プロモータに操作可能に結合された配列番号:3に記載されるヒトアポトーシスに特異的なeIF-5Aのヌクレオチド配列を含む発現ベクター。ヒトのガン細胞におけるアポトーシスを増加させる薬剤を製造するための請求項1に記載の発現ベクターの使用。アポトーシス特異的なeIF-5Aの発現増加が、配列番号:3によってコードされるポリペプチドの発現を増加させることである、請求項2に記載の使用。前記細胞がヒトに含まれる、請求項2に記載の使用。前記薬剤がヒトに投与される、請求項2に記載の使用。前記薬剤がヒトのガン細胞に直接投与される、請求項2に記載の使用。前記発現ベクターがDNA発現ベクターである、請求項2に記載の使用。前記発現ベクターがRNA発現ベクターである、請求項2に記載の使用。前記プロモータが構造的に活性なプロモータである、請求項2に記載の使用。前記発現ベクターがプラスミドである、請求項2に記載の使用。前記発現ベクターがアデノウイルスである、請求項2に記載の使用。前記ヒトのガン細胞が骨髄由来である、請求項2に記載の使用。本発明は、単離され及び/又は精製されたラットのアポトーシスに特異的なeIF5A及び/又はDHSの核酸及びポリペプチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びアポトーシスに特異的なeIF5A及びDHSの発現ベクターを提供する。さらに本発明は、アポトーシスに特異的なeIF5A及びDHSを用いアポトーシスを調節する方法を提供する。本発明は、ラットの黄体から単離されたeIF5Aをコードする全長cDNAの発見、及び特徴付けにある程度基づいており、それはアポトーシスに関与している。従って1例において、本発明は、ラットのアポトーシスに特異的なeIF5Aのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。さらに本発明により提供されるものは、ラットのアポトーシスに特異的なeIF5Aポリペプチドのアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチドである。ラットのアポトーシスに特異的なeIF5Aポリペプチドが、ラットに対する特異的な何らかのポリペプチドを意味し、それが、細胞をアポトーシスする際異なる発現が行われ、そしてデオキシハイプシンシンターゼにて触媒とされる前駆eIF5Aの特異的に保守されたリシンのαアミノ基に、スペルミジンの4アミノブチル成分を転移することによるデオキシハイプシン残基を形成し、そしてこの4アミノブチル成分をデオキシハイプシンヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化しハイプシンを形成し、これによってeIF5Aを活性化する。加えて本発明のラットアポトーシスに特異的なeIF5A配列の核酸及びポリペプチドが、本明細書に提供されているガイダンス、及び当業者周知の技術を用い、他の細胞、組織、器官、又は動物からアポトーシスに特異的な核酸及びポリペプチドの単離に使用することができる。さらに本発明は、本発明のラットのアポトーシスに特異的なeIF5Aポリペプチドをコードする核酸を検出するプライマー又はハイブリッドプローブとして適切な核酸分子を提供する。本発明の核酸は、DNARNADNARNAの二本鎖、タンパク質核酸又はその誘発物質でよい。本明細書に用いられる核酸又はポリペプチドが、実質的に細胞物質のないか又は、化学的前駆物質又は他の化学物質のない場合、単離された又は精製されたと言及される。単離された又は精製されたという用語が、膨大な数の他の配列の断片を含むライブリー種の調製を言及していないと理解すべきである。本発明の核酸又はポリペプチドが、均一性又は別の純度まで精製できる。精製レベルが意図される用途に依存する。重要な特質として他の成分が、かなりの量を存在していたとしても、調製にて核酸又はポリペプチドを所望する機能とすることができる。単離されたポリペプチドが、それを天然に発現する細胞から精製でき、そしてそれを発現するために変更された細胞から、又は周知のタンパク質合成方法を用い合成された細胞から精製することができる。例えばタンパク質の組み換え生成には、アポトーシス誘発IF5AかDHSのいずれかをコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングすることが含まれる。その発現ベクターが宿主内に誘発され、そしてそのタンパク質が宿主内にて発現される。次にそのタンパク質を、標準的タンパク質精製技術を用い、適切な精製方法のいずれかにより細胞から単離することができる。おそらく本発明のラットアポトーシスに特異的なeIF5Aポリペプチドをコードする単離された核酸が、配列番号1のヌクレオチド配列を有し、そして本発明の精製されたポリペプチドが、配列番号:2のアミノ酸配列を有す。さらに本発明のラットアポトーシスに特異的なeIF5Aの核酸及びポリペプチドが、配列番号1と配列番号2のそれぞれに実質的に同一か相同する配列、及び機能的な誘発物質又はその変異体を有する配列を包含する。本明細書に用いられるように、配列の実質的同一性又は実質的相同性という語句が、ある配列が、他の配列と実質的に構造又は機能的に同一であることを呈示するために用いられる。実質的に同一の配列や実質的な相同性を有する配列間の何らかの構造的又は機能的な相違を最少限にすること、すなわちこれらが、所望される用途に指示された機能への配列の能力に影響を及ぼさないことである。種々の相違は、たとえば違った種の間における使用コドンの遺伝的な変異化に起因するとみてよい。2以上の違った配列間において、かなりの量の配列の重なりや類似性がある場合、又は異なる配列が、配列の長さや構造が違ったとしても類似した生理特性を呈する場合、構造的相違が最少であると考えられる。たとえばこうした特徴が、明確な条件下にてハイブリダイズができ、又はタンパク質の場合、免疫的な交差反応性、類似する酵素活性などを含む。技術を有する開業医が、技術的に周知の方法でこれらの各特徴を容易に決定することができる。さらに、配列におけるこれらの間における配列の類似性が、少なくとも70以上、より好ましくは80以上、さらにより好ましくは90以上、最も好ましくは約95以上有する場合、2つのヌクレオチド配列が、実質的な相補である。活性と機能的に関連性のあるポリペプチドの部分との間の類似性に少なくとも50、好ましくは少なくとも70、より好ましくは少なくとも80、さらにより好ましくは90、最も好ましくは少なくとも95有するならば、2つのアミノ酸配列が実質的に相同である。2つの配列における同一性の割合を決定するため、上記配列が、最適な比較目的のためにが、一次及び二次アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に、最適な配列構成のため導入されるが、相同性のない配列が、比較目的のため無視してもよい構成される。好ましい例において、基準配列の長さの少なくとも30、40、50、60、70、80、又は90以上が、比較目的のため配向される。次に該当するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置にアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列の位置が、第二の配列の該当する位置として同じアミノ酸残基又はヌクレオチドより占められる場合、上記分子はその位置に同一であるは、アミノ酸又は核酸の相同性と同一である。2つの配列における同一割合が、配列により共有される同一位置の数の関数であり、2つの配列の最適な配向のため導入する必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮する。配列の比較、及び2つの配列間の同一性及び類似性の割合の決定を、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。本発明の核酸及びタンパク質の配列が、キー配列として使用され、配列データベースに対して検索が行われ、たとえば他のファミリーメンバー又は関係する配列を同定できる。こうした検索が、NBLAST及びXBLASTプログラムofAltschulら、JMolBiol21540310を参照を用いて行うことができる。BKASTヌクレオチドの検索は、NBLASTプログラムにより行うことができる。BKASTタンパク質の検索が、XBLASTプログラムにより行われ、本発明のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のため隙間を形成した配列構造を得るために、ギャプドブラストが、Altschulら、NucleicAcidsRes2533893402、に記載されたように利用することができる。BLAST及びギャプドブラストを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータを、使用することができる。核酸の機能的誘発体と言う用語は、遺伝子又は核酸配列の相同性又は類似性の意味として、本明細書に用いられる。機能的誘発体は、所定遺伝子の機能の少なくとも1部を保持し、それが本発明に従って利用することができる。本明細書に記載のアポトーシスに特異的なeIF5Aのポリペプチドの機能的誘発体は、少なくとも1部のアポトーシスに特異的なeIF5Aの活性、又はアポトーシスに特異的なeIF5Aと特異的抗体との免疫的交差反応を保持するアポトーシスに特異的なeIF5Aの断片、変異体、類似物質又は化学的誘発体である。アポトーシスに特異的なeIF5Aのポリペプチドの断片は、いずれかのサブセット分子を言及している。さらに機能変異体が、機能が変化しないか、有意に変化しなくなる類似アミノ酸の置換体を含む。機能的に必須アミノ酸が、部位特異的変異誘発法、又はアラニン走査変異誘発法Science24410811085を参照など、技術的に周知の方法により同定することができる。後者の方法により、分子中のあらゆる残基に単一のアラニン変異体が誘発される。次に得られた変異体の分子を、キナーゼ活性などの生物活性として、又はinvitroの増殖活性などのアッセイにおいて試験される。さらに結合相手基質を結合するために必須である部位を、結晶化、核磁気共鳴法又は光親和性標識法JMolBio224899904deVosらScience255306312を参照など構造分析により決定することができる。変異体は、1又は複数の置換されたヌクレオチドを有するヌクレオチドの置換変異体など、遺伝子全体又はその断片のいずれか実質的に同様の分子を言及するが、特定遺伝子とハイブリダイズするか、又は天然のDNAとハイブリダイズするmRNA転写物をコードする能力を維持している。相同性は、異なる動物遺伝子又は種からの断片又は変異体の配列を指している。類似体は、全分子、変異体又はその断片に実質的に類似するか、又はそれに対し機能する非天然の分子を指している。変異体ペプチドは、天然に発生するペプチド及び技術的に周知な方法により製造されたものを含む。こうした変異体は、本明細書記載のような分子技術及び配列情報を用い、同定作成を容易に行うことができる。さらにこうした変異体は、本発明のeIF5A又はDHSタンパク質に対し、配列及び/又は構造的相同性に基づいて他のタンパク質との区別を容易にすることができる。タンパク質が機能的変異体又は非機能的変異体であったとしても、相同性同一性の存在する程度が、主にパラログファミリーに存在する分散量、及びオルソログ間の進化する距離に基づくことになる。本発明の非天然に発生するeIF5A又はDHSの変異体を、組み換え技術を用い容易に生成できる。こうした変異体が、タンパク質のアミノ酸配列における欠失、付加、及び置換を含むがそれに限定されない。たとえば、一分類の置換体が保守されたアミノ酸置換である。こうした置換体は、同じ特徴の別のアミノ酸によりタンパク質中の所定のアミノ酸を置換するものである。典型的に保守置換体と見られる物には、脂肪族AlaValLeu及びIleの間にて一方から他方への置換物;ヒドロキシル残基SerとThrとの交換;酸性残基AspとGluとの交換;アミド残基AsnとGlnとの間の置換;塩基性残基LysとArgとの交換;芳香族残基Pheとの間の置換などがある。アミノ酸の変化が、表現型サイレントである可能性に関する指針が、Bowieら、Science24713061310に見出される。選択肢としてであるが、より好ましくは本発明のラットのアポトーシスに特異的なeIF5Aポリペプチドをコードする核酸は、配列番号1の物と相補的であるヌクレオチド配列と有意に高いストリンジェントな条件下にてハイブリダイズする。明細書に使用される用語ハイブリット化は、プローブ配列及び標的配列の特性に依存して当業者に容易に明らかになるよう、適切なストリンジェントな条件下にて核酸のハイブリット化の意味として、一般的に用いられる。ハイブリット化及び洗浄の条件が、技術的に良く知られ、インキュベート時間、温度及び/又は溶液のイオン強度を変えることにより所望のストリンジェントな条件を調節することが、容易に行われる。SambrookJら、molecularCloningALaboratoryManual2ndeditionColdSpringHarbourPressColdSpringHarborNewYork1989を参照。