"トランスポータードメインおよび積み荷を含む単離された送達構築物において、前記積み荷を標的化された細胞内区画中に送達し得ることを特徴とする構築物。トランスポータードメインおよび巨大分子を含む単離された送達構築物において、前記巨大分子を注射なしで対象の生物学的区画に送達し得ることを特徴とする構築物。請求項1または2のいずれか一項に記載の構築物において、開裂可能なリンカーをさらに含むことを特徴とする構築物。請求項1または2のいずれか一項に記載の構築物において、前記トランスポータードメインはCholix由来ポリペプチド配列を含むことを特徴とする構築物。請求項1に記載の構築物において、前記積み荷は、巨大分子、小分子、siRNA、PNA、miRNA、DNA、プラスミドおよびアンチセンス分子からなる群から選択されることを特徴とする構築物。標的化された細胞内区画中への積み荷の送達のためのものであることを特徴とする、請求項1に記載の構築物の使用。生物膜を越えるナノ粒子およびデンドリマーベースの担体の送達を介する積み荷の送達のためのものであることを特徴とする、請求項1に記載の融合物または構築物の使用。生物膜を越える積み荷の送達のための、トランスポータードメインによりデコレートされており、リンカーによりデコレートされているかまたはされていないことを特徴とする、請求項6に記載のナノ粒子およびデンドリマーベースの担体の使用。請求項1乃至5の何れかの何れか1項に記載の送達構築物および薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする医薬組成物。送達構築物をコードするポリヌクレオチドにおいて、前記送達構築物は、トランスポータードメインおよび積み荷を含み、前記構築物は、前記積み荷を標的化された細胞内区画中に送達し得ることを特徴とするポリヌクレオチド。請求項10に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。請求項11に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする単離された宿主細胞。当業者が認識するとおり、前記の記載は、本発明のある好ましい実施形態を詳細に記載し、したがって代表例にすぎず、本発明の実際の範囲を示すものではない。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のものにすぎず、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことも理解すべきである。特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。本明細書において使用される以下の用語は、特に規定のないかぎりそれらに属する意味を有する。本発明の根底をなす研究は、生物活性治療剤の腸送達を向上させるための単離された送達構築物を調製するために使用すべきトランスポータードメインとしてのCholix由来ポリペプチド配列の使用に関する。重要なことに、本明細書に記載の系および方法は、以下のもの、すなわち、巨大分子用量を注射なしで送達する能力;積み荷を、活性が要求される細胞内区画中に送達する能力;ならびに他の場合においてほとんどの生物膜の障壁特性に起因して妨害されている、生物膜を越えるナノ粒子および/またはデンドリマーベースの担体の送達を提供する。成熟Cholix毒素Cholixは、コレラ菌Vibriocholeraeにより分泌され、3つの主要な球形ドメインIa、II、およびIIIならびにドメインIIおよびIIIを連結する1つの小さいサブドメインIbから構成される極端に活性なモノマータンパク質分子量70kDである。成熟Cholix毒素のアミノ酸配列は、Jorgensen,R.ら,JBiolChem,28316:10671-106782008年およびそれに引用される参照文献に提供されている。本発明の単離された送達構築物の調製において使用されるCholix由来ポリペプチド配列は、成熟Cholixの報告された634アミノ酸タンパク質配列に由来する。したがって、本発明の送達構築物はトランスポータードメインを含む。本明細書において使用されるトランスポータードメインは、ある機能、例えば、細胞認識すなわち、受容体結合ドメインを含むおよびトランスサイトーシスすなわち、トランスサイトーシスドメインを含むを遂行し得る構造ドメインを指す。一般に、本発明の送達構築物の調製において使用すべきトランスポータードメインは、Cholixの機能ドメイン、例えばIaおよびIIに対応する構造ドメインを有するCholix由来ポリペプチド配列である。Cholix機能ドメインに対応する分子の一部に加え、本発明の送達構築物は、対象の生物学的区画への送達のための巨大分子をさらに含み得る。ある実施形態において、巨大分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖、および脂質の群から選択される。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、注射により対象に一般に投与されるポリペプチドホルモン、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、および凝固因子からなる群から選択される。それらの巨大分子の全ての配列は当業者に周知であり、送達構築物へのそれらの巨大分子の付着は、標準技術を使用する当業者の技能の十分範囲内である。巨大分子は、細胞結合もトランスサイトーシス活性も撹乱しない送達構築物の任意の部分中に導入することができる。巨大分子は、開裂可能なリンカーを介して送達構築物の残部に連結される。