"タイプIIのブタサーコウイルスcircovirusの精製物。ECACCに下記寄託番号で寄託された精製物から成る群の中から選択されるブタサーコウイルスの精製物:寄託番号第V97100219号寄託番号第V97100218号寄託番号第V97100217号寄託番号第V98011608号寄託番号第V98011609号。PMWS症候群のブタの生理標本または組織標本、特に病変部から分離されるブタサーコウイルスに感染したインビトロ細胞培地の細胞で産成され、単離されたブタサーコウイルスの精製物。ブタの腎臓株細胞で産成され、単離される請求項3に記載のブタサーコウイルスの精製物。PCVに汚染されていないPK/15細胞で産成され、単離される請求項4に記載のブタサーコウイルスの精製物。請求項1のサーコウイルスに感染した細胞のインビトロ細胞培地から集められた培養抽出物または上澄み。請求項1に記載のサーコウイルスに感染した細胞のインビトロの細胞培地から集められた抗原製剤。抗原としてブタサーコウイルスを含む請求項7に記載の抗原製剤を含むワクチンまたは請求項6に記載の培養の上澄みまたは抽出物。無毒化した生の全抗原を獣医学上許容される賦形剤または希釈液中必要に応じて獣医学上許容される補助剤およびフリーズドライ安定剤をさらに含むことができるに含む請求項8に記載のワクチン。抗原が不活性化されており、ワクチンが獣医学上許容される賦形剤または希釈液必要に応じて獣医学上許容される補助剤を含むことができるを含む請求項9に記載のワクチン。下記配列群の中から選択される配列を含むDNA断片:配列ID番号:1配列ID番号:2配列ID番号:3配列ID番号:4配列ID番号:6ORF1~13から成る群の中から選択されるORFを含むDNA断片。ORF4,7,10および13から成る群の中から選択されるORFを含む請求項12に記載のDNA断片。請求項11~13のいずれか一項に記載のDNA断片でコード化されたポリペプチド。請求項11~13のいずれか一項に記載のDNA配列または断片がゲノム中に組み込まれ、インビトロで発現可能なインビトロ発現ベクター。Ecoliおよびバキュロウイルスの中から選択される請求項15に記載の発現ベクター。必要に応じて精製された、請求項15または16に記載の発現ベクターによって製造されたポリペプチド。獣医学上許容される賦形剤または希釈液必要に応じて獣医学上許容される補助剤をさらに含むことができる中に請求項14または17に記載のポリペプチドを少なくとも1つ含むサブユニットワクチン。請求項11~13のいずれか一項に記載DNA配列または断片がゲノム中に組み込まれ、インビボで発現可能なインビボ発現ベクター。ブタには病原性ではなく、ブタで増殖可能な生ウイルスとプラスミドの中から選択される請求項19に記載の発現ベクター。ウイルス性ベクターがアウジェスキー病ウイルス、ブタアデノウイルス等のブタヘルペスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルス等のポックスウイルスから選択される請求項20に記載の発現ベクター。獣医学上許容される賦形剤または希釈液中に請求項19~21のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む生ワクチンまたはプラスミド。請求項1~4に定義の複数のブタサーコウイルスの抗原を含む請求項8~10、18および22のいずれか一項に記載のワクチン。ブタの他の病原体に対応する少なくとも1つの他のワクチン価を有する請求項8~10、18、22、23のいずれか一項に記載のワクチン。PRRS、Mycoplasmahyopneumonia、アクチノバシラス胸膜肺炎菌、Ecoli、ブタ萎縮鼻炎、仮性狂犬病、ブタコレラ、ブタインフルエンザから成る群の中から選択される少なくとも1つの他のワクチン価を有する請求項24に記載のワクチン。PRRSおよびMycoplasmahyopneumoniaから成る群の中から選択される少なくとも1つの他のワクチン価を有する請求項24に記載のワクチン。請求項11~13のいずれか一項に記載の配列の全てまたは一部を含むプローブまたはプライマー。請求項1~5のいずれか一項に記載のサーコウイルス、請求項14または17に記載のポリペプチド、またはこれらの断片から調製されるモノクローナル抗原またはポリクローナル抗原。テストするブタの生理学的液体標本または組織標本で抗原の存在をテストし、抗原自体またはこの抗原に対する抗体を検出するブタサーコウイルスの検出方法。本出願人は、カナダ、米国カリフォルニアおよびフランスブリタニーの農場から得た肺または神経節の標本から5つの新規なPCV株以下、本発明のサーコウイルスcircovirusというを単離することに成功した。これらのウイルスはPMWS症候群のブタの病変部に検出されるが、健康なブタには検出されない。本出願人はさらに、これらの4種の株カナダおよび米国の株と2種のフランスの株のゲノムの配列決定した。これらの株はヌクレオチドレベルで互いに非常に強い相同性96以上超をを示す、一方、PK/15株ははるかに弱い相同性約76しか示さない。従って、新規のタイプのブタサーコウイルスcircovirusを代表するものと考えられ、PK/15に代表されるタイプI第I群に対して、本発明の新規な株はタイプII第II群とよぶことにする。本発明の対象は単離または精製物の形をした上記定義の第II群のブタサーコウイルスcircovirusにある。本発明はさらに、生理標本または組織標本、特にPMWS症候群のブタの病変部の標本から実施例に記載した方法で単離可能なブタのサーコウイルスcircovirus、特にII型サーコウイルスを提供する。本発明の対象はECACCEuropeanCollectionofCellCulturesCentreforAppliedMicrobiologyResearchPortonDownSalisburyWiltshireSP40JGUnitedKingdomに寄託された下記の5種の株の精製物にある:1997年10月2日木曜日寄託:寄託番号第V97100219号以下、Imp.1008PCVという寄託番号第V97100218号以下、Imp.1010PCVという寄託番号第V97100217号以下、Imp.999PCVという1998年1月16日金曜日寄託:寄託番号第V98011608号以下、Imp.1011-48285という寄託番号第V98011609号以下、Imp.1011-48121という本発明はさらに、病気のブタから単離したブタサーコウイルスcircovirusおよび/または本発明株と有意な血清学的類似性を有するサーコウイルスおよび/またはPK/15のPCVとハイブリダイゼーションが全く無く、厳密な条件下で本発明株とのクロスハイブリダイゼーションを有するサーコウイルスに関するものである。