下記の一般式:式中、R1は水素原子又は水酸基の保護基を示し、Bsは保護基を有していてもよい核酸塩基を示し、nは0又は1以上の整数を示し、n個のXはそれぞれ独立に下記の一般式又は:式中、Bsは上記と同義であり、R2は水素原子又はシアノエトキシメチル基を示すで表される二価の基を示すで表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩の製造方法であって、下記の一般式式中、Bs、X、及びnは上記と同義であり、R3及びR4はそれぞれ独立に水酸基の保護基を示すが、いずれか片方は必要に応じてリンカーを介して結合した固相担体を示してもよいで表される化合物に下記の一般式又は:式中、Bsは上記と同義であり、CEMはシアノエトキシメチル基を示し、R5は水酸基の保護基を示し、R6は置換基を有していてもよいアリール基を示すで表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化する工程を含む方法。R6がフェニル基である請求項1に記載の方法。R5が44ジメトキシトリチル基である請求項1又は2に記載の方法。縮合を活性化剤の存在下で行う請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。活性化剤としてNピロリジニウムトリフレート又はNフェニルイミダゾリウムトリフレートを用いる請求項4に記載の方法。硫化剤としてジメチルチウラムジスルフィドを用いる請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。一般式においてnが0である化合物を出発原料として用いて上記工程をn1回繰り返す工程を含む請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。反応を固相法で行う請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。必要に応じてリンカーを介して固相担体に結合した一般式においてnが0である化合物を用いる請求項8に記載の方法。n1個のXが全てで表される二価の基であるか、又は全てで表される二価の基である請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法。請求項1に記載の一般式式中、R1、Bs、n、及びXは上記と同義であり、ただしR2はシアノエトキシメチル基を示すで表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩。請求項1に記載の一般式又は式中、Bs、CEM、R5、及びR6は上記と同義であるで表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシド。本発明の課題は、オリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートを立体選択的かつ効率的に合成する方法を提供することにある。本発明者らはOrgLett11pp9679702009に記載されたオキサザホスホリジン法によるホスホロチオエートRNAの合成方法を改良すべく鋭意研究を行った結果、RNAの2水酸基の保護基としてtertブチルジメチルシリル基に換えてシアノエトキシメチル基を用いると極めて高い縮合効率を達成することができること、及び求核性の小さい活性化剤であるNピロリジニウムトリフレートを用いた場合にもジアステレオ選択性を損なうことなく長鎖オリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートの合成に十分適用可能な高い縮合効率が得られることを見出した。また、求核性の高い活性化剤であるNフェニルイミダゾリウムトリフレートPhIMTを用いても高い立体選択性が得られ、4種類の核酸塩基を含んだ長鎖オリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートの合成に十分適用可能な高い縮合効率を得られることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。すなわち、本発明により、下記の一般式:式中、R1は水素原子又は水酸基の保護基を示し、Bsは保護基を有していてもよい核酸塩基を示し、nは0又は1以上の整数を示し、n個のXはそれぞれ独立に下記の一般式又は:式中、Bsは上記と同義であり、R2は水素原子又はシアノエトキシメチル基を示すで表される二価の基を示すで表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩の製造方法であって、下記の一般式式中、Bs、X、及びnは上記と同義であり、R3及びR4はそれぞれ独立に水酸基の保護基を示すが、いずれか片方は必要に応じてリンカーを介して結合した固相担体を示してもよいで表される化合物に下記の一般式又は:式中、Bsは上記と同義であり、CEMはシアノエトキシメチル基を示し、R5は水酸基の保護基を示し、R6は置換基を有していてもよいアリール基を示すで表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化する工程を含む方法が提供される。上記の方法の好ましい態様によれば、R6がフェニル基である上記の方法;R5が44ジメトキシトリチル基である上記の方法;縮合を活性化剤の存在下で行う上記の方法;活性化剤としてNピロリジニウムトリフレート又はNフェニルイミダゾリウムトリフレートを用いる上記の方法;硫化剤としてジメチルチウラムジスルフィドを用いる上記の方法;反応を固相法で行う上記の方法;n1個のXが全てで表される二価の基であるか、又は全てで表される二価の基である上記の方法が提供される。別の観点からは、本発明により、上記の一般式式中、R1、Bs、n、及びXは上記と同義であり、ただしR2はシアノエトキシメチル基を示すで表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩が提供される。