"次のステップを含む、PCV2のオープンリーディングフレーム2によって発現される組換えタンパク質を回収する方法A該PCV2由来組換えオープンリーディングフレーム2をトランスファーベクターにクローニングする;B該組換えオープンリーディングフレーム2を含む該トランスファーベクターの一部分をウイルスにトランスフェクトする;C培地中の細胞を該ウイルスで感染する;D該ウイルスに該オープンリーディングフレーム2由来タンパク質を発現させる;E細胞を上清から分離する;及びF該発現オープンリーディングフレーム2タンパク質を該上清中で回収する。請求項1に記載の方法であって、前記方法が、オープンリーディングフレームを該トランスファーベクターにクローニングする前にPCV2ウイルス株由来の該オープンリーディングフレーム2を増幅するステップをさらに含む方法。請求項1に記載の方法であって、前記組換えオープンリーディングフレーム2が、5’側のコザック配列、3’側のEcoRI認識部位、及びそれら両者の組合せからなる群から選ばれる配列をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。前記5’側のコザック配列が、配列番号1の配列を含む、請求項3に記載の方法。前記3’側のEcoRI認識部位が、配列番号2の配列を含む、請求項3または4に記載の方法。前記PCV2オープンリーディングフレームが、配列番号4の配列を含む、請求項1~5のいずれかに記載の方法。前記組換えタンパク質が、配列番号6の配列を含む、請求項1~6のいずれかに記載の方法。前記培地が、無血清昆虫細胞培地を含む、請求項1~7のいずれかに記載の方法。請求項1の方法であって、さらに次のステップを含む方法:iステップAの前に、該増幅されたオープンリーディングフレーム2を第1のベクターにクローニングする;ii該オープンリーディングフレーム2を第1のベクターから切り出す;及びiii該切り出されたオープンリーディングフレーム2をステップAで使用する。前記細胞が、SF細胞を含む、請求項1~9のいずれかに記載の方法。前記ウイルスが、バキュロウイルスを含む、請求項1~10のいずれかに記載の方法。前記トランスフェクトされる部分が、配列番号4の配列を含む、請求項1~11のいずれかに記載の方法。前記オープンリーディングフレーム2タンパク質が、細胞を該ウイルスで感染してから少なくとも5日目に該上清中で回収される請求項1~12のいずれかに記載の方法。PCV2に対する免疫応答を引き起こすための組成物を製造する方法であって、該方法が次のステップを含む方法:iPCV2のオープンリーディングフレーム2由来の組換えDNAを含むコンストラクトをウイルスにトランスフェクトする;ii該トランスフェクトされたウイルスを、培地中の細胞に感染させる;iii該ウイルスに該オープンリーディングフレーム由来の組換えタンパク質を発現させる;iv該発現されたオープンリーディングフレーム2タンパク質を上清中で回収する;及びv該回収されたタンパク質と適切なアジュバント又は他の薬学的に許容される担体又は賦形剤と合わせる。請求項14に記載の方法であって、前記方法が、該コンストラクトをトランスファーベクターから得る段階をさらに含む方法。請求項14または15に記載の方法であって、前記方法が、該オープンリーディングフレーム2を該トランスファーベクターにクローニングする前に、PCV2の株から該オープンリーディングフレーム2を増幅する段階をさらに含む方法。請求項14~16のいずれかに記載の方法であって、前記組換えオープンリーディングフレーム2が、5’コザック配列、3’EcoRI認識部位、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる配列をさらに含む方法。前記5’コザック配列が、配列番号1の配列を含む、請求項17に記載の方法。前記3’EcoRI認識部位が、配列番号2の配列を含む、請求項17または18に記載の方法。前記PCV2オープンリーディングフレーム2が、配列番号4の配列を含む請求項14~19のいずれかに記載の方法。前記組換えタンパク質が、配列番号6の配列を含む、請求項14~20のいずれかに記載の方法。前記培地が、無血清昆虫細胞培地を含む、請求項14~21のいずれかに記載の方法。請求項16~22のいずれかに記載の方法であって、次のステップをさらに含む方法:i該増幅されたオープンリーディングフレーム2を第1のベクターにクローニングする;ii該オープンリーディングフレームを該第1のベクターから切り出す;iii該切り出されたオープンリーディングフレーム2を該トランスファーベクターにクローニングするために使用する。前記細胞が、SF細胞を含む、請求項14~23のいずれかに記載の方法。前記ウイルスが、バキュロウイルスを含む、請求項14~24のいずれかに記載の方法。前記トランスフェクトされるコンストラクトが、配列番号4の配列を含む、請求項14~25のいずれかに記載の方法。前記オープンリーディングフレーム2タンパク質が、該細胞に該ウイルスが感染してから少なくとも5日目以降に回収される、請求項14~26のいずれかに記載の方法で。請求項14~27のいずれかに記載の方法であって、該回収段階が、該培地を該細胞及び細胞片から分ける分離ステップをさらに含む方法。前記分離ステップが、該細胞、細胞片、及び培地を、0.45μmから1.0μmの範囲にある孔径をもつフィルターを通してろ過するステップを含む、請求項28に記載の方法。請求項14~29のいずれかに記載の方法であって、該方法が、該回収されたタンパク質を適切なアジュバントと合わせる前に、該ウイルスを不活化するステップをさらに含む方法。PCV2由来のオープンリーディングフレーム2によって発現されるタンパク質を回収する方法であって、次のステップを含む方法:i該オープンリーディングフレーム2を含む組換えウイルスベクターを培地中で細胞に感染させる;ii該ベクターに該タンパク質を発現させる;及びiii上清中の該発現されるタンパク質を回収する。前記ウイルスベクターによる細胞の感染から少なくとも5日経過後に、該回収を行う、請求項31に記載の方法。請求項1、請求項14、請求項31、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる方法によって得られるものの組成物。請求項33に記載の組成物の医薬品としての使用。PCV2の感染を防ぐための医薬品を調製するための、請求項33に記載の組成物の使用。次の手順を含む、試料中のPCV2感染を検出するための診断キットを製造する方法:i請求項1、請求項14、請求項31、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる方法を使って組換えタンパク質を製造する;ii及び、該組換えタンパク質を適切な容器にパッケージングする。請求項36に記載の方法であって、取扱説明書を組換えタンパク質をパッケージングする容器と一緒に含ませるステップをさらに含む方法。PCV2ORF2タンパク質、又はPCV2ORF2タンパク質に由来する連続する少なくとも10個のアミノ酸をもつ、その免疫原性部分を含む、PCV2感染に係わる臨床症状の重さを軽減するために有効な免疫原性組成物。前記PCV2ORF2タンパク質が次のいずれかである、請求項38に記載の組成物:i配列番号5、配列番号6、配列番号9、配列番号10又は配列番号11からなる群から選ばれる配列を含むポリペプチド;iiiのポリペプチドに少なくとも80相同である任意のポリペプチド;iiii及び/又はiiのポリペプチドの任意の免疫原性部分;iv配列番号5、配列番号6、配列番号9配列番号10又は配列番号11の配列に含まれる少なくとも10残基の連続したアミノ酸からなる、iiiの免疫原性部分;v配列番号3または配列番号4の配列を含むDNAによってコードされるポリペプチド;vivのポリヌクレオチドに少なくとも80相同であるポリヌクレオチドによってコードされる任意のポリペプチド;viiv及び/又はviのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの任意の免疫原性部分;viiiviiの免疫原性部分であって、該免疫原性部分が配列番号3又は配列番号4の配列に含まれる少なくとも30個の連続するヌクレオチドを含む免疫原性部分。請求項38または39に記載の免疫原性組成物であって、不活化されたウイルスベクター及び細胞培養上清をさらに含む組成物。前記不活化ウイルスベクターが、PCV2ORF2タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスである、請求項38~40のいずれかに記載の組成物。請求項40または41に記載の免疫原性組成物であって、BEIを含む組成物。請求項42の免疫原性組成物であって、チオ硫酸ナトリウムを含む組成物。請求項39~43のいずれかに記載の免疫原性組成物であって、担体、アジュバント、培地、不活化剤、希釈剤、浸透圧調節剤、免疫モジュレーター剤、抗体及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる追加の成分を含む免疫原性組成物。前記組成物が、アジュバント、好ましくはカーボポールを含む、請求項44に記載の組成物。前記組成物が、薬学的に許容できる塩、好ましくは食塩を含む、請求項45に記載の組成物。前記組成物が、少なくとも0.2mcg/mlのPCV2ORF2タンパク質を含む、請求項38~46のいずれかに記載の組成物。前記組成物が、少なくとも2μgのPCV2ORF2タンパク質を含む、請求項38~46のいずれかに記載の組成物。請求項38~48のいずれかに記載の免疫原性組成物の少なくとも1用量を含む容器であって、1用量が少なくとも2μgのPCV2ORF2タンパク質を含む容器。請求項38~48のいずれかに記載の免疫原性組成物の10から250用量を含む容器であって、1用量が少なくとも2μgのPCV2ORF2タンパク質を含む容器。請求項49に記載の容器であって、さらに抗微生物学的活性剤を含む容器。請求項49に記載の容器及びPCV2感染に関係する臨床症状の重篤さを軽減するための、子ブタに対する少なくとも1用量の免疫原性組成物の筋肉内投与に関する情報を含む取扱い説明書を含むキット。前記取扱い説明書が、2回目の投与又は他のさらなる投与が直前の投与から少なくとも14日を越えるものである、少なくとも1用量の免疫原性組成物の2回目またはそれ以降の投与に関する情報を含む、請求項52に記載のキット。<好適な実施例の詳細な記載>これから述べられる実施例によって、本発明に従った好ましい材料と手順が示される。しかしながら、これらの実施例は例示のためだけに提供されるものであり、それによって本発明の範囲を制限するものではないと理解されるべきである。実施例1この実施例は、本発明の方法を用いたORF2の相対的な収率を公知方法を用いた場合と比較する。4本の1000mLスピナーフラスコそれぞれに、1.0×106個/mlのSf細胞を含む300mLの昆虫無血清培地、エクセル420JRHバイオサイエンス,レネクサ,KSが入れられた。マスター細胞培養はSFSpodopterafrugiperdaマスター細胞ストック、19継代、ロットN112-095Wとして識別される。