"パラポックスウイルスおよびイヌジステンパーウイルスに由来する異種DNAを含む組換えパラポックスウイルス。前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルスオビスウイルスORFVである、請求項1に記載の組換えパラポックスウイルス。前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルスオビス株D1701である、請求項2に記載の組換えパラポックスウイルス。前記組換えパラポックスウイルスが、パラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-HおよびパラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-Fからなる群から選択される、請求項3に記載の組換えパラポックスウイルス。前記異種DNAが、前記イヌジステンパーウイルスのHタンパク質をコードする遺伝子、前記Hタンパク質をコードする前記遺伝子の断片、前記イヌジステンパーウイルスのFタンパク質をコードする遺伝子、および前記Fタンパク質をコードする前記遺伝子の断片からなる群から選択される、請求項1に記載の組換えパラポックスウイルス。前記異種DNAが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Hタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項5に記載の組換えパラポックスウイルス。前記異種DNAが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Fタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項5に記載の組換えパラポックスウイルス。前記異種DNAが、配列番号1、配列番号1と少なくとも約98の同一性を有する配列、配列番号2、および配列番号2と少なくとも約98の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項1に記載の組換えパラポックスウイルス。前記異種DNAがパラポックスウイルスオビス株D1701のHindIII断片H/Hの中に挿入される、請求項1に記載の組換えパラポックスウイルス。前記異種DNAが、パラポックスウイルスオビス株D1701のHindIII断片H/Hの中のVEGFコード配列または隣接する非コード配列の中に挿入される、請求項9に記載の組換えパラポックスウイルス。請求項1に記載の組換えパラポックスウイルスの調製方法であって、前記パラポックスウイルスのゲノム内に異種DNAを挿入することを含む方法。前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルスオビスである、請求項11に記載の方法。前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルスオビス株D1701である、請求項11に記載の方法。前記組換えパラポックスウイルスが、パラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-HおよびパラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-Fからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。前記異種DNAが、前記イヌジステンパーウイルスのHタンパク質をコードする遺伝子、前記Hタンパク質をコードする前記遺伝子の断片、前記イヌジステンパーウイルスのFタンパク質、および前記Fタンパク質をコードする前記遺伝子の断片からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。前記異種DNAが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Hタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項15に記載の方法。前記異種DNAが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Fタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項15に記載の方法。前記異種DNAが、配列番号1、配列番号1と少なくとも約98の同一性を有する配列、配列番号2、および配列番号2と少なくとも約98の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。請求項1に記載の組換えパラポックスウイルスおよび担体を含む免疫原性組成物。前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルスオビスである、請求項19に記載の免疫原性組成物。前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルスオビス株D1701である、請求項20に記載の免疫原性組成物。前記組換えパラポックスウイルスが、パラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-HおよびパラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-Fからなる群から選択される、請求項19に記載の免疫原性組成物。前記異種DNAが、前記イヌジステンパーウイルスのHタンパク質をコードする遺伝子、前記Hタンパク質をコードする前記遺伝子の断片、前記イヌジステンパーウイルスのFタンパク質、および前記Fタンパク質をコードする前記遺伝子の断片からなる群から選択される、請求項19に記載の免疫原性組成物。前記異種DNAが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Hタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項23に記載の免疫原性組成物。前記異種DNAが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Fタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項23に記載の免疫原性組成物。前記異種DNAが、配列番号1、配列番号1と少なくとも約98の同一性を有する配列、配列番号2、および配列番号2と少なくとも約98の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項19に記載の免疫原性組成物。請求項19に記載の免疫原性組成物の調製方法であって、請求項1に記載の組換えパラポックスウイルスを担体と組み合わせることを含む方法。前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルスオビスである、請求項27に記載の方法。前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルスオビス株D1701である、請求項28に記載の方法。前記組換えパラポックスウイルスが、パラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-HおよびパラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-Fからなる群から選択される、請求項27に記載の方法。前記異種DNAが、前記イヌジステンパーウイルスのHタンパク質をコードする遺伝子、前記Hタンパク質をコードする前記遺伝子の断片、前記イヌジステンパーウイルスのFタンパク質、および前記Fタンパク質をコードする前記遺伝子の断片からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。前記異種DNAが、配列番号1、配列番号1と少なくとも約98の同一性を有する配列、配列番号2、および配列番号2と少なくとも約98の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。動物対象においてイヌジステンパーウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項19から26のいずれか一項に記載の治療上有効量の免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む方法。抗Hまたは抗Fタンパク質特異的防御免疫応答が誘導される、請求項33に記載の方法。イヌジステンパー疾患に対して動物対象を治療する方法であって、請求項19から26のいずれか一項に記載の治療上有効量の免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む方法。イヌジステンパー疾患に対して動物を治療するための薬物の調製における、請求項1から10のいずれか一項に記載の組換えパラポックスウイルスの使用。ワクチン接種動物からの感染動物の区別のためのアッセイにおける、請求項1から10のいずれか一項に記載の組換えパラポックスウイルスの使用。前記組換えパラポックスウイルスが、パラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-HおよびパラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-Fからなる群から選択される、請求項37に記載の使用。