また、本発明により、上記の一般式又は式中、Bs、CEM、R5、及びR6は上記と同義であるで表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドが提供される。本発明の方法によりオリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートを立体選択的かつ効率的に合成することができる。本発明の方法によれば、立体選択的に極めて高い縮合効率を達成することができることから、固相法に適用することにより長鎖のオリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートを高収率で製造することが可能になる。一般式においてR1は水素原子又は水酸基の保護基を示す。水酸基の保護基の種類は特に限定されず、一般的には、アセチル基やフェノキシアセチル基などのアセチル保護基、ベンジル基や4メトキシベンジル基などのベンジル保護基、ベンゾイル基、ピバロイル基、44ジメトキシトリチル基などのトリチル保護基、トリメチルシリル基やTertブチルジメチルシリル基などのシリル保護基、2エチル基やシアノエトキシメチル基などのエーテル保護基など適宜の保護基を用いることができる。水酸基の保護基についてはGreenら、ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis3rdEdition1999JohnWileySonsIncなどの成書を参照することができる。R1が保護基を示す場合には、合成過程においてこの保護基又は他の保護基を選択的に脱離させることができるように、R1の保護基は他の保護基とは異なる保護基であることが好ましい。R1の保護基としては、例えばトリチル保護基を用いることが好ましく、44ジメトキシトリチル基を用いることがより好ましい。Bsは保護基を有していてもよい核酸塩基を示す。核酸塩基としてはアデニン、ウラシル、チミン、グアニン、及びシトシンからなる群から選ばれる核酸塩基のほか、リボチミジンや5メチルウリジンなどの任意の修飾塩基を用いてもよい。好ましくは、RNAの構成塩基であるアデニン、ウラシル、グアニン、及びシトシンからなる群から選ばれる核酸塩基を用いることができる。核酸塩基は残基となって通常の結合部位でリボースに結合することができる。他の一般式におけるBsも上記と同様である。核酸塩基が保護基を有する場合、保護基の種類は特に限定されないが、アミノ基を有する核酸塩基を用いる場合にはアミノ基を保護することができる。例えば、アミノ基を有する核酸塩基であるアデニン、グアニン、及びシトシンのアミノ基を保護することが好ましい場合があり、保護基として、例えばベンゾイル基、4メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、4tertブチルフェノキシアセチル基、4イソプロピルフェノキシアセチル基、メチレン基などを用いることができる。他の一般式におけるBsも上記と同様である。一般式で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩が有するn2個のBsはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。nは0又は1以上の整数を示すが、好ましくはnは100以下の整数、より好ましくは50以下の整数、さらに好ましくは40以下の整数である。一般式において、n個のXはそれぞれ独立に上記の一般式又はで表される二価の基を示すが、上記で説明したのと同様にn個のXに含まれるn個のBsはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。R2は水素原子又はシアノエトキシメチル基を示すが、R2は水素原子である化合物は、本発明の合成方法によりR2がシアノエトキシメチル基であるリボヌクレオシドホスホロチオエートを製造した後に、シアノエトキシメチル基を脱離することにより製造することができる。一般式で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートの塩の種類は特に限定されないが、例えば、アンモニウム塩や有機アミンの塩のほか、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などの金属塩などが好ましく、より好ましくは、例えばアンモニウム塩やトリエチルアミン塩などの三級アルキルアミン化合物の塩やナトリウム塩などを用いることができる。一般式で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩は、水和物や溶媒和物の形態であってもよい。一般式で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートにおいて立体表記は絶対配置を示すが、本発明の方法により、一般式で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートの光学対掌体を製造することも可能である。一般式で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートは、上記の一般式で表される化合物に対して、上記の一般式又はで表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化することにより製造することができる。一般式においてR3及びR4はそれぞれ独立に水酸基の保護基を示す。水酸基の保護基は上記に説明したとおりであり、目的に応じて適宜の保護基を選択することができるが、R3及びR4が示す保護基は同一でも異なっていてもよい。