"ZM378、ZM379、ZM395、ZM401、ZM405、ZM408、ZM415、ZM416、およびZM417のシグネチャーアミノ酸を含む、HIVエンベロープタンパク質。ZM378のシグネチャーアミノ酸を含む、請求項1記載のタンパク質。gp160またはgp140タンパク質である、請求項1記載のタンパク質。図10に示すZM378のアミノ酸配列を含む、請求項1記載のタンパク質。請求項1記載のタンパク質をコードする単離された核酸。ベクター中に存在する、請求項5記載の核酸。前記ベクターがウイルスベクターである、請求項6記載の核酸。請求項1記載のタンパク質若しくは請求項5記載の核酸およびキャリアーを含む、組成物。アジュバントをさらに含む、請求項8記載の組成物。哺乳動物において、免疫反応を誘導する方法であって、請求項1記載の前記タンパク質または請求項5記載の前記核酸を、前記反応を誘導するのに十分な量で、前記哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法。前記哺乳動物がヒトである、請求項10記載の方法。請求項1記載の前記タンパク質に特異的な単離された抗体、またはその抗原結合性断片。HIV-1による哺乳動物細胞の感染を阻害する方法であって、請求項12記載の前記抗体または前記のその断片と前記細胞を、前記阻害が達成される条件下で接触させる工程を含む、前記方法。前記細胞がヒト細胞である、請求項13記載の方法。HIV-1エンベロープ糖タンパク質Envの分子および抗原性構造の知識が増加することによって、ワクチン設計に関する重要な新たな洞察が得られてきているが、この情報を広域中和抗体を誘発する免疫原に関する情報に変換するのは困難であった。本発明は、少なくとも部分的に、広域Nab反応に関連するクレードCウイルス配列において明らかな共通の中和シグネチャーが存在するかどうかという疑問を探究するため、ハイスループット形式で、機能するEnvを発現させる、SGAおよび新規プロモーターPCR法の使用[38]に基づく。以下の実施例に記載するように、34人の慢性感染個体由来のHIV-1クレードC擬似種における、自己および異種の多数の真正のそして機能性HIV-1env遺伝子に対する血清抗体の中和特性を特徴付けた。単一ゲノム増幅によって、総数474の全長HIV-1env遺伝子被験体あたり5~23を得た。これらの個体の1/3は、総ウイルス集団の9~38を占める同一のまたは類似の遺伝子配列を持つクローン増殖ウイルスの集団を宿した。Env偽型ウイルスとしてのこれらのenv遺伝子の機能分析によって、広範囲のウイルス感染性が示された。感染性におけるこの変動は、血漿ウイルス負荷と相関したが、トランスフェクション細胞におけるタンパク質発現レベルとは相関せず、より機能的なenv遺伝子が、HIV-1感染個体においてより高いウイルス負荷を導きうることが示唆された。以下の実施例はまた、15人の個体各々由来の多数のEnv3~6に関する、自己および異種血漿サンプル中の抗体に対する中和感受性の決定を記載する。自己ウイルスに関しては中和減少が観察されたが、異種中和が検出され、そしてこれを2つの別個の群:広域交差反応性中和を伴う血漿N=9および交差反応性中和が劣っている血漿N=6に分けることが可能であった。異種ウイルスに対してより強い中和活性を持つ血漿は、同時期の自己ウイルスをより強力に中和した。両群由来の血漿中のEnv配列の分析によって、V4領域中の共受容体結合部位近位に、より高い中和強度および幅と関連する、3つのアミノ酸シグネチャーが明らかになった。したがって、本発明は、強力な抗体反応に関連するシグネチャー例えばシグネチャー部位393、397、および413を保持するHIV-1サブタイプCEnv、および該Envをワクチン免疫原として用いる方法に関する。本発明はさらに、診断試験における診断ターゲットとして使用するためのこうしたEnvに関する。本発明はさらに、多価HIV-1ワクチンの調製における野生型WTウイルス配列の使用に関する2010年2月25日出願の米国仮出願第61/282,526号。B細胞反応のためのこうした多価ワクチンに含まれうる配列には、envが含まれ、そしてTヘルパーおよび細胞傷害性T細胞反応のためには、gag、pol、nefおよびtat配列が含まれる2006年8月23日出願の米国出願第11/990,222号。当該技術分野に周知の方法を用いて、本発明のワクチン抗原免疫原例えば強力な抗体反応に関連するシグネチャーを保持するEnv配列を化学的に合成しそして精製することも可能である。また、周知の組換えDNA技術によって免疫原を合成してもよい。本発明の免疫原をコードする核酸を、例えばDNAワクチンの構成要素として用いてもよく、ここでコーディング配列を裸のDNAとして投与し、または例えば、ウイルスベクター中に免疫原をコードするミニ遺伝子が存在してもよい。コード配列は、例えば、複製または非複製アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、弱毒化結核菌Mycobacteriumtuberculosisベクター、カルメットゲラン桿菌BCGベクター、ワクシニアまたは修飾ワクシニアアンカラMVAベクター、別のポックスウイルスベクター、組換えポリオおよび他の腸内ウイルスベクター、サルモネラ属Salmonella種細菌ベクター、赤痢菌属Shigella種細菌ベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスVEEベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、またはタバコモザイクウイルスベクター中に存在してもよい。