"配列番号1に対して少なくとも60のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドが非オキヒオドシエビ属Oplophorusルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、単離ポリヌクレオチド。非オキヒオドシエビ属Oplophorusルシフェラーゼがウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。非オキヒオドシエビ属Oplophorusルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。配列番号1に対して少なくとも60のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドは配列番号3のOgLucポリペプチドと比較して増強された発光を有し、ただし、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが表47に列挙されるもののうちの1つではない、ポリヌクレオチド。配列番号1に対して少なくとも60のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドは配列番号31のポリペプチドと比較して増強された発光を有し、ただし前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが配列番号3または15ではない、ポリヌクレオチド。配列番号1に対して少なくとも60のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドが配列番号29のポリペプチドと比較して増強された発光を有し、ただし、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが配列番号3または15ではない、ポリヌクレオチド。前記ポリペプチドが配列番号1に対して少なくとも80のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1~6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記ポリペプチドが配列番号1に対して少なくとも90のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1~7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。OgLuc変異体ポリペプチドが配列番号3のポリペプチドと比較して増強されたタンパク質安定性または増強された生体適合性のうちの少なくとも1つを有する、請求項1~8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。OgLuc変異体ポリペプチドがウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼと比較して増強された酵素安定性または増強された生体適合性のうちの少なくとも1つを有する、請求項1~9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドがホタルルシフェラーゼと比較して増強された酵素安定性または増強された生体適合性のうちの少なくとも1つを有する、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドがセレンテラジンの存在下で配列番号3のポリペプチドと比較して増強された発光を有する、請求項1~11のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、式IaまたはIb:またはの化合物の存在下で配列番号3のポリペプチドと比較して増強された発光を有する請求項1~12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、式中、R2は、またはC25直鎖アルキルからなる群から選択され;R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORからなる群から選択され;R8は、Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC12アルキルであり;Wは、-NH2、ハロ、-OH、-NHCOR、-CO2Rであり;XはS-、O-またはNR22-であり;Yは、H、-OH、またはOR11であり;Zは、CH-またはN-であり;各R11は独立してCORまたはCH2OCORであり;R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;各Rは独立してC17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;Rは、C17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;ただし、R2が、またはのとき、R8は、ではなく;R2が、であるとき、R8は、または低級シクロアルキルであり;R6がNH2であるとき、R2は、またはC25アルキルであり;またはR8は、ではない、ポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、異なるセレンテラジンと比較した場合のあるセレンテラジンの存在下で、配列番号3のポリペプチドと比較して相対的基質特異性における変化を有する、請求項1~13のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンと比較して式IaまたはIb:またはの化合物の存在下で、配列番号3のポリペプチドと比較して相対的基質特異性における変化を有する、請求項1~14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、式中、R2は、またはC25直鎖アルキルからなる群から選択され;R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORからなる群から選択され;R8は、Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC12アルキルであり;Wは、-NH2、ハロ、-OH、-NHCOR、-CO2Rであり;Xは-S-、-O-または-NR22-であり;Yは、-H、-OH、または-OR11であり;Zは、-CH-または-N-であり;各R11は独立して-CORまたは-CH2OCORであり;R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;各Rは独立してC17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;Rは、C17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;ただし、R2が、またはのとき、R8は、ではなく;R2が、であるとき、R8は、または低級シクロアルキルであり;R6がNH2であるとき、R2は、またはC25アルキルであり;またはR8は、ではない、ポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号3のポリペプチドと比較して増強された生体適合性を有する、請求項1~15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、セレンテラジンの存在下でウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、請求項1~16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、式IaまたはIb:またはの化合物の存在下で、ウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、請求項1~17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、式中、R2は、またはC25直鎖アルキルからなる群から選択され;R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORからなる群から選択され;R8は、Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC12アルキルであり;Wは、-NH2、ハロ、-OH、-NHCOR、-CO2Rであり;XはS-、O-またはNR22-であり;Yは、H、-OH、またはOR11であり;Zは、CH-またはN-であり;各R11は独立してCORまたはCH2OCORであり;R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;各Rは独立してC17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;Rは、C17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;ただし、R2が、またはのとき、R8は、ではなく;R2が、であるとき、R8は、または低級シクロアルキルであり;R6がNH2であるとき、R2は、またはC25アルキルであり;またはR8は、ではない、ポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、異なるセレンテラジンと比較してあるセレンテラジンの存在下で、ウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼと比較して相対的基質特異性における変化を有する、請求項1~18のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンと比較して式IaまたはIb:またはの化合物の存在下で、ウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼと比較して相対的基質特異性における変化を有する、請求項1~19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、式中、R2は、またはC25直鎖アルキルからなる群から選択され;R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORからなる群から選択され;R8は、Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC12アルキルであり;Wは、-NH2、ハロ、-OH、-NHCOR、-CO2Rであり;XはS-、O-またはNR22-であり;Yは、H、-OH、またはOR11であり;Zは、CH-またはN-であり;各R11は独立してCORまたはCH2OCORであり;R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;各Rは独立してC17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;Rは、C17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;ただし、R2が、またはのとき、R8は、ではなく;R2が、であるとき、R8は、または低級シクロアルキルであり;R6がNH2であるとき、R2は、またはC25アルキルであり;またはR8は、ではない、ポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドがウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼと比較して増強された生体適合性を有する、請求項1~20のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、ルシフェリン存在下のホタルルシフェラーゼと比較して、セレンテラジンの存在下で増強された発光を有する、請求項1~21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、ルシフェリン存在下のホタルルシフェラーゼと比較して、式IaまたはIb:またはの化合物の存在下で増強された発光を有する、請求項1~22のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、式中、R2は、またはC25直鎖アルキルからなる群から選択され;R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORからなる群から選択され;R8は、Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC12アルキルであり;Wは、-NH2、ハロ、-OH、-NHCOR、-CO2Rであり;XはS-、O-またはNR22-であり;Yは、H、-OH、またはOR11であり;Zは、CH-またはN-であり;各R11は独立してCORまたはCH2OCORであり;R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;各Rは独立してC17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;Rは、C17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;ただし、R2が、またはのとき、R8は、ではなく;R2が、であるとき、R8は、または低級シクロアルキルであり;R6がNH2であるとき、R2は、またはC25アルキルであり;またはR8は、ではない、ポリヌクレオチド。前記OgLuc変異体ポリペプチドがホタルルシフェラーゼと比較して増強された生体適合性を有する、請求項1~23のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。OgLuc変異体ポリペプチドが、オプロポルスグラキリロストゥリスOplophorusgracilirostris、オプロポルスグリマルディイOplophorusgrimaldii、オプロポルススピニカウダOplophorusspinicauda、オプロポルスフォリアケウスOplophorusfoliaceus、オプロポルスノヴァエゼエランディアエOplophorusnovaezeelandiae、オプロポルステュプスOplophorustypus、またはオプロポルススピノススOplophorusspinosus由来である、請求項1~24のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。少なくとも1つのアミノ酸置換が、配列番号1の1位、4位、6位、10位、11位、14位、15位、16位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、24位、25位、27位、28位、31位、32位、33位、34位、36位、38位、39位、40位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、54位、55位、56位、58位、59位、60位、66位、67位、68位、69位、70位、71位、72位、74位、75位、76位、77位、86位、87位、89位、90位、92位、93位、94位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、102位、106位、109位、110位、111位、112位、113位、117位、119位、124位、125位、126位、127位、128位、129位、130位、135位、136位、138位、139位、142位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、152位、154位、155位、158位、159位、163位、164位、166位、168位もしくは169位に対応する位置またはそれらの組み合わせに存在する、請求項1~25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記コードされたOgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するF1I、E4K、F6Y、W10Y、R11Q、A14V/S、G15R、Y16E、Q18D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/R/S/V/W/Y、D19N、Q20P/R、V21L/M、L22I/F、E23K、Q24A、G25L、L27M/V/A/D/G/I、S28Y、F31I、Q32H/L/P、A33N/M、L34M、V36E/M、V38F/I、T39I、P40T/I/L/Q、Q42H、K43N/R、I44F、V45E、L46Q、S47P、G48R、E49D/G/K、N50K/S、G51E/R/V、A54I/S、D55E/G、I56V、V58I/L、I59T、I60V、S66T/N、G67D/S、F68L/S/W/Y/D、Q69H、M70V、G71D、L72A/C/F/G/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y、E74I/K、M75F/K、I76F/N/V、F77A/C/D/G/M/N/S/T/V/W/Y、H86L/R、H87N/T、K89E、I90D/K/P/Q/R/T/V/Y、L92A/G/H/M/Q/R/S/Y、H93R、Y94F、G95D/S、T96A、L97E、V98F、I99T/V、D100I、V102E/M/T、M106I/K、Y109F、F110I、G111N、R112C、P113H/T/K、I117F、V119M、K124M、I125L、T126R、V127A、T128A/S、G129Q、T130K、N135D/Y、L136M、I138S、D139G、L142V/E/K/W、P145L/Q、D146G、G147N、S148T、L149I/M、L150V、R152H/S/E/T、T154S、I155T、V158I、T159I/S、L163I、C164S、N166I/F/E、L168F、もしくはA169Vのうちの少なくとも1つに対応する置換またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1~26のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも1つまたはそれらの組み合わせを含む、請求項1~27のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド:配列番号1に対応する、1位のイソロイシン、4位のリジン、6位のチロシン、10位のチロシン、11位のグルタミン、14位のバリンもしくはセリン、15位のアルギニン、16位のグルタミン酸、18位のアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、19位のアスパラギン、20位のアルギニンもしくはプロリン、21位のロイシンもしくはメチオニン、22位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、23位のリジン、24位のアラニン、25位のロイシン、27位のバリン、メチオニン、アラニン、アスパラギン酸、グリシンもしくはイソロイシン、28位のチロシン、31位のイソロイシン、32位のプロリン、ヒスチジン、もしくはロイシン、33位のアスパラギンもしくはメチオニン、34位のメチオニン、36位のメチオニンもしくはグルタミン酸、38位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、39位のイソロイシン、40位のトレオニン、イソロイシン、ロイシンもしくはグルタミン、42位のヒスチジン、43位のアスパラギンもしくはアルギニン、44位のフェニルアラニン、45位のグルタミン酸、46位のグルタミン、47位のプロリン、48位のアルギニン、49位のアスパラギン酸、グリシン、もしくはリジン、50位のリジンもしくはセリン、51位のグルタミン酸、アルギニン、もしくはバリン、54位のセリンもしくはイソロイシン、55位のグリシンもしくはグルタミン酸、56位のバリン、58位のイソロイシンもしくはロイシン、59位のトレオニン、60位のバリン、66位のトレオニンもしくはアスパラギン、67位のセリンもしくはアスパラギン酸、68位のロイシン、アスパラギン酸、セリン、チロシンもしくはトリプトファン、69位のバリン、70位のバリン、71位のアスパラギン酸、72位のグルタミン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、74位のリジンもしくはイソロイシン、75位のリジンもしくはフェニルアラニン、76位のアスパラギン、フェニルアラニン、もしくはバリン、77位のアラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、86位のアルギニンもしくはロイシン、87位のアスパラギンもしくはトレオニン、89位のグルタミン酸、90位のアスパラギン酸、リジン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、もしくはチロシン、92位のアラニン、グリシン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、セリン、もしくはチロシン、93位のアルギニン、94位のフェニルアラニン、95位のセリンもしくはアスパラギン酸、96位のアラニン、97位のグルタミン酸、98位のフェニルアラニン、99位のトレオニンもしくはバリン、100位のイソロイシン、102位のメチオニン、グルタミン酸、もしくはトレオニン、106位のイソロイシンもしくはリジン、109位のフェニルアラニン、110位のイソロイシン、111位のアスパラギン、112位のシステイン、113位のヒスチジン、トレオニン、もしくはリジン、117位のフェニルアラニン、119位のメチオニン、124位のメチオニン、125位のロイシン、126位のアルギニン、127位のアラニン、128位のアラニンもしくはセリン、129位のグルタミン、130位のリジン、135位のアスパラギン酸もしくはチロシン、136位のメチオニン、138位のセリン、139位のグリシン、142位のバリン、グルタミン酸、リジンもしくはトリプトファン、145位のロイシンもしくはグルタミン、146位のグリシン、147位のアスパラギン、148位のトレオニン、149位のイソロイシンもしくはメチオニン、150位のバリン、152位のヒスチジン、セリン、グルタミン酸もしくはトレオニン、154位のセリン、155位のトレオニン、158位のイソロイシン、159位のセリンもしくはイソロイシン、163位のイソロイシン、164位のセリン、168位のフェニルアラニン、もしくは169位のバリン。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138IおよびN166R、並びに配列番号1の1位、4位、6位、11位、14位、15位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、27位、28位、31位、32位、33位、34位、36位、38位、39位、40位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、54位、55位、56位、58位、59位、60位、66位、67位、68位、69位、70位、71位、72位、74位、75位、76位、77位、86位、89位、90位、92位、93位、94位、95位、96位、98位、99位、102位、106位、109位、110位、112位、113位、117位、119位、124位、126位、127位、128位、135位、136位、138位、139位、142位、145位、148位、149位、152位、154位、155位、158位、159位、163位、164位、168位、もしくは169位に対応する位置またはそれらの組み合わせに少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、請求項1~28のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。配列番号1に対応する4位のアミノ酸がグルタミン酸であり、11位のアミノ酸がアルギニンであり、33位のアミノ酸がリジンであり、44位のアミノ酸がイソロイシンであり、54位のアミノ酸がフェニルアラニンであり、115位のアミノ酸がグルタミン酸であり、124位のアミノ酸がリジンであり、138位のアミノ酸がイソロイシンであり、166位のアミノ酸がアルギニンであり、並びに配列番号1の1位、4位、6位、11位、14位、15位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、27位、28位、31位、32位、33位、34位、36位、38位、39位、40位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、54位、55位、56位、58位、59位、60位、66位、67位、68位、69位、70位、71位、72位、74位、75位、76位、77位、86位、89位、90位、92位、93位、94位、95位、96位、98位、99位、102位、106位、109位、110位、112位、113位、117位、119位、124位、126位、127位、128位、135位、136位、138位、139位、142位、145位、148位、149位、152位、154位、155位、158位、159位、163位、164位、168位、もしくは169位に対応しているある位置またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、請求項1~29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。少なくとも1つのアミノ酸置換が、配列番号1に対応するF1I、E4K、F6Y、R11Q、A14V、G15R、Q18D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/R/S/V/W/Y、D19N、Q20P/R、V21L/M、L22I/F、E23K、L27M/V、S28Y、F31I、Q32H/L/P、A33N/M、L34M、V36E/M、V38F/I、T39I、P40T、Q42H、K43N/R、I44F、V45E、L46Q、S47P、G48R、E49D/G/K、N50K/S、G51E/R/V、A54I/S、D55E/G、I56V、V58I/L、I59T、I60V、S66T/N、G67D/S、F68L/S/W/Y/D、Q69H、M70V、G71D、L72A/C/F/G/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y、E74I/K、M75F/K、I76F/N/V、F77A/C/D/G/M/N/S/T/V/W/Y、H86L/R、K89E、I90D/K/P/Q/R/T/V/Y、L92A/G/H/M/Q/R/S/Y、H93R、Y94F、G95D/S、T96A、V98F、I99T/V、V102E/M、M106I/K、Y109F、F110I、R112C、P113H/T、I117F、V119M、K124M、T126R、V127A、T128A/S、N135D/Y、L136M、I138S、D139G、L142V、P145L/Q、S148T、L149I、R152H/S、T154S、I155T、V158I、T159I/S、L163I、C164S、L168F、もしくはA169Vのうちの少なくとも1つまたはそれらの組み合わせに対応している、請求項29または30に記載のポリヌクレオチド。前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも1つまたはそれらの組み合わせを含む、請求項29または30に記載のポリヌクレオチド:配列番号1に対応する1位のイソロイシン、4位のリジン、6位のチロシン、11位のグルタミン、14位のバリン、15位のアルギニン、18位のアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、19位のアスパラギン、20位のアルギニンもしくはプロリン、21位のロイシンもしくはメチオニン、22位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、23位のリジン、27位のバリンもしくはメチオニン、28位のチロシン、31位のイソロイシン、32位のプロリン、ヒスチジン、もしくはロイシン、33位のアスパラギンもしくはメチオニン、34位のメチオニン、36位のメチオニンもしくはグルタミン酸、38位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、39位のイソロイシン、40位のトレオニン、42位のヒスチジン、43位のアスパラギンもしくはアルギニン、44位のフェニルアラニン、45位のグルタミン酸、46位のグルタミン、47位のプロリン、48位のアルギニン、49位のアスパラギン酸、グリシン、もしくはリジン、50位のリジンもしくはセリン、51位のグルタミン酸、アルギニン、もしくはバリン、54位のセリンもしくはイソロイシン、55位のグリシンもしくはグルタミン酸、56位のバリン、58位のイソロイシンもしくはロイシン、59位のトレオニン、60位のバリン、66位のトレオニンもしくはアスパラギン、67位のセリンもしくはアスパラギン酸、68位のアスパラギン酸、セリン、チロシンもしくはトリプトファン、69位のヒスチジン、70位のバリン、71位のアスパラギン酸、72位のグルタミン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、74位のリジンもしくはイソロイシン、75位のリジンもしくはフェニルアラニン、76位のアスパラギン、フェニルアラニン、もしくはバリン、77位のアラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、86位のアルギニンもしくはロイシン、89位のグルタミン酸、90位のアスパラギン酸、リジン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、もしくはチロシン、92位のアラニン、グリシン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、セリン、もしくはチロシン、93位のアルギニン、94位のフェニルアラニン、セリンもしくは95位のアスパラギン酸、96位のアラニン、98位のフェニルアラニン、99位のトレオニンもしくはバリン、102位のメチオニンもしくはグルタミン酸、106位のイソロイシンもしくはリジン、109位のフェニルアラニン、110位のイソロイシン、112位のシステイン、113位のヒスチジンもしくはトレオニン、117位のフェニルアラニン、119位のメチオニン、124位のメチオニン、126位のアルギニン、127位のアラニン、128位のアラニンもしくはセリン、135位のアスパラギン酸もしくはチロシン、136位のメチオニン、138位のセリン、139位のグリシン、142位のバリン、145位のロイシンもしくはグルタミン、148位のトレオニン、149位のイソロイシン、152位のヒスチジンもしくはセリン、154位のセリン、155位のトレオニン、158位のイソロイシン、159位のセリンもしくはイソロイシン、163位のイソロイシン、164位のセリン、168位のフェニルアラニン、もしくは169位のバリン。前記OgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138IおよびN166R、並びに、配列番号1の1位、4位、14位、15位、18位、20位、22位、23位、27位、33位、38位、39位、43位、49位、54位、55位、56位、58位、59位、66位、67位、68位、70位、71位、72位、75位、76位、77位、89位、90位、92位、93位、102位、106位、109位、113位、117位、126位、127位、136位、139位、145位、148位、163位、164位もしくは169位に対応する位置またはそれらの組み合わせに少なくとも1つのアミノ酸を含む、請求項1~26のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。配列番号1に対応する4位のアミノ酸がグルタミン酸であり、11位のアミノ酸がアルギニンであり、33位のアミノ酸がリジンであり、44位のアミノ酸がイソロイシンであり、54位のアミノ酸がフェニルアラニンであり、115位のアミノ酸がグルタミン酸であり、124位のアミノ酸がリジンであり、138位のアミノ酸がイソロイシンであり、166位のアミノ酸がアルギニンであり、並びに配列番号1の1位、4位、14位、15位、18位、20位、22位、23位、27位、33位、38位、39位、43位、49位、54位、55位、56位、58位、59位、66位、67位、68位、70位、71位、72位、75位、76位、77位、89位、90位、92位、93位、102位、106位、109位、113位、117位、126位、127位、136位、139位、145位、148位、163位、164位もしくは169位に対応しているある位置またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、請求項1~26のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記コードされたOgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するF1I、E4K、A14V、G15R、Q18D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/R/S/W/Y、Q20R、L22I、E23K、L27M/V、A33N、V38I、T39I、K43R、E49K、A54I/S、D55G、I56V、V58I/L、I59T、S66T/N、G67S、F68S/W/Y/D、M70V、G71D、L72A/C/F/G/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y、M75F/K、I76N、F77A/C/D/G/M/S/T/V/W/Y、K89E、I90D/K/P/Q/R/T/V/Y、L92A/G/H/M/Q/S/Y、H93R、V102E、M106K、Y109F、P113T、I117F、T126R、V127A、L136M、D139G、P145L、S148T、L163I、C164S、もしくはA169Vのうちの少なくとも1つに対応する置換またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項33または34に基記載のポリヌクレオチド。前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも1つまたはそれらの組み合わせを含む、請求項33または34に記載のポリヌクレオチド:配列番号1に対応する、1位のイソロイシン、4位のリジン、14位のバリン、15位のアルギニン、18位のアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トリプトファン、もしくはチロシン、20位のアルギニン、22位のイソロイシン、23位のリジン、27位のバリンもしくはメチオニン、33位のアスパラギン、38位のイソロイシン、39位のイソロイシン、43位のアルギニン、49位のリジン、54位のセリンまたはイソロイシン、55位のグリシン、56位のバリン、58位のイソロイシンまたはロイシン、59位のトレオニン、66位のトレオニンまたはアスパラギン、67位のセリン、68位のアスパラギン酸、セリン、チロシンまたはトリプトファン、70位のバリン、71位のアスパラギン酸、72位のグルタミン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、75位のリジンもしくはフェニルアラニン、76位のアスパラギン、77位のトリプトファン、チロシン、セリン、トレオニン、バリン、アラニン、グリシン、システイン、アスパラギン酸もしくはメチオニン、89位のグルタミン酸、90位のアスパラギン酸、リジン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、もしくはチロシン、92位のアラニン、グリシン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、セリン、もしくはチロシン、93位のアルギニン、102位のグルタミン酸、106位のリジン、109位のフェニルアラニン、113位のトレオニン、117位のフェニルアラニン、126位のアルギニン、127位のアラニン、136位のメチオニン、139位のグリシン、145位のロイシン、148位のトレオニン、163位のイソロイシン、164位のセリン、もしくは169位のバリン。前記OgLuc変異体ポリペプチドが配列番号1に対応するアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138IおよびN166R、並びに配列番号1に対応する1位、4位、6位、11位、18位、19位、20位、21位、22位、27位、28位、31位、32位、33位、34位、36位、38位、40位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50本発明の実施形態が詳細に説明される前に、発明がその適用において、以下の説明に記載される、または以下の図面に図示される構成要素の構造、合成および配置の詳細に限定されないことを理解すべきである。本発明は特定の実施形態および技術に関して記載されるが、本発明は他の実施形態、および様々な方法での実践または実行が可能である。本発明の方法の以下の説明では、特に断りがない限り、工程段階は室温約22°C、常圧で実行される。本明細書に記載されるあらゆる数値範囲が、小さい方の数値から大きい方の数値までの全ての数値を含むことも、明確に理解されるものとする。例えば、濃度範囲または有益作用範囲が1~50と記述されている場合、2~40、10~30、または1~3などの値が、本明細書において明示的に列挙されているものされる。同様に、配列同一性の範囲が、例えば、60~100未満のように与えられた場合、65、75、85、90、95等の中間値が、本明細書において明示的に列挙されているものとされる。これらは具体的に意図されるものの単なる例であり、最も低い値から最も高い値までの全ての可能な数値が本出願において明示的に述べられたものと見なされる。別段の明白な定めがない限り、~を含むという用語は、~を含むにより導入された列挙の構成要素に加えて、さらなる構成要素が所望により存在してよいことを示すために、本出願の文脈では使用される。しかしながら、~を含むという用語が、さらなる構成要素が存在しないという可能性を包含することは、本発明の特定の実施形態として企図される。すなわち、この実施形態の目的のために、~を含むは~から成るの意味を有するものとして理解されるべきである。以下の詳細な説明により、本発明の個々の特徴の特定の変形例および/または好ましい変形例が開示される。本発明は、特に好ましい実施形態として、本発明の特徴のうち2つ以上について記載された、特定の変形例および/または好ましい変形例のうちの2つ以上の組み合わせによって生じる実施形態も企図する。別段の明白な定めがない限り、本出願における相対量の表示の全ては、重量/重量ベースでなされる。総称により特徴付けられる成分の相対量の表示は、前記総称により包含される全ての特定の変形例または構成要素の総量を指すことが意図されている。総称により規定されるある成分がある相対量で存在することが明示され、この成分が該総称により包含される特定の変形例または構成要素であると、さらに特徴付けられた場合、該総称により包含される成分の総相対量が明示された相対量を上回る程に、該総称により包含される他の変種または構成要素は追加で存在しないことが意図されている。前記総称に包含される変形例または構成要素が他に全く存在しないことがより好ましい。概要種々の態様において、本発明は、新規化合物、新規ルシフェラーゼ、およびそれらの組み合わせに関する。本発明は、新規化合物、新規ルシフェラーゼ、および/またはそれらの組み合わせを含む、方法、組成物、およびキットを包含する。新規化合物は、発光を生じるのにセレンテラジンを利用するタンパク質により基質として使用され得る新規セレンテラジンであり、該タンパク質としては、例えば、刺胞動物ルシフェラーゼ例えば、ウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼ、クラゲルシフェラーゼ例えば、オワンクラゲAequoreajellyfishから得られるエクオリンおよび十脚類ルシフェラーゼ例えば、トゲオキヒオドシエビOplophorusgracilirostrisのルシフェラーゼ複合体等の種々の海洋生物に見出されるルシフェラーゼおよび発光タンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。種々の実施形態において、本発明の新規セレンテラジンは、天然セレンテラジンと比較して、増強された物理的安定性例えば、セレンテラジンの増強された安定性、低減された自己発光、および増加された細胞との生体適合性例えば、異種細胞型を含む細胞に対するより少ない毒性のうちの少なくとも1つを有する。本明細書で開示される新規ルシフェラーゼは、十脚類ルシフェラーゼの活性サブユニットの変異体を含む。新規ルシフェラーゼは、天然セレンテラジンおよび既知のセレンテラジン並びに本発明の新規セレンテラジンを含むがこれらに限定されない種々のセレンテラジンを、基質として利用することができる。新規ルシフェラーゼは、増強された発光増加された輝度、増強されたシグナル安定性および/または延長されたシグナル継続時間を含む、増強された酵素安定性すなわち、高温、pH変化、阻害剤、変性剤、および/または界面活性剤に対する増強された耐性を含む増強された酵素活性、改変された基質特異性すなわち、相対的基質特異性における変化、および増強された生体適合性細胞中での改善された発現、低減された毒性および/または細胞ストレスのうち少なくとも1つを含むのうち少なくとも1つを提示する。種々の実施形態において、本発明は、他の分子例えば、融合タンパク質に化学的に連結した、または固体表面例えば、粒子、毛細管、またはアッセイ管もしくはアッセイプレート上に付着した、可溶性の活性単量体として、溶液中に存在する新規ルシフェラーゼを包含する。新規セレンテラジンと新規ルシフェラーゼの特定の組み合わせは、増強された発光を含む、生物発光分析法のための重要な技術的利点を提供し、ここで、増強された発光は、増強されたシグナル安定性および増強されたセレンテラジン安定性を含む一つまたは複数の要因によるものであり得る。さらに、新規セレンテラジンの多くは、市販のセレンテラジンおよび/または既知のセレンテラジンよりもより小さくなるように設計された。いくつかの場合、本発明の新規ルシフェラーゼは、市販および/または既知のより大きなセレンテラジンよりもより小さな新規セレンテラジンを優先的に利用する。本発明は、新規ルシフェラーゼ変異体と新規セレンテラジン、新規ルシフェラーゼ変異体と既知または天然のセレンテラジン、および新規セレンテラジンとセレンテラジンを基質として用いるあらゆる既知または天然のタンパク質例えば、ルシフェラーゼまたは発光タンパク質との組み合わせを包含する。セレンテラジンという用語は、自然発生の天然のセレンテラジン並びにその類似体を指し、WO2003/040100および米国出願第12/056,073号段落[0086]に開示されるものこれらの開示は本明細書に参照によって組み込まれるに加え、例えば、セレンテラジン-n、セレンテラジン-f、セレンテラジン-h、セレンテラジン-hcp、セレンテラジン-cp、セレンテラジン-c、セレンテラジン-e、セレンテラジン-fcp、ビス-デオキシセレンテラジンセレンテラジン-hh、セレンテラジン-i、セレンテラジン-icp、セレンテラジン-v、および2-メチルセレンテラジンが含まれる。セレンテラジンという用語は、本明細書で開示される新規セレンテラジンも指す以下参照。既知のセレンテラジンという用語は、本発明より以前に知られていたセレンテラジン類似体を指す。OgLucという用語は、セレンテラジン存在下で発光を生じる、十脚類ルシフェラーゼタンパク質またはそのようなタンパク質の変異体を指す。OgLucタンパク質は、その自然発生形態では、単量体であるか、またはタンパク質複合体のサブユニットであり得る。本明細書で開示される例示的な実施形態で使用されるOgLucは、トゲオキヒオドシエビOplophorusgracilirostrisのルシフェラーゼ複合体から得られた19kDaのサブユニットであるが、他の十脚類種他のオキヒオドシエビ属Oplophorus種を含むから得られた同等のポリペプチドも使用可能であり、本発明に包含され、RDDennellObservationsontheluminescenceofbathypelagicCrustaceadecapodaoftheBermudaareaZoolJLinnSocLond42pp393-406を参照;また、PoupinetalSept1999InventairedocumentedesespeciesetbilandesformeslespluscommunesdelamerdIroiseRapportScientifiqueduLaboratoiredOceanographiedelEcoleNavaleBrestも参照、これらはそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる;例としては、プレシオペナエウスコルスカンスPlesiopenaeuscoruscansを含むチヒロエビ科Aristeidaefamily;ヘテロカルプスHeterocarpusおよびパラパンダルスリカルディParapandalusrichardiを含むタラバエビ科Pandalideafamily、ヒュメノペナエウスデビリスHymenopenaeusdebilisおよびメソペナエウストゥロピカリスMesopenaeustropicalisを含むクダヒゲエビ科Solenoceridaefamily;ルキフェルテュプスLucifertypusを含むユメエビ科Luciferidaefamily;セルゲステスアトゥランティクスSergestesatlanticus、セルゲステスアルクティクスSergestesarcticus、セルゲステスアルマトゥスSergestesarmatus、セルゲステスペディフォルミスSergestespediformis、セルゲステスコルヌトゥスSergestescornutus、セルゲステスエドゥワルドゥシSergestesedwardsi、セルゲステスヘンセニSergesteshenseni、セルゲステスペクティナトゥスSergestespectinatus、セルゲステスサルガッシSergestessargassi、セルゲステスシミリスSergestessimilis、セルゲステスヴィギラクスSergestesvigilax、セルギアカッレンゲリSergiachallengeri、セルギアグランディスSergiagrandis、セルギアルケンスSergialucens、セルギアプレヘンシリスSergiaprehensilis、セルギアポテンスSergiapotens、セルギアロブスタSergiarobusta、セルギアスキンティッランスSergiascintillans、およびセルギアスプレンデンスSergiasplendensを含むサクラエビ科Sergestidaefamily;グリュプスマルスピアリスGlyphusmarsupialis、レプトケラベルムデンシスLeptochelabermudensis、パラパシパエスルカティフロンスParapasiphaesulcatifrons、およびパシペアタルダPasipheatardaを含むオキエビ科Pasiphaeidaefamily;アカンテピュラアカンティテルソニスAcanthephyraacanthitelsonis、アカンテピュラアクティフロンスAcanthephyraacutifrons、アカンテピュラブレヴィロストゥリスAcanthephyrabrevirostris、アカンテピュラククッラタAcanthephyracucullata、アカンテピュラクルティロストゥリスAcanthephyracurtirostris、アカンテピュラエクシミアAcanthephyraeximia、アカンテピュラグラキリペスAcanthephyragracilipes、アカンテピュラキングスレユィAcanthephyrakingsleyi、アカンテピュラメディアAcanthephyramedia、アカンテピュラミクロプタルマAcanthephyramicrophthalma、アカンテピュラペラギカAcanthephyrapelagica、アカンテピュラプリオノタAcanthephyraprionota、アカンテピュラプルプレアAcanthephyrapurpurea、アカンテピュラサングイネアAcanthephyrasanguinea、アカンテピュラシボガエAcanthephyrasibogae、アカンテピュラステュロロストゥラティスAcanthephyrastylorostratis、エピュリナビフィダEphyrinabifida、エピュリナフィグエイライEphyrinafigueirai、エピュリナコスキュニイEphyrinakoskynii、エピュリナオムバンゴEphyrinaombango、ヒュメノドラグラキアリスHymenodoraglacialis、ヒュメノドラグラキリスHymenodoragracilis、メニンゴドラミッキュラMeningodoramiccyla、メニンゴドラモッリスMeningodoramollis、メニンゴドラヴェスカMeningodoravesca、ノトストムスギッボススNotostomusgibbosus、ノトストムスアウリクラトゥスNotostomusauriculatus、オプロポルスグラキリロストゥリスOplophorusgracilirostris、オプロポルスグリマルディイOplophorusgrimaldii、オプロポルスノヴァエゼアランディアエOplophorusnovaezealandiae、オプロポルススピニカウダOplophorusspinicauda、オプロポルスフォリアケウスOplophorusfoliaceus、オプロポルススピノススOplophorusspinosus、オプロポルステュプスOplophorustypus、シュステッラスピスブラウエリSystellaspisbraueri、シュステッラスピスクリスタタSystellaspiscristata、シュステッラスピスデビリスSystellaspisdebilis、およびシュステッラスピスペッルキダSystellaspispellucidaを含むヒオドシエビ科Oplophoridaefamily;並びにクロロトコイデススピニカウダChlorotocoidesspinicauda、タラッソカリスクリニタThalassocariscrinita、およびタラッソカリスルキダThalassocarislucidaを含むタラッソカリダエ科Thalassocaridaefamilyのルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定はされない。