また、固相法を行う場合には、R3及びR4のうちのいずれか片方が必要に応じてリンカーを介して結合する固相担体であってもよい。この場合、残りの一方には一般的な水酸基の保護基を用いることができる。固相担体の種類は特に限定されず、核酸誘導体の合成において固相担体として用いることができるものであれば任意の固相担体を用いることが可能である。リンカーの種類や長さも特に制限されず、当業者が適宜選択できる。例えば固相担体として定孔ガラス、オキサリル化-定孔ガラス、TentaGel支持体アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体、Porosポリスチレン/ジビニルベンゼンのコポリマーなどを挙げることができ、特に好ましい固相担体として高架橋アミノメチルポリスチレンなどを用いることができる。リンカーとしては、例えば、3アミノプロピル基、スクシニル基、22ジエタノールスルホニル基、ロングチェーンアルキルアミノ基などを挙げることができる。一般式又はで表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドにおいてR5は水酸基の保護基を示すが、水酸基の保護基は上記に説明したとおりであり、目的に応じて適宜の保護基を選択することができる。例えばトリチル保護基を用いることが好ましく、44ジメトキシトリチル基を用いることがより好ましい。R6は置換基を有していてもよいアリール基を示す。アリール基としては単環性又は縮合多環性のアリール基を用いることができるが、好ましくはフェニル基を用いることができる。フェニル基にはアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子などの置換基が1個又は2個以上存在していてもよい。好ましくはR6として無置換フェニル基を用いることができる。上記の縮合反応及び硫化反応はJAmChemSoc130pp16031160372008、OrgLett11pp9679702009、及びWO200592909に記載された条件を参照しつつ行うことができる。上記特許文献の開示の全てを参照により本明細書の開示に含める。縮合反応の効率を高めるために縮合反応を活性化剤の存在下で行うことができる。活性化剤の種類は特に限定されないが、本発明の方法は極めて反応性が高いことから、例えば求核性の低いNピロリジニウムトリフレートなどを用いても立体選択性を損なうことなく縮合効率の大幅な改善を達成できる。また、求核性の高い活性化剤であるNフェニルイミダゾリウムトリフレートを用いても高い立体選択性が得られ、4種類の核酸塩基を含んだ長鎖オリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートの合成に十分適用可能な高い縮合効率を得られる。硫化剤も特に限定されないが、例えばジメチルチウラムジスルフィドなどを用いることができる。上記の方法において、n1個のXとしてで表される二価の基又はで表される二価の基を任意の個数で組み合わせることができるが、n1個のXの全てがで表される二価の基であるか、又は全てがで表される二価の基である一般式のリボヌクレオシドホスホロチオエートを製造することが好ましい。上記の一般式で表される化合物に対して、上記の一般式又はで表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化することにより一般式で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートを製造した後、得られたリボヌクレオシドホスホロチオエートを出発原料として用いて上記の一般式又はで表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化することにより、リボヌクレオシドホスホロチオエート単位を一つ増加させた化合物を製造することができ、さらに得られた化合物を出発原料として用い、上記の一般式又はで表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化することにより、リボヌクレオシドホスホロチオエート単位をさらに一つ増加させることができる。この反応を繰り返して行うことにより、所望のn1個のリボヌクレオシドホスホロチオエート単位を有する一般式で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートを製造することができる。上記の繰り返しによるリボヌクレオシドホスホロチオエートの製造は、好ましくは固相法により行うことができる。固相法によるオリゴ核酸合成法を応用して自動合成機を用いて合成を行うことも可能である。固相法に関しては種々の文献を利用することができ、当業者であれば適宜の条件を容易に選択することが可能である。例えば、固相法を行うにあたりキャップ化や固相担体からの切り出しの条件も当業者であれば適宜選択できる。シアノエトキシメチル基の脱保護はテトラブチルアンモニウムフルオリドにより選択的に行うことができる。脱保護に際して副生するアクリロニトリルが核酸塩基に付加するのを抑制するために、アクリロニトリルの捕捉剤としてニトロメタンを少量加えることにより副反応を抑制して高収率で脱保護を行うことができる。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。例1O6シアノエチルN2フェノキシアセチル35O2OグアノシンN2フェノキシアセチル35O2Oグアノシンをトルエン、ジクロルメタンで繰り返し共沸することにより乾燥してジクロルメタン溶液とした。NNジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン及びメシチレンスルホニルクロリドを加え、室温で30分撹拌した。