"イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、N末端領域、表面ループ、表面、活性部位、二量体界面、基質捕捉ループ、又は埋没領域中の1つ以上の残基にて1つ以上の置換を含み、かつここで前記ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも30増加している、単離ポリペプチド。前記N末端領域における置換が、X2,X22,X36,X43,及びX58からなる群から選択される残基の置換である、請求項1に記載のポリペプチド。前記置換が、E2,S22,K36,R43,及びE58からなる群から選択される残基の置換である、請求項2に記載のポリペプチド。前記置換が、E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,及びE58Fからなる群から選択される、請求項3に記載のポリペプチド。前記埋没領域における前記置換が、X71,X89,X118,X161,X228,X268,X282,X288,X331,X391,X392,X437,X460,X461,X481,X488,及びX502からなる群から選択される残基の置換である、請求項1に記載のポリペプチド。前記置換が、R71,F89,A118,K161,M228,V268,S282,S288,C331,A391,W392,C437,M460,R461,T481,E488,及びT502からなる群から選択される残基の置換である、請求項5に記載のポリペプチド。前記置換が、R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,K161C,M228Y,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,C437L,C437M,M460A,R461A,R461Y,T481Y,E488L,T502F及びT502Mからなる群から選択される、請求項6に記載のポリペプチド。前記表面ループにおける前記置換が、X120,X151,X153,X254,X380,及びX409からなる群から選択される残基の置換である、請求項1に記載のポリペプチド。前記置換が、S120,L151,H254,S380,及びV409からなる群から選択される残基の置換である、請求項8に記載のポリペプチド。前記置換が、S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,H254C,S380E,及びV409Tからなる群から選択される、請求項9に記載のポリペプチド。前記二量体界面における前記置換が残基X247のものである、請求項1に記載のポリペプチド。前記置換が残基V247のものである、請求項11に記載のポリペプチド。前記置換がV247Mである、請求項12に記載のポリペプチド。前記表面における置換が、X348,X376,及びX389からなる群から選択される残基の置換である、請求項1に記載のポリペプチド。前記置換が、K348,L376,及びG389からなる群から選択される残基の置換である、請求項14に記載のポリペプチド。前記置換が、K348Y,及びG389Dからなる群から選択される、請求項15に記載のポリペプチド。前記基質捕捉ループにおける置換が、X443,X444,X447及びX448からなる群から選択される残基の置換である、請求項1に記載のポリペプチド。前記置換が、S444,I447及びA448からなる群から選択される残基の置換である、請求項17に記載のポリペプチド。前記置換が、S444S,I447T及びA448Vからなる群から選択される、請求項18に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する残基番号を付した次の不変の残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,及びX518,を含み、かつ更に:X2,X22,X36,X43,X58,X71,X89,X118,X120,X151,X153,X161,X228,X234,X247,X254,X268,X282,X288,X331,X348,X376,X380,X389,X391,X392,X409,X437,X443,X444,X447,X448,X460,X461,X481,X488,及びX502,からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも30上昇している、単離ポリペプチド。前記置換が、E2,S22,K36,R43,E58,R71,F89,A118,S120,L151,K161,M228,Q234,V247,H254,V268,S282,S288,C331,K348,L376,S380,G389,A391,W392,V409,C437,S444,I447,A448,M460,R461,T481,E488,及びT502からなる群から選択される残基の置換である、請求項20に記載のポリペプチド。前記置換が、E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,E58F,R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,K161C,M228Y,Q234R,V247I,V247L,V247M,H254C,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,K348Y,S380E,G389D,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,V409T,C437L,C437M,S444D,S444E,I447T,I447V,A448V,M460A,R461A,T481Y,E488L,T502F及びT502Mからなる群から選択される、請求項21に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する残基番号を付した次の不変の残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,及びX518,を含み、かつ更に:X134,X138,X143,X156,X159,X163,X166,X167,X170,X414,X421,及びX491からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、ここで、前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも50上昇している、単離ポリペプチド。前記置換がK134,K138,L143,I156,E159,F163,S166,H167,E170,K414,及びQ421からなる群から選択される残基の置換である、請求項23に記載のポリペプチド。前記置換が、K134P,K138C,L143F,L143V,I156G,E159G,E159Q,F163C,F163E,F163Q,F163V,F163Y,S166C,S166D,S166G,S166P,S166V,H167M,E170G,E170H,E170K,E170N,E170R,E170S,E170W,K414F,K414G,K414N,K414P,及びQ421Rからなる群から選択される、請求項24に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する残基番号を付した次の不変の残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,及びX518,を含み、かつ更に:X29,X47,X86,X94,X131,X134,X156,X162,X169,X178,X179,X231,X242,X369,X414,及びX421からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、ここで、前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも50上昇している、単離ポリペプチド。前記置換が、E29,N47,S86,K94,E131,K134,I156,V162,K169,K178,E179,S231,R242,F369,K414,及びQ421からなる群から選択される残基の置換である、請求項26に記載のポリペプチド。前記置換が、E29N,N47V,S86C,K94A,E131F,K134E,K134P,I156G,V162P,K169C,K178E,E179T,S231D,S231K,S231R,S231T,S231V,R242N,R242I,F369C,K414C,K414F,K414G,K414N,及びQ421Dからなる群から選択される、請求項27に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する残基番号を付した次の不変の残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,及びX518,を含み、かつ更に:X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170及びX172からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、ここで前記ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも20上昇しており、かつ前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも20上昇している、単離ポリペプチド。前記置換が、V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170及びS172からなる群から選択される残基の置換である、請求項29に記載のポリペプチド。前記置換が、V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,及びS172Vからなる群から選択される、請求項30に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、iN末端、ii残基134~179のN端末ヘリックス領域該残基番号は配列番号1野生型MEAイソプレン合成酵素と一致する、あるいはiiiN端末ヘリックス領域と相互作用する、N端末ヘリックス領域以外の他の残基、の1つ以上にて置換を含み、ここで前記ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも20上昇している、単離ポリペプチド。前記置換が、X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170及びX172からなる群から選択される残基の置換である、請求項32に記載のポリペプチド。前記置換が、V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170及びS172からなる群から選択される残基の置換である、請求項33に記載のポリペプチド。前記置換が、V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,及びS172Vからなる群から選択される残基の置換である、請求項34に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する:X2,X22,X36,X43,X58,X71,X89,X118,X120,X151,X153,X161,X228,X234,X247,X254,X268,X282,X288,X331,X348,X376,X380,X389,X391,X392,X409,X437,X443,X444,X447,X448,X460,X461,X481,X488,及びX502,からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、かつここで前記ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも30上昇している、単離ポリペプチド。前記置換が、E2,S22,K36,R43,E58,R71,F89,A118,S120,L151,K161,M228,Q234,V247,H254,V268,S282,S288,C331,K348,L376,S380,G389,A391,W392,V409,C437,S444,I447,A448,M460,R461,T481,E488,及びT502からなる群から選択される残基の置換である、請求項36に記載のポリペプチド。前記置換が、E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,E58F,R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,K161C,M228Y,Q234R,V247I,V247L,V247M,H254C,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,K348Y,S380E,G389D,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,V409T,C437L,C437M,S444D,S444E,I447T,I447V,A448V,M460A,R461A,T481Y,E488L,T502F及びT502Mからなる群から選択される、請求項37に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、N末端領域、N末端ヘリックス領域、表面ループ、表面、活性部位、二量体界面、基質捕捉ループ、又は埋没領域中の1つ以上の残基にて1つ以上の置換を含み、かつここで前記ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも40上昇している、単離ポリペプチド。前記N末端領域における置換が、X18,X36,及びX82からなる群から選択される残基の置換である、請求項39に記載のポリペプチド。前記置換が、Y18,K36,及びR82からなる群から選択される残基の置換である、請求項40に記載のポリペプチド。前記置換が、Y18E,Y18D,Y18S,K36P,及びR82Qからなる群から選択される、請求項41に記載のポリペプチド。前記N末端ヘリックス領域における置換が、X137,X143,X163,及びX170からなる群から選択される残基の置換である、請求項39に記載のポリペプチド。前記置換が、I137,L143,F163,及びE170からなる群から選択される残基の置換である、請求項43に記載のポリペプチド。前記置換が、I137C,L143N,F163I,F163Q,及びE170Gからなる群から選択される、請求項44に記載のポリペプチド。前記表面ループにおける前記置換が、X87,X409,及びX542からなる群から選択される残基の置換である、請求項39に記載のポリペプチド。前記置換が、G87,V409,及びF542からなる群から選択される残基の置換である、請求項46に記載のポリペプチド。前記置換が、G87S,G87N,G87R,V409S,及びF542Nからなる群から選択される、請求項47に記載のポリペプチド。前記表面における前記置換が残基X251のものである、請求項39に記載のポリペプチド。前記置換が残基T251のものである、請求項49に記載のポリペプチド。前記置換がT251Eである、請求項49に記載のポリペプチド。前記二量体界面における前記置換が残基X242のものである、請求項39に記載のポリペプチド。前記置換が残基R242のものである、請求項52に記載のポリペプチド。前記置換がR242Tである、請求項53に記載のポリペプチド。前記埋没領域における前記置換が、X437,X460,及びX461からなる群から選択される残基の置換である、請求項39に記載のポリペプチド。前記置換が、C437,M460,及びR461からなる群から選択される残基の置換である、請求項55に記載のポリペプチド。前記置換が、C437M,C437K,M460Q,M460G,M460A,R461D,R461S,R461T,及びR461からなる群から選択される、請求項56に記載のポリペプチド。前記基質捕捉ループにおける置換が、X443,X444,及びX447からなる群から選択される残基の置換である、請求項39に記載のポリペプチド。前記置換が、S444,及びI447からなる群から選択される残基の置換である、請求項58に記載のポリペプチド。前記置換が、S444P,I447Q,I447T,I447M,I447E,I447S,及びI447Rからなる群から選択される、請求項56に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する:X134,X138,X143,X156,X159,X163,X166,X167,X170,X414,X421,及びX491からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、かつここで、前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも50上昇している、単離ポリペプチド。前記置換が、K134,K138,L143,I156,E159,F163,H167,E170,K414,及びQ421からなる群から選択される残基の置換である、請求項61に記載のポリペプチド。前記置換が、K134P,K138C,L143F,L143V,I156G,E159G,E159Q,F163C,F163E,F163Q,F163V,F163Y,S166C,S166D,S166G,S166P,S166V,H167M,E170G,E170H,E170K,E170N,E170R,E170S,E170W,K414F,K414G,K414N,K414P,及びQ421Rからなる群から選択される、請求項62に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する:X29,X47,X86,X94,X131,X134,X156,X162,X169,X178,X179,X231,X242,X369,X414,及びX421からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、かつここで、前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも50上昇している、単離ポリペプチド。前記置換が、E29,N47,S86,K94,E131,K134,I156,V162,K169,K178,E179,S231,R242,F369,K414,及びQ421からなる群から選択される残基の置換である、請求項64に記載のポリペプチド。前記置換が、E29N,N47V,S86C,K94A,E131F,K134E,K134P,I156G,V162P,K169C,K178E,E179T,S231D,S231K,S231R,S231T,S231V,R242N,R242I,F369C,K414C,K414F,K414G,K414N,及びQ421Dからなる群から選択される、請求項65に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する:X50,X81,X134,X137,X143,X156,X159,X166,X167,X169,X170,及びX414からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、かつここで、前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも30上昇している、単離ポリペプチド。前記置換が、K50,D81,K134,I137,L143,I156,E159,S166,H167,K169,E170,及びK414からなる群から選択される、請求項67に記載のポリペプチド。前記置換が、K50S,D81F,K134E,K134P,I137N,L143V,I156G,E159D,E159G,E159Q,S166C,S166W,H167M,H167N,K169C,E170H,E170K,E170W,K414C,K414F,K414G,K414N,及びK414Pからなる群から選択される、請求項68に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素活性が改良されており、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する:X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170及びX172からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも20上昇しており、かつ前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも20上昇している、単離ポリペプチド。前記置換が、V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170及びS172からなる群から選択される残基の置換である、請求項70に記載のポリペプチド。前記置換が、V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,及びS172Vからなる群から選択される、請求項71に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する:X22,X71,X87,X162,X242,X288,X409,X414,X443,X444,X460,及びX502からなる群から選択される残基にて2つ以上の置換を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも160上昇している、単離ポリペプチド。前記置換が、S22,R71,G87,V162,R242,S288,V409,K414,S444,M460,及びT502からなる群から選択される残基の置換である、請求項73に記載のポリペプチド。前記置換が、S22R,R71I又はR、G87R,V162P,R242N,S288C,V409T,KX414F,S444D,M460A,及びT502Mからなる群から選択される、請求項74に記載のポリペプチド。前記置換が、aS22R,R71I,S288C,S444D,M460A,及びT502M;bG87R,V162P,R242N,S288C,V409T,K414R,及びS444D;又はcG87R,V162P,R242N,S288C,V409T,及びK414F,からなる群から選択される、請求項73に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する:X47,X87,X156,X162,X170,X231,X242,X288,X409,X414,及びX447からなる群から選択される残基の2つ以上に置換を含み、ここで、残基の付番は配列番号1と対応し、前記ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも30上昇しており、かつ前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも30上昇している、単離ポリペプチド。前記置換が、N47,G87,I156,V162,E170,S231,R242,S288,V409,K414,及びI447からなる群から選択される残基の置換である、請求項77に記載のポリペプチド。前記置換が、N47V,G87R,I156G,V162P,E170H,S231T,R242N,S288C,S288T,V409T,及びK414Fからなる群から選択される、請求項78に記載のポリペプチド。前記置換が、N47V,I156G,E170H,S231T,S288T,及びK414Fからなる群から選択される残基の置換である、請求項77に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する:X2,X18,X19,X21,X24,X26,X27,X29,X37,X42,X47,X48,X49,X56,X81,X82,X84,X93,X94,X95,X120,X123,X126,X131,X132,X134,X137,X139,X143,X151,X155,X166,X167,X169,X170,X171,X175,X179,X180,X197,X229,X231,X240,X242,X245,X246,X247,X251,X271,X282,X306,X317,X319,X369,X371,X376,X379,X380,X389,X392,X393,X408,X409,X421,X422,X423,X429,X437,X443,X444,X447,X455,X458,X461,X464,X466,X470,X473,X500,X502,X506,X513,X525、及びX531からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、a配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数PIは0.9以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.0以上であり、b配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数PIは0.8以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.2以上であり、並びにc配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数PIは0.5以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.5以上である、単離ポリペプチド。前記置換が、E2,Y18,L19,S21,T24,E26,S27,E29,K37,V42,N47,N48,E49,L56,D81,R82,V84,T93,K94,T95,S120,K123,N126,E131,N132,K134,I137,A139,L143,L151,N155,S166,H167,K169,E170,L171,K175,E179,L180,Q197,I229,S231,T240,R242,R245,R246,V247,T251,A271,S282,L306,D317,N319,F369,Q371,L376,K379,S380,G389,W392,K393,V408,V409,Q421,K422,Y423,R429,C437,S444,I447,S455,C458,R461,G464,S466,A470,S473,V500,T502,L506,T513,E525,及びV531からなる群から選択される残基の置換である、請求項81に記載のポリペプチド。前記置換が、E2A又はK又はP,Y18D又はE又はK又はS,L19Y,S21W,T24L又はV,E26C,S27D又はN,E29N,K37C又はD又はP又はQ又はS,V42M,N47D又はS,N48D又はG又はT,E49L又はV,L56E又はF又はG又はI又はK又はT又はV又はY,D81Q,R82N又はT又はV又はY,V84M,T93C又はF又はR又はS,K94G又はP,T95D又はF又はG又はI又はN又はW,S120C又はG又はM又はQ,K123V,N126E,E131H又はK又はL又はM又はT又はW又はY,N132I又はP,K134A,I137T,A139C又はQ,L143C又はD又はE又はH又はK又はM又はQ又はT又はV又はY,L151A又はF,N155A又はC又はG又はH又はQ又はR又はS又はW,S166N,H167F又はI又はN又はQ又はV,K169A又はC又はH又はN又はQ又はV,E170L又はS又はW又はY,L171A又はN又はQ又はT又はV又はY,K175C又はF又はI又はQ又はR,E179D,L180A又はI,Q197C又はD又はN,I229C,S231A,T240C,R242G,R245C又はK又はM又はQ又はT又はV,R246N,V247L又はM,T251D又はE又はN又はP又はQ又はS,A271T,S282Y,L306C,D317N,N319M,F369C又はD又はE又はG又はS,Q371F,L376I又はM,K379G又はQ,S380E,G389A又はD又はE又はK又はN又はQ又はS又はV,W392Y,K393C又はI又はT又はV,V408T,V409T,Q421H,K422D,Y423N又はS,R429E又はF又はQ,C437M,S444D又はE,I447T,S455A,C458T,R461A,G464C又はM又はN又はQ又はS,S466D,A470I又はL,S473I,V500A又はC,T502M,L506M,T513C又はG又はK又はN,E525F又はR,V531E又はH又はK又はQ又はR又はSからなる群から選択される、請求項82に記載のポリペプチド。イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号1と対応する:X2,X6,X18,X20,X22,X23,X24,X25,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X36,X37,X42,X44,X47,X48,X49,X50,X53,X54,X55,X56,X58,X59,X68,X71,X74,X77,X78,X79,X81,X82,X83,X84,X86,X87,X91,X93,X94,X95,X97,X98,X99,X109,X115,X116,X117,X118,X120,X123,X125,X126,X127,X128,X130,X131,X132,X133,X134,X136,X137,X138,X139,X140,X143,X151,X153,X155,X156,X159,X160,X161,X162,X163,X164,X166,X167,X169,X170,X171,X172,X175,X176,X177,X178,X179,X180,X181,X182,X190,X194,X197,X204,X211,X215,X217,X219,X221,X228,X229,X231,X232,X235,X241,X242,X245,X246,X247,X251,X254,X271,X272,X278,X279,X282,X296,X302,X317,X319,X320,X327,X331,X348,X351,X357,X361,X364,X365,X368,X369,X370,X371,X373,X377,X380,X383,X386,X389,X392,X393,X407,X408,X409,X410,X411,X414,X422,X423,X424,X428,X429,X432,X436,X437,X440,X443,X444,X447,X448,X457,X460,X461,X462,X463,X464,X465,X466,X468,X470,X471,X472,X473,X475,X480,X490,X491,X492,X494,X496,X500,X501,X502,X503,X510,X513,X515,X519,X525,X531,X536,X537,X540,X541,X542,及びX544からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、a配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数は0.9以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.0以上であり、b配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数PIは0.8以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.2以上である、単離ポリペプチド。前記置換が、E2,S6,Y18,L20,S22,D23,T24,D25,E26,S27,I28,E29,Y31,K32,K36,K37,V42,R44,N47,N48,E49,K50,F53,L54,T55,L56,E58,L59,L68,R71,S74,R77,G78,A79,D81,R82,F83,V84,S86,G87,A91,T93,K94,T95,L97,H98,G99,Q109,S115,Q116したがって、当該技術分野では、イソプレノイドを製造する際の原料を提供するための、イソプレンの効率的で大規模な生物学的生産法が必要とされている。本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、論文及び刊行物は、参照により明示的に本案件に援用される。本発明は、イソプレン合成酵素のポリペプチド変異体を少なくとも1つ含む組成物、並びにこのような変異体の製造法及び使用法を提供する。この変異体は、親イソプレン合成酵素ポリペプチドとは異なるアミノ酸残基置換を一箇所以上に含み、この場合の親イソプレン合成酵素は、野生型の配列であっても、あるいは野生型の配列でなくてよい。本発明は、ポリペプチド内の特定の位置でのアミノ酸残基置換を提供し、この置換により、少なくとも一つの特性が、親配列のものと比較して改良され得る。一部の特に好ましい実施形態では、改良される少なくとも一つの特性は、限定するものではないが次のものからなる群から選択される:比生産性、収率、細胞の性能指数cellularperformanceindex、比活性、ポリペプチド変異体を発現している宿主細胞の増殖性、発現、安定性、及び溶解性。特に、本発明は、宿主細胞においてイソプレン生産を増加させる、変異型の植物イソプレン合成酵素を提供する。一態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、N末端領域、表面ループ、表面、活性部位、二量体界面、基質捕捉ループ、又は埋没領域の1つ以上の残基にて1つ以上の置換を含み、このポリペプチドは、配列番号1と比較して少なくとも30増加している。一部の実施形態では、N末端領域の置換は、X2,X22,X36,X43,及びX58からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、E2,S22,K36,R43,及びE58からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,及びE58Fからなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、埋没領域における置換は、X71,X89,X118,X161,X228,X268,X282,X288,X331,X391,X392,X437,X460,X461,X481,X488,及びX502からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、R71,F89,A118,K161,M228,V268,S282,S288,C331,A391,W392,C437,M460,R461,T481,E488,及びT502からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,K161C,M228Y,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,C437L,C437M,M460A,R461A,R461Y,T481Y,E488L,T502F及びT502Mからなる群から選択される。一部の実施形態では、表面ループにおける置換は、X120,X151,X153,X254,X380,及びX409からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、S120,L151,H254,S380,及びV409からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,H254C,S380E,及びV409Tからなる群から選択される。一部の実施形態では、二量体界面における置換はX247の置換である。一部の実施形態では、置換はV247の置換である。一部の実施形態では、置換はV247Mである。一部の実施形態では、表面における置換は、X348,X376,及びX389からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、K348,L376,及びG389からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、K348Y,及びG389Dからなる群から選択される。一部の実施形態では、基質捕捉ループにおける置換は、X443,X444,X447及びX448からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はS444,I447及びA448からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はS444S,I447T及びA448Vからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号1と対応する残基番号を付した次の不変の残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,及びX518,を含み、かつポリペプチドは更に:X2,X22,X36,X43,X58,X71,X89,X118,X120,X151,X153,X161,X228,X234,X247,X254,X268,X282,X288,X331,X348,X376,X380,X389,X391,X392,X409,X437,X443,X444,X447,X448,X460,X461,X481,X488,及びX502,からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも30上昇している。一部の実施形態では、置換は:E2,S22,K36,R43,E58,R71,F89,A118,S120,L151,K161,M228,Q234,V247,H254,V268,S282,S288,C331,K348,L376,S380,G389,A391,W392,V409,C437,S444,I447,A448,M460,R461,T481,E488,及びT502からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,E58F,R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,K161C,M228Y,Q234R,V247I,V247L,V247M,H254C,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,K348Y,S380E,G389D,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,V409T,C437L,C437M,S444D,S444E,I447T,I447V,A448V,M460A,R461A,T481Y,E488L,T502F及びT502Mからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号1と対応する残基番号を付した次の不変の残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,及びX518,を含み、かつポリペプチドは更に:X134,X138,X143,X156,X159,X163,X166,X167,X170,X414,X421,及びX491からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、ここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも50上昇している。一部の実施形態では、置換はK134,K138,L143,I156,E159,F163,S166,H167,E170,K414,及びQ421からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、K134P,K138C,L143F,L143V,I156G,E159G,E159Q,F163C,F163E,F163Q,F163V,F163Y,S166C,S166D,S166G,S166P,S166V,H167M,E170G,E170H,E170K,E170N,E170R,E170S,E170W,K414F,K414G,K414N,K414P,及びQ421Rからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号1と対応する残基番号を付した次の不変の残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,及びX518,を含み、かつポリペプチドは更に:X29,X47,X86,X94,X131,X134,X156,X162,X169,X178,X179,X231,X242,X369,X414,及びX421からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、ここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも50上昇している。一部の実施形態では、置換はE29,N47,S86,K94,E131,K134,I156,V162,K169,K178,E179,S231,R242,F369,K414,及びQ421からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はE29N,N47V,S86C,K94A,E131F,K134E,K134P,I156G,V162P,K169C,K178E,E179T,S231D,S231K,S231R,S231T,S231V,R242N,R242I,F369C,K414C,K414F,K414G,K414N,及びQ421Dからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号1と対応する残基番号を付した次の不変の残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,及びX518,を含み、かつポリペプチドは更に:X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170及びX172からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号1と比較して少なくとも20上昇しており、かつこのポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも20上昇している。一部の実施形態では、置換は、V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170及びS172からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,及びS172Vからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、iN末端、ii残基134~179のN端末ヘリックス領域この残基番号は配列番号1野生型MEAイソプレン合成酵素と一致する、あるいはiiiN端末ヘリックス領域と相互作用する、N端末ヘリックス領域以外の他の残基、の1つ以上にて置換を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号1と比較して少なくとも20上昇している。一部の実施形態では、置換は:X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170及びX172からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170及びS172からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,及びS172Vからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X2,X22,X36,X43,X58,X71,X89,X118,X120,X151,X153,X161,X228,X234,X247,X254,X268,X282,X288,X331,X348,X376,X380,X389,X391,X392,X409,X437,X443,X444,X447,X448,X460,X461,X481,X488,及びX502,からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも30上昇している。一部の実施形態では、置換はE2,S22,K36,R43,E58,R71,F89,A118,S120,L151,K161,M228,Q234,V247,H254,V268,S282,S288,C331,K348,L376,S380,G389,A391,W392,V409,C437,S444,I447,A448,M460,R461,T481,E488,及びT502からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,E58F,R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,K161C,M228Y,Q234R,V247I,V247L,V247M,H254C,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,K348Y,S380E,G389D,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,V409T,C437L,C437M,S444D,S444E,I447T,I447V,A448V,M460A,R461A,T481Y,E488L,T502F及びT502Mからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、N末端領域、N端末ヘリックス領域、表面ループ、表面、活性部位、二量体界面、基質捕捉ループ、又は埋没領域中の1つ以上の残基にて1つ以上の置換を含み、かつここでポリペプチドは、配列番号1と比較して少なくとも40上昇している。一部の実施形態では、N末端領域における置換は:X18,X36,及びX82からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Y18,K36,及びR82からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:Y18E,Y18D,Y18S,K36P,及びR82Qからなる群から選択される。一部の実施形態では、N末端ヘリックス領域における置換は:X137,X143,X163,及びX170からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:I137,L143,F163,及びE170からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:I137C,L143N,F163I,F163Q,及びE170Gからなる群から選択される。一部の実施形態では、表面ループにおける置換は:X87,X409,及びX542からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:G87,V409,及びF542からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:G87S,G87N,G87R,V409S,及びF542Nからなる群から選択される。一部の実施形態では、表面における置換は残基X251の置換である。一部の実施形態では、置換は残基T251の置換である。一部の実施形態では、置換はT251Eである。一部の実施形態では、二量体界面における置換は残基X242の置換である。一部の実施形態では、置換は残基R242の置換である。一部の実施形態では、置換はR242Tの置換である。一部の実施形態では、埋没領域における置換は:X437,X460,及びX461からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:C437,M460,及びR461からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:C437M,C437K,M460Q,M460G,M460A,R461D,R461S,R461T,及びR461からなる群から選択される。