"下記一般式Iで表される構造を有する金属錯体。式中、原子団R1R2Nは、カルボニル基との共有結合が切断されると、蛍光性化合物を形成する原子団を表す。また、R3COは、原子団R1R2Nとカルボニル基との共有結合が切断されると、五座配位子が遷移金属からなる中心金属に配位結合してなる金属錯体を形成する原子団を表す。なお、カルボニル基中の酸素原子は、R3中の中心金属と配位結合している。原子団R3COを構成する五座配位子が、含窒素配位子である請求項1に記載の金属錯体。原子団R1R2Nとカルボニル基との共有結合が切断されると形成される金属錯体が、下記化学式IIで表される金属錯体である請求項2に記載の金属錯体。式中、MはFeCuMnZnNiCoRuの何れかを表す。原子団R1R2Nから形成される蛍光性化合物が、複素環式化合物である請求項1に記載の金属錯体。複素環式化合物が、レゾルフィン7‐Hydroxy‐3H‐phenoxazin‐3‐oneである請求項4に記載の金属錯体。下記一般式IIIで表される構造を有する請求項1に記載の金属錯体。式中、MはFeCuMnZnNiCoRuの何れかを表す。請求項1~6に記載の金属錯体を含む蛍光プローブ。過酸化水素の検出に使用する請求項7に記載の蛍光プローブ請求項7に記載の蛍光プローブを含むバイオアッセイ用キット。請求項7に記載の蛍光プローブを含むバイオイメージング用キット。請求項7に記載の蛍光プローブを含む臨床分析用キット。請求項7に記載の蛍光プローブで標識した標識抗体。請求項12に記載の標識抗体を含むバイオアッセイ用キット。請求項12に記載の標識抗体を含むバイオイメージング用キット。請求項12に記載の標識抗体を含む臨床分析用キット。そこで、この発明は、従来からあるものよりも、反応速度が速く、阻害剤による影響を受け難い過酸化水素検出用蛍光プローブを提供することを課題とする。発明者らは、鋭意検討の結果、特定の金属錯体と過酸化水素との反応速度が、従来からある過酸化水素蛍光プローブと過酸化水素との反応速度と比べて速いことを見出し、この発明を完成させた。すなわち、この発明は、下記一般式Iで表される構造を有する金属錯体を過酸化水素検出用蛍光プローブに使用することを主な特徴とする。式中、原子団R1R2Nは、カルボニル基との共有結合が切断されると、蛍光性化合物を形成する原子団を表す。また、R3COは、原子団R1R2Nとカルボニル基との共有結合が切断されると、五座配位子が中心金属に配位結合してなる金属錯体を形成する原子団を表す。なお、カルボニル基中の酸素原子は、R3中の中心金属と配位結合している。なお、原子団R3COを構成する五座配位子は含窒素配位子であってもよい。中でも、原子団R1R2Nとカルボニル基との共有結合が切断されると形成される金属錯体が、下記化学式IIで表される金属錯体であってもよい。式中、MはFeCuMnZnNiCoRuの何れかを表す。また、原子団R1R2Nから形成される蛍光性化合物は、レゾルフィン7‐Hydroxy‐3H‐phenoxazin‐3‐one、及びレゾルフィン誘導体2,8Difluoro7‐Hydroxy‐3H‐phenoxazin‐3‐one、2,8Dichloro‐Hydroxy‐3H‐phenoxazin‐3‐one等などの複素環式化合物であってもよい。なお、この発明に係る金属錯体のより具体的な例としては、下記一般式IIIで表される構造を有する金属錯体が挙げられる。式中、MはFeCuMnZnNiCoRuの何れかを表す。この発明の金属錯体を蛍光プローブに使用することによって、過酸化水素の発生メカニズムや発生のタイミングをより正確に捕捉して、生体内における過酸化水素の役割をより詳細に解明できる。また、この蛍光プローブをバイオアッセイやバイオイメージングに使用すれば、検体の処理時間が短縮でき、検査効率を向上できる。以下、この発明の実施の形態について説明する。この発明の金属錯体は、前記一般式Iや前記一般式III等で表される金属錯体である。なお、前記一般式I等で表される金属錯体に互変異性体、立体異性体、光学異性体等の異性体が存在する場合は、それら異性体もこの発明の金属錯体に含まれる。