"インスリン分子及び血液成分に共有結合するための反応基を含むインスリン誘導体。前記インスリン分子が以下の式I:の分子であり、そして前記反応基が、GlyA1、PheB1、及びLysB29の位置から選ばれる位置で、インスリン分子のアミノ酸に結合する、請求項1に記載のインスリン誘導体。前記反応基が、マイケルアクセプター、スクシンイミジル含有基、及びマレイミド含有基からなる群から選ばれる、請求項1又は2に記載のインスリン誘導体。前記マイケルアクセプターが、αβ,不飽和カルボニル部分である、請求項3に記載のインスリン誘導体。前記反応基が、マレイミド含有基である、請求項1又は2に記載のインスリン誘導体。前記反応基が、3マレイミドプロピオン酸MPAである、請求項1又は2に記載のインスリン誘導体。前記反応基が、リンカーを介して、前記インスリン分子のアミノ酸に結合される、請求項1~6のいずれか1項に記載のインスリン誘導体。前記リンカーが、2アミノエトキシ酢酸AEA、エチレンジアミンEDA、アミノエトキシエトキシスクシニミン酸AEES、AEESAEES、2[22アミノ]エトキシ酢酸AEEA、AEEAAEEA、NH2CH2nCOOH、[式中、nが、1~20の整数である]、及びアルキル鎖C1C10モチーフ、並びにそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項7に記載のインスリン誘導体。前記アルキル鎖C1C10モチーフが、酸素、窒素、又は硫黄原子が取り込まれうる飽和又は不飽和の1以上のアルキル鎖C1C10である、請求項8に記載のインスリン誘導体。前記アルキル鎖が、グリシン、3アミノプロピオン酸APA、8アミノオクタン酸AOA、及び4アミノ安息香酸APhAからなる群から選ばれる、請求項9に記載のインスリン誘導体。前記組合せが、AEEAEDA、AEEAAEEA、及びAEAAEEAからなる群から選ばれる、請求項8に記載のインスリン誘導体。前記リンカーが、NH2CH27COOHである、請求項6に記載のインスリン誘導体。以下の式:を有する、請求項1に記載のインスリン誘導体。以下の式:を有する請求項1に記載のインスリン誘導体。以下の式:を有する、請求項1に記載のインスリン誘導体。前記血液成分が、血液タンパク質である、請求項1に記載のインスリン誘導体。前記血液タンパク質が、血清アルブミンである、請求項16に記載のインスリン誘導体。請求項1~17のいずれか1項に記載されるインスリン誘導体及び血液成分を含むインスリン複合体であって、当該反応基及び当該血液成分が、当該反応基と当該血液成分との間で形成される共有結合を介して結合される、前記複合体。前記血液成分が、血液タンパク質である、請求項18に記載のインスリン複合体。前記血液タンパク質が、血清アルブミンである、請求項19に記載のインスリン複合体。前記複合体が、exvivoで形成される、請求項18に記載のインスリン複合体。医薬として許容される担体と供に、請求項1~17のいずれか1項に記載のインスリン誘導体を含む医薬組成物。医薬として許容される担体と供に、請求項18~21のいずれか1項に記載のインスリン複合体を含む医薬組成物。血糖関連疾患又は障害を患う対象において血糖関連疾患又は障害を治療する方法であって、請求項1~17のいずれか1項に記載のインスリン誘導体を、当該対象に投与することを含む、前記方法。前記血糖関連疾患が、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項24に記載の方法。前記血糖関連疾患が、I型糖尿病及びII型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項24に記載の方法。請求項18~21のいずれか1項のインスリン複合体の投与を含む、血糖関連疾患又は障害の治療方法。前記血糖関連疾患が、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項27に記載の方法。前記血糖関連疾患が、I型糖尿病及びII型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項27に記載の方法。請求項22及び23のいずれか1項に記載の医薬組成物の投与を含む、血糖関連疾患又は障害の治療方法。前記血糖関連疾患が、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項30に記載の方法。前記血糖関連疾患が、I型糖尿病及びII型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項30に記載の方法。血糖関連疾患又は障害の治療用医薬の製造のための、請求項1~17のいずれか1項に記載の誘導体の使用。