以下のアデノウイルスDNA配列:aE2a遺伝子;bE4orf6遺伝子;cVAIRNA遺伝子;およびdパルボウイルスVPキャプシド遺伝子ユニットを含む、アデノウイルス由来ヘルパーウイルス。前記パルボウイルスVPキャプシド遺伝子ユニットの発現がCMVプロモーターの制御下にある、請求項1に記載のアデノウイルス由来ヘルパーウイルス。i哺乳動物細胞がaVP1遺伝子およびVP2遺伝子を欠く組換えパルボウイルスベクター、bパルボウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクター、およびcE2a遺伝子、E4orf6遺伝子およびVAIRNA遺伝子由来のアデノウイルスDNA配列を含むアデノウイルス由来ヘルパーベクターでトランスフェクトされること、ならびにii前記組換えパルボウイルスが哺乳動物細胞または前記細胞を培養した後の培地から単離されることを特徴とする、組換えパルボウイルスの作製方法。前記哺乳動物細胞がHEK293T細胞である、請求項3に記載の方法。i哺乳動物細胞にaVP1遺伝子およびVP2遺伝子を欠く組換えパルボウイルス、およびb請求項1または2に記載のアデノウイルス由来ヘルパーウイルスを感染させること;およびii前記組換えパルボウイルスが前記哺乳動物細胞または前記細胞を培養した後の培地から単離されることを特徴とする、組換えパルボウイルスの作製方法。前記哺乳動物細胞がNBK細胞である、請求項5に記載の方法。前記組換えパルボウイルスがH-1またはMVMに由来する、請求項1~6のうちいずれか一項に記載の方法。前記ヘルパーウイルス/ベクターのアデノウイルスDNA配列がAd5に由来する、請求項1~7のうちいずれか一項に記載の方法。前記組換えパルボウイルスベクターにおいて、前記VP1遺伝子およびVP2遺伝子が導入遺伝子により置換される、請求項3~8のうちいずれか一項に記載の方法。前記導入遺伝子の発現がP38プロモーターの制御下にある、請求項9に記載の方法。前記導入遺伝子がマーカータンパク質をコードする遺伝子である、請求項9または10に記載の方法。前記導入遺伝子が治療用または免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子である、請求項9または10に記載の方法。前記治療用タンパク質が細胞傷害性ポリペプチド、サイトカインおよび/またはケモカインである、請求項12に記載の方法。請求項3~13のうちいずれか一項に記載の方法により得ることができる組換えパルボウイルス。請求項14に記載の組換えパルボウイルスを含有する細胞。請求項14に記載の組換えパルボウイルスと薬学上許容される担体を含有する医薬組成物。遺伝子療法または腫瘍を治療する方法に用いられる請求項3~13のうちいずれか一項に記載の方法により得ることができる組換えパルボウイルス。請求項1または2に記載のアデノウイルス由来ヘルパーウイルス/ベクターと組換えパルボウイルスを含有する組成物。前記アデノウイルス由来ヘルパーウイルスおよび前記組換えパルボウイルスが導入遺伝子を含有する、請求項18に記載の組成物。請求項19に記載の組成物を含有する細胞。遺伝子療法または腫瘍の治療を目的とする医薬組成物の製造のための、請求項3~13のうちいずれか一項に記載の方法により得ることができる組換えパルボウイルスまたは請求項18もしくは19に記載の組成物の使用。よって、本発明が基礎とする課題は、組換えパルボウイルス生産の効率を高めるための手段を提供することであった。この技術的課題は、特許請求の範囲に特徴付けられる実施形態を提供することによって解決される。驚くことに、組換えパルボウイルスの生産もまた、アデノウイルス遺伝子の手助けから利益を得ることができることが判明した。組換えパルボウイルスの生産は、従来、HEK293T生産細胞において、この細胞を組換えパルボウイルスゲノムおよびキャプシドVP遺伝子を担持するプラスミドでトランスフェクトすることによってなされてきた。用いられるプロトコールでは、最良の条件下で生産細胞あたり0.1~0.5形質導入単位TUtransductionunitの範囲という極めて低い力価の組換えパルボウイルスが得られるにすぎない。さらに、プラスミドトランスフェクション効率の違いによって、得られる力価に大きな変動もある。この方法で生成されるウイルスは複製欠陥型であるが、ウイルスゲノムとキャプシド遺伝子の間の相同組換えを介して再構成される複製能を有するウイルスRCVreplicationcompetentvirusesが一部少数含まれる[11]。これらのRCVは最終的なウイルス原株の望ましくない混入物であるため、組換えパルボウイルス生産の際にはそれらの生成を制限することが重要である。本発明に至る実験では、生産細胞をアデノウイルス由来プラスミドpXX6でトランスフェクトするかまたはそれらに組換えアデノウイルス-5Ad-5を感染させるかのいずれかによって細胞に導入されたアデノウイルス遺伝子を用いた組換えパルボウイルス生産の効率は有意に高めることができた。この新たなプロトコールを用いると、より短い時間3日ではなく2日で10倍を超える高い力価に達した。生成されたRCVのパーセンテージはアデノウイルスを用いないプロトコールに匹敵する。これらの結果から、パルボウイルスキャプシド遺伝子ユニットを担持する新規な複製欠陥型組換えAd-5ベクターAd-VPヘルパーが作出された。このヘルパーウイルスを使用したところ、NB324KNBKなどの他の生産細胞でも組換えパルボウイルスが作出でき、組換えウイルスに品質に影響を及ぼすことなくより高いウイルス力価が得られた。重要なことには、Ad-VPヘルパーを使用すると、トランスフェクション工程を用いなくてすむ。このプロセスは標準化することができ、再現性があり、生産時間とコストの両方が削減される。要約すると、アデノウイルス5由来ベクター、例えばpXX6トランスフェクションにより供給およびAd5ΔE1ΔE3トランスフェクションおよびAd5ΔE1ΔE3-CMV/GFP組換えウイルスの形態での感染により供給を使用すると、HEK293T細胞における組換えパルボウイルスの生産が10倍を超えて高まる。アデノウイルス由来ベクターによってもたされる生産増は、組換えパルボウイルスの送達様式プラスミドトランスフェクションかウイルス感染、ならびにHEK293T細胞内でのパルボウイルス導入遺伝子の大きさおよび性質に依存しない。