200ZYMV区およびZYMV2002ZYMV区では、GFPが全く蓄積せず、ALSVZP1ZYMV区では僅かにGFPが蓄積した図22。一次接種に用いたZYMVの各遺伝子断片を導入したALSVALSVZP1、ALSVZP3、ALSVZCP200のインサートチェックを行ったところ、全てのキュウリ個体でALSVのインサートが保持されていた。3:考察ZYMV遺伝子断片を導入したALSVをキュウリに接種すると、VIGSが誘導されZYMVに対する防御体制をとると予想された。先ず、ALSVベクター接種後の時間が干渉効果の誘導にどのように影響するか調べるため、ZYMVのCP遺伝子を導入したALSVALSVZCP200を接種後6日目、9日目および12日目に、それぞれ第1本葉、第2本葉および第3本葉に強毒ZYMV株の感染性クローンを接種し、干渉効果の誘導を調べた。その結果、3つの条件第1本葉二次接種区、第2本葉二次接種区、第3本葉二次接種区全てにおいて、上位葉でのZYMVの蓄積は認められなかった。また、GFP蛍光を観察したところ、第1本葉二次接種区では第1本葉から第3本葉でGFP蛍光が観察されたが、第2本葉二次接種区の接種葉でのみGFP蛍光が観察され、第3本葉二次接種区では接種葉においてもGFP蛍光が観察されなかった。以上よりALSVZCP200接種後の日数が経過するほどZYMVの拡がりを抑えることが明らかになった。この結果は、ALSVベクターによるサイレンシングの誘導がALSVの存在する領域でのみ誘導され、常にALSV増殖後にVIGSが誘導されるという観察結果と合わせて考えると、第1本葉および第2本葉に二次接種した試験区では、まだALSVが分布していないため接種葉および上葉ではZYMVの増殖と移行が起こったものと考えられる。これに対し、第3本葉に二次接種した試験区では既にALSVが分布し、VIGSが誘導されていたため、ZYMVの増殖が抑えられGFP蛍光が観察されなかったと考えられた。第1本葉に接種した試験区では第3本葉のごく一部に蛍光が観察されたものの、直接ELISA法を用いたZYMV量の測定ではウイルスは検出されないレベルであり、また全ての試験区で病徴が観察されなかった。以上より、ZYMV遺伝子断片を導入したALSVが感染したキュウリにおいて、接種から6日以上経過すればZYMVに対する干渉効果が誘導され、ZYMVの増殖を抑制できることを示している。次に、ALSVベクターに導入するZYMV遺伝子領域の違いが干渉効果の誘導に影響を与えるか調べるため、3種のZYMV遺伝子導入ALSVALSVZP1、ALSVZP3、ALSVZCP200間における干渉効果を比較した。ALSVZP1接種区では弱い病徴やGFP蛍光が観察されZYMVが蓄積したのに対し、ALSVZP3およびALSVZCP200接種区では、病徴は観察されず、また一部GFP蛍光が観察されたもののZYMVの蓄積は認められなかった。また、Cl、NlaおよびNlbの各断片も、前記のCP200断片およびP3断片と同様の効果を示した。キュウリ品種の違いが干渉効果に影響を与えるか調べるためALSVZCP200を用いて比較試験を行ったところ、誘導されるワクチン効果に品種間差は認められなかった。よって、品種の違いは干渉効果に影響を与えないと考えられ、3品種以外の品種においてもALSVベクターによる干渉効果の誘導が可能であると考えられた。ALSVベクターに導入する遺伝子断片の長さが干渉効果の誘導に影響を与えるか調べるため、ALSVZCP200とALSVZCP100による干渉効果を比較した。ALSVZCP100を一次接種した試験区ではZYMVが蓄積され、軽微な病徴やGFP蛍光が観察されたことから、誘導される干渉効果がALSVZCP200に比べ弱くなったと考えられた。この結果より、タバコにおいてPDS遺伝子のサイレンシングを誘導する際、異なるサイズのPDS遺伝子断片や同一のサイズで異なる部分のPDS遺伝子断片をALSVベクターに導入すると、サイレンシングの程度に違いが認められる報告例えば、非特許文献4と一致するものと考えられた。なお、挿入遺伝子のサイズをさらに小さくしたALSVZCP66、ALSVZCP33の試験でも、遺伝子サイズが小さくなるにつれて干渉効果が低減することが確認された。これらのことから、ALSVベクターを用いてあるウイルスに対して干渉効果を誘導する際、ALSVベクターに導入する遺伝子のサイズや部位によって、誘導される干渉効果が異なる可能性がある。