"明細書に記載の発明。複合化血清群Cのオリゴ糖は、ヒトへの使用が承認されている[例えば、MenjugateTM、参考文献6]。しかし、血清群A、血清群W135および血清群Yに対する複合ワクチンならびにその製造における改善の要求が存在し続ける。この要求は、参考文献8に開示される産物、方法および使用によって対処されるが、さらなる改変および改良の余地が、特に送達ならびに処方に関して存在し続ける。発明の開示本発明は、免疫原性組成物を提供し、この組成物は、aN.meningitidisの血清群Cに由来する莢膜サッカリド抗原、およびbキトサンアジュバントを含む。この組成物は好ましくは、c一以上のさらなる抗原および/またはd一以上のさらなるアジュバントを含む。本発明はまた、粘膜送達のための免疫原性組成物を提供し、この組成物は、N.meningitidisの血清群A、血清群C、血清群W135および血清群Yのうちの少なくとも二つに由来する莢膜サッカリドを含む。好ましくは、本発明の組成物におけるこの莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に複合体化され、および/またはオリゴ糖である。複合体化オリゴ糖抗原図1が特に好ましい。血清群Cの髄膜炎菌に由来する莢膜サッカリド抗原N.meningitidisの血清群Cの莢膜サッカリドは、抗原として広範に用いられている。例えば、MenjugateTMの活性構成要素は、CRM197キャリアタンパク質に結合された莢膜多糖類のオリゴ糖フラグメントである。本発明の組成物は、N.meningitidisの血清群Cに由来する莢膜サッカリド抗原を含むため、莢膜多糖類のオリゴ糖フラグメントの使用および/またはキャリアタンパク質へのサッカリド抗原の結合が好ましい。特に好ましいMenCサッカリド抗原は、参考文献6および参考文献9に開示される。オリゴ糖生成および結合のさらなる詳細は、以下に提供される。サッカリド混合物本発明の組成物は、N.meningitidisの血清群A、血清群C、血清群W135および血清群Yのうちの少なくとも二つすなわち2、3または4に由来する莢膜サッカリドを含み得る。N.meningitidisの一よりも多い血清群に由来するサッカリドの混合物が好ましく、例えば、血清群AC、血清群AW135、血清群AY、血清群CW135、血清群CY、血清群W135Y、血清群ACW135、血清群ACY、血清群CW135Y、血清群ACW135Yなど由来のサッカリドを含む組成物が好ましい。好ましくは、個々のサッカリド抗原の保護効力は、これらを組み合わせることによって取り除かれないが、実際の免疫原性例えば、ELISA力価は減少され得る。好ましい組成物は、血清群Cおよび血清群Yに由来するサッカリドを含む。他の好ましい組成物は、血清群C、血清群W135および血清群Yに由来するサッカリドを含む。混合物が、血清群Aおよび血清群Cの両方に由来する莢膜サッカリドを含む場合、MenAサッカリド:MenCサッカリドの比率w/wは、1よりも大きくあり得る例えば、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1またはこれ以上。混合物が、血清群Yならびに血清群Cおよび血清群W135のうちの一つまたは両方に由来する莢膜サッカリドを含む場合、MenYサッカリド:MenW135サッカリドの比率w/wは、1よりも大きくあり得例えば、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1またはこれ以上および/またはMenYサッカリド:MenCサッカリドの比率w/wは、1よりも小さくあり得る例えば、1:2、1:3、1:4、1:5またはこれよりも小さい。血清群A:血清群C:血清群W135:血清群Yに由来するサッカリドについての好ましい比率w/wは、1:1:1:1;1:1:1:2;2:1:1:1;4:2:1:1;8:4:2:1;4:2:1:2;8:4:1:2;4:2:2:1;2:2:1:1;4:4:2:1;2:2:1:2;4:4:1:2;および2:2:2:1である。莢膜多糖類の精製髄膜炎菌の莢膜多糖類は代表的に、多糖類の沈降例えば、カチオン性界面活性剤を用いる、エタノール分画、冷フェノール抽出タンパク質を除去するためおよび超遠心分離LPSを除去するための工程を包含する方法によって調製される[例えば、参考文献10]。しかし、より好ましい方法[8]は、多糖類の沈降、続いて低級アルコールを用いて沈殿した多糖類を可溶化する工程を包含する。沈降は、例えばテトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩例えば、臭化物塩またはヘキサジメチレンhexadimethrine臭化物ならびにミリスチルトリメチルアンモニウム塩のようなカチオン性界面活性剤を用いて達成され得る。セチルトリメチルアンモニウム臭化物CTABは、特に好ましい[11]。沈殿物質の可溶化は、メタノール、プロパン-1-オール、プロパン-2-オール、ブタン-1-オール、ブタン-2-オール、2-メチル-プロパン-1-オール、2-メチル-プロパン-2-オール、ジオールなどのような低級アルコールを用いて達成され得るが、エタノールは特に、CTAB-多糖類の複合体を可溶化するのに適している。エタノールは好ましくは、沈殿した多糖類に添加され、50と95との間の最終エタノール濃度エタノールと水との総含有量に基づくを提供する。再可溶化の後、多糖類をさらに処理し混入物を除去し得る。これは、たとえささいな混入物であっても容認できない状況例えば、ヒトのワクチン産生のためにおいて特に重要である。これは代表的に、濾過例えば、深層濾過、活性炭を通す濾過が用いられ得る、サイズ濾過および/または限外濾過の一以上の工程を包含する。混合物を除去するために一度濾過されると、この多糖類は、さらに処理および/または加工するために沈殿され得る。これは、カチオンを交換することによって容易に達成され得る例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩を添加することによって。多糖類は、化学的に改変され得る。例えば、改変され一以上のヒドロキシル基が保護基と置換され得る。これは特に血清群Aに有用である[12]。オリゴ糖莢膜サッカリドは一般に、オリゴ糖の形態である。これらは精製された莢膜多糖類の分解によって例えば、加水分解、マイルドな酸または加熱によって都合よく形成され、通常その後所望される大きさのフラグメントを精製する。多糖類の分解は好ましくは、30未満例えば、10と20との間、好ましくは血清群Aについておよそ10;血清群W135および血清群Yについて15と25との間、好ましくはおよそ15~20;血清群Cについて12と22との間などのオリゴ糖の最終の平均の重合度DPを提供するように実施される。DPは、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色分析アッセイ[13]によって都合よく測定され得る。加水分解が実施された場合、加水分解物は一般に短い長さのオリゴ糖を除去するための大きさにされる。これは、イオン交換クロマトグラフィーが続く限外濾過のような種々の方法で達成され得る。約6以下の重合度を有するオリゴ糖は好ましくは、血清群Aについて除去され、そしておよそ4未満のものは好ましくは、血清群W135および血清群Yについて除去される。共有結合本発明の組成物中の莢膜サッカリドは普通キャリアタンパク質に結合される。一般に結合体は、サッカリドをT-非依存性抗原からT-依存性抗原へ変換するので、サッカリドの免疫原性を高め、従って免疫記憶のプライミングを可能とする。結合体化は特に小児科のワクチンのために有用であり[例えば、参考文献14]かつ周知の技術ある[例えば、参考文献15~23などに概説される]。好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリアまたは破傷風類毒素のような細菌性毒素または類毒素である。CRM197ジフテリア類毒素[24、25、26]が特に好ましい。他の好ましいキャリアタンパク質としては、N.meningitidisの外膜タンパク質[27]、合成ペプチド[28、29]、ヒートショックタンパク質[30、31]、百日咳タンパク質[32、33]、サイトカイン[34]、リンホカイン[34]、ホルモン[34]、成長因子[34]、種々の病原体由来抗原に由来する多数のヒトCD4T細胞エピトープを含む人工タンパク質[35]、H.influenzaeに由来するタンパク質D[36]、C.difficileに由来する毒素AまたはB[37]などが挙げられる。