"重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を含み、前記重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号1または3の配列で示され、前記軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号15、9、11、7、13および5の配列のいずれか一つで示され、且つ前記配列番号1の第1番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンであることを特徴とするヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体または前記抗体の抗原結合性フラグメントFab。下記a~lのいずれか一つであり、配列番号1の第1番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである請求項1に記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。a配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号15の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH08、を有するKS10。b配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号9の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH05、を有するKS03。c配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号11の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH06、を有するKS06。d配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号15の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH08、を有するKS12。e配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号9の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH05、を有するKS04。f配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号11の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH06、を有するKS07。g配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号5の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH03、を有するKS02。h配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号7の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH04、を有するKS08。i配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号13の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH07、を有するKS11。j配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号5の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH03、を有するKS01。k配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号7の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH04、を有するKS05。l配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号13の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH07、を有するKS09。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を含み、前記重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号27の第1~120番目、または配列番号25の第1~120番目に相当し、前記軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号31の第1~109番目、または配列番号29の第1~109番目に相当するヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗原結合性フラグメントFab。定常領域のアミノ酸配列がヒト抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である重鎖、および定常領域のアミノ酸配列がヒト抗体の軽鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である軽鎖から成る請求項1または2に記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。前記重鎖の定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号17の配列で示され、且つ前記軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号19の配列で示される請求項1、2または4に記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号21の配列で示され、前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号23の配列で示され、且つ前記配列番号21の第1番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである請求項1、2、4、および5のいずれか一つに記載のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体。前記重鎖の可変領域および重鎖の定常領域CH1から成る重鎖フラグメントと、前記軽鎖の可変領域および軽鎖の定常領域から成る軽鎖から成り、前記CH1のアミノ酸配列はヒト抗体重鎖の定常領域CH1のアミノ酸配列と同一であり、且つ前記軽鎖の定常領域のアミノ酸配列はヒト抗体軽鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である請求項1または3に記載の抗原結合性フラグメントFab。前記CH1のアミノ酸配列は配列表の配列番号33の配列で示され、且つ前記軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号19の配列で示される請求項1、3または7のいずれかに記載の抗原結合性フラグメントFab。下記b1~b3のいずれか一つである請求項3、7または8のいずれかに記載の抗原結合性フラグメントFab。b1KS-7F:前記重鎖フラグメントのアミノ酸配列は配列表の配列番号27で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示される。b2KS-7A:前記重鎖フラグメントのアミノ酸配列は配列表の配列番号25で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示される。b3KS-2E:前記重鎖フラグメントのアミノ酸配列は配列表の配列番号25で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号29で示される。抗原結合性フラグメントAはFab、Fab’、Fab’2、Fv、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントまたは軽鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントであり、抗原結合性フラグメントBはFab’、Fab’2、Fv、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントまたは軽鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントである請求項1、2、4、5および6のいずれかに記載の抗体に由来する抗原結合性フラグメントA、または請求項1、3、7、8および9のいずれかに記載のFabに由来する抗原結合性フラグメントB。