下記を含む、インビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための結合体送達システム組成物:RNAiAメリチンx式中、メリチンはメリチンペプチドであり、Lは生理的に不安定な連結であり、Galはアシアロ糖タンパク質受容体ASGPrリガンドであり、xはメリチンの一級アミンの80よりも大きい値を有する整数であり、RNAiはRNA干渉ポリヌクレオチドであり、かつAは少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基またはガラクトースクラスターのいずれかである。RNA干渉ポリヌクレオチドが、DNA、RNA、dsRNA、siRNA、およびmicroRNAからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。肝細胞が肝実質細胞からなる、請求項1記載の組成物。ASGPrリガンドが複数のメリチンペプチド上のアミンの少なくとも90に可逆的に連結している、請求項1記載の組成物。メリチンペプチドがSeqID1、SeqID7、SeqID11、SeqID51、SeqID57、SeqID58、SeqID92、およびSeqID96からなるリストから選択される、請求項1記載の組成物。メリチンペプチドがD型アミノ酸からなる、請求項1記載の組成物。Lが二置換マレアマートである、請求項1記載の組成物。Lがアミドベンジルカルバマートである、請求項1記載の組成物。メリチンペプチドのアミノ末端に共有結合されたポリエチレングリコールPEGをさらに含む、請求項7記載の組成物。メリチンペプチドのアミノ末端に共有結合されたASGPrリガンドPEG結合体をさらに含む、請求項7記載の組成物。メリチンペプチドのアミノ末端に共有結合されたポリエチレングリコールPEGをさらに含む、請求項8記載の組成物。メリチンペプチドのアミノ末端に共有結合されたASGPrリガンドPEG結合体をさらに含む、請求項8記載の組成物。ASGPrリガンドがラクトース、ガラクトース、NアセチルガラクトサミンGalNAc、ガラクトサミン、Nホルミルガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、Nプロピオニルガラクトサミン、Nnブタノイルガラクトサミン、およびNイソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。生理的に不安定な連結L2を介してRNAiがAに連結されている、請求項1記載の組成物。L2がLに直交である、請求項14記載の組成物。ガラクトースクラスターがNアセチルガラクトサミントリマーからなる、請求項1記載の組成物。疎水性基がコレステロールからなる、請求項1記載の組成物。薬学的に許容される担体または希釈剤中で提供される、請求項1記載の組成物。下記の段階を含む、哺乳動物の肝細胞において発現される遺伝子の発現を阻害する方法:a該遺伝子の配列の一部と同一またはほぼ同一の配列を有するRNAiポリヌクレオチドを生成する段階;およびa該哺乳動物の血管に請求項1記載の組成物を注入する段階。下記の段階を含む、RNA干渉ポリヌクレオチド送達組成物を製造する方法:aメリチンペプチドを生成する段階;b二置換無水マレイン酸またはジペプチドアミンドベンジルアミン反応性カルボナートに共有結合されたASGPrリガンドをそれぞれが含む、複数の非荷電マスキング剤を生成する段階;cメリチンペプチドの集団上の一級アミンの80よりも多くを段階bのマスキング剤で修飾する段階、dRNA干渉ポリヌクレオチドを少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基またはガラクトーストリマーに連結する段階;fインビボでの投与に適した溶液中のRNA干渉ポリヌクレオチドおよび修飾メリチンペプチドを提供する段階。発明の詳細な説明本明細書において記載するのは、インビボでRNA干渉RNAiポリヌクレオチドを哺乳動物の肝細胞に送達するための改善された方法である。発明者らは、ハチ毒ペプチド由来の小さい送達ペプチドであるメリチンおよび独立に標的指向するRNAiポリヌクレオチドを用いる、インビボRNAiポリヌクレオチド送達システムを記載する。肝臓を標的とするRNAiポリヌクレオチド結合体分子およびアシアロ糖タンパク質受容体を標的とする可逆的に阻害したメリチンペプチドを用いることにより、肝臓への効率的なRNAiポリヌクレオチド送達が観察される。メリチンおよびRNAiポリヌクレオチドは独立に肝実質細胞を標的とするため、メリチンおよびポリヌクレオチドの濃度ならびにそれらの間の比は、結合した複合体の溶解性または複合体を製造する能力ではなく、成分の溶解性によってのみ制限される。同様に、ポリヌクレオチドおよびメリチンは、投与前の任意の時点で混合してもよく、または別々に投与してもよく、したがって成分は溶液または乾燥状態のいずれかで別々に保存することが可能である。本発明は、以下の組成物の結合体送達システムを含む:YメリチンxプラスNT、式中、NはRNAiポリヌクレオチドであり、Tはポリヌクレオチド標的指向部分20個以上の炭素原子を有する疎水性基またはガラクトースクラスターのいずれかであり、メリチンは本明細書に記載のハチ毒メリチンペプチドまたは誘導体であり、かつマスキング剤Mは、生理的に不安定で可逆的な連結Lを介してメリチンに共有結合されている、本明細書に記載のASGPrリガンドを含む。Lの切断はメリチン上の非修飾アミンを復旧する。Yは任意で、存在する場合には、メリチンのアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノもしくはカルボキシ末端システインに連結されているポリエチレングリコールPEGまたはASGPrリガンドPEG結合体を含む。アミノ末端またはアミノ末端システインへのYの結合が好ましい。xは2以上の整数である。その非修飾状態で、メリチンは膜活性である。しかし、送達ペプチドメリチンxは膜活性ではない。Mの結合によるメリチン一級アミンの可逆的修飾は、メリチンの膜活性を可逆的に阻害または不活化する。メリチン一級アミンの十分なパーセンテージを修飾して、ポリマーの膜活性を阻害し、肝細胞標的指向を提供する。好ましくはxは、任意のマスキング剤非存在下でのメリチン上のアミンの量により判定して、メリチン上の一級アミンの80よりも大きい、より好ましくは90よりも大きい値を有する。より具体的には、xはメリチン上の一級アミンの80よりも大きく、最大100の値を有する。メリチンは典型的には3~5つの一級アミンアミノ末端修飾されていない場合および典型的には2~4つのリジン残基を含むことに留意される。したがって、アミンのあるパーセンテージの修飾は、メリチンペプチドの集団におけるアミンのあるパーセンテージの修飾を反映することになる。可逆的連結Lの切断後、非修飾アミンが復旧し、それによりメリチンをその非修飾、膜活性状態に戻す。好ましい可逆的連結はpHに不安定な連結である。もう一つの好ましい可逆的連結はプロテアーゼ切断可能連結である。メリチンx、ASGPrを標的とする可逆的にマスクした膜活性ポリマー送達ペプチド、およびTN、ポリヌクレオチド結合体を別々に合成または製造する。TもNもメリチン、L、またはMに直接または間接的に共有結合されていない。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド結合体のマスクした、またはマスクしていないポリマーとの静電的また疎水性結合は、ポリヌクレオチドのインビボ肝送達に必要とされていない。マスクしたポリマーおよびポリヌクレオチド結合体は同じ容器または別々の容器で供給することができる。これらは投与の前に混合してもよく、同時投与してもよく、または逐次投与してもよい。