"ターゲット組換えポリペプチドの産生プロセスであって、ターゲットポリペプチドをコードする発現カセットを発現させ、そしてミトコンドリアフォルダーゼをコードする発現カセットを同時発現する工程を含む、前記プロセス。ミトコンドリアフォルダーゼがMia40ファミリーのメンバーを含む、請求項1記載のプロセス。2つまたはそれより多い、好ましくは2つのミトコンドリアフォルダーゼの発現カセットを同時発現させる、先行する請求項いずれか記載のプロセス。ミトコンドリアフォルダーゼがMia40ファミリーのメンバーおよびerv1またはerv2ファミリーのメンバーを含む、請求項3記載のプロセス。ターゲットポリペプチドをコードする発現カセットおよびミトコンドリアフォルダーゼをコードする発現カセットが、異なるベクター上に位置する、先行する請求項いずれか記載のプロセス。ターゲットポリペプチドをコードする発現カセットおよびミトコンドリアフォルダーゼをコードする発現カセットが、同じベクター上に位置する、請求項1~4のいずれか一項に記載のプロセス。ミトコンドリアフォルダーゼを分泌リーダーとともに発現させる、先行する請求項いずれか記載のプロセス。ミトコンドリアフォルダーゼを、可溶性融合パートナー、好ましくはチオレドキシンとともに発現させる、先行する請求項いずれか記載のプロセス。ターゲットポリペプチドをコードする発現カセットおよびミトコンドリアフォルダーゼをコードする発現カセットを含む、タンパク質発現系。ミトコンドリアフォルダーゼがMia40ファミリーのメンバーを含む、請求項9記載のタンパク質発現系。2つまたはそれより多い、好ましくは2つのミトコンドリアフォルダーゼの発現カセットを同時発現させる、請求項9または10記載のタンパク質発現系。ミトコンドリアフォルダーゼを分泌リーダーとともに発現させる、請求項9~11のいずれか一項に記載のタンパク質発現系。ミトコンドリアフォルダーゼを、可溶性融合パートナー、好ましくはチオレドキシンとともに発現させる、請求項9~12のいずれか一項に記載のタンパク質発現系。ミトコンドリアフォルダーゼをコードする発現カセットを含む、ベクター。ミトコンドリアフォルダーゼがMia40ファミリーのメンバーを含む、請求項14記載のベクター。2つまたはそれより多い、好ましくは2つのミトコンドリアフォルダーゼの発現カセットを含む、請求項14または15記載のベクター。ミトコンドリアフォルダーゼの発現カセットがまた、分泌リーダーもコードする、請求項14~16のいずれか一項に記載のベクター。ミトコンドリアフォルダーゼの発現カセットが、可溶性融合パートナー、好ましくはチオレドキシンもまたコードする、請求項14~17のいずれか一項に記載のベクター。請求項9~13のいずれか一項に記載のタンパク質発現系、または請求項14~18のいずれか一項に記載のベクターで形質転換されている、宿主細胞。宿主が大腸菌E.coliである、請求項19記載の宿主細胞。ミトコンドリアフォルダーゼは、ジスルフィド結合の形成およびミトコンドリア膜間腔におけるタンパク質の正しいフォールディングにおいて機能するタンパク質のクラスである。本発明のプロセスにおいて使用可能なミトコンドリアフォルダーゼには、ミトコンドリアスルフィドリルオキシダーゼが含まれる。使用可能なミトコンドリアフォルダーゼには、昆虫および植物ミトコンドリアフォルダーゼ、ならびに特に哺乳動物および酵母ミトコンドリアフォルダーゼ、ならびに前述のいずれかの機能性断片が含まれる。ミトコンドリアフォルダーゼの機能性断片には、一般的に、対応する参照フォルダーゼのスルフィドリルオキシダーゼドメイン断片またはスルフィドリルオキシダーゼ活性を有するその相同体が含まれる。例えば、酵母ミトコンドリアフォルダーゼは、一般的に、ミトコンドリア膜に活性モチーフを係留するように働く配列を含む。本発明において、酵母ミトコンドリアフォルダーゼは、存在するアンカー配列とともに使用してもよいし、またはアンカー配列は省かれてもよい。ミトコンドリアフォルダーゼの例は、Mia40ファミリーのメンバーおよびその相同体、ならびにErvファミリーのメンバー、特にErv1およびErv2ファミリーおよびその相同体である。使用可能なMia40ファミリーのメンバーには、ゼブラフィッシュDaniorerio、アフリカツメガエルXenopuslaevis、ニワトリGallusgallus、ヒトHomosapiens、マウスMusmusculus、ラットRattusnorvegicus、イヌCanislupusfamiliaris、ウマEquuscabbalus、チャイニーズハムスターCricetulusgriseus、アメリカムラサキウニStrogylocentratuspurpuratus、セイヨウミツバチApismellifera、キイロショウジョウバエDrosophilamelanogaster、アカイエカCulexpipiens、アカパンカビNeurosporasacrassa、クロコウジカビAspergillusniger、アスペルギルスクラバツスAspergillusclavatus、アスペルギルスフミガツスAspergillusfurnigatus、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、カンジダグラブラタCandidaglabrata、アシュビアゴシピルAshbyagossypil、クリプトコッカスネオフォルマンスCryptococcusneoformans、ピキアパストリスPichiapastoris、ハンゼヌラポリモルファHansenulapolymorpha、オストレオコッカスタウリOstreococcustauri、コットンウッドPopulustrichocarpa、シロイヌナズナArabidopsisthalianaおよびキイロタマホコリカビDictyosteliumdiscoideum由来のMia40の相同体が含まれ、好ましくはヒトおよびサッカロミセスセレビシエのものである。