"ウイルスベクターを産生する能力を有する細胞を、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素阻害物質を有効成分として含む培地で培養する工程を包含するウイルスベクターの製造方法。培地が、有効成分として、更に脂質類を含む請求項1記載の製造方法。細胞が継続的にウイルスベクターを産生する能力がある細胞である請求項1又は2に記載の製造方法。ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである請求項1~3いずれか記載の製造方法。ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質がトリコスタチンA及び酪酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも1種の物質である請求項1~4いずれか記載の製造方法。請求項1~5いずれか記載の方法で製造されたウイルスベクター。請求項6記載のウイルスベクターを用いて細胞を形質転換することを特徴とする形質転換された細胞集団の製造方法。請求項7に記載の製造方法で得られた形質転換された細胞集団。医薬に使用するための請求項8記載の細胞集団。医薬の製造に用いる請求項8記載の細胞集団。請求項8記載の細胞集団を有効成分として含有する医薬。対象に有効量の請求項11記載の医薬を投与する工程を含む疾病の治療方法又は予防方法。有効成分として、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素阻害物質を含むことを特徴とするウイルスベクター製造用培地。本発明の目的は、ウイルスベクターの製造に使用される培地、特に高いウイルスタイターを維持することを可能にするウイルス産生細胞の培養に使用される培地を開発し、当該培地を用いたウイルスベクターの製造方法、及び当該方法で製造されるウイルスベクターを用いた形質転換細胞集団の製造方法を提供することにある。本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、有効成分として、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素以下、ヒストンデアセチラーゼと記載する場合がある阻害物質を含む培地を用い、ウイルス産生細胞を培養することで、長期間にわたって高いウイルス産生を継続することができ、驚くべきことに高いウイルス力価のウイルス上清が得られることを見出し、本発明を完成させた。本発明を概説すれば、本発明は、[1]ウイルスベクターを産生する能力を有する細胞を、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素阻害物質を有効成分として含む培地で培養する工程を包含するウイルスベクターの製造方法、[2]培地が、有効成分として、更に脂質類を含む[1]記載の製造方法、[3]細胞が継続的にウイルスベクターを産生する能力がある細胞である[1]又は[2]に記載の製造方法、[4]ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである[1]~[3]いずれか記載の製造方法、[5]ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質がトリコスタチンA及び酪酸ナトリウムから成る群より選択される少なくとも1種の物質である[1]~[4]いずれか記載の製造方法、[6][1]~[5]いずれか記載の方法で製造されたウイルスベクター、[7][6]に記載のウイルスベクターを用いて細胞を形質転換することを特徴とする形質転換された細胞集団の製造方法、[8][7]に記載の製造方法で得られた形質転換された細胞集団、[9]医薬に使用するための[8]記載の細胞集団、[10]医薬の製造に用いる[8]記載の細胞集団、[11][8]記載の細胞集団を有効成分として含有する医薬、[12]対象に有効量の[11]記載の医薬を投与する工程を含む疾病の治療方法又は予防方法、[13]有効成分として、レチノイン酸類及びヒストン脱アセチル化酵素阻害物質を含むことを特徴とするウイルスベクター製造用培地、に関する。本発明のウイルスベクターの製造方法によれば、従来法と比べて、長期間ウイルス産生を継続することでき、かつ高いウイルス力価が得ることができる。したがって、本発明の方法では、一回の培養調製でウイルス量を多く回収することができる。また、本発明の培地で培養したウイルス産生細胞から調製されたウイルスベクターは、高いウイルス力価を有するので、従来法より高い遺伝子導入効率を示す。以下に本発明について詳細に説明する。本発明は、ウイルスベクターを産生する細胞の培養に適した培地を開示する。前記の培地は、細胞の培養に必要な成分を混合して作製された基本培地に、有効成分して、レチノイン酸類及びヒストンデアセチラーゼ阻害物質が含有されてなるものである。当該培地には、更に脂質類が含まれてもよい。本発明において、レチノイン酸は、ビタミンA酸とも呼ばれ、鎖部の二重結合がすべてtransのall-trans-レチノイン酸又は9位がcis構造をとる9-cis-レチノイン酸のいずれでもよい。また、その他のレチノイン酸異性体、レチノイン酸誘導体、及び人為的に合成した合成レチノイドも本発明において使用することができる。前記のレチノイン酸、レチノイン酸異性体、レチノイン酸誘導体及び人為的に合成した合成レチノイド又はそれらの塩を、本明細書ではレチノイン酸類と総称する。更に、本発明において、使用するレチノイン酸類は1種類でもよく、複数種類を組み合わせて使用してもよい。