ウイルス性株の増殖、特に全抗原例えばウイルスおよび/またはサブユニット例えばポリペプチドの製造は、PMWS症候群のブタの病変部の生理学標本または組織標本から単離されたウイルス株、特にブタ腎臓株細胞を汚染されていない細胞株特にPCV、ペスチウイルス、ブタアデノウイルスおよびブタパルボウイルスに汚染されていないPK/15細胞で増殖するのが有利である。これらの単離株がPK/15細胞での培養で非常に生産的であり、ウイルスまたは抗原の製造、特に不活性化ワクチンの製造に有利であるということは驚くべきことであり、予想できなかったことである。従って、本発明の他の対象は本発明のサーコウイルスcircovirusまたは病変部細胞、特にPMWS症候群のブタの細胞株の生理学標本または組織標本から単離される任意のブタサーコウイルスの少なくとも1つに感染された細胞をインビトロで培養した細胞株、特にPK/15細胞で継代した後に単離されるサーコウイルスcircovirusの調製方法にある。本発明のさらに別の対象は上記の培養抽出物または上澄み必要に応じて一般的な方法でさらに精製されていてもよいと、一般にインビトロの培養から得られる任意の抗原製剤にある。本発明のさらに別の対象は免疫抗原性の有効成分と、少なくとも1つの上記定義の抗原を含むワクチンにある。本発明のさらに別の対象は、無毒化した生全ワクチンをベースとする免疫抗原性の有効成分またはこの有効成分を精製して得られるワクチンにある。この無毒化は通常の方法、例えば細胞での継代、好ましくはブタ細胞、特にPK/15細胞等の株細胞での継代特に50~150、特に100回の継代で行なわれる。これらのワクチンは一般に獣医学上許容される賦形剤または希釈液と、さらには必要に応じて添加される獣医学上許容される補助剤およびフリーズドライ安定剤とを含むことができる。上記の抗原製剤およびワクチンは103~106のTCID50を有するのが好ましい。本発明のさらに別の対象は、不活化した本発明のサーコウイルス抗原をベースにした免疫抗原性有効成分またはワクチンにある。このワクチンは獣医学上許容される賦形剤または希釈液、さらには必要に応じて添加される獣医学上許容される補助剤を含むことができる。本発明のサーコウイルス断片の形でもよいは当業者に公知の方法で不活性化される。この不活性化は化学的方法、例えば抗原をホルムアルデヒドホルマリン、パラフォルムアルデヒド、β-プロピオラクトン、エチレンイミンまたはその誘導体等の試薬で処理して行なうことができる。好ましい不活性化法は試薬、特にエチレンイミンまたはβ-プロピオラクトンで処理する方法である。本発明の不活性化ワクチンにはアジュバンドを加え、当業者に公知の方法でエマルジョンの形、例えば油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョン等の乳剤の形にするのが好ましい。一般的なアジュバンド化合物を有効成分に添加してアジュバンド処理することもできる。使用可能な補剤アジュバンドとしては例えば水酸化アルミニウム、サポニン例えば非特許文献11参照、Avridine商標登録非特許文献12参照、DDAジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、非特許文献13参照、ポリホスファゼン非特許文献14参照、さらには有機油、スクアラン例えばSPT乳剤、非特許文献15参照、スクアレーン例えばMF59、非特許文献16参照をベースとする水中油乳剤または代謝可能な油をベースとする油中水乳剤好ましくは特許文献1、2に記載の乳剤を挙げることができる。補剤の組み合わせ、例えば乳剤AvrIDine商標登録またはDDAとの組み合せた選択することもできる。これらのワクチンは106~108のTCID50を有するのが好ましい。QuilljasaponinまたはQuilA;VaccinDesignTheSubunitandAdjuvantApproach1995MichaelFPowelとMarkJNewman編、PlennumPressNewYorkandLondonp210VaccineDesignp148VaccineDesignp157VaccineDesignp204VaccineDesignp147VaccineDesignp183国際特許第WOA94-20071号公報米国特許第5,422,109号明細書生ワクチン補剤は不活性化ワクチン用のものから選択するこができる。乳剤が好ましい。不活性化ワクチン用のものには特許文献3に記載のものも加えることができる。国際特許第WOA94-16681号公報凍結安定剤としては例えばSPGA非特許文献17、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストランまたはグルコース等の炭水化物、アルブミンまたはカゼイン等のプロテイン、これらの化合物の誘導体またはアルカリ金属燐酸塩等の緩衝剤を挙げることができる。BovarniketalJBacteriology59509950本件出願人は配列ID番号1~4で識別される4つの単離株のゲノムを得た。本発明のさらに他の対象はこれらの配列の一部または全てを含むDNA断片にある。本発明がこれと均等な配列すなわち上記配列の株の特徴または上記配列によりコードされるポリペプチドの機能を変更しない配列も含むものであるということは当然である。また、コードの欠失により変化した配列も含むということは理解てきよう。本発明はさらに、厳密な条件下で上記配列と混成可能であり、および/または、上記定義の第II群に属する本発明株と高い相同性を有するという意味で均等な配列も含むものである。これらの配列およびその断片は適当なベクターを用いてインビトロまたはインビボでポリペプチドの発現に有利に用いることができる。