親水性基は、質的な用語で、化学部分が水を好むことを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性であり、水との水素結合供与体または受容体である。親水性基は荷電または非荷電でありうる。荷電基は正に荷電アニオンもしくは負に荷電カチオンまたは両方両性イオンでありうる。親水性基の例には、以下の化学部分が含まれる:炭化水素、ポリオキシエチレン、特定のペプチド、オリゴヌクレオチド、アミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、硫黄、およびヒドロキシル。疎水性基は、質的な用語で、化学部分が水を避けることを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない傾向にある。親油性基は脂肪、油、脂質、および非極性溶媒に溶解し、水素結合を形成する能力はほとんど、またはまったくない。複数の炭素原子を含む炭化水素、特定の置換炭化水素、コレステロール、およびコレステロール誘導体は疎水性基および化合物の例である。疎水性基は、好ましくは、炭素および水素原子のみを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持し、例えば、フッ素を含む、非極性置換または非極性ヘテロ原子は許容されうる。この用語は脂肪族基、芳香族基、アシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基を含み、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状であってもよい。疎水性基なる用語は、ステロール、ステロイド、コレステロール、ならびにステロイドおよびコレステロール誘導体も含む。本明細書において用いられる膜活性ペプチドは、生体膜に対して以下の効果の1つまたは複数を誘導することができる、表面活性、両親媒性ペプチドである:非膜透過性分子が細胞に侵入する、もしくは膜を通過することを可能にする膜の変化もしくは破壊、膜における孔形成、膜の分裂、または膜の破壊もしくは溶解。本明細書において用いられる膜、または細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変化または破壊は、以下の検定の少なくとも1つにおいてペプチドの活性により機能的に規定することができる:赤血球溶解溶血、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こしうる膜活性ペプチドは、膜溶解性ペプチドとも呼ぶ。原形質膜よりもエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすペプチドはエンドソーム溶解性と考えられる。膜活性ペプチドの細胞膜に対する効果は一時的でありうる。膜活性ペプチドは、膜に対する親和性を有し、二重層構造の変性または変形を引き起こす。ポリヌクレオチドの細胞への送達は、膜に孔を形成する、またはエンドソームもしくはリソソーム小胞を破壊し、それにより小胞の内容物を細胞質中に放出させることを含む、原形質膜または内部の小胞膜エンドソームまたはリソソームなどを破壊または不安定化する、メリチンペプチドによって仲介される。エンドソーム溶解性ペプチドは、pH低下または溶解性酵素プロテアーゼの存在などの、エンドソーム特異的環境因子に反応して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こす、またはポリヌクレオチドもしくはタンパク質などの通常は細胞膜不透過性の化合物の、エンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部の膜封入小胞からの放出を提供することができるペプチドである。エンドソーム溶解性ポリマーは、エンドソーム内でのそれらの物理化学的性質のシフトを起こす。このシフトは、電荷、疎水性、または親水性におけるシフトの結果としての、ポリマーの溶解性または他の化合物もしくは膜と相互作用する能力における変化でありうる。例示的エンドソーム溶解性ペプチドは、pHに不安定または酵素に感受性の基または結合を有する。したがって、マスキング剤がpHに不安定な結合を介してポリマーに結合している、可逆的にマスクした膜活性ペプチドは、エンドソーム溶解性ポリマーであると考えることができる。本明細書において用いられるメリチンは、天然のハチ毒ペプチドメリチン由来の、約23から約32アミノ酸を含む、小さい両親媒性膜活性ペプチドである。天然メリチンは26アミノ酸を含み、アミノ末端では主に疎水性で、カルボキシ末端では主に親水性カチオン性である。本発明のメリチンは生体原料から単離することもでき、または合成品であってもよい。合成ポリマーは人による化学的プロセスによって調合または製造され、天然の生体プロセスによって生成されるものではない。本明細書において用いられるメリチンは、例えば、以下の種の毒液中で見いだすことができるメリチンファミリーの天然ハチ毒ペプチドを含む:コミツバチ、セイヨウミツバチ、トウヨウミツバチ、オオミツバチ、クロスズメバチの一種Vespulamaculifrons、スズメバチの一種Vespamagnifica、スズメバチの一種Vespavelutina、アシナガバチの一種PolistesspHQL2001、およびアシナガバチPolisteshebraeus。本明細書において用いられるメリチンは、天然メリチンペプチドと同一、または類似のアミノ酸配列を有する合成ペプチドを含む。具体的には、メリチンアミノ酸配列は図1に示すものを含む。メリチンの固有の高い膜活性を保持しているアミノ酸に加えて、1~8つのアミノ酸をペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に付加することができる。具体的には、システイン残基をアミノまたはカルボキシ末端に付加することができる。他の保存的アミノ酸置換が容易に構想されるため、図1のリストは網羅的であることを意図するものではない。合成メリチンペプチドは、天然のL型アミノ酸または鏡像異性のD型アミノ酸インベルソinversoを含むことができる。しかし、メリチンペプチドは基本的に全L型または全D型アミノ酸のいずれかを含むべきであるが、アミノまたはカルボキシ末端のいずれかに付属した反対の立体中心のアミノ酸を有していてもよい。メリチンアミノ酸配列は逆にすることもできるレトロretro。レトロメリチンはL型アミノ酸またはD型アミノ酸レトロインベルソを有しうる。2つのメリチンペプチドを共有結合してメリチン二量体を生成することもできる。メリチンは、組織標的指向を増強する、またはインビボ循環を促進する、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合された、マスキング剤以外の修飾基を有しうる。しかし、本明細書において用いられるメリチンは、互いに、またはもう一つのポリマーもしくは骨格に共有結合された、3つ以上のメリチンペプチドを含む鎖またはポリマーを含まない。マスキング本発明のメリチンペプチドは、可逆的修飾が膜活性を阻害し、メリチンを中和して正電荷を低減し、ほぼ中性電荷のポリマーを生成し、かつ細胞型特異的標的指向を提供する、可逆的に修飾したメリチンペプチドを含む。メリチンはペプチド上の一級アミンの可逆的修飾を通じて可逆的に修飾する。本発明のメリチンペプチドは、形質膜またはリソソームエンドサイトーシス膜を破壊することが可能である。しかし、ペプチドをインビボで投与すると、膜活性は毒性につながる。したがって、メリチンの膜活性の可逆的マスキングはインビボでの使用のために必須である。このマスキングは、マスキング剤をメリチンに可逆的に結合して、可逆的にマスクしたメリチン、すなわち送達ペプチドを生成することにより達成される。