"必要とする患者の損傷腎組織を修復および/または再生する方法であって、単離された成体腎臓幹細胞を前記患者に投与することを含み、成体腎臓幹細胞が、前記腎臓組織標本から単離され、系列陰性でc-kit陽性であり、前記腎臓幹細胞が、成体腎臓の1種以上の細胞型を生成し、それにより前記損傷組織を修復および/または再生する、前記方法。前記単離された成体腎臓幹細胞が、損傷組織に投与される前に培養により増殖される、請求項1に記載の方法。損傷組織が、急性腎傷害から生じる、請求項1に記載の方法。損傷組織が、虚血事象から生じる、請求項1に記載の方法。損傷組織が、慢性腎疾患から生じる、請求項1に記載の方法。単離された成体腎臓幹細胞が、損傷組織に投与される前に1種以上のサイトカインに暴露される、請求項1に記載の方法。腎臓組織標本が、患者から得られる、請求項1に記載の方法。単離された成体腎臓幹細胞が、腎臓静脈または腎臓動脈を通して患者に投与される、請求項1に記載の方法。単離された成体腎臓幹細胞が、腎臓組織への直接の注射により患者に投与される、請求項1に記載の方法。治療有効量の単離された成体腎臓幹細胞および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物であって、前記単離された成体腎臓幹細胞が、c-kit陽性で系列陰性であり成体腎臓組織から単離される、前記医薬組成物。単離された成体腎臓幹細胞が、腎臓細胞系列の1種以上を生成することが可能である、請求項10に記載の医薬組成物。単離された成体腎臓幹細胞を約2×104~約2×107個を含む、請求項10に記載の医薬組成物。常在性成体幹細胞を成体臓器から単離する方法であって、前記臓器からの組織標本を培養し、それにより組織外移植片を形成すること;培養された外移植片からc-kit陽性である細胞を選択すること;および前記c-kit陽性細胞を単離すること、を含み、前記単離されたc-kit陽性細胞が、常在性成体幹細胞である、前記方法。前記単離されたc-kit陽性細胞が、系列陰性である、請求項13に記載の方法。前記単離されたc-kit陽性細胞が、前記成体臓器の細胞系列の1種以上を生成することが可能である、請求項13に記載の方法。前記単離されたc-kit陽性細胞を培養により増殖させることを更に含む、請求項13に記載の方法。前記成体臓器が、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄である、請求項13に記載の方法。前記単離されたc-kit陽性細胞が、クローン原性で多能性かつ自己再生性である、請求項13に記載の方法。必要とする患者の臓器の損傷組織を修復および/または再生する方法であって、c-kit陽性幹細胞を前記臓器の組織標本から単離すること、および前記単離されたc-kit陽性幹細胞を損傷組織に投与すること、を含み、前記c-kit陽性幹細胞が分化された細胞を生成して、それが投与後に新しい臓器組織を集成assembleし、それにより損傷臓器を修復および/または再生する、前記方法。前記単離されたc-kit陽性幹細胞が、損傷組織に投与される前に培養により増殖される、請求項19に記載の方法。c-kit陽性幹細胞が、系列陰性である、請求項19に記載の方法。c-kit陽性幹細胞が、前記成体臓器の細胞系列の1種以上を生成することが可能である、請求項19に記載の方法。臓器が、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄である、請求項19に記載の方法。臓器が、脳である、請求項23に記載の方法。臓器が、肺である、請求項23に記載の方法。前記単離されたc-kit陽性幹細胞が、損傷組織に投与される前に1種以上のサイトカインに暴露される、請求項19に記載の方法。c-kit陽性幹細胞が、自家性である、請求項19に記載の方法。治療有効量の単離された成体臓器幹細胞および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物であって、前記単離された成体臓器幹細胞が、c-kit陽性で系列陰性であり成体臓器の組織から単離される、前記医薬組成物。前記臓器が、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄である、請求項28に記載の医薬組成物。前記臓器が、脳である、請求項29に記載の医薬組成物。前記臓器が、肺である、請求項29に記載の医薬組成物。前記単離された成体臓器幹細胞が、前記成体臓器の細胞系列の1種以上を生成することが可能である、請求項28に記載の医薬組成物。発明の概要本発明は、一部として、c-kitマーカが、ホ乳類の成体臓器に常在する、強力な再生能を有する成体幹細胞の集団を同定するために用いられ得る、という発見に基づいている。例えば本発明人は、驚くべきことに、成体心筋内に常在するc-kit陽性心筋幹細胞の集団を見出した。これらのc-kit陽性心臓幹細胞を、心筋梗塞後の梗塞周囲の心筋に移植すると、それらが損傷領域に遊走して、筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞に分化し、その後、増殖して心筋、冠動脈、細動脈、および毛細血管をはじめとする構造を形成し、梗塞の構造的および機能的完全性を回復させる。本発明人は、成体腎臓内に常在するc-kit陽性腎幹細胞の集団も発見した。したがって本発明は、再生能を有する成体臓器から、常在成体幹細胞を単離する方法を提供する。一実施形態において、その方法は、臓器の組織標本を培養し、それにより組織の外植片を形成すること;培養外植片からc-kit陽性である細胞を選択すること;および前記c-kit陽性細胞を単離すること、を含み、前記選択されたc-kit陽性細胞は、常在性成体幹細胞である。単離されたc-kit陽性臓器幹細胞は、クローン原性で多能性かつ自己再生性である。幾つかの実施形態において、c-kit陽性臓器幹細胞は、単離される成体臓器の細胞系列の1種以上または全てを生成することが可能である。特定の実施形態において、単離されたc-kit陽性細胞は、系列陰性lineagenegativeである。本発明は、必要とする患者の臓器の損傷組織を修復および/または再生する方法も提供する。一実施形態において、その方法は、c-kit陽性幹細胞を臓器の組織標本から単離すること、および単離されたc-kit陽性幹細胞を損傷組織に投与すること、を含み、c-kit陽性幹細胞は、分化された細胞を生成してそれが投与後に新しい臓器組織を集成assembleし、それにより損傷臓器を修復および/または再生する。幾つかの実施形態において、単離されたc-kit陽性幹細胞は、損傷組織に投与される前に培養で増殖される。特定の実施形態において、c-kit陽性幹細胞は、系列陰性である。別の実施形態において、本発明の方法により修復および/または再生される損傷組織は、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄からなる群より選択される臓器のものである。一実施形態において、本発明は、成体心筋から単離されたc-kit陽性心臓幹細胞を投与することにより、必要とする患者の損傷心筋を修復および/または再生する方法を提供する。幾つかの実施形態において、損傷心筋は、虚血事象、心筋梗塞、または心臓血管疾患、例えばアテローム性硬化症、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心臓血管欠損および動脈炎症、ならびに動脈、細動脈および毛細血管の他の疾患から生じる。特定の実施形態において、c-kit陽性心臓幹細胞は、自家性である。別の実施形態において、本発明は、成体腎臓から単離されたc-kit陽性腎臓幹細胞を投与することにより、必要とする患者の損傷腎臓組織を修復および/または再生する方法を提供する。幾つかの実施形態において、損傷腎臓組織は、急性腎傷害例えば、虚血性、毒性、または免疫関連から生じる。別の実施形態において、損傷腎臓組織は、IgA腎症、間質性腎炎、ループス腎炎、アルポート症候群、腎不全、糸球体疾患、アミロイドーシスおよび腎疾患、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、髄質性海綿腎、多嚢胞性異形成腎、ネフローゼ症候群、多嚢胞性腎疾患、融合腎、尿細管アシドーシス、腎血管性の病気、単純性腎嚢胞、単腎、尿細管または嚢胞性腎障害から生じる。特定の実施形態において、c-kit陽性腎臓幹細胞は、自家性である。本発明は、単離された成体臓器幹細胞および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物も含み、前記単離された成体臓器幹細胞は、c-kit陽性で系列陰性であり成体臓器の組織から単離される。単離された成体臓器幹細胞は、単離された成体臓器の細胞系列の1種以上を生成させることができる。一実施形態において、c-kit陽性臓器幹細胞は、心臓から単離される。別の実施形態において、c-kit陽性臓器幹細胞は、腎臓から単離される。本発明は、損傷臓器組織を修復および/または再生する際に使用される本発明の医薬組成物を含むキットも提供する。本発明は、c-kit陽性臓器幹細胞および臓器組織をインビトロで、場合によりサイトカインの存在下で培養する、臓器組織をエクスビボで生成および/または再生する手段も提供する。c-kit陽性臓器幹細胞は、単離された臓器の細胞系列の1種以上または全てに分化して、インビトロで増殖し、臓器組織および/または細胞を形成する。これらの組織および細胞が、臓器構造を集成してもよい。インビトロで形成された組織および/または細胞は、その後、例えばグラフトを介して、患者に移植されて、損傷臓器組織に構造的および機能的完全性を回復させることができる。本開示において、含む、含んでいる、含有する、および有するなどは、米国特許法に基づく意味を有することができ、包含する、包含しているなどを意味することができ;同様に本質的に~からなっているまたは本質的に~からなるは、米国特許法に基づく意味を有し、その用語は、制約はなく、引用されたものの基本的または新規な特徴が、引用されたもの以外の存在により変更せず、先行技術の実施形態を除外しない限り、引用されたもの以外の存在が可能である。本発明の方法は、医薬活性の侵害的例外が、生命工学の特許に違反するプロセスの実践に適用されないことを前提として、35U.S.C.§287c2Aiiiの下で生命工学的方法とみなされる。これらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明に開示されるか、またはそれから明白となりそれに包含される。以下の詳細な説明は、実施例により本発明を説明するために示されており、本発明を記載された具体的な実施形態に限定する意図はなく、参照により本明細書に組み入れられた添付の図面と一緒に理解することができる。詳細な説明本発明は、一部として、c-kit抗体が臓器組織を再生する能力を有する常在性成体臓器幹細胞のマーカである、という発見に基づいている。例えば本発明人は、成体心臓内に常在するc-kit陽性心臓幹細胞を同定したが、これらの幹細胞は、虚血性損傷後に機能的心筋の広範にわたる再生を誘導する。加えて本発明人は、成体腎臓に常在するc-kit陽性腎臓幹細胞も同定した。つまり一実施形態において、本発明は、臓器組織からそのような常在性成体臓器幹細胞を単離する方法を提供する。本明細書において用いられる臓器幹細胞は、成体臓器組織内に常在し、クローン原性で自己再生性であり、単離される臓器を含む細胞系列の1つ以上または全てを生じる例えば、多能性の幹細胞を指す。本発明の方法および組成物において用いられる臓器幹細胞は、自家または同種異系であってもよい。本明細書において用いられる自家は、同じ個体から得られた、または移されたものを指す即ち、自家輸血;自家骨髄移植片。本明細書で用いられる同種異系は、同じ種に属するまたはそれから得られるが、遺伝子が異なるものを指す例えば、同種異系組織グラフトまたは臓器移植片。本明細書において用いられる成体幹細胞は、胚を起源としない、または胚もしくは胎仔組織から得られない幹細胞を指す。同様に成体臓器は、出生後の動物の臓器を指す。一実施形態において、成体臓器から常在性成体幹細胞を単離する方法は、前記臓器の組織標本を培養し、それにより組織外移植片を形成すること、c-kit陽性である培養された外移植片から細胞を選択すること、および前記c-kit陽性細胞を単離すること、を含み、前記単離されたc-kit陽性細胞は、常在性成体幹細胞である。任意の成体臓器から得られた組織標本を、該方法において用いることができる。例えば成体臓器は、非限定的に、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄であってもよい。幾つかの実施形態において、臓器は、心臓である。他の実施形態において、臓器は、腎臓である。組織培養外移植片は、所望の臓器から得られた組織標本を適切な培地中で培養することにより作製される。組織外移植片を作製する方法は、当業者に公知である。例えばそのような一方法は、組織標本を細断すること、および細断された切片を適切な培地に配置すること、を含む例えば、実施例13参照。最初の培養後およそ1~2週間以内に、組織標本から増殖された臓器幹細胞を、得ることができる。最初の培養後およそ4週間目に、増殖された臓器幹細胞が、遠心分離により回収され、c-kit発現について選択されてもよい。用語c-kitは、幹細胞因子SCFの受容体として働く細胞表面抗原を指す。c-kitを発現する臓器幹細胞の集団を単離する陽性選択法は、当業者に周知である。可能な方法の例としては、非限定的に、様々な型の細胞選別、例えば蛍光標識細胞選別FACSおよび磁気細胞選別、ならびにアフィニティークロマトグラフィーの改良形態が挙げられる。c-kit発現について選択された臓器幹細胞が、好ましくは単離される。本明細書で用いられる単離されるは、臓器幹細胞が他の細胞、組織、および細胞片から分離されることを意味する。幾つかの実施形態において、単離された臓器幹細胞は、80、85、90、95、96、97、98、または99よりも大きな純度である即ち、他の細胞成分を80、85、90、95、96、97、98、または99含まない。幾つかの実施形態において、単離されたc-kit陽性臓器幹細胞は、インビトロで培養されて更に増殖される。単離されたc-kit陽性臓器幹細胞が、幾つかの実施形態において、例えば細胞培養プレートの1つのウェルに、個々に播種されて、個々の臓器幹細胞からクローンを得てもよい。最初の臓器組織外移植片を培養するため、または単離されたc-kit陽性幹細胞を更に増殖させるために用いられ得る培地の非限定的例は、DMEM/F12、患者血清、インスリン、トランスフェリン、および亜セレン酸ナトリウムを含むことができる。特定の実施形態において、培地は、ヒト組換えbFGF、ヒト組換えEGF、ウリジンおよびイノシンの1種以上を更に含むことができる。一実施形態において、培地の成分は、以下の概算範囲内で存在し得る:成分最終濃度患者血清5~20重量ヒト組換えbFGF10~100ng/mlヒト組換えEGF10~100ng/mlインスリン2~20μg/mlトランスフェリン2~20μg/ml亜セレン酸ナトリウム2~10ng/mlウリジン0.24~2.44mg/mlイノシン0.27~2.68mg/ml別の実施形態において、培地の成分の置換を、当業者に公知の通り行ってもよい。例えばインスリンは、インスリン様増殖因子Iと置換することができる。ウリジンおよびイノシンは、アデノシン、グアノシン、キサンチン、チミジン、およびシチジンをはじめとする他のヌクレオオチドの混合物と置換することができる。培地成分を、培養される特定の臓器組織外移植片に適合させるように、細胞培地への他の調整を行うことができる。更なる実施形態において、1種以上の増殖因子が、本明細書において提供される培地に存在することができるため、一実施形態において、培地は、1種以上の増殖因子、DMEM/F12、患者血清、インスリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸ナトリウム、そして場合により1種以上のヒト組換えbFGF、ヒト組換えEGF、ウリジンおよびイノシンを含む。培地の成分が、本明細書に記載の量で存在し得ることが企図され、当業者は、それに接触した任意の幹細胞の活性化を得るための1種以上の増殖因子の十分な量を決定することができよう。本発明の一実施形態において、上記培地は、臓器の損傷または梗塞領域において新しい臓器組織を再生または作製するために投与される臓器幹細胞の培養および増殖の間に使用することができる。特定の実施形態において、c-kit陽性臓器幹細胞は、系列陰性である。用語系列陰性は、細胞が特異的細胞系列に特徴的な抗体を発現しないことを意味することとして、当業者に公知である。例えば、c-kit陽性系列陰性臓器幹細胞は、分化決定された抗原感作細胞系列の検出可能なレベルのマーカ、例えば心臓マーカ、肝臓マーカ、造血系マーカ、内皮細胞マーカ、平滑筋細胞マーカ、神経マーカ、骨格筋マーカ、骨形成マーカ、腎臓マーカ、軟骨細胞マーカ、脂肪細胞マーカなどを発現しない。系列陰性臓器幹細胞は、非限定的に、c-kit陽性臓器幹細胞集団を細胞系列マーカに対する抗体と接触させることにより系列陽性lineagepositive細胞を除去し、続いて磁気ビーズおよびバイオマグネットにコンジュゲートさせた抗イムノグロブリン抗体を用いることにより抗体結合細胞を単離すること、をはじめとする様々な手段により単離することができる。あるいは、抗体結合された系列陽性幹細胞を、抗イムノグロブリン抗体にコンジュゲートさせたビーズを含有するカラムに保持させてもよい。免疫磁気ビーズに結合していない細胞は、系列陰性幹細胞分画を表しており、単離されてもよい。例えば、特異的細胞系列のマーカ例えば、心臓、造血系、血管、神経、肝臓、骨格筋、骨形成、腎臓、軟骨細胞、および脂肪細胞マーカを発現する細胞が、c-kit陽性臓器幹細胞集団から除去されて、系列陰性c-kit陽性臓器幹細胞を単離してもよい。血管系列のマーカとしては、非限定的に、GATA6SMC転写因子、Ets1EC転写因子、Tie-2アンジオポエチン受容体、VE-カドヘリン細胞接着分子、CD62E/E-セレクチン細胞接着分子、α-平滑筋アクチンα-SMA、収縮性蛋白質、TGFβ1受容体、Erg1、ビメンチン、CD31PECAM-1、フォンヴィレブランド因子vWF;第VIII因子の担体、Flk1VEGFR-2受容体、バンデイラエラシンプリシフォリアおよびハリエニシダのレクチンEC表面糖蛋白質結合分子が挙げられる。筋細胞系列のマーカとしては、非限定的に、GATA4心臓転写因子、Nkx2.5およびMEF2C筋細胞転写因子、ならびにα-筋節アクチンα-SA、収縮蛋白質が挙げられる。神経系列のマーカとしては、非限定的に、神経フィラメント200、GFAP、およびMAP1bが挙げられる。造血細胞系列のマーカとしては、非限定的に、GATA1、GATA2、CD133、CD34、CD45、CD45RO、CD8、CD20、およびグリコホリンAが挙げられる。他の細胞系列マーカは、当業者に公知であり、c-kit陽性臓器幹細胞集団から系列陽性細胞を除去するのに用いることができる。幾つかの実施形態において、c-kit陽性系列陰性成体臓器幹細胞を、他のマーカの発現について選択することができる。例えばc-kit陽性系列陰性心臓幹細胞の亜集団は、VEGF-R2受容体Flk1、c-MET受容体、およびIGF-1R受容体を発現した例えば、実施例8参照。他の臓器から単離された成体c-kit陽性系列陰性幹細胞は、VEGF-R2Flk1、c-MET、およびIGF-1Rをはじめとするこれらの追加的マーカの1種以上の発現に関して選択することができる。幾つかの実施形態において、単離されたc-kit陽性臓器幹細胞は、単離される成体臓器の細胞系列の1種以上を生成することが可能である。例えば、成体心臓から単離されたc-kit陽性幹細胞は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞をはじめとする心像系列の細胞型全てに分化することが可能である。理論に拘束されることを望むものではないが、単離されたc-kit陽性臓器幹細胞は、典型的には単離される臓器の細胞系列のみを生成させることが可能である。例として、心臓から単離された成体c-kit陽性臓器幹細胞は、心臓系列以外の細胞系列を生成することができない。しかし幾つかのc-kit陽性臓器幹細胞は、他の細胞系列を生成する、わずかな限定的能力を有し得る。例えば、骨髄から単離されたc-kit陽性幹細胞は、幾つかの例において、心臓系列の細胞を生成させることができる実施例1および2参照。つまり、腎臓から単離されたc-kit陽性臓器幹細胞は、成体腎臓の細胞型、例えば糸球体細胞糸球体壁側細胞、蛸足細胞、近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレのループの細い部分の細胞、尿細管細胞例えば、後腎の尿細管細胞、集合尿細管細胞、および腎間質細胞の1種以上に分化することが可能である。網膜から単離されたc-kit陽性臓器幹細胞は、成体網膜の細胞型、例えばかん体細胞、錐体細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、ミュラー細胞、水平細胞、またはグリア細胞の1種以上に分化することが可能である。肺から単離されたc-kit陽性臓器幹細胞は、成体肺の細胞型例えば、気管支細胞、肺胞細胞、線毛上皮細胞、杯細胞、基底細胞、肺血管細胞の1種以上に分化することが可能である。腸から単離されるc-kit陽性臓器幹細胞は、成体腸の細胞型例えば、腸吸収細胞、腸分泌細胞、パネート細胞、杯細胞の1種以上に分化することが可能である。肝臓から単離されたc-kit陽性臓器幹細胞は、成体肝臓の細胞型肝細胞の1種以上に分化することが可能である。脾臓、膵臓、胃、脳、食道、膀胱、表皮、および骨髄から単離されたc-kit陽性臓器幹細胞は、それぞれ、成体脾臓、膵臓、胃、脳、食道、膀胱、表皮、および骨髄の細胞型の1種以上に分化することが可能である。本発明は、必要とする患者の臓器の損傷組織を修復および/または再生する方法も提供する。一実施形態において、該方法は、前記臓器の組織標本からc-kit陽性幹細胞を単離すること、および前記単離されたc-kit陽性幹細胞を損傷組織に投与すること、を含み、前記c-kit陽性幹細胞は、投与に続いて新しい臓器組織に集成する分化された細胞を発生し、それにより損傷臓器を修復および/または再生する。組織標本は、処置を必要とする患者のものであってもよく、つまり患者自身の幹細胞自家幹細胞を受けるか、または組織標本が適合するドナーのものであれば、患者は同種異系幹細胞を受けてもよい。別の実施形態において、該方法は、患者の臓器の組織標本から単離されて、場合により培養で増殖された、単離されたc-kit陽性幹細胞を受容すること、および前記単離されたc-kit陽性幹細胞を損傷組織に投与すること、を含み、前記c-kit陽性幹細胞は、投与後に分化された細胞を生成して新しい臓器組織を集成し、それにより損傷臓器を修復および/または再生する。本明細書において用いられる患者または対象は、非限定的にヒト、ホ乳類、ハ虫類、両生類および魚類をはじめとする任意の脊椎動物を包含してもよい。しかし、有利には患者または対象は、ヒトなどのホ乳類、または家畜などのホ乳動物、例えばイヌ、ネコ、馬など、または生産ホ乳類、例えばウシ、ヒツジ、ブタなどである。一実施形態において、患者は、ヒトの患者である。本明細書で用いられる損傷組織は、暴露された組織内の細胞を死滅させる虚血または毒性状態へ暴露された臓器の組織または細胞を指す。虚血状態は、例えば卒中、動脈瘤、心筋梗塞、または他の心臓血管疾患もしくは関連の病気を原因とする血流の欠如により、引き起こされる可能性がある。酸素の欠乏は、周囲領域の細胞の死滅を引き起こして梗塞を残し、それは最終的には瘢痕となる。虚血は、酸素供給不足に陥った任意の臓器において起こる可能性がある。一実施形態において、損傷組織は、虚血事象から生じる。虚血事象または虚血傷害は、臓器組織への血液供給を欠乏させる、または欠乏させ得る任意の例である。虚血事象または傷害としては、非限定的に、低血糖、頻脈、アテローム性硬化症、低血圧、血栓塞栓症、血管の外的圧迫、塞栓症、鎌状細胞症、炎症性プロセスが挙げられ、それらは多くの場合、炎症血管の管腔内血栓、出血、心不全および心停止、敗血性ショックおよび心原生ショックをはじめとするショック、高血圧、狭心症ならびに低体温を伴う。本明細書において用いられる集成するassembleは、臓器幹細胞から生成された分化細胞の、機能的臓器構造、即ち心筋および/または心筋細胞、動脈、細動脈、毛細血管、腎尿細管、肺胞上皮、腸上皮絨毛/陰窩構造などへの集成を指す。特定の実施形態において、c-kit陽性臓器幹細胞は、本明細書に記載された通り系列陰性である。