本発明に使用されるレチノイン酸類の培地中の濃度としては、有効成分として作用する濃度を使用すればよく、特に限定はないが、all-trans-レチノイン酸以下、ATRAと記載するの場合、例えば、好適には1nM~10μM、より好適には5nM~200nMであり、特に好適には10~100nMである。本発明において、ヒストン脱アセチル化酵素ヒストンデアセチラーゼ阻害物質としては、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有するものであれば良く、1脂肪族酸類、例えば酪酸、フェニル酪酸、バルプロ酸、これらの塩、誘導体等、2ヒドロキサム酸類、例えばトリコスタチンTrichostatinA、オキサムフラチン、スベロイルアニリドsuberoylanilide、これらの塩、誘導体等、3環状ペプチド、例えばトラポキシンtrapoxin、アピシヂンapicidin、FK228、これらの塩、誘導体等、4ベンズアミド、その塩、誘導体等、が使用できる。本発明を限定するものではないが、ヒストンデアセチラーゼ阻害物質として、酪酸ナトリウム以下、NaBと記載する又はヒストンデアセチラーゼのアイソフォーム阻害域の広いトリコスタチンA以下、TSAと記載するが好適に使用される。本発明に使用されるヒストンデアセチラーゼ阻害物質の培地中の濃度としては、有効成分として作用する濃度を使用すればよく、特に限定はないが、TSAの場合、例えば、好適には10nM~50μM、より好適には20nM~10μM、特に好適には100nM~3μMである。NaBの場合、例えば、好適には1nM~50mM、より好適には1mM~10mMである。本発明のレチノイン酸類及びヒストンデアシラーゼ阻害物質を含む培地に、更に脂質類を含有させても良い。脂質類としては、脂肪酸類アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸やそれらの塩等、コレステロール、デキサメタゾン等のステロイド類、トコフェロール酢酸、トリグリセリド、リン脂質類グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、イノシトールリン脂質等等を使用することができる。これらの成分は単独でもしくは複数のものを組み合わせて培地に添加してもよい。例えば、血清成分を代替することを目的に培地添加剤として市販されている脂肪酸濃縮液をそのまま含有させても良い。本発明に使用される前記脂質類から任意に選択される脂質類の培地中の濃度としては、有効成分として作用する濃度を使用すればよく、特に限定はないが、好適には脂質類の総量として0.01mg/L~8.0mg/L、より好適には0.03mg/L~5.0mg/L、特に好適には0.1mg/L~4.0mg/Lである。例えば、脂肪酸濃縮液では容液比で、好適には1/10,000~1/50V/V、より好適には1/3,000~1/75V/Vであり、特に好適には1/1,000~1/100V/Vである。上記基本培地の成分としては、アミノ酸、糖類、有機酸のようなエネルギー源、ビタミン類、pH調整のための緩衝成分、無機塩類等があげられる。また、フェノールレッドのようなpH指示薬を含有していてもよい。このような基本培地として血清を含有しない公知の培地、例えば、DMEM、IMDM、ハムF12培地等を使用してもよく、これらはインビトロジェン社、シグマ社等から市販品として入手することができる。Opti-ProSFM、VP-SFM、293SFMIIいずれもインビトロジェン社製、HyQSFM4MegaVirハイクローン社製等の市販の培地も使用することができる。血清添加培地を使用してもよいが、血清由来の未知のウイルスの混入を防ぐために、無血清培地の使用が好ましい。無血清培地を使用する場合は、ヒト血液より高度に精製された血清アルブミン例えば医薬品として認可された血清アルブミン製剤や動物由来の高度に精製された血清アルブミン、又は組み換え血清アルブミンを含有する無血清培地が好適に使用される特開2007-105033号公報。本発明の培地により培養されるウイルス産生細胞には特に限定はないが、例えばレトロウイルス産生細胞が好適である。本発明は、上記の培地を使用することを特徴とするウイルスベクターの製造方法に関する。本発明により製造されるウイルスベクターには特に限定はない。例えば、レトロウイルスベクターオンコウイルスベクター、レンチウイルスベクターやそれらの改変体を包含する、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が挙げられる。好適にはレトロウイルスベクター、すなわち遺伝子組み換えレトロウイルスベクターが例示される。特に、無制限な感染、遺伝子導入を防止された複製能欠損レトロウイルスベクターが本発明に好適に使用される。公知の複製能欠損レトロウイルスベクターとしては、MFGベクターやα-SGCベクター国際公開第92/07943号パンフレット、pBabe[ヌクレイックアシドズリサーチNucleicAcidsResearch、第18巻、第3587-3596頁1990]、LXINクロンテック社製、DON-AIタカラバイオ社製等のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター[ヒト免疫不全ウイルスHIV由来ベクター、サル免疫不全ウイルスSIV由来ベクター等]あるいはこれらを改変したベクター例えばシュードタイプベクターが例示される。前記のウイルスベクターには任意の外来遺伝子を導入してもよい。導入される外来遺伝子には特に限定はなく、下記記載の本発明により製造されたウイルスベクターにより形質転換される細胞集団の用途に応じて、任意の遺伝子[酵素、サイトカイン類、又はレセプター類等のタンパク質をコードするものの他、細胞内抗体、アンチセンス核酸やsiRNAsmallinterferingRNA、リボザイムをコードするもの]が使用できる。