"2つの異なるサンプル群間のタンパク質の網羅的な発現変動量データ群と、前記2つの異なるサンプル群間の遺伝子の網羅的な発現変動量データ群とに基づいて、統合プロテオーム解析に供するデータ群を生成する統合プロテオーム解析用データ群の生成方法であって、前記タンパク質の網羅的な発現変動量データ群を構成する各タンパク質毎の発現変動量データに、そのタンパク質の第1のデータベースにおける固有番号と同タンパク質をコードする遺伝子の第2のデータベースにおける固有番号とに紐付けされた共通固有番号を付与するタンパク質固有番号共通化ステップと、前記遺伝子の網羅的な発現変動量データ群を構成する各遺伝子毎の発現変動量データに、その遺伝子の第3のデータベースにおける固有番号と同遺伝子より発現するタンパク質の第1のデータベースにおける固有番号とに紐付けされた共通固有番号を付与する遺伝子固有番号共通化ステップと、前記タンパク質固有番号共通化ステップを経たタンパク質の網羅的な発現変動量データ群と、前記遺伝子固有番号共通化ステップを経た遺伝子の網羅的な発現変動量データ群とを結合して、各タンパク質毎の発現変動量データと各遺伝子毎の発現変動量データとにより構成される結合データ群を生成するデータ結合ステップと、結合データ群を構成する各発現変動量データのうち、2つの異なるサンプル群間のタンパク質の発現変動量または遺伝子の発現変動量の有意差検定により得られたp値が所定値以上、または分散分析によるF値が所定値以下のデータを棄却するデータ棄却ステップと、前記データ棄却ステップを経た結合データ群のうち、タンパク質発現変動量データと遺伝子発現変動量データとで同じ共通固有番号が付与されているデータに対し、所定の条件に基づいていずれかのデータを採用して、タンパク質機能解析に供するデータ群を生成するデータ採用ステップと、を有することを特徴とする統合プロテオーム解析用データ群の生成方法。前記タンパク質の網羅的な発現変動量データ群は、液体クロマトグラフィーとマススペクトロメトリーとによる網羅的タンパク質発現解析により得られたデータ群および/または蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動とマススペクトロメトリーとにより得られたタンパク質の翻訳後修飾情報を含むデータ群であることを特徴とする請求項1に記載の統合プロテオーム解析用データ群の生成方法。前記遺伝子の網羅的な発現変動量データ群は、DNAマイクロアレイ解析により得られたデータ群であることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の統合プロテオーム解析用データ群の生成方法。前記データ採用ステップにおける前記所定の条件は、タンパク質発現変動量データであることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項に記載の統合プロテオーム解析用データ群の生成方法。前記2つの異なるサンプル群は、いずれも病理学的所見が同じであるが、その動態が互いに異なることを特徴とする請求項1~4のいずれか1項に記載の統合プロテオーム解析用データ群の生成方法。請求項1~5のいずれか1項に記載の統合プロテオーム解析用データ群の生成方法にて生成した統合プロテオーム解析用データ群を、統合プロテオーム解析に供して解析を行う統合プロテオーム解析方法。前記統合プロテオーム解析用データ群を構成する各発現変動量データの発現変動量の値に応じて、統合プロテオーム解析にて可視化された前記各発現変動量データに対応する分子表示の色を変更することを特徴とする請求項6に記載の統合プロテオーム解析方法。請求項1~5のいずれか1に記載の統合プロテオーム解析用データ群の生成方法にて生成した統合プロテオーム解析用データ群を、GO解析およびネットワーク解析に供して互いに紐付けられて探索されるタンパク質のうち、最大変動量のタンパク質を原因タンパク質として同定することを特徴とする原因タンパク質同定方法。請求項6または7に記載の統合プロテオーム解析方法によって互いに紐付けられて探索されるタンパク質のうち、最大変動量のタンパク質を原因タンパク質として同定することを特徴とする原因タンパク質同定方法。前記原因タンパク質にネットワーク解析により上流もしくは下流に近接して紐付けられるタンパク質または前記原因タンパク質の翻訳後修飾されたタンパク質を原因タンパク質として同定することを特徴とする請求項7または8に記載の原因タンパク質同定方法。前記原因タンパク質が生体内における動態に関連するタンパク質を同定することを特徴とする請求項8~10のいずれか1項に記載の原因タンパク質同定方法。前記動態が、薬剤に対する動態であって、細胞増殖、細胞分化または細胞死に関わる異常に関わる動態であることを特徴とする請求項8~11のいずれか1項に記載の原因タンパク質同定方法。前記原因タンパク質がビメンチン、リン酸化ビメンチン、ビメンチンフラグメント、エフリンまたはハイポキシア関連タンパク質Hypoxiainduciblefactor1HIF1およびこれらをコアとするネットワーク構成因子群であることを特徴とする請求項8~12のいずれか1項に記載の原因タンパク質同定方法。請求項8~13のいずれか1項に記載の原因タンパク質同定方法によって同定された原因タンパク質をマーカーとして薬剤に対する動態の探索に使用することを特徴とする原因タンパク質の使用方法。前記原因タンパク質を腫瘍マーカーとして使用することを特徴とする請求項13に記載の原因タンパク質の使用方法。前記原因タンパク質がビメンチン、リン酸化ビメンチン、ビメンチンフラグメント、エフリンまたはハイポキシア関連タンパク質HypoxiainduciblefactorHIF1およびこれらをコアとするネットワーク構成因子群であることを特徴とする請求項14または15に記載の原因タンパク質の使用方法。請求項8~13のいずれか1項に記載の原因タンパク質同定方法によって同定された原因タンパク質の発現を抑制することにより原因タンパク質に起因して発生する事象を処理または予防することを特徴とする原因タンパク質の発現抑制方法。そこで、本発明者らは、細胞組織内において、ある分子の生理現象に互いに関連する全ての細胞内発現タンパク質をプロテオーム解析によって時間軸に従って解析して網羅的な情報を得るために、遺伝子発現の変動を網羅的に解析するトランスクリプトーム解析学的手法と、かかる遺伝子発現により生成されるタンパク質を網羅的に解析および同定を行うプロテオーム解析学的手法とを組み合わせて統合した統合プロテオーム解析システムを用いて、生体内分子の発現解析手法を疾病などの原因究明や創薬に応用する研究戦略を見出して、本発明を完成した。つまり、本発明は、例えば、疾患などの病理学的な所見が同一であるにもかかわらず、薬剤などに対する動態挙動などが異なる2つのサンプル群に対し、DNAマイクロアレイや定量的PCRなどを用いて遺伝子発現の変動を網羅的に解析するトランスクリプトーム解析学的手法と、高速液体クロマトグラフィーHPLCや2次元電気泳動などに質量分析MassspectrometryMSを組み合わせて網羅的にタンパク質の解析および同定を行うプロテオーム解析学的手法とを統合した統合プロテオーム解析用データ群の生成方法ならびに統合プロテオーム解析方法を提供するとともに、生成されたその統合プロテオーム解析システムを用いて、かかる疾患に関与する生体内分子群を探索同定することにより、その疾病などの原因究明や創薬に応用する研究戦略を提供することを目的としている。本発明に係る統合プロテオーム解析システムは、試料中に混在する多くの分子の挙動を、短時間にかつ正確に網羅的に解析することを可能とするとともに、各種タンパク質の発現解析探索同定を統合して解析することにより医学創薬の分野をはじめ、生化学や農学などの分野においても、所定分子の生体内での動態挙動や機能などを把握する上に極めて有用に活用することが可能である。また、本発明に係る統合プロテオーム解析方法は、例えば、ヒトの生命現象の一つである疾患の起因となると考えられる原因物質の発現量を網羅的に解析して予測することを可能にする。