pXX6は組換えパルボウイルスの生産を加速化し、生産時間を3日から2日に短縮する。pXX6は、HEK293T細胞内でのパルボウイルスDNAの複製を有意に増強し、加速化する。pXX6は、望ましくない複製能を有するウイルスRCVの生成を促進せず、pXX6に基づくプロトコールを用いて得られるRCVのレベルは、従来のアプローチを用いて得られるものと同程度の低さである。Adヘルパー遺伝子ならびにパルボウイルスキャプシド遺伝子ユニットを含有するAd-VPヘルパーウイルスは、トランスフェクション工程を必要とすることなく、Ad-VPヘルパーウイルスを選択された組換えパルボウイルスと組み合わせて感染させることにより組換えパルボウイルスの増幅を可能とする。これにより生産時間とコスト例えば、トランスフェクション試薬および人員に関してが有意に削減される。さらに、例えばNBK細胞など、トランスフェクトが難しいがPVの優れた生産株である細胞系統の使用が可能となるので、用いるパッケージング細胞系統の選択におけるこれまでの制限が克服される。これにより、例えばバイオリアクターで組換えパルボウイルスの大規模生産が可能となる。よって、第1の態様において、本発明は、以下のアデノウイルスDNA配列:aE2a遺伝子;bE4orf6遺伝子;cVAIRNA遺伝子;およびdパルボウイルスVPキャプシド遺伝子ユニットを含む、アデノウイルス由来ヘルパーウイルスに関する。アデノウイルス由来ヘルパーウイルスは、パルボウイルスを形成するために必要なヘルパーウイルスの全てのDNA配列、すなわち、好ましくは、DNA配列a~dのみを含有する。このようなDNA配列は好ましくはアデノウイルス5に由来する。組換えパルボウイルスの作製の出発材料として好適なヘルパーベクターDNA配列は独国特許出願第19644500.0-41号に記載されており、すなわち、Ad5遺伝子E2A、E4およびVAはpDGプラスミドに由来してもよく、これらは個々のオリジナルプロモーターによるか、または異種プロモーターによって制御される。本明細書で用いるアデノウイルス由来ヘルパーウイルスという表現は、a~dに挙げられているオリジナル遺伝子を有するウイルスに関するだけでなく、例えばヌクレオチドの欠失または挿入を含むがなお所望の生物学的機能を有するタンパク質をコードする、改変遺伝子を有するウイルスにも関する。当業者ならば、一般的な方法の手段により、改変遺伝子が所望の生物学的機能を有する産物をなおコードするかどうかを判定することができる。また、当業者は、本発明のウイルスに特徴的な個々の遺伝子の供給源を知っている。上記のDNA配列および適当であればさらなる配列を含むウイルスの構築には、当技術分野で公知の一般法を使用することができる。これらの方法には、例えば、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual第2版ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYに記載されているように、invitro組換え技術、合成法およびinvivo組換え法が含まれる。本明細書で用いるパルボウイルスVPキャプシド遺伝子ユニットという表現は、VP1、VP2およびVP3をコードする遺伝子に関する。なお、VP3はVP2の切断産物である。好ましくは、パルボウイルスVPキャプシド遺伝子ユニットは、哺乳動物において活性な構成プロモーターまたは誘導プロモーター、およびcポリアデニル化シグナルの制御下にある。本明細書で用いる哺乳動物において活性な構成プロモーターまたは誘導プロモーターという表現は、哺乳動物において所望のDNA配列の転写を可能とするプロモーターの全て、とりわけ強い発現をもたらすもの、好ましくは、異種プロモーターを含む。好適なプロモーターは当業者に公知であり、例えば、構成プロモーターのCMVおよびサイトケラチンK14プロモーター、または誘導プロモーターのMMTVマウス乳癌ウイルス、メタロチオネインおよびテトラサイクリン制御プロモーター系Tet-on/-offが含まれる。さらに、アデノウイルス由来ヘルパーウイルスまたは組換えパルボウイルスベクタープラスミドは、標的細胞に首尾よく導入されたことを確認するために検出可能な表現型マーカーをコードする遺伝子を含み得る。好ましくは、このマーカータンパク質は蛍光タンパク質である。これにより、所望の標的細胞のトランスフェクションが容易に確認される。蛍光タンパク質をコードする好適な遺伝子の例としては、rfp-赤、gfp-緑、cfp-青およびyfp-黄遺伝子があり、rfp-赤Dsred-cDNA;Clontechが好ましい。マーカータンパク質の発現を駆動するのに好適なプロモーターの例としては、RSVラウス肉腫ウイルスプロモーター、CMVサイトメガロウイルスプロモーターおよびHSV単純ヘルペスウイルスtkプロモーターがあり、RSVプロモーターが好ましい。発現カセットプロモーター/マーカー遺伝子/ポリアデニル化部位が、ベクター内の当業者に容易に判定できる好適な部位に挿入される。本明細書で用いるパルボウイルスには、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む全てのパルボウイルスを包含する。自律性パルボウイルスには、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属およびコントラウイルス属のメンバーが含まれる。自律性パルボウイルスの例としては、限定されるものではないが、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルスおよびB19ウイルスが挙げられる。他の自律性パルボウイルスも当業者に知られている;例えば、BNFieldsetalVIROLOGY第2巻第69章参照。ディペンドウイルス属はアデノ随伴ウイルスAAVを含み、これには限定されるものではないが、1型AAV、2型AAV、3型AAV、4型AAV、5型AAV、6型AAV、鳥類AAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAVおよびヒツジAAVが含まれる;例えば、BNFieldsetalVIROLOGY第2巻第69章参照。好ましくは、VP1遺伝子およびVP2遺伝子を欠く組換えパルボウイルスベクターは、以下の構造:TR-repNS1/NS2-任意の導入遺伝子-TR[TR;末端反復]を有する。