特定の態様において、使用可能なMia40の相同体は、以下の配列番号1と、40より高い、しばしば50より高い、一般的に60より高い相同性、好ましくは80より高い相同性、最も好ましくは90より高い、特に95より高い相同性を有する。Mia40の好ましい相同体は、配列番号1を有するヒトコイルドコイルヘリックスコイルドコイルヘリックスドメイン含有タンパク質-4CHCHD-4である。使用可能なErvファミリーのメンバーには、酵母、哺乳動物、昆虫および植物由来のErv1およびErv2の相同体が含まれる。使用可能なervファミリーのメンバーには、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、ニワトリ、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウマ、チャイニーズハムスター、アメリカムラサキウニ、セイヨウミツバチ、キイロショウジョウバエ、アカイエカ、アカパンカビ、クロコウジカビ、アスペルギルスクラバツス、アスペルギルスフミガツス、サッカロミセスセレビシエ、カンジダアルビカンス、カンジダグラブラタ、アシュビアゴシピル、クリプトコッカスネオフォルマンス、ピキアパストリス、ハンゼヌラポリモルファ、オストレオコッカスタウリ、コットンウッド、シロイヌナズナ、キイロタマホコリカビ、ジャガイモSolanumtuberosam、ブドウVitisvinifera、タルウマゴヤシMedicatotruncatula、ダイズGlycinemax、オオムギHordeumvulgare、モロコシSorghumbicolourおよびトウモロコシZeamays由来のものが含まれ、好ましくはヒトおよびサッカロミセスセレビシエのものである。特定の態様において、Erv、例えばErv1およびErv2の相同体は、酸化還元中心、2つのアミノ酸によって分離されたシステイン対-CXXC-モチーフおよび16アミノ酸によって分離されたシステイン対C-16-CモチーフおよびフラビンアデニンジヌクレオチドFAD結合部位を含むスルフィドリルオキシダーゼ領域を含む。いくつかの好ましい態様において、配列番号6のアミノ酸74~173と、少なくとも40の相同性、好ましくは80より高い相同性、最も好ましくは90より高い、特に95より高い相同性を有するスルフィドリルオキシダーゼ領域を含むErv1相同体を使用する。いくつかの態様において、使用可能なErv1の相同体は、以下の配列番号6と、40より高い、しばしば50より高い、一般的に60より高い相同性、好ましくは80より高い相同性、最も好ましくは90より高い、特に95より高い相同性を有する。Erv1の好ましい相同体は、配列番号6を有するヒト肝再生タンパク質増強因子ALRPである。特定の態様において、使用するミトコンドリアフォルダーゼは、酸化還元中心、2つのアミノ酸によって分離されたシステイン対-CXXC-モチーフおよび16アミノ酸によって分離されたシステイン対C-16-CモチーフおよびFAD結合部位を含む、erv1またはerv2、特に植物、酵母またはヒトerv1またはerv2の機能性断片、例えば80~120アミノ酸、一般的に90~110アミノ酸、そして特に約100アミノ酸を含む断片である。1またはそれより多いミトコンドリアフォルダーゼは、ターゲットポリペプチド、好ましくは2またはそれより多く、そして特にMia40ファミリーのメンバーおよびerv1またはerv2ファミリーのメンバーであるターゲットポリペプチドと同時発現されてもよい。多くの好ましい態様において、ミトコンドリアフォルダーゼを、好ましくはフォルダーゼのN末端側に付着した、分泌リーダーとともに発現させる。特定の態様において、フォルダーゼは、N末端タグと、該タグに、好ましくは該タグのN末端側で付着した分泌リーダーを含む。使用可能な配列リーダーの例には、大腸菌におけるspA、phoA、リボース結合タンパク質、pelB、ompA、ompT、dsbA、torA、torT、およびtolTリーダー、ならびにWO2009/147382に開示される配列番号1、2、3、4および5などの真核リーダー配列が含まれる。2またはそれより多いフォルダーゼを発現させる場合、使用される配列リーダーは、同じであってもまたは異なってもよい。配列リーダーおよびフォルダーゼの組み合わせは、一般的に、当業者に周知の方法によって組み合わせをスクリーニングし、そして所望の特性を提供する組み合わせを選択することによって同定される。使用される分泌リーダーは、フォルダーゼの周辺質へのトランスファーを達成する。特定の態様において、ミトコンドリアフォルダーゼ、特にMia40ファミリーのメンバーを、周辺質におけるフォルダーゼの可溶性を増加させる可溶性融合パートナーとともに発現させる。