からなる群より選択される配列と少なくとも90の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、抗ウイルス活性を有するポリペプチド。からなる群より選択される配列と少なくとも95の配列同一性を有する配列を含む、請求項1記載のポリペプチド。抗肝炎活性を有する、請求項1記載のポリペプチド。抗B型肝炎活性を有する、請求項1記載のポリペプチド。抗C型肝炎活性を有する、請求項1記載のポリペプチド。ポリペプチドのN末端に共有結合したポリエチレングリコール部分をさらに含む、請求項1記載のポリペプチド。ポリエチレングリコール部分がmPEGプロピオンアルデヒドである、請求項6記載のポリペプチド。mPEGプロピオンアルデヒドが分子量約20kDまたは30kDを有する、請求項7記載のポリペプチド。mPEGプロピオンアルデヒドが直線状である、請求項7記載のポリペプチド。らなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。コードされるポリペプチドが、からなる群より選択される配列と少なくとも90の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。コードされるポリペプチドが、からなる群より選択される配列と少なくとも95の配列同一性を有する配列を含む、請求項11記載の単離ポリヌクレオチド。コードされるポリペプチドが抗B型肝炎活性を有する、請求項11記載の単離ポリヌクレオチド。コードされるポリペプチドが抗C型肝炎活性を有する、請求項11記載の単離ポリヌクレオチド50ホルムアミド、5×SSC1×SSC:015M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸ナトリウム、50mM燐酸ナトリウムpH76、5×デンハルト溶液、および2wvウシ血清アルブミン、10硫酸デキストラン、および20mgml変性剪断サケ精子DNAにおける約42°C~約70°Cのハイブリダイゼーション条件で、からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはその相補体とハイブリダイズすることができる単離ポリヌクレオチドであって、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。コードされるポリペプチドが抗B型肝炎活性を有する、請求項15記載の単離ポリヌクレオチド。コードされるポリペプチドが抗C型肝炎活性を有する、請求項15記載の単離ポリヌクレオチド。からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。以下の機能的に結合したエレメントを含む、発現ベクター:転写プロモーター;請求項1記載のポリペプチドをコードするDNAセグメント;および転写ターミネーター。請求項19記載の発現ベクターを導入されている培養細胞であって、DNAセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する細胞。以下を含むポリペプチドを作製する方法:DNAセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する、請求項19記載の発現ベクターが導入されている細胞を培養する段階;および発現されたポリペプチドを回収する段階。請求項1記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片。ポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、抗体断片、中和抗体、およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項22記載の抗体。抗体断片が、F、F、Fab、Fab、scFv、および最小認識単位からなる群より選択される、請求項22記載の抗体断片。請求項22記載の抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を含む、抗イディオタイプ抗体。からなる群より選択されるアミノ酸残基の配列を含むポリペプチドと、ポリアルキルオキシド部分とを含む融合タンパク質。ポリアルキルオキシド部分がポリエチレングリコールである、請求項26記載の融合タンパク質。ポリエチレングリコールがポリペプチドのN末端またはC末端に結合している、請求項27記載の融合タンパク質。ポリエチレングリコールがmPEGプロピオンアルデヒドである、請求項27記載の融合タンパク質。ポリエチレングリコールが分岐または直線状である、請求項27記載の融合タンパク質。ポリエチレングリコールの分子量が約20kDまたは30kDである、請求項27記載の融合タンパク質。第一の部分が、からなる群より選択されるポリペプチドを含み、ならびに第二の部分がポリエチレングリコールを含む、共有結合によって結合された第一の部分と第二の部分とを含む融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。からなる群より選択される単離ポリペプチド;ならびに薬学的に許容される媒体、を含む製剤。請求項33記載の製剤を含むキット。実施例実施例1哺乳類の発現プラスミドzcyto20およびzcyto21を含む発現プラスミドを相同的組換えによって構築した。zcyto20およびzcyto21cDNAの断片を、PCR増幅を用いて作製した。PCRのプライマーは以下の通りであった:zcyto20pZMP21:zc40923およびzc43152、それぞれ配列番号:42および43、ならびにzcyto21pZMP21:zc40922およびzc43153、それぞれ配列番号:2および73。PCR反応混合物を1アガロースゲルにおいて泳動して、インサートの大きさに対応するバンドを、QIAquick商標ゲル抽出キットQiagenValenciaCAを用いてゲル抽出した。BglIIによって切断したプラスミドpZMP21を、PCRインサート断片との組換えのために用いた。プラスミドpZMP21は、MPSVプロモーター、およびコード配列を挿入するための多数の制限部位を有する発現カセット;大腸菌複製開始点;SV40プロモーター、エンハンサーおよび複製開始点、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーター、を含む哺乳類選択マーカー発現単位;ならびに出芽酵母における選択および複製にとって必要なURA3およびCENARS配列を含む哺乳類発現ベクターである。これは、pRS316AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVA201102209に寄託、寄託番号77145から採取した酵母遺伝子エレメント、ポリオウイルスからのリボソーム内部認識配列IRESエレメント、および膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメインと共に、pZP9AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVA201102209に寄託、寄託番号98668から構築された。コンピテント酵母出芽酵母細胞100μlを、インサートDNA10μlおよび上記の切断されたpZMP21ベクター100ngと独立して混合して、混合物を02cm電気穿孔キュベットに移した。酵母DNA混合物を、075kV5kVcm、∞オームおよび25μFの電力供給BioRadLaboratoriesHerculesCA設定を用いてエレクトロパルスした。12Mソルビトール600μlをキュベットに加えて、酵母を100μlおよび300μlの少量でURADプレート2枚に播種して30°Cでインキュベートした。約72時間後、プレート1枚からのUra酵母形質転換体をH2O1mlに浮遊させて、軽く遠心して酵母細胞を沈降させた。細胞沈降物を溶解緩衝液2TritonX100、1SDS、100mMNaCl、10mMTris、pH80、1mMEDTA05mlに浮遊させた。溶解混合物500μlを、酸洗浄ガラスビーズ250μlおよびフェノールクロロホルム300μlを含むエッペンドルフチューブに加えて、3分間攪拌し、エッペンドルフ遠心機において最高速度で5分間遠心した。水相300μlを新しいチューブに移して、DNAをエタノールEtOH600μlおよび3M酢酸ナトリウム30μlによって沈殿させた後、最高速度で30分間遠心した。DNA沈降物をTE30μlに浮遊させた。エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞MC1061の形質転換は、酵母DNA沈殿物5μlおよび細胞50μlを用いて行った。細胞を20kV、25μF、および400オームでエレクトロパルスした。電気穿孔後、SOC2Bacto商標トリプトンDifcoDetroitMI、05酵母抽出物Difco、10mMNaCl、25mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4、20mMグルコース1mlを加えて、細胞50μlおよび200μlの少量をLBAMPプレートLBブロスLennox、18Bacto商標アガーDifco、100mglアンピシリン2枚に播種した。各構築物に関して、三つのクローンのインサートに配列分析を行って、各構築物につき正確な配列を含むクローン1個を選択した。大規模プラスミドDNAは、市販のキットQIAGENプラスミドメガキット、QiagenValenciaCAを用いて製造元の説明書に従って単離した。正しい構築物をzcyto20/pZMP21およびzcyto21/pZMP21と命名した。実施例2CHO細胞における哺乳類構築物の発現zcyto20pZMP21およびzcyto21pZMP21構築物200μgをPvuI200単位によって37°Cで3時間消化した後、IPAによって沈殿させて、15mL微量遠心管において遠心した。沈降物から上清をデカントして除き、70エタノール1mLによって洗浄して、室温で5分間インキュベートした。試験管を微量遠心機において14000RPMで10分間遠心して、沈降物から上清を吸引した。沈降物を滅菌環境においてPFCHO培地750μlに浮遊させて、60°Cで30分間インキュベートした。CHO細胞を遠心して、DNA培地溶液を用いて浮遊させた。DNA細胞混合物を04cmギャップキュベットに入れて、以下のパラメータを用いて電気穿孔した:950μF、高い静電容量、および300V。キュベットの内容物を取り出してPFCHO培地によって25mlに希釈して、125mL振とうフラスコに入れた。フラスコを37°C、6CO2のインキュベータに入れて、シェーカー上で120RPMで振とうさせた。実施例3zcyto20CHOタンパク質の精製および分析A.zcyto20CHOタンパク質の精製組換え型zcyto20IL28Aタンパク質をDXB11CHO細胞株のプールから産生した。培養物を回収して、02μmフィルターを用いて培地を濾過滅菌した。zcyto20CHOタンパク質の精製は、PorosHS50カラムAppliedBiosystemsFraminghamMA、MonolithicWCXカラムIscoIncLincolnNE、ToyoPearlブチル650SカラムTosoHMontgomeryvillePA、およびSuperdex75カラムAmershamBiosciencesPiscatawayNJを連続的に用いて行った。DXB111CHOからの培養培地をpH60に調節してからPoros50HSカラムにローディングした。カラムを50mMMES2モルフォリノエタンスルホン酸、100mMNaCl、pH6によって洗浄して、結合したタンパク質を、50mMMES、2MNaCl、pH6の60までの10カラム容積CVの直線勾配によって溶出した。溶出分画を回収してzcyto20タンパク質の有無をクーマシー染色を用いるSDSPAGEによって確認した。zcyto20タンパク質を含むこの分画をプールして、2回蒸留水によって伝導率が約20mSとなるまで希釈して、MonolithicWCXカラムにローディングした。カラムを9350mMMES、100mMNaCl、pH6、および750mMMES、2MNaCl、pH6によって洗浄した。結合タンパク質を、50mMMES、2MNaCl、pH6の7~50の25CV直線勾配によって溶出した。溶出分画を回収して、zcyto20タンパク質の有無をクーマシー染色を用いるSDSPAGEによって確認した。zcyto20タンパク質を含む分画をプールして1M硫酸アンモニウムとなるように調節してToyoPearlブチル650Sカラムにローディングした。Zcyto20は、硫酸アンモニウムの減少勾配によって溶出して、純粋なzcyto20を含む分画をプールして、Superdex75カラムに注入するために濃縮した。ゲル濾過カラムからzcyto20タンパク質を含む分画をプールして濃縮し、02μmフィルターによって濾過滅菌して80°Cで凍結した。最終精製タンパク質の濃度をBCAアッセイPierceChemicalCoRockfordILおよびHPLCアミノ酸分析によって決定した。B.zcyto20CHOタンパク質のSDSPAGEおよびウェスタンブロット分析組換え型zcyto20タンパク質をSDSPAGENupage4~12BisTrisInvitrogenCarlsbadCA、およびzcyto20CHOタンパク質と交叉反応するウサギ抗zcyto21CEEBVIgGを一次抗体として用いるウェスタンブロットによって分析した。InvitrogenのXcellIIミニセルCarlsbadCAを用いてゲルを電気泳動して、InvitrogenのXcellIIブロットモジュールを用いて機器マニュアルに提供された指示に従って、02μmニトロセルロースメンブレンBioRadLaboratoriesHerculesCAに転写した。