"長さが600アミノ酸残基までのリコンビナントキメラB型肝炎コアHBcタンパク質分子であって、a残基4位から75位及び85位から140位のHBc配列を含み、48位及び107位のシステイン残基の一方又は両方が別の残基によって置換されており、残基61位におけるシステインが存在するHBc分子のN末端183アミノ酸残基の少なくとも125のHBc配列を含み;b前記キメラのN末端、76位から85位の間HBcイムノドミナントループ中、又はC末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合した異種アミノ酸残基を含み、ここでi前記HBcイムノドミナントループ中の配列の0から全ての残基が存在するかもしくは置換されており、前記異種アミノ酸残基配列が、抗抗原若しくは複合ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を構成する1から40残基の免疫原又は配列を構成する1から245アミノ酸残基を含むか、又はii76位から85位のHBcの配列が存在し、更に欠落及び異種残基を含まないか、又はiii残基76位から85位の1つ又は2つ以上が欠如しているか又は置換されており;ciHBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号1のHBc配列のN末端からアミノ酸20位から1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位の1つから3つのシステイン残基N末端システイン残基、及びii前記HBc配列のC末端残基からキメラ分子のC末端側で更に前記キメラ分子のC末端から30残基内の1つから3つのシステイン残基C末端システイン残基の一方又は両方を含み;前記キメラ分子が1配列番号:1に対応する前記HBcキメラ配列において、アミノ酸の5までが置換されたアミノ酸残基を有し、2発現後における280nm対260nmにおける吸光度の比が、0.9対1.7である粒子に自己会合する、前記リコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。本発明は、宿主細胞による発現後に自己会合して粒子を形成する、組換えによって作製されたヘパドナウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質すなわちB型肝炎コアHBcキメラタンパク質、本明細書ではリコンビナントキメラHBcタンパク質分子、キメラB型肝炎コアタンパク質分子、HBcキメラ分子又は単にキメラとも称されるを含むワクチン又は接種物のための免疫原を目的とする。意図されるキメラ分子は、通常は約183位の残基で終了する天然のコア分子に比して少なくともC末端で切り縮められているであろう。意図されるリコンビナントキメラB型肝炎コアHBcタンパク質分子は、長さが約600までのアミノ酸残基である。このキメラは、aHBc分子のN末端183アミノ酸残基、好ましくは163アミノ酸残基、より好ましくはHBc分子のN末端156アミノ酸残基、もっとも好ましくはHBc分子のN末端149アミノ酸残基の少なくとも約125のHBc配列を含み、残基4位から約75位及び約85位から約140位のHBc配列を含み、ここで48位及び107位のシステイン残基の一方又は両方が別の残基によって置換されれている。意図されるキメラ分子はまた、biHBcプレコア配列の配列以外の配列中で配列番号1のHBc配列のN末端からアミノ酸20位から約1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位に存在する1つから3つのシステイン残基N末端システイン残基、及びiiHBc配列のC末端残基から分子のC末端にむかい、キメラ分子のC末端側から約30残基内の1つから3つのシステイン残基C末端システイン残基の一方又は両方を含む。前記キメラ分子は、HBc配列内に約20までの置換されたアミノ酸残基を含みことができ、更に、以下で考察されるように、リン酸緩衝食塩水pH74中で粒子が280nmから260nmで好ましくは09から約17、より好ましくは約12から約17の吸収比を示すことができるように、宿主細胞による発現時に自己会合して核酸と実質的に結合しない粒子を形成する。前記粒子は、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH68で1ヶ月間37°Cで保存した後、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成される粒子よりも典型的には安定であり、更に、HBcの48位及び107位にシステインを含む粒子よりも典型的には高収量で発現される。更にまた、場合によって前記キメラは、ペプチド結合により結合された異種アミノ酸残基をN末端、HBcイムノドミナントループ内すなわち残基約76から約85位の間又はキメラのC末端の1つ又は2つ以上に含む。前記N末端配列は、場合によって、HBc残基2‐4の1つとペプチド結合した、免疫原性エピトープを含む約75までのアミノ酸残基を含む異種配列を含む。前記HBcイムノドミナントループ配列は、iそのまま存在するか又は置換されており、HBcループとは異種で免疫原を構成す1つから約245アミノ酸残基、約40残基までの配列中に存在する抗抗原又は複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基とペプチド結合したHBc76位から85位の配列内の0から全ての残基、又はiiそのまま存在してあり、欠落及び異種残基を含まない76位から85位のHBcの配列、又はiii残基76位から85位の1つ又は2つ以上が存在しないか又は置換されれているものを含むことができる。前記C末端配列は、HBcにとって異種の配列中に免疫原性エピトープを含む約100までのアミノ酸残基を、HBc183位からC末端まで、又は好ましくはHBc165位からC末端まで、より好ましくはHBc156位からC末端まで、もっとも好ましくはHBc149位からC末端までの間に含むことができる。より好ましくは、意図されるキメラは、長さが約380アミノ酸残基までのリコンビナントHBcタンパク質分子を構成する。前記キメラは、aHBc分子のN末端163アミノ酸残基、又はより好ましくはN末端156アミノ酸残基、最も好ましくはHBc分子のN末端149アミノ酸残基の少なくとも約125、好ましくは少なくとも約135のHBc配列で、残基4位から約75位、及び約85位から約140位のHBc配列を含み、48位及び107位のシステイン残基の一方、好ましくは両方が別の残基、例えばセリンによって置換されているHBc分子を含む。キメラは、場合によって以下のi、iiの1つ又は2つ以上を含む:iキメラのN末端、HBcイムノドミナントループ内、及びC末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合された約75残基までの免疫原性配列ここで前記C末端配列は163位、好ましくは156位から天然のHBcC末端までのHBcの配列以外の配列である、iiそのまま存在しているか又は置換されており、更にHBcにとって異種であって免疫原を構成する0から約75、好ましくは1つから約45のアミノ酸残基、好ましくは1つから約40アミノ酸残基の配列中に存在する抗抗原又は複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基とペプチド結合した76位から85位の配列の0から全ての残基。更にまた、意図されるキメラ分子は、biHBcプレコア配列の配列以外の配列中に、配列番号1のHBc配列のN末端からアミノ酸20位から約1までのアミノ酸置に対応するキメラ分子のアミノ酸位に存在するN末端システイン残基、又はiiHBc配列のC末端残基からキメラ分子のC末端側で更に前記キメラ分子のC末端から約30残基内に存在するC末端システイン残基、又はi及びiiの両方の位置に存在する1つから3つのシステイン残基を含む。そのような意図されるキメラ分子は、cHBc配列内の約20までが置換されたアミノ酸残基を含み、更にd宿主細胞での発現時に自己会合して、下記で考察されるように、採集時、精製時及び溶解時に、280nmから260nmにおいて09から約17、より好ましくは約12から約17の吸収比を示す。前記の自己会合粒子は、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH68で1ヶ月間37°Cで保存した後、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点で同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも典型的にはより安定である。したがって、残基48位及び107位に存在する一方のシステイン、より好ましくは両方のシステインの欠如は、N末端もしくはC末端システイン又は両方のシステインによってまた別のやり方で安定化された粒子の保存安定性を強化することができる。これらシステイン残基の一方又は両方の置換によってキメラ分子の粒子の発現もまた強化することができる。別の実施態様は、リコンビナントB型肝炎ウイルスコアHBcタンパク質キメラ分子を目的とし、前記は約135から約365アミノ酸残基の長さを有し、更にドメインI、II、III及びIVと称されるN末端由来の4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む。前記キメラ分子のドメインIは約72から約150アミノ酸残基を含み、前記の配列はi少なくともHBcの4位から75位までの残基の配列、ii48位のシステイン残基の例えばセリンのようなまた別の残基による置換置き換え、iiiHBcプレコア配列の配列以外の配列中で配列番号1のHBc配列のN末端からアミノ酸20位から約1に対応するキメラ分子のアミノ酸位に存在する0から3つのシステイン残基N末端システイン残基、ivHBc残基2‐4の1つにペプチド結合した、約75までのアミノ酸残基を含む随意の免疫原性エピトープを含む。前記キメラ分子のドメインIIは、ドメインIのHBc残基約75とペプチド結合した約85アミノ酸残基までを含み、前記では、iHBcの約76位から約85位までの配列中の0から全ての残基が存在するか又は置換されてあり、更にHBcループとは異種で免疫原を構成する1つから約75アミノ酸残基、又は抗抗原若しくは複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基を構成する1つから約40残基の配列とペプチド結合しているか、又はii約76位から約85位のHBcの配列が存在し、欠落及び異種残基の添加を含まない。キメラのドメインIIIは、ドメインIIの残基約85にペプチド結合した約86位から約135位のまでのHBc配列であり、前記ドメインでは107位のシステインが別の残基で置換されている。キメラ分子のドメインIVは以下を含む:iドメインIIIの135位の残基にペプチド結合した、約136位から約163位まで、好ましくは約156位まで、もっとも好ましくは149位までの5から30残基、iiキメラ分子のC末端から約30残基内の0から3つのシステイン残基C末端システイン残基、及びiii163位、好ましくは156位、より好ましくは149位からC末端までのHBcに存在する配列以外の配列の0から約75アミノ酸残基。HBc150位からキメラ分子のC末端までのキメラ分子の配列は、約10より少ないアルギニン、リジン残基又は両残基の混合物を含む。この好ましいキメラ分子は、iキメラのHBc配列の約10までのアミノ酸残基が置換されているアミノ酸残基配列を有し、iiドメインI及びIVに記載の0から3つのシステイン残基に由来する少なくとも1つのシステイン残基を有し、更にiii宿主細胞による発現時に自己会合して粒子を形成する。