"少なくとも1つの成長因子を提供する細胞培養系において、成長因子不含培地に適合された細胞を培養するステップを含む、細胞培養方法。細胞を成長因子不含培地に最初に適合させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。適合ステップが、細胞を成長因子不含培地においておよそ20世代超にわたり成長させることを含む、請求項2に記載の方法。適合ステップが、細胞を成長因子不含培地においておよそ30~300世代にわたり成長させることを含む、請求項2に記載の方法。適合ステップが、細胞を成長因子不含培地においておよそ25~50世代にわたり成長させることを含む、請求項2に記載の方法。成長因子不含培地がインスリンを実質的に含まない、請求項2~5のいずれか一項に記載の方法。成長因子不含培地が成長因子を実質的に含まない、請求項2~6のいずれか一項に記載の方法。成長因子不含培地がタンパク質を実質的に含まない、請求項2~7のいずれか一項に記載の方法。成長因子不含培地が、インスリン、ペプトン、加水分解物、トランスフェリン、およびIGF-Iを実質的に含まない、請求項2~5のいずれか一項に記載の方法。成長因子不含培地が無血清である、請求項2~5のいずれか一項に記載の方法。成長因子不含培地が、無血清のタンパク質含有培地である、請求項2~5のいずれか一項に記載の方法。適合ステップが、細胞を、成長因子を含む培地において最初に成長させ、その後、細胞を成長因子不含培地において成長させることを含む、請求項2~11のいずれか一項に記載の方法。成長因子を含む培地が、成長因子を含む無血清培地である、請求項12に記載の方法。細胞培養系がフェドバッチ系である、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。フェドバッチ系が、流加培地を補給した基本培地を含む、請求項14に記載の方法。前記少なくとも1つの成長因子が基本培地において提供される、請求項14または15に記載の方法。前記少なくとも1つの成長因子が基本培地において提供されるが、流加培地においては提供されない、請求項16に記載の方法。前記少なくとも1つの成長因子が流加培地において提供される、請求項14~16のいずれか一項に記載の方法。基本培地および/または流加培地が、前記少なくとも1つの成長因子以外、他には他の成長因子を実質的に含まない、請求項15~18のいずれか一項に記載の方法。基本培地および/または流加培地が、前記少なくとも1つの成長因子以外、他にはペプトン、加水分解物、および/またはトランスフェリンを実質的に含まない、請求項15~18のいずれか一項に記載の方法。基本培地および/または流加培地が、前記少なくとも1つの成長因子以外、他にはタンパク質を実質的に含まない、請求項15~18のいずれか一項に記載の方法。基本培地および/または流加培地が、血清を実質的に含まない、請求項15~18のいずれか一項に記載の方法。前記少なくとも1つの成長因子が、インスリン、インスリン様成長因子IGF-I、合成IGF-ILR3、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。前記少なくとも1つの成長因子がインスリンである、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。インスリンが、およそ0.01mg/Lから1g/Lの範囲の濃度で提供される、請求項24に記載の方法。インスリンが、およそ10mg/Lの濃度で提供される、請求項24または25に記載の方法。インスリンが、およそ2mg/Lの濃度で提供される、請求項24または25に記載の方法。前記少なくとも1つの成長因子がLR3である、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。LR3が、およそ1ng/Lから1mg/Lの範囲の濃度で提供される、請求項28に記載の方法。LR3が、およそ1ng/Lから100μg/Lの濃度で提供される、請求項28に記載の方法。LR3がおよそ5μg/Lの濃度で提供される、請求項28に記載の方法。LR3がおよそ50μg/Lの濃度で提供される、請求項28に記載の方法。細胞培養系が大規模生産系である、請求項1~32のいずれか一項に記載の方法。細胞培養系がバイオリアクターを用いる、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。細胞培養系が振とう培養系を用いる、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。細胞が哺乳動物細胞である、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞である、請求項36に記載の方法。細胞が組換えタンパク質を発現する、請求項1~37のいずれか一項に記載の方法。組換えタンパク質が糖タンパク質である、請求項38に記載の方法。組換えタンパク質が、抗体またはその断片、ナノボディ、単一ドメイン抗体、SmallModularImmunoPharmaceuticals商標SMIP、VHH抗体、ラクダ抗体、サメ単一ドメインポリペプチドIgNAR、単一ドメイン足場例えば、フィブロネクチン足場、SCORPION商標治療薬N末端結合ドメイン、エフェクタードメイン、およびC末端結合ドメインを含む、一本鎖ポリペプチド、成長因子、凝固因子、サイトカイン、融合タンパク質、医薬原薬、ワクチン、酵素、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項38に記載の方法。細胞によって生産される組換えタンパク質を得るステップをさらに含む、請求項38に記載の方法。組換えタンパク質を精製するステップをさらに含む、請求項41に記載の方法。組換えタンパク質を含む医薬組成物を調製するステップをさらに含む、請求項42に記載の方法。細胞が、細胞の成長および/または生産性が、成長因子不含培地に最初に適合されていない対照細胞と比較して増大するような条件下で、培養される、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。細胞が、細胞の成長および/または生産性が、前記少なくとも1つの成長因子を有さない成長因子不含培地において培養される対照細胞と比較して増大するような条件下で、培養される、請求項1~44のいずれか一項に記載の方法。細胞の成長が、生存細胞密度VCD、生存率、累積積分生存細胞密度aIVCD、静電容量によって測定されるバイオマス蓄積量ABERプローブ、および/または充填細胞密度PCDによって決定される、請求項44または45に記載の方法。生産性が、力価、特異的生産性、および/または容積生産性によって決定される、請求項44~46のいずれか一項に記載の方法。細胞の成長および/または生産性が、前記対照細胞と比較して少なくとも約30増大する、請求項44~47のいずれか一項に記載の方法。細胞の成長および/または生産性が、前記対照細胞と比較して少なくとも約50増大する、請求項44~48のいずれか一項に記載の方法。力価が、前記対照細胞と比較して少なくとも約100増大する、請求項47に記載の方法。力価が、前記対照細胞と比較しておよそ2から3倍増大する、請求項47に記載の方法。請求項38~41のいずれか一項に記載の方法を用いて生産される組換えタンパク質。細胞をインスリン不含培養に適合させるステップ、前記細胞をインスリンまたはインスリン様成長因子を含む培地において培養するステップを含み、前記細胞が、前記細胞の成長および/または生産性が、インスリン不含培養に最初に適合されていないが他の点では同一の条件下で培養される対照細胞と比較して増大するような条件下で、培養される、細胞培養方法。本発明は、組換えタンパク質を生産するための改良された細胞培養系を提供する。本発明は、成長因子不含培地に馴化または適合された細胞が、成長因子依存性培養または完全に成長因子不含の細胞培養と比較して、細胞培養への成長因子の再添加に対してさらに応答性であり、驚くほど優れた成長および生産性ならびに遊離スルフヒドリルの蓄積の低減を示すという、予想外の発見を包含する。したがって、一態様において、本発明は、少なくとも1つの成長因子を提供する細胞培養系において、成長因子不含培地に適合された細胞を培養するステップを含む、細胞培養方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、細胞を成長因子不含培地に最初に適合させるステップを含む。いくつかの実施形態において、適合ステップは、細胞を成長因子不含培地においておよそ20世代超例えば、30、40、50、60、70、80、90、または100世代超にわたり成長させることを含む。いくつかの実施形態において、適合ステップは、細胞を成長因子不含培地においておよそ30~300世代にわたり成長させることを含む。特定の実施形態において、適合ステップは、細胞を成長因子不含培地においておよそ25~50世代にわたり成長させることを含む。いくつかの実施形態において、成長因子不含培地は、インスリンを実質的に含まない。いくつかの実施形態において、成長因子不含培地は、成長因子を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、成長因子不含培地は、タンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、成長因子不含培地は、インスリン、ペプトン、加水分解物、トランスフェリン、およびインスリン様成長因子IIGF-Iを実質的に含まない。いくつかの実施形態において、成長因子不含培地は、無血清である。いくつかの実施形態において、成長因子不含培地は、無血清のタンパク質含有培地である。いくつかの実施形態において、適合ステップは、細胞を、成長因子を含む培地において最初に成長させ、その後、細胞を成長因子不含培地において成長させることを含む。いくつかの実施形態において、成長因子を含む培地は、成長因子を含む無血清培地である。いくつかの実施形態において、細胞培養系は、フェドバッチ系である。いくつかの実施形態において、フェドバッチ系は、1つまたは複数の流加培地を補給した基本培地を用いる。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの成長因子は、フェドバッチ系の基本培地において提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの成長因子はフェドバッチ系の基本培地において提供されるが、流加培地においては提供されない。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの成長因子は、フェドバッチ系の流加培地において提供される。いくつかの実施形態において、基本培地および/または流加培地は、少なくとも1つの成長因子以外、他には他の成長因子を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、基本培地および/または流加培地は、少なくとも1つの成長因子以外、他にはペプトン、加水分解物、および/またはトランスフェリンを実質的に含まない。いくつかの実施形態において、基本培地および/または流加培地は、少なくとも1つの成長因子以外、他にはタンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、基本培地および/または流加培地は、血清を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの成長因子は、インスリン、インスリン様成長因子IGF-I、合成IGF-ILR3、およびその組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態において、少なくとも1つの成長因子は、インスリンである。いくつかの実施形態において、インスリンは、およそ0.01mg/Lから1g/Lの範囲の濃度で提供される。いくつかの実施形態において、インスリンは、およそ10mg/Lの濃度で提供される。いくつかの実施形態において、インスリンは、およそ2mg/Lの濃度で提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの成長因子は、LR3である。いくつかの実施形態において、LR3は、およそ1ng/Lから1mg/Lの範囲の濃度で提供される例えば、1ng/Lから100μg/L。いくつかの実施形態において、LR3は、およそ5μg/Lの濃度で提供される。いくつかの実施形態において、LR3は、およそ50μg/Lの濃度で提供される。いくつかの実施形態において、細胞培養系は、大規模生産系である。いくつかの実施形態において、細胞培養系は、バイオリアクターを用いる。いくつかの実施形態において、細胞培養系は、振とう培養系例えば、回転試験管、振とうフラスコ、および大規模振とう系を用いる。様々な細胞型を、本発明に従って用いることができる。例えば、いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、BALB/cマウス骨髄腫系、ヒト網膜芽細胞PER.C6、サル腎臓細胞、ヒト胚腎臓系293、ベビーハムスター腎臓細胞BHK、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO例えば、CHO細胞、CHO-K1細胞、CHO-DG44細胞、またはCHO-DUX細胞、マウスセルトリ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞VERO-76、ヒト子宮頸癌細胞HeLa、イヌ腎臓細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳腺腫瘍細胞、TRI細胞、MRC5細胞、FS4細胞、またはヒト肝臓癌系HepG2から選択される。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、CHO細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、組換えタンパク質を発現する。いくつかの実施形態において、組換えタンパク質は、糖タンパク質である。いくつかの実施形態において、組換えタンパク質は、抗体またはその断片、ナノボディ、単一ドメイン抗体、SmallModularImmunoPharmaceuticals商標SMIP、VHH抗体、ラクダ抗体、サメ単一ドメインポリペプチドIgNAR、単一ドメイン足場例えば、フィブロネクチン足場、SCORPION商標治療薬N末端結合ドメイン、エフェクタードメイン、およびC末端結合ドメインを含む、一本鎖ポリペプチド、成長因子、凝固因子、サイトカイン、融合タンパク質、医薬原薬、ワクチン、酵素、およびその組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明に従った方法は、細胞によって生産される組換えタンパク質を得るステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明に従った方法は、組換えタンパク質を精製するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明に従った方法は、組換えタンパク質を含む医薬組成物を調製するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞の成長および/または生産性が、成長因子不含培地に最初に適合されていない対照細胞と比較して増大するような条件下で、培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞の成長および/または生産性が、少なくとも1つの成長因子を有さない成長因子不含培地において培養される対照細胞と比較して増大するような条件下で、培養される。いくつかの実施形態において、細胞の成長は、生存細胞密度VCD、生存率、累積積分生存細胞密度aIVCD、静電容量によって測定されるバイオマス蓄積量ABERプローブ、および/または充填細胞密度PCDによって決定される。いくつかの実施形態において、生産性は、力価、特異的生産性、および/または容積生産性によって決定される。いくつかの実施形態において、細胞の成長および/または生産性は、対照細胞と比較して少なくとも約30増大する。特定の実施形態において、細胞の成長および/または生産性は、対照細胞と比較して少なくとも約50増大する。いくつかの実施形態において、力価は、対照細胞と比較して、少なくとも100増大する。特定の実施形態において、力価は、対照細胞と比較しておよそ2から3倍増大する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書において記載される発明の方法を用いて生産される組換えタンパク質を提供する。特定の実施形態において、本発明は、細胞をインスリン不含培養に適合させるステップ、および細胞をインスリンまたはインスリン様成長因子を含有する培地において培養するステップを含み、細胞が、細胞の成長および/または生産性が、インスリン不含培養に最初に適合されていないが他の点では同一の条件下で培養される対照細胞と比較して増大する条件下で培養される、細胞培養方法を提供する。本願において、またはの使用は、別段の記載が無い限り、および/またはを意味する。本願において用いられる場合、用語含むcompriseおよびこの用語の変型、例えば含むcomprisingおよび含むcomprisesは、他の添加剤、成分、整数、またはステップを排除することを意図したものではない。本明細書において用いられる場合、用語約およびおよそは、同等物として用いられる。約/およそを伴って、または伴わずに本願において用いられる任意の数字は、当業者によって理解されるあらゆる標準的な変動を網羅するものである。特定の実施形態において、用語およそまたは約は、別段の記載が無い限り、または内容から別段のことが明らかでない限り、言及された参照値の、いずれかの方向にそれより大きくまたは小さく25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、またはそれ未満に当てはまる一定範囲の値を言うこのような数値が、考えられる値の100を超える場合を除く。本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において明らかとなる。しかし、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲が、本発明の実施形態を示すものの、説明のためだけのものであり、限定するためのものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者に明らかとなろう。