転写は、25mMトリス塩基、200mMグリシン、および20メタノールを含む緩衝液において500mAで50分間行った。メンブレンを10脱脂粉乳の1×PBS溶液において10分間ブロッキングした後、25脱脂粉乳を含む1×PBS溶液において一次抗体によってプロービングした。ブロットを振とうさせながら室温で1時間標識した。二次抗体標識の場合、ブロットをPBSによって各10分間3回洗浄した後、ヤギ抗ウサギIgGHRPPierceChemicalCoRockfordILによって1時間プロービングした。ブロットを1×PBSによって各10分間3回洗浄した後、SuperSignal登録商標ULTRA試薬PierceChemicalCoRockfordILの1:1混合物を用いて発色させ、LumiImagerBoehringerMannheimGmbHGermanyを用いてシグナルを捕獲した。C.蛋白質精製および分析の要約CHO培地から精製したzcyto20タンパク質は、非還元条件で4~12ビストリスゲルにおいて、約20kDaで主にダブレットとして、および約38kDaで軽微なトリプレット二量体として移動した。それらは全て、還元条件では単一の20kDaバンドに崩壊した。MSペプチドマッピングにより、ジスルフィド結合に関して二つの異性体の混合物、およびO結合グリコシル化部位の存在が示された。実施例4zcyto21CHOタンパク質の精製および分析A.Zcyto21CHOタンパク質の精製組換え型zcyto21は、安定なDXB11CHO細胞株から産生した。培養物を回収して、02μmフィルターを用いて培地を濾過滅菌した。陽イオンおよび陰イオン交換カラムの組み合わせから始めて、その後に疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを行うことによって、タンパク質を条件培地から精製した。DXB111CHOカラム培地をpH60に調節した後、Poros50HSカラムAppliedBiosystemsFraminghamMAにローディングした。カラムを1×PBS、pH6によって洗浄して、結合したタンパク質を5×PBSpH84によって溶出した。溶出分画を回収して、zcyto21タンパク質の有無をクーマシー染色を用いるSDSPAGEによって確認した。この分画を伝導率13mSとなるように希釈してそのpHを84に調節し、Poros50HQカラムAppliedBiosystemsFraminghamMAに通過させた。zcyto21タンパク質を含む流出分画を、硫酸アンモニウムを用いて約127mSに調節して、ToyoPearlフェニル650SカラムTosoHMontgomeryvillePAにローディングした。Zcyto21タンパク質を硫酸アンモニウム濃度の減少勾配によって溶出して、純粋なzcyto21を含む分画をプールして、Superdex75カラムAmershamBiosciencesPiscatawayNJに注入するために濃縮した。最終精製タンパク質の濃度はBCAアッセイPierceChemicalCoRockfordILおよびHPLCアミノ酸分析によって決定した。B.Zcyto21CHOタンパク質のSDSPAGEおよびウェスタンブロット分析組換え型zcyto21タンパク質をSDSPAGENupage4~12BisTrisInvitrogenCarlsbadCAおよびウサギ抗zcyto21CEEBVIgGを一次抗体として用いるウェスタンブロットによって分析した。InvitrogenのXcellIIミニセルCarlsbadCAを用いてゲルを電気泳動して、InvitrogenのXcellIIブロットモジュールを用いて機器マニュアルに提供された指示に従って、02μmニトロセルロースメンブレンBioRadLaboratoriesHerculesCAに転写した。転写は、25mMトリス塩基、200mMグリシン、および20メタノールを含む緩衝液において500mAで50分間行った。メンブレンを10脱脂粉乳の1×PBS溶液において10分間ブロッキングした後、25脱脂粉乳を含む1×PBS溶液において一次抗体によってプロービングした。ブロットを振とうさせながら室温で1時間標識した。二次抗体標識に関して、ブロットをPBSによって各10分間3回洗浄した後、ヤギ抗ウサギIgGHRPPierceChemicalCoRockfordILによって1時間プロービングした。ブロットを1×PBSによって各10分間3回洗浄した後、SuperSignal登録商標ULTRA試薬PierceChemicalCoRockfordILの1:1混合物を用いて発色させ、LumiImagerBoehringerMannheimGmbHGermanyを用いてシグナルを捕獲した。C.蛋白質精製および分析の要約CHO培地から精製されたzcyto21タンパク質は、還元および非還元条件の双方において4~12ビストリスゲルにおいて二つまたはそれ以上の約28kDaのバンドとして移動した。MSペプチドマッピングにより、ジスルフィド結合に関して二つの異性体の混合物、一つのN結合グリコシル化部位、およびいくつかのO結合グリコシル化部位が存在することが示された。実施例5IL29型の同定IL29の精製プールからのピーク分画を、ジスルフィド再配列を制限するために、段階的な等級のトリプシンRocheAppliedScienceIndianapolisINによって、約pH63の燐酸緩衝液において37°Cで一晩消化した。各消化物を、四重極子時間飛行型ハイブリッド質量分析器MicromassMilfordMAにインライン接続した逆相HPLCAgilentPaloAltoCAによって分析した。スペクトルを回収して質量から質量に対する電荷比に変換して、IL29のトリプシン消化の結果生じた全ての理論的ペプチドおよびジスルフィド結合ペプチドの組み合わせを比較した。適当な質量をIL29におけるジスルフィド結合ペプチドに割付して、スペクトルを還元の前後で比較することによって、ジスルフィドを割付けした。分画20からの材料は、ジスルフィドパターンC15C112およびC49C145を示し、C171はSグルタチオニルシステインとして認められた全て、配列番号:4を参照して。分画51からの材料はジスルフィドパターンC49C145およびC112C171を示し、C15はSグルタチオニルシステインとして認められた配列番号:4を参照して。実施例6大腸菌発現プラスミド発現ベクター、pTAP237の構築プラスミドpTAP237は、相同的組換えによってPCR生成リンカーをpTAP186のSmaI部位に挿入することによって作製された。プラスミドpTAP186は、プラスミドpRS316出芽酵母シャトルベクターならびに、pKK2233に由来してtacプロモーターおよびrrnBターミネーターを含む大腸菌発現プラスミドであるpMALc2に由来した。プラスミドpTAP186はカナマイシン耐性遺伝子を含み、この遺伝子ではSmaI部位が破壊され、酵母ARSCEN6およびURA3配列に隣接してNotIおよびSfiI部位を有し、NotIによる消化によるプラスミドからの切り出しを促進する。PCR産生リンカーは、pTAP186における発現カプラー配列を合成RBSII配列に置換した。これは、配列番号:44および45にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドzc29740およびzc29741のそれぞれ100pmolから、ならびに配列番号:46および47にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドzc29736およびzc29738のそれぞれ約5pmolから調製された。これらのオリゴヌクレオチドを、94°Cで30秒間、50°Cで30秒間、および72°Cで30秒間を10サイクルの後に4°Cでの洗浄を行うPCRによって混合した。得られたPCR産物を100エタノールの2倍量による沈殿によって濃縮した。沈殿物を水10μlに浮遊させてSmaIによって消化したレシピエントベクターpTAP186への組換えのために用いて、合成RBSII配列を含む構築物を産生した。PCRによって生じたリンカー約1μgおよびSmaIによって消化したpTAP186100ngを共に混合して、コンピテント酵母細胞出芽酵母に形質転換した。酵母をURADプレートに播種して室温で約72時間放置した。次に、プレート1枚からのUra形質転換体をH2O1mLに浮遊させて、手短に遠心して酵母細胞を沈降させた。細胞沈降物を溶解緩衝液05mLに浮遊させた。DNAを回収して大腸菌MC1061に形質転換した。クローンを、配列番号:44および45においてそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドzc29740およびzc29741の各20pmolを用いて、先に開示したようにコロニーPCRによって上記のようにスクリーニングした。アガロースゲル上で正しい大きさのバンドを示すクローンに配列分析を行った。正しいプラスミドをpTAP237と命名した。実施例7IL29システイン変異体のコドン最適化A.IL29野生型発現構築物のコドン最適化作製天然のヒトIL29遺伝子配列は大腸菌株W3110において十分に確立されていなかった。IL29コード配列において用いられるコドンを調べたところ、これが、CAI値が0206に等しい、大腸菌において最も用いられていないコドンの過剰量を含むことが示された。CAIは、類義のコドンバイアスの統計学的測定値であり、タンパク質産生レベルを予測するために用いることができるSharpら、NucleicAcidsRes15:1281~951987。高度に発現されたタンパク質をコードする遺伝子は高いCAI値>06を有する傾向があるが、低いCAI値≦02を有する遺伝子によってコードされるタンパク質は一般的に発現が不十分である。このことは、大腸菌におけるIL29の産生が少ない理由を示唆した。さらに、まれなコドンはメッセージの次の半分に集合しており、それによって翻訳の停止、翻訳の未成熟終了、およびアミノ酸の誤取り込みの確率がより高くなるKaneJFCurrOpinBiotechnol6:494~5001995。その遺伝子がまれなコドンを含むタンパク質の発現レベルは、特定のまれなtRNAレベルを宿主において増加させると劇的に改善できることが示されているZdanovskyら、AppliedEnviromentalMicrob66:3166~31732000;Youら、Biotechniques27:950~9541999。pRAREプラスミドは大腸菌においてほとんど用いられないいくつかのコドンargU、argW、leuW、proL、ileX、およびglyTのtRNAをコードする遺伝子を有する。遺伝子は、その本来のプロモーターの制御下であるNovy、同書。pRAREの同時発現は大腸菌におけるIL29の産生を増強して約200mgLを産生した。これらのデータは、IL29をコードする遺伝子をより適当なコドン使用によって再再合成することは、大量のIL29を発現させるための改善されたベクターを提供することを示唆している。コドン最適化IL29コード配列は、重なり合う16個のオリゴヌクレオチドから構築された:zc44566配列番号:48、zc44565配列番号:49、zc44564配列番号:50、zc44563配列番号:51、zc44562配列番号:52、zc44561配列番号:53、zc44560配列番号:54、zc44559配列番号:55、zc44558配列番号:56、zc44557配列番号:57。これらの重なり合うオリゴヌクレオチドのプライマー伸長後にPCR増幅を行うと、コドンが大腸菌における発現に関して最適にされた完全長のIL29遺伝子が産生された。最終的なPCR産物を、酵母の相同的組換えによって発現ベクターpTAP237に挿入した。発現構築物を酵母から抽出して、コンピテント大腸菌MC1061に形質転換した。カナマイシンに対して耐性であるクローンをコロニーPCRによって同定した。陽性クローンをシークエンシングによって確認して、その後産生宿主株W3110に形質転換した。最適なIL29配列を有する発現ベクターをpSDH184と命名した。得られた遺伝子は大腸菌において非常に良好に発現され、新しい構築物による発現レベルは約250mgLまで増加した。B.コドン最適化zcyto21C172Sシステイン変異体発現構築物の作製zcyto21C172Sシステイン変異体を作製するために用いられる戦略は、QuickChange部位特異的変異誘発キットStratageneに基づく。製造元の提案に基づいて、C172S変異を導入するようにプライマーを設計した。これらのプライマーをZG44340配列番号:58、ZG44341配列番号:59と命名した。PCRを行ってQuickChange変異誘発の説明書に従ってzcyto21C172Sシステイン変異体を作製した。同一の50μlの反応物5個を作製した。pSDH175酵母ベクター骨格配列を欠失するDNA25μlを反応あたりの鋳型として用いた。以下の量の試薬を用いてPCRカクテルを作製した:10×PCR緩衝液30μl、ZG44340125ng2742μl、ZG44341125ng918μl、dNTP6μl、PfuTurboポリメラーゼStratageneLaJollaCA6μl、および水2064μl。カクテル475μlを各反応に用いた。PCR条件は以下の通りであった:95°Cで30秒を1サイクルの後に95°Cで30秒、55°Cで1分、68°Cで7分を16サイクルの後に、68°Cで7分を1サイクル行い、4°Cに維持して終了する。PCR反応5本を全て試験管1本にまとめた。製造元の説明書に従って、DpnI制限酵素5μlをPCR反応に加えて、37°Cで2時間インキュベートした。103モル濃度酢酸ナトリウムおよび2倍量の100エタノールを加えることによってDNAを沈殿させた。