本発明の組成物内において、一より多いキャリアタンパク質を使用することが可能である。従って、異なるキャリアタンパク質が、異なる血清群のために使用され得る例えば、血清群Aのサッカリドは、CRM197に結合され得る一方、血清群Cのサッカリドは、破傷風類毒素に対して結合され得る。また特定のサッカリド抗原のために一以上のキャリアタンパク質が使用され得る例えば、血清群Aサッカリドは、二つの群にあり得、いくつかはCRM197に結合され、他は破傷風類毒素に対して結合される。しかし、一般に全てのサッカリドについて同一のキャリアタンパク質を使用することが好ましい。単一のキャリアタンパク質は、一より多いサッカリド抗原を保有し得る[38]。例えば、単一のキャリアタンパク質は、血清群Aおよび血清群Cに由来するサッカリドに対して結合されている。0.5:1すなわち、過剰のタンパク質と5:1すなわち過剰のサッカリドとの間のサッカリドを有する結合体:タンパク質の比率w/wが好ましく、1:1.25と1:2.5との間の比率を有するものがより好ましい。結合体は、キャリアタンパク質を有さない結合体に使用され得る[39]。任意の適切な結合反応が使用され得、必要な場合、任意の適切なリンカーを用いて使用され得る。サッカリドは代表的に、結合前に活性化または機能化される。活性化は例えば、CDAPのようなシアン化試薬例えば、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸塩[40、41など]を含み得る。他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボレンnorborane、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、S-NHS、EDC、TSTUを使用する。参考文献21の序論をまた参照のことリンカー基を介する結合は、任意の公知の方法、例えば、参考文献42および参考文献43に記載される手順を用いてなされ得える。結合の一つの型は、多糖類の還元性のアミノ化、アジピン酸リンカー基の一末端とのアミノ基を生じる結合、および次いでアジピン酸リンカー基のもう一方の末端へのタンパク質の結合を含む[19、44、45]。他のリンカーとしては、B-プロピオンアミド[46]、ニトロフェニル-エチルアミン[47]、ハロアシルハロゲン化物[48]、グルコシド結合[49]、6-アミノカプロン酸[50]、ADH[51]、C4~C12部分[52]などが挙げられる。選択的にリンカーを使用する場合、直接的な結合が使用され得る。タンパク質に対する直接的な結合は、例えば、参考文献53および54に記載されるような、タンパク質の還元性のアミノ化が続く多糖類の酸化を含み得る。アジピンジエステル例えば、アジピン酸N-ヒドロキシスクシンイミドドジエステルを用いた誘導体化およびキャリアタンパク質との反応が続く、サッカリドへのアミノ基の導入を包含するプロセス例えば、末端の=O基を-NH2と置換することによるが、好ましい。結合の後、遊離サッカリドおよび結合体化サッカリドが、分離され得る。疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、ダイアフィルトレーションなどを含む多数の適切な方法が存在する[参考文献55および参考文献56などをまた参照のこと]。本発明の組成物が、結合体化オリゴ糖を含む場合、オリゴ糖の調製は、結合よりも前に行われることが好ましい。本発明の組成物の調製本発明の組成物が、一より多い型の莢膜サッカリドを含む場合、これらは別々に調製されることが好ましく任意の分解、結合などを含む、次いで混合され本発明の組成物を提供する。しかし、この組成物が、血清群Aに由来する莢膜サッカリドを含む場合、血清群Aのサッカリドは、加水分解の可能性を最小化するために、使用直前まで他のサッカリドと混合されないことが好ましい。これは、凍結乾燥された形態の血清群Aの構成要素および液状形態の他の血清群の構成要素とを有することによって容易に達成され得、使用の準備が整った場合、液状構成要素が使用され凍結乾燥された構成要素を再編成する。このように本発明の組成物は、キットから調製され得、このキットは、a凍結乾燥された形態のN.meningitidisの血清群Aに由来する莢膜サッカリド、ならびにb液状形態の、N.meningitidisの血清群C、血清群W135および血清群Yのうちの一以上例えば、1、2、3に由来する莢膜サッカリドを備える。本発明はまた、本発明の組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、N.meningitidisの血清群Aに由来する凍結乾燥された莢膜サッカリドとN.meningitidisの血清群C、血清群W135および血清群Yのうちの一以上例えば、1、2、3に由来する莢膜サッカリドとを混合する工程を包含し、この一以上のサッカリドは、液状形態である。本発明はまた、本発明の組成物を提供し、この組成物は、N.meningitidisの血清群C、血清群W135および血清群Yに由来する莢膜サッカリドを含み、このサッカリドは、液状形態である。この組成物は、再編成のために凍結乾燥された血清群Aのサッカリド抗原と共にパッケージングされ得るか、または例えば、血清群Aに対する免疫化は、所望されない場合そのままで組成物として使用され得る。本発明の組成物の調製本発明の組成物は、種々の方法で提示されかつパッケージングされ得る。組成物が、注射用である場合、これらは、バイアル中に提示され得るか、またはシリンジに予め充填されて提示され得る。このシリンジは、針を伴って供給されても、針を伴わずに供給されても良い。シリンジは、組成物の単一用量を含み、ここでバイアルは、単一用量または複数回の用量を含み得る。注射用の組成物は一般に、溶液または懸濁液である。あるいは、注射前に液状ビヒクル中に溶解または懸濁するための固体形態で提示され得る。本発明の組成物が、使用の前に即座に調製され例えば、血清群Aのサッカリドが、凍結乾燥された形態で提示される、そしてキットとして提示される場合、このキットは、二つのバイアルを含み得、または一つは予め充填されたシリンジおよび一つのバイアルとを含み得、そのシリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化させるために使用される。しかし、好ましい組成物は、粘膜送達用である。種々の粘膜送達の選択肢が利用可能であり、既に大量に生産されている比較的単純なデバイスを用いて容易なアクセスを提供するので鼻腔内経路が、最も実用的である。このように本発明の組成物は好ましくは、鼻内噴霧、点鼻薬、ゲルまたは散剤のような鼻腔内投与のために適合され、そして/またはパッケージングされる[例えば、参考文献57および参考文献58]。この組成物の粘膜送達のための選択的な経路は、経口、胃内、肺内、腸内、経皮、直腸、眼内および膣内の経路である。このように本発明の組成物は、粘膜投与に対して適合されそして/またはパッケージングされ得る[例えば、参考文献59、参考文献60および参考文献61を参照のこと]。この組成物が、経口投与用である場合、例えば、錠剤またはカプセル必要に応じて腸溶性コートされる、液体、遺伝子組換え植物の物質、点滴薬、吸入器、エアロゾル、腸溶性コート、坐薬、膣坐薬などの形態であり得る[また参考文献62および参考文献73の17章を参照のこと]。どのような送達経路であれ、本発明の組成物は好ましくは、単位用量形態にパッケージングされる。効果的な用量は、慣用的に確立され得る。注射または鼻腔内用途のための組成物の代表的なヒト用量は、0.1ml~0.5mlとの間の容量を有する例えば、一つの鼻孔あたり100μlづつ2回のスプレーする。各用量内において、個々のサッカリド抗原の量は一般に、1μg~50μgの間でありサッカリドの質量として測定される、それぞれ約10μgが好ましい。本発明の組成物は、好ましくは無菌である。この組成物は好ましくは、発熱物質なしである。この組成物は好ましくは、例えば、pH6とpH8との間に緩衝され、一般的に約pH7である。組成物が、水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を用いることが好ましい[63]。アジュバントこの組成物は一般に、一以上のアジュバントを含む。このアジュバントは、混合され本発明の組成物を形成する前および/または後にサッカリドに添加され得るが、異なるサッカリドと混合する前にサッカリド抗原とアジュバントとを混合することが好ましい。しかし、各サッカリドが、このような混合の前にアジュバント化されなければならないという必要はない。