下記A~Cのいずれか一つのタンパク質をコードする遺伝子。A請求項1、2、4、5および6のいずれか一つに記載の抗体。B請求項1、3、7、8および9のいずれか一つに記載のFab。C請求項10に記載の抗原結合性フラグメント。請求項1、2、4、5および6のいずれか一つに記載の抗体、および配列表の配列番号2または4の配列で示される請求項10に記載の抗原結合性フラグメントA、の重鎖の可変領域のコード配列、請求項1、2、4、5および6のいずれか一つに記載の抗体、および配列表の配列番号16、10、12、8、14および6のいずれか一つの配列で示される請求項10に記載の抗原結合性フラグメントA、の軽鎖の可変領域のコード配列、請求項1、3、7、8および9のいずれか一つに記載のFab、および配列表の配列番号2、4、28、および26のいずれか一つの配列の第1~360番目と同一の請求項10に記載の抗原結合性フラグメントB、の重鎖の可変領域のコード配列、または請求項1、3、7、8および9のいずれか一つに記載のFab、および配列表の配列番号16、10、12、8、14、6、32、および30のいずれか一つの配列の第1~327番目に相当する請求項10に記載の抗原結合性フラグメントB、の軽鎖の可変領域のコード配列、である請求項11に記載のタンパク質をコードする遺伝子。前記抗体の重鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号18の配列で示され、且つ前記抗体の軽鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号20の配列で示され、前記FabのCH1のコード配列は配列表の配列番号34の配列で示され、且つ前記Fabの軽鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号20の配列で示される請求項11または12に記載のタンパク質をコードする遺伝子。前記抗体の重鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号22の配列で示され、且つ前記抗体の軽鎖の定常領域のコード配列は配列表の配列番号24の配列で示され、請求項3、7、8および9のいずれか一つに記載のFabのコード配列は、下記c1~c3のいずれか一つである請求項11~13のいずれか一つに記載のタンパク質をコードする遺伝子。c1KS-7F:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号28で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号32で示される。c2KS-7A:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号26で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号32で示される。c3KS-2E:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号26で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号30で示される。遺伝子材料であって、請求項11~14のいずれか一つに記載の遺伝子を含む組み換えベクター、組み換え菌、組み換え細胞株、組み換えウイルス、または発現カセットである遺伝子材料。前記組み換えベクターは、前記Fab、抗体、または抗原結合性フラグメントを発現させるための原核生物または真核生物発現ベクターであり、前記組み換え菌は、前記遺伝子を有する大腸菌であり、前記組み換え細胞株は、前記遺伝子を組み込んだ哺乳動物細胞株であり、前記細胞株は好ましくはCHO細胞株、または293細胞株およびその亜系統であり、前記組み換えウイルスは、前記遺伝子を運搬する組み換えアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである請求項15に記載の遺伝子材料。d1ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気の予防および/または治療のための薬の調整、d2ヒト腫瘍壊死因子αを中和するための生成物の調整、またはd3ヒト腫瘍壊死因子αを定性的もしくは定量的に検出するためのキットの調整のための、請求項1、2、4、5および6のいずれか一つに記載の抗体、請求項1、3、7、8および9のいずれか一つに記載のFab、請求項10に記載の抗原結合性フラグメント、請求項11~14のいずれか一つに記載の遺伝子、または請求項15または16に記載の遺伝子材料、の使用方法。補助材料および有効成分を含み、前記有効成分は、請求項1、2、4、5および6のいずれか一つに記載の抗体、請求項1、3、7、8および9のいずれか一つに記載のFab、請求項10に記載の抗原結合性フラグメント、請求項11~14のいずれか一つに記載の遺伝子、および請求項15または16に記載の遺伝子材料の少なくとも一つを含み、前記補助材料は薬学的に許容できる担体または賦形剤である医薬組成物。ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気の治療での材料の使用方法であって、請求項1、2、4、5および6のいずれか一つに記載の抗体、請求項1、3、7、8および9のいずれか一つに記載のFab、請求項10に記載の抗原結合性フラグメント、請求項11~14のいずれか一つに記載の遺伝子、請求項15または16に記載の遺伝子材料、および請求項18に記載の医薬組成物のいずれか一つの材料の使用方法。前記ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気は、ヒト腫瘍壊死因子αの増加が原因の病気であり、前記病気として好ましくは、関節リウマチ、自己免疫性ぶどう膜炎、クローン病、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、または若年性特発性関節炎である請求項17または19に記載の使用方法。本発明の目的の一つは、ヒト腫瘍壊死因子αに対する親和性が、ヒト-マウスキメラ抗体であるRemicadeと同等か、またはそれより高い、ヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体および前記抗体の抗原結合性フラグメントFabを提供することにある。本発明に係るヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体またはFabは、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を含み、前記重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号1または3の配列で示され、前記軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号15、9、11、7、13および5の配列のいずれか一つで示され、且つ前記配列番号1の第1番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである。詳細には、前記抗体は下記a~lのいずれか一つから選ばれ、配列番号1の第1番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである。a配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号15の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH08を有するKS10、b配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号9の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH05を有するKS03、c配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号11の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH06を有するKS06、d配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号15の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH08を有するKS12、e配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号9の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH05を有するKS04、f配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号11の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH06を有するKS07、g配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号5の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH03を有するKS02、h配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号7の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH04を有するKS08、i配列番号3の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH02、および配列番号13の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH07を有するKS11、j配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号5の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH03を有するKS01、k配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号7の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH04を有するKS05、l配列番号1の配列で示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域SH01、および配列番号13の配列で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域SH07を有するKS09。本発明の他の目的は、ヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗原結合性フラグメントFabを提供することにある。前記Fabは、重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列表の配列番号27または配列番号25の第1~120番目に相当する重鎖、および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号31または配列番号29の第1~109番目に相当する軽鎖、を含む。本発明で提供する抗体は、定常領域のアミノ酸配列がヒトの重鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である重鎖、および定常領域のアミノ酸配列がヒトの軽鎖の定常領域のアミノ酸配列と同一である軽鎖から成る。前記抗体の重鎖定常領域は、いずれかのクラスIgG、IgA、IgM、IgE、IgDまたはサブクラスIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1、IgA2のヒト由来定常領域であっても良く、前記抗体の軽鎖定常領域は、ヒト由来定常領域のいずれかのクラスκまたはλ若しくはサブクラスλ1、λ2、λ3、λ4又はアロタイプκm1、κm2、κm3であっても良い。前記抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列は詳細には配列表の配列番号17の配列で示され、且つ前記抗体の軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は詳細には配列表の配列番号19の配列で示される。前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号21の配列で示され、前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号23の配列で示される。配列番号21の第1~120番目のアミノ酸配列は前記重鎖の可変領域に相当し、且つ第121~450番目のアミノ酸配列は前記重鎖の定常領域に相当する。配列番号23の第1~109番目のアミノ酸配列は前記軽鎖の可変領域に相当し、且つ第110~214番目のアミノ酸配列は前記軽鎖の定常領域に相当する。前記、配列番号21の第1番目のアミノ酸はグルタミン酸またはグルタミンである。本発明で提供するFabは、重鎖Fdフラグメントおよび軽鎖から成り、前記重鎖FdフラグメントはVHとCH1を含み、前記軽鎖はVKおよび軽鎖定常領域を含み、前記CH1のアミノ酸配列はヒト抗体重鎖のCH1定常領域のアミノ酸配列と同一であり、且つ、前記軽鎖定常領域のアミノ酸配列はヒト抗体軽鎖の定常領域と同一である。前記FdのFdフラグメントのCH1は、いずれかのクラスIgG、IgA、IgM、IgE、IgDまたはサブクラスIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1、IgA2のヒト由来のCH1定常領域であっても良い。前記Fabの軽鎖定常領域は、いずれかのクラスκまたはλまたはサブクラスλ1、λ2、λ3、λ4またはアロタイプκm1、κm2、κm3のヒト由来の軽鎖定常領域であっても良い。CH1のアミノ酸配列は配列表の配列番号33の配列で示され、前記軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号19の配列で示される。本発明の特定の実施形態では、前記Fabは、下記b1~b3のいずれか一つである。b1KS-7F:前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号27で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示される。b2KS-7A:前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号25で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示される。b3KS-2E:前記重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号25で示され、且つ前記軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号29で示される。本発明の更に別の目的は、抗原結合性フラグメントAまたは抗原結合性フラグメントBを提供することであり、前記抗原結合性フラグメントAはFab、Fab’、Fab’2、Fv抗体の可変領域フラグメント、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントまたは軽鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントであり、これらは前記抗体に由来し、前記抗原結合性フラグメントBはFab’、Fab’2、Fv、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントまたは軽鎖の可変領域から選ばれたポリペプチドフラグメントであり、これらは前記Fabに由来する。前記Fab’2は、軽鎖1対およびFdより僅かに大きい重鎖Fd’と称される1対を含む。ペプシンによるIgG分子の加水分解はFab’2フラグメントを産生し、Fab’2は2つのFabを含み、そのため2つの抗原エピトープと結合することができる。Fd’は約235アミノ酸残基を含み、VH、CH1、およびヒンジ領域を含む。Fvは軽鎖の可変領域VLおよび重鎖の可変領域VHから成り、それらは非共有結合により会合している。Fvは単一の抗原結合部位を有し、Fvの分子量は完全な抗体分子の約6分の1の分子量である。FvはScFv単一鎖の抗体、DsFvジスフィルド結合安定化抗体等を含む。ScFvは、1つの適切なオリゴヌクレオチドリンカーにより結合したVHおよびVLからできる1つのペプチド鎖である。DsFvは、軽鎖および重鎖の可変領域の適切な部位にそれぞれ1つのシステインを導入することにより形成された、ジスルフィド結合固定Fvフラグメントである。DsFvは、ScFvよりも結合能および安定性に優れていることが示されている。更に、次のタンパク質A~Cのうち、いずれか1つをコードする遺伝子は、特許請求の範囲に含まれる。A前記抗体、B前記Fab、C抗原結合性フラグメントAまたはB。抗体および抗原結合性フラグメントAの両方の重鎖可変領域のコード配列は配列表の配列番号2または4で示される。抗体および抗原結合性フラグメントAの両方の軽鎖可変領域のコード配列は、配列表の配列番号16、10、12、8、14および6のうちの1つから選ばれる。