沈殿は20°Cで20分間行った。DNAを14000rpmで5分間遠心して、沈降物をspeedvacによって乾燥した。DNA沈降物を水20μlに浮遊させた。PCRによって得られたDNAを大腸菌株DH10Bに形質転換した。DNA5μlをElectroMAXDH10B細胞Invitrogen40μlと混合した。細胞およびDNA混合物を、175kV、100Ωおよび25μFに設定したBioRadGenePulserII商標を用いて01cmキュベットBioRadにおいて電気穿孔した。電気穿孔した細胞を37°Cで1時間増殖させた。混合物をLB25μgmlカナマイシンプレートにおいて播種して37°Cで一晩インキュベートした。クローン10個をzcyto21C172Sインサートの有無に関してスクリーニングした。QIAprep商標SpinMiniprepキットQiagenValenciaCAを用いて、10個全てのクローンからDNAを単離して、XbaIおよびPstI制限酵素によって切断することによってインサートの有無を分析した。クローン9個がインサートを含み、zcyto21C172S変異が導入されていることを確認するためにシークエンシングした。クローンの配列を確認した後、pSDH188を標識した。実施例8大腸菌IL29発現構築物野生型配列を含むIL29のDNA断片を、PCRを用いて単離した。ベクター隣接配列の41塩基対bpおよびIL29のアミノ末端に対応する24bpを含むプライマーzc41212配列番号:60、およびzcyto21インサートを含むベクターの3末端に対応する38bpを含むプライマーzc41041配列番号:61を反応において用いた。PCR条件は以下の通りであった:94°Cで30秒、50°Cで30秒、および72°Cで1分を25サイクルの後に4°Cのすすぎ。PCR試料の少量2~4μLを、分析のために1×TBE緩衝液によって1アガロースゲルにおいて泳動し、予想される約500bpの断片のバンドを認めた。100μL反応物の残りの容積を無水エタノール200μLによって沈殿させた。沈降物を水10μLに浮遊させて、これを、SmaIによって切断したレシピエントベクターpTAP238に組換えするために用いて、先に開示したようにzcyto21をコードする構築物を産生した。正確な配列を有するクローンをpTAP377と命名した。クローンpTAP377をNot1Nco1DNA10μl、緩衝液3NewEnglandBiolabs5μL、Not12μL、Nco12μL、水31μLで37°Cで1時間によって消化して、T4DNAリガーゼ緩衝液予め消化物7μl、5×緩衝液2μL、T4DNAリガーゼ1μLによって再ライゲーションした。この段階は酵母の配列であるCENARSを除去して、ベクターを簡素化する。pTAP337DNAをPvu2およびPst1によって特徴的に消化して、酵母配列が存在しないことを確認した。PtaP377DNAを、まれな大腸菌tRNA遺伝子の他のコピーを有する宿主株である大腸菌株W3110pRAREに形質転換した。実施例9大腸菌IL28A発現構築物zcyto20の野生型配列配列番号:1に示すようにを含むDNA断片を、PCRを用いて単離した。ベクター隣接配列の41塩基対bpおよびzcyto20のアミノ末端に対応する24bpを含むプライマーzc43431配列番号:62、およびzcyto20インサートを含むベクターの3末端に対応する38bpを含むプライマーzc43437配列番号:63を反応において用いた。PCR条件は以下の通りであった:94°Cで30秒、50°Cで30秒、および72°Cで1分を25サイクルの後に4°Cのすすぎ。PCR試料の少量2~4μLを、分析のために1×TBE緩衝液によって1アガロースゲルにおいて泳動し、予想される約500bpの断片のバンドを認めた。100μL反応物の残りの容積を無水エタノール200μLによって沈殿させた。沈殿物を水10μLに浮遊させて、これをSmaIによって切断したレシピエントベクターpTAP238に組換えするために用い、先に開示したようにzcyto20をコードする構築物を産生した。正確な配列を有するクローンをpYEL7と命名した。これをNot1Nco1DNA10μL、緩衝液3NewEnglandBiolabs5μL、Not12μL、Nco12μL、水31μLで37°Cで1時間によって消化して、T4DNAリガーゼ緩衝液予め消化物7μl、5×緩衝液2μl、T4DNAリガーゼ1μLによって再ライゲーションした。この段階は酵母の配列であるCENARSを除去して、ベクターを簡素化する。除去されたpYEL7DNAをPvu2およびPst1によって特徴的に消化して、酵母配列が存在しないことを確認した。pYEL7DNAを、大腸菌株W3110pRAREに形質転換した。実施例10zcyto21C172Sシステイン変異体発現構築物zcyto21C172Sシステイン変異体配列番号:28を産生するために用いる戦略は、QuickChange登録商標部位特異的変異誘発キットStratageneLaJollaCAに基づく。製造元の提案に基づいて、C172S変異を導入するようにプライマーを設計した。これらのプライマーをそれぞれ、ZG44327およびZG44328それぞれ、配列番号:64および65と命名した。PCRを行って、QuickChange変異誘発の説明書に従ってzcyto21C172Sシステイン変異体を作製した。同一の50μl反応物5個を作製した。pTAP377酵母ベクター骨格配列を欠失DNA25μlを反応の鋳型として用いた。以下の量の試薬を用いてPCRカクテルを作製した:10×PCR緩衝液30μl、ZG44327配列番号:64125ng2742μl、ZG44328配列番号:65125ng918μl、dNTP6μl、PfuTurboポリメラーゼStratagene6μl、および水2064μl。カクテル475μlを各反応に関して用いた。PCR条件は以下の通りであった:95°Cで30秒を1サイクルの後に95°Cで30秒、55°Cで1分、68°Cで7分を16サイクルの後に、68°Cで7分を1サイクル行い、4°Cに維持して終了する。PCR反応5個を試験管1本にまとめた。製造元の説明書に従って、DpnI制限酵素5μlをPCR反応に加えて、37°Cで2時間インキュベートした。103モル濃度酢酸ナトリウムおよび2倍量の100エタノールAaperAlcoholShelbyvilleKYを加えることによってDNAを沈殿させた。沈殿は20°Cで20分間行った。DNAを14000rpmで5分間遠心して、沈降物をspeedvacによって乾燥した。DNA沈降物を水20μlに浮遊させた。PCRによって得られたDNAを大腸菌株DH10Bに形質転換した。DNA5μlをElectroMAXDH10B細胞InvitrogenCarlsbadCA40μlと混合した。細胞およびDNA混合物を、175kV、100Ωおよび25μFに設定したBioRadGenePulserII商標を用いて01cmキュベットBioRadにおいて電気穿孔した。電気穿孔した細胞を37°Cで1時間増殖させた。混合物をLB25μgmlカナマイシンプレートに播種して37°Cで一晩インキュベートした。クローン10個をIL29インサートの有無に関してスクリーニングした。DNAを、QIAprep商標SpinMiniprepキットQiagenを用いて10個全てのクローンから単離して、XbaIRocheおよびPstINewEnglandBiolabs制限酵素によって切断することによってインサートの有無を分析した。クローン9個がインサートを含み、zcyto21C172S変異が導入されていることを確認するためにシークエンシングした。クローンisolet6の配列を確認した後、pSDH171を標識した。zcyto21C15S変異体を作製するために類似の戦略を実行することができる。実施例11zcyto20C49Sシステイン変異体発現構築物zcyto20C49Sシステイン変異体コード配列は、オーバーラップPCR配列番号:20によって作製した。野生型IL28A配列配列番号:1の最初の187塩基を、鋳型としてpYEL7配列番号:67、ならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc43431配列番号:62およびzc45399配列番号:66を用いるPCR増幅によって作製した。塩基105~531からの第二のDNA断片を、鋳型としてpYEL7配列番号:67、ならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc45398配列番号:68およびzc43437配列番号:63を用いるPCR増幅によって作製した。プライマーzc45399配列番号:66およびzc45398配列番号:68は、システイン49をセリンに変化させた特異的改変配列を含んだ。これらの二つのPCR産物を合わせて、オリゴヌクレオチドプライマーzc43431配列番号:62およびzc43437配列番号:63を用いてPCRオーバーラップ増幅した。最終的なPCR産物を酵母の相同的組換えによって発現ベクターpTAP238に挿入したRaymondら、BiotechniquesJan26:134~8140~11999。発現構築物を酵母から抽出して、コンピテント大腸菌DH10Bに形質転換した。カナマイシン耐性クローンをコロニーPCRによってスクリーニングした。陽性クローンをシークエンシングによって確認した後、産生宿主株W3110pRAREに形質転換した。zcyto20C49Sシステイン変異体コード配列を有する発現構築物をpCAHN9と命名した。実施例12zcyto20C51Sシステイン変異体発現構築物zcyto20C51Sシステイン変異体コード配列は、オーバーラップPCR配列番号:24によって作製した。野生型IL28A配列の最初の193塩基を、鋳型としてpYEL7配列番号:67、ならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc43431配列番号:62およびzc45397配列番号:63を用いるPCR増幅によって作製した。塩基111~531からの第二のDNA断片を、鋳型としてpYEL7配列番号:67、ならびにオリゴヌクレオチドプライマーzc45396配列番号:70およびzc43437配列番号:63を用いるPCR増幅によって作製した。プライマーzc45397配列番号:69およびzc45396配列番号:70は、システイン51をセリンに変化させた特異的改変配列を含んだ。これらの二つのPCR産物を合わせて、オリゴヌクレオチドプライマーzc43431配列番号:62およびzc43437配列番号:63を用いてPCRオーバーラップ増幅した。最終的なPCR産物を、酵母の相同的組換えによって、本発明者らの施設内発現ベクターpTAP238に挿入したRaymondら、上記。発現構築物を酵母から抽出して、コンピテント大腸菌DH10Bに形質転換した。カナマイシン耐性クローンをコロニーPCRによってスクリーニングした。陽性クローンをシークエンシングによって確認した後、産生宿主株W3110pRAREに形質転換した。zcyto20C50Sシステイン変異体コード配列を有する発現構築物をpCAHN10と命名した。実施例13大腸菌におけるIL28A、IL29、およびCysからSerシステイン変異体の発現異なる実験において、実施例6~9に記載の発現ベクターのそれぞれによって形質転換した大腸菌を、001Antifoam289SigmaAldrichStLouisMO、30μgmlカナマイシン、35μgmLクロラムフェニコールを含むSuperbrothII培地BectonDickinsonSanDiegoCA100mLに接種して、37°Cで一晩培養した。接種物5mlを2L培養フラスコにおいて同じ培地500mLに加えて、これをOD600が4に達するまで250rpmで37°Cで振とうさせた。IPTGを最終濃度1mMで加えて、さらに25時間振とうを持続した。細胞を4000×gで4°Cで10分間遠心した。細胞沈降物を後に使用するまで80°Cで凍結した。実施例14IL28の再生と精製A.封入体の調製ヒト野生型IL29を、上記のように封入体として大腸菌株W3110において発現させた。フェドバッチ発酵物からの細胞沈降物を50mMトリス、pH73に浮遊させた。浮遊液をAPVGaulinホモジナイザーInvensysAPVTonawandaNewYorkに8000psiで3回通過させた。不溶性材料を15000gで30分間の遠心によって回収した。沈降物を50mMトリス、1vvTritonX100、pH73、および4M尿素によって連続的に洗浄した。次に、封入体を50mMトリス、6M塩酸グアニジン、5mMDTTにおいて室温で1時間分散させた。次に、材料を15000gで1時間遠心した。この段階からの上清は減少した不溶性IL29を含んだ。B.再生可溶化IL29を50mMトリス、pH8、075Mアルギニン、005PEG3350、2mMMgCl2、2mMCaCl2、04mMKCl、10mMNaCl、4mM還元グルタチオン、08mM酸化グルタチオンにおいて室温で攪拌しながら徐々に希釈した。再生緩衝液におけるIL29の最終濃度は01mgmlであった。再生混合物を室温で一晩放置した。濃酢酸を用いて浮遊液のpHを5に調節した。次に、浮遊液を02μmの濾紙に通過させた。再生混合物のRPHPLC分析は二つの顕著なピークを示した。C.精製再生混合物をpH5の50mMNaOAcによってインライン希釈して1:2、PharmaciaSPSepharoseFastFlow陽イオン交換カラムNorthPeapackNJにローディングした。カラムを50mMNaOAc、400mMNaCl、pH5の3カラム容積によって洗浄した。結合したIL29を50mMNaOAc、14MNaClによって溶出させた。固体2SO4を、2SO4の最終濃度が05Mとなるように陽イオン交換段階の溶出プールに加えた。