一部の実施形態では、基質捕捉ループにおける置換は:X443,X444,及びX447からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:S444,及びI447からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:S444P,I447Q,I447T,I447M,I447E,I447S,及びI447Rからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X134,X138,X143,X156,X159,X163,X166,X167,X170,X414,X421,及びX491からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも50上昇している。一部の実施形態では、置換はK134,K138,L143,I156,E159,F163,S166,H167,E170,K414,及びQ421からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はK134P,K138C,L143F,L143V,I156G,E159G,E159Q,F163C,F163E,F163Q,F163V,F163Y,S166C,S166D,S166G,S166P,S166V,H167M,E170G,E170H,E170K,E170N,E170R,E170S,E170W,K414F,K414G,K414N,K414P,及びQ421Rからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X29,X47,X86,X94,X131,X134,X156,X162,X169,X178,X179,X231,X242,X369,X414,及びX421からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも50上昇している。一部の実施形態では、置換はE29,N47,S86,K94,E131,K134,I156,V162,K169,K178,E179,S231,R242,F369,K414,及びQ421からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はE29N,N47V,S86C,K94A,E131F,K134E,K134P,I156G,V162P,K169C,K178E,E179T,S231D,S231K,S231R,S231T,S231V,R242N,R242I,F369C,K414C,K414F,K414G,K414N,及びQ421Dからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X50,X81,X134,X137,X143,X156,X159,X166,X167,X169,X170,及びX414からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも30上昇している。一部の実施形態では、置換はK50,D81,K134,I137,L143,I156,E159,S166,H167,K169,E170,及びK414からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換K50S,D81F,K134E,K134P,I137N,L143V,I156G,E159D,E159G,E159Q,S166C,S166W,H167M,H167N,K169C,E170H,E170K,E170W,K414C,K414F,K414G,K414N,及びK414Pからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性が改良されており、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170及びX172からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号1と比較して少なくとも20上昇しており、かつこのポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも20上昇している。一部の実施形態では、置換は、V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170及びS172からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,及びS172Vからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X22,X71,X87,X162,X242,X288,X409,X414,X443,X444,X460,及びX502からなる群から選択される残基にて2つ以上の置換を含み、ここで、残基の付番は配列番号1と対応し、ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも160上昇している。一部の実施形態では、置換は、S22,R71,G87,V162,R242,S288,V409,K414,S444,M460,及びT502からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はS22R,R71I又はR,G87R,V162P,R242N,S288C,V409T,KX414F,S444D,M460A,及びT502Mからなる群から選択される。一部の実施形態では、置換は:aS22R,R71I,S288C,S444D,M460A,及びT502M;bG87R,V162P,R242N,S288C,V409T,K414R,及びS444D,又はcG87R,V162P,R242N,S288C,V409T,及びK414Fからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X47,X87,X156,X162,X170,X231,X242,X288,X409,X414,及びX447からなる群から選択される残基の2つ以上に置換を含み、ここで、残基の付番は配列番号1と対応し、ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも30上昇しており、かつこのポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも30上昇している。一部の実施形態では、置換は:N47,G87,I156,V162,E170,S231,R242,S288,V409,K414,及びI447からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は:N47V,G87R,I156G,V162P,E170H,S231T,R242N,S288C,S288T,V409T,及びK414Fからなる群から選択される。一部の実施形態では、置換は:N47V,I156G,E170H,S231T,S288T,及びK414Fからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X2,X18,X19,X21,X24,X26,X27,X29,X37,X42,X47,X48,X49,X56,X81,X82,X84,X93,X94,X95,X120,X123,X126,X131,X132,X134,X137,X139,X143,X151,X155,X166,X167,X169,X170,X171,X175,X179,X180,X197,X229,X231,X240,X242,X245,X246,X247,X251,X271,X282,X306,X317,X319,X369,X371,X376,X379,X380,X389,X392,X393,X408,X409,X421,X422,X423,X429,X437,X443,X444,X447,X455,X458,X461,X464,X466,X470,X473,X500,X502,X506,X513,X525及びX531からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、a配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数PIは0.9以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.0以上であり、b配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数PIは0.8以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.2以上であり、並びにc配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数PIは0.5以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.5以上である。一部の実施形態では、置換はE2,Y18,L19,S21,T24,E26,S27,E29,K37,V42,N47,N48,E49,L56,D81,R82,V84,T93,K94,T95,S120,K123,N126,E131,N132,K134,I137,A139,L143,L151,N155,S166,H167,K169,E170,L171,K175,E179,L180,Q197,I229,S231,T240,R242,R245,R246,V247,T251,A271,S282,L306,D317,N319,F369,Q371,L376,K379,S380,G389,W392,K393,V408,V409,Q421,K422,Y423,R429,C437,S444,I447,S455,C458,R461,G464,S466,A470,S473,V500,T502,L506,T513,E525及びV531からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、E2A又はK又はP、Y18D又はE又はK又はS、L19Y、S21W、T24L又はV、E26C、S27D又はN、E29N、K37C又はD又はP又はQ又はS、V42M、N47D又はS、N48D又はG又はT、E49L又はV、L56E又はF又はG又はI又はK又はT又はV又はY、D81Q、R82N又はT又はV又はY、V84M、T93C又はF又はR又はS、K94G又はP、T95D又はF又はG又はI又はN又はW、S120C又はG又はM又はQ、K123V、N126E、E131H又はK又はL又はM又はT又はW又はY、N132I又はP、K134A、I137T、A139C又はQ、L143C又はD又はE又はH又はK又はM又はQ又はT又はV又はY、L151A又はF、N155A又はC又はG又はH又はQ又はR又はS又はW、S166N、H167F又はI又はN又はQ又はV、K169A又はC又はH又はN又はQ又はV、E170L又はS又はW又はY、L171A又はN又はQ又はT又はV又はY、K175C又はF又はI又はQ又はR、E179D、L180A又はI、Q197C又はD又はN、I229C、S231A、T240C、R242G、R245C又はK又はM又はQ又はT又はV、R246N、V247L又はM、T251D又はE又はN又はP又はQ又はS、A271T、S282Y、L306C、D317N、N319M、F369C又はD又はE又はG又はS、Q371F、L376I又はM、K379G又はQ、S380E、G389A又はD又はE又はK又はN又はQ又はS又はV、W392Y、K393C又はI又はT又はV、V408T、V409T、Q421H、K422D、Y423N又はS、R429E又はF又はQ,C437M、S444D又はE、I447T、S455A、C458T、R461A,G464C又はM又はN又はQ又はS、S466D、A470I又はL、S473I、V500A又はC、T502M,L506M,T513C又はG又はK又はN、E525F又はR、V531E又はH又はK又はQ又はR又はSからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X2,X6,X18,X20,X22,X23,X24,X25,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X36,X37,X42,X44,X47,X48,X49,X50,X53,X54,X55,X56,X58,X59,X68,X71,X74,X77,X78,X79,X81,X82,X83,X84,X86,X87,X91,X93,X94,X95,X97,X98,X99,X109,X115,X116,X117,X118,X120,X123,X125,X126,X127,X128,X130,X131,X132,X133,X134,X136,X137,X138,X139,X140,X143,X151,X153,X155,X156,X159,X160,X161,X162,X163,X164,X166,X167,X169,X170,X171,X172,X175,X176,X177,X178,X179,X180,X181,X182,X190,X194,X197,X204,X211,X215,X217,X219,X221,X228,X229,X231,X232,X235,X241,X242,X245,X246,X247,X251,X254,X271,X272,X278,X279,X282,X296,X302,X317,X319,X320,X327,X331,X348,X351,X357,X361,X364,X365,X368,X369,X370,X371,X373,X377,X380,X383,X386,X389,X392,X393,X407,X408,X409,X410,X411,X414,X422,X423,X424,X428,X429,X432,X436,X437,X440,X443,X444,X447,X448,X457,X460,X461,X462,X463,X464,X465,X466,X468,X470,X471,X472,X473,X475,X480,X490,X491,X492,X494,X496,X500,X501,X502,X503,X510,X513,X515,X519,X525,X531,X536,X537,X540,X541,X542,及びX544からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、a配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数は0.9以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.0以上であり、b配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数PIは0.8以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.2以上である。一部の実施形態では、置換は、E2,S6,Y18,L20,S22,D23,T24,D25,E26,S27,I28,E29,Y31,K32,K36,K37,V42,R44,N47,N48,E49,K50,F53,L54,T55,L56,E58,L59,L68,R71,S74,R77,G78,A79,D81,R82,F83,V84,S86,G87,A91,T93,K94,T95,L97,H98,G99,Q109,S115,Q116,E117,A118,S120,K123,Q125,N126,G127,N128,L130,E131,N132,L133,K134,D136,I137,K138,A139,I140,L143,L151,N155,I156,E159,A160,K161,V162,F163,A164,S166,H167,K169,E170,L171,S172,K175,I176,G177,K178,E179,L180,A181,E182,L190,R194,Q197,S204,K211,N215,V217,L219,L221,M228,I229,S231,V232,R235,S241,R242,R245,R246,V247,T251,H254,A271,F272,D278,C279,S282,I296,T302,D317,N319,A320,Y327,C331,K348,G351,Y357,A361,D364,L365,A368,F369,L370,Q371,A373,Y377,S380,T383,D386,G389,W392,K393,A407,V408,V409,Q410,N411,K414,K422,Y423,H424,S428,R429,H432,L436,C437,L440,S444,I447,A448,S457,M460,R461,T462,K463,G464,I465,S466,E468,A470,T471,E472,S473,M475,E480,L490,G492,L494,A496,V500,E501,T502,A503,S510,T513,H515,A519,E525,V531,T536,E537,L540,P541,F542,及びR544からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、E2C又はD又はN又はT又はV、S6N又はT、Y18A又はQ又はR、L20T,S22Q,D23N,T24C,D25T,E26D又はH又はK又はM又はR又はS又はV、S27A又はC又はG又はH又はI又はL又はM又はP又はQ、I28D又はN、E29Q,V30A又はD又はE又はM又はR又はT、Y31N,K32E,K36A又はC又はD又はE又はM又はN又はP又はQ、K37A又はE又はG又はH又はM又はN又はR又はT、V42F又はI、R44N又はQ、N47A又はG又はH又はM又はQ又はT又はW、N48H又はI又はK、E49A又はC、K50A又はD又はE又はF又はH又はS又はY、F53E又はH又はN又はP又はQ又はV、L54M,T55C又はD又はE、L56C又はN、E58N,L59H又はT、L68I,R71K又はM、S74D又はE又はN又はY、R77L,G78A又はD又はF又はL又はM、A79Q又はT、D81A又はF又はG又はM又はR又はS又はT又はV、R82A又はE又はH又はI又はK又はM又はQ又はS、F83W,V84A,S86A又はD又はM、G87D又はP、A91K又はW、T93A又はD又はE又はG又はL又はN又はP又はY、K94A又はD又はE又はH又はI又はL又はM又はN又はR又はS又はT、T95A又はE又はP又はQ又はS又はV又はY、L97F,H98A又はD又はF又はG又はI又はL又はM又はN又はQ、G99E又はF又はM、Q109E,S115A,Q116A又はC又はD又はE又はI又はP、E117C又はF又はL又はM又はV、A118M,S120H又はT又はV、K123L又はT、Q125E又はI又はY、N126A又はC又はD又はM又はT又はV、G127C,N128C又はD又はP又はQ、L130E,E131A又はC又はP又はQ又はS又はV、N132C又はD又はF又はH又はL又はR又はW又はY、L133D,K134E又はM又はQ又はS又はT又はV、D136E,I137E又はH又はN、K138I又はN、A139N,I140M又はW、L143S,L151C又はH又はI、G153C,N155I又はT又はV又はY、I156D又はN又はT、E159M,A160I,K161A又はC又はN又はQ、V162S,F163E又はQ、A164T,S166A又はD又はG、H167A又はE又はG又はK又はM又はR又はS又はT又はW、K169D又はI又はM又はS又はT、E170H又はK又はM又はQ又はT又はV、L171H又はK又はR又はS、S172A又はC、K175S,I176M,G177A又はC、K178A又はF又はR又はS又はT、E179A又はC又はL又はM又はN、L180C又はQ又はT、A181H又はQ又はS又はV、E182S,L190I又はM、R194L,Q197S,S204C,K211A又はN又はQ、N215C又はH、V217I,L219C,L221M,M228F又はY、I229V,S231K又はQ又はT、V232I,R235K,S241A又はM又はT、R242A又はD又はE又はH又はI又はM又はN又はQ又はS又はT、R245I又はL、R246D又はK、V247T,T251A又はG又はK又はR、H254D,A271C又はV、F272D又はG又はP又はW、D278A又はE又はN又はQ又はS又はT又はV又はW、C279A,S282A又はQ、I296V,T302H,D317E又はQ、N319F,A320C,Y327M,C331P,K348R又はY、G351D又はN、Y357M,A361T,D364E又はV、L365C又はM、A368N,F369M又はN又はR又はT又はV、L370G又はQ、Q371C又はS、A373G,Y377W,S380A又はC又はD又はQ又はT又はV、T383S,D386E又はN、G389H又はI、W392I又はS又はT又はV、K393Q,A407G,V408I,V409H又はI、Q410C又はD又はK又はL又はM又はT、N411G,K414E又はG又はL又はN又はP、K422A又はN又はT、Y423Q,H424E又はP又はQ又はV、S428E又はQ、R429I又はL又はT又はW又はY、H432E,L436M又はY、C437K又はT、L440I,S444P,I447A又はE又はM又はQ又はS、A448E又はM又はN又はP又はQ又はV、S457N又はT、M460Q又はR又はS、R461D又はE又はG又はQ又はS又はT、T462Q,K463A又はD又はE、G464L又はR、I465A又はC又はG又はS又はT、S466P,E468D,A470M,T471E又はH又はQ、E472D又はS、S473L又はV、M475T,E480N,L490A又はD又はE又はF又はH又はM、G492C,L494D,A496P又はT、V500L又はM、E501D,T502A又はC又はR又はV、A503I,S510C又はV、T513V,H515N,A519S又はT、E525A又はC又はP又はQ又はS、V531A又はM又はT、T536A又はF又はG、E537K又はT、L540A又はP、P541M,F542P,及びR544Cからなる群から選択される残基の置換である。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X2,X3,X13,X17,X18,X19,X20,X23,X25,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X33,X34,X36,X37,X40,X41,X42,X43,X44,X45,X46,X47,X48,X49,X50,X51,X53,X54,X55,X56,X57,X59,X60,X62,X71,X73,X74,X75,X77,X78,X79,X81,X82,X83,X84,X85,X86,X87,X88,X89,X91,X92,X93,X94,X95,X97,X98,X99,X100,X101,X102,X103,X107,X109,X111,X113,X114,X115,X116,X117,X118,X119,X120,X121,X123,X124,X125,X127,X128,X129,X130,X131,X133,X134,X135,X136,X137,X138,X139,X140,X143,X146,X151,X152,X153,X155,X156,X158,X160,X161,X162,X163,X166,X167,X169,X170,X171,X172,X175,X176,X177,X178,X179,X180,X181,X182,X183,X185,X187,X193,X194,X196,X197,X204,X210,X211,X212,X215,X216,X217,X218,X219,X220,X222,X223,X224,X226,X228,X229,X231,X232,X235,X240,X241,X242,X246,X251,X253,X260,X268,X270,X271,X272,X275,X276,X278,X282,X307,X314,X315,X317,X320,X321,X323,X328,X329,X331,X332,X333,X343,X345,X346,X350,X351,X352,X356,X357,X360,X361,X363,X364,X366,X367,X368,X369,X370,X371,X378,X379,X380,X383,X386,X389,X390,X392,X393,X402,X405,X408,X409,X410,X413,X414,X418,X422,X423,X424,X425,X426,X428,X429,X431,X432,X437,X444,X447,X448,X457,X460,X461,X462,X463,X464,X466,X467,X468,X469,X471,X472,X475,X484,X489,X490,X491,X492,X493,X494,X497,X500,X501,X502,X503,X504,X506,X509,X510,X511,X513,X515,X517,X519,X522,X528,X529,X531,X534,X535,X536,X537,X539,X540,X542,及びX544からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、a配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数PIは0.9以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.0以上であり、あるいはb配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数PIは0.8以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.2以上であり、並びにc配列番号1のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数PIは0.5以上であり、かつ配列番号1のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のPIのうち少なくとも1つは1.5以上である。一部の実施形態では、置換は、E2,A3,S13,D17,Y18,L19,L20,D23,D25,E26,S27,I28,E29,Y31,K32,D33,K34,K36,K37,A40,E41,V42,R43,R44,E45,I46,N47,N48,E49,K50,A51,F53,L54,T55,L56,L57,L59,I60,N62,R71,E73,S74,D75,R77,G78,A79,D81,R82,F83,V84,S85,S86,G87,G88,F89,A91,V92,T93,K94,T95,L97,H98,G99,T100,A101,L102,S103,L107,Q109,G111,E113,V114,S115,Q116,E117,A118,F119,S120,G121,K123,D124,Q125,G127,N128,F129,L130,E131,L133,K134,E135,D136,I137,K138,A139,I140,L143,A146,L151,E152,N155,I156,D158,A160,K161,V162,F163,S166,H167,K169,E170,L171,S172,K175,I176,G177,K178,E179,L180,A181,E182,Q183,N185,A187,H193,R194,T196,Q197,S204,K210,K211,E212,N215,Q216,V217,L218,L219,E220,A222,I223,L224,Y226,M228,I229,S231,V232,R235,T240,S241,R242,R246,T251,L253,L260,V268,V270,A271,F272,Q275,Y276,D278,S282,E307,E314,R315,D317,A320,I321,D323,M328,K329,C331,F332,L333,A343,D345,N346,K350,G351,E352,P356,Y357,K360,A361,A363,D364,C366,N367,A368,F369,L370,Q371,N378,K379,S380,T383,D386,G389,N390,W392,K393,V402,Y405,V408,V409,Q410,K413,K414,E418,K422,Y423,H424,D425,T426,S428,R429,S431,H432,C437,S444,I447,A448,S457,M460,R461,T462,K463,G464,S466,E467,E468,L469,T471,E472,M475,K484,K489,L490,G492,S493,L494,K497,V500,E501,T502,A503,I504,L506,Q509,S510,H511,T513,H515,G517,A519,S522,R528,K529,V531,V534,I535,T536,E537,I539,L540,F542,及びR544からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、E2H又はI又はS、A3E又はG又はK又はN又はQ又はR又はT,S13Q又はT,D17E,Y18F又はM又はN,L19F,L20I又はV,D23T,D25A又はE又はS,E26G又はN又はQ又はT,S27E又はF又はK又はV,I28E又はF又はM又はP,E29D又はP又はR又はT,V30N又はQ,Y31Q又はW,K32D又はG又はN又はR,D33N,K34D又はE又はQ又はS,K36F又はR,K37F又はI,A40C又はD又はE又はF又はM又はN又はP又はQ又はV,E41C又はD又はF又はN又はQ又はS又はV,V42A又はS又はT,R43I又はQ,R44A又はD又はK又はM又はY,E45C又はM又はN又はQ,I46F又はV,N47E又はI又はK又はR又はV,N48A又はC又はE又はF又はL又はQ又はR又はS,E49G又はH又はI又はR又はS又はW,K50C又はG又はM又はN又はP又はR,A51E又はG又はL又はQ又はT,F53D,L54A又はC又はE又はH又はI又はQ,T55A又はH又はN又はQ又はS又はY,L56H又はQ又はR又はS,L57I,L59F又はM又はS又はV又はY,I60C又はV,N62V,R71I,E73D,S74G又はM又はP,D75E,R77A又はN又はT又はV,G78E又はI又はK又はN又はP又はQ又はV又はW,A79M又はR又はY,D81C又はE又はH又はL又はN,R82C又はF又はG又はL又はW,F83G又はH又はI又はL又はV,V84F又はH又はL又はN又はQ又はR又はS又はT又はW又はY,S85C又はL又はN又はR,S86C又はN,G87C又はE又はF又はK又はL又はN又はT,G88C又はD又はI又はV又はW又はY,F89C又はI,A91C又はD又はE又はG又はH又はL又はR又はS又はT又はV又はY,V92A又はC又はE又はF又はG又はI又はL又はQ又はW,T93H又はI又はQ又はV又はW,K94C又はV又はY,T95C又はH又はK又はM,L97A又はM又はP,H98C又はS又はT又はV又はW,G99A又はC又はH又はP又はQ又はT,T100A又はI又はL又はM又はV,A101S,L102M,S103A又はC又はG又はL,L107C又はF,Q109C又はN又はS,G111A,E113C又はH又はV,V114C,S115D又はY,Q116G又はH又はL又はS又はT又はV,E117A又はD又はI,A118I又はV,F119L又はM,S120A又はD又はE又はF又はK又はN又はR又はW又はY,G121D又はL又はV又はW,K123I又はS又はW又はY,D124C又はE,Q125A又はD又はG又はH又はK又はL又はN又はS又はT又はV又はW,G127D又はF又はW,N128A,F129L又はY,L130A又はC又はD又はQ又はV又はY,E131D又はF又はG又はR,L133E又はG又はI又はP又はQ又はT又はV又はY,K134D又はG又はH又はI又はL又はN又はR又はW又はY,E135H又はS,D136N,I137A又はC又はD又はG又はP又はQ又はS又はV,K138C又はD又はE又はP又はR又はS又はV,A139P又はS又はT又はV,I140N又はQ又はS又はT又はV,L143A又はF又はG又はN又はR又はW,A146M,L151E又はG又はM又はN又はQ又はR又はS又はT又はV又はW,E152A又はD又はI又はM又はP,G153D,N155E又はK又はM,I156E又はK又はL又はR又はY,D158E,A160F又はH又はS,K161L又はR又はS又はY,V162D又はF又はN又はP又はT,F163C又はH又はI又はM又はV又はW又はY,S166C又はE又はH又はK又はP又はQ又はV又はW,H167C又はL又はP,K169E又はG又はR,E170G又はI又はN又はR,L171C又はE又はG又はI又はM又はW,S172G又はN又はQ又はR,K175A又はG又はH又はN又はP又はT又はV,I176A又はC又はN又はQ又はV,G177D又はE又はH又はN又はP又はT,K178D又はE又はG又はI又はL又はM又はN又はP又はQ又はV又はY,E179G又はI又はP又はQ又はS又はT又はV又はW又はY,L180F又はH又はV又はW,A181F又はM又はN又はW,E182H又はN,Q183A又はL,N185D,A187C又はS,H193W,R194I,T196V,Q197G,S204A又はF又はM又はW又はY,K210M,K211D又はE又はF又はG又はH又はI又はM又はR又はS又はT又はV,E212A又はD又はM又はP又はQ又はT,N215D又はY,Q216A又はE又はN,V217C又はE又はK又はN又はP又はQ又はT,L218V,L219I又はM又はV,E220D又はN,A222S,I223C,L224A又はC又はT又はV,Y226F,M228H又はR,I229A,S231D又はG又はH又はR又はV,V232Q,R235A又はD又はN,T240V,S241C,R242K又はL,R246H又はQ,T251H,L253M,L260M,V268I,V270I,A271S,F272Q,Q275E,Y276F又はH又はQ,D278L又はM又はR又はY,S282C,E307Q又はR,E314H,R315G又はK,D317S,A320N又はT,I321L又はM,D323I又はT,M328L,K329G又はQ又はR,C331T,F332Y,L333F,A343I又はV,D345Y,N346A,K350H又はW又はY,G351E又はM,E352F又はI又はM又はV,P356M又はS,Y357E,K360Q,A361Q又はS又はV,A363S,D364N又はT,C366A,N367D又はE又はM,A368D又はQ,F369H又はQ,L370A又はD又はE又はF又はH又はN又はR又はS又はT又はV,Q371G又はH又はI又はN又はP又はR又はT又はW又はY,N378D,K379E又はR又はS,S380K又はN,T383Q,D386K又はS,G389C又はM又はP又はR又はT,N390S,W392F又はM,K393H又はR,V402F又はI又はL,Y405F,V408Q又はS,V409C又はQ又はS,Q410E又はG又はH又はI又はR,K413P,K414C又はH又はI又はQ,E418N,K422G又はH又はQ又はR,Y423G,H424D又はG又はI又はS又はT,D425P,T426A又はM又はQ,S428V,R429A又はC又はD又はG又はH又はK又はN,S431G,H432A又はM,C437N,S444N又はQ又はT,I447K又はR,A448H又はS又はT,S457D,M460A又はE又はG、R461N,T462S,K463G又はN,G464A又はD又はE又はF又はH又はV又はY,S466E又はG又はK又はN又はT,E467N,E468A又はN又はP又はQ,L469A又はN,T471N,E472A又はG又はN,M475I,K484A,K489R,L490I又はY,G492T又はV,S493C又はG又はK又はV,L494G又はI又はQ又はV,K497M又はT,V500I又はY,E501N,T502H,A503L又はM,I504L,L506I又はV,Q509A,S510T,H511I又はM,T513S,H515Q,G517P,A519C,S522A又はK,R528K,K529A,V531G又はN,V534A又はS,I535C又はS又はT,T536M,E537H又はN又はQ,I539V,L540E又はQ又はR又はV,F542M,並びにR544G又はN又はP又はQ又はSからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X22,X36,X43,X58,X87,X89,X118,X151,X234,X247,X254,X282,X288,X391,X392,X437,X443,X447,X481,X488,X502,及びX542からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドは、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも30上昇している。一部の実施形態では、置換はS22,K36,R43,E58,G87,F89,A118,L151,Q234,V247,H254,S282,S288,A391,W392,C437,I447,T481,E488,T502及びF542からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、S22K又はR,K36H又はW,R43E,E58F,G87S又はR,F89D,A118E,L151Y,G153P,Q234R,V247I,H254C,S282H又はW,S288A又はT又はY,A391G,W392C、C437L,I447V,T481Y,E488L,T502F及びF542Nからなる群から選択される。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号1と対応する:X30,X134,X143,X156,X159,X172,X414,及びX421,からなる群から選択される残基の1つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも20上昇している。一部の実施形態では、置換は、K134,L143,I156,E159,S172,K414,及びQ421からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はV30K,K134C又はP、L143I,I156G,E159D,S172V,K414F,及びQ421R又はDからなる群から選択される残基の置換である。他の態様では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかのポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞、ラン藻細胞、又はクロストリジウムからなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞はバクテリア細胞である。一部の実施形態では、バクテリア細胞はグラム陽性バクテリア細胞又はグラム陰性バクテリア細胞である。一部の実施形態では、バクテリア細胞は、大腸菌、L.アシドフィラス、P.シトレア、枯草菌、B.リケニフォルミス、B.レンタス、B.ブレービス、B.ステアロサーモフィルス、B.アルカロフィルスBalkalophilus、B.アミロリケファシエンス、B.クラウシイ、B.ハロデュランス、B.メガテリウム、B.コアグランス、B.サークランス、B.ロータス、卒倒病菌、S.アルブス、S.リビダンス、S.コエリカラー、S.グリセウス、シュードモナス属、P.アルカリゲネス、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、及びC.グルタミクムCglutamicumからなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は藻類細胞である。一部の実施形態では、藻類細胞は緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は真菌細胞である。一部の実施形態では、真菌細胞は糸状菌である。一部の実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、酵母細胞は、酵母菌属、シゾサッカロミセス属、ピキア属、又はカンジダ属からなる群から選択される。一部の実施形態では、酵母細胞は出芽酵母細胞である。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性が改良されており、及び/又は宿主細胞に発現させた場合に増殖性が上昇するポリペプチドを同定する方法であって、配列番号1の野生型イソプレン合成酵素の比活性及び配列番号1の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較した場合に、宿主細胞の比活性が改良される及び/又は宿主細胞の増殖性が上昇する、ポリペプチド中の1つ以上の置換について、部位評価ライブラリsiteevaluationlibrary又はコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする工程を含む、方法を提供する。他の態様では、本発明は:X003C,X003D,X003E,X003F,X003G,X003H,X003I,X003K,X003L,X003M,X003N,X003P,X003Q,X003R,X003S,X003T,X003V,X003W,X003Y,X007C,X007D,X007E,X007F,X007G,X007H,X007I,X007K,X007L,X007M,X007N,X007P,X007Q,X007R,X007S,X007T,X007V,X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9T,X509V,X539L,X539T,X539V,X540H,X540I,X540K,X540T,X540V,X540Y,X544S,X544T,X544V,及びX544Wからなる群から選択される置換を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体は:X003T,X016I,X033F,X033H,X033I,X033V,X036I,X044F,X044M,X050H,X050I,X050T,X050W,X053I,X059C,X059E,X059F,X059H,X059I,X059K,X059Q,X059R,X059T,X069S,X069T,X074H,X074I,X074K,X074T,X074V,X074W,X078F,X078H,X078I,X078R,X078T,X078V,X078W,X078Y,X099I,X099K,X099T,X099V,X116F,X116I,X116N,X116P,X116T,X116V,X116W,X117C,X117F,X117I,X117L,X117M,X117W,X125F,X125V,X125W,X127H,X127T,X139T,X165F,X165H,X165K,X165Y,X173F,X173H,X173K,X173R,X173T,X173V,X173W,X174H,X174I,X174T,X179G,X179I,X179S,X216A,X421R,X448R,X448T,X448V,X462H,X462I,X462K,X462V,X462W,X476R,X476V,X487F,X487H,X487T,X487W,X489R,X490F,X490H,X490I,X490V,X490W,X491C,X491H,X491I,X491L,X491T,X491V,X491W,X492A,X492E,X493G,X493I,X493L,X493T,X493V,X493W,X495L,X498C,X540I,X540S,X540T,X540V,及びX544Kからなる群から選択される置換を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体は:X003T,X033H,X033I,X033V,X044F,X050I,X050W,X053I,X059C,X059F,X059H,X059I,X059K,X059R,X069S,X074I,X074K,X074W,X078I,X099I,X099K,X099T,X099V,X116F,X116I,X116T,X116V,X116W,X117F,X117I,X117L,X117W,X139T,X165H,X165Y,X173H,X173T,X173V,X173W,X174H,X174I,X078W,X078Y,X179I,X421R,X448T,X448V,X462H,X462K,X462V,X487T,X489R,X490H,X490I,X490V,X490W,X491I,X491H,X491L,X491T,X491V,X491W,X492A,X492E,X493G,X493I,X493L,X493T,X493V,X493W,X495L,X540I,X540T,X540Vからなる群から選択される置換を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体は:X003F,X003H,X003I,X003K,X003R,X003T,X003Y,X013L,X016I,X016L,X016M,X018C,X018G,X020M,X020S,X020T,X020V,X020Y,X023H,X025H,X025I,X025K,X025L,X025T,X025V,X033F,X033H,X033I,X033K,X033L,X033Q,X033R,X033S,X033T,X033V,X033W,X033Y,X036I,X036L,X036R,X036T,X036V,X036W,X036Y,X044C,X044F,X044H,X044I,X044K,X044T,X044V,X044Y,X050H,X050I,X050L,X050T,X050V,X050W,X050Y,X053G,X053H,X053I,X053K,X053L,X053R,X053S,X053T,X053V,X053W,X053Y,X059A,X059C,X059D,X059E,X059F,X059G,X059H,X059I,X059K,X059M,X059N,X059Q,X059R,X059T,X059V,X059W,X069A,X069H,X069I,X069K,X069L,X069M,X069N,X069Q,X069R,X069S,X069T,X069V,X074H,X074I,X074K,X074L,X074T,X074V,X074W,X074Y,X078F,X078H,X078I,X078K,X078L,X078T,X078V,X078W,X078Y,X087H,X087I,X087K,X087L,X087M,X087R,X087T,X087V,X087W,X087Y,X099F,X099I,X099K,X099L,X099R,X099S,X099T,X099V,X099W,X099Y,X116A,X116F,X116I,X116K,X116L,X116S,X116T,X116V,X116W,X116Y,X117F,X117H,X117I,X117L,X117M,X117W,X120F,X120H,X120I,X120K,X120L,X120T,X120V,X120W,X120Y,X121F,X121H,X121I,X121K,X121L,X121T,X121V,X121W,X121Y,X125H,X125I,X125M,X125T,X125W,X125Y,X127F,X127H,X127I,X127L,X127T,X127V,X127Y,X139C,X139H,X139I,X139P,X139S,X139T,X139V,X165A,X165D,X165F,X165H,X165K,X165L,X165R,X165T,X165Y,X173F,X173G,X173H,X173I,X173K,X173L,X173M,X173R,X173S,X173T,X173V,X173W,X173Y,X174F,X174H,X174I,X174K,X174L,X174R,X174T,X174V,X174W,X174Y,X177A,X177H,X177I,X177K,X177L,X177M,X177P,X177T,X177V,X177Y,X179F,X179G,X179H,X179I,X179K,X179L,X179M,X179S,X179T,X179V,X179W,X179Y,X194H,X197H,X197I,X197M,X197T,X197V,X202F,X202H,X202I,X202K,X202R,X202T,X202Y,X246H,X246K,X246T,X251H,X251K,X251N,X251Y,X254F,X254I,X254K,X254R,X254T,X254V,X254W,X308H,X308I,X308W,X376I,X376Y,X377H,X377I,X377L,X377V,X377W,X379H,X379R,X379T,X379V,X389H,X389I,X389K,X389L,X389M,X389R,X389S,X389T,X389V,X389Y,X403T,X403V,X421E,X421G,X421H,X421I,X421K,X421L,X421R,X421T,X421V,X421W,X426I,X426V,X430S,X430T,X430V,X445H,X448H,X448I,X448R,X448S,X448T,X448V,X457H,X457Q,X457R,X457T,X462F,X462G,X462H,X462I,X462K,X462L,X462S,X462V,X462W,X462Y,X476R,X476T,X476V,X476W,X476Y,X487A,X487C,X487F,X487G,X487H,X487L,X487M,X487R,X487S,X487T,X487V,X487W,X489H,X489I,X489L,X489R,X489T,X489V,X489W,X490F,X490H,X490I,X490M,X490T,X490V,X490W,X491A,X491C,X491F,X491H,X491I,X491K,X491L,X491M,X491N,X491R,X491S,X491T,X491V,X491W,X491Y,X492A,X492C,X492D,X492E,X492H,X492I,X492K,X492L,X492R,X492T,X492V,X492W,X492Y,X493A,X493C,X493E,X493G,X493I,X493K,X493L,X493M,X493R,X493T,X493V,X493W,X493Y,X495A,X495G,X495H,X495I,X495K,X495L,X495M,X495Q,X495R,X495S,X495T,X495V,X495W,X495Y,X496H,X496I,X496K,X496L,X496R,X496T,X496V,X496Y,X497H,X497I,X497L,X497T,X497V,X498F,X498G,X498H,X498I,X498K,X498L,X498R,X498S,X498T,X498V,X498Y,X509I,X509M,X509S,X509T,X509V,X539K,X539L,X539T,X539V,X540E,X540F,X540G,X540H,X540I,X540K,X540M,X540Q,X540R,X540S,X540T,X540V,X540W,X540Y,X544C,X544H,X544I,X544K,X544L,X544S,X544T,X544V,及びX544Wからなる群から選択される置換を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体は:X003T,X013L,X117I,X165Y,X421R,X495L,X509T,及びX540Vからなる群から選択される置換を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体はX003Tを含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体はX495Lを含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体はX509Tを含む。