"VPタンパク質のポリペプチド配列内に変異を含むH-1ラットパルボウイルスH-1PVであって、前記変異はH-1PVのI367位および/またはH373位にあるH-1ラットパルボウイルス。前記変異は、I367S変異である請求項1に記載のH-1ラットパルボウイルス。前記変異は、H373R変異である請求項1に記載のH-1ラットパルボウイルス。前記パルボウイルスは、腫瘍細胞中で発現した受容体に対する高い親和性を備える異種ペプチドまたはタンパク質をさらに含む請求項1~3のいずれか一項に記載のH-1ラットパルボウイルス。前記異種ペプチドまたはタンパク質は、アミノ酸配列RGDを含む請求項4に記載のH-1ラットパルボウイルス。前記異種ペプチドまたはタンパク質は、前記パルボウイルスのVP2タンパク質のA441位VP1タンパク質のA583に対応するで挿入される請求項4または5に記載のH-1ラットパルボウイルス。請求項1~6のいずれか一項に記載のH-1ラットパルボウイルスを含有する医薬組成物。癌治療に使用するための請求項1~6のいずれか一項に記載のH-1ラットパルボウイルス。前記使用は、メラノーマ、脳腫瘍、乳癌または子宮頸癌を治療するためであることを特徴とする請求項8に記載の使用のための請求項1~6のいずれか一項に記載のH-1ラットパルボウイルス。前記使用は、膠芽細胞腫を治療するためであることを特徴とする請求項9に記載の使用のための請求項1~6のいずれか一項に記載のH-1ラットパルボウイルス。そこで本発明の目的は、パルボウイルスをベースとする治療の有効性を高め、正常細胞への起こり得る副作用に対して更なる安全性を提供する再標的化パルボウイルスを提供することである。本発明によると、この目的は、特許請求の範囲に規定された主題によって達成される。そこで本発明は、ヒト腫瘍細胞に対する親和性を改良するために遺伝的に再プログラミングされたH-1PVを提供する。密接に関連するパルボウイルスMVMの分解結晶構造から類推して、H-1PV野生型カプシドのinsilico3Dモデルが開発された。このモデルに基づき、細胞膜の認識およびウイルス侵入のためのアミノ酸は、いわゆるディンプル領域内の、カプシドの2回対称軸のレベルで同定された。これらの残基のinsitu変異生成は、H-1PVの許容細胞への結合および侵入を有意に減少させた。次に、侵入欠損性ウイルスカプシドを遺伝子操作により作製し、3回軸スパイクである環状4C-RGDペプチドのレベルで挿入した。このペプチドは、癌細胞や成長の血管内で過剰発現することが公知であるαvβ3およびαvβ5インテグリンに結合する。このペプチドの挿入は、再遺伝子組み換えウイルスによって効率的に殺滅されるαvβ5インテグリンを過剰発現する細胞に向かうウイルス感染性をレスキューした。本発明の一実施形態は、例えば脳19、結腸20、子宮頸部21、乳房22、23起源の数多くのヒト腫瘍細胞系に感染して殺滅し、そして、現在、再発性多発性膠芽腫の患者を治療するためのフェーズIおよびII臨床試験5下にあるラットH-1PVに関する。細胞のタイプおよび実験条件に依存して、H-1PVは、非形質転換細胞には影響を及ぼすことなく、壊死24、アポトーシス25~28からリソソーム依存性細胞死29までの癌細胞における様々な細胞死経路を誘導する能力を有する。本発明者らは、ウイルスが癌細胞において酸化的ストレスを誘導し、DNA損傷、細胞周期停止およびアポトーシスを引き起こす能力について報告した。これらの作用は、非構造的NS1タンパク質によって媒介される28。本発明の方法は、2つの工程からなる。第1に、該ウイルスがその元来の許容細胞に侵入することを防止するウイルスの天然の指向性が阻止される。これは、細胞の認識および結合に関係するカプシド残基を改変することによって達成可能である。第2に、該ウイルスは、癌細胞内でのみ、または優先的に発現する受容体に対して高い親和性を備える異種ペプチドを該ウイルスカプシド内へグラフト化することによって癌細胞へ特異的に再標的化される。この工程には、該ペプチドの挿入を容認し、その腫瘍崩壊能力を維持しながら該ウイルスの再標的化を可能にする該ウイルスカプシド内の位置を同定する必要がある。どちらの工程にも、該ウイルスの正20面体カプシドが課する構造的拘束により極めて多くの課題がある。実際にカプシド内の変化は、効率的な粒子アセンブリと不適合であることが多い。再標的化工程は、さらにまた全部がH-1PVにおいて、これまで研究されていなかった、カプシドの構造的および機能的要素、ならびに1つ以上の特異的細胞受容体への結合に関係する領域に関する正確な知識を含んでいる。パルボウイルスファミリーのカプシドは、T=1正20面体対称で組立てられた60コピーの2~3のネステッドポリペプチド配列からなる30。H-1PVの場合、カプソマーVP-1およびVP-2は、C末端コア配列を共有するが長さの異なるN末端伸長部を有する選択的にスプライシングされた転写産物によってコードされる。古典的なパルボウイルスカプシドの外側構造は、3回対称軸ではスパイク様突起部、2回軸ではディンプルと呼ばれる陥凹部、5回対称軸ではビリオンの内側を該粒子の外側に連絡する孔隙を示す30。パルボウイルスファミリーのメンバーに対する細胞受容体は、細胞侵入がトランスフェリン受容体TfRへの結合によって媒介されるネコFPV血清型およびそのイヌ指向性変異体CPVについて記載されてきた31。AAVの様々な血清型は、ヘパリン硫酸プロテオグリカン32、αvβ5インテグリン33、線維芽細胞成長因子受容体34または血小板由来成長因子受容体α35への結合を介して侵入する。グロボシドGb4Cer36、Ku80自己抗原37およびαvβ1インテグリン38は、ヒト病原体B19に対する細胞受容体/共受容体と同定されている。それでもこのファミリーのメンバーの細胞受容体の大部分は、特に齧歯類パルボウイルスについては依然として不明である39。シアル酸への結合がMVMによる細胞表面受容体認識のために必要であることは、細胞膜付着および感染がどちらもノイラミニダーゼ感受性であるため公知である。シアル酸N-アセチルノイラミン酸に浸漬したMVMpカプシドのX線結晶構造は、糖が残基I362およびK368に直接隣接する、ウイルスカプシドの正20面体の2回対称軸を取り囲んでいるディンプル凹部内に位置することを明らかにしている。これらの残基の点突然変異は、細胞受容体のシアル酸成分に対する低い親和性を生じさせる10、40~42。化学薬品、診断ツールまたはウイルス性抗癌剤の特異的腫瘍標的化に適切なペプチドのうち、Arg-Gly-AspRGDペプチドが最も広く研究されている43~46。RGD配列は、多数の細胞外マトリックスECMタンパク質、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチンに見られ、これらのECMタンパク質のそれらの細胞受容体への結合の原因となる47。RGDペプチド、特にその環状形における、CDCRGDCFCRGD-4Cと称するは、典型的には癌細胞および血管新生血管内で過剰発現するαvβ3およびαvβ5インテグリン50、51へ強固に結合する48、49。RGD-4C/インテグリン相互作用は、アデノウイルス52~54およびアデノ随伴ウイルス13を癌細胞に再標的化するために活用され成功を収めている。要するに、本発明は、そのカプシドの改変により遺伝的に再プログラミングされたH-1PV侵入を提供する。構造的データの非存在下で、本発明者らは、その結晶構造が解明されている関連性の高いMVMのカプシドとのホモロジーに基づいてH-1PVカプシドをモデリングした。このモデルは、細胞の認識および侵入に関係する候補アミノ酸の同定を許容した。これらの残基の変異は細胞侵入を無効にし、このカプシドの3回軸スパイクのレベルでの突出しているRGD-4Cペプチドの挿入は、新規の癌特異的指向性を遺伝子組み換えウイルスに与え、ウイルス感染性および細胞殺滅をレスキューした。結論として、本発明は、臨床用途におけるH-1PVをより効率的およびより安全に使用するための道を開く。以下の実施例では、本発明による遺伝的に再プログラミングされたH-1PVの生成について記載する。4つの独創的な工程から構成された方法を追及した。1パルボウイルスH-1PVカプシドのinsilicoモデリング。これは、該カプシドの構造的および機能的要素、例えば細胞膜の認識および侵入に関係するアミノ酸ならびに再標的化ペプチドの挿入を容認する場所の同定についての正確な知識を獲得するために重要である。2シアル酸がH-1PV細胞膜の結合および侵入のために必要とされるという発見。これは、ウイルス感染がシアル酸を細胞表面から開裂する公知の化合物であるノイラミニダーゼに感受性であることを示すことにより証明された。