c-kit陽性臓器幹細胞は、損傷組織への投与前に、先に記載された通り培養により増殖させることができる。c-kit陽性臓器幹細胞は、任意の臓器から単離することができ、その臓器の損傷組織を修復および/または再生することができる。例えばc-kit陽性臓器幹細胞は、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄からなる群より選択される任意の臓器の損傷組織を修復するのに用いることができる。一実施形態において、臓器は、心臓である。別の実施形態において、臓器は、腎臓である。幾つかの実施形態において、c-kit陽性臓器幹細胞は、成体心筋から単離されて、必要とする患者に投与され、損傷心筋を修復および/または再生する。特定の実施形態において、患者は、アテローム性硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心血管欠損、心筋梗塞および動脈炎症、ならびに動脈、細動脈および毛細血管の他の疾患からなる群より選択される心臓血管疾患または障害に罹患している。本発明の一実施形態において、成体心筋から単離されたc-kit陽性臓器幹細胞を投与することによる、冠動脈または血管の閉塞または遮断を含む血管障害または疾患の処置のための方法および組成物が提供される。本発明は、心臓バイパス手術の代替法として、またはそれと併用で、そのような治療的処置に用いられ得る方法および組成物を提供する。別の実施形態において、c-kit陽性臓器幹細胞は、成体腎臓組織から単離され、必要とする患者に投与され、損傷腎臓組織を修復および/または再生する。一実施形態において、損傷腎臓組織は、急性腎傷害例えば、虚血性、免疫、毒性または外傷性傷害によるものである。別の実施形態において、損傷腎組織は、慢性腎疾患によるものである。本発明の方法は、IgA腎症、間質性腎炎、ループス腎炎、アルポート症候群、腎不全、糸球体疾患、アミロイドーシスおよび腎疾患、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、髄質性海綿腎、多嚢胞性異形成腎、ネフローゼ症候群、多嚢胞性腎疾患、融合腎、腎尿細管アシドーシス、腎血管性の状態、単純性腎嚢胞、単腎、尿細管および嚢胞性腎障害からなる群より選択される腎疾患または障害により損傷腎臓組織を修復および/または再生するために用いることができる。本発明の別の実施形態において、c-kit陽性臓器幹細胞、好ましくは培養および増殖されたc-kit陽性臓器幹細胞は、損傷組織に移植または送達される前に、1種以上のサイトカインまたは増殖因子への暴露により活性化される。一実施形態において、臓器幹細胞は、1種以上の増殖因子またはサイトカインと接触される。適切な増殖因子またはサイトカインは、非限定的に:それぞれの全体的教示が参照により本明細書に組み入れられた、Ko2006Kanemura2005Kaplan2005Xu2005Quinn2005Almeida2005BarnabeHeider2005Madlambayan2005KamangaSollo2005Heese2005He2005Beattie2005Sekiya2005Weidt2004Encabo2004およびBuytaeriHoefen2004に記載された、アクチビンA、アンジオテンシンII、骨形成蛋白質2、骨形成蛋白質4、骨形成蛋白質6、カルジオトロフィン-1、線維芽細胞増殖因子1,線維芽細胞増殖因子4、Flt3リガンド、グリア由来神経栄養因子、ヘパリン、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子-I、インスリン様増殖因子-II、インスリン様増殖因子結合蛋白質-3、インスリン様増殖因子結合蛋白質-5、インターロイキン-3、インターロイキン-6、インターロイキン-8、白血病阻害因子、ミッドカイン、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子BB、プロゲステロン、プトレッシン、幹細胞因子、間質由来因子-1、トロンボポエチン、形質転換増殖因子-α、形質転換増殖因子-β1、形質転換増殖因子-β2、形質転換増殖因子-β3、血管内皮増殖因子、Wnt1,Wnt3a、およびWnt5aをはじめとする、本明細書に記載された任意のものであってもよい。当業者は、1種以上の適当な増殖因子を選択することができる。好ましい一実施形態において、臓器幹細胞は、肝細胞増殖因子HGFおよび/またはインスリン様増殖因子-1IGF-1と接触される。一実施形態において、HGFは、約0~400ng/mlの量で存在する。更なる実施形態において、HGFは、約25、約50、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約225、約250、約275、約300、約325、約350、約375、または約400ng/mlの量で存在する。別の実施形態において、IGF-1が、約0~500ng/mlの量で存在する。更に別の実施形態において、IGF-1は、約25、約50、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約225、約250、約275、約300、約325、約350、客375、約400、約425、約450、約475、または約500ng/mlの量で存在する。上述のサイトカインまたは増殖因子の機能的バリアントを、本発明において用いることもできる。機能的サイトカイン/増殖因子バリアントは、対応する受容体に結合してそれを活性化する能力を保持する。バリアントは、ネーティブ蛋白質のアミノ酸置換、挿入、欠失、選択的スプライシングバリアントまたはフラグメントを含むことができる。例えば、NK1およびNK2は、HGFの天然スプライシングバリアントであり、c-MET受容体に結合することができる。機能を保持するサイトカイン/増殖因子蛋白質のこれらの型の天然由来スプライシングバリアントおよび遺伝子操作バリアントは、本発明の臓器幹細胞を活性化するのに用いることができる。本発明の一実施形態において、活性化された臓器幹細胞、好ましくは成体心筋から単離された活性化c-kit陽性臓器幹細胞例えば、心臓幹細胞は、治療または修復を必要とする血管構造の領域に送達または移植される。例えば一実施形態において、活性化された幹細胞は、閉塞または遮断された心臓血管または動脈の部位に送達または移植される。本発明の一実施形態において、c-kit陽性であり、flk-1エピトープVEGF-R2を含む心臓幹細胞は、治療または修復を必要とする領域に送達または移植される。本発明の別の実施形態において、活性化された幹細胞は、幹細胞が送達または移植される部位で動脈または血管を形成する。更なる実施形態において、形成された動脈または血管は、100μmを超える直径を有する。更なる実施形態において、形成された動脈または血管は、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、または少なくとも275μmの直径を有する。本発明の更に別の実施形態において、形成された動脈または血管は、閉塞または遮断の周辺をはじめとする治療または修復を必要とする領域の周辺に生体バイパスを提供することで、血流、血圧および循環を回復または改善する。本発明の更に別の実施形態において、活性化された幹細胞の投与は、他の治療手段、例えば、非限定的に1種以上の増殖因子を含む他の治療薬の投与と一緒に実行することができる。本発明は更に、臓器の損傷組織に適用される臓器幹細胞の治療有効用量または治療有効量に関わる。有効用量は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。前記用量は、1回以上の投与で投与することができる。臓器幹細胞の有効用量は、約2×104~約2×107、約1×105~約6×106、または約2×106であってもよい。以下の実施例において、2×104~1×105個の幹細胞が、マウスモデルにおいて投与された。マウスの臓器とヒトの臓器とでは明らかなサイズの差があるが、この範囲の幹細胞は、ヒトでも十分となる可能性がある。しかし、有効用量とみなされる量の正確な決定は、サイズ、年齢、処置される臓器のタイプ、損傷組織の領域および重症度、ならびに損傷からの経過時間など、各患者に固有の因子に基づいていてもよい。当業者、特に医師は、過度の実験をせずとも、有効用量となる幹細胞の数を決定することができよう。本発明の別の態様において、幹細胞は、臓器に送達される。幾つかの実施形態において、臓器幹細胞は、特に臓器の梗塞領域の隣接領域に送達される。当業者に承知される通り、梗塞領域は、目視可能であるため、この特定の幹細胞配置が可能である。臓器幹細胞は、有利には注射、特に処置を必要とする臓器への直接の注射により投与される。例えば、成体心筋から単離されたc-kit陽性臓器幹細胞例えば、心臓幹細胞は、心筋内注射により投与することができる。当業者に承知される通り、心臓は機能筋であるため、これは心臓への好ましい幹細胞送達法である。幹細胞を心臓に注射することにより、心臓の収縮運動による幹細胞の喪失が確実になくなる。本発明の更なる態様において、心臓幹細胞が、注射により経心内膜または経心外膜投与される。この好ましい実施形態は、幹細胞を保護的周囲膜に透過させることができ、細胞を心筋内注射する実施形態に必要とされる。本発明の別の実施形態において、臓器幹細胞は、カテーテルシステムの使用により臓器の損傷組織に送達することができる。例えば、処置を必要とする臓器への幹細胞のカテーテル送達は、臓器を灌流する血管例えば、腎臓動脈/静脈、肺動脈/静脈、肝臓動脈/静脈、冠動脈/静脈などを通して実行することができる。カテーテルの使用により、体腔の切開を必要とするより侵襲的な送達方法が排除される。当業者に承知される通り、本明細書に概説される通り、カテーテルアプローチを含む侵襲性がより小さい手順により、最適回復時間が可能となる。臓器幹細胞が心臓に送達される実施形態において、NOGAカテーテルまたは類似のシステムを、用いることができる。NOGAカテーテルシステムは、該当する領域の電気機械的マッピングと、目的の注射液を送達する、または目的の領域に治療薬を浴びせるために用いられ得る伸縮可能ニードルとを備えることにより、誘導投与を容易にする。当業者には、本発明と共に使用され得る造影とカテーテル送達システムとの一体化により目的の処置を行う能力も提供する別のシステムが、認識されよう。NOGAおよび類似のシステムの使用に関する情報は、例えばそれぞれの教示が全体として本明細書に組み入れられた、Sherman2003Patel2005およびPerrin2003に見出すことができる。本発明の更なる実施形態は、損傷臓器組織に遊走して該臓器を含む細胞系列に分化する臓器幹細胞を必要とする。修復される臓器の1種以上の細胞系列への分化は、損傷組織に構造的および機能的完全性を少なくとも一部回復させるために重要である。損傷心筋を修復する場合、心臓幹細胞が、筋細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞に分化する。これらの型の細胞が構造的および機能的完全性の両方を回復させるために存在しなければならないことは、当該技術分野において公知である。梗塞または虚血組織を修復する別のアプローチ、例えば米国特許第6,110,459号および第6,099,832号は、これらの細胞を直接、または培養されたグラフトとして心臓に移植することを含んだ。本発明の別の実施形態は、分化細胞の増殖、および該細胞による臓器構造の形成を含む。例えば、心臓幹細胞により生成された分化筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞は、冠動脈、細動脈、毛細血管、および心筋をはじめとする心臓構造を集成する。当業者に承知される通り、これらの構造の全てが、適正な心臓機能に不可欠である。文献に示されるように、内皮細胞および平滑筋細胞などの細胞の移植が、移植細胞を梗塞領域内で生育させることができるが、必要な構造を形成して心臓の完全な機能性を回復させることはできない。損傷臓器組織に機能的および構造的完全性の両方を少なくとも一部回復させる能力が、本発明の更に別の態様である。本発明は、治療有効量の単離された成体臓器幹細胞と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物も含み、前記単離された成体臓器幹細胞は、c-kit陽性で系列陰性であり成体臓器の組織から単離される。本明細書に記載される通り、単離された成体臓器幹細胞は、単離される成体臓器の細胞系列の1種以上または全てを生成することが可能である。例えば、成体臓器幹細胞が単離され得る臓器としては、非限定的に、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄が挙げられる。一実施形態において、臓器は、心臓である。別の実施形態において、臓器は、腎臓である。本発明の医薬組成物は、治療薬として、即ち、治療用途に使用してもよい。本明細書において、用語処置および治療は、治癒効果、緩和効果、および予防効果を含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、有効量の臓器幹細胞を、幹細胞因子SCF、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、間質細胞由来因子-1、スチール因子、血管内皮増殖因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、肝細胞増殖因子HGF、インスリン様増殖因子IGF-1、もしくはインターロイキン-3、または幹細胞を刺激および/もしくは動員し得る任意のサイトカインからなる群より選択されるサイトカインと組み合わせて含む。サイトカインは、単独でも、または幹細胞の刺激および/または動員;早期および後期造血の維持以下参照;単球の活性化以下参照、マクロファージ/単球増殖;分化、運動性および生存以下参照;心臓または血管状態の処置が、可能な任意の他のサイトカインまたは医薬剤、ならびに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤これらの組み合わせを含むと併用しても、または一緒に投与してもよい本発明の医薬組成物中のサイトカインは、早期および後期造血の維持に関わることが公知のメディエータ、例えばIL-1α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-13;コロニー刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、幹細胞因子、fit-3リガンド、肝細胞増殖因子、腫瘍壊死因子α、白血病阻害因子、形質転換増殖因子β1およびβ3;マクロファージ炎症蛋白質1α、血管原性因子線維芽細胞増殖因子1および2、血管内皮増殖因子、および結合組織形成細胞を通常の標的および供給源とするメディエータ血小板由来増殖因子A、表皮増殖因子、形質転換増殖因子αおよびβ2、オンコスタチンM、ならびにインスリン様増殖因子-1、または神経細胞神経成長因子SensebeLetalStemCells199715133-43、血小板および巨核細胞中に存在するVEGFポリペプチドWartiovaaraUetalThrombHaemosi1998801715MohleRProcNatlAcadSciUSA1997946638HIF-1、低酸素への応答に関与する数種の遺伝子のプロモータに結合してそれを刺激する強力な転写因子、内皮PASドメイン蛋白質1EPAS1、単球走化性蛋白質-1MCP-1などの付随機能を増進するための単球由来サイトカインも含むことができる。一態様において、本発明の医薬組成物は、注射により送達される。これらの投与送達経路としては、非限定的に、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻腔内投与をはじめとする皮下または非経口投与に加え、髄腔内および輸注法が挙げられる。したがって、好ましくは医薬組成物は、注射に適した形態である。本発明の医薬組成物を非経口投与するに場合、それは一般に、単位用量の注射可能な形態溶液、懸濁液、エマルジョンで配合される。注射に適した医薬配合剤としては、滅菌水溶液または分散液、および注射可能な滅菌溶液または分散液に再構成される滅菌粉末が挙げられる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど、これらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合には必要な粒径を維持すること、および界面活性剤を使用することにより、適正な流動性を維持することができる。非水性ビヒクル、例えば綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、またはピーナッツ油、およびミリスチン酸イソプロピルなどのエステルを、組成物の溶媒系として使用してもよい。加えて、抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート化剤、および緩衝剤をはじめとする、組成物の安定性、滅菌性、および等張性を増進する種々な添加剤を、添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより確実にすることができる。多くの場合、等張剤、例えば砂糖、塩化ナトリウムなどを含めるのが、望ましい。注射可能な医薬形態の長期吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。しかし本発明によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤が、臓器幹細胞と適合性でなければならない。滅菌注射可能溶液は、本発明を実施する際に使用される化合物を、所望により様々な量の他の成分と共に必要量の適当な溶媒中に組み入れることにより、調製することができる例えば治療有効量の臓器幹細胞を含む、本発明の医薬組成物は、任意の適合性担体、例えば様々なビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤を含有する注射可能配合剤中で患者に投与することができ、または本発明において用いられる化合物は、徐放性皮下移植片または標的送達システム、例えばモノクローナル抗体、イオン泳動、ポリマーマトリクス、リポソーム、およびミクロスフェアの形態で患者に非経口投与することができる。本発明に用いられる医薬組成物は、患者に経口投与することができる。錠剤、懸濁液、溶液、エマルジョン、カプセル、粉末、シロップなどで化合物を投与するなど、従来の方法が、使用可能である。化合物を経口または静脈内送達して、生物活性を維持する公知の技術が、好ましい。一実施態様において、本発明の組成物は、最初に投与し、その後、更なる投与により維持することができる。例えば、本発明の組成物は、1つのタイプの組成物で投与し、その後、異なる、または同じタイプの組成物を更に投与することができる。例えば、本発明の組成物は、静脈注射により投与して、血中レベルを適切なレベルにすることができる。その後、患者のレベルが、経口投薬剤型により維持されるが、患者の状態に応じて他の投与形態を用いることができる。ヒトが、一般にマウスや他の実験動物よりも長期にわたり処置を受け、処置が、疾患の進行期間や薬剤有効性に比例した期間となることに留意されたい。投薬は、単回投薬または数日間にわたる複数回投薬とし得るが、単回投薬が好ましい。つまり過度の実験をせずとも、本開示、本明細書の引用文献、および技術分野の知識から得られる技法により、ラット、マウスなどの動物実験からヒトに拡大することができる。処置は、一般に疾患の進行期間、薬剤有効性、および処置される患者に比例した期間を有する。投与される医薬組成物の量は、処置される患者および処置される臓器のタイプにより変動する。好ましい実施態様において、臓器幹細胞2×104~1×105個およびサイトカイン1日あたり50~500μg/kgが、患者に投与される。マウスの臓器とヒトの臓器とでは明らかなサイズの差があるが、幹細胞2×104~1×105個は、ヒトでも十分となる可能性がある。しかし、有効用量とみなされる量の正確な決定は、サイズ、年齢、処置される臓器、損傷組織の領域および重症度、ならびに損傷からの経過時間など、各患者に固有の因子に基づいてもよい。それゆえ投与量は、本開示および技術分野の知識から当業者により容易に確定され得る。つまり当業者は、本発明の方法において投与される組成物中の化合物および任意の添加剤、ビヒクル、ならびに/または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、任意の添加剤が活性幹細胞および/またはサイトカインに加えて、リン酸緩衝生理食塩水中0.001~50重量溶液の量で存在し、有効成分は、マイクログラム~ミリグラムの桁で、例えば約0.0001~約5重量、好ましくは約0.0001~約1重量、最も好ましくは約0.0001~約0.05重量、または約0.001~約20重量、好ましくは約0.01~約10重量、最も好ましくは約0.05~約5重量で存在する。もちろん、動物またはヒトに投与される任意の組成物に関して、および更に任意の特定の投与方法に関して、適切な動物モデル、例えばマウスなどのげっ歯類において致死量LDおよびLD50を決定することにより毒性を、そして適切な応答を誘発する組成物の投与量、組成物成分の濃度、組成物を投与するタイミングを決定することが好ましい。そのような決定は、過度の実験を必要とせず、当業者の知識、本開示、本明細書の引用文献から得られる。そして逐次投与の時間は、過度の実験をせずとも確定される。本発明の治療薬を含む組成物の例としては、開口部、例えば口腔、鼻腔、肛門、膣、経口、胃内、粘膜例えば、経舌、歯槽、歯肉、嗅覚、または呼吸器粘膜などのための液体製剤、例えば懸濁液、シロップ、またはエリキシル剤などの投与、および非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与例えば、注射投与用の製剤、例えば滅菌懸濁液またはエマルジョンが挙げられる。そのような組成物は、適当な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコースなどと混和されていてもよい。組成物は、凍結乾燥することもできる。組成物は、投与経路および所望の製剤に応じて、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、ゲル化または増粘用添加剤、防腐剤、着香剤、着色剤などの補助物質を含有することができる。過度の実験をせずとも、参照により本明細書に組み入れられた、REMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCE17版1985年などの標準教書を調べて、適切な製剤を調製してもよい。本発明の組成物は、選択されたpHに緩衝され得る液体製剤、例えば等張性水溶液、懸濁液、エマルジョン、または粘性組成物として簡便に提供される。消化管吸収が好ましい場合には、本発明の組成物は、持続放出性であるか、または液体充填物を有する固体製剤、例えばゼラチンが胃内で溶解して消化管送達を果たすゼラチン被覆液をはじめとする、丸薬、錠剤、カプセル、カプレットなどの固体形態であってもよい。鼻腔または呼吸器粘膜投与が望まれる場合、組成物は、圧迫式噴霧ディスペンサ、ポンプ式ディスペンサ、またはエアロゾルディスペンサによる形態で、分散されてもよい。エアロゾルは、通常は炭化水素による圧力下にある。ポンプ式ディスペンサは、好ましくは一定用量、または特定の粒径を持つ用量を分配することができる。本発明の組成物は、特に経口投与される場合には、より興味を引くように、薬学的に許容し得る着香剤および/または着色剤を含むことができる。粘性組成物は、ゲル、ローション、軟膏、クリームなど例えば、経皮投与用の形態であってもよく、典型的には、粘度が2500~6500cpsになるのに十分な量の増粘剤を含有するが、最大10,000cpsのより粘稠な組成物を用いてもよい。粘性組成物は、好ましくは2500~5000cpsの粘度を有し、この範囲を超えると投与がより困難になる。しかし、その範囲を超えると、組成物は、固体またはゼラチン形態に近付き、そうすれば経口摂取用の経口嚥下丸薬として容易に投与することができる。液体製剤は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より調製が容易である。加えて液体組成物は、特に注射や経口により、投与が幾分か簡便である。他方で、粘性組成物は、適当な粘度範囲で配合されると、胃の内膜または鼻腔粘膜などの粘膜と長時間接触することができる。