チロシンフェノールリアーゼtyrosinephenollyase活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。チロシンフェノールリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエアアグロメランスPantoeaagglomerans由来の遺伝子、シトロバクターブラッキーCitrobacterbraakii由来の遺伝子、デスルフィトバクテリュームハフニエンスDesulfitobacteriumhafniense由来の遺伝子、クロロフレクサスオウランティアカスChloroflexusaurantiacus由来の遺伝子、ノストックパンクチフォルメ由来の遺伝子、又はトレポネマデンティコラTreponemadenticola由来の遺伝子である請求項1に記載の形質転換体。チロシンフェノールリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の又はのDNAである請求項1に記載の形質転換体。配列番号16の塩基配列からなるDNA、配列番号23の塩基配列からなるDNA、配列番号24の塩基配列からなるDNA、配列番号25の塩基配列からなるDNA、配列番号26の塩基配列からなるDNA、又は配列番号27の塩基配列からなるDNAの何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシンフェノールリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項1~3の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウムグルタミカムである請求項1~4の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869である請求項1~3の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項1~3の何れかに記載の形質転換体。コリネバクテリウムグルタミカムPHE31受託番号:NITEBP-999形質転換体。請求項1~8の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、チロシン、その塩、又はそのエステルを含有する反応液中で反応させる工程と、反応培地中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない請求項9に記載のフェノールの製造方法。還元条件下の反応液の酸化還元電位が-200~-500ミリボルトである請求項9又は10に記載のフェノールの製造方法。本発明は、チロシンを原料として効率よくフェノールを製造できる微生物、及びチロシンを原料として効率よくフェノールを製造できる方法を提供することを課題とする。上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。コリネ型細菌にチロシンフェノールリアーゼ遺伝子を導入した形質転換体は、効率よくチロシンからフェノールを生産する。この形質転換体において、宿主のコリネ型細菌の染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼ遺伝子poxFが破壊され、又は欠損しているときは、一層効率よくフェノールを生産できる。この形質転換体は、還元条件下の反応液中で実質的に増殖しない状態で反応させる場合、特に、フェノール生産効率が高い。本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体及びフェノールの製造方法を提供する。項1.チロシンフェノールリアーゼtyrosinephenollyase活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。項2.チロシンフェノールリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエアアグロメランスPantoeaagglomerans由来の遺伝子、シトロバクターブラッキーCitrobacterbraakii由来の遺伝子、デスルフィトバクテリュームハフニエンスDesulfitobacteriumhafniense由来の遺伝子、クロロフレクサスオウランティアカスChloroflexusaurantiacus由来の遺伝子、ノストックパンクチフォルメ由来の遺伝子、又はトレポネマデンティコラTreponemadenticola由来の遺伝子である項1に記載の形質転換体。項3.チロシンフェノールリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の又はのDNAである項1に記載の形質転換体。配列番号16の塩基配列からなるDNA、配列番号23の塩基配列からなるDNA、配列番号24の塩基配列からなるDNA、配列番号25の塩基配列からなるDNA、配列番号26の塩基配列からなるDNA、又は配列番号27の塩基配列からなるDNAの何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシンフェノールリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA項4.宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項1~3の何れかに記載の形質転換体。項5.宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウムグルタミカムである項1~4の何れかに記載の形質転換体。項6.宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869である項1~3の何れかに記載の形質転換体。項7.宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項1~3の何れかに記載の形質転換体。項8.コリネバクテリウムグルタミカムPHE31受託番号:NITEBP-999形質転換体。項9.項1~8の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、チロシン、その塩、又はそのエステルを含有する反応液中で反応させる工程と、反応培地中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。項10.反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項9に記載のフェノールの製造方法。項11.還元条件下の反応液の酸化還元電位が-200~-500ミリボルトである項9又は10に記載のフェノールの製造方法。本発明の形質転換体を用いることにより、チロシンからフェノールを高効率で製造することができる。一般に微生物はフェノールのような溶剤の細胞毒性により生育が阻害されるため、微生物を用いてフェノールを製造することは困難であったが、本発明方法によれば、微生物を用いて、実用上十分に効率良くフェノールを製造することができる。以下、本発明を詳細に説明する。Iフェノール生産能を有する形質転換体本発明のフェノール生産能を有する形質転換体は、チロシンフェノールリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された形質転換体である。宿主コリネ型細菌とは、バージーズマニュアルデターミネイティブバクテリオロジーBargeysManualofDeterminativeBacteriology、Vol8、5991974に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウムグルタミカム、コリネバクテリウムエフィシェンスCorynebacteriumefficiens、コリネバクテリウムアンモニアゲネスCorynebacteriumammoniagenes、コリネバクテリウムハロトレランスCorynebacteriumhalotolerance、コリネバクテリウムアルカノリティカムCorynebacteriumalkanolyticum等が挙げられる。中でも、安全でかつフェノール生産性が高い点で、コリネバクテリウムグルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumR株FERMP18976、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ233FERMBP1497、MJ233AB41FERMBP1498等が挙げられる。