"ジメチルスルホキシド代替物としてのフルクタンを有効成分とする、細胞の凍結保存液。凍結保護作用として有効な量のジメチルスルホキシドを含まないものである、請求項1に記載の凍結保存液。無血清である、請求項1または2に記載の凍結保存液。エチレングリコール、プロピレングリコール、またはこれらの混合物を有効成分としてさらに含んでなる、請求項1~3のいずれか一項に記載の凍結保存液。フルクタンが、フルクトースのβ2→1グルコシド結合による直鎖状重合体を主鎖とする、イヌリン型フルクタン、フルクトースのβ2→6グルコシド結合による直鎖状重合体を主鎖とする、レバン型フルクタン、フルクトースのβ2→1およびβ2→6の両グルコシド結合を含む重合体を主鎖とする、フルクタン、およびこれらのフルクタンの加水分解物からなる群から選択される一種以上のものである、請求項1~4のいずれか一項に記載の凍結保存液。フルクタンが、ネギ科植物、キク科植物、マメ科植物、イネ科植物、ユリ科植物、ヤマノイモ科、リュウゼツラン科植物、アヤメ科植物、およびラン科植物からなる群から選択される植物の根または根茎由来である、請求項1~5のいずれか一項に記載の凍結保存液。フルクタンが、ラッキョウ、ニンニク、タマネギからなる群より選択されるネギ属植物の根または根茎由来である、請求項1~6のいずれか一項に記載の凍結保存液。フルクタンを植物の抽出物として含んでなる、請求項1~7のいずれか一項に記載の凍結保存液。フルクタンが、植物の抽出物を、限外濾過膜処理、エタノール沈殿処理、またはアセトン沈殿することにより精製されたものである、請求項1~8のいずれか一項に記載の凍結保存液。フルクタンの濃度が、20~60w/vである、請求項1~9のいずれか一項に記載の凍結保存液。細胞が、動物細胞である、請求項1~10のいずれか一項に記載の凍結保存液。細胞が、細胞集合体、組織、または組織片を形成しているものである、請求項1~11のいずれか一項に記載の凍結保存液。請求項1~12のいずれか一項に記載の凍結保存液を用いて、細胞を凍結保存することを含んでなる、細胞の凍結保存方法。細胞を懸濁した凍結保存液を、液体窒素によって急冷する工程を含んでなる、請求項13に記載の方法。以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。例1:フルクタンの調製方法小規模冷凍ラッキョウ500.1g三里浜特産農協より入手に対し1.5倍量の水を加え、フードカッター愛工舎製作所製でホモジナイズした後、綿布を用いて絞り、絞り汁を回収した。絞り粕に対し1.5倍量の水を加え、ホモジナイズした後、再度絞り汁を回収し、先の絞り汁と合わせた。得られた絞り汁を、pH10になるまで5水酸化カルシウム溶液を添加した後、炭酸ガスを通しpH6.9まで中和した。中和した絞り汁を、沸騰水中で、液温が80°Cに達してから20分間加熱蒸煮した。得られた絞り汁を、冷却後、濾紙アドバンテック製No.2を用いて濾過した。濾液に対し、1/7量の活性炭粒状活性炭、松葉薬品製を添加し、一晩放置後、珪藻土ナカライテスク製で濾過し活性炭の除去を行った。粉末化得られた濾液1100mlに対しエタノール5000mlを加えてフルクタンを沈殿させた。得られた沈殿物を、デカンテーションにより回収し、水に再溶解した溶液を、一晩、4°Cで、透析透析膜1-7/8、分画分子量12,000~14,000、三光純薬株式会社より入手した後、凍結乾燥して、フルクタン粉末59.03gを得た。例2:フルクタンの調製方法大規模原料としての乾燥ラッキョウ200.7kg威斯食品工業より入手を、2mm以下程度に粉砕し、2.76kgの水酸化カルシウムを懸濁させた抽出用の水に混合し、1時間、常温抽出を行い、1時間、95°Cで加熱抽出し、一晩、60°Cで加熱抽出した後、活性炭100kg粉末状活性炭、日本エンバイロケミカルズ製を添加して脱臭処理を行った。その後、珪藻土中央シリカ株式会社より入手で濾過し、残渣と活性炭を除去した。1限外濾過膜精製得られた抽出液を、限外濾過膜モジュールNTR-7430HG-S4F日東電工社製に通液させて、フルクタンの精製を行った。得られた精製液は、一端加熱殺菌した後、活性炭10kgを添加して再度脱色処理を行った。その後、精製液を、減圧濃縮し、85°Cで1時間加熱することにより殺菌し、噴霧乾燥により粉末化を行ったところ、精製フルクタン粉末91.6kgを得た。