これら外来遺伝子としては、例えば、細胞の医療への利用を目的とするものとして、配列特異的RNA分解酵素であるMazFを発現する遺伝子例えば、国際公開第2007/020873号パンフレット及び国際公開第2008/133137号パンフレット、腫瘍抗原やウイルス抗原を認識する抗体可変領域又はT細胞レセプターをコードする遺伝子、患者において欠失もしくは機能喪失している遺伝子等が挙げられる。また、LowaffinityNerveGrowthFactorReceptorの細胞外ドメイン遺伝子ΔLNGFR、ネオマイシン耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等の、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。前記外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにウイルスベクターに挿入して使用することができる。また、エンハンサー配列、ターミネーター配列、又はイントロン配列がベクター内に存在していてもよい。本発明では、前記のウイルスベクターをコードするDNAをウイルスパッケージング細胞株に導入して作製されたウイルス産生細胞を本発明の培地中で培養することにより、ウイルスベクターの製造が実施される。前記のパッケージング細胞株には特に限定はなく、公知のパッケージング細胞株、例えばPG13ATCCCRL-10686、PA317ATCCCRL-9078、GPE-86やGPenvAm-12米国特許第5,278,056号、Psi-Crip[プロシーディングオブザナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブジUSAProc.Natl.Acad.Sci.USA、第85巻、第6460-6464頁1988]等を使用することができる。また、トランスフェクション効率の高い293細胞や293T細胞にレトロウイルス粒子産生に必要な遺伝子が搭載されたパッケージングプラスミドレトロウイルスパッケージングキット:タカラバイオ社製、等を導入してレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。本発明の方法は、一過性に組換えウイルスベクターを産生するよう作製されたウイルス産生細胞、継続的にウイルスを産生する能力を有するウイルス産生細胞株のいずれにも利用することができる。後者を使用する場合には、ウイルス産生細胞株のマスターセルバンクMCBやワーキングセルバンクWCBのような凍結保存物を適切な手段で解凍後、前記の培地に直接植えて培養を開始し、前記細胞を増殖させ、ウイルスを産生させる。組換えウイルスベクターの大量調製のためには、さらに前記の培地にウイルス産生細胞株を適応させる馴化の工程を加えることが好ましい。ウイルス産生細胞の培養は、通常の培養条件で行うことができる。例えば、湿度95、CO2濃度5での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。培養は、例えば30~37°Cで実施できるが、所望の細胞の増殖、ウイルスベクターの産生が達成できる温度であれば前記の範囲以外の温度で実施してもよい。本発明では、こうして得られる培養液より上清を採取して、ウイルスベクターを得る。本発明において、ウイルスベクターは前記の上清のまま、上清をフィルターろ過して得られたろ液、公知の方法により濃縮もしくは精製されたウイルスベクターとして製造され、適切な方法により、例えば凍結して、使用するまで保存される。上記の本発明の培地を用いたウイルス産生細胞の培養によると、従来の培養方法より高い力価のウイルスベクターを得ることができる。また、本発明は、本発明の方法により製造されたウイルスベクターにより標的細胞を形質転換することを特徴とする、形質転換細胞を含有する細胞集団の製造方法も提供する。なお、前記ウイルスベクターにより細胞に導入される所望の遺伝子の数に限定はなく、1個の遺伝子であっても良く、複数の遺伝子であっても良い。ウイルスベクターによる標的細胞の形質転換は当該ウイルスベクターに適した公知の方法で行えばよい。例えばレトロウイルスベクターを使用する場合には、遺伝子導入の際にレトロネクチンRetroNectin、登録商標、タカラバイオ社製等の遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。本発明では高いウイルス力価のウイルスベクターを得られることから、当該ベクターを使用することにより、所望の遺伝子を保持する細胞を高い比率で含む細胞集団を得ることができる。本発明は、前記の本発明の細胞集団の製造方法により得られる細胞集団、並びに当該細胞集団の用途を提供する。本発明の方法により得られる細胞集団は種々の用途、例えば有用物質の生産に使用することができ、また、当該細胞集団自体を疾患の治療に使用することもできる。本発明の方法により、治療上有用な外来遺伝子を保持する細胞を含有する細胞集団を得ることができる。前記の細胞集団は、保持する遺伝子により付与される形質に応じて種々の疾患、例えば、がん、白血病、悪性腫瘍、肝炎、又は感染症疾患例えばインフルエンザ、結核、HIVHumanImmunodeficiencyVirus、ヒト免疫不全ウイルス感染症、AIDS、MRSA感染症、VRE感染症、もしくは深在性真菌症等の治療に使用することができる。また、本発明の方法により製造される細胞集団は、骨髄移植、放射線照射後等の免疫不全状態での感染症予防又は再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注、抗がん剤治療、放射線治療、抗体治療、温熱治療、他の免疫療法等、従来の治療法と組み合わせて利用できる。