中でも、R株FERMP18976、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウムフラバムBrevibacteriumflavum、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentum、ブレビバクテリウムディバリカタムBrevibacteriumdivaricatum、コリネバクテリウムリリウムCorynebacteriumlilium等のコリネ型細菌もコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumに菌名が統一されているLieblWetalTransferofBrevibacteriumdivaricatumDSM20297TBrevibacteriumflavumDSM20411BrevibacteriumlactofermentumDSM20412andDSM1412andCorynebacteriumglutamicumandtheirdistinctionbyrRNAgenerestrictionpatternsIntJSystBacteriol41255260、駒形和男らコリネフォルム細菌の分類発酵と工業45944963。旧分類のブレビバクテリウムラクトファーメンタムATCC13869株、ブレビバクテリウムフラバムのMJ233株FERMBP1497、MJ233AB41株FERMBP1498なども好適なコリネバクテリウムグルタミカムである。ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウムアンモニアゲネスBrevibacteriumammoniagenes例えばATCC6872株等が挙げられる。アースロバクター属菌としては、アースロバクターグロビフォルミスArthrobacterglobiformis例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株等が挙げられる。マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウムボビスMycobacteriumbovis例えばATCC19210株、ATCC27289株等が挙げられる。マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカスフロイデンライヒMicrococcusfreudenreichii例えばNo239株FERMP13221、マイクロコッカスルテウスMicrococcusleuteus、マイクロコッカスウレアエMicrococcusureae例えばIAM1010株、マイクロコッカスロゼウスMicrococcusroseus例えばIFO3764株等が挙げられる。また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート乳酸デヒドロゲナーゼlactatedehydrogenase:LDH、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼphosphoenolpyrvatecarboxylase、マレートデヒドロゲナーゼmalatedehydrogenaseなどの遺伝子の破壊株が挙げられる。このような遺伝子破壊株を宿主として用いることにより、フェノールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウムグルタミカムの、特にRFERMP18976株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、WO2005/010182A1に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。実施例3に示した通り、本発明者らは、コリネ型細菌が、他細菌に比べて、フェノールに対する耐性が極めて高いことを見出した。この点で、コリネ型細菌は本発明方法によるフェノール製造に好適である。また、コリネ型細菌は、他の好気性細菌に比べて、実質的に増殖しない還元条件下で効率よく物質生産を行える。この点でも、コリネ型細菌は本発明方法によるフェノール製造に好適である。チロシンフェノールリアーゼ酵素遺伝子チロシンフェノールリアーゼは、チロシンからピルビン酸及びアンモニアを脱離させてフェノールを生成する反応、及びその逆反応を触媒する酵素である。また、チロシンフェノールリアーゼは、カテコールとピルビン酸からL-DOPAを生成する反応も触媒する。チロシンフェノールリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来は特に限定されないが、パントエアアグロメランスPantoeaagglomerans由来の遺伝子、シトロバクターブラッキーCitrobacterbraakii由来の遺伝子、デスルフィトバクテリュームハフニエンスDesulfitobacteriumhafniense由来の遺伝子、クロロフレクサスオウランティアカスChloroflexusaurantiacus由来の遺伝子、ノストックパンクチフォルメ由来の遺伝子、トレポネマデンティコラTreponemadenticola由来の遺伝子が好ましく、パントエアアグロメランス由来の遺伝子がより好ましい。パントエアアグロメランスPantoeaagglomerans由来の遺伝子としては配列番号16の塩基配列からなるDNAが挙げられ、シトロバクターブラッキーCitrobacterbraakii由来の遺伝子配列番号23の塩基配列からなるDNAが挙げられ、デスルフィトバクテリュームハフニエンスDesulfitobacteriumhafniense由来の遺伝子配列番号24の塩基配列からなるDNAが挙げられ、クロロフレクサスオウランティアカスChloroflexusaurantiacus由来の遺伝子配列番号25の塩基配列からなるDNAが挙げられ、ノストックパンクチフォルメ由来の遺伝子配列番号26の塩基配列からなるDNAが挙げられ、トレポネマデンティコラTreponemadenticola由来の遺伝子としては配列番号27の塩基配列からなるDNAが挙げられる。また、本発明では、配列番号16、23、24、25、26、又は27の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシンフェノールリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。本発明においてストリンジェントな条件は、一般的な条件、例えば、MolecularCloningALaboratoryManualSecondEdition1989Vol2p1145に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度より5~10°C低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。チロシンフェノールリアーゼ活性は、JBiolChem24517671772MaterialsandMethodsに記載の方法を改変して測定できる。簡単に説明すると、試験用液に被験酵素を添加し、50mMリン酸カリウムバッファーpH8025mMLTyr01mMピリドキサールリン酸20グリセロールと酵素を含む反応液を調製し、30°C、30分間反応を行った。反応停止は06N塩酸終濃度添加により行った。これを遠心分離後、フィルターろ過し、生じたフェノールはHPLCで分析、定量したCosmosilC18ARII移動相20MeOH007過塩素酸。反応初速度とタンパク濃度から比活性を算出した1分間当たり、1マイクロモルのフェノールを産生せしめる酵素量を1unitとした。また、本発明では、配列番号16、23、24、25、26、又は27の塩基配列と同一性が90以上、好ましくは95以上、より好ましくは98以上の塩基配列からなり、かつチロシンフェノールリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYXver8GENETYX株式会社ゼネティックス製により算出した値である。配列番号16、23、24、25、26、又は27の塩基配列からなるDNAのホモログは、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができ、これにより高確率でチロシンフェノールリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが得られる。