"a配列番号10-12の何れか一のCDR-L1配列、b配列番号13-15の何れか一のCDR-L2配列、c配列番号16-18の何れか一のCDR-L3配列、d配列番号19-22の何れか一のCDR-H1配列、e配列番号23-26の何れか一のCDR-H2配列、及びf配列番号27-30の何れか一のCDR-H3配列からなる群より選択された少なくとも一のCDR配列を含んでなる単離された抗体。抗体断片である請求項1に記載の抗体。キメラ又はヒト化抗体である請求項1に記載の抗体。二重特異性抗体である請求項1に記載の抗体。T細胞の表面に発現されるタンパク質に結合する請求項4に記載の抗体。T細胞の表面に発現されるタンパク質がCD3である請求項5に記載の抗体。増殖阻害剤にコンジュゲートしている、請求項1に記載の抗体。細胞障害性剤にコンジュゲートしている、請求項1に記載の抗体。細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核酸分解酵素からなる群より選択される、請求項8に記載の抗体。細胞障害性剤が毒素である、請求項8に記載の抗体。毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群より選択される、請求項10に記載の抗体。毒素がメイタンシノイドである、請求項10に記載の抗体。細菌中で生成される、請求項1に記載の抗体。CHO細胞中で生成される、請求項1に記載の抗体。結合する細胞の死を誘発する、請求項1に記載の抗体。前記細胞が前立腺癌細胞である、請求項15に記載の抗体。検出可能に標識される、請求項1に記載の抗体。配列番号3-5に示される何れかのVL配列を含む単離された抗体。配列番号6-9に示される何れかのVH配列を含む単離された抗体。配列番号3のVL配列及び配列番号6のVH配列を含む単離された抗体。配列番号3のVL配列及び配列番号7のVH配列を含む単離された抗体。配列番号4のVL配列及び配列番号8のVH配列を含む単離された抗体。配列番号5のVL配列及び配列番号9のVH配列を含む単離された抗体。請求項1に記載の抗体を生成する細胞。請求項1に記載の抗体をコードする単離された核酸。請求項1に記載の抗体である第二の抗体が結合するTAT425抗原性エピトープに結合する第一の抗体を同定する方法であって、該方法が、該第二の抗体のTAT425ポリペプチドへの結合を遮断する該第一の抗体の能力を決定することを含み、該第二の抗体の該TAT425ポリペプチドへの結合を遮断する該第一の抗体の能力が、等しい抗体濃度で少なくとも40であった場合に、該第二の抗体が結合するエピトープへ該第一の抗体が結合することができることを示す方法。TAT425ポリペプチドを発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞に、請求項1に記載の抗体を接触させることを含み、該抗体の該TAT425ポリペプチドへの結合が、該細胞の増殖の阻害を引き起こす方法。前記TAT425ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列又はその細胞外ドメインを含む、請求項27に記載の方法。前記細胞が前立腺癌細胞である、請求項27に記載の方法。TAT425ポリペプチドを発現する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、該方法が、該哺乳動物に対して、請求項1に記載の抗体の治療的有効量を投与することにより、該哺乳動物を効果的に処置することを含む方法。前記TAT425ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列又はその細胞外ドメインを含む、請求項30に記載の方法。前記細胞が前立腺癌細胞である、請求項30に記載の方法。TAT425タンパク質を含むと疑われる試料中における該TAT425タンパク質の存在を決定する方法であって、該方法が、請求項1に記載の抗体に該試料を曝露し、該試料中において該タンパク質に対する該抗体の結合を決定することを含み、該タンパク質への抗体の結合が、該試料中における該タンパク質の存在を示す方法。前記試料が、前記タンパク質を発現すると疑われる細胞を含む、請求項33に記載の方法。前記細胞が前立腺癌細胞である、請求項34に記載の方法。前記抗体が検出可能に標識される、請求項33に記載の方法。哺乳動物において腫瘍の存在を診断する方法であって、該方法が、該哺乳動物から採取した組織細胞の試験試料、及び同じ組織起源の既知の正常細胞のコントロール試料における、TAT425ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを決定することを含み、コントロール試料と比較して試験試料における該TAT425ポリペプチドの発現レベルが高い場合に、試験試料を採取した哺乳動物における腫瘍の存在を示す方法。前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを決定する工程が、インサイツハイブリダイゼーション又はRT-PCR分析においてオリゴヌクレオチドを使用することを含む、請求項37に記載の方法。前記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを決定する工程が、免疫組織化学分析又はウエスタンブロット分析において抗体を使用することを含む、請求項37に記載の方法。前記腫瘍が前立腺腫瘍である、請求項37に記載の方法。前記TAT211ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列又はその細胞外ドメインを含む、請求項37に記載の方法。哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法であって、該方法が、該哺乳動物から採取した組織細胞の試験試料を請求項1に記載の抗体と接触させ、試験試料中での該抗体とTAT425タンパク質との複合体の形成を検出することを含み、複合体の形成が、該哺乳動物における腫瘍の存在を示す方法。前記組織細胞からなる試験試料が、癌性腫瘍を有すると疑われる個体から得られる、請求項42に記載の方法。前記癌性腫瘍が前立腺腫瘍である、請求項43に記載の方法。前記TAT425タンパク質が配列番号2のアミノ酸配列又はその細胞外ドメインを含む、請求項42に記載の方法。2E4.6.1、4D11.17.2、13H2.28.2、及び14E7.17.1からなる群から選択される抗体が結合するのと同じTAT425エピトープに結合する抗体。実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ATCC受託番号により以下の実施例及び明細書全体の中で特定されている細胞の供給源はアメリカンタイプカルチャーコレクション、マナッサス、バージニアである。実施例1:GeneExpress登録商標を用いた組織発現プロファイリング他のヒト腫瘍及び/又は正常ヒト組織に比べて対象となる特定のヒト腫瘍組織において発現が顕著に且つ検出可能に上方制御されるポリペプチド及びそれをコードする核酸を同定するために、遺伝子発現情報を含む専有データベースGeneExpress登録商標、GeneLogicInc.、米国メリーランド州ゲイサーズバーグを分析した。具体的に言うと、GeneExpress登録商標データベースの分析は、GeneLogicInc.米国メリーランド州ゲイサーズバーグから入手できるGeneExpress登録商標データベースで使用するソフトウエア、またはGeneExpress登録商標データベースで使用する、ジェネンテック社で作成され、開発された専有ソフトウエアを用いて行った。分析のポジティブヒットの評価は、例えば、正常基本組織及び/又は正常増殖性組織における組織特異性、腫瘍特異性及び発現レベルなどを含むいくつかの基準に基づく。このmRNAの発現分析を用いて、TAT425ポリペプチドをコードするmRNAが、ヒト前立腺腫瘍及び腎臓腫瘍において、それぞれ対応する正常なヒト前立腺及び腎臓組織に比べて、顕著に、再現可能に、且つ検出可能に過剰発現することが決定された。実施例2:TATのmRNA発現の定量的解析このアッセイにおいて、5’ヌクレアーゼアッセイ例えば、TaqMan登録商標及びリアルタイム定量的PCR例えば、ABIPrizm7700配列検出システムSequenceDetectionSystem登録商標が、他の悪性腫瘍又は正常な非癌性組織と比較して、癌性腫瘍又は腫瘍で著しく過剰発現している遺伝子を見つけるために使用された。5’ヌクレアーゼアッセイ反応は、蛍光PCRに基づく技術であり、リアルタイムで遺伝子発現をモニターするためにTaqDNAポリメラーゼ酵素の5’エキソヌクレアーゼ活性を利用している。二つのオリゴヌクレオチドプライマーその配列は目的の遺伝子又はEST配列に基づいているが、PCR反応の典型的なアンプリコンを生成するために使用される。第三のオリゴヌクレオチド、又はプローブは、2つのPCRプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計されている。プローブは、TaqDNAポリメラーゼ酵素により非拡張可能であり、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で標識されている。レポーター色素からの任意のレーザー誘起発光は、2つの色素がプローブ上にあるように互いに近接して配置されている場合、消光色素により消光される。PCR増幅反応の間、TaqDNAポリメラーゼ酵素は鋳型に依存した方法でプローブを切断する。