明白であろうが、適当な担体および他の添加剤の選択は、厳密な投与経路、特定の投与形態の性質、例えば液体投与形態例えば、組成物が溶液、懸濁液、ゲルまたはその他の液体形態に配合されるかまたは固体投与形態例えば、組成物が丸薬、錠剤、カプセル、カプレット、徐放性形態または液体充填形態に配合されるかに依存する。溶液、懸濁液、およびゲルは、通常、活性化合物に加えて大量の水好ましくは、精製水を含有する。微量の他の成分、例えばpH調整剤例えば、NaOHなどの塩基、乳化剤または分散剤、緩衝剤、防腐剤、湿潤剤、ゲル化剤例えば、メチルセルロース、着色剤、および/または着香剤が、存在してもよい。組成物は、等張性、即ち血液や涙液と同じ浸透圧性を有することができる。本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、または他の薬学的に許容し得る薬剤、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロプレングリコールまたは他の無機もしくは有機溶質を用いて達成することができる。塩化ナトリウムは、特にナトリウムイオンを含有する緩衝剤に好ましい。組成物の粘度は、薬学的に許容し得る増粘剤を用いて選択したレベルに維持してもよい。容易に且つ経済的に入手できて扱い易いことから、メチルセルロースが好ましい。他の適切な増粘剤としては、例えばキサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の好ましい濃度は、選択された薬剤に依存する。重要なことは、選択した粘度に到達させる量を使用することである。粘性組成物は、通常、そのような増粘剤の添加により溶液から調製される。薬学的に許容し得る防腐剤を用いて、組成物の有効期間を延長することができる。ベンジルアルコールが適切であるが、例えばパラベン、チメロサール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムをはじめとする様々な防腐剤を使用することもできる。防腐剤の適切な濃度は、総重量に基づいて0.02~2であるが、選択された薬剤に応じて適度に変動してもよい。組成物の成分が、活性化合物に関して化学的に不活性であるよう選択されるべきであることは、当業者に認識されよう。これは、化学および医薬原理の当業者にとって何ら問題を提示せず、または標準科書の参照もしくは単純な実験により過度の実験を含まずに、本開示および本明細書の引用文献から、問題を容易に回避することができる。本発明の組成物は、一般に許容される手順に従って成分を混合することにより調製される。例えば、選択された成分は、ブレンダまたは他の標準装置で単に混合して濃縮混合物を製造し、その後、水または増粘剤を、そしてことによると緩衝剤を添加してpHを制御するか、または溶質を添加して等張性を制御することにより、最終的な濃度および粘性に調整してもよい。一般に、pHは、約3~7.5であってもよい。組成物は、年齢、性別、体重、特定の患者の状態、投与に用いられる組成物の形態例えば、固体か液体かなどの因子を考慮して、医学および獣医学の当業者に周知の投与量および技術で投与することができる。ヒトまたは他のホ乳類の投与量は、本開示、本明細書に引用された文献、および当該技術分野の知識から、過度の実験をせずとも、当業者により決定することができる。初回投与および追加投与または逐次投与の適切なレジメンも様々であり、初回投与の後に逐次投与を含んでいてもよいが、言うまでもなく、本開示、本明細書に引用された文献、および当該技術分野の知識から、当業者により確認されてもよい。本発明の医薬組成物は、急性組織傷害例えば、虚血性、毒性、免疫関連の損傷または様々な慢性変性疾患から生じた損傷臓器組織を修復および/または再生するのに用いられる。したがって本発明は、これらの状態の任意の1種以上の処置または予防のための、本明細書において議論された臓器幹細胞の単独での、または本明細書において議論された1種以上のサイトカインと併用での投与、そのような処置または予防の組成物、そのような組成物を配合するための、本明細書に議論された臓器幹細胞の単独での、または本明細書において議論された1種以上のサイトカインと併用での使用、ならびにそのような組成物の調製および/またはそのような処置もしくは予防のための、本明細書に議論された幹細胞を単独で、または本明細書において議論された1種以上のサイトカインと一緒に含むキットを含む。そして有利な投与経路は、これらの状態を処置するのに最適なもの、例えば、非限定的に静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻腔内投与など皮下または非経口注射によるもの、ならびに髄腔内、輸注法を含む。本発明の別の態様は、常在性臓器幹細胞を動員するためのサイトカインの投与に関する。このサイトカインは、サイトカインの群から選択されてもよく、またはサイトカインの組み合わせを含んでいてもよい。幹細胞因子SCFおよび顆粒球コロニー刺激因子G-CSFは、幹細胞の血流への動員を誘発する刺激因子として当業者に公知であるBiancoetal2001Clutterbuck1997Kronewettetal2000Laluppaetal1997Patchenetal1998。間質細胞由来因子-1は、幹細胞動員を走化性により刺激することが示されており、スチール因子は、走化性および化学運動性を有するCaceresCortesetal2001Joetal2000KimandBroxmeyer1998Ikutaetal1991。血管内皮増殖因子は、動員の間に遊走を容易にする助けとなるパラクリンループに携わると推測されているBautzetal2000JanowskaWieczoreketal2001。マクロファージコロニー刺激因子および顆粒球マクロファージ刺激因子は、幹細胞の動員を刺激することにより、SCFおよびG-CSFと同じ手法で機能することが示されている。インターロイキン-3も、幹細胞の動員を刺激することが示されており、他のサイトカインと組み合わせると特に強力になる。サイトカインは、サイトカインをインビボで発現するベクターを介して投与することができる。インビボ発現用のベクターは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ポックスウイルスワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、MVA、NYVAC、ALVACなど、レンチウイルス、またはDNAプラスミドベクターなど、参照により本明細書に組み入れられた任意の文献に引用された、または当該技術分野で使用される、ベクターまたは細胞または発現系であってもよく、サイトカインは、そのようなベクターもしくは細胞もしくは発現系、またはその他のもの、例えばバキュロウイルス発現系、エシェリヒアコリなどの細菌ベクター、およびCHO細胞などのホ乳類細胞、を介したインビトロ発現のものであってもよい。例えば、米国特許第6,265,189号、同第6,130,066号、同第6,004,777号、同第5,990,091号、同第5,942,235号、同第5,833,975号を参照されたい。サイトカイン組成物は、幹細胞調製に有利または好ましいことが記述された経路以外の経路により投与させてもよいが、サイトカイン組成物は、有利には幹細胞調製に有利または好ましいと記述された経路で投与されてもよい。本発明の別の態様は、治療有効用量または治療有効量のサイトカインの投与を含む。有効用量は、有益な、または所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。前記用量は、1回以上の投与で投与される。好ましい実施形態において、用量は、治療開始後約2、3日の間に与えられる。しかし有効用量とみなされる量の正確な決定は、サイズ、年齢、梗塞サイズ、投与されるサイトカインまたはサイトカインの組み合わせ、損傷からの経過時間など、患者に固有の因子に基づいていてもよい。当業者、特に医師または心臓専門医は、過度の実験をせずとも、有効用量を構成するサイトカインの十分な量を決定し得るであろう。本発明は、注射、特に皮下または静脈内注射により送達される、治療有効用量または治療有効量のサイトカインの投与も含む。当業者に承知される通り、皮下注射または静脈内送達は、極めて一般的であり、適時に血流に取り込ませ、循環させる手法で、特定用量を送達する効果的方法を提示する。本発明の更なる態様は、患者の常在性幹細胞を刺激し、血流への動員を誘発する、投与されたサイトカインを含む。前述の通り、所与のサイトカインは、前記動員を促進する能力について、当業者に周知である。有利には、幹細胞が、血流中に動員化されたならば、幹細胞は、臓器の損傷領域にホーミングする。本発明の更なる実施形態は、有効量の1種以上のサイトカインを注射により臓器に投与することを含む。好ましくはサイトカインは、梗塞/虚血領域または梗塞/虚血領域に隣接する領域に送達される。当業者に承知される通り、梗塞領域は、目視可能であるため、この特定のサイトカイン配置が可能である。本発明の更なる実施形態は、単回投与によるサイトカインの送達を含む。本発明の更なる実施形態は、同用量のサイトカインを臓器に複数回投与することを含む。本発明の更なる実施形態は、勾配が形成するようにして、サイトカインを臓器に複数回2回以上、3回以上、4回以上、5回以上、または6回以上投与することを含む。例えばサイトカインの勾配は、臓器内の保存領域または幹細胞ニッシェから、臓器内の損傷組織の領域まで生成させることができる。幾つかの実施形態において、勾配は、保存領域または幹細胞ニッシェから臓器内の損傷組織まで、少なくとも1種のサイトカインを2回以上、3回以上、4回以上、5回以上、6回以上間隔をあけて注射することにより生成される。サイトカイン濃度は、損傷組織の方向に増加させることができ、即ち、損傷組織に最も近い場所への注射が、最高濃度のサイトカインを含有する。本発明の更なる実施形態は、常在性臓器幹細胞の刺激、遊走、増殖、および/または分化を含む。本発明の更なる態様は、患者の常在性臓器幹細胞を刺激して、血流への動員を誘発する、投与されたサイトカインを含む。先に言及された通り、所与のサイトカインは、前記動員を促進する能力について、当業者に周知である。同じく、幹細胞が、血流中に動員化されたならば、幹細胞は、臓器の損傷領域にホーミングする。つまり特定の実施形態において、移植された臓器幹細胞および動員された臓器幹細胞の両方が、損傷組織に遊走して、臓器の細胞系列の1種以上または全てに分化する。心臓構造は、エクスビボで生成され、その後、グラフトの形態で移植することができ、グラフトの移植は、単独であるか、または本開示内の臓器幹細胞と組み合わせるか、または臓器幹細胞および少なくとも1種のサイトカインと組み合わせる。損傷臓器組織をエクスビボで生成および/または再生する手段は、場合によりサイトカインの存在下で、インビトロで培養された臓器幹細胞および臓器組織を取り込んでもよい。臓器幹細胞は、単離された臓器の細胞系列の1種以上または全てに分化し、インビトロで増殖して、臓器特異性組織および/または細胞を形成する。これらの組織および細胞は、臓器組織に集成してもよい。その後、インビトロで形成された組織および/または細胞は、患者に、例えばグラフトにより移植して、損傷臓器組織に構造的および機能的完全性を回復させてもよい。追加または代わりとして、グラフトされる組織の供給源は、臓器のグラフトに使用される組織の他の供給源に由来するものであってもよい。臓器組織の機能的および構造的完全性の回復または一部回復有利には過去に生じたものを超えるが、本発明の更に別の態様である。したがって本発明は、更なる態様において、例えば損傷臓器組織を修復および/または再生する発明的方法に使用するための、臓器幹細胞および/または少なくとも1種のサイトカインを含む医薬組成物などの組成物を調製する方法を含む。追加として本発明は、本発明およびその多数の利点のより良い理解を提供する以下の非限定的な実施例により説明される。以下の実施例において参照される材料、試薬、化学薬品、アッセイ、サイトカイン、抗体、およびその他諸々の全てが、非限定的に、Genzyme、Invitrogen、GibcoBRL、Clonetics、FisherScientific、RDSystems、MBLInternationalCorporation、CNBiosciencesCoorporate、SigmaAldrich、およびCedarLaneLaboratoriesLimitedをはじめとする供給業者を通して、研究施設に容易に入手可能である。例えば、幹細胞因子は、SCF組換えヒト、組換えマウス、およびこれらに対する抗体の複数形態の名称でRDSystemsから入手可能であり;顆粒球コロニー刺激因子は、G-CSF組換えヒト、組換えマウス、およびこれらに対する抗体の複数形態の名称でRDSystemsから入手可能であり;幹細胞抗体-1は、SCA-1の名称でMBLInternationalCorporationから入手可能であり;多剤耐性抗体は、抗MDRの名称でCNBiosciencesCorporateから入手可能であり;c-kit抗体は、c-kitAb-1ポリクローナル抗体の名称でCNBiosciencesCorporateから入手可能である。実施例実施例1:梗塞心筋の造血幹細胞HSCの修復A.造血幹細胞の採取強化緑色蛍光蛋白質EGFPを発現する雄トランスジェニックマウスの大腿骨および脛骨から、骨髄を採取した。大腿骨および脛骨を摘出した後、筋肉を切除し、骨の上面および下面を切開し、回収用緩衝液を骨髄に浸潤させた。緩衝液と細胞を含有する液体を、1.5mlエッペンドルフチューブなどの試験管に回収した。骨髄細胞を、5ウシ胎仔血清FCSを含有するPBS中に懸濁させ、以下の造血細胞系列に特異的なラット抗マウスモノクローナル抗体と共に氷上でインキュベートした:CD4およびCD8Tリンパ球、B-220Bリンパ球、Mac-1マクロファージ、GR-1顆粒球CaltagLaboratoriesおよびTER-119赤血球Pharmingen。その後、細胞をPBSですすぎ、ヤギ抗ラットイムノグロブリンPolyscienceIncでコーティングした磁気ビーズと共に30分間インキュベートした。バイオマグネットにより系列陽性細胞Linを除去し、系列陰性Lin-をACK-4ビオチン抗c-kitmAbで染色した。細胞をPBSですすぎ、ストレプトアビジンコンジュゲートフィコエリトリンSA-PECaltagLabsで染色し、FACSVantage機器BectonDickinsonを用いた蛍光標識細胞選別FACSにより選別した。EGFPおよびACK-4-ビオチン-SA-EPの励起が、波長488nmで起こった。Lin-細胞を、染色強度の1~2logの差によりc-kit陽性c-kitPOSおよびc-kit陰性c-kitNEGに選別した図1。c-kitPOS細胞を、PBS5μl中2×104~1×105個に懸濁させ、c-kitNEG細胞をPBS5μl中1×105個の濃度に懸濁させた。B.マウスにおける心筋梗塞の誘発2月齢の雌C57BL/6マウスにおいて、Liら1997により記載された通り心筋梗塞を誘発させた。梗塞後3~5時間目に、マウスの胸腔を再度開き、Lin-c-kitPOS細胞を含有するPBS2.5μlを、梗塞に隣接する生存可能な心筋の前面および後面に注射した図2。未注射またはLin-c-kitNEG細胞を注射した梗塞マウス、および偽手術のマウス、即ち、開胸したが梗塞を誘発しなかったマウスを、対照として使用した。全動物を、手術後9±2日目に屠殺した。プロトコルは、治験審査委員会により認可されたものであった。結果は、平均±SDで表されている。2つの測定値間の有意性は、スチューデントt検定により決定し、多重比較において、ボンフェローニ法ScholzenandGerdes2000により評価した。P<0.05を、有意とみなした。雄性Lin-c-kitPOS骨髄細胞を、雌マウスの梗塞左心室周辺へ注射した結果、心筋が再生した。梗塞周辺領域とは、梗塞に隣接する生存可能な心筋の領域である。30匹中12匹のマウス40において、修復が得られた。梗塞再構成の失敗は、600拍/分bpmで収縮する組織への細胞移植の困難さに起因した。しかし、ドナー骨髄細胞のY染色体上の組織適合性抗原に対する免疫反応により、一部の雌レシピエントにおける修復欠如を説明することができる。密集した筋細胞は、梗塞領域の68±11を占め、心室の前面から後面まで広がっていた図2A~D。新しい筋細胞は、Lin-c-kitNEG細胞を注射されたマウスにおいては見出されなかった図2E。C.心室機能の決定マウスを、抱水クロラール400mg/kg体重、i.p.で麻酔し、非開胸式処置において左心室LV圧およびLVおよび-dP/dtを測定するためにマイクロチップ血圧トランスデューサモデルSPR671、Millarを右頸動脈にカニューレ挿入し、HSC移植片から得られた発生筋細胞が機能に影響を及ぼすかを決定した。未注射またはLin-c-kitNEG細胞を注射された梗塞マウスを、統計学的にまとめた。偽手術群との比較において、梗塞群は、心不全の徴候を示した図3。Lin-c-kitPOS細胞で処置されたマウスにおいて、LV拡張終期圧LVEDPは、36低下し、発生圧LVDP、LVおよび-dP/dtは、それぞれ32、40、および41上昇した図4A。D.細胞増殖決定およびEGFP検出腹大動脈にカニューレを挿入し、塩化カドミウムCdCl2を注射して心臓拡張期に心臓を停止させ、10緩衝ホルマリンにより心筋を逆潅流した。左心室の基部から頂部までの3種の組織断片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。冠動脈閉塞後9±2日目に、心室の梗塞部分は、肉眼でも組織検査でも容易に同定可能であった図2A参照。梗塞領域を定める心内膜面および心外膜面の長さ、ならびに左心室全体の心内膜および心外膜を、各断片で測定した。次に、それらの比を計算して、各例における平均梗塞サイズを得た。これは、顕微鏡に接続された画像分析装置を使用して倍率4倍で実行した。梗塞領域を定める心内膜周長と心外膜周長の比PfefferandBraunwald1990Lietal1997は、非処置マウス78±18、n=8と、Lin-c-kitPOS75±14、n=12またはLin-c-kitNEG細胞75±15、n=11で処置したマウスとで異ならなかった。Lin-c-kitPOS細胞が心筋再生をもたらすか確定するために、BrdU50mg/kg体重、i.p.を動物に連続4~5日間、連日投与した後、屠殺し、活発増殖期の累積細胞分裂を決定した。断片を抗BrdU抗体と共にインキュベートし、S期における心臓細胞核のBrdU標識を測定した。更に、ウサギポリクローナル抗マウスKi67抗体DakoCorpで試料を処置することにより、核内のKi67発現Ki67は、細胞周期中のG1、S、G2期、および早期有糸分裂期の細胞内で発現されるを評価した。FITCコンジュゲートヤギ抗ウサギIgGを、二次抗体として用いた図5および図6。EGFPを、ウサギポリクローナル抗GFPMolecularProbesを用いて検出した。マウスモノクローナル抗心臓ミオシン重鎖MAB1548;Chemiconまたはマウスモノクローナル抗α-筋節アクチンクローン5C5;Sigmaを用いて筋細胞を認識し、ウサギポリクローナル抗ヒトVIII因子Sigmaを用いて内皮細胞を認識し、マウスモノクローナル抗α-平滑筋アクチンクローン1A4;Sigmaを用いて平滑筋細胞を認識した。核は、10μg/mlのヨウ化プロピジウムPIで染色した。BrdUおよびKi67で標識された筋細胞M、内皮細胞EC、および平滑筋細胞SMCの核の百分比を、共焦点顕微鏡検査により得た。これは、標識された核の数を検査された核の総数で割ることにより実行した。各細胞集団において抽出された核の数は、以下の通りであった;BrdU標識:M=2,908;EC=2,153;SMC=4,877。Ki67標識:M=3,771;EC=4,051;SMC=4,752。EGFP標識についてカウントされた細胞数:M=3,278;EC=2,056;SMC=1,274。各例において、心臓ミオシン染色細胞で占められた面積を、梗塞領域により示される総面積で割った値で表示することにより、再生心筋中の筋細胞の百分比を決定した。筋細胞増殖は、BrdUおよびKi67により測定した場合、内皮細胞よりもそれぞれ93p<0.001および60p<0.001高く、平滑筋細胞よりも225p<0.001および176p<0.001高かった。形成した心筋における細胞の起源を、EGFPの発現により決定した図7および図8。EGFP発現は、細胞質に限定され、Y染色体は、新しい心臓細胞の核に限定された。EGFPを、筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞に特異的な蛋白質の標識と組み合わせた。それにより、各心臓細胞の型を同定し、冠血管内に組織された内皮細胞核および平滑筋細胞を認識することができた図5、図7、および図8。EGFPを発現した新しい筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞の百分比は、それぞれ53±9n=7、44±6n=7、および49±7n=7であった。これらの値は、EGFPを発現した移植Lin-c-kitPOS骨髄細胞の割合44±10n=6と一致した。筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞の平均54±8n=6が、ドナートランスジェニックマウスの心臓においてEGFPを発現した。E.Y染色体の検出蛍光インサイチュハイブリダイゼーションFISHアッセイのために、断片を70ホルムアルデヒドを含有する変性溶液に暴露した。エタノールで脱水した後、断片を、DNAProbeCEPYSatelliteIIISpectrumGreenVysisを用いて3時間ハイブリダイズした。核をPIで染色した。Y染色体は、心室の残存部分由来の細胞中には検出されなかった。しかし、新たに形成された筋細胞中にはY染色体が検出され、それらの起源が注射された骨髄細胞に由来することが示された図9。F.転写因子およびコネキシン43の検出断片を、ウサギポリクローナル抗MEF2C21SantaCruz、ウサギポリクローナル抗GATA-4H112SantaCruz、ウサギポリクローナル抗Csx/Nkx2.5DrIzumoから入手、およびウサギポリクローナル抗コネキシン43Sigmaと共にインキュベートした。FITCコンジュゲートヤギ抗ウサギIgGSigmaを、二次抗体として使用した。新たに形成された筋細胞が、機能的コンピテンスを図る成熟細胞となったことを確認するために、筋細胞エンハンサ因子2MEF2、心特異的転写因子GATA-4および早期筋細胞発生マーカCsx/Nkx2.5の発現を検査した。心臓において、MEF2蛋白質は、GATA-4により補充され、ミオシン軽鎖、トロポニンT、トロポニンI、α-ミオシン重鎖、デスミン、心房性ナトリウム利尿因子、およびα-アクチンなどの複数の心遺伝子のプロモータを相乗的に活性化するDurocheretal1997Morinetal2000。Csx/Nkx2.5は、筋細胞分化の初期段階に限定される転写因子であるDurocheretal1997。再構成された心臓において、心臓ミオシン標識細胞の全ての核が、MEF2図7A~FおよびGATA-4図10を発現したが、40±9のみが、Csx/Nkx2.5を発現した図7G~7I。これら筋細胞の性質を更に特徴づけるために、コネキシン43の発現を決定した。この蛋白質は、筋細胞間に原形質膜チャネルを生成することで細胞間結合および電気的結合を担いBeardsleetal1998Musiletal2000、コネキシン43が、細胞の細胞質中および密に整列する分化細胞の表面で明らかとなった図11A~11D。これらの結果は、心筋表現型の予期された機能的コンピテンスと一致した。加えて、様々な成熟段階にある筋細胞が、同じバンドおよび異なるバンド内で検出された図12。実施例2:梗塞心筋を修復するための骨髄細胞の動員A.心筋梗塞およびサイトカイン2月齢雄C57BL/6マウス15匹を脾摘し、2週間後に、組換えラット幹細胞因子SCF200μg/kg/日および組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子G-CSF50μg/kg/日Amgenを1日1回、5日間にわたり皮下注射したBodineetal1994Orlicetal1993。エーテル麻酔下、左心室LVを露出させ、冠動脈を結さつしたOrlicetal2001Lietal1997Lietal1999。SCFおよびG-CSFを、更に3日間与えた。対照は、脾摘して梗塞を起こさせたマウスおよび生理食塩水を注射された偽手術マウスSOからなった。50mg/kg体重のBrdUを、屠殺前に1日1回、13日間にわたり与え、27日後にマウスを殺処分した。