"配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシンまたはメチオニンを含んでいる、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素。配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを含んでいる、GH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素。配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニンを含んでいる、TreeseiのエンドグルカナーゼIの熱安定性変異体の酵素。配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを含んでいる、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素。配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを含んでいる、GH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素。配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンを含んでいる、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素。配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にグリシンを含んでいる、熱安定性変異体のTreeseiのエンドグルカナーゼI。配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる、請求項4に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素。配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる、請求項5に記載のGH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素。配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニンをさらに含んでいる、請求項8または9の記載の熱安定性変異体の酵素。配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンをさらに含んでいる、請求項1に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素。配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンをさらに含んでいる、請求項2に記載のGH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素。配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンをさらに含んでいる、請求項3に記載のTreeseiのエンドグルカナーゼIの熱安定性変異体の酵素。配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる、請求項1に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素。配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる、請求項2に記載のGH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素。配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに含んでいる、請求項3に記載のTreeseiのエンドグルカナーゼIの熱安定性変異体の酵素。約50°Cにおいて約1時間にわたるインキュベーション後に、野生型の酵素と比べて向上した熱安定性を示す、請求項1~16のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素。約50°Cにおいて約1時間にわたるインキュベーション後に、少なくとも約0.5mモルGE/μモル酵素/時間の比活性を有している、請求項1~17のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素。エンドグルカナーゼまたはエキソグルカナーゼである、請求項1、4、6、8、10、11および14のいずれか一項に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素。TreeseiのエンドグルカナーゼIの熱安定性変異体の酵素である、請求項1、4、6、8、10、11および14のいずれか一項に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素、または請求項2、5、9、10、12および15のいずれか一項に記載のGH7ファミリーエンドグルカナーゼ酵素。真菌または細菌に由来する、請求項1、4、6、8、10、11および14のいずれか一項に記載のグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素、または請求項2、5、9、10、12および15のいずれか一項に記載のGH7ファミリーエンドグルカナーゼ酵素。Candida、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Yarrowia、Acremonium、Agaricus、Alternaria、Aspergillus、Aureobasidium、Botryospaeria、Ceriporiopsis、Chaetomidium、Chrysosporium、Claviceps、Cochliobolus、Coprinopsis、Coptotermes、Corynascus、Cryphonectria、Cryptococcus、Diplodia、Exidia、Filibasidium、Fusarium、Gibberella、Holomastigotoides、Humicola、Irpex、Lentinula、Leptospaeria、Magnaporthe、Melanocarpus、Meripilus、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Piromyces、Poitrasia、Pseudoplectania、Pseudotrichonympha、Rhizomucor、Schizophyllum、Scytalidium、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trichoderma、Trichophaea、Verticillium、Volvariella、XylariaまたはSporotrichumthermophileからなる群から選択される真菌に由来する、請求項21に記載の熱安定性変異体の酵素。請求項1~22のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素を含んでいる、組成物。請求項1~22のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素をコードしている、単離された核酸。制御配列と作動可能に連結されている請求項24に記載の核酸を含んでいる、発現ベクター。請求項25に記載の発現ベクターを含んでいる、宿主細胞。Escherichia、Pseudomonas、Proteus、Ralstonia、Streptomyces、Staphylococcus、Lactococcus、Bacillus、Saccharomycescerevisiae、Schizosaccharomycespombe、Yarrowialipolytica、Hansenulapolymorpha、Kluyveromyceslactis、Pichiapastoris、Aspergillus、ChrysosporiumlucknowenseまたはTrichodermareeseiからなる群から選択される、請求項26に記載の宿主細胞。熱安定性変異体の酵素を生成するための方法であって、上記酵素を生成するための好適な条件において、請求項26または27に記載の宿主細胞を培養培地において培養することを包含している、方法。培養培地、ならびに請求項26または27に記載の上記宿主細胞を含んでいる組成物。請求項1~22のいずれか一項に記載の熱安定性変異体の酵素を、上記培養培地の上清に含んでいる、組成物。前処理したバイオマス混合物の粘度を低下させる方法であって、初期の粘度を有している前処理したバイオマス混合物を、請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させること;ならびに前処理した上記混合物の初期の上記粘度を低下させるために十分な条件において、接触させた上記バイオマス混合物をインキュベートすることを包含している、方法。バイオマスを糖に変換させる方法であって、上記バイオマスを、請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを包含している、方法。バイオマスを加水分解または分解する方法であって、上記バイオマスを、請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを包含している、方法。発酵生成物を生成する方法であって、バイオマスを請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させて第1の生成物を形成させること;ならびに上記第1の生成物を、発酵生成物を生成するために十分な条件において1つ以上の発酵微生物とともに培養することを包含している、方法。発酵生成物を生成する方法であって、バイオマスを請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させて第1の生成物を形成させること;ならびに上記第1の生成物を、化学処理によって発酵生成物を生成するために十分な条件において化学溶液とともにインキュベーションすることを包含している、方法。バイオマスを発酵させる方法であって、1つ以上の発酵微生物を、請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物によって処理されるバイオマスと接触させることを包含している、方法。燃料を生成する方法であって、バイオマスを請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させて糖の溶液を得ること;ならびに上記糖の溶液を、燃料を生成するために十分な条件において発酵微生物とともに培養することを包含している、方法。発酵生成物を生成する方法であって、バイオマスを、請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させて糖の溶液を得ること;ならびに上記糖の溶液を、化学処理によって燃料を生成するために十分な条件において化学溶液とともにインキュベーションすることを包含している、方法。上記バイオマスは結晶性セルロースを含んでいる、請求項31~38のいずれか一項に記載の方法。上記バイオマスはリグノセルロース性の植物材料を含んでいる、請求項31~38のいずれか一項に記載の方法。上記植物材料は、ススキ、シマヨシ、チカラシバ、スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、クサヨシ、ヨシ、ムギのわら、オオムギのわら、キャノーラのわら、エンバクのわら、トウモロコシの茎および葉、ダイズの茎および葉、エンバクの外皮、モロコシ、イネの外皮、サトウキビのバガス、トウモロコシの繊維、可溶性物質を有している穀類蒸留粕DDGS、ヒメアブラススキ、トウモロコシの穂軸、マツ、ヤナギ、ヤマナラシ、ポプラ木材ならびにエネルギーケインからなる群から選択される、請求項40に記載の方法。食品加工の方法であって、植物材料を、請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、消化可能な植物材料を得ることを包含している、方法。繊維製品をつや出しする方法であって、繊維製品を、請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、つや出しした繊維製品を得ることを包含している、方法。繊維製品を洗浄する方法であって、汚れた繊維製品を、請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、清潔な繊維製品を得ることを包含している、方法。製紙用パルプを漂白する方法であって、製紙用パルプを、請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、漂白した製紙用パルプを得ることを包含している、方法。研磨した結晶性セルロースの生成する方法であって、結晶性セルロースを、請求項23、29および30のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、研磨した結晶性セルロースを得ることを包含している、方法。洗剤、および請求項1~22のいずれか一項に記載の酵素を含んでいる、洗濯用洗剤組成物。請求項1~22のいずれか一項に記載の酵素を含んでいる、食品添加物。上記接触は、約50°C~約55°C、約55°C~約60°C、または約60°C~約70°Cの温度において行われる、請求項31~46のいずれか一項に記載の方法。