以下の段階を含むことを特徴とする、単量体型または凝集型のポリペプチドを得る方法:a単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を、pH4からpH6のpH値で非誘導体化コントロールドポアガラスcontrolledporeglassと共にインキュベートする段階、およびb上清を回収し、それによって単量体型のポリペプチドを得る段階、または、a単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を、pH4からpH6のpH値で非誘導体化コントロールドポアガラスと共にインキュベートする段階、b溶液からコントロールドポアガラスを回収する段階、c回収されたコントロールドポアガラスをpH2からpH3、またはpH7からpH8のpH値の第二の溶液と共にインキュベートし、それによって凝集型のポリペプチドを得る段階。以下の段階を含む、ポリペプチドを産生する方法:aポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する段階;b細胞または培養培地からポリペプチドを回収する段階;c回収したポリペプチドを含む溶液を、pH4からpH6のpH値で非誘導体化コントロールドポアガラスと共にインキュベートする段階;およびd上清を回収し、それによってポリペプチドを産生する段階。非誘導体化コントロールドポアガラスが非誘導体化コントロールドポアガラスビーズであることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。ポリペプチド1グラムあたり100m2から150m2の表面を有する非誘導体化コントロールドポアガラスを用いることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。ポリペプチドが免疫グロブリン、または免疫グロブリン断片、または免疫グロブリンコンジュゲートであることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。溶液が各々のpH値の緩衝溶液であることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。最後の段階として、1つまたは複数のクロマトグラフィー分離段階によってポリペプチドを精製する段階、を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。回収する段階が、遠心分離または濾過によって行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。インキュベートする段階が、1分から6時間であることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。pH4からpH6のpH値で高分子量のポリペプチドを吸着させるための非誘導体化コントロールドポアガラスの使用。a非誘導体化コントロールドポアガラスビーズ;bpH4からpH6のpH値の緩衝溶液;cpH2からpH3のpH値の緩衝溶液;dpH7からpH8のpH値の緩衝溶液を含むキット。発明の詳細な説明概して、凝集免疫グロブリンのみならず他の高分子量化合物から単量体の免疫グロブリンを分離する場合、一般的にクロマトグラフィー法が使用される。現在、非誘導体化コントロールドポアガラスuCPGが、たとえば非誘導体化Sepharose商標と比較して、溶液中に存在する二量体およびオリゴマーの免疫グロブリンならびに高分子量化合物に選択的に結合することが見いだされている。単量体の免疫グロブリンは、たとえばクロマトグラフィー材料としてuCPGを含有するクロマトグラフィーカラムのフロースルーから、または溶液をuCPGと共にインキュベートした上清から回収することができる。この効果は、緩衝溶液中の約50のpH値で顕著である。免疫グロブリン1gあたりおよそ50m2から150m2のuCPG表面により、凝集体の95までを回収することができ、単量体の免疫グロブリンの収量は80から90である。uCPGの適用を用いて、貯蔵前、または貯蔵後でさえも、活性な薬学成分バルクまたは最終調合材料から二量体およびオリゴマーを除去することができる。ポリペプチドは、天然または合成で産生されるか否かによらず、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基のポリマーである。アミノ酸残基約20個未満のポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。タンパク質は、1つもしくは複数のポリペプチド鎖または100個より多くのアミノ酸残基の少なくとも1つのポリペプチド鎖を含む高分子である。