"リガンドに対して高い親和性を有し、該リガンドに対して107M-1より大きい解離定数を示す、可溶性T細胞レセプターTCRであって、ここで、該可溶性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、可溶性TCR。前記TCRが前記リガンドに対して107M-1~1010M-1の解離定数を示す、請求項1に記載の可溶性TCR。前記リガンドがペプチド/MHCリガンドである、請求項1に記載の可溶性TCR。前記リガンドがスーパー抗原である、請求項1に記載の可溶性TCR。前記1つ以上の変異がCDR3αまたはCDR3βにおいて存在する、請求項1に記載の可溶性TCR。選択されたリガンドに対して107M-1より大きい解離定数を示す高親和性TCRをT細胞表面上で発現する、T細胞であって、ここで、該高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、T細胞。前記TCRが前記リガンドに対して107M-1~1010M-1の解離定数を示す、請求項6に記載のT細胞。前記リガンドがペプチド/MHCリガンドである、請求項6に記載のT細胞。前記リガンドがスーパー抗原である、請求項6に記載のT細胞。前記高親和性TCRがCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する変異体である、請求項6に記載のT細胞。標的細胞の自己免疫破壊をブロックする方法であって、該方法が、該標的細胞の表面上のTリンパ球によって認識される部位に対して高い親和性を有する可溶性変異体TCRと、該標的細胞とを接触させ、それにより該標的細胞の自己免疫破壊がブロックされ、ここで該可溶性、高親和性変異体TCRが該標的細胞の表面上のTリンパ球によって認識される部位に対して107M-1より大きい解離定数を示す、工程を包含する、方法。前記高親和性変異体TCRが前記該標的細胞の表面上のTリンパ球によって認識される部位に対して107M-1~1010M-1の解離定数を示す、請求項11に記載の方法。前記高親和性TCRがCDRにおいて1つ以上の変異を有する変異体である、請求項11に記載の方法。前記高親和性TCRがCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する変異体である、請求項13に記載の方法。所望でない細胞を殺傷するための薬学的組成物であって、該組成物が高親和性TCRを含み、ここで該TCRが該細胞の細胞表面マーカーに対して高い親和性を有し、そして治療化合物と結合されて、治療TCR誘導体を形成し、ここで該高親和性TCRが該所望でない細胞の細胞表面マーカーに対して107M-1より大きい解離定数を示し、ここで、該高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、組成物。前記高親和性TCRが前記所望でない細胞の細胞表面マーカーに対して107M-1~1010M-1の解離定数を示す、請求項15に記載の組成物。前記高親和性TCRがCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する変異体である、請求項15に記載の組成物。高親和性TCRを細胞表面上の選択されたペプチド/MHCリガンドを有する該細胞に結合する方法であって、該方法が、以下:該選択されたペプチド/MHCリガンドに対して107M-1より大きい解離定数を示す変異体TCRを提供する工程;該高親和性TCRを標識化する工程;および、該標識化高親和性TCRを細胞表面上に1つ以上のペプチド/MHCリガンドを有する該細胞を含むサンプルと接触させ、該高親和性TCRを該サンプル中に存在する選択されたペプチド/MHCリガンドに結合する工程、を包含する、方法。前記変異体TCRが前記選択されたペプチド/MHCリガンドに対して107M-1~1010M-1の解離定数を示す、請求項18に記載の方法。前記変異体TCRがCDRにおいて1つ以上の変異を有する、請求項18に記載の方法。前記変異体TCRがCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する、請求項20に記載の方法。T細胞の表面上に高親和性TCR変異体の発現を可能にする系に、該高親和性TCR変異体についての遺伝子をクローニングする方法であって、以下:TCRを変異させて、TCRの同族リガンドに対して少なくとも107M-1の解離定数を示す高親和性TCR変異体を作製する工程;該TCR変異体をベクターにクローニングする工程;該ベクターをT細胞にトランスフェクトする工程;および該T細胞の表面上に該高親和性TCR変異体を発現する工程、を包含する、方法。前記トランスフェクトされたT細胞が選択されたペプチド保有MHC細胞の認識のために使用される、請求項22に記載の方法。前記高親和性TCR変異体がCDRにおいて1つ以上の変異を有する、請求項22に記載の方法。前記高親和性TCR変異体がCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する、請求項24に記載の方法。請求項22の方法によって作製される、T細胞。変異体高親和性TCRの同族リガンドに対して107M-1より大きい解離定数を示す該変異体高親和性TCRをコードする、DNA配列であって、ここで、該変異体高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、DNA配列。前記TCR変異体が該TCR変異体同族リガンドに対して107M-1~1010M-1の解離定数を示す、請求項27に記載のDNA配列。前記TCR変異体がCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する、請求項27に記載のDNA配列。治療化合物に結合された可溶性の高親和性単鎖TCRを含む、治療TCR誘導体であって、ここで、該可溶性の高親和性単鎖TCRが、その同族のリガンドに対して107M-1より大きい解離定数を示し、ここで、該可溶性の高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、治療TCR誘導体。前記治療化合物が抗癌剤、治療放射性核種または細胞傷害性タンパク質である、請求項30に記載の治療TCR誘導体。前記可溶性の高親和性TCRが病原体に感染した細胞に特異的に結合する、請求項30に記載の治療TCR誘導体。前記治療化合物が、病原体に対して有毒である分子である、請求項32に記載の治療TCR誘導体。高親和性TCR変異体を発現するベクターで形質転換されたT細胞であって、ここで該形質転換されたT細胞が野生型T細胞よりもより大きな程度で活性化され得、ここで、該高親和性TCR変異体が選択されたリガンドに対して107M-1より大きい解離定数を示し、ここで、該高親和性TCR変異体がCDR中に1つ以上の変異を含む、T細胞。細胞の表面上の特異的ペプチド/MHCリガンドを検出する診断プローブであって、該プローブが該特異的ペプチド/MHCリガンドに結合する検出可能に標識化された高親和性TCRを含み、ここで、該検出可能に標識化された高親和性TCRが特異的ペプチド/MHCリガンドに対して107M-1より大きい解離定数を示し、ここで、該検出可能に標識化された高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、プローブ。病原体を不活化するための高親和性TCRを含む薬学的組成物であって、該高親和性TCRが該病原体に対して有毒である分子に結合され、ここで、該高親和性TCRが該分子に対して107M-1より大きい解離定数を示し、ここで、該高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、薬学的組成物。前記病原体が、以下:ウイルス、細菌および原生生物からなる群より選択される、請求項36に記載の組成物。薬学的キャリア中に高親和性TCRを含む、薬学的組成物であって、ここで、該高親和性TCRがリガンドに対して107M-1より大きい解離定数を示し、ここで、該高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、薬学的組成物。発明の要旨本発明は、組換え宿主細胞、例えば、酵母細胞望ましくはSaccharomycescerevisiaeの表面上に提示された免疫T細胞レセプターポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを提供する。このようなライブラリーから、高い親和性のTCRポリペプチド同族のリガンド:主要組織適合遺伝子複合体のタンパク質pMHCに結合するペプチドの複合体に関して、野生型よりも高い親和性を示すものが単離され得る。望ましくは、pMHCに対するTCRペプチドの親和性は、例えば、当該分野で公知の方法によって測定される場合、約107~約1010の解離定数に反映される。可溶性の高い親和性のTCRをコードする核酸を含むDNAライブラリーが提供され、ここで、このTCRは、変異体TCRコード配列を作製するためのTCRを変異誘発すること;変異体TCRの変異体TCRコード配列を含むDNAを酵母細胞に形質転換すること;この変異体TCRが酵母細胞の表面上に提示されるようにこの変異体TCRコード配列の発現を誘導すること;この酵母細胞を、ペプチド/MHCリガンドを結合する蛍光標識と接触して、選択された酵母細胞を産生すること;および、最も高い蛍光を示す酵母細胞を単離する、方法によって作製される。野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有する、酵母細胞の表面上に提示されたT細胞レセプタータンパク質のライブラリーがまた、提供され、ここで、このライブラリーは、T細胞レセプタータンパク質コード配列を変異誘発して変化に富むT細胞レセプタータンパク質コード配列変異体の集団を作製すること;このT細胞レセプター変異体コード配列を、酵母細胞に形質転換すること;酵母細胞の表面上でこのT細胞レセプター変異体コード配列の発現を誘導すること;そして、野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有する、T細胞レセプター変異体を発現する細胞が選択することによって形成される。本発明はさらに、同族リガンドに対して高い親和性の結合を示すTCRタンパク質細胞結合形態でかまたは可溶性形態でを提供する。本発明において、TCRタンパク質が結合するリガンドは、ペプチド/MHC複合体であるか、または選択プロセス望ましくは、繰り返された選択プロセスに起因して、このリガンドは、MHC成分例えば、スーパー抗原を含まないリガンドであり得る。このリガンドは、とりわけ、ペプチド、タンパク質、炭水化物部分、または脂質部分であり得る。これらの可溶性の高い親和性のTCRは、変異体TCRコード配列を作製するためにTCRを変異誘発する工程;変異体TCRのための変異体TCRコード配列を含むDNAを酵母細胞に形質転換する工程;この変異体TCRが酵母細胞の表面上に提示されるように、この変異体TCRコード配列の発現を誘導する工程;この酵母細胞を、ペプチド/MHCリガンドに結合する蛍光標識と接触して、選択された酵母細胞を生成する工程;および、最も高い蛍光を示す酵母細胞を単離する工程を包含する方法によって作製され得る。この可溶性の高い親和性のTCRは、好ましくは酵母ディスプレイによって単離される。本発明はさらに、高い親和性のTCRタンパク質の同族リガンドを検出するための方法を提供し、この方法は、高い親和性のTCRタンパク質を同族リガンドと結合させる工程を包含し、ここで、この高い親和性のTCRタンパク質が検出可能に標識化されるか、または添加される二次的な検出可能なタンパク質例えば、同族リガンドに結合する領域以外の領域においてTCRに特異的な抗体が存在する。