マイコプラズマニューモニアMycoplasmapneumoniaeに属する微生物のリボソーム蛋白質L7/L12に対する抗体であって、該微生物のリボソーム蛋白質L7/L12に特異的に反応し、該微生NmenigitidesNlactamicaNmucosaNsiccaHinfluenzaeBcatarrharisNgonorrhoeaeEcoli及びKpneumoniaeからなる群に属する他の微生物と識別できるモノクローナル抗体。他の微生物との識別が、ELISA法により106個/mlのマイコプラズマニューモニア細胞抽出液を検出し、108個/mlの他の微生物の細胞抽出液を検出しないことである、請求項1に記載のモノクローナル抗体。請求項1または2に記載の抗体の製造方法であって、以下の工程を有することを特徴とする、マイコプラズマニューモニアMycoplasmapneumoniaeに属する細菌のリボソーム蛋白質L7/L12に対するモノクローナル抗体の作製方法。1遺伝子操作手法によりあるいはマイコプラズマニューモニアMycoplasmapneumoniaeに属する細菌からの単離精製により得られた当該細菌の全長リボソーム蛋白質L7/L12を免疫源として、当該細菌の全長リボソーム蛋白質L7/L12に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程2上記1で得られたハイブリドーマから、さらに、当該細菌の全長リボソーム蛋白質L7/L12に特異的に反応し、当該細菌を他の細菌と種あるいは属で識別できるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程3上記2で得られたハイブリドーマから抗体を取得する工程以下の例は本発明を具体的に説明するためのものであって本発明について何らその範囲を限定するものではない。MycoplasmapneumoniaeからのRibosomalProteinL7L12遺伝子のクローニングMycoplasmapneumoniaeを、MycoplasmaSupplementを加えたPPLO寒天培地上に適当量植菌したのち、CO2インキュベーター中で37°C、5CO2条件で5時間培養した。生育したコロニーを最終的に5×109CFUml前後になるようにTE緩衝液和光純薬工業製に懸濁した。この懸濁液約15mlを微量遠心チューブに移し取り10000rpmで2分間遠心し、上澄み液を棄てた。沈殿部分を567μlのTE緩衝液に再懸濁した。さらに30μlの10SDSと3μlの20mgmlのProteinaseK溶液を加えて良く混合し、37°Cで1時間インキュベートした。懸濁液を56°Cで更に1時間インキュベートした。次に10のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド07MNaCl溶液を80μl加え、よく混合したのち65°Cで10分間インキュベートした。同一体積の241のクロロホルム-イソアミルアルコール混合液を700μl加えよく攪拌した。この溶液を微量遠心機で12000rpm、5分間、4°Cで遠心処理したのち、水層画分を新しい微量遠心管に移した。そこに06倍量のイソプロパノールを加えチューブをよく振ってDNAの沈殿を形成した。白いDNA沈殿をガラス棒ですくって1mlの70エタノール20°Cに冷却したものが入った別の微量遠心管に移した。その後チューブを10000rpmで5分間遠心し、上清を静かに除去した。1mlの70エタノールを追加し、混合物を更に5分間遠心した。再び上澄みを除去したのち沈殿を100μlのTE緩衝液に溶解しDNA溶液を得た。このゲノムDNA溶液の濃度をMolecularCloningAlaboratorymanual1989EdsShambrookJFritschEFandManiatisTColdSpringharborLaboratoryPressのE5SpectrophotometricDeterminationoftheAmountofDNAorRNAに従って定量した。このゲノムDNAのうち10ngを用いてPCRを行った。PCRはTaqポリメラーゼ宝酒造社製、コードR001Aを用いた。酵素に添付の緩衝液5μl、酵素に添付のdNTP混合物4μlおよび各200pmolのオリゴヌクレオチド配列表配列番号:3および4に示すものを酵素に加えた。全体の容量が50μlとなるように精製水を加えた。この混合物を、TaKaRaPCRThermalCycler480を用いて、95°C1分、50°C2分、72°C3分を5サイクル行ったのち、95°C1分、60°C2分、72°C3分を25サイクル行った。このPCR生成物の一部を用いて、15アガロースゲル中にて電気泳動を実施した。エチジウムブロマイド日本ジーン社製にて染色後、紫外線下で観察し、約400bpのcDNAが増幅されていることを確認した。制限酵素BamHIおよびXhoIを用いて切断後、15アガロースゲル中にて電気泳動とエチジウムブロマイドによる染色を行った。ゲルから約400bpのバンドを切り取った。このバンドをSuprec01宝酒造株式会社製で精製し、一般的なベクターであるpGEX6P1に挿入した。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりGST蛋白質とのフユージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。具体的にはベクターpGEX6P1と先のDNAとをそのモル比が13となるように混ぜ合わせて、T4DNAリガーゼにてベクターにDNAを組み込んだ。DNAを組み込んだベクターpGEX6P1は大腸菌のワンショットコンピテントセルに遺伝子学的手法により導入し、ついで50μgmlのアンピシリンシグマ社を含む半固体状の培養プレートであるLBLブロス寒天宝酒造株式会社製に接種した。プレートを37°Cで12時間インキュベートし、成長したコロニーを無差別に選択し、同じ濃度のアンピシリンを含むLブロス培養液に接種した。