また、本発明の統合プロテオーム解析方法は、例えば、同じ疾患に罹患した2つの患者群において、一方の患者群に対してはある薬剤が効果を示すが、他方の患者群に対しては効果を示さないというような場合がしばしばおこるけれども、本発明の統合プロテオーム解析方法は、その原因となっていると考えられる原因物質を網羅的に解析し予測することが可能となり、疾患に対する治療、予防ならびに予後の処置などに有用に適用可能である。さらに、本発明の統合プロテオーム解析方法においては、それぞれのサンプル群の分析結果から、各タンパク質の発現変動量データ群を統計学的に生成し、これを遺伝子機能解析GeneOntology:GO解析や、生体内シグナル伝達に関する経路解析、代謝経路解析などのネットワーク解析に供することにより、各患者群の生体内における薬剤の挙動や関連する特定のタンパク質の機能や違いなどを推定することができ、これにより、かかる特定のタンパク質の機能などを促進または欠失などさせることにより当該タンパク質に関連する疾患などの治療や予防などに供することができることになる。このような手法を用いて新規の腫瘍マーカーを同定する試みなどが数多くなされている例えば、特開特許文献2010-014689号公報参照。したがって、本発明は、タンパク質と遺伝子との両者の発現変動量の網羅的解析結果を総合的に加味して俯瞰し理解することができ、また、従来のタンパク質または遺伝子の発現変化量を単独で解析した場合に比して、より精度良く適切な解析結果を導くとともに、疾病の原因究明や創薬に応用することを可能とする統合プロテオーム解析用データ群の生成方法、および特に疾病の原因究明や創薬などに有用な統合プロテオーム解析方法を提供することを目的としている。また、本発明は、上記統合プロテオーム解析により、それぞれのサンプル群の分析結果から、各タンパク質の発現変動量データ群を統計学的に生成し、これを遺伝子機能解析GO解析や、生体内シグナル伝達に関する経路解析、代謝経路解析などのネットワーク解析することにより、各患者群の生体内における薬剤の挙動や関連する特定のタンパク質を探索することからなる原因タンパク質探索同定方法を提供することを目的としている。上記目的を達成するために、本発明は、1つの形態として、2つの異なるサンプル群間のタンパク質の網羅的な発現変動量データ群と、前記2つの異なるサンプル群間の遺伝子の網羅的な発現変動量データ群とに基づいて、タンパク質機能解析や創薬に応用可能なタンパク質機能解析に供するデータ群を生成する統合プロテオーム解析用データ群の生成方法であって、前記タンパク質の網羅的な発現変動量データ群を構成する各タンパク質毎の発現変動量データに、そのタンパク質の第1のデータベースにおける固有番号と同タンパク質をコードする遺伝子の第2のデータベースにおける固有番号とに紐付けされた共通固有番号を付与するタンパク質固有番号共通化ステップと、前記遺伝子の網羅的な発現変動量データ群を構成する各遺伝子毎の発現変動量データに、その遺伝子の第3のデータベースにおける固有番号と同遺伝子より発現するタンパク質の第1のデータベースにおける固有番号とに紐付けされた共通固有番号を付与する遺伝子固有番号共通化ステップと、前記タンパク質固有番号共通化ステップを経たタンパク質の網羅的な発現変動量データ群と、前記遺伝子固有番号共通化ステップを経た遺伝子の網羅的な発現変動量データ群とを結合して、各タンパク質毎の発現変動量データと各遺伝子毎の発現変動量データの合成により構成される結合データ群を生成するデータ結合ステップと、結合データ群を構成する各発現変動量データのうち、2つの異なるサンプル群間のタンパク質の発現変動量または遺伝子の発現変動量の統計的有意差検定により得られたp値が所定値以上、または分散分析analysisofvarianceANOVAによるF値が所定値以下のデータを棄却するデータ棄却ステップと、前記データ棄却ステップを経た結合データ群のうち、タンパク質発現変動量データと遺伝子発現変動量データとで同じ共通固有番号が付与されているデータに対し、所定の条件に基づいていずれかのデータを採用して、タンパク質機能解析に供するデータ群を生成するデータ採用ステップと、からなる統合プロテオーム解析用データ群の生成方法を提供する。また、本発明は、その好ましい態様として、上記統合プロテオーム解析用データ群の生成方法において、前記タンパク質の網羅的な発現変動量データ群は、液体クロマトグラフィーHPLCとマススペクトロメトリーMSとによる網羅的タンパク質発現解析により得られたデータ群および/または蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動2DimensionalFluorescenceDifferenceGelElectrophoresis2DDIGEとマススペクトロメトリーとにより得られた翻訳後修飾情報を含むタンパク質の発現変動データ群であることからなる統合プロテオーム解析用データ群の生成方法を提供する。また、本発明は、その別の好ましい態様として、上記統合プロテオーム解析用データ群の生成方法において、前記遺伝子の網羅的な発現変動量データ群は、DNAマイクロアレイ解析により得られたデータ群であることからなる統合プロテオーム解析用データ群の生成方法を提供する。また、本発明は、その別の好ましい態様として、上記統合プロテオーム解析用データ群の生成方法において、前記データ採用ステップにおける前記所定の条件は、タンパク質発現変動量データであることからなる統合プロテオーム解析用データ群の生成方法を提供する。また、本発明は、その別の形態として、上記統合プロテオーム解析用データ群の生成方法にて生成した統合プロテオーム解析用データ群を、統合プロテオーム解析に供して解析を行うことからなる統合プロテオーム解析方法を提供する。また、本発明は、その別の好ましい態様として、上記統合プロテオーム解析方法において、前記統合プロテオーム解析用データ群を構成する各発現変動量データの発現変動量の値に応じて、統合プロテオーム解析にて可視化された前記各発現変動量データに対応する分子表示の色を変更することにより、生体内で重要な分子ネットワークの把握を行うことからなる統合プロテオーム解析方法を提供する。本発明は、さらに別の形態として、上記統合プロテオーム解析用データ群の生成方法にて生成された統合プロテオーム解析用データ群を、遺伝子機能解析GO解析ならびに生体内シグナル伝達に関する経路解析、代謝経路解析などのネットワーク解析に供することにより、最大発現変動量のタンパク質もしくはそのタンパク質の翻訳後修飾されたタンパク質または上記ネットワーク解析により最大発現変動量のタンパク質に上流もしくは下流に近接して紐付けられるタンパク質を原因タンパク質として同定することからなる原因タンパク質同定方法を提供する。さらに、本発明は、その好ましい態様として、例えば、発癌性、薬剤感受性、薬剤耐性、転移性、免疫不全などの細胞増殖、細胞分化ならびに細胞死に関わる異常に起因する疾患もしくは病態に関与する原因タンパク質を同定することからなる原因タンパク質同定方法を提供する。さらにまた、本発明は、上記原因タンパク質を、例えば、発癌性、薬剤感受性、薬剤耐性、転移性、免疫不全などの細胞増殖、細胞分化ならびに細胞死に関わる異常に起因する疾患もしくは病態に関与する原因タンパク質に対するマーカーとして使用することからなる原因タンパク質の使用方法を提供する。さらにまた、本発明は、上記原因タンパク質の発現を抑制することによって上記原因タンパク質に起因して発生する事象の処理もしくは予防、例えば疾患や病態の治療もしくは予防をすることからなる原因タンパク質の発現抑制方法を提供する。さらに、本発明は、その好ましい態様として、上記原因タンパク質が、ビメンチン、リン酸化ビメンチン、エフリン、ハイポキシア関連タンパク質hypoxiainducibefactor1HIF1などであることからなる原因タンパク質の同定方法ならびに使用方法および発現抑制方法を提供する。本発明によれば、タンパク質と遺伝子との両者の発現変動量を総合的に加味して生体内分子挙動の全体像を解析することができ、しかも、従来のタンパク質または遺伝子の発現変化量を単独で解析した場合に比して、より高効率かつ高精度で適切な解析結果を導くことのできる統合プロテオーム解析用データ群の生成方法、および、統合プロテオーム解析方法を提供することができる。また、本発明に係る原因タンパク質探索方法は、生体内における薬剤などの動態に関連する特定のタンパク質を探索することができることから、当該タンパク質またはそれに関与する遺伝子を標的とした薬剤の開発を促進することが可能となるという大きな効果がある。