本発明で得られる形質転換細胞を含有する細胞集団を疾病の治療又は予防に使用する場合には、当該細胞の有効量が治療又は予防の対象、すなわちヒト又は非ヒト動物に投与される。細胞集団の投与方法は疾病に応じて適切なものを選択すればよく、例えば注射又は点滴による静脈、動脈、皮下、又は腹腔内等への投与が例示される。本発明で得られる細胞集団は医薬、すなわち疾病の治療剤又は予防剤となすことができ、当該医薬を対象に投与することにより、疾病を治療又は予防することができる。当該医薬は製薬分野で公知の方法に従い、前記の細胞集団を製剤化して製造することができる。例えば、本発明の方法により製造された細胞集団を有効成分として、非経口投与に適した公知の有機又は無機の担体、賦形剤又は安定剤等と混合し、点滴剤又は注射剤として調製することができる。以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例1トリコスタチンA添加培地の調製ウイルス産生細胞培養用無血清培地であるGT-T-RetroIタカラバイオ社製、以下、RetroIと記載するを基本培地A培地Aとして、レチノイン酸ATRA和光純薬社製を最終濃度10nM又は100nMとなるように添加し、さらにトリコスタチンATSAシグマ社製をそれぞれ最終濃度500nMになるように添加した、培地B-1及びB-2以下、培地B群と記載するを作製した。さらに、培地B-1に脂肪酸濃縮液ギブコ社製、以下lipidと記載するを溶液比V/Vで1/100、1/250、1/1000となるようにそれぞれ添加して、培地C-1、C-2、C-3以下、培地C群と記載するを作製した。さらに培地AにTSAのみ添加終濃度500nMした培地D、及びATRAのみ添加終濃度10nMした培地Eを作製した。各培地の組成を表1に示す。実施例21.レトロウイルス産生細胞の培養蛍光レポータータンパク質ZsGreen遺伝子を搭載したマウス由来組換えレトロウイルスベクターを産生するレトロウイルス産生細胞PG13:ATCCCRL-10686:をパッケージング細胞としたのワーキングセルバンクWCBを37°Cのウォーターバスにて解凍した。解凍された細胞液を15mL遠心チューブに移し、完全培地[10ウシ胎児血清10FBS、エスエーエフシーバイオサイエンス社製を含むDMEM培地ギブコ社製]を10mL加え、遠心処理500×g、5分間、20°Cを行った。遠心後、上清を除去し、10mLの完全培地に懸濁しセルカウントを行った。セルカウント後、完全培地を用いて、細胞懸濁液を78.5×104cells/mLに調製し、細胞培養用の100mmディッシュイワキ社製に前記の細胞懸濁液1mL、及び完全培地14.7mLを添加し、CO2インキュベーター37°C、湿度95、CO2濃度5にて培養を行った。継代間隔は3日とし、1継代目の播種細胞密度を1×104cells/cm2、液量を0.2mL/cm2として継代操作を行った。2継代目は播種細胞密度を0.9×104cells/cm2、液量を0.2mL/cm2として、細胞培養用の6穴トリートメントプレートBDFalcon社製の各ウェルに2mLずつ添加した。2継代目実施の3日後、培養上清液を取り除き、実施例1に記載の培地A、B-1、B-2、C-1、C-2、C-3、D、Eにそれぞれ置換した液量は0.1mL/cm2。その翌日に、各培地を回収し、それぞれ新しい同じ培地に交換した。なお、2継代の3日後からは、32°C、湿度95、CO2濃度5にて培養を行った。上記の培地の交換と回収を4日間連続で計4回行い、4回目は培地の添加を行わず培地の回収のみ行った。回収した培養上清液1回目、2回目、3回目、4回目は、0.22μmのポアサイズのフィルターミリポア社製でろ過し、各回ごとにレトロウイルス上清液として小分け分注後-80°C保存した。2.レトロウイルス上清液の遺伝子導入評価上記のように培地A~Eを用いて回収した各レトロウイルス上清液について遺伝子導入効率の測定を行った。培地A~Eを用いて回収したレトロウイルス上清液それぞれについて5倍希釈液を調製した。このとき希釈には、ACD-Aテルモ社製及びヒト血清アルブミンアルブミナー25CSLベーリング社製をそれぞれ5倍希釈、及び12.5倍希釈してアルブミンの終濃度がそれぞれ5、2になるように生理食塩水に添加したもの以下、5アルブミン溶液、及び2アルブミン溶液と記載を用いた。遺伝子導入用の容器は24穴ノントリートメントプレートBDFalcon社製を用いた。24穴ノントリートメントプレートは、予めACD-Aで最終濃度20μg/mLになるように希釈したRetroNectin登録商標、タカラバイオ社製を各ウェルに0.5mL添加して4°Cで一晩処理し、プレートからレトロネクチン溶液を取り除いた後、ACD-Aを各ウェルに0.5mL添加して取り除くという洗浄作業を2回行ったものを使用した。このプレートの各ウェルに各ウイルス希釈液を1mL添加し、遠心処理32°C、2000×g、2時間した。遠心後、各ウェルよりウイルス希釈液上清を取り除き、ヒト血清アルブミンアルブミナー25を16.67倍希釈してアルブミンの終濃度が1.5になるように生理食塩水に添加したもの以下、1.5アルブミン溶液と記載0.5mLずつで各ウェルを3回洗浄した。ヒトTリンパ球性白血病細胞SUP-T1ATCCCRL-1942を、SUP-T1用の培養用培地[10ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地シグマ社製]に、1×106cells/mLとなるように懸濁した。前記の洗浄後の24穴ノントリートメントプレートの各ウェルにこの懸濁液1mL0.5×106cells/cm2を添加し、遠心処理32°C、1000×g、10分した。遠心後、CO2インキュベーター37°C、湿度95、CO2濃度5にて1日間培養を行った。