上記のようにして形成された粒子は、核酸との結合を好ましくは実質的に含まず、更に好ましくは、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH68で1ヶ月間37°Cで保存された後でより安定である。一般的に見れば、48位及び107位に通常存在するHBcシステイン残基は、全ての意図されるキメラ分子で他の残基例えばセリンによって置換されれ、更に全ての意図されるキメラ分子は、HBc配列にとっては本来ではない、少なくとも1つのN末端又はC末端システイン残基を含む。したがって、いくつかの実施態様では、ドメインIのHBc配列は、少なくとも1つのN末端システイン残基とともに4位から75位の残基のみを含むのが好ましい。他の実施態様では、意図されるキメラ分子は、N末端システイン残基だけではなく、上記に単独であると記載されたように、ドメインIV内に1つのシステイン残基を含むことが好ましいすなわちHBc配列又は別のアミノ酸残基配列内に添加される。更にまた別の実施態様では、好ましいキメラ分子は、1つ又は2つ以上のC末端システイン残基のみを含み、ドメインIは、48位のHBcシステイン残基と同様に天然のHBc配列例えば図1の配列には存在しないシステイン残基を含まない。HBcシステイン残基は、図1のHBc配列の各々の約61位に存在する。意図されるワクチン又は接種物は、医薬的に許容できる希釈組成物典型的にはまた水を含むに溶解又は分散された免疫応答誘発量の前述の自己会合キメラ分子粒子を含む。意図されるキメラ分子のドメインI、II及びIVの1つ又は2つ以上に存在する特に好ましい非HBcエピトープは、マラリアCSタンパク質由来の免疫原性配列、インフルエンザAM2タンパク質のアミノ末端24由来の配列、B型肝炎表面たんぱく質HBsのプレS1又はプレS2領域由来の配列、又は米国特許5124726号Thortonetal更にその親特許4882145号に開示されたHBc由来の追加T細胞刺激配列、例えば約85位から約100位の配列もしくは約93位から約100位のより狭い領域である。特に好ましいリンカー残基はリジン残基である。本発明はいくつかの利点及び長所を有する。本発明の特別な利点は、好ましいキメラ粒子免疫原は、典型的には、48位及び/又は107位に置換されたシステイン残基を含みその他の点では同一のHBcキメラ粒子よりも調製時にはるかに高い安定性を示すということである一方、核酸を実質的に含まない。本発明の長所は、48位及び107位にシステイン以外の残基を含むキメラから形成された粒子は、48位及び107位にシステインを含むキメラタンパク質が会合した粒子よりも迅速にジスルフィド含有粒子を形成するということである。本発明のまた別の利点は、リコンビナント免疫原は容易に及び周知の細胞培養技術を用いて調製されるということである。本発明のまた別の利点は、前記免疫原は周知のリコンビナント技術を用いて容易に調製されるということである。本発明の更に別の利点は、粒子の発現は、48位及び107位の両方にシステインを含む同様なキメラ分子と比較して強化されるということである。本発明の更に別の利点は、発現された粒子は、48位及び107位にシステインを含む粒子よりも容易に性状を例えば品質確認の目的のために調べることができるということである。更に別の利点及び長所は下記の開示から当業者には明白であろう。システイン変異を含むキメラの構築A.プラスミドベクターpKK2233N及びシステイン置換ZhengらJBiolChem26794229429は、HBc183モノマー配列中に存在する4つのシステイン残基の2つはジスルフィド結合に必要とされないことを見出した。システイン48は与えられたサンプル中で部分的に共有結合していることが判明し、システイン107は遊離チオールとして存在することが分かった。これらのシステインの変異は粒子の会合又は安定性に影響を与えることは認められず、更にスルフヒドリル反応性は検出されず、システイン61及びシステイン183は完全にジスルフィド結合しているという決定的証拠を提供した。システイン残基C48及びC107の両方をセリン残基に変異させて、導入されたシステインを含む粒子のスルフヒドリル含有量が容易に定量された。セリンはシステインと化学的に極めて類似するアミノ酸であるので、前記は保存的変異であるヒドロキシルR基に対してスルフヒドリル基であることを除いてそれらは同一である。このキメラはこの後の全てのキメラのための鋳型として用いられた。鋳型の2つの変型が作製された。1つはV149で終わりHBc149C48SC107S、他方は追加のシステインをC末端に保持しているHBc149C48S/C107SC。HBc遺伝子は最初にpKK2233ベクターPharmaciaBiotechPiscatawayNJから入手できるでクローニングした。PCRを用いてNcoI部位を含むようにマルチクローニング部位を改変した。全てのPCR反応はミニサイクラーMinicycler登録商標MJResearchWalthamMAから入手できるを用いて実施した。全ての実験のPCR反応条件は以下のとおりであった:工程1-94°Cで3分工程2-92°Cで1分工程3-50°Cで1分工程4-72°Cで40秒工程5-工程2まで14回工程6-72°Cで5分工程7-4°Cで10分工程8-終了全てのオリゴヌクレオチドPCRプライマーはインビトロゲン及びHBc149C48位及び107位でシステインからセリンへの変異C48SC107Sを含むこれら2つのキメラを作製するために、いくつかのPCR反応が必要であった。C107S変異を先ず初めに内因性EarI部位を利用して実施した。5片をプライマー3及びプライマー5を用いて作製した前記プライマーはC107S変異を導入した。3片を完全マッチプライマー6及び4を用いて調製した。これらのフラグメントそれぞれ約320及び130塩基対をEarIで消化し、連結した。続いてこの連結物を鋳型として用いてC48S変異を導入した。HhaI部位をサイレント変異としてA54に導入し、この変異を可能にした。再びPCRを2つの半分部分で実施した。5片はプライマー3及び7を用いて導入し、一方、3片はプライマー8及び4を用いて作製した。これらの生成物それぞれ約165及び295塩基対を続いてHhaIで消化して連結した。続いて連結生成物をプライマー3及びプライマー4V149の後ろに終止コドンを配置又はプライマー9V149の後ろにシステインを付加のどちらかとともに増幅し、続いて終止コドンを付加した。生成物約450塩基対をNcoI及びHindIIIで消化し、上記のように調製したpKK2233Nベクターに連結してキメラHBc149及びHBc149Cを得た。5つのジスルフィドキメラの4つのパネルの構築はC48SC107Sキメラと類似の態様で実施した。第一の変異は2つの半分部分のPCRによって導入され、続いて第二の変異は、第一の連結物を鋳型として用いて2つの半分部分に導入された。全てのジスルフィドキメラはC末端システインを用いて作製され、全ての最初のPCRは鋳型としてHBc149Cを用いて実施された。キメラHBc149L55CH104CサイレントCac8I部位をHBcの残基E64辺りに導入して、L55C変異を作製した。プライマー3及び12を用いて5半分を増幅し、更にプライマー13及び9を用いて3半分を増幅した。続いてこれらPCR生成物をCac8Iで消化し連結した。続いて連結物を2つの半分部分で増幅した。5半分プライマー3及び10を用いて作製にはH104C変異を導入し、C48SC107キメラの構築で先に用いたEarI部位を用いて鋳型中のC107S変異は維持された。3半分は完全なマッチプライマー6及び9を用いた。EarIのよる消化の後で、フラグメントを連結し、プライマー3及び9で再度増幅した。この生成物をNcoI及びHindIIIで消化し、上記のように調製したpKK2233Nでクローニングした。キメラHBc149A58CL100CCA58C変異を導入する5半分を導入したCac8I部位を用い上記のL55C変異と同じ方法で作製した。プライマー3及び14を用いA58C変異を作製し、一方、プライマー13及び9から作製した同じ3PCR生成物上記L55CH104C参照をこの連結に用いた。しかしながら、L100C変異を作製するために、内因性Sau96I部位を利用した。5半分を完全マッチプライマー3及び15を用いて作製し、一方、プライマー16及び9を用いてL100C変異を3半分に導入した。PCR生成物をSau96Iで消化して連結し、続いてプライマー3及び9で再度増幅し、更に上記のようにpKK2233Nでクローニングした。キメラHBc149A69CV89CCA69C変異は、プライマー3及び17並びに内因性BstNI部位を用いて5PCRに導入した。3PCRには完全マッチプライマー18及び9を用いた。生成物をBstNIで消化し連結した。続いて前記連結物を用いて5PCR半分にV89C変異を作製し、前記は再度遺伝しないに天然に存在するSau96I部位を利用したプライマー3及び11。3PCRは完全マッチプライマー19及び9によりなんらの変異も導入しない。生成物をSau96Iで消化し、連結し、プライマー3及び9で再増幅し、更にpKK2233で上記のようにクローニングした。キメラHBc149W62CF97CCL55C及びA58Cの場合のように、W62C変異をCac8I部位から作製した。プライマー3及び20により5半分に前記変異を導入し、一方、L55C及びA58C変異を作製するために用いた同じ3PCR生成物を個々で用いた。生成物をCac8Iで消化し、連結し、更に第2回目のPCRに付した。Sau96I部位を再び利用してプライマー21及び9により3F97C変異を作製し、一方、5プライマー3及び15は完全マッチであった。このキメラの作製に必要なPCRは、更に別のCac8I部位がF97C変異の作製時に導入できるように前記の順序で実施される必要があることを特記する。Sau96Iで消化した後、生成物を連結し、プライマー3及び9で再び増幅し、更にpKK2233でクローニングした。キメラHBc149L67CR82CCHBcループ内のA80-S81配列にサイレンと変異を作製することによって、NheI部位をループ内に導入し、ほんの2回のPCRでこのキメラを作製することが可能になる。5片にプライマー3及び22を用いてL67C変異を導入し、3片にプライマー23及び9を用いてR82Cを導入した。PCR生成物それぞれ約245及び222塩基対をNheIで消化し、連結した。続いて、連結物をプライマー3及び9を用いて増幅し、標準的な450塩基対フラグメントを得た。前記をNcoI及びHindIIで消化し、pKK2233Nでクローニングした。B.ループ挿入ベクターの調製エンジニアリング技術により作製した5つのシステインを含むキメラの4つがHBc粒子への会合に成功した。したがってこれらの全てをイムノドミナントループに外来エピトープを受容する能力についてアッセイした。更にまた、導入システインを全くもたないキメラを会合能力更に後で安定性能力の比較のためのコントロールとして用いた。エピトープはHBcアミノ酸のアスパラギン酸78とプロリン79との間に挿入された。全てのエピトープが、5端でGly及びIleEcoRI制限部位によってコードされる並びに3端でGlu及びLeuSacI制限部位によってコードされるとフランキングするように、新規な制限部位EcoRI及びSacIを導入した。したがって、HBc149L55CH104CC会合粒子を形成することができなかったを除く全てのシステインキメラでベクターを作製し、HBc配列のアミノ酸残基D78とP79との間に異種エピトープを受容することができた。改変HBc149V2及びV16又はHBc183V8遺伝子イムノドミナントループ領域に合成dsDNAフラグメントの方向性挿入を受容できるを、PCRを用いて構築したD78とP79との間で挿入物を受容しV149に短縮されたプラスミドをV2と呼び、追加されたシステインをV149の後にもつ同じプラスミドをV16と呼び、D78とP79との間に挿入物を受容しC183で終わるプラスミドをV8と呼んだ。