"式1Aの化合物。本質的に非親油性である、請求項1に記載の化合物。前記化合物が、比色センサーであり、生細胞が生存可能な染色剤として有用である、請求項1に記載の化合物。前記生細胞が、原核細胞および真核細胞から選ばれる、請求項3に記載の化合物。使用される原核細胞が、バチルス属種およびシュードモナス属種である、請求項3に記載の化合物。使用される真核細胞が、酵母菌サッカロミセスセレビシエである、請求項3に記載の化合物。i.300~600rpm毎分回転数の速度の穏やかな撹拌下で、25~30°Cの範囲の温度にて、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンを溶媒に溶解すること;ii.工程iで得られた溶液を2~5°Cの範囲の温度で氷中に維持すること;iii.工程iiで得られた溶液に、トリエチルアミン塩基を、0.5~1.0mL/分の速度で、300~600rpmの速度の穏やかな撹拌下で加えること;iv.工程iiiで得られた溶液に、別途調製したテトラヒドロフラン中の4-4’-ジメチルアミノ-フェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドの溶液を、15~60mL/時の範囲の速度で、0~5°Cの範囲の温度で加えること;v.工程ivで得られた混合物を、25~30°Cの温度範囲で、5~10時間の範囲の期間撹拌すること;vi.工程vで得られた混合物を、20~60分の範囲の期間、65~70°Cの範囲の温度で還流させること;vii.工程viで得られた混合物をろ過して、リガンドの析出物を分離すること;viii.工程viiで得られたリガンドの析出物を洗浄し乾燥すること;ix.工程viiiで得られたリガンドを、20~25°Cの範囲の温度でアルコールに溶解すること;x.工程ixで得られたリガンドの溶液に、硝酸亜鉛溶液リガンドの0.3~0.8モル当量を、20~25°Cの範囲の温度で加えること;xi.工程xで得られた溶液を、20~25°Cの範囲の温度で、12~24時間の範囲の期間撹拌すること;xii.工程xiで得られた溶液を、10~20°Cの範囲の温度で、2~5時間の範囲の期間激しくかき混ぜること;xiii.工程xiiで得られた析出物を、クロロホルムでろ過し洗浄して式1Aの化合物を得ること、という工程を含む、式1Aの化合物の調製方法。工程iにおいて、使用される溶媒が、クロロホルム、メタノール、ジクロロメタン、およびテトラヒドロフランTHFからなる群から選ばれる、請求項7に記載の方法。工程ixにおいて、使用されるアルコールが、メタノールおよびエタノールから選ばれる、請求項7に記載の方法。a.iグルコース酵母抽出物寒天GYE培地中でサッカロミセス属種MTCC5548、iiニュートリエントブロス中でバチルス属種MTCC5549、およびiiiキングB培地中でシュードモナス属種MTCC5550を、30~40°Cの範囲の温度で、6~36時間の範囲の期間培養すること;b.工程aの細胞を、式1Aの化合物0.6×104~1.2×104Mと共に、28~38°Cの温度範囲で、5~20分の範囲の期間インキュベーションすること;c.工程bで得られたインキュベーションされた試料を、グルテルアルデヒドを用いて、7.4~7.6の範囲のpHの緩衝液中で、10~12時間の範囲の期間、28~38°Cの範囲の温度で固定すること;d.工程cで得られた試料を、前記緩衝液で、0.5~1.0時間の範囲の期間洗浄すること;e.工程dで得られた試料を、四酸化オスミウムおよび緩衝液で後固定し、前記緩衝液で洗浄すること;f.勾配をつけた水エタノール系により、工程eで得られた試料から水を除去すること;g.前記緩衝液中で工程fで得られた試料をすすぎ、スパッタコーター中で金でコーティングして、単純顕微鏡下で見える染色された標本を得ること;h.異なる色強度および染色細胞の形で生細胞を区別することを含む、請求項1に記載の化合物を用いた生細胞の染色方法。使用される緩衝液がリン酸緩衝液である、請求項10に記載の方法。センサーと生細胞との結合が、走査電子顕微鏡SEM分析により確認される、請求項10に記載の方法。染料で染色した後の細胞の生存能が、細胞分裂の発生を示す凹面スライドにおけるハンギングドロップ法によって試験微生物における二分裂を観察することにより証明される、請求項10に記載の方法。式1Aの化合物の可逆的結合が、光学顕微鏡およびUV-Vis分光法を介して、クエン酸ナトリウムの20w/v溶液で細胞を脱染することにより確認される、請求項10に記載の方法。式1Aの化合物による生細胞の染色が、生細胞の細胞壁上に存在するATPとセンサーとのヘプタ配位種の形成ここで3個のリン酸基はZnと配位し、得られる31PNMRは3個のリン原子すべてに関してシフトするにより行われる、請求項10に記載の方法。式1Aの化合物の吸収スペクトル滴定曲線が、ATPの添加後に40nmのスペクトルシフトを示し、ATPとの化合物の結合定数が、978±4M1である、請求項10に記載の方法。水における式1Aの化合物の溶解性が、α-CDシクロデキストリンの存在下で、約7~7.5倍増加する、請求項1に記載の式1Aの化合物。ZnIIに基づいた比色センサーL.Znの吸収極大がα-CDシクロデキストリンの水溶液を加えると5nmシフトする傾向があることを示すことにより、式1Aの化合物の染色の強度がα-CDシクロデキストリンの存在下で増加する、請求項1に記載の式1Aの化合物。式1Aの化合物による染色は10~20分で行われ、α-CDシクロデキストリンの存在下では1秒~2分で行われることにより、α-CDシクロデキストリンの存在下で式1Aの化合物の染色の速度が増加すること示す、請求項10に記載の方法。染料の無いサッカロミセス属種の細胞表面のSEM画像はなめらかであると認められたが、染料の存在下でのサッカロミセス属種の細胞表面は粗いと認められた、請求項10に記載の方法。染料の無いグラム陽性菌のSEM画像はなめらかであると認められ、染料を有するものは粗いと認められた、請求項10に記載の方法。染料の無いグラム陰性菌のSEM画像はなめらかであると認められ、染料を有するものは粗いと認められた、請求項10に記載の方法。グラム陽性菌の染色された細胞は、染色されたグラム陰性菌のものと比較して長く見えた、請求項10に記載の方法。AikoNonakaらOrg.Biomol.Chem.2008,6,3621の論文を参照すると、ここでは、水溶液中における多リン酸の蛍光検出用の新規な手法が記載されている。ZnII-DPADPA=ジピコリルアミン-付加フェニルボロン酸は、アリザリン染料と共にアセンブリを形成し、この中では、当該染料が、ZnII-DPA部分における配位亜鉛IIと結合しやすいことが開示されている。推定分析物としてピロリン酸PPiを加えることによって錯体が再編成され、代替のボロン酸エステルアセンブリが産生され、これは、肉眼で検出可能な蛍光の増加をもたらす。当該システムが、他のリン酸と比べてPPi選択性を示したことは興味深いことである。このシステムの欠点は、彼らは、様々なリン酸と結合し、一種類のリン酸に選択的に結合するものではないセンサーを見出したので、したがってこれはATPに対して選択的なセンサーではない。<本発明のZnIIに基づいた比色センサーL.Znスキーム1、式1AとAnal.Chem.2008,80,5312~5319およびOrg.Letts.2007,9,1979~1982に記載のZnIIに基づいた比色センサー1.Znスキーム1bとの比較>本発明者らの過去の論文OrganicLetters,2007,Vol.9,No.10,1979~1982およびAnal.Chem.2008,80,5312~5319に記載のZnIIに基づいた錯体[1.Znスキーム1b]は、本発明に記載の[L.Znスキーム1、式1A]とは異なる。これらの2つの論文で報告した所見は、実用化され得る染色剤はいずれも、水溶液に完全に可溶性でなければならないので、1.Znは、純粋な水溶液における有用性の面では重大な欠点を有することを示した。1.Znは、水に不溶性であり、これを可溶化するためには一定量のアルコールを使用しなければならず、その後にこの試薬のこのアルコール溶液を染色目的に使用することができる。しかしながら、当該錯体は、原核細胞および真核細胞に毒性が無いことが分かったが、アルコールの使用は、生体に対するある程度の副作用がある場合があるので望ましくないかあるいは実際の細胞染色実験には許容されなかった。本発明は、この問題を克服することができた。本特許出願では、我々は、式1Aの、ZnIIに基づいた別の錯体L.Znを報告し、これは、肉眼で検出することができる関連する色の変化を伴ってATPに結合することができる。この新規な試薬は水に完全に可溶性であり、したがって、細胞染色実験に関する任意の実用用途に適しており、かつ最もふさわしいものである。さらに、ATPに結合すると、この錯体の吸収極大は、40nm463nmから503nmまでシフトし、これは、我々が過去の論文で報告した試薬1.Znと比較して、より特徴的かつより鮮明な色の変化をもたらした。我々の過去の試薬1.Znでは、シフトは、エタノール-水性緩衝液中でわずかに21nmであった。本発明のZnII-錯体L.Zn本特許出願で報告のの40nmというより大きなシフトは、スペクトル測定には極めて重要であり、したがって、細胞増殖動態研究には極めて重要である。さらに、適切なセンサーは、至適な結合定数値を有することが望ましい。本特許出願で報告の本発明のZnII-錯体の結合定数は、我々が過去に報告した1.Znの1130±6M1よりも低い978±4M1である。これにより、過去に報告したZnII-錯体1.Znと比較して、このセンサーはより可逆的にATPに結合することができる。より重要なことには、このZnII-試薬のより高い溶解度は、α-シクロデキストリンα-CD図8ではa=L.Znのみ、b=L.Znα-CDの使用を介して達成することができる。α-CDの存在下では、図8に見られるように、α-CDを加えることにより、水溶液中のL.Znの溶解度は増加し、より多量のL.Znが溶液に移ることを示す色強度が増加する。このような所見は、過去の試薬1.Znについては報告されなかった。α-CDの使用は、薬物担体としては一般的であり、生細胞に対して完全に無毒であることが知られている。したがって、ZnII-錯体本特許出願で報告のと組み合わせたα-CDの使用は、より高濃度でのこのセンサー分子の使用機会を提供し、これはより良好な色の変化の達成図13、D1はα-CDを使用せず、D2はα-CDを使用、および生細胞のより迅速な染色に役立つことができる。α-CDの存在下で本発明のZnII-試薬L.Znを用いると、2分間のみのインキュベーションで真核および原核グラム陽性/グラム陰性細胞を染色できるが;過去の試薬1.Znでは、発色には細胞を10分間インキュベーションする必要があった。さらに、染色細胞本発明のZnII-錯体を使用の色強度は、過去に報告したものと比較して、はるかに強かった。これは、構造変動によってのみ達成され得るものである1.Znで報告したようなビスピコリルアミンに代わり、本発明の研究のアザ大環状リガンドの使用スキーム1b。本発明のZnII-錯体は、CTPと比較して、ATPに対して、より選択性があることが分かり、CTPに伴う色変化はほぼ無視され得るものである図2a。合成のばらつき:合成法によって、過去に報告したZnII-錯体1.Znの合成に使用したリガンドは、ジピコリルアミンと4-4-ジメチルアミノ-フェニルアゾベンゼンスルホニルクロリド1:1.05モル当量とを0°Cで反応させることにより合成して最もよい収率を達成した。本発明のリガンドLの合成のため、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンを4-4’-ジメチルアミノ-フェニルアゾベンゼンスルホニルクロリド1:1モル当量と室温30°Cで10時間反応させ、次いで1時間還流させた。4-4-ジメチルアミノ-フェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドの濃度を増加させる試みはいずれも、複数の生成物および不純物を生じることになり、これらの不純物を除去することは非常に困難であった。さらに、反応温度も、妥当な収率を達成するためには極めて重要である。0°Cでの反応では、本発明の研究で所望される生成物の収率が非常に低くなる。さらに、本発明の研究では、ZnII-錯体の精製未反応の有機試薬の除去は、CHCl3を用いた洗浄により達成され、これは、当該有機溶媒におけるその溶解性がより高いので過去の研究では可能ではなかった。この精製工程は、所望のZnII-錯体L.Znの精製を非常に容易にし、最も純粋な形態でのその単離に役立った。さらに、過去の複合体1.Znにおける中心のZnIIは、ビスピコシルアミン官能基の3個の窒素原子に配位し、これが、中心のZnIIに対する3個のリン酸酸素の結合の可能性を制限する。本発明の系L.Znでは、テトラアザ大環状部分の4個のN原子が、中心のZnIIに結合し、配位するN-原子の面より上にZnII-イオンがとどまり、これが、中心のZnIIに対する3個のリン酸O-原子の配位に役立ちスキーム1a、最終的に、ATPに結合した際のより良いスペクトル変化および可視的な色の変化をもたらす。