第2の態様において、本発明は、i哺乳動物細胞がaVP1遺伝子およびVP2遺伝子を欠くしかし、NS1/2コード配列を好ましくはパルボウイルスP4プロモーターの制御下に保持する組換えパルボウイルスベクター、bパルボウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクター、およびcE2a遺伝子、E4orf6遺伝子およびVAIRNA遺伝子由来のアデノウイルスDNA配列を含むアデノウイルス由来ヘルパーベクターでトランスフェクトされること、ならびにii前記組換えパルボウイルスが哺乳動物細胞または前記細胞を培養した後の培地から単離されることを特徴とする、組換えパルボウイルスの作製方法に関する。ヘルパーベクターは、当技術分野で公知のいずれのベクターであってもよい。例示的ベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミド、裸のDNAベクター、細菌人工染色体BAC、酵母人工染色体YACおよびウイルスベクターが挙げられる。好ましいウイルスベクターとしては、AAV、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン-バーウイルスEBV、バキュロウイルスおよびレトロウイルス例えば、レンチウイルスベクター、より好ましくは、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスベクターが挙げられる。組換えパルボウイルス粒子は、上記ベクターa~cを許容細胞この用語は当技術分野で理解されている例えば許容細胞はウイルスによる感染または形質導入が可能であるに導入することにより生産される。限定されるものではないが、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、陽イオンまたは陰イオンリポソーム、およびリポソームと核局在シグナルとの組合せをはじめ、ベクターを許容細胞に導入するいずれの方法も使用可能である。当技術分野で公知の好適な許容哺乳動物細胞はいずれも、パルボウイルスの生産に使用可能である。また、複製欠陥ヘルパーウイルスから欠損した機能を提供するトランス補足パッケージング細胞系統も好ましく、例えば、293細胞、911細胞、HeLa-E1細胞、633細胞または他のE1aトランス補足細胞がある。本発明の方法の好ましい実施形態では、哺乳動物細胞はHEK293またはHEK293T細胞である。第3の態様において、本発明は、i哺乳動物細胞にaVP1遺伝子およびVP2遺伝子を欠くしかし、NS1/2コード配列を好ましくはパルボウイルスP4プロモーターの制御下に保持する組換えパルボウイルス、およびb本発明のアデノウイルス由来ヘルパーウイルスを感染させること;およびii前記組換えパルボウイルスが前記哺乳動物細胞または前記細胞を培養した後の培地から単離されることを特徴とする、組換えパルボウイルスの作製方法に関する。本発明の新規なアデノウイルス由来ヘルパーウイルスAd-VPヘルパーウイルスを用いれば、感染にのみ基づくプロトコールが使用可能であり、トランスフェクションの必要が避けられる。これにより、トランスフェクションは難しいがHEK293T、例えばNBK細胞よりもパルボウイルスの複製に許容性が高い細胞系統においてパルボウイルスの生産を行う可能性が開ける。よって、本発明の該方法の好ましい実施形態では、哺乳動物細胞系統はNBKである。本適用に使用可能な細胞系統の他の例は、NB-E、SiHaまたはA9である。好ましくは、組換えパルボウイルスはパルボウイルスH-1またはMVMに由来する。本発明の該方法の好ましい実施形態では、組換えパルボウイルスベクターにおいて、VP1遺伝子およびVP2遺伝子は導入遺伝子、すなわち、少なくとも1つのTRが隣接する異種遺伝子により置換される。好ましくは、導入遺伝子は、配列特異的DNA結合タンパク質である非構造タンパク質NS1によりトランスで強く活性化される、H-1PVの自己P38プロモーターまたはマウスの自律性パルボウイルス微小ウイルスの制御下にある。好ましくは、導入遺伝子は、aマーカータンパク質、例えば上記のタンパク質;またはb治療用遺伝子、例えば、細胞傷害性ポリペプチド、サイトカインもしくはケモカイン、または免疫原性ポリペプチドワクチン;腫瘍サプレッサーまたはRNA干渉分子および/またはRNAi発現カセットアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、miRNAなどとして用いられるをコードする遺伝子である。本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる組換えパルボウイルスならびにこのような組換えパルボウイルスを含有する細胞も提供する。最後に、本発明はまた、本発明の組換えパルボウイルスと薬学上許容される担体を含有する医薬組成物、ならびに遺伝子療法または腫瘍を処置する方法に用いるための本発明の組換えパルボウイルスの使用に関する。このような薬剤の好適な担体および製剤は当業者に公知である。好適な担体としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば、油/水エマルション、湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。担体の種類は本発明のヘルパーベクターおよび組換えパルボウイルスをどのように投与するかによって異なる。好適な用量は担当医によって決められ、例えば、患者の年齢、性別および体重、疾患の重篤度、投与の種類などの種々の要因に依存する。遺伝子療法は、本発明のヘルパーベクターを用いて作製された組換えパルボウイルス粒子を用いて行うことができ、これらの細胞は該ウイルス粒子とともにインキュベートすることにより形質導入/感染を受ける。これらの細胞は生物体に存在してもよく、被感染細胞には有針注射、ジェット注射またはパーティクルガンにより到達可能である。他方、被形質導入細胞はまた、生物体から単離した後、生物体外で感染させた後に再び生物体に戻すこともできる。このような細胞は自己細胞と呼ばれる。さらに、前記生物体については、形質導入に同種細胞を使用することもできる。これに関しては、これらの細胞がその生物体に対応するHLA型に属すことが好都合である。当業者ならば、ある特定のHLA型を有する細胞を提供する方法を知っている。