リンカーは、2つの他の分子を共有的に、またはイオン、ファンデルワールスもしくは水素結合を介して結合させる分子、例えば、5’末端においてある相補的配列および3’末端において別の相補的配列にハイブリダイズし、ひいては2つの非相補的配列を結合させる核酸分子を指す。開裂可能なリンカーは、分解またはそうでなければ切断して開裂可能なリンカーにより連結された2つの構成成分を分離することができるリンカーを指す。開裂可能なリンカーは、一般に、酵素、典型的にはペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼなどにより開裂される。開裂可能なリンカーは、環境信号、例えば、温度、pH、塩濃度などの変化などにより開裂することもでき、それは、極性上皮膜を越える送達構築物のトランスサイトーシス後にそのような環境の変化が存在する場合である。ある実施形態において、送達構築物は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、および有機小分子からなる群から選択される第2の巨大分子ならびに第2の開裂可能なリンカーをさらに含み、前記第2の開裂可能なリンカーにおける開裂は、前記第2の巨大分子を前記構築物の残部から分離する。ある実施形態において、第1の巨大分子は第1のポリペプチドであり、前記第2の巨大分子は第2のポリペプチドである。ある実施形態において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、会合してマルチマーを形成する。ある実施形態において、マルチマーはダイマー、テトラマー、またはオクタマーである。さらなる実施形態において、ダイマーは抗体である。ある実施形態において、巨大分子は、上皮細胞の側底膜に存在する酵素により開裂可能でないように選択することができる。例えば、本実施例に記載のアッセイを使用してそのような開裂酵素が送達すべき巨大分子を開裂し得るかどうかを定型的に試験することができる。開裂し得る場合、開裂酵素により認識される不所望なアミノ酸配列を排除するように巨大分子を定型的に変化させることができる。次いで、変化した巨大分子を試験して当分野において定型的な方法を使用してそれが活性を保持することを確保することができる。ある実施形態において、第1および/または第2の開裂可能なリンカーは、極性上皮細胞の頂端側上よりも極性上皮細胞の側底上で高い活性を示す酵素により開裂可能である。ある実施形態において、第1および/または第2の開裂可能なリンカーは、極性上皮細胞の頂端側上よりも細胞膜中で高い活性を示す酵素により開裂可能である。ある実施形態において、開裂可能なリンカーは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質巨大分子を送達する場合、送達すべき巨大分子中に存在する配列を含む開裂可能なリンカーの使用を回避するようにその配列に基づき選択することができる。例えば、巨大分子がAALを含む場合、開裂可能なリンカーはこの配列を認識しない酵素により開裂されるように選択することができる。Cholix機能ドメインに対応する分子の一部に加え、本発明の送達構築物は、活性が要求される細胞内区画中への送達のための積み荷をさらに含み得る。本明細書において使用される積み荷には、限定されるものではないが、巨大分子、小分子、siRNA、PNA、miRNA、DNA、プラスミドおよびアンチセンス分子が含まれる。本発明により送達することができる積み荷の他の例には、限定されるものではないが、抗新生物化合物、例えばニトロソウレア、例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン;メチルヒドラジン、例えば、プロカルバジン、ダカルバジン;ステロイドホルモン、例えばグルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、アンドロゲン、テトラヒドロデスオキシカリコステロンtetrahydrodesoxycaricosterone;免疫活性化合物、例えば免疫抑制薬、例えば、ピリメタミン、トリメトプテリンtrimethopterin、ペニシラミン、シクロスポリン、アザチオプリン;および免疫刺激薬、例えば、レバミゾール、ジエチルジチオカルバメート、エンケファリン、エンドルフィン;抗菌化合物、例えば抗生物質、例えば、β-ラクタム、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペニムcarbapenimおよびモノバクタム、β-ラクタマーゼ阻害剤、アミノグリコシド、マクロライド、テトラサイクリン、スペクチノマイシン;抗マラリア薬、抗アメーバ薬;抗原虫薬;抗真菌薬、例えば、アンホテリシンβ、抗ウイルス薬、例えば、アシクロビル、イドクスウリジン、リバビリン、トリフルリジン、ビダルビンvidarbine、ガンシクロビル;抗寄生虫薬;駆虫薬antihalmintic;放射性医薬品;胃腸薬;血液学的化合物;免疫グロブリン;血液凝固タンパク質、例えば、抗血友病因子、第IX因子複合体;抗凝固薬、例えば、ジクマロール、ヘパリンNa;フィブロリシンfibrolysin阻害剤、例えば、トラネキサム酸;心血管薬;末梢抗アドレナリン作動薬;中枢作用降圧薬、例えば、メチルドパ、メチルドパHCl;降圧直接血管拡張薬、例えば、ジアゾキシド、ヒドララジンHCI;レニン-アンギオテンシン系に影響する薬物;末梢血管拡張薬、例えば、フェントラミン;抗狭心症薬;強心配糖体;強心性血管拡張薬、例えばアムリノン、ミルリノン、エノキシモン、フェノキシモン、イマゾダン、スルマゾール;抗不整脈薬;カルシウム流入遮断剤;血中脂質に影響する薬物、例えば、ラニチジン、ボセンタン、レズリンrezulin