SFマスター細胞ストックを作るために使用された細胞は、プロテインサイエンスコーポレーション、メリデン、CTから購入された。この実施例のためのSF細胞ラインは19から59継代の間に限定された。詳細に調べてはいないが、それ以外の継代数のものも本発明の目的のためには使えるであろうが、大規模製造のためにプロセスをスケールアップするためには、少なくとも19継代のものがおそらく必要であり、59継代を超えるものは発現に影響するかもしれない。より詳細には、液体窒素保存からの最初のSF細胞培養は、スピナーフラスコ中のエクセル420培地に懸濁して、連続的に撹拌しながら増殖させられた。培養は100mLから250mLのスピナーフラスコに、25から150mLのエクセル420無血清培地を入れて増殖させられた。細胞が細胞密度1.0~8.0×106細胞/mlまで増えたときに、それらは播種濃度0.5~1.5×106細胞/mLで新しい容器に分けられた。引き続き増える培養は容量36Lまでのスピナーフラスコ又は300Lまでのステンレス鋼製バイオリアクターで、2~7日間、25~29°Cで、増殖させられた。接種後、フラスコは27°Cで4時間インキュベートされた。続いて、各フラスコにはPCV2ORF2遺伝子配列番号4を含む組換えバキュロウイルスが接種された。PCV2ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルスは次のように作られた:PCV2の北米株からのPCV2ORF2遺伝子がPCR増幅されて5’コザック配列配列番号1及び3’EcoRI認識部位配列番号2を含む、pGEM-T-Easyベクタープロメガ、マジソン、WIにクローニングされた。それから、それは、引き続いて切り出され、運搬ベクターpVL1392BDバイオサイエンス、ファーミンゲン、サンディエゴ、CAにサブクローニングされた。サブクローニングされた部分はここに配列番号7として示される。PCV2ORF2遺伝子を含むpVL1392プラスミドはN47-064Yと名付けられ、その後、PCV2ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを作製するために、バキュロゴールドBaculoGold、登録商標BDバイオサイエンス、ファーミンゲンバキュロウイルスDNAとともにSf昆虫細胞プロテインサイエンス、メリデン、CTにコトランスフェクトされた。新しいコンストラクトはここに配列番号8として与えられる。PCV2ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルスはプラーク純化され、マスターシードウイルスMSVがSF細胞ラインで増殖させられ、分取され、-70°Cに保存された。MSVはバキュロウイルス特異的プライマーを用いるPCR-RFLPによってPCV2ORF2バキュロウイルスとして陽性識別された。MSV又は作業用シードウイルスを作製するためにPCV2ORF2バキュロウイルスに感染した昆虫細胞は、間接蛍光抗体測定法でポリクローナル血清又はモノクローナル抗体によって検出されるPCV2ORF2抗原を発現する。さらに、PCV2ORF2バキュロウイルスの同一性はN末端のアミノ酸配列によって確認された。PCV2ORF2バキュロウイルスMSVもまた、9C.F.R.113.27c、113.28及び113.55に従って純度がテストされた。スピナーフラスコに接種されたそれぞれの組換えバキュロウイルスは様々な重複感染度MOIをもっていた。フラスコ1は7.52mLの0.88MOIシードが接種された;フラスコ2は3.01mLの0.36MOIシードが接種された;フラスコ3は1.5mLの0.18MOIシードが接種された;そして、フラスコ4は0.75mLの0.09MOIシードが接種された。PCV2ORF2組変えバキュロウイルスを構築するために使用される基本的ステップを図示する概念的フロー図がここに図1として提供される。バキュロウイルスを接種した後に、フラスコは27±2°Cで7日間インキュベートされ、さらにその期間中100rpmで振とうされた。フラスコは通気できるように通気性キャップを使用した。各フラスコからのサンプルは、7日間にわたり、24時間毎に採取された。抽出後、各サンプルは遠心され、ペレットと上清の両方が分けられ、それからポアサイズ0.45~1.0μmのメンブレンを通して精密ろ過された。できあがったサンプルは、それから、その中に存在するORF2の量をELISAアッセイで定量された。ELISAアッセイは1:6000に0.05M炭酸バッファーpH9.6で希釈したキャプチャー抗体ブタ抗PCV2PabIgGProtGPBSで1:250に希釈を用いて行われた。100μLの抗体がそれからマイクロタイタープレートのウェルに置かれ、シールされ、一晩37°Cでインキュベートされた。プレートはそれから0.5mLのツイーン20シグマ、セントルイス、MOで100mLの10×D-PBSギブコインビトロゲゲン、カールスバッド、CA及び899.5mlの蒸留水を含む洗浄液で3回洗われた。続いて、250μLのブロッキング溶液5gカーネーション脱脂粉乳ネスレ、グレンデール、CAを10mLのD-PBSに溶かし、蒸留水で100mlに調製が各ウェルに加えられた。次のステップはテストプレートを洗い、その後、プレ希釈抗原を加えることである。プレ希釈抗原は200μLの希釈溶液0.5mLツイーン20を999.5mLのD-PBSに溶かすを希釈プレート上の各ウェルに加えることによって作られた。それからサンプルが1:240の比と1:480の比に希釈され、そして、100μLの各希釈サンプルが希釈プレートの一番上のウェルに加えられたつまり、一番上のウェルには100μLの1:240希釈が入り、他は100μLの1:480希釈が入る。系列希釈がそれからプレートの残りに対して100μLをそれぞれの連続するウェルからとり、プレート上の次のウェルに移動することによって行われた。各ウェルは次の移動を行う前に混合された。テストプレート洗いにはプレートを洗浄バッファーで3回洗うことが含まれた。プレートはそれからシールされ、洗浄バッファーでさらに3回洗う前に1時間37°Cでインキュベートされた。使用された検出抗体はPCV2ORF2に対するモノクローナル抗体であった。それは1:300に希釈溶液で希釈され、そして、それから100μLの希釈検出抗体がウェルに加えられた。プレートはその後シールされ、洗浄バッファーで3回洗われる前に1時間37°Cでインキュベートされた。コンジュゲート希釈剤がそれから正常ウサギ血清ジャクソンイムノリサーチ,ウェストグルーブ,PAを希釈液に1濃度になるように加えることによって調製された。コンジュゲート抗体ヒツジ抗マウスH1‐HRPジャクソンイムノリサーチがコンジュゲート希釈剤中で1:10,000に希釈された。100μLの希釈コンジュゲート抗体がそれから各ウェルに加えられた。プレートはそれからシールされ、洗浄バッファーで3回洗われる前に45分間37°Cでインキュベートされた。100μLの基質TMBペルオキシダーゼ基質,カークガードアンドペリーラボラトリーKPL,ガイザーズバーグ,MDが、等量のペルオキシダーゼ基質BKPLと混ぜられ、各ウェルに加えられた。プレートは室温で15分間インキュベートされた。それから100μLの1NHCL溶液が反応を停止するために全ウェルに加えられた。プレートはそれからELISAリーダーに通された。このアッセイの結果は下の表1に示される:これらの結果は、インキュベーション時間が延長されるときに、ORF2の遠心により分けられた細胞と培地の上清への発現が、遠心により分けられた細胞と培地のペレットでの発現よりも多いということを示している。従って、ORF2の発現を少なくとも5日間続けさせて、それを上清中で回収することが、5日間よりも短い期間発現を続けさせて、細胞からORF2を回収することよりもむしろ、ORF2の収量の著しい増大、従来の方法を超える著しい進歩を与える。実施例2この実施例はここで主張される発明の有効性に関するデータを提供する。1000mlのスピナーフラスコにおよそ1.0×106細胞/mlのSf細胞を含む300mlのエクセル420培地が入れられた。フラスコはそれから27°Cでインキュベートされ、100rpmで振盪された。続いて、フラスコに10mlの0.1のMOIをもつPCV2ORF2/Bacp6SD昆虫細胞でさらに6代継代した、PCV2ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルスウイルスシードが24時間のインキュベーション後に接種された。フラスコはそれから27°Cで合計6日間インキュベートされた。インキュベーションの後、フラスコは遠心され、生じた上清の3つのサンプルが採集され、不活化された。上清はその温度を37±2°Cに引き上げることによって不活化された。1番目のサンプルに対しては、環化して0.2MのバイナリエチレンイミンBEIとなったブロモエチレンアミン臭化水素酸塩の0.4M濃度0.3N水酸化ナトリウム溶液が上清に加えられて、終濃度5mMのBEIを与えた。2番目のサンプルに対しては、10mMのBEIが上清に加えられた。3番目のサンプルに対しては、上清にBEIが加えられなかった。サンプルはそれから48時間連続して撹拌された。最終最小濃度5mMを与える1.0Mチオ硫酸ナトリウム溶液が残りのBEIを中和するために加えられた。各サンプル中のORF2の量がそれから実施例1の記載と同じELISAアッセイ手順を用いて定量された。この結果は下の表2に見られよう。この実施例はBEIでの中和は組換えPCV2ORF2タンパク質産物の有意な量を除去したり分解したりしないということを説明する。これはBEI又は温度上昇からの上清中のORF2の大きな損失がないという事実によって裏づけられる。いわゆる当業者は回収されたORF2は安定なタンパク質産物であるということを理解するだろう。実施例3この実施例は本発明が組換えPCV2ORF2の小規模生産から、組換えPCV2ORF2の大規模製造までスケーラブルであることを示す。7000mLのエクセル420培地中の5.0×105細胞/mlのSF細胞/mlが、20000mLのアプリコンバイオリアクターに移植された。培地と細胞はそれから27°Cでインキュベートされ、100rpmで続く68時間の間撹拌された。68時間目に、41.3mLのPCV2ORF2バキュロウイルスMSV3が7000mLのエクセル420培地に加えられた。できた混合物はそれからバイオリアクターに加えられた。続く7日間、混合物は27°Cでインキュベートされ、100rpmで撹拌された。バイオリアクターからのサンプルは、感染後、4日目から開始し、24時間毎に抽出され、各サンプルは遠心された。サンプルの上清が保存され、ORF2の量がその後、SDS-PAGEデンシトメトリーを使って定量された。この結果は下の表3に見ることができる。実施例4このこの実施例は7つのPCV2ワクチン候補の効果をテストし、さらにPCV2の病原性株への暴露に続く有効性パラメタを定める。帝王切開により分娩され、初乳を与えられないCDCD、9~14日齢の、108匹の子ブタが無作為に同じ個体数の9つのグループに分けられた。