ノイラミニダーゼを用いた前処置は、H-1のNBKおよびHeLa細胞H-1に対する2つの高度に許容性の細胞系に結合して侵入する能力を劇的に減少させ、シアル酸がウイルス受容体の重要な構成成分であるという証拠を提供した。3脱標的化工程。この工程は、元来の許容細胞へのウイルス侵入を妨害するパルボウイルスの天然の指向性を無効にした。この工程は、シアル酸への結合に関係するアミノ酸各々VP1タンパク質内のI509およびR515に対応するVP2タンパク質のI367およびH373をコードする位置内でウイルスゲノムカプシドタンパク質コーディング領域を変異させることから構成された。シアル酸認識に関係する候補アミノ酸は、本発明者らの構造モデルおよび関連する自律性パルボウイルスMVMとの機能的ホモロジーに基づいて見いだされた。詳細には、残基373の改変H→Rは、該ウイルスが細胞に結合して侵入する能力を強度に損傷させたH-1野生型と比較して90超の減少。4再標的化工程。再標的化は、ウイルスカプシド内へ、典型的には癌細胞および血管新生血管内で過剰発現するαvβ3およびαvβ5インテグリン48、49に対する高い親和性を有するRGD-4C再標的化ペプチドを挿入することによって達成された50、51。この工程には、該ペプチドの挿入を容認し、該ウイルスの腫瘍崩壊能力に影響を及ぼさずにその再標的化特性を維持する該ウイルスカプシド内の位置の同定を必要とした。ウイルスゲノム内へのこの位置は本発明者らのモデルのおかげで同定され、VP2カプシドタンパク質のA441をコードするヌクレオチドに対応するVP1タンパク質のA583に対応する。この位置内でのRGD-4Cペプチドのグラフト化は、侵入欠損性変異体のウイルス感染性をレスキューした。この新規ウイルスは、シアル酸によらずに、野生型ウイルスに使用される経路とは別の経路により細胞に侵入することができる。本発明は、VPタンパク質のポリペプチド配列内に変異を含むH-1ラットパルボウイルスH-1PVであって、該突然変異がH-1PVのI367位および/またはH373位および/またはA441位VP2タンパク質に存在するH-1PVを提供する。当業者であれば、出発材料としてH-1PVの公表されたヌクレオチド配列を用いて当該技術分野において周知の方法を使用してそのような改変パルボウイルスを産生することができる61、62、さらに実施例1Cに記載した実験方法も参照されたい。用語H-1PVはさらに、その治療有用性に実質的に影響を及ぼす本発明の変異以外の追加の変異を含む可能性があるウイルスならびにそのようなウイルスをベースとするベクターに関する。前記パルボウイルスを活発に産生するために使用可能な、および治療に有用である適切なまた別の改変パルボウイルス、ベクターならびに細胞は、無用な実験努力無しで、当業者が備える技術の範囲内で本明細書の開示に基づいて容易に決定することができる。本発明の好ましい実施形態では、H-1PVの変異は、I367S変異および/またはH373R変異である。さらに好ましい実施形態では、本発明のH-1ラットパルボウイルスは、A441位で挿入される腫瘍細胞内で発現する受容体に対する高い親和性を備える異種タンパク質をさらに含んでいる。そのような異種ペプチドの例は、RGDファミリーメンバーであり、RGD-4Cペプチド、公知のヒト特異的受容体、例えばアデノウイルスを神経膠腫へ再標的化するために使用され成功を収めている上皮成長因子受容体55のペプチドリガンド、ペプチドアプタマー、ペプチドライブラリーまたはファージ提示スクリーニングアプローチにより選択された他のペプチドを含む。本発明のH-1PVの特に好ましい実施形態では、異種タンパク質はアミノ酸配列RGDを含んでいる63。当業者であれば、該異種タンパク質を挿入するために、例えば下記の実施例2および5に記載したアプローチを適用して、カプシドVP1およびVP2タンパク質内の適切な部位を選択することができる。ペプチドをグラフト化すべき位置の同定は、他の再標的化ペプチドの挿入を可能にする。一例として他のペプチドの使用を排除しないが、神経膠腫においても高頻度に過剰発現するペプチド標的化δ-EGFR上皮成長因子受容体70、または、例えば、アデノウイルスを子宮頸癌細胞へ再標的化すると報告された子宮頸癌特異的ペプチド71の挿入が挙げられる。本発明のH-1PVのいっそうより好ましい実施形態では、異種タンパク質が、VP1タンパク質のA583に対応するパルボウイルスのVP2タンパク質のA441位で挿入される。本発明は、本発明のH-1PVを含有する医薬組成物をさらに提供する。好ましくは、該パルボウイルスは前記医薬組成物中に有効量で存在し、薬学的に許容される担体と結合されている。薬学的に許容されるは、ウイルスの生物活性の有効性を妨害しない、およびそれが投与される患者にとって毒性ではない任意の担体を含むことを意図する。適切な医薬担体の例は当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝食塩液、水、エマルジョン、例えば油/水型エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、従来法によって調製することができ、被験者に有効量で投与することができる。有効量は、疾患の経過および重症度に影響を及ぼすのに十分であり、そのような病態の減少または寛解をもたらす有効成分の量を意味する。これらの疾患または障害の治療および/または予防に有用な有効量は、当業者には公知の方法を使用して決定することができる72。本発明のパルボウイルスについての好ましい用量は、約108~109pfuである単回注射。追加の医薬上適合する担体には、ゲル、生体吸収性マトリックス材料、該治療薬を含有する移植要素または任意の他の適切なビヒクル、送達もしくは分注手段もしくは材料を含むことができる。本発明のH-1PVの投与は、様々な方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって実施することができる。投与経路は、当然ながら、療法の種類および該医薬組成物中に含有されるまた別の化合物の種類に左右される。好ましい投与経路は、静脈内投与である。パルボウイルスの投与レジメンは、当該者が備えている技術の範囲内で、主治医が患者データ、観察所見および例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、性別を含む他の臨床因子、投与の時間および経路、腫瘍のタイプおよび特性、患者の一般的健康状態ならびに該患者が受ける他の薬物療法に基づいて容易に決定することができる。本発明のパルボウイルスが血液-脳関門を通って進入する能力を備える感染性ウイルス粒子を含む場合、治療は、該パルボウイルスの静脈内注射によって実施できる、または少なくとも開始できる。好ましい投与経路は、腫瘍内投与である。長期静脈内治療はパルボウイルスに対する中和抗体が形成されることにより無効力になり易いため、静脈内ウイルス投与の初期レジメン後に様々な投与様式を採用することができる、または代わりにそのような様々な投与技術、例えば頭蓋内もしくは腫瘍内ウイルス投与をパルボウイルス治療の全経過を通して使用することができる。また別の特殊な投与技術として、H1-PV含有組成物を患者に移植された起源から該患者に投与することができる。例えば、シリコーンもしくは他の生体適合性材料製のカテーテルを腫瘍除去手術中もしくは別個の手技によって該患者内に設置された小型の皮下リザーバーRickhamリザーバーに接続することができ、それ以上の外科的インターベンションを行わずに様々な時点でのパルボウイルス含有組成物の局所注入が可能になる。パルボウイルスもしくはパルボウイルス由来ベクター含有組成物は、定位外科的手法またはニューロナビゲーション標的化技術によって腫瘍内に注射することもできる。本発明のH-1PV含有組成物の投与は、適切なポンプシステム、例えば蠕動式注入ポンプまたは対流強化送達CEDポンプを使用して、移植されたカテーテルを通して低流量でのウイルス粒子もしくはウイルス粒子を含有する流体の連続注入によって実施することもできる。今までのところ、本発明のパルボウイルスを含有する組成物を投与するまた別の方法は、所望の癌組織へ該パルボウイルス含有組成物を分注するために構築および配置された移植製品からである。例えば、パルボウイルス含有組成物を含浸させたウエハーであって、外科的腫瘍切除の終了時に切除腔の辺縁に付着させるウエハーを使用することができる。そのような治療的インターベンションにおいて複数のウエハーを使用することができる。本発明の医薬組成物の適用に基づく療法は、癌、特にメラノーマ、脳腫瘍、乳癌または子宮頸癌の治療的処置に有用である。しかし本発明による療法は、原則として、パルボウイルスに感染し得る任意の腫瘍に適用することができる。