;呼吸器薬;交感神経様作用薬、例えば、アルブテロール、ビトルテロールメシル酸塩、ドブタミンHCl、ドーパミンHCl、エフェドリンSo、エピネフリン、フェンフルラミンHCl、イソプロテレノールHCl、メトキサミンHCl、二酒石酸ノルエピネフリン、フェニレフリンHCl、リトドリンHCl;コリン模倣薬、例えば、アセチルコリンCl;抗コリンエステラーゼ薬、例えば、エドロホニウムCl;コリンエステラーゼ再活性化剤;アドレナリン遮断薬、例えば、アセブトロールHCl、アテノロール、エスモロールHCl、ラベタロールHCl、メトプロロール、ナドロール、フェントラミンメシル酸塩、プロパノロールHCl;抗ムスカリン薬、例えば、臭化メチルアニソトロピン、アトロピンSOsub.4、クリニジウムBr、グリコピロレート、イプラトロピウムBr、スコポラミンHBr;神経筋遮断薬;脱分極薬、例えば、アトラクリウムベシル酸塩、ヘキサフルオレニウムBr、ヨウ化メトクリン、サクシニルコリンCl、ツボクラリンCl、ベクロニウムBr;中枢作用筋弛緩薬、例えば、バクロフェン;神経伝達物質および神経伝達作用剤、例えば、アセチルコリン、アデノシン、アデノシン三リン酸;アミノ酸神経伝達物質、例えば、興奮性アミノ酸、GABA、グリシン;生体アミン神経伝達物質、例えば、ドーパミン、エピネフリン、ヒスタミン、ノルエピネフリン、オクトパミン、セロトニン、チラミン;ニューロペプチド、一酸化窒素、K.sup.チャネル毒素;抗パーキンソン薬、例えば、アマルチジンamaltidineHCl、ベンズトロピンメシル酸塩、カルビドパ;利尿薬、例えば、ジクロルフェナミド、メタゾラミド、ベンドロフルメチアジド、ポリチアジド;抗偏頭痛薬、例えば、カルボプロストトロメタミンメシル酸塩、メチセルジドマレイン酸塩が含まれる。本発明の送達構築物のトランスポータードメインは、一般に、受容体結合ドメインを含む。受容体結合ドメインは、限定されるものではないが上皮細胞の頂端膜上に存在する細胞表面受容体に結合することが当業者に公知の任意の受容体結合ドメインであり得る。好ましくは、受容体結合ドメインは細胞表面受容体に特異的に結合する。受容体結合ドメインは、送達構築物のエンドサイトーシスを可能とするために十分な親和性で細胞表面受容体に結合すべきである。ある実施形態において、受容体結合ドメインは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、もしくは有機小分子、またはそれらの組合せを含み得る。上皮細胞の頂端膜上に存在する細胞表面受容体に結合するこれらの分子のそれぞれの例は、当業者に周知である。好適なペプチドまたはポリペプチドには、限定されるものではないが、細菌性毒素受容体結合ドメイン、例えばPE、コレラ毒素、Cholix毒素、ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素、志賀毒素、志賀様毒素などからの受容体結合ドメイン;抗体、例としてモノクローナル、ポリクローナル、および単鎖抗体、またはそれらの誘導体、成長因子、例えばEGF、IGF-I、IGF-II、IGF-IIIなど;サイトカイン、例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-6など;ケモカイン、例えばMIP-1a、MIP-1b、MCAF、IL-8など;ならびに他のリガンド、例えばCD4、免疫グロブリンスーパーファミリーからの細胞接着分子、インテグリン、IgA受容体に特異的なリガンドなどが含まれる。当業者は、受容体結合ドメインが結合する受容体の発現パターンに基づき適切な受容体結合ドメインを選択することができる。受容体結合ドメインは、限定されるものではないがそのような分子の付着に有用であり得ることが当業者に公知の任意の方法または手段により送達構築物の残部に付着させることができる。ある実施形態において、受容体結合ドメインは、送達構築物の残部と一緒に融合タンパク質として発現される。そのような実施形態は、受容体結合ドメインおよび構築物の残部がペプチドまたはポリペプチドから形成される場合、特に有用である。本発明の送達構築物のトランスポータードメインは、トランスサイトーシスドメインをさらに含む。トランスサイトーシスドメインは、上皮細胞の頂端膜上に存在する細胞表面受容体に結合したキメラタンパク質のトランスサイトーシスを生じさせることが当業者に公知の任意のトランスサイトーシスドメインであり得る。好ましい実施形態において、トランスサイトーシスドメインはCholixのドメインIIである。いかなる特定の理論にも作用機序にも限定されるものではないが、トランスサイトーシスドメインは、送達構築物が極性上皮細胞の頂端表面上に存在する受容体に結合した後、極性上皮細胞を介する送達構築物のトラフィッキングを可能とすると考えられる。極性上皮細胞を介するそのようなトラフィッキングは、本明細書においてトランスサイトーシスと呼ぶ。このトラフィッキングは、極性上皮細胞の側底膜からの送達構築物の放出を可能とする。細胞内活性を目的とする積み荷の送達のため、送達構築物は、積み荷を細胞内にトラフィッキングするためのエンドサイトーシスドメインを含み、開裂可能なリンカーも含み得る。これには、担体表面をエンドサイトーシスドメインの1つ以上のコピーによりデコレートし、リンカーによりデコレートするかまたはしないことにより細胞表面受容体に標的化されたナノ粒子および/またはデンドリマーベースの担体を使用する積み荷の細胞内送達が含まれる。いかなる特定の理論にも作用機序にも限定されるものではないが、エンドサイトーシスドメインは、送達構築物が細胞の表面上に存在する受容体に結合した後、細胞内への送達構築物のトラフィッキングを可能とすると考えられる。