"ヒトCD20に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD、及びIgE抗体から成る群より選択される、請求項1に記載の抗体。前記抗体がIgG1抗体である、請求項2に記載の抗体。前記抗体がIgG3抗体である、請求項2に記載の抗体。前記抗体がIgG4抗体である、請求項2に記載の抗体。前記抗体がIgA1又はIgA2抗体である、請求項2に記載の抗体。前記抗体がヒトCD20から、約105秒1以下の解離速度定数kdで解離する、上記請求項のいずれかに記載の抗体。前記抗体がヒトCD20に、約5nM以下の親和性定数KDで解離する、上記請求項のいずれかに記載の抗体。前記抗体が、以下:i補体の存在下でCD20発現細胞の補体依存的細胞傷害性CDCを誘導することができる;ii補体の存在下で、CD20及び高レベルのCD55及び/又はCD59を発現する細胞の補体依存的細胞傷害性CDCを誘導することができる;iiiCD20発現細胞のアポトーシスを誘導することができる;ivエフェクタ細胞の存在下で、CD20発現細胞の抗体依存的細胞傷害性ADCCを誘導することができる;vCD20を発現する細胞の同型接着を誘導することができる;viCD20に結合すると、脂質ラフトに転位することができる;viiCD20を発現する腫瘍細胞を有する対象の生存期間を延長することができる;viiiCD20を発現する細胞を枯渇させることができる;及びix低レベルのCD20を発現する細胞CD20low細胞を枯渇させることができるのうちから選択される特徴の一つ以上を有する、上記請求項のいずれかに記載の抗体。以下:i少なくとも20、そして好ましくは少なくとも30、10μgmlの抗体濃度で37°Cで3時間以内に、33volvolの血漿中BCLL細胞のCDC媒介性溶解を誘導することができる;ii少なくとも20、そして好ましくは少なくとも30、10μgmlの抗体濃度で37°Cで3時間以内に、33volvolの全血中BCLL細胞のCDC媒介性溶解を誘導することができる;iii20μgの用量で、30を越えるDaudi細胞を注射されたSCIDマウスの50生存率を延長することができる;及びiv連続4日間1日当たり625mgkgの投薬量でカニクイザルにおいて、低レベルのCD20を発現する末梢B細胞CD20lowB細胞を検出不能なレベルまで、50日間を越えて枯渇させることができる、から成る群より選択される特徴を一つ以上、有する、請求項9に記載の抗体。少なくとも20、そして好ましくは少なくとも30、10μgmlのCD20抗体濃度で37°Cで3時間以内に、33volvolの血漿存在下でBCLL細胞のCDC媒介性溶解を誘導することができる、請求項10に記載の抗体。それぞれ配列番号1及び配列番号3に記載された通りのヌクレオチド配列及びその保存的配列改変、をそれらの可変領域に含むヒト重鎖及びヒトカッパ軽鎖核酸にコードされた、上記請求項1乃至11のいずれかに記載の抗体。それぞれ配列番号5及び配列番号7に記載された通りのヌクレオチド配列及びその保存的配列改変、をそれらの可変領域に含むヒト重鎖及びヒトカッパ軽鎖核酸にコードされた、上記請求項1乃至11のいずれかに記載の抗体。それぞれ配列番号9及び配列番号11に記載された通りのヌクレオチド配列及びその保存的配列改変、をそれらの可変領域に含むヒト重鎖及びヒトカッパ軽鎖核酸にコードされた、上記請求項1乃至11のいずれかに記載の抗体。それぞれ配列番号2及び配列番号4に記載された通りのアミノ酸配列及びその保存的配列改変を含むヒト重鎖及びヒトカッパ軽鎖可変領域を有する、上記請求項1乃至11のいずれかに記載の抗体。それぞれ配列番号2及び配列番号4に記載された通りのアミノ酸配列に少なくとも90相同、好ましくは少なくとも95相同、そしてより好ましくは少なくとも98相同、又は少なくとも99相同なヒト重鎖及びヒトカッパ軽鎖可変領域を有する、上記請求項1乃至11のいずれかに記載の抗体。それぞれ配列番号6及び配列番号8に記載された通りのアミノ酸配列及びその保存的配列改変を含むヒト重鎖及びヒトカッパ軽鎖可変領域を有する、上記請求項1乃至11のいずれかに記載の抗体。それぞれ配列番号6及び配列番号8に記載された通りのアミノ酸配列に少なくとも90相同、好ましくは少なくとも95相同、そしてより好ましくは少なくとも98相同、又は少なくとも99相同なヒト重鎖及びヒトカッパ軽鎖可変領域を有する、上記請求項1乃至11のいずれかに記載の抗体。それぞれ配列番号10及び配列番号12に記載された通りのアミノ酸配列及びその保存的配列改変を含むヒト重鎖及びヒトカッパ軽鎖可変領域を有する、上記請求項1乃至11のいずれかに記載の抗体。それぞれ配列番号10及び配列番号12に記載された通りのアミノ酸配列に少なくとも90相同、好ましくは少なくとも95相同、そしてより好ましくは少なくとも98相同、又は少なくとも99相同なヒト重鎖及びヒトカッパ軽鎖可変領域を有する、上記請求項1乃至11のいずれかに記載の抗体。i配列番号2、4、6、8、10、又は12;及びii上記iに記載されたとおりのアミノ酸配列のいずれか一つに少なくとも90相同、好ましくは少なくとも95相同、そしてより好ましくは少なくとも98相同、又は少なくとも99相同な配列、から成る群より選択される少なくとも1つのヒト可変領域を含む、上記請求項1乃至11のいずれかに記載の抗体。請求項12乃至21のいずれか1つの抗体に規定されたヒトCD20上のエピトープに結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。i位置172のアミノ酸残基プロリンを含まない又は必要としない;ii位置170のアミノ酸残基アラニン又は位置172のプロリンを含まない又は必要としない;iii位置163のアミノ酸残基アスパラギン及び位置166のアスパラギンを含む又は必要とする;iv位置172のアミノ酸残基プロリンを含まない又は必要としないが、位置163のアミノ酸残基アスパラギン及び位置166のアスパラギンを含む又は必要とする;v位置170のアミノ酸残基アラニン又は位置172のプロリンを含まない又は必要としないが、位置163のアミノ酸残基アスパラギン及び位置166のアスパラギンを含む又は必要とする、CD20上のエピトープに結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。CD20に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体であって、以下の特徴:i変異型P172SCD20位置172のプロリンがセリンに変異したに、少なくともヒトCD20に対するのと同じ親和性で結合する;ii変異型AxP位置170のアラニンがセリンに変異し、位置172のプロリンがセリンに変異したに、少なくともヒトCD20に対するのと同じ親和性で結合する;iii10μgmlの抗体濃度のときに、変異型N166D位置166のアスパラギンがアスパラギン酸に変異したに対して、ヒトCD20に比較して50以上少ない結合を示す;又はiv10μgmlの抗体濃度のときに、変異型N163D位置163のアスパラギンがアスパラギン酸に変異したに対して、ヒトCD20に比較して50以上少ない結合を示す;のうちの一つ以上を有する、抗体。ヒトCD20の小型第一細胞外ループ中のエピトープに結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。CD20上の不連続なエピトープに結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。CD20上の不連続なエピトープに結合する単離されたヒトモノクローナル抗体であって、前記エピトープが、第一小型細胞外ループの部分と、第二細胞外ループの部分とを含む、単離されたヒトモノクローナル抗体。CD20上の不連続なエピトープに結合する単離されたヒトモノクローナル抗体であって、前記エピトープが、小型第一細胞外ループの残基AGIYAPと、第二細胞外ループの残基MESLNFIRAHTPYIとを含む、単離されたヒトモノクローナル抗体。請求項11乃至28のいずれか1つに記載された抗体の結合特徴を有する単離されたヒトモノクローナル抗体。i配列番号13、14、15、16、17、又は18;iiiに記載された配列の保存的配列改変;及びiiiヒトCD20への結合能を保持した、i又はiiに規定された配列のいずか1つのフラグメントから成る群より選択される少なくとも1つのCDR配列を含む、ヒトCD20に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。配列番号15を含む、請求項30に記載の抗体。i配列番号13、14、15、16、17、又は18;iiiに記載された配列の保存的配列改変;及びiiiヒトCD20への結合能を保持した、i又はiiに規定された配列のいずか1つのフラグメントから成る群より選択される少なくとも4つのCDR配列を含む、請求項30に記載された単離されたヒトモノクローナル抗体。配列番号13、14、15、16、17、及び18を含む、請求項30に記載の抗体。i配列番号19、20、21、22、23、又は24;iiiに記載された配列の保存的配列改変;及びiiiヒトCD20への結合能を保持した、i又はiiに規定された配列のいずか1つのフラグメントから成る群より選択される少なくとも1つのCDR配列を含む、ヒトCD20に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。i配列番号19、20、21、22、23、又は24;iiiに記載された配列の保存的配列改変;及びiiiヒトCD20への結合能を保持した、i又はiiに規定された配列のいずか1つのフラグメントから成る群より選択される少なくとも4つのCDR配列を含む、請求項34に記載された単離されたヒトモノクローナル抗体。配列番号19、20、21、22、23、及び24を含む、請求項34に記載された抗体。i配列番号25、26、27、28、29、又は30;iiiに記載された配列の保存的配列改変;及びiiiヒトCD20への結合能を保持した、i又はiiに規定された配列のいずか1つのフラグメントから成る群より選択される少なくとも1つのCDR配列を含む、ヒトCD20に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。配列番号27を含む、請求項37に記載の抗体。i配列番号25、26、27、28、29、又は30;iiiに記載された配列の保存的配列改変;及びiiiヒトCD20への結合能を保持した、i又はiiに規定された配列のいずか1つのフラグメントから成る群より選択される少なくとも4つのCDR配列を含む、請求項37に記載された抗体。配列番号25、26、27、28、29、及び30を含む、請求項39に記載の抗体。i配列番号13、19、又は25、あるいは、配列番号13、19又は25の配列の1つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;ii配列番号14、20、又は26、あるいは、配列番号14、20、又は26の配列の1乃至4つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;iii配列番号15、又は27、あるいは、配列番号15又は27の配列の1乃至4つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;iv配列番号16、あるいは、配列番号16の配列の1乃至2つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;v配列番号17、あるいは、配列番号17の配列の1乃至2つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;及びvi配列番号18又は30、あるいは、配列番号18又は30の配列の1乃至2つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;から成る群より選択される少なくとも1つのCDRを含む、上記請求項1乃至11のいずれかに記載の抗体。i配列番号13、19、又は25、あるいは、配列番号13、19又は25の配列の1つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;ii配列番号14、20、又は26、あるいは、配列番号14、20、又は26の配列の1乃至4つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;iii配列番号15、又は27、あるいは、配列番号15又は27の配列の1乃至4つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;iv配列番号16、あるいは、配列番号16の配列の1乃至2つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;v配列番号17、あるいは、配列番号17の配列の1乃至2つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;及びvi配列番号18又は30、あるいは、配列番号18又は30の配列の1乃至2つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列;から成る群より選択される少なくとも4つのCDRを含む、請求項41に記載の抗体。配列番号15、又は27、及び、配列番号15又は27の配列の1乃至4つのアミノ酸置換、欠失又は追加を有する配列から成る群より選択される1つのCDRを含む、請求項41に記載の抗体。インタクトIgG1抗体、インタクトIgG2抗体、インタクトIgG3抗体、インタクトIgG4抗体、インタクトIgM抗体、インタクトIgA1抗体、インタクトIgA2抗体、インタクト分泌性IgA抗体、インタクトIgD抗体、及びインタクトIgE抗体から成る群より選択されるインタクト抗体である、上記請求項のいずれか1つに記載された抗体であって、真核細胞では糖付加されている、抗体。抗体フラグメント又は一本鎖抗体である、上記請求項のいずれか1つに記載の抗体。i免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された、請求項24に定義された通りの重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の形の、結合ドメインポリペプチド、ii前記ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖CH2定常領域、及びiiiCH2定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖CH3定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である、上記請求項のいずれか一つに記載された抗体。VJ遺伝子セグメント再編成の結果、機能的ヒト重鎖導入遺伝子及び機能的ヒト軽鎖導入遺伝子が形成された、非ヒトトランスジェニック動物から得られたB細胞を、不死化細胞に融合させて含有するハイブリドーマにより産生される、上記請求項のいずれか1つに記載された抗体。VJ遺伝子セグメント再編成の結果、機能的ヒト重鎖導入遺伝子及び機能的ヒト軽鎖導入遺伝子が形成された、非ヒトトランスジェニック動物から得られたB細胞を、不死化細胞に融合させて含むハイブリドーマであって、上記請求項のいずれか1つに記載されたモノクローナル抗体を検出可能な量、産生する、ハイブリドーマ。それぞれ配列番号1、5、又は9及び配列番号3、7、又は11に記載された通りのヌクレオチド配列、及び、その保存的配列改変、をそれらの可変領域に含むヒトIgG重鎖及びヒトカッパ軽鎖核酸にコードされたヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。それぞれ配列番号2、6、又は10及び配列番号4、8、又は12に記載された通りのアミノ酸配列、及び、その保存的配列改変、を含むIgG重鎖及びカッパ軽鎖可変領域を有するヒトモノクローナルを産生するハイブリドーマ。ヒト重鎖及びヒト軽鎖をコードする核酸を含むトランスフェクトーマにより産生される、請求項1乃至45のいずれか1つに記載された抗体。ヒト重鎖及びヒト軽鎖をコードする核酸を含むトランスフェクトーマであって、請求項1乃至45のいずれか1つに記載された抗体を検出可能な量、産生する、トランスフェクトーマ。それぞれ配列番号1、5、又は9及び配列番号3、7、又は11に記載された通りのヌクレオチド配列、及び、その保存的配列改変、をそれらの可変領域に含むヒトIgG重鎖及びヒトカッパ軽鎖核酸にコードされたヒトモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマ。それぞれ配列番号2、6、又は10及び配列番号4、8、又は12に記載された通りのアミノ酸配列、及び、その保存的配列改変、を含むIgG重鎖及びカッパ軽鎖可変領域を有するヒトモノクローナルを産生するトランスフェクトーマ。それぞれ配列番号2、6、又は10及び配列番号4、8、又は12に記載された通りのアミノ酸配列、及び、その保存的配列改変、を含む重鎖及び軽鎖可変領域を有するヒトモノクローナルを産生する真核性又は原核性ホスト細胞。それぞれ配列番号2、6、又は10及び配列番号4、8、又は12に記載された通りのアミノ酸配列、及び、その保存的配列改変、を含む重鎖及び軽鎖可変領域を有するヒトモノクローナルを産生する非ヒトトランスジェニック動物又は植物。非ヒトトランスジェニック動物のB細胞に抗体を産生させるように、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する前記動物を、ヒトCD20又はヒトCD20発現細胞で免疫処理するステップと、前記B細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ヒトCD20に対して特異的なヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を形成するステップと、前記ハイブリドーマ、又はこのようなハイブリドーマを由来とするトランスフェクトーマからの培養上清から、CD20に特異的なヒトモノクローナル抗体を単離するステップと、を含む、ヒトCD20に結合するヒトモノクローナル抗体を作製する方法。前記免疫処理が、ヒトCD20をトランスフェクトしてある細胞で行われる、請求項57に記載の方法。非ヒトトランスジェニック動物のB細胞に抗体を産生させるように、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する前記動物を、ヒトCD20をトランスフェクトしてある細胞で免疫処理するステップと、前記動物のB細胞を単離するステップと、前記B細胞を骨髄腫細胞に融合させて、ヒトCD20に特異的なヒトモノクローナル抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成するステップと、前記ハイブリドーマ、又はこのようなハイブリドーマを由来とするトランスフェクトーマからの培養上清から、CD20に特異的なヒトモノクローナル抗体を単離するステップと、により得られる、ヒトCD20に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。ヒトVH313DP44生殖細胞系配列配列番号54を由来とする重鎖可変領域アミノ酸配列と、ヒトL6JK4CK配列番号55生殖細胞系配列を由来とする軽鎖可変領域アミノ酸配列と、を含む、単離されたヒト抗体であって、ヒトCD20に結合する、単離されたヒト抗体。ヒトVH309JH6b生殖細胞系配列配列番号56を由来とする重鎖可変領域アミノ酸配列と、ヒトVLL6JK5配列番号57生殖細胞系配列を由来とする軽鎖可変領域アミノ酸配列と、を含む、単離されたヒト抗体であって、ヒトCD20に結合する、単離されたヒト抗体。請求項1乃至45のいずれか1つに記載のヒト抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。補完的な機能活性を有する、請求項1乃至45のいずれか1つに記載の2つ以上のヒト抗体の組合せを含む組成物。請求項15に記載の第一の抗体と、請求項19に記載の第二の抗体とを含む、請求項61に記載の組成物。治療薬をさらに含む請求項62乃至64のいずれかに記載の組成物。放射性同位体を付着させるためのキレートリンカをさらに含む、請求項1乃至45のいずれか1つに記載の抗体。細胞傷害性作用薬、放射性同位体、又は薬物に連結させた、請求項1乃至45のいずれか1つに記載の抗体を含む免疫複合体。請求項1乃至45のいずれか1つに記載の抗体と、ヒトエフェクタ細胞への結合特異性部分とを含む二重特異的分子。請求項1乃至45のいずれか1つに記載の抗体と、ヒトFc受容体への結合特異性部分、又は、CD3などのT細胞受容体への結合特異性部分と、を含む二重特異的分子。細胞の成長が阻害されるように、請求項1乃至45のいずれか1つに記載の抗体の有効量に前記細胞を接触させるステップを含む、CD20発現細胞の成長を阻害する方法。CD20発現細胞の致死が起きるように、請求項1乃至45のいずれか1つに記載の抗体に前記細胞を接触させるステップを含む、CD20発現細胞を致死させる方法。前記細胞がBリンパ球又は腫瘍細胞である、請求項70又は71のいずれか1つに記載の方法。請求項1乃至45又は60乃至69のいずれか1つに記載のヒト抗体、組成物、免疫複合体、又は二重特異的分子、請求項94乃至97のいずれか1つに記載の発現ベクタ、を、CD20発現細胞が関与する疾患又は異常を治療又は予防するために有効量、対象に投与するステップを含む、前記疾患を治療又は予防する方法。前記疾患がB細胞リンパ腫である、請求項73に記載の方法。前記疾患がB細胞非ホジキンリンパ腫である、請求項73に記載の方法。前記疾患が、前駆B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫及び成熟B細胞新生物、例えばB細胞慢性リンパ球性白血病/小リンパ球性リンパ腫、B細胞プロリンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、外套細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、から成る群より選択される、請求項73に記載の方法。前記疾患が濾胞性リンパ腫である、請求項76に記載の方法。前記疾患が、B細胞慢性リンパ球性白血病/小リンパ球性リンパ腫である、請求項76に記載の方法。前記疾患が、リンパ腫様肉芽腫症、原発性浸出リンパ腫、血管内大B細胞リンパ腫、縦隔大B細胞リンパ腫、重鎖疾患γ、μ及びα疾患を含む、免疫抑制剤による治療で誘導されるリンパ腫、例えばシクロスポリン誘導性リンパ腫、及びメトトレキセート誘導性リンパ腫、である、請求項73に記載の方法。請求項1乃至45又は60乃至67のいずれか1つに記載の抗体、組成物、免疫複合体、又は二重特異的分子、請求項94乃至97のいずれか1つに記載の発現ベクタ、を、CD20発現免疫細胞が関与する免疫疾患を治療又は予防するために有効量、対象に投与するステップを含む、前記免疫疾患を治療又は予防する方法。治療法が、自己抗原に対する抗体を産生するB細胞の致死を含む、請求項80に記載の方法。前記疾患又は異常が、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、腎炎、湿疹、喘息、アテローム性硬化症、白血球接着不全、多発性硬化症、レイノー症候群、シェーグレン症候群、若年発症性糖尿病、ライター病、ベーチェット病、免疫複合体腎炎、IgAニューロパチー、IgM多発性神経炎、免疫媒介血小板減少症、例えば急性特発性血小板減少性紫斑病及び慢性特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、グレーブズ病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性感染性単核細胞症、HIV、及び疱疹ウィルス関連疾患、から成る群より選択される、請求項73に記載の方法。前記自己免疫疾患がリウマチ性関節炎RAである、請求項82に記載の方法。前記疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病、若年発症性糖尿病、多発性硬化症、免疫媒介性血小板減少症、例えば急性特発性血小板減少紫斑病及び慢性特発性血小板減少紫斑病、溶血性貧血、筋無力症、全身性硬化症、及び尋常性天疱瘡から選択される炎症性、免疫及び/又は自己免疫異常である、請求項73に記載の方法。前記疾患が、炎症性腸疾患IBD、潰瘍性結腸炎、クローン病、及び多発性硬化症から選択される炎症性、免疫及び/又は自己免疫異常である、請求項73に記載の方法。別の治療薬を対象に別々に投与するステップをさらに含む、請求項70乃至85のいずれか1つに記載の方法。前記治療薬が細胞傷害性作用薬又は放射毒性作用薬である、請求項86に記載の方法。前記治療薬が免疫抑制剤である、請求項86に記載の方法。前記治療薬が、例えばサイトカイン又はケモカインなど、免疫調節性作用薬である、請求項86に記載の方法。前記治療薬が、ドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、及びシクロホスファミドから成る群より選択される、請求項86に記載の方法。前記治療薬が、抗CD25抗体、抗CD19抗体、抗CD21抗体、抗CD22抗体、抗CD37抗体、抗CD38抗体、抗IL6R抗体、抗IL8抗体、抗IL15抗体、抗IL15R抗体、抗CD4抗体、抗CD11a抗体、抗アルファ4ベータ1インテグリン抗体、CTLA4Ig及び抗C3b抗体から成る群より選択される、請求項86に記載の方法。試料中のCD20抗原又はCD20発現細胞の存在を検出するためのinvitro法であって、前記試料を、請求項1乃至45のいずれか1つに記載の抗体に、前記抗体とCD20との間の複合体形成が可能な条件下で接触させるステップと、複合体の形成を検出するステップとを含む、方法。試料中のCD20抗原又はCD20発現細胞の存在を検出するための、請求項1乃至45のいずれか1つに記載の抗体を含む、キット。対象においてCD20抗原又はCD20発現細胞の存在を検出するためのinvivo法であって、請求項1乃至45のいずれか1つに記載の抗体を、前記抗体とCD20との間の複合体形成が可能な条件下で投与するステップと、形成された複合体を検出するステップとを含む、方法。ヒトCD20に結合するヒト抗体の軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖の両方の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクタ。ヒトCD20に結合するヒト抗体の軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖の両方の定常をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項95に記載の発現ベクタ。配列番号1、5、及び9に記載された通りのヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチドを含む重鎖可変領域と、配列番号3、7、及び11に記載された通りのヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域とをコードするヌクレオチド配列、及び、それらの保存的改変を含む発現ベクタ。