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、遊離したレポーター色素からのシグナルは、第二のフルオロフォアの消光効果を含まない。合成された各新規分子について、1分子のレポーター色素が遊離され、消光していないレポーター色素を検出することが、データの定量的解釈の基礎を提供する。5’ヌクレアーゼの手順は、ABIPrism7700TM配列検出SequenceDetectionなどのリアルタイム定量的PCR装置上で実行される。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子CCDカメラ及びコンピューターで構成される。このシステムは、サーモサイクラー上で96ウェル形式で試料を増幅する。増幅の間、レーザー誘起蛍光シグナルは、全96ウェルについて光ファイバーケーブルを介してリアルタイムに収集され、CCDで検出される。そのシステムは、測定器を動作し、データを分析するためのソフトウェアを含む。スクリーニングの出発物質は、様々な異なる癌組織の中から単離されたmRNAであった。mRNAは、例えば蛍光定量的に正確に定量される。ネガティブコントロールとして、RNAが、検査される癌組織と同じ組織型の種々の正常組織から単離された。5’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にCt、又は閾値サイクルとして表される。これは、レポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドレベルを超えて累積されるサイクルとして定義される。ΔCT値は、癌のmRNAの結果を正常ヒトmRNAの結果と比較した場合、核酸試料中の特定の標的配列の開始コピーの相対数の定量的な測定として用いられる。1Ctユニットは1PCRサイクル、又は正常に比べて約2倍の相対的な増加に対応するため、2ユニットは4倍の相対的増加に対応し、3ユニットは8倍の相対的増加に対応するなど、2又はそれ以上の異なる組織間でmRNAの相対的な倍増加を定量的に測定することができる。この技術を用いて、TAT425分子は、正常な非癌性ヒト前立腺組織に比べて、ヒト前立腺腫瘍で大幅に過剰発現されているすなわち、少なくとも2倍として同定されており、従って、哺乳類における前立腺癌の診断及び治療のための優れた標的ポリペプチドであることを表している。実施例3:インサイツハイブリダイゼーションインサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と局在化、特定のmRNA合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。インサイツハイブリダイゼーションは、Lu及びGillettCellVision1169176のプロトコールの最適化バージョンに従って、PCR生成32P標識リボプローブを用いて実施される。簡単に述べると、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼK20g/mlで15分間37°Cで脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリダイゼーションする。UTP標識アンチセンスリボプローブをPCR産物から生成し、55°Cで終夜ハイブリダイゼーションする。スライドをKodakNTB2核トラックエマルションに浸漬して4週間露出する。32Pリボプローブ合成6.0μl125mCiの32PUTPAmershamBF1002,SA<2000Ci/mmolをスピード真空乾燥させた。乾燥32PUTPを含む各管に以下の成分を添加した:2.0μlの5x転写バッファー1.0μlのDTT100mM2.0μlのNTP混合物2.5mM各10μlの10mMGTP,CTP及びATP10μlのH2O1.0μlのUTP50μM1.0μlのRNasin1.0μlのDNAテンプレート1μg1.0μlのH2O1.0μlのRNAポメラーゼPCR産物についてT3=AS,T7=S,通常管を37°Cで1時間インキュベートし、1.0μlのRQ1DNaseを添加し、ついで37°Cで15分間インキュベートした。90μlのTE10mMトリスpH7.6/1mMのEDTApH8.0を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMicrocon-50限外濾過ユニットに充填し、プログラム10を用いてスピンさせた6分間。濾過ユニットを第2の管に変換し、プログラム2を用いてスピンさせた3分間。最終回収スピンの後、100μlのTEを添加した。1μlの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBIOFLUORIIで数えた。プローブをTBE/尿素ゲル上で走らせた。1-3μlのプローブ又は5μlのRNAMrkIIIを3μlのローディングバッファーに添加した。加熱ブロック上で95°Cに3分間加熱した後、プローブを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルを流し、試料を充填し、180-250ボルトで45分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、-70°C冷凍機内で補強スクリーンを持つXARフィルムに1時間から終夜露出した。32PハイブリダイゼーションA.凍結切片の前処理スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で5分間解凍した。トレイを55°Cのインキュベータに5分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において4パラホルムアルデヒド中で10分間固定し、0.5xSSCで5分間室温で洗浄した25ml20xSSC975mlSQH2O。0.5μg/mlのプロテイナーゼ中、37°Cで10分間の脱タンパクの後250mlの予備加熱RNase無しRNaseバッファー中の10mg/mlストック12.5μl、切片を0.5xSSCで10分間室温で洗浄した。切片を、70、95、100エタノール中、各2分間脱水した。B.パラフィン包埋切片の前処理:スライドを脱パラフィンし、SQH2O中に配置し、2xSSCで室温において各々5分間2回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼK250mlのRNase無しRNaseバッファー中10mg/mlを500μl;37°C、15分間-ヒト胚又は8xプロテイナーゼK250mlのRNaseバッファー中100μl、37°C、30分間-ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5xSSCでのリンス及び脱水は上記のように実施した。C.プレハイブリダイゼーションスライドをBoxバッファー4xSSC、50ホルムアミド-飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。D.ハイブリダイゼーションスライド当たり1.0x106cpmのプローブ及び1.0μlのtRNA50mg/mlストックを95°Cで3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μlのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの32P混合物をスライド上のプレハイブリダイゼーション50μlに添加した。スライドを55°Cで終夜インキュベートした。E.洗浄洗浄は、2x10分間、2xSSC、EDTAで室温で実施し400mlの20xSSC16mlの0.25MEDTA、Vf=4L、次いでRNaseA処理を37°Cで30分間行った250mlRNaseバッファー中10mg/mlを500μl=20μg/ml。スライドを2x10分間、2xSSCEDTAで室温において洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件は次の通り:55°Cで2時間、0.1xSSC、EDTA20mlの20xSSC16mlのEDTA、Vf=4L。F.オリゴヌクレオチドここに開示した様々なDNA配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析に対して用いたオリゴヌクレオチドは添付図に示した核酸又はその相補鎖に相補的であるように得られた。G.結果TAT425に関しては、弱から中程度の発現が正常な前立腺上皮に観察されるものの、検査された他の正常組織では発現について陽性を示さなかった。これに対して、64の原発性前立腺癌のうち46が発現について陽性で、14の転移性前立腺癌のうち6が発現について陽性である。実施例4:GEPISによるTATペプチド発現差異の検証及び解析上記の一以上の例で説明したように、腫瘍抗原として同定されている可能性があるTATペプチドを以下のように分析し検証した。発現配列タグESTのDNAデータベースLIFESEQ登録商標、IncytePharmaceuticals,PaloAlto,CAを検索し、目的のEST配列をGEPISにより同定した。インシリコにおける遺伝子発現プロファイリングGEPISは、ジェネンテック社で開発された、新しい癌治療の標的に対する目的の遺伝子を特徴付けるバイオインフォマティクスツールである。GEPISは、遺伝子発現プロファイルを決定するための大量のEST配列及びライブラリ情報を利用している。GEPISは、ESTデータベースにおけるその出現数との比例関係に基づいて、遺伝子の発現プロファイルを決定することができ、それはLIFESEQ登録商標EST関連のデータベースとジェネンテック専有情報を厳格かつ統計学的に意味のある形で統合することによって動作する。