上記接触は約50°C~約55°Cの温度において行われる、請求項31~46のいずれか一項に記載の方法。上記接触は約60°C~約70°Cの温度において行われる、請求項31~46のいずれか一項に記載の方法。上記バイオマス、植物材料、繊維製品、汚れた繊維製品、製紙用パルプまたは結晶性セルロースは、接触させることの前に前処理される、請求項31~46および49~51のいずれか一項に記載の方法。本開示は特定のアミノ酸部位における変異を有している熱安定性グリコシルヒドロラーゼファミリー7の酵素例えばエンドグルカナーゼを含んでいる、熱安定性変異体の酵素に関する。本開示は、さらに、熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物および当該酵素を発現し得る宿主細胞ならびにそれらの使用方法に関する。I.定義他に定義されていなければ、すべての科学用語および技術用語は、それらが関連する技術分野において一般的に用いられているときと同一の意味を有すると理解される。本願の開示の目的として、以下の用語が定義されている。本明細書に用いられるときアミノ酸という用語は、タンパク質の化学的な構築ブロックを指す。それはタンパク質において一般的に見られる20個の標準のアミノ酸ならびにそれらの化学的に修飾された型またはアナログを包含している。本明細書に用いられるときポリペプチドという用語は、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸残基の一本鎖によって作られる化合物を指す。タンパク質という用語は、ポリペプチドと同義である。本明細書に用いられるとき酵素という用語は、触媒性の機能を実行するポリペプチドを指す。ポリペプチドのまさに触媒性の部分だけではなく、触媒性のドメインの機能的な役割から異なった機能的な役割を有する、または有していない、さらなるドメインまたはモチーフを包含し得る。これらの更なるドメインまたはモチーフは、天然に見られるか、または商業的に見られる他のポリペプチド由来であり得る。本明細書に用いられるとき野生型という用語は、生物種において天然に生じるような、変異されていない型のポリペプチドまたは遺伝子を指す。本明細書に用いられるときアライメントするという用語は、2つのポリペプチドを構造的または機能的に位置合わせすることを指す。2つ以上のポリペプチドにおけるアミノ酸は、それらが異なるポリペプチドにおいて同一の位置に配置されている場合、アライメントされているとみなされる。また、2つ以上のポリペプチドにおけるアミノ酸は、異なるポリペプチドにおいて同一の機能を実行する場合、アライメントされているとみなされる。例えば、2つ以上の酵素においてアライメントしたアミノ酸は、例えばそれぞれの酵素または基質基質群と、同一の接触を形成し得る;または酵素の機能における同一の触媒性の役割を担い得る。アライメントは当該分野においてよく知られているアルゴリズムを用いて行われ得る。本明細書に用いられるとき熱安定性という用語は、活性が測定可能であるまたは最適である温度において有する活性を失うことなく、特定の温度例えば高温に限定された曝露に耐えるためのタンパク質の機能を記載している。活性という用語は、定められた反応条件において与えられた基質の変換を定量的に記載している。比活性という用語は、定められた反応条件における酵素の量あたりの活性を定量的に記載している。本明細書に用いられるときセルラーゼという用語は、セルロースがグルコース、セロビオースまたはセロトリオースに加水分解される酵素反応を触媒する酵素またはそれらの酵素の活性を指し、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼを有する酵素例えばグルカノヒドロラーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼまたはβ-グルコシダーゼグルコヒドロラーゼの活性、および当該酵素の対応する酵素活性が挙げられるを指す。本明細書に用いられるときリグノセルロースという用語は、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンからなる任意の材料を指す。本明細書に用いられるときグリコシルヒドロラーゼファミリー7の酵素という用語は、グリコシルヒドロラーゼファミリー7に属する酵素を指す。GH7という用語は、グリコシルヒドロラーゼファミリー7と同義である。GH7ファミリーエンドグルカナーゼという用語は、エンドグルカナーゼの機能を有する、グリコシルヒドロラーゼファミリー7における酵素を指す。II熱安定性変異体の酵素本開示は、特定のアミノ酸において変異を含んで得る、熱安定性酵素グリコシルヒドロラーゼファミリー7に属する酵素が挙げられるに関する。出願人は、いかなる学説によっても結び付けられることは望んでいない;しかし、向上した熱安定性は、酵素の結晶化における高いBFactorの値によって特徴づけられる、フレキシブルな部位における変異によって実現されると考えられている。好ましい実施形態では、酵素は配列番号1の230位、113位または115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸における変異を有している、TrichodermareeseiのエンドグルカナーゼITrEGIである。他の実施形態では、酵素は、配列番号1の230位および/または113位および/または115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸における変異を有している、グリコシルヒドロラーゼ7GH7のメンバーである。ある実施形態において、GH7のメンバーはエンドグルカナーゼである。アミノ酸配列のアライメント配列番号1の230位、113位または115位のアミノ酸とアライメントする、グリコシルヒドロラーゼファミリー7のメンバーのアミノ酸は、配列番号1の230位、113位または115位のアミノ酸と構造的にアライメントするものである。配列番号1の230位、113位または115位のアミノ酸とアライメントする、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の酵素のアミノ酸は、配列番号1における同一の位置においてアライメントされ得;それらの配列番号1の参照配列における同一の位置において見いだされない傾向にある。例えば、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の酵素は、1位のアミノ酸において更なるメチオニンを有する配列番号1と同一の配列を有し得る。その場合、当該酵素の231位におけるグリシン残基は、配列番号1の230位のアミノ酸にアライメントするだろう。他の例の場合により、Cochlioboluscarbonum由来のセロビオヒドロラーゼICBHIの238位のアミノ酸であるリジンシグナルペプチドなしの成熟した酵素において番号付けした残基は、配列番号1の230位のアミノ酸にアライメントする。アライメントされたアミノ酸は、例えばいくつかが以下に議論されている、アルゴリズムを用いることによって、同定され得る。2つ以上のポリペプチドの配列が比較ウィンドウ同士、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いて、もしくは手動のアライメントおよび目視検査によりきちんと調整された指定領域同士の最大の一致を比較され、アライメントされ得る。配列比較のために、典型的にある一つの配列が、試験配列と比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列はコンピュータに入力され、必要であれば部分配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。既定のプログラムのパラメータを用いることができ、または代わりのパラメータを指定することもできる。本明細書に用いられるとき比較ウィンドウは、非限定的に20~600、通常約50~約200、より通常には約100~約150の任意の数の連続する位置のセグメントであり、配列が同一数の連続的な位置の参照配列と最適にアライメントされた後に、当該参照配列と比較されるセグメントについての言及を包含する。配列のアライメントの方法は、当該分野においてよく知られている。一例は、AltschuletalNucleicAcidsRes2533893402に記載されている、BLASTアルゴリズムを用いることである。配列の最適なアライメントのための他の例は、SmithandWatermanの局所的相同性アルゴリズム、NeedlemanandWunschJMolBiol48443453の相同性アライメントアルゴリズム、thesearchforsimilaritymethodofPearsonandLipmanProcNatlAcadSciUSA8524442448の類似性の方法の研究、コンピュータ制御のこれらのアルゴリズムの実行、および手動のアライメントおよび目視検査[例えば、BrentetalCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsIncを参照]である。より好ましくは、参照配列の他の特定のアミノ酸と構造的にアライメントするアミノ酸は、類似の構造的なモチーフおよびフレキシブルな領域を同定するために結晶構造の比較により想定され得、後者は高いBfactor値によって特徴づけられる。アミノ酸における変異または置換酵素は、連続的に重合した複数のアミノ酸残基を含んでいるアミノ酸配列によって構成されている。また、他に示されていなければ、特定のアミノ酸配列は、暗黙的にそれらの保存的に修飾されたバリアントを包含する。変異体は、当該酵素における1つ以上のアミノ酸残基が、当該分野において知られている技術によって野生型の配列から変化した酵素を指す。アミノ酸配列を変化させるための技術としては、部位特異的突然変異導入、カセット変異導入、ランダム変異導入、合成のオリゴヌクレオチドの構築、クローニングおよび他の遺伝子工学の技術EijsinkVGetal2005BiomolEng222130が挙げられるが、これらに限定されない。本開示における変化の結果、変異体の酵素は熱安定性の向上を有する。配列番号1の230位または113位または115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に、変異したアミノ酸を含んでいる、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、野生型のアミノ酸配列において、配列番号1の230位または113位または115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しているものである。例えば、TreeseiのエンドグルカナーゼIの野生型の配列が配列番号1である場合、変異体のTreeseiのエンドグルカナーゼIは、230位または113位または115位のアミノ酸において変異したまたは置換したアミノ酸を有する配列番号1の配列を有し得る。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位および/または113位および/または115位のアミノ酸とアライメントする、セリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、グリシン残基に、置換された/変異したアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素はエンドグルカナーゼである。最も好ましくは、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、TreeseiのエンドグルカナーゼIである。変異体は、天然に生じる標準の20のアミノ酸残基、保存的に修飾されたバリアントのアミノ酸残基、コドンによってコードされていない天然に生じるアミノ酸残基および天然に生じないアミノ酸残基による、アミノ酸の置換を含んでいる。変異の結果として、酵素は、熱安定性の向上を有する。本明細書に用いられるとき保存的に修飾されたバリアントのアミノ酸は、化学的に類似のアミノ酸を用いたアミノ酸の置換をもたらす、それぞれのアミノ酸の置換、欠失または付加を含んでいる。機能的に類似のアミノ酸を示している保存的な置換の表が、当該分野においてよく知られている。以下の8つの群は、互いに保存的なアミノ酸を含んでいる:1アラニンA、グリシンG;2アスパラギン酸D、グルタミン酸E;3アスパラギンN、グルタミンQ;4アルギニンR,リジンK;5イソロイシンI、ロイシンL、メチオニンM、バリンV;6フェニルアラニンF、チロシンY、トリプトファンW;7セリンS、スレオニンT;および8システインC、メチオニンM例えばCreightonProteinsを参照。20の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸例えば4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリジン、2-アミノイソブチル酸、イソバリンおよびアルファ-メチルセリンが野生型のポリペプチドのアミノ酸残基を置換し得る。限定された数の非保存的なアミノ酸、遺伝的なコードによってコードされていないアミノ酸および非天然のアミノ酸がアミノ酸残基を置換し得る。非天然のアミノ酸がタンパク質合成後に修飾され、および/または標準アミノ酸のものとは異なるそれらの側鎖側鎖群を有する。非天然アミノ酸は化学合成されることができ、好ましくは、市販されており、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリンならびに3,3-ジメチルプロリンが挙げられる。グリコシルヒドロラーゼファミリー7の酵素いくつかの実施形態において、熱安定性変異体の酵素は、グリコシルヒドロラーゼファミリー7に属している。