配列番号2、6、及び10に記載された通りのアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号4、8、及び12に記載された通りのアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とをコードするヌクレオチド配列、及び、それらの保存的配列改変を含む発現ベクタ。請求項95乃至98のいずれか1つに記載の発現ベクタと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。請求項1乃至45のいずれか1つの抗体に結合する抗イディオタイプ抗体。2F2、11B8又は7D8に結合する抗イディオタイプ抗体。試料中において、CD20に対するヒトモノクローナル抗体のレベルを検出するための、請求項100又は101に記載の抗イディオタイプ抗体の使用。本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び請求項から明白となるであろう。発明の詳細な説明本発明は、CD20発現細胞が関与する多種の異常を治療及び診断するための優れた抗体ベースの治療法を提供するものである。本発明の治療法は、CD20上に存在するエピトープに特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体を利用する。本発明に包含される単離されたヒトモノクローナル抗体には、IgA、IgG14、IgE、IgM、及びIgD抗体がある。ある実施態様では、本ヒト抗体はIgG1抗体、より具体的にはIgG1κ、又はIgG1、λアイソタイプである。別の実施態様では、本ヒト抗体はIgG3抗体、より具体的にはIgG3、又はIgG3、λアイソタイプである。さらに別の実施態様では、本ヒト抗体はIgG4抗体、より具体的にはIgG4、κ又はIgG4、λアイソタイプである。さらに別の実施態様では、本ヒト抗体はIgA1又はIgA2抗体である。さらに別の実施態様では、本ヒト抗体はIgM抗体である。ある実施態様では、本ヒト抗体は、VDJ組換え及びアイソタイプスイッチングを起こすことにより、CD20に対して複数のアイソタイプの抗ヒトモノクローナル抗体を産生することのできる、トランスジェニックマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物で産生される。従って、本発明の局面は、抗体、その抗体フラグメント及び医薬組成物だけでなく、モノクローナル抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物、B細胞、ホスト細胞トランスフェクトーマ、及びハイブリドーマを包含するものである。このようなトランスジェニック動物は、さらに、US20030017534に開示されたものなどのポリクローナル抗体を産生するためのトランスジェニックウサギであってもよい。従って、さらに本発明は、CD20に特異的に結合するヒトポリクローナル抗体も包含する。ある実施態様では、本発明は、i位置172にアミノ酸残基プロリンを含まない又は要さない;ii位置170のアミノ酸残基アラニン又は位置172のプロリンを含まない又は要さない;iii位置163のアミノ酸残基アスパラギン及び位置166のアスパラギンを含まない又は要さない;iv位置172のアミノ酸残基プロリンを含まない又は要さないが、位置163のアミノ酸残基アスパラギン及び位置166のアスパラギンを含む又は要する;あるいはv位置170のアミノ酸残基アラニン又は位置172のプロリンを含まない又は要さないが、位置163のアミノ酸残基アスパラギン及び位置166のアスパラギンを含む又は要する、ようなCD20上のエピトープに結合するポリクローナル抗体に関する。別の実施態様では、本発明は、以下の特徴:i変異型P172SCD20位置172のプロリンがセリンに変異しているに、ヒトCD20に対するのと少なくとも同じ親和性で結合する;ii変異型AxP位置170のアラニンがセリンに変異し、位置172のプロリンがセリンに変異しているに、ヒトCD20に対するのと少なくとも同じ親和性で結合する;iii抗体濃度が10μgmlのときに、ヒトCD20に対し、変異型N166D位置166のアスパラギンがアスパラギン酸に変異しているに対して50以上の少ない結合を示す;及び/又はiv抗体濃度が10μgmlのときに、ヒトCD20に比較して、変異型N163D位置163のアスパラギンがアスパラギン酸に変異しているに対して50以上の少ない結合を示す:のうちの1つ以上を有するヒトポリクローナル抗体に関する。さらに別の実施態様では、本発明は、ヒトCD20の小さな第一細胞外ループ中のエピトープに結合するヒトポリクローナル抗体に関する。さらに別の実施態様では、本発明は、CD20上の不連続なエピトープに結合するヒトポリクローナル抗体も包含する。更なる実施態様では、本発明は、第一の小さな細胞外ループの部分と、第二の細胞外ループの部分とを有する、CD20上の不連続なエピトープに結合するヒトポリクローナル抗体に関する。更なる実施態様では、本発明は、小さな第一の細胞外ループの残基AGIYAPと第二の細胞外ループの残基MESLNFIRAHTPYIとを有するCD20上の不連続なエピトープに結合するヒトポリクローナル抗体に関する。本発明の抗体を用いてCD20発現細胞を検出する方法は本発明に包含される。本発明の抗体を用いて、例えば増殖及び/又は分化活性などのCD20誘導性活性を遮断又は阻害する方法もさらに提供され、また腫瘍原性疾患例えばB細胞リンパ腫及び自己免疫疾患例えばRA、クローン病及びウェグナー肉芽腫症などのCD20関連異常の治療にも有用である。本発明をより容易に理解できるように、いくつかの用語をまず定義する。更なる定義は、詳細な説明全般に記載されている。用語CD20及びCD20抗原はここでは交換可能に用いられており、細胞によって天然で発現する、又はCD20をトランスフェクトした細胞で発現するヒトCD20のあらゆるバリアント、アイソフォーム及び種相同体を包含するものである。本発明の抗体のCD20抗原への結合により、CD20発現細胞例えば腫瘍細胞の致死が、CD20を失活させることにより、媒介される。CD20発現細胞の致死は、以下の機序:CD20発現細胞の補体媒介性細胞傷害性CDC;CD20発現細胞のアポトーシス;CD20発現細胞のエフェクタ細胞貪食;又はCD20発現細胞のエフェクタ細胞抗体依存性細胞傷害性ADCCのうちの1つ以上で起きるであろう。当業で認識されるCD20の同義語には、Bリンパ球抗原CD20、Bリンパ球表面抗原B1、Leu16、Bp35、BM5、及びLF5、がある。ここで用いられる場合の用語成長を阻害する細胞に言及するなどとは、例えば細胞培養の成長の、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、99、又は100の阻害など、抗CD20抗体に接触させたときに、抗CD20抗体に接触していない同じ細胞の成長に比較して、細胞成長のいずれかの測定可能な減少を包含するものと意図されている。このような細胞成長の減少は、エフェクタ細胞貪食、ADCC、CDC、及び/又はアポトーシスなど、多種ある機序のいずれによっても起き得る。用語ラフトとは、細胞の細胞膜の外側の小葉区域に位置するスフィンゴ脂質及びコレステロールを豊富に含む膜微小ドメインを言う。タンパク質がこのようなドメインに結合する能力により、そのタンパク質は機能を果たすことができる。例えば、CD20分子、本発明の抗体に結合後に脂質ラフトに転位すると、高密度のCD20抗原-抗体複合体が細胞膜に生じる。このような高密度のCD20抗原-抗体複合体により、CDC中の補体形の効率的な活性化が可能となる。ここで用いられる場合の用語抗体とは、全抗体及びそのいずれかの抗原の結合フラグメント即ち抗原結合部分又は一本鎖を包含するものである。抗体とは、ジスルフィド結合により相互に接続された少なくとも2つの重H鎖及び2つの軽L鎖とを含む糖タンパク質を言う。各重鎖は、重鎖可変領域ここではVHと省略する及び重鎖定常領域とから成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域ここではVLと省略する及び軽鎖定常領域とから成る。前記VH及びVL領域はさらに、より保存されたフレームワーク領域FRと呼ばれる領域に散在する相補性決定領域CDRと呼ばれる超可変領域に小さく分割することができる。各VH及びVLは、3つのCDR及び4つのFRが、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端まで並んだものから成る。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の多種の細胞例えばエフェクタ細胞や伝統的補体系の第一コンポーネントC1qを含むホスト組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介しているようである。抗体の抗原結合部分又は単に抗体部分という用語は、ここで用いる場合、抗体のうちで、抗原例えばCD20に対する特異的結合能を維持した1つ以上のフラグメントを言う。抗体の抗原結合機能は完全長抗体のうちの数フラグメントに行わせることができることが示されている。抗体の抗原結合部分という用語に包含される結合フラグメントの例には、iVL、VH、CL及びCH1ドメインから成る一価のフラグメントであるFabフラグメント;iiヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントから成る二価のフラグメントであるFNature341544546;及びvi単離された相補性決定領域、及びvii選択的に合成のリンカで接合してもよい2つ以上の単離されたCDRの組合せ、がある。さらに、Fvフラグメントの2つのドメインVL及びVHは別々の遺伝子にコードされているが、これらは、VL及びVH領域が対を成して一価の分子を形成するような一個のタンパク質鎖に作製できるようにする合成リンカーにより、組換え法を用いて接合することができる一本鎖FvscFvとして知られる;例えばBirdetalScience242423426andHustonetalProcNatlAcadSciUSA8558795883を参照されたい。このような一本鎖抗体もまた、抗体の抗原結合部分という用語に包含されるものと、意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、それらのフラグメントを、インタクト抗体と同じ態様で実用性についてスクリーニングされている。更なる例は、i免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド、iiヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖CH2定常領域、及びiiiCH2定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖CH3定常領域、を含め結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは重鎖可変領域でも、又は軽鎖可変領域でもよい。前記結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、さらに、US20030118592及びUS20030133939に開示されている。これらの抗体フラグメントを、当業者に公知の従来技術を用いて得、それらのフラグメントを、インタクト抗体と同じ態様で実用性の点でふるいにかける。用語エピトープは、抗体に特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群から成り、通常は特異的な三次元構造上の特徴や、特異的な電荷上の特徴を有する。コンホメーション的及び非コンホメーション的エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないことで区別される。用語不連続なエピトープとは、ここで用いられる場合、あるタンパク質の一次配列中の少なくとも2つの別々の領域から形成される、このタンパク質抗原上のコンホメーション的エピトープを意味する。用語二重特異的分子は、2つの異なる結合特異性部分を有する、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質もしくはペプチド複合体など、あらゆる作用物質を包含することを意図している。例えば当該分子は、a細胞表面抗原及びbエフェクタ細胞の表面上のFc受容体、に結合又は相互作用してもよい。用語多重特異的分子又はヘテロ特異的分子は、3つ以上の異なる結合特異性部分を有する、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質もしくはペプチド複合体など、あらゆる作用物質を包含することを意図している。例えば当該分子は、a細胞表面抗原、bエフェクタ細胞の表面上のFc受容体、及びc少なくとも一つの他の成分、に結合又は相互作用してもよい。従って本発明は、限定はしないが、CD20などの細胞表面抗原を狙った、そしてエフェクタ細胞上のFc受容体などの他の標的を狙った二重特異的、三重特異的、四重特異的、及び他の多重特異的分子を包含する。用語二重特異抗体はジアボディも含む。ジアボディはVH及びVLドメインが一個のポリペプチド鎖上に発現しているが、この同じ鎖上の2つのドメインの間で対を成すには短すぎるリンカを用いることで、これらドメインを別の鎖の相補ドメインと対を成させて、2つの抗原結合部位を生じるようにした二価の二重特異的な抗体であるProcNatlAcadSciUSA9064446448PoljakRJetalStructure211211123。用語ヒト抗体誘導体とは、例えば抗体と別の作用物質又抗体との結合体など、当該抗体のいずれかの改変形を言う。ここで用いられる、あるヒト抗体がある特定の生殖細胞系配列を由来とするとは、この抗体がヒト免疫グロブリン配列を用いたある形から、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子を持つトランスジェニックマウスを免疫したり、あるいは、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングするなどにより、得られた場合であり、但しこの場合、当該の所定のヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされたアミノ酸配列に対し、アミノ酸配列において少なくとも90、より好ましくは少なくとも95、さらにより好ましくは少なくとも96、97、98、又は99、同一である。典型的には、ある特定のヒト生殖細胞系配列を由来とするヒト抗体は、この生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされたアミノ酸配列に対して10個以下のアミノ酸の違い、より好ましくは5個以下、又はさらにより好ましくは4個以下、3個以下、2個以下、又は1個以下のアミノ酸の違いを示すであろう。ここで用いられる場合の用語ヘテロ抗体とは、そのうちの少なくとも2つが異なる特異性部分を有するような、一緒に連結された2つ以上の抗体、その誘導体又は抗原血業領域を言う。これらの異なる特異性部分には、エフェクタ細胞上のFc受容体に対する結合特異性部分と、腫瘍細胞などの標的細胞上の抗原又はエピトープに対する結合特異性部分とが含まれる。用語ヒト抗体は、ここで用いられる場合、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列を由来とする可変及び定常領域を有する抗体を包含するものと、意図されている。本発明のヒト抗体には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基が含まれていてもよい例えばinvitroでのランダムもしくは部位特異的変異誘発法、又は、invivoでの体細胞変異法による。しかしながら、用語ヒト抗体は、ここで用いられる場合、マウスなどの別の哺乳動物種を由来とするCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植されているような抗体を包含するものとは意図されていない。ここで用いる用語モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体組成物とは、単一の分子組成から成る抗体分子の製剤を言う。モノクローナル抗体組成物は単一の結合特異性及び親和性を特定のエピトープに対して示す。従って、用語ヒトモノクローナル抗体とは、単一の結合特異性を示すと共に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を由来とする可変領域及定常領域を有するような抗体を言う。ある実施態様では、本ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスなどの非ヒトトランスジェニックもしくはトランスクロモゾマル動物から得たB細胞を、不死化細胞に融合させて含むハイブリドーマにより産生される。用語組換えヒト抗体は、ここで用いられる場合、組換え手段により調製された、発現した、創出された又は単離されたあらゆる抗体を包含し、例えばaヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック又はトランスクロモゾマルの動物例えばマウス又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体下の項Iにさらに解説する、b例えばトランスフェクトーマなど、当該抗体を発現するように形質転換されたホスト細胞から単離された抗体、c組換えの、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、及びdヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングが関与するいずれかの他の手段により調製された、発現した、創出された又は単離された抗体、である。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を由来とする可変及び定常領域を有する。しかしながら、いくつかの実施態様では、このような組換えヒト抗体に、invitro変異誘発を行って又はヒトIg配列にういてトランスジェニックな動物を用いる場合はinvivo体細胞変異誘発を行って、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系VH及びVL配列を由来とする及び関連しながらも、invivoヒト抗体生殖細胞系レポートリー内に天然では存在しないであろう配列にすることができる。用語トランスフェクトーマは、ここで用いる場合、例えばCHO細胞、NS0細胞、HEK293細胞、植物細胞、又は酵母細胞を含む真菌など、本抗体を発現する組換え真核性ホスト細胞を包含する。ここで用いる場合の異種抗体は、このような抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物との関連から定義される。この用語は、非ヒトトランスジェニック動物を構成しない生物に見られるものに相当するアミノ酸配列又はコーディング核酸配列を有する抗体であって、一般的には非ヒトトランスジェニック動物のそれ以外の種を由来とする抗体を言う。ここで用いられるヘテロハイブリッド抗体とは、異なる生物由来の軽鎖及び重鎖を有する抗体を言う。例えば、ヒト重鎖をマウス軽鎖に結合させて有する抗体がヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例には、上に解説したキメラ抗体及びヒト化抗体がある。ここで用いる単離された抗体とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を言うものと、意図されている例えばCD20に特異的に結合する単離された抗体は、CD20以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。しかしながら、ヒトCD20のエピトープ、アイソフォーム又はバリアントに特異的に結合する単離された抗体であれば、例えば他の種由来など例えばCD20の種相同体、他の関連する抗原に対して交差反応性を有するであろう。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び/又は化学物質を実質的に含まないであろう。本発明のある実施態様では、異なる特異性を有する単離されたモノクローナル抗体の組合せを、良く定義された組成で組み合わせる。ここで用いる特異的結合とは、所定の抗原への抗体の結合を言う。典型的には、本抗体は約1×107M1の以下のKDに相当する親和性で結合し、所定の抗原に対しては、前記所定の抗原又は関係の近い抗原以外の非特異的な抗原例えばBSA、カゼインに対するその結合親和性よりも少なくとも2倍高いKDに相当する親和性で結合する。文言抗原を認識する抗体及び抗原に特異的な抗体はここでは用語抗原に特異的に結合する抗体と交換可能に用いられている。ここで用いられる用語kdsec1とは、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数を言うものと、意図されている。前記数値は、koff値とも言及される。ここで用いられる用語kaM1xsec1とは、特定の抗体-抗原相互作用の結合速度定数を言うものと、意図されている。ここで用いる用語KDMとは、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を言うものと、意図されている。ここで用いる用語KAM1とは、特定の抗体-抗原相互作用の結合平衡定数を言うものと、意図されており、kaをkdで除算することにより得られる。ここで用いられるアイソタイプとは、重鎖定常領域遺伝子にコードされた抗体クラス例えばIgM又はIgG1を言う。ここで用いるアイソタイプスイッチングとは、抗体のクラス、又はアイソタイプ、が、あるIgクラスから他のIgクラスのうちの一つに変化する現象を言う。ここで用いるスイッチングのないアイソタイプとは、アイソタイプスイッチングが起きないときに産生される重鎖のアイソタイプクラスを言い、スイッチングのないアイソタイプをコードするCH遺伝子は、典型的には、機能上の再編成の起きるVDJ遺伝子のすぐ下流の一番目にあるCH遺伝子である。アイソタイプスイッチングは、古典的もしくは非古典的なアイソタイプスイッチングに分類されてきた。古典的なアイソタイプスイッチングは、導入遺伝子中の少なくとも一つのスイッチ配列が関与する組換え事象により起きるものである。非古典的アイソタイプスイッチングは、例えばヒトσμとヒトΣμとの間の相同組換えδ関連欠失などで起きることがある。その他の非古典的スイッチング機序、なかでも例えば導入遺伝子間及び/又は染色体間の組換えなどがあると、アイソタイプスイッチングが起きることがある。ここで用いる用語スイッチ配列とは、スイッチ組換えを担うDNA配列を言う。スイッチドナー配列は典型的にμスイッチ領域であり、スイッチ組換えの際に欠失するコンストラクト領域の5側即ち上流にある。スイッチアクセプター領域は、欠失するコンストラクト領域と、置換定常領域例えばγ、ε、等との間にあるであろう。組換えが必ず起きるという特定の部位はないため、最終的な遺伝子配列は、コンストラクトからは予測できないことが多いであろう。ここで用いる糖付加パターンは、タンパク質、より具体的には免疫グロブリンタンパク質、に共有結合する糖単位のパターンであると定義しておく。ある異種抗体の糖付加パターンが、導入遺伝子のCH遺伝子の由来となった種よりも当該の非ヒトトランスジェニック動物の種の糖付加パターンの方により似ていると当業者が認識するのであれば、この異種抗体の糖付加パターンを、前記非ヒトトランスジェニック動物の種の産生する抗体に天然で起きる糖付加パターンに実質的に似ていると特徴付けることができる。ある物質に対してここで用いられる用語天然で発生するとは、物質が自然界に見られる事実を言う。例えば、ウィルスを含む生物中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列であって、天然にある源から分離でき、実験室で人間により意図的な改変を加えられていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は天然で発生したものである。ここで用いる用語再編成されるとは、Vセグメントが、DJ又はJセグメントのすぐ隣に位置することで、それぞれ完全VH又はVLドメインを実質的にコードするコンホメーションとなるような重鎖又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を言う。再編成の起きた免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞DNAに比較することで特定でき、再編成の起きた遺伝子座は少なくとも一つの組換えられた7量体/9量体相同配列を有するであろう。Vセグメントに関してここで用いる用語再編成のない又は生殖細胞系の立体配置とは、Vセグメントが組換えられておらず、D又はJセグメントのすぐ隣にあるような立体配置を言う。ここで用いる用語核酸分子には、DNA分子及びRNA分子が包含されるものと、意図されている。核酸分子は一本鎖でも、又は二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。CD20に結合する全抗体又は抗体部分例えばVH、VL、CDR3などをコードする核酸分子に関してここで用いる用語分離された核酸分子とは、当該のインタクト抗体又は抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、CD20以外の抗原に結合する抗体又は抗体部分をコードする、天然ではヒトゲノムDNA中で当該核酸をフランクしているであろう他のヌクレオチド配列を含まないような核酸分子を言うものと、意図されている。ある実施態様では、本ヒト抗CD20抗体は、2F8、7D8、又は11B8のヌクレオチド又はアミノ酸配列や、それぞれ配列番号1、5、又は9及び配列番号3、7、又は11に示された配列を有する重鎖VH及び軽鎖VL可変領域を含む。ここに開示及び請求するように、配列番号1-30に示す配列は、保存的配列改変、即ち、当該ヌクレオチド配列にコードされた、又は、当該アミノ酸配列を含有する、抗体の結合特性に有意に影響しない又は変化させないようなヌクレオチド及びアミノ酸配列改変を包含する。このような保存的配列改変には、ヌクレオチド及びアミノ酸の置換、付加及び欠失、がある。また、例えば部位指定変位誘発法及びPCR媒介変異誘発法など、当業で公知の標準的な技術によっても、配列番号1-30に改変を導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当業で定義されている。これらのファミリーには、塩基性の側鎖を持つアミノ酸例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン、酸性の側鎖を持つアミノ酸例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、無電荷の極性側鎖を持つアミノ酸例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン、非極性の側鎖を持つアミノ酸例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、ベータ分枝側鎖を持つアミノ酸例えばスレオニン、バリン、イソロイシン及び芳香族側鎖を持つアミノ酸例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、がある。