ポリペプチドはまた、炭水化物基などの非ペプチド成分を含みうる。炭水化物基および他の非ペプチド置換基を、ポリペプチドが産生される細胞によってポリペプチドに付加してもよく、置換基は細胞のタイプによって変化するであろう。ポリペプチドは、そのアミノ酸骨格構造に関して本明細書において定義される;炭水化物基などの置換基は一般的に明記されないが、それにもかかわらず存在しうる。免疫グロブリンという用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質を意味する。認められている免疫グロブリン遺伝子は、異なる定常領域遺伝子のみならず免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。免疫グロブリンは、たとえばFv、Fab、およびF2ならびに一本鎖scFv、またはダイアボディを含む多様な形状で存在しうる。完全な免疫グロブリンという用語は、2つの軽鎖免疫グロブリンポリペプチド軽鎖と2つの重鎖免疫グロブリンポリペプチド重鎖とを含む免疫グロブリンを意味する。重鎖および軽鎖免疫グロブリンポリペプチドの各々は、抗原と相互作用することができる結合領域を含む可変ドメイン可変領域、一般的にアミノ末端部分を含有する。重鎖および軽鎖免疫グロブリンポリペプチドの各々は、定常領域一般的にカルボキシル末端部分を含む。免疫グロブリン軽鎖または重鎖の可変ドメインは、順に異なるセグメント、すなわち、4つのフレームワーク領域FRおよび3つの超可変領域CDRを含む。免疫グロブリン断片という用語は、重鎖の可変ドメインVH、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、もしくはCH4ドメイン、または軽鎖の可変ドメインVLもしくはCLドメインから選択される少なくとも1つのドメインを含むポリペプチドを意味する。同様に、その誘導体および変種が含まれる。たとえば、1つまたは複数のアミノ酸またはアミノ酸領域が欠失している可変ドメインが存在しうる。免疫グロブリンコンジュゲートという用語は、さらなるポリペプチドとのペプチド結合を介して結合された免疫グロブリン重鎖または軽鎖の少なくとも1つのドメインを含むポリペプチドを意味する。さらなるポリペプチドは、ホルモン、または毒素、または増殖因子受容体、または抗融合ペプチド、または補体因子等などの非免疫グロブリンペプチドでありうる。組換えによって産生された免疫グロブリンを精製するために、異なるカラムクロマトグラフィー段階の組み合わせを用いることができる。一般的に、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーの後に、1つまたは2つの追加の分離段階を行う。最終精製段階は、凝集免疫グロブリン、残留HCP宿主細胞タンパク質、DNA宿主細胞核酸、ウイルス、または内毒素などの、微量の不純物および混入物を除去するためのいわゆる仕上げ段階である。この仕上げ段階に関して、フロースルーモードの陰イオン交換材料を用いることができる。タンパク質を回収および精製するために、微生物タンパク質によるアフィニティクロマトグラフィーたとえば、プロテインAまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーたとえば、陽イオン交換カルボキシメチル樹脂、陰イオン交換アミノエチル樹脂、および混合モード交換、チオフィリックthiophilic吸着たとえば、βメルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いる、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィーたとえば、フェニルSepharose、アザアレノフィリックarenophilic樹脂、またはmアミノフェニルボロン酸を用いる、金属キレートアフィニティクロマトグラフィーたとえば、NiおよびCuアフィニティ材料を用いる、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などのなどの異なる方法を用いることができる。互換的に用いることができる単量体型免疫グロブリンおよび単量体の免疫グロブリンという用語、ならびにその文法的同等物は、第二の免疫グロブリン分子に結合していない、すなわち別の免疫グロブリン分子に共有的にまたは非共有的に結合していない免疫グロブリン分子を意味する。