本明細書の任意の実施形態では、表面の疎水性アミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、対照的に接触するアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、保存的なアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、N端末ループのアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、表面の親水性アミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、表面ループのアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、活性部位のアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、可動ループのアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、疎水性ポケットのアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、C末端のアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、アミノ酸残基509はβ炭素が分岐している。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、N端末にトランケーションを有する。本明細書の任意の実施形態では、N端末のトランケーション部位は、図21A~21Bに示すものと一致するアミノ酸残基を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、植物イソプレン合成酵素の変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、ポプラ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、ウラジロハコヤナギ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、アメリカヤマナラシ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、P.トリコカルパP.trichocharpa変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、セイヨウハコヤナギ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、ウラジロハコヤナギv.アメリカヤマナラシ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、クズ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、アスペン変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、ヨーロッパナラ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、ヤナギ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素と少なくとも40配列相同性であるアミノ酸配列を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素と少なくとも60配列相同性であるアミノ酸配列を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素と少なくとも80配列相同性であるアミノ酸配列を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素と少なくとも90配列相同性であるアミノ酸配列を含む。本明細書の任意の実施形態では、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、少なくとも約0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、又は1.4の増殖指数を有する。他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、少なくとも約0.8、0.9、1.0、又は1.1の増殖指数を有する。他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、次の特性:比生産性が少なくとも約105である、収率が少なくとも約105である、及び細胞性能指数が少なくとも約105である、を1つ以上有する。他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、次の特性:比生産性が少なくとも約110である、収率が少なくとも約110である、及び細胞性能指数が少なくとも約110である、を1つ以上有する。他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、次の特性:比生産性が少なくとも約120である、収率が少なくとも約120である、及び細胞性能指数が少なくとも約120である、を1つ以上有する。他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、次の特性:比生産性が少なくとも約150である、収率が少なくとも約150である、及び細胞性能指数が少なくとも約150である、を1つ以上有する。他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、次の特性:比生産性が少なくとも約200である、収率が少なくとも約200である、及び細胞性能指数が少なくとも約200である、を1つ以上有する。他の態様では、本発明は、置換X491Sを含み、本明細書の実施例のいずれかに関する、イソプレン合成酵素変異体を提供する。他の態様では、本発明は、本明細書の実施例のいずれかに関する、イソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで変異体は、表Dに記載のものからなる群から選択された置換は含まない。他の態様では、本発明は、本明細書の実施例のいずれかに関する、イソプレン合成酵素変異体を提供、ここでこの変異体は、表E及び表Fには記載されていない。他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体及びキャリアを含む、組成物を提供する。他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体を容器に入れて含む、キットを提供する。他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸を提供する。他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸及びキャリアを含む組成物を提供する。他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸を容器に入れて含むキットを提供する。他の態様では、本発明は、操作可能にプロモーターと組み合わせた、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞を提供する。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、プラスミド内に収容される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、宿主細胞の染色体に組み込まれる。他の実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性バクテリア細胞、グラム陰性バクテリア細胞、糸状菌細胞、又は酵母細胞からなる群から選択される。他の実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性バクテリア細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、エシェリキア属大腸菌、パントエア属PanteoaspP.シトレア、バチルス属枯草菌、ヤロウイア属Y.リポリィティカ、及びトリコデルマ属T.リーゼイT.reeseiからなる群から選択される。他の実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、スクロース、及び油からなる群から選択される炭素源を含む培地で培養する。本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、グルコースを含む培地で培養する。本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、所望により生得的DXP経路と組み合わせて、IDIポリペプチドをコードしている異種又は生得的核酸並びに/あるいはDXSポリペプチドをコードしている異種又は生得的核酸を更に含む。本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、イソプレン合成酵素変異体、IDIポリペプチド、及びDXSポリペプチドをコードする1種のベクターを含む。本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセスセレビシエ及び、エンテロコッカスフェカリス由来のMVA経路関連性ポリペプチドからなる群から選択される、MVA経路関連性ポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、MVA経路関連性ポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードしている核酸を更に1つ以上含み、この場合ベクターは、イソプレン合成酵素変異体、MVA経路関連性ポリペプチド、及びDXSポリペプチドをコードしている。本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、DXSポリペプチド、IDIポリペプチド、DXP経路に関係するその他の1つ以上のポリペプチド、及び/又はMVA経路に関係するポリペプチド、をコードしている核酸を更に1つ以上含む。他の態様では、本発明は、イソプレン生産能をもつ宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を、宿主細胞に導入する工程を含む。他の態様では、本発明は、イソプレンを生産させる方法を提供し、方法は:a本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、イソプレンの生産に好適な条件下で培養する工程、並びにbイソプレンを生産させる工程を含む。一実施形態では、方法は、cイソプレンを回収する工程、を更に含む。他の態様では、本発明は、イソプレンを生産させる方法を提供し、方法は:ai宿主細胞;及びii本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体を操作可能にプロモーターと組み合わせてコードしている核酸;を用意する工程、bこの核酸を宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させる工程、並びにc形質転換させた宿主細胞をイソプレンの生産に好適な条件下で培養する工程、を含む。一実施形態では、方法は更に、dイソプレンを回収する工程、を含む。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素変異体を生産させる方法を提供し、方法は:ai宿主細胞;及びii本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体を操作可能にプロモーターと組み合わせてコードしている核酸;を用意する工程、bこの核酸を宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させる工程、並びにc形質転換させた宿主細胞をイソプレン合成酵素変異体の生産に好適な条件下で培養する工程、を含む。一実施形態では、方法は、イソプレン合成酵素変異体を単離する工程を更に含む。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素変異体をスクリーニングする方法を提供し、方法は、a宿主細胞を、約10μM~約70μMのIPTGと、約5mM~約20mMのメバロン酸MVAと、を含む培地と接触させる工程であって、ここで宿主細胞は、イソプレン合成酵素変異体を操作可能にプロモーターと組み合わせてコードしている核酸を含む、工程、並びにb宿主細胞の増殖速度を測定する工程を含み、ここで増殖速度が増加した場合、イソプレン合成酵素変異体が、宿主細胞においてDMAPPをイソプレンに変換する能力が向上していることが示される。一実施形態では、IPTGが約10μM~約60μMの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、IPTGが約20μM~約60μMの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、IPTGが約40μM~約60μMの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、IPTGが約50μMの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、MVAが約5mM~約20mMの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、MVAが約7mM~約15mMの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、MVAが約8mM~約12mMの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、MVAが約10mMの濃度で培地に含まれる。一実施形態では、宿主細胞はMD09-170である。イソプレン合成酵素変異体を操作可能にプロモーターと組み合わせてコードしているポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供される。宿主細胞の溶解液も提供し、この溶解液にはリゾチームが更に含まれる。一部の実施形態では、溶解液のpHが中性pH6.5~7.5であるのに対し、他の実施形態では、溶解液のpHは塩基性pH7.5~9.5である。本発明は、イソプレン合成酵素活性を検出する方法を更に提供し、方法は:a発現ベクターを含む宿主細胞を、イソプレン合成酵素変異体を生産させるのに好適な条件下で培養する工程、bリゾチームを含む溶解緩衝液で宿主細胞を溶解させて、細胞溶解液を生成する工程、並びにcジメチルアリールジホスフェートDMAPPから生成されるイソプレンを測定することにより、細胞溶解液に含まれるイソプレン合成酵素活性を検出する工程、を含む。本発明は、イソプレン合成酵素変異体を少なくとも1つ含む、方法及び組成物を提供する。この変異体は、親イソプレン合成酵素ポリペプチドとは異なるアミノ酸残基置換を一箇所以上に含み、この場合の親イソプレン合成酵素は、野生型の配列であってもあるいは野生型の配列でなくてよい。本発明は、ポリペプチド内の特定の位置でのアミノ酸残基の置換を提供し、この置換により、少なくとも1つの特性を、親配列又は参照配列よりも改良することができる。一部の特に好ましい実施形態では、改良される少なくとも一つの特性は、限定するものではないが次のものからなるから選択される:比生産性、収率、並びに細胞性能インデックス。特に、本発明は、宿主細胞においてイソプレン生産を増加させる、変異型の植物イソプレン合成酵素を提供する。生物生産により製造される本発明のイソプレンは、ゴム、ポリマー、及びエラストマーを製造する際の使用が見出される。本発明の実施には、別途記載のない限り、当該技術分野の範囲内のものである、タンパク質化学、分子生物学組み換え法など、微生物学、細胞生物学、生物化学、核酸化学、及び酵素学に関係する従来法が、採用され得る。このような技術は、MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版Sambrooketal.,1989並びにMolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版Sambrook及びRussel,2001本明細書では、合わせて、並びに個々にSambrookと参照する、OligonucleotideSynthesisM.J.Gait,ed.,1984;AnimalCellCultureR.I.Freshney,ed.,1987;HandbookofExperimentalImmunologyD.M.WeirC.C.Blackwell,eds.;GeneTransferVectorsforMammalianCellsJ.M.MillerM.P.Calos,eds.,1987;CurrentProtocolsinMolecularBiologyF.M.Ausubeletal.,eds.,1987,2001までの補足を含む;PCR:ThePolymeraseChainReaction,Mullisetal.,eds.,1994;CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistryJohnWileySons,Inc.,NewYork,2000;並びにAgrawal,ed.,ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs,SynthesisandPropertiesHumanaPressInc.,NewJersey,1993などの文献中に十分に説明されている。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。更に、本開示で提供される表題は本発明の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものである。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。それでもなお、本発明に対する理解を容易にさせる目的で、数多くの用語を以下に定義する。用語の定義本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本明細書において述べられるものと同様又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施において使用することができるが、好ましい方法及び材料については本明細書に述べる。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。Xは、任意のアミノ酸残基を指す。しかしながら、アミノ酸置換例えば、X003Cの文脈において、Xは、置換により生じるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を意味する例えば、Xは、C以外のアミノ酸残基であると理解される。一部の実施形態では、残基の位置の前の付加的な0は記載されず、したがって、例えば、残基位置3を参照する際、X003は、X3として記載される場合もある。イソプレンは、2-メチル-1,3-ブタジエンCAS78-79-5を指す。3,3-ジメチルアリールピロリン酸DMAPPからピロリン酸を除去することで得られる、直接的にかつ最終的に揮発性のC5炭化水素生成物であり得る。1つ以上のイソペンテニルジホスフェートIPP分子の1つ以上のDMAPP分子への結合又は重合は包含されない。イソプレンは、製造方法により限定されない。本明細書で使用するとき、用語イソプレン合成酵素、イソプレン合成酵素変異体及びIspSは、ジメチルアリール二リン酸DMAPPからピロリン酸を除去してイソプレンを生成する反応を触媒する酵素を指す。イソプレン合成酵素は、野生型配列であっても、あるいはイソプレン合成酵素変異体配列であってもよい。イソプレン合成酵素変異体としては、イソプレン合成酵素活性を有する非野生型ポリペプチドが挙げられる。当業者は、既知の手法によりイソプレン合成酵素活性を測定することができる。例えば、GC-MS例えば、国際公開第2009/132220号,実施例3を参照されたい又はSilveretal.,J.Biol.Chem.270:13010~13016,1995を参照されたい。変異体は、野生型イソプレン合成酵素の配列に、置換、付加、欠失、及び/又はトランケーションが生じたものであってよい。変異体は、非野生型イソプレン合成酵素の配列に、置換、付加、欠失、及び/又はトランケーションが生じたものであってよい。本開示に記載の変異体は、親イソプレン合成酵素ポリペプチドと異なるアミノ酸残基置換を少なくとも1つ含有し得る。一部の実施形態では、親イソプレン合成酵素ポリペプチドは野生型配列である。一部の実施形態では、親イソプレン合成酵素ポリペプチドは非野生型配列である。各種実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素の活性と比較して少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約100、少なくとも約110、少なくとも約120、少なくとも約130、少なくとも約140、少なくとも約150、少なくとも約160、少なくとも約170、少なくとも約180、少なくとも約190、少なくとも約200の活性を有し得る。各種実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素の配列に対し、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約91、少なくとも約92、少なくとも約93、少なくとも約94、少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、少なくとも約99配列相同性であり得る。各種実施形態では、変異体及び野生体間では1つ以上のアミノ酸残基が異なっていてよく、例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40又は50以上のアミノ酸残基が異なっていてよい。野生型イソプレン合成酵素としては、植物由来の任意のイソプレン合成酵素を挙げることができ、例えば、クズイソプレン合成酵素、ポプライソプレン合成酵素、ヨーロッパナライソプレン合成酵素、及びヤナギイソプレン合成酵素が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、天然に生じるは、天然に見られる例えば、組み換え法又は化学的方法により操作されていない任意の対象例えば、タンパク質、アミノ酸又は核酸配列を指す。本明細書で使用するとき、用語非天然に生じるは、天然には見られない任意の対象例えば、組み換えにより生成されたタンパク質又は化学合成されたタンパク質、アミノ酸、又は研究施設で作成された核酸配列を指す。対象とするアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基が、参照アミノ酸配列のアミノ酸残基と対応する又は対応している又は対応したとは、対象とする配列に含まれるアミノ酸残基が、参照アミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置と相同である位置又は等しい位置に配置されていることを示す。当業者は、ポリペプチド中の特定のアミノ酸残基の位置が、相同な参照配列の位置に対応するかどうかを判定することができる。例えば、イソプレン合成酵素ポリペプチドの配列を、既知の手法例えば、塩基の位置を整列し検索するツールであるBLAST、ClustalW2、又は構造に基づき配列を整列するプログラムであるSTRAPなどにより参照配列例えば、配列番号1図20と整列させることもできる。加えて、相同なポリペプチド残基の三次元構造を決定する際の補助として、参照配列の結晶構造座標を使用することもできる例えば、PCT出願/米国特許出願公開第2010/032134号国際公開第2010/124146号を参照されたい。他の態様では、立体構造レベルでの相同性を決定することで等価な残基を同定することもできる。このような手法を用いる場合、イソプレン合成酵素ポリペプチド又はイソプレン合成酵素変異体のアミノ酸残基は、対応する参照配列のアミノ酸残基の位置番号に従い、番号付けすることもできる。例えば、対象とするイソプレン合成酵素変異体の、各アミノ酸残基の位置番号を決定するために、配列番号1のアミノ酸配列図20を使用することもできる。2つの核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語同一は、以下の配列比較又は解析アルゴリズムのうちの1つを用いて評価する際に、最も一致するようにアライメントしたときに、2つの配列中の残基が同じのものであることを指す。本明細書で使用するとき、相同性は、配列類似性又は同一性を指し、同一性が好ましい。相同性は、当該技術分野で既知の標準法により決定することもできる例えば、SmithandWaterman,Adv.Appl.Math.2:482[1981];NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443[1970\;PearsonandLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444[1988];WisconsinGeneticsのソフトウェアパッケージに含まれるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTAなどのソフトウェアプログラムGeneticsComputerGroup,Madison,WI;並びにDevereuxetal.,Nucl.AcidRes.12:387~395[1984]を参照されたい。有用なアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、ペアワイズアラインメントのプログレッシブ法を用いて、一群の関連する配列から複数の配列のアラインメントを行う。PILEUPは、アラインメントを行うのに使用されるクラスタリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。PILEUPは、Feng及びDoolittleのプログレッシブアラインメントを単純化させて用いるFeng及びDoolittle、J.Mol.Evol.35:351~360[1987]を参照されたい。この方法は、Higgins及びSharpにより説明されるものと同様であるHiggins及びSharp、CABIOS5:151~153[1989]を参照されたい。有用なPILEUPパラメーターとしては、3.00のデフォルトギャップ重みづけdefaultgapweight、0.10のデフォルトギャップ伸長重みづけdefaultgaplengthweight及び重みつき末端ギャップweightedendgapsが挙げられる。Altschuletal.により報告されているBLASTアルゴリズムもその他の有用なアルゴリズムの例であるAltschuletal.,J.Mol.Biol.215:403~410[1990];並びにKarlinandAltschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873~5787[1993]を参照されたい。特に有用なBLASTプログラムはWU-BLAST-2プログラムであるAltschulら、Meth.Enzymol.266:460~480[1996]を参照されたい。WU-BLAST-2は、複数の検索パラメーターを使用し、これらのうちのほとんどはデフォルト値に設定される。調製可能なパラメーターは以下の値に設定される:overlapspan=1、overlapfraction=0.125、wordthresholdT=11。HSPS及びHSPS2パラメーターは、動的な値であり、検索対象となる配列に対し、特定のデータベースの特定の配列及び組成物の組成に基づきプログラム自体によって制定される。しかしながら、これらの値は、感受性を上昇させるように調整することができる。参照配列と対象とする試験配列との配列相同性は、当業者により容易に判定することができる。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列により共有される相同性は、配列をアライメントし、当該技術分野において既知の方法により同一性を判定することによって分子間での配列情報を直接比較することにより、判定される。配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムの一例は、BLASTアルゴリズムであるAltschulら、J.Mol.Biol.,215:403~410[1990]を参照されたい。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センターNationalCenterforBiotechnologyInformationより公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントを行ったときに一致するか又はある程度ポジティブであると評価されたpositivevalued閾値スコアTを満たすかのいずれかである問い合わせ配列中の長さWの短いワードを同定することにより、高スコアの配列ペアHSPを同定する。これらの最初にヒットした隣接ワードは、これらを含有するより長いHSPを見つけるための開始点として機能する。ワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り比較されている2つの配列の各々に沿って両方向に拡張される。ワードのヒットの拡張は、次の場合に止まる:累積アラインメントスコアが最大達成値から量Xだけ減少する、累積スコアがゼロ以下になる、又は、いずれかの配列の末端に到達する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXは、感受性及びアラインメントの速度を決定する。BLASTプログラムは、ワード長W:11、BLOSUM62スコアリングマトリックスHenikoffandHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915[1992]を参照されたいアラインメントB:50、期待値E:10、M’5、N’-4、並びに両鎖の比較をデフォルトとする。次に、BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計分析を行う例えば、上記KarlinandAltschulを参照されたい。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の一つの尺度は、最小和確率smallestsumprobabilityPNであり、これは、2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然により生じ得る確率の指標を提供する。例えば、試験核酸をイソプレン合成酵素の核酸と比較した際の最小和確率が、約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、及び最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸は本発明のイソプレン合成酵素の核酸と類似していると考えられる。イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている試験核酸は、最小和確率の比較結果が約0.5未満、及びより好ましくは約0.2未満である場合に、イソプレン合成酵素に関係している特定の核酸と類似していると考えられる。2つ以上の核酸又はポリペプチド配列についての文脈において、相同性percentidentical又はpercentidentityは、2つ以上の配列を最も一致するように比較及びアライメントし、配列比較アルゴリズムを用いて又は目視検査を用いて判定したときに、2つ以上の配列が、同一であるか、あるいは核酸残基又はアミノ酸残基と、表記される割合で相同であることを指すものである。参照アミノ酸配列に対する、対象とするアミノ酸配列の、配列相同性又は相同又は配列相同性又はアミノ酸配列相同性は、対象とするアミノ酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたって参照アミノ酸配列に対して表記される割合すなわち、アミノ酸とアミノ酸を並べたときの一致度だけ相同であることを意味する。したがって、2つのアミノ酸配列に対する、アミノ酸配列80相同性又は80相同性は、最適にアライメントした2つのアミノ酸配列中のアミノ酸残基のうち80が相同であることを意味する。参照核酸配列に対する、対象とする核酸配列の、配列相同性又は相同性又は配列相同性は、対象とする核酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたって参照配列に対して表記される割合すなわち、ヌクレオチドとヌクレオチドを並べたときの一致度だけ相同であることを意味する。したがって、2つの核酸配列に関しヌクレオチド配列の相同性が80であるか又は相同性が80であるとは、最適にアライメントした2つの核酸配列中のヌクレオチド残基のうち80が相同であることを意味する。一態様では、参照配列に対する対象とする配列の配列相同性又は配列相同性、又は相同性は、2つの配列を最適にアライメントし、比較長さにわたって、2つの最適にアライメントした配列を比較することで、算出することができる。最適なアライメントにおいて両方の配列の残基が一致している位置の数は、一致する位置の数を求めて一致する位置の数を比較長さ別途記載のない限り、参照配列の長さであるのうちの位置の合計数で除することで決定される。得られる数に100を乗じることで、参照配列に対する対象とする配列の配列相同性を算出する。最適アラインメント又は最適アラインメントを行ったは、最高の相同性スコアを与える2つ以上の配列のアラインメントを指す。例えば、2つのポリペプチド配列の最適アラインメントは、各配列中の同一のアミノ酸残基の最大数が共にアラインメントされているように手動で配列のアラインメントを行うことにより、あるいは、本開示に記載の又は当該技術分野において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を用いることにより、達成することができる。2つの核酸配列の最適アラインメントは、アラインメントされた各配列中で相同であるヌクレオチド残基が最大数になるように手動で配列のアラインメントを行うことにより、あるいは、本開示に記載の又は当該技術分野において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を用いることにより、達成することができる。既定のアミノ酸置換マトリックス、ギャップ存在ペナルティギャップオープンペナルティとも呼ばれる及びギャップ伸張ペナルティなどの既定パラメーターを用い、2つの配列例えば、ポリペプチド配列がこのペアの配列について類似性スコアが最も高くなるようアラインメントされた場合、最適アラインメントが行われたとみなされ得る。BLOSUM62スコアリングマトリックス上記Henikoff及びHenikoffを参照されたいは、多くの場合、ポリペプチド配列アラインメントアルゴリズム例えば、BLASTPにおいてデフォルトのスコアリング置換マトリックスとして使用される。ギャップ存在ペナルティはアラインメントされた配列の1つにアミノ酸ギャップが1つ導入された際に課せられ、ギャップ伸張ペナルティはギャップ中の各残基位置に対して課される。用いられる代表的なアラインメントは以下のものである:BLOSUM62スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ=11、及びギャップ伸張ペナルティ=1。アラインメントスコアは、アラインメントが開始及び終了する各配列のアミノ酸位置により例えば、アラインメントウィンドウ、並びに、場合によっては可能な限り最高の類似性スコアを達成するように一方若しくは両方の配列の中に1つ若しくは複数のギャップを挿入することにより、決定される。2つ以上の配列間の最適アラインメントは、目視点検により手動で、あるいは、コンピュータ例えば、アミノ酸配列に対するBLASTPプログラム及び核酸に対するBLASTNプログラム例えば、Altschulら、NucleicAcidsRes.2517:3389~34021997を参照されたい。米国国立生物工学情報センターNCBIのウェブサイトも参照されたい。又はCLUSTALWプログラムが挙げられるがこれらに限定されないを使用することにより、判定することができる。対象とするポリペプチドは、対象とするポリペプチドが、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約91、少なくとも約92、少なくとも約93、少なくとも約94、少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、少なくとも約99、又は少なくとも約99.5配列相同性であるアミノ酸配列を含む場合、参照ポリペプチドと実質的に同一である。2つのこのようなポリペプチド間の相同性は、最適にアラインメントされた2つのポリペプチド配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム例えば、BLAST,ALIGN,CLUSTALを使用することで、手入力で判定することができる。2つのポリペプチドが実質的に同一であることの1つの指標としては、第1ポリペプチドが、第2ポリペプチドと免疫的に交差反応性であることが挙げられる。通常、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性である。したがって、ポリペプチドは、例えば、2つのペプチドが1つの保存的アミノ酸置換又は1つ以上の保存的アミノ酸置換のみで異なる場合、第二ポリペプチドに対して実質的に同一である。対象とする核酸は、対象とする核酸が、参照核酸のヌクレオチド配列と少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約91、少なくとも約92、少なくとも約93、少なくとも約94、少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、少なくとも約99、又は少なくとも約99.5配列相同性であるヌクレオチド配列を含む場合、参照核酸と実質的に同一である。2つのこのような核酸間の相同性は、最適にアラインメントされた2つの核酸配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム例えば、BLAST、ALIGN、CLUSTALを使用することで、手入力で判定することができる。厳密な条件下例えば、中程度に厳密~非常に厳密という範囲で、2つの核酸分子が互いにハイブリッド形成することは、核酸配列が実質的に同一であることの1つの指標になる。核酸は、単鎖又は二本鎖のいずれかの形態をとっている2以上のデオキシリボヌクレオチド及び/又はリボヌクレオチドを指す。本明細書で定義される通りの核酸には、単一ヌクレオチド変異などの変異が生じ得ることは理解されるであろう。組み換え核酸は、対象とする核酸が、1つ以上の核酸、すなわち、対象とする核酸の由来する生物において天然に生じるゲノムに含まれ、対象とする核酸に隣接する、1つ以上の核酸例えば、遺伝子、を含まないことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、嫌気性微生物のゲノムDNAに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子例えば、cDNA、ゲノムDNA断片、又はPCRにより生産された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により生産されたcDNA断片として存在する、組み換えDNAが包含される。組み換え核酸は、当該技術分野において既知である分子生物学的手法により得ることができ、あるいは、組み換え核酸の一部又は全長を化学合成することもできる。異種核酸は、宿主細胞以外の他の種、又は宿主細胞と同種の他の株に由来している核酸配列であり得る。一部の実施形態では、配列は、同様の宿主細胞において天然に見られる他の核酸と同一ではない。一部の実施形態では、異種核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。内在性の核酸は、宿主細胞においてその核酸配列が天然に見られる核酸である。一部の実施形態では、内在性の核酸は、宿主細胞において天然に見られる野生型核酸と同一である。一部の実施形態では、内在性の核酸の1つ以上のコピーを宿主細胞に組み込む。本発明の核酸又はタンパク質は、単離又は精製形態であってよい。本明細書で使用するとき、核酸又はタンパク質に対して単離とは、これらが、限定するものではないが、細胞又は細胞培養物などの他の成分から分離されていることを意味する。均一な状態が好ましいものの、乾燥形態又は水溶液形態のいずれかであってもよい。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて判定される。調製液中に存在する主要なタンパク質又は核酸が実質的に精製される。用語精製は、核酸又はタンパク質が、電気泳動ゲル中で基本的に1本のバンドとして検出されることを意味する。具体的には、精製されたは、単離した際に、単離物が、単離物の少なくとも90重量、少なくとも95重量、少なくとも98重量、又はより好ましくは少なくとも99重量の核酸又はタンパク質を含有することを意味する。精製ポリペプチドは、例えば、研究室での合成、クロマトグラフィー、分取用電気泳動、ゲル電気泳動、遠心分離、沈殿、親和的精製などの数多くの手法により得ることができる一般的に、RScopes,ProteinPurification,Springer-Verlag,N.Y.1982,Deutscher,MethodsinEnzymologyVol.182:GuidetoProteinPurification,AcademicPress,Inc.N.Y.1990を参照されたい。ポリペプチドには、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが内含される。遺伝子暗号の縮重に起因し、ポリペプチドは1種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。異種ポリペプチドは、異種核酸によりコードされているポリペプチドである。一部の実施形態では、配列は、同様の宿主細胞において天然に見られる核酸によりコードされる他のポリペプチドと同一ではない。異種タンパク質の例としては、イソプレン合成酵素などの酵素が挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質をコードしている遺伝子が天然に生じる遺伝子であるのに対し、他の実施形態では、変異の生じている及び/又は合成遺伝子が使用される。内在性ポリペプチドは、宿主細胞においてそのアミノ酸配列が天然に見られるポリペプチドである。一部の実施形態では、内在性ポリペプチドは、宿主細胞において天然に見られる野生型ポリペプチドと同一である。本明細書で使用するとき、用語テルペノイド又はイソプレノイドは、テルペンと類似する、天然に生じる幅広く多様な部類の有機化合物を指す。テルペノイドは、炭素数5のイソプレン単位を組み合わせ、かつ様々な方法で修飾することで誘導されるものであり、構成員として使用されるイソプレン単位の数に基づいて分類される。ヘミテルペノイドは、イソプレン単位を1つ有する。モノテルペノイドは、イソプレン単位を2つ有する。セスキテルペノイドは、イソプレン単位を3つ有する。ジテルペノイドは、イソプレン単位を4つ有する。セステルテルペノイドは、イソプレン単位を5つ有する。トリテルペノイドは、イソプレン単位を6つ有する。テトラテルペノイドは、イソプレン単位を8つ有する。ポリテルペノイドは、イソプレン単位を8つ超有する。本明細書で使用するとき、用語ヘッドスペースは、密閉容器内で固体又は液体試料上にトラップされた蒸気/空気混合物を指す。