プロトコルはニューヨーク医科大学により認可されたものであった。結果は、平均±SDである。有意性はスチューデントt検定およびボンフェローニ法Lietal1999により決定した。対数順位検定により、致死率を計算した。P<0.05を、有意とした。骨髄Lin-c-kitPOS細胞が、心原性細胞系列に分化転換する能力を前提としOrlicetal2001、死滅した心筋領域にホーミングする確率を高めるために、末梢循環における該細胞の数を最大にするプロトコルを用いた。正常動物では、Lin-c-kitPOS細胞の血中頻度は、骨髄中に存在する同様の細胞のほんのわずかであるBodineetal1994Orlicetal1993。前述した通り、本明細書で用いられるサイトカイン処置は、骨髄中のLin-c-kitPOS細胞の著しい増加、およびこれらの細胞の骨髄から末梢血への再分配を促進する。このプロトコルで、循環中のLin-c-kitPOS細胞は250倍増加するBodineetal1994Orlicetal1993。現在の研究おいて、SCFおよびG-CSFによるBMC動員は、梗塞マウスの生存率を劇的に増加させ、サイトカイン処置により73のマウス15匹中11匹が、27日間生存したが、非処置梗塞マウスにおいては、致死率が非常に高かった図13A。この群の多数の動物が、心筋梗塞MI後3~6日で死亡し、わずか1752匹中9匹が27日目に至ったp<0.001。手術による外傷の影響を最小にするために、MI後48時間以内に死亡したマウスは、致死率曲線に含めなかった。左心房自由壁LVFW中の喪失筋細胞数により測定したところ、27日目に、サイトカイン注射動物64±11、n=11と生理食塩水注射動物62±9、n=9で、梗塞サイズは同様であった図14。重要なこととして、手術後27日目に屠殺されたサイトカイン処置梗塞マウスの11匹全てにおいて、骨髄細胞動員により心筋再生が促進された図13B。梗塞内の心筋成長は、6日目n=2および9日目n=2に早期死亡したマウス4匹にも見られた。心臓修復は、損傷領域の大半を占める、新たに形成された心筋バンドを特徴とした。発生組織は、損傷領域の境界域から内側に、そしてLVFWの心内膜から心外膜へと広がっていた。サイトカインの非存在下において、心筋置換は全く観察されず、瘢痕形成を伴う治癒が明らかとなった図13C。反対に処置マウスでは、小さなコラーゲン蓄積領域が検出された。B.超音波心臓検査および血行動態によるBMC動員の検出13-MHz線形トランスデューサ15L8を備えたSequoia256cAcusonを用いて、覚醒マウスにおいて超音波心臓検査を実施した。前胸部を剪毛し、乳頭筋の位置で傍胸骨短軸から二次元2D画像およびMモードトレーシングを記録した。Mモードトレーシングから、心臓拡張期および収縮期における解剖学的パラメータを得たPollicketal1995。2D短軸視像におけるLV断面積から、駆出率EFを導いたPollicketal1995:EF=[LVDA-LVSA/LVDA]×100式中、LVDAおよびLVSAは、心臓拡張期および収縮期におけるLV面積に対応する。マウスを抱水クロラール400mg/kg体重、ipで麻酔し、チャート式記録計に接続されたマイクロチップ圧力トランデューサSPR671、MillarをLVに進入させ、非開胸処置における血圧、ならびにおよび-dP/dtを評価したOrlicetal2001Lietal1997Lietal1999。EFは、冠動脈閉塞後9、16、および26日目において、非処置マウスよりも処置マウスでそれぞれ48、62、および114高かった図15D。サイトカインに暴露されたマウスにおいて、収縮機能が、壁の梗塞領域内で時間と共に発生した図15E~M;図16H~P、wwwpnasorg。反対に、LV拡張終期圧LVEDPは、非処置マウスにおいて76高かった。LV収縮期圧図示しない、発生圧LVDP、および-dP/dtの変動も、サイトカイン処置の非存在下でより激しくなった図17A~D。加えて、梗塞に隣接する領域および梗塞から遠隔の領域における心臓拡張期応力の増加は、サイトカイン処置マウスにおいて69~73少なかった図15N。したがって、サイトカイン介在での梗塞修復により、再生心筋において注目に値するレベルの収縮が回復し、拡張期壁応力が低下し、心室性能が向上した。梗塞心臓のインビボ変化の間に、心筋再生により、腔拡張および壁厚減少が緩和された。超音波心臓検査によれば、LV収縮終期直径LVESDおよび拡張終期直径LVEDDは、梗塞後9、16、および26日目に、サイトカイン処置マウスよりも非処置マウスでより増加した図16A~B。心臓収縮期AWSTおよび拡張期AWDT前壁厚の評価は、梗塞により妨げられた。測定可能な場合は、収縮期PWSTおよび拡張期PWDTの後壁厚は、処置マウスにおいてより大きくなった図16C~D。解剖学的には、梗塞に隣接する壁および梗塞から遠隔の壁は、サイトカイン注射マウスにおいて26および22厚かった図16E。BMC誘導修復は、壁厚対腔半径比を42上昇させた図15A。加えて、組織再生により、腔直径-14、長軸-5図16F~G、および腔容積-26図15Bの増大が抑制された。重要なこととして、処置動物において心室質量対腔容積比が、36上昇した15C。したがって、筋細胞および血管構造の新規集団の増殖および分化をもたらすBMC動員は、心代償不全の定義となる解剖学的変数を低減した。C.心臓の解剖学的構造および梗塞サイズの決定血行動態測定に続き、腹大動脈にカニューレを挿入し、心臓をCdCl2で心臓拡張期に停止させ、心筋を10ホルマリンで潅流した。LVの腔に、固定剤をインビボ測定された拡張終期圧に等しい圧力で充填したLietal1997Lietal1999。LV腔内軸を測定し、基部、中間部および頂部から得た3種の横断切片を、パラフィンに包埋した。中間部を用いてLV厚、腔直径、および容積を測定したLietal1997Lietal1999。梗塞サイズは、LVFWから喪失された筋細胞の数により決定したOlivettietal1991Beltramietal1994。心室質量に対する発生バンドの寄与を定量するために、最初にLVFW容積重量を1.06g/mlで割った値を、各群のマウスにおいて決定した。データは、偽手術SOにおいて56±2mm3、梗塞非処置動物において62±4mm3生存可能FW=41±3;梗塞FW=21±4、および梗塞サイトカン処置マウスにおいて56±9mm3生存可能FW=37±8;梗塞FW=19±5であった。非処置動物およびサイトカン処置動物における梗塞サイズを前提として、これらの値を、27日目の温存心筋および喪失心筋の予測値と比較した。SOにおけるLVFW容積56mm3と非処置マウス62および処置マウス64における梗塞サイズから、冠動脈閉塞後27日目に、残存が見込まれる心筋体積非処置=21mm3;処置=20mm3および喪失が見込まれる心筋体積非処置=35mm3;処置=36mm3を計算することができた図18A。新たに形成された心筋の体積を、サイトカイン処置マウスのみで検出すると、14mm3であることが見出された図18A。つまり、修復バンドにより、梗塞サイズが6436mm3/56mm3=64から39[36mm3-14mm3/56mm3=39]に縮小した。27日目のLVFWの温存部分は、非処置マウスおよび処置マウスにおいて41mm3および37mm3であったため上記参照、図18aに示された残存心筋は、それぞれ95p<0.001および85p<0.001肥大した。一貫して、筋細胞容積は94および77増加した図18B。D.形成された心筋の総容積の決定3種の断片それぞれにおいて、回復組織が占める面積および断片厚を測定することにより、再生心筋の体積を決定した。これら2つの変数の積から、各断片における組織修復体積を得た。3種の断片の値を加算し、形成された心筋の総体積を得た。加えて、各心臓において、筋細胞400個の容積を、測定した。断片を、デスミンおよびラミニン抗体ならびにヨウ化プロピジウムPIで染色した。核が中心に位置する、長軸方向に配列された細胞のみを含めた。各筋細胞において、核を通る長さおよび直径を収集し、円筒形と仮定して細胞容積を計算したOlivettietal1991Beltramietal1994。筋細胞を分類に分けて、筋細胞の分類総容積と平均細胞容積の比から、各分類の筋細胞数を計算したKajsturaetal1995Reissetal1996。心筋単位面積あたりの細動脈および毛細血管プロファイルの数を、過去に行われたものと同様に測定したOlivettietal1991Beltramietal1994。断片を、BrdUまたはKi67抗体と共にインキュベートした。マウスモノクローナル抗心臓ミオシンを用いて筋細胞Mを認識し、ウサギポリクローナル抗第VIII因子を用いて内皮細胞ECを認識し、マウスモノクロ-ナル抗α-平滑筋アクチンミオシンを用いて平滑筋細胞SMCを認識した。BrdUおよびKi67で標識されたM、EC、およびSMC核の比率を、共焦点顕微鏡検査により得たOrlicetal2001。核は、サイトカイン処置マウス11匹において抽出した;BrdU:M=3,541;EC=2,604;SMC=1,824、Ki67:M=3,096;EC=2,465;SMC=1,404。細胞増殖の累積度を測定するために、14日目から26日目にかけてBrdUを連日注射し、一方で屠殺時に細胞周期中の細胞数を決定するために、Ki67をアッセイした。Ki67は、G1期、S期、G2期、前期および中期にある細胞を同定し、後期および終期には減少するOrlicetal2001。BrdUおよびKi67陽性筋細胞の百分比は、それぞれECよりも1.6倍および1.4倍高く、SMCよりも2.8倍および2.2倍高かった図18C、19。形成した心筋は、梗塞の76±11を占め;筋細胞は61±12を構成し、新血管は12±5を、その他の成分は3±2を構成した。バンドは、再生筋細胞15×106個を含み、これらの細胞は活発な増殖期にあり、広いサイズ分布を有した図18D~E。ECおよびSMCの増殖の結果、新たな心筋1mm2あたり細動脈15±5個および毛細血管348±82個が形成された。幾つかのSMC層を有し、管腔直径が10~30μmである壁の厚い細動脈は、分化早期における血管を表した。時には、定着過程における修復心筋内の冠動脈分枝の不完全な潅流が、赤血球を含む細動脈および毛細血管をもたらすことがあった図18F~H。これらの結果から、新たな血管は機能的コンピテントであり、冠動脈循環と接続していることが立証された。それゆえ、組織修復により梗塞サイズは減少し、筋細胞増殖は血管形成を上回っており、筋量置換は梗塞心臓の優勢な特徴であった。E.細胞分化の決定細胞質マーカおよび核マーカを使用した。筋細胞核:ウサギポリクローナルCsx/Nkx2.5、MEF2、およびGATA4抗体Orlicetal2001Linetal1997Kasaharaetal1998;細胞質:マウスモノクローナルネスチンKachinskyetal1995、ウサギポリクローナルデスミンHermannandAebi1998、心臓ミオシン、マウスモノクローナルα-筋節アクチンおよびウサギポリクローナルコネキシン43抗体Orlicetal2001。EC細胞質:マウスモノクローナルflk-1、VE-カドヘリンおよび第VIII因子抗体Orlicetal2001Yamaguchietal1993Breieretal1996。SMC細胞質:flk-1およびα-平滑筋アクチン抗体Orlicetal2001Couperetal1997。コラーゲンI型抗体とコラーゲンIII型抗体との混合物により、瘢痕を検出した。5種の細胞質蛋白質:ネスチン、デスミン、α-筋節アクチン、心臓ミオシンおよびコネキシン43を同定し、筋細胞の分化の状態を確定したOrlicetal2001Kachinskyetal1995HermannandAebi1998。形成したバンドに分散する個々の細胞において、ネスチンが認識された図20A。これを例外とし、その他全ての筋細胞が、デスミン図20B、α-筋節アクチン、心臓ミオシン、およびコネキシン43図20Cを発現した。数種の心筋構造遺伝子のプロモータの活性化に関わる3種の転写因子:Csx/Nkx2.5、GATA-4、およびMEF2を検査したOrlicetal2001Linetal1997Kasaharaetal1998図21A~C。2種のECマーカであるflk-1およびVE-カドヘリンに対して陽性の単細胞Yamaguchietal1993Breieretal1996が、修復組織中に存在し図20DおよびE;単離されたSMCまたは動脈壁内のSMC中で、flk-1が検出された図20F。このチロシンキナーゼ受容体は、血管形成の間にSMCの遊走を促進するCouperetal1997。それゆえ梗塞心臓の修復は、全ての心臓細胞集団の増殖および分化に関与し、デノボ心筋をもたらした。実施例3:成体マウス心臓における原始心臓細胞の遊走原始細胞集団が、成体心室心筋中に存在するか、そしてこれらの細胞が、遊走能を有するかを決定するために、3種の主要増殖因子:肝細胞増殖因子HGF、幹細胞因子SCF、および顆粒球単球コロニー刺激因子GM-CSFを、化学誘引物質として使用した。SCFおよびGM-CSFは、造血幹細胞の移行を促進することが示されているため選択した。HGFは、造血幹細胞の遊走を誘発するが、この増殖因子は、心臓発生早期において心臓細胞前駆体の有糸分裂、分化および遊走に大きく関与する。これに基づき、マウス心臓から酵素作用により解離させた細胞を、サイズに応じて分別した。心臓細胞を心臓組織から解離する方法は、当業者に周知であり、それゆえ過度の実験は、必要ない参照により全体が本明細書に組み入れられた米国特許第6,255,292号参照。直径5~7μmで高い核対細胞質比を有する、小未分化細胞を含む均一な解離心臓細胞集団を、5μm細孔を含むゼラチンコーティングフィルタを特徴とするボイデンマイクロチャンバにおいてBoydenetal1962JExptlMed115453456遊走アッセイに供試した。3種の増殖因子の存在下における遊走細胞の用量反応曲線に、大きな差異は検出されなかった。しかし、HGFは、濃度100ng/mlで多数の細胞を動員するようであった。加えて、HGFに対して走化性反応を示した細胞は、c-kit陽性c-kitPOS細胞15、多剤耐性-1MDR-1標識細胞50、および幹細胞抗原-1Sca-1発現細胞30からなった。動員された細胞を15ウシ胎仔血清中で培養すると、それらは筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞に分化した。心臓ミオシン陽性筋細胞は、標本の50を構成したが、第VIII因子標識細胞は15、α-平滑筋アクチン染色細胞は4、およびビメンチン陽性第VIII陰性線維芽細胞は20含まれた。残りの細胞は、小未分化細胞であり、これら4種の抗体で染色されなかった。結論として、マウス心臓は、増殖因子により動員される原始細胞を有する。HGFは、インビトロで4種の心臓細胞系列に分化する細胞を移行する。実施例4:心臓c-kit陽性細胞はインビトロで増殖し、インビボで新たな心筋を生成する原始c-kitPOS細胞が老齢フィッシャー344ラットに存在するかを決定するために、解離した心臓細胞を、c-kit受容体抗体ACK-4-ビオチン、抗c-kitmAbでコーティングされた磁気ビーズに暴露した。分離後、これら小未分化細胞を、10ウシ胎仔血清中で培養した。細胞を数日間付着させると、1週間目に増殖を開始した。7~10日目に、コンフルエントに達した。継代P2およびP4で達成された倍増時間は、それぞれ30時間および40時間であった。細胞は、老齢期に達することなく、P18第90代まで増殖した。複製能力は、Ki67標識により確定され、P2において、88±14の細胞が、核内にKi67蛋白質を含んだ。P1~P4の間に、追加の測定値を得た。細胞の40がα-筋節アクチンまたは心臓ミオシンを、13がデスミンを、3がα-平滑筋アクチンを、15が第VIII因子またはCD31を、18がネスチンを発現した。これらのインビトロ条件下では、細胞は、筋節が適正に整列した明らかな筋原線維組織を示さず、自発的な収縮もなんら観察されなかった。同様に、AngII、ノルエピネフリン、イソプロテレノール、機械的伸長および電界刺激でも、収縮機能を開始することはできなかった。これに基づき、筋原性の平滑筋細胞系列および内皮細胞系列に関わるこれらの細胞が、それらの生物学的特性を永久に失ったか、あるいはそれらの役割がインビボで再建され得るかを評価することにした。P2における細胞のBrdU標識に続き、冠動脈閉塞後3~5時間目に、梗塞フィッシャー344ラットの損傷領域に、BrdU陽性細胞を注射した。2週間後に、動物を屠殺し、梗塞領域の特徴を検査した。長軸に沿って平行に配列された筋原線維を含む筋細胞が、核のBrdU標識との組み合わせで認識された。更に、細動脈および毛細血管プロファイルを含む血管構造が存在し、同じくBrdUに対して陽性であった。結論として、原始c-kit陽性細胞は、老齢心臓に常在し、損傷を受け機能低下した心筋に移植すると、増殖して実質細胞および冠血管へ分化する能力を維持している。実施例5:心臓幹細胞は若年および老齢ラット心臓における筋細胞複製を媒介する心臓は、分裂終了臓器ではなく、生理学的には細胞分裂して死滅細胞と入れ替わる筋細胞亜集団を含む。筋細胞増殖は、病理学的過負荷の間に増進され、筋量を増大し、心臓の性能を維持する。しかし、これらの複製筋細胞の起源は、依然として同定されていない。それゆえ、幹細胞/プロジェニター細胞の特徴を有する原始細胞を、フィッシャー344ラットの心筋において探索した。若年および老齢動物を試験して、加齢が幹細胞および分裂筋細胞のサイズ占有数に影響を及ぼすかを決定した。4月齢のラットにおけるc-kit陽性細胞およびMDR1陽性細胞の数は、それぞれ11±3および18±6/100mm2組織であった。27月齢のラットにおける値は、35±10および42±13/100mm2組織であった。新たに生成された小さな筋細胞が多数同定され、それらはやはりc-kit陽性またはMDR1陽性であった。細胞周期中の細胞の核内で発現されるKi67蛋白質は、4月齢および27月齢においてそれぞれ筋細胞の1.3±0.3および4.1±1.5で検出された。6回または56回の注射後のBrdU局在化は、4月齢において1.0±0.4および4.4±1.2、27月齢において4.0±1.5および16±4であった。組織片中で測定した有糸分裂指数から、有糸分裂中の筋細胞核の画分は、4月齢および27月齢においてそれぞれ82±28/106および485±98/106含むことが示された。これらの決定を解離筋細胞において確認して、細胞有糸分裂指数を得た。このアプローチにより、多核筋細胞の全ての核が同時に有糸分裂期にあったことを立証することができた。この情報は、組織断片では得られなかった。収集された値から、4月齢で95±31/106筋細胞が、27月齢で620±98/106が分裂中であることが示された。両月齢区間において、紡錘体、収縮環の形成、核膜の分解、核分裂および細胞質分裂が、証明された。結論として、原始未分化細胞は、成体心臓に存在し、加齢によるそれらの増加は、細胞周期に入り核分裂および細胞質分裂を起こす筋細胞数の増加と並行する。この関連性から、心臓幹細胞が老化した心臓における筋細胞増殖のレベルおよび運命を調節し得ることが示唆される。実施例6:ヒト心臓のキメラ現象および幹細胞の役割損傷された心臓のリモデリングにおいて常在性原始細胞が果たす重要な役割は、雌性心臓の雄レシピエントへの移植に関連して臓器キメラ現象を考慮する際に、十分に理解される。このために、雄宿主に移植された雌性心臓8個を、分析した。グラフトされた雌性心臓への雄性細胞の移行を、Y染色体に関するFISHにより同定した実施例1E参照。このアプローチによれば、Y染色体で標識された筋細胞、冠細動脈および毛細血管プロファイルの百分比は、それぞれ9、14、および7であった。同時に、移植された雌性心臓内の未分化c-kit陽性細胞および多剤耐性-1MDR1陽性細胞の数を測定した。加えて、これらの細胞がY染色体を含む可能性を確定した。心臓移植では、レシピエントの心房の一部を保存し、そこにドナー心臓をその心房の一部で取付ける。この外科処置は、宿主およびドナーに由来する心房が、移植心臓の複雑なリモデリング過程に寄与し得る未分化細胞を含むかを理解する上で重要である。定量的には、c-kit標識細胞およびMDR1標識細胞の値は、対照非移植心臓では非常に低く、左心室心筋100mm2あたりc-kitが3、MDR1が5であった。反対に、レシピエントの心房におけるc-kit細胞およびMDR1細胞の数は、15および42/100mm2であった。ドナーの心房における対応する値は、15および52/100mm2であり、心室においては11および21/100mm2であった。移植は、心臓における原始未分化細胞の著しい増加を特徴とした。宿主の心房中の幹細胞は、Y染色体を含み、ドナーの心房および心室において、それぞれ平均55および63のc-kit細胞およびMDR1細胞が、Y染色体を呈した。c-kit陽性細胞およびMDR1陽性細胞の全てが、CD45に対して陰性であった。これらの観察から、移植心臓への雄性細胞の移行はドナー心筋の再構築に大きな影響を及ぼしたことが示唆される。結論として、幹細胞は、成体心臓に広範に分布しており、それらの柔軟性および遊走能のために、高度に分化する筋細胞、冠細動脈および毛細血管構造を生成する。実施例7:成体マウス心臓における幹細胞の同定および局在化筋細胞のターンオーバーは、正常心臓において起こり、心筋損傷は、筋細胞増殖および血管成長の活性化をもたらす。このような適応性は、多能性の原始細胞が心臓に存在し、死滅筋細胞の生理学的置換および損傷後の細胞増殖応答に関与する可能性を上昇させる。これに基づき、正常マウス心臓における未分化細胞の存在を、幹細胞因子の受容体であるc-kit、細胞色素、毒性物質および薬物から排出し得るP-糖蛋白質である多剤耐性-1MDR1、ならびに細胞シグナリングおよび細胞接着に関与する幹細胞抗原-1Sca-1を含む表面マーカを用いて決定した。左心房および右心房、ならびに心室の基部、中間部、および頂部からなる4つの別個の領域を分析した。c-kit陽性細胞数は、心房、心室の頂部、基部、中間部においてそれぞれ26±11、15±5、10±7および6±3/100mm2であった。基部および中間部と比較すると、心房および心室頂部おけるc-kit陽性細胞の大きな比率は、統計的に有意であった。MDR1陽性細胞数は、c-kitを発現するものより大きかったが、同様の局在化パターンを示し、心房、心室頂部、基部、および中間部において43±14、29±16、14±7および12±10/100mm2であった。同じく、心房および心室頂部における値は、他の2つの部位よりも高かった。Sca-1標識細胞は、最高値を示し、心房において150±36/100mm2個の陽性細胞が見出された。c-kit、MDR1、およびSca-1に対して陽性の細胞は、CD45に対して、そして筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞の細胞質蛋白質に対して陰性であった。加えて、c-kitおよびMDR1の両方に対して陽性の細胞数を測定し、2種の幹細胞マーカを有する細胞を認識させた。心臓全体で、36のc-kit標識細胞が、MDR1を発現し、19のMDR1細胞が、c-kitも有した。結論として、幹細胞は、マウス心臓全体に分布しているが、心房および心室頂部といった低応力の領域に蓄積する傾向にある。実施例8:常在性心臓幹細胞の遊走、侵入および発現アッセイによる梗塞心筋の修復HGF受容体であるc-Metは、造血幹細胞および肝幹細胞において同定されているが126,90、最も重要には星状骨格筋細胞92および胚性心筋細胞127において同定されている。これらの所見により、著者は、c-MetがCSC中に存在するか、そしてそのリガンドHGFがこれらの未分化細胞に生物学的影響を及ぼすかを決定することにした。HGFは、インビトロでCSCの遊走および侵入を促進し、インビボで貯蔵領域から梗塞心筋部位への移行を助成するという仮説を設けた。HGFは、マトリックスメタロプロテアーゼ-294、95の発現および活性化を通して細胞遊走に影響を及ぼす128。この酵素ファミリーは、細胞外マトリックス中の障壁を破壊することができ、CSCの移動、ホーミング、および組織回復を容易にすることができる。IGF-1は、有糸分裂誘発性および抗アポトーシス性であり、神経幹細胞の増殖および分化に必要である96、97、98。CSCがIGF-1Rを発現する場合、IGF-1は、同等の手法でCSCに影響を及ぼし、損傷心筋へ遊走する間にそれらの生存可能性を保護することができる。IGF-1過剰発現は、成体マウス心臓における筋細胞増殖を特徴とし65、この細胞増殖の形態は、CSC活性化、分化および生存に依存し得る。