HBc149及びHBc183遺伝子は、2つのPCRプライマー対そのうちの1つはアミノ末端を増幅し、他方はカルボキシル末端を増幅するを用いて2つの半分部分で増幅した。V2の場合、PCR反応の生成物は249bpフラグメントN末端及び243bpフラグメントC末端であり、V16の場合、生成物は249bpフラグメントN末端及び246bpフラグメントC末端であり、V8の場合、生成物は249bpフラグメントN末端及び349bpフラグメントC末端である。調製したN末端フラグメントをNcoI及びEcoRIで消化し、C末端フラグメントをEcoRI及びHindIIIで消化した。続いてV2、V16及びV8のフラグメント対を共通のEcoRIオーバーハングで一緒に連結した。得られたNcoI-HindIIIフラグメントを続いてpKK2233Nベクターに連結した前記ベクターはNcoI及びHindIIIによる消化で既に調製されてあった。B細胞エピトープをV2、V16及びV8プラスミドに挿入するために、適切なプラスミドをEcoRI及びSacI制限酵素で消化した。5EcoRI及び3SacIオーバーハングを有する合成dsDNAフラグメントを続いて挿入した。全ての事例V2、V16及びV8で、グリシンイソロイシンEcoRI及びグルタミン酸ロイシンSacIアミノ酸対は挿入されたB細胞エピトープとフランキングする。挿入された制限部位は下記のプライマーで下線を付されている。V2HBc149NcoIF5TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA配列番号263HBcD78EcoRIR5GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC配列番号264HBcP79EcoRISacIR5CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG配列番号265HBc149HindIIIR5CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG配列番号266V16HBc149NcoIF5TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA配列番号263HBcD78EcoRIR5GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC配列番号264HBcP79EcoRISacIF5CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG配列番号265HBc149CHindIIIR5CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG配列番号267V8HBc149NcoIF5GGGCCATGGACATCGACCCTTA配列番号263HBcD78EcoRIR5GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC配列番号264HBcP79EcoRISacIF5CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG配列番号265HBc183HindIIIR5GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG配列番号268システイン変異がループに近いために、特にキメラHBc149L76CR82CCのためにプライマーセットをデザインする必要があったが、一方、他の全てのキメラは同じプライマーセットを用いた以下の表2及び表3。5半分は、プライマー3及び22HBc149L76CR82CCの場合にはプライマー23を用い、EcoRI部位を3端に付加することにより作製した。3半分は、プライマー24HBc149L76CR82CCの場合にはプライマー25及び9を用いて作製した前記によって、これらのフラグメントにEcoRI部位及び下流のSacIが付加された。続いて、全てのPCR生成物をEcoRIで消化し、各々対応する半分と連結し、プライマー3及び9を用いて再び増幅した。続いて、これらの生成物をNcoI及びHindIIIで消化し、準備したプラスミドpKK2233Nでクローニングした。各クローンの配列は、上記で述べたように自動DNA配列決定によって実証した。エピトープの選択は、導入システインを含まなかった同等なベクターV16でのエピトープの過去の成功又は不成功を基準にした。V16で成功しなかった2つのエピトープを選択した:1つはアルツハイマー病MorganetalNature408982985に関係するβアミロイドタンパク質残基1-32に由来し、残基701-721の防御抗原は炭疽菌BanthracisBaLittleetalMicrobiology142707715に由来する。十二指腸虫タンパク質Asp1残基292-303DrPeterHotzGeorgeWashingtonUniversityより提供は、V16で低いが検出可能な粒子会合を生じ、このエピトープも粒子生成がジスルフィド結合導入により増加するか否かの評価に含めた。最後のエピトープV16で非常に良好な粒子会合を示したは、このキメラの粒子会合及び安定性をエンジニアリング技術によって作製された型と比較するために含めた。前記エピトープは、インフルエンザAのM2タンパク質の細胞外ドメイン残基2-24ZebedeeetalJVirol6227622772;NeiryncketalNatMed5115763に由来し、前記は、このエピトープに関する我々の実験室での以前の実験で粒子会合に必要であることが判明した配列内の2つの改変を含んでいた。全てのエピトープ配列は下記の表3に提供されている。オリゴヌクレオチド配列は、アニールさせたときに上記のように調製したシステイン操作ベクターに連結することができる一本鎖粘着端を上部鎖及び下部鎖が保有するようにデザインされた。オリゴ鎖アニーリングは、ミニサイクラーMjResearchを用いて、等モル量のオリゴ10μMの各上部及び下部オリゴを添加し、95°Cで5分加熱し、続いて75°Cまで毎分1°Cずつ下げることによって実施した。アニールさせたオリゴ含有溶液を続いてTE緩衝液で1:20に希釈した。この方法をプライマー対、26及び27、28及び29、30及び31、並びに32及び33について実施した。各ジスルフィドベクターは、EcoRI及びSacIによる消化、続いて生じた小フラグメントからベクターを除いて調製した。続いてアニールさせたオリゴの各々の1μLを用意したベクターと連結した。更にクローンの配列は配列決定によって実証した、C.キメラの発現及び精製配列を確認した後、キメラでpREP4Qiagenlacリプレッサーを発現するプラスミドとともに大腸菌のBLR株NovagenMadisonWIを同時形質導入した。細胞を塩化カルシウム調製物によってコンピテントにしたSambrooketalMolecularCloningalaboratorymanual2ndedColdSpringHarborLaboratoryPress1989。プラスミドpKK2233はtacプロモーターを保有するがlacリプレッサーはコードせず、したがってこのタンパク質はpREP4によってtransで供給され、IPTGの添加によって誘発されるまでHBc遺伝子の発現を抑制する。形質転換体は、いずれのプラスミドの消失も防ぐために50μgLのアンピシリンpKK2233はアンピシリン耐性マーカーを有する及び10μgLのカナマイシンpREP4はカナマイシン耐性マーカーを有するを補充したLBプレートで平板培養される。続いて、同じ濃度の抗生物質を含む3mLのTBドライ培地DocFrugalSanDiegoCAの開始培養へ形質転換体を釣り上げ、一晩増殖させた。続いて各開始培養の1mLを用いて同じ抗生物質を含む500mLのTBドライ培地に接種し、06-10のOD600まで培養を増殖させ、続いて25μMのIPTGで誘発した。培養を16-24時間増殖させ、15000XGで10分遠心して細胞を採集した。キメラの会合はサイズ排除クロマトグラフィーを用いてアッセイした。会合したHBcは明瞭なピークとして溶出し4つのピークをもつプロフィールの2番目、前記は粒子が会合に失敗したときは存在しない未会合モノマーは最後のピークで溶出する。50mLの50mMトリスHClpH80及び10mMのEDTA溶解緩衝液に攪拌によって細胞ペレットを再懸濁する。続いて細胞懸濁液をミクロ液化剤MicrofluidicsNewtonMAを用いて溶解し、31000XGで20分遠心して細胞屑を沈殿させた。HBc粒子は典型的には可溶性分画に存在し、そこで上清の容積を測定し、飽和硫酸アンモニウムで1:1に希釈してタンパク質を沈殿させた。得られた溶液を4°Cで15分穏やかに攪拌し、続いて31000XGで20分、もう1回遠心して硫酸アンモニウム沈殿物を沈殿させた。上清を廃棄し、ペレットを5mLの溶解緩衝液に再懸濁させ、続いて透析チューブ分子量カット8000ダルトンに移した。サンプルを1Lの溶解緩衝液に対して少なくとも3時間透析し、045μmの注射筒フィルターでろ過し、続いて、25X100cmのXK26カラムに充填してアクタプライムAktaPrimeFPLC全てPharmaciaBiotechにつないだセファロースCL4B樹脂を用いてサイズ排除クロマトグラフィーに付した。カラムは20mMのリン酸ナトリウムpH68及び002アジ化ナトリウムで予備平衡化し、同じ緩衝液約800mLを15mL分の流速でポンプでカラムに通し、6-8mLの分画を採集した。粒子の生成は、カラムを通過する物質の最初の狭い第一のピークに続く特徴的なピークについて溶出プロフィールを調べることによって評価した。会合粒子が検出されたら、ピーク分画をプールし、20-25mLのカラム容積のコースHYPATITE登録商標C樹脂ClarksonWilliamsportPA25X20cmのカラムKontesVinelandNJに充填に通した。HBc粒子は典型的にはこの樹脂に最小限の結合を示し、そこで前記タンパク質をこのカラムにロードし、全溶出液を採集した。続いてカラムを50mMのリン酸ナトリウムpH68で溶出液のAbs280が01未満になるまで洗浄した。続いてプールを045μmのフィルターに通し、更にHPLCPerSeptiveBiosystemsのBioCad、FraminghamMAの溶媒ラインからMonoQ登録商標HR1010陰イオン交換カラムPharmaciaBiotechにロードした。カラムは、25mMトリスHCl及び002のアジ化ナトリウムで平衡化させ、サンプルをいったんロードしたら同じ緩衝液で洗浄した。粒子は、25mMのトリスHCl中の0-3MのNaClの直線状グラディエントで溶出させた。ピーク分画をプールし、飽和硫酸アンモニウムで1:1に希釈して再沈殿させ、穏やかに1時間4°Cで攪拌し、続いて17500XGで30分遠心した。得られたペレットを20mMのリン酸ナトリウムpH68の最小容積に再懸濁させ、透析チューブに移し、同じ緩衝液に対して十分に透析した。続いて、最終的な精製サンプルを045μmのフィルターに通し、前記を凍結する前に4°Cで24時間インキュベート維持した。タンパク質濃度はBCAアッセイSigmaStLouisMOから入手できるによって決定した。D.会合キメラの性状決定精製タンパク質は、それらの天然の配座にある粒子を調べるために2つの方法分析的サイズ排除及びエルマンEllmansテストを用いて性状を決定した非還元条件下での変性粒子を調べたもの非還元SDSPAGE、及びモノマーの完全性を調べたもの還元SDSPAGE。粒子状対非粒子状物質を評価するために、精製タンパク質サンプルを解析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した。