表4はこの実施例の全体的な研究設計を示す。グループのうち7つグル~プ1~7には、PCV2ORF2ポリペプチドの用量を投与され、グループのうちの1グループはチャレンジコントロールの役を務め、PCV2ORF2の投与がされず、残り1グループは厳密な陰性コントロールの役を務め、やはりPCV2ORF2の投与がされなかった。実験0日目に、グループ1からグループ7は割り当てられたワクチンで処理された。グループ7のブタは実験14日目にブースター処理を受けた。ブタはワクチン接種に続き副作用の兆候及び注射部位の反応を観察され、実験19日目に2番目の研究サイトに移動された。2番目の研究サイトでは、グループ1~8が一つの建物に一緒に収容されたが、グループ9は別の建物に収容された。すべてのブタが、スカシ貝KeyholelimpetヘモシアニンKLH/フロインドの不完全アジュバントICFAの投与を実験21日目と27日目に受け、実験24日目に、グループ1~8は病原性PCV2のチャレンジを受けた。チャレンジ前後に、血液サンプルがPCV2の血清学のために採取された。チャレンジ後に、平均的な日ごとの体重増加を確定するための体重データ、及び臨床症状が、PCV2の鼻からの排出を確認するための鼻スワブサンプルとともに、採取された。実験49日目に、全ての生き残ったブタが解剖され、肺が病変に従ってスコア化され、選ばれた組織が後日の免疫組織化学IHC的検査のためにホルマリン中に保存された。材料と方法これは、実験0日目に9から14日齢であった、CDCDブタにおいて行われた、一部盲検化されたワクチン接種-チャレンジのフィージビリティスタディであった。研究に含まれるため、種雄豚のPCV2IFAタイター≦1:1000であった。さらに、種雄豚の血清学的状態は既知のPRRS陰性の群れに由来した。28匹の種雄豚がPCV2の血清学的状態を検査された。14匹の種雄豚が1000以下のPCV2タイターを示し、1番目の研究サイトに移された。110匹の子ブタが帝王切開手術によって分娩され、実験~4日目にこの研究のために利用可能であった。上の表4に示されるように、実験~3日目に、1番目の研究サイトにいる108匹のCDCDブタが体重を測定され、耳タグで個体識別され、体重によって区分され、そして、無作為に9グループのうちの1つに割り振られた。算入基準に合致するテスト動物が研究に含められ、後に何らかの理由で除外された場合、調査員とモニターが、最終的な分析でその動物から採集されたデータの使用を判断するために、相談した。子ブタを登録した日は除外され、除外の理由は文書に記録されている。最初に、種雄豚で除外されたものはなかった。実験~3日目に、利用可能な110匹のうち総数108匹のブタが無作為に9グループのうちの1つに割り振られた。2匹の最も小さなブタ番号17及び18はグループに割り振られず、必要ならばエキストラとして利用可能であった。研究行程中、数匹の動物が除かれた。実験~1日目に82番のブタグループ9、実験3日目に56番のブタグループ6、実験4日目に53番のブタグループ9、実験8日目に28番のブタグループ8、実験7日目に69番のブタグループ8、及び実験9日目に93番のブタグループ4が、それぞれ、チャレンジ前に死亡していることが発見された。これら6匹のブタは最終的な研究結果に含まれていない。17番のブタエキストラのブタの1匹がグループ9に割り振られた、残りのエキストラのブタ、19番は、研究から除かれた。各グループに与えられた調製物は次の通りである:グループ1は、16μg/mlのORF2を含む1mlのウイルスORF2vORF2を投与することが計画された。これは、10.24mlのウイルスORF2256μg/25μg/ml=10.24mlvORF2を3.2mlの0.5カーボポール及び2.56mlのリン酸緩衝食塩水pH7.4と混合することにより行われた。こうして16mlのグループ1用調製物が作られた。グループ2は、8μg/mlのvORF2を含む1mlのvORF2を投与することが計画された。これは、5.12mlのvORF2128μg/25μg/ml=5.12mlvORF2を3.2mlの0.5カーボポール及び7.68mlのリン酸緩衝食塩水pH7.4と混合することにより行われた。こうして16mlのグループ2用調製物が作られた。グループ3は、4μg/mlのvORF2を含む1mlのvORF2を投与することが計画された。これは、2.56mlのvORF264μg/25μg/ml=2.56mlvORF2を3.2mlの0.5カーボポール及び10.24mlのリン酸緩衝食塩水pH7.4と混合することにより行われた。こうして16mlのグループ3用調製物が作られた。グループ4は、16μg/mlのrORF2を含む1mlの組換えORF2rORF2を投与することが計画された。これは、2.23mlのrORF2512μg/230μg/ml=2.23mlrORF2を6.4mlの0.5カーボポール及び23.37mlのリン酸緩衝食塩水pH7.4と混合することにより行われた。こうして32mlのグループ4用調製物が作られた。グループ5は、8μg/mlのrORF2を含む1mlの組換えORF2rORF2を投与することが計画された。これは、1.11mlのrORF2256μg/230μg/ml=1.11mlrORF2を6.4mlの0.5カーボポール及び24.49mlのリン酸緩衝食塩水pH7.4と混合することにより行われた。こうして32mlのグループ5用調製物が作られた。グループ6は、4μg/mlのrORF2を含む1mlの組換えORF2rORF2を投与することが計画された。これは、0.56mlのrORF2128μg/230μg/ml=0.56mlrORF2を6.4mlの0.5カーボポール及び25.04mlのリン酸緩衝食塩水pH7.4と混合することにより行われた。こうして32mlのグループ6用調製物が作られた。グループ7は、MAXPCV2KVを含む2mlのPCV2不活化ウイルス全粒子PCV2KVを投与することが計画された。これは、56mlのPCV2KVを14mlの0.5カーボポールと混合することにより行われた。こうして70mlのグループ7用調製物が作られた。最後に、グループ8は、2ml用量あたり0.5μg/ml又は1.0μg/mlのKLHを投与することが計画された。これは、40.71mlのKLH0.5μg/mlで7.0μgタンパク質/ml=570ml7.0μg/ml=0.5570ml、244.29mlのリン酸緩衝食塩水pH7.4及び285mlのフロインドアジュバントを混合することにより行われた。表5はこの実施例のキーとなる行動に対するタイムフレームを記載している。研究の生存中フェイズの完了に引き続き、病理学者によって、ホルマリン固定組織が免疫組織化学IHCによってPCV2抗原の検査がされ、血液サンプルはPCV2血清学の評価をされ、鼻スワブサンプルはPCV2排出の評価をされ、そして平均1日あたり体重増加ADWGが実験24日目から59日目まで決定された。動物は1番目の研究サイトで、5つの部屋の個別のケージに、誕生から約11日齢まで、収容されたほぼ研究0日目である。各部屋は同じレイアウトであり、加温され、ろ過された空気が分離単位ごとに供給される個別のステンレス鋼製のケージから構成されていた。各部屋は別々の暖房装置と換気装置をもち、それによって部屋の間の空気のクロスコンタミネーションを防いだ。動物は2番目の研究サイトで、2つの異なる建物に収容された。グループ9厳密な陰性コントロールが改造された仕上棟に分けて収容され、グループ1~8は改造された飼育棟に収容された。各グループは別々の檻に収容され檻1つにつきブタ11~12匹、各檻はブタ1匹につき約3.0平方フィートを提供した。各檻はプラスチック製の羽根板の板材でできた、高架デッキ上にあった。檻の下のピットは、排泄物やゴミの汚物槽として供された。各建物は別個の加温及び換気システムをもち、建物間の空気のクロスコンタミネーションをほとんどなくしていた。1番目の研究サイトでは、子ブタは特別組成のミルク飼料を、誕生からおよそ3週齢まで給餌された。全ての子ブタは固形の特別配合の飼料を実験19日まで食べていたおよそ41/2週齢。2番目の研究サイトでは、全てのブタは、週齢と体重に適した、特製の、薬が入っていない商用配合飼料を好きなときに給餌された。水も両方のサイトで随意に利用可能であった。全ての被験ブタは実験~2日目にビタミンEで、実験~1日目に鉄注射で、実験16、17、18及び19日目にナクセルNAXCEL、登録商標で処理された1.0mL、筋肉内注射、脚を順に変える。加えて、52番のブタグループ9は実験3日目に鉄注射で処理され、45番のブタグループ6は実験11日目に鉄注射で処理され、69番のブタグループ8はナクセルNAXCEL、登録商標で実験6日目に処理され、74番のブタグループ3はデキサメタゾンとペニシリンで実験13日目に、ナクセルNAXCEL、登録商標で実験14日目に、様々な健康上の理由から処理された。両方の研究サイトにいる間、ブタは家畜管理の下に置かれた。動物の健康診断は実験0日目に行われ、健康診断報告フォームに記録された。全ての動物は実験0日目の観察によって確認されたように、ワクチン接種前によい健康状態と栄養状態にあった。全てのテスト動物は、チャレンジの前に、よい健康及び栄養状態にあることが観察された。死骸と組織はレンダリングにより処分された。研究動物の最終処分は動物処分記録に記録された。実験0日目に、グループ1~6に割り振られたブタが、1.0mLのPCV2ワクチン1~6を、それぞれ、筋肉内注射IMで、首の左側部分に、滅菌した3.0mLのルアーロックシリンジと滅菌した20g×1/2ニードルを使って投与された。グループ7に割り振られたブタは、2.0mLのPCV2ワクチンNo.7を、筋肉内注射IMで、首の左側部分に、滅菌した3.0mLのルアーロックシリンジと滅菌した20g×1/2ニードルを使って投与された。実験14日目に、グループ7に割り振られたブタは、2.0mLのPCV2ワクチンNo.7を、筋肉内注射IMで、首の右側部分に、滅菌した3.0mLのルアーロックシリンジと滅菌した20g×1/2ニードルを使って投与された。実験21日目に、すべての被験ブタが、2.0mLのKLH/ICFAを、筋肉内注射IMで、右の太もも部分に、滅菌した3.0mLのルアーロックシリンジと滅菌した20g×1/2ニードルを使って投与された。実験27日目に、すべての被験ブタが、2.0mLのKLH/ICFAを、筋肉内注射IMで、左の太もも部分に、滅菌した3.0mLのルアーロックシリンジと滅菌した20g×1/2ニードルを使って投与された。実験24日目に、グループ8に割り振られたブタが、1.0mLのPCV2ISUVDLチャレンジマテリアル5.11log10TCID50/mLを筋肉内注射で、首の左側部分に、滅菌した3.0mLのルアーロックシリンジと滅菌した20g×1/2ニードルを使って投与された。追加の1.0mLの同じマテリアルが、鼻内IN注入で、滅菌した3.0mLのルアーロックシリンジと鼻カニューレを使って、各ブタに投与された鼻孔あたり0.5mL。被験ブタは、全体的な健康と副作用について、実験~4日目及び実験0日目から実験19日目まで、毎日観察された。