リガンドを同定するために高い親和性のTCRを用いるための好ましい方法は:高い親和性のTCRを検出可能な標識で標識化する工程;この標識化TCRをリガンドと接触する工程;標識化TCRが結合するリガンドを同定する工程を包含する。好ましくは、このリガンドは、野生型TCRよりも高い親和性でTCRに結合するペプチド/MHCリガンドである。このリガンドを同定する方法は、当業者に公知である。直接または間接的に、TCRタンパク質の検出を可能にする適切な標識としては、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性同位体、発色団などが挙げられるが、これらに限定されない。高い親和性のTCRタンパク質は、医学、獣医学もしくは植物の診断設定における標的リガンドの定性測定および定量測定のための手段としてか、または組織材料もしくは植物材料の同定のために、実験室で使用され得る。同様に、本発明の高い親和性のTCRは、標的材料またはリガンドの検出および/または定量のための試薬として使用され得る。選択されたペプチド/MHCリガンドに結合する高い親和性のTCRを用いる方法がまた、提供され、この方法は、この高い親和性のTCRをこの選択されたペプチド/MHCリガンドに結合する標識で標識化する工程;この標識化された高い親和性のTCRをMHC分子を含む細胞と接触させる工程を包含する。本発明の高い親和性のタンパク質ここで、このタンパク質は、高い親和性および特異性で腫瘍細胞抗原に特異的に結合するは、特定の癌の型の診断試験に使用され得るか、または生物好ましくは、哺乳動物、そしてまた好ましくは、ヒトにおいて、腫瘍の位置を確認するためならびに/または腫瘍のサイズおよび数を概算するための画像化試験の際に生物で使用され得る。診断試験のためにpMHCに結合する高い親和性のTCRを用いるための方法が提供され、この方法は、高い親和性のTCRを検出可能な標識で標識化する工程;この高い親和性のTCRが高い親和性を有するリガンドを含む細胞と、この高い親和性のTCRを接触させる工程;およびこの標識を検出する工程を包含する。この方法において、標識は、特定のペプチド/MHCリガンドに結合するために選択され得、これによって、特定のペプチド/MHCリガンドを発現する細胞が、標的化される。細胞表面上で特定のペプチド/MHC分子に対する診断プローブとして高い親和性のTCRを用いるための好ましい方法は:高い親和性のTCRを、特定のペプチド/MHCリガンドに結合する検出可能な標識で標識化する工程;このTCRを細胞と接触する工程;およびこの標識を検出する工程を包含する。特定の使用に依存した使用のために選択された検出可能な標識、および適切なの選択は、関連分野の当業者の十分に範囲内である。一般的に、目的のリガンドに対する高い親和性結合に関して選択されたTCRタンパク質は、このリガンドに特異的な抗体が使用され得る方法TCR対抗体タンパク質に対して手順の改変がなされ、このような改変は、当該分野で公知であるに使用され得る。高い親和性のTCR、望ましくは可溶性単鎖scTCRは、自己免疫疾患における細胞または組織の自己免疫破壊をブロックするために使用され得、ここで、標的細胞の表面上で細胞傷害性リンパ球によって認識される部位は、高い親和性のTCRによって結合される部位と同じである。細胞の自己免疫破壊をブロックするための好ましい方法は、標的細胞の表面上でTリンパ球によって認識される部位に高い親和性を有するTCRを、細胞と接触させる工程を包含し、これによって、細胞の自己免疫破壊がブロックされる。可溶性の、高い親和性のscTCRは、治療化合物例えば、制癌化合物、治療放射性核種または細胞傷害性タンパク質に結合され得、ここで、scTCRの同族のリガンドは、新生物形成細胞表面マーカーである。あるいは、高い親和性の可溶性scTCRの結合特異性は、病原体感染された標的細胞であり得例えば、ウイルス、細菌、または原生動物感染された標的細胞、そして、標的細胞が感染因子のさらなる複製無しに排除され得るように毒性分子が結合され得る。不活性病原体に対して高い親和性のTCRを使用する提供された方法は:この病原体に毒性である分子を、高い親和性のTCRに結合させる工程;およびこの病原体を発現する細胞と、このTCRを接触させる工程を包含する。毒性は、病原体が病原体の複製を回避または阻害することを意味する。疾患を処置するために高い親和性のTCRを使用するための方法がまた提供され、この方法は:新生物形成細胞表面マーカーに対して高い親和性を有するTCRを、治療化合物と結合させる工程:およびこのTCRを細胞と接触させる工程を包含する。TCRと結合され得る、疾患の進行を遅延する際に有用である任意の治療化合物が、使用され得る。治療化合物をTCRと結合する方法は、当該分野で公知である。高い親和性のTCR変異体に対する遺伝子を、T細胞の表面上で変異体の発現を可能にするシステムにクローニングするための方法がまた、提供され、この方法は:高い親和性のTCR変異体を作製するためにTCRを変異させる工程;このTCR変異体をベクターにクローニングする工程;このベクターをT細胞にトランスフェクトする工程;高い親和性のTCR変異体をT細胞の表面上に発現させる工程を包含する。この方法は、さらに:ペプチド/MHCリガンドによって他のT細胞よりも大きな程度に活性化されるT細胞を選択する工程を包含する。トランスフェクト/感染されたT細胞は、選択されたペプチド保有MHC細胞の認識に有用であり得る。これらのトランスフェクト/感染されたT細胞は、患者の疾患を処置する際に有用であり、ここで、患者由来のT細胞は、取り出され、そして高い親和性のTCR変異体を発現するベクターで形質転換され、そしてこの患者に戻されるここで、このT細胞は、患者の野生型T細胞よりも、ペプチド/MHCリガンドによって大きな程度に活性化される。可溶性の高い親和性のTCR分子は、関連分野の当業者に容易に明らかであるように、ほとんどの適用に対して抗体または単鎖抗体の代わりに使用され得る。本願発明は、例えば、以下を提供する:項目1リガンドを同定するために高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:高親和性TCRを標識化する工程;該標識化TCRをリガンドと接触させる工程;該標識化TCRと結合する該リガンドを同定する工程、を包含する、方法。項目2前記標識が、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性同位元素および発色団からなる群より選択される、項目1に記載の方法。項目3前記リガンドが、ペプチド/MHCリガンドである、項目1に記載の方法。項目4選択されたペプチド/MHCリガンドに結合するために高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:該高親和性TCRを、該選択されたペプチド/MHCリガンドに結合する標識で標識化する工程;該標識化高親和性TCRを、MHC分子を含む細胞と接触させる工程、を包含する、方法。項目5前記標識が、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性同位元素および発色団からなる群より選択される、項目4に記載の方法。項目6細胞の表面上の特定のペプチド/MHC分子に対する診断用プローブとして高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:高親和性TCRを、特定のペプチド/MHCリガンドに結合する標識で標識化する工程;該TCRを細胞と接触させる工程;該標識を検出する工程、を包含する、方法。項目7診断試験のためにpMHCに結合する高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:該高親和性TCRを検出可能な標識で標識化する工程;該高親和性TCRを細胞と接触させる工程;該標識を検出する工程、を包含する、方法。項目8前記存在する標識の数が検出される、項目7に記載の方法。項目9前記標識の位置が、生物体において検出される、項目7に記載の方法。項目10前記標識が、特定のペプチド/MHCリガンドに結合し、それによって、特定のペプチド/MHCリガンドを発現する細胞が標的化される、項目7に記載の方法。項目11細胞の自己免疫破壊をブロックするための方法であって、標的細胞の表面上のTリンパ球によって認識される部位に対して高い親和性を有するTCRを、細胞と接触させる工程であって、それによって、細胞の自己免疫破壊がブロックされる、工程、を包含する、方法。項目12疾患を処置するために高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:新生物細胞表面マーカーに対する高い親和性を有するTCRを、治療化合物と結合させる工程;および、該TCRを細胞と接触させる工程、を包含する、方法。項目13病原体を不活性化するために高親和性TCRを使用する方法であって、以下:病原体に対して毒性のある分子を、高親和性TCRに結合する工程;および、該TCRを、該病原体を発現する細胞と接触させる工程、を包含する、方法。項目14前記病原体が、ウイルス、細菌および原生動物からなる群より選択される、項目13に記載の方法。項目15野生型TCRよりもリガンドに対して高い親和性を有する、可溶性T細胞レセプターTCR。項目16前記リガンドが、ペプチド/MHCリガンドである、項目15に記載の可溶性高親和性TCR。項目17項目15に記載の可溶性高親和性TCRであって、該高親和性TCRが、以下:TCRを変異誘発して、変異体TCRコード配列を作製する工程;変異体TCRについての該変異体TCRコード配列を含むDNAを、酵母細胞に形質転換する工程;該変異体TCRコード配列の発現を誘導する工程であって、その結果、該変異体TCRが、該酵母細胞の表面上に提示される、工程;該酵母細胞を、蛍光標識と接触させる工程であって、該蛍光標識は、ペプチド/MHCリガンドに結合して、選択された酵母細胞を産生する、工程;および最も高い蛍光を示す酵母細胞を単離する工程、を包含する方法によって作製される、可溶性高親和性TCR。項目18酵母ディスプレイによって単離された、項目15に記載の可溶性高親和性TCR。項目19可溶性高親和性TCRをコードする核酸を含む、DNAライブラリーであって、該TCRが、以下:TCRを変異誘発して、変異体TCRコード配列を作製する工程;変異体TCRについての該変異体TCRコード配列を含むDNAを、酵母細胞に形質転換する工程;該変異体TCRコード配列の発現を誘導する工程であって、その結果、該変異体TCRが、該酵母細胞の表面上に提示される工程;該酵母細胞を、蛍光標識と接触させる工程であって、該蛍光標識は、ペプチド/MHCリガンドに結合して、選択された酵母細胞を産生する、工程;および最も高い蛍光を示す酵母細胞を単離する工程、を包含する方法によって作製される、DNAライブラリー。項目20野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有する、酵母細胞の表面上に提示されたT細胞レセプタータンパク質のライブラリーであって、ここで、該ライブラリーは、T細胞レセプタータンパク質コード配列を変異誘発して、T細胞レセプタータンパク質コード配列の変異体の多様な集団を生成する工程;該T細胞レセプター変異体コード配列を、酵母細胞に形質転換する工程;酵母細胞の表面上での該T細胞レセプター変異体コード配列の発現を誘導する工程;および、野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有するT細胞レセプター変異体を発現する細胞を選択する工程、によって形成される、ライブラリー。