細胞内へのそのようなトラフィッキングは、本明細書においてエンドサイトーシスと呼ぶ。このトラフィッキングは、関連する細胞内区画、例として限定されるものではないが核および核エンベロープ、リボソーム小胞、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ装置、およびサイトゾル中への送達構築物の放出を可能とする。本発明のある実施形態において、それらの細胞の側底表面において生じる生物学的プロセスを機能させるプロテアーゼおよびペプチダーゼの同定を評価する。それらのプロテアーゼおよびペプチダーゼは、それらの基質により定義することができるいくつかのカテゴリーに分類される、すなわち、1上皮側底表面から分泌され、活性化のためにトリミングが要求されるプレプロホルモンおよび酵素、2活性が開裂イベントにより中和されて活性が調節される活性ホルモンまたは酵素、ならびに3側底表面における作用が酵素的修飾により変化する全身性酵素または成長因子。それらの種々のカテゴリーに分類され、担体-リンカー-積み荷構築物の側底開裂に有用であり得るいくつかの潜在活性の例には、当分野において記載されているS9Bプロリルオリゴペプチダーゼサブファミリーのメンバー、例えばFAPおよびDDPIVが含まれる。本発明の核酸配列およびポリヌクレオチドは、任意の好適な方法、例として、例えば、適切な配列のクローニングまたはNarangら,Meth.Enzymol.,68:90-991979年のホスホトリエステル法;Brownら,Meth.Enzymol.,68:109-1511979年のホスホジエステル法;Beaucageら,Tetra.Lett.,22:1859-18621981年のジエチルホスホラミダイト法;例えば、Needham-VanDevanterらNucl.AcidsRes.12:6159-61681984年に記載の、例えば、自動合成装置を使用するBeaucageCaruthers,Tetra.Letts.,2220:1859-18621981年により記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法;および米国特許第4,458,066号明細書の固体担持法などの方法による直接化学合成により調製することができる。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションにより、または一本鎖をテンプレートとして使用するDNAポリメラーゼによる重合により二本鎖DNAに変換することができる。当業者は、DNAの化学合成が約100塩基の配列に限定される一方、より長い配列をより短い配列のライゲーションにより得ることができることを認識する。好ましい実施形態において、本発明の核酸配列は、クローニング技術により調製する。適切なクローニングおよびシーケンシング技術の例、ならびに当業者を多くのクローニング訓練に導くために十分な指示は、Sambrookら,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL2NDED.,Vols.1-3,ColdSpringHarborLaboratory1989年、BergerandKimmeleds.、GUIDETOMOLECULARCLONINGTECHNIQUES,AcademicPress,Inc.,SanDiegoCalif.1987年、またはAusubelらeds.,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,GreenePublishingandWiley-Interscience,NY1987年に見出される。生物試薬および実験装置の製造業者からの生成物情報も有用な情報を提供する。そのような製造業者には、SIGMAchemicalcompanySaintLouis,Mo.、RDsystemsMinneapolis,Minn.,PharmaciaLKBBiotechnologyPiscataway,N.J.、CLONTECHLaboratories,Inc.PaloAlto,Calif.、ChemGenesCorp.,AldrichChemicalCompanyMilwaukee,Wis.、GlenResearch,Inc.,GIBCOBRLLifeTechnologies,Inc.Gaithersberg,Md.、FlukaChemica-BiochemikaAnalytikaFlukaChemieAG,Buchs,Switzerland、Invitrogen,SanDiego,Calif.、およびAppliedBiosystemsFosterCity,Calif.、ならびに当業者に公知の多くの他の商業的供給源が含まれる。複製およびタンパク質の組換え発現の支持に好適な細胞は、当分野において周知である。そのような細胞は、特定の発現ベクターにより適宜形質移入または形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を大規模発酵槽の播種のために成長させて臨床用途に十分な量のタンパク質を得ることができる。そのような細胞には、原核微生物、例えば大腸菌E.coli;種々の真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO、NSO、292;酵母;昆虫細胞;ならびにトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物などが含まれ得る。標準的技術は、外来遺伝子をそれらの系中で発現させる分野において公知である。