膜活性の阻害に加えて、マスキング剤は細胞特異的相互作用、すなわち標的指向を提供する。全般的に、マスキング剤がポリマーの膜活性を阻害し、かつインビボでの肝細胞標的指向を提供することは、マスキング剤の必須の特徴である。メリチンは非修飾マスクしていない状態で膜活性であり、修飾マスクした状態で膜活性ではない不活化。所望のレベルの不活化を達成するのに十分な数のマスキング剤をペプチドに連結する。マスキング剤の結合によるメリチンの所望のレベルの修飾は、適切なペプチド活性検定を用いて容易に判定される。例えば、メリチンが所定の検定において膜活性を有するならば、その検定において膜活性の所望のレベルの阻害を達成するのに十分なレベルのマスキング剤がペプチドに連結されている。いかなるマスキング剤も非存在下で、ペプチド上の一級アミンの量により判定して、メリチンペプチドの集団上の一級アミン基の≧80または≧90の修飾が好ましい。マスキング剤のペプチドへの結合がペプチドの正電荷を低減し、したがってより中性の送達ペプチドを生成することも、マスキング剤の好ましい特徴である。マスクしたペプチドが水溶性を保持していることが望ましい。本明細書において用いられるメリチンは、修飾ペプチドが膜活性を示さず、インビボで細胞特異的すなわち、肝細胞標的指向を示す場合、マスクされている。メリチンは、マスキング剤をペプチドに連結している結合の切断がペプチド上のアミンを復旧し、それにより膜活性を復旧する場合、可逆的にマスクされている。マスキング剤がメリチンに生理的に不安定で可逆的な結合を通じて共有結合していることも、もう一つの必須の特徴である。生理的に不安定で可逆的な連結または結合を用いることにより、マスキング剤をインビボでペプチドから切断し、それによりペプチドのマスクを除去し、マスクしていないペプチドの活性を復旧することができる。適切な可逆的連結を選択することにより、所望の細胞型または細胞部位に送達または標的指向した後にメリチンの活性を復旧する結合体を生成することが可能である。連結の可逆性はメリチンの選択的活性化を提供する。可逆的共有結合は、生理的に不安定な結合、細胞生理的に不安定な結合、pHに不安定な結合、pHに非常に不安定な結合、pHに極度に不安定な結合、およびプロテアーゼ切断可能な結合からなる群より選択されうる、可逆的または不安定な結合を含む。本明細書において用いられるマスキング剤は、ASGPrリガンドおよびアミン反応性基を有する、好ましくは中性非荷電の化合物を含み、ここでアミン反応性基のペプチド上のアミンとの反応はASGPrリガンドの可逆的な生理的に不安定な共有結合を介してのペプチドへの連結を生じる。アミン反応性基は、適切な生理的状態例えば、エンドソームリソソーム中などのpH低減、またはエンドソームリソソーム中などの酵素的切断に応答しての切断によってメリチンアミンが再生されるように選択する。ASGPrリガンドは、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する基、典型的には糖類である。本発明の好ましいマスキング剤は、水溶液中でポリマーを修飾ポリマーと可逆的結合を形成することができる。好ましいアミン反応性基は二置換無水マレイン酸を含む。好ましいマスキング剤は以下の構造で表される:式中、R1はアシアロ糖タンパク質受容体ASGPrリガンドを含み、かつR2はメチルCH3基、エチルCH2CH3基、またはプロピルCH2CH2CH3基などのアルキル基である。いくつかの態様において、ガラクトースリガンドを、以下の構造によって例示されるPEGリンカーを通じてアミン反応性基に連結する:式中、nは1から19の間の整数である。もう一つの好ましいアミン反応性基は、以下の構造によって表されるジペプチドアミドベンジルアミン反応性カルボナート誘導体を含む:式中:R1はアミノ酸1のR基であり、R2はアミノ酸2のR基であり、R3はCH2OCOZであり、ここでZはハロゲン化物、であり、かつ、R4はASGPrリガンドを含む。活性化カルボナートとメリチンアミンとの反応により、ASGPrリガンドがメリチンペプチドに、ペプチダーゼ切断可能なジペプチドアミドベンジルカルバマート連結を介して連結される。ジペプチドの酵素切断により、標識指向リガンドがペプチドから除去されて脱離反応が誘発され、これはペプチドアミンの再生を引き起こす。上記の構造はメリチンペプチドに連結された1つのマスキング剤を示しているが、実際には、好ましくはメリチンペプチド集団上のアミンの80よりも多くが修飾されるように、いくつかのマスキング剤をメリチンペプチドに連結する。ジペプチドGluGly、AlaCit、PheCitCitはアミノ酸シトルリンであるを実施例3に示す。上記の構造に関して、GluGly、AlaCit、PheCitはR2R1を表す。荷電アミノ酸も許容可能であるが、中性アミノ酸が好ましい。他のアミノ酸の組み合わせも、それらが内因性プロテアーゼによって切断されるとの条件で可能である。加えて、アミドベンジル基と標的指向リガンドとの間のリンカーとして、3~5つのアミノ酸を用いてもよい。マレイン酸無水物に基づくマスキング剤と同様、ASGPrリガンドをPEGリンカーを介してペプチダーゼ切断可能なジペプチドアミドベンジルカルボナートに連結することができる。膜活性ポリアミンは、過剰のマスキング剤存在下でマスキング剤に結合することができる。過剰のマスキング剤は送達ペプチドの投与前に結合送達ペプチドから除去してもよい。もう一つの態様において、本発明のメリチンペプチドを、アミノまたはカルボキシ末端で、立体安定化剤またはASGPrリガンド立体安定化剤結合体の共有結合により、さらに修飾する。疎水性末端の修飾が好ましく;通常の配列を有するメリチンではアミノ末端、レトロメリチンではカルボキシ末端が好ましい。好ましい立体安定化剤はポリエチレングリコールである。アミノまたはカルボキシ末端修飾は、当技術分野において標準の方法を用いて、合成中にペプチドに連結してもよい。または、アミノまたはカルボキシ末端修飾は、アミノまたはカルボキシ末端システイン残基を有するメリチンペプチド上のシステイン残基の修飾を通じて行ってもよい。好ましいポリエチレングリコールは1~120エチレン単位を有する。もう一つの態様において、好ましいポリエチレングリコールはサイズが5kDa未満である。ASGPrリガンド立体安定化剤結合体NAGPEG修飾のために、好ましい立体安定化剤は1~24エチレン単位を有するポリエチレングリコールである。末端PEG修飾は、可逆的マスキングと組み合わせると、メリチン送達ペプチドの毒性をさらに低減する。末端NAGPEG修飾は有効性を増強する。立体安定化部分本明細書において用いられる立体安定化部分は、立体安定化部分を含まない分子に比べて、それが結合している分子の分子内または分子間相互作用を防止または阻害する、非イオン性親水性ポリマー天然、合成、または非天然のいずれかである。立体安定化部分は、それが結合している分子が静電相互作用に参加することを妨害する。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による、複数の物質の非共有結合である。立体安定化部分は血液成分との相互作用を阻害し、したがって細網内皮系によるオプソニン作用、食作用、および取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定化部分は、それらが結合している分子の循環時間を延長することができる。立体安定化部分は分子の凝集も阻害しうる。好ましい立体安定化部分はポリエチレングリコールPEGまたはPEG誘導体である。本発明に適したPEG分子は、約1~120のエチレングリコールモノマーを有する。