そのため、複数のウイルス遺伝子断片を導入したALSVを作出し、その干渉効果について比較検討することが好ましい。市販されている弱毒ZYMVと、ZYMV遺伝子導入ALSVALSVZP1、ALSVZP3、ALSVZCP200の干渉効果の比較試験では、GFP蛍光の分布に差が認められた。すなわち、弱毒ZYMV接種区ではZYMVのGFP蛍光は全く観察されなかった。これは、弱毒ウイルスとALSVによる干渉効果の機構の差があるためと考えられる。つまり、ALSVベクターでは、導入遺伝子断片のサイレンシングによって干渉効果を誘導するRNA介在性機構であるため、ALSVが分布していない領域ではサイレンシングの誘導がなされていないため、強毒株のZYMVが増殖したと考えられる。これに対し、弱毒ZYMVでは、同種のウイルスによる干渉効果であるため、タンパク質介在性干渉効果が強毒ZYMVの増殖を抑え、蛍光が全く観察されなかったものと考えられた。さらに、ALSVベクターとZYMVでは感染葉でのウイルスの拡がり方が異なり、ALSVは葉の基部から先端部に向けてその範囲を拡げるように拡がるのに対し、ZYMVは葉脈全体に先ず拡がり、その後葉脈から染み出すように拡がるといった移行の違いも干渉効果に影響しているのかもしれない。ALSVを一次接種後にZYMVを二次接種した区では、ALSVの蓄積量が増加したのは、ZYMVとの重複感染によるsynergismが起こっていたものと考えられる例えば、非特許文献7。また、wtALSV接種区でも弱い干渉効果すなわち、植物体の矮化が認められなかったことは、このsynergismが影響しているのかもしれない。以上をまとめると、ALSVベクターにZYMVの遺伝子断片を組み込むことによってZYMVに対する干渉効果が誘導された。しかし、導入した遺伝子断片の種類、サイズ、位置によって干渉効果に強弱が見られ、実際にウイルスに対する干渉効果の誘導ベクターとして利用する場合には、ウイルス遺伝子断片導入ALSVを複数作製し、その効果を比較することが好ましい。キュウリモザイクウイルスCMVの遺伝子断片を導入したALSVベクターによる干渉効果1:材料と方法11:実験材料111:供試植物キノア、NicotianatabacumcvXanthincタバコ、とキュウリ青大胡瓜を供試した。112:供試ウイルス供試ウイルスは東北大学農学部准教授高橋英樹博士より分譲されたCucumbermosaicvirusstrainY以下CMVYおよび、独立行政法人農業生物資源研究所より入手したCMVisolate42CM以下CMV42CM、MAFF番号104087である。12:CMV遺伝子断片のALSVベクターへの導入121:CMV遺伝子断片のクローニング実施例1の145と同様の方法CMVY感染タバコ葉からでRNA抽出を行い、抽出したRNAを鋳型とし、既知のCMVY遺伝子配列をもとに設計したマイナス鎖のプライマーCMVY1a、CMVY2a、CMVYCPを用いて表2:配列番号10-15、CMVYのRNA1accessionnumber:D12537、RNA2accessionnumber:D12538、RNA3accessionnumber:D12499に対する逆転写反応を以下の方法で行った。02ml容PCRチューブにRNA溶液を2μl、滅菌水を6μl、5×RTBufferを4μl、25mMdNTPmixtureTaKaRaを8μl、10μMのマイナス鎖プライマーを1μl、RNaseInhibitorを05μl、ReverTraAceを05μl混合し、TaKaRaPCRThermalCyclerDiceVersionIIIModelTP600を使用して42°Cで50分間処理し、その後95°Cで5分間処理し、最後に4°Cで5分間処理し、獲られた産物をRT産物とした。得られたRT産物を鋳型とし、1a遺伝子750ntの増幅にはCMVY1aとCMVY1a、2a遺伝子663ntの増幅にはCMVY2aとCMVY2a、CP遺伝子558ntの増幅にはCMVYCPとCMVYCPの組み合わせ第2表のプライマーを用いたPCRによる各遺伝子断片の増幅とPCR産物のサイズ確認、PCR産物のMonoFasDNA精製キットIを用いた精製を、実施例1の121と同様の方法で行い、精製した遺伝子断片をそれぞれC1a遺伝子断片、C2a遺伝子断片、CCP遺伝子断片とした。