図面は、説明のためだけのものであり、限定するためのものではない。定義本発明をさらに容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語のさらなる定義は、明細書全体を通して説明される。約、およそ:本明細書において用いられる場合、1つまたは複数の特定の細胞培養条件に適用される、用語約およびおよそは、その1つまたは複数の培養条件についての言及された参照値に近似した一定範囲の値を言う。特定の実施形態において、用語約は、その1つまたは複数の培養条件についての言及された参照値の25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1パーセント、またはそれ未満に当てはまる一定範囲の値を言う。適合するおよび適合している:本明細書において用いられる場合、用語適合するまたは文法的な同等物は、細胞培養に関して用いられる場合、細胞を特定のタイプの細胞培養条件に導入し、安定性の終了の前に細胞を複数世代にわたり成長させるプロセスを言う。本明細書において用いられる場合、細胞または細胞系は、細胞が、安定性の終了の前に細胞培養において複数世代例えば、10、20、30、40、50世代超にわたり成長し得る場合、細胞培養に適合している。細胞は、細胞が先の条件における細胞の成長速度および/または生存率に近似した成長速度および/または生存率を示す場合、細胞培養条件に適合している。いくつかの実施形態において、培養条件に適合された細胞は、先の条件における細胞の成長速度および/または生存率と20、10、または5未満しか異ならない成長速度およびまたは生存率を示す。いくつかの実施形態において、細胞は、1つまたは複数の成長因子を欠く培地における成長に適合している。いくつかの実施形態において、細胞は、インスリンを欠く培地における成長に適合している。いくつかの実施形態において、細胞は、インスリン、ペプトン、加水分解物、トランスフェリン、およびIGF-1の1つまたは複数を欠く培地における成長に適合している。いくつかの実施形態において、細胞は、インスリンを欠く無血清培地における成長に適合している。細胞を細胞培養に適合させることはまた、細胞を細胞培養に馴化させることとも言われる。適合した細胞はまた、馴化した細胞とも言われる。アミノ酸:本明細書において用いられる用語アミノ酸は、ポリペプチドの形成に通常用いられる20の天然アミノ酸、またはこれらのアミノ酸の類似体もしくは誘導体の全てを言う。アミノ酸は、培地において細胞培養物に提供され得る。培地において提供されたアミノ酸は、塩として、または水和物形態で提供され得る。抗体:本明細書において用いられる用語抗体は、免疫グロブリン分子、または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、Fab断片またはFab’2断片などの、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を言う。特定の実施形態において、抗体は、当業者に知られている典型的な天然抗体、例えば、4つのポリペプチド鎖、すなわち2つの重鎖および2つの軽鎖を含む、糖タンパク質である。特定の実施形態において、抗体は、一本鎖抗体である。例えば、いくつかの実施形態において、一本鎖抗体は、重鎖および/または軽鎖の2つ以上のメンバーが例えばペプチド結合を介して共有結合している、典型的な天然抗体の変異体を含む。特定の実施形態において、一本鎖抗体は、重鎖および軽鎖からなる2ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質であり、前記鎖は、例えば鎖間ペプチドリンカーによって安定化されており、前記タンパク質は、抗原を特異的に結合する能力を有する。特定の実施形態において、抗体は、重鎖のみを含む抗体、例えば、ラマおよびラクダを含むラクダ科のメンバーにおいて天然に見られる抗体である例えば、それぞれ参照することによってその全体が組み込まれる、Castermanらによる米国特許第6,765,087号、Castermanらによる米国特許第6,015,695号、およびCastermanらによる米国特許第6,005,079号を参照されたい。本明細書において用いられる用語モノクローナル抗体およびモノクローナル抗体組成物は、ただ1つの種の抗原結合部位を含有する、したがって、単一のエピトープまたは特定の抗原のみと通常は相互作用する、抗体分子の集団を言う。モノクローナル抗体組成物は、したがって、典型的には、それと共に前記組成物が免疫反応する特定のエピトープに対する、単一の結合親和性を示す。用語ポリクローナル抗体およびポリクローナル抗体組成物は、特定の抗原と相互作用する複数の種の抗原結合部位を含有する抗体分子の集団を言う。バッチ培養:本明細書において用いられる用語バッチ培養は、培地以下の培地の定義を参照されたいを含む、細胞の培養において最終的に用いられる成分の全てと、細胞自体とが、培養プロセスの開始時に提供される、細胞を培養する方法を言う。バッチ培養は、典型的には、ある時点で停止し、培地内の細胞および/または成分は回収され、また精製されてもよい。バイオリアクター:本明細書において用いられる用語バイオリアクターは、哺乳動物細胞培養物の成長に用いられる任意の容器を言う。バイオリアクターは、哺乳動物細胞の培養に有用である限り、任意のサイズのものであり得る。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも1リットルであり、また、10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10000、120000リットル以上、またはその間の任意の容積であり得る。限定はしないがpHおよび温度を含む、バイオリアクターの内部条件は、典型的には、培養期間の間に制御される。バイオリアクターは、哺乳動物細胞培養物を、本発明の培養条件下で培地内に懸濁した状態で保持するために適切な、ガラス、プラスチック、または金属を含む任意の材料から構成され得る。本明細書において用いられる用語生産バイオリアクターは、目的のポリペプチドまたはタンパク質の生産において用いられる最終バイオリアクターを言う。大規模細胞培養の生産バイオリアクターの容積は、典型的には、少なくとも500リットルであり、また、1000、2500、5000、8000、10000、120000リットル以上、またはその間の任意の容積であり得る。当業者であれば、本発明の実施において用いるための適切なバイオリアクターの選択を知り、前記選択が可能であろう。細胞密度および高い細胞密度:本明細書において用いられる用語細胞密度は、所与の培地容積内に存在する細胞の数を言う。本明細書において用いられる用語高い細胞密度は、5×106/mL、1×107/mL、5×107/mL、1×108/mL、5×108/mL、1×109/mL、5×109/mL、または1×1010/mLを超える細胞密度を言う。細胞の生産性:本明細書において用いられる用語細胞の生産性は、所与の培地容積量における、哺乳動物細胞培養物によって生産される、組換えによって発現したタンパク質例えば、ポリペプチド、抗体などの全量を言う。細胞の生産性は、典型的には、培地1ミリリットル当たりのタンパク質のミリグラム数mg/mLまたは培地1リットル当たりのタンパク質のグラム数g/Lで表される。細胞の成長速度および高い細胞成長速度:本明細書において用いられる用語細胞成長速度は、方程式lnX2-lnX1/T2-T1式中、X2は、時点T2時間表示での細胞密度培養容積1ミリリットル当たりの細胞100万個単位で表されるであり、X1は、さらに早い時点T1での細胞密度であるによって定義される、時間-1単位で表される細胞密度の変化率を言う。いくつかの実施形態において、本明細書において用いられる用語高い細胞成長速度は、0.023時間-1を超える成長速度値を言う。細胞の生存率:本明細書において用いられる用語細胞の生存率は、培養中の細胞の、所与の一連の培養条件または実験変動下で生存する能力を言う。本明細書において用いられるこの用語はまた、特定の時点での培養物における生細胞および死細胞の総数に対する、その時点で生存している細胞の割合を言う。対照および試験:本明細書において用いられる場合、用語対照は、それに対して結果が比較される標準であるという、その当技術分野において理解されている意味を有する。典型的には、対照は、変量を分離することによって実験における整合性を増強して、このような変量について結論付けるために用いられる。いくつかの実施形態において、対照は、比較基準を提供するための、試験反応または試験アッセイと同時に行われる反応またはアッセイである。1つの実験において、試験すなわち、試験またはモニタリングされる変量が適用されるか、または存在する例えば、成長因子不含培地に適合された細胞系。第2の実験において、対照、すなわち、試験される変量は、適用されないかまたは存在しない例えば、成長因子不含培地に適合していない対照細胞系。いくつかの実施形態において、対照は、歴史的対照すなわち、以前に行われた培養、または以前から知られている結果である。いくつかの実施形態において、対照は、印刷されたまたは別の方法で保存された記録であるか、またはこのような記録を含む。対照は、陽性対照または陰性対照であり得る。培養物、細胞培養物、および哺乳動物細胞培養物:本明細書において用いられるこれらの用語は、細胞集団の生存および/または成長に適した条件下で培地以下の培地の定義を参照されたいにおいて成長する、哺乳動物細胞集団を言う。当業者には明らかなように、本明細書において用いられるこれらの用語は、哺乳動物細胞集団とその集団が成長する培地とを含む組み合わせを言い得る。エルマンアッセイ:本明細書において用いられる場合、用語エルマンアッセイは、細胞培養培地における遊離スルフヒドリル基を測定するために行われるアッセイを言う。エルマン試薬、すなわち5,5-ジチオ-ビス-2-ニトロ安息香酸DTNBは、溶液内の遊離スルフヒドリル基を定量するための水溶性化合物である。特に、この化合物の溶液は、スルフヒドリルと反応すると、測定可能な黄色の生成物を生じさせる。DTNVは、遊離スルフヒドリル基と反応して、混合したジスルフィドおよび2-ニトロ-5-チオ安息香酸TNBを生じさせる。この反応におけるDTNBの標的は、遊離スルフヒドリル基の共役塩基R-S-である。典型的には、この反応の速度は、いくつかの因子、すなわち、1反応pH、2スルフヒドリルのpKa、ならびに3立体的および静電気的効果に応じる。TNBは、この反応において生じる着色種であり、可視範囲で高いモル吸光係数を有する。スルフヒドリル基は、既知の濃度のスルフヒドリル含有化合物、例えばシステインからなる標準曲線と比較することによって、試料内で推量することができる。さらに、またはあるいは、スルフヒドリル基は、TNBの吸光係数を参照することによって定量することができる。フェドバッチ培養:本明細書において用いられる用語フェドバッチ培養は、さらなる成分が培養プロセスの開始時のある程度後に培養物に提供される、細胞を培養する方法を言う。提供される成分は、典型的には、培養プロセスの間に枯渇した、細胞のための栄養補給物を含む。フェドバッチ培養は、典型的には、基本培地で開始し、さらなる成分が流加培地として提供される。フェドバッチ培養は、典型的には、ある時点で停止し、培地内の細胞および/または成分は回収され、また精製されてもよい。流加培地:本明細書において用いられる用語流加培地は、細胞培養の開始時の後に添加される、成長中の哺乳動物細胞に栄養を与える、栄養を含有する溶液を言う。流加培地は、最初の細胞培養培地において提供されるものと同一の成分を含有し得る。あるいは、流加培地は、最初の細胞培養培地において提供されたものに加えて1つまたは複数のさらなる成分を含有し得る。さらに、またはあるいは、流加培地は、最初の細胞培養培地において提供された1つまたは複数の成分を欠き得る。特定の実施形態において、流加培地の1つまたは複数の成分は、これらの成分が最初の細胞培養培地において提供された濃度またはレベルと同一または類似の濃度またはレベルで提供される。特定の実施形態において、流加培地の1つまたは複数の成分は、これらの成分が最初の細胞培養培地において提供された濃度またはレベルとは異なる濃度またはレベルで提供される。機能的変異体:本明細書において用いられる場合、用語機能的変異体は、アミノ酸配列例えば成長因子の機能的変異体の文脈において、元の配列の生物学的活性例えば、細胞の成長または増殖を刺激する活性に実質的に類似の生物学的活性を保持する分子を意味する。機能的変異体または同等物は、天然誘導体であり得るか、または合成的に調製される。例示的な機能的変異体は、元のタンパク質の生物学的活性例えば、細胞の成長または増殖を刺激する活性が保存されている限りの、1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含む。例えば、機能的変異体は、元のタンパク質例えば、インスリンなどの成長因子のアミノ酸配列に少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99同一なアミノ酸配列を有し得る。インスリンの機能的変異体には、天然IGFおよび天然IGFの合成変異体例えばLR3が含まれる。遺伝子:本明細書において用いられる用語遺伝子は、その少なくとも一部分が、個別の最終生成物、典型的には限定はしないがポリペプチドをコードする、任意のヌクレオチド配列、DNA、またはRNAを言う。この用語は、ポリペプチドまたは他の個別の最終生成物をコードするコード配列のみを言うものではなく、基底レベルの発現を調節する、コード配列の前および後の領域以下の遺伝子制御エレメントの定義を参照されたい、ならびに個々のコードセグメントエキソンの間の介在配列イントロンも包含し得る。遺伝子制御エレメント:本明細書において用いられる用語遺伝子制御エレメントは、それが機能可能に連結している遺伝子の発現を調節する、任意の配列エレメントを言う。遺伝子制御エレメントは、発現レベルを増大または低下させることによって機能し得、また、コード配列の前、中、または後に位置し得る。遺伝子制御エレメントは、例えば、転写の開始、伸長、もしくは終結、mRNAのスプライシング、mRNAの編集、mRNAの安定性、細胞内でのmRNAの局在化、翻訳の開始、伸長、もしくは終結、または遺伝子発現の任意の他の段階を調節することによって、遺伝子発現の任意の段階で作用し得る。遺伝子制御エレメントは、個別に、または互いに組み合わされて機能し得る。成長因子不含培地:本明細書において用いられる用語成長因子不含培地は、少なくとも1つの成長因子を実質的に含まない例えば、少なくとも1つのサイトカイン、ホルモン例えばインスリン、ならびに/または細胞の成長もしくは生存率を刺激および/もしくは維持する他のタンパク質物質が添加されていない任意の培地を包含する。例えば、成長因子不含培地は、インスリンを実質的に含まないインスリン不含培地であり得る。いくつかの実施形態において、成長因子不含培地は、いかなる成長因子も実質的に有さない培地である。例えば、成長因子不含培地は、インスリン、ペプトン、加水分解物、トランスフェリン、およびインスリン様成長因子IIGF-Iを実質的に含まない可能性がある。いくつかの実施形態において、成長因子不含培地は、無タンパク質培地とも呼ばれる、タンパク質を実質的に含まない培地である。典型的には、無タンパク質培地は、血清または他のタンパク質補給物を欠く。用語培地および実質的には、以下にさらに定義される。ハイブリドーマ:本明細書において用いられる用語ハイブリドーマは、免疫学的源に由来する不死化細胞と抗体生産細胞との融合によって生成される細胞を言う。得られたハイブリドーマは、抗体を生産する不死化細胞である。ハイブリドーマを生成するために用いられる個々の細胞は、限定はしないがラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびヒトを含む、任意の哺乳動物源に由来し得る。この用語はまた、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞系との間の融合生成であるヘテロハイブリッド骨髄腫融合体の子孫が続いて形質細胞と融合すると生じる、トリオーマ細胞系を包含する。さらに、この用語は、例えばクアドローマなどの、抗体を生産する任意の不死化ハイブリッド細胞系を含むものである例えば、Milsteinら、Nature、537:30531983を参照されたい。積分生存細胞密度:本明細書において用いられる用語積分生存細胞密度またはIVCDは、培養過程にわたる生存細胞の平均密度に、培養を行った時間をかけたものを言う。いくつかのケースにおいて、積分生存細胞密度はまた、累積積分生存細胞密度aIVCDとも呼ばれる。生産されたポリペプチドおよび/またはタンパク質の量の推測は、培養過程にわたって存在する生存細胞の数に比例し、積分生存細胞密度は、培養過程にわたって生産されるポリペプチドおよび/またはタンパク質の量の推定に有用なツールである。培地、細胞培養培地、培養培地:本明細書において用いられるこれらの用語は、成長中の哺乳動物細胞に栄養を与える、栄養を含有する溶液を言う。典型的には、これらの溶液は、最低限の成長および/または生存のために細胞に必要な、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、ならびに微量元素を提供する。この溶液はまた、ホルモンおよび成長因子を含む、最低速度を超えて成長および/または生存を増強する成分を含有し得る。溶液は、好ましくは、細胞の生存および増殖に最適なpHおよび塩濃度に調製される。培地はまた、規定培地、すなわち、組成が分からないタンパク質、加水分解物、または成分を含有しない無血清培地であり得る。規定培地は、動物由来の成分を有さず、全ての成分は、化学構造が分かっている。代謝廃棄産物:本明細書において用いられる用語代謝廃棄産物は、細胞培養物にとって何らかの形で有害な、代謝プロセスの結果生じる、細胞培養物によって生産される化合物を言う。例示的な代謝廃棄産物には、グルコース代謝の結果生産されるラクテート、およびグルタミン代謝の結果生産されるアンモニウムが含まれる。モル浸透圧濃度および重量モル浸透圧濃度:重量モル浸透圧濃度は、水性溶液内の溶解した溶質粒子の浸透圧の測定値を言う。溶質粒子には、イオンと非イオン化分子との両方が含まれる。重量モル浸透圧濃度は、溶液1kgに溶解した、浸透圧的に活性な粒子の濃度すなわちオスモルで表される38°Cで1mOsm/kgH2Oは、19mmHgの浸透圧に等しい。モル浸透圧濃度は、逆に、1リットルの溶液に溶解した溶質粒子の数を言う。本明細書において用いられる場合、略記mOsmは、ミリオスモル/溶液kgを意味する。