本明細書で使用するとき、単数形a、an、及びtheには、文脈に明示されない限り、対象物が複数ある場合をも包含する。別途記載のない限り、それぞれ、核酸は左から右に5’→3’の向きで記述され、アミノ酸は左から右にアミノ末端→カルボキシ末端の向きで記述される。本明細書を通じて与えられるあらゆる最大数の限定は、あらゆるより小さい数値の限定を、あたかもそのようなより小さい数値の限定が明確に書かれているかのように包含するものと理解されることが意図される。本明細書の全体を通じて与えられるすべての最小の数値的限定には、これよりも大きいすべての数値的限定が、あたかもこうしたより大きい数値的限定が本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。本明細書の全体を通じて与えられるすべての数値的範囲には、これよりも狭い数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値的範囲がすべて本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。本開示において、実施形態に包含される及び説明する約aboutを付した値又はパラメーターについては、約を付したその値又はパラメーター自体を目的とする。本開示に記載される本発明のすべての態様及び実施形態は、態様及び実施形態を含むcomprising、態様及び実施形態からなるconsisting、及び態様及び実施形態から本質的になるconsistingessentiallyofを含むことが理解される。記載の要素から本質的になる方法又は組成物には、特定の工程又は材料のみが含まれ、かつこれらの工程又は材料は、方法及び組成物の基本特性及び新規特性に実質的に影響しないことは理解されるであろう。本発明は記載される特定の方法論、プロトコール、及び試薬に制限されるものではなく、これらは当業者により使用される文脈に応じて変動し得ることが理解されるであろう。発明の詳細な説明ポリイソプレン及び多様なコポリマーイソブチレン、ブタジエン、スチレン、又は他のモノマーの製造にイソプレンモノマーを使用する。採算の合うレベルのイソプレンを生産し得る株原核生物又は真核生物の株を樹立するには、DXP又はMVA経路の一部又は全体、あるいはMVA及びDXP経路の両方を最適化する必要がある。この経路において鍵となる酵素はイソプレン合成酵素IspSであり、この酵素は前駆体であるDMAPPをイソプレンに変換する。これまでに同定されているイソプレン合成酵素IspSとしては、ポプラ、ヨーロッパナラ及びクズなどの植物由来のものが挙げられる。同定されている植物IspS酵素の一部は、これまでに、大腸菌で発現させることで、ある程度特性評価されており、これらの酵素の動態パラメーターは、精製タンパク質をもとにinvitroで決定されている。しかしながら、生得的IspS酵素の動的パラメーターKm、速度定数などは、イソプレンを宿主生物で商業的に生産するには不十分なものである。したがって、解決すべき課題のうち1つとしては、より多量のイソプレンを生物学的に製造することができるよう特性が改良されたイソプレン合成酵素変異体例えば、特定の残基が置換されている変異体の供給が挙げられる。本明細書に記載されるような課題を解決するにあたり、イソプレン合成酵素を宿主で発現させることができる例えば、宿主微生物。更に、イソプレン合成酵素変異体は、対象とする特性に変化が生じるよう設計される。IspS変異体の特性評価は、好適な任意の手法又は試験によりなされ、好ましくは対象とする特性の評価に基づくものである。これらの変異体は、宿主微生物におけるイソプレンの商業的生産に有用である。対象とする特性としては、限定するものではないが、細胞内活性の上昇、IspSを発現している細胞の比生産性の上昇g/L/OD/時間以降により詳述する、収率g/gグルコース例えば、下記等式2、及び細胞性能指数イソプレン重量グラム/乾燥細胞重量グラムが挙げられる。理論に束縛されるものではないが、これらの特性は、IspSに関係する次の特性:細胞生存能の増加例えば、宿主細胞に対する基質例えば、DMAPP毒性の除去による、あるいはイソプレン合成酵素の毒性を軽減させることによる、宿主細胞のより良好な増殖、kcatの増加、Kmの減少、比活性の上昇、溶解度の上昇、不溶性の低下、リボソーム結合性の上昇、翻訳開始速度の増加、翻訳伸長速度の増加、転写開始速度の増加、転写伸長速度の増加、DNAの2次構造の減少、RNAの2次構造の減少、DNAの2次構造の増加、RNAの2次構造の増加、折りたたみ速度の増加、細胞内のシャペロンに対する親和性の上昇、安定性の増加、タンパク質の代謝回転の減少、細胞内プロテアーゼに対する暴露の減少、細胞内プロテアーゼに対する親和性の減少、周辺質への局在性の減少、細胞質への局在性の増加、封入体形成の減少、膜局在の減少、より望ましいコドンによる発現増加、DNA安定性の増加、RNA安定性の増加、並びにRNA分解の減少、のいずれかにより、あるいはこれらを組み合わせることにより得ることができる。簡潔には、IspS変異体をコードしている、又はこの変異体を発現している核酸配列DNA及びRNAの特性に、あるいはIspS酵素自体のもつ生化学的特性に好ましく作用する任意の変異により、細胞内部の活性をより向上させることができる。対象とする他の特性としては、至適pH、温度安定性例えば、Tm値、並びに基質阻害又は生成物阻害などを引き起こす可能性のあるインヒビターに対する感受性などが挙げられる。酸化安定性及びタンパク質分解安定性も対象とする。更に、金属イオンの作用及び金属イオンのイオン強度による活性化又は阻害も対象とする。DXP経路、MVA経路、又はこれらの両方の経路を発現している大腸菌などの、宿主生物に関する文脈において、これらの特性及びパラメーターは、invitroでの、精製イソプレン合成酵素又はある程度精製したイソプレン合成酵素によるDMAPPのイソプレンへの変換をもとに評価することができる。多様な宿主においてイソプレンを生産させることを目的とした本発明において、1種以上の試験条件下で様々な程度の安定性、溶解度、活性、及び/又は発現レベルを示す酵素を使用することが見出されるものと企図される。本発明は、イソプレンの生産量が増大する組成物及び方法を特徴とする。特に、これらの組成物及び方法は、イソプレンの生成速度を増加させ、かつ生成されるイソプレンの総量を増加させる。天然ゴムを用いる代わりに、本開示に記載のイソプレン生産に関する生合成工程を用いることは望ましい。以降に詳細に記載する通り、細胞のイソプレン生産量は、イソプレン合成酵素IspS変異体をコードしている異種核酸を細胞に導入することで、非常に増加させることができる。加えて、異種イソプレン合成酵素核酸を含有している細胞によるイソプレン生産は、細胞による1種以上のDXP経路に関係するポリペプチド例えば、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼDXSポリペプチド及び/又はイソペンテニル二リン酸イソメラーゼIDIポリペプチドの発現量を増加させることで増大させることができる。例えば、DXS核酸及び/又はIDI核酸を細胞に導入できる。DXS核酸は、異種核酸であっても、内在性の核酸の相補的な複製であってもよい。同様にして、IDI核酸は、異種核酸であっても、内在性の核酸の相補的な複製であってもよい。一部の実施形態では、DXS及び/又はIDIポリペプチドの量は、内在性DXS及び/又はIDIプロモーターあるいは制御配列を、DXS及び/又はIDI核酸の転写を増加させるその他のプロモーター及び/又は制御配列と置き換えることで、増大する。一部の実施形態では、細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸例えば、植物イソプレン合成酵素核酸、並びにイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の相補的コピー、のいずれをも含有する。コードされているDXS及びIDIポリペプチドは、イソプレンの生合成に関するDXP経路の一部をなす図22。DXSポリペプチドは、ピルビン酸及びD-グリセルアルデヒド-3-リン酸を1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸へと変換する。任意の特定の理論に制限されることを意図するものではないが、DXSポリペプチド量を増加させることで、DXP経路に取り込まれる炭素量が増加し、その結果イソプレン生産が増加することになるものと考えられる。IDIポリペプチドは、イソペンテニルジホスフェートIPP及びジメチルアリールジホスフェートDMAPPの相互変換を触媒する。任意の特定の理論に制限されることを意図するものではないが、細胞中のIDIポリペプチド量を増加させることで、DMAPPに変換され、ひいてはイソプレンへと変換されるIPP量が増加するものと考えられる。以降に詳細に記載する通り、一部の実施形態では、異種イソプレン合成酵素核酸を含有している細胞によるイソプレン生産は、細胞による1種以上のMVAポリペプチドの発現を増大させることで増強できる図22。MVA経路に関係する代表的なポリペプチドには、次のポリペプチド、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼAA-CoAチオラーゼポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAシンターゼHMG-CoAシンターゼポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAレダクターゼHMG-CoAレダクターゼポリペプチド、メバロン酸キナーゼMVKポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼPMKポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼMVDポリペプチド、IDIポリペプチド、及びMVA経路に関係するポリペプチドの活性を2つ以上有するポリペプチド例えば、融合ポリペプチドのいずれかが含まれる。例えば、MVA経路に関係する1種以上の核酸を細胞に導入できる。一部の実施形態では、細胞はMVA経路上流を含有し、このMVA経路上流には、AA-CoAチオラーゼ、HMG-CoA合成酵素、及びHMG-CoA還元酵素の核酸が包含される。一部の実施形態では、細胞はMVA経路下流を含有し、このMVA経路下流には、MVK、PMK、MVD、及びIDIの核酸が包含される。一部の実施形態では、細胞はMVA経路全体を含有し、このMVA経路全体には、AA-CoAチオラーゼ、HMG-CoA合成酵素、HMG-CoA還元酵素、MVK、PMK、MVD、及びIDIの核酸が包含される。MVA経路に関係する核酸は、異種核酸又は内在性核酸の相補的複製であってよい。一部の実施形態では、1種以上のMVA経路に関係するポリペプチドの量は、内在性プロモーター又はMVA経路に関係する核酸の制御配列を、MVA経路に関係する核酸の転写を増加させるその他のプロモーター及び/又は制御配列と置き換えることで増大する。一部の実施形態では、細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸例えば、植物イソプレン合成酵素核酸、並びにイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の相補的コピー、のいずれをも含有する。一部の実施形態では、少なくとも一部の細胞は、連続培養法希釈を行わない連続培養などで、少なくとも約5、10、20、50、75、100、200又は300回以上分裂させた後も、異種イソプレン合成酵素の核酸、DXS核酸、IDI核酸、その他のDXP経路及び/又はMVA経路に関係する核酸を維持する。本発明の任意の態様に関する一部の実施例では、内在性イソプレン合成酵素、DXS、IDI、その他のDXP経路及び/又はMVA経路の、異種核酸又はこれらの核酸の相補的複製は、抗菌剤のカナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、又はクロラムフェニコールなどの選択マーカーも含む。イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ジメチルアリールジホスフェートDMAPPをイソプレンに変換する。代表的なイソプレン合成酵素ポリペプチドとしては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも1つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがDMAPPをイソプレンへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがイソプレン合成酵素ポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。細胞抽出物中でのイソプレン合成酵素のポリペプチド活性は、例えば、Silveretal.,J.Biol.Chem.270:13010~13016,1995、及びこの文献の参照文献に記載の通りに測定できる。一実施形態では、DMAPPSigmaは窒素流下で濃縮させ、乾燥させ、100mMリン酸カリウム緩衝液pH8.2を用い100mMに再水和し、-20°Cで保存する。アッセイを実施するために、金属製スクリューキャップと、テフロンコーティングのなされたシリコン製隔壁AgilentTechnologiesとを取り付けた20mLヘッドスペースバイアル瓶内で、5μLの1MMgCl2、1mM250μg/mlDMAPP、65μLの植物抽出緩衝液PEB50mMTris-HClpH8.0、20mMMgCl2、5グリセロール、及び2mMDTTを、25μL細胞抽出物に加え、振盪させながら37°Cで15分間培養した。250mMEDTA200μLを加え、あるいは熱不活化によりこの反応をクエンチさせ、イソプレンをGC/MSによって定量化する。イソプレン合成酵素親配列親イソプレン合成酵素から、イソプレン合成酵素変異体を生成する。親イソプレン合成酵素は、野生型及び非野生型のイソプレン合成酵素などの、本明細書に記載される通りのイソプレン合成酵素である。代表的な親イソプレン合成酵素の核酸としては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも1種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。代表的な親イソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載されるような任意の生物資源から誘導されるポリペプチド及び核酸の変異体が挙げられる。一部の実施形態では、親イソプレン合成酵素は、マメ科、ヤナギ科、又はブナ科のものである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、タイワンクズクズSharkeyetal.,PlantPhysiology137:700~712,2005、ポプラウラジロハコヤナギ×トレムラCAC35696,Milleretal.,Planta213:483~487,2001又はウラジロハコヤナギ、アスペンアメリカヤマナラシPopulustremuloidesSilveretal.,JBC27022:13010~1316,1995、又はヨーロッパナラQuercusroburZimmeretal.、国際公開第98/02550号から天然に生じるポリペプチド又は核酸である。好適な親イソプレン合成酵素としては、限定するものではないが、GenBank受入番号AY341431、AY316691、AB198180、AJ294819.1、EU693027.1、EF638224.1、AM410988.1、EF147555.1、AY279379、AJ457070、及びAY182241として定義されるものが挙げられる。その他の親配列は、PCT出願/米国特許出願公開第2009/041581号国際公開第2009/132220号及びPCT出願/米国特許出願公開第2010/032134号国際公開第2010/124146号に記載される。各種実施形態では、親イソプレン合成酵素は、MEAウラジロハコヤナギの配列に対して、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約92、少なくとも約94、少なくとも約96、少なくとも約98、少なくとも約99配列相同性である。他の実施形態では、親イソプレン合成酵素は、全長のウラジロハコヤナギの配列又は完全なウラジロハコヤナギの配列に対して、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約92、少なくとも約94、少なくとも約96、少なくとも約98、少なくとも約99配列相同性である例えば、図21A及び21Bを参照されたい。本発明の酵素変異体を生成するのに好適な様々な方法が、当該技術分野において既知であり、限定するものではないが、例えば、部位飽和変異導入、系統的変異導入法、変異挿入、ランダム変異、部位特異的変異導入、及び定向進化、並びに様々な他の組み換え手法が挙げられる。イソプレン合成酵素変異体ポリペプチド、例えばイソプレン合成酵素は、一次構造アミノ酸配列及びポリペプチド周囲の環境により決定される三次構造を有する。この三次構造は、ポリペプチドの活性、安定性、結合親和性、結合特異性、及び他の生化学的特性を決定する。したがって、生物活性の改良例えば、触媒活性及び/又は溶解度の増加などを計画する際には、タンパク質の三次構造に関する情報から十分な指針を得ることができる。各種イソプレン合成酵素の結晶構造座標は国際公開第2009/132220号及びPCT出願/米国特許出願公開第2010/032134号国際公開第2010/124146号に記載されている。本発明者らは、変異体において1つ以上の特性を改良し得る変異例えば、置換位置を、親イソプレン合成酵素において同定した。本発明の一態様では、変異は、以下に記載の通りのMEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素配列番号1中の位置に一致する位置における置換である。そのため、一態様では、これらの位置に1つ以上の置換を有するイソプレン変異体例えば、実施例7~9に記載の通りのものを製造し、かつ以降に詳細に記載するイソプレン合成酵素特性の改良について、スクリーニングすることができる。当業者が同定目的で使用することのできる代表的な特性としては、限定するものではないが、MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素の比活性と比較した場合に比活性が増大していること、並びに同様の増殖条件下で、MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素を発現している組み換え宿主細胞の増殖性と比較した場合に、イソプレン合成酵素変異体を発現させた組み換え宿主細胞の増殖性が増大していること、が挙げられる。MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素の配列は、次の通りである並びに図20にも示す:MEARRSANYEPNSWDYDYLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQRLGLGYRFESDIRGALDRFVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLRETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGENILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAVVQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFER配列番号1。本開示に記載の置換を組み合わせ、イソプレン合成酵素特性の改良についてスクリーニングすることができる。置換を組み合わせで含み、イソプレン合成酵素特性が1つ以上改良されたイソプレン合成酵素変異体の非限定例としては、表25変異体1~27及び表26変異体1~12に記載の変異体が挙げられる。一態様では、MEAウラジロハコヤナギの変異として同定された残基を表Aに掲載する。表A中の残基及び残基番号は、配列番号1に示すMEAウラジロハコヤナギの残基番号と一致する図20。表A.変異導入部位表Aで使用されるとき、表面疎水性は、疎水性アミノ酸残基がタンパク質の表面に存在することを意味し、表面親水性は、親水性アミノ酸残基がタンパク質の表面に存在することを意味し、対称的に接触は、イソプレン合成酵素分子の表面上の残基が、他のイソプレン合成酵素分子の表面上の残基と、結晶構造を形成するよう接触していることを意味し、保存性は、残基が、大部分のテルペン合成酵素で共通していることを意味し、N末端ループは、残基が、タンパク質のN末端ループに存在していることを意味し、表面ループは、残基が、タンパク質の表面ループに存在することを意味し、活性部位は、残基が、タンパク質の活性部位に存在していることを意味し、可動性ループは、残基が、タンパク質の可動性ループに存在していることを意味し、疎水性ポケットは、残基が、タンパク質の疎水性ポケットに存在することを意味し、並びにC末端は、残基が、タンパク質のC末端領域に存在することを意味する。以降の実施例において更に記載する通り、表Aに示す残基位置で置換を行い、様々なイソプレン合成酵素変異体を製造した。本開示表A、B、特許請求の範囲、又は実施例を包含するに記載の任意の変異体を本発明の組成物及び方法に使用できる。MEAウラジロハコヤナギ変異体において生成した具体的な置換を表Bに示す。表B.MEAウラジロハコヤナギの代表的なアミノ酸置換表Bは、MEAウラジロハコヤナギにおける具体的な置換を示す。他の親イソプレン合成酵素において、対応する残基を同様に変異させて、本発明のイソプレン合成酵素変異体を生成することもできる。表Cは、本発明の代表的な置換を示し、Xは任意のアミノ酸残基を指す。しかしながら、Xは置換により生じるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を指すことは理解されるであろう例えば、X3Cでは、XはC以外のアミノ酸残基である。表C中の残基の付番は、MEAウラジロハコヤナギ配列のものと一致する。したがって、異なる親配列例えば、野生型アメリカヤマナラシに関し、残基003は、MEAウラジロハコヤナギの残基003に相当するアメリカヤマナラシ配列中の残基を示し、かつアメリカヤマナラシ配列の残基003は、アメリカヤマナラシのアミノ酸配列において、必ずしも配列中の第3番目の残基である必要はないということが理解されるであろう。表C.代表的なアミノ酸残基置換一部の実施形態では、変異体は、X003T,X013L,X165Y,X421R,X495L,X509T,及びX540Vからなる群から選択された置換を含む。一部の実施形態では、変異体はX003Tを含む。一部の実施形態では、変異体はX013Lを含む。一部の実施形態では、変異体はX165Yを含む。一部の実施形態では、変異体はX421Rを含む。一部の実施形態では、変異体はX495Lを含む。一部の実施形態では、変異体はX509Tを含む。一部の実施形態では、変異体はX540Vを含む。一部の実施形態では、変異体は置換X491Sを含む。一部の実施形態では、変異体は更に置換X491S,に加えて、X003C,X003D,X003E,X003F,X003G,X003H,X003I,X003K,X003L,X003M,X003N,X003P,X003Q,X003R,X003S,X003T,X003V,X003W,X003Y,X007C,X007D,X007E,X007F,X007G,X007H,X007I,X007K,X007L,X007M,X007N,X007P,X007Q,X007R,X007S,X007T,X007V,X007W,X007Y,X009A,X009C,X009D,X009E,X009F,X009G,X009H,X009I,X009K,X009L,X009M,X009N,X009P,X009Q,X009R,X009S,X009T,X009V,X009W,X012A,X012C,X012D,X012E,X012F,X012G,X012H,X012I,X012K,X012L,X012M,X012P,X012Q,X012R,X012S,X012T,X012V,X012W,X012Y,X013A,X013C,X013D,X013E,X013F,X013G,X013H,X013I,X013K,X013L,X013M,X013N,X01P3、X013Q,X013R,X013T,X013V,X013W,X013Y,X016A,X016C,X016D,X016E,X016F,X016G,X016H,X016I,X016K,X016L,X016M,X016N,X016P,X016Q,X016R,X016S,X016T,X016V,X016W,X018A,X018C,X018D,X0E18、X018F,X018G,X018H,X018I,X018K,X018L,X018M,X018N,X018P,X018Q,X018R,X018S,X018T,X018V,X018W,X020A,X020C,X020D,X020E,X020F,X020G,X020H,X020I,X020K,X020M,X020N,X020P,X020Q,X020R,X020S,X020T,X020V,X020W,X020Y,X023A,X023C,X023E,X023F,X023G,X023H,X023I,X023K,X023L,X023M,X023N,X023P,X023Q,X023R,X023S,X023T,X023V,X023W,X023Y,X025A,X025C,X025E,X025F,X025G,X025H,X025I,X025K,X025L,X025M,X025N,X025P,X025Q,X025R,X025S,X025T,X025V,X025W,X025Y,X026A,X026C,X026D,X026F,X026G,X026H,X026I,X026K,X026L,X026M,X026N,X026P,X026Q,X026R,X026S,X026T,X026V,X026W,X026Y,X027A,X027C,X027D,X027E,X027F,X027G,X027H,X027I,X027K,X027L,X027M,X027N,X027P,X027Q,X0R27、X027V,X027W,X027Y,X033A,X033C,X033E,X033F,X033G,X033H,X033I,X033K,X033L,X033M,X033N,X033P,X033Q,X033R,X033S,X033T,X033V,X033W,X033Y,X036A,X036C,X036D,X036E,X036F,X036G,X036G,X036I,X036L,X036M,X036N,X036P,X036Q,X036R,X036S,X036T,X036V,X036W,X036Y,X044A,X044C,X044D,X044E,X044F,X044G,X044H,X044I,X044K,X044L,X044M,X044N,X044P,X044Q,X044S,X044T,X044V,X044W,X044Y,X050A,X050C,X050D,X050E,X050F,X050G,X050H,X050I,X050L,X050M,X050N,X050P,X050Q,X050R,X050S,X050T,X050V,X050W,X050Y,X053A,X053C,X053D,X053E,X053G,X053H,X053I,X053K,X053L,X053M,X053N,X053P,X053Q,X053R,X053S,X053T,X053V,X053W,X053Y,X059A,X059C,X059D,X059E,X059F,X059G,X059H,X059I,X059K,X059M,X059N,X059P,X059Q,X059R,X059S,X059T,X059V,X059W,X059Y,X069A,X069C,X069D,X069E,X069F,X069H,X069I,X069K,X069L,X069M,X069N,X069P,X069Q,X069R,X069S,X069T,X069V,X069W,X069Y,X074A,X074C,X074D,X074E,X074F,X074G,X074H,X074I,X074K,X074L,X074M,X074N,X074P,X074Q,X074R,X074T,X074V,X074W,X074Y,X078A,X078C,X078D,X078E,X078F,X078H,X078I,X078K,X078L,X078M,X078N,X078P,X078Q,X078R,X078S,X078T,X078V,X078W,X078Y,X081A,X081C,X081E,X081F,X081G,X081H,X081I,X081K,X081L,X081M,X081N,X081P,X081Q,X081R,X081S,X081T,X081V,X081W,X081Y,X087A,X087C,X087D,X087E,X087F,X087H,X087I,X087K,X087L,X087M,X087N,X087P,X087Q,X087R,X087S,X087T,X087V,X087W,X087Y,X099A,X099C,X099D,X099E,X099F,X099H,X099I,X099K,X099L,X099M,X099N,X099P,X099Q,X099R,X099S,X099T,X099V,X099W,X099Y,X116A,X116C,X116D,X116E,X116F,X116G,X116H,X116I,X116K,X116L,X116M,X116N,X116P,X116R,X116S,X116T,X116V,X116W,X116Y,X117A,X117C,X117D,X117F,X117G,X117H,X117I,X117K,X117L,X117M,X117N,X117P,X117Q,X117R,X117S,X117T,X117V,X117W,X117Y,X120A,X120C,X120D,X120E,X120F,X120G,X120H,X120I,X120K,X120L,X120M,X120N,X120P,X120Q,X120R,X120T,X120V,X120W,X120Y,X121A,X121C,X121D,X121E,X121F,X121H,X121I,X121K,X121L,X121M,X121N,X121P,X121Q,X121R,X121S,X121T,X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6R,X496S,X496T,X496V,X496W,X496Y,X497A,X497C,X497D,X497E,X497F,X497G,X497H,X497I,X497L,X497M,X497N,X497P,X497Q,X497R,X497S,X497T,X497V,X497W,X497Y,X498A,X498C,X498D,X498E,X498F,X498G,X498H,X498I,X498K,X498L,X498M,X498N,X498Q,X498R,X498S,X498T,X498V,X498W,X498Y,X509A,X509C,X509D,X509E,X509F,X509G,X509H,X509I,X509K,X509L,X509M,X509N,X509P,X509R,X509S,X509T,X509V,X509W,X509Y,X514A,X514C,X514D,X514E,X514F,X514G,X514H,X514I,X514K,X514L,X514M,X514N,X514P,X514Q,X514R,X514S,X514T,X514V,X514W,X521A,X521C,X521D,X521E,X521F,X521G,X521H,X521I,X521K,X521L,X521M,X521N,X521P,X521Q,X521R,X521S,X521V,X521W,X521Y,X539A,X539C,X539D,X539E,X539F,X539G,X539H,X539K,X539L,X539M,X539N,X539P,X539Q,X539R,X539S,X539T,X539V,X539W,X539Y,X540A,X540C,X540D,X540E,X540F,X540G,X540H,X540I,X540K,X540M,X540N,X540P,X540Q,X540R,X540S,X540T,X540V,X540W,X540Y,X544A,X544C,X544D,X544E,X544F,X544G,X544H,X544I,X544K,X544L,X544M,X544N,X544P,X544Q,X544S,X544T,X544V,X544W,及びX544Yからなる群から選択された別の置換も含み、ここで、Xは任意のアミン酸を意味し、各アミノ酸残基の位置は、図20に示す通りのウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素配列中のアミノ酸残基の位置と対応させて付番される。置換X491Sは、表B又はCに記載の任意の他の置換と組み合わせてもよい。一部の実施形態では、変異体は、アミノ酸残基:N438,E451,及びY514を含む。一部の実施形態では、変異体は、アミノ酸残基:F287,G397,N438,E451,及びY514を含む。一部の実施形態では、変異体はS491を含む。一部の実施形態では、変異体は、S491に加えて、X003C,X003D,X003E,X003F,X003G,X003H,X003I,X003K,X003L,X003M,X003N,X003P,X003Q,X003R,X003S,X003T,X003V,X003W,X003Y,X007C,X007D,X007E,X007F,X007G,X007H,X007I,X007K,X007L,X007M,X007N,X007P,X007Q,X007R,X007S,X007T,X007V,X007W,X007Y,X009A,X009C,X009D,X009E,X009F,X009G,X009H,X009I,X009K,X009L,X009M,X009N,X009P,X009Q,X009R,X009S,X009T,X009V,X009W,X012A,X012C,X012D,X012E,X012F,X012G,X012H,X012I,X012K,X012L,X012M,X012P,X012Q,X012R,X012S,X012T,X012V,X012W,X012Y,X013A,X013C,X013D,X013E,X013F,X013G,X013H,X013I,X013K,X013L,X013M,X013N,X01P3、X013Q,X013R,X013T,X013V,X013W,X013Y,X016A,X016C,X016D,X016E,X016F,X016G,X016H,X016I,X016K,X016L,X016M,X016N,X016P,X016Q,X016R,X016S,X016T,X016V,X016W,X018A,X018C,X018D,X0E18、X018F,X018G,X018H,X018I,X018K,X018L,X018M,X018N,X018P,X018Q,X018R,X018S,X018T,X018V,X018W,X020A,X020C,X020D,X020E,X020F,X020G,X020H,X020I,X020K,X020M,X020N,X020P,X020Q,X020R,X020S,X020T,X020V,X020W,X020Y,X023A,X023C,X023E,X023F,X023G,X023H,X023I,X023K,X023L,X023M,X023N,X023P,X023Q,X023R,X023S,X023T,X023V,X023W,X023Y,X025A,X025C,X025E,X025F,X025G,X025H,X025I,X025K,X025L,X025M,X025N,X025P,X025Q,X025R,X025S,X025T,X025V,X025W,X025Y,X026A,X026C,X026D,X026F,X026G,X026H,X026I,X026K,X026L,X026M,X026N,X026P,X026Q,X026R,X026S,X026T,X026V,X026W,X026Y,X027A,X027C,X027D,X027E,X027F,X027G,X027H,X027I,X027K,X027L,X027M,X027N,X027P,X027Q,X0R27、X027V,X027W,X027Y,X033A,X033C,X033E,X033F,X033G,X033H,X033I,X033K,X033L,X033M,X033N,X033P,X033Q,X033R,X033S,X033T,X033V,X033W,X033Y,X036A,X036C,X036D,X036E,X036F,X036G,X036G,X036I,X036L,X036M,X036N,X036P,X036Q,X036R,X036S,X036T,X036V,X036W,X036Y,X044A,X044C,X044D,X044E,X044F,X044G,X044H,X044I,X044K,X044L,X044M,X044N,X044P,X044Q,X044S,X044T,X044V,X044W,X044Y,X050A,X050C,X050D,X050E,X050F,X050G,X050H,X050I,X050L,X050M,X050N,X050P,X050Q,X050R,X050S,X050T,X050V,X050W,X050Y,X053A,X053C,X053D,X053E,X053G,X053H,X053I,X053K,X053L,X053M,X053N,X053P,X053Q,X053R,X053S,X053T,X053V,X053W,X053Y,X059A,X059C,X059D,X059E,X059F,X059G,X059H,X059I,X059K,X059M,X059N,X059P,X059Q,X059R,X059S,X059T,X059V,X059W,X059Y,X069A,X069C,X069D,X069E,X069F,X069H,X069I,X069K,X069L,X069M,X069N,X069P,X069Q,X069R,X069S,X069T,X069V,X069W,X069Y,X074A,X074C,X074D,X074E,X074F,X074G,X074H,X074I,X074K,X074L,X074M,X074N,X074P,X074Q,X074R,X074T,X074V,X074W,X074Y,X078A,X078C,X078D,X078E,X078F,X078H,X078I,X078K,X078L,X078M,X078N,X078P,X078Q,X078R,X078S,X078T,X078V,X078W,X078Y,X081A,X081C,X081E,X081F,X081G,X081H,X081I,X081K,X081L,X081M,X081N,X081P,X081Q,X081R,X081S,X081T,X081V,X081W,X081Y,X087A,X087C,X087D,X087E,X087F,X087H,X087I,X087K,X087L,X087M,X087N,X087P,X087Q,X087R,X087S,X087T,X087V,X087W,X087Y,X099A,X099C,X099D,X099E,X099F,X099H,X099I,X099K,X099L,X099M,X099N,X099P,X099Q,X099R,X099S,X099T,X099V,X099W,X099Y,X116A,X116C,X116D,X116E,X116F,X116G,X116H,X116I,X116K,X116L,X116M,X116N,X116P,X116R,X116S,X116T,X116V,X116W,X116Y,X117A,X117C,X117D,X117F,X117G,X117H,X117I,X117K,X117L,X117M,X117N,X117P,X117Q,X117R,X117S,X117T,X117V,X117W,X117Y,X120A,X120C,X120D,X120E,X120F,X120G,X120H,X120I,X120K,X120L,X120M,X120N,X120P,X120Q,X120R,X120T,X120V,X120W,X120Y,X121A,X121C,X121D,X121E,X121F,X121H,X121I,X121K,X121L,X121M,X121N,X121P,X121Q,X121R,X121S,X121T,X121V,X121W,X121Y,X125A,X125C,X125D,X125E,X125F,X125G,X125H,X125I,X125K,X125L,X125M,X125N,X125P,X125R,X125S,X125T,X125V,X125W,X125Y,X127A,X127C,X127D,X127E,X127F,X127H,X127I,X127K,X127L,X127M,X127N,X127P,X127Q,X127R,X127S,X127T,X127V,X127W,X127Y,X139C,X139D,X139E,X139F,X139G,X139H,X139I,X139K,X139L,X139M,X139N,X139P,X139Q,X139R,X139S,X139T,X139V,X139W,X139Y,X165A,X165C,X165D,X165E,X165F,X165G,X165H,X165K,X165L,X165M,X165N,X165P,X165Q,X165R,X165S,X165T,X165V,X165W,X165Y,X173A,X173C,X173D,X173F,X173G,X173H,X173I,X173K,X173L,X173M,X173N,X173P,X173Q,X173R,X173S,X173T,X173V,X173W,X173Y,X174A,X174C,X174D,X1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A,X539C,X539D,X539E,X539F,X539G,X539H,X539K,X539L,X539M,X539N,X539P,X539Q,X539R,X539S,X539T,X539V,X539W,X539Y,X540A,X540C,X540D,X540E,X540F,X540G,X540H,X540I,X540K,X540M,X540N,X540P,X540Q,X540R,X540S,X540T,X540V,X540W,X540Y,X544A,X544C,X544D,X544E,X544F,X544G,X544H,X544I,X544K,X544L,X544M,X544N,X544P,X544Q,X544S,X544T,X544V,X544W,及びX544Yからなる群から選択される置換を含み、ここで、Xは任意のアミン酸を意味し、各アミノ酸残基の位置は、図20に示す通りのウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素配列中のアミノ酸残基の位置と対応させて付番される。一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体の配列は、野生型イソプレン合成酵素の配列とは異なる。一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体の配列は、PCT出願/米国特許出願公開第2009/041581号国際公開第2009/132220号又はPCT出願/米国特許出願公開第2010/032134号国際公開第2010/124146号に記載の配列とは異なる。一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体は、PCT出願/米国特許出願公開第2009/041581号国際公開第2009/132220号に開示のアミノ酸残基置換を含まない。一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体は、表Dに示すアミノ酸残基置換を含まない。一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体は、表Eに記載の配列を含まない。一部の実施形態では、表E及びFに記載の配列は、これらの表に記載のものから選択される置換を1つ以上有し得る。一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体は、表Fに記載の配列を含まない。表4~6に記載の配列及び置換に関する残基付番は、PCT出願/米国特許出願公開第2009/041581号国際公開第2009/132220号又はPCT出願/米国特許出願公開第2010/032134号国際公開第2010/124146号に定義の通りのものである。当業者は、表4~6に記載の残基をMEAウラジロハコヤナギなどの参照配列図20配列番号1と対応させる方法を決定することができる。N端末トランケーション一部の実施形態では、変異体は、N端末領域の1つ以上のアミノ酸残基のトランケーションを含むN端末領域のトランケーションを含む。例えば、実施例10を参照されたい。N端末トランケーションの例は、PCT出願/米国特許出願公開第2009/041581号国際公開第2009/132220号に記載されている。一部の実施形態では、N端末トランケーションを含むイソプレン合成酵素変異体は、完全長のイソプレン合成酵素と比較して比活性が増加している。例えば、N端末トランケーションの例としては、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素の:MEA変異体、MSV変異体、MVS変異体、MTE変異体、MNV変異体、TRC-3変異体、TRC-4変異体、TRC-5変異体、TRC-6変異体及びTRC-7変異体;アメリカヤマナラシイソプレン合成酵素:MET変異体;及びP.トリコカルパイソプレン合成酵素の、N端末でトランケートされた残基と対応する残基が挙げられる。MET変異体の配列は、PCT出願/米国特許出願公開第2009/041581号国際公開第2009/132220号に記載される。一部の実施形態では、変異体においてトランケーションの生じた残基は、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素MEA変異体においてトランケーションの生じた残基と一致する図21A~21Bを参照されたい。イソプレン合成酵素変異体の特性一部の実施形態では、変異体は、参照配列と比べ少なくとも一つの特性が改良されている。一部の実施形態では、参照配列は親配列である。一部の実施形態では、参照配列は野生型イソプレン合成酵素である。一部の実施形態では、参照配列はMEAウラジロハコヤナギ配列番号1のものであり、図20にも示す、対象とする特性としては、限定するものではないが、細胞内活性の増加、比生産性の増加、収率の増加、及び細胞性能指数の増加が挙げられる。一部の実施形態では、比生産性は、少なくとも約2、3、4、5、67、8、9、10倍以上に増加する。一実施形態では、比生産性は約20mg/L/OD/hrである。他の実施形態では、収率は、少なくとも約2、3、4、5倍以上に増加する。他の実施形態では、細胞性能指数は、少なくとも約2、3、4、5倍以上に増加する。他の実施形態では、細胞内活性は少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10倍以上に増加する。理論に束縛されるものではないが、これらの特性は、IspSに関係する次の特性:細胞生存能の増加、kcatの増加、Kmの減少、比活性の増加、溶解度の増加、不溶性の低下、リボソーム結合性の増加、翻訳開始速度の増加、翻訳伸長速度の増加、転写開始速度の増加、転写伸長速度の増加、DNAの2次構造の減少、RNAの2次構造の減少、DNAの2次構造の増加、RNAの2次構造の増加、折りたたみ速度の増加、細胞内のシャペロンに対する親和性の増加、安定性の増加、タンパク質の代謝回転の減少、細胞内プロテアーゼに対する暴露の減少、細胞内プロテアーゼに対する親和性の減少、周辺質への局在性の減少、細胞質への局在性の増加、封入体形成の減少、膜局在の減少、より望ましいコドンによる発現増加、DNA安定性の増加、RNA安定性の増加並びにRNA分解の減少、のいずれかにより、あるいはこれらを組み合わせることにより得ることができる。簡潔には、IspS変異体をコードしている、又はこの変異体を発現している核酸配列DNA及びRNAの特性に、あるいはIspS酵素自体のもつ生化学的特性に好ましく作用する任意の変異により、細胞内部の活性をより向上させることができる。対象とするその他の特性としては、至適pH、温度安定性例えば、Tm値、並びに基質阻害又は生成物阻害を含む存在し得るインヒビターに対する感受性が挙げられる。