本発明のセンサー分子L.Znの応用可能性および過去に報告した分子1.Znの限界:このタイプの比色センサー分子は、嚢胞性線維症についての研究に非常に有用であり得る。というのも、これがその場で産生されるATPの定量的な検出を可能にするからであり、これは細胞のエネルギー効率を示す。この測定は、ATPが、嚢胞性線維症に対して重要である、非常に重要なタンパク質のほとんどを調節するので、重要性が非常に大きい。さらに、このタイプの比色センサーは、ATPの量を定量する方法としてフローサイトメトリーを用いた実験に懸濁細胞と共に使用することもできる。言うまでもなく、結合剤は、ATPに対して選択的であり、水溶液中で活性でなければならない。このような用途には、いかなるアルコールや他の有機溶媒の使用をも避けることが必須である。過去に報告したD1およびD2化合物1.Znの大きな欠点は、特定の量のアルコールを使用しなければならず、これがこの試薬を実用的な目的に使用する可能性を制限することである。純粋な水溶液を使用して、細胞染色研究用に本発明の錯体L.Znが用いられる。主成分の1つは、このL.Zn錯体の合成には珍しく過去の錯体1.Znと比較した場合、これが違い、より正確には、向上した溶解性および染色特性をもたらす。合成法において、見かけ上は些細であるが、非常に重要な違いがあり、これが所望の化合物L.Znを最大の収率で達成する際に非常に重要である。アルコールのいくつかの重大な副作用:アルコールを飲む1つの影響は血球凝集であり、これは赤血球が互いに凝集し、微小血管を塞ぎ、組織が酸素不足に陥り、細胞死を招く。この細胞死は、脳において最も深刻であり、多くの場合認識されない。アルコールは他の食品のようには消化されず、変換されて細胞や組織に運ばれる代わりに;アルコールは、通常の消化過程を回避して直接血流に乗る。アルコールの約20パーセントは胃壁を介して血液へ直接吸収され、80パーセントは小腸を介して血流へ吸収される。[発明の目的]本発明の主な目的は、ZnIIに基づいた比色センサースキーム1、式1Aを調製し、好適な生細胞用染色剤としてのその使用方法を開発することである。本発明の別の目的は、目視検出が可能な色の変化を伴ってアデノシン三リン酸ATPに選択的に結合する化学センサーを用いた、検出手法を開発することである。本発明のさらに別の目的は、水溶液または生理的条件におけるATPの検出方法を標準化することである。本発明のさらに別の目的は、水における化学センサーの溶解性の向上に適した手法を見出すことである。本発明のさらに別の目的は、光学顕微鏡を用いた、酵母真核生物細胞ならびにグラム陽性菌およびグラム陰性菌原核生物細胞などの生体微生物中のATPの検出に適した手法を開発することである。本発明の別の目的は、グラム陽性菌とグラム陰性菌とを区別するために、この化学センサーの使用の可能性を検討することである。本発明の別の目的は、化学センサーの適性を試験することである。本発明の別の目的は、細胞増殖動態を研究するための手法を確立することである。[発明の概要]したがって、本発明は、式1Aの化合物を提供する。本発明の実施形態では、当該化合物は本質的には非親油性である。本発明の別の実施形態では、当該化合物は、生細胞用に好適な染色剤として有用な比色センサーである。本発明の別の実施形態では、当該生細胞は、原核細胞および真核細胞から選ばれる。本発明の別の実施形態では、使用される原核細胞は、バチルス属種およびシュードモナス属種である。本発明の別の実施形態では、使用される真核細胞は酵母サッカロミセスセレビシエである。本発明の別の実施形態では、式1Aの化合物の調製方法は、下記の工程を含む:i.300~600rpm毎分回転数の速度の穏やかな撹拌下で、25~30°Cの範囲の温度にて、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンを溶媒に溶解すること;ii.工程iで得られた溶液を2~5°Cの範囲の温度で氷中に維持すること;iii.工程iiで得られた溶液に、トリエチルアミン塩基を、0.5~1mL/分の速度で、300~600rpmの速度の穏やかな撹拌下で加えること;iv.工程iiiで得られた溶液に、別途調製したテトラヒドロフラン中の4-4-ジメチルアミノ-フェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドの溶液を、15~60mL/時の範囲の速度で、0~5°Cの範囲の温度で加えること;v.工程ivで得られた混合物を、25~30°Cの温度範囲で、5~10時間の範囲の期間撹拌すること;vi.工程vで得られた混合物を、20~60分の範囲の期間、65~70°Cの範囲の温度で還流させること;vii.工程viで得られた混合物をろ過して、リガンドの析出物を分離すること;viii.工程viiで得られたリガンドの析出物を洗浄し乾燥すること;ix.工程viiiで得られたリガンドを、20~25°Cの範囲の温度でアルコールに溶解すること;x.工程ixで得られたリガンドの溶液に、硝酸亜鉛溶液リガンドの0.3~0.8モル当量を、20~25°Cの範囲の温度で加えること;xi.工程xで得られた溶液を、20~25°Cの範囲の温度で、12~24時間の範囲の期間撹拌すること;xii.工程xiで得られた溶液を、10~20°Cの範囲の温度で、2~5時間の範囲の期間激しくかき混ぜること;xiii.工程xiiで得られた析出物を、クロロホルムでろ過し洗浄して式1Aの化合物を得ること。本発明の別の実施形態では、当該溶媒は、クロロホルム、メタノール、ジクロロメタン、およびテトラヒドロフランTHFからなる群から選ばれる。本発明の別の実施形態では、使用するアルコールは、メタノールおよびエタノールから選ばれる。本発明の別の実施形態では、式1の化合物を用いた、生細胞の染色方法であって、当該工程は下記を含む:a.iグルコース酵母抽出物寒天GYE培地中でサッカロミセス属種MTCC5548、iiニュートリエントブロス中でバチルス属種MTCC5549、およびiiiキングB培地中でシュードモナス属種MTCC5550を、30~40°Cの範囲の温度で、6~36時間の範囲の期間培養すること;b.工程aの細胞を、式1Aの化合物0.6×104~1.2×104Mと共に、28~38°Cの温度範囲で、5~20分の範囲の期間インキュベーションすること;c.工程bで得られたインキュベーションされた試料を、グルテルアルデヒドを用いて、7.4~7.6の範囲のpHの緩衝液中で、10~12時間の範囲の期間、28~38°Cの範囲の温度で固定すること;d.工程cで得られた試料を、上記緩衝液で、0.5~1.0時間の範囲の期間洗浄すること;e.工程dで得られた試料を、四酸化オスミウムおよび緩衝液で後固定し、上記緩衝液で洗浄すること;f.勾配をつけた水エタノール系により、工程eで得られた試料から水を除去すること;g.前記緩衝液中で工程fで得られた試料をすすぎ、スパッタコーター中で金でコーティングして、単純顕微鏡下で見える染色標本を得ること;h.異なる色強度および染色細胞の形で生細胞を区別すること。本発明の別の実施形態では、使用される緩衝液は、リン酸緩衝液である。本発明の別の実施形態では、センサーと生細胞との結合は、走査電子顕微鏡SEM分析により確認される。本発明の別の実施形態では、染料で染色した後の細胞の生存能が、細胞分裂の発生を示す凹面スライドにおけるハンギングドロップ法によって試験微生物における二分裂を観察することにより証明される。さらに本発明の別の実施形態では、式1Aの化合物の可逆的結合が、光学顕微鏡およびUV-Vis分光法を介して、クエン酸ナトリウムの20w/v溶液で細胞を脱染することにより確認される。本発明の別の実施形態では、式1Aの化合物による生細胞の染色が、生細胞の細胞壁上に存在するATPとセンサーとのヘプタ配位種の形成ここで3個のリン酸基はZnと配位し、得られる31PNMRは3個のリン原子すべてに関してシフトするにより行われる。本発明の別の実施形態では、式1Aの化合物の吸収スペクトル滴定曲線は、ATPの添加後に40nmのスペクトルシフトを示し、ATPとの化合物の結合定数は、978±4M1である。本発明の別の実施形態では、水における式1Aの化合物の溶解性が、α-CDシクロデキストリンの存在下で、約7~7.5倍増加する。本発明の別の実施形態では、ZnIIに基づいた比色センサーL.Znの吸収極大がα-CDシクロデキストリンの水溶液を加えると5nmシフトする傾向があることを示すという点で、式1Aの化合物の染色の強度がα-CDシクロデキストリンの存在下で増加する。本発明の別の実施形態では、式1Aの化合物による染色は10~20分で起こり、α-CDシクロデキストリンの存在下では1秒~2分で起こるので、α-CDシクロデキストリンの存在下で式1Aの化合物の染色の速度が増加すること示す。本発明の別の実施形態では、染料の無いサッカロミセス属種の細胞表面のSEM画像はなめらかであると認められたが、対照的に染料を有するものは粗いと認められた。本発明の別の実施形態では、染料の無いグラム陽性菌のSEM画像はなめらかであると認められたが、染料を有するものは粗いと認められた。本発明の別の実施形態では、染料の無いグラム陰性菌のSEM画像はなめらかであると認められたが、染料を有するものは粗いと認められた。本発明の別の実施形態では、グラム陽性菌の染色された細胞は、染色されたグラム陰性菌のものと比較して長く見えた。本発明のさらに別の実施形態では、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンは、6~15ミリモルの濃度域にある。本発明の別の実施形態では、トリエチルアミンの添加速度は、0.5~1.0mL/分の範囲から選ばれる。本発明のさらに別の実施形態では、4-4’-ジメチルアミノフェニルアゾ-ベンゼンスルホニルクロリドは、15~20mMの濃度域にある。本発明のさらに別の実施形態では、4-4-ジメチルアミノフェニルアゾ-ベンゼンスルホニルクロリドの添加速度は、15~60mL/時の範囲から選ばれる。本発明のさらに別の実施形態では、反応混合物は、5~10時間の範囲の期間、25~30°Cの範囲の温度を維持しながら撹拌される。本発明のさらに別の実施形態では、反応混合物は、20~60分の範囲の期間還流される。本発明のさらに別の実施形態では、このように調製したリガンドは、14~20mMの範囲の濃度および20~30°Cの範囲の温度を維持しながら、溶媒に溶解される。本発明のさらに別の実施形態では、硝酸亜鉛溶液は、リガンドの0.3~0.8モル当量で使用される。本発明のさらに別の実施形態では、リガンドと硝酸亜鉛溶液との反応混合物は、12~24時間の範囲の期間、20~30°Cの温度範囲で撹拌される。本発明のさらに別の実施形態では、最終反応混合物は、10~20°Cの範囲の温度で、2~5時間の範囲の期間静止位置に維持される。本発明のさらに別の実施形態では、培養された種は、0.1~0.15mMの濃度範囲で、28~38°Cの範囲の温度で、5~20分の範囲の期間、センサーとインキュベーションされる。本発明のさらに別の実施形態では、生物試料は、センサーで染色される。本発明のさらに別の実施形態では、酵母細胞真核生物グラム陽性菌およびグラム陰性菌原核生物は、同一のセンサーで染色した際の染色された細胞の色強度に基づいて区別することができる。本発明のさらに別の実施形態では、曝露後の試験微生物のコロニーは、その生存能を確認するために、寒天培地プレート上に線画することにより増殖される。[図面の簡単な説明]スキーム1は、ZnII-アザ大環状錯体L.Znスキーム1、式1Aの合成を示し、またL.ZnとATPとの結合様式スキーム1、式1Bを示す。スキーム2は、α-CDα-シクロデキストリンによるL.Znスキーム1、式1Aの包接機構を示す。図1は、下記の種々のアニオン~17.0mMの存在下における25°CでのHEPESN-2-ヒドロキシエチル-ピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸緩衝液pH~7.2中でのL.Znスキーム1、式1A8.87μMの吸光度スペクトルを示す;1:ATP;2:CTP;3:ADP;4:F、Cl、Br、I、CH3COO、H2PO4、PPi、SO42、NO3、CN、AMP、SCN。図2は、種々のリン酸イオンの存在下および非存在下での水溶液中でのL.Znスキーム1、式1A8.87μMの色の変化を示す。左から右に:ブランク、およびH2PO4、PPi、AMP、ADP、ATP、CTP添加アニオン濃度~500μM。図3は、pH7.210mMHEPES緩衝液で25°CにてL.ZnII-化合物スキーム1、式1A9.46μMの水溶液に[ATP]=0~17.28mMを加えた際の吸収スペクトルの滴定曲線を表すグラフを示す。図4は、pH7.210mMHEPES緩衝液で25°CにてL.ZnII-化合物スキーム1、式1A1.79μMに[CTP]=0~10.17mMを加えた際の吸収スペクトルの滴定曲線を表すグラフを示す。図5は、pH7.210mMHEPES緩衝液で25°CにてL.ZnII-化合物スキーム1、式1A8.86μMにADP[ADP]=0~6.55mMを添加した際の吸収スペクトルの滴定曲線を表すグラフを示す。図6Aは、25°CでのL.Zn-ATPスキーム1、式1Bの結合の様式を明らかにするために、500MHzBrukerモデル番号Advance-DPX-500Instrumentを用いてD2O中で記録した31PNMRスペクトルを表すグラフを示す;ATPAのみ、およびATPとZnII-錯体B、L.Znスキーム1、式1A。