自然発生形態のトゲオキヒオドシエビOplophorusgracilirostrisルシフェラーゼの成熟したすなわち、シグナル配列を含まない19kDaサブユニットのポリペプチド配列すなわち、BAB13776の169アミノ酸、残基28~196が配列番号1に示される。種々の実施形態において、合成OgLuc配列例えば、C1A4Eポリペプチド配列、配列番号3に示されるようなの最初にメチオニン残基およびバリン残基が挿入されることにより、異種系におけるクローニングおよび発現が促進される。それにもかかわらず、一貫性を保つために、本明細書で参照される種々のアミノ酸置換の位置番号は、配列番号1、すなわち、トゲオキヒオドシエビOplophorusgracilirostrisルシフェラーゼタンパク質複合体の成熟したシグナル配列を含まない天然の19kDaサブユニットのポリペプチド配列に対して特定される。具体的には、あるタンパク質は、そのアミノ酸配列が配列番号1と整列されたときに、配列同一性が30超、好ましくは40超、最も好ましくは50超であり、且つ、該タンパク質がセレンテラジンを基質として利用して発光を触媒することができ、且つ、配列番号1の8位に対応する位置で開始する該アミノ酸配列が下記:GSAIVKFEFYWxLIVMFSYQxxKxNHGKxDExLIVMFYLIVMWFxGLIVMAKRGであり、前記アミノ酸配列が、5より多い差異を有することがないか、またはより好ましくは4、3、2、もしくは1より多い差異を有することがないか、または最も好ましくは差異を含まず、その差異が表4に記載の式VIIのパターン位置patternposition1、2、3、5、8、10、12、14、15、17、または18に対応する位置で生じる場合、十脚類ルシフェラーゼである。差異には、表4のパターン位置の間のギャップまたは挿入も含まれ得る。変異体という用語は、開始ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列の改変型を指す。親のparentalという用語は、その後に改変される開始配列を指す相対語である。親配列は通常、得られた改変配列にコードされるタンパク質の参照として、例えば、親配列および改変配列にコードされるタンパク質の活性レベルまたは他の性質を比較するために、使用される。開始配列は自然発生のすなわち、天然または野生型の配列であり得る。開始配列は、その後に改変される変異体配列でもあり得る。ポリペプチド配列は、配列の最初、中央、および/または最後で、一つまたは複数のアミノ酸自然発生であっても合成であってもよいが置換、欠失、および/または付加された場合に、改変される。ポリヌクレオチド配列は、配列の最初、中央、および/または最後で、一つまたは複数のヌクレオチドが置換、欠失、および/または付加された場合に、改変されるが、該配列にコードされるアミノ酸は変更されても変更されなくてもよい。いくつかの実施形態では、改変により、特定のOgLucまたはOgLuc変異体の機能性断片である変異体が生成される。機能性断片は、完全長の親配列と同じ機能活性を有する完全長未満の親配列である断片である。機能活性とは発光を呈する能力である。いくつかの実施形態では、改変により、循環置換された配列並びに欠失および/または挿入を含む置換された配列等の、親配列の置換された配列である変異体が生成される。本明細書で開示されるOgLuc変異体のいくつかは、考察を容易にするために、略名を割り当てられる。C1A4EC1A4Eとも称されるという用語は、配列番号1に対しアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138I、およびN166Rを有するある特定のOgLuc変異体配列番号2および3を指すここで、型式xyは、変異体アミノ酸yに変えられる、位の親アミノ酸xを表す。本明細書で提供されるC1A4EOgLuc変異体の変異体は、特に明記しない限り、少なくともC1A4Eに存在するアミノ酸置換を含有する。IVYという用語は、配列番号1に対し追加のアミノ酸置換F54I、I90V、およびF77Yを有する、C1A4EOgLuc変異体の変異体配列番号8および9を指す。IVという用語は、配列番号1に対し追加のアミノ酸置換F54IおよびI90Vを有する、C1A4EOgLuc変異体の別の変異体配列番号14および15を指す。QC27という用語は、配列番号1に対し追加のアミノ酸置換Q18L、F54I、L92H、およびY109Fを有する、C1A4EOgLuc変異体のさらに別の変異体配列番号4および5を指す。QC27-9aという用語は、配列番号1に対し追加のアミノ酸置換V21L、F68Y、L72Q、M75K、H92R、およびV158Fを有する、QC27OgLuc変異体の変異体配列番号6および7を指す。9B8という用語は、配列番号1に対し追加のアミノ酸置換Q18L、F68Y、L72Q、およびM75Kを有する、IVOgLuc変異体の変異体配列番号18および19を指す。9B8optという用語は、9B8変異体のコドン最適化型配列番号24を指す。9B8optK33Nという用語は、配列番号1に対し追加のアミノ酸置換K33Nを有する、9B8opt変異体の変異体配列番号42および43を指す。9B8optK33N170Gという用語は、配列番号1に対し、変異体のC末端に付加された追加のグリシン、すなわち、170Gを有する、9B8optK33N変異体の変異体配列番号68および69を指す。L27VT39TK43RY68DおよびL27Vという用語は、配列番号1に対し追加のアミノ酸置換L27V、T39T、K43R、およびY68Dを有する、9B8optK33N変異体の変異体配列番号88および89を指す。T39TK43RY68DおよびV2という用語は、配列番号1に対し追加のアミノ酸置換T39T、K43R、およびY68Dを有する、9B8optK33N変異体の変異体配列番号92および93を指す。一般的に、増強されたとは、特定の性質例えば、発光、シグナル安定性、生体適合性、タンパク質安定性例えば、酵素安定性、またはタンパク質発現が、参照ルシフェラーゼセレンテラジンの組み合わせまたは試験中のルシフェラーゼのそれと比較した場合に、増加されたことを意味し、ここで、増加は、参照ルシフェラーゼとセレンテラジンの組み合わせまたは試験中のルシフェラーゼよりも、少なくとも1、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも500、または少なくとも1000大きい。発光という用語は、適切な条件下、例えば、セレンテラジン等の適切な基質の存在下における、OgLuc変異体の光出力を指す。光出力は、セレンテラジン基質を追加してすぐに開始され得る発光反応の開始時点での、光出力の瞬間的またはほぼ瞬間的な測定値T=0発光またはフラッシュと称されることもあるとして測定されてもよい。種々の実施形態における発光反応は、溶液中で行われる。他の実施形態では、発光反応は、固体の支持体上で行われる。溶液は、溶解物、例えば原核生物または真核生物の発現系における細胞から得られたものを含有してもよい。他の実施形態では、発現が無細胞系で行われるか、またはルシフェラーゼタンパク質が細胞外培地に分泌され、後者の場合は、溶解物を作製する必要がない。いくつかの実施形態では、発光タンパク質を含有する反応チャンバ例えば、96ウェルプレート等のマルチウェルプレートの1ウェルに、例えばセレンテラジン、緩衝液等の適切な物質を注入することによって、反応が開始される。さらに他の実施形態では、OgLuc変異体および/または新規セレンテラジンは宿主に導入され、発光が該宿主またはその一部分上で測定され、該一部分には、その生物体もしくは細胞全体、組織、外植片、または抽出物が含まれ得る。反応チャンバは、例えばルミノメーターまたは光電子増倍管を用いて、光出力を測定することができる読み取り装置に配置してもよい。光出力または発光は、例えば同一反応チャンバ中で、数秒間、数分間、数時間等、経時的に測定してもよい。光出力または発光は、経時的に平均測定値として、シグナル減衰の半減期として、一定期間に渡るシグナルの合計として、またはピークの出力として報告してもよい。発光は相対発光量RLU単位で測定してもよい。OgLuc変異体の増強された発光は、以下の特徴、すなわち増強された光出力すなわち輝度、増強された基質特異性、増強されたシグナル安定性、および/または延長されたシグナル継続時間のうちの一つまたは複数によるものであり得る。増強されたシグナル安定性には、例えば、経時的なシグナル減衰の半減期によって測定されるように、ルシフェラーゼからのシグナルがどれだけ長く発光し続けるかにおいての増加が含まれる。以下の実施例に示されるように、天然基質、既知基質、または新規基質と組み合わされた、野生型OgLuc、OgLuc変異体タンパク質、ウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼ例えば、hRluc、またはホタルルシフェラーゼ例えば、ポティヌスピュラリスPhotinuspyralis由来のLuc2ルシフェラーゼ等のルシフェラーゼの比較できる性質と比較して、増強された発光を測定することができる。例えば、特定のセレンテラジン天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン、または新規セレンテラジンを含むと組み合わされた所与のOgLuc変異体の発光は、以下の実施例で開示されるアッセイのうちの一つまたは複数を用いて、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン、または本明細書で開示される新規セレンテラジンのいずれかと組み合わされたOgLuc変異体C1A4E、IV、またはIVYのうちの一つの性質と比較することができる。具体的には、増強された発光は、基質PBI-3939と共に対象のOgLuc変異体を含有する細菌溶解物のインキュベーションにより生じる発光シグナルRLUを測定することによって決定することができる。測定は、Gloに類似した動態を提供するTERGITOL商標を含有し得る試薬中で行われ、例えば、その中では、酵素の不活性化が減速され、発光シグナルが安定されるが、このことは、本出願の他の場所に記載される。いくつかの実施形態では、いくつかのルシフェラーゼ変異体、例えば、L27Vは、特定の化合物、例えば、PBI-3939と共に、TERGITOL商標非存在下で、延長された発光期間、またはglowに類似した動態を提供する。発光シグナルは、C1A4E変異体とセレンテラジンまたはセレンテラジン-h、またはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼと天然セレンテラジン等の基準点のそれと比較することができる。酵素安定性とは、酵素活性の安定性すなわち、反応条件に対する酵素活性の耐性を指す。増強された酵素安定性とは、酵素活性の増強された安定性すなわち、反応条件に対する増強された耐性を指す。増強された酵素安定性には、増強された熱安定性例えば、高温での安定性および化学安定性例えば、阻害剤、または例えばTRITON商標X-100を含む界面活性剤等の変性剤の存在下での安定性が含まれる。酵素安定性は、高温または化学的変性剤の存在等の、特にタンパク質構造に破壊的であると知られている条件下での、タンパク質安定性の尺度として使用することができる。具体的には、増強されたタンパク質安定性は、本出願の他の場所例えば、実施例28に記載されるような熱分析を用いて決定することができる。発光シグナルは、C1A4E変異体とセレンテラジンもしくはセレンテラジン-h、またはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼと天然セレンテラジンの基準点と比較することができる。生体適合性とは、ルシフェラーゼおよび/またはセレンテラジン化合物に対する、細胞例えば、原核生物細胞または真核生物細胞の耐性を指す。ルシフェラーゼおよび/またはセレンテラジン化合物の生体適合性は、宿主細胞に引き起こすストレスに関連している。例えば、細胞に許容されないルシフェラーゼすなわち、細胞にストレスを与えるルシフェラーゼは、細胞内で効率的に発現され得ず、例えば、そのようなルシフェラーゼは細胞内で発現可能ではあるが、発現されたタンパク質による封入体形成によって活性の低減を示す。ルシフェラーゼの生体適合性は、外来遺伝子、すなわち、ルシフェラーゼまたはその断片をコードする遺伝子を含有する導入遺伝子の挿入を許容する細胞の能力に関連しており、それにより、該導入遺伝子を有する細胞が、ストレス応答経路の誘導、成長速度減少、および/または生存率減少例えば、生細胞数減少、膜完全性低減、またはアポトーシスの割合増加を含むストレスの徴候を示すことはない。細胞ストレスの他の徴候には、遺伝子発現、シグナル経路、および/または調節経路における変化が含まれ得る。OgLuc変異体の増強された生体適合性は、増強されたタンパク質発現および/または低減された細胞ストレス等の要因によるものであり得る。OgLuc変異体をコードする特定のポリヌクレオチドの増強された発光発現は、野生型OgLuc、またはコドン最適化ポリヌクレオチドを含むOgLuc変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発光発現レベルと比較して決定することができ、ここで、発光活性はタンパク質発現レベルをモニターするための手段として使用され得る。具体的には、OgLuc変異体、新規セレンテラジン化合物および/またはそれらの組み合わせの増強された生体適合性は、細胞生存率および/または細胞の成長速度を測定することで決定することができる。例えば、OgLuc変異体の増強された生体適合性は、セレンテラジン化合物の非存在下で、ホタルルシフェラーゼもしくはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼを含有するか、またはルシフェラーゼを含有しない細胞と比較して、OgLuc変異体を含有する細胞の生存率および/または成長速度を測定して、ルシフェラーゼが細胞に対してどの程度適合性および/または毒性があるかを決定することによって、決定することができる。新規セレンテラジン化合物の増強された生体適合性は、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンと比較して、新規セレンテラジン化合物に暴露された細胞のルシフェラーゼ発現がない場合における細胞生存率を測定して、該セレンテラジン化合物が細胞に対してどの程度適合性および/または毒性があるかを決定することによって、決定することができる。OgLuc変異体と新規セレンテラジン化合物の組み合わせ増強された生体適合性は、OgLuc変異体を含有し、新規セレンテラジンに暴露された細胞の生存率および/または成長速度を測定することで決定することができ、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼを含有するか、またはルシフェラーゼを含有せず、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンに暴露された細胞と比較することができる。具体的には、増強された生体適合性は、本出願の他の場所に記載されるような細胞生存率解析例えば、実施例18に記載されるようなCELLTITER-GLO登録商標アッセイ、または製造業者の取扱説明書に従ってカスパーゼ-GLO登録商標の技術を使用するもの等のアポトーシスアッセイを用いてまたは当該技術分野において周知の細胞生存率解析を用いて、決定することができる。細胞生存率またはアポトーシスに対するOgLuc変異体の影響は、C1A4E変異体、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼ等の、参照ルシフェラーゼの影響と比較することができる。細胞生存率またはアポトーシスに対する新規セレンテラジン化合物の影響は、細胞生存率またはアポトーシスに対する天然セレンテラジン化合物または既知のセレンテラジン化合物の影響と比較することができる。増強された生体適合性は、細胞成長または遺伝子発現に対するOgLuc変異体および/または新規セレンテラジン化合物の影響を測定することによっても決定することができる。例えば、OgLuc変異体の増強された生体適合性は、別のルシフェラーゼを含有するか、またはルシフェラーゼを含有しない細胞と比較して、一定期間後の細胞数を測定することにより、またはOgLuc変異体を含有する細胞試料中のストレス応答遺伝子の発現を測定することにより、決定することができる。新規セレンテラジン化合物の増強された生体適合性は、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンに暴露されたか、またはセレンテラジンに暴露されていない細胞と比較して、一定期間後の細胞数を測定することにより、または新規セレンテラジン化合物に暴露された細胞試料中のストレス応答遺伝子の発現を測定することにより、決定することができる。細胞成長または遺伝子発現に対するOgLuc変異体の影響は、C1A4E変異体、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼ等の参照ルシフェラーゼと比較することができる。細胞成長または遺伝子発現に対する新規セレンテラジンの影響は、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンと比較することができる。細胞質中で、または分泌型として本発明のOgLuc変異体を発現する頑強で安定な細胞株の特定は、輝度が高いルシフェラーゼシグナルおよび小サイズのOgLuc遺伝子によって促進され得る。比較的小さな遺伝子配列は、細胞ゲノムへの外来DNAの組込みによりもたらされる遺伝的不安定性の可能性を減少させることが期待される。本発明のOgLuc変異体および/または新規セレンテラジンの増加された輝度の結果として、天然のOgLuc、ホタルルシフェラーゼ、またはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼ等の他の既知のルシフェラーゼと比較して、より少ないタンパク質発現と、それによる形質移入に要するより少ないDNAは、所与の輝度レベルを提供することが可能であり、これは、OgLuc変異体および/または新規セレンテラジンの増強された生体適合性に寄与する。OgLuc変異体の増強された生体適合性は、他のルシフェラーゼ、例えば、天然OgLuc、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼを形質移入された細胞と同じ発光レベルを有する細胞を作製するための一過性導入に必要な、DNAまたは試薬、例えば、形質移入化学薬品の量によって測定することができる。いくつかの実施形態では、他のルシフェラーゼにより得られる同レベルの発光を有する形質移入細胞を作製するための、形質移入に必要なOgLuc変異体DNAまたは試薬の量は、別のルシフェラーゼ、例えば、天然OgLuc、ホタルルシフェラーゼ、またはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼに必要な量未満である。OgLuc変異体の増強された生体適合性は、形質移入後の細胞の回復時間により測定することができる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体を形質移入された後の回復に要する時間は、別のルシフェラーゼ、例えば、天然OgLuc、ホタルルシフェラーゼ、またはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼの場合に必要とされる時間未満である。相対的基質特異性は、試験セレンテラジン基質存在下でのルシフェラーゼの発光を、参照セレンテラジン基質存在下でのルシフェラーゼの発光で除算することによって決定される。例えば、相対的特異性は、ルシフェラーゼと本発明の新規セレンテラジンの発光を、該ルシフェラーゼと異なるセレンテラジン例えば、天然セレンテラジンもしくは既知のセレンテラジン例えば図1参照、または本発明の異なる新規セレンテラジンの発光で除算することによって決定することができる。比較される試験セレンテラジン基質および参照セレンテラジン基質は、相対的基質特異性を決定するための比較基質対comparisonsubstratepairであると見なされる。相対的基質特異性の変化は、比較基質対を用いる試験ルシフェラーゼの相対的基質特異性を、同じ比較基質対を用いる参照ルシフェラーゼの相対的基質特異性で除算することによって測定される。例えば、相対的特異性の変化は、本発明の新規セレンテラジンを用いる試験ルシフェラーゼの、異なるセレンテラジン例えば、天然セレンテラジンもしくは既知のセレンテラジンまたは本発明の異なる新規セレンテラジンと比較した場合の相対的基質特異性を、同じ本発明の新規セレンテラジンを用いる参照ルシフェラーゼの、試験ルシフェラーゼに対し使用された同一の異なるセレンテラジンと比較した場合の相対的基質特異性で割ることによって、決定することができる。いくつかの実施形態では、ある新規セレンテラジンを用いる発光が、異なる新規セレンテラジンを用いる発光と比較される。いくつかの実施形態では、ある天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光が、別の天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光と比較される。さらに他の実施形態では、ある天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光が、ある新規セレンテラジンを用いる発光と比較される。本発明の新規セレンテラジンは、増強された物理的安定性例えば、増強されたセレンテラジン安定性または減少した自己発光等の特性を含む。セレンテラジンの物理的安定性とは、セレンテラジンが、ルシフェラーゼによって基質として使用された場合に、発光する能力を維持するような、特定の条件下でどの程度安定であるかを指す。ルシフェラーゼまたは発光タンパク質の活性に依存しない発光は、自己発光と呼ばれる。自己発光は、減衰または分解の間に光の形態で放出されるエネルギーによって発せられる物質の発光である。例えば、自己発光は、発光基質であるセレンテラジンの自然酸化によって生じ得る。本明細書で使用される場合、純粋なまたは精製されたとは、目的の種が、存在する主な種であることすなわち、モル濃度および/または質量基準で、水、溶媒、緩衝液、または組成物における水溶液系の他の通常成分を除いた、いかなる他の個々の種よりもより豊富であることを意味し、いくつかの実施形態では、精製された画分は、目的の種が、存在する全巨大分子種のうち少なくとも約50モル濃度基準でを構成する組成物である。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全巨大分子種の約80超を構成し、いくつかの実施形態では、約85超、約90超、約95超、または約99超を構成する。いくつかの実施形態では、目的の種は、該組成物が単一の巨大分子種から本質的に成る本質的な均一性混入物種が従来の検出方法で組成物中に検出できないになるまで精製される。セレンテラジン誘導体いくつかの実施形態では、本発明は、式IaまたはIb:またはの新規セレンテラジン誘導体を提供し、式中、R2は、またはC25直鎖アルキルからなる群から選択され;R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORからなる群から選択され;R8は、Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;式中、R3およびR4は共にHまたは共にC12アルキルであり;Wは、-NH2、ハロ、-OH、-NHCOR、-CO2Rであり;Xは、-S-、-O-または-NR22-であり;Yは、-H、-OH、または-OR11であり;Zは、-CH-または-N-であり;各R11は独立して-COR’’または-CH2OCOR’’であり;R22は、H、CH3またはCH2CH3であり各Rは独立してC17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;R’’は、C17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;ただし、R2がまたはであるとき、R8は、ではなく;R2が、であるとき、R8は、または低級シクロアルキルであり;そしてR6がNH2であるとき、R2は、またはC25アルキルであり;または、R8はではない。アルキルという用語は、本明細書で使用される場合、炭化水素化合物から1個の水素原子を取り除くことによって得られる一価の部分に関し、飽和でも、部分不飽和でも、または完全不飽和であってもよい。アルキル基は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。アルキル基は、例えば、ハロで所望により置換されていてもよい。直鎖アルキル基の例としては、エチル、n-プロピル、n-ブチル、およびn-プロピル、n-ヘキシルおよびn-ヘプチルが挙げられるが、これらに限定はされない。一つまたは複数の炭素炭素二重結合を有する不飽和アルキル基の例としては、エテニルビニル、-CH=CH2、2-プロペニルアリル、-CH-CH=CH2、およびブテニルが挙げられるが、これらに限定はされない。一つまたは複数の炭素炭素三重結合を有する不飽和アルキルの例としては、エチニルおよび2-プロピニルプロパルギルが挙げられるが、これらに限定はされない。分岐鎖アルキル基の例としては、イソプロピル、イソ-ブチル、sec-ブチル、t-ブチルおよびイソ-ペンチルが挙げられる。低級シクロアルキルという用語は、本明細書で使用される場合、3~5個の炭素原子を有する炭化水素化合物から1個の水素原子を取り除くことによって得られる一価の部分に関する。飽和低級シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチルおよびシクロペンチル等の基が挙げられるが、これらに限定はされない。一つまたは複数の炭素炭素二重結合を有する不飽和低級シクロアルキル基の例としては、シクロプロペニル、シクロブテニルおよびシクロペンテニル等の基が挙げられるが、これらに限定はされない。ハロという用語は、本明細書で使用される場合、Cl、F、BrまたはI等のハロゲンに関する。いくつかの実施形態では、R2はであり;XはOまたはSである。他の実施形態では、R2はC25直鎖アルキルである。ある実施形態では、R8は、低級シクロアルキルまたはHである。他の実施形態では、R8はベンジルである。いくつかの実施形態では、R’’は、-CCH33、-CHCH32、-CH2CCH33、または-CH2CHCH32である。いくつかの実施形態では、本発明は、式IIaまたはIIb:またはで示される化合物を提供し、式中、XはOまたはSであり、R6はHまたはOHであり、R11は上記定義の通りであり、破線の結合は任意の環の存在を表す。いくつかの実施形態では、本発明は、式IIIaまたはIIIb:またはで示される化合物を提供し、式中、R12はC25直鎖アルキル、フリルまたはチエニルであり、R6はHまたはOHであり、R11は上記定義の通りであり、破線の結合は任意の環の存在を表す。いくつかの実施形態では、本発明は、式IVaまたはIVb:またはで示される化合物を提供し、式中、XはOまたはSであり、R6はHまたはOHであり、R18はH、または低級シクロアルキルであり、R3、R4およびR11は上記定義の通りであり、破線の結合は任意の環の存在を表す。いくつかの実施形態では、本発明は、式VaまたはVb:またはで示される化合物を提供し、式中、R8はベンジルであり、R11は上記定義の通りであり、破線の結合は任意の環の存在を表す。いくつかの実施形態では、本発明は、式VIaまたはVIb:またはの新規セレンテラジン誘導体を提供し、式中、R2は、またはC25直鎖アルキルからなる群から選択され;R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORからなる群から選択され;R8は、、Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;式中、R3およびR4は、共にH、または共にC12アルキルであり;Wは、-NH2、ハロ、-OH、-NHCOR、-CO2Rであり;Xは、-S-、-O-または-NH-であり;Yは、-H、-OH、または-OR11であり;Zは、-CH-または-N-であり;各R11は、独立して、-COR’’または-CH2OCOR’’であり;各Rは、独立して、C17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;R’’は、C17直鎖アルキルまたはC17分岐鎖アルキルであり;破線の結合は任意の環の存在を表し、これは飽和であっても不飽和であってもよく;ただし、R2がまたはであるとき、R8は、ではなく;R2が、であるとき、R8は、または低級シクロアルキルであり;そしてR6がNH2であるとき、R2は、またはC25アルキルであり;または、R8はではない。本発明によれば、適切な化合物は、を含む。異性体、塩および保護形態ある化合物は、一つまたは複数の特定の幾何学的形態、光学的形態、鏡像異性形態、ジアステレオ異性形態、エピマー形態、立体異性形態、互変異性形態、高次構造形態、またはアノマー形態で存在している場合があり、例えば、シス型およびトランス型;E型およびZ型;c型、t型、およびr型;エンド型およびエキソ型;R型、S型、およびメソ型;D型およびL型;d型およびl型;型および-型;ケト型、エノール型、およびエノラート型;シン型およびアンチ型;向斜型および背斜型;α型およびβ型;アキシャル型およびエクアトリアル型;舟型、いす型、ねじれ型、エンベロープ型、および半いす型;並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされず、これ以後は、集合的に異性体と称する。互変異性型に関する下記の記述を除いて、構造異性体すなわち、単に空間中の原子の配置によってではなく、原子間の連結において異なる異性体が、本明細書で使用される用語異性体から特定的に除外されることに留意されたい。例えば、メトキシ基、-OCH3への言及は、その構造異性体であるヒロドキシメチル基、-CH2OHへの言及と解釈されるべきではない。同様に、オルト-クロロフェニルへの言及は、その構造異性体であるメタ-クロロフェニルへの言及と解釈されるべきではない。しかし、あるクラスの構造体への言及は、そのクラスに含まれる構造異性体を含み得る例えば、C17アルキルはn-プロピルおよびイソ-プロピルを含み;ブチルはn-ブチル、イソ-ブチル、sec-ブチル、およびtert-ブチルを含み;メトキシフェニルはオルト-メトキシフェニル、メタ-メトキシフェニル、およびパラメトキシフェニルを含む。一つまたは複数の同位体置換を有する化合物が特別に用語異性体に含まれることに留意されたい。例えばHは、1H、2HD、および3HTを含むいかなる同位体形態で存在してもよく;Cは、12C、13C、および14Cを含むいかなる同位体形態で存在してもよく;Oは、16Oおよび18Oを含むいかなる同位体形態で存在してもよい、等。特に断りがない限り、特定の化合物への言及には、ラセミ混合物および他のその混合物を全体的にまたは部分的に含む、そのような異性体全てが含まれる。そのような異性体を調製する方法例えば、不斉合成および分離するための方法例えば、分別再結晶およびクロマトグラフ法は、当該技術分野において周知であるか、または既知の様式で、本明細書に示されている方法、または既知の方法を適合させることにより容易に得ることができる。特に断りがない限り、特定の化合物への言及には、例えば、以下で論じられるような、そのイオン形態、塩形態、溶媒和化合物形態、および保護形態も含まれる。活性化合物の対応する塩、例えば、薬剤的に許容できる塩を調製、精製、および/または操作することが好都合であるかまたは望ましい場合がある。薬剤的に許容できる塩の例は、BergeetalJPharmSci66119で述べられている。例えば、化合物が陰イオンであるか、または陰イオンであり得る官能基例えば、-COOHは-COO-であり得るを有する場合、適切な陽イオンによって塩が形成され得る。適切な無機陽イオンの例としては、NaおよびK等のアルカリ金属イオン、Ca2およびMg2等のアルカリ土類陽イオン、並びにAl3等の他の陽イオンが挙げられるが、これらに限定はされない。適切な有機陽イオンの例としては、アンモニウムイオンすなわち、NH4および置換アンモニウムイオン例えば、NH3R、NH2R2、NHR3、NR4が挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの適切な置換アンモニウムイオンの例としては、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミンから誘導されたもの、並びにリジンおよびアルギニン等のアミノ酸から誘導されたものが挙げられる。一般的な四級アンモニウムイオンの一例はNCH34である。化合物が陽イオンであるか、または陽イオンであり得る官能基例えば、-NH2は-NH3であり得るを有する場合、適切な陰イオンによって塩が形成され得る。適切な無機陰イオンの例としては、以下の無機酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定はされない:塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、および亜リン酸。適切な有機陰イオンの例としては、以下の有機酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定はされない:酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、パルミチン酸、乳酸、リンゴ酸、パモ酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、安息香酸、桂皮酸、ピルビン酸、サリチル酸salicyclic、スルファニル酸、2-アセトキシ安息香酸2acetyoxybenzoic、フマル酸、フェニルスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸の、シュウ酸、パントテン酸、イセチオン酸、吉草酸、ラクトビオン酸、およびグルコン酸。適切な高分子陰イオンの例としては、以下の高分子酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定はされない:タンニン酸、カルボキシメチルセルロース。活性化合物の対応する溶媒和化合物を調製、精製、および/または操作することが好都合であるかまたは望ましい場合がある。溶媒和化合物という用語は、溶質例えば、活性化合物、活性化合物の塩と溶媒の複合体を表すための従来の意味で、本明細書では使用される。溶媒が水である場合、溶媒和化合物は、水和物、例えば、一水和物、二水和物、三水和物等と都合良く称され得る。活性化合物を化学的に保護された形態で調製、精製、および/または操作することが好都合であるかまたは望ましい場合がある。化学的に保護された形態という用語は、本明細書で使用される場合、一つまたは複数の反応性官能基が望ましくない化学反応から保護されている、すなわち、保護された基または保護基マスクされた基もしくはマスク基、または遮断された基もしくは遮断基としても知られているの形態にある化合物に関する。反応性官能基を保護することにより、他の保護されていない反応性官能基が関与する反応を、保護された基に影響を与えずに行うことができ;保護基は、通常は後のステップで、分子の残りに実質的に影響を与えずに除去することができる。例えば、ProtectiveGroupsinOrganicSynthesisを参照されたい。例えば、ヒドロキシ基は、エーテル-ORまたはエステル-OC=ORとして保護されてもよく、例えば、t-ブチルエーテル;ベンジル、ベンズヒドリルジフェニルメチル、もしくはトリチルトリフェニルメチルエーテル;トリメチルシリルもしくはt-ブチルジメチルシリルエーテル;またはアセチルエステル-OC=OCH3、-OAcとして保護されてもよい。例えば、アルデヒドまたはケトン基は、それぞれアセタールまたはケタールとして保護されてもよく、そこでカルボニル基>C=Oは、例えば第一級アルコールを用いる反応によって、ジエーテル>COR2に変換される。アルデヒドまたはケトン基は、酸の存在下で大過剰の水を用いる加水分解によって、容易に再生される。例えばアミン基は、例えばアミドまたはウレタンとして保護されてもよく、例えば、メチルアミド-NHCO-CH3;ベンジルオキシアミド-NHCO-OCH2C6H5、-NHCbzとして;t-ブトキシアミド-NHCO-OCCH33、-NH-Boc;2-ビフェニル-2-プロポキシアミド-NHCO-OCCH32C6H4C6H5、-NH-Bpocとして、9-フルオレニルメトキシアミド-NH-Fmocとして、6-ニトロベラチルオキシアミド-NH-Nvocとして、2-トリメチルシリルエチルオキシアミド-NH-Teocとして、2,2,2-トリクロロエチルオキシアミド-NH-Trocとして、アリルオキシアミド-NH-Allocとして、2-フェニルスルホニルエチルオキシアミド-NH-Psecとして;または、好適な場合、N-オキシドとして保護されてもよい。例えばカルボン酸基は、エステルとして保護されてもよく、例えば、C17アルキルエステル例えば、メチルエステル;t-ブチルエステル;C17ハロアルキルエステル例えば、C17トリハロアルキルエステル;トリC17アルキルシリル-C17アルキルエステル;もしくはC520アリール-C17アルキルエステル例えば、ベンジルエステル;ニトロベンジルエステルとして;またはアミド、例えば、メチルアミドとして保護されてもよい。例えばチオール基は、チオエーテル-SRとして保護されてもよく、例えば、ベンジルチオエーテル;アセトアミドメチルエーテル-S-CH2NHC=OCH3として保護されてもよい。セレンテラジン誘導体の合成本発明によるセレンテラジン誘導体は、実施例1~16に詳細に記載された方法に従って合成することができる。オキヒオドシエビ属Oplophorusルシフェラーゼ変異体本発明の実施形態では、本明細書に記載される種々の技術が、改良された合成OgLucポリペプチドを生成するために、アミノ酸置換部位を特定するのに使用された。追加の技術が、ポリペプチドの発現を増強させるために、種々のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化するのに使用された。一つまたは複数のアミノ酸置換を、単独でまたは組み合わせて行うことにより、増強された発光例えば、増強された輝度、増強されたシグナル安定性、増強された酵素安定性、および/または相対的基質特異性の変化を有する合成OgLuc型ポリペプチドが生成されることが発見された。さらに、種々の合成OgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに一つまたは複数のコドン最適化置換を含むことにより、種々の真核生物および原核生物の発現系において、増強されたポリペプチド発現がもたらされた。本発明の一実施形態は、原核細胞および/または真核細胞で発現された場合に、単量体型で可溶性であり且つ活性を有する合成OgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のOgLuc変異体は、いかなる目的タンパク質または目的分子にもカップリングさせることができる。いくつかの実施形態では、該変異体は融合タンパク質であり、例えばいくつかの変異体は、N末端またはC末端のいずれかに結合されるHaloTag登録商標ポリペプチドにカップリングされる。特に断りのない限り、HaloTag登録商標融合体である変異体には、名称の部分としてHT7が含まれる例えば、IVY-HT7。いくつかの実施形態では、シグナル配列例えば、自然発生のトゲオキヒオドシエビOplophorusgracilirostrisシグナル配列が融合タンパク質のN末端に結合されて、細胞からの該融合タンパク質の分泌が促進される。哺乳類細胞または他の細胞型におけるタンパク質分泌を促進するための、OgLucルシフェラーゼの自然発生のシグナル配列以外のシグナル配列は、当該技術分野において周知である。OgLuc変異体を細胞膜の外表面上に位置させるため、または提示するために、膜アンカー配列と組み合わせたシグナル配列を使用してもよい。OgLuc変異体を膜または細胞内の他の部位に位置させるために、当該技術分野において周知の他の方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、本発明は、対応する親変異体十脚類ルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する改変された十脚類ルシフェラーゼを提供する。例えば、親変異体OgLucは、C1A4E、IVY、IV、QC27、QC27-9a、9B8、9B8optK33N、9B8optK33N170G、V2またはL27Vである。別の実施形態では、本発明は、新規セレンテラジンを利用する改変された十脚類ルシフェラーゼを提供する。一実施形態では、改変された十脚類ルシフェラーゼは、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジンまたは新規セレンテラジンに対する相対的特異性に変化がある。一実施形態では、改変された十脚類ルシフェラーゼは、対応する親変異体十脚類ルシフェラーゼと比較して、相対的特異性に変化がある。いくつかの実施形態では、対応する親の、変異十脚類ルシフェラーゼは、十脚目に含まれる科の様々な種を含む十脚類種であり、例としては、プレシオペナエウスコルスカンスPlesiopenaeuscoruscansを含むチヒロエビ科Aristeidaefamily;ヘテロカルプスHeterocarpusおよびパラパンダルスリカルディParapandalusrichardiを含むタラバエビ科Pandalideafamily、ヒュメノペナエウスデビリスHymenopenaeusdebilisおよびメソペナエウストゥロピカリスMesopenaeustropicalisを含むクダヒゲエビ科Solenoceridaefamily;ルキフェルテュプスLucifertypusを含むユメエビ科Luciferidaefamily;セルゲステスアトゥランティクスSergestesatlanticus、セルゲステスアルクティクスSergestesarcticus、セルゲステスアルマトゥスSergestesarmatus、セルゲステスペディフォルミスSergestespediformis、セルゲステスコルヌトゥスSergestescornutus、セルゲステスエドゥワルドゥシSergestesedwardsi、セルゲステスヘンセニSergesteshenseni、セルゲステスペクティナトゥスSergestespectinatus、セルゲステスサルガッシSergestessargassi、セルゲステスシミリスSergestessimilis、セルゲステスヴィギラクスSergestesvigilax、セルギアカッレンゲリSergiachallengeri、セルギアグランディスSergiagrandis、セルギアルケンスSergialucens、セルギアプレヘンシリスSergiaprehensilis、セルギアポテンスSergiapotens、セルギアロブスタSergiarobusta、セルギアスキンティッランスSergiascintillans、およびセルギアスプレンデンスSergiasplendensを含むサクラエビ科Sergestidaefamily;グリュプスマルスピアリスGlyphusmarsupialis、レプトケラベルムデンシスLeptochelabermudensis、パラパシパエスルカティフロンスParapasiphaesulcatifrons、およびパシペアタルダPasipheatardaを含むオキエビ科Pasiphaeidaefamily;アカンテピュラアカンティテルソニスAcanthephyraacanthitelsonis、アカンテピュラアクティフロンスAcanthephyraacutifrons、アカンテピュラブレヴィロストゥリスAcanthephyrabrevirostris、アカンテピュラククッラタAcanthephyracucullata、アカンテピュラクルティロストゥリスAcanthephyracurtirostris、アカンテピュラエクシミアAcanthephyraeximia、アカンテピュラグラキリペスAcanthephyragracilipes、アカンテピュラキングスレユィAcanthephyrakingsleyi、アカンテピュラメディアAcanthephyramedia、アカンテピュラミクロプタルマAcanthephyramicrophthalma、アカンテピュラペラギカAcanthephyrapelagica、アカンテピュラプリオノタAcanthephyraprionota、アカンテピュラプルプレアAcanthephyrapurpurea、アカンテピュラサングイネアAcanthephyrasanguinea、アカンテピュラシボガエAcanthephyrasibogae、アカンテピュラステュロロストゥラティスAcanthephyrastylorostratis、エピュリナビフィダEphyrinabifida、エピュリナフィグエイライEphyrinafigueirai、エピュリナコスキュニイEphyrinakoskynii、エピュリナオムバンゴEphyrinaombango、ヒュメノドラグラキアリスHymenodoraglacialis、ヒュメノドラグラキリスHymenodoragracilis、メニンゴドラミッキュラMeningodoramiccyla、メニンゴドラモッリスMeningodoramollis、メニンゴドラヴェスカMeningodoravesca、ノトストムスギッボススNotostomusgibbosus、ノトストムスアウリクラトゥスNotostomusauriculatus、オプロポルスグラキリロストゥリスOplophorusgracilirostris、オプロポルスグリマルディイOplophorusgrimaldii、オプロポルスノヴァエゼアランディアエOplophorusnovaezealandiae、オプロポルススピニカウダOplophorusspinicauda、オプロポルスフォリアケウスOplophorusfoliaceus、オプロポルススピノススOplophorusspinosus、オプロポルステュプスOplophorustypus、シュステッラスピスブラウエリSystellaspisbraueri、シュステッラスピスクリスタタSystellaspiscristata、シュステッラスピスデビリスSystellaspisdebilis、およびシュステッラスピスペッルキダSystellaspispellucidaを含むヒオドシエビ科Oplophoridaefamily;並びにクロロトコイデススピニカウダChlorotocoidesspinicauda、タラッソカリスクリニタThalassocariscrinita、およびタラッソカリスルキダThalassocarislucidaを含むタラッソカリダエ科Thalassocaridaefamilyのルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定はされない。ある実施形態では、改変されたルシフェラーゼは、対応する野生型ルシフェラーゼと比較して、原核細胞および/または真核細胞において、増加された発光例えば、少なくとも1.3倍、少なくとも2倍、または少なくとも4倍を有する。いくつかの実施形態では、改変された十脚類ルシフェラーゼの一つまたは複数の特性は、別の種から得られたルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼの比較できる特性と比較される。