前記血糖関連疾患が、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠性糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項33に記載の使用。前記血糖関連疾患が、I型糖尿病及びII型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項33に記載の使用。血糖関連疾患又は障害の治療用医薬の製造のための、請求項18~19のいずれか1項に記載の複合体の使用。前記血糖関連疾患が、I型糖尿病、II型糖尿病、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、及び膵炎からなる群から選ばれる、請求項36に記載の使用。前記血糖関連疾患が、I型糖尿病及びII型糖尿病からなる群から選ばれる、請求項37に記載の使用。[0036]本発明に従って、持続性インスリン誘導体が提供される。より特異的に、当該インスリン誘導体は、インスリン分子及びそれに結合する反応基を含み、当該反応基は、血液成分に共有結合するためのものである。本出願では、インスリン反応基-血液成分の複合体の形成をもたらす共有結合は、本発明のインスリン誘導体を投与した際に、インビボで形成されうるということが意図される。当該共有結合が、本発明のインスリン誘導体を、組み換えアルブミンであるアルブミンソース又は対象の血漿から抽出されたアルブミンソースと接触することにより、又は他の適切なソースのいずれかから提供することによりイクスビボで生じうるということも意図される。ここで当該ソースは、当業者により知られている。[0037]インスリン分子は、未変性のヒトインスリン例えば、下記式Iにおける未変性ヒトインスリンの配列を参照のことであるか、又はそのアナログ、例えばアミノ酸置換1又は複数、アミノ酸欠失1又は複数、又はアミノ酸添加1又は複数を有するインスリン分子などでありうる。以下は、本発明に従って使用されうるインスリンアナログの例として記載されており、本アナログを制限する意図はない:AventisPharmaceuticalsIncのランタス商標と呼ばれるインスリングラルギン当該薬剤はA21の位置で置換されたグリセリンを有し、そしてB鎖のC-末端において加えられた2のアルギニン残基を有する、NovoNordiskASのレべミール商標と呼ばれるインスリンデテミール当該薬剤は、B30の位置でスレオニンが欠失され、そしてリジンB29の側鎖上に加えた未変性ヒトヒトインスリンである;Elilillyのヒューマログ商標と呼ばれるインスリンリスプロ当該薬剤は、LysB28、ProB29ヒトインスリンである;NovoNordiskAS、ノボログ商標と呼ばれるインスリンアスパート該薬剤はAspB28ヒトインスリンである;並びにAventisのアピドラApidra商標と呼ばれるインスリングルリシンGlulisine当該薬剤は、LysB3、GluB29ヒトインスリンであるである。[0038]反応基は、インスリン分子又はそのアナログ上の異なる官能基に結合されうる。好ましくは、当該反応基は、インスリン分子の利用できるアミノ基、例えばA鎖及びB鎖のN-末端アミノ酸のαアミノ基、又はLysB29のε-アミノ基に結合される。本発明に従って、置換された及び/又は加えられたアミノ酸1又は複数を含むインスリンアナログは、反応基を結合するためのさらなるアミノ基を含んでもよいか;或いは反応基が結合するために適した他の官能基を含みうる。インビボ又はイクスビボで、血液成分を共有結合することができる好ましい反応基は、マイケルアクセプターα,β、不飽和カルボニル部分スクシンイミジル含有基及びマレイミド含有基である。より好ましい反応基は、マレイミド含有基であり、そしてより得意的にMPA3-マレイミドプロピオン酸である。[0039]場合により、反応基は、リンカーを介してインスリン分子に結合される。当該リンカーは、好ましくは、ヒドロキシエチルモチーフ、例えば2-アミノエトキシ酢酸AEA、エチレンジアミンEDA、アミノエトキシエトキシスクシニミン酸AEES、2-[2-2-アミノエトキシ]エトキシ酢酸AEEA、AEEA-AEEA、-NH2-CH2n-COOH[式中、nは1~20の整数である]、飽和又は不飽和の1以上のアルキル鎖C1-C10であって、酸素、窒素、又は硫黄原子を含みうるアルキル鎖モチーフ、例えばグリシン、3-アミノプロピオン酸APA、8-アミノオクタン酸OA、4-アミノ安息香酸AphAからなる群から選ばれる。リンカーの組合せの例は、非限定的にAEEA-EDA、AEEA-AEEA、AEA-AEEA、AEES-AEESなどを含む。