Fabおよび抗原結合性フラグメントBの両方の重鎖可変領域のコード配列は、配列表の配列番号2、4、28のいずれかの配列の第1~360番目および配列番号26の配列の第1~360番目に相当する。Fabおよび抗原結合性フラグメントBの両方の軽鎖可変領域のコード配列は配列表の配列番号16、10、12、8、14、6、32のいずれかの配列の第1~327番目、および配列番号30の第1~327番目に相当する。前記配列において、配列番号6、8、14、10、12および16は全て327ヌクレオチドを有する一方、配列番号2、4は360ヌクレオチドを有する。抗体の重鎖定常領域のコード配列は、配列表の配列番号18で示され、抗体の軽鎖定常領域のコード配列は、配列表の配列番号20で示される。FabのCH1領域のコード配列は、配列表の配列番号34で示され、Fabの軽鎖定常領域のコード配列は配列表の配列番号20で示される。本発明の実施態様では、抗体の重鎖のコード配列は詳細には配列表の配列番号22で示され、抗体の軽鎖のコード配列は配列表の配列番号24で示される。前記Fabのコード配列は以下、c1~c3のいずれか一つである。c1KS-7F:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号28で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号32で示される。c2KS-7A:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号26で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号32で示される。c3KS-2E:Fabの重鎖フラグメントのコード配列は配列表の配列番号26で示され、且つFabの軽鎖のコード配列は配列表の配列番号30で示される。配列番号22の第1~360番目および360~1350番目の位置のヌクレオチドは前記重鎖の可変領域の配列および重鎖の定常領域の配列にそれぞれ相当する一方、配列番号24の第1~327番目および第328~642番目の位置のヌクレオチドは、前記軽鎖の可変領域の配列および軽鎖の定常領域の配列にそれぞれ相当する。本発明の別の目的は、次の遺伝子材料を提供することにある。遺伝子材料は、前記遺伝子セットを含む、組み換えベクター、組み換え菌、組み換え細胞株、組み換えウイルス、または発現カセットである。組み換えベクターは、抗体、Fab、または抗原結合性フラグメントを発現する、原核生物または真核生物発現ベクターである。組み換え菌は、前記遺伝子セットを有する大腸菌Escherichiacoliである。組み換えの細胞株は、遺伝子組み換え細胞株か融合細胞株であり、遺伝子組み換え細胞株は、本発明のヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体、Fab、抗原結合性フラグメントをコードする遺伝子をトランスファーした哺乳動物細胞株であっても良く、好ましくは、CHO細胞株、または293細胞株およびその亜系統である。融合細胞株は本発明の前記ヒト化抗ヒト腫瘍壊死因子α抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞である。組み換えウイルスは組み換えアデノウイルスまたは組み換えのアデノ随伴ウイルス等であり、前記遺伝子セットを運搬する。発現カセットは、上流から下流に、プロモーター、プロモーターより転写が開始される抗体またはFabまたは抗原結合性フラグメント、およびターミネーターの3つのフラグメントを含むDNA分子である。宿主細胞を、抗体、Fab、または抗原結合性フラグメントをコードする遺伝子を含む組み換えベクターにより、トランスフェクトまたはトランスフォームすると、対応するタンパク質が発現され、抗体、Fab、抗原結合性フラグメントが得られる。前記宿主細胞は、哺乳動物細胞を含むが、これに限られず、バクテリア、酵母、昆虫細胞等を含む、真核細胞であって良いし、原核細胞であっても良い。大量のタンパク質発現に有用である哺乳動物細胞は多種多様存在し、293、CHO、SP20、NS0、COS、BHK、またはPerC6細胞等である。細胞をトランスフェクトする方法は多様であり、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションなどを含むが、これらに限定されない。抗体、Fab、または抗原結合性フラグメントの好ましい発現方法は以下の通りである。組換え型タンパク質の発現量を増加させるために、安定してトランスフェクトした宿主細胞中の組み換えベクターにより遺伝子増幅を行なう。例えば、DHFR欠損宿主細胞は、ジヒドロ葉酸還元酵素DHFRを含む組み換えのベクターで安定してトランスフェクトされ、次にメトトレキサートMTXは、宿主細胞中の組み換えベクターのコピー数を増加させるのに十分な濃度で、細胞培養液へ加えることができる。コーディング遺伝子配列の組み合わせから成るFabまたはIgGの発現の後に、酵素免疫測定法ELISAまたは他の測定により、培地中のタンパク質濃度を決定することができる。Fabフラグメントについては、プロテインGを使用して、アフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。また、IgGタンパク質はプロテインAを使用して、アフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。更に、抗体、Fab、抗原結合性フラグメント、遺伝子、以下の遺伝子材料の使用方法も特許請求の範囲に含む。d1ヒト腫瘍壊死因子αに関連した病気の予防および/または治療のための薬の調整、または、d2ヒト腫瘍壊死因子αを中和するための生成物の調整、またはd3ヒト腫瘍壊死因子αを定性的もしくは定量的に検出するためのキットの調整。ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気は、ヒト腫瘍壊死因子αの増加により引き起こされる病気であり、前記病気として好ましくは、関節リウマチ、自己免疫性ぶどう膜炎、クローン病、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、または若年性特発性関節炎である。本発明の更に別の目的は、補助材料および有効成分を含む医薬組成物を提供することであり、有効成分は、前記の抗体、Fab、抗原結合性フラグメント、遺伝子、および遺伝物質の材料のうち少なくとも1つを含み、補助材料は薬学的に許容可能な担体または賦形剤である。医薬組成物の中の有効成分は、前記のFabまたは抗体のいずれか一つであっても良いし、前記の抗原結合性フラグメントのいずれか一つであっても良いし、前記の遺伝子のいずれか一つであっても良いし、前記の遺伝子材料のいずれか一つであっても良い。更に特許請求の範囲には、ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気の治療での、前記の抗体、Fab、抗原結合性フラグメント、遺伝子、遺伝子材料、および医薬組成物の材料のうちいずれか一つの使用も含まれる。ヒト腫瘍壊死因子αに関連する病気は、ヒト腫瘍壊死因子αの増加によって引き起こされ、前記病気として好ましくは、自己免疫性ぶどう膜炎、関節リウマチ、クローン病、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、または若年性特発性関節炎である。以下、発明の理解を助けるために実施例を示すが、本発明の範囲がこれらによって制限されるものではない。特に記載していない限り、以下に記載の実験方法はすべて従来の実験的方法である。特に記載していない限り、実施例の中で使用される実験材料はすべて、生化学試薬の一般的な店で購入可能である。以下の実施例の定量試験は3回繰り返して行い、結果は平均値である。ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体の重鎖および軽鎖のCDRの接合、PCRによる特定部位の変異誘発、および本発明で述べる突然変異体ライブラリーのスクリーニングを、従来の遺伝子組換え技術および抗原抗体相互作用に基づく免疫学技術によって行い、更に、詳細な実験の手順および手段は、JosephSambrook,MolecularCloning:aLaboratoryManual,SciencePress,3rdeditionおよび同様の実験ハンドブックに記載されている。以下の実施例におけるEC50を、結果のグラフを作成中に、ソフトウェアGraphPadPrism5に光学濃度OD450の値を入力することにより得た。実施例1:ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabの発現とその活性の検出本実施例では、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体の3つのFabFabは重鎖Fdフラグメントと抗体の軽鎖から成る、即ちKS-2E,KS-7A,およびKS-7Fを含む。