図6Bは、25°CでのL.Zn-ATPスキーム1、式1Bの結合の様式を明らかにするために、500MHzBrukerモデル番号Advance-DPX-500Instrumentを用いてD2O中で記録した31PNMRスペクトルを表すグラフを示す;CTPCのみ、およびZnII-錯体と結合したCTPD、L.Znスキーム1、式1A。図7は、化合物7.2μMおよび過剰のATP900μMが存在する場合のESI電子スプレーイオン化質量分析の結果を表すグラフを示し、L.Zn-ATPスキーム1、式1Bの形成と一致する。L.Zn-ATPスキーム1、式1Bモノナトリウム塩の分子量は1081である。使用機器:ThermoFinniganLCQ登録商標AdvantageMAX四重極イオントラップ機器、サンホセ、カリフォルニア州、米国図8は、25°Cの水溶液中での、様々な[α-CD]0~2.3mMとの、L.Znスキーム1、式1A8.3μMの系統的なスペクトル変化を示す。はめ込み画像は、再蒸留および脱イオン水におけるaα-CDの非存在下およびb存在下でのL.Znスキーム1、式1Aの飽和溶液の色の画像である。図9Aは、25°Cでの、A染色していない酵母細胞ならびにBL.Znスキーム1、式1A1.16×104MおよびCL.Znスキーム1、式1A5×104Mとα-CD2.92×103Mとで染色した酵母細胞の光学顕微鏡画像を示す。図9Bは、25°Cでの、A染色していない、BL.Znスキーム1、式1A0.66×104M、およびCL.Znスキーム1、式1A0.5×103Mとα-CD2.92×103Mとで染色したグラム陽性菌の光学顕微鏡画像を示す。図9Cは、25°Cでの、A染色していない、BL.Znスキーム1、式1A0.66×104M、およびCL.Znスキーム1、式1A0.5×103Mとα-CD2.92×103Mとで染色したグラム陰性菌の光学顕微鏡画像を示す。図10Aは、aL.Znスキーム1、式1A2.97μM/ATP13.6mMの存在下でのL.Znスキーム1、式1A/ATP13.6mMおよびクエン酸ナトリウム溶液20w/v、bL.Znスキーム1、式1A7.1μM/酵母の存在下/L.Znスキーム1、式1A7.1μM酵母細胞の存在下およびこれにクエン酸ナトリウム溶液35w/vを加えたものの吸収スペクトルを表す。スペクトルは25°Cで記録した。図10Bは、AL.Zn-α.CD0.5mM[α.CD]=2.92mMで染色、BL.Zn66μMで染色した酵母、ならびにCクエン酸ナトリウム20W/Vで処理後のL.Zn-α.CD染色酵母細胞、Dクエン酸ナトリウム20W/Vで処理後のL.Zn染色酵母細胞の光学顕微鏡画像を示す。図11は、Aブランクの酵母細胞、BL.Zn錯体スキーム1、式1Aで処理した酵母細胞、Cブランクのグラム陰性菌細胞、DL.Znスキーム1、式1A錯体で処理したグラム陰性菌細胞、Eグラム陽性菌細胞、およびFL.Znスキーム1、式1A錯体で処理したグラム陽性菌細胞のSEM画像を表す。[L.Zn]=0.116mM。図12は、経時的な細胞数の変化から得られたaサッカロミセスセレビシエ、cシュードモナスフルオレセンスeバチルスメガテリウムの増殖曲線を示す。L.Znスキーム1、式1AD-10.106mMおよびL.Znスキーム1、式1A0.164mMとα-CD0.938mMD-2との存在下での、bサッカロミセスセレビシエ、dシュードモナスフルオレセンス、およびfバチルスメガテリウムの水性培地の600nmでの吸光度の相対的変化。25°Cで試験を行った。図13は、L.Znスキーム1、式1A[D-10.106mMおよびL.Znスキーム1、式1A0.164mMとα-CD0.938mMD-2]とで染色し、異なる時間間隔でモニタリングした酵母細胞の光学顕微鏡画像を示す。[発明の詳細な説明]本発明は、中間体リガンドであるE-4-4-1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-1-イルスルホニルフェニルジアゼニル-N,N-ジメチルアニリンLスキーム1、式2は、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンとE-4-4-ジメチルアミノフェニルジアゼニルベンゼン-1-スルホニルクロリドとの反応により合成されたことを規定する。これは、対応するZnII-錯体L.ZnIIスキーム1、式1Aの合成のために、非水性溶媒中でのZnNO32との反応に使用する前にさらに精製した。この錯体は、中性の水溶液または生理的なpHの溶液中で、肉眼に検出でき得る関連する色の変化を伴って、ATPおよびCTPなどの三リン酸と結合することが分かった。これは、真核生細胞および原核生細胞用の、可能性のある染色剤としてこのZnII-錯体を使用する可能性を切り開くものである。このZnII-試薬は、CTPの検出にも使用することができるが、ATPと比較するとCTPに対するこの錯体の親和性ははるかに低い。これらの所見に基づいて、本発明は、様々な化学的および生物学的アッセイ方法を伴う多くの分析技術を介して徐々に開発された。本発明は、ATPに対する選択性を有するZnII-アザ大環状環に基づいた錯体であるL.Znスキーム1、式1Aを提供する。本発明は、ZnIIに基づいた比色センサーの調製方法を提供し、当該方法は、下記工程を含む:i.50~100mLの容量範囲でかつクロロホルム、メタノール、ジクロロメタン、テトラヒドロフランなどの範囲の溶媒を使用して、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンを6~15mMの濃度範囲で溶解すること;ii.工程iの溶液を2~5°Cの温度範囲に保持し、トリエチルアミン塩基を、緩やかな撹拌下で0.5~1mL/分の速度で加え、次いで、15~60mL/時の範囲の速度で4-4-ジメチルアミノ-フェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドの15~25mM溶液を加えた;iii.工程iiで得られた混合物を、25~30°Cの温度範囲で、5~10時間の範囲の期間撹拌すること;iv.混合物を20~60分の範囲の期間還流させること;v.析出物をTHFでろ過し次いで洗浄し、その後固形物を乾燥させてリガンドを得ること;vi.20~25°Cの温度範囲で、リガンドをアルコールに溶解して、14~20mMの範囲の濃度を得ること;vii.工程viで調製した溶液に、20~25°Cの温度範囲で、リガンドの0.3~0.8モル当量の範囲の硝酸亜鉛水溶液を加えること;viii.工程viiの溶液を、同じ温度範囲で、12~24時間の範囲の期間撹拌すること;ix.工程viiiで得られた溶液を、10~20°Cの温度範囲で、2~5時間の期間激しくかき混ぜること;x.クロロホルムで析出物をろ過し、洗浄してセンサーを得ること;xi.単離したiGYE培地中のサッカロミセス属種、iiニュートリエントブロス中のバチルス属種、およびiiiキングB培地中のシュードモナス属種を、30~40°Cの温度範囲で、6~36時間の期間培養すること;xii.0.1~0.15mMの範囲の濃度を有する工程xで得られたセンサー100μlと共に、工程xiで得られた各培養種100μlを、28~38°Cの温度範囲で、5~20分の範囲の期間インキュベーションすること;xiii.単純顕微鏡下で観察するために、センサーで試料を染色すること;xiv.異なる色強度によりグラム陽性菌とグラム陰性菌とを区別すること;xv.寒天培地プレート上に線画して工程xiからxivまでの試験微生物のコロニーを増殖させること。[化合物Lスキーム1、式2の合成]1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンサイクラム247mg、1.23mmoleを、250mL丸底RBフラスコ中で無水テトラヒドロフラン40mLに溶解した。テトラヒドロフラン10~15mL中の4-4-ジメチルアミノ-フェニルアゾ-ベンゼンスルホニルクロリド400mg、1.23mmoleとトリエチルアミンEt3N1mLとの溶液を、氷冷状態の上記溶液に加えた。次いで、得られた混合物を25°C~30°Cで10時間撹拌し、次いで、1時間さらに還流した。このようにして得られたオレンジ色の析出物をテトラヒドロフランでろ過し洗浄した。最後に、固体残渣Lを乾燥させた;収率:75。化合物L.Znスキーム1、式1Aの合成L200mg;0.41mmoleの溶液を、100mL一首フラスコ中でメタノール25mLに溶解した。これに、硝酸亜鉛水溶液1.0mL148.69mgのZnNO3.6H2Oに相当、1.2モル当量を加えた。得られた溶液を、25°C~30°Cで24時間撹拌した。反応混合物を4°Cの冷蔵庫に5時間保存し、紫色の析出物が現われた。これをグーチろ過器3番を用いてろ過により採取し、CHCl3で数回洗浄した;収率:65。[生物試料調製]染色研究で使用した微生物は、CSMCRIの庭園の土21.7587325N72.1443897Eから取ったシュードモナス属種MTCC5550、アラビア海ベラワル海岸、20.95973N70.27932Eから取ったバチルス属種MTCC5549、凝乳から取ったサッカロミセス属種MTCC5548である。サッカロミセス属種の分離株はGYEグルコース酵母抽出物寒天培地で、バチルス属種のものはニュートリエントブロスで、およびシュードモナス属種のものはキングB培地で、24時間37°Cで培養した。これを100μl取り、30~40°Cで、L.Znスキーム1、式1A1.16×104M溶液100μlと共にインキュベーションした。試料は、pH7.5の0.1Mリン酸緩衝液中の2v/vグルタルアルデヒドで、一晩室温25~30°Cで固定した。次いで、試料を、室温25~30°Cで1時間0.1Mリン酸緩衝液pH7.5で洗浄した。同じ緩衝液中で2w/v四酸化オスミウムOsO4中で後固定を行い、20分間0.1Mリン酸緩衝液で一回洗浄した。次いで、勾配を付けた水-エタノール系で水を除去した;25エタノール15分、50エタノール15分、75エタノール30分、90エタノール60分、無水アルコール30分。顕微鏡観察前に、試料を緩衝液中ですすぎ、スパッタコーターポーラロンSC7620中で金でコーティングした。材料を加速電圧15kVで走査電子顕微鏡SEMLEO1430VP中で検査した。ブランク、ならびに染色真核生物酵母、グラム陽性およびグラム陰性細胞のSEM画像図11を記録して、染色の際の細胞の外面の形態変化を示した最大濃度のATPは、細胞膜周辺腔中のミトコンドリアを介して放出され、次いで細胞表面に分泌されるので。いくつかのATP結合カセットタンパク質例えば、周辺質タンパク質PEP、哺乳類AMP活性化プロテインキナーゼAMPKも、形質膜に蓄積することが報告されている。[aNelson,D.L.;Cox,M.M.;Lehninger:PrinciplesofBiochemistry,2003第三版,WorthPublishers.NY;Bergey,bJohn,D.H.;Noel,G.H.;Peter,R.K.;Bergey’s,H.A.S.ManualofDeterminativeBacteriology,1994,第九版,LippincottWilliamsWilkins]。染料を有する酵母細胞の画像染色された細胞表面は粗いことが分かったとは対照的に、染料が無い酵母細胞のSEM画像は、なめらかであると認められた。これは、細胞に接着している異物、すなわち、L.Znスキーム1、式1Aの存在を示した。染料L.Znスキーム1、式1Aが結合した際の細胞表面の変化も、染色剤の非存在下および存在下での、グラム陰性およびグラム陽性菌について記録したSEM画像から明らかであった図11C~11F。試料表面のSEM画像中のコントラストの違いはまた、試料表面の不均一な化学的性質の表れである。グラム陽性菌と比べたグラム陰性菌の比較的明るい細胞表面は、細胞外表面上により高い負電荷が蓄積していることを示す。この所見は、細胞外ATP放出がグラム陰性菌でより高く、ポーリンと呼ばれるタンパク質を有するより多孔性の表面であることを記載している過去の報告とよく相関している[aWexler,H.M.ClinicalInfectiousDiseases.1997,25,S284.bIvanova,E.P.;Alexeeva,Y.V.;Pham,D.K.;Nicolau,W.D.;Internationalmicrobiology,2006,9,37.cWerner,T.P.;Amrhein,N.;Freimoser,F.M.BMCPlantBiology,2007,7:51doi:10.1186/1471-2229-7-51.]。[染色剤としてL.Znスキーム1、式1Aを用いた酵母および細菌グラム陽性とグラム陰性細胞の染色、ならびに光学顕微鏡を用いた染色した細胞培養の観察。]サッカロミセス属種の分離株はGYEグルコース酵母抽出物寒天培地で、バチルス属種のものはニュートリエントブロスで、およびシュードモナス属種のものはキングB培地で、24時間37°Cで培養した。これを100μl取り、[L.Zn]=1.16×104M溶液pH7.2、10mMHEPES緩衝液100μlと共に室温でインキュベーションした。