"細胞集団を作製するための方法であって、前記方法は以下の工程:a宿主細胞の集団を、前記宿主細胞の集団のサブセットのゲノムDNAへ組み込む、目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一つのコピーを含んでいる少なくとも1つのベクターを用いて形質転換して、それによって目的のタンパク質を産生できる宿主細胞の集団を生成し、前記宿主細胞の集団は、形質転換された宿主細胞および形質転換されていない宿主細胞を含み、かつ前記目的のタンパク質を産生できる前記宿主細胞の集団の前記生成は、個々の前駆細胞クローンのクローン選択を必要としない工程と;b前記宿主細胞の集団を維持して目的のタンパク質を産生する工程と;を包含する、方法。請求項1に記載の方法であって、さらに以下の工程:c工程aおよびbを少なくとも1回繰り返して、複数の細胞集団を生成し、各々の集団が、ポリクローナルタンパク質の組成物の種々の構成要素を産生できる、工程と;d工程a~cによって生成される前記複数の細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する工程と、を包含する、方法。前記宿主細胞の集団が、複数のベクターを用いて形質転換され、各々のベクターが、前記宿主細胞の集団のサブセットのゲノムDNAへ組み込む、目的の2つ以上のタンパク質をコードする核酸配列の異なるコピーを含んでおり、それによって目的の2つ以上のタンパク質を産生できる宿主細胞の集団を生成する、請求項1または2に記載の方法。目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一つのコピーを用いて形質転換された前記宿主細胞の集団のサブセットを選択する工程をさらに包含する、請求項1または2に記載の方法。目的の2つ以上のタンパク質をコードする核酸配列で形質転換された前記宿主細胞集団のサブセットを選択する工程をさらに包含する、請求項3に記載の方法。前記選択がネガティブ選択工程である、請求項4または5に記載の方法。前記選択がポジティブ選択工程である、請求項4または5に記載の方法。前記選択工程が、前記複数の細胞集団を混合する前に起こる、請求項4、6または7のいずれか1項に記載の方法。前記選択工程が、前記複数の細胞集団を混合した後に起こる、請求項4~7のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターが、レトロウイルスベクター、AAVベクター、およびリコンビナーゼまたはインテグラーゼによって認識可能な遺伝子エレメントを担持していないベクターからなる群より選択される、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターが、ベクターのライブラリーである、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターのライブラリーが、一緒になって単一の多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードする、請求項11に記載の方法。ポリクローナル細胞集団を産生するための方法であって、前記方法は、以下の工程:a1つ以上の宿主細胞を、レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質を用いて、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも1つのコピーを含む少なくとも1つのレトロウイルスベクターを用いて形質転換し、前記少なくとも1つのレトロウイルスベクターが前記レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質に結合されるか、またはそれによって結合され得、かつ前記形質転換が個々の細胞のクローン選択を必要としない、工程と;bポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;c工程a~bを少なくとも1回繰り返して、ポリクローナルタンパク質の組成物の異なる構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;d工程a~cによって生成される少なくとも2つの細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を産生する工程と、を包含する、方法。工程bで生成される前記細胞集団が、形質転換された宿主細胞および形質転換されていない宿主細胞を含む、請求項13に記載の方法。工程bの後に、形質転換された宿主細胞の細胞集団を選択することをさらに包含する、請求項13または14に記載の方法。前記選択工程が、個々の前駆細胞の選択も、単一の前駆細胞からの細胞株の産生も必要としない、請求項15に記載の方法。前記選択工程が、G418、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、およびゼオシンからなる群より選択される少なくとも1つの選択可能なマーカーを使用する、請求項15または16のいずれか1項に記載の方法。前記レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質が、パッケージング細胞株中の前記宿主細胞に提供されるインテグラーゼタンパク質、別のDNAベクター上にコードされる前記宿主細胞に提供されるインテグラーゼタンパク質、および組換えタンパク質として前記宿主細胞に提供されるインテグラーゼタンパク質からなる群より選択される、請求項13~17のいずれか1項に記載の方法。前記少なくとも1つのレトロウイルスベクターが、レトロウイルスベクターのライブラリーである、請求項13~18のいずれか1項に記載の方法。前記レトロウイルスベクターのライブラリーが、一緒になって単一の多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードする、請求項19に記載の方法。ポリクローナル細胞集団を産生するための方法であって、前記方法は以下の工程:a1つ以上の宿主細胞を、repタンパク質またはrep様タンパク質を用いて、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも1つのコピーを含んでいる少なくとも1つのベクターで形質転換し、前記repタンパク質またはrep様タンパク質が、核酸配列の宿主細胞ゲノムへの組み込みを媒介し、かつ前記形質転換が個々の細胞のクローン選択を必要としない工程と;bポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;c工程a~bを少なくとも1回繰り返して、ポリクローナルタンパク質の組成物の異なる構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;d工程a~cによって生成される少なくとも2つの細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する工程と、を包含する、方法。工程bで生成される前記細胞集団が、形質転換された宿主細胞および形質転換されていない宿主細胞を含む、請求項21に記載の方法。工程bの後に、形質転換された宿主細胞の細胞集団を選択する工程をさらに包含する、請求項21または22に記載の方法。前記選択工程が、個々の細胞の選択も単一の前駆細胞からの細胞株の産生も必要としない、請求項23に記載の方法。前記選択工程が、G418、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンおよびゼオシンからなる群より選択される少なくとも1つの選択マーカーを用いる、請求項23または24のいずれか1項に記載の方法。前記repタンパク質またはrep様タンパク質が、パッケージング細胞株中の前記宿主細胞に提供されるrepまたはrep様タンパク質、別のDNAベクター上にコードされる前記細胞に提供されるrepまたはrep様タンパク質、および組換えタンパク質として前記細胞に提供されるrepまたはrep様タンパク質からなる群より選択される、請求項21~25のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターが、一本鎖DNAウイルスベクターおよび二本鎖DNAベクターからなる群より選択される、請求項22~26のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスAAVベクターである、請求項22~26のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターが、ベクターのライブラリーである、請求項22~28のいずれか1項に記載の方法。前記ベクターのライブラリーが、一緒になって単一の多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードする、請求項28に記載の方法。前記単一の多量体タンパク質が、抗体およびT細胞レセプターTCRからなる群より選択される、請求項30に記載の方法。前記複数のポリペプチドが、一緒になって特定の抗原性エピトープを結合する、免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでいるポリペプチドおよび免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでいるポリペプチドを含んでなる、請求項12、20または30に記載の方法。前記複数のポリペプチドが、一緒になってT細胞レセプターTCRを形成する2つのポリペプチドを含んでなる、請求項12、20または30に記載の方法。前記一緒になってTCRを形成する2つのポリペプチドが、TCRのα鎖を含んでいるポリペプチド、およびTCRのβ鎖を含んでいるポリペプチドを含んでなる、請求項33に記載の方法。前記一緒になってTCRを形成する2つのポリペプチドが、TCRのγ鎖を含んでいるポリペプチド、およびTCRのδ鎖を含んでいるポリペプチドを含んでなる、請求項33に記載の方法。前記少なくとも1つのベクターが、一緒になって特定の抗原性エピトープを結合する、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の両方をコードする核酸を含む、請求項1、13または21に記載の方法。前記少なくとも1つのベクターが、ワクチンの構成要素をコードする、請求項1、13または21に記載の方法。工程dにおいて、工程cにおいて生成された細胞の大集団が混合されて、ポリクローナル細胞集団が生成される、請求項2、13または21に記載の方法。工程dにおいて生成される前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも一万個の細胞を含む、請求項2、13または21に記載の方法。工程dにおいて、生成される前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも10万個の細胞を含む、請求項2、13または21に記載の方法。工程dにおいて、生成されるポリクローナル細胞集団が、少なくとも100万個の細胞を含む、請求項2、13または21に記載の方法。工程dにおいて、生成されるポリクローナル細胞集団が、少なくとも一千万個の細胞を含む、請求項2、13または21に記載の方法。工程dにおいて、少なくとも2つの細胞集団が1:1の比で混合される、請求項2、13または21に記載の方法。工程dにおいて、少なくとも2つの細胞集団が1:1とは異なる比で混合される、請求項2、13または21に記載の方法。工程dにおいて生成されるポリクローナル細胞集団をバンキングすることをさらに包含する、請求項2、13または21に記載の方法。工程dの後、工程a~bによって生成される個々の細胞集団がバンキングされない、請求項2、13または21に記載の方法。工程dにおいて生成されるポリクローナル細胞集団からポリクローナルタンパク質組成物を精製することをさらに包含する、請求項2、13または21に記載の方法。工程aにおいて、宿主細胞が、前記少なくとも1つのベクターを用いて少なくとも2回形質転換される、請求項1、2、13または21に記載の方法。工程aにおいて、宿主細胞が、前記少なくとも1つのベクターを用いて少なくとも5回形質転換される、請求項1、2、13または21に記載の方法。前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも2つの細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項2、13または21に記載の方法。前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも5つの細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項2、13または21に記載の方法。前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも10個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項2、13または21に記載の方法。前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも15個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項2、13または21に記載の方法。前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも20個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項2、13または21に記載の方法。前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも25個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項2、13または21に記載の方法。前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも50個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項2、13または21に記載の方法。前記宿主細胞の集団が、少なくとも2つの異なるタンパク質を産生できる、請求項3に記載の方法。前記宿主細胞の集団が、少なくとも5つの異なるタンパク質を産生できる、請求項3に記載の方法.前記宿主細胞の集団が、少なくとも10個の異なるタンパク質を産生できる、請求項3に記載の方法。前記タンパク質が抗体である、請求項50~59のいずれか1項に記載の方法。前記タンパク質が、T細胞レセプターである、請求項50~59のいずれか1項に記載の方法。前記タンパク質が、ワクチン中で使用される、請求項50~59のいずれか1項に記載の方法。前記ポリクローナルタンパク質の組成物が、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群より選択される方法によって精製される、請求項47に記載の方法。前記ポリクローナルタンパク質の組成物の安定性が、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、パパイン消化に続く2-Dゲル分析、マイクロアレイ、qPCR、およびELISAアッセイからなる群より選択される方法によって決定される、請求項47に記載の方法。請求項1、2、3、13または21に記載の方法によって産生される、細胞集団。請求項47に記載の方法によって産生される、組換え抗体組成物。というわけで、治療剤として有用な改良された組換えポリクローナルタンパク質、および組換えポリクローナルタンパク質の安定な集団を産生するための方法が依然として必要とされている。本発明は、一部は、個々の前駆細胞クローンのクローン選択も、個々の細胞株の産生も必要としない、安定な細胞集団の産生のための方法の開発に基づく。本明細書に開示されるような、単一の組換えポリペプチドまたは複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団の安定性は、大集団の形質転換細胞を用いることによって達成される。驚くべきことに、開示された方法を用いれば、単一の組換えポリペプチドまたは複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団の安定性が達成され、それが経時的に、集団の特定の細胞へのバイアスなしに維持され得る。本明細書において開示されるとおり、形質転換された細胞の大集団の使用は、安定な細胞集団例えば、単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団または多数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団を調製および維持するための驚くべき利点を提供する。