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は、少なくとも60、例えば、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、もしくは少なくとも99、または100のアミノ酸配列同一性を、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、27、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、56、58、60、62、64、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、または95に対して有する。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体またはその機能性断片は、多くて5つまでの差異を有し、またはより好ましくは多くて4、3、2、もしくは1つまでの差異を有し、または最も好ましくは差異を含まず、その差異は表4に記載の式VIIのパターン位置1、2、3、5、8、10、12、14、15、17、または18に対応する位置に生じる。差異には、表4のパターン位置の間のギャップまたは挿入も含まれ得る。いくつかの実施形態では、本発明のOgLuc変異体は、N末端、C末端、または両方に一つまたは複数の異種アミノ酸配列を有しエピトープまたは融合タグを有するもの等の融合ポリペプチド、これが、任意で直接的または間接的に目的分子と相互作用する。いくつかの実施形態では、異種配列の存在は、目的分子との相互作用の前または後に、OgLuc変異体の発光を実質的に変化させない。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列はエピトープタグである。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列は、目的分子との相互作用の間または後に立体構造変化を起こすものであり、この立体構造変化は次いでOgLuc変異体の活性を変化させる。例えば、そのようなアミノ酸配列を有するOgLuc変異体は、アロステリック相互作用を検出するのに有用である。OgLuc変異体またはOgLuc変異体またはその断片との融合体は、受容体として使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明のOgLuc変異体の断片が異種アミノ酸配列に融合され、それにより該融合体はβバレル構造を形成し、その融合タンパク質は、自然発生セレンテラジンまたは本明細書で論じられる種々の既知のセレンテラジンを含むその類似体、もしくは本発明の新規セレンテラジンから発光を起こすことが可能である本発明のOgLuc変異体またはその融合体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドまたは該OgLuc変異体もしくはその融合体を有する単離された宿主細胞、および本発明のポリヌクレオチド、OgLuc変異体もしくはその融合体、または宿主細胞の使用方法も提供される。2つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関しての、同一性という用語は、任意の数の配列比較アルゴリズムを用いて、または手動の整列および目視検査により測定して、比較ウィンドウまたは指定領域上で最大の一致が得られるよう比較および整列された場合に、同一である2つ以上の配列または部分列、もしくは同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを指定された割合で有する2つ以上の配列または部分列を指す。比較のために配列を整列させる方法は当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、Smithetalのアルゴリズム、NeedlemanandWunschの相同性アライメントアルゴリズム、PearsonandLipmanの類似性検索方法、アルゴリズム、例えば、FASTA、SSEARCH、GGSEARCHWilliamRPearsonhttpfastabiochvirginiaedufastawww2fastaintroshtmlによるバージニア大学のFASTAサーバーで利用可能、一連のClustalプログラムChennaetalNuclAcidsRes3134973500;httpwwwebiacukまたはhttpwwwchembnetorgで例を入手可能、または他の配列解析ソフトウェアのコンピューターによる実行によって、実施することができる。有意な配列変異例えば、ドメイン順序の改変、ドメインの欠損/付加、ドメインの繰り返し、ドメインのシャッフル、循環置換を有するポリペプチド配列間で最大一致を有する整列をつくることは、ABA法RaphaeletalGenomeRes1423362346、他の適切な方法、または該ポリペプチド配列の2つの連結された同一コピーを用いた整列の実行等の、特殊化した方法の使用を必要とする場合があることは当該技術分野において周知である。核酸分子、ポリヌクレオチドまたは核酸配列という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質前駆体の産生に必要なコード配列を含むDNAまたはRNAを含む核酸を指す。コードされたポリペプチドは、完全長のポリペプチド、その断片完全長未満、または融合ポリペプチドをもたらす、完全長のポリペプチドもしくはその断片のいずれかと別のポリペプチドとの融合体であってよい。タンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、すなわち遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域は、cDNA、ゲノムDNAまたはRNAの形態で存在し得る。DNA形態で存在する場合、オリゴヌクレオチドは一本鎖例えば、センス鎖または二本鎖であり得る。エンハンサー/プロモーター、スプライスジャンクション、ポリアデニル化シグナル等の適切な調節領域は、適切な転写開始および/または一次RNA転写物の正確なプロセシングを可能とするのに必要である場合、遺伝子のコード配列のすぐそばに位置され得る。他の制御または調節エレメントとしては、転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルおよびエンハンサーエレメントが挙げられるが、これらに限定はされない。ペプチド、タンパク質およびポリペプチドとは、翻訳後修飾例えば、グリコシル化またはリン酸化に関係なく、さまざまな長さのアミノ酸鎖を意味する。本発明の核酸分子は、誘導が最初になされる親タンパク質のアミノ酸配列に対し少なくとも60、例えば、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、または100のアミノ酸配列同一性であるアミノ酸配列を有する、人工のすなわち、合成の変異体タンパク質の変異体またはそのポリペプチド断片をコードし、ここで該親タンパク質はその後さらに改変される自然発生の天然または野生型配列または変異体配列であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質という用語は、一つまたは複数の異種配列例えば、非OgLucポリペプチドに対しN末端および/またはC末端で連結された参照タンパク質例えば、OgLuc変異体を含有するキメラタンパク質を指す。異種配列としては、HaloTag登録商標融合タンパク質プロメガ社、FlAsHフルオレセインヒ素らせん結合剤、およびReAsH赤色ヒ素らせん結合剤例えば、LUMIO商標タグ認識配列インビトロジェン社、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素CAT、β-ガラクトシダーゼβ-Gal、ラクタマーゼP-gal、ネオマイシン耐性Neo、GUS、ガラクトピラノシド、緑色蛍光タンパク質GFP、ルシフェラーゼ例えば、ウミシイタケRenillareniformisルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ例えば、ポティヌスピィラリスPhotinuspyralisまたはポトゥリスペンンシュルヴァニカPhoturispennsylvanica、またはコメツキムシルシフェラーゼ例えば、ピィロポルスプラギオフタラムスPyrophorusplagiophthalamusまたはピィレアリヌステルミティルミナンスPyrearinustermitilluminansまたはツチボタルルシフェラーゼ例えば、フリクソトゥリクスヒルトゥスPhrixothrixhirtus、キシロシダーゼ、チミジンキナーゼ、アラビノシダーゼおよびSNAPタグ、CLIPタグ、ACPタグおよびMCPタグニューイングランドバイオラボ社NewEnglandBiolabs等のレポータータンパク質が含まれ得るが、これらに限定はされない。一実施形態では、キメラタンパク質は、HaloTag登録商標融合タンパク質プロメガ社にN末端で連結されたOgLuc変異体を含有する。別の実施形態では、キメラタンパク質は、HaloTag登録商標融合タンパク質にC末端で連結されたOgLuc変異体含有する。核酸は様々なタイプの変異を含有することが知られており、変異とは、特定の塩基位置にあるヌクレオチドの配列における、野生型の配列と比較した場合の改変を指す。変異は、核酸配列を参照配列、例えば野生型配列と異ならせる一つまたは複数の塩基の挿入もしくは欠失、または終止コドンでの置換を指す場合もある。置換とは、配列中の特定位置にあるアミノ酸における変化、例えば、4位でのAからEへの変化を指す。ベクターという用語は、その中にDNAの断片を挿入またはクローニングし得、DNAセグメントを細胞に導入するのに用いることができ、細胞中で複製可能である、核酸分子を指す。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド等に由来し得る。野生型または天然という用語は、本明細書で使用される場合、自然発生源から単離されたその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集合の中で最も頻繁に観察されるもの、それ故に該遺伝子の野生型形態と任意に名付けられるもの、である。対照的に、変異体という用語は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較された場合に、配列および/または機能特性における改変すなわち、改変された特徴を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然の変異体を単離することが可能であることに注意する;これらは、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較された場合に、それらが変更された特徴を有するという事実によって特定される。例示的なポリヌクレオチドおよびタンパク質本発明は、野生型OgLucと比較した場合に、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するOgLuc変異体またはそのタンパク質断片、例えば、欠失、例えば1~約5個残基の欠失、およびそのキメラ融合体米国特許出願第2009/0253131号およびWIPO出願第WO2007/120522号、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれるを有するものを含み、該置換によって、増強された安定性、増強された発光、例えば、増加された発光、発光動態のより大きな安定性、および/または変更された発光色を有するOgLuc変異体がもたらされる。OgLuc変異体の配列は、対応する野生型OgLucのアミノ酸配列と実質的に同一である。実質的に同一な配列を有するポリペプチドまたはペプチドとは、アミノ酸配列が完全にではないが大部分において、同一であり、それが関連する配列の機能活性を保持していることを意味する。通常、2つのアミノ酸配列は、それらが少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99、ただし100未満のアミノ酸配列同一性である場合に、実質的に同一である。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は組換えポリヌクレオチドにコードされる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体、またはその機能性断片は、多くて5つまでの差異を有し、またはより好ましくは多くて4、3、2、もしくは1つまでの差異を有し、または最も好ましくは差異を含まず、それらの差異は、表4に記載の式VIIのパターン位置1、2、3、5、8、10、12、14、15、17、または18に対応する位置に生じる。差異には、表4のパターン位置の間のギャップまたは挿入も含まれ得る。本発明のOgLuc変異タンパク質または融合タンパク質は、組換え法または固相化学的ペプチド合成法によって作製することができる。そのような方法は当該技術分野において周知である。使用法およびキット本発明の化合物およびタンパク質は、ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼ基質、例えばセレンテラジンが使用されている、いかなる方法においても使用することができる。例えば、それらは、試料中の一つもしくは複数の分子、例えば酵素、酵素反応のための補助因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性化剤、もしくはOHラジカルを検出するために、または一つもしくは複数の条件、例えば酸化還元条件を検出するためにセレンテラジンの類似体を使用する生物学的発光法bioluminogenicmethodにおいて、使用することができる。試料としては、動物例えば、脊椎動物、植物、真菌、生理液例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物等、細胞、細胞溶解物、細胞上清、または細胞の精製画分例えば、細胞成分分画が含まれ得る。かかる分子の存在、量、スペクトル分布、発光動態、または比活性を検出または定量することができる。その分子は、多相溶液multiphasicsolution例えば、乳剤または懸濁剤を含む溶液中においてでも、固体支持体例えば、粒子、毛細管、またはアッセイ容器assayvessel上ででも、検出または定量することができる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は、目的酵素、例えば、CYP450酵素、MAOA酵素またはMAOB酵素、カスパーゼ等を検出するために、発光に基づくアッセイで使用することができる。新規セレンテラジンは、エクオリン、オベリン、またはiPhotina等の発光タンパク質と一緒に使用することができる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は、別の分子例えば、フルオロフォア、発色団、またはナノ粒子に対するエネルギー供与体として使用することができる。本発明は、転写レポーターをコードするポリヌクレオチドも提供する。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体またはその断片は、転写制御配列、例えば、一つまたは複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはそれらの組み合わせに機能的に連結することで、発現カセットを形成することができる。例えば、OgLuc変異体は、最小プロモーターおよびcAMP応答要素CREに機能的に連結することができる。本発明のタンパク質はバイオセンサーとして使用されてもよく、例えば、OgLuc変異体は、別の分子例えば、一つまたは複数の目的分子の存在下で、または特定の条件下で、一つまたは複数の変化した活性を有する。目的分子と相互作用すると、または特定の条件に曝されると、バイオセンサーは立体構造変化を起こすか、または化学的に変化し、これによって、酵素活性または発光、例えば、比活性、スペクトル分布、または発光動態の変化が引き起こされる。例えば、本発明のOgLuc変異体、例えば循環置換変異体は、目的分子に対する相互作用ドメインを含むことができる。あるいは、例えば、OgLuc変異体は、エネルギー受容体、例えば蛍光タンパク質にカップリングすることができ、酵素からエネルギー受容体へのエネルギー移動の効率を変化させる相互作用ドメインを含むことができる。例えば、バイオセンサーは、プロテアーゼ、キナーゼ、リガンド、抗体等の結合タンパク質、cAMPもしくはcGMP等の環状ヌクレオチド、またはカルシウム等の金属を検出するために、適切なセンサー領域をOgLuc変異体配列に挿入することによって作製することができる。一つまたは複数のセンサー領域を、C末端、N末端、および/またはポリペプチド配列中の一つまたは複数の適切な位置に挿入することができ、そこで、センサー領域は一つまたは複数のアミノ酸を含む。循環置換されたOgLuc変異体の場合、センサー領域は、親OgLuc変異体のN末端とC末端の間に挿入することができる。さらに、挿入されたセンサー領域の1つまたは全ては、センサーをOgLuc変異体ポリペプチドの残りにカップリングさせるためのリンカーアミノ酸を含むことができる。ルシフェラーゼバイオセンサーの例は、米国特許出願公開第2005/0153310号および第2009/0305280号およびPCT国際公開第2007/120522A2号に記載されており、これらは各々、参照によって本明細書に組み込まれる。種々の実施形態において、本明細書で開示されるOgLuc変異体は、エネルギー受容体にエネルギーを転移するのに、例えば生物発光共鳴エネルギー移動BRET解析において、使用することができる。例えば、BRET解析で使用されるOgLuc変異体は、2つの分子が互いに結合可能であるかどうか、または細胞中で共存するかどうかを決定するのに使用することができる。例えば、OgLuc変異体は、目的の分子またはタンパク質と組み合わされて、第一の融合タンパク質を生成する生物発光供与分子として使用することができる。種々の実施形態において、第一融合タンパク質はOgLuc変異体および目的タンパク質を含有する。種々の実施形態において、OgLuc変異体を含有する第一融合タンパク質は、細胞溶解物、無傷細胞、および生きている動物を含むがこれらに限定はされない系の中で、タンパク質/タンパク質相互作用を検出するのに、BRET解析において使用することができる。種々の実施形態において、HaloTag登録商標を、蛍光受容体分子として使用することができる。いくつかの実施形態では、HaloTag登録商標は、第2の目的タンパク質に、またはOgLuc変異体に、融合することができる。例えば、OgLuc変異体は、HaloTag登録商標に融合することができ、細胞または動物中で発現させることができ、そしてHaloTag登録商標TMRリガンド等の蛍光HaloTag登録商標リガンドで標識することができる。続いて、融合体が励起されて、細胞浸透性OgLuc基質存在下で蛍光が発せられ得る。いくつかの実施形態では、BRETは、少数の非限定例を命名するのに、蛍光タンパク質、例えば、限定はされないが、緑色蛍光タンパク質GFPもしくは赤色蛍光タンパク質RFPと、または蛍光ラベル、例えば、フルオレセイン、ローダミングリーン、オレゴングリーン、またはアレクサ488と組み合わせて、OgLuc変異体を用いて行うことができる。種々の実施形態において、本発明のOgLuc変異体および/または新規セレンテラジンは、2つの生体分子、例えばポリペプチドの相互作用を検出するのに、タンパク質相補試験PCAにおいて使用することができる。例えば、本発明のOgLuc変異体は、分離に耐性がある部位で、2つの断片に分離することができ、分離されたOgLuc変異体の各断片は、相互作用すると考えられている目的のポリペプチドの対、例えば、FKBPおよびFRBの対のうちの一つに融合することができる。目的の2つのポリペプチドが実際に相互作用する場合、OgLuc断片は互いにすぐ近くまで接近し、機能的な、活性OgLuc変異体を再構成する。いくつかの実施形態では、再構成されたOgLuc変異体の活性は、天然セレンテラジンもしくは既知のセレンテラジンまたは本発明の新規セレンテラジンを用いて検出および測定することができる。いくつかの実施形態では、分割されたOgLuc変異体は、lac-ZLangleyetalPNAS7212541257またはリボヌクレアーゼSLevitandBergerJBiolChem2511333-1339に類似したより一般的な相補系complementationsystemで使用することができる。いくつかの実施形態では、別のOgLuc変異体断片Bと補完し合うことが知られているOgLuc変異体断片Aと称するを標的タンパク質に融合することができ、得られた融合体は、断片Bを含有する細胞または細胞溶解物における発光を介してモニターすることができる。いくつかの実施形態では、断片Bの供給源は同一の細胞であるか例えば、断片Bの遺伝子が、細胞のゲノムに組み込まれる場合、または細胞内の別のプラスミドに含有される場合、または別の細胞から得られた溶解物もしくは精製タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、この同一の融合タンパク質断片Aは、断片Bと、固体支持体への付着が可能なHaloTag登録商標等のポリペプチドとの融合を用いて、捕捉および固定化することができる。いくつかの実施形態では、発光は、捕捉の成功を示すのに、または捕捉された物質の量を定量するのに使用することができる。種々の実施形態において、本発明のOgLuc変異体および/または新規セレンテラジンは、セレンテラジンを定量するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、セレンテラジン例えば、天然セレンテラジンもしくは既知のセレンテラジン、または本発明の新規セレンテラジンは、特定の生化学的活性、例えば、アポトーシスおよび薬物代謝のプローブとして使用することができる。いくつかの実施形態では、セレンテラジン濃度は、目的の特定酵素によって作用され得る前セレンテラジンまたは前基質によって、特定の酵素活性に対して、連結される。いくつかの実施形態では、前セレンテラジンは、ルシフェラーゼと混合されたときに発光を直接補助することができない分子であるが、目的の特定酵素による酵素的プロセシングを通じて、セレンテラジンに変換することができる。いくつかの実施形態では、このアプローチは、薬物代謝に用いられるもの例えば、シトクロムP450酵素、モノアミンオキシダーゼ、およびグルタチオンS転移酵素等の酵素;並びにアポトーシスに用いられるもの例えば、カスパーゼ等の酵素に対して使用することができる。例えば、セレンテラジン例えば、天然セレンテラジンもしくは既知のセレンテラジン、または本発明の新規セレンテラジンは、6’-O-メチル等の切断可能な基を含有するように改変することができる。いくつかの実施形態では、特定のシトクロムP450酵素と一緒にインキュベートされた場合、前記6’O-メチルは切断されて、前セレンテラジンは、本発明のOgLuc変異体で検出可能なセレンテラジンに変換される。いくつかの実施形態では、前セレンテラジンは、発光を補助するのに必要な他の成分、例えば、本発明のOgLuc変異体等の発光タンパク質と混合されて、単一試薬および均一なアッセイを提供することができる。例えば、前記試薬が試料に加えられると、前セレンテラジンがセレンテラジンに変換される際に、発光が生じる。種々の実施形態において、前セレンテラジンからセレンテラジンの生成に結び付けられ得る他の酵素、小分子、または他の細胞プロセスに関して、同様のアッセイを開発することができる。種々の実施形態において、本発明のOgLuc変異体および/または新規セレンテラジンは、遺伝子転写レポーター系として使用することができる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は、異なる波長の光を発するルシフェラーゼ、例えば、赤色コメツキムシルシフェラーゼCHROMA-LUC商標;プロメガ社と多重化することができる。例えば、本発明のOgLuc変異体が機能的なレポーターとして使用される場合、赤色CHROMA-LUC商標ルシフェラーゼは、遺伝的調節に対する非特異的な効果に対して対照をとるために、または形質移入の効率を正規化するために、使用することができる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体から生じる発光およそ460nmおよび赤色CHROMA-LUC商標およそ610nmは、波長識別フィルタとともにルミノメーターを用いて、容易に分離することができ、同じ試料から得られる両方のシグナルの測定を可能にする。別の例では、本発明のOgLuc変異体は、転写レポーターとして使用することができ、アッセイ試薬に含有される異なる波長の光を発するルシフェラーゼと対合させることができる。例えば、本発明のOgLuc変異体は、転写レポーターとして使用することができ、エクオリンもしくはcAMP循環置換ホタルルシフェラーゼバイオセンサーのいずれかと、または同時に両方と対合させることで、1つの試料の中で複数の経路を検出することができる。そのような系では、例えば、エクオリンはカルシウムの検出および/または測定に、バイオセンサーはcAMPの検出および/または測定に、そしてOgLuc変異体は下流の遺伝子発現のモニタリングに、使用することができる。別の例では、OgLuc変異体は、一つまたは複数の追加のルシフェラーゼと一緒に使用することができ、そこで、各ルシフェラーゼの発光は選択的酵素阻害剤の使用によって別々に測定することができる。例えば、第一のルシフェラーゼの発光は、適切な基質および緩衝液の追加の際に測定することができ、第二のルシフェラーゼの測定は、その後の適切な基質および緩衝液並びに第一のルシフェラーゼに対して選択的な一つまたは複数の阻害剤の追加の際に行うことができる。別の例では、アッセイ試薬に含有されるルシフェラーゼは、細胞生理の特定の側面、例えば、細胞生存率を評価するためのATP、または細胞アポトーシスを評価するためのカスパーゼ活性を測定するのに使用することができる。種々の実施形態において、本発明のOgLuc変異体は、形質移入困難な細胞株において、あるいは、おそらく非分裂初代細胞、例えば、幹細胞またはHepG2細胞においてでさえ、レポーターとして使用することができる。それらの高いシグナル強度のために、本発明のOgLuc変異体により、形質移入効率が低い場合でも、検出可能な発光が可能となる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は、形質移入に関わる条件に特に感受性がある、例えば、DNA濃度上昇または形質移入試薬の追加に対して感受性がある細胞において、レポーターとして使用することができる。従って、種々の実施形態において、本発明のOgLuc変異体の増強された発光によって、より低いDNA濃度、より少ない形質移入試薬、および/またはアッセイ開始前のより短い形質移入後の時間での適切なレベルの発光が達成可能であり、その結果、感受性の細胞に負担となる毒性が減少する。種々の実施形態において、OgLuc変異体の増強された発光は、シグナルがさらに後の時点で検出されることも可能にする。さらに他の実施形態では、OgLuc変異体は、単一コピーの天然プロモーターのためのレポーターとして使用することができる。種々の実施形態において、本発明のOgLuc変異体は、標的タンパク質の細胞内レベルをモニターする手段として、目的の標的タンパク質用の融合タグとして使用することができる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は、細胞内のストレス応答経路例えば、DNA損傷、酸化的ストレス、炎症に関わる特定のタンパク質をモニターするのに、様々なタイプの刺激がそれらの経路で果たす役割を探求する手段として、使用することができる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は、標的タンパク質の細胞輸送をモニターする手段としても、使用することができる。例えば、OgLuc変異体は、ウイルスゲノム例えば、HIV、HCVに融合させることもでき、それによって、有望な抗ウイルス剤での処理後に、力価レベル、すなわち感染価を、細胞中でモニターすることができる。いくつかの実施形態では、前記変異体は、高発現クローンを特定するための蛍光標識細胞分取FACSのために、緑色蛍光タンパク質GFPまたはHaloTag登録商標標的タンパク質に加えてに融合させることもできる。種々の実施形態において、細胞質内で、または分泌型として、本発明のOgLuc変異体を発現する頑強で安定な細胞株の特定は、OgLuc変異体の増強されたシグナルおよびOgLuc遺伝子の小さなサイズによって、促進され得る。比較的小さな遺伝子配列は、外来DNAの細胞ゲノムへの組込みによりもたらされる遺伝的不安定性の可能性を減少させることとなる。種々の実施形態において、本発明のOgLuc変異体は、様々な異なるイムノアッセイの概念の中に組み込むことができる。例えば、OgLuc変異体は、一次または二次抗体に融合させることにより、特定の分析物の検出方法を提供することができる。別の例として、OgLuc変異体は、タンパク質Aまたはタンパク質Gに融合させることが可能であり、その融合体は、特定の分析物に結合した特定の抗体を検出するのに使用することができる。別の例として、OgLuc変異体は、ストレプトアビジンに融合させることが可能であり、特定の分析物に結合した特定のビオチン化抗体を検出するのに使用することができる。さらに別の例として、OgLuc変異体の補完的な断片は、一次および二次抗体に融合させることが可能であり、そこで、該一次抗体は特定の分析物を認識し、該二次抗体は一次抗体を認識する。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体の活性は、分析物の存在下で再構成されるであろう。さらに別の例として、OgLuc変異体は、分析物例えば、プロスタグランジンと複合体化させることが可能であり、競合的サンドイッチELISA形式にて使用することができる。分析物と複合体化されたOgLuc変異体は、分析物と結合することができる抗体を検出するのにも使用することができ、そこで、その結合活性は、該OgLuc変異体が該抗体に選択的に連結するのを可能にする。抗原標的に対する患者の抗体価を定量的に測定するためにウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼを使用している例は、ルシフェラーゼ免疫沈降系であるBurbeloetalExpertReviewofVaccines9567578。種々の実施形態において、本発明のOgLuc変異体および新規基質は、生細胞における発光検出に使用することができる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は、レポーターまたは別のものとして細胞内で発現させることができ、細胞は、セレンテラジン、例えばPBI-3939等の新規セレンテラジンで処理され、セレンテラジンは、培養液中の細胞に浸透し、OgLuc変異体と反応し、発光する。細胞浸透性であるだけでなく、PBI-3939は、細胞生存率の点から、天然セレンテラジンに匹敵する生体適合性を示す。いくつかの実施形態では、培地中の天然セレンテラジンの安定性を増加させることが知られている化学修飾を含有するあるバージョンのPBI-3939が合成可能であり、より頑強な生細胞中でのOgLuc変異体ベースのレポーターアッセイに使用することができる。さらに他の実施形態では、本発明のOgLuc変異体および/または新規セレンテラジンを含有する試料細胞、組織、動物等を含むは、種々の顕微鏡検査技術および画像処理技術を用いて分析可能である。さらに他の実施形態では、分泌可能なOgLuc変異体が、生細胞レポーター系の一部として細胞中で発現される。種々の実施形態において、本明細書で開示されるOgLuc変異体および/または新規セレンテラジンは、キットの一部として提供可能である。前記キットは、使用者が本明細書で開示されるようなアッセイを実行するのを可能にするための、適切な試薬および説明書と共に、本明細書に記載されるような一つもしくは複数のOgLuc変異体ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または両方の形態および/またはセレンテラジンを含み得る。セレンテラジンは、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン、または本明細書で開示される新規セレンテラジンのうちのいずれかであり得る。キットは、本明細書で開示されるような一つまたは複数の緩衝液も含み得る。改変されたルシフェラーゼまたはその融合体をコードするベクターおよび宿主細胞発光活性を有するもの、もしくは別の分子に補完されて発光活性がもたらされ得るもの、または発光活性を有するその融合体等の、OgLuc変異体またはその断片をコードする望ましい核酸分子が調製されると、OgLuc変異体もしくはその断片、例えば、補完のためのもの、または発光活性を有するその融合体をコードする発現カセットが調製され得る。例えば、OgLuc変異体をコードする核酸配列を含む核酸分子は、転写制御配列、例えば、一つまたは複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはそれらの組み合わせに所望により機能的に連結されて、発現カセットを形成することができる。核酸分子または発現カセットは、選択マーカー遺伝子を所望により含むベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターに導入され得、該ベクターは、目的細胞、例えば、大腸菌Ecoli、ストレプトマイセス種Streptomycesspp、炭疽菌種Bacillusspp、ブドウ球菌種Staphylococcusspp等の原核細胞、並びに植物双子葉類または単子葉類、真菌酵母、例えば、ピキア属Pichia、サッカロマイセス属Saccharomycesまたはシゾサッカロミセス属Schizosaccharomycesを含む酵母、もしくは哺乳類細胞を含む真核細胞、それらの溶解物、またはinvitro転写/翻訳混合物に導入され得る。哺乳類細胞としては、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞、およびヒト細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。哺乳類細胞株としては、限定なしで、CHO、COS、HEK293、HeLa、CV-1、SH-SY5Y、およびNIH3T3細胞が挙げられるが、多数の他の細胞株も使用可能である。コードされたOgLuc変異体の発現は、合成プロモーターを含む原核細胞または真核細胞中で発現可能ないかなるプロモーターによっても制御することができる。原核細胞プロモーターとしては、プロモーター活性を有するいかなる断片をも含む、SP6、T7、T5、tac、bla、trp、gal、lacまたはマルトースプロモーターが挙げられるが、これらに限定はされない。真核細胞プロモーターとしては、プロモーター活性を有するいかなる断片をも含む、構成的プロモーター、例えば、CMV、SV40およびRSVプロモーター等のウイルスプロモーター、並びに調節プロモーター、例えば、プロモーター、hsp70プロモーターおよびCREにより調節される合成プロモーター等の誘導プロモーターまたは抑制プロモーターが挙げられるが、これらに限定はされない。コードされたOgLuc変異体の発現は、RNAプロセシングの調節または翻訳の調節等の転写後過程によって、例えばRNAi、miRNA、shRNA、siRNAによって、またはRNAもしくはタンパク質の分解によって、制御することもできる。本発明の核酸分子、発現カセットおよび/またはベクターは、カルシウム媒介性の形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション等が挙げられるがこれらに限定はされない任意の方法によって、細胞に導入することができる。OgLuc変異体をコードする、最適化された配列、並びにベクターおよび宿主細胞本発明のOgLuc変異体、その機能性断片またはその融合タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子ポリヌクレオチドも提供される。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも1つの選択された宿主中での発現に最適化された核酸配列を含む。最適化された配列は、コドン最適化された配列、すなわち、別の生物、例えば遠縁生物と比較した場合に、ある生物でより頻繁に使用されるコドン、並びにコザック配列および/もしくはイントロンを付加もしくは改変するための改変、並びに/または望ましくない配列、例えば、潜在的転写因子結合部位を取り除くための改変、を含む。そのような最適化された配列は、宿主細胞に導入された場合に、増強された発現、例えば、増加されたタンパク質発現レベルを提供することができる。最適化された配列の例は、米国特許第7,728,118号および米国特許出願公開第2008/0070299号、第2008/0090291号、および第2006/0068395号に開示されており、そのそれぞれが参照によって本発明に組み込まれる。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは本発明のOgLuc変異体をコードする核酸配列を含み、この核酸配列は哺乳類宿主細胞での発現に最適化される。いくつかの実施形態では、最適化されたポリヌクレオチドは、対応する最適化されていない配列にハイブリダイズしなくなり、例えば、中ストリンジェントまたは高ストリンジェントな条件下で、最適化されていない配列にハイブリダイズしない。ストリンジェントなstringencyという用語は、温度、イオン強度、および他の化合物の存在の条件に関して使用され、その条件下で核酸ハイブリダイゼーションが行われる。高ストリンジェントなhighstringency条件では、核酸塩基対合は、高頻度に相補的な塩基配列を有する核酸断片の間だけで起こる従って、中ストリンジェントまたは低ストリンジェントな条件は、互いに完全には相補的でない核酸がハイブリダイズまたはアニーリングされることが所望される場合に、しばしば使用される。当該技術分野では、中ストリンジェントまたは低ストリンジェントな条件を構成するために、多数の等価条件が使用可能であることがよく知られている。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、対応する最適化されていない配列に対し90未満、例えば80未満の核酸配列同一性を有し、任意で、最適化されていない配列にコードされるポリペプチドと、少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。単離された核酸分子、例えば、最適化された核酸配列を含む、コンストラクト、例えば発現カセットおよびベクター、並びに単離された核酸分子、コンストラクトまたはベクターを含むキットも提供される。本発明のOgLuc変異体、その断片またはその融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子は、任意で、特定の宿主細胞内での発現に最適化され、また任意で、転写制御配列、例えば、一つまたは複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはそれらの組み合わせに機能的に連結されて、発現カセットを形成する。いくつかの実施形態では、本発明のOgLuc変異体、その断片またはその融合体をコードする核酸配列は、コドン、例えば親OgLuc配列中のコドンのうち少なくとも25を、特定の選択された細胞において選択的に使用されるコドンと置換することによって最適化される。好ましいコドンは、選択された細胞において比較的高いコドン利用頻度を有しており、それらの導入によって、選択された宿主細胞に存在する転写因子への転写因子結合部位、および他の望ましくない構造特性の導入が、比較的少ないことが好ましい。望ましくない構造特性の例としては、制限酵素部位、真核性配列エレメント、脊椎動物プロモーターモジュールおよび転写因子結合部位、応答要素、大腸菌Ecoli配列エレメント、mRNA二次構造が挙げられるが、これらに限定はされない。従って、最適化された核酸産物は、コドン利用頻度の改善、および望ましくない転写制御配列の数の減少による、不適切な転写挙動のリスクの低減の結果として、向上した発現レベルを有し得る。単離され、最適化された核酸分子は、コドンの30超、35超、40超または45超、例えば、50超、55超、60あるいはそれ以上において、対応する野生型核酸配列のコドンとは異なるコドン組成を有し得る。本発明用の例示的なコドンは、特定の生物における同一のアミノ酸に対して、少なくとも1つの他のコドンよりもより頻繁に使用されるコドンであり、いくつかの実施形態では、その生物において使用率が低いコドンでもなく、該核酸分子の発現のためのクローニングまたはスクリーニングに使用される生物において使用率が低いコドンではない。さらに、特定のアミノ酸に対するコドンすなわち、3つ以上のコドンを有するようなアミノ酸は、その他の好ましくないコドンよりもより頻繁に使用される2つ以上のコドンを含み得る。他の生物においてよりもある生物においてより頻繁に使用されるコドンが核酸分子中に存在することによって、それらのコドンをより頻繁に使用する生物の細胞に導入する際に、それらの細胞中での野生型または親の核酸配列の発現より大きなレベルで、それらの細胞において発現される核酸分子がもたらされる。本発明のいくつかの実施形態では、異なるコドンは哺乳動物でより頻繁に使用されるものであり、一方、さらに他の実施形態では、異なるコドンは植物でより頻繁に使用されるものである。様々な生物に対し好ましいコドンは、当該技術分野で知られており、例えば、httpwwwkazusaorjpcodonを参照のこと。特定の種類の哺乳動物、例えばヒトは、別の種類の哺乳動物とは異なる、一連の好ましいコドンを有し得る。同様に、特定の種類の植物は、別の種類の植物とは異なる、一連の好ましいコドンを有し得る。本発明の一実施形態では、異なっているコドンの大半は、所望の宿主細胞において好ましいコドンであるものである。哺乳動物例えば、ヒトおよび植物を含む生物にとって好ましいコドンは、当該技術分野で知られている例えば、WadaetalNuclAcidsRes182367MurrayetalNuclAcidsRes17477。参考例1.α-アミノニトリル化合物1の合成:フラスコを亜硫酸水素ナトリウム71.4mmolおよび17mLの水で満たした。これに、14mLのテトラヒドロフランTHF中のアルデヒド69.3mmolの溶液を、内部温度を60°C未満に保つ速度で滴加した。得られた懸濁液を周囲温度で40分間撹拌し、水酸化アンモニウム溶液4.85mLを2分間かけて加えた。得られた溶液を、磁気的に撹拌しながら、60°Cで1時間油浴で加熱し、その後周囲温度で一晩放置した。溶液を、内部温度が5°C未満に測定されるまで、氷/塩水槽中で冷却した。これに、14mLの水中のシアン化ナトリウム71.4mmolの溶液を、30分間かけて滴加した。得られた混合物を、およそ10°Cで20分間、30°Cで2時間、そして周囲温度で18時間、撹拌した。反応混合物を、各200mLのジエチルエーテルに3回抽出し、合わせた抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。混合物を濾過し、溶液を氷浴中で20分間冷却した。撹拌した溶液に、沈殿が止むまで塩化水素ガスを加えて、懸濁液を1時間撹拌した。固体を濾過分離し、各50mLのジエチルエーテルで3回すすいだ。物質を真空下で乾燥させて、6.4g47.5mmolの白色固体を得た69。手順は、以下から改変したものである:FreifelderandHasbrouckSynthesisofPrimary12DiaminesbyHydrogenationofalphaAminonitrilesJournaloftheAmericanChemicalSociety82696698。参考例2.2-オキソ-2-フェニルアセトアルデヒドオキシム化合物2の合成:フラスコをカリウムtert-ブトキシド58mmolおよび63mLのtert-ブチルアルコールで満たした。溶液になるまで混合物を撹拌し、35mLのtert-ブチルアルコール中の適切なベンゾフェノン50mmolの溶液を15分間かけて滴加した。反応混合物を1時間撹拌し、無希釈の亜硝酸イソアミル75mmolを5分間かけて加えた。反応混合物を完了したかどうかモニターし、その後100mLのヘプタンで希釈した。得られた固体38mmolを吸引濾過で収集し、真空下で一定重量になるまで乾燥させた。手順は、以下から改変したものである:HagedornetalChemBer98193。参考例3.ピラジン誘導体化合物3の合成三つ口フラスコに温度計、隔壁、およびアルゴン導管argonlineを取り付けた。これに、アミノニトリル47.5mmol、無水ピリジン190mL、およびオキシム61.75mmolを加えた。混合物を15分間十分に撹拌し、テトラ-クロロビス-ピリジルチタン複合体94.9mmolを、内部温度が40°C未満を維持していることを確認しながら、35分間かけて、5回に分けて加えた。添加完了後、反応混合物を一晩周囲温度で撹拌した。反応混合物を、少しずつ、炭酸水素ナトリウム174mLの水中で21.75gの溶液にゆっくりと加えた。得られた混合物を15分間十分に撹拌し、80gのセライトを加えた。懸濁液を30分間撹拌し、ブフナー漏斗を通して濾過した。濾液を取って分液漏斗にかけ、濾滓を400mLのメタノールに懸濁させた。混合物を30分間撹拌し、再度濾過した。この工程を合計で4回繰り返した。メタノール性の濾液を合わせて濃縮し、残渣を200mLの酢酸エチルEtOAcに溶解させた。溶液を最初の濾液を含む分液漏斗に加え、混合物をさらに各100mLのEtOAcで3回抽出した。合わせた抽出物を、各100mLの飽和炭酸ナトリウムで2回、各100mLのブライン溶液で2回洗浄した。有機溶媒を蒸発させ、未精製のピアジンオキシドpyazineoxideを褐色の油状物質として得た。物質を3mLのメタノールに溶解させ、89mLのジクロロメタンDCMを加えた。この溶液に、亜鉛末80.7mmolを加え、15°Cの内部温度に達するまで、混合物を氷浴中で冷却した。混合物を氷酢酸3mLで処理し、油浴中で40分間、30°Cの内部温度まで温めた。反応混合物を室温まで冷却し、セライトのパッドを通して濾過した。濾滓をDCMですすぎ、合わせた濾液を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液で洗浄した。粗生成物をヘプタン/EtOAc勾配を用いるシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。これにより2.9g29のピラジンが褐色固体として得られた。手順は、以下から改変したものである:KishietalThestructureconfirmationofthelightemittingmoietyofbioluminescentjellyfishTetrahedronLett132747。参考例4.セレンテラジンの合成方法A:以下の化合物が方法Aで合成できる:化合物PBI-3840、PBI-3886、PBI-3857、PBI-3887、PBI-3913、PBI-3894、PBI-3896、PBI-3897、PBI-3841およびPBI-3842フラスコをピラジン8.25mmol、ピルビン酸14.0mmol、カンファースルホン酸0.8mmol、および無水2-メチルTHF150mLで満たした。フラスコに冷却器、および4オングストロームのモレキュラーシーブで満たしたソックスレー抽出器を取り付け、反応混合物を油浴中110°Cで18時間加熱した。篩を新品と取り換えて、還流を24時間続けた。反応混合物を濾過および濃縮し、残渣をEtOAc200mLに溶解させた。この溶液を、各25mLの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で3回、100mLの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、pH5、および100mLのブライン溶液で洗浄した。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、2.3g6.2mmol、75の未精製エナミン/酸を得た。この物質を無水THF30mLに溶解させ、その溶液を氷/水浴中で10分間冷却した。これに、カルボジイミド9.0mmolおよび無希釈ジイソプロピルエチルアミン14.9mmolを加えた。10分後に冷浴を取り除き、反応混合物を周囲温度で3時間撹拌した。反応混合物に、50mLの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、pH5を加え、混合物を10分間十分に撹拌した。二相混合物を各100mLのEtOAcで3回抽出し、合わせた抽出物をブライン溶液で洗浄した。有機溶液を濃縮し、残渣をDCM/メタノール勾配を用いるシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。これにより、336mg0.94mmol、16のデヒドロセレンテラジンが赤色固体として得られた。この物質を10mLのメタノールに懸濁し、混合物を氷浴中で冷却した。これに、水素化ホウ素ナトリウム100mg、2.6mmolを1時間かけて3回に分けて加えた。反応混合物をさらに30分間撹拌し、pH5になるまで無希釈の氷酢酸を滴加した。溶液を濃縮し、残渣を15mLの水で粉砕した。固体を吸引濾過で単離し、真空下で数時間乾燥させて、318mg94の未精製セレンテラジンを黄色固体として得た。