また、前記一般式I等の金属錯体が塩を形成する場合には、その塩もこの発明の金属錯体に含まれる。前記塩は、酸付加塩でも塩基付加塩でもよく、前記酸付加塩を形成する酸は公知の無機酸又は有機酸であればよく、前記塩基付加塩を形成する塩基は公知の無機塩基又は有機塩基であればよい。この発明の金属錯体は、例えば、下記の一般式IVのように、ヒドロキシルラジカル、ペルオキシナイトライト、過酸化水素等の活性酸素種と反応すると迅速に、A蛍光性化合物とB金属錯体とに分解する。そして、この蛍光性化合物を可視紫外線強度計などによって検出すれば、活性酸素種の発生を検出できる。そのため、この発明の金属錯体は、活性酸素種、中でも過酸化水素を検出する蛍光プローブとして使用できる。また、この蛍光プローブは、公知の方法によって、モノクローナル又はポリクローナル抗体と結合させることができ、この蛍光プローブによって標識された抗体は、蛍光プローブとして使用できる。この発明の蛍光プローブ及びこの蛍光プローブによって標識した抗体は、その用途を特に限定することなく、あらゆる用途に使用できる。例えば、この蛍光プローブ又はこの蛍光プローブによって標識した抗体と公知の試薬等とを組み合わせて、バイオアッセイ用キット、バイオイメージング用キット、臨床検査用キットなどを構築し、バイオアッセイ、バイオイメージング、臨床検査などに使用することが可能である。これらのキットは蛍光プローブが蛍光するまでの反応時間が短く、阻害剤による影響を受け難い。そのため、これらのキットを使用することによって、従来からあるキットと比べて、検査時間を短縮でき、精度の高い検査結果が得られる。バイオアッセイ用キットとしては、例えば、グルコースオキシダーゼ標識抗体を使用するELISA法用キット、グルコースオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、スフィンゴメリナーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、アセチルコリンオキシダーゼ、モノアミン酸化酵素、ガラクトースオキシダーゼ、キサンチン酸化酵素等の過酸化水素を発生する酵素の定量用キット等が挙げられる。バイオイメージング用キットとしては、例えば、上記の過酸化水素を発生する酵素の細胞内での蛍光イメージング剤としての利用等が挙げられる。臨床検査用キットとしては、例えば、過酸化水素の発生を検出する臨床検査用キット、例えば、ヒトや動物の体液中のカタラーゼ定量用キット、食品中のカタラーゼ定量用キット、コレステロールオキシダーゼと併用するコレステロールの定量定量用キット、アセチルコリンエステラーゼ、アセチルコリンオキシダーゼと併用するアセチルコリンの定量用キット等が挙げられる。また、この発明の蛍光プローブは酸化還元酵素によって基質から生じる酸化力の弱い過酸化水素によっても蛍光を生じる。そのため、この発明の蛍光プローブと酸化還元酵素等とを組み合わせれば、グルコース、ガラクトース、コレステロール、尿酸、無機リン酸、無機ピロリン酸等の測定に使用することができる。中でも、阻害剤の影響を受け難いことから、薬物治療中の糖尿病患者の血中グルコース濃度定量用キットに適している。なお、これらのキットに使用する試薬、キットによる試料の処理手順等については、この発明の蛍光プローブ等を使用する以外は特に限定することなく、公知の試薬、処理手順等を適宜組み合わせて使用すればよい。以下、この発明について実施例に基づいてより詳細に説明する。ただし、以下の実施例によって、この発明の特許請求の範囲は如何なる意味においても制限されない。1金属錯体の調製この発明に係る金属錯体を調製した。具体的には、図1の反応経路に沿って配位子を合成したのち、鉄錯体を調製した。なお、理解しやすくするため、以下の説明では、同じ化合物については図1と同じ記号を使用した。1試薬NNNTrispropane13diamine以下、化合物dと省略する。