129位のグリシンが置換されているヒトプロラクチン変異体の有効濃度を細胞に暴露することを含む、プロラクチン受容体を発現する乳癌細胞の増殖を阻害する方法。ヒトプロラクチン変異体の129位のグリシンがアルギニンに置換されている、請求項1記載の方法。治療を必要とする被験者において乳癌の治療に用いられる請求項1記載の方法。ヒトプロラクチン変異体が併用療法レジメンの一部として被験者に投与される、請求項3記載の方法。併用療法レジメンが抗エストロゲン剤の投与を含む、請求項4記載の方法。抗エストロゲン剤がタモキシフェンである、請求項5記載の方法。129位のグリシンが置換されているヒトプロラクチン変異体の有効濃度を細胞に暴露することを含む、プロラクチン受容体を発現する前立腺癌細胞の増殖を阻害する方法。ヒトプロラクチン変異体の129位のグリシンがアルギニンに置換されている、請求項7記載の方法。治療を必要とする被験者において前立腺癌の治療に用いられる請求項7記載の方法。ヒトプロラクチン変異体が併用療法レジメンの一部として被験者に投与される、請求項9記載の方法。併用療法レジメンが抗アンドロゲンの投与を含む、請求項10記載の方法。細胞不含切断型プロラクチン受容体の有効濃度を細胞に暴露することを含む、プロラクチン受容体を発現する乳癌細胞の増殖を阻害する方法。治療を必要とする被験者において乳癌の治療に用いられる請求項12記載の方法。ヒトプロラクチン変異体が併用療法レジメンの一部として被験者に投与される、請求項13記載の方法。併用療法レジメンが抗エストロゲン剤の投与を含む、請求項14記載の方法。抗エストロゲン剤がタモキシフェンである、請求項15記載の方法。細胞不含切断型プロラクチン受容体の有効濃度を細胞に暴露することを含む、プロラクチン受容体を発現する前立腺癌細胞の増殖を阻害する方法。治療を必要とする被験者において前立腺癌の治療に用いられる請求項17記載の方法。ヒトプロラクチン変異体が併用療法レジメンの一部として被験者に投与される、請求項18記載の方法。併用療法レジメンが抗アンドロゲンの投与を含む、請求項19記載の方法。129位のグリシンが置換されているヒトプロラクチン変異体の有効濃度を細胞に暴露することを含む、プロラクチン受容体を発現する細胞において細胞アポトーシスを誘導する方法。ヒトプロラクチン変異体の129位のグリシンがアルギニンに置換されている、請求項21記載の方法。細胞がプロラクチン受容体を発現するように遺伝子操作されている、請求項21記載の方法。dプロラクチン受容体を発現する細胞に化合物を接触させる段階;e細胞におけるアポトーシスのレベルを測定する段階;およびfbにおいて得られたアポトーシスのレベルを化合物の非存在下で得られたレベルと比較する段階を含む、プロラクチン受容体活性を調節することができる化合物を同定する方法であって、bにおいて得られたレベルが化合物の非存在下において得られたレベルと異なる場合、プロラクチン受容体活性を調節することができる化合物が同定される方法。化合物が細胞におけるアポトーシスのレベルを増加させる、請求項24記載の方法。化合物がプロラクチン受容体アンタゴニストの存在下で細胞におけるアポトーシスのレベルを減少させる、請求項24記載の方法。5.詳細な説明制限するためではなくて、明確にするために、本発明の詳細な説明を以下の小章に分ける:iプロラクチン変異体;ii切断型プロラクチン受容体;およびiii本発明の用途。51プロラクチン変異体本発明は、その受容体でPRLの作用に拮抗するプロラクチンPRL変異体を提供する。プロラクチンPRLという用語は、本明細書においてヒトおよびヒト以外の動物型のホルモンであるプロラクチンを意味する。そのようなプロラクチンには、アミノ酸配列を図10に述べたプロラクチンが含まれるが、これらに限定されない同様に、クックCookeら、1981、JBiolChem256:4007;クックCookeら、1980、JBiolChem225:6502;コウモトKohmotoら、1984、EurJBiochem138:227;ツボカワTsubokawaら、1985、IntJPeptideProteinRes25:442;ボンダーBondarら、1991、ゲンバンク受入番号X63235;ササベージSasavageら、1982、JBiolChem257:678;ミラーMillerら、1980、Endocrinol107:851;リLiら、1970、ArchBiochemBiophys141:705;リLi、1976、IntJPeptideProteinRes8:205;マーチナントMartinantら、1991、BiochemBiophysActa1077:339;レーマンLehmanら、1988、IntJPeptideProteinRes31:544;リLiら、1989、IntJPeptideProteinRes33:67;ハンクスHanksら、1989、JMolEndocrinol2:21;ワタヒキWatahikiら、1989、JBiolChem264:5535;カラツァスKaratzasら、1990、NuclAcidsRes18:3071;ヤスダYasudaら、1990、GenCompEndocrinol80:363;ノソNosoら、IntJPeptideProteinRes39:250;バックバインダーBuckbinderら、1993、ProcNatlAcadSciUSA90:3820;タカハシTakahashiら、JMolEndocrinol5:281;ヤマグチYamaguchiら、1988、JBiolChem263;9113;レントラーデルルーRentlerDelrueら、DNA8:261;ヤスダYasudaら、1987、GenCompEndocrinol66:280;チャンChangら、1991、ゲンバンク受入番号X61049;チャンChangら、1991、ゲンバンク受入番号X61052;ヤスダYasudaら、1986、ArchBiochemBiophys244:528;クワナKuwanaら、1988、AgricBiolChem52:1033;ソングSongら、1988、EurJBiochem172:279;メルシエMercierら、1989、DNA8:119を参照のこと。プロラクチンPRL変異体という用語は、本来の型のアミノ酸配列が、アミノ酸の挿入、欠失、および/または置換によって変化している場合を含む、その本来の型と比較して構造的に変化しているプロラクチンの型を意味する。そのような変異体の、PRLの受容体におけるPRLの作用に対する拮抗能は、通常の条件で、PRLによって媒介される作用の変異体の阻害能として定義される。例えば、PRLがある種の細胞に対して増殖作用を有する場合、本発明のPRL変異体は、その種の細胞の増殖を阻害する;以下の理論に制限されることなく、PRLは阻害作用が認められるためにはある程度のレベルが存在すると考えられる。図5Aは、本発明の実施例を説明しており、ここで、ヒトプロラクチンhPRLはT47Dヒト乳癌細胞の増殖を誘導するが、129位のグリシンがアルギニン残基に置換されている、hPRLAと呼ばれるhPRL変異体は、hPRLまたはhPRLAを加えていないT47D細胞と比較してT47D細胞の増殖を阻害する;T47DレベルがPRLを生じると考えられているギンスバーグフォンデルアールGinsbergandVonderharr、1995、CancerRes55:2591~2595。特定の非制限的な実施例として、PRL変異体は、PRLおよびPRL変異体の双方が存在する場合に、その受容体を通じてのPRLの作用能を変異体が阻害するか否かを決定することによって、PRLのアンタゴニストとして同定されてもよい。一例として、PRLの所定の濃度Xが培養においてPRLRを発現する細胞の増殖において増加Yに関連している場合、同等の細胞試料を濃度XのPRLおよび濃度VのPRL変異体に暴露すると、細胞の増殖はZ増加するが、ここでZはYより小さく、負の数であってもよいであろう。本発明の一つの非制限的な態様において、PRL変異体は129位のグリシンが別のアミノ酸に置換されているヒトPRLの変異体である。G129として速記法で示される置換ここではグリシン以外の天然または合成アミノ酸であるは、本来の配列からの単なる変異であってもよく、または幾つかの変化の一つであってもよいアミノ酸の挿入、欠失、および/または置換を含む。置換アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニンのような中性の極性アミノ酸;セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸のような中性の非極性アミノ酸;アスパラギン酸およびグルタミン酸のような酸性アミノ酸;ならびにアルギニン、ヒスチジン、またはリジンのような塩基性アミノ酸であってもよい。