本明細書で特に定義されない限り、本発明に関連して用いる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本発明の態様の記載に用いられる用語に、以下の定義を適用することができる。それらは、参照により本明細書に組み込まれる各個別の参照に含まれるあらゆる矛盾した定義に優先する。約またはおよそは、測定可能な数値変数に関連して用いられる場合、示された変数値、および、示された値の実験誤差内例えば、平均の95の信頼区間内にある全ての変数値または示された値の10内にある全ての変数値のどちらか大きい方を指すが、これは、約が週単位の時間間隔について用いられる場合を除くものであり、その場合においては、約3週間は17から25日間であり、約2から約4週間は10から40日間である。本明細書で用いられる動物および対象という用語は、飼いならされたおよび野生の両方の哺乳動物を含むイヌジステンパー感染症にかかりやすい任意の動物を含む。本明細書で用いられる抗体は、供与源、製造方法または他の特性にかかわらず抗原結合部位を含む任意のポリペプチドである。それは、抗原に対して、その抗原に対する免疫応答の結果として特異的に結合する免疫グロブリン分子またはその断片を指す。免疫クロブリンは、定常領域および可変領域を有する軽ポリペプチド鎖および重ポリペプチド鎖から構成される血清タンパク質であり、定常領域の組成に基づいてクラス例えば、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに分けられる。所定の抗原に対して特異的な抗体は、抗体の可変領域が排他的に特異的抗原を認識し、結合することを示す。その用語としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、四量体抗体、四価抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体、ドメイン特異性抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン削除抗体、融合タンパク質、ScFc融合タンパク質、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体およびCDRグラフト抗体が挙げられるが、それらに限定されるものではない。抗体は、天然の供与源もしくは組換え型の供与源に由来する無傷免疫グロブリンであることができるか、または無傷免疫クロブリンの免疫活性部分であることができる。抗体は、限定されるものではないが、Fab、Fab’2、Fab’断片、Fv断片、一本鎖FvScFv断片、Fd断片、dAb断片、二重抗体diabody、CDR3ペプチド、束縛FR3-CDR3-FR4ペプチド、ナノボディnanobody、二価ナノボディ、小モジュラー免疫薬smallmodularimmunopharmaceuticalSMIPおよびミニボディminibody、上述した断片のいずれか、それらの化学的または遺伝子的に操作された対応物、ならびに抗原結合機能を保持する他の抗体断片を含む、限定されるものではないが抗体断片を含む抗原結合性タンパク質に転化することができる。典型的には、そのような断片は抗原結合性ドメインを含む。当業者によって認識されるように、そのような分子のいずれかは、その免疫原性を低下させるため、その親和性を増加させるため、その特異性を変化させるため、または他の目的のために、操作例えば生殖細胞系化germlinedすることができる。本明細書で用いられる抗原または免疫原は、対象に曝露した際にその抗原に対して特異的な免疫応答を誘導する1種以上のエピトープ直線状、立体構造または両方を含む分子を指す。抗原という用語は、サブユニット抗原抗原は、抗原が事実上関連づけられる全生物体から分離区分されている、ならびに死滅、弱毒化、または不活化された細菌、ウイルス、菌、寄生虫または他の微生物を指す。抗原という用語はまた、抗イディオタイプ抗体またはその断片等の抗体、および抗原または抗原決定基エピトープを模倣し得る合成ペプチドミモトープをも指す。抗原という用語はまた、インビボで、例えばDNA免疫化適用で抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをも指す。本明細書で用いられる抗原性は、タンパク質またはポリペプチドに対して高められた抗体によって免疫特異的に結合するタンパク質またはポリペプチドの能力を指す。緩衝液は、別の化学物質の濃度の変化を防ぐ化学系を意味する。プロトン供与体および受容体系は、水素イオン濃度pHの著しい変化を防ぐ緩衝液の役割をする。緩衝液の更なる例は、弱酸およびその塩共役塩基の混合物または弱塩基およびその塩共役酸の混合物を含有する溶液である。本明細書で用いられるイヌは、一般に犬と呼ばれるものを含むが、イヌ科の他のメンバーを含む。イヌジステンパーウイルスという用語は、モノネガウイルス目におけるパラミクソウイルス科におけるモルビリウイルス属のメンバーを指す。本明細書で用いられる細胞系または宿主細胞という用語は、ウイルスが複製し得るまたは維持され得る原核細胞または真核細胞を意味する。細胞性免疫応答または細胞媒介免疫応答は、Tリンパ球または他の白血球またはその両方が媒介するものであり、サイトカイン、ケモカイン、および活性化されたT細胞、白血球またはその両方から産生される同様の分子の産生を含む。保存的置換は、本技術分野で定義されており、当業者に公知であり、それらの関連した物理学的特性に従って残基を分類すると認められる。本明細書で用いられる培養物cultureという用語は、他の種または型がない場合に成長する細胞または微生物の集団を意味する。本明細書で用いられるDIVAという用語は、ワクチン接種動物から感染動物を区別することが可能なワクチンまたは免疫原性組成物を意味する。用量は、対象に与えられるワクチンまたは免疫原性組成物を指す。初回用量または初回抗原刺激用量は、Day0で与えられるそのような組成物の用量を指す。二次用量または三次用量または年間用量は、初回用量と同じワクチンまたは免疫原性組成物であってもなくてもよい、初回用量に続いて与えられるそのような組成物の量を指す。エピトープは、T細胞受容体または特異的抗体に結合する抗原の特異的部位であり、典型的には約3個のアミノ酸残基から約20個のアミノ酸残基を含む。本明細書で用いられる賦形剤は、抗原ではないワクチンまたは免疫原性組成物の任意の成分を指す。断片は、タンパク質または遺伝子の切断部分を指す。機能的断片および生物学的活性断片は、完全長タンパク質または遺伝子の生物学的性質を保持する断片を指す。免疫学的活性断片immunogenicallyactivefragmentは、免疫応答を誘発する断片を指す。本明細書で用いられるFタンパク質という用語は、イヌジステンパーウイルスの融合タンパク質を指す。本明細書で用いられるHタンパク質という用語は、イヌジステンパーウイルスの血球凝集素糖タンパク質を指す。本明細書で用いられる異種という用語は、異なる種または株に由来することを意味する。本明細書で用いられる同種という用語は、同じ種または株に由来することを意味する。相同性またはパーセント相同性は、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列相同性を達成した後の、更に配列相同性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮した比較配列内の残基と同一である候補配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を指す。相同体または種相同体は、実質的なポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつ同一または同様の生物学的機能および/または特性を有する、2種以上の異なる種で見出される遺伝子を含む。好ましくは、種相同体を表すポリヌクレオチド配列は、例によって本明細書に記載されているように、中程度にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズし、同一または同様の生物学的活性および、または特性を有する。別の態様において、種相同体を表すポリヌクレオチドは、約60超の配列相同性、約70超の配列相同性、約80超の配列相同性、約90超の配列相同性、約95超の配列相同性、約96超の配列相同性、約97超の配列相同性、約98超の配列相同性、または約99超の配列相同性を共有する。液性免疫応答は、抗体によって少なくとも部分的に媒介されるものを指す。同一性またはパーセント同一性は、両配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後の、配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮しない比較配列内の残基と同一である候補配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸の割合を指す。対象における免疫応答は、抗原に対する液性免疫応答、細胞性免疫応答、または液性および細胞性免疫応答の発生を指す。免疫応答は、診断目的もしくは他の試験のために十分であってよいか、または病原体の感染によって引き起こされる有害な健康効果もしくはその合併症を含む疾患の徴候もしくは症状を予防するために適切であってよい。免疫応答は、通常、本技術分野において公知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて決定することができる。