本発明の組換えパルボウイルス粒子はまた、化学療法、すなわち腫瘍療法に対するアジュバント適用にも有用である。Ad-VPヘルパーの用途は、組換えパルボウイルスの生産に限定されない。Ad-VPヘルパーは癌療法においてrecPVとの併用も可能である。これにより腫瘍部位で二次的なrecPV複製が可能となり、パルボウイルスの治療効力が増す。さらに、Ad-VPヘルパーに第2の抗癌導入遺伝子を挿入することもでき、併用処置の治療能がさらに増す。よって、本発明はまた、本発明のヘルパーウイルスと組換えパルボウイルスを含む医薬組成物に関する。好ましくは、両成分は、治療用ポリペプチド、例えば、抗癌ポリペプチドをコードする異なる導入遺伝子を含有する。実施例1材料および方法A細胞HEK293TおよびNB324KNBK細胞を、それぞれ10DMEMまたは5ウシ胎仔血清MEM、2mML-グルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地DMEMまたは改変イーグル培地MEMで培養した。細胞は37°C、5CO2および湿度92で維持した。BプラスミドおよびウイルスpH-1-EGFPは、SacI/NotI制限部位を用い、pChi-hH-1-EGFP[23]からpsr19-H-1-Δ800[2]へEGFP遺伝子をサブクローニングすることによって得た。phH-1-Lucは[2]に記載されているphH1Δ1600lucである。精製Ad-GFPウイルスはDr.LaurentMailly国立保健医学研究所InsermU748生物学研究所、ストラスブール、フランスから厚意により譲渡されたものであり、1GFUは48時間以内に1個の293T細胞を緑にすることができるということに基づき、HEK293T細胞に対して緑色蛍光単位/ml[GFU/ml]で力価を測定した。pAd-VPヘルパープラスミドこのベクターの概略マップは図7に示されているは、AdEasy商標アデノウイルスベクター系Agilenttechnologies、Stratagene製品、ヴァルドブロン、ドイツを用い、製造者の説明書に従い、pAd5ΔE1ΔE3[24]とpShuttle-CMV/VPH-1ベクターをBJ5183細菌中で組み換えることによって作出した。pShuttle-CMV/VPH1は、PmeI消化を用いてpcDNA5-CMV/VPH-1からVP領域をサブクローニングし、それをEcoRVで消化したpShuttle-CMVベクターAgilenttechnologies、Stratageneの製品に再びライゲーションすることにより作出した。pcDNA5-CMV/VPH-1は、BamHI/XhoI制限部位を用い、領域をpVP-subからpcDNA5/FRT/TOInvitrogen、カールスルーエ、ドイツへサブクローニングすることにより作出した。pVP-subは、まず、HpaI制限部位をpBluescriptSKプラスミドpBSK、Stratageneのポリリンカーに挿入し、その後、それに、HindIII/HpaI制限部位を用い、VP遺伝子ユニットを含有する、pBKCMV/VPH-1プラスミド[2]由来のH-1PVゲノムの2647-4680nt断片をサブクローニングすることにより構築した。Ad-VPヘルパーウイルスは従来、HEK293T細胞での3回の生産で作製し、その後、二重CsCl勾配によって精製し、アデノ-X商標ラピッドタイターキットClontech、サンジェルマンアンレー、フランスを用いて力価を測定した。Cトランスフェクション図1、3、4および5に示される実験に関して、トランスフェクションはFugeneHDRocheDiagnosticsAppliedSciences、マンハイム、ドイツを用い、若干変更した製造者の説明に従って行った。プラスミドを血清不含培地で終濃度20ng/μlとなるように希釈した。次に、FugeneHDを1:2.5の比μgDNA:μlFugeneで加え、この混合物を室温で30~60分間インキュベートした。その後、この混合物を細胞に滴下した。図2に関しては、トランスフェクションは[25]に記載のようにポリエチレンイミンPEISigma-AldrichChemieGmbh、ミュンヘン、ドイツを用いて行った。6cmディッシュ形式では、8×105293T細胞/ディッシュを播種した。1日後、細胞を、記載した場合のみ、以下の量でトランスフェクトした:1.2μg組換えパルボウイルスベクター、2.4μgpCMV/VP、3μgpXX6、5.2μgpAd5ΔE1ΔE3および3または5.2μgpFRT/lacZeoInvitrogen対照充填DNAとして使用。10cmディッシュ形式および175cm2フラスコでは、細胞数およびプラスミド量は比例して調整し、2.5倍および6倍した。D抗体以下の抗体をウエスタンブロット解析に用いた:ポリクローナル抗NS1SP8抗血清Dr.NathalieSalome、DKFZ、ハイデルベルク、ドイツから厚意により譲渡、ウサギポリクローナル抗GFPSantaCruz、ハイデルベルク、ドイツおよびマウスモノクローナル抗アクチンクローンC4、MPBiomedicals、イルキルシュ、フランス。Eルシフェラーゼアッセイルシフェラーゼアッセイ系Promega、マンハイム、ドイツを用いた。2.5×104NBK細胞/ウェルを48ウェルプレートに播種し、翌日、種々の希釈率の粗ウイルス抽出液0.1mlを感染させた。感染48時間後、細胞をPBSで洗浄し、100μlの1倍の受動的溶解バッファーで溶解させた。10μlの細胞溶解液を50μlのルシフェラーゼ基質と混合し、生じた発光を、照度計FluoroskanAscentFL、ThermoLabsystems、ドライアイヒ、ドイツを用いて10秒間測定した。Fウイルス力価の測定形質導入アッセイ2.5×104NBK細胞/ウェルを48ウェルプレートに播種し、翌日、種々の希釈率の粗ウイルス抽出液0.1mlを感染させた。感染72時間後、GFP陽性細胞を、蛍光顕微鏡を用いて計数した。ウイルス力価形質導入単位/ml[TU/ml]を次のように計算した:緑色細胞の数×希釈倍率×10。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応qPCR粗ウイルス抽出液をベンゾナーゼ登録商標ヌクレアーゼウルトラピュアグレードSigma50U/ml、37°C、30分で消化し、トランスフェクトされたプラスミドを残してゲノムDNAを除去した。