さらなる非アジュバント化サッカリド抗原が添加される場合、過剰なアジュバントは、一つのサッカリド調製物に含まれ得、その結果この過剰量は所望される終濃度まで希釈される。一つの特定の実施形態において、本発明の組成物が、凍結乾燥された抗原例えば、凍結乾燥された血清群Aの構成要素から調製される場合、これは凍結乾燥された物質中にアジュバントを含まないことが好ましくあり得る。粘膜送達のために、粘膜アジュバントを用いることが好ましい。粘膜アジュバントとしては、AE.coli熱不安定性エンテロトキシンLT、もしくはその解毒化変異体[例えば、参考文献64の5章];Bコレラ毒素CT、もしくはその解毒化変異体[例えば、参考文献64の5章];またはC生体分解可能かつ無毒性の物質例えば、ポリα-ヒドロキシ酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、多無水物、ポリカプロラクトンなどポリラクチド-コ-グリコリドなどのようなから形成される微粒子すなわち直径約100nm~約150nmの粒子、より好ましくは直径約200nm~約30μm、および最も好ましくは直径約500nm~約10μmであり、必要に応じて負電荷を帯びた表面例えば、SDSを有するもしくは正電荷を帯びた表面例えば、CTABのようなカチオン性界面活性剤を有するを有するように処理される;Dポリオキシエチレンエーテルもしくはポリオキシエチレンエステル[65];Eオクトキシノール[66]もしくはポリオキシエチレンアルキルエーテルとの組合せにおけるポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤またはオクトキシノール[67]のような少なくとも一つのさらなる非イオン性界面活性剤との組合せにおけるエステル界面活性剤;Fキトサン[例えば、68];G免疫賦活性のオリゴヌクレオチド例えば、CpGオリゴヌクレオチドおよびサポニン[69];Hリポソーム[参考文献73の13章および14章];Iアミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体例えば、RC-529のようなモノホスホリル脂質A模倣物[70];JポリホスファゼンpolyphosphazenePCPP;Kエステル化ヒアルロン酸微粒子[72]のような生体接着剤71もしくはポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体からなる群より選択された粘膜付着性物質が挙げられるが、これらに限定されない。他の粘膜アジュバントはまた、利用され得る[例えば、参考文献73の7章を参照のこと]。上に提供される粘膜アジュバントに加えて、本発明の組成物は、以下の群:A水酸化アルミニウムオキシ水酸化物を含むのようなアルミニウム塩ミョウバン、リン酸アルミニウムヒドロキシホスフェートhydroxyphosphateを含む、硫酸アルミニウムなど[参考文献73の8章および9章];B油中水エマルジョン処方物ムラミルペプチド[ムラミルペプチドとしては、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミンthr-MDP、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミンノル-MDP、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ-エチルアミンMTP-PEなどを含む]または細菌の細胞壁の構成要素のような他の特定の免疫賦活性因子を伴うかまたは伴わない、例えば、aMF59TM[参考文献73;74、75の10章]であって、5スクアレン、0.5Tween80、および0.5Span85を含有し必要に応じてMTP-PEを含有する、マイクロフリューダイザーを用いて1ミクロン未満の粒子へ処方される、bSAFであって、10スクアレン、0.4Tween80、5プロニックpluronicブロックポリマーL121、およびthr-MDPを含み、1ミクロン未満のエマルジョンへマイクロ流動化されるかまたはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生じるためにボルテックスされる、ならびにcRibiTMアジュバント系RASRibiImmunochem,Hamilton,MTであって、2スクアレン、0.2Tween80、およびモノホスホリピドAMPL、トレハロースジミコレートTDM、および細胞壁骨格CWS、好ましくはMPLCWSDetoxTMからなる群に由来する一以上の細菌性の細胞壁の構成要素を含有する;CQS21またはStimulonTMCambridgeBioscience,Worcester,MAのようなサポニンアジュバント[参考文献73の22章]であって、単純な形態またはISCOM免疫賦活性複合体;参考文献73の23章のようにそこから生じた粒子の形態のいずれかであり、このISCOMは、さらなる界面活性剤を欠いたものであり得る例えば、参考文献76;D完全フロイントアジュバントCFAおよび不完全フロイントアジュバントIFA;Eインターロイキン例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[77]など、インターフェロン例えば、γインターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF、腫瘍壊死因子TNFなどのようなサイトカイン、Fモノホスホリル脂質AMPLまたは3-O-脱アシル化MPL3dMPL例えば、参考文献78および79であって、肺炎球菌のサッカリド例えば、参考文献80と一緒に用いる場合、必要に応じてミョウバンを実質的に含まない;G3dMPLと、例えば、QS21および/または油中水エマルジョン例えば、参考文献81、参考文献82および参考文献83との組合せ;HCpGモチーフすなわち、少なくとも一つのCGジヌクレオチドを含有するを含むオリゴヌクレオチドであって、必要に応じてシトシンの代わりに5-メチルシトシンが用いられる;I免疫賦活剤および金属塩の粒子例えば、参考文献84;Jサポニンおよび油中水エマルジョン例えば、参考文献85;Kサポニン例えば、QS213dMPLIL-12必要に応じて、ステロール例えば、参考文献86;L二本鎖RNA;M組成物の効果を増強するために免疫腑活性因子として作用する他の物質[例えば、参考文献73の7章]から選択される一以上のさらなるアジュバントを含有し得る。リン酸アルミニウムが使用される場合、一以上のサッカリドをこのアルミニウム塩へ吸着することが可能であるが、そのように吸着しないことが好ましく、そして溶液中にリン酸イオン例えば、リン酸緩衝液の使用によるを含まないことによって有利に働く。水酸化アルミニウムが用いられる場合、サッカリドをこの塩に吸着させることが好ましい。アジュバントとしての水酸化アルミニウムの使用は、血清群Aに由来するサッカリドについて好ましくあり得る。好ましい粘膜アジュバントは、キトサントリメチルキトサンを含むおよび細菌毒素特にLTの解毒された変異物である。これらは、単独で使用され得るか、または同時投与が、用いられる毒素の用量を減少させ、それによって安全性を改善するように、有利に組み合わせて用いられ得る。さらに、キトサン単独が、Th2に偏向される反応を生じさせるのに対して、LTK63の添加は、Th1に偏向される反応に対する変化を引き起こし得る。キトサンキトサンは、アジュバントとしての用途が公知であり[例えば、参考文献87~参考文献98]、特に粘膜例えば、鼻腔内用途について公知である。キトサン図11は、外骨格exoskeletalポリマーのキトサンのN-脱アセチル化誘導体であるが図12、N-脱アセチル化はほとんど完了しない。脱アセチル化とは、キトサンと異なり、キトサンが、希釈した酢酸水溶液およびギ酸水溶液中に可溶であることを意味する。キトサンはまた、ワクチンのない製薬分野において広範な適用性が見出されている[99]。キトサンのグルコサミドモノマーの反復は、アミン基を含む。この基は、遊離アミン-NH2またはポリマーの溶解性に影響するプロトン化を伴ったカチオン性アミン-NH3として存在し得る。アミン基は、化学的に活性でありかつ置換され得る。本発明の特定の目的について、このアミン基は、一以上のアルキル基A例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルなどで置換され得、例えば、-NHA、-NH2A、-NA1A2、-NHA1A2、-NA1A2A3である。好ましい誘導体は、トリ-アルキル化であり、そして特に好ましい誘導体は、トリメチル化であるすなわち、トリメチルキトサン、またはTMC-図13。