本明細書で用いられる免疫原性のまたは免疫原性は、抗原に対して特異的に向けられた免疫応答を誘発する能力を指す。本明細書で用いられる免疫原性組成物または免疫学的に有効な量または免疫応答を生じさせるために有効な量という用語は、単独でまたは医薬的に許容し得る担体と共に動物に投与する場合に特異的な免疫応答を生じさせるすなわち、免疫原性活性を有する、免疫系が認識することが可能な組成物または抗原を指す。本明細書で用いられる鼻腔内投与は、対象の鼻を通した、あるいは経由した身体へのワクチンまたは免疫原性組成物等の物質の導入を指し、主に鼻粘膜を通した物質の輸送を含む。本明細書で用いられる単離されたは、それが天然に存在する環境から、単独で、あるいは異種宿主細胞または染色体もしくはベクター例えば、プラスミド、ファージ等中で取り出されていることを意味する。単離された微生物は、それが天然に存在する環境から分離されたた場合等、例えば培養物内に生物体が他の微生物を実質的に有さない組成物を指す。単離されたは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド等の特に定義された任意の物質を記載するために用いる場合、通常はその物質、例えばポリペプチドまたは核酸、が見出される元の細胞性環境とは別の物質を指す。ゆえに本明細書において、一例として挙げるに過ぎないが、本発明のポリヌクレオチドで構築される組換え細胞系は、単離された核酸を利用する。別の場合、ワクチンまたは免疫原性組成物として特定のタンパク質または特異的免疫原性断片を主張または用いる場合、それが自然の中に存在することができる在り方と比較して、それが同定され、分離され、ある程度精製されたので、それが単離されたと考えられる。抗原を産生する組換え細菌または真核細胞発現ベクター内でタンパク質またはその特異的免疫原性断片を産生する場合、それは、単離されたタンパク質または核酸として存在すると考えられる。例えば、ポリヌクレオチドで構築された組換え細胞系は、単離された核酸を利用する。医薬剤は、疾患の予防、治癒もしくは改善、または何らかの生理学的な状態もしくは発生の予防に有用な任意の剤を指す。感染多重度MOIという用語は、細胞1個当たりの生物体の数の比率を指し、それは、所定の感染症にどれくらいの接種材料を用いる予定であるかを詳細に示す。本明細書に用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞の単一系が産生する抗体を指し、全ては特定の抗原上の1つのエピトープに対して特異的である。モノクローナル抗体を作製するために用いる抗原は、病原体の単離タンパク質または病原体全体として提供することができる。ハイブリドーマは、骨髄腫細胞および特異的抗体産生細胞の融合によって形成される雑種細胞からなるクローン細胞系である。一般に、モノクローナル抗体はマウス起源である。しかし、モノクローナル抗体はまた、ファージディスプレイ技術もしくはファージディスプレイと同等の方法によって、または非マウス起源の雑種細胞によって産生された抗原の特定のエピトープに対して作製された抗体のクローン集団をも指す。本明細書で用いられる経口または経口的投与は、口を通して、または、それを経由して、対象の身体にワクチンまたは免疫原性組成物等の物質を導入することを指し、嚥下または口腔粘膜を通した輸送例えば舌下または口腔内粘膜吸収またはその両方を含む。気管内も経口または経口的投与の手段である。本明細書で用いられる経口鼻投与は、鼻および口を通して、または、それを経由して、対象の身体に免疫原性組成物またはワクチン等の物質を導入することを指し、これは、例えば鼻内に1つ以上の液滴を入れることによって起こる。経口鼻投与は、経口および鼻腔内投与に関連した輸送プロセスを含む。本明細書で用いられるパラポックスウイルス、パラポックスウイルス株という用語は、ポックスウイルス科およびパラポックスウイルス属に属するウイルスを指す。本明細書で用いられるパラポックスウイルスオビスおよびORFVという用語は、ポックスウイルス科、パラポックスウイルス属およびパラポックスウイルスオビス種に属するウイルスを指す。これらのウイルスは、伝染性膿疱ウイルス、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルスまたはオルフウイルスとも呼ばれる。それらは、それらを他のポックスウイルスから区別する独特の螺旋状の外殻を有する。パラポックスウイルスオビス株D1701という用語は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,365,393号に記載されているウイルスを指す。パラポックスウイルスオビス株D1701-Vは、サル細胞系Veroに適合させたパラポックスウイルスオビス株D1701を指す。非経口投与は、消化管を含まない経路を通して、または、それを経由して、対象の身体にワクチンまたは免疫原性組成物等の物質を導入することを指す。非経口投与としては、皮下、筋肉内、経皮、皮内、腹腔内、眼内および静脈内投与が挙げられるが、それらに限定されるものではない。本明細書で用いられる病原体または病原微生物という用語は、その宿主動物内で疾患、疾病または異常状態を誘導するかまたは引き起こす可能性がある微生物、例えばイヌジステンパーウイルス、を意味する。医薬的に許容し得るは、適切な医学的判断の範囲内にある物質であって、過度の毒性、刺激、アレルギー応答等なしで対象の組織に接触する使用に適しており、妥当な効果対危険比に相応し、それらの用途に有効である物質を指す。本明細書で用いられるポリクローナル抗体は、特定の病原体または抗原に対して作製された抗体の混合集団を指す。一般に、前記集団は様々な抗体群を含み、各群は、病原体または抗原の特定のエピトープに対して特異的である。ポリクローナル抗体を作製するためには、病原体または抗原に対する抗体を宿主が産生するよう誘導する接種または感染によって病原体全体または単離抗原を宿主に導入する。本明細書で用いられるポックスウイルスという用語は、ポックスウイルス科に属するウイルスを指す。これらのウイルスは、楕円形の、非常に大きな二本鎖DNAウイルスである。本明細書で用いられるポリヌクレオチドという用語は、鎖中で共有結合したヌクレオチドモノマーで構成された有機ポリマー分子を意味する。DNAデオキシリボ核酸およびRNAリボ核酸は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。本明細書で用いられるポリペプチドという用語は、鎖中で結合した2個以上のアミノ酸で構成された有機ポリマー分子を意味する。本明細書で用いられる予防する、予防することまたは予防等の用語は、微生物の複製を阻害すること、微生物の伝染を阻害すること、または微生物がその宿主内でそれ自体を確立することを阻害することを意味する。本明細書で用いられるこれらの用語等は、感染症の1つ以上の徴候または症状を阻害すること、または妨げること、または緩和することを意味することもできる。ワクチンまたは免疫原性組成物に関して本明細書で用いられる防御、防御すること、防御免疫等は、ワクチンまたは免疫原性組成物で使用された抗原が由来する生物体によって引き起こされる疾患の症状をワクチンまたは組成物が予防または軽減することを意味する。防御および防御すること等の用語はまた、対象中にすでに存在する疾患または疾患の1つ以上の症状を治療的に処置するためにワクチンまたは免疫原性組成物を用いることができることも意味する。組換え的に調製されたPPVまたは組換えPPVは、それらのゲノム内に挿入および/または欠失を有するPPVである。挿入および欠失は、分子生物学的方法を用いて作成される。特異的結合、特異的に結合する等の用語は、生理学的またはアッセイ条件下で測定可能であり、選択的である複合体を形成する2個以上の分子として定義される。適切に選択された条件下で、非特異的結合が阻害されると同時にそのような結合が実質的に阻害されない場合、抗体または他の阻害剤はタンパク質に特異的に結合すると言われる。特異的結合は、高親和性を特徴とし、化合物またはタンパク質に対して選択的である。非特異的結合は、通常は低親和性を有する。例えば、IgG抗体における結合は、一般に、少なくとも約10-7M以上、例えば、少なくとも約10-8M以上、または少なくとも約10-9M以上、または少なくとも約10-10以上、または少なくとも約10-11M以上、または少なくとも約10-12M以上の親和性を特徴とする。その用語は、例えば多くの抗原によって担持されない特定のエピトープに対して抗原結合性ドメインが特異的であって、その場合、抗原結合性ドメインを担持する抗体が一般に他の抗原に結合しない場合に適用可能である。本明細書で用いられる特異的免疫原性断片は、その配列に対して特異的な抗体またはT細胞が認識可能な配列の一部を指す。本明細書で用いられる実質的に同一は、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、または少なくとも約99の配列同一性の程度を指す。本明細書で用いられる治療上有効量という用語は、微生物またはサブユニット抗原またはポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたはそれらの組み合わせの量であって、それが投与された対象における免疫応答を誘発するのに十分な量を意味する。本明細書で用いられる治療剤は、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症もしくは真菌感染症、それらによって引き起こされる疾患または状態の処置治療を助ける任意の分子、化合物、ウイルスまたは治療薬、好ましくは弱毒化されたもしくは死滅させたウイルス、あるいはサブユニットまたは化合物を指す。