観察結果は臨床観察記録に記録された。全ての被験ブタは、注射部位の反応について、実験0日目から実験7日目まで観察され、グループ7は実験14日目から21日目までさらに観察された。実験~3、24及び49日目、又は、チャレンジ後にブタが死んでいることが発見された日に、平均1日あたり体重増加が、キャリブレーションされた体重計の上で、それぞれのブタの体重を測定することによって、決定された。体重は体重フォームに記録された。実験~3日目の体重が、無作為抽出の前に、ブタを分けるために利用された。実験24日目及び実験49日目の体重データが、各ブタに対する、この期間内の、平均1日あたり体重増加ADWGを決定するために、利用された。チャレンジ後、実験49日以前に死んだブタに対しては、実験24日目から死亡の日までのADWGを表すように、ADWGが調整された。PCV2の血清学を決定するため、各子ブタから、静脈全血が、眼窩静脈洞から、実験~3日目及び13日目に、採集された。各子ブタに対して、眼窩静脈洞から、滅菌したキャピラリーチューブを片側の目の目頭に挿入し、約3.0mLの全血を、4.0mLの血清分離チューブSSTに吸引することによって、血液が採集された。実験24、31及び49日目に、各ブタからの静脈全血が、上大静脈から、滅菌した18g×1/2バキュテイナーニードルベクトンディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー、バキュテイナーニードルホルダー及び13mLのSSTを使い、採集された。各時点での血液採集が、サンプル採集記録に記録された。各SST内の血液は、凝固するままにされ、その後、各SSTがスピンダウンされて血清が集められた。集められた血清は滅菌したスナップチューブに移され、-70±10°Cで、後日検査されるまで、保存された。血清サンプルは、PCV2抗体の存在を、BIVI-RDの職員によって、検査された。ブタは実験20日目から実験49日目まで1日1回、臨床症状を観察され、臨床的観察は臨床観察記録に記録された。PCV2の鼻からの排出を検査するため、実験24、25日目に、そして、その後奇数実験日毎に実験49日目まで、滅菌したダクロンのスワブがそれぞれのブタの左あるいは右の鼻から鼻内部に可能な限り無菌的に挿入されブタ1匹に対してスワブ1個、数秒間動かし、それから取り除いた。それぞれのスワブはそれから1IFBS、500ユニット/mLのペニシリン、500μg/mLのストレプトマイシン及び2.5μg/mLのフンギゾンを含有する1.0mLのEMEM培地を入れた1つの滅菌済スナップ式キャップのチューブに入れられた。スワブはチューブ内で分解され、スナップチューブは封をされ、動物の番号、採集の日、実験序数日、及び鼻スワブで適切なラベルをされた。封されたスナップチューブはBIVI‐セントジョセフに移送されるまで一晩、-40±10°Cで保管された。鼻スワブの採集品は鼻スワブサンプル採集フォームに記録された。BIVI‐RDが鼻スワブサンプルのPCV2の定量的なウイルスの単離VI検査を行った。結果はlog10値で表された。1.3log又はそれよりも小さい値は陰性とみなされ、1.3logよりも大きな値は陽性とみなされた。最初の研究サイトで死んだブタNo.28、52、56、69、82、及び93は診断を行うのに必要なレベルまで解剖された。肉眼的病変が記録され、これらのブタからは組織が保存されなかった。2番目の研究サイトで、実験49日目よりも前に死亡したブタ番号、45、23、58、35、実験49日目に安楽死の前に死んでいることが発見されたブタ番号、2、43及び実験49日目に安楽死させられたブタは解剖された。あらゆる肉眼的病変が確認され、病変がある肺葉のパーセンテージが解剖報告フォームに記録された。2番目の研究サイトで解剖された103匹のブタのそれぞれから、扁桃腺、肺、心臓、肝臓、腸間膜リンパ節、腎臓及び鼠径部リンパ節の組織サンプルが緩衝10ホルマリンが入った1つのコンテナに入れられた;一方、同じ前述の器官からとられた別の組織サンプルは、ワールパックM-テックダイアグノスティクス社、セルウォール、UKにいれられ、それぞれのワールパックは氷上に置かれた。それぞれのコンテナは適切にラベルされた。サンプルを採集したものは解剖報告フォームに記録された。その後、ホルマリン固定組織サンプル及び診断要求フォームがIHC検査のために提出された。IHC検査は、サンプルの受け入れ、サンプルとスライドの調製、及び染色技術について、標準的なISUラボラトリーの手順に従って実施された。ワールパック内の新鮮な組織アイスパックとともに保存-70°C±10°Cと将来的的に使用するために研究モニターに送られた。ホルマリン固定サンプルは病理学者によって、IHCによるPCV2検出の検査がされ、次のスコア化システムを使いスコア化された:0=なし;1=貧弱な陽性染色、ほとんど染色箇所がない;2=中程度に陽性染色、多数の染色箇所;及び、3=明らかな陽性染色、組織全体にわたって分布。病理学者が鼠径部リンパ節と腸間膜リンパ節を確信をもって区別できないという事実のために、これらの組織に対する結果は単純にリンパ節及び1動物あたり2つの組織のそれぞれに対して与えられる最も高いスコアがラベルされた。結果この実施例にの結果が下記に与えられる。グループ9からの1匹のブタが実験0日目以前に、さらに5匹グループ4から1匹;グループ6から1匹;グループ8から2匹;及びグループ9から1匹のブタがワクチン接種後に死亡したことが注記される。死後の検査により、6匹はすべてワクチン接種又はPMWSに関係しない潜在的感染によって死亡したことが示された。1日あたり平均体重増加ADWGの結果は下に表6に示される。厳密な陰性コントロールであるグループ9が最も高いADWGを示し1.06±0.17lb/日、8μgのrORF2の1用量を投与されたグループ5が0.94±0.22lb/日次に位置し、4μgのvORF2の1用量を投与されたグループ3が最も低いADWG0.49±0.21lb/日を示し、不活化ワクチンの2用量を投与されたグループ7がそれに続いた0.50±0.15lb/日。PCV2の血清学の結果は下に表7に示される。9つすべてのグループはPCV2に対して実験~3日目には血清学的陰性であった。実験14日目に、vORF2ワクチンの接種を受けたグループが最も高いタイターを示し、187.5から529.2の範囲であった。不活化ワクチンを投与されたブタが次に高いタイターを示し、rORF2ワクチンを投与されたグループがそれに続いた。グループ8及び9はこの時には血清学的陰性のままであった。実験24日目及び実験31日目に、vORF2を投与されたブタは強い血清学的反応を示し続け、不活化ワクチンの2用量を投与されたグループがすぐ後に続いた。rORF2ワクチンを投与されたブタは血清学的に応答が遅く、グループ8と9は血清学的陰性のままであった。実験49日目に、vORF2ワクチン、2用量の不活化ウイルスワクチン及び最低用量のvORF2ワクチンをを投与されたブタが最も強い血清学的応答を示した。16μg及び8μgのrORF2ワクチンを投与されたブタは、チャレンジコントロールよりもやや高いIFAタイターを示した。グループ9は実験49日目に強い血清学的応答を示した。チャレンジ後の臨床的観察の結果が下の表8に示される。この結果のまとめは、異常な行動、異常な呼吸、咳及び下痢を含む。表9は、グループごとの全臨床症状発生件数のまとめからの結果を含み、表10はグループごとのチャレンジ後死亡率のまとめからの結果を含む。この研究において確認された最も普通の臨床症状は、軽度から重度の昏睡としてスコアされた異常行動であった。2種類のより低用量のvORF2を投与されたブタ、16μgのrORF2を投与されたブタ及びKVワクチンを2用量投与されたブタは、発生率≧27.3を示した。8μgのORF2を投与されたブタと厳密な陰性コントロールグループは全く異常行動を示さなかった。この研究では、ブタは全く異常呼吸を示さなかった。咳は全てのグループで頻繁に0から25確認されたが、下痢も同様0~20であった。確認された臨床症状は、全くPMWSに病患特異的ではなかった。全体的な臨床症状の発生率はグループ間で異なっていた。いずれかのvORF2ワクチンを投与されたグループ、16μgのrORF2を投与されたグループ、KVワクチンの2用量を投与されたグループ及びチャレンジコントロールグループは、最も高い臨床症状発生率≧36.4を示した。厳密な陰性コントロールグループ、8μgのrORF2を投与されたグループ及び4μgのrORF2を投与されたグループは、それぞれ、0、8.3及び9.1の全体的な臨床症状発生率を示した。グループ間の全体的な死亡率も同様に異なっていた。KVワクチンを2用量投与されたグループは最も高い死亡率16.7を示した;その一方で、4μgのvORF2、16μgのrORF2又は8μgのrORF2を投与されたグループ及び厳密な陰性コントロールグループは全て0の死亡率を示した。PCV2の鼻からの排出の結果は下記の表11に示される。実験24日目のチャレンジ後、実験27日目にグループ7の1匹のブタがPCV2を排出し始めた。実験33日目まで、他のグループでは排出するものはいなかった。鼻からの排出の大部分は、実験35日目から45日目まで確認された。3種類のvORF2ワクチンのいずれかを投与されたグループ及びrORF2を4又は8μg投与されたグループは、最も低いPCV2の鼻からの排出発生率≦9.1を示した。チャレンジコントロールグループグループ8は最も高い排出率80を示し、63.3の発生率を示した厳密な陰性コントロールグループがそれに続いた。グループごとの黄疸発生率、グループごとの胃潰瘍発生率、グループごとの平均肺病変スコア、及びグループごとの肺病変発生率が下の表12に示される。6匹のブタが1番目の試験サイトで研究のワクチン接種後フェイズ中に死亡したグループ4、N=1;グループ6、N=1;グループ8、N=2;グループ9、N=2。6匹中4匹のブタには、1又は2以上の体腔において、フィブリンの病変があった。1匹のブタグループ6はクロストリジウム症に一致する病変があり、また、1匹のブタグループ9には肉眼的病変が無かった。研究のワクチン接種後フェイズの間に死亡したブタには、PMWSに一致する病変が全く無かった。チャレンジ後に死亡したブタと実験49日目に安楽死させられたブタが解剖された。解剖では、黄疸及び胃潰瘍が、どのグループにも見られなかった。平均肺病変に関しては、グループ9が最も低い平均肺病変0を示し、グループ1が0.40±0.50で、グループ5が0.68±1.15で、それに続いた。グループ2,3,7及び8が最も高い平均肺病変≧7.27を示した。これら4グループのそれぞれは、これら4グループに対する結果を高く歪曲する、肺病変≧71.5なる1匹のブタを含んだ。0の肺病変が確認されたグループ9を除き、残る8グループは≦36の肺病変を示した。ほとんど全ての確認された肺病変が、赤/紫及びかたまっていると記載された。グループごとのIHC陽性発生率のまとめが表13に示される。グループ1vORF2-16μg及びグループ5rORF2-8μgが最も低率のIHC陽性の結果16.7を示した。