コード配列はまた、例えばCMVプロモーターなどの活性プロモーターを含むDNAプラスミドとして発現させてもよい。本発明の配列を発現するのに、他の生存ベクターもまた使用可能である。好ましくはヒト細胞における発現を最適化したコドンおよびプロモーターを用いて、免疫原をコードする核酸を細胞内に導入することによって、患者自身の細胞において、本発明の免疫原の発現を誘導してもよい。DNAワクチンを作製し、そして用いる方法の例は、例えば米国特許第5,580,859号および第5,589,466号および第5,703,055号に開示される。本発明には、本発明の免疫原例えばgp160またはgp140またはその断片例えば、単独のまたは脂質と会合したgp41、gp120、あるいはgp120の断片、あるいは該免疫原をコードする核酸配列の免疫学的有効量を、薬学的に許容されうる送達系中に含む組成物が含まれる。免疫不全ウイルス感染の防止および/または治療に該組成物を用いてもよい例えばヒトにおいて。アジュバント例えばミョウバン、AS021GSKより、オリゴCpG、MF59またはEmulsigen、乳化剤、薬学的に許容されうるキャリアーまたはワクチン組成物中にルーチンに提供される他の成分を用いて、本発明の組成物を配合してもよい。一般の当業者は、最適な配合物を容易に設計可能であり、そしてこれには、即時放出用のおよび/または徐放用の、そして全身免疫誘導および/または局所粘膜免疫誘導用の配合物が含まれうる例えば鼻内投与用の配合物を設計してもよい。皮下、鼻内、直腸内、膣内、経口、筋内、または他の非経口もしくは経腸経路、あるいはその組み合わせを含む、任意の好適な経路によって、本発明の組成物を投与してもよい。免疫反応を誘導するのに十分な量で、例えば単回用量または多数回用量として、免疫原を投与してもよい。一般の当業者は、最適な免疫スケジュールを容易に決定可能であり、そしてこれは患者、組成物および求めている効果に応じて多様でありうる。本発明の組成物および投与措置の例には、例えばDNAプライム組換え水疱性口内炎ウイルスブーストおよび抗体用の組換えEnvタンパク質ブースト、NYVACなどのポックスウイルスプライムおよびタンパク質Envオリゴマーブースト、またはその断片、あるいはDNAプライム組換えアデノウイルスブーストおよびEnvタンパク質ブースト、あるいは単に抗体誘導のため、アジュバント中のタンパク質としての組換えエンベロープgp120またはpg140として発現される、コンセンサスまたはモザイクgag遺伝子、およびコンセンサスまたはモザイクnef遺伝子、およびコンセンサスまたはモザイクpol遺伝子、および上記シグネチャーを保持するEnvを含むコンセンサスEnvまたは上記シグネチャーを保持するEnvを含むモザイクEnvが含まれる米国出願第10/572,638号、PCT/US2006/032907、米国出願第11/990,222号および第12/192,015号を参照されたい。本発明は、本発明の免疫原および/または該免疫原をコードする核酸、ならびに/あるいは上に示すベクター中のミニ遺伝子として発現される免疫原の両方の直接使用を意図する。例えば、免疫原をコードするミニ遺伝子をプライムおよび/またはブーストとして用いてもよい。本開示を読むと、全エンベロープ遺伝子またはその一部すなわちミニ遺伝子としてが使用可能であることが認識されるであろう。発現されたタンパク質の場合、タンパク質サブユニットが使用可能である。上記に示すように、本発明はまた、診断ターゲットおよび診断試験にも関する。例えば、哺乳動物細胞の一過性または安定トランスフェクションによって、本発明のシグネチャー保持Envを発現させてもよいまたはこれらを例えば組換えワクシニアウイルスタンパク質として発現させてもよい。タンパク質をELISA、Luminexビーズ試験、または他の診断試験で用いて、HIV感染の最も初期の段階で、患者由来の生物学的サンプル中の伝染/創始者ウイルスに対する抗体を検出することも可能である。本発明はまた、本発明のシグネチャー保持Envに特異的な抗体に、そしてこうした抗体の断片に、そして該抗体を用いて、HIV-1による被験体の細胞の感染を阻害する方法にも関する。該方法は、被験体例えばヒト被験体に、HIV-1特異的抗体またはその断片を、該抗体またはその断片が感染を阻害するような量および条件下で投与する工程を含む。本発明にしたがって、被験体または被験体の免疫系/細胞とHIV-1が接触する前に、あるいは脆弱細胞の感染後に、抗体を投与してもよい。接触前または接触直後の投与は、被験体の脆弱細胞例えばT細胞の感染阻害を最大限にしうる。上に示すように、本発明の方法において、損なわれていないintact抗体またはその断片例えば抗原結合性断片のいずれを用いてもよい。例示的な機能性断片領域には、scFv、Fv、Fab’、FabおよびFab’2断片が含まれる。一本鎖抗体もまた使用可能である。適切な断片および一本鎖抗体を調製するための技術が当該技術分野に周知である例えばUSP5,855,866;5,877,289;5,965,132;6,093,399;6,261,535;6,004,555;7,417,125および7,078,491ならびにWO98/45331を参照されたい。