特に、これに使用可能な本発明のDNA断片を形成する読み取り枠はタイプIIのサーコウイルスのゲノム配列で同定されている。本発明は、少なくともこれらの読み取り枠対応するアミノ酸配列の一つを含む全てのポリペプチドに関するものである。特に、本発明は主としてORF4、ORF7、ORF10またはORF13で構成されるプロテインに関するものである。インビトロのサブユニットを発現するための発現手段としてはEcoliまたはバキュロウイルス特許文献3を用いるのが好ましい。米国特許第4,745,051号明細書上記の単数または複数のコード配列またはその断片をバキュロウイルスゲノム例えばAutographacalifornicaNuclearPolyhedrosisVirusAcNPVに組み込み、次いで、それを昆虫細胞、例えばSpodopterafruigiperdaSf9寄託番号ATCCCRL1711で増殖される。また、イースト例えば酵母またはほ乳類細胞例えばCHO、BHK等の真核細胞でサブユニットを製造することもできる。本発明のさらに他の対象は、これらの発現手段によってインビトロで製造され、必要に応じて一般的な方法で精製されたポリペプチドにある。本発明のさらに他の対象は、このようにして得られた少なくとも1つのポリペプチドまたはその断片を獣医学上許容される賦形剤または希釈液中に含むサブユニットワクチンにある。組み換え生ワクチンの製造時にインビボ発現させるには単数または複数のコード化配列またはその断片を単数または複数のポリペプチドを発現できる条件下で適当な発現ベクターに挿入する。適切なベクターとしては好ましくはブタで増殖可能でブタに対しては非病原性の生ウイルスを当業者に周知の方法で使用することができる。特に、アウジェスキー病ウイルス、ブタアデノウイルス等のブタヘルペスウイルス、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルス等を用いることができる特許文献4~7。国際特許第WOA90-11092号公報国際特許第WOA93-19813号公報国際特許第WOA94-21797号公報国際特許第WOA95-20660号公報従って、本発明の他の対象は、このようにして精製されたベクターと、組み換え生ワクチンまたはプラスミドワクチンポリヌクレオチドまたはDNAワクチンにある。これらのワクチンは獣医学上許容される賦形剤または希釈液を含むことができる。本発明のワクチン無毒化、不活性化、サブユニット、組み換えおよびプラスミド生ワクチンは本発明の一つまたは複数2、3つのサーコウイルスから成る一つまたは複数の有効成分抗原を含むことができる。本発明の上記各種ワクチンはブタの他の病原体に対するワクチンと組み合わせることができる。特にPMSW症候群に関連する病原体に対するワクチンと組み合わせることができる。本発明のワクチン、特に不活性化ワクチンはブタの他の病原体に対応する他のワクチン価を含むことができる。これらのブタの他の病原体の中では好ましくはPRRSPorcineReproductoryandRespiratorySyndromeブタ生殖器および呼吸器症候群特許文献8~10および非特許文献18を参照および/またはMycoplasmahyopneumonia特許文献11~13および非特許文献19を参照を挙げることができる。他の重要なワクチン価の中ではアクチノバシラス胸膜肺炎菌、Ecoli、ブタ萎縮鼻炎porcineAtrophicRhinitis、仮性狂犬病アウジェスキー病、ブタコレラ、ブタインフルエンザを挙げることができる。国際特許第WOA93-07898号公報国際特許第WOA94-18311号公報フランス国特許第2,709,966号公報CChareyre他、IPVSCongressBirminghamEngland59July1998p139の議事録欧州特許第597,852号第550,477号、第571,648号第15回IPVSCongressのOMartinon達、p157284285およびGReynaud達、p150本発明のさらに他の対象は、本発明のサーコウイルスに対してブタの免疫反応を誘発する方法、特にブタに有効なワクチン接種方法にある。このワクチン接種方法では上記ワクチンを一回または複数回にわたってブタに投与する。同じワクチン接種プロトコルで複数種の前記ワクチンを組み合わせることも可能である。このワクチンは大人のブタだけでなく、若いブタまたは妊娠中の雌に対して投与することができる。妊娠中の雌にワクチン接種することによって新生児に受動免疫母親抗体:maternalantibodyを与えることができる。本発明はさらに、本発明のブタサーコウイルスの存在を診断する方法を提供する。従って、本発明の他の対象は診断テストと下記試薬を用いたテスト方法にある。互いに異なるサーコウイルスの配列が分かると共通の配列を定義でき、公知の全てのブタサーコウイルスを識別できる試薬を製造することができる。当業者は特定の診断を実施するために対応するPK/15サーコウイルスの配列とほとんどまたは全く相同性を示さない領域に対応する配列の断片を選択することができる。配列を並べることによって当業者は所望の試薬を選択することができる。第1の試薬は上記DNA配列およびその断片で構成され、それは周知のハイブリッド法またはPCRポリメラーゼ鎖反応法によってプローブまたはプライマーとして用いられる。第2の試薬は上記ウイルスの配列によってコードされたポリペプチドまたはベクター前記参照を用いて発現されたまたは公知のペプチド合成法によって化学的に合成されたポリペプチドで構成される。第3および第4の試薬はウイルス、ポリペプチドまたは断片、抽出物またはDNA配列でコードされたものから一般的な方法で製造可能なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体からなる。上記の第2、第3および第4の試薬は本発明の対象である診断法で用いることができる。この診断法では検査するブタから得られた生理学的液体標本血液、血漿、血清等または組織標本神経節、肝臓、肺、腎臓等中に本発明のサーコウイルスに特有な抗原の存在を調べて抗原自体を検出するか、この抗原に対する抗体を検出する。