これらの誘導体は、より広いpHの範囲にわたって非改変のキトサンよりもより高い水溶性を有する。キトサンポリマー中の全てのアミンが、この様に置換される必要は無い。キトサン鎖の長さに従った置換の程度は、1H-NMRによって決定され得、反応工程の数および時間によって制御され得る[100]。少なくとも10例えば、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、95またはこれ以上のモノマーが、置換アミンを有することが好ましい。キトサン中の100のモノマーが、アルキル化アミンを保有することが稀であることの2つの主な理由が存在する。第一に、置換反応は、通常100の効率ではない。第二に、100のモノマー単位がアミン基を保有しているキトサンを見出すことは稀であり、それはキトサンの脱アセチル化が通常100の効率ではないためである。従って本発明に用いられるアルキル化キトサン誘導体は、いくつかのモノマー単位にアミド基および/または非アルキル化基を有し、そしてキトサンは、いくつかのアミド基を保有し得る。本発明と共に用いられるキトサンおよび誘導体は好ましくは、少なくとも75脱アセチル化されている。キトサンは、種々の分子量があり、例えば、分子量およそ5,000~10,000を有するオリゴ糖から高分子量例えば、600,000~1,000,000のポリマーがある。カチオン性キトサンまたは誘導体が使用される場合、塩、例えば塩化物または乳酸塩の形態である。キトサンまたは誘導体は、種々の物理学的な形態、例えば、溶液中粉末として、または粒子形態を取り得る。粒子形態微粒子を含むは、好ましく、交差結合または非交差結合されていなくてもよく、かつ噴霧乾燥によって好都合に形成され得る[101、102]。他の物理学的な形態としては、ゲル、ビーズ、フィルム、スポンジ、ファイバー、エマルジョンなどが挙げられる。本発明の組成物、プロセス、方法および使用をいうために用いられた場合、用語キトサンは、キトサンのこれら全ての形態ならびに誘導体を含む。解毒化された変異毒素NADから標的タンパク質へのADP-リボース単位の移動を触媒するADP-リボシル化細菌性外毒素は、広く知られている。例としては、ジフテリア毒素Corynebacteriumdiphtheriae、外毒素APseudomonasaeruginosa、コレラ毒素CT;Vibriocholerae、熱不安定性エンテロトキシンLT;E.coliおよび百日咳毒素PTが挙げられる。さらなる例は、参考文献103および参考文献104にある。この毒素は代表的に、機能的に異なるドメイン-AおよびBの二つに分けられる。Aサブユニットは、毒素の酵素活性を担い、一方Bサブユニットは、細胞性結合を担う。このサブユニットは、同一のポリペプチド鎖上のドメインであり得るか、または別々のポリペプチド鎖であり得る。このサブユニットは、それ自体がオリゴマーであり得、例えば、CTのAサブユニットは、A1およびA2から構成され、これらはジスルフィド結合によって結合され、そしてそのBサブユニットは、ホモペンタマーである。代表的に、標的細胞との最初の接触は、Bサブユニットによって媒介され、次いでサブユニットAのみが、細胞へ入る。この毒素は代表的に、免疫原性であるが、ワクチンにこれらを含めることは、それらの毒性によって阻害される。免疫原性までも除去されることなく毒性を除去するために、この毒素は、グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドのような化学薬品を用いて処理されている。さらに合理的なアプローチは、重要な活性部位の残基の部位特異的変異誘発に依存して、免疫原性を保持しながら毒素の酵素活性を除去する[例えば、参考文献105CTおよびLT、106PT、64など]。現在の無細胞性の百日咳ワクチンは、二つのアミノ酸置換Arg9→LysおよびGlu129→Gly;PT-9K/129G[107]を伴う百日咳毒素の形態を含む。これらの免疫原性の特性と同様に、この毒素は、アジュバントとして用いられている。非経口的なアジュバント活性は初めに1972年[108]に観察され、そして粘膜アジュバント活性は、1984[109]に観察された。驚くべきことに、この毒素の解毒化形態は、アジュバント活性を保持していることが1993年に見出された[110]。本発明の組成物は、解毒化されたADP-リボシル化毒素を含む。この毒素は、ジフテリア毒素、Pseudomonas外毒素Aまたは百日咳毒素であり得るが、好ましくはコレラ毒素CTまたはより好ましくはE.coli熱不安定性エンテロトキシンLTである。用いられ得る他の毒素は、参考文献104その中で配列番号1~7、およびその変異体に開示されるものである。免疫原性および/またはアジュバント活性を損なうことのないこれら毒素の解毒化は、任意の適切な方法によって達成され得、変異誘発が好ましい。変異誘発は、一以上の置換、欠失、および/または挿入を含み得る。好ましい解毒化変異は、Arg-7残基での変異例えば、Lys置換を有するLT;Arg-7残基での変異例えば、Lys置換を有するCT;Arg-11残基での変異例えば、Lys置換を有するCT;Val-53での変異を有するLT;Val-53での変異を有するCT;Ser-61残基での変異例えば、Phe置換を有するCT;Ser-63残基での変異例えば、LysまたはTyr置換を有するLT[例えば、参考文献64~K63の5章;参考文献111-Y63;Ser-63残基での変異例えば、LysまたはTyr置換を有するCT;Ala-72残基での変異例えば、Arg置換を有するLT[112-R72];Val-97での変異を有するLT;Val-97での変異を有するCT;Tyr-104での変異を有するLT;Tyr-104での変異を有するCT;Pro-106残基での変異例えば、Ser置換を有するLT;Pro-106残基での変異例えば、Ser置換を有するCT;Glu-112での変異例えば、Lys置換を有するLT;Glu-112での変異例えば、Lys置換を有するCT;Arg-192残基での変異例えば、Gly置換を有するLT;Arg-9残基での変異例えば、Lys置換を有するPT;Glu-129での変異例えば、Gly置換を有するPT;および参考文献105に開示されるいずれかの変異体である。これら変異は、例えば、PTまたはLTにおけるArg-9-LysGlu-129-GlyとD53およびK63変異の両方との組合せなどであり得る。63残基または72残基での変異を有するLTは、好ましい解毒化された毒素である。LT-K63およびLT-R72の毒素が特に好ましい[113]。これら残基の番号付けは、原型の配列に基づくことが理解され、例えば、Ser-63は実際には、所定のLT改変体の第63番目のアミノ酸でなくても良いが、アミノ酸配列のアライメントは、Ser-63に対応する位置を示すことが理解される。解毒化された毒素は、アジュバント活性に適するようにAサブユニットおよび/またはBサブユニットの形態であり得る。組成物のさらなる構成要素髄膜炎菌性のサッカリド抗原に加えて、本発明の組成物は、髄膜炎菌性のタンパク質抗原を含み得る。N.meningitidisの血清群B[例えば、参考文献114~119など]またはOMV調製物[例えば、参考文献120~123など]に由来するタンパク質を含むことが好ましい。非髄膜炎菌性抗原および非ナイセリア抗原好ましくは髄膜炎菌性の構成要素に対する免疫反応を減少させないものもまた、含まれ得る。例えば、参考文献124は、N.meningitidisの血清群Bおよび血清群Cに由来するオリゴ糖と一緒にHibサッカリドとの組合せを開示する。肺炎球菌、A型肝炎ウィルス、B型肝炎ウィルス、B.pertussis、ジフテリア、破傷風、Helicobacterpylori、ポリオおよび/またはH.influenzaeが好ましい。