本発明の医薬組成物は、本発明の遺伝子融合物または化学構築物および薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書において使用される薬学的に許容可能な担体は、生理学的に適合可能な任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを意味する。薬学的に許容可能な担体の一部の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。薬学的に許容可能な物質の追加の例は、湿潤剤または抗体の保存期間もしくは有効性を向上させる少量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤または緩衝剤である。任意の慣用の賦形剤、担体またはビヒクルが本発明の送達構築物と不適合性である場合を除き;本発明の医薬製剤におけるその使用が企図される。ある実施形態において、活性化合物の医薬組成物は、組成物を急速放出から保護する担体を用いて調製することができ、例えば制御放出配合物、例としてインプラント、経皮貼付剤、およびマイクロカプセル化送達系である。生分解性の生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。そのような配合物を調製する多くの方法は、特許されるか、一般に当業者に公知である。例えば、SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystemsJ.R.Robinsonら,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978年参照。ある実施形態において、本発明の送達構築物は、例えば、不活性希釈剤または吸収性食用担体とともに経口投与することができる。化合物および、所望により他の成分を硬または軟シェルゼラチンカプセル剤中に封入し、錠剤に圧縮し、または対象の食事中に直接取り込むこともできる。経口治療剤投与のため、送達構築物を賦形剤とともに取り込み、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート剤などの形態で使用することができる。本発明の化合物を非経口投与以外により投与するため、化合物をその不活性化を防止するための材料によりコートし、または化合物をその材料と同時投与することが必要であり得る。一般に、薬学的有効量の本発明の送達構築物を対象に投与する。当業者は、送達構築物の投与量が有効量の下記巨大分子を送達するために十分かどうかを容易に決定することができる。ある実施形態において、約1.mu.gから約1gの送達構築物を投与する。他の実施形態において、約10.mu.gから約500mgの送達構築物を投与する。さらに他の実施形態において、約10.mu.gから約100mgの送達構築物を投与する。さらに他の実施形態において、約10.mu.gから約1000.mu.gの送達構築物を投与する。さらに他の実施形態において、約10.mu.gから約250.mu.gの送達構築物を投与する。さらに他の実施形態において、約10.mu.gから約100.mu.gの送達構築物を投与する。好ましくは、約10.mu.gから約50.mu.gの送達構築物を投与する。本発明の送達構築物は、対象への巨大分子の局部または全身送達のための慣用の技術と比べていくつかの利点を提供する。そのような利点のうちの最大のものは、針を使用して対象の皮膚を穿刺することなく巨大分子を送達する能力である。多くの対象が、反復の常用量の巨大分子を要求する。例えば、糖尿病患者は、インスリンを1日数回注射して血糖濃度を管理しなければならない。巨大分子の送達を注射なしで達成することができる場合、疼痛またはそれに伴う潜在的な合併症を回避することにより、そのような対象の生活の質が大幅に改善される。さらに、送達構築物の多くの実施形態を構築し、組換え系中で発現させることができる。組換え技術は、任意の好適な巨大分子の導入のために設計された挿入部位を有する送達構築物の作製を可能とする。そのような挿入部位は、必要が生じれば、当業者が新規巨大分子の送達のための送達構築物を迅速に容易に生成することを可能とする。さらに、上皮細胞の側底膜に存在する酵素により開裂されるリンカーによる送達構築物の残部への巨大分子の連結は、上皮膜を越えるトランスサイトーシス直後に巨大分子の送達構築物からの遊離および送達構築物の残部からの放出を可能とする。そのような遊離は、巨大分子に対する免疫応答の誘導の可能性を低減させる。これは、巨大分子と、送達構築物の残部から離れたその標的との相互作用も可能とする。本発明の送達構築物の他の利点は、当業者には明らかである。実施例1上記のとおり成熟コレラ菌VibriocholeraCholixをコードするプラスミド構築物を調製し、使用して成熟Cholixタンパク質を大腸菌E.coli発現系中で発現させた;例えば、Jorgensen,R.ら,JBiolChem,28316:10671-106782008年参照。Cholix遺伝子の非毒性突然変異形態以下、ntCholixと称するも、立体配座の顕著な変化なしで非毒性となるPEタンパク質における欠失8710E553と類似するアミノ酸位置581におけるグルタミン酸の遺伝子欠失8710E581により調製した;Killeen,K.P.andCollier,R.J.,BiochimBiophysActa,1138:162-1661992年。タンパク質発現は、大腸菌E.coliDH5α細胞Invitrogen,Carlsbad,CAを使用して適切なプラスミドによる熱ショック42°Cにおいて1分間による形質転換後に達成した。抗生物質含有培地に基づき選択された形質転換細胞を単離し、Luria-BertaniブロスDifco中で成長させた。