形質転換のためのベクターの構築PCRで増幅したチロシンフェノールリアーゼ酵素をコードするDNAは、それぞれ、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentum2256由来のpAM330特開昭5867699、MiwaKetalCrypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteriaAgricBiolChem48290129031984及びYamaguchiRetalDeterminationofthecompletenucleotidesequenceoftheBrevibacteriumlactofermentumplasmidpAM330andtheanalysisofitsgeneticinformationNucleicAcidsSympSer162652671985、コリネバクテリウムグルタミカムATCC13058由来のpHM1519MiwaKetalCrypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteriaAgricBiolChem48290129031984及びpCRY30KurusuYetalIdentificationofplasmidpartitionfunctionincoryneformbacteriaApplEnvironMicrobiol577597641991、コリネバクテリウムグルタミカムT250由来のpCG4特開昭57183799、KatsumataRetalProtoplasttransformationofglutamateproducingbacteriawithplasmidDNAJBacteriol、1593063111984、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50特開昭62166890、pEK0、pEC5、pEKEx1EikmannsBJetalAfamilyofCorynebacteriumglutamicumEscherichiacolishuttlevectorsforcloningcontrolledgeneexpressionandpromoterprobingGene10293981991などが挙げられる。好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウムグルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3フォスフェートデヒドロゲナーゼA遺伝子のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子mdhのプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子ldhAのプロモーターPldhAなどが挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnBT1T2ターミネーター、大腸菌のtrpAターミネーター、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentumのtrpターミネーターなどが挙げられ、中でも、rrnBT1T2ターミネーターが好ましい。形質転換形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる。中でも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は、公知の方法KurusuYetalElectroporationtransformationsystemforCoryneformbacteriabyauxotrophiccomplementationAgricBiolChem544434471990及びVertesAAetalPresenceofmrrandmcrlikerestrictionsystemsinCoryneformbacteriaResMicrobiol1441811851993により行うことができる。形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地等を用いることができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質又は糖アルコール;酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸;エタノール、プロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種を単独で使用でき、又は2種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約01~10w/vとすればよい。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミンビタミンB1、ピリドキシンビタミンB6、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。培地のpHは約5~8が好ましい。好ましい微生物培養培地としては、A培地InuiMetalMetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditionsJMolMicrobiolBiotechnol7182196、BT培地OmumasabaCAetalCorynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithoppositeATPdependentregulationJMolMicrobiolBiotechnol891103等が挙げられる。培養温度は約15~45°Cとすればよく、培養時間は約1~7日間とすればよい。宿主染色体遺伝子の破壊又は欠失宿主のコリネ型細菌は、その染色体上に存在するフェノール2モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより、一層効率良くフェノールを製造することができる。遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある米国特許第6303383号、特開平05007491号。具体的には、実施例1の項目に記載の方法により、フェノール2モノオキシゲナーゼ遺伝子poxFが破壊され、又は欠失したコリネ型細菌を得ることができる。IIフェノールの製造方法上記説明した本発明の形質転換体を、チロシンを含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含む方法によりフェノールを製造することができる。微生物の増殖反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25~38°Cで、約12~48時間培養して増殖させることが好ましい。培養用培地反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。炭素源として、糖類グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖;スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖;澱粉のような多糖;糖蜜等、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール;酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸;エタノール、プロパノールのようなアルコール;ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約01~10w/vとすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミンビタミンB1、ピリドキシンビタミンB6、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。培地のpHは約6~8が好ましい。具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地InuiMetalMetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditionsJMolMicrobiolBiotechnol7182196、BT培地OmumasabaCAetalCorynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithoppositeATPdependentregulationJMolMicrobiolBiotechnol891103等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。反応液反応液は、フェノール前駆体フェノール原料を含有する水、緩衝液、無機塩培地などを用いることができる。前駆体としては、チロシンLチロシン、Dチロシン、又はこれらの混合物、その塩、又はそのエステルを用いることができる。中でも、Lチロシン、その塩、又はそのエステルが好ましい。