手順1.KS-2E、KS-7AおよびKS-7Fの発現ベクターの作成1軽鎖および重鎖の配列の取得ヒトの腫瘍壊死因子αRD社,カタログ番号:210-TA-050の免疫性を付与したマウスから、ハイブリドーマ細胞を得て、モノクローナルスクリーニングを行い、全RNAを抽出し、テンプレートとして用い、重鎖可変領域のヌクレオチド配列を一般的なプライマーである、P1:5’-GCGAATTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3’、P2:5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3’を用い、PCRにより増幅し、且つ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、一般的なプライマーP3:5’-GACATTCTGMTSACMCAGMCTCC-3’、P4:5’-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3’を用い、PCRにより増幅した。目的のバンドを含むゲル断片を、回収のために切り取った。抗体の軽鎖および重鎖の増幅産物は夫々、ベクターpMD18-TTaKaRa社、カタログ番号:D101Cに挿入した。単一のコロニーを別々に選び、抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を確認するためにシークエンシングを行った。2ヒト化Fabの作成アミノ酸配列の相同性の比較は、生成物の軽鎖可変領域とヒト化抗体の軽鎖可変領域、および、生成物の重鎖可変領域とヒト化抗体の重鎖可変領域とを比較した。配列相同性は、IgBLASThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/、およびIMGTImMunoGeneTics,IMGT:http://www.imgt.orgで夫々検索した。検索結果に基づいて、軽鎖および重鎖共に相同性の高い配列を有する抗体をヒト化抗体のテンプレートとして選んだ。生成物の重鎖可変領域VHを、より配列の相同性が高いヒト化抗体IGHV3-1507登録番号:M99406のフレームワーク領域へ接合し、生成物の軽鎖可変領域VKは、より配列の相同性が高いヒト化抗体IGKV6-2101登録番号:X63399のフレームワーク領域へ接合した。ヒト由来重鎖フラグメントFdおよび軽鎖の多数の変異サイクルの後、様々な軽鎖および重鎖破片Fdの組み合わせを、ベクターpTLRamodifiedpET22bvectorに挿入した。詳細には、各末端に制限酵素サイトBamHIおよびEcoRIを夫々有する軽鎖用の様々なDNA、および各末端に制限酵素サイトNotIおよびXhoIを夫々有する重鎖Fdフラグメント用の様々なDNAを準備した。DNAの2群を、夫々ベクターpTLRの対応する制限酵素サイト間へ移動、即ち、軽鎖用の様々なDNAを制限酵素サイトBamHIおよびEcoRIの間に挿入し、重鎖フラグメントFd用の様々なDNAを、制限酵素サイトNotIおよびXhoIの間に挿入し、様々なFab発現ベクターKS-2E、KS-7A、KS-7F、を夫々発現する3つのFab発現ベクターを含むを作成した。前記した軽鎖および重鎖フラグメントFdの様々な組み合わせは、3つのFabKS-2E、KS-7A、およびKS-7Fを含む。KS-2Eの重鎖フラグメントのアミノ酸配列は、配列表の配列番号25で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号26で示され、且つ、KS-2Eの軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号29で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号30で示される。KS-7Aの重鎖フラグメントのアミノ酸配列は、配列表の配列番号25で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号26で示され、且つKS-7Aの軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号32で示される。KS-7Fの重鎖フラグメントのアミノ酸配列は、配列表の配列番号27で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号28で示され、且つKS-7Fの軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号31で示され、そのヌクレオチド配列は配列番号32で示される。前述のpTLRベクターを得るためのpET22bベクター組み換え手順の詳細は、以下の通りである。第1に、DNA断片T-L-RDNA塩基配列に短縮され、配列表の配列番号35で示されるを、人工的に合成し、それは両末端に制限酵素サイトSalIおよびNotIを有するT7プロモーター、ラクトースオペレーターおよびリボソーム結合部位RBSを含み、pET22bベクターΝovage社製、アメリカおよびT-L-RDNA塩基配列を、SalIおよびNotI制限酵素の両方で夫々切断し、その後、T4DNAリガーゼにより結合しトランスフォームし、最後に単一コロニーを従来方法により選び、適切に組み換えベクターを選びシークエンシングを行った。手順2.KS-2E、KS-7AおよびKS-7Fの原核生物の発現E.coli株Top10に上述の作成したFab発現ベクターKS-2E、KS-7A、KS-7F、を夫々発現する3つのFab発現ベクターを含むをトランスフォームし、その後、クロラムフェニコールと共に2-YTプレートペプトン1.6、酵母エキス1、NaCl0.5、および寒天末1.5上に蒔いた。翌日、いくつかの単一コロニーを選択するために適切なコロニー密度のプレートを選んだ。各陽性のコロニーから、8つの単一コロニーを選び、96穴ディープウェルプレートに蒔き、発現用のIPTGを用いて誘導した。各単一コロニーを、クロラムフェニコールを含む6mLの2-YT液体培地ペプトン1.6、酵母エキス1、およびNaCl0.5入りのチューブに加え、37°C、12時間、250rpmで振とうした。細菌懸濁液の0.2μLを各チューブからピペットで取り、保管のためにクロラムフェニコールを含む2-YTプレート上に移した。5mLの細菌懸濁液を、500mLのクロラムフェニコール含有2-YT液体培地に播種し、OD600が0.6に達するまで、33°C、300rmpで培養した。IPTGは3時間の誘導時間で様々なFabの発現を誘導させるために、培地へ最終濃度50μΜの濃度で加えた。誘導した発現が完了した後に、培地を10°C、15分間、5100rpmで遠心分離した。上清を廃棄し、バクテリアの沈殿を40mLの予冷したTES溶液で完全に再懸濁した。水で20まで薄め予冷したTES66mLを、再懸濁したバクテリアの溶液へ再び加え、氷上で40分間インキュベートし、その後、4°C、10分、13000rpmで遠心分離した。遠心分離の後、Fabタンパク質KS-2E、KS-7A、またはKS-7Fタンパク質を含むぺリプラズム抽出物である上清を集めた。ぺリプラズム抽出物をG-25GE社,17-0034-01カラムを通して、脱塩した。プロテインGGE社、17-0618-04充填済みカラムを準備し、平衡溶液20mMリン酸緩衝液、pH6.5で平衡にし、タンパク質サンプルをロードした。サンプルのロード後、カラムを平衡溶液で連続して洗い、次に平衡溶液0.1MGly-HCl、pH2.5で直接的に溶出した。溶出画分を集め、その収集前に分画収集チューブに1.0Mトリス塩酸緩衝液pH9.0を、トリス緩衝液と溶出画分が1:9の体積比率となるように添加しておき、溶出画分をpH7.0に迅速に調節した。収集した液体は目的のタンパク質を含む。タンパク質の純度をSDS-PAGEによって分析し、タンパク質サンプル中のタンパク質濃度を測定した。最後に、タンパク質サンプルをサブパッケージし、-80°Cで保管し、これにより、高純度のFabタンパク質3つのタンパク質、KS-2E、KS-7AおよびKS-7Fを含むを得た。手順3.KS-2E、KS-7AおよびKS-7Fの生物活性の測定1ELISAによる腫瘍壊死因子αへのヒト化Fabの結合分析腫瘍壊死因子αに結合するFabを次の手順によりスクリーニングした。ELISAプレートを、1ウェルあたり基質として100ngのヒト由来腫瘍壊死因子αRD社,カタログ番号:210-TA-050でコーティングした。Fabタンパク質手順2で準備した、3つのタンパク質、KS-2E、KS-7AおよびKS-7Fを含む40nMを2倍希釈したものを添加し、インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトC-Kappa二次抗体シグマ社,カタログ番号:K3502を加え、最後に、TMBを反応の進行のために加え、2M硫酸は反応を止めるために入れ、これにより、腫瘍壊死因子α結合Fabタンパク質を測定した。