上記抗体およびその断片を組成物例えば薬学的組成物として配合してもよい。適切な組成物は、薬学的に許容されうるキャリアー例えば水性媒体中に溶解されるかまたは分散された抗体または抗体断片を含んでもよい。組成物は、無菌であってもよいし、そして注射可能型であってもよい。抗体およびその断片は、また、皮膚または粘膜に対する局所投与に適した組成物として配合されてもよい。こうした組成物は、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ペーストまたはエアロゾルの形を取ってもよい。適切な組成物を調製する際に、標準的配合技術を用いてもよい。性交後膣洗浄として、またはコンドームとともに投与するように、抗体を配合してもよい。本発明の抗体および抗体断片は、例えば、以下の環境において、予防のための該抗体の有用性を示す:iHIV-1感染に対して予期される曝露が知られる環境において、本明細書記載の抗体またはその結合性断片を、消毒剤microbiocideとして予防的に例えばIVまたは局所的に投与してもよく、iiレイプ被害者、または商業的風俗店従業員、またはコンドーム保護を伴わないあらゆる性感染の環境において生じるものなどの、曝露が知られるかまたは推測される環境において、本明細書記載の抗体またはその断片を、曝露後予防剤として、例えばIVまたは局所的に投与してもよく、そしてiii急性HIV感染AHIの環境において、本明細書記載の抗体またはその結合性断片を、初期ウイルス負荷を制御し、そしてCD4T細胞プールを保持し、そしてCD4T細胞破壊を防止する、AHIに関する治療として、投与してもよい。適切な用量範囲は、例えば、抗体、そして配合物の性質および投与経路に依存しうる。当業者は過度の実験を伴わずに、最適用量を決定可能である。10ng~20μg/mlの範囲の抗体用量が適切でありうる。本発明にはまた、本明細書記載の抗体またはその断片をコードする核酸配列も含まれる。核酸配列は、プロモーターに機能可能であるように連結されて、発現ベクター中に存在することも可能である。本発明はさらに、こうしたベクターを含む単離細胞に、そして抗体またはその断片を作製する方法であって、核酸配列が発現され、そして抗体または断片が産生されるような条件下で、こうした細胞を培養する工程を含む前記方法に関する。本発明の特定の側面を、以下の限定されない実施例により詳細に記載することも可能である米国出願第61/322,725号、第61/322,821号、および第61/322,663号が本明細書に援用される。HIV-1に対する広域でそして強力な中和抗体の誘発は困難であった。しかし、近年の研究によって、HIV-1感染を有効に制御するAIDSワクチンには、中和抗体が必要であることが示されている。HIV-1が自然感染中に中和抗体を誘導する能力を理解するため、サブタイプC感染個体各々由来の多数のEnv偽ウイルスを用いて、包括的な自己および異種中和アッセイを行い、そしてV4領域中の共受容体結合部位近位に、より高い中和強度および幅と関連する、3アミノ酸シグネチャーを同定した。広域反応性中和抗体反応を誘発するためのシグネチャーの同定は、HIV-1に対する中和抗体を誘導可能なワクチン候補の開発のために重要な意味を有する。これらの結果はまた、異種ウイルスに対するより強い中和活性を持つ同時期血漿における自己中和の存在、慢性感染個体の大部分におけるウイルスのクローン増殖、ならびにEnv偽ウイルスの感染性および感染個体におけるウイルス負荷の間の正の相関も示した。実験詳細HIV-1env遺伝子の増幅。ザンビアヌドーラにおける同時期HIV-1株の研究において登録された37人のHIV-1陽性個体から、血漿サンプルを収集した。該研究は、熱帯病研究センター倫理委員会、デューク大学施設審査委員会、および米国国立衛生研究所によって認可された。ウイルスRNAを血漿から抽出し、そしてSuperscriptIIIInvitrogen、カリフォルニア州カールスバッドを用いて、cDNAに逆転写した。先に記載されるように、単一ゲノム増幅SGAの後、pPCR技術を用いて、SGA産物の5’端にCMVプロモーターを付加することによって、各個体から多数のrev/env遺伝子を得た。単回感染アッセイ。FuGENE6トランスフェクション試薬RocheDiagnostics;インディアナ州インディアナポリスを用いて、24ウェルプレート中、pPCR産物をenv不全HIV-1主鎖プラスミドpSG3Δenvと293T細胞に同時トランスフェクションした。簡潔には、pPCRDNA150ngおよびpSG3ΔenvDNA150ngを1.2μlのFuGENE6とFuGENE:DNA比3μl:1μg、血清不含DMEMを含めて20μlの総体積中で混合し、30分間インキュベーションし、そして前日にウェルあたり5x104に植え付けた293T細胞70集密に添加した。トランスフェクション48時間後、上清を採取した。96ウェルプレート200μl中、等体積の偽ビリオンをDEAE5μg/mlとともに、TZM-bl細胞に添加した。培養を、5CO2とともに、37°Cで48時間インキュベーションした。感染TZM-bl細胞から上清100μlを除去し、そして100μlのBright-Gloルシフェラーゼアッセイ基質を緩衝液Promega;ウィスコンシン州マディソンとともに細胞に添加した。2分間インキュベーションした後、100μlの細胞溶解物を黒一色の96ウェルプレートに添加した。