かん流培養:本明細書において用いられる用語かん流培養は、さらなる成分が培養プロセスの開始時の後に連続的にまたは半連続的に培養物に提供される、細胞を培養する方法を言う。提供される成分は、典型的には、培養プロセスの間に枯渇した、細胞のための栄養補給物を含む。培地内の細胞および/または成分の一部分は、典型的には、連続的または半連続的ベースで回収され、また精製されてよい。ポリペプチド:本明細書において用いられる用語ポリペプチドは、ペプチド結合を介して共に連結したアミノ酸の連続的な鎖を言う。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を言うために用いられるが、当業者には、この用語が非常に長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して共に連結された2つのアミノ酸を含む最小の鎖を言うこともできることが理解されよう。タンパク質:本明細書において用いられる用語タンパク質は、個別の単位として機能する1つまたは複数のポリペプチドを言う。単一のポリペプチドが個別の機能単位であり、個別の機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永続的な物理的関連を要する場合、本明細書において用いられる用語ポリペプチドおよびタンパク質は、区別せずに用いられる。個別の機能的単位が、互いに物理的に関連している2つ以上のポリペプチドを含む場合、本明細書において用いられる用語タンパク質は、物理的に結合し、個別の単位として共に機能する、複数のポリペプチドを言う。組換えによって発現したポリペプチドおよび組換えポリペプチド:本明細書において用いられるこれらの用語は、そのポリペプチドを発現するように遺伝子操作された哺乳動物宿主細胞から発現するポリペプチドを言う。組換えによって発現したポリペプチドは、哺乳動物宿主細胞において通常発現するポリペプチドに同一または類似であり得る。組換えによって発現したポリペプチドはまた、宿主細胞に対して外来であり得、すなわち、哺乳動物宿主細胞において通常発現するペプチドに対して異種であり得る。あるいは、組換えによって発現したポリペプチドは、ポリペプチドの一部分が、哺乳動物宿主細胞において通常発現するポリペプチドに同一または類似であるアミノ酸配列を含有するが、他の部分が宿主細胞に対して外来であるという点で、キメラであり得る。播種:本明細書において用いられる用語播種は、細胞培養物をバイオリアクターまたは別の容器に提供するプロセスを言う。細胞は、別のバイオリアクターまたは容器内で先に増殖されていてよい。あるいは、細胞は、それらをバイオリアクターまたは容器に提供する直前に凍結および解凍されていてよい。この用語は、単一の細胞を含む任意の数の細胞に言及する。無血清培地:本明細書において用いられる場合、用語無血清培地は、動物の血清通常はウシ胎仔血清またはその抽出物を含有しない培地を言う。無血清培地はまた、規定培地、すなわち、組成が分からない血清、加水分解物、または成分を含有しない無血清培地であり得る。規定培地は、動物由来の成分を有さず、全ての成分は、化学構造が分かっている。本明細書において提供されるいくつかの実施形態において、無血清培地は、少なくとも1つの成長因子を含む成長因子不含培地と比較して。実質的に:本明細書において用いられる場合、用語実質的には、目的の特徴または特性の完全なまたはほぼ完全な範囲または程度を示す質的条件を言う。生物学的分野の当業者には、生物学的現象および化学的現象が、もしあっても、完了に達することおよび/もしくは完了に向けて進むこと、または絶対的な結果を達成することもしくは避けることが稀であることが理解されよう。用語実質的には、したがって、多くの生物学的現象および化学的現象に固有の完全性が潜在的に欠けていることを捉えるために、本明細書において用いられる。補給成分:本明細書において用いられる用語補給成分は、限定はしないが、ホルモンおよび/もしくは他の成長因子、特定のイオンナトリウムイオン、塩化物イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、およびリン酸イオンなど、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物、アミノ酸、脂質、ならびに/またはグルコースもしくは他のエネルギー源を含む、最低速度を超えて成長および/または生存を増強する成分を言う。特定の実施形態において、補給成分は、最初の細胞培養物に添加され得る。特定の実施形態において、補給成分は、細胞培養の開始後に添加され得る。力価:本明細書において用いられる用語力価は、哺乳動物細胞培養物によって生産される、組換えによって発現したポリペプチドまたはタンパク質の全量を、所与の量の培地容積で割ったものを言う。力価は、典型的には、培地1ミリリットル当たりのポリペプチドまたはタンパク質のミリグラム単位で表される。詳細な説明本発明は、とりわけ、組換えタンパク質の改良された生産のための改良された細胞培養系を提供する。特に、本発明は、少なくとも1つの成長因子例えば、インスリン、IGF-I、および/またはLR3を提供する細胞培養系において、成長因子不含培地に適合された細胞を培養することに基づく、細胞培養の方法を提供する。本発明の様々な態様は、以下の節において詳細に記載される。当業者には、しかし、本明細書において記載されるこれらの実施形態に対する様々な修正が添付の特許請求の範囲の範囲内であることが理解されよう。本発明の範囲を規定するものは特許請求の範囲およびその同等物であり、これは、特定の実施形態のこの記載に、または特定の実施形態のこの記載によって、限定されるものではなく、また限定されるべきではない。節の使用は、本発明を限定するものでなない。各節は、任意の本発明の態様に適用され得る。本願において、またはの使用は、別段の記載が無い限り、および/またはを意味する。成長因子不含培地への適合本明細書において用いられる場合、成長因子不含培地への適合は、細胞を成長因子含有培地から成長因子不含培地に移し、細胞を適切な条件下で成長させて、安定性の終了の前に複数世代例えば、10、20、30、40、50世代超にわたり細胞が成長因子不含培地おいて成長し得るようにするプロセスを言う。典型的には、成長因子不含培地への細胞の適合は、細胞が増殖するためならびに所望の細胞密度、生存率、および/または生産性を達成するために十分な時間にわたり細胞を成長させることを伴う。例えば、典型的な適合プロセスは、例えば1、2、3、4、5、6週間超にわたり細胞を成長因子不含培地において成長させることを伴い得る。細胞は、様々なプロセスを用いて成長因子不含培地に適合させることができる。通常、細胞は、例えば、培地における多くの継代を通して、成長因子不含培地に適合させることができる。本発明に従うと、成長因子不含培地は、インスリン、ペプトン、加水分解物、トランスフェリン、インスリン様成長因子IIGF-I、および/または任意の他の成長因子もしくは成長因子様成分を実質的に含まない培地であり得る。典型的には、成長因子不含培地は、血清を実質的に含まない。いくつかのケースにおいて、成長因子不含培地は、タンパク質を実質的に含まない、完全に無タンパク質の培地である無タンパク質培地とも呼ばれる。典型的には、本発明に適した成長因子不含培地は、最低限の成長および/または生存のために細胞に必要な、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、および微量元素を提供する、化学的規定培地である。このような培地はまた、限定はしないが、特定のイオンナトリウムイオン、塩化物イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、およびリン酸イオンなど、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物、高い最終濃度で存在する無機化合物例えば鉄、アミノ酸、脂質、および/またはグルコースもしくは他のエネルギー源を含む、最低速度を超えて成長および/または生存を増強する補給成分を含有し得る。成長因子不含培地は、好ましくは、細胞の生存および増殖に最適なpHおよび塩濃度に調製される。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞培養の開始時にインスリン不含としてもよい。このケースでは、細胞は、典型的には、無血清条件および成長因子不含条件に同時に導入される。例えば、凍結された細胞ストック典型的には、無血清であるが成長因子を含有する培地内に維持されるを、無血清かつインスリン不含培地内に解凍することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、無血清であるが成長因子を含有する培地において最初に成長させられ、その後、成長因子不含培地に移される。このケースでは、凍結された細胞ストックは、無血清であるが成長因子を含有する培地内に解凍され、一定期間例えば、約2または4週間にわたり、典型的には細胞が安定な成長および生産性に達するまで、培養され得る。細胞は次に、成長因子不含培地に移される。あるいは、細胞は、血清を含有するが成長因子不含の培地において最初に成長させられ、その後、無血清かつ成長因子不含培地に移され得る。様々な播種密度を、適合培養に用いることができる。典型的には、培養を開始するため、および継代に、高い播種密度を用いることができる。適切な例示的な播種密度は、0.5e6、0.75e6、1.0e6、1.5e6、または2.0e6個細胞/mLであり得る。いくつかの実施形態において、播種密度は、0.1e6、0.2e6、0.3e6、0.4e6個細胞/mLであり得る。細胞は、標準的なまたは修正された細胞培養条件下で成長因子不含培地において培養することができる。例えば、細胞は、およそ25~42°Cの間の温度例えば、25、30、31、37、40°Cで成長させることができる。細胞は、懸濁液において、または接着細胞として、成長させることができる。細胞はまた、小さな容積例えば、およそ1mL、5mL、10mL、15mL、50mL、または1L内で、または大規模例えば、100L、250L、400Lで培養することができる。試験管、プレート、フラスコ、バイオリアクター、または任意の他の容器を、適合プロセスの間に細胞を成長させるために用いることができる。細胞培養物は、培地の酸素供給の増大および細胞への栄養の分散のために撹拌または振とうすることができる。典型的には、細胞密度、生存率、生産性および/または力価は、成長因子不含細胞培養物の成長または生産性をモニタリングするために、定期的に例えば、1日に1回、週に1回、または週に2回測定することができる。本明細書において用いられる場合、成長因子不含適合細胞または成長因子不含適合細胞系は、安定性の終了の前に成長因子不含培地において複数の世代例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130またはそれを超える世代にわたり成長し得る細胞を言う。典型的には、良好に適合した成長因子不含細胞培養物は、高い生存細胞密度、生存率、特異的生産性、および/または力価を示す。成長因子不含適合細胞または成長因子不含適合細胞系はまた、成長因子非依存性細胞または成長因子非依存性細胞系と呼ばれる。例示的な適合プロセスは、実施例の節において詳細に記載されている例えば、実施例1を参照されたい。さらなる培養方法および/または成長因子不含培地への細胞の適合は、当技術分野において知られており、本発明を実施するために用いることができる。WO97/05240、JP2696001、米国特許第5,393,668号、米国特許第6,100,061号、およびBurkyJ.E.ら、BiotechnologyBioengineering、2007、Vol.96、No.2、p281~293を参照されたく、これら全ての教示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。成長因子の再添加を伴う生産培養系成長因子不含適合細胞は、生産培養に用いることができる。本発明者らは、成長因子不含培地または無タンパク質培地への細胞の適合または馴化が可能であるばかりではなく、生産培養についての所望の結果をもたらすことを実証した。例えば、成長因子不含適合細胞は、このような成長因子の非存在下でも、生産培養において用いることができ、類似の条件で培養された成長因子依存性細胞と比較して驚くほど優れた成長および生産性を示す。さらに驚くべきことに、本発明者らは、成長因子不含適合すなわち、成長因子非依存性細胞が、生産培養への成長因子の再添加に対してさらに応答性であり、成長因子依存性培養物または完全に成長因子不含の細胞培養物と比較して顕著にさらに増強した成長および生産性を示すことを発見した。したがって、本発明は、少なくとも1つの成長因子を提供する生産細胞培養系において、成長因子不含培地に適合された細胞を培養することによる、細胞培養の方法を検討する。成長因子の提供本明細書において用いられる場合、成長因子を提供するとは、1つまたは複数の成長因子が、成長因子不含適合細胞を培養する細胞培養培地に添加されることを意味する。本明細書において用いられる場合、用語成長因子は、細胞の成長または増殖を刺激し得る任意の物質を言う。いくつかの実施形態において、成長因子は、ホルモンなどの短鎖ペプチドである。様々な成長因子を、本発明に従った生産培養に添加することができる。例示的な適切な成長因子には、限定はしないが、インスリン、IGF-1、IGF-Iの合成類似体例えばLR3、およびその機能的変異体が含まれる。本明細書において用いられる場合、用語機能的変異体は、成長因子の文脈において、元の成長因子の生物学的活性例えば、細胞の成長または増殖を刺激する活性に実質的に類似の生物学的活性を保持する分子を示す。機能的変異体または機能的同等物は、天然誘導体であり得るか、または合成的に調製される。例示的な機能的変異体は、元の成長因子の生物学的活性例えば、細胞の成長または増殖を刺激する活性が保存されている限りの、1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含む。例えば、機能的変異体は、インスリンなどの元の成長因子のアミノ酸配列に少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99同一なアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態において、インスリンの機能的変異体は、インスリン様成長因子である。インスリン様成長因子には、限定はしないが、IGF-1、LR3が含まれる。いくつかの実施形態において、単一の成長因子例えばインスリンが、生産培養に添加される。いくつかの実施形態において、成長因子の組み合わせを、生産培養に添加することができる。本発明に従うと、成長因子は、生産培養の間の任意の段階で提供することができる。例えば、成長因子は、生産培養の開始時に添加することができる。あるいは、またはさらに、成長因子は、その後の1つまたは複数の時点で添加することができる。複数の成長因子例えば、インスリンおよびLR3を用いる場合、これらは、同時にまたは連続的に生産培養に添加され得る。成長因子は、生産培養物のための培地成分の一部として含まれ得るか、または個別に添加され得る。例えば、成長因子は、フェドバッチ培養の基本培地、流加培地、または両方に添加され得る。いくつかの実施形態において、成長因子は、フェドバッチ培養の基本培地にのみ添加される。複数の成長因子を用いる場合、これらはまた、生産培養に異なる培地部分で添加され得る。例えば、1つの成長因子例えばインスリンが基本培地に添加され得、別の成長因子例えばLR3が流加培地に添加され得る。複数の成長因子は、生産培養において、付加的なまたは相乗的な効果をもたらし得る。いくつかの実施形態において、成長因子は、生産培養の前に提供され得る。例えば、成長因子例えばインスリンは、生産培養物を播種するために細胞が採取される前に、培養物例えば、適合培養物または最初の培養物内に再導入され得る。成長因子は、様々な濃度で添加され得る。例えば、個々の成長因子の適切な濃度または複数の成長因子の組み合わされた濃度は、およそ0~2000mg/L例えば、0~1000mg/L、0~750mg/L、0~500mg/L、0~250mg/L、0~200mg/L、0~150mg/L、0~100mg/L、0~75mg/L、0~50mg/L、0~25mg/L、0~10mg/L、0~1mg/L、0~750μg/L、0~500μg/L、0~250μg/L、0~200μg/L、0~150μg/L、1~100μg/L、0~75μg/L、0~50μg/L、0~40μg/L、0~30μg/L、0~25μg/L、0~20μg/L、0~15μg/L、0~10μg/L、0~5μg/L、0~1μg/L、0~750ng/L、0~500ng/L、0~250ng/L、0~200ng/L、0~150ng/L、0~50ng/L、0~25ng/L、0~10ng/L、0~5ng/Lの間の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、個々の成長因子の適切な濃度または複数の成長因子の組み合わされた濃度は、およそ0.1ng/L、1ng/L、5ng/L、25ng/L、50ng/L、75ng/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L、25μg/L、50μg/L、75μg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L、140mg/L、150mg/L、175mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L、1000mg/L、1500mg/L、または2000mg/Lであり得る。生産培養限定はしないが、バッチ培養、フェドバッチ培養、かん流系、および回転試験管培養を含む、様々な生産培養を、本発明に用いることができる。バッチ培養プロセスは、典型的には、特定の細胞密度の播種培養物を有する大規模生産培養物を接種すること、細胞の成長および生存率を促進する条件下で細胞を成長させること、細胞が特定の細胞密度に達したら培養物を回収すること、ならびに発現したタンパク質を精製することを含む。フェドバッチ培養手順は、バッチ培養物に栄養および細胞の成長の間に消費される他の成分を補給する、さらなる1つまたは複数のステップを含む。培地本明細書において用いられる場合、用語培地単数および培地複数は、成長中の哺乳動物細胞に栄養を与える栄養を含有する1つまたは複数の溶液を言う。様々な培地を、血清ベースの培地および無血清培地の両方を含む生産培養に用いることができる。