ウイルスからウイルスDNAを放出させるために、各サンプル10μlを、56°Cで30分間、全40μlのアルカリ性溶解バッファーTEバッファー中1MのNaOHに溶解させた。溶解は960μlの40mMHClを加えることで停止させた。ウイルスDNAの定量は、ABIPrism7700サーマルサイクラーAppliedBiosystemsを用い、NS1特異的TaqMan商標プローブAppliedBiosystems、ダルムシュタット、ドイツを用いたリアルタイムqPCRにより行い、SDS2.1ソフトウエアAppliedBiosystemsの手段により分析した。要するに、パルボウイルスDNAを増幅し、NS1特異的5’FAM-MGB3’標識TaqMan商標プローブを用いて検出した。NS1配列を含むプラスミドを101~108コピー/反応の範囲で連続希釈し、qPCRの標準化に用いた。各反応混合物20μlは、1×TaqManUniversalPCRMasterMix商標AppliedBiosystems、0.3μΜ標識NS1-TaqMan商標プローブ、0.3μΜの各プライマーおよび3μlの鋳型からなった。ウイルスDNAハイブリダイゼーションアッセイNBK細胞を6cmディッシュに5×105細胞/ディッシュの密度で播種した。翌日、粗ウイルス抽出液を10ー4~10ー71:10段階で連続希釈した後、総容量400μlでNBK細胞の感染に用いた。10分おきにプレートを振盪させながら37°Cで1時間インキュベートした後、各ディッシュに5mlの培地を加えた。感染72時間後、細胞層をPBSで洗浄し、25mm径のニトロセルロースフィルターSchleicherSchuell、ダッセル、ドイツを細胞の上にのせ、100μlのPBSで湿らせた。次に、これらのフィルターを、変性バッファー0.5MNaOHおよび1.5MNaClで飽和させたワットマン濾紙上に逆さまに置いた。5分後、フィルターを中和バッファー0.5MTris/HClpH7.2、1.5MNaClおよび1mMEDTAで飽和させたワットマン濾紙に移した。5分後、DNAを80°Cで2時間焼き付けることにより固定した。プレハイブリダイゼーションは3×SSC1×SSCは0.15MNaClおよび0.015Mクエン酸ナトリウムである、1SDS、5mMEDTA、10×デンハート液および100μg/mlサケ精子DNA中、65°Cで1時間行った。ハイブリダイゼーションはpMVMプラスミドのEcoRVnt385~EcoRInt1084断片に相当する放射性プローブを加えることにより行い、アガロースゲル電気泳動により精製し、MegaprimeDNALabellingSystemGEHealthcare、ミュンヘン、ドイツを用いて[32P]dCTPで標識した。65°Cで一晩インキュベートした後、フィルターを65°Cで30分間洗浄バッファー13×SSCpH7、1SDSで、次いで、65°Cで30分間洗浄バッファー20.3×SSCpH7で洗浄した。その後、フィルターをワットマン濾紙上に置き、プラスチックホイルで覆い、-80°Cで一晩、ラジオグラフィーフィルムに露光した。感染細胞は、放射性標識ウイルスDNAのためにフィルム上で黒い点を呈する。ウイルス力価複製単位RU/ml[RU/ml]を次のように計算した:黒い点の数×希釈倍率×7.5。プラークアッセイ単層で増殖させたNBK細胞に粗ウイルス抽出液の連続希釈物を1時間感染させた後、接種物をBacto商標寒天BectonDickinsonGmbH、ハイデルベルク、ドイツ上層最小必須培地[]L-グルタミンGibco、Invitrogen、5FBS、2mML-グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン中0.68に置き換えた。感染5日後、PBSで希釈したBacto商標-寒天0.85を含有するニュートラルレッド0.2mg/mlを加えることによって、生細胞を18時間染色した。プラークを計数し、力価をプラーク形成単位PFU/mlとして表した。GDNA抽出およびサザンブロット法組換えウイルスの生産中に生産されたウイルスDNA中間体の分析のために、vTEバッファー10mMTris-HCl[pH8.7]、1mMEDTAと2×Hirtバッファー20mMTris[pH7.4]、20mMEDTA、1.2SDSの混合物1:1で細胞抽出液を調製し、次いで46°C、60回/分の回転下で18時間、プロテイナーゼK400μg/mlで消化した。次に、DNAを0.5μmおよび0.4μmのニードルを数回通して剪断し、フェノール-クロロホルム抽出を行い、最後にDpnI消化を行ってウイルスゲノムを担持する細菌プラスミドを除去した。DNAサンプル2gを1アガロースゲル電気泳動により分画した。ゲルにおけるDNA変性および中和の後、従来のサザントランスファー手順によりDNAをHybond-NナイロンメンブランGEHealthcareに転写し、次いで膜にUV架橋させた。次に、メンブラン上に存在するウイルス中間体を、ウイルスDNAハイブリダイゼーションアッセイのフィルターに用いたものと同じ手順で検出した。実施例2アデノウイルス遺伝子は組換えパルボウイルス生産を高める本試験では、アデノウイルス遺伝子が組換えパルボウイルス生産を高めることができるかどうかを検討した。この目的で、HEK293T細胞を、GFP導入遺伝子を担持する組換えパルボウイルスプラスミドprec.PV-GFP、H-1パルボウイルスキャプシドタンパク質をコードするプラスミドpCV/VPおよびアデノウイルス5由来プラスミドpXX6で一時的に同時トランスフェクトした。pXX6はE2a、E4orf6およびVAIRNAアデノウイルス遺伝子を含有し、AAV生産を促進するのに十分である[17、18]。トランスフェクション3日後、細胞を溶解し、rec.PV-GFPウイルス生産を実施例1に記載されているように形質導入アッセイにより評価した。従って、これらのウイルス生産細胞からの細胞抽出液を用いて新鮮なNBK細胞に接種を行った。48時間後、GFP陽性NBK細胞を蛍光顕微鏡によりモニタリングした図1A。pXX6およびパルボウイルスプラスミドでトランスフェクトされた細胞からの抽出液では、パルボウイルスプラスミド単独でトランスフェクトされた細胞に比べて陽性緑色細胞の数がはるかに多くなり、このことはパルボウイルスプラスミド単独でトランスフェクトされた細胞からの溶解液に含まれる組換えパルボウイルスの量が少なかったことを示す。