このように、ヒト抗CD20抗体の中で予測される重要でないアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基に置換することが好ましい。さらに本発明は、前記のアミノ酸残基のうちの1つ以上が、前記アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に大きく影響する又は変えることなく、アシル化又は糖付加などにより誘導体化されているような、配列番号1-30に記載した通りのアミノ酸配列の誘導体や、その保存的配列改変も包含する。さらに本発明は、本抗体の機能的又は薬物動態上の特性を変えるために、Fc領域中に変更が行ってある抗体も包含する。このような変更の結果、C1qの結合やCDCの減少又は増加、あるいは、FcγRの結合及びADCCの減少又は増加がもたらされるであろう。置換を、例えば、重鎖定常領域の位置234、235、236、237、297、318、320及び322のアミノ酸残基の1つ以上で行うことで、未改変の抗体に比較して抗原への結合能を維持したままエフェクタ機能を変えることができる。US5624821及びUS5648260を参照されたい。本抗体のinvivo半減期を、当該のIg定常ドメイン又はIg様定常ドメインのサルベージ受容体エピトープを改変することで、当該分子がインタクトCH2ドメイン又はインタクトIgFc領域を含まないようにしても、向上させることもできる。US6121022及びUS6194551を参照されたい。invivo半減期はさらに、例えば位置252のスレオニンをロイシンに置換したり、位置254のスレオニンをセリンに置換したり、あるいは位置256のスレオニンをフェニルアラニンに置換するなど、Fc領域で変異を起こさせることで、増加させることができる。US6277375を参照されたい。さらに、本抗体のエフェクタ機能を変えるために、本抗体の糖付加パターンを改変することができる。例えば、Fc領域の位置297のAsnに通常付着させられるフコース単位を加えないトランスフェクトーマで本抗体を発現させることができ、それによりFcγRIIIに対するFc領域の親和性が高まり、ひいては、NK細胞の存在下での本抗体のADCCが増加するであろうShieldetalJBC27726733を参照されたい。さらに、糖付加の改変はCDCを改変するためにも行うことができる。代替的には、別の実施態様では、飽和変異誘発法などにより、抗CD20抗体コーディング配列の全部又は一部にわたって変異をランダムに導入することができ、その結果得られる改変された抗CD20抗体を結合活性についてふるいわけすることができる。従って、ここで開示された重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド配列にコードされた、及び/又は、ここに開示された即ち、配列番号1-30重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を含有する、抗体には、保存的に改変された同様な配列にコードされているか、又は、含有する、実質的に同様な抗体が含まれる。このような実質的に同様な抗体を配列番号1-30としてここに開示された部分的即ち重鎖及び軽鎖可変領域配列に基づいてどのように作製できるかに関する更なる議論を、以下に提供する。核酸の場合、用語実質的な相同性は、最適にアライメントして比較した場合の2つの核酸又はそのうちの指示した配列が、適当なヌクレオチド挿入又は欠失がありながらも、ヌクレオチドの少なくとも約80、通常はヌクレオチドの少なくとも約90乃至95、そしてより好ましくは少なくとも約98乃至995、同一であることを指すものである。代替的には、数セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で当該鎖の相補配列にハイブリダイズするときに、実質的な相同性が存在することとする。ヌクレオチド及びアミノ酸配列の場合、用語相同性は、適当な挿入又は欠失に対して最適にアライメント及び比較したときに、2つの核酸又はアミノ酸配列同士の間の同一性の程度を指す。代替的には、数DNAセグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で当該鎖の相補配列にハイブリダイズするときに、実質的な相同性が存在することとする。二つの配列間のパーセント同一性は、これら二つの配列を最適にアライメントするのに導入せねばならないギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れたときの、これら配列に共通の同一位置の数の関数である即ち、相同性=同一位置の数/位置の総数×100。二つの配列間の配列の比較及びパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例に解説するように、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。二つのヌクレオチド間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージhttpwwwgcgcomで入手できるのGAPプログラムを用い、NWSgapdnaCMP行列を用いて、ギャップウェイトを40、50、60、70、又は80にし、そしてレングスウェイトを1、2、3、4、5、又は6にして決定することができる。二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、ALIGNプログラムバージョン20に組み込まれたEマイヤース及びWミラーのアルゴリズムを用い、PAM120ウェイト残基表を用いて、ギャップレングスペナルティを12、そしてギャップペナルティを4にして、決定することもできる。さらに、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージhttpwwwgcgcomで入手できるのGAPプログラムに組み込まれたニードルマン及びワンシュ444453のアルゴリズムを用い、Blossum62行列又はPAM250行列のいずれかを用いて、ギャップウェイトを16、14、12、10、8、6、又は4にし、レングスウェイトを1、2、3、4、5、又は6にして、決定することができる。さらに本発明の核酸及びタンパク質の配列をクエリー配列として利用して、公開データベースの検索を行って、例えば関連する配列を同定することなどができる。このような検索は、AltschuletalJMolBiol21540310のNBLAST及びXBLASTプログラムバージョン20を利用すれば行える。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラムを用い、スコア100、ワード長12にして行うと、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラムを用い、スコア50、ワード長3にして行うと、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップのあるアライメントを行うには、GappedBLASTをAltschuletalNucleicAcidsRes2533893402が解説する通りに利用できる。BLAST及びギャップドBLASTプログラムを利用する場合、各プログラムの例えばXBLAST及びNBLASTのデフォルトパラメータを利用できる。httpwwwncbinlmnihgovを参照されたい。当該核酸は全細胞中にあっても、細胞ライセート中にあっても、又は部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形で存在してもよい。核酸は、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動法、及び当業で公知の他の技術を含む標準的な技術により、例えば他の細胞内核酸又はタンパク質など、他の細胞成分又は他の混入物質を取り除いて精製されている場合に、分離されている又は実質的に純粋であることになる。FAusubeletaledCurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenePublishingandWileyInterscienceNewYorkを参照されたい。cDNA、ゲノム又は混合物由来である本発明の核酸組成物は、しばしば天然配列改変された制限部位等を除きのままであり、遺伝子配列を提供する標準的技術に従って変異させてもよい。コーディング配列の場合、これらの変異は、必要に応じアミノ酸配列を左右するものでもよい。具体的には、ここで解説した天然V、D、J、定常、スイッチ及び他のこのような配列に実質的に相同又は由来とするDNA配列が考えられる由来するが、ある配列が別の配列と同一か、もしくは別の配列から改変されていることを指す場合。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに作動的に連結されたことになる。例えば、あるプロモータ又はエンハンサが、あるコーディング配列の転写を左右するのであれば、その配列に作動的に連結されていることになる。転写制御配列に関する場合、作動的に連結されたとは、連結しようとするDNA配列が連続していることを意味し、また2つのタンパク質コーディング領域を接合するために必要な場合には、連続し、かつ読み取り枠内にあることを意味する。スイッチ配列の場合には、作動的に連結された、とは、当該配列がスイッチ組換えを起こし得ることを指す。ここで用いる用語ベクタとは、連結された先の別の核酸を輸送できる核酸分子を言うものと、意図されている。ベクタの一種が、付加的なDNAセグメントを連結できる環状の二本鎖DNAループを言うプラスミドである。ベクタのもう一つの種類がウィルスベクタであり、この場合、付加的なDNAセグメントは、ウィルスゲノム内に連結させることができる。いくつかのベクタは導入された先のホスト細胞内で自律的複製が可能である例えば細菌由来の複製開始点を有する細菌ベクタや、エピソームほ乳類ベクタなど。他のベクタ例えば非エピソームほ乳類ベクタなどは、ホスト細胞に導入されるや、ホスト細胞のゲノムに組み込まれるため、ホストゲノムと一緒に複製される。さらに、いくつかのベクタは、作動的に連結された先の遺伝子の発現を命令することができる。このようなベクタをここでは組換え発現ベクタ又は単に発現ベクタと呼ぶ。一般的に、組換えDNA技術で実用性のある発現ベクタは、しばしばプラスミドの形である。本明細書では、プラスミドが最も普通に用いられている形のベクタであるため、プラスミド及びベクタを交換可能に用いている場合がある。しかしながら、本発明には、例えばウィルスベクタ例えば複製欠陥レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ随伴ウィルスなど、同等の機能を果たす他の形のこのような発現ベクタも包含されることが、意図されている。ここで用いる用語組換えホスト細胞又は単にホスト細胞とは、組換え発現ベクタが導入された細胞を言うものと、意図されている。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も言うものと意図されていることは、理解されねばならない。突然変異又は環境による影響が原因で、特定の改変が継代に起きる場合があるため、このような後代は実際には親細胞と同一でないかも知れないが、それでも尚、ここで用いる用語ホスト細胞の範囲内に含まれる。組換えホスト細胞には、例えば、CHO細胞、NS0細胞及びリンパ球がある。ここで用いられる場合の用語対象には、あらゆるヒト又は非ヒトの動物が含まれる。用語非ヒト動物には、例えばヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類等、ほ乳類及び非ほ乳類などのあらゆる脊椎動物が含まれる。用語トランスジェニックの非ヒト動物とは、一つ以上のヒト重鎖及び/又は軽鎖導入遺伝子又はトランスクロモソームをその動物の天然のゲノムDNAに組み込ませて又は組み込ませずに含むゲノムを有すると共に、完全ヒト抗体を発現することのできる非ヒト動物を言う。例えば、トランスジェニックマウスは、当該マウスがCD20抗原及び/又はCD20発現細胞で免疫されたときにヒト抗CD20抗体を産生するように、ヒト軽鎖導入遺伝子と、ヒト重鎖導入遺伝子又はヒト重鎖トランスクロモソームとを有することができる。該ヒト重鎖導入遺伝子はマウスの染色体DNAに、例えばHCo7又はHCo12マウスなどのHuMAbマウスなどのトランスジェニックの場合と同様に組み込むことができ、あるいは、当該のヒト重鎖導入遺伝子を、WO0243478に解説された通りのトランスクロモソーマル例えばKMマウスの場合と同様に染色体外に維持することもできる。このようなトランスジェニック及びトランスクロモソーマルマウスは、VDJ組換え及びアイソタイプスイッチングを起こすことにより、CD20に対して複数のアイソタイプ例えばIgG、IgA及び/又はIgEのヒトモノクローナル抗体を産生することができる。本発明の多様な局面を以下の小項でさらに詳述する。I.CD20に対するヒト抗体の作製本発明のモノクローナル抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばKohlerandMilsteinNature256495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術など、を含む多様な技術により作製できる。体細胞ハイブリダイゼーション法が基本的には好適であるが、モノクローナル抗体を作製する他の技術、例えばBリンパ球のウィルス又は腫瘍形成性形質転換や、ヒト抗体遺伝子のライブラリを用いたファージディスプレイ技術など、も利用できる。ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための好適な動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は大変よく確立された手法である。融合用の免疫化脾細胞の免疫プロトコル及び単離のための技術は当業で公知である。融合相手例えばマウス骨髄腫細胞及び融合法も公知である。ある好適な実施態様では、CD20を狙ったヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を持つトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルマウスを用いて作製できる。これらのトランスジェニック及びトランスクロモソームマウスには、ここでそれぞれHuMAbマウス及びKMマウスと呼ばれるマウスが含まれ、まとめてここではトランスジェニックマウスとよばれる。HuMAbマウスは、再編成していないヒト重鎖μ及びγ及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子最小遺伝子座を、内因性のμ及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的設定された変異と一緒に含有するLonbergNetalNature368856859。従って、当該マウスは低いマウスIgM又はκ発現を示し、免疫処理に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子がクラススイッチング及び体細胞変異を起こして高親和ヒトIgGκモノクローナル抗体を産生する上記のLonbergNetal;LonbergNHandbookofExperimentalPharmacology11349101にレビュー;LonbergNandHuszarDInternRevImmunolVol136593andHardingFandLonbergNAnnNYAcadSci764536546。HuMAbマウスの調製はTaylorLetalNucleicAcidsResearch2062876295ChenJetalInternationalImmunology5647656TuaillonetalJImmunol15229122920LonbergetalNature368856859LonbergNHandbookofExperimentalPharmacology11349101TaylorLetalInternationalImmunology6579591LonbergNandHuszarDInternRevImmunolVol136593HardingFandLonbergNAnnNYAcadSci764536546FishwildDetalNatureBiotechnology14845851に詳述されている。さらに、すべてLonberg及びKayのUSNos5545806;5569825;5625126;5633425;5789650;5877397;5661016;5814318;5874299;及び5770429や、SuraniらのUS5545807;WO9824884、WO9425585、WO931227、WO9222645、WO9203918及びWO0109187も参照されたい。KMマウスは、ヒト重鎖トランスクロモソーム及びヒトカッパ軽鎖導入遺伝子を含有する。さらにKMマウスにおいては、内因性のマウス重鎖及び軽鎖遺伝子は、このマウスを免疫すると、マウス免疫グロブリンではなくヒト免疫グロブリンが産生するように、破壊されている。KMマウスの作製やそれらを用いてヒト免疫グロブリンを産生させる方法は、WO0243478に詳述されている。免疫処理CD20に対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するためには、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルマウス例えばHCo12、HCo7又はKMマウスを、上記のLonbergNetal上記のFishwildDetal及びWO9824884に解説されたようにCD20抗原の濃縮製剤及び/又はCD20発現細胞で免疫することができる。代替的には、マウスをヒトCD20をコードするDNAでめんえきすることができる。好ましくは、当該マウスは1回目の輸注時に6乃至16週齢であるとよい。例えば、CD20抗原の濃縮製剤5乃至50μgを用いて、HuMAbマウスを腹腔内により免疫することができる。CD20抗原の精製もしくは濃縮製剤を用いた免疫処置でも抗体が生じない場合、細胞株など、CD20発現細胞でマウスを免疫して、免疫応答を促進することもできる。多様な抗原を用いて蓄積した経験では、HuMAbトランスジェニックマウスは、まずCD20発現細胞を完全フロイントアジュバントに入れて腹腔内IP又は皮下SC免疫し、その後PBSにCD20発現細胞を入れて1週置きに最高で合計10回IP免疫処置したときに最も良く応答することが示された。免疫応答は、眼窩後方の採血で得た血漿試料で、免疫プロトコルの経過にわたって観察することができる。血漿はFACS分析以下に解説するようにでスクリーニングすることができ、充分な抗体価の抗CD20ヒト免疫グロブリンを持つマウスを融合に用いることができる。マウスは、と殺及び脾臓の摘出から3日前にCD20発現細胞を静注して追加免疫することができる。各抗原について2乃至3回の輸注を行う必要があるだろうと予測される。CD20に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製CD20に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するには、免疫後のマウスから脾細胞及びリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適した不死化細胞株に融合させることができる。こうして出来たハイブリドーマを次に、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングすることができる。例えば免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単個細胞懸濁液を、50PEGで、P3X63Ag8653非分泌性マウス骨髄腫細胞の数の6分の1に融合させることができる。細胞を平底の微量定量プレートに約2×105になるようにプレートし、20ウシクローン血清、18653調整培地、5オリゲンIGEN社、4mMLグルタミン、1mMLグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、5mMHEPES、0055mM2メルカプトエタノール、50単位mlペニシリン、50mgmlストレプトマイシン、50mgmlゲンタマイシン及び1×HATScience2291202。例えばある実施態様では、ヒト抗体遺伝子などの目的の遺伝子を、WO8704462、WO8901036及びEP338841に開示されたGS遺伝子発現系又は当業で公知の他の発現系で用いられるものなど、真核性発現プラスミドなどの発現ベクタ内に連結することができる。クローニングされた抗体遺伝子を持つ精製済みのプラスミドは、CHO細胞、NS0細胞又はHEK293細胞などの真核性ホスト細胞や、あるいは代替的には、植物由来細胞、真菌もしくは酵母細胞のような他の真核細胞に導入することができる。これらの遺伝子を導入するために用いられる方法は、エレクトロポレーション、リポフェクチン、リポフェクタミン又は他のものなど、当業で解説された方法であってよいであろう。これらの抗体遺伝子をホスト細胞に導入後、本抗体を発現している細胞を特定し、選抜することができる。これらの細胞は、その後それらの発現レベルを増幅させ、グレードアップして抗体を産生させることのできるトランスフェクトーマである。組換え抗体は、これらの培養上清及び/又は細胞から単離及び精製することができる。CD20に対するヒトモノクローナル抗体を作製する更なる組換え手段代替的には、クローニングされた抗体遺伝子を、Ecoliなどの微生物など、原核細胞を含む他の発現系で発現させて、一本鎖Fv抗体、藻類や昆虫細胞を作製することができる。さらに、本抗体は、ヒツジ及びウサギからの乳中に、又は、ニワトリの卵中に、又はトランスジェニック植物中になど、非ヒトトランスジェニック動物中に産生させることができる。例えばVermaRetalAntibodyengineeringComparisonofbacterialyeastinsectandmammalianexpressionsystemsJImmunolMeth216165181PollocketalTransgenicmilkasamethodfortheproductionofrecombinantantibodiesJImmunolMeth231147157及びFischerRetalMolecularfarmingofrecombinantantibodiesinplantsBiolChem380825839を参照されたい。インタクト抗体を発現させるための部分的抗体配列の使用抗体は、標的抗原と、主に6番目の重鎖及び軽鎖相補性決定領域CDRに位置するアミノ酸残基を通じて相互作用する。このために、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外側のアミノ酸配列よりも個々の抗体間で多様である。CDR配列は大半の抗体-抗原相互作用を担っているため、特定の天然発生型抗体由来のCDR配列を、異なる特性を持つ異なる抗体由来のフレームワーク領域内に移植した形で含有する発現ベクタを構築することにより、特定の天然発生型抗体の特性を模倣した組換え抗体を発現させることが可能である例えばRiechmannLetalNature332323327JonesPetalNature321522525及びQueenCetalProcNatlAcadSciUSA861002910033を参照されたい。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公共のDNAデータベースから得ることができる。これらの生殖細胞系配列は、B細胞成熟中のVJ接合により形成される、完全に集合した可変遺伝子を含まないこととなるため、成熟抗体遺伝子配列とは異なるであろう。生殖細胞遺伝子配列はまた、高親和二次レパートリ抗体の配列からも、可変領域全体にわたって個々に均一に異なるであろう。例えば、体細胞変異は、フレームワーク領域1のアミノ末端部分と、フレームワーク領域4のカルボキシ末端部分では、あまり頻繁には起きない。さらに、多くの体細胞変異は、本抗体の結合特性を大きくは変化させない。この理由で、もとの抗体のものと同じ結合特性を有するインタクト組換え抗体を作り直すためにも、特定の抗体の全DNA配列を得る必要はないWO9945962を参照されたい。CDR領域にわたる部分的重鎖及び軽鎖配列があれば、この目的には充分であることが多い。この部分的配列を用いて、どの生殖細胞系可変及びジョイニング遺伝子セグメントが、組換えられた抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。次に、この生殖細胞系配列を用いて、可変領域の消失部分を充填する。重鎖及び軽鎖リーダ配列は、タンパク質の成熟中に切断されるため、最終的な抗体の特性には寄与しない。消失配列を加えるために、クローニングされたcDNA配列を合成オリゴヌクレオチドにライゲーション又はPCR増幅法により組み合わせることができる。代替的には、可変領域全体を、一組の短い、重複のあるオリゴヌクレオチドとして合成し、PCR増幅で組合せて、完全に合成の可変領域クローンを作製することもできる。このプロセスは、消失又は含有又は特性の制限部位や、あるいは、特定のコドンの最適化など、いくつかの長所を有する。ハイブリドーマからの重鎖及び軽鎖転写産物のヌクレオチド配列を用いて、重複した組の合成オリゴヌクレオチドをデザインして、天然配列と同一のアミノ酸コーディング能を持つ合成V配列を作製する。合成の重鎖及びカッパ鎖配列は天然の配列と3つの方法で異ならせることができる:オリゴヌクレオチド合成及びPCR増幅が容易に行われるように、反復したヌクレオチド配列の部分に中断を入れる;最適な翻訳開始部位をコザックの法則に従って取り入れる;及びHindIII部位を、該翻訳開始部位の上流に操作する。重鎖及び軽鎖可変領域の両方について、最適化されたコーディング及び対応する非コーディング鎖配列を、対応する非コーディングオリゴヌクレオチドのほぼ中間点で30乃至50ヌクレオチドに分断する。このように、各鎖につき、当該のオリゴヌクレオチドを、150乃至400ヌクレオチドのセグメントに渡す重複する二本鎖の組に組み立てることができる。次にこのプールをテンプレートして用いて、150乃至400ヌクレオチドのPCR増幅産物を作製する。典型的には、一個の可変領域オリゴヌクレオチドの組を2つのプールに分割し、これら2つのプールを別々に増幅して2つの重複するPCR産物を作製することになるであろう。次に、これらの重複する産物をPCR増幅により組み合わせて、完全な可変領域を形成する。さらに、このPCR増幅で、カッパ軽鎖のBbsI部位、又は、ガンマ重鎖のAgeI部位を含む重鎖又は軽鎖定常領域の重複するフラグメントを含有させて、発現ベクタコンストラクト内へ容易にクローニングすることのできるフラグメントを作製するのも好ましいであろう。次に、再構築された重鎖及び軽鎖可変領域を、クローニングされたプロモータ、リーダ配列、翻訳開始、定常領域、3側非翻訳、ポリアデニレーション、及び転写終了、配列を組み合わせて、発現ベクタコンストラクトを形成する。該重鎖及び軽鎖発現コンストラクトは、組み合わせて単一のベクタにすることも、ホスト細胞に同時トランスフェクト、順次トランスフェクト、又は別々のトランスフェクトしてから、このホスト細胞を融合させて、両方の鎖を発現するホスト細胞を形成することもできる。