前記の方法では、各サンプルの50-90μgをスーパーロース6HR1030カラムPharmaciaBiotech上に注入し、HPLCBioCad又はアクタピューリファイアAktaPurifierPharmaciaBiotechのどちらかとつないだ。20mMのリン酸ナトリウムpH68をポンプで05mL分の流速でカラムに通した。粒子の完全性はピークの溶出プロフィールの可視化によって評価した。この場合、約7mLの溶出位置の1つのピークの存在は完全に形成された粒子の存在である。後のピークは非粒子構造、例えばダイマー及びモノマーを示す。ジスルフィド結合形成は、ZhengらJBiolChem26794229429が記載した方法と類似の方法を用いて判定した。したがって、粒子は、ELISAプレートのウェルで20mMリン酸ナトリウムpH68及び01SDS中で最終濃度1mgmLに希釈された。続いて、エルマン試薬Sigmaのストック溶液をジメチルスルホキシドDMSO中で200mMの濃度で作製した。続いてこの溶液を20mMリン酸ナトリウムpH68中で1:200に希釈し、HBcサンプルに最終濃度01mMに添加した。反応は室温で15分進行させた。プレートをスペクトラマックスSpectramax登録商標;MolecularDevicesSunnyvaleCAで412nmで読み取った。続いて比色分析を実施してジスルフィド結合形成を決定した。この場合、エルマン試薬と遊離スルフヒドリルとの反応性は黄色を生じ、サンプル中の完全なジスルフィド結合は発色を生じなかった。粒子の最終的な性状決定は非還元及び還元SDSPAGEゲルを用いて実施し、モノマー及びダイマーのジスルフィド結合誘発架橋とともにモノマーの完全性を調べた。全てのSDSPAGEゲルはNuPAGE登録商標システムInvitrogenarlsbadCAを用いて泳動した。NuPAGE登録商標10ビストリス15mmX10ウェルをエクセルシュアロックXCellSureLock登録商標電気泳動装置でMES緩衝液を用いて泳動した。サンプルは、LDSNuPAGE登録商標サンプル緩衝液を添加し、50°Cで10分加熱して調製した。還元サンプルの調製のためには、βメルカプトエタノールを加熱工程の前に最終濃度10に添加した。ゲルは、提供されたプロトコルにしたがい200Vで30-40分泳動し、続いてシンプリーブルーセーフステインSimplyBlueSafeStainInvitrogenCarlsbadCAで染色した。非還元サンプルの架橋は、モノマー及びダイマー種の存在及びゲルの最上部にスメァとして認識することができる高分子量タンパク質の存在によって確認された。モノマーの完全性は、既知の標準物と同じ分子量約17kDaをもつ1本の限局バンドの存在によって確認された。粒子の安定性は、種々の温度4°C,室温及び37°Cで一定時間0、3、7及び14日で分析のためにサンプルを採集インキュベートしたサンプルについて上記の方法を用いて評価した。E.N末端システイン及びイムノドミナントループにPファルシパルム由来のCSリピートエピトープを含むキメラ粒子を発現するためのベクター2つの発現ベクターV2Pf1及びV2Pf1を調製して、N末端システイン残基のキメラ粒子安定化能力を決定した。ベクターV2Pf1を作製するために、オリゴヌクレオチド、HBcNcoIF及びHBc149HindIIIRを用いてベクターV2pF1からハイブリッドHBc遺伝子を増幅させる。得られた528bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK2233N既に同じ2つの酵素で切断されているに挿入する。ベクターV2Pf1を作製するために、オリゴヌクレオチド、HBcNcoIF及びHBc149HindIIIRを用いてベクターV2pF1からハイブリッドHBc遺伝子を増幅させる。得られた528bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK2233N既に同じ2つの酵素で切断されているに挿入する。HBcNcoIFMGCELDPYKEFG配列番号2775GCGCCATGGGGTGTGAGCTCGACCCTTATAAAGAATTTGG配列番号278HBcNcoIFMGCDIDPYKEFG配列番号2795GCGCCATGGGGTGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGG配列番号280F.V7クローニングベクターの調製T細胞エピトープをHBcキメラC末端に融合させるために、新規なベクターを構築した。固有のEcoRI及びSacI制限部位をバリン149とHindIII部位との間に挿入し、合成dsDNAのEcoRIHindIII又はEcoRISacI制限部位への定方向性挿入を容易にした。下記のPCRプライマー対を用いて、アミノ末端にNcoI制限部位並びにカルボキシル末端にEcoRI、SacI及びHindIII部位を有するHBc149遺伝子を増幅させた。前記PCR反応生成物479bpをNcoI及びHindIIIで消化し、pKK2233NでクローニングしV7を形成した。T細胞エピトープを挿入するために、プラスミドV7をEcoRI及びHindIII又はEcoRI及びSacIで消化し、EcoRIHindIII又はEcoRISacIオーバーハングを有する合成dsDNAフラグメントをV7に連結した。全てのV7構築物のために、天然のHBcの最後のアミノ酸バリン149及び挿入されるT細胞エピトープの最初のアミノ酸を、EcoRI制限部位を形成するヌクレオチドによってコードされるグリシンイソロイシン二ペプチド配列によって分離させた。EcoRISacIに挿入されるエピトープの場合、T細胞エピトープの後ろ、終止コドンの前にSacI部位によって提供される付加グルタミン酸ロイシン残基が存在する。表示のプライマーでは制限部位に再び下線が付されている。HBc149NcoIF5TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA配列番号263HBc149SacIEcoRIH3R5CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG配列番号281G.V12発現構築物の調製V12ベクターをV2及びV7ベクターから構築する。V12ベクターは、アミノ酸78と79の間にB細胞エピトープを含むとともに、バリン149の下流にT細胞エピトープを含む。EcoRIHindIIIに挿入されたT細胞エピトープを含むV7ベクターのカルボキシル末端を2つのPCRプライマーHBcP79SacIF及びpKK2233451532Rを用いて増幅し、SacI及びHindIII制限部位によってフランキングされたアミノ酸79-149及びT細胞エピトープに対応するdsDNAフラグメントを提供する。前記PCR生成物をSacI及びHindIIIで切断し、続いて、同じ2つの酵素で切断して用意した所望のV2ベクターにクローニングする。前記PCRプライマーは、HBc遺伝子のアミノ酸149の後ろに存在するT細胞エピトープに関係なく、全てのV7遺伝子のカルボキシル末端の増幅に使いやすい。制限部位には下線が付されている。HBcP79SacIF5CGCGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG配列番号282pKK2233451532R5GTATCAGGCTGAAAATC配列番号283H.V2に挿入されるPファルシパルムCSリピートB細胞エピトープV2及びV7構築物のためには、対象のB細胞V2又はT細胞V7エピトープをコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRISacI制限部位に挿入する。対象のB細胞又はT細胞エピトープをコードする合成dsDNAフラグメントは、相補性の一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、95°Cに5分加熱し、続いて1°C分の速度で室温に冷却することによって調製する。このアニーリング反応はTE緩衝液中で実施される。二本鎖DNAは、上部に示したコードされるエピトープ配列とともに下記に示されている。ポンド記号は、以下のアミノ酸配列のいくつかで終止コドンの存在を示すために用いられる。インフルエンザAM2ポリペプチド配列を含むキメラの調製A.インフルエンザAM2のN末端ドメインのV2、V7、V8、V16、V34、V47、V48、V54及びV55クローニングベクターへの挿入:V2、V7、V8、V16、V34及びV55構築物のためには、M2エピトープインフルエンザAM2の残基2-24;配列番号9をコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRISacI制限部位に挿入し、一方、V47、V48及びV54構築物のためには、同一物の残基1-24をNcoISacI制限部位に挿入した。合成dsDNAフラグメントは相補性一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、95°Cで5分加熱し、続いて1°C分の速度で室温に冷却することによって調製した。このアニーリング反応はTE緩衝液中で実施した。二本鎖DNAは、上部に示したコードされるエピトープ配列とともに下記に示されている。B.個々のシステイン変異インフルエンザAM2のN末端ドメイン[M2M2]のV47発現ベクターへの挿入:M2タンパク質の残基1-24をコードする、17位又は19位のどちらかのシステインがセリンに変異したアニールDNAフラグメントを下記に示す。前記は上記のパートAに記載したようにV47のNcoISacI制限部位に挿入された。C.インフルエンザAM2のN末端ドメイン[M2]の発現ベクターV8、V16、V47、V48及びV54への挿入:V8及びV16構築物のためには、システインからセリンへの2つの変異を保有し、M2エピトープインフルエンザAM2タンパク質の残基2-24をコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRISacI制限部位に挿入し、一方、V47、V48及びV54構築物のためには、同一物の残基1-24をNcoISacI制限部位に挿入した。合成dsDNAフラグメントは上記のパートAに記載したように調製した。D.インフルエンザAM2のN末端ドメインのまた別のコピーの発現ベクターV54M2のN末端への挿入:天然のM2配列[M2]又は変異M2配列[M2]のどちらかの更に別のコピーを現存のM2配列のN末端でクローニングした。これらのクローンの構築では、付加されたコピーがただ1つのイニシエーターメチオニンを供給することができるように本来のメチオニンを除去した。PCRを用いて2つのフラグメントで構築物を作製した。2つの天然M2コピーを含むクローン[M2V54M2]を作製するために、鋳型V54M2を用いて、先ず初めにN末端フラグメント生成フラグメントは353bpを増幅し前記はXhoI部位したがってグルタミン酸の後ろにアミノ酸ロイシンをM2配列のD24の後ろに挿入する、続いてC末端フラグメント生成フラグメントは538bpを増幅した前記はM2配列のS2のN末端にXhoIを挿入し、したがってメチオニンを除去する。M2の天然のコピーの後ろに変異を含むクローン[M2C17S、C19SV54M2]を作製するために、鋳型V54M2を用いてN末端フラグメントを作出し、一方、C末端フラグメントは上記のものと同一である生成フラグメントサイズもまた同一である。調製されたN末端フラグメントをBamHI及びXhoIで消化し、C末端フラグメントはXhoI及びHindIIIで消化した。