"不死化されたB細胞を生成する方法であって、B細胞を前記の不死化が達成されるような条件下でエプスタインバーウイルスEBVを用いて形質転換することを含む、前記方法。前記のB細胞がIgG記憶B細胞である、請求項1に記載の方法。前記のB細胞を末梢血から得る、請求項2に記載の方法。前記のB細胞を末梢血、粘膜組織またはリンパ組織から得る、請求項1に記載の方法。前記のB細胞がIgMまたはIgA-記憶B細胞である、請求項1に記載の方法。さらに前記の不死化されたB細胞を培養で増加することを含む、請求項1に記載の方法。さらに前記の増加された集団から望まれる抗原特異性を有する抗体を産生する細胞を分離することを含む、請求項6に記載の方法。さらに前記の分離された細胞をクローニングし、前記のクローニングされた細胞から前記の抗体またはその可変重鎖もしくは可変軽鎖をコードする核酸配列を単離することを含む、請求項7に記載の方法。前記の細胞がモノクローナルに、オリゴクローナルに、またはポリクローナルに増加される、請求項6に記載の方法。前記のB細胞が哺乳類のB細胞である、請求項1に記載の方法。前記のB細胞がヒトのB細胞である、請求項10に記載の方法。本発明は、少なくとも部分的に、不死化されたB細胞を生成する方法に関する。その方法は、EBVを用いて標準的なプロトコルを用いてB細胞を形質転換することを含み得る。下記の実施例は末梢血から得られたIgG記憶B細胞の使用を含むが、方法は他の組織からの例えば、粘膜またはリンパ組織からの他のB細胞亜集団に、および他のアイソタイプの細胞例えばIgMナイーブB細胞またはIgA-記憶B細胞であるが、それらに限定されないに適用することができる。本方法は、CD40ライゲーションおよびEBV形質転換をTLR-9ライゲーションと組み合わせる。このアプローチは、多数のB細胞の迅速かつ効率的なスクリーニングを可能にする。本発明に従って、EBVで形質転換したB細胞を培養で増加させ、培養上清を望まれる抗原特異性を有する抗体の存在に関してスクリーニングすることができる例えば、抗体の抗原特異性を病原体例えばHIV-1またはPCT/US09/63271において言及されている他の病原体、化学物質または毒素に対して向けることができる。次いで抗体産生B細胞の不死化されたクローンを分離し、望まれる抗原特異性を有する抗体が発現するような条件下でさらに培養することができる。抗体は標準的な技法を用いて培地から単離することができる。B細胞は、培養における細胞密度を変化させることにより、モノクローナルに、オリゴクローナルに、またはポリクローナルに増加することができる例えば、主にモノクローナルな増加のために10個以下の細胞/ウェルの細胞密度から、ポリクローナルな増加のために100個以上の細胞/ウェルまで。細胞を10細胞/ウェル未満の密度でまくのが好都合である。モノクローナル抗体またはそれのVHおよび/またはVL鎖をコードする核酸配列を、クローニングされたB細胞から標準的な技術を用いて分離することができる。本発明に従って、宿主細胞例えば293T細胞を目的のモノクローナル抗体のVHおよび/またはVL鎖をコードする核酸配列を含むコンストラクトを用いて、それらの配列が発現し、望まれる特異性を有する抗体が産生されるような条件下で形質移入することができる。このようにして産生された抗体は、標準的な技法を用いて例えば宿主細胞から、またはその中で宿主細胞が培養されている培地から単離することができる。本発明の好ましい抗体はCH0219に由来し、1-27-G2、1-27-G11および1-19-F10が含まれる図5および6参照。本発明の抗体は、例えば診断的に、または療法的に用いることができる。例えば、抗体はそれに対してそれらが向けられている個々のポリペプチドまたは他の抗原の同定および/または例えば親和性精製技術を用いる精製において有用である可能性がある。抗体は、例えば免疫アッセイ、放射免疫アッセイRIAまたは酵素結合免疫吸着測定法ELISAにおける試薬として用いることもできる。抗体は、検出可能な標的例えば放射性同位体、蛍光分子または酵素を用いて標識することができる。本明細書で開示される方法により産生された抗体は、病原体、例えばHIV-1を検出するために用いることができる。本発明には、本発明の抗体およびキャリヤーを含む医薬組成物も含まれる。