本発明は、統合プロテオーム解析用データ群の生成方法ならびに同生成方法にて生成した統合プロテオーム解析用データ群を用いる統合プロテオーム解析方法、およびそれを用いた原因物質同定方法に関する。まず、本発明に係る統合プロテオーム解析用データ群の生成方法について、図1を参照して簡単に説明する。図示するように、本発明の統合プロテオーム解析用データ群の生成方法は、2つの異なるサンプル群間のタンパク質の網羅的な発現変動量データ群と、遺伝子の網羅的な発現変動量データ群とに基づいて、タンパク質機能解析に供するデータ群を生成する統合プロテオーム解析用データ群の生成することからなっている。ここでサンプルとは、例えば、動物、植物、微生物等の細胞や、細胞から抽出した細胞抽出物を言い、DNAや遺伝子転写産物、遺伝子から発現したタンパク質、翻訳後修飾を受けたタンパク質が含まれているものである。また、2つの異なるサンプル群とは、動物、植物、微生物等の生物種にかかわらず、状態の異なる個体や生体から得られたサンプルのことをいう。また、サンプル群の元となる固体や生体は、単数であっても良く、また、複数であっても良い。タンパク質の網羅的な発現変動量データ群とは、2つの異なるサンプル群をそれぞれ高速液体クロマトグラフィーHPLCや2次元電気泳動に質量分析機器マススペクトロメトリー:MS、DNAマイクロアレイを組み合わせた統合プロテオーム解析学的手法により分析し、得られた一群のサンプル中に含まれる複数のタンパク質の定量値を元にして、他方の群のサンプル中に含まれる複数のタンパク質の定量値の変化量を算出したデータ群である。具体的には、図2aおよびbに示すようなデータ群であり、図2aは、2つの異なるサンプルを、それぞれ蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動2DDIGEに供し、各スポットを質量分析することにより定量し、変化量を求めることにより作成したデータ群である。また、図2bは、2つの異なるサンプル群を、AppliedBiosystems社製iTRAQ試薬にて処理し、nanoLCMSMSにより個々のタンパク質を分離し質量分析することにより定量し、変化量を求めることにより作成したデータ群である。なお、図中においてMethodは分析方法を示し、EntrezGeneIDは後述する共通固有番号を示し、Foldchangeは発現変動量を示し、pvalueは発現変動量の有意差検定の結果であるp値を示し、Regulationはタンパク質の変動方向増減を示し、SpotNo。は2DDIGE法にて同定されたスポットの個数を示し、Modificationは予想される翻訳後修飾の種類を示し、Totalfoldchangeは2DDIGE法にて修飾が異なるが同じタンパク質であると同定されたスポットの発現変動量の総和を示し、Genetitleは遺伝子名およびその機能に関する定義を示し、SwissProtはタンパク質のデータベースである第1のデータベースとしてのSwissProtにおけるアクセッションナンバー固有番号を示し、GOは遺伝子オントロジーGeneontology分類を示している。また、SwissProtは、スイスバイオインフォマティクス研究所と、欧州バイオインフォマティクス研究所とが共同で提供するタンパク質のアミノ酸配列データベースである。また、Modificationの欄に記載の略号は、Pはリン酸化を示し、Acはアセチル化を示し、Fは断片化fragmentationを示している。このように、タンパク質の網羅的な発現変動量データ群に、同定されたタンパク質の翻訳後修飾のデータが含まれているため、生成した統合プロテオーム解析用データ群後述を用いて統合プロテオーム解析を行った際に、遺伝子の発現変動、タンパク質の発現変動に加えて翻訳後修飾をも反映させた解析結果を導くことができる。本実施形態において、遺伝子の網羅的発現変動量データ群はDNAmicroarrayにより得ることとし、タンパク質の網羅的な発現変動量データ群は、2DDIGE法やLCMSiTRAQ法により得ることとしたが、これに限定されるものではなく、2つの異なるサンプル群間のタンパク質の網羅的な発現変動量データ群を得ることのできる解析手法、たとえば様々なトランスクリプトーム的手法、あるいはプロテオーム解析学的手法によるもので統合プロテオーム解析学的手法に用いことのできるによるものであれば良い。遺伝子の網羅的な発現変動量データ群とは、2つの異なるサンプル群をそれぞれDNAマイクロアレイ等の手法により分析し、得られた一方のサンプル群中に含まれる複数の遺伝子の発現量を元にして、他方のサンプル群中に含まれる複数の遺伝子の発現量を算出した変化量のデータ群である。具体的には、図3に示すようなデータ群であり、図中においてMethodは分析方法を示し、EntrezGeneIDは後述する共通固有番号を示し、ProbesetIDはDNAマイクロアレイに固定されたプローブの固有番号を示し、Foldchangeは発現変動量を示し、pvalueは発現変動量の有意差検定の結果であるp値を示し、Regulationはタンパク質の変動方向増減を示し、Genetitleは遺伝子名およびその機能に関する定義を示し、GOは遺伝子オントロジーGeneontology分類を示している。このような2つの異なるサンプル群間のタンパク質の網羅的な発現変動量データ群以下、タンパク変動量データ群という。と、同上の2つの異なるサンプル群間の遺伝子の網羅的な発現変動量データ群以下、遺伝子変動量データ群という。に基づいて、統合プロテオーム解析的タンパク質機能解析に供するデータ群を生成することとなる。具体的には、図4に示すように、タンパク質固有番号共通化ステップと、遺伝子固有番号共通化ステップと、データ結合ステップと、データ棄却ステップと、データ採用ステップとを経てタンパク質機能解析に用いるための統合プロテオーム解析用データ群を生成することに特徴を有している。タンパク質固有番号共通化ステップは、タンパク質の網羅的な発現変動量データ群を構成する各タンパク質毎の発現変動量データに、そのタンパク質の第1のデータベースにおける固有番号と同タンパク質をコードする遺伝子の第2のデータベースにおける固有番号とに紐付けされた共通固有番号を付与する。ここで、タンパク質の第1のデータベースは、例えば2DDIGE解析にて使用した質量分析計や、LCMSに付属する質量分析計に予め備えられたタンパク質同定用のデータベースと解釈することができる。特に近年の質量分析計とデータ解析用計算機に備えられたデータベースには、同定したタンパク質のデータに、一般に広く知られているSwissProt等のIDを付与可能としたものも多く、図1にも示したように、各タンパク質毎の発現変動量データには第1のデータベースにおける固有番号として、SwissProtのIDが付与されている。また、同タンパク質をコードする遺伝子の第2のデータベースにおける固有番号とは、米国生物工学情報センターNationalCenterforBiotechnologyInformation:NCBIが提供するGenBankや、欧州分子生物学研究所EuropeanMolecularBiologyLaboratoryが提供するEMBLや、日本の国立遺伝学研究所が提供するDDBJで付与される固有番号や、これらのデータベースから冗長性を廃しつつ統合管理する戦略で運用されているアメリカ国立医学図書館およびNCBIによる統合型データベースEntrezの固有番号と解釈することができる。後に詳述するが、本実施形態では、図2に空欄で示したように、Entrezの固有番号を第2のデータベースにおける固有番号として付与する。なお、この図2におけるタンパク質の網羅的な発現変動量データ群のEntrezの固有番号は、次に述べる共通固有番号としての機能も兼ねている。共通固有番号は、前述の第1のデータベースにおける固有番号と、前述の第2のデータベースにおける固有番号とに紐付けされた固有番号である。例えば、第1のデータベースのおける固有番号をSwissProtの固有番号とし、第2のデータベースにおける固有番号をDDBJの固有番号とした場合、両者の固有番号は直接的には紐付けがなされていない。