次の日、SUP-T1用の培養用培地を1mLそれぞれ添加し、更に1日間培養した。培養後、レトロウイルスによる遺伝子導入効率を調べるために、蛍光レポータータンパク質ZsGreenの発現を調べた。感染培養後の細胞0.5×106cellsをエッペンドルフチューブに移し、遠心処理4°C、500×g、5分間にて細胞を沈殿させた。上清を取り除いた後、沈殿した細胞は終濃度が0.5となるようにBSAウシ胎児血清アルブミン、シグマ社製を添加したリン酸バッファーギブコ社製以下、0.5BSA/PBSと記載950μLに懸濁し、遠心処理4°C、500×g、5分間にて再度細胞を沈殿させた。上清を再度取り除いた後、0.5BSAシグマ社製を添加したリン酸バッファーギブコ社製400μLの0.5BSA/PBSに懸濁し、この懸濁液をフローサイトメトリー測定に供した。3.フローサイトメトリー解析フローサイトメトリー解析はBDFACSCantoIIフローサイトメーターベクトンディッキンソン社を用いて機器指示書に従い行った。ZsGreenの発現率の求め方は、前方散乱光FSC、側方散乱光SSCの2パラメータヒストグラムx軸:FSC、y軸:SSC上で、目的細胞集団をゲートでくくり、そのゲート中の細胞集団をGFP検出パラメーターのヒストグラムx軸:GFPの蛍光強度、y軸:細胞数を示すで展開し、アイソタイプコントロールと比較してGFP蛍光強度の高い細胞をZsGreen陽性細胞として定義し、前述のゲート中全細胞数に対するZsGreen陽性細胞数の比率を遺伝子導入率GT:GeneTransductionefficiencyとし、及び蛍光強度MFI:MeanFluorescenceIntensityを測定した。遺伝子導入効率の測定結果を図1に示す。実施例2-2の培養方法により取得した各日のウイルス上清液を評価し、4日間のウイルス上清液の平均値を算出した。図1に示されるように、培地B群、C群を用いて回収したレトロウイルス上清液の遺伝子導入効率は、基本培地である培地Aよりも2倍以上の遺伝子導入効率を示した。すなわち、培地Aよりも高タイターのウイルスが得られ高効率にZsGreen遺伝子が導入された。また、培地B群、C群ともに培地D、Eと比較しても、TSA又はATRA単独よりも高い前記効果が得られた。なお、図中、NGMCは非遺伝子導入細胞を意味し、陰性対照を示す。以下図2~図15中も同様の意味である。蛍光強度以下、遺伝子発現強度を意味するの測定結果を図2に示す。実施例2-2の培養方法により取得した各日のウイルス上清液を評価し、4日間のウイルス上清液の平均値を算出した。図2に示されるように、培地B群、C群を用いて回収したレトロウイルス上清液の蛍光強度は、培地Aよりも2倍程度高い蛍光強度を示した。すなわち、培地Aよりも高タイターのウイルスが得られ高効率に遺伝子が導入されることにより蛍光レポータータンパク質ZsGreenが高発現された。また、培地D、Eと比較しても、TSA又はATRA単独よりも高い前記効果が得られた。実施例3NaB添加培地の調製実施例1記載の培地Aに、ATRAを最終濃度10nM、及び100nMとなるように添加し、さらに酪酸ナトリウムNaBを最終濃度5mMになるように添加して、培地F-1、F-2をそれぞれ作製した。更に、培地Fにlipidを溶液比V/Vで1/100、1/250、1/1000となるように添加して、培地G-1、G-2、G-3をそれぞれ作製した。さらに培地AにNaBのみ添加終濃度5mMした培地H、及びATRAのみ添加終濃度10nMした培地Eを作製した。これらの培地組成を表2に示す。実施例4レトロウイルス産生細胞の培養実施例2記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、実施例3の培地A、F群、G群、H及びEを用いて、実施例2-1と同様にしてウイルス上清液を取得した。遺伝子導入は実施例2-2と同様に行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例2-3と同様に行った。遺伝子導入効率の測定結果を図3に示す。図3に示されるように、培地F群、G群を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Aよりも2倍程度高い遺伝子導入効率を示した。すなわち、培地F群、G群では培地Aよりも高タイターのウイルスが得られ高効率にZsGreen遺伝子が導入された。また、培地H、ENaB又はATRA単独と比較しても、高い効果が得られた。蛍光強度の測定結果を図4に示す。実施例2-2の培養方法により取得した各日のウイルス上清液を評価し、4日間のウイルス上清液の平均値を算出した。図4に示されるように、培地F群、G群を用いて回収したレトロウイルス上清液で得られた遺伝子導入細胞は、培地Aを用いた場合よりも2倍程度高い蛍光強度を示した。すなわち、培地Aよりも高タイターのウイルスが得られ高効率に遺伝子が導入されることにより蛍光レポータータンパク質ZsGreenが高発現された。また、培地H、Eを用いた場合と比較しても細胞の蛍光強度は高かった。実施例5VPA添加培地の調製実施例1記載の培地Aに、レチノイン酸ATRAを最終濃度10nMとなるように添加し、さらにバルプロ酸VPA和光純薬工業を最終濃度500μM、1mM、2mMになるように添加した、培地I-1、I-2、及びI-3以下、培地I群と記載するを作製した。また、比較対照として、培地AにVPAを最終濃度500μM、1mM、2mMになるように添加した、培地J-1、J-2、及びJ-3以下、培地J群と記載するを作製した。さらに培地AにNaBのみ添加終濃度5mMした培地H、及びNaB終濃度5mMとATRA終濃度10nMを添加した培地F-1を作製した。これらの培地組成を表3に示す。