本発明の好ましい態様において、hPRLの129位のグリシンは、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、プロリン、チロシン、システイン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸に置換してもよい。本発明の最も好ましい態様において、置換は129位のグリシンをアルギニンG129Rに置換する。さらに特定の非制限的な態様において、本発明は、129位のグリシンが欠失しているプロラクチン変異体を提供する。さらに他の非制限的な態様において、プロラクチン変異体は融合蛋白質の一部としてもう一つの蛋白質に結合している。一つの特定の態様として、プロラクチン変異体はインターロイキン2に結合してもよい。そのような態様の一つの非制限的な例は、インターロイキン2に結合したヒトプロラクチンのG129R変異体である。本発明のPRL変異体は化学合成、または組換えDNA技術によって調製してもよい。一般的にPRLのcDNAは、標準的なPCR増幅技術、PRLを産生する細胞脳下垂体細胞などから調製した鋳型としてのRNAまたはcDNA、および既知のPRL核酸またはアミノ酸配列に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドプライマー、を用いて調製してもよい。hPRLをコードするcDNA調製の非制限的な実施例を下記の第7章に記載する。次にランダムに、または部位特異的変異誘発のいずれかによってPRLcDNAに変化を導入してもよい。オリゴヌクレオチド媒介部位特異的変異誘発を用いる例についても実施例7に記載しており、hPRLへのG129R置換の導入を説明する。PRL変異体が組換え技術によって産生される場合、PRL変異体をコードする核酸を、適したプロモーター/エンハンサー配列に機能的に結合した発現ベクターに組み入れてもよい。発現ベクターは、さらに、転写終結部位、ポリアデニル化部位、リボソーム結合部位、シグナル配列等を含む、PRL変異体の発現を助ける1つまたは複数のエレメントを含んでもよい。適した発現系には、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、粘菌、ならびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物を含む生物が含まれる。適した発現ベクターには、pHSV1のような単純ヘルペスウイルスに基づくベクターゲラーGellerら、1990、ProcNatlAcadSciUSA87:8950~8954;MFGのようなレトロウイルスベクタージャフィーJaffeeら、1993、CancerRes53:2221~2226、および特にLN、LNSX、LNCX、LXSNのようなモロニーレトロウイルスベクターミラーロスマンMillerandRosman、1989、Biotechniques7:980~989;MVAのようなワクシニアウイルスベクタースッターモスSutterandMoss、1992、ProcNatlAcadSciUSA89:10847~10851;pJM17のようなアデノウイルスベクターアリAliら、1994、GeneTherapy1:367~384;バーカーBerker、1988、Biotechniques6:616~624;ワンドファイナーWandandFiner、1996、NatureMedicine2:714~716;AAVneoのようなアデノ関連ウイルスベクタームラカチョMuraCachoら、1992、JImmunother11:231~237;レンチウイルスベクターツッファレイZuffereyら、1997、NatureBiotechnology15:871~875;pCDNA3およびpCDNA1インビトロゲン社、pET11a、pET3a、pET11d、pET3d、pET22d、およびpET12aノバゲン社のようなプラスミドベクター;プラスミドAH5SV40起点およびアデノウイルスの主要後期プロモーターを含む、pRCCMVインビトロゲン社、pCMUIIパアボPaaboら、1986、EMBOJ5:1921~1927、pZipNeoSVセプコCepkoら、1984、Cell37:1053~1062、pSRαDNAX、パロアルト、カリフォルニア州、およびpBKCMV;ならびにp2Bacインビトロゲン社のようなバキュロウイルス発現ベクターオライリーOReillyら、1995、バキュロウイルス発現ベクターBaculovirusExpressionVectors、オックスフォード大学出版が含まれる。次に、組換え発現系において産生されたPRL変異体を、電気穿孔、クロマトグラフィーアフィニティクロマトグラフィーを含む、および限外濾過を含む、標準的な技術によって精製してもよい。52切断型プロラクチン受容体本発明は、細胞不含切断型プロラクチン受容体本明細書においてPRLBPと呼ばれるを提供し、これはPRLとの結合能を保持し、したがって、PRL結合に関してPRLRの細胞表面型と競合することができ、それによって、PRLの受容体との相互作用能を阻害することができる。PRLBPは、酵素的、または組換え型DNA技術のいずれかを用いて、PRLPの膜貫通および/または細胞内ドメインの全てまたは一部を除去することによって調製してもよい。本発明の特定の非制限的な態様において、切断されるPRLRはボウチンBoutinら、1989、MolEndocrinol3:1455~1461に記載の通りである。組換え型の調製に関して、本来のプロラクチン受容体をコードする核酸分子を調製してもよく、次にPRLBPをコードするように変化させてもよい。例えば、PRLRは下記の実施例9に述べる技術を用いてクローニングしてもよいが、これらに限定されない。多様な異なる生物からのPRLRのアミノ酸配列が既知である。ヒトPRLR配列はゲンバンク受入番号13032から得ることができる。さらに、PRLRの細胞外、膜貫通および細胞質ドメインを表すアミノ酸残基もまた既知である例えば、ケリーKellyら、1989、BiolReprod40:27~32を参照のこと。これらのドメインが解明されれば、当業者は、PRLとの結合能を保持するがPRLの作用を阻害するために用いてもよいPRLRの切断型を容易に産生することができると考えられる。当業者に周知であるDNA組換え法を、PRLBPコード配列および適当な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために用いることができる。発現効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含めることによって増強することができる。方法は、インビトロ組換え型DNA、合成技術およびインビボ組換え体を含んでもよい例えば、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる、サムブルックSambrookの分子クローニング、実験マニュアルMolecularCloningALaboratoryManual、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、およびグローバーGloverDM編、1985DNAのクローニング:実践アプローチDNACloning:APracticalApproarch、MRLプレス株、オックスフォード、イギリス、第I、II巻を参照のこと。組換えDNA技術を用いてPRLBPを産生する場合、例えば、溶解度または精製を容易にすることができる融合蛋白質を操作することが都合がよい可能性がある。そのような融合蛋白質は、所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列は、当技術分野で公知の方法によって適当なリーディングフレームにおいて互いにライゲーションすること、および当技術分野で一般的に公知の方法によって融合蛋白質を発現することによって作製することができる。そのような融合蛋白質に含まれるPRLBP遺伝子産物は、例えば、一つまたは複数の細胞外ドメインまたは部分、好ましくはリガンド結合部分を含むことができる。hPRLBP発現に関して一つの特定の実施例において、pcDNA31HisXpressインビトロゲン社、サンジエゴ、カリフォルニア州のような哺乳類の発現ベクターを用いてもよい。このベクターはヒト早初期サイトメガロウイルスプロモーターおよびbGHポリA付加シグナルを含む。さらに、これはインフレームHis6ペプチドをN末端に提供し、これによってhPRLBPの精製後に容易に検出することができる。そのようなベクターを用いて培養細胞において産生された組換え型hPRLBPは、下記の第7章に記載する技術を用いて限外濾過によって濃縮してもよい。