GEPISは非常に具体的な分析課題又は広範なスクリーニング課題の何れかを実施するように構成することができるが、この例では、GEPISは、新規腫瘍抗原を同定しクロス検証するために使用される。初期スクリーニングでは、GEPISは、特定の組織または目的の組織多くの場合目的の腫瘍組織での発現に関連するLIFESEQ登録商標データベースからのEST配列を同定するために使用される。この初期スクリーニングで同定されたEST配列又は、初期スクリーニングから取得した複数の関連した重複しているEST配列を整列させることから得られるコンセンサス配列は、その後、エンコードされたタンパク質中の少なくとも1つの膜貫通ドメインの存在を特定することを意図してスクリーニングに供された。最後に、GEPISは、目的の様々な配列についての完全な組織発現プロファイルを生成するために用いられた。このタイプのスクリーニングのバイオインフォマティクスを使用して、様々なTATペプチド及びそれらをコードする核酸分子が、他の癌及び/又は正常な非癌性組織と比較して、特定のタイプの癌又は所定の癌において有意に過剰発現されているものとして同定された。GEPISヒットの評点は、例えば、正常で不可欠な組織及び/又は増殖性組織における、組織特異性、腫瘍特異性及び発現レベルを含むいくつかの基準に基づいている。この分析を使用して、GEPISによって決定されるTAT425は、特定の腫瘍すなわち、前立腺、腎臓、膵臓において、その関連する正常組織と比較して、高度な組織発現及び発現の著しい上方制御を証明している。このように、TAT425ポリペプチドは、哺乳動物における癌の診断及び治療のための優れた標的ポリペプチドである。実施例5:TAT425ポリペプチドに結合する抗体の調製この実施例は、TAT425に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。使用することができる免疫原には、精製TAT、TATを含む融合タンパク質、及び細胞表面上に組換えTATを発現する細胞が含まれる。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入したTAT免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL-TDMアジュバントRibiImmunochemicalResearh,Hamilton,MTに乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗TAT抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。適当な抗体力価が検出された後、抗体にポジティブ陽性な動物に、TATの静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を35ポリエチレングリコールを用いて、ATCCから番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HATヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。ハイブリドーマ細胞は、TATに対する反応性についてのELISAでスクリーニングされる。TATに対する所望のモノクローナル抗体を分泌するポジティブ陽性ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。陽性ハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗TATモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで増殖させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ-を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインA又はプロテインGへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。その他の技術において、BALB/cマウスCharlesRiver,Hollister,CAまたはC57BL/6/TAT425.koマウスGenentech,SouthSanFrancisco,CAを、以前に記述されるように、mFlt3リガンドDNA及びMGM-CSFDNAジェネンテックの有無によらず、TAT425をエンコードする50μgのプラスミドDNAを、乳酸リンゲル液で希釈し、水力学的尾静脈HTV注射により免疫化したLiuetalGeneTher61258及びHerweijerandWolffGeneTher10453。脾臓を最後のHTV免疫感作後3日で回収した。これらのマウス由来の脾細胞は、その血清の全てが、FACSによりTAT425を過剰発現する293細胞に強い結合を示し、電気融合CytopulseまたはBTXによりX63-Ag8.653マウス骨髄腫細胞アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、MDと融合させ、37°Cで、7CO2で、10ウシ胎児血清FBS、4.5g/Lのグルコース、25mMのHEPES、0.15mg/mlのオキサロ酸、100μg/mlのピルビン酸、0.2U/mlのインスリン、2mMのL-グルタミン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンペニシリン-ストレプトマイシンPenicillin-Streptomycin、Invitrogen,Carlsbad,CA、NCTC-109Lonza、NEAAインビトロジェンを補充したダルベッコ改変イーグル培地DMEM中で一晩インキュベートし、5.7μMのアザセリンと100μMのヒポキサンチンHA,Sigma-Aldrich,St.Louis,MOを補充した96ウェルプレートにプレーティングした。融合後11日目に、上清を、ELISA及びFACSによってIgG産生についてスクリーニングした。FACSにより強いTAT425特異的結合を示すIgG抗体を分泌するハイブリドーマを増殖させ、限界希釈によりサブクローニングした。サブクローニングの第二ラウンド後に最高のFACS結合を示す最終クローンをバイオリアクターでの大規模生産のために増殖させたIntegraBiosciences,Chur,Switzerland。前述のように上清をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製した。上記の技術を使用して、天然型TAT425ポリペプチドに結合する様々なモノクローナル抗体を生成した。これらのモノクローナル抗体は、種々の細胞TAT425タンパク質、LuCAP77細胞、LuCAP105細胞、LuCAP141細胞、およびLNCaP-shTAT425細胞を発現するように設計された293細胞を含むの表面に発現されたTAT425ポリペプチドに結合することが、周知かつ日常的に用いられる技術、例えばウエスタンブロット、ELISA分析、TAT425ポリペプチドを発現している細胞のFACS分類分析及び/又は免疫組織化学分析を用いて示されている。これらの抗TAT425抗体に関連するアミノ酸配列が図3-10に示されている。これらの抗体は、TAT425の発現に関連した人間の癌の診断及び治療における使用を見出すであろう。実施例6:免疫組織化学分析TAT425に対する抗体を上述のように調製し、以下のように、商業的に入手されたM4I-80ラット抗TAT425モノクローナル抗体を用いて免疫組織化学分析を行った。まず組織切片をアセトン/エタノール凍結又はパラフィン包埋中で5分間固定した。次いで組織切片をPBSで洗浄し、その後アビジン及びビオチンVectorKitでそれぞれ10分間遮断した後、PBSで洗浄した。次いで切片を10の血清で20分間遮断し、その後ブロッティングにより過剰量を取り除いた。その後切片に10μg/mlの濃度で1時間にわたり一次抗体を添加し、その後PBSで洗浄した。次いでビオチン標識した二次抗体抗一次抗体を30分間にわたって切片に添加し、その後切片をPBSで洗浄した。次に切片をVectorABCキットの試薬に30分間曝し、その後PBSで洗浄した。さらに切片をジアミノベンジジンPierceに5分間曝し、その後PBSで洗浄した。次いでMayersのヘマトキシリンを用いて切片を対比染色し、カバーガラスで覆って可視化した。また、Sambrook等、MolecularCloninngALaboratoryManualNewYorkColdSpringHarborPress1989及びAusubel等、CurrentProtocolsofMolecularBiologyUnit316JohnWiley及びSonsに記載のようにして、免疫組織化学分析を行うこともできる。これらの分析結果から、TAT425ポリペプチドの検出可能な発現が、29の独立した原発性ヒト前立腺癌試料のうち27で観察されそのうち24は中程度から高度のTAT425発現を示した、及び29の転移性ヒト前立腺癌試料のうち26で観察されたそのうち13は中程度から高度のTAT425発現を示したことを示している。実施例7:競合的結合分析及びエピトープマッピング記載されたモノクローナル抗体が結合するTAT425エピトープは、標準的な競合的結合分析によって決定することができる。クロスブロッキング研究は、蛍光を定量するPANDEXTMScreenMachineを用いて、TAT425を発現するように操作されたインタクトなPC3細胞における直接的な蛍光によって抗体において行うことができる。