例示的な実施形態では、安定な細胞集団は、大型だが有限の集団の進化動態で概説されるような特定の数学的限界に従って生成される。単一の組換えポリペプチドを発現する安定な形質転換された細胞集団は、個々の形質転換細胞の大きい集団を生成するために、目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも1つのコピーを含んでいる少なくとも1つのベクターの宿主細胞の集団を、宿主細胞のゲノムDNAに形質転換し例えば、優先的組み込みによって、その宿主細胞の集団を維持することによって得てもよい。例示的な実施形態では、複数の組換えポリペプチドを発現する安定な形質転換細胞の集団は、個々の形質転換された細胞の大きい集団を最初に生成し例えば、優先的組み込みによって、次いで、多数の個々の細胞集団例えば、個々の細胞集団あたり、約100,000以上の細胞を混合することによって得てもよい。個々の形質転換された細胞の大集団を用いて、安定なポリクローナル細胞集団が生成されるので、開示された方法は、個々の細胞株をバンキングする必要はない。さらに、安定な細胞集団は、経時的に集団の特定の細胞に対するバイアスなしに、形質転換されていない細胞の存在下で維持され得る。結果として、開示された方法は、安定なクローンの選択を要する方法よりも迅速で、効果的で、かつ費用が少ない。細胞集団を産生するための開示された方法は、治療用の組換えタンパク質および治療用の組換えポリクローナルタンパク質組成物、例えば、組換えポリクローナルワクチン、組換えポリクローナル抗体組成物、および組換えポリクローナルT細胞レセプター組成物の大規模産生および製造のために用いられ得る。一つの態様では、本明細書に提供されるのは、細胞集団を産生するための方法である。この細胞集団は、モノクローナル細胞集団例えば、この細胞集団は、目的の単一のタンパク質を産生するであっても、またはポリクローナル細胞集団例えば、この細胞集団は、目的の複数のタンパク質、例えば、ポリクローナル抗体組成物を産生するであってもよい。この方法は、a宿主細胞の集団を、その宿主細胞の集団のサブセットのゲノムDNAへ組み込む、目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一つのコピーを含む少なくとも1つのベクターを用いて形質転換して、それによって目的のタンパク質を産生できる宿主細胞の集団を生成するという工程と、bこの宿主細胞の集団を維持して目的のタンパク質を産生するという工程とを包含する。宿主細胞のこの集団は、形質転換された宿主細胞と形質転換されていない宿主細胞の両方を包含してもよく、かつ細胞集団の生成および/または維持のための個々の前駆細胞クローンのクローン選択を必要としない。例示的な実施形態では、宿主細胞の集団は、宿主細胞ゲノムDNAへ優先的に組み込むベクターを用いて形質転換される。特定の実施形態では、この方法は、cの工程であって、工程aおよびbを少なくとも1回繰り返して複数の細胞集団を生成ここで各々の集団は、ポリクローナルタンパク質の組成物の種々の構成要素を産生できるする工程と;dの工程であって、工程a~cによって生成される上記複数の細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する工程と、をさらに包含してもよい。特定の実施形態では、この細胞集団は、上記宿主細胞の集団を、複数のベクターを用いて形質転換各々のベクターは、上記宿主細胞の集団のサブセットのゲノムDNAへ組み込む、目的の2つ以上のタンパク質をコードする核酸配列の異なるコピーを含んでおり、それによって目的の2つ以上のタンパク質を産生できる宿主細胞の集団が生成されるすることによって産生され得る。この実施形態では、ポリクローナル細胞集団および従ってポリクローナルタンパク質組成物は、複数の細胞集団を混合することなく得ることが可能ここで各々の細胞集団は、ポリクローナルタンパク質組成物の異なる構成要素を産生するである。いくつかの実施形態では、この細胞集団は、形質転換された宿主細胞と、形質転換されてない宿主細胞の両方を包含し得る。形質転換されてない宿主細胞が存在する場合、この開示された方法はさらに、この集団中で形質転換された細胞のサブセットを選択するための選択工程を包含し得る。この選択工程は、ネガティブ選択工程であっても、またはポジティブ選択工程であってもよい。例示的なネガティブ選択マーカーとしては、限定するものではないが、G418、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、およびゼオシンが挙げられる。例示的なポジティブ選択としては、培養培地に与えられない必須アミノ酸を作製できる酵素の使用が挙げられる。この選択工程は、上記複数の個々の細胞集団を混合する前に行われてもよい。あるいは、この選択工程は、上記複数の細胞集団を混合した後に行われてもよい。選択はまた、複数のベクターを用いて生成される細胞集団で、一回の形質転換で行われてもよい例えば、一回の形質転換における各々のベクターが、目的の2つ以上のタンパク質をコードする場合。開示される方法で用いられ得る例示的なベクターとしては、レトロウイルスベクター、AAVベクター、例としては、一本鎖DNAウイルスベクターであるAAVベクター、二本鎖DNAベクターであるAAVベクターおよび宿主細胞のゲノムへリコンビナーゼまたはインテグラーゼ媒介で挿入するための遺伝子エレメントを欠いている二本鎖DNAベクターが挙げられる。例示的な実施形態では、組換えのポリクローナル細胞集団は、レトロウイルスのインテグラーゼ、あるいは一本鎖DNAウイルス由来のrepタンパク質またはrep様タンパク質を用いて生成され得る。レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質またはウイルスのrepタンパク質例えば、アデノウイルスrepタンパク質の使用は、他の形質転換方法よりも利点がある。なぜなら各々が、宿主細胞ゲノムへの例えば、宿主細胞ゲノムDNAへの高効率組み込みおよび/または高効率の優先的組み込みを媒介し得るからである。レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質の場合、目的の核酸の複数のコピーを、高発現に関連する位置で宿主細胞ゲノムへ組み込んでもよい。repタンパク質の場合、ヒト細胞株を用いれば、目的の核酸の組み込みは典型的にはAAVS部位で生じる。例えば、ヒト細胞株、例えば、HEK293細胞を、繰り返し形質転換して、高レベルの発現が可能な、複数のAAVS部位に安定に組み込まれるDNAを含有する細胞株を得てもよい。さらに、宿主細胞をいずれかのベクターで繰り返し形質転換して、完全に形質転換されている細胞集団例えば、細胞の少なくとも98が、目的のDNAの少なくとも1つのコピーを担持するを生成してもよい。従って、レトロウイルスインテグラーゼ、あるいは一本鎖DNAウイルス由来のrepタンパク質の使用によって、個々の形質転換細胞の大集団が生成できる。一態様では、本発明は、ポリクローナル細胞集団を産生するための方法を提供する。この方法は、a1つ以上の宿主細胞を、レトロウイルスインテグラーゼタンパク質を用いて、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも1つのコピーを含む少なくとも1つのレトロウイルスベクターを用いて形質転換するという工程と;bポリクローナルタンパク質組成物の構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;c形質転換および生成の工程を少なくとも1回繰り返して、ポリクローナルタンパク質の組成物の異なる構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;d工程a~cによって生成される少なくとも2つの細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を産生する工程と、を包含する。形質転換工程工程aでは、少なくとも1つのレトロウイルスベクターが結合されるか、またはそれがレトロウイルスのインテグラーゼタンパク質によって結合されてもよい。さらに、1つ以上の宿主細胞の形質転換は、個々の前駆細胞クローンのクローン選択も、および/または細胞株の産生も必要としない。本明細書に開示されるとおり、宿主細胞のゲノムへのレトロウイルスベクターの組み込みは、組み込みの有効性を増強するインテグラーゼによって媒介される。レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質の使用によって、ほぼあらゆる細胞が少なくとも1つの組換え事象を有する、少数の細胞の形質転換が可能になる。例示的なインテグラーゼとしては、限定するものではないが、レンチウイルスを含むRNAウイルス由来のインテグラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリクローナルタンパク質組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも1つのコピーを含んでいる少なくとも1つのレトロウイルスベクターを用いた1つ以上の宿主細胞の形質転換は、この宿主細胞のゲノムへポリクローナルタンパク質組成物の構成要素をコードする核酸配列のコピーを組み込むことになる。いくつかの実施形態では、前記少なくとも1つのレトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターのライブラリーである。レトロウイルスベクターのライブラリーは、一緒になって多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードし得る。例示的な多量体タンパク質としては、抗体およびT細胞レセプターが挙げられる。他の実施形態では、このレトロウイルスベクターは、2つ以上のポリペプチドをコードする核酸を含んでもよい例えば、この核酸は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両方をコードしてもよく、またはこの核酸は、T細胞レセプターの両方の鎖をコードしてもよい。別の態様では、本発明は、形質転換工程のために一本鎖DNAウイルスベクターまたは二本鎖DNAベクターを用いる、ポリクローナル細胞集団を産生するための方法を提供する。この方法は、以下の工程:a1つ以上の宿主細胞を、repタンパク質またはrep様タンパク質を用いて、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも1つのコピーを含んでいる少なくとも1つのベクターで形質転換する工程と;bポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;c形質転換および生成の工程を少なくとも1回繰り返して、ポリクローナルタンパク質の組成物の異なる構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;d工程a~cによって生成される少なくとも2つの細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できる細胞のポリクローナル集団を生成する工程と、を包含する。この形質転換工程では、repまたはrep様タンパク質は、宿主細胞ゲノムへの核酸配列の組み込みを媒介する。さらに、1つ以上の宿主細胞の形質転換は、個々の前駆細胞クローンのクローン選択も、および/または細胞株の産生も必要としない。一本鎖DNAウイルスベクターまたは二本鎖DNAベクターは、アデノ随伴ウイルスAAVベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのベクターとは、一本鎖DNAウイルスベクターまたは二本鎖DNAベクターのライブラリー例えば、AAVベクターのライブラリーである。このベクターのライブラリーは、一緒になって多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードし得る。例示的な多量体タンパク質としては、抗体およびT細胞レセプターが挙げられる。他の実施形態では、一本鎖DNAウイルスベクターは、2つ以上のポリペプチドをコードする核酸を含んでもよい例えば、この核酸は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の両方をコードしてもよいし、またはこの核酸は、T細胞レセプターの両方の鎖をコードしてもよい。別の態様では、本明細書に提供されるのは、リコンビナーゼまたはインテグラーゼによって認識可能な遺伝子レメントなしで、形質転換工程のために、一本鎖RNA、一本鎖DNAまたは二本鎖DNAのベクター例えば、リコンビナーゼまたはインテグラーゼによって認識可能な遺伝子レメントを含まないベクター、例えば、優先的な組み込みに適切でないベクターを用いて、ポリクローナル細胞集団を生成するための方法である。例示的なベクターを図14に示す。この態様では、宿主細胞ゲノムDNAへの優先的な組み込みのための遺伝子エレメントがないので、この組み込みは、宿主細胞のゲノムDNAへランダムである。開示されたベクターを用いるランダムな組み込みによって、形質転換細胞の数が少なくなり、全体的な発現レベルが少なくなる場合があるが、安定な集団を得られる場合もある。安定な集団の生成は、予想されていなかった。なぜなら、ランダムな組み込みによって形質転換された細胞は一般には、不安定であると考えられているからである。前述の実施形態のいずれにおいても、1つ以上の宿主細胞を、同じウイルスベクターで、複数の反復的な形質導入を用いて形質転換してもよく、例えば、宿主細胞は、少なくとも1つのウイルスベクターを用いて、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の回数、形質転換される。宿主細胞集団に対する複数の反復的な形質転換の使用によって、宿主細胞ゲノムへ組み込まれたウイルスベクターの少なくとも1つのコピーを含む細胞の割合が増大し得る。前述の実施形態のいずれかでは、本明細書に開示のような組換え細胞集団は、少なくとも2つの異なる細胞集団ここで各々の細胞は異なる組換えタンパク質を産生できるを含んでもよい。例示的な実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20またはそれ以上細胞集団各々の細胞集団は、異なるタンパク質を産生するを含む。宿主細胞集団が、複数のベクターで形質転換された特定の実施形態では、宿主細胞の集団は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20またはそれ以上の異なるタンパク質を産生できる場合がある。この組換えタンパク質は、抗体であっても、T細胞レセプターであっても、またはワクチン中へ封入される因子であってもよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも2つの異なる細胞集団各々の細胞集団は、抗体を産生できるを含んでもよい。例示的な実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20またはそれ以上の細胞集団各々の細胞集団は、異なる抗体を産生するを含んでもよい。例示的なポリクローナル抗体組成物では、2つ以上の抗体が、同じ、同様もしくは異なる抗原性エピトープ、またはそれらの組み合わせに結合し得る。抗体が、異なる抗原性エピトープに結合する場合、このエピトープは、1つ以上の標的ポリペプチド上にあってもよい。いくつかの実施形態では、組換え抗体組成物中の1つ以上の抗体は、抗原結合フラグメントであってもよい。いくつかの実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも2つの異なる細胞集団ここで各々の細胞集団は、ワクチンに含まれるべき異なる組換えタンパク質を産生できるを含んでもよい。例示的な実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20またはそれ以上の細胞集団各々の細胞集団は、ワクチンへの封入のための異なる組換えタンパク質を産生するを含んでもよい。例えば、組換えタンパク質は、同じ病原体の1つ以上の感染因子、所定の感染因子の改変体例えば、変異体型、または異なる感染因子を模倣し得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞集団は、各々の細胞集団が、T細胞レセプターを産生できる、少なくとも2つの異なる細胞集団を含んでもよい。