試料を、pH7.5の0.1Mリン酸緩衝液中の2v/vグルタルアルデヒドで25~35°Cで一晩固定した。次いで、試料を、25~35°Cで1時間0.1Mリン酸緩衝液pH7.5で洗浄した。同じ緩衝液中で2w/v四酸化オスミウムOsO4中で後固定を行い、20分間0.1Mリン酸緩衝液で一回洗浄した。次いで、勾配を付けた水-エタノール系で水を除去した;25エタノール15分、50エタノール15分、75エタノール30分、90エタノール60分、無水アルコール30分。顕微鏡観察前に、試料を緩衝液中ですすぎ、スパッタコーターポーラロンSC7620中で金でコーティングした。材料を加速電圧15kVで走査電子顕微鏡SEMLEO1430VP中で検査した。[L.Znスキーム1、式1Aの溶解性の向上は、水溶液であるスキーム2]水におけるL.Znスキーム1、式1Aの溶解性は限定的である0.0448gL1。しかしながら、これは、α-シクロデキストリンα-CDの存在下で向上させることができる。L.Znスキーム1、式1A2.3mgを再蒸留水5mLに溶解し、25~35°Cで1時間撹拌した。次いで、溶液をろ過し、ろ液中の溶解固形物の濃度を方程式O.Dfiltrate/εLZnO.Dfiltrateは、ろ液の光学濃度であり、εLZnは、L.Znのモル吸光係数である数値は、別の実験により前もって求めたに基づいて求め、0.0448gL1であると分かった。同様の実験をα-CDの存在下で繰り返した。この場合、L.Znスキーム1、式1Aを2.913mg含む再蒸留水5mLに、α-CDを14.2mg溶解し、この溶液を25°Cで1時間撹拌し;懸濁固形物がほとんどない溶液が得られた。これをG-4グーチろ過器を用いてろ過した。ろ液を採取し、ろ液の光学濃度O.Dを458nmでモニタリングした。包接錯体擬ロタキサン形態の完全な形成を考慮して、公知のεLZnαCD値および458nmでのO.D.に基づいて濃度を求めた。計算により、0.34gl1のL.Znスキーム1、式1Aが、得られた溶液中に存在することが示された。したがって、L.Znスキーム1、式1A基準で、~7.5倍の溶解性の増加が達成され、これは、水溶液中のα-CDの非存在下および存在下でのL.Znスキーム1、式1Aの飽和溶液の可視的な色の違いでも明らかである図8。擬ロタキサン形態の水溶液中のL.Znスキーム1、式1Aは、スキーム2でL.Zn.CDとして示されている。[リガンドLスキーム1、式2の特性決定]化合物Lの単離収率収率は出発化合物に基づいて計算した;75。1HNMR500MHz,CDCl3,TMS,JHz,δppm:7.98-7.962H,d,J=8.0,Ar-He7.9-7.874H,m,Ar-Hc,Hd,7.063H,b,-NHmacrocycle,6.77-6.752H,d,J=8.0,Ar-Hb,3.1516H,br,Hfhijkmno,3.116H,s,-NCH32,2.034H,br,Hgl.Es-Msポジティブモード:m/z;488.30MH.元素分析データ:計算値C:59.11,H:7.65,N:20.11,測定値C:59.1,H:7.5,N:20.2。[L.Znスキーム1、式1Aの特性決定]化合物L.Znの単離収率収率は出発化合物に基づいて計算した;65。1HNMR500MHz,DMF-d7,TMS,δppm:7.92-7.912H,d,J=8.5,Ar-He,7.88-7.862H,d,J=9,Ar-Hc,7.81-7.792H,d,J=8.5,Ar-Hd,6.92-6.92H,d,J=9.5,Ar-Hb,3.136H,s,-NCH32,2.92-2.918H,br,Hfgno,2.75-2.7412H,br,Hhijklm,.ES-msポジティブモード、m/z:676.00M.元素分析:計算値C:42.57,H:5.51,N:18.62;測定値C:42.88,H:5.56,N:18.22.分析データは、この分子の推定構造とよく一致している。[L.Znスキーム1、式1Aとα-CDとの包接錯体形成のための安定度定数の評価]事前のスペクトル研究は、過剰のα-CD0~2.3mM水溶液をL.Znスキーム1、式1Aの8.3μM溶液に加えると、L.Znスキーム1、式1A463nmの吸収極大が、より短い波長458nmにシフトする傾向があることを示す。α-CD中のトランス-1,2-ビス-4-ピリジルエチレン、4,4’-アゾピリジンAZP、およびのいくつかの関連するビピリジン/ビフェニル分子を加えた際のホスト-ゲストタイプの包接錯体の形成は、数名の研究者によって報告されているShukla,A.D.;Bajaj,H.C.;Das,A.Angew.Chem.Int.Ed.2001,40,446.;Shukla,A.D.;Bajaj,H.C.,Das,A.Nat.Acad.Science,2002,114,431.;Beer,A.J.;Macartney,D.H.Inorg.Chem.2000,39,1410.;Macartney,D.H.;Waddling,C.A.;Inorg.Chem.1994,33,5912.;Philip,D.;Stoddart,J.F.Angew.Chem.Int.Ed.1996,35,1154.。CDキャビティーにおけるこれら化合物への包接がHOMO-LUMOエネルギーギャップに影響を及ぼし、これにより吸収スペクトルバンドが影響されるエネルギー準位の摂動は、大きなものであるとは報告されていないがことも報告されている。したがって、本研究では、観察された5nmのシフトは、包接現象および擬ロタキサン錯体の形成に起因する可能性がある。系統的分光光度滴定をした際、吸収極大が5nmシフトすることが分かり、2つの同時等吸収点が観察された。この分光光度滴定に基づいた会合定数を求めると、会合定数値が255±15M1であることが示された。UV-vis滴定からの結合定数の算出に使用した一般式は次のとおりである:L.ZnCD=L.Zn.CDLの吸収極大はλLであり、この波長での吸光係数およびODは、それぞれεLおよびALである。L.Zn.CDの吸収極大はλLZnCDであり、この波長での吸光係数およびODは、それぞれεLZnCDおよびALZnCDである。したがって、所与の濃度のレセプター分子[L]およびα-シクロデキストリン[CD]について[L.Zn.CD]=[{ALZnCD-A0}/εLZnCD]1式中、A0は、外部からCDを加える前のλLZnCDでのOD値である。ALZnCDは、100モル当量のCDを加えた後のλLZnCDにて記録した。したがって、λLZnCD=ALZnCD/[L.Zn]free2レセプター分子はすべてCDに結合し、CDはこの波長では全く吸収しないと仮定すればしたがって、一旦[L.Zn.CD]を求めることができれば、式1および3を用いて、錯形成していないレセプター分子[L.Zn]の濃度を計算することができる。[L.Zn]free=[L.Zn]initial-[L.Zn.CD]3および、[CD]free=[CD]initial-[L.Zn.CD]4Kが、CDの所与の濃度での包接錯体L.Zn.CDの形成定数である場合、結合定数、K=[L.Zn.CD]/{[L.Zn]free[CD]free}5したがって、大過剰のα-CD125倍の存在下では、擬ロタキサン形態、つまり、L.Zn.α-CDスキーム2は、水溶液中で支配的な形態として存在すると考えられる図8。L.Znスキーム1、式1Aとして示される化合物の、ATPおよび他のアニオンとのカップリングに起因する電子スペクトル変化を測定する実験を行った。様々な重要なアニオンATP、CTP、ADP、AMP、PPi、H2PO4、SO42、CH3CO2、I、Br、Cl、およびFなどに対するZn-錯体L.Znスキーム1、式1Aの結合挙動を調べるために、次の実験を行った。ATP、CTP、ADP、AMP、PPi、H2PO4、SO4、CH3CO2、I、Br、Cl、およびFのナトリウム塩の溶液~21mMを、10mMHEPES緩衝液pH7.2におけるそれぞれの塩を用いて調製し、使用まで保存した。さらに、化合物L.Znスキーム1、式1Aの溶液44.35μMを、再蒸留され脱イオン化された水を用いて調製し、保存した。これら保存溶液を、溶液を調製した日に実験に使用した。プローブ保存液前もって調製し保存した44.35μMの化合物L.Zn本発明のスキーム1、式1Aの溶液の最終濃度が8.87μMになるようにプローブ保存液1mLを10mL試験管に入れた後に試験液を使用した。これに、ATPおよび他のアニオンCTP、ADP、AMP、PPi、H2PO4、SO42、CH3CO2、I、Br、Cl、およびFの前もって調製し保存した溶液それぞれ4mLを、溶液それぞれのアリコートが17mMになるように試験管に加えた。次いで、得られた溶液を、適宜ベースライン補正した後に、複光束分光光度計ShimadzuUV-3101PCを用いてUV-visスペクトル測定に使用し、この結果を図1に示す。図1に示すように、本発明の化合物L.Znスキーム1、式1Aの吸収スペクトルでは、ATPがpH7.2にて加えられると、明確な新しい吸収スペクトルバンドが503nmに現れた。したがって、ATP~1920当量の溶液をL.Znスキーム1、式1Aの溶液に加えると、40nmの赤方偏移が観察された。CTPのこの偏移ははるかに少なく、9nmの赤方偏移が観察されたのみである。対照的に、2000当量の他のアニオンが加えられると、変化は観察されなかった。したがって、本発明の化合物L.Znスキーム1、式1Aは、ATPと優先的にカップリングすることが分かる。水性培地中のL.Znスキーム1、式1A8.87μMの溶液を、過剰量の~500μMの様々なリン酸アニオンH2PO4、PPi、AMP、ADP、ATP、およびCTPなどで処理した。それぞれのアニオンを加えると、ATPの存在下でのみ著しい色の変化が観察された。ADPおよびCTPの場合は、色の変化がわずかに観察された。したがって、L.Znスキーム1、式1Aは、様々なリン酸アニオンのうちでATPに選択的に結合することができ、ATPの結合に伴う色の変化は、肉眼で検出することができる図2。[ATPの濃度に応じた化合物L.Znスキーム1、式1Aに対するUv-visスペクトル滴定実験。]ZnII-化合物L.Znスキーム1、式1AとATPとの結合特性を調べるために、次の実験を行った。ATP21.6mMの溶液を、10mMN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸HEPES緩衝液pH7.2を用いて調製した。さらに、化合物L.Znスキーム1、式1A、実施例1で得られたの溶液47.3μMを、再蒸留し脱イオン化した水を用いて調製した。これら保存溶液を、溶液を調製した日に実験に使用した。L.Znスキーム1、式1A[L.Zn]=47.3μMの保存液1.0mLを、L.Zn溶液の最終濃度が9.46μMになるように試験管に入れた。これに、様々な量のATP0.1~4mLの保存ATP溶液21.6mMを加えた。次いで、得られた溶液を、10mMHEPES緩衝液pH7.2を加えて、得られるアリコートの全容積を5mLに維持して希釈し、これを複光束分光計およびクォーツ分光測光用セル3.5mL容量を用いた分光光度測定に使用した。全スペクトル変化は、適宜ベースライン補正した後に、複光束分光光度計ShimadzuUV-3101PCを用いて測定した。この滴定中の実験すべてでスリット幅は0.2nmで変更せずにおき、その結果を図3に示す。図3に示すように、様々なATPとの化合物L.Znスキーム1、式1Aの吸収滴定スペクトルである。本発明によれば、化合物の最終濃度がpH7.2で9.46μMであると、ATPの添加量は、0当量から1826モル当量まで増加し、したがって、錯体L.Zn-ATPスキーム1、式1Bの形成による新しいスペクトルバンドが、503nmの波長で観察された。したがって、本発明の錯体L.Zn-ATPスキーム1、式1Bの形成の結合定数は、当該化合物およびATPの分光光度滴定実験によると978±15M125°Cであったことが分かる。UV-vis滴定からの結合定数の計算に使用した一般式は次のとおりである。L.ZnA=L.Zn-AL.Znの吸収極大はλLであり、この波長での吸光係数およびODは、それぞれεLおよびALである。L.Zn-Aの吸収極大はλLZnAであり、この波長での吸光係数およびODは、それぞれεLZnAおよびALZnAである。したがって、所与の濃度のレセプター分子[L.Zn]およびアニオン[A]について、[L.Zn-A]=[{ALZnA-A0}/εLZnA]6式中、A0は、外部からAを加える前のλLZnAでのOD値である。ALZnAは、100モル当量のAを加えた後のλLZnAにて記録した。したがって、εLZnA=ALZnA/[L.Zn]free7レセプター分子はすべてAに結合し、A単独ではこの波長では吸収しないと仮定すればしたがって、一旦[L.Zn-A]を求めることができれば、式6および7を用いて、錯形成していないレセプター分子[L.Zn]の濃度を計算することができる。[L.Zn]free=[L.Zn]initial-[L.Zn-A]8および、[A]free=[A]initial-[L.Zn-A]9Kが、Aの所与の濃度での包接錯体L.Zn-Aの形成定数である場合、結合定数、K=[L.Zn-A]/{[L.Zn]free[A]free}10L.Znスキーム1、式1A[L.Zn]=8.95μMの保存液1.0mLを、L.Zn溶液の最終濃度が1.79μMになるように試験管に入れ、これに、様々な量のCTP0.1~4mLの保存CTP溶液12.71mMを加えた。