各モノクローナル抗体は、確立された手順を用いて、フルオレセインイソチオシアネートFITCとコンジュゲートされるSanFranciscoWJFreemanCo。TAT42を発現するPC3細胞のコンフルエントな単層をトリプシン処理し、一回洗浄し、0.5ウシ血清アルブミンBSAおよび0.1アジ化ナトリウムを含有する冷PBS中に1.75×106細胞/mlで再懸濁した。最終濃度1のラテックス粒子IDC,Portland,ORが、PANDEXTMプレート膜の目詰まりを低減するために加えられた。懸濁液中の細胞の20μl、精製したモノクローナル抗体100μg/ml~0.1μg/mlの20μlをPANDEXTMプレートウェルに添加し、氷上で30分間インキュベートする。20μlのFITC標識モノクローナル抗体の所定希釈液が各ウェルに添加され、30分間インキュベートし、洗浄し、蛍光をPANDEXTMScreenMachineにより定量化する。モノクローナル抗体は、同じ抗体濃度での無関係なモノクローナル抗体コントロールと比較した場合、各々が他の結合を40以上ブロックするならば、一つのエピトープを共有することが考えられる。このアッセイを使用して、当業者は、上記のものと同じエピトープに結合する他のモノクローナル抗体を同定することができる。欠失分析はまた、配列番号2の抗原エピトープとして示されるポリペプチド配列内のおよその位置を同定するために行われ得る。一実験において、抗TAT425モノクローナル抗体の2E4.6.1,4D11.17.2,13H2.28.2,及び14E7.17.1が互いにエピトープ結合を競合することはないことが実証された。そのようなものとして、四つの抗体の各々は、TAT425タンパク質において独立した非重複の細胞外抗原エピトープに結合することが確定された。実施例8:TAT425に結合する、毒素をコンジュゲートした抗体の調整細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療において腫瘍細胞を殺すか又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体-薬剤コンジュゲートADC、つまり免疫複合体を用いるとCancerCell3207212Syrigos及びEpenetosAnticancerResearch19605614NiculescuDuvaz及びSpringerAdvDrgDelRev26151172;米国特許第4975278号、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうるLancetpp60305ThorpeAntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapyAReviewinMonoclonalAntibodies84BiologicalAndClinicalApplicationsAPincheraらpp475506。これによって、最小限の毒性で最大限の効果が求められる。ADCを設定して精製するために、モノクローナル抗体の選択性並びに薬剤結合特性及び薬剤放出特性に注目した。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は共に、この方策に有用であるとして報告されているCancerImmunolImmunother2118387。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる、上掲。抗体-毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンJoftheNatCancerInst9215731581;MandlerらBioorganicMedChemLetters1010251028;MandlerらBioconjugateChem13786791、メイタンシノイドProcNatlAcadSciUSA9386188623、及びカリケアマイシンCancerRes582928;HinmanらCancerRes5333363342などの小分子毒素が含まれる。本発明の抗体薬剤コンジュゲートにおいて、抗体を、リンカーを介して、一つ以上の薬剤部分、例えば抗体につき約1~約20の薬剤部分にコンジュゲートする。式:Ab-pを有するADCはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる:1共有結合の後に薬剤部分Dと反応してAbLを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応;及び2共有結合の後に抗体の求核基と反応してDLを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ADCを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、6マレイミドカプロイル、マレイミドプロパノイル、バリンシトルリン、アラニンフェニルアラニン、pアミノベンジルオキシカルボンイル、Nスクシンイミジル4ペンタノエート、Nスクシンイミジル4シクロヘキサン1カルボキシレート、及びNスクシンイミジルアミノ安息香酸エステルを含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において記述される。いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリンシトルリン、アラニンフェニルアラニンを含む。例示的なトリペプチドは、グリシンバリンシトルリン及びグリシングリシングリシンを含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンB、C及びD又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む:iN末端アミン基、ii側鎖アミン基、例えばリシン、iii側鎖チオール基、例えばシステイン、およびiv抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステルおよびアリールヒドラジド基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群およびリンカー試薬により共有結合を形成することができる:i活性エステル、例えばNHSエステル、HOBtエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物;iiアルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド;iiiアルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばDTTによる処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、2の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる2イミノチオランを用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、1、2、3、4又はそれ以上のシステイン残基を導入することによって抗体に導入されてもよい。また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入することによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル基が生じうる。他の実施態様では、N末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成するBioconjugateChem3138146;米国特許第5362852号。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。DNAの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの2つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、レセプターに抗体をコンジュゲートし、ここで抗体レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤にコンジュゲートするリガンドを投与する。毒素を精製した抗体に連結することによって抗体薬剤コンジュゲートを生産するための技術には周知のものがあり、当分野で慣例的に用いられる。例えば、毒素DM1への精製されたモノクローナル抗体のコンジュゲートは、以下の通りに達成されうる。精製された抗体は、ジチオピリジル基を導入するために、Nスクシンイミジル4ペンタノエートによって、誘導体化される。NaCl及びEDTAを含有する44.7mLの50mMリン酸カリウムバッファ中の抗体を、SPPにて処理した。室温、アルゴン下にて90分間インキュベートした後、抗応混合物を、35mMのクエン酸ナトリウム、154mMNaCl、2mMEDTAにて平衡化したSephadexG25カラムにゲル濾過する。抗体含有分画をプールして、アッセイした。抗体SPPPyを上記の35mMクエン酸ナトリウムバッファ、pH6.5にて希釈して、およそ2.5mg/mLの終濃度にした。次いで、DM1を含む3.0mMのジメチルアセトアミドに流す。流速は5.0mL/分、65の分画を回収する。分画をプールし、分析した。