本発明の抗原および抗体は公知の任意の臨床診断法で用いることができるが、上記の抗原および抗体を獣医、ブリーダーまたは動物の飼い主が直接現場で使用可能な方法で用いるのが好ましい。臨床技術および現場技術を有する当業者は上記の抗原および/または抗体を試薬として用いることができる。本発明で用いるのに好ましい診断法はウェスタンブロット法、免疫抗体法、ELISA酵素結合免疫測定法および免疫クロマトグラフィーである。免疫クロマトグラフィー法に関しては特に非特許文献20と特許文献14~29を参照することができる。RobertFZulketalClinChem31711441150国際特許第WOA88-08534号公報国際特許第WOA91-12528号公報欧州特許第291,176号公報欧州特許第299,428号公報欧州特許第291,194号公報欧州特許第284,232号公報米国特許第5,120,643号明細書米国特許第5,030,558号明細書米国特許第5,266,497号明細書米国特許第4,740,468号明細書米国特許第5,266,497号明細書米国特許第4,855,240号明細書米国特許第5,451,504号明細書米国特許第5,141,850号明細書米国特許第5,232,835号明細書米国特許第5,238,652号明細書標本中に特有な抗体は間接法、競合法または置換法によって検出するのが好ましい。そのためには抗原自体を診断試薬として用いるか、抗体の認識を保持する抗原断片を診断試薬として用いる。標識化はペルオキシダーゼを用いた標識化または特殊な標識化、好ましくはコロイド性金を用いた標識化が有利である。標本中の抗原自体をこの抗原に特有な標識化した抗体を用いて検出することもできる。標識化は上記のものが有利である。競合法または置換法または抗原自体の検出に用いられる抗原に特有な抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナール抗体、これら抗体の断片、好ましくはFabまたはF2断片であるである。本発明はさらに、上記抗体を生理学的液体標本または組織標本中の抗原の検出またはこれら標本または試験片中に存在する抗体の検出のための診断試薬として使用可能な本発明抗原に特有のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の製造方法に関するものである。本発明はものでさらに、これらの抗体の免疫機能を有する断片、特にFおよびF2断片は本発明に含まれる。抗体は一般的な方法で製造することができる。特に非特許文献21または非特許文献22を参照することができる。これらの内容は本件明細書の一部を成す。特に、抗原またはその断片の少なくとも1つで免疫化されたネズミの脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合この方法自体は公知することができる。AntibodiesALaboratoryManual1988ColdSpringHarborLaboratoryUSAJWGodingMonoclonalAntibodiesPrinciplesandPracticeAcademicPressInc本発明の他の対象は上記抗原に特有なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、特にネズミまたはウサギの抗体の純粋または部分的に純粋な製剤或いは粗原料からなる製剤にある。本発明では上記のDNA配列を基にした所望のエピトープワクチン用エピトープまたは診断用エピトープを決めることができる。本発明のサーコウイルスのゲノムのDNA配列から、エピトープを決めることができる。当業者は公知の方法、例えば適切なコンピュータプログラムまたはPEPSCANを用いてエピトープを求めることができる。このエピトープはプロテインの免疫優性領域であり、プロテインの表面に露出した領域である。このエピトープは抗体によって認識され、診断の分野において診断目的の抗体の調製または診断試薬として用いられる対応するペプチドの製造に用いられる。少なくともエピトープは8~9個のアミノ酸を有するペプチドである。一般には最小でも13~25個のアミノ酸が好ましい。当業者は一つまたは複数の上記技術および利用可能なその他の技術を用いて診断用のペプチドまたは抗体で用いるエピトープを見付けることができる。従って、本発明の他の対象はこの抗原および/またはこの抗原に特有なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む診断キットにある。これらは特に、前記の診断技術による診断キットである。以下、下記の図を参照して本発明の実施例をさらに詳細に説明する。しかし、本発明が下記実施例に限定されるものではない。配列IDリスト配列ID番号1=Imp.1011-48121株のゲノムのDNA配列配列ID番号2=Imp.1011-48285株のゲノムのDNA配列配列ID番号3=Imp.999株のゲノムのDNA配列配列ID番号4=Imp.1010株のゲノムのDNA配列配列ID番号5=PK15株のゲノムのDNA配列配列ID番号6=1997年10月3日のフランスの最初の出願におけるImp.999株のゲノムのDNA配列実施例1ブタサーコウイルスcircovirus株の培養および分離組織標本はフランス、カナダおよび米国で子豚の肺およびリンパ節から集めた。これらの子豚は離乳後多機能萎縮症候群に典型的な臨床的徴候を示したものである。ウイルスを単離するため組織標本は死体解剖直後に-70°Cで冷凍した。ウイルス単離のために無菌の乳鉢と乳棒を用いて無菌の砂で組織を粉砕し、イールEarl塩EMEMBioWhittakerUKLtdWorkinghamUK、ペニシリン100IUmlおよびストレプトマイシン100μm/mlを含む最小培地MEM-SA培地中に約15の組織標本を含む懸濁液を調製した。粉砕物をMEM-SAに溶解し、4°C、3000gで30分間、遠心分離にかけて上澄みを回収した。細胞培地の接種前に、100μlのクロロホルムを2mlの各上澄みに添加し、室温で10分間混合した。この混合物を超遠心分離管に移し、10分間3000gで遠心分離して上澄みを回収した。次いで、この上澄みをウイルス分離実験で種菌として用いた。