このようなスクリーニング手順により、高い活性の3つのFabを得た。それはKS-2E、KS-7FおよびKS-7Aであり、これらのタンパク質は全体で2つの異なるVHVH01およびVH02;VH01のアミノ酸配列は配列番号25で示され、ヌクレオチド配列は配列番号26で示され、VH02のアミノ酸配列は配列番号27で示され、ヌクレオチド配列は配列番号28で示される、および2つの異なるVKVK03およびVK05;VK03のアミノ酸配列は配列番号29で示され、且つそのヌクレオチド配列は配列番号30で示され、VK05のアミノ酸配列は配列番号31で示され、且つヌクレオチド配列は32で示される表1を含む。ELISAによる腫瘍壊死因子αへのヒト化Fab結合能の試験結果を図1に示す。その結果が示すように、前記の得られた3つのヒト化Fabは、ヒト-マウスキメラ抗体であるRemicadeのFabフラグメントと同様に抗原親和性を示し、その中でKS-7AおよびKS-7Fは腫瘍壊死因子αへの結合に関するEC50値において、ヒト-マウスキメラ抗体RemicadeのFabフラグメントよりも優れている表2。2L929細胞毒性試験による腫瘍壊死因子α抑制中のヒト化Fabの生物活性の検出更に、腫瘍壊死因子αの中和における前記の3つのヒト化FabKS-2E、KS-7FおよびKS-7Aの生物活性は、細胞生物学実験であるL929細胞毒性試験で検証した。この実験では、対数増殖期の1×104個のL929細胞を、96穴プレートのDMEM10FBS、Gibco社培地中に播種した。24時間後に、ヒト由来腫瘍壊死因子αRD社,カタログ番号:210-TA-050を0.5ng/mL、およびアクチノマイシンDFlukaを0.5μg/mL加えた。細胞を4つの群に分け、前記の3つのヒト化Fab、および対照の抗体RemicadeのFabフラグメントを各群にそれぞれ添加し、細胞を別途24時間培養した。最後に、細胞の生存率をCCK8キットDojindo研究所で分析した。結果を図2に示す。この結果は、前記の3つのヒト化Fabは、腫瘍壊死因子αを効率的に中和する生物活性を発揮できることを示し、その中で、腫瘍壊死因子αの中和においてKS-7Aの生物活性は、ヒト-マウスキメラ抗体RemicadeのFabフラグメントの生物活性よりも優れていた。図2のデータは、3回行った実験の平均値±標準偏差である。実施例2:ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabのCDR3に関する親和性成熟ライブラリーの作成更に、前記のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabフラグメントの抗原への親和性を増加させるために、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabの発現ベクター内の、重鎖VH02CDR3および軽鎖VK05CDR3の親和性成熟ライブラリーを別々に作成した。重鎖と軽鎖のCDR3領域は、抗体の抗原への結合のために最も重要な領域であるので、CDR3領域の部位飽和変異誘導を行いスクリーニングすることが、より高い親和性を有する抗体作成につながる可能性がある。重鎖および軽鎖のCDR3の部位飽和変異誘導ライブラリーの作成のために、部位特異的変異誘導のための一組のプライマーを設計し、PCR反応で使用した。PCR反応により増幅した反応生成物は、一組のプライマーと同一の縮重比率で共に混在しており、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabの発現ベクターにクローニングした。軽鎖CDR3の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成は、以下のように行った。プライマー5シリーズおよび軽鎖下流プライマー65’-CGGAATTCCGTACGTTTCACTTCCAGATTGG-3’を用い、且つ目的部分のDNA産物を産生するための鋳型として軽鎖のDNAを用い、PCRを行い、DNA産物をFab発現ベクターにクローニングし、エレクトロトランスファーを行い、軽鎖CDR3の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成のために播種した。プライマー5シリーズはCDR3の変異部位を含み、総じて表3に記載の19個のプライマーを含む。CDR3の重鎖の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成は、以下のように行った。変異プライマー7シリーズおよび重鎖下流プライマー85’-CCGCTCGAGGCGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCCTG-3’を用い、且つ目的部分のDNA産物を産生するための鋳型として重鎖のDNAを用い、PCRを行い、DNA産物をFab発現ベクターにクローニングし、エレクトロトランスファーを行い、重鎖CDR3の特定部位の突然変異誘発ライブラリーの作成のために播種した。プライマー7シリーズはCDR3の変異部位を含み、総じて表4に記載の22個のプライマーを含む。最終的に確立した軽鎖および重鎖の変異ライブラリーより、抗腫瘍壊死因子αRD社への高い結合能を有する抗腫瘍壊死因子α抗体のFabを、ELISAの結果に基づき選択した。高い活性を有する2つの重鎖可変領域、即ち、SH01およびSH02を得るために重鎖変異体をスクリーニングした。また高い活性を有する6つ軽鎖可変領域、即ち、SH03、SH04、SH05、SH06、SH07およびSH08を得るために軽鎖変異体をスクリーニングした。実施例3:高親和性のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabの発現と活性評価この実施例は、それぞれFA01およびFA02の名称を持つ2つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabに関する。FA01の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号15で示されそのヌクレオチド配列は配列表の配列番号16で示される、その軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号19で示されそのヌクレオチド配列は配列表の配列番号20で示される、その重鎖Fdフラグメントの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号1で示されそのヌクレオチド配列は配列表の配列番号2で示され、その重鎖定常領域CH1のアミノ酸配列は配列表の配列番号33で示されるそのヌクレオチド配列は配列表の配列番号34で示される。FA02の軽鎖可変領域は、配列表の配列番号9で示されそのヌクレオチド配列は配列表の配列番号10で示される、その軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号19で示されそのヌクレオチド配列は配列表の配列番号20で示される、その重鎖Fdフラグメントの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号1で示されそのヌクレオチド配列は配列表の配列番号2で示され、その重鎖定常領域CH1のアミノ酸配列は配列表の配列番号33で示されるそのヌクレオチド配列は配列表の配列番号34で示される。手順1.高親和性のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabの作成と発現2つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabを作成する過程は実施例1と同様である。前記の2つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabの重鎖および軽鎖をコードするDNAを、FA01に関するpFA01Fab発現ベクターを得るため、FA02に関するpFA02Fab発現ベクターを得るために、それぞれpTLRベクターの対応する領域に挿入した。前記の実施例1に記載の手順に従い、高純度のFA01およびFA02タンパク質を得た。手順2.高親和性のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabの生物活性の検出L929細胞毒性試験によって、前記の2つのヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体のFabFA01およびFA02の生物活性を解析した。手順の詳細は実施例1と同様である。OD450値の結果を、EC50を計算するためにソフトウェアGraphPadプリズム5に入力した。結果を表5に示す。