この分析において、抗体分子当たりの結合されるDM1薬剤分子の数は、252nm及び280nmの吸光度を測定して決定する。また、例示として、毒素DM1への精製されたモノクローナル抗体のコンジュゲートは、以下の通りに達成されうる。精製された抗体は、シクロヘキサン1カルボキシレートで誘導体化して、SMCCリンカーを導入する。50mMリン酸カリウム/50mM塩化ナトリウム/2mMEDTA、pH6.5中で、7.5モル等量のSMCCにて20mg/mLの抗体を処理した。室温のアルゴン下で2時間撹拌した後に、反応混合物を、50mMリン酸カリウム/50mM塩化ナトリウム/2mMEDTA、pH6.5にて平衡化したSephadexG25カラムにてろ過する。抗体を含有する分画をプールして、アッセイする。次いで、抗体SMCCを、50mMリン酸カリウム/50mM塩化ナトリウム/2mMEDTA、pH6.5で希釈して、最終濃度およそ10mg/mlとし、10mMのDM1を含むジメチルアセトアミド溶液にて反応させる。反応は、16.5時間、室温、アルゴン下にて撹拌して行う。コンジュゲート反応混合物は、pH6.5の1×PBSによるSephadexG25ゲル濾過カラムに濾過する。次いで、DM1/抗体の比を252nmと280nmの吸光度にて測定する。さらに、選択した抗体の遊離システインを、ビスマレイミド試薬BM4にて修飾して、抗体の表面上の反応していないマレイミド基を除去する。これは、BM4を50のエタノール/水混合液に10mMの濃度になるまで溶解して、およそ1.6mg/mlの濃度でリン酸緩衝食塩水に抗体を含有する溶液に10倍のモル過剰量を加え、1時間反応させることによって達成される。過剰なBM4は、30mMクエン酸塩、pH6と150mMNaClバッファによるゲル濾過にて除去した。およそ10倍のモル過剰DM1を、ジメチルアセトアミドに溶解して、抗体BMPEO中間生成物に加える。また、ジメチルホルムアミドを用いて薬剤成分試薬を溶解してもよい。反応混合物を終夜反応させて、PBSでゲル濾過ないし透析を行って反応していない薬剤を取り除く。PBS中のS200カラムによるゲル濾過を用いて、高分子量凝集塊を取り除いて、精製された抗体BMPEODM1コンジュゲートに供給する。典型的に、細胞毒性剤は、抗体の多数になりうるリジン残基により抗体にコンジュゲートされている。対象の抗体に存在するか、又は対象の抗体中に操作したチオール基によるコンジュゲートもまた達成されている。例えば、システイン残基は遺伝子工学技術によってタンパク質内に導入されて、リガンドの共有結合的付着部位を形成しているJBiolChem1396449650;Bernhard等BioconjugateChem5126132;Greenwood等TherapeuticImmunology1247255;Tu等ProcNatlAcadSciUSA9648624867;Kanno等JofBiotechnology76207214;Chmura等ProcNatAcadSciUSA9884808484;米国特許第6248564号。一旦遊離システイン残基が対象の抗体の中に存在すると、毒素はその部位に連結されうる。例えば、薬剤リンカー試薬であるマレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンE、すなわちMCMMAE、マレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンF、すなわちMCMMAF、MCvalcitPABMMAE又はMCvalcitPABMMAFをDMSOに溶解して、濃度がわかっているアセトニトリルと水にて希釈して、冷やしたシステイン誘導体化抗体を含むリン酸緩衝生理食塩水に添加する。およそ1時間後に、過剰量のマレイミドを添加して反応を止め、反応していない抗体チオール基を覆った。反応混合物を遠心限外濾過によって濃縮し、毒素コンジュゲート抗体を精製して、PBS中のG25樹脂による溶出によって脱塩して、無菌条件下で0.2mのフィルターにて濾過して、保存のために凍結した。さらに、本発明の抗TAT抗体は、以下の技術を用いてアウリスタチン及びドロスタチン毒素にコンジュゲートされうる。抗体は、pH8.0の500mMホウ酸ナトリウムと500mM塩化ナトリウムに溶解して、過剰量の100mMジチオトレイトールで処理した。37°Cでおよそ30分インキュベートした後、SephadexG25樹脂で溶出することによって、バッファを交換して、1mMDTPAを含むPBSにて溶出した。溶液の280nmの吸光度とDTNBと反応させて412nmの吸光度の測定によるチオール濃度から、還元した抗体濃度を決定することによって、チオール/Ab値を調べる。PBSに溶解した還元型抗体を氷上で冷やす。薬剤リンカー試薬であるマレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンE、すなわちMCMMAE、MCMMAF、3MCvalcitPABMMAE又は4MCvalcitPABMMAFをDMSOに溶解して、濃度がわかっているアセトニトリルと水にて希釈して、冷やした還元型抗体をPBSに添加する。およそ1時間後に、過剰量のマレイミドを添加して反応を止め、反応していない抗体チオール基を覆った。反応混合物を遠心限外濾過によって濃縮し、コンジュゲートした抗体を精製して、PBS中のG25樹脂による溶出によって脱塩して、無菌条件下で0.2mのフィルターにて濾過して、保存のために凍結した。実施例9;TAT425二重特異性抗体の産生及び特性評価TAT425二重特異性抗体、具体的には抗CD3/TAT425二重特異性抗体の構築を以下に記述する。さまざまな突起を空洞へprotruberance-into-cavity二重特異性抗体が以前に記載されている。例えば、米国特許第5731168号及び米国特許第7183076号;RidgwayetalProtEng9617621AtwelletalJMolBiol2702635MerchantetalNatBiotechn16677681を参照。特定の場合において、以前にChamowetalJImmunol1534268によって記述された、ヒト化抗CD3/CD4-IgGキメラ間のCH3界面が、発現コンストラクトで共トランスフェクトされた哺乳動物細胞株から回収することができ得るヘテロ多量体の割合を最大化するように操作された。本明細書に用いられる場合、ヘテロ多量体は、少なくとも第一のポリペプチド及び第二ポリペプチドを含む、分子、例えば、二重特異性抗体を指し、ここで第二のポリペプチドは、アミノ酸配列において、第一のポリペプチドから少なくとも1つのアミノ酸残基を異にする。前項に引用された文献に記載されているように、ヘテロ多量体形成を促進するために用いられる戦略は、一以上の突起変異を第一のポリペプチド、例えば、一抗体H鎖のCH3ドメインに導入すること、及びまた、一以上の対応する空洞変異を第二のポリペプチド、例えば、第二の抗体H鎖のCH3ドメインに導入することに依存する。突起変異は小さいアミノ酸を大きなものと置換し、空洞変異は大きいアミノ酸を小さなものと置換する。更に、突起変異及び空洞変異に加えて、遊離型チオール含有残基が2つのポリペプチド、例えば、2つのCH3ドメインの界面に導入され、これらがヘテロ多量体の形成を促進することが示された。様々な典型的な、突起を空洞へprotruberance-into-cavityの変異、及びポリペプチドの界面で導入される遊離型チオール含有残基が記述されている。例えば、米国特許第5731168号及び米国特許第7183076号;RidgwayetalProtEng9617621AtwelletalJMolBiol2702635MerchantetalNatBiotechn16677681を参照。以下の工程が抗CD3/TAT425二重特異性抗体を産生するために実行される。マウス抗CD3モノクローナルAbUCHT1のヒト化抗CD3軽鎖L及び重鎖Hをコードする大腸菌発現プラスミドが構築される米国特許第5821337号及び米国特許第6407213号ShalabyetalJExpMed1752171992andRodriguesetalIntJCancer7451992。多くの適当な大腸菌発現プラスミドがpAK19を含み、当技術分野で知られている。CarteretalBioTehcnology10163167ヒト化抗CD3のH鎖のCH3ドメインへ、突起又は空洞のどちらかを上記のように導入する変異が例えば部位特異的突然変異誘発法により成される。様々な部位特異的突然変異誘発法が当該技術分野で知られている。例えば、KunkeletalMethodsEnzymol154367382を参照。更に、抗TAT425軽鎖及び重鎖、例えば本明細書に記載される抗TAT425軽鎖及び重鎖をコードする大腸菌発現プラスミドが構築される。抗TAT425のH鎖の上記のとおりのCH3ドメインにおいて、対応する空洞抗CD3のCH3ドメインが突起の変異を有する場合又は対応する突起抗CD3のCH3ドメインが空洞の変異を有する場合の何れかを導入する変異が、例えば、部位特異的突然変異誘発法により成される。二重特異性抗CD3/TAT425抗体は上記の大腸菌発現プラスミドを、当該技術分野で周知の方法で、適切な大腸菌株、例えば、33B6の中へ形質転換することにより産生される。例えば、RodriguesetalCancerRes556370を参照。抗体は、前述のように10リットルの発酵槽で増殖させた形質転換した大腸菌から分泌されるCarteretalBioTechnology10163167。抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて、精製され、分析される。例えば、AtwelletalJMolBiol2702635を参照。