典型的には、このような溶液は、最低限の成長および/または生存のために細胞に必要な、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、ならびに微量元素を提供する。このような溶液はまた、限定はしないが、ホルモンおよび/または他の成長因子、特定のイオンナトリウムイオン、塩化物イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、およびリン酸イオンなど、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物、高い最終濃度で存在する無機化合物例えば鉄、アミノ酸、脂質、および/またはグルコースもしくは他のエネルギー源を含む、最低速度を超えて成長および/または生存を増強する補給成分を含有し得る。特定の実施形態において、培地は、細胞の生存および増殖に最適なpHおよび塩濃度に有利に調製される。本発明の特定の実施形態において、ヘキサメチレン-ビスアセトアミドHMBAおよび酪酸ナトリウムNaBなどの化学的誘発剤を培地に補給することが有利であり得る。これらの最適な補給物は、培養の開始時に添加され得るか、または、枯渇した栄養を補充するため、もしくは他の理由で例えば、流加培地として、後の時点で添加され得る。広範な哺乳動物成長培地を、本発明に従って用いることができる。特定の実施形態において、細胞は、培地の成分が知られておりかつ制御されている様々な化学的規定培地の1つにおいて成長させることができる。特定の実施形態において、細胞は、培地の成分の全てが知られているおよび/または制御されているわけではない複合培地において成長させることができる。哺乳動物細胞の培養のための、化学的に規定された成長培地は、ここ数十年にわたり広く開発され、公開されている。規定培地の全ての成分は、良く特徴付けされており、したがって、規定培地は、血清または加水分解物などの複合添加物を含有していない。最近、生産性の高い組換えタンパク質生産細胞の培養をサポートするという明確な目的の培地調製物が開発されており、このような培地を、本発明の実施において用いることができる。いくつかの実施形態において、規定培地は、典型的には、水中の濃度が分かっている、およそ50の化学物質を含む。いくつかの実施形態において、規定培地は、タンパク質成分を必要とせず、したがって、無タンパク質規定培地と呼ばれる。培地の典型的な化学成分は、5つの広義カテゴリー、すなわち、アミノ酸、ビタミン、無機塩、微量元素、およびきちんとカテゴリー化できない雑カテゴリーに分類される。典型的には、微量元素は、マイクロモル濃度以下のレベルで含まれる様々な無機塩を言う。例えば、一般的に含まれる微量元素は、亜鉛、セレン、銅などである。いくつかの実施形態において、鉄第一鉄塩または第二鉄塩は、マイクロモル濃度で、最初の細胞培養培地における微量元素として含まれ得る。マンガンもまた、多くの場合、ナノモル濃度からマイクロモル濃度の範囲で、二価陽イオンMnCl2またはMnSO4として、微量元素内に含まれる。多くのあまり一般的ではない微量元素は、通常、ナノモル濃度で添加される。複合培地の全ての成分が良く特徴付けされているわけではなく、したがって、複合培地は、とりわけ単純炭素源および/または複合炭素源、単純窒素源および/または複合窒素源、ならびに血清などの添加物を含有し得る。いくつかの実施形態において、本発明に適した複合培地は、本明細書において記載される規定培地の他の成分に加えて、加水分解物などの添加物を含有する。様々な培地が、当技術分野において知られており、本発明を実施するために適合され得る。例えば、適切な例示的な培地は、米国特許第7,294,484号、米国特許第7,300,773号、および米国特許第7,335,491号において記載されており、これら全ての開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。様々な市販の培地もまた、本発明を実施するために用いることができる。1つまたは複数の成長因子を、本発明に従った様々な濃度で、本明細書において記載される様々な培地に添加することができる。典型的には、規定培地などの無血清培地が、生産培養に用いられる。いくつかの実施形態において生産培養のための適切な培地は、再添加された成長因子以外、血清、他の成長因子、またはペプトン、加水分解物、トランスフェリンなどを含む典型的なタンパク質補給物を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、生産培養のための適切な培地は、再添加される成長因子以外、タンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、生産培養のための培地は、再添加された成長因子以外、適合に用いられる成長因子不含培地と同一である。播種本発明に従うと、成長因子不含培地に適合された細胞成長因子非依存性細胞または成長因子非依存性細胞系としても知られているは、生産培養を開始するために用いられる。典型的には、生産培養に適した成長因子細胞は、成長因子不含適合培養において良好な成長および生存率を示す。これらは、生産培養物を播種するために、様々な段階例えば、適合培養の開始時、中間、または終了近くで適合培養から採取することができる。生産培養における開始細胞密度は、当業者によって選択され得る。本発明に従うと、生産培養における開始細胞密度は、培養容積当たり単一の細胞と低い可能性がある。好ましい実施形態において、しかし、生産培養における開始細胞密度は、1mL当たり約2×102個の生存細胞から、1mL当たり約2×103、2×104、1×105、2×105、1×106、2×106、5×106、または10×106個、およびそれを超えるまでの生存細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、初期培養において最初に成長させられる。初期培養容積は、任意のサイズのものであり得るが、多くの場合、最終生産において用いられる生産バイオリアクターの培養容積よりも小さく、しばしば、細胞は、生産バイオリアクターに播種する前に、容積の増していくバイオリアクター内で複数回継代される。初期細胞培養物および中間細胞培養物は、次の中間生産バイオリアクターまたは最終生産バイオリアクターに播種する前に、任意の所望の密度まで成長させることができる。細胞のほとんどが播種の前に生存したままであることが好ましいが、完全なまたはほぼ完全な生存率が必要とされるわけではない。本発明の一実施形態において、細胞は、例えば低速遠心分離によって、上清から除去され得る。除去された細胞を、次のバイオリアクターに播種する前に培地で洗浄して、望ましくない代謝廃棄産物または培地成分を除去することが望ましい場合もある。培地は、細胞が以前に成長した培地であり得るか、または本発明の実施者によって選択される異なる培地もしくは洗浄溶液であり得る。細胞は、次に、生産バイオリアクターに播種するために、適切な密度まで希釈され得る。本発明の好ましい実施形態において、細胞は、生産バイオリアクターにおいて用いられる同一の培地内に希釈される。あるいは、細胞は、本発明の実施者の要求および要望に応じて、または細胞自体の特定の要件、例えば、細胞が、生産バイオリアクターへの播種の前に短期間保存されるかどうかに対応するために、別の培地または溶液内に希釈され得る。培養条件上記のように生産バイオリアクターが播種されると、細胞培養は、細胞培養物の生存、成長および生存率を促進する条件下で、初期成長相で維持される。正確な条件は、細胞型、細胞が由来した生物、ならびに目的の発現する組換えタンパク質の性質および特徴に応じて変化する。本発明に従うと、生産バイオリアクターは、ポリペプチドまたはタンパク質の大規模生産に適した任意の容積であり得る。好ましい実施形態において、生産バイオリアクターの容積は、少なくとも500リットルである。他の好ましい実施形態において、生産バイオリアクターの容積は、1000、2500、5000、8000、10000、12000リットル以上、またはその間の任意の容積である。当業者であれば、本発明の実施において用いるための適切なバイオリアクターの選択を知り、前記選択が可能であろう。生産バイオリアクターは、生産されたポリペプチドまたはタンパク質の発現または安定性に干渉しない、細胞の成長および生存率を促進する任意の材料で構成され得る。初期成長相の細胞培養の温度は、細胞培養物が生存し続ける温度範囲に主に基づいて選択される。例えば、初期成長相の間、CHO細胞は、37°Cで良好に成長する。通常、ほとんどの哺乳動物細胞は、約25°Cから42°Cの範囲内で良好に成長する。好ましくは、哺乳動物細胞は、約35°Cから40°Cの範囲内で良好に成長する。当業者であれば、細胞の要求および実施者の生産要件に応じて、細胞を成長させるための適切な1つまたは複数の温度を選択できよう。本発明の一実施形態において、初期成長相の温度は、単一の一定温度で維持される。別の実施形態において、初期成長相の温度は、ある温度範囲内で維持される。例えば、温度は、初期成長相の間に徐々に上昇または低下し得る。あるいは、温度は、初期成長相の間の様々な時点で、個別の温度ずつ、上昇または低下し得る。当業者であれば、単一の温度を用いるべきかまたは複数の温度を用いるべきか、および温度を徐々に調整するべきかまたは個別の温度ずつ調整するべきかを決定することができよう。細胞培養物は、培地の酸素供給の増大および細胞への栄養の分散のために撹拌または振とうすることができる。あるいは、またはさらに、当技術分野において周知の特別な散布装置を用いて、培養物の酸素供給を増大および制御することができる。本発明に従うと、当業者であれば、限定はしないがpH、温度、酸素供給などを含むバイオリアクターの特定の内部条件を制御または調節することが有利であり得ることが理解されよう。細胞は、初期成長相の間、実施者の要求および細胞自体の要件に応じて、さらに長いまたは短い時間にわたり成長させることができる。一実施形態において、細胞は、障害なく成長することが可能である場合に細胞が最終的に達する最大生存細胞密度の所与のパーセンテージである生存細胞密度を達成するために十分な一定期間にわたり成長させられる。例えば、細胞は、最大生存細胞密度の1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または99パーセントの所望の生存細胞密度を達成するために十分な一定期間にわたり成長させることができる。別の実施形態において、細胞は、所定の期間にわたり成長することが可能である。例えば、細胞培養の開始濃度、細胞が成長する温度、および細胞の固有の成長速度に応じて、細胞は、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20日以上にわたり成長させることができる。いくつかのケースにおいて、細胞は、1カ月以上にわたり成長することが可能であり得る。細胞は、初期成長相の温度での播種バイオリアクターにおけるその成長が、その接種の時点での生産バイオリアクターにおける生存細胞密度が既に最大生存細胞密度の所望のパーセンテージであるほどに十分であった場合、生産バイオリアクターにおいて0日間成長させられる。本発明の実施者は、ポリペプチドまたはタンパク質の生産要求量および細胞自体の要求に応じて、初期成長相の期間を選択することができる。培養条件の変更本発明の教示に従うと、初期成長相の最後に、培養条件の少なくとも1つを変更して、培養条件の2つ目のセットが適用され、培養において代謝転換が生じるようにすることができる。阻害性代謝産物、最も顕著にはラクテートおよびアンモニアの蓄積は、成長を阻害する。例えば細胞培養の温度、pH、重量モル浸透圧濃度、または化学的誘発剤レベルの変化によって達成される代謝転換は、特定のグルコース消費速度に対する特定のラクテート生産速度の比率の低減によって、特徴付けされ得る。1つの非限定的な実施形態において、培養条件は、培養温度を変更することによって変更される。しかし、当技術分野において知られているように、温度の変更は、適切な代謝転換を達成させ得る唯一のメカニズムではない。例えば、このような代謝転換はまた、限定はしないがpH、重量モル浸透圧濃度、および酪酸ナトリウムレベルを含む他の培養条件を変更することによっても達成され得る。上述したように、培養の変更のタイミングは、ポリペプチドまたはタンパク質の生産要求量または細胞自体の要求に基づいて、本発明の実施者によって決定されよう。培養の温度を変更すると、温度の変更は、比較的段階的であり得る。例えば、温度変化が完了するには、数時間または数日間要し得る。あるいは、温度の変更は、比較的急激であり得る。例えば、温度変化は、数時間以内に完了し得る。適切な生産および制御装置、例えばポリペプチドまたはタンパク質の商業的大規模生産において標準的なものを考えると、温度変化は、1時間未満でも完了し得る。続く成長相における細胞培養の温度は、細胞培養物が生存し続け、商業的に適切なレベルで組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質を発現する温度範囲に主に基づいて選択される。通常、ほとんどの哺乳動物細胞は、約25°Cから42°Cの範囲内で、生存し続け、商業的に適切なレベルで組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質を発現する。好ましくは、哺乳動物細胞は、約25°Cから35°Cの範囲内で、生存し続け、商業的に適切なレベルで組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質を発現する。当業者であれば、細胞の要求および実施者の生産要求量に応じて、細胞を成長させる適切な1つまたは複数の温度を選択できよう。本発明の一実施形態において、続く成長相の温度は、単一の一定温度で維持される。別の実施形態において、続く成長相の温度は、ある温度範囲内で維持される。例えば、温度は、続く成長相の間に徐々に上昇または低下し得る。あるいは、温度は、続く成長相の間の様々な時点で、個別の温度ずつ、上昇または低下し得る。当業者であれば、複数の個別の温度変更がこの実施形態に包含されることが理解されよう。例えば、温度は1回変更され得、細胞は特定の期間にわたりこの温度または温度範囲で維持され、その後、温度は、さらに高いまたは低い温度に再び変更され得る。それぞれの個別の変更の後の培養の温度は、一定であり得るか、または特定の温度範囲内に維持され得る。培養条件、成長、または生産性のモニタリング本発明の特定の実施形態において、実施者には、成長中の細胞培養物の特定の条件を定期的にモニタリングすることが有利であることが見出され得る。細胞培養条件のモニタリングによって、実施者は、細胞の成長または生産性が最適なレベルであるかどうか、または培養が次善の生産相に移ろうとしているかどうかを決定して、細胞培養条件をそれに応じて調整し得ることが可能になる。特定の細胞培養条件をモニタリングするために、少量の培養物アリコートが分析のために取り出される。非限定的な例として、温度、pH、細胞密度、細胞の生存率、積分生存細胞密度、ラクテートレベル、アンモニウムレベル、モル浸透圧濃度、細胞の生産性、または発現した組換えタンパク質の力価をモニタリングすることが有利であり得る。当業者がこれらの条件を測定することを可能にする多くの技術が、当技術分野において周知である。例えば、細胞密度は、血球計、コールターカウンター、または細胞密度試験CEDEXを用いて測定することができる。生存細胞密度は、培養試料をトリパンブルーで染色することによって決定することができる。死細胞のみがトリパンブルーを取り込むため、生存細胞密度は、細胞の総数を計数し、染料を取り込んだ細胞の数を細胞の総数で割り、そして逆数を取ることによって決定することができる。HPLCを用いて、ラクテート、アンモニウム、または発現したポリペプチドもしくはタンパク質のレベルを決定することができる。あるいは、発現したタンパク質のレベルは、標準的な分子生物学技術、例えば、SDS-PAGEゲルのクマシー染色、ウェスタンブロッティング、ブラッドフォードアッセイ、ローリーアッセイ、ビウレットアッセイ、およびUV吸光度によって決定することができる。発現したポリペプチドまたはタンパク質の、リン酸化およびグリコシル化を含む翻訳後修飾をモニタリングすることも有利または必要であり得る。いくつかの実施形態において、細胞培養はまた、エルマンシグナルを検出するためのエルマンアッセイによってモニタリングされる。本明細書において用いられる場合、用語エルマンアッセイは、細胞培養培地における遊離スルフヒドリル基を測定するために行われるアッセイを言う。エルマン試薬、すなわち5,5-ジチオ-ビス-2-ニトロ安息香酸DTNBは、溶液内の遊離スルフヒドリル基を定量するための水溶性化合物である。特に、この化合物の溶液は、スルフヒドリルと反応すると、測定可能な黄色の生成物を生じさせる。DTNVは、遊離スルフヒドリル基と反応して、混合したジスルフィドおよび2-ニトロ-5-チオ安息香酸TNBを生じさせる。この反応におけるDTNBの標的は、遊離スルフヒドリル基の共役塩基R-S-である。典型的には、この反応の速度は、いくつかの因子、すなわち1反応pH、2スルフヒドリルのpKa、ならびに3立体的および静電気的効果に応じる。TNBは、この反応において生じる着色種であり、可視範囲で高いモル吸光係数を有する。スルフヒドリル基は、既知の濃度のスルフヒドリル含有化合物、例えばシステインからなる標準曲線と比較することによって、試料内で推量することができる。さらに、またはあるいは、スルフヒドリル基は、TNBの吸光係数を参照することによって定量することができる。いくつかの実施形態において、細胞培養条件のモニタリングはまた、対照に対して、細胞の成長、生産性、栄養利用、および/または廃棄物蓄積を比較することを伴う。典型的には、対照培養は、成長因子依存性培養である。さらに、またはあるいは、対照培養は、いかなる成長因子も再添加しない、無タンパク質または成長因子不含の生産培養である。正確な対照は、比較基準を提供するために同時に行われる培養であり得る。あるいは、正確な対照はまた、歴史的対照すなわち、以前に行われた対照から得られたデータ、またはこれまでに知られている歴史的結果であり得る。正確な対照に対する比較は、細胞培養条件の調整を容易にし得、その結果、細胞の成長および/または生産性を最大にし得る。細胞が、細胞の成長および/または生産性例えば、細胞密度、細胞の生存率、積分生存細胞密度、細胞の生産性、および/または力価が、成長因子依存性培養または成長因子を再添加しない無タンパク質培養もしくは成長因子不含培養のものと比較して増大するような、本発明に従った細胞培養条件下で培養され得ることが検討される。