aヒト免疫不全ウイルスHIVの第1サブタイプまたは組換え体に対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第1ベクター;およびbHIVの第2サブタイプまたは組換え体に対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第2ベクター;を含む組成物。薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む、請求項1記載の組成物。第1ベクターのインサートまたは第2ベクターのインサートが、2つまたはそれ以上の、agag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vprもしくはvpu遺伝子またはbその変異体および任意で、cHIVゲノムの非コード化制御配列;の配列を含む、請求項1記載の組成物。2つまたはそれ以上の配列の少なくとも1つが、ウイルスRNAのキャプシド形成を制限する変異を含む、請求項3記載の組成物。2つまたはそれ以上の配列の少なくとも1つが、ジンクフィンガーをコードする一つまたは複数の配列に変異を有するgag配列を含む、請求項3記載の組成物。HIV1の非コード化制御配列からシス作動性RNAのキャプシド形成配列の全てまたは一部が削除されている、請求項4記載の組成物。2つまたはそれ以上の配列が、一つまたは複数のpolの酵素活性を阻害する変異を有するpol配列を含む、請求項3記載の組成物。酵素活性がインテグラーゼ活性である、請求項7記載の組成物。酵素活性が逆転写酵素活性である、請求項7記載の組成物。酵素活性がプロテアーゼ活性である、請求項7記載の組成物。酵素活性がpol配列の一部の削除またはpol配列への一つまたは複数の点変異の導入により阻害される、請求項8、9または10の組成物。第1ベクターのインサートまたは第2ベクターのインサートが、一つまたは複数の欠失または点変異を有するtat、rev、nef、vif、vpr、またはvpuを含む、請求項3記載の組成物。欠失または点変異がtat、rev、nef、vif、vpr、またはvpuの一つまたは複数の開始コドンを不活性化させる、請求項12記載の組成物。第1ベクターまたは第2ベクターが、aジンクフィンガーが不活性化されているgagタンパク質;bipol配列のいくつかまたは全てを除去することによりインテグラーゼ活性が阻害されている、およびiipol配列内の一つまたは複数の点変異により逆転写酵素のポリメラーゼ、鎖転移およびまたはRNアーゼH活性が阻害されているpolタンパク質;並びにc変異を含まないenv、tat、rev、およびvpuをコードするプラスミドである、請求項3記載の組成物。コードされたタンパク質がサブタイプBもしくはDHIV1またはサブタイプBもしくはDHIV1の組換え体に由来する、請求項14記載の組成物。第1ベクターまたは第2ベクターがpGA2JS2を含む、請求項14記載の組成物。コードされたタンパク質がサブタイプAHIV1またはサブタイプAHIV1の組換え体に由来する、請求項14記載の組成物。第1ベクターまたは第2ベクターがpGA1IC2を含む、請求項17記載の組成物。コードされたタンパク質がサブタイプCHIV1またはサブタイプCHIV1の組換え体に由来する、請求項14記載の組成物。第1ベクターまたは第2ベクターがpGA1IN2を含む、請求項19記載の組成物。コードされたタンパク質がHIV1のサブタイプE、F、G、H、I、J、KもしくはLサブタイプまたはサブタイプE、F、G、H、I、J、KもしくはLHIV1の組換え体に由来する、請求項14記載の組成物。第1ベクターまたは第2ベクターがaジンクフィンガーが不活性化されているgagタンパク質;bipol配列のいくつかまたは全てを除去することによりインテグラーゼ活性が阻害されている、iipol配列内の一つまたは複数の点変異により逆転写酵素のポリメラーゼ、鎖転移およびまたはRNアーゼH活性が阻害されている、およびiiiプロテアーゼのタンパク質分解活性が一つまたは複数の点変異により阻害されているpolタンパク質;並びにc変異を含まないenv、tat、rev、およびvpu;をコードするプラスミドである、請求項3記載の組成物。コードされたタンパク質がサブタイプBもしくはDHIV1またはサブタイプBもしくはDHIV1の組換え体に由来する、請求項22記載の組成物。第1ベクターまたは第2ベクターがpGA2JS7を含む、請求項23記載の組成物。コードされたタンパク質がサブタイプAHIV1またはサブタイプAHIV1の組換え体に由来する、請求項22記載の組成物。第1ベクターまたは第2ベクターがpGA1IC25を含む、請求項25記載の組成物。コードされたタンパク質がサブタイプCHIV1またはサブタイプCHIV1の組換え体に由来する、請求項22記載の組成物。第1ベクターまたは第2ベクターがpGA1IN3を含む、請求項27記載の組成物。コードされたタンパク質がHIV1のサブタイプE、F、G、H、I、J、KもしくはLサブタイプまたはサブタイプE、F、G、H、I、J、KもしくはLHIV1の組換え体に由来する、請求項22記載の組成物。第1ベクターまたは第2ベクターがaジンクフィンガーが不活性化されているgagタンパク質;biインテグラーゼ活性が阻害されている、iipol配列内の一つまたは複数の点変異により逆転写酵素のポリメラーゼ、鎖転移およびまたはRNアーゼH活性が阻害されている、およびiiipol配列内の一つまたは複数の点変異によりプロテアーゼのタンパク質分解活性が阻害されているpolタンパク質;c変異体開始コドンを含むvpuタンパク質;並びにd変異されていない形態のenv、tat、およびrevタンパク質をコードするプラスミドである、請求項3記載の組成物。コードされたタンパク質がサブタイプBもしくはDHIV1またはサブタイプBもしくはDHIV1の組換え体に由来する、請求項30記載の組成物。第1ベクターまたは第2ベクターがpGA2JS71を含む、請求項31記載の組成物。コードされたタンパク質がHIV1のサブタイプA、C、E、F、G、H、I、J、KもしくはLサブタイプまたはサブタイプA、C、E、F、G、H、I、J、KもしくはLHIV1の組換え体に由来する、請求項30記載の組成物。ベクターがウイルスである、請求項1記載の組成物。ウイルスが組換えポックスウイルスである、請求項34記載の組成物。ウイルスが改変ワクシニアアンカラウイルスである、請求項34記載の組成物。改変ワクシニアアンカラウイルスが、JS2またはJS7の配列に対合するクレードB配列をコードする組換え核酸を有する、請求項36記載の組成物。改変ワクシニアアンカラウイルスが、IC2またはIC25の配列に対合するクレードA配列をコードする組換え核酸を有する、請求項36記載の組成物。改変ワクシニアアンカラウイルスが、IN2またはIN3の配列に対合するクレードC配列をコードする組換え核酸を有する、請求項36記載の組成物。改変ワクシニアアンカラウイルスがサブタイプA、B、C、D、E、F、G、H、I、J、KもしくはLHIV1の組換え体であるかまたはDNAワクチンの配列に対合するサブタイプA、B、C、D、E、F、G、H、I、J、KもしくはLHIV1の組換え体である、請求項36記載の組成物。aHIVワクチンを必要とする対象を同定する段階;およびbヒト免疫不全ウイルスに対する免疫応答を誘導または増強するワクチンインサートを含むベクターを含む治療上有効量の組成物を対象に投与する段階;を含む、対象を処置する方法。aHIVワクチンを必要とする対象を同定する段階;およびbiヒト免疫不全ウイルスHIVの第1サブタイプまたは組換え体に対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第1ベクターおよびiiHIVの第2サブタイプまたは組換え体に対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第2ベクターを含む治療上有効量の組成物を対象に投与する段階;を含む、対象を処置する方法。aHIVワクチンを必要とする対象を同定する段階;並びにbiヒト免疫不全ウイルスHIVの第1サブタイプまたは組換え体に対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第1ベクター、iiHIVの第2サブタイプまたは組換え体に対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第2ベクター、およびiiiHIVの第3サブタイプまたは組換え体に対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第3ベクターを含む治療上有効量の組成物を対象に投与する段階;を含む、対象を処置する方法。組成物を投与する段階が、保護免疫応答をプライムおよびブーストする目的で1回を超える頻度でプラスミドベクターを投与する段階を含む、請求項40、41、または42の方法。組成物を投与する段階が、免疫応答をプライムする目的で1回または1回を超える頻度でプラスミドベクターを投与する段階、および免疫応答をブーストする目的で続けて1回または1回を超える頻度で改変ワクシニアアンカラウイルスを投与する段階を含む、請求項40、41、または42の方法。プラスミドベクターがJS2、JS7もしくはJS71と称するインサート、およびまたはIC2、IC25、IC48もしくはIC90、と称するインサート、およびまたはIN2もしくはIN3と称するインサートを含み、そしてここでブースティングは、プライミングのために用いられるプラスミドに対合したHIV配列を含有する改変ワクシニアアンカラウイルスを投与する段階を含む、請求項45記載の方法。プラスミドベクターがHIVクレードAおよびまたはクレードB、およびまたはクレードC、およびまたはクレードD、およびまたはクレードE、およびまたはクレードF、およびまたはクレードG、およびまたはクレードH、およびまたはクレードJ、およびまたはクレードK、およびまたはクレードL、およびまたはその組換えサブタイプを含み、そしてここでブースティングは、プライミングのために用いられるプラスミドに対合したHIV配列を含有する改変ワクシニアアンカラウイルスを投与する段階を含む、請求項45記載の方法。組成物を投与する段階が、保護免疫応答をプライムおよびブーストする目的で1回を超える頻度で改変ワクシニアアンカラウイルスを投与する段階を含む、請求項40、41、または42の方法。プライミングが、クレードB組換えMVAウイルスおよびまたはクレードA組換えMVAウイルスおよびまたはクレードC組換えMVAウイルスおよびまたはいずれかのその組換えサブタイプを投与する段階を含み、そしてここでブースティングは、プライミングのために用いられる同一の改変ワクシニアアンカラウイルスを投与する段階を含む、請求項44記載の方法。プライミングが、改変ワクシニアアンカラベクターのクレードAおよびまたはクレードB、およびまたはクレードC、およびまたはクレードD、およびまたはクレードE、およびまたはクレードF、およびまたはクレードG、およびまたはクレードH、およびまたはクレードJ、およびまたはクレードK、およびまたはクレードL、およびまたはその組換えサブタイプを投与する段階を含み、そしてここでブースティングはプライミングのために用いられる同一の改変ワクシニアアンカラベクターを投与する段階を含む、請求項44記載の方法。詳細な説明本発明は幅広い種類のベクターおよびベクターの型例えばプラスミドおよびウイルスベクターを包含し、その各々は、必ずしも必要というわけではないが、その抗原が得られたまたは誘導された病原体に対して免疫応答を引き出す例えば誘起または増強する一つまたは複数の抗原をコードする一つまたは複数の核酸配列を含むことができる免疫応答を引き出すタンパク質をコードする配列を本明細書ではワクチンインサートまたは単にインサートと称することがあり;変異が天然発生配列に導入される場合、得られた変異体は天然発生配列から誘導される。インサートを含まないベクターは本発明の範囲内であり、そしてインサート自体もまた本発明の組成物であることを明らかにするために、ベクターは必ずしも抗原をコードする必要がないことが指摘される。従って、本発明は本明細書に開示する核酸配列、その類似体、およびこれらの核酸を含有する組成物を特徴とするベクターにインサートを加えたものか、またはインサートのみか;例えば生理学的に許容される溶液、これは担体、例えばリポソーム、カルシウム、粒子例えば金ビーズまたはDNAを細胞に分配するために用いられるその他の試薬を含んでよい。類似体は本明細書に開示したものと同一でないが、本発明の配列に含まれるもの例えば本明細書に開示するJS、ICまたはIN配列のいずれかに類似する位置で同一または類似の変異例えば同一の点変異または類似の点変異を含む配列でよい。