一部の態様において、本明細書で開示される発明の形質転換されたおよび/または活性化されたB細胞を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、医薬的に許容できるキャリヤーまたはアジュバントも含有することができる。本発明の抗体、またはその断片例えば抗原結合断片は、疾患の処置のために、疾患の予防のために、および/または疾患の診断のために用いることができる。一部の態様において、本明細書で開示される主題のモノクローナル抗体は、上記で記述したような医薬組成物または医薬品中で、それを必要とする対象に投与することができる。適切な投与経路は、処置される、予防される、または診断される予定の疾患に依存するであろうが、IV、IM、鼻腔内または皮下が含まれ得る。粘膜組織への直接の投与も、適切である場合は達成することができる。本発明の特定の観点が下記の実施例においてより詳細に記述されている。実施例の研究において、CD40L発現L細胞が用いられたが、他のCD40L発現細胞例えばCD40L発現293T細胞、CD4T細胞、またはマクロファージ、樹状細胞、FDC、胸腺上皮および内皮細胞、抗CD40抗体733737SaelandetalJExpMed178113120BamchereauandRoussetNature353678679またはCD40ライゲーションを誘導するための他の手段例えばCD40作動薬を用いることができる。実施例において用いられたEBVの株はB95-8であったが、他のEBVの株も用いることができ、比較可能な作用を仲介する他のウイルス例えばサルに関するヒヒヘルペスウイルスも同様である。実施例において用いられたTLRリガンドはODN2006871であったが、本発明には他のTLRリガンド例えばLPS、R484の使用が含まれる。Chk2キナーゼ阻害剤も実施例において用いられた。他の抗アポトーシス剤を用いることもできる例えば、ATM阻害剤、または発癌性ストレスもしくはDNA損傷応答のあらゆる阻害剤。用いられた刺激カクテルは他の刺激計画よりもよい収量を与えたことは理解されるであろう。下記の実施例で記述されるように、末梢血からのIgG記憶B細胞を2工程のプロセスにより濃縮した:1CD2、CD14、CD16、CD235aおよびIgD細胞の、PEコンジュゲート抗体のカクテルを一次抗体として、商業的に入手可能な抗PEマイクロビーズを二次抗体として用いる磁気ビーズ分離による枯渇;2ネガティブ選択された細胞画分に抗IgGマイクロビーズコンジュゲート抗体によるポジティブ選択を適用することによる、IgG細胞の濃縮。細胞を14日間刺激した。刺激の終了時に、細胞をRNA抽出のためにまとめてアッセイし、および/または後の処理のためにRNAlater中で保存した。HIV-1慢性および感染していない対象での繰り返し実験において、ポアソン分布の単一ヒットモデルに従って、結果としてモノクローナルな増加をもたらす細胞希釈度の決定を行った。統計モデルを、新しいfresh、およびRNAlater中で処理した刺激された細胞の両方から4個ずつ選択されたウェルのVH鎖の配列決定により検証した。その結果を図3において要約する。ポアソン分布の単一ヒットモデルは、慢性的にHIV-1に感染した対象においてモノクローナルなB細胞の増加は10個以下の細胞/ウェルが培養状態に置かれた場合に起こると予測した。PCRデータは、10細胞/ウェルにおいて、刺激後にIgGを分泌しているIgGの試料の87.57/8で重鎖がモノクローナルであったことを確認した。1つのウェルにおいて2つの異なるクローンが存在し、それらの一方は機能し、他方は機能しなかった。患者間の多様性を説明するため、モノクローナルな培養物を増殖させる可能性を増大させるため、細胞を8細胞/ウェルの密度でまく決定をしたポアソン分布の単一ヒットモデルにより50の陽性ウェルが予測された。本明細書で開示される方法は、ヒトならびに霊長類、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ハムスター、飼い慣らされた動物例えばイヌおよびネコおよび家畜例えば、ウシ、ブタ、ウマが含まれる非ヒト哺乳類および適切な場合にはそれらに由来する細胞例えばB細胞と関連して実施することができる。本発明の特定の観点が図3および4においてより詳細に記述されている2009年11月11日に出願されたPCTUS09/63271も参照、その全内容を本明細書に援用する。