得られた精製フルクタン粉末は、フルクタン含量測定、分子量分布の分析を行った。フルクタン含量純度測定フルクタン含量は、フルクタンを加水分解し、得られた果糖の量から算出した。加水分解の手順としては、希釈した抽出液に10w/vクエン酸溶液を添加してpH3.0以下に調整し、100°Cで150分間加熱を行った後、1mol/Lの水酸化ナトリウム溶液で中和し、定容した。その後、F-キットロシュダイアグノスティックス社製を用いて、加水分解物の果糖含量と、加水分解前の抽出液の果糖含量およびスクロース含量とを測定し、下記式により、フルクタン含量を算出した。フルクタン含量=0.9×加水分解後果糖含量-加水分解前果糖含量-加水分解前スクロース含量×180.16/342.3F-キットにより果糖含量およびスクロース含量を計測する際の吸光度の測定340nmには、島津製作所製の分光光度計UVmini-1240を使用した。粉末化した試料については、予め適量の脱イオン水に溶解させた後、抽出液と同様に分析を行った。分子量分布の分析フルクタンの分子量分布の分析は、高速液体クロマトグラフHPLCを用いて行ったGFC分析。分析条件は下記の通りである。分析用の試料は、抽出液または粉末を0.2mol/Lの硝酸ナトリウム溶液で希釈したものを、0.45μmのメンブレンフィルターミニザルトRC、ザルトリウスステディム製で濾過したものを用いた。フルクタン分子量HPLC分析条件装置:CCP8020シリーズ東ソー製カラム:TSKguardcolumnPWXL,TSKgelG4000PWXL,G3000PWXL,G2500PWXL東ソー製検出器:示差屈折計RI-8020東ソー製溶離液:0.2M硝酸ナトリウム溶液流速:1.0ml/minアプライ量:100μlカラム温度:40°C分子量マーカー:プルランShodexSTANDARDP-82、昭和電工社製測定の結果、得られた精製フルクタン粉末のフルクタン含量は、92.6であった。これは、後述する限外濾過膜処理による精製を行わない製法により調製されたフルクタン粉末の含量81.5を大きく上回っていた。また、フルクタン分子量は、6,000~110,000Da付近に広い分布を示していた図1参照。2エタノール沈殿による精製限外濾過膜処理を行わない製法でフルクタンを調製し、エタノール沈殿による精製を検討した。i限界濾過膜処理を行わない製法によるフルクタンの調製原料としての乾燥ラッキョウ500kg威斯食品工業より入手を、粒径2mm以下程度に粉砕し、6.9kgの水酸化カルシウムを懸濁させた抽出用の水原料に対して10倍量に混合し、1時間、常温抽出を行い、1時間、95°Cで加熱抽出し、3時間、60°Cで加熱抽出した後、抽出液に活性炭250kg粉末状活性炭、日本エンバイロケミカルズ製を添加し、1時間撹拌し、活性炭処理を行った。その後、40~45°Cの温度を維持しながら珪藻土中央シリカ株式会社より入手で濾過した。次に抽出液を減圧濃縮処理し、濃縮抽出液を85°Cで1時間加熱殺菌し、加熱後の濃縮抽出液を噴霧乾燥して、フルクタンを含有する粉末を254kg得たフルクタン含量81.5。iiエタノール沈殿フルクタンの20溶液前記iで得られた粉末を水に溶解したものを下記表1の量でエタノールに添加し、フルクタンを沈殿させた。珪藻土濾過により沈殿を回収し、水に再溶解させた後、再度濾過して得られた精製液を、凍結乾燥により粉末化した。各精製粉末のフルクタン含量とフルクタン分子量を前述の方法にて分析した結果を下記の表1および図2に示す。例3:フルクタンの凍結保護効果動物細胞の凍結保存に対して、フルクタンの細胞保護効果を検証した。凍結保存液の調製リン酸緩衝液PBSリン酸濃度9.5mM、pH7.6に、終濃度が10v/vになるようにジメチルスルホキシドDMSO和光純薬工業株式会社より入手を添加し、さらにこれに対し終濃度が10w/vになるように例21で調製したフルクタン粉末を添加したものを凍結保存液として用いた。対照凍結保存液として、10のDMSOを含むリン酸緩衝液を用いた。凍結保存試験試験には、0.1BSAを添加したASF104培地味の素社製で培養したマウスハイブリドーマ細胞2E3-O株を用いた。各凍結保存液に、上記細胞を細胞濃度が約1.0×106cells/mlとなるように懸濁し、これをそれぞれ凍結チューブ住友ベークライト社製に1mlずつ入れた。