それゆえ、ある所定の遺伝子→タンパク質発現系にある対応する遺伝子とタンパク質であるのに、これらのデータを統合して検討するのは困難であった。そこで、本実施形態では、第1のデータベースにおける固有番号と、第2のデータベースにおける固有番号とに紐付けされた固有番号を付与することで、同じ発現系にある遺伝子の発現変動量データとタンパク質の発現変動量データとを容易に統合可能としている。この共通固有番号は、データベースにおける固有番号と、前述の第2のデータベースにおける固有番号とに紐付けされたものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、Entrezの固有番号とすることができる。次に、遺伝子固有番号共通化ステップについて説明する。遺伝子固有番号共通化ステップは、遺伝子の網羅的な発現変動量データ群を構成する各遺伝子毎の発現変動量データに、その遺伝子の第3のデータベースにおける固有番号と同遺伝子より発現するタンパク質の第1のデータベースにおける固有番号とに紐付けされた共通固有番号を付与するステップである。ここで、遺伝子の第3のデータベースにおける固有番号は、例えば、DNAマイクロアレイのProbesetIDと解釈することができる。また、同遺伝子より発現するタンパク質の第1のデータベースにおける固有番号とは、前述したSwissProtの固有番号と解釈することができる。また、第3のデータベースにおける固有番号と、第1のデータベースにおける固有番号と、に紐付けされた共通固有番号は、前述のタンパク質固有番号共通化ステップと同様に、例えば、Entrezの固有番号とすることができる。次に、データ結合ステップについて説明する。このデータ結合ステップは、前述のタンパク質固有番号共通化ステップを経たタンパク質の網羅的な発現変動量データ群と、前述の遺伝子固有番号共通化ステップを経た遺伝子の網羅的な発現変動量データ群とを結合して、各タンパク質毎の発現変動量データと各遺伝子毎の発現変動量データとにより構成される結合データ群を生成するステップである。すなわち、このデータ結合ステップによって、2DDIGE法やLCMS等の統合プロテオーム解析学的手法により得られた解析データと、DNAマイクロアレイ等のトランスクリプトーム解析学的手法により得られた解析データとが統合されることとなる。つまり、具体的には、iTRAQ法ならびに2DDIGE法によるタンパク質についての解析結果、およびDNAマイクロアレイによるmRNAについての解析結果の全ての結果をパールスクリプトPerlScriptを用いて同一書式の一行区切りのテキスト形式に変換して統合した統合プロテオーム解析用データ群iPEACHintegratedProteinExpressionAnalysisChartを作成する。具体的には、上記各種の解析法で得られたタンパク質の網羅的な発現変動量データ群と、遺伝子の網羅的な発現変動量データ群とを結合して、各タンパク質毎の発現変動量データと各遺伝子毎の発現変動量データとを共通固有番号順に並び替えを行うことで、結合データ群とする。このようにして得た結合データ群は、次に、データ棄却ステップにて処理を行う。このデータ棄却ステップでは、結合データ群を構成する各発現変動量データのうち、2つの異なるサンプル群間のタンパク質の発現変動量または遺伝子の発現変動量の有意差検定により得られたp値が所定値以上のデータを棄却する。次に、データ棄却ステップを経た結合データ群を、データ採用ステップにて処理する。このデータ採用ステップでは、タンパク質発現変動量データと遺伝子発現変動量データとで同じ共通固有番号が付与されているデータに対し、所定の条件に基づいていずれか一方のデータを採用して、タンパク質機能解析に供するデータ群を生成するステップである。ここで、所定の条件は、例えば、タンパク質発現変動量データと遺伝子発現変動量データとで同じ共通固有番号が付与されている場合、生体内タンパク質の直接的挙動を反映するものとして、タンパク質発現変動量データを採用する条件とするのが好ましい。また、タンパク質発現変動データの内でも、翻訳後修飾を受け分子の機能調節が行われている可能性のあるものは注目すべき分子として採用することが好ましい。このような構成とすることにより、実際の細胞内でのタンパク質の発現変動の重要性に即した統合的なタンパク質の発現解析結果を得ることができる。このように、本発明に係る統合プロテオーム解析用データ群の生成方法によれば、上述してきたステップを踏まえることによって、タンパク質と遺伝子との両者の発現変動量を総合的に加味することができ、しかも、従来のタンパク質または遺伝子の発現変化量を単独で解析した場合に比して、より精度良く適切な解析結果を導くことのできる統合プロテオーム解析用データ群を生成することができる。以下、タンパク質機能解析に供するデータ群の生成について、図面を参照しながら更に具体的に説明する。本実施形態に係る統合プロテオーム解析用データ群の生成方法では、まず、図2に示したタンパク変動量データ群を構成する各タンパク質毎の発現変動量データに、そのタンパク質の第1のデータベースにおける固有番号、ここではSwissProtの固有番号と、同タンパク質をコードする遺伝子の第2のデータベースにおける固有番号、ここではEntrezGeneIDとに紐付けされた共通固有番号を付与するタンパク質固有番号共通化ステップを行う。特に、本実施形態では、2DDIGEとLCMSiTRAQ法との2種類の分析方法によるタンパク変動量データ群を得ているため、これらを結合させた上で共通固有番号の付与を行う。具体的には、図2aおよびbにて示した2つのタンパク変動量データ群を結合させて、図5aに示す1つのタンパク変動量データ群を作成する。図2aおよびbの2つのタンパク質発現変動データには、予め2DDIGE法によって得られた同一タンパク質の生体内分子状態変化の情報SpotNoと、質量分析計による解析結果から得られた翻訳後修飾の情報modificationを付与しており、その結果も統合データに反映される。次に、この変動量データ群を構成する各タンパク質毎の発現変動量データに対して、図5bにて太線の黒枠で示すように、同タンパク質をコードする遺伝子の第2のデータベースにおける固有番号、本実施形態では、EntrezGeneIDを付与する。このEntrezGeneIDの付与は、2DDIGE解析にて使用した質量分析計や、LCMSに付属する質量分析計が有するタンパク同定用のデータベースによって付与されたGeneTitleや、SwissProtのIDに基づいて付与を行うことができる。また、EntrezGeneIDの付与は、手作業で行っても良いが、2DDIGEやLCMSにて同定されるタンパク質の数は数千~数万と膨大な数にのぼるため、コンピュータ等によりEntrezGeneのデータベースをインターネットを介して参照しながら付与を行うようにしても良い。このような構成とすることにより、膨大な数の各タンパク質毎の発現変動量データに対し、人為的な入力ミスと労力を飛躍的に削減しながら第2のデータベースにおける固有番号を付与することができる。なお、この際のユーザインターフェイス用のプログラムとしては、上記機能を有するソフトウエアを各使用者のコンピュータにインストールするよう構成してもよく、また、上記機能を有するプログラムをインターネット上のサーバに格納し、使用者のコンピュータに予めインストールされたブラウザソフトウェアを用いてインターネットを介して処理可能に構成しても良い。次に、図3にて示した遺伝子変動量データ群を構成する各遺伝子毎の発現変動量データに、その遺伝子の第3のデータベースにおける固有番号、ここではDNAマイクロアレイのProbesetIDと、同遺伝子より発現するタンパク質の第1のデータベースにおける固有番号、ここではSwissProtの固有番号とに紐付けされた共通固有番号を付与する遺伝子固有番号共通化ステップを行う。具体的には、図3にて示した遺伝子変動量データ群を構成する各遺伝子毎の発現変動量データに対して、図6にて太線の黒枠で示すように、本実施形態では、EntrezGeneIDを付与する。このEntrezGeneIDの付与は、DNAマイクロアレイのProbesetIDに基づいて付与を行うことができる。