ヒトIgGκのための発現ベクタの構築に用いるプラスミドを以下に解説する。当該のプラスミドは、PCR増幅後のV重鎖及びVカッパ軽鎖cDNA配列を用いて完全な重鎖及び軽鎖最小遺伝子を再構築できるように構築された。これらのプラスミドを用いると、完全ヒト、又はキメラIgG1、κ又はIgG4、κ抗体を発現させることができる。同様なプラスミドは、他の重鎖アイソタイプの発現のためにも、又は、ラムダ軽鎖を含む抗体の発現のためにも、構築することができる。このように、本発明の別の局面では、発明のヒト抗CD20抗体、例えば11B8、2F2、又は7D8、の構造上の特徴を用いて、例えばCD20に結合するなど、本発明の抗体の少なくとも1つの機能特性を維持した構造上関連するヒト抗CD20抗体を創出する。より具体的には、2F2、7D8、又は11B8の1つ以上のCDR領域を組換えにより公知のヒトフレームワーク領域及びCDRに組み合わせると、付加的な、組換え操作された本発明のヒト抗CD20抗体を創出することができる。従って、別の実施態様では、本発明は、抗体を調製するステップを含む、抗CD20抗体を調製する方法を提供し、本抗体は、1ヒト重鎖フレームワーク重鎖フレームワーク領域及びヒト重鎖CDRであって、但しこの場合前記ヒト重鎖CDRのうちの少なくとも1つが図53、55、又は57又は配列番号13-15、19-21、又は25-27の相当するアミノ酸残基に示されたCDRのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト重鎖フレームワーク重鎖フレームワーク領域及びヒト重鎖CDRと、2ヒト軽鎖フレームワーク領域及びヒト軽鎖CDRであって、但しこの場合、前記ヒト軽鎖CDRのうちの少なくとも1つが、図53、55、又は57又は配列番号16-18、22-24、又は28-30の相当するアミノ酸残基に示されたCDRのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト軽鎖フレームワーク領域及びヒト軽鎖CDRと、を含み、;またこの場合、本抗体は、CD20への結合能を保持している。本抗体のCD20への結合能は、実施例に記載したものなど、標準的な結合検定法を用いて判定することができる例えばFACS分析。当技術分野において、抗体の重鎖及び軽鎖CDR3ドメインは、抗原に対する抗体の結合特異性親和性において特に重要な役割を果たすことが良く知られているため、上記に記載した通りに調製された本発明の組換え抗体は、好ましくは、2F2、7D8、又は11B8の重鎖及び軽鎖CDR3を含むとよい。本抗体は、さらに、2F2、7D8、又は11B8のCDR2を含むこともできる。本抗体は、さらに、2F2、7D8、又は11B8のCDR1を含むこともできる。従って、本発明は、さらに、ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖CDR1領域、ヒト重鎖CDR2領域、及びヒト重鎖CDR3領域であって、但しこの場合、前記ヒト重鎖CDR3領域が、図53、55、又は57又は配列番号15、21、又は27の相当するアミノ酸残基に示された通りの2F2、7D8、又は11B8のCDR3である、ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖CDR1領域、ヒト重鎖CDR2領域、及びヒト重鎖CDR3領域と、ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖CDR1領域、ヒト軽鎖CDR2領域、及びヒト軽鎖CDR3領域であって、但しこの場合、前記ヒト軽鎖CDR3領域が、図53、55、又は57又は配列番号18、24、又は30に示された通りの相当するアミノ酸残基に示された通りの2F2、7D8、又は11B8のCDR3である、ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖CDR1領域、ヒト軽鎖CDR2領域、及びヒト軽鎖CDR3領域、とを含み、但しCD20に結合する、抗CD20抗体を提供するものである。本抗体は、さらに、2F2、7D8、又は11B8の重鎖CDR2及び又は軽鎖CDR2を含んでもよい。本抗体は、さらに2F2、7D8、又は11B8の重鎖CDR1及び又は軽鎖CDR1を含んでもよい。好ましくは、上に解説された操作された抗体のCDR1、2、及び/又は3は、さらに、ここで開示された2F2、7D8、又は11B8のものと全く同じアミノ酸配列を含むとよい。しかしながら、当業者であれば、2F2、7D8、又は11B8の精確なCDR配列から何らかの逸脱があっても、CD20への本抗体の結合能が実際には維持されることがあることは理解されよう例えば保存的置換。従って、別の実施態様では、当該の操作された抗体は、2F2、7D8、又は11B8のうちの一つ以上のCDRに対して例えば90、95、98又は995同一である一つ以上のCDRから成っていてもよい。単にCD20に結合するだけでは、上に記載したものなどの操作された抗体は、例えば:1CD20からの低い解離速度;2CD20への高親和結合;3CD20上の固有のエピトープへの結合、及び/又は、CD20への特異的配向での結合、及び/又は、特異的な形のCD20への結合;4CD5559陰性もしくはCD5559陽性細胞上における高レベルのCDCの媒介;5CD20への結合時の脂質ラフトへの転位;6CD20を発現する細胞の成長の阻害;7CD20を発現する細胞のアポトーシスの誘導;8CD20を発現する細胞の同型接着の誘導;9CD20を発現する腫瘍細胞を有する対象の生存率延長;10適したエフェクタ細胞と混合したときの、CD20標的のADCCの媒介;11CD20を発現する細胞を枯渇させる能力;及び/又は12低レベルのCD20を発現する細胞CD20low細胞を枯渇させる能力;など、本発明の抗体の他の機能上の特性をそれらが保持しているかで、選抜されてもよい。CD20に対するヒトモノクローナル抗体の結合の特徴付けヒト抗CD20抗体を精製するために、選抜されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製用の2リットル入りスピナフラスコで成長させることができる。上清を濾過し、濃縮してから、プロテインA-セファロースIgG1アイソタイプ抗体の場合ニュージャージー州ピスカタウェイ、ファルマシア社、あるいは、IgG3アイソタイプ抗体の場合は抗ヒトIgG被覆セファロース又はプロテインG-セファロースで、アフィニティクロマトグラフィすることができる。溶出したIgGをゲル電気泳動法及び高速液体クロマトグラフィでチェックして、純度を確認することができる。緩衝溶液をPBSに交換し、濃度は、OD280により、143吸光係数を用いて判定することができる。本モノクローナル抗体をアリクォートし、-80°Cで保存することができる。選択されたヒト抗CD20モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを判定するには、部位指定もしくは多部位指定変異誘発法を用いることができる。精製された抗体のアイソタイプを判定するには、アイソタイプELISAを行うことができる。微量定量プレートのウェルを10μgmlの抗ヒトIgで、一晩、4°Cで被覆することができる。5BSAで遮断後、このプレートを10μgmlのモノクローナル抗体又は精製済みアイソタイプコントロールと、周囲温度で2時間、反応させる。次にこのウェルをヒトIgGl、IgG2、IgG3又はIgG4あるいはヒトIgM特異的アルカリホスファターゼ結合プローブのいずれかと反応させることができる。洗浄後、このプレートをpNPP基質で展開させ、ODof405650のODで分析する。免疫済みマウスの血清中で抗CD20抗体の存在を実証したり、あるいは、CD20を発現する生存細胞へのモノクローナル抗体の結合を実証するには、フローサイトメトリを用いることができる。簡単に説明すると、CD20を発現する細胞株標準的な成長条件下で成長させたものを、01BSA及び002アジ化ナトリウムを含有するPBSに入れた多様な濃度のモノクローナル抗体と混合し、4°Cで30分間、インキュベートする。洗浄後、細胞を、フルオレセイン標識抗ヒトIgG抗体に、一次抗体染色と同じ条件下で反応させる。試料は、単個生存細胞に当たる光及び側光散乱特性を用いて、FACS装置でフローサイトメトリにより分析することができる。フローサイトメトリに加えて、又は代わりに、蛍光顕微鏡法を用いた代替的検定法を用いてもよい。細胞は、上述したのと全く同じ通りに染色することができ、蛍光顕微鏡法で調べることができる。この方法により、個々の細胞の観察が可能となるが、抗原濃度によっては、感度が劣るであろう。抗CD20ヒトIgGは、さらに、ウェスタンブロット法でも、CD20抗原との反応性について、検査することができる。簡単に説明すると、CD20発現細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行うことができる。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロースメンブレンに移し、20マウス血清で遮断し、検査対象のモノクローナル抗体でプローブすることとなる。ヒトIgGの結合は、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを用いて検出することができ、BCIPNBT基質錠剤ミズーリ州セントルイス、シグマケミカルズ社で展開させることができる。CD20に対するヒトモノクローナル抗体の貪食及び細胞致死活性CD20への特異的結合に加え、ヒトモノクローナル抗CD20抗体を、CD20発現細胞の貪食及び致死の媒介能についても、検査することができる。モノクローナル抗体活性のinvitroでの検査は、invivoモデルで検査を行う前の最初のスクリーニングとなるであろう。簡単に説明すると、健康なドナーからの多核白血球PMN、NK細胞、単球又は他のエフェクタ細胞をフィッコールハイパック密度遠心分離法で精製し、混入赤血球を溶解させることができる。洗浄後のPMNを、10熱不活化ウシ胎児血清を加えたRPMIに懸濁させ、51Crで標識したCD20発現細胞に、多様なエフェクタ細胞対腫瘍細胞の比率エフェクタ細胞:腫瘍細胞で加えることができる。次に、精製済みのヒト抗CD20IgGsを多様な濃度で加えることができる。無関係のヒトIgGは陰性コントロールとして用いることができる。検定は、用いるエフェクタ細胞の種類に応じて、37°Cdえ4乃至20時間、行うことができる。試料は、培養上清中に遊離する51Crを測定することにより、細胞溶解について検定することができる。抗CD20モノクローナル抗体を組み合わせて検査して、細胞溶解が複数のモノクローナル抗体で促進されるかどうかを調べることもできる。CD20に結合するヒトモノクローナル抗体をinvivoモデル例えばマウスで検査して、CD20発現腫瘍細胞の成長を制御する上でのそれらの効果について調べることもできる。これらの抗体は、例えば、限定的なものと意図されてはいない以下の基準に基づいて選抜することができる:1.CD20を発現する生存細胞への結合;2.CD20からの低い解離速度;3.CD20への高親和結合;4.CD20上の固有のエピトープへの結合、及び/又は、CD20への特異的配向での結合、及び/又は、特異的な形のCD20への結合;5.CD20発現細胞のオプソニン化;6.ヒトエフェクタ細胞存在下でのCD20発現細胞の成長阻害、貪食及び/又は致死の媒介;7.CD5559陰性もしくはCD5559陽性細胞上におけるCDCの誘導能8.同型接着の誘導能;9.CD20への結合時の脂質ラフトへの転位;10.アポトーシスの誘導能;11.CD20発現細胞上のADCCの媒介;12.CD20を発現する細胞を枯渇させる能力;及び/又は13.低レベルのCD20を発現する細胞CD20low細胞を枯渇させる能力。本発明の好適なヒトモノクローナル抗体は、これらの基準の一つ以上に合致するものである。ヒトモノクローナル抗CD20抗体は、それらのCDC媒介能について、多種の公知の技術を用いて検査することができる。例えば健康な対象の血液を遠心分離して補体用の血清を得、採集することができる。多種のmAbのCDC活性を判定するために、様々な方法を用いることができる。例えば51Crの遊離を測定することができ、あるいは、膜透過性の上昇を、ヨウ化プロピジウムPI排除検定法を用いて評価することもできる。簡単に説明すると、標的細胞を洗浄し、RPMI1BSA中に1x106mlになるように再懸濁させることができる。多様な濃度のmAbをこの細胞に加えて、室温で10乃至15分間、結合させることができる。次に、血清を最終濃度20まで加え、細胞を37°Cで45分間、インキュベートすることができる。各試料の細胞すべてをFACS試験管に入れたPI溶液に加えられる。その後この混合液をすぐに、FACScaliburフローサイトメータを用いたフローサイトメトリにより評価し、CellQuestプロソフトウェアカリフォルニア州マウンテンビュー、BDバイオサイエンセズ社を用いて分析することができる。アポトーシスを開始させる能力について検査するには、例えばヒトモノクローナル抗CD20抗体をDaudiなどのCD20陽性腫瘍細胞と一緒に、37°Cで約20時間、インキュベートすることができる。この細胞を採集し、アネキシンVFITC結合緩衝液BDバイオサイエンセズ社中で洗浄し、アネキシンVFITCBDバイオサイエンセズ社で15分間、4°Cの暗室で標識することができる。各試料からの全ての細胞をPI溶液10μgmlのPBS溶液をFACS試験管内で加え、すぐにフローサイトメトリで上述のように評価することができる。本発明のある特定の実施態様では、本ヒトモノクローナル抗体を、2つ以上の抗CD20モノクローナル抗体を含む医薬組成物などとして、組み合わせて用いる。例えば、異なるが補完的な活性を有するヒト抗CD20モノクローナル抗体を、所望の治療もしくは診断効果を達成するために単一の治療法で組み合わせることができる。ある好適な実施態様では、当該の組成物は、CDCを媒介する抗CD20ヒトモノクローナル抗体を、アポトーシスを誘導する別のヒト抗CD20モノクローナル抗体と組み合わせて含む。別の実施態様では、当該の組成物は、エフェクタ細胞の存在下で標的細胞の効果の高い致死を媒介する抗CD20ヒトモノクローナル抗体を、CD20発現細胞の成長を阻害する別のヒト抗CD20モノクローナル抗体と組み合わせて含む。II.ヒトモノクローナル抗CD20抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物の作製さらに別の局面では、本発明は、CD20に特異的に結合するヒト抗体を発現することのできる、トランスジェニック又はトランスクロモソーマルマウスなどの非ヒトトランスジェニック及びトランスクロモソーマル動物を提供するものである。ある具体的な実施態様では、本発明は、CD20発現細胞で免疫されたときに、当該のマウスがヒト抗CD20抗体を産生するように、ヒト重鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック又はトランスクロモソーマルマウスを提供する。該ヒト重鎖導入遺伝子は、ここで詳述し、例示するように、HuMAbマウスなど、トランスジェニックと同様に、マウスの染色体DNAに組み込むことができる。代替的には、該ヒト重鎖導入遺伝子を、WO0243478に解説された通りのトランスクロモソーマル例えばKMマウスの場合のように、染色体外に維持することもできる。このようなトランスジェニック及びトランスクロモソーマル動物は、VDJ/VJ組換え及びアイソタイプスイッチングを起こすことにより、CD20に対して複数のアイソタイプ例えばIgG、IgA及び/又はIgEのヒトモノクローナル抗体を産生することができる。外来の抗原刺激に対し、異種の抗体レパートリーで応答する非ヒトトランスジェニック及びトランスクロモソーマル動物のデザインには、当該のトランスジェニック動物に含まれた異種の免疫グロブリン導入遺伝子が、B細胞発生の経路全般にわたって正確に機能する必要がある。これには、例えば、異種重鎖導入遺伝子のアイソタイプスイッチングが含まれる。従って、導入遺伝子は、アイソタイプスイッチングが誘導されるように構築され、抗体遺伝子の以下の特徴のうちの1つ以上:1高レベル及び細胞種特異的な発現、2機能的な遺伝子再編成、3対立遺伝子排除の活性化及び対立遺伝子排除に対する応答、4充分な一次レパートリの発現、5シグナル伝達、6体細胞超変異、及び7免疫応答中の導入遺伝子抗体の優性。前述の基準の全てを満たす必要はない。例えば、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座を機能的に破壊した実施態様では、この導入遺伝子は対立遺伝子排除を活性化する必要はない。さらに、導入遺伝子が機能的に再編成された重鎖及び/又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む実施態様では、機能遺伝子の再編成という二番目の基準は、少なくとも導入遺伝子が既に再編成されている限りにおいて、不要である。分子免疫学の背景については、引用をもってここに援用することとするFundamentalImmunology2ndeditionPaulWilliamEedRavenPressNYを参照されたい。いくつかの実施態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体を作製するために用いる非ヒトトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマル動物は、再編成された、再編成のない、又は再編成された及び再編成のないものの組合せの異種免疫グロブリン重鎖及び軽鎖導入遺伝子を、このトランスジェニック動物の生殖細胞に含有する。重鎖導入遺伝子のそれぞれは少なくとも一つのCH遺伝子を含む。加えて、この重鎖導入遺伝子が、このトランスジェニック動物のB細胞中で、複数のCH遺伝子をコードする異種導入遺伝子のアイソタイプスイッチングを支援できる機能的アイソタイプスイッチ配列を含有してもよい。このようなスイッチ配列は、導入遺伝子CH遺伝子の源として働く種由来の生殖細胞免疫グロブリン遺伝子座に天然で存在するものであってもよく、あるいはこのようなスイッチ配列は、導入遺伝子コンストラクトを受け取る側の種トランスジェニック動物にあるものを由来としてもよい。例えば、トランスジェニックマウスを作製するために用いるヒト導入遺伝子コンストラクトは、マウス重鎖遺伝子座に天然で存在するものと類似のスイッチ配列が導入されている場合には、より高頻度でアイソタイプスイッチング事象を起こすと思われる。これはおそらく、マウススイッチリコンビナーゼ酵素系で機能するにはこのようなマウススイッチ配列は最適であるが、ヒトスイッチ配列はそうでないからであろう。スイッチ配列は従来のクローニング法で分離及びクローンしてもよく、又は、免疫グロブリンスイッチ領域配列に関して公開された配列情報に基づいてデザインされた重複合成オリゴヌクレオチドからdenovo合成してもよいSiderasetalIntlImmunol1631642。前述のトランスジェニック動物のそれぞれの場合、機能的に再編成された異種重鎖及び軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子が、このトランスジェニック動物のB細胞の大部分で見られる少なくとも10パーセント。本発明のトランスジェニック動物を作製するために用いる導入遺伝子は、少なくとも一つの可変遺伝子セグメント、一つの多様性遺伝子セグメント、一つのジョイニング遺伝子セグメント、及び少なくとも一つの定常領域遺伝子セグメント、をコードするDNAを含む重鎖導入遺伝子を含む。免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子は、少なくとも一つの可変遺伝子セグメント、一つのジョイニング遺伝子セグメント、及び少なくとも一つの定常領域遺伝子セグメント、をコードするDNAを含む。前記軽鎖及び重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、当該の非ヒトトランスジェニック動物を構成しない種を由来とする免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントをコードするDNAを由来とするか、又は、このようなDNAに相当するため、この非ヒトトランスジェニック動物にとって異種である。本発明の一局面では、これら個々の遺伝子セグメントが再編成されないように、即ち、機能的免疫グロブリン軽鎖又は重鎖をコードするよう、再編成されないように、導入遺伝子を構築する。このような再編成のない導入遺伝子は、V、D、及びJ遺伝子セグメントの組換え機能的再編成を支援し、好ましくは、CD20抗原に暴露したときに、非ヒトトランスジェニック動物内でD領域遺伝子セグメントの全部又は一部が再編成後の免疫グロブリン重鎖へ取り込まれることを支援するとよい。代替的な実施態様では、当該導入遺伝子は再編成のない最小遺伝子座を含むものである。このような導入遺伝子は典型的に、C、D、及びJセグメントの大部分や、V遺伝子セグメントのサブセットを含む。このような導入遺伝子コンストラクトにおいては、多様な調節配列、例えばプロモータ、エンハンサ、クラススイッチ領域、RNAプロセッシングの際のスプライス-ドナー及びスプライス-アクセプタ配列、組換えシグナル等、は、当該の異種DNA由来の対応する配列を含む。このような調節配列は、この導入遺伝子に、本発明で用いられる非ヒト動物と同じ種から、又は、関連する種から、導入してよい。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを導入遺伝子内でげっ歯類免疫グロブリンエンハンサ配列に組み合わせて、トランスジェニックマウスでの利用に向けてもよい。代替的には、哺乳動物のゲノムに天然で存在することが公知の機能的DNA配列にとって同種でないような合成調節配列を、導入遺伝子に組み込んでもよい。合成調節配列は、例えばスプライス-アクセプタ部位又はプロモータ/エンハンサモチーフの許容可能な配列を明示したものなど、コンセンサスの規則に従ってデザインされる。例えば、最小遺伝子座は、天然で発生する生殖細胞Ig遺伝子座に比較して、必須でないDNA部分例えば介在配列;イントロン又はその一部分に、少なくとも一つの中間即ち当該部分の末端ではないの欠失を有するゲノム免疫グロブリン遺伝子座部分を含む。好適な非ヒトトランスジェニック及びトランスクロモソーマル動物、例えばマウス、は、大きなレパートリー、理想的には容量を調節後のヒトのそれと実質的に同様なレパートリーで、免疫グロブリン産生を示すことになるものである。前記レパートリーは、理想的には、容量を調節後のヒトが示すものに、通常は少なくとも約10、好ましくは25乃至50又はそれ以上、近いとよいであろう。概して、少なくとも約1000種の異なる免疫グロブリン理想的にはIgG、好ましくは104乃至106又はそれ以上の種類が、主にマウスゲノムに導入された様々なV、J及びD領域の数に応じて、そしてジョイニング領域でのV2、Fv、又は一本鎖Fvなどを含め、少なくとも一種の抗体又はその抗体フラグメントを結合特異性部分として含む。この抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖二量体であっても、あるいは、その内容を引用をもって援用することと明示しておく1990年8月7日発行のLadneretalの米国特許第4946778号に解説されているように、Fv又は一本鎖コンストラクトなど、その何らかの最小フラグメントであってもよい。さらに本抗体は、US20030118592及びUS20030133939に開示されるような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質であってもよい。ある実施態様では、本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、エフェクタ細胞の表面上に存在するFcγR又はFcαRに対する結合特異性部分と、CD20などの標的細胞抗原に対する第二結合特異性部分とを含む。ある実施態様では、Fc受容体に対する結合特異性を、その結合がヒト免疫グロブリンGIgGの遮断を受けないヒトモノクローナル抗体によって提供する。ここで用いる用語IgG受容体とは、1番染色体上にある8つのγ鎖遺伝子のいずれをも言う。これらの遺伝子は、3つのFcγ受容体クラス:FcγRICD64、FcγRIICD32、及びFcγRIIICD16に分類される合計12種の膜貫通又は可溶性の受容体アイソフォームをコードしている。ある好適な実施態様では、前記Fcγ受容体はヒト高親和FcγRIである。これらの好適なモノクローナル抗体の作製及び特徴付けは、その教示全体を引用をもってここに援用することとするFangeretalのPCT出願WO8800052及び米国特許第4954617号に解説されている。これらの抗体はFcγRI、FcγRII又はFcγRIIIのエピトープに、当該受容体のFcγ結合部位とは異なる部位で結合するため、これらの結合は、生理的レベルのIgGでは実質的に遮断を受けない。本発明で有用な特異的抗FcγRI抗体はMAb22、MAb32、MAb44、MAb62及びMAb197である。MAb32を産生するハイブリドーマはアメリカンタイプカルチャーコレクションからATCC受託番号HB9469で入手できる。抗FcγRIMAb22、MAb22のFである。H22抗体の作製及び特徴付けはGrazianoRFetalJImmunol15549965002及びPCTUS9310384に解説されている。H22抗体産生細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションに1992年11月4日に指定番号HA022CL1で寄託され、受託番号CRL11177を受けている。さらに別の好適な実施態様では、Fc受容体に対する結合特異性部分を、その結合が好ましくはヒト免疫グロブリンAIgAの遮断を受けない、Fcアルファ受容体FcαRICD89などのヒトIgA受容体に結合する抗体に提供させる。用語IgA受容体には、19番染色体上にある一個のα遺伝子FcαRIの遺伝子産物が包含されるものと、意図されている。この遺伝子は、55乃至110kDaの選択的にスプライシングされる膜貫通型アイソフォームをいくつかコードしていることが知られている。FcαRICD89は、単球/マクロファージ、好酸性及び好中性顆粒球上で構成的に発現するが、非エフェクタ細胞集団上では発現しない。FcαRIはIgA1及びIgA2の両方に対して中間の親和性≒5×107M1を有するが、この親和性は、GCSF又はGMCSFなどのサイトカインに暴露すると上昇するCriticalReviewsinImmunology16423440。FcαRIに、IgAリガンド結合ドメイン以外で結合する、A3、A59、A62及びA77と同定された4種類のFcαRI特異的モノクローナル抗体が解説されている。。FcαRI及びFcγRIは、1単球、PMN、マクロファージ及び樹状細胞などの免疫エフェクタ細胞上に主に発現する;2高レベル例えば1個の細胞当たり5000乃至100000で発現する;3細胞傷害活性ADCC、ファゴサイトーシスの媒介物質である;4自己抗原を含め、それらが狙う抗原の抗原提示促進を媒介する、点で、本発明での使用に好適なトリガー受容体である。別の実施態様では、前記の二重特異的分子は、本発明に基づく2つのヒトモノクローナル抗体から成り、この場合これら2つのヒトモノクローナル抗体は、例えば2F2と11B8の組合せなど、一方が主にCDCを誘導することにより作用し、他方が主にアポトーシスを誘導することにより作用するなど、補完的な機能上の活性を有するものである。