例示的な実施形態では、組換え細胞集団は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20またはそれ以上の細胞集団各々の細胞集団は、異なるT細胞レセプターを産生するを含んでもよい。T細胞レセプターは、主要組織適合性複合体分子に結合した、同じ、同様もしくは異なる抗原、またはそれらの組み合わせを認識し得る。ポリクローナルT細胞レセプター組成物は、α-βヘテロ二量体およびγ-δヘテロ二量体の組み合わせであってもよい。少なくとも2つの個々の細胞集団は、組換えポリクローナル細胞集団を生成するため、1:1の比、または1:1とは異なる比で混合され得る。例示的な実施形態では、この組換えポリクローナル細胞集団は、少なくとも100個の細胞、少なくとも1,000個の細胞、少なくとも10,000個の細胞、少なくとも100,000個の細胞、少なくとも百万個の細胞、少なくとも一千万個の細胞、少なくとも二千万個の細胞、またはそれ以上の細胞を含んでもよい。例示的な実施形態では、個々の細胞集団は、ポリクローナル細胞集団中に等しく存在する。組換え細胞集団は、将来の試験、スクリーニング、製造または使用例えば、治療用ポリクローナル抗体、ワクチン製造などを含むその他の使用のためにバンキングされてもよい。例示的な実施形態では、個々の細胞株は、組換えポリクローナル細胞集団の生成前にはバンキングされない。いくつかの実施形態では、この方法は、ポリクローナルタンパク質組成物をポリクローナル細胞集団から精製することを包含する。本発明のこれらならびに他の態様および利点は、以下の図面、詳細な説明および特許請求の範囲によって示される。本明細書において用いる場合、含んでいる、包含しているとは、限定のないことを意味し、言及される例は非限定的である。本明細書に開示されるのは、安定な細胞集団例えば、単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団、および複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団を産生するための方法、ならびに抗体、T細胞レセプターおよびワクチンのような組換えのポリクローナルタンパク質を産生するための方法である。この開示された方法によって、安定な細胞集団を産生するための公知の方法および/または組換えポリクローナルタンパク質を産生するための公知の方法を上回る有意な利点が得られる。なぜなら開示された方法は、クローン選択すなわち、個々の細胞クローン前駆細胞次に個々の細胞株として増殖されるを選択する選択マーカーの使用を必要としないからである。結果として、開示された方法は、個々の安定な細胞クローンの選択を要する方法よりも迅速かつ効果的である。本明細書に記載されるとおり、単一の組換えポリペプチドまたは複数の組換えポリペプチドのいずれかを発現する安定な細胞集団は、個々の形質転換された細胞の大集団から生成され得、これによって安定な細胞集団を調製し、かつ維持するための驚くべき利点が得られる。さらに、開示された方法を用いて生成される細胞集団は、経時的に集団中の特定の細胞に対するバイアスなしに維持され得ることは予想外であった。さらに、本開示の方法では、細胞の大集団を用いて安定な細胞集団本明細書では、組換えポリクローナル細胞集団またはポリクローナル細胞集団と呼ばれるを生成するので、個々の細胞株例えば、選択プロセスを用いて単一の前駆細胞から生成された個々のクローン細胞株のバンキングの必要はない。本明細書に記載される、組換え細胞集団例えば、単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団および複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団は、大型だが有限の集団の進化動態で概説されるように、特定の数学的限界内で挙動する例えば、進化的に安定な集団を維持するために、変異体が、進化的に適合が乏しい場合に、その基準を規定している初期モデルを記載している、M.Smith,1974J.Theor.Biol.47:209~221;Nash均衡を用いることによって、有限だが大型の集団が安定なままであり得ることを数学的に決定することが容易であったことを記述している、Crawford1990J.Theor.Biol.145:83-94;変異の逸脱が、集団サイズの増大とともに増大する特定の閾値を超える場合にのみ、ある集団を凌駕し得るということを示した、Nowakら2004Nature428:646~650およびLessard2005Theor.PopulationBiol.68:19-27を参照のこと。これらのモデルによれば、有限だが大きい類似のタイプの集団を混合した場合、ある限られた時間の長さにわたって安定なままであるという可能性が高い;しかしこの時間の長さは、十分に大きい集団の状況では本質的に無限であり得る。理論的に束縛されることは望まないが、安定な進化挙動のモデルが、大きい個々の形質転換細胞集団で開始することによって、組換え細胞集団例えば、単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団および複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団に適用され得る。ポリクローナル細胞集団に関しては、個々の細胞集団は、増殖およびタンパク質発現に関して同様のプロフィールを有する組換えポリクローナルタンパク質の発現への実際の適用に基づいて、関連付けてもよい。本明細書では、各々の構成要素の細胞集団の比は、細胞集団の混合物を得るために、所望されるとおりにすなわち各々が単一のタンパク質を発現し、全体として所望されるどのような比ででも複数のタンパク質の所定の安定な混合物を発現させるように調節可能であると、想定されている。例えば、組換えポリクローナル細胞集団が、組換えポリクローナル抗体を産生するための細胞集団である場合、単一の抗体を各々が産生する、個々の細胞集団の比は、ポリクローナル混合物中の個々の抗体の役割を考慮して、治療上有効なポリクローナル抗体集団を生成するように調節できる。開示される方法は、ポリクローナル細胞集団中のバランスを達成するように設計される。例えば、バランスは、抗体のような複数の構成要素タンパク質を作製する場合、および異なる抗体を含有する混合細胞集団中の両方で必要である。ポリクローナル細胞集団中のバランスは、安定な個々の細胞集団を生成することによって、次いで安定な個々の細胞集団を混合して、ポリクローナル細胞集団を得ることによって達成され得る。個々の細胞集団およびポリクローナル細胞集団の両方で安定性を達成するために、両方の集団の進化動態を考慮しなければならない。本明細書で開示されるように、同様の細胞の大集団が混合される場合、それらは、集団中での特定の細胞に対する経時的なバイアスなしに、限られた時間の長さにわたって安定なままである、という事実が驚くべきことに発見された;しかし、時間の長さは、十分に大きい集団の状況では本質的に無限であり得る。安定なポリクローナル細胞集団は、十分な数の個々の細胞を用いて細胞集団を生成する場合、本明細書に記載のように継続して生成されてもよい。本明細書では、10,000個を超える個々の細胞を有する細胞集団が混合される場合、合わせた細胞集団は、安定なポリクローナル細胞集団を生じて、限られた時間の間ポリクローナルタンパク質の生産プロセスにおいて、それは本質的に無限であるに、このようなポリクローナルタンパク質産物を生成する。例示的な実施形態では、本明細書に記載される安定な細胞集団は、目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも1つのコピーを含んでいる少なくとも1つのベクターの、宿主細胞ゲノムDNAへの優先的な組み込みを用いて、宿主細胞の集団を形質転換して、個々の形質転換された細胞の大集団を生成することによって得られる。優先的組み込みを用いる開示された方法を用いて、単一の組換えポリペプチドおよび複数の組換えポリペプチドを発現する細胞集団を生成してもよい。優先的組み込みのための例示的なベクターは、下に詳細に記載される。開示された方法のさらなる説明の前に、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。これらの定義は、当業者によって、開示の残りの部分と照合して読まれ、理解されるべきである。他に規定されない場合には、本明細書に用いられる全ての技術および化学的用語は、当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。細胞株という用語は、本明細書において用いる場合、単一の前駆細胞由来の細胞の集団を指す。当業者は、所定の細胞株中に含まれる細胞が単一の前駆細胞由来であるので、その細胞株中の細胞の各々は、少なくとも最初は、同じゲノム特徴を共有していることを理解するであろう例えば、Posteら、PNAS198178:6226~6230を参照のこと。細胞株は典型的には、個々の前駆細胞クローンを選択することによって例えば、選択マーカー、例えば、抗生物質選択マーカー、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、またはハイグロマイシンを用いて生成される。次いで、この個々の前駆細胞クローンを培養して、目的の遺伝子産物を産生できる細胞株を増殖する。細胞集団、細胞混合物、形質転換された細胞集団および組換え細胞集団という用語は、本明細書において用いる場合、共通の遺伝的背景を共有するが、遺伝子的に同一ではない細胞の集団を指す。単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団では、目的のDNAフラグメントは、複数の細胞に組み込まれここで各々の細胞における組み込み部位は、ゲノムの1つ以上の位置であってもよい、これによって遺伝子的に同一ではない集団の細胞が創出される。細胞集団とは、個々のタンパク質細胞由来ではなく、および/または同じゲノム内容物を有する細胞から構成されていないので、細胞株とは異なる。例えば、本明細書に記載される細胞集団では、単一の前駆細胞を特定するための選択プロセス、およびその後の単一の前駆細胞のクローン増殖はない。本明細書に記載される細胞集団は、むしろ細胞の混合物であり、この混合物中の各々の細胞は、ゲノム中の1つ以上の位置に組み込まれているDNAを有し得る。単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団の安定性は、個体群動態学によって達成される。例示的な実施形態では、本明細書に記載される細胞集団,細胞混合物または形質転換された細胞集団は、例えば、複数の組換えポリペプチドを発現するポリクローナルであってもよい。ポリクローナルの細胞集団では、目的の2つ以上のDNAフラグメントを、複数の細胞に組み込んでここで各々の細胞における組み込み部位は、ゲノム中の1つ以上の位置である、遺伝子的に同一ではない細胞を創出してもよい。本明細書に記載されるポリクローナル細胞集団は、2つ以上のモノクローナル細胞集団を混合することによって生成され得る。あるいは、ポリクローナル細胞集団は、バルクの質転換手順によって生成されてもよく、その場合、目的の複数のDNAフラグメントが、複数の宿主細胞に組み込まれる例えば、宿主細胞1つあたり目的のDNAフラグメントが1つ。本明細書に記載されるポリクローナル細胞集団は、個々の前駆細胞を特定するための選択プロセスも、その後の個々の細胞株のクローン増殖も必要としない例えば、ポリクローナル細胞集団は、各々が個々の前駆体細胞に由来する個々の細胞株の混合物ではない。ポリクローナル細胞集団の安定性は、個体群動態学によって達成される。本明細書に用いられる形質転換という用語は、外来DNAを細胞に導入するための任意の方法を指す。本明細書において用いる場合、形質転換とは、トランスフェクション、感染、形質導入またはドナー細胞とアクセプター細胞との融合を含めて、外来DNAを細胞に導入するための方法を包含する広義の用語である。ランダム組み込みという用語は、本明細書において用いる場合、目的のDNAフラグメント例えば、目的のタンパク質をコードする部分的または完全なDNAを細胞のゲノムに組み込むプロセスであって、このDNAのフラグメントが、そのゲノムの任意の一部に等しい確率で組み込まれ得るプロセスを指す。当業者は、ランダムな組み込みが、形質転換手順を指しており、宿主細胞ゲノム中の所定の位置へ発現構築物をガイドすることは一切行われないことを理解するであろう。例えば、特定の実施形態では、ランダムな組み込みとは、天然の組み込み部位に影響する外因的に追加された配列または酵素の補助なしに、宿主細胞の機構によって自然に行われる組み込みプロセスを指すH.Wurtetle,GeneTherapy,2003,10:1791~1799。本明細書において用いる場合、部位特異的組み込みという用語は、目的のDNAフラグメント例えば、目的のタンパク質をコードする部分的または完全なDNAを細胞のゲノムに組み込むプロセスであって、目的のDNAのフラグメントが、そのゲノム中の特定の配列に標的にされるプロセスを指す。この特定の標的配列は、ゲノム中に天然に存在してもよいし、または宿主細胞のゲノム中に遺伝子操作例えば、Flpリコンビナーゼ媒介性組み込みのために、細胞のゲノムへFRT部位を遺伝子操作されてもよい。部位特異的組み込みの例は、宿主細胞ゲノム中の特定の部位へ目的のDNAフラグメントを標的組み込みするためのFlpリコンビナーゼの使用である。組み込みの特異的な部位は、FRT部位として公知のDNA配列で生じる。FLPは、FRT部位に対して極めて特異的であるという点で、インテグラーゼの中でも例外である。FRT部位へのDNAの部位特異的な組み込みは、標的組み込みのためにDNAフラグメント中にFRT部位DNA配列を含むことによって達成し得る。しかし、FRT部位は、ほとんどのゲノムでは天然には存在しないので、典型的には、FRT部位は、目的のDNAフラグメントの導入前に目的の宿主細胞のゲノムに組み込まれなければならない。優先的組み込みpreferentialintegrationという用語は、本明細書において用いる場合、目的のDNAフラグメント例えば、目的のタンパク質をコードする部分的または完全なDNAを細胞のゲノムに組み込むプロセスを指し、この場合、DNAのフラグメントは、ゲノムの所定の領域を標的とするただし、単一の規定の部位、例えば、FRT部位は標的とされない。本明細書において用いる場合、優先的な組み込みは、ランダムな組換え事象ではない。なぜなら、目的のDNAは、宿主細胞ゲノム中の規定の領域または特異的な部位に組み込まれる可能性が増大しているからである。優先的な組み込みはまた、組み込み部位での変動があるので、部位特異的な組み込みとは異なる。優先的組み込みの例としては、AAVrepタンパク質単数または複数によるAAVシステムを用いる組み込みが挙げられる。AAVS1部位への安定な組み込みは、逆方向末端反復またはITR配列によって媒介され、各々のITR配列は、145塩基対を含む例えば、Bohenzkyら、1988Virology1662:316~27;Wang,XSら、1995J.Mol.Biol.2505:573~80;Weitzman,MDら、1994PNAS9113:5808~12。近年のデータでは、AAVベクターは、宿主細胞へ、そして染色体19上に位置するAAVS1部位のようなrep標的配列RTSへ、約10の効率で残りの90は、ヒトゲノムにまたがるタンパク質のRTS部位にまたがってひろがる、組み込むことが示唆されている例えば、SmithRH,GeneTherapy200815,817~822およびHueserら、PLoSPathog67:e1000985.doi:10.1371/journal.ppat.1000985に記載のとおり。優先的組み込みの他の例としては、レトロウイルスベクター系の使用ここでレトロウイルスベクターは、総ゲノムの約5を包含する開口クロマチンドメインへ組み込まれる;attP部位とattB部位との間で組換えを行う、ファージインテグラーゼΦC31またはλインテグラーゼの使用A.C.Grothら、PNAS,2000,97:59995~6000;ならびにCreリコンビナーゼおよび種々のlox部位、例えば、バクテリオファージP1由来のloxPまたはそれらの改変体もしくは変異体、例えば、lox43、lox44、lox66、lox71、lox75、lox76、およびlox511C.GormanおよびC.Bullock,Curr.OpinioninBiotechnology2000:11:455~460の使用が挙げられる。優先的組み込みにおける相違はまた、特定のレトロウイルスのインテグラーゼで観察され得、例えば、HIVは好ましくは、発現された遺伝子中でリッチな染色体領域に組み込まれ、MMLVは好ましくは、転写開始部位付近に組み込まれ、そしてASLVは、活性な遺伝子について弱い優先度ただし、転写開始領域に関する優先度はないで組み込まれるMitchellら、PLoSBiol,2004,2:e234。