好ましいリンカーは、8-アミノオクタン酸AOAであるか、又は反応基MPAでリンカーを使用しないものである。当業者は、どのタイプのリンカーが、本発明の目的のために適しているかを容易に知るであろう。[0040]本発明はまた、インスリン複合体に関する。当該複合体は、その反応基が、共有結合を形成するために、インビボ又はイクスビボで血液成分と反応されたインスリン誘導体を含む。それゆえ、当該複合体は、インビボにおいて、インスリン誘導体の投与により形成されるか、又はイクスビボにおいて、インスリン誘導体を血液溶液又は精製血液成分と、共有結合の形成を許容するイクスビボの条件下で接触することにより形成されうる。精製血液成分は、血液成分からの抽出及び精製により提供されうるか、又は組み替え技術により産生されうる。好ましい血液成分は、血液タンパク質であり、より好ましくは血清アルブミンである。[0041]本発明はさらに、血糖関連疾患又は障害の治療方法であって、インスリン誘導体又はインスリン複合体の投与を含む方法に関する。血糖関連疾患又は障害は、I型糖尿病及びII型糖尿病、並びに妊娠性糖尿病を含む。また、嚢胞性線維症、多嚢胞性卵巣症候群、膵炎及び他の膵臓関連疾患もまた、本発明のインスリン誘導体又はインスリン複合体を投与することにより治療されうる。インスリンはまた、成長因子として知られており、そしてそれゆえ、本発明のインスリン誘導体又はインスリン複合体は、傷の治癒及び他の関連する適応のための局所投与に有用でありうる。[0042]以下の実施例は、本発明の範囲を制限する目的ではなく、上記される発明をさらに例示する目的である。[0043]図1は、インスリン分子並びに以下の実施例にそって言及されるGlyA1、PheB1、及びLysB29部位を示す。実施例IGlyA1-MPA-インスリンの合成[0044]インスリン100mgを、DMFジメチルホルムアミド20ml及びTFA100μl中に溶解した。当該溶液に、NMM4-メチルモルホリン、200μl及びMPA-OSuN-スクシンイミジル3マレイミドプロパノエート、92mg25当量を加え、そして当該反応液を2時間攪拌した。水を加えることにより反応を止め、そしてAcOH酢酸でpH4に調節した。アセトニトリルを加えて、沈殿を溶解し、そして水/アセトニトリル3:1の全体の体積は20mlであった。当該溶液を半調製HPLC中に注入した。PhenomenexLuna10mフェニル-ヘキシル21mm×250mmカラムを、水性TFA溶液水中に01TFA、溶媒A及びアセトニトリルTFA溶液アセトニトリル中に01TFA、溶媒Bで平衡化した。27から31までのBの勾配を120分かけて流すことにより、95ml/分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、214及び254nmでUV吸収により検出した。分画を95mlの一定分量で回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接LC/MSに注入後に質量検出により同定した。Rt=36~46分で純粋な分画を回収し、混合し、そして凍結乾燥して、23mgの回収されたインスリンと供に白色粉末40mgを与えた。[0045]計算された質量は、59585g/molであり、そしてLC-MSにより計測された質量は、59580g/molである。[0046]表1は、アミノ酸配列分析フェニルイソチオシアネートを使用するエドマン分解を示し、当該分析は、A鎖のN末端がブロックされ、そしてN末端フェニルアラニンが、いまだに遊離していたということを確かめるために行われた。実施例IIPheB1MPAインスリンの合成[0047]インスリン100mgをDMSOジメチルスルホキシド4ml及びEt3Nトリエチルアミン100μl中に、超音波処理して溶解した。当該溶液に、Boc2Oジtertブチルジカルボネート93mg、25当量を加え、そして当該反応液を室温で30分間攪拌した。反応溶液を、AcOHでpH4に調節した。当該溶液を、半調製HPLC中に注入した。PhenomenexLuna10mフェニル-ヘキシル21mm×250mmカラムを、水性TFA溶液水中に01TFA、溶媒A及びアセトニトリルTFA溶液アセトニトリル中に01TFA、溶媒Bで平衡化した。27から40までのBの勾配を120分かけて流すことにより、95ml/分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、214及び254nmでUV吸収により検出した。分画を95mlの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接LC/MSに注入後に質量検出により同定した。