より好ましくは、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の酵素は、エンドグルカナーゼ、エンド-β-1,4-グルカナーゼ、エンド-β-1,3-1,4-グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼまたはエキソセルラーゼであり得る。いくつかの実施形態において、GH7の酵素は、エンドグルカナーゼである。最も好ましくは、エンドグルカナーゼは、配列番号1を有するTrichodermareeseiのエンドグルカナーゼIである、いくつかの好ましい実施形態において、エンドグルカナーゼは、炭水化物結合ドメインCBMを含んでいる。他の実施形態において、エンドグルカナーゼはCBMを欠損している。いくつかの実施形態において、酵素は細菌由来である。細菌の種は、グラム陽性例えばBacillus、Streptococcus、Streptomyces、Staphylococcus、Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Clostridium、GeobacillusもしくはOceanobacillusまたはグラム陰性例えばEscherichiacoli、Pseudomonas、Salmonella、Campylobacter、Helicobacter、Flavobacterium、Fusobacterium、Ilyobacter、NeissenaまたはUreaplasmaであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、酵素は、Bacillusalkalophilus、Bacillusamyloliquefaciens、Bacillusbrevis、Bacilluscirculans、Bacillusclausii、Bacilluscoagulans、Bacillusformus、Bacilluslautus、Bacilluslentus、Bacilluslicheniformis、Bacillusmegaterium、Bacilluspumilus、Bacillusstearothermophilus、BacillussubtilisまたはBacillusthuringiensisに由来する。他の実施形態において、酵素は、Streptococcusequisimilis、Streptococcuspyogenes、Streptococcusuberis、StreptococcusequisubspZooepidemicus、Streptomycesachromogenes、Streptomycesavermitilis、Streptomycescoelicolor、StreptomycesgriseusまたはStreptomyceslividansに由来する。いくつかの実施形態において、酵素は真菌由来である。好ましい実施形態において、酵素は、酵母種Candida、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、SchizosaccharomycesもしくはYarrowiaの由来、または糸状菌種Acremonium、Agaricus、Alternaria、Aspergillus、Aureobasidium、Botryospaeria、Ceriporiopsis、Chaetomidium、Chrysosporium、Claviceps、Cochliobolus、Coprinopsis、Coptotermes、Corynascus、Cryphonectria、Cryptococcus、Diplodia、Exidia、Filibasidium、Fusarium、Gibberella、Holomastigotoides、Humicola、Irpex、Lentinula、Leptospaeria、Magnaporthe、Melanocarpus、Meripilus、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Piromyces、Poitrasia、Pseudoplectania、Pseudotrichonympha、Rhizomucor、Schizophyllum、Scytalidium、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trichoderma、Trichophaea、Verticillium、Volvariella、XylariaもしくはSporotrichumthermophileに由来する。いくつかの実施形態において、酵素は、Saccharomycescarlsbergensis、Saccharomycescerevisiae、Saccharomycesdiastaticus、Saccharomycesdouglasii、Saccharomyceskluyveri、SaccharomycesnorbensisまたはSaccharomycesoviformisに由来する。他の実施形態において、酵素は、Acremoniumcellulolyticus、Aspergillusaculeatus、Aspergillusawamori、Aspergillusfumigatus、Aspergillusfoetidus、Aspergillusjaponicus、Aspergillusnidulans、Aspergillusniger、Aspergillusoryzae、Chrysosporiumkeratinophilum、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiumtropicum、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、Fusariumbactridioides、Fusariumcerealis、Fusariumcrookwellense、Fusariumculmorum、Fusariumgraminearum、Fusariumgraminum、Fusariumheterosporum、Fusariumnegundi、Fusariumoxysporum、Fusariumreticulatum、Fusariumroseum、Fusariumsambucinum、Fusariumsarcochroum、Fusariumsporotrichioides、Fusariumsulphureum、Fusariumtorulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusariumvenenatum、Humicolagrisea、Humicolainsolens、Humicolalanuginosa、Irpexlacteus、Mucormiehei、Myceliophthorathermophila、Neurosporacrassa、Penicilliumfuniculosum、Penicilliumpurpurogenum、Phanerochaetechrysosporium、Trichodermaharzianum、Trichodermakoningii、Trichodermalongibrachiatum、TrichodermareeseiまたはTrichodermavirideに由来する。好ましい実施形態において、酵素は、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、Thielaviaaustraleinsis、Thielaviafimeti、Thielaviamicrospora、Thielaviaovispora、Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、Thielaviasetosa、ThielaviasubthermophilaまたはThielaviaterrestrisに由来する。酵素の熱安定性/活性酵素の活性は、酵素の熱安定性の指標として用いられ得る。異なる反応条件例えば、異なる温度における酵素の活性を監視することは、それらの条件における酵素の安定性を監視することに言い換えられる。酵素は、特定の反応条件において活性である場合、それらの条件において安定であるとみなされる。好ましい実施形態では、変異体の熱安定性酵素は、30、35、40、45、50、55、65または70°Cにおいて約1時間にわたるインキュベーション後に、親となる変異させられていない野生型の酵素と比べて、向上した熱安定性を示す。いくつかの実施形態において、熱安定性変異体の酵素は、0.5、0.75、1.25、1.5、1.75、または2時間インキュベートされる。いくつかの好ましい実施形態において、熱安定性変異体の酵素は、約50°Cにおいて約1時間にわたるインキュベーション後に、少なくとも約0.5mモルGE/μモル酵素/時間の、典型的には少なくとも約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、または1mモルGE/μモル酵素/時間の比活性を有している。酵素は、一般的に、セルラーゼ活性例えばエンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、および/またはセルロース結合能を有している。セルラーゼ活性またはセルロース結合能は、多くのよく知られている方法酵素電気泳動像、還元糖アッセイ例えば、DNSミクロまたはDNSマクロ、ネルソン-ソモギー法のミクロまたはマクロ、ネルソン法のセミ-マクロ、フェリシアン化物-1、フェリシアン化物-2、PAHBAHミクロまたはマクロ、BCAおよび改変したBCA、パラニトロフェノール-標識グリコシドを用いたアッセイ、生成物の解析、総糖アッセイ例えばフェノール-H2SO4またはアントロンH2SO4、酵素的グルコースアッセイおよびセルロース結合アッセイによって測定され得る。セルラーゼ活性およびセルロース結合能のための基質としては、可溶性の基質または不溶性の基質が挙げられる。可溶性の基質は、例えば、セロデキストリンおよびその誘導体、短鎖セルラーゼ、β-メチルウンベリフェリル-オリゴ糖、p-ニトロフェノール-オリゴ糖、長鎖セルロース誘導体、カルボキシメチルセルロースCMC、ヒドロキシエチルセルロースHECである。不溶性の基質としては、綿、WhatmanNo1フィルタ紙、パルプ例えば、SolkaFloc、結晶性セルロース例えば、綿、微結晶性セルロース例えば、Avicel登録商標、バロニアのセルロース、細菌性セルロース、非結晶性セルロース例えば、PASC、アルカリ膨潤セルロース、染色セルロース、蛍光セルロース、色素生成および発蛍光団の誘導体例えば、トリニトロフェニル-カルボキシメチルセルロースTNP-CMCおよびFluramセルロース、実用的なセルロース含有基質、α-セルロース、前処理したリグノセルロースバイオマスが挙げられる。230位のアミノ酸の変異一局面において、本開示は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素に関する。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、またはメチオニンを有している。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを有しているGH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸、またはアルギニンを有している、TreeseiのエンドグルカナーゼIの熱安定性変異体の酵素である。113位のアミノ酸における変異他の局面において、本開示は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有している、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素に関する。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを有している。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを有している、GH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。115位のアミノ酸における変異さらなる他の局面において、本開示は、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有している、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素に関する。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンを有している。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にグリシンを有している、熱安定性変異体のTreeseiのエンドグルカナーゼIの酵素である。変異の組み合わせを有している酵素本開示は、特定のアミノ酸において変異を有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー7の酵素を有している熱安定性変異体の酵素に関する。好ましい実施形態において、配列番号1の230位または113位または115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有している。いくつかの実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位、113位または115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異の組み合わせを有している。