共に2010年4月9日に出願された米国仮出願第61/322,663号および第61/322,725号を援用する。実験の詳細完全培地の調製PBMC、EBV-B細胞、J774A.1、およびK6H6/B5細胞株のための完全培地CM以下:115.2熱非働化ウシ胎児血清FCS21非必須アミノ酸NEAA31mMピルビン酸ナトリウム415mMHEPES緩衝液、pH7.352mML-グルタミンGlu6100U/mlペニシリンGPen7100μg/mlストレプトマイシンStrepを補ったRPMI1640Invitrogen調製:1.FCSのボトル500ml/ボトル、-20°Cを解凍し、熱非働化c’の非働化のために56°Cで30分間保温する2.ボトルを冷まし、31mlのGluPen/Strep100×、100ml/ボトル、-20°Cを添加する3.FCS-抗生物質混合物をチューブ中に50ml/チューブで小分けし、-20°Cで凍結させる4.100mlのFCS-抗生物質混合物をRPMI1640のボトル500ml/ボトル、4°Cに添加する5.6.2mlのHEPES緩衝液100×、100ml/ボトル、4°Cをボトル中に添加する6.6.2mlのピルビン酸ナトリウム100×、100ml/ボトル、4°Cを添加する7.6.2mlのNEAA100×、100ml/ボトル、4°Cを添加する8.CMを0.22μmフィルターユニットを通して濾過する。9.全CM:618.6mlIgG記憶B細胞刺激プロトコル凍結させたPBMCを標準的な操作手順により解凍するPBMCをPBS/1BSA中で10×106PBMC/mlで再懸濁し、より高い100μlまで切り上げるroundup。細胞を4°Cで保つ。次のPEコンジュゲート抗体のそれぞれの単一ロットの力価測定により決定された次の濃度におけるマスター混合物を調製する抗-CD235a[0.08μl/106PBMC]抗-CD2[5μl/106PBMC]抗-CD16[5μl/106PBMC]抗-IgD[5μl/106PBMC]抗-CD14[20μl/106PBMC]100μlの細胞を5ml丸底FACSチューブ中に小分けし、等しい体積のマスター混合物をそれぞれのチューブ中に分ける混合し、4°Cで30分間保温する2ml/チューブのPBS/1BSAを添加する1500rpmで5分間遠心分離するペレットを乱さずに上清を除去する100μl/チューブのPBS/1BSAを添加する200μl/チューブの抗PEマイクロビーズを添加する混合し、4°Cで15分間保温する2ml/チューブのPBS/1BSAを添加する300×gで10分間遠心分離するペレットを乱さずに上清を除去する細胞が塊になるのを防ぐため、チューブを十分に軽く叩いてペレットをほぐす。1mlのPBS/1BSA/チューブを添加して十分に混合する。細胞の塊に関して目視でチェックする。塊が存在する場合は、P1000を用いて混合することによりそれらを壊す。チューブを5mlチューブのためのAutoMACS冷却装置中に移す。DEPLETESプログラムを動かすB細胞画分の処理通過画分のチューブを集める細胞を15mlコニカルチューブ単数または複数中で合わせて一緒にする。300×gで10分間遠心分離する200μlのPBS/1BSA中で再懸濁する。107細胞までに関して20μlの抗IgGマイクロビーズを添加する十分に混合し、4°Cで15分間保温する2mlのPBS/1BSAを添加する300×gで10分間遠心分離する1mlのPBS/1BSA中で再懸濁する。チューブを15mlチューブ冷却装置中に移すPOSSEL_5プログラムを動かすポジティブ選択された画分を集める1500rpmで5分間遠心分離する底に触れずにSNを取り外す完全培地中で再懸濁する正確な細胞数および体積を決定するEBV懸濁液B95-8;1ml/100,000B細胞、ODN20062.5μg/mlおよびchk2阻害剤5μMで一夜刺激するその間に、γ照射した75GyCD40Lで形質移入したL細胞を96ウェル組織培養プレート中に5,000細胞/ウェルでまく一夜培養の後、EBVで形質転換された細胞の生存度をチェックする細胞を、ODN2006およびchk2-iを含有する完全培地中で、80個の生存可能な細胞/mlで再懸濁し、100μl/ウェルで移すすなわち8細胞/ウェル、それは慢性的にHIV-1に感染した対象に関して1個の活性化された細胞/ウェルに等しい100μl/ウェル中に5000個のCD40LL細胞を含有する96ウェルプレート中に、100μl/ウェルの細胞懸濁液を小分けする1プレート/細胞濃度合計6プレート、すなわち3プレート/細胞の小分け37°Cで14日間保温するB細胞のEBVによる形質転換IgG記憶B細胞に関して1EBV感染の前日に、照射したCD40L-L細胞7,500cGrayを調製し、細胞を96ウェルプレート丸底の中に5,000細胞/ウェル100μl/ウェルで分配する。