I.発現ベクター本発明の発現ベクターは、目的の少なくとも1つのポリペプチドをコードするように構築される。本明細書において用いる場合、目的のポリペプチドおよび目的のタンパク質という用語は、目的の核酸または遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。本明細書において開示された方法は、組換えのポリクローナル細胞集団によって発現され得るポリペプチドまたはタンパク質の種類によって限定されないと想定されている。目的の例示的なタンパク質としては、抗体免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含むまたはそのフラグメント、T細胞レセプター分子、およびワクチンのタンパク質成分が挙げられる。本明細書において用いる場合、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素という用語は、ポリクローナルタンパク質の組成物中に含まれるタンパク質を指す。このタンパク質は、単一のポリペプチドを含んでもよいし、または2つ以上のポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質であってもよい。例示的な多量体タンパク質としては、抗体およびT細胞レセプターが挙げられる。例えば、インタクトな四量体抗体は、特定の標的ポリペプチドに一緒に結合する、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖と呼ばれる、2つの異なるポリペプチド配列から産生される。T細胞レセプターTCRは、2つのポリペプチド鎖を含んでいるヘテロ二量体タンパク質である例えば、このヘテロ二量体は、αおよびβのポリペプチド鎖またはγおよびδのポリペプチド鎖を含んでもよい。ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素が単一のポリペプチドを含む場合、このタンパク質の構成要素は、単一の発現ベクターによってコードされてもよい。例えば、この発現ベクターは、目的の単一のポリペプチドをコードする核酸配列の少なくとも1つのコピーを含んでもよい。単一の発現ベクターが2つ以上のポリペプチドをコードする核酸を含んでもよいということも想定されている。例えば、単一の発現ベクターは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の配列の両方をコードする核酸配列、またはTCRの両方のポリペプチド鎖をコードする核酸配列のうちの少なくとも1つのコピーを含んでもよい。発現ベクターが、目的の2つ以上の核酸を含む場合例えば、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の両方、またはTCRの両方の鎖、目的の核酸は、ポリシストロン性配列でベクター中に配列されてもよく、必要に応じて、配列内リボソーム進入部位IRESによって隔てられてもよい。あるいは、目的の各々の核酸は、個々の調節性エレメント例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー配列の制御下でベクター中に配列されてもよい。いくつかの実施形態では、目的の各々の核酸は、ベクター中に同じ方向で、ただし個々の調節性エレメントの制御下で配列されてもよい。他の実施形態では、目的の各々の核酸は、ベクター中に反対方向で配列されてもよい。あるいは、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素は、2つ以上の発現ベクターによってコードされてもよい。例えば、ポリクローナル組成物の構成要素が多量体タンパク質である場合、2つ以上のポリペプチドが少なくとも2つの異なる発現ベクター上にコードされてもよく例えば、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、別々のベクター上にコードされる。従って、多量体タンパク質の個々のポリペプチド鎖が2つ以上のベクターに含まれる場合、当業者は、両方のベクターとも、同じ宿主細胞中に形質転換されて、多量体タンパク質を生成することを理解するであろう。例示的な実施形態では、一緒になって単一の多量体タンパク質例えば、抗体またはTCRを形成する複数のポリペプチドをコードするために、ベクターのライブラリーを用いてもよい。例えば、ベクターのライブラリーは、各々のベクターが1つ以上のポリペプチドをコードする核酸を含む、複数のベクターを含んでもよい。当業者は、ベクターのライブラリーが、単一の宿主細胞中にトランスフェクトされて、多量体タンパク質を生成し得ることを理解するであろう。例示的な発現ベクターとしては、宿主細胞ゲノムへ組み込み得るウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターおよび一本鎖DNAウイルスベクター例えば、アデノウイルスベクターが挙げられる。例示的なレトロウイルスベクターレトロベクターとしても公知は、レトロウイルス類、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスMoMuLVおよびラウス肉腫ウイルスRSV、およびレンチウイルス類宿主細胞のゲノムへ組み込み得る由来であり得る。レトロウイルス類は、細胞へDNAフラグメントを導入し、かつそれらをウイルスのコードするインテグラーゼ酵素の活性を通じてゲノムに組み込み得る。インテグラーゼ媒介性のプロウイルス組み込みは、ランダム組み込みまたはリコンビナーゼベースの方法と比較してはるかに効率的である。レトロウイルス組み込みは、開口クロマチンの領域で優先的に生じ、これは他の方法と比較して低率の発現サイレンシングをもたらす。レトロウイルス組み込みは、ゲノムを通じて単一部位で生じても、複数部位で生じてもよく、コピー数は、複数回の形質導入またはより多数の感染を通じて増大され得る下に詳細に考察。種々のレトロウイルスベクターが当該分野で周知である。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、複製欠損例えば、ウイルス複製の必須遺伝子、例えば、ウイルス粒子の構造、レプリカトリーreplicatoryおよびDNA修飾タンパク質をコードする遺伝子が欠失されるか、または無効にされるであってもよい。当業者は、このような遺伝子の欠失が、目的のDNAの挿入のためにベクター中でスペースを提供し得ることを理解する例えば、8~10kbのDNAフラグメント。このウイルス粒子構造、レプリカトリーreplicatoryおよびDNA修復タンパク質は、ウィルス粒子のタンパク質をコードする核酸の一過性の同時トランスフェクションを通じて例えば、インテグラーゼタンパク質は、別のDNAベクター上にコードされる、または組換えタンパク質として、ウイルスパッケージングの間に、パッケージング細胞株中にトランスで提供される。この方法を用いれば、高いウイルス力価を達成することが可能である。この方法でパッケージングされたレトロウイルスを用いて細胞集団を繰り返し感染することによって、複数のゲノム挿入が達成され得、これによって、目的の組換えタンパク質の安定かつ高レベルの発現がもたらされる。これは、プラスミドコードcDNAの多数のコピーのトランスフェクションおよび組み込みを通じて、または遺伝子増幅方法を通じて生み出される細胞株の特徴である不安定性とは対照的である。一般には、レトロウイルスベクターは、長末端反復longterminalrepeatまたはLTR配列すなわち、5’および3’のLTRに隣接される目的の2つ以上の遺伝子を含む。本発明のレトロウイルスベクターは、特定のLTRに限定されないと想定されている。例示的なLTRとしては、限定するものではないが、MoMLV、MoMuSV、MMTV、HIVおよびウマ伝染性貧血LTRが挙げられる。LTRは、ウイルスのゲノムRNAの会合に必要な配列、逆転写酵素およびインテグラーゼ機能、ならびにウイルス粒子にパッケージングされるべきゲノムRNAの発現の指向に関与する配列を含み得る。例示的なレトロウイルスベクターは、参照によって本明細書に援用される米国特許第6,852,510号、および同第7,378,273号に開示される。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、G糖タンパク質を含んでいる偽型レトロウイルスベクターであってもよい例えば、このG糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス、ピリーPiryウイルス、チャンディプラChandipuraウイルス、コイ春季ウイルス血症ウイルス、およびモコラウイルスのG糖タンパク質からなる群より選択され得る。他のウイルスベクターおよび形質導入方法もまた記載されており、これには、レンチウイルス系例えば、ヒト免疫不全ウイルス1および2HIV-1およびHIV-2、シミアン免疫不全ウイルスSIV、猫免疫不全ウイルスFIV、ウマ伝染性貧血ウイルスEIAV、ヤギ関節炎脳炎ウイルスCAEV、ビスナウイルス、およびジェンブラナ病ウイルスJDVが挙げられる。レンチウイルスベクターおよび系は、非分裂性の、最終的に分化された細胞に感染する能力、およびインテグラーゼベースの機構を通じてゲノムへ挿入する能力の故に興味深い。HIVベースの系は、ヒト臨床産物の産生および遺伝子療法適用に関していくつかの安全性の懸念を提起するが、多数の関連の動物ウイルスが、これらの目的で開発されている例えば、Olsen,J.C.1998GeneTherapy5:1481~1487を参照のこと。追加的に、イントロンのような、レトロウイルスビリオンでは通常見出されないさらなるエレメントを、当該分野で公知の方法を用いて組み込んでもよいBloら、DNACellBiol.2007,26:773~9。あるいは、レトロウイルスエレメントは、DNAプラスミドでウイルス粒子を創出することなく用いられ得る。これらのDNAプラスミドは、AAVITR配列がレトロウイルスLTRで置換されており、repタンパク質がレトロウイルスインテグラーゼで置換されていること以外は、上記のようにAAVの二本鎖DNAプラスミドについて記載されたのと概念的に同様である。あるいは、一本鎖DNAウイルス類を用いて、目的の核酸を宿主細胞ゲノムに組み込んでもよい。一本鎖DNAウイルス類としては、限定するものではないが、DNAウイルスのボルティモア分類システムで第II群または第VII群に分類されるウイルスが挙げられる。第II群のウイルスの例としては、アデノ随伴ウイルスAAVおよびパルボウイルスが挙げられ、第VII群のウイルスの例としてはB型肝炎ウイルスが挙げられる。例示的な一本鎖DNAウイルスは、アデノ随伴ウイルスAAVであり、これは、分裂している細胞および非分裂細胞の両方に感染可能であり、かつAAVS1と命名される、特定の部位ヒト第19染色体において、時間のほぼ10、残りの90はヒトゲノムにまたがる他のRTS部位に広がっているで、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれる能力を有しているHueserら、PLoSPathog67:el000985.doi:10.1371/journal.ppat.1000985。AAVS1部位への安定な組み込みは、逆方向末端反復invertedterminalrepeatすなわちITR配列によって媒介され、各々のITR配列は、145塩基対を含む例えば、Bohenzkyら,1988Virology1662:316~27;Wang,XSら,1995J.Mol.Biol.2505:573~80;Weitzman,MDら,1994PNAS9113:5808~12を参照のこと。AAVのITR領域のヌクレオチド配列は、当該分野で周知である例えば、Kotin1994HumanGeneTherapy5:793-801。例示的なAAVITR配列は、野性型核酸配列であってもよく、あるいは、1つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよい。AAVITR配列は、限定するものではないが、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7を含む任意のAAV血清型由来であってもよい。一般には、5’および3’のITR配列は、目的の選択された核酸に隣接するが、当業者は、5’および3’のITR配列が、同じAAV血清型由来であっても、または異なるAAV血清型由来であってもよいことを理解するであろう。例示的なAAVベクターが当該分野で周知であり、これには限定するものではないが、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7が挙げられる例えば、米国特許第6、852、510号を参照のこと。AAVのrepタンパク質はまた、AAVゲノムのAAVS1特異的な組み込みに必須であることが示された。repタンパク質は、シスですなわち、ITR配列に隣接する目的の核酸と同じベクター上に提供されてもよく、または、限定するものではないが、組換えタンパク質として、またはエピソームベクターを含む別のDNAベクターのいずれかとしてトランスで提供されてもよい例えば、Weitzman,MDら、上記;ZhouMuzyczka1998J.Virol.724:3241~7を参照のこと。レトロウイルス類と同様に、AAVベクターのクローニング能力は、ウイルス遺伝子の置換から生じる。AAVベクターのクローニング能力は限られている4.8キロベースkbが、挿入スペースは、ポリペプチドの発現に十分であり例えば、免疫グロブリン軽鎖は、約670塩基対のcDNAによってコードされ、免疫グロブリン重鎖は、約1.2kbのcDNAによってコードされる、種々の調節性および発現エレメントの挿入用に約3.0kbを提供する。いくつかの実施形態では、AAVベクターは、ヘッド-ツー-テールhead-to-tailコンカテマーこれはベクターのクローニング能力を倍化し得るを形成するように配置された例えば、アニーリングされた2つ以上のゲノム由来のITR配列を含むように設計され得る。特定の実施形態では、AAVまたはレトロウイルスベクターからビリオンを生成しなければならないことによって具体化されるサイズ限界は、AAVbのITR、またはレトロウイルスベクターのLTRを担持する二本鎖プラスミドDNAベクターを創出し、インテグラーゼを提供することによって回避され得るが、この場合、AAVrepタンパク質またはレトロウイルスインテグラーゼは、DNAベクター上またはタンパク質としてのいずれかで、トランスである。例えば、図15に示されるベクターマップは、このようなITR二本鎖DNAベクターの1つを示し、図17に示されるベクターマップは、rep発現プラスミドを示す。目的の1つ以上の遺伝子例えば、目的のタンパク質をコードするDNA分子を含有するベクター例えば、レトロベクターまたはAAVベクターを生成するために、公的に利用可能な、または以前に決定された配列情報を用いて化学的に合成してもよい。合成DNA分子を、定常領域コード配列および発現制御配列などの他の適切なヌクレオチド配列に連結して、所望のタンパク質をコードする従来の遺伝子発現構築物を生成してもよい。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質が抗体である場合、抗体配列は、B細胞、例えば、形質細胞、またはハイブリドーマから、従来のハイブリダイゼーション技術またはポリメラーゼ連鎖反応PCR技術によって、合成核酸プローブその配列は本明細書に提供される配列情報に基づく、またはB細胞もしくはハイブリドーマ細胞における抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に関する先行技術の配列情報を用いて、クローニングしてもよい。規定の遺伝子構築物の産生は、当該分野の慣用的な技術に含まれる。所望の抗体をコードする核酸は、例えば、レトロウイルスベクターの5’と3’LTR配列の間、またはAAVベクターの5’と3’ITR配列の間で発現ベクターに組み込まれてもよい連結されてもよい。このベクターはまた、目的の遺伝子、例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー配列、スプライシングシグナルなどの効率的な発現に必要な配列、および感染性ビリオンへウイルスRNAを効率的にパッケージングするのに必要な配列を含んでもよい例えば、パッケージングシグナルPsi、tRNAプライマー結合部位-PBS、逆転写に必要な3’調節性配列PBS。目的の1つ以上の遺伝子は、プロモーターおよび/またはエンハンサーのような調節性エレメントに作動可能に連結され得る。本発明は、特定のプロモーターに限定されないものと想定されている。