互換的に用いることができる凝集型免疫グロブリンおよび凝集免疫グロブリンという用語、ならびに二量体の免疫グロブリンおよび多量体の免疫グロブリンという用語ならびにその全ての文法的同等物は、少なくとも1つの追加の免疫グロブリン分子に共有的または非共有的に結合して、サイズ排除クロマトグラフィーカラムから1つのピークとして溶出される免疫グロブリン分子を意味する。本出願において用いられる単量体型という用語およびその文法的同等物は、免疫グロブリン分子の100が単量体型で存在することを必ずしも意味するわけではない。この用語は、サイズ排除クロマトグラムのピーク面積として決定した場合に、免疫グロブリンが本質的に単量体型であること、すなわち免疫グロブリンの少なくとも90が単量体型であること、ある態様においては、免疫グロブリンの少なくとも95が単量体型であること、別の態様においては、免疫グロブリンの少なくとも98が単量体型であること、さらなる態様においては、免疫グロブリンの少なくとも99が単量体型であること、および最後の態様においては、免疫グロブリンの99より多くが単量体型であることを意味する。単量体型および凝集型という用語は、他の免疫グロブリンに結合していない免疫グロブリン分子と、他の免疫グロブリン分子に結合している免疫グロブリン分子との混合物を意味する。この混合物において、単量体型も凝集型も、排他的に存在するわけではない。高分子量HMW型という用語は、ポリマーの、すなわち凝集した免疫グロブリンを意味し、この場合、該凝集体は水性緩衝溶液中でなおも可溶性である。本出願において用いられる100という用語は、明記された成分以外の成分の量が、明記された条件下で言及された分析法の検出限界未満であることを意味する。本出願において用いられる90、95、98、99という用語は、正確な値ではないが、明記された条件下で言及された分析法の精度内である値を意味する。クロマトグラフィー材料は、コア材料およびそれに付着したクロマトグラフィー官能基を含む。コア材料は、シリカ、ゼオライト、ヒドロキシアパタイト、もしくはガラスなどの無機材料、セルロースもしくはアガロースなどの有機材料、またはポリなどの合成ポリマー材料でありうる。本明細書において報告される方法において用いられる溶液は、1つの態様において緩衝溶液である。緩衝溶液という用語は、酸またはアルカリ物質の添加または放出によるpHの変化が、溶存する緩衝物質によって平均される溶液を意味する。そのような特性を有する任意の緩衝物質を用いることができる。一般的に、薬学的に許容される緩衝物質が用いられる。1つの態様において、緩衝溶液は、リン酸および/またはその塩からなるリン酸緩衝溶液、または酢酸および/またはその塩からなる酢酸緩衝溶液、またはクエン酸および/またはその塩からなるクエン酸緩衝溶液、またはモルフォリン緩衝溶液、または2エタンスルホン酸緩衝溶液、またはヒスチジン緩衝溶液、またはグリシン緩衝溶液、またはトリスアミノメタンTRIS緩衝溶液から選択される。別の態様において、緩衝溶液は、リン酸緩衝溶液、または酢酸緩衝溶液、またはクエン酸緩衝溶液、またはヒスチジン緩衝溶液から選択される。任意で、緩衝溶液は、たとえば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、またはクエン酸カリウムなどの追加の塩を含みうる。非誘導体化クロマトグラフィーコア材料、特に非誘導体化コントロールドポアガラスを用いて、ポリペプチド、特に凝集型免疫グロブリン、すなわち二量体およびオリゴマーの免疫グロブリン分子を選択的に吸着させることができる。一般的に、CPGビーズは、約125μmの平均粒子径を有する。本明細書において用いられるCPGビーズの特異的表面積は36m2gであると決定された。図1Aにおいて、非誘導体化コントロールドポアガラス、架橋アガロースSepharose商標、およびポリの吸着特性を示す。ポリペプチドは、一方で非誘導体化コントロールドポアガラスに結合することができることが認められ、他方で、結合能の、強いpH依存性を認めることができる。図1Bに認められうるように、ProSepvAウルトラ培地は、pH75でIgGの最高の吸着を示す。ProSepvAウルトラ培地は、プロテインAアフィニティリガンドがガラス表面に結合している官能化CPG材料である。pH50では、CPGに対するIgGの吸着は、官能化プロテインAゲルより高いことが観察された。pH30、50、および75の異なるpH値でIgGをuCPGと共にインキュベートした後、上清をSEHPLCによって分析した。pH50および75での非誘導体化CPGビーズとのインキュベーション後、溶液から可溶性凝集体がほぼ完全に除去されたことが観察された図2。図6は、pH50のpH値で12時間のインキュベーション後にuCPGに吸着したIgGの量対上清中のタンパク質濃度を示す。比較的低いタンパク質濃度で飽和に達することができ、20mgIgGm2CPGで最大吸着に達することができる。