2完全培地CM中の記憶B細胞を1200RPM300gで4°Cにおいて5分間遠心分離する。3ペレットを、ODN20065.0μg/mlおよびChk2阻害剤II10μMを含有する1mのCM中で再懸濁する1×105細胞/ml。4EBV懸濁液B95-8細胞上清、-80°Cの冷凍庫または液体N2タンク中で保管を1ml/1×105記憶B細胞で添加する。5ODN2006およびChk2阻害剤IIの終濃度はそれぞれ2.5および5μMである。6細胞を5CO2培養器中で37°Cにおいて一夜培養する。7培養後、生存可能な細胞を数え、それらを5μg/mlPS2006ODN2006および10μMChk2阻害剤IIを含有するCM中で80個の生存可能な細胞/mlで再懸濁する。8細胞を、照射したCD40L-L細胞を有する96ウェルプレートの中に8細胞/ウェル100μl/ウェルで分配する。9細胞を5CO2培養器中で37°Cにおいて培養する。107日目に、それぞれのウェルから90μlの上清を採取し、2.5μg/mlPS2006ODN2006および5μMChk2阻害剤IIを含有する100μlの新しいCMで置き換える。1114日目に、機能アッセイのためにそれぞれのウェルから100μlの上清を集める。12結合アッセイのためにそれぞれのウェルからさらに20μlの上清を集める。13RNALater中での保管のために、混合してそれぞれのウェルから30μlの細胞を集める。142.5μg/mlのODN2006および5μMのChk2阻害剤IIを含有する160μlの新しいCMを添加する。この時に、ODN2006は必要ではない可能性がある。B95-8マーモセットB細胞株;ノースカロライナ大学チャペルヒル校CD40L-L細胞ヒトCD40Lで形質転換したマウス線維芽細胞ODN2006Invivogen;tlrl-hodnb-5Chk2阻害剤IIEMD/Calbiochem;220486RNALaterプロトコル凍結96ウェル培養プレートで、細胞を100μl/ウェルの上清中で培養するすなわち、必要であれば過剰な上清を除去する150μl/ウェルのRNAlaterを添加し、-80°Cで凍結させる解凍その手順全体を通してPBSを冷やしておく96ウェルプレートを解凍し、それを氷上に置いておく細胞をウェルからRNアーゼフリーの無菌のエッペンドルフチューブ300μl中に移す無菌のPBSをそれぞれのチューブに1.5mlまで添加する。微量遠心機において300×gで10分間遠心分離する。緩衝液を吸引し、210μlのPBS中で再懸濁する10μlを取り出し、10μlのトリパンブルーを添加し、血球計算板で数える細胞を氷上に置いておき、可能な限り早くRNA抽出を実施するあるいは、細胞をFSCおよびSSCゲーティングPI無しを用いて単一細胞選別してPCRプレート中に、マスター混合物を含有するウェル中に入れることができるB細胞のEBV形質転換に関する条件の最適化-実験596ウェル形式I.目的:エプスタインバーウイルスEBVによる形質転換の効率を向上させることおよび限界希釈法無しでモノクローナルEBV-B細胞株を得ることII.試料:カスタマイズしたMiltenyiキットを用いることにより凍結/解凍されたPBMCから分離された記憶B細胞III.方法:記憶B細胞を感染のためにODN20062.5μg/mlChk2阻害剤2-アリールベンズイミダゾール2-arylbenzamidazole;5μMまたはIL-21,000IU/mlR8482.5μg/mlの存在下でEBV懸濁液B95-8;1ml/100,000B細胞と共に培養した。一夜培養の後、細胞を同じ濃度の上記の薬物を含有する培地中で再懸濁し、96ウェルプレート丸底中に30細胞/ウェルで分配した。細胞を、表IIIにおいて示したように、γ照射したフィーダー細胞と共培養した。