ウエスタンブロット解析によれば、pXX6条件で得られた抽出液で感染させたNBK細胞では、高レベルのパルボウイルスNS1とともに高レベルのGFPタンパク質が確認された図1B。組換えパルボウイルスの生産が付加的アデノウイルス要素の存在によってさらに改善可能であるかどうかを調べるために、パルボウイルス生産の増強におけるpXX6とより完成度の高いpAd5ΔE1ΔE3ベクターの効果を比較した。トランスフェクション3日後に、上記のようにウイルス形質導入アッセイを行った。図1Cに示されるように、pAd5ΔE1ΔE3とpXX6は双方とも、陰性対照または充填条件と比較して10倍を超える有意なウイルス生産増を見せる。アデノウイルスヘルパーは106緑色形質導入単位TU/mlを達成可能であり、これは播種した生産細胞あたり平均5TUに相当する。pAd5ΔE1ΔE3とpXX6は双方とも、これらの実験条件下で匹敵する組換えパルボウイルスの生産増をもたらし、pXX6に含まれる遺伝物質でこの効果の誘導に十分であることを示唆する。pXX6の助けで生産された組換えパルボウイルスの量を慎重に定量するために、HEK293T細胞を175cm2フラスコに播種した後、pXX6を伴って、または伴わずにprec.PV-GFP、pCMV/VPで同時にトランスフェクトした。トランスフェクション3日後に、細胞をvTEバッファーに溶解させた図2の凡例参照。細胞溶解液に含まれる生産ウイルスを、キャプシド封入パルボウイルスゲノムの濃度を測定するパルボウイルス特異的定量的PCRを用いて直接定量し、ウイルスゲノムVg/mlで表した。さらに、これらの細胞溶解液をNBK指標細胞の感染に用い、ウイルス力価を、i形質導入アッセイGFP陽性細胞を計数し、ウイルス収量を形質導入単位TU/mlとして表した、およびiiパルボウイルス特異的ハイブリダイゼーションアッセイウイルスDNA複製を保持する細胞の数を、NS放射性標識プローブを用いて検出したにより定量した。そして、生産されたウイルスの濃度を複製単位RU/mlとして表した。図2は、種々のアッセイの全てにおいてpXX6プラスミドの存在下でウイルス生産の有意な増大が確認されたことを示す。次に、pXX6が望ましくない複製能を有するパルボウイルスRCVのより高い同時生産をもたらし得るかどうかを検討した。RCVを、NBK細胞に対する従来のパルボウイルスプラークアッセイを用いて測定したところ、得られたPFU/TUの比はpXX6によっては影響を受けず図2、右のパネル、このことはpXX6がRCVの生産性を高めず、従って、生産される組換えウイルスの品質を保持することを示す。図1および2に示される結果を確認するために、より長いリポーター導入遺伝子であるprec.PV-ルシフェラーゼprec.PV-Luc従前に用いたGFP導入遺伝子の場合の731ntの代わりに1656ntの挿入を担持する別の組換えパルボウイルスを用いて同様の実験を行った。より長い導入遺伝子800ntを越えるを担持するパルボウイルスの生産は、より短いもの800ntまでを用いた生産よりもいっそう効率が低いことが知られている[2]。違うアデノウイルスヘルパープラスミドpVAE2AE4-5のパルボウイルスの生産を高める能力もまた調べた。このベクターは違うプラスミド骨格にpXX6と同様のアデノウイルス遺伝子を有する[26]。細胞をprec.PV-Luc、pCMV/VP、およびアデノウイルスヘルパープラスミドpXX6もしくはpVAE2AE4-5の一方で同時にトランスフェクトし、またはAd5ΔE1ΔE3-CMV/GFPAd-GFPウイルスに感染させた0.1~5GFU/細胞の範囲のMOI図3参照。トランスフェクション/感染3日後に、組換えパルボウイルス生産の収量を、ルシフェラーゼ形質導入アッセイを用いて評価した。図3で得られた結果により、組換えパルボウイルス生産に対するpXX6の増強効果が確認されおよそ24倍、異なるより長い導入遺伝子を担持する他のパルボウイルスに対するこのベクターの明確な効果が一般化される。pVAE2AE4-5も同程度にパルボウイルスの生産を高め、見られた増加を担う要素はpXX6およびpVAE2AE4-5の共通のアデノウイルス配列内にあり、プラスミド骨格には無いことが確認される。組換えアデノウイルスによる感染もパルボウイルス生産を高めたので、見られたヘルパー効果はアデノウイルス遺伝要素をトランスフェクションまたは感染により生産細胞に導入するために選択された方法には依存しないはずである。rec.PV-Luc生産の最大増加およそ30倍は、Ad-GFPをMOI1で用いて得られた。これらの条件下では、感染2日後に生産細胞において100のアデノウイルスGFP形質導入が見られた。Ad-GFPをMOI2および5で用いた場合には細胞毒性が見られデータは示されていない、このことはこれらの条件下でなぜ低いパルボウイルス力価が得られたかを説明する。アデノウイルスを用いて見られた生産増は、おそらくアデノウイルス形質導入率が高いためにトランスフェクトされたヘルパープラスミドの場合よりもやや高かった。これらの結果を合わせると、アデノウイルスゲノム要素の存在が組換えパルボウイルスの生産を高めることが証明される。実施例3pXX6は組換えパルボウイルス生産を加速化する経時的推移実験では、pXX6がウイルス生産の速度論に影響を及ぼすかどうかを検討した。細胞をまず、pXX6を伴って、または伴わずに、prec.PV-GFP、pCMV/VPで同時にトランスフェクトし、トランスフェクション12、24、48および72時間後にウイルス生産を評価した。これまでのように、pXX6の存在は組換えパルボウイルスの生産を大幅に高める図4。この効果は24時間後に見ることができるが9.2倍、生産収量が最大となる1.5×106TU/ml48時間目により明確になる30.4倍。pXX6の不在下でのウイルス生産はずっと低い効率であった最大力価:1.3×105GFU/ml。組換えパルボウイルスが通常では生産72時間後に回収されることは重要なことである。よって、組換えパルボウイルス生産においてアデノウイルス要素を用いるとウイルス力価が増大し、生産時間が24時間短縮される。サザンブロット図6Bによれば、トランスフェクション48時間および72時間後に、pXX6の存在下で生産されたウイルスDNAの量の増加が確認された。単量体複製パルボウイルスDNA型mRFはpXX6条件では大幅に高濃度となり、24時間目にすでに検出可能であり、48時間目および72時間目に強く増強された。