実施例6レトロウイルス産生細胞の培養実施例2記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、実施例5の培地A、I群、J群、H、及びF-1を用いて、実施例2-1の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を実施例2-1では4日間としているが、本実施例では3日間で回収したウイルス上清液を混合して評価している。遺伝子導入はウイルス希釈を10倍とした以外は実施例2-2と同様に行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例2-3と同様に行った。遺伝子導入効率の測定結果を図5に示す。図5に示されるように、培地I群を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Aよりも2倍程度高い遺伝子導入効率を示した。すなわち、培地I群では培地Aよりも高タイターのウイルスが得られ高効率にZsGreen遺伝子が導入された。また、培地J群VPA単独と比較しても、高い効果が得られた。なお、実施例4の図2の結果と同様、培地F-1は、培地HNaB単独と比較しても、高い効果が得られた。実施例71.レトロウイルス産生細胞の作製国際公開第2008/153029号パンフレット記載のコドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルスベクターMS-MA24-siTCRを用いて、HEK293T細胞ATCCCRL-11268に、RetorovirusPackagingKitEcoタカラバイオ社製を用いて製品プロトコールに従いトランスフェクションし、各種エコトロピックレトロウイルス上清液を獲得した。このウイルス上清液を0.45μmフィルターMilexHV、ミリポア社製にてろ過し、PG13細胞にポリブレンを使用する方法により感染させ、限界稀釈法により細胞のクローン化を行った。2.レトロウイルス産生細胞のパイロットスケール培養実施例7-1で得られたクローン細胞から作製したワーキングセルバンクWCBを37°Cのウォーターバスにて解凍した。解凍された細胞液を15mL遠心チューブに移し、完全培地[10ウシ胎児血清10FBS、エスエーエフシーバイオサイエンス社製を含むDMEM培地ギブコ社製]を10mL加え、遠心処理500×g、5分間、20°Cを行った。遠心後、上清を除去し、10mLの完全培地に懸濁しセルカウントを行った。セルカウント後、完全培地を用いて、細胞懸濁液を78.5×104cells/mLに調製し、細胞培養用の100mmディッシュイワキ社製に前記の細胞懸濁液1mL、及び完全培地14.7mLを添加し、CO2インキュベーター37°C、湿度95、CO2濃度5にて培養を行った。継代間隔は3日とし、1継代目の播種細胞密度を1×104cells/cm2、液量を0.2mL/cm2として継代操作を行った。2継代目は播種細胞密度を1.0×104cells/cm2、液量を0.2mL/cm2として、細胞培養用のCELLBIND処理T225フラスコCORNING社製1個あたりに45.0mLずつ添加した。2継代目実施の3日後、培養上清液を取り除き、表4記載の培地H、F-1、K、L、及びB-1にそれぞれ置換した液量は0.1mL/cm2。なお、デキサメタゾンDEXナカライテスク社製は、培地K、Lに最終濃度100nMとなるように添加した。培地置換の翌日に、各培地を回収し、それぞれ新しい同じ培地に交換した。なお、2継代の3日後からは、32°C、湿度95、CO2濃度5にて培養を行った。上記の培地の交換と回収を3日間連続で計3回行い、3回目は培地の添加を行わず培地の回収のみ行った。回収した培養上清液1回目、2回目、3回目は、混合した後0.22μmのポアサイズのフィルターミリポア社製でろ過し、レトロウイルス上清液として小分け分注後-80°C保存した。3.レトロウイルス上清液の遺伝子導入評価レトロウイルス上清液について遺伝子導入効率の測定を行った。レトロネクチンを25μg/mL、抗CD3抗体OKT3、ヤンセンファーマ株式会社を5μg/mLとなるようにPBSに溶解した。この溶液を表面処理したtissueculturetreated6穴プレートに各ウェル1mLずつ添加し、37°Cで5時間放置した。その後溶液を除き、GT-T-RetroIIIタカラバイオ社製、以下、RetroIIIと記載するを用いて1mLずつ各ウェルを2回洗浄した。次に、RetroIIIにIL-2NOVARTIS社製を最終濃度600IU/mL、ファンギゾンブリストルマイヤーズスクイブ社製を最終濃度0.5μg/mL、自己血漿0.6となるように調製した培養用培地以下、CMと記載するを1mLずつで各ウェルを洗浄し、レトロネクチン/抗CD3抗体固定化プレートを作製した。ヒト末梢血より分離した末梢血単核球PBMCを、0.2×106個/mLとなるように、CMで調製し、この懸濁液6.7mLをフィブロネクチンフラグメント/抗CD3抗体固定化プレートに0.7mL/cm2となるように加え、培養を開始した。0.14×106mL/cm2培養開始より4日目に遺伝子導入操作を下記のように行った。培地H、F-1、K、L、及びB-1を用いて回収したレトロウイルス上清液それぞれについて原液、5倍希釈液を調製した。このとき希釈には、ACD-A、5アルブミン溶液及び2アルブミン溶液を用いた。遺伝子導入用の容器は24穴ノントリートメントプレートを用いた。24穴ノントリートメントプレートは、予めACD-Aで最終濃度20μg/mLになるように希釈したRetroNectinを各ウェルに0.5mL添加して4°Cで一晩処理し、プレートからRetroNectin溶液を取り除いた後、ACD-Aを用いて0.5mLずつで各ウェルの洗浄を2回行ったものを使用した。