この結果は、FA01およびFA02の活性がRemicade抗体のFabフラグメントの活性より強力であることを示唆する。実施例4:ヒト化腫瘍壊死因子α抗体のIgG発現およびその活性の検出手順1.ヒト化腫瘍壊死因子α抗体IgGに関する組み換え発現ベクターの作成実施例1および2において得た、2つの重鎖FdフラグメントSH01とSH02をそれぞれ含むおよび6つの軽鎖SH03、SH05、SH04、SH06、SH07およびSH08をそれぞれ含むをコードするDNAフラグメントを、表6に示す様に相互に結合し、オーバーラップ伸長PCRoverlapextensionPCRによりIgG1Fc定常領域に関するDNAフラグメントを共に組み立て、組み換えにより発現プラスミドpcDNA3.1に挿入した。CHO細胞を、作成した組み換え発現プラスミドでトランスフェクションし、完全長ヒト化抗体を発現させた。手順の詳細は以下に述べる通りである。1軽鎖に関するDNAフラグメントを組換えによって、真核細胞発現ベクターpcDNA3.1に直接挿入した。以下のプライマー、5’-TGAAAGCTTATGGAAATTGTGCTGACTCAGTCTC-3’下線部は制限酵素部位HindIII、5’-AATCTCGAGTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3’下線部は制限酵素部位XhoIを設計し、PCR増幅反応で使用した。増幅産物を制限酵素HindIIIR0104L、NEB社製およびXhoIR0146L、NEB社製を用いてダブルダイジェストし、T4DNAリガーゼを用いて、同じ酵素を用いダブルダイジェストしたpcDNA3.1の大きいフラグメントをライゲーションした。2重鎖用DNA断片は、オーバーラップ伸長PCRによりIgG1Fc定常領域用のDNA断片と共に組み立て、且つ組換えによってpcDNA3.1に挿入する必要がある。以下のプライマー、5’-ACTGGTACCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGG-3’下線部は制限酵素部位KpnI、5’-GATGGGCCCTTGGTGCTAGCGGAGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCC-3’;5’-GATGGGCCCTTGGTGCTAGCGGAGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCC-3’;5’-AATCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3’下線部は制限酵素部位XhoIを設計し、PCR増幅反応で使用した。集めたPCR産物を、制限酵素KpnIR0142L、NEB社製およびXhoIR0146L、NEB社製でダブルダイジェストし、同じ制限酵素でダブルダイジェストした発現プラスミドpcDNA3.1に組み換えにより挿入し、適切な組み換え体を得るために切断解析およびシークエンシングにより確認した。表7の18個の抗体用の発現ベクターを、前記の手順に従い準備した。KS01Glu、KS03Glu、KS05Glu、KS06Glu、KS09GluおよびKS10Gluの重鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号2ヌクレオチド配列の第1~3番目はGAGであるで示され、且つ配列番号1第1番目のアミノ酸はGluであるに示される重鎖の可変領域をコードする。KS01Gln、KS03Gln、KS05Gln、KS06Gln、KS09GlnおよびKS10Glnの重鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、ヌクレオチド配列の第1~3番目をCAGに置換した配列表の配列番号2で示され、且つ配列番号1で示される重鎖可変領域第1番目のアミノ酸はGlnであるをコードする。KS02、KS04、KS07、KS08、KS11およびKS12の重鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号4で示され、配列番号3のように示される重鎖可変領域をコードし、KS01Glu,KS01GlnおよびKS02の軽鎖可変領域をコードするDNA配列の全ては配列表の配列番号6で示され、且つ配列番号5に示される軽鎖可変領域をコードする。KS03Glu、KS03GlnおよびKS04の軽鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号10で示され、配列番号9で示される軽鎖可変領域をコードする。KS05Glu、KS05GlnおよびKS08の軽鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号8に示され、配列番号7に示されるような軽鎖可変領域をコードする。KS06Glu、KS06GlnおよびKS07の軽鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号12に示され、配列番号11に示される軽鎖可変領域をコードする。KS09Glu、KS09GlnおよびKS11の軽鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号14に示され、配列番号13に示される軽鎖可変領域をコードする。KS10Glu、KS10GlnおよびKS12の軽鎖可変領域をコードするDNA配列はすべて、配列表の配列番号16に示され、配列番号15に示される軽鎖可変領域をコードする。18個の抗体の重鎖定常領域をコードするDNA配列は配列表の配列番号18で示され、配列番号17で示される重鎖定常領域をコードする。18個の抗体の軽鎖定常領域をコードするDNA配列は配列表の配列番号20で示され、配列番号19で示される軽鎖定常領域をコードする。手順2.完全長ヒト化抗腫瘍壊死因子αIgG抗体の発現と精製手順1で得た軽鎖組み換えプラスミドおよび重鎖組み換えプラスミドを、完全長ヒト化抗体を発現させるためにCHO細胞に同時導入した。表6に示されるような組み合わせに対応するプラスミドを、従来方法によりCHO細胞にそれぞれ安定的に同時導入した後、12個の対応する完全長組み換え抗体が細胞培養の上清に分泌された。上清を対応する完全長IgG抗体を得るために精製した。精製の手順の詳細は以下の通りである。1クロマトグラフィーの充填材MabselectSureGE社製、Superdex200GE社製2緩衝液アフィニティー平衡化緩衝液PBS:0.2Mリン酸水素ナトリウム:82.5mL/L;0.2Mナトリウム二水素ナトリウム:17.5mL/L;2M塩化ナトリウム:75mL/L;に超純水を加えて、完全にかき混ぜてよく混合し、1M水酸化ナトリウムまたは1M塩化水素を用いてpHを7.1~7.3に調整した。アフィニティー溶出緩衝液:NaCl2.922g/L、無水酢酸ナトリウム0.49g/L、氷酢酸2.9mL/L添加、pH3.4~3.6。アフィニティー再生緩衝液:5.8mL/L氷酢酸、pH3.0。アフィニティー定置洗浄CIP緩衝液:1M水酸化ナトリウム100mL/L。ゲル濾過クロマトグラフィー溶液PBS:0.2Mリン酸水素ナトリウム:82.5mL/L;0.2Mリン酸二水素ナトリウム:17.5mL/L;2M塩化ナトリウム:75mL/L;超純水を加え、完全にかき混ぜよく混合し、1M水酸化ナトリウムまたは1M塩化水素を用いて、pHを6.8に調整した。3サンプルの準備清澄濾過遠心分離:サンプルは、10~15分、5000~6000rpmで遠心分離した。ろ過:遠心分離の後、サンプルの上清はH70.450.2μmフィルターでろ過した。4アフィニティークロマトグラフィーAKTA精製システムAKTApurificationsystemおよびアフィニティークロマトグラフィーカラムMabselectorMabselectSureを設置する。カラム体積の2倍体積量の超純水で洗浄する。基線が安定するまでカラム体積の5倍体積量のアフィニティー平衡化緩衝液で洗浄し、サンプルを注入する。サンプルの注入後、カラム体積の5~10倍体積量のアフィニティー平衡化緩衝液で洗浄する。その後、カラムをアフィニティー溶出緩衝液で、1カラム体積量で連続して溶出し、280nmのメジャー吸光度ピークmajorabsorbancepeakに対応する画分を集めた。そのカラムはカラム体積の3倍体積量のアフィニティー再生緩衝液で溶出した。アフィニティー平衡化緩衝液で中性のpHになるように洗浄した。カラム体積の5倍体積量のMabselectCIP緩衝液もしくはMabselectSureCIP緩衝液を用い、定置洗浄を行う。基線が安定するまで、カラム体積の3倍体積量のアフィニティー平衡化緩衝液で洗浄する。基線が安定するまで、カラム体積の3倍体積量の超純水で洗浄する。カラム体積の3倍体積量の20エタノールで洗浄し、アフィニティークロマトグラフィーカラムを保管する。5ゲル濾過クロマトグラフィーAKTA精製システムおよびSuperdex200ゲル濾過クロマトグラフィーカラムを設置する。