精製した3種の遺伝子断片を用いたpGEMTEasyVectorSystemによるTAクローニングと、そのライゲーション産物を用いた大腸菌DH5αの形質転換、スモールスケール培養と煮沸法によるプラスミド抽出、抽出プラスミドの1アガロースゲルを用いた電気泳動による選抜とEcoRIを用いた制限酵素処理によるインサート保持の確認は、実施例1の121と同様の方法で行った。122:CMV遺伝子断片のシークエンスTAクローニングによって作製したプラスミドは、実施例1の122と同様の方法でプラスミドの精製とシークエンス解析を行った。配列を確認したプラスミドをそれぞれpGEMC1a、pGEMC2a、pGEMCCPとした図23。123:CMV遺伝子断片のALSVベクターへの導入pGEMC1aを鋳型にCMVY1aXhoとCMVY1aBam、pGEMC2aを鋳型にCMVY2aXhoとCMVY2aBam、pGEMCCPを鋳型にCMVYCPXhoとCMVYCPBamの組み合わせ表3:配列番号16-21で、実施例1の121と同様の方法でPCRを行った。PCR産物のBamHIとXhoIを用いた制限酵素処理、MonoFasDNA精製キットIを用いた精製はII13と同様の方法で行った。各種CMVインサートDNAとベクターDNAをDNALigationKitVer21を用いて行い大腸菌DH5αを形質転換後、スモールスケール培養し、煮沸法によってプラスミドを抽出した。各CMVインサートDNAを保持するクローンは、それぞれ1μgμlの濃度に調整し、得られたプラスミドをALSVR2L5R5C1a、ALSVR2L5R5C2a、ALSVR2L5R5CCPとした図24。124:ALSVベクターの接種とウイルス化精製した各プラスミドALSVR2L5R5C1a、ALSVR2L5R5C2a、ALSVR2L5R5CCPは、実施例1の124と同様の方法でウイルス化を行い、各プラスミドの接種によって得たウイルスをそれぞれALSVC1a、ALSVC2a、ALSVCCPとし、以後の試験の接種源とした。13:供試植物への接種法と一次接種および二次接種131:一次接種タバコへの一次接種は以下のとおり行った。wtALSV、ALSVC1a、ALSVC2a、ALSVCCPにそれぞれ感染したキノア葉を2倍容のALSV磨砕緩衝液で磨砕した。作製した各ALSV磨砕液を5葉期のタバコの第3から第5本葉の3枚に、カーボランダム法で接種した。タバコは25°Cの長日条件で育成した。キュウリへの一次接種はII1と同様の方法で行い、25°Cの長日条件で育成した。132:二次接種タバコでの二次接種にはCMVYを用いて以下の通り行った。CMVY感染タバコ葉を2倍容の01Mリン酸緩衝液pH70で磨砕し、第7から第9本葉の3枚にカーボランダム法で二次接種した。二次接種後、タバコは一次接種後と同様に25°Cの長日条件で育成した。キュウリへの二次接種にはCMV42CMを用いて以下の方法で接種した。CMV42CM感染タバコ葉を2倍容の01Mリン酸緩衝液pH70で磨砕し、第1本葉1枚にカーボランダム法で二次接種した。二次接種後、キュウリは一次接種後と同様に25°Cの長日条件で育成した。なお、二次接種に用いたCMVYとCMV42CMは、あらかじめ01Mリン酸緩衝液pH70を用いてタバコに接種し、病徴の現れたタバコの上葉を採取し、80°Cで凍結保存したものを使用した。14:病徴観察とウイルス検定141:病徴の観察病徴の観察は二次接種後毎日行った。タバコは二次接種後9日目に、キュウリは二次接種後18日目にデジタルカメラFinePixS1Proを用いて病徴を撮影した。142:ウエスタンブロット法一次接種後7日目に、タバコでは第3本葉から第5本葉を採取し、キュウリでは子葉2枚を採取し、II13と同様の方法でウエスタンブロットを行い、一次接種したALSVの感染を確認した。143:ELISA法タバコにおけるCMVYとALSVの蓄積量は以下のように検定試料を作製し、直接ELISA法で定量した。二次接種後9日目に第12本葉から第15本葉を採取し、乳鉢と乳棒を用いて20倍容のPBSTで磨砕し、磨砕液1mlを15ml容マイクロチューブに移した。14000rpm4°Cで5分間遠心し、得られた上清を検定試料とした。上記の方法で作製した検定試料を用いて、実施例1の144の直接ELISA法でウイルスの定量をした。キュウリにおけるCMV42CMとALSVの蓄積量は以下のように検定試料を作製し、実施例1の144の直接ELISA法で定量した。