項目21T細胞の表面上に高親和性TCR変異体の発現を可能にする系に、該高親和性TCR変異体についての遺伝子をクローニングする方法であって、以下:TCRを変異誘発して、高親和性TCR変異体を作製する工程;該TCR変異体を、ベクターにクローニングする工程;該ベクターを、T細胞にトランスフェクトする工程;該T細胞の表面上に該高親和性TCR変異体を発現させる工程、を包含する、方法。項目22野生型よりもペプチド/MHCリガンドによって活性化されるT細胞を選択する工程をさらに包含する、項目21に記載の方法。項目23前記トランスフェクト/感染されたT細胞が、選択されたペプチド保有MHC細胞の認識のために使用される、項目21に記載の方法。項目24項目21の方法によって作製された、T細胞。好ましい実施形態の詳細な説明明細書および特許請求の範囲このような用語に対して与えられる範囲を含むの明瞭なそして一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。コード配列は、タンパク質のアミノ酸配列についてコードするか、またはtRNAまたはrRNAのような機能的なRNAについてコードする遺伝子またはcDNAの一部である。相補体または相補的な配列は、ワトソン-クリック塩基対形成法則に従う別の配列のヌクレオチドと水素結合した二重鎖を形成するヌクレオチドの配列を意味する。例えば、5’-AAGGCT-3’についての相補的な塩基配列は、3’-TTCCGA-5’である。下流は、DNAまたはRNAにおける任意の部位の3’側を意味する。発現は、構造的なRNArRNA、tRNAまたはメッセンジャーRNAmRNAへの遺伝子の転写および引き続くmRNAのタンパク質への翻訳をいう。具体的に例示されたTCR配列に機能的に等価であるアミノ酸配列は、単一または複数のアミノ酸置換によって、アミノ酸の付加および/または欠失によって、改変されたアミノ酸配列をいい、ここで、1つ以上のアミノ酸は化学的に改変されているが、それにも関わらず、本発明の細胞結合または可溶性TCRタンパク質の結合特異性および高い親和性結合活性を保持する。機能的に等価なヌクレオチド配列は、具体的に例示された細胞結合または可溶性TCRタンパク質と同一の生物学的活性を実質的に有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。本発明の状況において、可溶性TCRタンパク質は、ネイティブな細胞結合TCRの一部を欠き、そして、溶液中で安定であるすなわち、それは、本明細書中で記載されるように処理される場合、そしてタンパク質溶液についての標準的な条件下で、一般的に溶液中で凝集しない。2つの核酸配列は、これらの配列が別々の生物に由来する場合、このような生物が異なった種であろうとなかろうと、これらの配列が、同一の生物において同一の配列中で天然に存在しない限り、お互いに異種である。相同性は、2つのヌクレオチド間またはアミノ酸配列間の同一性の程度をいう。単離されたは、天然の状態からヒトの手によって変更されることを意味する。単離された組成物または物質が天然に存在する場合、それは、その本来の環境から変化されるかまたは取り出されるか、あるいはその両方である。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、その用語が本明細書中で使用される場合、天然の状態で共存する物質から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。リンカー領域は、タンパク質の2つの機能的または構造的ドメインを作動可能に連結するアミノ酸配列である。核酸構築物は、天然に存在する遺伝子から単離されたか、他に天然に存在しない様式で組み合わされそして並列された核酸のセグメントを含むように改変された核酸分子である。核酸分子は、3’-5’-リン酸ジエステル結合によって結合されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかを含む単一または二重鎖の直鎖状ポリヌクレオチドを意味する。2つのDNA配列は、連結の性質が、それらの配列がお互いに対してそれらの正常な機能をもたらす能力を妨げない場合、作動可能に連結されている。例えば、プロモーター領域は、このプロモーターがコード配列の転写をもたらし得る場合、コード配列に作動可能に連結されている。ポリペプチドは、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸の直鎖状ポリマーである。プロモーターは、シス作用DNA配列を意味し、一般的に80~120塩基対長であり、そして遺伝子の開始部位の上流に位置し、これに対してRNAポリメラーゼは、結合し得そして正確な転写を開始する。転写調節の開始/終了調節を提供しそして/または下流のコード配列の発現を増強する増加するさらなる転写調節配列に関連し得る。組換え核酸分子例えば、組換えDNA分子は、2つ以上の非相同性DNA分子の連結を介してインビトロで形成された新規の核酸配列である例えば、少なくとも1つのブローニング部位にクローン化された外来のDNAの1つ以上のインサートを含む組換えプラスミド。形質転換は、異なった遺伝子型の別の細胞由来の精製された組換えDNAの外部適用によってゲノムまたは細胞の方向付けられた改変を意味し、被験体細胞のゲノム中へのその取り込みおよび組み込みを生じる。細菌においては、この組換えられたDNAは、代表的には細菌の染色体には組み込まれないが、その代わりに、プラスミドとして自律的に複製する。上流は、DNAまたはRNA中の任意の部位の5’側を意味する。ベクターは、宿主細胞中で自律的に複製可能でありそして外来DNAを受け入れ可能である核酸分子である。ベクターは、複製の自分自身の起源、外来DNAの挿入について使用され得る制限エンドヌクレアーゼについての1つ以上の独特の制限部位、そして通常抗生物質耐性をコードする遺伝子のような選択マーカー、およびしばしば挿入されたDNAの発現のための認識配列例えば、プロモーターを保有する。一般的なベクターとしては、プラスミドベクターおよびファージベクターが挙げられる。高い親和性T細胞レセプターTCRは、野生型TCRよりもより強力に標的リガンドへ結合する操作されたTCRを意味する。T細胞は、αβヘテロ二量体T細胞レセプターTCRを介したMHC産物に結合された外来ペプチドを認識する。TCRレパートリーは、抗体重鎖および軽鎖遺伝子において使用される同一の遺伝子再配列機構によって作製された広範な多様性を有する[Tonegawa,S.1988Biosci.Rep.8:3-26]。多様性の大部分は、αおよびβ鎖の相補性決定領域3CDR3をコードする可変Vおよび連結Jまたは、多様性、D領域の接合部において作成される[DavisおよびBjorkman1988Nature334:395-402]。しかし、TCRは、抗体が体細胞点変異を生じるようには、おそらく同時には、体細胞点変異を起さない。TCRはまた、抗体と同一の程度の親和性変異を起こさない。TCRは、天然に存在するように、105から106M-1まで変化する親和性を有するようであり、これに対して、抗体は代表的に、105から109M-1まで変化する親和性を有する[Davisら、1998Annu.Rev.Immunol.16:523-544;Eisenら、1996Adv.ProteinChem.49:1-56]。TCRにおける体細胞変異の非存在は、より低い親和性に関連し得るが、TCRがより高い親和性を有する選択的な利点が存在しないことがまた議論されている。実際、T細胞活性化の連続的に引き起こす[Valituttiら1995Nature375:148-151]および速度論的校正[Rabinowitzら1996Proc.Natl.Acad.USA93:1401-1405]モデルは共に、より長いオフレートoff-rateより高い親和性と関連したはシグナル伝達プロセスに有害であることを示唆する。より高い親和性TCRは、T細胞応答について必要なペプチド特異性を維持し得ないこともまたありうる。例えば、MHCの溝内に結合されたペプチドは、制限されたアクセス可能な表面を示し[Bjorkman,P.J.1997Cell89:167-170]、これは、代わりに、相互作用おいて生成され得るエネルギーの量を制限し得る。他方、MHCへリックスに対してエネルギーを向けることによって、TCRの親和性を上昇することは、おそらくネガティブな選択の間の胸腺欠失を生じる[Bevan,M.J.1997Immunity7:175-178]。我々は、T細胞レセプタータンパク質のより高い親和性に対する固有な構造特性または遺伝的制限は存在しないことを示す。より高い親和性TCR変異体は、酵母ディスプレイコンビナトリアル技術およびTCR変異体例えば、VαおよびVβCDR3変異体を使用することによって、インビボ選択圧力の非存在下で、生成される。標的リガンドに対する比較的強力な結合について選択された変異体特定のp/MHC複合体は、100倍以上高い親和性すなわち、p/MHCについて約10nMのKdを有し得、そして、これらの変異体は、高度のペプチド特異性を保持した。プロリンまたはグリシンが豊富な保存されたCDR3モチーフを有するTCRタンパク質についての強力な優先性がまた明らかである。高い親和性TCRの可溶性単量体形態は、抗原提示細胞上のp/MHC複合体を直接検出可能であった。これらの発見は、TCRの親和性成熟が、少なくともインビトロで可能であることを証明する。従って、操作されたTCRタンパク質は、特定のリガンドを標的化するために使用され得、これらとしては、MHC成分の非存在下において特定のp/MHC複合体およびペプチド、タンパク質または他のリガンドが挙げられる。ペプチド特異性を保持するより高い親和性のTCRを作製することが可能か否かを試験するために、本発明者らは、特徴付けられたTCRを、指向性インビトロ進化のプロセスに供した。ファージディスプレイ技術[Clacksonら1991Nature352:624-628]は、抗体とTCRV領域との間の広範囲な構造的類似性にもかかわらず、単鎖TCRscTCR、Vβ-リンカー-Vαの操作における成功はまだ証明されていない。しかし、本発明者らは、scTCRが、抗体操作において首尾良いことが証明された系[BoderおよびWittrup1997前出;Kiekeら1997前出]において、酵母の表面上に提示され得る[Kiekeら1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:5651-5656]ということを近年示した。CTLクローン2C由来のscTCRの温度安定化改変体T7と呼ばれる[Shustaら1999J.Mol.Biol.292:949-956]を、本研究において使用した。CTLクローン2Cは、酵素2-オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ由来の[Udakaら1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11272-11276]、p2Caと呼ばれる結合した八量体ペプチドを有する同種異系抗原Ldを認識する。九量体改変体QL9はまた、CTL2Cにより認識されるが、2CTCRによる10倍高い親和性を有する[Sykulevら1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11487-11491]。構造的研究は、2CTCRのCDR3αがペプチドに近く、そしてpMHC複合体に付随するためにコンホメーション変化を受けることが示されたが[Garcia1998Science279:1166-1172]、アラニンスキャニング変異誘発は、CDR3αループが、結合相互作用に対して最少エネルギーの寄与をすることを示す[Manning1998前出]。