次いで、得られた溶液を、10mMHEPES緩衝液N-2-ヒドロキシエチル-ピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸pH7.2を加えて、得られるアリコートの全容積を5mLに維持して希釈し、これをクォーツ分光測光用セル3.5mL容量による分光光度測定に使用した。全スペクトル変化は、適宜ベースライン補正した後に、分光光度計ShimadzuUV-3101PCを用いて測定した。この滴定中の実験すべてでスリット幅は0.2nmで変更せずにおき、その結果を図4に示す。図4に示すように、様々なCTPとの化合物L.Znスキーム1、式1Aの吸収滴定スペクトルである。本発明によれば、化合物の最終濃度がpH7.2で1.79μMであると、CTPの添加量は、0当量から5681当量まで増加し、したがって、錯体L.Zn-CTPの形成による新しいスペクトルバンドが、477nmの波長で観察された。したがって、本発明の錯体L.Zn-CTPの形成の結合定数は、当該化合物およびCTPの分光光度滴定実験によると220±15M125°Cであったことが分かる。L.Znスキーム1、式1A[L.Zn]=44.3μMの保存液1mLを、L.Zn溶液の最終濃度が8.86μMになるように試験管に入れた。これに、様々な量のADP0.1~4mLの保存ADP溶液8.19mMを加えた。次いで、得られた溶液を、10mMHEPES緩衝液pH7.2を加えて、得られるアリコートの全容積を5mLに維持して希釈し、これをクォーツ分光測光用セル3.5mL容量のマッチドペアを用いた分光光度測定に使用した。全スペクトル変化は、適宜ベースライン補正した後に、複光束分光光度計ShimadzuUV-3101PCを用いて測定した。この滴定中の実験すべてでスリット幅は0.2nmで変更せずにおき、その結果を図5に示す。図5に示すように、様々なADPとの化合物L.Znスキーム1、式1Aの吸収滴定スペクトルである。本発明によれば、化合物の最終濃度がpH7.2で8.86μMであると、ADPの添加量は、0から924モル当量まで徐々に増加し、したがって、錯体L.Zn-ADPの形成による新しいスペクトルバンドが、471nmの波長で観察された。したがって、本発明の錯体L.Zn-ADPの形成の結合定数は、当該化合物およびADPの分光光度滴定実験によると142±15M125°Cであったことが分かる。ATPおよびCTPの31PNMRスペクトル図6Aおよび図6BをBruker500MHzBrukerAvanceII-DPX500MHzFTNMRに記録した。L.Znスキーム1、式1AとのATPの結合も31PNMR分光法により確認した図6A。L.Znスキーム1、式1Aに結合したATPのα、β、およびγ-P-原子の31Pシグナルのアップフィールドシフトそれぞれ0.07ppm、0.09ppm、および0.05ppmが観察された。ほぼ同様のシフトが、他の研究者により過去に報告されているOjida,A.;Park,S.K.;Mito-oka,Y.;Hamachi,I.TetrahedronLett.2002,43,6193。α、β、およびγ-P原子の31PNMRシグナルは、それぞれのリン酸単位を介したL.Znスキーム1、式1AのZn-原子への結合を示す。この所見により我々は、L.Znスキーム1、式1AがATPの存在下でヘプタ配位錯体を形成することができるとの結論に至る。このタイプのヘプタ配位Zn錯体の例は、文献[aLindloy,L.F.;Busch,D.H.Inorg.Chem.1974,13,2494.bWester,D.;Palenik,G.J.J.Am.Chem.Soc.1974,95,6505.]にある。CTPに対して同様の実験を繰り返すと、31Pシグナルの非常に僅かなシフトが観察された図6B。L.Znスキーム1、式1Aに結合したCTPのα、β、およびγ-P-原子の31Pシグナルのアップフィールドシフトそれぞれ0.0ppm、0.03ppm、および0.01ppmが観察された。ADPおよびAMPを用いて同じ実験を行った場合には、そのようなシフトは観察されなかった。したがって、31PNMRスペクトルのデータも、観察された結合親和性の傾向ATP>>CTP>ADP>>AMPを裏付ける。恐らく、ATPとL.Znスキーム1、式1Aとの向上した静電的相互作用が、L.Zn-ATPにおける効率的なL.Zn-Oリン酸結合に非常に重要である。したがって、L.Znスキーム1、式1Aの観察された結合選択性ATP>>CTP>ADP>>AMPは、リン酸種のアニオン電荷数の差に起因し得る。ATPの非存在下および存在下での錯体L.Znスキーム1、式1Aの質量分析を、エレクトロスプレーイオン化ESI技術を用いて行った。本発明の化合物L.Zn、スキーム1、式1AとATPとの錯体が形成されたかどうかを判断するために、文献Kwon,J.Y.;Jang.Y.J.;Lee,Y.J.;Kim,K.M.;SeoM.S.;Nam,W.;Yoon,J.J.Am.Chem.Soc.2005,127,10107を参照してエレクトロスプレーイオン化質量分析を行った。化合物L.Znスキーム1、式1A;7.2μMおよび900μMのATP125モル当量をメスフラスコに入れ、HPLCグレードの水5mLに溶解して、混合液を形成した。次に、この混合液を、ポジティブモードのエレクトロスプレーイオン化ESI技術を用いて質量分析した。その結果、ピークは、m/z=1082周辺で得られ、図7に示す使用機器:ThermoFinniganLCQ登録商標AdvantageMAX四重極イオントラップ機器、サンホセ、カリフォルニア州,米国図7。L.Znスキーム1、式1Aの水溶液にATPのジナトリウム塩の水溶液を加えると、新たな錯体L.Zn-ATPスキーム1、式1Bが形成された。この溶液を、ESI-質量スペクトルの記録に使用し、スペクトルを図7に示す。図7に示すピークは、[C34H49N12P3SO15NaZnH]=[L.ZnNO32-2NO3][C10H12N5O13P3Na2-Na]Hの[C24H37N7P3SO2Zn]に対応する質量を示す。これは、L.Znスキーム1、式1AとATPとの1:1錯体の形成を支持していることが明らかである。したがって、質量スペクトル分析は、提案する錯体L.Zn-ATPの形成を裏付けている。電子スペクトル研究に関する記載について上記したように、本発明のZnII錯体L.Znスキーム1、式1Aは、水溶液中の他のアニオンを認識せず、ATPに選択性を示す。ATPに結合すると、肉眼で検出可能なはっきりした色の変化を伴うより好ましい電荷移動遷移により、503nmにL.Znスキーム1、式1Aの新たな吸収バンドが現われた。したがって、これにより我々はこの本発明のZnII-錯体L.Zn、スキーム1、式1Aを、光学顕微鏡のみを介して観察するための生細胞用の比色染色剤として使用する可能性を調査する機会を得た。真核微生物であるサッカロミセスセレビシエScerevisiaeは、そのエネルギーをATPの形態で取り出し、その細胞の表面は、負電荷を持つATPイオンを有する。したがって、我々は、真核細胞を染色するためのレセプター分子L.Znスキーム1、式1Aを使用することができた。酵母細胞を、レセプター分子L.Znスキーム1、式1A1.16×104Mに20分間またはL.Zn-CDスキーム2[L.Zn]=0.5×103M[α-CD]=2.92×103Mに2分間曝露し、次に、水混合液で洗浄し、次いで光学顕微鏡AXIOIMAGER-CarlZeiss下で観察した。事前のスペクトル研究は、L.Znスキーム1、式1Aの吸収極大463nmは、α-CD0~2.3mMの水溶液をL.Znスキーム1、式1Aの8.3μM溶液へ加えると、より短い波長458nmにシフトすることを示す。CDキャビティーにおける包接がHOMO-LUMOエネルギーギャップに影響を及ぼすことが予想され、これにより吸収スペクトルバンドが影響されるエネルギー準位の摂動は、大きなものであるとは予想されていないが。したがって、本研究では、観察された5nmのシフトは、包接現象および擬ロタキサン錯体の形成に起因する可能性がある。系統的分光光度滴定をした際、吸収極大が5nmシフトすることが分かり、2つの同時等吸収点が観察された。この分光光度滴定に基づいた会合定数を求めると、会合定数値が255±15M1であることが示された。したがって、大過剰のα-CD125倍の存在下では、擬ロタキサン形態、つまり、L.Zn.α-CDスキーム2は、水溶液中で支配的な形態として存在すると考えられる図8。通常の光学顕微鏡AXIOIMAGERCarlZeiss下で観察した無色の酵母細胞の画像を図9Aに示す。このように観察したL.Znスキーム1、式1A0.116mMおよびL.Zn.α-CDスキーム2[L.Zn]=0.5mM、[α-CD]=2.92mMで処理した細胞の画像を、図9Bおよび9C同様の倍率でにそれぞれ示す。図9Aは、処理した細胞がL.Znスキーム1、式1Aで染色されること、細胞の色はピンク色-紫色図9ABに変わったことを示した。酵母細胞の変色は、細胞表面の負電荷を持つリン酸基が、レセプター分子L.Znスキーム1、式1Aに効果的に結合していることを示した。この染色は、水/エタノール70/30、v/vの混合物を用いた後洗浄の後でも安定していることが分かった。エタノールは、脱水剤および生物試料の良好な固定剤として作用することが知られている。当該細胞をL.Znスキーム1、式1A、L.Zn.α-CDスキーム2、または遊離ZnIIイオンの溶液で処理して対照実験を行うと;そのような色の変化は観察されなかった。これは、観察された染色についての妥当な理由として、L.Znスキーム1、式1Aへの細胞表面のATPイオンの結合を裏付ける。細胞表面上のその場で産生されたATPイオンのL.Znスキーム1、式1Aへの結合は、観察された染色の妥当な理由と考えられた。さらに、吸収スペクトル図10Aおよび光学顕微鏡画像図10Bは、染色された細胞が、過剰50モル当量のクエン酸イオンをATPおよび染色された酵母細胞に加えると無色になることを示した。同じ所見が、酵母細胞とL.Zn/L.Zn.α-CDスキーム2との混合物で観察された図10B。この所見は、酵母細胞中でその場で産生されたATPの可逆的結合に基づいて説明することができる。我々はまた、原核生物グラム陽性およびグラム陰性菌細胞の染色剤としてのL.Zn/L.Zn.α-CDの使用可能性を調査した。図9BAおよび9CAは、光学顕微鏡下で観察した場合の2種類の細菌バチルスメガテリウムグラム陽性およびシュードモナスフルオレセンスグラム陰性の画像をそれぞれ示した。図9BBおよび9CBは、L.Znスキーム1、式1A66μMの存在下で観察した場合の同じ細菌の画像を示した。これらの図は、L.Znの存在下で細菌の染色における色の明らかな変化を明確に示した。図9bCおよび9cCは、L.Zn.α-CD[L.Zn]=0.5mM、[α-CD]=2.92mMの存在下で観察した場合の同じ細菌の画像を示した。同一の倍率で撮影した図9Bおよび9Cは、本発明の染料L.Znスキーム1、式1Aがまた、グラム陽性およびグラム陰性菌を、染色した細胞の明らかに異なる色強度および形状によって区別できることを示した。予想されたように、グラム陽性菌の染色された細胞は、染色されたグラム陰性菌のものと比較して長く見えた。L.Zn.α-CDスキーム2による2種類の異なる細菌の染色強度の違いは、各細菌細胞の細胞生物学や、染色の際に関与する詳細な生化学のほか;それぞれの細菌の細胞構造および細胞壁組成の違いに深く言及することがより一層よく理解することができる。ブランク、ならびに染色真核生物酵母、グラム陽性およびグラム陰性細胞のSEM画像図11は、染色の際の細胞の外面の形態変化を示した。染料を有する酵母細胞の画像染色された細胞表面は粗いと認められたとは対照的に、染料が無い酵母細胞のSEM画像は、なめらかであると認められた。これは、細胞に接着している異物、すなわち、L.Znスキーム1、式1Aの存在を示した。染料L.Znスキーム1、式1Aが結合した際の細胞表面の変化も、染色剤の非存在下および存在下での、グラム陰性およびグラム陽性菌について記録したSEM画像から明らかであった図11C~11F。試料表面のSEM画像中のコントラストの違いはまた、試料表面の不均一な化学的性質の表れである。グラム陽性菌と比べたグラム陰性菌の比較的明るい細胞表面は、細胞外表面上により高い負電荷が蓄積していることを示す。影響を受けなかった細胞増殖および成長により、染色剤L.ZnまたはL.Zn.α-CDのいずれかは毒性が無く、染色後に細胞を生存可能に維持したことが裏付けられた。したがって;L.Znスキーム1、式1Aは、ATPなどの生物活性分子の効率的なその場での化学センサーとしてかつ好適な染色剤としても使用することができる。真核生物の酵母細胞サッカロミセスセレビシエならびに原核生物の細菌細胞グラム陽性シュードモナスフルオレセンスおよびグラム陰性バチルスメガテリウムの、L.Znスキーム1、式1Aの非存在下および存在下での、水性培地中における増殖プロファイルを図12に示す。吸光度対時間tの変化を30時間までその後は増殖の大きな変化は観察されなかったのでプロットした。