材料をToyoPearlフェニル650SHICカラムTosohBiosepMontgomeryPAにローディングした。次に、カラムを50mMNaOAc、1M2SO4、pH5の3カラム容積によって洗浄した。50mMNaOAc、1M2SO4、pH5から50mMNaOAc、pH5の直線勾配の10カラム容積を用いて、結合したzcyto21を溶出させた。溶出液の分画を回収した。この段階において二つの顕著なピークを認めた。溶出分画のRPHPLC分析を行った。最終的に緩衝液をPBS、pH73に交換すると、二つのジスルフィド結合異性体に対応する二つの産物が産生された。実施例15IL29システイン変異体の再生および精製実施例3に記述するように、IL29の精製は二つのジスルフィド結合異性体を産生した。HICFPLC段階を用いて二つの型を分離した。分子は基線部では分離しなかった。実質的に純粋な異性体>95を得るためには、強いピークシェービングPeakShavingを用いなければならなかった。この段階およびプロセス全体の伸長による収量は悪化した。最終的な収量はC15C112型およびC112C171型に関してそれぞれ、8および9であった。CHOおよびバキュロウイルスBV系において産生された野生型IL29も、類似の現象を示した。異性体のC15C112型は、I型INFに対するジスルフィド結合パターンが相同であることが確立された。C15C112型はまた、ISREアッセイにおいてC112C171より30倍高い生物活性を示した下記を参照されたい。zcyto21Cys172Serミューテインの再生および精製zcyto21C172Sポリペプチド配列番号:29の封入体調製、再生、および精製は、IL29野生型配列番号:4と本質的に同じである。ミューテインの再生混合物のRPHPLC分析は、野生型IL29のC15C112型に対応する唯一の顕著なピークを示した。その後のHICクロマトグラフィーでは、単一のピークのみが示された。したがって、強いピークシェービングを用いることは不要であった。プロセス全体の最終収量は50に近い。zcyto21Cys172Serポリペプチド配列番号:29は、実施例16に示したISREアッセイにおいて野生型IL29のC15C112型と同等の生物活性を示した。実施例16抗ウイルス活性:HeLaおよびL929細胞における細胞変性作用抗ウイルス活性に関する最初の機能的アッセイは、一過性にトランスフェクトしたヒト胎児腎HEK細胞からの条件培地を用いて行った。この条件培地の産生は以下のように記述される。ヒトまたはマウスIL28A、IL28B、またはIL29の完全長のcDNAを、標準的な技法を用いてpzp7Zベクターにクローニングした。ヒトまたはマウスIL28A、IL28B、またはIL29構築物を293HEK細胞にトランスフェクトした。簡単に説明すると、各構築物に関して細胞700000個ウェル6ウェルプレートを、DMEM10ウシ胎児血清2mlにおいてトランスフェクションの約18時間前に播種した。ウェルあたりヒトまたはマウスIL28A、IL28B、またはIL29DNA15μg、およびpIRES2EGFPDNAClontech05μgを、DMEMの全量100μlでFugene6試薬RocheBiochemicals6μlに加えた。pIRES2EGFPDNA2μgの単独を陰性対照として用いた。これらのトランスフェクション混合物を、予め播種した293細胞に30分後に加えた。24時間後、細胞培地を除去してDMEM01ウシ胎児血清を加えた。条件培地を48時間後に回収して、045ミクロンフィルターを通して濾過して、抗ウイルスおよびレポーターアッセイに用いた。抗ウイルスアッセイは、ヒト子宮頚癌細胞HeLaおよびマウス線維芽細胞L929を用いて行った。1日目に、96ウェル平底マイクロタイタープレートにおいて、ヒトまたはマウスIL28A、IL28B、またはIL29を含む条件培地を希釈して細胞50000個を播種した。37°Cで24時間インキュベーション後、培地を除去して、感染多重度01の脳心筋炎ウイルスを含む培地に交換した。細胞を再度37°Cで24時間インキュベートした。培養ウェルを、細胞変性効果の有無に関して4点尺度において肉眼的に採点して、次にこれを表7に示すようにCPEに変換した。GFP単独および精製ヒトインターフェロンa2a、またはマウスインターフェロンαをトランスフェクトした条件培地を対照として含めた。表7細胞変性効果の決定表8は、ヒトまたはマウスIL28A、IL28B、またはIL29を含む条件培地がHeLa細胞においてウイルス感染CPEを用量依存的に阻害したが、対照GFP条件培地は細胞変性作用の出現を有意に阻害することができなかったことを示している。表9に示すように、ヒトまたはマウスIL28A、IL28B、またはIL29を含む条件培地は、L929細胞におけるウイルス感染を阻害しなかった。双方の実験において、精製インターフェロンは陽性の抗ウイルス活性を示した。表8条件培地CMを用いたHeLa細胞におけるヒトまたはマウスIL28A、IL28B、またはIL29の細胞変性効果表9条件培地CMを用いたL929細胞におけるヒトまたはマウスIL28A、IL28B、またはIL29の細胞変性効果実施例17インターフェロン反応経路によるシグナル伝達1型インターフェロンとその特異的受容体との相互作用によって、その抗ウイルス/抗増殖活性に関与する多くの遺伝子が誘導された。これらには、25オリゴアデニレートシンテターゼ25OAS、二本鎖RNA依存的PkrキナーゼPkr、ホスホリピッドスクランブラーゼ、および細胞内接着分子1ICAM1が含まれる。56kDaインターフェロン刺激遺伝子産物ISG56kのようなまだ未知の機能を有する遺伝子の誘導も同様に起こる。これらの遺伝子の一部または全てがIL28Aによる細胞の処置によって誘導されるか否かを決定するために、ヒトDaudiBリンパ様細胞を、IL28Aを発現するバキュロウイルスを感染させたSf9からの条件培地によって72時間処置した。野生型バキュロウイルスを感染させたSf9細胞からの条件培地を陰性対照として用いた。処置後、細胞を回収して総RNAを単離するために溶解した。逆転写酵素を用いて総RNA1μgをcDNAに変換して、これを、上記のようにヒトインターフェロン刺激遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。ヒトグリセロール3ホスフェートデヒドロゲナーゼG3PDHのオリゴヌクレオチドプライマーを非インターフェロン刺激遺伝子対照として用いた。結果は、IL28Aによる細胞の処置後に、ISG56k、Pkr、25OAS、および燐脂質スクランブラーゼが明らかに誘導されることを示している。ICAM1または他のインターフェロン刺激遺伝子対照、G3PDHに関しては誘導を認めなかった。実施例18シグナル伝達レポーターアッセイシグナル伝達レポーターアッセイを用いて、ヒトおよびマウスIL28およびIL29とIL28受容体との機能的相互作用を決定することができる。ヒト胎児腎HEK細胞に、クラスIIサイトカイン受容体ヒトDIRS1、IFNαR1、IFNαR2、およびIL28受容体を含むのcDNAを含むpZP7発現ベクターの存在下または非存在下で、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を促進するインターフェロン刺激反応エレメントISREを含むレポータープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をクラスIIリガンドIL28A配列番号:2、IL29配列番号:4、IL28B配列番号:6、zcyto10、huIL10およびhuIFNa2aを含むによって刺激した後のルシフェラーゼ活性は、細胞表面上のトランスフェクトしたおよび無処置のサイトカイン受容体とリガンドとの相互作用を反映している。結果および方法を以下に記述する。細胞のトランスフェクション293HEK細胞を以下のようにトランスフェクトした:293細胞700000個ウェル6ウェルプレートを、DMEM10ウシ胎児血清2mlにおいてトランスフェクトの約18時間前に播種した。1ウェルあたり、pISREルシフェラーゼDNAStratagene1μg、サイトカイン受容体DNA1μg、およびpIRES2EGFPDNAClontech1μgを、DMEMの全量100μlでFugene6試薬RocheBiochemicals9μlに加えた。サイトカイン受容体を含めない場合には、pIRES2EGFPDNA2μgを用いた。このトランスフェクション混合物を、予め播種した293細胞に30分後に加えた。24時間後、トランスフェクトした細胞を、トリプシンEDTAを用いてプレートから採取して、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて細胞約25000個ウェルで再度播種した。リガンド刺激の約18時間前に、培地をDMEM05FBSに交換した。シグナル伝達レポーターアッセイシグナル伝達レポーターアッセイは、以下のように実施した:DMEM05FBSにおいて37°Cで18時間インキュベートした後、トランスフェクト細胞を以下のクラスIIリガンド:IL28A、IL29、IL28B、zcyto10、huIL10およびhuIFNa2aの希釈液DMEM05FBSによって刺激した。37°Cで4時間インキュベートした後、細胞を溶解して、ルシフェラーゼ基質の添加後にルミノメーターによって相対光単位RLUを測定した。得られた結果を培地単独対照に対する実験試料のRLUの誘導倍率実験試料のRLU/培地単独のRLU=誘導倍率として示す。表10は、IL28A、IL29、およびIL28BがISREルシフェラーゼをトランスフェクトした293細胞において、培地単独と比較してルシフェラーゼ活性の15~17倍のISREシグナル伝達を誘導することを示している。内因性のCRF24配列番号:71を用いてIL28受容体αサブユニットDNA配列番号:11をトランスフェクション混合物に添加すると、IL28A、IL29、およびIL28BによるISREシグナル伝達のさらに6~8倍の誘導が起こり、最終的な誘導は104~125倍となる。他のトランスフェクトしたクラスIIサイトカイン受容体DNAはいずれもISREシグナル伝達の増加を生じなかった。これらの結果は、IL28A、IL29、およびIL28BがIL28サイトカイン受容体と機能的に相互作用することを示している。表10はまた、huIFN2aがISREルシフェラーゼトランスフェクト293細胞においてISREシグナル伝達を誘導することができ、培地単独と比較してルシフェラーゼ活性の205倍誘導を生じることを示している。しかし、IL28受容体DNAをトランスフェクションに加えてもISREシグナル伝達ISREルシフェラーゼDNA単独と比較しては11倍増加であり、IL28受容体の過剰発現がIL28A、IL29、およびIL28Bシグナル伝達に対して正の作用を及ぼすのに対し、IL28受容体の過剰発現はインターフェロンのシグナル伝達に負の作用を及ぼすことを示唆している。表10クラスIIサイトカイン刺激後のトランスフェクト293細胞のインターフェロン刺激反応エレメントISREのシグナル伝達誘導倍率実施例19IL29システイン変異体によるシグナル伝達アッセイ細胞のトランスフェクションヒトIL28受容体を安定に過剰発現する293HEK細胞を産生するために、293細胞を以下のようにトランスフェクトした:293細胞300000個ウェル6ウェルプレートを、DMEM10ウシ胎児血清2mlにおいて、トランスフェクションの約6時間前に播種した。1ウェルあたり、ヒトIL28受容体αサブユニット配列番号:11のcDNAを含むpZP7発現ベクター2μgを、DMEMの全量100μlでFugene6試薬RocheBiochemicals6μlに加えた。このトランスフェクション混合物を、予め播種した293細胞に30分後に加えた。48時間後、トランスフェクト細胞を2μgmlピューロマイシン選択下に置いた。ピューロマイシン耐性細胞を細胞集団として維持した。ヒトIL28受容体を過剰発現する293HEK細胞を以下のようにトランスフェクトした:293細胞700000個6ウェルプレートを、DMEM10ウシ胎児血清2mlにおいて、トランスフェクションの約18時間前に播種した。1ウェルあたり、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を促進するインターフェロン刺激反応エレメントISREを含むKZ1571μgを、DMEMの全量100μlでFugene6試薬RocheBiochemicals3μlに加えた。このトランスフェクション混合物を、予め播種した293HEK細胞に30分後に加えた。48時間後、トランスフェクト細胞を、トリプシンEDTAを用いてプレートから回収して500μgmlG418GeneticinLifeTechnologiesにおいて再度播種した。ピューロマイシンおよびG418耐性細胞を細胞集団として維持した。シグナル伝達レポーターアッセイシグナル伝達レポーターアッセイは以下のように実施した:ヒトIL28受容体を過剰発現してKZ157を含む293HEK細胞をトリプシンEDTAによって処置して、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて細胞約25000個ウェルで再度播種した。リガンド刺激の約18時間前に、培地をDMEM05FBSに交換した。DMEM05FBSにおいて37°Cで18時間インキュベートした後、トランスフェクトした細胞を、異なるシステイン結合パターンを含む異なる型の大腸菌由来zcyto21の希釈液DMEM05FBSにおいてによって刺激した。37°Cで4時間インキュベートした後、細胞を溶解して、ルシフェラーゼ基質を添加した後ルミノメーターにおいて相対光単位RLUを測定した。得られた結果を、培地単独対照に対する実験試料のRLUの誘導倍率実験試料のRLU/培地単独のRLU=誘導倍率として示す。