いくつかの実施形態において、本発明に従った細胞培養物の成長は、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、1001倍増大する。細胞培養物の成長は、生存細胞密度、生存率、および/または積分生存細胞密度IVCDによって決定することができる。いくつかの実施形態において、本発明に従った細胞培養物の生産性は、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、または5倍増大する。生産性は、目的の発現した組換えタンパク質の特異的生産性および/または力価によって決定することができる。本発明の細胞培養物は、栄養例えばグルコースの利用が増大していることも考慮される。いくつかの実施形態において、細胞の成長および生産を最大にするために、グルコースを培養プロセスの間に戻し入れて、枯渇したグルコースを補充することが可能である。従来の成長因子依存性培養での永続的なおよび未解決の問題は、細胞の成長、生存率、および発現したタンパク質の生産に対して有害な効果を有する代謝廃棄産物の生産である。本発明の細胞培養は、代謝廃棄産物の蓄積が減少していることが考慮される。特に、実施例の節において記載されているように、本発明の細胞培養は、例えばエルマンアッセイによりモニタリングされる、遊離スルフヒドリルの蓄積が低減している。細胞細胞培養およびタンパク質の発現が生じやすい任意の哺乳動物細胞または哺乳動物細胞型を、本発明に従って利用することができる。本発明に従って用いられ得る哺乳動物細胞の非限定的な例には、BALB/cマウス骨髄腫系NSO/l、ECACC番号:85110503、ヒト網膜芽細胞PER.C6CruCell、Leiden、TheNetherlands、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1系COS-7、ATCCCRL1651、ヒト胚腎臓系懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた293または293細胞、Grahamら、J.GenVirol.、36:591977、ベビーハムスター腎臓細胞BHK、ATCCCCL10、チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFRCHO、UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:42161980、例えば、CHO、CHO-K1、CHO-DG44、またはCHO-DUX細胞、マウスセルトリ細胞TM4、Mather、Biol.Reprod.、23:243~2511980、サル腎臓細胞CV1ATCCCCL70、アフリカミドリザル腎臓細胞VERO-76、ATCCCRL-1587、ヒト子宮頸癌細胞HeLa、ATCCCCL2、イヌ腎臓細胞MDCK、ATCCCCL34、バッファローラット肝細胞BRL3A、ATCCCRL1442、ヒト肺細胞W138、ATCCCCL75、ヒト肝細胞HepG2、HB8065、マウス乳腺腫瘍MMT060562、ATCCCCL51、TRI細胞Matherら、AnnalsN.Y.Acad.Sci.、383:44~681982、MRC5細胞、FS4細胞、およびヒト肝臓癌系HepG2が含まれる。特に好ましい実施形態において、本発明は、CHO細胞系からのポリペプチドおよびタンパク質の培養および発現において用いられる。さらに、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の数の市販されているおよび市販されていないハイブリドーマ細胞系を、本発明に従って利用することができる。当業者であれば、ハイブリドーマ細胞系が最適な成長およびタンパク質発現のために異なる栄養要件を有し得ることおよび/または異なる培養条件を要求し得ることが理解され、必要に応じて条件を修正することができよう。上記のように、多くの場合において、細胞は、高レベルのタンパク質を生産するように選択または操作される。多くの場合、細胞は、高レベルのタンパク質を生産するように、例えば、目的のタンパク質をコードする遺伝子の導入および/または目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する制御エレメント内因性のものであっても導入されたものであってもの導入によって、遺伝子操作される。特定のタンパク質は、最終的には何らかの方法で目的のタンパク質の生産を限定する、細胞の成長、細胞の生存率、または細胞のいくつかの他の特徴に対する有害な効果を有し得る。特定のポリペプチドを発現するように操作された1つの特定のタイプの細胞集団の中でさえも、細胞集団内の多様性は存在し、その結果、特定の個々の細胞が、さらに良好に成長し、かつ/または目的のポリペプチドをさらに生産する。本発明の特定の好ましい実施形態において、細胞系は、細胞の培養のために選択された特定の条件下での堅固な成長のために、実施者によって経験的に選択される。特に好ましい実施形態において、特定のポリペプチドを発現するように操作された個々の細胞は、細胞の成長、最終細胞密度、細胞生存率パーセント、発現したポリペプチドの力価、もしくはこれらの任意の組み合わせ、または実施者によって重要であるとみなされる任意の他の条件に基づいて、大規模生産のために選択される。組換えタンパク質の発現細胞は、様々な目的のタンパク質を発現するように操作され得る。目的のタンパク質は、宿主細胞に対して内因性の遺伝子から、または遺伝子操作を通して宿主細胞内に導入された遺伝子から発現され得る。タンパク質は、天然に生じるものであり得るか、または代替的に、人間の手によって操作もしくは選択された配列を有し得る。操作されたタンパク質は、個別に天然に生じる他のポリペプチドセグメントから組み立てられ得るか、または1つもしくは複数の非天然のセグメントを含み得る。本発明に従って望ましく発現され得るタンパク質は、多くの場合、興味のある生物学的活性または化学的活性に基づいて選択される。例えば、本発明は、任意の薬学的にまたは商業的に関連する抗体またはその断片、ナノボディ、単一ドメイン抗体、SmallModularImmunoPharmaceuticals商標SMIP、VHH抗体、ラクダ抗体、サメ単一ドメインポリペプチドIgNAR、単一ドメイン足場例えばフィブロネクチン足場、SCORPION商標治療薬N末端結合ドメイン、エフェクタードメイン、およびC末端結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチド、成長因子、凝固因子、サイトカイン、融合タンパク質、医薬原薬、ワクチン、酵素、受容体、ならびにその組み合わせを発現させるために採用され得る。抗体薬学的作用物質または他の市販作用物質として現在用いられている、または研究中の、多くの抗体を考えると、抗体の生産は、本発明に従って特に興味深いものである。抗体は、特定の抗原を特異的に結合する能力を有するタンパク質である。宿主細胞において発現される任意の抗体は、本発明に従って用いることができる。好ましい実施形態において、発現される抗体は、モノクローナル抗体である。別の好ましい実施形態において、モノクローナル抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は、2つ以上の生物に由来するアミノ酸断片を含有する。キメラ抗体分子は、例えば、マウス、ラット、または他の種の抗体に由来する抗原結合ドメインと、ヒトの定常領域とを含み得る。キメラ抗体を作製するための様々なアプローチが記載されている。例えば、Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81、68511985;Takedaら、Nature314、4521985;Cabillyら、米国特許第4,816,567号;Bossら、米国特許第4,816,397号;Tanaguchiら、欧州特許公開EP171496;欧州特許公開第0173494号、英国特許GB2177096Bを参照されたい。別の好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、例えば、リボソームディスプレイライブラリーまたはファージディスプレイライブラリーの使用例えば、Winterら、米国特許第6,291,159号、およびKawasaki、米国特許第5,658,754を参照されたい、または、非変性の抗体遺伝子が不活化され、ヒト抗体遺伝子で機能的に置き換えられているが、非変性免疫系の他の成分は無傷のままである、異種移植種の使用例えば、Kucherlapatiら、米国特許第6,657,103号を参照されたいを介して、ヒト抗体由来である。別の好ましい実施形態において、モノクローナル抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、アミノ酸残基の大部分がヒト抗体に由来するキメラ抗体であり、したがってヒト対象に送達されたときのあらゆる考えられる免疫反応を最小化する。ヒト化抗体において、相補性決定領域におけるアミノ酸残基は、所望の抗原特異性または抗原親和性を付与する非ヒト種由来の残基で少なくとも部分的に置き換えられている。このような改変された免疫グロブリン分子は、当技術分野において知られているいくつかの技術例えば、Tengら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、80、7308~73121983;Kozborら、ImmunologyToday、4、72791983;Olssonら、Meth.Enzymol.、92、3~161982のいずれかによって作製することができ、好ましくは、参照することによって全て本明細書に組み込まれるPCT公開WO92/06193またはEP0239400の教示に従って作製される。ヒト化抗体は、例えば、ScotgenLimited、2HollyRoad、Twickenham、Middlesex、GreatBritainによって、商業的に生産され得る。さらなる参照のために、参照することによって全て本明細書に組み込まれる、Jonesら、Nature321:522~5251986;Riechmannら、Nature332:323~3291988;およびPresta、Curr.Op.Struct.Biol.2:593~5961992を参照されたい。別の好ましい実施形態において、上記のモノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体は、天然のいかなる種におけるいかなる抗体においても天然に生じないアミノ酸残基を含有し得る。これらの外来残基は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体に新規なまたは修飾された特異性、親和性、またはエフェクター機能を付与するために利用することができる。別の好ましい実施形態において、上記の抗体は、全身的な薬物療法のための薬剤、例えば毒素、低分子量細胞傷害性薬剤、生物学的応答修飾因子、および放射性核種にコンジュゲートされ得る例えば、Kunzら、Calicheamicinderivative-carrierconjugates、US20040082764A1を参照されたい。一実施形態において、本発明は、アミロイド前駆体タンパク質のAβ断片またはアミロイド斑の他の成分に特異的に結合し、アルツハイマー病の特徴である脳におけるアミロイド斑の蓄積の治療において有用である抗体を生産するために用いられる。例えば、米国仮特許出願第60/636,684号を参照されたい。いくつかの実施形態において、本発明は、HER2/neu受容体を特異的に結合する抗体を生産するために用いられる。いくつかの実施形態において、本発明は、抗CD20抗体を生産するために用いられる。いくつかの実施形態において、本発明は、TNFα、CD52、CD25、VEGF、EGFR、CD11a、CD33、CD3、アルファ-4インテグリン、および/またはIgEに対する抗体を生産するために用いられる。別の実施形態において、本発明の抗体は、癌などの増殖性疾患における、標的細胞および/または標的組織上で発現する細胞表面抗原に対するものである。一実施形態において、抗体は、IgG1抗ルイスY抗体である。ルイスYは、構造Fuca1→2Galβ1→4[Fuca1→3]GlcNacβ1→3Rを有する糖鎖抗原であるAbeら、1983J.Biol.Chem.、25811793~11797。ルイスY抗原は、ヒト上皮腫瘍乳癌、結腸癌、肺癌、および前立腺癌を含むの60から90の表面上に発現しその少なくとも40がこの抗原を過剰発現する、正常組織においては発現が限定されている。Leyを標的化し、腫瘍を効果的に標的化するために、抗原に対する排他的特異性を有する抗体が理想的に望ましい。したがって、好ましくは、本発明の抗ルイスY抗体は、1型構造すなわち、ラクト系の血液群LeaおよびLebと交差反応せず、好ましくは、他の2型エピトープすなわち、ネオラクト構造様LexおよびH2型構造を結合しない。好ましい抗ルイスY抗体の例は、hu3S193と呼ばれる本明細書においてその全体が組み込まれる、米国特許第6,310,185号、米国特許第6,518,415号、米国特許第5,874,060号を参照されたい。ヒト化抗体hu3S193Attia,M.A.ら、1787~1800は、Leyに対する特別な特異性を有する、腺癌細胞に対して作製されたマウスモノクローナル抗体であるKitamura,K.、12957~129613S193からのCDRグラフティングによって生成させた。hu3S193は、Leyについての3S193の特異性を保持しているだけではなく、相補体依存性の細胞傷害性以下、CDCと呼ぶおよび抗体依存性の細胞傷害性以下、ADCCと呼ぶを仲介する能力も獲得しているAttia,MA.ら、1787~1800。この抗体は、125I、111In、または18F、および111In、99mTc、もしくは90Yなどのキレート剤を要する他の放射性標識で標識されたhu3S193での生体分布研究によって実証されたように、ヌードマウスにおいてLey発現異種移植片を標的化するClarkら、4804~4811。別の実施形態において、抗体は、Myo29、Myo28、およびMyo22と呼ばれるヒト抗GDF-8抗体ならびにそれに由来する抗体および抗原結合断片の1つである。これらの抗体は、高い親和性で成熟GDF-8を結合し得、例えばActRIIBの結合の阻害およびレポーター遺伝子アッセイによって実証されるように、インビトロおよびインビボでのGDF-8活性を阻害し、かつ、骨格筋質量および骨密度の負の調節に関連するGDF-8活性を阻害し得る。例えば、Veldmanら、米国特許出願第20040142382号を参照されたい。受容体薬学的作用物質および/または市販作用物質として効果的であることが示されている別のクラスのポリペプチドには、受容体が含まれる。受容体は、典型的には、細胞外シグナル伝達リガンドを認識することによって機能する、膜貫通糖タンパク質である。受容体は、典型的には、リガンドの結合の際に標的の細胞内分子をリン酸化することによってシグナル伝達経路を開始させ、細胞内の発生上または代謝上の変化をもたらす、リガンド認識ドメインに加えて、タンパク質キナーゼドメインを有する。一実施形態において、目的の受容体は、1つまたは複数の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインを除去するように修飾され、前記ドメインの代わりに、Igドメインが付着していてよい。好ましい実施形態において、本発明に従って生産される受容体は、受容体チロシンキナーゼRTKである。RTKファミリーには、多くの細胞型の様々な機能に不可欠な受容体が含まれる例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、YardenおよびUllrich、Ann.Rev.Biochem.57:433~478、1988;UllrichおよびSchlessinger、Cell61:243~254、1990を参照されたい。RTKの非限定的な例には、線維芽細胞成長因子FGF受容体ファミリーのメンバー、上皮成長因子受容体EGFファミリーのメンバー、血小板由来成長因子PDGF受容体、免疫グロブリンおよびEGF相同性ドメイン-1TIE-1受容体およびTIE-2受容体を有するチロシンキナーゼ参照することによって本明細書に組み込まれる、Satoら、Nature3766535:70~741995、ならびにそのいくつかが血管新生を直接的にまたは間接的に促進することが示唆されているc-Met受容体MustonenおよびAlitalo、J.CellBiol.129:895~898、1995が含まれる。RTKの他の非限定的な例には、胎児肝臓キナーゼ1FLK-1キナーゼインサートドメイン含有受容体KDRと呼ばれることもあるTermanら、Oncogene6:1677~83、1991または血管内皮細胞成長因子受容体2VEGFR-2、血管内皮細胞成長因子受容体1VEGFR-1と呼ばれることもあるfms様チロシンキナーゼ-1Flt-1DeVriesら、Science255;989~991、1992;Shibuyaら、Oncogene5:519~524、1990、ニューロピリン-1、エンドグリン、エンドシアリン、およびAxlが含まれる。当業者であれば、本発明に従って好ましく発現され得る他の受容体を理解するであろう。特に好ましい実施形態において、腫瘍壊死因子アルファ受容体および腫瘍壊死因子ベータ受容体の形態の腫瘍壊死因子阻害剤TNFR-1、1991年5月20日に公開されたEP417,563;およびTNFR-2、1991年5月20日に公開されたEP417,014が、本発明に従って発現される参考として、参照することによって本明細書に組み込まれる、NaismithおよびSprang、JInflamm.471~2:1~71995~96を参照されたい。一実施形態に従うと、腫瘍壊死因子阻害剤は、可溶性TNF受容体、好ましくはTNFR-Igを含む。一実施形態において、本発明の好ましいTNF阻害剤は、TNFRIおよびTNFRIIの可溶性形態、ならびに可溶性TNF結合タンパク質であり、別の実施形態において、TNFR-Ig融合体はTNFR:Fcであり、本明細書において用いられるこの用語は、p75TNF-α受容体の細胞外部分の2つの分子からなる二量体であり、各分子がヒトIgG1の235個のアミノ酸Fc部分からなる、エタネルセプトを言う。成長因子および他のシグナル伝達分子薬学的作用物質および/または市販作用物質として効果的であることが示されている別のクラスのポリペプチドには、成長因子および他のシグナル伝達分子が含まれる。成長因子には、細胞によって分泌され、また他の細胞上の受容体に結合しそれを活性化し、受容体細胞における代謝上または発生上の変化を開始させる、糖タンパク質が含まれる。