手順は、以下から改変したものである:KakoiandInoueChemLett11299300。方法B:以下の化合物を方法Bによって合成することができる:化合物PBI-3882、PBI-3932、PBI-3881フラスコをグリオキサール2.2mmol、アミノピラジン1.1mmol、エタノール20mL、12NHCl0.6mL、および水1mLで満たした。反応混合物を24時間加熱還流し、濃縮した。残渣をDCM/メタノール勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、100mg0.25mmol、23のセレンテラジン生成物が暗色固体として得られた。手順は、以下から改変したものである:InoueetalSquidbioluminescenceIIIsolationfromWataseniascintillansandsynthesisof2637dihydroimidazo12apyrazin3oneChemLett41414。方法C:新規セレンテラジンの合成以下の化合物を方法Cによって合成することができる:PBI-3939、PBI-3945、PBI-3889、PBI-4002化合物4-5-アミノ-6-ベンジルピラジン-2-イルフェノールは、以前に記載されている方法に従って調製することができるKishietalTetrahedronLett132747MosrinetalOrganicLetters113406KakoiChemPharmBull50301。2-アミノ-3-ベンジル-5-フェニルピラジンの合成。丸底フラスコを5g33.5mmolの2-イソニトロソアセトフェノン、6.7g36.8mmolの2-アミノ-3-フェニルプロパンニトリル塩酸塩および100mLの無水ピリジンで満たした。混合物を-20°Cに冷却し、4.6mL40.0mmolのTiCl4を滴加した。反応物を-20°Cで30分間維持し、2.5時間かけて80°Cに加熱した。溶媒を蒸発させ、残渣を1LのDCMに溶解させた。この溶液を飽和NaHCO3およびブラインで洗浄した。全ての揮発性物質を蒸発させ、残渣をエタノール400mLに再溶解させた。ラネーNi2.0g、水性懸濁液を加え、反応を1気圧の水素下で5日間撹拌させた。混合物をセライトに通し、揮発性物質を除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィヘプタン/DCMにかけ、2.5g29の2-アミノ-3-ベンジル-5-フェニルピラジンを得た。2アミノ3フェニルプロパンニトリル塩酸塩の合成。丸底フラスコを65g0.624molの亜硫酸水素ナトリウムおよび150mLの水で満たした。THF150mL中の75g0.624molのフェニルアセトアルデヒドの溶液を滴加した。20分間撹拌した後、37mLの14M水酸化アンモニウムを一度に加え、混合物を60分間かけて60°Cに加熱した。0°Cに冷却した後、混合物を150mLの水で希釈し、内部温度を10°C未満に保ちつつ水100mL中のシアン化ナトリウム27.5g、0.560molの溶液を滴加した。添加したらすぐに、混合物を2時間かけて30°Cに加熱し、エーテルで抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、全ての揮発性物質を蒸発させ、残渣を3.5Lのエーテルに溶解させ、400mLの3.3Mのエタノール性HClで処理した。得られた沈殿物を濾過し、真空乾燥させて、55g60の生成物を得た。3-フラン-2-イル-2-オキソプロパン酸の合成。100mLフラスコに、3-フラン-2-イル-2-オキソプロパノエート940mgを23mLの冷6NNaOHとともに加えた。不溶性混合物を溶解するまで90°Cの浴中で5分間撹拌した。溶液が酸性になるまで冷1NHClを加えたおよそ120mL。溶液を2×50mLEtOAcで抽出した。合わせた有機層を40mLブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。溶液を蒸発させて、540mgの褐色固体を得た。固体を、97トリフルオロ酢酸TFA水溶液からアセトニトリルACNへの勾配を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーHPLCでさらに精製した。エチル3-フラン-2-イル-2-オキソプロパノエートの合成。異性体E/Z-エチル2-ホルムアミド-3-フラン-2-イルアクリレート5.0gの混合物を含む500mLのフラスコに、50/50エタノール/水中の1.4M5HClの冷却溶液220mLを加えた。5時間後、反応物を200mLのEtOAcと30mLのブラインに分配した。水層を2×50mLのEtOAcで抽出した。合わせた有機層を1×50mLの水、および1×50mLのブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。有機層を26gのセライトにより共蒸発させ、ヘプタンからEtOAcへの勾配を用いて80gのシリカ金silicagold上で溶出させた。適切な、合わせた画分を蒸発させて、2.1gを得た。E/Z-エチル2-ホルムアミド-3-フラン-2-イルアクリレートの合成。500mLのフラスコに、50mLのジエチルエーテル、Cu2O320mg、およびフリルアルデヒド5.2mLを加えた。そのフラスコTheflaskedを氷浴中で冷却し、エチル2-イソシアノ酢酸5.3mLを加えた。1.5時間後、カリウムtert-ブトキシド5gを反応物に加えた。4時間後、その不均一な反応物を濾過した。60mLの30クエン酸および20mLのEtOAcを加え、10分間撹拌した。水層を50mLのEtOAcで抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。EtOAc層を24gのセライトにより共蒸発させ、ヘプタンからEtOAcへの勾配を用いる80gシリカ金上で溶出した。黄色シロップ状物質はさらなる精製なしで使用された。2オキソ3チオフェン2イルプロパン酸の合成。250mLのフラスコに、E/Z-5-チオフェン-2-イルメチレンイミダゾリジン-2,4-ジオン5.0gおよび100mLの冷却6NNaOHを加えた。混合物を1時間かけて100°Cに加熱した。濃縮したHClを酸性pH=1になるまで前記冷却溶液に加えた。混合物を8×50mLのジエチルエーテルで抽出した。合わせたエーテル層を50mLのブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて、3.36gの固体を得た。試料をα,α,α-トリフルオロトルエンでの再結晶化でさらに精製して、1.63gを得た。E/Z-5-チオフェン-2-イルメチレンイミダゾリジン-2,4-ジオンの合成。250mLのフラスコに、ヒダントイン9.8gおよびチオフェン-2-カルバルデヒド10gを加えた。混合物に、ピペリジン9.6mLを滴加した。混合物を1時間かけて100°Cに加熱し、その後300mLの1NHClに注いだ。固体を濾過し、水で洗浄し、真空中で乾燥させて、4.9gの固体を得た。ステップ1.マイクロ波バイアル10mLに、適切なフェニルピラジン-2-アミン100mg、適切なピルビン酸2等量、DCM1mL、および1,1,1-トリフルオロエタノール1mLを、80°Cで30分間、撹拌しつつ加熱した。反応物を2グラムのセライトに共吸着させ、溶媒を真空中で除去した。セライトを24gの球状シリカゲルに添加し、ヘプタンから酢酸エチルへの勾配を用いて溶出した。適切な画分を合わせて蒸発させた。ステップ2.THF0.5mLに溶解された、ステップ1で単離した物質を、氷浴中で冷却した。無水酢酸25μL、ジメチルアミノピリジン8.5mg、およびトリエチルアミン25μLを加えた。2時間後、THFの大部分を真空中で除去した。生成物を30クエン酸2mLの水溶液で沈殿させた。固体を水2mLで洗浄し、その後3mLのDCMに溶解させた。DCMを、1×2mLの水で、続いて1×2mLのブラインで洗浄した。DCM層を2グラムのセライトに共吸着させ、溶媒を真空中で除去した。セライトを12gの球状シリカゲルに添加し、ヘプタンからDCMへの勾配を用いて溶出した。適切な画分を合わせて、蒸発させた。ステップ3.DCM1mLに溶解させた、ステップ2で得られた物質を氷浴中で冷却した。溶液に、メタノール0.5mLおよびジエチレングリコールジメチルエーテル中の水素化ホウ素ナトリウム溶液325μLの0.5Mを加えた。2時間後、酢酸10μLを加え、溶液を30クエン酸水溶液1mLおよびDCM2mLにすばやく分配した。DCM層を1グラムのセライトに共吸着させ、溶媒を真空中で除去した。セライトを4gの球状シリカゲルに添加し、DCMからEtOAcへの勾配を用いて溶出した。適切な画分を合わせて、蒸発させた。ステップ4R=OAcの場合のみ.ステップ3の物質をTHF200μLに溶解させ、氷浴中で冷却した。1等量のTHF中1.35Mカリウムメトキシドを溶液に加えた。30分後、反応物をDCM1mLと30クエン酸1mLに分配した。DCM層を0.5gのセライトに共吸着させ、溶媒を真空中で除去した。セライトを4gの球状シリカゲルに添加し、DCMからEtOAcへの勾配を用いて溶出した。適切な画分を合わせて、蒸発させた。方法D:以下の化合物を方法Dによって合成することができる:化合物PBI-3899、PBI-3900、PBI-3925、PBI-3933、PBI-3946。概して、水素雰囲気下、パラジウム触媒存在下で、アミノピラジンを2等量の2-オキソ酸と縮合させた。生成されたαアミノ酸を精製し、その後、分子内縮合のために活性化して、対応するイミダゾピラジノンを生じた。実施例5.8-ベンジル-6-4-ヒドロキシフェニル-2-プロピルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンの合成2-3-ベンジル-5-4-ヒドロキシフェニルピラジン-2-イルアミノペンタン酸。4-5-アミノ-6-ベンジルピラジン-2-イルフェノール100mg、0.36mmolを、エタノール20mL中の2-オキソ吉草酸84mg、0.72mmolと混合した。Pd/C活性炭中の10パラジウム、40mgを加え、反応混合物を65°Cに加熱した。空気をN2ガスによって泡立たせて除去し、水素風船を反応フラスコに取り付けた。反応を4時間継続的に撹拌した。冷却後、それを濾過し、得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー溶出溶媒:ヘプタン中50EtOAcで精製して、生成物を黄色粉末70mg、52として得た。1HNMR831782731692534420110098087MSmz3783。8-ベンジル-6-4-ヒドロキシフェニル-2-プロピルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オン。2-3-ベンジル-5-4-ヒドロキシフェニルピラジン-2-イルアミノペンタン酸49mg、0.13mmolを、DCM10mLに溶解させた。ピリジン0.5mLを加え、続いてN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド54mg、0.26mmolを加えた。反応混合物を室温で1時間ゆっくりと撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー溶出溶媒:EtOAc~DCM~DCM中10メタノールで精製して、生成物を黄色粉末40mg、86として得た。1HNMR735688440281181102MSmz3590。実施例6.8-ベンジル-2-ブチル-6-4-ヒドロキシフェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンの合成2-3-ベンジル-5-4-ヒドロキシフェニルピラジン-2-イルアミノヘキサン酸。4-5-アミノ-6-ベンジルピラジン-2-イルフェノール200mg、0.72mmolを、エタノール20mL中の2-ケトヘキサン酸ナトリウム塩220mg、1.44mmolと混合した。Pd/C活性炭中の10パラジウム、100mgを、数滴の酢酸と共に加え、反応混合物を65°Cに加熱した。空気をN2ガスによって泡立たせて除去し、水素風船を反応フラスコに取り付けた。反応を4時間継続的に撹拌した。冷却後、それを濾過し、得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー溶出溶媒:ヘプタン中50EtOAcで精製して、生成物を黄色粉末130mg、46としてを得た。MSmz3922。8-ベンジル-2-ブチル-6-4-ヒドロキシフェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オン。2-3-ベンジル-5-4-ヒドロキシフェニルピラジン-2-イルアミノヘキサン酸130mg、0.33mmolをDCM10mLに溶解させた。ピリジン0.5mLを加え、続いてN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド137mg、0.67mmolを加えた。反応混合物を室温で1時間ゆっくりと撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー溶出溶媒:EtOAc~DCM~DCM中10メタノールで精製して、生成物を黄色粉末110mg、89として得た。1HNMR730688440284177151089MSmz3743。実施例7.8-ベンジル-2-エチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンPBI-3925の合成2-3-ベンジル-5-フェニルピラジン-2-イルアミノブタン酸。3-ベンジル-5-フェニルピラジン-2-アミン200mg、0.77mmolを、エタノール20mL中の2-オキソ酪酸157mg、1.54mmolと混合した。Pd/C活性炭中の10パラジウム、100mgを加え、反応混合物を65°Cに加熱した。空気をN2ガスによって泡立たせて除去し、水素風船を反応フラスコに取り付けた。反応を4時間継続的に撹拌した。冷却後、それを濾過し、得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー溶出溶媒:ヘプタン中50EtOAcで精製し、生成物を黄色粉末90mg、34として得た。1HNMR772732748446420225099MSmz3483。2-3-ベンジル-5-フェニルピラジン-2-イルアミノブタン酸をDCM10mLに溶解させた。ピリジン0.5mLを加え、続いてN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド137mg、0.67mmolを加えた。反応混合物を室温で1時間ゆっくりと撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー溶出溶媒:EtOAc~DCM~DCM中10メタノールで精製して、生成物を黄色粉末110mg、89として得た。1HNMR726684707403247096MSmz3302実施例8.8-ベンジル-6-フェニル-2-3,3,3-トリフルオロプロピルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンの合成5,5,5-トリフルオロ-2-オキソペンタン酸。エチル4,4,4-トリフルオロブチレート1g、5.88mmolおよびシュウ酸ジエチル3.87g、26.5mmolを、エタノールに溶解させた。ナトリウムエトキシドエタノール中21、2.09gを溶液に加え、反応混合物を0.5時間撹拌した。溶媒を蒸留し、残渣をEtOAc/水で抽出した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過後、溶媒を除去して透明な液体を得た。MSmz2691。その後、液体を3NHCl20mLに溶解させ、反応混合物を4時間還流させた。冷却後、反応混合物をEtOAcで抽出した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過後、溶媒を除去し、残渣を次のステップに直接使用した。MSmz1697。5,5,5-トリフルオロ-2-3-ベンジル-5-フェニルピラジン-2-イルアミノブタン酸。3-ベンジル-5-フェニルピラジン-2-アミン240mg、0.92mmolを、エタノール20mL中の5,5,5-トリフルオロ-2-オキソペンタン酸150mg、0.88mmolと混合した。Pd/C活性炭中の10パラジウム、100mgを加え、反応混合物を65°Cに加熱した。空気をN2ガスによって泡立たせて除去し、水素風船を反応フラスコに取り付けた。反応を4時間継続的に撹拌した。冷却後、それを濾過し、得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー溶出溶媒:ヘプタン中50EtOAcで精製し、生成物を黄色粉末200mg、54としてを得た。1HNMR11451020794734534396423302328FNMR763MSmz4161。セレンテラジンR1=H、R2=-CH2CH2CF3。5,5,5-トリフルオロ-2-3-ベンジル-5-フェニルピラジン-2-イルアミノブタン酸100mg、0.24mmolをDCM10mLに溶解させた。ピリジン0.5mLを加え、続いてN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド100mg、0.48mmolを加えた。反応混合物を室温で1時間ゆっくりと撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー溶出溶媒:EtOAc~DCM~DCM中の10メタノールで精製して、生成物を黄色粉末80mg、87として得た。1HNMR736343160192FNMR674MSmz3982。実施例9.8-ベンジル-2-フラン-2-イルメチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンPBI-3939の合成PBI39398-ベンジル-2-フラン-2-イルメチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オン:3-フラン-2-イル-2-オキソプロパン酸および3-ベンジル-5-フェニルピラジン-2-アミンを出発物質として用いて、方法Cから合成した。1HNMRδ888802761-738737-714638626464440C24H20N3O2の計算による正確な質量mz38216実測値mz382。実施例10.8-ベンジル-6-フェニル-2-チオフェン-2-イルメチルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンPBI-3889の合成PBI-38898-ベンジル-6-フェニル-2-チオフェン-2-イルメチルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オン:2-オキソ-3-チオフェン-2-イルプロパン酸および3-ベンジル-5-フェニルピラジン-2-アミンを出発物質として用いて方法Cから合成した。1HNMRδ885799763-702694462458269C24H20N3OSの計算された正確な質量mz39813実測値mz398。実施例11.8-シクロプロピル-2-4-ヒドロキシベンジル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンPBI-3897の合成PBI-38978-シクロプロピル-2-4-ヒドロキシベンジル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オン:3-シクロプロピル-5-フェニルピラジン-2-アミンおよび3-4-ヒドロキシフェニル-2-オキソプロパン酸を出発物質として用いて方法Aにより合成した。C22H18N3O2の計算による正確な質量mz35614実測値mz356。実施例12.8-ベンジル-2-メチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンPBI-3932の合成PBI-39328-ベンジル-2-メチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オン:1,1-ジメトキシプロパン-2-オンおよび3-ベンジル-5-フェニルピラジン-2-アミンを出発物質として用いて方法Bによって合成した。C20H18N3Oの算出による正確な質量mz31614実測値mz316。実施例13.2-4-ヒドロキシベンジル-8-メチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンPBI-3896の合成PBI-38962-4-ヒドロキシベンジル-8-メチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オン:3-メチル-5-フェニルピラジン-2-アミンおよび3-4-ヒドロキシフェニル-2-オキソプロパン酸を出発物質として用いて方法Aによって合成した。1HNMRδ884800747717669626417286248。実施例14.8-ベンジル-2-4-ヒドロキシベンジル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンPBI-3840の合成PBI-38408-ベンジル-2-4-ヒドロキシベンジル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オン:3-4-ヒドロキシフェニル-2-オキソプロパン酸および3-ベンジル-5-フェニルピラジン-2-アミンを出発物質として用いて方法Aを使用して合成した。C26H22N3O2の算出による正確な質量mz40817実測値mz408。実施例15.保護されたセレンテラジン安定化PBI-4377の合成ジメチルホルムアミドDMF中のPBI-3939、炭酸カリウム1.1等量およびヨウ化カリウム1.1等量の混合物に、アルゴン雰囲気下、室温で、1等量のピバル酸クロロメチルを加えた。反応の進行を薄層クロマトグラフィーでモニターし、完了後すぐに、反応混合物を数分間氷浴中で冷却し、その後、反応物体積と等量の水を添加した。得られた混合物を適切な有機溶媒例えば、EtOAcで抽出し、抽出物を濃縮し、粗生成物を得た。物質をシリカゲルクロマトグラフィーでさらに精製した。実施例168-ベンジル-2-1-メチル-1H-イミダゾール-2-イルメチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンPBI-4525、8-ベンジル-6-4-ヒドロキシフェニル-2-1-メチル-1H-イミダゾール-2-イルメチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンPBI-4540および2-1H-イミダゾール-2-イルメチル-8-ベンジル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オンPBI-4541の合成10mmolの2-メチルイミダゾール誘導体1または2を含むフラスコに、アルゴン雰囲気下で、20mLの無水THFを加え、溶液をドライアイス/アセトン浴中でおよそ-78°Cに冷却した。冷却した混合物に、9.3mmolのn-ブチルリチウム溶液ヘキサン中2.46Mを数分かけて滴加した。得られた溶液をおよそ-78°Cで30分間撹拌し、6.7mmolの化合物3を、注射器を介して加えた。反応混合物を3時間撹拌し、20mLの飽和塩化アンモニウム溶液および20mLの飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加してクエンチした。冷浴を取り除き、室温まで温めた後、混合物を3×100mLのEtOAcで抽出した。合わせた抽出物を乾燥させMgSO4、真空濃縮し、未精製化合物4または5を、シリカゲルカラムクロマトグラフィEtOAc/ヘプタンで精製した。マイクロ波バイアルを100mg1等量の化合物6または7、および2等量の化合物8または9で満たした。混合物に、4.5mLのエタノールおよび0.25mLの濃縮HClを加えた。反応混合物をマイクロ波中100°Cで1.5時間加熱した。得られた混合物を50mLのEtOAcに加え、20mLの飽和炭酸水素ナトリウム溶液および20mLのブラインで順次洗浄した。有機相を真空濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィメタノール/ジクロロメタンで精製して、化合物10~12を得た。実施例17.新規セレンテラジンの安定性および自己発光の特性評価新規セレンテラジンのPBI-3939、PBI-3889、PBI-3945、PBI-4002、またはPBI-3896の安定性および自己発光の特徴付けを決定した。より高い安定性およびより少ない自己発光は、基質/試薬において魅力的な技術的特徴である。安定性を決定するため、20μMの新規セレンテラジンPBI-3939、PBI-3889、PBI-3945、PBI-4002、もしくはPBI-3896、30μMの天然セレンテラジン、または22μMの既知のセレンテラジン-hもしくは既知のセレンテラジン-hhを、50mMCDTA、150mMKCl、50mMDTT、35mMチオ尿素、1TERGITOL登録商標NP-9v/v、および0.1MAZU登録商標DF204を含有するレポーター試薬緩衝液中に置いた。反復試験試料を室温すなわち、22~24°Cで様々な期間インキュベートし、その後-70°Cに移行した。全ての試料を回収し凍結した後、それらを解凍し、フェノールレッド0.1PRIONEX登録商標無しの40μLのDMEM中の、OgLuc変異体IVを含有する10μLの細菌細胞溶解物と混合した。試料の発光をIV添加の5分後に読み取った。T90は、発光シグナルが、周囲温度すなわち22°Cで、10だけ減衰すなわち、活性が10だけ喪失するのに要する時間の量を表す。発光シグナルT90の減衰速度を、対数RLU対時間としてプロットされたデータの線型回帰の傾斜から決定したが、これは、以下の式から算出された:t=lnA/A0÷-k式中、A=時間tでの強度、A0=時間0での強度、およびk=減衰速度、である。表1に示されるように、既知のセレンテラジン-hおよびセレンテラジン-hh、新規セレンテラジンPBI-3939、PBI-3889、PBI-3945、PBI-4002、およびPBI-3896のT90値は、天然セレンテラジンよりも高かったが、これは、これらのセレンテラジンが天然セレンテラジンよりもより安定な化合物であったことを示している。自己発光の特徴付けを決定するため、HEK293細胞を、DMEM10FBSピルビン酸塩中、15,000細胞/ウェルで、一晩増殖させた。培地を除去し、CO2非依存性培地10FBS中に希釈された、図2に示される各20μMの新規セレンテラジン、すなわち、PBI-3939、PBI-3889、PBI-3945、PBI-4002、PBI-3841、PBI-3897、PBI-3896、PBI-3925、PBI-3894、PBI-3932、およびPBI-3840、天然セレンテラジン並びに既知のセレンテラジンであるセレンテラジン-hおよびセレンテラジン-hhと置き換えた。基質を添加した直後にGLOMAX登録商標ルミノメーター1秒/ウェルで発光を測定した。バックグラウンド発光は154±15RLUであった。表1は、天然セレンテラジンに対して正規化された自己発光の特徴付けを示している自己発光セレンテラジンに対して正規化。天然セレンテラジンと比べて、セレンテラジン-hは自己発光がより多かったが、その他全ての試験セレンテラジンは自己発光がより少なかった。表1:種々のセレンテラジンを用いた、IVの安定性実験および自己発光特徴付け実施例18新規セレンテラジンの毒性新規セレンテラジンの毒性をHEK293細胞において調査した。HEK293細胞を、DMEM10FBSピルビン酸塩中、15,000/ウェルで、一晩増殖させた。培地を除去し、CO2独立培地10FBSに希釈された新規セレンテラジン化合物またはDMSO対照と置き換えた。化合物添加から24時間後に、CELLTITER-GLO登録商標アッセイ試薬プロメガ社を用い、製造業者の取扱説明書に従って、細胞生存率を測定し、発光はGLOMAX登録商標ルミノメーター1秒/ウェルで測定した。表2は、HEK293細胞における、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hおよびセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンPBI-3939、PBI-3889、PBI-3841、PBI-3897、PBI-3945、PBI-4002、およびPBI-3840の毒性を示している。PBI-3840を例外として、新規セレンテラジンは少なくともセレンテラジン-hhと同じ毒性を有していた。新規セレンテラジンのいくつかは、天然セレンテラジンおよびセレンテラジン-hと同じ毒性を有していた。表2:CELLTITER-GLO登録商標に基づく、HEK293細胞における種々のセレンテラジンの毒性実施例19PBI-3939のKmPBI-3939のKmを決定するため、OgLuc変異体L27V実施例26に記載を、HaloTag登録商標タンパク質精製系を用いて、HaloTag登録商標融合によって、製造業者の取扱説明書に従って精製し、フェノールレッドおよび0.1PRIONEX登録商標を含まないDMEMに希釈した。様々な量のPBI-3939を含有する50μLのアッセイ緩衝液100mMMESpH6、35mMチオ尿素、0.5TERGITOL登録商標NP-9v/v、1mMCDTA、2mMDTTおよび150mMKClを、50μLの希釈酵素およそ20pM最終酵素濃度に加え、発光を22°C、3分後に測定した。図3のデータが示すように、PBI-3939のKmはおよそ10μMであった。実施例20化合物PBI-4525、PBI-4540およびPBI-4541の特徴付け化合物PBI-4525、PBI-4540およびPBI-4541を、それらの発光検出能に関してスクリーニングした。分析のため、20μMのそれぞれの化合物を、アッセイ試薬を作製するために100mMHEPESpH7でpH7に調整したアッセイ緩衝液100mMMESpH6、35mMチオ尿素、0.5TERGITOL登録商標NP-9v/v、1mMCDTA、2mMDTTおよび150mMKClに加えた。その後、アッセイ試薬を、フェノールレッドを含有しないDMEMおよび0.1PRIONEX登録商標中の36pM精製L27V02酵素実施例25Bに記載と混合した。対照として、20μMPBI-3939またはPBI-4528を含有するアッセイ緩衝液を使用した。アッセイ試薬を酵素混合物に加えてから3分後に、発光を前述の通りに測定した。表3は、化合物PBI-4525、PBI-4540およびPBI-4541が、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼからの発光を検出するのに使用できることを示している。表3実施例21OgLucパターン配列異なるクラスのルシフェラーゼを含む酵素ファミリーは、共通の3次元構造および明確な触媒活性を有することによって、認識できる。酵素ファミリーは他の酵素ファミリーと進化史を共有しているため、それらはそれらの3次元構造において類似性も示す。構造解析および機能解析の様々な手段によって、発明者は、OgLucが、代表的な十脚類ルシフェラーゼとして、進化史の共有性を含めて、脂肪酸結合タンパク質FABPに著しく類似した3次元構造を有していることを決定した。従って、十脚類ルシフェラーゼは、FABPに類似した特徴的な3次元構造を有し、セレンテラジンを基質として利用し発光を触媒すると定義することができる。他のルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ等は、明らかに異なる3次元構造を有しており、このことは、それらが異なる酵素ファミリーに属しており、進化史を共有していないことを示している。渦鞭毛藻類ルシフェラーゼは、FABPに対しいくらかの類似性を示す3次元構造を有しているが、このことは、進化史は共有しているが、セレンテラジンを基質として利用せず、従って十脚類ルシフェラーゼと同じ酵素ファミリーに属していないことを示している。アミノ酸配列は3次元構造程はよく保存されていないため、配列比較のみに基づいて酵素ファミリーを定義することは困難である可能性がある。例えば、FABP全ては特徴的な樽型3次元形状を有しているが、それらのアミノ酸配列の比較により、非常に低いレベルの配列同一性がしばしば明らかにされる。それでも、配列同一性を3次元構造の共有性を示すのに使用することができる。それらのアミノ酸配列が整列されて、30超の配列同一性、好ましくは40超の配列同一性、および最も好ましくは50の配列同一性を明らかにすることができた場合、2つのタンパク質は類似の3次元構造を有することとなるChothiaandLeskEMBOJ5823826TramontanoGenomics4402-405。従って、あるタンパク質は、そのアミノ酸配列とOgLucの配列が整列された際、配列同一性が30超、好ましくは40超、および最も好ましくは好ましくは50超である場合、且つ、該タンパク質がセレンテラジンを基質として利用し、発光を触媒可能である場合、十脚類ルシフェラーゼである。酵素ファミリーのその特徴的な3次元構造を維持するのに必要な構造的な制約のために、酵素ファミリーのアミノ酸配列のいくつかの部分は、より大きな量の保存すなわち、より大きなレベルの配列同一性を示す。従って、これらの保存領域は、2つのタンパク質の間で共有された共通の3次元構造というさらなる証拠として役立つことができる。保存された配列パターンは、シグネチャーsignature、モチーフ、またはフィンガープリントとも称されるが、当該技術分野において周知の手作業によるまたはコンピュータによる方法によって作製することができる。パターンは、PROSITE等の公開データベースに見出すことができるhttpexpasyorgprositeSigristetalNucleicAcidsRes38D161D166。例えば、保存アミノ酸配列のパターンは、多数の既知のFABPを調べて見出され得る。PROSITE2010年10月5日の、リリース20.67は、FABPパターン受入番号PS00214、1990年4月に作成、2006年4月に更新されたデータを含む。このFABPパターンは、18個のアミノ酸の位置にまたがり、以下の通りに定義される:GSAIVKFEFYWxLIVMFxxKxNHGFYDExLIVMFYLIVMNGLIVMAKR配列番号329VI、ここで:アミノ酸に対しては、標準的なIUPACの1文字コードが使用される。あらゆるアミノ酸が許容される位置に対しては、xの記号が使用される。ある部位における代替的なアミノ酸はアミノ酸を角括弧[]の間に列挙することによって示される例えば:[ALT]は、その位置がAla、Leu、またはThrである可能性を表す。ある部位における特定のアミノ酸の欠如は波括弧{}によって示される例えば:{AM}は、ある位置がAlaおよびMet以外のあらゆるアミノ酸であることを表す。各配列の位置またはパターン中の構成要素は、その隣から、-によって隔てられている。各配列の位置は、パターン位置と称され、例えば[GSAIVK]は式VIのパターン位置1と見なされ、{FE}は式VIのパターン位置2と見なされるなど等である。保存された配列パターンは共通の、基礎をなす3次元構造からもたらされるが、該配列パターンへのいくつかの変化は、3次元構造への撹乱をもたらさずに可能であり得る。例えば、FABPファミリーのいくつかの構成要素について、PROSITEパターンにおける4つの部位で差異が見出される。FABPファミリーのこれらの追加の構成要素としては、偽陰性ヒットfalsenegativehitとしてPROSITEに列挙される5つのタンパク質、すなわち、FABPパターンUniProtデータベース受入番号FBP12_HUMAN、FABP1_FASGI、FABP2_FASHE、FABPL_SCHBI、RET5_BOVINにより拾われなかった、FABPタンパク質ファミリーメンバー、およびFABPの折り畳みを有することが知られる1つのタンパク質蛋白質構造データバンク受入番号2A02が挙げられる。OgLucはFABPとかなり類似した3次元構造共有しているが、天然アミノ酸配列および変異体アミノ酸配列の配列パターンも、PROSITEパターンと5つの位置で差異を有し、わずかに異なっている。種々の実施形態において、OgLucにおけるパターンは、配列番号1の8位に対応する位置で開始する。アミノ酸の置換、欠失、または挿入配列パターンは差異とみなされ、含められる。これらの追加のFABPおよびOgLuc変異体からの配列情報を組み合わせて、改良された配列パターンが誘導できる:GSAIVKFEFYWxLIVMFSYQxxKxNHGKxDExLIVMFYLIVMWFxGLIVMAKRG配列番号330VII。このパターンを誘導するために使用される配列情報を表4に示す。縦列1は、パターン位置N末端からC末端まで列挙;パターンの長さは18アミノ酸であるを特定しており、縦列6は、OgLucにおける対応する配列の位置配列番号1に従って番号付けを特定している。縦列2は、各パターン位置のPROSITEFABPパターン式VI要素を示している。縦列3は、PROSITEFABPパターンによっては表されない6つのFABPファミリーメンバーに存在するアミノ酸を列挙している。縦列4は、PROSITEパターンによっては表されないOgLuc配列番号1またはOgLuc変異体に存在するアミノ酸を列挙している。縦列5は、縦列2、3、および4のパターン情報を組み合わせることにより作成される改良されたパターンOgLucパターン式VIIを列挙している。縦列7は、PROSITEFABPパターン位置に対応するOgLuc配列番号1におけるアミノ酸を列挙している。縦列8は、前記改良パターンに対応する位置で、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ配列8つの異なる種に存在するアミノ酸GenBank受入番号2021262A、AAA68491、AAC36472、AAV35379、AAV35380、AAL40676、AAL40677、AAV35378、AAV35377、AAV35381、および蛋白質構造データバンク受入番号1VPRを列挙している。改良パターン式VIIは、FABPとOgLucの間で共有される3次元タンパク質構造の表示すなわち、フィンガープリントとして役立つ。しかし、このパターンとの厳密な一致は3次元構造の共有性を表すのに必要ではない。本明細書で与えられる例から、共通の3次元構造は、パターン中に5つもの変化を有していてさえ存在し得る。また、例えば、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼはFABPおよびOgLucに類似した3次元構造を有するが、該ルシフェラーゼは改良パターンとの4つの差異を有する。従って、あるタンパク質は配列類似性およびセレンテラジンの発光への利用に基づいて十脚類ルシフェラーゼと見なすことができるが、前記改良された配列パターンを有することによってもさらに認識することができる。具体的には、あるタンパク質は、そのアミノ酸配列を配列番号1またはその変異体と整列させたときに、配列同一性が30超、好ましくは40超、最も好ましくは50超であり、且つ、そのタンパク質が発光を触媒するのにセレンテラジンを基質として利用でき、且つ、配列番号1の8位に対応する位置で開始するアミノ酸配列が以下:GSAIVKFEFYWxLIVMFSYQxxKxNHGKxDExLIVMFYLIVMWFxGLIVMAKRG配列番号330VIIであり、前記アミノ酸配列が、5より多い差異を有さず、またはより好ましくは4、3、2、または1より多い差異を有さず、または最も好ましくは差異が無く、その差異が表4に記載の式VIIのパターン位置1、2、3、5、8、10、12、14、15、17、または18に対応する位置で生じる場合、十脚類ルシフェラーゼである。差異には、表4のパターン位置の間のギャップまたは挿入も含まれ得る。表4:タンパク質配列パターン実施例22OgLuc変異体の生成実験の詳細特に明記しない限り、無作為置換を有する開始OgLuc変異体配列のさらなる変異体は、製造業者の取扱説明書に従う、誤りがちな、変異誘発性PCRに基づく系であるGeneMorphII無作為変異誘発キットストラタジーン社;DaughteryPNASUSA972029、およびNNK部位飽和ZhengetalNucleicAcidsResearch32e115を用いて、生成された。特定の変異を有する開始OgLuc変異体のさらなる変異体を、オリゴをベースとする部位特異的変異誘発キットであるQuikChange部位特異的変異誘発キットストラタジーン社;KunkelPNASUSA82488を製造業者の取扱説明書に従って用いて、生成した。得られた変異体は、T7プロモーターに基づいた発現用のpF1KFLEXI登録商標ベクタープロメガ社の背景において、構築された。あるいは、得られた変異体は、融合タンパク質を生成するために、C末端にHaloTag登録商標プロメガ社;本明細書ではHT7と称するを有する、または有さない大腸菌Ecoliリボソーム結合部位を含有するように改変されたT7プロモーターおよびCMVプロモーターを含有する、pF4Agベクター市販品pF4Aプロメガ社の1つのバージョンの背景において、構築されたOhanaetalProteinExpressionandPurification68110120。例えば、C1A4E変異体を得るために、pF1Kベクターのバックグラウンドで、NNK飽和突然変異誘発実験が行われた。C1A4Eライブラリーが、HT7なしで、pF4Agベクターのバックグラウンドで、作製された。QC27、QC27-9a、およびIVYライブラリーが、C末端HT7有りで、pF4Agベクターのバックグラウンドで作製された。IVベースの変異体が、HT7無しで、pF4Agベクターバックグラウンドで作成された。得られたベクターは、当該技術分野において周知の技術を用いて、KRX大腸菌Ecoliを形質転換するのに使用された。作製されたOgLuc変異体は、変異体において特定されたアミノ酸置換にちなんで、および/または該変異体を含有する大腸菌Ecoliクローンにちなんで命名されており、例えば図6Aは、他の結果の中で、大腸菌Ecoliクローン16C5が置換Q20Rを有することを示している。スクリーニングの詳細得られたライブラリーを大腸菌Ecoliで発現させ、対応する開始OgLuc変異体と比較した場合に、増加した光出力すなわち、増加した発光、増加した輝度、または増加した発光または相対的特異性の変化を有するOgLuc変異体を求めて、自動装置の系を用いて、第一のスクリーニングを行った。自動装置による第一スクリーニングは、以下のように行われた:作製されたライブラリーから得られた個々のコロニーを、96ウェルプレート中の最少培地に播種するのに使用し、37°Cで17~20時間増殖させたM1培養物。M1培養物を、新しい最少培地で1:20に希釈し、37°Cで17~20時間増殖させたM2培養物。M2培養物を1:20に希釈して誘導培地とし、ウォークアウェイwalkaway誘導、すなわち、自動誘導させつつ25°Cで17~20時間増殖させたSchagatetalKRXAutoinductionProtocolAConvenientMethodforProteinExpressionPromegaNotes981618。新規セレンテラジンのPBI-3841、PBI-3842、PBI-3857、PBI-3880、PBI-3881、PBI-3886、PBI-3887、PBI-3897、PBI-3896、またはPBI-3894が第一スクリーニングで基質として使用された場合、誘導培地はラムノースおよびグルコースを含有していた。天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-h、または新規セレンテラジンPBI-3840、PBI-3889、PBI-3899、もしくはPBI-3900が第一スクリーニングで基質として使用された場合、誘導培地はラムノースもグルコースも含有していなかった。異なる誘導培地の使用は、C1A4Eと新規セレンテラジンとの間で生じた発光に基づいて決定された。すなわち、ラムノースおよびグルコースを含有する誘導培地が、C1A4Eを用いるその他の新規セレンテラジンと比較して、C1A4Eを用いる、より少ない発光を生じた新規セレンテラジンと共に使用された。10μLの誘導細胞を、300mMHEPESpH8.0、300mMチオ尿素、0.3×PassiveLysisBufferPLB;プロメガ社カタログ番号E194A、0.3mg/mLリゾチーム、および0.003U/μLRQ1デオキシリボヌクレアーゼを含有する60μLの溶解緩衝液を用いて溶解し、150mMKCl、1mMCDTA、10mMDTT、0.5TERGITOL登録商標NP-9v/v、および20μMの天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン、または新規セレンテラジンを基質として含有する50μLのアッセイ緩衝液を用いて、発光を測定した。各変異体についての発光測定は試薬添加の3分後に行い、相対発光量RLUの値を、各プレートに対応する開始OgLuc変異体の8個の対照ウェルの平均に対して正規化した。アッセイを、TECAN登録商標自動装置系上で完了した。目的のOgLuc変異体を、それぞれそのような変異体におけるいかなる追加のアミノ酸置換をも特定するために、当該技術分野において周知の標準的な配列決定技術を用いて配列決定した。目的の変異体クローンに非自動装置手動系を用いる第二のスクリーニングを行った。手動のスクリーニングを以下のように行った:変異体クローンを96ウェルプレート中で3連で増殖させ、発現され、アッセイ緩衝液がマルチチャンネルピペットを用いての手動で加えられる以外は自動化されたアッセイについて記載されたようにアッセイされた。各変異体について、発光を測定し、平均をとり、対応する開始OgLuc変異体に対し正規化した。TECAN登録商標INFINITE登録商標F500ルミノメーターを用いて発光測定を行った。相対的特異性における変化の決定試験セレンテラジン基質存在下でのルシフェラーゼの発光を、参照セレンテラジン基質存在下でのルシフェラーゼの発光で除算することにより、相対的基質特異性を決定した。例えば、本発明の新規セレンテラジンを用いるルシフェラーゼの発光を、異なるセレンテラジン例えば、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジン、または本発明の異なる新規セレンテラジンを用いるルシフェラーゼの発光で除算することによって、相対的特異性を決定した。比較された試験セレンテラジン基質および参照セレンテラジン基質は、相対的基質特異性を決定するための比較基質対であると見なされた。比較基質対を用いる試験ルシフェラーゼの相対的基質特異性を、同じ比較基質対を用いる参照ルシフェラーゼの相対的基質特異性で除算することによって、相対的基質特異性における変化を決定した。例えば、異なるセレンテラジン例えば、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンまたは本発明の異なる新規セレンテラジンと比較した場合の、本発明の新規セレンテラジンを用いる試験ルシフェラーゼの相対的基質特異性を、試験ルシフェラーゼに対し用いられた同一の異なるセレンテラジンと比較した場合の、同一の本発明の新規セレンテラジンを用いる参照ルシフェラーゼの相対的基質特異性で除算することによって、相対的特異性における変化を決定した。ある新規セレンテラジンを用いる発光を、異なる新規セレンテラジンを用いる発光と比較した。ある天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光を、別の天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光と比較した。ある天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光を、新規セレンテラジンを用いる発光と比較した。新規セレンテラジンに対する対応する開始OgLuc鋳型と比較した場合の、OgLuc変異体の発光RLUにおける増加、並びに参照セレンテラジンに対する発光における低減または変化なしは、相対的特異性における変化の指標であった。対応する開始OgLucと比較した場合の、新規セレンテラジンおよび参照セレンテラジンの両方に対するOgLuc変異体の発光における低減であるが、新規セレンテラジンを用いるOgLuc変異体の発光がより減少することも、相対的特異性における変化の指標とされた。新規セレンテラジンおよび参照セレンテラジンに対しての、対応する開始OgLucと比較した場合のOgLuc変異体の発光における増加は、活性/安定性/発現における向上を示した。新規セレンテラジンおよび参照セレンテラジンの両方を用いるOgLuc変異体の発光が増加するが、新規セレンテラジンを用いる発光の増加がより大きい場合、それにより、相対的特異性における増加およびOgLuc変異体の活性/安定性/発現における向上が示されたことになる。A.C1A4E変異体米国特許仮出願番号第12/773,002号米国特許出願公開第2010/0281552号に以前に記載された、C1A4E配列番号2および3を、追加の合成OgLuc変異体を生成するために、第一の開始配列すなわち、親配列として使用した。C1A4Eは、配列番号1に対し、以下:A4E、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138I、およびN166Rのアミノ酸置換を有する。実施例1~14に記載される新規セレンテラジン例えば図4参照を基質として用いる、細菌溶解物を含有するC1A4Eの発光を、前に記載された通りに測定し、天然セレンテラジンおよび既知のセレンテラジンを基質として使用する発光と比較した図5A~G。