全てのウイルス単離研究はブタサーコウイルス、ペスチウイルス、ブタアデノウイルスおよびブタパルヴォウイルスに感染していないことが分かっているPK/15細胞培地で実施した非特許文献23。AllanGetalPathogenesisofporcinecircovirusexperimentalinfectionsofcolostrumdeprivedpigletsandexaminationofpigfoetalmaterialVetMicrobiol1995444964ブタサーコウイルスの単離は下記方法によって実施した:PK/15細胞の単一層をトリプシン処理トリプシン-versene混合物によって集密的な培養から解離し、最終濃度が約400,000細胞1mlであるペスチウイルスMEM-G培地に感染していない15のウシ胎児血清を含むMEM-SA培地に溶解した。次に、この細胞懸濁液の10mlの部分標本を2mlの前記接種材料の部分標本と混合し、最終混合物を2つの25cm2ファルコンフラスコに6mlの容積に分取した。37°Cで18時間、10のCo2を含む雰囲気下で培養した。培養後、半集密的な単一層を300mMのD-グルコサミンCatG48175、SigmaAldrich株式会社、PooleUKで処理し非特許文献24、さらに37°Cで48~72時間培養を続けた。この最終培養に続いて、2つのファルコンの1方を3回凍結/融解サイクルにかけた。残りのファルコンのPK/15細胞はトリプシン-versene溶液で処理し、20mlのMEM-G培地中に再懸濁し、400,000細胞/ml濃度で75cm2ファルコン中に接種した。新しく接種されたフラスコは凍結/融解サイクル後に得られた対応する可溶化液5mlを添加して超感染させた。TischrIetalArchVirol1987963957実施例2免疫抗体法または切片上ハイブリッド形成法によるブタサーコウイルスを検出するためのするための細胞培地標本の調製5mlの容積の超感染した懸濁液を回収し、無菌で脱脂したカバーガラスを含む直径55mmのペトリ皿中に接種した。フラスコ中およびカバーガラス上で37°Cで培養し、実施例1に記載のグルコサミンで処理した。カバーガラス上での培養はグルコサミン処理後24~48時間で回収し、室温で10分間アセトンを用いて、または4時間緩衝剤処理した10のホルムアルデヒドを用いて固定した。この固定後、全てのカバーガラスをシリカゲル上で-70°Cで貯蔵してから、ハイブリッド形成の研究および細胞免疫の研究に使用した。実施例3ハイブリッド形成法によるPCV配列の検出法ハイブリッド形成法は病気のブタから集めた組織に対して実施し、ホルムアルデヒドで固定し、ウイルス単離実施例2参照用に接種した細胞培地の調整で用い、カバーガラスに固定した。PK/15ブタサーコウイルスPCVおよび感染性ニワトリ貧血症ウイルスCAVに対応する完全なゲノムプローブを用いた。1.7キロの塩基ペアkbpの挿入断片の形にクローン化されたPCVゲノムの複製型を含むプラスミドpPCVIMeehanBetalSequenceofporcinecircovirusDNAaffinitieswithplantcircovirusJGenVirol199778221227をPCV固有DNA源として用いた。2.3kbpの鳥サーコウイルスCAVの複製型を含む鳥プラスミドpCAAIを負対照として用いた。2つのプラスミドのグリセロール源をアルカリ法非特許文献25によってプラスミドの製造および精製で用い、これらはプローブ調製用のテンプレートとして用いた。PCVおよびCAVの完全なゲノムを表すサーコウイルスプローブはメーカ推薦の方法で市販の非放射性ラベリングキットDIGDNALabellingKit、BoehringerMannheimLewisUKを用いて上記精製プラスミド各プローブに1μgおよびヘキサヌクレオチドプライマーから製造した。SambrookJetalMolecularcloningALaboratoryManual2ndEditionColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNewYork1988ハイブリッド形成法で使用する前に、プローブをジゴキシジェニンで標識化し、容積50~100μlの純水に溶解した。パラフィンに包み、ホルムアルデヒドで固定した病気のブタの組織標本と、ホルムアルデヒドで固定した感染細胞培地の製剤を下記方法でPCV核酸検出のために調製した:5μm厚の切片をパラフィンに包まれた組織塊から切り出し、濃度を次第に薄くしたアルコール溶液中で再水和した。ホルムアルデヒドで固定した組織切片および細胞培地を15分間および5分間それぞれ5mMのEDTAを含む0.05MのTris-HCL緩衝剤pH7.6を用いた0.5のプロテナーゼK溶液中で37°Cで培養した。次に、スライドガラスを加圧滅菌した蒸留水中の1グリシン溶液中に30秒配置し、0.01MのPBS緩衝剤燐酸緩衝食塩水pH7.2で2度洗浄し、最後に無菌蒸留水で5分間洗浄した。スライドガラスを最後に外気で乾燥し、プローブと接触させた。各組織/プローブ製剤を清潔な脱脂カバーガラスで被覆し、90°Cの炉内に10分間配置した後、氷塊と1分間接触させ、最後に37°Cで18時間培養した。次に、調整物を2Xクエン酸ナトリウム塩SSC緩衝剤pH7.0に短時間含浸した後、2XのSSC緩衝剤中で5分間、2回洗浄し、最後にPBS緩衝剤中で5分間、2回洗浄した。洗浄後、調整物を0.1Mのマレイン酸、0.15MのNaCLpH7.5マレイン緩衝剤の溶液中に10分間含浸し、マレイン緩衝剤中の遮断試薬の1溶液Cat1096176BoehringerMannheimUKLewisEastSussexUK中で37°Cで20分間培養した。次に、調整物を遮断緩衝剤で希釈された抗ジゴキシジェニンモノクローナル性抗体BoehringerMannheimの1/250溶液中で37°Cで1時間培養し、PBS中で洗浄し、最後に抗ネズミ免疫グロブリン抗体を用いて37°Cで30分間培養した。調整物をPBSで洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ作用を室温で20分間、PBS中の0.5水酸化ペルオキシド溶液で処理して遮断した。