タンパク質発現は、1mMのイソプロピル-D-チオガラクトピラノシドIPTGの添加により誘導した。IPTG誘導2時間後、細胞を5,000×gにおいて4°Cにおいて10分間遠心分離することにより回収した。細胞溶解後に封入体を単離し、タンパク質を6MのグアニジンHClおよび2mMのEDTApH8.0、さらに65mMのジチオトレイトール中で可溶化させた。リフォールディングおよび精製後、タンパク質をCa2およびMg2を欠くPBSpH7.4中で約5ml/mlで-80°Cにおいて保存した。それらの試験において使用した全てのタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーに基づき>90の純度であることを確認した。次いで、ntCholix形態をそのC末端において修飾してタンパク質のC末端付近に局在する遊離スルフヒドリル残基を介する直接化学カップリングを可能とした。C末端修飾についての戦略を図1に示す。C末端修飾は、タバコエッチ病ウイルスTEVからの高度に選択的なプロテアーゼのためのコンセンサス開裂配列ENLFQSを有するシステイン拘束ループ、第2のシステイン、およびヘキサ-ヒスチジンHis6タグを含むものであった。第2のCysは、カップリングのために最終的に使用されるCysとのジスルフィド架橋を形成するために含めた。His6配列をタンパク質に添加することにより精製を簡便化し、TEV開裂配列は軽度の還元後に末端Cys残基を選択的に除去するための機序を提供した。ntCholix構築物の発現および単離後のTEV開裂および0.1mMのジチオトレイトールによる軽度の還元は、積み荷付着の包括的機序としてのマレイミドベース反応を介する積み荷、AlexaFluor登録商標488蛍光色素の直接化学カップリングを可能とした。得られた構築物を本明細書においてntCholix-Alexa488と呼ぶ。TEVプロテアーゼ開裂、還元、および遊離スルフヒドリルとのマレイミド反応を介する積み荷カップリング後、遊離したC末端配列の除去を第2のNi2カラムクロマトグラフィー工程により達成した。実施例2ntCholix-Alexa488の経上皮輸送を、インビトロでCaco-2単層を使用して評価した。第1に、Caco-2細胞継代数25-35を上記のとおりコンフルエント単層に成長させた;Rubasら,PharmRes,10:113-1181993年。手短に述べると、細胞を37°CにおいてDMEM/2mMのL-グルタミン、10のウシ胎児血清、および100単位のペニシリン/ストレプトマイシンが濃縮されたDMEM/高成長培地中で5CO2および90湿度の雰囲気中で維持した。細胞を、75cm2フラスコ中で1:3の分割比において毎週継代し、CorningCostarCambridge,MA製の予備湿潤化およびコラーゲンコートされた浸透性0.4μm細孔サイズポリカルボネートTranswell商標フィルター支持体上に、63,000個の細胞/cm2の密度において播種した。成長培地を1日おきに交換した。電圧抵抗計WorldPrecisionInstruments,Sarasota,FLを使用する顕著な経上皮抵抗TEER測定の収集により決定したコンフルエント単層を、播種20~26日後に使用した。Cholixのインビトロ輸送を評価するための対照として使用すべき2つの追加の材料も調製した。フィルター損傷についての内部対照として、テトラメチルローダミンイソチオシアネートTRITC標識70kDaデキスタンdextanを商業的供給源Sigmaから入手した。非特異的色素介在輸送についての対照として、ウシ血清アルブミンBSA;Sigmaの表面上の遊離アミンの一部をAlexa488カルボン酸スクシンイミジルエステルA488-CASE;Invitrogenと反応させた。カップリング反応は、室温において中性pHにおいて10:1のA488-CASE:BSAのモル比において4時間実施し、この時点において過剰のグリシンを添加して反応停止させた。得られた精製生成物は、BSA1分子当たり約3つのAlexa488分子を含有した。テトラメチルローダミンイソチオシアネートTRITC標識70kDaデキスタンSigmaをフィルター損傷についての内部対照として使用した。蛍光計測は、BMGlabtechFLUOstarOmega機器をTRITC-デキストラン最適Ex=547およびEm=572について540nmの励起および610nmの発光に、Alexa488タンパク質最適Ex=496およびEm=519について480nmの励起および520nmの発光に設定して使用して行った。経上皮輸送流動速度は、インビトロでCaco-2細胞の極性単層を使用して頂端Apから側底BlおよびBlからAp方向において計測して粘膜から漿膜および漿膜から粘膜の流動イベントをそれぞれ記載した。輸送試験の開始直前、それぞれのフィルターの経上皮抵抗TEERを計測し;<200Ωcm2の単層TEER読取りを試験から排除した。ApおよびBl培地を含まれる単層から除去し、それらの表面をリン酸緩衝生理食塩水PBSにより1回洗浄した。次いで、単層の1つの組は、10μgのntCholix-A488および10μgのTRITC-デキストランまたは10μgのBSA-A488および10μgのTRITC-デキストランを含有する100μLのPBSのApドナー適用を受けた。次いで、レシーバーBl区画は、500μLのPBSを受けて輸送試験についてのT0を設定した。ドナーおよびレシーバーの両区画を37°Cにおける4時間のインキュベーション後にサンプリングして単層を越えて輸送された材料の量および頂端表面に保持された量をそれぞれ測定した。曝露の4時間後、それらの単層の頂端表面に添加された材料の約5の輸送が観察された図2参照。基底区画中の75kDaのTRITC-デキストランのレベルを示すいずれのフィルターも分析から排除した。