図5Aは、天然セレンテラジンセレンテラジン、既知のPBI-3880、並びに新規セレンテラジンのPBI-3842、PBI-3857、PBI-3881、PBI-3882、PBI-3886、およびPBI-3887を基質として用いる、C1A4Eの発光を示している。既知のセレンテラジンおよび新規セレンテラジンを用いる発光測定は、天然セレンテラジンを用いるC1A4Eの発光に対し正規化され、低減倍率が、天然セレンテラジンと比較された図5B。図5C~Eは、天然セレンテラジン並びに新規セレンテラジンPBI-3945、PBI-3894、およびPBI-4002をそれぞれ用いての、C1A4Eの発光を示している。図5Fは、天然セレンテラジンおよび新規セレンテラジンPBI-3840、PBI-3897、PBI-3889、PBI-3899、およびPBI-3900を用いるC1A4Eの発光を示している。図5Gは、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジンPBI-3912並びに新規セレンテラジンPBI-3913、PBI-3925、PBI-3939、PBI-3933、PBI-3932、PBI-3946、PBI-3841、およびPBI-3896を用いるC1A4Eの発光を示している。データは、C1A4E変異体がそれぞれの新規セレンテラジンを基質として使用可能であることを示している。特に明記しない限り、C1A4Eにおいて特定されたアミノ酸置換を少なくとも有するC1A4E変異体が生成された。前に記載された通りの無作為変異誘発によって、C1A4Eの4400種の変異体クローンから成るライブラリーライブラリー1を作製し、相対的特異性変化および/または活性変化、例えば、輝度における向上を求めて、前述の通りにスクリーニングした。変異体を、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-h、既知のPBI-3880、および新規セレンテラジンPBI-3840、PBI-3841、PBI-3842、PBI-3857、PBI-3881、PBI-3886、PBI-3887、PBI-3889、PBI-3897、およびPBI-3900を基質として用いて、一次スクリーニングした。さらに、前記変異体の半分を、新規セレンテラジンのPBI-3896およびPBI-3894を基質として用いてスクリーニングした。先の新規化合物のスクリーニングから特定された、目的の既知の変異を有する変異体を含有するプレートを選択した。一次スクリーニングにおいて試験された新規セレンテラジンのうちの一つまたは複数について、向上を示した変異体相対的特異性における変化または活性における変化を単離し、配列決定し、二次スクリーニングにおいてスクリーニングした。手動の二次スクリーニングにおいて、変異体を、既知のセレンテラジンPBI-3912、セレンテラジン-h、セレンテラジン-hh、2-メチルセレンテラジン、およびセレンテラジンv;並びに新規セレンテラジンのPBI-3840、PBI-3897、PBI-3889、PBI-3899、PBI-3900、PBI-3925、PBI-3944、PBI-3932、PBI-3945、PBI-3913、およびPBI-3896を基質として用いて試験した。図6A~Dは、変異体クローンについて、C1A4Eに対し正規化された平均発光をまとめたものである。図6A~Dは、これらの変異体AA配列における置換をまとめたものであり、変異体は、以下:A14V、G15R、Q18L、Q20R、L22I、E23K、L27V、L27M、K33N、T39I、E49K、F54S、F54I、D55G、I56V、V58I、V58L、I59T、S66T、G67S、F68S、L72Q、M75K、I76N、F77T、F77C、K89E、I90V、I90T、L92H、H93R、M106K、Y109F、P113T、I117F、T126R、V127A、L136M、D139G、P145L、S148T、C164S、またはA169Vの追加のアミノ酸置換のうち少なくとも1つを有していた。54位、92位、および109位でのアミノ酸置換は重要であった。なぜならこれらの位置での置換はより大きな光出力または向上された相対的特異性、すなわち、図6A~Cに示すように、天然セレンテラジンから離れて、少なくとも1つの新規セレンテラジンに向かう特異性を提供したからである。クローン29H7におけるアミノ酸置換F54Iは、天然セレンテラジン、および新規セレンテラジンのうちのいくつかを用いて、より大きな光出力を提供した。クローン40H11におけるアミノ酸置換Q18L、クローン04A12におけるアミノ酸置換L92H、およびクローン43F9におけるアミノ酸置換Y109Fは、向上された相対的特異性を提供した。表5は、前に記載した通りに生成された、77位、92位、または109位に追加のアミノ酸置換を有するC1A4E変異体を列挙しているAA変化。これらの変異体を、光出力の増加について前に記載した通りに分析した。すなわち、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、および新規セレンテラジンPBI-3939、PBI-3894、PBI-3896、PBI-3897、PBI-3932、またはPBI-3925を基質として使用して、C1A4Eよりも少なくとも1.3倍明るい変異体を求めてスクリーニングした。以下:L92G、L92Q、L92S、L92A、L92M、L92H、L92Y、F77W、F77Y、F77S、F77T、F77V,、F77A、F77G、F77C、F77D、F77M、およびY109Fの追加の置換は、C1A4Eよりも少なくとも1.3倍明るい変異体をもたらした。表5に示されるように、L92H、F77WおよびF77A置換は、PBI-3897、PBI-3896、およびPBI-3932による、最も劇的な向上があった。表5:77位、92位および109位の部位飽和追加のC1A4E変異体A群は、前に記載した通りの部位特異的変異誘発によって作製されたことで、配列番号1に対し、以下:18、20、54、59、72、77、89、92、109、113、127、136、または164のアミノ酸位置の少なくとも1つにおいて追加の置換を有する。これらのアミノ酸位置が選択されたのは、ライブラリー1の一次および二次スクリーニングに基づき、これらの位置での置換は、C1A4Eと比較した場合に、以下のうち少なくとも1つを基質として用いる総光出力を増加させたためである:新規セレンテラジンのPBI-3841、PBI-3896、PBI-3897、PBI-3894、PBI-3925、もしくはPBI-3932、または既知のセレンテラジンである2-メチルセレンテラジンもしくはPBI-3912。図7は、変異体クローンおよび各変異体に含まれる追加のアミノ酸置換を列挙している。変異体クローンは、前述の通り、手動の二次スクリーニングについての記載の通りに3連で分析し、C1A4Eに対し正規化した。図8A~Bおよび図9は、種々のセレンテラジンを基質として用いた場合の、図7に列挙される変異体の正規化された平均発光を示している。図8A~Bおよび図9は、C1A4Eと比較して、列挙された新規化合物に対する発光が大きく増加した、または、C1A4Eと比較して、既知のセレンテラジンに対する発光における変化が無いもしくは減少した変異体を示している。追加のアミノ酸置換Q18L、F54I、L92H、およびY109Fを有するクローンQC27は、C1A4Eと比較して、PBI-3896による発光において561.32倍の増加、PBI-3894では392.98倍の増加、およびPBI-3896では283.85倍の増加を有した。このデータは、Q18L、L92H、およびY109Fが互いに組み合わせ可能であり、追加の置換により、向上した相対的特異性を有する変異体がもたらされることことを示している。ライブラリー1から特定された重要な他の置換は、追加の変異体B群を作製するために組み合わされた図10。配列番号1に対し、追加のアミノ酸置換を、以下のアミノ酸位置の少なくとも1つに行った:18、20、54、71、77、90、92、109、または127。これらの置換は、以下の新規セレンテラジンのうち少なくとも1つを基質として用いることにより、向上を示した:PBI-3841、PBI-3896、PBI-3897、PBI-3894、PBI-3925、またはPBI-3932。これらの変異体を、A群の変異体について記載したように、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3939、PBI-3945、PBI-3840、PBI-3932、PBI-3925、PBI-3894、およびPBI-3896を用いて分析した。変異体クローンは、前に記載した通り、手動の二次スクリーニングについての記載の通りに3連で分析し、C1A4Eに対し正規化した。図11は、種々のセレンテラジンを基質として用いた場合の、図10に列挙される変異体の正規化された平均発光を示している。図11は、C1A4Eと比較して、列挙された新規セレンテラジンに対する発光が大きく増加した、または、C1A4Eと比較して、天然セレンテラジンおよび既知のセレンテラジンに対する発光における変化が無いもしくは減少した変異体を示している。追加のアミノ酸置換I90Vおよび/またはY109FC群を有する追加の変異体を生成し、A群またはB群より生成された変異体と比較した図12参照。I90V置換I90V、Y109F置換Y109F、または両方の置換LE2を有する変異体を含むクローンを、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3939、PBI-3945、PBI-3889、PBI-3840、PBI-3925、PBI-3932、PBI-3894、PBI-3896、およびPBI-3897を基質として用いるA群の組換え体について記載されたようなアッセイを使用して、クローンQC27、QC2E7、QC2F4、およびQC1A11と比較した図12。変異体クローンは、前に記載した通り、手動の二次スクリーニングについての記載の通りに3連で分析し、C1A4Eに対し正規化した図12。図12は、C1A4Eと比較して、列挙された新規セレンテラジンに対する発光が大きく増加し、C1A4Eと比較して、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンに対する発光における変化が無いもしくは減少した変異体を示している。図12は、天然セレンテラジンおよび新規基質のいくつかに対して、I90Vがより大きな光出力を提供することを示している。B.QC27変異体追加のアミノ酸置換Q18L、F54I、L92H、およびY109Fを有している、Aから得られた変異体QC27配列番号4および5を、前に記載した通りpF4A改変ベクターにクローニングし、C末端HT7プロメガ社融合タンパク質QC27-HT7配列番号44および45を生成した。QC27-HT7の4400種の変異体ライブラリー2を前に記載した通りの無作為変異誘発によって作製し、天然セレンテラジン並びに新規セレンテラジンのPBI-3896およびPBI-3897を基質として用い、相対的特異性における変化の増加を求めて、前に記載した通りに一次スクリーニングした。変異体クローンを選択し、配列決定し、前に記載した通り天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3897、PBI-3896、およびPBI-3894を基質として用いて手動の二次スクリーニングで分析した。図13は、これらの変異体試料において特定された追加のアミノ酸置換配列、並びに二次スクリーニングにおいて天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3897、PBI-3896、およびPBI-3894を基質として使用する、対応する開始QC27-HT7に対し正規化された該変異体の発光を列挙している。図14における変異体は、以下:F1I、R11Q、L18I、L18Q、V21L、V21M、L22F、F31I、Q32H、V45E、L46Q、S47P、G48R、E49D、G51E、D55E、G67S、F68Y、F68L、Q69H、L72Q、E74K、E74I、M75K、I76F、I76V、H86R、I90T、H92Q、H92R、T96A、V98F、I99V、I99T、V102M、M106I、F109Y、L142V、V158I、T159S、L168F、またはG170Rの追加のアミノ酸置換のうち少なくとも1つを有していたG170Rは、HT7とOgLuc変異体の間のリンカー領域に位置していた。変異体24B12におけるアミノ酸置換F68Y、変異体29C4におけるL72Q、および変異体3H11におけるM75Kは、それぞれ、天然セレンテラジンおよび新規基質のいくつかに対して、より大きな光出力を提供した。変異体25A11におけるアミノ酸置換V21Lおよび変異体1B6におけるH92Rは、相対的特異性の向上を提供した。これら置換の両方の場合において、発光シグナルは、新規セレンテラジンを基質として使用することにより低減したが、天然セレンテラジンおよび既知のセレンテラジンを基質として使用することでより低減した。前に記載した通りの部位特異的変異誘発を用いて、特定のアミノ酸置換図14を有するように、追加のQC27-HT7変異体を生成した。追加の置換は、配列番号1に対し以下:21、68、72、75、76、90、92、および158のアミノ酸位置の少なくとも1つにおいてなされたが、これは、これらの位置が図14に示されるように相対的特異性変化における向上を示したためである。図15は、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、および新規セレンテラジンのPBI-3897、PBI-3841、PBI-3896、およびPBI-3894を基質として使用した場合の、対応する開始QC27-HT7に対して正規化されたQC27-HT7変異体の発光を示している。図15に示されるように、3つのアミノ酸置換F68Y、L72Q、およびM75KをV158Iと組み合わせることにより、例えば変異体QC271でのように、各試験セレンテラジンに対し、より大きな光出力が提供された。C.QC27-9a変異体Bから得られた、追加のアミノ酸置換V21L、H29R、F68Y、L72Q、M75K、およびV158Iを有するQC27-HT7融合タンパク質である変異体QC27-9a配列番号6および7を、ライブラリーを作製するための開始配列として使用した。前に記載した通りの無作為変異誘発によってQC27-9aの4400種の変異体ライブラリー3を作製し、天然セレンテラジン並びに新規セレンテラジンのPBI-3841およびPBI-3897を使用して、増加した相対的特異性変化を求めてスクリーニングした。変異体クローンを選択し、配列決定し、前に記載した通りの手動の二次スクリーニングで、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、既知のセレンテラジン-h、並びに新規セレンテラジンのPBI-3841およびPBI-3897を基質として使用して、分析した。図16は、変異体試料において特定された追加の置換AA変化、並びに二次スクリーニングにおいて天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、既知のセレンテラジン-h、並びに新規セレンテラジンのPBI-3841およびPBI-3897を基質として使用する、対応する開始QC27-9aに対して正規化された該変異体の平均発光を列挙している。相対的特異性における増加は、開始テンプレートと比較した場合に、新規セレンテラジン、天然セレンテラジン、および既知のセレンテラジンを用いる変異体の発光に低減があったが、天然セレンテラジンおよび既知のセレンテラジンを用いる発光がより減少した場合を表している。例えば、アミノ酸置換L22Fを有する変異体30D12では、新規セレンテラジンのPBI-3841およびPBI-3897を用いる活性においておよそ3倍の喪失があった。しかし、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-h、および既知のセレンテラジン-hhを用いる変異体30D12の発光は、10倍以上低減した。図17は、ヒト化ウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼ本明細書ではhRLと称される配列番号30および31と比較した場合の、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3841およびPBI-3897を基質として使用する、C1A4E、QC27-HT7およびQC27-9aの発光の比較を示している。PBI-3897を用いてのQC27-9aの反応は、PBI-3841を用いるQC27-9aよりもより明るかったが図17参照、進化の傾向、すなわち、発光における向上の大きさは、PBI-3841表6に対して最も大きかった。発光における向上440倍と、天然セレンテラジンに対する発光における低減800倍を組み合わせることより、天然セレンテラジンと比較した場合の、PBI-3841を使用するQC27-9aの相対的特異性における変化350,000倍が示された。表6:天然セレンテラジンおよびセレンテラジン-hhと比較した場合の、PBI-3897およびPBI-3841に対するOgLuc変異体の相対的特異性における変化D.IVY変異体追加のアミノ酸置換F54I、I90V、およびF77Yを有するC1A4E変異体であるIVY配列番号8および9を、前に記載した通りにpF4A改変ベクターにクローニングし、C末端HT7融合タンパク質IVY-HT7を生成した。IVY-HT7の4400種の変異体ライブラリー4を無作為変異誘発により作製し、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3840、PBI-3889、PBI-3925、PBI-3932、およびPBI-3945を基質として使用しての、増加された光出力すなわち、増加された輝度および増加された相対的特異性を求めてスクリーニングした。変異体クローンを選択し、配列決定し、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3889、PBI-3939、PBI-3945、およびPBI-4002を基質として使用する、前に記載した通りの二次スクリーニングにおいて3連で分析した。図18および図19は、変異体試料において特定された追加の置換AA変化、並びに、二次スクリーニングにおいて、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3889、PBI-3939、PBI-3945、およびPBI-4002を基質として使用する、IVY-HT7に対して正規化された変異体の平均発光を列挙している。図18は、以下:Q18H、D19N、Q20P、Q32P、K33N、V38I、V38F、K43N、I44F、E49G、I60V、Q69H、I76N、Y77N、Y94F、G95S、G95D、F110I、V119M、K124M、L149I、またはR152Sのアミノ酸置換のうち少なくとも1つを有するPBI-3945A群を用いての性能に基づいて選択された変異体を列挙している。図19は、以下:F6Y、Q18L、L27V、S28Y、Q32L、K33N、V36E、P40T、Q42H、N50K、G51R、H86L、N135D、またはI155Tのアミノ酸置換のうち少なくとも1つを有するPBI-3889B群を用いての性能に基づいて選択された変異体を列挙している。追加のIVY-HT7変異体を、前に記載した通りの部位特異的変異誘発を用いて、追加の特定のアミノ酸置換を有するように生成した。図20は、配列番号1に対し、以下:19、20、27、32、38、43、49、58、77、95、110、および149の追加のアミノ酸位置のうち少なくとも1つを有する変異体を列挙しているが、それは、これらの置換が、PBI-3945およびPBI-4002に対する特異性を示した図18の変異体において特定されたためである。図21は、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-h、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3939、PBI-3945、PBI-4002、PBI-3932およびPBI-3840を基質として使用する、IVY-HT7に対して正規化された、図20に列挙される変異体の発光を示している。いずれの変異体も、IVY-HT7を超える向上を示さなかったが、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いての発光が約3~4対数減少したが、PBI-3945およびPBI-4002を用いての発光が2倍しか減少しなかった場合が、変異体C5.19配列番号12および13等であった。変異体C5.19は、追加のアミノ酸置換L27V、V38I、およびL149Iを有する。図22は、配列番号1に対し、以下:6、18、27、28、33、34、36、40、50、51、135、および155の追加のアミノ酸位置のうち少なくとも1つを有する変異体を列挙しているが、それは、これらの置換が、PBI-3889およびPBI-3939に対する特異性を示した図19の変異体において特定されたためである。図23は、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-h、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3939、PBI-3945、PBI-3889、PBI-4002、PBI-3932、およびPBI-3840を基質として使用した場合の、IVY-HT7に対して正規化された、図21に列挙される変異体の発光を示している。IVY-HT7と比較した場合、それぞれの変異体に対して、発光が低減した。変異体C1.3配列番号10および11は、PBI-3939を用いた場合に、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いた場合より約2000倍多い発光を有した。変異体C1.3は、追加のアミノ酸置換F6Y、K33N、N135D、およびI155Tを有する。hRLおよびIVY-HT7と比較した場合の相対的特異性変化に関して最良のIVY-HT7変異体は、PBI-3945を用いた場合に最良の発光を有したC5.19、およびPBI-3889を用いた場合に最良の発光を有したC1.3であった。図24は、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-h、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3939およびPBI-3945を使用する、hRL、IVY-HT7、C5.19C末端でのHT7融合、およびC1.3C末端でのHT7融合の発光を示している。E.IV変異体追加のアミノ酸置換F54IおよびI90Vを有するC1A4E変異体であるIV配列番号14および15を、前に記載した通りに生成した。転写レポーターとして使用するための最も明るい変異体を決定するために、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3939、PBI-3945、PBI-3889、およびPBI-4002を基質として使用する、C1A4E配列番号2および3、IVY配列番号8および9、およびIV配列番号14および15に対して提供される発光を前に記載した通りに測定した。hRLを対照として使用した。図25に示されるように、IVは、C1A4EおよびIVYの両方よりも明るかった。IVにおけるアミノ酸置換F54Iは、天然セレンテラジンおよびいくつかの新規基質に対し、より大きな光出力を提供した。これら全ての変異体は、試験セレンテラジンを用いるhRLよりも明るかった。A、BおよびDすなわち、開始配列としてのC1A4E、IVY、およびQC27から作製されたライブラリーのスクリーニングから得られたデータを再検討して、種々のセレンテラジンを用いる、増加した光出力すなわち、増加した輝度を有するような追加のアミノ酸置換を決定した。IV変異体を、天然セレンテラジンに対する特異性を2~10倍だけ低減させた追加の置換を有するように、前に記載した通りに生成した。図26に列挙されるように、IV変異体クローンは、以下:F1I、E4K、Q18L、L27V、K33N、V38I、F68Y、M70V、L72Q、M75K、またはV102Eのアミノ酸置換のうち少なくとも1つの追加のアミノ酸置換配列を有していた。アミノ酸置換の全ての組み合わせについて、変異体クローンの16枚のプレートを、前に記載した自動装置を用いる方法を使用して、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-h、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3889およびPBI-3945を基質として用いて、一次スクリーニングおよび分析をした。向上した発光を有する変異体を選択し、配列決定し、前に記載した通りの手動スクリーニングを用いて3連で分析した。天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-h、既知のセレンテラジン-hh、並びに新規セレンテラジンのPBI-3889、PBI-3939、PBI-3945、およびPBI-4002を基質として用いて、発光を測定した。対応する開始配列IVおよびhRLを、対照として使用した。図26は、変異体、および該変異体において特定された追加のアミノ酸置換を列挙している。図27は、IVに対して正規化された、二次スクリーニングにおける変異体の平均発光を示している。追加のアミノ酸置換F1I、L27V、およびV38Iを有する変異体8A3配列番号26および27は、新規セレンテラジンを用いた場合に向上した相対的特異性を有しが、IVよりも明るくはなかった。追加のアミノ酸置換L27Vを有する変異体8F2配列番号46および47は、使用された4種の新規セレンテラジンのうち3種を用いた場合に、向上した相対的特異性および輝度を提供した。追加のアミノ酸置換Q18L、F68Y、L72Q、およびM75Kを有する変異体9B8配列番号18および19は、全ての基質に対してより明るく、天然セレンテラジンを超える、いくつかの相対的特異性における利点も提供した。追加のアミノ酸置換Q18L、L27V、V38I、F68Y、L72Q、およびM75Kを有する変異体9F6配列番号20および21は、8F2に見られたものと同様の向上を示した。追加のアミノ酸置換E4K、K33N、F68Y、L72Q、およびM75Kを有する変異体15C1配列番号16および17は、全ての新規セレンテラジンに対してより明るかったが、相対的特異性における利点にはいかなる向上もなかった。変異体1D6におけるアミノ酸置換Q18Lは、向上した相対的特異性、すなわち、IVに関連して、天然セレンテラジンから離れて、新規基質へと向かう相対的特異性を提供した。通常、アミノ酸置換L27Vは、IVに関連して、向上した相対的特異性を提供した。図28は、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン-hh、既知のセレンテラジン-h、並びに新規セレンテラジンのPBI-3939、PBI-3945、PBI-3889、およびPBI-4002を基質として用いての二次スクリーニングにおける、8A3、9B8、9F6、および15C1変異体の発光を、IVおよびhRLと比較して示している。変異体8A3は、IVと比較して、天然セレンテラジンを用いた場合の輝度において、2対数分の減少を有した。変異体9F6は、IVと比較して、天然セレンテラジンを用いた場合の輝度において、1対数分の低減を有した。PBI-3945を用いた場合の変異体15C1は最も明るかったが、そのシグナル半減期は短かった実施例27参照。F.9B8変異体Eから得られた9B8変異体を、さらに改変して、増加した発光および/またはPBI-3939に対し向上した相対的特異性を有する追加の変異体を生成した。アミノ酸置換L72Qは、増加した発光すなわち輝度のために有益なアミノ酸置換であるように見えたが、それは、その全てが向上した発光を示した変異体9B8、9F6、および15C1において、この置換が特定されたためである。72位での他のアミノ酸置換が、輝度における同様の増加を提供するか否かを決定するために、前に記載した通り、72位を代替的な残基で飽和させることによって、9B8の追加の変異体を生成した。4連で大腸菌Ecoli溶解物を調製し、アッセイ緩衝液が10mMCDTA、150mMKCl、10mMDTT、100mMHEPESpH7.0、35mMチオ尿素、および0.5TERGITOL登録商標NP-9v/vを含有していること以外は前に記載した通りに、PBI-3939を基質として用いて輝度を分析した。表7は、9B8に対して正規化された発光RLU9B8に対して正規化された、すなわち向上倍率によって示されるように、9B8と比較した場合に同様の、または向上した発光を有する9B8変異体変異体を列挙している。72位でのA、G、N、R、およびMのアミノ酸置換は、少なくともアミノ酸Qと同じすなわち1倍輝度という利点を提供した。表7:変異体9B8と比較した場合に同様の発光を有する変異体新規PBI-3939に対して向上した相対的特異性を有する追加の変異体を、変異体9B8におけるアミノ酸位置18、68、72、75、および90を飽和させることによって、前に記載した通りに生成した。大腸菌Ecoli溶解物を調製し、天然セレンテラジンおよび新規PBI-3939を基質として用いて、前に記載した通りに輝度を分析した。対応する9B8の発光の割合に対して正規化された、天然セレンテラジンを用いる変異体の発光に対する、PBI-3939を用いる変異体の発光の割合から、相対的特異性を決定した。表8は、PBI-3939に対する相対的特異性において少なくとも1.1倍の増加を有する9B8変異体変異体を列挙している。結果は、各部位での少なくとも1つの追加の変化が、天然セレンテラジンと対照して、PBI-3939に対する向上した相対的特異性を提供したことを示している。アミノ酸置換K、D、F、G、Y、W、およびHを18位に有する9B8変異体は、相対的特異性において最も高い倍率の向上を有した。表8:PBI-3939に対する向上した相対的特異性を有する変異体G.9B8K33N変異体輝度、相対的特異性、および熱安定性に対するアミノ酸置換K33Nの利点を調べるために、追加の変異体である9B8optK33N配列番号42および43を生成した。9B8optK33Nを試験し、種々の適用の中で9B8opt実施例25Aに記載と比較した。変異体9B8optまたは9B8optK33Nを含む大腸菌Ecoli溶解物を作製し、アッセイ緩衝液が0.1TERGITOL登録商標NP-9v/vを含有する以外は前に記載した通りに分析した。新規PBI-3939および天然セレンテラジンを基質として用いて、溶解物から発せられた発光を測定した。PBI-3939および天然セレンテラジンに対する変異体の相対的特異性を、前に記載した通りに算出した。9B8optK33NK33Nは、9B8optと比較した場合、より大きな光出力RLU、および天然セレンテラジンに対してよりもPBI-3939に対してより大きな相対的特異性を有した図29。このことは、K33N置換がより大きな光出力および向上した相対的特異性を提供したことを示している。9B8optK33Nを開始テンプレートとして用いて、新しいOgLucライブラリーを作製した。DIVERSIFY登録商標PCR無作為変異誘発キットクロンテック社;カタログ番号630703を用いて、無作為なライブラリーを作製した。条件5ユーザマニュアル中に列挙されるを使用して追加の変異体を生成し、83個の無作為に選択したクローンから得た配列データを集計することによって平均突然変異率を算出した結果、遺伝子あたり2.6個の変異であった。このPCRライブラリーを、前に記載したpF4Agベースの非融合型ベクターバックグラウンドnonfusionvectorbackground、およびサンドイッチ型バックグラウンドsandwichbackground、すなわち、Id-OgLuc-HT7実施例45に記載にクローニングした。pF4Agベースの非融合型ベクターバックグラウンドにおける変異体を、NFを用いて設計した。サンドイッチ型ベクターバックグラウンドにおける変異体を、Fを用いて設計した。両方のベクターにPCR産物をクローニングするために、アミノ酸、すなわちグリシンを、pF4Agにおける変異体配列に付加し、OgLuc変異体170Gに新しい170位を生成した。170Gはサンドイッチ型コンストラクトに存在するが、この場合、OgLucとHT7の間のリンカーの部分であるとみなされる。各ライブラリーについて、4,400種の大腸菌Ecoliクローンを、以下の例外を除き前に記載した通りに、分析した。溶解緩衝液は、HEPESの代わりの300mMMESpH6.0、および0.5TERGITOL登録商標NP-9v/vを含有したが、チオ尿素は含有しなかった。アッセイ緩衝液は、HEPESの代わりの100mMMESpH6.0、および35mMチオ尿素を含有した。アッセイにおける体積assayvolumeは以下の通りであった:10μLの細胞、40μLの溶解緩衝液、および50μLのアッセイ緩衝液。pF4Agベースの非融合型バックグラウンドにおけるPCRライブラリーを、9B8optK33N170G配列番号68および69と比較した場合に増加した発光を有する追加の変異体を求めてスクリーニングした。その後、選択された変異体を、HEK293細胞およびNIH3T3細胞において分析した。各細胞型について、15,000個の細胞を播種し、37°Cで一晩増殖させた。その次の日に、実施例25に記載される通りに、細胞に、形質移入の対照としての10ngのpGL4.13プロメガ社、および100ngのOgLuc試験DNAを形質移入した。培地を除去し、溶解緩衝液がHEPESの代わりに100mMMESpH6.0を含有する以外は実施例25に記載される通りに、100μLの溶解緩衝液で細胞を溶解させ、GLOMAX登録商標ルミノメーターを用いて発光を測定した。各試料について、20μMPBI-3939を含有する50μLの溶解緩衝液を用いて、10μLの溶解物を分析した。形質移入対照については、50μLのBRIGHT-GLO商標アッセイ試薬を用いて、10μLの溶解物を分析した。表9は、大腸菌Ecoli、HEK293細胞、およびNIH3T3細胞における変異体の発光においての増加倍率、並びにこれらの変異体に存在するアミノ酸置換を示している。変異体27A5NF配列番号70および71、23D4NF配列番号72および73および24C2NF配列番号74および75は、大腸菌EcoliおよびHEK293細胞における発光において、少なくとも1.3倍の増加があった。表9:大腸菌Ecoli、HEK293細胞およびNIH3T3細胞における、9B8optK33N170Gと比較した場合のOgLuc変異体により発せられる発光の増加上記のデータに基づいて、さらなる組み合わせ変異体combinationvariantを、170Gを持たないpF4Agベースの非融合型ベクターバックグラウンドの背景において、設計し、作製した表10参照。変異体を、上記の通りに、大腸菌Ecoli、HEK293細胞およびNIH3T3細胞において分析し、9B8optK33Nと比較した。天然セレンテラジンを用いた場合の発光についても、変異体を試験した。表10は、大腸菌Ecoli、HEK293細胞、およびNIH3T3細胞における変異体の発光においての増加倍率、並びにこれらの変異体試料に存在するアミノ酸置換を示している。接頭辞9B8optK33Nに、変異体における追加のアミノ酸置換を加えることにより、変異体を命名した。表11は、大腸菌Ecoli、NIH3T3細胞、およびHEK293細胞においての、天然セレンテラジンと比較した場合のPBI-3939に対する異なる変異体の相対的特異性を示している。表10に示されるように、変異体9B8optK33NT39TK43RY68DV2;配列番号92および93は、大腸菌Ecoliにおける向上した発光、およびNIH3T3細胞における発光においてのわずかな向上を有した。変異体9B8optK33NL27VK43RY68DL27V、K43R、Y68Dは、試験された3種の細胞型において、発光における中間の向上表10、および9B8optK33N表11を超える、相対的特異性における5倍の増加を有した。表10:大腸菌Ecoli、NIH3T3細胞およびHEK293細胞における、9B8optK33Nと比較した場合のOgLuc組み合わせ変異体により発せられる発光における増加表11:大腸菌Ecoli、NIH3T3細胞およびHEK293細胞における、天然セレンテラジンと比較した場合の、PBI-3939に対するOgLuc組み合わせ変異体の相対的特異性における変化追加のOgLuc変異体を、配列番号1に対し以下:L27V、T39T、K43R、Y68D、またはS66Nの追加のアミノ酸置換のうち少なくとも1つを含有するように、9B8optK33Nから作製した変異体におけるアミノ酸置換に関する表12の試料を参照。接頭辞9B8optK33Nの後ろに変異体における追加のアミノ酸置換を加えることにより、変異体を命名した。上記から得られた、これらの追加の変異体並びに変異体9B8optK33NL27VY68DL27V、Y68D、9B8optK33NL27VK43RY68DL27V、K43R、Y68D、9B8optK33NL27VK43RS66NL27V、K43R、S66N、および9B8optK33NT39TK43RY68DT39T、K43R、Y68D;V2としても知られているを、輝度、相対的特異性、シグナル安定性および熱安定性について試験した。変異体を、変異体9B8opt9B8および9B8optK33NK33Nに対して、比較した。変異体を含有する大腸菌Ecoli溶解物を作製し、前に記載した通りに分析した。新規PBI-3939および天然セレンテラジンを基質として用いて溶解物から生じた発光を測定した。9B8optにより発せられた発光に対して変異体の発光を正規化した表12。PBI-3939および天然セレンテラジンに対する変異体の相対的特異性を、PBI-3939を基質として用いた場合の変異体の発光を、天然セレンテラジンを基質として用いた場合の変異体の発光で除算することにより算出した表12。このデータは、アミノ酸置換L27Vが天然セレンテラジンに対する特異性を低減させることを示している。表12:細菌溶解物における、9B8と比較した場合のOgLuc変異体により発せられる発光の増加、および天然セレンテラジンと比較した場合のPBI-3939に対するOgLuc変異体の特異性における変化H.V2変異体V2追加のアミノ酸置換K33NT39TK43RY68Dを有する9B8optをテンプレートとして用いて、一連の追加の変異体を設計した。表13に示される置換を、128の脂肪酸結合タンパク質1VYF、1FDQ、2A0A、1O8V、1BWY、2ANS、1VIV、1PMP、1FTP、2HNX、1JJJ、1CBR、2CBS、1LPJ、1KQW、2RCQ、1EII、1CRB、1IFC、2PYI、2JU3、1MVG、2QO4、1P6P、2FT9、1MDC、1O1U、1EIO;米国特許出願公開第2010/0281552号参照の構造に基づく整列による既知の多様性、または、2基質特異性において役割を果たすことが以前に特定された位置での、代替的な残基の探索のいずれかに基づいて設計した。表13のコンセンサスの下に列挙される変化は、整列された上記脂肪酸結合タンパク質のうち少なくとも50において特定された残基に関する。主な少数派の下に列挙される変化は、上記脂肪酸結合タンパク質の多くで特定されたが、整列された配列のうち50未満にしか存在しなかった残基に関する。他の下に列挙される変化は、整列された配列における所与の位置で、主な少数派の残基より少ない頻度で特定された残基に関する。最後に、特異性の下に列挙される変化は、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体に対する変異体の特異性を決定することに関わると思われる位置に関する。例えば、27位親配列、すなわちV2におけるロイシン残基での設計された特異性変化は、代替的な化学的性質を表す他の疎水性残基またはアミノ酸例えば、環を含有する他の疎水性残基、無電荷の極性側鎖を含有する残基、または荷電側鎖含有する残基に変化され;40位親配列におけるプロリンでの設計された特異性変化は、異なる化学的性質化学的性質例えば、環を含有する他の疎水性残基、無電荷の極性側鎖を含有する残基、または荷電側鎖含有する残基の試料採取に変化され;注目すべきことに、グリシン、グルタミン、イソロイシン、およびロイシンがこの位置、整列された脂肪酸結合タンパク質で特定されることである。表13標準的な部位特異的変異誘発プロトコル先の実施例を参照を用いて変異体を構築し、得られたプラスミドは、分析のために、大腸菌Ecoliの中に、変換された。培養物を、前に記載した通りに、最少培地中で標準的なウォークアウェイ誘導walkawayinductionによって増殖させた。培養され、形質転換された大腸菌Ecoli細胞10μLに、40μLの溶解緩衝液100mMMESpH6.0、0.3XPLB、0.3mg/mLリゾチーム、0.003U/μLRQ1デオキシリボヌクレアーゼIおよび0.25TERGITOL登録商標NP-9v/vを加え、その後、等量の50μLのアッセイ試薬1mMCDTA、150mMKCl、2mMDTT、20μMPBI-3939または天然セレンテラジン、100mMMESpH6.0、35mMチオ尿素、および0.5TERGITOL登録商標NP-9v/vを追加で加えた。発光を、GLOMAX登録商標96マイクロプレートルミノメータープロメガ社で測定した。表14は、分析中に特定された異なるアミノ酸置換をまとめたものである。PBI-3939および天然セレンテラジンの両方について測定された発光に関して、データは、親クローンV2に対して正規化されたように、提示される。天然セレンテラジンに関して、PBI-3939に対する特異性における相対変化もまた示される。表14I.L27V変異体OgLuc変異体L27Vを開始テンプレート、すなわち開始配列または親配列として用いて、L27V変異体におけるアミノ酸のいくつか表15が配列番号1の天然OgLucルシフェラーゼに存在するアミノ酸に戻った追加の変異体を作製した。変異体を前に記載した通りに、部位特異的変異誘発によって構築した。その後変異体を、天然セレンテラジンまたはPBI-3939のいずれか用いる相対活性について先に記載した通りに、スクリーニングした。基質/アッセイ試薬Hに記載を加えた5分後に、発光をTECAN登録商標INFINITE登録商標F500で測定し、L27V変異体開始テンプレートに対して正規化した。溶解物のSDS-PAGE分析は、比較できる発現レベルを示しているデータ未記載。表15は、天然セレンテラジンまたはPBI-3939を用いた場合の、L27V変異体の相対活性を示している。1未満の相対活性は、L27V変異体におけるその部位の残基と比較した場合に、その復帰変異が有害であることを示している。1を超える相対活性は、L27V変異体におけるその部位の残基と比較した場合に、その復帰変異が活性に対し都合が良いことを示している。これらの変異体に関するいくつかの追加のデータは、以下を示した。166K、54F、54AおよびL27Vを熱安定性について試験した。166K、54F、および54AのT1260°Cは、それぞれ87、74、および33であった。このことは、これらの置換が熱安定性における低減を引き起こすことを示している。これらの同一の4つの変異体のKm値は以下であった。天然セレンテラジンについては、L27Vは16μMであり、54Aは23μMであり、54Fは40μMであり、166Kは21μMであった。PBI-3939については、L27Vは18μMであり、54Aは62μMであり、54Fは163μMであり、166Kは23μMであった。このことは、L27Vに対する、特に54位の置換に対するより高い基質親和性を示している。表15実施例23166位の変異解析A.166位の異なるアミノ酸の、ルシフェラーゼ活性に対する影響を評価するために、166位のアルギニンR残基を、pF4Agベクターの背景においてすなわち、野生型OgLuc配列配列番号1の背景において先に記載した通りの部位特異的変異誘発を用いて、その他の19の各アミノ酸に置換した。その後これらの166位変異体を、前に記載した通りに大腸菌Ecoliにおいて発現させた。溶解物を作製するため、50μLの0.5×FASTBREAK商標細胞溶解試薬プロメガ社を、950μlの誘導された培養物に加え、混合物を22°Cで30分間インキュベートした。解析のために、100μMPBI-3939、30μM天然セレンテラジン、または22μMセレンテラジン-hのいずれかを含有する50μLのアッセイ試薬先に実施例22Hで記載の中で、50μLの溶解物を分析した。発光を前に記載した通りに測定した図30A~C。図30A~Cは、N166変異体の相対活性を示している。ウェスタン分析により、全ての変異体の比較できる発現が確認されたデータ未記載。B.特定の1アミノ酸置換、L27V、A33N、K43R、M75K、T39T、L72QおよびF68Dを、野生型OgLucまたはN166Rバックグラウンドにおいて評価した。1アミノ酸置換を前に記載した通りの部位特異的変異誘発によって生成し、前に記載した通りに大腸菌Ecoliにおいて発現し、22μM天然セレンテラジンを含有するアッセイ試薬実施例22Hに先述を用いて発光を測定した図30D。ウェスタン分析により、全ての変異体の比較できる発現が確認されたデータ未記載。実施例24.欠失変異体以下のような欠失がL27V変異体に対してなされた:表16OgLuc変異体L27VのN末端は、メチオニン、バリンおよびフェニルアラニン、すなわち、MVFである。番号付けの目的のために、フェニルアラニンを最初のアミノ酸と見なした。Val-1は、MVFにおけるバリンが欠失されたことを表す。MVFのメチオニンは、これらの欠失に含まれた。L27欠失変異体を、前に記載した通りに、pF4Agベクターにクローニングし、大腸菌EcoliKRX細胞において発現させた。記載のように、誘導および溶解物調製を行い、溶解物をアッセイ試薬前述;100μMPBI-3939を用いて分析し、発光を前に記載した通りに測定した図31。データは、OgLuc変異体のより小さな断片も発光を生じさせることがきることを示している。実施例25.OgLuc変異体のコドン最適化A.IVおよび9B8IVおよび9B8OgLuc変異体を、コドン最適化のためのテンプレートとして使用した。目的は、当業者には理解されるように、二重にあり、すなわち、1OgLuc変異体の調節または発現を強力に干渉し得る、既知の転写因子結合部位、または他の制御配列、例えば、プロモーターモジュール、スプライス供与/受容部位、スプライスサイレンサー、コザック配列、およびポリAシグナルを除去すること、並びに、2まれにしか使用されないコドンを除去し、大腸菌Ecoli、ヒト、他の哺乳類、または他の真核生物の細胞において最も多く使用されるコドンを好むように、タンパク質配列を変更しないサイレント変異によってDNA配列を変更すること、であるWadaetalNucleicAcidsRes182367。optakaoptAおよびoptBと称される、IVおよび9B8に対する2つの異なる最適化された配列を、各変異体に対して設計した。各変異体に対する最初の最適化された配列、すなわちopt/optAを、各部位に対する2つの最良の、すなわち最も一般的な、ヒトコドン表17参照を特定し、その後、各部位での取り込みのためにその2つのうち1つを無作為に選ぶことによって、設計した。optBバージョンのために、先の、コドン使用頻度最適化型、すなわちopt/optAを開始テンプレートとして用い、各コドンを、このコドン最適化戦略のために特定された前記2つの最良のヒトコドンのうちのもう一方で置き換えた。一例として、IVまたは9B8のいずれかの配列の3位にあるロイシンは、コドンTTGによってコードされる。TTGは、ヒト細胞のロイシンに対する前記2つの最も一般的なコドンのうちの1つではないため、該コドンを、ロイシンに対する代替的な、より一般的なコドン、CTCopt/optAまたはCTGoptBに変更した。これと同じ方法を配列中の全てのロイシンに対して繰り返し、アプローチの無作為性のため、最終的に、CTCコドンはoptBになることができ、CTGはoptAになることができた。最適化への、この2つのコドン使用頻度アプローチのために、配列opt/optAおよびoptBは、最大限にコドンが異なっていた。表17:コドン最適化に使用されたコドンその後、それぞれの4つの配列IVopt、IVoptB;9B8opt、9B8optBを、転写因子結合部位または上記のような他の制御配列の有無について分析しゲノマティクスソフトウェア社GenomatixSoftware、ドイツ、これらの望ましくない配列を、サイレントなヌクレオチド変更によって壊した。ヒトおよび大腸菌Ecoliの両方について、まれではないコドンが他に存在したいくつかの場合では、たとえそれらが選択1でも選択2でもないが、これらのコドンのうちの1つを変更することによって、転写因子結合部位または他の調節要素を除去した表18参照。転写因子結合部位または他の調節要素の除去にまれなコドンの導入が関与した場合には、転写結合部位または他の調節要素は、通常変更されなかった。表18:転写結合部位および他の調節要素を除去するために使用された追加のコドンIVのコドン最適化型IVopt配列番号22およびIVoptB配列番号23および9B89B8opt配列番号24および9B8optB配列番号25を、生成し、当該技術分野において周知の方法により、pF4Agにクローニングした。HEK293細胞を15,000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、37°Cで一晩増殖させた。