二次接種後18日目に第3本葉から第6本葉のそれぞれからII14と同様にリーフディスクを6枚採取し、検定試料を作製した。直接ELISA法によるCMVYおよびCMV42CMの定量には、CMV抗体日本植物防疫協会研究所と酵素標識をしたCMV抗体日本植物防疫協会研究所を使用した。144:RNA抽出法とRTPCR法タバコでは二次接種後9日目にタバコの最上位葉を採取し、キュウリでは二次接種後18日目にキュウリの最上位葉を採取し、それぞれ80°Cで凍結し、検定試料とした。RNA抽出と逆転写反応およびPCRは全て実施例1の145と同様の方法で行い、ALSVのインサート配列の保持を確認した。2:結果21:タバコにおけるCMVY遺伝子断片を導入したALSVベクターの干渉効果CMVY遺伝子断片を導入したALSVベクターの接種によって、タバコでCMVYに対する干渉効果の誘導が可能かどうか調べるため、wtALSVおよびCMVYの各遺伝子断片を導入したALSVALSVC1a、ALSVC2a、ALSVCCPを一次接種したタバコにCMVYを二次接種し、CMVYに対する干渉効果の誘導を調べた。ALSVの一次接種を行わずCMVYのみを二次接種した試験区CMVYのみ区やwtALSVを一次接種後CMVYの二次接種を行った試験区wtALSVCMVY区では、二次接種後約3日で全個体の接種葉で黄斑が観察され、約7日には上葉に激しいモザイク症状が観察された。これに対して、ALSVC2aを一次接種後にCMVYのを二次接種した試験区ALSVC2aCMVY区では、全ての個体で病徴は観察されなかった。ALSVC1aを一次接種後にCMVYを二次接種した試験区ALSVC1aCMVY区では、6個体中3個体の上葉に弱いモザイク症状が観察され、残りの3個体では病徴が観察されなかった。一方、ALSVCCPを一次接種後にCMVYを二次接種した試験区ALSVCCPCMVY区では6個体全ての上葉に弱いモザイク症状が観察された図25、表4。CMVYの蓄積を調べたところ、ALSVC2aCMVY区ではCMVYの蓄積は認められなかった。これに対して、ALSVCCPCMVY区ではCMVYのみ区やwtALSVCMVY区と同程度蓄積していた。ALSVC1aCMVY区では、CMVYのみ区やwtALSVCMVY区の3分の1程度蓄積していた図26。ALSVの定量ではALSVC1aCMVY区とALSVC2aCMVY区ではALSVのみ区と同程度蓄積し、wtALSVCMVY区ではALSVのみ区に比べ蓄積量が若干増加していることが確認された。一方、ALSVCCPCMVY区では、ALSVのみ区の半分から4分の1程度少なく蓄積していることが確認された図26。一次接種に用いたCMVYの各遺伝子断片を導入したALSVALSVC1a、ALSVC2a、ALSVCCPのインサートチェックを行ったところ、全てのキュウリ個体でALSVのインサートが保持されていた。22:キュウリにおけるCMVY遺伝子断片を導入したALSVベクターの干渉効果wtALSVおよびCMVYの各遺伝子断片を導入したALSVALSVC1a、ALSVC2a、ALSVCCPを一次接種したキュウリにおけるCMV42CMに対する干渉効果を調べた。CMV42CMのみ二次接種した試験区CMV42CMのみ区やwtALSVを一次接種後にCMV42CMを二次接種した試験区wtALSVCMV42CM区では、二次接種後約3日で全ての個体の第2本葉で退緑斑が観察され、その後展開した上葉で退緑斑が観察された。特に、第6本葉から第8本葉ではモザイク症状が観察された。これに対し、ALSVC2aを一次接種後にCMV42CMを二次接種した試験区ALSVC2aCMV42CM区では、全個体で病徴が観察されなかった。ALSVC1aを一次接種後にCMV42CMを二次接種した試験区ALSVC2aCMV42CM区では、6個体中2個体で接種葉に退緑斑が観察され、第2本葉から第4本葉で退緑斑観察された。第5本葉より上の葉では病徴が観察されなかった。また、残り4個体では病徴が観察されなかった。ALSVCCPを一次接種後にCMV42CMを二次接種した試験区ALSVCCPCMV42CM区では6個体全てにCMV42CMのみ区やwtALSVCMV42CM区と同様の病徴が観察された図27。CMV42CMの定量の結果、ALSVC2aCMV42CM区ではCMV42CMの蓄積は認められなかった。