本明細書で用いられる治療上有効量は、病原体、例えばウイルス、細菌、寄生虫または真菌による感染によって引き起こされる、有害な健康効果またはその合併症を含む疾患の徴候または症状を予防または寛解させるために適当な抗原またはワクチンまたは免疫原性組成物の投与を受けた対象例えば犬における免疫応答を誘導する抗原またはワクチンまたは免疫原性組成物の量を指す。液性免疫もしくは細胞媒介免疫、または液性および細胞媒介免疫の両方を誘導することができる。抗原、ワクチンまたは免疫原性組成物に対する動物の免疫原性応答は、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを通して間接的に、または野生型株による誘発後の徴候および症状のモニタリングを通して直接的に評価することができる。ワクチンまたは免疫原性組成物によって付与された防御免疫は、排出される誘発生物体の減少、および/または、対象の死亡率、罹患率、体温、ならびに全体的な身体的状態、健康および動作等の臨床徴候の減少を測定することによって評価することができる。治療上有効なワクチンまたは免疫原性組成物の量は、使用する特定の免疫原または対象の状態に応じて変化することができ、当業者によって決定することができる。本明細書で用いられる治療するtreat、治療すること処置すること、treatingまたは処置treatment等の用語は、微生物による感染症を予防するか、軽減するか、または排除することを意味する。また、これらの用語等は、微生物の複製を減少させること、微生物の伝染を減少させること、微生物がその宿主内でそれ自体を確立する能力を減少させること、または微生物がその宿主内でそれ自体を確立することを防ぐことを意味することもできる。また、本明細書で用いられるこれらの用語等は、微生物による感染症の1つ以上の徴候もしくは症状を軽減させること、寛解させること、または排除すること、あるいは微生物による感染症からの回復を早めることを意味することもできる。本明細書で用いられるワクチン接種するおよびワクチン接種すること等の用語は、動物にワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを意味する。本明細書で用いられるワクチンおよびワクチン組成物という用語は、感染症を予防もしくは軽減するか、または感染症の1つ以上の徴候もしくは症状を予防もしくは軽減する、改変されて生きているか、弱毒化されたか、もしくは死滅されたウイルスもしくは細菌を含む組成物、またはサブユニットワクチン、または上述のものの任意の組み合わせを意味する。病原体に対するワクチンの防御効果は、通常、対象内で免疫応答を誘導することによって達成される。一般的に言って、感染症の発現率の消滅もしくは減少、徴候もしくは症状の寛解、または感染した対象からの微生物の排除の促進は、ワクチン組成物の防御効果を示す。本明細書に記載されるワクチンは、イヌジステンパーウイルスによって引き起こされる感染症に対する防御効果を提供する。本明細書で用いられる変異体という用語は、変異的差異を除けば誘導された配列が所定の配列と本質的に同一である、所定のタンパク質および/または遺伝子配列の誘導体を指す。前記差異は、天然に存在してもよいし、合成もしくは遺伝子操作で作製してもよい。ベクターまたはベクターウイルスは、異種DNAの挿入に適切であり、細胞または生物体内に挿入DNAを輸送することが可能であり、適切な場合、異種DNAを発現させることを可能にするPPVである。本明細書で用いられる獣医学的に許容し得るという用語は、適切な医学的判断の範囲内にある物質であって、過度の毒性、刺激、アレルギー応答等を伴うことなく動物の組織に接触する使用に適しており、妥当な効果対危険比に相応し、それらの用途に有効である物質を指す。本明細書で用いられる獣医学的に許容し得る担体という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、かつそれが投与される獣医学対象にとって有毒でない担体媒体を指す。ウイルス、免疫原性組成物およびワクチン本発明は、イヌジステンパーウイルスに由来する異種DNAを含む組換えパラポックスウイルスの調製のためのパラポックスウイルスの使用を包含する。一態様においては、イヌジステンパーウイルスに由来する異種DNAを含む組換えパラポックスウイルスの調製のためのパラポックスウイルスオビスPPVOが用いられる。別の態様においては、パラポックスウイルスオビス株D1701が用いられる。この株は、米国特許第6,365,393号、Rzihaetal2000JBiotechnol83137145、およびCottoneetal1998VirusResearch565367に記載されている。更なる態様においては、パラポックスウイルスオビスD1701-Vが用いられる。パラポックスウイルスに挿入される遺伝子配列は、イヌジステンパーウイルスに由来する異種DNAを含む。一態様において、異種DNAは、イヌジステンパーウイルスのHタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、異種DNAは、配列番号1、または配列番号1と少なくとも98の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。イヌジステンパーウイルスのH遺伝子を含むクローン化断片の完全な配列配列番号1を図7に示す。それは、制限酵素クローニングおよび分析BamHIおよびKpnIのための5’20ntおよび3’21nt末端上のリンカー配列を有する完全長コード領域1824ntを含む。一態様において、異種DNAは、イヌジステンパーウイルスのFタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、異種DNAは、配列番号2、または配列番号2と少なくとも98の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。イヌジステンパーウイルスのF遺伝子を含むクローン化断片の完全な配列配列番号2を図8に示す。それは、制限酵素クローニングおよび分析BamHIおよびKpnIのための5’19ntおよび3’16nt末端上のリンカー配列を有する完全長コード領域1989ntを含む。ポリヌクレオチドの配列についての知識によって、そのポリヌクレオチドのあらゆる可能な断片が容易に利用可能になる。ゆえに、本発明は、Hタンパク質の断片を提供する。ゆえに、本発明はまた、Fタンパク質の断片をも提供する。一態様においては、機能的断片が提供される。別の態様においては、生物学的活性断片が提供される。断片は、例えば濾過またはクロマトグラフィ等の従来の方法によって精製することができる。断片は、当業者に公知の方法による組換えによって作製することができる。組換えパラポックスウイルスの調製においては、パラポックスウイルスオビス株D1701のHindIII断片H/Hの中に異種DNAを挿入する。別の態様においては、パラポックスウイルスオビス株D1701のHindIII断片H/Hの中のVEGFコード配列または隣接する非コード配列の中に異種DNAを挿入する。異種DNAをパラポックスウイルスに挿入するために用いる方法は標準的であり、当業者に公知である。それらは、米国特許第6,365,393号に記載されている。一態様において、イヌジステンパーウイルスに由来する異種DNAを含む組換えパラポックスウイルスは、パラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-HまたはパラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-Fである。これらのウイルスは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約を遵守して、健康保護局カルチャーコレクションHealthProtectionAgencyCultureCollectionsHPAカルチャーコレクションの一部である欧州細胞カルチャーコレクションECACC英国、ウィルトシアSP40JG、サリスバリー、ポートンダウンに寄託されている。プラスミドpdV-CDV-Hの配列7,975ntは配列番号3であり、それは配列表に示される。プラスミドpdV-CDV-Fの配列8,134ntは配列番号4であり、それは配列表に示される。本発明はまた、本明細書に記載される配列と少なくとも約99、少なくとも約98、少なくとも約97、少なくとも約96、少なくとも約95、少なくとも約93、少なくとも約90、少なくとも約85、少なくとも約80、少なくとも約75、少なくとも約70、少なくとも約65、少なくとも約60、少なくとも約55、および少なくとも約50の同一性および/または相同性を有するポリヌクレオチド配列をも包含する。本発明はまた、本明細書に記載される配列番号のいずれか1つの非コード鎖または補体に厳密性が中~高程度の条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列およびその種相同体をも包含する。例示的な厳密性の高い条件としては、65°C~75°Cにおける0.2×SSC/0.1SDSを含む緩衝液中での最終的洗浄が挙げられるのに対して、例示的な厳密性が中程度の条件としては、35°C~45°Cにおける2×SSC/0.1SDSを含む緩衝液中での最終的洗浄が挙げられる。