ASGPrリガンド標的化部分または基は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体分布特性を増強して、結合体の細胞特異的分布および細胞特異的取り込みを改善する。ガラクトースおよびガラクトース誘導体は、肝実質細胞表面上で発現されるアシアロ糖タンパク質受容体ASGPrへのそれらの結合を通じて、インビボで分子を肝実質細胞へと標的化させるために用いられてきた。本明細書において用いられるASGPrリガンドまたはASGPrリガンドは、ガラクトースおよびガラクトースと等しいか、またはそれよりも大きいASGPrへの親和性を有するガラクトース誘導体を含む。ガラクトース標的化部分のASGPrへの結合は、送達ペプチドの肝実質細胞への細胞特異的標的化および送達ペプチドの肝実質細胞へのエンドサイトーシスを促進する。ASGPrリガンドは、ラクトース、ガラクトース、NアセチルガラクトサミンGalNAc、ガラクトサミン、Nホルミルガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、Nプロピオニルガラクトサミン、Nnブタノイルガラクトサミン、およびNイソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択されてもよいIobstSTandDrickamerKJBC19962716686。ASGPrリガンドはモノマー例えば、1つのガラクトサミンを有するまたはマルチマー例えば、複数のガラクトサミンを有するの部分でありうる。一つの態様において、メリチンペプチドを、ペプチド上の一級アミンの≧80または≧90へのASGPrリガンドマスキング剤の結合により、可逆的にマスクする。不安定な連結連結またはリンカーは、関心対象の1つの化学基または区分を関心対象のもう一つの化学基または区分に、1つまたは複数の共有結合を介して連結する、2つの原子間の接続である。例えば、連結はマスキング剤をペプチドに接続することができる。連結の形成は2つの別々の分子を1つの分子に接続することもあり、または同じ分子内の2つの原子を接続することもある。連結は中性電荷でもよく、または正もしくは負の電荷を有していてもよい。可逆的または不安定な連結は可逆的または不安定な結合を含む。連結は任意に2つのつなぎ合わせた原子間の距離を延ばすスペーサーを含んでいてもよい。スペーサーは連結に柔軟性およびまたは長さをさらに加えうる。スペーサーには、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基が含まれるが、それらに限定されるわけではなく;これらはそれぞれ1つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類を含みうる。スペーサー基は当技術分野において周知で、前述のリストは本発明の範囲を制限する意図はない。不安定な結合は、同じ分子内の他の共有結合を分解または切断しない条件下で選択的に分解または切断されうる、水素原子への共有結合以外の共有結合である。より具体的には、不安定な結合は、適切な条件下で同じ分子内の他の不安定でない共有結合よりも安定性が低い熱力学的に、またはより速やかに分解される動力学的に共有結合である。分子内の不安定な結合の切断は、2つの分子の生成を引き起こしうる。当業者にとって、結合の切断または不安定性は一般には結合切断の半減期t12結合の半分が切断するのに要する時間によって議論される。したがって、不安定な結合は、分子内の他の結合よりも速やかに選択的に切断されうる結合を含む。適切な条件は不安定な結合の型によって決まり、有機化学において周知である。不安定な結合はpH、酸化もしくは還元条件もしくは物質、温度、塩濃度、酵素の存在ヌクレアーゼ、およびプロテアーゼを含むエステラーゼなど、または添加した物質の存在に対して感受性でありうる。例えば、pH上昇または低下はpHに不安定な結合に対する適切な条件である。不安定な基が変換を起こす速度は、不安定な基を含む分子の化学成分を変えることによって制御することができる。例えば、不安定な基の近くに特定の化学部分例えば、電子受容体または供与体を付加することで、化学変換が起こる特定の条件例えば、pHに影響をおよぼしうる。本明細書において用いられる生理的に不安定な結合は、哺乳動物の体内で通常遭遇する条件、または遭遇するものに類似の条件下で切断可能な不安定な結合である。生理的に不安定な連結基は、特定の生理的条件にある場合に化学変換例えば、切断を起こすように選択される。本明細書において用いられる細胞生理的に不安定な結合は、哺乳動物の細胞内条件下で切断可能な不安定な結合である。哺乳動物の細胞内条件には、哺乳動物の細胞において見られる、または遭遇するものに類似の、pH、温度、酸化または還元条件または物質、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解または加水分解酵素などの、哺乳動物の細胞において通常存在する酵素活性の存在も含まれる。細胞生理的に不安定な結合は、薬学的に許容される外因性物質の投与に反応して切断されてもよい。半減期が45分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、非常に不安定であると考えられる。半減期が15分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、極度に不安定であると考えられる。化学変換不安定な結合の切断は、薬学的に許容される物質の細胞への添加によって開始されてもよく、または不安定な結合を含む分子が適切な細胞内およびまたは細胞外環境に到達した場合に自然に起こってもよい。例えば、pHに不安定な結合は、分子が酸性化されたエンドソームに入ると切断されうる。したがって、pHに不安定な結合はエンドソームで切断可能な結合であると考えられる。酵素切断可能結合は、エンドソームもしくはリソソームまたは細胞質に存在するものなどの酵素に曝露された場合に切断されうる。ジスルフィド結合は、分子が細胞質のより還元性の環境に入った場合に切断されうる。したがって、ジスルフィドは細胞質で切断可能な結合であると考えられる。本明細書において用いられるpHに不安定な結合は、酸性条件pH<7下で選択的に分解される不安定な結合である。細胞エンドソームおよびリソソームは7未満のpHを有するため、そのような結合はエンドソームで不安定な結合と呼んでもよい。pHに不安定ななる用語は、pHに不安定、pHに非常に不安定、およびpHに極度に不安定な結合を含む。無水物のアミンとの反応はアミドおよび酸を生成する。多くの無水物にとって、逆反応無水物およびアミンの生成は非常に遅く、エネルギー的に好ましくない。しかし、無水物が環状無水物である場合、アミンとの反応はアミド酸、すなわちアミドおよび酸が同じ分子内にある分子を生じる。同じ分子内に両方の反応性基アミドおよびカルボン酸が存在することで、逆反応が加速される。特に、一級アミンの無水マレイン酸および無水マレイン酸誘導体との生成物であるマレアミド酸は、その非環式類縁体よりも1×109から1×1013倍速くアミンおよび無水物に逆戻りするKirby1980。アミドおよび酸を生成するアミンの無水物との反応アミド酸を生成するアミンの環状無水物との反応アミンおよび無水物を生成するアミド酸の切断はpH依存的で、酸性pHで大幅に加速される。このpH依存的反応性を利用して可逆的なpHに不安定な結合およびリンカーを生成することができる。シスアコニット酸はそのようなpH感受性リンカー分子として用いられてきた。γカルボキシラートをまず分子にカップリングさせる。第二段階で、αまたはβカルボキシラートのいずれかを第二の分子にカップリングさせて、2つの分子のpH感受性カップリングを生成する。このリンカーのpH5での切断の半減期は8から24時間の間である。