反応混合物を飽和重曹水で洗浄し、集めた洗液をジクロルメタンで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をトルエン、ジクロルメタンで繰り返し共沸することにより乾燥してジクロルメタン溶液とした。これを0°Cまで冷却し、Nメチルモリホリンを加えて、0°Cのまま20分撹拌した。これに2シアノエタノール、18ジアザビシクロ540ウンデク7エンを加え、0°Cで25分撹拌した後、1MKH2PO4水溶液を加えた。有機層を分離後、1MKH2PO4水溶液で洗浄し、集めた洗液をジクロルメタンで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー200gシリカゲル酢酸エチルヘキサンによって精製した。これを飽和重曹水で洗浄し、集めた洗液をジクロルメタンで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮することで目的物を得た。無色非晶質。1HNMRδ892831738740698711616510520477485469453429435401408381392302261266095112O6シアノエチルN2フェノキシアセチル2OグアノシンO6シアノエチルN2フェノキシアセチル35O2Oグアノシンをトルエンテトラヒドロフランで繰り返し共沸することにより乾燥してテトラヒドロフラン溶液とした。これを35°Cまで加熱し、トリエチルアミン3HFを慎重に滴下して、35°Cのまま45時間撹拌した。0°Cに冷却後、水を5mlを加え、反応混合物を0°Cのまま1時間撹拌した。反応混合物中のテトラヒドロフランを減圧留去した後、ジエチルエーテルを75ml加えて、室温で1時間撹拌した。生成した沈殿物を吸引ろ過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒を留去した。これをメタノールで再結晶した後、得られたものをジエチルエーテルで洗浄し、減圧下溶媒を留去することで目的物を得た。無色非晶質。1HNMRδ857728733693696609539541511505467478436398357372332348316322250266O6シアノエチルN2フェノキシアセチル5O2OグアノシンO6シアノエチルN2フェノキシアセチル2Oグアノシンをピリジンで繰り返し共沸することにより乾燥してピリジン溶媒とした。これを0°Cに冷却し、44ジメトキシトリチルクロリドを加えた。室温に戻しながら2時間撹拌した後、メタノールを加えて、減圧下溶媒を留去し、クロロホルム溶液とした。これを飽和重曹水で洗浄して、集めた洗液をクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー55gofシリカゲル酢酸エチルヘキサンピリジンにより精製することで目的物を得た。無色非晶質。1HNMRδ888810699742679624501495479490465426365378349336302250例25O3O5フェニルテトラヒドロ1H3Hピロロ12c132オキサザホスホリジン2イル2Oウリジン5O2Oウリジンをピリジン、トルエンと繰り返し共沸することにより乾燥してテトラヒドロフラン溶液とした。これにトリエチルアミンを加え、78°Cに冷却後、オキサザホスホリジンクロリドの05Mテトラヒドロフラン溶液を78°Cのまま慎重に滴下した。室温に戻しながら15時間撹拌した後、クロロホルムで希釈し、飽和重曹水を加えた。有機層を分離後、飽和重曹水で洗浄し、集めた洗液をクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー15gNHシリカゲルトルエン酢酸エチルトリエチルアミンにより精製した。目的物を含むフラクションを集め、飽和重曹水で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮することで目的物を得た。無色非晶質。1HNMRδ80772472867668259557551649650148943542138739437437735236030731326715616209412831PNMRδ1582N6アセチル5O3O5フェニルテトラヒドロ1H3Hピロロ12c132オキサザホスホリジン2イル2OアデノシンN6アセチル5O2Oアデノシンにトリエチルアミン、オキサザホスホリジンクロリドの05Mテトラヒドロフラン溶液を加えて、室温で2時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー25gNHシリカゲルトルエン酢酸エチルトリエチルアミンにより精製することで目的物を得た。無色非晶質。1HNMRδ87786182672074568062457749550647348344038339237833836534130631826023615916908812831PNMRδ1570N4アセチル5O3O5フェニルテトラヒドロ1H3Hピロロ12c132オキサザホスホリジン2イル2OシチジンN4アセチル5O2Oシチジンにトリエチルアミン、オキサザホスホリジンクロリドの05Mテトラヒドロフラン溶液を加えて、室温で15時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー粗生成物030g30gNHシリカゲルヘキサン酢酸エチルトリエチルアミン、粗生成物030g30gNHシリカゲルヘキサン酢酸エチルトリエチルアミン及び粗生成物123g123gNHシリカゲルヘキサン酢酸エチルトリエチルアミンにより精製することで目的物を得た。黄色非晶質。1HNMRδ96885472274268867768459457249851548442643338639637537835036930431525927822415116708612831PNMRδ1580O6シアノエチルN2フェノキシアセチル5O3O5フェニルテトラヒドロ1H3Hピロロ12c132オキサザホスホリジン2イル2OグアノシンO6シアノエチルN2フェノキシアセチル5O2Oグアノシンにトリエチルアミン、オキサザホスホリジンクロリドの05Mテトラヒドロフラン溶液を加えて、室温で2時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー20gNHシリカゲルトルエン酢酸エチルトリエチルアミンにより精製することで目的物を得た。