Wallac1420マルチラベルカウンターPerkinElmer:マサチューセッツ州ウォルサムで発光を測定した。先に記載されるように[39]、TCID50を決定した。中和アッセイ。先に記載されるように[39、40]、TZM-bl細胞の単回感染後、ルシフェラーゼ活性の減少としてHIV-1中和を測定した。等量の偽ビリオン200TCID50を各反応に用いた。16の血漿サンプル試験したEnv偽ウイルスに対して、15の自己および1の異種および1つのHIV-1陽性血清対照に関して、pPCR偽ビリオンに対する中和力価を決定した。両種性ネズミ白血病Env偽ウイルスもまた、非特異的中和対照として含めた。ウェスタンブロット。pPCR産物およびpSG3Δenvの同時トランスフェクション48時間後、293T細胞を250μlの溶解緩衝液50mMTris-HCl、150mMNaCl、20mMEDTA、1Triton-X100、0.1SDS、pH7.4で溶解した。細胞溶解物を6x変性サンプル緩衝液300mMTris-HClpH6.8、12mMEDTA、12SDS、864mM2-メルカプトエタノール、60グリセロール、0.05ブロモフェノールブルーと混合した。サンプルを10分間煮沸し、そして次いでNuPAGENovex4~12Bis-TrisgeInvitrogen;カリフォルニア州カールスバッドに装填した。サンプルをニトロセルロース膜にトランスファーした後、1カゼインおよび0.01NaN3を含有するPBS中で膜を1時間ブロッキングした。ブロットをHIV-1陽性血清1:500およびHIV-1Envタンパク質に対するマウスmAb13D51μg/mlと反応させた。最後に、IRDye800コンジュゲート化アフィニティ精製ヤギ抗ヒトIgG抗体RocklandImmunochemicals;ペンシルバニア州ギルバーツビル、およびAlexa-Fluor680コンジュゲート化ヤギ抗マウスIgG抗体Invitrogen;カリフォルニア州カールスバッドと膜を反応させた。蛍光を検出し、そしてEnvタンパク質およびp24バンドの密度をOdyssey赤外画像化系LiCorBiosciences;ネブラスカ州リンカーンで決定した。トランスフェクション細胞におけるEnvタンパク質のレベルを同じ細胞におけるp24Gag抗原の量を越える倍相違として表した。配列分析。SGAenvアンプリコンの配列を、ABI3730x1遺伝子分析装置AppliedBiosystems;カリフォルニア州フォスターシティで、サイクル配列決定およびダイターミネーター法によって得た。Sequencherプログラム4.7GeneCodes;ミシガン州アナーバーを用いて、各envSGAの個々の配列断片を組立て、そして編集した。シグネチャー分析に使用可能なコドン整列ファイルを得るため、CLUSTALW[41]およびGenecutterwww.hiv.lanl.govを用いて、env配列を整列させた。レジェンドに明記するように、近隣結合法または最尤法のいずれかを用いて系統樹を構築した。階層的クラスター化分析。血漿の中和能力対数逆数希釈ID50スコアは、LosAlamosNationalLabのウェブに基づくヒートマップインターフェースhttp://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HEATMAP/heatmap.htmlおよび統計パッケージR[42]を用いて、本研究で用いたエンベロープのパネルに対して試験した際、類似の中和強度パターンに組織化された。無作為復元ブートストラップ戦略を用いて、エンベロープの試験パネルを10,000回再サンプリングし、そしてこれによって、ブートストラップサンプルの96で反復される、ロバストでそして特徴的な2つのクラスター:低い交差中和能力を持つ1つの群、および多数の異種Cクレードウイルスを交差中和する能力を有する別の群[43]が同定された。これらの2群を、続くシグネチャー分析に用いた。同じ戦略を用いて、同様の中和感受性を持つEnvの統計的にロバストなクラスターを同定した。高いブートストラップ値を持つクラスターは、典型的には、各々2、3のEnvしか含まず、そしてこれらのEnvクラスターは、典型的には、単一の被験体内に見られた。したがって、本発明者らは、ヒートマップ図において、個体によるEnv偽ウイルスを体系化する一方、図に重ね合わせて示すように、有意なブートストラップクラスターに関する情報を保持することを決定した。シグネチャー分析。本発明者らはまず、交差反応性中和プロファイルまたは弱い中和プロファイルを有する血漿を持つ個体からエンベロープ配列を得たかどうかを示す、ヒートマップクラスター化パターンに基づいて、エンベロープ配列を2つの群に分けた。系統樹分析のため、コドン整列されたDNAを提供する、GeneCutterwww.hiv.lanl.govを用いて、シグネチャー分析に用いる整列を生成した。系統発生補正法を用いて、すべてのシグネチャー部位を同定した。データ中で観察されるパターンは、ウイルス系譜の最初の歴史的発生によって課された相関創始者効果から生じるか、またはHIV-1の場合、最近の生物学的相互作用の結果であるかいずれである可能性もあるため、系統発生補正が非常に重要である。創始者効果を説明しないと、誤った統計結果を導きうる[44]。ウイルスの配列は全進化歴に依存する一方、原因となる相関は、最近の変化との相関に明らかである。