37°Cで8時間振とう培養集菌後、WizardMiniprepを用い、添付の説明書に従ってプラスミドを分離した。プラスミドは制限酵素BamHIXhoIにて切断処理した。約370bpのDNAを切断することによってPCR生成物の挿入を確認した。挿入されたDNAの塩基配列を上記クローンを用いて決定した。挿入DNA断片の塩基配列の決定は、AppliedBiosystems社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はPRISMReadyReactionDyeTerminatorCycleSequencingKitを用いて行った。先ず、95μlの反応液、40μlの08pmolμlのT7プロモータープライマー、および65μlの016μgμlテンプレートDNAを05mlのマイクロチューブに加え、混合した。混合物を2層の100μl鉱油で覆ったのち、25サイクルPCR増幅処理を行った。ここで、1サイクルは、96°Cでの30秒間の処理、55°Cでの15秒間の処理、および60°Cでの4分間の処理からなる。生成物を4°Cで5分間保持した。反応終了後、80μlの無菌精製水を加え、攪拌した。生成物を遠心分離し、水層をフェノールークロロホルム混合液で3回抽出した。10μlの3M酢酸ナトリウムpH52と300μlのエタノールを100μlの水層に加え、攪拌した。その後14000rpm、室温で15分間遠心し、沈殿を回収した。沈殿を75エタノールで洗浄後、真空下に2分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、4μlの10mMのEDTAを含むホルムアミドに溶解して90°Cで2分間変性した。このものは氷中で冷却してシークエンスに供した。無差別に選択した5個のクローンのうち2個はPCRに用いたプローブと配列上の相同性を有していた。また、RibosomalProteinL7L12蛋白質の遺伝子配列と一致したDNA配列が明白であった。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号:1及び2に示すような配列であった。この遺伝子断片は、明らかにMicoplasmapneumoniaeのRibosomalProteinL7L12蛋白質の遺伝子をコードするものである。MycoplasmapneumoniaeからのRibosomalProteinL7L12遺伝子の大腸菌での大量発現と精製発現ベクターを組み込んだ大腸菌をLB培地中で50ml、37°C、一昼夜培養した。500mlの2倍濃度のYT培地を37°Cで1時間加熱した。1晩培養した大腸菌液50mlを500mlの前述の培地に入れた。一時間後、550μlの100mMイソプロピルβDチオガラクトピラノシドを導入し、4時間培養した。生成物を回収し、250mlの遠心チューブに移し、7000rpmで10分間遠心した。上澄みを棄てて50mMTris緩衝液pH74、25Sucroseを含むLysis緩衝液25mlずつに溶解した。さらに10NP40125ml、1MMgCl2125μlを加えてプラスチックチューブに移した。氷冷下、1分間の超音波処理を5回行った。その後、12000rpmで15分間遠心し、上清を回収した。次に、PBSでコンディショニングしたグルタチオンアガロースカラムに前記の上澄み液を吸着させた。次に、20mMTris緩衝液pH74、42mMMgCl2、1mMジチオスレイトールを含む洗浄液でカラムを2ベッドボリューム分洗浄した。5mMのグルタチオンを含む50mMTris緩衝液pH96中で溶離処理をした。溶出画分の蛋白質含有量をピグメント結合法で決定し、主画分を取得した。得られた精製GSTフュージョンRibosomalProteinL7L12蛋白質の純度は電気泳動法により確認したところ約75であり免疫源として充分な純度を確保できた。MycoplasmapneumoniaeのRibosomalProteinL7L12蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製まずマウスの免疫についてはMycoplasmapneumoniaeのGSTフュージョンRibosomalProteinL7L12蛋白質抗原100μgを200μlのPBSに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを200μl加え混合した。エマルジョン化したのち200μlを腹腔内に注射した。同じエマルジョン化抗原を2週間後、4週間後、および6週間後に腹腔内に注射した。2倍濃度のエマルジョン化抗原を10週間後および14週間後に腹腔内に注射した。最終の免疫化終了の3日後に脾臓を摘出し、細胞融合した。無菌的に取り出したマウスの脾細胞108個に対し骨髄腫細胞2×107個をガラスチューブに取り良く混合したのち1500rpmで5分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。細胞融合に使用した骨髄腫細胞は、NS1系の細胞株を用い10の牛胎児血清を含むRPMI1640培地で培養し、細胞融合の2週間前から013mMのアザグアニン、05μgmlのMC210、10の牛胎児血清を含むRPMI1640培地で1週間培養後、さらに10の牛胎児血清を含むRPMI1640培地で1週間培養したものを用いた。37°Cに保持したRPMI1640培養液50mlを混合細胞試料に加え、1500rpmで遠心分離した。上澄み液を除去後、37°Cに保持した50ポリエチレングリコール1mlを加え、1分間攪拌した。37°Cに保持したRPMI1640培養液10mlを加え、混合液を殺菌したピペットで約5分間吸引排出する事により激しく攪拌した。5分間1000rpmで遠心分離し、上澄み液を除去したのち、細胞濃度が5×106mlとなるように30mlHAT培養液を加えた。