本発明のパルボウイルスH1は腫瘍細胞を殺滅することができるが正常細胞に悪影響をもたらすことはなく、そのような感染は、例えば、ウイルスもしくはそのようなウイルスに基づくベクターの大脳内使用によって、有害な神経学的もしくは他の副作用を及ぼすことなく腫瘍特異的療法を達成するために実施することができる。本発明によるH-1PVによって治療可能な患者には、ヒトならびに非ヒト動物が含まれる。後者の例には、制限なく、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコなどの動物が含まれる。以下では実施例によって本発明を詳細に説明する。実施例1材料および方法AVP2ホモロジーモデリングH-1VP2カプソマーのホモロジーモデリングは、デンマーク工科大学生物学的配列分析センターのCPHmodels3.0サーバーhttp://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/で、テンプレートとして38~593配列内のH-1VP2カプソマーとの66.4ホモロジーを共有する既に3.25Å分解されたMVMpbVP21Z143D結晶構造モデル41を用いて実施した。次に得られたモデルを立体化学的性質について検証し、さらにPROCHECK56、WHAT-CHECK57、ERRAT58、VERIFY-3D59およびPROVE60を使用して精密に分析したが、全て全カプソマーが特に高い信頼性でモデリングされたことを証明した。BH-1カプシドの3DモデルH-1PVカプシドの3Dモデルを生成するために、60コピーのVP2モデルをPyMol61で組み立て、バックボーンのCαに焦点を当てたMVMpb1Z14モデル上でアラインメントした。アラインメントは、最初に配列アラインメント、次に構造アラインメントを実施し、次にフィット中に見いだされた構造的異常を拒絶するために改良サイクルを実施するルーチンツールを用いて達成した。該カプシド表面のトポグラフィー特徴を得るために、ホームメードアプリケーションを開発した補足情報。このアプリケーションは、カプシドPDBファイルからビリオンの質量中心の場所を計算し、次に質量中心と該カプシドを形成する各原子との距離を計算する。各質量-原子中心距離をb-係数フィールドに代えて元のPDBファイルにロードし、最後にPyMolプログラムを使用して色付き勾配として表示する。CH-1PV変異体の生成H-1PV変異体を構築するために、HindIII-HpaIを用いてpSR19クローン62を消化して得たVP遺伝子単位を含有するウイルスゲノムのフラグメントを最初にpBSK-HpaIベクターにサブクローニングしてpVPsub構築体を生成した。pBSK-HpaIは、5’-AGCTTATCGATACCGTCGACGTTAACC-3’および5’-TCGAGGTTAACGTCGACGGTATCGATA-3’オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって得られるHpaI制限部位を含有するアダプターとHindIII-XhoIを置換することによって構築される改変ポリリンカーを備えるpBluescriptSKプラスミドStratagene社である。insitu変異生成は、以前に記載されたようにテンプレートとしてpVPsub63を使用して、下記のプライマー導入された変異は下線で表示、クローンpVPsubI367Sには5’-GGTACCGCTAGACAGCACAGCTGGCGAGG-3’および5’-CCTCGCCAGCTGTGCTGTCTAGCGGTACC-3’、クローンpVPsubH373Rには5’-GCTGGCGAGGACCGTGATGCAAACGGAGC-3’および5’-GCTCCGTTTGCATCACGGTCCTCGCCAGC-3’を用いて実施した。改変VP2は最後に、HindIIIおよびHpaI制限酵素を使用して、pH-1PV-I367SおよびpH-1PV-H373R脱標的化変異体を生成するためにそれらの親pSR19バックボーンへクローニングし戻した。H-1PV-H373R-RGD-4C再標的化変異体は、RGD-4CCDCRGDCFCペプチド64をpH-1PVH373R変異体のVP2カプシドタンパク質のA441VP1タンパク質のA583に対応する内へ挿入することによって構築したSwiss-Prot:P03136.1配列にしたがって。このために、オーバーラップエクステンションPCR65を下記のプライマー、RGD1、5’-GCCGCGGAGACTGTTTCTGCGGCAGAACTAACATGCA-3’、RGD2:5’-AACAGTCTCCGCGGCAGTCACAAGCTATGGCGTCTTCTC-3’RGD-4C関連配列は下線で表示した、External1、5’-CGAAGATTGGGCCAAAC-3’およびExternal2、5’-TTTGTCCCAAATTTGTCC-3’を用いて実施した。生じたPCRフラグメントを次にMfeI-DraIII制限酵素を用いてpH-1PVH373Rクローンにクローニングした。D細胞HEK293T形質転換ヒト胚腎、NB324K新生児ヒト腎およびSK-MEL-28皮膚メラノーマ細胞系は、ATCCLGSStandards社、独国ウェーゼルから入手した。HeLa子宮頸癌細胞は、Alonso博士ドイツがん研究センター、独国ハイデルベルクより寄贈された。一次ケラチノサイトおよび軽度の色素性一次ヒト成人メラノサイトHEMa-LPは、各々PromoCell社独国ハイデルベルクおよびInvitrogen社現在はAppliedBiosystems社、独国ダルムシュタットの一部から購入した。293T、HeLaおよびSK-MEL-28細胞は、10のFBSを補給したダルベッコの改良イーグル培地Gibco、Invitrogen社、独国ダルムシュタット中で増殖させた。NB324K細胞は、5のFBSを補給した最小必須培地中で増殖させた。一次メラノサイトは、HMGSを補給した培地254Invitrogen社中で増殖させた。一次ケラチノサイトは、ヒトケラチノサイト補給物HKGSCAScadeBiologies社、オレゴン州ポートランドを含有するEpiLifeをベースとする培地中で増殖させた。全培地は、一次メラノサイトおよびケラチノサイトの培地を除き、2mMのL-グルタミン、100U/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシンを含有していた。細胞は、37°Cの5のCO2中および92湿度で維持した。E細胞ウイルスの結合および侵入アッセイ5×104cells/ウエルを24ウエルプレート内に播種し、1mLの完全培地中で増殖させた。21時間後、細胞をさらに3時間37°Cで0.1U/mLのノイラミニダーゼSigma-AldrichChemie社、独国シュタインハイムを含めて、または含めずに増殖させた。次に培養培地を取り除き、500Vg/cellのMOI感染多重度でH-1PV野生型または変異ウイルスを含有する0.5mLの無血清培地と置換した。結合アッセイのために、ウイルスが細胞表面受容体に結合することができるが細胞内には進入することができないように1または2時間4°Cで3回ずつ感染を実施した。取り込みアッセイのために、感染は、結合ウイルス粒子の内在化を可能にするウイルス細胞取り込みアッセイのために、37°Cで2時間NB324K、正常ケラチノサイトおよびHeLaまたは6時間正常メラノサイトおよびSK-MEL-28実施した。感染細胞は、500μLのPBSで洗浄し、トリプシンGibco、Invitrogen社、独国ダルムシュタットを用いた処理により採取し、200μLの完全培地中に再懸濁させ、これは細胞表面からの検出可能なウイルス剥離が全く付随しないことを証明したデータは示していない。細胞を次にウイルス粒子を遊離させるため3回の急速冷凍/解凍サイクルにかけた。ウイルスDNAは、オリジナルのウイルス接種菌および細胞溶解液からQiaAmpMinEluteウイルスキットQiagen社、独国ヒルデンを製造業者の取扱説明書にしたがって使用して精製し、上述したパルボウイルス特異的qPCRを使用して定量した。図5Bに記載した結果については、幾つかの改変を導入した。特に、細胞は48ウエルプレート内の200μLの完全培地中に播種した。24時間後、培地を取り除き、104Vg/cellのMOIの濃度で精製ウイルス調製物を含有する200μLの無血清培地と置換した。4°Cで30分後、プレートは未結合粒子を除去するために無血清培地で洗浄し、次にさらに37°Cで2時間インキュベートした。500μLのPBSで洗浄した後、細胞を100μLのトリプシン0.05を用いて処理し、この反応は100μLの完全培地を用いて停止させた。