3の産物Bocインスリン、GlyA1LysB29BisBocインスリン、及びTrisBocインスリンを単離し、そして所望のGlyA1LysB29BisBocインスリンを混合し、そして凍結乾燥して白色粉末を与えた72mg。[0048]DMF3ml中のGlyA1LysB29BisBocインスリン51mgを、MPAOSu36mgと、Et3N30μlの存在下で反応させた。当該反応液を2時間室温で攪拌した。DMFを減圧下で蒸発させた。当該残基を、TFA2mlで10分間処理し、そして次にTFAを蒸発させた。粗製生成物を水アセトニトリル3;1中で溶解し、そして当該溶液を、半調製HPLC中に注入した。PhenomenexLuna10mフェニル-ヘキシル21mm×250mmカラムを、水性TFA溶液水中に01TFA、溶媒A及びアセトニトリルTFA溶液CH3CN中に01TFA、溶媒Bで平衡化した。27から32までのBの勾配を120分かけて流すことにより、95ml/分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、214及び254nmでUV吸収により検出した。分画を95mlの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接LC/MSに注入後に質量検出により同定した。純粋な分画を混合し、そして凍結乾燥して、白色粉末を与えた29mg。[0049]計算された質量は、59585gmolであり、そしてLCMSにより計測された質量は、59584gmolであった。[0050]アミノ酸配列分析フェニルイソチオシアネートを使用するエドマン分解を使用して、B鎖のN末端がブロックされ、そしてA鎖のN末端グリシンがいまだに遊離していたことを確認した表1参照のこと。実施例IIIB1MPAOAインスリンの合成[0051]GlyA1LysB29-BisBoc-インスリン39mgを含むDMF3mL及びEt3N30μLを、MPA-OA-OSu[N-スクシンイミジル8-N-3-マレイミドプロパニルカルボニルアミノオクタノエート]25mgと4時間反応させた。DMFを蒸発させ、そして残渣をTFAで10分間処置した。TFAを蒸発させた後、残渣を水アセトニトリル1:3中に溶解した。当該溶液を半調製HPLCに注入した。PhenomenexLuna10mフェニル-ヘキシル21mm×250mmカラムを、水性TFA溶液水中に01TFA、溶媒A及びアセトニトリルTFA溶液アセトニトリル中に01TFA、溶媒Bで平衡化した。27から36までのBの勾配を120分かけて流すことにより、95ml/分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、214及び254nmでUV吸収により検出した。分画を95mlの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接LC/MSに注入後に質量検出により同定した。純粋な分画を混合し、そして凍結乾燥して、白色粉末21mgを与えた。[0052]計算されたMassは60995gmolであり、そしてLCMSにより計測された質量は、60996gmolである。実施例IVLysB29MPAインスリンの合成[0053]インスリン74mgをDMSO2ml及びAcOH46μL中に溶解した。当該溶液にBoc2O69mg、25当量を加え、そして反応液を5時間室温で攪拌した。水15ml及びアセトニトリル5mlを加え、そして反応液を半調製HPLCカラムC18フェニルへキシルに、流速95ml分、そして勾配を27~40で120分間で注入した。43分での分画を混合し、そして凍結乾燥してGlyA1PheB1-Boc2-インスリン30mgを与えた。[0054]GlyA1PheB1-Boc2-インスリン30mgを含むDMF2mL及びNMM4-メチルモルフォリン、100μLをMPA-OSu10mgと60分間反応させた。DMFを蒸発させ、そして残渣をTFAで10分間処理した。該残渣を水アセトニトリル3:1中で溶解し、そして溶液を半調製HPLCに注入した。PhenomenexLuna10mフェニル-ヘキシル21mm×250mmカラムを、水性TFA溶液水中に01TFA、溶媒A及びアセトニトリルTFA溶液アセトニトリル中に01TFA、溶媒Bで平衡化した。27から32までのBの勾配を120分かけて流すことにより、95ml/分で溶出を達成した。ペプチドを含む分画を、214及び254nmでUV吸収により検出した。分画を95mlの一定分量に回収した。所望の産物プロファイルを含む分画を、直接LC/MSに注入後に質量検出により同定した。純粋な分各を混合し、そして凍結乾燥して、白色粉末を与えた222mg。[0055]計算された質量は、59585gmolであり、そしてLCMSにより計測された質量は、59580gmolである。