このプレートの各ウェルに各ウイルス希釈液を1mL添加し、遠心処理32°C、2000×g、2時間した。遠心後、各ウェルよりウイルス希釈液上清を取り除き、1.5アルブミン溶液0.5mLずつで各ウェルを3回洗浄した。培養細胞懸濁液を回収し、CMに、0.145×106cells/mLとなるように懸濁した。前記の洗浄後の24穴ノントリートメントプレートの各ウェルにこの懸濁液1mL0.0725×106cells/cm2を添加し、遠心処理32°C、1000×g、10分した。遠心後、CO2インキュベーター37°C、湿度95、CO2濃度5にて4時間培養を行った。その後、細胞懸濁液をCMで5倍希釈し、表面処理したtissueculturetreated6ウェルプレートに添加し培養を継続した。培養開始から7日目に細胞懸濁液と等量のCMを加え、2倍希釈して培養を更に継続した。培養開始から10日目に、レトロウイルスによる遺伝子導入効率を調べるために、MAGE-A4テトラマー-PEルードヴィッヒ社製、及びHumanCD8-APCcy7ベクトンディッキンソン社製にて染色し、フローサイトメーターによりCD8陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。具体的には、感染培養後の細胞0.3×106cellsをエッペンドルフチューブに移し、遠心処理4°C、500×g、5分間にて細胞を沈殿させた。上清を取り除いた後、沈殿した細胞は950μLの0.5BSA/PBSに懸濁し、遠心処理4°C、500×g、5分間にて再度細胞を沈殿させた。上清を再度取り除いた後、MAGE-A4テトラマー-PE1μLに0.5BSAを8μL添加した混合液で懸濁し、30分、4°Cで反応させた。その後、HumanCD8-APCcy7を1μL加え、30分、4°Cで反応させた。反応後、950μLの0.5BSA/PBSを添加し、遠心処理4°C、500×g、5分間にて上清を取り除く工程を2回行った後、400μLの0.5BSA/PBSに懸濁し、この懸濁液をフローサイトメトリー測定に供した。4.フローサイトメトリー解析フローサイトメトリー解析はBDFACSCantoIIフローサイトメーターを用いて機器指示書に従い行った。CD8陽性細胞中のテトラマー陽性細胞の存在比率の求め方は、APCcy7、PE検出パラメーターの2パラメータヒストグラムx軸:APCcy7の蛍光強度、y軸:PEの蛍光強度を示す上で、アイソタイプコントロールによりAPCcy7CD8、PEMAGE-A4テトラマー非発現細胞の蛍光強度領域を確認後、その領域を境に4分割し、APCcy7、PE発現細胞の蛍光強度領域を定め、その細胞数の割合を測定した。測定後、遺伝子導入効率GT:GeneTransductionefficiencyは、下記の式により求めた。GT=CD8、及びテトラマー陽性細胞数/CD8陽性細胞数遺伝子導入効率の測定結果を図6に示す。図6に示されるように、F-1、K、L、及びB-1を用いて回収したレトロウイルス上清液の導入効率は、基本培地である培地AにNaBを添加した培地Hよりも顕著に高い遺伝子導入効率を示した。すなわち、実施例2および4に記載の蛍光蛋白質発現ウイルスベクターに限らず、また、実験スケール以上のパイロットスケールにおいても、高タイターのウイルスが得られ高効率に目的遺伝子が導入された。5.レトロウイルス上清液のRNAコピー数評価レトロウイルス上清液についてRNAコピー数の測定を行った。測定は、RetrovirusTiterSetforRealTIMEPCRタカラバイオ社製を用いて、取扱説明書の標準的な使用方法に従ってRNAコピー数を算出した。結果については、図7に示されるように実施例7-4の遺伝子導入効率の結果と同様、ATRA、DEXの片方、又は両方をNaBと組み合わせることにより、基本培地である培地AにNaBを添加した培地Hよりも顕著に高いRNAコピー数以下、図中RNACOPYと記載を示した。実施例8TSA添加培地の調製2培地AにデキサメタゾンDEXを最終濃度100nM、レチノイン酸ATRAを最終濃度1μMとなるように添加し、さらにトリコスタチンATSAをそれぞれ最終濃度50nM、500nMになるように添加した、培地M-1、及びM-2以下、培地M群と記載するを作製した。さらに培地AにTSAを終濃度50nM、500nMになるように添加した、培地D-1、及びD-2以下、培地D群と記載するNaBのみ添加終濃度5mMした培地H、及びNaB終濃度5mM、レチノイン酸ATRAを最終濃度100nM、デキサメタゾンDEXを最終濃度100nM添加した培地Nを作製した。各培地の組成を表5に示す。実施例91.レトロウイルス産生細胞の培養実施例7-1記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、実施例8記載の培地を用いて、実施例2-1の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を実施例2-1では4日間としているが、本実施例では3日間で回収したウイルス上清液を混合して評価している。2.レトロウイルス上清液の遺伝子導入評価遺伝子導入はCD8抗体をHumanCD8-FITCベクトンディッキンソン社製を用いて実施した以外は実施例7-3と同様に行った。遺伝子導入効率の評価は、実施例7-4と同様に行った。遺伝子導入効率の測定結果を図8に示す。図8に示されるように、M-1とD-1、M-2とD-2、及びHとNを比較すると、NaB又はTSAと、ATRA、DEXを併用した培地を用いて回収したレトロウイルス上清液の導入効率は、NaB、TSA単独添加培地であるD群、及びHよりも顕著に高い遺伝子導入効率を示した。また、TSAは50nMより500nMで効果があった。3.レトロウイルス上清液のRNAコピー数評価レトロウイルス上清液についてRNAコピー数の測定を行った。