無色非晶質。1HNMRδ87981070074267662357448250146343534439030431924815916608812931PNMRδ1568例3例2と同様にして4R5Sオキサザホスホリジンクロリドを用いて以下の化合物を合成した。5O3O5フェニルテトラヒドロ1H3Hピロロ12c132オキサザホスホリジン2イル2Oウリジン5O2Oウリジンにトリエチルアミン、4R5Sオキサザホスホリジンクロリドの05Mテトラヒドロフラン溶液を加えて、室温で15時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー粗生成物030g3gNHシリカゲルヘキサン酢酸エチルトリエチルアミン、粗生成物140g55x27cm30gNHシリカゲルヘキサン酢酸エチルトリエチルアミンにより精製することで目的物を得た。無色非晶質。1HNMRδ924811724741685598579520δ48148942543236838734135430331424625115916808812831PNMRδ1594N6アセチル5O3O5フェニルテトラヒドロ1H3Hピロロ12c132オキサザホスホリジン2イル2OアデノシンN6アセチル5O2Oアデノシンにトリエチルアミン、オキサザホスホリジンクロリドの05Mテトラヒドロフラン溶液を加えて、室温で2時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー13gNHシリカゲルトルエン酢酸エチルトリエチルアミンにより精製することで目的物を得た。無色非晶質。1HNMRδ87786182171674267662257950749848548943634939430331526124815616608912831PNMRδ1561N6アセチル5O3O5フェニルテトラヒドロ1H3Hピロロ12c132オキサザホスホリジン2イル2OシチジンN4アセチル5O2Oシチジンにトリエチルアミン、オキサザホスホリジンクロリドの05Mテトラヒドロフラン溶液を加えて、室温で15時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー14gNHシリカゲルトルエン酢酸エチルトリエチルアミンにより精製することで目的物を得た。黄色非晶質。1HNMRδ95886172274469968659857849550447842743437338833935630031224922415816708612831PNMRδ1590O6シアノエチルN2フェノキシアセチル5O3O5フェニルテトラヒドロ1H3Hピロロ12c132オキサザホスホリジン2イル2OグアノシンO6シアノエチルN2フェノキシアセチル5O2Oグアノシンにトリエチルアミン、4R5Sオキサザホスホリジンクロリドの05Mテトラヒドロフラン溶液を加えて、室温で15時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー粗生成物030g30gNHシリカゲルヘキサン酢酸エチルトリエチルアミン、粗生成物15g15gNHシリカゲルヘキサン酢酸エチルトリエチルアミンにより精製することで目的物を得た。無色非晶質。1HNMRδ87781369874567678057647549946243937739034236230331923415917508812831PNMRδ1568例2及び3の反応では目的物のリボヌクレオシドオキサザホスホリジンがいずれも高いジアステレオ選択性で得られた。例4又はリボヌクレオシドオキサザホスホリジンをモノマーユニットとして用いて、ホスホロチオエートRNA2量体を立体選択的に固相合成した。反応工程を以下に示す。固相担体としてCPG、リンカーとしてサクシニルリンカーを用い、固相担体上のウリジンの5水酸基とモノマーユニットを求核性の小さい活性化剤であるCMPTで縮合させた後、生成したホスファイトをDTDで硫化し、濃アンモニアエタノール31vvで処理して固相担体から切り出し、不斉補助基と核酸塩基部位の保護基の脱保護を行うことで立体選択的に2量体を合成した。二量体の定量を容易にする目的でCEM基を残した状態でRPHPLCで分析し、縮合効率及びジアステレオ選択性を算出した。その結果、オリゴマー合成に十分に応用可能な高い縮合効率で、かつ高いジアステレオ選択性で縮合反応が進行することが確認できた。また、本反応は縮合反応が5分程度で完了しており、TBDMS基を用いる従来の反応では二量体の縮合に15分を要したのと比べて極めて反応性が高いことが確認された。上記と同様にして、ホスホロチオエートRNA4量体AllUps3U、AllUps3U、AllApsGpsCpsU、及びAllApsGpsCpsUを合成した。反応工程を以下に示す。活性化剤CMPTを用いて縮合させた後、未反応の5水酸基、不斉補助基のアミノ基をそれぞれトリフルオロアセチルイミダゾールを用いてキャップ化した。キャップ化は目的とする配列以外の合成を抑制するとともに、不斉補助基のアミノ基をアシル化することで塩基性を低下させ、反応系中の酸性度を保持する目的で行った。続いて、DTDによりホスファイトの硫化、5末端のDMTr基の除去を行い、さらにモノマーユニットを縮合させた。一連の鎖長伸長サイクルを繰り返し行うことで目的の塩基配列を有するホスホロチオエート4量体を合成した。最後に濃アンモニアエタノールの塩基性条件下で固相担体から切り出し、保護基の除去を行った。結果を以下の表3に示す。