また、EntrezGeneIDの付与は、手作業で行っても良いが、DNAマイクロアレイにて分析される遺伝子の数は数千~数万と膨大な数にのぼるため、コンピュータ等によりEntreGeneのデータベースをインターネットを介して参照しながら付与を行うようにしても良い。このような構成とすることにより、膨大な数の各タンパク質毎の発現変動量データに対し、労力を飛躍的に削減しながら共通固有番号を付与することができる。なお、この際のユーザインターフェイス用のプログラムとしては、上記機能を有するソフトウェアを各使用者のコンピュータにインストールするよう構成してもよく、また、上記機能を有するプログラムをインターネット上のサーバに格納し、使用者のコンピュータに予めインストールされたブラウザソフトウェアを用いてインターネットを介して処理可能に構成しても良い。次に、タンパク質固有番号共通化ステップを経たタンパク質の網羅的な発現変動量データ群図5b参照と、遺伝子固有番号共通化ステップを経た遺伝子の網羅的な発現変動量データ群図6参照とを結合して、結合データ群を生成する。具体的には、図7に示すように、各タンパク質毎の発現変動量データと各遺伝子毎の発現変動量データとを共通固有番号にて並び替えした結合データ群とする。このような処理を行うことにより、2DDIGE法やLCMS等の統合プロテオーム解析学的手法により得られた解析データと、DNAマイクロアレイ等のトランスクリプトーム解析学的手法により得られた解析データとを統合した結合データ群を生成することができる。また、結合データ群では共通固有番号にて並び替えを行っているため、例えば図7中黒枠で示すように、ある遺伝子からタンパク質が発現する発現系を分析方法別に一塊のデータとして目視することが可能となり、遺伝子やタンパク質の発現変動量を把握する上で有用である。次に、結合データ群に対して、データ棄却ステップによる処理を行う。ここでは、結合データ群を構成する各発現変動量データのうち、p値が所定値以上の各発現変動量データを棄却する。ここで、p値の閾値となる所定値は、例えば、005とすることができるが、これに限定されるものではなく、所望の精度に応じてさらに低い値例えば、001や0005等としても良い。但し、この所定値を過剰に低く設定すると、棄却する発現変動量データが増加するため、正しい解析結果が得られなくなる可能性があり留意が必要である。なお、本実施形態では、p値が所定値以上の各発現変動量データを棄却することとしたが、分散分析によるF値が所定値以下のデータを棄却するようにしても良い。このデータ棄却ステップを経ることで、結合データ群は、図8aに示すように、p値が所定値以上の各発現変動量データが棄却されたデータ群となる。次に、データ棄却ステップを経た結合データ群に対して、データ採用ステップによる処理を行う。ここでは、結合データ群のうち、タンパク質発現変動量データと遺伝子発現変動量データとで同じ共通固有番号が付与されているデータに対し、所定の条件に基づいていずれか一方のデータを採用して、タンパク質機能解析に用いるための統合プロテオーム解析用データ群を生成する。すなわち、図8aに黒枠で示すように、結合データ群中にタンパク質発現変動量データと遺伝子発現変動量データとで同じ共通固有番号が付与されているデータが存在する場合、例えば、タンパク質発現変動量データであることを条件として、タンパク質発現変動量データを結合データ群を構成するデータとして採用する。これにより、図8bに黒枠で示すように、重複する共通固有番号が付されたデータはなくなり、タンパク質機能解析に供するデータ群が生成されることとなる。このようにして生成された統合プロテオーム解析用データ群は、例えば、GO解析や生体内シグナル伝達に関する経路解析、代謝経路解析などのネットワーク解析に供することで、効率的かつ精度の高い機能解析を行うことができる。つまり、本発明の統合プロテオーム解析用データ群は、遺伝子発現解析や各種のタンパク質発現解析結果の意味と詳細な情報rawdataを損なうことなく統合し、更にタンパク質の翻訳後修飾に関する情報をも加味することで、生体内におけるタンパク質発現変動の全容が効果的かつ容易に把握できるように構築されている。そのため、本統合プロテオーム解析用データ群を用いることによって、より精度の高い生体内分子ネットワークの解析や、関連する新しい分子の機能解明が可能となる。しかしながら、本発明の方法にて生成された統合プロテオーム解析用データ群を解析して同定された特定のタンパク質分子が、プログラム上で如何に高い信頼性の高いデータであったとしても、実際の生体サンプルに適用した場合、実際にどの程度信頼性の高い生物学的情報を得ることができるかは疑問が残るところである。そのために、本発明においては、実際の疾患に関連する各種組織ならびに細胞サンプルを用いて、プロテオミクスデータベースの構築を行い、疾患の薬剤治療標的となる病態マーカーや創薬の標的となる細胞内異常シグナルネットワークの検索ならびに同定を行って病態プロテオミクスを展開することができるかどうかを検討する必要がある。ただし、実際の病態サンプルを用いてかかる病態マーカーや細胞内異常シグナルネットワークを検索するためには、ゲノム解析やmRNA発現解析、タンパク質の発現解析や特異的翻訳後修飾/相互作用解析などの様々な分子解析結果を統合的に総合的に評価する事によってはじめて可能となると考えられる。しかし、前述したように、これらの解析方法論は元来個々に確立されているため、出力されるデータの言語やフォーマットや表示の概念がそれぞれ異なっており、これらを融合して統合的に評価することはこれまで困難であった。すなわち、これまでは、複数の装置によって異なる概念で解析され、病態組織細胞内の異常活性を示すタンパク質ネットワークや翻訳後修飾、細胞内タンパク質の相互作用機能等の多くの情報を得たとしても、それらを有機的に結びつけて解釈することが簡単にできなかった。そこで、本発明では、病態関連分子解析を効率的に進めることができる上記統合マイニング解析プログラムを用いて、腫瘍組織細胞の機能分子メカニズム解析、バイオマーカー探索等に応用可能かどうかを検討した。本発明においては、脳腫瘍患者の脳腫瘍組織から採取したサンプルを用いて、iTRAQ法ならびに2DDIGE法を用いたプロテオーム解析およびDNAマイクロアレイ法を用いたトランスクリプトーム解析を融合的に用いて得られた全ての情報を、統合プロテオーム解析用データ群を用いて統合マイニングすることによって、病態等において異常に制御されている病態等の原因タンパク質やシグナル伝達経路などを特異的に抽出した。つまり、脳腫瘍患者の脳腫瘍組織から採取した同一サンプルを用いて同時進行で種々のディファレンシャル解析を行い、これらから得られた特異的変動分子群の定量的発現情報を統合し、新しい抗癌剤耐性に関与する分子シグナルネットワークの抽出をして一連の解析を行い、脳腫瘍に関与していると考えられるタンパク質を探索同定した後、このタンパク質が実際にその疾患の病態に関与しているかどうかの検証を行った。この検証では、本発明による統合マイニングによる解析方法論が、例えば、腫瘍組織細胞内で抗がん剤抵抗性に関与して活性化しているシグナル分子キャスケードを抽出し、関与分子群の翻訳後修飾を含むいかなる発現変動と構造変化がその腫瘍の治療抵抗性に関与するかを明らかにすること、即ち、腫瘍の薬剤耐性メカニズムの一端を解明することの可能性、さらには、これらの統合的な解析によって、病態の治療方針や予後予測をより正しく診断するための臨床マーカーや、有効な治療薬を開発するための基礎情報のデータベース化の可能性の検証を行うことを目標とした。なお、本明細書においては、脳腫瘍患者の脳腫瘍組織から採取したサンプルを例に挙げて説明したが、説明を簡略にするだけの意図で例示しただけであって、本発明は、かかる脳腫瘍に一切限定されるものではなく、本発明の目的を達成できるものであれば、医学分野ばかりではなく、あらゆる分野においても適用可能であることは当然のことである。ここで、脳腫瘍サンプルを用いた統合マイニング法について具体的に説明する。脳腫瘍サンプルとしては、悪性グリオーマにおいて唯一化学療法に対して感受性を示す退形成乏突起膠腫患者から摘出した脳腫瘍組織のサンプルを使用した。このAOAOAは、現在のところ明確に予後を予測できる簡便な診断マーカーは存在せず、早期において患者の化学療法感受性を見極めるマーカーや治療ターゲットの開発は早急に取り組むべき重要な課題として近年注目されている。