無水シスアコニット酸および無水マレイン酸の構造切断が起こるpHを、不安定な部分に化学的成分を付加することにより制御する。マレアミド酸のアミンおよび無水マレイン酸への変換の速度は、無水マレイン酸系の置換R2およびR3に強く依存する。R2がメチルである場合、変換の速度はR2およびR3が水素である場合よりも50倍速い。R2およびR3の両方にアルキル置換がある場合例えば、23ジメチル無水マレイン酸、速度の上昇は劇的であり:非置換無水マレイン酸よりも10000倍速い。アミンの23ジメチル無水マレイン酸による修飾から生成されたマレアマート結合は、pH5で4から10分の間の半減期で切断されて無水物およびアミンを復旧する。R2およびR3が水素よりも大きい基である場合、アミド酸のアミンおよび無水物への変換は、R2およびまたはR3が水素である場合よりも速いと予測される。pHに非常に不安定な結合:pHに非常に不安定な結合は45分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに非常に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。pHに極度に不安定な結合:pHに極度に不安定な結合は15分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに極度に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。二置換環状無水物は、マスキング剤の本発明のメリチンペプチドへの結合のために特に有用である。これらは生理的にpHに不安定な連結を提供し、容易にアミンを修飾し、かつ細胞エンドソームおよびリソソームで見られる低いpHでの切断によってこれらのアミンを復旧する。第二に、アミンとの反応によって作成されるαまたはβカルボン酸基は、ポリマーに対して予想される負電荷の約120しか寄与しないようであるRozemaetalBioconjugateChemistry2003。したがって、ペプチドの二置換無水マレイン酸による修飾は、高い負電荷を有するペプチドを作成するよりもむしろ、ペプチドの正電荷を効果的に中和する。インビボ送達のためにはほぼ中性の送達ペプチドが好ましい。RNAiポリヌクレオチド結合体本発明者らは、RNAiポリヌクレオチドの疎水性基またはガラクトースクラスターいずれかであるポリヌクレオチド標的化部分への結合、およびRNAiポリヌクレオチド結合体の前述の送達ペプチドとの同時投与は、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの肝細胞、特に肝実質細胞への効率的、機能的送達を提供することを見いだした。機能的送達とは、RNAiポリヌクレオチドが細胞に送達され、予期される生物活性である遺伝子発現の配列特異的阻害を有することを意味する。哺乳動物の脈管構造に投与された、ポリヌクレオチドを含む多くの分子は、通常は肝臓によって体から排出される。ポリヌクレオチドが体からの除去のために分解またはそれ以外に処理され、ポリヌクレオチドが遺伝子発現の配列特異的阻害を引き起こさない、肝臓によるポリヌクレオチドのクリアランスは、機能的送達とは考えない。RNAiポリヌクレオチド結合体を、RNAiポリヌクレオチドをポリヌクレオチド標的化部分に共有結合することにより生成する。ポリヌクレオチドを、それが反応性基Aを含むように合成または修飾する。標的化部分も、それが反応性基Bを含むように合成または修飾する。反応性基AおよびBは、それらが当技術分野において公知の方法を用いて共有結合を介して連結されうるように選択する。標的化部分は、RNAiポリヌクレオチドの3または5末端に連結してもよい。siRNAポリヌクレオチドに対し、標的化部分はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに連結してもよいが、センス鎖が好ましい。一つの態様において、ポリヌクレオチド標的化部分は疎水性基からなる。より具体的には、ポリヌクレオチド標的化部分は、少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基からなる。ポリヌクレオチド標的化部分として用いる疎水性基は、本明細書において疎水性標的化部分と呼ぶ。適切な例示的疎水性基は、コレステロール、ジコレステロール、トコフェロール、ジトコフェロール、ジデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、イソプレノイド、およびコレアミドを含む群より選択されうる。6個以下の炭素原子を有する疎水性基はポリヌクレオチド標的化部分として有効ではないが、8から18個の炭素原子を有する疎水性基は疎水性基のサイズ増大すなわち、炭素原子の数の増大に伴い漸増するポリヌクレオチド送達を提供する。疎水性標的化部分のRNAiポリヌクレオチドへの結合は、送達ペプチドの同時投与なしでは、RNAiポリヌクレオチドの効率的な機能的インビボ送達を提供しない。siRNAコレステロール結合体は、他の研究者らによりインビボでsiRNAsiRNAコレステロールを肝細胞に送達すると報告されているが、任意のさらなる送達媒体なしでは、高濃度のsiRNAが必要で、送達効果は悪い。本明細書に記載の送達ペプチドと組み合わせると、ポリヌクレオチドの送達は大幅に改善される。siRNAコレステロールを本発明の送達ペプチドと一緒に提供することにより、siRNAコレステロールの有効性は約100倍高まる。ポリヌクレオチド標的化部分として有用な疎水性基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択してもよく、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロール、ステロイド、およびステロイド誘導体であってもよい。疎水性標的化部分は好ましくは、炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持する置換またはヘテロ原子、例えばフッ素は許容されうる。疎水性標的化部分は、当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3または5末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、疎水性基はいずれの鎖に結合してもよい。もう一つの態様において、ポリヌクレオチド標的化部分はガラクトースクラスターガラクトースクラスター標的化部分を含む。本明細書において用いられるガラクトースクラスターは、2から4つの末端ガラクトース誘導体を有する分子を含む。本明細書において用いられるガラクトース誘導体なる用語は、ガラクトースおよびアシアロ糖タンパク質受容体に対してガラクトースと同等またはそれよりも大きい親和性を有するガラクトースの誘導体の両方を含む。末端ガラクトース誘導体を分子に、そのC1炭素を通じて結合する。アシアロ糖タンパク質受容体ASGPrは肝実質細胞に特有で、分枝ガラクトース末端糖タンパク質に結合する。好ましいガラクトースクラスターは、それぞれアシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する3つの末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体を有する。より好ましいガラクトースクラスターは、3つの末端Nアセチルガラクトサミンを有する。当技術分野において一般的な他の用語には、三分岐ガラクトース、三価ガラクトースおよびガラクトーストリマーが含まれる。三分岐ガラクトース誘導体クラスターはASGPrに、二分岐または単鎖ガラクトース誘導体構造よりも大きい親和性で結合するBaenzigerandFiete1980Cell22611620;Connollyetal1982JBiolChem257939945。