グループ8チャレンジコントロール及びグループ9厳密な陰性コントロールが最も高率のIHC陽性の結果、それぞれ90及び90.9を示した。チャレンジ後、8μgのrORF2抗原を1用量投与されたグループ5は、他の6種類のワクチングループよりも優れた効果を示した。グループ5は最も高いADWG0.94±0.22lb/日、最も低い異常行動発生率0、2番目に低い咳発生率8.3、最も低い全臨床症状発生率8.3、最も低い死亡率0、最も低い鼻からのPCV2排出率8.3、2番目に低率の平均肺病変0.68±1.15及び最も低い陽性組織発生率16.7を示した。様々なレベルのrORF2抗原を投与されたグループは全体的に様々なレベルのvORF2抗原を投与されたグループよりも優れた結果を示し、不活化全粒子PCV2ワクチンを2用量投与されたグループは最も悪い結果を示した。表14及び15はグループごとのチャレンジ後のデータのまとめを含む。この研究の結果は、あらゆる今後のワクチン開発の努力がrORF2ワクチンに集中すべきであることを示している。全般的に、鼻からのPCV2排出がチャレンジ後に検出され、PCV2ワクチンによるワクチン接種が排出の低減をもたらした。選ばれたリンパ組織の免疫組織化学はまた、ADWG、臨床症状、及び肉眼的病変における大きな違いはグループ間で検出されなかったが、ワクチンの効果に対するよいパラメタとして役立った。この研究は、鼻からのPCV2の排出、PCV2の血清型変換及び厳密な陰性コントロールグループであるグループ9でのIHC陽性組織によって証拠づけられる、外部からのPCV2が研究中のどこかの時点で持ち込まれたという事実のために、分析しにくかった。考察7種類のPCV2ワクチンがこの研究で評価されたが、それは、実験0日目に1回投与される3種類の異なる用量レベルのvORF2抗原、実験0日目に1回投与される3種類の異なる用量レベルのrORF2抗原、及び実験0日目と実験14日目に投与される1用量レベルの不活化全粒子PCV2ワクチンを含んだ。全般的に、8μgのrORF2抗原を含むワクチンの1用量を投与されたグループ5が最もよい結果を示した。グループ5は最も高いADWG、最も低い異常行動発生率、最も低い異常呼吸発生率、2番目に低い咳発生率、最も低い全体的臨床症状の出現率、最も低い死亡率、最も低い鼻からのPCV2排出率、2番目に低率の平均肺病変及び最も低いIHC陽性組織の発生率を示した。興味深いことに、グループ5よりも高用量のrORF2抗原を投与されたグループ4はグループ5と同等又はより優れた結果を示さなかった。グループ4は、グループ5よりも、やや低いADWG、より高い異常行動発生率、より高い全体的な臨床症状の出現率、より高い鼻からのPCV2排出率、より高率の平均肺病変、及びより高いIHC陽性組織の発生率を示した。これら2つのグループ間の違いが統計学的に意味が無いことを示せたかもしれない統計学的解析は、これらのデータについては行われなかったが、グループ4はグループ5と同等の成果を示していないという観察された傾向がある。ワクチン接種後、6匹のブタが最初の研究サイトで死亡した。6匹のブタのうち4匹は、ワクチン投与を受けないグループ8又はグループ9からであった。6匹のブタはすべてPMWSに合致する病変を呈していなかった。副作用は全く報告されず、全般的に、7種類全てのワクチンは、約11日齢のブタに投与されたときに安全であることが明らかとなった。研究のワクチン接種後フェイズの間、ワクチングループの中で、3用量レベルのvORF2ワクチン又は不活化全粒子ワクチンを投与されたブタは、最も高いIFATレベルを示したが、一方、グループ5は最も低いIFATレベルをチャレンジ直前に示した。正式には証明されていないが、離乳後まもなくの若いブタへのPCV2の主要な伝染ルートは、口と鼻の直接接触によるものであると信じられており、生産環境で鼻からのPCV2排出を減少する効果のあるワクチンは感染の拡大をコントロールすることを助けるだろう。3種類のvORF2抗原レベルのうち1種類を投与されたグループ及び8μgのrORF2を投与されたグループは、最も低い鼻からのPCV2排出率8.3を示した。予想通り、チャレンジコントロールグループは最も高い鼻からの排出率80を示した。PCV2感染に続き、PMWSを発症したブタの肉眼的病変は典型的には、一般的なリンパ節症と次のうちの1又は複数の組合せからなる:1小葉間浮腫を伴う間質性肺炎、2皮膚の蒼白又は黄疸、3斑点のある萎縮性肝臓、4胃潰瘍、及び5腎炎。解剖時に、黄疸、肝炎、腎炎、及び胃潰瘍はどのグループでも確認されず、リンパ節炎は特に検査されなかった。平均肺病変スコアはグループ間で異なっていた。16μgのvORF2抗原を投与されたグループは、最も低い平均肺病変スコア0.40±0.50を示し、8μgのrORF2を投与されたグループ0.68±1.15がそれに続いた。予想通り、チャレンジコントロールグループが最も高い平均肺病変スコア9.88±29.2を示した。4グループ全てで、平均肺病変スコアが、非常に高い肺病変スコアをもつ、各グループの1匹のブタのせいで上昇した。肺病変のほとんどは、赤/紫及びかたまっているとして記載された。典型的には、PMWSに関係する肺病変は、小肺葉浮腫のためにタン色で散らばっているとして記載される。この研究で確認された肺病変は、PCV2感染に関係するのではなく、二次的な肺感染生物が存在していたかもしれない。本研究の状況では、肺病変スコアは、おそらくPCV2による肺感染の量の本当の値を反映しない。他の研究者は、IHCによるPCV2抗原の存在と組織病理学の間の直接的な相関を示した。選ばれた組織の組織病理学はこの研究では行われなかった。グループ116μgのvORF2とグループ58μgのrORF2は最も低いPCV2抗原に対して陽性のブタの発生率8.3を示したが、一方、グループ9厳密な陰性コントロールグループ-90.9とグループ8チャレンジコントロールグループ-90.9は最も高いPCV2抗原に対して陽性のブタの発生率を示した。このテストの非主観的な性質のため、IHCの結果は、おそらく、ワクチンの効力を判定するための最もよいパラメタのひとつである。そして、本発明の一態様では、1ml/1用量の抽出されたPCV2ORF2rORF2抗原による組換え産物の、CDCDブタモデルにおける、PCV2チャレンジに対する、最小保護用量MPDが決定された。様々なレベルのrORF2抗原を投与された3グループのうち、グループ58μgのrORF2抗原は明瞭に最も高いレベルの保護を示した。グループ5は最もよい結果を示すか、又は、試験されたパラメタのすべてに関して最も好ましい結果と結び付けられた。グループ5がチャレンジ後に他の6つのワクチングループと比較されたとき、グループ5は最も高いADWG0.94±0.22lb/日、最も低い異常行動発生率0、2番目に低い咳の発生率8.3、最も低い全臨床症状の発生率8.3、最も低い死亡率0、最も低い鼻からのPCV2排出率8.3、2番目に低率の平均肺病変0.68±1.15、及び最も低いIHC陽性組織の発生率を示した。本発明の別の態様では、1ml/1用量の、部分的に精製されたPCV2ORF2vORF2抗原である、コンベンショナルな産物の、CDCDモデルにおける、PCV2チャレンジに対するMPDが決定された。様々なレベルのvORF2抗原を投与された3グループのうち、グループ116μgのvORF2抗原は明瞭に最も高いレベルの保護を示した。グループ1はADWG,平均肺病変、及びIHCに関して、グループ2及び3をよりも優れていた。グループ1及び28μgのvORF2抗原は、臨床症状の全発生率に関して同じ性能を発揮し、グループ34μgのvORF2抗原は最も低い死亡率を示し、3グループ全てが鼻からの排出に関して同じ性能を示した。全体的に、vORFワクチンはrORF2ワクチンと同程度の性能を示さなかった。本発明のさらに別の態様では、2ml/2用量の、コンベンショナルな不活化PCV2ワクチンの最大用量の、CDCDブタモデルにおける、PCV2チャレンジに対する有効性が決定された。この研究で評価された7種類のワクチンのうち、不活化全粒子PCV2ワクチンが、最も悪い性能を示した。2用量の不活化全粒子PCV2ワクチンを投与された子ブタは、最も低いADWG、2番目に高い異常行動率58.3、2番目に高い臨床症状の全発生率58.3、最も高い死亡率16.7、2番目に高い鼻からの排出発生率41.7、もっとも高い平均肺病変9.88±29.2、高率の確認された肺病変75、及び中程度の組織でのIHC発生率41.7を示した。しかしながら、免疫応答を誘導することについてはかなり有効であった。本発明のさらに別の態様では、鼻からのPCV2排出が、有効性パラメタとして検討され、以前の研究からの以前のPCV2有効性パラメタが再確認された。この研究からの結果は鼻からのPCV2の排出が鼻内チャレンジに続いて起こること及びチャレンジ後にPCV2ワクチンがPCV2の鼻からの排出を低減するということを示す。さらに、この研究からの結果及び文献中の報告は、将来のPCV2ワクチン試験においても同様にIHCが評価され続けるべきであることを示す。この研究から生じるいくつかの追加の結論は、リンパ節症はPMWSのひとつの特徴であるということである。PMWSのもうひとつの特徴はリンパ球の減少と多核/巨大食細胞である。さらに、副作用又は注射部位の反応が7種類のPCV2ワクチンのいずれに対しても確認されず、7種類のPCV2ワクチンがすべて若いブタに投与されたときに安全であることが明らかになった。実施例5この実施例は8種類のPCV2ワクチン候補の有効性をテストし、PCV2の病原性株への曝露後の以前のチャレンジ研究からのPCV2チャレンジパラメタを確認する。帝王切開で分娩され、初乳を与えられないCDCD、6~16日齢の150匹の子ブタが、体重によって分別され、無作為に同じ個体数の10グループに割り振られた。表16は、この実施例に対する全般的な研究設計を示す。各グループに与えられたワクチンの調製物は次の通りであった。PCV2ワクチンNo.1は、グループ1に1×2ml用量で投与される、高用量16μg/2ml用量のIMS1314でアジュバントされた不活化組換えORF2抗原16μgrORF2-IMS1314であった。PCV2ワクチンNo.2は、グループ2に1×2ml用量で投与される、高用量16μg/2ml用量のカーボポールでアジュバントされた一部精製VIDOR-1生成PCV2ORF2抗原16μgvORF2-カーボポールであった。PCV2ワクチンNo.3は、グループ3に1×2ml用量で投与される、高用量16μg/2ml用量のカーボポールでアジュバントされた不活化組換えORF2抗原16μgrORF2-カーボポールであった。PCV2ワクチンNo.4は、グループ4に1×1ml用量で投与される、高用量16μg/1ml用量のカーボポールでアジュバントされた一部精製VIDOR-1生成PCV2ORF2抗原16μgvORF2-カーボポールであった。ワクチンNo.5は、グループ5に1×2ml用量で投与される、4μg/2ml用量のカーボポールでアジュバントされた不活化組換えORF2抗原4μgrROR2-カーボポールであった。PCV2ワクチンNo.6は、グループ6に1×2ml用量で投与される、1μg/2ml用量のカーボポールでアジュバントされた不活化組換えORF2抗原1μgrORF2-カーボポールであった。