比較のため、従来法により2水酸基の保護基をTBDMS基として同様にCMPTを用いてAllApsGpsCpsUの合成を行った場合の平均縮合効率は77であった。上記と同様にしてホスホロチオエートRNA12量体としてAllUps11Uを合成した。反応工程を以下に示す。合成後、DMTr定量から算出した平均縮合収率はRp体、Sp体ともに99であった。求核性の小さいCMPTを用いてRNAオリゴマーの合成を行っても、良好な平均縮合効率が得られた。濃アンモニアEtOHで4時間処理してオリゴマーを固相担体から切り出した後、ろ過により固相担体を除去し、再度アンモニア処理をして保護基を脱保護した。その後、反応液の溶媒を2ml程度まで留去してからCEM基及びDMTr基を残した状態でRPHPLCにより分析した。目的物と思われるメインピークを分取精製し、滅菌水で凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩した後、05ニトロメタンを加えた05MTBAF溶液で5時間処理してCEM基を脱保護した。SepPak精製によりTBAFを除去し、凍結乾燥により溶媒を留去した。その後、80酢酸溶液で1時間処理してDMTr基を脱保護した。SepPak精製により脱塩し、RPHPLCにより目的物と思われるメインピークを分取精製し、滅菌水で凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩し、目的物を得た。MALDITOFMASにより同定を行い、目的物であることを確認した。All11U12mer単離収率は12。収率は吸光係数ε260120320を用いて算出MALDITOFMASmzcalcdforC108H131N24O83P11S11378509found378862All11U12mer単離収率は14。収率は吸光係数ε260120320を用いて算出MALDITOFMASmzcalcdforC108H131N24O83P11S11378509found378925例54種類の核酸塩基を含んだAll3を合成した。DMTr定量により平均縮合効率を算出した結果、平均縮合効率はRp体90Sp体93であった。メインピークをRPHPLCにより分取精製した後、TBAFによりCEM基を除去し、MALDITOFMASにより目的物であることを確認した。AllCpsApsGpsU3単離収率1を用いて算出MALDITOFMASSmzcalcdforC114H141N45O71P11S11396829found397075AllUps11Uの製造に比べて単離収率が低下する理由はシチジンモノマーの反応性が低いことにあると推定されたことから、シチジンモノマーを用いる縮合反応を2回繰り返し行うことでAll3を同様に合成したところCpsApsGpsU3単離収率1を用いて算出MALDITOFMASSmzcalcdforC114H141N45O71P11S11396829found396915例6:活性化剤の検討ホスホロチオエートRNAのRNAi医薬としての応用を目指し、核酸自動合成機による大量合成を考えた場合、ダブルカップリングは実用的な方法とはいえず、また得られた縮合効率もRNAオリゴマー合成に不十分であり、さらにシチジンモノマーの反応性を改善しなければなければならない。シチジンモノマーユニットの縮合反応効率を向上させる目的として、縮合反応に用いる活性化剤を検討した。活性化剤の検討は、2水酸基にTBDMS基を導入した先行研究において、高い縮合反応効率を実現している酸アゾール複合体Nフェニルイミダゾリウムトリフレートを活性化剤としてモデル配列AllCpsCpsCpsU4量体を合成することにより行った。求核性の高いPhIMTを活性化剤として4量体を合成した。HPLCプロファイルを図1に示す。4量体を合成後、DMTr定量から算出した平均縮合効率は89と、求核性の小さいCMPTと比較して縮合反応効率が大幅に向上し、オリゴマー合成に十分適応可能な良好な反応性を示した。しかしながら、PhIMTは求核性の高い活性化剤であることから、エピマー化が進行する可能性がある。そこで、次に、PhIMTを活性化剤としてUpsU2量体を合成し、各ジアステレオマーの立体選択性を見積もった。2量体のHPLCプロファイルを図2に示す。PhIMTを活性化剤としてUpsU2量体を合成することにより、縮合反応時の立体選択性を算出した。立体選択性は、RPHPLCにより分析したときの保持時間から、ジアステレオマーを同定して見積もった。その結果、HPLCprofileのArea値から求めた立体選択性は、Rp体では980、Sp体では997であった。CEM基を保護基とした本合成条件においても、良好な立体選択性を発現することがわかった。以上の条件検討から、活性化剤としてPhIMTを用いることにより、縮合反応効率が向上し、良好な立体選択性を発現することがわかった。この結果は、RNAオリゴマー合成に適用するのに十分である考え、次にPhIMTを活性化剤として、4種類の核酸塩基を含んだRNAオリゴマーを合成することにした。例7:PhIMTを活性化剤としたAll312量体の合成縮合反応における活性化剤を検討した結果、求核性の高い活性化剤であるPhIMTを用いると、シチジンモノマーユニットの反応性が大幅に向上し、RNAオリゴマー合成に十分適応可能な縮合効率、立体選択性を発現した。そこで、活性化剤をCMPTからPhIMTに変更して、4種類の核酸塩基を含んだホスホロチオエートRNAオリゴマー合成を行った。PhIMTを活性化剤として、All312量体の固相合成を行った。得られた12量体のHPLCプロファイルを図3に示す。その結果、Rp体、Sp体ともに、シチジン導入工程における縮合反応効率を、10程度向上させることに成功した。次に、目的物と思われるピークをRPHPLCにより分取精製した後、滅菌水で凍結乾燥を3回繰り返した。以上、求核性の高い活性化剤であるPhIMTを用いた場合、シチジンモノマーの反応性が大幅に向上し、非常に良好な縮合効率でホスホロチオエートRNAオリゴマーを立体選択的に合成可能であることが示された。