続いてフラグメント対を共通のXhoIオーバーハングで一緒に連結し、生成されたBamHIHindIIIフラグメントを続いてpKK2233NベクターBamHI及びHindIIIで予め消化されていたに連結した。変異M2配列の更に別の2つのコピーを現存のM2配列のN末端でクローニングした。繰り返せば、前記遺伝子の1位でイニシエーターメチオニンを温存して、構築物M2C17SC19SM2C17SC19SV54M2224を得た。更に繰り返せば、前記クローンは2つのPCRフラグメントで生成された。鋳型V54M2を用いてN末端フラグメント生成フラグメントは353bpを増幅した前記はPstI部位したがってグルタミンの後ろにアミノ酸ロイシンを変異M2配列のD24の後ろに挿入する。上記に由来する鋳型M2C17SC19SV54M2を用いて、C末端フラグメント生成フラグメントは613bpを作製した前記は変異M2配列のS2のN末端にPstI部位を挿入し、したがってメチオニンを除去する。調製されたN末端フラグメントをBamHI及びPstIで消化し、C末端フラグメントはPstI及びHindIIIで消化した。続いてフラグメント対を共通のPstIオーバーハングで一緒に連結した。生成されたBamHIHindIIIフラグメントを続いてpKK2233NベクターBamHI及びHindIIIで予め消化されていたに連結した。M2V54M2;M2pKKBamHIF5CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG配列番号365M2D24XhoIR5GCGCTCGAGATCACTTGAATCGTT配列番号366M2XhoIS2R5GCGCTCGAGAGCTTATTGACCGAAGTTGAAACC配列番号367HBc149CHindIIIR5CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTACTCTCCGGAAG配列番号267M2M2V54M2pKKBamHIF5CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG配列番号365M2D24PstIR5GCGCTGCAGATCACTTGAATCGTT配列番号368M2PstIS2F5GCGCTGCAGTCTCTGCTGACCGAAG配列番号369HBc149CHindIIIR5CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG配列番号267E.天然のM2HBcの切端型の構築:183残基完全長HBc配列を含む本来のM2HBc構築物NeiryncketalNatureMed511571163:WO9907839をV149まで短縮し、全遺伝子をpKK2233発現ベクターに移した。前記を達成するために、プラスミド3453UniversityofGentより提供されたを鋳型としてPCR反応で用い、523bpの生成物を得た。前記生成物を制限酵素AflIII及びHindIIIで消化し、続いてpKK2233NベクターNcoI及びHindIIIで予め消化したに連結した。AflIIIM2F5CGCGACATGTCTCTGCTGACCG配列番号370HBcHindIIIR5CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG配列番号371部分的切端粒子を発現するための発現ベクターの合成部分的切端HBc粒子を発現するための発現プラスミドを調製するために、ただ1つのアミノ末端オリゴヌクレオチドPCRプライマーをHBc149NcoIFを固有のC末端プライマーと一緒に用いた。例えば、HBc156EcRCV1600粒子発現プラスミドを調製するために、プラーマーHBc149NcoIF及びHBc156H3Rを用いる。プライマーHBc149NcoIF及びHBc156H3Rを用いてHBc156CCV1601粒子発現プラスミドを調製した。用いた全てのプラーマーの配列は下記に示す。粒子の切端及びいくつかの事例ではC末端システイン残基の取り込みに加えて、大腸菌での発現に最適であるコドンもまた用いた。いくつかのアルギニンコドン特にAGA及びAGGは大腸菌ではほとんど用いられず、更に翻訳時のポリペプチド合成を失速させ、不完全な終了をもたらすことによって大腸菌でのタンパク質の効率的な発現の障害となると考えられていることは周知である。HBcの150から183の間の16のアルギニンのコドンのうち、7つは稀なAGAコドンによってコードされ、2つは非常に稀なAGGコドンによってコードされる。したがって、この実験では、全てのAGA及びAGGコドンを、大腸菌でより頻繁に用いられるコドンで置換した。稀なアルギニンコドンの連続的な置換を可能にするために、HBc156遺伝子を先ず初めに合成しCV-1600及びCV1601粒子、続いてHBc163構築物CV1634及びCV1632粒子のための鋳型として用いた。HBc163構築物はその後HBc171構築物CV1642及びCV1643粒子のための鋳型として用い、最後にHBc171構築物をアルギニンコドン最適化HBc182及びHBc183構築物のための鋳型として用いる。非最適化HBc182構築物CV1575もまたコントロールのために調製した。全てのPCR生成物は制限酵素NcoI及びHindIIIで切断し、発現ベクターpKK2233N上記述べたように同じ酵素で既に切断されているでクローニングした。アミノ末端プライマー配列NcoI制限部位は下線を付されているは以下のとおりである:HBc149NcoIF5TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA配列番号263カルボキシル末端プライマー配列HindIII制限部位は下線を付されているは以下のとおりである:HbC156H3R5GCGAAGCTTACTAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG配列番号372HBc156CH3R5GCGAAGCTTACTAACAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG配列番号373HBc163H3R5GCGAAGCTTACTAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG配列番号374HBc163CH3R5GCGAAGCTTACTAACAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG配列番号375HBC171H3R5GCGAAGCTTACTACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT配列番号376HBc171CH3R5GCGAAGCTTACTAACACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT配列番号377HBc183H3R5GCGAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGATCGCCGGCGACGCGGCGATTGAGAGCGTC配列番号378HBc182H3R5GCGAAGCTTACTATTGAGATTCCCGAGATTGA配列番号379HBc183H3R5GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG配列番号380HBC149HindIIIR5CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG配列番号266HBc149CHindIIIR5CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG配列番号267下記の表は、完全長のHBcAgHBc183及びC末端短縮を含む全ての粒子のC末端の立体配置を示すアラインメントを示している。配列は、全ての構築物によって共有されている配列番号1のHBcのN末端からアミノ酸残基149までにしたがってアラインメントされている。C末端システイン残基は存在するときは下線を付されている。表構築物名称配列配列番号HBc183VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC381HBc182VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQ382HBc171CVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPC383HBc171VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSP384HBc163CVRRRGRSPRRRTPSPC385HBc163VRRRGRSPRRRTPSP386HBc156CVRRRGRSPC387HBc156VRRRGRSP388アッセイの方法A.抗原性1.粒子ELISA精製粒子を被覆緩衝液50mM重炭酸ソーダ、pH96中で2μgmLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した100μLウェル。前記ELISAストリップを室温で一晩インキュベートした約18時間。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液EWBリン酸緩衝食塩水PBS、pH74、005トゥイーン20で洗浄し、更にPBS中の3BSAで1時間ブロックした200μLウェル。ELISAストリップを乾燥状態で20°Cで必要になるまで保存した。粒子の抗原性を決定するために、抗血清をEWB中の1BSAを用いて希釈し、100μLウェルを抗原被覆ELISAウェルに添加した。血清を1時間インキュベートし、ELISA洗浄緩衝液上記で洗浄し、抗マウスHRPTheBindingSiteSanDiegoCAHRPセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合物又は他の適切な抗体を1時間用いて探索した。ELISA洗浄緩衝液で洗浄した後、前記反応物をTMブルー基質の添加によって100μLウェル可視化した。10分後に1NのH2SO4100μLウェルを添加して反応を停止させ、ELISAプレート読取装置で450nmで読み取った。2.合成ペプチドELISA20アミノ酸残基の合成ペプチド5又は24アミノ酸残基の合成ペプチドM2を被覆緩衝液50mM重炭酸ソーダ、pH96中で1μgmLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した100μLウェル。一晩約18時間37°Cのインキュベーターでインキュベートすることによってウェル上のペプチドを乾燥させる。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液リン酸緩衝食塩水PBS、pH74、005トゥイーン20で洗浄し、更にPBS中の3BSAで1時間ブロックした200μLウェル。ELISAストリップを乾燥状態で20°Cで必要になるまで保存した。粒子の抗原性を決定するために、抗血清モノクローナル又はポリクローナルをEWB中の1BSAを用いて希釈し、100μLウェルをペプチド被覆ELISAウェルに添加した。血清を1時間インキュベートし、ELISA洗浄緩衝液で洗浄し、抗マウスHRP複合物上記のように100μLウェルで又は他の適切な抗体を1時間用いて探索し、再びELISA洗浄緩衝液で洗浄し、続いてTMブルー基質の添加によって100μLウェル可視化した。10分後に1NのH2SO4100μLウェルを添加して反応を停止させ、ELISAプレート読取装置で450nmで読み取った。B.粒子の免疫原性粒子の免疫原性をアッセイするために、選択アジュバント中の10又は20μgの粒子でマウスをIPで免疫し、4週間して同じアジュバント中の10μgの粒子でブースター免疫した。