限外濾過後のhPRLBPの濃度は、蛋白質アッセイ法によって決定して、抗His抗体サンタクルズ、カリフォルニア州を用いてウェスタンブロット解析によって確認してもよく、および密度測定法によって定量してもよいフェルナデスコプチックFernadezandKopchick、1990、AnalBiochem191:268~271。または、切断型PRLBPは、例えばペプチドシンセサイザーを用いて蛋白質合成技術によって作製してもよい。さらに、切断型PRLBPは、天然に存在する、または遺伝子操作したPRLR産生細胞のいずれかから完全長のPRLR蛋白質を精製して、その後トリプシンのような蛋白質分解酵素を用いて精製蛋白質を酵素的に分解してPRLBPを形成することによって調製してもよい。53PRLRアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ法本発明は、PRLR活性を調節する化合物または組成物を同定するために用いることができ、したがって細胞増殖の調節および異常な細胞増殖に関連した疾患の治療に有用となる可能性がある、細胞に基づくアッセイ系を提供する。本発明の細胞に基づくアッセイ系は、細胞のアポトーシスを調べるためにデザインされる。アッセイ系はPRLRアンタゴニストであるG129RがPRLRを発現する細胞においてアポトーシスを誘導することができるという知見に基づいている。本発明に従って、PRLRの活性を調節し、それによって細胞増殖を調節する化合物をスクリーニングするために、細胞に基づくアッセイ系を提供する。PRLR活性に影響を及ぼす可能性がある化合物には、PRLRに結合して、且つシグナル伝達を活性化するアゴニスト、または活性化を遮断するアンタゴニストのいずれかである化合物が含まれるがこれらに限定されない。本発明のアッセイ系は、PRLRと相互作用して、それによってその機能に影響を及ぼす化合物を同定するための迅速で信頼できる方法を提供する。プロラクチン受容体活性を調節することができる化合物を同定する方法は、aプロラクチン受容体を発現する細胞に化合物を接触させる段階;b細胞のアポトーシスのレベルを測定する段階;およびcbにおいて得られたアポトーシスのレベルを化合物の非存在下で得られたレベルと比較する段階を含み、bにおいて得られたレベルが化合物の非存在下で得られたレベルと異なる場合、プロラクチン受容体活性を調節することができる化合物が同定される方法である。アポトーシスのレベルが該アッセイ法において増加していれば、プロラクチン受容体のアンタゴニストが同定される。本発明のさらにもう一つの態様において、以下の段階を含むプロラクチン受容体の活性を誘導することができる化合物を同定する方法であって、プロラクチン受容体媒介アポトーシスを誘導する化合物の存在下において、アポトーシスのレベルが減少すれば、プロラクチン受容体の活性を活性化することができる化合物が同定される方法が提供される:aプロラクチン受容体媒介アポトーシスを誘導する化合物の存在下および非存在下で、プロラクチン受容体を発現する細胞に化合物を接触させる段階;bプロラクチン受容体媒介アポトーシスを誘導する化合物の存在下および非存在下で、細胞におけるアポトーシスのレベルを測定する段階;およびcbにおいて得られたアポトーシスのレベルを比較する段階。この目的のため、内因性にPRLRを発現する細胞を用いて受容体の活性を調節する化合物をスクリーニングすることができる。本発明の好ましい態様において、細胞は、例えば乳癌細胞または前立腺癌細胞のような形質転換細胞である。さらに、通常PRLRを発現していない細胞を、PRLR遺伝子を発現するように遺伝子操作することができ、そのような細胞をスクリーニング目的に用いてもよい。当業者は、トランスフェクションすることができ、且つPRLRのバックグラウンドレベルが低いか全くない任意の細胞株も許容可能であることを理解する。そのような細胞に基づくアッセイ系を利用する場合、PRLRを発現する細胞を試験化合物または溶媒対照例えば、プラセボに暴露する。PRLRアゴニストを同定するようにデザインされたアッセイ法において、G129RのようなPRLR媒介アポトーシスを誘導する化合物もまた、アッセイ法に加えられる。暴露後、細胞はアポトーシスのレベルを測定するためにアッセイすることができる。アポトーシスを測定するようにデザインされたアッセイ法には、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニック末端標識TUNELアッセイ法ケバースKebersら、1998、ExperimentalCellResearch240:197~205;活性化カスパーゼを検出するアッセイ法ジャニッケJanickeら、1998、JBiolChem273:9357~9360;ゲル電気泳動によって断片化DNAを検出するDNAラダーゲルアッセイ法ブルシュBurschら、1996、Carcinogenesis17:1595~1607;bcl2およびbax蛋白質レベルを検出するアッセイ法ビュエルツバーガーWuertzbergerら、1998、CancerReseach58:1876~1885;アポトーシス細胞における核濃縮を検出するためのヘキスト/DAPI染色ブルシュBurschら、1998、Carcinogenesis17:1595~1607;細胞質膜上のホスファチジルセリンのアネキシンV染色ファンエンゲランドvanEngelandら、1996、Cytometry24:131~139;ヨウ化プロピジウム染色後のフローサイトメトリーによるDNA含有量の分析シャーウッドSherwoodら、MethodsinCellBiology46:77~97;ならびに電子顕微鏡および位相差顕微鏡を用いた形態学的研究ブルシュBurschら、Carcinogenesis17:1595~1607が含まれる。試験化合物が、溶媒対照によって処置した細胞において認められるレベル以上にアポトーシスのレベルを誘発することができれば、その試験化合物はPRLRによって媒介されるシグナル伝達を阻害するアンタゴニストとして作用することを示している。対照的に、試験化合物が溶媒対照によって処置した細胞において認められたレベル以上に、G129Rのような化合物の存在下でアポトーシスのレベルを減少させることができれば、試験化合物がPRLRによって媒介されるシグナル伝達を誘導することが示される。高処理能スクリーニングは、考えられるPRLRアンタゴニストまたはアゴニストをそれぞれ含むマイクロタイタープレートのウェルに試験細胞を播種することによって行うことができる。ウェルはまた、完全な培地を含み、あるアゴニストがG129Rのような化合物であると同定される場合が含まれる。可能性があるアンタゴニストまたはアゴニストとのインキュベーション後、細胞を上記のような方法を用いてアポトーシスの有無をアッセイする。可能性があるアンタゴニストはPRLRを発現する細胞においてアポトーシスを誘導する化合物である。可能性があるアゴニストは、受容体結合に関してG129Rと競合して、それによってG129R誘導アポトーシスを阻害する化合物である。本発明に従ってスクリーニングしてもよい化合物には、無機化合物、ペプチド、抗体およびその断片、ならびにPRLRに結合してPRLRの活性を活性化するすなわちアゴニスト、またはPRLRの活性を阻害するすなわち、アンタゴニスト他の有機化合物例えば、ペプチド模倣体が含まれるが、これらに限定されない。化合物は例えば、ランダムペプチドライブラリのメンバーを含むがこれらに限定しない可溶性ペプチドのようなペプチド例えば、ラムLamら、1991、Nature354:82~84;ホーグテンHoughtenら、1991、Nature354:84~86を参照のこと、およびDおよび/またはL型アミノ酸からなる組合せ化学由来分子ライブラリ、ホスホペプチドランダムまたは部分的に縮重した定方向ホスホペプチドライブラリのメンバーを含むが、これらに限定しない;例えば、ソンギャングSongyangら、1993、Cell72:767~778を参照のことを含んでもよいが、これらに限定されない。ライブラリのスクリーニングは、一般的に公知の多様な方法のいずれによっても行うことができる。本発明の特定の態様において、PRLのペプチド変異体は、PRLRの活性の調節能に関してスクリーニングしてもよい。本明細書に記述したアッセイ法を通じて同定される化合物は例えば、異常な細胞増殖に関連した疾患を改善するために有用となる可能性がある。スクリーニングにおいて同定された化合物の有効性を調べるアッセイ法は、癌のような増殖性疾患の動物モデル系において調べることができる。54本発明の用途本発明は、それによってPRL変異体PRLアンタゴニストとして作用するまたはPRLRの切断型PRL結合に関して内因性受容体と競合するをPRLの作用を阻害するために、特にPRL媒介細胞増殖を阻害するために用いることのできる方法および組成物を提供する。