規定の残基またはドメインを、それが正確に同一の数字で示される位置ではないようであったとしても、種々のHIVクレードで同定することができる。本明細書に記載するものと区別されるが、HIV遺伝子生成物を同様に不活性化する変異を含む類似体をシークエンシングすることもできる。例えば、本明細書に記載する遺伝子の1つよりも多かれ少なかれトランケートされているが、同様に不活性化されている例えば特定の酵素活性を喪失している遺伝子は本発明の範囲内である。以下でより詳細に記載する病原体および抗原はいずれかのクレードの例えばいずれかの公知のクレード由来か、またはいずれかの単離体由来の例えばクレードA、AG、B、C、D、E、F、G、H、I、J、KまたはLヒト免疫不全ウイルスを含む。ベクターが病原体に由来する配列を含む場合、免疫応答を引き出すためにこれを患者に投与することができる。このように抗原コード化ベクターを単独でまたは互いに組み合わせて投与する方法もまた本明細書に記載する。患者を免疫するためにそれにより患者が感染するようになる危険性を低減させる、またはすでに感染してしまった患者を処置するためにこれらの方法を実施することができ;発現された場合、抗原は実質的に感染を防御できる例えば免疫が続く病原体による誘発に対して保護することができるか、または患者の健康に及ぼす影響の程度を制限できる、細胞媒介のおよび体液性の双方の免疫応答を引き出すことができる。多くの場合、患者はヒト患者であるが、本発明はそのように限定されるものではない。非ヒト霊長類、飼い馴らされた動物および家畜を含むその他の動物を処置することもできる。本明細書で記載する組成物は、それらが指向する病原体または病原体のサブタイプ例えば複数のHIVクレードに関わらず、核酸ベクター例えばプラスミドを含むことができる。本明細書で記載するように、pGA1、pGA2と称するプラスミドもちろんこれらのベクター自体を含むの一つまたは複数の特徴または特性特に指向された終止配列および強力なプロモーターを有するベクターをワクチンまたは治療の基礎として使用することができる。標準的な組換え技術そのいくつかを以下の実施例で説明するを用いてこのようなベクターを操作して、投与し、続いて発現させた場合、抗原が得られたかまたは誘導された病原体に対するいくつかの形態の保護例えば感染に対する保護、疾患に対する保護、または一つまたは複数の疾患の徴候または症状の改善を患者に提供する免疫応答を患者が引き出す例えば誘起または増強する抗原をコードする配列を含むようにすることができる。コードされる抗原はいずれかのHIVクレードもしくはサブタイプまたはいずれかのその組換え体のものでよい。免疫不全ウイルスに由来するインサートに関して、異なる単離体が集団多様性を呈し、その各々の単離体はクレードのコンセンサス配列から全体的に類似する多様性を有している例えばSubbaraoら、AIDS10補冊A:S13231996。このように、いずれかの単離体を同一クレードの別の単離体の配列の合理的な代表として用いることができる。従って、組換え事象、代替スプライシングまたは変異の結果である遺伝子または核酸分子の天然変種を用いて本発明の組成物を作製し、そして本明細書に記載する方法を実施することができるこれらの変種を本明細書で単にHIVの組換え体と称することができる。さらに、いずれかの構築物内の一つまたは複数のインサートを変異させてヒトにおけるその天然の生物学的活性を低減させることができるそしてそれによりその安全性を高めるこれらのヒトにより作製された変種を本明細書でHIVの組換え体と称することもできる同様に天然発生組換え体が存在する。前記したように、JS2、JS7およびJS71の記載では、そして以下に記載するように例えば実施例7から10を参照、キャプシド形成に参加する配列に変異を導入することができる。例えばHIV例えばHIV1の非コード化制御配列のシス作動性RNAキャプシド形成配列を例えばその全てまたは一部の欠失により変異させることができる。また別に、あるいはそれに加えて、いずれかの抗原タンパク質例えば前記で列挙したものを含むいずれかのHIV抗原例えばウイルスRTまたはプロテアーゼをコードする配列を変異させることができる。例えば本発明の組成物は2個のベクター:a第1サブタイプまたは組換え体のヒト免疫不全ウイルスHIVに対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第1ベクター、およびb第2サブタイプまたは組換え体のHIVに対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第2ベクター;を有するものを含む。組成物は薬学的に許容されるものでよく、そして担体またはアジュバントさらに以下で論じるを含むことができる。さらに、第1ベクターのインサートまたは第2ベクターのインサートは2つまたはそれ以上の、agag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vprもしくはvpu遺伝子、またはbその変異体、および選択的にcHIVゲノムの非コード化制御配列単一のプロモーターの配列を含む;の配列を含むことができる。2つまたはそれ以上の配列のうちの少なくとも1つは変異体であるか、またはウイルスRNAのキャプシド形成を制限するように変異させることができる複数の変異がキャプシド形成を感知できるほどに制限するのが好ましい。当技術分野において公知の技術を用いて変異を導入し、そして例えば発現または免疫原性に及ぼすその影響を決定することができ;依然十分に発現される例えば野生型の対応物とほぼ同様に、またはそれよりも良好に発現される抗原が、その野生型の対応物よりも生物学的活性が低い抗原は本発明の範囲内である。免疫応答を検定するための技術を利用することもできる。例えば抗ウイルス抗体またはウイルス特異的T細胞を検出することができる。変異体構築物例えばワクチンインサートは本明細書で記載する一つまたは複数の置換変異体例えば実施例参照または別のHIVクレードの類似の変異をコードする配列を含むことができる。さらに、または、それをコードする遺伝子配列の一部を除去することによりHIV抗原の活性を低くすることができる。このように、本発明の組成物は、免疫応答を引き出すことができるが、変異体であり対応する野生型配列とは異なる長さのタンパク質をコードしても異なる内容のタンパク質をコードしても、そしてそれにより患者において発現されたときに正常な生物学的機能をあまり実行できない抗原をコードする構築物を含むことができる。前記したように、分子生物学および免疫学で標準的な技術を用いて発現、免疫原性、および活性を検定することができる。いくつかのプラスミドを構築し、そしてそれを用いて抗原を発現させた例えばpGA2JS2構築物でマカクにおける免疫原性の研究を行った。作成しそして使用したプラスミドにはpGA1およびその誘導体pGA11およびpGA12;並びにpGA2およびその誘導体pGA21およびpGA22などがある実施例1から8を参照。作製したワクチン構築物は典型的には骨格ベクターおよびインサートと称され、バックスラッシュとは区別されている。これらの構築物はHIV1抗原を発現し、そしてこれらの構築物を本明細書で記載するように患者に投与することができる。抗原野生型および投与するためにそれを安全にする変異を含有するものを以下で詳細に論じるが、ここでは現在の証拠に基づいて、JS7様インサートを含有するプラスミドは、JS2様インサートを含有するプラスミドよりもさらに良好な免疫原性を呈するようであり、そして抗Env抗体により明らかであるように免疫応答のプライミングにさらに有効であることに留意される。pGA2JS7およびpGA2JS71はpGA2JS2とはいくつかの点で異なっており、その1つはその各々の抗原の供給源である。pGA2JS7およびpGA2JS71では、GagおよびPol遺伝子がHIV1HXB2から得られ、一方pGA2JS2ではこれらの遺伝子はHIV1の非常に近縁の単離体であるHIV1BH10から得られた。従って、本発明はHIV1HXB2から得られたGagおよびPol遺伝子を含むインサート並びにそれらを含有するベクターおよび組成物を特徴とする。さらにこれらのインサートはGagPolにより実行される一つまたは複数の生物学的活性を阻害する変異を含有することができる。JS7およびJS2と称されるワクチンインサートもまた、JS7がそのプロテアーゼ遺伝子に不活性化点変異を有している点で異なっている。この変異は、本発明者らが考えるには、pr55Gagタンパク質の時期尚早な細胞内切断を妨げることにより、ウイルス様粒子VLPの形成を促進する。pGA2JS7およびpGA2JS71の双方はこのプロテアーゼ変異を含有し、そして双方の構築物はVLPを大量に生成する。従って、本発明は変異体gagおよびまたはpol配列例えばプロテアーゼ遺伝子を阻害する変異例えば一つまたは複数の欠失または点変異を含むインサートを特徴とする。pGA2JS71のvpu遺伝子におけるさらなる点変異により、Vpu発現の喪失およびEnv発現の増加に至るpGA2JS71では、Vpuの開始部位が顆粒のATGと一緒に変異されVpuの翻訳を排除する。Env発現の増加はGag発現に影響しない。gag、polを含むいずれかのワクチンインサート;ウイルスプロテアーゼをコードするいずれかのワクチンインサート;またはvpu遺伝子を含むいずれかのワクチンインサートにおいてそれが得られたクレードまたは単離体に関わらず同一のまたは類似の変化を起こすことができる。さらに、本明細書で記載するいずれかのプラスミドまたはベクター化された生ワクチン例えばMVAに配置されたワクチンインサートにこれらの変化を起こすことができるすなわちpGAベクター、pGAベクター自体、または単独でまたはDNAプライムした患者と関連して例えばブーストするために用いることができるワクシニアベクターの一つまたは複数の特徴または特性を有しているいずれかのプラスミドにおいて。本発明の範囲内のいずれかのプラスミドを細胞、例えば293T細胞ヒト胚腎細胞系をトランスフェクトし、そして例えば抗原捕捉ELISAまたはウェスタンブロットにより抗原発現のレベルを検定することにより発現に関して試験することができる。本明細書で試験するプラスミドに匹敵するか、またはそれよりも高いレベルで免疫原を発現するプラスミドは強力な治療候補であり、そして本発明の範囲内であるもちろん、それが作製する抗原発現のレベルに関わらず、有効な免疫応答例えば、いずれかの望ましい程度の感染からの保護またはその他の治療上の利益を引き出すいずれかの構築物は本発明の範囲内である。VLPを生成するための候補ベクターの能力を同様に検定することができ;VLPに類似するベクターの生成物が増えるほど、それらが強力な抗体応答を引き出す可能性が高くなるこれは望ましい特徴であるが、それにも関わらず、VLPの形成に失敗したベクターは有用であり、そして本発明の範囲内である。細胞培養中の発現およびVLP形成を検定することに加えて、インビボで候補ベクターを検定することができる。例えば、動物モデルにおいてそして最終的にはヒト患者において免疫原性を検定することができる。実質的に本明細書に記載するpGAベクターと同一の配列を有し、そして本明細書に記載する一つまたは複数の抗原を発現するプラスミドは、それが患者において治療上有益な応答を誘起または増強するのに十分免疫原性である限り、本発明の範囲内であるたとえプラスミドの一つまたは複数の構成部分、例えばマーカー遺伝子または抗生物質抵抗性遺伝子が除去されていても、プラスミドは実質的にpGAベクターと同一の配列を有することができる。動物の免疫原性に関する試験では、そのペプチドに応答するT細胞の頻度を評価するために、抗原ペプチドでの刺激に応答するIFNγ生成に関して細胞内サイトカインアッセイ法またはELISPOTアッセイ法を実施することができる。増殖アッセイ法を実施することもできる。一過性のトランスフェクションにより生成された抗原を刺激に用いることができ、そして偽トランスフェクション培養物の上澄を対照として提供することができる。望む場合、データを刺激インデックスとして提示することができる偽抗原の存在下の培養物の成長により分けられた病原性例えばウイルス抗原の存在下での培養物の成長。pGA1およびpGA2ならびにそれらの誘導体を含む本発明の核酸ベクターは、いずれかのHIVクレードまたは単離体すなわちHIVのいずれかのサブタイプまたは組換え体から得られるか、または誘導される少なくとも1つの抗原これを免疫原と称することもできるをコードすることができる。抗原または免疫原性は、HIVウイルスの構造成分でよく;グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化されてよく;細胞内で、細胞表面で発現されるか、または分泌されてよい通常分泌される抗原は分泌を指向するシグナル配列に連結されていてよい。