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などが挙げられる。また、エステルとしては、炭素数1~4のアルコールとのエステルなどが挙げられる。チロシンは、水に難溶なので、チロシン塩を用いるのが好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。前駆体は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。反応液中のチロシン、その塩、又はそのエステルの濃度は、約05~10w/vが好ましく、約1~7w/vがより好ましく、約2~5w/vがさらにより好ましい。上記範囲であれば、効率良く、フェノールを製造できる。緩衝液としては、リン酸バッファー、トリスバファー、炭酸バッファーなどが挙げられる。緩衝液の濃度は、約10~150mMが好ましい。無機塩培地としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等の無機塩の1種又は2種以上を含む培地が挙げられる。中でも、硫酸マグネシウムを含む培地が好ましい。無機塩培地として、具体的には、BT培地OmumasabaCAetalCorynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithoppositeATPdependentregulationJMolMicrobiolBiotechnol891103等が挙げられる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。反応液のpHは約6~8が好ましい。反応中は、アンモニア水溶液、水酸化ナトリウム水溶液などを用いて、pHコントローラー微生物からの染色体DNAの抽出コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumRからの染色体DNA抽出は、A培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7gを蒸留水1Lに溶解に、炭素源として、最終濃度4になるように50グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット商品名:GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit、アマシャム社製を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。パントエアアグロメランスPantoeaagglomeransNBRC12686からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。クローニングベクターの構築クローニングベクターpCRB22の構築コリネバクテリウムカゼイJCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点以降、pCASE1oriと記す配列、及びクローニングベクターpHSG298タカラバイオ株式会社製をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、pCASE1ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号1pCASE1ori配列、配列番号2クローニングベクター-pHSG298を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。pCASE1ori配列増幅用プライマーa1;5’ATAGATCTAGAACGTCCGTAGGAGC3’配列番号3b1;5’ATAGATCTGACTTGGTTACGATGGAC3’配列番号4尚、プライマーa1及びb1には、BglII制限酵素部位が付加されている。クローニングベクターpHSG298増幅用プライマーa2;5’ATAGATCTAGGTTTCCCGACTGGAAAG3’配列番号5b2;5’ATAGATCTCGTGCCAGCTGCATTAATGA3’配列番号6尚、プライマーa2及びb2には、BglII制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、JapanCollectionofMicroorganismsより入手したコリネバクテリウムカゼイJCM12072から抽出したトータルDNA及びクローニングベクターpHSG298タカラバイオ株式会社製を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1ori配列の場合約14kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約27kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムカゼイ株由来のプラスミドpCASE1ori配列含む約14kbDNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG298を含む約27kbDNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液とした。得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG298約27kbのDNA断片に加え、pCASEori配列の約14kbDNA断片が認められた。pCASE1ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。クローニングベクターpCRB207の構築コリネバクテリウムグルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseをコードするgapA遺伝子のプロモーター配列以降、PgapAと記すを含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK2233ファルマシア社製由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列以降、ターミネーター配列と記すを含むDNA断片を以下の方法により増幅した。PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列番号7PgapA配列、配列番号8ターミネーター配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PgapA配列増幅用プライマー;5’CTCTGTCGACCCGAAGATCTGAAGATTCCTG3’配列番号9;5’CTCTGTCGACGGATCCCCATGGTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG3’配列番号10尚、プライマーa3には、SalI制限酵素部位が、プライマーb3には、SalI、BamHI及びNcoI制限酵素部位が付加されている。ターミネーター配列増幅用プライマーa4;5’CTCTGCATGCCCATGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGA3’配列番号11b4;5’CTCTGCATGCTCATGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG3配列番号12尚、プライマーa4には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマーb4には、SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、コリネバクテリウムグルタミカムRから抽出した染色体DNA及びpKK2233プラスミドファルマシア社製を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、PgapA配列の場合約06kb、ターミネーター配列の場合、約04kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカムR由来PgapA配列を含む約06kbDNA断片10μlとクローニングベクターpCRB22約41kbを各々制限酵素SalIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションB液とした。得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SalIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB22約41kbのDNA断片に加え、PgapA配列の約06kbDNA断片が認められた。PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。