図12a~fは、代謝プロセスにおけるそれぞれの細胞の漸進的な増殖を伴う細胞増殖とATP生成との良好な相関性を示した。これらの動態検査は、増殖の様々な局面をモニタリングするために行われ;ここで、バッチ培養としてのATP濃度の増加は、誘導期から対数期そしてその後の定常期まで増え、最終的には増殖曲線の下落が観察された。図12a、12c、および12eは、それぞれ、経時的なサッカロミセスセレビシエ、シュードモナスフルオレセンス、およびバチルスメガテリウムの実際の増殖曲線を示す。一方、図12b、12d、および12fは、L.Znスキーム1、式1AD1およびL.Zn.α-CDスキーム2D2の存在下での、サッカロミセスセレビシエ、シュードモナスフルオレセンス、およびバチルスメガテリウムの経時的な細胞質中のATPの相対的な増加をそれぞれ示す。図12は、同一の実験条件下の培養物中の実際の細胞増殖およびATP濃度の増加がよく一致したことを示す。実際の細胞増殖およびATP濃度で観察された相対的な減少図12は、ATPを消費する異化プロセスが一定時間以降より重要になることを考慮すれば説明することができる。ATPやADP/AMP/PPiのいずれも、生物系の細胞内では高濃度で保存することはできない。細胞質中のそれらの相対的な濃度は、一般に、様々な生物学的プロセスによって狭い濃度限度に調節されている。実際には、細菌は、確実に細胞の要求が満足されるが超過しないように、代謝プロセスに調節機構を設けている。したがって、この調節の生理的な結果は同じであるが、グラム陽性およびグラム陰性菌における機構は全く異なる。しかしながら、動態検査は、染色剤としてL.Znスキーム1、式1Aを用いると、代謝プロセスの際の細胞増殖およびATPの放出は相関し得ることを示した。グラム陰性菌の場合に観察された吸収変化の程度およびより急峻な傾斜は、グラム陽性菌と比較して、細胞増殖の際に放出されたATPへのL.Znスキーム1、式1Aのより高い結合を示した。細胞の生存能力を、光学顕微鏡下で、L.Znスキーム1、式1Aでの染色の前後に観察した。細胞増殖、細胞分裂、ならびに細胞運動性は、染色した細胞懸濁液を、3時間まで凹面スライド中で調製した懸滴hangingdropとして取った際に観察することができる図13。我々は、金属中心がアニオン性分析物との結合にレセプター単位として作用する容易な2工程合成法に従って、新規なZnIIに基づいた比色センサーL.Znスキーム1、式1Aを合成した。当該センサーは、純粋な水性媒体中でATPに対して選択的であり、ATPに結合した後に著しい色の変化を示す。様々な生体細胞真核および原核細胞で産生されたATPへの結合を介したこの化合物の生細胞を染色する能力を試験した。この試薬は細胞を染色することが分かり、これは光学顕微鏡を介して目で見ることができ、かつ毒性がないことが分かった。この好適な染色剤により、細胞増殖動態に関する研究を行うことができる。本発明は、ZnIIに基づいた比色センサーL.Znスキーム1、式1Aの調製、および生細胞用の好適な染色剤としてのその使用方法を開発することに関連する。ここで、センサーの調製は、リガンドの合成および、亜鉛塩溶液とのその反応を伴う。金属中心は、アニオン性分析物との結合のレセプター単位として作用する。センサーは、水性媒体中でアデノシン三リン酸ATPに選択的であり、ATPに結合後に著しい色の変化を示す。センサーは染色剤として機能し、細胞増殖動態に関する研究を行うことができる。従来技術は、ZnIIに基づいた比色センサーを生細胞用の好適な染色剤としてどのように使用することができるかについて開示も教示もしていない。本発明で初めて、酵母細胞真核生物およびグラム陽性/グラム陰性菌細胞原核生物が、染色された細胞の色強度に基づいて区別され得ることを報告する。さらに、センサーは毒性が無く、細胞の染色後であっても、水性媒体中で生体細胞の細胞増殖動態の評価およびモニタリングに使用することができる。本発明が有する進歩性は、次のとおりである。i様々な生物学的リン酸の中でもATPに優先的に結合するZnIIに基づいた比色センサーL.Znスキーム1、式1Aの調製、iiセンサーは、水性媒体中でpH7.2の生理学的条件下で生細胞の染色に活性がある;iiiセンサーは、生細胞に対して毒性がない、およびivα-シクロデキストリン中へのセンサーの包接が、生細胞の染色強度、およびその後の色強度に基づく分離を増進させる。本発明を通じて我々が解決した技術的課題は、呼吸過程で産生される様々な濃度のATPの認識を介した生体内での細胞増殖動態の評価に使用することができる生細胞用の好適な染色剤を開発することである。生理的条件での生細胞の染色に有用なセンサーに関する従来公知の方法で遭遇する大きな問題の1つは、センサーの毒性である。生細胞の死亡の原因となるので、使用する当該センサーの毒性によりインビボ細胞増殖動態の研究をすることができない。対照的に、本発明のZnに基づいた比色センサーは毒性が無く、生体細胞のインビボ細胞増殖動態の評価に有用であることが分かった。さらに、このセンサーのおかげで、代謝プロセスにおけるそれぞれの細胞の漸進的な増殖に伴う、細胞増殖とアデノシン三リン酸ATPのその場での生成との相関性を確立することができる。[実施例]下記の実施例は、例示するために記載したものであり、したがって本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。容量が250mLの丸底フラスコ中で、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンサイクラム247mg1.23mM濃度を無水テトラヒドロフラン100mL12.3mM濃度に緩やかに撹拌しながら25°Cで溶解した。溶液を含むフラスコを5°Cの温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン5mLを1.0mL/分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン50mL中に4-4’-ジメチルアミノフェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドを400mg含む溶液24.76mM濃度を、50mL/時間、撹拌しながら5°Cの温度で加えた。25°Cの温度に到達した後に混合物を6時間撹拌し、次いで30分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物リガンドを、濃度が15mMになるように25°Cでメタノールに溶解した。これに、リガンドの0.5モル当量の硝酸亜鉛溶液を25°Cの温度で加え、15時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により15°Cまで下げ、さらに3時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物センサーの析出物をクロロホルムで洗浄し、静置した。GYE培地中のサッカロミセス属種100μLを、25°Cにて10分間の期間、1.0×104Mの濃度のセンサー100μLと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。化合物Lスキーム1、式2の単離収率:収率;75収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,CDCl3,TMS,JHz,δppm:7.98-7.962H,d,J=8.0,Ar-He7.9-7.874H,m,Ar-Hc,Hd、7.063H,b,-NHmacrocycle、6.77-6.752H,d,J=8.0,Ar-Hb、3.1516H,br,Hfhijkmno、3.116H,s,-NCH32、2.034H,br,Hgl.ES-msポジティブモード:m/z;488.30MH.元素分析データ:計算値C:59.11,H:7.65,N:20.11,実測値C:59.1,H:7.5,N:20.2。化合物L.Znスキーム1、式1Aの単離収率:収率;65収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,DMF-d7,TMS,δppm:7.92-7.912H,d,J=8.5,Ar-He,7.88-7.862H,d,J=9,Ar-Hc,7.81-7.792H,d,J=8.5,Ar-Hd,6.92-6.92H,d,J=9.5,Ar-Hb,3.136H,s,-NCH32,2.92-2.918H,br,Hfgno,2.75-2.7412H,br,Hhijklm,.ES-msポジティブモード,m/z:676.00M.元素分析:計算値C:42.57,H:5.51,N:18.62;実測値C:42.88,H:5.56,N:18.22。容量が250mLの丸底フラスコ中で、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンサイクラム247mg1.23mM濃度を無水テトラヒドロフラン154mL8.0mM濃度に緩やかに撹拌しながら25°Cで溶解した。溶液を含むフラスコを5°Cの温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン5mLを1.0mL/分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン50mL中に4-4’-ジメチルアミノフェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドを400mg含む溶液24.76mM濃度を、50mL/時間、撹拌しながら5°Cの温度で加えた。25°Cの温度に到達した後に混合物を6時間撹拌し、次いで30分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物リガンドを、濃度が15mMになるように25°Cでメタノールに溶解した。これに、リガンドの0.5モル当量の硝酸亜鉛溶液を25°Cの温度で加え、15時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により15°Cまで下げ、さらに3時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物L.Zn、スキーム1、式1Aの析出物センサーをクロロホルムで洗浄し、静置した。GYE培地中のサッカロミセス属種100μLを、25°Cにて10分間の期間、1.0×104Mの濃度のセンサー100μLと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。化合物Lスキーム1、式2の単離収率:収率;70収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,CDCl3,TMS,JHz,δppm:7.98-7.962H,d,J=8.0,Ar-He7.9-7.874H,m,Ar-Hc,Hd,7.063H,b,-NHmacrocycle,6.77-6.752H,d,J=8.0,Ar-Hb,3.1516H,br,Hfhijkmno,3.116H,s,-NCH32,2.034H,br,Hgl.Es-Msポジティブモード:m/z;488.30MH.元素分析データ:計算値C:59.11,H:7.65,N:20.11,実測値C:59.1,H:7.5,N:20.2。化合物L.Znスキーム1、式1Aの単離収率:収率;65収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,DMF-d7,TMS,δppm:7.92-7.912H,d,J=8.5,Ar-He,7.88-7.862H,d,J=9,Ar-Hc,7.81-7.792H,d,J=8.5,Ar-Hd,6.92-6.92H,d,J=9.5,Ar-Hb,3.136H,s,-NCH32,2.92-2.918H,br,Hfgno,2.75-2.7412H,br,Hhijklm,.ES-msポジティブモード,m/z:676.00M.元素分析:計算値C:42.57,H:5.51,N:18.62;実測値C:42.88,H:5.56,N:18.22。容量が250mLの丸底フラスコ中で、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンサイクラム247mg1.23mM濃度を無水ジクロロメタン100mL12.3mM濃度に緩やかに撹拌しながら25°Cで溶解した。溶液を含むフラスコを5°Cの温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン5mLを1.0mL/分で加えた。別途調製した、無水ジクロロメタン50mL中に4-4’-ジメチルアミノフェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドを400mg含む溶液24.76mM濃度を、50mL/時間、撹拌しながら5°Cの温度で加えた。25°Cの温度に到達した後に混合物を6時間撹拌し、次いで30分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物リガンドを、濃度が15mMになるように25°Cでメタノールに溶解した。