次の日、TRANSIT登録商標-LT1形質移入試薬ミラスバイオ社MirusBioを用いて、細胞に、pF4Ag中にコドン最適化型をコードする100ngのプラスミドDNAを、6連のウェル中で一過的に形質移入し、37°Cで一晩増殖させた。HEK293細胞に、GL4.13Luc2/SV40PaguioetalpGL4VectorsANewGenerationofLuciferaseReporterVectorsPromegaNotes89710またはpGL4.73hRL/SV40同著のいずれかも形質移入し、形質移入効率における差異に対して正規化した。10ng/形質移入または全導入DNAの10が使用された。培地を除去し、細胞を、10mMCDTA、150mMKCl、10mMDTT、100mMHEPESpH7.0、35mMチオ尿素、および0.5TERGITOL登録商標NP-9v/vを含有する100μLの溶解緩衝液で溶解させて、溶解物試料を作製した。溶解物試料の発光をTECAN登録商標INFINITE登録商標F500ルミノメーターで以下のように測定した:hRLおよびOgLuc変異体について、10μLの溶解物試料を、20μMの基質hRLに対しては天然セレンテラジン、そしてOgLuc変異体に対してはPBI-3939を含有する50μLの溶解緩衝液を用いた場合の発光について分析した。ホタルルシフェラーゼであるLuc2配列番号28および29については、10μLの溶解物試料を、50μLのBRIGHT-GLO商標ルシフェラーゼアッセイ試薬プロメガ社を用いた場合の発光について分析した。図32は、OgLuc変異体のコドン最適化型を含有する溶解物について測定された発光の、hRLおよびLuc2との比較を示している。当該技術分野において周知の方法を用いて、hRLおよびOgLuc変異体はpGL4.13に対して正規化し、Luc2はpGL4.73に対して正規化した。図32に示されるように、Luc2はhRLよりもおよそ14倍より高い発光を有した。OgLuc変異体はLuc2およびhRLと比較してより高い発光を有した。IVのコドン最適化型IVoptおよびIVoptBおよび9B89B8optは、非最適化型と比較して、増加した発光を示した。この最適化の結果、opt/optAバージョンは、ヒトHEK293細胞において、それらの親配列よりもより良好に発現されたが、一方で、optBバージョンは、親配列と比較して、HEK293細胞において同様には発現されなかった。B.L27VL27V変異体配列番号88を最適化して、一般的な脊椎動物応答要素Genomatixデータベースにあるあらゆる転写因子結合部位TFBSの発生頻度を最小化した。L27V変異体の3つの差異について最適化型を作製した:1.L27V01-バージョン1配列番号319個々のTFBSを除いて、プロモーターモジュールおよび他の全ての望ましくない配列要素以下に追加の詳細をヌクレオチド置換によって除去した。2.L27V02-バージョン2L27V01を開始配列、すなわち親配列として使用し、高い厳密性の一致基準を用いて、多くのTFBSを可能な限り除去したより高い厳密性は結合部位へのより良い一致に関与し、従って、より低い厳密性よりもより少ない一致しか発見しない。L27V02に対して作製された、A配列番号322B配列番号318という2つのバージョンがあった。これら2つのバージョンは、望ましくない配列要素を除去するために、各バージョンに対して、異なるコドンを選択することによって作製された。より低い厳密性でTFBSを探索することにより、両方のバージョンを分析した。3.L27V03-バージョン3配列番号325L27V02B配列番号318を開始配列として使用した。より低い厳密性のTFBS一致を、可能であれば除外した。L27V03を、L27V02Aとはコドンが非常に異なるように、作製した。L27V最適化変異体を作製するのに、以下の基準を用いた:1.コドン使用頻度:好ましくは、最良の2つのヒトコドンを各アミノ酸に対して使用しIV変異体に対して行ったように、まれなヒトコドンHS;アミノ酸の10未満をコードの使用は避けた表19。まれな大腸菌EcoliコドンECの使用は、望ましくない配列要素を除去するために、必要な場合に、用いた。表192.可能であれば除去された望ましくない配列要素A.制限酵素RE部位:クローニングに有用ではあるが、その他の点では読み取り枠ORF中に存在するべきではないRE部位を除去した。B.真核生物配列要素:mRNA鎖中の、スプライス供与部位およびスプライス受容部位、スプライスサイレンサー、コザック配列並びにポリA配列を除去した。C.脊椎動物プロモーターモジュールPMGenomatix分類中:脊椎動物を除去した。D.脊椎動物TFBSGenomatix分類中:脊椎動物、一般的なコアプロモーター要素、および種々の他の配列を可能であれば除去した。これは、L27V最適化型2および3にだけ適用され、バージョン1には適用されなかった。E.大腸菌Ecoli配列要素:大腸菌Ecoliプロモーターを除去した。F.mRNA二次構造:5’末端付近の強固な二次構造高いmRNA折り畳みエネルギーZukerNucleicAcidRes3134063415および他の強固なヘアピン構造を除去した。配列比較、対配列同一性パーセントが、表20に提供されるはヌクレオチド差異の数を表す。表20実施例26.OgLuc変異体のシグナル安定性A.15C1、9BおよびIVPBI-3945を用いた場合の15C1のシグナル安定性、並びにPBI-3889を用いた場合の9B8のシグナル安定性を測定し、IVと比較した。15C1、9B8、またはIVをコードするプラスミドDNAを含む大腸菌Ecoliを、8連で、増殖させて、前に記載した通りに誘導した。細胞を、300mMHEPESpH8.0、0.3×PassiveLysisBufferPLB;プロメガ社カタログ番号E194A、0.3mg/mLリゾチーム、および0.003U/μLRQ1デオキシリボヌクレアーゼを含有する溶解緩衝液を用いて溶解させた。溶解物を溶解緩衝液中で1:1000に希釈し、TECAN登録商標INFINITE登録商標F500ルミノメーターを用いて発光を測定した。10μLの希釈溶解物試料に、150mMKCl、1mMCDTA、10mMDTT、100mMチオ尿素、0.5TERGITOL登録商標NP-9v/v、および20μMの新規セレンテラジンPBI-3945またはPBI3889のいずれかを含有する50μLのGlo0.5TERGITOLアッセイ緩衝液0.5TERGITOLを添加した直後に、測定を行った。試料にアッセイ緩衝液を添加した後、ある期間にわたって30秒毎にプレートを再読み取りすることによって、変異体のシグナル安定性を決定した。当該技術分野において周知の方法を用いて、これらの測定から、シグナル半減期を決定した。平均シグナル半減期を、変異体とIVの間で比較した。15C1および9B8の両方が少なくとも30分のシグナル半減期を有した図33。PBI-3945を用いて分析された15C1は、t=0でより高い発光を有したが、そのシグナルは、PBI-3889を用いて分析された変異体9B8よりも、より急速に減衰した。t=10分で、PBI-3945を用いた場合の15C1の発光と、PBI-3889を用いた場合の9B8の発光は同等であった。B.9B8optK33N9B8optK33N変異体のシグナル安定性を試験した。変異体を含有する大腸菌Ecoli溶解物を調製し、アッセイ緩衝液が0.25TERGITOL登録商標NP-9v/v、100mMMESpH6.0、1mMCDTA、150mMKCl、35mMチオ尿素、2mMDTT、および20μMPBI-3939を含有する以外は前に記載した通りに、分析した。表22は、変異体のシグナル半減期を分単位で示しており、アミノ酸置換L27Vがシグナル安定性を向上させることを示している。表22:細菌溶解物におけるOgLuc変異体のシグナル安定性L27V変異体9B8K33NL27VT39TK43RY68D;配列番号88および89のシグナルの活性および安定性を測定し、ホタルLuc2ルシフェラーゼおよびウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼのそれと比較した。L27V変異体、Luc2ルシフェラーゼおよびウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼを、HaloTag登録商標に融合し、大腸菌Ecoliで発現させた。前記ルシフェラーゼを、製造業者のプロトコルpFN18A;HaloTag登録商標タンパク質精製系に従って、精製標識としてHaloTag登録商標を用いて精製した。10pMの各精製ルシフェラーゼ0.01PRIONEX登録商標を含有するフェノールレッドを含まないDMEMで希釈を、次に等量のアッセイ試薬100mMMESpH6、35mMチオ尿素、0.5TERGITOL登録商標NP-9v/v、1mMCDTA、2mMDTT、150mMKCl、並びにL27V変異体に対する100μMPBI-3939;ホタルルシフェラーゼに対するONE-GLO商標ルシフェラーゼアッセイ系プロメガ社;およびウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼに対するRENILLA-GLO商標ルシフェラーゼアッセイ系プロメガ社と混合し、経時的に3分、10分、20分、30分、45分および60分、発光をモニターした。図34A~Bは、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼと比較した場合の、L27V変異体の高い比活性図34Aおよびシグナル安定性図34Bを示している。実施例27.OgLuc変異体の酵素動態A.IV、15C1、9B8、9F6および9A3当該技術分野において周知の方法を用いて、IV並びにIV変異体の15C1、9B8、9F6、および9A3を含有する大腸菌Ecoliの溶解物を用いて、発光を測定する酵素反応動態アッセイを行った。溶解緩衝液がpH7.5である以外は実施例26に記載の通りに、細胞を誘導し、溶解させ、希釈した。先に実施例26に記載されるアッセイ緩衝液におけるPBI-3939の2倍連続希釈液を、希釈溶解物を用いて、アッセイした。図35は、IVと、変異体15C1、9B8、9F6、および9A3の双曲線の一致を用いて算出されたKmおよびVmaxの値を示している。変異体9B8および9F6は、IVと比較してより高いKm値を有したが、他の変異体のKm値は変化が無かった。IVと比較した場合に、変異体15C1、9B8、および9F6は全てより高いVmax値を有したが、8A3はより低いVmax値を有した。15C1は、アミノ酸置換K33Nを含有するPBI-3945を用いた場合に最も高い発光を有したが、このことは、K33Nが増加した発光を提供したことを示している。9B8変異体を、この追加の置換を有するように作製し、この変異体に発光の向上を与えた。9B8および9F6の追加の変異体を、アミノ酸置換K33NまたはV38I9B8K33NV38Iおよび9F6K33Nのうち少なくとも1つを有するように作製した。光出力および安定性の増加に対する、68位、72位、および75位でのアミノ酸置換の重要性を強調するために、変異体1D6を使用した。図36は、IVと、変異体9B8、9B8K33NV38I、9F6、9F6K33N、および1D6の双曲線当てはめ用いて算出されたKmおよびVmax値を示している。実際のKm値は、9B8および9F6に関して、図35と図36の間で異なっているが、変異体間の全体的な傾向は一貫していた。変異体9B8optおよび9B8optK33Nについての酵素動態、すなわちVmaxおよびKmの値を、大腸菌Ecoli溶解物が、1mMCTDA、150mMKCl、2mMDTT、100mMMESpH6.0、35mMチオ尿素、0.25TERGITOL登録商標NP-9v/v、10mg/mL2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、および20μMPBI-3939を含有する緩衝液を用いてアッセイされる以外は上記の通りに、決定し、比較した。発光を、TECAN登録商標INFINITE登録商標F500ルミノメーターで測定した。図37に示されるように、9B8optK33NのVmaxおよびKmの値は、9B8optよりもより高く、このことは、このクローンがより明るく、基質に対してより低い親和性を有することを示している。B.9B8OPTK33N変異体OgLuc変異体の酵素動態の値を、発光をGLOMAX登録商標ルミノメーターを用いて測定した以外は前に記載した通りに決定した。各変異体に対して、3連を用いた。表23は、HYPER.EXE、バージョン1.0を用いて算出した、平均Km値および平均Vmax値を、標準偏差それぞれKm/-およびVmax/-と共に示している。表23:OgLuc変異体のVmaxRLU/0.5秒およびKmμMの値実施例28.OgLuc変異体のタンパク質安定性ルシフェラーゼタンパク質の安定性は発光に影響を及ぼす別の因子であるため、変異体のタンパク質安定性、すなわち熱安定性が決定された。A.15C1、9B8、9F6、8A3およびIV15C1、9B8、9F6、8A3またはIVを含む大腸菌EcoliおよびhRL配列番号30および31を発現する大腸菌Ecoliの溶解物を、前に記載した通りの誘導された培養物から調製した。溶解物試料を、0.1ゼラチンと共に10mMHEPESpH7.5を含有する緩衝液で1:1000に希釈した。希釈された溶解物100μL試料を、レプリケート96ウェルプレート中で、50°Cでインキュベートした。異なる時点で、プレートを-70°Cマイナス70摂氏温度に置いた。前に記載した通りに発光を測定する前に、各プレートを室温すなわち22°Cで10分間解凍した。試料10μLの各解凍試料を、天然セレンテラジンを基質として用いてアッセイした。各時点のプレートにアッセイ緩衝液を添加した直後に発光を測定した。タンパク質の半減期は、タンパク質安定性を示すものであったが、これは当該技術分野において周知の方法を用いて各時点の発光データから算出された。表24は、分時間単位でそれぞれ630.110.5、346.65.8、770.212.8および65.41.1の半減期を有する変異体15C1、9B8、9F6、および8A3のタンパク質安定性を示している。比較すると、hRLは9.6分の半減期を有し、一方でIVは27.2分の半減期を有した。表24はまた、4時間の時点で、15C1、9B8、および9F6それぞれの79、61、および80が活性状態を維持していたことを示している。表24:50°CでのOgLuc変異体のタンパク質安定性B.1D6、9B8、9B8K33NV38I、9F6、9F6K33N、およびIV1D6、9B8、9B8K33NV38I、9F6、9F6K33N、またはIVを含む大腸菌Ecoliの溶解物を、前に記載した通りに、誘導された培養物から調製し、発光についてアッセイした。溶解物のタンパク質安定性、すなわち熱安定性を、本実施例中の上記の通りにアッセイした。図38は、インキュベーション期間の開始時点、すなわちt=0で天然セレンテラジンを基質として用いて測定された、50°Cでの変異体の分分単位の半減期、および試料の発光を示している。変異体9B83338と9F6の差異は、1つのアミノ酸置換、L27Vであったが、このことは、このアミノ酸置換が安定性を増加させたことを示している。68位、72位、および75位における活性/発現置換の付加が、安定性を増加させた。図38は、K33Nがより大きな熱安定性を変異体9F6に与えたこと、並びに変異体9B8が変異体1D6よりもより大きな光出力および安定性を有したことを示している。これら2つの変異体の差異、すなわち、9B8が追加のアミノ酸置換F68Y、L72Q、およびM75Kを有していることは、これら3つの置換の重要性を示すものである。熱安定性に加えて、発現、安定性、および溶解性により決定される構造的完全性もまた、発光に影響を及ぼし得る。改善された変異体の構造的完全性をさらに試験するする手段として、pF4Agベースのすなわち、HT7無しOgLuc変異体N166R米国特許仮出願番号第12/773,002号米国特許出願公開第2010/0281552号において先に記述される、C1A4E、IV、9B8、および9F6を含むKRX大腸菌Ecoliを、ルリアブロス培地LB中37°Cで、OD600=0.6まで増殖させ、その後ラムノース0.2最終濃度の添加により過剰発現を誘導した。2連で誘導された培養物を、次に25°Cまたは37°Cのいずれかで17時間増殖させ、その時点で、全画分Tおよび可溶性画分Sを調製し、ゲルを染色するのにSIMPLYBLUE商標SafeStainインビトロジェン社を用いて、SDS-PAGEで分析した図39A~B。hRLおよびLuc2を、対照として使用した。25°Cで誘導が起こったとき、OgLuc変異体、hRLおよびLuc2は、十分に発現され、可溶性であった図39A;N166R変異体を除くOgLuc変異体の可溶性画分におけるおよそ19kDaの暗いバンド、並びにhRLおよびLuc2それぞれの可溶性画分におけるおよそ36kDaおよび64kDaのバンドに注目。対照的に、37°CではC1A4E、IV、9B8、および9F6は十分に発現されたが全画分に示されるように、hRLまたはLuc2よりも有意により良く、上昇した誘導温度が用いられた場合、9B8変異体および9F6変異体のみが可溶性であった図39B参照;9B8および9F6の可溶性画分におけるおよそ19kDaの暗いバンドに注目。これらの結果は、表24および図38に示される熱安定性データに追従するものである。C.9B8OPTおよび9B8OPTK33N変異体9B8optおよび9B8optK33Nの熱安定性を比較した。変異体9B8optまたは9B8optK33Nを含む大腸菌Ecoli溶解物を、以下の例外はあるが前に記載した通りに、調製して分析した:溶解物を前に記載した溶解緩衝液中で1:100に希釈し、同一実験の希釈溶解物をサーモサイクラー中60°Cでインキュベートした。異なる時点で一定分量を取り出し、ドライアイス上に置いて、試料を凍結した。凍結された溶解物を22°Cで解凍し、20mMCDTA、150mMKCl、10mMDTT、20μMPBI-3939、100mMHEPESpH7.0、35mMチオ尿素、および0.1TERGITOL登録商標NP-9v/vを含有する緩衝液を用いて、アッセイした。発光をGLOMAX登録商標ルミノメータープロメガ社で測定した。図40Aは、分単位の時間にわたって測定された、RLU単位の発光の自然対数ln値という、光出力の経時変化を示している。図40Bに示されるように、9B8optK33Nは60°Cで6.8時間の半減期を有し、これは9B8optの半減期5.7時間よりも長かった。表25は、9B8optおよび9B8optK33Nの60°Cでの熱安定性T1260°C、並びにインキュベーション期間の開始時点すなわち、t=0での発光RLUデータを示している。9B8optK33Nは、9B8optよりも、より安定でおよそ1.8倍明るかったが、このことは、アミノ酸置換K33Nがより大きな光出力およびより高い熱安定性の両方を与えたことを示している。表25:9B8optおよび9B8optK33Nの熱安定性および発光データD.9B8K33N変異体60°Cでの変異体の熱安定性を、アッセイ緩衝液がHEPESの代わりに100mMMESpH6.0を含有したこと以外は上記の通りに、調べた。表26および図41は、60°Cでの変異体の半減期を時間単位で示している。データは、アミノ酸置換L27Vが熱安定性を向上させたことを示している。表26:60°CでのOgLuc変異体の熱安定性変異体9B8およびV29B8K33NT39TK43RY68Dも、それらの安定性を決定するために、HEK293細胞においてスクリーニングした。前に記載した通りに、変異体をpF4Agにクローニングし、HEK293細胞15,000細胞/ウェルに形質移入した。形質移入後、細胞をアッセイ試薬前に記載した通りに;PBI-3939無し中に溶解させ、20μMPBI-3939を含むアッセイ試薬を用いて、発光を測定した。9B8は5.2時間の半減期を有し、一方、V2は16.8時間の半減期を有した。これは、大腸菌Ecoliにおけるこれらの変異体について分かった半減期と一致している表26。E.L27V変異体L27V変異体9B8K33NL27VT39TK43RY68Dの活性を、様々なpH、および異なる塩条件で評価した。9B8および9B8K33Nは、pH6およびpH7において同様の安定性を有することが前もって示されたデータ未記載。様々な塩条件での活性を評価するために、20μMPBI-3939および変動量のKClまたはNaClを含む50μLのアッセイ緩衝液を、L27VpF4Agを一過的に形質移入されたHEK293細胞50μLと混合した。発光を測定し、活性パーセント塩無しに対する発光の割合を決定した図42B。様々なpHにおける活性を評価するため、様々なpH値に対し用量設定された、100mMクエン酸塩、100mMMES、100mMPIPES、100mMHEPES、100mMTAPS、0.5TERGITOL登録商標NP-9v/v、0.05MAZU登録商標DF204、1mMCDTA、および1mMDTTを含有する試薬を作製した。アッセイ試薬中の362pML27Vを、基質である100μMPBI-3939と混合し、発光を測定した図42A。実施例29.OgLuc変異体のゲル濾過クロマトグラフ分析A.C1A4Eおよび9B8ゲル濾過分析を用いて理論値に基づく精製OgLucタンパク質の予想分子量を検証し、それによりそれらのオリゴマー状態を決定した。OgLuc変異体C1A4Eおよび9B8の相対的流体力学的体積の比較を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって行った。この分析のために、OgLuc変異体、C1A4Eおよび9B8のヌクレオチド配列を、HQ-TaggedFLEXI登録商標ベクタープロメガ社にクローニングし、大腸菌EcoliKRX細胞において過剰発現される、N末端にHQHQHQ標識されたタンパク質を生成した。過剰発現されたタンパク質を、HISLINK商標タンパク質精製系プロメガ社を用い、製造業者の取扱説明書に従って、精製した。個々の標準タンパク質および試料タンパク質の試料を、ゲル濾過クロマトグラフィーで分析した。このゲル濾過クロマトグラフィーは、24°C、アジレント1200HPLC上で、Superdex2005/150GLカラムGEヘルスケア社を用いて、0.25mL/分の流速で行われた図43A~B。移動相すなわち、泳動緩衝液は、50mMトリスおよび150mMNaClから構成されていたpH7.5。タンパク質の溶出を214nmおよび280nmでモニターした。標準的な検量線を、以下を用いて作成した:1オボアルブミン、43kDaGEヘルスケア社、2炭酸脱水酵素、29kDaシグマ社および3ミオグロビン、17kDaウマ心筋、シグマ社。精製タンパク質の分子量を検量線から直接算出した。このカラムを用いて観察されたタンパク質の相対的な溶出は、7.98分にオボアルブミン、8.65分に炭酸脱水酵素、8.97分に9B8、および9.06分にミオグロビンであった図43A~B。図43Bに示されるように、9B8は21kDaのタンパク質予想MWはおよそ19kDaとして溶出されたが、このことは9B8変異体が単量体として存在したことを示しており、一方、C1A4Eはおよそ4.3分に溶出され図43A、このことは、C1A4Eが多量体、例えば、恐らくは四量体複合体またはより大きな何かとして、発現され存在していることを示している。B.L27V変異体OgLuc変異体L27Vが単量体状態で存在することを示すために、ゲル濾過分析を用いて理論値に基づく精製L27Vタンパク質の予想分子量を検証し、それによりそれらのオリゴマー状態を決定した。L27V変異体の相対的流体力学的体積をゲル濾過クロマトグラフィーによって作製した。この分析のために、L27V変異体のヌクレオチド配列をHaloTag登録商標ベクターpFN18Aプロメガ社にクローニングし、大腸菌EcoliKRX細胞プロメガ社において過剰発現されるHaloTag登録商標末端標識化タンパク質を生成した。過剰発現されたタンパク質を、HaloTag登録商標タンパク質精製系プロメガ社を用い、製造業者の取扱説明書に従って精製した。個々の標準タンパク質および試料タンパク質の試料を、24°C、アジレント1200HPLC上で、Superdex2005/150GLカラムGEヘルスケア社を用いて、0.25mL/分の流速で行われるゲル濾過クロマトグラフィーで分析した図56。移動相すなわち、泳動緩衝液は、50mMトリスおよび150mMNaClをから構成されていたpH7.5。タンパク質の溶出を214nmおよび280nmでモニターした。標準的な検量線を、以下を用いて作成した:1オボアルブミン、43kDaGEヘルスケア社、2ミオグロビン、17kDaウマ心筋、シグマ社、および3リボヌクレアーゼ、14kDaウシ膵臓、GEヘルスケア社。図44に示されるように、L27V変異体は24kDaのタンパク質予想MWはおよそ19kDaとして溶出され、このことは、L27V変異体が単量体として存在していたことを示している。実施例30.OgLuc変異体のタンパク質発現レベルA.IV、8A3、8F2、9B8、9F6および15C1タンパク質発現の正規化によって、比活性における潜在的な差異についての情報が得られた。タンパク質発現を定量するための手段を提供するため、前に記載した通りに、OgLuc変異体をC末端HT7を含有するpF4Agベクターにクローニングし、OgLuc変異体-HT7融合タンパク質を生成した。以下の融合タンパク質を生成した:IV-HT7配列番号48および49、8A3-HT7配列番号34および35、8F2-HT7配列番号50および51、9B8-HT7配列番号36および37、9F6-HT7配列番号38および39、および15C1-HT7配列番号52および53。OgLuc変異体-HT7融合体を含む大腸菌Ecoliを、前に記載した通りに、増殖させて誘導した。900μLの細胞培養物を100μLの10×FASTBREAK商標細胞溶解試薬プロメガ社で溶解させた。HaloTag登録商標TMR-リガンドプロメガ社を、各細菌溶解物試料に加えて、0.5μMの最終濃度を得た。細菌溶解物を、製造業者の説明書に従って、室温で30分間、HaloTag登録商標TMR-リガンドと一緒にインキュベートした。10μLの各試料を1×FASTBREAK商標で1:1に、すなわち、10μLの試料:10μLの1×FASTBREAK商標に希釈した。各試料について、15μLの溶解物および15μLの1:1希釈物を、SDSPAGEによって分析した。標識化融合タンパク質をSDS-PAGEで分離し、SIMPLYBLUE商標SafeStainで染色し図45A、蛍光画像作成を行ったGEヘルスケア社製Typhoon。バンドを、ImagequantソフトウェアGEヘルスケア社を用いて定量化した。図45Bは、IV-HT7に対して正規化された、IV-HT7IV、15C1-HT715C1、9B8-HT79B8、9F6-HT79F6、および8F2-HT78F2の、図45Aから測定されたバンド体積を示している。データは、IV変異体が、IVと比較して、十分に発現されていることを示している。B.9B8opt、V2およびL27V9B8opt、V2およびL27Vの発現レベルおよび溶解性を比較した。これら3つの変異体は、pF4Agバックグラウンドの背景において、大腸菌EcoliKRX細胞を形質転換するのに使用された。得られたクローンを発現実験に使用し、発現実験では、単一コロニーを30°Cで一晩増殖させ、LBで1:100に希釈し、およそ0.5のOD600まで増殖させ、その後、0.2ラムノースを用いて、25°Cで18時間誘導した。次に細胞を、0.5×FASTBREAK商標溶解試薬プロメガ社の存在下で、室温で30分間インキュベートし、得られた溶解物を-20°Cで保存した。氷上でゆっくりと解凍した後、4°C、10分間の高速遠心分離によって可溶性画分を調製した。次に、未精製の全画分Tおよび可溶性画分Sを、発現レベルについて、SDS-PAGESimplyblue染色図46A、並びに発光測定図46Bによって分析した。発光測定のために、96ウェルマイクロタイタープレート中の50μLの可溶性溶解物を、50μLのアッセイ試薬前述;40μMPBI-3939と混合し、TECAN登録商標INFINITE登録商標F500マルチ検出プレートリーダーを用いて発光を測定した。これらの結果は、発現レベルおよび溶解性に関しての、これら3つの変異体の順位が、L27V>V2>9B8optであることを示している。実施例31.哺乳類細胞で発現されるOgLuc変異体の輝度A.IVおよび9B8pF4Agベクターすなわち、HT7無し中のIVおよび9B8変異体を、HEK293細胞における輝度について評価した。hRLを対照として使用した。簡潔に説明すると、15,000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種されたHEK293細胞に、TRANSIT登録商標-LT1を用いて、種々の変異体および/または制御配列をコードするプラスミドDNAを一過的に形質移入した。細胞を実施例25に記載の通りに、増殖させ、溶解させ、処理した。細胞に、形質移入対照としてpGL4.13プロメガ社を同時形質移入した10ng/形質移入または全導入DNAの10を使用。発光を、hRLに対する基質として天然セレンテラジンを用いて、またはOgLuc変異体に対する基質としてPBI-3939を用いて、前に記載した通りに測定した。OgLuc変異体データを、Luc2の発光すなわち、ルシフェリン基質添加後の発光測定を用いて、形質移入効率に対して補正した。OgLuc変異体IVおよび9B8は、hRLウミシイタケ属Renillaと比較した場合に、より大きな発光を有した図47。哺乳類細胞においての、1モルあたりでの輝度の比較のために、実施例30に記載の変異体9B8のC末端HT7融合タンパク質pF4Ag-OgLuc-9B8-HT7を分析し、C末端HT7-hRL融合タンパク質pF4Ag-ウミシイタケ属Renilla-HT7およびC末端HT7-Luc2融合タンパク質pF4Ag-Luc2-HT7と比較した。HEK293細胞15,000を播種し、37°Cで一晩増殖させた。これらの細胞に、pF4Ag-ウミシイタケ属Renilla-HT7、pF4Ag-Luc2-HT7、またはpF4Ag-OgLuc-9B8-HT7からの、100ngのDNAを形質移入し、37°Cで一晩増殖させた。培地を除去し、前に記載した通りに細胞を溶解させた。10μLの各試料を、Luc2に対して50μLのBRIGHT-GLO商標、hRLに対して50μLの20μM天然セレンテラジン、および変異体9B8に対して50μLの20μMPBI-3939を用いた場合の発光RLUについて、アッセイした。6個のウェルから得られた溶解物をプールし、実施例30に記載の通りにHaloTag登録商標TMR-リガンドでタグ付けした。タグ化融合タンパク質をSDS-PAGEで分離し、蛍光画像作成を行ったGEヘルスケア社製Typhoon。バンド密度を測定して、各々のルシフェラーゼ酵素の存在するモルの相対数を定量化し、各試料のRLU値を算出されたバンド密度に対し正規化して、各タンパク質の発現レベルを正規化した。すなわち、RLUをTMRタグ定量化を用いて正規化した図48。モル対モル基準で、9B8変異体はLuc2よりもおよそ15倍明るく、hRLよりも100倍を超えて明るかった。このデータは比活性における差異を表すものであった。B.9B8optおよび9B8optK33NHEK293細胞で発現された変異体9B8optおよび9B8optK33Nの輝度を、実施例31においてHT7を含まない変異体について記載された通りに、測定して比較した。変異体DNAを含有する30ngおよび100ngのプラスミドDNAを、HEK293細胞に形質移入するのに用いた。1mMCTDA、150mMKCl、2mMDTT、100mMMESpH6.0、35mMチオ尿素、0.25TERGITOL登録商標NP-9v/v、および10mg/mL2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを含有する溶解緩衝液で細胞が溶解されたこと以外は実施例31に記載の通りに、細胞を増殖させて誘導した。溶解物を、20μMPBI-3939を含有する溶解緩衝液を用いてアッセイし、TECAN登録商標GENIOS商標プロルミノメーターで発光を測定した。図49に示されるように、9B8optK33Nは、HEK293細胞において、9B8optと比較してより大きな発光を有し、これは、表25および図29における細菌中の発現データに追従するものである。C.9B8K33N変異体HEK293細胞およびNIH3T3細胞において発現された変異体の輝度を、前に記載した通りに測定した。変異体の発光を、9B8optにより発せられた発光に対して正規化した表27。表27:NIH3T3細胞およびHEK293細胞においてOgLuc組み合わせ変異体によって発せられた発光の増加D.L27V単独のホタルルシフェラーゼおよび融合体としてのホタルルシフェラーゼに対する、L27V変異体の発光の比較を行った。HEK293細胞およびHeLa細胞を、それぞれ15,000細胞/ウェルおよび10,000細胞/ウェルで12ウェルプレートのウェルに播種し、37°C、5CO2で一晩インキュベートした。次に、細胞に、L27VまたはLuc2を含有するpF4Agの連続希釈物を形質移入した。20ngのpGL4.13プロメガ社をL27Vと共に同時形質移入し、20ngのpGL4.73プロメガ社をLuc2と共に同時形質移入して、L27VまたはLuc2プラスミドDNAのより低い希釈物のための担体DNAとして機能させた。次に、TRANSIT登録商標-LTI形質移入試薬を用い、製造業者の取扱説明書に従って、プラスミドDNAを細胞各細胞型の各希釈に対し6連でに形質移入した。次に、細胞を37°C、5CO2で24時間インキュベートした。形質移入後、培地を細胞から除去し、0.5TERGITOL登録商標NP-9v/vを含有する100μLのPBSを加え、室温で10分間振盪した。10μLの各細胞溶解物を、ONE-GLO商標ルシフェラーゼアッセイ系プロメガ社;Luc2またはアッセイ試薬20μMPBI-3939を用いる実施例22H;OgLucを用いて、アッセイした。HEK293図50AおよびHeLa細胞図50Bについて、前に記載した通りに発光を測定した。融合パートナーとしてのL27VおよびLuc2の比較を、上記の通りに行った。L27VおよびLuc2を、pF4AgにおいてHaloTag登録商標タンパク質に融合させた。図50C~Dは、HEK293図50CおよびHeLa細胞図50Dにおいて、異なる融合体を用いた場合に測定された発光を示している。発光の測定に加えて、タンパク質発現も分析した。形質移入を上記の通りに行った。形質移入後、培地を細胞から取り除き、細胞を1×PBSで洗浄した。1μMHaloTag登録商標TMRリガンドプロメガ社および20UデオキシリボヌクレアーゼIを含有する100μLの0.1×MammalianLysisBufferプロメガ社を加え、細胞を室温で45分間、ゆっくり振盪しながらインキュベートした。次に、細胞試料を-20°Cで凍結した。タンパク質分析のために、32.5μLの4×SDSローディングダイを各試料に加え、試料を95°Cで2分間加熱した。次に、10μLの試料をSDS-PAGEゲル上に添加し、前に記載した通りにTyphoonScannerで画像処理した図50E。実施例32.ホタルルシフェラーゼと比較した場合の精製OgLuc変異体の輝度実施例33に記載の通りに、9B8OgLuc変異体を過剰発現させて精製した。希釈された酵素および基質間の反応は、以下の2×緩衝液/アッセイ試薬を用いて行われた:100mMMESpH6.0、1mMCDTA、150mMKCl、35mMチオ尿素、2mMDTT、0.25TERGITOL登録商標NP-9v/v、0.025MAZU登録商標DF204、10mg/mL2-ヒドロキシ-β-シクロデキストリン、および20μMPBI-3939。精製された酵素および基質の最終的なアッセイ濃度は、それぞれ0.5pMおよび10μMであった。同時に、希釈された精製ホタルルシフェラーゼすなわち、QUANTILUM登録商標組換えルシフェラーゼプロメガ社と希釈された精製ルシフェリンの反応を分析した。ホタルルシフェラーゼ反応用のアッセイ緩衝液/試薬はBRIGHT-GLO商標であり、その最終アッセイ濃度は0.5pM酵素および500μMルシフェリンであった。各反応用の緩衝液/試薬は白熱glow動態を与えることが知られており、15分の時点が発光データを収集するのに用いられた。この実験から得られた結果は、PBI-3939を用いる9B8opt19,200RLUが、BRIGHT-GLO商標を用いるQUANTILUM登録商標組換えルシフェラーゼ2,300RLUのおよそ8倍より明るかったことを示した。実施例33.阻害分析非特異的相互作用に対するOgLuc変異体の感受性を決定するために、9B8およびL27V変異体の活性を、LOPAC薬理的活性化合物のライブラリーライブラリーに対して、スクリーニングした。前記化合物をDMSO中で1mMに希釈することにより、LOPAC1280ライブラリーシグマ社を作製した。アッセイの当日、前記化合物を1×PBS中で20μMに希釈し、10μLを96ウェルの白色プレートに移した。各ウェルに、Glo溶解緩衝液プロメガ社中で104に希釈された、10μLの精製された9B8、L27VまたはホタルルシフェラーゼLuc2酵素を加え、室温で2分間インキュベートした。試料に、20μLのアッセイ試薬1mMCDTA、150mMKCl、2mMDTT、100mMMESpH6.0、35mMチオ尿素、0.5TERGITOL登録商標NP-9v/vおよび60μMPBI-3939を加え、3分間インキュベートし、TECAN登録商標GENIOS商標プロルミノメーターで発光を測定した。ホタルルシフェラーゼをアッセイするために、製造業者のプロトコルに従ってBRIGHT-GLO商標アッセイ試薬プロメガ社を使用した。陰性対照として、各プレートの8ウェルには、1×PBS2グリセロールが含められた。陽性対照として、各プレートの8ウェルには、2DMSO中の2mMスラミンまたは2DMSO中の2mMルシフェラーゼ阻害剤1カルバイオケム社が含まれた。LOPACライブラリーの事前のスクリーニングすなわち、LOPACライブラリーを、20μMというより低い基質濃度の9B8変異体を使用してスクリーニングしたにおいて、スラミンはOgLucの阻害剤であることが特定された。図51における結果は、LOPACライブラリー中の化合物とL27Vの間の非特異的相互作用が、概して低頻度であることを示している。このことは、生細胞ベースの型式例えば、高処理スクリーニング系を含む、多様な化学物質および治療薬候補の大規模なライブラリーに対するスクリーニング手段として、L27Vを使用できる可能性を示している。阻害耐性をさらに試験するために、精製された9B8およびL27Vを、様々な濃度のスラミンシグマ社S-2671およびチロホスチンAG835Tyrag835シグマ社T-5568に対して、スクリーニングした図52A~C。図52E~Dは、スラミンおよびTyrag835それぞれの化学構造を示している。精製された9B8およびL27Vを上記の通りに調製した。阻害剤の連続希釈物0、2μM、6μM、20μM、60μM、200μMおよび2mMを、2DMSOを含む1×PBS中で調製した。96ウェル白色アッセイプレートのウェルに、10μLの希釈酵素および10μLの希釈阻害剤を加え、室温で2分間インキュベートした。20μLのアッセイ試薬上記を加え、GLOMAX登録商標-96ルミノメーターで発光を測定した図52A~C。図52A~Bは、9B8およびL27Vの、スラミン図52AおよびTyrag835図52Bに対する用量反応曲線を示している。図52Cは、9B8およびL27Vに対するスラミンおよびTyrag835の50阻害濃度IC50を示している。データは、L27Vが、多様な化学物質および/または治療薬候補の大規模ライブラリーに対するスクリーニング手段として使用でき得る、頑強なレポーターであることを示している。実施例34.非特異的タンパク質相互作用に対する抵抗性1.精製9B8酵素および精製L27V酵素を、0.5mg/mLBSAを含有する、または含有しない緩衝液1×PBS、1mMDTT、および0.005IGEPAL登録商標CA-630中で1:10に連続希釈して4セットの各希釈物、200μLをPCRストリップ管に入れた。試料を60°Cでインキュベートし、0時間、2時間、4時間、および6時間の時点で、各変異体について1セットの希釈物を-70°Cに移行させた。活性を分析するために、試料を水浴中で室温まで解凍した。50μLのアッセイ試薬前に記載した通り、100μMPBI-3939を含むを加え、TECAN登録商標INFINITE登録商標F500プレートリーダーで、発光を1分ごとに30分間測定した。活性を、1×106および1×107希釈物の平均発光を用いて算出した図53。2.プラスチックに対するOgLuc変異体の反応性を示すために、精製9B8および精製L27Vを、ポリスチレンプレートに曝して、それらの活性を測定した。0.1PRIONEX登録商標を含むフェノールレッドを含まないDMEM中の、50μLの精製9B845.3pMおよび精製L27V85.9pMを、96ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルに、60分、40分、20分および0分の時点で入れた。試料に、20μMPBI-3939を含有する50μLのアッセイ試薬上記を加え、室温で5分間インキュベートした。発光を前に記載した通りに測定し、活性パーセントを決定した図54;時間0に対する発光の割合。実施例35.翻訳後修飾OgLuc変異体が、哺乳類細胞で発現された場合に何らかの翻訳後修飾を経るかどうかを決定するために、哺乳類細胞および大腸菌Ecoliの両方において、9B8およびL27V変異体を発現させ、質量分析MSによって分析した。9B8およびL27V変異体を、N末端HaloTag登録商標融合体大腸菌Ecoliに対してはpFN18K;HEK293細胞に対してはpFN21Kとして、HEK293細胞および大腸菌EcoliKRXプロメガ社細胞中で発現させ、HaloTag登録商標タンパク質精製系プロメガ社を用い、製造業者の説明書に従って、精製した。およそ5ピコモルの精製酵素を、LTQOrbitrapVelos質量分析計サーモサイエンティフィック社に連結されたC4カラムウォーターズ社製XbridgeBEH300、3.5μmを用いるLC/MSによって分析した。検出のためにLTQを用いて600~2000m/zからデータを得て、MagTranv1.03ソフトウェアを用いて処理したZhangetalJAmSocMassSpectrom9225233。無修飾OgLuc変異体、すなわち、いかなる翻訳後修飾も存在しないOgLuc変異体の、19,665Daという算出された質量と比較して、精製された酵素は両方とも19,666Daという実験的に決定された質量を有していた。実施例36.OgLuc変異体の転写レポーターとしての評価A.IV転写レポーターとしてのOgLuc変異体の使用を試験した。cAMPの転写レポーターを生成するために、hRLおよびIVを、当該技術分野において周知の方法を用いて、バルナーゼ配列barnasesequenceを含有する改変されたpGL4ベクタープロメガ社にサブクローニングし、目的のDNA断片で置き換えた。フォルスコリンFSK等のcAMP作動薬での刺激の際に、cAMPを蓄積している細胞が前記レポーターを活性化して発光するように、改変されたpGL4のリーダー配列は最小プロモーターおよびcAMP応答要素CRE;配列番号96を含有していた。この実験では、hRLまたはIVいずれかの転写レポーターコンストラクトの2ngのDNAが、実施例25に記載の通りに、HEK293細胞の形質移入に使用された。形質移入から24時間後、細胞を100μMFSKで処理した。FSKで処理しなかった細胞は対照として使用した。6時間後、レポーター試薬を、処理細胞および対照細胞に加えた。hRLについては、レポーター試薬はRenilla-Glo商標試薬プロメガ社であった。IVについては、レポーター試薬は1mMCDTApH5.5、150mMKCl、10mMDTT、0.5TERGITOL登録商標NP-9v/v、20μMセレンテラジン-h、および150mMチオ尿素を含有していた。10分後、Varioskan登録商標Flashサーモサイエンティフィック社で発光を読み取った。図55は、FSKで処理されたFSKまたは処理されていない-FSK、hRLウミシイタケ属RenillaまたはIV転写レポーターを含有するHEK293細胞の正規化された発光を示している。応答、すなわち、発光における誘導倍率または増加倍率倍率を、処理細胞FSKからの発光を対照細胞-FSKからの発光で除算することによって決定した。図55に示されるように、hRLについての応答は50未満であり、一方、IVについては、応答は300を超えており、このことは、転写レポーターとしてのIVの用途を明らかにするものである。B.9B8および9B8opt転写レポーターとしての変異体9B8および9B8optの使用も、以下の変更を加えてIV転写レポーターについて先述される通りに試験して、hRLおよびLuc2転写レポーターに対して比較した。変異体9B8または9B8optのいずれかを含有するcAMPの転写レポーターを、上記の通りに生成した。FSK誘導の6時間後、培地を細胞から除去して、実施例25に記載の100μLの溶解緩衝液で置き換え、溶解物を生成した。FSKで処理されたか、または処理されていない形質移入細胞の溶解物を、実施例25に記載される通りに、発光についてアッセイした。10μLのLuc2溶解物を、50μLのBRIGHT-GLO商標ルシフェラーゼアッセイ試薬を用いてアッセイした。10μLのhRL溶解物を、20μM天然セレンテラジンを含有する50μLの溶解緩衝液を用いてアッセイした。10μLの変異体9B8および9B8opt溶解物を、20μMPBI-3939を含有する50μLの溶解緩衝液を用いてアッセイした。図56は、FSKで処理された誘導または処理されていない基底、9B8、9B8opt、hRL、またはLuc2転写レポーターを含有するHEK293細胞の正規化された発光を示している。応答、すなわち、発光における誘導倍率または増加倍率倍率を、誘導された発光を基底の発光で除算することによって決定した図56。誘導倍率の値はLuc2以外の各レポーターについて同様であるが、誘導された9B8opt転写レポーターによって生じた発光は、誘導されたウミシイタケ属Renilla転写レポーターよりもおよそ2.5対数より高く、Luc2転写レポーターよりもおよそ1.5対数より高かった。図56は、転写レポーターとしての9B8および9B8optの使用を示す。C.9B8optおよび9B8optK33N変異体9B8optおよび9B8optK33Nを、溶解性転写レポーターアッセイにおいて比較した。変異体9B8optK33Nを、サイクリックAMP応答要素CREを含有するpGL4.29ベクタープロメガ社に、当該技術分野において周知の方法を用いてクローニングした。9B8optK33N転写レポーターを、HEK293細胞において、上記の通りに試験して、9B8opt転写レポーターに対して比較した。変異体の転写レポーターバージョンを含有する30ngおよび100ngのプラスミドDNAを、HEK293細胞の形質移入に使用した。細胞を、FSKを用いて、発光測定前に5時間誘導した。細胞を、1mMCTDA、150mMKCl、2mMDTT、100mMMESpH6.0、35mMチオ尿素、0.25TERGITOL登録商標NP-9v/v、および10mg/mL2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを含有する溶解緩衝液を用いて溶解させた。発光を、TECAN登録商標GENIOS商標プロルミノメーターで測定した。溶解物を、20μMPBI-3939を含有する溶解緩衝液を用いてアッセイした。図57は、FSKで処理された誘導、または処理されていない基底、9B8optまたは9B8optK33N転写レポーターコンストラクトを発現するHEK293細胞の正規化された発光補正された形質移入を示している。図57に示されるように、9B8optについての誘導倍率は、30ngのDNAが形質移入に使用された場合は360であり、100ngが形質移入に使用された場合は109であったが、一方、9B8optK33Nについての誘導倍率は、それぞれ、275および147であった。より多量なDNAを形質移入に使用した場合、K33Nはより大きな応答を提供した。D.L27V1.L27Vを、本実施例のCに記載の通りに、CRE、NFkBまたはHSE熱ショック要素応答要素を含有するレポーターベクターにクローニングした。次に、レポーターコンストラクトを前に記載した通りにHEK293細胞またはHeLa細胞に形質移入した。次に、細胞を、CREに対してはFSKを、NFkBに対してはTNFαを、またはHSEに対しては17-AAGを用いて誘導した。発光を、20μMPBI-3939を含有するアッセイ試薬を用いて、前に記載した通りに測定した図58A~C。レポーターコンストラクトを、HEK293、HeLa、NIH3T3、U2OSおよびJurkat細胞株全てにおいて、妥当性確認したデータ未記載。2.L27V02およびL27V02PPEST配列;配列番号323を含有を、本実施例のCに記載の通りに、レポーターベクターpGL4.32ベースにクローニングした。PEST配列を含有する他のOgLuc変異体としては、L27V01-PEST00およびL27V03-PEST02それぞれ、配列番号320および326が挙げられる。次にレポーターコンストラクトを、前に記載した通りに、HEK293細胞に形質移入した。次に、FSKを用いて細胞を誘導し、20μMPBI-3939を含有するアッセイ試薬を用いて前に記載した通りに、発光を測定した図59A~B。種々の他のレポーターコンストラクトも構築し、種々の細胞株において試験した図59C。図59Aは、HEK293細胞におけるCRE系についての、完全用量反応を示している。図59Bは、図59Bを要約したものである。図59Cは、図59A~Bのデータを要約したものであり、NFkB応答要素についての同種のデータを示している。