[0056]アミノ酸配列分析フェニルイソチオシアネートを使用するエドマン分解を使用して、B鎖N末端フェニルアラニン及びA鎖N末端グリシンの両方が、遊離であることを確認した表1を参照のこと。実施例VMPAAEES2COOHリンカーの合成[0057]フラッシュカラムクロマトグラフィーをBiotage商標40iフラッシュクロマトグラフィーモジュラーシステムを使用して行った。半調製HPLC精製を、PhenomexlunaRP18、10μフェニルへキシル250×212mmカラムを使用してWatersBreezeシステム1500シリーズにおいて、95ml分の移動層流速で行った。PhenomexlunaRP18、10μフェニルへキシル250×500mmカラムを、50ml分移動層流速で使用して、Glison690システムを調製スケールの精製に使用した。水01TFA中のアセトニトリルCH3CN01TFAの勾配を、各化合物の合成方法において指示された詳細に基づいて使用した。LC-MSを、ES1エレクトロスプレーソースを備えるAglient1100シリーズLCMSDシングル4極子質量分析計を使用して行った。実施例VIPheB1-MPA-AEES2-インスリン[0058]メタノール150ml中の22アミノエトキシエタノール500gを、Boc2O934gと30分間反応させた。メタノールを吸引下で蒸発させ、そして残渣を酢酸エチル中に溶解し、水、塩類溶液で洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発後、粗製生成物を、次のステップに使用した。MSmZ205。[0059]保護アルコールを、Et3N66mlの存在下で、NNジメチルホルムアミド500ml中に溶解した。MsClメシレートクロリドを0°Cで30分かけて滴下して加え、そして室温で1時間攪拌した。NaN31276gを次に反応混合液に加え、次にNMMNメチルモルフォリン、215mlを加え、そして反応液を40~50°Cで16時間攪拌した。反応混合液を酢酸エチル2lに注ぎ、そして水で洗浄した。水層を酢酸エチル2Lで戻し抽出し、そして混合酢酸エチル層を水、塩類溶液で洗浄し、そして乾燥した。当該溶媒の蒸発後、粗製生成物を次のステップに使用した1014g、いくらかのDMFを含む。MSmz231。[0060]当該粗製生成物624gをメタノール300ml中に溶解し、次にPdOAc230g及びギ酸96、62gを加えた。反応終了後、Pd種を、セライトを通したろ過により取り除いた。メタノールを吸引下で取り除き、そしてさらに減圧下で乾燥させた。粗製生成物を次のステップに使用した。[0061]粗製生成物をジクロロメタン中に溶解し、そしてEt3Nで塩基性になるまで中和した。無水コハク酸323gを一回で加えた。当該反応液を室温で1時間攪拌した。溶媒を吸引下で取り除き、そして残渣を、HCl1Nにより、pH3に酸性化した。当該生成物を酢酸エチルで抽出した。当該酢酸エチル層を、シリカゲルプラグ1kgを通した。次に該シリカゲルを、2~4メタノールを含む酢酸エチルで洗浄した。純粋な分画薄層クロマトグラフィーにより判断されるを混合し、そして溶媒を吸引下で取り除いて、BocAEESを油状残渣として与えた36g、44。MSmz305。[0062]BocAEES55gを、NヒドロキシスクシンイミドNHS457g及びエチルジメチルアミノプロピルカルボジミドヒドロクロリドEDC762gを含むジクロロメタン30mlで2時間処理した。NHSエステルを酢酸エチル500ml中に注ぎ、01NHClで洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を吸引下で取り除き、そして当該残渣をそのまま次のステップで使用した。[0063]BocAEES605gをトリフルオロ酢酸TFA、10mlで10分間処理した。TFAを吸引下で取り除き、そしてさらに減圧下で乾燥した。AEESアミノ酸をNNジメチルホルムアミド20ml中に溶解し、そして過剰量のNMMで塩基性化した。次に実施例Vの粗製生成物を加え、そして反応液を室温で1時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、そして残渣を、5~40の勾配を60分かけて使用する調製HPLCに注入した。当該溶媒を取り除き、そして残渣を減圧下で乾燥して、BocAEES2COOHを油として与えた564g、84。MSmz478[0064]Boc-AEES2-COOH360gをトリフルオロ酢酸TFA、10mlで10分間処理した。TFAを吸引下で取り除き、そしてさらに減圧下で乾燥させた。AEES2アミノ酸を、NNジメチルホルムアミド中に溶解し、そしてNMMで塩基性にした。