求核性の高いPhIMTを活性化剤とした4種類の核酸塩基を含んだホスホロチオエートRNAのオリゴマー合成では、2水酸基の保護基として立体的に小さいCEM基を用いた場合、立体障害の大きな保護基であるTBDMS基を使用した従来法よりも10程度高い縮合効率が得られた。このように、シチジンモノマーユニットの反応性は、塩基部位の塩基性度だけではなく、2水酸基の立体的な環境により大きく変化することがわかった。ホスホロチオエートRNAオリゴマー合成において十分な縮合反応効率を獲得するには、求核性の高い活性化剤とともに、2水酸基の保護基として立体的に小さなCEM基を用いることが極めて重要であることが示された。例8:ホスホロチオエートRNA12量体の合成から脱保護ホスホロチオエートRNA12量体としてAll312量体を合成した。合成後、DMTr定量から算出した平均縮合収率は、Rp体は94、Sp体は97であった。求核性の高い活性化剤であるPhIMTを用いてRNAオリゴマーの合成を行うことで、良好な平均縮合効率が得られた。濃アンモニアEtOHで4時間処理してオリゴマーを固相担体からの切り出した後、ろ過により固相担体を除去し、再度アンモニア処理をして保護基を脱保護した。その後、反応液の溶媒を2ml程度まで留去してからCEM基及びDMTr基を残した状態でRPHPLCにより分析した。目的物と思われるメインピークを分取精製し、滅菌水で凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩した後、05ニトロメタンを加えた05MTBAF溶液で5時間処理してCEM基を脱保護した。SepPak精製によりTBAFを除去し、凍結乾燥により溶媒を留去した。その後、80酢酸溶液で1時間処理してDMTr基を脱保護した。SepPak精製により脱塩し、RPHPLCにより目的物と思われるメインピークを分取精製し、滅菌水で凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩し、目的物を得た。MALDITOFMASにより同定を行い、目的物であることを確認した。All312mer単離収率は5。収率は吸光係数ε260124000を用いて算出MALDITOFMASmzcalcdforC108H131N24O83P11S11396829found397119All312mer単離収率は10。収率は吸光係数ε260124000を用いて算出MALDITOFMASmzcalcdforC108H131N24O83P11S11396829found397253上記反応における固相合成は以下の工程を繰り返すことにより行なった。3ジクロロ酢酸ジクロルメタン15sx4洗浄及び乾燥縮合515min洗浄及び乾燥キャップ化ナフタレン30s洗浄及び乾燥硫化10min洗浄及び乾燥縮合時間は2量体では5min、4量体のうちUps3Uでは10min、ApsGpsCpsUでは15min、12量体については15minとした。キャップ化は4量体、12量体の合成において行った。各ステップを繰り返すことで鎖長伸長した後、5ODMTr基を残した状態又は除去した状態でアンモニア処理を行った。5ODMTr基の除去は、3DCAジクロルメタン処理により行い、ジクロルメタンにて洗浄した。続いて濃アンモニアエタノールを加え、密栓した後、2量体については3時間、4量体については8時間又は12時間、12量体については48時間アンモニア処理を行なった。2量体、4量体に関しては、アンモニアを留去した後、凍結乾燥してものに滅菌水を加え、ろ過をしてRPHPLCにより分析した。12量体に関しては、溶液が2ml程度になるまで減圧留去した後、RPHPLCにより分析した。4量体、12量体に関しては、RPHPLCにより分取精製を行い、残渣を滅菌水を用いて凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩を行なった後、4量体に関しては05CH3NO2を加えた05MTBAFDMSO溶液中で4時間室温で撹拌し、12量体に関しては05CH3NO2を加えた05MTBAFDMSO溶液中で5時間室温で撹拌した。01MTEAAbufferを加えて反応を停止し、4量体に関してはRPHPLC、12量体に関してはRPHPLCにより分析した。逆相HPLCにはPEGASILODS5μmcolumn又はμBondasphereC185μmcolumnをカラムとして用いた。溶出条件として条件Aバッファー、30°C、60min、05mLmin条件Bバッファー、30°C、90min、05mLmin条件C、30°C、75min、05mLmin、条件D、30°C、75min、05mLmin及び条件E、30°C、60min、05mLminを用いた。12量体に関しては、SepPaktC18を用い80アセトニトリル水溶液で溶出することで脱塩を行なった。得られた12量体を含む溶液を凍結乾燥した後、80酢酸溶液中で1時間室温で撹拌した。2MTEAAバッファーを加えて反応を停止し、SepPaktC18を用い40アセトニトリル水溶液で溶出することで脱塩を行なった。得られた溶液のアセトニトリルを減圧留去した後、RPHPLCにより分析した。12量体をRPHPLCにより分取精製し、滅菌水で凍結乾燥を三回繰り返し脱塩した後、目的とするRNAオリゴマーを得た。得られたRNAオリゴマーは、MALDITOFMASSにより目的物を同定した。例9CEM基の脱保護条件を検討した。CEM基はTBAFにより選択的に除去されるが、TBAFによる脱保護反応の際にホスホロチオエートの脱硫が数観測される場合がある。この理由は、不斉補助基の残渣が触媒として働き、脱硫反応を促進していることにあると考えられる。RPHPLCにより分取精製を行うことで、脱硫を大幅に抑制可能であることから、4量体を分取精製した後に脱保護反応に付した。文献記載の方法に従って05MTBAFで処理することによりCEM基を脱保護した。