同等の厳密性の条件は、AusubeletalProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonspp603to6410に記載されているように温度および緩衝液または塩濃度の変化を通して達成することができることが本技術分野で分かっている。組換えPPVは、細胞、細胞系および宿主細胞内で増殖させることができる。前記細胞、細胞系または宿主細胞としては、例えば、哺乳動物細胞および非哺乳動物細胞であってよいが、それらに限定されるものではない。PPVを増殖させ得る細胞、細胞系および宿主細胞は、容易に知られており、当業者が利用可能である。一態様においては、Vero細胞が用いられる。他の態様においては、ウシ腎臓またはヒツジ精巣細胞が用いられる。組換えPPVは、免疫原性組成物またはワクチンにおける使用前に更に弱毒化または不活性化させることができる。弱毒化および不活性化の方法は、当業者に周知である。弱毒化のための方法としては、適切な細胞系上における細胞培養物内での連続継代、紫外線照射および化学的突然変異生成が挙げられるが、それらに限定されるものではない。不活性化のための方法としては、ホルマリン、ベータプロピオラクトンBPLもしくはバイナリーエチレンイミンBEIによる処置、または当業者に公知の他の方法が挙げられるが、それらに限定されるものではない。ホルマリンによる不活性化は、ウイルス懸濁液を37のホルムアルデヒドと混合してホルムアルデヒド終濃度を0.05とすることによって行うことができる。室温でおよそ24時間一定に撹拌することによってウイルス-ホルムアルデヒド混合物を混合する。次いで、適切な細胞系上の成長についてアッセイして、不活性化ウイルス混合物を生き残ったウイルスについて試験する。BEIによる不活性化は、本発明のウイルス懸濁液を0.1MのBEI0.175NNaOH中における2-ブロモ-エチルアミンと混合してBEI終濃度を1mMとすることによって行うことができる。室温でおよそ48時間一定に撹拌することによってウイルス-BEI混合物を混合した後、1.0Mのチオ硫酸ナトリウムを添加して終濃度を0.1mMとする。混合を更に2時間続ける。適切な細胞系に関する成長についてアッセイして、不活性化ウイルス混合物を生き残ったウイルスについて試験する。組換えPPVは、免疫原性組成物およびワクチンで用いることができる。免疫原性組成物およびワクチンは、製剤用ビヒクル、賦形剤または媒体の役割をする液体、半固体または固体希釈剤を含む1種以上の獣医学的に許容し得る担体を場合によって含んでいてもよい。本明細書で用いる場合、獣医学的に許容し得る担体としては、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗細菌および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤等が挙げられる。希釈剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を挙げることができる。等張剤としては、当業者に周知の塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、当業者に周知のアルブミンが挙げられる。保存剤としては、当業者に周知のメルチオレートmerthiolateが挙げられる。アジュバントとしては、当業者に公知の多くの他のものの中で、RIBIアジュバント系RibiInc.、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、例えばフロイント完全および不完全アジュバント、ブロックコポリマーCytRx、ジョージア州アトランタ、SAF-MChiron、カリフォルニア州エメリービル、AMPHIGEN登録商標アジュバント、サポニン、QuilA、QS-21CambridgeBiotechInc.、マサチューセッツ州ケンブリッジ、GPI-0100GalenicaPharmaceuticals,Inc.、アラバマ州バーミンガムもしくは他のサポニン分画物、モノホスホリルリピドA、アブリジンリピド-アミンアジュバントAvridinelipidamineadjuvant、大腸菌組換え体等由来の易熱性毒素、コレラ毒素またはムラミルジペプチドが挙げられるが、それらに限定されるものではない。本発明の文脈において有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は、当業者によって容易に決定することができる。一態様において、本発明は、約50μg~約2000μgのアジュバントを含む免疫原性組成物およびワクチンについて検討する。別の態様において、アジュバントは、約100μg~約1500μg、または約250μg~約1000μg、または約350μg~約750μgの量で含まれる。別の態様において、アジュバントは、免疫原性組成物またはワクチンの約500μg/2ml用量の量で含まれる。免疫原性組成物およびワクチンは抗生物質を含んでいてもよい。そのような抗生物質としては、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、マクロライド、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミドおよびテトラサイクリンのクラスからのものが挙げられるが、それらに限定されるものではない。一態様において、本発明は、約1μg/ml~約60μg/mlの抗生物質を含む免疫原性組成物およびワクチンについて検討する。別の態様において、免疫原性組成物およびワクチンは、約5μg/ml~約55μg/mlの抗生物質、または約10μg/ml~約50μg/mlの抗生物質、または約15μg/ml~約45μg/mlの抗生物質、または約20μg/ml~約40μg/mlの抗生物質、または約25μg/ml~約35μg/mlの抗生物質を含む。更に別の態様において、免疫原性組成物およびワクチンは、約30μg/ml未満の抗生物質を含む。組換えPPVに加えて、免疫原性組成物およびワクチンは、他の抗原を含んでいてもよい。抗原は、微生物の不活性化された全体的もしくは部分的調製物の形態であってもよく、または遺伝子工学技術もしくは化学合成によって得られた抗原分子の形態であってもよい。本発明による使用に適切な他の抗原としては、病原性細菌または病原性ウイルスに由来するものが挙げられるが、それらに限定されるものではない。組換えイヌジステンパーウイルス免疫原性組成物およびワクチンは、例えばエールリヒアカニスEhrlichiacanis、イヌパルボウイルスCPV、イヌパラインフルエンザウイルスCPI、イヌアデノウイルスII型CAV-2、イヌアデノウイルスCAV、イヌコロナウイルスCCV、レプトスピライクテロヘモリジアLeptospiraicterohemorrhagiaeLI、レプトスピラカニコーラLeptospiracanicolaLC、レプトスピラグリポティフォーサLeptospiragrippotyphosaLG、レプトスピラポモナLeptospirapomonaLP、ボレリアブルグドルフェリBorreliaburgdorferi等の1種以上の更なるイヌ抗原との混合物を場合によって含んでいてもよい。抗原の1つの組み合わせは、コロナウイルスおよびレプトスピラ新興血清型レプトスピラグリポティフォーサおよびレプトスピラポモナを含むを有するまたは有さない、イヌパルボウイルス、イヌアデノウイルスおよびイヌパラインフルエンザの分離株を包含する。本明細書に記載される免疫原性組成物およびワクチンは、CDVに対する有効な免疫応答を誘導するために動物に投与することができる。従って、CDVに対する有効な免疫応答を刺激する方法であって、イヌジステンパーウイルスに由来する異種DNAを含む組換えパラポックスウイルスを含む治療上有効量の免疫原性組成物またはワクチンを動物に投与することを含む方法が本明細書において記載される。一態様において、前記方法は、抗Hタンパク質血清抗体の誘導をもたらす。別の態様において、前記方法は、抗Fタンパク質血清抗体の誘導をもたらす。本明細書に記載される免疫原性組成物およびワクチンは、イヌジステンパー疾患に対して動物対象にワクチン接種を行うために動物に投与することができる。免疫原性組成物およびワクチンは、動物におけるイヌジステンパー疾患を予防または治療するために動物に投与することができる。従って、イヌジステンパー疾患に対して動物にワクチン接種を行い、イヌジステンパー疾患を予防または治療する方法であって、イヌジステンパーウイルスに由来する異種DNAを含む組換えパラポックスウイルスを含む治療上有効量の免疫原性組成物またはワクチンを動物に投与することを含む方法が本明細書において記載される。形態、投与量、投与経路免疫原性組成物およびワクチンは、投与経路に応じて様々な形態で作製することができる。例えば、免疫原性組成物およびワクチンは、注射用に適した滅菌水溶液もしくは分散液の形態で作製することができるか、または凍結乾燥技術を用いて凍結乾燥形態で作製することができる。凍結乾燥された免疫原性組成物およびワクチンは、典型的には約4°Cで維持され、安定化溶液例えば生理食塩水およびHEPESで戻すことができる。別の場合、凍結乾燥によって免疫原性組成物およびワクチンを保存することができる。免疫原性組成物およびワクチンは、懸濁液またはエマルジョンの形態で作製することもできる。免疫原性組成物およびワクチンは、治療上有効量の上記組換えPPVを含む。精製ウイルスを免疫原性組成物もしくはワクチン中に直接用いることができるか、または更に弱毒化もしくは不活性化することができる。