一実施形態において、目的のタンパク質は、ActRIIB受容体の細胞外ドメインと抗体のFc部分とを含むActRIIB融合ポリペプチドである例えば、Wolfmanら、ActRIIBfusionpolypeptidesandusestherefor、US2004/0223966A1を参照されたい。別の実施形態において、成長因子は、修飾されたGDF-8プロペプチドであり得る例えば、Wolfmanら、ModifiedandstabilizedGDFpropeptidesandusesthereof、US2003/0104406A1を参照されたい。あるいは、目的のタンパク質は、ホリスタチンドメイン含有タンパク質であり得る例えば、Hillら、GASP1:afollistatindomaincontainingprotein、US2003/0162714A1;Hillら、GASP1:afollistatindomaincontainingprotein、US2005/0106154A1;Hillら、Follistatindomaincontainingproteins、US2003/0180306A1を参照されたい。哺乳動物の成長因子および他のシグナル伝達分子の非限定的な例には、サイトカイン;上皮成長因子EGF;血小板由来成長因子PDGF;線維芽細胞成長因子FGF、例えばaFGFおよびbFGF;形質転換成長因子TGF、例えば、TGF-アルファ、およびTGFベータ1、TGFベータ2、TGFベータ3、TGFベータ4、またはTGFベータ5を含むTGFベータ;インスリン様成長因子-Iおよびインスリン様成長因子-IIIGF-IおよびIGF-II;des1-3-IGF-I脳IGF-I、インスリン様成長因子結合タンパク質;CDタンパク質、例えばCD-3、CD-4、CD-8、およびCD-19;エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形成タンパク質BMP;インターフェロン、例えばインターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、およびインターフェロンガンマ;コロニー刺激因子CSF、例えば、M-CSF、GM-CSF、およびG-CSF;インターロイキンTL、例えば、IL-1からIL-10;腫瘍壊死因子TNFアルファおよび腫瘍壊死因子TNFベータ;インスリンA鎖;インスリンB鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;凝固因子、例えば因子VIIIC、因子IX、組織因子、およびフォンヴィレブランド因子;抗凝固因子、例えばタンパク質C;心房性ナトリウム利尿因子;肺表面活性物質;プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼまたはヒト尿型もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子t-PA;ボンベシン;トロンビン、造血成長因子;エンケファリナーゼ;RANTESregulatedonactivationnormallyT-cellexpressedandsecreted;ヒトマクロファージ炎症性タンパク質MIP-1-アルファ;ミュラー管阻害物質;リラキシンA鎖;リラキシンB鎖;プロリラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子BDNF、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、ニューロトロフィン-5、またはニューロトロフィン-6NT-3、NT-4、NT-5、またはNT-6、または神経成長因子、例えばNGF-ベータが含まれる。当業者であれば、本発明に従って発現され得る他の成長因子またはシグナル伝達分子を理解するであろう。Gタンパク質共役受容体薬学的作用物質および/または市販作用物質として効果的であることが示されている別のクラスのポリペプチドには、成長因子および他のシグナル伝達分子が含まれる。Gタンパク質共役受容体GPCRは、7回膜貫通ドメインを有するタンパク質である。リガンドがGPCRに結合すると、シグナルは細胞内で変換され、その結果、細胞の生物学的または生理学的な特性が変化する。Gタンパク質およびエフェクターGタンパク質によって調節される細胞内酵素およびチャネルを伴うGPCRは、細胞内のセカンドメッセンジャーの状態を細胞外インプットに連結する、モジュラーシグナル伝達系の成分である。これらの遺伝子および遺伝子産物は、疾患の潜在的な原因物質である。ロドプシン遺伝子およびV2バソプレッシン受容体遺伝子における特異的な欠陥は、様々な形態の常染色体優性および常染色体劣性の網膜色素変性症、腎性尿崩症を生じさせることが示されている。これらの受容体は、中枢神経系と末梢との両方の生理学的プロセスに非常に重要である。GPCRタンパク質スーパーファミリーは、今や、250を超えるタイプのパラログを含有し、このパラログは、すなわち、異なる種に由来する同一の受容体であるオルソログとは対照的に、遺伝子複製または他のプロセスによって生成する変異体に相当する受容体である。スーパーファミリーは、5つのファミリー、すなわち、ロドプシンおよびベータ2アドレナリン受容体に代表され、現在200を超える固有のメンバーに代表される受容体であるファミリーI、最近特徴付けされた副甲状腺ホルモン/カルシトニン/セクレチン受容体ファミリーであるファミリーII、哺乳動物における代謝調節型のグルタメート受容体ファミリーであるファミリーIII、キイロタマホコリカビD.discoideumの走化性および発生において重要なcAMP受容体ファミリーであるファミリーIV、ならびに、STE2などの真菌の交配フェロモン受容体であるファミリーVに分けることができる。GPCRには、生体アミンの受容体、炎症の脂質メディエーターの受容体、ペプチドホルモンの受容体、および感覚シグナルメディエーターの受容体が含まれる。GPCRは、この受容体がその細胞外リガンドに結合すると活性化される。リガンドと受容体との相互作用の結果生じる、GPCRにおける立体構造の変化は、GPCRの細胞内ドメインに対するGタンパク質の結合親和性に影響する。これは、GTPが高い親和性でGタンパク質と結合することを可能にする。GTPによるGタンパク質の活性化によって、Gタンパク質のαサブユニットとアデニル酸シクラーゼまたは他のセカンドメッセンジャー分子生成因子との相互作用が生じる。この相互作用は、アデニル酸シクラーゼの活性、ひいてはセカンドメッセンジャー分子であるcAMPの生産を調節する。cAMPは、他の細胞内タンパク質のリン酸化および活性化を調節する。あるいは、cGMPまたはエイコシノイドなどの他のセカンドメッセンジャー分子の細胞レベルは、GPCRの活性によって上方調節または下方調節され得る。Gタンパク質のaサブユニットは、GTPaseによるGTPの加水分解によって不活性化され、αサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットが再会合する。ヘテロ三量体Gタンパク質は次いで、アデニル酸シクラーゼまたは他のセカンドメッセンジャー分子生成因子から解離する。GPCRの活性はまた、細胞内および細胞外のドメインまたはループのリン酸化によって調節され得る。グルタメート受容体は、神経伝達において重要なGPCR群を形成する。グルタメートは、CNSにおける主要な神経伝達物質であり、神経可塑性、認知、記憶、学習、ならびにいくつかの神経学的障害、例えばてんかん、脳卒中、および神経変性における重要な役割を有すると考えられているWatson,S.およびS.Arkinstall1994TheG-ProteinLinkedReceptorFactsBook、AcademicPress、SanDiegoCA、pp.130~132。グルタメートのこれらの効果は、イオンチャネル型および代謝調節型と呼ばれる2つの異なるクラスの受容体によって仲介される。イオンチャネル型受容体は、固有の陽イオンチャネルを含有し、グルタメートの迅速な興奮作用を仲介する。代謝調節型受容体は、調整性であり、カルシウム依存性のカリウム伝導を阻害することおよびイオンチャネル型受容体の興奮性伝達を阻害および強化することによって、ニューロンの膜興奮性を増大させる。代謝調節型受容体は、アゴニストの薬理学およびシグナル伝達経路に基づいて5つのサブタイプに分類され、脳組織において広く分布している。血管作動性腸管ポリペプチドVIPファミリーは、その作用がGPCRによっても仲介される、関連するポリペプチドの群である。このファミリーの鍵となるメンバーは、VIP自体、セクレチン、および成長ホルモン放出因子GRFである。VIPは、平滑筋の弛緩、様々な組織における分泌の刺激または阻害、様々な免疫細胞活性の調節、ならびにCNSにおける様々な興奮活性および阻害活性を含む、広い生理学的作用プロフィールを有する。セクレチンは、膵臓および腸における酵素およびイオンの分泌を刺激し、脳においても少量で存在する。GRFは、成長ホルモンの合成および下垂体前葉からの放出を調節する重要な神経内分泌物質である上記のWatson,S.およびS.Arkinstall、pp.278~283。GPCRへのリガンドの結合の後、立体構造の変化はGタンパク質に伝わり、これによって、α-サブユニットが結合型GDP分子をGTP分子に交換し、βγ-サブユニットから解離する。α-サブユニットのGTP結合型形態は、典型的には、エフェクター調節部分として機能し、サイクリックAMP例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって、ジアシルグリセロール、またはイノシトールリン酸などの、セカンドメッセンジャーの生産をもたらす。βサブユニットおよびγサブユニットのさらに小さいプールと会合する、20を超える異なるタイプのα-サブユニットが当業者の間で知られている。哺乳動物のGタンパク質の例には、Gi、Go、Gq、Gs、およびGtが含まれる。Gタンパク質は、LodishH.ら、MolecularCellBiologyScientificAmericanBooksInc.、NewYork、N.Y.、1995において広く記載されており、その内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる。GPCRは、薬剤の作用および開発のための主要な標的である。実際、受容体は、現在知られている薬剤の半分超をもたらしておりDrews、NatureBiotechnology、1996、14:1516、GPCRは、治療的介入のための最も重要な標的であり、臨床的に処方された薬剤の30が、GPCRを拮抗または促進させるMilligan,G.およびRees,S.、1999TIPS、20:118~124。これは、これらの受容体が、治療標的としての、確立された、証明された歴史を有することを示す。通常、本発明の実施者であれば、その目的のポリペプチドを選択し、その正確なアミノ酸配列を理解するであろう。本発明に従って発現される任意の所与のタンパク質は、独自の特異な特徴を有し、培養された細胞の細胞密度または生存率に影響し得、また同一の培養条件下で成長した別のポリペプチドまたはタンパク質よりも低いレベルで発現され得る。当業者であれば、細胞の成長および/または任意の所与の発現したポリペプチドもしくはタンパク質の生産を最適化するために、本発明のステップおよび組成物を適切に修正し得るであろう。酵素薬学的作用物質および/または市販作用物質として効果的であることが示されている別のクラスのタンパク質には、酵素が含まれる。酵素は、それらが生産された細胞培養条件によって酵素活性が影響され得るタンパク質であり得る。したがって、本発明に従った、所望の酵素活性を有する酵素の生産はまた、特に興味深いものである。当業者であれば、培養中の細胞によって発現され得る多くの既知の酵素を理解するであろう。酵素の非限定的な例には、カルボヒドラーゼ、例えば、アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ナリンガナーゼ、ペクチナーゼ、およびプルラナーゼ;プロテアーゼ、例えば、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、フィシン、中性プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ例えば、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼ、レンネット、レンニン、キモシン、サブチリシン、サーモリシン、アスパラギン酸プロテイナーゼ、およびトリプシン;リパーゼまたはエステラーゼ、例えば、トリグリセリダーゼ、ホスホリパーゼ、前胃エステラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、イミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、およびペニシリンアシラーゼ;イソメラーゼ、例えばグルコースイソメラーゼ;酸化還元酵素、例えば、アミノ酸酸化酵素、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、グルコース酸化酵素、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、またはペルオキシダーゼ;リアーゼ、例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、フマラーゼ、またはヒスタダーゼ;トランスフェラーゼ、例えばシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ;リガーゼ;キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ラッカーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、ペクチン分解酵素、ポリフェノール酸化酵素、リボヌクレアーゼ、ならびにトランスグルタミナーゼが含まれる。遺伝子制御エレメント当業者には明らかなように、遺伝子制御エレメントは、ポリペプチドまたはタンパク質の遺伝子発現を調節するために用いることができる。このような遺伝子制御エレメントは、関連する宿主細胞において活性であるように選択されるべきである。制御エレメントは、構成的に活性であり得るか、または既定の状況下で誘導性であり得る。誘導性の制御エレメントは、発現したタンパク質が毒性であるかまたは細胞の成長および/もしくは生存率において別の有害な影響を有する場合、特に有用である。このような場合において、誘導性の制御エレメントを介するポリペプチドまたはタンパク質の発現の調節は、細胞の生存率、細胞密度、および/または発現したポリペプチドもしくはタンパク質の全収量を向上させ得る。本発明の実施において有用な多くの制御エレメントが当技術分野において知られており、利用可能である。本発明に従って用いられ得る、代表的な構成的哺乳動物プロモーターには、限定はしないが、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼHPTRプロモーター、アデノシンデアミナーゼプロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ベータアクチンプロモーター、および当業者に知られている他の構成的プロモーターが含まれる。さらに、真核細胞においてコード配列の構成的な発現を推進することが知られているウイルスプロモーターには、例えば、シミアンウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、パピローマウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルスHIVプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスCMVプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長い末端反復LTR、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、ならびに当業者に知られている他のウイルスプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターは、誘導物質の存在下での機能可能に連結しているコード配列の発現を推進し、同様に本発明に従って用いられ得る。例えば、哺乳動物細胞において、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下での下流コード配列の転写を誘導する。他の誘導性プロモーターは、当業者に認識され、かつ/または知られている。通常、遺伝子発現配列はまた、転写および翻訳の開始にそれぞれ関与する5非転写配列および5非翻訳配列、例えば、TATAボックス、キャップ配列、CAAT配列などを含む。エンハンサーエレメントが、発現されるポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルを増大させるために用いられてもよい。哺乳動物細胞において機能することが示されているエンハンサーエレメントの例には、Dijkemaら、EMBOJ.19854:761において記載されているようなSV40初期遺伝子エンハンサー、およびGormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA1982b79:6777において記載されているようなラウス肉腫ウイルスRSVの長い末端反復LTRに由来するエンハンサー/プロモーター、およびBoshartら、Cell198541:521において記載されているようなヒトサイトメガロウイルスが含まれる。制御エレメントをコード配列に連結するための系は、当技術分野において周知である一般的な分子生物学的技術および組換えDNA技術は、参照することによって本明細書に組み込まれる、Sambrook、Fritsch、およびManiatis、MolecularCloning:ALaboratoryManual、SecondEdition、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NY、1989において記載されている。発現のための好ましいコード配列を様々な成長条件および誘発条件下で様々な哺乳動物細胞に挿入するために適切な市販のベクターもまた、当技術分野において周知である。宿主細胞へのコード配列および関連する制御エレメントの導入目的のタンパク質の発現を達成するために十分な核酸を哺乳動物宿主細胞内に導入するために適切な方法は、当技術分野において周知である。