この混合物を均一になるまで攪拌し、01mlずつを96穴の培養プレートに注ぎ、37°C、7の炭酸ガス雰囲気下で培養した。HAT培地を、第1日、第1週、および第2週にそれぞれ01mlずつ加え、ELISA法により所望の抗体を産生する細胞をスクリーニングした。005のアジ化ソーダ含むPBS中に溶解したGSTフュージョンRibosomalProteinL7L12蛋白質およびGST蛋白質をそれぞれ10μgml濃度で希釈した液を100μlずつ96穴プレートに別々に分注し4°Cで1晩吸着させた。上澄み除去後、1牛血清アルブミン溶液200μl添加し室温で1時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液で洗浄した。これに融合細胞の培養液100mlを加え、室温にて2時間反応させた。上澄み液を除去し、沈殿を洗浄液で洗浄した。次いで、濃度50ngmlのペルオキシダーゼでラベルしたgoatantimouseIgG抗体溶液100μlを加え、室温にて1時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。TMB溶液を100μlずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで1Nの硫酸100μlを加えて反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。この結果、GSTフュージョンRibosomalProteinL7L12蛋白質にのみ反応しGST蛋白質には反応しない陽性ウェルが見いだされRibosomalProteinL7L12蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し24穴プラスティックプレート中、HAT培地で培養した。培養した融合培地を細胞数が約20個mlになるようにHT培地で希釈し50μlを、HT培地に懸濁した6週齢のマウス胸腺細胞106個と96穴培養プレート中で混合した。混合後、7CO2条件下、37°Cで2週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のELISA法にて同様に検定し、RibosomalProteinL7L12蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。さらに、同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマMPRB1~5の計5クローンを取得した。MycoplasmapneumoniaeのRibosomalProteinL7L12蛋白質を検出するモノクローナル抗体の選択前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。具体的には、RPMI1640培地を用いて継代培養した細胞をあらかじめ2週間前に05mlのプリスタンを腹腔内に注射したBlabCマウスの腹腔内に5×106個注射した。3週間後腹水を回収し、その遠心上澄みを取得した。得られた抗体を含む溶液をProteinAカラムに吸収させ、3倍量のPBSで洗浄した。次いで、クエン酸緩衝液pH3で溶出した。抗体画分を回収し、各ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体を取得した。この5株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてELISA法により評価した。モノクローナル抗体の評価にはサンドウィッチ分析法を用いた。作成されたモノクローナル抗体をペルオキシダーゼに結合せしめることにより検出用の抗体として用いた。酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼSigmaグレードVIを用い結合には試薬Sアセチルチオ酢酸Nヒドロキシスクシンイミドを使用しAnalyticalBiochemistry1326873に述べられている方法に従って行った。ELISA反応においては市販の抗Mycoplasmapneumoniaeポリクローナル抗体を10μgml濃度で希釈した液を100μlずつ96穴プレートに別々に分注し4°Cで1晩吸着させた。上澄み除去後、1牛血清アルブミン溶液200μl添加し室温で1時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液で洗浄した。これに各微生物の培養液に濃度03となる量のTritonX100を加え常温で5分間抽出することにより得られた抗原溶液100μlを加え、室温で2時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。次いで、濃度5μgmlのペルオキシダーゼ標識抗RibosomalProteinL7L12蛋白質抗体溶液100μlを加え、室温にて1時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。TMB溶液を100μlずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで1Nの硫酸100μlを加えて反応を停止した。450nmの吸光度を測定した。酵素標識抗体としてハイブリドーマMPRB1由来のモノクローナル抗体を用いた場合、試験したMycoplasmapneumoniaeの全ての株を106個mlの感度の感度で検出すると同時に他のHaemophilusinfluenzaeKlebsiellapneumoniaeChlamydiapneumoniaeおよびNeisseriameningitides等の微生物について108個mlの高濃度でも反応性を示さずRibosomalProteinL7L12蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでMycoplasmapneumoniae特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。