これに対し、ALSVCCPCMV42CM区では、CMV42CMのみ区やwtALSVCMV42CM区と同程度CMV42CMが蓄積し、ALSVC1aCMV42CM区では、約半分のZYMVが蓄積していた図28。また、ALSVC1aCMV42CM区とALSVC2aCMV42CM区では、ALSVのみ区と同程度のALSVが蓄積し、wtALSVCMV42CM区ではALSVのみに比べ蓄積量が増加していた。一方、ALSVCCPCMV42CM区では、ALSVのみ区より少なく蓄積していた図28。一次接種に用いたCMVYの各遺伝子断片を導入したALSVALSVC1a、ALSVC2a、ALSVCCPのインサートチェックの結果、全てのALSVがインサートを保持していた。3:考察タバコおよびキュウリの両植物のALSVC2aを接種した試験区では、CMVYおよびCMV42CMに対する干渉効果が誘導され、病徴やウイルスの蓄積は確認されなかった。これに対し、ALSVC1aおよびALSVCCPを接種した試験区では穏かな病徴が観察され、CMVYおよびCMV42CMの蓄積が確認された。この干渉効果の違いはALSVベクターに導入したそれぞれの遺伝子断片の違いであると考えられる。2a遺伝子断片を組み込んだALSVC2aではCMVYおよびCMV42CMの病徴やウイルスの蓄積が全く確認されなかったことから、ALSVベクターによる干渉効果の誘導はタバコとキュウリの両植物においても可能であることが示され、ALSVベクターの宿主植物において干渉効果誘導ベクターとしての利用が期待される。ALSVに導入した各CMVY遺伝子断片領域とそれに対応するCMV42CMの遺伝子領域の塩基配列の相同性を比較したところ、1a遺伝子では903、2a遺伝子では981、CP遺伝子では979相同であった。本実施例2では、既知のCMVY遺伝子を基に構築した2a遺伝子断片を導入したALSVによって、2つのCMVCMVYとCMV42CMに対して干渉効果を誘導することができた。この結果から、塩基配列の相同性が保存されている遺伝子領域の断片を導入したALSVベクターを宿主に接種することで、異なる系統や分離株に対する干渉効果を誘導可能であることが示された。実施例1の結果と合わせて考察すると、ALSVベクターは異なる属のウイルスにおいて干渉効果の誘導に成功したことから、ALSVベクターに導入する遺伝子断片を変えることで、多数のウイルスに対する干渉効果を誘導する防除剤植物ワクチンの作出が短期間で可能であることが示された。SMVの遺伝子断片を導入したALSVベクターによる干渉効果SMVの外被タンパク質をコードするゲノム配列の一部201ntを挿入したALSVSMVCPALSVを作出し、SMVに対する干渉効果を試験した。SMVCPALSVをダイズ品種Jackおよび丹波黒の子葉に1次接種後、展開した初生葉もしくは第一本葉にSMVをカーボランダム法により2次接種チャレンジ接種した。その結果、SMV単独接種区では上葉にモザイクと縮葉症状を示したのに対し、SMVCPALSVを1次接種した区では病徴はほとんど観察されなかった。また、SMV単独接種区と比較するとSMVの増殖量が著しく低下しており、SMVCPALSVによる干渉効果が生じていることが確認された。また、上葉におけるSMVの分布をティッシュブロット分析により解析したところ、SMV単独接種個体ではSMVが葉全面にモザイク状に分布しているのに対し、SMVCPALSVを1次接種した個体ではウイルスが葉脈とその近傍のみに局在していることが明らかとなった。ZYMVとCMVの遺伝子断片を導入したALSVベクターによる干渉効果実施例1と同様のZYMV遺伝子断片150ntと実施例2のCMV遺伝子断片150ntを融合した形で挿入したALSVZCALSVを作出し、ZYMVとCMVに対する干渉効果を試験した。ZCALSVをキュウリ子葉に1次接種後、5~6日後に第1本葉にZYMVとCMVをそれぞれ単独で、または混合し2次接種チャレンジ接種した。その結果、対象区では上葉にZYMVの奇形を伴う激しいモザイクZYMV2次接種区や激しいモザイクCMV2次接種区、激しいモザイクと矮化症状混合2次接種区が現れたのに対して、ZCALSV1次接種区ではZYMV単独、CMV単独、ZYMVとCMV混合のいずれの2次接種区に対しても干渉効果を示し、明瞭な病徴は認められず、また各ウイルスの蓄積も抑制されていた。以上の結果から、2種類のウイルスを同時に抑制するALSV混合ワクチン株の作出が可能であることが確認された。