nMの親和性を達成するには多価が必要とされる。アシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する1つのガラクトース誘導体の結合は、送達ペプチドと同時投与した場合に、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの肝実質細胞への機能的送達を可能にしない。ガラクトースクラスターはそれぞれ中心の分枝点に連結している3つのガラクトース誘導体を含む。ガラクトース誘導体を中心分枝点に糖のC1炭素を通じて結合する。ガラクトース誘導体を好ましくは分枝点にリンカーまたはスペーサーを介して連結する。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである米国特許第5885968号;BiessenetalJMedChem1995Vol39p15381546。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG3スペーサーである。分枝点は、3つのガラクトース誘導体の結合を可能にし、分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合をさらに可能にする、任意の低分子である。例示的分枝点基はジリシンである。ジリシン分子は、それを通じて3つのガラクトース誘導体が結合する3つのアミン基、およびそれを通じてジリシンがRNAiポリヌクレオチドに結合しうるカルボキシル反応性基を含む。分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合は、リンカーまたはスペーサーを通じて起こりうる。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG3スペーサー3つのエチレン単位である。ガラクトースクラスターは当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3または5末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、ガラクトースクラスターはいずれの鎖に結合してもよい。好ましいガラクトース誘導体はNアセチルガラクトサミンGalNAcである。アシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する他の糖類は、ガラクトース、ガラクトサミン、Nホルミルガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、Nプロピオニルガラクトサミン、Nnブタノイルガラクトサミン、およびNイソブタノイルガラクトサミンを含むリストから選択されてもよい。多くのガラクトース誘導体のアシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性は研究されており例えば:IobstSTandDrickamerKJBC19962716686参照、または当技術分野において典型的な方法を用いて容易に判定される。ガラクトースクラスターの一態様分枝点と核酸との間にPEGスペーサーを有するガラクトースクラスターポリヌクレオチド、または核酸もしくはポリ核酸なる用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する当技術分野の用語である。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。120未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い。天然核酸はデオキシリボースまたはリボースリン酸骨格を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で重合されるポリヌクレオチドで、天然リボースまたはデオキシリボースリン酸骨格と同じまたは類似の塩基を含むが、異なる型の骨格を含みうる。ポリヌクレオチドは任意の当技術分野において公知の技術を用いて合成することができる。当技術分野において公知のポリヌクレオチド骨格には、PNAペプチド核酸、ホスホロチオアート、ホスホロジアミダート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸骨格の他の変種が含まれる。塩基にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらにはさらに天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類縁体が含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラート、およびハロゲン化アルキルなどであるが、それらに限定されるわけではない、ヌクレオチド上に新しい反応性基を配置する修飾が含まれるが、それらに限定されるわけではない。塩基なる用語は、DNAおよびRNAの任意の公知の塩基類縁体を含む。ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドはインビトロで重合してもよく、組換えでもよく、キメラ配列、またはこれらの基の誘導体を含む。ポリヌクレオチドは5末端、3末端、または5および3両末端に末端キャップ部分を含んでいてもよい。キャップ部分は、逆方向デオキシ脱塩基部分、逆方向デオキシチミジン部分、チミジン部分、または3グリセリル修飾でありうるが、それらに限定されるわけではない。RNA干渉RNAiポリヌクレオチドは、配列特異的様式で導入遺伝子のメッセンジャーRNAmRNA転写物を分解またはその翻訳を阻害するための、哺乳動物細胞のRNA干渉経路機構との相互作用を通じてRNA干渉を誘導することができる分子である。2つの主なRNAiポリヌクレオチドは低分子または短い干渉RNAsiRNAおよびマイクロRNAmiRNAである。RNAiポリヌクレオチドは、siRNA、マイクロRNA、二本鎖RNAdsRNA、短鎖ヘアピンRNAshRNA、およびRNA干渉を誘導しうるRNAをコードする発現カセットを含む群より選択されうる。siRNAは、典型的には15~50塩基対、好ましくは21~25塩基対を含み、細胞内で発現された標的遺伝子またはRNAにおけるコード配列と同じ完全に相補的またはほぼ同じ部分的に相補的ヌクレオチド配列を有する、二本鎖構造を含む。siRNAはジヌクレオチド3オーバーハングを有していてもよい。siRNAは2つのアニールしたポリヌクレオチドまたはヘアピン構造を形成する1つのポリヌクレオチドからなっていてもよい。本発明のsiRNA分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含む。一つの態様において、結合体のsiRNAは2つのオリゴヌクレオチド断片から構築され、ここで1つの断片はsiRNA分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、第二の断片はsiRNA分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。もう一つの態様において、センス鎖はアンチセンス鎖に、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して接続される。マイクロRNAエトキシ22デオキシβDガラクトピラノシドすなわち、アミノビスエトキシエチルNAG11モル当量、およびピリジン200μl、15当量を加えた。次いで、溶液を15時間撹拌した。