本発明の方法は、プロラクチン変異体またはPRLRの切断型を、増殖しつつある細胞がプロラクチン受容体を発現する増殖性疾患を有する被験者に投与することを含む。特に特異的な非制限的態様において、本発明のPRL変異体または切断型PRLRPRLBPとも呼ばれるは、PRLPRLR利用率に応じて変化する作用を推論することができるように、異なるレベルのPRLRおよび/またはPRLを発現する細胞株のパネルにおけるPRL活性の拮抗能について調べてもよい。例えば、hPRL変異体または切断型hPRLRの活性を、以下の異なる5つのヒト乳癌細胞株の全てまたはサブセットにおいて調べてもよいATCCから得たT47D、MCF7、HTB19、HTB20、およびHTB123。これらの細胞株上のhPRL受容体数は:T47D25800個/細胞、MCF78300個/細胞、HTB196435個/細胞、HTB205480個/細胞、HTB1231094個/細胞、正常乳房細胞=1700個/細胞であると報告されている。したがって、これらの細胞株はヒト乳癌細胞上のhPRL受容体レベルのスペクトルを表す。ヒト乳癌細胞株を用いることは、種特異性によって引き起こされる可能性がある混乱confusing作用を回避するために、乳腺刺激ホルモン研究において広く用いられているラットNb2T細胞リンパ腫細胞株を用いるよりも好ましいことに留意されたい。PRL変異体または切断型PRLRの作用を決定するために用いることのできるアッセイ法には、i変異型PRLに関してアンタゴニストが受容体レベルで競合するか否かを調べるための、競合的受容体結合アッセイ法;ii推定のアンタゴニストがPRLによって誘発される細胞内シグナル伝達を阻害するか否かを調べるための、STAT5蛋白質の燐酸化の検出/定量;およびiii変異型PRLまたは切断型PRLRについて可能性がある阻害作用を調べる総合試験として用いられる細胞増殖アッセイ法、が含まれる。PRL、変異型PRL、または切断型PRLRの増殖または抗増殖作用を調べる1つの好ましい方法は、図6に概略を示し、下記の第8章に説明するような混合細胞培養アッセイ法である。本発明のPRL変異体またはPRLBPの投与によって利益が得られる可能性がある疾患には、PRLRを発現する細胞の良性および悪性増殖の双方が含まれる。そのような疾患には、乳房腺腫および繊維嚢胞症のような良性疾患、ならびに管型、硬性、髄様、コロイド型、および葉状の癌局所または転移性を含む乳癌のような悪性疾患を有する乳房の増殖性疾患;ならびに前立腺過形成および前立腺癌局所または転移性を含む前立腺の増殖性疾患が含まれるがこれらに限定されない。成長ホルモン受容体を発現する細胞を含む疾患を含む、PRLRと相同な受容体を発現する細胞を含む増殖性疾患もまた治療してもよい。下記の実施例11に記載するように、プロラクチン変異体はヒト乳癌細胞および前立腺癌細胞において細胞アポトーシスを誘導することができる。このように、本発明は、プロラクチン受容体を発現する細胞のみならず、プロラクチン受容体と相同な受容体を発現する細胞においてアポトーシスを誘導し、それによってそのような細胞の増殖を阻害する方法を提供する。本発明の1つの態様において、PRLR受容体の発現は、癌細胞集団のような、アポトーシスの標的とされる特異的細胞集団に向けることができる。PRLRを発現する核酸分子は、遺伝子療法プロトコールにおいて用いられる方法と同じ方法を用いて、標的細胞集団に移入することができる。標的細胞集団が表面上で発現されれば、プロラクチン変異体との接触を通じて受容体が活性化されて、標的細胞のアポトーシスを誘導することができる。増殖性疾患の治療において、PRL変異体またはPRLBPは、単独、または連続もしくは併用治療レジメンの一部として投与してもよい。非制限的な例として、治療すべき疾患が乳癌である場合、併用レジメンにおいて用いられるさらなる物質は、タモキシフェンのような抗エストロゲン剤および/または化学療法剤を含んでもよい。治療すべき疾患が前立腺癌である場合、併用レジメンにおいて用いられるさらなる物質は抗アンドロゲン剤および/または化学療法剤を含んでもよい。併用治療レジメンは、プロラクチン変異体を4OHタモキシフェンのような抗エストロゲン剤と併用して用いたところ、相乗的な阻害作用を示したという知見に基づいている。したがって、本発明は、前記の方法において用いるために適した薬学的担体中にPRL変異体またはPRLBPを含む組成物を提供する。そのような組成物は、局所適用、静脈内、動脈内、くも膜下、腹腔内、経口等を含む任意の適した技術によって投与することができる。本発明における用途に適した薬学的組成物には、その意図する目的を達成するために有効な量のPRL変異体またはPRLBPを含む組成物が含まれる。より詳しく述べると、有効量は、PRLRを発現する細胞の増殖を阻害して、それによって増殖性疾患に関連した症状を減少させるために必要なPRL変異体またはPRLBPの量を意味する。有効量の決定は、当業者が十分に行える範囲内である。本発明の化合物の有効濃度は、細胞培養系および/またはトランスジェニック動物において確立してもよい。有効量は異なる多様なアッセイ法を用いて決定できる。例えば、細胞増殖アッセイ法は、細胞増殖を阻害するために必要なPRL変異体またはPRLBPの濃度を定量するために実施してもよい。さらに、細胞アポトーシスを誘導するために必要なPRL変異体またはPRLBPの濃度を定量するアッセイ法を行ってもよい。腫瘍細胞増殖の阻害は、PRL変異体またはPRLBPによる腫瘍細胞増殖の阻害を検出するためにアッセイすることができる。そのような場合、PRL変異体またはPRLBPの有効量は、癌細胞の増殖を阻害し、且つ患者において腫瘍の増殖を阻害するために必要な量である。特定の場合、増殖性疾患を示す被験者に、プロラクチン変異体またはPRLBPをさらに別の1つまたは複数の物質と共に同時投与することが望ましいかも知れない。そのような物質には例えば、タモキシフェンのような抗エストロゲン剤、または抗アンドロゲン剤が含まれる。これらのさらに別の化合物の有効量の決定は、当業者が十分に行える範囲内である。組成物の量は、当然のこととして、治療すべき被験者、治療すべき増殖性障害、障害の症状の重症度および処方医師の判断に左右される。場合によっては、望ましくない副作用によって治療をより低用量へと調節するのみならず、臨床反応が適切でない場合には治療をより高いレベルに調節することが必要であるかも知れない。6.実施例:アンタゴニスト活性を有する変異型プロラクチンのデザインhPRLに関して現在利用できる結晶構造データはないため、ガルニエGarnierら1987、JMolBiol120:97~120が開発したコンピューターアルゴリズムプログラムを用いて、hPRLとhGHとの二次構造を解析して比較した。その結果、全体的なαヘリックス領域が非常に類似していることが示され、このことは、これらのホルモンが類似の全体的立体構造を共有することを示唆している。第三のαヘリックスにおけるアミノ酸配列をGHとPRLとで比較したところ、hPRLの129位グリシンがhGHの120位のグリシンに対応すること、そしてこれがGHPRLファミリーにおいて絶対的に保存されていることが明らかであるチェンChenら、1994、JBiolChem269:15892~15897。したがって、hPRL受容体特異的アンタゴニストを作製するために、hPRLにおけるグリシンのアルギニンへの置換変異体を調製した。7.実施例:G129Rプロラクチン変異体の調製71ヒトプロラクチン遺伝子のクローニングヒトPRLは逆転写酵素RTを用いてその後ポリメラーゼ連鎖反応PCRを行うことによって首尾よくクローニングされた。簡単に説明すると、ヒト下垂体ポリARNAクロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州を鋳型として用いた。hPRLcDNAの停止コドンTAAから2塩基先で始まるhPRLアンチセンスプライマー5GCTTAGCAGTTGTTGTTGTG3をデザインし、およびATGからセンスプライマー5ATGAACATCAAAGGAT3をデザインした。RTPCRはパーキンエルマーシータスインクノーウォーク、コネチカット州のキットを用いて実施した。得られたhPRLのヌクレオチド配列を、改変したT7DNAポリメラーゼシーケナーゼ、ユナイテッドステイツバイオケミカルを用いてジデオキシチェーンターミネーション法によって決定したところ、ゲンバンクに報告された配列と1つの塩基が異なることを除いては同一であり、その結果コドン21位でのサイレント突然変異CTG→CTCが生じていることが判明した。pUCIGMet発現ベクターの調製を含むクローニングプロセスの概略図を図1に要約する。72G129Rプロラクチン変異体の作製hPRLcDNAおよびM13F1複製起点を含む親プラスミド図1を大腸菌CJ236に形質転換した。