MPAOSu294を加え、そして混合液を、30分間攪拌した。NNジメチルホルムアミドを減圧下で取り除いた。残渣を水中に溶解し、そして4~50の勾配を60分かけて使用する調製HPLC中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を取り除いて、MPAAEES2COOHを、灰白色固体38g、95として与えた。MSmz5422[0065]MPAAEES2COOH304gを、NMM113mlを含むNNジメチルホルムアミド20ml中に溶解し、そしてpニトロフェニルクロロホルメートで処理した113g。反応混合液を室温で2時間攪拌した。NNジメチルホルムアミドを減圧下で取り除いた。残渣を、Biotage商標システムを使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。カラムを酢酸エチル500mlで洗浄し、続いて10メタノールを含む酢酸エチル1lで洗浄した。純粋な分画を、混合し、そして溶媒を取り除いて、MPAAEES2CO2PNPを固体として与えた139g、37。MSmz663。[0066]NMM200μLの存在下で室温にて、GlyA1、LysB29-BisBoc-インスリン200mgを含むNN-ジメチルホルムアミド10mLを、実施例VIIIからのMPA-AEES2-CO2PNP200mgと16時間結合させた。NNジメチルホルムアミドを減圧下で取り除き、そして残渣をTFAで10分間処理した。TFAを吸引下で取り除き、該残渣を水中に溶解し、そして120分かけて27~32勾配を使用するHPLC中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を凍結乾燥して、PheB1MPAAEES2インスリンを、白色粉末として与えた950mg、437。MSmz63304実施例VIINMM200μLの存在下で室温にて、GlyA1、PheB1-BisBoc-インスリン200mgを含むNN-ジメチルホルムアミド10mLを、実施例VIからのMPA-AEES2-CO2PNP200mgと16時間結合させた。NNジメチルホルムアミドを減圧下で取り除き、そして残渣をTFAで10分間処理した。TFAを吸引下で取り除いた後、該残渣を水中に溶解し、そして120分かけて27~32勾配を使用するHPLC中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を凍結乾燥して、LysB29MPAAEES2インスリンを、白色粉末として与えた5630mg、259。MSmz63288実施例VIIIB29MPAOAインスリンの合成[0068]GlyA1PheB1BisBocインスリン205mgを含むNNジメチルホルムアミド10mlを、MPAOACO2SU139mgと、室温で16時間、NMM20μLの存在下で結合した。溶媒を減圧下で取り除き、そして残渣を水中で溶解し、そして120分かけて27~36勾配を使用するHPLC中に注入した。純粋な分画を混合し、そして溶媒を凍結乾燥して、LysB29MPAOHインスリンを、白色粉末642mg、31として与えた。MSmz60988実施例IXインビトロ結合アッセイ[0069]Wistarラットの肝臓膜を、[125I]インスリン、及びさらなる濃度インスリン、図1において記載されるDAC:インスリン、並びにその対応する複合体と、4°Cで16時間インキュベーションした。膜をろ過し、そして3回洗浄し、そしてフィルターをカウントして、特異的に結合された[125I]インスリンを測定した。IC50を、GraphPadPrismソフトウェアを使用して計算した。[0070]IC50の結果を、表2に記載した。図2及び図3は、本発明のインスリン誘導体の濃度関数における阻害割合の点で、ラット肝臓膜に結合するインスリンを記載する。実施例Xインビトロ生物活性[0072]インビトロ活性を評価するために、脂肪細胞におけるグルコースの取り込みを使用した。生物アッセイにおいて使用するために、3T3L1細胞、マウス線維芽細胞系列を脂肪細胞に分化させた。3T3L1細胞をDMEM及び10FBS中に撒き、そしてコンフルエントになるまで成長させ、続いて2日間インキュベーションした。デキサメタソン及びインスリンを加えることにより分化を誘導したD0。7日目に、90より多い細胞が、脂肪細胞の表現型、つまり脂肪滴の増加を示した。図4A4Cは、3日後の前脂肪細胞を示し、そして7日目の脂肪細胞を示す。図5A及び5Bは、4日目での脂肪細胞及び7日目の脂肪細胞のオイルレッドO染色を示す。図6A及び6Bは、4日目及び7日目でのオイルレッドO染色及びメチレンブルー染色を示す。