本試験の最初の部分で、遊走および侵入アッセイを実施して、走化性HGFの存在下でのc-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞の動員性を確定した。心臓細胞を酵素作用により解離し、筋細胞を除去した124。小細胞を無血清培地SFM中に再懸濁させた。上方ウェルおよび下方ウェルを有する改変ボイデンチャンバNeuroProbeGaithersburgMDを用いて、細胞遊走を測定した。48ウェルプレート用フィルタは、直径5μmの細孔を有するゼラチンコーティングポリカーボネート膜からなった。0.1BSAおよび漸増濃度のHGFを含有するSMFを、下方ウェルに充填し、小細胞懸濁液50μlを、上方ウェルに入れた。5時間後、フィルタを、4パラホルムアルデヒド中で40分間固定し、PI、c-kit、およびMDR1抗体で染色した。FITCコンジュゲート抗IgGを、二次抗体として使用した。各HGF濃度で、6種の別個の実験を行った。各アッセイにおいて、各ウェル内の無作為に選択した40個の領域をカウントし、用量反応曲線を作成した図61。小細胞に及ぼすIGF-1の分裂促進作用は、IGF-1単独の、またはHGFと組み合わせた遊走アッセイデータは示さないを実施することにより除外した。24ウェルおよび12種の細胞培養インサートを備えたチャンバChemicon、Temecula、CAを使用して、侵入アッセイを実施した。増殖因子が枯渇した細胞外マトリックスの薄層を、インサート表面に広げた。反対に、100ng/mlのHGFを、下方チャンバに入れた。侵入細胞は、コーティングを消化し、ポリカーボネート膜の底部に付着した。遊走アッセイで記載したのと同じプロトコルに従って、移行した細胞の数を48時間後に測定した。4種の別個の実験を実施した図62。遊走アッセイで得られた結果と一致し、IGF-1は細胞侵入に何ら影響しなかったデータは示さない。遊走は、両方の細胞型において類似しており、100ng/mlHGFでピークに達した。5時間後、下方チャンバに遊走したc-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞の数は、それぞれ対照細胞の3倍および2倍であった。HGF濃度を高くしても、細胞遊走は改善されなかった図61および62。これに基づき、100ng/mlのHGFを使用して、c-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞の、侵入チャンバの合成細胞外マトリックスを透過する能力も決定した。48時間以内に、該増殖因子は、チャンバの下部におけるc-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞の数をそれぞれ8倍および4倍増加させた図61および62。IGF-1は、25~400ng/mlで変動する濃度で、上記CSCの動員性に影響を及ぼさなかった。IGF-1をHGFに添加しても、HGF単独で得られるc-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞の遊走性および侵入性を改変しなかった。小未分化c-MetPOS細胞を、免疫磁気ビーズを用いて回収し、これらの細胞のゼラチンを開裂する能力を、ザイモグラフィーにより評価した図63。手短に言えば、小細胞を、心臓n=4から単離し、次にc-Met抗体をコーティングされたマイクロビーズMiltenyi、Auburn、CAにより分離した。細胞を、100ng/mlのHGFに37°Cで30分間暴露した。細胞溶解物を、0.1ゼラチンと共重合した10ポリアクリルアミドゲルInvitrogen、Carlsbad、CAで泳動させた。ゲルを、クーマシーブルー染色液0.5中でインキュベートし、ゼラチン溶解活性領域を、灰色背景に対する透明バンドとして検出した。これを行って、c-MetPOS細胞がマトリックスメタロプロテアーゼMMPを発現し、ゲル中に存在する基質を消化できるかを実証した94、95。肯定的な結果が得られ図63、これらの原始細胞の動員性が、少なくとも一部は、MMPの活性化によることが示唆された。合わせると、これらのインビトロアッセイは、CSCにおけるHGFの走化性機能を示している。そのようなHGFの役割は、c-Met受容体への結合と、それに続くMMP合成の刺激により仲介されるようである94、95。マウスにおける心筋梗塞心筋梗塞をマウスにおいて作製し、5時間後、HGFおよびIGF-1を含有する溶液を、心房から境界域にかけて4箇所に注射した。HGFを漸増濃度で投与し、貯蔵CSCと死滅組織間で走化性勾配を作出した。このプロトコルは、損傷領域へのCSCのホーミングを増進し、新しい心筋を生成するよう導入された。これが成立すれば、動物死に関連する大きな梗塞は急速に縮小し、梗塞サイズおよび生存の限界が、この介入により拡大する。雌SV-EVマウス129匹を、使用した。麻酔ケタミン150mg-アセプロマジン1mg/kg体重、i.m.に続いてマウスを人工呼吸させ、心臓を露出させ、左冠動脈を結さつした61、87。増殖因子で処置される動物における冠動脈結さつは、非常に大きな梗塞を誘発するよう大動脈の起点の可能な限り近くで実施した。次に、閉胸し、動物を覚醒させた。5時間後、マウスを麻酔し、再度開胸し、各2.5μlのHGF-IGF-1を心房から梗塞に隣接する領域にかけて4箇所に注射した。最後の2つの注射は、境界域の両側に行った。HGFの濃度は、梗塞に向かって50から100および200ng/mlに漸増させた。IGF-1は、200ng/mlの一定濃度で投与した。6~16日目にマウスにBrdU50mg/kg体重を注射し、この期間に、新たに形成され増殖した小さな心筋細胞を同定した。偽手術マウスおよび梗塞非処置マウスには、標準生理食塩水を同じ4部位に注射した。臓器修復に及ぼすCSCの影響を議論する前に、c-kitおよびMDR1を発現する細胞におけるc-MetおよびIGF-IRの存在を、対照マウスの心房および左心室LVで測定した。同一の分析を、冠動脈閉塞に供されたマウスの心房、梗塞LV、および非梗塞LVで行った。この決定は、増殖因子投与後2~3時間目に実施し、つまり冠動脈閉塞後7~8時間目を表している目的は、原始細胞が死滅細胞および周辺の生存心筋に侵入すること、ならびにHGFおよびIGF-1がこのプロセスに関与することを証明することであった。c-MetおよびIGF-1Rを、正常心臓n=5、梗塞処置心臓n=6、および梗塞非処置心臓n=5の領域に分散するc-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞において検出した図22A~F。c-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞の大部分が、c-MetおよびIGF-1Rを単独でまたは一緒に発現した。心筋梗塞および増殖因子の投与は、心筋内のc-MetおよびIGF-1Rが存在する、しないにかかわらず、一貫してCSCの相対的割合を変化させることはなかった図64。ヘアピン1アポトーシスおよびヘアピン2壊死標識ならびに核内のKi67発現細胞周期中の細胞を利用して、損傷心臓および非損傷心臓の様々な部位におけるc-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞の生存可能性および活性化をそれぞれ確認した図22G~L。CSCは、対照マウスにおいて、心室より心房に多く存在した。急性心筋梗塞および増殖因子投与は、心臓内の原始細胞の数および分布を著しく変化させた。生存可能なc-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞は、境界域および遠隔組織の温存する心筋だけでなく、梗塞領域の死滅心筋においても有意に増加した。重要なこととして、CSCは、心房では減少しており図22MおよびN、この貯蔵部位から応力をかけられた生存心筋および死滅心筋に原始細胞の移行が生じたことが示唆された。生存可能なCSCが、心室よりも心房に残存する、という異なる現象が、梗塞非処置マウスにおいて認められた。対照動物および梗塞処置マウスにおいて、アポトーシスおよび壊死は、梗塞心筋および周辺心筋内のc-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞において検出されなかった。Ki67標識は、境界域および梗塞に分布する未分化細胞のそれぞれ約35および20において同定された図65。梗塞非処置マウスにおいて、梗塞内のc-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞の大半が、アポトーシスであった図22MおよびN。壊死は、認められなかった。アポトーシスCSCの死滅勾配が、梗塞から離れた心筋および心房組織まで観察された。これらのマウスにおいて、生存可能c-kitPOS細胞およびMDR1POS細胞の10~14だけが、Ki67を発現した図65。つまりこれらの結果は、CSCがc-MetおよびIGF-1Rを発現し、それによりHGFおよびIGF-1が梗塞心臓におけるCSCのコロニー形成、増殖、および生存に肯定的な影響を有するという概念を裏づけている。インビトロおよびインビボデータに基づけば、HGFは、細胞遊走において、そしてIGF-1は細胞分裂および生存可能性において優勢な役割を有するようである。しかし、梗塞非処置マウスにおいて、CSCは、梗塞領域に移行せず、既存の原始細胞は、アポトーシスにより死滅する。即ち、重要な疑問は、梗塞内に位置するCSCが様々な心臓細胞系列に分化して死滅心筋を再構成することが可能であるか、であった。肯定的な所見から、梗塞処置マウスにおける心臓修復のメカニズム、および梗塞非処置マウスにおける心筋再生の欠如の可能な説明が得られるであろう。解剖学的測定のために、心臓をCdCl2により拡張期で停止させ、心筋を10ホルマリンで潅流した。インビボで測定された拡張終期圧に等しい圧力でLV腔に固定剤を充填した。LV腔内軸を決定し、中間部を使ってLV厚および腔直径を得た。梗塞サイズは、心室中隔を含むLVから喪失された筋細胞の数により測定した87。16日目の心筋梗塞は、非処置マウスおよびHGF-IGF-1処置マウスの左心室および中隔においてそれぞれ42n=15および67n=22の筋細胞を喪失させた図23A。60という大きな梗塞にもかかわらず、増殖因子に暴露されたマウスは、心機能をより良好に保存した図23B。HGF-IGF-1は、LV拡張終期圧の上昇およびdP/dtおよび-dP/dtの減少を抑える結果となった。梗塞サイズの差は、致死率に影響を及ぼさず、これは2つのマウス群で同様であり、非処置群において43、処置群において40であった。重要なこととして、増殖因子を受容したマウス22匹中14匹が、LVの60を超える梗塞が有りながら生存した。これらのマウスのうち7匹には、LVの75から86に及ぶ梗塞があった。非処置マウスは、60を超えない梗塞を有していた図23CおよびD。注射されたマウスとは異なり、LV壁の後側の一部および心室中隔全体は、非処置動物が生存するためには保存されなければならなかった。60より大きな梗塞は、マウス、ラット、イヌ、およびその他の任意ホ乳類の生命と相容れない。46梗塞を有するヒトの場合、不可逆的心原性ショックおよび死が併発する99。偽手術マウスのLV容積、ならびに非処置および処置動物の梗塞サイズから、冠動脈閉塞後16日目に生存および喪失するであろう心筋体積を計算することが可能であった。筋細胞、血管構造、およびその他の組織成分を含む新たに形成された心筋の体積を、増殖因子処置マウスのみで検出したところ、8mm3であることが見出された。つまり修復バンドにより、梗塞サイズが67から57に縮小した図68および69。HGF-IGF-1の走化性および有糸分裂誘発性は、壁の梗塞領域において原始細胞の動員、増殖および分化をもたらして、新しい心筋を生成した。小動物におけるこの方法論的アプローチの複雑さにもかかわらず、85マウス26匹中22匹の例で梗塞内の心筋バンドの形成が得られた。バンドは、損傷領域の65±8を占め、壁の内層および外層から等距離の梗塞中間部に位置した。非常に大きな梗塞において、壁の全体的厚さが、発生心筋により置換された図23E~H。解剖学的には、長軸および腔直径は、2群の梗塞マウスで同様であり、治療的介入が積極的な心室リモデリングを促進したことが示される。この概念は、処置マウスにおける60という大きな梗塞サイズと一致する。加えて、壁厚対腔半径比は、非処置マウスより処置マウスで低下が少なかった。この関連性は、処置マウスにおいてLV拡張終期圧の上昇がより小さかったことと合わせて、この群における拡張期壁応力の増加を有意に緩和した図67。原始細胞を、モノクローナルc-kitおよびMDR1抗体で標識した82、83。BrdU取込みを、BrdU抗体により検出した61、87。抗第VIII因子を用いて内皮細胞を、そして抗α-平滑筋アクチンを用いて平滑筋を認識させた。筋細胞分化については、ネスチン、デスミン、心臓ミオシン、α-筋節アクチン、N-カドヘリンおよびコネキシン43抗体を使用した。梗塞内の瘢痕形成は、抗コラーゲンI型と抗コラーゲンIII型との混合物により検出した83、61、87。修復心筋の組成を、形態計測により評価した。筋細胞、内皮細胞、および平滑筋に特異的な抗体を、実質細胞および血管プロファイルの認識に使用した61、87。更に、細胞のBrdU標識を、経時的な再生組織のマーカとして使用した。筋細胞が、バンドの84±3を、冠血管構造が12±3を、そしてその他の構成成分が4±1を占めた。新たな筋細胞は、600~7,200μm3で変動し、平均容積は2,200±400μm3であった図68および69。合わせると、筋細胞3.1±1.1×106個が形成され、2.4±0.8×106個の細胞の喪失を補てんした。このわずかに過剰な細胞再生は、筋細胞サイズと矛盾していた。偽手術心臓において、筋細胞容積の18,000±3,600μm3は、増殖細胞の8.2倍であった。重要なこととして、筋量喪失の16が、梗塞後16日で再構成された喪失筋量:18,000×2.4×106=43mm3;再生筋量:2,200×3.1×106=7.0mm3;7.0:43=16。新たな筋細胞は、依然として成熟中であったが、インビボでは超音波心臓検査で、そしてインビトロでは機械的検査で実証された通り、機能的コンピテントであった。超音波心臓検査を、13-MHz線形トランスデューサを備えたAcusonSequoia256cを使用することにより、覚醒マウスにおいて実施した87。乳頭筋の位置で傍胸骨短軸から二次元2D画像およびMモードトレーシングを記録した。駆出率EFを、2D短軸視像におけるLV断面積から得た。EF=[LVDA-LVSA/LVDA]×100式中、LVDAおよびLVSAは、心臓拡張期および収縮期におけるLV面積に対応する。血行動態測定では、マウスを麻酔し、チャート式記録計に接続されたMillerマイクロチップ圧力トランデューサをLVに進入させ、非開胸処置において圧力、ならびにおよび-dP/dtを評価した。15日目に実施された超音波心臓検査から、処置された梗塞壁の再生部分において収縮作用が一部回復されたことが示された。駆出率も、非処置マウスよりも処置マウスで高くなった図24A~E。即ち、構造的修復は、機能的修復を伴った。新たな筋細胞が機能的コンピテンスに達して、心室性能の向上に寄与したことを確認するために、これらの細胞を、壁の梗塞領域の再生心筋から酵素作用により解離して129、収縮的挙動をインビトロで評価した124、130。梗塞処置マウスn=10からコラゲナーゼ消化により単離した筋細胞を、1.0mMのCa2を含む細胞浴30±0.2°Cに入れ、0.5Hzの方形脱分極パルスにより心臓拡張閾値の2倍の強度で3~5msの期間刺激した。パラメータは、コンピュータに記憶させたビデオ画像から取得した124、130。発生筋細胞は小さく、筋原繊維は筋細胞膜下領域内の細胞の周囲に位置した。新たな筋細胞は、新生仔細胞に類似し、DNAを活発に複製した。それらは、温存された肥大心室筋細胞よりも著しく小さかった図25AおよびB。生存している古い筋細胞と比較して、増殖中の細胞は、最大短縮および短縮速度が大きく、最大短縮までの時間が短かった図25C~J。単離された、新たに生成された筋細胞をKi67で染色して、これらの細胞が細胞周期中であり、それゆえDNAを合成しているかを決定した。梗塞処置マウスの単離された生存肥大筋細胞に理想的なプロトコルを、適用した。これに基づき、単核細胞および二核細胞における各筋細胞核のDNA量を、PI染色および共焦点顕微鏡検査により評価した図25AおよびB。対照の2倍体マウスリンパ球を、ベースラインとして使用した。目的は、細胞系列への分化決定の前にCSC中で細胞融合が起こるか確認することである。この可能性は、近年、インビトロ試験により示唆された131、132。周期中でない新たな筋細胞および肥大した温存された細胞は、2倍体核のみを有し、そのような現象が心修復における役割を担うことは、除外された図66。バンド内の成熟中の筋細胞の分化レベルを確定するために、ネスチン、デスミン、心臓ミオシン重鎖、α-筋節アクチン、N-カドヘリン、およびコネキシン43の発現を、評価した。N-カドヘリンは、筋膜接着を同定し、コネキシン43は、介在板内の細隙結合を同定する。これらの蛋白質は、発生の過程で調節される。コネキシン43は、筋細胞の電気的結合および収縮の同調性にとっても不可欠である。これら6種の蛋白質は、新たに形成された筋細胞の実質的に全てで検出された図26A~N。BrdUにより標識された筋細胞の百分比は、84±9であり、再生組織において細胞増殖が進行中であることが示された。心修復には、毛細血管および細動脈の形成が含まれた図27A~D。管腔内の赤血球の存在は、血管が冠血管循環に連結していることを示した。しかし、この段階の心筋回復は、毛細血管構造よりも抵抗細動脈の優勢な成長を特徴とした。新たな心筋1mm2あたり、59±29個の細動脈および137±80個の毛細血管が存在した。現在の所見は、常在性CSCがその貯蔵域から動員され、梗塞心筋においてコロニー形成し、そこで心臓細胞系列に分化し、組織再生をもたらすことを示す可能性がある。ここで使われた介入は、通常はホ乳類の生命と適合しない梗塞サイズの動物を救うことができた。実施例9:心臓幹細胞はインビトロで分化し、インビボで機能的コンピテンスを獲得するA.細胞の回収およびクローニング心臓細胞を、20~25月齢雌フィッシャーラットから単離した111、112。インタクト細胞を分離し、筋細胞を除去した。小細胞を再懸濁させ、凝集体をろ過器で除去した。細胞を、膜の外面に局在するN末端エピトープを認識するウサギc-kit抗体H300、SantaCruzと共にインキュベートした121。細胞を、抗ウサギIgGDynalでコーティングされた磁気ビーズに暴露し、c-kitPOS細胞を、磁石を使って回収したn=13。FACSn=4については、細胞を、r-フィコエリトリンコンジュゲートラットモノクローナル抗c-kitPharmingenで染色した。両方法を用いれば、c-kitPOS細胞は、小細胞集団の6~9で変動した。c-kitPOS細胞は、筋細胞α-筋節アクチン、心臓ミオシン、デスミン、α-心臓アクチニン、コネキシン43、内皮細胞EC;第VIII因子、CD31、ビメンチン、平滑筋細胞SMC;α-平滑筋アクチン、デスミン、および線維芽細胞F;ビメンチン細胞質蛋白質に対して陰性を示した。筋細胞系列の核マーカNkx2.5、MEF2、GATA-4は、細胞の7~10において、細胞質蛋白質は、細胞の1~2において検出された。c-kitPOS細胞は、骨格筋転写因子MyoD、ミオゲニン、Myf5、即ち、骨髄、リンパ球および赤血球細胞系列のマーカCD45、CD45RO、CD8、TER-119を発現せず、細胞がLin-c-kitPOS細胞であることが示された。c-kitPOS細胞を、1~2×104細胞/mlNSCMで播種して、神経幹細胞の選択および増殖に用いた122。これは、ダルベッコMEMおよびハムF12比1:1、10ng/mlbFGF、20ng/mlEGF、5mMHEPES、インスリン-トランスフェリン-セレナイトにより構成された。c-kitPOS細胞は、2週間以内に付着し、増殖を開始した図28a、b。その後、NSCMを分化培地DMと交換し、7~10日間でコンフルエンスに達した。細胞を、トリプシン処理により継代した。Ki67発現により決定される細胞周期中の細胞は、各代PP1~P5各Pにおいてn=5で74±12~84±8で変動した。P2およびP4における倍増時間は、平均41時間であった。細胞は、増殖停止および老齢期に達することなくP23まで分裂し続け、その時点で細胞を凍結した。心臓細胞系列は、P0~P23で同定された。P0n=7、P3n=10、P10n=13およびP23n=13において、筋細胞は29~40、ECは20~26、SMCは18~23、およびFは9~16であった。液体窒素中で6ヶ月後に増殖したP23のアリコートは、親細胞と同じ表現型を発現した。DM中で増殖させた場合のP0およびP1において、細胞の50がNkx2.5を、60がMEF2を、30がGATA-4を、および55がGATA-5を示した図28c~f。反対に、骨格筋MyoD、ミオゲニン、Myf5、血液細胞CD45、CD45RO、CD8、TER-119、および神経MAP1b、神経フィラメント200、GFAPマーカは、同定されなかった。クローニングのために、細胞を10~50個/mlNSCMで播種した図28g109、110。1週間後、単一の細胞に由来するコロニーを認識させると図28h、フィブロネクチン、プロコラーゲンI型およびビメンチンは存在せず、線維芽細胞系列が除外された。個々のコロニーをクローニングシリンダにより剥離し、播種した。複数のクローンが発生し、各調製物において1つのクローンを選択し、特徴づけを行った。10FCSおよび10-8Mデキサメタゾンを含有するMEMを用いて、分化を誘発したDM。サブクローニングのために、複数クローン由来の細胞を、10~50細胞/mlNSCMで播種した。単一のサブクローンを単離し、DM中で播種した。各サブクローニングステップで、細胞アリコートを懸濁液中で増殖させ、クローン球を発生させた。各クローンは、Lin-c-kitPOS細胞2~3個の群を複数含んでいたが図29a、これら細胞の大部分約20~50個はc-kitNEG細胞の中に分散されていた。一部の細胞はKi67陽性であり、有糸分裂中のものもあった図29b~d。心臓ミオシンおよびα-筋節アクチンを発現する筋細胞、第VIII因子、CD31およびビメンチンを発現するEC、α-平滑筋アクチンを発現するSMC、ならびにビメンチンのみを発現するFが、各クローンにおいて同定された図29e~h。ネスチンを含有する小細胞の凝集体も、存在した補足情報。つまり、心筋から単離されたLin-c-kitPOS細胞は、幹細胞について予測された特性を有した。それらは、クローン原性、自己再生性および多能性であり、主要心臓細胞型の起源を与えた。数個の一次クローンをサブクローン分析し、一次クローンの表現型の安定性、つまりクローン原性、自己再生性および多能性を確認した。ほとんどのクローンの表現型は、一次クローンのものと区別されなかった。しかし、8個のサブクローンのうち2個において、一方では筋細胞のみが得られ、他方では独占的にECが同定された。コーニング非処理皿内の懸濁液中で増殖させたクローン原性細胞は、球状クローンを生成した図30a。この固定剤非依存性の増殖は、幹細胞に典型的である14,15。球状体は、c-kitPOSおよびc-kitNEG細胞のクラスターと、多量のネスチンとから構成されていた図30b~d。他の幹細胞と同様に14,15、DMに播種した後、球状体は容易に付着し、細胞は球状体の外に遊走し、分化した図30e~h。細胞を、4パラホルムアルデヒド中に固定し、未分化細胞を、c-kit抗体で標識した。筋細胞用マーカは、Nkx2.5、MEF2、GATA-4、GATA-5、ネスチン、α-筋節アクチン、α-心臓アクチニン、デスミンおよび心臓ミオシン重鎖などであった。SMC用マーカは、α-平滑筋アクチンおよびデスミン、EC用は第VIII因子、CD31およびビメンチン、F用は第VIII因子の非存在下のビメンチン、フィブロネクチン、およびプロコラーゲンI型で構成した。MyoD、ミオゲニンおよびMyf5を、骨格筋細胞マーカとして使用した。CD45、CD45RO、CD8およびTER-119を使用して、造血細胞系列を除外した。MAP1b、神経フィラメント200およびGFAPを使用して、神経細胞系列を認識した。BrdUおよびKi67を使用して、細胞周期中の細胞を同定した61、87。核を、PIにより染色した。筋細胞およびSMCは、インビトロで収縮することができなかった。アンジオテンシンII、イソプロテレノール、ノルエピネフリンおよび電気刺激は、収縮を促進しなかった。ECは、eNOSなどの完全分化マーカを発現しなかった。B.心筋梗塞および細胞移植BrdU標識細胞P2;陽性細胞=88±6を移植した。心筋梗塞を、2月齢の雌フィッシャーラットにおいて作製した111。