従って、本発明者らは、変異誘発の試みを、CDR3αの先端を形成する5つの残基に集中させた。105の独立したTCR-CDR3α酵母変異体のライブラリーを、蛍光で標識化されたQL9/Ldリガンドを用いるフローサイトメトリーによる選択にかけた[DalPortoら1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6671-6675]。4回の選別および増殖の後、15個の異なる酵母コロニーを、リガンドに結合する能力について、scTCR改変体T7これは、wtCRD3α配列を保有するに比較して試験した図1。抗Vβ8.2抗体F23.2これは、タンパク質のCDR1領域およびCDR2領域における残基を認識するを、コントロールとして使用して、wtscTCR-T7変異体およびscTCR変異体図1におけるqL2およびqL7ならびにその他が、各々scTCRのほぼ等しい表面レベルを有することが示された図1。対照的に、可溶性QL9/Ldリガンドは、各変異体酵母クローンに非常によく結合するが、wtscTCR-T7には結合しなかった。MCMV配列番号1/Ld複合体これは、CTLクローン2Cにより認識されないは、scTCR変異体にも、wtscTCR-T7にも結合せず、このことは、scTCR変異体がペプチド特異性を保持していることを示した。変異体TCRの相対的親和性はまた、一定の濃度でQL9/Ldリガンドで観察されるシグナルにおける差異に基づいて、クローンによって変化するようであった。15の変異体のCDR3α配列は、全て、出発した2CTCR配列表1と異なっていた。BLASTアラインメントアルゴリズムによる比較は、2つのモチーフへと配列を整列させた。あるモチーフは、残基ストレッチの中間にグリシンを含んでいたが、別のモチーフは、3つの直列プロリンを含んでいた。3つのプロリン全てが、最も高い親和性部位を生成させる際に重要であるという証拠が、変異体q3rを用いた結果により示唆される。変異体q3rは、3つのプロリンのうち2つのみを含んでおり、そして三重プロリン変異体と比較して減少した結合を示した。グリシン含有変異体は、カルボキシ側に対する2つの残基のうち正に荷電した残基を選択し7/9、そしてアミノ側に対する2つの残基のうち芳香族のかつ/または正に荷電した残基を選択する4/9および5/9ようであった。理論に拘束されることは望まないが、モチーフにおける102位のグリシン残基についての選択は、CDR3αループが増加した親和性を達成するためにこの残基の周りでのコンホメーションの柔軟性を必要とすることを示していると考えられる。このことは、リガンドが配位したTCRのCDR3αループとリガンドが配位していないTCRのCDR3αループとの間で観察された、大きな6Åのコンホメーション差異と一致する[Garciaら1998前出]。グリシンが抗体のVDJ接合部における最も一般的な残基であり、そしてグリシンの存在は、近年、4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルアセチルハプテンに応じて増加した親和性と関連付けられたことに留意することもまた興味深い[Furukawaら1999Immunity11:329-338]。グリシンを含有する単離物と対照的に、CDR3αループの先端におけるプロリンリッチ配列についての選択は、どんな理論にも束縛されることを望まないが、これらのTCR分子がより高い親和性を付与するより堅固なコンホメーションを示すということを示すと考えられる。その親和性成熟誘導体に比較して低い親和性の生殖細胞系抗体のX線結晶解析構造は、高い親和性の状態が、ハプテンを付随する配置における抗体の安定化に起因し得たことを示した[Wedemayerら1997Science276:1665-1669]。同様に、生殖細胞系抗体に類似し得るscTCRのNMR溶液構造は、CDR3αおよびβループが、両方とも有意な運動性を示したことを示した[Hareら1999Nat.Struct.Biol.6:574-581]。TCR:pMHC相互作用の最近の熱力学的研究はまた、結合におけるコンホメーション変化の重要性を示唆した[Willcoxら1999Immunity10:357-365;Bonifaceら1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:11446-11451]。本明細書中で考察されるTCR変異体の構造研究および熱力学的研究により、本発明者らは、2つのCDR3αモチーフGly対Proリッチがより高い親和性を付与する機構において異なるか否かを調べることが可能になった。scTCR変異体は、無効なnull無関連なペプチド/Ld複合体MCMV配列番号1/Ldに結合しなかったが、親和性の増加が、微細なfine特異性における変化と関連付けられたことは可能なままであった。この問題を調べるために、本発明者らは、以前にそのwt2CTCRについての結合親和性における有意な差異を示すことが支援された、QL9の5位Pheペプチド改変体を使用した[Schlueter1996J.Immunol.157:4478-4485]。酵母表面上の種々のTCR変異体およびクローン2Cに対するこれらのpMHCの結合を、フローサイトメトリーにより測定した。図2に示されるように、2C上のネイティブTCRは、チロシンまたはヒスチジンのいずれかを5位に含むがグルタミン酸は含まないQL9改変体に結合し得る。より高い親和性のTCR変異体の各々は、保存的チロシン置換ペプチドを認識する能力を保持し、そしてこれらは、グルタミン酸置換ペプチドを認識できないようであった。しかし、TCR変異体のうちのいくつかqL2、qL5、およびqL7は、ヒスチジン置換ペプチドに異なる程度であるが結合したが、その他の変異体qL1、qL3、およびqL8は、このペプチドに結合しなかったこのアッセイの検出限界内。従って、CDR3αループは、ペプチドの微細な特異性の認識に影響し得るが、TCRが含まれる唯一の領域ではない。CDR3に指向された選択に関する初期の研究[Sant’Angeloら1996Immunity4:367-376;Jorgensenら1992Nature355:224-230]から示唆されたように、ペプチド特異性に対する効果は、改変体ペプチドとのCDR3α残基の直接の相互作用に起因し得る。あるいは、結合エネルギーは、Ld分子自体におけるペプチドに誘導される変化に向けられ得る。後者の可能性は、2CTCR:QL9/Ld相互作用の場合におけるよりもおそらく起こりやすい。なぜならば、QL9の5位は、Ld溝に向いていると推測されたからである[Schlueterら1996前出,Speirら1998Immunity8:553-562]。微細特異性分析はまた、同族のペプチドについて増加したか、または少なくとも変更された特異性を有するTCRを操作することが可能であることを示す。従って、単一のTCRの短い領域CDR3αのみの指向された進化は、所望のペプチド結合特異性および/または増加した結合親和性を有する多くのTCR改変体の単離を可能にする。選択されたCDR3α変異体に関連する親和性の増加の大きさを決定するために、野生型T7scTCRおよびqL2scTCRは、酵母分泌系において可溶性形態として発現された。精製されたscTCR調製物を、T2-Ld細胞の表面上でLd上に負荷されたQL9またはMCMV配列番号1に対する、125I標識化抗LdFabフラグメントの結合を遮断する能力について比較した[Manning1998前出、Sykulevら1994Immunity1:15-22]。予測されたように、T7もqL2scTCRも、MCMV配列番号1ペプチドでアップレギュレートされたT2-Ld細胞に対する125I-Fabフラグメントの結合を阻害することができなかった。しかし、T7およびqL2の両方が、QL9/Ldに対する抗LdFabフラグメントの結合を阻害し得た図3。qL2scTCR改変体は、結合の阻害において標識化されていないFabフラグメントと同程度の効力であったが、T7scTCRは、160倍も小さい効力4回の独立した適定の中で、平均して140倍の差であった。QL9/LdについてのscTCRのKD値を、その阻害曲線から、T7について1.5μMおよびqL2について9.0nMと算出した。T7についての値は、2CscTCRについて以前に報告された3.2μMのKDと密接に一致した[Manningら1999J:Exp.Med.189:461-470]。これらの発見は、CDR3α指向性変異誘発と組み合わされた酵母系が、特定のpMHCリガンドについての、少なくとも約100倍高い固有の結合親和性を有する変異体の選択を可能にするということを示す。可溶性scTCRがそのpMHCリガンドに関して高い親和性を有する場合、抗体のように、細胞表面結合抗原についての特異的プローブとして有用である。このことを確かめるために、この可溶性T7およびqL2scTCRを、ビオチン化し、そして標識化されたscTCR分子を、QL9、p2Ca、またはMCMV配列番号1を負荷されたT2-Ld細胞とインキュベートした。qL2scTCRT7scTCRではないは、QL9またはp2CaとインキュベートされたT2細胞の容易に検出可能な染色を生じた図4A~4B。p2Caアップレギュレートされた細胞がまた、qL2scTCRにより容易に検出されたことは重要である。なぜならば、p2Caは、同種反応性alloreactiveクローン2Cにより認識されたペプチドの天然で処理された形態であり、そしてこれは、2CTCRについてQL9/Ld複合体よりも低い親和性でさえ有するからである[Sykulevら1994前出]。本発明者らの研究において記載される高親和性レセプターは、VJ接合部における改変により誘導されたT細胞における遺伝子再配列によりインビボで非常に有効に作用する同じプロセスDavisおよびBjorkman1988Nature334:395-402。本発明者らがインビトロで高親和性TCRの広範なセットを容易に単離し得たという事実は、高親和性レセプターに対する遺伝的制限も構造的制限も存在しないということを示す。このことは、インビボで見出されるTCRの固有の低い親和性が、より高い親和性についての選択の欠如、およびおそらくより低い親和性の選択に起因するという見解を支持するSykulevら1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:11990-11992;Valituttiら1995Nature375:148-151;Rabinowitzら1996Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1401-1405。この点において、本発明のより高い親和性のTCRはここで、T細胞応答に対する親和性の効果についての仮定を直接的に試験するための試薬を提供するDavisら1998Ann.Rev.Immunol.16:523-544;Sykulevら1995前出;Valituttiら1995前出;Rabinowitzら1996前出。要約すると、本発明者らは、T細胞レセプター抗体と同程度広範なタンパク質のクラスを代表するが、抗体と同様に操作されて、高い親和性の、抗原特異的プローブを与え得ることを示した。さらに、高親和性レセプターの可溶性変形は、細胞上の特異的ペプチド/MHC複合体を直接検出し得る。従って、これらの操作されたタンパク質は、例えば、腫瘍細胞についての診断剤として有用である。高親和性TCRの可溶性誘導体は、高親和性の抗原特異的プローブとして有用であるか、またはさらに操作され得る。適切に標識化された場合またはこの可溶性TCRに検出可能なリガンドにより結合される場合の可溶性TCR誘導体は、細胞例えば、腫瘍細胞もしくはその他の新形成細胞の誘導された表面、またはウイルス感染細胞もしくはその他の疾患細胞の診断的抗原上の特異的ペプチド/MCHC複合体についてのプローブとして作用し得る。