選択される条件が、ハイブイット化されている配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸におけるGCの相対的含有量、及び組み合わせミスの許容量にて求められる。有意的に低い相補度を有する遺伝子鎖間を部分的にハイブリット化が所望される場合、ストリンジェントの低い条件が好ましい。完全か、ほぼ完全な相補性が所望される場合、高いストリンジエントな条件が好ましい。典型的に高いストリンジエントな条件に対し、ハイブリット化溶液には、6XSSC001MEDA1Xデンハルト溶液及び05SDSが含まれる。ハイブリット化は、約68°Cにてクローン化されたDNAの断片に対して約3乃至4時間、そして全真核細胞のDNAに対し約12乃至16時間行われた。ストリンジエントが有意に低い場合、ハイブリット化の温度を、二重鎖の融解温度より低い約42°Cに低下させた。そのTmでは、GCの含有量及び二重鎖の長さ、並びにその溶液のイオン強度の関数であることが知られている。本明細書に用いられているように、DNA又はRNAの該当する部分にハイブリダイズという語句は、ハイブリダイズする分子、たとえば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はいずれかのヌクレオチド配列が、適切な条件下にてハイブリット化を行うため、ほぼ同じサイズで、そこに類似性が十分ある配列を有する他の核酸分子の配列を認識し、そしてそれにハイブリダイズすることを意味する。たとえばヌクレオチド長100のセンス分子が、2つの配列間で約70以上の配列の類似性がある限り、核酸配列の約100ヌクレオチド部分の認識し、それにハイブリダイズすることになる。該当する部分が、それにハイブリダイズする分子より有意に小さくても大きくても、たとえば2030の大小、好ましくは1215以下の大小でも良い。さらに加えてポリペプチドの機能的変異体が、機能的に変化しないか、実質的に変化しない類似したアミノ酸の置換を含むことができる。機能として必須アミノ酸を、部位特異的な変異誘発法、又はアラニン走査変異誘発法Science24410811085を参照など技術的に知られた方法により同定することができる。後者の方法が、分子のあらゆる残基に単一アラニンの変異体を導入する。その後得られた変異分子を、生物活性又はアッセイのために試験する。たとえばアポトーシスに特異的なeIF5Aの類似体とは、非天然のタンパク質又は全タンパク質又はその断片のいずれかに擬似的ペプチドとして実質的に類似することを指している。アポトーシスに特異的なeIF5Aの化学的誘発体が、通常でないある領域のペプチド又はペプチド断片としての付加的な化学成分を含む。修飾化が、選択された側鎖又は末端の残基との反応を可能にする有機誘発化剤と、ペプチドの標的化されたアミノ酸残基とを反応させることにより、ペプチド又はその断片に導入することができる。ラットの黄体から単離されたアポトーシスに特異的なeIF5Aをコードする全長cDNAの最初の発見及び特徴付けにより、ラットの黄体から単離され、アポトーシスに関与するDHSをコードするcDNAクローンの部分的長さの発見及び特徴付けを導き出す。従って付加的な例において、本発明は、ラットのアポトーシスに特異的なDHSポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。さらに提供されるものは、ラットのアポトーシスに特異的なDHSポリペプチドのアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチドである。ラットのアポトーシスに特異的なDHSポリペプチドが、ラットに対し特異的な何らかの適切なポリペプチドを意味し、それが、アポトーシスする細胞に異って発現され、そして不活性eIF5Aの特異的に保守されるリシンのαアミノ基にスペルミジンの4アミノブチル成分を転移させることにより、デイキシハイプシン残基の形成を触媒し、デイキシハイプシンを形成し、それによりeIF5Aを活性化させる。好ましくは、本発明におけるラットのアポトーシスに特異的なDHSポリペプチドをコードする単離された核酸が、配列番号:22のヌクレオチド配列を有し、そして本発明の精製されたポリペプチドが、配列番号23のアミノ酸配列を有する。さらに本発明のラットのアポトーシスに特異的なDHS核酸及びポリペプチドが、各配列番号22及び配列番号23に実質的に同一又は相同性を有する配列、及び前記の機能的な誘発及びその断片を有する配列を含む。選択肢としてさらに好ましくは、前記本発明の単離された核酸も又配列番号22の相補鎖と高いストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。本明細書に記載されたラットのアポトーシスに特異的なeIF5A配列の核酸及びポリペプチドにおける例のように、本発明において、ラットのアポトーシスに特異的なDHS配列の核酸及びポリペプチドを、ヒトを含む他の動物からアポトーシスに特異的なDHS配列の核酸及びポリペプチドを単離するため使用することができる。動物及びヒトからこうしたDHS配列を単離することが、技術的に周知な方法及び本明細書に提供されるガイダンスを用い、少なくとも80交差している種の類似した配列に基づいて行うことができる。さらに本発明は、本発明におけるアポトーシスに特異的なDHSポリペプチドをコードする核酸を検出するため、プライマー又はハイブリット化プローブとして適切である核酸分子を提供する。アポトーシスに特異的なeIF5A及びDHSが、アポトーシスを基本とする疾患過程を含む、アポトーシスを調節するための適切な標的であり、その理由が、アポトーシス経路に関係する下流のイフェクター及び転写因子の転写後の調節を作用できることである。従ってさらに本発明は、アポトーシスに特異的なeIF5A及び/又はDHS機能を調節する薬剤を、細胞に投与することにより、細胞におけるアポトーシスの調節方法を提供する。なおアポトーシスに特異的なeIF5A機能だけ、アポトーシスに特異的なDHS機能だけ、又はアポトーシスに特異的なeIF5AとDHSの両方の機能を調節できることが、当業者にて理解されるであろう。アポトーシスは、細胞におけるアポトーシスに特異的なeIF5A及び/又はDHS機能の通常レベルを、いずれか適切な変更によって調節することができる。本明細書に意図されるように、修飾又は変更が、完全か又は部分的に可能であり、細胞におけるeIF5A及び/又はDHS機能の転写又は翻訳の制御の変化、あるいはそれを変更させる他の変化を含むことができる。アポトーシスに特異的なeIF5A又はDHS機能が、何らかの活性を意味し、それが、DHSにより触媒される前駆体eIF5Aの特異的に保守されたリシンのαアミノ基に、スペルミジンの4アミノブチル成分を転移することによりデオキシハイプシン残基の形成し、その4アミノブチル成分をデオキシハイプシンヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化しハイプシンを形成し、それによりeIF5Aを活性にする。本発明の1例において、薬剤がアポトーシスに特異的なeIF5A及び/又はDHS機能を阻害し、それによりアポトーシスを阻害することができる。アポトーシスを阻害することは、たとえば細胞の縮重、クロマチンの縮合、核の断片化、及び膜の泡状化などアポトーシスを十分に明確にされた成形的特性を特徴付けるいずれか又は全における強度、及び/又は数のなんらかの減少、及び/又は開始における遅延を意味する。アポトーシスに特異的なeIF5A及び/又はDHS機能を阻害できる1つの薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドが、1部のアポトーシスに特異的なeIF5Aポリペプチド及び/又はアポトーシスに特異的なDHSポリペプチドを有する。アポトーシスに特異的なeIF5Aポリペプチド及び/又はDHSポリペプチドをコードする多くの適切な核酸配列が、技術的に知られている。例えば配列番号134511151920及び21、配列番号6及び8、配列番号12及び16のeIF5A、及び配列番号7、又はその1部として、適切な配列を提供する。他の適切な配列が、本明細書に記載された方法によりプローブとして周知の配列を用い見出すことができる。従ってさらに本発明は、アポトーシスに特異的なeIF5Aポリペプチド及び/又はアポトーシスに特異的なDHSポリペプチドの1部をコードするアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその相補鎖を提供する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、RNA又はDNAたとえば、cDNA、ゲノムDNA、又は合成RNA又はDNA等のRNA又はDNAが、可能な形態である。DNAは、2本鎖又は1本鎖で良くそして例え1本鎖であったとしても、コードする鎖又はコードしない鎖のいずれでもよい。標的核酸と低重合体化合物との特異的ハイブリット化が、核酸の通常な機能と干渉することになる一般的にアンチセンスとして言及されている。干渉されるDNA機能が複製及び転写を含む。干渉されるRNA機能は、たとえばタンパク質翻訳部位にRNAの転移、RNAからタンパク質の翻訳、1又は複数のmRNA種を生成するRNAのスプライシング、及びRNAに接合できるか又はRNAにより増強できる触媒的活性など全ての機能を含む。こうしたアンチセンスオリゴヌクレオチド全体の効果は、アポトーシスに特異的なeIF5A及び/又はDHSの発現、及び/又は産生された活性化アポトーシスに特異的なeIF5Aの量を阻害することである。選択肢として、アポトーシスに特異的なDHSによるアポトーシスに特異的なeIF5Aの活性化を、DHS酵素反応を阻害する化学的薬剤を投与することにより阻害することができる。たとえば、PGF2αを注入することにより、アポトーシスを誘発後DHS反応の阻害剤であるスペルミジンにて動物を処理した場合、アポトーシスを反映するDNAラダーリングの開始をラットの黄体において遅延する。Jakusら、JBiolChem2681315113159を参照。さらに、アポトーシスに特異的なeIF5ADNARNA又はタンパク質を変性させるか、又はアポトーシスに特異的なDHSDNARNA又はタンパク質を変性させ薬剤を加えることにより、アポトーシスに特異的なDHSによるアポトーシスに特異的なeIF5Aの活性を阻害し、アポトーシスを阻害又は実質的に減少させることができる。本発明の別の例において、内在性哺乳動物のアポトーシスに特異的なDHS、アポトーシスに特異的なeIF5A、又はその両方の発現を阻害することは、リボザイムの使用を介して影響される。適切な薬剤の例には、アポトーシスに特異的なDHSによりアポトーシスに特異的なeIF5Aの活性化を阻害する薬剤、デオキシハイプシンヒドロキシラーゼによりアポトーシスに特異的なeIF5Aの活性化を阻害する薬剤、アポトーシスに特異的なDHSの転写及び/又は翻訳を阻害する薬剤、アポトーシスに特異的デイキシハイプシンヒドロキシラーゼの転写及び/又は翻訳を阻害する薬剤、及びアポトーシスに特異的なeIF5Aの転写又は翻訳を阻害する薬剤が含まれる。たとえば、アポトーシスに特異的なDHSによりeIF5A活性化を阻害する薬剤は、スペルミジン、13ジアミノプロパン、14ジアミノブタン、17ジアミノヘプタン、又は18ジアミノオクタンである。さらに細胞のアポトーシスに特異的なeIF5Aをコードする遺伝子を不活性化することによりアポトーシスに特異的なeIF5Aを阻害することが可能である。細胞の遺伝子を欠失する、又は遺伝子内の欠失又は変異化を導入することで、こうした不活性化が起こり、それにより遺伝子を不活性化させる。さらにその遺伝子を、内在性アポトーシスに特異的なeIF5Aタンパク質の発現が起こらないように、別のDNA断片をその遺伝子に挿入することにより、不活性化させることができる。さらに、細胞におけるアポトーシスに特異的なDHSをコードする遺伝子を不活性にすることにより、アポトーシスに特異的なeIF5Aの活性化を阻害することができる。真核細胞の遺伝子内に欠失、挿入などの変異化を導入する方法は、技術的に周知であり、たとえば米国特許番号5464764を参照。細胞における遺伝子の変異化に有益なオリゴヌクレオチド及び発現ベクターを、技術的に周知な方法及び本明細書に提供されるガイダンスにより作成することができ、たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成及び発現するための有益な方法が、細胞における遺伝子を変異化するために有益なオリゴヌクレオチド及び発現ベクターの作成に使用できることである。さらに細胞におけるアポトーシスに特異的なeIF5Aをコードする遺伝子の発現を阻害することにより、アポトーシスに特異的なeIF5Aの発現を阻害することが可能である。こうした不活性化が、たとえば同時阻害が起こるように、細胞内にアポトーシスに特異的なeIF5Aをコードするヌクレオチド配列を導入することにより、同時阻害を介して実現することができる。さらに、同時阻害を介し細胞におけるアポトーシスに特異的なDHSをコードする遺伝子の発現を阻害することで、アポトーシスに特異的なeIF5Aの活性を阻害することが可能である。