例えば、参照することによって全て本明細書に組み込まれる、Gethingら、Nature、293:620~6251981;Manteiら、Nature、281:40~461979;Levinsonら;EP117,060;およびEP117,058を参照されたい。哺乳動物細胞では、形質転換の好ましい方法には、GrahamおよびvanderErb、Virology、52:456~4571978のリン酸カルシウム沈殿法、またはHawley-Nelson、Focus15:731193のlipofectamine商標GibcoBRL方法が含まれる。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の通常の態様は、1983年8月16日に発行された米国特許第4,399,216号においてAxelによって記載されている。哺乳動物細胞を形質転換するための様々な技術については、Keownら、MethodsinEnzymology1989、Keownら、MethodsinEnzymology、185:527~5371990、およびMansourら、Nature、336:348~3521988を参照されたい。哺乳動物細胞においてポリペプチドまたはタンパク質を発現させるために適切なベクターの非限定的な代表的な例には、pCDNA1;pCDOkayama、ら1985Mol.CellBiol.5:1136~1142を参照されたい;pMClneoポリAThomasら、1987Cell51:503~512を参照されたい;およびpAC373またはpAC610などのバキュロウイルスベクターが含まれる。好ましい実施形態において、ポリペプチドまたはタンパク質は、宿主細胞内に安定的にトランスフェクトされる。しかし、当業者には、本発明が一過的にまたは安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞と共に使用され得ることが理解されよう。発現したタンパク質の単離通常、典型的には、本発明に従って発現されたタンパク質またはポリペプチドを単離および/または精製することが望ましい。好ましい実施形態において、発現したポリペプチドまたはタンパク質は、培地内に分泌され、したがって、細胞および他の固体は、精製プロセスにおける第1のステップとして、例えば遠心分離または濾過によって除去され得る。本明細書において記載される方法および組成物によって細胞の生存率が増大するため、この実施形態は、本発明に従って用いられる場合に特に有用である。その結果、培養プロセスの間に死ぬ細胞が少なくなり、発現したポリペプチドまたはタンパク質の収量を減少させ得る可能性がある、培地内に放出されるタンパク質分解酵素が少なくなる。あるいは、発現したポリペプチドまたはタンパク質は、宿主細胞の表面に結合する。この実施形態において、培地は除去され、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する宿主細胞は、精製プロセスにおける第1のステップとして溶解される。哺乳動物宿主細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的崩壊および高pH条件への曝露を含む、当業者に周知の任意の数の手段によって達成され得る。ポリペプチドまたはタンパク質は、限定はしないがクロマトグラフィー例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル濾過、遠心分離、もしくは差次的溶解度、エタノール沈殿を含む、標準的な方法によって、またはタンパク質の精製のための任意の他の利用可能な技術によって、単離および精製することができる例えば、参照することによって全て本明細書に組み込まれる、Scopes、ProteinPurificationPrinciplesandPractice2ndEdition、Springer-Verlag、NewYork、1987;Higgins,S.J.およびHames,B.D.編、ProteinExpresssion:APracticalApproach、OxfordUnivPress、1999;ならびにDeutscher,M.P.、Simon,M.I.、Abelson,J.N.編、GuidetoProteinPurification:MethodsinEnzymologyMethodsinEnzymologySeries、Vol182、AcademicPress、1997を参照されたい。免疫アフィニティークロマトグラフィーでは、特に、タンパク質は、タンパク質を、そのタンパク質に対して作製され固定支持体に固定された抗体を含む、アフィニティーカラムに結合させることによって、単離することができる。あるいは、インフルエンザ外被配列、ポリヒスチジン、またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼなどのアフィニティータグを、標準的な組換え技術によってタンパク質に付着させて、適切なアフィニティーカラム上を通過させることによる容易な精製を可能にすることができる。フェニルメチルスルホニルフルオリドPMSF、ロイペプチン、ペプスタチン、またはアプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤を、任意のまたは全ての段階で添加して、精製プロセスの間のポリペプチドまたはタンパク質の分解を低減させるかまたはなくすことができる。プロテアーゼ阻害剤は、発現したポリペプチドまたはタンパク質を単離および精製するために細胞を溶解しなくてはならない場合に、特に望ましい。当業者には、的確な精製技術が、精製されるポリペプチドまたはタンパク質の特徴、ポリペプチドまたはタンパク質が発現する元の細胞の特徴、および細胞が成長する培地の組成に応じて変化することが理解されよう。医薬製剤本発明の特定の好ましい実施形態において、生産されたポリペプチドまたはタンパク質は、薬理学的活性を有し、医薬品の調製において有用である。上記の本発明の組成物は、対象に投与することができるか、または限定はしないが、非経口経路例えば静脈内経路、皮内経路、皮下経路、経口経路、経鼻経路、気管支経路、眼経路、経皮経路局所的経路、経粘膜経路、直腸経路、および膣経路を含む、任意の利用可能な経路による送達のために最初に製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、典型的には、哺乳動物細胞系から発現された精製されたポリペプチドまたはタンパク質、送達物質すなわち、上記の陽イオン性ポリマー、ペプチド分子輸送体、界面活性剤などを、薬学的に許容できる担体と組み合わせて含む。本明細書において用いられる場合、表現薬学的に許容できる担体には、薬学的投与に適合する、溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。補足的な活性化合物もまた、組成物内に組み込むことができる。医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤化される。非経口適用、皮内適用、または皮下適用に用いるための溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る:無菌の希釈剤、例えば注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒;抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン;抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム;キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸;緩衝液、例えばアセテート、シトレート、またはホスフェート;および張性を調整するための作用物質、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用のバイアル内に入れることができる。注射可能な使用に適切な医薬組成物は、典型的には、無菌水溶液水溶性の場合、または無菌の注射可能な溶液もしくは分散の即時調製のための分散および無菌粉末を含む。静脈内投与では、適切な担体には、生理食塩水、静菌性の水、CremophorEL商標BASF、Parsippany、NJ、またはリン酸緩衝生理食塩水PBSが含まれる。全てのケースにおいて、組成物は無菌であるべきであり、容易な注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。好ましい医薬製剤は、製造および保存の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなくてはならない。通常、関連する担体は、例えば水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど、および適切なその混合物を含有する、溶媒または分散媒質であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤を用いることによって、分散のケースでは所要の粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、維持することができる。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くのケースにおいて、組成物内に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続吸収は、組成物内に、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。無菌の注射可能溶液は、所要の量の精製されたポリペプチドまたはタンパク質を、上記に列挙された成分の1つまたは組み合わせを有する適切な溶媒内に組み込み、必要に応じて、その後濾過滅菌することによって、調製することができる。通常、分散は、哺乳動物細胞系から発現された精製されたポリペプチドまたはタンパク質を、基本分散媒質および上記に列挙されたもののうちの所要の他の成分を含有する無菌の媒体内に組み込むことによって、調製される。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌の粉末のケースでは、好ましい調製方法は、活性成分と任意のさらなる所望の成分との粉末を、事前に滅菌濾過されたその溶液からもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。経口組成物は通常、不活性の希釈剤または食用担体を含む。経口的な治療的投与の目的では、精製されたポリペプチドまたはタンパク質は、賦形剤と共に組み込むことができ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で用いることができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして用いるために、流体担体を用いて調製することができる。薬学的に適合可能な結合剤および/またはアジュバント材料は、組成物の一部として含めることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含有し得る:結合剤、例えば、微晶質セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチン;賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Primogel、もしくはトウモロコシデンプン;潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロート;流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素;甘味料、例えば、ショ糖もしくはサッカリン;または香料、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料。経口送達のための製剤は、胃腸管内での安定性を向上させるため、および/または吸収を増強させるための作用物質を、有利に組み込み得る。吸入による投与では、哺乳動物細胞系から発現された精製されたポリペプチドまたはタンパク質および送達物質を含む本発明の組成物は、好ましくは、適切な推進剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で送達される。本発明は、経鼻スプレー、吸入器、または上気道および/もしくは下気道への他の直接的な送達を用いる、組成物の送達を特に検討する。インフルエンザウイルスに対するDNAワクチンの鼻腔内投与は、CD8T細胞応答を誘発することが示されており、このことは、気道における少なくともいくつかの細胞が、この経路によって送達された場合のDNAを取り込み得ること、および本発明の送達物質が細胞の取り込みを増強することを示す。本発明の特定の実施形態に従うと、哺乳動物細胞系から発現された精製されたポリペプチドおよび送達物質を含む組成物は、エアロゾル投与のための大きな多孔性粒子として製剤化される。全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によるものであり得る。経粘膜投与または経皮投与では、浸透される障壁に対して適切な浸透剤が、製剤において用いられる。このような浸透剤は、通常、当技術分野において知られており、これには、例えば、経粘膜投与では、洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤の使用を介して達成され得る。経皮投与では、精製されたポリペプチドまたはタンパク質および送達物質は、当技術分野において一般的に知られているように、軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリーム内に製剤化される。組成物はまた、直腸への送達のために、坐剤例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を伴うまたは停留浣腸の形態で調製することができる。一実施形態において、組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系を含む制御放出製剤などの、身体からの迅速な除去からポリペプチドまたはタンパク質を保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤を調製するための方法は、当業者に明らかであろう。材料はまた、AlzaCorporationおよびNovaPharmaceuticals,Inc.から商業的に得ることができる。リポソーム懸濁液ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染細胞に標的化されたリポソームを含むもまた、薬学的に許容できる担体として用いることができる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号において記載されているような、当業者に知られている方法に従って調製することができる。投与の容易性および投与の均一性のために、経口組成物または非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが有利である。本明細書において用いられる投与単位形態は、治療される対象のための単位投与量として適した物理的に個別の単位を言い、各単位は、所要の薬学的担体を伴って、所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性なポリペプチドまたはタンパク質を含有する。本発明に従って発現するポリペプチドまたはタンパク質は、様々な間隔で、必要に応じた異なる期間にわたり、例えば、1週間に1回、約1から10週間の間、2から8週間の間、約3から7週間の間、約4週間、5週間、または6週間などにわたり、投与することができる。当業者には、限定はしないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全体的健康および/または年齢、ならびに存在する他の疾患を含む、特定の因子が、対象を効果的に治療するために必要な投与量およびタイミングに影響し得ることが理解されよう。通常、本明細書において記載されるポリペプチドまたはタンパク質での対象の治療は、単一の治療を含み得、または多くのケースにおいて、一連の治療を含み得る。適切な用量が、ポリペプチドまたはタンパク質の効能に応じ得ること、および場合により、例えば事前に選択された所望の応答が達成されるまで用量を増大させていく投与を介して、特定のレシピエントに合わせられ得ることが、さらに理解される。任意の特定の動物対象のための特定の用量レベルが、採用される特定のポリペプチドまたはタンパク質の活性、対象の年齢、体重、全体的健康、性別、および食餌、投与の時間、投与経路、排出速度、薬剤の任意の組み合わせ、ならびに調節される発現または活性の程度を含む、様々な因子に応じ得ることが理解される。本発明は、非ヒト動物を治療するための本発明の組成物の使用を含む。したがって、投与の用量および方法は、獣医学的な薬理学および医学の既知の原則に従って選択することができる。ガイダンスは、例えば、Adams,R.編、VeterinaryPharmacologyandTherapeutics、8thedition、IowaStateUniversityPress;ISBN:0813817439;2001において見ることができる。本発明の医薬組成物は、投与のための指示と共に、容器、パック、またはディスペンサー内に含めることができる。先の記載は、代表的なものにすぎず、限定するものではないと理解される。本発明を実行するための代替的な方法および材料、ならびにまたさらなる適用は、当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲に含まれるものである。実施例1インスリン不含培地への適合この実施例は、様々な細胞系が、例えば、インスリン、他の成長因子、および/または任意のタンパク質成分を実質的に欠く培地における多くの継代を介して、インスリン不含培地に適合され得ることを実証する。いくつかのケースにおいて、細胞は、適合培養の開始時にインスリン不含としてもよい。いくつかの実施形態において、細胞系は、同時に無血清およびインスリン不含に良好に移すことができる。いくつかのケースにおいて、細胞を無血清であるがインスリンを含有する培地において最初に成長させ、その後、インスリン不含培地に移すことが望ましい場合がある。