調整物を再度PBS中で洗浄し、使用直前に調製した3-アミノ-9-ジエチルカルバゾルAEC基質CambrIDgeBioscienceCambrIDgeUKで処理した。最後に水道水で洗浄した後、調整物をヘマトキシリンで逆染色し、水道水で青色化して固定液GVAMountCambrIDgeBioscienceCambrIDgeUKで顕微鏡のカバーガラスに固定した。対照実験には無関係な負プローブCAVと正プローブPCVを病気のブタおよび病気ではないブタから得られた標本で使用することが含まれる。実施例4免疫抗体法によるPCVの検出法アセトンを用いて固定した全ての細胞倍地の最初のスクリーニングを貯蔵した大人のブタ血清の1/100希釈を用いた間接免疫抗体法IIFで実施した。この貯蔵血清は北アイルランドの25匹の大人の雌ブタからの血清を含み、PCV:ブタパルボウイルス、ブタアデノウイルスおよびPRRウイルスを含む広範囲のブタのウイルスに対する抗体を含むことで知られている。血清PBSで希釈を細胞培地と37°Cで1時間接触させた後、PBS中で2回洗浄してIIFを実施した。細胞培地をイソチオシアン酸フルオレセインに結合したPBSで1/80に希釈したウサギの抗ブタ免疫グロブリン抗体を用いて1時間染色し、PBSで洗浄し、グリセロール緩衝剤に固定し、紫外線下で顕微鏡観察した。実施例5病気のブタの組織における切片上ハイブリッド形成結果フランス、カナダおよびカリフォルニアの多機能性萎縮病変を有する子豚から集めた組織から調製したPCVゲノムプローブを用いた切片上ハイブリッド形成法から、研究された複数の病変部に病変部に関連するPCV核酸の存在が示された。これに対してPCVゲノムプローブを病気でないブタから集めた組織に用い時またはCAVプローブを病気のブタの組織に用いた時には何の徴候も見られなかった。PCV核酸の存在はサイトプラズムおよびカリフォルニアの子豚の肺の病変部を浸潤する多数の単核細胞の核に認められた。PCV核酸の存在は肺細胞、気管支および細気管支の上皮細胞および細動脈、細静脈およびリンパ管の内皮細胞にも見られた。病気のフランスのブタではPCV核酸の存在は多数の濾胞性リンパ細胞のサイトプラズマおよびリンパ節の同様な毛細血管内の単核細胞に検出された。また、PCV核酸は一次的合胞体にも検出された。これらの検出結果から、カリフォルニアのブタの肺、フランスのブタの腸間膜リンパ節およびカナダのブタの器官の標本を新規なブタサーコウイルス株の単離用に選択した。実施例6新規なブタサーコウイルス株の細胞培養結果と、免疫抗体法による検出多機能性萎縮症候群の臨床的徴候を示すフランスの子豚Imp1008株、カリフォルニアの子豚Imp999株およびカナダの子豚Imp1010株から集めた標本を培養した細胞培地には細胞変性作用CPEは全く見られなかった。しかし、アセトンを用いて固定した後、貯蔵されたブタのポリクローン化した血清を用いて培養した細胞培地から得られた製剤を免疫標識化することによって、カリフォルニアの子豚Imp999株の肺、フランスの子豚Imp1008株の縦隔リンパ節およびカナダの子豚Imp1010株の器官を用いて培養した培地中の多数の細胞に核蛍光が現れた。実施例7ブタサーコウイルスのゲノムDNAの抽出ブタサーコウイルスPCVの新規な株の複製型を72~76時間の培養後に回収した感染したPK/15細胞培地実施例1参照75cm2ファルコン10個を用いて調製し、CAVの複製型のクローン化で記載したグルコサミンで処理した非特許文献26。この複製型の2本鎖DNAはHirt法非特許文献27の変形法で抽出した。ToddDetalDotblothybrIDizationassayforchickenanaemiaagentusingaclonedDNAprobeJClinMicrobiol199129933939HirtBSelectiveextractionofpolyomavirusDNAfrominfectedcellculturesJMolBiol196736365369MolitorTWetalPorcineparvovirusDNAcharacterizationofthegenomicandreplicativeformDNAoftwovirusisolatesVirology1984137241254実施例8ブタサーコウイルスImp999株のゲノムの複製型の制限地図Hirt法で抽出されたDNA1~5μgをメーカの推薦する方法に従ってS1ヌクレアーゼAmershamで処理し、各種制限酵素で消化し、消化物をTodd達が記載の方法非特許文献29で、臭化エチジウムの存在下、1.5のアガロースゲル上で電気泳動で分離した。Imp999株の培地から抽出したDNAは独特のEcoRI部位、2つのSacI部位を有し、PstI部位は全く持たない。従って、この制限プロフィールは、逆にPstI部位を有し、EcoRI部位を全く持たないPCVのPK/15株非特許文献30が示す制限プロフィールとは異なっている。PurificationandbiochemicalcharacterizationofchickenanemiaagentJGenVirol199071819823MeehanBetalSequenceofporcinecircovirusDNAaffinitieswithplantcircovirus199778221227実施例9ブタサーコウイルスImp999株のゲノムのクローン化制限酵素EcoRIを有するPCVImp999株の2本鎖複製型の消化で生じた約1.8kbpの制限断片を市販のQiagenkitQIAEXIIGelExtractionKitCat20021QIAGENLtdCrawleyWestSussexUKを用いて1.5アガロースゲル実施例3参照上で電気泳動で分離した。次に、このEcoRI-EcoRI制限断片を標準クローン化法非特許文献31によって予め同じ制限酵素を用いて消化し、脱リン酸したベクターpGEM7PromegaMedicalSupplyCompanyDublinIrelandと結合した。得られたプラスミドを標準的方法によってEscherichiacoliJM109宿主株StratageneLaJollaUSAに変換した。