同時阻害として有益なオリゴヌクレオチド及び発現ベクターが、技術的に周知な方法及び本明細書に提供されるガイダンスにより作成でき、たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチドの作成及び発現に有益な方法が、同時阻害として有益なオリゴヌクレオチド及び発現ベクターを作成するために使用することができる。同時阻害のための方法は、技術的に知られており、たとえば、米国特許第5686649を参照。阻害による1つの結果を介しは、内在的に翻訳可能なアポトーシスに特異的なeIF5A又はDHSをコードするmRNAの量が減少することである。その結果生成されるアポトーシスに特異的なDHSタンパク質量が減少されることにより、活性化されたeIF5A量が減少され、更にアポトーシスに特異的タンパク質の翻訳を減少させる。従って新規のタンパク質の合成が求められることから、アポトーシスは、阻害されるか又は遅延される。本発明の別の例において、薬剤が、アポトーシスに特異的なeIF5A又はDHSの機能を誘発することにより、アポトーシスを誘発することができる。アポトーシスの誘発は、強度又は数の増大、又はたとえば細胞の縮重、クロマチンの縮合、核の断片化、及び膜の水泡などの十分に明確にされたアポトーシスを特徴付ける形態的特性のいずれか又は全ての開始を増強することを意味する。アポトーシスに特異的なeIF5A及び/又はDHS機能を誘発する適切な薬剤を使用することができる。不活性及び活性な形態のポトーシスに特異的なeIF5Aを投与できることは、当業者に理解されよう。もし不活性な形状、又はハイプシンの未修飾形状にて投与される場合、天然のアポトーシスに特異的なDHSが、eIF5Aを活性化することになる。アポトーシスに特異的なeIF5Aポリペプチド及び/又はDHSポリペプチドをコードする多くの適切な核酸配列が、技術的に知られている。たとえば、配列番号134511151920及び21、配列番号6及び8、配列番号12及び16eIF5A、及び配列番号7、又はその1部分から、適切な配列が提供される。他の適切な配列は、本明細書に記載された方法によりプローブとして周知な配列を用い見出すことができる。たとえば、組み換え型産生ポリペプチドを含む、むきだしの核酸、又はポリペプチドを、細胞に投与することができる。込み換え型産生ポリペプチドは、eIF5A又はDHSタンパク質をコードするDNA配列が、適切な発現ベクター内に配置されたことを意味し、それが以下に詳細に記載されている。宿主細胞が、発現ベクターにてトランスフェクトされ、その後所望のポリペプチドを生成する。次にそのポリペプチドを宿主細胞から単離する。組み換え型アポトーシス誘発eIF5Aタンパク質を、たとえばChineseHamsterOvary細胞にて産生し、そして当業者により組換え型DHSを用いて活性化させることができる。Wangら、JBiolChem2761754117549Erikssonら、SeminHematil382431を参照。さらにこのポリペプチドを合成することができ、それが周知のタンパク質合成方法を用い合成される。ポリペプチドの摂取は、たとえば広範囲な細胞内への摂取に介在する炭疽症から誘発されるリガンドを用い容易に行うことができる。Liuら、JBiolChem2764632646332を参照。さらに組み換え型タンパク質を、リポソームを用いて哺乳動物の標的細胞、組織、及び器官に投与することができる。タンパク質を閉塞するリポソームが、静脈内にて投与される。標的化が、リポソームに特定細胞リセプターへのリガンドを組み入れることにより行うことができる。KanedaAdvDrugDeliveryRev43197205を参照。アポトーシスに特異的なeIF5A又はDHS機能を誘発できる好ましい薬剤の1は、発現ベクターである。従って本発明は、アポトーシスに特異的なeIF5Aポリペプチド及び/又はDHSポリペプチドをコードする核酸に操作的に結合したプロモータを有する発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターが、RNA又はDNA、たとえばcDNA、ゲノムDNA、並びに合成によるRNA又はDNAの形状で良い。DNAは2本鎖、又は1本鎖にて可能であり、たとえ1本鎖であったとしても、コード鎖又は非コード鎖のいずれでも可能である。どれか適切な発現ベクターを参照を使用することができる。好ましくはその発現ベクターが、アポトーシスに特異的なeIF5Aポリペプチド、及び又はアポトーシスに特異的なDHSポリペプチドをコードする核酸配列に操作的に結合するプロモータ配列を有する。発現ベクター内にて所望の核酸及びプロモータは、そのプロモータが、核酸の発現を誘発できるように操作的に結合される。核酸が発現される条件にて何か適切なプロモータを使用することができる。こうした適切なプロモータの例には、種々のウイルスのプロモータ、真核細胞のプロモータ、及び構造的に活性なプロモータが含まれる。こうした操作による結合が維持される限り、発現ベクターが、複数の核酸を含むことができる。発現ベクターには、ポリアデニール化配列、リボソームエントリー部位、転写調節要素、ベクターの安定性や転写、あるいは細胞内の所望の転写の翻訳又はプロセシングを高める他の配列、又は他のいずれかの適切な要素などの所望による他の要素が含まれる。発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、又はレンチウイルスなどのウイルスから誘発される。本発明の発現ベクターが、宿主細胞内でトランスフェクトされ、それが、バクロウイルス系を参照、及び293COS7C1273T3CHOHeLaBHKなどの確立された細胞株を含む細菌種、哺乳動物又は昆虫の宿主細胞を含むが、それに限定されない。プラスミド及び他のウイルスベクターと異なり、アデノウイルスベクターが、心筋層、血管内皮、及び骨格筋などの心臓血管関連部位に高レベルのタンパク質を発現し、分裂、非分裂の両方の細胞に遺伝子の移送が行われることから、アデノウイルスベクターが有意に好まれる。さらにその遺伝子が、エピクロモソマル位置におけるアデノウイルスベクター機能により移送され、さらに宿主ゲノムの必須部位に移送遺伝子を挿入し、不適切な危険性をほとんどなく輸送される。さらに所望されるアデノウイルスベクターが、ウイルスの複製に求められる少なくとも1つの遺伝子機能に欠陥がある。好ましくは、アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのE1E2及び/又はE4領域の特に重要なゲノム機能の少なくとも1つに欠陥がある。より好ましくはそのベクターが、アデノウイルスゲノムのE3領域の少なくとも1部にさらに欠陥がある。組み換え型アデノウイルスが、培養培地にウイルスを単に加えることにより、培養細胞に導入することができる。宿主の動物ヒトへの感染が、血流又は所望の組織にウイルス粒子を直接注入することにより行うことができる。血清中のウイルスの半減期を、リポソーム又はポリエチレングリコールと、ウイルスとを複合することにより、延長することができる。アデノウルスベクターが、通常ウイルス線維タンパク質のノブ領域とコクサッキーウイルス及びアデノウイルスリセプター、CARとの間の相互作用を介して細胞に入る。ウイルスベクターが、特定細胞リセプターに特異的リガンドを発現させるためウイルスを遺伝子操作することにより、特定細胞に対し、又はCARを発現しない細胞に対して対象とすることができる。別の例において、内在性のアポトーシスに特異的なeIF5A、又はアポトーシスに特異的なDHS、又はその両方の転写を、化学物質を用い化学的上限調節をすることにより、又はアポトーシスに特異的なeIF5Aの活性化を化学的に強化することにより、アポトーシスを開始又は増強することができる。こうした例の1において、PGF2αを、動物ヒトのガン細胞又は腫瘍に、DHS及びeIF5Aの転写物を上限調節まで投与することができる。アポトーシスに特異的なeIF5Aが、アポトーシスに基づく疾患過程を含む、その理由がアポトーシス経路に関与する下流のイフェクター及び転写因子の転写後の調節に作用すると考えられる。アポトーシスに特異的なeIF5Aとアポトーシスに特異的なDHSの単独か、組み合わせのいずれかにて調節する本発明の方法は、アポトーシスの誘発又は増強することになるか、又はアポトーシスとなることが出来ない要因とされるか、要因とするか、そうでなければそれと関連した病因を有する疾患を、治療及び防止するための新たな方法及び組成物を形成する動物細胞にて行うことができる。多くの重要なヒトの疾患は、アポトーシス制御における異常により引き起こされる。これらの異常性は、細胞数の病理的な増大、又は損傷による細胞の喪失のいずれかにて起こる。限定されない例として、本発明の方法及び組成物が、以下のアポトーシス関連疾患及び不全を防止又は治療するため使用される、すなわち神経細胞神経細胞変性不全、自己免疫不全、多発性硬化症、デユシェンヌ筋ジストロフィ、運動性神経細胞不全、虚血性疾患、慢性心臓不全、発作、乳児脊髄筋萎縮、急性心停止、腎機能不全、アトピー性皮膚炎、敗血及び敗血発作、AIDS、肝炎、緑内症、糖尿病、喘息、色素性網膜症、骨多孔症、異種移植片の拒絶、及び火傷による障害に使用される。本発明の方法は、それぞれ悪性腫瘍細胞の殺傷か腫瘍の進行を阻害するに充分な量で、悪性腫瘍細胞を有するか腫瘍に罹っている動物に対する療法的治療に使用することができる。これを実現する十分な量が、治療としての有効な投与量として定義される。これを使用するための有効量が、疾患の重篤度、及び動物自身の一般的な免疫系症状に依存することになる。腫瘍細胞の増殖を阻害することは、悪性腫瘍の進行の防止又は減少、たとえば腫瘍の増殖、浸襲性、転移及び/又は再発を防止又は減少させることを意味する。本発明の方法は、たとえば、胸部、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部及び頚部、卵巣、前立腺、脳、すい臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、頚部管又は肝臓を含む何か適合する腫瘍を治療するために使用することができる。動物、好ましくは哺乳動物、そしてより好ましくはヒトが、本発明の組成物及び方法を用い治療できることである。従って本発明の方法は、invitro、exvivo、又はinvivoにて行うことができる。さらに投与計画は、動物の疾患状態や症状で変化し、そして一回の薬物適用量又は連続注入から1日当たり複数の投与までの典型的な範囲となるか又は治療及び動物の症状により明示されるかである。しかしながら本発明が、何か特定の投与量に限定されないことを留意すべきである。本発明において、何か適切な方法又は経路が、たとえば経口、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内への投与のため使用することができる。投与されるアンタゴニストの用量は、たとえば投与される分子の型、治療される腫瘍のタイプ及び重篤度、及び投与する経路を含む多くの要因に依存する。しかしながら本発明は、何か特定方法又は投与の経路に限定されないことを強調すべきである。別の1例において、本発明の方法は、1又は複数の従来の治療と組み合わせて使用することができる。たとえば適切な抗腫瘍剤は、化学療法剤又は放射線などを使用することができる。さらに別の例において本発明の方法は、たとえばサイトカイン又は他の免疫刺激剤など1又は複数のアジュバントと組み合わせ使用することができる。さらに別の例において、アポトーシス関連疾患の診断は、アポトーシスに特異的なeIF5A、及び2つが構造的に相同的するが、カルボキシル末端にて違う、異なるプロモータによって異なる位置から転写される点にて、アポトーシスに特異意的eIF5Aと異なる増殖するeIF5Aを用いて行うことができる。本発明の診断方法が、所定細胞に存在するeIF5Aの増殖量と、同一細胞に存在するアポトーシスに特異的なeIF5A量とを比較することを含む。通常に機能をしている間、細胞が、アポトーシスに特異的なeIF5Aなどのサイトカイン、レチノイドステロイドファミリーの核リセプターに対するリガンド、及びタンパク質キナーゼを結合及び阻害する小分子化合物を含む、アポトーシス調節剤として有望であることを示す生物応答修飾剤を、本方法を使用するアポトーシス調節活性を定義するためスクリーニングすることができる。適切な候補の1が、タンパク質キナーゼCαアンチセンスオリゴヌクレオチドのISIS3521であり、それが抗腫瘍作用を有する。他の特定候補としては、ガン及び神経細胞変性疾患に誘発する種々の細胞型におけるアポトーシスを誘起及び実行に必須の役割を果すことが知られたカスパーゼ;Bcl2の生成をブロックするアンチセンスの薬剤であるGENASENSETM;P53を療法的に標的とする遺伝子である、INGN241;抗CD20モノクロナールであるrituximab及び心臓血管症及びガンのため一般的に誘発される療法が含まれる。予防又は治療を目的として、動物に使用される場合、本発明の核酸及びポリペプチドが、医薬的に受け入れ可能な担体を付加的に含む組成物の形状にて投与できることが理解されよう。医薬的に受け入れ可能な適切な担体には、たとえば1又は複数の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストローズ、グリセロール、エタノールなど、並びにその組み合わせが含まれる。