F細胞のトランスフェクションおよびウイルス産生6×106個のHEK293T細胞を175cm2のフラスコ内でプレーティングし、Reedetal.66にしたがって15μgのウイルスプラスミド/フラスコを用いて一過的にトランスフェクトした66。3日後、細胞を採取し、ウイルス粒子を3回の冷凍/解凍サイクルで細胞懸濁液から遊離させた。粗細胞抽出物を50U/mLのBenzonaseヌクレアーゼ超高純度グレードSigma社を用いて37°Cで30分間かけ消化した。ウイルスはZolotukhinetal.67にしたがってイオジキサノールIodixanol不連続勾配を使用して精製した。産生したウイルス粒子は、qPCRにより定量し下記を参照、カプシド化ウイルスゲノムVgとして表示した。ウイルスストックの更なる増幅は、100Vg/cellのMOIで使用したNB324K細胞系の感染によって実施した。細胞は感染5~7日後に採取し、上述のように処理した。Gウイルスの滴定定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応qPCRおよびプラークアッセイは、以前に記載されたように68実施した。感染単位IUアッセイは、7.5×103cells/ウエルNB324KもしくはHEK293Tまたは5×103cells/ウエルHeLaで播種した96ウエルプレート内で実施した。播種1日後、細胞をウイルスストックの10倍連続希釈液で感染させ、37°Cで72時間、5のCO2でインキュベートした。感染細胞のアルカリ溶解0.75MのNaOH後、DNAをナイロン膜へ移し、架橋させ、pMVプラスミドのEcoRVnt385-EcoRInt1084フラグメントに対応する32P-放射性標識NS-1-特異的プローブへハイブリダイズさせた。オートラジオグラフィーのためにブロットをX線フィルムに曝露させた。滴定実験は、常に少なくとも2回ずつ実施した。H定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応qPCR粗細胞抽出物は、ゲノムDNAおよび残留しているトランスフェクトしたプラスミドを除去するために、Benzonase登録商標ヌクレアーゼ超高純度グレード[Sigma-AldrichChemie社、独国シュタインハイム]、50U/mL、37°Cで30分間を用いて消化した。ウイルスDNAをビリオンから遊離させるために、10μLの細胞抽出物を30μLのアルカリ性溶解バッファーTEバッファー中1MのNaOHと56°Cで30分間混合した。溶解は、960μLの40mMのHClを加えることによって停止させた。ウイルスDNAの定量は、NSl-特異的TaqMan商標プローブである5’-6-FAMATGCAGCCAGACAGTTA-MGB-3’AppliedBiosystems社、独国ダルムシュタットを用いたリアルタイムqPCRによって、以下のプライマーNS1-FOR、5’-GCGCGGCAGAATTCAAACT-3’およびNS1-REV5’-CCACCTGGTTGAGCCATCAT-3’を使用して実施した。PCRは、ABIPrism7700サーマルサイクラーAppliedBiosystems社、独国ダルムシュタットを用いて実施し、SDS2.1ソフトウエアAppliedBiosystems社によって分析した。NS1配列を含有するプラスミドを101~108コピー/反応で連続希釈し、qPCRの標準化に使用した。個々の反応混合物20μLは、1×TaqManUniversalPCRMasterMix商標AppliedBiosystems社、0.3μMの標識NS1-TaqMan商標プローブ、0.3μMの各プライマーおよび3μLのテンプレートから構成された。I電子顕微鏡観察カーボンコートした300メッシュの銅グリッドを2分間ウイルス懸濁液の5μLアリコート上に表面を下にして配置し、2酢酸ウラニルを用いて30秒間染色し、およそ1分間乾燥させた。顕微鏡写真は、20、100倍の倍率でZeiss10A電子顕微鏡Zeiss社、独国オーバーコッヘンを用いて80kVの加速電圧で撮影した。倍率インジケータは、グレーティングレプリカとの比較によって定期的に調節した。J細胞生存度アッセイ一次メラノサイトおよびSK-MEL-28細胞のウイルス毒性は、代謝的に活性な生存細胞の指標として培養のATP含量を測定するCellTiter-Glo登録商標アッセイPromega社、独国マンハイムを用い、決定した。つまり、細胞を不透明な壁に囲まれた96ウエルプレート内の50μLの培地中で2,000cells/ウエルの密度で播種した。24時間のインキュベーション後、細胞を50μLの培地中に希釈した精製ウイルス一次メラノサイトについては200,000Vg、SK-MEL-28については500,000Vgで感染させた。感染5日後、80μLのCellTiter-Glo登録商標試薬を細胞培地に直接加えた。2分間のオービタルに攪拌した後、培養をさらに室温で10分間インキュベートした。細胞増殖シグナルを次にプレート読取りルミノメーターFluoroskanAscentFL、ThermoLabsystems社、独国ドライアイヒを使用して測定した。培地のみを含有するウエルをバックグラウンド評価のために使用した。細胞生存性のパーセンテージは、バックグラウンド減算後のウイルス感染対モック処理培養のルミネセント値の比率から計算した。Kプラークアッセイ単層中で増殖させたNBK細胞は、粗ウイルス懸濁液の連続希釈液を用いて1時間感染させ、その後接種菌を5のFBS、2mMのL-グルタミン、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシンを含有する最小必須培地[]L-グルタミンGibco、Invitrogen社、独国ダルムシュタット中0.68のBacto商標寒天Becton,DickinsonandCompany社のオーバーレイと置換した。感染5日後、生存細胞はPBS中に希釈したニュートラルレッド0.2mg/mL含有Bacto商標寒天0.85を添加し18時間染色した。プラークを計数し、力価をプラーク形成単位PFU/mLで表示した。L感染単位アッセイNBKまたは293T/17指標細胞は、5×105cells/皿の密度で6cm皿内に播種した。24時間後、1:10段階で連続的に希釈した粗ウイルス懸濁液を使用して総量400μL中の指標細胞を感染させた。37°Cでの1時間のインキュベーションおよび10分毎のプレートの攪拌後、5mLの培地を各培養皿に加えた。感染72時間後、細胞層をPBSで洗浄し、径25mmのニトロセルロースフィルターSchleicherSchuell社、独国ダッセルを細胞の上部に適用し、100μLのPBSで湿らせた。フィルターを続いて5分間変性バッファー0.5MのNaOHおよび1.5MのNaClを用いて飽和させたワットマンWhatman紙上に上下を逆にして配置した。次にフィルターをさらに5分間、中和バッファー0.5MのTris/HCl[pH7.2]、1.5MのNaClおよび1mMのEDTAで飽和させたワットマン紙へ移した。DNAは、80°Cで2時間フィルターを焼成し固定した。プレハイブリダイゼーションは、3×SSC1×SSCは0.15MのNaCl0.015Mのクエン酸ナトリウム、1のSDS、5mMのEDTA、10×のデンハルト液および100g/mLのサケ精子DNA中において65°Cで1時間実施した。ハイブリダイゼーションは、pMVMプラスミドのEcoRVnt385-EcoRInt1084フラグメントに対応する放射性プローブの添加によって実施し、アガロースゲル電気泳動法によって精製し、MegaprimeDNA標識システムGEHealthcare社を使用する[32P]dCTPを用いて標識した。65°Cでの一晩にわたるインキュベーション後、フィルターを最初に65°Cで30分間3×SSCpH7、1のSDS中で、次に65°Cで30分間0.3×SSCpH7中で洗浄した。続いてフィルターをワットマン紙上に置き、プラスチック箔中に包み、-80°CでX線撮影用フィルムに一晩曝露させた。ウイルスDNA増幅を支持する細胞は、放射性標識ウイルスDNAを用いたハイブリダイゼーションに起因してフィルム上の黒色ドットとして出現する。ウイルス力価は、黒色ドット×希釈係数×7.5の数として計算し、感染単位IU/mLで表示した。Mフローサイトメトリーによるインテグリン発現の決定細胞を採取し、室温で5分間1,500rpmで遠心した。ペレットを新鮮培地中に再懸濁させ、氷上で冷却し、次に4°CのFACSバッファー10のFCSおよび0.01のNaN3が補給されたPBS中で洗浄した。