典型的には、免疫原性組成物またはワクチンは、約1×102~約1×1012PFU、または約1×103~約1×1011PFU、または約1×104~約1×1010PFU、または約1×105~約1×109PFU、または約1×106~約1×108PFUを含む。防御効果を提供するために有効な免疫原性組成物またはワクチン中のウイルスの正確な量は、当業者が決定することができる。免疫原性組成物およびワクチンは、一般に、約0.5mlから約5mlの間の体積の獣医学的に許容し得る担体を含む。別の態様において、担体の体積は、約1mlから約4mlの間、または約2mlから約3mlの間である。別の態様において、担体の体積は、約1ml、または約2ml、または約3ml、または約5mlである。免疫原性組成物およびワクチンにおける使用に適切な獣医学的に許容し得る担体は、本明細書に記載されるもののいずれかであることができる。当業者は、投与前にウイルスを弱毒化または不活性化する必要があるのかどうかについて容易に決定することができる。別の態様において、組換えPPVは、更に弱毒化することなく動物に直接投与することができる。治療上有効なウイルスの量は、動物の状態および感染の程度を含む幾つかの因子のいずれかに応じて変化する可能性があり、当業者が決定することができる。本発明の方法によれば、単一用量を動物に投与することが可能であり、または、それに代えて2回以上の接種を約2~約10週間の間隔で行うことができる。追加抗原刺激計画を必要とする可能性があり、最適な免疫化を提供するために投与量計画を調整することができる。当業者は、最適な投与計画を容易に決定することができる。免疫原性組成物およびワクチンは、血流内に、筋肉内に、または内部臓器内に直接投与することができる。それらは、経口的にまたは鼻腔内に投与することができる。非経口投与のための適切な手段としては、静脈内、動脈内、腹腔内、鞘内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内および皮下が挙げられるが、それらに限定されるものではない。非経口投与のための適切な装置としては、針顕微針を含む、注射器、無針注射器および注入技術が挙げられる。非経口製剤は、典型的には、賦形剤、例えば塩、炭水化物および緩衝剤好ましくは、約3~約9、または約4~約8、または約5~約7.5、または約6~約7.5、または約7~約7.5のpHにを含有し得る水溶液であるが、幾つかの適用のために、それらは、滅菌非水溶液として、または滅菌した、発熱性物質を含まない水等の適切なビヒクルと共に用いられる乾燥形態として、より適切に製剤化することができる。例えば凍結乾燥による、滅菌条件下における非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的医薬技術を用いて容易に達成することができる。イヌジステンパー疾患に対して動物にワクチン接種を行うための薬物の調製に、本明細書に記載される組換えパラポックスウイルスおよび免疫原性組成物およびワクチンを用いることができる。本発明は、動物対象内に存在するパラポックスウイルスの起源を決定する方法を提供する。DIVAワクチンワクチン接種動物から感染動物を区別することが可能なものを利用するワクチン接種は、動物対象内に存在するパラポックスウイルスの起源を決定するための手段を提供する。この区別は、ELISA、ウエスタンブロット法およびPCRを含むがそれらに限定されるものではない各種の診断方法のいずれかによって達成することができる。これらの方法および他の方法は当業者に容易に認識されかつ知られている。本明細書に記載されるパラポックスウイルスは、それらのゲノム組成および発現するタンパク質の両方とも野生型株と区別することができる。そのような区別により、ワクチン接種と感染動物の間の識別が可能になる。例えば、特定の実験室試験においてパラポックスウイルスに対して試験が陽性である動物が、野生型パラポックスウイルス株を有するかどうかを、またはすでにワクチン接種を通して得られた組換えパラポックスウイルスを有するかどうかを決定することができる。その決定を行うために様々なアッセイを用いることができる。例えば、パラポックスウイルスに対する試験が陽性である動物からウイルスを分離することでき、以前のワクチン接種を示すパラポックスウイルスゲノムの存在を決定するために核酸ベースのアッセイを用いることができる。核酸ベースのアッセイとしては、サザンまたはノーザンブロット分析、PCRおよび配列決定が挙げられる。別の場合、タンパク質ベースのアッセイを用いることができる。タンパク質ベースのアッセイでは、感染が疑われる細胞または組織をパラポックスウイルスに対する試験が陽性である動物から単離することができる。細胞抽出物は、そのような細胞または組織から作製でき、例えば、すでに接種した組換えパラポックスウイルスまたは野生型パラポックスウイルスのどちらかの存在を区別して同定することができるウイルスタンパク質に対する適切な抗体を用いたウエスタンブロット法に付すことができる。動物において誘導される免疫応答の程度および性質は、様々な技術を用いて評価することができる。例えば、接種動物から血清を回収し、例えば従来のELISAでパラポックスウイルスに対して特異的な抗体の有無について試験することができる。リンパ組織内の細胞障害性Tリンパ球CTLの応答の検出は、細胞性免疫応答の誘導を示すT細胞分裂増殖等のアッセイによって達成することができる。関連技術は、本技術分野において、例えばColiganetalCurrentProtocolsinImmunologyJohnWileySonsIncに十分に記載されている。組換えパラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-Hは、DIVAアッセイで用いることができる。一態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーN-遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーP-遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。更に別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーL-遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。更に別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーM-遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。組換えパラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-Fは、DIVAアッセイで用いることができる。一態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーN-遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーP-遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。更に別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーL-遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。更に別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーM-遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。以下の例証となる非限定的な実施例によって本発明を更に記載する。実施例1.CDV-HおよびCDV-Fタンパク質を発現する組換えウイルスD1701-V-CDV-HおよびD1701-V-CDV-Fの作製CDVのHタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えパラポックスウイルスオビス、およびCDVのFタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えパラポックスウイルスオビスを作製した。HおよびFタンパク質の発現を評価した。組換えパラポックスウイルスオビスD1701-V-CDV-HおよびD1701-V-CDV-Fの作製のために、パラポックスウイルスオビスPPVOベクター系米国特許第6,365,393号;Rzihaetal2000JBiotechnol83137145;Fischeretal2003JVirol7793129323;Henkeletal2005JVirol79314325を用いた。PCRによってウイルス株RockbornからCDV-H遺伝子およびF遺伝子を得て、BamHI-KpnI制限消化、アガロースゲル08w/v電気泳動、およびQiaexIIゲル抽出Qiagen;ドイツによる精製に続いて、大きさが1865bpHまたは2024bpFのBamHI-KpnIDNA断片としてクローニングした。プラスミドpdV-Rec1Fischeretal2003をBamHIおよびKpnIで二重消化し、ライゲーションFastライゲーションキット、Promega;ドイツに用いた。大腸菌DH5αF’Invitrogen、ThermoFisherScientific;ドイツの形質転換後、プラスミドDNAのBamHI-KpnI制限消化によって挿入陽性コロニーを選択した。これによって、転移プラスミドpdV-CDV-H図1Aまたは転移プラスミドpdV-CDV-F図1Bが得られた。