酸化安定性及びタンパク質分解安定性も対象とする。更に、金属イオンの作用及び金属イオンのイオン強度による活性化又は阻害も対象とする。一実施形態では、比活性の値は、所定の時間で製造されたイソプレンモル量を、各試料に含まれるタンパク質の具体的な量で除算することにより、SELのすべての組み合わせに含まれる各変異体毎に算出することができる。性能指数PIは、任意の所定の変異体の比活性を、同一のマイクロタイタープレートで得られたいくつかの野生型の比活性測定値の平均により除算することにより算出することができる。例えば、比活性のPI値が1.5である変異体は、野生型と比べ、性能が50向上されている。タンパク質濃度に関するPI及び生産されるイソプレンに関するPIも、同様の方法で算出することができる。これらの測定値を用い、実施例に示す通りの詳細なデータ解析を行った。イソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸を含む宿主細胞の増殖指数又は性能指数を使用して、個々の変異体が対象とする特性を有するか否かを示すこともできる。増殖指数及び性能指数は、当業者に既知の手法、及び/又は本開示に教示される通りの手法に従い測定することもできる。増殖及び性能指数は、参照配列と比較することにより、個々の変異体に関し測定できる。一部の実施形態では、参照配列は、変異体の親配列である。一部の実施形態では、参照配列は野生型配列である。一部の実施形態では、参照配列は、MEAウラジロハコヤナギである。一部の実施形態では、増殖指数は、実施例2に記載の方法に従って測定する。一部の実施形態では、増殖指数は、実施例4に記載の方法に従って測定する。各種実施形態では、変異体の増殖指数は、参照配列と比較した場合に、少なくとも約0.8、少なくとも約0.9、少なくとも約1.0、少なくとも約1.1、少なくとも約1.2、少なくとも約1.3である。各種実施形態では、変異体の性能指数は、参照配列と比較した場合に、少なくとも約0.7、少なくとも約0.8、少なくとも約0.9、少なくとも約1.0、少なくとも約1.1、少なくとも約1.2である。対象とする特性を測定する手法は当業者に既知である。いくつかの手法を実施例において更に記載する。改良する所望の結果又は特性に基づき変異体を評価することができる。例えば、比活性が増大するよう設計したイソプレン合成酵素変異体は、精製又は一部精製したイソプレン合成酵素変異体を用いinvitroで、又は大腸菌などの宿主生物に関する文脈においてinvivoで、DMAPPのイソプレンへの変換について試験することができる。場合により、大腸菌は、DXP経路、MVA経路、又はこれらの両方を発現し得る。改良した活性は、他のイソプレン合成酵素、例えば、野生型イソプレン合成酵素、親イソプレン合成酵素、又は他の参照ポリペプチドと比較して評価する。多様な宿主においてイソプレンを生産させることを目的とした本発明において、1種以上の試験条件下で、例えば、様々な程度の安定性、溶解度、活性、及び/又は発現レベルを示す酵素を使用することが見出されるものと企図される。ハイスループットな手法を用いると、効率的な方法でこれらの特性を評価することができる。細胞内DMAPP濃度の増加と、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素IspSを発現させることで軽減され得る大腸菌の増殖阻害との間には、強い相関がある。理論に束縛されるものではないが、IspS活性が増強されると、DMAPPは、より迅速にイソプレンへと変換されるようになり、その結果増殖性が更に良好になるはずである。これらの条件下でIspS変異体を発現する大腸菌の増殖速度をモニターすることで、本発明者らは、細胞内でDMAPPをイソプレンへと変換する能力が増強されている、IspS酵素変異体を同定した。本発明は、また、イソプレン合成酵素変異体をスクリーニングする方法を企図し、方法は、a宿主細胞を、約10μM~約70μMのIPTGと、約5mM~約20mMのメバロン酸MVAと、を含む培地と接触させる工程であって、ここで宿主細胞は、イソプレン合成酵素変異体を操作可能にプロモーターと組み合わせてコードしている核酸を含む、工程、並びにb宿主細胞の増殖速度を測定する工程を含む。変異体の増殖速度は、参照イソプレン合成酵素例えば、親イソプレン合成酵素、野生型イソプレン合成酵素、又はMEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素の増殖速度と比較することができる。この手法を、対象とする特定の性質をもつ変異体、例えば、本開示に記載の1つ以上の性質をもつ変異体の、スクリーニングに使用することができる。一部の実施形態では、増殖速度の増加は、宿主細胞の合成酵素のもつ、MAPPをイソプレンに変換する能力が、イソプレン合成酵素変異体では増強されていることを意味する。例えば、増殖速度は、当該技術分野で既知の手法により、あるいは以降の実施例において例示される通りに解析することができる。一部の実施形態では、手法は、変異体の増殖指数を測定する工程を更に含む。一部の実施形態では、手法は、変異体の性能指数を測定する工程を更に含む。変異体を選別する際、対数増殖期での及び/又は最終的な細胞密度での、細胞の増殖速度を、要素として考慮にいれることもできる。以降、実施例において示す変異体に関し例示する通り、対数増殖期の細胞増殖速度を考慮に入れた。更に、本開示に記載の変異体を選別する際、増殖速度及び最終密度も考慮に入れた。一部の実施形態では、IPTGは、約10μM~約60μMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、IPTGは、約10μM~約200μMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、IPTGは、約20μM~約60μMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、IPTGは、約20μM~約120μMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、IPTGは、約40μM~約60μMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、IPTGは、約40μM~約100μMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、IPTGは、約40μMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、IPTGは、約50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、又は200μMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、MVAは、約5mM~約20mMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、MVAは、約7mM~約15mMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、MVAは、約8mM~約12mMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、MVAは、約10mMの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、宿主細胞はMD09-170である。他の態様では、1つ以上の改良した特性は、以降の実施例において、更に記載され、例示される通りに、生産性に関係する位置を解析することで観察され得る。生産性に関係する位置は、特性の改良されたコンビナトリアルな変異体を製造するのに最も有用な、これらの分子例えば、イソプレン合成酵素などの酵素内位置として記載することができ、この位置により、少なくとも1つの変異を組み合わせることができる。組み合わせることのできる変異は、コンビナトリアルな変異体を選別するのに使用することのできる、これらの分子内の置換として記載され得る。組み合わせることのできる変異は、発現、比活性又は増殖性を著しく低下させることなく、なおかつ、増殖性又は比活性などといった、分子に関する少なくとも1つの所望の特性を改良するものである。IspS内の、組み合わせることのできる変異の存在しているすべての位置を、実施例1及び実施例2に例示される通りの、比活性に関するDMAPP解析、記載のIspS変異体を発現しているMEAウラジロハコヤナギの増殖曲線、並びにタンパク質の定量から得られる、性能指数PI値を用い、決定することができる。生産性に関係する位置は、複数の置換にある程度耐性を示し、なおかつ以降に示す通りのコンビナトリアルさに関する一群の基準を満たす位置であってよい。データ群を評価する際、生産性に関係するほとんどの位置を以降の基準に当てはめて評価した。野生型IspSと比較した場合に、比活性及び発現についての性能指数PIが最小になるような位置に置換のなされた場合に、PIが0.9以上であり、かつ野生型IspSと比較した場合に比活性又は増殖性についての少なくとも1つのPIが1.0以上である場合、これらの位置は第A群として分類する。野生型IspSと比較した場合に、比活性及び発現についての性能指数PIが最小になるような位置に置換のなされた場合に、PIが0.8以上であり、かつ野生型IspSと比較した場合に比活性又は増殖性についての少なくとも1つのPIが1.2以上である場合、これらの位置は第B群として分類する。野生型IspSと比較した場合に、比活性及び発現についての性能指数PIが最小になるような位置に置換のなされた場合に、PIが0.5以上であり、かつ野生型IspSと比較した場合に比活性又は増殖性についての少なくとも1つのPIが1.5以上である場合、これらの位置は第C群として分類する。第A、B、及びC群は、複数置換に対する許容度の異なる位置を更に含有し得る。この置換許容度を測定するために、各位置に等級を割り当てることができる。この等級は、第A、B、又はC群に当てはまる各位置の置換率に従って割り当てることができる。組み合わせ可能な代表的な位置及び置換を表31に示す。増殖性に関与する位置の等級を決定するための基準は次の通りのものである:所定の位置での置換の0超15未満が第A、B、又はC群にあてはまる場合、等級は1に割り当てられる。所定の位置での置換の15以上30未満が第A、B、又はC群に当てはまる場合、等級は2に割り当てられる。所定の位置での置換の30以上50未満が第A、B、又はC群に当てはまる場合、等級は3に割り当てられる。所定の位置での置換の50以上が第A、B、又はC群に当てはまる場合、等級は4に割り当てられる。基質には、置換が属する群をもとに、更に好適なスコアを割り当てることができる。スコアが高くなるほど、その置換が、コンビナトリアルな変異体を製造する際に使用するのにより好適なものであることを意味する。代表的な安定性スコア適性スコアを表30に示し、記載する。上記基準に当てはまるIspSのそれぞれの置換に関する安定性スコア及び等級を表31に記載する。表30.既定された群の適性スコアしたがって、本発明の一態様では、イソプレン合成酵素変異体は、実施例に例示する通りにと評価される改良されたイソプレン合成酵素特性を有するポリペプチド例えば、単離ポリペプチドであり得る。実施例に例示する通りにとカラムに表記されたこれらのポリペプチドは、配列番号1MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素と対応させて付番した残基位置に1つ以上の置換を有し得る。一部の非限定例では、改良されたイソプレン合成酵素特性を有する単離ポリペプチドは、配列番号1に対応する:X2,X18,X19,X21,X24,X26,X27,X29,X37,X42,X47,X48,X49,X56,X81,X82,X84,X93,X94,X95,X120,X123,X126,X131,X132,X134,X137,X139,X143,X151,X155,X166,X167,X169,X170,X171,X175,X179,X180,X197,X229,X231,X240,X242,X245,X246,X247,X251,X271,X282,X306,X317,X319,X369,X371,X376,X379,X380,X389,X392,X393,X408,X409,X421,X422,X423,X429,X437,X443,X444,X447,X455,X458,X461,X464,X466,X470,X473,X500,X502,X506,X513,X525,及びX531からなる群から選択される残基のうちの1つ以上が置換されている。一部の実施形態では、これらの置換は、E2,Y18,L19,S21,T24,E26,S27,E29,K37,V42,N47,N48,E49,L56,D81,R82,V84,T93,K94,T95,S120,K123,N126,E131,N132,K134,I137,A139,L143,L151,N155,S166,H167,K169,E170,L171,K175,E179,L180,Q197,I229,S231,T240,R242,R245,R246,V247,T251,A271,S282,L306,D317,N319,F369,Q371,L376,K379,S380,G389,W392,K393,V408,V409,Q421,K422,Y423,R429,C437,A443,S444,I447,S455,C458,R461,G464,S466,A470,S473,V500,T502,L506,T513,E525,及びV531からなる群から選択される残基に生じ得る。一部の実施形態では、置換は、E2A又はK又はP、Y18D又はE又はK又はS、L19Y、S21W、T24L又はV、E26C、S27D又はN、E29N、K37C又はD又はP又はQ又はS、V42M、N47D又はS、N48D又はG又はT、E49L又はV、L56E又はF又はG又はI又はK又はT又はV又はY、D81Q、R82N又はT又はV又はY、V84M、T93C又はF又はR又はS、K94G又はP、T95D又はF又はG又はI又はN又はW、S120C又はG又はM又はQ、K123V、N126E、E131H又はK又はL又はM又はT又はW又はY、N132I又はP、K134A、I137T、A139C又はQ、L143C又はD又はE又はH又はK又はM又はQ又はT又はV又はY、L151A又はF、N155A又はC又はG又はH又はQ又はR又はS又はW、S166N、H167F又はI又はN又はQ又はV、K169A又はC又はH又はN又はQ又はV、E170L又はS又はW又はY、L171A又はN又はQ又はT又はV又はY、K175C又はF又はI又はQ又はR、E179D、L180A又はI、Q197C又はD又はN、I229C、S231A、T240C、R242G、R245C又はK又はM又はQ又はT又はV、R246N、V247L又はM、T251D又はE又はN又はP又はQ又はS、A271T、S282Y、L306C、D317N、N319M、F369C又はD又はE又はG又はS、Q371F、L376I又はM、K379G又はQ、S380E、G389A又はD又はE又はK又はN又はQ又はS又はV、W392Y、K393C又はI又はT又はV、V408T、V409T、Q421H、K422D、Y423N又はS、R429E又はF又はQ,C437M,A443Q,S444D又はE、I447T、S455A、C458T、R461A,G464C又はM又はN又はQ又はS、S466D、A470I又はL、S473I、V500A又はC、T502M,L506M,T513C又はG又はK又はN、E525F又はR、V531E又はH又はK又はQ又はR又はSからなる群から選択される。本発明の他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、実施例に例示する通りにと評価される改良されたイソプレン合成酵素特性を有するポリペプチド例えば、単離ポリペプチドであってよい。実施例に例示する通りにとカラムに表記されたこれらのポリペプチドは、配列番号1MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素と対応させて付番した残基位置に1つ以上の置換を有し得る。一部の非限定例では、改良されたイソプレン合成酵素特性を有する単離ポリペプチドは、配列番号1に対応する:X2,X6,X18,X20,X22,X23,X24,X25,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X36,X37,X42,X44,X47,X48,X49,X50,X53,X54,X55,X56,X58,X59,X68,X71,X74,X77,X78,X79,X81,X82,X83,X84,X86,X87,X91,X93,X94,X95,X97,X98,X99,X109,X115,X116,X117,X118,X120,X123,X125,X126,X127,X128,X130,X131,X132,X133,X134,X136,X137,X138,X139,X140,X143,X151,X153,X155,X156,X159,X160,X161,X162,X163,X164,X166,X167,X169,X170,X171,X172,X175,X176,X177,X178,X179,X180,X181,X182,X190,X194,X197,X204,X211,X215,X217,X219,X221,X228,X229,X231,X232,X235,X241,X242,X245,X246,X247,X251,X254,X271,X272,X278,X279,X282,X296,X302,X317,X319,X320,X327,X331,X348,X351,X357,X361,X364,X365,X368,X369,X370,X371,X373,X377,X380,X383,X386,X389,X392,X393,X407,X408,X409,X410,X411,X414,X422,X423,X424,X428,X429,X432,X436,X437,X440,X443,X444,X447,X448,X457,X460,X461,X462,X463,X464,X465,X466,X468,X470,X471,X472,X473,X475,X480,X490,X491,X492,X494,X496,X500,X501,X502,X503,X510,X513,X515,X519,X525,X531,X536,X537,X540,X541,X542,及びX544からなる群から選択される残基のうちの1つ以上が置換されている。一部の実施形態では、これらの置換は:E2,S6,Y18,L20,S22,D23,T24,D25,E26,S27,I28,E29,V30,Y31,K32,K36,K37,V42,R44,N47,N48,E49,K50,F53,L54,T55,L56,E58,L59,L68,R71,S74,R77,G78,A79,D81,R82,F83,V84,S86,G87,A91,T93,K94,T95,L97,H98,G99,Q109,S115,Q116,E117,A118,S120,K123,Q125,N126,G127,N128,L130,E131,N132,L133,K134,D136,I137,K138,A139,I140,L143,L151,G153,N155,I156,E159,A160,K161,V162,F163,A164,S166,H167,K169,E170,L171,S172,K175,I176,G177,K178,E179,L180,A181,E182,L190,R194,Q197,S204,K211,N215,V217,L219,L221,M228,I229,S231,V232,R235,S241,R242,R245,R246,V247,T251,H254,A271,F272,D278,C279,S282,I296,T302,D317,N319,A320,Y327,C331,K348,G351,Y357,A361,D364,L365,A368,F369,L370,Q371,A373,Y377,S380,T383,D386,G389,W392,K393,A407,V408,V409,Q410,N411,K414,K422,Y423,H424,S428,R429,H432,L436,C437,L440,A443,S444,I447,A448,S457,M460,R461,T462,K463,G464,I465,S466,E468,A470,T471,E472,S473,M475,E480,L490,G491,G492,L494,A496,V500,E501,T502,A503,S510,T513,H515,A519,E525,V531,T536,E537,L540,P541,F542,及びR544からなる群から選択される残基に生じ得る。他の実施形態では、置換は,E2C又はD又はN又はT又はV,S6N又はT,Y18A又はQ又はR,L20T,S22Q,D23N,T24C,D25T,E26D又はH又はK又はM又はR又はS又はV,S27A又はC又はG又はH又はI又はL又はM又はP又はQ,I28D又はN,E29Q,V30A又はD又はE又はM又はR又はT,Y31N,K32E,K36A又はC又はD又はE又はM又はN又はP又はQ,K37A又はE又はG又はH又はM又はN又はR又はT,V42F又はI,R44N又はQ,N47A又はG又はH又はM又はQ又はT又はW,N48H又はI又はK,E49A又はC,K50A又はD又はE又はF又はH又はS又はY,F53E又はH又はN又はP又はQ又はV,L54M,T55C又はD又はE,L56C又はN,E58N,L59H又はT,L68I,R71K又はM,S74D又はE又はN又はY,R77L,G78A又はD又はF又はL又はM,A79Q又はT,D81A又はF又はG又はM又はR又はS又はT又はV,R82A又はE又はH又はI又はK又はM又はQ又はS,F83W,V84A,S86A又はD又はM,G87D又はP,A91K又はW,T93A又はD又はE又はG又はL又はN又はP又はY,K94A又はD又はE又はH又はI又はL又はM又はN又はR又はS又はT,T95A又はE又はP又はQ又はS又はV又はY,L97F,H98A又はD又はF又はG又はI又はL又はM又はN又はQ,G99E又はF又はM、Q109E,S115A,Q116A又はC又はD又はE又はI又はP、E117C又はF又はL又はM又はV、A118M,S120H又はT又はV、K123L又はT、Q125E又はI又はY、N126A又はC又はD又はM又はT又はV、G127C,N128C又はD又はP又はQ、L130E,E131A又はC又はP又はQ又はS又はV、N132C又はD又はF又はH又はL又はR又はW又はY、L133D,K134E又はM又はQ又はS又はT又はV、D136E,I137E又はH又はN、K138I又はN、A139N,I140M又はW、L143S,L151C又はH又はI、G153C,N155I又はT又はV又はY、I156D又はN又はT、E159M,A160I,K161A又はC又はN又はQ、V162S,F163E又はQ、A164T,S166A又はD又はG、H167A又はE又はG又はK又はM又はR又はS又はT又はW、K169D又はI又はM又はS又はT、E170H又はK又はM又はQ又はT又はV、L171H又はK又はR又はS、S172A又はC、K175S,I176M,G177A又はC、K178A又はF又はR又はS又はT、E179A又はC又はL又はM又はN、L180C又はQ又はT、A181H又はQ又はS又はV、E182S,L190I又はM、R194L,Q197S,S204C,K211A又はN又はQ、N215C又はH、V217I,L219C,L221M,M228F又はY、I229V,S231K又はQ又はT、V232I,R235K,S241A又はM又はT、R242A又はD又はE又はH又はI又はM又はN又はQ又はS又はT、R245I又はL、R246D又はK、V247T,T251A又はG又はK又はR、H254D,A271C又はV、F272D又はG又はP又はW、D278A又はE又はN又はQ又はS又はT又はV又はW、C279A,S282A又はQ、I296V,T302H,D317E又はQ、N319F,A320C,Y327M,C331P,K348R又はY、G351D又はN、Y357M,A361T,D364E又はV、L365C又はM、A368N,F369M又はN又はR又はT又はV、L370G又はQ、Q371C又はS、A373G,Y377W,S380A又はC又はD又はQ又はT又はV、T383S,D386E又はN、G389H又はI、W392I又はS又はT又はV、K393Q,A407G,V408I,V409H又はI、Q410C又はD又はK又はL又はM又はT、N411G,K414E又はG又はL又はN又はP、K422A又はN又はT、Y423Q,H424E又はP又はQ又はV、S428E又はQ、R429I又はL又はT又はW又はY、H432E,L436M又はY、C437K又はT、L440I,A443R,S444P,I447A又はE又はM又はQ又はS、A448E又はM又はN又はP又はQ又はV、S457N又はT、M460Q又はR又はS、R461D又はE又はG又はQ又はS又はT、T462Q,K463A又はD又はE、G464L又はR、I465A又はC又はG又はS又はT、S466P,E468D,A470M,T471E又はH又はQ、E472D又はS、S473L又はV、M475T,E480N,L490A又はD又はE又はF又はH又はM、G491E又はK又はS又はT又はV又はY、G492C,L494D,A496P又はT、V500L又はM、E501D,T502A又はC又はR又はV、A503I,S510C又はV、T513V,H515N,A519S又はT、E525A又はC又はP又はQ又はS、V531A又はM又はT、T536A又はF又はG、E537K又はT、L540A又はP、P541M,F542P,及びR544Cからなる群から選択される残基の置換である。本発明の他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、実施例に例示する通りにと評価される改良されたイソプレン合成酵素特性を有するポリペプチド例えば、単離ポリペプチドであってよい。実施例に例示する通りにとカラムに表記されたこれらのポリペプチドは、配列番号1MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素と対応させて付番した残基位置に1つ以上の置換を有し得る。一部の非限定例では、改良されたイソプレン合成酵素特性を有する単離ポリペプチドは、配列番号1に対応する:X2,X3,X13,X17,X18,X19,X20,X23,X25,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X33,X34,X36,X37,X40,X41,X42,X43,X44,X45,X46,X47,X48,X49,X50,X51,X53,X54,X55,X56,X57,X59,X60,X62,X71,X73,X74,X75,X77,X78,X79,X81,X82,X83,X84,X85,X86,X87,X88,X89,X91,X92,X93,X94,X95,X97,X98,X99,X100,X101,X102,X103,X107,X109,X111,X113,X114,X115,X116,X117,X118,X119,X120,X121,X123,X124,X125,X127,X128,X129,X130,X131,X133,X134,X135,X136,X137,X138,X139,X140,X143,X146,X151,X152,X153,X155,X156,X158,X160,X161,X162,X163,X166,X167,X169,X170,X171,X172,X175,X176,X177,X178,X179,X180,X181,X182,X183,X185,X187,X193,X194,X196,X197,X204,X210,X211,X212,X215,X216,X217,X218,X219,X220,X222,X223,X224,X226,X228,X229,X231,X232,X235,X240,X241,X242,X246,X251,X253,X260,X268,X270,X271,X272,X275,X276,X278,X282,X307,X314,X315,X317,X320,X321,X323,X328,X329,X331,X332,X333,X343,X345,X346,X350,X351,X352,X356,X357,X360,X361,X363,X364,X366,X367,X368,X369,X370,X371,X378,X379,X380,X383,X386,X389,X390,X392,X393,X402,X405,X408,X409,X410,X413,X414,X418,X422,X423,X424,X425,X426,X428,X429,X431,X432,X437,X444,X447,X448,X457,X460,X461,X462,X463,X464,X466,X467,X468,X469,X471,X472,X475,X484,X489,X490,X491,X492,X493,X494,X497,X500,X501,X502,X503,X504,X506,X509,X510,X511,X513,X515,X517,X519,X522,X528,X529,X531,X534,X535,X536,X537,X539,X540,X542,及びX544からなる群から選択される残基のうちの1つ以上が置換されている。一部の実施形態では、これらの置換は、E2,A3,S13,D17,Y18,L19,L20,D23,D25,E26,S27,I28,E29,V30,Y31,K32,D33,K34,K36,K37,A40,E41,V42,R43,R44,E45,I46,N47,N48,E49,K50,A51,F53,L54,T55,L56,L57,L59,I60,N62,R71,E73,S74,D75,R77,G78,A79,D81,R82,F83,V84,S85,S86,G87,G88,F89,A91,V92,T93,K94,T95,L97,H98,G99,T100,A101,L102,S103,L107,Q109,G111,E113,V114,S115,Q116,E117,A118,F119,S120,G121,K123,D124,Q125,G127,N128,F129,L130,E131,L133,K134,E135,D136,I137,K138,A139,I140,L143,A146,L151,E152,G153,N155,I156,D158,A160,K161,V162,F163,S166,H167,K169,E170,L171,S172,K175,I176,G177,K178,E179,L180,A181,E182,Q183,N185,A187,H193,R194,T196,Q197,S204,K210,K211,E212,N215,Q216,V217,L218,L219,E220,A222,I223,L224,Y226,M228,I229,S231,V232,R235,T240,S241,R242,R246,T251,L253,L260,V268,V270,A271,F272,Q275,Y276,D278,S282,E307,E314,R315,D317,A320,I321,D323,M328,K329,C331,F332,L333,A343,D345,N346,K350,G351,E352,P356,Y357,K360,A361,A363,D364,C366,N367,A368,F369,L370,Q371,N378,K379,S380,T383,D386,G389,N390,W392,K393,V402,Y405,V408,V409,Q410,K413,K414,E418,K422,Y423,H424,D425,T426,S428,R429,S431,H432,C437,S444,I447,A448,S457,M460,R461,T462,K463,G464,S466,E467,E468,L469,T471,E472,M475,K484,K489,L490,G491,G492,S493,L494,K497,V500,E501,T502,A503,I504,L506,Q509,S510,H511,T513,H515,G517,A519,S522,R528,K529,V531,V534,I535,T536,E537,I539,L540,F542,及びR544からなる群から選択される残基に生じさせてよい。他の実施形態では置換は、E2H又はI又はS、A3E又はG又はK又はN又はQ又はR又はT,S13Q又はT,D17E,Y18F又はM又はN、L19F,L20I又はV、D23T,D25A又はE又はS,E26G又はN又はQ又はT,S27E又はF又はK又はV、I28E又はF又はM又はP、E29D又はP又はR又はT,V30N又はQ,Y31Q又はW,K32D又はG又はN又はR,D33N,K34D又はE又はQ又はS,K36F又はRK37F又はI、A40C又はD又はE又はF又はM又はN又はP又はQ又はV、E41C又はD又はF又はN又はQ又はS又はV、V42A又はS又はT,R43I又はQ,R44A又はD又はK又はM又はY,E45C又はM又はN又はQ,I46F又はV、N47E又はI又はK又はR又はV、N48A又はC又はE又はF又はL又はQ又はR又はS,E49G又はH又はI又はR又はS又はW、K50C又はG又はM又はN又はP又はR,A51E又はG又はL又はQ又はT,F53D,L54A又はC又はE又はH又はI又はQ,T55A又はH又はN又はQ又はS又はY,L56H又はQ又はR又はS,L57I,L59F又はM又はS又はV又はY,I60C又はV、N62V,R71I,E73D,S74G又はM又はP、D75E,R77A又はN又はT又はV、G78E又はI又はK又はN又はP又はQ又はV又はW、A79M又はR又はY,D81C又はE又はH又はL又はN、R82C又はF又はG又はL又はW、F83G又はH又はI又はL又はV、V84F又はH又はL又はN又はQ又はR又はS又はT又はW又はY,S85C又はL又はN又はR,S86C又はN、G87C又はE又はF又はK又はL又はN又はT,G88C又はD又はI又はV又はW又はY,又はY、又はI、A91C又はD又はE又はG又はH又はL又はR又はS又はT又はV又はY,V92A又はC又はE又はF又はG又はI又はL又はQ又はW、T93H又はI又はQ又はV又はW、K94C又はV又はY,T95C又はH又はK又はM,L97A又はM又はP、H98C又はS又はT又はV又はW、G99A又はC又はH又はP又はQ又はT,T100A又はI又はL又はM又はV、A101S,L102M,S103A又はC又はG又はL,L107C又はF,Q109C又はN又はS,G111A,E113C又はH又はV、V114C,S115D又はY,Q116G又はH又はL又はS又はT又はV、E117A又はD又はI、A118I又はV、F119L又はM,S120A又はD又はE又はF又はK又はN又はR又はW又はY,G121D又はL又はV又はW、K123I又はS又はW又はY,D124C又はE,Q125A又はD又はG又はH又はK又はL又はN又はS又はT又はV又はW、G127D又はF又はW、N128A,F129L又はY,L130A又はC又はD又はQ又はV又はY,E131D又はF又はG又はR,L133E又はG又はI又はP又はQ又はT又はV又はY,K134D又はG又はH又はI又はL又はN又はR又はW又はY,E135H又はS,D136N,I137A又はC又はD又はG又はP又はQ又はS又はV、K138C又はD又はE又はP又はR又はS又はV、A139P又はS又はT又はV、I140N又はQ又はS又はT又はV、L143A又はF又はG又はN又はR又はW、A146M,L151E又はG又はM又はN又はQ又はR又はS又はT又はV又はW、E152A又はD又はI又はM又はP、G153D,N155E又はK又はM,I156E又はK又はL又はR又はY,D158E,A160F又はH又はS,K161L又はR又はS又はY,V162D又はF又はN又はP又はT,F163C又はH又はI又はM又はV又はW又はY,S166C又はE又はH又はK又はP又はQ又はV又はW、H167C又はL又はP、K169E又はG又はR,E170G又はI又はN又はR,L171C又はE又はG又はI又はM又はW、S172G又はN又はQ又はR、K175A又はG又はH又はN又はP又はT又はV、I176A又はC又はN又はQ又はV、G177D又はE又はH又はN又はP又はT,K178D又はE又はG又はI又はL又はM又はN又はP又はQ又はV又はY,E179G又はI又はP又はQ又はS又はT又はV又はW又はY,L180F又はH又はV又はW、A181F又はM又はN又はW、E182H又はN、Q183A又はL,N185D,A187C又はS,H193W,R194I,T196V,Q197G,S204A又はF又はM又はW又はY,K210M,K211D又はE又はF又はG又はH又はI又はM又はR又はS又はT又はV、E212A又はD又はM又はP又はQ又はT,N215D又はY,Q216A又はE又はN、V217C又はE又はK又はN又はP又はQ又はT,L218V,L219I又はM又はV、E220D又はN、A222S,I223C,L224A又はC又はT又はV、Y226F,M228H又はR,I229A,S231D又はG又はH又はR又はV、V232Q,R235A又はD又はN、T240V,S241C,R242K又はL,R246H又はQ,T251H,L253M,L260M,V268I,V270I,A271S,F272Q,Q275E,Y276F又はH又はQ,D278L又はM又はR又はY,S282C,E307Q又はR,E314H,R315G又はK,D317S,A320N又はT,I321L又はM,D323I又はT,M328L,K329G又はQ又はR、C331T,F332Y,L333F,A343I又はV、D345Y,N346A,K350H又はW又はY,G351E又はM,E352F又はI又はM又はV、P356M又はS,Y357E,K360Q,A361Q又はS又はV、A363S,D364N又はT,C366A,N367D又はE又はM,A368D又はQ,F369H又はQ,L370A又はD又はE又はF又はH又はN又はR又はS又はT又はV、Q371G又はH又はI又はN又はP又はR又はT又はW又はY,N378D,K379E又はR又はS,S380K又はN、T383Q,D386K又はS,G389C又はM又はP又はR又はT,N390S,W392F又はM,K393H又はR,V402F又はI又はL,Y405F,V408Q又はS,V409C又はQ又はS,Q410E又はG又はH又はI又はR,K413P,K414C又はH又はI又はQ,E418N,K422G又はH又はQ又はR、Y423G,H424D又はG又はI又はS又はT,D425P,T426A又はM又はQ,S428V,R429A又はC又はD又はG又はH又はK又はN、S431G,H432A又はM,C437N,S444N又はQ又はT,I447K又はR,A448H又はS又はT,S457D,M460A又はE又はg、R461N,T462S,K463G又はN、G464A又はD又はE又はF又はH又はV又はY,S466E又はG又はK又はN又はT,E467N,E468A又はN又はP又はQ,L469A又はN、T471N,E472A又はG又はN、M475I,K484A,K489R,L490I又はY,G491A又はC又はM又はN又はQ,G492T又はV、S493C又はG又はK又はV、L494G又はI又はQ又はV、K497M又はT,V500I又はY,E501N,T502H,A503L又はM,I504L,L506I又はV、Q509A,S510T,H511I又はM,T513S,H515Q,G517P,A519C,S522A又はK,R528K,K529A,V531G又はN、V534A又はS,I535C又はS又はT,T536M,E537H又はN又はQ,I539V,L540E又はQ又はR又はV、F542M,及びR544G又はN又はP又はQ又はSからなる群から選択される。本発明の他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、実施例に例示する通りにと評価される改良されたイソプレン合成酵素特性を有するポリペプチドポリペプチド例えば、単離ポリペプチドであってよい。実施例に例示する通りにとカラムに表記されたこれらのポリペプチドは、配列番号1MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素と対応させて付番した残基位置に1つ以上の置換を有し得る。本発明の他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、実施例に例示する通りにと評価される改良されたイソプレン合成酵素特性を有するポリペプチド例えば、単離ポリペプチドであってよい。実施例に例示する通りにとカラムに表記されたこれらのポリペプチドは、配列番号1MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素と対応させて付番した残基位置に1つ以上の置換を有し得る。本発明の他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、イソプレン合成酵素特性が改良されており、配列番号1MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素に対応させて付番した残基位置の1箇所以上に置換を有し、実施例11の表31に示す通り、4と評価されるポリペプチド例えば、単離ポリペプチドであってよい。他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、イソプレン合成酵素特性が改良されており、配列番号1MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素に対応させて付番した残基位置の3箇所以上に置換を有し、実施例11の表31に示す通り、3と評価されるポリペプチド例えば、単離ポリペプチドであってよい。他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、イソプレン合成酵素特性が改良されており、配列番号1MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素に対応させて付番した残基位置の1箇所以上に置換を有し、実施例11の表31に示す通り、2と評価されるポリペプチド例えば、単離ポリペプチドであってよい。他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、イソプレン合成酵素特性が改良されており、配列番号1MEAウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素に対応させて付番した残基位置の1箇所以上に置換を有し、実施例11の表31に示す通り、1と評価されるポリペプチド例えば、単離ポリペプチドであってよい。代表的な核酸本発明のイソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸は、本発明の範囲内で提供され、企図される。各種実施形態では、核酸は組み換え核酸である。例えば、一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体の核酸は、組み換え核酸が、イソプレン合成酵素変異体と、別のポリペプチド例えば、融合ポリペプチドの精製又は検出を容易にする、His-タグなどといった、ペプチドの全て又は一部とを含む融合ポリペプチドをコードするよう、他のポリペプチドの全て又は一部をコードしている他の核酸に操作可能に連結させる。一部の実施形態では、組み換え核酸の一部又は全ては化学的に合成される。一部の態様では、核酸は異種核酸である。異種核酸とは、その核酸配列が同じホスト細胞内に自然に見出される別の核酸の配列と同一ではない核酸のことを意味する。一部の実施形態では、核酸は、天然に生じるイソプレン合成酵素核酸に由来する少なくとも約50、100、150、200、300、400、500、600、700、又は800以上連続する核酸を含む。一部の態様では、核酸は、野生型すなわち、天然に生じる配列イソプレン合成酵素核酸の配列と比較して1つ以上の変異を有する。一部の実施形態では、核酸は、イソプレン合成酵素の核酸の転写又は翻訳を増加させる変異例えば、サイレント変異を1箇所以上に有する。一部の実施形態では、核酸は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている任意の核酸を縮重させた変異体である。イソプレン合成酵素の核酸は、当業者に既知の標準法により、発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。イソプレン合成酵素、プロモーター、ターミネーター、並びに他の配列などの対象とする核酸を含むDNAコンストラクトを連結し、これらを好適なベクターに挿入するのに使用される手法は、当該技術分野において周知である。加えて、ベクターは、既知の組み換え法例えば、InvitrogenLifeTechnologiesのGateway法により構築することができる。一部の実施形態では、現在、天然に生じる細胞において観察されるよりもはるかに高濃度でイソプレン合成酵素の核酸を過剰発現させることが望ましい場合がある。核酸の過剰発現は、ポリペプチドをコードしている核酸を、マルチコピープラスミドに選択的にクローニングすることで、あるいはこれらの核酸を強誘導型の又は常時発現型のプロモータの制御下に配置することで、誘導することができる。所望のポリペプチドを過剰発現させる手法は、分子生物学領域で一般的で、かつ周知のものであり、その例は、Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarbor,2001に見出すことができる。経路に関係するポリペプチド例上記の通り、DXP経路及び/又はMVA経路の1つ以上のポリペプチドを、本開示に記載のイソプレン合成酵素変異体と組み合わせて使用して、イソプレン生産を増加させることができる。したがって、特定の態様では、MVA経路に関係する1つ以上のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸は異種核酸である。他の態様では、MVA経路に関係する1つ以上のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸は、内在性の核酸の複製である。本開示における任意の態様では、1つ以上のMVA経路に関係するポリペプチドは、a2分子のアセチル-CoAを縮合させてアセトアセチル-CoAを生成する酵素、bアセトアセチル-CoAをアセチル-CoAと縮合させてHMG-CoAを生成する酵素例えば、HMGシンターゼ、cHMG-CoAをメバロン酸に変換する酵素、dメバロン酸をしてリン酸化してメバロン酸5-リン酸を生成する酵素、eメバロン酸5-リン酸をメバロン酸5-ピロリン酸に変換する酵素、fメバロン酸5-リン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、並びにgイソペンテニルピロリン酸をジメチルアリールジホスフェートへと変換する酵素、から選択できる。本開示における任意の態様では、1つ以上のMVA経路に関係するポリペプチドは、aアセトアセチル-CoAをアセチル-CoAと縮合させてHMG-CoAを生成する酵素例えば、HMGシンターゼ、bHMG-CoAをメバロン酸へと変換する酵素、cメバロン酸リン酸をメバロン酸5-リン酸に変換する酵素、dメバロン酸5-リン酸をメバロン酸5-ピロリン酸に変換する酵素、並びにeメバロン酸5-ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、から選択される。本開示における任意の態様では、メバロン酸をリン酸化してメバロン酸5-リン酸を生成する酵素は、M.マゼイメバロン酸キナーゼ、ラクトバチルスメバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルスサケイメバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセスセレビシエメバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカスメバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカスニューモニアエメバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセスメバロン酸キナーゼポリペプチド、又はストレプトマイセスCL190メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択できる。