この抗体はAMMP1と名付けられた。表2はAMMP1を用いた結果のみを示す。別の微生物と交差反応を示す他の抗体を使用した結果はここで言及しない。RibosomalProteinL7L12蛋白質固定化アフィニティカラムを用いたMycoplasmapneumoniaeRibosomalProteinL7L12蛋白質と特異的に反応するポリクローナル抗体の取得実施例1に記載の方法により取得したMycoplasmapneumoniaeRibosomalProteinL7L12蛋白質またはTritonX100処理した菌体の上清を抗原として使用した。100μgの抗原を含む生理食塩水約12mlをフロイントアジュバント15mlとともに乳化した。エマルジョンをSPF日本白色ウサギに皮下注射してウサギを免疫化した。2週間おきに5~6回免疫し、抗体価を確認した。抗体価の確認はELISA法により実施した。005のアジ化ソーダ含むPBS中に溶解したMycoplasmapneumoniaeのRibosomalProteinL7L12蛋白質を10μgml濃度に希釈した液を100μlずつ96穴プレートに分注し4°Cで1晩吸着させた。上澄み除去後、1牛血清アルブミン溶液200μl添加し室温で1時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液で洗浄した。正常のウサギ血清および免疫化したウサギの抗血清を希釈して得られた溶液100μlを加え、室温にて2時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。次いで、濃度50ngmlのペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体溶液100μlを加え、室温にて1時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。OPD溶液を100μlずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで1Nの硫酸100μlを加えて反応を停止した。492nmの吸光度を測定した。抗体価上昇を確認後、大量採血を実施した。耳動脈から血液をガラス製遠心管に採取し、37°Cで1時間放置後、4°Cで一晩静置した。その後3000rpm5分間遠心し、上清を回収した。得られた抗血清は4°Cで保存した。MycoplasmapneumoniaeのRibosomalProteinL7L12蛋白質を固定化したアフィニティカラムを調製した。HiTrapNHS活性化カラムを用いた。カラムを1mMHClで置換後直ちにRibosomalProteinL7L12蛋白質のPBS溶液を加えた。カラムを30分間静置後、ブロッキング試薬を加え、PBSで平衡化した。このMycoplasmapneumoniaeのRibosomalProteinL7L12蛋白質固定化アフィニティカラムを使用して、MycoplasmapneumoniaeのTritonX100処理した菌体の上清を抗原として得られた抗血清中のポリクローナル抗体の精製を行った。この抗血清をPBSで5倍に希釈し、045μmのフィルターを通した後、流速05mlminでMycoplasmapneumoniaeのRibosomalProteinL7L12蛋白質固定化カラムに吸着させた。その後01Mグリシン緩衝液pH21でカラムから溶出し、直ちに1MTris緩衝液pH90で中和した後、抗体価測定法と同様のELISA法により目的とする抗体の溶出画分を回収した。このようにして得られたポリクローナル抗体は特表平7-509565号公報に記載されているOIA法により評価した。精製した抗体はOIA法の捕捉抗体として使用した。また検出抗体としては実施例4に記載したAMCT1モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで酵素標識したものを使用した。酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼを用い結合には試薬Sアセチルチオ酢酸Nヒドロキシスクシンイミドを使用しAnalyticalBiochemistry1326873に述べられている方法に従って行った。OIA反応においては005アジ化ナトリウムを含むPBS中の精製ポリクローナル抗体を10μgml濃度に01MHEPES緩衝液pH80で希釈した液を50μlずつシリコンウエハー上に添加し室温で30分反応させた後、蒸留水で洗浄し、サッカロース及びアルカリ処理カゼインを含むコーティング溶液でコーティング後、使用した。上記操作で得られた各微生物の培養液に濃度05となる量のTritonX100を加え常温で5分間抽出することにより得られた抗原溶液15μlを上記シリコンウェハーの上に添加し、室温で10分間反応させた。次いで、20μgmlペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗体を15μl加え、10分間反応させた。蒸留水で洗浄後、TMB溶液を15μlずつ加え、混合物を室温にて5分間反応させた。生成物を蒸留水で洗浄し、酵素反応により生成した青色を肉眼で観察した。この結果、表3に示すように、精製ポリクローナル抗体APMP1を捕捉抗体として用いることにより、Mycoplasmapneumoniaeを108個mlの感度で検知できること、および他の微生物の反応性は検知できないことが明らかである。このようにしてMycoplasmapneumoniaeのRibosomalProteinL7L12蛋白質を固定化したアフィニティカラムにより、Mycoplasmapneumoniaeに特異的に反応するポリクローナル抗体を取得したことを確認した。