特に好ましくは、非ナイセリア抗原は、以下:-CagA[125~128]、VacA[129、130]、NAP[131、132、133]、HopX[例えば、134]、HopY[例えば、134]および/またはウレアーゼのようなHelicobacterpyloriに由来する抗原-Streptococcuspneumoniaeに由来するサッカリドまたはタンパク質抗原[例えば、135、136、137]-不活化ウィルスのようなA型肝炎ウィルスに由来する抗原[例えば、138、139]-表面抗原および/またはコア抗原のようなB型肝炎ウィルスに由来する抗原であって[例えば、139、140]、好ましくは表面抗原はリン酸アルミニウムへ吸着される[141]-HaemophilusinfluenzaeBに由来するサッカリド抗原であって[例えば、9]、好ましくは、リン酸アルミニウムへ吸着されないか、または吸着される[142]-C型肝炎ウィルスに由来する抗原[例えば、143]-N.gonorrhoeaeに由来する抗原[例えば、114~117]-Chlamydiapneumoniaeに由来する抗原[例えば、参考文献144~145、146、147、148、149、150]-Chlamydiatrachomatisに由来する抗原[例えば、151]-Porphyromonasgingivalisに由来する抗原[例えば、152]-IPVのようなポリオ抗原[例えば、153、154]-凍結乾燥された不活化ウィルス[例えば、156、RabAvertTM]のような狂犬病の抗原[例えば、155]-はしか、おたふくかぜおよび/または風疹の抗原[例えば、参考文献1の12章、13章および17章]-赤血球凝集素および/またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原[例えば参考文献1の21章]-Moraxellacatarrhalisに由来する抗原[例えば、157]-StreptococcusagalactiaeB群連鎖球菌に由来する抗原[例えば、158、159]-StreptococcuspyogenesA群連鎖球菌に由来する抗原[例えば、159、160、161]-Staphylococcusaureusに由来する抗原[例えば、162]-呼吸器合胞体ウィルスRSV[163、164]および/またはパラインフルエンザウィルスPIV3[165]のようなパラミクソウィルスに由来する抗原-Bacillusanthracisに由来する抗原[例えば、166、167、168]-黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、テング熱ウィルスの四つの血清型、ダニ媒介性脳炎ウィルス、西ナイルウィルスのようなフラビファミリーフラビウィルス属のウィルスに由来する抗原-古典的なブタの発熱ウィルス、ウシのウィルス性下痢ウィルス、および/またはボーダー病ウィルスに由来するようなペスチウィルス-例えば、パルボウィルスB19に由来するパルボウィルス抗原-破傷風トキソイド[例えば、参考文献1の18章]-B.pertussis、必要に応じてまたパートアクチンpertactinならびに/または凝集原2および凝集原3との組合せに由来する百日咳ホロトキシンPTおよび糸状の赤血球凝集素FHA[例えば、参考文献169および170]-細胞性百日咳抗原を、含む。この混合物は、一以上のこれらのさらなる抗原を含み得、これらは必要な場合には解毒化され得る例えば、化学的手段および/または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒化。ジフテリア抗原が、この混合物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原もまた含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が、含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原もまた含まれることが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むことが好ましい。混合物中の抗原は代表的に、少なくとも各1μg/mlの濃度で存在する。一般に、いずれかの所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫反応を誘発するのに十分である。本発明の組成物と一緒に1髄膜炎菌性サッカリド、2Haemophilusinfluenzaeに対する免疫反応を誘導する抗原、および3Streptococcuspneumoniaeに対する免疫反応を誘導する抗原の三つ全てを含まないことが好ましくあり得る。しかし、これら三つの抗原が同一の組成物中に含まれる場合、この組成物は、アジュバントとしてキトサンのアルキル化誘導体例えば、トリメチルキトサンを含むことが好ましい。混合物中にタンパク質抗原を用いることの代替として、抗原をコードする核酸が用いられ得る。従って混合物のタンパク質の構成要素は、タンパク質をコードする核酸好ましくは、例えばプラスミド形態のDNAによって置換され得る。同様に、本発明の組成物は、サッカリド抗原例えば、ミモトープmimotope[171]または抗イデオタイプ抗体を模倣するタンパク質を含み得る。これらは個々のサッカリド構成要素を置換し得るか、またはこれらを補充し得る。例としては、このワクチンは、サッカリド自体の代わりにMenC[172]莢膜多糖類またはMenA[173]莢膜多糖類のペプチド模倣物peptidemimicを含み得る。本発明の組成物は、界面活性剤例えば、Tween80のようなTweenを低レベル例えば、0.01未満で含み得る。本発明の組成物は、糖アルコール例えば、マンニトールまたはトレハロースを例えば、およそ15mg/mlで含み得る特に、これらが凍結乾燥されている場合、または凍結乾燥された物資から再構成される物質を含む場合。免疫原性本発明の組成物は、免疫原性である。好ましい免疫原性組成物は、ワクチンである。本発明によるワクチンは予防的すなわち、感染を防ぐためまたは治療的すなわち、感染後に疾患を処置するためのいずれかであり得るが、代表的に予防的である。本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、髄膜炎菌のサッカリドに加えて、代表的に薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアは、それ自体が組成物を受容する個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは代表的に大きく、ゆっくりと代謝される高分子であり、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸コポリマー、トレハロース[174]、脂質凝集体例えば、油滴またはリポソームおよび不活化ウィルス粒子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。このワクチンはまた、希釈剤例えば、水、生理食塩水、グリセロールなども含み得る。さらに、補助的な物質保湿剤または乳化剤、pH緩衝物質なども存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細な考察は、参考文献175に利用可能である。ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的有効量のサッカリド抗原、および必要とされる場合、上記のいずれか他の構成要素を含む。免疫学的有効量によって、単一用量または一連の一部としてのいずれかにおいて、個体に対する量が、処置または予防について有効であることを意味する。この量は処置されるべき個体の健康状態および物理的状態、年齢、処置されるべき個体の分類学的な群例えば、ヒトではない霊長類、霊長類など、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、処置する医師による医学的状態の評価ならびに他の関連因子に依存して変化する。この量は、慣用的な試行により決定され得る比較的広い範囲であることが予期される。本発明の組成物の免疫原性は、試験被験体に対してこれらを投与し、12月齢~16月齢の子供、または動物モデル[176]、次いで血清の殺菌性抗体SBAおよび抗莢膜IgGの総結合力および高結合力のELISA力価GMTを含む標準的なパラメーターを決定することによって決定され得る。これらの免疫反応は一般に、組成物の投与後およそ4週間で決定され、組成物の投与前に決定された値と比較される。少なくとも4倍または8倍のSBA増加が好ましい。一よりも多い用量の組成物が、投与される場合、一回よりも多い投与後の判定がなされ得る。本発明の組成物の投与上記のように、本発明の組成物は、種々の経路非経口的および粘膜を含むによって投与され得る。非経口的投与の好ましい経路は、注射である。注射は、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内であり得る。大腿部への筋肉内投与が、好ましい。針の無い注射が用いられ得る。粘膜投与の好ましい経路は、鼻腔内である。経皮Transdermal投与または経皮transcutaneous投与もまた可能である例えば、参考文献177を参照のこと。投与は、単一用量スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。