本開示における任意の態様では、メバロン酸をメバロン酸5-リン酸へとリン酸化する酵素はM.マゼイメバロン酸キナーゼである。MVA経路上流に関係するポリペプチドMVA経路の上流は、細胞内代謝により生産されるアセチルCo-Aを、aiチオラーゼ活性又はiiアセトアセチル-CoA合成酵素活性、bHMG-CoA還元酵素、及びcHMG-CoA合成酵素活性のいずれかの活性をもつポリペプチドの作用によりメバロン酸に変換する際の開始基質として利用する。まず始めに、チオラーゼ又はアセトアセチル-CoA合成酵素アセチル-CoA及びマロニル-CoAを利用するの作用によりアセチルCo-AをアセトアセチルCoAに変換する。次に、アセトアセチル-CoAは、HMG-CoA合成酵素の酵素作用により、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAHMG-CoAへと変換される。このCo-A誘導体をHMG-CoA還元酵素により還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド生産の律速段階となる。MVA経路上流に関係するポリペプチドの非限定例としては、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼAA-CoAチオラーゼポリペプチド、アセトアセチル-CoAシンターゼポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAシンターゼHMG-CoAシンターゼポリペプチド、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA還元酵素HMG-CoA還元酵素ポリペプチドが挙げられる。MVA経路上流のポリペプチドには、MVA経路上流のポリペプチドの活性を少なくとも1つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが含まれる。MVA経路上流に関係する代表的な核酸としては、MVA経路上流に関係するポリペプチドの活性を少なくとも1つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。MVA経路に関係する代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。したがって、本開示では、MVA経路上流関連性ポリペプチドをコードしている任意の遺伝子は、本発明において使用できることを企図する。特定の実施形態では、L.グレイー、E.フェシウム、E.ガリナルム、E.カセリフラブス及び/又はE.フェーカリス由来の様々なmvaE及びmvaS遺伝子を、単独で、あるいはMVA経路上流関連性タンパク質をコードしている1つ以上の他のmvaE及びmvaS遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。他の実施形態では、アセトアセチル-CoA合成酵素の遺伝子は、i3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA合成酵素HMG-CoA合成酵素ポリペプチド及び3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA還元酵素HMG-CoA還元酵素ポリペプチドをコードしている1つ以上の他の遺伝子との組み合わせで本発明の範囲内のものとして企図される。したがって、特定の態様では、企図される遺伝子の任意の組み合わせを、本開示に記載される任意の手法により、組み換え細胞で発現させることができる。国際公開出願第2009/076676号、同第2010/003007号、及び同第2010/148150号に記載の、MVA経路上流に関係するポリペプチドのその他の非限定例を、本開示に使用できる。mvaE及びmvaSポリペプチドをコードしている遺伝子特定の実施形態では、L.グレイー、E.フェシウム、E.ガリナルム、E.カセリフラブス及び/又はE.フェーカリス由来の様々なmvaE及びmvaS遺伝子を、単独で、あるいはMVA経路上流関連性タンパク質をコードしている1つ以上の他のmvaE及びmvaS遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。L.グレイー、E.フェシウム、E.ガリナルム、E.カセリフラブス、及びE.フェーカリスでは、mvaE遺伝子は、チオラーゼ及びHMG-CoA還元酵素の活性のいずれをも保有しているポリペプチドをコードする。実際に、mvaE遺伝子産物は、真性細菌で見られる、IPP生合成に関係する最初の二機能性酵素となるものであり、HMG-CoA還元酵素の第一例は、天然において他のタンパク質と融合していたHedl,etal.,JBacteriol.2002April;1848:2116~2122。それに対しmvaS遺伝子は、HMG-CoA合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする。したがって、組み換え細胞例えば、大腸菌は、L.グレイー、E.フェシウム、E.ガリナルム、E.カセリフラブス及び/又はE.フェーカリス由来のmvaE及びmvaS遺伝子を1つ以上発現してメバロン酸を生成するよう設計することができる。1つ以上のmvaE及びmvaS遺伝子をマルチコピープラスミドで発現させることもできる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、1つ以上のmvaE及びmvaS遺伝子を宿主細胞の染色体に組み込むことができる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、1つ以上のmvaE及びmvaS遺伝子のいずれもの異種発現に際し、遺伝子発現は、誘導型プロモーター又は常時発現型プロモーターのいずれかにより駆動できる。プロモーターは、1つ以上のmvaE及びmvaS遺伝子の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。本開示における任意の態様では、組み換え宿主細胞は、1種以上の1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸DXP経路に関係するポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸を更に含み得る。一態様では、DXP経路に関係するポリペプチドを1つ以上コードしている1つ以上の核酸は、異種核酸である。他の態様では、DXP経路に関係する1種以上のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸は、内在性の核酸の複製である。特定の態様では、DXP経路に関係するポリペプチドは、a1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼDXS、b1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼDXR、c4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールシンターゼMCT、d4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼCMK、e2C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼMCS、f1-ヒドロキシ-2-メチル-2-E-ブテニル-4-二リン酸シンターゼHDS、及びg1-ヒドロキシ-2-メチル-2-E-ブテニル-4-二リン酸レダクターゼHDRからなる群から選択される。他の態様では、DXP経路関連性ポリペプチドはDXSである。他の態様では、当業者は、Wood-Ljungdahl経路の酵素を利用しない経路により、1分子のグルコースから3分子のアセチル-CoAを生成し得る、代替的な代謝過程を使用できる。その代わりに、特定の生物、特にビフィドバクテリウム属において見出されるホスホケトラーぜを使用する[例えば、BiologyoftheProkaryotesed.Lengeler,DrewsandSchlegel;BlackwellScience,NewYork,1999,p.299~301;Meileetal.,J.ofBacteriology,2001,183:9,2929~36;Jeongetal.,J.Microbiol.Biotechnol.,2007,17:5,822~829を参照されたい]。ホスホケトラーゼ酵素は、典型的な代謝で用いられるピルビン酸の酸化以外の経路により、キシルロース5-リン酸又はフルクトース6-リン酸からのアセチル-CoAリン酸アセチルを介するの生成を行うことができる。ホスホケトラーゼポリペプチドを用いアセチルCoAの生合成を増加させることで、メバロン酸経路上流に依存する生合成経路の生産性が向上し、メバロン酸の生合成が大幅に増加し、結果として、DMAPP及びIPPなどの下流のイソプレノイド前駆体分子の生合成を増加させることができる。標準法を使用し、ペプチドがD-フルクトース6-リン酸又はD-キシルロース5-リン酸をアセチル-Pへと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがホスホケトラーゼペプチド活性を有するかを判断できる。次に、アセチル-Pはフェリルアセチルヒドロキサム酸ferrylacetylhydroxamateへと変換され得る。この変換は、分光測定により検出可能であるMeileetal.,J.Bact.183:2929~2936,2001。ペプチド活性を有するものとして同定されたポリペプチドであれば、本発明に使用するのに好適である。代表的なホスホケトラーゼ核酸としては、限定するものではないが、ラクトバチルスロイテリ、ビフィオバクテリアムロンガム、フェリモナスバレアリカ、ペドバクターサルタンス、ストレプトマイセスグリセウス、及び/又はノカルディオプシスダッソンビレイから単離したホスホケトラーゼが挙げられる。アセトアセチル-CoA合成酵素遺伝子他の態様では、アセトアセチル-CoA合成酵素の遺伝子akanphT7を使用できる。アセトアセチル-CoA合成酵素遺伝子は、マロニル-CoA及びアセチル-CoAからアセトアセチル-CoAを合成する活性を有し、かつ2分子のアセチル-CoAからアセトアセチル-CoAを合成する活性は最小限である例えば、非活性である酵素をコードしている遺伝子である。例えば、Okamuraetal.,PNASVol107,No.25,pp.11265~112702010を参照されたい。この文献中のnphT7に関する教示は、本開示に明確に援用される。日本国特許公開第2008-61506A号及び米国特許出願公開第2010/0285549号には、放線菌のストレプトマイセス属CL190株のアセトアセチル-CoA合成酵素遺伝子が記載されている。アセトアセチル-CoA合成酵素も、アセチルCoA:マロニルCoAアシル基転移酵素として参照され得る。使用することのできる代表的なアセトアセチル-CoA合成酵素又はアセチルCoA:マロニルCoAアシル基転移酵素としては、GenbankAB540131.1が挙げられる。本開示に記載の任意の態様又は実施例では、マロニル-CoA及びアセチル-CoAからアセトアセチル-CoAを合成する能力を有する酵素を使用できる。本開示に記載の特定の実施形態では、マロニル-CoA及びアセチル-CoAからアセトアセチル-CoAを合成する能力を有する放線菌のストレプトマイセス属から誘導されるアセトアセチル-CoA合成酵素遺伝子を使用できる。代表的な宿主細胞本開示において請求される手法により、各種宿主細胞を用い、イソプレン合成酵素変異体を発現することのできる組み換え宿主細胞を生成し、イソプレンを生産することができる。宿主細胞は、天然にイソプレンを生産する細胞であっても、あるいは天然には生産しない細胞であってもよい。一部の実施形態では、宿主細胞はDXP経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、この経路を使用したイソプレンの生成を促進するために、イソプレン合成酵素、DXP経路ポリペプチド例えば、DXS、及び/又はIDI核酸が加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞はMVA経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、この経路を使用したイソプレンの生成を促進するために、イソプレン合成酵素及び/又はMVA経路に関係する核酸が1つ以上加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞はDXP経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、MVA経路及びDXP経路の一部又は全体を使用してイソプレンを生成するために、MVA経路に関係した核酸が1つ以上加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞は、DXP及びMVA経路の両方を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、これらの経路の一方又は両方によるイソプレンの生成を促進するために、イソプレンシンターゼ核酸、DXS核酸、IDI核酸、又はMVA経路に関係する核酸が1つ以上加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピキア属、カンジダ属又はY.リポリィティカなどの酵母である。一部の実施形態では、宿主細胞は、B.リケノフォルミスBlichenoformis又は枯草菌などのバチルス株、P.シトレアなどのパントエア株、P.アルカリゲネスなどのシュードモナス属株、S.リビダンス又はS.ルビギノーサスなどのストレプトマイセス株、大腸菌などのエシェリキア株、エンテロバクター株、ストレプトコッカス株、メタノサルシナマゼイなどの古細菌株、又はC.グルタニカムなどのコリネバクテリウム株である。本明細書で使用するとき、バチルス属としては、当業者に既知のバチルス属のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、枯草菌、B.リケニフォルミス、B.レンタス、B.ブレービス、B.ステアロサーモフィルス、B.アルカロフィルスBalkalophilus、B.アミロリケファシエンス、B.クラウシイ、B.ハロデュランス、B.メガテリウム、B.コアグランス、B.サークランス、B.ロータス、及びB.チューリンゲンシスが挙げられる。バチルス属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、再分類された種を含む属としては、限定するものではないが、現在ゲオバチルスステアロサーモフィルスとして命名されているB.ステアロサーモフィルスなどの生物が包含されるものと意図する。酸素の存在下での耐性内生胞子の生産を行うという特徴は、バチルス属を定義する特徴であると考えられるものの、この特徴は、近年アリサイクロバチルス、アムピバチルス、アネウリニバチルス、アノキシバチルス、ブレビバチルス、フィロバチルス、グラシリバチルス、ハロバチルス、パエニバチルス、サリバチルスSalibacillus、サーモバチルス、ウレイバチルス、及びバルジバチルスと呼ばれる微生物にも当てはまる。一部の実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトマイセス株例えば、S.リビダンス、S.コエリカラー、又はS.グリセウス及びバチルス株が挙げられる。一部の実施形態では、生物資源は、大腸菌又はシュードモナス属などのグラム陰性細菌である。一部の態様では、宿主細胞は植物であり、例えば、マメ科、例えばマメ亜科Faboideaeなどの植物である。一部の態様では、生物資源はクズ、ポプラ例えば、ウラジロハコヤナギ又はウラジロハコヤナギxトレムラCAC35696など、ヤマナラシ例えば、アメリカヤマナラシ、又はヨーロッパナラである。一部の態様では、宿主細胞は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ミドリムシ目、クロミスタ、又は渦鞭毛藻類である。一部の実施形態では、宿主細胞はラン藻であり、例えば、形態学的に次の群:クロオコッカス、プレウロカプサ、オスシラトリアルスOscillatoriales、ネンジュモ、又はスティゴネマのいずれかに分類されるラン藻などが挙げられる。一部の実施形態では、宿主細胞は嫌気性細菌である。嫌気性細菌は増殖の際に酸素を必要としない微生物である。嫌気性微生物は、偏性嫌気性細菌、通性嫌気性細菌、又は耐気性細菌であり得る。これらの微生物は、上掲のバクテリア、及び酵母などの任意の微生物であり得る。偏性嫌気性細菌は、大気中酸素濃度で死に至る、嫌気性細菌である。偏性嫌気性細菌の例としては、限定するものではないが、クロストリジウム、ユーロバクテリウムEurobacterium、バクテロイデス、ペプトストレプトコッカス、ブチリバクテリウムButyribacterium、ベイロネラ、及びアクチノマイセスが挙げられる。一実施形態では、偏性嫌気性細菌はクロストリジウムリュングダリイ、クロストリジウムオートエタノジナムClostridiumautoethanogenum、ユウバクテリウムリモサム、クロストリジウムカルボキシジボランスClostridiumcarboxydivorans、ペプトストレプトコッカスプロダクツスPeptostreptococcusproductus、及びブチルバクテリウムメチロトロフィカムButyribacteriummethylotrophicumからなる群から選択されるいずれか1種、あるいはこれらの組み合わせであってよい。通性嫌気性細菌は、酸素の存在下で好気性呼吸を行うことができ、かつ酸素の制限下又は酸素非存在下では嫌気性の発酵を行うことのできる嫌気性細菌である。通性嫌気性細菌の例としては、限定するものではないが、エシェリキア、パントエア、酵母、並びにヤロウイアが挙げられる。一部の実施形態では、宿主細胞は光合成細菌である。他の実施形態では、宿主細胞は非光合成細菌である。使用することのできる他の代表的な宿主細胞は、米国特許出願公開第2009/0203102号、国際公開第2009/076676号、同第2010/003007号、同第2009/132220号、同第2010/031062号、同第2010/031068号、同第2010/031076号、同第2010/031077号、及び国同第2010/031079号に記載されている。代表的な形質転換方法イソプレン合成酵素、DXS、IDI、及び/又はMVA経路の核酸又はこれらの核酸を収容しているベクターは、これらの核酸にコードされているイソプレン合成酵素、DXS、IDI、及び/又はMVA経路に関係するポリペプチドを発現させる際、標準的な発現法を用い、宿主細胞例えば、バクテリア細胞に挿入することができる。宿主細胞へのDNAコンストラクト又はベクターの導入は、形質転換、電気穿孔法、核酸のマイクロインジェクション、形質導入、形質移入例えば、リポフェクションを利用した又はDEAE-デキストリンを利用した形質移入、あるいは組み換えファージウイルスを用いた形質移入、リン酸カルシウムDNA沈殿法を用いるインキュベーション、DNAコートした微粒子銃による高速導入、及びプロトプラストの融合などの手法により実施できる。一般的な形質転換法は、当該技術分野において既知である例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiologyF.M.Ausubeletal.edsChapter9,1987;Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,ColdSpringHarbor,2001;並びにCampbelletal.,CurrGenet,16:53~56,1989を参照されたい。これらの開示は、それぞれ参照によりその全体が組み込まれ、特に形質転換法に関して組み込まれる。導入された核酸は、染色体DNAに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。使用することのできる他の代表的な形質転換法は、米国特許出願公開第2009/0203102号、国際公開第2009/076676号、同第2010/003007号、同第2009/132220号、同第2010/031062号、同第2010/031068号、同第2010/031076号、同第2010/031077号、及び国際公開第2010/031079号に記載されている。代表的な細胞培養培地宿主細胞を培養するにあたり任意の炭素源を使用することができる。用語炭素源は、宿主細胞又は生物により代謝することのできる、1つ以上の炭素を含有している化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するにあたり使用される細胞培地には、宿主細胞の生存能を維持させる又は宿主細胞を増殖させるのに好適な任意の炭素源を包含させることができる。一部の実施形態では、炭素源は炭水化物単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖など、転化糖例えば、酵素により処理したスクロースシロップ、グリセロール、グリセリン例えば、バイオディーゼル又は石鹸の製造工程で生成される副産物のグリセリン、ジヒドロキシアセトン、C1化合物からなる炭素源、脂肪酸例えば、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、又は多価不飽和脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ポリペプチド例えば、微生物又は植物タンパク質又はペプチド、再生可能な炭素源例えば、加水分解したバイオマス由来の炭素源、甜菜糖又はサトウキビ廃糖蜜などのバイオマスに由来する炭素源、酵母エキス、酵母エキス由来の成分、ポリマー、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、コハク酸エステル、乳酸塩、酢酸塩、エタノール、又はこれらのうちの任意の2つ以上の組み合わせである。一部の実施形態では、炭素源は、限定するものではないが、グルコースなどの光合成生成物である。単糖の例としては、グルコース及びフルクトースが挙げられ、オリゴ糖の一例としては、ラクトース及びスクロースが挙げられ、並びに多糖の例としては、デンプン及びセルロースが挙げられる。代表的な糖としては、六炭糖例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース及び五炭糖例えば、キシロース又はアラビノースが挙げられる。一部の実施形態では、細胞培地は、糖、並びに糖以外の炭素源例えば、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、C1化合物、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、又は酵母エキス由来の成分を含有する。一部の実施形態では、細胞培地は、糖、並びにポリペプチド例えば、微生物由来又は植物由来タンパク質又はペプチドを含有する。一部の実施形態では、微生物由来ポリペプチドは、酵母又はバクテリア由来のポリペプチドである。一部の実施形態では、植物ポリペプチドは、大豆、トウモロコシ、セイヨウアブラナ、タイワンアブラギリ、パーム、落花生、ヒワマリ、ココナツ、カラシナ、ナタネ、綿実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、胡麻、又は亜麻仁由来のポリペプチドである。一部の実施形態では、糖濃度は、ブロス1L当たり、少なくとも約5グラム以上であり5g/L、ここで、ブロスの体積には、細胞培地の体積及び細胞体積を包含する、例えば、少なくとも約10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、又は400g/L以上である。一部の実施形態では、糖濃度は、約50~約400g/Lであり、例えば、約100~約360g/L、約120~約360g/L、又は約200~約300g/Lである。一部の実施形態では、この糖濃度には、宿主細胞の培養前及び/又は培養中に添加された糖の総量が含まれる。代表的な脂質は、C4脂肪酸を1つ以上含有している任意の物質であり、なかでも飽和、不飽和、又は分岐型脂肪酸である。代表的な脂肪酸としては、式R-COOHの化合物が挙げられ、ここで、Rは炭化水素である。代表的な不飽和脂肪酸としては、Rが炭素-炭素二重結合を少なくとも1つ含有する化合物が挙げられる。代表的な不飽和脂肪酸としては、限定するものではないが、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミトエライジン酸、及びアラキドン酸が挙げられる。代表的なポリ不飽和脂肪酸としては、Rが炭素-炭素二重結合を複数含有する化合物が挙げられる。代表的な飽和脂肪酸としては、Rが飽和脂肪族基である化合物が挙げられる。一部の実施形態では、炭素源には、C12飽和脂肪酸、C14飽和脂肪酸、C16飽和脂肪酸、C18飽和脂肪酸、C20飽和脂肪酸、又はC22飽和脂肪酸などのC12~C22脂肪酸が1種以上含有される。代表的な実施形態では、脂肪酸はパルミチン酸である。一部の実施形態では、炭素源は脂肪酸塩例えば、不飽和脂肪酸、脂肪酸誘導体例えば、不飽和脂肪酸、又は脂肪酸誘導体の塩例えば、不飽和脂肪酸である。好適な塩としては、限定するものではないが、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、及びこれに類するものなどが挙げられる。ジ-及びトリグリセロールはグリセロールの脂肪酸エステルである。一部の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリド濃度は、ブロス1L当たり、少なくとも約1グラム以上であり1g/L、ここで、ブロスの体積には、細胞培地の体積及び細胞体積を包含する、例えば、少なくとも約5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、又は400g/L以上である。一部の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの濃度は、約10~約400g/Lであり、例えば、約25~約300g/L、約60~約180g/L、又は約75~約150g/Lである。一部の実施形態では、濃度には、宿主細胞の培養前及び/又は培養中に添加した脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの総量が含まれる。一部の実施形態では、炭素源は、i脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリド、及びiiグルコースなどの糖を両方含有する。一部の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの、糖に対する比率は、炭素基準で約1:1すなわち、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドは糖炭素毎に1つずつである。特定の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの量は、約60~180g/L、糖質の量は約120~360g/Lである。代表的な微生物ポリペプチド炭素源としては、酵母又はバクテリア由来の1種以上のポリペプチドが挙げられる。代表的な植物ポリペプチドの炭素源としては、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、タイワンアブラギリ、パーム、落花生、ヒワマリ、ココナツ、カラシナ、ナタネ、綿実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、胡麻又は亜麻仁由来の一種以上のポリペプチドが挙げられる。代表的な再生可能な炭素源としては、乳清浸透液、コーンスティープリカー、甜菜廃糖蜜、大麦モルト、及び前述のいずれか由来の成分が挙げられる。また、代表的な再生可能な炭素源としては、トウモロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、発酵工程に関係する細胞廃棄物、及び大豆、トウモロコシ、若しくは小麦の粉砕に由来するタンパク質副生成物などのバイオマス中に存在する、グルコース、ヘキソース、ペントース及びキシロースも挙げられる。いくつかの実施形態では、バイオマス炭素源はリグノセルロース、ヘミセルロース、又はセルロース材料であり、例えば、草、小麦、小麦わら、バガス、サトウキビバガス、軟質木材パルプ、トウモロコシ、トウモロコシの芯又は皮、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穀粒の繊維、トウモロコシ茎葉、スイッチグラス、籾殻製品、又は穀粒トウモロコシ、ソルガム、ライ麦、ライ小麦、大麦、小麦、及び/又は醸造かすの湿式若しくは乾式粉砕による副生成物が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なセルロース材料には、木、紙及びパルプ廃棄物、草質植物、及び果実パルプが挙げられる。いくつかの実施形態では、炭素源には、茎、穀粒、根、又は塊茎などの任意の植物部分が挙げられる。一部の実施形態では、次のいずれかの植物:トウモロコシ、小麦、ライ麦、ソルガム、ライ小麦、米、キビ、大麦、キャッサバ、マメ科植物、例えば、豆及び豌豆、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、及び/又はタピオカの、一部又は全体を炭素源として使用する。いくつかの実施形態では、炭素源は、キシロースとグルコースの両方を含むか、スクロースとグルコースの両方を含むバイオマス加水分解産物などの、バイオマス加水分解産物である。一部の実施形態では、細胞培養培地に加える前に、再生可能な炭素源バイオマスなどを前処理する。一部の実施形態では、前処理としては、酵素処理、化学処理、あるいは酵素及び化学処理の両方の組み合わせが挙げられる例えば、Farzanehetal.,BioresourceTechnology9618:2014~2018,2005;米国特許第6,176,176号;同第6,106,888号を参照されたい。一部の実施形態では、再生可能な炭素源は、細胞培養培地に加える前に一部又は完全に加水分解する。一部の実施形態では、再生可能な炭素源トウモロコシ茎葉などは、細胞培養培地に加える前に、アンモニア爆砕AFEXによる前処理を行う例えば、Farzanehetal.,BioresourceTechnology9618:2014~2018,2005を参照されたい。AFEX前処理時には、再生可能な炭素源を、温和な温度約60~約100°C、及び高圧約250~約300psi約1.72~約2.07MPaで液体無水アンモニアにより約5分処理する。次に、圧を急速に開放する。この手法では、リグニン可溶化、ヘミセルロース加水分解、セルロースの脱結晶化などの化学作用及び物理作用を組み合わせ、表面積を増大させることで、酵素によるセルロース及びヘミセルロースの発酵糖へのほぼ完全な変換を可能にする。AFEX前処理は、ほとんどすべてのアンモニアを回収し、再利用することができ、なおかつ残余は下流工程において微生物用の窒素源として役立つという利点を有する。同様に、洗浄流にはAFEX前処理は必要とされない。したがって、AFEX処理後の乾燥物質の回収率は実質的に100である。AFEXは、乾燥対乾燥プロセスを基本とする。処理後の再生可能な炭素源は、長期にわたって安定であり、酵素加水分解又は発酵工程時に固体充填量を非常に多くして供給できる。セルロース及びヘミセルロースは、AFEX工程でほとんど又は全く分解されずに良好に保存される。AFEX前処理後の再生可能な炭素源は、酵素加水分解する前に中和する必要はない。AFEX処理後に炭素源を酵素加水分解し、混じりけのない糖ストリームを生成し、続いてこれを発酵に使用する。一部の実施形態では、炭素源例えば、再生可能な炭素源濃度は、少なくとも又は約0.1、0.5、1、1.52、3、4、5、10、15、20、30、40、又は50グルコースw/vに相当する。グルコース等量は、参照としてグルコースを用い、炭素源から生成されたグルコース量を測定する、標準的HPLC法によって割り出すことができる。一部の実施形態では、炭素源例えば、再生可能な炭素源濃度は、約0.1~約20グルコース、例えば、約0.1~約10グルコース、0.5~約10グルコース、約1~約10グルコース、約1~約5グルコース、又は約1~約2グルコースに相当する。一部の実施形態では、炭素源には、酵母エキス又は酵母エキスに含まれる1種以上の成分が含まれる。一部の実施形態では、糖濃度は、ブロス1L当たり、少なくとも約1グラム以上であり1g/L、ここで、ブロスの体積には、細胞培地の体積及び細胞体積を包含する、例えば、少なくとも約5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、又は300/L以上である。一部の実施形態では、酵母エキスの濃度は約1~約300g/Lであり、例えば、約1~約200g/L、約5~約200g/L、約5~約100g/L、又は約5~約60g/Lである。一部の実施形態では、この酵母エキス濃度には、宿主細胞の培養前及び/又は培養中に添加された酵母エキスの総量が含まれる。一部の実施形態では、炭素源には、酵母エキス又は酵母エキスに含まれる1種以上の成分及び他の炭素源、例えばグルコースの両方を含む。一部の実施形態では、酵母エキス対他の炭素源の比は、約1:5、約1:10、又は約1:20w/wである。これに加え、炭素源には、炭酸ガス、又はメタノールなどのC1化合物からなる基質も含まれる。メチロトローフ酵母Yamadaetal.,Agric.Biol.Chem.,532541~543,1989及びバクテリアHunteret.al.,Biochemistry,24,4148~4155,1985により、C1化合物基質例えば、メタノール、ホルムアルデヒド、又はギ酸からグリセロールが生成されることも報告されている。これらの生物は、メタンをギ酸に酸化して、C1化合物を同化し、グリセロールを生成できる。炭素の同化経路は、リブロースモノリン酸、セリン、又はキシルロース-モノリン酸を介するものであり得るGottschalk,BacterialMetabolism,SecondEdition,Springer-Verlag:NewYork,1986,参照により全体を、特に炭素源に関する記載を本開示に組み込む。リブロースモノリン酸経路は、ギ酸をリブロース-5-リン酸と縮合させて、六炭糖のフルクトースを生成し、最終的には、三炭糖生成物であるグリセルアルデヒド-3-リン酸を生成する。同様に、セリン経路では、C1化合物をメチレンテトラヒドロ葉酸により同化し、解糖系に送り込む。メチロトローフは、C1及びC2基質に加え、数多くのその他の炭素含有化合物を、例えば、メチルアミン、グルコサミン、及び代謝活性に関係する数多くのアミノ酸を利用することも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンに含まれる炭素を利用し、トレハロース又はグリセロールを生成することが知られているBellionetal.,Microb.GrowthClCompd.,Int.Symp.,7thed.,415~32.Editors:Murrelletal.,Publisher:Intercept,Andover,UK,1993。同様にして、数多くの種類のカンジダが、アラニン又はオレイン酸を代謝するSulteretal.,Arch.Microbiol.1535,485~9,1990。一部の実施形態では、細胞は、生理的塩類及び栄養分を含有している標準培地で培養する例えば、Pourquie,J.etal.,BiochemistryandGeneticsofCelluloseDegradation,eds.Aubertetal.,AcademicPress,pp.71~86,1988;andIlmenetal.,Appl.Environ.Microbiol.63:1298~1306,1997を参照されたい。代表的な増殖培地は、ルリア-ベルターニLBブロス、サブローデキストロースSDブロス、又は酵素培地YMブロスなどの一般的な商業的に製造された培地である。微生物学又は発酵科学に関係する当業者には、使用することのできるその他の制限培地又は合成増殖培地、並びに特定の宿主細胞の増殖に好適な培地は知られているであろう。細胞培地は、適当な炭素源以外に、適当なミネラル、塩類、補因子、バッファー、及び培養の増殖又はイソプレン生成の促進に適した当業者には周知の他の成分を含むことが望ましい例えば、国際特許出願公開第2004/033646号及び当該明細書の引用文献、並びに国際特許出願公開第96/35796号及び当該明細書の引用文献を参照。イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、及び/又はMVA経路の核酸が誘導性プロモーターの制御下にあるような一部の実施形態では、イソプレンシンターゼ、DXS、IDI、及び/又はMVA経路ポリペプチドの発現を誘導するうえで有効な濃度で、誘導剤例えば、糖、金属塩又は抗微生物剤などを培地に加えることが望ましい。一部の実施形態では、細胞培地には、DXS、IDI、又はMVA経路に関係する1つ以上の核酸を有するベクター上の抗生物質耐性核酸カナマイシン耐性核酸などに対応した抗生物質カナマイシンなどを含有させる。使用することのできる他の代表的な細胞培養培地は、米国特許出願公開第2009/0203102号、国際公開第2009/076676号、同第2010/003007号、同第2009/132220号、同第2010/031062号、同第2010/031068号、同第2010/031076号、同第2010/031077号、同第2010/031079号に記載されている。代表的なイソプレン生産法一部の実施形態では、イソプレン生産条件下で細胞を培養培地で培養する。一部の実施形態では、培養時に細胞が生産するイソプレン量は、1時間につき、細胞の湿潤重量1g当たり、約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、又は5,000ナノモルnmole/gwcm/hr以上である。一部の実施形態では、イソプレンの量は、約2~約5,000nmole/gwcm/hr、例えば、約2~約100nmole/gwcm/hr、約100~約500nmole/gwcm/hr、約150~約500nmole/gwcm/hr、約500~約1,000nmole/gwcm/hr、約1,000~約2,000nmole/gwcm/hr、又は約2,000~約5,000nmole/gwcm/hrである。nmole/gwcm/hr単位のイソプレンの量は、米国特許第5,849,970号に開示の通りに測定できる。例えば、ヘッドスペース2mLに含まれるイソプレン例えば、密閉したバイアル瓶で、32°C、200rpmで振盪させながら約3時間培養した2mL培養物などの培養物から、ヘッドスペースに放出されたイソプレンは、n-オクタン/porasilCカラムAlltechAssociates、Inc.Deerfield、ILを取り付け、RGD2酸化水銀還元ガス検出器TraceAnalyticalMenloPark、CAに連結させた等温操作系85°Cなどの、一般的なガスクロマトグラフィー系を用い測定する例えば、Greenbergetal,Atmos.Environ.27A:2689~2692,1993;Silveretal.,PlantPhysiol.97:1588~1591,1991を参照されたい。標準イソプレン濃度をもとにした検量線により、ガスクロマトグラフィーの面積単位をイソプレン量nmolに変換する。一部の実施形態では、細胞の湿潤重量g当たりの値は、細胞培養物サンプルのA600値を得、次に、A600値が既知である細胞培養物の湿潤重量に関する検量線をもとにA600値を細胞重量gに変換することで算出する。一部の実施形態では、細胞重量gは、ブロス1L細胞培地及び細胞を含むのA600値が1である場合、湿潤細胞が1g含まれているものと仮定し、概算する。この値を、培養物をインキュベートした時間数例えば3時間で除算する。一部の実施形態では、培養時に細胞が生産するイソプレン量は、1時間につき、細胞の湿潤重量1g当たり、約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、又は100,000ngng/gwcm/h以上である。一部の実施形態では、イソプレン量は、約2~約5,000ng/gwcm/h、例えば、約2~約100ng/gwcm/h、約100~約500ng/gwcm/h、約500~約1,000ng/gwcm/h、約1,000~約2,000ng/gwcm/h、又は約2,000~約5,000ng/gwcm/hである。イソプレン量inng/gwcm/hは、上記のイソプレン生産量nmole/gwcm/hrに68.1を乗じることで算出できる以下の式5に記載の通り。一部の実施形態では、細胞は、培養時に累積力価総量約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000mg/Lブロス1L当たりの生産量mg。ここで、ブロス体積には、細胞体積及び細胞培地の体積を含む以上のイソプレンを生産する。一部の実施形態では、イソプレン量は約2~約5,000mg/L、例えば、約2~約100mg/L、約100~約500mg/L、約500~約1,000mg/L、約1,000~約2,000mg/L、又は約2,000~約5,000mg/Lである。振盪フラスコ又は同様の培養装置におけるイソプレンの比生産量mg/Lは、OD600が約1.0の細胞培養物から試料を1mL採取し、20mLバイアル瓶に移し入れ、30分インキュベートした後に、ヘッドスペース中のイソプレン量を測定することで、測定できる。OD600が1.0でない場合、測定値は、OD600により除算して、OD600が1.0になるよう標準化できる。ヘッドスペースに含まれるイソプレン量mg/Lに係数38を乗じ、培養培地のOD600値をもとにした、1時間当たりのイソプレン生産量mg/Lブロス/hr/OD600に変換することもできる。単位mg/Lブロス/hr/OD600の値に、時間数とOD600値を乗じ、イソプレンmg/Lブロス単位での累積力価を得ることもできる。発酵槽の瞬間イソプレン生産速度mg/Lブロス/hrは、発酵槽で放出された気体試料を採取し、イソプレン量気体1L当たりのイソプレン重量mgなどの単位を解析し、この値に、ブロス1Lにつき放出される気体速度例えば、1時間当たりに60Lの気体が放出されることを意味する1vvm気体体積/ブロス体積/分を乗じることで測定することができる。したがって、気体の放出濃度が1mg/Lである場合、空気流1vvm下での瞬間生産速度は60mg/Lブロス/hrに相当する。必要に応じて、単位mg/Lブロス/hrの値をOD600により除算することで、mg/Lブロス/hr/OD単位で比速度を得ることもできる。イソプレンの平均放出濃度に、発酵時の発酵ブロス1L当たりの放出気体総量offgasspargedを乗じることで、イソプレン/L気体の平均値を総生産物の生産性発酵ブロス1L当たりのイソプレン重量,mg/ブロスLに変換することもできる。したがって、イソプレンの平均放出濃度が0.5mg/ブロスL/hrである場合、1vvm下10時間経過時の総生成物濃度は300mg/ブロスLに相当する。一部の実施形態では、細胞は、培養時に、細胞培養培地に含まれる炭素の約0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、又は1.6以上をイソプレンに変換する。一部の実施形態では、炭素のイソプレンへの変換率は約0.002~約1.6であり、例えば、約0.002~約0.005、約0.005~約0.01、約0.01~約0.05、約0.05~約0.15、0.15~約0.2、約0.2~約0.3、約0.3~約0.5、約0.5~約0.8、約0.8~約1.0、又は約1.0~約1.6である。炭素のイソプレンへの変換率炭素収率とも呼ばれるは、生産されたイソプレンに含まれる炭素原子のモル数を、炭素源バッチ中の並びに供給したグルコース及び酵母エキスに含まれる炭素モル濃度に含まれる炭素原子のモル数により除算することで測定できる。この数に100を乗じ、百分率を生成する式1に示す通り。式1炭素収率=生産されたイソプレンに含まれる炭素のモル数/炭素源に含まれる炭素のモル数100この計算式では、酵母エキスには50重量の炭素が含有されるものと仮定することができる。式2炭素収率=39.1gイソプレン1/68.1mol/g5C/mol/[181221gグルコース1/180mol/g6C/mol17780g酵母エキス0.51/12mol/g]100=0.042当業者であれば、イソプレン生産速度又は生産されたイソプレン量は、容易に任意の単位に変換できる。単位を相互変換するための代表的な等式を以下に掲載する。イソプレン生産速度単位総生産量及び比生産量式31gイソプレン/Lブロス/hr=14.7mmolイソプレン/Lブロス/hr合計容積流量式41nmolイソプレン/gwcm/hr=1nmolイソプレン/Lブロス/hr/OD600この変換式では、OD600の値が1のブロス1Lには、1gの湿潤細胞が含まれているものと仮定する。式51nmolイソプレン/gwcm/hr=68.1ngイソプレン/gwcm/hrイソプレンの分子量式61nmolイソプレン/Lガス中O2/hr=90nmolイソプレン/Lブロス/hr培養ブロス1L当たりのO2流速90L/hr式71μgイソプレン/L放出ガス中イソプレン量=60μgイソプレン/Lブロス/hr流速60Lガス/Lブロス1vvm力価単位合計単位及び比単位式81nmolイソプレン/1mg細胞タンパク質=150nmolイソプレン/Lブロス/OD600この変換式では、OD600値が1のブロス1Lに含まれる合計タンパク質量は約150mgであると仮定する比生産性式91gイソプレン/Lブロス=14.7mmolイソプレン/Lブロス合計力価必要に応じて、細胞の湿潤重量単位を細胞の乾燥重量単位へと変換する際に、式10を使用することができる。式10細胞乾燥重量=細胞湿潤重量/3.3本発明に包含される一部の実施例では、イソプレン合成酵素変異体のポリペプチドをコードしている異種核酸を含む細胞は、本質的に同様の条件下で、イソプレン合成酵素変異体ポリペプチドをコードしている核酸を含まない細胞を増殖させた場合の生産量の、少なくとも約2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、又は400倍以上の量に相当するイソプレンを生産する。本発明に包含される一部の実施例では、イソプレン合成酵素変異体のポリペプチドと、DXS、IDI、及び/又はMVA経路関連性ポリペプチドのうちの1つ以上とをコードしている異種核酸を含む細胞は、本質的に同様の条件下で、異種核酸を含まない細胞を増殖させた場合の生産量の、少なくとも約2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、又は400倍以上の量に相当するイソプレンを生産する。代表的なイソプレン精製法一部の実施形態では、本開示の任意の方法は、イソプレンを回収する工程を更に包含する。例えば、本発明の組成物及び方法を用い生産させたイソプレンを、ガスストリッピング、分画、吸着/脱着、浸透気化法、固相からのイソプレンの熱又は減圧脱着、又は固相に不動化又は吸収させたイソプレンの溶媒による抽出などの標準法を用い回収することができる例えば、米国特許第4,703,007号及び同第4,570,029号を参照されたい。一部の実施形態では、イソプレンの回収には、液体イソプレンイソプレンの未希釈溶液又はイソプレンの溶媒希釈液などの単離を包含する。ガスストリッピングには、連続的な様式で、発酵による放出気流からイソプレン蒸気を除去することを包含する。このような除去は、いくつかの異なる方法で達成することができ、これには、固相への吸着、液相への分割、又は直接凝縮が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、蒸気の露点を上回る温度で希釈イソプレン蒸気ストリームの膜濃縮により、液体イソプレンの凝縮がもたらされる。一部の実施形態では、回収は、米国仮出願特許第61/288,142号2009年12月18日出願に記載の通りに実施する。イソプレンの回収には、一工程又は複数工程を包含し得る。一部の実施形態では、発酵により生じた気体からのイソプレン蒸気の回収、及びイソプレンの液相への転換は同時に行う。例えば、放出される気体流から、イソプレンを直接液体へと凝縮させることができる。一部の実施形態では、発酵により生じた気体からのイソプレン蒸気の回収、及びイソプレンの液相への転換は連続的に行う。