5時間後に、ラット22匹の梗塞を境界とする両側に、2×105個の細胞を注射し、12匹は10日目に、10匹は20日目に屠殺した。各期間に、梗塞ラット8~9匹および偽手術ラット10匹に生理食塩水を注射し、5匹にLin-c-kitNEG細胞を注射し、対照として用いた。20日後に殺処分したラットのみで、ケタミン麻酔下、9日後と19日後に超音波心臓検査を実施した。Mモードトレーシングから、LV拡張終期の直径および壁厚を得た。駆出率を、計算した87。10日目および20日目に、動物を麻酔して、非開胸処置においてLV圧、ならびにおよび-dP/dtを評価した111。術後10日目および20日目において、致死率は、非処置ラットよりも処置ラットで低かったが、統計的な有意性はなく、全群合わせて平均35であった。プロトコルは、治験審査委員会により認可されたものであった。C.解剖学的および機能的結果心臓を拡張期に停止させ、ホリマリンで固定した。梗塞サイズは、左心室から喪失された筋細胞の比率により87、10日目には処置ラットおよび非処置ラットにおいてそれぞれ53±7および49±10NS、20日目には処置ラットおよび非処置ラットにおいてそれぞれ70±9および55±10P<0.001と決定された。各心臓において、新たな筋細胞400個の容積を測定した。断片を、デスミンおよびラミニンおよびPIで染色した。核が中央に位置し長軸方向に配列された筋細胞において、核を通る細胞長および直径を収集して、細胞容積を計算した87。断片を、BrdUおよびKi67抗体と共にインキュベートした。10日目の処置梗塞12個のうち9個において、そして20日目の処置梗塞10個全てにおいて、再生した心筋のバンドが、同定された。10日目では、バンドは薄く不連続であったが、20日目では、より太くなり、梗塞領域全体に存在した図31a~c。筋細胞M、EC、SMCおよびFは、それぞれ心臓ミオシン、第VIII因子、α-平滑筋アクチン、および第VIII因子の非存在下でのビメンチンにより同定した。筋細胞は、心臓ミオシン抗体およびヨウ化プロピジウムPIによっても同定した。10日目および20日目に、それぞれ30mm3および48mm3の新たな心筋が、測定された。組織再生により、梗塞サイズが10日目に53±7から40±5にP<0.001、そして20日目には70±9から48±7にP<0.001縮小した。BrdUおよびKi67により標識された細胞を、共焦点顕微鏡検査により同定した103、105。BrdU標識のために抽出された核数は:M=5,229;EC=3,572;SMC=4,010;F=5,529であった。Ki67の対応する値は:M=9,290;EC=9,103;SMC=8,392であった。筋細胞分化は、心臓ミオシン、α-筋節アクチン、α-心筋アクチニン、N-カドヘリンおよびコネキシン43を用いて確認した。コラーゲンは、コラーゲンI型およびIII型抗体により検出した。移植細胞を、BrdUにより標識したため、発生心筋内の細胞の起源を、このマーカにより同定した。筋細胞、細動脈図31f~nおよび毛細血管プロファイルを、検出した。10日目は、20日後よりも筋細胞、毛細血管および細動脈の割合が低く、コラーゲンは高かった。Ki67により評価された細胞増殖は、10日目は増大し、20日目には減少した補足情報。心臓ミオシン、α-筋節アクチン、α-心臓アクチニン、N-カドヘリンおよびコネキシン43が、筋細胞において検出された図31o~p;補足情報。10日目は、筋細胞は小さく、筋節はほとんど検出されず、N-カドヘリンおよびコネキシン43はほとんどが細胞質中に存在していた図31o。筋細胞容積は、平均で1,500μm3であり、筋細胞13.9×106個が、形成された。20日目は、筋細胞は密集し、筋原線維はより豊富になり、N-カドヘリンおよびコネキシン43が、筋膜接着および介在板のネクサスを画定した図31p。筋細胞容積は、平均で3,400μm3であり、13×106個の筋細胞が存在した。筋細胞アポトーシスを、単一塩基が突出したヘアピン型オリゴヌクレオチドプローブのインサイチュライゲーションより測定した。アポトーシス用に抽出された核の数は、10日目で30,464個、20日目で12,760個であった。10日目から20日目までの筋細胞数の保存は、Ki67標識の減少、およびアポトーシスの増加と一致していた0.33±0.23に対して0.85±0.31、P<0.001。つまり、初期は筋細胞増殖が優勢であり、後には筋細胞肥大が優勢となった。10日目~20日目に、血管数がほぼ倍増された。新たな筋細胞の機械的特性を決定する手順は、既に記載されている30。梗塞処置ラットn=4から単離された筋細胞を、1.0mMCa2を含む細胞浴30±0.2°C内で播種し、0.5Hzの方形脱分極パルスにより、心臓拡張期閾値の2倍の強度で3~5msの期間刺激した。コンピュータに記憶させたビデオ画像から、機械的パラメータを取得した。処置された心臓の梗塞領域および非梗塞領域から単離された筋細胞の機械的挙動を、20日目に測定した図32a~e。新しい細胞はカルシウム耐性があり、刺激に応答した。しかし、温存された筋細胞と比較すると、成熟中の細胞は、最大短縮および短縮速度が低く、最大短縮までの時間および50再伸長までの時間は、2群の細胞で同様であった図33a~l。発生筋細胞は、ほとんど周囲に分布した筋原線維を有し、筋節線紋が明らかであった図32a~e。細胞移植により、梗塞サイズおよび腔拡張は減少し、壁厚および駆出率は増加した。20日目に、収縮が、梗塞心室壁において再現され、拡張終期圧、発生圧、ならびにおよび-dP/dtは、改善した。拡張期応力は、処置ラットにおいて52低かった補足情報。つまり、心修復により促進された構造的および機能的改変により、拡張期負荷が低下し、心室性能が向上した。梗塞サイズはラットの2つの群で同様であったにもかかわらず、この有益な効果が生じた。移植細胞のコロニー形成、複製、分化、および組織再生には、c-kitPOS細胞および損傷心筋が必要であった。偽手術ラットに注射されたc-kitPOS細胞は、グラフトが不十分であり、分化しなかった。梗塞の周辺へのc-kitNEG細胞の注射は、心修復に効果がなかった。本明細書で報告されるLin-c-kitPOS細胞の多能性表現型は、ニワトリ113、ゼブラフィッシュ114、およびホ乳類115における心臓細胞系列決定と明らかに反するものになり、筋細胞、SMC、およびECのそれぞれが、別個の系列を起源とすることが結論づけられる。しかし、全ての研究が一致しているわけではない116。これらの実験113、114、115、116は、本明細書において実施された通り、マーキングされた細胞のいずれかの発生可能性を扱っているわけではないため、異なる結果は、正常な発生運命と発生可能性との差の別例を表している可能性がある。加えて、損傷心筋を修復する手段としての、ヒト胚性幹細胞117、プロジェニター内皮細胞101およびクローン原性細胞52の柔軟性が、近年になり証明されている101、52。実施例10:増殖因子による心臓幹細胞CSCの動員は覚醒イヌにおいて梗塞心筋の修復を促進し、局部的および全体的心機能を改善する上述の非限定的な実施例の方法を、下記の例外を含みながら使用した。げっ歯類における梗塞後の幹細胞ホーミングおよび分化による心筋再生は、同様のタイプの心臓修復が大型ホ乳類に起こるか、という疑問には答えていない。更に、新たな心筋が、梗塞部分の機能異常に作用して収縮を回復し得るかについても、未知である。この目的で、血行動態および局部的壁機能を測定するために、イヌに慢性的に計器を取り付けた。拍出量およびEFも、測定した。左前下行冠動脈の付近で水圧オクルダーを膨張させることにより、心筋梗塞を誘発させた。4時間後、HGFおよびIGF-1を境界域に注射し、幹細胞を動員および活性化し、その後、イヌを最長30日間モニタリングした。増殖因子により慢性的な心臓修復が導入され、梗塞の膨張が後退し、セグメント短縮は-2.0±0.7から5.5±2.2に、拍出力は-18±11から53±10mm×mmHgに、拍出量は22±2から45±4mlに、駆出率は39±3から64±4に上昇した。梗塞後8時間目の処置イヌにおいて、原始細胞数が、ベースラインの240±40個から1700±400個遠隔心筋、4400±1200個境界域、および3100±900個梗塞領域のc-kit陽性細胞/100mm2に増加した。Ki67標識は、遠隔、隣接、および梗塞心筋の、それぞれ48、46および26のc-kit陽性細胞において検出された。つまり、これらの細胞は、高度に複製されていた。このような効果は、梗塞非処置イヌにおいて、実質的になかった。急性実験に、冠動脈閉塞後10~30日目の移植結晶implantedcrystalsにより定義された梗塞心筋の定量分析を補足した。新たな心筋における奇異性運動から正常収縮への変化は、400~16,000μm3のサイズで変動し、平均容積2,000±640μm3である筋細胞の生成を特徴とした。BrdU標識された内皮および平滑筋細胞を含む抵抗血管は、87±48/mm2組織であった。毛細血管は、細動脈の2~3倍存在した。合わせると、梗塞の16±9が、健常な心筋により置換された。つまり、イヌ科常在性原始細胞は、貯蔵部位から動員され、死滅心筋に到達することができる。幹細胞の活性化および分化により、梗塞心臓の修復が促進され、局所的な壁運動および全身的な血行動態が改善される。実施例11:常在性心臓幹細胞の動員は梗塞心臓におけるアンジオテンシンII遮断に対する重要な追加的処置を構成する上述の非限定的な実施例の方法を、下記の例外を含みながら使用した。心筋梗塞MIの主要な合併要因の2つは、筋量喪失と腔拡張であり、両者ともネガティブな左心室LVリモデリングと心性能の低下に寄与する。これらのMIの悪影響を阻止しようとして、常在性心臓幹細胞CSCを動員および活性化して組織再生を促進し、AT1受容体遮断薬ロサルタンLosを20mg/kg体重/日で投与して細胞肥大と、それによる腔容積の増加を抑制した。これに基づき、MIをマウスにおいて作製し、動物を4群に再分別した:1.偽手術SO;2.MIのみ;3.MI-Los;4.Mi-Los-CSC。MI後1ヶ月目に、動物を屠殺し、LV機能、梗塞寸法、心臓リモデリングを評価した。CSC処置マウスにおいて、心筋再生も測定した。LVが失った筋細胞の数に基づく梗塞サイズは、MIで47、MI-Losで51、およびMi-Los-CSCで53であった。MIおよびMI-Losと比較し、LosおよびCSCで処置されたMIでは、腔直径がMIに対して-17およびMI-Losに対して-12、長軸がMIに対して-26p<0.001およびMI-Losに対して-8p<0.002、腔容積がMIに対して-40p<0.01およびMI-Losに対して-35p<0.04と、損傷心臓よりも好適な転帰が得られた。LV量対腔容積比は、MIおよびMI-LosよりもMI-Los-CSCにおいてそれぞれ47p<0.01および56p<0.01高かった。MI-Los-CSCにおける組織修復は、900μm3の新たな筋細胞10×106個で構成された。更に、このマウス群において、心筋1mm2あたり細動脈70個および毛細血管200個が存在した。9mm3の新たな心筋が生成され、MIサイズは22減少し、LVは53から41となった。超音波心臓検査によれば、MI-Los-CSCマウスの壁の梗塞領域において、収縮機能が再現された。血行動態検査によれば、MI-Los-CSCマウスは、LVEDPが低く、および-dP/dtが高かった。結論として、心室リモデリングに及ぼすロサルタンの肯定的影響は、梗塞領域へのCSC移行を介した心修復過程により増強される。動員されたCSCは、梗塞サイズおよび心室拡張を低減し、それにより梗塞心臓の収縮挙動を更に向上させる。実施例12:肝細胞増殖因子HGFはc-metの核への移行を誘発し、GATA-4の発現および心臓幹細胞CSC分化を活性化する上述の非限定的な実施例の方法を、下記の例外を含みながら使用した。予備試験において、著者らは、c-kitまたはMDR-1に対して陽性のCSCが表面受容体c-metを発現することを証明することができた。c-metは、HGFの受容体であり、リガンド結合は、マトリックスメタロプロテアーゼの合成を介して細胞運動性を促進した。しかし、c-met活性化がCSCの生態および機能に更なる影響を有するかは、知られていない。この目的で、NSCMにおいて50ng/mlのHGFに暴露されたCSC上のc-metが、細胞内内在化および移行により増殖因子に応答するかを試験した。驚くべきことに、原始的特性を維持したこれらの被刺激細胞において、c-metの核内局在化が、共焦点顕微鏡検査により検出された。HGFがc-metに及ぼすこの異例の影響により、動員された受容体が他の核内蛋白質と相互作用して、CSCの細胞増殖および分化に関与し得る可能性が生じた。細胞系列の分化決定における心特異的転写因子GATA-4の重要な役割から、免疫沈降およびウエスタンブロット法により、c-metおよびGATA-4により生成された蛋白質複合体を同定した。1回のHGF刺激に続く時間依存性分析により、c-met-GATA-4複合体が15分から3日目までに漸増したことが示された。時間を、原始細胞の、筋細胞および他の心臓細胞への分化とも結びつけた。GATA-4とc-metのDNAレベルの間の分子内相互作用を確定するために、HGFで1時間刺激された細胞から単離された核抽出物に、ゲルシフトアッセイを実施した。GATA配列を含むプローブを用いて、シフトしたバンドを得た。しかし、GATA-4抗体の追加により、極度にシフトしたバンドが得られた。反対に、c-met抗体の包含により、GATAバンドの光学密度は低減した。TATAボックス上流のGATA配列が、c-metプロモータにおいて同定されたため、第二移動性シフトアッセイを実施した。この場合、HGF刺激細胞由来の核抽出物は、c-met抗体により軽減されたバンドシフトをもたらした。反対に、GATA-4抗体は、極度にシフトしたバンドを誘発した。即ち、核レベルでのHGF介在c-met移行は、c-metに転写因子機能を授与することができ、今後の試験では、このDNA結合がGATA-4発現を増強し、未成熟心臓細胞の分化をもたらすかを実証することになろう。実施例13:ヒト心臓幹細胞の単離および増殖、ならびにそれに有用な培地の調製作業室内の滅菌条件下で、心筋組織平均重量1g以下を採取した。DMEM/F12Cambrex12719F425~450ml、5~10の患者血清心耳組織と共に得られた患者血液100~150mlから得られた血清50~75ml、20ng/mlヒト組換えbFGFPeprotech10018B、20ng/mlヒト組換えEGFSigmaE9644、5μg/mlインスリンRayBiotechIP01270、5μg/mlトランスフェリンRayBiotechIP03363、5ng/ml亜セレン酸ナトリウムSigmaS5261、1.22mg/mlウリジンSigmaU3003、および1.34mg/mlイノシンSigmaI1024を使って、増殖培地を調製した。増殖培地を充填した滅菌ペトリ皿内に組織を浸漬し、その後、滅菌条件下で小片200~400mgに切断した。その後、各組織片を、凍結培地1mlを含む1.2ml低温保存バイアルに移した凍結培地は、増殖培地とDMSOとの容積比9:1の混合物、例えば、培地9mlとDMSO1mlの混合物で構成された。低温保存バイアルを、-70°C~-80°Cに予冷したナルゲン容器内で凍結させ、その後、-70°C~-80°Cで少なくとも3日間貯蔵した。37°Cに加温された水浴内に蒸留水中の70エタノール溶液を含有する容器に浸漬することにより、試料を37°Cで解凍した。2分後、バイアルをフード下に置き、開封して、ピペッティングにより上澄みを除去し、室温に保たれた標準生理食塩水で置換した。その後、試料を100mmペトリ皿に移し、生理食塩水で2回洗浄した。Steri250Inotechで滅菌したピンセットを使用して、心標本から線維組織および脂肪を手作業で分離した。その後、試料を増殖培地に移し、1~2mm2の薄片に細断した。上記の通り5~10ヒト血清で富養化した増殖培地を含有する、カバーガラス下の非コーティングディッシュに、薄片を播種した。ペトリ皿を5CO2下37°Cのインキュベータに入れた。組織播種後1~2週間目に、CSCの成長は明らかとなった。細胞増殖の全期間にわたり週2回、増殖培地を交換した。培地を4°Cで貯蔵し、使用前に37°Cで加温した。合計8mlの培地を、100mmペトリ皿中で使用した。培養片または細胞により生成された調整培地を保存するために、1回に培地6mlのみを取出し、新鮮な培地6mlを添加した。更に2週間後、約5,000個の心筋細胞クラスターが、各組織断片を包囲すると予測された。サブコンフルエンス状態で、増殖培地を除去し、一皿あたりトリプシン0.25[Carnbrexカタログ番号10170;内毒素は無視し得るレベル]4mlを用いて、5~7分かけて細胞を剥離させた。血清含有培地6mlを用いて、反応を停止させた。その後、Myltenyi免疫磁気ビーズを使用して、細胞を選別し、c-kitPOS細胞を得た。抗c-kitH300sc5535SantaCruzを一次抗体として使用し、マイクロビーズとコンジュゲートさせた抗ウサギ抗体130048602Miltenyiを二次抗体として使用する間接法により、細胞選別を実施した。心筋試料から増殖した細胞を、15mlファルコンチューブに入れ、850g、4°Cで10分間遠心分離した。培地を除去し、細胞を10mlPBS中に再懸濁させた。細胞を再度、洗浄の目的で、850g、4°Cで10分間遠心分離した。PBSを除去し、細胞ペレットを975μlPBS中に再懸濁させてから、1.5ml試験管に移した。25μlの抗c-kit抗体25μgの抗体に相当H300sc5535SantaCruzを添加した。360度回転シェーカー中のバイアルにて、抗体と共に4°Cで1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を850g、4°Cで10分間遠心分離し、PBS1ml中に再懸濁させ、再度遠心分離した。その後、シェーカー内のバイアルを180度回転させながら、細胞を、免疫ビーズにコンジュゲートさせた二次抗体PBS80μlおよび抗体20μlと共に4°Cで45分間インキュベートした。インキュベーション後、PBS400μlを添加し、細胞懸濁液を分離カラムに通して磁気選別したMiltenyi130042201。c-kit陽性細胞はカラムに付着し、それを回収し、1.5ml試験管に入れた。細胞を遠心分離し、予め加温37°Cされた培地1mlに再懸濁させ、24ウェルプレートに播種した。その後、c-kit細胞を、増殖培地に播種して、増殖させた。3~4ヶ月後±1ヶ月、およそ百万個の細胞が得られた。増殖培地を、細胞増殖の全期間にわたり週2回交換した。培地は4°Cで貯蔵し、使用前に37°Cで加温した。合計1mlの培地を、24ウェル各々において使用した。所望の数の注射用細胞を得るために、細胞をサブコンフルエントで3回継代した:135mmペトリ皿に培地2mlを充填;260mmペトリ皿に培地4mlを充填;および3100mmペトリ皿に培地8mlを充填。培養細胞により生成された調整培地を保存するために、各継代で培地の2/3のみを交換した。c-kit細胞CSCの特性を、a転写因子、例えばGATA4、MEF2C、Etsl、およびGATA6、ならびにbその他の抗原、例えばa-筋節アクチン、トロポニンI、MHC、コネキシン43、N-カドヘリン、フォンヴィレブランド因子、平滑筋アクチンなどの、c-kitに対する抗体および心臓細胞系列の分化決定されたもの即ち、心臓の筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞のマーカに対する抗体を用いて、免疫細胞化学法およびFACSにより分析した。所望なら、その他のマーカおよび/またはflk-1などのエピトープについて、細胞を分析することもできる。CSCを活性化するために、CSCを、200ng/ml肝細胞増殖因子および200ng/mlインスリン様増殖因子-1を更に含有する増殖培地と共に、2時間インキュベートした。実施例14:ヒト心臓幹細胞の単離および増殖、ならびに心筋梗塞治療における使用先に記載された通り、心臓手術を受けた同意のある患者51人から、除去された心筋標本を入手した。試料を細断し、肝細胞増殖因子およびインスリン様増殖因子-1をそれぞれ200ng/mlおよび200ng/mlの濃度で補充された培地を含む非コーティングペトリ皿の表面に播種した。29例で、細胞の増殖に成功した。このサブセットにおいて、細胞増殖は、播種後約4日目に明らかとなり、約2週間目には細胞約5,000~7,000個のクラスターが、各組織片を包囲した図70A~C。組織から増殖した細胞を、免疫ビーズを用いてc-kitについて選別し、培養したBeltrami2003Linke2005。先に記載された通り、細胞表現型をFACSおよび免疫細胞化学法により定義したBeltrami2003Orlic2001Urbanek2005。選別したc-kitPOS細胞を固定し、心臓、骨格筋、神経、造血系の細胞系列のマーカについて試験して下記表1、系列陰性Lin--hCSCを検出したBeltrami2003Linke2005Urbanek2005。P0の心筋試料由来の細胞増殖画分は、幹細胞抗原c-kit、MDR1およびSca-1様を発現し図70D~F、これらは、それぞれ細胞集団全体の1.8±1.7、0.5±0.7、1.3±1.9を構成した。これらの細胞は、CD133、CD34、CD45、CD45RO、CD8、CD20およびグリコホリンAを含む造血細胞マーカに対して陰性であった下記表1。心転写因子GATA4および筋細胞転写因子MEF2Cは、これらの細胞の一部に存在した。細胞の大部分が、筋細胞、SMC、およびECの細胞質蛋白質を発現した。一部の細胞が、神経フィラメント200に対して陽性であった図70G~J。未分画細胞のFACS分析で、免疫標識により得られたデータを確認した。細胞化学のために、可能な場合には、交差反応および自己蛍光を防ぐために、抗体を蛍光色素または量子ドットにより直接標識した表1、オンラインLinke2005Urbanek2005。未分画細胞およびc-kitPOS細胞のFACSに使用した抗体を、表2に列挙するBeltrami2003Urbanek2005。動物における過去の結果からBeltrami2001Linke2005、免疫ビーズを用いて細胞をP0でc-kitについて選別した。c-kitPOS細胞は、Lin-細胞52±12および早期分化決定細胞48±12を含んだ図71A。ヒト血清の存在下で播種されたc-kitPOS細胞は、急速に付着し、P8まで増殖し続け、細胞集団は約25回倍増した。細胞は安定した表現型を維持し、P8において増殖停止または老齢期に達しなかった。c-kitPOS細胞の百分比は、P1からP8まで変動せず、平均71±8であった。細胞周期中のKi67POS細胞図71Bは、P1からP8まで一定していて、平均48±10であった。しかし、細胞の6±4は、細胞老化マーカであるp16INK4aを発現した図71C。FACS分析により、c-kitPOS細胞が造血細胞系列に対して陰性を保ち、大部分が、トランスフェリン受容体CD71を発現し、これがKi67と密接に相関する図71Dことが示された。未分化状態のc-kitPOS細胞63±6が、心臓細胞の核蛋白質および細胞質蛋白質の非存在により確定された表1。幹細胞性を示す中間径のフィラメントネスチンが、62±14のc-kitPOS細胞において見出された図71E~G。クローニングアッセイヒトc-kitPOS細胞を、P0で選別し、顕微鏡による制御下で、個々のc-kitPOS細胞を、テラサキプレートの各ウェルに0.25~0.5個/ウェルの密度で播種した図71HBeltrami2003Linke2005。1を超える細胞を含有するウェルは、除外し、定着されるc-kitPOS細胞の50±10が、Lin-であった。BrdU10μMを1日3回、5日間にわたり添加したBeltrami2003Linke2005。約3~4週間後、53個の小クローンが、6,700個の単一播種細胞から産生された。つまり、c-kitPOS-hCSCは、0.8クローニング効率を有した。クローン中の細胞数は、200~1,000で変動した図71I。クローン53個のうち12個は、更に増殖しなかった。残りのクローン41個は、増殖して、免疫細胞化学法により特徴づけられた。倍増時間は29±10時間であり、5日後の細胞の90±7が、BrdUPOSであった。デキサメタゾンを使用して、分化を誘発しBeltrami2003Linke2005、その結果、心臓細胞系が、検出された。それらは、筋細胞、SMC、およびECを含んでいた図71J。筋細胞は、優勢な細胞集団であり、ECおよびSMCが、それに続いた図75。心筋梗塞心筋梗塞を、標準的な免疫抑制レジメンZimmermann2002で処置された麻酔下の雌免疫欠損スキッドマウスUrbanek2005およびフィッシャー344ラットBeltrami2003において作製した。