BSA-Alexa488の対照タンパク質は、この同一の4時間の期間にわたり基底区画中でいかなる有意なレベルも示し得なかった図2参照。輸送の平均は、Cholixについて5.025±1.13であり、BSAについて0.56±0.33であったN=4。このデータは、Cholixの遺伝子的に解毒された形態がインビトロでヒト腸癌細胞系Caco-2の極性単層を越えて効率的に輸送され得ることを確立した。実施例3アミノ酸A386においてトランケートされたCholixのバリアントCholix386およびCholix386のC末端における緑色蛍光タンパク質GFPの遺伝子ライゲーション物Cholix386GFPも調製し、大腸菌E.coli.中で発現させた。タンパク質発現は、大腸菌E.coliDH5α細胞Invitrogen,Carlsbad,CAを使用して、適切なプラスミドによる熱ショック42°Cにおける1分間による形質転換後に達成した。抗生物質含有培地に基づき選択された形質転換細胞を単離し、Luria-BertaniブロスDifco中で成長させた。タンパク質発現は、1mMのイソプロピル-D-チオガラクトピラノシドIPTGの添加により誘導した。IPTG誘導2時間後、細胞を5,000×gにおいて4°Cにおいて10分間遠心分離することにより回収した。細胞溶解後に封入体を単離し、タンパク質を6MのグアニジンHClおよび2mMのEDTApH8.0、さらに65mMのジチオトレイトール中で可溶化させた。リフォールディングおよび精製後、タンパク質をCa2およびMg2を欠くPBSpH7.4中で約5ml/mlで-80°Cにおいて保存した。Cholix386GFPリフォールディングは、この蛍光タンパク質に伴う蛍光サインの収集および保持によりモニタリングした;Sampleら,ChemSocRev,3810:p.2852-642009年。緑色蛍光タンパク質GFPは、UpstateCharlottesville,VAから購入した。それらの試験において使用した全てのタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーに基づき>90の純度であることを確認した。468/508nmの励起/発光特性を有する共有結合により統合された赤色蛍光色素を含有し、アルデヒド表面官能基を有するポリスチレンビーズ10nm直径XPR-582を、DukeScientificPaloAlto,CAから入手した。100μlのXPR-582ビーズ2の固体におけるを約2.5nモルのGFPまたはCholix386GFPと、200μlの最終容量の中性pH7.0リン酸緩衝生理食塩水PBS中で混合した。室温において穏やかに2時間振とうした後、20μlのウシ血清アルブミンBSA;Sigma,St.Louis,MOのPBS中2mg/ml溶液を添加した。次いで、調製物をPBSによる希釈およびMilliporeBedford,MA製の100,000分子量カットオフMicroconフィルター装置を使用する濃縮の3回のサイクルにより透析した。コートされたビーズの最終調製物は、1の固体であった。実施例4A549ATCCCCL-185商標、L929ATCCCRL-2148商標、およびCaco-2ATCCHTB-37商標細胞を、5CO2中で37°Cにおいて完全培地、すなわち、10のウシ胎児血清、2.5mMのグルタミン、100Uのペニシリン/ml、および100μgのストレプトマイシン/mlが補給されたDulbecco改変Eagle培地F12DMEMF12GibcoBRL,GrandIsland,N.Y.中で維持した。細胞に2から3日毎にこの培地完全培地と称するを供給し、5から7日毎に継代した。アッセイのため、細胞を24または96ウェルプレート中に播種し、コンフルエンスまで成長させた。Caco-2細胞をコンフルエント単層としてコラーゲンコートされた0.4μm細孔サイズのポリカルボネート膜transwell支持体Corning-Costar,Cambridge,MA上で成長させ、箸型Millicell-ERS登録商標電圧計Milliporeを使用して計測して>250Ωcm2の経上皮電気抵抗TEERに達して18~25日後に使用した。CholixまたはCholix386GFPの頂端から側底A→Bおよび側底から頂端B→Aのそれらの単層を越える輸送は、37°Cにおける20μgの適用4時間後に輸送されたタンパク質の量を計測することにより決定した。TEER計測および10kDa蛍光デキストランの広がりHPLCサイズ排除プロトコルを使用して計測を使用して試験過程の間の単層障壁特性を確認した。Cholix輸送の程度は、細胞ベース細胞毒性アッセイにおいて回収した培地の滴定により決定した。輸送されたCholix386GFPは、捕捉のための抗GFP抗体および検出のためのCholixに対するポリクローナル血清を使用する酵素結合免疫吸着アッセイELISAにより計測した。インビトロでの極性Caco-2細胞単層を越える輸送速度は、ELISAフォーマット分析により評価されたとおり、Cholix、ntCholixおよびCholix386GFPについて比較可能であった。Cholixの場合、極性Caco-2細胞は、アポトーシスのTUNEL検出またはラクテートデヒドロゲナーゼLDH放出について試験した場合、タンパク質により毒性化されなかった。重要なことに、CholixおよびCholixベースタンパク質キメラは、Caco-2単層の頂端から側底表面に効率的に輸送されるが、側底から頂端方向においては輸送されないことが見出された。これらの輸送速度および方向性は、この同一のフォーマットにおいて試験されたPEについて既に観察されたものと比較可能であった。