2つの効果の分離、すなわち系統発生補正によって、表現型に対する最近の変化による影響を概算することが可能になる。これには、ウイルスおよびウイルスの祖先状態の概算の間の系譜的な関連の統計的再構築が必要である。本発明者らは、これを、Bhattacharyaら[44]が最初に開発した、系統発生補正したフィッシャーの厳密法を適応させて、最尤系統樹を通じて実行し、そして最近の共通の祖先に比較した際、所定のアミノ酸における変化または静止に基づく突然変異パターンと表現型の関連に関して試験した。本発明者らは、整列中のすべての段に見られる各アミノ酸の突然変異パターンをスクリーニングした。多数の試験に関して補正するため、本発明者らは、q値を用いて、偽発見率を評価した[45]。各々で見出された4つの最強の関連は、0.03のp値および0.27のq値を有し、したがって同定されたシグネチャーの少なくとも1つは偽陽性であるようであり、そして全体として、境界線の有意性しか得られず、したがってこれらのシグネチャーは、仮説を生じさせるフレームワークで、さらなる研究に値する潜在的に興味深い部位と見なされるべきである。ヌクレオチド配列寄託番号。すべてのenv遺伝子配列のGenBank寄託番号は、GU329048-GU329523である。結果全長env遺伝子の遺伝子分析。2005年、ザンビアヌドーラにおいて、50人のCHI個体から血漿サンプルを収集した。SGAによって、50人の被験体のうち37人から総数474の完全env遺伝子を得た。残った13人の被験体に関する陰性のPCR結果は、血漿ウイルス負荷が低いかまたは検出不能であるかいずれかのためであった。37人のPCR陽性被験体各々から、平均して13のenvSGA5~23の範囲を配列決定した表1。系統発生分析は、被験体の大部分n=34がHIV-1サブタイプCに感染していることを示した図1。他の3人は、サブタイプD、A/C組換え体大部分の中央領域がCまたはG/J組換え体のいずれかに感染していた。単系統樹が11人の個体で観察されタイプI、一方、26人の個体70では、2つの別個のenv系譜タイプIIが発見された図1。2つの別個の系譜のこの頻度は、先に記載された急性HIV-1サブタイプBおよびC感染で[37、46]、そしてサブタイプBのCHI個体未公表データで観察された20~30の頻度よりもはるかに高い。同一のまたは緊密に関連するenv配列が、37人の被験体のうち13人35で同定され表2、HIV-1感染個体における少数派ウイルス集団のクローン増殖が示唆された。これらの被験体において、クローン増殖Envは、サンプリングされたenv集団の9~38を構成した。クローン増殖されたエンベロープの各集団における配列は、系統樹においてゼロまたは限定された枝長さの緊密なクラスターを形成し図2;この緊密なクラスター化は、高いブートストラップ値によって支持された>85。9人の被験体は、1つのクローン増殖されたenv変異体を有し図2A~I、一方、さらなる4人の被験体ZM377、ZM405、ZM414、およびZM415は、2つの独立のクローン増殖集団を有した図2J~M。2人の被験体ZM402およびZM405におけるクローン増殖された変異体は新規系譜を形成した図2Eおよび2J。緊密に関連しているが、クローン増殖変異体から分岐し始めている配列が4人の被験体ZM377、ZM401、ZM414、およびZM415で観察された図2D、J、LおよびM。ZM394において、クローン増殖ウイルスおよび他のウイルスの間の組換え体env配列を検出した図2I。これらの後者の組換え体は、この被験体におけるウイルス集団の多様性の実質的な増加に寄与した。組換え体配列が系統樹から排除される場合、クローン増殖ウイルスは、被験体における新規ウイルス系譜の発生に相当した図2I。感染個体におけるenv擬似種の機能分析。各感染個体由来の多数のenv遺伝子のハイスループット機能スクリーニングのため、SGAアンプリコンにCMVプロモーターを付加するpPCR法[38]を用いた。293T細胞をpPCR産物およびEnv不全主鎖プラスミドSG3Δenvで同時トランスフェクションすることによって、Env偽型ウイルスを生成した。TZM-bl細胞において、ルシフェラーゼ活性によって感染性を測定した。調べた総数474のEnvのうち、37780が機能的であることが見出された表1。すべての新規に特徴付けられたenv遺伝子が、8人の被験体において機能性であり、一方、数人の被験体において、env遺伝子のわずかの割合のみが機能性であったZM419およびZM393に関して、それぞれ10および18。3人の個体ZM373、ZM380およびZM382において、すべてのEnv偽型ウイルスが非常に感染性であり、そして感染性の相違はわずか数倍であった図3。これらの後者のenv配列は、各被験体における単系統ウイルス群を構成した。特に、大部分の他の個体由来のEnv偽型ウイルスの感染性は、非常に可変性であったルシフェラーゼ活性において1~2対数相違。6人の個体由来の11のenv配列において、組換え遺伝子が見出された。これらの機能性を調べると、8つ73が生物学的に機能性である一方、他の3つは機能性でなかった図4。ZM420.9は、1ヌクレオチド挿入によって引き起こされる読み枠シフトのため、機能性でなかった。この結果は、いくつかの組換え体が生物学的利点を獲得する可能性がある一方、他のものは致死性であり、そして非機能性遺伝子を生じうることを示唆した。