実施例10:インビトロでの腫瘍細胞死滅アッセイ対象のTAT425ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を、標準的な発現ベクター及びクローニング法を使用して得る。あるいは、対象のTAT425ポリペプチドを発現する多くの腫瘍細胞株は例えばATCCから公的に入手可能であり、標準的なELISA又はFACS分析法を使用して常套的に同定することができる。ついで抗TAT425ポリペプチドモノクローナル抗体及びその毒素コンジュゲート誘導体をアッセイで用いて、TAT425ポリペプチド発現細胞を死滅させるインビトロでの抗体の能力を定量することができる。例えば、対象のTAT425ポリペプチドを発現する細胞を上述のようにして得て、96ウェルの皿に蒔く。一分析例では、抗体/毒素コンジュゲート又は裸の抗体を4日の期間の細胞インキュベーションの間、含ませる。第二の独立の分析例では、細胞を抗体/毒素コンジュゲート又は裸の抗体と共に1時間インキュベートし、ついで洗浄して、4日の期間、抗体/毒素コンジュゲートの不存在下でインキュベートする。ついで、細胞生存度を、PromegaのCellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssayカタログ番号G7571を使用して測定する。未処理細胞はネガティブコントロールになる。実施例11:ハイブリダイゼーションプローブとしてのTATの使用以下の方法は、TATをコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとして、すなわち哺乳類における腫瘍の存在を診断するための使用を記載する。ここに開示した完全長又は成熟TATのコード化配列を含んでなるDNAを、ヒト組織cDNAライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける相同的なDNA例えば、TATの天然に生じる変異体をコードするもののスクリーニングのためのプローブとしてもまた用いられる。いずれかのライブラリーDNAを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高ストリンジェント条件で実施した。放射標識TAT誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、50ホルムアルデヒド、5×SSC、0.1SDS、0.1ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2×デンハルト溶液、及び10硫酸デキストランの溶液中で、42°Cにおいて20時間行った。フィルターの洗浄は、0.1×SSC及び0.1SDSの水溶液中、42°Cで行った。ついで、完全長天然配列TATをコードするDNAと所望の配列同一性を有するDNAは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。実施例12:大腸菌中でのTATの発現この実施例は、大腸菌中での組換え発現によるTATの非グリコシル化形態の調製を例証する。TATをコードするDNA配列は、選択されたPCRプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、pBR322大腸菌由来のもの;Bolivar等Gene295参照であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸化される。PCR増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリHisリーダー最初の6つのSTIIコドン、ポリHis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む、TATコードする領域、ラムダ転写ターミネーター、及びargU遺伝子を含む。ライゲーション混合物は、ついで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いて選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのLBプレートで増殖する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドDNAが単離され、制限分析及びDNA配列で確認される。選択されたクローンは、抗生物質を添加したLBブロスなどの液体培地で終夜増殖させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を所望の光学密度まで増殖させ、その間に発現プロモーターが作動する。さらに数時間の細胞培養の後、遠心分離による集菌が可能である。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化TATタンパク質を、タンパク質が堅く結合する条件下で金属キレート化カラムを用いて精製した。以下の手法を用いて、ポリHisポリヒスタグ形態でTATを大腸菌で発現させてもよい。TATをコードするDNAを選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでPCR増幅された、ポリHisタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株52W3110fuhAtonAlongalErpoHtshtpRtsclpPlacIqに基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中、30°Cで振盪しながら3-5のO.D.600に達するまで増殖させた。ついで培地をCRAP培地3.57gの2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム2H2O、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのShefieldhycaseSF、並びに110mMのMPOS、pH7.3、0.55w/vのグルコース及び7mMのMgSO4の混合で調製中に50-100倍希釈し、30°Cで振盪させながら約20-30時間増殖させた。試料を取り出してSDSPAGE分析により発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞ペレットを精製及びリフォールディングまで凍結させた。0.5から1Lの発酵6-10gペレットからの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量w/vで再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4°Cで終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸化によりブロックされた変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckmanのUltracentrifuge中で40,000rpmで30分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4の3-5容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagenNi-NTA金属キレートカラムに充填した。カラムを50mMのイミダゾールCalbiochem,Utrolgradeを含む添加バッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4°Cで保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。試料を、20mMのトリス、pH8.6、0.3MのNaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのEDTAからなる新たに調製した再生バッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50~100マイクログラム/mlとなるように選択した。リフォールディング溶液を4°Cで12-36時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はTFAを最終濃度0.4約3のpHで添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2-10で添加した。再生したタンパク質を、PorosR1/H逆相カラムで、0.1TFAの移動バッファーと10~80のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分の一定分量をSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最も緻密であり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。所望の折り畳みTATポリペプチドを含有する画分をプールし、その溶液に向けられた弱い窒素の気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質は、透析によるか、又は調製バッファーで平衡化したG25SuperfinePharmacia樹脂を用いたゲル濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4のマンニトールを含む20mMのHepes、pH6.8に調製され、滅菌濾過された。