5mL/分に流量を調整して、1カラム体積量の超純粋で洗浄し、カラム体積の2倍体積量のSuperdex200カラムクロマトグラフィー平衡化液で洗浄する。2.5mL/分に流量を調整して、アフィニティークロマトグラフィーピークに対応する画分を集め、pH値を調整し、カラム上に直接注入した。サンプル注入の後、Superdex200カラムクロマトグラフィー平衡化液で溶出し、目的の280nmピークを集めた。引き続き1カラム体積量で洗浄した。クロマトグラフィーカラムは0.01M水酸化ナトリウムで保管した。手順3.ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体IgGの活性の検出手順2で得た12個のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体IgGを、L929細胞毒性試験操作の詳細は実施例1に述べた通りにより腫瘍壊死因子αの中和の生物活性を試験し、その結果のOD450値を得て、EC50を計算するためにソフトウェアGraphPadプリズム5に入力した。腫瘍壊死因子αの活性を抑制するための12個のヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体IgGのEC50値を表7に示した。その結果は、ヒト化抗腫瘍壊死因子α抗体の生物活性はかなり増加し、KS10は最も高い生物活性があることを示す。従って、更なる抗体活性の詳細な調査は、主としてKS10に関して行った。実施例5:KS10Gluのヒト腫瘍壊死因子αへの結合の動態評価ヒト腫瘍壊死因子αRD社,210-TA-050およびNHS-LCLC-ビオチンThermo-fisher社製,カタログ番号:21338をモル比で1:3の比率で一様に混合し、1時間室温で保持した。その後、残りのNHS-LCLCビオチンは、PD-10脱塩カラムGE社製、カタログ番号:17-0851-01によって取り除いた。得られた最終結合産物は50μg/mLのビオチン-ヒト腫瘍壊死因子αであった。KS10のヒト腫瘍壊死因子αへの結合動態パラメータはOctetRED96システムForteBio社intheOctettechnologyplatformによって決定した。試験の手順を機器の取り扱い説明書に従い設定した。50μg/mLビオチン-ヒト腫瘍壊死因子αをローディングLoadingすることによりStreptavidinバイオセンサーSAに結合させた。その抗体濃度の適切な範囲を以下の通り、6000nM、2000nM、666.7nM、222.2nM、74.1nMおよび24.7nMのパイロット試験により決定した。Remicadeはポジティブコントロールとして使用し、PBSpH7.4はブランクのコントロールとして使用した。その結果表8は、KS10のKD値はRemicadeのKD値よりも小さいことを示し、それはKS10のヒト腫瘍壊死因子αへの親和性がヒト-マウスキメラ抗体Remicadeの親和性よりも高いことを示唆する。更に、チンパンジー腫瘍壊死因子α配列番号36で示されるアミノ酸配列および配列番号37で示されるヌクレオチド配列、アカゲザル腫瘍壊死因子α配列番号38で示されるアミノ酸配列および配列番号39で示されるヌクレオチド配列、マウス腫瘍壊死因子αmTNF-αPROSPEC製、カタログ番号:CYT-252、およびヒトTNFβPROSPEC製、カタログ番号:CYT-224へのKS10の結合親和性を決定した。OctetRED96システムの親和性評価基準に従い、抗原の抗体への結合に起因する光波の変位距離は、2つの物質間の親和性を間接的に反映し、光波の変位距離が長いと、親和性は高い。その結果図3は、KS10がヒト腫瘍壊死因子αにかなり強力に結合すること、チンパンジーの腫瘍壊死因子αにも大いに結合すること、アカゲザルの腫瘍壊死因子αに弱く結合すること、マウス腫瘍壊死因子αおよびヒト腫瘍壊死因子βにほとんど結合しないことを示す。従って、本発明において抗体はヒト化の後に特異的結合能を有することを確認した。実施例6:ヒト腫瘍壊死因子αを誘発した関節リウマチモデルラットへのKS10Gluの影響SPFグレード、半分が雄で半分が雌、体重140~180g、72匹の4~6週齢SpragueDawleyラットlaboratoryanimallicense:SCXKSichuan2008-24を使用した。ラットを1週間慣らし、無作為に1群12匹で6群、即ち、正常群、負対照群、モデル対照群、KS105mg/kg群、KS1010mg/kg群およびKS1020mg/kg群に分けた。試験の初めに、正常群を除く各群のラットに10抱水クロラール350mg/kgで麻酔をかけた。モデリングの前に、ラットに3つの異なる量のKS105mg/kg、10mg/kgおよび20mg/kgを尾静脈注入し、負対照群およびモデル対照群のラットには等量の食塩水を尾静脈注入した。15分後に、0.5mg/mLのヒト腫瘍壊死因子αRD社,カタログ番号:210-TA-0501BSAで溶かし、60μL/ラットの量を注入したを1mLの注射器で、3つのKS10投与群およびモデル対照群に急性関節炎1つの足首のモデリングを引き起こすために、ラットの左足首の関節腔に注入し、等量の1BSAを負対照群ラットの左足首の関節腔に注入した。注入の成功は、関節腔の両側のくぼみの漸次腫脹によって示された。正常群ラットには前記の注入は行わなかった。モデルは18時間後に確立され、各群中のラットの左足首関節の腫脹度を以下のように0~4の変調段階基準modifiedgradationcriteriaでそれぞれ採点した。0:発赤と腫脹なし、1:足首関節のみ発赤および/または腫脹、2:足首関節の発赤と腫脹および足底の腫脹、3:足首関節および足底の発赤と腫脹、4:足首関節、足底および足の表面の発赤および腫脹RΟWilliams,MFeldmann,andRΝMaini,Anti-tumornecrosisfactoramelioratesjointdiseaseinmurinecollagen-inducedarthritis,ProcNatlAcadSciUSA,1992October15;8920:9784-9788を参照。モデルを確立した20時間後に、滑膜関節液を抜いた。関節周辺の柔組織を分離し、均質化し、遠心し-70°Cで凍結した。IL-lβおよびIL-6のレベルはラットELASAキットIL-lβRD社製,カタログ番号:RLB00;IL-6RD社製,カタログ番号:R6000Bを用いて決定した。スコア図4は、KS10の3つの投与量で、ヒト腫瘍壊死因子αが誘発するラットの関節の発赤および腫脹を、大いに緩和することができ、ヒト腫瘍壊死因子αが誘発する関節リウマチの進行に大いに拮抗できることを示す。サイトカイン評価では、KS10の3つの投与量で、滑液および関節周辺の柔組織でIL-lβ図5およびIL-6図6のレベルを大いに下げることが示され、このことは、KS10がヒト腫瘍壊死因子αによって誘発されるIL-lβおよびIL-6の増加レベルを完全にブロックすることができ、KS10のヒト腫瘍壊死因子αに対する活性の証拠となることを示す。実施例7:ヒト腫瘍壊死因子αを誘発したぶどう膜炎モデルラットへのKS10Glu処理効果40匹の健康なLewisラットを、正常群、モデル群、負対照群、KS10群に分けた。ラットに、10抱水クロラール0.35mL/kg1回投与を腹腔内に注入した。ラットに麻酔をかけた後、モデル群および負対照群のそれぞれのラットに、毛様体筋の平らな部分を通してガラス体に生理食塩水10μLを注入し30G1/2針を使用、4mg/mLのKS10溶解液PBSで作成したを10μL、KS10群のラットそれぞれに同様に注入した。30分後、10μLのヒト腫瘍壊死因子α約0.5mg/mLをモデル群およびKS10群の各ラットの静脈内に注入し、10μLの1BSAを負対照群の各ラットの静脈内に注入した。最初の投与によりモデルが形成されてから24時間および48時間後に、ラットを麻酔し、細隙灯の下観察し、それぞれ採点した。採点基準は、文献FleisherLN,FerrellJB,SmithMG,McGahanMC,Lipidmediatorsoftumornecrosisfactor-α-induceduveitisInvestOphthalmolVisSci,1991Jul;328:2393-9および改訂版を参照したものであり、虹彩の充血0~20:充血なし、1:少し充血、2:重度の充血、縮瞳0~10:正常な瞳孔、1:縮瞳、前房滲出0~20:前房滲出なし、1:少し前房滲出;2:重度の前房滲出、暗瞳孔caligopupillaeまたは虹彩後癒着0~20:癒着なし、1:一方の部位で癒着、2:両方の部位で癒着である。採点結果を表9に示す。これはKS10が、眼内の透明度を増加させ、虹彩充血、繊維素性滲出および暗瞳孔caligopupillaeまたは虹彩後癒着を抑えることを示すぶどう膜炎評価基準のスコアを、著しく低下できることを示す。従って、KS10がヒト腫瘍壊死因子αにより誘発されるぶどう膜炎への重大な拮抗作用を発揮することが示された。"