高親和性TCR細胞に結合したタンパク質または可溶性誘導体についての他の適用としては、特定の自己免疫疾患の診断または研究における使用が挙げられる。特徴的なペプチド/MHCまたはその他のマーカー表面抗原が公知であるかまたは同定され得る場合、高親和性の可溶性TCRは、その細胞表面部分への特異的結合のために単離され得、そして診断または治療において使用され得る。破壊されることが所望される細胞が、高親和性TCR望ましくは可溶性TCRタンパク質により認識される特徴的かつ特異的細胞表面部分を有する場合、高親和性TCRタンパク質望ましくは可溶性誘導体は、癌の処置または他の障害における治療剤として、細胞傷害性因子に結合して使用され得る。同様に、本明細書中に記載される可溶性高親和性TCRは、画像化剤にカップリングされ得、そして腫瘍細胞が存在する身体内の部位ここでTCRが、高親和性および特異性を有する腫瘍細胞マーカーに特異的に結合するを同定するために使用され得る。不適切に自己免疫破壊の標的にされてきた細胞または組織の表面に結合した高親和性TCRは、標的細胞または組織の細胞表面への結合について細胞傷害性リンパ球と競合することにより、これらの細胞傷害性リンパ球による自己免疫組織破壊を低減させ得る。これらの結果はまた、T細胞応答における重要で、基本的な疑問の状況において考慮され得る。T細胞レセプターについて以前に観察された低い親和性は、体細胞変異の非存在に起因するのか、またはT細胞に対して作用するインビボでの選択的圧力に起因するのか本発明者らの研究において記載される高親和性レセプターは、VJ接合部でのバリエーションに由来したT細胞において非常に有効に作用する同じプロセス[DavisおよびBjorkman1988前出]。本発明者らが、インビトロで高親和性TCRの広範なセットを容易に単離し得たという事実は、高親和性レセプターへの構造的制限または遺伝的制限が存在しないことを示す。このことは、インビボで見出される元々低い親和性のTCRが、より高い親和性の選択の欠如およびおそらくより低い親和性の選択の欠如に起因すると言う見解を支持する[Sykulevら1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:11990-11992;Rabinowitzら1996前出]。この点において、ここでより高い親和性のTCRは、T細胞応答に対する親和性の効果についての仮説を直接試験するための試薬を提供する[Davisら1998前出;Sykulevら1995前出;Valituttiら1995前出;Rabinowitzら1996前出]。遺伝子コードの縮重に起因して、多数の機能的に等価なヌクレオチド配列が、同じアミノ酸配列をコードするということが、当業者に理解される。さらに、当業者は、標準的な変異誘発技術により、本明細書中に記載される抗原決定活性アッセイを組み合わせて、変更されたTCR配列を得、そしてそれらを特定の結合活性を有するポリペプチドの発現について試験し得る。当該分野で公知の有用な変異誘発技術としては、限定せずに、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、領域特異的変異誘発、リンカースキャニング変異誘発、およびPCRによる部位指向性変異誘発が挙げられる[例えば、Sambrookら1989およびAusubelら1999を参照のこと]。改変体TCRコード配列を得る際に、当業者は、TCR由来のタンパク質が、生物学的活性の損失も減少もなしに、特定のアミノ酸置換、付加、欠失および翻訳後修飾により改変され得ることを認識する。特に、保存的アミノ酸置換、すなわち、1つのアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、極性およびコンホメーションの別のアミノ酸との置換が、タンパク質の機能を有意に変更しないようであることは周知である。タンパク質を構成する20種の標準的なアミノ酸は、以下のような保存的アミノ酸の4つのグループに広く分類され得る:非極性疎水性グループは、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンを含む;極性非荷電、中性グループは、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニンおよびチロシンを含む;正に荷電した塩基性グループは、アルギニン、ヒスチジンおよびリシンを含む;そして負に荷電した酸性グループは、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。タンパク質中の1つのアミノ酸を同じグループ内の別のアミノ酸と置換することは、そのタンパク質の生物学的活性に不利な影響を有さないようである。ヌクレオチド配列間の相同性は、DNAハイブリダイゼーション分析によって決定され得、ここでは、二本鎖DNAハイブリッドの安定性は、生じる塩基対形成の程度に依存する。高温および/または低塩含量の条件は、ハイブリッドの安定性を減少させ、そして選択された程度より少ない相同性を有する配列のアニール化を妨げるために変更させ得る。例えば、約55のG-C含量を有する配列に対して、40~50°C、6×SSC塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム緩衝液および0.1SDSドデシル硫酸ナトリウムというハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、約60~70の相同性を示し、50~65°C、1×SSCおよび0.1SDSのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、約82~97の相同性を示し、そして52°C、0.1×SSCおよび0.1SDSのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、約99~100の相同性を示す。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を比較するためそして相同性の程度を測定するための広範囲のコンピュータプログラムはまた、利用可能であり、そして市販されるソフトウエアとフリーソフトウエアの両方の供給源を提供する表は、Ausubelら1999において見出される。すぐに利用可能な配列比較および複数の配列整列アルゴリズムは、それぞれ、BasicLocalAlignmentSearchToolBLASTAltschulら、1997およびClustalWプログラムである。BLASTは、http://www.ncbi.nlm.nih.govでインターネット上で利用可能であり、そしてClustalWのバージョンは、http://www2.ebi.ac.ukで利用可能である。微生物の工業的株例えば、Aspergillusniger、Aspergillusficuum、Aspergillusawamori、Aspergillusoryzae、Trichodermareesei、Mucormiehei、Kluyveromyceslactis、Pichiapastoris、Saccharomycescerevisiae、Escherichiacoli、BacillussubtilisまたはBacilluslicheniformisあるいは植物種例えば、カノーラ、ダイズ、コーン、トマト、オオムギ、ライムギ、コムギは、TCRペプチドの組換え産生のための宿主細胞として使用され得る。高親和性TCRタンパク質または可溶なタンパク質の異種発現における第1工程として、発現構築物は、TCRまたは可溶なTCRのコード配列、ならびに制御配列例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターを含むように構築される。シグナル配列および選択マーカーのような他の配列はまた、含まれ得る。scTCRの細胞外発現を達成するために、発現構築物は、分泌性シグナル配列を含み得る。シグナル配列は、細胞質発現が所望される場合、発現構築物上に含まれない。プロモーターおよびシグナル配列は、宿主細胞において機能的であり、そしてTCRまたは可溶なTCRタンパク質の発現および分泌を提供する。転写ターミネーターは、効果的な転写を保証するために含まれる。発現またはタンパク質精製を増強する補助的配列はまた、発現構築物に含まれ得る。種々のプロモーター転写開始調節領域は、本発明に従って使用され得る。適切なプロモーターの選択は、提案される発現宿主に依存する。異種供給源からのプロモーターは、それらが選択された宿主において機能的である限り、使用され得る。プロモーター選択はまた、所望の有効性およびペプチドまたはタンパク質の産生のレベルに依存する。誘導プロモーター例えば、tacは、しばしば、E.coliにおけるタンパク質発現のレベルを劇的に増加させるために利用される。タンパク質の過剰発現は、宿主細胞に有害であり得る。その結果、宿主細胞の増殖は制限される。誘導プロモーター系の使用によって、宿主細胞は、遺伝子発現の誘導前に、受容可能な密度まで培養されることが可能となり、それによって、より高い産生物収量を容易にする。種々のシグナル配列が、本発明に従って使用され得る。TCRコード配列と同種のシグナル配列が、使用され得る。あるいは、効果的な分泌および発現宿主におけるプロセシングのために選択されるかまたは設計されたシグナル配列はまた、使用され得る。例えば、適切なシグナル配列/宿主細胞の組としては、B.subtilisにおける分泌のためのB.subtilissacBシグナル配列、およびSaccharomycescerevisiaeα接合因子またはP.pastoris分泌のためのP.pastoris酸性ホスファターゼphoIシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、タンパク質コード配列に対するシグナルペプチダーゼ切断部位をコードする配列によって、または通常10より少ないコドンからなる短いヌクレオチドブリッジbridgeここで、このブリッジは、下流のTCR配列の正しい読み取り枠を保証するによって、直接連結され得る。転写および翻訳を増強するためのエレメントは、真核生物のタンパク質発現系について同定されている。例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMVプロモーター1000bpを異種プロモーターのいずれかの端に配置することは、植物細胞において転写レベルを10~400倍増強させ得る。発現構築物はまた、適切な翻訳開始配列を含む。適切な翻訳開始のためのKozakコンセンサス配列を含むための発現構築物の改変は、翻訳のレベルを10倍増大させ得る。選択マーカーがしばしば利用されこれは、発現構築物の一部分であっても、または発現構築物と離れて例えば、発現ベクターによって運ばれるいてもよい、その結果、マーカーは、目的の遺伝子と異なる部位で統合され得る。例としては、抗生物質に耐性を与える例えば、blaは、E.coli宿主細胞に対してアンピシリン耐性を与え、nptIIは、広範囲の原核生物細胞および真核生物細胞に対してカナマイシン耐性を与えるマーカー、または宿主を最少培地で増殖させるマーカー例えば、HIS4は、P.pastorisまたはHis-S.cerevisiaeがヒスチジンの非存在下で増殖することを可能にするが挙げられる。選択可能なマーカーは、それ自身の転写および翻訳の開始ならびに停止の調節領域を有し、マーカーの独立した発現を可能にする。抗生物質耐性がマーカーとして利用される場合、選択のための抗生物質濃度は、その抗生物質に依存して変化し、通常、抗生物質10~600μg/培地1mLの範囲である。