次いで、溶媒を除去し、得られた固体を5mLの水に溶解し、01TFA、水アセトニトリル勾配を用いての逆相HPLCにより精製した。一般的な二置換無水マレイン酸マスキング剤R1は中性ASGPrリガンドを含む。好ましくは非荷電のマスキング剤。Rはメチルまたはエチルであり、かつnは2から100の整数である。好ましくは、PEGは5から20のエチレン単位を含むnは5から20の整数である。より好ましくは、PEGは10~14のエチレン単位を含むnは10から14の整数である。PEGは長さが変動するものであってもよく、5~20または10~14エチレン単位の平均長を有していてもよい。または、PEGは、例えば、正確に11または13エチレン単位を有する、単分散、一様または離散型であってもよい。nは1から10の整数である。上に示す通り、PEGスペーサーは無水物基とASGPrリガンドとの間に位置してもよい。好ましいPEGスペーサーは1~10エチレン単位を含む。または、無水物とNアセチルガラクトサミンとの間でアルキルスペーサーを用いてもよい。nは0から6の整数である。無水物とNアセチルガラクトサミンとの間で他のスペーサーまたはリンカーを用いてもよい。しかし、親水性、中性好ましくは非荷電スペーサーまたはリンカーが好ましい。Bプロテアーゼペプチダーゼ切断可能なマスキング剤メリチンペプチドは、特殊化した酵素切断可能なリンカーを用いて可逆的に修飾することもできる。これらの酵素切断可能なリンカーはアミドベンジル活性化カルボナート部分に連結されたジペプチドを用いる。活性化カルボナートとペプチドアミンとの反応により、アシアロ糖タンパク質受容体リガンドなどの標的指向化合物がメリチンペプチドに、ペプチダーゼ切断可能なジペプチドアミドベンジルカルバマート連結を介して連結される。ジペプチドの酵素切断により、標的指向リガンドがペプチドから除去されて脱離反応が誘発され、これはペプチドアミンの再生を引き起こす。以下の酵素的に切断可能なリンカーを合成した:ジペプチドGluGly、AlaCit、PheCitCitはアミノ酸シトルリンであるを示す。他のアミノ酸の組み合わせも許容可能である。加えて、アミドベンジル基と標的指向リガンドとの間のリンカーとして、3~5つのアミノ酸を用いてもよい。さらに、当技術分野において公知の他の活性化カルボナートも上記の化合物において用いるパラニトロフェノールの代わりに容易に用いられる。実施例4メリチンの可逆的修飾マスキングA無水マレイン酸に基づくマスキング剤による修飾修飾前に、5×mgの二置換無水マレイン酸マスキング剤例えば、CDMNAGを01氷酢酸水溶液から凍結乾燥した。乾燥した二置換無水マレイン酸マスキング剤に、02×mLの等張グルコースおよび10×mgのHEPES遊離塩基中のメリチン×mgの溶液を加えた。無水物が完全に溶解した後、動物への投与前に、溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートした。二置換無水マレイン酸マスキング剤のペプチドとの反応により下記を得た:式中、Rはメリチンであり、かつR1はASGPrリガンド例えば、NAGを含む。無水物とポリマーアミンとの間の反応で生じた無水物カルボキシルは、予想される電荷の約120を示すRozemaetalBioconjugateChemistry2003。したがって、膜活性ポリマーは、高度に負に荷電したポリアニオンに変換されるのではなく、有効に中和される。Bプロテアーゼ切断可能なマスキング剤による修飾1×mgのペプチドおよび10×mgのHEPES塩基を1~10mgmLで、2~6×mgのNAG含有プロテアーゼ切断可能基質のアミン反応性pニトロフェニルカルボナートまたはNヒドロキシスクシンイミドカルボナート誘導体の添加によりマスクした。次いで、動物への注入前に、溶液を室温RTで少なくとも1時間インキュベートした。実施例5siRNAsiRNAは以下の配列を有していた:第VII因子齧歯類第VII因子=霊長類ApoBsiRNA:siLUC小文字=2OCH3置換s=ホスホロチオエート連結ヌクレオチドの後のf=2F置換ヌクレオチドの前のd=2デオキシRNA合成を、AKTAOligopilot100GEHealthcare、Freiburg、Germanyおよび固体支持体としての多孔性ガラスCPGを用い、固相上で通常のホスホラミダイト化学により実施した。実施例6siRNA標的指向分子結合体AGalNAcクラスターの合成GalNAcクラスターポリヌクレオチド標的指向リガンドを米国特許出願公開第20010207799号に記載のとおりに合成した。BGalNAcクラスターsiRNA結合体前述の実施例6AのGalNAcクラスターを、図2に示し、以下に記載するとおりに、siRNAに結合した。1化合物1150mg、0082mmol、図2を無水メタノール55mlに溶解し、ナトリウムメチラート42μLを加えたMeOH中25溶液。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。同量のメタノールと、同時にアニオン交換材料のAmberliteIR120を分割して加え、pH約70とした。Amberliteをろ過により除去した。溶液をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。化合物2を白色泡状物として定量的収率で得た。TLCSiO2、ジクロロメタンDCMMeOH5:101CH3COOH:Rf2=003;検出のために、MeOH中の硫酸の溶液5を用い、続いて加熱した。ESIMS、直接注入、負モード;MH1計算値:14527;MH1測定値:14525。2化合物220mg、0014mmol、図2をピリジンおよびジクロロメタンと同時蒸発させた。残渣を無水DMF09mlに溶解し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながらDMF中のNヒドロキシスクシンイミドNHSの溶液16mg、0014mmolを加えた。0°CでDMF中のNNジシクロヘキシルカルボジイミドDCCの溶液32mg、0016mmolをゆっくり加えた。反応混合物を室温まで加温し、終夜撹拌した。化合物3をそれ以上精製せずにRNAへの結合に用いた。3アミノ修飾RNAの合成センス鎖の5末端にC6アミノリンカーを有するRNAを、AKTAOligopilot100GEHealthcareFreiburgGermanyおよび固体支持体として細孔制御ガラスcontrolledporeglassを用い、1215μmolの規模で、固相上、標準のホスホラミダイト化学により産生した。2Oメチルヌクレオチドを含むRNAを、対応するホスホラミダイト、2OメチルホスホラミダイトおよびTFAヘキシルアミノリンカーアミダイトを用いて生成した。切断および脱保護ならびに精製を、当技術分野において公知の方法により達成したWincottFetalNAR19952314267784。アミノ修飾RNAをアニオン交換HPLCにより特徴付け純度:961、同一性をESIMSにより確認したMH1計算値:69374;MH1測定値:69390。配列:;u、c:対応する塩基の2Oメチルヌクレオチド、s:ホスホロチオアート。4GalNAcクラスターのRNAへの結合5末端にC6アミノリンカーを有するRNA254μmolを凍結乾燥し、250μLのホウ酸ナトリウム緩衝液01molLホウ酸ナトリウム、pH85、01molLKClおよび11mLDMSOに溶解した。8μLのNNジイソプロピルエチルアミンDIPEAを加えた後、RNA溶液を持続的に撹拌しながら、これにDMF中の化合物3の溶液理論的には0014mmol、図2をゆっくり加えた。反応混合物を35°Cで終夜撹拌した。反応をRPHPLCResourceRPC3ml、緩衝液:A:水中100mM酢酸トリエチルアンモニウムTEAA、20M、pH70、B:95アセトニトリル中100mMTEAA、勾配:20CVで5Bから22Bを用いてモニターした。