これまでに唯一、AOAOAの染色体1番短腕部と19番長腕部の片アレル欠失LossofHeterozygosity:LOHと化学療法感受性の関連性が報告されているが、化学療法感受性との因果関係を詳細に説明できる特定の遺伝子などの情報は全く報告されていない。理由として、ゲノム上の欠失が必ずしも遺伝子の欠失と相関しない転座の可能性や、あるいは、欠失した遺伝子群を介して間接的に化学療法耐性メカニズムに作用している他の遺伝子の関与等が考えられ、詳細なAOAOAの化学治療感受性のメカニズムをゲノムや遺伝子レベルのみで結論を出すには限界があった。まず、AOAOA患者から摘出した脳腫瘍組織のサンプルは、病理学的チェック、染色体異常の有無、正常異常、悪性度グレードの違い、抗癌剤感受性有無などを基にして分類をする。つまり、上記脳腫瘍サンプルを、病理学的チェックでは、1p19qLOHを有するタイプと、1p19qLOHを持たないタイプの2種類に分類する。このLOHとLOH-とは、一般的に知られる所見として、いずれも病理学的には同様の所見を示すけれども、LOHは抗ガン剤や放射線治療に感受性で予後がよく、逆にLOH-は、抗がん剤に非感受性で非常に予後が悪いという違いがあることが知られている。次いで、1p19qLOHサンプルと1p19qLOH-サンプルからそれぞれタンパク質とmRNAを抽出する。タンパク質は、2種類のプロテオーム解析、つまり、2次元電気泳動法による2DDIGE法、および電気泳動を用いないLCMASSによるiTRAQ法を同時進行で行って、タンパク質レベルで差異のあった分子群を質量分析解析によってタンパク質変動と翻訳後修飾などの解析を行って同定される。mRNAは、DNAマイクロアレイを用いてトランスクリプトーム解析に供してmRNAの発現変動などを解析する。2DDIGE法ならびにiTRAQ法によるプロテオーム解析、およびトランスクリプトーム解析による網羅的解析から得られるデータは、本発明の統合プロテオーム解析用データ群を解析するアプリケーションであるiPEACHを用いて整理統合され、これを用いてGO解析およびKeyMolnetソフトウエアによる分子間ネットワーク解析を行う図8参照。上記のiPEACHを用いたGO解析および分子間ネットワーク解析によって、その結果、1p19qLOHおよび1p19qLOH-の脳腫瘍組織において抗癌剤感受性に関連して変動している重要な分子群を特定し、脳腫瘍細胞内における抗癌剤感受性関連シグナルネットワークを抽出することが可能となる。予測された分子ネットワーク構成分子群に関しては、更にAOAOA検体サンプルすべてについてウエスタンブロッテイングおよび組織免疫染色にて検証を行うとともに、1p19qLOHおよび1p19qLOH-のグリオーマ培養細胞を用いて同様の検証と、さらにsiRNA、阻害剤ならびに活性化剤を融合的に用いた生化学的な活性測定、抗がん剤感受性阻害や活性化等の検証実験を行うことによって、悪性グリオーマにおける抗癌剤感受性に関わる分子機序を解明することができる。ここで、本発明において、統合プロテオーム解析用データ群を作成するためのプロテオーム解析法の1つてあるiTRAQ法について簡単に説明する。iTRAQ法は、2~4つの比較したいサンプルをそれぞれ異なる標識試薬でラベルした後、両者を混合して解析を行う。つまり、iTRAQ法は、4plexでも、8plexでも行うことができる。標識に用いる試薬としては、組成は全く同様でありながら、4~8種類のリポーターイオンを持つisobaricTag標識試薬を用いて、トリプシン処理によりフラグメント化した各サンプルのペプチド末端を標識したのち混合する。これらをイオン交換などにより分画し、nanoLCによる逆相クロマトを行い、オンラインでnanoESIQqTOF、およびnanoMALDITOFTOFによる質量分析を行う。nanoLCによって同じフラクションに分画された4つのiTRAQ標識ペプチドは、分子量の違いによって質量分析にてはじめて区別され、その量の差異が定量される。同時にMSMS解析によりタンパク質の同定を行うことができる。本発明において、統合プロテオーム解析用データ群を作成するためのプロテオーム解析法の別の1つてある2DDIGE法は、基本的にはiTRAQ法と同様に、サンプルから抗癌剤感受性、非感受性、正常の3種類それぞれの可溶化タンパク質を蛍光試薬であるCy2、Cy3、またはCy5で標識し、それぞれを混合後、2次元電気泳動後、共焦点蛍光ゲルスキャナーによって解析する。さらに、特異的なリン酸化タンパク質染色液であるProQDiamondを用いて、リン酸化タンパク質の発現の差異を同一の2次元電気泳動ゲルで行う。紫色に染まって見えるスポットが、非感受性のサンプルにおいてリン酸化が特異的に亢進しているタンパクスポットであり、また黄色に染まっているスポットが、正常のサンプルにおいてリン酸化が亢進した、すなわち、非感受性でリン酸化が減少しているタンパクスポット群であると判定することができる。次に、本発明において、統合プロテオーム解析用データ群を作成するためのトランスクリプトーム解析法であるヒトDNAマイクロアレイ法について簡単に説明する。上記プロテオーム解析に用いたのと同一サンプルから抽出したmRNAを、ヒトcDNAオリゴチップを用いてトランスクリプトーム解析を行い、同時進行で行うプロテオーム解析の結果を比較する。この比較結果により、同一のサンプルから検出されたmRNAの発現分子の数が、プロテオーム解析手法によって特異的に発現が上昇および減少するものとして同定されるタンパク質群の発現パターンと大きく異なっている。これらの分子は、時として、タンパク質レベルでは上昇しているにもかかわらず、mRNAレベルでは逆に減少しているものも多く見受けられるところから、この違いは、細胞内におけるタンパク質とmRNAの発現と安定性の時間的ラグが反映されているものと考えられる。mRNAの発現の上昇は、タンパク質として充分に反映された時終了し、減少するのに対し、タンパク質がクリアランスされ不足するとmRNAの発現は誘導され上昇する。つまり、細胞内のある時間軸だけを切り取ってみると、あるタンパク質は上昇しているが、mRNAは減少していて、またあるタンパク質は減少しているが、mRNAは上昇している、ということは常に起こっていても不思議ではないと考えられる。そして、差異のあったすべての分子群を同定後、タンパク質およびmRNA発現レベルのデータ、すなわち、タンパク質の網羅的な発現変動量データ群と、mRNAの網羅的な発現変動量データ群とを、本発明に係る統合プロテオーム解析用データ群の生成方法にて整理統合して作成したプログラムiPEACHで自動的に統合データマイニングする図9。つまり、このプログラムiPEACHは、1p19qLOHおよび1p19qLOH-AOAOA組織内で発現が確認された遺伝子とタンパク質群のそれぞれの同定分子群の全ての情報を含むリストを、パールスクリプトPerlScriptを用いて同一書式の一行区切りのテキスト形式に変換して読み込み、アクセッション番号を統合したファイルとして作成される。このファイルには、genedescription分子の定義や機能情報、染色体位置情報、統合プロテオミクスにおける解析法すなわち、DNAマイクロアレイ、iTRAQMALDIMS、iTRAQESIMSMS、2DDIGE等、GeneOntologyannotation、タンパク質翻訳後修飾の有無と頻度2DDIGEで同定された修飾スポットの情報などが付与されている。また、統合ファイルのデータの内、それぞれの分子に重み付けを行い、優先順位をつけ、同一タンパク質でもタンパク質の翻訳後修飾が併せて確認されるものを注目すべき分子として自動的に上位にランクするアルゴリズムを用いている。更に、自動的に有意と評価して閾値を設定し、閾値以下の変動分子を解析対象から外すようにマスクした後、GO解析やKeyMolnet等の分子ネットワーク解析に直接用いることが出来るように整形済みテキストとして統合ファイルを出力することができる。ここで説明している例においてのオリジナル解析データの一元化ファイルにおいては、約30000個の分子情報を対象とし、その中から統計学的に定量性が有意な分子を抽出する図8参照。