例えば、イソプレンを、固相に吸着させ、次に溶媒を用い固相から抽出することができる。一部の実施形態では、本開示の任意の方法は、イソプレンの精製を更に包含する。例えば、本発明の組成物及び方法を用い生成したイソプレンを、標準法により精製することができる。精製とは、イソプレンを生成した際に存在している1種以上の成分から、イソプレンを分離する手法を指す。一部の実施形態では、イソプレンは実質的に純粋な液体として得られる。精製法の例としてはi抽出溶媒からの蒸留、及びiiクロマトグラフィーが挙げられる。本明細書で使用するとき、精製イソプレンは、イソプレンを生成した際に存在している1種以上の成分から分離したイソプレンを意味する。例えば、米国特許出願公開第2009/0203102号、PCT出願国際公開第2009/076676号、米国特許出願第12/496,573号を参照されたい。一部の実施形態では、イソプレンはイソプレンの生産時に存在する他の成分を少なくとも約20重量含んでいない。各種実施形態では、イソプレンの純度は、少なくとも又は約25重量、30重量、40重量、50重量、60重量、70重量、75重量、80重量、90重量、95重量、重量又は99重量である。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、HPLC分析、又はGC-MS分析等の任意の適切な方法で分析することができる。本明細書の上記のすべての刊行物及び特許は、参照により本開示に組み込まれる。本発明の範囲及び精神から逸脱せずとも、本発明に記載の方法及び系の様々な修正及び改変が、当業者には明白であろう。これまでに、本発明を、特定の実施形態に関連付けて記載したが、本発明は、特定の実施形態に不当に制限されるよう請求されるものではないことは理解されるべきである。本明細書に記載の各種実施形態に関する1つの、幾つかの、又は全ての特性は、本発明の他の実施形態と組み合わせることができることも理解されるであろう。本発明のこれらの態様及び他の態様は、当業者にとっては容易に理解されるであろう。実験以降の実施例は例示目的で提供され、更に特定の好ましい実施形態及び本発明の態様を示すものであり、発明の範囲を制限するよう解釈されるものではない。以降の実験に関する記載では、次の略号を用いる:°Cセ氏温度;rpm毎分回転;H2O水;diH2O脱イオン水;aa及びAAアミノ酸;bp塩基対;kbキロ塩基対;kDキロダルトン;gmグラム;μg及びugマイクログラム;mgミリグラム;ngナノグラム;μL及びuLマイクロリットル;mLミリリットル;mmミリメートル;qs十分な数量;nmナノメートル;μm及びumマイクロメートル;Mモル濃度;mMミリモル濃度;μM及びuMマイクロモル濃度;pMピコモル濃度;U単位;MW分子量;sec秒;min分;hr時間;OD600600nmでの吸光度;BSAウシ血清アルブミン;DMAPPジメチルアリールジホスフェート;DTTジチオスレイトール;EtOHエタノール;IPTGイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド;イソプレン2-メチル-1,3-ブタジエン;IspSイソプレン合成酵素;PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動;PBSリン酸緩衝食塩水[150mMNaCl、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.2];及びSDSドデシル硫酸ナトリウム。以降の実験例で参照されることになる製品又はサービスを提供している企業に対し、次の略号を用いる:AgilentAgilentTechnologiesSantaClara、CA;BectonCoulterBectonCoulter,Inc.Fullerton、CA;Bio-RadBio-RadLaboratoriesHercules、CA;CaymanChemicalCaymanChemicalCo.AnnArbor、MI;CTCAnalyticsCTCAnalyticsA.G.Zwingen、Switzerland;EMSElectronMicroscopySupplyHatfield、PA;EpicentreEpicentreBiotechnologiesMadison、WI;IntegratedDNATechnologiesIntegratedDNATechnologiesCoralville、IA;InvitrogenInvitrogenCorp.Carlsbad、CA;MolecularDynamicsMolecularDynamicsSunnyvale、CA;NovagenNovagen,Inc.Madison、WI;PerkinElmerPerkinElmerWaltham、MA;RocheRocheAppliedScienceIndianopolis、IN;SigmaSigma-AldrichSt.Louis、MO;StratageneStratageneCloningSystemsLaJolla、CA;QiagenQiagen,Inc.Valencia、CA;TakaraTakaraBioUSAMadison、WI;ThomsonInstrumentThomsonInstrumentCo.Oceanside、CA;VPScientificVPScientific,Inc.SanDiego、CA;andZinsserZinsserNorthAmericaNorthridge、CA。以降の実施例は例示目的で提供するものであり、いかなる方法によっても本発明を制限することを意図しない。実施例1.イソプレン合成酵素の増殖性スクリーニング:検証、最適化及び制限本例は、改良されたイソプレン合成酵素変異体を選択するための、invivoスクリーニングの開発を記載する。本発明者らは、invivoでのスクリーニングを用いることで、対照我々の場合、最も有効なイソプレン合成酵素MEA-ポプラアルバPoplarAlbaと比べイソプレン合成酵素活性が劣る細胞を選別することができることを見出した。加えて、invivoでのスクリーニングを用いることで、対照我々の場合、最も有効なイソプレン合成酵素MEA-ポプラアルバと比べイソプレン合成酵素活性が優れている細胞を選別することもできる。方法細胞株:下流経路を常時発現しており、pETプラスミドからイソプレン合成酵素変異体を発現している株をスクリーニングした。スクリーニングした株は、DW425陽性対照であった。アッセイ条件:50uMカナマイシンを含有させたLB培地で、細胞株を34°Cにて一晩増殖させた。1グルコース、0.1酵母エキス及び、8mMMgSO4、並びに次の濃度:0、10、20、30、40、50、60、又は70uMのうちのいずれかの濃度のIPTGを含有させたTM3培地に、OD600が約0.2になるよう、一晩培養物を希釈した。誘導後に細胞を約2時間増殖させ、各種濃度のメバロン酸0、5、7.5、10、15、20mMと一晩培養に使用したものと同様の培地を含有させた96ウェル透明底マイクロタイタープレートに移し、最終的にOD600が0.2~0.3になるまで1日培養した。SpectramaxUV-Vis分光光度計を用い、動態解析モードでプレートを監視した。各測定5分間隔前に1分間振盪を行い、34°Cで3時間実験を監視した。データ解析:すべてのデータはエクセルに移行した。吸光度の測定値を自然対数に変換した。LINEST関数を用い、連続的な曲線を作成し、対数増殖速度定数増殖速度を生成した。代謝産物の解析は、以降に記載する、代謝産物MVA、DXPの小規模メタノール/水抽出プロトコルを用い実施した:1.小規模実験に由来する試料をクエンチする;通常、1mL試料をスピンダウンし、上清を廃棄し、100μL純メタノールをペレットに加え、代謝産物の抽出及び解析までの間、試料を-80°Cで保存した。2.-80°Cの冷凍庫から試料を取り出した;ペレットを再懸濁したガラス製のキャピラリ管でペレットを破壊しておくことが推奨された。3.試料を、微量高速冷却遠心機で14000grfcで4分スピンダウンした。4.上清をきれいな1.5mLエッペンドルフチューブに移した。5.ペレットを100μLの6:1MeOH/5mMNH4OAcpH8.0に再懸濁した。14000grfcで4分遠心した。対象とする代謝産物がpH8.0で安定でない場合例えば、DXP代謝産物、又はCoA含有代謝産物、試料は6:1MeOH/5mMNH4OAcpH7.0で抽出してもよい。6.上清を、工程4より得た上清と組み合わせた。7.工程5~6を繰り返し、100μL1:1MeOH/5mMNH4OAcpH8.0又は上記のように場合によりpH7.0で抽出する。上清を回収後、試料のペレットは廃棄してもよい。上清画分を集めた1.5mLエッペンドルフチューブの蓋を閉め、抽出物をボルテックス処理し混合した。8.懸濁されている細片を除去する目的で、1.5mLエッペンドルフチューブを14000grfcで4分遠心分離した。9.円錐形の挿入口を備えるLC/MSバイアル瓶に、約200μL抽出物を入れた。残りの抽出物を-20°Cで貯蔵した。理論に束縛されるものではないが、2ギ酸を分散させる際にはリピートピペットを使用することが推奨される迅速にピペッティングし、容量を一定に保つため。リピートピペットは、一般的なピペットと比べ時間効率に非常に優れており、かつ非常に正確であることからかつ良好な目盛りを持ち適切に維持するものと考えられ、精密である技術的に積極的に置き換えられている。更なる推奨としては、限定するものではないが、エッペンドルフチューブは可能な限り氷上0°Cで保管し、微量遠心機は、遠心分離するサンプルを冷却するために、-9°Cに設定し約20分予冷却し、ペレットを再懸濁する際には、ガラス製キャピラリ管を使用すべきである。細胞ペレットの機械的破壊は、ほんの僅かに物理的補助を用い、非常に手早く行う。細胞塊が簡単にチューブの蓋の裏に貼り付いてしまい、試料の量が減ってしまい、有意な実験誤差を引き起こす可能性があることから、再懸濁したペレットをボルテックスにかけることは推奨されない。理論に束縛されるものではないが、LC/MS解析の実施には以降の操作を推奨する:1.LC/MSバイアル瓶は、解析中4°Cにてトレイに保管する。カラムは室温のものを用いる。Xcaliburの手順開始後に、トレイ/カラム温度は自動的に設定され得るものの、トレイ温度は前もって設定しておくほうが好ましい。2.スプレッドシートに記載の通りに調製した標準を較正用に使用する。標準を調製した日付を各チューブのラベルに記録する。3.イソプレノイド及びMVA経路代謝産物を解析するLC/MS法現在では新製品のTSQQuantumAccessで行う-方法ファイル:IPS_BioBasic100_090316又は同様に、最新のデータ拡張を参照されたい;HPLCカラム:Macherey-NagelNucleodexβ-OHEC2mm×100mm粒径5μm、粒径100Å、C/N720351.20;ガードカラム:721460.40現在では2mmガードカラムは入手不可。DXP経路代謝産物用のLC/MS法:MethoddevelopmentC18-ionpair\Metabolites_C18_TBAip_11、トリブチルアンモニウムアセタートをイオン対試薬として用いる;HPLCカラム:C18PhenomenexSynergi4μHydro-RP80A150×2.0mm、C/N00F-4375-B0;ガードカラム:セキュリティガードカートリッジAQC184×2.0mm、C/NAJ0-7510。CoA含有代謝産物を検出するためのLC/MS法については、Protocolforacidicextractionofmetabolitesatsmall-scaleCoAs,etc..を参照されたい。4.解析後、試料は-20°Cで保管し、標準は-80°Cで保管する。5.代謝産物の定量は、LCQuanソフトウェアパッケージにより容易に行うことができる。すべての希釈試料最初のメタノールクエンチを含むから逆算を行い、濃度はODに対し基準化し、200ODの発酵ブロス1Lに含まれる細胞内容積は約50mLであると仮定し、細胞内濃度に変換する。結果未知のタンパク質を発現するプラスミドプールから、DMAPP利用酵素を選択するための系は、すでに開発されているApplEnvironMicrobiol.2007October;7319:6277~6283。本発明者らは、イソプレン合成酵素活性をもつ細胞を選別することのできるスクリーニングプロトコルを改良し、最適化した。選別は、大腸菌中のDMAPP濃度は細胞増殖速度に相関するとの結論を示す実験結果に基づくものである図1。したがって、理論に束縛されるものではないが、これらの細胞の増殖速度は、細胞内DMAPP濃度についてのバイオセンサーと考えることができる。理論に束縛されるものではないが、この選別の原理は、DMAPPを消費する酵素イソプレン合成酵素の酵素活性を増加させることで、細胞内DMAPP濃度が減少し、ひいては増殖速度が増加することになるというものである。この仮説を試験するため、DW425細胞を、IPTG及びメバロン酸マトリックスを各種濃度で含有させた培地で増殖させた図2及び図3。IPTG濃度60uM以上で増殖させた細胞は、メバロン酸を添加しなくとも増殖が減弱した誘導を行なっていない細胞と比較。IPTG濃度0~50μMでは、誘導を行なっていない細胞と比較して増殖は減弱した。誘導を行なっていない細胞において、すべての濃度のメバロン酸で、細胞増殖は阻害された。選別したいずれかの所定のメバロン酸濃度に関し、IPTG濃度を増加させると、増殖速度が増加した図2及び図3。細胞の発現している酵素濃度が、IPTG添加濃度に相関するか判断するために、以前の研究を実施した。その結果、これらの株においてイソプレン合成酵素の発現/活性の増加により増殖性が改良された。実施例2DMAPP毒性除去によるウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素SELの解析細胞内DMAPP濃度の上昇と、大腸菌の増殖阻害との間には強い相関があり、この相関は、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素IspSを発現させることで減弱させることができる。理論に束縛されるものではないが、IspS活性が増強されると、DMAPPは、より迅速にイソプレンへと変換されるようになり、その結果増殖性が更に良好になるはずである。本発明者らは、これらの条件下で、IspS変異体を発現している大腸菌の増殖速度を監視することで、細胞内でのDMAPPのイソプレンへの変換能が改良されたIspS変異体を同定することができる。方法:1プラスミド及び株の構築:SELプラスミド骨格-テンプレートpDu39を用い、QuikChangeStratagenePCRを行い、SEL生成に使用するプラスミド骨格を構築したプライマー配列については表1を参照されたい。PCR産物を1μLDpnIRocheで3時間処理し、次に製造元の推奨するプロトコルに従い、1μLの全反応物を用い、化学的な形質転換に対し受容能のある大腸菌Top10cellsInvitrogenを形質転換させた。細胞を回収し、50μg/mLカナマイシンを含有させたLB培地に播種した。翌日、増殖性が陽性のコロニーを選別し、プラスミド精製Qiagen及び配列決定QuintaraBiosciencesを行った。翻訳領域全長を配列決定し、コード配列の完全性を確認して、正しい塩基変化を保有するプラスミドを選別した。これらのプラスミドのうちpCL201図4を参照されたいは、SELVerdezyne及びDNA2.0を構築する際の骨格として選別した。表1.QuikChange及び配列決定プライマーPCR及びサイクリングパラメーター:QuikChangePCR:1uLpDu395uL10XPfuUltraHF緩衝液1uLdNTPs1uL50uMMEAヘアピン破壊pETF1uL50uMMEAヘアピン破壊pETR2uLDMSO39uLdiH2O1uLPfuUltraHFポリメラーゼStratageneQuikChange用のPCRサイクリングパラメーター:1.95°C1分2.95°C50秒3.60°C50秒4.68°C7分5.工程2に戻る18サイクル繰り返す6.68°C7分pCL201の配列:tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatggaagcacgtcgctctgcgaactacgaacctaacagctgggactatgattacctgctgtcctccgacacggacgagtccatcgaagtatacaaagacaaagcgaaaaagctggaagccgaagttcgtcgcgagattaataacgaaaaagcagaatttctgaccctgctggaactgattgacaacgtccagcgcctgggcctgggttaccgtttcgagtctgatatccgtggtgcgctggatcgcttcgtttcctccggcggcttcgatgcggtaaccaagacttccctgcacggtacggcactgtctttccgtctgctgcgtcaacacggttttgaggtttctcaggaagcgttcagcggcttcaaagaccaaaacggcaacttcctggagaacctgaaggaagatatcaaagctatcctgagcctgtacgaggccagcttcctggctctggaaggcgaaaacatcctggacgaggcgaaggttttcgcaatctctcatctgaaagaactgtctgaagaaaagatcggtaaagagctggcagaacaggtgaaccatgcactggaactgccactgcatcgccgtactcagcgtctggaagcagtatggtctatcgaggcctaccgtaaaaaggaggacgcgaatcaggttctgctggagctggcaattctggattacaacatgatccagtctgtataccagcgtgatctgcgtgaaacgtcccgttggtggcgtcgtgtgggtctggcgaccaaactgcactttgctcgtgaccgcctgattgagagcttctactgggccgtgggtgtagcattcgaaccgcaatactccgactgccgtaactccgtcgcaaaaatgttttctttcgtaaccattatcgacgatatctacgatgtatacggcaccctggacgaactggagctgtttactgatgcagttgagcgttgggacgtaaacgccatcaacgacctgccggattacatgaaactgtgctttctggctctgtataacactattaacgaaatcgcctacgacaacctgaaagataaaggtgagaacatcctgccgtatctgaccaaagcctgggctgacctgtgcaacgctttcctgcaagaagccaagtggctgtacaacaaatctactccgacctttgacgactacttcggcaacgcatggaaatcctcttctggcccgctgcaactggtgttcgcttacttcgctgtcgtgcagaacattaaaaaggaagagatcgaaaacctgcaaaaataccatgacaccatctctcgtccttcccatatcttccgtctgtgcaatgacctggctagcgcgtctgcggaaattgcgcgtggtgaaaccgcaaatagcgtttcttgttacatgcgcactaaaggtatctccgaagaactggctaccgaaagcgtgatgaatctgatcgatgaaacctggaaaaagatgaacaaggaaaaactgggtggtagcctgttcgcgaaaccgttcgtggaaaccgcgatcaacctggcacgtcaatctcactgcacttatcataacggcgacgcgcatacctctccggatgagctgacccgcaaacgcgttctgtctgtaatcactgaaccgattctgccgtttgaacgctaaggatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatウラジロハコヤナギIspSのアミノ酸配列:MEARRSANYEPNSWDYDYLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQRLGLGYRFESDIRGALDRFVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLRETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGENILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAVVQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFERSEL発現宿主-MCM521のP1可溶化液本明細書に記載を調製し、分子生物学領域で一般的な手法Miller,AShortCourseinBacterialGeneticsに従ってBL21DE3に形質導入した。20μg/mLカナマイシンを含有させたLBプレートで、形質導入体を選別した。陽性コロニーを更にPCRにより検証し、BL21DE3株においてPL.2-mKKDyIの存在を確認した。次に、1μLpCP20プラスミドによりこの株を形質転換させ、50μg/mLカルベニシリンを含有させたLBで陽性コロニーを選別し、30°Cで一晩インキュベートした。陽性形質転換体をLBプレートに画線し、37°CでインキュベートしてpCP20プラスミドを欠損させた。ネオマイシンカナマイシン耐性マーカーの欠損を確認するため、37°Cで増殖させたコロニーを、20μg/mLカナマイシン、50μg/mLカルベニシリン、又は抗生物質不含有のいずれかのLB培地に播種した。pCP20を欠損させ、カナマイシン耐性マーカーは含有させずにPL.2mKKDyIを組み込んだ株は、カナマイシン及びカルベニシリンに対し感受性になる。対照として親BL21DE3株を用い、カナマイシン及びカルベニシリンに対し感受性を示す4種のコロニーにおいて、BL21DE3にmKKDyIが存在しているかPCRにより確認した。これにより得られた株、MD09-170を、以下に記載のSELに対する増殖アッセイ時に、IspS変異体を発現させるのに用いた。増殖アッセイの対照株には、IspS発現に関する陰陰性及び陽性対照として、空のpET24aベクター又はpCL201のいずれかを保有させた表2を参照されたい。表2.株2SELの構築:IspSの25種の部位評価ライブラリSELを、比活性に関し予め解析しておいてた。表3に、これらのライブラリに含有させた残基を示す。増殖アッセイに関し、これらのライブラリ中にIspS変異体を保有しているプラスミドを精製し、発現宿主MD09-170を形質転換した:グリセロールストックから、元のライブラリを直接複製し、96ウェルディープウェルプレートVWRを用い、50μg/mLカナマイシンを含有させたLBで30°Cで一晩増殖させた。一晩増殖させた細胞を遠心沈降Eppendorf5804Rにより回収し、上清を廃棄した。製造元の推奨するプロトコルに従って、NucleospinMulti-96Plusプラスミド精製キットMachereyNagelを用い、HamiltonMicrolabSTARロボットにより、細胞ペレットからプラスミドを精製した。42°Cに設定したEppendorfThermomixerRセットを使用し、各変異体について得られたプラスミドDNA3μLを用い、平底96ウェルポリスチレンプレートFalconで、化学的な形質転換に対し受容能のあるMD09-170細胞を形質転換した。2時間後に細胞をLB培地に回収し、希釈し、50μg/mLカナマイシンを含有させたLB培地で一晩インキュベートした。全25種のオリジナルのライブラリ由来の変異体を包含するMD09-170細胞を含有させたプレートのグリセロールストックを作製し、増殖アッセイによる解析前に-80°Cで保管した。第2組の80のSELをDNA2.0に外注し、作成した。これらのライブラリを用い、スクリーニング宿主MD09-170を直接形質転換させた。表4に、第2組用に選別した全80の残基を示す。まず現在判明しているウラジロハコヤナギIspS結晶構造における位置に基づいて部位を選択した。DW425及びDW424株表2を参照されたいを、それぞれ野生型及び陰性対照として96ウェルプレートに巻き戻した。表3.25種のSEL用に選別した部位表4.80種のSEL用に選別した部位3IspS活性の増大に関係する増殖アッセイ増殖アッセイの際、平底マイクロタイタープレートCellstarを用い、50μg/mLカナマイシンを含有させた200μLLB培地に、SELのグリセロールストックを播種し、SystemDuetzEnzyscreenBVにより30°Cにて一晩増殖させた。誘導前に、各ウェル由来の一晩培養物7μLを、50μMのIPTGと50μg/mLカナマイシンとを含有しているTM3培地100μLに播種し、プレートを30°Cにて2時間増殖させた。次に、ガラス底四角型96ウェルマイクロタイタープレートMatricalにおいて、11mMメバロン酸、50μMIPTG及び50μg/mLカナマイシンを含有させたTM3培地に、誘導前の培養物を1:10希釈した。培養物を34°Cで増殖させ、GrowthProfiler1152Enzyscreenで225rpmで約10時間振盪させた。製造元の推奨するプロトコルに従って、各IspS変異体に関し増殖曲線を生成した。空のpET24aベクターDW424を保有している株を陰性対照とし、野生型ウラジロハコヤナギIspSDW425を発現している株を陽性対照として、MVAの存在下又は非存在下のいずれかで増殖させた。データ解析の際、野生型対照と比較した場合の各変異体の比増殖速度を所定の時間にわたって測定した。具体的には、マイクロソフトのエクセルでLINEST関数を用い、連続的な曲線を作成し、対数増殖速度定数増殖速度を生成した。これらの値を、陽性対照由来の4つ殆どの場合の増殖定数の平均により除算し、各変異体の増殖指数を生成した。全105種のSELライブラリに含まれる変異体についての増殖指数値を表5に示す。一部の場合では、特定の変異体はグリセロールストックに存在していないか、LB培地での一晩培養で増殖しなかったか、あるいは増殖アッセイの際に最終的なプレートに移行されていない場合があった。これらの特定のウェルの値は、ND未検出として掲載する。ウラジロハコヤナギIspSの初回変異導入では特定の変異は生成されずに、野生型残基が置換された。表5.プレート001の増殖指数順位表5.プレート002の増殖指数順位表5.プレート003の増殖指数順位表5.プレート004の増殖指数順位表5.プレート005の増殖指数順位表5.プレート006の増殖指数順位表5.プレート007の増殖指数順位表5.プレート008の増殖指数順位表5.プレート009の増殖指数順位表5.プレート010の増殖指数順位表5.プレート011の増殖指数順位表5.プレート012の増殖指数順位表5.プレート013の増殖指数順位表5.プレート014の増殖指数順位表5.プレート015の増殖指数順位表5.プレート016の増殖指数順位表5.プレート017の増殖指数順位表5.プレート018の増殖指数順位表5.プレート019の増殖指数順位表5.プレート020の増殖指数順位表5.プレート021の増殖指数順位表5.プレート022の増殖指数順位表5.プレート023の増殖指数順位表5.プレート024の増殖指数順位表5.プレート025の増殖指数順位表5.プレート026の増殖指数順位表5.プレート027の増殖指数順位結果/考察表6に、1.2以上の増殖指数を示したすべての変異体を示す。理論に束縛されるものではないが、これらの位置に変異が生じることで、幾つかの異なる経路により、IspSの細胞内活性が増加される場合がある。理論に束縛されるものではないが、細胞内活性は、IspSに関係する次のいずれかの特性:細胞生存能の上昇、kcatの上昇、Kmの低下、比活性の増大、溶解性の増大、不溶性の低下、リボソーム結合性の向上、翻訳開始速度の増加、翻訳伸長速度の増加、転写開始速度の増加、転写伸長速度の増加、DNAの2次構造の減少、RNAの2次構造の減少、DNAの2次構造の増加、RNAの2次構造の増加、折り畳み速度の増加、細胞内シャペロンとの親和性の上昇、安定性の増加、タンパク質の代謝回転の減少、細胞内プロテアーゼに対する曝露の減少、細胞内プロテアーゼに対する親和性の減少、周辺質への局在の減少、細胞質に対する局在の改良、封入体形成の減少、膜局在の減少、より望ましいコドンによる発現の増加、DNA安定性の上昇、RNA安定性の上昇、及びRNA分解性の低下により、あるいはこれらの特性を組み合わせることにより増加する場合がある。理論に束縛されるものではないが、IspSをコードしている又は発現している核酸配列DNA及びRNAの特性、あるいはIspSそのものの生化学的特性に対し正の効果を示す任意の変異により、細胞内活性を増大させることができる。1.2以上の増殖指数を有するすべての変異体に、メバロン酸及びIPTGマトリックスを用い第2増殖アッセイを行う。競合実験において最良の増殖性を示し得る酵素を判別するために、これらの変異体も併せてプールし、IPTG誘導下かつメバロン酸経路作動下で複数回濃縮した。最も有望な変異体を、イソプレン生産株において比生産性に及ぼす効果について更に評価する。対象とする一部の変異としては、限定するものではないが、A3T,S13L,I165Y,Q421R,F495L,Q509T,及びL540Vが挙げられる。これらの変異体はすべて、IPTG/メバロン酸マトリックスを用いる第2アッセイ時に、野生型と比較して増殖性に利点を示した。関連するセイヨウハコヤナギ、アメリカヤマナラシ及びP.トリコカルパ種由来の同種イソプレン合成酵素においてもこの部位にスレオニンが見られることから、A3T変異体を特に対象とする。ヤマナラシ種由来のIspSの共通配列に変更を加えることで、酵素の活性をより増大させることができる。F495Lは、残基K487~K497からなる暴露表面ループ暴露表面ループ中に位置することから、F495L変異は特に対象となる。図5は、それぞれinvivoにおいて細胞生存率に正の効果を示し、invitroにおいてIspS比活性を示す、G491S及びL494P,の両方の近位に存在することを示す。加えて、この表面ループには高い増殖率を示すその他の変異が複数存在する。総合して、このループに変異を生じさせると、細胞内酵素活性において重要な役割が示される場合がある。Q509I及びQ509V変異はいずれも増殖性の向上を示し、かつこれらのみがβ炭素で分岐しているアミノ酸残基であることから、Q509T変異は特に対象となる。図6は、Q509が、IspS活性部位の近傍に位置する活性部位内には位置していないことを示す。この特定のアミノ酸のβ炭素に分岐構造を存在させると、酵素活性に対し効果が付与され得る。表7に示す残基は、高DMAPP圧下で増殖させる場合に必須のものであり、したがって、一実施形態では、不変の残基として見なすことができる。任意の他の残基により野生型のアミノ酸を置換した場合、増殖速度アッセイ条件下での増殖が最小限になるか又は増殖しなくなる。各位置についての増殖指数値を表7に示す。フェニルアラニン287F287は活性部位に位置し、活性部位キャビティの底部を構成する図7。他のテルペン合成酵素F287との構造アラインメントに基づき、炭素原子を5つ以上含有するイソプレノイドにより活性部位への接近を妨害することで、活性部位に収容され得る基質長を決定する。グリシン397G397は、活性部位キャビティの側面に位置する図8。この残基はα-ヘリックス中のねじれ部位に存在し、ヘリックスを曲げる際にねじれ部位に必要とされる、グリシン及び他の低分子アミノ酸に特有の構造的柔軟性を示す。ヘリックス中の折り曲げは、活性部位中に推定される基質結合位置に隣接する。アスパラギン438N438は、活性部位の頂部に位置する図9。他のテルペン合成酵素との構造アラインメントによると、N428は、マグネシウムイオンとの直接的な協調に関与し得ること、並びに基質と相互作用する可能性があることが示される。グルタミン酸451E451は、活性部位上に位置する基質アクセスループに存在する図10。ホモロジーモデリング及び他のテルペン合成酵素との構造アラインメントに基づくと、これらのループは、基質を補足する際の開口部位となり、基質が活性部位に結合した後に、活性部位を覆って空間を閉鎖する。残基E451は、この工程中に、1つ以上のマグネシウムイオンと協調して働くものと想定される。チロシン514Y514は、N438下の活性部位に存在する図11。Y514は基質との結合に関与し、あるいは触媒作用に直接関与し得る。表6.増殖指数が1.2以上の変異体表7.不変部位の増殖指数実施例3増殖率に関係する位置分析本例は、SELデータの解析結果を位置を用い例示する。特定の変異に対応させた増殖指数を、次に表8として示す。表8実施例4イソプレン合成酵素の単一部位変異を発現している大腸菌クローンの増殖データの解析本例は、増殖率の代わりに性能指数をもとに増殖データの解析を示す。EnzyscreenGrowthProfiler1152を用い、一定時間ごとにG値を決定した。エクセルを用い、線形回帰により、各試料の増殖速度を算出した。時間に対するG値ΔG/Δtの増加により与えられる。この値をスロープと呼ぶ。最終G値から初期G値を除算し、各試料の最終細胞密度を概算した。この数をδと呼ぶ。各96ウェルプレートに関し、各スロープ及びδ値を、野生型対照を含有しているウェルの平均値により除算することで、正規化した。算出の際には、野生型の示したいくつかの明らかな外れ値を除外した。正規化値を、性能指数又はP.I.と呼ぶ。スロープPI及びδPIは非常に相関性が高く、これらの値から、平均PIと呼ばれるPIを更に算出した。この値は、単に2つのPI値の平均値である。表9は、解析したすべての位置におけるすべての変異についての各種PI値を示し、表10は、平均正規化PIに関し高い値を有していた上位150種の変異を示す。表9.表10.標準平均PI値が上位150位に入る変異体実施例5G491Sイソプレン合成酵素変異体のもつ生存能の上昇次の例は、イソプレン合成酵素のG491S変異体を発現し、野生型イソプレン合成酵素を発現している細胞と比較した場合に発酵時の生存能が増加しているイソプレン生産大腸菌を示す。この実験は、14Lフェドバッチスケールで実施した。株構築BL21Novagen中のクエン酸合成酵素遺伝子gltA前に位置するプロモーターを、常時発現型低発現プロモーター、すなわちGI1.2米国特許第7,371,558号により置き換えた。gltAWilde,R,andJ.Guest.1986.J.Gen.Microbiol.132:3239~3251については2つの野生型プロモーターが報告されており、合成プロモーターを、遠位プロモーターの-35領域の直後に挿入した。プライマーUpgltACm-F及びDngltA1.xgiCm-R表11を参照されたい、並びにテンプレートとしてGeneBridgesHeidelberg,Germany由来のプラスミドFRT-gb2-Cm-FRTを用い、PCR産物を得たPCR産物を精製し、λredを用いる組み換えに製造元GeneBridges,Heidelberg,Germanyによる記載の通りに使用した。更なる評価にあたって、複数種のコロニーを選別した。プロモーター領域は、プライマーgltAPromSeqF及びgltApromSeqR表11を参照されたいを用い増幅し、及びDNAを抽出した。水30uLにコロニーを再懸濁し、95°Cで4分間加熱し、この試料のうち2uLをテンプレートとして50uL反応液に使用した。得られたPCR産物の配列決定結果を観察した後、3種の異なるプロモーラーGI1.2、GI1.5及びGI1.6米国特許第7,371,558号を保有しているコロニーを更なる使用のため保存した表11。株MCM521由来のP1可溶化液によりCMP258を形質導入し、20ug/mLカナマイシンを含有させたLBプレートでコロニーを選別し、株MD09-313を構築した。以下に記載の通りにCMP258及びMCM521を製造できる。Ausubel,etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWileyandSons,Inc.に記載の方法に従って、P1可溶化液を調製した。製造元により推奨されるプロトコルを用い、株MD09-314からカナマイシンマーカーを除去したGeneBridges,Heidelberg,Germany。株CMP141、CMP142、及びCMP143からP1可溶化液を生成し、これらを株MD09-314に形質導入し、それぞれCMP440、CMP441、及びCMP442を生成した表11。製造元GeneBridges,Heidelberg,Germanyにより推奨されるプロトコルを用い、クロラムフェニコールマーカーを除去し、それぞれ株CMP451、CMP452、及びCMP453を生成した表11。イソプレン生産株の構築の際、電気穿孔法を用い、MVA経路上流関連性プラスミド、及びpDW34野生型イソプレン合成酵素を含有又はpCHL243イソプレン合成酵素のG491S変異体、以降を参照のことのいずれかを用い株CMP451を形質転換した。37°Cで1時間かけて株を液体LB培地に回収し、50μg/mLカルベニシリン及び50μg/mLスペクチノマイシンを含有させた選択的固体寒天培地のプレートに播種し、37°Cで一晩インキュベートした。これらの抗生物質に耐性を示し、野生型IspS株CMP457、遺伝子型については表12を参照されたい又はG491SIspS株DW415、遺伝子型については表12を参照されたいのいずれかのプラスミドを保有している単離株を、以降の試験のために選別した。株MCM518-521及び528-531の構築:組み込みしたmKKDyIを駆動するλプロモーターP1形質導入により、100kbまでのDNAをバクテリア株間で移動させることができるThomasonら、2007。P1形質導入を行い、バクテリア染色体の一部を大腸菌K12MG1655から大腸菌BL21DE3へと移動させ、大腸菌BL21DE3における17,257bpの欠失箇所を置き換えた。2つのストラテジーを使用し、異なる選択マーカーを用い、組み換えられたバクテリア染色体を含有しているクローンを同定した。第1に、出願人らは、その欠失が菌株に悪影響を与えないような、導入しようとする17,257bpの配列に近い遺伝子に抗生物質マーカーを挿入した。その抗生物質マーカーを含む菌株は、マーカーと同時に形質導入される17,257bpの細菌染色体の小片を有している可能性が高い。この場合では、出願人らは、カナマイシン耐性遺伝子kanRをコードした遺伝子を、126のアミノ酸からなる機能が不明なタンパク質をコードしているybgS遺伝子に挿入した。第2に、ガラクトースの利用に関与している多くの遺伝子が、大腸菌BL21DE3に形質導入する17,257bpの断片内で、pglの近くに位置することが知られていることから、大腸菌K12MG1655大腸菌BL21DE3において欠失させた17,257bpの配列を含有するから得られたP1ライセートにより形質導入され、0.4w/vガラクトースを含むM9培地6g/LNa2HPO4、3g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、0.5g/LNH4Cl、0.1mMCaCl2、2mMMgSO4で単離されたコロニーは、この細菌染色体の17,257bpの断片を含有している可能性が高い。プライマーMCM120及びMCM224を用い、製造元のプロトコルに従ってStratageneHerculase商標II融合キットAgilentTechnologies,StratageneProductsDivision,LaJolla,Californiaを使用し、GeneBridgesFRT-gb2-Cm-FRTテンプレートからクロラムフェニコール耐性CmRのカセットを増幅させた。4つの50μLPCR反応物を以下のようにサイクルさせた:95°C/2分;95°C/20秒、55°C/20秒、72°C/1分を30サイクル;及び72°C/3分。反応物を次に4°Cに冷却した。4つの反応物をプールし、製造元のプロトコルに従ってQiagenPCRカラムに装填し、55°Cにて60μLの溶出緩衝液EBにより溶出した。標準的な手順を用いて、電気穿孔法により、プラスミドpRedET-カルベニシリンRGeneBridges,Heidelberg,Germanyを、大腸菌BL21DE3MCM446株CmR,gi1.6mKKDyIA1-3に導入した。30°CにてSOC培地で1時間振盪して形質転換体を回復させ、次にLB50μg/mLカルベニシリンLB/carb50プレートで30°Cにて一晩選別した。カルベニシリン耐性コロニーをMCM508株として凍結した。5mLのLB/carb50に新たに画線し、30°CにてOD600が約0.5になるまでMCM508株を増殖させた。約0.5になった時点で40mMのL-アラビノースを添加し、培養物を37°Cにて1.5時間インキュベートした。次いで遠心分離により細胞を回収し、上記のように精製した増幅産物3μLを電気穿孔し、500μLのSOC培地で37°Cにて1.5~3時間回復させた。形質転換体を37°CにてLB10μg/mLのカナマイシンLB/kan10プレートで選別した。標的座への増幅産物の組み込みを、プライマーGB-DW配列番号及びMCM208配列番号を用いPCRにより確認した。配列決定した結果、得られた増幅産物は以下に列挙する配列を有する4つのクローンと同一であった。4つのカルベニシリン感受性クローンをMCM518-MCM521株として凍結した。MCM518-MCM521株をLB/kan10に再画線し、37°Cで一晩増殖させた。MCM518-MCM521株のコロニーを回収し、37°CにてLB/kan10で培養し、酵母Flpリコンビナーゼ、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性遺伝子をコードしかつ宿主細胞に温度感受性の複製を付与するpCP20プラスミドを用い電気的に形質転換したCherepanov,P.P.ら、Gene1581:9~141995。細胞を、500μLのSOC培地で振盪しながら30°Cで1時間回復させた。形質転換体を30°Cで一晩LB/carb50プレートで選別した。各プレート由来のコロニーを30°CにてLB/carb50培地で増殖させ、視覚的に濁りが観察されるまでモニターした。培養を次に37°Cで少なくとも3時間行った。培養物から細胞をLBプレートに画線し、37°Cで一晩増殖させた。翌日、コロニーをLB、LB/carb50及びLB/kan10に植えた。カルベニシリン及びカナマイシンの両方に感受性であるコロニーすなわち、carb50及びkan10で増殖できないを液体LBで培養し、MCM528-MCM531株として凍結した。大腸菌株プライマー配列プロモーター/mMVKアセンブリの上流に組み込まれた、GeneBridgesのFRT-gb2-Cm-FRTカセット由来の配列を有する、バクテリオファージラムダλ由来の新しいPLプロモーター及びmMVK翻訳領域のごく初めの配列、並びにMCM508株由来のMVA経路下流のインテグロンの残りが後に続くmMVK翻訳領域の残部、を含有する、MCM518-MCM521株の染色体にアセンブリを組み込んだ。MCM518に組み込んだプロモーター/mMNK配列aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagcMCM519に組み込んだプロモーター/mMVK配列aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacctaaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagcMCM520に組み込んだプロモーター/mMVK配列aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacctaaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagcMCM521に組み込んだプロモーター/mMVK配列aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacgtaaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagcpTrc-MEA-AlbaG491S-mMVKの構築:QuikChangeStratagene変異導入PCRのサイクルパラメーターについては以降を参照されたいにより、変異G491SをpDW34pTrc-MEA-Alba-mMVKに導入した。次に、PCR産物を、1μLDpnIRocheにより処理し、37°Cでインキュベートして親DNAテンプレートを消化した。次に、この溶液のうち1μLを用い、準的な分子生物学的手法により電気穿孔法を行い、MCM531を形質転換した。1時間かけて液体LB培地に形質転換細胞を回収し、次に50μg/mLカルベニシリン及び5mMメバロン酸を含有させたLB固体寒天プレートに播種した。単離コロニーからプラスミドを精製し、配列決定QuintaraBiosciencesを完了させ、変異G491SpCHL243中、図12を参照されたいの存在の有無を確認した。QuikChange反応用のPCR混合物QuikChange反応用のPCRサイクルパラメーター95°C-1分95°C50秒、60°C50秒、68°C3分18回68°C-10分表11.