ここで記載されるTATポリペプチドのあるものは、この方法を使用して成功裏に発現させ精製した。実施例13:哺乳動物細胞中でのTATの発現この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるTATの潜在的なグリコシル化形態の調製を例示する。発現ベクターとしてpRK51989年3月15日発行のEP307247を参照のことを用いた。場合によっては、TATDNAを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてTATDNAを挿入させる。得られたベクターは、各々pRK5TATと呼ばれる。一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞とすることができる。ヒト293細胞ATCCCCL1573は、ウシ胎児血清及び場合によっては栄養成分及び/又は抗生物質を添加したDMEMなどの媒質中で組織培養プレートにおいて増殖させて集密化した。約10μgのpRK5-TATDNAを、VARNA遺伝子をコードする約1μgのDNAと混合しThimmappaya等Cell31543、500μlの1mMトリス-HCl、0.1mMEDTA、0.227MCaCl2に溶解させた。この混合物に、500μlの50mMHEPESpH7.35、280mMのNaCl、1.5mMのNaPO4を滴下添加し、25°Cで10分間沈殿物を形成させた。沈殿物を懸濁し、293細胞に加えて37°Cで約4時間定着させた。培養培地を吸引し、2mlのPBS中20グリセロールを30秒間添加した。293細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。形質移入の約24時間後、培養培地を除去し、培養培地単独又は200μCi/mlの35S-システイン及び200μCi/mlの35S-メチオニンを含む培養培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15SDSゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、TATポリペプチドの存在を現すとして選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し無血清培地で、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。これに換わる技術において、TATは、Somparyrac等ProcNatlAcadSci127575に記載された硫酸デキストラン法を用いて293細胞に一過的に導入される。293細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで増殖させ、700μgのpRK5-TATDNAを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、PBSで洗浄した。DNA-デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を20グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたTATを含む試料を濃縮し、透析及び/又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。他の実施態様では、TATをCHO細胞で発現させることができる。pRK5-TATは、CaPO4又はDEAE-デキストランなどの公知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地単独又は35Sメチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。TATポリペプチドの存在を判定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、ついで条件培地を収集する。ついで、発現されたTATを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。また、エピトープタグTATは、宿主CHO細胞において発現させてもよい。TATは、pRK5ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、ついで、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリHisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリHisタグTAT挿入物は、ついで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで上記のように形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリHisタグTATを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ni2-キレートアフィニティークロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。また、TATは、一過性発現法によって、CHO及び/又はCOS細胞中で、あるいは他の安定な発現法によってCHO細胞中で発現させることもできる。CHO細胞における安定な発現は,以下の方法を用いて実施することが可能である。タンパク質を、各タンパク質の可溶形態のコード化配列例えば、細胞外ドメインがヒンジ、CH2及びCH2ドメインを含むIgG1定常領域配列に融合したIgGコンストラクトイムノアドヘシン及び/又はポリHisタグ形態として発現する。PCR増幅に続いて、それぞれのDNAを、Ausubel等CurrentProtocolsofMolecularBiologyUnit316JohnWileyandSonsに記載されたような標準的技術を用いてCHO発現ベクターにサブクローニングした。CHO発現ベクターは、対象とするDNAの5’及び3’に適合する制限部位を有し、cDNAの便利なシャトル化ができるように作製される。ベクターは、Lucas等NuclAcidsRes24917741779に記載されたようにCHO細胞での発現を用い、対象とするcDNA及びジヒドロフォレートレダクターゼDHFRの発現の制御にSV40初期プロモーター/エンハンサーを用いる。DHFR発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。所望のプラスミドDNAの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬SUPERFECT登録商標Quiagen、DOSPER登録商標及びFUGENE登録商標BoehringerMannheimを用いいて約一千万のCHO細胞に導入した。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように増殖させた。約3×107細胞を、下記のような更なる増殖及び生産のためにアンプル中で凍結させた。プラスミドDNAを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで5分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地0.2μm濾過PS20、5の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mlスピナーに分けた。1-2日後、細胞を150mLの選択増殖培地を満たした250mLスピナーに移し、37°Cでインキュベートした。さらに2-3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3×105細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なCHO培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5122469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2×106細胞/mLで播種した。0日目に、細胞数とpHを測定した。1日目に、スピナーをサンプリングし、濾過空気での散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプリングし、温度を33°Cに変え、500g/Lのグルコース及び0.6mLの10消泡剤例えば35ポリジメチルシロキサンエマルション、DowCorning365MedicalGradeEmulsionの30mLとした。生産を通して、pHは7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4°Cで貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。ポリHisタグコンストラクトについて、タンパク質はNi-NTAカラムQiagenを用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes、pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi-NTAカラムに4-5ml/分の流速で4°Cにおいてポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4のマンニトール、pH6.8を含む貯蔵バッファー中で25mlのG25SuperfinePharmaciaカラムを用いて脱塩し、-80°Cで貯蔵した。