上記PCRにより増幅したpKK2233プラスミド由来ターミネーター配列を含む約04kbDNA断片10μlを制限酵素NcoI及びBspHIで、上述のクローニングベクターpCRB2062μlを制限酵素NcoIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションC液とした。得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB206約47kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列の約04kbDNA断片が認められた。rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。クローニングベクターpCRB209の構築コリネバクテリウムグルタミカムR由来のgapAglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseA遺伝子のプロモーター以降、PgapAと記す配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号13pCRB207を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。pCRB207配列増幅用プライマーa5;5’CTCTCATATGCTGTTTTGGCGGATGAGAG3’配列番号14b5;5’CTCTCATATGGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG3’配列番号15尚、プライマーa5及びb5にはNdeI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニングベクターpCRB207を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaq宝酒造株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB207配列を含む約51kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したpCRB207由来遺伝子を含む約51kbDNA断片10μlを制限酵素NdeIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼ宝酒造株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションD液とした。得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NdeIで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクタ-をpCRB209と命名した。フェノール生産遺伝子のクローニングパントエアアグロメランス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングパントエアアグロメランス由来のチロシンフェノールリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号16パントエアアグロメランスtpl遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。tpl遺伝子増幅用プライマーa6;5’CTCTCATATGAACTATCCTGCCGAGC3’配列番号17b6;5’CTCTCATATGTTAAATAAAGTCAAAACGCGCAGTAAAG3’配列番号18尚、プライマーa6及びb6には、NdeI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、パントエアアグロメランスは、NITEBiologicalResourceCenterNBRCより入手したパントエアアグロメランスNBRC12686から抽出した染色体DNAを用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、パントエアアグロメランスtpl遺伝子の場合約14kbのDNA断片が検出できた。フェノール生産遺伝子発現プラスミドの構築フェノール生産遺伝子のpCRB209へのクローニング上記項に示したPCRにより増幅したパントエアアグロメランス株由来tpl遺伝子を含む約14kbDNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB2092μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションE液とした。得られたライゲーションE液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約51kbのDNA断片に加え、パントエアアグロメランス株由来tpl遺伝子ライゲーションE液の場合、長さ約14kbの挿入断片が認められた。パントエアアグロメランス株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB209tplPAと命名した図1。コリネバクテリウムグルタミカムの染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウムグルタミカム株poxF遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウムグルタミカム株の染色体上poxF遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際してコリネバクテリウムグルタミカムRの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。poxF1領域増幅用プライマーa7;5’CTCTTCTAGATACGTCCTAAACACCCGAC3’配列番号19b7;5’GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC3’配列番号20尚、プライマーa7には、XbaI制限酵素部位が付加されている。poxF2領域増幅用プライマーa8;5’CAAGTCAGCAATGGTTGGTC3’配列番号21b8;5’CTCTTCTAGATGATCAGTACCAAGGGTGAG3’配列番号22尚、プライマーb8には、XbaI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、コリネバクテリウムグルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウムグルタミカムpoxF1領域の場合約08kb、poxF2領域の場合約08kbのDNA断片が検出できた。次に、上記のPCRにより増幅したpoxF1領域断片とpoxF2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。さらに、得られたpoxF1及びpoxF2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpoxF欠失断片の増幅を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、poxF欠失断片約16kbが検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカムR由来poxF欠失配列約17kbDNA断片10μlと約44kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725JMolMicrobiolBiotechnol、Vol8、243254、特開20061244402μlを各々制限酵素XbaIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションF液とした。得られたライゲーションF液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約44kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来poxF欠失遺伝子ライゲーションF液の場合、長さ約17kbの挿入断片が認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来poxF欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725poxFCGと命名した。