タンパク質をロードしたCPGをpH30のpH値の緩衝溶液中でインキュベートすると、定量的脱離を行うことができる。シリカ表面に対するタンパク質の吸着は一般的に、定義された条件下で可逆的であると報告されている。クロロホルム、メタノール、または2プロパノールなどの刺激の強い化学溶媒を用いることができるたとえば、ManningJNetalJournalofChromatographyB4874150StankovicCJetalAnalBiochem184100103を参照されたい。その上、pH値を変化させることに加えてたとえば、EdyVGetalJGenVirol33517521を参照されたい、カオトロピック塩を用いることができるたとえば、MecsIetalArchVirol81303311を参照されたい。最大の吸着はpH50で観察することができる図7。IgG吸着の減少は、pHをIgGの等電点IPより上に上昇させた場合に観察することができるたとえば、IPは、図8に示されるIgGのゼータ電位測定を用いることによって80であると決定された。IgGのゼータ電位は、pH値滴定に応じて決定することができる。ナノサイズのCPGの表面電荷も同様にpH値に依存する。CPGのIPは、約4であると測定され得る。pH4を超えるpH値では、CPGの表面電荷は、陽性から陰性へと変化する。たとえば、68HMWを含有する溶液を、約5のpH値で01m2から10m2の異なるuCPG表面積と共にインキュベートした。溶液中の残留HMW高分子量化合物の百分率を、SEHPLCを用いて上清中で決定した。図4において、インキュベーション前に当初存在した、タンパク質1グラムあたりのCPG表面積に吸着した百分率での単量体およびHMWの量を示す。50m2CPG表面gIgGを用いる場合、溶液中に当初存在したHMWの63を吸着させることができる。溶液中に当初存在した単量体の9が粒子に結合する。140m2CPG表面gタンパク質を適用することにより、HMWのほぼ95が結合することができるが、単量体の22が吸着されるに過ぎない。約250m2CPG表面gタンパク質では、HMWのほぼ100がCPG表面に吸着することができる図5を参照されたい。50m2から150m2CPG表面gタンパク質のあいだで、オリゴマーをほぼ完全に除去することができる。インキュベーションの際に存在するCPG表面積は、溶液中に残っているLMW低分子量化合物の量に対して効果を有しない。このように、免疫グロブリンの可溶性凝集体を、非誘導体化CPGに吸着させることができる。タンパク質1グラムあたりに利用することができるCPGの表面積を用いて、インキュベーション後に溶液中に残っている凝集種および単量体種の量を制御することができる。100m2から150m2gタンパク質の表面積を用いて、約5のpH値でIgG溶液から可溶性凝集体の60から95を除去することができ、同時に単量体IgGの80から90が溶液中に残っている。タンパク質のコンフォメーションを、表面への吸着前、吸着中、および吸着後に調べた。6日間のインキュベーションのあいだ、不溶性凝集体の形成によるタンパク質の喪失は認められない。SEHPLCによって測定されたHMWのレベルは、CPGの表面積が増加すると減少した。1日インキュベーション後、インキュベーションを5日間延長しても、可溶性凝集体レベルのさらなる減少は検出されない。上清中のHMWの増加は測定されない。1つの態様において、インキュベーションは1分から24時間である。さらなる態様において、インキュベーションは1分から6時間である。uCPGにIgGを曝露しても、FTIR分光法によって測定した場合に二次構造のコンフォメーションの変化は起こらなかった。本明細書において報告される局面は、pH4からpH6のpH値で非誘導体化コントロールドポアガラスと共にポリペプチドをインキュベートする段階、を含む、ポリペプチドを得る方法である。1つの態様において、非誘導体化コントロールドポアガラスは、pH45からpH55のpH値で用いられる。別の態様において、uCPGは、約pH5のpH値で用いられる。別の態様において、インキュベートする段階は緩衝溶液中である。約という用語は、その後に続く値が正確な値ではないが、1つの態様において、その値の±10、または別の態様において、その値の±5、またはさらなる態様において、その値の±2、または1つの態様において、その値の±1である範囲の中心点であることを意味する。値が百分率で与えられる相対値である場合、約という用語はまた、その後に続く値が正確な値ではないが、1つの態様において、その値の±10、または別の態様において、その値の±5、またはさらなる態様において、その値の±2、または1つの態様において、その値の±1である範囲の中心点であることを意味し、範囲の上限は100の値を超えることはできない。