例えば、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸における変異および配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸における変異を有している。本開示は、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、上に記載されているような、配列番号1の230位、113位または115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸における変異のすべての可能な組み合わせを有している酵素を有している。A113位および115位のアミノ酸における変異一局面において、本開示は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントする第2のアミノ酸においてさらに変異を有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素に関する。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントする第2のアミノ酸にさらに変異を有している。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントする第2のアミノ酸においてスレオニンまたはグリシンを有している。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントする第2のアミノ酸にさらに変異を有しているGH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントする第2のアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに有している、変異体の熱安定性GH7ファミリーエンドグルカナーゼ酵素である。B113位、115位および230位のアミノ酸における変異好ましい実施形態において、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントする第2のアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している。好ましい実施形態において、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンを有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントする第2のアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニンを有している。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに有しており、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にさらに変異を有している、GH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリンを有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントする第2のアミノ酸にスレオニンまたはグリシンをさらに有しており、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸またはアルギニンをさらに有している、GH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。C230位および113位のアミノ酸における変異一局面において、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にさらに変異を有している。好ましい実施形態において、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、またはメチオニンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にさらに変異を有している。他の好ましい実施形態において、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、またはメチオニンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンを有している。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、GH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを有しており、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、GH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを有しており、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンを有している、GH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、TreeseiのエンドグルカナーゼI酵素である。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸、またはアルギニンを有しており、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、TreeseiのエンドグルカナーゼI酵素である。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸、またはアルギニンを有しており、配列番号1の113位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にロイシンまたはセリンを有している、TreeseiのエンドグルカナーゼI酵素である。D230位および115位のアミノ酸における変異一局面において、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にさらに変異を有している。好ましい実施形態において、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、またはメチオニンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にさらに変異を有している。他の好ましい実施形態において、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にセリン、スレオニン、ロイシン、またはメチオニンを有しているグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを有している。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに含んでいる、GH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、GH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にリジンを有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを有している、GH7ファミリーエンドグルカナーゼの熱安定性変異体の酵素である。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異を有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、TreeseiのエンドグルカナーゼI酵素である。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸、またはアルギニンを有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸に変異をさらに有している、TreeseiのエンドグルカナーゼI酵素である。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、配列番号1の230位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にアラニン、グルタミン、グルタミン酸、またはアルギニンを有しており、配列番号1の115位のアミノ酸とアライメントするアミノ酸にスレオニンまたはグリシンを有している、TreeseiのエンドグルカナーゼI酵素である。III.熱安定性変異体の酵素を含んでいるポリペプチドいくつかの実施形態において、規定されている酵素は、機能的なドメインリーダーぺプチド、プロペプチド、結合ドメインおよび/または触媒性のドメインが挙げられると融合されている。好適な結合ドメインとしては、種々の特異性の炭水化物結合ドメイン例えばCBM熱安定性変異体の酵素の使用の間に存在する炭水化物の成分に向上した親和性をもたらすが挙げられるが、これに限定されない。酵素的に活性な好適なドメインは、所望の生成物の生成において、熱安定性変異体の酵素の活性を補助する活性を有している。触媒性ドメインの非限定的な例としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ例えばキシラナーゼ、エンドマンナナーゼ、エキソマンナナーゼ、グルカナーゼ、アラビナーゼ、ガラクトシダーゼ、ぺクチナーゼ、および/または他の活性例えばプロテアーゼ、リパーゼおよび/または酸ホスファターゼなどまたはそれらの機能的な断片が挙げられる。融合タンパク質は、リンカー配列を介して必要に応じて上記ポリペプチドと連結されている。上記リンカー配列は、規定されている熱安定性変異体の酵素もしくはそれらの断片、および当該融合ドメインを、いずれの構成要素の特性に大きく影響せずに単純に連結するか、または意図されている用途にとって機能的な重要性を必要に応じて有している。いくつかの実施形態において、タンパク質分解性の切断部位は、融合タンパク質のパートナーおよび所定のタンパク質配列の間に設けられて、融合タンパク質配列の除去を可能にしている。IV.核酸、ベクターおよび宿主細胞また、熱安定性変異体の酵素の製造方法、ベクターおよび宿主細胞が提供される。一局面において、本開示は、熱安定性変異体の酵素をコードしている単離された核酸を提供する。他の局面において、本開示は、熱安定性変異体の酵素をコードしている単離された核酸を含んでいる発現ベクターを提供する。さらなる他の局面において、本開示は、熱安定性変異体の酵素をコードしている単離された核酸を含んでいる発現ベクターを有している宿主細胞を提供する。他の局面において、本開示は、当該酵素を生成するための好適な条件において、熱安定性変異体の酵素をコードしている核酸を有している発現ベクターを含んでいる宿主細胞を培養することによって、熱安定性変異体の酵素を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記酵素をコードしているDNAは、公開されている配列から化学合成され得るか、または遺伝子を有している宿主細胞から直接的に例えばcDNAライブラリーのスクリーニングまたはPCR増幅によって入手され得る。いくつかの実施形態において、酵素は、発現カセットに含まれているか、および/または標準的な分子的なクローニング技術によって、好適な発現ベクターにクローニングされている。そのような発現カセットまたはベクターは、転写の開始または終結を補助する複数の配列例えばプロモーターおよびターミネーターを含んでおり、一般的に選択マーカーを含んでいる。発現ベクター/宿主細胞の組合せは、周知であり、示されている方法に使用され得る。典型的に、発現カセットまたはベクターは、好適な発現宿主細胞に導入され、当該発現宿主細胞は対応するポリペプチドを発現する。特に好適な発現宿主は、発現宿主の細菌の属Escherichia例えばEscherichiacoli、Pseudomonas、キシラナーゼexlA、gpd-プロモーターcgh1、cbhll、エンドグルカナーゼ遺伝子EGI~EGV、Cel61B、Cel74A、egl1-egl5、gpdプロモータ、Pgk1、pki1、EF-1α、tef1、cDNA1およびhex1プロモーターに対する遺伝子を促進させるプロモーターは、特に好適であり、多数の異なる生物例えばAniger、Treesei、Aoryzae、AawamoriおよびAnidulans由来であり得る。いくつかの実施形態において、酵素は、好適な同種または異種のシグナル配列と組換え的に一体にされている。当該シグナル配列は、細胞外または細胞周辺の空間に熱安定性変異体の酵素の分泌を導き、それによって細胞上清または細胞周辺腔もしくは溶菌液における酵素活性の直接的な測定を可能にする。Escherichiacoli、他のグラム陰性細菌および当該分野に公知の他の生物にとって、特に好適なシグナル配列としては、lyA、DsbA、Pbp、PhoA、PelB、OmpA、OmpTまたはM13ファージGill遺伝子の発現を促進させる配列が挙げられる。Bacillussubtilis、グラム陽性生物および当該分野に公知の他の生物にとって、特に好適なシグナル配列としては、AprE、NprB、Mpr、AmyA、AmyE、Blac、SacBの発現を駆動する配列がさらに挙げられ、Scerevisiaeまたは酵母にとって、特に好適なシグナル配列としては、キラートキシン、Bar1、Suc2、接合因子α、Inu1AまたはGgplpシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、例えば発現されたタンパク質の残りからそれらを除去する、多くのシグナル配列によって切断され得る。