マウスを2、4、6及び8週で採血した。280:260吸収比の決定精製粒子の280:260吸収比を決定するために、粒子を20mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH68で約02mgmLの濃度に希釈し、260及び280nmの波長で吸収値を測定した。280nmで測定された吸収を260nmの値で割って、280:260比を決定した。前記の比をいくつかのサンプル天然粒子HBc183、残基149位の後ろで切端したHBc粒子HBc149、及び本明細書のいずれかの場所で明らかにしたいくつかのHBcキメラを含むについて得た。前記の比は下記の表に示されている。完全長粒子CV1559は、NeirynckらNatureMed511571163が最初に報告した粒子調製物で、一方、完全長粒子CV1607は同様な粒子であるが、ポリペプチドの17位及び19位のM2ポリペプチドシステイン配列番号9のX17及びX19がセリン残基に変異している。表NT:テスト実施せず。CV1159はNeirynckが記載したIM2HBcと同一である。耐熱性プロトコル精製粒子は、50mMのNaPO4pH68を用いて05-1mgmLの濃度に希釈し、4°C、室温又は37°Cでインキュベートした。サンプルを種々の時点で採取し、SDSPAGEサンプル緩衝液還元型と混合し、10SDSPAGEゲルで泳動した。ゲルをシンプリーブルーセーフステインSimplyBlueSafeStainInvitrogenCarlsbadCAを用いて染色してから分析した。ハイブリッド粒子の解析的ゲルろ過分析25mLのスーパーロースSuperrose6HR1030クロマトグラフィーカラムAmershamPharmacia17053701及びBioCAD登録商標SPRINT還流クロマトグラフィーシステムを用いて、精製ハイブリッドHBc粒子の解析的ゲルろ過分析を実施した。UV検出装置を280nmの波長のモニターのために設定する。カラムは、3カラム容積CV;約75mLの緩衝液20mMNaPO4pH68を流速050mL分で用いて平衡化した。分析するべき粒子を20mMのNaPO4pH68を用いて1mgmLの濃度に希釈した。続いて200マイクロリットルμLのサンプルを前記カラムにロードした。流速050mL分で20mMのNaPO4pH68を用いてサンプルをカラムから溶出させた。N末端システイン残基を含む粒子又はそのようなシステインを含まない同様な粒子を上記の方法を用いて解析した。280nmのトレースの積分はBioCADソフトPerSeptiveを用いて実施した。インフルエンザM2構築物最近、NeirynckらNatureMed511571163及びWO9907839は、M2の24アミノ酸残基の細胞外ドメインと完全長HBc粒子HBc183アミノ酸残基1-4を欠くのN末端との融合を報告した。本明細書でIM2HBcと称する前記構築物の模式図は下記に示されている。前記模式図では前記24量体はHBcのN末端と連結されている。IM2HBcMSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDHBc配列番号389ある説明例では、M2エピトープはB型肝炎コアのイムノドミナントループに挿入され、CV1475と称される粒子は良好に発現され、そのような挿入及び精製のために以前に考察された技術を用いて精製することができた。M2エピトープの変異型M2の天然の17位及び19位の2つのシステイン残基はアラニン残基によって置換されているもまたイムノドミナントループで発現されCV1473粒子、生じた粒子は精製された。これら2つの粒子を下記に模式的に示す。CV1475HBcGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELHBc配列番号390CV1473HBcGISLLTEVETPIRNEWGARANDSSDELHBcC配列番号391CV1473粒子構築物は、天然の配列CV1475と比較したとき約7倍多い精製粒子を生じた。システイン残基の変異が粒子の潜在保護能力を変化させたのか否かは決定されていない。しかしながら、HBcのイムノドミナントループに配送されたエピトープは、同一物が他の領域N末端を含むに融合されたときと比較して通常は顕著に免疫原性を示し、生じた粒子は抗HBc免疫原性の低下を示す。M2のN末端24量体エピトープがC末端切端B型肝炎コア粒子のN末端と融合された粒子もまた調製された。前記構築物CV1438はまたN末端プレコア配列配列番号259を含んでいた。ハイブリッドタンパク質CV1492の末端この事例ではHBc遺伝子のVal149の直後にただ1つのシステイン残基を含む同様な構築物を調製した。これらの構築物を下記に模式的に示す。CV1438MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGIHBc配列番号392CV1492MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGIHBcC配列番号393本来のイニシエーターメチオニンからの翻訳開始を防止するために、前記残基のコドンを省略したことは特記されるべきである。EcoRIGI及びSacIEL制限部位によって付与された残基には下線が付されている。プレコア配列は下線を付されたEL残基とHBcの間に挙げられている。SDSPAGEによる分析によって、CV1438モノマー構築物は、SDSPAGEゲルで分子量コントロールとして添加されたCV1492HBc149を含む、CV1475及びCV1473と比較して調製時に不安定であることが示された。CV1438モノマーの不安定性は粒子の解析的ゲルろ過を用いたときは明瞭ではなかった。CV1475及びCV1473は両方とも、CV1438及びCV1492よりもわずかに小さな分子量を有すると期待された。なぜならば、前者の2つはイムノドミナントループに直接挿入されたM2エピトープを含み、したがってCV1438及びCV1492に存在するプレコア配列配列番号259を欠くからである。期待通り、CV1492はCV1475及びCV1473よりも大きかったが、CV1438CV1492と同一であるが、C末端のシステイン残基を確保しているは、明白な切断のためにCV1475及びCV1473より明らかに大きくはない。HBcのN末端ドメインI又はループドメインIIに連結された以前に考察したM2のN末端細胞外配列を含み、更にまた、HBcのループドメインII又はC末端ドメインIVに連結されたM2タンパク質C末端配列を含む構築物例えば配列番号11の配列表A参照もまた意図される。意図されるそのような構築物はまた、本明細書のいずれかの箇所で考察したように少なくとも1つの安定化C末端システイン残基を含む。イムノドミナントループ融合を含むハイブリッドHBc粒子のアミノ末端を改変してシステイン残基、及び最小M2由来配列を取り込むために、一連の合成オリゴヌクレオチドを合成する。V2Pf1を作製するために、オリゴヌクレオチドM2NcoIF及びHBc149HindIIIRを用いて、ベクターV2Pf1のハイブリッドHBc遺伝子を増幅する。得られた546bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK2233N同じ2つの酵素によってその前に切断されているに挿入する。V2Pf1を作製するために、オリゴヌクレオチドM2NcoIF及びHBc149HindIIIRを用いて、ベクターV2Pf1のハイブリッドHBc遺伝子を増幅する。得られた540bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK2233N同じ2つの酵素によってその前に切断されているに挿入する。N及びC末端の両システイン残基を含む又は含まないHBcキメラ分子C末端が残基149で短縮されたHBcのN末端で、又はN末端近くでペプチド結合したインフルエンザAM2タンパク質の残基1-24を含む、一連のHBcキメラ分子含有粒子を調製した。前記キメラタンパク質分子は種々のN末端配列を含んでいた。前記配列はM2配列又は変種を含み、更にいくつかはC末端システイン残基を含んでいた。以下の表9A-9Cに挙げた全ての精製粒子は、解析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析して、精製に続いて粒子状構造の維持を評価した。CV1603と称される粒子N末端システイン残基を含まないは、亜粒子状構造への分解を示す証拠を提示した。その理由は、タンパク質が1500秒の範囲で溶出したからである粒子はほぼ1000秒で溶出する。粒子CV1590天然のN末端M2配列の2つのセリン残基がシステイン残基に変異していることを除いてCV1603粒子と同様であるの同様な分析では、前記構築物は精製の後粒状構造を維持することが示され、溶出は約1000秒で生じ、これはハイブリッド粒子にとって典型的である図4。CV1590粒子については分解の証拠は存在しなかった。CV1560粒子そのキメラタンパク質は又2つのN末端システイン残基を有するは、前記もまた精製後に粒子状構造を有することを示したが、前記はある程度の分解も示し、安定化はCV1590粒子ほどは強固でないことを示唆した。CV1590とCV1560粒子のN末端立体配置の比較以下の表11によって、CV1560粒子の2つのシステイン残基の相対的な位置は、3つのアミノ酸残基DELの欠落のためにCV1590粒子と比較して3アミノ酸残基だけシフトしていることが示された。前記は、システイン残基は、最適な架橋を可能にするためにコア遺伝子の開始部から最小限の距離であることが必要である可能性を示している。M2又はM2変種配列及びC末端システイン残基を含む粒子CV1603粒子は、精製後迅速に分解することが図4で示された。CV1605粒子を含むHBcキメラ分子は、CV1605の成分キメラ分子がただ1つのC末端安定化システインを有することを除いてCV1603粒子の分子と類似する。C末端システイン残基のCV1603への付加がタンパク質により高い安定性を付与することができるか否かを決定するために、CV1605粒子の発現を誘導するプラスミドを作製した。精製に続いて、CV1605粒子を解析的サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した。前記実験の結果によって、粒子の安定化はCV1603粒子の場合よりも完全であるが、CV1590粒子よりも不完全であることが示されたCV1590粒子は2つのアミノ末端システイン残基を含みC末端安定化システインを含まない。顕著な量のCV1605は粒子構造のままであったが、広い範囲にわたって溶出する亜粒子構造をもつ不均質な混合物の存在を示す証拠があった。これらの観察は、このハイブリッド粒子CV1603の場合、CV1605で見出されるようなC末端安定化は、CV1590粒子で見出されるN末端安定化よりも不完全であることが示唆される。ハイブリッド粒子のアミノ末端及びカルボキシ末端システインの安定化合体の両立性を調べるために、CV1604粒子の発現を誘導する発現プラスミドを構築した。CV1604粒子の成分キメラ分子は、CV1590のように天然のM2ポリペプチド配列に存在する2つのアミノ末端安定化システイン残基を、CV1605のようにC末端安定化システインと同様に含む。CV1604粒子の分析によって、前記粒子は精製後均質な粒子状態を維持することが示され、前記2つの安定化の方法は補完的であり、互いに協調的に用いられることを示した。HBcのN末端とN末端システイン残基との間のまた別のリンカー配列をCV1438粒子及びCV1492粒子を用いて究明した。これら粒子は両方とも、アミノ酸配列ELLGWLWGIDI配列番号398をM2融合部とHBcのアミノ酸D4との間に含んでいる。