EBV感染の2週間後、それぞれのウェルを顕微鏡下で調べ、生きたリンパ芽細胞系LCLの塊を含有するウェルの数を決定して全体の形質転換効率を概算した。加えて、培養上清中の総IgGのレベルをIgG特異的免疫グロブリンIgELISAを用いて測定し、IgG産生B細胞の形質転換効率を決定した。B細胞のEBV形質転換に関する条件の最適化実験696ウェル形式IV.目的:エプスタインバーウイルスEBVによる形質転換の効率を向上させることおよび限界希釈法無しでモノクローナルEBV-B細胞株を得ることV.試料:カスタマイズしたMiltenyiキットを用いることにより凍結/解凍されたPBMCから分離された記憶B細胞VI.方法:記憶B細胞を感染のためにODN20062.5μg/mlChk2阻害剤2-アリールベンズイミダゾール2-arylbenzamidazole;5μMまたはIL-21,000IU/mlR8482.5μg/mlの存在下でEBV懸濁液B95-8;1ml/100,000B細胞と共に培養した。一夜培養の後、細胞を同じ濃度の上記の薬物を含有する培地中で再懸濁し、96ウェルプレート丸底中に10または30細胞/ウェルで分配した。細胞を、表IVにおいて示したように、γ照射したフィーダー細胞と共培養した。EBV感染の2週間後、我々はそれぞれのウェルを顕微鏡下で調べ、生きたリンパ芽細胞系LCLの塊を含有するウェルの数を決定して全体の形質転換効率を概算した。加えて、培養上清中の総IgGのレベルをIgG特異的免疫グロブリンIgELISAを用いて測定し、IgG産生B細胞の形質転換効率を決定した。結果この方法を用いて、慢性的にHIV-1に感染した対象から広く中和する抗HIV-1モノクローナル抗体を単離した。対象はクレードAHIV-1ウイルスに感染しており、広い血清中和を示した。おおよそ20,000,000個の末梢血単核細胞PBMCを集め、濃縮および一夜EBV形質転換の後におおよそ30,000個の生存可能なIgG記憶B細胞を得た。細胞を8細胞/ウェルの密度で培養した。刺激の終了時に、3,600個の培養物を、ELISAアッセイを用いて総IgG産生、クレードB伝染始祖gp140Env63521への結合ELISA、および中和するのが難しいHIV-1CAP45株の中和3層tier、クレードC;TZM-blアッセイに関してスクリーニングした。それぞれのウェルからの細胞の分割量Aliquotsを、1上清の収集および液体窒素での凍結のためにさらに増加し、2RNAlater中で凍結させた。この実験において、予想されたように、1799/3600の培養物50がIgGを分泌した。それらの内で、24の培養物がgp140Env63521に結合し1.33、26のクローンがHIV-1CAP45の50より多くを中和した範囲:51.2~85.6。gp140Env63521に結合した1つのクローンのみがHIV-1CAP45も中和した。興味深いことに、HIV-1CAP45を中和した3つのクローンはIgAおよびIgMアイソタイプのものであった。これは、完全な純化ではなく、IgG分泌記憶B細胞に関する濃縮が存在した80~90の純度という考えと一致している。20の最もよく中和した試料neutralizersの回収の日に凍結させたバルク細胞bulkcellsからのVHおよびVL鎖を増幅し、37がモノクローナルであり52.6がオリゴクローナル培養物あたり2または3種類の機能する配列であることが分かった。さらに1週間増加させて培養物からの上清に対して、中和の広さCAP45が含まれる5種類の中和するのが難しいウイルス、および陰性対照としてSVAおよび伝染始祖transmittedfounderエンベロープEnv63521が含まれる3種類のエンベロープに対する結合の広さに関するチェックを行った。2つのクローン1-27-G11および1-19-B7がウイルスの3/4を50を超えて中和することが分かった。クローン1-27-G11は2つのVH鎖しか有していなかった。モノクローナル抗体を回収するために、VHおよびVL鎖を形質移入系において発現させている。いずれの中和クローンも伝染したエンベロープには結合しなかったが、以前に同定された24種類の伝染したgp140Env63521に結合するクローンの内の9種類37.5はEnv1086CおよびEnv00MSAにも結合した。上記で引用した全ての文書および他の情報源を、そのまま本明細書に援用する。"