このiPEACHプログラムにより、各データを瞬時に一元化することが可能となり、GO解析、パスウェイ解析等へ供することができるため、重要な分子群の抽出操作が容易にできる。ここで、統合プロテオーム解析用データ群iPEACHの作成に際して、上記解析結果の生データからiPEACHに付加されるアノテーションテーブルの列に記載される項目としては、iTRAQならびにiTRAQについてはそれぞれfoldchangeならびにpvalue、およびiTRAQ質量分析結果ならびにiTRAQ質量分析結果についてはそれぞれペプチド同定数、翻訳後修飾を受けたペプチドの数冗長性あり、翻訳後修飾の数冗長性なし、ならびに翻訳後修飾の種類などが挙げられる。また、2DDIGEについては、foldchangeならびにpvalue、およびタンパク質毎の同定されたスポット数、totalfoldchange全てのスポットの変動の総和、averagefoldchange全てのスポットの変動の平均、representativefoldchange全てのスポットの中で最も変動が大きかったものの値ならびに質量分析結果の翻訳後修飾の種類冗長性なしなどが挙げられる。さらに、DNAマイクロアレイについてはfoldchangeおよびpvalueなどが挙げられる。また、NCBIからiPEACHに付加されるアノテーションテーブルの列に記載される項目としては、EntrezGeneID、GeneSymbol、Maplocation染色体上の位置、Descriptiontypeofgene遺伝子の名称定義、OMIMMIMnumber、OMIMClinicalSynopsisならびにOMIMTitleWordOMIMRecordの名称が挙げられる。さらに、KEGGからiPEACHに付加されるアノテーションテーブルの列に記載される項目としては、EntryKEGGデータベースのアクセッションNo。KEGGOrtolhogyNo。、GeneNameKEGGデータベース上の遺伝子名、DefinitionKEGGデータベース上の遺伝子定義、KEGGPathwayKOSystemに基づいたKEGGPathwayの情報ならびにClass遺伝子機能の階層的定義と分類が挙げられる。さらにまた、EnsembleからiPEACHに付加されるアノテーションテーブルの列に記載される項目としては、UniProtのCatalyticactivity、UniProtのCofactor、UniProtのDisruptionPhenotype、UniProtのEnzymeRegulation、UniProtのDevelopmentalStage、UniProtのInteraction、UniProtのPathway、UniProtのSimilarity、UniProtのSubcellularLocation、UniProtのCarbohyd、UniProtのSignal、UniProtのTransmem、UniProtのDomain、UniProtのCaBind、UniProtのZnFing、UniProtのDNABind、UniProtのMotif、UniProtのBinding、UniProtのModRes、UniProtのLipid、UniProtのDisulfid、ならびにUniProtのCrosslinkが挙げられる。続いて、上記のようにして得られた統合プロテオーム解析データを用いて、GO解析とネットワーク解析による活性シグナルの絞り込みの検討をする。つまり、1p19qLOHおよび1p19qLOH-のAOAOA組織間でiPEACH解析の後、有意に発現変動していると評価された分子群のリスト内で、1p19qLOH-で発現が亢進している分子群に焦点を当て解析を行った。mRNAの発現変動では、エフリンが最も大きく発現していることが確認された。タンパク質の発現変動においては同様の比較でビメンチンが最も大きく発現が変動しており1p19qLOH-で454倍高発現、p15、発現減少したプローブが863プローブであった。データマイニングはGeneSpringsGXによって行った。これらの方法によりタンパク質の発現変動のみならずリン酸化タンパク質のプロファイリングProQが可能となった。全タンパク質スポットは各サンプル平均4000個であり、全てのプロファイルの定量的な統計解析結果より、タンパク質の発現に有意な変動があったスポットを電気泳動ゲルから抽出し、トリプシン分解を行ったのち、タンパクペプチドを抽出して質量分析装置により、タンパク質の同定を行った。その結果、LOH―群にて特異的に上昇している分子が合計3922個のスポットのうち、LOH―群において12倍以上に上昇したスポットとして合計106個、また、同様の群にて12倍以下に減少したスポットとして105個がリストアップされた。その中で最も等電点および分子量ともに変動しながら発現量の上昇が認められた分子として、ビメンチンビメンチンが同定された。iPEACHによる統合データリスト化ステップEntrez番号、SWNo、GeneNo、分子名、発現比、pValue、修飾ありなし、GO、解析方法を表示し、解析方法によって異なるデータ行同じ分子でも解析結果が異なる、2DDIGEで複数個同定されているものは翻訳後修飾があるとしてその同定数を記載するを含めてすべてリスト化した。このファイルからもう一度、このリストの表記法にformatされた分子を変動率のおおきいものから順に並び替えをして、統合uplist、downlistを作成する。又同時にこのフォーマットで書き直したプロテオミクスデータとトランスくりプトームデータを別個に抜き出した。今回の解析によるデータは定量的に解析できた分子リストとして30、000行におよび、また抽出されたプロテオミクスによる解析の最もup率が高かった分子がビメンチンVimentinであり、DNAアレイで最も高かった分子がエフリンA4EphrinA4であった。GeneSpringsによるGO解析ステップiTRAQ法によるプロテオーム解析で同定されたタンパク質2103個のうち発現増加したタンパク質40個p12と発現減少したタンパク質32個p12とタンパク質105個p15と発現減少したプローブ863個p005、05AffymetrixIDとをEntrezGeneIDNoに変換して統合した結果、発現増加したタンパク質が1512個と発現減少したタンパク質846個の合計16287個のタンパク質が抽出された。このデータをもとに、GeneSpringsGXによるGO解析を行った結果、Biologicalprocessにおいては、regulationofgeneexpression、regulationoftranscriptionおよびMolecularfunctionにおいては、DNAbinding、phosphotransferaseactivityおよびphosphategroupasacceptorが有意に上昇していることが確認された。KeyMolnetによる分子ネットワーク解析ステップGO解析により抽出された分子群の関係性を解析するために、GO解析により抽出された重要な分子リストをもとに、上記一元化ファイルから各分子に紐づけられた発現変動量ならびにLocus情報を取り出してKeyMolnetによる解析に供した。。この解析により、これら分子群を含む経路を明らかにすることができた。つまり、KeyMolnet解析の結果、ビメンチンを中心にその修飾酵素分子群PAK、P13K、PKC、Rho等のキナーゼやカルパイン等のプロテアーゼなどが上昇しているのが認められた。また、その修飾酵素分子はChr1p19qに座位Locusしていることが判明した。さらに、これらの酵素分子群の上流まで調べたところ、GproteinやEphA4などが上昇しているのが認められた図11。なお、これらのネットワークの最上流に存在する分子がEphA4てあって、その変動量は上流では一番大きかったDNAマイクロアレイによる解析では発現増加したLOH―細胞の14倍の発現増加。この結果、GO解析のみによる分子群の抽出では不明であった分子群の関係性、どのようなパスウェイが活性化しているのかなどをKeyMolnet解析により供することで知ることが可能になった。また、KeyMolnetによる分子ネットワーク解析では、EphrinA4とビメンチンを始点終点として、全てのデータからこれに関連するもののネットワークを抽出し、最終的に、EphrinA4→CDC42→p21dependentproteinkinase→ビメンチンリン酸化→Calpain→ビメンチンの特異的切断、さらに、報告されていない所見として、ビメンチン→EphrinA4のネットワークが抽出できた図24。