発現構築物は、公知の組換えDNA技術Sambrookら、1989;Ausubelら、1999を利用することによって構築される。制限酵素消化および連結は、DNAの2つのフラグメントを連結させるために利用される基本的工程である。DNAフラグメントの末端は、連結前に改変を必要とし得、そしてこれは、突出を埋めること、ヌクレアーゼ例えば、ExoIIIでフラグメント単数または複数の末端部分を欠失すること、部位を指向された突然変異誘発によって、またはPCRによって新しい塩基対を添加することによって達成され得る。ポリリンカーおよびアダプターは、選択されたフラグメントの連結を容易にするために利用され得る。発現構築物は、代表的に、E.coliの制限、連結および形質転換の数ラウンドroundを利用する段階で構築される。発現構築のために適切な多くのクローニングベクターは、当該分野において公知であるλZAPおよびpBLUESCRIPTSK-1、Stratagene、LaJolla、CA;pET、NovagenInc.Madison、WI-Ausubelら、1999において引用される、そして特定の選択が、本発明には重要ではない。クローニングベクターの選択は、宿主細胞への発現構築物の導入のために選択される遺伝子転移系によって影響される。各段階の終わりに、得られた構築物は、制限、DNA配列、ハイブリダイゼーションおよびPCR分析によって分析され得る。発現構築物は、クローニングベクター構築物線状か環状かのいずれかとして宿主に形質転換され得るか、あるいはクローニングベクターから除去され得、そして送達ベクターとして使用され得るか、または送達ベクター内に導入され得る。送達ベクターは、選択された宿主細胞型において、発現構築物の導入および保持を容易にする。発現構築物は、多くの公知の遺伝子導入系例えば、天然の能力competence、化学的に媒介される形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、微粒子銃形質転換、トランスフェクション、または結合Ausubelら、1999;Sambrookら、1989のいずれかによって宿主細胞に導入される。選択される遺伝子転移系は、使用される宿主細胞およびベクター系に依存する。例えば、発現構築物は、プロトプラスト形質転換またはエレクトロポレーションによってS.cerevisiae細胞に導入され得る。S.cerevisiaeのエレクトロポレーションは、容易に達成され、そしてスフェロプラスト形質転換に匹敵する形質転換効率をもたらす。リガンド結合部位以外の部位でTCRタンパク質によって特異的に反応するモノクローナルまたはポリクローナル好ましくは、モノクローナル抗体は、当該分野において公知である方法によって作製され得る。例えば、HarlowおよびLane1988Antibodies:ALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratories;Goding1986MonocolonalAntibodies:PrinciplesandPractice第2版、AcademicPress、NewYork;およびAusubelら1999MolecularBiology、JohnWileySons,Inc.、NewYorkのCurrentProtocolsを参照のこと。特定のpMHCに特異的な細胞結合形態または可溶形態の高親和性のTCRタンパク質は、例えば、生物学的サンプル例えば、細胞、組織サンプル、生検材料、体液などのスクリーニングのため、または試験サンプルにおける同族pMHCの存在を検出するための診断プローブとして有用である。しばしば、高親和性のTCRタンパク質は、検出可能なシグナルを提供する基質を連結させる共有結合か非共有結合かのいずれかことによって標識化される。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補助因子、インヒビター、蛍光試薬、化学発光試薬、磁気粒子などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、TCRタンパク質は、第2の結合分子に対するリガンドに結合し得:例えば、TCRタンパク質は、ビオチン標識化され得る。従って、標的細胞または分子に結合したTCRの検出は、検出可能なストレプトアビジン蛍光分子、放射活性分子、化学発光分子、または他の検出可能な分子が付着されるか、または、発色団基質が利用可能である酵素が付着される、ストレプトアビジンの結合によって達成され得る。scTCRタンパク質に共有結合するべきこのような標識物および/または有毒な化合物の使用を記載する米国特許のとしては、以下の号が挙げられるが、これらに限定されない:標識化されたTCRタンパク質は、使用される標識に適切なモニタリングデバイスまたは方法を用いて検出され得る。蛍光顕微鏡または蛍光活性化セルソーティングは、標識が蛍光部分である場合に使用され得、そして標識が、放射性核種である場合、γカウンティング、オートラジオグラフィまたは液体シンチレーションカウンティングが、例えば、その方法が分析されているサンプルおよび使用される放射性核種に適切であるという条件で使用され得る。さらに、本明細書中に述べられるMHC成分の非存在下で同族pHMCリガンドまたは他のリガンドに対する結合部位の一部でないTCRタンパク質の部分を認識する検出可能な分子または粒子がある場合、第2の検出分子または粒子が利用され得る。当業者は、インサイチュでの診断画像処理に有用な化合物を知っている;例えば、米国特許第5,101,827号、同第5,059,413号を参照のこと。インビボの治療および/または画像処理に有用な放射性核種はとしては、111インジウム、97ルビジウム、125ヨウ素、131ヨウ素、123ヨウ素、67ガリウム、99テクネチウムが挙げられる。毒素としては、一旦、TCR-毒素複合体が細胞に結合される場合、毒性部分が内部移行し、その結果、その細胞傷害性効果を及ぼし得るという条件では、とりわけ、ジフテリア毒素、リシンおよびトウゴマ毒素が挙げられる。免疫毒性テクノロジーは、当該分野において周知であり、そして適切な毒性分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない;化学療法薬剤例えば、ビンデシン、葉酸代謝拮抗財例えば、メトトレキセート、シスプラチン、マイトマイシン、アンスロサイクリンanthrocyclines例えば、ダウノマイシン、ダウノルビシンまたはアドリアマイシンおよびリボソーム不活性化タンパク質のような細胞傷害性タンパク質例えば、ジフテリア毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アブリン、リシン、シュードモナス属体外毒素Aまたはこれらの組換え誘導体。一般的に、例えば、OlsnesおよびPihl1982Pharmac.Ther.25:355-381およびMonoclonalAntibodiesforCancerDetectionandTherapy、BaldwinおよびByers編、159頁-179頁、AcademicPress、1985を参照のこと。特定のpMHCリガンドに特異的な高親和性TCRタンパク質は、特定のpMHCに関連する疾患に罹患すると考えられる動物ヒトを含むを診断において有用である。本発明のscTCR分子は、本質的に、任意の抗原を基本的に検出するのに有用であり、新生物状態、異常なタンパク質、あるいは細菌、真菌、ウイルス、原虫、酵母、線虫または他の寄生生物による感染またはインフェステーションに関連するものが挙げられるが、これらに限定されない。高親和性のscTCRタンパク質はまた、生産された異常なタンパク質が存在する特定の遺伝子疾患の診断の際に使用され得る。これらの高親和性タンパク質の例示的な適用は、自己免疫疾患の処置においてであり、その中には、既知のpMHCがある。I型糖尿病は、免疫破壊を誘発する自己抗原に関して比較的よく特徴付けられる。多発性硬化症、セリアック病、炎症性腸疾患、クローン病および慢性関節リウマチは、このような適用に対するさらなる候補疾患である。自己免疫破壊を不適切に標的化する、細胞または組織の表面上のp/MHC複合体に対する結合特異性を有する高親和性のTCR可溶性タンパク質は、細胞傷害性リンパ球による標的細胞への結合について競合することによって、自己免疫破壊のアンタゴニストとして役立ち得る。対照的に、高親和性TCRタンパク質望ましくは、可溶性の一本鎖TCRタンパク質これは、破壊が有益である細胞表面上の抗原またはp/MHCに特異的に結合するは、有毒な化合物例えば、毒素または放射性核種に結合し得、その結果、標的細胞への結合は、細胞傷害性リンパ球による引き続いての結合および破壊を引き起こす。破壊のために標識化された細胞は、新生物細胞例えば、腫瘍細胞、ウイルス、細菌、または原虫で感染された細胞、あるいは他の疾患原因因子もしくは寄生生物であり得、すなわち、それは、細菌、酵母、真菌、原虫または所望されない細胞であり得る。このような高親和性のscTCRタンパク質は、本明細書中に記載される方法によって得ることができ、そして続いて、目的の特定のリガンドについてスクリーニングするために使用され得る。高親和性のTCR組成物は、当該分野において公知の任意の方法によって処方され得る。これらは、代表的に、特に経静脈投与、経腹膜投与、または滑液投与特定の疾患によって決定される経路でのための注射剤として、または、経鼻または経口投与のための処方物液体溶液か懸濁液かのいずれかとして調製され得る。注射または他の投与前の液体中の、溶液または懸濁液に適切な固体の形態はまた、調製され得る。この調製物はまた、例えば、乳化され得るか、またはリポソーム中にカプセル化されたタンパク質単数および複数/ペプチド単数および複数であり得る。活性な成分はしばしば、賦形剤またはキャリアと混合され、これらは、薬学的に受容可能であり、そして活性な成分と共存可能である。適切な賦形剤としては、水、生理的食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。注射可能な、エアロゾルまたは経鼻処方物の形態の高親和性のTCRタンパク質の濃度は、通常、0.05~5mg/mlの範囲にある。特定の有効な用量の選択は、公知であり、そして当業者によって過度の実験なしに行われる。同じ用量が、他の粘膜表面に投与され得る。さらに、所望される場合、ワクチンは、少量の補助的物質例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、および/またはワクチンの効果を増強するアジュバントを含み得る。有効であり得るアジュバントの例としては、以下が挙げられるが、これらの限定されない:水酸化アルミニウム;N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミンthr-MDP;N-アセチル-nor-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミンCGP11637、nor-MDPと呼ばれる;N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3ヒドロキシホスホリル-エチルアミンCGP19835A、MTP-PEと呼ばれるおよびRIBIこれは、細菌から抽出された3つの成分を含む:2のスクアレン/Tween80乳濁液中のモノホスホリルリピドA、トレハロースジマイコレートdimycolateおよび細胞壁骨格MPLTDMCWS。当該分野において公知であるこのようなさらなる処方物および投与の形態はまた、使用され得る。