これに、リガンドの0.5モル当量の硝酸亜鉛溶液を25°Cの温度で加え、15時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により15°Cまで下げ、さらに3時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物L.Zn、スキーム1、式1Aの析出物センサーをクロロホルムで洗浄し、静置した。GYE培地中のサッカロミセス属種100μLを、25°Cにて10分間の期間、1.0×104Mの濃度のセンサー100μLと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。化合物Lスキーム1、式2の単離収率:収率;30収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,CDCl3,TMS,JHz,δppm:7.98-7.962H,d,J=8.0,Ar-He7.9-7.874H,m,Ar-Hc,Hd,7.063H,b,-NHmacrocycle,6.77-6.752H,d,J=8.0,Ar-Hb,3.1516H,br,Hfhijkmno,3.116H,s,-NCH32,2.034H,br,Hgl.Es-Msポジティブモード:m/z;488.30MH.元素分析データ:計算値C:59.11,H:7.65,N:20.11,実測値C:59.1,H:7.5,N:20.2。化合物L.Znスキーム1、式1Aの単離収率:収率;65収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,DMF-d7,TMS,δppm:7.92-7.912H,d,J=8.5,Ar-He,7.88-7.862H,d,J=9,Ar-Hc,7.81-7.792H,d,J=8.5,Ar-Hd,6.92-6.92H,d,J=9.5,Ar-Hb,3.136H,s,-NCH32,2.92-2.918H,br,Hfgno,2.75-2.7412H,br,Hhijklm,.ES-msポジティブモード,m/z:676.00M.元素分析:計算値C:42.57,H:5.51,N:18.62;実測値C:42.88,H:5.56,N:18.22。容量が250mLの丸底フラスコ中で、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンサイクラム247mg1.23mM濃度を無水テトラヒドロフラン100mL12.3mM濃度に緩やかに撹拌しながら25°Cで溶解した。溶液を含むフラスコを5°Cの温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン5mLを1.0mL/分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン62mL中に4-4’-ジメチルアミノフェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドを400mg含む溶液20mM濃度を、50mL/時間、撹拌しながら5°Cの温度で加えた。25°Cの温度に到達した後に混合物を6時間撹拌し、次いで30分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物リガンドを、濃度が15mMになるように25°Cでメタノールに溶解した。これに、リガンドの0.5モル当量の硝酸亜鉛溶液を25°Cの温度で加え、15時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により15°Cまで下げ、さらに3時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物L.Zn、スキーム1、式1Aの析出物センサーをクロロホルムで洗浄し、静置した。GYE培地中のサッカロミセス属種100μLを、25°Cにて10分間の期間、1.0×104Mの濃度のセンサー100μLと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。化合物Lスキーム1、式2の単離収率:収率68収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,CDCl3,TMS,JHz,δppm:7.98-7.962H,d,J=8.0,Ar-He7.9-7.874H,m,Ar-Hc,Hd,7.063H,b,-NHmacrocycle,6.77-6.752H,d,J=8.0,Ar-Hb,3.1516H,br,Hfhijkmno,3.116H,s,-NCH32,2.034H,br,Hgl.Es-Msポジティブモード:m/z;488.30MH.元素分析データ:計算値C:59.11,H:7.65,N:20.11,実測値C:59.1,H:7.5,N:20.2。化合物L.Znスキーム1、式1Aの単離収率:収率65収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,DMF-d7,TMS,δppm:7.92-7.912H,d,J=8.5,Ar-He,7.88-7.862H,d,J=9,Ar-Hc,7.81-7.792H,d,J=8.5,Ar-Hd,6.92-6.92H,d,J=9.5,Ar-Hb,3.136H,s,-NCH32,2.92-2.918H,br,Hfgno,2.75-2.7412H,br,Hhijklm,.ES-msポジティブモード,m/z:676.00M.元素分析:計算値C:42.57,H:5.51,N:18.62;実測値C:42.88,H:5.56,N:18.22。容量が250mLの丸底フラスコ中で、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンサイクラム247mg1.23mM濃度を無水テトラヒドロフラン100mL12.3mM濃度に緩やかに撹拌しながら25°Cで溶解した。溶液を含むフラスコを5°Cの温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン5mLを1.0mL/分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン62mL中に4-4’-ジメチルアミノフェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドを400mg含む溶液20mM濃度を、25mL/時間、撹拌しながら5°Cの温度で加えた。25°Cの温度に到達した後に混合物を6時間撹拌し、次いで30分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物リガンドを、濃度が15mMになるように25°Cでメタノールに溶解した。これに、リガンドの0.35モル当量の硝酸亜鉛溶液を25°Cの温度で加え、15時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により15°Cまで下げ、そして、さらに3時間激しく撹拌した。所望の化合物L.Zn、スキーム1、式1Aの析出物センサーをクロロホルムで洗浄し、静置した。GYE培地中のサッカロミセス属種100μLを、25°Cにて10分間の期間、1.0×104Mの濃度のセンサー100μLと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。化合物Lスキーム1、式2の単離収率:収率75収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,CDCl3,TMS,JHz,δppm:7.98-7.962H,d,J=8.0,Ar-He7.9-7.874H,m,Ar-Hc,Hd,7.063H,b,-NHmacrocycle,6.77-6.752H,d,J=8.0,Ar-Hb,3.1516H,br,Hfhijkmno,3.116H,s,-NCH32,2.034H,br,Hgl.Es-Msポジティブモード:m/z;488.30MH.元素分析データ:計算値C:59.11,H:7.65,N:20.11,実測値C:59.1,H:7.5,N:20.2。化合物L.Znスキーム1、式1Aの単離収率:収率50収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,DMF-d7,TMS,δppm:7.92-7.912H,d,J=8.5,Ar-He,7.88-7.862H,d,J=9,Ar-Hc,7.81-7.792H,d,J=8.5,Ar-Hd,6.92-6.92H,d,J=9.5,Ar-Hb,3.136H,s,-NCH32,2.92-2.918H,br,Hfgno,2.75-2.7412H,br,Hhijklm,.ES-msポジティブモード,m/z:676.00M.元素分析:計算値C:42.57,H:5.51,N:18.62;実測値C:42.88,H:5.56,N:18.22。容量が250mLの丸底フラスコ中で、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンサイクラム247mg1.23mM濃度を無水テトラヒドロフラン100mL12.3mM濃度に緩やかに撹拌しながら25°Cで溶解した。溶液を含むフラスコを5°Cの温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン5mLを1.0mL/分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン62mL中に4-4’-ジメチルアミノフェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドを400mg含む溶液20mM濃度を、25mL/時間、撹拌しながら5°Cの温度で加えた。25°Cの温度に到達した後に混合物を6時間撹拌し、次いで30分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物リガンドを、濃度が15mMになるように25°Cでメタノールに溶解した。これに、リガンドの0.75モル当量の硝酸亜鉛溶液を25°Cの温度で加え、15時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により15°Cまで下げ、さらに3時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物L.Zn、スキーム1、式1Aの析出物センサーをクロロホルムで洗浄し、静置した。GYE培地中のサッカロミセス属種100μLを、25°Cにて10分間の期間、1.0×104Mの濃度のセンサー100μLと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。化合物Lスキーム1、式2の単離収率:収率75収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,CDCl3,TMS,JHz,δppm:7.98-7.962H,d,J=8.0,Ar-He7.9-7.874H,m,Ar-Hc,Hd,7.063H,b,-NHmacrocycle,6.77-6.752H,d,J=8.0,Ar-Hb,3.1516H,br,Hfhijkmno,3.116H,s,-NCH32,2.034H,br,Hgl.Es-Msポジティブモード:m/z;488.30MH.元素分析データ:計算値C:59.11,H:7.65,N:20.11,実測値C:59.1,H:7.5,N:20.2。化合物L.Znスキーム1、式1Aの単離収率:収率63収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,DMF-d7,TMS,δppm:7.92-7.912H,d,J=8.5,Ar-He,7.88-7.862H,d,J=9,Ar-Hc,7.81-7.792H,d,J=8.5,Ar-Hd,6.92-6.92H,d,J=9.5,Ar-Hb,3.136H,s,-NCH32,2.92-2.918H,br,Hfgno,2.75-2.7412H,br,Hhijklm,.ES-msポジティブモード,m/z:676.00M.元素分析:計算値C:42.57,H:5.51,N:18.62;実測値C:42.88,H:5.56,N:18.22。容量が250mLの丸底フラスコ中で、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンサイクラム247mg1.23mM濃度を無水テトラヒドロフラン100mL12.3mM濃度に緩やかに撹拌しながら25°Cで溶解した。溶液を含むフラスコを5°Cの温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン5mLを1.0mL/分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン62mL中に4-4’-ジメチルアミノフェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドを400mg含む溶液20mM濃度を、25mL/時間、撹拌しながら5°Cの温度で加えた。