ウリジンを含む一本鎖プラスミドDNAを、形質転換したCJ236細菌からヘルパーバクテリオファージM13k07を用いて単離した。G129R変異を指向する配列を含むオリゴヌクレオチド6pmolを、アニーリング緩衝液200mMトリス塩酸、20mMMgCl2、100mMNaClにおいて、70°Cで5分間加熱した後徐々に冷却することによって一本鎖DNA02pmolとアニーリングした。G129R変異をコードするオリゴヌクレオチド5CGGCTCCTAGAGaggATGGAGCT3を用いて、T4DNAポリメラーゼによって触媒される一本鎖DNAを鋳型として用いてDNAの相補鎖の合成をプライミングした。合成後、二本鎖DNAを用いて大腸菌DH5aを形質転換した。個々のクローンを単離して、DNAヌクレオチドシークエンシングによってhPRLG129Rに関してスクリーニングした。以降、G129RhPRL変異体をhPRLAと呼び、Aはそのアンタゴニスト活性を指す。73クローニングした蛋白質の発現hPRLおよびhPRLAコード核酸をそれぞれ、cDNAの転写がマウスメタロチオネインエンハンサー/プロモーター配列およびbGHポリA付加シグナルによって制御される哺乳類細胞発現ベクターに挿入したチェンChenら、1991、JBiolChem266:2252~2258;チェンChenら、1991、Endocrinol129:1402~1408;チェンChenら、1991、MolEndocrinol5:1845~1852;チェンChenら、1994、JBiolChem269:15892~15897。hPRLおよびhPRLAを産生する安定なマウスL細胞株を確立するために、マウスL細胞チミジンキナーゼTK陰性およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼAPRT陰性をインビトロ発現系として選択した。hPRL陽性対照として用いられるおよびhPRLA約5~10mgL24時間細胞100万個を発現する安定な細胞株を調製した。膜限外濾過を用いて、チェンChenら1994、JBiolChem269:15892~15897が記述した技術を用いて、hPRLおよびhPRLAを細胞培養馴化培地から部分的に精製すると共に濃縮した。分離は相対的分子サイズおよび膜の孔サイズに基づいている。限外濾過膜は、アミコンインクノートロウ、マサチューセッツ州から得た。2つのタイプの膜、すなわちYM10およびYM100を使用した。膜貫通圧20psiの下でアミコンYM100によって、攪拌した細胞200mlをまず、培養培地からの大きい不純物を除去するために用いた。透過物hPRLの回収率>90を、溶液の容積を減少させて、このように蛋白質を濃縮するためにYM10膜を使用する第二の濾過プロトコールに適用した。hPRLまたはhPRLAの濃度は、ディアグノスティックプロダクツコーポレーションロサンゼルス、カリフォルニア州のイムノラジオメトリックアッセイIRMAキットを用いて決定した。8.実施例:G129Rプロラクチン変異体の阻害活性81材料および方法放射性受容体結合アッセイ法ハーディングHardingら1996、JBiolChem271:6708~6712が記述したように、ラクトペルオキシダーゼ法を用いて、80~105μCiμgの比活性を有するNa125Iによって、精製hPRLを標識した。簡単に説明すると、10mCiのNa125IをhPRL1mgに加えた。次に、ラクトペルオキシダーゼ10μgを04molL酢酸緩衝液10μlに溶解する、pH56およびH2O2176mmolLを5μlを加えた。30分後、移入用緩衝液047molL蔗糖、006molLKI、002アジ化ナトリウム、pH76100μlを加えることによって反応を終了させた。次に、放射性標識hPRLをセファデックスG100クロマトグラフィーによって分離した。ヒト乳癌細胞を6ウェルプレートに播種した。無血清DMEM中で2~3時間プレインキュベートして、血清を枯渇させた後、細胞単層を、様々な濃度のhPRLまたはhPRLAの存在下で、125IhPRL50000cpmを含む無血清馴化培地に37°Cで2~3時間暴露した。室温で3時間インキュベートした後、細胞を燐酸緩衝生理食塩液PBSで2回洗浄して、その後1SDS01NNaOH1ml中で溶解した。次に、溶解物中のCPMを決定した。非特異的結合は、非特異的置換を制御するために、非標識hPRL5μgmlを通常のマウスL細胞馴化培地に加えることによって測定した。STAT5蛋白質のチロシン燐酸化のhPRL誘導のアッセイ法STAT蛋白質は、分子量が約92~95kDaの蛋白質のファミリーを表し、これはGHRまたはPRLR含有細胞をそれぞれGHまたはPRLで処置した場合にチロシン燐酸化されることが判明した。STAT5のチロシン燐酸化は受容体媒介事象であり、リガンド誘発シグナル伝達における重要な段階であると考えられているワカオWakaoら、1994、EMBOJ13:2182~2191;カザンスキーKazanskyら、1995、MolEndocrinol9:1598~1609;ワックスマンWaxmanら、1995、JBiolChem270:13262~13270。このアッセイ法は、野生型PRLによるSTAT5燐酸化誘導のhPRLおよびhPRLAの阻害能を評価するために用いた。簡単に説明すると、ヒト乳癌細胞を12ウェルプレートに播種した。無血清DMEMにおいて2~3時間プレインキュベーションした後、細胞を無血清DMEMにおいてhPRLおよびhPRLAの様々な濃度に暴露した。細胞を37°Cで15分間インキュベートして、PBSで1回洗浄し、溶解緩衝液50mMトリス塩酸、pH68、1SDS、1βメルカプトエタノール、01MDTT、5蔗糖、100μMオルトバナジン酸ナトリウム、および06ブロモフェノールブルー300μl中に溶解した。細胞溶解液30μlを4~125SDSPAGEに供して、ホースラディッシュペルオキシダーゼHRP結合抗ホスホチロシン抗体PY20およびECL試薬キットアマシャム社、イリノイ州を用いてイムノブロット分析を行った。次に、ブロットをX線フィルムに露出して標準的な方法を用いて現像したコダック社、ロチェスター、ニューヨーク州。このアッセイ法はチェンChenら1994、JBiolChem269:15892~15897;チェンChenら、1995、Endocrinol136:660~667;ワンWangら、1994、ProcNatlAcadSciUSA91:1391~1395;チェンChenら、1995、MolEndocrinol9:292~302;ハーディングHardingら、1996、JBiolChem271:6708~6712に記載されている。細胞増殖アッセイ法hPRLAを、組織培養において乳癌細胞増殖の阻害能に関して調べた。ヒト乳癌細胞株を、ATCCの推奨に従って対応する培養培地中で増殖させた。細胞を37°Cで5CO2を含む空気の湿潤大気中で維持した。アッセイ条件は、本質的にギンスバーグフォンデルアールGinsburgandVonderhaar1995、CancerRes55:2591~2595が記述した通りであった。個々の増殖実験に関して、細胞を12ウェル培養プレートに密度約2×104個ml、1mlウェルで播種した。次に、細胞を1日間接着させてT47D、MCF7、HTB19およびHTB20細胞、浮遊細胞であるHTB123細胞を除く、その後上層の培地を除去して、ITSインスリントランスフェリンセレニウムBSAリノレン酸培養添加剤;コラボレイティブリサーチ、ベッドフォード、マサチューセッツ州を含む培地によって無血清条件に変更した。hPRL単独またはhPRLAと併用したhPRLの様々な濃度を導入した。さらに3日間培養後、細胞を簡単にトリプシン処理してから回収して、細胞計数器において計数した。特定の実験に関しては、図6に概略を示す混合細胞培養アッセイ法を用いた。このアッセイ法において、乳癌細胞を、PRLまたはPRL変異体をコードし、それらの組換え型蛋白質を発現する核酸によってトランスフェクトした発現細胞と共に培養した。発現細胞の数を変化させることによって、混合培養細胞中に存在するPRLまたはPRL変異体の量は増加または減少した。図6に示すように、固定数の乳癌細胞T47Dを多穴細胞培養プレートのウェルに加えた。対照として用いる特定のウェルでは、発現細胞を加えなかった。次に、発現細胞hPRLLPRLまたはhPRLALPRLAのいずれかを発現するトランスフェクトしたL細胞の数を増加させて、乳癌細胞含有ウェルに加えて、混合培養物を作製した。同じ数の発現細胞を平行して培養し、対照として用いたT47D細胞を含まない。標準的な条件で一定期間培養した後、ウェル中に存在する細胞数を計数して、対応する対照培養中のL細胞数を差し引いた。次に、得られた数をT47D対照培養におけるT47D細胞数と比較して、乳癌細胞増殖に及ぼす組換え型産物の作用を評価することができる。