目的の遺伝子を発現するための適切なプロモーターとしては、限定するものではないが、EF1αプロモーター、CMVプロモーター、β-アクチンプロモーター、FerLプロモーター、複合compositeプロモーター、例えば、CMVEF-1αの組み合わせ、SV40エンハンサー、基本プロモーターおよび三分節リーダー複合プロモーター、RSVLTR、およびモロニーマウス白血病ウイルスの長末端反復配列が挙げられる。目的の1つ以上の遺伝子を発現するための適切なエンハンサーとしては、SV40およびCMVエンハンサーが挙げられる。ベクターとしてはまた、イントロンに関連するスプライシング配列が挙げられ、このようなイントロンの例は、βグロビンイントロン1、EF-1αイントロン1およびβアクチンイントロン1、および/または1つ以上のポリA配列、例えば、早期および後期SV40ポリA、ウシ成長ホルモンポリA、ヒト成長ホルモンポリA、EF-1αポリAおよびチミジンキナーゼポリAである。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質の分泌が所望される場合、そのベクターは、シグナルペプチド配列を含むように改変されてもよい。一般には、シグナルペプチド配列は、約15~30個の疎水性アミノ酸残基を含んでもよい。例えば、Zwizinskiら,1980J.Biol.Chem.25516:7973-77,Grayら、Gene392:247-54[1985]、およびMartialら,1979Science205:602~607を参照のこと。シグナルペプチド配列は、当該分野で公知であり、これには、限定するものではないが、ヒト成長ホルモン、ラクトフェリン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、血清アルブミンα-カゼイン、分泌アルカリホスファターゼ、抗体κ、λまたは重鎖の生殖系列、およびα-ラクトアルブミン由来のシグナルペプチド配列を挙げることができる。このベクターとしてはまた、ポリシストロン性mRNAの翻訳の内部開始により、例えば、第二の遺伝子に由来する発現産物の産生を可能にするため、ポリシストロン遺伝子の間に位置する、追加の配列内リボソーム進入部位internalribosomeentrysiteすなわちIRES配列を含んでもよい。IRES配列を組み込んでいるベクターは当該分野で公知である。このベクターとしてはまた、タンパク質生成物の酵素的切断により、例えば、第二の遺伝子に由来する発現産物の産生を可能にするため、ポリシストロン遺伝子の間に位置する、追加的な2/フリン配列を含んでもよい。2A/フリン配列を組み込んでいるベクターは当該分野で公知であるJostockら、ApplMicrobiolBiotechnol201087:1517~1524。このベクターはまた、目的の遺伝子に対して5’または3’のいずれかでRNAエクスポートエレメントを含むように改変され得る例えば、米国特許第5,914,267号;同第6,136,597号;および同第5,686,120号;ならびにWO99/14310を参照のこと。RNAエクスポートエレメントの封入によって、目的のタンパク質をコードする核酸配列にスプライスシグナルもイントロンも組み込むことなく、目的のタンパク質の高い発現が生じ得る。例示的な実施形態では、本発明のベクターは、形質転換された細胞の選択を提供する選択マーカーを含まない。上記で考察されたとおり、一般には、レトロウイルスベクターは、以下の構造を有し得る:LTR-XXXXX-LTRここで、LTR配列が隣接するXXXXXは、プロモーター、リーダー配列、目的のタンパク質をコードする核酸配列例えば、軽鎖配列および/または重鎖配列またはT細胞レセプター配列、および/またはポリA配列のようなエレメントの組み合わせであってもよい。他の調節性エレメントが必要に応じて含まれてもよい。例示的な実施形態では、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の両方を含んでいるレトロウイルスベクターは、以下の構造を有してもよい:LTR-X-軽鎖のプロモーター-κリーダー配列-免疫グロブリン軽鎖配列-軽鎖のポリA配列-重鎖のエンハンサー-重鎖のプロモーター-重鎖リーダー配列-免疫グロブリン重鎖可変配列-重鎖定常領域配列CH-重鎖のポリA配列-X-LTR。この構造を有しているレトロウイルスベクターは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列の両方を同じ方向に含む。このレトロウイルスベクターの例示的なプロモーターとしては、CMVエンハンサーおよび/またはSV40エンハンサーを先行して有するEF1αプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、調節性エレメントの組み合わせ、例えば、CMVエンハンサーを軽鎖配列の前に有するヒトEF-1αプロモーター、および重鎖配列の前にSV40エンハンサーを有するラットまたはマウスのEF-1αプロモーターの組み合わせが挙げられる。特定の実施形態では、調節性エレメントの組み合わせ、例えば、1つの核酸の発現を駆動するヒトEF-1αプロモーター、および第二の核酸の発現を駆動するラットまたはマウスのEF-1αプロモーターの組み合わせは、レトロウイルスベクター構築物の安定性を増強し得る。別の実施形態では、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の両方を含んでいるレトロウイルスベクターは、以下の配列を有し得る:LTR-X-軽鎖のポリA-軽鎖配列-κリーダー配列-軽鎖のプロモーター-エンハンサー配列-重鎖のプロモーター-重鎖リーダー配列-免疫グロブリン重鎖可変配列-重鎖定常領域配列CH-重鎖のポリA配列-X-LTR。この構造を有しているレトロウイルスベクターは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列の両方を反対方向に含む。このベクターの例示的なプロモーターとしては、CMVエンハンサーおよび/またはSV40エンハンサーをそのプロモーターに先行して有するEF-1αプロモーター、またはそれらの調節性エレメントの組み合わせが挙げられる。別の例示的な実施形態では、免疫グロブリン軽鎖のみを含んでいるレトロウイルスベクターは以下の構造を有し得る:LTR-X-軽鎖のプロモーター-κリーダー配列-免疫グロブリン軽鎖配列-軽鎖のポリA配列-X-LTR。レトロウイルスベクターの例示的なプロモーターとしては、CMVエンハンサーおよび/またはSV40エンハンサーを先行して有するEF-1αプロモーター、またはそれらの調節性エレメントの組み合わせが挙げられる。別の例示的な実施形態では、免疫グロブリン重鎖のみを含んでいるレトロウイルスベクターは以下の構造を有し得る:LTR-X-重鎖のプロモーター-重鎖リーダー配列-免疫グロブリン重鎖可変配列-重鎖定常領域配列CH-重鎖のポリA配列-X-LTR。レトロウイルスベクターの例示的なプロモーターとしては、CMVエンハンサーおよび/またはSV40エンハンサーを先行して有するEF-1αプロモーター、または調節性エレメントの組み合わせが挙げられる。例示的なAAVベクターは、隣接するLTR配列が隣接するITR配列によって置き換えられていることを除いて、上記の構造と類似の構造を有し得る。図14は、pExcelとして本明細書に言及される例示的な抗体発現ベクターの略図を示す。このpExcelベクターは、本明細書に記載されるように、抗体発現カセットの一過性発現または組み込みのために免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両方を発現して、ポリクローナル細胞集団を生成するために用いられ得る。重鎖および軽鎖の両方の免疫グロブリン発現のためのpExcelベクターは以下のエレメントを含む:ColE1ori=細菌複製起点;CMV=CMVエンハンサー;hFerL=耐性遺伝子の発現を駆動する、hFerL真核生物コアプロモーター;EM7=耐性遺伝子の発現を駆動する、細菌プロモーター;Neo/Kan:Neomycin真核生物/Kanamycin原核生物耐性遺伝子;BグロビンpA=βグロビンポリアデニル化配列;hEF1α=ヒトEF1αプロモーター;重鎖リーダーHeavyLeader=例えば、VhX由来のリーダー;軽鎖リーダーLightLeader=例えば、kX由来のリーダー;可変重鎖=制限部位に隣接する、目的の抗体の重鎖の可変領域;hIG1定常重鎖=ヒトIgG1定常領域のcDNA;SV40pA=SV40ポリアデニル化配列;BGHpA=BGHポリアデニル化配列;軽鎖LightChain=制限部位に隣接する、目的のλ抗体またはκ抗体のいずれかの可変領域および定常領域;およびrEF1α=ラットEF1αプロモーターイントロンおよびエキソンは、EF1αプロモーターおよびリーダーについてアノテーションされている。図15は、以下のエレメントを含んでいるポリクローナル細胞集団への抗体発現カセットの一過性発現または組み込みのための、pEXCEL/ITRと本明細書で呼ばれる例示的な抗体発現ベクターの略図を示す:左ITRおよび右ITR=AAV2由来の逆末端反復InvertedTerminalRepeat配列;ColE1ori=細菌複製起点;CMV=CMVエンハンサー;hFerL=耐性遺伝子の発現を駆動する、hFerL真核生物コアプロモーター;EM7=耐性遺伝子の発現を駆動する、細菌プロモーター;Neo/Kan:Neomycin真核生物/Kanamycin原核生物耐性遺伝子;BグロビンpA=βグロビンポリアデニル化配列;hEF1α=ヒトEF1αプロモーター;重鎖リーダーHeavyLeader=例えば、VhX由来のリーダー;軽鎖リーダーLightLeader=例えば、kX由来のリーダー;可変重鎖=制限部位に隣接する、目的の抗体の重鎖の可変領域;hIG1定常重鎖ConstantHeavy=ヒトIgG1定常領域のcDNA;BGHpA=BGHポリアデニル化配列SV40pA=SV40ポリアデニル化配列;軽鎖LightChain=制限部位に隣接する、目的のλ抗体またはκ抗体のいずれかの可変領域および定常領域;およびrEF1α=ラットEF1αプロモーターイントロンおよびエキソンは、EF1αプロモーターおよびリーダーについてアノテーションされている。図16は、pEXCEL-ITRのエレメント並びにAAV2のp5プロモーター領域由来のp5IEE:p5組み込み有効性エレメントIntegrationEfficiencyElementの各々を含んでいるポリクローナル細胞集団へ抗体発現カセットを一過性発現させるまたは組み込みのための、pEXCEL-ITR/p5と本明細書で呼ばれる例示的な抗体発現ベクターの略図である。このエレメントは、ITR配列に隣り合う位置であってもよい。あるいは、p5エレメントは、ITR配列のうちの一方または両方を置き換えてもよい。図17は、本明細書においてpExcel-Rep78ベクターと呼ばれる、例示的なRep78ベクターの略図である。このpExcel-Rep78ベクターは、以下のエレメントを含む:SV40プロモーター=Rep78由来の真核生物プロモーター;Rep78=AAV2由来のRep78のコード配列;SV40後期pA=SV40由来の後期ポリアデニル化配列;Amp=アンピシリン耐性遺伝子および細菌プロモーター;ならびにORI=細菌複製起点の開始部位。組換えレトロウイルスベクターの構築後、レトロベクターを、パッケージング細胞株に導入する。パッケージング細胞株は、所望の宿主範囲を有するウイルス粒子へウイルスのゲノムRNAをパッケージングするために、トランスで必要なタンパク質すなわち、ウイルスがコードしているgag、polおよびenvのタンパク質を提供する。この宿主範囲は、ウイルス粒子の表面上に発現されるエンベロープ遺伝子産物の種類によって部分的に制御される。パッケージング細胞株は、エコトロピック狭宿主性、アンホトロピック広宿主性またはキセノトロピック異種指向性なエンベロープ遺伝子産物を発現し得る。あるいは、パッケージング細胞株は、ウイルスのエンベロープenvタンパク質をコードする配列を欠いてもよい。この場合、パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムを、膜会合タンパク質例えば、envタンパク質を欠く粒子にパッケージングし得る。細胞へのウイルスの進入を可能にする膜会合タンパク質を含有するウイルス粒子を生成するために、レトロウイルス配列を含んでいるパッケージング細胞株を、膜会合タンパク質例えば、水疱性口内炎ウイルスVSVのGタンパク質をコードする配列でトランスフェクトする。すると、このトランスフェクトされたパッケージング細胞は、トランスフェクトされたパッケージング細胞株発現の膜会合タンパク質を含むウイルス粒子を生成し得る;これらのウイルス粒子別のウイルスのエンベロープタンパク質によってキャプシド形成される、1つのウイルス由来のウイルスゲノムRNAも含むは、偽型ウイルス粒子と呼ばれる。一本鎖DNAウイルスベクターが用いられる場合、例えば、AAVベクターでは、このベクターを、宿主細胞の増殖感染を促進するために、無関係のヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクチンで同時感染させる。例示的な実施形態では、組換えAAVビリオンは、AAVベクターおよびAAVヘルパープラスミドの両方でトランスフェクトされた宿主細胞中で産生され得る。AAVヘルパープラスミドは一般的に、AAVのrepおよびcapタンパク質を含むが、AAVのITRは欠く。従って、AAVヘルパープラスミドは、それ自体を複製もパッケージングもできない。AAVベクターは、AAVのITR配列ウイルスの複製およびパッケージング機能を提供するが隣接する目的の遺伝子を含む。ヘルパープラスミドおよびAAVベクター目的の核酸を含んでいるが、当該分野で周知の方法を用いて宿主細胞に同時形質転換された後、宿主細胞をヘルパーウイルスで感染させて、AAVのrepおよびcapタンパク質の発現を促す、ヘルパープラスミドに存在するAAVプロモーターをトランス活性化する。次に、目的の核酸を含んでいる組換えAAVビリオンを精製し、これを用いて所望の多重度の感染で宿主細胞を感染させて、1細胞あたり高コピー数を提供してもよい。下に考察されるとおり、宿主細胞は、同じAAVベクターおよび/またはAAVベクターのライブラリーを用いて繰り返し形質導入されてもよい。II.宿主細胞ウイルスベクターによる形質導入に適した種々の宿主細胞例えば、レトロベクター、AAVベクターなどの使用が想定されている。例示的な宿主細胞株としては、哺乳動物細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣ChinesehamsterovaryCHO細胞、サル腎臓CV1COS細胞、ベビーハムスター腎臓BHK細胞、ウシ乳腺上皮細胞、ヒト胎児由来腎臓HEK細胞、ヒト子宮頸癌HeLa細胞、マウスセルトリ細胞TM4、アフリカ遺伝子サル腎臓細胞VERO-76、イヌ腎臓細胞MDCK、バッファローラット肝臓細胞BRL3A、ヒト肝臓細胞HepG2、ヒト肺線維芽細胞WI-38、IMR-90またはMRC-5、マウス乳腺腫瘍細胞MMT060562、TR1細胞、ラット線維芽細胞、および骨髄腫細胞が挙げられる。哺乳動物細胞に加えて、昆虫細胞株、両生類細胞株、および植物細胞も用いられてよい。適切な昆虫細胞株の例としては、限定するものではないが、Sf細胞例えば、Sf9およびSf21細胞株、ならびにHighFive商標細胞株および蚊の細胞株例えば、MOS-55細胞株が挙げられる。III.形質転換方法および細胞集団の生成例示的な実施形態では、目的の少なくとも1つのタンパク質または目的のタンパク質のライブラリーをコードするウイルスベクターを用いて、宿主細胞ゲノム例えば、宿主細胞ゲノムDNAを形質転換してもよい。例えば、宿主細胞は、レトロウイルスベクターおよびレトロウイルスのインテグラーゼタンパク質を用いて、または一本鎖DNAウイルスベクター例えば、AAVベクターおよびrepタンパク質を用いて、1細胞あたり少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも5回、少なくとも10回以上のウイルスベクターの多重感染で形質導入してもよい。約10~約1,000,000という感染の多重度を用いて、組み込まれたベクターの約2~約100コピーを含んでいる感染した宿主細胞のゲノムを生成してもよい。いくつかの実施形態では、約10~約10,000という感染の多重度が用いられる。例示的な実施形態では、1つ以上の宿主細胞は、繰り返し形質転換され得る。例えば、宿主細胞は、米国特許第6,852,510号および同第7,378,273号に記載のように、同じウイルスベクター例えば、レトロベクター、AAVベクターなどで少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20回以上形質導入される。