二量体複製DNA型dRFは、48時間および72時間の生産時点でpXX6の存在下でのみ明確に検出された。よって、pXX6はウイルスDNAの複製を増大させるだけでなく、加速化もする。実施例4pXX6はまたトランスフェクション/感染に基づくプロトコールにおいて組換えパルボウイルス生産を高める組換えパルボウイルスは、生産細胞を2つのプラスミド1つはVPキャプシドタンパク質をコードし、もう1つは目的の導入遺伝子を担持する残りのパルボウイルスゲノムを含有するで同時にトランスフェクトすることにより、慣例的に生産される。ウイルス感染はトランスフェクションより良好な遺伝子送達法であるので、本発明者らは当該プロトコールのトランスフェクション工程をできる限り感染に置き換えることを目的とした。1つの可能性は、VP含有プラスミドでトランスフェクトされた許容細胞を感染させることにより組換えパルボウイルスを増幅することであろう。この場合、トランスフェクションはVP-プラスミドにのみ限定され、一方、パルボウイルス組換えゲノムはウイルス感染によって送達される。しかしながら、実験室でのこれらの実験では、この方法を用いて組換えパルボウイルスを生産できなかった。このpXX6のヘルパー機能を考えて、この場合にpXX6の導入が組換えパルボウイルスの生産を救済できるかどうかを検討した。細胞をpXX6と組み合わせて、または組み合わせずにpCMV/VPでトランスフェクトした後、rec.PV-GFPに感染させた。結果は、pXX6プラスミドの存在下でのみ接種物として用いたウイルス用量の有意な増幅およそ17倍を示した図5、データは示されていない。これらの結果は、pXX6が単独トランスフェクションに基づくプロトコールにおいて組換えパルボウイルスの生産を助けるだけでなく、組換えウイルスDNAの供給源として感染力のあるウイルス粒子が用いられる場合にも組換えパルボウイルスの生産を助けることを示す。このことは、組換えパルボウイルスの2回目の増幅にpXX6を使用する可能性を裏付ける。実施例5組換えAd-VPヘルパーウイルスを用いた組換えパルボウイルスの生産VP-プラスミドトランスフェクションを避け、単にヘルパーウイルスの同時感染によりウイルス増幅を可能とするために、パルボウイルス生産を助けるのに必要なAd遺伝子だけでなくパルボウイルスVPキャプシド遺伝子ユニットも担持するアデノウイルスを用いて組換えパルボウイルスが生産可能かどうかを調べた。VP遺伝子をpAd5ΔE1ΔE3およびpShuttle-CMV/VPの組換えにより、pAd5ΔE1ΔE3にクローニングし[24]、pAd-VPヘルパー構築物を作出した。Ad-VPヘルパーウイルスは従来、HEK293Tで生産されてきた。Ad-VPヘルパーの形状および力価は、対照として用いるAd5ΔE1ΔE3ウイルスと同様であったデータは示されていない。新規なAd-VPヘルパーウイルスを用いれば、感染のみに基づくプロトコールを用いることができ、トランスフェクションの必要が避けられる。このことは、トランスフェクトは難しいが、HEK293Tよりもパルボウイルス複製に許容度が高い細胞系統、例えばNBK細胞において生産を行う可能性を拓く。NBK細胞を6ウェルプレートに播種し、翌日、以下の組換えパルボウイルス:hH-1-GFP、H-1-GFP、MVM-GFPまたはChi-hH-1-GFPのうちの1つとともに精製Ad-VPヘルパーに感染させた。感染3日後に細胞を溶解し、形質導入アッセイを用い、生産された組換えウイルスの力価を測定した。従前のように、複製能を有するウイルスの生産を制御するためにプラークアッセイを行った。この手順を用いると、図1Cで得られるようなトランスフェクションに基づくプロトコールを用いる場合の2~5倍の力価が得られたデータは示されていない。重要なことには、この手順はAd-VPヘルパーの不在下で行われた生産に比べてRCV混入率を引き上げることはなかった。これらの結果は、組換えパルボウイルスの生産にAd-VPヘルパーを使用する有効性を強調する。結論として、Ad-VPヘルパー手順は以下の利点を与える:iウイルス原株の品質に影響を及ぼさずに高力価で組換えパルボウイルスの生産を可能とすること、ii生産時間を1日短縮することデータは示されていない、iiiウイルス感染のみに基づき、トランスフェクション工程の必要が避けられること、ivパルボウイルス複製に対してHEK293Tよりも許容度が高いが、トランスフェクションが難しいためにこれまで使用できなかった細胞系統例えば、NBKにおいて組換えパルボウイルスの生産を可能とすること、およびvトランスフェクション試薬、時間および人員のコストを削減するので、より経済的なプロセスであること。参照文献1AtchisonRWBCCastoandWMHammonAdenovirusAssociatedDefectiveVirusParticlesScience1965149p75462KestlerJetalcisrequirementsfortheefficientproductionofrecombinantDNAvectorsbasedonautomonousparvovirusesHumGeneTher199910p1619323DupontFetalTumorselectivegenetransductionandcellkillingwithanoncotropicautomonousparvovirusbasedvectorGeneTher20007p79064OlijslagersSetalPotentiationofarecombinantoncolyticparvovirusbyexpressionofApoptinCancerGeneTher20018p958655ElBakkouriKetalInvivoantitumouractivityofrecombinantMVMparvoviralvectorscarryingthehumaninterleukin2cDNAJGeneMed20057p189976HaagAetalHighlyefficienttransductionandexpressionofcytokinegenesinhumantumorcellsbymeansofautomonousparvovirusvectorsgenerationofantitumorresponsesinrecipientmiceHumGeneTher200011p5976