他の実施態様では、本発明の二重特異的及び多重特異的分子はさらに、CD20などの標的細胞抗原に、結合するなど認識する結合特異性部分を含む。ある好適な実施態様では、前記結合特異性部分を、本発明のヒトモノクローナル抗体に提供させる。ここで用いるエフェクタ細胞特異抗体とは、エフェクタ細胞のFc受容体に結合する抗体又は機能的抗体フラグメントを言う。本発明で用いるのに好適な抗体は、エフェクタ細胞のFc受容体に、内因性免疫グロブリンが結合しない部位で結合するものである。ここで用いる用語エフェクタ細胞とは、免疫応答の認識及び活性化段階でなく、免疫応答のエフェクタ段階に関与する免疫細胞を言う。免疫細胞の例には、骨髄又はリンパ系由来の細胞、例えばリンパ球例えば、細胞溶解性T細胞CTLを含むB細胞及びT細胞、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多核白血球、顆粒球、マスト細胞、及び好塩基球、がある。いくつかのエフェクタ細胞は特異的Fc受容体を発現し、特異的免疫機能を果たす。好適な実施態様では、エフェクタ細胞は、ADCCを誘導できる好中球など、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性ADCCを誘導することができる。例えば、FcRを発現する単球、マクロファージは、標的細胞の特異的致死及び他の免疫系構成成分への抗原提示か、又は、抗原提示細胞への結合に関与している。他の実施態様では、エフェクタ細胞は、標的抗原、標的細胞、又は微生物を貪食することができる。エフェクタ細胞上の特定のFcRの発現は、サイトカインなどの体液性因子により調節することができる。例えば、FcγRIの発現がインターフェロンガンマIFNγにより上方調節されることが判明している。この発現亢進により、FcγRI担持細胞の標的に対する細胞傷害活性が増す。エフェクタ細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食又は溶解することができる。標的細胞は、本発明の組成物例えばヒトモノクローナル抗体、二重特異的もしくは多重特異的分子の標的とすることができる、対象例えばヒト又は動物内の何らかの望ましくない細胞を意味することとする。好適な実施態様では、本標的細胞は、CD20を発現又は過剰発現している細胞である。CD20を発現する細胞には、典型的に、B細胞及びB細胞腫瘍、がある。ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本発明の二重特異的もしくは多重特異的分子に利用できる他の抗体は、マウス、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体である。このようなマウス、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体は当業で公知の方法により調製することができる。本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、化学的技術例えばDMKranzetalProcNatlAcadSciUSA785807を参照されたい、ポリオーマ技術ReadingのUS4474893を参照されたい又は組換えDNA技術を用いて作製することができる。具体的には、本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、当業で公知であり、ここに紹介された実施例で解説する方法を用いて、例えば抗FcR及び抗CD20結合特異性部分など、構成部分の結合特異性部分を結合させることにより、調製できる。例えば本二重特異的及び多重特異的分子の各結合特異性部分を別々に作製しておき、後で相互に結合することができる。これら結合特異性部分がタンパク質又はペプチドである場合、多種の結合又は架橋剤を共有結合に用いることができる。架橋剤の例には、プロテインA、カルボジイミド、NスクシンイミジルSアセチルチオアセテート、55ジチオビス、oフェニレンジマレイミド、Nスクシンイミジル3プロピオネート、及びスルホスクシンイミジル4シクロヘキサン1カルボキシレートJExpMed1601686LiuMAetalProcNatlAcadSciUSA828648を参照されたいがある。他の方法にはPaulusNo78118132Brennanetal2298183、及びGlennieetal13923672375が解説したものがある。好適な結合剤は両者ともピアースケミカル社イリノイ州ロックフォードから入手できるSATA及びスルホSMCCである。結合特異性部分が抗体例えば二種のヒト化抗体である場合、これらは2つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して結合させることができる。ある特に好適な実施態様では、前記ヒンジ領域を修飾して、奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは1つ、を結合前に含有させる。代替的には、両方の結合特異性部分を同じベクタにコードさせ、同じホスト細胞内で発現及び集合させることができる。この方法は、当該二重特異的及び多重特異的分子がMAb×MAb、MAb×Fab、Fab×F2又はリガンド×Fab融合タンパク質である場合に特に有用である。例えば二重特異的分子など、本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、例えば一本鎖二重特異抗体、1つの一本鎖抗体及び結合決定基を含む一本鎖二重特異的分子、又は2つの結合決定基を含む一本鎖二重特異的分子など、一本鎖分子であってもよい。さらに二重特異的及び多重特異的分子は一本鎖分子であってもよく、あるいは少なくとも2つの一本鎖分子を含んで成るものでもよい。二重及び多重特異的分子を調製する方法は、例えば米国特許第5260203号;米国特許第5455030号;米国特許第4881175号;米国特許第5132405号;米国特許第5091513号;米国特許第5476786号;米国特許第5013653号;米国特許第5258498号;及び米国特許第5482858号に解説されている。二重特異的及び多重特異的分子の、それらの特異的標的への結合は、酵素結合免疫吸着検定法、ラジオイムノアッセイ、FACS分析、バイオアッセイ例えば成長阻害、又はウェスタンブロット検定法などにより、確認することができる。これらの検定法はそれぞれ、大まかに言って、目的のタンパク質-抗体複合体の存在を、この複合体に特異的な標識済みの試薬例えば抗体により検出するものである。例えばFcR抗体複合体は、この抗体FcR複合体を認識して特異的に結合する、例えば酵素に結合させた抗体又は抗体フラグメントなどを用いて、検出することができる。代替的には、当該の複合体を、多種の他の免疫検定法のいずれかを用いて検出することもできる。例えば抗体を放射性標識し、ラジオイムノアッセイで用いることができる、アルキル化剤例えばメクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチンBSNU及びロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンC、及びcisジクロロジアミンプラチナムシスプラチン、アントラサイクリン、及び抗有糸分裂剤例えばビンクリスチン及びビンブラスチン、がある。ある好適な実施態様では、本治療薬は細胞傷害性薬剤又は放射毒性薬剤である。別の実施態様では、本治療薬は免疫抑制剤である。さらに別の実施態様では、本治療薬はGMCSFである。ある好適な実施態様では、本治療薬はドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、スルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド又はリシンAである。さらに本発明の抗体を、例えばヨウ素131、イットリウム90又はインジウム111などの放射性同位体に結合させて、癌などのCD20関連異常を治療するための細胞傷害性放射性医薬を作製することができる。本発明の抗体複合体を用いて所定の生物学的応答を修飾することができるが、当該の薬物成分を、古典的な化学療法薬に限定されるものと、捉えられてはならない。例えば当該の薬物成分は、所望の生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質には、例えばアブリン、リシンA、シュードモナスエキソトキシン、又はジフテリア毒素などの酵素活性のある毒素又はその活性フラグメント;腫瘍壊死因子又はインターフェロンγなどのタンパク質;又は、例えばリンホカイン、インターロイキン1IL1、インターロイキン2IL2、インターロイキン6IL6、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF、顆粒球コロニー刺激因子GCSF、又は他の成長因子などの生物学的応答修飾物質、が含まれよう。このような治療的部分を抗体に結合させる技術は公知であり、例えばArnonetalMonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapyinMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapyReisfeldetalpp24356HellstrometalAntibodiesForDrugDeliveryinControlledDrugDeliveryRobinsonetalpp62353ThorpeAntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapyAReviewinMonoclonalAntibodies84BiologicalAndClinicalApplicationsPincheraetalpp475506AnalysisResultsAndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapyinMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapyBaldwinetalpp30316及びThorpeetalThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibodyToxinConjugatesImmunolRev6211958を参照されたい。更なる実施態様では、本発明に基づくヒトモノクローナル抗体を、例えばチウケセタン原語:tiuxetanなどのリンカ-キレート剤に付着させると、本抗体を放射性同位体に結合することができる。V.医薬組成物別の局面では、本発明は、本発明のヒトモノクローナル抗体を1つ又は組合せで含有する、医薬組成物などの組成物を提供するものである。前記の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤や、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy19thEditionGennaroEdMackPublishingCoEastonPA1995に開示されたものなど、従来技術に従ったいずれか他の公知のアジュバント及び医薬品添加物と一緒に調合してもよい。ある実施態様では、当該組成物は、主にCDCを誘導することにより作用する1つの抗体を、主にアポトーシスを誘導することにより作用する別の抗体と組み合わせるなど、異なる機序で作用する単離された複数の例えば2つ以上本発明のヒト抗体の組合せを含む。さらに本発明の医薬組成物を、併用療法で、即ち他の薬剤と組み合わせて、投与することができる。例えば、前記の併用療法には、本発明の組成物を、少なくとも1つの抗炎症剤又は少なくとも1つの免疫抑制剤と一緒に含めることができる。ある実施態様では、このような治療薬は、例えばステロイド系薬物又はNSAID非ステロイド系抗炎症剤など、一つ以上の抗炎症剤を含む。好適な薬剤には、例えば、アスピリン及び他のサリチル酸、Cox2阻害剤、例えばロフェコキシブ及びセレコキシブや、イブプロフェン、フェノプロフェン、ナプロキセン、スリンダック、ジクロフェナック、ピロキシカム、ケトプロフェン、ジフルニサール、ナブメトン、エトドラック、オキサプロジン、及びインドメタシンなどのNSAID、がある。別の実施態様では、このような治療薬は、1つ以上のDMARD、例えばメトトレキセート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、ピリミジン合成阻害剤、例えばレフルノミド、IL1受容体遮断剤、例えばアナキンラ、及びTNFα遮断剤、例えばエタネルセプト、インフリキシマブ及びアダリムマブなど、を含む。別の実施態様では、このような治療薬は、1つ以上の免疫抑制剤、例えばシクロスポリン及びアザチオプリン、を含む。さらに別の実施態様では、このような治療薬、一つ以上の化学療法薬、例えばドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、カルムスチン、シクロホスファミド、及びクロラムブシル、を含む。別の実施態様では、本発明のヒト抗体を、クロラムブシル及びプレドニゾロン;シクロホスファミド及びプレドニゾロン;シクロホスファミド、ビンクリスチン、及びプレドニゾン;シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びプレドニゾン;フルダラビン及びアントラサイクリン、と組み合わせて;又は他の普通のNHL用の多剤計画、例えばinNonHodgkin’sLymphomasMakingsenseofDiagnosisTreatmentandOptionsLorraineJohnston1999O’ReillyandAssociatesIncに開示されたもの、と組み合わせて投与してもよい。さらに別の実施態様では、本ヒト抗体を、放射線治療及び/又は自己由来末梢幹細胞又は骨髄移植と併用投与してもよい。さらに別の実施態様では、本ヒト抗体を、抗CD25抗体、抗CD19抗体、抗CD21抗体、抗CD22抗体、抗CD37抗体、抗CD38抗体、抗IL6R抗体、抗IL8抗体、抗IL15抗体、抗IL15R抗体、抗CD4抗体、抗CD11a抗体例えばエファリズマブ、抗アルファ4ベータ1インテグリン抗体例えばナタリズマブ、及びCTLA4Igから選択される1つ以上の抗体と併用投与してもよい。ある具体的な実施態様では、本ヒトモノクローナル抗体を、例えば移植片対宿主疾患患者においてなど、水疱性類天疱瘡の治療に向けて抗CD25抗体と組み合わせて投与する。別の具体的な実施態様では、本ヒトモノクローナル抗体を、悪性疾患の治療に向けて、抗CD19抗体、抗CD21抗体、抗CD22抗体、抗CD37抗体、及び抗CD38抗体から選択される1つ以上の抗体と組み合わせて投与する。さらに別の具体的な実施態様では、本ヒト抗体を、炎症性疾患の治療に向けて、抗IL6R抗体、抗IL8抗体、抗IL15抗体、抗IL15R抗体、抗CD4抗体、抗CD11a抗体例えばエファリズマブ、抗アルファ4ベータ1インテグリン抗体例えばナタリズマブ、及びCTLA4Igから選択される1つ以上の抗体と組み合わせて投与する。さらに更なる実施態様では、補体活性化を高めるために本ヒト抗体を抗C3b抗体と組み合わせて投与してもよい。ここで用いる場合の薬学的に許容可能な担体には、生理学的に適合性あるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、当該の担体が静脈内、筋肉内、皮下、腸管外、脊髄もしくは表皮投与例えば注射又は輸注によりに適しているとよい。投与経路によっては、活性化合物、即ち抗体、二重特異的及び多重特異的分子を、当該化合物を不活化しかねない酸及び他の天然条件の作用から当該化合物を保護する物質で被覆してもよい。薬学的に許容可能な塩とは、親化合物の所望の生物活性を保持しつつも、望ましくない毒性作用を与えないような塩を言う例えばBergeSMetalJPharmSci66119を参照されたい。このような塩の例には、酸添加塩及び塩基添加塩がある。酸添加塩には、非毒性の無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン等から誘導されたものや、非毒性の有機酸、例えば脂肪族モノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族の酸、脂肪族及び芳香族のスルホン酸等から誘導されたものがある。塩基添加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属から誘導されたものや、NNジベンジルエチレンジアミン、Nメチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等の非毒性の有機アミンから誘導されたものがある。本発明の組成物は、当業で公知の多種の方法により投与することができる。当業者であれば理解されるように、投与の経路及び/又は形態は、所望の結果に応じて様々であろう。当該活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロ封入送達系を含む制御放出製剤など、急速な放出から当該化合物を保護する担体と一緒に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸など、生分解性で生体適合性あるポリマを用いることができる。このような製剤の調製法が数多く、当業者に広く公知である。例えばSustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystemsJRRobinsonedMarcelDekkerIncNewYork1978を参照されたい。特定の投与経路で本発明の化合物を投与するには、当該化合物の失活を防ぐ物質でそれを被覆するか、又は当該化合物と同時投与することが必要な場合がある。例えば本化合物を、適したリポソームなどの担体又は希釈剤に入れて対象に投与してもよい。薬学的に許容可能な希釈剤には生理食塩水及び水性の緩衝液がある。リポソームには水中油中水CGFエマルジョンや、従来のリポソームがあるJNeuroimmunol727。薬学的に許容可能な担体には無菌の水溶液又は分散液並びに、無菌の注射液又は分散液の即時調製用の無菌粉末がある。このような媒質及び薬剤の、薬学的に活性な物質のための使用は当業で公知である。従来の媒質又は薬剤が当該活性化合物にとって不適合でない限り、本発明の医薬組成物中のその使用は考察されたところである。補助的な活性化合物も、本組成物中に組み込むことができる。治療用の組成物は典型的に無菌でなければならず、また製造及び保管条件下で安定でなければならない。本組成物は、高い薬物濃度に適した溶液、マイクロ乳液、リポソーム、又は他の秩序ある構造として調合することができる。当該の担体は、例えば水、エタノール、ポリオール例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等、及びこれらの適した混合物などを含有する溶媒又は分散媒であってよい。適した流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いたり、分散液の場合には必要な粒子の大きさを維持したり、そして界面活性剤を使用するなどにより、維持できる。多くの場合、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸塩及びゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を組成物中に含めることにより、可能である。無菌の注射用溶液は、必要量の活性化合物を適した溶媒に、必要に応じて上に列挙した成分の1つ又は組み合わせと一緒に加えた後、滅菌マイクロ濾過を行うことにより、調製できる。分散液は一般的には、塩基性の分散媒と、上に列挙したものの中で必要な他の成分とを含有する無菌の賦形剤に当該活性化合物を加えることで、調製されている。無菌の注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合、好適な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥凍結乾燥であり、その結果、活性成分及び付加的な所望の成分の粉末が、予め殺菌濾過されたその溶液から生じる。投薬計画は、最適な所望の応答例えば治療的応答が得られるように調節される。例えば単一の巨丸剤を投与してもよく、複数に分割された用量を一定期間にわたって投与しても、又は、治療状況の緊急度を指標として用量を比率的に増減させてもよい。投与の容易さ及び投薬量の均一性のためには、非経口用組成物を単位剤形で調合することが特に有利である。ここで用いる単位剤形とは、治療しようとする対象にとって単位型の投薬量として調整された物理的に別個の単位を言う。各単位は、必要な薬品用担体との関連から所望の治療効果を生ずるよう計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の詳細は、a活性化合物の固有の特徴、及び、達成しようとする特定の治療効果、及びbこのような活性化合物を、個体の感受性の治療に向けて配合する技術に内在する限界、によって決定され、またこれらに直接依存する。薬学的に許容可能な抗酸化剤の例には:1水溶性の抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等;2油溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソールBHA、ブチル化ヒドロキシトルエン、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロール、等;及び3金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸、ソルビトール、酒石酸、リン酸等がある。治療用組成物の場合、本発明の調合物には、経口、鼻孔、局所口腔内及び舌下を含む、直腸、膣及び/又は非経口投与に適したものが含まれる。当該調合物は適宜、単位剤形で提供してもよく、製薬業で公知の何らかの方法で調製してもよい。一個分の剤形を作製するために担体物質と組み合わせることのできる活性成分の量は、治療しようとする対象、及び特定の投与形態に応じて様々であろう。一個分の剤形を作製するために担体物質と組み合わせることのできる活性成分の量は、一般に、治療効果を生む組成物量となるであろう。概して、100パーセントのうちで、この量は約001パーセント乃至約99パーセントの活性成分、好ましくは約01パーセント乃至約70パーセント、最も好ましくは約1パーセント乃至約30パーセントの範囲であろう。経膣投与に適した本発明の調合物には、さらに、当業で適していることが公知の担体を含有するペッサリ、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー調合物がある。本発明の組成物の局所もしくは経皮投与用の剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤、がある。当該の活性化合物は、薬学的に許容可能な担体や、必要に応じて何らかの保存剤、緩衝剤、又は推進剤と無菌条件下で混合してよい。ここで用いる文言非経口投与及び非経口的に投与するとは、通常は注射による、腸管内及び局所投与以外の投与形態を意味し、その中には、限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び輸注、がある。本発明の医薬組成物中に用いてもよい適した水性及び非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等、及びこれらの適した混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、がある。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料を用いたり、分散液の場合には必要な粒子の大きさを維持したり、そして界面活性剤を使用するなどにより、維持できる。これらの組成物には、保存剤、湿潤剤、乳濁剤及び分散剤などのアジュバントを含有させてもよい。微生物の存在を防ぐには、上述の滅菌法と、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の多種の抗菌剤及び抗カビ剤の含有の両方を行うと、確実になろう。例えば糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めることも好ましい場合がある。加えて、注射用の薬形の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を含めることにより、可能である。ある実施態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体を、皮下注射により結晶型で投与する。YangetalPNAS10069346939を参照されたい。本発明の化合物を製薬としてヒト及び動物に投与する場合、これらを単独で与えることもできるが、又は、例えば001乃至995より好ましくは01乃至90の活性化合物を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含有する医薬組成物としても、与えることができる。本発明の化合物を製薬としてヒト及び動物に投与する場合、これらを単独で与えることもできるが、又は、例えば001乃至995より好ましくは01乃至90の活性化合物を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含有する医薬組成物としても、与えることができる。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与形態にとって、患者に毒性となることなく所望の治療応答を得るために有効量の活性成分が得られるよう、変更してもよい。選択される投薬量レベルは、用いる本発明の特定の組成物又は、そのエステル、塩又はアミドの活性、投与経路、投与機関、用いる特定の化合物の排出速度、治療期間、用いる特定の組成物と併用する他の薬物、化合物及び/又は物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び以前の医療歴等、医業で公知の因子を含め、多種の薬物動態学的因子に依拠することとなろう。当業において通常の技術を有する医師又は獣医であれば、本医薬組成物の必要な有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、この医師又は獣医は、当該医薬組成物中に用いる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を得るのに必要なそれより少ないレベルで開始し、この投薬量を所望の効果が得られるまで次第に増加させていってもよい。一般的には、本発明の組成物の適した一日当たりの用量は、治療効果を生むために有効な最も少ない用量である化合物量であろう。このような有効量は一般に、上で解説した因子に依拠するであろう。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下によることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与するとよい。