1つの態様において、ポリペプチド、特に単量体型の免疫グロブリンを得る方法は、以下の段階を含む:apH4からpH6のpH値で、単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を非誘導体化コントロールドポアガラスと共にインキュベートする段階;b上清を回収し、それによって段階aの上清から単量体型のポリペプチドを得る段階。別の態様において、ポリペプチド、特に凝集型の免疫グロブリンを得る方法は以下の段階を含む:apH4からpH6のpH値で、単量体型および凝集型のポリペプチドを含む溶液を非誘導体化コントロールドポアガラスと共にインキュベートする段階;bインキュベートした非誘導体化コントロールドポアガラスを回収する段階;c段階aの溶液のpH値とは少なくとも2pH単位異なるpH値での溶液のインキュベーションにより、非誘導体化コントロールドポアガラスから凝集型ポリペプチドを回収する段階。1つの態様において、インキュベーションは、ポリペプチドを含む溶液に、非誘導体化コントロールドポアガラスの規定量を添加する段階によって行われる。同様に1つの態様において、インキュベートする段階は、非誘導体化コントロールドポアガラスを含むクロマトグラフィーカラムに溶液を適用することによって行われる。第一の態様において、ポリペプチドは、インキュベーションの上清から回収される。第二の態様において、ポリペプチドはカラムのフロースルーから回収される。高分子量化合物の回収は、いずれの態様においてもインキュベーション溶液のpH値から少なくとも2pH単位異なるpH値で、溶液をコントロールドポアガラスに適用することによって行われる。1つの態様において、第一の方法はバッチ法である。1つの態様において、方法は以下の段階を含む:免疫グロブリンを含む溶液をプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって精製する段階;任意で、免疫グロブリンをイオン交換クロマトグラフィーによって精製する段階;pH4からpH6のpH値で、溶液を含む得られた免疫グロブリンを非誘導体化コントロールドポアガラスと共にインキュベートする段階;先の段階の上清を回収し、それによって単量体型の免疫グロブリンを得る段階。本明細書において報告される別の局面は、以下の段階を含む、ポリペプチド、特に単量体型の免疫グロブリンを産生する方法である:aポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階;b細胞または培養培地からポリペプチドを回収する段階;cpH4からpH6のpH値で非誘導体化コントロールドポアガラスと共にポリペプチドをインキュベートする段階;d段階cの上清を回収し、それによって単量体型のポリペプチドを産生する段階。1つの態様において、非誘導体化コントロールドポアガラスと共にインキュベートする段階は、1分から120分である。図3において、pH値および緩衝化合物に依存した非誘導体化コントロールドポアガラスへの高分子量HMW化合物の蓄積を示す。非誘導体化コントロールドポアガラスは、およそpH5のpH値で、緩衝物質とは無関係に免疫グロブリン溶液から高分子量化合物を吸着することが認められうる。1つの態様において、緩衝物質は、酢酸または酢酸ナトリウムもしくは酢酸カリウムなどのその塩、およびクエン酸またはクエン酸ナトリウムもしくはクエン酸カリウムなどのその塩から選択される。図4において、非誘導体化コントロールドポアガラスに対する高分子量HMW化合物の吸着を、単量体の免疫グロブリンの吸着と比較する。HMW化合物の吸着量は、適用したポリペプチドの質量あたりのコントロールドポアガラスの表面積に対して指数関数的依存性を示すことが認められうる。単量体の免疫グロブリンの吸着量は、適用されたポリペプチドの質量あたりコントロールドポアガラスの表面に対して一次関数的依存性を示す。図5において、異なるように処置した溶液のサイズ排除クロマトグラムを示す。たとえば140m2CPG表面gポリペプチドを用いることによって、高分子量化合物の低減が起こることが認められうる。図6において、非誘導体化コントロールドポアガラスの表面被覆を示す。表面被覆は、非誘導体化コントロールドポアガラスの2mgm2表面に達したことが認められうる。吸着は、pH値を変化させることによって元に戻すことができる。ある態様では、吸着した高分子量化合物は、pH値をpH5から少なくとも2pH単位異なる値に変化させることによって、ある態様では、pH30またはpH70に変化させることによって、非誘導体化コントロールドポアガラスから回収される。