2×105cellsを氷上の総量100μL中、以下の抗体のいずれかとともに90分間インキュベートした全てMillipore社、カリフォルニア州テメキュラ、i希釈率1:50のマウスIgG1-FITCイソタイプコントロール、クローンCi4、ii4μg/mLのマウスαvβ3-FITC、クローンLM609、およびiii4μg/mLのマウスαvβ5-FITC、クローンP1F6。細胞は1mLのFACSバッファーで2回洗浄し、最後に700μLのFACSバッファー中に再懸濁させた。細胞をフローサイトメトリーFACSort、BectonDickinson社、北アイルランド、フランクリンレークスにより分析し、データはFCSExpressバージョン3DeNovoSoftware社、カリフォルニア州ロサンゼルスを使用して評価した。実施例2H-1PVカプシドのinsilicoモデリングH-1PVカプシドの結晶構造は未だ解明されていないため、本発明者らは、密接に関連するMVMパルボウイルスの分解結晶構造とのホモロジーによってH-1カプシドのinsilico3Dモデルを構築した。本発明者らは、最初にH-1PVVP2カプシドタンパク質の構造をモデリングした。図1に示したように、モデリングされたH-1PVVP2のトポロジーは他のパルボウイルスカプシドタンパク質に類似している。八本鎖のβ-バレルモチーフβB~βIは、β鎖間のループ挿入によって装飾されたコア隣接カプシドを形成する。他の小さなβ二次構造は、ループ内においてCPVまたはMVMにおけるのと同様に異なる場所で見いだすこともできる。本発明者らのモデルによると、H-1PVVP2タンパク質は、これまでに決定された全てのパルボウイルス構造内で保存されている配列である69正二十面体2回軸の近くで残基126~137にわたる小さなα-ヘリックスαAドメインを含有している図1。VP2タンパク質は、60H-1VP単位の90超を表す。MVMの場合、VP2のみから作成されたウイルス様粒子が全野生型ビリオンから得られたモデルとは有意に相違にしなかったことが記載されている43。このため、本発明者らは、VP2のみに基づきH-1PVカプシドをモデリングすることを決定した。完全H-1カプシド3Dモデルを形成するために、60コピーのVP2モデルをPyMol内でクローニングし、MVMpb結晶構造モデル上でアラインメントしたモデリングのために採用したパラメーターの詳細については実施例1を参照されたい。結果として生じたT=1正二十面体カプシドモデルは、特徴的な哺乳動物自律性パルボウイルスカプシドの全ての主要構造特徴、例えばi5本の対称性関連リボンのクラスタリングによって形成されるキャニオンによって取り囲まれた5回軸ポア、ii6つの大きな表面ループ各3回対称軸関連VP2サブユニットから2つずつのクラスタリングの結果として生じる3回軸スパイク、およびiii2回軸ディンプル図2Aを示す。H-1およびMVMカプシドは、この態様では極めて類似しており、匹敵する形状を備える。両方のカプシドにおいて、5回軸ポア構造は該カプシドの仮想中心からおよそ130Å離れているが図2B、他方3回軸スパイク図2Cおよび2回軸ディンプル図2Dは各々該中心から145および100Å離れている。3回軸スパイクの中心は、MVMと比較してH-1における突出がわずかに少ないと思われ約130Å対約135Å、この中心はGLU233の露出した側鎖に起因して3つの偏心先端に取り囲まれている。実施例3シアル酸はH-1PV細胞膜の認識および侵入に関係しているこのモデルの分析は、2回軸ディンプルがMVMおよびH-1PV中で保存されることを示唆している図3。MVMではこの領域はシアル酸に結合し、これは細胞侵入にとって重要であると思われる10。特にMVMカプソマーの2つの残基は、この領域の表面でシアル酸に結合することが証明されている40~42。ノイラミニダーゼを用いたシアル酸を表面タンパク質から開裂する処理は、MVM細胞侵入を大きく損傷させることが証明された。シアル酸はH-1カプシドの細胞膜への結合にも関係している。2つのH-1PV高許容細胞系であるHeLaおよびNBKをH-1PV感染前にノイラミニダーゼの存在下または非存在下で増殖させた。ノイラミニダーゼを用いた前処理は、HeLaおよびNB324K細胞両方のウイルスを取り込む能力を劇的におよそ95減少させ、これはMVMに類似して、H-1PVがシアル酸と相互作用し、この結合がパルボウイルス感染にとって重要であることを示している図4およびデータは示していない。実施例4insitu突然変異生成によるH-1PVの脱標的化受容体の認識レベルでウイルスの指向性を再方向付けるためには、該ウイルスのその天然受容体への結合を無効にすること再標的化がまず重要である。シアル酸はMVMおよびH-1PVの細胞表面認識を媒介すると思われるため、本発明者らはMVMと同様、H-1PVのディンプル領域もまた糖との相互作用に関係している可能性がある。MVM内では、I362およびK368の両方がシアル酸への結合に関係している。質量および電荷特性ならびにinsilicoモデリングに基づいて、本発明者らは、I367およびH373を各々SおよびRと単独で置換することを決定し、H-1PVI367SおよびH1PVH373R変異体を生成した。HEK293T細胞中でのウイルスDNAトランスフェクション後、見かけは正常な形態のウイルス粒子が形成された図5A。しかし変異はNBKおよびHeLa細胞の両方におけるウイルスの結合および侵入に大きく影響し図5B、残基373での改変を有するウイルスについては90超の減少が観察された。感染単位およびプラークアッセイは、突然変異が導入された結果細胞に侵入した感染粒子の数の減少を確証した図5C。さらに、変異ウイルスは野生型H-1PVと比較して低い力価で生成されたが図5D、異なるウイルスバッチ間で安定性に関する差は観察されなかったデータは示していない。さらに、NB324K細胞と同様、突然変異は、ウイルスのHeLa細胞への結合および侵入に残基373での改変を有するウイルスについて観察された90の減少より多く、大きく影響した図5E。NB324K、HeLaおよびHEK293T細胞内で実施されたウイルスDNAハイブリダイゼーションアッセイは、導入された置換の結果、それらの複製周期を開始するために細胞に侵入することができる変異粒子の数が大幅に減少することを確証した図5F。以前の結果と一致して、H373R変異体についての阻害はI367S変異体についての阻害よりもはるかに明白であった。一貫して、どちらの変異体もウイルスがNB324K内でプラークを形成する能力を損傷させ、H373R置換について強度の作用が観察された図5G。2つの変異ウイルスは、さらにLDHおよびMTTアッセイ各々によって測定されるように、細胞を溶解してそれらの増殖を停止させる能力の低下も表示したデータは示していない。実施例5環状RGDペプチドのそのカプチド内への挿入による侵入欠陥性H-1PVH373R変異体のα5β5インテグリンへの再標的化上記に提示した結果は、VPタンパク質内のH373R置換が、該タンパク質が適正に組み立てられ、カプシドを形成する能力を維持しながら、ウイルス細胞膜の認識および侵入の両方を劇的に減少させることを示した。H-1PVの遺伝的再プログラミングの第2工程は、ウイルス侵入のレベルで該ウイルスに明確な腫瘍親和性を付与可能な癌特異的再標的化ペプチドをそのカプシド内へ挿入することによってこの侵入欠損性変異体をさらに改変することであった。αvβ3およびαvβ5インテグリンは癌細胞内で過剰発現することが多い。これらのインテグリンは、RGDモチーフを含有するペプチドによって効率的に認識される。詳細には、4つのシステイン残基2つのジスルフィド結合を形成することにより該ペプチドを構造的に安定させるによって取り囲まれた中心RGDモチーフから構成される、RGD-4Cとして公知である環状RGD含有ペプチドアミノ酸配列、CDCRGDCFCは、αvβ3およびαvβ5インテグリンの認識において最も強力なペプチドであり48、49、アデノウイルスおよびAAVの再標的化に使用され成功を収めてきた52~54。本発明者らは、その再標的化特徴を保存しながらカプシドの外表面でのペプチドの露出を保証するであろうウイルスカプシド内の位置の同定を開始した。本発明者らは、本発明者らのinsilicoカプシドモデルに依存して、カプシド表面の2つの態様、i突出のレベル、およびii該ペプチドが外側に露出させられる機会を増加させる親水性の性質へ特に注意を払いながら、潜在的挿入部位をスクリーニングした。特にこれらの基準を満たした2つのVP残基図6にS1およびS2部位として表示したが存在した。それらはV2配列内のGly234およびAla441に対応し、3回対称軸のスパイクに存在する2つのループ内に位置する図6AおよびB。