同じ細胞集団に対する、複数の繰り返しの形質導入の使用は、組み込まれたベクターの少なくとも1つのコピーを含んでいる宿主細胞の割合を増大し、かつ複数の組み込まれたコピーを含有する宿主細胞集団を生成するために用いられ得ると想定されている。理論によって束縛されることは望まないが、複数の反復の形質転換は、得られた細胞集団からのタンパク質産生も増大し得る。宿主細胞を形質転換するための方法は、当該分野で周知である。要するに、宿主細胞は、宿主細胞ゲノムへの目的の1つ以上の遺伝子の感染および引き続く組み込みを可能にするのに十分な時間、感染性ベクターを含んでいる培地に暴露される。当業者は、組み込みの量が、1宿主細胞に積層するために用いられる培地の量例えば、小容積を用いると、2宿主細胞がベクターに暴露される時間の長さと、3宿主細胞のコンフルエンシーと、4感染の多重度とを操作することによって最大化され得る。本明細書に記載されるとおり、いくつかの実施形態では、ベクターのライブラリーを用いて宿主細胞の集団を形質転換する。宿主細胞を、2つ以上のベクターで形質転換する場合、2つ以上のベクターの形質転換は、同時であってもよいし例えば、宿主細胞は、2つ以上のベクター、例えば、ベクターのライブラリーを含有する溶液に暴露される、または異なる時点例えば、連続であってもよい。宿主細胞が各々のベクター例えば、ウイルスベクターで連続して形質転換される場合、宿主細胞は、第一のベクターでトランスフェクトされ、ある期間継代され、次いで、任意の引き続くベクターでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、第一のベクターで繰り返し形質転換され、その後任意の追加のベクターで形質転換例えば、繰り返し形質転換されてもよい。例示的な実施形態では、本明細書に開示される形質転換方法は、個々の前駆細胞例えば、個々の細胞クローンのクローン選択の使用ならびに/または組み込まれた目的の遺伝子を含有する細胞を特定および選択するための細胞株の産生を必要としない。上記のように、本発明のベクターは、選択マーカーを含まなくてもよい。本明細書に開示される方法は、複数の、反復的な形質転換を利用して、目的の1つ以上の遺伝子の少なくとも1つが組み込まれたコピーを含有する細胞の少なくとも80、85、90、95、98、99および100を含む宿主細胞集団を生成する。いくつかの実施形態では、細胞集団は、形質転換された宿主細胞と形質転換されていない宿主細胞との両方を含んでもよい。形質転換されていない宿主細胞が存在する場合、この開示された方法はさらに、集団中の形質転換された細胞のサブセットを選択する選択工程を包含し得る。この選択工程は、ネガティブ選択であっても、またはポジティブ選択であってもよい。例示的なネガティブ選択マーカーとしては、限定するものではないが、G418、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンおよびゼオシンが挙げられる。例示的なポジティブ選択としては、培養培地から排除される必須アミノ酸を作製可能な酵素の使用が挙げられる。選択工程は、複数の個々の細胞集団を混合する前に行われてもよい。あるいは、この選択工程は、複数の個々の細胞集団の混合後に行ってもよい。選択はまた、複数のベクターを用いて生成される細胞集団で、単回の形質転換で行われてもよい例えば、単回の形質転換における各々のベクターが、目的の2つ以上のタンパク質をコードする場合。目的の遺伝子の少なくとも1つ以上のコピーを組み込んでいる宿主細胞は、さらに多くの細胞数が望まれる場合、当該分野で周知の標準的な技術を用いて増殖してもよい。個々の細胞集団は、約百万個の細胞、約5百万個の細胞、約一千万個の細胞、約二千万個の細胞またはそれ以上の個数の細胞まで増殖されてもよい。例示的な実施形態では、個々の細胞集団は、下に考察されるように細胞集団を混合する前に約一千万個の細胞まで増殖される。IV.組換えポリクローナル細胞集団を産生するための細胞集団の混合少なくとも2つの個々の細胞集団各々が、異なるタンパク質を産生するは、本明細書に記載の方法工程から生成される場合、細胞のポリクローナル混合物本明細書においてはポリクローナル細胞集団と呼ばれるを生成するように混合されてもよい。例示的な実施形態では、少なくとも2つの個々の細胞集団を生成して、それを混合し、複数のタンパク質を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する。ポリクローナル細胞集団は、各々が異なるタンパク質を産生できる少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100またはそれ以上の細胞集団を含んでもよい。少なくとも2つの個々の細胞集団は、等しい数例えば、1:1の比で混合されても、または1:1とは異なる比例えば、1:2の比、1:3の比、1:4の比、1:5の比、1:10またはそれ以上の比で混合されてもよい。3つ以上の個々の細胞集団が混合される場合、その細胞は、例えば、1:1:1の比、または例えば、1:1:1の比とは異なる任意の可能な比率で混合されてよいことも想定されている。ポリクローナル細胞集団はさらに、当該分野で周知の方法を用いて増殖されてもよいし、または細胞バンクを形成するために凍結されてもよい下に考察される。ポリクローナル細胞集団の全体的なサイズは、少なくとも100個の細胞、少なくとも1,000個の細胞、少なくとも1万個の細胞、少なくとも10万個の細胞、少なくとも百万個の細胞、少なくとも5百万個の細胞、少なくとも一千万個の細胞、少なくとも二千万個の細胞、少なくとも5千万個の細胞またはそれ以上の細胞を含んでもよい。例示的な実施形態では、組換えポリクローナル細胞集団は、個々の細胞集団各々が異なるタンパク質を産生できるから生成されてもよく、ここで各々の個々の細胞集団は、約百万個の細胞である。例えば、組換えのポリクローナルタンパク質の組成物が5つの異なるタンパク質を含む場合、組換え細胞集団の大きさは、少なくとも5百万個の細胞例えば、5つの個々の細胞株の各々から約百万個の細胞である。ポリクローナル細胞集団のサイズは、十分大きく、1つの細胞を産生する1つのトランスフェクトされた細胞集団のガウス増殖曲線は、第二または第三などのタンパク質を産生するトランスフェクトされた細胞集団に対して同一であるか、または実質的に同一であると考えられる。本明細書に記載されるポリクローナル細胞集団の安定性は、トランスフェクトされた細胞の大集団を用いること、および個々の細胞集団のうち多数例えば、1つの個々の細胞集団あたり約百万個以上の細胞を混合して、組換えポリクローナル細胞集団を産生することによって達成される。V.組換え細胞集団のバンキング組換え細胞集団例えば、単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団および異なるタンパク質を産生できる少なくとも2つの異なる細胞集団を含んでいるポリクローナルの細胞集団を、将来の試験、スクリーニング、製造および/または使用のためにバンキングすなわち、凍結および貯蔵してもよい。細胞集団は、当該分野で周知の方法を用いて、個々のバイアルまたはアンプル中でアリコートにされて、凍結され得る例えば、凍結ストックを生成するために。アリコートのサイズ、1バイアルあたりの細胞の数、およびバイアルまたはアンプルの数は、細胞集団の所望の用途次第で変化し得る。いくつかの実施形態では、細胞集団は、1バイアルあたり約百万個、約5百万個、約一千万個、または約二千万個の細胞という総細胞カウントでバンキングされ得る。例示的な実施形態では、ポリクローナル細胞集団は、1バイアルあたり約一千万個の細胞という総細胞カウントでバンキングされる。細胞集団例えば、ポリクローナル細胞集団は、バンキングされて、タンパク質組成物例えば、ポリクローナルタンパク質組成物のさらなる試験および確認に供されてもよいことが想定されている。本明細書に記載される方法によって産生されるポリクローナルタンパク質組成物の確認の際、細胞集団の1つ以上の凍結アンプル例えば、モノクローナルまたはポリクローナルの細胞集団が解凍されて、標準的な細胞培養技術を用いて増殖されてもよいと考えられることが想定されている。このような工程は、所定のポリクローナルタンパク質組成物の大規模容量を産生できる細胞株を樹立例えば、治療用途用のポリクローナルタンパク質組成物を産生するための細胞株の製造するために行われ得る。ある特定の実施形態では、単一のタンパク質例えば、単一の抗体を発現する個々の細胞集団はバンキングすなわち、凍結および貯蔵されない。VI.組換えポリクローナルタンパク質組成物本明細書に記載の方法によって産生される組換えポリクローナルタンパク質の組成物は、タンパク質の混合物を含む。いくつかの実施形態では、ポリクローナルタンパク質の組成物は、1つ以上の標的タンパク質上の異なる抗原性エピトープに結合する抗体の混合物である。例えば、ポリクローナル細胞集団は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、または100個の異なる抗原性エピトープに結合する、ポリクローナル抗体組成物を産生できる少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100またはそれ以上の細胞集団を含み得る。異なる抗原性エピトープに結合する場合、これらのエピトープは、同じ標的タンパク質上に存在していてもよいし、異なる標的タンパク質例えば、少なくとも2、3、4、5個以上の異なる標的タンパク質上に存在していてもよい。2つ以上のポリペプチドを標的にする例示的なポリクローナル抗体組成物としては、限定するものではないが、同じ分子経路でポリペプチドを標的にする組成物例えば、リガンド、その同族のレセプター、および/または下流のエフェクター分子、重複機能を有するポリペプチド例えば、同じレセプターを通して機能する2つのリガンド、または同じ細胞の表面上に各々が発現されるポリペプチド例えば、少なくとも2つのポリペプチドが、同じ疾患関連細胞、例えば、腫瘍細胞上で両方とも発現されるが挙げられる。いくつかの実施形態では、2つ以上の標的ポリペプチドは、同じ疾患、障害または状態との関連を除いて、無関係のポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、組換えポリクローナルタンパク質の組成物は、単一のポリペプチドを標的にする抗体の混合物を含んでいる組換えポリクローナル抗体組成物である例えば、抗体の混合物は、同じ、類似例えば、部分的に重複するエピトープ、または異なる抗原性エピトープを同じ標的ポリペプチド上で標的にし得る。いくつかの実施形態では、組換えポリクローナル抗体組成物は、野性型および変異体型例えば、治療法例えば、癌の処置に対する抵抗性または疾患重篤度の増大に関連する公知の変異体の両方のポリペプチドを標的にし得る。本発明の例示的な抗体ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含み、6つの相補性決定領域CDRすなわち、免疫グロブリン重鎖上の3つのCDR、および免疫グロブリン軽鎖の上の3つのCDRを含んでいる四量体抗体を形成する。本発明の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列は、天然の抗体配列、または遺伝子操作された抗体配列、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体および多価特異的抗体例えば、二価特異的抗体に相当し得ることが想定されている。目的のポリペプチドは、Fab、Fab’、Fab’2、またはFvフラグメントのような抗原結合フラグメントに相当し得るとも考えられる。抗体および抗体フラグメントの抗原性を減少または排除するための方法は、当該分野で周知である。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体組成物は、四量体のインタクトな抗体例えば、天然に存在する抗体および/または遺伝子操作された抗体および/またはその抗原結合フラグメントの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体組成物中の1つ以上の抗体は、検出可能な標識またはエフェクター分子、例えば低分子例えば、毒素のような他の部分に対して化学的にコンジュゲートされてもよい。ポリクローナル抗体組成物は、2つ以上のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖を含んでもよい。例えば、免疫グロブリン重鎖は、以下のアイソタイプのうちいずれか1つを含んでもよい:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgDおよびIgE。個々の細胞集団の混合の際、組換えポリクローナル混合物は、同じまたは異なるアイソタイプの免疫グロブリン重鎖配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組換えポリクローナル抗体組成物は、少なくとも2つ以上の異なるアイソタイプを含んでもよい。ポリクローナル抗体組成物は、当該分野で周知の方法を用いて精製され得る。例示的な方法としては、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーが挙げられる。選択された精製方法は、ポリクローナル抗体組成物中の全ての抗体が同じアイソタイプであるかまたは関連のアイソタイプ例えば、IgG1、IgG2、およびIgG4であるかに依存し得る。この抗体が、同じアイソタイプであるか、または関連のアイソタイプである例えば、全ての抗体がIgG抗体である場合、この抗体は、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製され得る。この抗体が異なるおよび無関係のアイソタイプである場合、ゲル濾過を用いて、ポリクローナル抗体組成物を精製してもよい。いくつかの実施形態では、このポリクローナルタンパク質の組成物は、ワクチンとして使用するためのタンパク質の混合物である。このポリクローナル組成物は、同じ病原体の1つ以上の感染性因子、所定の感染因子の改変体例えば、変異体型、アイソフォームなど、または異なる感染性因子を模倣する組換えタンパク質を含んでもよい。ポリクローナルタンパク質の組成物のタンパク質構成要素は、疾患を生じることが公知であるかまたは疑われるタンパク質標的または因子の組み合わせを含んでもよい。ポリクローナルタンパク質の組成物は、限定するものではないが、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む当該分野で周知の方法を用いて精製されてもよい。限定するものではないが、ポリクローナル抗体組成物、ポリクローナルワクチン組成物を含む、ポリクローナルタンパク質の組成物の安定性は、当該分野で周知の方法を用いて決定され得る。例示的な方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーHPLC、パパイン消化に続く2-Dゲル分析、マイクロアレイ、定量的PCRqPCR、およびELISAアッセイが挙げられる。バンキングされたポリクローナルタンパク質の組成物を経時的に定期的にモニターして、組換えポリクローナルタンパク質の組成物を構成する個々のタンパク質の安定性をアッセイしてもよいことが想定されている。特定の実施形態では、ポリクローナルタンパク質混合物の安定性は、高速液体クロマトグラフィーHPLCによって分析され得る。サンプルは以下に記載のように調製してもよい:細胞例えば、FreeStyle293-F培養物Invitrogenは、400×gで5分間の遠心分離に供し、この上清を次に、急速凍結および-20°Cで貯蔵し、そして96ウェルフィルタープレート3MEmpore,カタログ番号6065を用いる引き続く濾過に供してもよい。HPLCUltimate3000RSLC,Dionex分析を、WCX-10ProPacカラムDionex,カタログ番号016830、流速1ml/分、30°Cのカラム温度、および220/280nmの検出を用いて行ってもよい。抗体タンパク質は、20mMの2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、pH5.6緩衝液Aと20mMのMES/1MNaCl、pH5.6緩衝液Bとの間の直線勾配を有するイオン交換カラムから溶出してもよい。各々の上清のサンプルのクロマトグラフィー分析は、連続工程、例えば全部で14分7分にわたる5~33の緩衝液Bの勾配、0.5分にわたる33~100の緩衝液Bの勾配、1分間の100緩衝液B、0.5分にわたる100~5の緩衝液Bの勾配、および5分間の5の緩衝液Bで行われてもよい。ChromeleonConsoleプログラムDionexを用いて、ピークの値を、mAUA280および保持時間分の関数として算出してもよい。これらのクロマトグラフィー条件を用いて、抗体タンパク質を別個の保持時間で溶出してもよい。