フェノール分解に関わる遺伝子破壊株の構築マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウムグルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725poxFCGを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムRを形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地A液体培地、および15寒天に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10スクロース含有BT寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2mlを蒸留水1Lに溶解、および15寒天に塗付した。プラスミドpCRA725poxFCGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725poxFCG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラスサブチリスBacillussubtilisのsacRsacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725poxFCG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacRsacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウムグルタミカムR株poxF遺伝子マーカーレス破壊株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumΔpoxFと命名した。フェノール生産遺伝子導入株の構築上述のプラスミドpCRB209tplPAを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムΔpoxF株を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209tplPAの導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE31と命名した。コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE31は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足258郵便番号2920818の独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託した受託日:2010年11月2日、受託番号:NITEBP999。実施例2コリネバクテリウムグルタミカムフェノール生産遺伝子導入株及び副生経路破壊株のフェノール生成実験実施例1において作製したコリネバクテリウムグルタミカムPHE31株を、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムPHE31株を、カナマイシン50μgmlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムPHE31株を、カナマイシン50μgmlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、終菌体濃度10となるようにBT液体培地07硫酸アンモニウム、005リン酸二水素カリウム、005リン酸水素二カリウム、005硫酸マグネシウム7水和物、00006硫酸鉄7水和物、000042硫酸マンガン水和物、000002ビオチン、000002チアミン塩酸塩に50ml懸濁した。この菌体懸濁液を容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下酸化還元電位;450mV、反応開始からそれぞれ01310時間後に、基質として40mMのLチロシン二ナトリウム塩を逐次添加し、33°Cに保った水浴中で攪拌しながら反応させた。サンプリングした反応液を遠心分離し、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。この結果、コリネバクテリウムグルタミカムPHE31株は、還元条件下における反応において、24時間後に34mMのフェノールを生成していた。実施例3フェノール生産用宿主としての適性試験フェノールによる好気増殖への影響コリネバクテリウムグルタミカム、エシェリヒアコリおよびシュードモナスプチダについて、好気培養におけるフェノールの生育阻害試験を行った。尚、本試験に用いたシュードモナスプチダS12は、溶媒耐性菌として報告されており、これまでに唯一フェノール生産の宿主として用いられた技術が開示されている。コリネバクテリウムグルタミカムRをA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、33°C、15時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムRを、A液体培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40gを蒸留水1Lに溶解10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムRを、A液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノールが終濃度0、016、02、024、032mMとなるように添加し、33°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。エシェリヒアコリJM109をLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布し、37°C、15時間暗所に静置した。上記プレートで生育したエシェリヒアコリJM109を、LB液体培地1ポリペプトン、05酵母エキスおよび05塩化ナトリウム10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、37°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したエシェリヒアコリJM109をLB液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、016、020mMとなるように添加し、37°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。シュードモナスプチダF1およびS12をLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布し、30°C、15時間暗所に静置した。上記プレートで生育したシュードモナスプチダF1およびS12を、LBグルコース液体培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウムおよび04グルコース10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、30°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したシュードモナスプチダF1およびS12株をLBグルコース液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、010、020mMとなるように添加し、30°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。培地中へのフェノール添加による好気増殖への影響の解析結果を図2に示す。エシェリヒアコリは、016フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け、020フェノールでは完全に増殖が阻害された。シュードモナスプチダF1及び溶剤耐性菌として報告されていたシュードモナスプチダS12は、ほぼ同じ傾向を示し、010フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け020フェノールでは完全に増殖が阻害された。これに対して、コリネバクテリウムグルタミカムは、エシェリヒアコリが顕著な増殖阻害を受けた016のフェノール存在下においても増殖への影響はほとんどなく、エシェリヒアコリやシュードモナスプチダでは完全に増殖を阻害された020のフェノール存在下においても良好な生育を示した。さらに024のフェノール存在下において増殖が可能であった。このように、コリネバクテリウムグルタミカムはエシェリヒアコリおよびシュードモナスプチダと比較して、フェノールに対し高い耐性を有し、フェノール生産の宿主として高い適性を有することが示された。