82結果および考察放射性受容体結合アッセイ法の結果ヒト癌細胞のパネルに沿ってT47DおよびHTB123細胞を用いて実施したアッセイ法の結果を図2に示す。それらは、ヒト白血病細胞、リンパ腫細胞および網膜芽細胞腫細胞と比較したところ、調べた細胞の中でも2つの細胞株T47DおよびHTB123のhGH受容体特異的結合が最小であったことを示している。STAT5蛋白質の燐酸化hPRLおよびhPRLA、およびその併用がT47Dヒト乳癌細胞においてSTAT5蛋白質の燐酸化を誘導するか否かを調べる実験から、hPRLAがhPRLによって誘導されるシグナル伝達を遮断することができ図3、それによってPRLAのアンタゴニスト活性を証明することが示された。特に、図3は、hPRLによって誘導されたSTAT5蛋白質の燐酸化の誘導レーン2がhPRLAのみの存在下では認められなかったことレーン3、hPRLおよびhPRLAの等量が存在する場合レーン4には部分的に消失すること、そして過剰量のhPRLAが存在する場合には検出不可能であることレーン5を示している。細胞増殖アッセイ法T47D細胞をhGHまたはhPRLのいずれかに暴露した実験からの細胞増殖アッセイ結果を図4に示す。ベル型の用量反応曲線は、GHおよびPRLシグナル伝達の双方に類似の作用機序すなわち、1つのリガンドによって受容体が二量体を形成するが用いられていることを示唆している。リガンドの結合部位1の親和性は、結合部位2の親和性より明らかにはるかに高いために、高濃度のホルモンでは、全ての受容体が、高親和性部位を通じて単一のリガンドによって占有される自己拮抗現象。図5A~BはhPRLおよびhPRLAヒトプロラクチンのG129R変異体の作用図5Aを、エストロゲンおよびエストロゲンアンタゴニストであるタモキシフェンの作用図5Bと比較している。hPRLおよびエストロゲンはT47D細胞の増殖を増加させたが無処置対照培養物と比較して、hPRLAとタモキシフェンは同等の阻害作用を示した。図7および8は、hPRLまたはhPRLAヒトプロラクチンのG129R変異体を発現するトランスフェクトしたL細胞の数を変化させてy軸に示す、T47Dヒト乳癌細胞と共に24もしくは72時間図7、または1、2、3もしくは5日間図8培養した混合細胞培養アッセイ法の結果を示す。hPRLはT47Dの増殖を増加させたが無処置T47D細胞培養物と比較して、hPRLAは増殖を100まで阻害した。図9A~Bは、2つの異なるヒト乳癌細胞株T47DおよびMCF7それぞれ、図9Aおよび9Bに対する、混合細胞培養でのhPRLAの阻害作用を比較している。トランスフェクトされたL細胞によって発現されたhPRLAは、双方の細胞株に対して阻害作用を示したが、おそらくMCF7細胞と比較してT47D細胞上のプロラクチン受容体の数がより多いために、その作用はT47D細胞においてより大きかったシウShiuら、1979、CancerRes39:4381~4386;オーマンディOrmandyら、1997、JClinEndocrinolMetab82:3692~3699。9.実施例:プロラクチン受容体のクローニングhPRLBPcDNAを逆転写酵素RTの後にポリメラーゼ連鎖反応PCRを用いてクローニングした。推定の膜貫通ドメインから66塩基に位置するNcoI制限酵素切断部位でhPRLBPアンチセンスプライマーをデザインし、終止コドンを組み入れた5GCACTtcaGTATCCATGGTCTGGT3。翻訳開始コドンATGを含むセンスプライマーをデザインした5AGAAGGCAGCCAACatgAAG3。RTPCRは、パーキンエルマーシータスインクノーウォーク、コネチカット州のキットを用いて実施した。ヌクレオチド配列hPRLBPは、改変したT7DNAポリメラーゼシーケナーゼ、ユナイテッドステイツバイオケミカルを用いてジデオキシチェーンターミネーション法によって決定した。10.実施例:プロラクチンアンタゴニストの阻害作用およびタモキシフェンと併用した場合のその相乗作用以下の章は、プロラクチン変異体を抗エストロゲン剤と共に加えると、細胞増殖に相乗的な阻害作用を誘導することを示す細胞増殖アッセイ法に由来するデータを記述する。101材料および方法RTPCRRTPCR技術を用いてhPRLcDNAをクローニングした。ヒト下垂体mRNAはクロンテックラボラトリーズインクパロアルト、カリフォルニア州94303から購入した。RTPCRキットはパーキンエルマーインクノーウォーク、コネチカット州から購入した。hPRLcDNAの停止コドン小文字から2塩基のhPRLアンチセンスプライマーRT反応のためのをデザインし5GCttaGCAGTTGTTGTTGTG3、および翻訳開始コドンATGからセンスプライマーをデザインした5atgAACATCAAAGGAT3。RTPCR反応は製造元の推奨に従って実施した。次に、PCR産物を、インビトロゲンコーポレーションカールスバッド、カリフォルニア州の発現ベクターpcDNA31にクローニングした。hPRLcDNAの発現はヒト早初期サイトメガロウイルスCMVエンハンサー/プロモーター、ならびにウシGH遺伝子からのポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列によって制御した。このベクターは、ネオマイシン抵抗性哺乳類細胞の選択を可能にするネオマイシン遺伝子も含む図1B。HprlG129Rの合理的デザイン第三のαヘリックス領域における全ての既知のPRLのアミノ酸配列をGH配列と共に配置した。hPRLの129位のグリシンがPRLにおいて不変であり、hGHの120位に対応することは明らかであり、このことはその機能においておそらく重要な役割を有することを示唆している。したがって、本発明者らは、hPRLの129位のグリシンにおける単一のアミノ酸置換変異体hPRLG129Rを作製することを決定した。本発明者らは、hPRLR特異的アンタゴニストを産生することを期待して、hGHアンタゴニストの検出にこれまで首尾よく用いられてきたものと類似のアプローチを用いた図11。オリゴヌクレオチド定方向変異誘発PCR変異誘発プロトコールを用いて、hPRLG129RcDNAを作製した。所望の変異を含むオリゴヌクレオチド5CTTCTAGAGcgcATGGAGCTCATA3;および5CCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCC3はナショナルバイオサイエンスインクNationalBiosciencesIncプリマス、ミネソタ州により合成された。129位のアルギニンに対するコドンを小文字で示し、制限部位XbaIを下線で示す。PCR産物をXbaIによって消化して、先に記述したベクターに再びライゲーションした図1B。次に、変異をDNAヌクレオチドシークエンシングによって確認した。細胞株2つのヒト乳癌細胞株T47DおよびMCF7およびマウスL繊維芽細胞株をATCCから得た。いずれのヒト乳癌細胞株もエストロゲン受容体ER陽性でPRLR陽性の細胞株として特徴付けされているオーマンディOrmandyCJら、1997、JClinEndocrinolMetabo82:3692~99。細胞は、MCF7細胞およびL細胞に関してはダルベッコ改変イーグル培地DMEMにて、T47D細胞に関してはRPMI1640培地にて、デキストランコーティングしたチャコールで処理した10ウシ胎児血清DCCFCSを加えた後に単層培養物としてルーチン的に増殖させた。ヒト乳癌細胞の培地はフェノールレッドを加えずに用いたその可能性があるエストロゲン様活性を回避するため。培養細胞を37°Cで5CO2を含む湿潤大気中で維持して、週に2回継代した。hPRLおよびhPRLG129R蛋白質の発現および産生マウスL細胞トランスフェクションおよび安定な細胞の選択は、これまでに記載された方法に軽度の改変を加えて実施したゾウZhouYら、1996、Gene177:257~129;スンSunXZら、1997、JSteroidBiochemMolBiol63:29~36。簡単に説明すると、細胞を6ウェルプレートに播種して、培養が50コンフルエントになるまで培養した。トランスフェクションの当日に、細胞を無血清培地によって1回洗浄して、pcDNA3hPRLまたはpcDNA3hPRLG129R1μgおよびリポフェクタミン10μlギブコBRLを含む無血清培地1ml中で5時間培養した。増殖培地2mlをDNAリポフェクタミン溶液に加えて、インキュベーションを継続した。18~24時間のインキュベーション後、新鮮な増殖培地を用いてDNAリポフェクタミン混合物を含む培地と交換した。トランスフェクションの72時間後、細胞を1:10に希釈して、neo遺伝子発現に関して選択するために選択培地400μgmlG418に継代した。個々のコロニーを単離して増殖させた。