別の例示的な精製プロトコールでは、抗体タンパク質は、FreeStyle293-F細胞Invitrogen中で、293fectinTransfectionReagentInvitrogen,カタログ番号12347-019を製造業者の指示に従って用いて発現させ、HiTrapMabSelectGEHealthcare,カタログ番号28-4082-53カラムを用いて精製してもよく、緩衝液はBioscaleMiniBioGelP6DesaltingCartridgeBiorad,カタログ番号732-5304で交換されてもよい。この溶出された抗体タンパク質は、A280によって定量され、混合され、HPLCによって分析されてもよい。VII.組換えポリクローナルタンパク質組成物の使用本発明の組換えポリクローナルタンパク質の組成物を用いて、癌を含む種々の疾患および障害例えば、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌および頭頸部癌を処置してもよい。例えば、癌細胞を、治療上有効な量のポリクローナルタンパク質組成物例えば、ポリクローナル抗体組成物に暴露して、癌細胞の増殖を阻害または軽減してもよい。いくつかの実施形態では、本発明の組換えポリクローナル抗体組成物は、癌細胞増殖を、少なくとも40、50、60、70、80、90、95、98、99または100まで阻害する。他の実施形態では、本発明のポリクローナルタンパク質の組成物を用いて、細菌および/またはウイルス感染症、ならびに感染性タンパク質、例えば、プリオン類および毒素類を処置してもよい。本明細書において用いる場合、処置する、処理するtreat、処置すること、処理することtreatingおよび処置、処理treatmentとは、哺乳動物における、例えば、ヒトにおける疾患の処置を意味する。これには以下が含まれる:a疾患を阻害すること、すなわち、その進行を停止すること;およびb疾患の軽減、すなわち、疾患状態を退行させること;およびc疾患を治癒すること。一般には、活性成分の治療上有効な量は、0.01mg/kg~100mg/kg、例えば、1mg/kg~100mg/kg、1mg/kg~10mg/kgの範囲である。投与される量は、処置されるべき疾患または適応症の種類および程度、患者の全体的な健康度合、抗体のインビボ力価、薬学的処方物および投与経路などの変数に依存する。初回投薬量は、所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために上限を超えて増大されてもよい。あるいは、初回投薬量は、最適量よりも少なくてもよく、毎日の投薬量は、処置の経過の間に漸増してもよい。ヒト投薬量は、例えば、0.5mg/kg~20mg/kgで移行するようにデザインされた従来の第I相用量漸増試験で、最適化され得る。投薬頻度は、投与の経路、投薬量および処置されている疾患などの因子に依存して変化し得る。例示的な投与頻度は、1日に1回、週に1回、および2週に1回である。好ましい投与経路は、非経口、例えば、静脈内注入である。ポリクローナルタンパク質ベースの薬物の処方物例えば、ポリクローナル抗体、ワクチンなどは、当該分野の技術の範囲内である。いくつかの実施形態では、ポリクローナルタンパク質組成物例えば、ポリクローナル抗体組成物を凍結乾燥して、投与時点で緩衝化生理食塩水中に再懸濁する。治療用途に関しては、本発明のポリクローナルタンパク質の組成物を薬学的に許容される担体と合わせるのが好ましい。本明細書において用いる場合、薬学的に許容される担体とは、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題も合併症もなく、ヒトおよび動物の組織と接触して用いるのに適した緩衝液、担体および賦形剤合理的な利点/リスクの比が釣り合っているを意味する。この担体単数または複数は、処方物の他の成分と適合性であり、レシピエントに対して有害でないという意味で許容可能でなければならない。薬学的に許容される担体としては、薬学的投与に適した、緩衝液、溶媒、分散媒体、コーティング、等張性および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質用のこのような媒体および因子の使用は当該分野で公知である。本発明のポリクローナルタンパク質を含んでいる薬学的組成物例えば、抗体、ワクチンは、単位投与剤形で与えられてもよく、任意の適切な方法によって調製されてもよい。薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方されるべきである。投与経路の例は、静脈内IV、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜および直腸の投与である。ポリクローナル抗体の投与の好ましい経路は、IV注入である。有用な処方物は、薬学の分野で周知の方法によって調製され得る。例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences,第18版MackPublishingCompany,1990。非経口投与に適した処方成分としては、滅菌希釈液、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒;抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン;抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム;キレート剤、例えば、EDTA;緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩;ならびに張度の調節剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースが挙げられる。静脈内投与のための適切な担体としては、生理学的食塩水、静菌水、CremophorELTMBASF,Parsippany,NJ、またはリン酸緩衝生理食塩水PBSが挙げられる。この担体は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、微生物に対して防腐されなければならない。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールおよびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散培地であってもよい。薬学的処方物は好ましくは無菌である。滅菌は例えば、無菌濾過膜を通した濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、濾過滅菌は、凍結乾燥および再構成の前に行われてもまたは後に行われてもよい。実施例以下の実施例は、単に例示であって、決して本発明の範囲や内容を限定するものではない。実施例1:外因性DNA配列の安定な発現を促進するための、AAVRepタンパク質を用いる安定なポリクローナル細胞集団の産生A.AAVRepタンパク質は、培養された細胞において、外因性DNA配列の安定な発現を増強する。本実施例の目的は、AAVRepタンパク質が、培養された細胞中で外因性のDNAの安定な発現を増強するか否かを決定することであった。GFPを、Freestyle293細胞中で発現し、続いて種々の濃度のpAAV2-Rep78とともにpExcel-ITR:GFPの同時トランスフェクションを行った。Freestyle293細胞2×106を、2μgのpExcel-ITR:GFPおよび2μg、40ng、20ng、10ngまたは4ngのpAAV2-Rep78とともに、293-Fectinを用いて、製造業者の指示に従って同時トランスフェクトを行った。細胞を、選択なしに25日間培養した。3~4日毎に、GFP発現を、FACS分析によって評価した。17、21および25日のGFPを発現する細胞の割合を平均したが、エラーバーは、図1に示されるように、標準偏差を示している。ベクター単独pExcel-ITR:GFP対pRep78が1:0によって、図1に示されるように、約1の組み込みが生じた。高レベルのRep78は、細胞に対して毒性であるが、Rep78は、毒性未満の用量で投与された場合、より高い全体的に安定な組み込み効率を媒介し例えば、図1に示されるようなpExcel-ITR:GFP対pRep78の1:1の濃度比は、ベクター単独での組み込みと比較してAAVrep78媒介性の組み込みのわずかな増大しか生じなかった図1では1:0、pRep78の滴定によって、安定な発現を約5倍まで増強した、pRep78の濃度例えば、1:50および1:100が明らかになった。B.非ウイルスAAV組み込みは、安定な抗体発現を生じるこの実施例の目的は、非ウイルスAAV組み込みが安定な抗体発現を生じるか否かを検討することであった。Freestyle293細胞30×106を、30μgのpExcel-ITR:5.55.D2これは、抗S.aureusδ毒素IgG1を発現すると150ngのpAAV2-Rep78とともに、293-Fectinを用いて、製造業者の指示に従って同時トランスフェクトし、IgG1産生を経時的にモニターした。トランスフェクションの3日後、細胞を、500μg/mLのG418を含有している増殖培地で継代した。細胞培養上清のFc-特異的ELISAを、1週に2回行った。各々の時点でのIgG1の総pg/mlを、培養物中の1日あたりの平均細胞数で割った。図2に示すとおり、1日あたり1細胞に産生される抗体のピコグラム数pg/細胞/日として測定した場合の相対発現は、11週間にわたって4~8pg/細胞/日の間で維持される。細胞の密度および生育可能性は、G418選択期間の間に低下するようであり、これはこの期間に細胞の抗体産生に影響を与えたが、21日3週までには、細胞の密度および生育可能性は、トランスフェクション前レベルまで回復した発現レベルは、G418選択開始の14日後に一過性のトランスフェクションレベル時間=0に接近する。追加実験をまた、全部で5つの異なる抗体産生細胞集団で行い二連で実施、11週の期間にわたって安定性をモニタリングした。これらの集団の発現レベルは、実験の経過中、3~10pg/細胞/日で維持された。得られた細胞集団は、クローン細胞株ではなく、ほとんどRep78タンパク質によって媒介される多様な分布の組み込み事象を有している細胞で構成されているバルク細胞集団である図1および図10に示される結果によって示されるとおり。これらの結果によって、4×106個の細胞/mlという細胞濃度では、10,000Lの容積を満たすのにこの実験では31日を要することが示唆される。11週まで、これは、7.75×1012リットルに等しいか、または7.75×107の1万リットルの製造容器に等しい。ポリクローナル集団混合物の引き続く例では、10,000Lの産生容器に繁殖させるのに十分な数の細胞集団を産生させる間ずっと安定であることを示す時間的期間が示される。このデータではまた、図2に示されるように、これらの細胞集団が、その産生容積の何倍も安定に抗体を産生できることが示唆される。C.安定なポリクローナル細胞混合物の産生組換えポリクローナル細胞集団の個々の抗体構成要素を経時的にモニターして、AAVRepタンパク質組み込みを用いて産生される種々のポリクローナル細胞集団の安定性を評価した。以下の抗体名称を有する4つの異なる抗体を発現するFreestyle293細胞集団を、図2に記載されるようなpExcel-ITRベクター系を用いて生成した:42.11.D4Bordetellapertussis特異的な抗体、5.55.D2S.aureus特異的な抗体、26.3.E2ウシκ-カゼイン特異的な抗体および42.18.C2破傷風毒素特異的な抗体。トランスフェクションの21日後、4つの集団の各々を等しい数の細胞2×105/mL混合して、時間を0日と指定した。図3に示されるとおり、表示された時点例えば、3日、7日、10日、14日、17日、21日、28日、31日、35日で、細胞培養上清のIEXHPLC分析を行った。各々の時点のスタックされたHPLCクロマトグラムを図3Aに示す。HPLC分析からの各々の抗体のピーク下面積を用いて、図3Bに示されるように、総集団内の各々の抗体の割合を経時的に算出した。実験の全経過にわたり集団内の各々の抗体の割合を平均し、その標準偏差を図3Cに示す。例えば、図3B~図3Cでは、抗体42.11.D4を発現する細胞は、総細胞集団の23.1±2.1であり;抗体5.55.D2を発現する細胞は、総細胞集団の30.3±2.2であり;抗体26.3.E2を発現する細胞は、総細胞集団の26.0±2.1であり、抗体42.18.C2を発現する細胞は、総細胞集団の20.6±3.0である。図3に示されるデータは、AAVのRep78タンパク質を用いるpExcel-ITRベクター系が、試験された4つの抗体集団で構成される安定なポリクローナル集団を産生したことを示す。ポリクローナル集団内の4つの細胞集団の各々各々が異なる抗体を発現するは、お互いに対して35日間にわたって安定であった例えば、HPLCプロフィールで測定されるとおり、全経過時間にわたって、全発現で、任意の所定の抗体にはほとんど変動がなかった。ポリクローナル集団が一旦確立されれば、観察されたポリクローナル内の4つの異なる集団のいずれにも、偏りもバイアスもなかった。ポリクローナル細胞集団はまた、AAVのRep78タンパク質およびp5エレメント本明細書ではpExcel-ITR/p5と呼ばれるを有するpExcel-ITRベクター系を用いて産生された。組換えポリクローナル細胞集団の個々の抗体構成要素を経時的にモニターして、ポリクローナル集団の安定性を評価し、p5エレメントが集団の安定性に及ぼす効果を測定した。以下の抗体名称を有する4つの異なる抗体を発現するFreestyle293細胞集団を、図3に記載されるようなpExcel-ITR/p5ベクター系を用いて生成した:42.11.D4、5.55.D2、26.3.E2および42.18.C2。トランスフェクションの21日後、4つの集団の各々を等しい細胞数2×105/mL混合して、時間を0日と指定した。図4に示されるとおり、表示された時点例えば、3日、7日、10日、14日、17日、21日、28日、31日、35日で、細胞培養上清のIEXHPLC分析を行った。各々の時点のスタックしたHPLCクロマトグラムを、図4Aに示す。HPLC分析由来の各々の抗体のピーク下面積を図4Aに示す。HPLC分析からの各々の抗体のピーク下面積を用いて、図4Bに示されるように、経時的に、総集団内の各々の抗体の割合を算出した。実験の全経過にわたり集団内の各々の抗体の割合を平均し、その標準偏差を図4Cに示す。例えば、図4B~図Cでは、抗体42.11.D4を発現する細胞は、総細胞集団のうち23.4±1.9であり;抗体5.55.D2を発現する細胞は、総細胞集団のうち28.6±2.5であり;抗体26.3.E2を発現する細胞は、総細胞集団のうち28.7±1.6であり;かつ抗体42.18.C2を発現する細胞は、総細胞集団のうち19.4±2.8である。図4に示されるデータによって、p5エレメントを有するAAVのRep78タンパク質を用いるpExcel-ITR/p5ベクター系が、試験された4つの抗体集団からなる安定なポリクローナル集団を生成したことが示される。p5エレメントで達成された結果は、p5エレメントなしに達成された結果と同様であって、このポリクローナル集団の正確な混合物は、図3に示されるものとはわずかに異なっていたが、p5エレメントがポリクローナル細胞集団の安定性を変化させなかったことを、これは示している。両方の例例えば、pEXCEL-ITR系対pEXCEL-ITR/p5系を用いるとも、ほぼ等しい数の細胞集団を単に混合したに過ぎない。これは細胞混合物中の各々の抗体について異なる結果をもたらし得るが、ポリクローナルの集団が一旦確立されたら、観察されたポリクローナル細胞集団内の4つの異なる集団のいずれにも、偏りもバイアスもなかった。D.モノクローナルの安定な細胞集団を選択する前の、安定なポリクローナル細胞混合物の産生この実験の目的は、安定なポリクローナル細胞混合物は、モノクローナルの安定な細胞集団を選択する前に生成され得るか否かを検討することであった。例えば、この実験では、細胞集団を混合してポリクローナル細胞集団を生成したが、選択マーカー例えば、G418を含有する培地中で選択され得る、選択マーカーネオマイシンを用いて、個々の安定な細胞集団を選択することはなかった。Freestyle293細胞30×106を、以下の抗体のうちの1つをコードする150ngのpAAV2-Rep78および30μgのいずれかのpExcel-ITR図5A-Bを参照またはpExcel-ITR/p5図5C~Dを参照を用いてトランスフェクトした:42.11.D4、5.55.D2、26.3.E2または42.18.C2。トランスフェクションの3日後、4つの集団の各々を等しい細胞数2×105/mL混合して、時間を0日と指定した。