本発明の高親和性TCRタンパク質、および/または高親和性TCRタンパク質に対して類似90より大きい同一性の一次構造を有するpMHC結合フラグメント同族のリガンドについて高親和性を維持するは、中性形態または塩形態としてワクチン中に処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩ペプチドの遊離アミノ酸基で形成されたが挙げられるがこれらに限定されない。この塩は無機酸例えば、塩酸またはリン酸および有機酸例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、またはマレイン酸で形成される。遊離のカルボキシル基で形成された塩はまた、無機塩基例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄、および有機塩基例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノ-エタノール、ヒスチジン、およびプロカインに由来し得る。治療用途のための高親和性TCRタンパク質例えば、細胞毒性化合物に結合体化されたタンパク質を、当該分野で公知の方法に従って、投与処方物に適切な様式で、そして予防的におよび/または治療的に効果的であるような量および様式で、投与する。投与されるべき量は、一般に1用量あたり約100~20,000μgタンパク質の範囲、より一般的には、1用量あたり約1000~10,000μgの範囲である。同様の組成物が、画像化における用途のために標識化した高親和性TCRタンパク質を用いて類似の様式で投与され、例えば、自己免疫攻撃下でかつ同属のpMHCを含む組織を検出するか、またはその表面に同属のpMHCを保有する癌細胞を検出し得る。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、医師または獣医師の判定に依存し得、そして各個体について特有であり得るが、このような決定は、このような医師の当該分野の範囲内である。ワクチンまたは他の免疫原性組成物は、単回用量;2用量スケジュール例えば、2~8週間間隔;または複数用量スケジュールで与えられ得る。複数用量スケジュールは、ワクチン接種の一次コースが1~10以上の別の用量、続いて、免疫応答を維持するおよび/または強化するために必要な場合、引き続く時間間隔で投与される他の用量例えば、第二用量は1~4カ月、そして必要な場合、数ヶ月後に引き続く用量を含み得るスケジュールである。本発明のレトロウイルス様粒子で免疫したヒトまたは他の動物は、同属のレトロウイルスによる感染から防御される。クローニング、DNA単離、増幅および精製のため、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応のための標準的技術、ならびに種々の別の技術は、公知の技術であり、そして当業者によって通常使用される。多数の標準的技術が、以下に記載されている:Sambrookら1989MolecularCloning:第二版、ColdSpringHarborLaboratory,Plainview,NewYork;Maniatisら1982MolecularCloning、ColdSpringHarborLaboratory,Plainview,NewYork;Wu編1993Meth.Enzymol.218,PartI;Wu編1979MethEnzymol.68:Wuら編1983MethEnzymol.100および101;GrossmanおよびMoldave編Meth.Enzymol.65;Miller編1972ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork;OldandPrimrose1981PrinciplesofGeneManipulation,UniversityofCaliforniaPress,Berkeley;SchleifおよびWensink1982PracticalMethodsinMolecularBiology;Glover編1985DNACloning第IおよびII号、IRLPress,Oxford,UK;HamesandHiggins編1985NucleicAcidHybridization,IRLPress,Oxford,UK;ならびにSetlowおよびHollaender1979GeneticEngineering:PrinciplesandMethods、1~4号、PlenumPress,NewYork。ここで使用した略号および命名法は、この分野で標準的とみなされ、そしてここで引用される文献のような専門の文献中に通常用いられている。本出願に引用される全ての参考文献は、本開示と矛盾しない程度まで、本明細書に提供される開示および実験手順を補充するために、本明細書において参考として援用される。以下の実施例は、例示的な目的のために提供されるものであり、そして本明細書に記載される本発明の特許請求の範囲を限定する意図ではない。当業者に対して生じる、例示された記事および/または方法における任意のバリエーションは、本発明の範囲内におさまることが意図される。実施例高い親和性のTCRを作成するための一般的方法は、1998年1月20日出願、米国特許出願番号09/009,388号、および1999年1月20日出願WO99/36569これらは、本明細書の開示と矛盾しない程度まで、参考として援用されるに与えられる。実施例1.ライブラリーの構築指向性進化のための足場として用いた2CscTCRT7は、TCRの安定性を増大させるがpMHC結合を可能にすることが示されている、6つの変異体βG17E、βG42EβL81S,αL43P、αW82R、およびαI118Nを含んだ[例えば、Shusta,E.V.ら1999J.Mol.Biol.292,949~956]。AGA2-特異的上流プライマーGGCAGCCCCATAAACACACAGTAT配列番号3および変性下流プライマーCTTTTGTGCCGGATCCAAATGTCAGSNN5GCTCACAGCACAGAAGTACACGGCCGAGTCGCTC配列番号4を用いて、T7scTCRVαCDR3の変異性PCRを、実施した。下線を付した塩基配列番号4の最初から11番目のG、終わりから13番目のGは、特有のBamHIおよびEagI制限部位を誘導するサイレント変異の位置を示す。精製したPCR産物を、NdeIおよびBamHIを用いて消化し、そしてNdeI-BamHIで消化したT7/pCT302に連結した[BoderおよびWittrup1997前出;Kiekeら1999前出;Shustaら1999前出]。連結混合物をDH10Bエレクトロ-コンピテントなE.coliGibcoBRI,Gaithersburg,MD中に形質転換し、そして形質転換体を、アンピシリン100μg/ml補充した250mLのLB中にプールし、そして37°Cで一晩増殖した。プラスミドDNAを、GietzおよびSchiestl[Geitzら1995Yeast11:355~360]の方法によって、酵母Saccharomycescerevisiae株EBY100中に形質転換した。実施例2.細胞ソーティング酵母ライブラリー[Shustaら1999Curr.Opin.Biotechnol.10:117~122]を、SD-CAA2デキストロース、0.67酵母窒素ベース、1カザミノ酸Difco、Livonia,MI中で、30°Cで、OD600=4.0まで増殖した。表面scTCR発現を誘導するため、酵母を遠心分離によってペレット化し、SG-CAA2ガラクトース、0.67酵母窒素ベース、1カザミノ酸中で、OD600=1.0まで再懸濁し、そして20°Cで24時間インキュベートした。一般に、約107細胞/チューブを、50μlのQL9/Ld/IgGダイマー[DalPortoら1993前出]これは0.5mg/mlBSAPBS-BSAを補充したリン酸緩衝化生理食塩水pH7.4中で希釈してあるとともに、1時間氷上でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、そしてFITC結合体化ヤギ抗マウスIgGFab72KirkegaardPerry,Gaithersburg,MD含有PBS-BSAを用いて30分間標識した。次いで、ソーティングの直前に、PBS-BSA中で酵母を洗浄し、そして再懸濁した。コールター753ベンチを用いたFACSソーティングによって最高の蛍光を示す細胞を、単離した。単離後、ソーティングした細胞をSD-CAA中で増殖し、そして以降の回の選択のためにSG-CAA中で誘導した。引き続く4回の総ソーティングを実施した。染色に用いたQL9/Ld/IgGダイマーの濃度は、ソート1~3については50μg/mlであり、そして最終のソートについては0.5μg/mlであった。各ソートから単離した総細胞のパーセンテージは、それぞれ5.55、2.68、2.56および0.58であった。ソート3および4のアリコートをSD-CAA上にプレートし、個々のクローンを単離した。クローンは、コールターEpicsXL装置を用いたフローサイトメトリーにより分析した。実施例3.可溶性のscTCR産生T7およびqL2のオープンリーディングフレームを、pCT302NheI-XhoIから切り出し、そしてNheI-XhoIで消化したpRSGALT酵母発現プラスミドに連結した[Shustaら1999前出]。ライゲーション連結したプラスミドをDH10Bエレクトロ-コンピテントなE.coliGibcoBRL中に形質転換した。プラスミドDNAを細菌培養物から単離し、そしてSaccharomycescerevisiaeBJ5464αura3-52trp1leu21his3200pep4::HIS3prb11.6Rcan1GAL中に形質転換した[Shustaら1999前出]。酵母クローンを30°Cで48時間1リットルのSD-CAA/Trp20mg/mLトリプトファン中で増殖した。scTCR分泌を誘導するため、細胞を4000×gでの遠心分離によってペレット化し、1mg/mlBSAを補充した1リットルのSG-CAA/Trp中に再懸濁し、そして20°Cで72時間インキュベートした。培養上清を4000×gでの遠心分離によって回収し、約50mlに濃縮し、そしてPBS、pH8.0に対して透析した。6His-タグ化scTCRを、ネイティブなニッケルアフィニティークロマトグラフィーNi-NTASuperflow,Qiagen,Valencia,CA;5mMおよび20mMイミダゾール、pH8.0洗浄;250mMイミダゾール溶出によって精製した[Shustaら1999前出]。実施例4.細胞結合アッセイQL9/Ldに対する可溶性scTCRの結合を、以前に記載した競合様式でモニターした[Manningら1998前出;Sykulevら1994前出]。ペプチド-上方制御アップレギュレートT2-Ld細胞3×105/ウェルを、125I標識化抗LdFabs30-5-7および種々の濃度のscTCRの存在下で、氷上で1時間インキュベートした。結合および未結合の125I30-5-7Fabをオリーブオイル/ジブチルフタラートによる遠心分離によって分離した。阻害曲線を作成し、最大阻害の50を生じるインヒビター濃度を決定した。解離定数をChengおよびPursoffの式を用いて算出した[Cheng1973Biochem.Pharm.22:3099~3108]。細胞結合pMHCに対するscTCRの直接結合をモニターするため、ペプチド-アップレギュレートT2-Ld細胞5×105/チューブを、ビオチン化可溶性scTCRとともに、氷上で40分間インキュベートし、続いてストレプトアビジン-フィコエリトリンPharMingen,SanDiego,CAを用いて30分間染色した。フローサイトメトリーによって細胞蛍光を検出した。実施例5.