いくつかの実施形態において、酵素の残りは、単独に発現されるか、またはN末端もしくはC末端における他のペプチド、タグもしくはタンパク質例えば6XHis、HAまたはFLAGタグとの融合体として発現される。好適な融合体としては、親和性、精製または検出を容易にするタグ、ペプチドまたはタンパク質例えば6XHis、HA、キチン結合タンパク質、チオレドキシンまたはFLAGタグ、ならびに示されているポリペプチドの発現、分解またはプロセシングを容易にするタグ、ペプチドまたはタンパク質が挙げられる。好適なプロセシング部位としては、エンテロキナーゼ、STE13、Kex2またはインビボもしくはインビトロの切断のための他のプロテアーゼの切断部位が挙げられる。いくつかの実施形態において、酵素は、多くの形質転換方法によって発現宿主細胞に導入される。当該形質転換方法としては、エレクトロポレーション、脂質に補助された形質転換または形質移入リポフェクション、例えば塩化カルシウムおよび/またはリン酸カルシウムを用いた化学的に媒介される形質転換、例えば宿主細胞のプロトプラストの酢酸リチウムを介した形質転換、微粒子銃遺伝子銃の形質転換、例えば宿主細胞のプロトプラストのPEGを介した形質転換、例えば細菌または真核細胞のプロトプラストを用いたプロトプラストの融合、リポソームを介した形質転換、Agrobacteriumtumefaciens、アデノウイルスまたは他のウイルスもしくはファージの形質転換または形質導入が挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、酵素は細胞内に発現される。必要に応じて、酵素の細胞内発現、またはシグナル配列例えば上述した配列を用いた細胞周辺腔における分泌の後に、細胞透過化または溶解のステップは、熱安定性変異体の酵素を上清に放出させるために使用され得る。膜の障壁の破壊は、機械的な手段例えば超音波、圧力処理フレンチプレス、キャビテーションまたは膜を分解する酵素例えばリゾチームまたは酵素の混合物の使用によって達成される。さらなる代替として、酵素をコードしているポリヌクレオチドは、好適な無細胞発現系の使用によって発現される。無細胞系において、所定のポリヌクレオチドは、典型的にプロモーターの補助をともなって転写されるが、環状の発現ベクターを形成するためのライゲーションは任意である。他の実施形態において、RNAは外因的に加えられるか、または転写なしで生成され、無細胞系において翻訳される。いくつかの実施形態において、酵素は組換え的に生成され、他の実施形態において、ポリペプチドは合成的に生成されるか、または単純な生成源から精製される。いくつかの実施形態において、酵素は、例えば抽出、検出および/または精製を補助するために、N末端および/またはC末端の融合タンパク質として生成される。融合タンパク質のパートナーの例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGST、6XHis、GAL4DNA結合および/または転写活性ドメイン、FLAGタグ、MYCタグまたは当業者に公知の他のタグが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、タンパク質分解性の切断部位は、融合タンパク質の配列の除去を可能にするために、融合タンパク質のパートナーおよび所定のタンパク質配列の間に設けられている。融合タンパク質は、規定されているポリペプチドの活性を妨げないことが好ましい。V.組成物いくつかの局面において、本開示は、特定のアミノ酸に変異を有するグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素をコードしている核酸を有している発現ベクターを含んでいる宿主細胞を含んでいる組成物を提供する。他の実施形態において、本開示は、培養培地の上清におけるグリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物を提供する。好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、GH7ファミリーのエンドグルカナーゼである。他の好ましい実施形態において、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の熱安定性変異体の酵素は、TreeseiのエンドグルカナーゼIである。いくつかの実施形態において、組成物は1つ以上のさらなる所定のタンパク質を含んでいる。組成物に見られる所定のタンパク質の非限定的な例としては、ヘミセルラーゼ、アルファ-ガラクトシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、ベータ-グルカナーゼ、エンド-ベータ-1,4-グルカナーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシランアセチル-エステラーゼ、ガラクタナーゼ、エンド-マンナナーゼ、エキソ-マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラッカーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、ホスファターゼ、脂肪分解性の酵素、クチナーゼおよび/または他の酵素が挙げられる。VI.使用方法本開示の酵素、ベクター、宿主細胞および組成物は、種々の産業用途単糖およびオリゴ糖へのバイオマス例えば、セルロースおよびリグノセルロースの消化、例えば、生物燃料の生成、繊維製品手法洗浄、コットンの柔軟加工およびデニムの仕上げ処理が挙げられる、例えば色のケア用、洗浄用および抗汚染antideposition用の洗剤の製造および使用;食品に基づく方法食品加工およびマッシュが挙げられる;パルプおよび紙の手法例えば、製紙用パルプの漂白、脱インキ、廃液処理の改善、研磨された結晶性セルロースの製造および繊維改質が挙げられるにおける使用について見出されている。したがって、例えば可溶性の糖を生成するためのセルロース含有組成物の消化または加水分解例えば、酵素発酵または化学発酵によるにおける、そのような用途にとっての、規定されている酵素、核酸および組成物の方法および使用が提供される。熱安定性変異体の酵素は、高温において酵素活性を維持している。いくつかの実施形態において、熱安定性変異体の酵素は、約50~55°C、典型的に約50、51、52、53または54°C;約55~60°C、典型的に約55、56、57、58または59°C;約60~70°C、典型的に約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69または70°Cの温度において使用される。向上したこの熱安定性は、変異体酵素を、高い温度において理想的に実施されるリグノセルロースの加水分解にとって特に好適にする。この特性のために、熱安定性変異体の酵素は、後述する種々の産業用途に使用され得る。前処理されたバイオマス混合物の粘度の低下熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における当該熱安定性変異体の酵素を含んでいる、規定されている組成物は、種々の産業用途における利用例えば生物燃料の生成における単糖およびオリゴ糖への分解前の、前処理されたバイオマス混合物の粘度の低下が挙げられるについて見出されている。例えば生物燃料の生成において、供給原料として使用されるバイオマスは、バイオマスのセルロース性成分の加水分解を阻害し得る高レベルのリグニンを一般的に含有している。典型的にバイオマスは、セルロース成分の加水分解への利用可能性を向上させるために、例えば高温および/または高圧を用いて、前処理される。しかし、前処理は、高粘度のバイオマス混合物を一般的に生じる。また、前処理されたバイオマス混合物の高粘度は、前処理されたバイオマス混合物の効率的な加水分解を妨害し得る。有利なことに、本開示のポリペプチドおよび組成物は、バイオマスのさらなる分解の前に、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させるために使用され得る。したがって、本開示の一部の実施形態は、初期の粘度を有している前処理されたバイオマス混合物を、本開示の熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物のいずれかと接触させること、ならびに前処理されたバイオマス混合物の上記初期の粘度を低下させるために十分な条件において、接触させた上記バイオマス混合物をインキュベートすることによって、前処理されたバイオマス混合物の粘度を低下させる方法に関する。いくつかの実施形態において、開示されている方法は、前処理工程の一部として実施される。前処理工程はさらなるステップを含み得る。上記さらなるステップは、本開示の熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物のいずれかを、高温下においてバイオマスを前処理するステップの後に、前処理されたバイオマス混合物に対して加えるステップ、および前処理されたバイオマス混合物の上記初期の粘度を低下させるために十分な条件において、熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物とともに、前処理されたバイオマスをインキュベーションするステップである。熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物は、混合物の温度が高い間にか、または混合物の温度が下げられた後に、前処理されたバイオマス混合物に加えられ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、熱処理が実施された同じ容器または容器vesselorcontainerにおいて実施される。他の実施形態において、上記方法は、熱処理が実施された容器とは別の容器または容器において実施される。バイオマスとしては、植物材料、都市ごみおよび紙屑が挙げられ得るが、これらに限定されない。植物材料としては、ススキ、シマヨシ、チカラシバ、スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、クサヨシ、ヨシ、ムギのわら、オオムギのわら、キャノーラのわら、エンバクのわら、オートスペルトoatspelt、トウモロコシの茎および葉、ダイズの茎および葉、エンバクの外皮、モロコシ、イネの外皮、サトウキビのバガス、トウモロコシの繊維、オオムギ、エンバク、アマ、コムギ、リンシード、柑橘類のパルプ、綿実、ラッカセイ、アブラナ、ヒマワリ、エンドウマメ、ルピナス、ヤシの仁、ココナツ、コンニャク、イナゴマメガム、グアールガム、ダイズ、可溶性物質を有している穀類蒸留粕DDGS、ヒメアブラススキ、トウモロコシの穂軸、マツ、針葉樹の軟木、ユーカリ、カンバ、ヤナギ、ヤマナラシ、ポプラ木材、交配種のポプラ、エネルギーケイン、短い輪作の木質収穫物、収穫物の残余物、庭ゴミまたはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。バイオマスの消化熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる、規定されている組成物は、当該分野において周知の多種類のセルロース性バイオマス植物バイオマス、微生物性バイオマス、精製セルロースおよびリグノセルロース性の供給原料が挙げられるを分解するために使用され得る。生体燃料エネルギーは、植物の細胞壁の成分であるセルロースおよびヘミセルロースから主になっている。単量体の糖へのこれらの多糖の加水分解は、異なる化学結合を切断するために共働的に作用する1組の酵素を必要とするDoddandCannGCBBioenergy122009。セルロースは、バイオマスにおける支配的な多糖他の多糖ヘミセルロース、リグニンおよびペクチンが挙げられるとともにである。セルロースは、無水セロビオース直鎖状のβ-1-4-D-グルカンのホモポリマーであり、β-1,4-グリコシド結合においてともに連結されているグルコースユニットを含んでいる。ヘミセルロース性成分は、化学組成において異なり得る。ヘミセルロースは、種々の置換基を有している複雑な分枝構造に、種々の化合物例えば、キシラン、キシログルカン、アラビノキシランおよびマンナンを含んでいる。しかし、一般的に多形のセルロースは、類似するグルカン鎖の不溶性の結晶マトリクスとして、主に植物組織に見られる。セルロース性のバイオマスとしては、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンを含有しているリグノセルロースバイオマスが挙げられる。精製セルロースとしては、ホロセルロース例えば、SolkaFlok、微結晶性セルロース、例えば、Avicel登録商標およびSigmacell、および高い可溶性のセルロースエーテルカルボキシメチルセルロースCMCが挙げられる。セルロース含有基質としては、可溶性の基質および不溶性の基質が挙げられる。可溶性の基質は、例えば、セロデキストリンおよびその誘導体、短鎖セルラーゼ、β-メチルウンベリフェリル-オリゴ糖、p-ニトロフェノール-オリゴ糖、長鎖セルロース誘導体、カルボキシメチルセルロースCMC、ヒドロキシエチルセルロースHECである。不溶性の基質としては、綿、WhatmanNo1フィルタ紙、パルプ例えば、SolkaFloc、結晶性セルロース例えば、綿、微結晶性セルロース例えば、Avicel登録商標、バロニアのセルロース、細菌性セルロース、非結晶性セルロース例えば、PASC、アルカリ膨潤セルロース、染色セルロース、蛍光セルロース、色素生成および発蛍光団の誘導体例えば、トリニトロフェニル-カルボキシメチルセルロースTNP-CMCおよびFluramセルロース、実用的なセルロース含有基質、α-セルロース、前処理したリグノセルロースバイオマスが挙げられる。