二次微分UVまたはIR分光法によって、吸着が二次または三次構造に影響を及ぼさないことが示されうる。免疫グロブリン調製物からの高分子量化合物の選択的吸着により、非誘導体化コントロールドポアガラスを用いることは、凝集型の残留免疫グロブリンを除去するために、後処理プロセスの終了時の活性な薬学的成分の精製にとって適当でありうる。pH5からpH6へのpH値の操作は、バルクの活性な薬学的成分のpH値に対応する。非誘導体化コントロールドポアガラスを用いると、オリゴマー型、および用いない場合に後処理プロセスの後期段階では除去が難しい二量体型の免疫グロブリンでさえも除去することが可能である。加えて、バッチモードでの取り扱いは、非誘導体化コントロールドポアガラスビーズをバルクのタンパク質溶液と単にインキュベートする段階、およびたとえば遠心分離または濾過によってCPGを除去することによって凝集体を除去する段階によって行うことができる。以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載される。記載の技法に改変を行うことができ、それらも本発明の精神の範囲内であると理解される。実施例1材料および方法抗体pH60のヒスチジン緩衝液中でキメラFcIgG1ラットFab抗体の完全に精製したバルクIgGAを実験のために得た。アリコートを、pH30の100mM酢酸緩衝液、pH50の100mM酢酸緩衝液、およびpH75の200mMトリスアミノメタン緩衝液の中で透析した。その後SterivexGV022μmフィルターMilliporeBillericaUSAを用いることによって溶液を濾過した。CPGMilliporeBillericaUSAのControlledporedglassCPG700ビーズを用いた。化学物質用いた他の全ての化学物質および試薬は少なくとも分析等級であった。酸性酸は、FlukaSteinheimGermanyから得、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム、および塩化ナトリウムは、MerckKGDarmstadtGermanyから得、トリスアミノメタンはAngusIbbenbuerenGermanyから得た。LヒスチジンはAjinomotoRaleighUSAから得た。表面に対する吸着モノクローナル抗体mAbのCPG表面に対する吸着を、規定の表面を規定量のタンパク質と共にインキュベートすることによって異なるpHで調べた。それゆえ、ビーズスラリーを精製水MilliQMilliporeBillericaUSAに懸濁し混合した。ビーズを真空濾過022μmセルロースフィルターディスク、SartoriusGoettingenGermanyによって収集して、その後精製水MilliQMilliporeBillericaUSAによってすすいだ。次に、ビーズを40°Cで乾燥させて、ガス吸着BETによって測定された規定の表面を表す、規定の質量を量り取った。次にビーズを、規定のpHでタンパク質溶液と混合して、ロータリーミキサーRM5FroebelLindauGermanyにおいて35rpmで上部空き高なしで室温で12時間インキュベートした。次に試料を、10000×gで10分間遠心分離して、ビーズをタンパク質溶液から分離した。遠心分離した試料の上清についてタンパク質濃度の測定およびSEHPLC分析を行った。3つ組の試料を調製し、結果は平均値±SDとして表す。異なるビーズ表面に対するmAbの吸着等温線を、5m2ビーズ表面を含有する試料および02mgmlから60mgmlまでの様々な濃度のmAbを調製することによって決定した。先に記述したように試料を12時間インキュベートし、10000×gで10分間遠心分離して、タンパク質溶液からビーズを分離し、上清中のタンパク質濃度を決定した。上清中で測定されたタンパク質の量を、インキュベーション前に当初存在したタンパク質の量から差し引くことによって、吸着したタンパク質の量を決定した。3つ組の試料を調製し、結果は平均値±SDとして表す。CPG表面に対するHMWの選択的吸着を調べるために、68HMWを含有するpH5の100mM酢酸緩衝液中のIgGを、01~10m2CPG表面と共にインキュベートした。試料を先に記述したように12時間インキュベートし、10000×gで10分間遠心分離して、タンパク質溶液からビーズを分離し、上清中のタンパク質濃度を測定した。加えて、上清をSEHPLCによって分析した。吸着したHMWおよび単量体の量をそれぞれ、上清中で測定されたHMWの量を、インキュベーション前に当初存在したHMWの量から差し引くことによって、決定した。3つ組の試料を調製し、結果は平均値±SDとして表記する。