表11は、全て配列番号:15を参照して、野生型大腸菌由来IL29のC1C3型C16C113が、野生型C3C5型C113C172または野生型C1C3およびC3C5型C16C113、C113C172の混合物よりISREシグナル伝達をより良好に誘導できることを示している。表12は、野生型大腸菌由来IL29のC1C3C16C113、およびシステイン変異体C172S大腸菌由来IL29配列番号:29のC1C3C16C113;配列番号:15が、ヒトIL28受容体を過剰発現する293HEK細胞においてISREシグナル伝達を等しく誘導できることを示している。表11大腸菌由来IL29の異なる型によるISREシグナル伝達誘導倍率表12大腸菌由来IL29の異なる型によるISREシグナル伝達誘導倍率実施例20ポリICおよびウイルス感染によるIL28A、IL29、IL28Bの誘導新鮮に単離されたヒト末梢血単核細胞を、ポリイノシン酸ポリシチジル酸、01のMOIをもつ脳心筋炎ウイルスの存在下において、または培地のみにおいて、増殖させた。15時間のインキュベーション後、全RNAを細胞から単離し、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼで処理した。100ng全RNAを、製造会社により提案されているように、PlatinumTaqキットおよび遺伝子特異的プライマーを含むSuperscriptOneStepRTPCRを用いる1段階RTPCRのための鋳型として用いた。ヒトIL28A、IL28BおよびIL29、IFNαならびにIFNβのRNAの低量から検出不可能な量が、未処理の細胞に見られた。対照的に、IL28A、IL29、IL28BのRNAの量は、ポリIC処理およびウイルス感染の両方により増加し、I型インターフェロンについても見られた。これらの実験は、I型インターフェロンのようなIL28A、IL29、IL28Bは、二本鎖RNAまたはウイルス感染により誘導されうる。実施例21HepG2細胞におけるIFNαと比較したIL28、IL29シグナル伝達活性A細胞トランスフェクションHepG2細胞を、以下のようにトランスフェクションした:700000HepG2細胞ウェルを2ミリリットルDMEM10ウシ胎児血清に、トランスフェクションのおよそ18時間前に蒔いた。ウェルにつき、1マイクログラムpISREルシフェラーゼDNAおよび1マイクログラムpIRES2EGFPDNAを6マイクロリットルFugene6試薬に加え、合計100マイクロリットルDMEMにした。このトランスフェクション混合物を、あらかじめ蒔かれたHepG2細胞へ30分後、加えた。24時間後、トランスフェクションされた細胞をトリプシンEDTAを用いてプレートから取り出し、96ウェルマイクロタイタープレートに、およそ25000細胞ウェルで再び蒔いた。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM05FBSに交換した。Bシグナル伝達レポーターアッセイシグナル伝達レポーターアッセイを以下のように行った:37°C、DMEM05FBSでの18時間のインキュベーション後、トランスフェクションされた細胞を、100ngmlIL28A、IL29、IL28B、zcyto24、zcyto25およびhuIFNα2aリガンドで刺激した。37°C、4時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後、照度計で相対光ユニットを測定した。得られた結果は、培地のみの対照に対する実験試料のRLUの倍誘導として示されている。表13は、IL28A、IL29、IL28B、zcyto24およびzcyto25が、ISREルシフェラーゼでトランスフェクションされたヒトHepG2肝臓細胞においてISREシグナル伝達を誘導することを示している。表13HepG2細胞におけるサイトカイン依存性ISREシグナル伝達の倍誘導実施例22HepG2細胞におけるIFNαと比較したIL29抗ウイルス活性抗ウイルス活性法をヒト細胞でのEMCVに適応させた。細胞をサイトカインと共に蒔き、01~1の感染多重度におけるEMCVによる曝露の前に24時間、インキュベートした。細胞を、感染の24時間後、色素取り込みバイオアッセイで生存度について分析した。標的細胞にMTTを与え、37°Cで2時間、インキュベートした。可溶化剤溶液を添加し、37°Cで一晩、インキュベートし、570nmにおける光学濃度を測定した。OD570は、抗ウイルス活性に正比例する。結果は、IL29およびIFNがHepG2細胞で試験された場合の抗ウイルス活性を示している:IL29、IFNβおよびIFNα2aをEMCV感染および色素取り込みアッセイの前に様々な濃度でHepG2へ加えられた。3連のウェルからのOD570の平均および標準偏差をプロットする。OD570は、抗ウイルス活性に正比例する。IL29について、EC50は、060ngmlであった;IFNα2aについて、EC50は、057ngmlであった;およびIFNβについて、EC50は、046ngmlであった。実施例23肝臓およびリンパ球分画におけるIL28RAmRNA発現IL28RAについてのmRNA分布をさらに調べるために、半定量的RTPCRをSDS7900HTシステムを用いて行った。1段階RTPCRを、各試料について100ng全RNAおよび遺伝子特異的プライマーを用いて行った。標準曲線をBjabRNAを用いて各プライマーセットについて作成し、すべての標本値をHPRTに対して標準化した。標準化された結果は、表14~17に要約されている。IFNAR2およびCRF24についての標準化された値もまた示されている。表14B細胞およびT細胞は、有意なレベルのIL28RAmRNAを発現する。低レベルは、樹状細胞およびたいていの単球に見られた。表14に示されているように、正常肝臓組織および肝臓由来細胞株は、実質的なレベルのIL28RAおよびCRF24のmRNAを示す。表15表15に示されているように、主要な気道上皮細胞は、豊富なレベルのIL28RAおよびCRF24を含む。表16表16に示されているように、IL28RAは、正常および罹患肝臓検体に存在し、C型肝炎およびB型肝炎に感染した検体由来の組織に発現が増加している。表17表18~22に示されているように、IL28RAは、正常B細胞、Bリンパ腫細胞株、T細胞、Tリンパ腫細胞株、正常および形質転換されたリンパ球ならびに正常なヒト単球において検出できる。表18表19表20表21表22実施例24マウスIL28はダウディ細胞増殖に影響を及ぼさないヒトダウディ細胞を50000細胞ミリリットルでRPMI10FBSに懸濁し、5000細胞を96ウェルプレートのウェルごとに蒔いた。IL29CEE、IFNγまたはIFNα2aを各ウェルへ2倍連続希釈で加えた。IL29CEEは、1000ngmlから05ngmlまでの濃度範囲で用いられた。IFNγは、125ngmlから006ngmlまでの濃度範囲で用いられた。IFNα2aは、62ngmlから003ngmlまでの濃度範囲で用いられた。細胞を37°Cで72時間、インキュベートした。72時間後、アラマーブルーを20マイクロリットルウェルで添加した。プレートを37°C、5COで24時間、さらにインキュベートした。プレートを、波長544および波長590において、SoftMaxProプログラムを用いるFmaxプレートリーダー上で読んだ。アラマーブルーは、細胞の代謝活性に基づく蛍光測定読み出しを与え、従って、陰性対照と比較した細胞増殖の直接的測定である。結果は、IL29CEEが、IFNα2aとは対照的に、ダウディ細胞の増殖に有意な影響を及ぼさないことを示している。実施例25マウスIL28はマウスB細胞に増殖抑制効果を生じないマウスB細胞を、MACS磁気ビーズを用いてCD43細胞を枯渇させることにより、2つのBalbC脾臓から単離した。精製されたB細胞をLPS、抗IgMまたは抗CD40モノクローナル抗体と共にインビトロで培養した。マウスIL28またはマウスIFNαを培養物に加え、3Hチミジンを48時間目に加え、3Hチミジン取り込みを72時間の培養後、測定した。10ngmlでのIFNαは、LPSまたは抗IgMのいずれかで刺激されたマウスB細胞による3Hチミジン取り込みを阻害した。しかしながら、IL28は、1000ngmlを含むいずれの試験された濃度においても、3Hチミジン取り込みを阻害しなかった。対照的に、mIFNαおよびマウスIL28の両方とも、抗CD40モノクローナル抗体で刺激されたマウスB細胞による3Hチミジン取り込みを増加させた。これらのデータは、IFNaとは違って、マウスIL28が、高濃度でさえも増殖抑制活性を示さないことを実証している。さらに、zcyto24は、抗CD40モノクローナル抗体の存在下において増殖を促進させる。その結果は、マウスIL28が高濃度でさえもマウスB細胞への増殖抑制活性を示さない点で、マウスIL28はIFNαと異なることを例証している。さらに、マウスIL28は、抗CD40モノクローナル抗体の存在下において増殖を促進させる。実施例26骨髄増殖アッセイ新鮮なヒト骨髄単核細胞を、αMEM、10FBS、50マイクロモルのβメルカプトエタノール、2ngmlFLT3Lにおいて37°Cで、2時間、プラスチックへ付着させた。非付着細胞を、その後、1000ngmlIL29CEE、100ngmlIL29CEE、10ngmlIL29CEE、100ngmlIFNα2a、10ngmlIFNα2aまたは1ngmlIFNα2aの存在または非存在下における、αMEM、10FBS、50マイクロモルのβメルカプトエタノール、2ngmlFLT3Lにおいて、25000~45000細胞ウェルで蒔いた。これらの細胞を、骨髄由来造血細胞の増殖または分化について試験するために様々なサイトカインとインキュベートした。8~12日後、アラマーブルーを20マイクロリットルウェルで添加した。プレートを37°C、5COで24時間、さらにインキュベートした。プレートを、波長544および波長590において、SoftMaxProプログラムを用いるFmaxプレートリーダー上で読んだ。アラマーブルーは、細胞の代謝活性に基づく蛍光測定読み出しを与え、従って、陰性対照と比較した細胞増殖の直接的測定である。IFNα2aは、試験されたすべての条件下において、骨髄増殖の有意な阻害を引き起こした。対照的に、IL29は、IL3、IL4、IL5、IL7、IL10、IL12、IL21の存在下またはサイトカイン添加なしにおいて、骨髄細胞の増殖に有意な影響を及ぼさなかった。骨髄細胞増殖の少しの阻害が、IL2またはIL15の存在下に見られた。実施例27IL28およびIL29のシグナル伝達の可溶性受容体での阻害Aシグナル伝達レポーターアッセイシグナル伝達レポーターアッセイは、zcytor19Fc4ホモ二量体およびzcytor19FcCRF24Fcヘテロ二量体の可溶性受容体の、zcyto20、zcyto21およびzcyto24シグナル伝達への阻害剤性質を示すために用いられうる。zcytor19受容体を過剰発現させるヒト胚性腎臓細胞を、ルシフェラーゼ受容体遺伝子の転写を操作するインターフェロン刺激応答配列を含むレポータープラスミドでトランスフェクションする。トランスフェクションされた細胞のリガンド、zcyto21、zcyto24を含むでの刺激後のルシフェラーゼ活性は、リガンドの可溶性受容体との相互作用を反映している。B細胞トランスフェクションzcytor19を過剰発現させる293HEK細胞を以下のようにトランスフェクションした:700000個の293細胞ウェルを2ミリリットルのDMEM10ウシ胎児血清にトランスフェクションの約18時間前に蒔いた。ウェルにつき、1マイクログラムpISREルシフェラーゼDNAおよび1マイクログラムpIRES2EGFPDNAを6マイクロリットルフュージーン6試薬に加え、合計100マイクロリットルDMEMにした。このトランスフェクション混合物を、あらかじめ蒔かれた293細胞へ30分後、加えた。24時間後、トランスフェクションされた細胞をトリプシンEDTAを用いてプレートから取り出し、96ウェルマイクロタイタープレートに、およそ25000細胞ウェルで再び蒔いた。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM05FBSに交換した。Cシグナル伝達レポーターアッセイシグナル伝達レポーターアッセイを以下のように行った:37°C、DMEM05FBSでの18時間のインキュベーション後、トランスフェクションされた細胞を、10ngmlzcyto20、zcyto21またはzcyto24、および10マイクログラムmlの以下の可溶性受容体で刺激した;ヒトzcytor19Fcホモ二量体、ヒトzcytor19FcヒトCRF24Fcヘテロ二量体、ヒトCRF24Fcホモ二量体、マウスzcytor19Igホモ二量体。37°C、4時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後、照度計で相対光ユニットを測定した。得られた結果は、PBSのみの存在下におけるシグナル伝達に対する、可溶性受容体の存在下におけるリガンド誘導シグナル伝達のパーセント阻害として示されている。表23は、ヒトzcytor19FcヒトCRF24ヘテロ二量体の可溶性受容体が、対照の16と45の間で、zcyto20、zcyto21およびzcyto24誘導シグナル伝達を阻害することができることを示している。ヒトzcytor19Fcホモ二量体の可溶性受容体もまた、zcyto21誘導シグナル伝達を45、阻害することができる。huCRF24Fcまたはmuzcytor19Igのホモ二量体の可溶性受容体に関して、有意な効果は見られなかった。表23可溶性受容体による、リガンド誘導のインターフェロン刺激応答配列シグナル伝達のパーセント阻害実施例28IL28およびIL29は新鮮なヒトPBMCにおいてHIV複製を阻害するヒト免疫不全ウイルスは、免疫系の細胞に感染する病原性レトロウイルスである。