プライマー表12:大腸菌株pCHL243配列gtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagcgccgctgagaaaaagcgaagcggcactgctctttaacaatttatcagacaatctgtgtgggcactcgaccggaattatcgattaactttattattaaaaattaaagaggtatatattaatgtatcgattaaataaggaggaataaaccatggaagctcgtcgttctgcgaactacgaacctaacagctgggactatgattacctgctgtcctccgacacggacgagtccatcgaagtatacaaagacaaagcgaaaaagctggaagccgaagttcgtcgcgagattaataacgaaaaagcagaatttctgaccctgctggaactgattgacaacgtccagcgcctgggcctgggttaccgtttcgagtctgatatccgtggtgcgctggatcgcttcgtttcctccggcggcttcgatgcggtaaccaagacttccctgcacggtacggcactgtctttccgtctgctgcgtcaacacggttttgaggtttctcaggaagcgttcagcggcttcaaagaccaaaacggcaacttcctggagaacctgaaggaagatatcaaagctatcctgagcctgtacgaggccagcttcctggctctggaaggcgaaaacatcctggacgaggcgaaggttttcgcaatctctcatctgaaagaactgtctgaagaaaagatcggtaaagagctggcagaacaggtgaaccatgcactggaactgccactgcatcgccgtactcagcgtctggaagcagtatggtctatcgaggcctaccgtaaaaaggaggacgcgaatcaggttctgctggagctggcaattctggattacaacatgatccagtctgtataccagcgtgatctgcgtgaaacgtcccgttggtggcgtcgtgtgggtctggcgaccaaactgcactttgctcgtgaccgcctgattgagagcttctactgggccgtgggtgtagcattcgaaccgcaatactccgactgccgtaactccgtcgcaaaaatgttttctttcgtaaccattatcgacgatatctacgatgtatacggcaccctggacgaactggagctgtttactgatgcagttgagcgttgggacgtaaacgccatcaacgacctgccggattacatgaaactgtgctttctggctctgtataacactattaacgaaatcgcctacgacaacctgaaagataaaggtgagaacatcctgccgtatctgaccaaagcctgggctgacctgtgcaacgctttcctgcaagaagccaagtggctgtacaacaaatctactccgacctttgacgactacttcggcaacgcatggaaatcctcttctggcccgctgcaactggtgttcgcttacttcgctgtcgtgcagaacattaaaaaggaagagatcgaaaacctgcaaaaataccatgacaccatctctcgtccttcccatatcttccgtctgtgcaatgacctggctagcgcgtctgcggaaattgcgcgtggtgaaaccgcaaatagcgtttcttgttacatgcgcactaaaggtatctccgaagaactggctaccgaaagcgtgatgaatctgatcgatgaaacctggaaaaagatgaacaaggaaaaactgagtggtagcctgttcgcgaaaccgttcgtggaaaccgcgatcaacctggcacgtcaatctcactgcacttatcataacggcgacgcgcatacctctccggatgagctgacccgcaaacgcgttctgtctgtaatcactgaaccgattctgccgtttgaacgctaactgcataaaggaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagccagatcggccgcaccggtctggatttcgaaaagcacccttatgtgtctgcggtaattgagaaaatgcgcaaatctattcctattaacggtgttttcttgaccgtcgattccgacatcccggtgggctccggtctgggtagcagcgcagccgttactatcgcgtctattggtgcgctgaacgagctgttcggctttggcctcagcctgcaagaaatcgctaaactgggccacgaaatcgaaattaaagtacagggtgccgcgtccccaaccgatacgtatgtttctaccttcggcggcgtggttaccatcccggaacgtcgcaaactgaaaactccggactgcggcattgtgattggcgataccggcgttttctcctccaccaaagagttagtagctaacgtacgtcagctgcgcgaaagctacccggatttgatcgaaccgctgatgacctctattggcaaaatctctcgtatcggcgaacaactggttctgtctggcgactacgcatccatcggccgcctgatgaacgtcaaccagggtctcctggacgccctgggcgttaacatcttagaactgagccagctgatctattccgctcgtgcggcaggtgcgtttggcgctaaaatcacgggcgctggcggcggtggctgtatggttgcgctgaccgctccggaaaaatgcaaccaagtggcagaagcggtagcaggcgctggcggtaaagtgactatcactaaaccgaccgagcaaggtctgaaagtagattaaagtctagttaaagtttaaacggtctccagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactctttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagcagatcaattcgcgcgcgaaggcgaagcggcatgcatttacgttgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagcgcgaattgatctg発酵番号20100307及び20100436の発酵条件発酵:発酵番号20100307:CMP437発酵番号20100437:DW415培地組成発酵培地1L当たり:K2HPO47.5g、MgSO47H2O2g、クエン酸一水和物2g、クエン酸鉄アンモニウム0.3g、酵母エキス0.5g、1000×改変微量金属溶液1mL。すべての成分を脱イオン水に加え、溶解させた。この溶液を加熱滅菌した123°Cで20分。水酸化アンモニウム28によりpHを7.0に調整し、容量を適量に調整した。滅菌及びpH調製後にグルコース10g、ビタミン溶液8mL、及び抗生物質を加えた。1000×改変微量金属溶液1L当たり:クエン酸H2O40g、MnSO4H2O30g、NaCl10g、FeSO47H2O1g、CoCl26H2O1g、ZnSO7H2O1g、CuSO45H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO42H2O100mg。各成分を一度に脱イオン水に溶解させ、HCl/NaOHによりpHを3.0に調整し、次いで液量を適量に合わせ、0.22マイクロメートルフィルタを用い、ろ過滅菌した。ビタミン溶液1L当たり:塩酸チアミン1.0g、D--ビオチン1.0g、ニコチン酸1.0g、D-パントテン酸4.8g、塩酸ピリドキシン4.0g。各成分を一度に脱イオン水に溶解させ、HCl/NaOHによりpHを3.0に調整し、次いで液量を適量に合わせ、0.22マイクロメートルフィルタを用い、ろ過滅菌した。供給液1kg当たり:グルコース0.57kg、脱イオン水0.38kg、K2HPO47.5g、及び100Foamblast10g。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。溶液を25°Cに冷却した後、マクロ塩溶液3.4mL、1000×改変微量金属溶液0.8mL、及びビタミン溶液6.7mLを加えた。マクロ塩溶液1L当たり:MgSO47H2O296g、クエン酸一水和物296g、クエン酸鉄アンモニウム49.6g。すべての成分を水に溶解させ、適量に合わせ、0.22マイクロメートルのフィルタを用い、ろ過滅菌した。2つの株に対し、15Lの生物反応器で、pH7.0、34°C下で発酵を行った。凍結させた大腸菌株を解凍し、トリプトンと酵母エキスを加えた生物反応器の培地LBに摂種した。摂取した大腸菌を、550nmOD550での吸光度測定値が1.0になるまで増殖させ、500mLを15L生物反応器に摂種し、初期槽容量を5Lに合わせた。10時間にわたって供給液を漸増させて最大4.5g/分供給し、次にパルス供給を開始した。パルス供給は30分行い、pHを7.04超に上昇させた。パルス供給の速度は調整可能であり、TCER/300と同等であった。供給するパルスの最大速度は13.5g/分を超過させなかった。発酵中の生物反応器には、グルコースを総重量で7.4~7.5kg供給した。細胞のOD550が6になった時点で、濃度200uMになるようIPTGを発酵槽に加え、誘導を実施した。生物反応器から発生した気体に含まれるイソプレン濃度を、iSCANHamiltonSundstrand質量分析計を用い測定した。膜電位の測定及び生存能判定のための実験手順膜電位を利用して、発酵時のバクテリアの生存能を評価した。発酵槽からブロスを回収し、PBS緩衝液を用い直ちに150倍希釈した。次いで、1μMビス-1,3-ジブチルバルビツル酸トリメチンオキソノールDiBAC43、Invitrogen、カタログ番号B-438を含有させたPBS緩衝液を用い細胞を更に150倍希釈した。試料を10分間染色し、フローサイトメトリーFACSCalibur,BectonDickinsonにより単個細胞の緑色蛍光を定量した。488nmの励起波長と、530nmの発光波長を用いた。まず始めに、対数増殖期の大腸菌BL21の培養液及び加熱殺菌した大腸菌BL21の培養液をDiBAC43で染色し、生菌及び死菌の緑色蛍光強度をそれぞれ測定した。この情報を利用して、フローサイトメトリーデータを解析する際のゲーティングを行い、膜電位をもつ細胞画分及び膜電位をもたない細胞画分を判別した。無傷なバクテリアのみを識別するために、適切な細胞の大きさ488nmにて前方散乱対側方散乱を測定についてもゲーティングを行った。次に、これらの基準のもと、通過する細胞が発する緑色蛍光強度を利用し、発酵試料中に含まれる正常な膜電位をもつ細胞画分と、膜電位をもたない細胞画分とを判別した。正常な膜電位をもつ細胞は生細胞であり、かつ代謝活性をもつものであると仮定し、それに対し、膜電位をもたない細胞は視細胞であり、代謝活性をもたないものであると仮定する。結果:メバロン酸経路によりイソプレンを生産している2株CMP437及びDW415を、フェドバッチ条件下での生存能について解析した。DW415株がイソプレン合成酵素に変異G491Sを有していたことを除き、2株は同質遺伝子を有していた。2株は発酵時に同様の増殖性を示し、相当量のイソプレンを生産した。放出気体に含まれるイソプレン及びCO2の濃度間の比によると、イソプレン合成酵素のG491S変異体を発現しているDM415株では、図13に示す通り、ほとんどの時点で、呼吸速度と比較してイソプレン生産速度が増加していた。DiBAC43染料によりバクテリアを染色し、フローサイトメトリーを用い緑色蛍光の発光強度を解析することで、発酵時の個々のバクテリアの膜電位を更に測定した。DiBAC43染料は膜電位の損なわれたバクテリアに浸透する。膜電位をもたないバクテリアは、一般的に死細胞であるものと見なされる。イソプレン合成酵素の対立遺伝子であるG491Sを発現しているDW415株では、図14に示す通り、発酵期間のほとんどで生存能が有意に増大した。実施例66×Hisタグを付加し、結晶化を目的とした、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素G491S変異体の構築本例は、結晶化を目的とした、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素のG491S変異体の構築例を示す。大腸菌宿主細胞内でのMVA経路への暴露に対し良好な耐性を示す変異体を濃縮し、変異G491Sこれまでに、非切断型IspS配列においてG507Sとして参照を保有しているウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素IspSを同定した。G491S,の有益な特性をより正確に判断するために、酵素変異体を精製し、その結晶構造を解像度2.6Åで解析し、次に未改変の野生型親酵素の構造と比較した。方法TEVプロテアーゼ認識部位と、IspSのC末端に6×Hisタグとを保有している、ベクター骨格MD09-163野生型酵素をコードしている。図1を参照されたいを用い、G491S変異体を構築した。製造元の推奨するプロトコルに従って、QuikChange変異導入キットStratageneを用い、G491S変異体を生成した以下のPCRの反応及びサイクルパラメーターを参照されたい。QuikChangeにより反応させ、製造元の推奨するプロトコルに従って、化学的な形質転換に対し受容能のある大腸菌TOP10細胞Invitrogenを形質転換し、LBKan50選択培地プレートに播種した。カナマイシンに耐性を示したコロニーをPCR法により直接的に選別し、プライマーQB1493及びT7ReverseQuintaraBiosciencesを用い配列決定を行い、配列を確認した。TOP10細胞を選択培地で増殖させ、プラスミドを精製Qiagenし、次にこのプラスミドを用い、製造元の推奨するプロトコルに従って、IspS変異体を発現させる前に化学的な形質転換に対し受容能のあるBL21DE3pLysSInvitrogenを形質転換した。QuikChange変異導入35μLH2O5μL10XPfuUltraIIrxn緩衝液6μL2.5mMdNTPsRoche1μL20μMG507SQC2For1μL20μMG507SQC2Rev1μLPfuUltraIIHSポリメラーゼStratagene1μLDNAテンプレートMD09-163QuickChange変異導入-サイクルパラメーター195°C-4分295°C-20秒352°C-20秒468°C-7分5工程2へ戻る5回繰り返す695°C-20秒755°C-20秒868°C-7分9工程2へ戻る20回繰り返す1068°C-10分114°C-停止表13.QuikChange及び配列決定プライマー表14.プラスミド:表15.株:1ウラジロハコヤナギMEATEV-MD09-163WTのアミノ酸配列MEARRSANYEPNSWDYDYLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQRLGLGYRFESDIRGALDRFVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLRETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGENILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAVVQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFERENLYFQGLEHHHHHHMD09-163のDNA配列tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgat配列表13ウラジロハコヤナギMEAG491STEV-pDW100G491Sのアミノ酸配列MEARRSANYEPNSWDYDYLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQRLGLGYRFESDIRGALDRFVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLRETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGENILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAVVQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLSGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFERENLYFQGLEHHHHHHpDW100のDNA配列tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagtt配列表2IspS-G491Sの発現及び精製6×Hisタグ付与したIspS-G491Sの発現N末端に6×Hisタグ付与したIspSをDW398株で発現させ、これを精製した。増殖法は、BL21λDE3pLysS細胞で発現させたヒスチジンタグ付加酵素に好適なものである。各1Lの予定していた増殖用に、10mLの一晩培養物を調製した。25mLフラスコを用い、10mLLB培地に適切な抗生物質50mg/mLカナマイシン、25mg/mLクロラムフェニコールを加え、新しい細胞プレートから1コロニーを接種し、あるいは凍結させたグリセロールストックを直接摂取した。約220rpmで振盪させながら、培養物を30°Cで一晩増殖させた。一日培養物は、各培養時に適切な抗生物質を添加した1LLB培地で調製した。各1Lの一日培養物に10mLの一晩培養物を接種し、OD600が約0.4~0.6に到達するまで、約220rpmで振盪しながら30~37°Cで増殖させた。次に、400μMのIPTGにより1日培養物に発現誘導を行い、220rpmで振盪しながら30°Cにて5~6時間増殖させた。次に、4°Cにて10,000×gで10分間遠心沈降し、細胞を回収した。回収後、細胞は次工程に直接用いるか、あるいは使用までの間-80°Cで保存した。6×Hisタグ付加したIspSの精製ヒスチジンタグ付加した酵素をBL21λDE3pLysS細胞から精製するにあたって、細胞を新鮮な溶解緩衝液溶解緩衝液pH8.0:Ni洗浄緩衝液0.5mMPMST、0.01Tween-20、1mg/mLリゾチーム、0.2mg/mLDNaseI、Ni洗浄緩衝液:50mMNaH2PO4、300mMNaCl、20mMイミダゾールに穏やかに再懸濁した。細胞ペレットに対し、培養培地1Lにつき約40~50mL溶解緩衝液を使用した。次に細胞を氷上で約30分インキュベートした。次に、可溶化液が透明になり始めるまで、フレンチプレスのセルを2~3回通過させて1200psi/Highsetting8.27MPa/Highsettingに設定して大型フレンチプレスセルを使用、細胞懸濁液を完全に可溶化させた。活性解析及びゲル解析約100μLのため可溶化液を保存した。次に、SorvallDiscovery90SE超遠心機により、4°Cにて30,000xgで30分遠心分離し、可溶化液を清澄化させた。上清を回収し、維持した。清澄化させた可溶化液試料を、活性解析及びゲル解析のため保存した約100μL。清澄化させた可溶化液を、0~100Ni緩衝液Bを用い、HisTrapHPカラムGEhealthcareに充填した。カラムに可溶化液を充填した後、このカラムをNi洗浄緩衝液50mMNaH2PO4、300mmNaCl、20mMイミダゾールpH8.0により洗浄した。次に、0~100Ni溶出緩衝液50mMNaH2PO4、300mMNaCl、500mMイミダゾールpH8.0を用い、カラムからhisタグ付加IspSを溶出させ、hisタグ付加IspSを含有している画分を回収した。次にカラムをNi脱着緩衝液20mMNaH2PO4、0.5mNaCl、50mMEDTApH7.4で洗浄した。次に、製造元の指示に従い、試料をSDS-PAGEゲル4~12ゲルNUPAGE、Invitrogenにより解析した。所望の画分をスピンフィルタVivaspin-20、Sartorisで濃縮し、次に、SephadexG25樹脂を装填したHiPrep26/10脱塩カラムGEheathcareで脱塩した。G-25緩衝液は、50mMHEPES、50mMNaCl、及び1mMDTTからなり、pH7.4であった。次に画分を解析し、濃縮した。次に試料を-80°Cで保存した。TEV切断DW398株由来のIspS-G491SDW398株については上記のとおりである。消化にはTurboTEVプロテアーゼEtonBioscienceInc.を用いた。精製タンパク質10μgにつき1単位のTurboTEVを使用した。消化は4°Cで一晩行った。試料をNi緩衝液で平衡化させた他のNiカラムに素通りさせ、未切断の酵素、タグ、TurboTEVプロテアーゼ同様にタグ付加されている、及び不純物を除去した。Niカラムを素通りさせ、洗浄液をSDS-PAGEゲルNUPAGE、Invitrogen;図16を用い解析し、及びDMAPP活性を解析した。高純度の酵素を含油している試料をプールし、1mMDTTを含有している50mMNaClpH7.4緩衝液で脱塩し、-80°Cで保存した。結晶構造の決定構造物DW398を記載の通りに生成し、次に、可能性のある結晶化条件を検討するためにタンパク質濃縮液を調製した。構造物を精製し、以下に記載の通りに別個に結晶化条件を検討した。研究室内で行ったすべての結晶化スクリーニングには、ハンギングドロップ蒸気拡散法を採用し、設定を行った。最小限に、市販のスクリーニングキット:HamptonResearch社AlisoViejo、CAのCrystalScreen及びQiagen社Valencia、CAのJCSGSuiteを用い、構造物を調査した。HamptonResearch社のCrystalScreen及びQiagen社のJCSGSuiteを用い、最初の結晶化スクリーニングを設定した。数多くの条件でこの構造物から結晶の生成が観察された;条件の最適化には、pH、沈殿剤、濃度、及びインヒビターの100通りもの調整が包含された。最適化実験により、回折用に10種の異なるDW398結晶を選別した。IspS-G491Sタンパク質からなり、3.5Åの分解能で回折する結晶を得た。大きな、棒状の結晶は正方形の空間群P43212に属し、格子定数はa=154.75、b=154.75、c=142.20である。2.5μLタンパク質10mg/mLタンパク質を2.5μL沈殿剤[0.1Mマロン酸ナトリウムpH7.0、18重量/体積ポリエチレングリコール3350、0.2Mチオシアン酸ナトリウム]と混合し、500μL沈殿剤に対し平衡化させ、結晶を成長させた。液体窒素による結晶の急速凍結前に、結晶は0.1Mマロン酸ナトリウムpH7.0、18重量/体積ポリエチレングリコール3350、0.2Mチオシアン酸ナトリウム、及び25重量/体積エチレングリコールに通し、凍結保護した。結晶をスタンフォードシンクロトロン放射光研究所に送付し、ビームライン7-1でデータを回収し、解像度2.6Åの回折像を得た。MosflmLeslie,A.1998J.ofAppl.Crystallography30,1036~1040によりデータを統合し、SCALACollaborativeComputationalProject,N.1994ActaCrystallographicaSectionD50,760~763によりスケーリングした。国際公開第2009/132220号に記載の通りの開始モデルとして、事前に構造決定していたウラジロハコヤナギ由来のIspS構造を用い、データを段階的にMOLREPVagin,A.,andTeplyakov,A.1997J.ofAppl.Crystallography30,1022~1025解析した。結晶は、溶媒含量63で、単位が非対称の二量体を1つ含有していた。可視化プログラムのCootEmsley,P.,etal.2010ActaCrystallographicaSectionD66,486~501を用い、マニュアルで再構築を繰り返す工程では、Refmac5CollaborativeComputationalProject,N.1994ActaCrystallographicaSectionD50,760~763により微調整を行った。微調整の間、Molprobityを用いタンパク質の幾何を確認したDavis,I.W.,etal.2007Nucl.AcidsRes.,35:W375~W383。現行モデルではRWork値は23.5であり、RFree値は28.6である。構造体は二量体から構成されていた図17。各モノマーは2つのらせん状のドメイン、活性部位を含むC末端ドメイン、及び機能未知のN端末ドメインから構成される。電子密度により、株DW398の位置491にはセリンが存在することが明確に示された図18。野生型IspS及びIspS-G491Sの構造アラインメントにより、全体的な折りたたみには変化が見られないものの、残基490~497を含有しているループの立体構造は、野生型タンパク質及び変異体タンパク質の間で異なっていることが示される図19。座標を付属書1に掲載する。実施例7:ウラジロハコヤナギIspSの完全な部位評価ライブラリSELの主要な比活性の解析親ベクターpCL201に完全なウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素MEAウラジロハコヤナギ骨格鎖544アミノ酸の部位評価ライブラリSELを構築し図4、比活性についてスクリーニングして、特性の改良されたイソプレン合成酵素IspS分子を同定した。ほとんどの場合、所定の位置のSELは、野生型を含む全20種の可能性のあるアミノ酸を含有していた。各ライブラリの付番はMEAウラジロハコヤナギ図20のORFに対応させ、開始メチオニンを位置1とする。MD09-170細胞に、発現させる変異体を含有させた個々の株を、各ウェルが、MEAウラジロハコヤナギの所定の位置での特異的なアミノ酸置換に対応するよう、マイクロタイタープレートに整列させた。マイクロタイタープレートには、可能性のある置換を全て組み込んだ4種のSEL、すなわちMEAウラジロハコヤナギの4箇所の位置を収容させた。残りのウェルには対照株を用いた。各試料に含まれるIspSタンパク質の一定量ごとに生産されたイソプレンの量を測定するために、プレートで株を増殖させ、発現誘導し、可溶化させた。SELのすべての組み合わせに含まれる全ての変異体について比活性を算出した。方法細胞増殖及び可溶化MEAウラジロハコヤナギIspSライブラリのグリセロールストックを短時間で解凍し、カナマイシンを20ug/mLで添加した液体LB培地を含有させたマイクロタイタープレートCellstarに播種した。EnzyscreenclampシステムEnzyscreenを用い、培養物を、振盪インキュベータ内で、飽和するまで250rpm、30°Cで一晩増殖させた。翌日、培養物を回収し、50ug/mLカナマイシン及び50uMIPTGを含有させたTM3-グルコース培地に、Liquidator96ピペットRaininInstrumentsを用い1:10比で接種した。野生型対照をそれぞれ増殖させ、TM3-グルコースを含有させた各マイクロタイタープレートに接種した。それぞれのウェルには30uM~65uMのIPTGを用い誘導強度を測定した。プレートを振盪インキュベータに戻し、250rpm、30°Cで発現誘導を5時間行った。次にインキュベータからプレートを取り出し、卓上遠心機で3700rpm、4°Cで20分遠心沈降させ、培養物をポリプロピレン製マイクロタイタープレートNuncに播種した。上清を除去し、溶解、DMAPPアッセイ、及びタンパク質の定量までの間、ペレットは-80°Cで保存した。細胞の溶解前に、プレートは-80°Cの冷凍庫から取り出し、卓上で10分間解凍した。Biomek自動化ワークステーションBeckmanCoulterにより、ペレットを200uL溶解緩衝液100mMTris、100mMNaClpH7.6緩衝液、1mg/mLBSA、50U/uLEpicentrereadylyseリゾチーム、0.1mg/mLDNase、0.5mMPMSF/AEBSF、5mMMgCl2に十分再懸濁し、除去し、室温で450rpmで30分振盪した。次に溶解液を3200rpm、4°Cで10分遠心処理し、DMAPP及びドットブロットアッセイのため、Biomekにより150uL上清を新しいマイクロタイタープレートに分取した。DMAPPアッセイDMAPPアッセイに際し、Liquidator96ピペットRaininInstrumentsを用い、96ウェルガラスブロックZinser中の75uLDMAPPアッセイ緩衝液100mMTris/100mMNaClpH7.6、1mg/mLBSA、50mMMgCl2、1mMDMAPPに25uL可溶化液を添加した。ガラスブロックをアルミホイルシールBeckmanCoulterで密閉し、室温で450rpmで1分インキュベートした。ガラスブロックを次に34°Cの水浴で30分インキュベートした後、70°Cで2分インキュベートし反応を停止させた。GC-MSに充填する前にBlocksを短時間冷却させた。密閉したガラスブロックを、水素炎イオン化検出器FIDと、CTCCombiPALオートサンプラーとを取り付けたAgilent7890aガスクロマトグラフィーGCシステムに充填した。GCFID法に用いたパラメーターを以下に記載する。カラム:ZB-5ms寸法:15mx0.25mm×0.25μmオーブン:GCはChemstationソフトウェアバージョンE.02.00.493を使用して制御し、CTCオートサンプラーはCycleComposerソフトウェアバージョン1.5.2を使用して制御した。CycleComposerソフトウェアは、連続的に1つの試料を注入した後に他の試料を順に注入するという作業を合計で48回行うようプログラムした。較正に応答する因子を測定するため、0.2体積/体積イソプレン/窒素ガスAirLiquideを標準として使用した。3つの別個の2mLバイアル瓶に較正ガスを充填し、上記の方法により解析して、応答因子の平均量を定量した。算出した応答因子量をもとに、マイクロソフトエクセルにより、個々の試料のピーク面積をイソプレン濃度の計算値に変換した。タンパク質定量タンパク質定量アッセイ前に、各プレート由来の複数の野生型試料をGC-MSによりイソプレンについて解析し、比活性が既知のMEAウラジロハコヤナギをもとにタンパク質濃度を逆算し、マイクロタイタープレート中の全ての試料の平均IspS量を定量した。ドットブロットアッセイを実施する際、ニトロセルロース膜Invitrogenを、1XPBS緩衝液10mMリン酸ナトリウム、150mMNaClPH7.8/-0.2に浸し、少なくとも5分平衡化させた。次に、HamiltonMicroLabSTAR液体操作ワークステーションにより、ウラジロハコヤナギIspSの充填濃度が0.025~0.5ugになるよう可溶化液を1XPBSで希釈した。精製した標準を濃度0.025~1ugで添加した。ブロッティングユニットMinifold-1、Whatmanを、製造元の推奨するプロトコルに従って組み立てた。陰圧を短時間加え、過剰な1XPBS緩衝液を除去した。試料各約200uLをMinifold-1に分取し、20kPaで陰圧を加えた。試料を完全に濾過した後、ウェルを1XPBS緩衝液200uLで一回洗浄した。洗浄緩衝液を膜から完全に除去してから真空を解除し、ピンセットを使用して膜を注意深く取り外し、ラベリングし、きれいなろ紙上で乾燥させた。ニトロセルロース膜上の各位置にブロットされたウラジロハコヤナギIspS分子を、WesternBreezeキットInvitrogenにより免疫検出した。一次モノクローナル又はポリクローナル抗体抗精製ウラジロハコヤナギIspSマウス抗体、ProsciIncorporatedはブロッキング溶液により1:5000希釈し、二次抗体AlexaFluor488抗マウスヤギIgGHL、Invitrogenはブロッキング溶液により2ug/mLに希釈した。製造元の推奨するプロトコルに従って、Storm860分子イメージャーGMI,Inc.及びImageQuantソフトウェアGEHealthcareにより蛍光スポットを定量し、マイクロソフトエクセルにより既知の標準と比較することで各試料の比タンパク質濃度を測定した。結果SELのすべての組み合わせに含まれる各変異体毎に、所定の時間で製造されたイソプレンモル量を、各試料に含まれるタンパク質の具体的な量で除算することにより、比活性値を算出した。性能指数PIは、任意の所定の変異体の比活性を、同一のマイクロタイタープレートで得られたいくつかの野生型の比活性測定値の平均により除算することにより算出した。例えば、比活性のPI値が1.5である変異体は、野生型と比較して活性が50増大している。同様の手法で、タンパク質濃度及びイソプレン生産のPIも算出し、これらの値を、より詳細なデータ解析に利用した。表16に、表17及び18に掲載する残基の配置に関し正確な定義を提供する。例えば、表17又は18でN-末端として掲載する残基は、参照配列MEAウラジロハコヤナギIspS配列番号1の残基1~215である。表16.MEAウラジロハコヤナギIspSアミノ酸位置の配置に関する定義MEAウラジロハコヤナギ構造内の対象とするアミノ酸の表面接近性及び推定機能も表17及び18に掲載する。ChemicalComputingGroup,Inc.により作成され、保守されているMOEプログラムにより表面接近性を算出した。各残基の親水性表面領域を推定し、特定の半径を有するプローブを用い評価した。次に、推定データをペプチドライブラリと比較し、これらのデータ間の比を表面接近性として記録した。表17及び18にも各残基に推定される機能を掲載する。例えば、機能としては、限定するものではないが、金属の結合活性部位、基質の捕捉、ループ形状の変形、ポット内でのその他の相互作用、及び二量体形成などが挙げられる。一次データをもとに、MEAウラジロハコヤナギ内の、野生型残基から変えるのに向かない残基位置を同定した表17、図23~29を参照されたい。これらの位置に野生型のものとは異なるアミノ酸置換をもつMEAウラジロハコヤナギ変異体は、30PI≦0.3以下の非活性を示し、すなわち機能的に不活性であった。これはつまり、MEAウラジロハコヤナギによりDMAPPをイソプレンへと効率的に変換するにあたり、最低限これらの位置に野生型残基が存在する必要があることを意味する。これらの位置の多くはMEAウラジロハコヤナギの活性部位に、又は活性部位近傍図24を参照されたいに位置し、限定するものではないが、金属の結合基質の配向に関係、基質の捕捉、基質の結合、及び触媒に関与するものと推定される。例えば、図25は、酵素機能における役割が未知である残基位置を示す。図26は、IspS二量体形成に関与し得る残基位置を示し、図27及び28はN末端に含まれ、又はN末端と相互作用し、ループによる遮蔽又は活性部位の機能に関与し得る残基位置を示す。図29は、基質捕捉ループ内に存在する、置換に耐性のないtoleratenosubstitutions残基位置を示す。再試験に当たり、最初のinvitroアッセイ時に野生型よりも高い比活性を示す変異体を選別した。上記の方法に従い、但し、免疫検出の際に、標準的な生化学的実施法に従って、ポリクローナル抗体に加えてモノクローナル抗体を使用して、変異体を試験した。表18に、再試験を行った変異体のうち、野生型よりも比活性の高かったPI>1.3変異体の一覧を掲載する。図30は、再試験時に変異体が比活性の増大を示した、IspSの結晶構造中の全ての位置を示す。これらの変異により、表18に掲載する推定上の機能を変更/増感させることで、IspSに対し、野生型酵素と比べ比活性上の利益が付与される。図31は、変異体が比活性の増大を示すことになる、IspSのN末端内に埋め込まれている又はIspSのN末端と相互作用する残基位置を示す。図32は、変異体が比活性の増大を示すことになる、IspSのC末端内に埋め込まれている又はIspSのC末端と相互作用する残基位置を示す。図33は、IspS変異体の二量体形成に正に作用する位置247を示し、図34は、変異体の比活性に明らかに有益である、N末端中のその他の残基位置を示す。図35は、変異体の比活性が高くなる、表面ループ上の残基配置を示し、図36は、変異体の比活性が高くなる、酵素表面上のループ以外の場所の残基配置を示す。図37は、変異体の比活性が野生型と比較して高くなる、基質捕捉ループ推定における残基配置を示す。この領域の特定の残基位置に、活性が増大する変異を有するものの、隣接する位置に変化はない表17及び図29を参照されたい。これにより、IspSにおいて基質捕捉ループであると推定された部位は、酵素作用によりDMAPPをイソプレンに変換するにあたって重要な部位であり、変化による影響を受けやすく、この部位を変化させることで、活性には負の又は正の作用のいずれかが生じ得ることが示される。表18に掲載し、図30~37に示したすべての変異体、又はこれらの変異体の組み合わせにより、酵素に更に効率的にDMAPPをイソプレンに変換させるIspS変異が示される。表18.MEAウラジロハコヤナギの再試験した変異体のうち比活性のPIが1.3以下であるもの実施例8:一次スクリーニングにより得られた1024の変異体に対する増殖アッセイDMAPPのイソプレンへの変換を触媒する酵素能を増大させるMEAウラジロハコヤナギ変異体を、invitroでの一次比活性スクリーニングにより同定した。IspSは生細胞内で機能すべき酵素であることから、invivoにおいて酵素の示すDMAPPのイソプレンへの変換能を測定する必要もあった。実施例1及び2は、invivoでのIspSの有効性を評価するための方法論を示す。本質的に、DMAPPのイソプレンへの変換により、IspSは、大腸菌の増殖に対するDMAPPの毒性効果を軽減する。増殖曲線において野生型と比較して性能が増大しているということは、所定の株内でイソプレン合成酵素の機能が向上していることを意味する。IspS変異体が、比活性の向上と、最良の増殖性能のいずれをも示すことは、発酵時のイソプレン生産を向上させるのに最も合う酵素の指標になる。方法増殖アッセイ及び比活性の測定増殖性を試験し、野生型MEAウラジロハコヤナギ酵素に対して比活性が増大していることを確認するため、一次比活性スクリーニングから得られた1024の変異体を選別した。本試験の実施にあたり、変異性の高い変異忍容性位置に変異をもち、比活性及び発現性のいずれもが野生型と比較して優位に低下していない変異体を選別した。増殖アッセイ用に、もとのグリセロールストックプレートから個々の変異体を単離し、再配置した。メバロン酸MVAの存在下で、変異体に対し低濃度及び高濃度のIPTGにより誘導を行い、増殖曲線を生成した。これらの株では、MVAが取り込まれ、かつ細胞増殖に対し毒性を示すDMAPPがメバロン酸経路に積極的に取り込まれる。機能性のウラジロハコヤナギIspS分子を発現させることで、DMAPPのイソプレンへの変換と、増殖阻害の緩和が得られる。これらのアッセイでは、良好に機能するIspS分子ほどDMAPPをイソプレンへと効果的に変換し、結果として増殖性が向上する。MEAウラジロハコヤナギIspSライブラリのグリセロールストックを短時間で解凍し、カナマイシンを20μg/mLで添加した液体LB培地を含有させたマイクロタイタープレートに播種した。培養物を、振盪インキュベータ内で、飽和するまで250rpm、30°Cで一晩増殖させた。翌日、培養物を回収し、50ug/mLカナマイシン、及び40又は100uMIPTGSigmaを含有させたTM3-グルコース培地に、1:10比で接種した。野生型対照を別個に増殖させ、IPTGの用量決定を行うためそれぞれ30uM~65μM培養時には40μMで誘導の、又は40~200μM培養時には100μMで誘導のTM3グルコースを含有させた各マイクロタイタープレートに接種した。プレートを振盪インキュベータに戻し、250rpm、30°Cで前誘導を2時間行った。次に、マイクロタイタープレートMatrical中で、50μg/mLカナマイシン、40又は100μMのIPTG、及び20mMMVAを含有させたTM3グルコース培地により培養物を1:10比で希釈した。MVAを添加し、又は添加せずに野生型対照に誘導を行い、並びに必要に応じてIPTGを用い、対照の誘導応答性を計測した。プレートをGrowthProfiler1152Enzyscreenに移し、製造元の推奨に従って、10時間の時間経過にわたって増殖曲線及び光学密度ODを測定した。40又は100μMのいずれかの濃度でIPTGによる誘導を行った、野生型株の4つの複製と比較して、各株の増殖に関係する性能指数PIを算出した。300分経過時点でのODに関係するPI値、最大OD、及び曲線下面積を算出した。本試験において、40μMのIPTGにより誘導を行ったすべての変異体の比活性も、これまでの実施例に記載の方法に従って求めた。同様の前誘導プレートから、増殖アッセイに使用する試料として試料を単離した。結果表16に、表19及び23に掲載する残基の配置に関し正確な定義を提供する。表19に、比活性のPI値が1.4以上であるすべての変異体を掲載する。配置、表面への接近し易さ、及び推定される機能も掲載する。表19に、単独で又は組み合わせによりIspSの反応効率を向上させる数種類の変異体を掲載する。図38及び39に、変異体が比活性の増大を示した残基配置を示す。比活性の増大した変異体では、DMAPPのイソプレンへのより効率的な変換が可能になり、かつ細胞による、発酵時のイソプレン生産量が増大することになる。表20及び21に、それぞれ誘導濃度40uM及び100uMでの増殖性の向上した変異体を掲載する。いくつかの異なる増殖性パラメーターを測定した結果、すべて互いに良好に相関していたものの、表20及び21に掲載する変異体の、最大ODのPI値のみを試験した。掲載した変異体は、所定の誘導濃度下で、野生型よりも50良好PI=1.5以上な最大OD値を示した。40uM及び100uMIPTGによる誘導条件下のいずれもで増殖性の向上した変異体最大ODでのPI値=1.3以上を表22に掲載し、図40及び41に示す。これらの変異により、総合的な増殖性を最も高く、かつIspSを発現している細胞におけるDMAPPのイソプレンへの変換効率が最も高い変異体を示す。これらの変異体のうちいくつかのものは、MEAウラジロハコヤナギの残基134~179にまたがる、特定のN端末へリックス領域付近又は領域内に存在する。この位置又はこの位置付近表16、20~23に示すN末端へリックスでのいくつかの変更により、いずれかの又は両方の増殖条件にて増殖性の向上が示された。MEAウラジロハコヤナギ内のこの位置に複数の変異体をマップするだけでなく、増殖性に対し最も有効性を示す変異体をヘリックスから外側に向け、かつ酵素表面上に配置する図41、43、及び44を参照されたい。表23に、3つのパラメーター、すなわち比活性、40uM及び100uMIPTGによる誘導下での最大ODのすべてについて、性能の向上が示されたPI=1.2以上変異体を掲載する。これらの変異体のうちいくつかの物を表22に掲載する。V30K及びV84Tを除き、これらの変異体のうち大部分のものは、上記N端末へリックス内又はヘリックス近傍にも位置する図42を参照されたい。これにより、残基150~172にまたがるへリックスにおける変異は、宿主細胞の増殖性の向上のみならす、酵素活性の向上にも重要であることが示される。N端末へリックス図43を参照されたいが触媒機能を持つことは明瞭には示されていないものの、これらの変異体は、IspS活性、すなわち酵素の立体構造の変更による分子内相互作用、あるいは同定されていない酵素、細胞内プロセス、又は構造との上記相互作用を介した分子間相互作用、のいずれかに影響し得る。単独で、又は触媒速度の増加などの有益な特性を付与する他の変異との組み合わせで、特定の位置に変異を包含しているMEAウラジロハコヤナギ酵素は、宿主株の増殖速度を増大させ、かつ発酵時のイソプレン生産性を向上させ得るようである。表19.再試験したMEAウラジロハコヤナギ変異体のうち比活性のPI値が1.4以上である変異体表20.40mMIPTG下、最大ODでのPI値が1.5以下であるMEAウラジロハコヤナギ変異体表21.100mMIPTG下、最大ODでのPI値が1.5以下であるMEAウラジロハコヤナギ変異体表22.40mM及び100mMIPTG下、最大ODでのPI値が1.3以下であるMEAウラジロハコヤナギ変異体表23.40μMのIPTG、及び100μMのIPTG下、最大ODでの比活性のPIが1.2以下であるMEAウラジロハコヤナギ変異体実施例9:コンビナトリアルライブラリに対する比活性及び増殖アッセイ3つの7員ライブラリに組み込むために、比活性、増殖性、又はいずれもの形質の改良されたMEAウラジロハコヤナギIspSの単一の変異体を選別した。方法pCL201ベクターを用いライブラリを構築し、MD09-170スクリーニング株を形質転換したDNA2.0。ライブラリにおいて、それぞれ128の可能性のある組み合わせのうちの約80~90を示す160の変異体を、これまでの実施例に記載の方法に従い、比活性及び増殖性をもとにスクリーニングした。表24に、コンビナトリアルライブラリ用に選別した変異、結晶構造中の位置、表面への接近性、及び選別基準比活性、増殖性、又はこれらの両方を掲載する。実施例7及び8に、これらの位置のアミノ酸に推定される機能を掲載する。表24.コンビナトリアルライブラリ用に選別した変異体結果比活性及び/又は増殖性能が大幅に改良されたコンビナトリアルな変異体を同定した。表25は、比活性の性能指数PIが2.6以上であるコンビナトリアルな変異体の一覧を包含する。左端のカラムは変異体番号を掲載し、続くカラムはライブラリ中の7つの異なる位置に関する遺伝子型を掲載する。比活性の向上した変異体において、酵素作用によるDMAPPのイソプレンへの変換がより効率的に行われるのは、動態パラメーターの改良によるものであるように思われる。表26は、比活性、40uMでの最大OD、及び100uMでの最大ODのPI値が1.3以上であるコンビナトリアルな変異体の一覧を包含する。比活性及び増殖パラメーターのいずれもが向上したIspS変異体は、野生型酵素と比較してDMAPPのイソプレンへの変換もより効率的に行い、また、宿主内でのIspSの有害な作用を軽減することから、宿主株の増殖に有益であるようである。各ライブラリメンバーは、可能性のある7つの変異が任意の組み合わせで含有するものであり、変異のもたらす効果は、異なる構成において複数回観察された。この観察結果は、各ライブラリにおいて最も効果的な組み合わせを同定する助けとなる、信頼性の高い内部対照となった。例えば、比活性の高いコンビナトリアル変異体では変異S444Dが存在していたため、この変異は、他の改良型変異と組み合わせることで、invitro活性に特に効果的に作用することが示唆される。M460A,A443G,及びI447Tもこの種類の効果を示した。同様にして、変異V162Pは、比活性及び増殖性のいずれについても特性の改良されたすべてのコンビナトリアル変異体に存在していたため、前段に記載の理由から、V162Pは他の変異との組み合わせで良好に機能し、宿主細胞内でDMAPPをイソプレンにより効率的に変換させるのに理想的な変異であり得ることが示唆された。I156G及びE170Hもこの作用を示した。変異G087R,R242N,及びS288Tも、他の変異と組み合わせた場合に比活性を改良したが、アッセイで常に最も高い性能を示したわけではなかった。表25及び26に示したコンビナトリアル変異は、宿主細胞による発酵時に、DMAPPをイソプレンへと最適に変換させるようIspS酵素を大幅に改良した。これらの特定のコンビナトリアル変異体に生じさせた個々の変異の有無をもとに、微生物における発酵によるイソプレン生産を最適化するのに必要とされる最終的なIspS変異体に組み合わせることのできるすべての変異のうち、最も良好な変異を示すことができる。表25.MEAウラジロハコヤナギのコンビナトリアル変異体のうち比活性のPIが2.6以下であるもの表26.MEAウラジロハコヤナギのコンビナトリアル変異体のうち、比活性、40μMのIPTG下での最大OD、及び100μMのIPTG下での最大ODのPIが1.3以下である変異体実施例10:MEAウラジロハコヤナギIspSのN端末トランケーションの判定イソプレン合成酵素は、N末端に、適切な酵素作用によるDMAPPのイソプレンへの変換に必要とされるタンデムアルギニン残基を含有する。トランケーションの結果、MEAウラジロハコヤナギは、よりN端末領域が長い酵素と比較した場合に、最大で、天然に生じる、葉緑体を標的とするペプチドと高い比活性を示す。MEAウラジロハコヤナギ酵素は、アルギニン残基図45を参照されたいの上流にはただ2残基のみをもつが、これらの残基が酵素活性に関してもつ機能は報告されていなかった。したがって、MEAウラジロハコヤナギ酵素のN端末をトランケーションさせ、トランケーションにより更にIspSの比活性に対し効果が付与されるか否かを評価するアッセイを行った。方法これまでに示した通り、製造元の推奨するプロトコルに従ってテンプレートpCL201プライマー配列については表27を参照されたいに対しQuikChangeStratagenePCRを行い、MEAウラジロハコヤナギの2つのトランケーションを構築した。PCR産物を1μLDpnIRocheで3時間処理し、次に製造元の推奨するプロトコルに従って、1μLの完全反応液を用い、化学的な形質転換に対し受容能のある大腸菌Top10細胞Invitrogenを形質転換した。細胞を回収し、50μg/mLカナマイシンを含有させたLB培地に播種した。翌日、増殖性が陽性のコロニーを選別し、プラスミド精製Qiagen及び配列決定QuintaraBiosciencesを行った。翻訳領域全長を配列決定し、コード配列の完全性を確認して、正しいトランケーションを保有するプラスミドを選別した。電気穿孔法を用い、発現株MD09-170を、プラスミド、pDW207図46を参照されたい及びpDW208図47を参照されたいにより形質転換し、非活性を測定した表28を参照されたい。比活性はこれまでに示した通りに測定した。各トランケーション体に関し少なくとも30の複製をMEAウラジロハコヤナギと比較して解析した。表27.QuikChange変異導入に使用したプライマー表28.N端末トランケーションをもつ株結果株DW618MAR又はDW619MRRで発現させた、トランケートされているウラジロハコヤナギIspSの比活性は、それぞれ親MEAウラジロハコヤナギ酵素と比較して改良されておらず、あるいはわずかに低かった。表29は、ウラジロハコヤナギIspSのMAR及びMRRトランケーション体の両方の性能指数を示す。MARトランケーション体は、対照MEAウラジロハコヤナギ分子とほぼ等しい比活性を示し、MRRトランケーション体は、対照のおよそ81の比活性を示した。これらのトランケーション体の比活性は、MEAウラジロハコヤナギと比較して増大していなかったものの、これらは、アルギニン残基以外のN末端をすべて除去する必要がある場合に、将来的に、IspS酵素によりDMAPPをイソプレンに変換する発酵株に使用できそうな程度の十分な活性を保有していた。表29.トランケートしたウラジロハコヤナギIspS変異体の性能指数ウラジロハコヤナギIspSMARのアミノ酸配列MARRSANYEPNSWDYDYLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQRLGLGYRFESDIRGALDRFVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLRETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGENILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAVVQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFERpDW207のプラスミドDNA配列tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgta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