タンパク質濃度の決定タンパク質濃度を、緩衝液ブランクを差し引いた後の280nmおよび320nmでの測光吸光度を用いることによって決定したUVVisspectrophotometerEvolution500ThermoFisherScientificWalthamUSA。320nmでの吸光度を、280nmでの吸光度から差し引き、この吸光度の値を用いて、ランベルトベールの法則に従ってタンパク質含有量を計算した。SEHPLCサイズ排除高速液体クロマトグラフィーSEHPLC実験を、SummitHPLCシステムDionexIdsteinGermanyにおいてTSK3000SWXLカラムTosohBioseparationStuttgartGermanyを用いて行った。溶出のピークを、DionexIdsteinGermanyのUVダイオードアレイ検出器UVD170Uによって、280nmでモニターした。200mMリン酸カリウムおよび250mM塩化カリウムで構成されるpH70の水性緩衝液を用いて、流速05ml分でイソクラティッククロマトグラフィーを室温で行った。各試料は、注入1回あたり100μgのmAbロードを含有した。ChromeleonソフトウェアDionexIdsteinGermanyを用いることによってクロマトグラムをマニュアル通りに積分した。二量体およびより大きい可溶性オリゴマーを含むより高い分子量種HMWの百分率を、単量体のピークおよびより低分子量種LMWのピークを含む総面積に関連する相対面積mAU分として決定した。FTIR分光法ビーズ表面上のタンパク質の二次構造を調べるために、FTIRスペクトルを、ゲルマニウム結晶を用いるMIRacle減衰全反射ATRセルを適用してTensor27BrukerOpticsEttlingenGermanyによって記録した。CPGビーズを、pH50の酢酸緩衝液中6mgmlIgGの溶液と共に室温で12時間インキュベートした。インキュベーション前にSEHPLCによって測定したところ、溶液は15HMWのレベルを示した。インキュベーションは飽和モードで行った。インキュベーション後、ビーズを緩衝液によって洗浄した。pH90の200mMトリス緩衝液を用いてビーズから脱離させた後、AquaSpec透過セルを用いて、タンパク質の二次構造を調べた。850~4000cm1で記録した各々のスペクトルに関して、120スキャンのインターフェログラムを、4cm1の分解能を有する両面獲得モードで収集した。緩衝液と湿ったビーズの参照スペクトルをそれぞれ差し引いて、タンパク質のスペクトルを得た。ベクトルの標準化によってスペクトルを編集した後、OPUS60ソフトウェアBrukerOpticsEttlingenGermanyを適用して13pointSavitskyGolay平滑化関数を用いて、二次微分の生成および平滑化を行った。さらに、透過モードで記録したスペクトルとの比較を可能にするために、ATRモードで記録した吸収スペクトルを、バンドの強度およびバンドの位置に関して修正した。それゆえ、波数依存的異常分散を克服するために、FringeliFringeliUPChimia46200214に従ってソフトウェアOPUS60BrukerOpticsEttlingenGermanyのさらなるATR修正を用いたGoldbergMEandChaffotteAFProteinSci1427812792GrdadolnikJIntJVibrSpec6ed2。ゼータ電位測定異なるpH値でのタンパク質および超音波処理ナノサイズCPG700の電荷を決定するために、タンパク質およびCPG700ビーズの電気泳動移動度を、MalvernZetasizerNanoSMalvernInstrumentsWorcestershireUKを用いるレーザードップラー速度測定法を行うことによって測定した。ゼータ電位ζを、MalvernDTSソフトウェアバージョン50MalvernInstrumentsWorcestershireUKを用いて、均一な電荷分布を仮定してヘンリーの方程式から計算した。試料の調製に関して、5mgmlmAb溶液をpH50の50mM酢酸緩衝液の中で透析して、その後02M塩酸を用いることによってpHを20に滴定した。CPG700ビーズを同じ緩衝液システムに懸濁し、pHを20に調節した。滴定装置MPT2MalvernInstrumentsWorcestershireUKを適用することによって、試料を、02M水酸化ナトリウム溶液によってpH2からpH12まで滴定した。ゼータ電位を、温度制御折り返しキャピラリーセルMalvernInstrumentsWorcestershireUKにおいて25°CでpH2から12のあいだで15段階で決定した。各測定を3回繰り返し、平均値±SDを報告する。