必要に応じ、治療用組成物の有効な一日分の用量を、2回、3回、4回、5回、6回又はそれ以上の小分けした用量に分けて別々に、全日にわたって適当な間隔を置きながら、選択的には単位剤形で投与するとよい。本発明の化合物を単独で投与することも可能であるが、本化合物を医薬調合物組成物として投与することが好ましい。ある実施態様では、本発明に基づくヒトモノクローナル抗体を、例えば200乃至400mgm2など、10乃至500mgm2の週間投薬量で輸注により投与してもよい。このような投与は、例えば3乃至5回など、例えば1乃至8回まで、繰り返してもよい。該投与を、例えば2乃至12時間など、2乃至24時間にわたる継続的輸注で行ってもよい。別の実施態様では、毒性の副作用を減らすために、本ヒトモノクローナル抗体を、例えば24時間を超えてなど、長時間にわたる遅い継続的輸注で投与してもよい。さらに別の実施態様では、本ヒトモノクローナル抗体を、例えば300mg、500mg、700mg、1000mg、1500mg又は2000mgなど、250mg乃至2000magの週間投薬量で、例えば4乃至6回など、最高8回までで投与する。該投与を、例えば2乃至12時間など、2乃至24時間にわたる継続的輸注で行ってもよい。このような投与養生法を、必要に応じて、例えば6ヶ月後又は12ヶ月後など、一回以上、繰り返してもよい。投薬量は、本CD20抗体を標的決定する抗イディオタイプ抗体を用いることにより、生物学的試料に入れて投与したときの血中のモノクローナル抗CD20抗体の量を測定することにより、決定又は調節することができる。さらに別の実施態様では、本ヒトモノクローナル抗体を、例えば6ヶ月以上の期間にわたって週1回など、維持療法で投与する。さらに別の実施態様では、本発明に基づくヒトモノクローナル抗体を、CD20に対するヒトモノクローナル抗体の一回の輸注に続き、放射性同位体に結合させた抗CD20に対するヒトモノクローナル抗体を輸注するステップを含む養生法により、投与してもよい。該養生法を、例えば7乃至9日後など、この養生法を、例えば7乃至9日後に繰り返してもよい。治療用組成物は当業で公知の医療器具を用いて投与できる。例えばある好適な実施態様では、本発明の治療用組成物を、例えば米国特許第5399163号;第5383851号;第5312335号;第5064413号;第4941880号;第4790824号;又は第4596556号に開示された器具などの無針皮下注射器具で投与することができる。本発明で有用な公知のインプラント及びモジュールの例には、制御された速度で薬品を分配するインプラント可能なマイクロ輸注ポンプを開示する米国特許第4487603号;薬品を皮膚を透過させて投与する治療器具を開示する米国特許第4486194号;精確な輸注速度で医薬を送達する医療用輸注ポンプを開示する米国特許第4447233号;継続的な薬物送達のための可変流量式のインプラント可能な輸注装置を開示する米国特許第4447224号;多チャンバコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第4439196号;及び浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第4475196号、がある。これらの特許を引用をもってここに援用することとする。数多くの他のこのようなインプラント、送達系、及びモジュールが当業者に公知である。いくつかの実施態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体を、invivoで確実に適正に分布するように調合することができる。例えば血液脳関門BBBは数多くの親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物がBBBを確実に透過するようにする望ましい場合には、これらを例えばリポソーム中に調合することができる。リポソームの製造方法については、例えば米国特許第4522811号第5374548号;及び第5399331号を参照されたい。前記リポソームは、特定の細胞又は臓器に選択的に輸送されて目的の薬物送達を高めるような1つ以上の成分を含んでいてもよいJClinPharmacol29685。標的決定成分の例には、葉酸又はビオチン例えばLowetalの米国特許第5416016号を参照されたい;マンノシドUmezawaetalBiochemBiophysResCommun1531038;抗体FEBSLett357140MOwaisetalAntimicrobAgentsChemother39180;その様々な種が本発明の調合物や、本発明の分子の構成成分を成していてもよいサーファクタントプロテインA受容体AmJPhysiol1233134;p120JBiolChem2699090があり、さらにKKeinanenMLLaukkanenFEBSLett346123JJKillionIJFidlerImmunomethods4273を参照されたい。本発明の一実施態様では、本発明の治療用化合物をリポソーム中に調合する。より好適な実施態様では、当該リポソームが標的決定成分を含む。最も好適な実施態様では、当該リポソーム中の治療用化合物を、腫瘍又は感染に近位の部位への大量注射により送達する。当該組成物は、注射筒での注入が容易な程度に流動性でなくてはならない。それは、製造及び保管条件下で安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から守られていなくてはならない。更なる実施態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体を、胎盤を通るそれらの輸送を妨げる又は減らすように調合することができる。これは、例えば抗体のPEG化や、又はF2フラグメントを用いるなど、当業で公知の方法により行うことができる。更に、CunninghamRundlesCZhuoZGriffithBKeenanJBiologicalactivitiesofpolyethyleneglycolimmunoglobulinconjugatesResistancetoenzymaticdegradationJImmunolMethods152177190andtoLandorMMaternalfetaltransferofimmunoglobulinsAnnAllergyAsthmaImmunol74279283を参照することができる。これは、当該の抗体を、再発性自然流産を治療又は防止するために用いる場合に特に関係する。腫瘍の治療のための治療上有効量は、完全でも、又は部分的でもいい他覚的腫瘍応答により測定することができる。完全応答CRは、疾患の非臨床的、放射線学的又は他の証拠であると定義されている。部分的応答PRは、腫瘍の凝集物の大きさの50を越える減少が原因で起きる。悪化までの中央値時間は、他覚的腫瘍応答の時間的長さを特徴付ける測定値である。また、腫瘍治療にとっての治療上有効な投薬量は、疾患の進行を安定化させるその力によっても、測定することができる。ある化合物の癌阻害能は、ヒト腫瘍での効験を予測する動物モデル系で評価することができる。代替的には、ある組成物のこのような特性を、当該化合物の細胞成長もしくはアポトーシス阻害能を調べたり、又は、当業者に公知のinvitro検定法により、評価することができる。治療用化合物の治療上有効量は、対象において腫瘍の大きさを減らすか、又は、症状を改善することができるものである。当業者であれば、対象の体格、対象の症状の重篤度、及び選択された特定の組成物又は投与経路といった因子に基づいて、このような量を決定できよう。リウマチ性関節炎にとっての治療上有効な投薬量は、好ましくは、患者においてACR20の改善の予備的定義PreliminaryDefinitionofImprovement、より好ましくはACR50の改善の予備的定義PreliminaryDefinitionofImprovement、そしてさらにより好ましくは、ARC70の改善の予備的定義PreliminaryDefinitionofImprovementをもたらすものであろう。ACR20の改善の予備的定義PreliminaryDefinitionofImprovementは:軟弱関節得点TCJ及び膨張性関節得点SWJにおける20の改善及び以下の五つの評価点のうち3つにおける≧20の改善:患者疼痛評価、患者包括的評価、担当医包括的評価、患者自己評価による能力障害、急性相反応物、と定義されている。ACR50及びACR70は、同じ方法でそれぞれ≧50及び≧70の改善と定義されている。更なる詳細については、FelsonetalinAmericanCollegeofRheumatologyPreliminaryDefinitionofImprovementinRheumatoidArthritisArthritisRheumatism38727735を参照されたい。本組成物は、無菌、かつ、本組成物を注射筒で送達可能な程度に流動性でなくてはならない。当該の担体は、水に加え、等張の緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等、及びこれらの適した混合物であってよい。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いたり、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、そして界面活性剤を利用するなどにより、維持できる。多くの場合、糖類、マンニトール又はソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンなど、吸収を遅らせる物質を組成物中に含めると、可能である。活性化合物を上述のように適切に保護すれば、当該化合物を、例えば不活性の希釈剤又は同化可能な食用担体と一緒に経口投与してもよい。VI.発明の用途及び方法本発明のヒト抗体ここで解説された免疫複合体、二重特異的/多重特異的物質、組成物及び他の誘導体は、CD20を発現する細胞の関与する診断及び治療を含め、invitro及びinvivoで診断上及び治療上の数多くの実用性を有する。例えば本抗体を、多種の疾患を治療、予防又は診断するために、invitro又はexvivoなどの培養中の細胞や、又は、invivoでなどヒト対象に投与することができる。ここで用いる用語対象には、CD20に対するヒト抗体に応答正常又は悪性するヒト及び非ヒト動物が包含されるものと、意図されている。好適な対象には、B細胞を阻害又は制御することにより是正又は改善することのできる以上を有するヒトの患者が含まれる。例えば、ある実施態様において、本発明のヒト抗体を用いて、NHLなどのB細胞リンパ腫を含め、CD20を発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする異常など、腫瘍化異常のある対象を治療することができる。治療及び/又は防止の可能な腫瘍化疾患の例には、前駆B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫を含め、NHLなどのB細胞リンパ腫及び成熟B細胞新生物、例えばB細胞慢性リンパ球性白血病/小リンパ球性リンパ腫、B細胞プロリンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、外套細胞リンパ腫、低級、中級及び高級FLを含む濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、がある。B細胞非ホジキンリンパ腫の更なる例は、リンパ腫様肉芽腫症、原発性浸出リンパ腫、血管内大B細胞リンパ腫、縦隔大B細胞リンパ腫、重鎖疾患γ、μ及びα疾患を含む、免疫抑制剤による治療で誘導されるリンパ腫、例えばシクロスポリン誘導性リンパ腫、及びメトトレキセート誘導性リンパ腫、である。更なる実施態様では、本発明のヒト抗体を用いてホジキンリンパ腫を治療することができる。CD20発現B細胞が関与する、治療及び/又は予防の可能な免疫異常の例には、自己免疫異常、例えば乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、腎炎、湿疹、喘息、アテローム性硬化症、白血球接着不全、多発性硬化症、レイノー症候群、シェーグレン症候群、若年発症性糖尿病、ライター病、ベーチェット病、免疫複合体腎炎、IgAニューロパチー、IgM多発性神経炎、免疫媒介血小板減少症、例えば急性特発性血小板減少性紫斑病及び慢性特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、グレーブズ病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性感染性単核細胞症、HIV、及び疱疹ウィルス関連疾患、がある。更に、B細胞のウィルス感染により引き起こされる又は媒介される他の疾患及び異常は、更なる例は、重症急性呼吸窮迫症候群及び舞踏病網膜炎である。更に、他の疾患及び異常には、エプスタイン-バーウィルスEMBOJ12811820に解説された通りにホモ接合型破壊し、内因性のマウス重鎖遺伝子を、PCT公報WO0109187の実施例1に解説された通りにホモ接合型に破壊した。このマウス株はFishwildetalNatureBiotechnology14845851に解説された通りのヒトカッパ軽鎖導入遺伝子KCo5を持つ。このマウス株は、さらに、WO0243478に解説された14番染色体フラグメントhCFから成るヒト重鎖トランスクロモソームも持つ。HCo7マウスは、JKD破壊をそれらの内因性軽鎖カッパ遺伝子にChenetalEMBOJ12821830に解説された通りのもの、CMD破壊をそれらの内因性重鎖遺伝子WO0114424の実施例1に解説された通りのもの、KCo5ヒトカッパ軽鎖導入遺伝子FishwildetalNatureBiotechnology14845851に解説されたもの、及びHCo7ヒト重鎖導入遺伝子US5770429に解説されたものを持つ。HCo7及びKMマウス免疫化:HCo7及びKMマウスを、ヒトCD20トランスフェクトされたNS0細胞で免疫した。1回目の免疫処理のために、マウス1匹当たり、1x107個の細胞の150μlPBS溶液を1:1で完全フロイントアジュバントに混合し、腹腔内注射した。次のip免疫処理は、アジュバントとない同様の量の細胞を用いて行った。融合前の3及び2日間、マウスを05x107個の細胞のPBS懸濁液で静脈内により追加刺激した。マウスの血清中のヒトCD20を狙った抗体の存在を、フローサイトメトリにより、FACS分析を用い、ヒトCD20をトランスフェクトされたNS0細胞やCD20陰性親NS0細胞を用いて観察した。CD20に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製:マウス脾細胞をHCo7及びKMマウスから単離し、PEGでマウス骨髄腫細胞株に標準的なプロトコルに基づいて融合させた。次に、その結果できたハイブリドーマをヒトIgG、κの産生についてELISAでスクリーニングし、またCD20特異性について、ヒトCD20をトランスフェクトしたNS0及びSKBR3細胞を用いてFACS分析によりスクリーニングした。免疫後のマウスの脾臓リンパ球の単個細胞懸濁液を、SP20非分泌性マウス骨髄腫細胞の4分の1の数に50PEGシグマ社で融合させた。細胞をほぼ1×105/ウェルになるように平底微量定量プレートにプレートした後、約2週間、10ウシ胎児血清、10P388D1ATCC、CRLTIB63調整培地、35オリゲンのDMEM高グルコース、Lグルタミン及びピルビン酸ナトリウムのメディアテック、CRL10013溶液に5mMHEPES、0055mM2メルカプトエタノール、50mgmlゲンタマイシン及び1xHATシグマ社、CRLP7185を加えたものを含有する選択培地でインキュベートした。1-2週間後、細胞を、HATをHTに取り替えた培地で培養した。次に個々の細胞をフローサイトメトリによりヒト抗CD20モノクローナルIgG抗体についてスクリーニングした。広汎なハイブリドーマ成長が起きたら、培地を通常、10乃至14日後に観察した。抗体分泌性ハイブリドーマを取り替え、再度スクリーニングし、そしてまだヒトIgGについて陽性であれば、抗CD20モノクローナル抗体を限界希釈によりサブクローニングした。次に安定なサブクローンをinvitroで培養して少量の抗体を、特徴付け用の組織培養株中に産生させた。親細胞の反応性を保持したFACSにより各ハイブリドーマ由来のクローンを1つ、選び出した。510個のバイアルの細胞バンクを、各クローン毎に作製し、液体窒素中に保管した。CD20/一次スクリーンに結合するヒトモノクローナル抗体の選抜抗体のアイソタイプを判定するために、アイソタイプELISAを行った。微量定量プレートのウェルを1μgmlのマウス抗ヒトカッパ軽鎖で、1ウェル当たり50μlのPBS溶液にして被覆して、4°Cで一晩、インキュベートした。5ニワトリ血清で遮断した後、プレートをその上清及び精製済みアイソタイプコントロールと反応させた。次にプレートを周囲温度で1乃至2時間、インキュベートした。次にこのウェルをヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4特異的西洋わさびペルオキシダーゼ結合プローブと反応させた。プレートを展開させ、上述した通りに分析した。4種類のハイブリドーマ細胞株を作製したが、3つはKMマウスの融合体であり、1つは、以下の抗体を発現するHCo7マウスの融合体である:2F2:ヌクレオチド配列:配列番号1及び3、並びにアミノ酸配列:配列番号2及び4を持つヒトモノクローナルIgG1、κ抗体。4C9:2F2と全く同じアミノ酸配列である配列番号2及び4を持つヒトモノクローナルIgG1、κ抗体。7D8:ヌクレオチド配列:配列番号5及び7並びにアミノ酸配列:配列番号6及び8を持つヒトモノクローナルIgG1、κ抗体。11B8:ヌクレオチド配列:配列番号9及び11並びにアミノ酸配列:配列番号10及び12を持つヒトモノクローナルIgG3、κ抗体。用語2F2は、ここでは、ハイブリドーマクローン2F2由来の抗体と、ハイブリドーマクローン4C9由来の同一の抗体の両方を指すために用いられている。本発明の抗体は、それらが由来するもとのトランスジェニック又はトランスクロモソーマル非ヒト動物により判定される他のアイソタイプに切り換えることができる。本発明のある実施態様では、11B8ヒトモノクローナルIgG3、κ抗体を、全く同じVH及びVL鎖を有するヒトモノクローナルIgG1、κに切り換えることができる。別の実施態様では、本2F2IgG1、κ抗体又は7D8IgG1、κ抗体を、全く同じVH及びVL鎖を有するヒトモノクローナルIgG2、IgG4、IgA1、IgA2又はIgEアイソタイプに切り換えることができる。実施例2CD20に対するヒト抗体の抗体配列決定VL及びVH領域の配列決定RNAの調製:全RNAを、すべてHuMAbCD20ハイブリドーマ細胞株2F2、7D8及び11B8の5x106個の細胞から、RNeasyキットオランダ、ライスデン、ウェストバーグ、キアジェン社をメーカのプロトコル通りに用いて調製した。2F2及び7D8のcDNA調製:RNAの5’RACEReady相補DNAを、1μgの全RNAから、SMARTRACEcDNA増幅キットクロンテック社をメーカのプロトコルに従って用いて調製した。VH及びVL領域を、アドバンテージHF2PCRキットを用い、そして以下のプライマを用いて増幅した:VKRACE25’GCAGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTCCカッパにアニールVHRACE25’GCTGTGCCCCCAGAGGTGCTCTTGGAGGCH1にアニール11B8のcDNA調製:118B細胞由来のRNAの相補DNAを、3μgの全RNAから、AMVリバーストランスクリプターゼを緩衝剤ドイツ、マンハイム、ロシュダイアグノスティックスGmbH社、オリゴd15米国ウィスコンシン州マジソン、プロメガ社、dNTPドイツ、マンハイム、ロシュダイアグノスティックス社及びRNAsinプロメガ社と一緒にメーカのプロトコル2000年、バージョン3に従って用いて調製した。クローニング用のVH及びVL領域を増幅するために用いるPCRプライマ:用いたプライマ対:VHFR15’プライマAB62CAggTKCAgCTggTgCAgTCAB63SAggTgCAgCTgKTggAgTCAB65gAggTgCAgCTggTgCAgTCVHリーダ5’プライマAB85ATggACTggACCTggAgCATCAB86ATggAATTggggCTgAgCTgAB87ATggAgTTTggRCTgAgCTgAB88ATgAAACACCTgTggTTCTTCAB89ATggggTCAACCgCCATCCTVH3’プライマAB90TgCCAgggggAAgACCgATggVKFR15’プライマAB8RACATCCAgATgAYCCAgTCAB9gYCATCYRgATgACCCAgTCAB10gATATTgTgATgACCCAgACAB11gAAATTgTgTTgACRCAgTCAB12gAAATWgTRATgACACAgTCAB13gATgTTgTgATgACACAGTCAB14gAAATTgTgCTgACTCAgTCVKリーダ5’プライマAB123CCCgCTCagCTCCTggggCTCCTgAB124CCCTgCTCAgCTCCTggggCTgCAB125CCCAgCgCAgCTTCTCTTCCTCCTgCAB126ATggAACCATggAAgCCCCAgCACAgCVK3’プライマAB16CgggAAgATgAAgACAgATg但し式中KT又はG、SC又はG、RA又はG、YC又はT、及びWA又はT。2F2及び7D8をクローニングするためのVH及びVL領域を増幅するために用いたPCR条件:ポリメラーゼ連鎖反応PCRをHFポリメラーゼミックスクロンテック社をT1サイクラウェストバーグ、バイオメトラ社で用いて行った。PCR条件:94°C30秒、5サイクル72°C1分94°C30秒70°C30秒5サイクル72°C1分94°C30秒68°C30秒2730サイクル72°C1分11B8をクローニングするためのVH及びVL領域を増幅するために用いたPCR条件:ポリメラーゼ連鎖反応PCRをAmpliTaqポリメラーゼパーキンエルマ社をT1サイクラオランダ、ライスデン、ウェストバーグ、バイオメトラ社で用いて行った。PCRサイクリングプロトコル:94°C2分11サイクル94°C30秒65°C30秒、1サイクル毎にマイナス1°C72°C30秒30サイクル94°C30秒55°C30秒72°C30秒72°C10分4°Cまで冷却pGEMTベクタ系II2F2、7D8、及び118B中のVH及びVLのクローニング:アガロースゲルでPCR産物を分析後、この産物を、QIAEXIIゲル抽出キットオランダ、ライスデン、ウェストバーグ、キアジェン社で精製した。各VH及びVL領域の2つの個別に増幅したPCR産物をpGEMTベクタ系II消化を行い、アガロースゲル上で分析した。配列決定2F2、7D8及び11B8V領域を、pGEMTベクタ系IIでのクローニング後に配列決定した。配列決定は、Baseclearオランダ、ライデンで行われた。配列は、生殖細胞V遺伝子配列をVbasehttpwwwmrccpecamacukvbaseokphpmenu901でアライメントすることにより、分析された。得られた配列を図53-58に示す。実施例3GSNS0細胞系での2F2及び118Bの組換え作製2F2T2F2抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を、PCRを用いて標準的なクローニングベクタであるpGem5Zfから、最適なKozak配列と、GS定常領域ベクタpCONγ1f及びPCONκロンザ社中で断片をクローニングするのに適した制限部位とを含有するプライマを用いて増幅した。増幅後、当該断片を精製し、クローニング用の制限酵素で消化し、2つのベクタ内に連結した。重鎖可変断片をHindIII及びBsiWIで消化し、予めHindIII及びBsiWIで消化してあるpCONγ1fベクタ内に連結し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。軽鎖可変断片をHindIII及びApaIで消化し、予めHindIII及びApaIで消化してあるPCONκベクタ内に連結し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。pCONγ1f可変重及びPCONκ可変軽ベクタをそれぞれ図1及び2に示す。形質転換させたEcoliコロニをコロニPCRでチェックし、各重鎖及び軽鎖コンストラクトのうちの2つの陽性コロニを、プラスミド単離用に成長させた。これら4つのクローンのうちの単離されたプラスミドを配列決定した配列を確認した。HCクローンの両方と、LCクローンのうちの1つが、正しい配列を有していることが見出された。2つのHC及び1つのLCコンストラクトを組み合わせて、LCHCの2つの組合せを作製し、CHOK1細胞内に過渡的に同時トランスフェクトして、2F2抗体の適正な産生のためのコンストラクトを確認した。正常な産生レベルには、この発現実験においてすべての組み合わせて到達し、HC及びLCコンストラクトのそれぞれのクローン1つを二重遺伝子ベクタの構築に選んだ。標準的なクローニング法を用いて、重鎖ベクタであるpCONγ1f可変重鎖由来の完全発現カセットを、軽鎖ベクタであるpCONκ可変軽に連結することにより、HC及びLCコンストラクトを二重遺伝子クローニングベクタを組み合わせて、pCONγ1fκ2F2と指名した。pCONγ1fκ2F2ベクタを図3に示す。このコンストラクトは再度、CHOK1細胞での過渡的トランスフェクションで機能検査され、正常な発現レベルを示した。pCONγ1fκ2F2プラスミドの可変領域を配列決定して、正確な配列を再確認した。pCONγ1fκ2F2を、非反復制限酵素PvuIで消化し、発現に重要な領域の外側で切断することで、直線状のプラスミドを安定なトランスフェクションのために調製した。完全な直線化は、アガロースゲル電気泳動法で確認され、DNAを精製し、使用時まで-20°Cで保存した。NS0ホスト細胞の6回のトランスフェクションを、プラスミドDNAを用いたエレクトロポレーションにより、上記の直線状DNAプラスミドを用いて行った。トランスフェクション後、細胞を96ウェルプレートに分配し、インキュベートした。選択培地10透析済みウシ胎児血清及び10μMのGS阻害剤Lメチオニンスルホキシミンを含有するが、グルタミンは含有しないを加え、プレートを観察して、いつ、非トランスフェクト細胞が死亡してトランスフェクト細胞の焦点距離が残るかを判定した。GSベクタ系に関する更なる詳細については、WO8704462を参照されたい。トランスフェクト後のプレートをほぼ3週間、インキュベートして、コロニを形成させた。その結果できたコロニを顕微鏡検査して、コロニが検定にとって適した大きさウェルの底面を60を越えて覆うであること、そして、1つのコロニのみが各ウェル中に存在すること、を確認した。436個のトランスフェクタントからの細胞上清をスクリーニングして、集合した抗体について、IgG、κ、ELISAで調べた。このデータを用い、111個のトランスフェクタントを、静的培養での進行及び更なる評価に向けて選抜した。選抜された細胞系の培養物を展開させ、低血清含有培地ウシ胎児血清BSA及び添加された1dFCSを含有するに適合させ、静的培養での生産性の更なる評価を行ったELISA及びコンフルエント率の測定。65個の最もランクの高い細胞系を進行に向けて選抜した。選択された細胞系の生産性の予備評価を、低血清含有培地BSA及び添加した1dFCSを含有するに入れたバッチ震盪フラスコ懸濁液培養株で行った。