アミノ酸残基LGWLWGIDIはHBcのプレコアのアミノ酸6からアミノ酸I3に由来し、この位置から翻訳が開始するのを防ぐためにHBcのイニシエーターコドンが欠落している前記は本実験の妥協の産物である。HBプレコア配列は7位にシステインを含んでいる。これらの粒子は、CV1438の成分キメラ分子はHBcの149位で終了するが、CV1492の成分キメラ分子はHBcの149位で終了し、配列番号1のHBcに対応する150位に末端システインを含むという点でのみ相違していた。また別の方法であるが上記で考察したものと類似の方法それによれば粒子は約10分で溶出するを用いて解析的ゲルろ過によって分析したとき、両構築物は精製後に粒子状態であることが示された。この実験は、切端粒子のアミノ末端及びカルボキシル末端システイン安定化の両立性、並びにアミノ酸配列における実質的変動性及びN末端システイン残基とHBc遺伝子の開始部間の距離に対する寛容性を示した。表9A表9B表9C下記の表10は、HBeAg、及びN末端融合物をもつ粒子のN末端の立体配置を明らかにするアラインメントを示している。配列は、全ての構築物が共有する配列番号1のHBcのN末端のアミノ酸残基4位からアラインメントされている。存在する場合は、N末端のシステイン残基には下線が付されている。下記の表11は、本明細書で意図される、N末端インフルエンザAM2配列又は変種を含む粒子の安定性を評価した結果の一覧表を提供する。表に示されているように、安定な粒子は、配列番号1のHBc配列のN末端に対してマイナス1414位のN末端システイン残基を粒子自体のN末端周囲に含むHBcキメラ分子から生成されている。表11a:48位及び107位のそのシステインがセリンに変化している。b:第二のN末端M2コピーから数える。種々のM2含有粒子の抗原性モノクローナル抗体14C2に対する種々の粒子の抗原性をELISAを用いて調べた。それらの本来の構造で粒子が維持されていることを担保するために、ELISAプレートを粒子を捕捉するポリクローナル抗体ウサギで先ず初めに被覆し、続いて14C2モノクローナル抗体又は、HBc粒子のイムノドミナントループに対して特異性を有する抗HBcモノクローナル抗体のどちらかの種々の希釈で調べた。下記の表に提示したデータは、HBcのイムノドミナントループにおけるM2eの提示は、N末端での提示と比較して、14C2モノクローナル抗体のM2eエピトープのアクセス能力を顕著には変化させないことを示しているIM2HBcCV1559及びCV1604。これらの観察は驚くべきことではない。なぜならば、14C2は、N末端に結合するのではなくM2eの内部領域M2のアミノ酸8、10、11及び14と結合することが以前に示されたからであるZebedeeetalJVirol6227622727。更に、CV1569を除く全ての粒子が抗HBcモノクローナル抗体3105に対する抗原性を維持していた。3105による認識の低下は、イムノドミナントループに挿入された配列を有する粒子について以前に観察された現象であり、これは典型的には免疫後にこれら粒子に対する抗HBc応答の低下に転化される。モノクローナル抗体3105はInstituteofImmunologyTokyoJapanから購入した。抗体のサブクラス及び防御種々のM2eHBc構築物10μgマウス及び種々のアジュバントをアッセイしたいくつかの実験の要約。約12を腹腔投与し、約12を鼻内投与した。各群14匹マウスについて、血清をプールし、抗M2eIgGサブクラス抗体の力価を決定した。結果は第二のブースター後1週間で採取した血清から得られた。IgG2a力価が104を超えるマウスについて、IgG2Aの力価は104であった。アジュバントは、ワクチンに対するそれらの免疫応答の強さ及び持続期間の強化能力が免疫応答のTh1Th2偏向の調節能力とともにだんだんと解明されていった。多くの実験的アジュバントは研究中であるが、ミョウバンは、米国でFDA承認ワクチンの成分であるただ1つのアジュバントである。典型的にはミョウバンは免疫応答をTh2型に偏向させる前記偏向はマウスでの高レベルのIgG1抗体産生によって示される。ミョウバンによって製剤化されたM2eHBc粒子は顕著にIgG1応答を誘発するが、IgG2a及びIgG2b抗体Th1インジケーターであるもまた誘発される。Th1型IgGサブクラスの産生を強化させるために、RC529を補充したアルヒドロゲル製剤粒子RC529はコリキサ社CorixaCorporationが開発したMPLの合成誘導体であるをマウスでテストした。これらの実験によって、アルヒドロゲル登録商標製剤へのRC529の包含は、抗M2eIgG2a:IgG1比を約10倍高めて、抗M2eIgG2a力価の劇的な強化をもたらすことが明らかにされた。両群の全てのマウスが致死的攻撃から完全に防御されたが、しかしながら、アルヒドロゲル登録商標単独に対して、アルヒドロゲルRC529で製剤化されたCV1569で免疫したマウスで罹患率の低下体温降下及び体重減少が示唆された。選択キメラの粒子会合サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィルの分析によって、前記5つの予想システイン変異キメラのうちの4つが良好に粒子に会合した。C48及びC107のセリンへの変異は粒子会合に影響がないことを確認するために、HBc149及びHBc149を、C末端システイン保有ペア、HBc149C及びHBc149Cとともに使用した。これらの構築物の包含はまた、粒子の安定性の比較及び変異粒子のジスルフィド結合の程度の決定のために必要であった。全ての発現粒子を精製し、最終収量を以下に一覧表にした。粒子収量は、非操作HBc149と比較して一般的に非常に高く、導入変異は粒子会合に大きな衝撃を与えなかったことが示唆された。第1回目の粒子産生における高い成功により、キメラの全てを異種ループ挿入物を受容するように同様に改変したが、ただし不成功の粒子HBc149L55CH104CCは除外した。表12:システイン変異を保有するキメラの精製タンパク質収量:この段階で粒子は典型的には75以上純粋である。NA会合無し各キメラの約2mgが性状決定実験に必要であると決定された。そこで、多くの事例で、最大約50AU半精製タンパク質25mgを陰イオン交換カラムに適用し、過剰ローディングを回避した。したがって、最終精製タンパク質収量は、HAクロマトグラフィー工程の後で廃棄された物質量を基準に予想される収量を表す。会合粒子の性状決定ジスルフィド結合形成は時間及び温度の関数であることが判明した。その天然の配座が改変操作された各粒子の解析的サイズ排除クロマトグラフィーによる分析では、4°C、室温及び37°Cで実施し0、3、7及び14日で分析した2週間におよぶ安定性実験で粒子間に相違は示されなかった。与えられた粒子について全ての溶出プロフィルは実質的に同一であってので、簡潔にするために、37°Cで0日及び14日もっとも厳しい条件のプロフィルのみが記載されている。C末端システインを欠く2つのコントロール粒子HBc149及びHBcは、それらの粒子状構造を完全には保持できず、それらの溶出プロフィルは低次構造の別個の集団を示した。粒子の架橋についての更なる解析は、粒子タンパク質の非還元SDSPAGEゲルへの泳動能力の判定によって評価された。ジスルフィド結合は、ほとんどの粒子コントロールを含むで0日目に不完全で、この実験の間中4°Cで不完全のままであることが示された。モノマー及びダイマーバンドの濃度の低下、及び高次マルチマーの出現における対応する増加によって判定されるように、室温でのインキュベーションはジスルフィド結合を強化した。重要なことには、37°Cでインキュベートされた全ての粒子C末端非安定化コントロールを除くが7日後に完全にジスルフィド結合された。特に注目すべきことは、C末端安定化C48SC107Sキメラは0日目に完全にジスルフィド結合されるようで、そのC48C107の対応物はジスルフィド結合を生じず、前記実験期間中にはC48SC107Sキメラが達成した同じレベルの架橋には到達しなかった。更にまた、改変操作粒子、HBc149W62CF97CCは0日目に同じ高レベルの架橋を示した。全てのサンプルの還元SDSPAGEゲルで、安定性実験の開始から終了までモノマーの濃度に顕著な変化は示されず、0日目及び14日目に採取されたサンプルの37°Cゲルでの比較によって例証されたように全てのモノマーは全温度にわたって無傷のままであることが示唆された。重要なことには、非還元状態下で分析を実施した選択キメラについて時間が経過したときのモノマー及びダイマーの濃度の減少はモノマーの分解のためではないことがこれらの観察によって確認された。前記安定性実験の全時点で全ての粒子について遊離チオールの存在を測定し、ジスルフィド結合形成の程度を確定した。遊離チオールはエルマン試薬と反応するが、ジスルフィド結合に必要とされるものは、エルマン試薬と反応しない。これらの実験によって、遊離チオールの存在は時間経過にしたがって減少し、37°Cでインキュベートされたサンプルでは室温及び4°Cでインキュベートされたサンプルと比較して加速されることが示された。前記の観察は、非還元SDSPAGEゲル前記ゲルでは構築物の泳動は遊離チオールのレベルの減少に比例して低下するを用いた粒子の解析で得られた観察と一致する。Zhengら上掲書の観察と一致して、野生型のC48及びC107を含む前記2つのコントロール粒子は、全ての時点及び温度で遊離チオールの存在を示し、これらのシステイン残基はほとんどが還元状態のままであることが確認された。これらのシステインがセリンに変異している対応する粒子では、遊離チオールの反応性は消失し、あらためてC61及びC150は完全にジスルフィド結合されているという事実が立証された。改変操作された粒子は精製工程の終了時に完全には架橋されなかったが、非還元SDSPAGEゲルでの遊離モノマー及びダイマーの存在によって証明されたように、いずれも37°C7日でほとんど検出不能レベルの遊離チオールを示した。これらのデータは有用で、仮定的ジスルフィド結合形成残基の予測に用いられるコンピュータモデリングは非常に有力であったが、完璧な予想ではなかった。しかしながら、ループの安定性はこの態様では予想が困難で、したがって一組のエピトープ保有ベクターを作製した。第一に、全てのC48SC107Sエピトープ保有粒子は、それらの野生型の対応物と類似の態様で反応し、前記の変異は粒子の会合に影響を与えないことを示したことは記載されるべきである。βアミロイドエピトープ前記は改変操作された非ジスルフィド粒子で安定な粒子に会合することができないもまた4つの全ての改変操作システインベクターで会合に失敗し、システインがイムノドミナントループと架橋してモノマーをその所望の立体配置に維持することができないことを示した。ASP1エピトープは改変操作ベクターで同様な態様を示したが、ただし付加システインをもたないコントロールベクターは低レベルの会合粒子を生成した。炭疽エピトープPAコントロール粒子で会合に失敗したは、実際A58CL100Cベクターでは低レベルの会合粒子を生成したが、他のベクターでは生成できなかった。最後に、インフルエンザエピトープ高レベルの会合HBcをコントロールベクターゼ生じたは、4つの改変操作粒子のうち2つL76CR82Cキメラ及びW62CF97Cキメラで中等度のレベルの会合ベクターを生成した。全てのキメラの粒子収量の要約は下記の表3に示されている。良好に会合した粒子は下線を付されている。表13:エピトープ保有キメラの生成タンパク質収量:粒子はこの段階で典型的には75以上純粋である。HBc149Cは、簡潔にするために改変操作ジスルフィド粒子名から省略した。原型のV16IA2C2SクローンキメラCV1569と同様いずれの粒子も発現されなかったが、C48SC107S型は同様な発現レベルを示した。