次いで、凍結チューブを、-80°Cフリーザーを用いて、7日間、保存した後、37°C水浴にチューブを漬けて解凍した。解凍した細胞を、0.1BSAを添加したASF104培地味の素社製にて20時間培養した後、トリパンブルー色素排除法により、生細胞密度と死細胞の密度とを測定し、下記式により、各凍結保存液についての生存率を算出した。生存率=生細胞密度/生細胞密度死細胞の密度×100その結果を表2に示す。例4:構造および抽出方法の異なるフルクタンを用いた凍結保護効果の検証4-1構造の異なるフルクタンを用いた凍結保護効果の検証リン酸緩衝液に、終濃度が10v/vになるようにDMSOを添加し、さらにこれに対し終濃度が0.1w/vになるように、レバン和光純薬工業株式会社より入手、イヌリンシグマ社より入手、上記例1にて調製したフルクタンをそれぞれ添加したものを凍結保存液として用いた。対照凍結保存液として、終濃度10v/vとなるようにDMSOを添加したリン酸緩衝液を用いた。凍結保存液および解凍後の培養時間を3日間に変更した以外は、例3と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。その結果を下記の表3に示す。4-2抽出方法の異なるフルクタンを用いた凍結保護効果の検証リン酸緩衝液に、例21で調製したフルクタン粉末純度92.6、または抽出時にpH5.1~5.4の条件下で一晩加熱させて低分子化させたフルクタン低分子化フルクタンを、溶媒量に対して30w/vとなるように添加したもの例えば、フルクタン粉末の場合は、PBS100mlにフルクタン粉末30gを添加したものフルクタン粉末添加濃度30を凍結保存液として用いた。対照凍結保存液として、ウシ胎児血清FBSBIOWEST社に、終濃度10v/vとなるようにDMSOを添加したものを用いた。凍結保存液および解凍後の培養時間を65時間に変更した以外は、例3と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。その結果を下記の表4に示す。フルクタンの終濃度の測定1純度を用いた測定フルクタン粉末添加濃度30におけるフルクタンの終濃度は、25mlのPBS溶液にフルクタン粉末7.5gを溶解したところ、総量29.8mlであり、フルクタン粉末の純度が92.6であったことから、概算上23.3w/vであった。2フェノール硫酸法前記フルクタン粉末添加濃度30の終濃度を、フェノール硫酸法でも測定した。凍結保存液100μlと、5W/Vフェノール100μlとを試験管で混合し、撹拌した。混合液に硫酸500μlを加え、良く撹拌させた後、40°Cの恒温槽15分間反応させ、反応液を490nmで吸光度を測定した。その結果、フルクタン粉末添加濃度30の終濃度は、24.0w/vとなった。例5:フルクタン濃度の検証リン酸緩衝液に、例21にて調製したフルクタンを、それぞれ溶媒量に対して15、30、45、60、75w/vとなるように添加したもの例えば、フルクタン15の場合は、PBS100mlにフルクタン15gを添加したものフルクタン添加濃度15を凍結保存液として用いた。対照凍結保存液として、ウシ胎児血清FBSに、終濃度10v/vとなるようにDMSOを添加したものを用いた。凍結保存液および解凍後の培養時間を68時間に変更した以外は、例3と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。その結果を下記の表5に示す。さらに、リン酸緩衝液に、例21にて調製したフルクタンを、それぞれの溶媒量に対して25、30、35、40、45、50w/vとなるように添加したものを凍結保存液として用いた。対照凍結保存液として、フルクタン無添加のリン酸緩衝液およびウシ胎児血清に、終濃度10となるようにDMSOを添加したものを用いた。凍結保存液および解凍後の培養時間を65時間に変更した以外は、例3と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。その結果を下記の表6に示す。例6:凍結保存液の検討リン酸緩衝液に、濃度0、1.0、3.0、5.0、10v/vとなるようにDMSOを添加し、さらにこの混合溶媒に対して40w/vとなるように例21にて調製したフルクタンを添加したもの例えば、DMSO5.0の場合は、PBS95mlにDMSO5mlを添加し、さらにフルクタン40gを添加し、濾過滅菌したものDMSO5.0、フルクタン添加濃度40を凍結保存液として用いた。