さらに、ウサギ抗Cholix抗血清の添加は、インビトロでCaco-2単層を越えるCholixの効率的輸送もCholix関連タンパク質の効率的輸送も遮断し得ないことが観察された。共焦点蛍光顕微鏡法を使用してインビトロでCaco-2単層を越えるCholix386GFPトランスサイトーシスの性質を試験した。経時試験は、上皮細胞中へのCholix386GFP流入をその頂端適用の5分以内で示し、細胞の側底領域への細胞を介する輸送を15分以内で示した。頂端Cholix386GFPに15分間曝露し、続いて過剰のCholix386GFPを頂端室apicalchamberから除去した試料において、GFP蛍光は、細胞の側底表面の方向において継続し、頂端表面に戻って継続しないことが観察された。Cholix386GFPのこの一方向移動は、頂端および側底区画中のCholix386GFP含有量をこの経時にわたり計測することにより確認された。Caco-2単層の側底表面におけるCholix386GFPの適用は、細胞中に流入するいかなる有意な蛍光も示さず、輸送試験と一致した。輸送されたCholix、ntCholixおよびCholix386GFPのウエスタンブロット分析は、それらのタンパク質が大きい変化なしで輸送されることを示唆した。インビトロ試験は、Cholix386GFPに化学的にカップリングさせた100nm直径の蛍光ラテックスビーズが、頂端適用後にCaco-2単層を越えて効率的に輸送されることも示した。100nm直径を有するラテックスビーズの選択は、クラスリンコートピット由来の125nm直径のエンドソームの内腔内に容易にフィットし得る材料を提供した。したがって、これらの研究は、Cholix386GFP-ラテックスビーズが頂端細胞表面におけるエンドソーム取り込みに続くエンドソームベースの細胞内トラフィッキングと一致する機序により極性Caco-2細胞を経て移動することを示唆する。Cholix386GFP-カップリング100nm直径蛍光ラテックスビーズの、抗Cholix抗血清との予備インキュベーションは、それらのビーズの輸送を変化させ得なかった。100nm直径蛍光ラテックスビーズに化学的にカップリングした同様の量のGFPは、Caco-2単層を越えるそれらの粒子のインビトロ輸送を促進しなかった。共焦点蛍光顕微鏡試験は、Cholix386GFPとGFPによりコートしたラテックスビーズについてトランスサイトーシスにおいて観察される差異と一致した。CholixがPEと同様に極性上皮障壁を越えて輸送され得るという結果は、予期されるものではない。それらの構造が結晶学的分析により示唆されるとおり同様である一方、それらの表面のアミノ酸組成は著しく異なり;実際、アミノ酸類似性に基づくアラインメント法はそれら2つのタンパク質に容易に合致しない。このことは、病原菌由来タンパク質、例えばそれら2つの毒性因子の、宿主細胞受容体と相互作用する能力が表面発現アミノ酸構成成分を必要とすることが想定されるという点で重要である。それらのタンパク質それらの実質的に異なるアミノ酸配列を有するの両方が極性上皮を越えて効率的に輸送されるため、一部の他の機序がこの輸送能についてのその基礎を形成する可能性が極めて高い。PEおよびCholixにより共有される構造関連性がそれらの効率的なトランスサイトーシスの固有能の基礎を形成することが本発明者らの主張である。PEおよびCholixタンパク質の両方が頂端表面受容体に結合してエンドソーム区画に接近する能力を有する一方、この相互作用およびそれらのタンパク質の細胞内トラフィッキングに関与する他の受容体についての潜在性がタンパク質表面上の特異的なアミノ酸よりも立体配座構造に基づく可能性がより高い。本明細書において開示および特許請求される物品および方法の全ては、本開示に照らして過度の実験なしで行い、遂行することができる。本発明の物品および方法を好ましい実施形態に関して記載したが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく変形を物品および方法に加えることができることは当業者には明らかである。当業者に明らかな全てのそのような変形形態および均等物は、目下既存であるか後に開発されるかにかかわらず、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨および範囲内にあるものとみなす。本明細書に挙げられる全ての特許、特許出願、および刊行物は、本発明が属する分野の当業者の水準を示す。全ての特許、特許出願、および刊行物は、全ての目的のために、それぞれの個々の刊行物が任意のおよび全ての目的のために参照により全体として組み込まれることが具体的および個別的に示されるのと同程度に参照により全体として本明細書に組み込まれる。本明細書に説明的に記載される本発明は、好適には、本明細書に具体的に開示されていないいかなる要素の不存在下でも実施することができる。したがって、例えば、本明細書におけるそれぞれの場合、用語含む、本質的に~からなる、およびからなるのいずれかを、他の2つの用語のいずれとも置き換えることができる。用いられる用語および表現は、説明の用語として使用され、限定の用語として使用されるものではなく、そのような用語および表現の使用において、記載される特徴およびその一部のいかなる均等物も排除するものではないが、種々の改変が特許請求される本発明の範囲内で考えられることが認識される。したがって、本発明が好ましい実施形態および任意選択の特徴により具体的に開示されているが、本明細書において開示される概念の改変および変形を当業者がし得ること、ならびにそのような改変形態および変形形態は添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内であるとみなされることを理解すべきである。"