同じく、PCVImp999株のEcoRI-EcoRI制限断片をベクターpBlueScriptSKStratageneLaJollaUSAのEcoRI部位にクローン化した。各宿主株に対して得られたクローンの中から所望の大きさの断片を有する少なくとも2つのクローンを選択した。次に、得られたクローンを培養し、Imp999株の完全なゲノムを含むプラスミドを標準的なプラスミド調製および精製法によって少容量2mlまたは大容量250mlに精製した。SambrookJetalMolecularcloningALaboratoryManual2ndEditionColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNewYork1988実施例10PCVImp999株のゲノムDNAの配列2本鎖複製型2つのEcoRIImp999のクローン配列クローンpGEM72およびpGEM78をメーカー推薦の方法で配列キットAmpliTaqDNApolymeraseFSCat402079PEAppliedBiosystemsWarringtonUKおよびAppliedBioSystemsAB1373Aautomaticsequencingapparatusを用いてSangerのジデオキシヌクレオチド法で決定した。最初の配列反応はM13前方および後方自在プライマーを用いて実施した。続く配列反応はDNA歩行法によって実施した。その後の配列に必要なオリゴヌクレオチドはLifeTechnologyInchinnanBusinessParkPaisleyUKによって合成された。得られた配列は集め、MacDNASISversion32のソフトウェアCat22020101AppligeneDurhamUKを用いて分析した。各種の読み取り枠をNationalCenterforBiotechnologyInformationサーバーで入手可能なBLASTalgorithmを用いて解析した。クローンpGEM78配列ID番号6から最初に得られた完全な配列EcoRIEcoRIは図13、14に表してある。この配列はEcoRI部位のGの後に任意に始まり、ヌクレオチドに関してはいくつか不安定な部分を有している。次いで、この配列が最適化された。配列ID番号3図9~14はこの株の配列を全て表しており、EcoRI部位の始めすなわち最初のヌクレオチドとしてGから任意に始まる。同様の方法本発明の他の3つの分離株の配列を得た配列ID番号1、2、4および図1~4および図7、8参照。これら4つの株のゲノムの大きさは下記の通りである:Imp.1011-481211767個のヌクレオチドImp.1011-482851767個のヌクレオチドImp.9991768個のヌクレオチドImp.10101768個のヌクレオチド実施例11PCVImp999株の配列の分析Imp999株から得られた配列をGenBankのデータバンクに収容された配列との相同性テストで用いた結果、検出された有意な相同性はPK/15株の配列寄託番号Y09921図9~12参照と約76の相同性であった。データバンクNCBIサーバーのBLASTXalgorithmを用いた6つのフェーズでの配列の翻訳の相同性テストでは、アミノ酸レベルで、GenBankU49186配列でコードされるプラントGenBank番号1841515のサーコウイルスに類似のBBTBウイルスの理論的レプリカーゼに対応する読み取り枠と94の相同性を示すということが分かった。PCVImp999株から得られた配列と有意な相同性を示すものはデータバンクに収容された他の配列にはなかった。多機能萎縮症候群の臨床的徴候を示すカリフォルニアの子豚から得られた病変部を用いて培養されたImp999株から得られた配列のには解析から、この単分離ウイルスが新規なブタサーコウイルス株であることが明らかになった。実施例12配列の比較分析新規な4つのPCV株のヌクレオチド配列とPCVのPK/15株の配列図9~12とを整列比較した。新規な4つの株と公知のPK/15株とに関する相同性マトリクスを作成した。結果は下記の通りである:1:Imp.1011-481212:Imp.1011-482853:Imp.9994:Imp.10105:PK/152つのフランス株Imp101148121とImp101148285の相同性は99以上0.9977である。2つの北米株Imp999とImp1010の相同性も99以上0.9949以上である。フランス株と北米株との相同性はわずかに96以上である。これら全ての株とPK/15株との相同性は75~76の値に落ちる。このことから、本発明の株はPK/15株に代表される種類とは異なる新規なブタサーコウイルスの代表であると言える。PK/15がタイプIを表すのに対し、PMWS症候群を示すブタから単離されたこの新規な株をタイプIIのブタサーコウイルスとよぶことにする。このタイプIIに属する株は実際には非常に離れた地理的領域から単離されたにもかかわらず、驚くべきヌクレオチド配列の相同性を示す。実施例13新規なPCV株のゲノムによってコードされるプロテインの分析Imp1010単離株のヌクレオチド配列は多機能性萎縮症候群に関する他のサーコウイルス株を代表するものと考えられる。この配列をBLASTXalgorithm非特許文献32と、ソフトウェアMacVector60OxfordMolecularGroupOxfordOX44GAUKのプログラムとを組み合わせを用いて詳細に分析した。この配列環状ゲノム上には20個のアミノ酸より大きいサイズの読み取り枠またはORFが13個検出できた。この13個のORFは下記の通りである:AltschletalJMolBiol1990215403410各ORFの開始位置および終了位置は株1010のゲノムの図7、8に表された配列配列ID番号4を参照する。ORF1~13の端部は株999と同一である。これらは下記ORF3と13を除き、株1011-48121および1011-48285とも同一である:ORF31432-1539、センス、108nt、35aaORF3314-1377、アンチセンス、705nt、234aaこれら13のORFの内で4つがクローン化ウイルスPCVPK/15のゲノム上に位置する類似のORFと有意な相同性を有する。多機能性萎縮症候群に関連するサーコウイルス単離株全てのゲノム上に存在する読み取り枠をそれぞれ分析した。