25°Cの温度に到達した後に混合物を6時間撹拌し、次いで30分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物リガンドを、濃度が15mMになるように25°Cでメタノールに溶解した。これに、リガンドの0.75モル当量の硝酸亜鉛溶液を25°Cの温度で加え、15時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により15°Cまで下げ、さらに3時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物L.Zn、スキーム1、式1Aの析出物センサーをクロロホルムで洗浄し、静置した。ニュートリエントブロス培地中のバチルス属種100μLを、25°Cにて10分間の期間、1.0×104Mの濃度のセンサー100μLと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。化合物Lスキーム1、式2の単離収率:収率75収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,CDCl3,TMS,JHz,δppm:7.98-7.962H,d,J=8.0,Ar-He7.9-7.874H,m,Ar-Hc,Hd,7.063H,b,-NHmacrocycle,6.77-6.752H,d,J=8.0,Ar-Hb,3.1516H,br,Hfhijkmno,3.116H,s,-NCH32,2.034H,br,Hgl.Es-Msポジティブモード:m/z;488.30MH.元素分析データ:計算値C:59.11,H:7.65,N:20.11,実測値C:59.1,H:7.5,N:20.2。化合物L.Znスキーム1、式1Aの単離収率:収率;65収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,DMF-d7,TMS,δppm:7.92-7.912H,d,J=8.5,Ar-He,7.88-7.862H,d,J=9,Ar-Hc,7.81-7.792H,d,J=8.5,Ar-Hd,6.92-6.92H,d,J=9.5,Ar-Hb,3.136H,s,-NCH32,2.92-2.918H,br,Hfgno,2.75-2.7412H,br,Hhijklm,.ES-msポジティブモード,m/z:676.00M.元素分析:計算値.C:42.57,H:5.51,N:18.62;実測値C:42.88,H:5.56,N:18.22。容量が250mLの丸底フラスコ中で、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンサイクラム247mg1.23mM濃度を無水テトラヒドロフラン100mL12.3mM濃度に緩やかに撹拌しながら25°Cで溶解した。溶液を含むフラスコを5°Cの温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン5mLを1.0mL/分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン62mL中に4-4’-ジメチルアミノフェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドを400mg含む溶液20mM濃度を、25mL/時間、撹拌しながら5°Cの温度で加えた。25°Cの温度に到達した後に混合物を6時間撹拌し、次いで30分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物リガンドを、濃度が15mMになるように25°Cでメタノールに溶解した。これに、リガンドの0.75モル当量の硝酸亜鉛溶液を25°Cの温度で加え、15時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により15°Cまで下げ、さらに3時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物L.Zn、スキーム1、式1Aの析出物センサーをクロロホルムで洗浄し、静置した。キングB培地中のシュードモナス属種100μLを、25°Cにて10分間の期間、1.0×104Mの濃度のセンサー100μLと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。化合物Lスキーム1、式2の単離収率:収率75収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,CDCl3,TMS,JHz,δppm:7.98-7.962H,d,J=8.0,Ar-He7.9-7.874H,m,Ar-Hc,Hd,7.063H,b,-NHmacrocycle,6.77-6.752H,d,J=8.0,Ar-Hb,3.1516H,br,Hfhijkmno,3.116H,s,-NCH32,2.034H,br,Hgl.Es-Msポジティブモード:m/z;488.30MH.元素分析データ:計算値C:59.11,H:7.65,N:20.11,実測値C:59.1,H:7.5,N:20.2。化合物L.Znスキーム1、式1Aの単離収率:収率65収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,DMF-d7,TMS,δppm:7.92-7.912H,d,J=8.5,Ar-He,7.88-7.862H,d,J=9,Ar-Hc,7.81-7.792H,d,J=8.5,Ar-Hd,6.92-6.92H,d,J=9.5,Ar-Hb,3.136H,s,-NCH32,2.92-2.918H,br,Hfgno,2.75-2.7412H,br,Hhijklm,.ES-msポジティブモード,m/z:676.00M.元素分析:計算値C:42.57,H:5.51,N:18.62;実測値C:42.88,H:5.56,N:18.22。容量が250mLの丸底フラスコ中で、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンサイクラム247mg1.23mM濃度を無水テトラヒドロフラン100mL12.3mM濃度に緩やかに撹拌しながら25°Cで溶解した。溶液を含むフラスコを5°Cの温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン5mLを1.0mL/分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン62mL中に4-4’-ジメチルアミノフェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドを400mg含む溶液20mM濃度を、25mL/時間、撹拌しながら5°Cの温度で加えた。25°Cの温度に到達した後に混合物を6時間撹拌し、次いで30分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物リガンドを、濃度が15mMになるように25°Cでメタノールに溶解した。これに、リガンドの0.75モル当量の硝酸亜鉛溶液を25°Cの温度で加え、15時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により15°Cまで下げ、さらに3時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物L.Zn、スキーム1、式1Aの析出物センサーをクロロホルムで洗浄し、静置した。キングB培地中のシュードモナス属種100μLを、25°Cにて10分間の期間、1.25×104Mの濃度のセンサー100μLと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。化合物Lスキーム1、式2の単離収率:収率75収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,CDCl3,TMS,JHz,δppm:7.98-7.962H,d,J=8.0,Ar-He7.9-7.874H,m,Ar-Hc,Hd,7.063H,b,-NHmacrocycle,6.77-6.752H,d,J=8.0,Ar-Hb,3.1516H,br,Hfhijkmno,3.116H,s,-NCH32,2.034H,br,Hgl.Es-Msポジティブモード:m/z;488.30MH.元素分析データ:計算値C:59.11,H:7.65,N:20.11,実測値C:59.1,H:7.5,N:20.2。収率65収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,DMF-d7,TMS,δppm:7.92-7.912H,d,J=8.5,Ar-He,7.88-7.862H,d,J=9,Ar-Hc,7.81-7.792H,d,J=8.5,Ar-Hd,6.92-6.92H,d,J=9.5,Ar-Hb,3.136H,s,-NCH32,2.92-2.918H,br,Hfgno,2.75-2.7412H,br,Hhijklm,.ES-msポジティブモード,m/z:676.00M.元素分析:計算値C:42.57,H:5.51,N:18.62;実測値C:42.88,H:5.56,N:18.22。容量が250mLの丸底フラスコ中で、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカンサイクラム247mg1.23mM濃度を無水テトラヒドロフラン100mL12.3mM濃度に緩やかに撹拌しながら25°Cで溶解した。溶液を含むフラスコを5°Cの温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン5mLを1.0mL/分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン62mL中に4-4’-ジメチルアミノフェニルアゾベンゼンスルホニルクロリドを400mg含む溶液20mM濃度を、25mL/時間、撹拌しながら5°Cの温度で加えた。25°Cの温度に到達した後に混合物を6時間撹拌し、次いで30分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物リガンドを、濃度が15mMになるように25°Cでメタノールに溶解した。これに、リガンドの0.75モル当量の硝酸亜鉛溶液を25°Cの温度で加え、15時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により15°Cまで下げ、さらに3時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物L.Zn、スキーム1、式1Aの析出物センサーをクロロホルムで洗浄し、静置した。キングB培地中のシュードモナス属種100μLを、25°Cにて10分間の期間、1.45×104Mの濃度のセンサー100μLと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。化合物Lスキーム1、式2の単離収率:収率75収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,CDCl3,TMS,JHz,δppm:7.98-7.962H,d,J=8.0,Ar-He7.9-7.874H,m,Ar-Hc,Hd,7.063H,b,-NHmacrocycle,6.77-6.752H,d,J=8.0,Ar-Hb,3.1516H,br,Hfhijkmno,3.116H,s,-NCH32,2.034H,br,Hgl.Es-Msポジティブモード:m/z;488.30MH.元素分析データ:計算値C:59.11,H:7.65,N:20.11,実測値C:59.1,H:7.5,N:20.2。収率65収率は出発化合物に基づいて算出した。1HNMR500MHz,DMF-d7,TMS,δppm:7.92-7.912H,d,J=8.5,Ar-He,7.88-7.862H,d,J=9,Ar-Hc,7.81-7.792H,d,J=8.5,Ar-Hd,6.92-6.92H,d,J=9.5,Ar-Hb,3.136H,s,-NCH32,2.92-2.918H,br,Hfgno,2.75-2.7412H,br,Hhijklm,.ES-msポジティブモード,m/z:676.00M.元素分析:計算値C:42.57,H:5.51,N:18.62;実測値C:42.88,H:5.56,N:18.22。[本発明の利点]1.ZnIIに基づいた比色センサーは、他のヌクレオチドよりも、優先的にアデノシン三リン酸ATPと結合する。2.センサーは、生細胞に毒性が無い。3.センサーは、好適な染色剤としてかつ細胞増殖動態研究用に使用することができる。4.α-シクロデキストリンの使用が、センサーの水に対する溶解性を向上させる。5.染色された微生物細胞は、光学顕微鏡を介して、ならび培養液中でセンサーと共に肉眼ではっきりと見ることができる。6.センサーは本質的に非親油性である。7.染色方法は容易単一の染色剤であり、迅速であり、環境にやさしい。8.これは、一工程のみでグラム陽性菌とグラム陰性菌とを区別することができる特殊な染色剤である。"