さらに医薬的に受け入れ可能な担体が、湿潤剤又は乳化剤などの補助物質、防腐剤又は緩衝液を最小量含み、それが結合タンパク質の保存寿命又は効能を高める。注射する組成物が、技術的に周知なように、迅速に提供できるように成形され、哺乳動物への投与後、活性成分の放出を維持又は遅延することができる。本発明の組成物は、種々の形状でも良い。これらには、たとえば、錠剤、ピル、粉末、液状、分散又は懸濁状、リポソーム、座薬、注射できるが溶解しない溶液など、固体、半固体、及び液状の投与形状が含まれる。好ましい形状は、意図された投与モード、及び適用される治療法に依存する。こうした組成物を、医薬的技術においてよく知られた方法にて調製することができる。この組成物を作成する際の活性成分が、通常担体と混合されるか、又は担体により希釈されるか、及び/又はたとえばカプセル、サケット、紙又は他の容器の形状にて可能な担体内にて包含される。担体を希釈剤として使用する場合、それが、固体、半固体、又は液状体で良く、それらが、活性成分のための担体、賦形剤又は培地として作用する。従って組成物は、錠剤、薬用ドロップ、サケット、カッシュ、エリキシル剤、エアロゾルの形状、例えば10重量の活性化合物を含む軟膏、ソフト、及びハードなゼラチンカプセル、座薬、注射用液体、懸濁液、無菌状に包装された粉末、及び局所頒布として可能である。現在本発明に一般的に記載されたものと同一のものが、図示される方法にて提供される、以下の実施例を参照することにより容易に理解されよう。実施例が本発明を理解する際の支援となると説明されているが、いかなる点においてその範囲を限定する意図がなく、且決して限定するように構成されていない。本実施例が、従来の方法の詳細な説明が含まれていない。こうした方法が、当業者に充分に知られ多く公に記載されている。ベクター及びプラスミドの構成に用いられるもの、こうしたベクター及びプラスミドにポリペプチドをコードする核酸の挿入、宿主細胞内にプラスミドを導入、遺伝子の発現及び決定及び遺伝子産生などの従来の方法の詳細な記載は、多くの公開文献から得ることができ、たとえば、SambrookJら、MolecularCloningALaboratoryManual2ndedColdSpringHarborLaboratoryPressが含まれる。本明細書に言及する全ての文献が、その全体において組み入れられている。実施例1本実施例は、アポトーシスに特異的発現を呈するラットのeIF5A核酸をコードする全長cDNAの単離、及び特徴付けを実証する。ラットの黄体における過剰排卵及びアポトーシスの誘発メスの未成熟ラットを、50IUのPMSG、さらに60から65時間後50IUのHCGにて皮下注射し過剰排卵させた。HCG処理から7日後、黄体のアポトーシスを、500mgのPGF2αで皮下注射にて誘発した。PGF2αにて処理後そのラットを、種々異なる時間にて犠牲にし、黄体を取り出し液体窒素中に入れた。コントロールとしての黄体組織を、PGF2α処理直前のラットを犠牲にして得た。ラットの卵巣の黄体細胞の分散過剰排卵から6乃至9日後、ラットを、500mgのPGF2αにより複数部位を皮下注射にて処理した。15乃至30分後、卵巣を過剰排卵されたラットから取り出し、氷上のEBSSに置きブロット乾燥しそして計量した。結合している組織を除去し、そして卵巣を、カミソリ刃にて細断し、EBSS2Xにて2回洗浄した。コラゲナーゼ溶液を、EBSS5mlに65mgのコラゲナーゼを攪拌することにより調製した。8個の卵巣から細断された組織を、50mlのエレンメヤーフラスコにEBSS中5mlのコラゲナーゼに加え、そしてダイアムドピペットに数回引き入れることでゆっくりと振動させた。次に細断された組織の入っているフラスコを、95の空気、5のCO2の下にゆっくり振動させながら、37°Cの20分間水浴中に置いた。このインキュベート後、そのフラスコを氷上に置き、そして細胞の懸濁物を、プラスチック製移送ピペットによりSwissNirexNylonMonifilamentに合せたニテクスフィルター上に移した。その濾過物を15mlのファルコン試験管に収集した。コラゲナーゼ溶液の第二のアリコートを、50mlのエレンメヤーフラスコに残っている細断した組織に加え、ピペットを用いゆっくりと振動させ、10分間インキュベートし、そして上記のように濾過した。2つの濾過物を合わせ臨床遠心分離機にて室温で、5分間遠心分離した。2mlまでの上澄液以外全てを、ピペットにて取り出し廃棄し、沈殿している細胞を、残っている2mlの上澄液にて再懸濁した。その細胞を、5mlのMEMを加えることにより2回洗浄し、そして上記ように遠心分離にかけそして再懸濁した。洗浄された細胞を、50mlのエレンメヤーフラスコに10mmのグルタミンを含む30mlsのMEMに再懸濁し、そして95の空気、5のCO2下、37°Cにて1時間、振動することなくインキュベートした。次に、その細胞を上記のように遠心分離により沈殿させ、そして10mmのグルタミンを含むMEMにおいて再懸濁した。分散された細胞の濃度を、血球計数計を用いて決定し、そして変動性をトリプシンブルー染料を用いて評価した。25x105細胞のアリコートを、12x75mmの試験管に入れ、そして95の空気、5のCO2下、37°C、25時間振動することなくインキュベートした。この期間におけるアポトーシスの進行を、DNAのラダーリング度を評価することで監視した。DNAラダーリングによるラット黄体のアポトーシスの視覚化アポトーシスの程度を、DNAラダーリングにより決定した。製造指示に従いQLAampDNABloodKitを用いてゲノムDNAを、分散された黄体細胞又は細断された黄体組織から単離した。PGF2αにて処理しアポトーシスを誘発する前、アポトーシスを誘発した1時間、及び24時間後の黄体組織を細断した。単離されたDNAを、02μCiα32PdCTPimMのTris05mMのEDTA3単位のKlenow酵素、及び各dATPdGTP及びdTTPに02pMより500ngのDNAを、室温にて30分間インキュベートして末端を標識化した。組み込まれなかったヌクレオチドを、Sambrookらによる1mlのSepadexG50カラムにその試料を通すことにより除去した。次にその試料をTris酢酸EDTAゲル電気泳動により溶解した。そのゲルを真空下室温にて30分間乾燥し、そしてX線フイルムに80°Cにて24時間暴露した。1つの例において過剰排卵のラットの黄体におけるアポトーシスの程度を、注射によりPGF2αを注入し0、1、又は24時間後のいずれかにて試験した。0時間であるコントロールではPGF2αが注入されることなく、卵巣を取り出した。アポトーシスに関連したヌクレアーゼ活性を反映した低分子量のDNA断片のラダーリングが、PGF2αの処理前に細断されたコントロール黄体組織に明示されないが、アポトーシス誘発1時間以内では認識することができ、アポトーシス誘発24時間後までには顕著に表れ、それが、図16に示されている。この図におけるパネルの上部が、ラット黄体のアポトーシスに特異的なDHScDNAの32PdCTPにて標識化された3の未翻訳領域にてプローブされたNorthernblotのオートラジオグラフィである。パネルの下側は、全RNAの臭化エチジウム染色ゲルである。各レーンが、10μのRNAを含む。そのデータは、血清を取り出した後のeIF5A転写の下限調節があることを示している。別の例における該当するコントロール動物を、PGF2αの代りに生理食塩水にて処理した。生理食塩水又はPGF2αにて処理し15分後、黄体を動物から取り出した。ゲノムDNAを、動物から組織を取り出し3時間、及び6時間後その黄体から単離した。そのゲノムDNAのDNAラダーリング及び末端標識化の増大が、明示されたが、組織を取り出し3時間後では、明示されていない。図17を参照。さらに黄体がPGF2αにて処理して15分後に細断された場合、アポトーシスを反映するDNAのラダーリングが明示され、EBSSにおけるinvitroの条件下、6時間保持された。さらにアポトーシスに関連するヌクレアーゼ活性が、ゲノムDNAのより進展した末端標識からも明らかである。別の例において、過剰排卵を、皮下注射にて500μのPGF2αの注入により誘発した。コントロールラットを、等量の生理食塩水溶液にて処理した。15乃至30分後、卵巣を取り出し、そしてコラゲナーゼにより細断した。PGF2αにて処理されたラットの分散された細胞を、10mmのグルタミン、プラス10mmのスペルミジンにて1時間、そしてスペルミジンがなく10mmのグルタミンにてさらに5時間、又は10mmのグルタミンプラス10mmのスペルミジンにて1時間、そして10mmのグルタミン、プラス1mmのスペルミジンにてさらに5時間にてインキュベートした。各試料から500ngのDNAを、Klenow酵素を用いてα32PdCTPにて標識化し、18のアガロースゲルにて分離し、そして24時間フイルムに暴露した。結果を図18に示す。さらに他の例において、過剰排卵されるラットを、体重当たり1mg100gのスペルミジン量を皮下注射にて、体重当たり0333mg100gの3等分の容量を、500μのPGF2αにて皮下注射する前2412及び2時間にて注入された。コントロールラットを3組みに、すなわち注入しないもの、3匹がスペルミジンを注入するがPGF2αを注入しない、及び3匹が、PGF2αの処理前に当量の生理食塩水による注入、に分けた。卵巣を、プロスタグランジンにて処置後1時間35分又は3時間45分のいずれかにてラットの前面から取り出しDNAの単離に使用した。各試料から500ngのDNAを、Klenow酵素を用いてα32PdCTPにて標識化し、18のアガロースゲル上にて分離し、そして24時間フイルムに暴露した、レーン1、注入なしレーン2、3匹を、スペルミジンにて注入レーン3、3匹を生理食塩水を注入し、その後PGF2αにて注入、レーン4、3匹をスペルミジンにて注入し、その後PGF2αにて注入、レーン5、3匹をスペルミジンにて注入し、その後PGF2αにて注入、レーン6、3匹をスペルミジンにて注入し、その後PGF2αにて注入、レーン7、3匹をスペルミジンにて注入し、その後PGF2αにて注入したものである。得られた結果を図19に示す。RNAの単離PGF2αによるアポトーシスを誘発後の種々の時間にて、全RNAを、ラットより取り出した黄体組織から単離した。要約すればその組織を液体窒素中にてすり潰した。すり潰された粉末を、30mlのグアニジニウム緩衝液に混合した。その混合物をMiraclothの4層を通し濾出し、そして10000gで4°C、30分間遠心分離にかけた。次に上澄液を、塩化セシウム密度勾配遠心分離に、11200g、20時間かけた。ペレット状RNAを、75エタノールにてすすぎ洗し、600mlのDEPC処理水にて再懸濁し、そしてRNAを15mlの95エタノール及び60mlの3MNaoAcにより70°Cにて析出させた。ゲノムDNAの単離、及びラダーリングゲノムDNAを、製造業者の指示によるQIAampDNABloodKitを使用して抽出された黄体組織又は分散された黄体細胞から単離した。そのDNAは、02μCiα32PdCTP1mMのTris、05mMのEDTA3単位のKlenow酵素、及びdATPdGTP及びdTTPそれぞれ02pM、により500ngのDNAを室温で30分間インキュベートすることにより、末端を標識化した。組み込まれないヌクレオチドを、Maniatisらによる記載方法により、1mlのSephadexG50カラムに試料を通すことにより除去した。次にその試料をTris酢酸EDTAゲル電気泳動により溶解した。そのゲルを、真空下室温にて30分間乾燥し、x線フイルムにて80°C、24時間暴露した。プラスミドDNAを単離し、そしてDNAの配列決定上記Sambrookらにより記載のアルカリ溶解法を、プラスミドDNAを単離するため使用した。全長ポジテブなcDNAを、ジデオキシ配列決定法を用い配列決定した。Sangerら、ProcNatlAcadSciUSA7454635467を参照。オープンリーデングフレームを、BLASTsearchを用い翻訳、解析し、そして配列構成を、BCMSearchLauncherMultipleSequenceAlignmentsPatternInducedMultipleAlignmentMethodを用いて行ったを参照。配列及び配列の構成を図511に示した。ラットの黄体RNAのノーザンブロットハイブリッド化アポトーシスの種々の段階にてラットの黄体から単離された20mgの全RNAを、1の変性ホルムアルデヒドアガロースゲルにて分離し、ナイロン膜上に固定した。ランダムプライマーキットを用い32PdCTPで標識化された全長のラットアポトーシスに特異的なeIF5AcDNAを、膜7x107をプローブするため使用した。別の選択肢として、ランダムプライマーキットを用いて32PdCTPにて標識化された、全長のラットアポトーシスに特異的なDHScDNAを、膜をプローブするため使用した。その膜を一度1xSSC、01のSDSにて室温で1回洗浄し、02xSSC、01のSDSにて65°Cで3回洗浄した。その膜を乾燥し、そしてX線フイルムに70°Cにて1昼夜暴露した。示すことができるように、eIF5A及びDHSが共に、黄体組織をアポトーシスする際に上限調節される。