さらに具体的には、抗原はGag、gp120、Pol、Env例えばCCR5を用いるEnv;例えば図19参照、Tat、Rev、Vpu、Nef、Vif、Vpr、またはVLP例えばEnv欠損HIVVLPなどのVLPを形成できるVLPから誘導されたポリペプチドの全てまたは抗原部分でよい。特定のインサートおよびインサート担持組成物は以下を含む。組成物がインサートを伴うベクターまたはインサート単独のいずれかを含み、そしてインサートが単一の抗原をコードする場合、抗原は野生型かまたは変異体gag配列例えばジンクフィンガーをコードする一つまたは複数の配列において変異を有するgag配列例えば配列番号:7もしくは8の1279~1281位、1288~1290位、1342~1344位もしくは1351~1353位のいずれかの位置で、または別のクレードのHIVgag配列の類似の位置でのヌクレオチドでの変異でよい。変異はコードされたタンパク質を変化させることを意図しているので、サイレント変異ではない例えばコドンの第3塩基ゆらぎ位置でのもの本発明のインサートに含まれるgagまたはいずれか別のHIV配列の文脈で、これは真実である。一つまたは複数のちょうど列挙した位置での変異は、392、395、413または416位の一つまたは複数のシステイン残基を別の残基例えばセリンに変化させる。または、変異は配列番号:10~13の1271~1273位、1280~1282位、1334~1336位、もしくは1343~1345位のいずれかの位置、または別のクレードのHIVgag配列の類似の位置でよい。このような変異は390、393、411または414位の一つまたは複数のシステイン残基を別の残基例えばセリンに変化させる。または、変異は配列番号:14または15の1260~1262位、1269~1271位、1323~1325位、もしくは1332~1334位のいずれかの位置、または別のクレードのHIVgag配列の類似の位置でよい。このような変異は390、393、411または414位の一つまたは複数のシステイン残基を別の残基例えばセリンに変化させる。組成物がインサートを伴うベクターまたはインサート単独のいずれかを含み、そしてそのインサートが複数のタンパク質抗原をコードする場合、抗原の1つは野生型または前記したものを含む変異体gag配列でよい。同様に、組成物が1つより多くの型のベクターまたは1つより多くの型のインサートを含む場合、少なくとも1つのベクターまたはインサート単一の抗原をコードしても、複数の抗原をコードしてもは、野生型または前記したものもしくは別のHIVクレードに由来する類似の配列を含む変異体gag配列を含むことができる。例えば、組成物が第1および第2ベクターを含む場合、いずれかまたは双方のベクターのワクチンインサートはインサートが単一の抗原をコードしても、複数の抗原をコードしてもGagをコードすることができ;双方のベクターがGagをコードする場合、第1ベクターのGag配列は一方のHIVクレード例えばクレードBに由来してよく、そして第2ベクターのGag配列は他方のHIVクレード例えばクレードCに由来してよい。組成物がインサートを伴うベクターまたはインサート単独のいずれかを含み、そしてインサートが単一の抗原をコードする場合、抗原は野生型かまたは変異体Polでよい。配列は一つまたは複数の核酸を除去または置換することにより変異され、そしてこれらの削除または置換により、結果的にその野生型の対応物よりも酵素活性の低いPol遺伝子産物を生成することができる例えば低インテグラーゼ活性、低逆転写酵素RT活性、または低プロテアーゼ活性。例えば配列番号:7の2454~2456位または2697~2699位の一つまたは複数の位置で、または別のサブタイプもしくは組換え体の配列の類似の位置で変異を導入することによりRTを阻害することができる。本発明は酵素活性に及ぼすいずれかの特定の影響を有する変異に限定されるわけではないが、2454~2456位での変異はポリメラーゼ活性を不活性化することによりRTを阻害し、そして2697~2699位での変異は鎖転移活性を切除することによりRTを阻害すると考えられる。従って、これらの変異および遺伝子産物の活性に及ぼす類似の影響を有するその他の変異は本発明の範囲内である。さらに具体的には、変異は配列番号:7の2454~2456位のヌクレオチドによりコードされるアミノ酸アスパラギン酸Dをいずれか別のアミノ酸例えばアスパラギンNに変化させることができる。また別に、あるいは加えて、例えば配列番号:7の3333~3335位のヌクレオチドに変異例えばグルタミン酸残基EをトリプトファンWに変化させる変異を導入することにより、ポリメラーゼのRNアーゼH活性を阻害することができる。または、変異は配列番号:8または9別のクレードBインサートの2418~2420位、2661~2663位、または3297~3299位のいずれかの位置でよい。または、変異は配列番号:10から13の2410~2412位、2653~2655位、または3289~3291位のいずれかの位置でよい例えばこれらの位置のアルパラギン酸D、トリプトファンWおよびグルタミン酸E残基を各々アスパラギンN、スレオニンT、およびまたはグルタミンQに変化させることができる。または、変異は配列番号:14または15の2387~2389位、2630~2632位、または3266~3268位のいずれかの位置でよい。当業者は別のクレードの類似の残基をコードする核酸を、たとえこれらの残基が本明細書で試験したクレードの位置と正確に同一の位置で見出されなくても、同定することができる。組成物がインサートを伴うベクターまたはインサート単独のいずれかを含み、そしてそのインサートが複数のタンパク質抗原をコードする場合、抗原の1つは野生型または前記したものを含む変異体pol配列でよいこれらの多タンパク質コード化インサートは野生型または前記した変異体gag配列をコードすることもできる。同様に、組成物が1つの型のベクターまたは1つより多くの型のインサートを含む場合、少なくとも1つのベクターまたはインサートは単一の抗原をコードしても、複数の抗原をコードしても、野生型または前記したものを含む変異体pol配列および、選択的に、野生型または前記したものを含む変異体gag配列すなわちインサートはGagPolをコードすることができるを含むことができる。例えば、組成物が第1および第2ベクターを含む場合、いずれかまたは双方のベクターのワクチンインサートはインサートが単一の抗原をコードしても、複数の抗原をコードしてもPolをコードすることができ;双方のベクターがPolをコードする場合、第1ベクターのPol配列は一方のHIVクレード例えばクレードBに由来してよく、そして第2ベクターのPol配列は他方のHIVクレード例えばクレードAGに由来してよい。インサートがいくつかまたは全てのpol配列を含む場合、変化できるpol配列の別の部分はプロテアーゼ活性をコードする配列である別のPolの酵素活性に影響する配列が変化していてもいなくてもそれに関わらない。例えば、配列番号:8の1641~1643位で変異例えば通常このコドンによりコードされるグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、例えばアラニンAに変化させる変異を導入することができる。本明細書に記載する別の変異体例えばgag変異体と同様に、別のHIVクレードから得られた配列に類似の変異を作ることができる。例えば、配列番号:10の1633~1635位アルギニンRを別のアミノ酸、例えばアスパラギンNに変化させる、配列番号:12の1703~1705位グリシンGを別の残基、例えばバリンVに変化させるまたは配列番号:13の1828~1830位ロイシンLを別の残基、例えばメチオニンMに変化させるに変異を導入することができる配列番号:10、12および13は全てクレードAG配列を示す。クレードCのインサートでは、配列番号:14の1610~1612位で変異を導入することができるアスパラギン酸Dを別のアミノ酸残基、例えばアスパラギンNなどに変化させる。組成物がインサートを伴うベクターまたはインサート単独のいずれかを含み、そしてそのインサートが単一の抗原をコードする場合、抗原は野生型または変異体Env、Tat、Rev、Nef、Vif、Vpr、またはVpuでよい。組成物がインサートを伴うベクターまたはインサート単独のいずれかを含み、そしてそのインサートが複数のタンパク質抗原をコードする場合、抗原の1つは野生型または変異体Envでよい。例えば複数のタンパク質発現インサートが野生型または変異体GagPolおよびEnvをコードすることができ;それらはまた野生型または変異体GagPolおよびEnv並びに一つまたは複数のTat、Rev、Nef、Vif、Vpr、またはVpuその各々は野生型または変異体でよいをコードすることができる。その他の抗原と同様、Env、Tat、Rev、Nef、Vif、Vpr、またはVpuを一つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換により変異させることができる例えばこれらの抗原のいずれかは点変異を含むことができる。Envに関しては、一つまたは複数の変異は図19に示すいずれかのドメインにおいてでよい。例えば、一つまたは複数のアミノ酸をgp120表面およびまたはgp41膜貫通切断生成物から除去することができる。Gagに関しては、一つまたは複数のアミノ酸を一つまたは複数の、マトリックスタンパク質p17、キャプシドタンパク質p24、ヌクレオキャプシドタンパク質p7およびC末端ペプチドp6;から除去することができる。例えば一つまたは複数のこれらの領域におけるアミノ酸を除去することができるこれは特に、ベクターがウイルスベクター、例えばMVAである場合に望ましい。Polに関しては、一つまたは複数のアミノ酸をプロテアーゼタンパク質p10、逆転写酵素タンパク質p66p51、またはインテグラーゼタンパク質p32から削除することができる。さらに具体的には、本発明の組成物は、a一つまたは複数のジンクフィンガーが不活性化されていてウイルスRNAのパッケージングが制限されているGagタンパク質;biインテグラーゼ活性がいくつかのまたは全てのpol配列の欠失により阻害されている、およびiiポリメラーゼ、逆転写酵素の鎖転移およびまたはRNアーゼH活性がpol配列内の一つまたは複数の点変異により阻害されているPolタンパク質;並びにc変異を伴うかまたは伴わないEnv、Tat、Rev、およびVpu;をコードするベクター例えばプラスミドまたはウイルスベクターを含むことができる。この態様では、その他と同様、コードされたタンパク質をサブタイプA、BもしくはCHIV例えばHIV1またはその組換え体から得るか、または誘導することができる。組成物が同一でないベクターを含む場合、各々の型のベクターの配列は異なるHIVクレードもしくはそのサブタイプまたは組換え体に由来してよい。例えば、本発明はちょうど記載した抗原GagPol、Env等をコードするプラスミドベクターを含む組成物を特徴とし、その場合、プラスミドのいくつかは1つのクレードから得られるかまたは誘導される抗原を含み、そしてその他のプラスミドは別のクレードから得られるまたは誘導される抗原を含む。2、3、4、5、6、またはそれ以上のクレード全クレードを含むを示す混合物は本発明の範囲内である。第1および第2ベクターが組成物に含まれる場合、いずれかのベクターはpGA1JS2、pGA1JS7、pGA1JS71、pGA2JS2、pGA2JS7、pGA1JS71でよいpGA11またはpGA12をpGA1の代わりに用いることができ、そしてpGA21またはpGA22をpGA2の代わりに用いることができる。同様にいずれかのベクターはpGA1IC25、pGA1IC2、pGA1IC48、pGA1IC90、pGA2IC25、pGA2IC2、pGA2IC48またはpGA2IC90でよいここでもpGA11またはpGA12をpGA1の代わりに用いることができ、そしてpGA21またはpGA22をpGA2の代わりに用いることができる。また別の態様では、コードされたタンパク質はサブタイプCHIV例えばHIV1もしくはその組換え体のタンパク質、またはそれから誘導されたタンパク質でよい。例えば、ベクターはpGA1IN2、pGA11IN2、pGA12IN2、pGA1IN3、pGA11IN3、pGA12IN3、pGA2IN2、pGA21IN2、pGA22IN2、pGA2IN3、pGA21IN3またはpGA22IN3でよい。コードされたタンパク質はまたいずれかのHIVクレードまたはサブタイプE、F、G、H、I、J、KもしくはLまたはその組換え体のタンパク質、またはそれから誘導されたタンパク質でもよい。HIV1分類系はLosAlamosNationalLaboratoryHIVSequenceCompendium2001、Kuikenら、TheoreticalBiologyandBiophysicsGroupT10LosAlamos、ニューメキシコ州により発行2001;http:hivweblanlgovにより公開されている。