PCV2ワクチンNo.7は、グループ7に1×2ml用量で投与される、低用量0.25μg/2ml用量のカーボポールでアジュバントされた不活化組換えORF2抗原0.25μgrORF2-カーボポールであった。PCV2ワクチンNo.8は、グループ8に1×2ml用量で投与される、高用量不活化前タイター>8.0log/2ml用量の、カーボポールでアジュバントされた、不活化された、コンベンショナルな、殺された、VIDOR-1によって生成したPCV2Struve抗原>8.0logKV-カーボポールであった。実験0日目に、グループ1~8はそれらに割り当てられたワクチンで処理された。グループ1~3及び5~8はそれらに対応するワクチンのブースターを実験14日目に再び投与された。16μgのvORF2-カーボポールの1用量の効果が、実験14日目にブースターを投与されなかったグループ4についてテストされた。子ブタは、2度のワクチン接種に続く副作用と注射部位の反応を観察された。実験21日目に、子ブタは、グループ1~9が1つの建物に収容され、グループ10が別の建物に収容される2番目の研究サイトに移動された。全ての子ブタはフロイントの不完全アジュバントでアジュバントしたスカシ貝ヘモシアニンKLH/ICFAを実験22及び28日目に投与された。実験25日目に、グループ1~9は約4logの病原性PCV2ウイルスでチャレンジされた。実験46日目までにチャレンジコントロールグループではほとんど死亡が起きなかった。ブタを免疫刺激し、PCV2チャレンジマテリアルの病原性を増加させる試みでは、すべてのグループがインゲルバックINGELVAC、登録商標PRRSMLV豚生殖器呼吸器症候群ワクチン、改変生ウイルスで実験46日目に処理された。チャレンジ前後の血液サンプルがPCV2血清学のために採集された。チャレンジ後の、平均1日当たり体重増加ADWGを決定するための体重データ及び臨床的徴候の観察結果が採集された。実験50日目に、全ての生き残っているブタが解剖され、肉眼的病変が記録され、肺が病理学のためにスコア化され、選ばれた組織が後日のPCV2抗原を検出するための免疫組織化学IHCによる検査のためにホルマリン中に保存された。材料と方法これは、実験0日目に6から16日例のCDCDブタで実施された、一部盲検化したワクチンチャレンジの実現可能性研究である。この研究に加入されるためには、種雄豚のPCV2IFA≦1000であった。さらに、種雄豚の血清学的状態は既知のPRRS陰性群れに由来した。16匹の種雄豚がPCV2血清学的状態を検査され、16匹全てが≧1000のPCV2タイターを有し、最初の研究サイトに移送された。150匹の子ブタが帝王切開手術によって分娩され、実験~3日目に、この研究のために利用可能であった。上記の表16に示されるように、実験~3日目に、最初の研究サイトで、150匹のCDCDブタが体重を測定され、耳タグで個体識別され、体重によって区分され、無作為に10グループのうちの1つに割り振られた。血液サンプルが全てのブタから採集された。加入基準に合致する被験動物がこの研究に加入され、後に何らかの理由によって除外されたならば、調査員とモニターが、最終的な分析で、その動物から採集されたデータの使用を決定するために、相談をした。ブタを加入した日は除外され、除外の理由は記載されている。加入基準に合致し、研究のために選ばれ、1番目の研究サイトに運ばれた種雄豚で除外されたものはなかった。子ブタは研究から全く除外されず、被験動物は終了前に研究から除かれなかった。表17は、この実施例の主要な行動のタイムフレームを記載する。この研究の生存中フェイズの完了に続き、ホルマリン固定組織が、病理学者によって、免疫組織化学IHCで、PCV2抗原検出のために、検査され、血液サンプルがPCV2血清学のために評価され、平均1日あたり体重増加ADWGが実験25日目から実験50日目まで決定された。動物は1番目の研究サイトで7つの部屋の個別のケージに、誕生から約11日齢まで収容されたほぼ実験0日目。各部屋は同一レイアウトであり、積み重ねられた個々のステンレス鋼製ケージからなり、加温及びろ過された空気が各分離ユニットに個別に供給された。各部屋には個別の暖房及び換気が装備され、それによって部屋間の空気のクロスコンタミネーションを防止した。動物は2番目の研究サイトで2つの異なる建物に収容された。グループ10厳密な陰性コントロールグループは別個に改造された飼育棟に収容され、グループ1~9は改造された分娩棟に収容された。各グループは別々の檻に収容され檻あたり14~15匹、各檻はブタ1匹あたり約2.3平方フィートを提供した。グループ2、4及び8は、通路の片側の3つの隣接した檻に入れられ、グループ1、3、5、6、7、及び9は通路の反対側の6つの隣接した檻に入れられた。グループを分けたのは、グループ2、4、及び8に投与されるワクチンが十分に不活化されていないという、研究モニターによる懸念のためであった。各檻は、プラスチック製スレートの床を備えた架台の上にあった。檻の下のピットは排泄物貯蔵タンクとして供された。各建物は個別に暖房及び換気システムを装備し、建物間の空気のクロスコンタミネーションの可能性をほとんどなくしていた。1番目の研究サイトで、子ブタは特別に調合されたミルク飼料を誕生から約3週齢まで給餌された。全ての子ブタは固形の、特別に配合された飼料を実験21日目およそ、41/2週齢まで食べていた。2番目の研究サイトでは、全てのブタが、週齢と体重に対して適切な、特製の薬剤添加していない商用配合飼料を、随時、与えられた。両研究サイトでの水は、やはり任意に利用することができた。全ての被験ブタは、実験19、20、及び21日目に、注射するももを変えながら、筋肉内注射で、1.0mLのナクセルNAXCEL、登録商標で処理された。さらに、ブタNo.11グループ1が、実験10日目に、0.5mLのナクセルNAXCEL、登録商標で、筋肉内注射で処理され、ブタNo.13グループ10が、実験10日目に、1mLのペニシリン及び1mLのプレデフPREDEF、登録商標2Xで処理され、ブタNo.4グループ9が、実験11日目に、1.0mLのナクセルNAXCEL、登録商標で、筋肉内注射で処理され、ブタNo.1グループ1、4及び11が、実験14日目に、様々な健康上の理由により、それぞれ1.0mlのナクセルNAXCEL、登録商標で、筋肉内注射で処理された。両研究サイトにいる間、ブタは家畜管理の下に置かれた。動物の健康検査は実験~3日目に行われ、健康検査記録フォームに記録された。全ての動物が、ワクチン接種前に、実験0日目の観察によって確認されたように、よい健康及び栄養状態にあった。全ての被験動物が、チャレンジの前に、よい健康及び栄養状態にあることが観察された。死骸と組織はレンダリングによって廃棄された。研究に使用した動物の最終処分は動物処分記録に記録された。実験0及び14日目に、グループ1~3と5~8に割り振られたブタは、2.0mLの割り当てられたPCV2ワクチン1~4を、それぞれ、筋肉内注射で、右側及び左側の首部分に、滅菌した3.0mLルアーロックシリンジ及び滅菌した20g×1/2ニードルを使って、投与された。グループ4に割り振られたブタは、1.0mLのPCV2ワクチンNo.2を、筋肉内注射で、右側の首部分に、滅菌した3.0mLルアーロックシリンジ及び滅菌した20g×1/2ニードルを使って、実験0日目にのみ、投与された。実験22日目に、全ての被験ブタが、2.0mLのKLH/ICFAを、筋肉内注射で、左側の首部分に、滅菌した3.0mLルアーロックシリンジ及び滅菌した20g×1ニードルを使って、投与された。実験28日目に、全ての被験ブタが、2.0mLのKLH/ICFAを、筋肉内注射で、右側のもも部分に、滅菌した3.0mLルアーロックシリンジ及び滅菌した20g×1ニードルを使って、投与された。実験25日目に、グループ1~9に割り振られたブタは、1.0mLのPCV2ISUVDLチャレンジマテリアル3.98log10TCID50/mLを、筋肉内注射で、右側の首部分に、滅菌した3.0mLルアーロックシリンジ及び滅菌した20g×1ニードルを使って、投与された。追加の1.0mLの同じマテリアルが、鼻内IN注入で、滅菌した3.0mLのルアーロックシリンジと鼻カニューレを使って、各ブタに投与された鼻孔あたり0.5mL。実験46日目に、全ての被験ブタが2.0mLのインゲルバックINGELVAC、登録商標PRRSMLVを、筋肉内注射で、右側の首部分に、3.0mLルアーロックシリンジ及び滅菌20g×1ニードルを使って、投与された。PRRSMLVは、PCV2チャレンジマテリアルの病原性を増大させる意図で投与された。被験ブタは、全般的な健康状態と副作用を、実験~3日目及び実験0日目から21日目まで、毎日観察された。各ブタは、正常又は異常な行動、呼吸又は咳についてスコア化された。観察結果は臨床観察記録に記録された。全ての被験ブタは、実験0日目から実験7日目まで観察され、そして、グループ7は実験14日目から21日目まで、注射部位の反応を、さらに観察された。平均1日あたり体重増加は、実験~3、25及び50日目、又はチャレンジ後にブタが死んでいることが発見された日に、校正された秤の上で、各ブタを体重測定することによって決定された。体重は体重フォームに記録された。実験~3日目の体重が、ブタを無作為に割り振る前に、区分するために利用された。実験25日目及び実験50日目の体重データが、各ブタに対する、これらの時点の間の、平均1日あたり体重増加ADWGを決定するために利用された。チャレンジ後、実験50日目よりも前に死亡したブタについては、ADWGが、実験25日目から死亡の日までのADWGを表すように、調整された。PCV2血清学を決定するために、実験~3及び14日に、目静脈全血が、各子ブタから、眼窩静脈洞から、採集された。各子ブタについて、血液が、眼窩静脈洞から、滅菌したキャピラリーチューブを一方の目の目頭に挿入し、約3.0mLの全血を4.0mLの血清分離チューブSSTに吸引することによって、採集された。実験25、32、及び50日目に、各ブタからの静脈全血が、上大静脈から、滅菌した20g×1/2バキュテイナーニードルベクトンディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー、バキュテイナーニードルホルダー及び13mLのSSTを使い、採集された。各時点での血液採集が、サンプル採集記録に記録された。各SST内の血液は、凝固するままにされ、その後、各SSTがスピンダウンされて血清が集められた。集められた血清は滅菌したスナップチューブに移され、-70±10°Cで、後日検査されるまで、保存された。血清サンプルは、PCV2抗体の存在を、BIVI-RDの職員によって、検査された。ブタは、1日1回、実験22日目から実験50日目まで、臨床症状を観察され、正常又は異常な行動、呼吸又は咳についてスコア化された。臨床的な観察は臨床観察記録に記録された。ブタNo.46グループ1及び98グループ9が1番目の研究サイトで死亡した。これら2つの死は出血死として分類され、これら2匹のブタについては解剖が行われなかった。