は既報HureauCGroniSGuillotRBlondinGDubocCAnxolabehereMallartESynthesesXrayStructuresSolidStateHighFieldElectronParamagneticResonanceandDensityFunctionalTheoryInvestigationsonChloroandAquaMnIIMononucleaR3COmplexeswithAminoPyridinePentadentateLigandsInorgChem20084792389247に従って合成したものを使用した。これ以外の試薬については市販のものを使用した。237diacetoxy10Hphenoxazine以下、化合物bと省略する。の合成窒素雰囲気下、Resazurinナトリウム塩化合物a150g597mmolの氷酢酸溶液10mlに亜鉛粉末129g296mmolを加え、一時間攪拌した。反応液から溶媒を除去して、NNdimethyl4aminopyridineDMAP073g597mmolを加え、アセトン40mlに溶解した。反応溶液に無水酢酸121g119mmolを加え、室温で攪拌した。反応終了はTLCにて確認したRf028SiO2酢酸エチル:ヘキサン=12。反応終了後、反応溶液をCeliteCeliteCorporationを使用してろ過し、ろ液を濃縮真空乾燥して褐色固体を得た。これをカラムクロマトグラフィーSiO2酢酸エチル:ヘキサン=15~によって精製し、淡黄色の固体を得た11g収率62。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法1HNMR及び13CNMR、フーリエ変換赤外分光光度計の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。1HNMRδ22552662864164713CNMRδ2231104113211651294143114491699FTIR1755cm13379cm13NBromoacetyl37diacetoxyphenoxazine以下、化合物cと省略する。の合成窒素雰囲気下、化合物b及び炭酸ナトリウムの乾燥アセトニトリル溶液にbromoacetylbromideを加え、3時間攪拌した。溶液の色が淡黄色から深緑色へ変化した。反応終了後、Celiteにより反応溶液をろ過し、ろ液を濃縮真空乾燥して深緑色固体を得た13g収率94。この化合物は精製せずに次の反応に使用した。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法1HNMR及び13CNMR、フーリエ変換赤外分光光度計の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。1HNMRδ23141269369576213CNMRδ21226711121172124512631495151816591692FTIR16760cm117628cm14Nacetyl37diacetoxyphenoxazineNNNtrispropane13diamine以下、化合物eと省略する。の合成窒素雰囲気下、化合物c及び炭酸カリウムの乾燥アセトニトリル溶液10mlに化合物dを徐々に加え、室温で24時間攪拌した。Celiteにより反応溶液をろ過し、ろ液を濃縮真空乾燥させ、赤褐色の油状物質を得た。油状物質をカラムクロマトグラフィーRf010SiO2酢酸エチル:ヘキサン=11を使用して精製し、赤褐色固体を得た。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法1HNMRの測定結果から同定した。その結果を以下に示す。1HNMRδ1682522693613753866816887097427547568475Nacetyl37dihydroxyphenoxazineNNNtrispropane13diamine化合物fの合成化合物e及び亜硫酸ナトリウムを14dioxane水混合溶液に溶解し、24時間加熱還流した。反応溶液は赤色蛍光を発していた。溶媒を濃縮したのち、水を1ml加えて、再結晶し、赤色固体を得た。