c-kitPOS細胞を、先に記載された通り心臓手術を受けた患者8名の心筋試料約3標本/患者から単離し、増殖させた。これらの試験において、c-kitPOS細胞約200,000個を、各試料から入手する際に、c-kitPOS細胞を、P2で回収した。このプロトコルには、約7週間を要した。冠動脈閉塞後まもなく、約40,000個のヒトc-kitPOS細胞を、境界域の両側で2箇所に注射したBeltrami2003Orlic2001Lanza2004。動物をBrdUに暴露し、梗塞および細胞移植後2~3週間で屠殺したBeltrami2003Orlic2001Urbanek2005Lanza2004。超音波心臓検査を実施し、その2~3日後に、左心室LV圧およびdP/dtを測定したBeltrami2003Orlic2001Urbanek2005Lanza2004。心臓を拡張期に停止させ、ホルマリンでの潅流により固定した。各心臓において、梗塞サイズ、ならびにヒト筋細胞、細動脈、および毛細血管の形成を測定したAnversa2002。修復が、処置マウス25匹中17匹68および処置ラット19匹中14匹74において得られた。梗塞再構成の失敗を適正に解釈するために、c-kitPOS細胞を、ローダミン標識小球体と共に注射して、注射部位および細胞の適正投与を確認したLeri2005Kajtsura2005。処置に失敗した動物は、処置に成功した動物の適当な対照と見なされた。完全にするために、免疫欠損梗塞マウス12匹および免疫抑制梗塞ラット9匹にPBSを注射し、追加対照として使用した。梗塞サイズは、全群で同様であり、マウスでは平均48±9、ラットでは平均52±12であった。ヒト心筋は全ての例に存在し、ヒトc-kitPOS細胞が、梗塞マウスおよびラットの境界域内に適切に送達されていた。ヒト心筋のこれらの病巣は、梗塞内に位置し、Aluプロープを用いたヒトDNA配列の検出により認識されたJust2003。喪失心筋の再構成の程度は、マウスにおいて1.3±0.9mm3、ラットにおいて3.7±2.9mm3であった図72A~C。新たに形成された細胞の蓄積は、構造のBrdU標識によっても決定し、BrdUは、観察期間全体を通して動物に与えた。ヒトc-kitPOS細胞は、患者8名から得たが、様々なヒト細胞について心修復の程度に明らかな差はなかった。組織再生の変動性は、細胞の供給源と独立しており、その他の要因が処置された心臓の回復に影響を及ぼしたことが示唆される。ヒト心筋の形成を、処置ラットの心壁の梗塞部分におけるヒトAluDNA配列の認識により確認した。加えて、ヒトMLC2vDNA配列を、ヒトAluDNAと共に同定した図72D。同じ動物における生存心筋は、ヒトAluまたはヒトMLC2vDNA配列を含まなかった。生存可能な心筋は、ラットMLC2vDNAを示した。処置マウスにおいて、ヒト心筋は、密集した筋細胞からなり、それが新組織の84±6を占める一方、抵抗細動脈および毛細血管プロファイルは、合わせて7±3を占めた。処置ラットの対応する値は、83±8および8±4であった。単離されたヒト血管プロファイルと共にSMCおよびECを検出したが、それらは梗塞全体に散在されていた図76。注射に失敗した梗塞マウスおよびラット、またはPBSで処置された動物においては、ヒト筋細胞、SMCおよびECは、検出されなかった。インサイチュハイブリダイゼーションおよびPCRヒト細胞を、ヒト特異的Alu反復配列に対するFITC標識プローブBiogenexを用いたインサイチュハイブリダイゼーションにより検出したJust2003。加えて、ヒトX染色体、ならびにマウスおよびラットX染色体を、同定したQuaini2002。DNAを、ヒト細胞で処置されたラットの生存可能なLVおよび梗塞LVの組織片から抽出した。ヒトAlu長さおよそ300塩基対であり、霊長類ゲノムに特異的に見出され、10を超えるヒトゲノムに存在し、ヒトにおいては平均距離4kbで位置する、ならびにラットおよびヒトミオシン軽鎖2v配列についてPCRを実施した下記表3参照。二次抗体による非特異的標識を避けるため、ほとんどの一次抗体を、蛍光色素により直接標識した表1。この予防策にもかかわらず、組織片に内在する微量の自己蛍光を排除することは、このアプローチでは不可能であるLeri2005Linke2005Urbanek2005。このアーチファクトの原因を除外するために、可能な場合は、一次抗体を量子ドットにコンジュゲートさせ;これらの半導体粒子の励起波長および発光波長を自己蛍光の範囲外とし、変数混同を排除するLeri2005。量子ドット標識は、再生されたヒト心筋バンド内の心筋細胞、SMCおよびECの転写因子、細胞質蛋白質および膜蛋白質の同定に適用した。Aluプローブによるヒト細胞の認識に続き、心臓ミオシン重鎖およびトロポニンIを、転写因子GATA4およびMEF2Cと共に新たな筋細胞中で検出した。加えて、結合蛋白質コネキシン43およびN-カドヘリンを、これらの発生筋細胞の表面で同定した図72E~J。ラミニンも、間質において明らかとなった。ヒト筋細胞は、両動物モデルにおいて100~2,900μm3のサイズで著しく変動した図77。雌性ヒト細胞を、雌梗塞マウスおよびラットに注射した。それゆえ、ヒトX染色体も、マウスおよびラットX染色体と共に同定し、ヒト細胞とマウスまたはラット細胞との融合が検出された。ヒトX染色体とマウスまたはラットX染色体の共局在は、新たに形成された筋細胞、冠細動脈および毛細血管プロファイルにおいてはなんら認められなかった図73H~M。重要なこととして、ヒト筋細胞、SMCおよびECは、最大2つのX染色体を持っていた。それゆえ細胞融合は、キメラ梗塞心臓におけるヒト心筋の形成に、重要な役割を担っていなかった。ヒト心筋の特徴ヒトc-kitPOS細胞の注射により媒介される血管形成を、ヒトSMCおよびECのみで構成される冠細動脈および毛細血管により証明した図73A~F。マウスまたはラット冠血管構造において、ヒトSMCとECとの目視可能な完全性は存在しなかった。ヒト細胞および非ヒト細胞により形成された血管が見出された例はなかった。ヒト細動脈および毛細血管の数は、ラットおよびマウスと同等であり、両方の例で、筋細胞8個あたり1つの毛細血管が存在した図73G。加えて、酸素についての拡散距離は、平均18μmであった。これらの毛細血管パラメータは、胎仔期後半および新生仔期のヒト心臓において見だされたものと同様であるAnversa2002。ヒト心筋は機能的コンピテントである再生されたヒト心筋が機能的コンピテントであり、梗塞心臓の機能を部分的に回復しているかを決定するために、貫壁性梗塞および新規形成ヒト心筋の有無を調べる組織学的証明に続き、超音波心臓図を遡及的に調査した図74A~C;図78。心筋再生を、壁の梗塞域における検出可能な収縮機能に関連づけたこれは、組織再構成がなければ決して起こらなかった。ヒト心筋の形成により、梗塞心室の駆出率が上昇した図74D。更に、心筋再生により、腔拡張が緩和され、LV質量対腔容積比が上昇し図74E、梗塞後のLVEDPの上昇ならびにLVDPおよび正負dP/dtの低下を制限することにより、全体的心室機能を改善した図74F。関連するところでは、本実施例全体で提供された結果は、平均±SDである。有意性は、スチューデントt検定およびボンフェローニ法により決定したAnversa2002。実施例15:心臓幹細胞による大冠動脈の形成-生体バイパス血管構造閉塞に及ぼすクローン原性EGFPPOS-c-kitPOS-CSC非活性化CSCならびにHGFおよびIGF-1により活性化されたEGFPPOS-c-kitPOS-CSC活性化CSCの注射の影響を比較するために、フィッシャー344ラットの左冠動脈、を標準的手順により閉塞した。非活性化CSCまたは活性化CSC活性化は移植の2時間前に行なったを、閉塞された左冠動脈の近辺に移植した。結さつの解剖学的位置のため、細胞移植部位は、結さつにより発生した心室壁の梗塞領域からは離れていた図82。心筋内に播種された非活性化CSCは、送達の12時間および24時間後から48時間後まで漸増する高度のアポトーシス率を示した図83。細胞死により、1~2週間で移植細胞は完全に消失した。反対に増殖因子で活性化されたCSCの移植において、著しい効能が検出された図79a。活性化CSCは、心筋にホーミングし、そこでアポトーシスが急性に細胞複製に勝ったが、続いて細胞分裂が細胞死を上回った図79b-d。活性化CSCおよび非活性化CSCは、注射部位における非損傷心筋内に蓄積したが、細胞生着は、活性化細胞に限定された。生着には、細胞間接触、ならびに細胞と細胞外マトリクスとの相互作用を成立させる表面蛋白質が合成される必要があるLapidot2005。コネキシン43、N-およびE-カドヘリン、ならびにL-セレクチンは、大部分の活性化CSCにおいてのみ発現された図79e。これらの結合蛋白質および接着蛋白質は、心筋内の非活性化CSCクラスターには存在しなかった。アポトーシスは、生着細胞にはなんら影響を及ぼさず、非生着細胞にのみ関与した図79f。この現象は、プログラム細胞死が細胞間接触の欠如により惹起される、非生着細胞のアノイキスと一致したFrisch2001Melendez2004。増殖因子によるCSCの活性化が細胞生着において役割を担うこと、および細胞生着が虚血損傷と独立していることを立証するために、活性化CSCを、対照である非梗塞マウスのインタクト心筋に注射した。1ヶ月後、多量の細胞が、心臓の心外膜域に存在した図79g。これらの細胞は、コネキシン43および45、N-およびE-カドヘリン、ならびにL-セレクチンを発現した。移植細胞は、恐らく組織損傷が存在せず、喪失心筋を再生する必要があることから、未分化表現型を維持したBeltrami2003Orlic2001Mouquet2005。処置後2日目の定量測定により、注射された非活性化CSC80,000~100,000個の約54,800±2,600個のみが、心筋中に存在することが示された。活性化CSCの送達後、EGFPを発現する多量の細胞が、検出された。しかしこれらは、投与細胞総数48,000±13,000より明らかに少なかった。これらの細胞は、非生着CSCおよび生着CSCのそれぞれ死滅産物および分裂産物であった。SDF-1ケモカイン12およびSDF-1は、虚血に伴いアップレギュレートされAbott2004Ceradini2005、組織内の酸素勾配に関与し得ることからButler2005、冠動脈閉塞により作り出された心筋環境の変化が、活性化CSCの血管平滑筋細胞SMCおよび内皮細胞ECへの分化に影響を及ぼすかを決定するために、SDF-1ケモカイン12およびSDF-1の転写調節因子である低酸素症誘導因子-1HIF-1の発現を測定した。この心筋応答は、梗塞心筋の長軸断面で認められ、低酸素状態は梗塞心室の基部から中間部および頂部に向かって漸増した。反対に、HIF-1およびSDF-1の発現は、頂部の死滅心筋内で最も少なく、中間部でもあまり存在せず、虚血しているが生存可能な心筋基部に向かって非常に明白になった。HIF-1およびSDF-1は、血管壁の内膜に限定されていた。免疫標識は、ウエスタンブロット法によるHIF-1およびSDF-1の局所的発現ならびにELISAで測定されたSDF-1レベルと一致した。梗塞心臓における伝導冠動脈およびその分枝の発達に及ぼす活性化CSCの影響を、冠動脈結さつおよび処置後2週間目および1ヶ月目に評価した。有意な規模の血管成長は、生後10~15日以内に起こるがOlivetti1980Rakusan1984、ラットにおける生後の冠動脈樹構造の成熟にはおよそ1ヶ月を要することからAnversa2002、前記の時点を選択した。梗塞および細胞移植後2週間目に、新たに形成された大きなEGFP陽性冠動脈が、注射部位の極近傍の心筋外膜に見出された図80a、b。生成された血管は、生存心筋および閉塞冠動脈に近い心臓基部における梗塞境界部を貫通していた。直径150μm以上の伝導動脈は、弾性内膜を有し、心室の基部および中間部上側の生存可能な心筋に限定された。比較として、左冠動脈の起点は、直径約275μmを有する。新たに形成されたEGFP陽性心筋は、再生された血管の隣接域または遠隔域の生存心筋にも全く見出されなかった。このことは、臓器の局地的な必要性に対するCSCの選択的応答を立証しており、幹細胞増殖および分化を調整しているようであるBaxter2000。直径25μm未満の小抵抗細動脈の存在は、瘢痕化した梗塞領域に限定された図80c。このサイズの抵抗細動脈は、2週間目の温存心筋内では検出されなかった。同様に、少数の毛細血管が存在したが、梗塞心筋内のみであった。全ての例において、血管壁は、EGFP陽性SMCおよびECのみで構成されていた。再生血管においては、EGFP陰性SMCまたはECは、存在しなかった。これにより、血管形成における既存のSMCおよびECと活性化CSCの分化決定したものとによる共同的役割の可能性が排除される。血管形成は、これらの条件下での唯一の血管成長メカニズムのようであった。梗塞および細胞療法後1ヶ月目に、形成された冠血管構造がその後に退化する一時的な血管であるか、または時間と共に更に成長する機能的コンピテントな血管であるかを決定するために、観察を行った。この期間は、更なる血管成長の検出のためだけでなく、梗塞治癒の特徴づけにも関係した。梗塞治癒は、げっ歯類において、約4週間で完了しFishbein1978、壊死細胞内にコラーゲンIII型およびI型を蓄積させる。治癒の早期に存在した血管は、アポトーシスにより次第に死滅するためCleutjens1999、瘢痕化した心筋は、多くても数個の瘢痕化血管プロファイルを含む。それゆえ、異なる分類のEGFP陽性冠血管の分布を、2週間目および1ヶ月目の梗塞心筋および非梗塞心筋において測定した。1ヶ月目に、直径が6~250μmの範囲の多数のEGFP陽性冠血管が、壁の生存可能な心筋および梗塞領域の両方に存在しており、時間に応じて冠血管構造が拡大したことが示唆される。1ヶ月目に、毛細血管プロファイルを伴う大、中、および小サイズの冠動脈および細動脈が、心室壁の温存心筋および梗塞部分の両方で検出された。2週間目に認められた通り、再生血管は、EGFP陽性SMCおよびECのみで構成されていた図84。これらの観察は、1ヶ月後には全クラスの冠血管が発生したことを示す定量的結果により裏づけられた図80d。つまり活性化CSCは、ラット冠血管樹構造の様々な区分をデノボ生成することができる。CSCの実際の増殖能力を評価するために、冠動脈分類および毛細血管プロファイルの再構成が、常在性ECおよびSMCと注射されたCSCとの融合事象を伴うかWagers2004を決定した。ヘテロカリオンの形成を、血管壁内のEGFP陽性ECおよびSMCの核内性染色体を測定することにより確認したUrbanek2005aUrbanek2005bDawn2005。雌性クローン原性CSCは、雌性心臓に移植されたため、新たに形成された血管のX染色体の数を、FISHにより同定した図80e。全ての例において、多くても2つのX染色体が、再生ECおよびSMCにおいて見だされ、細胞融合が、あったとしても、活性化CSCによる冠血管構造の回復における役割は小さいことが示唆された。新しい心外膜冠血管が、大動脈および既存の冠循環系に機能的に接続しているかを決定するために、エクスビボ調製を利用した。ローダミン標識デキストランMW70,000;赤色蛍光を含有する酸素化タイロード液を用い、心臓を大動脈により逆方向に連続潅流した。この分子は内皮障壁を通過せず、二光子顕微鏡で冠血管構造全体を可視化することができるUrbanek2005Dawn2005。生物学的構造によるレーザ光の散乱のためHelmchen2005、この分析法は最も外側の約150μmの心筋外膜に限定された心室壁は、厚さ約2.0mmを有する。常在性冠血管および生成された冠血管を、それぞれ壁のEGFP標識緑色蛍光非存在および存在により判別した。組織コラーゲンは、二光子励起とコラーゲンの周期的構造の結果である第二高調波発生青色蛍光により検出したSchenkeLayland2005。コラーゲンの離散的局在は、生存可能な心筋に対応するものと推定され、広範なコラーゲンの蓄積は、梗塞心筋を表すものと解釈された。デキストランを用いた大動脈からの潅流により、2週間目の処置ラットの非梗塞心筋外膜内で、直径ほぼ200μmおよびEGFP陽性壁の大血管を同定した図81a。極微量のコラーゲンが、血管壁近くに認められた。同様の血管が、2週間目および1ヶ月目の瘢痕化心筋においても認められた図81b~e。時には、新しい冠血管は、EGFP陽性細胞により部分的に置換されていて、心筋再生の離散的病巣図示しないに対応する梗塞の心外膜領域を横切っていた図81e。分解能により可能な場合には、既存のEGFP陰性壁冠血管と生成されたEGFP陽性壁冠血管の間の直接接続が認められ図81f、これらの一時的に異なる、冠血管樹構造の新旧セグメントの統合が証明された。細胞処置による冠循環の改善は、心室拡張の緩和、ならびに壁厚対腔半径比および心室質量対腔容積比の相対的上昇に関連した図81g。これらの解剖学的変数は、心室機能および心筋負荷に著しく影響するPfeffer1990。予測された通り、冠循環の再生は、梗塞サイズを縮小しなかった図81g。細胞療法を冠動脈結さつ後まもなく導入すると、閉塞冠動脈により供給された心筋細胞が4~6時間で死滅したAnversa2002。しかし、左心室拡張終期圧、発生圧、正負のdP/dt、および拡張期応力における血行動態変化は全て、細胞療法により媒介された冠動脈潅流の改善により部分的に抑制された図81h。実施例16:大動物モデルにおける心臓幹細胞のカテーテル方式冠動脈内送達ブタ15頭を、1心房付属組織を切除および採取すること、ならびに2遠位の左前下行冠動脈を90分間閉塞して心筋梗塞を誘発し、次に再潅流すること、という2つの目的で開胸した。CSCを心房付属物から採取し、先に記載された通りエクスビボで培養および増殖させ、2~3ヶ月平均86日後に同じブタに冠動脈内注射した。ブタ7頭が冠動脈内CSC注射を受け、8頭がビヒクル注射を受けた。全てのブタに、一連の心臓マーカ試験、2D超音波心臓検査、および亜群において侵襲的血行動態モニタリングに加え、内臓の詳細な組織病理学検査を実施した。心臓または組織病理学的検査した様々な臓器において、CSC処置に関連する悪影響の徴候はなく、処置されたブタは、心機能改善の傾向を実証した。これらの結果から、この虚血性心筋症の大動物モデルにおけるCSCの冠動脈内送達の安全性および実現可能性が確認された。実施例17:成体腎臓幹細胞の単離c-kit抗原が、損傷後の広範な心筋再生を誘発し得る常在性成体心臓幹細胞の信頼性のあるマーカであったという著者らの所見に基づいて、著者らは、この同じ幹細胞抗原が、腎臓をはじめとする他の臓器の幹細胞内に存在し得る可能性を検査した。著者らは、FACS分析、二光子顕微鏡検査、ならびに免疫標識および共焦点顕微鏡検査を用いて、マウス腎臓の糸球体および尿細管内のc-kit陽性細胞を同定した。最初に、強化緑色蛍光蛋白質EGFPがc-kitプロモータの制御下で存在するトランスジェニックマウスモデルを用いて、胚性期の発生腎臓図85および成体臓器図86におけるc-kit陽性細胞の直接視覚化を得た。多光子顕微鏡検査およびエクスビボ腎臓調製を用いて、成体マウス腎臓内のc-kit陽性EGFP陽性細胞の分布を定義した。このアプローチは成功し、推定の腎臓幹細胞KSCを含有する糸球体を、同定した図86。成体マウス腎臓の糸球体および尿細管においてc-kit陽性細胞の存在を、免疫標識および共焦点顕微鏡検査により確認した図87。これらの結果により、成体マウス腎臓の糸球体の入手、およびc-kit陽性KSCを単離および増殖させる培養条件の確立が促進された図88。複数の調製を、数ヶ月間で実施した。同様の試験を、c-kitを潜在的KSCの幹細胞抗原として用いる胚性および新生仔ラット腎臓において実施した図89および90。これらの結果から、c-kit陽性KSCが成体マウスおよびラットの腎臓内に存在し、そのような細胞を培養で増殖させ得ることが示された。次に、同様のc-kit陽性細胞がヒト腎臓内に存在するかを確認する試験を実施して、肯定的結果が得られた。免疫標識および共焦点顕微鏡検査を用いることにより、c-kit陽性細胞が、糸球体係蹄および傍糸球体装置図示しないにおいてボウマン嚢の付近で同定された。加えて、c-kit陽性細胞を、尿細管内および腎実質全体図示において同定した。つまりこれらの実施例の結果から、c-kit陽性常在性幹細胞が、腎臓など他の臓器において同定され得ることが実証された。これらの幹細胞を用いて、損傷臓器組織を修復および/または再生することができる。実施例18:成体腎臓幹細胞を用いた損傷腎臓組織の修復腎臓組織試料をラット、マウス、またはヒトから単離し、試料を細断して培地を含む非コーティングペトリ皿の表面に播種する。組織から増殖された細胞を、免疫ビーズでc-kitについて選別して、実施例17に記載された通り培養する。細胞表現型を、実施例14に記載された通りFACSおよび免疫細胞化学により心臓幹細胞について定義する。選別されたc-kitPOS細胞を固定し、腎臓、心臓、骨格筋、神経および造血細胞系列のマーカについて試験し、系列陰性Lin-腎臓幹細胞KSCを検出する。標準の免疫抑制レジメンにより処置された免疫欠損スキットマウスまたはフィッシャー344ラットにおいて急性腎傷害例えば、腎虚血または腎毒性障害を誘発した後まもなく、c-kitPOS-KSCを虚血組織の境界域または傍髄質領域内で、2回注射する。動物をBrdUに暴露して、損傷および細胞移植後2~3週間目に屠殺する。各腎臓において、組織損傷のサイズ、ならびにBrdU標識腎臓細胞および構造の形成を、決定する。c-kitPOS細胞-KSCの注射を受けた動物が、細胞注射を受けていない、またはc-kitNEG細胞の注射を受けた動物に比較して、損傷部位でc-kitPOS-KSCによる組織修復を示し、デノボ腎臓細胞例えば、間質細胞、尿細管細胞、糸球体壁側細胞などおよび腎臓構造を生成させると予測される。こうして、本発明の好ましい実施形態を詳細に記載したが、添付の請求の範囲により定義される本発明は、本発明の主旨または範囲から逸脱せずとも多くの明らかな変形態様が可能であるため、上記説明で示された特定の詳細に限定されないことが理解されるべきである。本明細書に引用された全ての発行物、特許および特許出願が、参照により全体として本明細書に組み入れられる。記載された特定の方法論、プロトコルおよび材料は、変動し得るため、開示された発明がこれらに限定されないことは理解されよう。同じく、本明細書で用いられた用語が、特定の実施形態を説明することを目的としていて、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることは理解されよう。当業者は、日常的実験のみを用いれば、本明細書に記載された発明の具体的実施形態の多くの均等物を認識する、またはそれを確認し得るであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されるものとする。