可溶性融合パートナーの例は、当該技術分野に周知である。好ましい可溶性融合パートナーは、活性または不活性型のいずれでも使用可能なチオレドキシンである。ミトコンドリアフォルダーゼおよびターゲットポリペプチドの発現は、恒常性または誘導性のいずれであってもよいプロモーターの調節下にある。特定の態様において、ミトコンドリアフォルダーゼの発現は恒常性プロモーターの調節下にあり、そしてターゲットポリペプチドの発現は誘導性プロモーターの調節下にある。他の態様において、ミトコンドリアフォルダーゼおよびターゲットポリペプチドの両方の発現は、誘導性プロモーターの調節下にある。これらの態様において、誘導性プロモーターは、同じ誘導因子によって、または異なる誘導因子によって、調節されていてもよい。誘導性プロモーターが同じであってもまたは異なってもよいことが認識されるであろう。いくつかの態様において、ミトコンドリアフォルダーゼおよびターゲットポリペプチドは、単一のプロモーター、好ましくは誘導性プロモーターの調節下にある。2またはそれより多いミトコンドリアフォルダーゼを同時発現させる場合、各フォルダーゼとともに、同じタイプのプロモーターまたは異なるプロモーターを使用してもよい。各フォルダーゼの発現は、望ましい場合、単一のプロモーターの調節下にあってもよい。多くの好ましい態様において、プロモーターは原核プロモーターである。使用可能な原核プロモーターの例には:aファージRNAポリメラーゼ依存性プロモーター、特にT7RNAポリメラーゼ依存性プロモーター系、好ましくは単一のT7プロモーター、本明細書に援用されるStudierおよびMoffat,J.Mol.Biol.189:113-1301986に開示されるものを含む、特にT7遺伝子10プロモーター;およびb宿主RNAポリメラーゼに基づくプロモーター系、特に大腸菌RNAポリメラーゼに基づくプロモーター系が含まれる。T7RNAポリメラーゼ依存性プロモーター系を使用する場合、T7RNAポリメラーゼの供給源が必要であり、これは、当該技術分野に知られる方法によって提供され、そして一般的に、必要なファージポリメラーゼを発現するλDE3プロファージを宿主株内に挿入して、溶原性宿主株を生成することによる。また、T7RNAポリメラーゼ遺伝子を所持する特殊化λ形質導入ファージに感染させることによって、T7RNAポリメラーゼを細胞に送達してもよい。本発明の側面において使用可能な恒常性プロモーターの例には、T7A1、T7A2、T7A3、spcリボソームタンパク質オペロンプロモーター、β-ラクタマーゼ遺伝子プロモーター、ファージλのPLプロモーター、複製調節プロモーターPRNAIおよびPRNAII、rrnBリボソームRNAオペロンのP1およびP2プロモーター、Lacリプレッサータンパク質プロモーターpLacI、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼGAPDHおよび形質膜H-ATPアーゼPMA1プロモーター、接合因子MF-αプロモーター、KEX2、TEF-1、サルウイルス40SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスRSVプロモーター、サイトメガロウイルスCMVプロモーター、およびヒトβ-アクチンプロモーターが含まれる。恒常性プロモーターのさらなる例には、調節領域を除去するように修飾されている誘導性プロモーター、例えばlacまたはtacオペレーターを除去するように修飾されたlacまたはtacプロモーターが含まれる。使用可能な誘導性プロモーターの例には、lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA、アラビノース誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター高温および低温両方、銅誘導性プロモーター、uspA、uspB、malK、浸透圧誘導性プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、フェロモン誘導性プロモーター、グルコアミラーゼプロモーター、テトラサイクリン反応性プロモーター、ヒトc-fosプロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、およびグルココルチコイド誘導性プロモーターが含まれる。プロモーターは、一般的に、宿主細胞において有効であることが知られるプロモーターから選択されると認識される。例えば、大腸菌プロモーターは、一般的に、大腸菌宿主細胞において使用される。恒常性または誘導性型のいずれかで使用される、好ましいプロモーターの例には、T7遺伝子10プロモーター、T7A1、T7A2、T7A3、lpL、lpR、lac、lacUV5、trp、tac、trc、ara、phoAおよびrrnBが含まれる。最も好ましいプロモーターは、lpL、lacおよびtacである。本発明のプロセスにおいて使用される発現カセットは、発現ベクター内に含まれる。発現ベクターは宿主細胞ゲノム内に組み込まれてもよいが、好ましくは、染色体外要素、例えばプラスミド内に含まれる。あるいは、発現ベクターは、ファージまたはウイルスベクター内に組み込まれ、そしてこれらを用いて、宿主細胞系内に発現系を送達してもよい。発現ベクターは、当該技術分野に知られる方法によって組立て可能である。