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法1HNMR及び13CNMRの測定結果から同定した。その結果を以下に示す。1HNMRδ16125025936483937338165165372474776777283513CNMRδ2265355986811045111212291238124912651387149515321580160117806鉄錯体の合成化合物fのメタノールアセトニトリル溶液にFeII22CH3CNを加え、1時間撹拌した。溶液の色は褐色へと変化した。1時間後、ジエチルエーテルを加え、析出した沈殿をろ過したのち、真空乾燥して茶褐色の固体を得た38mg収率35。なお、この化合物は、高分解能質量分析計の測定結果から同定した。その結果、HRMSmz3291であった。2反応速度の測定1この発明に係る蛍光プローブ以下、MBFh1と省略する。の反応速度を調べた。具体的には以下のようにして調べた。MBFh1の20mMMOPSbuffer溶液を4面セルに調製した。これに、終濃度が25μM,5μM,50μM,500μMとなるように過酸化水素水を添加して、最大蛍光波長である590nm励起波長570nmにおける蛍光強度の時間変化を25°Cで測定した。その結果を図2に示す。図2から、過酸化水素の濃度が微量5μMであっても800秒で蛍光強度が最大値に達すること、同濃度で蛍光強度が最大値の半分に達するには3分180秒で済むことが分かった。以上の結果から、MBFh1は、従来からある蛍光プローブに比べて、反応速度が約100倍速いことが確認できた。3反応速度の測定2MBFh1の反応速度をより精密に調べた。具体的には以下のようにして調べた。MBFh1の20mMMOPSbuffer溶液を4面セルに調製した。これに、終濃度が125μM375μM,5μM125μM25μMとなるように過酸化水素水を添加して、590nm励起波長570nmにおける蛍光強度の時間変化を25°Cで測定した。その結果を図3に示す。図3から、添加した過酸化水素の濃度が高くなるにつれて、グラフの傾きが大きくなっていることが確認できた。また、グラフの傾きから、反応速度を計算したところ、381±02M1S1であることが分かった。そして、この反応速度は、天然のペルオキシダーゼよりは遅いものの、既存の蛍光プローブよりは速いことが分かった。4.酵素によって発生した過酸化水素の検出酵素によって発生した過酸化水素が検出できるかどうか調べた。具体的には以下のようにして調べた。MBFh1の20mMMOPSbuffer溶液を4面セルに調製した。これに、終濃度が0008mgmlとなるようにグルコースオキシダーゼを添加したのち、590nm励起波長570nmにおける蛍光強度の時間変化を25°Cで測定した。また、MBFh1のMOPSbuffer溶液にグルコースオキシダーゼを添加してから、100秒後に終濃度が008mgmlとなるようにカタラーゼを添加し、蛍光強度の時間変化を同様にして測定した。これらの測定結果を図4に示す。図4から、グルコースオキシダーゼを添加すると、蛍光強度が直ぐに強くなることが確認できた。また、カタラーゼを添加して、過酸化水素を減少させると、蛍光強度の増強を完全に抑制できることが確認できた。これらの結果から、MBFh1は、酵素反応によって生じる酸化力の弱い過酸化水素を検出できることが分かった。5D-グルコース検出感度の確認MBFh1が、D-グルコースを検出できることは、実施例4で確認した。そこで、MBFh1のD-グルコースの検出感度について調べた。具体的には次のようにして調べた。MBFh1の20mMMOPSbuffer溶液に、終濃度が25μM、5μM、19μM、25μMとなるようにグルコースを添加し、添加した溶液を4面セルに収納した。これに、終濃度が0008mgmlとなるようにグルコースオキシダーゼを添加して50秒撹拌したのち、590nmにおける蛍光強度励起波長570nmを25°Cで測定した。その結果を図5に示す。図5から、蛍光強度とグルコース濃度との間に強い相関性があるとともに、MBFh1を蛍光プローブとして使用することによって、25μMという低濃度でも、グルコースを検出できることが確認できた。