本発明の組成物はまたa1つのまたは双方のジンクフィンガーが不活性化されているGagタンパク質;biインテグラーゼ活性がいくつかのまたは全てのpol配列の欠失により阻害されている、iiポリメラーゼ、逆転写酵素の鎖転移およびまたはRNアーゼH活性がpol配列内の一つまたは複数の点変異により阻害されている、およびiiiプロテアーゼのタンパク質溶解活性が一つまたは複数の点変異により阻害されているPolタンパク質;並びにc変異を伴うかまたは伴わないEnv、Tat、Rev、およびVpu;をコードするベクター例えばプラスミドベクターを含むことができる。前記したように、配列番号:8の1641~1643位で、または別のHIVクレードの配列の類似の位置で変異を導入することによりタンパク質溶解活性を阻害することができる。例えば、プラスミドは本明細書でJS7、IC25およびIN3として記載したインサートを含有することができる。別の抗原をコードするプラスミドでも当てはまることであるが、ちょうど記載した抗原をコードするプラスミドは異なるHIVクレードもしくはそのサブタイプまたは組換え体から得られるかまたは誘導される別のプラスミドと組み合わせる例えば混合することができる。インサート自体sansベクターもまた本発明の範囲内である。本発明のその他のベクターはGagタンパク質例えば1つまたは双方のジンクフィンガーが不活性化されているGagタンパク質;Polタンパク質例えばインテグラーゼ、RTおよびまたはプロテアーゼ活性が阻害されているPolタンパク質;Vpuタンパク質変異体開始コドンを有する配列によりコードされていてよい;並びにEnv、TatおよびまたはRevタンパク質野生型または変異体をコードするプラスミドを含む。その他の抗原をコードするプラスミドにも当てはまることであるが、ちょうど記載した抗原をコードするプラスミドを、異なるHIVクレードもしくはそのサブタイプまたは組換え体から得られるかまたは誘導される抗原をコードするその他のプラスミドと組み合わせる例えば混合することができる。インサート自体sansベクターもまた本発明の範囲内である。クレードBHIV1配列のJS2またはJS7シリーズを発現するものを含む前記したプラスミドをいずれかの対象に投与することができるが、クレードBのHIVに暴露されているか、または暴露されている可能性がある対象に投与するのが最も有利であろう同じことがプラスミドベクター以外のベクターにも当てはまる。同様に、クレードCHIV1配列のINシリーズを発現するプラスミドまたはその他のベクターをクレードCのHIVに暴露されているか、または暴露されている可能性のある対象に投与することができる。種々のクレードの抗原を発現するベクターを組み合わせて1つより多くのクレードに対する免疫応答を引き出すことができるので1つのベクターが異なるクレードに由来する複数の抗原を発現しても、複数のベクターが異なるクレードに由来する単一の抗原を発現しても、これを達成することができる、規定の対象を最も良く保護するワクチン処方を調整することができる。例えば、対象がクレードB以外のクレードが優勢である世界の地域に暴露される可能性がある場合、優勢なクレードまたは複数のクレードに対する免疫応答を引き出すことを最適化する抗原または複数の抗原を発現するベクターまたは複数のベクターを処方および投与することができる。それが発現する抗原は、変えることができるプラスミドベクターの一部だけではない。有用なプラスミドは実質的に転写相補的塩基対形成によりRNA分子がDNA鋳型で形成される方法を阻害するターミネーター配列を含有してもしなくてもよい。有用なターミネーター配列はラムダT0ターミネーターおよびその機能的断片または変種を含む。ターミネーター配列は同一の配向でのベクター内、および原核細胞において発現されるいずれかのオープンリーディグフレームのC末端に位置するすなわちターミネーター配列およびオープンリーディグフレームは動作可能なように連結されている。原核細胞内でプラスミドが複製されるので、選択マーカーからワクチンインサートへの読み過ごしを防御することにより、細菌が成長し、そしてプラスミドが複製するのでターミネーターがインサートを安定化する。選択マーカー遺伝子は当技術分野において公知であり、そして例えばマーカーが発現される細胞に抗生物質抵抗性例えばカナマイシン、アンピシリン、またはペニシリンに対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。選択マーカーはマーカーの不在下でそれを破壊する条件下で、その生存により細胞を選択することを可能にするためにそのように称されている。選択マーカー、ターミネーター配列、または双方または各々のもしくは双方の一部を、必ずしも必要ではないが、それが患者に投与される前にプラスミドから切除することができる。同様に、プラスミドベクターを環状形態で、制限エンドヌクレアーゼで消化することにより直線化した後に、またはベクター骨格のいくつかを変化させるかもしくは除去した後に投与することができる。核酸ベクターは複製起点例えば原核細胞oriおよび、一つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するのに加えて、抗原コード化インサートをクローン化でき、選択的にプロモーター配列およびポリアデニル化シグナルを含むことができる転写カセットを含むこともできる。強力なプロモーターとして公知のプロモーターを用いることができ、そしてそれが好ましい。このようなプロモーターの1つはサイトメガロウイルスCMV極初期プロモーターであるが、本発明の範囲から逸脱することなくその他の弱いものを含むプロモーターを使用することができる。同様に、強力なポリアデニル化シグナルを選択することができる例えばウシ成長ホルモンBGHコード化遺伝子に由来するシグナル、またはウサギβグロビンポリアデニル化シグナルBohmら、JImmunolMethods193:29401996;Chapmanら、NuclAcidsRes19:397939861991;Hartikkaら、HumGeneTherapy7:120512171996;Manthorpeら、HumGeneTherapy4:4194311993;Montgomeryら、DNACellBiol12:7777831993。ベクターはさらにリーダー配列組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子リーダー配列tPAの合成相同体であるリーダー配列は選択的に転写カセットにあってもよいおよびまたはイントロン配列例えばサイトメガロウイルスCMVイトロンAまたはSV40イントロンを含むことができる。イトロンAの存在によりRNAウイルス、細菌および寄生虫に由来する多くの抗原の発現が増加し、これは恐らく真核細胞mRNAとしてのプロセシングおよび機能を支持する配列を有するRNAを発現させることにより提供される。当技術分野において公知のその他の方法、例えば非限定例としては、真核細胞の原核細胞性mRNAのコドン使用の最適化などにより発現を増強することもできるAndreら、JVirol72:149715031998;Uchijimaら、JImmunol161:559455991998。マルチシストロン性ベクターを用いて1つより多くの免疫原または免疫原および免疫刺激タンパク質を発現させることができるIwasakiら、JImmunol158:459146011997a;Wildら、Vaccine16:3533601998。このようにおよびベクター構築物のその他の選択的な成分でも当てはまることであるが、一つまたは複数のHIVクレードまたは単離体に由来する一つまたは複数の抗原をコードするベクターは、必ずしも必要ではないが、リーダー配列およびイントロン例えばCMVイントロンAを含むことができる。本発明のベクターは抗原コード化配列を受け入れるために用いることができる部位で、そして転写カセットがCMVIEプロモーターのイントロンA配列を含むかどうかで異なっている。従って、当業者は本発明の範囲から逸脱することなく、プラスミド内の複数の挿入部位または複数のクローニング部位を修飾することができる。イントロンAおよびtPAリーダー配列の双方は、場合によっては抗原発現を増強することが示されているChapmanら、NuclAcidsResearch19:397939861991。以下でさらに記載するように、本発明のベクターを、遺伝子アジュバントなどのアジュバントと共に投与することができる。従って、核酸ベクターは、それが発現する抗原に関わらず、選択的にGMCSF、IL15、IL2、インターフェロン応答因子、分泌型flt3、および変異カスパーゼ遺伝子のような遺伝子アジュバントを含んでもよい。例えば一つまたは複数のC3d遺伝子配列例えば1から3個のまたはそれ以上のC3d遺伝子配列を発現された抗原に融合することにより、遺伝子アジュバントを融合タンパク質の形態で供給することもできる。投与されたベクターがpGAベクターである場合、これは例えばpGA1配列番号:1もしくはその誘導体配列番号:2および3またはpGA2配列番号:4もしくはその誘導体配列番号:5および6の配列を含むことができる。pGAベクターを本明細書でさらに詳細に記載する実施例1から8をも参照。pGA1はプロモーターbp1~690、CMVイントロンAbp691~1638、tPAリーダー配列の合成擬似体bp1659~1721、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列bp1761~1983、ラムダT0ターミネーターbp1984~2018、カナマイシン抵抗性遺伝子bp2037~2830およびColEIレプリケーターbp2831~3890を含む3897bpのプラスミドである。pGA1構築物のDNA配列配列番号:1を図2に示す。図1では、指示した制限部位は抗原コード化配列をクローニングするのに有用である。ワクチンインサートの5末端をtPAリーダーの上流にクローニングする場合、ClaIまたはBspDI部位を用いる。tPAリーダー配列と共にフレーム内で配列をクローニングするためにNheI部位を用いる。SmaIとBlnIとの間に列挙された部位を抗原コード化配列の3末端をクローニングするために用いる。pGA2はpGA1に見出されるイントロンA配列の947bpを欠く2947bpのプラスミドである。pGA2はイントロンA配列の欠失以外はpGA1と同一である。pGA2は効率的な発現のために上流のイントロンを必要としない配列のクローニング、または上流のイントロンが良好な発現のために必要とされるスプライシングのパターンに干渉する配列のクローニングに役立つ。図5はワクチンインサートをクローニングするのに有用な制限部位を有するpGA2の概要のマップを示す。図6aはpGA2配列番号:2のDNA配列を示す。ワクチンインサートをpGA2にクローニングするための制限部位の使用はpGA1に断片をクローニングするのに用いられるものと同一である。pGA21およびpGA22はpGA2の多重クローニング部位誘導体である。図7aおよび8aは各々pGA21配列番号:5およびpGA22配列番号:6のDNA配列を示す。本明細書に開示したものと異なる骨格配列を有するpGAプラスミドもまた、プラスミドが治療上有効であるのに必要な実質的に全ての特性を有する限り本発明の範囲内である例えば患者に投与した場合、プラスミドが所定のまたは望ましい病原体に対する免疫応答を誘起または増強する限り、ヌクレオチドを置換し、ヌクレオチドを付加し、またはヌクレオチドを除去することができる。例えば1から10個、11から20個、21から30個、31から40個、41から50個、51から60個、61から70個、71から80個、81から90個、91から100個、または100個より多くのヌクレオチドを除去または置換することができる。1つの態様では、患者にベクターを含む治療上有効量の生理学的に許容される組成物を投与することにより本発明の方法例えば患者において免疫応答を引き出す方法を実施することができ、前記ベクターはHIVに対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含有することができる。ベクターは前記したpGA構築物の一つまたは複数の特性例えば選択マーカー遺伝子、原核細胞性複製起点、終止配列例えばラムダT0ターミネーターそして選択遺伝子マーカーに動作可能なように連結されている、並びにプロモーター配列、免疫不全ウイルスから誘導された少なくとも1つの抗原をコードする核酸インサート、およびポリアデニル化シグナル配列を含む真核細胞性転写カセットを有するプラスミドベクターでよい。もちろん、本発明のワクチンインサートをpGA構築物例えばpGA1またはpGA2以外のベクターの特性を有さないプラスミドベクターにより分配することができる。