アポトーシスに特異的なeIF5Aの発現が、ゼロ時間にPGF2αlowで処理しアポトーシスを誘発後実質的に高められ、処理後1時間以内に実質的に増大し、処理8時間以内にてより有意に増大し、そして処理24時間以内で僅かに増大する。DHSの発現が、時間ゼロで低く、処理1時間以内で実質的に増大し、処理8時間以内にてより有意に増大し、そして処理24時間以内で再度僅かに増大した。ラットのアポトーシスする黄体の形成酵母、菌類及びヒトのeIF5Aの配列に基づくプライマーを使用したRTPCRの産生物遺伝子の3末端に相当する部分長のアポトーシスに特異的なeIF5A配列を、酵母、菌類及びヒトのeIF5Aの配列から設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、RTPCRによりアポトーシスラットの黄体RNA鋳型から生成した。ラットのeIF5A遺伝子の3末端を単離するために用いられた上流のプライマーが、20ヌクレオチドの再生プライマー:5TCSAARACHGGNAAGCAYGG3で、ここでSはC及びGから選択されRはA及びGから選択され、HはAT及びCから選択され;そしてNは任意の核酸である。ラットのeIF5A遺伝子の3末端を単離するために用いられる下流プライマーが、42ヌクレオチド:5GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3を含んでいる。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を行った。要約すれば、5mgの下流プライマーを用いcDNAの第一の鎖を合成した。次に第一の鎖を、上流及び下流の両プライマーを用いRTPCRの鋳型として使用した。アガロースゲル上のRTPCR産生物を分離すると、900bpの断片の存在を示し、それが平滑末端リゲーションを用いpBluescriptTMにサブクローンされ、そして配列決定された。3末端のcDNA配列が配列番号11で、そして3末端のアミノ酸が配列番号12である、図12を参照。遺伝子の5末端に相当し、そして3末端と重なり合う、部分長のアポトーシスに特異的なeIF5A配列を、RTPCRによるアポトーシスラットの黄体RNA鋳型から生成した。5のプライマーは、24merで、CAGGTCTAGAGTTGGAATCGAAGC3の配列を有し、それがヒトeIF5A配列から作成された。3プライマーは、30merで、3末端のRTPCR断片より設計された5ATATCTCGAGCCTTGATTGCAACAGCTGCC3配列を有する。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行った。要約すると、5mgの下流プライマーを用いDNAの第一鎖を合成した。次に第一鎖を、上流と下流の両プライマーを用いRTPCRの鋳型として使用した。アガロースゲル上のRTPCR産生物を分離すると、500bpの断片があることを示し、それを、上流と下流の各プライマーに存在するXbaI及びXhoIクローニング部位を用い、pBluescriptTMにてサブクローンし、そして配列決定した。5末端のcDNA配列が配列番号15で、そして5末端のアミノ酸配列が、配列番号16である。図2を参照。ラットのアポトーシスに特異的なeIF5Aの3と5の末端配列が重なり合い、そして全長のcDNA配列をコードする。RTPCRにより得られたラットのアポトーシスに特異的黄体eIF5A遺伝子の全長cDNAとしてのヌクレオチド配列、配列番号1が、図3に明示され、そして相当する誘発アミノ酸配列配列番号9である。eIF5Aの誘発された全長アミノ酸配列が、ヒト及びマウスのeIF5A配列にて構成される。図79を参照。アポトーシスするラット黄体の生成、ヒトDHS配列に基づくプライマーを使用したRTPCRの産生遺伝子の3に相当する部分長のアポトーシスに特異的なDHS配列を、ヒトのDHS配列から設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、RTPCRによりアポトーシスするラットの黄体RNA鋳型から生成した。5プライマーが、20merで、5GTCTGTGTATTATTGGGCCC3の配列を有し、3プライマーが42merで、5TCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3の配列を有する。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行った。要約すると、5mgの下流プライマーを用い、cDNAの第一鎖を合成した。次に第一鎖を、上流と下流の両プライマーを用いRTPCRの鋳型として使用した。アガロースゲル上にRTPCR産生物を分離すると、606bpの断片を存在することが示され、それが平滑末端リゲーションを用いpBluescriptTMにサブクローンされ、そして配列決定された。RTPCRにより得られたラットのアポトーシスに特異的黄体DHS遺伝子のcDNAの部分長としてのヌクレオチド配列を、図4に示しさらに該当して誘発されたアミノ酸配列が配列番号7である。ゲノムDNAの単離、及びサザーン法による分析サーザンブロッテング用のゲノムDNAを、切除されたラットの卵巣から単離した。約100mgの卵巣組織を、小片に分割し15mlのチューブに入れた。この組織を、その組織の懸濁液を静かに振盪することにより、1mlのPBSにて2回洗浄し、さらにピペットを用いてPBSを取り出した。その組織を、206mlのDNA緩衝液にて再懸濁し、そして240μlの10SDS、及び100μlのプロテナーゼKを加えた。その組織を水槽にいれ45°Cにて1昼夜振盪した。その後の期日に、別の100μlのプロテアーゼKを加え、そしてその組織懸濁液を水槽にて45°Cにてさらに4時間インキュベートした。インキュベート後その懸濁液を、当量のフェノール:クロロフォルム:アミルアルコールにて1回抽出し、さらに当量のクロロフォルム:イソアミルアルコールにて1回抽出した。抽出後110容量の3Mの酢酸ナトリウム及び2容量のエタノールを加えた。ブーゼンバーナを用いてシールし、フック内に形成されたガラスピペットを使用し、溶液からDNAスレッドを溶液から取り出し、清浄なマイクロ遠心チューブにそのDNAを移した。そのDNAを70エタノールにて1回洗浄し、そして10分間空気乾燥した。DNAペレットを500μlの10mMのTrisHClに溶解し、10μのRNaseAを加えて、そしてそのDNAを37°Cにて1時間インキュベートした。そのDNAを、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールにて1回抽出し、そして3Mの酢酸ナトリウムを110容量、及び2容量のエタノールを加えることでDNAを沈殿させた。DNAを、4°C、13000xgにて10分間遠心分離にかけてペレッ化した。DNAペレットを、70のエタノールにて1回洗浄し、DNAを4°Cにて1昼夜回転することにより、10mMのTrisHClを200μlにて溶解した。サーザンブロット分析用に、ラットの卵巣から単離されたゲノムDNAが、内在性の遺伝子において切断されないか、1回のみ切断かのいずれかである種々の制限酵素にて消化された。これを行うために10μgのゲノムDNA、20μlの10X反応緩衝液、および100Uの制限酵素を、200μlの全反応容量に5乃至6時間反応させた。消化されたDNAを、07アガロースゲルに負荷し、40ボルトで6時間又は15ボルトで1昼夜電気泳動にかけた。電気泳動後そのゲルを、02NのHClにて10分間再精製し、その後変性溶液にて2乃至15分間洗浄し、そして2乃至15分間中性緩衝液にて洗浄した。そのDNAをナイロン膜に移しさらにその膜を、ハオブリダイゼーション溶液、05のSDS及び15mgのdenaturedsalmonspermDNAにてプレハイブルダイズした。ラットのeIF5AcDNAの3URTの700bpPCR断片を、a32PdCTPを用い、ランダムプライミングにて標識化し、そして1X106cpmmlにてその膜に加えられた。同様に、ラットのDHScDNAの606bpPCR断片が、α32PdCTPにて標識化されたランダムプライムであり、第二の同定膜に1X106cpmmlで加えられた。そのブロットを42°Cにて一昼夜ハイブリダイズし、さらに2XSSC及び01のSDSで42°Cにて2回洗浄し、そして1XSSC及び01のSDSで42°Cにて2回洗浄した。次にそのブロットを、3乃至10日間フイルムに暴露した。ラットの黄体ゲノムDNAを、図20に示すように制限酵素にて切断し、32PdCTPにて標識化された全長eIF5AのcDNAにてプローブした。ストリンジェントの高い条件下でのハイブリダイゼーションが、各制限酵素にて消化されたDNA試料に対し、幾つかの切断断片に全長cDNAプローブをハイブリダイズを表し、eIF5Aの幾つかのアイソフォームの存在を示している。特に注意すべきもののうち、ラットゲノムDNAがEcoRVにより消化される場合、アポトーシスに特異的なeIF5Aのオープンリーデングフレーム内の制限部位を有し、eIF5Aのアポトーシスに特異的アイソフォームの2つの制限酵素断片を、サザンブロット法にて検出することができる。2つの断片が、図20の2重の矢印にて示されている。eIF5Aのアポトーシスに特異的アイソフォームに相当する制限酵素断片が、標識化されたEcoR1及びBamH1、オープンリーデンフレーム内に切断部位がない制限酵素である、レーンにて標識化されたEcoR1及びBamH1を単一矢印により示される。これらの結果により、アポトーシスに特異的なeIF5Aが、ラットの単一コピー遺伝子であることが示唆される。図5から13に示されるように、種を交差して高い保守性があり、したがってそれは、いずれかの種内のアイソフォーム間を有意な量の保守性があることが期待できるであろう。図21が、32PdCTPにて標識化された、ラット黄体アポトーシスに特異的なDHScDNAの一部分の長さにてプローブされたラットゲノムDNAのサザンブロットを示す。ゲノムDNAが、プローブとして使用される部分長のcDNAを切断しない制限酵素としての、EcoRVにより切断された。その切断による断片が、遺伝子の2つの複製があるか、又はその遺伝子がEcoRV部位にてイントロンを含んでいるかを示し実証した。実施例2本例は、アポトーシスに特異的なeIF5A及びDHSによるアポトーシスの調節を実証COS7細胞の培養及びRNAの単離野生型T抗原をコードするSV40の変異体にて形質転換されたアフリカ緑サルの腎臓線維芽細胞様の細胞株のCOS7を、トランスフェクションに基づく全実験に使用した。COS7細胞を、Lグルタミンのリッター当たり0584g、グルコースのリッター当たり45g、及び037の炭酸水素ナトリウムにて、DulbeccosModifiedEaglesMediumにおいて培養した。培養培地に、10の牛胎児血清及び100単位のペニシリンストレプトマイシンを補充した。その細胞を、5のCO2及び95の空気の湿気性環境下37°Cにて増殖させた。その細胞を、025のトリプシン及び1mMのEDTAの溶液により、接着細胞を剥離することにより、それぞれ3乃至4日小領域の培養を行った。剥離された細胞を、新たな培養皿にて新鮮な培地と分離比110にて調合した。RNAを単離するため使用されるCOS7細胞を、150mmの組織培養処理皿にて増殖させた。トリプシンEDTA溶液にて細胞を剥離して、その細胞が採取された。剥離された細胞を遠心チューブに集め、さらにその細胞を、3000rpmにて5分間遠心分離にてペレットとした。その上澄液を取り出し、そして細胞を液体窒素によりフラッシュ冷凍した。RNAを、GenEluteMammalianTotalRNAMiniprepkitを用い、作成指示に従って冷凍細胞から単離した。組み換え型プラスミドの構成及びCOS7細胞のトランスフェクションセンス配向のラットのアポトーシスeIF5A、及びアンチセンス配向における3の翻訳されない領域のラットアポトーシスeIF5Aの全長コードする配列を輸送する組み換え型プラスミドが、哺乳動物のエピトープタグ発現ベクターのpHM6を用いて構成され、それを図21に示す。そのベクターには以下のもの、すなわちCMVプロモータ、ヒトサイトメガロウイルス介在初期プロモータエンハンサー;インフルエンザヘマグルチニンからのHAノナペプチドエピトープタグBGHpABovine増殖ホルモンポリアデニール化シグナルf1orif1originSV40oriSV40初期プロモータ及びオリジンNeomycinNeomycin耐性遺伝子SV40pASV40ポリアデニール化シグナルColE1ColE1オリジンアンピシリンアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。ラットのアポトーシスeIF5A及びラットのアポトーシスeIF5Aの3UTRの全長をコードする配列を、pBluescriptにおける元来あるラットeIF5AのRTPCR断片からPCRにより増幅した。全長eIF5Aの増幅に使用されるプライマーが以下の様である、つまり前方5GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG3及び逆方5CTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG3であった。