個々の細胞株の発現レベルは、ディアグノスティックプロダクツインクロサンゼルス、カリフォルニア州のイムノラジオメトリーアッセイIRMAキットを用いて決定した。発現レベルが高い細胞株を増殖させた。hPRLおよびhPRLG129Rを含む馴化培地を以下のように調製した。安定な細胞を85~90コンフルエンシーでT150培養フラスコに播種した。次に、増殖培地を、1DCCFCSを含むRPMI1640培地50mlに交換して、1日おきに3回採取した。採取した培地をプールして、02μmフィルターユニットを通して濾過し、細胞片を除去して、使用するまで-20°Cで保存した。hPRLまたはhPRLG129Rの濃度はhPRLIRMAによって決定した。ウェスタンブロット分析プロトコールを用いてそれぞれのバッチ産物をさらに確認したフェルナンデクスFernandexEら、1990、AnalBiochem191:268~271。本発明者らは、このプロトコールを、インビトロ研究のためのhGHアンタゴニストを含むhGH類似体研究に用いたチェンChenWYら、1994、JBiolChem269:15892~15897。T47D細胞におけるSTAT蛋白質のチロシン燐酸化このアッセイ法は、モデル標的細胞としてT47D細胞を用いて、シグナル伝達に及ぼすhPRLおよびhPRLG129Rの作用を調べるためにデザインされている。簡単に説明すると、T47D細胞を12ウェルプレートに播種した。無血清培地での2~3時間のプレインキュベーションの後、細胞を無血清培地中で様々な濃度のhPRLもしくはhPRLG129R、またはhPRLとhPRLG129Rとの混合物に暴露した。細胞を37°Cで15分間インキュベートして、PBSで1回洗浄して、溶解緩衝液50mMトリス塩酸、pH68、1SDS、1βメルカプトエタノール、01MDTT、5蔗糖、100μMオルトバナジン酸ナトリウム、および06ブロモフェノールブルー200μl中に溶解した。次に、バイオラドプロテインIIシステムを用いて細胞溶解液30μlを4~125SDSPAGE解析した。電気泳動後、ゲルをハイボンドECLメンブレンアマシャム社、イリノイ州に100ボルトの一定電圧で2時間転写した。ブロットをすすぎ用緩衝液10mMトリス塩酸、pH75、75mMNaCl、01ツイーン20、1mMEDTA中に4BSAベーリンガーマンハイム、インジアナ州を含むブロッキング溶液中で2時間インキュベートして、その後すすぎ用緩衝液で2回15分間洗浄した。ブロットを、ホースラディッシュペルオキシダーゼHRP結合抗ホスホチロシン抗体PY20アマシャム社、イリノイ州をブロッキング溶液中に01μgmlの濃度で含む溶液と共に1時間インキュベートした。インキュベーション後、ブロットをすすぎ用緩衝液15分、それぞれ2回によって洗浄して、製造元アマシャム社、イリノイ州の提唱に従ってECL試薬キットを用いて展開した。次に、ブロットをX線フィルムに露出して、標準的な方法コダック社、ロチェスター、ニューヨーク州を用いて現像した。HPRLG129R馴化培地アッセイ条件はギンスバーグフォンデルアールGinsburgandVonderhaar1995、CancerRes55:2591~2595が記述した方法から改変した。T47D細胞をトリプシン処理して、1DCCFCSを含むRPMI1640培地中で96穴プレートに容量100μlウェルで加えた。それぞれの細胞株にとって最適な細胞数/ウェルは、滴定アッセイ後に予め決定した。T47D細胞に関しては、細胞15000個/ウェルを播種した。細胞を沈殿させて、一晩12~18時間接着させ、その後hPRL、hPRLG129R、E2、または4OHタモキシフェンのいずれかの様々な濃度を培養培地の総量100μlとして加えた。精製したhPRLNIHの国立ホルモン下垂体プログラムNationalHormonPituitaryProgramのパーロウParlow博士からの寄贈を、安定なL細胞から産生されたhPRLの陽性対照として用いた。細胞を、5CO2インキュベータ内で37°Cでさらに96時間インキュベートした。インキュベーション後、MTSPMS溶液セルタイター96アクエアスキット、プロメガコーポレーションを、製造元の指示に従ってそれぞれのウェルに加えた。バイオラドベンチマークマイクロプレートリーダーを用いて、プレートを490nmで読みとった。実験は3連で行い、それぞれの細胞株について3~6回繰り返した。102結果hPRLのクローニングおよび変異誘発RTPCR技術を用いてhPRLcDNAをヒト下垂体mRNAからクローニングした。対応するPCR産物のサイズは長さが663塩基対であり、これをpcDNA31発現ベクターにクローニングした。hPRLのヌクレオチド配列は、自動シークエンサーPEアプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州を用いてジデオキシチェーンターミネーション法によって決定した。hPRLcDNA配列は、1つの塩基の違いを除いてゲンバンクに報告された配列と同一であり、その結果コドン21位でのサイレント変異が起こるCTG→CTCことが判明した。HPRLG129RcDNAもまた、PCRによって産生して、シークエンシングした。hPRLおよびhPRLG129Rの発現マウスL細胞をhPRLまたはhPRLG129RcDNAのいずれかに安定にトランスフェクトさせて、neo抵抗性クローンを選択して増殖させた。馴化培地を採取してRIMAキットを用いて発現の有無を調べた。hPRLおよびhPRLG129Rを約~1mgL24時間細胞100万個の量で産生するhPRLおよびhPRLG129R安定なマウスL細胞株を作製した図12。hPRLG129RによるSTAT蛋白質のチロシン燐酸化の阻害STAT蛋白質は、分子量約92~95kDaの蛋白質のファミリーを表す。GHアンタゴニストの阻害作用は、STAT蛋白質のチロシン燐酸化の阻害レベルを測定することによってアッセイすることができるチェンChenら、1994、JBiolChem269:15892;ワンWangら、ProcNatlAcadSciUSA91:1391~1395;シルバSilva、1993、Endocrinology133:2307~2312。そのようなアッセイ法を用いて、GHアンタゴニストhGHG120Rは、STAT蛋白質燐酸化のGH誘導を用量依存的に阻害することが示された。T47Dヒト乳癌細胞に対してhPRLおよびhPRLG129Rを用いた結果から、hPRLG129RがSTAT蛋白質の燐酸化を刺激するために活性でないことが示された。しかし、hPRLG129RをhPRLと共に加えると、hPRLによって誘導されたシグナル伝達を用量依存的に遮断することができ図13、このことは、これがhPRLアンタゴニストとして機能していることを示唆している。hPRLG129Rは、hPRLによって誘導されるSTAT蛋白質の燐酸化を5:1の比で完全に阻害した。ヒト乳癌細胞増殖アッセイ法ヒトPRLおよびhPRLG129Rは、細胞培養において乳癌細胞増殖を刺激/阻害するか否かに関してさらに調べた。hPRL、hPRLG129R、E2、4OHタモキシフェンを加えた後の乳癌細胞増殖の光学顕微鏡検査を図14A~Eに示す。hPRL15B、hPRLG129R15CとE215D、4OHタモキシフェン15E処置細胞との間の細胞密度に有意な差が認められることは明らかである。同様に、hPRLG129R処置細胞の全体的な細胞状態は、光学顕微鏡検査の下で健康ではなかったことを指摘することは注目に値する。96ウェル細胞増殖アッセイ法の結果を図15~18に示す。hPRLはT47D増殖を用量依存的に刺激した。hPRLの最大刺激250ngmlは1回投与/4日間インキュベーションの後に基礎レベルを約20上回った。しかし、hPRLおよびE2を同時に適用すると、相乗作用が認められた。10nME2の存在下でhPRLの最大反応100ngmlは、hPRL単独と比較して3倍以上であった図15。一方、hPRLG129Rは、細胞増殖に対して用量依存的な阻害作用を示した図16A。hPRLG129R150ngmlの阻害作用は、アッセイ系において4OHタモキシフェンの最大500nM用量より強力であった図16B。4OHタモキシフェン500nMの1回処置の最大阻害は対照の約15であるが図16B、hPRLG129Rの1回処置による最大阻害は対照の25であった図16A。hPRLG129Rはまた、hPRL誘導細胞増殖を競合的に阻害することができた。hPRLG129Rは、1:1のモル比でhPRLの刺激作用を停止させることができ、2:1のモル比では、細胞増殖を阻害した図17。より重要なことは、hPRLG129Rを4OHタモキシフェンと共に適用すると、阻害作用はhPRLG129Rまたは4OHタモキシフェンの最大用量のいずれかと比較して倍加した図18。