CREおよびNFkBレポーターコンストラクトを両方とも、HEK293、HeLa、HepG2、Jurkat、ME180、HCT116、およびU2OS細胞株において試験した。3.HEK293細胞T25フラスコ中の0.9×106個の細胞に、pNFkB-L27V分泌コンストラクト配列番号463および464;IL-6分泌配列配列番号461および462によって天然OgLuc分泌配列の配列番号54が置き換えられた、メトリディアロンガMetridialongaクロンテック社、pNFkB-L27V天然分泌配列;配列番号465および466またはホタルルシフェラーゼLuc2;pGL4.32ベースプラスミドDNAを、FUGENE登録商標HDプロメガ社を用い、製造業者の取扱説明書に従って、形質移入した。細胞を37°C、5CO2で8時間インキュベートし、その後0.5mLのTrypLEインビトロジェン社中でトリプシン処理した。次に、溶解物を、10FBS、1×NEAAおよび1×ピルビン酸ナトリウムを含有する8mLのDMEMに再懸濁した。次に、100μLの再懸濁試料を96ウェルプレートのウェルに加え、37°C、5CO2で16時間インキュベートした。インキュベートした後、培地を細胞から除去して、TNFα連続希釈したを含有する、または含有しない、100μLの新しい培地と置き換えた。分泌についてアッセイするため、3時間および6時間の時点で、5μLの培地3連を細胞から取り出し、PBSで50μLにして、50μLのアッセイ試薬前述と同様に、100μMPBI-3939を含有すると混合した。前に記載した通りに、0分および10分の時点で発光を測定した図60。メトリディアロンガMetridialongaルシフェラーゼ活性を測定するために、Ready-To-Glow商標分泌型ルシフェラーゼ系クロンテック社を、製造業者のプロトコルに従って使用した。簡潔に説明すると、5μLのReady-to-Glow商標試薬を5μLの試料および45μLのPBSに加えた。試薬添加直後に発光を測定した図60。E.L27V最適化変異体プラスミドDNApGL4.32-L27V00、pGL4.32-L27V01、pGL4.32-L27V02、pGL4.32-L27V03、およびpGL4.13を、FUGENE登録商標HDを用い、製造業者のプロトコルに従って、形質移入用に構築した。pGL4.32ベクタープロメガ社は、NF-κB応答要素を含有している。L27Vコドン最適化配列によって、ベクター中のLuc2P配列が置き換えられた。pGL4.13ベクタープロメガ社は、SV40プロモーターにより駆動されるLuc2遺伝子を含有している。次に、300μLのDNA形質移入混合物を、6mLのHeLa細胞懸濁液2×105細胞/mLと混合し、均質化し、100μLを96ウェルプレートのウェルに播種した。次に、細胞を37°C、5CO2で一晩インキュベートした。インキュベートした後、BSAを含有するDPBS中の10μLの10×rhTNFαをウェルに加え、37°C、5CO2で4.5時間インキュベートした。6ウェルに、ビヒクルのみを加えた。次に、細胞を室温で20分間平衡化させ、その後、100μLのアッセイ試薬前述と同様、100μMPBI-3939を含有するを加えた。Luc2を発現しているか、またはビヒクル単独処理を受けた細胞に、100μLのONE-GLO商標ルシフェラーゼアッセイ試薬を加えた。アッセイ試薬添加の12分後、前に記載した通りに発光を測定した。図61A~Bは絶対発光を示しており、図61C~Dは正規化された発光を示しており、図61E~Fは応答倍率を示している。実施例37.転写レポーターアッセイにおけるOgLuc変異体転写レポーターとして使用される本発明のOgLuc変異体の能力を決定するために、フォワードトランスフェクション、リバーストランスフェクション、および大量bulkトランスフェクションにおいて、OgLuc変異体9B8optを転写レポーターとして使用した。これらの形質移入法が選択されたのは、それらが遺伝子転写レポーターの一過性発現に、一般に使用されるアプローチの代表であるためである。フォワードトランスフェクションcAMP応答要素CREおよび9B8optまたはPESTタンパク質分解配列をさらに含む9B8opt9B8opt-Pを含有する転写レポーターを、pGL4.29プロメガ社バックボーンにおいて作製した。すなわち、pGL4.29ベクターのluc2P遺伝子を9B9opt配列番号24または9B8opt-P配列番号65で置き換えた。pGL4.29を対照/基準として使用した。HEK293細胞を、6個の96ウェル組織培養プレートに、15,000細胞/ウェルで播種した。細胞を100μLのDMEM10FBS1×可欠アミノ酸NEAA中で増殖させ、37°Cで一晩インキュベートした。細胞に、10ngまたは100ngプラスミドDNA/ウェルのpGL4.299B8opt、pGL4.299B8opt-P、またはpGL4.29のいずれかを一過的に形質移入した。プラスミドDNAを、850μLのOPTI-MEM登録商標インビトロジェン社および32.4μLのFUGENE登録商標HD形質移入試薬プロメガ社と混合し、室温で10分間インキュベートした。8μLの形質移入/レポーターDNA混合物を適切なウェルに加えた2コンストラクト/プレート。細胞を37°Cで4時間インキュベートした。培地を、OPTI-MEM登録商標0.5透析FBS1×NEAA1×ピルビン酸ナトリウム1×Penn-Strepで置き換え、37°Cで一晩インキュベートした。インキュベートした後、OPTI-MEM登録商標中の10nMまたは10μMFSK10×ストックからを細胞に加え、37°Cで3時間インキュベートした。100mMMESpH6.1、1mMCDTA、150mMKCl、35mMチオ尿素、2mMDTT、0.25TERGITOL登録商標NP-9v/v、0.025MAZU登録商標DF204、および20μMPBI-3939を含有する溶解試薬を、pGL4.299B8optまたはpGL4.299B8opt-Pを含有する細胞に加えて、室温で10分間インキュベートした100μLの溶解試薬を100μLの細胞に加えた。ONE-GLO商標アッセイ試薬プロメガ社を、pGL4.29を含有する細胞に加え、製造業者のプロトコルに従って使用した100μLの試薬を100μLの細胞に加えた。発光をGLOMAX登録商標ルミノメーターで測定した。表26は、10nMベースラインまたは10mMFSKで処理された、CREを含有する転写レポーターを発現するHEK293細胞の発光、およびFSKに対する応答すなわち、10nMFSKで処理された細胞の発せられた発光で除算した、10mMFSKで処理された細胞により発せられた発光を示している。表28に示される結果は、9B8optおよび9B8opt-Pが、luc2Pよりもより明るかったこと、並びに、全てのルシフェラーゼレポーターが、100ngのDNAが形質移入に使用された場合にFSKに対し応答したことを示している。しかし、10ngだけのDNAが形質移入に使用された場合は、luc2Pレポーターについての発光は、ルミノメーターの検出レベルを下回った。表28:HEK293細胞における、CREを含有する転写レポーター3時間の時点リバーストランスフェクション抗酸化反応要素AREおよび9B8optまたは9B8opt-Pを含有する転写レポーターを、pGL4.29プロメガ社バックボーンにおいて作製した。すなわち、当該技術分野において周知の方法を用いて、pGL4.29ベクターのluc2P遺伝子を9B9optまたは9B8opt-Pで置き換え、CREを、2×ARE配列番号66で置き換えた。HEK293細胞をトリプシン処理しT75フラスコ、3mLのトリプシン、DMEM10FBS1×NEAAを含有する培地中で、1x105細胞/mLおよそ8.9x106個の総細胞に再懸濁した。各転写レポーターを、1.2mLのOPTI-MEM登録商標、12μLの転写レポーターDNA100ngおよび36μLのFUGENE登録商標HD形質移入試薬を混合することにより形質移入用に作製し、室温で35分間インキュベートした。インキュベートした後、624μLの形質移入/レポーターDNA混合物を、12mLの細胞懸濁液に加え、反転によって混合した。混合後、100μLの細胞/DNA混合物を、96ウェルプレートのウェルに加えた2コンストラクト/プレート。細胞を、37°Cで22時間インキュベートした。OPTI-MEM登録商標中の、Tert-ブチルヒドロキノンNrf2安定剤;tBHQ;1μMベースラインまたは20μMまたはスルホラファンNrf2を活性化させることが知られている有機硫黄抗酸化剤;1μMベースラインまたは20μMを、各ウェルに加え、37°Cで24時間インキュベートした。フォワードトランスフェクションについての上記の通りの100μLの溶解試薬を用いて、細胞を溶解させた。発光をGLOMAX登録商標ルミノメーターで測定した。表29は、1μMベースラインまたは20μMのスルホラファンで処理された、AREを含有する転写レポーターを発現するHEK293細胞の発光、およびスルホラファンに対する応答すなわち、20μMのスルホラファン処理細胞の発せられた発光で除算された、1μMのスルホラファン処理細胞により発せられた発光を示している。表30は、1μMベースラインまたは20μMtBHQで処理された、AREを含有する転写レポーターを発現するHEK293細胞の発光、およびtBHQに対する応答すなわち、20μMtBHQ処理細胞の発せられた発光で除算された、1μMtBHQ処理細胞により発せられた発光を示している。表29および表30は、9B8optおよび9B8opt-Pが、AREに対する2つの異なる既知の刺激の存在を報告し得ることを示している。表29:HEK293細胞におけるAREを含有する転写レポーター24時間の時点表30:HEK293細胞におけるAREを含有する転写レポーター24時間の時点大量トランスフェクションフォワードトランスフェクションにおいて記載された、CREおよび9B8optまたは9B8opt-Pを含有する転写レポーターを、HEK293細胞およびNIH3T3細胞の大量トランスフェクションで使用した。熱ショック応答要素HRE;配列番号67および9B8optまたは9B8opt-Pを含有する転写レポーターを、pGL4.29プロメガ社バックボーンにおいて作製した。すなわち、pGL4.29ベクターのluc2P遺伝子を9B9optまたは9B8opt-Pで置き換え、CREをHREで置き換えた。HREおよび9B8opt-Pを含有する転写レポーターを、HeLa細胞の大量トランスフェクションで使用した。HEK293、NIH3T3、またはHeLa細胞を、HEK293細胞については、3mLの完全培地DMEM10FBS1×NEAA1×ピルビン酸ナトリウム中で4.5×105細胞/ウェルの密度で、NIH3T3細胞については、3mLの完全培地DMEM10ウシ胎仔血清FCS1×NEAA1×ピルビン酸ナトリウム中で3×105細胞/ウェルの密度で、またはHeLa細胞については、3mLの完全培地DMEM10FBS1×NEAA中で9.9×105細胞/ウェルの密度で、形質移入の前日に6ウェル組織培養プレートの1つのウェルに播種した。細胞を37°Cで一晩増殖させた。155μLのOPTI-MEM登録商標中の3,300ngのレポータープラスミドDNAを9.9μLのFUGENE登録商標HD形質移入試薬と混合し、短時間ボルテックスし、室温で10分間インキュベートした。CRE転写レポーターをHEK293細胞およびNIH3T3細胞の形質移入に使用した。HRE転写レポーターをHeLa細胞の形質移入に使用した。レポーター混合物を細胞に加え、穏やかに前後に揺らして混合した後、37°Cで6時間HEK293およびNIH3T3または3時間HeLaインキュベートした。次に、細胞をトリプシン処理し、培地HEK293細胞に対してはDMEM10FBS1×NEAA1×ピルビン酸ナトリウム、NIH3T3細胞に対してはDMEM10FCS1×NEAA1×ピルビン酸ナトリウム、またはHeLa細胞に対してはDMEM10FBS1×NEAAに再懸濁し、その後、96ウェルプレートの各ウェルに播種しHEK293については20,000細胞/100μL、NIH3T3については10,000細胞/100μL、またはHeLaについては13,000細胞/μL、37°Cで一晩インキュベートした。OPTI-MEM登録商標中の、FSKCRE刺激物質または17-AAGHRE刺激物質;17-アリルアミノ-デメトキシゲルダナマイシンを、細胞に加えFSKについては、10nMまたは10μM最終濃度;17-AAGについては、1nMまたは1μM最終濃度、37°Cで4時間FSKまたは6時間17-AAGインキュベートした。プレートを恒温器から取り出し、25分間、室温に対し平衡化させた。フォワードトランスフェクションについての上記の通りの100μLの溶解試薬を用いて、細胞を溶解させた。GLOMAX登録商標ルミノメーターで発光を測定した。表31は、10nMベースラインまたは10mMFSKで処理された、CREを含有する転写レポーターを発現するHEK293細胞の発光、およびFSKに対する応答を示している。表32は、10nMベースラインまたは10mMFSKで処理された、CREを含有する転写レポーターを発現するNIH3T3細胞の発光、およびFSKに対する応答を示している。表33は、10nMベースラインまたは10mM17-AAGで処理された、HREを含有する転写レポーターを発現するHeLa細胞の発光、および17-AAGに対する応答を示している。表29~表31は、19B8optOgLuc変異体の両バージョンとも、2つの異なる細胞株、HEK293およびNIH3T3という背景において、CREに対するFSKの存在および刺激作用を報告することができること、並びに、29B8optPが、HeLa細胞という背景において、HREに対する17-AAGの存在および刺激作用を報告することができることを示している。表31:HEK293細胞におけるCREを含有する転写レポーター4時間の時点表32:NIH3T3細胞におけるCREを含有する転写レポーター4時間の時点表33:HeLa細胞におけるHREを含有する転写レポーター6時間の時点実施例38.発現困難な細胞DifficulttoExpressCellにおける溶解性レポーターおよび分泌型レポーター細胞懸濁液中の1×105細胞/mLのHepG2細胞に、プラスミドDNAL27V02、luc2Pプロメガ社、luc2プロメガ社またはL27V02-IL6IL-6分泌配列と置き換えられた天然分泌配列を有するL27V02;IL601-L27V02A;配列番号324を含有するpGL4.32バックボーン;プロメガ社を、FUGENE登録商標HDを用い、製造業者の取扱説明書に従って、リバーストランスフェクションしたDNA-形質移入混合物対細胞が1:20。次に、100μLの細胞懸濁液を96ウェルプレートのウェルに播種し、37°C、5CO2で22時間インキュベートした。IL-6分泌配列で置き換えられた天然分泌配列を有する他のOgLucコンストラクトとしては、IL601-L27V01およびIL602-L27V03それぞれ、配列番号321および327が挙げられる。分泌分析のために、培地を細胞から除去して、細胞を100μLのDPBSで洗浄した。100μLの完全培地DMEM10FBS1×NEAAを、変動用量1pg/mL~100ng/mLのrhTNFαTNFαと一緒に、4.5時間加えた。次に、10μLの培地を取り出し、90μLの完全培地に加え、100μLのアッセイ試薬前述と同様;100μMPBI-3939を加えた。発光を前に記載した通りに測定した図62A。溶解性分析のために、播種後、細胞を37°C、5CO2で4.5時間インキュベートした。次に、細胞を20分間、室温に対して平衡化した。アッセイ試薬前述と同様;100μMPBI-3939を細胞に加え、発光を前に記載した通りに測定した図62B。実施例39.溶解性レポーターの追加の特徴細胞ベースの、溶解性転写レポーターという背景における本発明のOgLuc変異体は、他のルシフェラーゼを用いて現れ得るよりも早くシグナルが現れる程の大きさの発光シグナルを提供するはずである。明るい発光によって、弱いプロモーターが試験されることも可能となるはずである。実施例40.哺乳類細胞形質移入本発明のOgLuc変異体を、形質移入困難な細胞株difficulttotransfectcellline、例えば、Jurkat、HepG2、初代細胞、非分裂初代細胞、または幹細胞例えば、図59C参照において、レポーターとして使用した。それらの高いシグナル強度により、OgLuc変異体は、形質移入効率が低い場合に、検出可能な発光を可能にする。OgLuc変異体は、形質移入に関連する条件、すなわち、DNA濃度、形質移入試薬添加に特に感受性を有する細胞においても、レポーターとして使用することができる。OgLuc変異体の輝度により、適切な発光レベルを、より低いDNA濃度、より少ない形質移入試薬、および恐らくは、アッセイ開始前のより短い形質移入後時間を用いて、達成することができる。これは、そうでなければ感受性細胞であろうものに対して、毒性という負担をそれほど与えないであろう。OgLuc変異体の明るい発光は、そのような出力が望ましい事象において、非常に長い時点で、シグナルが検出されることも可能にするはずである。別の例として、OgLuc変異体は、単一コピーの天然プロモーター、例えば、HSBチミジル酸キナーゼTKプロモーター、HOX遺伝子、またはLIN28に対するレポーターとして使用され得る。実施例41.安定した細胞株細胞質中でまたは分泌型として本発明のOgLuc変異体を発現する、頑強で安定した細胞株の特定は、ルシフェラーゼの明るいシグナルおよび小サイズのOgLuc遺伝子によって容易となり得る。比較的小さな遺伝子配列は、外来DNA組込みによってもたらされる遺伝的不安定性の可能性を減少させるはずである。本発明のOgLuc変異体を用いて安定な細胞株を作製するために、OgLuc変異体および選択マーカー遺伝子、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはピューロマイシンのヌクレオチド配列を含むプラスミドDNAを、目的の細胞株、例えば、HEK293細胞の形質移入に使用する。初期継代数、例えば10継代未満の細胞を、T251×106またはT753×106組織培養フラスコに播種し、一晩増殖させて、およそ75コンフルエントにする。次に、細胞を、上記プラスミドDNAおよび適切な形質移入試薬、例えば、TRANSIT登録商標-LT1またはFUGENE登録商標HDを用いて形質移入する。形質移入の48時間後、培地を、細胞上で、選択薬剤、例えば、G418、ハイグロマイシンまたはピューロマイシンを、未形質移入細胞を死滅させるのに予め決定された濃度で含有する選択培地で置き換える。プラスミドDNAを含有する細胞の選択は2~4週間かけて行われる。この期間中、細胞を、選択培地中で種々の濃度で、T25またはT75組織培養フラスコのいずれかに再播種する。再播種された細胞上の培地は、2~3週間、3~4日毎に、新しい選択培地と取り換える。フラスコは生細胞コロニーの情報を求めてモニターされる。最終的に、フラスコは、多くの大コロニーを含むが、死細胞はほとんど含まない。フラスコ中の安定したコロニーのプールから、単一コロニーを単離し、1枚の24ウェル組織培養プレート中に増殖させる。簡潔に説明すると、細胞をトリプシン/EDTA法を用いて回収する。すなわち、培地を除去し、Ca2およびMg2を含有しないPBSで洗い、トリプシン/EDTAで処理することにより剥離して、細胞を回収する。細胞を、血球計数器を用いて計数し、完全培地中で1×105に希釈する。次に、細胞を、完全培地中で100細胞/mL、33細胞/mL、10細胞/mL、および3.3細胞/mLに希釈する。100μLの各希釈物を、96ウェル組織培養プレートの全ウェルに播種し各希釈に対し1プレート、4~5日間増殖させて、その後、50μLの選択培地を細胞に加える。播種からおよそ1週間後、細胞を、コロニー増殖を求めて目視で選別し、別の50μLの選択培地を加える。単一コロニーがウェルの面積の40~60を占めるまで、細胞を継続的にモニターする。コロニーが増殖および選別できる状態であるとき、トリプシン/EDTA法を用いてコロニーを回収する。各コロニーを以下のように選択培地に移す:1機能アッセイ、例えば発光検出用に、1:10に希釈して、96ウェルアッセイプレートの6ウェルに移す;2細胞生存率アッセイ、例えば細胞TITER-GLO登録商標発光細胞生存率アッセイプロメガ社用に、1:10に希釈して、透明底96ウェルアッセイプレートの3ウェルに移す;並びに3増殖用に、1:10に希釈し、24ウェル組織培養プレートに移す。次に、機能アッセイおよび細胞生存率アッセイ用のプレート中の細胞を2~3日間増殖させて、機能アッセイおよび細胞生存率アッセイを行う。24ウェルプレート中の陽性クローンを、機能アッセイおよび細胞生存率アッセイを用いてさらに試験し、さらに、少なくとも20継代の間の発現および応答の安定性、正常な増殖率形態を試験し、将来での使用のために可能な限り早期の継代で凍結する。実施例42.OgLuc分泌シグナル分析A.IVopt野生型OgLucは、合成後に処理されて、分泌シグナル配列が切断された成熟タンパク質にされる。分泌シグナル配列がOgLuc変異体の分泌を促進するかどうかを決定するために、実施例25のIVopt変異体およびhRLを、N末端OgLuc分泌シグナル配列番号54を含有するpF4Agにクローニングした。10ウシ胎児血清FBSを含有する100μLのダルベッコー修飾イーグル培地DMEM中のHEK293細胞15,000に、実施例25に記載の通りに、100ngのプラスミドDNA、すなわち、分泌シグナルを含む、または含まないhRLまたはIVoptを形質移入し、37°Cで一晩増殖させた。50μLの培地を取り出し、新しいプレートに移し、後のアッセイ用に保存し、培地試料を作製した。培地の残りを除去し、実施例25に記載される100μLの溶解緩衝液で細胞を溶解させ、溶解物試料を作製した。10μLの培地試料および10μLの溶解物試料を発光についてアッセイした図63。OgLuc分泌シグナル配列を有するウミシイタケ属Renillasigまたは有さないウミシイタケ属RenillahRLの試料を、20μM天然セレンテラジンを含有する50μLの溶解緩衝液を用いて測定した。OgLuc分泌シグナル配列を有するIVoptsigまたは有さないIVoptIVoptの試料を、20μMPBI-3939を含有する50μLの溶解緩衝液を用いて測定した。図63において、黒塗りのバーは、いかなる溶解試薬も存在しない培地から検出された光の量を表す。白いバーは、溶解試薬を添加したときに検出された光の合計分泌物非分泌物を表す。図63は、IVoptがHEK293細胞から増殖培地に分泌されたこと、および分泌シグナル配列が哺乳類細胞において機能的であったことを示している。IVoptsigは、かなりの量のルシフェラーゼが培地中で検出された唯一の状況を表している。結果は、この特定のシグナルペプチドがhRLの分泌を促進しなかったことも示している。B.9B8、V2およびL27VOgLucの分泌シグナル配列がその分泌を促進するかどうかを検定するために、OgLuc変異体9B8、V2およびL27Vを、N末端OgLuc分泌シグナル配列を含有するpF4Agにクローニングした。変異体を、分泌シグナル配列を含有しないベクターにもクローニングした。次に、CHO細胞またはHeLa細胞を、10FBSおよび1×ピルビン酸ナトリウムを含有する1mLのF12培地CHO細胞中、または10FBSおよび1×ピルビン酸ナトリウムを含有するDMEMHeLa細胞中で、100,000細胞/ウェルで、12ウェルプレート中に播種し、37°C、5CO2で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、細胞に、分泌シグナル配列を含み、または含まずに、9B8、V2、またはL27Vを含有する1μgのプラスミドDNAを、TRANSIT登録商標-LT1形質移入試薬ミラスバイオ社MirusBioおよびOPTI-MEM登録商標培地インビトロジェン社を用いて、形質移入した。再度、細胞を37°C、5CO2で一晩インキュベートした。2度目の一晩インキュベーションの後、培地を取り出し、分析用に保存した。細胞に、1mLのアッセイ緩衝液1mMCDTA、150mMKCl、2mMDTT、100mMMESpH6.0、35mMチオ尿素および0.5TERGITOL登録商標NP-9v/vを加え、細胞溶解物を作製した。各試料から得られた10μLの細胞溶解物または保存した培地に、40μMPBI-3939を含有する50μLのアッセイ緩衝液を加え、発光を上記の通りに測定した。図64A~Dは、9B8、V2およびL27V変異体が分泌系secretablesystemで使用できることを示す。分泌された変異体の安定性を決定するために、各試料から得られた保存した培地の一定分量150μLを、37°Cまたは50°Cに置いた。次に、その一定分量を異なる時点0分、1分、2分、3分、5分、6分、および7分で取り出し、ドライアイス上で凍結し、アッセイされるまで-20°Cに保った。安定性についてアッセイするため、培地の一定分量を室温まで解凍し、10μLの各一定分量を、上記の通りの、PBI-3939を含有するアッセイ緩衝液pH6.0と混合した。発光を上記の通りに測定し、半減期t50を決定した表34。表34C.9B8およびV2と、メトリディアロンガMetridialongaの分泌型ルシフェラーゼとの比較OgLuc変異体9B8およびV2の分泌を、メトリディアロンガMetridialongaから得られた分泌型ルシフェラーゼのそれと比較した。CHO細胞を、10FBSを含有する3mLのF12培地中で300,000細胞/ウェルで、6ウェルプレートのウェル中に播種し、37°C、5CO2で一晩インキュベートした。次に、TRANSIT登録商標-LTIを用い、製造業者の取扱説明書に従って、10ngまたは100ngの各変異体またはメトリディアMetridiaルシフェラーゼクロンテック社プラスミドDNAを、細胞に形質移入し、37°C、5CO2で20時間インキュベートした。形質移入後、培地を細胞から取り出して、アッセイした。OgLuc変異体については、50μLのアッセイ試薬前述;40μMPBI-3939を用いて、50μLの培地をアッセイした。メトリディアMetridiaルシフェラーゼについては、Ready-to-Glo商標分泌型ルシフェラーゼレポーター系クロンテック社を用い、製造業者のプロトコルに従って、培地をアッセイした。簡潔に説明すると、5μLの1×基質/反応緩衝液を50μLの培地試料に加えた。次に、発光を前に記載した通りに測定した図65A~B。実施例43.生細胞中でのOgLuc変異体および新規セレンテラジンの評価A.生細胞中でのOgLuc変異体およびPBI-3939の使用を試験した。HEK293細胞を96ウェルプレート中に、15,000細胞/ウェルで播種し、37°Cで一晩増殖させた。次の日、細胞に、3連でTRANSIT登録商標-LT1を用いて、pF4Ag中の100ngのhRLまたは9B8optを一過的に形質移入し、37°Cで一晩増殖させた。次の日、hRLおよび9B8opt形質移入細胞の両方について、増殖培地を除去し、60μMVIVIREN商標生細胞基質プロメガ社、60μMENDUREN商標生細胞基質プロメガ社、または60μMPBI-3939を含有する培地で置き換えた。非形質移入細胞はバックグラウンド対照として使用した。プレートを37°Cで1日間インキュベートし、TECAN登録商標GENIOS商標プロルミノメーターで定期的に、すなわち24時間の間に11回測定した。図66A~Bは、各基質について、非形質移入細胞の発光で除算された形質移入細胞の発光、すなわちシグナル/バックグラウンド比を示している。データは、細胞をVIVIREN商標、ENDUREN商標、またはPBI-3939と一緒にインキュベートすることによって、9B8optが生細胞環境すなわち、溶解無しにおいて発光を生じたことを示している。データは、PBI-3939が培養液中の細胞に浸透し、OgLuc変異体と反応し、発光を生じることができ、それ故、OgLuc変異体を生細胞アッセイにおける使用に適合することも明らかにした。B.OgLuc変異体を用いて生細胞分析を実証するために、L27VをHaloTag登録商標に融合させ、生細胞中で発現させてモニターした。U2OS細胞を、40,000細胞/mLでイメージングチャンバウェルに播種し、37°C、5CO2で一晩インキュベートした。次に、FUGENE登録商標HDを用い、製造業者のプロトコルに従って、L27Vを含有するプラスミドpFC14K、pFN21KもしくはpF4Ag全てプロメガ社、または天然配列もしくはIL-6分泌配列を有する、L27Vを含有するpF4Agを、細胞に形質移入した。次に、細胞を37°C、5CO2で24時間インキュベートした。インキュベートした後、細胞をHaloTag登録商標TMRリガンドプロメガ社に暴露し、画像取得し、固定した。次に、HaloTag登録商標技術におけるICCプロトコル:FocusonImaging技術マニュアルプロメガ社;TM260に従って、免疫細胞化学ICCを行った。使用した一次抗体は、ウサギ抗OgLuc9B8ポリクローナル抗体1:1000であった。使用した二次抗体は、アレクサ488結合二次抗体緑であった図67A。図67Aは緑色蛍光チャネルを示しており、図67Bは微分干渉コントラストDICを示している。37°CCO2雰囲気試料室ソーレントサイエンティフィック社SolentScientificLtd、イギリスを取り付けた、オリンパス社製FluoviewFV500共焦点顕微鏡オリンパス社、米国を用いて、画像を得た。図67B~Dは、天然配列またはIL-6分泌配列を有する場合の、ICCイメージを示している。両方のシグナル配列が、核内の酵素量を劇的に減少させる。細胞質における標識化の区切り性質punctuatenatureは、分泌過程で起こることが予測されるベシクル形成を示すものである。データは、シグナルペプチドの存在が核中のルシフェラーゼ量を減少させることを示す。C.上で示されるように、本発明のOgLuc変異体および新規基質は生体適合性である。OgLuc変異体が目的のプロモーターを有する発現ベクターにクローニングされ、レポータータンパク質として細胞中で発現されるという、レポーター系が想定される。次に細胞は、培養下の細胞に浸透し、OgLuc変異体と反応し、発光を生じるPBI-3939で処理される。細胞浸透性であることに加えて、PBI-3939は、細胞生存率の点で天然セレンテラジンに匹敵する生体適合性を示す。培地中の天然セレンテラジンの安定性を増加させることが知られている化学修飾を含むあるバージョンの化合物3939は、合成可能で、より頑強な生細胞でのOgLuc変異体ベースのレポーターアッセイに使用することができる。生細胞でのレポーター機能reportingの別の例には、分泌型OgLuc変異体のレポーターとしての使用が含まれる。天然の分泌シグナルペプチドまたは他の既知の分泌シグナルペプチドは、OgLuc変異体のN末端に融合することができ、それによって、該融合体が哺乳類細胞で発現される場合に、その一部分が細胞膜を貫通して培地中に分泌される。基質を添加すると、発光が生み出される。実施例44.タンパク質融合レポーター本発明のOgLuc変異体は、目的の標的タンパク質に対する融合タグとして、その標的タンパク質の細胞内レベルをモニターする手段として使用することができる。ストレス応答経路、例えば、DNA損傷、酸化的ストレス、炎症に関わる特定のタンパク質は、各種の刺激がこれらの経路で果たす役割を探索する手段として、細胞中でモニターすることができる。変異体は、標的タンパク質の細胞輸送をモニターする手段としても使用することができる。変異体は、ウイルスゲノム例えば、HIV、HCVにも融合することができ、それにより、有望な抗ウイルス剤での処理の後に、力価レベル、すなわち感染価を細胞中でモニターすることができる。変異体は標的タンパク質に加えて緑色蛍光タンパク質GFPまたはHalotag登録商標にも融合することができ、それによって、高発現クローンを特定し、局在情報を提供するのにFACSを使用することができる。実施例45.3成分融合タンパク質サンドイッチにおけるOgLuc変異体の評価3成分融合タンパク質、またはサンドイッチ融合体は、BRETに基づくバイオセンサーの最適化のために、生物発光タンパク質および蛍光タンパク質を互いに近くに配置するのに使用することができる。A.C14AE、IV、9B8および9F6OgLuc変異体C14AE配列番号55および56、IV配列番号57および58、9B8配列番号61および62、および9F6配列番号63および64、並びにhRL配列番号32および33を、不良な融合パートナーとして知られるN末端IdBenezraetalCell614959、および正規化のために用いられたC末端HT7を有するpF4Ag融合ベクターに、クローニングした。目的の遺伝子をIdとHT7の間にサンドイッチしたすなわち、Id-ルシフェラーゼ-HT7。pF4AgまたはpF4Agサンドイッチバックグラウンドにおいて変異体コンストラクトを含有する大腸菌Ecoli溶解物を、実施例26に記載の通りに調製し、次に、実施例25に記載の緩衝液中の20μM天然セレンテラジンを用いてアッセイした。図68は、pF4AgまたはpF4Agサンドイッチバックグラウンドのいずれかにおける各変異体の発光を示しているSand。図69は、IdおよびHT7の存在による、pF4Agにおける変異体の発光をpF4Ag-サンドイッチにおける変異体の発光で除算することによって決定された、発光における低減倍率を示している。最大値を有する試料は、不良な融合パートナーIdに対して最も高い感受性を示した。変異体9B8は、サンドイッチ背景において最も明るかった。B.9B8OPTおよび9B8OPTK33N変異体9B8optおよび9B8optK33Nを、上記の通りに、サンドイッチバックグラウンドにおいて分析した。9B8opt配列番号40および41および9B8optK33N配列番号59および60のサンドイッチコンストラクトを、上記の通りに構築した。大腸菌Ecoli溶解物を、図40を作製するのに用いたものと同じアッセイ緩衝液およびルミノメーターを用いて、アッセイし、測定した。図70は、サンドイッチバックグラウンドの存在下における低減倍率を示しており、これは、9B8optK33Nが、9B8optと比べて、不良な融合パートナーIdに対する感受性が低いことを示している。C.23D2および24C2変異体23D4NFおよび24C2NFをId-OgLuc-HT7サンドイッチバックグラウンドにサブクローニングし、大腸菌Ecoliにおいてアッセイした。サンドイッチ変異体、23D4F配列番号76および77および24C2F配列番号78および79を、サンドイッチバックグラウンドにおける9B8optK33N配列番号59および60と比較した。表35は、変異体が、サンドイッチバックグラウンドbackgroundcontextにおける9B8optK33Nと少なくとも同じ発光を有していたことを示している。表35:サンドイッチバックグラウンドにおける9B8optK33N170Gと比較した場合の、OgLuc変異体により発せられる発光の増加D.1F7および15H1Id-OgLuc-HT7サンドイッチバックグラウンドにおけるPCRライブラリーを、サンドイッチバックグラウンドにおける9B8optK33Nと比較して増加された発光を有する追加の変異体を求めてスクリーニングした。次に選別された変異体をHEK293細胞およびNIH3T3細胞においてアッセイした。表36は、大腸菌Ecoli、HEK293細胞およびNIH3T3細胞での、サンドイッチ変異体の発光における増加倍率、並びにこれらの変異体に存在するアミノ酸置換を示している。1F7F配列番号84および85および15H1F配列番号86および87は、大腸菌Ecoliでの発光において少なくとも1.3の増加倍率を有していた。1F7Fは、HEK293細胞およびNIH3T3細胞での、サンドイッチバックグラウンドにおける9B8optK33Nよりもより明るかった。表36:サンドイッチバックグラウンドにおける9B8optK33Nと比較した場合の、OgLuc変異体により発せられる発光の増加サンドイッチ変異体をpF4Agベースの非融合型バックグラウンドベクターにサブクローニングして1F7NF配列番号80および81および15H1NF配列番号82および83を作製し、上記の通りに分析し、9B8optK33Nと比較した。表37は、大腸菌Ecoli、HEK293細胞およびNIH3T3細胞での、変異体の発光における増加倍率を示している。1F7NFおよび15H1Fは、大腸菌EcoliおよびHEK293細胞での発光において少なくとも1.3の増加倍率を有していた。表37:9B8optK33N170Gと比較した場合の、OgLuc変異体により発せられる発光の増加E.V2、9B8optK33NL27VK43RY68D、9B8optK33NL27VT39TK43RS66NおよびL27V変異体9B8optK33NT39TK43RY68DV2;配列番号92および93、9B8optK33NL27VK43RY68D配列番号339および340、9B8optK33NL27VT39TK43RS66N配列番号341および342、および9B8optK33NL27VT39TK43RY68DL27V;配列番号88および89を、上記の通りにId-OgLuc-HT7サンドイッチバックグラウンドにサブクローニングし、上記の通りにHEK293細胞およびNIH3T3細胞においてアッセイした。サンドイッチされた変異体により発せられた発光を、9B9optK33Nサンドイッチ配列番号59および60により発せられた発光表38と比較した。L27Vサンドイッチ配列番号90および91およびV2サンドイッチ配列番号94および95は、HEK293細胞およびNIH3T3細胞での発光において少なくとも1.3の増加倍率を示した。表38:サンドイッチバックグラウンドにおける9B8optK33Nと比較した場合の、サンドイッチバックグラウンドにおけるOgLuc変異体により発せられた発光における増加変異体V2、9B8optK33NL27VK43RY68D、9B8optK33NL27VT39TK43RS66N、およびL27Vのサンドイッチバージョンおよび非サンドイッチバージョンを、実施例37に記載の通りにHEK293細胞およびNIH3T3細胞においてアッセイした。非サンドイッチ型変異体により発せられた発光を、サンドイッチ型変異体により発せられた発光と比較した表39。表39に示されるデータは、図70に示されるように、9B8optK33Nサンドイッチの発光における低減倍率が、大腸菌Ecoli細胞においてよりも、哺乳類細胞においてより少なかったことを示している。表39:サンドイッチバックグラウンド存在下でのOgLuc変異体の発光における減少倍率実施例46.多重化A.変異体9B8optを発現する大腸菌Ecoliの溶解物を、実施例27における先の記載の通りに調製し、フェノールレッド無しのDMEM0.1PRIONEX登録商標中で1000倍に希釈した。6.3μg/mLの精製赤色コメツキムシルシフェラーゼおよび変異体9B8optを発現する大腸菌Ecoli溶解物を含有する試料からの発光を、改変されたDUAL-GLO登録商標ルシフェラーゼアッセイ系プロメガ社を用いて、検出した。20μMセレンテラジン-hを含有するDUAL-GLO登録商標STOPGLO登録商標試薬、および20μMPBI3939を含有するDUAL-GLO登録商標STOPGLO登録商標試薬を、製造業者のプロトコルに従って使用し、単一試料からの赤色コメツキムシルシフェラーゼおよびOgLuc変異体9B8ルシフェラーゼを検出した。3連で実行した。発光をターナー社Turner製MODULUS商標ルミノメーターで検出した。表40は、赤色コメツキムシルシフェラーゼコメツキムシにより発せられた平均発光、およびセレンテラジン-hcoelhまたはPBI-39393939を使用した場合に9B8optOglucにより発せられた発光を示している。標準偏差/-および変動係数CVも示される。セレンテラジン非存在下における、DUAL-GLO登録商標ルシフェラーゼアッセイ系のDUAL-GLO登録商標STOPGLO登録商標試薬による赤色コメツキムシシグナルの消光量を示すために、セレンテラジン無し対照を行った。セレンテラジン無し対照は、349倍の消光をもたらした。表40は、赤色コメツキムシおよびOgLuc変異体9B8両方からの大きな発光シグナルが、単一試料で検出されたことを示している。このことは、各シグナルが、2段階アッセイにおいて連続して読み取り可能であること、および、第一酵素からのシグナルが第二酵素からのシグナルに有意な寄与を与えないだけ十分に消光され得ることを示す。表40:改変されたDUAL-ルシフェラーゼ商標レポーターアッセイを用いた、赤色コメツキムシルシフェラーゼおよび9B8optルシフェラーゼにより発せられた平均発光B.上記の多重レポーターアッセイを逆順すなわち、OgLuc発光を最初に検出し、消光し、そして第二発光を検出で行うことができることを示すために、例えば、赤色コメツキムシまたはホタルルシフェラーゼ、種々のウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼ阻害剤米国特許出願公開第2008/0248511号参照を、OgLucも阻害するそれらの能力を求めてスクリーニングした。2つの異なる、先に特定された、ウミシイタケ属Renilla阻害剤、PBI-3077および1424を、変異体9B8上記の通りに希釈を発現する大腸菌Ecoli溶解物試料、並びに100mMMESpH6.0、1mMCDTA、150mMKCl、35mMチオ尿素、2mMDTT、0.25TERGITOL登録商標NP-9v/v、0.025MAZU登録商標DF204、および20μMPBI-3939を含有する緩衝液に、種々の濃度で表41参照加えた。発光をGLOMAX登録商標-マルチマイクロプレートルミノメータープロメガ社;ターナー社製MODULUS商標としても知られているを用いて測定したこと以外は前に記載した通りに、発光を測定した。表41に示されるように、両化合物がOgLuc発光を阻害することができた。このことは、レポーターアッセイにおいてOgLuc変異体が別のルシフェラーゼと多重化され得、OgLuc変異体からの発光が、レポーターアッセイにおいて最初に検出されるということを示す。表41:PBI-3939を基質として用いて、9B8optを発現する細菌溶解物により発せられた発光に対する、PBI-3077およびPBI-1424の影響C.OgLuc変異体L27VとホタルルシフェラーゼFluc間のスペクトル分解を解析した。フェノールレッド無しのDMEM0.1PRIONEX登録商標中の精製L27V前述;9.54pMを、20μMPBI-3939を含有するアッセイ試薬前述と混合した。同じ培地中の精製ホタルルシフェラーゼ酵素QUANTILUM登録商標組換えルシフェラーゼ;プロメガ社;271ng/mLを、試薬100mMHEPESpH7.4、1mMCDTA、16mMMgSO4、1TERGITOL登録商標NP-9v/v、0.1MAZU登録商標DF204、5mMATP、50mMDTT、333μMルシフェリンと混合した。1×ウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼアッセイ溶解緩衝液プロメガ社中の精製ウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼ5ng/mLGST-ウミシイタケ属Renillaを、ウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼアッセイ緩衝液中の10.5μMの天然セレンテラジンと混合した。L27VおよびFlucについては3分後に、ウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼについては10分後に、発光を測定した図71。D.別の例として、本発明のOgLuc変異体は、転写レポーターとして使用することができ、エクオリンまたはcAMP循環置換型ホタルルシフェラーゼバイオセンサーのいずれかまたは両方同時にと対合して、単一試料における複数の経路を検出することができる例えば、エクオリンはカルシウムの検出および/または測定用、バイオセンサーはcAMPの検出および/または測定用、そしてOgLuc変異体は下流の遺伝子発現のモニタリング用。E.本発明のOgLuc変異体との多重化の他の例としては、以下が挙げられる:i細胞に本発明のOgLuc変異体およびホタルルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、第一試薬が、細胞を溶解させるために、並びに、第一のルシフェラーゼに発光を発するための基質を提供するために、添加され得る。次に、第一ルシフェラーゼからの発光が測定されることとなる。次に、第二の試薬が、第一ルシフェラーゼからの発光を消光するために、並びに、第二のルシフェラーゼから発光を生み出すための基質を提供するために、加えられることとなる。次に、第二のルシフェラーゼからの発光が測定されることとなる。どのルシフェラーゼを最初に測定するかの選択は、第二の試薬による、第一ルシフェラーゼからの発光を消光する能力にのみ依存することになるであろう。この例において、高濃度のルシフェリンホタルルシフェラーゼに対する基質はOgLuc変異体の活性を阻害することが示されているため、OgLuc変異体からの発光は最初に測定され得る。ii細胞に、本発明のOgLuc変異体およびホタルルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、第一のルシフェラーゼのための、発光を発するための生細胞基質を含有した第一試薬が添加され得る。次に、第一ルシフェラーゼからの発光が測定されることとなる。次に、第二の試薬が、細胞を溶解させるために、第一ルシフェラーゼからの発光を消光するために、そして第二のルシフェラーゼから発光を生み出すための基質を提供するために、加えられることとなる。次に、第二のルシフェラーゼからの発光が測定されることとなるであろう。これは、細胞溶解が、生細胞基質の利用をさらに制限し、第一ルシフェラーゼからの発光の消光に寄与すること以外は、iと類似している。iii細胞に本発明のOgLuc変異体およびホタルルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、両方のルシフェラーゼから発光を発するための基質を含んでいた1つの試薬が添加され得るが、各ルシフェラーゼからの発光はスペクトル的に異なっている。OgLuc変異体の発光極大はおよそ460nmであり、ホタルルシフェラーゼに対するある基質、例えば5’-クロロルシフェリンおよび5’-メチルルシフェリンは、およそ610nmの発光極大を生み出すことができる。従って、青色発光から赤色発光へのいくらかの重なりは存在し得るが、青色発光への赤色発光の重なりは存在しないであろう。このことは、数学的補正はほとんど含まれるないであろうことを示唆している。iv細胞に本発明のOgLuc変異体およびホタルルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、両方のルシフェラーゼから発光を発するための生細胞基質を含んでいた1つの試薬が添加され得る。この例の独自の特徴は、ホタルの発光が、生細胞アッセイ温度、例えば37°Cで、赤色に変化する傾向があり、そのため、いくつかの異なるルシフェリン誘導体が、OgLuc変異体のとはスペクトル的に異なる発光を発するために、ホタルルシフェラーゼに対する生細胞基質として選択され得るということである。v細胞に本発明のOgLuc変異体およびウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、第一試薬が、細胞を溶解させるために、並びに、第一のルシフェラーゼに発光を発するための基質を提供するために、添加され得る。次に、第一ルシフェラーゼからの発光が測定されることとなる。次に、第二の試薬が、第一ルシフェラーゼからの発光を消光するために、並びに、第二のルシフェラーゼから発光を生み出すための基質を提供するために、加えられることとなる。次に、第二のルシフェラーゼからの発光が測定されるだろう。どのルシフェラーゼを最初に測定するかの選択は、第二の試薬による、第一ルシフェラーゼからの発光を消光する能力にのみ依存するであろう。この例として、OgLuc変異体またはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼのいずれかの発光を消光するための阻害剤の使用が、必要とされるだろう。vi細胞に本発明のOgLuc変異体およびコメツキムシルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、両方のルシフェラーゼから発光を発するための基質を含んでいた1つの試薬が添加され得るが、コメツキムシルシフェラーゼは天然ルシフェリンによって赤色に変化した発光を発するため、各ルシフェラーゼからの発光はスペクトル的に異なっている。実施例47.循環置換L27V変異体の循環置換CPバージョンを2つ作製した:CP84およびCP95。数字記号はN末端の残基を指す例えば、84は、CPバージョンの新しいN末端を表す。。循環置換を作製するために、先のN末端およびC末端は、リンカー無しCP84リンカー無し配列番号97および98、CP95リンカー無し配列番号105および106または5CP845AAリンカー配列番号99および100およびCP955AAリンカー配列番号107および108、10CP8410AAリンカー配列番号101および102およびCP9510AAリンカー配列番号109および110、または20CP8420AAリンカー配列番号103および104およびCP9520AAリンカー配列番号111および112アミノ酸リンカー、GSSGGn配列番号113と、N末端およびC末端間で融合される。注意:L27VはN末端でフェニルアラニンから始まるすなわち、MVF。MVはリンカー無しコンストラクト中に存在するが、リンカーコンストラクト中には存在しない。一度循環置換されると、CPL27V変異体は、pF1Kベクターにクローニングされた。