イムノアドヘシンFc含有コンストラクトを以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー、pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラムPharmaciaにポンプ供給した。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸、pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μLの1Mトリスバッファー、pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリHisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はSDSポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマンEdman分解によりN末端アミノ酸配列決定した。ここに開示されるTATポリペプチドのあるものは、この方法を使用して成功裏に発現させ精製した。実施例14:酵母中でのTATの発現以下の方法は、酵母中でのTATの組換え発現を記述する。第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのTATの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。TATをコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してTATの細胞内発現を指示する。分泌のために、TATをコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、天然TATシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又は転化酵素分泌シグナル/リーダー配列、及び必要ならばTATの発現のためのリンカー配列と共にクローニングすることができる。酵母菌株AB110等の酵母菌は、ついで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10トリクロロ酢酸での沈降及びSDS-PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。続いて組換えTATは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。TATを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。ここに開示されるTATポリペプチドのあるものは、この方法を使用して成功裏に発現させ精製した。実施例15:バキュロウイルス感染昆虫細胞中でのTATの発現以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるTATの組換え発現を示す。TATをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリHisタグ及び免疫グロブリンタグIgGのFc領域などを含む。pVL1393Novagenなどの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単に述べると、TATコード化配列,又はTATのコード化配列の所望する部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列が、5’及び3’領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5’プライマーは、隣接する選択された制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、ついで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBACULOGOLDTMウイルスDNAPharmingenを、SpodopterafrugiperdaSf9細胞ATCCCRL1711中にリポフェクチンGIBCO-BRLから市販を用いて同時形質移入することにより作成される。28°Cで4-5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、OReilley等BaculovirusexpressionvectorsALaboratoryManualOxfordOxfordUniversityPressに記載されているように実施した。次に、発現されたポリHisタグTATは、例えばNi2-キレートアフィニティークロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等Nature362175179に記載されているように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製した。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー25mMのHepes、pH7.9;12.5mMのMgCl2;0.1mMのEDTA;10グリセロール;0.1のNP-40;0.4MのKCl中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清をローディングバッファー50mMリン酸塩、300mMのNaCl、10グリセロール、pH7.8で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。Ni2-NTAアガロースカラムQiagenから市販を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLのローディングバッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mLでカラムに充填した。カラムを、分画回収が始まる点であるA280のベースラインまでローディングバッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー50mMリン酸塩;300mMのNaCl、10グリセロール、pH6.0で洗浄した。A280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収し、SDS-PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼQiagenに複合したNi2-NTAでのウエスタンブロットで分析した。溶離したHis10-タグTATを含む画分をプールしてローディングバッファーで透析した。あるいは、IgGタグ又はFcタグTATの精製は、例えば、プロテインA又はプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。ここに開示されるTATポリペプチドの一部は、この方法を使用して成功裏に発現させ精製した。実施例16:特異的抗体を用いたTATポリペプチドの精製天然又は組換えTATポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロTATポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレTATポリペプチドは、対象のTATポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗TATポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインAでの精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインAでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr活性化セファロースTM等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のTATポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるTATポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化TATポリペプチドは、細胞が増殖する培地中に有用な量で分泌される。可溶化TATポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはTATポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下で洗浄される。ついで、カラムは、抗体/TATポリペプチド結合を分解する条件下で溶離され、TATポリペプチドが回収される。上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した実施物は、本発明のある態様の一つの例示として意図されており、機能的に等価なあらゆるコンストラクトがこの発明の範囲内にあるため、寄託されたコンストラクトにより、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の態様の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の特許請求の範囲内に入るものである。"