[0073]3T3L1脂肪細胞を、5mMグルコース及び05FBSを含むDMEM中で一晩飢餓状態にした。細胞を、1BSAを含むクレブリンゲルHepes緩衝液中で洗浄し、そして増加濃度のインスリン、DAC:インスリン誘導体、及びその対応する複合体で、20分間、37°Cでインキュベーションし、そして[14C]2デオキシDグルコース1μCiウェルでさらに20分間インキュベーションした。細胞を可溶化し、そして放射活性を計測した。グルコース取り込みを、インスリンコントロールに対して計算し、そしてEC50を、GraphPadPrism商標ソフトウェアを使用して計算した。[0074]表3は、試験された化合物に対するEC50の結果を示し、そして図7は、当該化合物の濃度Mの関数におけるコントロールのグルコース取り込みの割合を示す。実施例XI[0075]さらに、インビトロ活性を評価するために、脂肪細胞の他のソースにおいてグルコース取り込みを使用した。体重175±25gのWister由来雄ラットから得た副睾丸脂肪を使用する。組織003gmlを、コラゲナーゼを含む改変HEPES溶液pH74により、37°Cで分解した。試験化合物及び又は溶媒を、500μLの一定量の改変HEPES緩衝液pH74でインキュベーションし、そしてD[3-3-H]グルコース25μCimlを次に加えて、2時間インキュベーションした。試験化合物誘導性のグルコース取り込みであって、コントロール2nMインスリンの応答に対して50以上多いグルコースの取り込みの増加は、有力なインスリン受容体アゴニスト活性を指し示す。50を超えて、インスリン誘導性グルコースの取り込み応答を阻害する試験化合物は、インスリン受容体アンタゴニスト活性を指し示す。化合物は、10、1、01、001、及び0001μMでスクリーニングされる。[0076]表4は、試験される化合物についてのEC50の結果を示し、そして図8は、化合物の濃度M関数におけるコントロールのグルコース取り込み割合を示す。実施例XIIインビボ実験[0077]組換えヒトインスリンと本発明のインスリン誘導体との間の血中グルコース低下効力の評価は、糖尿病の雌dbdbマウスに皮下投与される際に、比較される。[0078]試験化合物を、一回の皮下ボーラス注射により、5~6週齢のメスdbdbマウス、体重243~333gに投与した。注射された投与溶液の平均体積は、035mlマウス125mlkgであった。[0079]組換えイーコリEcoliヒトインスリン以下でrHインスリンと呼ぶは、ICNTMにより、28IUmgの濃度で提供される。インスリン誘導体のストック溶液を、合成インスリン誘導体を酸性水~pH2で再構成することにより、1429mgml~400IUmlで調製した。ストック溶液を次に09NaClで希釈し、そして022μmフィルターMillexGVを通して、表5に表される投与溶液を得た。群Iは、コントロール溶液として、09NaClUSPを受けた。[0081]群と処理は、表6において要約される。[0082]血液採取一滴を、尻尾の先で行い、そしてグルコースレベルを、手持ちグルコメーターモデル:ワンタッチUltraTM、LifescanCanadaを使用して測定した。血液グルコースレベルを、投与前に一度全ての動物で測定し、そして投与後1、2、3、4、6、24、30、48、及び72時間で測定した。インビボ結果:[0083]全ての動物は、試験化合物の投与前に通常であるようにみえた。投与後およそ1時間で、100IUkgの組換えヒトインスリンrHインスリンで皮下投与された群2の動物は、活動が少し低下し、そして非強調的な歩行を示した。他の処置を受けた動物は、実験を通して通常であるように見えた。食餌消費のわずかな減少が、実施例IIIの179mgkgの化合物で処置された動物において観測された。[0084]表7は、rHインスリン及びインスリン誘導体の一回投与の後の食餌消費全重量ケージgを示す。[0085]表8は、rHインスリン及びインスリン誘導体の一回投与後のコントロールに対する食餌消費全重量ケージを示す。血糖の差分は、図9、10、11、12、13、及び14において報告された各々のマウスについて、投与後の血中グルコースレベル対投与前のグルコースレベルから計算される。一般的に、インスリン誘導体実施例I、実施例II、及び実施例IIIは、用量依存的様式で血中グルコース濃度を低下でき、そして一回の投与量100IUkgのみで試験された組換えインスリンは、2時間活性であった。36mgkgにおいて、実施例2は、最初の2時間インスリンと同程度の活性であり、一方実施例I及び実施例IIIでは不十分な効果しか得られない。rHインスリンの低下効果は、179mgkgでより強調された。なぜなら、当該効果が24時間まで観察されたからである。