本発明の発現ベクターは、一般的に、プラスミドの形で使用される。プラスミドは染色体外プラスミドまたは組込みプラスミドであってもよく、好ましくは染色体外プラスミドである。誘導性プロモーターを含む発現ベクターは、一般的に、オペレーター配列を含む。本発明記載のプロセスにおいて使用可能なオペレーター配列には、lac、gal、deoおよびglnが含まれる。1またはそれより多い完全パリンドロームオペレーター配列を使用してもよい。いくつかの態様において、2つの完全パリンドロームオペレーター配列を使用し、最も好適には、1つのオペレーター配列はプロモーターの下流に位置し、そして1つのオペレーター配列はプロモーターの上流に位置する。2つのオペレーター系を使用する場合、オペレーター配列には、好ましくは、プロモーターの調節を最大にするためにスペースが置かれる。多くの態様において、スペースは85~150塩基対、置かれており、好ましくは90~126塩基対、置かれており、そして最も好ましくは91または92塩基対、置かれている。特定の態様において、オペレーター配列は、転写開始点と重なる。オペレーター系は、一般的に、適切なリプレッサー配列とともに使用されることが認識されるであろう。リプレッサー配列は、リプレッサータンパク質を産生し、例えばlacオペレーターと用いる場合はlacI遺伝子配列である。他のlacリプレッサー配列もまた使用可能であり、例えば、lacリプレッサータンパク質レベルを増加させるために、lacIQ配列を使用してもよい。リプレッサー配列は、宿主細胞ゲノムによって、またはさらなる適合プラスミドを使用することによってもまた、提供可能である。発現ベクターは、特にベクターがプラスミドを含む際、典型的には、以下の1またはそれより多くも含む:選択可能マーカー、例えば抗生物質耐性を与える配列、およびcer安定性配列。本発明のプロセスで使用可能な宿主細胞は、原核宿主細胞である。原核細胞の例には、細菌細胞、例えば大腸菌、ネズミチフス菌Salmonellatyphimurium、霊菌Serratiamarsescens、プチダ菌Pseudomonasputidaおよび緑膿菌Pseudomonasaeruginosaを含むグラム陰性細菌細胞、ならびに枯草菌Bacillussubtilisを含むグラム陽性細菌細胞が含まれる。好ましい宿主細胞は、細菌、特に腸内細菌科、特に大腸菌、および特にそのBまたはK12株である。多くの特に好ましい態様において、ターゲットポリペプチドは、分泌リーダー、特に周辺質への分泌を達成する周辺質分泌リーダーとともに発現され、好ましくは該リーダーをポリペプチドのN末端側に付着させる。いくつかの態様において、ターゲットポリペプチドは、N末端タグと、該タグに、好ましくは該タグのN末端側に付着した分泌リーダーを含む。使用可能な配列リーダーの例には、大腸菌におけるspA、phoA、リボース結合タンパク質、pelB、ompA、ompT、dsbA、torA、torT、およびtolTリーダー、ならびにWO2009/147382に開示される配列番号1、2、3、4および5などの真核リーダー配列が含まれる。使用される配列リーダーは、ミトコンドリアフォルダーゼで使用される任意の配列リーダーと同じであってもまたは異なっていてもよい。本発明のプロセスによって発現可能なポリペプチドには、療法タンパク質およびペプチドが含まれ、サイトカイン、増殖因子、抗体、抗体断片、免疫グロブリン様ポリペプチド、酵素、ワクチン、ペプチドホルモン、例えばインスリン、ケモカイン、受容体、受容体断片、キナーゼ、ホスファターゼ、イソメラーゼ、ヒドロリアーゼ、転写因子および融合ポリペプチドが含まれる。発現させてもよい抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および生物学的活性を有する抗体断片が含まれ、上記いずれかの多価および/または多重特異性型が含まれる。天然存在抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって相互連結された2つの同一の重H鎖および2つの同一の軽L鎖の4つのポリペプチド鎖を含む。各重鎖は、可変領域VHおよび定常領域CHを含み、CH領域は、天然型において、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3を含む。各軽鎖は、可変領域VLおよび1つのドメイン、CLを含む定常領域を含む。VHおよびVL領域は、より保存された、フレームワーク領域FRと称される領域が散在する、相補性決定領域CDRと称される超過変性領域に、さらに細区分可能である。VHおよびVLは各々、3つのCDRおよび4つのFRで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順で配置される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。発現可能な抗体断片は、望ましい生物学的活性を有する、損なわれていないintact抗体の部分を含む。抗体断片には、一般的に、少なくとも1つの抗原結合部位が含まれる。