CD4T細胞および単球は、一次感染細胞型である。インビトロでHIV複製を阻害するIL28およびIL29の能力を試験するために、正常なドナー由来のPBMCをIL28、IL29およびMetIL29C172SPEGの存在下においてHIVウイルスに感染させた。新鮮なヒト末梢血単核細胞を、HIVおよびHBVについて血清反応陰性であったスクリーニングされたドナーから得られた全血から単離した。末梢血細胞を低速度遠心分離により2~3回、ペレット状にし洗浄し、混入している血小板を除去するためにPBSに再懸濁した。洗浄された血液細胞をダルベッコのリン酸緩衝食塩水で11に希釈し、50mL遠心分離管における14mLのリンパ球分離培地、MediatechIncHerndonVAによる;密度10780002gml一面に層にし、600xGで30分間、遠心分離した。団結したPBMCを結果として生じた界面から穏やかに吸引し、その後、低速度遠心分離によりPBS中で2X、洗浄した。最後の洗浄後、細胞をトリパンブルー排除により数え、15ウシ胎児血清、2mMLグルタミン、4μgmlPHAPを追加したRPMI1640に1x107細胞mLで再懸濁した。細胞を37°Cで48~72時間、インキュベートするようにさせておいた。インキュベーション後、PBMCを遠心分離し、15FBS、2mMLグルタミン、100UmLペニシリン、100μgmLストレプトマイシン、10μgmLゲンタマイシン、および20UmL組換えヒトIL2を含むRPMI1640に再懸濁した。PBMCを、培地において1~2x106細胞mLの濃度で維持し、アッセイプロトコールに用いるまで隔週の培地交換を行った。単球は、組織培養フラスコへの付着の結果として培養物から枯渇した。標準PBMCアッセイについて、少なくとも2人の正常なドナー由来のPHAPに刺激された細胞をプールし、1x106細胞mLの最終濃度へ新鮮な培地に希釈し、50μLウェルで、96ウェル丸底マイクロプレートの内部ウェルに蒔いた。試験希釈をマイクロタイターチューブに2X濃度で調製し、各濃度の100μLを標準的形式で適切なウェルに配置した。IL28、IL29およびMetIL29C172SPEGを0~10μgmlの濃度で、通常には12対数希釈で、加えた。予定希釈度のウイルス貯蔵物の50μLを各試験ウェルに置いた。細胞およびウイルスのみが加えられたウェルをウイルス対照として用いた。分離プレートを、MTSアッセイ系を用いる薬物細胞毒性研究のために、ウイルスなしで同様に調製した。PBMC培養物を感染後7日間、維持し、その時点で、細胞を含まない上清試料を収集し、逆転写酵素活性およびp24抗原レベルについてアッセイした。IL28、IL29およびMetIL29C172SPEGでの逆転写酵素活性またはp24抗原レベルにおける減少は、抗ウイルス活性の指標であると思われる。結果は、IL28およびIL29が、HIVおよびAIDSを治療するにおいて治療的価値をもちうることを実証しているものと思われる。実施例29IL28およびIL29はマーモセット肝臓細胞におけるGBVB複製を阻害するHCVは、RNAウイルスのフラビウイルス科のメンバーである。HCVは、エキソビボまたはインビトロのいずれの培養においてもあまり複製せず、それゆえに、インビトロで分子の抗HCV活性を試験する満足な系がない。GBウイルスBは、それがHCVと比較的高レベルの配列同一性をもち、かつ肝臓指向性ウイルスであるため、抗HCV抗ウイルス剤の開発における使用として魅力的な代理モデルである。現在まで、そのウイルスは、特定のヒト以外の霊長類の一次肝細胞においてのみ増殖することができる。これは、インビトロで肝細胞を単離し、それらをGBVBで感染させることによるか、またはGBVB感染したマーモセットから肝細胞を単離し、直ちにそれらを抗ウイルス化合物と用いることによるかのいずれかで、達成される。IL28、IL29およびMetIL29C172SPEGの効果は、3連で6つの半対数希釈IL28、IL29またはMetIL29C172SPEGポリペプチドで、TaqManRTPCRによりGBVB細胞外RNA産生について、およびCellTiter96試薬を用いて細胞毒性について、アッセイされた。未処理の培養物は、細胞およびウイルスの対照としての役割を果たす。RIBAVIRINおよびIFNαの両方が陽性対照化合物として含まれる。一次肝細胞培養物を単離し、コラーゲンコーティングされたプレート上に蒔く。次の日、培養物を、GBVBビリオンに曝す前に24時間、試験試料で処理する、またはインビボで感染した肝細胞を用いる場合、直ちに試験試料で処理する。試験試料および培地は、次の日に加えられ、3日後に交換される。3~4日後、上清を収集し、細胞数をCellTiter96で定量化する。ウイルスRNAを上清から抽出し、標準としてRTPCR標的を含むインビトロで転写されたRNAを用いる定量的TaqManRTPCRアッセイにおいて3連の複製について定量化する。複製試料の平均を計算する。ウイルス産生の阻害は、未処理のウイルスおよび細胞対照に対して、3連の試料の平均RNA値および細胞数値をプロットすることにより、評価される。GBVBRNA産生の50阻害を結果として生じる薬物の阻害性濃度、および対照値に対して細胞数の50の破壊を結果として生じる毒性濃度は、データで作成されたグラフから補間法により計算される。IL28およびIL29によるGBVBRNA産生の阻害は、肝細胞、C型肝炎の感染の原発性器官、におけるこのC型肝炎様ウイルスへのIL28およびIL29の抗ウイルス性質の指標であり、陽性結果は、IL28またはIL29がヒトにおいてHCV感染を治療するのに有用でありうることを示唆している。実施例30IL28、IL29およびMetIL29C172SPEGはWT10細胞におけるHBV複製を阻害する慢性B型肝炎は、ウイルスのヘパドナウイルス科に属する、ヒトの最も一般的かつ重篤なウイルス感染の一つである。IL28およびIL29のHBVに対する抗ウイルス活性を試験するために、IL28、IL29およびMetIL29C172SPEGを、ヒト肝臓系統HepG2の変異体を用いるインビトロ感染系においてHBVに対して試験した。IL28、IL29およびMetIL29C172SPEGは、この系においてウイルスの複製を阻害し、ヒトでHBVを治療することにおける治療的価値を示唆している。WT10細胞は、ヒト肝臓細胞株HepG22215の派生物である。WT10細胞は、HBVゲノムで安定的にトランスフェクションされ、その細胞株においてHBV転写産物の安定的発現を可能にする340234072000。WT10アッセイにおいて、問題の薬物および3TC対照は、半対数系列で希釈された5つの濃度それぞれでアッセイされる。評価項目は、細胞外HBVDNAについてのTaqManPCR、およびCellTiter96試薬を用いる細胞数である。アッセイは、KorbaetalAntiviralRes152172281991およびKorbaetalAntiviralRes1955701992により記載されたものと類似している。簡単には、WT10細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに蒔く。16~24時間後、HepG22215細胞の集密的な単層を洗浄し、培地を、3連で試験試料の様々な濃度を含む完全培地と交換する。陽性対照として、3TCが用いられ、陰性対照として、培地のみを細胞へ加える。3日後、培地を、適切に希釈された試験試料を含む新鮮な培地と交換する。試験化合物の最初の添加から6日後、細胞培養上清を収集し、プロナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼで処理し、リアルタイム定量的TaqManPCRアッセイに用いる。PCR増幅されたHBVDNAは、増幅したHBVDNAにハイブリダイズする消光した蛍光プローブ分子の外ヌクレオチド鎖分解性分解から生じる蛍光シグナルにおける増加をモニターすることによりリアルタイムで検出される。各PCR増幅について、標準曲線は、精製されたHBVDNAの希釈を用いて同時に作成される。抗ウイルス活性は、HBVDNAレベルにおける低下から計算される。色素取り込みアッセイは、その後、毒性を計算するために用いられる細胞生存度を測定するために使用される。治療指数は、TC50IC50として計算される。IL28、IL29およびMetIL29C172SPEGは、IC5080を生じるであろう最大希釈であった。細胞生存度は、Vmaxプレートリーダーを用いて、製造会社のプロトコールに従ってCellTiter96試薬を使用し測定された。試験試料は、半対数系列でアッセイ培地に希釈された、6つの濃度それぞれにおいて試験された。IFNαおよびRIBAVIRINは、陽性対照として用いられた。試験試料は、ウイルス感染の時点で加えられた。各濃度におけるパーセントCPE低下およびパーセント細胞生存度についての平均バックグラウンドならびに試料色補正データは、対照に対して決定され、IC50は、TC50に対して計算された。IL28、IL29およびMetIL29C172SPEGは、MDBKウシ腎臓細胞においてBVDVにより引き起こされる細胞死を抑制した。IL28は、002μgmlのIC50で細胞死を抑制し、IL29は、019μgmlのIC50で細胞死を抑制し、MetIL29C172SPEGは、045μgmlのIC50で細胞死を抑制した。これは、IL28およびIL29がウイルスのフラビウイルス科に対する抗ウイルス活性をもっていることを実証した。実施例32IL28およびIL29による、インターフェロン刺激遺伝子の誘導Aヒト末梢血単核細胞新鮮な単離されたヒト末梢血単核細胞を、IL29、IFNα2aの存在下において、または培地のみにおいて増殖させた。細胞を6、24、48または72時間、インキュベートし、その後、全RNAを単離し、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼで処理した。100ng全RNAを、製造会社により提案されているように、TaqmanOneStepRTPCRMasterMix試薬および遺伝子特異的プライマーを用いるOneStepSemiQuantitativeRTPCRのための鋳型として用いた。結果は、HPRTに対して標準化され、各時点について培地のみの対照に対する倍誘導として示されている。表24は、IL29が、試験されたすべての時点において、ヒト末梢血単核細胞においてインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。表24B活性化ヒトT細胞ヒトT細胞を、PanTcellIsolationキットを用いて、製造会社の使用説明書に従い、新鮮に採取された末梢血単核細胞から負の選択により単離した。T細胞を、その後、プレートに結合した抗CD3、可溶性抗CD28およびインターロイキン2で5日間、活性化しかつ増殖させ、洗浄し、その後、IL2でさらに5日間、増殖させた。活性化および増殖後、細胞を、IL28A、IL29または培地のみで、3、6または18時間、刺激した。全RNAを単離し、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼで処理した。OneStepSemiQuantitativeRTPCRを上の実施例に記載されているように行った。結果は、HPRTに対して標準化され、各時点について培地のみの対照に対する倍誘導として示されている。表25は、IL28およびIL29が、試験されたすべての時点において、活性化ヒトT細胞においてインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。表25C一次ヒト肝細胞2人の別々のドナー由来の新鮮に単離されたヒト肝細胞を、IL28A、IL29、IFNα2a、または培地のみで、24時間、刺激した。刺激後、全RNAを単離し、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼで処理した。OnestepsemiquantitativeRTPCRを上の実施例で前に記載されているように行った。結果は、HPRTに対して標準化され、各時点について培地のみの対照に対する倍誘導として示されている。表26は、IL28およびIL29が、24時間の刺激後、一次ヒト肝細胞においてインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。表26DHepG2およびHuH7:ヒト肝臓肝細胞腫細胞株HepG2およびHuH7をIL28A、IL29、IFNα2a、IFNB、または培地のみで、24または48時間、刺激した。別個の培養において、HepG2細胞を20ngmlのMetIL29C172SPEGまたはMetIL29PEGで上記のように刺激した。全RNAを単離し、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼで処理した。100ng全RNAを、前に記載されているように、onestepsemiquntitativeRTPCRについての鋳型として用いた。結果は、HPRTに対して標準化され、各時点について培地のみの対照に対する倍誘導として示されている。表27は、IL28およびIL29が、24および48時間後、HepG2およびHuH7肝臓肝細胞腫細胞株においてISG発現を誘導することを示している。表27表28示されたデータは、24時間の培養後の20ngmlの、IL29のMetIL29PEGおよびMetIL29C172SPEGバージョンについてである。示されたデータは、HPRTに対して標準化され、刺激されていない細胞に対する倍誘導として示されている。