例えば、ZM394において、クローン増殖ウイルスおよび他のウイルス間の組換え体ウイルスは、非機能性から非常に感染性までの範囲の異なるレベルの感染性を生じた図2Iおよび4。しかし、組換え体配列は、非組換え体に比較して、不活性ウイルスが特に濃縮されてはいなかったフィッシャーの厳密検定、p=0.4。26人の個体を、系統樹分析において互いに分離されている2つの系譜のウイルスに感染させた図1。しかし、同じ患者において、異なる系譜のウイルス間で、Env偽ウイルスの感染性には有意な相違は観察されなかったデータ未提示。Env機能における可変性の範囲を考慮すると、偽ウイルスアッセイにおけるEnv感染性のレベルが、タンパク質発現レベル、または血漿ウイルスRNA負荷のいずれかと関連するかどうかに関心が持たれた。図5に示すように、偽ウイルス感染性およびウイルス負荷の間には、正の相関に向かう傾向が見られたp=0.05。Envクローンがかなりの範囲の感染性を示す3人の被験体ZM400、ZM413およびZM414由来の多数のenvSGAに関するウェスタンブロットによって、トランスフェクションされた293T細胞におけるタンパク質発現を定量化した。独立のトランスフェクション間の変動に関して調節するため、Env発現を同じ細胞におけるp24Gagタンパク質発現に対して標準化した。サイズおよびgp160のgp120へのプロセシング切断効率は、試験したenv遺伝子間で異なった。すべてのEnvはZM414ではほとんどサイズ変動を示さず未成熟に一部切除されたものを除く、一方、他のものはZM400およびZM413の両方で多様であった図6。外部ドメインgp120は、ZM400においてすべての発現されたEnvに関して観察されたが、ZM413およびZM414では、大部分が未切断gp160であった。Env偽ウイルスの感染性は、各個体におけるEnv発現のレベルに相関しないことが見出された。これらの結果は、感染性における変動が、トランスフェクション細胞における発現レベル、タンパク質サイズまたはgp160の切断効率によっては決定されないことを示唆した。成熟HIV-1粒子上には少数のEnvスパイクしか存在しないため、トランスフェクション細胞における感染に十分なEnvの量が、完全に感染性の偽ウイルスの産生に必要な閾値よりも高かった可能性がある[47、48]。非感染性偽ウイルスは、Env発現の非存在または一部切除Env発現のいずれかと関連した;これらの場合は、配列分析によって、未成熟停止コドンまたはフレームシフト欠失のいずれかによって説明された。自己および異種中和。各被験体由来の多数の代表的なEnv偽型ウイルスに対する血漿サンプルをアッセイすることによって、自己および異種血漿サンプルにおける中和活性のチェッカーボードスタイルのデータセットを生成した。血漿供給が限定されていたため、15人の被験体14のサブタイプCおよび1つのA/C組換え体由来の血漿サンプルに加えて1つのさらなる血漿サンプルZM383を用いて、これらの15人の被験体由来の60のEnv偽型ウイルスを用いて中和アッセイを実行することが可能であるのみであった。最尤系統樹分析に見られるように、ウイルス集団を代表する、各被験体由来の多数のenv遺伝子3~6の範囲を選択した図7。単系統ウイルスに関しては、3または4のenv遺伝子を選択する一方、多数のEnv系譜を持つ個体において、各系譜から1~3のenv遺伝子を選択した。中和結果を図8に要約する。大部分のウイルス/血漿組み合わせ75は、20~3,769の中和力価で陽性であり、ここで、組み合わせのおよそ1/3は、>100の中和力価を生じた図8。1人の被験体ZM380を除きすべてで、同時期血漿すなわちEnvと同じ時点で得られた血漿による多様なレベルの自己ウイルス中和が検出された。大部分の場合で、中和強度は比較的低かった;が、7人の被験体ZM378、ZM379、ZM401、ZM408、ZM413、ZM416およびZM417の自己ウイルス擬似種において、少なくとも1つの変異体に対して、>100の力価が検出された。いくつかの場合で、同じ被験体由来の多数のenv遺伝子間で、実質的な相違が見られた。例えば、被験体ZM408における多数のenv変異体に対する自己中和の力価は、24~598の範囲であり、そして被験体ZM416において、これらは37~449の範囲であった。異種血漿によって、中和感受性に関して、すべてのEnv偽型ウイルスをアッセイした。ヒートマップ分析によって、血漿サンプルを、低いLおよび高いH中和強度群に分離した図9。血漿サンプルの統計的に支持されるクラスター化が観察され、特徴的な低活性クラスターを左側に囲む。全体として、7つの血漿サンプルは、限定された交差中和活性を有した。しかし、他の9つの血漿サンプルは、中程度から強度の交差反応性中和活性図8および図9を所持した。いくつかの血漿ZM408、ZM378、ZM395およびZM379は15の感染個体由来の60の偽ウイルスのほぼすべてを中和した。中和シグネチャー分析。強力でそして交差反応性のNabを含む血漿サンプルの同定によって、本発明者らは、これらの被験体由来のEnvの間に、強力な中和活性に関連するシグネチャー配列が存在するかどうか疑問を抱いた。各血漿サンプルは個体あたり1つの値に相当するため、本発明者らはシグネチャー研究のため、個体内のすべての変異体のコンセンサス配列のみを用い、それによって、各被験体に見られる各位の最も共通のアミノ酸を捕捉した。