または、組成物は本明細書に記載するインサートを含むいずれかのウイルスまたは細菌ベクターを含むことができる。従って、本発明は単一の型のベクターすなわち同一のワクチンインサートすなわち同一抗原をコードするインサートを含有するプラスミドまたはウイルスベクターの投与を包含する。他でも明らかであるように、患者に2つの型のベクターを投与することができ、そしてこれらのベクターの各々が異なるクレードのHIVに対する免疫応答を引き出すことができる。例えば本発明はaヒト免疫不全ウイルスHIVの第1サブタイプまたは組換え体に対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第1ベクターおよびbHIVの第2サブタイプまたは組換え体に対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第2ベクターを含む組成物を患者に投与する方法を特徴とする。第1および第2ベクターは本明細書に記載するいずれかでよい。同様に第1および第2ベクターのインサートは本明細書に記載するいずれかでよい。治療上有効量のベクター第1、第2、第3等のベクターを考慮したとしてもを筋肉内または皮内経路により、生理学的に許容される担体、希釈剤、また賦形剤、および選択的にアジュバントと一緒に投与することができる。治療上有効量のいくつかのまたは異なるベクターを続いて筋肉内または皮内経路により、生理学的に許容される担体、希釈剤、また賦形剤、および選択的に免疫応答をブーストするためのアジュバントと一緒に投与することができる。それが誘導されたワクチンまたはベクターに組み込まれる抗原の正確な特性に関わらず、当業者はこのような成分を容易に選択することができる。本発明のプラスミドベクターのみを投与することにより、本発明のウイルスベクターまたは組換えウイルスのみを投与することにより、または双方を投与することにより例えばプラスミドベクターまたはプラスミドベクターの混合物または組み合わせを投与することができる免疫応答をプライムするように、そしてウイルスベクターまたは組換えウイルスまたはウイルスベクターの混合物もしくは組み合わせが免疫応答をブーストするように免疫応答を引き出す方法を実施することができる。プラスミドおよびウイルスベクターまたは組換えウイルスを投与する場合、そのインサートは対合することができる。対合するために、プラスミド内のインサート例えばGagをコードする配列、Envをコードする配列等および組換えウイルス内のウイルスベクターの一つまたは複数の配列が同一であるが、用語はそれほど限定的ではない。対合する配列はまた互いに異なっていてもよい。例えば、ウイルスベクターで感染された細胞において、DNAベクターに用いた配列が変異しているか、またはさらに変異してその配列をコードするウイルスベクターの複製およびコードされた抗原例えばGag、GagPol、またはEnvの発現を可能にするまたは最適化する場合、ウイルスベクターにより発現されるインサートはDNAベクターにより発現されるインサートに対合する。少なくともいくつかの本発明の免疫不全ウイルスワクチンインサートを設計して単一のDNAから非感染性VLP真のVLPおよびウイルスタンパク質の凝集物を包含し得る用語を作製した。通常免疫不全ウイルスにより用いられて単一のウイルスRNAから複数の遺伝子産物を発現するサブゲノムスプライシングエレメントを用いてこれを達成した。サブゲノムスプライシンパターンはi全長ウイルスRNAに存在するスプライシング部位およびアクセプター、iiRev応答性エレメントRREおよびiiiRevタンパク質により影響を受ける。レトロウイルスRNAのスプライシング部位は真核細胞性RNAのスプライシング部位に関する正準配列を使用する。RREはRevタンパク質と相互作用して核から細胞質へのウイルスRNAの輸送を可能にするおよそ200bpのRNA構造である。Revの不在下で、免疫不全ウイルスのおよそ10kbのRNAがほとんど制御遺伝子Tat、Rev、およびNefに関するmRNAにスプライシングを被る。これらの遺伝子はRTおよびEnvの間およびゲノムの3末端に存在するエクソンによりコードされる。Revの存在下では、Envに関する1つスプライシングされたmRNAおよびGagおよびPolに関するスプライシングされていないmRNAが、Tat、Rev、およびNefに関して複数スプライシングされたmRNAに加えて発現される。単一のDNAからの非感染性VLPの発現は、免疫不全ウイルスワクチンに多くの利点を付与する。単一のDNAからの多くのタンパク質の発現は、ワクチン接種された宿主にこれらのタンパク質に包含される幅広いTおよびB細胞エピトープに応答する機会を与える。複数のエピトープを含有するタンパク質の発現により、様々な組織適合型によるエピトープの提示が可能になる。タンパク質全体を用いることにより、異なる組織適合型の宿主に幅広いT細胞応答を上昇させる機会が提供される。これはその高い変異率が免疫応答から即座に逃れるための助けとなる免疫不全ウイルス感染の有効な封じ込めに必須であるEvansら、NatMed5:127012761999;Poignardら、Immunity10:4314381999、Evansら、1995。本発明のワクチン接種スキームの文脈で、薬物治療にも当てはまるように、逃れるために複数の変異を必要とする多重エピトープT細胞応答は単一のエピトープT細胞応答これは逃れるために単一の変異のみを必要とするよりも良好な保護を提供する。また免疫原を操作して、発現された抗原を特定の細胞区画に標的化させることにより抗体またはTcを上昇させるのに多かれ少なかれ有効にすることもできる。例えば抗体応答は細胞の細胞質膜に提示されるか、またはそこから分泌される抗原により、細胞の内部に局在する抗原によるよりもさらに有効に上昇するBoyleら、IntImmunol9:189719061997;Inchauspeら、DNACellBiol16:1851951997。迅速な細胞質分解およびMHCI経路へのさらに有効なペプチド負荷を引き起こすプロテオソームにDNAコード化タンパク質を標的化するN末端ユビキチン化シグナルを用いることによりTc応答を増強させることができるRodriguezら、JVirol71:849785031997;Toberyら、JExpMed185:9099201997;Wuら、JImmunol159:603760431997。DNA上昇免疫応答についての機構的な基礎に関する概説に関しては、RobinsonおよびPertmer、AdvancesinVirusResearch53巻、AcademicPress2000を参照されたい。免疫応答を操作する別の研究法は免疫原を免疫標的化または免疫刺激分子に融合させることである。今日では、最も成功するこれらの融合は、分泌された免疫原を抗原提示細胞APCまたはリンパ節に標的化するBoyleら、Nature392:4084111998。従って、本発明は、免疫標的化または免疫刺激分子、例えばCTLA4、Lセレクチン、またはサイトカイン例えばIL1、IL2、IL4、IL7、IL10、IL15、またはIL21のようなインターロイキンに融合した本明細書に記載するHIV抗原を特徴とする。このような融合体をコードする核酸およびそれらを含有する組成物例えばベクターおよび生理学的に許容される調製物もまた本発明の範囲内である。種々の方法でDNAを分配することができ、その方法のいずれかを用いて本発明のプラスミドを対象に分配することができる。例えば、DNAを例えば生理食塩水中で注射する例えば皮下注射用針を用いるか、または微粒子銃で例えばDNAコートされたビーズを加速させる遺伝子銃により分配することができる。生理食塩水注射によりDNAが細胞外間隙に分配され、一方遺伝子銃分配はDNAを細胞に直接打ち込む。生理食塩水注射には遺伝子銃よりも多量のDNAが必要とされる典型的には100から1000倍多いFynanら、ProcNatlAcadSciUSA90:11478114821993。これらの2つの型の分配はまた、生理食塩水注射が応答を1型T細胞ヘルプに偏らせるが、一方遺伝子銃分配は応答を2型T細胞ヘルプに偏らせるという点でも異なっているFeltquateら、JImmunol158:227822841997;Pertmerら、JVirol70:611961251996。生理食塩水中で注射されたDNAは迅速に体中に拡散する。銃により分配されたDNAは標的部位により局在化する。いずれの接種方法に従っても、細胞外プラスミドDNAは半減期が約10分間と短いKawabataら、PharmRes12:8258301995;Lewら、HumGeneTher6:5531995。生理食塩水注射によるワクチン接種は筋肉内imまたは皮内idにでき;遺伝子銃分配は皮膚または外科的に暴露された組織、例えば筋肉に投与することができる。分配のその他の経路は概してあまり好ましくないが、それにも関わらず本発明の組成物を投与するために使用することができる。例えば粘膜に、または接種の非経口経路によりDNAを適用することができる。生理食塩水中のDNAの鼻内投与は良好な成功Asakuraら、ScandJImmunol46:3263301997;Sasakiら、InfectImmun66:8238261998bおよび限定的な成功Fynanら、ProcNatlAcadSciUSA90:11478114821993の双方を経験している。遺伝子銃は膣粘膜にDNAを分配した後、IgGを上昇させるのに成功したLivingstonら、AnnNewYorkAcadSci772:2652671995。DNAの粘膜表面への分配でのいくつかの成功はまたリポソームMcCluskieら、AntisenseNucleicAcidDrugDev8:4014141998、マイクロスフェアChenら、JVIrol72:575757611998a;Jonesら、Vaccine15:8148171997および組換え赤痢菌ベクターSizemoreら、Science270:2993011995;Sizemoreら、Vaccine15:8048071997を用いても達成されている。例えばこれらの作用物質リポソーム、マイクロスフェアおよび組換え赤痢菌ベクターを用いて本発明の核酸を分配することができる。応答を上昇させるのに必要なDNAの用量は分配方法、宿主、ベクター、およびコードされる抗原に依存する。分配の方法は最も影響力のあるパラメーターであろう。DNAの生理食塩水注射には概してDNA10μgから5mgが用いられ、一方DNAの遺伝子銃分配にはより典型的にはDNA02μgから20μgが用いられる。概して、マウスでは低用量のDNA生理食塩水注射には10から100μg、そして遺伝子銃分配には02μgから2μgが用いられ、そして霊長類には高用量生理食塩水注射には100から1mg、そして遺伝子銃分配には2μgから20μgが用いられる。遺伝子銃分配に必要なDNAのさらに低量は、直接DNAを細胞に分配する金ビーズを反映している。前記したDNAベクターに加えて、多くの異なるポックスウイルスを単独ですなわち核酸またはDNAプライムなしで、またはワクチン投与計画のブースト成分として用いることができる。MVAは特にマウスモデルにおいて有効であるSchneiderら、NatMed4:3974021998。MVAは、天然痘の撲滅のためのキャンペーンの終盤に開発されたワクシニアウイルスの高度に弱毒された株であり、そして100000人以上のヒトにおいて安全性が試験されたMahnelら、BerlMunchTierarztlWochenschr107:2532561994;Mayrら、ZentralblBakteriol167:3753901978。ニワトリ細胞における500を越える継代の間に、MVAはそのゲノムの約10および霊長類細胞において効率的に複製する能力を喪失した。その複製の制限にも関わらず、MVAは高度に有効な発現ベクターでありSutterら、ProcNatlAcadSciUSA89:10847108511992、霊長類におけるパラインフルエンザウイルスDurbinら、JInfectDis179:134513511999、麻疹Stittelaarら、JVirol74:423642432000および免疫不全ウイルスBarouchら、JVirol75:515151582001;Ourmanovら、JVirol74:274027512000;Amaraら、JVirol76:762576312002に関する保護免疫応答を上昇させることが判明した。MVAの相対的に高度な免疫原性はいくつかのウイルス抗免疫防御遺伝子の喪失に一部寄与しているBlanchardら、JGenVirol79:115911671998。ワクシニアウイルスを用いて組換え遺伝子発現に関して、および組換え生ワクチンとしてウイルスベクターを操作したMackettら、ProcNatlAcadSciUSA79:74157419;Smithら、BiotechGenetEnginRev2:3834971984。