他の成長因子不含培地に細胞を適合させるために、類似の方法を用いることができる。例示的な適合実験の設計を、図1において説明する。具体的には、凍結された細胞ストックを、無血清培地/インスリン不含培養内に直接的に解凍することができる適合プロセス1。あるいは、細胞を、無血清であるがインスリンを含有する培養において最初に2週間にわたり成長させ、次いで、インスリン不含培養に移すことができる適合プロセス2。インスリン含有培養において成長した細胞は、対照として用いられる。典型的には、高い播種密度が、適合プロセスにおける継代のために用いられる。図2において示されるように、抗体1を生産するクローン細胞系を、適合プロセス1または2を用いて適合させた。対照細胞を、インスリン含有培養において成長させた。3つ全ての細胞培養は、約32世代での解凍から開始し、安定性の終了EOSに達する前に、約135世代にわたって成長させた。細胞の生産性Qp、pg/細胞/日を、細胞培養物プロセス全体にわたり時々測定し、図2に示す。両方のインスリン不含培養物が、類似のおよび安定な成長レベルおよび生産性レベルを有していた。対照細胞は、培養プロセスの間の不安定性の兆候を示した。別の実施例を図3に示す。ナノボディ1を生産するクローン細胞系を、適合プロセス1または2を用いて適合させた。対照細胞を、インスリン含有培養において成長させた。3つ全ての培養は、約32世代での解凍から開始し、EOSの前に、約150世代にわたって成長させた。細胞の生産性Qp、pg/細胞/日を、細胞培養物プロセス全体にわたり時々測定し、図3に示す。インスリンを有する培養または有さない培養で、大きな差は観察されなかった。細胞は、様々な時点で、塊状であり、分厚いものであった。全体として、細胞系は、インスリン不含培地内に良好に移された。さらなる例示的な適合結果を、図4~7に示す。これらの結果の全てが、様々な細胞系が、高い生存率、成長速度、および生産性を伴って、インスリン不含培養における成長にうまく適合され得ることを実証する。今までのところ、抗体、融合タンパク質、およびナノボディを発現する10を超える細胞系が、インスリン不含培養にうまく適合されている。実施例2成長因子の再添加を伴うフェドバッチ生産培養多くのインスリン不含適合細胞を、成長、生存率、または生産性に対する負の影響をほとんどから全く有さないフェドバッチ培養において試験した。この実施例において記載される実験は、驚くべきことに、成長因子不含培地に馴化または適合された細胞が、成長因子依存性培養または完全に成長因子不含の細胞培養と比較して、生産培養における成長因子の再添加に対してさらに応答性であり、さらに増強した成長および生産性を示すことを示した。実験1良好に適合された細胞は、フェドバッチ培養または他のタイプの生産培養を行うために用いることができる。典型的には、決定ポイントは、2週間ごとである。細胞が良好な成長および生存率を示す場合、細胞を適合培養から採取し、フェドバッチに入れることができる。この実験において、インスリン不含適合細胞および対照細胞は、フェドバッチ培養を行うために、適合培養から、DCB細胞バンクの作製、Mid1培養時点1の中間、Mid2培養時点2の中間、およびEOS培養時点の安定性の終了で採取される。この実験において、フェドバッチの基本培地は、10mg/Lのアミノ酸およびインスリンを補給した培地A基本培地を含有していた。140mg/Lのインスリンを含有する培地Bを、流加培地として用いた。細胞を、15mLの培養容積において成長させた。1.5e6個細胞/mLの播種密度を用いた。pHを、温度変更後7日目および9日目に調整した。4日目5、7日目4、および9日目3に補給流加を行った。2つの細胞系ナノボディを発現する細胞系1およびモノクローナル抗体を発現する細胞系2をこの実験において用いた。生存細胞密度、生存率、累積積分生存細胞密度aIVCD、特異的生産性、力価、栄養利用、および代謝廃棄物の蓄積についての例示的な結果を、図8~21に示す。この実験において、生存細胞密度は、GuavaCellCounterによって測定した。aIVCDは、培養過程にわたる生存細胞の平均密度を決定して、それに、培養を行った時間量をかけることによって測定した。特異的生産性は、所与の量の培地容積において細胞培養物によって生産された組換えによって発現したタンパク質の全量を決定することによって測定した。力価は、ForteBioOctet機器を用いる干渉法によって測定した。栄養利用および代謝廃棄物の蓄積レベルは、細胞培養培地におけるグルコース、ラクテート、グルタメート、グルタミン、アンモニウム、ナトリウム、またはカリウムの濃度を検出することによって測定した。結果は、適合プロセスの間のDCBからEOSから採取された適合細胞から開始したフェドバッチ培養において最小の差が見られたことを示す。重要なことに、インスリン不含適合細胞からの培養物は、高い細胞密度のフェドバッチプロセスに置かれた場合、適合していない細胞での対照培養物と比較して、2倍~3倍の力価をもたらした。インスリン不含適合細胞からの培養物はまた、さらに高いIVCD例えば、完全にインスリン不含の生産に対して50の平均増大、および既存のインスリン依存性プラットフォームに対して30の平均増大を有していた。インスリン不含適合細胞からの培養物はまた、インスリン依存性細胞と比較した場合、栄養利用における差を示した。例えば、インスリン不含適合細胞の培養物は、より多くのグルコースを利用した。実験2この実験は、フェドバッチ培養における様々な濃度のインスリンおよびLR3合成IGF-1の再添加を試験するために設計された。この実験において、培地Cを基本培地として用い、培地Bを流加培地として用いた。標的播種密度は、0.5×106個細胞/mLであった。pHを、温度変更後7日目、9日目、または11日目に調整した。補給流加を、4日目、7日目、および9日目に培養物に添加した。50グルコースを、必要に応じて、培養物に流加した。細胞は、15mLの培養において成長させた。ノボインスリンまたはLR3合成IGF-1をインスリン不含基本培地および/または流加培地内に補給して、培地ロットが全実験で同一となるようにした。基本培地および/または流加培地において用いられる様々な濃度のインスリンおよびLR3を、表1にまとめる。この研究は、濃度範囲発見の調査のため、および、以下の因子、基本インスリン、基本LR3成長因子、流加インスリン、流加LR3成長因子を試験するために設計された。完全にインスリン不含の培養である条件1を、ベースライン対照として用いた。条件2は、インスリン依存性のプラットフォーム対照であった。50グルコースを、11日目に、条件4の下で培養された細胞に5g/Lで流加した。この実験において用いられた細胞は、モノクローナル抗体を発現する。収集されたエンドポイントには、GUAVA、pH、代謝分析NOVA、Osmo、力価Octet、インスリン、エルマン、生成物の質例えば、SEC、N-グリカンが含まれた。例示的な結果を、図22~32に示す。結果は、陽性対照条件2が歴史的データに対して同等なプロフィールを示すことを示した図22。インスリン不含ベースライン条件1と比較した場合、さらに高いaIVCDが全ての培養物において観察された図23。完全にインスリン不含の条件は、回収物の最低の生存率および密度を有する条件1図24。生存率は、非常に低いインスリン濃度例えば、条件3=0、0、0.165、0で負の影響を受け得る。全ての条件におけるグルコースレベルが許容できたが、全体として、14日目の回収物によって使い果たされた図25。ラクテートの変更は、ほとんどの条件において見られた図26。インスリンまたはLR3を戻し入れることによって、容積生産性が有意に向上する図27。インスリン不含適合細胞の特異的細胞生産性は、インスリン依存性の対照細胞のものと比較して増大している図28。実験3この実験において、モノクローナル抗体を発現する適合細胞を、インスリンまたはLR3の再添加を伴うフェドバッチにおいて培養した。この実験において、適合培地は10mg/Lのインスリンを含有し、基本培地は10mg/Lインスリンを含有し、流加培地は165mg/Lのインスリンを含有していた。培地が流加当たり培養物中50ng/mLの濃度で分けられるように、LR3合成IGF-1を流加培地に補給した。力価およびエルマンシグナルついての例示的な結果を、図33および34に示す。最も高い力価は、インスリン不含適合細胞に、生産におけるインスリンまたはLR3を足したものにおいて見られた図33。LR3の再添加を伴うインスリン不含適合細胞を用いる生産培養において、エルマンシグナルは存在しなかった図34。エルマンアッセイは、細胞培養培地における遊離スルフヒドリル基を測定する。エルマンシグナルの低減は、遊離スルフヒドリル基の量の低減を示す。したがって、インスリン不含適合細胞培養物は、対照細胞と比較して、細胞培養培地のエルマン測定における増大の遅延を示し、このことは、培地における遊離スルフヒドリル基のレベルがさらに低いことを示す。通常、理想的なパフォーマンスは、インスリン不含適合培養にLR3をプラスしたもので見られた。これは最大の14日目の力価、細胞の生産性Qp、および積分生存細胞密度IVCDを有する。生存率は、14日目を経て85超に維持された。エルマンシグナル上昇の遅延が生じ、後期のラクテート生産は観察されなかった。インスリン不含適合培養にインスリンをプラスしたものは、LR3を有するインスリン不含培養と同等の力価、Qp、およびIVCDを有する。エルマンの上昇は、プラットフォームインスリン濃度で遅延した。最良の成長は37°Cであった。インスリンを有さないインスリン不含適合培養は、低いIVCDを伴う、37°Cでの最も遅い成長を示した。これはまた、初期のエルマンシグナルの上昇も有している。実験4この実験は、補給流加を伴うLR3の再添加をさらに試験するために設計された。標準的なpH調整されたフェドバッチを用いた。培地C/-インスリンを基本培地として用いた。培地B/-インスリンを流加培地として用いた。LongR3を、補給流加と共に、50ng/mLの低レベルまたは150ng/mLの高レベルで添加した。0.7e6個細胞/mLおよび1.5e6個細胞/mLの2つの播種密度を用いた。pHを、試料に対する温度変更後7日目、9日目、および11日目に調整した。この実験において用いられる細胞は、モノクローナル抗体を発現する。積分生存細胞密度、生存率、力価、特異的生産性、エルマンシグナルを説明する例示的な結果を、図35~39に示す。要するに、インスリンを伴って通常どおり継代し、その後フェドバッチ内に置いた、対照培養物は、予想通り機能した。インスリン不含培地に適合していない培養物は、インスリンを有さないフェドバッチ内に置かれると、あまり機能しなかった。インスリンを戻し入れると、生産の向上が示された。LongR3の添加は、培養物の成長を促進した。実験5この実験は、インスリンが基本培地または流加培地においてさらに効果的であるかどうかを試験するため、およびどれだけ低いインスリンを用いることができるかを知るために設計された。基本培地/-インスリンは、アミノ酸を補給した培地A基本培地を含有していた。培地Bを流加培地/-インスリンとして用いた。本発明者らは、4つの基底インスリンレベル0、0.2、1、10mg/Lおよび5つの流加インスリンレベル0、0.165、1.65、16.5、140mg/Lを試験した。この実験において培養された細胞は、モノクローナル抗体を発現する。力価に対する例示的な結果を図40に示す。確認されるように、基本に戻し入れられたインスリンは、この実験においてさらに効果的であった。細胞はまた、インスリンレベルに対するある程度の用量応答を示した。実験6この実験は、基本培地および/または流加培地における追加のインスリン濃度レベルを試験するために設計された。基本培地/-インスリンは、アミノ酸を補給した培地A基本培地を含有していた。培地Bを流加培地として用いた/-インスリン。細胞は、15mLの培養容積で成長させた。標的播種密度は、1.5e6個細胞/mLであった。pHを、温度変更後7日目、9日目、および10日目に調整した。補給流加を、4日目5、7日目4、および9日目3に行った。Fc融合タンパク質を発現する細胞系1、ナノボディを発現する細胞系2、モノクローナル抗体を発現する細胞系3および4を含む、4つの異なる細胞系をこの実験において培養した。以下の条件を試験した。例示的な結果を、図41~54に示す。結果は、力価における有意な増大が、異なる細胞系においてインスリンをインスリン不含適合培養物に戻し入れた場合に見られることを示した。インスリンを戻し入れたインスリン不含適合培養物はまた、IVCDの増大を示した。成長および力価の平均増大は、完全にインスリン不含の培養物と比較して約50である。0.2mg/Lと低い基本培地におけるインスリンレベルは、細胞の成長および生産性を増強させた。実施例3Design-Expertを用いる最適化フェドバッチ培養の条件をさらに最適化するために、Design-Expert登録商標7.0.1ソフトウェアStat-Ease,Inc.を用いた。Design-Expert登録商標は、様々な特徴付けステップからの歴史的データを用いて細胞培養パラメータの最適範囲を設計する、ソフトウェアパッケージである。典型的には、このような研究のタイプは、応答表面歴史的データとして知られている。設計モデルは、誘導二次方程式として知られている。Design-Expert登録商標は、範囲発見調査のために用いられ、試験因子は、基本インスリン、基本成長因子、流加インスリン、および流加成長因子などであった。典型的には、以下の所望の基準が用いられる:基本インスリン=最少化基本成長因子=ゼロに等しい流加インスリン=最少化流加成長因子=ゼロに等しい力価=最大化Qp=最大化エルマン=最大化エルマンがベースラインを超える培養日図55および56は、Design-Expert登録商標ソフトウェアを用いる分析によって作成された例示的なヒートマップを示し、これは、基本培地B、X軸および流加培地C、Y軸における様々なインスリン濃度で成長した細胞培養物における、予測された所望の結果を示す例えば、図56における力価。図56において示されるように、最高力価の予測は赤で示され、一方、最低力価の予測は青で示される。図56は、フェドバッチ培養の基本培地において補給される約2mg/Lという少ないインスリンを用いて、および流加培地においてインスリンを伴わずに、所望の細胞培養結果例えば、高い力価を得ることが可能であり得ることを説明する。同等物当業者であれば、ただの通常の実験、本明細書において記載される本発明の具体的な実施形態の多くの同等物を用いることを認識するか、または確認し得よう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されるものではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲に説明される。特許請求の範囲において、1つのa、1つのan、およびそのtheなどの冠詞は、逆の指示がない限り、または文脈から別段のことが明らかでない限り、1つまたは2つ以上を意味し得る。群の1つまたは複数のメンバーの間にまたはを含む請求項または記載は、逆の指示がない限り、または文脈から別段のことが明らかでない限り、群のメンバーの1つ、2つ以上、または全てが、所与の生成物もしくはプロセス内に存在する、採用される、または別の形で関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、群の正確に1つのメンバーが所与の生成物もしくはプロセス内に存在する、前記生成物もしくはプロセスにおいて採用される、または前記生成物もしくはプロセスに別の形で関連する実施形態を含む。本発明は、群のメンバーの2つ以上または全てが所与の生成物もしくはプロセス内に存在する、前記生成物もしくはプロセスにおいて採用される、または前記生成物もしくはプロセスに別の形で関連する実施形態を含む。さらに、本発明が、列挙された請求項の1つまたは複数からの1つまたは複数の限定、要素、箇条、記述用語などが別の請求項内に導入されている、全ての変型、組み合わせ、および順列を包含することが理解される。例えば、別の請求項に従属している任意の請求項は、同一の基本請求項に従属している任意の他の請求項において見られる1つまたは複数の限定を含むように修正され得る。要素が列挙として存在している場合、例えば、マーカッシュ群形式では、要素の各サブグループもまた開示されており、1つまたは複数の任意の要素が群から除去され得ることが理解される。通常、本発明または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと言及されている場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様が、このような要素、特徴などから構成されるか、またはこれらから基本的に構成されることが理解される。単純化の目的で、これらの実施形態は、本明細書においてこの通りの言葉で具体的に説明されてはいない。用語含むcomprisingが非限定的なものであり、さらなる要素またはステップを含めることを許容することに留意されたい。範囲が与えられている場合、エンドポイントが含まれる。さらに、別段の指示がない限り、または文脈および当業者の理解から別段のことが明らかでない限り、範囲として表されている値は、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、本発明の異なる実施形態における言及された範囲内の任意の具体的な値または部分的範囲を、前記範囲の下限の10分の1単位まで推測し得る。さらに、先行技術に当てはまる本発明の任意の特定の実施形態が、請求項の任意の1つまたは複数から明確に除外され得ることが理解される。このような実施形態は当業者に知られていると見なされるため、これらは、除外が本明細書において明確に説明されていなくても、除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態例えば、任意の標的化部分、任意の疾患、障害、および/または症状、任意の結合剤、任意の投与方法、任意の治療用途などが、任意の理由で、先行技術の存在に関連しているか否かに関わらず、任意の1つまたは複数の請求項から除外され得る。上記およびテキスト全体にわたって論じられる刊行物は、本願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書における何物も、本発明者らが先行の開示に基づいてこのような開示に先行する権利を有していないということを承認するものとしては解釈されない。参考文献の組み込み本願において引用される全ての刊行物および特許文献は、それぞれの個別の刊行物または特許文献の内容が本明細書に組み込まれるかのように同程度に、参照することによってその全体が組み込まれる。"