2番目の研究サイトで、チャレンジ後で実験50日目よりも前に死亡したブタ及び実験50日目に安楽死させられたブタは、解剖された。あらゆる肉眼的病変が確認され、病変のある肺葉のパーセンテージが解剖報告フォームに記録された。2番目の研究サイトで解剖されたブタのそれぞれから、扁桃腺、肺、心臓、及び腸間膜リンパ節の組織サンプルが、緩衝10ホルマリン入りの1つのコンテナに入れられた;一方、同じ前述の器官からの別の組織サンプルはワールパックWhirl-pak、登録商標Mテックダイアグノスティクス社、セルウォール、UKに入れられ、それぞれのワールパックWhirl-pak、登録商標は氷上に置かれた。各コンテナは適切にラベルされた。サンプル採取が解剖報告フォームに記録された。その後、ホルマリン固定組織サンプル及び診断リクエストフォームがIHC検査に提出された。IHC検査は、サンプル受け入れ、サンプルとスライドの調製、及び染色技術について、標準的な研究室の手順に従って行われた。ワールパックWhirl-pak、登録商標内の新鮮な組織は、氷パックとともに、保存-70°C±10°C及び将来的な使用のために、研究モニターに送られた。ホルマリン固定組織が、病理学者によって、PCV2を検出するために、IHCで検査され、次のスコアリングシステムを使ってスコア化された:0=なし;1=わずかに陽性の染色、ほとんど染色部位なし;2=中程度に陽性の染色、複数の染色部位;及び3=明らかな陽性染色、組織全体に散らばる。分析のために、スコア0は陰性とみなされ、0よりも大きいスコアは陽性とみなされた。結果この実施例の結果は下記に与えられる。ブタNo.46及び98が、実験14日目及び25日目に、それぞれ死亡したことが認められる。これらの死亡は、出血死に分類される。ブタNo.11グループ1は、実験15日目に、早い呼吸で息を切らしていた。その他の点では、この観察期間中、全てのブタが、行動、呼吸及び咳について正常であり、どのグループに関しても、全身的な副作用は認められなかった。実験0日目のワクチン接種後に、注射部位の反応は認められなかった。実験14日目のワクチン接種後、グループ1のブタ14匹中7匹50が、実験15日目にスコア2の腫れを示した。グループ1の14匹中4匹28.6が、実験16日目に、なお2の腫れを示していた。他のグループでは、それぞれのワクチン接種後に注射部位の反応は見られなかった。平均1日あたり体重増加ADWGの結果が下の表18に示される。出血のために死亡したブタNo.46及び98が、グループの結果から除かれた。1用量の16μgvORF2-カーボポールを投与されたグループ4は、最も高いADWG1.16±0.26lb/日を示し、1.07±0.21lb/日から1.11±0.26lb/日の範囲のADWGを示すグループ1、2、3、5、6及び10がそれに続いた。グループ9が最も低いADWG0.88±0.29lb/日を示し、それぞれ、0.93±0.33lb/日及び0.99±0.44lb/日を示すグループ8及び7が、それに続いた。PCV2血清学の結果が、下記の表19に示される。10グループ全てが、実験~3日目にはPCV2に対して血清陰性であった。実験14日目に、PCV2タイターは10グループ全てについて低いままであった50~113の範囲。実験25日目に、全粒子不活化ワクチンを投与されたグループ8が、最も高いPCV2タイター4617を示し、16μgvORF2-カーボポールを投与されたグループ2、1用量の16μgvORF2-カーボポールを投与されたグループ4、及び16μgrORF2-カーボポールを投与されたグループ3が、それぞれ、2507、1920及び1503のタイターを示し、それに続いた。実験32日目チャレンジ後1週間に、グループ1~6及びグループ8のタイターは2360から7619の範囲であった;一方、グループ70.25μgrORF2-カーボポール、9チャレンジコントロール、及び10厳密な陰性コントロールは、それぞれ、382、129及び78のタイターを示した。実験50日目解剖の日に、10グループ全てが高いPCV2タイター≧1257を示した。実験25、32、及び50日目に、2用量の16μgrORF2-カーボポールを投与されたグループ3は、2用量の16μgrORF2-IMS1314を投与されたグループ1よりも高い抗体タイターを示した。実験25、32及び50日目に、2用量の16μgvORF2を投与されたグループ2は、1用量のみの同じワクチンを投与されたグループ4よりも高いタイターを示した。実験25及び32日目に、それぞれ1、4、1、及び0.25μgの、減量レベルのrORF2-カーボポールを投与されたグループ3、5、6、7は、減量に対応した抗体タイターを示した。チャレンジ後の臨床的観察からの結果が下に示される。表20は異常行動、異常呼吸、咳及び下痢の観察を含む。表22はグループごとのチャレンジ後死亡率のまとめからの結果を含む。チャレンジ後の異常な行動、呼吸及び咳の発生率は、16μgrORF2-IMS1314グループ1、16μgrORF2-カーボポールグループ3、1μgrORF2-カーボポールグループ6、0.25μgrORF2-カーボポールグループ7を投与されたブタ、及びチャレンジコントロールグループグループ9のブタでは低かった。チャレンジ後の異常な行動、呼吸及び咳の発生率は、16μgvORF2-カーボポールグループ2、1用量の16μgvORF2-カーボポールグループ4、4μgrORF2-カーボポールグループ5、>8logKV-カーボポールグループ8を投与されたブタ、及び厳密な陰性コントロールグループグループ10のブタでは、0であった。臨床症状の全体的な発生率はグループ間で異なった。16μgvORF2-カーボポールグループ2、1用量の16μgvORF2-カーボポールグループ4を投与されたブタ、及び厳密な陰性コントロールグループグループ10のブタは、発生率0を示した;16μgrORF2-カーボポールグループ3及び1μgrORF2-カーボポールグループ6を投与されたブタは発生率6.7を示した;16μgrORF2-IMS1314を投与されたブタグループ1は7.1の全体的な発生率を示した;4μgrORF2-カーボポールグループ5、0.25μgrORF2-カーボポールグループ7、及び>8logKVワクチンを投与されたブタは、13.3の発生率を示した;及び、チャレンジコントロールグループグループ9のブタは、14.3の発生率を示した。グループ間の全般的な死亡率は同様に異なった。2用量のKVワクチンを投与されたグループ8が20.0の最も高い死亡率を示し、チャレンジコントロールのグループ9及び0.25μgrORF2-カーボポールを投与されたグループ7がそれに続き、それぞれ、14.3及び13.3の死亡率を示した。1用量の16μgvORF2-カーボポールを投与されたグループ4は、6.7の死亡率を示した。他のグループ、1、2、3、5、6、及び10は0の死亡率を示した。グループ間の平均パーセント肺病変及び暫定的診断結果のまとめが下の表23にしめされる。チャレンジコントロールグループであるグループ9は、最も高いパーセント肺病変を平均値10.81±23.27で示し、0.25μgrORF2-カーボポールを投与され、平均値6.57±24.74を示すグループ7、4μgrORF2-カーボポールを投与され、平均値2.88±8.88を示すグループ5、及びKVワクチンを投与され、平均値2.01±4.98を示すグループ8がそれに続いた。残りの6グループは、0.11±0.38から0.90±0.15の範囲のより低い平均パーセント肺病変を示した。肺炎の暫定的な診断は、グループ間で異なった。2用量の16μgrORF2-カーボポールを投与されたグループ3は、最も低い肺炎の暫定診断を、13.3でされた。チャレンジコントロールグループであるグループ9は、グループの50が暫定的に肺炎と診断され、厳密な陰性コントロールグループであるグループ10及び2用量の16μgvORF2-カーボポールを投与されたグループ2が、それぞれ46,7又は40で、暫定的に肺炎と診断され、それに続いた。グループ1、2、3、5、9及び10はグループのうち0がPCV2に感染したと暫定的に診断された;一方、グループ8は、2用量のKVワクチンを投与されたが、グループのうち最も高い率、20で、PCV2に感染したと暫定的に診断された。2用量の0.25μgrORF2-カーボポールを投与されたグループ7は及び1用量の16μgvORF2-カーボポールを投与されたグループ4は、それぞれ、13.3及び6.7で、PCV2感染を暫定的に診断された。胃潰瘍は、グループ7の1匹のブタで診断されたのみであった6.7;一方、他の9つのグループは胃潰瘍が見られないままであった。グループIHC陽性発生率の結果のまとめが、下の表24に示される。グループ116μgrORF2-IMS1314が、0のブタが陽性という最も低いIHC陽性グループ率の結果を示し、それにグループ216μgvORF2-カーボポール及びグループ416μgvORF2-カーボポールの単一用量が、それぞれ6.7と13.3のグループIHC率で続いた。チャレンジコントロールグループであるグループ9は、100のブタがPCV2に対して陽性である最も高いIHC陽性発生率を示し、厳密な陰性コントロールグループであるグループ10、及びグループ8KVワクチンが、それぞれ、93.3、80のブタがPCV2に対して陽性で、それに続いた。考察7種類のPCV2ワクチンがこの実施例で評価されたが、それには、2回投与される高用量16μgのIMS1314でアジュバントされたrORF2抗原、ブタの1つのグループには1回、もう一つのグループには2回投与される高用量16μgのカーボポールでアジュバントされたvORF2抗原、2回投与されるカーボポールでアジュバントされた4μg用量のrORF2抗原、2回投与されるカーボポールでアジュバントされた1μg用量のrORF2抗原、2回投与される低用量0.25μgのカーボポールでアジュバントされたrORF2抗原、及び高用量>8logのカーボポールでアジュバントされた不活化全粒子PCV2ワクチン、を含んだ。全般に、16μgのrORF2-IMS1314を2用量投与されたグループ1は、カーボポールでアジュバントされた様々なレベルのvORF2又はrORF2抗原を投与されたグループ2から7よりもややよい効果を、そして、不活化全粒子PCV2ワクチンを2用量投与されたグループ8よりもはるかによい効果を示した。グループ1は3番目に高いADWG1.80±0.30lb/日、最も低い異常行動発生率0、最も低い異常呼吸発生率0、低い咳発生率7.1、低い全臨床症状発生率7.1を示し、最も低い死亡率0、2番目に低い平均肺病変率0.15±0.34、2番目に低い肺炎率21.4及び最も低いIHC陽性組織の発生率0で、3つの他のグループに結び付けられた。しかしながら、グループ1は、注射部位の反応が確認された唯一のグループであり、それは、ワクチン接種を受けたブタの50を2回目のワクチン接種の1日後に含んだ。グループ2から7に投与された他のワクチンは、不活化ワクチンよりもよい効果及びグループ1に投与されたワクチンとほぼ同等の効果を示した。グループ8は、カーボポールでアジュバントされた不活化PCV2ワクチンの2用量を投与されたが、どのワクチングループに対しても最も悪い組合せを示した。