測定は、RetrovirusTiterSetforRealTIMEPCRを用いて、取扱説明書の標準的な使用方法に従ってRNAコピー数を算出した。結果については、図9に示されるように実施例9-2の遺伝子導入効率の結果と同様、M-1とD-1、M-2とD-2、及びHとNを比較すると、ATRA、DEXの両方をNaB、又はTSAと組み合わせることにより、NaB、又はTSA単独添加培地よりも顕著に高いRNAコピー数を示した。また、TSAは50nMより500nMで効果があった。実施例10TSA添加培地の調製3実施例1と同様の方法で表6記載の最終濃度となるように培地を調製した。実施例11レトロウイルス産生細胞の培養実施例2記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。実施例10記載の培地を用いて、実施例2-1の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を本実施例では4日間で回収して混合したウイルス上清液と、3日間で回収して混合したウイルス上清液を評価している。遺伝子導入はウイルス希釈を10倍とした以外は実施例2-2と同様に行い、遺伝子導入効率及び蛍光強度の評価は、実施例2-3と同様に行った。遺伝子導入効率の測定結果を図10に示す。図10に示されるように、培地O群を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Aよりも6~8倍程度高い遺伝子導入効率を示した。また、遺伝子導入効率は、3日間より4日間の方が対照群からの上昇効果が大きかった。蛍光強度の測定結果を図11に示す。図11に示されるように、培地O群を用いて回収したレトロウイルス上清液での蛍光強度は、培地Aよりも2~3.5倍程度高い蛍光強度を示した。実施例129-cisレチノイン酸9-cisナカライテスク社製、AM80添加培地の調製実施例1と同様の方法で表7記載の最終濃度となるように培地を調製した。ここで、AM80にタミバロテンシグマ社製を使用した。実施例13レトロウイルス産生細胞の培養実施例2記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。実施例12記載の培地を用いて、実施例2-1の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を実施例2-1では4日間としているが、本実施例では3日間で回収したウイルス上清液を混合して評価している。遺伝子導入はウイルス希釈を10倍とした以外は実施例2-2と同様に行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例2-3と同様に行った。遺伝子導入効率の測定結果を図12に示す。図12に示されるように、培地P群、R群を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Aよりも1.5~2倍程度高い遺伝子導入効率を示した。なお、9-cis、AM80単独の培地Q群、S群の遺伝子導入効率は培地Aと同程度か減少する。実施例14スベロイルアニリドヒドロキサム酸SAHACAYMAN社製添加培地の調製実施例1と同様の方法で表8記載の最終濃度となるように培地を調製した。実施例15レトロウイルス産生細胞の培養実施例2記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。実施例14記載の培地を用いて、実施例2-1の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を実施例2-1では4日間としているが、本実施例では3日間で回収したウイルス上清液を混合して評価している。遺伝子導入はウイルス希釈を10倍とした以外は実施例2-2と同様に行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例2-3と同様に行った。遺伝子導入効率の測定結果を図13に示す。図13に示されるように、培地T群を用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Aよりも1.4~1.9倍程度高い遺伝子導入効率を示した。また、SAHA濃度が対応するU群培地よりも高い遺伝子導入効率を示した。実施例16NaB添加培地の調製2細胞培養用培地であるDMEMに非働化FBSを溶液比V/Vで1/10加えた基本培地培地Vとして、レチノイン酸ATRAを最終濃度100nMとなるように添加し、さらに酪酸ナトリウムNaBを最終濃度5mMになるように添加して、培地Wを作製した。さらに培地VにNaBのみ添加終濃度5mMした培地X、及びATRAのみ添加終濃度100nMした培地Yを作製した。各培地の組成を表9に示す。実施例17レトロウイルス産生細胞の培養実施例2記載のレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。実施例16記載の培地を用いて、実施例2-1の方法でウイルス上清液を取得した。ただし、ウイルス回収日数を実施例2-1では4日間としているが、本実施例では3日間で回収したウイルス上清液を混合して評価している。遺伝子導入はウイルス希釈を10倍とした以外は実施例2-2と同様に行い、遺伝子導入効率、蛍光強度の評価は、実施例2-3と同様に行った。遺伝子導入効率の測定結果を図14に示す。図14に示されるように、培地Wを用いて回収したレトロウイルス上清液での遺伝子導入効率は、培地Vよりも1.2倍程度高い遺伝子導入効率を示した。蛍光強度の測定結果を図15に示す。図15に示されるように、培地Wを用いて回収したレトロウイルス上清液での蛍光強度は、培地Vよりも1.5倍程度高い蛍光強度を示した。"