抗体断片の例には:iVL、CL、VHおよびCH1ドメインを有するFab断片;ii2つのFab誘導体間でジスルフィド架橋によって二価断片を形成可能な、CH1ドメインのC末端に1またはそれより多いシステイン残基を有するFab’断片などのFab誘導体;iiiVHおよびCH1ドメインを有するFd断片;ivCH1ドメインのC末端に1またはそれより多いシステイン残基を有するFd誘導体などのFd誘導体;v抗体の単一アームのVLおよびVHドメインを有するFv断片;viVLおよびVHドメインが共有結合している一本鎖FvscFv抗体などの一本鎖抗体分子;vii定常領域ドメインを含みまたは含まずに別の可変ドメインVHまたはVLドメインポリペプチドに連結された、定常領域ドメインを含まないVHまたはVLドメインポリペプチド例えばVH-VH、VH-VL、またはVL-VL;viiiドメイン抗体断片、例えばVHドメイン、またはVLドメイン、およびVHまたはVLドメインいずれかの抗原結合断片、例えば単離CDR領域からなる断片などのドメイン抗体断片;ix2つの抗原結合部位を含むいわゆるディアボディ、例えば同じポリペプチド鎖中で、軽鎖可変ドメインVLに連結された重鎖可変ドメインVH;ならびにx相補性軽鎖ポリペプチドとともに抗原結合領域の対を形成する、タンデムFdセグメント対を含むいわゆる直鎖抗体が含まれる。調製可能な好ましい抗体断片は、哺乳動物単一可変ドメイン抗体であり、これは、免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列を含み、そして抗原に特異的に結合しすなわち500nMまたはそれ未満、例えば400nMまたはそれ未満、好ましくは250nMまたはそれ未満、および最も好ましくは100nMまたはそれ未満の解離定数、そして単一可変ドメインとして抗原に結合する;すなわちいかなる相補性可変ドメインも含まない、フォールディングされたポリペプチドドメインを含む、抗体断片である。単一可変ドメイン抗体には、完全抗体可変ドメイン、ならびに修飾可変ドメイン、例えば抗体可変ドメインに特徴的でない配列によって1またはそれより多いループが置換されているもの、あるいは一部切除されているtruncatedか、またはNもしくはC末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに可変ドメインのフォールディングされた断片が含まれる。調製可能な好ましい単一可変ドメインは、VHおよびVLの群より選択され、VカッパおよびVラムダを含む。最も好ましくは、単一可変ドメインは、ヒトまたはラクダ科camelidドメインであり、ヒト化ラクダ科ドメインを含む。ターゲットポリペプチドが、分泌される2またはそれより多い鎖を含む場合、特に、ターゲットポリペプチドが、2またはそれより多い鎖を含む断片抗体である場合、鎖の各々は、分泌リーダーに付着することも可能であり、そしてこうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをこれにしたがって設計する。使用される分泌リーダは同じであってもまたは異なってもよい。発現系を、使用される細胞に関して、当該技術分野に周知の方法によって発現させる。好ましい発現法は、特に発酵によって、増殖培地中で宿主細胞を培養し、そして次いで発現されたポリペプチドを回収する工程を含む。用語増殖培地は、宿主細胞が増殖するために用いられる栄養培地を指す。多くの態様において、栄養液を使用する。所定の宿主細胞用の適切な増殖培地およびポリペプチドを回収する方法が、当該技術分野に周知である。誘導性プロモーターを使用する場合、発現は、こうしたプロモーターに適した誘導因子、例えばイソプロピル-β-D-1チオガラクトピラノシドIPTG、IPTGの類似体、例えばイソブチル-C-ガラクトシドIBCG、ラクトースまたはメリビオースを添加することによって誘導可能である。他の誘導剤を用いてもよく、そしてこれらは、別の箇所により詳細に記載される例えば、TheOperon,MillerおよびRenznikoff監修1978を参照されたい。誘導因子は、個々にまたは組み合わせて使用してもよい。本発明のプロセスによって産生されるポリペプチドは、望ましい場合、さらなる精製工程、例えば、イオン交換クロマトグラフィー;疎水性に基づくクロマトグラフィー、例えばHIC、逆相クロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、または混合様式クロマトグラフィー:あるいはサイズに基づく精製、例えばゲルろ過の1またはそれより多くに供してもよい。また、産生されるポリペプチドを1またはそれより多い再フォールディング工程に供してもよい。ミトコンドリアフォルダーゼおよびターゲットポリペプチドの同時発現に関して上述されるような発現カセットを含むタンパク質発現系は、本発明の別の側面を形成する。こうしたタンパク質発現系で形質転換された宿主細胞は、本発明のさらなる側面を形成する。ミトコンドリアフォルダーゼの発現カセットを含むベクターは、本発明のさらに別の側面を含む。本発明は以下の実施例によって、限定なしに例示される。ポリペプチド、ベクターおよび株の要約pAVE354の構築pAVE354構築のための出発プラスミドは、pACYCDuetEMDBioscienceカタログ番号71147-3であった。NcoIおよびXhoIでの消化によって、このベクターからT7プロモーターおよびマルチクローニングサイトを除去した。これらを、国際特許出願WO2007/088371に記載されるように調製されたpAVE029のNcoI-XhoI断片で置き換えた。