最初の用量スケジュールに続いてブースター量スケジュールであり得る。初回刺激と追加免疫との間の適切な時期は、慣用的に決定され得る。投与は一般に、動物に対するものであり、特にヒト被験体が、処置され得る。この組成物は特に、子供および十代の若者のワクチン接種に有用である。医療方法および使用本発明は、患者において免疫反応を惹起する方法を提供する。この方法は、本発明の組成物を患者に投与する行程を包含する。免疫反応は好ましくは、髄膜炎疾患に対して保護するものであり、体液性免疫反応および/または細胞性免疫反応を含み得る。この免疫反応および/または投与は好ましくは両方とも粘膜性である。患者は好ましくは、子供である。さらに好ましい患者の部類としては、成人女性であり、特に出産適齢期の女性または妊娠女性である。本発明の組成物は、母体経路を介して子供を受動的に免疫することに特に適している。本方法は、N.meningitidisに対して既に刺激されている患者において追加免疫反応を生じ得る。本発明はまた、N.meningitidisの血清群A、血清群C、血清群W135および血清群Yの内の少なくとも二つに由来する莢膜サッカリドの使用を提供し、ここでこの莢膜サッカリドは、免疫反応を生じるための動物に対する鼻腔内送達のための医薬品の製造においてキャリアタンパク質に結合され、および/またはオリゴ糖である。本発明はまた、免疫反応を生じるための動物に対する鼻腔内送達のための医薬品の製造において、1N.meningitidisの血清群A、血清群C、血清群W135および血清群Yのうちの少なくとも一つに由来する莢膜サッカリドであって、この莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に対して結合され、ならびに/またはオリゴ糖である莢膜サッカリド、そして2キトサンの使用も提供する。この使用はまた、3解毒化されたADP-リボシル化毒素も含み得る。これら医薬品は好ましくは、Neisseria例えば、髄膜炎、敗血症、淋病などによって引き起こされる疾患の予防および/または処置のためのものである。これらは好ましくは、鼻腔内投与用である。これらは好ましくは、N.meningitidisの血清群A、血清群C、血清群W135および血清群Yのうちの少なくとも二つすなわち、2、3または4に由来する莢膜サッカリドを含む。Th1/Th2偏りキトサンその誘導体を含むおよび抗原を含むワクチン組成物は、当該分野に公知である。キトサンは、Th2に偏った免疫反応を生じる。これらワクチンへの解毒化されたADP-リボシル化毒素アジュバント例えば、LTK63のようなLT変異物の添加が、Th1偏りを有するようにこの免疫反応を変化させ得ることが見出されている。従って本発明は、キトサンアジュバント、変異ADP-リボシル化毒素および抗原を含むワクチンを提供し、このワクチン組成物は、被験体への投与後Th1に偏った免疫反応を提供する。本発明はまた、キトサン含有ワクチンのTh1/Th2のバランスを変えるための方法も提供し、この方法は、このワクチンに解毒化されたADP-リボシル化毒素を添加する工程を包含する。定義用語含むcomprisingは、含むincludingおよび含むconsistingを意味し、例えば、Xを含むcomprising組成物は、Xのみを含み得るか、または付加物を含み得る例えば、XY。数値xに関連する用語約は、例えばx±10を意味する。単語実質的にsubstantiallyは、完全にcompletelyを除外せず、例えば、Yを実質的に有さない組成物は、Yを完全に有さなくてもよい。必要な場合、この単語実質的には、本発明の定義から省略され得る。本発明は、例えば以下の項目を提供する。項目1粘膜送達のための免疫原性組成物であって、該組成物は、N.meningitidisの血清群A、血清群C、血清群W135および血清群Yの少なくとも二つの血清群に由来する莢膜サッカリドを含む、組成物。項目2免疫原性組成物であって、該組成物は、aN.meningitidisの血清群Cに由来する莢膜サッカリド抗原、およびbキトサンアジュバントを含む、組成物。項目3項目2に記載の組成物であって、該組成物は、c一以上のさらなる抗原および/またはd一以上のさらなるアジュバントを含む、組成物。項目4項目1~3のいずれかの項目に記載の組成物であって、ここで前記莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に結合され、および/またはオリゴ糖である、組成物。項目5項目3に記載の組成物であって、ここで前記莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に結合されたオリゴ糖である、組成物。項目6項目1~5のいずれかの項目に記載の組成物であって、該組成物は、N.meningitidisの血清群A、血清群C、血清群W135および血清群Yの2個、3個または4個に由来する莢膜サッカリドを含む、組成物。項目7項目6に記載の組成物であって、該組成物は、血清群AC、血清群AW135、血清群AY、血清群CW135、血清群CY、血清群W135Y、血清群ACW135、血清群ACY、血清群CW135Y、または血清群ACW135Yに由来するサッカリドを含む、組成物。項目8項目1~7のいずれかの項目に記載の組成物であって、該組成物は、鼻腔内投与のために適合および/またはパッケージ化される、組成物。項目9項目8に記載の組成物であって、該組成物は、鼻内噴霧または点鼻液の形態である、組成物。項目10項目1~9のいずれかの項目に記載の組成物であって、該組成物は、キトサンアジュバントおよび/またはE.coli熱不安定性毒素の解毒変異体を含む、組成物。項目11項目10に記載の組成物であって、ここで前記キトサンは、トリ-アルキル化キトサンである、組成物。項目12項目11に記載の組成物であって、ここで前記キトサンは、トリメチルキトサンである、組成物。項目13項目10~12のいずれか一項に記載の組成物であって、ここで前記E.coli熱不安定性毒素の解毒変異体は、残基63でセリンからリジンへの置換を有する、組成物。項目14項目1~13のいずれかの項目に記載の組成物であって、ここで該組成物は、1髄膜炎菌のサッカリド、2Haemophilusinfluenzaeに対する免疫反応を誘導する抗原、および3Streptococcuspneumoniaeに対する免疫反応を誘導する抗原の三つ全てを含まない、組成物。項目15項目10~14のいずれかの項目に記載の組成物であって、ここで該組成物は、1髄膜炎菌のサッカリド、2Haemophilusinfluenzaeに対する免疫反応を誘導する抗原、および3Streptococcuspneumoniaeに対する免疫反応を誘導する抗原の三つ全て、ならびにキトサンのアルキル化誘導体を含む、組成物。項目16キットであって、a凍結乾燥された形態のN.meningitidis血清群Aに由来する莢膜サッカリド、ならびにbN.meningitidisの血清群C、血清群W135および血清群Yの一以上に由来する莢膜サッカリドを含み、ここでaおよびbは、組み合わされた場合、粘膜投与に適しているように処方されている、キット。項目17患者において免疫反応を惹起する方法であって、該方法は、項目1~15のいずれか一項による組成物を患者へ投与する工程を包含する、方法。項目18N.meningitidisの血清群A、血清群C、血清群W135および血清群Yの少なくとも二つに由来する莢膜サッカリドの使用であり、ここで該莢膜サッカリドは、免疫反応を惹起するために、動物へ粘膜送達するための医薬品の製造において、キャリアタンパク質に結合され、および/またはオリゴヌクレオチドである、使用。項目19免疫反応を惹起するために、動物へ粘膜送達するための医薬品の製造における、1N.meningitidisの血清群A、血清群C、血清群W135および血清群Yの少なくとも一つに由来する莢膜サッカリドであって、ここで該莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に対して結合され、および/またはオリゴ糖である、莢膜サッカリド、ならびに2キトサン、の使用。項目20項目18または項目19に記載の使用であって、ここで前記医薬品は、鼻腔内送達用である、使用。項目21ワクチン組成物であって、該組成物は、キトサンアジュバント、変異ADP-リボシル化毒素および抗原を含み、ここで該ワクチン組成物は、被験体への投与後、Th1に偏った免疫反応を生じる、ワクチン組成物。発明を実施するための様式髄膜炎菌性血清群Cワクチン[182]CRM197髄膜炎菌Cオリゴ糖結合体[6、9]を、一用量あたり1μgでN-トリメチル-キトサンクロリドアジュバント[178]および/またはLT-K63アジュバントを用いてマウスに鼻腔内投与した。