全長3UTRのラットeIF5Aを増幅するために、使用されるプライマー以下のようである、つまり前方5AATGAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC3及び逆方5GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3である。アガロースゲル電気泳動後に単離された全長のラットeIF5APCR生成物の長さが、430bpであるが、3UTRのラットeIF5APCR生成物の長さが、697bpである。両PCR生成物を、pHM6全長eIF5A及びpHM6アンチセンス3UTRのeIF5Aを形成するためにpHM6のHind3及びEcoR1部位にてサブクローンした。全長のラットeIF5APCR生成物を、抗HAパーオキシダーゼ抗体を使用して組み換え型タンパク質を検出できるよう複数のクローニング部位の上流に存在するインフルエンザ赤血球凝縮素からノナペプチドエピトープタグにて、フレームにサブクローンした。ヒトのサイトメガロウイルス介在初期プロモータエンハンサーにより、発現が誘発され哺乳動物細胞株における高レベル発現が保証される。さらにプラスミドが、安定なトランスフェクトの選択を可能にするネオマイシン耐性遺伝子、及びCOS7などのSV40ラージT抗原を発現する細胞において、エピソーマルの複製を可能にするSV40初期プロモータ及びオリジンを特徴とする。トランスフェクト実験に使用されるCOS7細胞を、タンパク質抽出に使用される細胞用24ウエルの細胞培養プレート、又は染色用に使用される細胞用4チャンバー培養スライドのいずれかにて培養した。その細胞を、10のFBSにて補充されたが、ペニシリンストレプトマイシンを欠失した状態のDMEM培地にて、50乃至70の密集度まで増殖させた。24ウエルプレートの1ウエルに又は培養スライドに充分なトランスフェクト培地を、425μlの血清のないDMEMに、032μgのプラスミドDNAを希釈し、そしてその混合物を室温にて15分間インキュベートすることにより調製した。16μlのトランスフェクト試薬、LipofectAMINEを、425μlの血清のないDMEMにて希釈し、そして室温にて5分間インキュベートした。5分後LipofectAMINE混合物をDNA混合物に加え、室温にて30乃至60分間共にインキュベートした。トランスフェクトされた細胞をトランスフェクション培地に置く前に、血清のないDMEMにて1回洗浄し、そしてその細胞を増殖チェンバーに4時間戻した。インキュベート後、017mlのDMEMプラス20のFBSをその細胞に加えた。その細胞を、ウエスタンブロット分析用に染色するか、採取する前にアポトーシスとなる様が誘発される、いずれか前にさらに40時間培養した。コントロールとして、プラスミドDNAがトランスフェクション培地から除外される、モックトランスフェクションも行った。タンパク質の抽出及びウエスタンブロッテング法細胞をPBSにて2回洗浄し、さらに150μlの熱SDSゲル負荷緩衝液を加えることにより、タンパク質が、トランスフェクトされた細胞からウエスタンブロッテング法のため単離された。細胞溶離物をマイクロ遠心チューブに採取し、95°Cにて10分間加熱し、その後13000xgにて10分間遠心分離にかけた。上澄液を新しいマイクロ遠心チューブに移し、それを使用するまでー20°Cにて保存した。ウエスタンブロッテング法では、全タンパク質として25又は5μgが、12のSDSポリアクリルアミドゲル上にて分離された。分離されたタンパク質を、ポリビニリデンジフルオライド膜に移した。次にその膜を、停止溶液乳粉、PBS中002のナトリウムアジドに1時間インキュベートした。その膜をPBSTに4°Cで1昼夜保存した。翌日室温まで加温した後その膜を、1μgmlのポリビニルアルコールに30秒間ブロックした。その膜を脱イオン水にて5回すすぎ洗いし、その後PBSに5乳の溶液に30分間ブロックした。一次抗体をその膜にインキュベートする前に、PBSに5乳の溶液に30分間プレインキュベートした。幾つかの一次抗体を使用した。抗HAパーオキシダーゼ抗体を15000に希釈して使用し、組み換え型タンパク質の発現を検出した。この抗体がパーオキシダーゼに接合されることから、二次抗体を全く必要としなく、そしてそのブロットを洗浄し、そして化学蛍光法にて発生させた。使用された他の一次抗体が、p53Bcl2及びcMycを認識する原ガン遺伝子からのモノクロナール抗体である。p53へのモノクロナール抗体を01μgmlの希釈にて使用し、そしてBcl2及びcMycへのモノクロナール抗体を083μgmlの希釈にて共に使用した。60乃至90分間一次抗体とインキュベートした後その膜を、PBSTにて15分間3回洗浄した。次に2次抗体を、PBSに1乳にて希釈しそしてその膜にて60乃至90分間インキュベートした。p53が、一次抗体として使用される場合、使用される2次抗体が、アルカリホスファターゼに接合された11000に希釈したヤギ抗マウスIgGであった。Bcl2及びcMycが一次抗体として使用される場合、パーオキシダーゼに接合されたラビット抗マウスIgGを、15000の希釈にて使用した。二次抗体とインキュベートした後その膜を、PBSTにて3回洗浄した。ブロットを生成するため、比色分析法及び化学蛍光法の2種の検出方法が使用された。p53が、アルカリホスファターゼに接合の2次抗体と結合する1次抗体として使用した場合のみ、比色分析法を使用した。結合抗体が、033mgmLのニトロブルーテトラゾリウム、0165mgmLの5ブロモ4クロロ3インドリルホスフェイト、100mMのNaCl5mMのMgCl2、及び100mMのTrisHClの溶液にて、暗所でそのブロットをインキュベートすることで視覚化された。色素反応を、PBSに2mMのEDTAにてそのブロットをインキュベートすることにより停止した。化学蛍光検出法を、抗HAパーオキシダーゼ、Bcl2及びcMycを含む他の全ての一次抗体のため使用した。ECLプラスウエスタンブロッテング検出キットを、ペルオキシダーゼ接合の結合抗体を検出するために使用した。簡単にはその膜を、光ブロット乾燥しさらに試薬Aと試薬Bとを401にした混合物を暗所にて、5分間インキュベートした。膜をブロット乾燥し、アセテートシート間に置いて、そして10秒から10分間時間を変えてX線フイルムに暴露した。COS7細胞におけるアポトーシスの誘発トランスフェクトされたCOS7細胞におけるアポトーシスを誘発するために、2種の方法が用いられ、それは血清の無い方法とストレプトマイシン種としてアクチノマイシンDにて処理する方法である。両処理のためトランスフェクションより40時間後に、その培地をとり出した。血清飢餓実験のためその培地を、血清及び抗生物質の無いDMEMと置き換えた。10のFBSにて補給される抗生物質の無いDMEMにて増殖した細胞をコントロールとして使用した。アポトーシスを誘発するアクチノマイシンDに対し、その培地が、10のFBSにて補充された抗生物質のないDMEM、及びメタノールに溶解された1μgmlのアクチノマイシンDと置き換えられた。コントロール細胞を、10のFBSにて補充された抗生物質のないDMEM、及び等量のメタノールにて増殖した。両方法に対して、アポトーシス細胞の割合を、ヘキストかAnnexinVCy3のいずれかにて染色し、48時間後に決定した。さらにアポトーシスの誘発が、図22に示すようにノーザンブロット分析により確認された。ヘキストによる染色核の染色剤としてヘキストを、核の断片化や縮合化などの形態的特性に基づいてアポトーシス細胞を同定するため、トランスフェクトされたCOS7細胞の核標識に使用した。無水メタノールと氷酢酸とを31の混合から成る固定液を、使用直前に調製した。等量の固定液を、培養スライド上に増殖するCOS7細胞の培地に加え2分間培養した。培地固定液の混合液を細胞から除去し廃棄し、そして新たに1mlの固定液を細胞に加えた。5分後その固定液を廃棄し、1mlの新たな固定液をその細胞に加え5分間インキュベートした。固定液を廃棄しそして1mlのヘキスト染料を加える前に、その細胞を4分間空気乾燥した。暗所に10分間インキュベートした後その染色溶液を廃棄し、そしてスライドを脱イオン水にて1分間3回洗浄した。洗浄後1mlのMcI1vaines緩衝液をその細胞に加え、そして暗所にて20分間インキュベートした。その緩衝液を廃棄しその細胞を暗所にて5分間空気乾燥し、そしてその培養スライドのウエルを分けるチャンバーを取り出した。蛍光用として数滴のVectashieldを入れた培地を、そのスライドに加え、カバースリップでかぶせた。染色された細胞を、UVフイルターを用い蛍光電子顕微鏡下にて観察した。明るく染色された細胞又は断片化された核を、アポトーシスとして得点した。アネクシンVCy3の染色アネクシンVCy3のアポトーシス検出キットを、アポトーシス細胞に蛍光標識外在性のホスファチジルセリンに使用した。そのキットを、以下の修飾を伴う製造業者の手順に従って使用した。簡単には、4つのチャンバーの培養スライドで増殖するトランスフェクトされたCOS7細胞を、PBSにて2回そして1X結合緩衝液にて3回洗浄した。150μlの染色溶液にて1μgmlのAnnCy3を加え、そしてその細胞を暗所にて10分間インキュベートした。次に染色溶液を除去し、細胞を1X結合緩衝液にて5回洗浄した。チャンバーウオールを培養スライドから取り出し、そして数滴の1X結合緩衝液がその細胞上に置かれ、カバースリップにてかぶせられた。ポジテブに染色された細胞の赤色蛍光を可視化させるために、緑フィルターを用いて蛍光顕微鏡により染色細胞を分析した。可視光下細胞数を計数して全細胞の集団を決定した。実施例3本例は、アポトーシスに特異的なeIF5A及びDHSにてアポトーシスを調節することを実証する。前実施例記載の一般的手順及び方法を用いて、図23が、COS7細胞の一過性トランスフェクションのための手順を示すフローチャートで、そこで血清の無い培地における細胞を、プラスミドDNAでリポフェクトAMINEにて4時間インキュベートし、血清を加えてそしてその細胞をさらに40時間インキュベートした。次にその細胞が、分析前さらに48時間血清を含む通常の培地にてインキュベートされるか、分析前にアポトーシスを誘発するため血清を取り除く、又は分析前アポトーシスを誘発する前に48時間アクチノマイシンDにて処理されるかのいずれかである。図22は、pHM6にてトランスフェクトした後、COS7細胞における外来タンパク質の一過性発現を示すウエスタンブロットである。タンパク質を、モックトランスフェクトするか、pHM6LacZpHM6アンチセンス3rF5A、又はpHM6センスrF5Aにてトランスフェクトするかいずれかにて、48時間後COS7細胞から単離した。各試料から5μgのタンパク質を、SDSPAGEにより分画し、PVDF膜に移し抗HAパーオキシダーゼによりウエスタンブロット処理をした。結合抗体が化学蛍光法により検出され、30秒間X線フイルムに暴露した。LacZ及びセンスラットアポトーシスeIF5Aの発現を、明らかに見ることができる。上記のように、COS7細胞を、モックトランスフェクトされるか、pHM6センスrF5Aにてトランスフェクトされるかのいずれかであった。トランスフェクトから40時間後、48時間血清を止めてアポトーシスとなるようその細胞を誘発した。トランスフェクトされた細胞抽出物のカスパーゼのタンパク質分解活性を、蛍光定量均一カスパーゼアッセイキットを用い測定した。さらにDNA断片化が、FragELDNAFragmentationApoptosisDetectionkitを用いて測定され、それは、DNA断片の曝された3OH末端に、フルオレセイン標識デオキシヌクレオチドにて標識化してある。さらにCOS7細胞が、モックトランスフェクトされるか、pHM6センスrF5Aにてトランスフェクトされるかのいずれかであった。トランスフェクト化から40時間後、その細胞を血清を含む定常培地にさらに48時間増殖するか、48時間血清を停止しアポトーシスとなるよう誘発するか、あるいは48時間05μgmlのアクチノマイシンDにて処理することによりアポトーシスとなるよう誘発するかのいずれかである。その細胞ではヘキスト33258にて染色し、アポトーシスによる核の断片化を示すか、アネクシンAnnexinVCy3にて染色し、アポトーシスに伴うホスファチジルセリンの暴露を示すかのいずれかである。さらに染色された細胞を、緑色フィルターを使用し蛍光顕微鏡下見て計数することにより、アポトーシスになる割合を決定する。細胞の全集団を可視光線下にて計数した。図25では、COS7細胞が、センス配向の全長ラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて、一過性トランスフェクトされた場合に、カスパーゼ活性を増大することを反映し、アポトーシスを増強することが示されている。ラットアポトーシス誘発eIF5Aを発現すれば、カスパーゼ活性を60増大することになった。図26では、COS7細胞が、センス配向の全長ラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて一過性にトランスフェクトされた場合に、DNA断片化を増大することを反映し、アポトーシスを増強することが示されている。ラットアポトーシス誘発eIF5Aを発現すれば、DNA断片化を273増大することになった。