本明細書で記載するいずれかのHIV抗原をコードすることができるDNA配列をワクシニアウイルスのゲノムに導入することができる。遺伝子がウイルスのライフサイクルに必須でないウイルスDNAの部位で組み込まれる場合、新たに生成された組換えワクシニアウイルスを感染性にしすなわち外来の細胞を感染することができる、そして組み込まれたDNA配列を発現させることが可能である。本発明の組成物および方法の特徴であるウイルスベクターは高度に弱毒されているのが好ましい。天然痘ワクチン接種の望ましくない副作用を回避するために、ワクシニアウイルスのいくつかの弱毒株が開発された。改変ワクシニアアンカラMVAウイルスは、ニワトリ胚線維芽細胞におけるワクシニアウイルスのアンカラ株の長期の連続継代により作製されたCVA:Mayrら、Infection3:6141975参照。MVAウイルスはAmericanTypeCultureCollectionATCC;番号VR1508;Manassas、バージニア州から公に入手可能である。MVA株の望ましい特性は臨床試験において実証されているMayrら、ZentralblBakteriol167:3753901978;Sticklら、DtschMedWschr99:238623921974;SutterおよびMoss、ProcNatlAcadSciUSA89:10847108511992もまた参照。高リスク患者を含む120000人以上のヒトにおけるこれらの研究の間、MVAワクチンの使用に随伴される副作用はなかった。MVAベクターを以下のように調製することができる。DNA配列、例えば外来性のポリペプチド例えば本明細書に記載するいずれかのHIV抗原をコードし、そしてMVAゲノムでの天然発生欠失例えば欠失IIIまたはその他の複数の非必須部位;6個の主要なゲノムDNAの欠失欠失I、II、III、IV、VおよびVIと称する全部で31000塩基対が同定されているMayerら、JGenVirol72:103110381991に隣接するMVADNA配列によりフランキングされる、本明細書に記載するインサート配列を含有するDNA構築物を、相同組換えが生じる条件下で、MVAで感染させた細胞に導入する。一度DNA構築物が真核細胞に導入され、そして外来性DNAがウイルスDNAで組換えられると、当技術分野において公知の方法により組換えワクシニアウイルスを単離することができる検出マーカーの使用により単離を促進することができる。挿入されるように構築されたDNAは直線状または環状でよい例えばプラスミド、直線プラスミド、遺伝子、遺伝子断片、または修飾されたHIVゲノム。外来性DNA配列を、天然発生欠失をフランキングする配列の間に挿入する。DNA配列をより良好に発現させるために、配列は制御配列を含むことができる例えばワクシニア11kDa遺伝子または75kDa遺伝子のプロモーターのようなプロモーター。種々の方法、例えばカルシウムリン酸補助トランスフェクションGrahamら、Virol52:4564671973およびWiglerら、Cell16:7777851979、エレクトロポレーションNeumannら、EMBOJ1:8418451982、マイクロインジェクションGraessmannら、MethEnzymol101:4824921983、リポソームによるStraubingerら、MethEnzymol101:5125271983、スフェロプラストによるSchaffner、ProcNatlAcadSciUSA77:216321671980または当技術分野において公知のその他の方法などによりDNA構築物をMVA感染した細胞に導入することができる。組換えMVAウイルスの調製はMossら、PCT国際公開公報第0207275号A2国際出願番号第PCTUS0206713号にさらに詳細に記載されている。DNAを分配する場合、プラスミドベクターを用いる場合とちょうど同じように、ウイルスベクターにより適量に到達することができる。例えばMVA基盤のワクチンの1×108pfuを分配でき、そして筋肉内、皮内、静脈内または粘膜経由で投与を実施することができる。従って、本発明は、aヒト免疫不全ウイルスHIVの第1サブタイプまたは組換え体に対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第1ウイルスベクター、およびbHIVの第2サブタイプまたは組換え体に対する免疫応答を引き出す一つまたは複数の抗原をコードするワクチンインサートを含む第2ウイルスベクター;を含む組成物を特徴とする。ウイルスベクターは組換えポックスウイルスまたは改変ワクシニアアンカラMVAウイルスでよく、そしてインサートはいずれかのクレードに由来する本明細書に記載するいずれかのHIV抗原でよい例えばクレードA、B、またはCHIV例えばHIV1抗原をコードする、予防的または治療的に有効な量のMVAを投与することができる。さらに、プラスミドベクターと組み合わせて投与する場合例えばDNAプライムに続いて投与する場合、MVA担持配列はプラスミド担持配列に対合することができる。例えば、組換えクレードB配列を発現するワクシニアウイルス例えばMVAはプラスミドインサートのJSシリーズに対合することができる。同様に組換えクレードA配列を発現するワクシニアウイルス例えばMVAはプラスミドインサートのICシリーズに対合することができ;組換えクレードC配列を発現するワクシニアウイルス例えばMVAはプラスミドインサートのINシリーズに対合することができる。以下に特定のクレードを例示するが、本発明がそのように限定されるわけではない。ウイルスベクターを含有する組成物はいずれか公知のクレードクレードA、B、C、D、E、F、G、H、I、J、KまたはLなどに由来するHIV抗原を発現するウイルスベクターを含むことができる。もちろん免疫応答を引き出す方法を、同様にこれらのクレードのいずれかに由来する抗原を発現する組成物を用いて実施することができる。本明細書に記載するプラスミドまたはウイルスベクターのいずれかをアジュバントすなわちワクチンの免疫原性を高めるためにワクチンに添加されるいずれかの物質と共に投与することができ、そしていずれかの慣用される投与経路例えば筋肉内、皮内、静脈内、または粘膜経由;以下を参照により投与することができる。本明細書に記載するベクターDNAでもウイルス基盤でもと一緒に用いられるアジュバントは徐々に抗原を放出するものでよい例えばアジュバントはリポソームでよいか、またはそれ自体強力な免疫原性であるアジュバントでよいこれらのアジュバントは相乗的に機能すると考えられる。従って、本明細書に記載するワクチン組成物は公知のアジュバントまたは、DNAの取り込みを促進するか、免疫系細胞を接種部位に動員するか、または応答するリンパ細胞の免疫活性化を促進するその他の物質を含むことができる。これらのアジュバントまたは物質には油および水エマルジョン、コリネバクテリウムパルブム、バシラスカルメッテゲラン、水酸化アルミニウム、グルカン、硫酸デキストラン、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、バクトアジュバント、特定の合成ポリマー、例えばポリアミノ酸およびアミノ酸のコポリマー、サポニン、REGRESSINVetrepharm、Athens、ジョージア州、AVRIDINENNジオクタデシルNNビスプロパンジアミン、パラフィン油、並びにムラミルジペプチドなどがある。同一のまたは同時接種されたベクターの免疫変調分子をコードする遺伝子アジュバントを用いることもできる。例えばGMCSF、IL15、IL2、インターフェロン応答因子、および変異カスパーゼ遺伝子を、病原性免疫原例えばHIV抗原をコードするベクターまたは免疫原の投与と同時もしくはほぼ同時に投与される別個のベクターに含めることができる。発現された抗原をアジュバント配列、例えば1個、2個、3個またはそれ以上のC3dコピーに融合させることもできる。本明細書に記載する組成物をいずれかの非経口または局所経路を経るなどの種々の方法で投与することができる。例えば静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内の方法により個体に接種することができる。接種は例えば皮下注射用の針、針のない分配装置、例えば液体流を標的部位に推進させるものを用いて、または金ビーズ上のDNAを標的部位に打ち込む遺伝子銃を使用してよい。病原性ワクチンインサートを含むベクターを溶液、ゲル、泡または坐剤による鼻内投与、すなわち点鼻剤もしくは吸入剤、または直腸内もしくは膣内投与などの種々の方法により粘膜表面に投与することができる。または、ワクチンインサートを含むベクターを錠剤、カプセル、チュアブル錠、シロップ、エマルジョン等の形態で経口的に投与することができる。また別の態様では、ベクターを経皮的に、受動的皮膚パッチ、イオン泳動的手段等により投与することができる。いずれかの生理学的に許容される培地を用いてワクチンインサートを含むベクター核酸基盤でもベクター化された生ワクチンでもを導入することができる。例えば当技術分野において公知の適当な薬学的に許容される担体には、非限定例としては滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース、または緩衝溶液などがある。培地は補助剤、例えば希釈剤、安定剤すなわち糖グルコースおよびデキストロースが以前に記されたおよびアミノ酸、保存剤、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、粘性または注入能力、色等を増強する添加剤を含むことができる。好ましくは培地または担体は副作用を生じないか、または利益が伝えられるよりもはるかに重量超過しないと副作用を生じない。本発明をさらに以下の実施例により説明するが、これは説明のために提供され、そして限定を意図するものではない。本出願の全体にわたって引用された参照文献、公開された特許出願および特許の全ての内容は、その全てを参照として本明細書に組み入れられる。本発明の多くの態様が記載されている。それにも関わらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾を行うことができることは理解されよう。実施例1pGA1pGA1図1および2参照は1ColE1複製起点複製起点oriを含有し、そしてRNAプライマーおよび2個の複製開始の負のレギュレーターをコードする672bp配列、2カナマイシン抵抗性遺伝子細菌におけるプラスミド選択のための抗生物質抵抗性遺伝子、3ラムダT0ターミネーター、並びに4上流のイントロンここではCNVイントロンA、CNV極初期CMVIEプロモーター、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化配列由来の終止配列BGHpAを含む真核細胞発現カセットを含有する。組織プラスミノーゲンアクチベーターtPAリーダー配列の合成擬似物質もまた発現カセット内に含まれる。発現カセットは複数の制限部位を含むことができ、そしてこれらの部位はいずれかのHIVクレードに由来する抗原をコードする発現カセットの封入を促進することを、所望どおりに含めるかまたは排除することができる。pGA1のクローニング部位はtPAリーダーの上流にClaI部位、tPAリーダーのフレーム内にクローニングするためのNheI部位、並びにBGHpAに先立ってクローニングするためのXmnI、SmaI、RsrII、およびAvrII部位を含む。ColE1レプリケーターを含有する元来の構築されたプラスミドはpBR322であったBolivarら、Gene2:951131977;Sutcliffeら、ColdSpringHarborQuantBiol43:77901978。ラムダT0ターミネーターScholtissekら、NucleicAcidsRes15:31851987はプラスミドの原核細胞性成長中のカナマイシン抵抗性遺伝子から真核細胞発現カセットこの場合、ワクチン転写カセットへの読み過ごしを防御する。ワクチン発現カセットへの読み過ごしを防御することにより、ターミネーターは細菌の成長中のプラスミドインサートの安定化を助ける。市販のベクターpZErO21Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州および真核細胞発現ベクターpJW4303Luら、Vaccine15:9209231997からPCR断片を用いて、真核細胞のためのColE1レプリケーター、カナマイシン抵抗性遺伝子、および転写調節エレメントを1個のプラスミドに組み合わせた。pZErO21由来の1859bp断片ヌクレオチド1319~3178位はColE1複製起点およびカナマイシン抵抗性遺伝子を含んだ。