混合の直後に、細胞を、500μg/mLのG418を含有する増殖培地に継代した。細胞培養上清のIEXHPLC分析を、上記のように、3日、7日、10日、14日、17日、21日、28日、31日および35日に行った。各々の抗体のピーク下面積を用いて、図5Aおよび図5Cに示されるように、経時的に総集団内の各々の抗体の割合を計算した。例えば、図5Aおよび図5Bに示されるとおり、抗体42.11.D4は、総細胞集団のうち37.6±1.1であり;抗体5.55.D2は、総細胞集団のうち33.6±1.0であり;抗体26.3.E2は、総細胞集団のうち20.7±0.7であり;抗体42.18.C2は、総細胞集団のうち8.1±0.5である。別の例では、図5Cおよび図5Dに示されるように、抗体42.11.D4は、総細胞集団のうち31.1±1.2であり;抗体5.55.D2は、総細胞集団のうち27.0±2.5であり;抗体26.3.E2は、総細胞集団のうち35.5±0.8であり;抗体42.18.C2は、総細胞集団のうち6.4±1.4である。実験の全経過にまたがる集団内の各々の抗体の割合を平均し、その標準偏差を図5Bおよび図5Dに示す。このデータによって、ポリクローナル細胞集団は、G418で選択する前に混合される場合、安定であることが示される。このデータはまた、個々の構成要素の損失例えば、単一の抗体構成要素のいずれかがポリクローナル集団について10未満であることも示す例えば、抗体42.18.C2を発現する細胞の損失は10未満であるので、抗体42.18.C2の発現は、ポリクローナル混合物中で経時的に失われることはない。このデータによってまた、低く表されている集団または小細胞集団が、経時的に失われることなく、試験される期間全体を通じて同じ比率で残っていることが示される。さらなる実験を行って、pExcel-ITRベクター系を用いて安定なポリクローナル細胞集団を産生する場合の再現性の試験を行った。二連のポリクローナル細胞集団を産生した。個々の細胞集団が、pExcel-ITRベクター系を用いて以下の抗体のうちの1つを発現した:42.11.D4、5.55.D2、26.3.E2および42.18.C2。上記のような4つの抗体の各々を発現する細胞を含んでいるポリクローナル細胞集団を混合した直後に、ポリクローナル細胞集団を二つの培養物に分けて、平行培養した。細胞培養上清のIEXHPLC分析は、上記のように、3日、7日、10日、14日、17日、21日、28日、31日および35日に行った。二連の培養物中の各々の抗体の割合を平均し、その標準偏差を図6Aに示す。本実施例では、これらの二連の培養物の間の相対的な相違は、データで反映されるとおり最小である。いずれの抗体にも、平均から離れた偏りもバイアスもない。標準偏差は、HPLCピーク下の総面積が小さいほど大きいという意味で、測定方法を反映している。さらなる実験では、抗体42.11.D4、5.55.D2、26.3.E2および42.18.C2を発現するポリクローナル集団を生成して、上記のように分けた。一部を培養物中に維持したが、残りは凍結して、液体窒素中に保管した。1週後に、凍結されたポリクローナル集団を解凍して、回収した。細胞培養上清のHPLC分析は、新鮮なポリクローナル集団および解凍したポリクローナル集団の両方で行った。同じ17日の期間にまたがって2つの集団内の各々の抗体の割合を平均し、その標準偏差を図6Bに示す。このデータによって、ポリクローナル集団内の構成要素抗体の比の変動は、独立して培養される場合でも、または凍結保存された後でさえも、識別可能だとしても極めて小さいことが示される。これらの結果によって、特異的な特徴および所望の特徴を有するポリクローナル集団は、予想可能な結果をふまえて、貯蔵および回収できることが示される。E.抗体の複雑な混合物は、ポリクローナル集団から精製され得る。本実施例の目的は、抗体の複雑な混合物が、ポリクローナル細胞集団から継続して精製され得るか否かを決定することであった。抗体42.11.D4、5.55.D2、26.3.E2および42.18.C2を発現するポリクローナル集団の細胞培養上清由来の抗体集団を、プロテインA-ベースの捕獲プロトコールを用いて精製した。精製された抗体集団のIEXHPLC分析を、精製していない培養上清の抗体集団と比較した図7。これらの結果、精製によって、ポリクローナル集団内の異なる抗体エレメントの全てが効率的に回収されることが示唆される。サンプルの容量が増大し、相対的なピークの高さが大きくなるとき、サンプル中の相対的な標準偏差が有意に低下することも、観察された。この結果は、これらの全実施例の全データの基礎であるHPLCプロフィールから得られる実測値の小さい相違は、組成物中の真の変化よりもむしろ、相対的な観察誤差である可能性が高いことを示唆している。F.ポリクローナル細胞集団は、選択圧なしで安定である。細胞集団の安定性を、選択圧の非存在下で試験した。図2に記載されるような細胞集団を確立した。6週後、抗体5.55.D2を発現する細胞集団を2つの培養物に分けた。一方は、選択薬物G418の存在下で培養を継続したが、G418は他の増殖培地からは除去した◆。細胞培養上清のFc特異的ELISAは、1週に2回行った。IgG1の総pg/mlを、各々の時点で、培養物中の1日あたりの平均細胞数で割った;両方の培養物について、各週の平均pg/細胞/日を図8に示す。このデータによって、IgG1産生には4週間にわたって有意な相違が観察されなかったことが示される。このデータによって、この細胞集団における抗体産生ベクターの組み込みは、選択圧の非存在下でさえ安定なままであることが示唆される。G.AAV-Rep依存性の組み込みは、抗体産生の増大をもたらす。Freestyle293細胞30×106を、293-Fectinを用いて、150ngのpAAV2-Rep78を含む場合と含まない場合に分けて、30μgのpExcel-ITR:5.55.D2でトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、両方のトランスフェクトされた集団を、500μg/mLのG418を含有する増殖培地中に継代した。細胞培養上清のFc特異的ELISAを、週に2回行った。IgG1の総pg/mlを、各時点で、培養物中の1日あたりの平均細胞数で割った;選択中の各週について、平均pg/細胞/日を、図9に示す。Repタンパク質の非存在下では、pExcel-ITR:5.55.D2は、ランダムな組み込みを介して組み込まれる。pg/細胞/日で測定された相対的な産生は、、Repタンパク質が組み込みを媒介する場合さらに高く、このことは、Rep媒介性の組み込みこれは、本明細書に規定のように優先的な組み込みであるとランダムな組み込みとの間に質的な相違が存在することを示している例えば、Repタンパク質が、さらに発現許容的な部位にITRを運ぶプラスミドを組み込むのを助けることを記載している、Smith,RH.,GeneTherapy200815,817~822を参照のこと。図9では、図2について上記されるとおり、得られた集団は、クローンではなくすなわち、細胞株ではなく、実際には、組み込み事象の多様な分布からなる可能性が高いバルク集団に相当する。ランダム組み込みおよび優先的組み込みの両方とも、安定的に発現する集団をもたらし得る。H.AAV-Rep依存性の組み込みは、組み込み事象の増大をもたらす。Freestyle293細胞2×106を、293-Fectinを用いて、10ngのpAAV2-Rep78とともに抗体5.55.D2を発現する2μgの表示されたベクター系でトランスフェクトした。細胞を選択なしに17日間培養した。3~4日ごとに、抗体5.55.D2を発現する細胞数をFACS分析によって評価した。17日目に抗体5.55.D2を発現する細胞の割合を示す。図2および図9に示される結果と同様に、得られた集団はクローンではなく、実際には、多様な分布の組み込み事象で構成されている可能性が高いバルク集団に相当する。非ウイルスのAAV媒介性の組み込みは、集団中の細胞数の増大をもたらし、ランダムな組み込みと比較して少なくとも1つの組み込み事象を経験する図1および図10に示されるとおり。ランダム組み込みを用いて、目的のタンパク質を発現する安定な集団を創出できるが、組み込みの相対数およびそれらの組み込みの質は、非ウイルスAAV媒介性の系の質よりも低い例えば、ヒトゲノムにおけるランダム組み込みの大半が相対的に不安定であることを記載している、MigLiaccioら、Gene2562000197~214を参照のこと。実施例2:外因性DNA配列の安定な発現を促進するため、レトロウイルスインテグラーゼを用いる安定なポリクローナル細胞集団の産生A.レトロウイルスインテグラーゼは、培養細胞において、外因性DNA配列の安定な発現を促進する。この実験の目的は、レトロウイルスインテグラーゼが、培養された細胞で外因性DNA配列の安定な発現を促進することを示すことであった。GP2-293細胞Clontech,MountainView,CA、レトロウイルスパッケージング細胞株を、水疱性口内炎ウイルスVSV-GのG糖タンパク質を発現するベクターであるp-VSV-GClontech、およびpEF/myc/nuc/GFPInvitrogen,Carlsbad,CAからクローニングされたGFPを含有する修飾されたpQCXINベクターClontechであるp486図18を用いて同時トランスフェクトした。FreeStyle293FInvitrogen細胞を、トランスフェクションの48時間後に、GFPを含有する、上で得られたレトロウイルス粒子を用いて形質導入した。この形質導入された細胞を、抗生物質選択なしで連続的に継代培養し、形質導入の有効性は、GuavaeasyCyte8HTを用いてFACSを介して定期的にアッセイしたEMDMillipore,Billerica,MA。図11のグラフは、複製の培養物由来のGFP陽性細胞の平均パーセントを示す。このデータによって、GFP発現陽性の細胞のパーセントが、表示された時間的期間中一貫していることが示され、形質導入の有効性は、細胞のうち95超が、単一の形質導入後に安定してGFP陽性であることを示す。このデータはまた、抗生物質選択が無い状態では、安定な組み込み集団は、組み込み体を有さない細胞の存在下でさえ維持され得ることを示す。従って、細胞集団が生成され、かかる細胞の大半がゲノムDNAに1つ以上の組み込みを有しているが、その細胞集団は、組み込みが生じない細胞のサブセットも有しているような状態で、維持されてもよい。この集団のこの形質転換されてないサブセット例えば、DNAフラグメントの組み込みがなかった細胞は、より進化的に適合せず、細胞集団で細胞の全体的な割合を経時的に変化しない例えば、組み込み体が存在しないあるいは反対に、組み込み体が存在する集団がより顕著になる場合に、偏りもバイアスも観察されない。本明細書で記載されるような細胞集団で得られるデータによって、開示された細胞集団が、混合された個々の細胞株とは異なって挙動することが示される。例えば、細胞株例えば、MigLiaccioら、Gene2562000197~214、および混合された細胞株は不安定である場合が多い。驚くべきことに、本明細書で開示されるデータは、ポリクローナル細胞集団が経時的に安定であることを示す。B.レトロウイルスのインテグラーゼを用いる、安定なポリクローナル細胞集団の産生本実験の目的は、レトロウイルスのインテグラーゼを用いて抗体を発現する安定なポリクローナル細胞集団を生成することであった。GP2-293細胞Clontechレトロウイルスパッケージング細胞株を、水疱性口内炎ウイルスVSV-GのG糖タンパク質を発現するベクターであるp-VSV-GClontech、ならびに抗体の重鎖および軽鎖を含んでいる改変pQCXINベクターClontech例としては、ベクターp543図19を参照のことを用いて同時トランスフェクトした。FreeStyle293FInvitrogen細胞は、トランスフェクション48時間後に、各々が以下の抗体を含んでいる上で得られたレトロウイルス粒子を用いて形質導入した:5.55D2、26.3E2、42.11D4、または42.18C2。この形質導入された細胞を連続して継代培養した。培養上清を形質導入の10日後に取り除き、HPLCを介して分析した。頂部のクロマトグラムは、レトロウイルスベクター系によって生成される抗体に相当する精製抗体の標準の混合物である。4つの引き続くクロマトグラムは、レトロウイルスベクター系を用いて産生された抗体を含有する培養上清の分析を示す図12に示すとおり。図12に示すとおり、抗体タンパク質は、別個の保持時間でHPLCカラムから溶出した。さらに、レトロウイルスベクター系を用いて産生された抗体、および標準抗体混合物由来の対応する抗体は、同様の保持時間を示す。このクロマトグラムの標識された5.55D2では、1つのピークは、標準的な抗体混合物における全長5.55D2抗体に対応する。より短い保持時間を有する第二のピークは、抗体のλ軽鎖の過剰産生に相当し得る。本実施例は、バランスのとれた抗体発現ベクターが宿主細胞ゲノムDNA中に安定に組み込まれ得ることを示す。当業者は、重鎖および軽鎖のバランスが常に単純ではないこと、および較正されなければならないことを理解するであろう。例えば、図19に示される構築物を含んでいるIRESについては、重鎖および軽鎖のバランスは、4つの抗体のうち3つで存在した。バランスを得るためには、レトロウイルスベクターまたはそれらの構成要素を用いる種々の選択肢がある。1つの選択肢は、一本鎖のベクターを用いて1細胞あたり複数の組み込みで完全なバランスを示す細胞株を選択することである例えば、米国特許第6,852,510号を参照のこと。あるいは、図19に存在するIRESエレメントは、プロモーターエレメントのような別のエレメントで置き換えてもよい。IRESがプロモーターで置き換えられた1つのこのような構築物は、追加の推定の過剰のλ軽鎖なしに、5.55.D2抗体を生じるのに成功した。さらに、2A/フリン切断部位を用いてもよいJostockら、ApplMicrobiolBiotechnol201087:1517~1524。あるいは、DNAプラスミドベクターを、例えば、図15に示されるように用いてもよく、その場合、ITRエレメントをLTRエレメントで置換して、クローニングされたレトロウイルスのインテグラーゼ遺伝子を、Repタンパク質の代わりに用いる図17に示すRep含有プラスミド。別の実験では、抗体軽鎖を形質導入されたFreestyle293F細胞の形質導入効率もまた試験した。上記のとおり、GP2-293細胞Clontechレトロウイルスパッケージング細胞株を、水疱性口内炎ウイルスVSV-GのG糖タンパク質を発現するベクターであるp-VSV-GClontech、ならびに抗体の軽鎖を含んでいる改変pQCXINベクターClontech例としては、p498図20を参照のことを用いて同時トランスフェクトした。FreeStyle293FInvitrogen細胞は、トランスフェクション48時間後に、抗体5.55D2、26.3E2、42.11D4、または42.18C2由来の軽鎖を含んでいる上で得られたレトロウイルス粒子を用いて形質導入した。この形質導入された細胞を、抗生物質選択の非存在下で連続して継代培養した。形質導入の4日後および7日後に、細胞を固定して、製造業者の指示Invitrogenに従って、FIXPERM試薬を用いて透過化処理し、FITC-コンジュゲートしたマウス抗ヒト軽鎖λ抗体またはκ抗体BioLegend,SanDiego,CAを用いてλ軽鎖またはκ軽鎖について染色した。形質導入効率は、GuavaeasyCyte8HTEMDMilliporeを用いてFACSを介してアッセイした。FITC-染色したλもしくはκ軽鎖またはモック形質導入細胞の平均パーセントを図13に示す。図13から、形質導入の有効性は、4日~7日の間で増大するか、または標準誤差内にとどまった。代表的なFACSの側面対前方散乱プロットおよび緑色蛍光ヒストグラムを、λ抗体5.55D2およびκ抗体26.3E2の形質導入の4日および7日間について、図13Bに示す図13B。図13によって、抗体鎖、すなわち、免疫グロブリン軽鎖が、図11に示されるGFP構築物に近い率で細胞集団中に形質転換され得ることが示される。従って、抗体重鎖を担持するベクターがこれらの細胞集団中にその後形質転換されて、重鎖および軽鎖の両方を含んでいる完全な抗体が作製され得る。参照による援用本明細書で言及される特許文献および科学的文献の各々の全開示は、全ての目的のために参照によって本明細書に援用される。等価物本発明は、その趣旨からもその本質的な特徴からも逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明に限定されるものではなく、あらゆる点で例示とみなされるべきである。従って本発明の範囲は、前述の説明によるのではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、この特許請求の範囲の意味および等価な範囲に該当するあらゆる変更が、その中に包含されるものとする。"