いくつかの局面において、熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物は、結晶性セルロースと接触させるために使用されて、セルラーゼ、エクスパンシンおよびセルロース結合タンパク質のアッセイのために使用される研磨された結晶性セルロースを生じさせる。他の局面において、熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物は、バイオマスと接触させるために使用されて、バイオマスを加水分解/分解するか、またはバイオマスを糖に変換する。いくつかの実施形態において、熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物は、バイオマスと接触させるために使用され、その生成物は、発酵生成物を生成するために十分な条件下において、複数の発酵性微生物とともに培養されるか、または化学溶液とともにインキュベートされる。他の実施形態において、バイオマスは、熱安定性変異体の酵素、当該熱安定性変異体の酵素を発現する宿主細胞、または培養培地の上清における熱安定性変異体の酵素を含んでいる組成物によって処理され、当該バイオマスを発酵させるために1つ以上の発酵性微生物と接触させられる。好ましい実施形態において、バイオマスは前処理される。生物燃料の生成規定されている本開示の酵素および組成物は、セルロース、セルロース含有バイオマス、およびセルロース含有供給原料の分解および加水分解における利用について見出されている。上記分解および加水分解は、例えば、生物燃料例えば、エタノール、ブタノール、他の生成物または中間体の生成ためにバイオマスから得られる化学的な供給原料または発酵の供給原料としての単糖、二糖およびオリゴ糖の生成を目的としている。規定されているポリペプチドのそのような利用のための方法および組成物が、提供される。当該利用は、例えば、1生物燃料の発酵性生成を目的とする、リグノセルロース分解性のバイオマスの、可溶性の糖への変換、2前処理されたリグノセルロースの、可溶性の糖への変換、3高塩濃度または高いイオン性の液体の存在下における、リグノセルロースの、可溶性の糖への変換、4高温例えば、50、51、52、53、54もしくは55°C、またはこれらを超える範囲例えば、60°C~70°Cにおける、結晶性セルロースの、可溶性の糖への変換である。一実施形態において、規定されている組成物は、細胞の除去ありもしくはなしの粗製の発酵ブロスの構成においてか、または半精製もしくは精製の酵素調製物の形態において、酵素を含んでいる。代替的に、規定されている本開示の宿主細胞は、バイオマスを用いた発酵工程におけるポリペプチドの供給源として使用される。一実施形態において、本開示の酵素は、バイオマスの分解を補助して生物燃料例えば、エタノールを生成するためのセルロースの分解における利用について見出されている。エタノールは、バイオマスの酵素分解および放出された糖のエタノールへの変換によって生成される。この種のエタノールは、バイオエタノールまたは生物燃料としばしば呼ばれる。エタノールは、1未満~100以下の混合物における燃料の添加物または増量剤燃料の代用品として使用される。一実施形態において、バイオマスからの生物燃料の生成のために、規定されている酵素、組成物および方法は、セルロースの、その単量体グルコースまたは他の可溶性の糖への変換において、発酵例えば、微生物発酵または化学発酵による生物燃料例えば、エタノールへの続く変換のために、使用される。例えば、規定されている酵素および方法は、酵素的な加水分解によるそのような変換規定されているポリペプチドを用いた加水分解へと続く、典型的に高温において実施される前処理を必要に応じて包含しているのために使用され得る。一実施形態において、規定されている酵素は、植物材料のより大規模な加水分解のために、他のカルボヒドラーゼ例えば、マンナーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、α-ガラクトシダーゼおよび/またはセルラーゼと組み合わせて使用され得る。食品加工また、本開示の酵素を含んでいる組成物は、食品または動物の飼料の加工および製造における利用について見出されている。いくつかの非栄養因子は、動物の飼料および人間用の食品の調製における特定の植物材料の使用を制限している。リグノセルロース性材料例えばセルロールを含有している植物材料は、動物による当該植物材料の消化性を大きく低下させる。この影響は、植物材料のより高い割合が飼料に変換されることを可能にし、飼料のコストを低下させるセルロース性の分解酵素すなわち熱安定性変異体の酵素の使用を介して低下される。さらに、熱安定性酵素の活性を介して、セルロース性材料は、さらなるエネルギーを供給するためにより容易く吸収され得るより単純な糖に分解される。したがって、本開示の酵素を含んでいる組成物は、食品または動物の飼料の加工および/または製造のために好ましく使用される。規定されている本開示の酵素は、単胃動物例えば、家禽およびブタのための飼料に対する添加物、および人間の食品のための添加物として有用である。いくつかの実施形態において、酵素は、飼料の添加物としての代わりに飼料を前処理するために使用される。いくつかの実施形態において、酵素は、離乳直後のブタ、育児室のブタ、子ブタ、肥育しているブタ、成長期のブタ、最後の仕上げ中のブタ、産卵鶏、若鶏および/または七面鳥のための飼料に加えられるか、当該飼料を前処理するために使用される。いくつかの実施形態において、酵素は、植物材料例えば、ヤシの仁、ココナツ、コンニャク、イナゴマメガム、グアールガム、ダイズ、オオムギ、エンバク、アマ、コムギ、トウモロコシ、ラインシード、柑橘類のパルプ、綿実、ラッカセイ、ナタネ、ヒマワリ、エンドウマメおよびルピナスから得られた飼料に加えられるか、または当該飼料を前処理するために使用される。熱安定性のために、酵素は、粒状化ステップの前に飼料混合物に熱が加えられる固形飼料の製造工程における利用について見出されている。当該製造工程は、工業的なペレットミルのほとんど場合に見られる。一例において、酵素は、粒状化ステップに先立って他の飼料成分、または粒状化ステップの後にすでに形成された固形飼料に対して加えられる。食品加工を目的としているか、または飼料の補助剤としての酵素を含んでいる組成物において、当該組成物は、他の代替物例えば、着色剤、芳香化合物、安定剤、ビタミン、ミネラル、および他の飼料もしくは食品を向上させる酵素などを必要に応じて含んでいる。これは、いわゆるプレミックスpremixに適用される。本開示に係る食品添加物は、加工食品を製造するために、他の食品成分と組み合わせられ得る。生じる組合せの食品添加物は、加工食品を形成するために適切な量において他の食品成分例えば、穀類または植物タンパク質と混合される。繊維製品の洗浄および洗剤また、規定されている酵素、方法および組成物は、繊維製品の手法高温処理条件における洗浄、コットンの柔軟加工、およびデニムの仕上げ処理、コットン繊維のつや出しが挙げられる、ならびに洗剤の製造および使用例えば、色ケア、洗浄および抗汚染における利用について見出されている。例えば、酵素は、セルロースを含んでいるシミおよび汚れの除去を容易にするための洗剤組成物における利用について見出されている。一実施形態において、酵素は洗剤組成物に使用され、そのような洗剤組成物およびその使用が提供される。一実施形態において、洗剤組成物は、アミラーゼ、マンナーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、エンドグルカナーゼおよびエキソグルカナーゼの群から得られた他の酵素との組合せにおいて、酵素を含んでいる。酵素を含んでいる本開示の洗剤組成物は、任意の好都合な形態例えば、棒状、タブレット、粉末、粒状、ペーストまたは液体にある。液体洗剤は、典型的に70以下の水および0~30の複数の有機溶媒もしくは複数の非水性成分を含有している、一般的に水性である。洗剤組成物は、1つ以上の界面活性剤例えば、非イオン性半極性が挙げられる、アニオン性、カチオン性、および/または双性イオン性を含んでいる。界面活性剤は、0.1重量~60重量のレベルにおいて典型的に存在している。含められている場合に、洗剤は、約1~約40のアニオン性の界面活性剤例えば、直鎖状のアルキルベンゼンスルホン酸塩、α-オレフィンスルホン酸塩、硫酸アルキル脂肪アルコールの硫酸塩、アルコールエトキシ硫酸塩、二級アルカンスルホン酸塩、α-スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキルコハク酸、アルケニルコハク酸、または石鹸を典型的に含んでいる。含められている場合に、洗剤は、約0.2~約40の非イオン性の界面活性剤例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸のモノエタノールアミド、脂肪酸のモノエタノールアミド、ポリヒドロキシのアルキル脂肪酸アミド、またはグルコースアミンのN-アシルN-アルキル誘導体グルカミドを典型的に含んでいる。洗剤組成物は、0~65の洗剤のビルダーまたは錯化剤例えば、ゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトロトリ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、アルキルコハク酸、アルケニルコハク酸、可溶性のシリケートまたは層状化されたシリケートを必要に応じて含んでいる。洗剤組成物は、1つ以上のポリマー例えば、カルボキシメチルセルロースCMC、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン-N-オキシド、ポリビニルイミダゾール、ポリカルボキシレート例えば、ポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸共重合体およびラウリルメタクリレート/アクリル酸の共重合体を必要に応じて含んでいる。洗剤は、過酸形成活性剤例えば、テトラアセチルエチレンジアミンまたはノナノイルオキシベンゼンスルホネートと組み合わせられ得る、漂白系例えば、過酸化水素原料例えば、過ホウ酸塩または過炭酸塩を必要に応じて含んでいる。代替的に、漂白系は、アミド、イミドまたはスルホン型のペルオキシ酸を含んでいる。一実施形態において、酵素は、1リットルの洗浄溶液につき0.01~100mgの酵素タンパク質好ましくは1リットルの洗浄溶液につき0.05~5mgの酵素タンパク質、特に1リットルの洗浄溶液につき0.1~1mgの酵素タンパク質に対応する量において加えられている。製紙用パルプ加工他の実施形態において、規定されている組成物および酵素は、例えばセルロース性材料のパルプ化のための高温適用におけるパルプおよび紙の手法例えば、製紙用パルプの漂白、脱インキ、廃液処理の向上、および繊維の改質における利用について見出されている。そのような目的のための、規定されている酵素を使用する方法および組成物が提供される。例えば、一実施形態において、酵素は、製紙用パルプ例えば、化学パルプ、半化学パルプ、クラフトパルプ、機械パルプまたはスルファイト法によって調製されたパルプの酵素補助漂白における利用について見出されている。いくつかの実施形態において、パルプは、酸素、オゾン、過酸化物またはペルオキシ酸を用いて漂白された無塩素パルプである。いくつかの実施形態において、酵素は、低リグニン含量を示す改変または連続のパルピング法によって生成されたパルプの酵素補助漂白に使用される。いくつかの実施形態において、酵素は単独において使用され、他の実施形態において、それらは、他の酵素例えば、キシラナーゼ、α-ガラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼおよび/またはセロビオヒドロラーゼの酵素との組合せにおいて提供される。以下の実施例は、与えられている実施形態を例示するために提示されており、発明の範囲を限定すると意図されていない。実施例1-TrichodermareeseiのエンドグルカナーゼIの変異生成TrichodermareeseiのエンドグルカナーゼITrEGIは、この酵素の結晶構造が利用可能であること、およびこのエンドグルカナーゼがTrichodermareeseiによって産生される最も豊富なエンドグルカナーゼであることから向上した熱安定性をもたらすために最初に選択された。TrEGIの熱安定性を向上させる最初の手法は、Bfactorにしたがった手法BFIT法ReetzMTetalAngewChemIntEdEngl457745512006を用いることに基づいていた。結晶構造から得られるBfactorは、ポリペプチドにおける残基の可動性の指標である。この手法において、最大の変動性のある部位に一致する最高の平均Bfactorを有していた残基を、向上した熱安定性を得る目的の変異生成のために選択した。この手法は、中温性酵素の熱安定性がその構造における最大の変動性のある部位における厳密さを向上させることによって促進され得るという仮定に基づいていた。TrEGIの結晶構造を用いて、最高のBfactor値を有している20残基を同定した表1。1つ以上のアミノ酸によって構成されている7つの部位部位A284~287位のアミノ酸、部位B301~302位のアミノ酸、部位C113位、115位のアミノ酸、部位D238位のアミノ酸、部位E230位のアミノ酸、部位F323位のアミノ酸、部位G291位のアミノ酸を、変異生成のために選択した図1、表1。TreeseiのエンドグルカナーゼIのクローニングEscherichiacoliのコドン傾向を用いて合成されたTrEGI用の遺伝子cel7bUniProtNoP07981を、GenScriptGenScriptCorporationPiscatawayNJUSAから購入した。