前記プラスミド内の関連の制限部位およびそれらのヌクレオチドnulceotide位置を前記図に示す。アンピシリン抵抗性遺伝子AmpiRならびにT7およびSP6プロモーターも示される。QiagenPlasmidMaxiKitQiagen;ドイツによって両転移プラスミドを調製し、DNA塩基配列決定のために用いた。この目的のために、pdV-Rec1内の挿入部位の上流に位置するプライマーORF32N配列番号5;5’-GCGCGCTGCGGGTGCGCTACCAATTCGCGC-3’および挿入部位の下流に位置するプライマーORF31N配列番号6;5’-GCATCCCGTTACCACCGGAGACCGACGCTCCC-3’、ならびに内部H遺伝子特異的プライマーCDH-F配列番号7;5’-CAGATGCAGTGGAGCTACTACTTC-3’およびCDH-R配列番号8;5’-GGATCTAGAGGTAATGTCAACCGC-3’をそれぞれ用いた。これによって、挿入H遺伝子の完全な配列配列番号1の決定が可能になった。内部F遺伝子特異的プライマーCDF-F配列番号9、5’-CCCTGCTATGCAACATATGTCGTGTG-3’およびCDF-R配列番号10、5’-CGTTATACCATATCAGGGTATTGCCTCC-3’によって、完全なF遺伝子配列配列番号2の決定が可能になった。Bluo-Gal染色による組換え体の選択Vero細胞106個の細胞を0.1MOI感染多重度のlacZ発現ウイルスD1701-VrVで感染させ、2時間後に製造業者の推奨AmaxaNucleofector;Lonza、ドイツに従ってヌクレオフェクションによって2μgのpdV-CDV-HまたはpdV-CDV-FプラスミドDNAでトランスフェクトした。3~4日後にウイルス溶解物を採取し、6ウェルプレートFisherScientific;ドイツ内でVero細胞に関する滴定のために用いた。プラークが見えるようになった際、記載されているようにFischeretal2003、アガロース含有Bluo-Galを被せた。外観が白色のウイルスプラークを採集し、48ウェルプレートの単一ウェル内でVero細胞1×105個の細胞の同時感染のために単一プラーク溶出液リン酸緩衝食塩水PBS中に4°Cで終夜を用いた。プラーク-PCRによる組換え体の選択PasamontesetalJVirolMethods351371411991の方法を改良して、各ウイルスプラーク分離株からのDNAの単離を行った。ウイルス溶解物0.2mlを3回凍結-70°Cおよび融解37°Cし、氷上で3回、20~30秒間超音波破砕した超音波水浴。フェノールおよびクロロホルム抽出の後、10μgの酵母tRNAまたは3μlのGlycoBlueAmbion;ドイツを加えた後、エタノール沈殿を行った。DNAペレットを70v/vのエタノールで2回洗浄し、乾燥後に14μlの2回蒸留水aquabidestに溶解した。CDV-H特異的PCRのために、4.0pmolのCDH-F配列番号7および4.0pmolのCDH-R配列番号8のプライマーからなる1μlのプライマー混合物ならびに5μlのReddyMix2×PCRAbgene、ThermoFisherScientific;ドイツと4μlのDNAを氷上で混合した。PCRは、TrioThermoblockBiometra;ドイツ内で、98°Cで2分間インキュベートした後、96°Cで1分間、65°Cで30秒間、72°Cで30秒間、および72°Cで2分間の最終拡張工程を40サイクル行うことによって実施した。CDV-F特異的PCRについては、プライマーCDF-FおよびCDF-Rをそれぞれ用いて、65°Cの代わりに68°Cで30秒間を除いて同一の条件を用いた。水平の1w/vアガロース-臭化エチジウム1ml当たり0.3マイクログラムゲルでPCR産物を分離した。大きさが686bpのH遺伝子特異的PCR断片を示すプラーク分離株からのウイルス溶解物を希釈し、上記のようにBluo-Galアガロースオーバレイを用いて更に少なくとも3回プラーク精製した。また、大きさが766bpのF遺伝子特異的PCR断片を示すプラスミドpdV-CDV-Fによるトランスフェクションからのプラーク分離株も、H遺伝子含有ウイルスプラークについて記載したように更にプラーク精製した。最後に、4μlのDNA、3.95pmolのプライマーlacZ-F配列番号11;5’-cgatactgtcgtcgtcccctcaa-3’および4.13pmolのプライマーlacZ-R配列番号12;5’-caactcgccgcacatctgaact-3’を用いたLacZ遺伝子特異的PCRで、HまたはF遺伝子に対して陽性の組換えウイルスプラーク分離株のDNAを試験した。5μlのAccuPrimeSuperMixIIInvitrogen、FisherScientific;ドイツを加えた後、98°Cで2分間加熱し、その後96°Cで1分間、62°Cで30秒間および68°Cで90秒間、そして68°Cで2分間の最終拡張工程を40サイクル行うことによってPCRを行った。PCR産物の分離は、上記のように行った。大きさが508bpのLacZ遺伝子特異的断片がなかったので、対応する組換えウイルスプラーク分離株が、3回のプラーク精製後にLacZ発現親ウイルスD1701-VrVを含まないことが分かった。D1701-V-CDV-HおよびD1701-V-CDV-Fの高力価ウイルス保存液の調製後、後述するようにウイルスDNAを調製し、CDV-PCRおよびLacZ-PCRにおける試験に用いた。組換えウイルスプラークの免疫組織化学的染色IPMA挿入された外来遺伝子の発現の成功が、24ウェルプレート内でVero細胞に関して滴定した組換えウイルスプラークの免疫組織化学的染色を含むIPMAによって最初に試みられた。ウイルスプラークの外観試験の後、各ウェルから培地を吸引し、ラミナーフローフード内でプレートをおよそ10分間開いたままで細胞を乾燥させた。その後、-20°Cで15~20分間氷冷無水メタノールで細胞を固定した。氷冷1v/vウシ胎仔血清FCSを含むPBSで2回洗浄した後、10v/vFCSを含有するPBSで細胞を室温RTで90分間ブロックした。外来遺伝子発現の検出は、1:2.000で希釈したFタンパク質に対する多クローン性ウサギR抗血清P.PlattetA.Zurbriggenベルン大学、スイスにより提供図2Aまたは1のFCSを含むPBS中で1:1.000で希釈した多クローン性Hタンパク質特異的ウサギ抗血清MC711V.vonMesslingケベック大学、カナダにより提供図2Bによる室温で60分間のインキュベーションによって達成された。PBS-T0.05v/vのTween-20を含有するPBSで3回洗浄した後、1:2000で希釈したペルオキシダーゼ結合抗ウサギ二次抗体Jackson-ImmunoRes.、DIANOVA;ドイツを加え、室温で60分間インキュベートした。PBS-TおよびPBSによる完全な洗浄の後、基質VectorNovaRed、Axxora;ドイツを、赤褐色の陽性の染色が現れるまで、製造業者の指示書の推奨にしたがって加えた。陰性対照として、1:100で希釈した、Fタンパク質に対する多クローン性ウサギ抗血清で非感染細胞をインキュベートした図2C。D-1701-VrVまたはD-1701-Vを感染させた細胞も陰性対照として用いた。ウイルスプラークおよび感染細胞は、CDVのFタンパク質図2AおよびHタンパク質図2Bに対して陽性が強いことが分かった。実施例2.D1701-V-CDV-HおよびD1701-V-CDV-Fの特性決定ウイルス保存液の調製D1701-V-CDV-HおよびD1701-V-CDV-Fの高力価組換えウイルス保存液を得るため、10~20個のT150培養フラスコGreiner;ドイツを同時に0.5のMOIで感染させた。3日後、およそ80の細胞変性効果CPEが認められ、遠心分離13,000rpm、4°Cで2時間のために全フラスコの細胞および上清を採取し、回収した。慎重に上清を除去し、ウイルスペレットを1~2mlのPBSに4°Cで終夜溶解させた。10秒間の3パルス100W各パルス間に10秒間の破壊を用いて氷上での音波処理音波細胞破壊器Soniccelldisruptor、Branson;ドイツによってウイルス懸濁液を完全に分散させた後、遠心分離500~700×g、10分間、4°Cを行い、細胞破壊片を除去した。上清を氷上で保管して、1.0mlのPBS中に細胞ペレットを再懸濁させ、氷上で超音波破砕したその間に10秒間の休止を伴う20秒間で2回、次いで30秒間で1回。低速遠心分離の後、その上清を最初の上清と組み合わせ、一定分量に分け、滴定し、-70°Cで保管した。ウイルスDNAの特性決定Vero細胞をMOI0.5で感染させ、2~3日後およそ80のCPEにトリプシン処理および4°Cの短時間の低速遠心分離によって採取した。MasterPureDNAIsolationKitEpicentreBiotechnology、BiozymScientific;ドイツを用いて、製造業者の手順に従ってDNAを単離した。正確な座位におけるCDV-HまたはF遺伝子の挿入を確認するため、2μgのDNAを制限酵素で消化し、0.8w/vのアガロースゲル内で分離し、標準的手法に従ってサザンブロットハイブリダイゼーションのためのナイロン膜GEHealthcare;ドイツに転移させた。CDV-HまたはF遺伝子特異的プローブCDV-HまたはCDV-FPCRの産物をゲル単離し、RediPrimeGEHealthcare;ドイツを用いて放射性物質で標識した32P-dCTP、MPBiomedicals;ドイツ。