その際、脱CEM化反応の際の副生成物であるアクリロニトリルが核酸塩基部位に付加するのを抑制するためにニトロメタンを05添加した。脱保護反応後にRPHPLCにより分析を行ったところ、脱保護反応は定量的に進行しており、核酸塩基部位の修飾や脱硫などの副反応は認められなかった。例10:ホスホロチオエートRNAの酵素耐性nP1による酵素分解については、単離精製した312量体、nP1、50mMCH3COONa、1mMZnCl2を含む水溶液を16h、37°Cで恒温放置した。01MTEAAバッファーを加えた後、1分間、100°Cで恒温放置して酵素を失活させた。残渣をろ過した後、RPHPLCにより分析した。SVPDEによる酵素分解については、単離精製した312量体、SVPDE、100mMTrisHCl、15mMMgCl2を含む水溶液を16時間、37°Cで恒温放置した。01MTEAAバッファーを加えた後、1分間、100°Cで恒温放置して酵素を失活させた。残渣をろ過した後、RPHPLCにより分析した。SnakevenomホスホジエステラーゼはSigmaより、ヌクレアーゼP1はYamasaより購入したものを用いた。合成した各ホスホロチオエートRNA12量体の酵素耐性を確認することにより、リン原子の絶対立体配置を決定した。酵素は、3exoヌクレアーゼであるSVPDEとendoヌクレアーゼであるnP1の2種類を立体決定に使用した。SVPDEはRp体のホスホロチオエートジエステル結合を、nP1はSp体を選択的に加水分解する酵素として知られている。各オリゴマーは、上記の実験方法に示すように、37°C、16時間、恒温放置して酵素反応させた。その後、酵素を失活させてから、RPHPLCにより分析した。その結果、All11U12量体及びAll312量体では、SVPDEによりオリゴマーが全て酵素分解され、またAll11U12量体及びAll312量体では、nP1によりオリゴマーが全て酵素分解された。結果を図4に示す。この結果から、合成したRNAオリゴマーの絶対立体配置がそれぞれRp体、Sp体であることが示された。例11:四種類の核酸塩基を含んだホスホロチオエートRNAの二重鎖融解温度Tmの解析r3r3二重鎖融解温度の測定方法単離精製したAll3又はAll3又はstereorandom3又は3と3各々045nmolを、10mMリン酸、100mMNaCl、及び01mMEDTAを含む水溶液に溶かした。オリゴマー溶液を減圧下、10分間脱気したのち8連セルに165μl加え、室温から5°C分の速度で90°Cまで上昇させた後、90°Cの状態を10分間保持し、2°C分の速度で0°Cになるまで温度を下降させ、アニーリングを行なった。オリゴマー溶液を0°Cで90分間静置した後、窒素気流下、05°C分の速度で90°Cまで温度を上昇させながら、05°C間隔で260nmにおける吸光度を測定した。本合成法により合成したAll312量体が、相補的配列をもつ天然型RNA12量体の間で形成する二重鎖の融解温度Tmを測定した。リン原子の絶対立体配置が、二重鎖形成能に与える影響について詳細に解析するため、天然型RNA12量体とリン原子の立体が制御されていない立体制御されていない3RNA12量体についても、二重鎖形成能を評価した。二重鎖融解温度は、より生理条件に近い10mMリン酸バッファー、100mMNaClの緩衝液で測定した。結果を図5及び表9に示す。All312量体が形成する二重鎖のTm値は、6538°Cであり、天然型RNAが形成する二重鎖よりも37°C高く、4種類の核酸塩基を含んだRp体は天然型RNAよりも安定な二重鎖を形成することがわかった。一方、All312量体が形成する二重鎖のTm値は、5094°Cと天然型RNAが形成する二重鎖よりも1071°C低く、不安定化することがわかった。また、立体制御していないホスホロチオエートRNAの二重鎖のTm値は、5748°Cとなり、天然型RNAよりも若干ながら不安定ではあるが、Rp体とSp体のちょうど中間の二重鎖形成能をもった。以上、各絶対立体配置間のホスホロチオエートRNAの二重鎖形成能をまとめると以下のようになる。二重鎖安定性AllPSRNA天然型RNAランダムPSRNAAllPSRNA例12:核酸自動固相合成機によるホスホロチオエートRNA12量体の合成オキサザホスホリジンモノマーユニットを用いて、立体制御されたホスホロチオエートRNAオリゴマーの合成を自動固相合成機で行った。立体選択的に合成されたホスホロチオエートRNAのRNAi医薬への応用を踏まえると、簡便で再現性の高い自動固相合成機によりRNAオリゴマーを大量合成することを可能とする工程を確立することが非常に重要である。そこで、以前に手動固相合成で検討した4種類の核酸塩基を含んだホスホロチオエートRNA12量体の合成を自動固相合成機により行った。自動固相合成機は、AppliedBiosystems社製のExpedite8909NucleicAcidSynthesisSystemを使用した。自動固相合成では、サクシニルリンカーを介してHCPに担持させた5Ouridineを用いた。縮合時間は、15分とした。各ステップを繰り返すことで鎖長伸長した。続いて、DMTr基を残した状態でカラムに濃アンモニアEtOHを加え、4h、25°Cで固相担体から切り出した後、15mlファルコンチューブに濃アンモニアEtOHで洗浄しながら移し、44時間、25°Cで恒温放置した。続いて、アンモニアを溶液が2ml程度になるまで溶媒留去した後、RPHPLCにより分析した。その結果、目的物がメインピークで得られ、自動固相合成機においても問題なく各ステップにおいて良好な縮合効率で縮合反応が進行することがわかった。その後、RPHPLCにより分取精製を行い、残渣を滅菌水を用いて凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩を行なった。得られた12量体のHPLCプロファイルを図6に示す。