pJW4303由来の2040bp断片ヌクレオチド376~2416位はイントロンAを伴うCMVIEプロモーター、組織プラスミノーゲンアクチベーターリーダーtPAの合成相同体、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化部位BGHpAを含んだ。ポリメラーゼ連鎖反応PCRによりSalI部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて断片を増幅した。pZErO2由来のカナマイシン抵抗性の転写カセットおよび逆の転写配向のpJW4303の真核細胞性転写カセットとのライゲーション産物をさらに発展させるために同定した。pGAベクターのこの親のヌクレオチド番号付けをCMVプロモーターの5末端の最初の塩基対から開始した。その5末端にBamHI制限エンドヌクレアーゼ部位およびその3末端にXbaI制限エンドヌクレアーゼ部位を有する391bp断片のPCR増幅によりT0ターミネーターをpGAベクターのこの親に導入した。断片の最初の355bpはpJW4303転写カセットから誘導されたBGHpA配列における配列であり、合成オリゴヌクレオチドの次の36個の塩基はT0配列およびXbaI部位を導入した。導入されたT0ターミネーター配列は配列を含んだ。BamHIXbaI断片を含有するT0ターミネーターを、pZErO2およびpJW4303から作製したプラスミドのT0ターミネーターを含まない相同体断片と置換した。産物をシークエンシングしてT0配向を確認した図1。ヌクレオチド1755~1845間の真核細胞性転写カセットにおける領域はSIVnefの読み枠の最後の30bpを含有した。ヌクレオチド1858位で配列を変異させ、そしてAvrII制限エンドヌクレアーゼ部位を作製することによりこの領域をpGAから除去した。天然発生AvrII部位はヌクレオチド1755位に位置する。AvrII酵素での消化そして次のT4DNAリガーゼでの再ライゲーションにより、ヌクレオチド1755~1845間でのDNAのSIVセグメントの除去が可能になった。HIV1配列のpGAベクターへのクローニングを促進するために、部位特異的変異誘発のための標準的な技術を用いてbp1648位にClaI部位、およびbp1747位にRsrII部位を導入した。構築物を配列分析により確認した。実施例2pGA11pGA11配列番号:2は、多重クローニング部位がEcoRI部位を含むように変化していること以外はpGA1と同一である。これを以下のプライマーフォワードおよびリバース各々配列番号:17および18を用いて部位特異的変異誘発により達成した。従って、pGA11ベクターは本発明の態様であり;pGAプラスミドの一つまたは複数の特徴または特性を有するその他のベクター詳細な説明を参照と同様であるが、多重クローニング部位の制限エンドヌクレアーゼ部位は異なっている例えば本発明は、それ以外は実質的にpGA1に類似するが、その多重クローニング部位に多少異なる制限エンドヌクレアーゼ部位を有するプラスミドを包含する。実施例3pGA12pGA12配列番号:3は、多重クローニング部位がEcoRI部位の5にBamHIおよびXhoI部位を含むように変化していること以外はpGA11と同一である。これをプライマーおよびリバースプライマーを用いて部位特異的変異誘発により達成した。実施例4pGA2pGA2を図5で図式的に説明し、そしてそのヌクレオチド配列を図6配列番号:4に示す。pGA2は、イントロンA配列がpGA2のCMVプロモーターから除去されていること以外はpGA1と同一である。CMVプロモーターのmRNAキャップ部位から8bp下流にClaI部位を導入することによりpGA1からpGA2を作製し;配列:およびを有する相補的プライマーを用いたオリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発を用いてClaI部位を導入した。新たなClaI部位を挿入した後、ClaIでpGA1を消化してpGA1から946bpのClaI断片を除去し、そして次にライゲートしてpGA2を生成させた。実施例5pGA21pGA21配列番号:5は、多重クローニング部位がEcoRI部位を含むように変化していること以外はpGA2と同一である。これを以下のプライマー:フォワードおよびリバースを用いて部位特異的変異誘発により達成した。従って、pGA21ベクターは本発明の態様であり;pGAプラスミドの一つまたは複数の特徴または特性を有するその他のベクター詳細な説明を参照と同様であるが、多重クローニング部位の制限エンドヌクレアーゼ部位は異なっている例えば本発明は、それ以外は実質的にpGA1に類似するが、その多重クローニング部位に多少異なる制限エンドヌクレアーゼ部位を有するプラスミドを包含する。実施例6pGA22pGA22配列番号:6は、多重クローニング部位がEcoRI部位の5にBamHIおよびXhoI部位を含むように変化していること以外はpGA11と同一である。これをフォワードプライマーおよびリバースプライマー各々配列番号:23および24を用いて部位特異的変異誘発により達成した。実施例7免疫欠損ウイルスワクチンインサートベクターのpGA1およびpGA2シリーズのためのHIV1ワクチンインサートを構築して、免疫欠損ウイルスにより用いられる同一のサブゲノムスプライシング機構を用いて単一のRNA転写体から複数のHIV1タンパク質を発現した。これらの多タンパク質発現ベクターが感染性ウイルスを形成しなかったことを確認するために、欠失および点変異を導入してレトロウイルスライフサイクルの必須工程を不能化した。図9は正常なレトロウイルスゲノムおよび代表的なワクチンインサートの図式を示す。インサートで除去されている領域を点描する。Xは点変異を示す。欠失はプロウイルスDNAの逆転写、組み込みおよび発現のためのシス作動性エレメントをコードする長末端反復LTRの双方を含んだ。ウイルスRNAのキャプシド形成を促進する5LTRに隣接する5配列は除去されている。polコード化インテグラーゼの領域のコード化配列並びに補助遺伝子vifおよびvprは除去されている。そして、最終的にNef制御タンパク質をコードする遺伝子であるnefは除去されている。以下の実施例で記載する全てのインサートに共通する7つの点変異が図式に含まれる。これらは、ジンクフィンガーに媒介されるウイルスRNAのパッケージングを制限するヌクレオキャプシドタンパク質のジンクフィンガーにおける4つの変異、およびウイルスRNAの逆転写を防御する逆転写酵素における3つの変異を含む。gagおよびまたはpolを含むいずれかのワクチンインサートにおいて類似の変化を作製することができる。さらに、本明細書に記載するいずれかのプラスミドまたはベクター化された生ワクチンのいずれかに配置されるワクチンインサートにおいてこれらの変化または類似の変化を作製することができるすなわちpGAベクターの一つまたは複数の特徴または特性を有するいずれかのプラスミド、pGAベクター自体、または単独でもしくはDNAプライムされた患者と組み合わせて例えばブーストするために用いることができるワクシニアベクター。以下に記載するHIV1ワクチンインサートをいずれかのpGAベクターまたはこれらのベクターのさらなる誘導体において発現させることができる。以下に提示するインサートの実例を、そのインサートの将来的な使用のために計画されているpGAベクターの実例と共に提示する。しかしながら、これらのインサートのいずれかをいずれかのpGAベクターおよびその他の真核細胞発現ベクターにおいて使用することができる。実施例8pGA2JS2、多タンパク質クレードBHIV1インサートpGA2JS2の配列を図7a配列番号:7、その機能的領域およびこれらの領域の起源を図7bに、並びにその点変異の位置を図7cに示す。本明細書に記載するJS2インサートを米国、欧州および日本で蔓延しているHIV1配列に対する免疫応答を引き出すように、クレードBHIV1配列で設計した。前記したように、いずれかのクレードB単離体をその他のクレードB単離体の合理的な代表として使用することができる。HIV1単離体はコレセプターとして異なるケモカインレセプターを使用し、そして伝染する大部分のウイルスはCCR5コレセプターを使用するのでBerger、AIDS11補冊A:S3161997、設計したワクチンインサートはCCR5使用Envであった。もちろん、いずれかその他のコレセプターを介して機能するか、または天然発生もしくは合成配列から免疫原性を高めるように構築されたEnvを同様に作製し、そして使用することができる。高度に発現する多タンパク質発現クレードBワクチンインサートを達成するために、表1に示すような7個の異なるHIV1配列から候補ワクチンを構築した。表1候補のワクチンインサートの比較最初の構築物であるpBH10VLPを、細菌において安定であり、そして真核細胞において高度に発現するIIIB配列から調製した。HIV1BH10配列を、NIHが資金援助しているAIDSレポジトリーカタログ番号90から入手した。親pHIV1BH10をPCR反応の鋳型として用いてpBH10VLPを構築した。プライマーを設計して、5非翻訳リーダー配列の105bpおよびGagの開始コドンからRTコード化配列の終わりまでの配列を包含する5から3GagRtPCR産物5PCR産物を生成させた。オリゴヌクレオチドプライマーはPCR産物の5末端にClaI部位を、そしてPCR産物の3末端にEcoRIおよびNheI部位を導入した。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて5PCR産物を増幅した。env領域のためのPCR産物3PCR産物はvpu、tat、rev、およびenv配列、並びにその各々のmRNAの適切なプロセシングおよび発現に必要なスプライスアクセプター部位を包含する。EcoRI部位をこの産物の5末端に導入し、そしてNheIおよびRsrII部位を3末端に導入した。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて3PCR産物を増幅した。5PCR産物をpGA1のClaIおよびNheI部位でpGA1にクローン化し、そしてシークエンシングにより構築物の同一性を確認した。次いで3PCR産物をEcoRIおよびNheI部位で5クローンに挿入してpBH10を生成させた。このプラスミドの構築によりLTR、インテグラーゼ、vif、vprおよびnef配列を欠くプロウイルス配列に至った図9参照。pBH10VLPは、Envを用いるCCR5ではなく、Envを用いるCXCR4をコードしたので、pBH10中間体のenv配列を6個の異なるR5Envをコードする配列で置換した表1。異なるウイルスゲノムに由来するtat、rev、vpu、およびenvコード化配列を包含するEcoRIからBamHIまでの断片をpBH10に置換した。得られたenvおよびrev配列は置換された配列およびHIV1BH10配列のキメラであった図9参照。HIV1ADAエンベロープの場合、BamHI部位をHIV1ADA配列に導入して、pBH10のEcoRIからBamHIまでの領域をEcoRIからBamHIまでの断片に置換した。これらの構築の結果を表1にまとめている。試験した6個の配列のうち、6AVLPが形質転換された細菌におけるプラスミド成長を不良にした。プラスミド6AVLPをさらに発展させなかった。その他の構築物のうち、pBH10ADAキメラはウイルスGagおよびEnvタンパク質の最高の発現を生じた表1。293T細胞における一過性のトランスフェクションでは、pBH10ADAキメラからの発現がHIV1ADAまたはHIV1IIIBの野生型プロウイルスのものよりも高かった。発現はまた以前の、プライミングに成功したアカゲマカクにおける細胞毒性T細胞応答を有したKentら、JVirol72:10180101881998多タンパク質発現HIV1ワクチンdpolの発現Richmondら、JVirol72:909291001998よりも高かった。pBH10ADAキメラをここでJS1と称した。所定のまたは望ましいHIV1インサートを有するプラスミドを同様に検定できることを認識すべきである。次に、ヒトにおいて非感染性ワクチン剤として使用するために、不活性化点変異をJS1に導入して構築物の安全性をさらに高めたもちろん、何ら試験するまえに、変異を先制的に作製することができる図10c参照。4つのコドン変異をヌクレオキャプシドのジンクフィンガーに導入してウイルスRNAのキャプシド形成を制限し、そして3つのコドン変異をpolの逆転写酵素領域に導入してウイルス逆転写酵素を不活性化した。これらの変異を有するJS1インサートをJS2と称した。部位特異的変異誘発キットStratageneを用いて製造者のプロトコルに従って変異を作製した。全ての変異をシークエンシングにより確認した。変異誘発に使用したプライマー対は、であった。実施例9pGA2JS7ワクチンプラスミドpGA2JS7の配列を図11a配列番号:8に、その機能的領域およびこれらの領域の起源を図11bに、そしてそのコドン変異の位置を図11cに示す。