TMCを、一用量あたり8μgで使用し、18.9の代替品と共にエビの殻に由来するキトサンChitoclearPrimexehf、Iceland94.5アセチル化から調製した[179]。LT-K63を、一用量あたり1μgまたは0.1μgで用いた。麻酔されていない雌性BALB/cを、10μl量の処方物一鼻孔あたり5μlを用いて0日、21日、35日目に鼻腔内免疫化した。血清サンプルを、各免疫化の前後に採取した。鼻孔の洗浄を、三度目の免疫化の後10日間行った。MenCおよびLTに対して特異的なIgG抗体およびIgA抗体の力価を、ELISAによって決定した[180]。コントロールのマウスに、水酸化アルミニウムアジュバント500μgを含む400μl量を皮下的s.c.に与えた。全ての処方物を、LTK63粘膜アジュバントを、加えてもしくは加えずに、皮下免疫のためにCRM-MenC結合体ワクチンとアジュバント、またはTMCの粉末懸濁物とを混合することによって使用直前にpH7.4のPBS中に調製した。血清サンプルを0日目、20日目ポスト-1、34日目ポスト-2、および45日目ポスト-3に取り、この日にマウスを屠殺し、鼻の洗浄を行い、そして脾臓を取り除いた。鼻の洗浄を、0.1ウシ血清アルブミンBSAおよび1mMフェニルメタンスルホニルフルオライドPMSFを含有する1mlPBSpH7.4を流しそして吸引することを繰り返すことによって実施した。血清および粘膜の抗MenC-特異的IgG抗体、抗-CRM197-特異的IgG抗体および抗-LTK63特異的IgG抗体ならびに抗MenC-特異的IgA抗体、抗-CRM197-特異的IgA抗体および抗-LTK63特異的IgA抗体の滴定を、以前に詳細に述べられたように[180~182]、個々の血清サンプルについてELISAによって実施した。抗体滴定を、両側スチューデント検定によって統計学的に比較した。N.meningitidisのC群C11系統に対する血清の殺菌活性を、補体の供給源として胎児ウサギ血清を用い、既に記載された標準的な方法[119、180]に従ってプールした血清サンプルについて滴定した。血清IgG反応を、図14に示す:AELISAおよびB殺菌性対数目盛。図15は、A血清およびB鼻の洗浄液におけるIgA力価を示す。図16は、脾臓増殖アッセイの結果を示す。このデータは、TMCのみが、免疫原性を増強することを示し、またLT-K63アジュバントと共に同時投与した場合、TMCが免疫原性を増強することを示す。1μgのLT-K63とTMCとの混合物を受けているマウスは、皮下免疫によって得られるIgG力価に匹敵するIgG力価を得た。さらに、両方の用量の混合アジュバントは、皮下免疫と同等のまたは皮下免疫よりも良好な血清殺菌性抗体反応を生じた。皮下免疫は、鼻の洗浄液においてMenC-特異的IgA反応を生じなかった。従って、TMCおよびLTK-63は、MenCサッカリド抗原単独または組合せのいずれかについて効果的な鼻腔内アジュバントである。有利なことには、LT-K63へのTMCの添加は、免疫原性の減少を伴うことなくLT-K63の用量を90減少させることが可能である。従って、TMCは、免疫原性の減少を伴うことなく潜在的な残留毒性を有する構成要素を減少させることが可能である。さらなる実験において、以下の九つの組成物を比較した。図20に示すように、これらの結果は、最高の血清抗MenCIgG抗体力価が、LTK63変異体およびキトサンまたはTMCの両方と一緒にCRM-MenCワクチンを用いて鼻腔内i.n.免疫されているマウスの群第7群~第9群において得られたことを確認する。抗体の力価は、同一用量のワクチンを用いて皮下免疫化したマウスで見出された抗体力価に匹敵したP>0.05皮下免疫したマウスにおいてのみ検出可能な抗体を誘導した、第一回の免疫化後の反応は除く。10μgから50μgへのTMC用量の増加は、血清抗MenC抗体反応の有意な増強をTMC10μg[第4群]対TMC50μg[第6群]についてP<0.01、1μgのLTK63変異体のみを含むワクチンを用いて鼻腔内i.n.免疫したマウス第3群において観察されたレベルに匹敵するレベルまで誘導した。ワクチン処方物へ1μgのLTK63変異体を添加することによる抗MenC抗体反応の有意な増強は、TMCの最小用量10μgを受けているマウスの群において明白であった第7群対第4群についてP<0.01。アジュバントを加えたCRM-MenCワクチンを用いて鼻腔内免疫したマウスのみが、利用したアジュバント/TMC用量に関係なく、MenCに対する検出可能な血清IgA抗体を有したが、皮下s.c.免疫したマウスは有さなかった。最終的に、LTK63粘膜アジュバントおよびTMCの両方の同時使用は、LTK63のみで誘導した殺菌性力価1:4000、TMCのみで誘導した殺菌性力価1:1,000~1:4,000、および皮下で与えられたワクチンのみで誘導した殺菌性力価1:4,000よりもより高い殺菌性力価1:16,000を誘導した。同様の実験を、アジュバントとして非メチル化Chitoclearキトサンを用いて実施した。マウスに、同一の経路で、一用量あたり2.5μgのサッカリドで同一の結合体抗原を与えたが、LT-K631μgおよび/またはキトサン10μgまたは20μgを伴う。六つの群のマウスを使用した。図17~図19に示すように、ミョウバンを用いた皮下投与と比べて、LT-K63およびキトサンを用いた鼻腔内投与は、同等のIgG反応および血清殺菌性反応を生じ、鼻のIgA反応を生じた。LKK63用量の減少補助剤としてのTMCの使用が、全体的な粘膜免疫賦活作用を損失することなく、LTK63用量の減少を可能とするか否かについて調べるために、以下の組成物を試験した。図21に示すように、一用量あたり1μgでのLTK63の強力な免疫賦活作用第6群は、この変異物を、0.1μgまたは0.05μg第4群および第5群の投薬量で用いた場合、劇的に低下する。LTK63変異体とTMCとの同時使用は、血清抗MenC抗体反応を完全に回復させた第7群~第9群。殺菌性抗体反応は、限定的な用量のLTK63変異体を用いて免疫されたマウスにおいてごく僅かであった第4群および第5群。しかし、LTK63を、TMCと同時投与した場合第7群~第9群、CRM-MenC結合体ワクチンを皮下に受けたマウス第1群において見出される殺菌性抗体力価に匹敵するか、またはより高いレベルで殺菌性抗体力価は増加した。LTK63を加えたCRM-MenCワクチンと共にTMCを用いて、または用いずに鼻腔内i.n.免疫したマウスは、鼻の洗浄液においてMenCに対する検出可能なIgA抗体を有するが、皮下s.c.免疫したマウスは有さなかった。従って、TMCおよびLTK63変異体の付加的な効果は、互いに限定された用量で非常に良好に効果を与え、その結果LTK63変異体の総量の使用は、TMCについての必要量を減少させ、そしてTMC総量の使用は、MenCに対する強力な抗体反応および防御抗体反応の誘導に必要なLTK63変異体の量を限定する。実際に、非常に少量のLTK63アジュバントすなわち、0.1μgまたは0.05μgで、CRM-MenC結合体ワクチンを、TMCと一緒に同時投与した場合、高殺菌性抗体力価が、誘導されたが、TMCが存在しない場合には誘導されなかった。これはまた、CRMキャリアおよびLTK63自体に対する免疫反応の増強にも当てはまった示さず。これらのデータは、これらの分子の内因性粘膜免疫賦活作用が、適切な生体接着性物質と一緒に処方されることによって効率的に増強され得ることを明瞭に示す。従って、鼻腔内i.n.送達したワクチンの安全なプロフィールを、非毒性のLT変異物およびTMCの同時使用によってさらに増強されることが予測される。このデータは、髄膜炎菌性結合体ワクチンに対する保護免疫反応が、二つの適切な粘膜アジュバントの会合を用いる粘膜免疫によって改善され得ることを示す。特に、この保護免疫反応の質は、適切な用量の粘膜アジュバントに依存して改変され得る。Th1/Th2偏りキトサンを用いて処方したCRM197を用いた鼻腔内i.n.免疫は、優先的に機能的Th2型表現型に向かって免疫反応を誘導し[183、184]、その一方でLT変異物、特に非毒性LTK63変異体は、Th1/Th0機能的表現型に向かう鼻腔内i.n.免疫の後、抗原特異的免疫反応に優先的に偏る[185~157]。本発明の組成物のTh1/Th2のバランスを研究し、そしてLTK63アジュバントまたはTMCアジュバントの使用を、用いた用量に依存するTh1型反応またはTh2型反応を誘導するためにこれら二つの成分の性質を微細に調節することを見出した。マウスを、上記のように免疫化した。