参考文献1AbottJDetalStromalcellderivedfactor1alphaplaysacriticalroleinstemcellrecruitmenttotheheartaftermyocardialinfarctionbutisnotsufficienttoinducehomingintheabsenceofinjuryCirculation110330033052AicherAetalEssentialroleofendothelialnitricoxidesynthaseformobilizationofstemandprogenitorcellsNatMed9137013763AlvarezDoladoMPardalRGarciaVerdugoJMetalFusionofbonemarrowderivedcellswithPurkinjeneuronscardiomyocytesandhepatocytesNature2003425968734AmadoLCSaliarisAPSchuleriKHetalCardiacrepairwithintramyocardialinjectionofallogeneicmesenchymalstemcellsaftermyocardialinfarctionProcNatlAcadSciUSA20051021147495AmericanHeartAssociation2001HeartandStrokeStatisticalUpdateDallasTexAmericanHeartAssociation20006AmericanHeartAssociationHeartDiseaseandStrokeStatistics-2005UpdateURLwwwamericanheartorgdownloadableheart1105390918119HDSStats2005Updatepdf7AndersonDJStemcellsandpatternformationinthenervoussystemthepossibleversustheactualNeuron3019358AnversaPOlivettiGCellularbasisofphysiologicalandpathologicalmyocardialgrowthInHandbookofPhysiologyTheCardiovascularSystemTheHeart751449AnversaPandKajsturaJVentricularmyocytesarenotterminallydifferentiatedintheadultmammalianheartCircRes8311410AnversaPandNadalGinardBMyocyterenewalandventricularremodellingNature415240311ArsenijevicYandWeissSJNeurosciInsulinlikegrowthfactorIisadifferentiationfactorforpostmitoticCNSstemcellderivedneuronalprecursorsdistinctactionsfromthoseofbrainderivedneurotrophicfactorJNeurosci1821182812ArsenijevicYetalInsulinlikegrowthfactorIisnecessaryforneuralstemcellproliferationanddemonstratesdistinctactionsofepidermalgrowthfactorandfibroblastgrowthfactor2JNeurosci21719420213AsaharaTetalIsolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesisScience27596496714BacheRJEffectsofhypertrophyonthecoronarycirculationProgCardiovascDis3040344015BalsamLBWagersAJChristensenJLKofidisTWeissmanILRobbinsRCHaematopoieticstemcellsadoptmaturehaematopoieticfatesinischemicmyocardiumNature20044286687316BautzFetalExpressionandsecretionofvascularendothelialgrowthfactorAbycytokinestimulatedhematopoieticprogenitorcellsPossibleroleinthehematopoieticmicroenvironmentExpHematol2000June28700617BaxterAGThecellsthatknewtoomuchJClinInvest105167518BeardsleMAetalRapidturnoverofconnexin43intheadultratheartCircRes8362963519BeltramiAPBarlucchiLTorellaDetalAdultcardiacstemcellsaremultipotentandsupportmyocardialregenerationCell20031147637620BeltramiAPetalEvidencethathumancardiacmyocytesdivideaftermyocardialinfarctionNEnglJMed3441750721BeltramiAPetalChimerismofthetransplantedheartNEnglJMed34651522BeltramiAPetalSubmitted23BeltramiCAetalStructuralbasisofendstagefailureinischemiccardiomyopathyinhumansCirculation8915116324BiancoPetalBonemarrowstromalstemcellsnaturebiologyandpotentialapplicationsStemCells1918019225BirchmeierCandBrohmannHCurrOpinCellBiol1272526BlackstoneEHLytleBWCompetingrisksaftercoronarybypasssurgerytheinfluenceofdeathonreinterventionJThoracCardiovascSurg1191221123027BlanpainCLowryWEGeogheganAPolakLFuchsESelfrenewalmultipotencyandtheexistenceoftwocellpopulationswithinanepithelialstemcellnicheCell20041186354828BlauHMetalTheevolvingconceptofastemcellentityorfunctionCell1058294129BlockGDetalJCellBiol132113330BlumeetalAreviewofautologoushematopoeticcelltransplantationBiologyofBloodMarrowTransplantation611231BodineDMetalEfficientretrovirustransductionofmousepluripotenthematopoieticstemcellsmobilizedintotheperipheralbloodbytreatmentwithgranulocytecolonystimulatingfactorandstemcellfactorBlood841482149132BreierGetalMolecularcloningandexpressionofmurinevascularendothelialcadherininearlystagedevelopmentofcardiovascularsystemBlood8763064133BrittenMBetalInfarctremodelingafterintracoronaryprogenitorcelltreatmentinpatientswithacutemyocardialinfarctionmechanisticinsightsfromserialcontrastenhancedmagneticresonanceimagingCirculation1082212221834BrookerGJetalEndogenousIGF1regulatestheneuronaldifferentiationofadultstemcellsJNeurosciRes593324135BroudyVCStemcellfactorandhematopoiesisBlood901345136436BruggeretalExvivomanipulationofhematopoeticstemandprogenitorcellsSeminarsinHematology37424937BuntingKDetalBlood9690238ButlerJMetalSDF1isbothnecessaryandsufficienttopromoteproliferativeretinopathyJClinInvest115869339CaceresCortesJRetalSteelfactorsustainsSCLexpressionandthesurvivalofpurifiedCD34bonemarrowcellsintheabsenceofdetectablecelldifferentiationStemCellsJanuary19597040CapassoJMandAnversaPAmJPhysiol263H84141CaplanAIandHaynesworthSEMethodforenhancingtheimplantationanddifferentiationofmarrowderivedmesenchymalcellsFiledNov161990USPatNo519798542CarmelietPAngiogenesisinlifediseaseandmedicineNature43893293643CeradiniDJGurtnerGCHomingtohypoxiaHIF1asamediatorofprogenitorcellrecruitmenttoinjuredtissueTrendsCardiovascMed15576344CeradiniDJetalProgenitorcelltraffickingisregulatedbyhypoxicgradientsthroughHlF1inductionofSDF1NatMed1085886445ChengWetalAgingdoesnotaffecttheactivationofthemyocyteIGF1autocrinesystemafterinfarctionandventricularfailureinFischer344ratsCircRes7853654646ChienRStemcellslostintranslationNature2004428607847ChimentiCKajsturaJTorellaDetalSenescenceanddeathofprimitivecellsandmyocytesleadtoprematurecardiacagingandheartfailureCircRes2003936041348ChiuetalCellularCardiomyoplastyMycardialRegenerationWithSatelliteCellImplantationAnnThoracSurg60121849CleutjensJPMBlankesteijnWMDaemenMJAPSmitsJFMTheinfarctedmyocardiumSimplydeadtissueoralivelytargetfortherapeuticinterventionsCardiovascRes4423224150ClutterbuckRDetalGCSFmobilizationofhaemopoieticcellpopulationsinSCIDmiceengraftedwithhumanleukaemiaBoneMarrowTransplantAugust203253251ColesJGetalInhibitionofHumanXenogenicorAllogenicAntibodiestoReduceXenograftorAllograftRejectioninHumanRecipientsPatentNoWO9534581AlpublishedDec21199552CondorelliGetalCardiomyocytesinduceendothelialcellstotransdifferentiateintocardiacmuscleimplicationsformyocardiumregenerationProcNatlAcadSciUSA9810733853CoultasLChawengsaksophakKRossantJEndothelialcellsandVEGFinvasculardevelopmentNature43893794554CouperLLetalVascularendothelialgrowthfactorincreasesthemitogenicresponsetofibroblastgrowthfactor2invascularsmoothmusclecellsinvivoviaexpressionoffmsliketyrosinekinase1CircRes8193293955DangNCJohnsonCEslamiFarsaniMHaywoodLJBonemarrowembolisminsicklecelldiseaseareviewAmJHematol20057961756DawnBetalCardiacstemcellsdeliveredintravascularlytraversethevesselbarrierregenerateinfarctedmyocardiumandimprovecardiacfunctionProcNatlAcadSciUSA1023766377157DevelopmentDevelopment11848949858DinsmoreJProcineCardiomyocytesandTheirUseinTreatmentofInsufficientCardiacFunctionPatentNoWO9638544publishedDec5199659DurocherDetalThecardiactransciptionfactorsNkx25andGATA4aremutualcofactorsEMBOJ165687569660EisenbergCABaderDQCE6aclonalcelllinewithcardiacmyogenicandendothelialcellpotentialsDevBiol16746948161FieldLJMyocardialgraftsandcellularcompositionsFiledJun71995USPatNo573372762FieldLJNonhumanmammalhavingagraftandmethodsofdeliveringproteintomyocardialtissueFiledNov161992USPatNo560230163FieldLJMyocardialGraftsandCellularCompositionsUsefulforSamePatentNoWO9514079A1publishedMay26199564FieldingetalAutologousbonemarrowtransplantationCurrOpinHematology1994141241765FishbeinMCMacleanDMarokoPRExperimentalmyocardialinfarctionintheratqualitativeandquantitativechangesduringpathologicevolutionAmJPathol90577066FrischSMScreatonRAAnoikismechanismsCurrOpinCellBiol555556267GillisSMethodforimprovingautologoustransplantationFiledSep261991USPatNo519994268GrittiAetalEpidermalandfibroblastgrowthfactorsbehaveasmitogenicregulatorsforasinglemultipotentstemcelllikepopulationfromthesubventricularregionoftheadultmouseforebrainJNeurosci193287329769GussonietalNormaldystrophintranscriptsdetectedinDuchennemusculardystrophypatientsaftermyoblasttransplantationNature35643543870HamasunaRetalRegulationofmatrixmetalloproteinase2byhepatocytegrowthfactorscatterfactorinhumangliomacellsHGFSFenhancesMMP2expressionandactivationaccompanyingupregulationofmembranetype1MMPIntJCancer822748171HelmchenFDenkWDeeptissuetwophotonmicroscopyNatMethods293294072HermannHandAebiUInSubcellularBiochemistryIntermediateFilamentsVol3131936273HidemasaOetalTelomerasereversetranscriptasepromotescardiacmusclecellproliferationhypertrophyandsurvivalProcNatlAcadSciUSA98103081031374HillebrandsJLetalOriginofneointimalendotheliumandalphaactinpositivesmoothmusclecellsintransplantarteriosclerosisJClinInvest1071411142275HuangHMetalOptimalproliferationofahematopoieticprogenitorcelllinerequireseithercostimulationwithstemcellfactororincreaseofreceptorexpressionthatcanbereplacedbyoverexpressionofBcl2Blood1999Apr159325697776IkutaKetalMousehematopoieticstemcellsandtheinteractionofckitreceptorandsteelfactorInternationalJournalofCellCloning1991945146077JacksonKAetalHematopoieticpotentialofstemcellsisolatedfrommurineskeletalmuscleProcNatlAcadSciUSA9614482678JacksonKAetalJClinInvest107139579JanowskaWieczorekAetalAutocrineparacrinemechanismsinhumanhematopoiesisStemCells2001199910780JessupMBrozenaSHeartfailureNEnglJMed3482007201881JoDYetalChemotaxisofprimitivehematopoieticcellsinresponsetostromalcellderivedfactor1TheJournalofClinicalInvestigation2000January10510111182JustLTimmerMTiniusJetalIdentificationofhumancellsinbrainxenograftsandinneuralcoculturesofratbyinsituhybridisationwithAluprobeJNeurosciMethods2003126697783KachinskyAMetalIntermediatefilamentsincardiacmyogenesisnestininthedevelopingmouseheartJHistochemCytochem4384384784KajsturaJRotaMWhangBetalBonemarrowcellsdifferentiateincardiaccelllineagesafterinfarctionindependentlyofcellfusionCircRes2005961273785KajsturaJetalApoptoticandnecroticmyocytecelldeathsareindependentcontributingvariablesofinfarctsizeinratsLabInvest748610786KajsturaJetalThecellularbasisofpacinginduceddilatedcardiomyopathyMyocytecelllossandmyocytecellularreactivehypertrophyCirculation922306231787KanjetalMyocardialischemiaassociatedwithhighdosecarmustineinfusionCancer1991681910191288KasaharaHetalCardiacandextracardiacexpressionofCsxNkx25homeodomainproteinCircRes8293694689KawadaHFujitaJKinjoKetalNonhematopoieticmesenchymalstemcellscanbemobilizedanddifferentiateintocardiomyocytesaftermyocardialinfarctionBlood200410435818790KawamotoATkebuchavaTYamaguchiJetalIntramyocardialtransplantationofautologousendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularizationofmyocardialischemiaCirculation2003107461891KedesLHetalCompositionsandMethodsforTransductionofCellsPatentNoWO9512979A1publishedMay18199592KehatIetalHumanembryonicstemcellscandifferentiateintomyocyteswithstructuralandfunctionalpropertiesofmyocytesJClinInvest10840741493KeilFetalEffectofinterleukin3stemcellfactorandgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactoroncommittedstemcellslongtermcultureinitiatingcellsandbonemarrowstromainaonesteplongtermbonemarrowcultureAnnHematol2000May79243894KempermannGetalActivitydependentregulationofneuronalplasticityandselfrepairProgBrainRes2000127354895KimCHandBroxmeyerHEInvitrobehaviorofhematopoieticprogenitorcellsundertheinfluenceofchemoattractantsstromalcellderivedfactor1steelfactorandthebonemarrowenvironmentBlood1998Jan1911001096KocherAAetalNeovascularizationofischemicmyocardiumbyhumanbonemarrowderivedangioblastspreventscardiomyocyteapoptosisreducesremodelingandimprovescardiacfunctionNatureMedicine2001April743043697KohetalDifferentiationandlongtermsurvivalofC2C12myoblastgraftsinheartJournalofClinicalInvestigation921548155498KrauseDSetalMultiorganmultilineageengraftmentbyasinglebonemarrowderivedstemcellCellMay10536937099KronenwettRetalTheroleofcytokinesandadhesionmoleculesformobilizationofperipheralbloodstemcellsStemCells200018320330100LaluppaJAetalEvaluationofcytokinesforexpansionofthemegakaryocyteandranulocytelineagesStemCellsMay15198206101LanzaRMooreMAWakayamaTetalRegenerationoftheinfarctedheartwithstemcellsderivedbynucleartransplantationCircRes2004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