図27では、COS7細胞が、センス配向の全長のラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて一過性にトランスフェクトされた場合に、核の断片化を増大することを反映し、アポトーシスの検出が示されている。ラットアポトーシス誘発eIF5Aを発現する細胞の断片化された核の発生率が有意に多くなる。図28では、COS7細胞が、センス配向の全長ラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて一過性にトランスフェクトされた場合に、核の断片化を増大することを反映し、アポトーシスの増強が示されている。ラットアポトーシス誘発eIF5Aを発現すると、非血清の飢餓状態、及び血清の飢餓状態の各試料におけるコントロールより核の断片化が27と63増大している。図29では、COS7細胞が、センス配向の全長ラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて一過性にトランスフェクトされた場合に、ホスファチジルセリンに暴露することを反映し、アポトーシスの検出が示されている。図30では、COS7細胞が、センス配向の全長ラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて一過性にトランスフェクトされた場合に、ホスファチジルセリン暴露の増大を反映し、アポトーシスの増強が示されている。ラットアポトーシス誘発eIF5Aを発現すると、非血清の飢餓状態、及び血清の飢餓状態の各試料で、コントロールよりホスファチジルセリン暴露が140と198増大している。図31では、COS7細胞が、センス配向の全長ラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて一過性にトランスフェクトされた場合に、核断片化の増大を反映しアポトーシスの増強が示されている。ラットアポトーシス誘発eIF5Aを発現すると、未処理及び処理例それぞれにおいてコントロールより核断片化が115と62増大している。図32では、センス配向の全長ラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて一過性にトランスフェクトされたCOS7細胞が、更に処理されないか、アポトーシスを誘発する処理を行うかのいずれかの条件下にてアポトーシス増強の比較が示されている。実施例4本実施例は、アポトーシスに特異的なeIF5A及びDHSを投与した後、アポトーシス活性が調節されることを実証している。さらにCOS7細胞を、モックトランスフェクト、pHM6LacZにてトランスフェクト、pHM6センスrF5Aにてトランスフェクトするかのいずれかにて行い、さらに40時間インキュベートした。各試料から5μgの試料を、SDSPAGEにて分画しPVDS膜に移し、そしてBcl2を認識するモノクロナール抗体にてウエスタンブロット処理した。ペルオキシダーゼに結合したラビット抗マウスIgGが、二次抗体として使用され、そして結合抗体を、化学蛍光及びX線フイルムに暴露することにより検出した。その結果を図32に示す。pHM6LacZにてトランスフェクトされた細胞よりpHM6センスrF5Aにてトランスフェクトされた細胞では、有意に少ないBcl2を検出することができ、したがってBcl2が下限調節される。さらにCOS7細胞が、モックトランスフェクトされるか、pHM6アンチセンス3rF5Aにてトランスフェクトされるか、pHM6センスrF5Aにてトランスフェクトされるかのいずれかであった。トランスフェクトから40時間後、その細胞が、48時間血清を停止しアポトーシスに成るよう誘発した。各試料からタンパク質抽出物の5μgの試料を、SDSPAGEにて分画しPVDF膜に移し、そしてBcl2を認識するモノクロナール抗体にてウエスタンブロット処理した。ペルオキシダーゼに結合したラビット抗マウスIgGが、二次抗体として使用され、そして結合抗体を化学蛍光及びX線フイルムに暴露することにより検出した。さらに追加として、COS7細胞が、モックトランスフェクトされるか、pHM6LacZにてトランスフェクトされるか、又はpHM6センスrF5Aにてトランスフェクトされるかのいずれかで、40時間インキュベートされた。各試料からタンパク質抽出物の5μgの試料を、SDSPAGEにて分画しPVDF膜に移し、そしてp53を認識するモノクロナール抗体にてウエスタンブロット処理した。アルカリ性ホスファターゼに結合したヤギ抗マウスIgGを、二次抗体として使用しそして結合した抗体を化学蛍光法にて検出した。最終的なCOS7細胞が、モックトランスフェクトされるか、pHM6LacZにてトランスフェクトされるか、又はpHM6センスrF5Aにてトランスフェクトされるかのいずれかでトランフェクトされ、そして40時間インキュベートされた。各試料からタンパク質抽出物の5μgの試料を、SDSPAGEにて分画しPVDF膜に移しそしてp53を認識するモノクロナール抗体にてプローブした。対応するタンパク質ブロットを、抗HAペルオキシダーゼにてプローブされ、ラットのアポトーシスに特異的なeIF5A発現レベルを決定した。アルカリ性ホスファターゼに結合したヤギ抗マウスIgGを、二次抗体として使用し、そして結合した抗体を化学蛍光法にて検出した。図33では、COS7細胞が、センス配向の全長ラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて一過性にトランスフェクトされた場合に、Bcl2の下限調節を示している。パネルの上部が、クーマシーブルータンパク質ブロットを表し、パネルの下部は、該当するウエスタンブロットを示している。有意的に少ないBcl2が、pHM6LacZにてトランスフェクトされた細胞よりpHM6センスrF5Aにてトランスフェクトされた細胞において、検出することができる。図34では、COS7細胞が、アンチセンス配向の全長ラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて一過性にトランスフェクトされた場合に、Bcl2の上限調節を示している。パネルの上部が、クーマシーブルー染色のタンパク質のブロットを表し、パネル下部が、該当するウエスタンブロットを示している。有意に多くのBcl2が、モックトランスフェクトされるか、又はpHM6センスrF5Aにてトランスフェクトされる細胞より、pHM6アンチセンス3rF5Aにてトランスフェクトされる細胞にて検出することができる。図35では、COS7細胞が、センス配向の全長ラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて一過性にトランスフェクトされた場合、cMycの上限調節を示している。パネルの上部が、クーマシーブルー染色のタンパク質ブロットを表し、パネルの下部は、該当するウエスタンブロットを示している。有意的に多くのcMycが、pHM6LacZ又はモックコントロールによりトランスフェクトされる細胞より、pHM6センスrF5Aにてトランスフェクトされる細胞にて検出することができる。図36では、COS7細胞が、センス配向の全長ラットアポトーシス誘発eIF5Aを含むpHM6にて一過性にトランスフェクトされた場合に、p53の上限調節を示している。パネルの上部が、クーマシーブルーにて染色のタンパク質ブロットを表し、パネルの下部は、該当するウエスタンブロットを示している。有意的に多くのp53が、pHM6LacZ又はモックコントロールによりトランスフェクトされる細胞より、pHM6センスrF5Aにてトランスフェクトされる細胞にて検出することができる。図37では、COS7細胞におけるpHM6全長のラットアポトーシス誘発eIF5Aの発現によるp53の上限調節の依存性を示している。抗HAペルオキシダーゼにてプローブされたウエスタンブロットにおいて、パネル上部は、クーマシーブルーにて染色のタンパク質ブロットを表し、パネルの下部は、該当するウエスタンブロットを示している。より多くのラットアポトーシス誘発eIF5Aが、第二のトランスフェクションより第一のトランスフェクションにおいて検知するとができる。抗p53にてプローブされるウエスタンブロットにおいて、パネル上部のAでは、クーマシーブルーにて染色のタンパク質ブロットを表し、そしてパネルの下部では、p53によるウエスタンブロットを示している。第一のトタンスフェクションに対し有意的に多くのp53が、pHM6LacZ又はモックコントロールによりトランスフェクトされる細胞より、pHM6センスrF5Aにてトランスフェクトされる細胞にて検出することができる。ラットのアポトーシス誘発eIF5Aの発現が有意に少ない第二のトタンスフェクションに対し、pHM6センスrF5A、pHM6LacZ又はモックコントロールにてトランスフェクトされた細胞間のp53のレベルに検出可能な差がなかった。実施例5本例は、アポトーシスに特異的なeIF5Aが、活性p53を有する細胞、及び活性p53を有しない細胞のアポトーシスを誘発でき、そのアポトーシスに特異的なeIF5Aが、p53経路以外の経路を通りアポトーシスを開始できることを示している。さらにこれは、上流に作用し広範囲な異なる型のガンを殺すことができるという、当方の意図が裏付けられている。さらに本例では、eIF5A1の活性部位が、RNA結合領域をほとんど含むようなタンパク質のカルボキシ末端であることを示唆している。さらに本例では、ヒトeIF5A2が、それがアポトーシスを誘発できない様大部分増殖eIF5Aの可能性を実証している。従ってヒトのデータバンクにおける2つのeIF5A遺伝子のうちアポトーシスに特異的なeIF5A1がアポトーシス遺伝子であり、eIF5A2が増殖遺伝子であると考えられる。PKO及びPKOE6細胞の培養野生型p53を発現するヒト結腸悪性腫瘍細胞株のPKO、及びp53の通常なレベル及び機能の減少をもたらす、安定に組み入れられたヒト乳頭腫ウイルスE6原ガン遺伝子を含むPKO由来の細胞株としてのPKOE6を、トランスフェクトに基づく実験のため使用した。PKO及びPKOE6細胞を、非必須アミノ酸、Earles塩、及びLグルタミンと共にMinimumEssentialMediumEagleに培養した。その培養培地には、10の胎児牛血清及び100単位のペニシリンストレプトマイシンが補充された。その細胞を、5のCO2と95の空気の加湿環境下にて37°Cにて増殖させた。その細胞を、025のトリプシン及び1mMのEDTAの溶液により接着細胞を剥離させることにより、3乃至4日ごとにサブカルチャーしたした。剥離細胞を、新たな培養皿に新鮮な培地と分離比を110乃至112にて調製した。ヒトeIF5A2のクローニングGenBankから利用できるヒトeIF5A2の配列に対し設計されたプライマーを用い、ヒトeIF5A2を、PKO細胞より単離されたRNAによるRTPCRで単離した。図38では、ヒトeIF5A2の配列を有するRKO細胞から単離されたヒトeIF5Aの配向が提供される。RNAを、GenEluteMammalianTotalRNAMiniprepKitを用い、PKO細胞から単離した。eIF5A2を増幅させるために使用される前方プライマーが、5AAACTACCATCTCCCCTGCC3の配列を有し、逆方プライマーが、5TGCCCTACACAGGCTGAAAG3の配列を有した。得られた936bpのPCR産生物が、pGEMTEasyVectorにサブクローンされ、そして配列決定された。次にpGENTEasyeIF5A2の構造を、哺乳動物発現ベクターpHM6内に、フレームにてサブクローンされるようeIF5A2PCR断片を生成するための鋳型として使用した。ヒトeIF5A2を増幅するために用いられた前方プライマーが、5ATCAAGCTTGCCCACCATGGCAGACG3aposであり、逆プライマーが、5AACGAATTCCATGCCTGATGTTTCCG3であった。得られた505bpのPCR産生物がHind3及びEcoR1にて消化され、pHM6のHind3及びEcoR1にサブクローンされた。pHM6切断eI5A1の構造eIF5A1のカルボキシ末端領域が、そのアポトーシス誘発活性に重要であるかどうか、決定するために、カルボキシ末端を欠失したeIF5A1が構成された。アミノ酸1から127をコードする欠失eIF5A1が、鋳型としてpBSラットeIF5A1を使用するPCRにより生成された。前方PCRプライマーが、5GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG3であり、そして逆方プライマーは、5TCCGAATTCGTACTTCTGCTCAATC3であった。得られた390bpのPCR産生物が、Hind3及びEcoR1にて消化され、pHM6のHind3及びEcoR1にサブクローンされた。トランスフェクショントランスフェクション実験に使用されるPKO又はPKOE6細胞を、ヘキスト染色用として使用する細胞に対し8ウエルチャンバー培養スライド又はフローサイトメトリーにより分析されるよう細胞に対し6ウエルプレートにて培養した。その細胞を、10のFBSにて補給されるが、ペニシリンストレプトマイシンを欠失したMEM培地にて、70乃至80の密集度に増殖させた。8ウエル培養スライドの1ウエルに充分なトランスフェクション培地を、22μlの血清の無いMEMに0425μgのプラスミドDNAを希釈して調製し、その混合物を室温にて15分間インキュベートした。