異なるペプチドおよび異なるMHC分子Kbについて特異的である高親和性TCRの同定TCRのCDR3α領域の酵母ディスプレイ変異体の同じライブラリーを用いて、異なるMHC分子に対して結合した異なるペプチドになお特異的である、より親和性の高いTCRについて選択することが可能であった。この場合、SIYRと呼ばれるペプチドSIYRYYGL配列番号5を、Kbと呼ばれるMHC分子に結合し、そしてこのリガンド複合体を、蛍光形態中で用いて、フローサイトメトリーにより選択した。高い親和性のTCRを発現する16のクローンを、配列決定した。各々のクローンは、CDR3α領域において異なる配列を示した表2。これらのTCRの特異性の例として、変異3SQ2を、二次試薬単独SA:PE、抗-Vβ抗体F23.2および3つのペプチド/Kb複合体OVA/Kb,dEV8/Kb、およびSIYR/Kbを含む、種々の因子で染色した。図5に示すように、元来の選択に用いたpMHCSIYR/Kbのみが、変異TCRに対して結合するのに十分な親和性を有した。野生型TCRは、試験したいずれの濃度でもSIYR/Kbリガンドに結合しなかったデータ示さず。変異TCR3SQ2はまた、酵母分泌系における可溶性タンパク質として発現され、そして、それが腫瘍細胞の表面上のpMHCに直接結合する能力についてビオチン化後に試験された。図6に示すように、標識化した3SQ2は、適切なペプチドSIYRのみを発現した腫瘍細胞に非常によく結合した。染色は、ペプチドの存在にかかわらず、任意のKb分子に結合する図6高親和性抗Kbモノクローナル抗体B8.24.3とほぼ同じ強度であった。実施例6.同じMHC分子Kbに結合した異なるペプチドについて特異的である高親和性TCRの同定同じTCR足場が、同じMHCに対して結合した異なるペプチドに対しても、より高い親和性の形態を単離するために用いられ得るか否かを決定するため、本発明者らは、Kbに結合した、dEV8EQYKFYSV配列番号6と呼ばれるペプチドを用いてTCRCDR3αライブラリーをスクリーニングした。ビオチン化dEV8/Kbリガンドその後、フィコエリトリン-ストレプトビアジン,PE-SAを用いたフローサイトメトリーによるいくつかのソート後、dEV8/Kbに結合した酵母細胞の有意な富化が存在した図7においてPEレベルによって示されるように。dEV8/Kbでの選択によって単離されたクローンのうち6つを配列決定したところ、CDR3配列は全て異なっていた表3。これらの配列は類似であったが、SIYR/Kbを用いた選択によって単離されたクローンの配列とは異なっていた2つの例である、3SQ2および3SQ5をまた、表3に示す。同じTCRライブラリーの変異体を用いてさえ、異なる抗原に対して、より高い親和性のTCRを単離することが可能であると結論できる。単離されたクローンの抗原特異性を証明するため、dEV8/Kb選択クローンのうちの1つ4d1を、異なる抗体およびリガンドのパネルを用いて試験した図6。予期された通り、このTCRは、3つの適切な抗体抗-Vβ8抗体F23.2,抗HAタグ抗体、および抗Hisタグ抗体、およびdEV8/Kb抗原とは反応するが、他の抗原、OVA/Kbとは反応しない。野生型TCRは、ペプチドKb複合体のいずれとも結合しないデータ示さず。このように、高い親和性のTCRは、選択された抗原に特異的であった。実施例7.TCRの異なる領域β鎖の相補性決定領域3においてランダムなTCRライブラリーを作成することによる、高親和性TCRの同定上記の本実施例は、CDR3と呼ばれるα鎖の領域内で変異したTCRのライブラリーを用いた。TCRの他の領域がまた、より高い親和性のTCRを生成するように変異され得ることを示すため、β鎖のCDR3領域の5連続アミノ酸残基内のランダム変異のライブラリーを、出発物質としてqL2TCR変異体を用いて、生成した。次いで、このライブラリーを、qL2変異体で検出した濃度以下のQL9/Ldリガンドで選択した。5つの酵母クローンフローサイトメトリーによって選択したを配列決定したところ、各々は、異なるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示した図8。変異された5つのアミノ酸領域内には配列の顕著な保存が存在しており、このことは、この配列モチーフが高い親和性について最適であったことを示唆していた。本発明者らは、特定のpMHCに対して、より高い親和性を有する誘導体を生じるためにTCRの異なる領域を変異することが可能であると結論付ける。上記の詳細な説明は、多くの特殊性を含み、これらは、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではなく、単に、本発明の現在の好適な実施形態のいくつかの例示を提供するだけである。例えば、特別に例示されたリガンド以外のリガンドが用いられてもよい。従って、本発明の範囲は、示された実施例によってではなく、添付の特許請求の範囲およびその法的な等価物によって決定されるべきである。本明細書に引用される全ての参考文献は、本明細書における開示と矛盾しない程度まで援用される。配列表配列表SEQUENCELISTINGBOARDOFTRUSTEESOFTHEUNIVERSITYOFILLINOISHIGHAFFINITYTCRPROTEINSANDMETHODSF111502CDUUS601691791999120653PatentInversion3014PRTARTIFICIALSEQUENCE1MetCysMetVal124PRTARTIFICIALSEQUENCE2SerIleTyrArg1324PRTARTIFICALSEQUENCE3GlyGlyCysAlaGlyCysCysCysCysAlaThrAlaAlaAlaCysAla151015CysAlaCysAlaGlyThrAlaThr20474PRTARTIFICIALSEQUENCE4CysThrThrThrThrGlyThrGlyCysCysGlyGlyAlaThrCysCys151015AlaAlaAlaThrGlyThrCysAlaGlySerAsnAsnSerAsnAsnSer202530AsnAsnSerAsnAsnSerAsnAsnGlyCysThrCysAlaCysAlaGly354045CysAlaCysAlaGlyAlaAlaGlyThrAlaCysAlaCysGlyGlyCys505560CysGlyAlaGlyThrCysGlyCysThrCys657058PRTARTIFICIALSEQUENCE5SerIleTyrArgTyrTyrGlyLeu1568PRTARTIFICIALSEQUENCE6GluGlnTyrLysPheTyrSerVal1577PRTARTIFICIALSEQUENCE7SerGlyPheAlaSerAlaLeu1587PRTARTIFICIALSEQUENCE8SerSerTyrGlyAsnTyrLeu1597PRTARTIFICALSEQUENCE9SerArgArgGlyHisAlaLeu15107PRTARTIFICIALSEQUENCE10SerSerArgGlyThrAlaLeu15117PRTARTIFICIALSEQUENCE11SerHisPheGlyThrArgLeu15127PRTARTIFICIALSEQUENCE12SerMetPheGlyThrArgLeu15137PRTARTIFICIALSEQUENCE13SerHisGlnGlyArgTyrLeu15147PRTARTIFICIALSEQUENCE14SerTyrLeuGlyLeuArgLeu15157PRTARTIFICALSEQUENCE15SerLysHisGlyIleHisLeu15167PRTARTIFICIALSEQUENCE16SerLeuThrGlyArgTyrLeu15177PRTARTIFICIALSEQUENCE17SerLeuProProProLeuLeu15187PRTARTIFICIALSEQUENCE18SerIleProThrProSerLeu15197PRTARTIFICIALSEQUENCE19SerAsnProProProLeuLeu15207PRTARTIFICIALSEQUENCE20SerAspProProProLeuLeu15217PRTARTIFICIALSEQUENCE21SerSerProProProArgLeu15227PRTARTIFICIALSEQUENCE22SerAlaProProProIleLeu15237PRTARTIFICIALSEQUENCE23SerGlyThrHisProPheLeu15247PRTARTIFICIALSEQUENCE24SerGlyHisLeuProPheLeu15257PRTARTIFICIALSEQUENCE25SerAspSerLysProPheLeu15267PRTARTIFICIALSEQUENCE26SerSerAspArgProTyrLeu15277PRTARTIFICIALSEQUENCE27SerLeuGluArgProTyrLeu15287PRTARTIFICIALSEQUENCE28SerArgGluAlaProTyrLeu15297PRTARTIFICIALSEQUENCE29SerLeuHisArgProAlaLeu15307PRTARTIFICIALSEQUENCE30SerLeuHisArgProAlaLeu15317PRTARTIFICIALSEQUENCE31SerSerAsnArgProAlaLeu15327PRTARTIFICIALSEQUENCE32SerThrAspArgProSerLeu15337PRTARTIFICIALSEQUENCE33SerGlySerArgProThrLeu15347PRTARTIFICIALSEQUENCE34SerLeuValThrProAlaLeu15357PRTARTIFICIALSEQUENCE35SerAlaThrSerProAlaLeu15367PRTARTIFICIALSEQUENCE36SerSerIleAsnProAlaLeu15377PRTARTIFICIALSEQUENCE37SerAlaSerTyrProSerLeu15387PRTARTIFICIALSEQUENCE38SerArgTrpThrSerGlyLeu15397PRTARTIFICIALSEQUENCE39SerGlySerArgProAlaLeu15407PRTARTIFICIALSEQUENCE40SerLeuThrHisHisPheLeu15417PRTARTIFICIALSEQUENCE41SerMetThrHisHisPheLeu15427PRTARTIFICIALSEQUENCE42SerLeuSerArgProTyrLeu15437PRTARTIFICIALSEQUENCE43SerLeuThrArgProTyrLeu15447PRTARTIFICIALSEQUENCE44SerThrTyrArgHisTyrLeu15457PRTARTIFICIALSEQUENCE45SerGlyLeuAlaArgProLeu15467PRTARTIFICIALSEQUENCE46SerLeuHisArgProAlaLeu15477PRTARTIFICIALSEQUENCE47SerGlyThrHisProPheLeu15487PRTARTIFICIALSEQUENCE48GlyGlyGlyGlyThrLeuTyr15497PRTARTIFICIALSEQUENCE49GlyGlyGlyGlyValLeuTyr15507PRTARTIFICIALSEQUENCE50GlyLeuGlyGlyIleLeuTyr15517PRTARTIFICIALSEQUENCE51GlyGlnGlyGlyValLeuTyr15527PRTARTIFICIALSEQUENCE52GlySerGlyGlyIleIleTyr15537PRTARTIFICIALSEQUENCE53GlyGlyGlyGlyIleLeuTyr15"