全体図は、インスリン誘導体が、24時間までコントロール群に比べて活性であることを示したが、グルコースレベルが投与後1~2時間減少し、次に3~4時間で増加し、そして再び6時間で減少しているということに留意することは重要である。この上昇と下降応答は、マウスの食性および代謝が、薬剤の効力に影響を与えうる重要なパラメーターであるということを示唆しうる。dbdbマウスが、年齢につれてインスリン抵抗性を発達させ、このことが、グルコース低下効果を得るために注射されなければならないかなり高用量のインスリンを説明しうるということについて言及することは重要である。実施例XIII通常ラットにおける薬物動態プロファイル[0087]Rhインスリン、実施例IIIのインスリン誘導体、及び実施例IIIのインスリン誘導体の複合体を、7~8週齢の雄CDラットに、36nmolkgsc又は12nmolkg静脈内ivのいずれかで投与した。血液サンプルを、72時間までrhインスリン処置した動物については3時間まで回収した。薬剤レベルを、ヒトインスリンELISAキットLincoを使用して測定した。薬物動態パラメーターを、WinNonlinソフトウェアを使用して、化合物投与経路あたりN=4で非区画分析により計算した。図15は、通常のSDラットにおけるインスリンの薬物動態プロファイルである。ここでインスリンは、scで36nmolkgで投与され、そしてivで12nmolkgで投与された。図16は、通常のSDラットにおける実施例IIIの複合体の薬物動態プロファイルであり、ここで複合体は、scで36nmolkg、及びivで12nmolkgで投与された。図17は、通常のSDラットにおける実施例IIIのインスリン誘導体の薬物動態プロファイルであり、ここでインスリン誘導体は、scで36nmolkgで投与され、そしてivで12nmolkgで投与された。図18は、インスリン、実施例IIIのインスリン誘導体、及び実施例IIIのインスリン誘導体の複合体の皮下投与のPKプロファイルである。図19は、インスリン、実施例IIIのインスリン誘導体、及び実施例IIIのインスリン誘導体の複合体の静脈内投与のPKプロファイルである。実施例XIV糖尿病ラットにおける一回用量の薬力学[0088]雄CDラットにおいて、ストレプトゾトシン60mgkgの一回iv注射で、糖尿病を誘導した。2日後、DAC商標:インスリン誘導体を120nmolkg、前もって成形された複合体300nmolkg、rhインスリン20Ukg120nmolkg、又は溶媒を、ラットに1回sc注射した。血中グルコースレベルを手持ちグルコメーターで、注射直前、及び投与後1、2、3、4、6、8、10、11、24、30、及び48時間後、5匹のラット群で測定した。但し溶媒群については3匹のラット群で試験した。通常のラットにおける血糖の範囲は、52~76mmollであった。[0089]図20は、120nmolkgの実施例I~IVを投与した後のラットにおける血中グルコースレベルを示す。図21は、本発明の実施例I~IVの対応する複合体を300nmolkgで投与した後の、ラットにおける血糖レベルを示す。実施例XV繰返し皮下注射後の、DAC:インスリン誘導体の効力及び前もって成形された対応の複合体の効力の評価[0090]本アッセイは、成獣雄CD商標ラットに繰返し皮下注射した後の、実施例IIIのインスリン誘導体及びその複合体の効力対遊離ヒト組換えインスリンの効力を評価するために行われた。[0091]1型糖尿病を、ストレプトゾトシン60mgkg、pH45の1回静脈iv注射により、実験1日目に雄CD商標ラットに誘導した。高血糖は、血液を試験する血中グルコースモニターを使用して確認された。試験化合物を、実験3日目から14日目まで1日1回、皮下sc注射により1mlkg体重で投与した。血中グルコースレベルを、それぞれの日の投与の直前、及び投与後2、8、19時間で試験した。食餌と水の消費量を、毎日モニターした。体重を、実験1、3、6、9、12、15、及び17日目に集めた。[0092]図22は、実施例IIIのインスリン誘導体についての1日目、6日目、及び12日目における1日の血中グルコースプロファイルを示し、そして図23は、実施例IIIのインスリン誘導体の複合体について、1日目、6日目、及び12日目での1日の血中グルコースプロファイルを示す。[0093]本発明は、その特異的な実施態様に関して記載される一方で、さらなる改良が可能であり、そして当該出願が、本発明の原理に一般的に従う発明、並びに本発明が関連する技術において既知又は慣習的な慣行の範囲内であり、本明細書に記載された基本的特徴に適用され、そして添付の特許請求の範囲内に従う開示からの逸脱を含む発明の全てのバリエーション、使用、又は適応をカバーすることが意図されることが、理解されるであろう。"