BH10のGag配列をJS7インサートではHIV1HXB2のGag配列に置換する。これを以下のプライマー:フォワードおよびリバースを用いたHXB2配列p5プラスミド、NIHAIDSReserachandReferenceProgram、カタログ番号3119のPCR増幅により達成した。フォワードプライマーはJS2インサートで見出されたのと同一の位置にClaI部位を導入し、そしてリバースプライマーはJS2インサートの同一部位に類似する独特なEcoRI部位を導入した。次いでこのPCR断片を変異誘発のためにpGA11に挿入した。次いでジンクフィンガー領域における安全性変異およびRT変異を、JS2インサートに関して前記したように導入した。JS7はまた、プロテアーゼの活性部位で不活性化コドン変異を有する点でJS2と異なっている。プライマーおよびを用いてこの変異を導入した。一度シークエンシングにより変異が確認されると、HXB2GagPolインサートをClaIおよびEcoRI部位を介してpGA2JS2に導入した。ウイルスプロテアーゼによるpr55Gagポリタンパク質の時期尚早な切断のためにHIV1タンパク質の凝集物を発現するJS2インサートと対照的に、JS7インサートはDNA発現細胞の原形質膜から出芽する未熟なウイルス様粒子VLPを形成する。実施例10pGA2JS71ワクチンプラスミドpGA2JS71の配列を図12a配列番号:9に、その機能的領域およびこれらの領域の起源を図12bに、そしてそのコドン変異の位置を図12cに示す。pGA2JS71は、vpuで開始コドンおよび直ぐ上流のATGが変異しているpGA2JS7の誘導体である。これらの変異を導入してEnvの発現のレベルを上昇させた。部位特異的変異誘発キットStratageneおよびオリゴヌクレオチド:フォワードおよびリバースを用いてVpuの開始コドンにおける変異を達成した。実施例11pGA1IS25ワクチンプラスミドpGA1IS25の配列を図13a配列番号:10に、その機能的領域およびこれらの領域の起源を図13bに、そしてその点変異の位置を図13cに示す。本明細書に記載するIC25インサートを西アフリカで蔓延しているHIV1配列に対する免疫応答を引き出すように、クレードAおよびGAGと称するの循環組換え体で設計した。前記したように、西アフリカからのいずれかのクレードAG単離体をその他のクレードAG単離体の合理的な代表として使用することができる。HIV1単離体はコレセプターとして異なるケモカインレセプターを使用し、そして伝染する大部分のウイルスはCCR5コレセプターを使用するのでBerger、AIDS11補冊A:S3161997、設計したAGワクチンインサートはCCR5使用Envを有した。もちろん、いずれかその他のコレセプターを介して機能するか、または天然発生もしくは合成AG配列から免疫原性を高めるように構築されたEnvを同様に作製し、そして使用することができる。高度に発現する多タンパク質発現クレードAGワクチンインサートを達成するために、表2に示すような4個の異なるAGHIV1単離体から候補ワクチンを構築した。表2候補のAGワクチンインサートの比較各単離体に関してフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて5GagRTPCR産物を増幅した。Env領域に関する3PCR産物はvpu、tat、rev、およびenv配列並びにその各々のmRNAの適切なプロセシングおよび発現に必要なスプライスアクセプター部位を包含する。EcoRI部位をこの産物の5末端に導入し、そしてNheIおよびRsrII部位を3末端に導入した。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて3PCR産物を増幅した。もちろん、患者928に由来するものはさらに発展させるのに特に好ましい表2。コドン変異ではなく欠失を伴う928配列をIC1と称した。IC1よりもさらに不能なウイルスであるIC25を構築するために用いた試験計画はJS1からJS7を構築するために用いたものに類似した。具体的には4つのコドン変異をgag配列に導入してRNAパッケージングに関与するジンクフィンガーを不活性化し、3つのコドン変異をpol配列に導入して逆転写酵素の転写、鎖転移およびRNアーゼH活性を不活性化し、そしてプロテアーゼの活性部位のコドンを変異させてウイルス性Gagタンパク質のタンパク質溶解性切断およびウイルス粒子の成熟を制限した。プロテアーゼ変異はまたGagポリタンパク質の時期尚早な切断を制限し、そして未熟なVLPの出芽を可能にした。部位特異的変異誘発キットStratageneを用いて製造者のプロトコルに従って不活性化コドン変異を作製した。全ての変異をシークエンシングにより確認した。変異誘発に使用したプライマー対は、であった。実施例12pGA1IC2pGA1IC2の配列を図14a配列番号:11に、その機能的領域およびこれらの領域の起源を図14bに、そしてその点変異の位置を図14cに示す。pGA1IC2は、プロテアーゼに不活性化点変異を含有しないこと以外はpGA1IC25と同一である。実施例13pGA1IC48pGA1IC48の配列を図15a配列番号:12に、その機能的領域およびこれらの領域の起源を図15bに、そしてその点変異の位置を図15cに示す。pGA1IC48は、プロテアーゼにおけるコドン変異が薬物抵抗性変異体に生じたものであること以外はpGA1IC25と同一であるJocabsenら、Virology206:5275341995。この変異はプロテアーゼ機能を部分的にのみ不活性化する。Stratageneキットおよび以下のオリゴヌクレオチド:およびを用いて変異誘発を実施した。この変異はプロテアーゼ機能を部分的にのみ不活性化する。実施例14pGA1IC90pGA1IC90の配列を図16a配列番号:13に、その機能的領域およびこれらの領域の起源を図16bに、そしてその点変異の位置を図16cに示す。pGA1IC90は、プロテアーゼにおけるコドン変異が薬物抵抗性変異体に生じたものであること以外はpGA1IC25と同一であるJocabsenら、Virology206:5275341995。この変異はプロテアーゼ機能を部分的にのみ不活性化する。Stratageneキットおよび以下のオリゴヌクレオチド:およびを用いて変異誘発を実施した。実施例15pGA1IN3pGA1IN3の配列を図17a配列番号:14に、その機能的領域およびこれらの領域の起源を図17bに、そしてその点変異の位置を図17cに示す。本明細書に記載するIN3インサートを、インドでウイルスから回収されたクレードC配列から構築した。前記したように、いずれかのクレードC単離体をその他のクレードC単離体の合理的な代表として使用することができる。HIV1単離体はコレセプターとして異なるケモカインレセプターを使用し、そして伝染する大部分のウイルスはCCR5コレセプターを使用するのでBerger、AIDS11補冊A:S3161997、構築するために選択したCワクチンインサートはCCR5使用Envを有した。もちろん、いずれかその他のコレセプターを介して機能するか、または天然発生もしくは合成C配列から免疫原性を高めるように構築されたEnvを同様に作製し、そして使用することができる。高度に発現する多タンパク質発現クレードCワクチンインサートを達成するために、表3に示すような、米国NIAIDAIDSレポジトリーから入手した4個の異なるクレードCHIV1配列から候補ワクチンを構築した。これらのうち、インドのクローンからのものをさらに発展させるために特に好ましいことが判明した。表3クレードCの候補のワクチンインサートの比較インドのクローン由来の5および3配列をオリゴヌクレオチドおよびPCRを用いてpGA12にクローン化して5および3断片を作製した。GagおよびRTをコードする5断片を、断片の5末端でBamHI部位を組み込んだフォワードプライマー、並びに断片の3末端でXhoI部位および2個の停止コドンを組み込んだリバースプライマーを用いて作製した。Tat、Rev、Vpu、およびEnvをコードする3断片をフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて作製した。XhoIおよびNheI制限部位が3断片の各々5および3末端で組み込まれるようにこれらを設計した。これらの断片を、定方向クローニングを用いてpGA12に導入しpGA12IN1を作製した。IN1よりもさらに望ましいウイルスであるIN3を構築するために用いた試験計画はJS1からJS7を構築するのに用いたものに類似した。具体的には4つのコドン変異をgag配列に導入してRNAパッケージングに関与するジンクフィンガーを不活性化し、3つのコドン変異をpol配列に導入して逆転写酵素の転写、鎖転移およびRNアーゼH活性を不活性化し、そしてプロテアーゼの活性部位のコドンを変異させてウイルス性Gagタンパク質のタンパク質溶解性切断およびウイルス粒子の成熟を制限した。プロテアーゼ変異はまたGagポリタンパク質の時期尚早な切断を制限し、そして未熟なVLPの出芽を可能にした。部位特異的変異誘発キットStratageneを用いて製造者のプロトコルに従って不活性化コドン変異を作製した。全ての変異をシークエンシングにより確認した。変異誘発に使用したプライマー対は、であった。実施例16pGA1IN2pGA1IN2の配列を図18a配列番号:5に、その機能的領域およびこれらの領域の起源を図18bに、そしてその点変異の位置を図18cに示す。pGA1IN2は、プロテアーゼにD25N不活性化点変異を有さない点でpGA1IN3と異なっている。実施例17対合したrMVAに提供された配列JS、ICおよびINインサートの配列を用いて対合した組換え改変ワクシニアアンカラrMVAベクターを調製した。これらの対合したベクターを種々DNAのブースター接種として使用することができる。また抗HIV免疫応答をプライミングおよびブースティングの双方を行うためにこれらを使用することもできる。ウイルスベクターを作製するために提供された配列は逆転写酵素に3つの不活性化点変異を含んだ。組換えMVAベクターを構築し、そして特徴づけした代表的な研究は以下のとおりである。MVAウイルスこれはAmericanTypeCultureCollectionから入手できるをニワトリ胚線維芽細胞CEFの最終希釈により3回プラーク精製し、ニワトリ胚線維芽細胞CEFは9日齢SPFPremiumSPAFASニワトリ受精卵から作製され、BおよびE卵Stevens、ペンシルバニア州により分配された。2次CEF細胞をMVAのMOI005で感染させ、そして2pLW48でトランスフェクトした前記したように;図20Aおよび20B参照。37°Cで2日間インキュベートした後、ウイルスを収集し、3回凍結および解凍を行った。ついでこれをCEFプレートに載せた。4日に、Xgluc基質を添加した後青色に染色されるこれらの感染の中心を取り、これはプラスミドおよび感染ウイルスの間で組換えが起こったことを示しており、そしてこれをCEFプレートに接種した。再度、青色に染色されたこれらの増殖巣を取った。これらのGUS含有増殖巣を3検体ずつプレートに載せ、そしてGUS染色ここではこれを削除したかったおよびADAエンベロープ発現に関して分析した。GUS染色および非染色増殖巣並びにたいていのエンベロープ染色増殖巣の約同数の混合集団を有したこれらのサンプルの第3の複製プレートから個々の増殖巣を取った。これらの増殖巣を3検体ずつ再度プレートに載せ、同じように分析した。5継代の後、エンベロープタンパク質を発現したが、二重反復のためGUS遺伝子が除去されたウイルスを誘導した。免疫染色により、このウイルスもまたGagPolタンパク質を発現した。MAVHIV48感染細胞ライゼートのアリコートを、EnvおよびGagPolタンパク質の双方の発現に関するためのモノクローナル抗体での免疫沈殿および免疫染色により分析した。これらの試験の双方で、これらのタンパク質の各々を検出した。組換えウイルスが感染した細胞の上澄でgag粒子を産生することが20スクロースクッションで35S標識粒子をペレット化することにより示された。電子顕微鏡により、細胞から外側および出芽、並びに細胞の小胞内の双方でgag粒子を可視化した。gag粒子はその表面にエンベロープタンパク質を有した。このように、ADAトランケートされたエンベロープおよびHXB2GagPolタンパク質を発現する組換えMVAウイルスを作製した。最終ウイルスで除去されている一過性に発現されたGUSマーカーを用いてMVA組換えウイルスを作製する。新たなハイブリッド初期後期プロモーターのために、ADAエンベロープの高発現が可能であるPsynII;例えば図21、22および24参照。さらに、感染細胞の表面のタンパク質の量を増強することができ、そして従って免疫原性を増強することができるので、エンベロープはトランケートされている。組換え体の安定性もまた増強された。