本発明者らは、先に記載された最尤系統樹補正法[44]を用いて、ヒートマップに示される2つの別個のクラスターに基づき、強いまたは弱いサブタイプC交差反応性中和反応のいずれかと関連するアミノ酸を探した図9。多数の試験課題があるためEnvのすべての部位に関して試験を行った、本発明者らは、p値の分布に基づいて、q値を用いて、偽発見率を概算した[45]。4つのシグネチャー部位が同定された:3つはgp120中であり、そして1つはgp41中であった。各部位は0.03のp値を有したが、0.27のq値を有し;したがって、同定されたシグネチャーの1またはそれより多くが偽陽性であった可能性もある図10。本発明者らは、これらが有意性に向かう最強の傾向を示したため、本明細書において、仮説を生じさせる様式で、これらを含めた。興味深いことに、4つのシグネチャー部位のうち3つがV4領域で見られた393G、397G、および413N。V4領域は、C3アルファ-2らせんドメインと関連して、サブタイプCウイルスにおける中和感受性パターンに寄与すると考えられる[18、49、50]図11。第4のシグネチャーは、gp41細胞質ドメインの末端で見られ、そして856位のリジンLからなった。最も興味深いシグネチャーは413N位であり、これは弱い反応を有するものに対して、特に強力な中和抗体を誘発する個体から単離されたエンベロープのマルチサブタイプ研究において、優れた血清学的Nab幅と関連して独立に同定された、N連結グリコシル化部位シグネチャーの一部である投稿準備中、SG、BH、FG、DMおよびBK。したがって、より交差反応性のNabを刺激するEnvは、413位においてAsnNに突然変異している傾向があった。これらはまた、393位および397位でGlyGに向かう突然変異を有する傾向があったが、397位は非常に変動性である領域中にあり、信頼性を持って整列させるのが困難であった。興味深いことに、自己中和活性は、異種中和強度のL血漿群よりもH血漿群において、有意により高かったp=0.0016図12。言い換えると、異種ウイルスに対してより強い中和活性を所持する血漿は、同時期自己ウイルスをより強力に中和した。さらに、393位、397位、および413位は、単一の個体内で非常に可変性であることが見出され、これらの部位に対して、異なる感染において反復性の免疫圧があることが示された。総合すると、これらのデータは、V4ループにおけるシグネチャーパターンが、サブタイプCウイルスに対する強力でそして交差反応性の中和抗体の刺激に重要でありうることを示唆する。要約すると、本発明者らは、SGAおよびpPCR法を用いて、37人の個体各々において、多数のHIV-1env遺伝子を特徴付けた。各個体におけるenv遺伝子擬似種の配列および機能分析によって、ウイルスの多数の系譜、頻繁なクローン増殖、ウイルス負荷およびEnv偽ウイルスの感染性の間の正の相関に向かう傾向、env遺伝子擬似種集団間の非常に多様な感染性、ならびに高レベルの中和活性を持つ血漿における配列のV4領域中のシグネチャーアミノ酸が示された。こうした中和シグネチャーの同定は、有効なHIV-1ワクチンの開発に関する意味を有しうる。慢性HIV-1感染に関して予期されるように、本明細書の本研究において、非常に多様なウイルス擬似種集団が検出された。被験体内env遺伝子多様性は、この研究においては8もの高さであった。本発明者らが最近確立したpPCR法を用いて、本発明者らは、SGAPCR産物をクローニングすることなく、偽ウイルスを生成することによって、HIV-1感染個体各々から、多数のenv遺伝子の表現型的特性を特徴付け可能であった。37人の個体由来の474のEnv偽ウイルスの感染性を分析すると、高い割合80のenv遺伝子が機能性であることが明らかになった。これは、より少数のenv遺伝子を用いた本発明者らの先の報告[38]と一致するが、PBMCからバルクPCRによって特徴付けられたenv遺伝子集団から報告される率10よりもはるかにより高い[25]。率が異なるのは、env遺伝子を得るのに用いた方法およびサンプル供給源が異なるためである可能性が高かった。機能分析によって、同じ個体由来のEnv偽ウイルスの感染性が大部分の個体において有意に多様である1~2対数ことが示された。これは、1人の個体由来の血漿から得られたenv遺伝子[51]に類似であるが、同じ個体から均一の感染性を示す、PBMC由来env遺伝子[25]とは異なる。トランスフェクションされた細胞におけるEnvタンパク質の検査によって、各個体中のEnv偽ウイルス間の感染性の変動は、invitro発現レベルとは相関しないことが示された。損なわれていないenvオープンリーディングフレームがある場合、env遺伝子の非機能性は、ウイルス粒子内への取り込み、またはターゲット細胞上のCD4および共受容体との劣った相互作用に影響を及ぼす突然変異によって、引き起こされうる。興味深いことに、Env偽ウイルスの感染性レベルおよびドナー被験体におけるウイルス負荷の間で、正の相関傾向が観察され、invivoで、より感染性であるenv遺伝子が、高レベルのウイルス負荷を導きうることが示唆された。37人の個体のうち13人35が擬似種ウイルス集団の間の緊密に関連する配列の1または2のクラスターを所持した。各個体にユニークであり、そして個体内で保存されるこれらの配列は、互いに同一であるかまたはほぼ同一であった。各配列は、SGAによって独立のPCRから得られるため、これらはinvivo由来の独立のウイルスゲノムに相当する。