対照凍結液として、ウシ胎児血清に、終濃度10v/vとなるようにDMSOを添加したものを用いた。凍結保存液および解凍後の培養時間を42時間に変更した以外は、例3と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。その結果を下記表7に示す。例7:エチレングリコールとフルクタンとを含んでなる凍結保存液の検討リン酸緩衝液に、濃度0、2.5、5.0、7.5、10v/vとなるようにエチレングリコールEG058-00986、和光純薬工業株式会社より入手を添加し、さらにこの混合溶媒に対して30w/vとなるように例21にて調製したフルクタンを添加したもの例えば、EG5.0の場合は、PBS9.5mlにEG0.5mlを添加し、さらにフルクタン3gを添加し、濾過滅菌したものEG5.0、フルクタン添加濃度30を凍結保存液として用いた。対照凍結液として、ウシ胎児血清に、終濃度10v/vとなるようにDMSOを添加したものを用いた。凍結保存液および解凍後の培養時間を37時間に変更した以外は、例3と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。その結果を下記表8に示す。また、添加するエチレングリコールの濃度は、2.5未満では、凍結保護効果が十分でなく、15以上となると、生細胞密度の減少が生じた。例8:プロピレングリコールとフルクタンとを含んでなる凍結保存液の検討リン酸緩衝液に、濃度0、1.0、2.0、4.0、8.0v/vとなるようにプロピレングリコールPG164-04996、和光純薬工業株式会社より入手を添加し、さらにこの混合溶媒に対して30w/vとなるように例21にて調製したフルクタンを添加したもの例えば、PG5.0の場合は、PBS9.5mlにPG0.5mlを添加し、さらにフルクタン3gを添加し、濾過滅菌したものPG5.0、フルクタン添加濃度30を凍結保存液として用いた。対照凍結液としては、ウシ胎児血清に、終濃度10v/vとなるようにDMSOを添加したものを用いた。凍結保存液および解凍後の培養時間を37時間に変更した以外は、例3と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。その結果を下記表9に示す。また、添加するプロピレングリコールの濃度は、8.0以上となると生細胞密度の減少が生じた。例9:CHO細胞への凍結保護効果下記の表10記載の組成で凍結保存液を調製した。なお、フルクタンは、例21にて調製したフルクタンを用いた。試験には、無血清培地ISCD-CHOISジャパン社製にグルタミン2mMを添加した培地で培養したCHOChineseHamsterovaryDP-12細胞AmericanTypeCellularCollectionより入手を用いた。各凍結保存液に、上記細胞を細胞濃度が約1.0×106cells/mlとなるように懸濁し、これをそれぞれ凍結チューブ住友ベークライト社製に1mlずつ入れた。次いで、凍結チューブを、-80°Cフリーザーを用いて、数日間6日間保存した後、37°C水浴にチューブを漬けて解凍した。解凍した細胞を、無血清培地IS-CHO-CDISジャパン社製にて4日間培養した。各凍結保存液について、解凍直後、2日後、4日後の生細胞数と死細胞数をトリパンブルー色素排除法により測定した。その結果を図3に示す。例10:間葉系幹細胞への凍結保護効果下記の表11記載の組成で凍結液を調製した。なお、フルクタンは、例21にて調製したフルクタンを用いた。試験には、15FBSBIOWEST社より入手を添加したα-MEM培地ギブコ社より入手で培養した、ウイスターラット三協ラボサービスより入手から単離した骨髄由来の間葉系幹細胞を用いた。各凍結保存液に、上記細胞を細胞濃度が約1.0×106cells/mlとなるように懸濁し、これをそれぞれ凍結チューブ住友ベークライト社製に1mlずつ入れた。次いで、凍結チューブを、-80°Cフリーザーを用いて、5日間保存した後、37°C水浴にチューブを漬けて解凍した。解凍した細胞を、FBSを15含むα-MEMにて3日間培養した。各凍結保存液について、解凍直後、1日後、2日後、3日後の生細胞数と死細胞数をトリパンブルー色素排除法により測定した。その結果を図4に示す。"