生じたプラスミドをNBJ0738-7-3と称し、そして制限消化および配列決定によって確認した。ミトコンドリアフォルダーゼヒトコイルドコイルヘリックスコイルドコイルヘリックスドメイン含有タンパク質-4CHCHD-4タンパク質Mia40ファミリーポリペプチドのタンパク質配列を、Genbank、寄託番号AAH33775.1から得た配列番号1:SYARQEGKDRIIFVTKEDHETPSSAELVADDPNDPYEEHGLILPNGNINWNCPCLGGMASGPCGEQFKSAFSCFHYSTEEIKGSDCVDQFRAMQECMQKYPDLYPQEDEDEEEEREKKPAEQAEETAPIEATATKEEEGSS。分泌リーダー配列番号2:MKVSTAFLCLLLTVSAFSAQVLAを含む融合タンパク質を設計した。これを、大腸菌チオレドキシンATrxA:Genbank寄託番号AAA67582.1配列番号3IIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWSGPSKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAのN末端側で、タグDYKDEDK-配列番号16を通じて付着させた。チオレドキシン活性部位51CGPC54を51SGPS54に変化させた。チオレドキシンC末端をCHCHD-4のN末端側に融合させ、これもまた突然変異させて、3位の非触媒システイン残基を除去し、そしてこれをセリン残基で置換した。リーダーを含むこの融合タンパク質のタンパク質配列を配列番号4に示す。配列番号4このタンパク質をコードする、配列番号5の遺伝子を、NBJ0738-7-3のNdeI/XhoI部位にクローニングし、そして制限消化および配列決定によって確認した。配列番号5ミトコンドリアフォルダーゼヒト肝再生タンパク質増強因子ALRP、Erv1ファミリーポリペプチドのタンパク質配列をGenbank寄託番号EAW85580.1から得た配列番号6:AAPGERGRFHGGNLFFLPGGARSEMMDDLATDARGRGAGRRDAAASASTPAQAPTSDSPVAEDASRRRPCRACVDFKTWMRTQQKRDTKFREDCPPDREELGRHSWAVLHTLAAYYPDLPTPEQQQDMAQFIHLFSKFYPCEECAEDLRKRLCRNHPDTRTRACFTQWLCHLHNEVNRKLGKPDFDCSKVDERWRDGWKDGSCD。FLAGタグDYKDDDDK-配列番号17を通じて、これを、N末端側で、配列番号2の分泌リーダーに付着させた。リーダーを含むこの融合タンパク質のタンパク質配列を配列番号7に示す。配列番号7配列番号7をコードする遺伝子を、オペレーター配列を含まない大腸菌Lacプロモーター、および大腸菌における発現のために最適化されたALRP遺伝子コドンからなる配列、配列番号8を用いて合成した。これを、NBJ078-18-3のHpaI部位内にEcoRV断片としてクローニングして、pAVE0354を作製し、そして制限消化および配列決定によって確認した。配列番号8CLD331およびCLD420の構築pAVE314の生成のための出発ベクターは、WO2007/088371に記載されるように調製されたpAVE029であった。LamBリーダーを含むIGF-1の遺伝子をNdeI/XhoI断片として合成した。以下の配列番号9を参照されたい。これをpAVE029NdeI/XhoI部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをpAVE314と名付けた。発現プラスミドpAVE314を大腸菌株W3110に形質転換して、CLD331を作製した。次いで、発現プラスミドpAVE354をCLD331に形質転換して、CLD420を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で-80°Cに維持した。配列番号9CLD429およびCLD433の構築pAVE356の生成のための出発ベクターは、pAVE029であった。OmpAリーダーを含むヒト成長ホルモンhGHの遺伝子をNdeI/XhoI断片として合成した。以下の配列番号10を参照されたい。これをpAVE029NdeI/XhoI部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをpAVE356と名付けた。配列番号10発現プラスミドpAVE356をW3110に形質転換して、CLD429を作製した。次いで、発現プラスミドpAVE354をCLD429に形質転換して、CLD433を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で-80°Cに維持した。CLD048およびCLD426の構築株CLD048をWO2007/088371に記載されるように調製した。次いで、発現プラスミドpAVE354をCLD048に形質転換して、CLD426を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で-80°Cに維持した。CLD430およびCLD428の構築pAVE157の生成のための出発ベクターは、pAVE029である。A5B7Fabの遺伝子をNdeI/XhoI断片として合成した。