ELISAによる回収抗体濃度及び許容可能な成長特徴に基づき、30個の細胞系を、無血清培地でのバッチ震盪フラスコ懸濁液培養株を用いた更なる評価に向けて選抜した。最高の抗体濃度を生じた10個の細胞系を、更に、無血清培地に入れた複式供給バッチ震盪フラスコ懸濁液培養株で評価した。回収時の産物濃度は、公知の標準的な方法に従って、プロテインA高速液体クロマトグラフィHPLCにより判定された。すべての細胞株が2F2抗体を、プロテインAHPLCで判定したところ6711333mgLの範囲の良好な収率で産生した。11B8T同様な方法で、GSNS0細胞株を、以下のように僅かに本トランスフェクション法を改変して、11B811B8Tと指名の組換え産生のために樹立した。NS0ホスト細胞のトランスフェクションを4回、プラスミドDNAを用いたエレクトロポレーションにより、上記の直線状DNAプラスミドを用いて行った。その結果できたコロニを顕微鏡検査して、コロニが検定にとって適した大きさウェルの底面を60を越えて覆うであること、そして、1つのコロニのみが各ウェル中に存在すること、を確認した後、596個のトランスフェクタントからの細胞上清をスクリーニングして、集合した抗体について、IgG、κ、ELISAで調べた。このデータを用い、100個のトランスフェクタントを、静的培養での進行及び更なる評価に向けて選抜した。選抜された細胞系の培養物を展開させ、低血清含有培地ウシ胎児血清BSA及び添加された1dFCSを含有するに適合させ、静的培養での生産性の更なる評価を行ったELISA及びコンフルエント率の測定。60個の最もランクの高い細胞系を進行に向けて選抜し、生産性データが入手できなかった更に13個の細胞系も進行させた。選択された細胞系の生産性の予備評価を、低血清含有培地BSA及び添加した1dFCSを含有するに入れたバッチ震盪フラスコ懸濁液培養株で行った。ELISAによる回収抗体濃度及び許容可能な成長特徴に基づき、30個の細胞系を、無血清培地でのバッチ震盪フラスコ懸濁液培養株を用いた更なる評価に向けて選抜した。最高の抗体濃度を生じた10個の細胞系を、更に、無血清培地に入れた複式供給バッチ震盪フラスコ懸濁液培養株で評価した。回収時の産物濃度は、公知の標準的な方法に従って、プロテインA高速液体クロマトグラフィHPLCにより判定された。これに基づき、細胞系のうちの1つを廃棄した。残りの9個の細胞系は、すべて、11B8抗体を、プロテインAHPLCで判定したところ354771mgLの範囲の良好な収率で産生した。実施例4ハイブリドーマ由来2F2及びトランスフェクトーマ由来組換え2F2Tの比較ゲル電気泳動法SDSPAGE及び陰性アガロースゲル電気泳動の使用により、2F2及び2F2Tは同じ大きさであり、電荷が僅かに異なることが示された。さらに、2F2及び2F2Tは、CD20トランスフェクトNS0細胞及びRaji細胞に、FACScaliburTM米国カリフォルニア州、ベクトンディッキンソン社を用いたフローサイトメトリで測定したところ同じ様な親和性で結合する。非トランスフェクトNS0細胞への結合は観察されなかったことから、2F2及び2F2Tの特異性が実証された。2F2及び2F2Tはまた、ARH77細胞IgG形質細胞白血病、Daudi細胞、DOHH細胞濾胞性中心芽細胞性/中心溶解性リンパ腫から進行した難治性免疫芽球性B細胞リンパ腫、ドイツ、ブラウンシュバイグ、DSMZ、及びRaji細胞において、CDCを濃度依存的な態様で同程度に誘導して、フローサイトメトリによる細胞溶解PI陽性細胞を計数する。二番目の実験では、2F2及び2F2Tの濃度を一定に維持し、他方、血清を様々な濃度で加えた。2F2及び2F2T間に有意な違いは観察されなかった。最後に、細胞関連CD20に結合した2F2及び2F2Tは、補体因子C1qに強く、かつ同程度に結合する。本実験はDaudi細胞、DOHH細胞、及びRaji細胞において、フルオレセイン結合抗C1qポリクローナル抗体を、C1qの結合を検出するために用いて行われた。実施例5:CD20に対するヒト抗体の結合特性異なる細胞株への結合:NS/0、ヒトCD20をトランスフェクトしたNS/0、Daudi細胞およびRaji細胞を、2F2、7D8および11B8を含有する培養上清とともに4°Cで30分間インキュベートし、続いて、FITC結合抗ヒトIgGAbとともにインキュベートした。FACScaliburフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーによって結合を評価した。負の対照アイソタイプに対応したサンプルと、蛍光強度を比較した。図4に示すように、3つの抗体は全て、ヒトCD20をトランスフェクトしたNS/0細胞に結合したが、一方、親細胞、非トランスフェクトNS/0細胞に対する結合は認められなかった。3つ全ての抗体は、2つの異なるバーキットリンパ腫B細胞株RajiおよびDaudiにも結合した。このことは、2F2、7D8および11B8はCD20特異的であることを示している。7D8または11B8を含有する上清を非飽和条件下で試験した。したがって、2F2と比較してより低い中間蛍光強度が観察される。フローサイトメトリーにより測定した2F2のEC50値:ヒトB細胞上で発現したCD20の2F2の見かけのアフィニティーを測定するために、3例のヒトドナーから単離したPBMCと、CD3陰性細胞のゲーティング法を用いて、2F2で結合曲線を作成した。単離したPBMCをある濃度域のFITC標識2F2とともに1時間インキュベートし、FACSで分析し、中間蛍光強度MFIを測定した。MFI値を抗体濃度の関数として図5Aおよび5Bに示す。EC50値は、GraphPadPrism302を用いて、非線形回帰により計算した。ヒトにおける2F2のEC50値は、3ドナー全てについて類似しており、中間値±semは、287±12.7ng/ml1.9±0.1nMであった。CD20発現細胞に対する125I標識mAbsの結合:mAbsを、ヨードビーズIodobeadsPierceChemicalCoRockfordILを用いてヨウ素化した。125I標識mAbsを連続的に希釈し、RamosEHRB細胞とともに、37°Cで2時間、アジ化ナトリウムおよび2-デオキシグルコースの存在下でインキュベートし、エンドサイトーシスを阻害した。次いで細胞結合した125I標識mAbs、および無細胞の125I標識mAbsを、フタレートオイルの混合物を介して、14000xgで2分間遠心分離し、結合平衡状態を妨害することなく、急速分離させた。結合した抗体とともにペレット化した細胞をガンマカウンターWallacUKLtdMiltonKeynesUKを用いて計測した。図6に示すように、2F2および11B8は、類似のKDもしくは類似の飽和点を示している。これは、双方の抗体が類似のアフィニティーで結合することを示すものである。しかしながら、11B8は、2F2より低いレベルで飽和する。これは、11B8が異なる形態のCD20を認識することを示している。これはまた、更なる実験にも一致しており、同様のレベルの結合飽和細胞1個につき約2~3×105個の抗体分子によって示されているように、同様の数の2F2およびリッキシマブ分子がRamosEHRB細胞およびDaudi細胞上でCDD20に結合することを示している。対照的に、11B8およびB1は、このレベルの半分のレベルで飽和し、約1~2×105個の抗体分子のみがRamos-EHRB細胞図7AおよびDaudi細胞図7Bに結合する。ヨウ素化された抗体がFcレセプターを介して結合するという可能性を排除するために、抗CD20Fab’2断片を用いた結合曲線を確認した。また、同数の2F2およびリッキシマブ-Fab’2断片が、Ramos-EHRB細胞とDaudi細胞の双方に結合した。これらの実験においても、Ramos-EHRBおよびDaudi細胞に結合した2F2またはリッキシマブ抗体分子は、この細胞に結合した11B8およびB1の数の約2倍で飽和状態となった。解離速度:mAbsの解離速度を測定するために、Ramos-EHRB細胞アジド2DOGの存在下での最終体積:1mlを37°Cで2時間、2μg/mlの125ImAbsとともにインキュベートし、結合の最大値に達した。微小遠心管2000rpmで2分での遠心分離後、上清を除去し、ペレットを迅速に1ml培地中に再懸濁させ、すぐに、37°Cで、15ml円錐チューブ中の9mlの培地に移した。次の2時間の間の様々な時点において、0.4mlのサンプルを除去し、フタレートオイル上で分離し、細胞表面に残る放射線標識したmAbsのレベルを測定した。図8に示すように、2F2および11B8の双方は、リッキシマブまたはB1と比較して、CD20から有意に遅く解離した。抗CD20Fab2断片の解離速度:2μg/mlの、2F2、11B8およびリッキシマブの125I標識Fab2断片をそれぞれ用いて、RamosEHBR細胞を飽和状態にした。RamosEHBR細胞を高濃度の非標識抗体の存在下で洗浄し、インキュベートした。RamosEHRBとの最大の最初の結合を100に設定した。ローディング後、次の3時間の複数の時点において、0.4mlのサンプルを除去し、フタレートオイル上で分離し、細胞表面に残る放射線標識mAbのレベルを測定した。図9からわかるように、2F2および11B8は、リッキシマブと比べて、CD20の表面からはるかにゆっくりと解離した。90分後、約50のFab2リッキシマブ分子が細胞に結合したが、Fab22F2分子の半分が3時間後に解離した。2F2、11B8T、およびリッキシマブのkdkoff値は、以下のように計算する。抗CD20mAb機能オフ速度:リッキシマブに比べて2F2解離速度が遅いことの効果を、機能的CDCアッセイにおいて評価した。この目的のために、Daudi細胞またはSU-DHL4細胞を10μg/mlの抗CD20mAbまたはアイソタイプ対照抗体とともにプレインキュベートし、洗浄し、さらに別の時点において培地中でインキュベートした。アッセイ開始後のこれらの時点において、サンプルを補体正常ヒト血清:20vol/volとともにインキュベートし、次いで、さらに45分間37°Cでインキュベートした。その後、細胞の溶解を、PIヨウ化プロピジウム染色法を用いて、FACSで測定した。溶解細胞PI陽性細胞を図10ADaudi細胞または図10BSU-DHL4細胞に、インキュベーション時間の関数として示す。2F2は、双方の細胞株において高CDCを誘導し、6時間後、さらに細胞の90まで溶解した。このことは、細胞のCD20飽和が十分高く、補体が媒介する、大半の細胞の溶解を誘導したことを示している。対照的に、そして解離速度の研究と一致して、リッキシマブは、急速に細胞から解離し、6時間のインキュベーション後、特異的な溶解を誘導しなかった。11B8を対照として使用したが、CDCを誘導しなかった。実施例6:CD20に対するヒト抗体のCDC血清の調製:補体溶解のための血清を、健康なボランティアからの血液をオートセップゲルおよび凝固アクチベーターバキュテイナーチューブautosepgelandclotactivatorvacutainertubesBDbiosciencesRutherfordNJ中に抜き取って調製した。それを室温で30~60分間保持し、次いで3000rpmで5分間遠心分離を行った。血清を回収し、-80°Cで保存した。フローサイトメトリー:フローサイトメトリーを行うために、CellQuestプロソフトウェアBDBiosciencesMountainviewCAとともにFACScaliburフローサイトメーターを用いた。前方側方スキャターforwardsidewardscatterFCS閾値を調節することによって細胞残骸を除外しながら、少なくとも5000の現象を分析のために集めた。CDCカイネティクス:第1の一連の実験n=3において、5つの異なるB細胞株、すなわち、Daudi、SU-DHL-4、Raji、DOHHおよびARH-77のCDCのカイネティクスを、ヒト血清を加える10分前に、10μg/mlの2F2、リッキシマブおよびIgG対照抗体をそれぞれ、添加することによって測定した。CDC誘導後、いくつかの時間間隔で最大1時間、細胞をPI溶液中に懸濁させ、細胞溶解PI陽性細胞の数をフローサイトメトリーによって測定した。その結果を図11AARH-77細胞、11BDaudi細胞、11CRaji細胞、11DDOHHおよび11ESU-DHL-4に示す。示されているように、抗体を添加すると、5分以内に、細胞溶解が誘導された。興味深いことに、2F2を添加したところ、5つ全てのB細胞株の80より多くで、著明な細胞溶解が認められた。リッキシマブは、SU-DHL-4およびDaudi細胞株においてのみ、80より多くの細胞溶解を誘導した。一方、DOHH細胞株の細胞溶解は、~50であり、ARH-77およびRaji細胞株においては20未満であった。IgG対照抗体を用いたものでは溶解は認められなかった図11Bにのみデータを示している。CDC血清滴定:別個の一連の実験n=5において、NHS正常なヒト血清を、2つの異なる抗体濃度、0.5μg/mlおよび5μg/ml、で滴定した。ある濃度域のNHSを添加する前に、細胞を2F2またはリッキシマブを用いて10分間プレインキュベートした。CDCの誘導の45分後、細胞をPI溶液に再懸濁した。細胞溶解PI陽性細胞の数をフローサイトメトリーで測定した。図12A~Dは、溶解したPI陽性細胞のパーセンテージを、NHS濃度の関数として示している。図12Aは、Daudi細胞の細胞溶解を示し、図12Bは、ARH-77細胞の細胞溶解を示し、図12Cは、DOHH細胞の細胞溶解を示し、そして、図12Dは、Raji細胞の細胞溶解を示している。NHS濃度を増加させることによって、細胞溶解の増加が観察された。2F2を添加することによって、最も高いNHSおよび抗体濃度で、Daudi細胞の溶解が最大となった。リッキシマブは、最も高いNHS濃度で、Daudi細胞の約50の細胞溶解を誘導した。ARH-77細胞においては、NHSおよび2F2の濃度が最も高いときのみ、約75の細胞溶解が導かれた。抗体濃度が低いと、ARH-77細胞溶解を十分に誘導しなかった。リッキシマブは、本実験においては、ARH-77細胞の溶解を誘導することができなかった。2F2は、高濃度および低濃度において、NHS濃度依存性の細胞溶解を誘導することができた。一方、リッキシマブは、これらの条件下で溶解を誘導することができなかった。最後に、2F2は、Raji細胞のNHS濃度依存性の細胞溶解を誘導した。それは、5μg/mlのmAbを用いたときのみ明らかであた。リッキシマブを用いたものでは溶解は認められなかった。これらの実験においては、アイソタイプ対照抗体を用いた場合、溶解は認められなかったデータは示していない。CDC抗体滴定:抗CD20抗体が低濃度でCDCを誘導する可能性を測定するために、抗体を滴定するn=6実験を行った。種々の細胞株をある濃度域の2F2およびリッキシマブそれぞれとともに、NHSを添加する10分前にプレインキュベートした。37°Cでのインキュベーションの45分後最大の溶解が生じるとき、細胞をPI溶液に再懸濁させ、細胞溶解PI陽性細胞の数をフローサイトメトリーによって測定した。図13ADaudi細胞、13BDOHH細胞、13CARH-77細胞および13DRaji細胞は、溶解したPI陽性細胞のパーセンテージを、抗体濃度の関数として示している。2F2もリッキシマブも、細胞溶解の濃度依存的増加を誘導した。2F2は、2μg/mlのDaudi細胞を添加するとすぐ、80より多くの細胞溶解を誘導した。一方、リッキシマブを用いた場合、10μg/mlを添加した後でさえ、このレベルに到達しなかった。また、2F2は、0.4μg/mlで、DOHH細胞の80を超える溶解を誘導したが、一方、この濃度においてリッキシマブを用いた場合の溶解は最小であった。リッキシマブ分析される細胞の合計の30までを用いた場合のDOHH細胞の溶解は、10μg/mlで最大に達した。2F2によるARH-77およびRaji細胞の溶解の誘導は、より低かったが、それでもなお、10μg/mlの抗体濃度で70までの溶解が達成された。最も高い濃度において、リッキシマブは、ARH-77細胞の~23のみにおいて、Raji細胞の~6のみにおいて、溶解を誘導した。同様の実験において、2F2、2F2T、11B8Tおよびリッキシマブについて、それらが、Daudi細胞株およびRaji細胞株のCDCを誘導する能力を有しているかどうかを調べた。図14Aおよび14B参照。この実験においても、10μg/mlでトランスフェクトーマtransfectoma由来の2F2Tを用いた場合、Daudi細胞で80を超える細胞溶解が認められた。一方、リッキシマブは、10μg/mlにおいてさえも、溶解は60に過ぎなかった。図14A参照。2F2Tを用いた場合のDaudi細胞の溶解は、ハイブリドーマ由来の2F2を用いた場合に観察された溶解と同じであった。Raji細胞の溶解は、より困難であったが、2F2および2F2Tもまた、Raji細胞の溶解を同程度に誘導した図14B。リッキシマブは、Raji細胞のCDCを誘導することができなかった。これは図13Dに示された実験と一致するものである。図14Aおよび14Bからわかるように、Daudi細胞もRaji細胞も11B8TによるCDCの影響を受けやすかった。B1は、Daudi細胞の溶解を誘導した少量に過ぎなかったが、Raji細胞の溶解を誘導することはできなかった。Daudi細胞における抗CD20のCDC活性:各抗体のCDC活性を測定するために、ヨウ化プロビジウムPI染色細胞のFACS分析によって膜透過性の上昇を評価した。簡単に述べれば、Daudi細胞を洗浄し、RPMI/1BSA中に1×106個/mlで再懸濁させた。種々の濃度のヒトモノクローナル抗体をDaudi細胞に添加し、細胞上でCD20に室温で10~15分間、結合させた。その後、補体源としての血清を添加し、最終濃度を20v/vとし、その混合物を37°Cで45分間インキュベートした。次いでその細胞を分析するまで、4°Cで保持した。次いで、各サンプル150μlを、FACSチューブ中の10μlのPI溶液10μg/mlのPBSに添加した。すぐにその混合物をフローサイトメトリーによって評価した。図15Aに示すように、2F2および7D8は、リッキシマブと比較してすぐれたCDC活性を示していた。第2の実験において、細胞を上記のようにヒトモノクローナル抗体で標識し、洗浄し、PBS中において、ヒト血清を添加する前に、37°Cで45分間インキュベートした。これによって、血清添加時に、細胞に結合する抗体のみが、細胞溶解のための補体を活性化することができることを確認した。図15Bに示すように、2F2および7D8と比較して、リッキシマブにおいて、CDC活性が減少した。これは、ヒト抗体2F2および7D8が血清添加前に細胞を洗浄することによる影響を受けなかったことを示すものである。Raji細胞における抗CD20のCDC活性:CD55およびCD59の表面発現が比較的高く、したがって、補体の攻撃に対する耐性が高い、Raji細胞を用いてCDC活性を評価した。ヒト抗体をRaji細胞に添加し、15分間結合させた。ヒト血清20を添加し、その混合物を37°Cで45分間インキュベートした。図16Aに示されているように、リッキシマブは、Raji細胞のCDCの媒介において効果がなかったが、2F2または7D8によってオプソニン化されたRaji細胞においては、有意なレベルの細胞溶解が発生した。したがって、2F2および7D8は、CD55/59陽性標的細胞を溶解する独自の能力を有している。別の実験において、Raji細胞を、飽和濃度の抗CD55mAb最終濃度:5μg/mlおよび抗CD59mAb最終濃度:5μg/mlとともに、プレインキュベートし、これらの補体防御分子の効果をブロックした。次いで、ヒト抗CD20抗体を、血清20とともに上記のように37°Cで45分間添加した。図16Bに示されているように、CD55およびCD59分子の遮断によって、ヒト抗体2F2または7D8では、Raji細胞のほぼ100が溶解したが、一方、リッキシマブを用いて観察されたものにおいては、細胞溶解が25増加したに過ぎなかった。補体インヒビターIの役割-表面分子の発現:CD55やCD59などの補体インヒビターは、リッキシマブ誘導性CDCに対する感受性において重要な役割を果たしているようであるので、検討中のB細胞株Raji、Daudi、DOHH、ARH-77およびSU-DHL-4上でのこれらの分子の発現を測定するために実験を行った。細胞をFITC結合抗CD55抗体、抗CD59抗体および抗CD20抗体で染色し、分子の発現をフローサイトメトリーによって分析した。その結果を下の表1に示す。補体インヒビターIIの役割-CD55およびCD59のブロッキング:抗CD20誘導CDC中におけるCD55およびCD59の役割をさらに調べるために、CDCの誘導を行う前にn=3、双方の補体インヒビター分子を特異的な抗体でブロッキングした。2F2のみでは、部分的な溶解しか誘導されなかったので、Raji細胞を用いた。Raji細胞1×105個/50μlを、ある濃度域の2F2およびリッキシマブと、抗CD555μg/mlまたは抗CD595μg/ml抗体とともに用いて、プールされたNHS20を添加する前に10分間プレインキュベートした。CDC誘導の45分後、PI溶液中に細胞を再懸濁させた。細胞溶解PI陽性細胞の数をフローサイトメトリーによって測定した。図17A~17Cは、溶解したPI陽性細胞のパーセンテージを、抗体濃度の関数として示し、3つの実験のうち1つの実験を例として示している。図17Aは、抗CD55抗体を用いたRaji細胞のインキュベーション、図17Bは、抗CD59抗体を用いたRaji細胞のインキュベーション、そして、図17Cは、抗CD55抗体および抗CD59抗体を用いたRaji細胞のインキュベーションを示している。図17Aからわかるように、抗CD55抗体を添加しても、2F2もしくはリッキシマブ誘導CDCに影響がなかった。抗CD59抗体を添加したら、細胞の2F2およびリッキシマブへの感受性が~30増加した図17B。抗CD55および抗CD59を添加したところ、さらに抗CD20誘導性の細胞溶解を~30高めた図17C。フローサイトメトリーIによって測定された補体因子の役割-C1q結合:抗CD20抗体2F2およびリッキシマブならびにアイソタイプ対照抗体を種々のB細胞株に添加した。インキュベーションの10分後、NHS1vol/volを添加した。さらに37°Cで、10分間のインキュベーションを行い、細胞を洗浄した後、上清を捨て、細胞ペレットをFITC結合抗C1q抗体とともにインキュベートした。データは、C1qで染色した細胞の蛍光強度の中間値を示しており、図18ADaudi、18BARH-77、18CDOHHおよび18DRajin=6に示している。その結果は、検討したB細胞株とは無関係に2F2によるC1qの結合の抗体濃度依存性の上昇を示すものであった。さらに2F2によるC1qの結合は通常、試験した全ての細胞株において、リッキシマブによる結合より高かった。アイソタイプ対照抗体を用いた場合、蛍光の中間値の上昇は認められなかったデータは示していない。フローサイトメトリーIIによって測定された補体因子の役割-古典経路を介しての補体の活性化:C4cの抗体が塗布された細胞への固着は、古典経路を介しての補体の活性化を示す。抗CD20抗体2F2およびリッキシマブならびにアイソタイプ対照抗体を、種々のB細胞株に添加した。37°Cで10分間のインキュベーション後、NHS1vol/volを添加した。さらなるインキュベーションおよび細胞の洗浄後、上清を捨て、細胞ペレットをFITC結合抗C4c抗体とともにインキュベートした。データは、C4cで染色した細胞の蛍光強度の中間値を示しており、図19ADaudi、19BARH-77、19CDOHHおよび19DRajin=6に示している。補体因子C4cの2F2への固着は、試験した全てのB細胞株において証明されn=3、最大で抗体の1μg/mlに達した。細胞株とは無関係に、2F2結合後のC4cの固着は、リッキシマブ後よりはるかに高かった。アイソタイプ対照抗体を用いた場合、蛍光の中間値の上昇は認められなかったデータは示していない。熱不活性化血清中のCDC:細胞Daudi細胞、ARH-77細胞またはRaji細胞および抗体リッキシマブ、2F2、2F2T、11B8、およびアイソタイプ対照抗体HuMabKLHIgG1を、ある濃度域の抗CD20抗体で、10分間プレインキュベートした。NHS活性もしくは30分後57°Cの水浴中で熱不活性化されたものを添加した。CDC導入の45分後、細胞をPI溶液中に再懸濁した。細胞溶解PI陽性細胞の数をフローサイトメトリーによって測定した。熱不活性化血清の存在下では、用いられた細胞株およびCD20抗体とは無関係に、溶解は観察されなかった。そして、CDCは、熱不活性化血清の存在下では、認められなかった。実施例7CD20に対するヒト抗体のADCC、ADCCアッセイIヒト好中球の濃縮:多形核細胞好中球、PMNを、ヘパリン化全血から濃縮した。血液をRPMI1640中で2倍に希釈し、フィコールリンパ球分離培地1077g/ml、710g、RT、20分;BioWhittakercat17829Elotno014832上に重ね、2000rpmで20分間遠心分離を行った。その分子細胞層を除去し、好中球を含有するペレット内の赤血球を、氷冷NH4Cl溶液155mMのNH4Cl、10mMのNaHCO3、0.1mMのEDTA、pH7.4を用いて低張溶解した。残りの好中球を2回洗浄し、10FCSRPMI-10を添加したRPMI1640中に再懸濁した。ヒト抹消血単核細胞の濃縮:ヒト血をRPMI1640で2倍に希釈し、血液細胞をフィコールリンパ球分離培地:1077g/ml、710g、RT、20分;BioWhittakerCambrexBioScienceVerviersVerviersBelgiumcat17829Elotno014832上に重ねた。抹消血単核細胞MNCを境界相から回収し、洗浄し、10FCS、2mMのL-グルタミン、5U/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン全てBioWhittakerから入手を添加したRPMI1640培養培地中に再懸濁し、それに25MMのHEPESBioWhittakerを添加した。ADCCセットアップ:標的B細胞新鮮に単離されたB細胞もしくはB細胞株からのB細胞を20μCiの51CrAmershamBiosciencesUppsalaSwedenで2時間標識した。RPMI-10中で集中的に洗浄した後、該細胞を1×105個/mlに調節した。全血または単離されたエフェクター細胞50μl;MNCs、PMNまたは血漿50μl、感作抗体50μl、およびRPMI-1050μlを丸底マイクロタイタープレートGreinerBioOneGmbHFrickenhausenGermanyに添加した。標的細胞50μlを最終的な体積が200μlとなるように添加することによって、アッセイを開始した。単離エフェクター細胞については、エフェクター対標的E:Tの比率40:1を使用した。全血として、推定されたエフェクター対標的E:Tの比率=40:1に対応する33vol/volの量を用いた。インキュベーション3時間、37°C後、遠心分離を行ってアッセイを止め、3倍からの51Cr放出を、シンチレーションカウンターにおいて毎分放射能数cpmで測定した。細胞毒性のパーセンテージを下記式から計算した。相対溶解率=実験上のcpm-基本cpm最大cpm-基本cpm×100最大51Cr放出は、標的細胞に過塩素酸最終濃度3を添加することによって測定し、基本放出は、感作抗体およびエフェクター細胞の不存在下で行った。統計:データをワンウェイANOVAによって分析した後、Tukey’sマルチ比較ポストホック試験を行った。分析は、GraphPadPrismversion302forWindows登録商標GraphPadSoftwareSanDiegoCAUSAを用いて行った。ARH-77細胞の溶解:第1の一連の実験において、ARH-77細胞を標的細胞として用いた図20。