トランスフェクション試薬である、085μlのLipofectAMINEを、22μlの血清の無いMEMにて希釈し、さらに室温にて5分間インキュベートした。5分後LipofectAMINE混合物を、DNA混合物に加えそして30乃至60分間室温にてインキュベートした。トランスフェクトされた細胞を、血清の無いMEMにて1回洗浄し、その後44μのMEMをトランスフェクション培地に加え、それを細胞の上に被せるようにした。その細胞を増殖チェンバー内へ4時間にて戻した。インキュベーション後、88μlのMEM20のFBSを細胞に加えた。次にその細胞をさらに44時間培養し、その後前記のようにヘキスト33258にて染色した。別の組みの実験において、8ウエル培養スライドにおけるRKO又はRKPE6細胞を、トランスフェクションから24時間後に025μgmlのアクチノマイシンDにて処理し、そして20時間後ヘキストにて染色した。6ウエルプレートで行われたトランスフェクションを、全ての試薬が481倍だけ増大したことを除いて同じ方法にて行った。6ウエルプレートにてトランスフェクトされたRKO細胞を、トランスフェクションから48時間後に採取し、そして下記のようにフローサイトメトリーにて分析するため固定した。トランスフェクション効率の決定トランスフェクションの効率は、5ブロモ4クロロ3イオドリルβDガラクトピラノシドにて、pHM6LacZトランスフェクトされた細胞を染色することにより決定した。青色染色の細胞が、LacZ発現のトランスフェクトされた細胞であり、そして青色染色細胞数を全細胞数で割ることにより、トランスフェクション効率を計算した。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクション後48時間染色した。その細胞をPBSで2回洗浄し、そして05のグルタルアルデヒドPBSにて室温で10分間固定した。その細胞を1mMのMgCl2PBSにて3回洗浄し、さらに青色に染色された細胞が現れるまで染色溶液5mMのK4Fe63H2O5mMのK3Fe61mMのMgCl201のXGALinPBSにてインキュベートした。ヘキスト染色核の断片化及び縮合に基づくアポトーシス細胞を同定するため、核染色のヘキストを、トランスフェクトされたPKO及びPKOE6細胞の核を標識化するために使用した。無水メタノールと氷酢酸が31の混合液から成る固定液を、使用直前に調製した。等容量の固定液を、細胞を培養スライドに増殖させる培地に付加し、2分間インキュベートした。培地定着液の混合物を細胞から取り出して廃棄し、そして1mlの固定液をその細胞に付加した。5分後その固定液を廃棄し、そして1mlの新鮮な固定液をその細胞に付加し5分間インキュベートした。この固定液を廃棄しそしてその細胞を、1mlのヘキスト染色を加える前に、4分間空気乾燥した。暗所にて10分間インキュベートした後、染色溶液を廃棄し、スライドを脱イオン水にて1分間にて3回洗浄した。洗浄後、1mlのMcIlvaines緩衝液を細胞に付加し、暗所にて20分間インキュベートした。緩衝液を廃棄しそしてその細胞を、暗所にて5分間空気乾燥し培養スライドのウエルを分離するチャンバーを取り出した。蛍光のため数滴のVectashirld取り付け培地を、そのスライドに加えカバースリップを被せた。染色された細胞を、UVフィルターを用いて蛍光顕微鏡下にて観察した。明るく染色された細胞又は断片化された核を、アポトーシスとしての得点とした。フローサイトメトリーによるDNA断片化の検出アポトーシスの期間に形成されるDNAの断片を、FluoresceinFragELTMDNAFragmentationDetectionKitを用い、フルオレセイントにて標識化されたデオキシヌクレオチドで標識化した。6ウエルの培養プレートに種々の構成にてトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションから48時間後トリプシン化することにより採取し、製造業者の指示により固定し標識化した。簡単には細胞を、1000xgにて40°C、5分間でペレット化し、PBSに1回洗浄した。その細胞を4のホルムアルデヒドPBSにて再懸濁し、そして室温にて10分間インキュベートした。その細胞を再度ペレット化し1mlの80エタノールにて再懸濁しそして4°Cにて保存した。分析する日に1mlの固定された細胞を、マイクロフージチューブに移し、そしてその細胞を1000xgにて5分間遠心分離によりペレット化した。ペレット化された細胞を、200μの1XTBSにて再懸濁し、そして10乃至15分室温にてインキュベートした。次にその細胞を再度ペレット化し、20μgmlのプロテアーゼKを100μlにて再懸濁し、室温で5分間インキュベートした。その細胞を1XTdTEquilibration緩衝液100μlにて再懸濁し、室温にて10乃至30分間インキュベートした。次にその細胞を遠心分離によりペレット化し、TdTLabelingReactionMixtureを60μlにて再懸濁し、そして暗所にて1乃至15時間インキュベートした。インキュベートした後その細胞を遠心分離によりペレット化し、200μlの1XTBSにて2回洗浄した。その細胞を05mlの1XTBSである最終容量にて再懸濁し、そして488nmのアルゴンイオンレザー源を備えたフロサイトメータにて分析した。タンパク質の抽出及びウエスタンブロッテングタンパク質をトランスフェクトされた細胞からウエスタンブロッテング用に単離し、その細胞をPBSにて2回洗浄し、さらに150μlの熱いSDSゲル負荷緩衝液を加えた。その細胞溶離物をマイクロ遠心分離チューブに集め、95°Cにて10分間加熱しさらに13000Xgにて10分間遠心分離にかけた。上澄液を新たなマイクロ遠心分離チューブに移し、そして使用に準備するまで20°Cにて保存した。ウエスターンブロッテング用に、全量5μg又は10μgのタンパク質を、12のSDSポリアクリルアミドゲルに分けた。分離されたタンパク質を、ポリビニリデンジフルオライド膜に移した。次にその膜を、ブロッキング溶液乳粉、PBSに002のナトリウムアジドにて、1時間インキュベートし、そしてPBSTにて15分間3回洗浄した。その膜をPBSTに4°Cにて1昼夜保存した。翌日室温に加温した後、その膜を1μgmlのポリビニルアルコールに30秒間ブロックした。その膜を脱イオン水にて5回すすぎ洗いし、さらにPBSに5の乳溶液にて30分間ブロックした。1次抗体が膜にてインキュベートする前に、PBS0025のTween20に5乳の溶液にて、30分間予備インキュベートした。p53を認識する原ガン遺伝子からモノクロナール抗体か、ニワトリにて高められたヒトeIF5A1のcターミナル末端に相同の合成ペプチドに対し、対象とされるポリクロナール抗体とのいずれかにてその膜をブロットした。p53に対するモノクロナール抗体を、01μgmlの希釈にて、そしてeIF5A1に対する抗体を、11000の希釈にて使用した。1次抗体にて60乃至90分間インキュベートした後、その膜をPBSTにて15分間3回洗浄した。次に2次抗体をPBS0025Tween20における1乳にて希釈し、その膜を60乃至90分間インキュベートした。p53を1次抗体として使用すると、使用される2次抗体を11000に希釈し、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗マウスIgGであった。抗eIF5A1が、1次抗体として使用された場合、パーオキシダーゼに結合したラビット抗ニワトリIgYを、110000の希釈にて使用した。二次抗体にてインキュベートした後その膜をPBSTにて3回洗浄した。2種の検出方法つまり比色分析法及び化学蛍光法を、ブロット生成のために使用した。p53を、アルカリホスファターゼ接合の二次抗体と結合する一次抗体として使用した場合のみ、比色分析を使用した。結合した抗体を、033mgmlのニトロブルーテトラゾリウム、0165mgmLの5ブロモ4クロロ3インドリルホスフェート、100mMのNaCl5mMのMgCl2、及び100mMのTrisHClの溶液にて、暗所にてそのブロットをインキュベートすることにより可視化した。その色反応を、PBSにおける2mMのEDTAにブロットをインキュベートすることにより停止させた。化学蛍光検出方法が、抗HAパーオキシダーゼ及び抗eIF5A1を含む、他のあらゆる一次抗体に対し使用された。ECLプラスウエスタンブロット検出キットを、ペルオキシダーゼに結合した結合抗体を検出するため使用した。簡単にはその膜を、光によりブロット乾燥し、その後暗所にて試薬Aと試薬Bとを401の混合にして5分間インキュベートした。その膜をドライブロットし、アセテートシート間に置いて、そして10秒から30分間時間を変え、その時間X線フイルムに暴露した。図39は、一過性トランスフェクション後のPKO及びPKOE6細胞に発生するアポトーシスの割合を明示するグラフを示す。PKO及びPKOE6細胞を、pHM6LacZ又はpHM6eIF5A1にて一過性にトランスフェクトした。24時間後その細胞を、025μgmlのアクチノマイシンDか、等量のメタノールのいずれかにて処理した。その細胞を20時間後ヘキストにて染色し、UVフイルターを用い蛍光顕微鏡下にて観察した。縮合されたクロマチンにてより明るく染色された細胞を、アポトーシスとしての得点とした。上記実験を検討し、アクチノマイシンDにて処理し、そしてpHM6LacZにてトランスフェクトしたPKO細胞と、アクチノマイシンDにて処理されなく、pHM6LacZにてトランスフェクトした細胞とを比較すると、アポトーシスが240増大するを示した。アクチノマイシンDにて処理し、そしてpHM6eIF5A1にてトランスフェクトしたPKOE6細胞と、アクチノマイシンDにて処理されなく、pHM6LacZにてトランスフェクトした細胞とを比較すると、アポトーシスが105増大することを示した。図40が、一過性トランスフェクション後のPKO細胞に発生するアポトーシスの割合を明示するグラフを示す。PKO細胞を、pHM6LacZ、pHM6eIF5A1、pHM6eIF5A2又はpHM6の切断eIF5A1にて一過性にトランスフェクトした。44時間後その細胞をヘキストにて染色し、UVフイルターを用いて蛍光顕微鏡下にて観察した。縮合されたクロマチンにより明るく染色された細胞を、アポトーシスとして得点した。pHM6eIF5A1にてトランスフェクトされた細胞を、pHM6LacZにてトランスフェクトされたコントロール細胞と比較してアポトーシスが25増大した。この増大では、pHM6eIF5A2又はpHM6の切断eIF5A1にてトランスフェクトされた細胞に対し明らかでない。図41が、一過性トランスフェクション後のPKO細胞に発生するアポトーシスの割合を明示するグラフを示す。PKO細胞がトランスフェクトされない状態か、pHM6LacZ、又はpHM6eIF5A1にて一過性にトランスフェクトされたかのいずれかである。44時間後その細胞をヘキストにて染色し、UVフイルターを用いて蛍光顕微鏡下にて観察した。縮合されたクロマチンにより明るく染色された細胞を、アポトーシスとして得点した。トランスフェクションの効率のため収集後、pHM6eIF5A1にてトランスフェクトされた細胞の60がアポトーシスであった。図42は、一過性トランスフェクション後のPKO細胞のアポトーシスのフローサイトメトリー分析を提供する。PKO細胞がトランスフェクトされない状態か、pHM6LacZ、pHM6eIF5A1、pHM6eIF5A2、又はpHM6の切断eIF5A1にて一過性にトランスフェクトされたかのいずれかであった。48時間後その細胞を採集しそして固定した。アポトーシスを反映する断片化されたDNAを、フルオロセイン結合のデオキシヌクレオチドにて標識化し、488nmのアルゴンイオンレザー源を備えたフローサイトメトリーにて分析した。ゲートE下発生する蛍光は、非アポトーシス細胞からであり、そしてゲートF下に発生する蛍光は、アポトーシスを受けた細胞からである。その表が、各ゲートのピーク下の面積に基づいて計算されたアポトーシスを受けた細胞の割合を明示している。トランスフェクトされない細胞におけるアポトーシスのバックグランドに対し、及びトランスフェクト効率に対し補正した後、pHM6eIF5A1にてトランスフェクトされた細胞の80が、アポトーシスを呈した。pHM6LacZ、pHM6eIF5A1、pHM6eIF5A2、又はpHM6の切断eIF5A1にてトランスフェクトされた細胞が、アポトーシスのバックグランドレベルしか呈さなかった。図43が、025μgmlのアクチノマイシンDにて、03724及び48時間、処理されたRKO細胞から抽出されたタンパク質のウエスタンブロット法を提供する。5μg又は10μgの全タンパク質を、12のSDSポリアクリルアミドゲルにて分離し、ポリブニリデンジフルオライド膜に移した。パネルの上部は、一次抗体として抗p53を使用するウエスタンブロットを明示している。パネルの中央は、一次抗体として抗eIF5A1を使用するウエスタンブロットを明示している。パネルの下部は、等量の負荷を実証するために、化学蛍光検出の後、クーマシーブルーにて染色された抗eIF5A1ブロットのため使用される膜を明示している。p53とeIF5A1が共にアクチノマイシンDにより処理することにより上限調節される。