グループ8は最も低いADWG0.93±0.33lb/日、2番目に高い異常行動率6.7、最も高い異常呼吸率6.7を示し、最も高い臨床症状の全体低出現率13.3で他の3つのグループに結び付けられ、全グループ中で最も高い死亡率20を示し、そして、全ワクチングループ中で最も高いIHC陽性率80を呈した。不活化全粒子PCV2ワクチンがグループ8に投与される前に十分に不活化されていなかったかもしれないという懸念があったが、それによってこのグループの悪い結果が説明されるかもしれない。残念ながらこの懸念を確定するための明確なデータが利用できなかった。全般的に、この実施例の場合では、コンベンショナルな不活化PCV2ワクチンはPCV2に関係する病気を低減することの助けとはならなかった。先に言及されたように、副作用は、IMS1314でアジュバントされたワクチンを除き、テストワクチンと全く関係しなかった。注射部位の反応が、IMS1314で組成されたワクチンによる2回目のワクチン接種から1日後に50.0のブタで、そして2回目のワクチン接種から2日後に38.6のブタで確認された。カーボポールでアジュバントされたワクチンを投与されたブタでは全く反応が確認されなかった。IMS1314でアジュバントされたワクチンをワクチン接種されたブタを含むいかなる研究も、ブタの注射部位の反応を念入りにモニターし続けるべきである。全てのブタは実験~3日目にPCV2に対して血清陰性であり、グループ2だけが実験14日目に100を超えるタイターを示した。実験25日目チャレンジの日に、グループ8は最も高いPCV2抗体タイター4619を示し、グループ2がそれに続いた2509。グループ7、9及び10を例外として、全てのグループが強い抗体反応を実験32日目までに呈した。実験50日目までに、グループ7,9及び10を含む全てのグループが強い抗体反応を呈した。PCV2感染とそれに続くPMWSの進行の特徴のひとつは、離乳後ブタにおける成長障害であり、重症の事例では、体重減少が確認される。各グループの平均1日あたり体重増加は、成長障害又は体重減少を示す定量的方法である。この実施例では、グループ間でADWGに大きな違いが無かった。グループ8が、0.88±0.29lb/日の最も低いADWGを示し、その一方、グループ4は1.16±0.26lb/日の最も高いADWGを示した。この研究の状況の中では、グループ間に将来のワクチンの効力をADWGに基づかせるだけの十分な違いが無かった。体重削痩に加え-呼吸困難、下肢萎縮、皮膚蒼白及び時折、黄疸がPMWSに関係する臨床症状である。この実施例では、異常な行動及び異常な呼吸及び咳が低頻度で各グループに確認された。この研究で証明されたように、このチャレンジモデル及びチャレンジ株は手に負えない臨床症状を引き起こさず、これはワクチンの効能が基づく強いパラメタではない。全般的に、死亡率はこの実施例では高くなく、チャレンジコントロールグループで高い死亡率が見られないことによって、ワクチンの有効性が基づくこのパラメタが制限される。実験46日目以前に、グループ4及び7はそれぞれ15匹中1匹のブタが死亡した。グループ9は14匹のブタ中2匹が死亡し、グループ8では15匹のブタ中3匹のブタが死亡した。チャレンジコントロールグループであるグループ9は、PCV2の臨床症状を示しておらず、わずか2匹の死亡がこのグループ中では第46日目までに起きた。豚繁殖呼吸障害症候群ウイルスPRRSVMLVワクチンが全ての豚に実験46日目に投与された。以前の研究は、インゲルバックINGELVAC、登録商標PRRSMLVを、PCV2に係わるPMWS病状を悪化させる免疫刺激剤として利用され、これらの以前の研究では死亡率がより高かった。2匹の死亡は、実験46日目のPRRSワクチン投与のすぐ後に起こった―グループ4は実験46日目に1匹が死亡し、グループ7は実験47日目に1匹が死亡した―これらはおそらく、実験50日目までのPRRSワクチンの投与には関係しないだろう。実験50日目までに、2用量の不活化ワクチンを投与されたグループ8は、最も高い死亡率20を示し、グループ9チャレンジコントロールとグループ70.25μgrORF2-カーボポールが、それぞれ、死亡率14.3と13.3でそれに続いた。全般に、PRRSワクチンをチャレンジモデルにこの実施例のチャレンジ後観察フェイズの遅い時期に投与することによって、死亡率が有意に上昇することは無かった。PCV2感染に続いてPMWSを発症したブタにおける肉眼的病変は、典型的には、全身的なリンパ節症と次のものの1または2以上の組合せからなる:1小葉間浮腫による間質性肺炎、2皮膚の蒼白又は黄疸、3まだらの萎縮肝臓、4胃潰瘍、及び5腎炎。解剖時実験50日目には、黄疸、肝炎、及び腎炎が、どのグループにも認められなかった。胃潰瘍はグループ7の1匹のブタについて確認されたが、リンパ節症は詳細に検査されなかった。PCV2感染と密接に関連する病変の存在に基づき、3つのグループが、少なくとも1匹のブタがPCV2PMWSと暫定的に診断された。グループ8は、不活化ワクチンの2用量を投与されたが、20が暫定的にPCV2と診断され、一方、グループ7及びグループ4は、それぞれ、13.3及び6.7が、暫定的にPCV2と診断された。平均肺病変スコアは、解剖時に、グループ間で一致しなかった。グループ1、2、3、4、6及び10は、0.11±0.38から0.90±0.15にわたる低い肺病変スコアを示した。期待通り、グループ9は、チャレンジコントロールグループであり、最も高い平均肺病変スコア10.81±23.27を示した。4つのグループにおいて、平均肺病変スコアが、非常に高い肺病変スコアを示す、1から3匹のブタのために、これらのグループのそれぞれにおいて、上昇した。肺の病変は赤/紫で固まっていた。典型的には、PMWSに関係する肺病変は、タン、小葉間の浮腫で固まっていないとして記載される。この研究で確認される肺病変は、PCV2感染に関係しないか、あるいは、2次的な肺感染病原体が存在していたかもしれない。この研究の状況の中で、肺病変スコアはおそらく、PCV2に起因する肺感染の量の正しい尺度を反映していない。さらに加えて、肺炎という暫定的な診断が、同じように濫用されたかもしれない。肺病変をもつブタは、何匹かは0.10と小さいが、肺炎の暫定的診断でリストされた。この実施例では、肉眼的病変と肺病変に関して、ワクチンの効力が根拠とする十分な違いがグループ間になかった。IHCの結果は、グループ間の最も大きな違いを示した。グループ116μgrORF2-IMS1314は、PCV2抗原に対して、最も低い陽性IHCの結果を示した0;一方、グループ9及び10は、それぞれ100及び93.3の発生率をもち、最も高い陽性IHCの結果を示した。グループ3、5、6及び7は、それぞれ16、4、1又は0.25μgの、カーボポールでアジュバントされた、rORF2抗原を投与されたが、それぞれ20、20、40及び46.7のIHC陽性率を示した。グループ2は、カーボポールでアジュバントされた16μgのvORF2の2用量を投与されたが、6.7のIHC陽性率を示し、その一方で、わずか1用量の同じワクチンを投与されたグループ4は、13.3のIHC陽性率を示した。この検査の目的の本質及びIHCの結果が期待される結果と相関していたという事実のため、IHC検査はおそらく最もよい、ワクチンの有効性が根拠とするパラメタの1つである。そして、本発明の一態様では、CDCDブタモデルにおける、PCV2のチャレンジに対する、カーボポールでアジュバントされたPCV2rORF2の最小保護用量MPDが決定される。グループ3、5,6および7はそれぞれ2用量のカーボポールでアジュバントしたrORF2抗原を投与されたが、各グループでrORF2抗原のレベルは異なっていた。グループ3、5,6及び7は、それぞれ、16、4、1又は1μgのrORF2抗原を投与された。一般に、rORF2抗原のレベルが減少することによってPCV2抗原タイターが減少し、死亡率、平均肺病変及びIHC陽性組織の出現率が上昇した。異なるレベルのrORF2-カーボポールを投与されたグループのうち、それぞれ、16又は4μgのrORF2抗原の2用量を投与されたグループ3及び5は、各々わずか20のIHC陽性率を示し、そして各々類似の抗原タイターを示した。全般に、IHC陽性の結果に基づけば、2回投与されるrORF2抗原の最小保護用量は約4μgである。本発明の別の態様では、組換えrORF2及びVIDOR-1vORF2PCV2抗原の抗原性が評価された。グループ2は16μgのvORF2の2用量を投与され、グループ3は16μgのrORF2の2用量を投与された。両方のワクチンはカーボポールでアジュバントされていた。両方のワクチンは安全であることが見出され、両者は0の死亡率を有していた。グループ2は2507のPCV2抗原タイターを実験25日目に示したが、一方、グループ3は1503のPCV2抗原タイターを示した。グループ3はグループ2よりも低い平均の肺病変スコアを示した0.11±0.38対0.90±0.15が、グループ2はグループ3よりも低いIHC陽性発生率を示した6.7対20。全般に、両ワクチンは類似の抗原性を有していたが、vORF2はややよいIHCの結果に結びついた。本発明のさらに別の態様では、2種類の異なるアジュバントカーボポールとIMS1314の適合性が決定された。グループ1及び3は、ともに16μgのrORF2抗原を含む2用量のワクチンを投与されたが、グループ1はIMS1314でアジュバントされた抗原を投与された一方で、グループ3はカーボポールでアジュバントされた抗原を投与された。両グループは本質的に同じADWG、本質的に同じチャレンジ後の臨床的徴候の発生率、同じ死亡率、及び本質的に同じ肺病変の平均を有していた;しかし、グループ1はIHC陽性率0である一方で、グループ3はIHC陽性率20であった。しかしながら、カーボポールでアジュバントされたワクチンを投与されたグループ3は、IMS1314でアジュバントされたグループ1よりも高いIFATPCV2タイターを実験25、32及び50日目に示した。全般に、IMS1314でアジュバントされたPCV2ワクチンはよりよいIHCの結果を提供するものの、PCV2の感染から圧倒的によい保護を与えず、注射部位の反応を誘導する。カーボポールでアジュバントされたPCV2ワクチンはIMS1314でアジュバントされたワクチンとほぼ同様の性能を発揮するが、いかなる副作用にも結びつかなかった。本発明のさらに別の態様では、PCV2ORF2の1ml‐1用量製品としての実現可能性が確定された。グループ2及び4は両方ともに16μgのカーボポールでアジュバントされたvORF2ワクチンを研究0日目に受けたが、グループ2は実験14日目に2回目接種を受けた。グループ4はグループ2よりもやや高いADWG及び低い肺病変の平均を示したが、グループ2は実験25、32及び50日目に、より高いIFATPCV2タイター及びより低いIHC陽性組織の発生率を呈した。この2つのグループに対する他のすべての結果が類似していた。全般に、1用量のカーボポールでアジュバントされたvORF2は、同じワクチンの2用量と同じように作用した。"