このことから、MBFh1はサンプル中のグルコースを測定するための蛍光プローブとして使用できることが分かった。6他のペルオキシダーゼ基質が反応性に与える影響の比較MBFh1の反応性と、従来技術である非特許文献11に記載のAmplexRed登録商標酵素アッセイキットの反応性とを、他のペルオキシダーゼ基質の存在下で比較した。具体的には次のようにして比較した。MBFh1の20mMMOPSbuffer溶液を調製し、5つの4面セルに収納した。各4面セルに過酸化水素5μM、コントロール、過酸化水素5μMとpクレゾール25μM、過酸化水素5μMとフェノール25μM、過酸化水素5μMとチロシン25μM、過酸化水素5μMとチラミン25μMを添加し、590nm励起波長570nmにおける蛍光強度の時間変化を25°Cで測定した。得られた蛍光強度の相対値を、コントロールを100として計算した。また、蛍光色素AmplexRed5μMと西洋ワサビペルオキシダーゼ以下、HRPと省略する。22nMをMBFh1の代わりに使用して、蛍光強度の相対値を同様にして調べた。その結果を図6に示す。図6から、MBFh1は、他のペルオキシダーゼ基質が存在していても、過酸化水素による蛍光強度がそれほど低下しないこと、が分かった。これに対して、比較に使用した蛍光色素とペルオキシダーゼは、他のペルオキシダーゼ基質が存在すると、過酸化水素による蛍光強度がかなり低下することが確認できた。このことから、MBFh1による反応系は、従来からある反応系に比べて、過酸化水素以外のペルオキシダーゼ基質による影響を受け難い、すなわち、これらによって阻害され難いことが分かった。7活性酸素種に対する反応性の比較MBFh1と、非特許文献11に記載のAmplexRed登録商標酵素アッセイキットの活性酸素種に対する反応性を調べた。具体的には、次のようにして調べた。MBFh1又はAmplexRed5μMの20mMMOPSbuffer溶液を調製し、それぞれ5つの4面セルに入れた。酸化剤である過酸化水素、t-ブチルヒドロペルオキシド、次亜塩素酸ナトリウム、酸化カリウムを終濃度が50μMとなるように各セルに添加して、25°Cで500秒間撹拌したのち、590nm励起波長570nmにおける蛍光強度を25°Cで測定した。なお、比較のため、酸化剤を添加しないセルの蛍光強度も同様に測定した。その結果を図7に示す。図7から、MBFh1は過酸化水素、t-ブチルヒドロペルオキシドによって蛍光強度が極めて増強し、それらに比べれば低いものの、スーパーオキシドアニオンラジカルによっても蛍光強度が強くなることが確認できた。これに対して、AmplexRedは実験した活性酸素種に対して僅かに反応するだけであり、蛍光強度は殆ど増強しないことが確認できた。このことから、MBFh1は過酸化水素以外の活性酸素種の検出にも使用できることが分かった。8.反応機構について発明者らは、MBFh1が蛍光プローブとして優れている理由について、MBFh1が鉄錯体と蛍光色素AmplexRedモチーフとが共有結合している化合物だからである、と考えた。そこで、MBFh1を使用した場合と、AmplexRed及びMBFh1の鉄錯体部分と構造的に類似する化合物Fe3を使用した場合の蛍光強度の時間変化の違いを比較して調べた。具体的には、次のようにして調べた。まず、MBFh1の20mMMOPSbuffer溶液を4面セルに調製した。つぎに、4面セルに終濃度が500μMとなるように過酸化水素水を添加して、590nm励起波長570nmにおける蛍光強度の時間変化を25°Cで測定した。また、MBFh1の代わりに、蛍光色素AmplexRed5μM及びFe35μMを使用して、蛍光強度の時間変化を同様にして調べた。これらの結果を図8に示す。図8から、MBFh1を使用した場合には過酸化水素を添加してから直ぐに蛍光強度が強くなることが確認できた。これに対して、蛍光色素AmplexRed及びFe3を使用した場合には、蛍光強度は殆ど強くならないことが確認できた。この結果から、MBFh1の分子内酸化が、MBFh1の蛍光強度の強さに関係していることが分かった。"