フォワードプライマー5’AAAAAACATATGCAACAACCGGGCACCTCC3’配列番号2およびリバースプライマー5’AAAAAAGTCGACTTACAGACATTGCGAGTAGTA3’配列番号3を用いることによって、上記遺伝子をPCR増幅した。それから、プラスミドpIVEX2.4d-TrEGIを生成するためにNdeIおよびSalIを用いた二重消化の後に、PCR産物をpIVEX2.4dベクターRocheAppliedScienceIndianapolisINUSAにクローニングした。クローン化した遺伝子の配列決定を、ElimBiopharmaceuticalsHaywardCAUSAにおいて実施した。TreeseiのEGIの部位特異的変異生成TreeseiのEGIの238位、291位および323位のアミノ酸における部位特異的変異生成テンプレートとしてpIVEX2.4d-TrEGIを、部位特異的変異生成キットStratageneLaJollaCAUSAを用いて、表2に示されているプライマーを用いて製造者のプロトコルにしたがって、実施した。TreeseiのEGIの230位、113位115位、284~287位、および301~302位のアミノ酸を有している部位における部位特異的変異生成テンプレートとしてpIVEX2.4d-TrEGIを、OE-PCRを用いて実施した。第1のPCRの産物を、プラスミドテンプレートpIVEX2.4d-TrEGI、および変異生成を予定している位置のみにおいてEGIの標的配列と異なっている複数のプライマー表1を用いて生成した。ゲル精製に続いて、PCR断片をOE-PCR用のプライマーおよびテンプレートとして使用して、TreeseiのEGIの変異生成された遺伝子を構築した。すべてのPCR反応を、PfuDNAポリメラーゼStratageneを用いて実施した。OE-PCR用の最適条件は、以下の通りである:30秒間の98°Cにおける変性の1サイクル;10秒間の98°Cにおける変性、30秒間の60°Cにおけるアニーリング、40秒間の72°Cにおける伸長の30サイクル;および50分間の72°Cにおける最後の伸長。このOE-PCR産物を、ゲル精製し、それから、変異EGI遺伝子を有しているpIVEX2.4dプラスミドを構築するためのテンプレートプライマーとしてのpIVEX2.4d-TrEGIを有しているメガプライマーとして使用した。すべてのプライマーは、IDTIntegratedDNATechnologiesIncCoralvilleIAUSA;表2によって快く提供された。PCR産物の量および純度を、1.2のアガロースゲルにおいて分析した。すべてのキメラ遺伝子の配列決定を、ElimBiopharmaceuticalsHaywardCAUSAにおいて実施した。Treeseiの変異体EGI遺伝子のPCRTreeseiの変異体EGI遺伝子を含んでいる細胞の終夜の培養物1μLをPCR反応に使用して、無細胞EGI発現用のテンプレートを生成した。各反応混合物は、100μMのT7fwdプライマーおよびT7revプライマー、1×PCR緩衝液、2.5mMのdNTPおよび0.2ユニットのLATaqポリメラーゼからなり、20μLの最終の総体積を有していた。以下のプロトコルを使用した:5分間の95°Cにおける変性の1サイクル;20秒間の95°Cにおける変性、20秒間の55°Cにおけるアニーリング、1分間の72°Cにおける伸長;および5分間の72°Cにおける最後の伸長。実施例2-TreeseiのEGIの無細胞合成無細胞合成プラットフォームKimTetalBiotechnolBioengDOI101002bit228562010を、上述のように生成されたTreeseiのEGI変異体のタンパク質発現のために使用した。S30細胞抽出物の調製一部の改変をともなったPrattの手順PrattJMTranscriptionandtranslationApracticalapproach1791984にしたがって、Ecoli株BL21Star商標InvitrogenCarlsbadCAUSA、およびその誘導体株BL21Star商標pGro7から、細胞抽出物を調製した。GroEL/ESをコードしているシャペロンプラスミドpGro7を、TakaraBioTAKARABIOShigaJapanから購入した。3Lの2×YTPG培地22mMのNaH2PO4、40mMのNa2HPO4、および100mMのグルコースを補った2×YTにおいて、37°Cにおいて強制的な撹拌および曝気をともなって、細胞を培養した。pGroを有している細胞のために、0.05のL-アラビノースを培地に加え、細胞密度OD600が0.6に達したときにイソプロピルチオガラクトピラノシドIPTG、1mMを加えてT7RNAポリメラーゼの発現を誘導した。細胞を、対数期の中間部midlogphaseOD600=4.5において回収し、緩衝液A湿潤細胞のgごとに20mLにそれらを懸濁させることによって3回にわたって洗浄し、それから遠心分離した。緩衝液Aは、0.05v/vの2-メルカプトエタノール2-MEを含んでおり、10mMのTris-アセテート緩衝液pH8.2、14mMの酢酸マグネシウム、60mMのグルタミン酸カリウムおよび1mMのジチオスレイトールDTTを含有していた。ペレットを-80°Cに保存する前に、湿潤細胞のペレットの重さを計った。解凍した細胞10gを、12.7mLの緩衝液B2-MEなしの緩衝液Aに懸濁させ、20000psiの一定圧力においてFrenchcellpressThermoScientificWalthamMAUSAにおいて崩壊させた。それから、溶解物を、30000g、4°Cにおいて30分にわたって遠心分離し、ペレット画分から分離し、それから再び遠心分離した。最後の上清を100rpmにおいて振とうし、それから、プレインキュベーション溶液293.3mMのTris-アセテートpH8.2、2mMの酢酸マグネシウム、10.4mMのATP、200mMのクレアチンリン酸、4.4mMのDTT、0.04mMのアミノ酸、26.7μg/mLのクレアチンキナーゼを、10mLの上記上清に穏やかに加え、それから穏やかに振とうしながら80分にわたって37°Cにおいてインキュベートした。10000の分画分子量MWCOを有しているPiercemembraneSnakeSkin商標PleatedDialysisTubingRockfordILUSAを用いて、プレインキュベートしたサンプルを、4×45分にわたって、それぞれ緩衝液Bに対して4°Cにおいて透析した。保持されている抽出物を、4000g、4°Cにおいて10分にわたって遠心分離して、上清を得た。細胞抽出物の還元活性を消耗させるために、S30抽出物を、10mMの酸化グルタチオンとともに、2時間にわたって30°Cにおいてインキュベートした。残余のグルタチオン分子を、200倍体積の緩衝液CDTTおよび2-MEなしの緩衝液Aに対して、3時間にわたって4°Cにおいて処理された抽出物を透析することによって除去した。生じた抽出物を、少量の分取物に分け、無細胞タンパク質合成に用いるまで-80°Cに保存した。タンパク質合成無細胞タンパク質合成用の標準的な反応混合物は、15μLの総体積において以下の成分からなっていた:57mMのHepes-KOHpH7.5;1.2mMのATP;0.85mMずつのCTP、GTPおよびUTP;0.14mg/mLのEcoliの総tRNA混合物MRE600株由来;90mMのグルタミン酸カリウム;80mMの酢酸アンモニウム;12mMの酢酸マグネシウム;34μg/mLのL-5-ホルミル-5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸フォリン酸;2.0mMずつの20のすべてのアミノ酸;2のPEG8000;67mMのクレアチンリン酸CP;3.2μg/mLのクレアチンキナーゼCK;2.5mMの酸化グルタチオン;2.5mMの還元グルタチオン;150μg/mLのDsbC;16.7μg/mLのPCR産物;27v/vのS30-GroEL/ES細胞抽出物。無細胞反応を、2時間にわたって30°Cにおいて実施した。また、無細胞合成を用いて合成されたタンパク質量を決定するために、10μMのL-[U-14C]ロイシン11.3GBq/mmol、AmershamBiosciencesGEHealthcarePiscatawayNJUSAを無細胞反応に加えた。無細胞発現されたタンパク質の可溶性を分析するために、無細胞混合物を、15000rpm、4°Cにおいて10分にわたって遠心分離した。合成された可溶性タンパク質の量を、遠心分離の上清を分析することによって決定した。他の文献KimDMandChoiCYBiotechnolProg126456491996に記載されているように、液体シンチレーションカウンターTriCarb2810TRLiquidScintillationAnalyzerPerkinElmerIncWalthamMAUSAを用いたTCA-不溶性放射性活性から、無細胞合成された各セルラーゼの量を見積もった。TreeseiのEGIの無細胞発現にとっての酸化還元電位の最適化TrEGIはジスルフィド結合を有している。種々の酸化還元電位のもとにこの酵素を発現させることは、還元グルタチオンおよび酸化グルタチオンの量を変えることによって達成され、無細胞合成を実施することは、これらのジスルフィド結合を正確に形成させるために必要な酸化還元空間redoxspaceの調査になった。無脂肪合成における酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンの量は、以下の通りに変更された:酸化グルタチオン:還元グルタチオン-0:5、1:4、2:3、3:2、4:1および5:0mM。グルタチオンの総濃度は、無細胞合成反応において5mMに常に維持された。種々の酸化還元条件のもとに合成されたTrEGI酵素は、CMCプレートにスポットされた。プレートを50°Cにおいて終夜インキュベートし、コンゴレッドを用いて染色した。結果は、正確なジスルフィド結合形成によって構成されている活性な酵素が無細胞発現反応の酸化還元電位にかかわらず得られることを示している図2。実施例3-向上した熱安定性/活性を有しているTrEGI変異体のスクリーニングスクリーニングにおける最初のステップは、野生型TrEGIがその活性のすべてまたはほとんどを消失する条件を同定することであった。それから、これらの条件を、向上した熱安定性を有している変異体を同定するためのスクリーニング条件として使用した。TrEGI変異体にとってのスクリーニング条件の選択野生型TrEGIの熱安定性を測定するために、無細胞合成されたTrEGIの10μL20pmolを、100mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0と混合した。異なる長さの時間0、10、20、30、40、50、60分にわたって、種々の温度45、50、55、60、65、70°Cにおいて酵素混合物をインキュベートした後に、1.5v/vのCMCを、予熱処理した酵素混合物に加えて、1時間にわたって50°Cにおいて加水分解反応を開始させた。DNS法MillerGLAnalChem314264281959によって、還元糖の濃度を測定した。また、野生型TrEGIの熱安定性を、CMC-アガープレート上にスポットすることによって試験した。無細胞合成されたTrEGIの10μL20pmolを、2μLの1Mの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5と混合した。異なる長さの時間10、30、60分にわたって、53、55、57、60および65°Cにおいて酵素混合物をインキュベートした後に、2μLの酵素混合物をCMCプレートにスポットした。図3に示されている結果に基づいて、30分にわたる酵素の50°Cの予熱を、野生型の親TrEGIがこれらの条件においてその活性を消失したので、すべての変異体にとってのスクリーニング過程のために選択した。変異体TrEGI酵素のスクリーニングおよび選択のプロトコルは、図4および以下に示されている。TrEGI変異体を選択するためのスクリーニング処理変異体をEcoliに形質導入し、プレートに播いた。各部位部位Aを除くについて、配列空間の95の適用範囲に対応するコロニーをピックして、深底の96ウェルプレートにおいて終夜、培養した。次に、テンプレートとして終夜培養物を用いて96ウェルプレートにおいて、これらのコロニーのPCRを実施して、~300ng/μLの直鎖のTrEGI遺伝子の産物をもたらし、続いて無細胞発現のために使用した。無細胞発現された15μLのTrEGI変異体に、2μLの1Mの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.85を、約5までpHが下がるまで加えた。TrEGI変異体を、それから、30分にわたって50°Cに加熱し、その後にCMC-アガープレート1のCMC、1.5のアガー、50mMのアセテート緩衝液pH4.85にスポットし、50°Cにおいて終夜、オーブンにおいてインキュベートした。無細胞合成を用いて発現させた組換えTrEGIが30分にわたる50°Cにおけるインキュベーションによってすべての活性を消失する図3ので、無細胞発現された変異体TrEGI酵素を、CMCプレートにスポットする前に、30分にわたって50°Cにおいてインキュベートした。CMCプレートを、1のコンゴレッドを用いて5分にわたって翌日に染色した。親より高い熱安定性を有している変異体は、熱処理後に活性を保持しており、したがってコンゴレッドを用いて染色したCMCプレート上にハロ領域または消失領域を生じさせた。このため、プレートを、変異生成の次のラウンドにとっての親として使用され得る活性な酵素ヒットについて分析した。部位A~Gにおける変異生成は、組換えTrEGIに対して50°Cにおける向上した熱安定性を有している500未満の変異体を生成した図5;表3。