本発明者らは、これらの位置で挿入されたRGD-4Cペプチドが外表面へ良好に露出され図6C、VP2タンパク質配列のAla441のニトロカルボキシ基S2部位の隣にRGD-4Cが挿入されるとH-1PVH373R-RGD-4C変異体H-1RGDと略記するが生成されると予測した。HEK293細胞内でのウイルスDNAのトランスフェクション後、ビリオンが類似量で形成され、野生型ビリオンと同一の形態学的外観を有していたが、これはこの位置での挿入がウイルスアッセンブリもパッケージングも損傷させなかったことを示している図7AおよびB。本発明者らは、次にH-1RGDが野生型ウイルスと比較してNB324Kに感染する能力を試験した。αvβ3およびαvβ5インテグリンの発現は、これらの細胞内では本発明者らの検出限界を下回った図7C。NB324K細胞の表面上のαvβ3およびαvβ5インテグリンの欠損と一致して、H-1RGDはH373R脱標的化ウイルスに類似して挙動し、これらの細胞に効率的には感染しなかった図7D。次に、細胞侵入アッセイは、αvβ3およびαvβ5インテグリンを過剰発現することが公知であるSK-MEL-28皮膚メラノーマ細胞を使用して実施した70、71。図7Eに示したように、野生型ウイルスはこれらの細胞に侵入することができ、このウイルス侵入は該細胞をノイラミニダーゼで前処理することによってほぼ完全に無効されたが、これはHeLaおよびNBK細胞内と同様、ウイルスがSK-MEL-28細胞に侵入するためには細胞表面シアル酸を必要とすることを示唆している。予想通り、侵入欠損性H-1PVH373R変異体は、SK-MEL-28細胞に感染することができなかった。注目すべきことに、RGD-4Cペプチドのこの変異体への挿入は、該細胞内への侵入の大部分をレスキューした。重要なことには、ウイルス侵入はノイラミニダーゼ処理に対して部分的にのみ感受性であったが、これはRGD-4C含有ウイルスがシアル酸からは独立した代替経路を通して細胞に感染することを示している図7E。さらにウイルスの抗腫瘍特徴がカプシド改変によって影響を受けるかどうかについても、SK-MEL-28細胞を殺滅するRGD-4C含有ウイルスの有効性を評価することによって調査した。細胞生存度アッセイは、H-1PVH373Rが細胞に感染し得ないのはそれらを殺滅できないことと極めて明確に関連することを証明した。反対に、RGD-4C含有ウイルスはSK-MEL-28細胞を効果的に殺滅した図7F。これらをまとめると、これらの実験は、H-1PVウイルスカプシドを本発明によって改変することでウイルス侵入のレベルでの癌細胞に対する親和性を増加させることができることを証明している。実施例6αvβ5インテグリンを発現するメラノーマ細胞に対するH-1RGD特異性本実施例では、実施例5と類似の結果を追加のコントロールを用いて証明した。RGD-4Cの挿入がヒト癌細胞対ヒト正常一次細胞へのウイルス再標的化をもたらすかどうかについて試験した。内在化アッセイは、αvβ3およびαvβ5インテグリンを過剰発現するSK-MEL-28皮膚メラノーマ細胞を使用して実施した70、71。比較のために、HeLa細胞をさらに非形質転換ヒトメラノサイトおよびケラチノサイトの一次培養と一緒に試験した。フローサイトメトリー分析は、SK-MEL-28内でのαvβ3およびαvβ5インテグリンの高い発現を確証した。さらに、一次メラノサイトはαvβ3インテグリンを優先的に発現することがわかったが、αvβ3およびαvβ5インテグリン両方の発現は一次ケラチノサイトおよびHeLa細胞においてほとんど検出されなかった図11A。図11Bに示したように、ウイルス侵入がノイラミニダーゼを用いた前処理培養によって劇的に減少させられたため、野生型ウイルスはシアル酸依存方法でこれらの相違する培養全てによって取り込まれた。これらの結果はさらに、野生型ウイルスの取り込みが表面シアル酸に依存することを証明したHeLaおよびNB324K細胞において以前に得られたデータを確証した。予想通り、H373R脱標的化ウイルスはHeLa細胞の膜に結合して侵入することができなかった。類似の無効性は、SK-MEL-28および正常細胞培養中でも見いだされた。注目すべきことに、RGD-4Cペプチドの脱標的化ウイルス内への挿入は、αvβ3/αvβ5メラノーマ細胞内への侵入を大きくレスキューした。H-1RGDの結合および侵入はノイラミニダーゼ処理に対して部分的にのみ感受性であったが、これはH-1RGDウイルスがシアル酸からは独立した代替経路を通して細胞に感染することを示している。H-1RGDウイルス上で表示されたRGDペプチドはまたαvβ3正常メラノサイトの一部の、メラノーマ細胞と比較してはるかに低いレベルのレスキューと相関していた。これとは対照的に、RGD挿入依存性レスキューは、インテグリン陰性HeLa細胞および正常ケラチノサイトにおいては有意ではなかった。これらをまとめると、これらのデータは、細胞表面でのαvβ3およびαvβ5インテグリンの存在が各々低効率および高効率でのH-1RGD取り込みを可能にすることを示している図11AおよびB。次に、インテグリン陽性メラノーマSK-MEL-28細胞上へのH-1RGDのRGD媒介性再標的化が脱標的化H373R変異体と比較してこのウイルスの強化された腫瘍崩壊能力に反映されるかどうかを調査した。図12に示したように左のパネル、正常メラノサイトは、パルボウイルス細胞毒性の腫瘍特異性と一致して、改変ウイルスならびに野生型H-1PVの両方を用いた感染に抵抗した。これとは対照的に、H-1RGDおよび親ウイルスは、H373R変異体と、メラノーマ細胞を効果的に殺滅する能力によって識別することができた図12、右のパネル。H373R変異体内へのRGD挿入はメラノーマ細胞内でのこのウイルスの侵入だけではなく上記参照、細胞変性作用もレスキューしたが、これは内在化後にH-1RGDがウイルス毒性タンパク質の発現に対して競合的であることを示唆している。実際、パルボウイルス誘導性細胞障害の主要エフェクターであることが公知のNS1の産生は、H-1RGDおよび野生型ウイルスで感染させたメラノーマ細胞中では高レベルで検出することができたがH373R変異体で感染させた場合は検出することができなかったデータは示していない。結論として、これらの実験は、H-1PVカプシドを、ウイルス腫瘍崩壊能力を保存しながらこのウイルスを個別癌細胞の表面に方向付けるために遺伝的に改変可能なことを証明している。参照文献1SieglGBiologyandpathogenicityofautonomousparvovirusesInBernsKIeditorTheparvovirusesNewYorkNYPlenumPressInc1983p2973622MoussetSRommelaereJMinutevirusofmiceinhibitscelltransformationbysimianvirus40Nature198230053793CornellsJJBecquartPDuponchelNSalomeNAvalosseBLNambaMetalTransformationofhumanfibroblastsbyionizingradiationachemicalcarcinogenorsimianvirus40correlateswithanincreaseinsusceptibilitytotheautonomousparvovirusesH1virusandminutevirusofmiceJVirol1988621679864TelermanATuynderMDupressoirTRobayeBSigauxFShaulianEetalAmodelfortumorsuppressionusingH1parvovirusProcNatlAcadSciUSA199390870265RommelaereJGeletnekyKAngelovaALDaefflerLDinsartCKiprianovaIetalOncolyticparvovirusesascancertherapeuticsCytokineGrowthFactorRev201021185956GrekovaSZawatzkyRHorleinRCziepluchCMincbergMDavisCetalActivationofanantiviralresponseinnormalbutnottransformedmousecellsanewdeterminantofminutevirusofmiceoncotropismJVirol201084516317CornellsJJDeleuLKockURommelaereJParvovirusoncosuppressionLondonArnoldELtd20068EtingovIItahRMincbergMKerenNausANamHJAgbandjeMcKennaMetalAnextensionoftheMinuteVirusofMicetissuetropismVirology2008379245559RubioMPLopezBuenoAAlmendralJMVirulentvariantsemerginginmiceinfectedwiththeapathogenicprototypestrainoftheparvovirusminutevirusofmiceexhibitacapsidwithlowavidityforaprimaryreceptorJVirol200579112809010LopezBuenoARubioMPBryantNMcKennaRAgbandjeMcKennaMAlmendralJMHostselectedaminoacidchangesatthesialicacidbindingpocketoftheparvoviruscapsidmodulatecellbindingaffinityanddeterminevirulenceJVirol20068015637311KrugerLEskerskiHDinsartCCornellsJRommelaereJHaberkornUetalAugmentedtransgeneexpressionintransformedcellsusingaparvoviralhybridvectorCancerGeneTher2008152526712MullerOJKaulFWeitzmanMDPasqualiniRArapKleinschmidtJAetalRandompeptidelibrariesdisplayedonadenoassociatedvirustoselectfortargetedgenetherapyvectorsNatBiotechnol2003211040613GirodARiedMWobusCLahmHLeikeKKleinschmidtJetalGeneticcapsidmodificationsallowefficientretargetingofadenoassociatedvirustype2NatMed199951052614MichelfelderSKohlschutterJSkorupaAPfenningsSMuller0KleinschmidtJAetalSuccessfulexpansionbutnotcompleterestrictionoftropismofadenoassociatedvirusbyinvivobiopanningofrandomvirusdisplayPeptidelibrariesPLoSOne20094e512215WaterkampDAMullerOJYingYTrepelMKleinschmidtJAIsolationoftargetedAAV2vectorsfromnovelvirusdisplaylibrariesJGeneMed2006813071916KrasnykhVDmitrievIMikheevaGMillerCRBelousovaNCurielDTCharacterizationofanadenovirusvectorcontainingaheterologouspeptideepitopeintheHIloopofthefiberknobJVirol19987218445217GonzalezRVereecqueRWickhamTJVanrumbekeMKovesdiIBautersFetalIncreasedgenetransferinacutemyeloidleukemiccellsbyanadenovirusvectorcontainingamodifiedfiberproteinGeneTher199963142018CoughlanLVallathSSahaAFlakMMcNeishIAVassauxGetalInvivoretargetingofadenovirustype5toalphavbeta6integrinresultsinreducedhepatotoxicityandimprovedtumoruptakefollowingsystemicdeliveryJVirol20098364162819HerreroYCMCornellsJJHeroldendeCRommelaereJSchlehoferJRGeletnekyKParvovirusH1infectionofhumangliomacellsleadstocompleteviralreplicationandefficientcellkillingIntJCancer2004109768420MalerbaMDaefflerLRommelaereJIggoRDReplicatingparvovirusesthattargetcoloncancercellsJVirol20037766839121FaisstSGuittardDBennerACesbronJYSchlehoferJRRommelaereJetalDosedependentregressionofHeLacellderivedtumoursinSCIDmiceafterparvovirusH1infectionIntJCancer199875584922VanPachterbekeCTuynderMBrandenburgerALeclercqGBorrasMRommelaereJVaryingsensitivityofhumanmammarycarcinomacellstothetoxiceffectofparvovirusH1EurJCancer19973316485323VanPachterbekeCTuynderMCosynJPLespagnardLLarsimontDRommelaereJParvovirusH1inhibitsgrowthofshorttermtumorderivedbutnotnormalmammarytissueculturesIntJCancer199355672724RanZRayetBRommelaereJFaisstSParvovirusH1inducedcelldeathinfluenceofintracellularNADconsumptionontheregulationofnecrosisandapoptosisVirusRes1999651617425OhshimaTIwamaMUenoYSugiyamaFNakajimaTFukamizuAetalInductionofapoptosisinvitroandinvivobyHlparvovirusinfectionJGenVirol19987930677126RayetBLopezGuerreroJARommelaereJDinsartCInductionofprogrammedcelldeathbyparvovirusH1inU937cellsconnectionwiththetumornecrosisfactoralphasignallingpathwayJVirol199872889390327UenoYHaradaTIsekiHOhshimaTSugiyamaFYagamiKPropagationofratparvovirusinthymiclymphomacelllineC58dandsubsequentappearanceofaresistantcellcloneafterlyticinfectionJVirol20017539657028HristovGKramerMLiJElAndaloussiNMoraRDaefflerLetalThroughItsNonstructuralProteinNS1ParvovirusH1InducesApoptosisviaAccumulationofReactiveOxygenSpeciesJVirol2010859092229DiPiazzaMMaderCGeletnekyKHerreroYCMWeberESchlehoferJetalCytosolicactivationofcathepsinsmediatesparvovirusH1inducedkillingofcisplatinandTRAILresistantgliomacellsJVirol20078141869830CotmoreSFTattersallPParvoviralhostrangeandcellentrymechanismsAdvVirusRes20077018323231ParkerJSMurphyWJWangDOBrienSJParrishCRCanineandfelineparvovirusescanusehumanorfelinetransferrinreceptorstobindenterandinfectcellsJVirol200175389690232SummerfordCSamulskiRJMembraneassociatedheparansulfateproteoglycanisareceptorforadenoassociatedvirustype2virionsJVirol19987214384533SummerfordCBartlettJSSamulskiRJAlphaVbeta5integrinacoreceptorforadenoassociatedvirustype2infectionNatMed19995788234QingKMahCHansenJZhouSDwarkiVSrivastavaAHumanfibroblastgrowthfactorreceptor1isacoreceptorforinfectionbyadenoassociatedvirus2NatMed1999571735DiPasqualeGDavidsonBLSteinCSMartinsIScudieroDMonksAetalIdentificationofPDGFRasareceptorforAAV5transductionNatMed2003913061236BrownKEAndersonSMYoungNSErythrocytePantigencellularreceptorforB19parvovirusScience1993262114737MunakataYSaitoItoTKumuraIshiiKHuangJKoderaTIshiiTetalKu80autoantigenasacellularcoreceptorforhumanparvovirusB19infectionBlood200510634495638WeigelKelleyKAYoderMCSrivastavaAAlpha5betalintegrinasacellularcoreceptorforhumanparvovirusB19requirementoffunctionalactivationofbetalintegrinforviralentryBlood200310239273339HuefferKParrishCRParvovirushostrangecelltropismandevolutionCurrOpinMicrobiol20036392840LopezBuenoASegoviaJCBuerenJA0SullivanMGWangFTattersallPetalEvolutiontopathogenicityoftheparvovirusminutevirusofmiceinimmunodeficientmiceinvolvesgeneticheterogeneityatthecapsiddomainthatdeterminestropismJVirol200882119520341KontouMGovindasamyLNamHJBryantNLlamasSaizALFocesFocesCetalStructuraldeterminantsoftissuetropismandinvivopathogenicityfortheparvovirusminutevirusofmiceJVirol200579109314342NamHJGurdaWhitakerBGanWYIlariaSMcKennaRMehtaPetalIdentificationofthesialicacidstructuresrecognizedbyminutevirusofmiceandtheroleofbindingaffinityinvirulenceadaptationJBiolChem200628125670743HemminkiABelousovaNZinnKRLiuBWangMChaudhuriTRetalAnadenoviruswithenhancedinfectivitymediatesmolecularchemotherapyofovariancancercellsandallowsimagingofgeneexpressionMolTher200142233144WitloxAMVanBeusechemVWMolenaarBBrasHSchaapGRAlemanyRetalConditionallyreplicativeadenoviruswithtropismexpandedtowardsintegrinsinhibitsosteosarcomatumorgrowthinvitroandinvivoClinCancerRes20041061745BurkhartDJKaletBTColemanMPPostGCKochTHDoxorubicinformaldehydeconjugatestargetingalphavbeta3integrinMolCancerTher20043159360446SarkiojaMKanervaASaloJKangasniemiLErikssonMRakiMetalNoninvasiveimagingforevaluationofthesystemicdeliveryofcapsidmodifiedadenovirusesinanorthotopicmodelofadvancedlungcancerCancer200610715788847HodivalaDilkeKMReynoldsARReynoldsLEIntegrinsinangiogenesismultitalentedmoleculesinabalancingactCellTissueRes20033141314448AssaMuntNJiaXLaakkonenPRuoslahtiESolutionstructuresandintegrinbindingactivitiesofanRGDpeptidewithtwoisomersBiochemistry2001402373849NagelHMaagSTassisANestleFOGreberUFHemmiSThealphavbeta5integrinofhematopoieticandnonhematopoieticcellsisatransductionreceptorofRGD4CfibermodifiedadenovirusesGeneTher20031016435350BrooksPCClarkRAChereshDARequirementofvascularintegrinalphavbeta3forangiogenesisScience19942645697151ZitzmannSEhemannVSchwabMArginineglycineasparticacidpeptidebindstobothtumorandtumorendothelialcellsinvivoCancerRes20026251394352MagnussonMKHongSSHenningPBoulangerPLindholmLGeneticretargetingofadenovirusvectorsfunctionalityoftargetingligandsandtheirinfluenceonvirusviabilityJGeneMed200243567053WesselingJGBosmaPJKrasnykhVKashentsevaEABlackwellJLReynoldsPNetalImprovedgenetransferefficiencytoprimaryandestablishedhumanpancreaticcarcinomatargetcellsviaepidermalgrowthfactorreceptorandintegrintargetedadenoviralvectorsGeneTher200189697654NiuGXiongZChengZCaiWGambhirSSXingLetalInvivobioluminescencetumorimagingofRGDpeptidemodifiedadenoviralvectorencodingfireflyluciferasereportergeneMolImagingBiol200791263455PiaoYJiangHAlemanyRKrasnykhVMariniFCXuJetalOncolyticadenovirusretargetedtoDeltaEGFRinducesselectiveantigliomaactivityCancerGeneTher2009162566556LaskowskiRAMossDSThorntonJMMainc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