以下の配列番号11を参照されたい。これをpAVE029NdeI/XhoI部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをpAVE157と名付けた。配列番号11発現プラスミドpAVE157をW3110に形質転換して、CLD430を作製した。次いで、発現プラスミドpAVE354をCLD430に形質転換して、CLD428を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で-80°Cに維持した。CLD453およびCLD454の構築pAVE366の生成のための出発ベクターは、pAVE029であった。OmpAリーダーを含むFGF21の遺伝子をNdeI/XhoI断片として合成した。以下の配列番号12を参照されたい。これをpAVE029NdeI/XhoI部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをpAVE366と名付けた。配列番号12発現プラスミドpAVE366をW3110に形質転換して、CLD453を作製した。次いで、発現プラスミドpAVE354をCLD453に形質転換して、CLD454を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で-80°Cに維持した。CLD442およびCLD443の構築pAVE364の生成のための出発ベクターは、pAVE029であった。OmpAリーダーを含むRapLRの遺伝子をNdeI/XhoI断片として合成した。これをpAVE029NdeI/XhoI部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをpAVE364と名付けた。発現プラスミドpAVE364をW3110に形質転換して、CLD442を作製した。次いで、発現プラスミドpAVE354をCLD442に形質転換して、CLD443を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で-80°Cに維持した。RapLR配列配列番号13CLD438およびCLD439の構築pAVE362の生成のための出発ベクターは、pAVE029であった。OmpAリーダーを含むElafinの遺伝子をNdeI/XhoI断片として合成した。以下の配列番号14を参照されたい。これをpAVE029NdeI/XhoI部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをpAVE362と名付けた。配列番号14発現プラスミドpAVE362をW3110に形質転換して、CLD438を作製した。次いで、発現プラスミドpAVE354をCLD438に形質転換して、CLD439を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で-80°Cに維持した。CLD440およびCLD441の構築pAVE363の生成のための出発ベクターは、pAVE029であった。OmpAリーダーを含むMIC6の遺伝子をNdeI/XhoI断片として合成した。以下の配列番号15を参照されたい。これをpAVE029NdeI/XhoI部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをpAVE363と名付けた。配列番号15発現プラスミドpAVE363をW3110に形質転換して、CLD440を作製した。次いで、発現プラスミドpAVE354をCLD440に形質転換して、CLD441を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で-80°Cに維持した。振盪フラスコ評価テトラサイクリン10μg/mlを補った5mlルリアブロスLB、5g/L酵母エキス、10g/Lトリプトン、および5g/L塩化ナトリウム内に、10μlの融解グリセロールストックを接種した。これを軌道振盪装置中、37°Cで16時間インキュベーションした。次いで、この培養の500μlを用いて、50mlのルリアブロス上述のような組成を含有する250mlエルレンマイヤーフラスコに接種した。フラスコを、軌道振盪装置中、200rpm、37°Cでインキュベーションした。OD600=0.5/-0.1になるまで増殖を監視した。この時点で、フラスコを適切な濃度のIPTGイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドで誘導し、そして上記条件下で22時間インキュベーションを続け、この間、増殖および産物蓄積の測定のために試料を採取した。発酵評価450μlのグリセロールストックを、5g/L酵母エキス、10g/Lペプトン、10g/L塩化ナトリウム、10g/Lグルコースおよび15mg/Lテトラサイクリンを含有する450mLのルリアブロスLBを含有する2.0L整流装置付き振盪フラスコに添加することによって、以下の結果中に記載するような株の発酵接種物を産生した。フォルダーゼを含まない株を培養する際には、クロラムフェニコールを添加しなかったが、フォルダーゼを含む株を培養する際には、34mg/Lの濃度でクロラムフェニコールを含んだ。振盪装置-インキュベーター中、200rpmの攪拌で、37°Cで10時間接種物を増殖させた。