実施例4-向上した熱安定性を有しているTrEGI変異体の性質決定スクリーニングによって同定された変異体を、TrEGI変異体ともなうインキュベーションによるCMC加水分解を測定することによって、向上した熱安定性について試験した。TreeseiのEGI変異体の活性/熱安定性の測定TrEGI変異体の活性/熱安定性を測定するために、無細胞合成された10μLの酵素20pmolを、100mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.85と混合した。異なる時間の長さ0、15、30、45、60分にわたる50°Cにおける酵素混合物のインキュベーション後に、1.1v/vのCMCを、予熱処理した酵素混合物に加えて、1時間にわたる50°Cにおける加水分解反応を開始させた。還元糖の濃度をmDNS法MillerGLAnalChem314264281959によって測定した。図6に示されている結果が表している通り、試験された変異体は、無細胞合成された野生型TrEGIと比べて、向上した活性を有していた。TrEGIの熱安定性に対する変異の影響は、CMCの添加前により長時間にわたって加熱されたサンプルにおいて特に著しい。TrEGIにおける変異された残基を、配列決定によって以下のように同定した:変異体F2、F3、H6およびF6は、G230E/V119M/Q93H変異によって構成されており、変異体F12はG230Q変異によって構成されており、変異体G1はG230K変異によって構成されており、変異体G8およびH3は、G230A変異によって構成されており、変異体G12は、G230X変異によって構成されており、変異体H1はG230S変異によって構成されている。図7は、アッセイ前に45分にわたる50°Cにおける熱処理ありaおよび熱処理なしbで試験したすべての変異体の結果を示している。示されている通り、変異体酵素の群は、野生型TrEGIより良好な熱安定性を有していた。TreeseiのEGIの部位EG230における変異30分にわたる50°Cにおけるインキュベーション後に保持された高い活性を示した70の変異体の配列決定によって、すべてではなく6つの変異体が部位E230位のアミノ酸、グリシンに変異を有していたことが明らかにされた。天然のグリシン残基の代わりの部位Eにおけるアラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、ロイシン、リジン、グルタミン酸、グルタミンおよびメチオニンの置換は、一部が図8に示されている向上した熱安定性を導いた。種々の長さの時間にわたる50°Cにおける熱処理の前後における、これらのいくつかの変異体の比活性を、図9にまとめている。上述したプロトコルを用いて、活性を測定した。最も安定な変異体G230Kは、1時間にわたる50°Cにおけるインキュベーション後に、これらの条件下にその活性を消失する親のTrEGIと比べて、約80の活性を保持していた。TreeseiのEGIの部位CD113、D115における変異さらに、部位C113、115位のアミノ酸における変異は、TrEGIのより熱安定性のバリアント熱処理によって保持された~80の活性を生じると示された。熱安定性のTrEGI変異体を生じる、この部位におけるアミノ酸置換は、D113S、D113L、D115TおよびD115Gであった。TreeseiのEGIの二重変異体D113L/D115TおよびD113S/D115Gは、図10に示されているように、50°Cにおける加熱処理のありおよびなしにおいて、活性である。TreeseiのEGIの部位EG230、および部位CD113、D115における変異複数の変異を有しているTrEGIバリアントの熱安定性表4を、上述したプロトコルのように試験した。酵素濃度は0.15~0.3μMであった。3つのアミノ酸における変異D113S、D115TおよびG230XX=K、A、S、R、E、MまたはTを有しているTrEGIバリアント表4は、野生型TrEGIと比べて向上した熱安定性を示した図1。また、三重変異体は、G230単一の変異体に対して向上した比活性を有していた。さらに、TrEGIバリアントG230T/D113S/D115Tは、30分にわたる53°Cにおける処理の後に活性を示した。D113L/D115Gの置換を有しているTrEGIの二重変異体、およびこれらの置換表4における変異番号10~18を含んでいるTrEGIの三重変異体は、50°Cにおいて実質的な活性を示さなかった。まとめると、実験結果は、TrichodermareeseiのエンドグルカナーゼIにある230位および/または113位および/または115位のアミノ酸残基における置換が酵素の熱安定性を向上させることを示している。この位置における異なるアミノ酸への変更は、50°C以上の温度において、親酵素と比べて非常に向上した熱安定性を有している変異体酵素を生じさせた。熱安定性のこの向上は、変異体酵素がより長時間にわたってより高い温度において活性を維持することを可能にし、これによって、産物への基質の全体的により高い変換を可能にした。実施例5-セルロース性基質に対するTreeseiのEGI変異体の活性また、異なるセルロース性基質に対するTrEGI変異体の影響を調べた図12および13。不溶性のセルロース性基質に対するエンドグルカナーゼ活性の測定不溶性基質についてのすべてのセルロース分解性アッセイを、1w/vの基質、100mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.85、0.15~0.3μMのセルラーゼを含んでいる70μLの終体積、96ウェルプレート、3つ1組、50、53または55°Cにおいて実施した。96ウェルプレートを、アルミホイルを用いて密封し、蒸発を最小化するための加熱された上部を有しているサーモサイクラーにおいてインキュベートした。セルラーゼ活性を、Avicel登録商標、および前処理されているイオン性の液体Avicel登録商標ILAvicel登録商標について測定した。混合物を、50、53または55°Cにおいて1時間にわたってインキュベートした後に、後述するグルコースのオキシダーゼ-ペルオキシダーゼアッセイを用いて放出された可溶性の還元糖の量を測定する前に、4°Cに冷却した。グルコースのオキシダーゼ-ペルオキシダーゼアッセイ基質としてのAmplexRedを用いたグルコースのオキシダーゼ-ペルオキシダーゼアッセイによって、放出された可溶性の糖の量を測定した。簡単に説明すると、加水分解反応から得られた上清の8μLを、1時間にわたって室温RTにおいて8μLのβ-グルコシダーゼ5mg/mLとともにインキュベートして、可溶性のセロビオースのすべてをグルコースに変換させた。それから、64μLのグルコースオキシダーゼ1.25U/mL、HRP1.25U/mLおよびAmplexRed60μMを含有している125mMのリン酸緩衝液pH7.45を加えること、および10分にわたってRTにおいてインキュベーションすることによって、放出されたグルコースの量を測定した。形成されるレゾルフィンの量は、存在するグルコースの量と一致している。レゾルフィンの蛍光を、530nmにおける励起および590nmにおける発光検出によって測定した。図12aおよびbに示されているように、G230におけるグルタミン酸、グルタミン、リジン、アラニンまたはセリンの置換を有している同定されたTrEGI変異体は、50°CにおけるAvicel登録商標およびILAvicel登録商標の加水分解において、野生型TrEGIと比べて向上した活性を有していた。同様に、D113S、D115T変異、およびG230におけるグルタミン酸、グルタミン、リジン、アラニンもしくはセリンの置換を有しているTrEGIの三重変異体は、50、53または55°CにおけるAvicel登録商標およびILAvicel登録商標の加水分解において、野生型TrEGIと比べて向上した活性を示した図12cおよびd。異なる変異体の活性における向上は、野生型TrEGIの活性を超えて約1.5~5倍の範囲であった。TrEGI変異体の活性の、異なるセルロース性基質に対する比較を図13に示している。試験した変異体は、野生型TrEGIに対して、基質の加水分解における向上した活性を有していた。G230に単一のアミノ酸置換を有しているTrEGI変異体との比較において、3つのアミノ酸G230、D113、D115に変異を有しているTrEGI変異体は2.5倍~の向上した活性を有していた図13bおよびc。実施例6-グリコシルヒドロラーゼファミリー7に由来する熱安定性変異体の酵素この実施例は、変異なしの野生型酵素に対してその熱安定性を向上させるための、グリコシルヒドロラーゼファミリー7の変異を目的としている。使用される種々の技術は上述されている。第1のステップは、酵素のポリペプチド配列を配列番号1の配列とアラインメントさせて、これによって配列番号1の230位、113位および115位のアミノ酸とアラインメントするアミノ酸残基を同定することである。第2のステップは、セリン、スレオニン、ロイシン、メチオニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニンまたはグリシンに、同定されたこれらのアミノ酸の1つ以上を変異させることである。変異された酵素をそれから発現させ、精製する。第3のステップは、変異された酵素の熱安定性を測定することである。変異された酵素を、異なる時間の長さ例えば、15~60分の間にわたって、ある温度例えば、50~70°Cの間においてインキュベートする。このインキュベーションの後に、変異体酵素のセルラーゼ活性を評価する。この評価は、種々のセルロース性基質を用いて実施され得る。酵素の野生型をこの評価におけるコントロールとして使用する。高温において最も活性な変異された酵素は、種々の産業用途例えば、生物燃料生産、食品加工、繊維製品の洗浄などに使用され得る。実施例7-Treeseiの熱安定性のEGI変異体この実施例では、異なるセルロース性基質におけるTrEGI変異体の熱安定性を試験した。ScerevisiaeにおけるTreeseiのEGIの発現ScerevisiaeにおけるTreeseiのEGIおよび改変された変異体の生成のために、C末端に対して6つのヒスチジン残基を加えた後に、pCu424ベクターLabbeSandThieleDJMethodsEnzymol1999306145153に遺伝子をクローニングした。酵素の分泌を可能にするために、改変されたα-因子AppS4シグナルペプチドRakestrawJAetalBiotechnolBioeng200910311921201を上記遺伝子のN末端に加えた。TreeseiのEGI遺伝子を含んでいるpCu424を、LiAc法GietzRDandSchiestlRHNatProtoc200723134を用いて、さらなるpmr1ノックアウトを有しているScerevisiae株YVH10RobinsonASetalBiotechnology199412381384にトランスフォームした。発現のために、飽和されているYPD培地の前培養物を使用して、1Lの選択培地SC-Trpに植菌し、3日にわたって30°Cにおいて培養した。培養物を、4000gにおいて5分にわたって沈降させ、25°Cにおける3日間の誘導のために、500μMのCuSO4を補ったYPD培地に懸濁させた。Niアフィニティークロマトグラフィーを用いて、EGIを培養上清から精製した。Scerevisiaeにおいて発現されたTreeseiのEGIのトリミンググリコシル化Scerevisiaeにおいて発現されたTreeseiの精製EGIの3~5mgを、pH7.0の25mMのリン酸緩衝液において200ユニットのPNGaseFNEBとともに、18時間にわたって30°Cにおいてインキュベートし、さらなる100ユニットのPNGaseFを加え、さらなる24時間にわたってインキュベートした。無細胞のTreeseiのEGIタンパク質の熱安定性G230部位およびD113D115部位に種々のアミノ酸置換を有しているTreeseiのEGI変異体は、Ecoli細胞抽出物酵素をグリコシル化する能力を有していないに基づく無細胞タンパク質合成を用いて発現されたときに、Avicel登録商標およびILAvicel登録商標に対する親酵素より熱安定性が高いとわかった。図14に示されているように、TreeseiのEGI変異体は、Avicel登録商標に対する50°Cにおける活性について、親酵素と比べて約2倍の向上を有している。図15に示されているように、TreeseiのEGI変異体は、ILAvicel登録商標に対する50°Cにおける活性について、親酵素と比べて約5倍の向上を有している。Scerevisiaeにおいて発現されたTreeseiのEGIの熱安定性TreeseiのEGIの熱安定性変異体を酵母Scerevisiaeにおいて発現させて、これらの酵素バリアントのグリコシル化の、それらの活性/安定性に対する影響を調べた。D113SD15T変異と組み合わせてG230部位に種々のアミノ酸A、E、R、L、TおよびSを有している、酵母において発現させたTreeseiのEGI変異体を、Ni-NTAクロマトグラフィーを用いて精製した。酵母における発現によるこれらの酵素の過剰なグリコシル化MW100~200kDaのために、PNGaseFを用いてN末端グリコシル化を切り取って、Treeseiにおいて発現された未処理の酵素と非常に近いグリコシル化レベルMW55~60kDaまでを有しているTrEGI酵素を得た。切り取り処理されたグリコシル化を有している改変されたこれらの酵素の活性測定によって、Avicel登録商標およびILAvicel登録商標に対する50°C~65°Cの温度における向上した活性が示された図16~18。最良の変異体G230AD113SDT変異は、Avicel登録商標に対する60°Cにおける活性について、親酵素と比べて約2倍の向上を示し、ILAvicel登録商標に対する65°Cにおける活性について、親酵素と比べて約2倍の向上を示した図18。図17は、G230AD113SDT変異がAvicel登録商標に対するT50の約4°Cの上昇を有していたことを示している。"