097WetzelKetalTransductionofhumanMCP3byaparvoviralvectorinducesleukocyteinfiltrationandreducesgrowthofhumancervicalcarcinomacellxenograftsJGeneMed20013p326378WetzelKetalMCP3deliveredbyparvovirusMVMpreducestumorigenicityofmousemelanomacellsthroughactivationofTlymphocytesandNKcellsIntJCancer2007120p1364719GieseNAetalSuppressionofmetastatichemangiosarcomabyaparvovirusMVMpvectortransducingtheIP10chemokineintoimmunocompetentmiceCancerGeneTher20029p4324210EnderlinMetalTNFalphaandtheIFNgammainducibleprotein10deliveredbyparvoviralvectorsactinsynergytoinduceantitumoreffectsinmouseglioblastomaCancerGeneTher200916p1496011BrandenburgerAandSRussellAnovelpackagingsystemforthegenerationofhelperfreeoncolyticMVMvectorstocksGeneTher19963p9273112ChangLSYShiandTShenkAdenoassociatedvirusP5promotercontainsanadenovirusE1AinducibleelementandabindingsiteforthemajorlatetranscriptionfactorJVirol198963p34798813CarterBJBAAntoniandDFKlessigAdenoviruscontainingadeletionoftheearlyregion2AgeneallowsgrowthofadenoassociatedviruswithdecreasedefficiencyVirology1992191p473614JanikJEetalEfficientsynthesisofadenoassociatedvirusstructuralproteinsrequiresbothadenovirusDNAbindingproteinandVAIRNAVirology1989168p320915FisherKJetalTransductionwithrecombinantadenoassociatedvirusforgenetherapyislimitedbyleadingstrandsynthesisJVirol199670p5203216NayakRandDJPintelAdenoassociatedvirusescaninducephosphorylationofeIF2alphaviaPKRactivationwhichcanbeovercomebyhelperadenovirustype5virusassociatedRNAJVirol200781p119081617GrimmDandJAKleinschmidtProgressinadenoassociatedvirustype2vectorproductionpromisesandprospectsforclinicaluseHumGeneTher199910p24455018XiaoXJLiandRJSamulskiProductionofhightiterrecombinantadenoassociatedvirusvectorsintheabsenceofhelperadenovirusJVirol199872p22243219GrimmDetalNoveltoolsforproductionandpurificationofrecombinantadenoassociatedvirusvectorsHumGeneTher19989p27456020GuanWetalThegenomeofhumanparvovirusb19canreplicateinnonpermissivecellswiththehelpofadenovirusgenesandproducesinfectiousvirusJVirol200983p95415321LedinkoNandHWToolanHumanadenovirustype12asahelperforgrowthofH1virusJVirol19682p155622FoxEPTMoenJrandJWBodnarReplicationofminutevirusofmiceDNAinadenovirusinfectedoradenovirustransformedcellsVirology1990176p4031223WrzesinskiCetalChimericandpseudotypedparvovirusesminimizethecontaminationofrecombinantstockswithreplicationcompetentvirusesandidentifyaDNAsequencethatrestrictsparvovirusH1inmousecellsJVirol200377p3851824HeTCetalAsimplifiedsystemforgeneratingrecombinantadenovirusesProcNatlAcadSciUSA199895p25091425ReedSEetalTransfeetionofmammaliancellsusinglinearpolyethylenimineisasimpleandeffectivemeansofproducingrecombinantadenoassociatedvirusvectorsJVirolMethods2006138p859826MatsushitaTetalAdenoassociatedvirusvectorscanbeefficientlyproducedwithouthelpervirusGeneTher19985p93845