2F2n=3、リッキシマブn=3または11B8Tn=1を添加した結果、約50のMNC媒介性のARH-77細胞の溶解が起こった。好中球の存在下では、特異的溶解は認められなかった。補体の役割を評価するために血漿を添加したところ、2F2を用いたインキュベーション後、ARH-77細胞の溶解が起こったが、リッキシマブp50フォトン/5分。各マウスの腫瘍質量を、光シグナルを体表面に統合させることによって、25、32、39および46日目に定量化した。図43参照。最速の腫瘍成長は、アイソタイプ対照群において観察された。リッキシマブでの治療によって、腫瘍成長が有意に阻害された。しかしながら、2F2T、11B8TおよびB1による腫瘍成長阻害の方が、より強かった。有意なレベルを示した以下の表2を参照されたい。実施例13:カニクイザルでの実験および薬物導体学的研究1日1回連続4日間静脈投与伏在静脈を介して後、カニクイザル約2歳;体重:2.1~2.6kgの範囲における2F2の薬物動態学的パターンおよび薬理学的効果を決定することを目的とした。その同等の力価を決定するために、本研究では、リッキシマブの薬理学的効果の比較も行った。この目的のために、6匹のオスおよび6匹のメスカニクイザルを、4日間連続で、定用量体積の10ml/kgで、1.25、6.25および12.5mg/kg/日の用量レベルで2F2またはリッキシマブをそれぞれ投与する、6用量群に割り付けた。最後の用量を投与後、130日間、動物を投与後観察した。この研究に採用した実践および手順は、UnitedKingdomDepartmentofHealthが制定したOECDPrinciplesofGoodLaboratoryPracticeにしたがっている。全ての動物を、処置に対して悪い健康状態の徴候または反応を示していないかどうかについて、定期的に観察し、身体測定を行った。本研究の間に、血液学、凝固、臨床化学および尿検査の実験室での検査を行った。血液サンプルおよびリンパ節生体組織をリンパ節表面から取得し、投与中、および投与後観察を通して、フローサイトメトリー分析を行った。以下の細胞表現型、すなわち、CD3、CD4、CD8、CD20およびCD21について、フローサイトメトリーによって分析した。投与後観察期間完了後、動物を殺し、詳細な剖検を行った。2F2またはリッキシマブを用いた治療に関連すると考えられる有害な臨床徴候または所見は認められなかった。図44および45は、治療された動物の抹消血のCD20およびCD21発現細胞のフローサイトメトリー分析をそれぞれ示す。図46は、リンパ節でのCD20発現細胞のフローサイトメトリー分析を示す。あわせて、本研究中に分析された双方の表現型は、6.25mg/kg/日合計25mg/kgおよび12.5mg/kg/日合計50mg/kgで2F2およびリッキシマブを投与した後、強く、有効なB細胞欠失を示している。さらに、データは、2F2で処置した動物のリンパ節および抹消血におけるCD20発現細胞の再増殖は、25mg/kgおよび50mg/kgを投与した75日後、すなわち、リッキシマブで治療した動物におけるより著明に遅く、起こった。さらに、図47A~Cは、抹消血におけるCD20低CD23CD40高発現細胞サブポピュレーションYVugmeysteretal2003Cytometry52A101109のフローサイトメトリー分析を示す。1日1回1.25mg/kg図47A、6.25mg/kg図47B、および12.5mg/kg図47Cの用量レベルで、2F2またはリッキシマブのいずれかを連続4日間静脈投与することによって治療したサルから取得した抹消血細胞を、抗ヒトCD20FITCネズミモノクローナル抗体Coulterを用いて、室温で10分間、インキュベートした。その後、PBSとともにカウントビーズcountbeads添加し、細胞を2回洗浄し300g、10分間、その後すぐ、CD20低CD23CD40高対CD20高CD23CD40低発現細胞サブポピュレーションの分析を、フローサイトメーターBeckmanCoulterで行った。示されたCD20低CD23CD40高細胞は個/μlで表した。図47からわかるように、2F2は、CD20低CD23CD40高発現細胞では、リッキシマブと比較して完全な長い欠失を示していた。実施例14:部位特異的突然変異誘導を用いたエピトープマッピング突然変異誘導アプローチを用いたエピトープマッピング研究によれば、第2の細胞外ループの170位のアラニンA170および172位のプロリンP172は、公知の抗CD20抗体によるヒトCD20の認識にとって重要である。Deansと共同研究者MJPolyaketalBlood2002999pp32563262MJPolyaketalJImmunol19981617pp32423248による研究においては、試験された全ての抗CD20mAbの結合は、A170とP172を対応するネズミCD20残基S170およびS172に変更することによって阻害された。AxPエピトープの認識における異種性が認識されたが、リッキシマブのような大半の抗体は、ヒトA170xP172配列に突然変異したS170およびS172を持つネズミCD20を認識する。ところが、他のいくつかのものは、AxP配列のN末端の近くにさらなる突然変異を必要とする。本発明のA170xP172刺激がまた、抗体の結合にとって有用であるかどうかを確認するために、部位特異的突然変異誘導AxP突然変異=A170S、P172Sを用いて、AxP配列をSxSに突然変異させ、細胞をAxP突然変異および野生型WTCD20DNAを用いて、トランスフェクトし、抗CD20mAbsの結合特性を比較した。さらなる突然変異体、P172S172位のプロリンをセリンに変異させた、N166D166位のアスパラギンをアスパラギン酸に変異させたおよびN163D163位のアスパラギンをアスパラギン酸に変異させたを調製した。部位特異的突然変異誘導を用いて、変異したアミノ酸残基が本発明の抗体の結合に重要であるかどうかを評価した。これを調べるために、制限部位を導入する好適なプライマーおよび最適な発現のための理想的なKozak配列を用いてCD20コード配列を増幅させることによって、CD20発現ベクターを構築した。増幅した断片を消化し、発現ベクターpEE13.4中にライゲーションした。Ecoli中でトランスフォーメーション後、挿入物についてコロニーをスクリーニングし、正しい配列を確認するために、配列のための2つのクローンを選択した。コンストラクトをpEE134CD20HSと名づけた。突然変異誘導を行い、AxP突然変異を導入し、またヒトCD20の20マウス突然変異を細胞外ループ領域に導入した。制限酵素による消化および配列決定によって突然変異誘導を確認した。そのコンストラクトを一時的にCHO細胞AxP突然変異のためまたはHEK293F細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後または48時間後にフローサイトメトリーを用いて分析を行った。オリゴヌクレオチドPCRプライマー:オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、IsogenBVMaarssenTheNetherlandsによって定量化した。濃度100pmol/μlの水中にプライマーを再構築し、必要時まで-20°Cで保存した。PCRおよび配列プライマーの概要を表3に示す。核酸の光学密度測定:Ultrospec2100proClassicAmershamBiosciencesUppsalaSwedenを用いて、製造元の指示にしたがって、光学密度を測定した。OD260nmの分析によってDNA濃度を測定したOD260nmユニット=50μg/ml。参照溶液は、核酸を溶解するために使用される溶液と同じとした。Ecoli培養物からのプラスミドDNAの単離:プラスミドDNAを、Qiagen社製キットを用いて、製造元の指示にしたがって、Ecoli培養物から単離したWestburgBVLeusdenTheNetherlands。嵩高のプラスミドを調製するために、HiSpeedplasmidMaxikitか、HiSpeedplasmidMidikitのいずれかを使用したQiagen。小規模のプラスミドを調製するためにはすなわち、2mlのEcoli培養物、QiaprepSpinMiniprepKitQiagenを使用し、DNAを50μlのTETris-HCl、10mM、pH8.0、EDTA、1mM中に溶出させた。PCR増幅:PfuTurbocHotstartDNAポリメラーゼStratageneAmsterdamTheNetherlandsについて、製造元の指示にしたがって、PCR反応を行った。各反応物20μlは、1×PCR反応緩衝液、200μMの混合dNTPs、6.7pmolずつのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、約1ngの鋳型DNAおよび1ユニットのPfuTurbocHotstartDNAポリメラーゼを含有していた。95°Cで2分のプログラムを30サイクル、次いで95°Cで30秒を30サイクル用いて、TgradientThermocycler96BiometraGmbHGoettingenGermany上でPCR反応を行い、45~65°Cの勾配で30秒のアニーリング、72°Cで2分の伸長、次いで、72°Cで10分の最終的な伸長ステップ、続いて4°Cで保存を行った。完全な反応をアガロースゲル電気泳動によって分析した。アガロースゲル電気泳動:アガロースゲル電気泳動を、1×トリス/酢酸/EDTATAE緩衝液中、50mlのゲルを用いて、SambrookMolecularCloningLaboratoryManual第3刷にしたがって行った。ゲルにエチジウムブロミドを含ませ、UV光の下で観察することによってDNAを視覚化した。ゲルの画像は、CCDカメラおよび画像分析システムによって記録したGeneGnomeSyngeneCambridgeUK。制限酵素による消化:制限酵素は、NewEnglandBiolabsBeverlyMAから供給を受け、供給元の推奨に従って使用した。通常、100ngは、最終体積10μlで、適切な緩衝液中に含まれた5ユニットの酵素によって消化された。必要に応じて、反応の体積を増加させた。消化物を製造元の推奨温度で、最低60分インキュベートした。不適合の緩衝液または温度用件を有する制限酵素を用いて、2倍の消化を必要とする断片の場合は、各酵素の好ましい条件が結果として提供されるように、消化を連続的に行った。アルカリフォスファターゼ処理ShrimpアルカリフォスファターゼUSBClevelandOHを供給元の推奨にしたがって使用した。アルカリフォスファターゼは、DNA断片の末端から5’-ホスフェート基を除去し、それによって、セルフライゲーションを妨害する。DNA断片のセルフ再ライゲーションは、複製-競合ベクターとすることができた。この酵素は、大半の制限酵素緩衝液において活性であるが、必要に応じて添加された。消化後、温度を15分間70°Cに上げることによって、酵素を不活性化した。PCRの精製および制限酵素反応生成物:ミニ溶出PCR精製キットQiagenより供給を用いて、製造元の指示にしたがって精製を行った。簡単に述べれば、DNAサンプルを5体積の結合緩衝液IQiagen中に希釈し、エッペンドルフ型遠心チューブ中のミニ溶出カラム上に載せた。集合体をベンチトップ微量遠心機中で遠心分離した。このカラムを緩衝液IIQiagenで2回洗浄した:緩衝液処理後、集合体を遠心分離にかけ、フロースルーを捨てた。緩衝液を添加せずに、遠心分離によってカラムを乾燥させた。溶出緩衝液をカラムに添加することによってDNAを溶出し、溶出物を遠心分離によって回収した。単離DNAをUVスペクトロスコピーによって定量化し、また、アガロースゲル電気泳動によって質を評価した。アガロースゲルからのDNA断片の単離:適切であればすなわち、多数の断片が存在する場合、消化されたDNAサンプルをゲル電気泳動によって分離し、所望の断片をゲルから切り出し、QIAEXIIゲル抽出キットQiagenを用いて、製造元の指示にしたがって、回収した。簡潔に述べれば、DNAバンドをアガロースゲルから切り出し、適切な緩衝液中に、55°Cで溶融した。QIAEXII樹脂を添加し、5分間インキュベートした。QIAEXII樹脂を短い遠心分離ステップ1分、14000g、RTによってペレット化し、500μlの洗浄緩衝液PEで2回洗浄した。最終的なペレットをフードで乾燥させ、DNAを適切な体積のTEと温度DNAのサイズによるで溶出させた。DNA断片のライゲーション:ライゲーションを、QuickLigationKitNewEnglandBiolabsを用いて製造元の指示にしたがって行った。各ライゲーションにおいては、ベクターDNAを適切に3倍の余剰モルの挿入DNAと混合し、その結果、DNAの総量を10μl中200ng未満とし、必要に応じて体積を水で調整した。これに、10μlの2×Quickライゲーション緩衝液および1μlのQuickT4DNAリガーゼを添加し、このライゲーション混合物を室温で、5~30分間インキュベートした。DNAのバクテリアへのトランスフォーメーション:DNAのサンプルを用いて、OneShotDH5αT1RコンピテントEcoli細胞InvitrogenBredaTheNetherlandsを、ヒートショック法により、製造元の指示にしたがって、トランスフォーメーションした。簡単に述べれば、1~5μlのDNA溶液典型的には、2μlのDNAライゲーション混合物をトランスフォーメーションコンピテントバクテリア細胞のアリコートに添加し、その混合物を氷上で30分間インキュベートした。42°Cで30秒間、水浴に移すことによって、細胞にヒートショックを施し、その後、氷上で5分間、さらにインキュベーションを行った。非選択的培地SOCで、37°C、1時間、撹拌しながらインキュベーションすることによって、細胞を回収し、続いて、適切な選択物質アンピシリン、50μg/mlを含有する寒天プレート上に伸ばした。プレートを、37°Cで16~18時間、または、バクテリアのコロニーが明らかになるまで、インキュベートした。バクテリアコロニーのPCRによるスクリーニング:バクテリアコロニーをスクリーニングして、PCRコロニースクリーニング技法を用いて、所望の配列を含むベクターの存在を調べた。0.5体積のHotStarTaqMasterMixQiagen、4pmolのフォーワードおよびリバースプライマーを含有し、水を含んだ、20μlのPCR反応混合物をPCRチューブに添加した。コロニーに20μlのピペットチップで軽く触れ、対応するプラスミドを含有するバクテリアを成長させるための培養チューブ中の2mlのLBに接触させた後、20μlのPCR混合物中に再懸濁させた。95°Cで15分のプログラムを35サイクル、次いで94°Cで30秒を35サイクル用いて、TgradientThermocycler96Biometra上でPCR反応を行い、55°Cで30秒のアニーリング、72°Cで2分の伸長、次いで、72°Cで10分の最終的な伸長ステップ、続いて4°Cで保存を行った。出来上がった反応をアガロースゲル電気泳動によって分析した。コロニーPCRに用いられるプライマーの詳細については、表3を参照されたい。DNA配列:プラスミドDNAサンプルを、配列分析をするためにAGOWABerlinGermanyに送信した。配列分析は、ベクターNTIソフトウェアパッケージInformaxFrederickMDUSAを使用して行った。突然変異誘導QuikChange登録商標XL部位特異的突然変異誘導キットCat2005175Lot1120630StratageneEuropeのいずれかを用いて、製造元の指示にしたがって、突然変異誘導を行った。突然変異誘導反応物を、エタノール製剤を用いて濃縮し、1ショットDH5αT1RコンピテントEcoli細胞にトランスフォームするか、またはElectroTenBlue登録商標ElectroporationCompetentCellsにエレクトロポレーションした。トランスフェクションを行う前に、コロニーをコロニーPCRと制限酵素による消化によって確認した。HEK293F細胞トランスフェクション:HEK293F細胞をInvitrogenから取得し、製造元の指示にしたがって、293fectinを用いて、トランスフェクトした。HEK293F細胞を全ての単一突然変異体配列のために用いた。CHO細胞トランスフェクション:約95のコンフルエンスに成長したCHO細胞を、リポフェクタミン2000M668019InvitrogenBredaNetherlandsを用いて、CD20野生型、突然変異体cDNAまたは双方のコンストラクトの組み合わせで、一時的にトランスフェクトした。この目的のために、24μgの析出したDNAを500μlのオプチメムoptimem中に、AxP100:WT0;AxP33.3:WT66.6;AxP66.6:WT33.3;AxP0:WT100の比率で希釈した1μg/μl。各トランスフェクションにつき、24μlのリポフェクタミンを500μlのオプチメム中に希釈した。その後、希釈リポフェクタミンとともにインキュベートしRT、5分、その希釈DNAを希釈リポフェクタミンとともにインキュベートした。その溶液を穏やかに混合し、インキュベートしたRT、20分間後、1000μlのDNA/リポフェクタミンをCHO細胞に添加し、37°Cで48時間、5CO2のもとで、十分に混合し、インキュベートした。CHO細胞をトランスフェクトした2日後、細胞をFACS緩衝液0.1BSAおよび0.002NaN3が添加されたPBSで2回洗浄した。CHO細胞をトリプシン/EDTAGibcoBRLLifeTechnologiesPaisleyScotlandで処理し、培養プレートをはずした。抗CD20抗体結合:HEK293F細胞およびCHO細胞を、2×106/mlの濃度で、PBSに取り出し、丸底プレート1×105/ウェルに添加した。その後、50μlのCD20mAbを添加し、1ウェルにつき、10、5、2.5または0μgの連続希釈を行った4°C、30分間。FACS緩衝液0.1BSAおよび0.002NaN3を添加したPBS中で洗浄後、該細胞をフローサイトメーターBectonDickinsonSanDiegoCAUSAで分析し、サンプルごとに5,000の現象を高流速で得た。図48A~Eからわかるように、全てのCD20mAbsは、WTCD20を発現するCHO細胞に効率的に結合した。予期した通り、リッキシマブは、AxP突然変異体と結合し図48A、そしてB1は、この突然変異体と弱く結合した図48D。対照的に、2F2と11B8の双方は、WTおよびAxP突然変異体CD20に同様に十分に結合した図48Bおよび図48C。ある量のWTCD20を表面に滴定することは、実際には、リッキシマブとB1の結合を滴定することである。2F2と11B8はまた、突然変異の有無とは無関係である。本研究は、2F2および11B8のヒトCD20への結合は、170位および172位のアミノ酸に感受性がないことを示している。したがって、2F2および11B8は、新規なCD20エピトープを認識する新たなクラスのCD20mAbsを表すものである。図49Aは、2F2、11B8T、B1またはリッキシマブの突然変異体P172S対WTCD20へのパーセンテージ結合を示し、図49Bは、2F2T、11B8T、B1、CATCAT13.6E12、マウスモノクローナルIgG2A抗CD20抗体、DiatecCom、対照アイソタイプ抗体KLH、またはリッキシマブの突然変異体CD20AxP対WTCD20へのパーセンテージ結合を示す。166位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換している突然変異体CD20N166Dとしては、2F2が非常に低い結合を示している。一方、B1、リッキシマブおよび11B8Tは、結合可能であった。図49Cを参照されたい。同様の実験において、CAT13.6E12およびリッキシマブは、CD20N166Dと結合することが可能であったが、2F2Tのみが非常に低い結合を示していた。図49Dを参照されたい。163位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換している突然変異体CD20N163Dとしては、ここでも、リッキシマブ、11B8TおよびB1は、CD20N163Dと結合することが可能であったが、2F2および2F2Tは非常に低い結合を示しただけであった。図49Eを参照されたい。同様の実験において、CAT13.6E12およびリッキシマブは、CD20N163Dと結合することが可能であったが、2F2Tだけは非常に低い結合を示した。図49Fを参照されたい。これらの実験は、2F2および11B8が異なるエピトープに結合することを示している。実施例15:Pepscan法を用いたエピトープマッピングペプチドの合成:7-、9-、および15量体ペプチドを常法によって合成した。いくつかのケースにおいて、15量体ペプチドの辺の化学的結合は、潜在的に不連続なエピトープのアミノ酸配列を同定するのを助けている。公知の処置にしたがってHMGeysenetal1984ProcNatlAcadSciUSA813998JWSlootstraetal1996MolDivers187およびPCT国際公開第WO0160769号、7-、9-、および15量体ペプチドを合成した。それは、2F2または11B8のヒトCD20分子への可能な結合に関与する結合部位またはエピトープとなり得るだろう。9-、および15量体をループとして合成し、クレジットカードフォーマットのミニPEPSCANカード455ペプチドフォーマットカードを用いてスクリーニングを行った。様々な位置の全てのループ状ペプチドアミノ酸をシステインで置換した例えば、アセチル-XCXXXXXXXXXXXCX-ミニカード。ペプチドを、標準的なFmoc化学を用いて合成し、スカベンジャーを有するTFAを用いて脱保護した。続いて、脱保護されたペプチドをマイクロアレイ上で、0.5mMの1,3-ビスブロモメチルベンゼンにアンモニウムビカーボネート溶液20mM、pH7.9と反応させ、アセトニトリル1:1v/vを添加した。マイクロアレイをその溶液中で穏やかに30~60分間振とうし、溶液中に完全に浸した。最後に、マイクロアレイを余剰のミリポア水で十分洗浄し、1ドデシル硫酸ナトリウム、0.1β-メルカプトエタノールをPBSpH7.2中に含有する破壊緩衝液中で、70°Cで30分間、超音波処理し、続いて、ミリポア水でさらに45分超音波処理した。続いて、マイクロウェルをELISAアッセイのスクリーニングのために準備した。PepscanELISAアッセイ:共有結合したペプチドを含有する455ウェルクレジットカードフォーマットのポリエチレンカードを血清5ウマ血清v/vおよび5オボアルブミンw/vを含有するブロッキング溶液中で1:1000に希釈とともにインキュベートした4°C、一晩。洗浄後、ペプチドを抗ヒト抗体ペルオキシダーゼ1:1000に希釈、1時間、25°Cとともにインキュベートし、ペルオキシダーゼ基質を洗浄後、2,2’-アジノ-ジ-3-エチルベンズチアゾリンスルホネートおよび2μl/mlの3H2O2を添加した。1時間後、発色を測定した。ELISAの発色を、CCDカメラと画像プロセシングシステムを用いて定量化した。セットアップは、CCDカメラと55mmレンズSonyCCDVideoCameraXC77RRNikonmicronikkまたは55mmf28レンズ、カメラアダプターSonyCameraadaptorDC77RRおよびImageProcessingSoftwarepackageOptimasバージョン65MediaCyberneticsSilverSpringMD20910USAからなる。Optimasは、ペンティアムIIコンピュータシステム上で動く。異なる抗体濃度でのペプチドの吸光度OD値を下記の表4および表5に示す。表4から明らかなように、11B8は、10μg/mlでも、100μg/mlでも、ヒトCD20の小さな第1の細胞外ループのAGIYAPへの結合を示したが、試験した他の抗体は、AGIYAPへの有意な結合を示さなかった。さらに、11B8は、10μg/mlでも、100μg/mlでも、ヒトCD20の第2の細胞外ループのMESLNFIRAHTPYIへの結合を示したが、試験した他の抗体は、MESLNFIRAHTPYIへの有意な結合を示さなかった。表5から明らかなように、リッキシマブは、10μg/mlでも、100μg/mlでも、ヒトCD20の第2の細胞外ループのEPANPSEKへの結合を示したが、試験した他の抗体は、EPANPSEKへの有意な結合を示さなかった。実施例16:抗イディオタイプ抗体抗イディオタイプ抗体の生成:マウス抗イディオタイプ抗体を、Balb/Cマウスを2F2または11B8Tで免疫し、NS1骨髄腫細胞と融合して、これらのマウスの脾臓からハイブリドーマを生成することによって、常法を用いて作製した。以下の抗イディオタイプ抗体、すなわち、抗2F2sab11、抗2F2sab12、抗2F2sab13、抗11B8Tsab22、抗11B8Tsab23、抗11B8Tsab24、抗11B8Tsab25および抗11B8Tsab26を作製した。これらを、2F2T、7D8および11B8Tとの特異的結合について試験した。ELISAプレートを精製した2F2T、7D8または11B8T最終濃度が1.2μg/mlとなるようにPBS中に希釈した。37°C、2時間を塗布した。プレートを、0.05Tween20および2トリ血清を含有するPBSでブロッキングした室温、1時間。続いて、そのプレートを抗イディオタイプ抗体の培養から得た上清とともにインキュベートした最終濃度を1~10μg/mlに調節した。RT、2時間。結合したマウス抗イディオタイプ抗体を、ウサギ抗マウスIgG-HRP結合抗体JacksonImmunoResearchを用いて検出した。図50に示すように、抗2F2sab11、抗2F2sab12および抗2F2sab13は、2F2Tおよび7D8と結合するが、11B8Tまたは無関係のアイソタイプ対照ヒト抗体とは結合しない。2F2Tと7D8は、VLおよびVH配列が非常に相同しているので、抗2F2イディオタイプ抗体と7D8とが反応することが期待される。図51は、抗11B8Tsab22、抗11B8Tsab23、抗11B8Tsab24、抗11B8Tsab25および抗11B8Tsab26の全てが11B8Tに同程度結合することを示している。免疫診断ツールとしての抗イディオタイプ抗体:2F2/7D8特異的抗イディオタイプ抗体および11B8T特異的抗イディオタイプ抗体を、免疫診断ツールとして使用して、実験室または患者サンプル中のCD20に対するヒトモノクローナル抗体のレベルを検出し、定量化することができる。これは抗CD20抗体の薬物動態学を調べるために、または、抗CD20抗体の投与量を決定および調整するために、そして、患者における疾患および治療効果をモニターするために有用かもしれない。そのようなアッセイの例として、ELISAプレートに4μg/mlの抗2F2sab11、抗2F2sab12またはF2sab13を塗布した。プレートを0.05Tween20および2トリ血清を含有するPBSでブロッキングした室温、1時間。続いて、そのプレートを連続希釈した2F2Tとともにインキュベートした10,000~9.77ng/ml、RT、2時間。結合した2F2Tをマウス抗ヒトIgGHRP-結合抗体を用いて検出した。図52A~Cに示すように、2F2Tの用量依存的結合が観察された。等価物当業者なら、ルーチンの実験法を用いるだけで、ここに記載された本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の請求項に包含されることが意図される。従属請求項に開示された態様のあらゆる組み合わせも本発明の範囲であると考えられる。引用による援用本明細書において引用した全ての特許、ペンディングの特許出願、他の文献は、その全体を引用によってここに援用している。"