20mlの振盪フラスコ接種物を用いて、フォルダーゼまたは酵母エキスを含まない株を培養した際には、酵母エキスおよびテトラサイクリンを補い、フォルダーゼを含む株を培養した際には、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補って、4Lの最小グリセロールバッチ増殖培地を含有する5L作業体積発酵装置に接種した。以下に記載する操作条件下で発酵を行った。温度を30°Cの一定温度IGF-1株に調節するか、または最初の7~9時間は37°C、次いで30°Cに低下させ、そして発酵の残りの時間、30°Cに調節した他のすべて。25w/v水酸化アンモニウムを自動的に添加することによって、pHを7.0に調節した。溶解酸素圧dOTセットポイントは、空気飽和の30であり、そして最低250rpmから最大1500rpmの発酵装置スターラー速度および入口ガス流への酸素の補充の自動的な調整によって調節した。発酵容器への気流は、常に0.5v/v/分であった。dOTの急激な上昇によって特徴付けられる炭素供給源すなわちグリセロールの枯渇まで、発酵をバッチ方式で行った。炭素供給源消耗時点で、グリセロール/硫酸アンモニウムフィードの添加によって、流加発酵を開始した。発酵におけるバイオマスレベルがOD600=45~55に到達したら、IPTGを最終濃度2mMIGF-1、0.1mMh-Gh、または0.5mMA5-B7まで添加することによって、誘導を行った。誘導後、流加期を40~48時間続けたIGF-1実行に関しては40時間;残りは48時間。次いで、細胞および残った細胞不含増殖培地を採取した。採取した細胞をさらに、浸透圧ショック細胞分画に供して、可溶性大腸菌周辺質分画中に分配される、タンパク質含有細胞分画を単離した。分析法試料の全細胞溶解物のSimplyBlue染色SDS-PAGEゲルを用いて、振盪フラスコに関する集積レベルおよび発酵評価を行った。採取した細胞をさらに、浸透圧ショック細胞分画に供して、可溶性大腸菌周辺質分画中に分配される、タンパク質含有細胞分画を単離し、そしてSimplyBlue染色SDS-PAGEゲルを用いて、異なる分画中の集積レベルを決定した。OS1浸透圧ショック分画は、スクロース緩衝液中での洗浄後の上清であり、OS2分画は、低イオン強度緩衝液での洗浄後の上清であり、上清/増殖培地は、細胞不含残渣増殖培地であり、そして細胞ペレットは、浸透圧ショック分画後の細胞ペレットである。精製された活性D1.3Fabを用いて用意した標準曲線を参照することによって、ELISAアッセイにおけるリゾチーム抗原へのD1.3Fabの結合を決定することにより、可溶性周辺質抽出物および残渣増殖培地中の生物学的活性D1.3Fabの集積を概算した。精製された活性D1.3Fabを用いて用意した標準曲線を参照することによって、ELISAアッセイにおけるヒトIgGFabドメインに特異的な抗体へのA5B7Fabの結合を決定することにより、可溶性周辺質抽出物および残渣増殖培地中の生物学的活性A5B7Fabの集積を概算した。結果株CLD331および420SDS-PAGE/ウェスタンブロットによって、振盪フラスコ中、IGF-1は、振盪フラスコおよび発酵の両方から、~6kDaのプロセシングされた産物として分泌されることが示され、分泌が成功したことが示された。株CLD429および433SDS-PAGEによって、振盪フラスコ中、hGHは、~22kDaのプロセシングされた産物として分泌されることが示され、分泌が成功したことが示された。株CLD048および433ELISA分析によって、振盪フラスコ中、同等の条件下で、D1.3は、フォルダーゼを含まない場合の300μg/mlに比較して、フォルダーゼを含むと600μg/mlで分泌されることが示された。これによって、フォルダーゼの発現は、活性産物収量の増加を導きうることが示された。株CLD428および430ELISA分析によって、振盪フラスコ中、同等の条件下で、A5B7は、フォルダーゼを含まない場合の18ng/ml/ODに比較して、フォルダーゼを含むと54ng/ml/ODで分泌されることが示された。発酵装置において、A5B7は、フォルダーゼを含まない場合の874μg/Lに比較して、フォルダーゼを含むと1335μg/Lで分泌された。これらの結果は、フォルダーゼの発現が活性産物収量の増加を導きうることを示した。株CLD453および454SDS-PAGE/ウェスタンブロットによって、振盪フラスコ中、FGF-21は、~23kDaのプロセシングされた産物として分泌されることが示され、分泌が成功したことが示された。株CLD442および443SDS-PAGE/ウェスタンブロットによって、振盪フラスコ中、RapLR1は、~12kDaのプロセシングされた産物として分泌されることが示され、分泌が成功したことが示された。株CLD438および439SDS-PAGE/ウェスタンブロットによって、振盪フラスコ中、Elafinは、フォルダーゼの存在下で、~7kDaのプロセシングされた産物として分泌されるが、フォルダーゼがないと、株中で検出不能であることが示された。これによって、フォルダーゼの発現は、産物分泌の増加を導きうることが示された。株CLD440および441SDS-PAGE/ウェスタンブロットによって、振盪フラスコ中、MIC6は、~39kDaの産物として分泌されることが示され、分泌が成功したことが示された。"