しかしながら、精製されたときは、C48SC107S型では1mg未満の材料、精製材料の110が原型クローンから回収され、異なる精製方法がこのタイプのキメラには必要かもしれないということを示唆した。精製では、粒子はヘパタイトカラムに強固に結合しているようであり、このカラムからの回収はロードされたもののわずかに10であった。この実験で使用した他の粒子では60又はそれ以上が前記カラムで回収された。インフルエンザの粒子セットがもっとも完全であったので、前記は安定性実験のためのただ1つの粒子組立てセットであった。精製は最適ではないようであったが4種の粒子のうち2種の回収は非常に低かった、前記材料を以前に見出されたようにジスルフィド結合促進のために37°Cでインキュベートし、最初の安定性実験に用いた同じ解析方法を用いてこれら粒子の性状を調べた。最初この実験は以前に記載したように2週間実施するためにセットアップしたが、0、3及び7日で採集したサンプルがパターンの観察に十分であった。0日目に粒子は非還元ゲルで典型的なジスルフィド結合を示したが、4種の粒子の解析は、全ての改変操作粒子において別個の切断モノマーを明らかにした。コントロール粒子V16IA2C2Sは切断を示さなかったが、ただしこれは完全なままであったただ1つのロットで、他の全て5ロットは同じ切断パターンを示したデータは提示されていない。3日間のインキュベーションによって、完全なモノマーの分解がV16及びL76CR82Cで示され、W62CF97Cキメラでは切断生成物の一定の増加が示されたが、ただしこれらの天然の粒子は無傷のままであった。しかしながら、解析的サイズ排除クロマトグラフィーによる天然の粒子の解析は、精製V16キメラは会合粒子ではなかった前記は、おそらく極めて低い精製収量のためで、おそらく形成された粒子は精製カラムから効率的に溶出されなかったのであろう。全ての粒子の分解傾向は、安定性実験が終了する7日間の間ずっと続いた。IA2C2Sエピトープに関する最近の研究では、ループで提示されるとき、このエピトープは切断されやすいことが判明した。したがって、N末端配列決定は約半分で切断されたフラグメントを示し、前記は挿入エピトープ内の位置で切断されている。したがって、モノマーは単純に個々のエピトープの性質のためにループの安定化に関係なく切断されるのであろうと考えられる。他のエピトープを含むループの安定性の更なる解明が進行中である。HBcタンパク質CV1843及びCV1842コントロールタンパク質モノマー当たり1つ又は2つ以上の複合事象を可能にするために、HBc担体を考案及び構築した。本明細書で意図された複合反応は、糖類、ペプチド、脂質又は糖脂質を第一アミンに結合させる。担体タンパク質CV1843はただ1つのリジン残基を含み、前記残基は、HBcイムノドミナントループのHBc77位に存在する付加されたリジンである。リジンマイナス変異体CV1842に関する実験によって、ある種のハプテン特にペプチドはN末端に複合することができるが、オリゴ糖、ジアシルLOSは複合させることができないことが示された。前記の相違はおそらくハプテンタイプの幾何学構造及び/又は親水性における相違のためであろう。この固有の合成にはヘルパーT細胞エピトープの付加は必要とされないが、ただしヘルパーT細胞エピトープは融合タンパク質として担体に複合させるか、又は前記とともに発現させることができる。したがって、CV1843タンパク質は、リジンコドンAAAをアルギニンコドンCGCで置き換えることにより7位で、リジンコドンAAGをアルギニンコドンAGGで置き換えることにより97位で、更にシステインコドンTGTをセリンコドンTCTで置き換えることのより48位及び107位でHBcコアの4つのアミノ酸変異を含んでいる。リジンコドンの1つの挿入はHBc遺伝子のアミノ酸L76とE77との間で実施された。上記の位置特異的変異導入は、出発プラスミドCV1123をクィックチェンジQuickChangeXL位置特異的変異導入キットStratageneとともに用いて達成した。各変異導入又は挿入に2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。一方のプライマーは他方の相補鎖である。全ての変異導入反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、変異コドンが、基部ヌクレオチド変異部位にもっとも近いとしてG又はCと併せて、変異コドンのどちらかの側に存在する16から20ヌクレオチドのフランキング配列と一緒に存在できるように考案された。PfuターボTurboDNAポリメラーゼを変異導入PCRに用い、DpnIを親DNAプラスミドの消化に用いた。用いたプライマーセットは下記に示されている。ここで与えられた位置の本来の残基は一文字名で最初に記され、続いて置換位置の番号、続いて置換のための一文字名が記載されている。77位のリジンKの挿入のためのプライマーは、ただ1つの残基が前記の位置に挿入されるだけであるので本来の残基も置換残基も含んでいない。7位のためのプライマーK7RフォワードCCATGGACATCGACCCTTATCGCGAATTTGGAGCTACTGTGGAG配列番号440K7RリバースCTCCACAGTAGCTCCAAATTCGCGATAAGGGTCGATGTCCATGG配列番号44197位のためのプライマーK97RフォワードCACTAATATGGGCCTAAGGTTCAGGCAACTCTTGTGG配列番号442K97RリバースCCACAAGAGTTGCCTGAACCTTAGGCCCATATTAGTG配列番号44348位のためのプライマーC48SフォワードGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGC配列番号444C48SリバースGCAGTATGGTGAGGTGAAGAATGCTCAGGAGACTCTAAGGC配列番号445107位のためのプライマーC107SフォワードGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAG配列番号446C107SリバースCTCTTCCAAAAGTGAGAGAAGAAATGTGAAACCACAAGAGTTGCC配列番号44777位にリジン挿入のためのプライマーK77フォワードCCTGGGTGGGTGTTAATTTGAAAGAAGATCCAGCGTCTAGAG配列番号448K77リバースCTCTAGACGCTGGATCTTCTTTCAAATTAACACCCACCCAGG配列番号449CV1842タンパク質粒子ベクターはCV1843タンパク質粒子の形成のためのベクターと同じ方法で構築した。CV1842タンパク質は、7、97、48及び107位にCV1843と同じ4つの変異を含んでいる。しかしながら、CV1842タンパク質は77位にリジン挿入を含んでいない。CV1842タンパク質粒子は、リジンを官能基として用いるとき、複合でCV1843のためのコントロール粒子として機能する。リコンビナントプラスミドは大腸菌BLRで増殖させ、05mMのIPTGで誘発し、更に一晩約18時間増殖させた。細胞を遠心で採集し、ミクロ液化によって溶解させた。可溶性物質を2度硫安沈殿させ、セファロースCL4BカラムAmershamにロードした。カラムから溶出した第二のピークをセラミックヒドロキシアパタイトカラムにロードし、溶出させ、硫安で再度沈殿させた。タンパク質を水に再懸濁し、解析と複合のために50mMのリン酸ナトリウムpH68に対して透析した。CV1843及びCV1123タンパク質へのdLOS複合CV1843タンパク質及びCV1123タンパク質を以下の実験に用いた。アジピン酸ジヒドラジドADH誘導9274dLOSはXinXingGu博士NationalInstituteofHealthBethesdaMDから供給され、2つの方法の各々によりHBcの各タイプと別々に複合させた。第一の方法は、CV1123上の酸性残基との直接的なカルボジイミド結合であった。第二は、ADH誘導スクシンイミジル32ピリジルジチオプリピオンアミドNγマレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステルGNBS販売元の指示に従って調製を用いて7、77及び97位のリジンとの結合であった。したがって、ADH誘導dLOSをNスクシンイミジル32ピリジルジチオプロピオネートSPDPと反応させ、混合ジスルフィドを生成し、更にNγマレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステルGNBSをHBcタンパク質のN末端アミン又はεアミノリジンと反応させ手HBc誘導スクシンイミドエステルを生成した。SPDP混合ジスルフィドのジチオスレイトールとの反応、それに続く透析によって3チオプロピオンヒドラジドdLOS誘導体が提供され、前記をHBc誘導スクシンイミドエステルと反応させて所望の複合物を生成した。上記で調製した複合物を用い、食塩水溶液又は食塩水とともにミョウバンへの複合物の予備吸着のどちらかを用いてマウスを免疫した各群に5匹。マウスを3回3週間離して免疫した。提示した力価は最後の追加免疫後2週間である。各投与用量は5μgの炭水化物を含んでいた。ELISA条件は文献から採用したSunetalVaccine1812641272。以前から存在する力価を示した抗体クラスはIgMのみであった。全ての構築物で力価は1log高められた。IgG2b力価はワクチンのミョウバンへの吸着を止めたときに顕著に低下した。これは炭水化物の脱アシル化又は加水分解によるものであろうSturgessetalVaccine1711691178。いずれのマウスも測定可能な力価のIgG2aを示さなかった。IgG1誘発Th2反応の特徴はHBc上のより長い架橋物による免疫で減速したが、最終的には残りの動物と同じレベルまで上昇した。IgG3レベルは類似していた。CV1843及びCV1842タンパク質から調製された粒子とのペプチド複合CV1843及びCV1842タンパク質から調製された粒子にペプチドを複合させた。前記ペプチドは、アミノ酸配列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD配列番号450を有し、リンカーNγマレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステルスルホGMBS、PierceChemicalCoを用いて複合させた。最適化後、複合の結果は所望のリジンとの結合を示し、更に下記に考察するようにアミノ末端との結合もまた示した。したがって、CV1843タンパク質から調製された粒子の銀染色還元SDSPAGE分析は、約22000ダルトンの完全に還元されたHBcポリペプチド鎖のモノマーバンド、その上に1リピート1ペプチド付加バンド及び前記1リピートバンドの上に2リピート2ペプチド付加バンドを示した。約44000ダルトンの領域には、更にまた1つの主要バンド及び2つの複合バンドが存在した。CV1842タンパク質から調製された粒子の場合、モノマー及びダイマーバンドが、モノマー及びダイマーの他に単一ポリペプチドが存在する場合のバンドのように存在した。したがって、CV1843タンパク質から調製された粒子の場合は、前記ペプチドは7位及びN末端の付加リジンの両者に複合されたが、リジン残基をもたないCV1842タンパク質から調製された粒子の場合、前記ペプチドはN末端にのみ複合された。モノマー及びダイマーは完全な還元は不能とみなされ、複合後2つの22000ダルトンのモノマーに分離する。これらの結果は、精製粒子はペプチドを前記精製粒子と複合させることができることを明瞭に示している。本明細書に引用した特許及び論文は各々参照により本明細書に含まれる。英文中の冠詞a又はanは1つ又は2つ以上を含むことを意図する。前述の説明及び実施例は例示的であり、限定と解されるべきではない。本発明には他の変型がなお可能であり、当業者には容易に類推されるであろう。"