例えば、100nM4OHタモキシフェンは100ngmlのhPRLG129Rの存在下においても15阻害を生じ、阻害作用は対照の約32となった。同時培養実験安定なマウスL細胞株は、マウスL細胞が検出不可能なPRLRを有するという事実により、それらがhPRLまたはhPRLG129Rのいずれかを産生するか否かによらず、通常のL細胞と同様に類似の速度で増殖するチェンChen、1994、JBiolChem269:15892~15897。同時培養実験のセットアップにより、生物学的に活性なhPRLG129Rの持続的な存在が提供され、それによってこれらの腫瘍細胞における最大反応が得られた。LG129R細胞と共に培養後のヒト乳癌細胞株はいずれも、用量依存的な増殖阻害を示した図19A~B。反応は、馴化培地実験と比較してかなり劇的であった。細胞増殖の完全な阻害は双方の細胞株において得られた。MCF7細胞の反応パターンがT47D細胞のパターンと比較して右にシフトしたことは注目に値する、すなわちMCF7細胞では同じ阻害作用を誘発するためにより多くのhPRLG129Rを必要とした。これらの結果は、MCF7細胞上のhPRLRの総数がT47D細胞上に認められる数よりはるかに少ないという事実によって説明することができるオーマンディOrmandyら、GenesDev15:167~178;シーShih、1981、ホルモンと乳癌HormonesandBreastCancer、コールドスプリングハーバー研究所、パイク、シイテリ、およびウォルシュPikeSiiteriandWalsh編、185~194頁。11.実施例:ヒトプロラクチン受容体アンタゴニストG129Rは多数のヒト乳癌細胞株および前立腺癌細胞においてアポトーシスを誘導する111材料および方法細胞株ヒト乳癌細胞株MDAMB134、T47D、BT474、およびMCF7はATCCから得た。これらの乳癌細胞株はそのPRLRレベルに基づいて選択した。細胞株MDAMB134は最高のPRLRレベルを有し、これにPRLRレベルが減少する順にT47D、BT474、MCF7が続くオーマンディOrmandy、JClinicalEndocrinologyandMetabolism82:3692~3699。細胞培養ATCCから得たT47D細胞は、10FBSギブコBRLを加えたRPMI1640フェノールレッドを含まないにおいて増殖させた。BT474細胞は10FBSおよびATCC推奨添加剤を加えたRPMI1640培地フェノールレッドを含まないにおいて増殖させた。MCF7細胞を、10FBSを加えたDMEM培地フェノールレッドを含まないにおいて増殖させた。細胞は5CO2の存在下で湿潤大気中で37°Cで増殖させた。MDAMB134細胞は、20FBSを加えたLeibovitzL15培地中でCO2不含大気中で増殖させた。乳癌細胞をトリプシン処理002トリプシンEDTAして、10CSSチャコール通過血清加えたそれぞれの培地フェノールレッドを含まない中で1週間増殖させた。その後、細胞を再度トリプシン処理して、8室スライドシステムラブテックIIに1室あたり60~70のコンフルエンスで播種した。翌日、1CSSを加えたそれぞれの培地フェノールレッドを含まないを用いて乳癌細胞に処置を施した。MDAMB134VI細胞は、フェノールレッド含有培地であるが、他の乳癌細胞と同じ血清条件で増殖させた。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニック末端標識TUNELアッセイ法断片化DNAのニックをその3OH末端で標識する。酵素ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてフルオレセイン標識dUTPを3OH末端に取り込ませる。所定の処置期間の後、製造元の指示に従ってチャンバーを取り外し、TUNELアッセイ法アポトーシス検出システム、フルオレセインプロメガを製造元の指示通りに実施した。オリンパスIX70顕微鏡システムを用いて、スライドをFITCフィルターの下で調べた。112結果アポトーシスプログラムされた細胞死は、細胞の死を時間的および秩序的に調節する中心的な生理的メカニズムの1つであるステラーStellarH、1995、Science267:1445。アポトーシスの生化学的特徴は、ヌクレオソーム内部のDNA切断でありワイルーWyllu、1980、Nature284:555;ロイRoyら、1992、ExpCellRes200:416~424;ワイルーWyllu、1980、IntRevCytol68:251~306、これはTUNELアッセイ法または従来のゲル電気泳動によって検出することができるチェンChen、1996、JBiolChem61:9~17。癌は、少なくとも幾つかの生理学的刺激に反応してアポトーシスを受ける能力が減少した悪性疾患であるホフマンHoffmanら、1994、Oncogene9:1807。癌細胞をアポトーシスを引き起こすように誘導することができる薬物は、癌療法において有効となることが証明されると考えられる。本明細書に示したように、PRLRアンタゴニストであるG129Rは、多数のヒト乳癌細胞株においてDNA断片化によって検出されるアポトーシスを誘導することができる。図20A~Fは、G129Rが24時間の処置後に用量依存的にアポトーシスを誘導すること、およびアポトーシスが生理学的濃度50ngml、図20Cにおいても起こることを示している。G129RのPRLRに対する特異性を証明するために、hPRLNIHのパーロウ博士の寄贈およびG129Rを同時に用いて細胞を1:1および1:4の比で処理した図20G~H。G129RがhPRLと1:1の比で競合できること図20E、そしてG129Rによって誘導されたDNA断片化を4:1の比で競合的に逆転できることは明白である図20F。hPRLのマイトゲン救済作用はG129Rがアポトーシスを誘導するさらなる別の証明である。同じ結果がBT474細胞を用いて得られた。乳癌細胞におけるDNA断片化は、G129Rの50ngmlの濃度による2時間処理後でも明らかである図21A~D。これまでの研究において、4OHタモキシフェンが乳癌細胞の増殖をG129Rと共に相乗的に阻害することが示された。したがって、4OHタモキシフェンも同様にDNA断片化によるアポトーシスを乳癌細胞において誘導することを確認するために、4OHタモキシフェンを本試験に含めた。意外にも、4OHタモキシフェンは、4OHタモキシフェンが細胞増殖を阻害することができるという事実にも関わらず、同じプロトコールによってアッセイしたところ、T47D、MCF7、またはBT474細胞において、1μMもの高濃度でもアポトーシスを誘導しなかった図22A~H。4OHタモキシフェンとは対照的に、G129R250ngは、24時間の処置後に4つ全てのPRLR陽性乳癌細胞株において、アポトーシスDNA断片化を誘導した図23A~F。さらに、カスパーゼ3活性化に及ぼすhPRLG129Rの作用を、図24に示すように、T47D細胞においてアポップアラートCPP32カスパーゼ3アッセイキットクロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州を用いてアッセイした。T47D細胞は250ngmlのhPRLG129Rによって2時間処置した。アッセイ法はDEVDCHOカスパーゼ3阻害剤の存在下で実施して、hPRLG129Rによるカスパーゼ3誘導が特異的事象であることを証明した。上記のデータは、乳癌細胞がプロラクチンを主な増殖因子として利用するように順応し、PRLRに対するG129Rの競合的結合によってこれを枯渇させると、PRL増殖シグナルの遮断に至り、アポトーシスを起こすことを示している。このように、hPRLによって提供される持続的なマイトゲンシグナルが、乳癌細胞内に存在するアポトーシスシグナルを無効にして、遅延型アポトーシスプロセスを進行させる可能性がある。本明細書に示したデータは、プロラクチン受容体アンタゴニストであるG129Rが、タモキシフェンと共に内分泌療法において、またはそれ自身乳癌の治療に用いることができることを示している。さらに、2つの前立腺癌細胞は、TUNELアッセイ法を用いて検出すると、hPRLG129Rの250ngによる24時間の処理に反応してアポトーシスを起こした図25。試料は2本ずつ実施して、それぞれの試料は細胞約200万個で構成された。本発明は、本発明の個々の局面の単なる説明として解釈される、本明細書に記述した特異的な態様によって範囲を制限されるわけではなく、機能的に同等な方法および成分も本発明の範囲内である。実際に、本明細書に示して記述したものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかになると考えられる。そのような改変は本発明の範囲内に含まれると解釈される。様々な論文を本明細書に引用しているが、その内容はその全文が参照として本明細書に組み入れられる。