実施例33HCVレプリコン系におけるIL28およびIL29の抗ウイルス活性HCV複製を阻害する抗ウイルス薬の能力は、HCVレプリコン系についてインビトロで試験されうる。レプリコン系は、HCVゲノムRNAの構成的複製を方向づけるサブゲノムRNAレプリコンでトランスフェクションされたHuh7ヒト肝細胞腫細胞株からなる。10IUmlのIFNαでのレプリコンクローンの処理は、HCVRNAの量を未処理の対照細胞株と比較して85、低下させる。72時間後には、レプリコンクローンにより産生されたHCVRNAの量を低下させるIL28AおよびIL29の能力は、IL28AIL29処理によりHuh7細胞に与えられた抗ウイルス状態が、HCVレプリコン複製を阻害するのに効果的であり、それにより、HCV複製を阻害するのに効果的である可能性が非常に高いことを示している。BayerBranchedchainDNAキットにより測定されるようなHCV複製を阻害するIL28AおよびIL29の能力は、以下の条件下で行われる:110μgmlまでの増加性濃度におけるIL28単独210μgmlまでの増加性濃度におけるIL29単独310μgmlまでの増加性濃度におけるPEGIL29単独403、10および30IUmlにおけるIFNα2A単独5Ribavirin単独陽性対照はIFNαであり、陰性対照はribavirinである。細胞は、生存度を評価するために72時間後にアラマーブルーで染色される。条件1~3についての濃度は以下である:10μgml、032μgml、010μgml、0032μgml、0010μgml、00032μgml。レプリコンクローンは、上で列挙された用量で3日間連続、1日あたり1X、処理される。全HCVRNAは、72時間後、測定される。実施例34IL28およびIL29は病原性ウイルスに対する抗ウイルス活性をもつ特にアデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ピキンデウイルスおよびポリオウイルスを含む病原性ウイルスのパネルに対するIL28およびIL29の抗ウイルス活性をインビトロでアッセイするために、2つの方法が用いられる。これらの2つの方法は、細胞の視覚的検査により測定されるウイルス誘導細胞変性効果の抑制、および細胞へのニュートラルレッド色素取り込みにおける増加である。CPE抑制方法において、7つの濃度の試験薬物が、宿主細胞を含む96ウェル平底マイクロプレートにおいて各ウイルスに対して評価される。化合物は、ウイルスの24時間前に加えられ、細胞あたり001~00001感染性粒子の感染多重度と同等と考える、ウイルスに依存して、ウェルあたりおよそ5~100細胞培養感染用量の濃度で用いられる。試験は、適当なウイルスの細胞変性効果が発生するのを可能にするのに十分な特定時間の37°Cでのインキュベーション後に読まれる。NR取り込みアッセイにおいて、色素は、視覚による得点を得るために用いられるプレートの同じセットに添加される。2時間後、細胞に吸収されかつ続いて細胞から溶出される色素の色の強さは、マイクロプレート自動リーダーを用いて測定される。抗ウイルス活性は、半対数グラフ用紙上に化合物濃度対パーセント阻害をプロットすることにより決定された50有効濃度として表示される。いくつかの場合におけるEC50IC50は、適切な回帰分析ソフトウェアにより決定されうる。一般的に、NRアッセイにより測定されたEC50は、CPE方法により得られたものより2~4倍高い。表29視覚的アッセイ表30ニュートラルレッドアッセイ法実施例35IL28、IL29、metIL29PEGおよびMetIL29C172SPEGはマウス肝臓細胞株AML12においてISG誘導を刺激するインターフェロン刺激遺伝子は、I型インターフェロンにより、ならびにまたIL28およびIL29ファミリー分子によっても、誘導される遺伝子であり、IFNならびにIL28およびIL29が抗ウイルス活性へ導く類似した経路を誘導することを示唆している。ヒトI型IFNは、マウス細胞へほとんどまたは全く活性をもたず、種間交差反応性の欠如に起因するものと考えられる。ヒトIL28およびIL29がマウス細胞に効果を生じるかどうかを試験するために、ヒトIL28およびIL29によるISG誘導が、マウス肝臓由来細胞株AML12におけるリアルタイムPCRにより評価された。AML12細胞を、6ウェルプレートの完全DMEM培地に2x106細胞ウェルの濃度で蒔いた。細胞を蒔いてから24時間後、ヒトIL28およびIL29を培養物へ20ngmlの濃度で加えた。対照として、細胞は、マウスIFNαで刺激されるかまたは刺激されないかのいずれかであった。細胞を、CHO由来ヒトIL28AまたはIL29の添加から8、24、48および72時間後、採集した。RNAをRNAEasykitを用いて細胞ペレットから単離した。RNAを、どんな混入しているDNAもRNAから取り除くためにデオキシリボヌクレアーゼで処理した。cDNAをPerkinElmerRTmixを用いて作製した。ISG遺伝子誘導は、マウスOAS、PkrおよびMx1に特異的なプライマーならびにプローブを用いるリアルタイムPCRにより評価された。定量的データを得るために、HPRTリアルタイムPCRは、ISGPCRと二重化された。標準曲線は、IFNに刺激されたマウスPBL由来のRNAの既知の量を用いて得られた。すべてのデータは内部HPRT発現に対する発現として示されている。ヒトIL28AおよびIL29は、マウス肝細胞細胞株AML12においてISG誘導を刺激し、I型IFNとは違って、IL2829ファミリータンパク質が異種間反応性を示すことを実証した。表31示されたすべてのデータは、HPRT遺伝子発現に対する倍として表示されている。OASmRNAのng=内部のHPRTmRNAのngに対するOASmRNA量の標準化された値ハウスキーピング遺伝子、HPRT例として、48時間時点についてのデータが示されている。表32AML12のもの細胞は、20ngmlMetIL29PEGまたはMetIL29C172SPEGで24時間、刺激された。示されたデータは、HPRTに対して標準化され、刺激されていない細胞に対する倍誘導として示されている。実施例36ISGはヒトIL29を発現させるトランスジェニックマウスの脾臓において効率的に誘導されるEulckプロモーターの制御下でヒトIL29を発現させるトランスジェニックマウスを作製した。ヒトIL29がマウスにおいてインビボで生物活性をもつかどうかを研究するために、ISGの発現を、EulckIL29トランスジェニックマウスの脾臓におけるリアルタイムPCRにより分析した。トランスジェニックマウスは、Eulckプロモーターの制御下でヒトIL29遺伝子を発現させる構築物を用いて作製された。このプロモーターは、T細胞およびB細胞において活性がある。トランスジェニックマウスおよびそれらの非トランスジェニック同腹子を約10週間の齢で屠殺した。マウスの脾臓を単離した。RNAをRNAEasykitを用いて細胞ペレットから単離した。RNAを、どんな混入しているDNAもRNAから取り除くためにデオキシリボヌクレアーゼで処理した。cDNAをPerkinElmerRTmixを用いて作製した。ISG遺伝子誘導は、マウスOAS、PkrおよびMx1に特異的なプライマーならびにプローブを用いるリアルタイムPCRにより評価された。定量的データを得るために、HPRTリアルタイムPCRは、ISGPCRと二重化された。さらに、標準曲線は、IFNに刺激されたマウスPBLの既知の量を用いて得られた。すべてのデータは内部HPRT発現に対する発現として示されている。IL29Tgマウスから単離された脾臓は、それらの非Tg同腹子対照と比較してISGOAS、PkrおよびMx1の高誘導を示し、ヒトIL29がマウスにおいてインビボで生物活性があることを示唆した。表33示されたすべてのデータは、HPRT遺伝子発現に対する倍発現である。2匹のマウスにおける平均発現が示されている。実施例37ヒトIL28およびIL29タンパク質は、マウスの肝臓、脾臓および血液においてISG遺伝子発現を誘導するヒトIL28およびIL29がインビボでインターフェロン刺激遺伝子を誘導するかどうかを測定するために、CHO由来ヒトIL28AおよびIL29タンパク質をマウスへ注射した。さらに、大腸菌由来IL29はまた、MetIL29C172SPEGおよびMetIL29PEGを用いて上記のようにインビボアッセイで試験された。様々な時点および異なる用量において、ISG遺伝子誘導が、マウスの血液、脾臓および肝臓で測定された。C57BL6マウスに、一連の用量のCHO由来ヒトIL28AおよびIL29またはMetIL29C172SPEGおよびMetIL29C16C113PEGを腹腔内または静脈内に注射した。マウスを様々な時点で屠殺した。脾臓および肝臓をマウスから単離し、RNAを単離した。RNAはまた、血液細胞からも単離された。細胞をペレット状にし、RNAをRNAEasyキットを用いてペレットから単離した。RNAを、どんな混入しているDNAもRNAから除去するためにデオキシリボヌクレアーゼで処理した。cDNAをPerkinElmerRTmixを用いて作製した。ISG遺伝子誘導は、マウスOAS、PkrおよびMx1に特異的なプライマーならびにプローブを用いるリアルタイムPCRにより測定された。定量的データを得るために、HPRTリアルタイムPCRは、ISGPCRと二重化された。標準曲線は、IFNに刺激されたマウスPBLの既知の量を用いて計算された。すべてのデータは内部HPRT発現に対する発現として示されている。ヒトIL29は、用量依存性様式で、マウスの肝臓、脾臓および血液においてISG遺伝子発現を誘導した。ISGの発現は、注射後の1~6時間の間でピークになり、48時間まで、対照マウスより多い持続的発現を示した。この実験において、ヒトIL28Aは、ISG遺伝子発現を誘導しなかった。表34示された結果は、HPRT遺伝子発現に対する倍発現である。IL29が静脈内の250μgの単回投与で肝臓にOASを誘導したことについての試料データセットが示されている。示されたデータは、5匹の異なる動物群からの平均発現である。表35表36マウスは、静脈内に100μgのタンパク質を注射された。示されたデータは、マウスの肝臓からのHPRT発現に対する倍発現である。同様のデータがマウスの血液および脾臓から得られた。実施例38IL28およびIL29はマウスにおいてISGタンパク質を誘導するISGタンパク質の誘導へのヒトIL28およびIL29の効果を分析するために、IL28およびIL29で処理されたマウス由来の血清ならびに血漿をOAS活性について試験した。C57BL6マウスに、PBSまたは一連の濃度のヒトIL28もしくはIL29を静脈内に注射した。様々な時点において、血清および血漿をマウスから単離し、OAS活性をEikenChemicalsからのOAS放射性免疫アッセイキットを用いて測定した。IL28およびIL29は、マウスの血清および血漿においてOAS活性を誘導し、これらのタンパク質がインビボで生物活性があることを示した。表37OAS活性は、ヒトIL29の単一濃度についての血漿のpmoldLにおいて示されている。実施例39IL28およびIL29はマウスにおいてアデノウイルスによる病変を阻害する肝臓に感染するウイルスに対するIL28およびIL29の抗ウイルス活性を試験するために、内部緑色蛍光タンパク質遺伝子を発現させる感染性アデノウイルスベクターに対して、試験試料をマウスにおいて試験した。静脈内に注射される場合、これらのウイルスは、最初に、遺伝子発現について肝臓を標的とする。アデノウイルスは、複製欠損であるが、ASTおよびALTのような肝臓酵素の血清レベルの測定により、または肝臓病変の直接的検査によりモニターされうる、炎症性細胞浸潤による肝臓損傷を引き起こす。C57BL6マウスに、50μgマウスIL28またはMetIL29C172SPEGの腹腔内注射を1日1回、3日間、与えた。対照動物にPBSを注射した。第3回投与から1時間後、マウスに、アデノウイルスベクター、AdGFPの単回の静脈内ボーラス尾静脈注射を与えた。この後、隔日に、マウスに、PBS、マウスIL28またはMetIL29C172SPEGの追加の用量をさらに4回分として与えた。PBS、マウスIL28またはMetIL29C172SPEGの最終投与から1時間後、マウスは、終末的に採血され、屠殺された。血清および肝臓組織を分析した。血清は、ASTおよびALT肝臓酵素について分析された。肝臓は、単離され、GFP発現および組織像について分析された。組織像について、肝臓検体をホルマリンに固定し、その後、パラフィンに包埋し、続いて、HE染色をした。処理することを目隠しされていた肝臓の切片を光学顕微鏡で調べた。変化は、注意深く観察され、肝臓病変および炎症を測定するように設計された尺度で得点を付けられた。マウスIL28およびIL29は、肝臓蛍光により測定されるようなアデノウイルス感染および遺伝子発現を阻害した。PBSで処理されたマウスは、平均相対肝臓蛍光が524であった。対照的に、IL28で処理されたマウスは、相対肝臓蛍光が345であり、IL29で処理されたマウスは、相対肝臓蛍光が389であった。アデノウイルスおよび遺伝子発現における低下は、血清ALTおよびASTレベルならびに組織像により測定されるような肝臓病変の減少へと導いた。PBSで処理されたマウスは、平均血清ASTが234UL、および血清ALTが250ULであった。対照的に、IL28で処理されたマウスは、平均血清ASTが193UL、および血清ALTが216ULであり、IL29で処理されたマウスは、平均血清ASTが162UL、および血清ALTが184ULであった。さらに、肝臓組織像は、マウスIL28かまたはIL29のいずれかを与えられたマウスが、PBSで処理された群より低い肝臓および炎症得点であった。IL29群由来の肝臓はまた、PBS処理群においてより、少ない洞様細胞の増殖、少ない有糸分裂像、および少ない肝細胞における変化であった。