大腸菌Ecoli細胞にCPベクターを形質移入し、前述の標準的なウォークアウェイ誘導プロトコルを用いて最少培地中で増殖させた。各CPコンストラクトのために、細胞を96ウェルプレートの8ウェル中で増殖させた。誘導後、各試料からの前記8ウェルをプールし、10μLを、40μLの溶解緩衝液100mMMESpH6.0、0.3×PLB、0.3mg/mLリゾチーム、0.003U/μLデオキシリボヌクレアーゼI、および0.25TERGITOL登録商標NP-9v/v中で、溶解させた。次に、溶解物を溶解緩衝液中で1:100リンカーを有するCPバージョンまたは1:1000非CPバージョンに希釈した。リンカーを含まないCPバージョンは希釈しなかった。溶解物または溶解希釈物を、50μLのアッセイ試薬前述中で、3連でアッセイした。発光を前に記載した通りに測定した図72。実施例48.循環置換のための追加の部位の特定追加のCP部位を特定し、ルシフェラーゼ活性に対するそのCP部位の影響を決定し、断片間のつなぎ鎖tetherの使用を研究するために、L27V変異体のおよそ3番目の部位すなわち、アミノ酸毎に作製された循環置換を有するCPコンストラクトを構築した図73E参照。当業者であれば、他の部位、例えば、1番目および2番目の部位も、本明細書に記載の方法を用いて、本明細書に記載の循環置換されたOgLuc変異体において試験および使用が可能であることを理解するであろう。例えば、L27V変異体は、循環置換、特に、比較的大きな結合ドメインが置換された断片例えばcAMP/RIIbBベースのセンサーの間に配置される状況に対して、特に寛容性があることが分かっている。それぞれの部位に、配列番号328を加えた。下線を引いた配列は、TEVプロテアーゼ認識部位を指す。リンカーの目的は、2つの変異体断片間に、機能的なルシフェラーゼ酵素を生成する方法においてそれらが結合できるように、十分長いつなぎ鎖を提供することである。TEVプロテアーゼ認識部位は、活性を維持することに対するその重要性を調査することができるように、つなぎ鎖を破壊するための手段を提供するために使用されたTEVプロテアーゼの存在下で。TEVプロテアーゼ認識部位の使用は、どのCP部位がタンパク質相補試験PCAに、またはバイオセンサー応用例えば、CP部位間への応答要素の挿入に有用であるかを予測するための方法を作った。TEV切断前に見られる活性は、変異体酵素の各半分が繋ぎ止められた状態でどのように振る舞うかを表す。認識部位に結合するTEVは切断を引き起こし、それによって変異体酵素の各半分を分離させる。TEVにより切断された試料は、非誘導状態を表し、どのくらいの量のバックグラウンドが予想され得るかの指標となるだろう。TEV切断後の低活性は、各半分が誘導無しでは集合することができないことを示している。TEV切断後に大きな活性喪失を示す試料は、PCAおよびバイオセンサー応用において機能するであろう部位を示す。PCAの場合、変異体酵素の各半分は、誘導による結合事象の後に集合する繋留することができる結合パートナーに融合されることとなる。バイオセンサーの場合、各半分は、結合が誘導される立体構造変化が起こった後に、繋留することとなる。PCAについての一例は、L27Vの半分の一方をFRBに、もう一方の半分をFKBPに融合させることとなるであろう。各半分は、ラパマイシンへの暴露によって近くまで運ばれることとなるBanaszynskietalJAmChemSoc12747154721。バイオセンサー応用の一例は、サイクリックAMP結合ドメイン例えば、RIIbBをCP部位間に挿入し、結合ドメインへのサイクリックAMPの結合によって立体構造変化を誘導することであろう。各CPL27Vコンストラクトを構築した後、CP酵素をコムギ胚芽、大腸菌E.coliおよび哺乳類細胞中で発現させ、TEVプロテアーゼで消化して、ルシフェラーゼ活性を調べた。1.コムギ胚芽での分析のために、CPコンストラクトを、TnT登録商標T7カップリングコムギ胚芽抽出系プロメガ社を用い、製造業者の説明書に従って、発現させた。次に、TnT登録商標反応物を1×PBS0.1ゼラチン中で1:100に希釈し、20μLを、25μLのTEV反応試薬5μLの20×ProTEV緩衝液プロメガ社、1μLの100mMDTT、および2μLの10UProTEVPlusプロメガ社に加えた。消化反応物の体積を水で100μLにして、30°Cで60分間インキュベートした。TEVプロテアーゼを含まない対照試料も調製した。次に、10μLの消化試料を、40μlのDMEMに加え、最終体積を50μLにし、50μLのアッセイ試薬前に記載した通り;100μMPBI-3939中でアッセイした。発光を前に記載した通りに測定した図73A~D。2.哺乳類細胞での分析のために、逆トランスフェクションプロトコルを用いて、HEK293細胞にCPL27V変異体を形質移入した。簡潔に説明すると、1ngのCPL27VプラスミドDNAを1μgの担体DNAと混合し、12ウェルプレートの1ウェル中の細胞に加えた。次に、細胞を37°C、5CO2で16時間インキュベートした。次に、細胞から培地を除去し、細胞を1×PBSで洗い、1mLの1×PLBを加えることによって、細胞溶解物を調製した。次に、溶解物を0.1ゼラチンを含有する1×PBS中で1:10に希釈した。次に、40μLの希釈溶解物を、上記の通りのTEVプロテアーゼ消化で使用した。10μLの消化物をフェノールレッドを含まない40μLのDMEMと混合し、50μLのアッセイ試薬前述;100μMPBI-3939を加えた。発光を前に記載した通りに測定した図73H。3.大腸菌Ecoliでの分析の場合、CPL27V変異体を発現する大腸菌Ecoli培養物を、30°Cで一晩増殖させた。これらの培養物を使用してLB抗菌剤中で1:100に希釈、最終的な誘導用の新しい出発培養物を作製した。出発培養物を、37°Cで2.5時間、振盪させながらインキュベートしたOD600はおよそ0.5である。ラムノース0.2の最終濃度を加え、培養物を25°Cに移し、18時間、振盪させながらインキュベートした。溶解物を作製するために、50μLの0.5×FASTBREAK商標細胞溶解試薬プロメガ社を、950μLの誘導された培養物に加え、混合物を22°Cで30分間インキュベートした。次に50μLの溶解した培養物を、上記の通りにTEVプロテアーゼで消化し、室温で2時間インキュベートした。分析のために、溶解物をHaloTag登録商標哺乳類精製緩衝液プロメガ社中で1:10,000に希釈し、50μLを、50μLのアッセイ試薬前に記載した通り;100μMPBI-3939中でアッセイした。基底発光およびTEVにより誘導された発光を、前に記載した通りに、5分の時点で測定し図73F、応答図73Gを決定した。図73A~Dは、小麦胚芽抽出物で発現された種々のCP-TEVプロテアーゼL27Vコンストラクトの基底発光を示している。図73Eは、TEVプロテアーゼに反応した、誘導されたCP変異体を要約したものであり反応は低減倍率、これは、CP変異体をTEVセンサーとして使用できること、すなわち、それらがつなぎ鎖依存性を表すことを示している。少なくとも1.2倍の変化を示す変異体を、スチューデントの検定対応なしのp値;0.03の信頼水準を用い、表示として、さらに妥当性検証した。これらの結果は、各CP変異体が発光を発することが可能であることを示している。種々のCP-TEVプロテアーゼL27VコンストラクトをHEK293細胞中で発現させた。前に記載した逆トランスフェクションプロトコルを用いて、1μgの担体DNAと一緒に、1ウェルあたり1ngのDNAを形質移入した。各細胞試料を、12ウェルプレートにおいて、1mLの培地中で増殖させた。培地を除去し、1mLの1×PLBを添加することで細胞溶解物を調製した。試料を1×PBS0.1ゼラチン中で1:10に希釈した。40μLの希釈試料をTEV消化用に準備した。10μLの消化反応物を、前に記載した通りに、フェノールレッドを含有しない40μLのDMEMおよび50μLのPBI-3939に加えた。図73Hは、HEK293細胞で発現された種々のCP-TEVプロテアーゼL27Vコンストラクトの発光を示している。図73A~H中のデータは、L27V変異体を様々な部位で循環置換できること、および異なる部位がつなぎ鎖の長さと関連した異なる依存性を有していることを示す。哺乳類細胞のデータおよびコムギ胚芽のデータは、TEV切断による同様の低減倍率を示している。つなぎ鎖により依存的な、すなわち、よりTEVプロテアーゼ開裂に対する感受性がより高いCPL27V変異体は、PCAの有望な候補である。つなぎ鎖に対する依存性がより低いCPL27V変異体は、自己相補/二量体化アッセイの有望な候補であり得る。実施例49.タンパク質相補試験タンパク質相補試験PCAは、2つの生体分子、例えばポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。PCAは、互いに接近させられた場合に機能的な活性タンパク質に再構成され得る、同一タンパク質、例えば酵素の2つの断片を利用する。本発明のOgLuc変異体は、分離に寛容性のある部位で、2つの断片に分離され得る。その後、分離されたOgLuc変異体の各断片は、相互作用すると考えられている目的のポリペプチド対例えばFKBPおよびFRBのうちの一方に融合され得る。目的の2つのポリペプチドが実際に相互作用するならば、OgLuc断片は互いにすぐ近くに接近して、機能的な活性OgLuc変異体を再構成する。その後、再構成されたOgLuc変異体の活性を、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンまたは本発明の新規セレンテラジンを用いて、検出および測定することができる。別の例では、開裂OgLuc変異体は、lac-ZLangleyetalPNAS7212541257またはリボヌクレアーゼSLevitandBergerJBiolChem25113331339に類似した、より一般的な相補系で使用することができる。具体的には、別のOgLuc変異体断片Bを補完することが知られているOgLuc変異体断片Aと命名を、標的タンパク質に融合させることができ、得られた融合体を、断片Bを含有する細胞または細胞溶解物中の発光によってモニターすることができる。断片Bの源は、同一細胞染色体中または別のプラスミド上のいずれかであるか、または別の細胞由来の溶解物または精製タンパク質であり得る。この同一の融合タンパク質断片Aは、断片Bと、固体の支持体に付着可能なHaloTag登録商標等のポリペプチド間の融合によって、捕捉または固定化することができる。その後、発光は、成功した捕捉を実証するために、または捕捉された物質の量を定量化するために、使用することができる。タンパク質相補の方法は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2005/0153310号に従って行うことができる。1.9B8optPCAコンストラクトを以下のように構築した:-p9B8PCA1/4=pF5A/Met-[9B8opt51-169]-GGGGSGGGSS-FRB配列番号331および332pF5A/FKBP-GGGSSGGGSG-[9B8opt1-50]配列番号337および338-p9B8PCA1/2=pF5A/Met-[9B8opt51-169]-GGGGSGGGSS-FRB配列番号331および332pF5A/[9B8opt1-50]-GGGGSGGGSS-FRB配列番号333および334-p9B8PCA2/3=pF5A/[9B8opt1-50]-GGGGSGGGSS-FRB配列番号333および334pF5A/FKBP-GGGSSGGGSG-[9B8opt51-169]配列番号335および336-p9B8PCA3/4=pF5A/FKBP-GGGSSGGGSG-[9B8opt51-169]配列番号335および336pF5A/FKBP-GGGSSGGGSG-[9B8opt1-50]配列番号337および338PCAコンストラクトを、FUGENE登録商標HDを用い、製造業者の取扱説明書に従って、96ウェルプレート中に、HEK293細胞15,000細胞/ウェルに形質移入した。次に、細胞を37°C、5CO2で一晩インキュベートした。形質移入後、細胞上の培地を、10FBSを含有するCO2非依存性培地で置き換えた。次に、20μMPBI-3939を含有するアッセイ試薬を加え、28°Cで、VarioskanFlashで発光を測定した。次に、100μMラパマイシンをウェルに加え、発光を1時間連続的に測定した。応答倍率を、所与のウェルの全発光を、同じウェルのラパマイシン前処理の発光で除算することにより算出した図74。2.PCAにおけるOgLuc変異体の用途を示すために、L27V02A変異体断片をFKBPまたはFRBで補完しcomplementate、FKBPおよびFRB間の相互作用を測定した。表42は、構築および試験された種々のタンパク質相補PCAコンストラクトを列挙している。2/3は、1L27V02Aの古いoldC末端古い=L27V02Aの元のC末端が、FKBPのC末端のパートナーであり;2L27V02Aの古いN末端がFRBのN末端のパートナーである、変異体相補対を示している。1/4は、1L27V02Aの古いN末端がFKBPのC末端のパートナーであり;2L27V02Aの古いC末端がFRBのN末端のパートナーである、変異体対を示している。全てのコンストラクトについて、FKBPはL27V02A断片のN末端に位置しており、FRBはL27V02A断片のC末端に位置していた。例えば、157位表42、2/3および1/411および12配列番号288~295参照、103位表42、2/3および1/49および10配列番号296~303参照、および84位表42、2/3および1/47および8配列番号304-315参照に開裂部位splitsiteを有するPCAコンストラクトを構築した。他のPCAコンストラクトを構築した配列番号343~426および428~440表21参照。表42表21表42に記載の相補対を、前に記載した通りに、pF4Agベクターにクローニングした。次に、PCAコンストラクト900μLを、製造業者の説明書に従って、ウサギ網状赤血球溶解物RRL;プロメガ社または小麦胚芽抽出物プロメガ社中で発現させた。各PCA対の1.25μLの発現反応物expressionreactionを、10μLの2×結合緩衝液100mMHEPES、200mMNaCl、0.2CHAPS、2mMEDTA、20グリセロール、20mMDTT、pH7.5および7.5μLの水と混合し、18μLを96ウェルプレートのウェルに移した。2μLの5μMラパマイシン最終濃度0.5μMを加え、10分間室温でインキュベートした。インキュベートした後、100μLのPBI-393950×ストックをアッセイ緩衝液中で1×に希釈、そして、室温で3分間インキュベートする。発光を前に記載した通りに測定した図76A~B:コムギ胚芽;図76C~D:ウサギ網状赤血球;図76E~F:無細胞系[whichsystemWGorRRL];図76G:HEK293細胞。図76A~Gは、種々のタンパク質相補PCAL27V対の発光各対の一方のL27V断片は、記載の通りの2/3構成図76Aおよび76Cまたは1/4構成図76Bおよび76Dを用いて、FKBPまたはFRBのいずれかに融合されていた、小麦胚芽抽出物図76Aおよび76Bおよびウサギ網状赤血球溶解物RRL図76Cおよび76D中でモニターされたFKBPおよびFRBの相互作用;種々のタンパク質相補PCA陰性対照の発光図76Eを示している。無細胞系RRL図76FおよびHEK293細胞図76G中の、1/4構成を用いる種々のタンパク質相補L27Vの発光を測定した。図76A~G中のデータは、種々の異なる欠失、すなわちL27V変異体の小断片が、機能的であることを示す。3.細胞ベースのPCAにおけるPCAコンストラクトの用途を示すために、コンストラクトをHEK293細胞に形質移入し、PBI-4377を用いてアッセイした。各PCA対6、12、55、84、および103からのプラスミドDNA5ngを、40ngの担体DNApGEM-3fzおよび5μLのOPTI-MEM登録商標と混合し、室温で5分間インキュベートした。次に、FUGENE登録商標HD0.15μLを加え、室温で15分間再びインキュベートした。DNA形質移入混合物を、10FBS抗菌剤無しを含有するDMEM中の100μLのHEK293細胞1.5×105細胞/mLに加え、96ウェルプレートのウェルに移し、37°C、5CO2で一晩インキュベートした。形質移入後、培地を除去し、20μMまたは50×PBI-4377を含有するCO2非依存性培地で置き換え、37°C、CO2調節無しで、2時間インキュベートした。発光を測定し、10μLのラパマイシン加え、再度、発光を2分毎に2時間測定した図76A~C。4.タンパク質-タンパク質相互作用の阻害剤を特定するための、PCAコンストラクトの用途を示すために、本実施例の2に記載のコンストラクトを使用した。表42に記載の相補対、1032/3、1572/3、1031/4および1571/4を、前に記載した通りにpF4Agベクターにクローニングした。次に、PCAコンストラクト25μLを、製造業者の説明書に従って、ウサギ網状赤血球溶解物RRL;プロメガ社中で発現させた。各PCA対の1.25μLの発現反応物を、10μLの2×結合緩衝液100mMHEPES、200mMNaCl、0.2CHAPS、2mMEDTA、20グリセロール、20mMDTT、pH7.5および7.5μLの水と混合し、16.2μLを96ウェルプレートのウェルに移した。ラパマイシンを、様々な量のFK506で試験した。反応物に、FRB-FKBP結合阻害剤、FK50610×を加え、反応物を室温で10分間インキュベートした。15nMのラパマイシン10×原液を、最終濃度が1.5nMラパマイシンとなるように加え、室温で2時間インキュベートした。インキュベートした後、100μLのPBI-393950×ストックをアッセイ緩衝液中で1×に希釈、そして、室温で3分間インキュベートした。GLOMAX登録商標ルミノメーターで発光を測定した。図77は、本明細書で開示されるPCAコンストラクトが、タンパク質-タンパク質相互作用の阻害剤を特定するのに使用することができることを示す。5.溶解性型式lyticformatにおけるPCAコンストラクトの用途を示すために、相補対、1032/3、1572/3、および1031/4を、HEK293細胞に形質移入し、PBI-3939を用いてアッセイした。各PCA対からの0.5ngのプラスミドを、5μLのOPTI-MEM登録商標および49ngのpGEM-3zfプロメガ社と混合した。試料混合物を室温で5分間インキュベートした。次に、0.15μLのFUGENE登録商標HDを試料混合物に加え、室温で15分間インキュベートした。1.5×105細胞/mLの濃度の、10FBSを含有するDMEM抗菌剤無し中の100μLのHEK293細胞を、各試料混合物に加えた。次に、細胞試料を96ウェルプレートの1ウェルに移し、37°C、5CO2で一晩インキュベートした。次の日、11.1μLの10μMラパマイシン最終濃度1μMを、ウェルの半分に加え、11.1μLの水をウェルのもう半分に加えた。96ウェルプレートを37°Cで1時間インキュベートした。100μLのアッセイ試薬PBI-39392μLの50×PBI-3939を前に記載した98μLのアッセイ試薬と混合を、各ウェルに加え、プレートを37°Cで4分間インキュベートした。GLOMAX登録商標ルミノメーターで、37°C、0.5秒の積分時間および1回の読み取りで、発光を測定した図76H。実施例50.OgLuccAMPバイオセンサー本発明のOgLuc変異体は、濃度を通じてだけでなく、酵素活性の調節を通じても、光出力に関わることができる。例えば、cAMPバイオセンサーは、プロテインキナーゼAから得られたcAMP-結合ドメインを循環置換されたOgLuc変異体に組み入れることによって開発され得る。本発明のOgLuc変異体は、当該技術分野において周知の方法例えば、米国特許出願公開第2005/0153310号によるそのような置換に対し寛容性がある部位で、循環置換され得る。哺乳類細胞中で発現された場合、得られた循環置換されたOgLuc変異体キメラタンパク質は、cAMPに対する細胞内バイオセンサーとして機能し得る。cAMPがバイオセンサーに結合すると、バイオセンサーは、活性型ルシフェラーゼ酵素を生成する立体構造変化を起こす。細胞をアデニル酸シクラーゼに対する活性化物質であるフォルスコリンで処理することは、フォルスコリンの増加濃度に伴って、発光における増加をもたらすはずである。カルシウムCa2、cGMP、およびカスパーゼおよびタバコエッチ病ウイルスTEV等のプロテアーゼを含むがこれらに限定はされない、標的に対する同様のバイオセンサーは、それぞれに対する適切な結合ドメインまたは切断部位を、循環置換されたOgLuc変異体に組み入れることによって、開発することができる。cAMPセンサーとの関連で変異体9B8optを分析することにより、OgLucのバイオセンサーとしての有用性が示された。循環置換のための部位が下記のように選択されること以外はPCT出願PCT/US2007/008176に記載される通りに、OgLuc変異体配列に隣接したプロテインキナーゼ-AのRIIβBサブユニットを含有する循環置換されたコンストラクトを構築し、無細胞系で発現させた。cAMPの存在下および非存在下で、新生タンパク質をアッセイした。cAMPに対する応答を、活性比cAMP/-cAMPと定義する。OgLucの構造モデルが、PCT/US2010/33449で先に記載された、既知の構造のある脂肪酸結合タンパク質への類似性に基づいて、作製されている。モデルは、標準的なタンパク質構造モチーフ;αへリックスおよびβシートの規則正しい配列を予測している。循環置換部位としてこれらの構造要素間を移行する領域を選択した表43参照。1.バイオセンサーコンストラクトの発現用鋳型は、プラスミドpF5プロメガ社中の、C末端のOgLuc配列-RIIβB配列-N末端OgLuc配列から成った。TNT登録商標T7カップリングコムギ胚芽抽出系プロメガ社品番L4140を、コンストラクトを翻訳するのに使用した。TNT登録商標コムギ胚芽抽出反応は、25μLのTNT登録商標コムギ胚芽抽出液L411A、2μLのTNT登録商標反応緩衝液L462A、1μLのアミノ酸混合物、完全CompleteL446A、1μLのRNasin登録商標40U/μLN2615、1μLのTNT登録商標T7RNAポリメラーゼL516A、1.0μgのDNA鋳型、および50μLの総体積にするためのヌクレアーゼを含まない水を含んでいた。反応混合物を30°Cで120分間インキュベートした。50μLのOgLuc翻訳混合物に、100μMcAMPを含有する、または含有しない、50μLのOgLucGlo試薬100mMMESpH6.0、1mMCDTA、150mMKCl、35mMチオ尿素、2mMDTT、0.25TERGITOL登録商標NP-9v/v、0.025MAZU登録商標DF204、および20μMPBI-3939を加えることでOgLuc活性検査を行い、動態読み取りを30分間行ったTECAN登録商標INFINITE登録商標F500プレートリーダー。cAMP有りでバイオセンサーにより発せられた発光を、cAMP無しでバイオセンサーにより発せられた発光で除算することによって、応答を決定する表43。表43:循環配列されたOgLucバイオセンサーのcAMPに対する応答2.CP部位51で循環置換された9B8optのcAMPバイオセンサーを、1に記載の通りに作製した。次に、バイオセンサーを、FUGENE登録商標HDを用い、製造業者の取扱説明書に従って、96ウェルプレート中に、HEK293細胞15,000細胞/ウェルに形質移入し、37°C、5CO2で一晩インキュベートした。形質移入後、培地を除去し、10FBSを含有するCO2非依存性培地で置き換えた。次に、細胞を37°C、5CO2で2時間インキュベートし、その後、様々な量のFSKを加えた。次に、細胞を再度、37°C、5CO2で3時間インキュベートした。次に、6μMPBI-3939加え、13分後に発光を測定した図78。3.L27Vの循環置換型CP;例えばCP6は、Met後に新しい残基1となる古い残基6を指すバージョンおよび直鎖開裂型SS;例えばSS6は、以下のように方向づけられたセンサーを指す:OgLuc1~6-RIIβb結合部位配列番号441および442-OgLuc7~169バージョンを、cAMPバイオセンサー配列番号467~574として使用した。L27V変異体のCP配列番号467~498および555~574バージョンおよびSS配列番号499-554バージョンを、前に記載した通りに誘導し、製造業者の説明書に従ってウサギ網状赤血球溶解物RRL;プロメガ社中で発現させた。RIIβb結合部位のC末端とOgLucルシフェラーゼ配列の間のリンカー配列はGGGTCAGGTGGATCTGGAGGTAGCTCTTCT配列番号575であった。RIIβb結合部位のN末端とOgLucルシフェラーゼ配列の間のリンカー配列は、AGCTCAAGCGGAGGTTCAGGCGGTTCCGGA配列番号576であった3.75μLの発現反応物を1.25μLの4×cAMP最終濃度1nM~0.1mMと混合し、室温で15分間インキュベートした。インキュベション後、100μLのPBI-393950×ストックをアッセイ緩衝液中で1×に希釈、そして、室温で3分間インキュベートした。GLOMAX登録商標ルミノメーターで発光を測定した図79A~B。前に記載した通りに、HEK293細胞中で発現され、フォルスコリンで処理された、L27V変異体のCPバージョンおよびSSバージョンについての発光も測定した図79C-D。図79A~Dは、本明細書で開示されるOgLuc変異体の循環置換型バージョンおよび直鎖開裂型バージョンは、バイオセンサーとして使用することができることを示す。実施例51.細胞内分布および細胞内局在細胞内分布を分析するために、U2OS細胞を、10FBSを含有するマッコイ5A培地インビトロジェン社中で2×104細胞/cm2で、ガラス底培養皿に播種した。次に、細胞を37°C、5CO2で24時間インキュベートした。次に、細胞に1/20量の形質移入混合物FUGENE登録商標HDおよびpF5A-CMV-L27VCMVプロモータープロメガ社を有するpF5AベクターにクローニングされたL27V変異体配列番号88、またはpGEM3ZFプロメガ社;陰性対照を形質移入し、37°C、5CO2で24時間インキュベートした。インキュベートした後、細胞培地を、0.5FBSおよび100μMPBI-4378を含有するCO2非依存性培地と置き換えた。37°Cで30分間インキュベートした後、フィルタ処理されていない画像を、25、100、1000、および5000ミリ秒間、60×対物レンズ図80A-Bを用いるオリンパス社製LV200生物発光顕微鏡で撮り込んだ。細胞内局在を分析するために、IL-6分泌配列配列番号461および462を有するGPCRAT1Rアンジオテンシン1型受容体配列番号459および460または転写因子であるNrf2配列番号317とのN末端L27V融合体を、GSSGリンカー配列番号457および458を用いて作製し、上記の通りにU2OS細胞に形質移入した図81A~C。図81CGPRCは、IL6シグナル配列がL27V変異体配列の上流であり、AT1RがL27V変異体配列の下流である場合のコンストラクトの発現を示している。L27V変異体単独も形質移入した非融合。37°C、5CO2で24時間インキュベートした後、細胞培地を、0.5FBSを含有するCO2非依存性培地で置き換え、非CO2調節雰囲気下、37°Cで1時間平衡化した。次に等量の培地200μMPBI-3939を加え、直後に、60×または150×対物レンズを用いるオリンパス社製LV200生物発光顕微鏡で、フィルタ処理されていない画像を撮り込んだ図81A-C。L27V単独を発現する細胞については、画像撮り込み直前に、PBI-3939を細胞から洗い落とした。実施例52.細胞内シグナル経路のモニタリング本実施例は、転写活性化を表す応答要素の例とは対照的にタンパク質レベルで細胞内シグナル経路をモニターするのに使用されている新規ルシフェラーゼの2つの例を提供する。変異体9B8opt配列番号24を、IkBGrossetalNatureMethods2607614C末端に、すなわち、N-IkB-9B8opt-CまたはODDHif-1-αの酸素依存性分解ドメインMorozetalPLoSOne4e5077N末端に、すなわち、N-9B8opt-ODD-Cのいずれかに融合した。IKBは、TNFαで刺激されると細胞中で分解されることが知られており;そのため、IKB-9B8optコンストラクトは、生細胞TNFαセンサーとして使用することができる。ODDHif-1-αは、低酸素を誘導する化合物で刺激されると細胞内に蓄積されることが知られており;そのため、ODD-9B8optコンストラクトは生細胞低酸素センサーとして使用することができる。9B8optを有するIkBまたはODDとの融合体を含有するコンストラクトpF5Aを、HEK293細胞中で、前に記載した通りの逆トランスフェクション5ngIkBまたは0.05ngODDのDNAキャリアーDNAと混合して合計50ngを得たを介して発現させ、37°C、5CO2で24時間インキュベートした。形質移入後、培地を、0.5FBSおよび20μMPBI-4377を含有する新しいCO2非依存性培地と置き換え、37°Cで4時間、大気中のCO2に対し平衡化した。次に、細胞を刺激に暴露した:IkB融合体発現細胞に対してはTNFα、そしてODD融合体発現細胞に対してはフェナントロリン。DMSOビヒクルを対照細胞に加えた。TNFα/IKB試料について、刺激を加えるおよそ15分前に100μg/mLシクロヘキシミドを加え、新しいタンパク質の合成を妨げた。処理後の示された時点で、細胞を発光についてアッセイした。データ正規化のために、所与の時点での各試料のRLUを、刺激直後に同じ試料から得られたRLUで除算した。次に、各センサーの応答倍率を決定した図82A~C。B.前記タンパク質レベルでの酸化的ストレスシグナル経路をモニターするために、L27Vを使用した。L27Vまたはウミシイタケ属RenillaルシフェラーゼRlucを、pF5K発現ベクターにおいて、Nrf2/NFE2L2と融合させたC末端で;すなわち、N-Nrf2-L27V-CまたはN-Nrf2-Rluc-C。Keap1はNrf2の負の制御因子である配列番号217。Nrf2-L27V02のタンパク質レベルの調節を忠実に表すために、Keap1を共発現させ、Nrf2レベルを低く維持したユビキチン化を介して。Nrf2-L27VまたはNrf2-Rluc5ng、pF5KおよびHaloTag登録商標-Keap1融合タンパク質pFN21-HT7-Keap1配列番号316;50ngを、前に記載した通りに96ウェルプレートに播種する時点で細胞に形質移入することによって、HEK293細胞中で発現させ、37°C、5CO2で24時間インキュベートした。形質移入後、培地を、L27Vについては0.5FBSおよび20μMPBI-4377を含有する、またはウミシイタケ属Renillaルシフェラーゼについては20μMENDUREN商標プロメガ社を含有する新しいCO2非依存性培地と置き換え、細胞を37°C、大気中CO2下で4時間平衡化した。動態解析のために、20μMD,LスルホラファンまたはビヒクルDMSOを使用した。図83Aでは、発光が、処理後の示された時点で、前に記載した通りに測定された。データ正規化のために、所与の時点での各試料の発光を、刺激直後に同じ試料から得られた発光で除算した図83B~C。C.Bに記載されるNrf2センサーと、Nrf2ARE-Luc2Pレポータープロメガ社の応答の比較を行った。Nrf2センサーおよびレポーターの両方を、上記のセクションBに記載される通りにスクリーニングした。ホタルLuc2Pレポーター遺伝子アッセイのために、ONE-GLO商標アッセイ試薬を使用した。図84A~Bは、2時間におけるNrf2-L27Vおよび16時間におけるNrf2ARE-Luc2Pの正規化された応答を示す。実施例53.BRETによる、OgLuc変異体の生物発光レポーターとしての評価生物発光共鳴エネルギー移動BRETは、タンパク質-タンパク質相互作用のモニタリングを可能にする。分子内エネルギー移動を、HT7がフルオロフォア、すなわちTMR励起/発光ex/em波長=555/585nmまたはローダミン110励起/発光波長=502/527nmで事前に標識されたIVとHT7融合パートナーの間で調べた。実施例34のIV-HT7融合タンパク質を含有する50μLの細菌細胞溶解物を、0.001μM~10μMフルオロフォアリガンド存在下、または非存在下で、室温で1時間インキュベートした。インキュベートした後、22μMセレンテラジン-hを含有する50μLのRENILLA-GLO商標を、50μLの酵素-リガンド混合物に加え、発光スペクトルを5分の時点で記録した。TMR図83Aまたはローダミン110Rhod110図85Bを有するIV-HT7のスペクトルの例が示され、これは、リガンドのex/emがOgLucの発光ピークである460nmに近いほど、BRETがより大きかったことを示しているすなわち、ローダミン110を用いた方がより大きい。このデータは、融合タンパク質上の、OgLuc変異体とフルオロフォア間で分子内エネルギー移動が発生可能であることを示している。3つの異なる対照を比較のために使用したデータ未記載:1非HT融合、2HTリガンドで標識されなかったHT融合、および3OgLucとHTの間のTEV部位でタンパク分解により開裂された標識化HT融合近接/距離の関与を示した。BRETは3つの異なる対照において観察されなかったが、このことは、HTがBRETを達成するのに関わっていたことを示している。C末端HT7を有するC1A4EおよびIVが、N末端HT7を有するものと比べて、BRETがより大きかった。実施例54.生細胞様式または溶解性様式のタンパク質近接解析1例において、循環置換されたCPまたは直鎖開裂型SSOgLuc融合タンパク質はタンパク質近接の測定に適用される。OgLucは、プロテアーゼ基質アミノ酸配列例えば、TEVの挿入を介して置換または開裂され、低い生物発光を発する。不活性ルシフェラーゼが、モニタータンパク質に繋留される例えば、遺伝子融合を介して。有望な相互作用タンパク質が、プロテアーゼ例えば、TEVに繋留される例えば、遺伝子融合を介して。前記2つのモニタータンパク質が相互作用するか、または十分近位に存在する場合例えば、恒常的な相互作用、薬剤刺激または経路応答を介して、ルシフェラーゼが開裂されて、増加された生物発光活性を生じる。前記の例は、細胞、または生化学分析において、タンパク質近接の測定に適用することができる。さらに、OgLuc変異体ルシフェラーゼの高い熱安定性は、溶解された細胞、または生化学分析における抗体-抗原相互作用の測定を可能にし得る。実施例55.生物発光分析1.カスパーゼ-3酵素を検出するための生物発光分析におけるOgLuc変異体の用途を示すために、9B8opt変異体を、DEVDカスパーゼ-3開裂配列を含む前セレンテラジン基質を用いる生物発光分析において使用した。精製カスパーゼ-3酵素を、実施例27に記載の通りに調製された、変異体9B8optを発現する大腸菌Ecoli溶解物試料と混合し、100mMHEPESpH7.5中の23.5μMz-DEVD-セレンテラジン-hを含むかまたは含まない、100mMMESpH6.0、1mMCDTA、150mMKCl、35mMチオ尿素、2mMDTT、0.25TERGITOL登録商標NP-9v/v、0.025MAZU登録商標DF204を含有する緩衝液中で10倍に希釈した。カスパーゼ-3酵素を溶解物試料と一緒に室温で3時間インキュベートし、ターナー社製MODULUS商標ルミノメーターで、様々な時点における発光を検出した。細菌溶解物のみを含有する試料およびカスパーゼ-3のみを含有する試料を、対照として使用した。3連を用いた。図86および表44は、9B8opt、従って他の本発明のOgLuc変異体が、目的酵素を検出するための、前セレンテラジン基質を用いる生物発光分析において使用され得ることを示す。表44:z-DEVD-セレンテラジン-hを基質として使用して、精製カスパーゼ-3を用いるかまたは用いずにインキュベートした、9B8opt変異体を発現する細菌溶解物から発せられたRLU単位の平均発光2.L27V変異体を、DEVDカスパーゼ-3開裂配列を含む前セレンテラジン基質を用いる生物発光分析で使用した。100mMMESpH650μL中の精製カスパーゼ-3酵素1mg/mLを、アッセイ緩衝液50μL中の227nML27V02変異体および47μMPBI-3741z-DEVD-セレンテラジン-hと混合した。反応物を室温で3時間インキュベートし、発光を前に記載した通りに検出した。L27V変異体を用いるアッセイを、ホタルルシフェラーゼバージョンのアッセイ、カスパーゼ-GLO登録商標3/7-アッセイ系カスパーゼ-Glo;プロメガ社と比較した。表45は、L27V変異体、従って他の本発明のOgLuc変異体が、目的酵素を検出するための、前セレンテラジン基質を用いる生物発光分析において使用され得ることを示す。表45実施例56.免疫学的検定本発明のOgLuc変異体は、種々の異なるイムノアッセイ概念に組み込まれる。例えば、OgLuc変異体は、検出法に特定の分析物を提供するために、一次抗体または二次抗体に、遺伝的に融合または化学的に結合される。別の例として、OgLuc変異体は、タンパク質A、タンパク質G、タンパク質L、またはIg断片に結合することが知られているあらゆる他のペプチドもしくはタンパク質に遺伝的に融合または化学的に結合され、今度はこれが、特定の分析物に結合した特異的抗体を検出するのに使用され得る。別の例として、OgLuc変異体がストレプトアビジンに遺伝的に融合または化学的に結合され、特定の分析物に結合した特異的ビオチン化抗体を検出するのに使用される。別の例として、ELISAのようなあらゆる様式において、一次抗体が特定の固定化された分析物を認識し、二次抗体が該一次抗体を認識する場合、OgLuc変異体の相補的断片は一次および二次抗体に遺伝的に融合または化学的に結合される。OgLuc変異体活性、すなわち発光は、固定化された分析物の存在下で再構成され、該分析物を定量化する手段として使用される。別の例として、OgLuc変異体の相補的断片は2つの抗体に融合され得、そこで一方の抗体が1つのエピトープで特定の分析物を認識し、第二の抗体が別のエピトープで該分析物を認識する。OgLuc変異体活性は分析物の存在下で再構成されることとなる。前記方法は、細胞溶解物または細胞培地等の複雑な環境における分析物定量化analytequantificationの測定に適していることとなるでだろう。別の例として、一方の抗体が特定の分析物を、修飾を問わず認識し、第二の抗体が修飾された分析物例えば、翻訳後修飾後のみを認識する場合、OgLuc変異体の相補的断片は2つの抗体に融合され得る。OgLuc変異体活性は、分析物が修飾される場合にのみ、分析物の存在下で再構成されることとなる。この方法は、細胞溶解物等の複雑な環境における修飾された分析物の測定に適していることとなるであろう。別の例として、OgLuc変異体は、分析物例えば、プロスタグランジンに複合体化され、競合的サンドイッチELISA様式において使用され得る。実施例57.二量体形成アッセイ本実施例は、完全長の循環置換型OgLuc変異体が、それぞれの結合パートナー、例えばFRBおよびFKBPに融合され、タンパク質相補性分析で使用され得ることを示す。本明細書で開示される方法と従来のタンパク質相補性の間の重要な差異は、相補性はなかったが、2つの完全長酵素、例えば循環置換型OgLuc変異体の二量体化があったことである。簡潔に説明すると、低活性用に同様に構築された、循環置換されたレポータータンパク質を、融合タンパク質パートナーの両方に融合した図87A参照。例えば、各融合パートナーは、全く同じに構築された、置換されたレポーターに連結され得る。融合パートナーの相互作用により置換されたレポーターはすぐ近くに運ばれ、それによってより高い活性を有するハイブリッドレポーターの再構築が可能となった。新しいハイブリッドレポーターは、構造的拘束を低減させるように、各循環置換されたレポーターの部分を含んでいた。循環置換された、直鎖開裂型L27V変異体CP84およびCP103N-SS-169-1-SS1-FRB-CおよびC-1-SS1-SS-169-FKBPを、前に記載した通りにクローニングし、製造業者の説明書に従って、ウサギ網状赤血球溶解物RRL;プロメガ社中で、発現させた25μL。各二量体化対の1.25μLの発現反応物を、10μLの2×結合緩衝液100mMHEPES、200mMNaCl、0.2CHAPS、2mMEDTA、20グリセロール、20mMDTT、pH7.5および7.5μLの水と混合し、18μLを96ウェルプレートのウェルに移した。反応物に、2μLのラパマイシン最終濃度0および0.1~1000nMを加え、反応物を室温で10分間インキュベートした。インキュベートした後、100μLのPBI-393950×ストックをアッセイ緩衝液中で1×に希釈、そして、室温で3分間インキュベートした。GLOMAX登録商標ルミノメーターで発光を測定し図87B、応答を決定した図87C。図87B~Cは、PCA型二量体化アッセイを介してタンパク質-タンパク質相互作用を検出するのに、本発明のOgLuc変異体を使用することができることを示す。実施例58.細胞内半減期OgLuc変異体9B8、9B8K33N、V2、L27V、およびV2L27Mの細胞内半減期を決定した。15~100mmプレートにおける10FBSおよび1×ピルビン酸ナトリウムを含有するF12培地中のCHO細胞500,000に、9B8、9B8K33N、V2、L27VV2L27VまたはV2L27M全てpF4Aベクターバックグラウンド中を含有する30μLの100ng/μLプラスミドDNAを、TRANSIT登録商標-LT1ミラス社Mirusを用い、製造業者の説明書に従って、形質移入した。次に、細胞を6時間インキュベートした。インキュベートした後、培地を除去し、1mLのトリプシンを加え、細胞をプレートから剥離した。次に、3mLのF12培地を加え、細胞を計数した。次に、細胞を10,000細胞/ウェルで、96ウェルプレートの6ウェル6ウェル/変異体に播種し、37°Cで一晩インキュベートした。試料を3枚のプレートに散布した。各プレートは、異なる時点での測定に対し、6つの反復実験を有した。一晩インキュベートした後、培地をt=0試料のための細胞から除去して、100μLのアッセイ緩衝液前述;基質無しを加えた。試料をドライアイス上で凍結させ、-20°Cで保存した。シクロヘキシミド100mg/mLを、OPTI-MEM登録商標中で、1:100に希釈して1mg/mLの最終濃度にした。DMSO100も、OPTI-MEM登録商標中で、1:100最終濃度1に希釈した。希釈したシクロヘキシミド1mg/mLを、それぞれの形質移入された変異体の試料の3つの反復実験に加え11μL、11μLの希釈したDMSO1を、その他の3つの反復実験に加えた。次に、細胞を37°C、5CO2でインキュベートし、様々な時点すなわち、0時間、0.5時間、0.9時間、2.5時間、4.3時間、および6.2時間で取り出し、t=0試料として処理した。分析のために、試料を室温まで解凍し、10μLを50μLのアッセイ試薬中でアッセイした。GLOMAX登録商標ルミノメーターで発光を測定した。各時点で、未処理およびシクロヘキシミド処理試料の発光を測定した。シクロヘキシミドで処理された細胞のRLUを、未処理細胞のRLUで正規化した。各変異体の細胞内半減期を、各時点での、未処理のものからの発光に対する、シクロヘキシミドCHXで処理したものからの発光の割合を測定することによって算出した。次に、前記割合を、時間に対して自然対数プロット未処理に対する処理のし、半減期を算出した表46。OgLuc変異体は、完全なfullstrengthCMVプロモーターを有する場合はおよそ6~9時間の細胞内半減期を有したが、CMV欠失変異体d2を有する場合は、半減期が減少した。完全なCMVプロモーターと組み合わされたPEST分解シグナルが存在することにより、半減期は有意に減少する。表46実施例52に記載の逆トランスフェクションプロトコルを用い、HEK293細胞を使用して、別の実験を完了させたデータ未記載。この実験から得られた結果は、PESTを有するL27V変異体の細胞内半減期が10分であることを示している。この実験で使用された分解シグナルを持たないL27V変異体は、この実験を通じて減衰を示さなかった。この場合、減衰をt=0での未処理細胞に対して正規化した。実施例59.OgLuc変異体の尿素への暴露ホタルルシフェラーゼは比較的不安定であることが知られているが、尿素暴露に対してはさらにより感受性が高い。これがOgLuc変異体を用いた場合でも当てはまるかどうかを決定するために、OgLucの尿素に対する感受性を決定した。5μlの45.3μML27V酵素を100μLの尿素溶液100mMMOPSpH7.2、100mMNaCl、1mMCDTA、5グリセロールおよび様々な濃度の尿素と混合し、室温で30分間インキュベートした。5μLの尿素L27V酵素溶液を、フェノールレッド0.1PRIONEX登録商標無しのDMEM中に10,000倍希釈し、50μLを、100μMPBI-3939前述を含有する50μLのアッセイ試薬と混合し、発光を10分の時点で読み取った図88。図88は、L27Vが、尿素耐性であるか、または尿素除去後に非常に迅速に機能的酵素にリフォールディングしたことを示している。これは、化学的変性条件が含まれている場合に、L27Vがレポーター酵素として使用され得ることを示唆している例えば、OgLuc変異体に基づく反応の前の酵素反応を止めるのに変性剤が使用される条件での多重化。精製L27V変異体の0.31mg/mLの原液を、緩衝液PBS1mMDTT0.005IGEPAL中に100,000倍希釈し、3M尿素と共に、25°Cで30分間インキュベートし、次に、100μMPBI-3939前述を含有するアッセイ試薬と1:150μL50μL混合した。反応物を、前に記載した通りに100分間;1分の読み取り間隔、TECAN登録商標INFINITE登録商標F500ルミノメーターで読み取った図89。結果は、3M尿素がL27V変異体の活性をおよそ50だけ低減させるが、尿素を2倍に1.5Mの最終濃度に希釈すると、活性が、恐らくはりフォールディングのために、増加することを示している。実施例60.OgLuc融合タンパク質の画像取得本実施例は、蛍光励起の必要なしに、生細胞におけるタンパク質移行をモニターするための、OgLucおよびOgLuc変異体の用途を示す。OgLuc変異体を、ヒト糖質コルチコイド受容体GR;配列番号451および452、ヒトプロテインキナーゼCαPKCa;配列番号449および450またはLC3配列番号577および578に融合させた。生物発光画像法を用いて細胞内タンパク質移行を分析するために、HeLa細胞を、10FBSを含有するDMEM培地インビトロジェン社中2×104細胞/cm2で、ガラス底培養皿MatTek中に播種した。次に、細胞を37°C、5CO2で24時間インキュベートした。次に、細胞に1/20量の形質移入混合物FUGENE登録商標HDおよびpF5Aベクタープロメガ社にクローニングされた、L27V02-GR配列番号453および454またはL27V02-PKCα配列番号455および456をコードするDNAを形質移入した。L27V02-GRに関するプラスミドDNAを、pGEM-3ZFプロメガ社中で1:20希釈し、L27V02-GRの適切な発現レベルを達成した。L27V02-LC3およびL27V02-PKCαに関するプラスミドDNAは、無希釈で使用した。次に、細胞を37°C、5CO2で24時間インキュベートした。GR融合タンパク質を形質移入された細胞を、1木炭/デキストランで処理されたFBSインビトロジェン社を補充されたMEM培地を用いて、20時間GR作動薬を枯渇させた。形質移入の24時間後PKCα測定の場合または形質移入の48時間後GR測定の場合、イメージング直前に、細胞培地を100μMPBI-3939を含有するCO2非依存性培地で置き換えた。150×対物レンズを用いるオリンパス社製LV200生物発光顕微鏡で、フィルタ処理されていない画像を直ちに撮り込んだ。L27V02-GR融合タンパク質の細胞質ゾルから核への移行は、0.5mMデキサメタゾンでの15分間の刺激によって達成された。L27V02-PKCα融合タンパク質の細胞質ゾルから原形質膜への移行は、100nMPMAでの20分間の刺激によって達成された。L27V02-LC3融合タンパク質形質移入細胞は、未処理のままにするか、または10FBSを含有するDMEM培地インビトロジェン社中の50mMクロロキンで処理した。L27V02-グルココルチコイド受容体糖質コルチコイド非存在下では、糖質コルチコイド受容体GRはHsp90タンパク質と複合体化し、細胞質ゾルに存在する。GRがデキサメタゾン等の糖質コルチコイドと相互作用すると、GRタンパク質はこれらのタンパク質複合体から分離して核に移行し、遺伝子転写を制御する。図90A~Bは、HeLa細胞における、PBI-3939基質を用いての、L27V02-糖質コルチコイド受容体GR融合タンパク質の、デキサメタゾンにより誘導された細胞質ゾルから核内への受容体NR移行の生物発光画像を示している。L27V02-PKCaホルボールエステルで処理すると、PKCαタンパク質は原形質膜に動員され、膜動力学およびシグナル伝達を含む細胞応答を制御する。図91A~Bは、U-2OS細胞における、PBI3939基質を用いての、OgLucL27V02-PKCα融合体の、ホルボールエステルにより誘導されたプロテインキナーゼCαPKCαの細胞質ゾルから原形質膜への移行の生物発光画像を示している。L27V-LC3処理されたLC-3タンパク質とオートファゴソームとの会合は、オートファジーにおける特徴的なステップを表す。クロロキン処理は、自己貪食性流出をこの段階で停止させ、オートファゴソーム上にLC-3タンパク質の蓄積をもたらす点状の細胞内分布をつくる。図92A~Bは、2つの代表的なHeLa細胞試料における、PBI-3939基質を用いての、OgLucL27V-LC3融合タンパク質配列番号592および593の、クロロキンにより誘導されたオートファゴソームタンパク質移行の生物発光画像法を示している。表47.但し書きリスト"