これら4つのORFは下記の通り:各ORFの始めと終わりの位置は図7、8に表された配列配列ID番号4を参照する。ORFの大きさヌクレオチドntでは終止コドンを含む。PCVImp1010とPCVPK-15の単離株のゲノム機構の比較からから、2つのウイルスのゲノムに保存された4つのORFが同定できた。下記の表は観察された相同性の程度を表す:最大の相同性はORF4Imp1010とORF1PK-15との間に見られた86相同性。このプロテインはおそらくウイルスのDNA複製に含まれ、ウイルスの複製に必須であるため、このことは予想されることである非特許文献33。ORF13Imp1010とORF2PK-15との間の配列同一性は余り強くない66.4の同一性が、この2つのORFはそれぞれ、鳥サーコウイルスCAV非特許文献34の主構造プロテインのN-末端領域と同一な良く保存されたN-末端基本領域を有している。さらに、ORF7Imp1010とORF3PK-15との間と、ORF10Imp1010とORF4PK-15との間に大きな違いが見られた。PCVPK-15のORF3とORF4と比較すると、それぞれにImp1010分離株のORF7とORF10のC-末端領域に欠失がある。最大の配列相同性はORF7/ORF3重複部分の水準において61.5の相同性とORF10/ORF4重複部分の水準において83の相同性のN-末端領域の水準において見られる。MeehanetalGenVirol199778221227;MankertzetalJGenVirol199879381384MeehanetalArchVirol1992124301319ブタサーコウイルスのゲノム構造はゲノムが極端に高密度であるため非常に複雑であるように見える。主構造プロテインはおそらくブタサーコウイルスゲノムの同じ鎖上に位置する複数の読み取り枠間のスプライシングに由来するものである。従って、上記の表に記載の全ての読み取り枠ORF1~ORF13でタイプIIのブタサーコウイルスにコードされた抗原プロテインの全てまたは一部を表すことができ、これらは特有の病気および/またはワクチン接種に使用可能な抗原である。本発明はこれらのORFを少なくとも1つ含む全てのプロテインに関するものである。本発明は主としてORF4、ORF7、ORF10またはORF13で構成されるプロテインに関するものである。実施例14新規な株からクローンされたPCVゲノムの感染特性Imp999単離株の完全なゲノム複製型を含むプラスミドpGEM78をMeehanB達に記載の方法によってPK/15細胞に形質移入した非特許文献35。未感染のPK/15細胞に形質移入した後の最初の継代に対して実施された免疫抗体法の分析実施例4参照から、クローンpGEM78のプラスミドは感染性PCVウイルスを誘導することが示された。感染性PCVの遺伝物質を含むクローンが利用可能になったことによってウイルス性ゲノムに任意の有用な処置をして無毒化ワクチンまたは組み換えワクチンを製造し、或いは診断キット用抗原を製造することができ、変成PCVウイルスブタで無毒化または欠失を製造することができるようになった。CharacterizationofviralDNAsfromcellsinfectedwithchickenanemiaagentsequenceanalysisoftheclonedreplicativeformandtransfectioncapabilitiesofclonedgenomegragmentsArchVirol1992124301319実施例15インビトロ培養によるPCV抗原の製造感染していないPK/15細胞の培養およびウイルス処置を実施例1と同じ方法で実施した。感染細胞を37°Cで4日間培養後、トリプシン処理し、回収し、命名した。次の継代は1mlにつき400,000個の感染細胞を接種した。実施例16ウイルス性抗原の不活化ウイルス培養の最後に、感染した細胞を回収し、超音波BransonSonifierまたはロータースタータータイプのコロイドミルUltraTurraxIKAを用いて溶解した。次に、懸濁液を3700gで30分間、遠心分離した。このウイルス懸濁液を37°Cで18時間、0.1エチレンイミンで、或いは、28°Cで24時間、β-プロピオラクトンで不活化した。ウイルス価が不十分な場合にはウイルス懸濁液を300kDaのメンブレンMilliporePTMK300を用いた限外濾過で濃縮した。不活化ウイルス懸濁液は5°Cで貯蔵した。実施例17有機油をベースにしたワクチン乳剤の製造下記処方でワクチンを調製した:不活化ブタサーコウイルス懸濁液:250mlMondanIDe商標登録ISA70PIC750ml水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソンタービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。一回のワクチン投与量は約1075のTCID50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は0.5ml、筋肉経路の投与量は2mlである。実施例18代謝可能な油ベースのワクチン乳剤の製造下記処方でワクチンを調製した:不活化ブタサーコウイルス懸濁液:200mlDehymulsHRE7Henkel60mlRadia7204Oleofina740ml水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソンタービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。一回のワクチン投与量は約1075のTCID50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は0.5ml、筋肉内経路の投与量は2mlである。実施例19過免疫血清PCV-T、PK/15から調製されたモノクローナル抗体F99およびカナダ株から調製された過免疫血清PCV-Cで汚染されたアメリカおよびフランスのPCVウイルス株およびPK/15の間接免疫抗体法の結果間接的免疫抗体法で正の反応を示した血清またはモノクローナル抗体の最後の希釈液の逆数。"