次いでこれをサザンブロットハイブリダイゼーションに用い、0.5w/vの脱脂乳粉末、1.0w/vのドデシル硫酸ナトリウムSDSおよび0.5mg/mlの変性仔ウシ胸腺DNAKT-DNA、Sigma;ドイツを含有する4×SSPE1×=0.18MのNaCl、10mMのPP、1mMのEDTA、pH7.4中で50°Cの条件下で実施した。X線KodakX-Omat;ドイツの曝露の後、0.4NのNaOH中で、45°Cで30~60分間のインキュベーションによってプローブをフィルタから除去し、その後0.1×SSC、0.5SDS、0.2Mトリス-HClpH7.4で100°Cの短時間インキュベーションを行った。2回目のハイブリダイゼーションのために、文献Cottoneetal1998VirusRes565367の記載に従ってvegF-E座位を含むD1701-VのHindIII断片Hを用いた。サザンブロットの結果から、D1701-VrVのゲノム内へのHまたはF遺伝子の正確な挿入が確認された。CDV-HまたはF遺伝子特異的RNAの検出Vero細胞を3~5のMOIで感染させ、感染後p.i.、異なる時点で、SurePrepTotalRNAExtractionKitFisherScientific;ドイツを用いてトータルRNAを単離した。更に、シトシンアラビノシドAraC;0.04mg/ml、Sigma;ドイツまたはシクロヘキシミドCHX、0.1mg/ml、Serva;ドイツの存在下で感染させた細胞からRNAを抽出し、挿入されたH-またはF-遺伝子の初期発現について試験した。対照として、非感染細胞からRNAを単離した。ホルムアルデヒドを含む変性1アガロースゲルでそれらのRNAを分離し、文献KroczekRASiebertEAnalBiochem18490951990の記載にしたがってナイロン膜に転移させた。放射性物質で標識したCDV-HまたはCDV-FのPCR断片を42°CのUltraHyb溶液Ambion;ドイツ中でハイブリダイゼーションプローブとして用いた。結果は、ORFVの初期vegF-Eプロモーターの制御下のその調節によるCDV-HまたはCDV-F遺伝子の前初期発現を明確に示したRzihaetal1999JBiotechnol73235242。免疫蛍光法によるCDVのHまたはFタンパク質の検出免疫蛍光法のために、1.0のMOIで、4チャンバースライドBDFalcon;ドイツ内でVero細胞1×105個/mlを感染させた。感染後、異なる時点で細胞を培地で洗浄し、37°Cで15分間、3.7v/vメタノールを含まないホルムアルデヒドPierce、ThermoFisherScientific;ドイツで固定した。PBSで3回洗浄した後、37°Cで5分間の0.2v/vトリトンX-100による処置によって細胞を透過化処理した。PBS洗浄後、37°Cで30~40分間、5のFCSを含むPBSで細胞をブロックした。CDV-HまたはCDV-Fタンパク質の検出のため、ウサギ抗-CDV-H抗体1:2000で希釈またはウサギ抗-CDV-F抗体1:200で希釈、および抗ウサギ-Alexa-5551:2000で希釈を用いて細胞を37°Cで1時間インキュベートした。PBSで5回洗浄した後、PBSに1:2000で希釈した二次抗ウサギAlexa-555または抗ウサギAlexa-488抗体MolecularProbes;ドイツを用いて、37°Cで30分間、暗所でスライドをインキュベートした。陰性対照として、非感染細胞を用いた。ORFVによる感染の後の後期の時点での細胞の検出は、RudigerRaue博士PfizerInc、英国によって提供されたORFV特異的ウサギ抗血清PAS2274を用いて実施した。1FCSを有するPBSに血清を1:100で希釈し、1:2000の希釈率で二次抗体抗ウサギAlexa-488を用いた。製造業者Biotium;ドイツの指示書に従ってPhalloidin-647でアクチン細胞骨格の染色を行った後、暗所において室温で20~30分間、0.04μg/mlのDAPI4’,6-ジアミジノ-2’-フェニルインドールジヒドロクロリド;ロシュモレキュラーバイオケミカルズ;ドイツで核の染色を行った。PBS中での完全な洗浄の後、スライドにMowiol-DABCOを固定し、Axiovisionソフトウェアを用いてZeiss社のApoTomeで蛍光撮像を行った。DAPIで核を染色した。図3に示される結果からは、各組換え体で感染させたMOI=1.0Vero細胞内におけるCDV-Hタンパク質またはCDV-Fタンパク質の強い発現が明らかである。後期に感染させた細胞は、抗血清PAS2274による特異的染色によって更に同定することができた。非感染細胞またはD1701-VもしくはD1701-VrVを感染させた細胞の使用を介して染色の特異性を試験した。ウエスタンブロット法によるCDV-HまたはFタンパク質の検出Vero細胞3×105個の細胞を3.0のMOIで同時に感染させ、5CO2雰囲気において37°Cでインキュベートした。感染後の異なる時点で細胞および上清を採取し、遠心分離し8,900×g、10分間、4°C、細胞沈降物を1.0mlのPBSで3回洗浄し、1v/vトリトンX-100を含有する0.15mlのPBS中に再懸濁させた。氷上で30分後、溶解物を15.000×g、4°Cで15分間遠心分離し、SDS-PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動のために上清を保存した。この目的のために、3部の溶解物を1部の4×DualColorタンパク質負荷緩衝液Fermentas;ドイツと混合し、5分間沸騰させ、超音波破砕し、推奨FMCBioproducts、Biozym;ドイツにしたがってトリス-トリシン-SDS操作緩衝液と共に8w/vProSieve50ゲルを用いておよそ10μgのタンパク質をSDS-PAGEによって分離した。分子量マーカーとして着色済みタンパク質ラダーFermentas;ドイツを用いた。電気泳動の後、製造業者Pierce、ThermoFisherScientific;ドイツの指示書に従って、タンパク質をPVDF膜に転移させた。室温で3時間の3×RotiblockRoth;ドイツ中における膜ブロック化の後、多クローン性ウサギ抗Hまたは抗F抗血清P.Plattet博士およびA.Zurbriggen博士ベルン大学、スイスによって提供を1×RotiBlock中に1:10,000で希釈して用いた。4°Cでの終夜のインキュベーションの後、膜を5回、TBS-T0.05v/vTween-20を有するトリス緩衝生理食塩水中で完全に洗浄し、室温で1時間、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体1:20,000;Jackson-ImmunoRes.、Dianova;ドイツでインキュベートした。TBS-T洗浄の後、文献ImmobilonWestern、Millipore;ドイツに推奨されるようにECL基質を用いた。化学発光X線フィルムCL-XPosure、Pierce、ThermoFisherScientific;ドイツを用いて反応タンパク質を検出した。予想される分子量H=80kDa;F0=60kDa、F1=40kDaのCDV-HまたはFタンパク質の発現を、感染後の異なる時点で確認した。図4は、CDVのFタンパク質の検出を代表として示す。上部のパネルは多クローン性F特異的ウサギ抗血清との反応を示し、切断されたF1CDV遺伝子産物を検出している。中央のパネルは、アクチン-βタンパク質の検出を示し、それは、相当するタンパク質の量が各ウェルにロードされたことを証明している。下部のパネルは、後期ORFV主要エンベロープタンパク質F13Lの検出を示す。インビトロでのウイルス産生ORFVベクターのゲノム内へのCDV遺伝子の挿入がウイルス成長に影響を与える可能性があるのかについて試験するため、滴定実験または一段階ウイルス成長曲線SSGCによって組換え体のウイルス産生を親D1701-Vと比較した。代表として図5にD1701-V-CDV-Hウイルスについて示されるように、全細胞溶解物を感染後p.i.の示された時間で採取して、3回滴定した。感染性の後代の産生は、親D1701-Vウイルスと区別がつかなかった。この実験は、CDV遺伝子を挿入しても親ベクターウイルスと比較してインビトロ成長特性が変わらないという結論を支持している。実施例3.免疫蛍光法によるCDV-H特異的抗体の検出Vero細胞をCDVOnderstepoort株で感染させた図6A~Cか、または感染させず図6Dに組換えD1701-V-CDV-H107PFUで筋肉内に免疫化したマウスの血清1:1000で希釈で固定し、インキュベートした。DAPIによって細胞核を染色した。核外染色は、マウス抗血清との特異的な反応性の結果である。パネルDは、位相コントラスト照明を示し、細胞融合によって特徴づけられるCDV感染細胞をより良好に視覚化する。このアッセイは、CDV-H抗原を発現するORFV組換え体を有するマウスの免疫化によって特異的血清抗体の産生が生じることを証明した。実施例4.免疫蛍光法によるCDV-F特異的抗体の検出106PFUまたは107PFUのD1701-V-CDV-Fを含有する0.1mlでBalb/Cマウス4~6週齢一群当たりn=5を1回、2回または3回、2週間間隔で、筋肉内に免疫化する。最後の免疫化の2週間後までに毎週血清試料をそれぞれ採取する。D1701-V-CDV-Fの免疫原性を試験するため、上記の手順に従って免疫蛍光法およびウエスタンブロット法によってその血清を分析する。全体的に、これらの結果は、ORFV組換え体D1701-V-CDV-H内におけるCDV-Hの発現の成功を証明する。それらはまた、ORFV組換え体D1701-V-CDV-F内におけるF-遺伝子の発現の成功を証明する。"