群は、以下を受けた。個々のマウスに由来する脾臓を、切除し、マウスの各群に由来する細胞を、一緒にプールし、10胎仔ウシ血清、2mML-グルタミン、25mMHepes、100Uペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに5mM2-メルカプト-エタノールを含有するDMEM中に懸濁した。2×105細胞を、U底96ウェルプレート中の200μlの培地に播種し、そして示したように異なる濃度でCRM-MenC結合体を用いて5日間刺激した。細胞増殖を、培養を終了する前に16時間、1ウェルあたり1μCiの3[H]-チミジンを添加することによって決定した。次いで細胞を、濾紙上に回収し、取り込まれた放射活性を、シンチレーションカウンターで測定した。最高濃度の抗原を用いて刺激した三連の細胞培養に由来する上清を、プールし、そしてラット抗マウスサイトカイン特異的モノクローナル抗体を用いてIFN-γおよびIL-5のレベルを調べるためにELISAによって試験した。手短に言えば、96穴プレートを、0.1M重炭酸塩緩衝液で希釈した適切な量の抗マウスIFN-γ抗体または抗マウスIL-5抗体を用いてコートした。4°Cで一晩のインキュベーション、洗浄および室温で2時間1BSAを用いてコートされていない部位の浸潤の後、上清を、ウェルに添加し、4°Cで一晩インキュベートした。結合したサイトカインを、ビオチン化抗IFN-γ抗体または抗IL-5抗体を用いて決定し、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンを37°Cで1時間添加した。結合した抗体を、o-フェニレンジアミン基質を用いて示し、その後マイクロプレートELISAリーダーを用いて450nmでプレートを読んだ。サイトカイン濃度は、組換えマウスIFN-γまたは組換えマウスIL-5の既知の量を用いて作製された検量線生成によって決定した。図22に示したように、LTK63のみを加えたCRM-MenCワクチンを用いた鼻腔内免疫は、最高用量で与えた場合1μg、第6群、IgG1アイソタイプおよびIgG2aアイソタイプの両方の抗MenCIgG抗体を誘導した。しかし、より少量の用量ではすなわち、0.1μgおよび0.05μg、抗MenCIgG1は、検出可能であったが、低い力価では、IgG2aは、検出できなかった。TMCのみを用いた場合、抗MenCIgG1抗体のみが、検出可能であった。CRM-MenCワクチンを伴うLTK63変異体とTMCとの同時投与は、抗MenCIgG1抗体の力価を増強する第7群、第8群、および第9群対第3群についてp<0.05だけでなく、特に少用量のLTK63において第7群および第8群IgG2a抗体を誘導した。予測したように、水酸化アルミニウムの存在下での皮下免疫は、IgG2aと比較した場合、MenCに対するIgG1のより高い力価を誘導し、重要なことに、鼻腔内ワクチンを受けているマウスにおいて決して検出されないIgEも誘導した。全てのこれらのデータにより、Th2反応をプライムし得るTMC様化合物の存在下においてすら、Th1依存性抗原特異的IgGアイソタイプIgG2aを誘導するLTK63の性質が強く確認される。LTK63またはTMCの存在下においてCRM-MenCワクチンによる鼻腔内免疫は、インビトロでの抗原による再刺激により特異的に増殖するT-細胞のプライミングを誘導した。さらに、マウスが、皮下に結合体ワクチンを受けているマウスにおいて観察されるレベルと同様かまたはより高いレベルでLTK63およびTMCの両方を伴うワクチンを受けている場合、この増殖反応は、増強した。図23に示すように、TMCのみを加えたワクチンを用いた鼻腔内免疫は、IL-5とIFN-γとの両方の産生を誘導した。免疫化のために用いられたTMC量の増加は、IFN-γの産生量を強く抑制したが、IL-5の産生量を抑制しなかった。TMCを伴うワクチン処方物へのLTK63変異体一用量あたり1μgの添加は、細胞のIL-5を産生する能力を劇的に抑制し、同時に、LTK63のみを加えたワクチンを用いて免疫化したマウスに由来する培養物の上清において検出可能であるのと同様に高レベルのIFN-γを誘導した。IFN-γの産生を誘導するLTK63の能力は、鼻腔内免疫のためにより少用量0.1μgまたは0.05μgを用いた場合、顕著に減少した図24。ワクチン処方物へのTMCの添加は、LTK63の最高用量1μgでのIFN-γ産生のパターンを変化させなかった;逆に、LTK63を、より少用量で与えた場合、IL-5の産生を有利にした。まとめると、これらのデータは、i機能的Th1型表現型に向かう免疫反応を偏らせるLTK63の性質主により高用量で、ii機能的Th2型免疫反応を促進するTMCの性質、iii二つの成分の適切な用量および混合によりTh1型免疫反応とTh2型免疫反応との間のバランスを調節する可能性を示す。キトサンおよびLTK36についてのTh1/Th2バランスのこれまでの研究は、固定した、高用量のLTK631μg以上またはキトサンを用いている。しかし、両成分の減少した用量を用いて、TMCおよびLTK63によってプライムしたTh2型反応およびTh1型反応は、より容易に観察され得る。TMCおよびLTK63の最低用量において、免疫反応の偏りは、ほとんど明らかでなかった。1μgのLTK63が、TMCの任意の用量を含有するワクチン処方物に添加された場合、免疫反応は、Th1型反応に向かって一貫して偏らされ、IFN-γの産生およびIL-5産生の全体的な抑制を伴う。これらのデータは、TMCのTh2に偏ったIL-5産生反応をしのぐLTK63の顕著なTh1誘導の役割を強く示唆する。実際、IL-5の産生は、最低用量のLTK63と一緒に最高用量のTMCを受けている群においてのみ維持された。LTK63変異体の含有は、Th1型免疫反応を有利にし、さもなければ単独で用いた鼻腔内のTMCまたは皮下のミョウバンによってTh2機能的表現型に向かって駆動されている。まとめると、このデータは、優先的なTh1機能的表現型またはTh2機能的表現型に向かう免疫反応の偏りは、ワクチン処方物に存在する特定の粘膜アジュバントによって駆動されるだけでなく、重要なことに、鼻腔内送達したワクチン処方物に存在する成分の各々の相対量によっても駆動される。従って、本保護免疫反応の特性を、適切な用量の粘膜アジュバントおよび送達系によって、保護に必要とされるエフェクターの機能に応じて、微細に調整し得る。混合性ワクチンオリゴ糖結合体の混合性ACWY組成物を、参考文献8に記載される物質を用いて調製した。この組成物を、PBSを用いてpH7.4に緩衝した。結合体の各々の濃度は、以下であった。この組成物を、アジュバントを用いないかまたは以下の粘膜アジュバントのうちの一つを用いて、10μlの容量一方の外鼻孔につき5μlでマウスに鼻腔内投与した。比較のために、同一の抗原組成物を、水酸化アルミニウムアジュバントを用いて皮下に投与した。コントロールとして、MenC結合体のみを、組合せの組成物におけるMenCと同じ濃度で同一の経路によって、同一のアジュバントを用いて投与した。従って、10個の群のマウスは、以下の組成物を受けた。実験の最初の組において、以下の3つの鼻腔内用量ミョウバンについては皮下の血清IgGレベルは、以下のとおりであって、GMTMEU/ml±標準偏差として表した図2:同一の動物を、胎児ウサギの補体存在下で血清殺菌性抗体について試験した。用いた株は、A-F6124、C-C11、W135-5554およびY-240539であった。結果は、以下のとおりであった図3:脾臓における細胞の増殖もまた、同一の10群について試験した。MenACWY抗原を受けた奇数の群についての結果を図4Aに示し、MenCのみを受けた偶数の群は、図4Bである。実験の第二組において、マウスは、鼻腔内に20μlの以下のACWY組成物各抗原として2μgのサッカリドを受けた皮下にACWY組成物を受けた1群を除く:三回の免疫化後の血清IgGを、図5に示し、血清BCAを、図6に示し、そして細胞増殖を、図7Aおよび図7Bに示す。同様の実験の第三組において、マウスは、鼻腔内に20μlの以下のACWY組成物各抗原として2μgのサッカリドを受けた皮下にACWY組成物を受けた第1群を除く:三回の免疫化後の血清IgGを、図8に示し、血清BCAを、図9に示し、そして細胞増殖を、図10Aおよび図10Bに示す。従って、LTK63およびTMCの両方、特にこれらの組み合わせは、髄膜炎菌の血清群A、血清群C、血清群W135および血清群Yに対する混合性ワクチンの鼻腔内送達のための高度に効果的なアジュバントである。本発明は、例のみによって記載され、本発明の範囲内および精神内にある限り、改変がなされ得ると理解される。"