20°CでEtOH中の酢酸ナトリウム3Mを用いてRNAを沈澱させた後、RNA結合体を前述の条件を用いて精製した。純粋な分画を集め、所望の結合体化合物4を酢酸ナトリウムEtOHを用いて沈澱させ、純粋なRNA結合体を得た。結合体4を収率59で単離した150μmol。結合体4の純度をアニオン交換HPLCで分析し純度:855、同一性をESIMSにより確認したMH1計算値:83744;MH1測定値:83760。5結合体4センス鎖を2Oメチル修飾アンチセンス鎖とアニールさせた。siRNA結合体を、アニーリング緩衝液20mMリン酸ナトリウム、pH68;100mM塩化ナトリウム中の相補鎖の等モル溶液を混合し、85~90°Cの水浴中で3分間加熱し、3~4時間の間に室温まで冷却することにより生成した。二重鎖形成を、未変性ゲル電気泳動により確認した。C疎水性基siRNA結合体1アルキル基とのsiRNA結合siRNAの5C10NHSエステル修飾センス鎖NHSC10siRNA、またはCOC9siRNAを、GlenResearchVirginiaUSAからの5CarboxyModifierC10アミダイトを用いて調製した。まだ固体支持体に結合している活性化合物RNAを以下の表1に挙げる親油性アミンとの結合のために用いた。センス鎖CPG100mgローディング60μmolg、RNA06μmolを、SigmaAldrichChemieGmbH×100。アミンの80よりも多くの修飾が最適なメリチンマスキングおよび活性を提供した。表6ApoBsiRNAコレステロール結合体およびCDMNAGの示したレベルで可逆的に修飾したメリチンによって処置したマウスにおける正常な肝細胞中のApoB活性の阻害aTNBS検定により定量実施例13マウスにおけるインビボでのメリチン送達ペプチドによるApoBsiRNA送達後の内因性ApoBレベルのノックダウン、メリチンペプチド誘導体示した配列を有するメリチンペプチドを前述のとおりCDMNAG5×で可逆的に修飾した。次いで、示した量のメリチンを示した量のApoBsiRNAコレステロール結合体と同時注入した。ApoBレベルへの影響を前述のとおりに判定した。表7ApoBsiRNAコレステロール結合体および示したCDMNAGで可逆的に阻害したメリチンペプチドによって処置したマウスにおける正常な肝細胞中のApoB活性の阻害aマウスあたりのペプチドμgbマウスあたりのsiRNAμgdMel=D型アミノ酸を有するメリチンペプチド実施例14マウスにおけるインビボでのメリチン送達ペプチドによるApoBsiRNA送達後の内因性ApoBレベルのノックダウン、酵素的に切断可能なマスキング剤メリチンを前述のとおり示した量の酵素的に切断可能なマスキング剤で可逆的に修飾した。次いで、200~300μgのマスクしたメリチンを50~100μgのApoBsiRNAコレステロール結合体と同時注入した。ApoBレベルへの影響を前述のとおりに判定した。ペプチダーゼ切断可能なジペプチドアミドベンジルカルバマートで修飾したメリチンは有効なsiRNA送達ペプチドであった。D型メリチンペチドの酵素的に切断可能なマスキング剤と組み合わせての使用が好ましい。ペプチドマスキングはより安定であったため、同じレベルの標的遺伝子ノックダウンにはより多くのペプチドが必要とされるが、治療指数は変化または改善のいずれもしなかったCDMNAGによる同じペプチドのマスキングに比べて。表8第VII因子siRNAコレステロール結合体および示した酵素的に切断可能なマスキング剤で可逆的に阻害したGILメリチンD型SeqID7によって処置したマウスにおける正常な肝細胞中の第VII因子活性の阻害aマスキング反応において用いたメリチンアミンあたりのマスキング剤の量。実施例15マウスにおけるインビボでのメリチン送達ペプチドによるApoBsiRNA送達後の内因性ApoBレベルのノックダウン、アミン修飾したメリチンペプチド示したPEGアミノ末端修飾を含むメリチンペプチドを前述のとおりに合成した。次いで、PEGアミノ末端修飾したメリチンペプチドを前述のとおり5×CDMNAGで可逆的に修飾した。次いで、示した量のメリチンを100~200μgのApoBsiRNAコレステロール結合体と同時注入した。ApoBレベルへの影響を前述のとおりに判定した。サイズが5kDa未満のPEGの付加により、メリチンペプチドの毒性が低減した。5kDaよりも大きいPEGでのアミノ末端修飾は、有効性の低下を引き起こしたデータは示していない。表9ApoBsiRNAコレステロール結合体および示したCDMNAGで可逆的に阻害したメリチンペプチドによって処置したマウスにおける正常な肝細胞中のApoB活性の阻害実施例16膜活性を有することが公知の他のメリチン誘導体配列表10膜活性を有するメリチンペプチド実施例17霊長類におけるメリチン送達ペプチドによる第VII因子siRNA送達後の第VII因子ノックダウンNAGPEG2GILメリチンを前述のとおり10×CDMNAGとの反応によりマスクした。GILメリチンを前述のとおり5×CDMNAGとの反応によりマスクした。第1日に、1mgkgのマスクしたNAGPEG2GILメリチン、1mgkgのマスクしたGILメリチン、または3mgkgのマスクしたGILメリチンを、2mgkgのコレステロール第VII因子siRNAと、カニクイザルCynomolgusmacaqueMacacafascicularis霊長類雄、30~80kgに同時注入した。2mlkgを伏在静脈に22~25ゲージの静脈内カテーテルを用いて注入した。対照として、もう一つの霊長類の組に10mgkgGILメリチンおよび2mgkgの対照siRNA、コレステロールルシフェラーゼsiRNAを同時注入した。示した時点図3~5に示すで、血液試料を採取し、第VII因子および毒性マーカーについて分析した。血液を大腿静脈から採取し、霊長類を終夜絶食させた後、全血を採取した。血液尿素窒素BUN、アラニントランスアミナーゼALT、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAST、およびクレアチニンについて血液検査を、CobasIntegra400RocheDiagnosticsにより製造者の推奨に従って実施した。第VII因子レベルを前述のとおりに判定した。第VII因子の有意なノックダウンが1mgkg未満のペプチド用量で観察された。10mgkgのペプチド用量では有意な毒性は観察されなかった。したがって、マスクしたメリチンペプチドは5~10の治療指数を有する。実施例18霊長類におけるメリチン送達ペプチドによるApoBsiRNA送達後のApoBノックダウンGILメリチンを前述のとおり5×CDMNAGとの反応によりマスクした。第1日に、2mgkgのマスクしたGILメリチンを、2mgkgのコレステロールApoBsiRNAと、カニクイザル霊長類に同時注入した。示した時点表11で、血液試料を採取し、ApoBタンパク質レベルおよび毒性マーカーについて分析した。血液尿素窒素BUN、アラニントランスアミナーゼALT、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAST、およびクレアチニンについて血液検査を、CobasIntegra400RocheDiagnosticsにより製造者の推奨に従って実施した。ApoBレベルを前述のとおりに判定した。BUN、クレアチニン、またはASTにおいて増大は観察されなかった。第2日注入の1日後に、ASTの一過性でわずかな上昇のみが観察された。ApoBのノックダウンは第11日に100近くに達し、31日間低いままであった。表11ApoBsiRNAコレステロール結合体およびCDMNAGでマスクしたGILメリチンによって処置した霊長類における正常な肝細胞中のApoB活性の阻害