これらのデータは、マウスIL28およびIL29が肝臓指向性ウイルスに対する抗ウイルス性質をもつことを実証している。実施例40LCMVモデルマウスにおけるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染は、急性および慢性感染の優れたモデルである。これらのモデルは、サイトカインの抗ウイルス免疫応答への効果、ならびにIL28およびIL29が、ウイルス量および抗ウイルス免疫応答へ与える効果を評価するために用いられる。用いられる2つのモデルは以下のものである:LCMVアームストロング感染およびLCMVクローン13感染。5405472003HoffmanetalJImmunol170133913532003を参照。ウイルスに応答してのCD8T細胞発生の3段階がある:1増殖、2収縮および3記憶。IL28またはIL29は、急性および慢性モデルの両方についての各段階中に注射される。慢性モデルにおいて、IL28またはIL29は、IL28またはIL29の持続性ウイルス量への効果を評価するために感染から60日後に注射される。急性および慢性モデルの両方について、IL28またはIL29が注射され、血液、脾臓および肝臓におけるウイルス量が調べられる。調べられうる他のパラメーターは以下のものを含む:LCMV特異的CD8T細胞の数を数えるためのフローによる四量体染色;それらの同族LCMV抗原で刺激される場合、サイトカインを産生する四量体細胞の能力;およびそれらの同族LCMV抗原に応答して増殖するLCMV特異的CD8T細胞の能力。LCMV特異的T細胞は、細胞活性化および分化状態を評価するためにフローサイトメトリーにより表現型で分類される。また、LCMV特異的CTLの、それらの同族LCMV抗原を生んでいる標的細胞を溶解する能力が調べられた。LCMV特異的CD4T細胞の数および機能もまた評価される。IL28またはIL29での治療後のウイルス量における低下が測定される。任意の器官、特に肝臓、でのウイルス量における50低下は有意であると思われる。IL28またはIL29で処理されたマウスについて、処理されていないマウスに対して、増殖する、サイトカインを生成する、または成熟表現型を示す四量体陽性のT細胞のパーセンテージにおける20増加もまた、有意とみなされるものと思われる。ウイルス量における低下へと導くIL28またはIL29の注射は、特に、未処理の場合、ウイルス力価が長期間上昇したままである慢性モデルにおいて、ウイルス感染のより効果的な制御のおかげである。未処理のマウスに対してのウイルス力価における2倍低下は、有意とみなされる。実施例41急性ウイルス感染のインフルエンザモデルA抗ウイルス活性を試験する予備実験インフルエンザによる急性感染へのIL28またはIL29の抗ウイルス活性を測定するために、インフルエンザに感染したC57BL6マウスを用いるインビボ研究を以下のプロトコールを用いて行う:動物:群あたり30匹、148匹のマウスを含む、生後6週間の雌BALBcマウス。群:抗体力価および組織学について並行して行う絶対的対照媒体生理食塩水アマンタジン10mg日、感染の2時間前に開始する5日間IL28またはIL29処理IL28またはIL29IL28またはIL290日目-絶対的対照を除き、すべての動物がインフルエンザウイルスに感染ウイルス量について免疫学検査0~9日目-IL28またはIL29の毎日の注射体重および全体的様子の記録3日目-群あたり8匹の動物の屠殺右肺におけるウイルス量左肺における組織変化抗体力価測定のための血液試料10日目-すべての生き残っている動物の屠殺、抗体力価測定のための血液試料の採集、直接的CTLアッセイおよび以下のマーカー:CD3CD4、CD3CD8、CD3CD8CD11b、CD8CD44CD62L、CD3DX5、GR1F480およびCD19についての定量的免疫表現型分類のための肺リンパ球の単離研究No2マウス適応性ウイルスに感染したC57BL6マウスにおけるIL28またはIL29の効力研究は、生後8週間の雌C57BL6マウスを用いて行われる。群1:媒体群2:陽性対照:抗インフルエンザ中和抗体;40μgマウス、感染の2時間後および4時間後群3:IL28またはIL29群4:IL28またはIL29群5:IL28またはIL29次の生活に従って、観察および免疫学的検査が調製される:0日目-すべての動物がインフルエンザウイルスに感染0~9日目-IL28またはIL29の毎日の注射体重および全体的様子を隔日に記録10日目-生き残っている動物の屠殺、および肺におけるウイルス量を測定するウイルスアッセイを行う肺リンパ球の単離を用いる肺における直接的CTLアッセイのために。四量体染色:インフルエンザA核タンパク質エピトープを含むMHCクラスI四量体を結合するCD8T細胞の数が、ウイルスペプチド:FLUNP366374Db、とMHCクラスIの複合体を用いて評価される。定量的な、以下の免疫表現型分類:CD8、四量体、細胞内IFNγ、NK11、CD8、四量体、CD62L、CD44、CD3、NK11、細胞内IFNγ、CD4、CD8、NK11、DX5、CD3、NK11、DX5、四量体、血球計算器調整のための単一色試料。生存再曝露研究30日目:マウスに関する生存研究は、IL28またはIL29の異なる用量で、または陽性の抗インフルエンザ抗体の対照で、9日間、処理される。体重および個々の血清試料における抗体産生が測定される。再曝露研究:0日目:両方の群は、APRウイルスに感染させられる。群6は処理されない。群7はIL28またはIL29の125μgで9日間、処理される。30日目:生存研究体重および個々の血清試料における抗体産生が測定される。60日目:再曝露研究各群における生存しているものは、2つの下位群へ分割される群6Aおよび7AはAPRウイルスに再曝露される群6Bおよび7BはAPRウイルスに再曝露される両方の群は、経過観察され、屠殺の日が決定される。体重および個々の血清試料における抗体産生が測定される。実施例42IL28およびIL29はインビボでB型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス活性をもつトランスジェニックマウスモデルは、高レベルの感染性HBVの複製を維持し、HBV感染についての化学療法モデルとして用いられた。トランスジェニックマウスは、抗ウイルス薬で処理され、HBVDNAおよびRNAのレベルが、処理後のトランスジェニックマウス肝臓および血清において測定される。HBVタンパク質レベルもまた、処理後のトランスジェニックマウス血清において測定されうる。このモデルは、HBVウイルス力価を低下させることにおけるラミブジンおよびIFNαの効果を評価するために用いられた。HBVTGマウスに、25、25もしくは250マイクログラムのIL28またはIL29の腹腔内注射を隔日に14日間を与える。マウスを、処理の日および7日目に、血清収集のために血液を採取する。IL29の最終投与から1時間後、マウスは、終末の採血を受け、屠殺される。血清および肝臓は、肝臓HBVDNA、肝臓HBVRNA、血清HBVDNA、肝臓HBc、血清Hbeおよび血清HBsについて分析される。IL28またはIL29に応答しての肝臓HBVDNA、肝臓HBVRNA、血清HBVDNA、肝臓HBc、血清Hbeまたは血清HBsにおける低下は、これらの化合物のHBVに対する抗ウイルス活性を反映している。実施例43IL28およびIL29はBCBL1細胞におけるヒトヘルペスウイルス8複製を阻害するIL28およびIL29の抗ウイルス活性は、Bリンパ系細胞株、BCBL1を用いるインビトロ感染系においてHHV8に対して試験された。HHV8アッセイにおいて、試験化合物およびガンシクロビル対照を、半対数系列で希釈された5つの濃度それぞれでアッセイした。評価項目は、細胞外HHV8DNAについてのTaqManPCR、およびCellTiter96試薬を用いる細胞数である。簡単には、BCBL1細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに蒔いた。16~24時間後、細胞を洗浄し、培地を、3連で試験化合物の様々な濃度を含む完全培地と交換した。ガンシクロビルが陽性対照であり、培地のみが陰性対照である。3日後、培地を、適切に希釈された試験化合物を含む新鮮な培地と交換した。試験化合物の最初の投与から6日後、細胞培養上清を収集し、プロナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼで処理し、その後、リアルタイム定量的TaqManPCRアッセイに用いた。PCR増幅されたHHV8DNAは、増幅したHHV8DNAにハイブリダイズする消光した蛍光プローブ分子の外ヌクレオチド鎖分解性から生じる蛍光シグナルにおける増加をモニターすることによりリアルタイムで検出された。各PCR増幅について、標準曲線は、精製されたHHV8DNAの希釈を用いて同時に作成された。抗ウイルス活性は、HHV8DNAレベルにおける低下から計算される。新規の色素取り込みアッセイは、その後、毒性を計算するために用いられる細胞生存度を測定するために使用された。治療指数は、TC50IC50として計算される。IL28およびIL29は、BCBL1細胞におけるHHV8ウイルス複製を阻害する。IL28Aは、IC50が1μgml、およびTC50が10μgmlであった。IL29は、IC50が65μgml、およびTC50が10μgmlであった。MetIL29C172SPEGは、IC50が014μgml、およびTC50が10μgmlであった。実施例44エプスタインバーウイルスに対する、IL28およびIL29の抗ウイルス活性IL28およびIL29の抗ウイルス活性が、Bリンパ系細胞株、P3HR1でのインビトロ感染系においてEBVに対して試験される。EBVアッセイにおいて、試験化合物および対照を半対数系列で希釈された5つの濃度それぞれでアッセイする。評価項目は、細胞外EBVDNAについてのTaqManPCR、およびCellTiter96試薬を用いる細胞数である。簡単には、P3HR1細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに蒔く。16~24時間後、細胞を洗浄し、培地を、3連で試験化合物の様々な濃度を含む完全培地と交換する。陽性対照に加えて、培地のみが陰性対照として細胞に加えられる。3日後、培地を、適切に希釈された試験化合物を含む新鮮な培地と交換する。試験化合物の最初の投与から6日後、細胞培養上清を収集し、プロナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼで処理し、その後、リアルタイム定量的TaqManPCRアッセイに用いる。PCR増幅されたEBVDNAは、増幅したEBVDNAにハイブリダイズする消光した蛍光プローブ分子の外ヌクレオチド鎖分解性から生じる蛍光シグナルにおける増加をモニターすることによりリアルタイムで検出される。各PCR増幅について、標準曲線は、精製されたEBVDNAの希釈を用いて同時に作成された。抗ウイルス活性は、EBVDNAレベルにおける低下から計算される。新規の色素取り込みアッセイは、その後、毒性を計算するために用いられる細胞生存度を測定するために使用された。治療指数は、TC50IC50として計算される。実施例45単純ヘルペスウイルス2に対するIL28およびIL29抗ウイルス活性IL28およびIL29の抗ウイルス活性は、ベロ細胞でのインビトロ感染系においてHSV2に対して試験された。IL28およびIL29の抗ウイルス効果は、細胞変性効果の抑制アッセイにおいて評価された。アッセイは、細胞変性HSV2ウイルスによるベロ細胞の殺害、ならびにIL28およびIL29による細胞殺害の抑制を含む。ベロ細胞を10ウマ血清、1グルタミンおよび1ペニシリンストレプトマイシンを加えた、フェノールレッドを含むダルベッコの改変基本培地において増殖させ、CPE抑制アッセイは、2FBS、1グルタミンおよび1ペニシリンストレプトマイシンを加えた、フェノールレッドなしのDMEMにおいて行われる。アッセイの前日に、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、数え、100μlウェルの容量である96ウェル平底BioCoatプレートに104細胞ウェルで蒔いた。次の日、培地を除去し、ウイルスのあらかじめ力価測定されたアリコートを細胞に加えた。用いられるウイルスの量は、最大CPE発生の時点で完全な細胞殺害を生じるであろう最大希釈である。細胞生存度は、Vmaxプレートリーダーを用いて、CellTiter96試薬を使用し、製造会社のプロトコールに従って、測定される。化合物は、半対数系列でアッセイ培地に希釈された、6つの濃度それぞれにおいて試験される。アシクロビルは、陽性対照として用いられた。化合物は、ウイルス感染の時点で加えられる。各濃度におけるパーセントCPE低下およびパーセント細胞生存度についての平均バックグラウンドならびに薬物色補正データは、対照に対して決定され、IC50は、TC50に対して計算される。IL28A、IL29およびMetIL29C172SPEGは、このアッセイにおいて細胞死を抑制しなかった。IFNαの抗ウイルス活性もアッセイになかった。本明細書において引用した全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に利用可能な材料例えば、GenBankアミノ酸およびヌクレオチド配列提出の完全な開示は、参照により本明細書に組み入れられる。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明快にするために限って提供されている。それらから理解されるのは必要な制限のみである。本発明は、示したおよび記述した正確な詳細に限定されず、当業者に明白である変更は、請求の範囲によって定義される本発明に含まれるであろう。