関連しているが、同一のまたはほぼ同一の配列から分岐し始めているenv配列、ならびにこれらの保存されるセットおよびその個体由来のより多様なウイルスの間の組換え体によって、感染個体において、いくつかのウイルスのクローン増殖があることが示される。全体として、これらはウイルス集団の9~38を占めた。いくつかのウイルス種のクローン増殖が、HIV-1感染個体において、異なる組織で見られた[52]。血漿におけるクローン増殖ウイルスの供給源が何かは明らかでない。クローン増殖ウイルスが、複製適合または免疫回避突然変異のため、利点を有する可能性がある。クローン増殖ウイルスは、主要なウイルス集団におけるウイルスのものとは異なるアミノ酸を含有するため、そしてこれらは他のウイルスと組換え可能であるため図2I、これらは、主な集団のウイルスによって誘発される免疫反応の回避に役割を果たす可能性もある。この仮説を試験するには、多数の時点のサンプルの長期的な研究が必要であろう。自己および異種血漿サンプルを用いた、各個体由来の多数の代表的なenv遺伝子を含むチェックボード中和データの分析によって、強力な中和血漿と関連する3アミノ酸のシグネチャーが明らかになった。gp120のV4ループ中のシグネチャー部位393および397と関連するグリシンは、いくつかの方式で抗体中和に影響を及ぼしうる。まず、側鎖に関連する静電電荷の喪失が、同族エピトープの静電ポテンシャルを調節することによって、抗体結合を妨害する可能性もある。第二に、側鎖を欠くため、グリシンはより高い柔軟性を示し、V4ループ中のコンホメーション運動に影響を及ぼす可能性もある。393位および397位のグリシンによる柔軟性およびより少ない電荷反発によって、V4が非常に多様なコンホメーションをサンプリングすることが可能になりうる。対照的に、シグネチャー413Nは、N連結グリコシル化を仲介し、そして立体障害によって潜在的にV4ループ運動を阻害することによって、役割を果たしうる。部位413は、17bおよびCCR5結合部位に近位であり、そして近位結合モチーフRIKQHXB2残基419~422に隣接する。最近の糖ペプチド質量分析MS研究によって、M群コンセンサスHIV-1エンベロープ、CON-Sgp140において、この部位でグリカンが実際に付着していることが見出された[53]。高解像度法、オンライン高性能液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレイイオン化質量分析HPLC/ESI-MSおよびオフラインHPLC後のマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析MALDI-MSの両方によって、潜在的なグリコシル化部位413が実際にグリコシル化されていることが決定された。しかし、この位のグリコシル化が、invivoでのより高いレベルの中和抗体力価の誘導とどのように関連しているかは不明である。この位は非常に可変性であり;実際、強い反応を誘発するのに必要であるのではなく、強い反応によって反対に選択されるselectedagainstため、グリコシル化部位が、強力な中和活性と関連するEnvにおいて濃縮される可能性もある。最近の研究において、5つのサブタイプBおよび5つのCサブタイプウイルスのパネルに対して、36の血清を用いて、サブタイプC血清において中和シグネチャーが調べられた[20]。シグネチャーパターンの追跡を可能にする、血清学的パターンの明らかなクラスター化は見出されなかった。しかし、V1~V4ループの長さおよび交差サブタイプ中和能力の間の相関が観察された。本研究において、本発明者らは、ウィルコクソン順位統計を用いて、高いおよび低い中和血漿によってグループ化された各個体由来のコンセンサスEnvの長さを比較することによって、V1~V4の全長またはV1、V2、およびV4の長さを別個に比較した際、こうした相関に関する証拠を発見しなかった。これは単に、サンプルの数がこの効果を示すには不足していたためである可能性もある。他の可能性は、本研究におけるすべてのサンプルが、免疫回避の発展中に、可変ループの長さがすでに長くなっているCHI個体由来のものであることである。先の研究はまた、アルファ-2らせんが強い選択圧の下にあることを示し[50]、そしてこの領域がサブタイプCウイルスの自己中和に対する耐性と関連することが見出された[49]。V4領域は、アルファ-2らせんのすぐ下流であり、そしてこれらは構造的に互いに近い。C3V4領域が、自己および異種Nabの誘導に関与する可能性があることもまた見出された[18]。新規に同定された3つのシグネチャーアミノ酸は、Nabによってターゲティングされる先に報告された領域の近位に位置し、三次構造がサブタイプCウイルスに対するNabの誘導に重要な役割を果たしうることが示唆される。この潜在的なシグネチャーの同定は、少なくとも、世界中に最も蔓延しているHIV-1サブタイプであるサブタイプCに対する、強力で、そして広く反応性であるNabを誘発する新世代Env免疫原の設計を補助しうる。参考文献表表1.HIV-1感染個体由来のSGAおよび機能性env遺伝子の要約表2.HIV-1感染個体におけるクローン増殖env配列の特徴付け注:停止コドン;I-系統樹クラスターI;II-系統樹クラスターII本明細書に引用するすべての文書および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。"