このビメンチン-エフリンA4ネットワークビメンチン-エフリン活性化ループともいうは、新規でかつ化学療法耐性の悪性グリオーマ細胞中に異常に活性化していることが確認された。このネットワークは、EphA4-cdc42-PAKの活性化カスケードから構成され、ビメンチンのリン酸化ならびにカルパインによる断片化を生起し、そのN末端断片が核に転座する。この現象が、化学療法による治療を施した後の患者の癌の進行と余命に非常に関係していることが分かった。興味深いことに、ビメンチンのN末端断片は、エフリンA4の転写因子に変換され、エフリンA1またはsiRNA処理により発現の上昇または下降が観察された。、これらの現象は、抗がん剤であるTMZに対する感受性の増加または減少にそれぞれ関連していた。その結果、細胞ビメンチンの中間径フィラメントのN末端断片は、悪性グリオーマの化学療法耐性を、Eph4-cdc42-PAK1-vimentin活性化ループを経由して増加する転写因子となりうることを示していて、創薬の候補を探索する有用なツールとなりうることを示唆している。本実施例では、実施例1で使用した組織ライセートを、2次元ゲル電軌泳動し、ボアサイズ02μmのボリビニリデンフルオライドPVDFメンブレンを用いて、1時間450nmでブロッテイングした。このPVDFメンブレンをsimplyblueで染色し、シークエンシングに用いるビメンチンスポットを切り出して空気乾燥した。N末端アミノ酸シークエンスは、エドマンEdman分解法で決定した。そのアミノ酸シークエンスは、BLASTプログラムを用いてNCBIデータベース中のビメンチンシークエンスと比較して決定した。ビメンチンの免疫組織化学的解析GO解析ならびにKeyMolnet解析にて有意に上昇した重要な分子としてビメンチンに注目して、その発現量を組織免疫染色法とウエスタンブロッテイング法により検証した。実験は、ビメンチンに対するモノクローナル抗体V9を用い、統合ロテオミクスに供したものと同じ患者由来組織を用いて組織免疫染色法およびウエスタンブロッテイング法で行った。また、LOH-であると報告されているU373細胞およびU251細胞、ならびにLOHであると報告されているU87MG細胞およびA172細胞を用いて、ウエスタンブロッテイングを行った。さらに、統合プロテオミクスに供した以外の患者由来組織を用いてウエスタンブロッテイングを行った。図12Aは、AO患者の組織とグリオーマ細胞株におけるビメンチン発現を示すビメンチンによる組織免疫染色法による解析結果を示している。なお核はヘマトキシリンで染色した。その結果、LOH群に比べてLOH-群の組織において、細胞質と核周辺にビメンチンが強く発現しているのが確認された。図21Bは、AO組織中のビメンチンのウエスタンブロット図である。ウエスタンブロッテイングは、LOHとLOH―のAO患者の組織からの細胞ライセートサンプルをSDS-PAGE電気泳動で分離した後、PVDFメンブレン上でエレクトロブロットして、抗ビメンチン抗体でイムノブロットした。組織を用いたビメンチンのウエスタンブロッテイングにおいて、そのビメンチンの発現量はLOH群に比べてLOH-群の組織において顕著に上昇していたことが分かった。また、約50KDaの分子量のビメンチンに加えて、約45kDa前後のバンドビメンチンが3本観察され、それらのバンドについても増加がみられた。図12Aは、LOHとLOH―のAO患者の組織におけるビメンチン量を示している。本実験は、統合プロテオミクスに供した以外の患者由来の組織合計39検体、LOH-:18検体、LOH:18検体も用いてビメンチンのウエスタンブロッテイングを行い、ビメンチンの定量を行ったところ、ビメンチンの発現量が有意に増加していたことが確認された。図12Bは、グリオーマ細胞のビメンチン発現量をウエスタンブロッテイングで検証した結果を示している。本実験では、ウエスタンブロッテイングは、LOH患者とLOH―のグリオーマ患者の組織からの細胞ライセートサンプルをSDS-PAGE電気泳動で分離した後、PVDFメンブレン上でエレクトロブロットし、抗ビメンチン抗体でイムノブロットした。対照としてActinを使用した。なお、グリオーマ細胞株としては、LOH-群の細胞U251、U373、LOH群の細胞A172およびU87を用いた。その結果、LOH群に比べ、LOH-群の細胞においてより多くのビメンチンが発現し、かつビメンチンの切断が亢進しているのが観察された。図12Cは、LOHとLOH―のAO患者の組織およびグリオーマ細胞株におけるEphA4発現を示している。上段は、LOHとLOH―のAO患者の組織におけるEphA4量を示し、下段は、グリオーマ細胞株U251、U373、A172およびU87中のEphA4のウエスタンブロット図である。ウエスタンブロッテイングは、LOH患者とLOH―のグリオーマ患者の組織からの細胞ライセートサンプルをSDS-PAGE電気泳動で分離した後、PVDFメンブレン上でエレクトロブロットし、抗ビメンチン抗体でイムノブロットした。対照としてActinを使用した。図22は、グリオーマ細胞U373およびA172の生長におけるsiRNAを用いたビメンチンのサイレンシングの効果を示す図である。本実験は、glioma細胞を1×106個ウエルの割合で6ウエルプレートに播種し、24時間後にlipofectamin2000を用いてビメンチンsiRNAまたはcontrolsiRNAを取り込ませた。siRNA導入48時間後に、ウエスタンブロッテイングでその発現量を評価した図22A。siRNA導入24時間後に、グリオーマ細胞を1000個ウエルの割合で96ウエルプレートに播種し、さらに48時間後にウエスタンブロッテイングを用いて細胞生存を評価する図22A。また、ビメンチンsiRNA導入48時間後にグリオーマ細胞2×104個をマトリゲルインベージョンチャンバーに無血清状態で播種し、invasionassayを行った。24時間後にDiffQuicを用いて染色し評価した図22B。その結果、グリオーマ細胞株においては、ビメンチンsiRNAにより細胞増殖ならびに浸潤能が低下したことが確認された。このことは、ビメンチンの発現増加は、細胞増殖と浸潤能を亢進し、予後を悪化させている可能性があることを示している。図23は、グリオーマ細胞株U373およびA172の薬剤抵抗性の差異を示している。薬剤としては、抗がん剤であるTMZTemozolomideを使用した。図23Aは、TMZの濃度変化に対する薬剤抵抗性を示している。図23Bは、siRNAを用いたビメンチンのサイレンシングによるグリオーマ細胞株のTMZに対する抵抗性と、コントロールとのTMZに対する抵抗性を示している。図23Aでの実験では、グリオーマ細胞株において、ビメンチンの発現量が抗癌剤抵抗性に及ぼす影響を調べた。実験は、グリオーマ細胞株を96ウエルプレートに100個ウエルの割合で播種し、5時間後にTMZを0-20μMの濃度で加えた。6日間後にウエスタンブロッテイングを用い吸光度を測定し行った。TMZ濃度が0μMの時をコントロールとして、その吸光度をそれぞれの基準とし、TMZの濃度ごとに生存細胞の割合をで表示した。その結果、TMZ濃度5、10ならびに20μMそれぞれで、U373はA172よりも有意に抗癌剤に抵抗性を示した。つまり、グリオーマ細胞株では、ビメンチンの発現量が多いほど抗癌剤抵抗性が上昇していることが分かった。図23Bでの実験では、グリオーマ細胞株において、ビメンチンのsiRNAによるビメンチン発現低下が抗癌剤抵抗性に及ぼす影響を調べた。実験は、グリオーマ細胞を6ウエルプレートに106個ウエルの割合で播種し、24時間後にリポフェクタミン2000lipofectamin2000を用いてビメンチンsiRNAまたはcontrolsiRNAを取り込ませた。ビメンチンsiRNA導入24時間後に、グリオーマ細胞株を96ウエルプレートに100個ウエルの割合で播種しなおし、5時間後にTMZを0-20μMの濃度で加えた。6日間後にウエスタンブロッテイングを用い吸光度を測定した。TMZ濃度が0μMの時のコントロールの吸光度をそれぞれの基準とし、TMZの濃度ごとに生存細胞をで表示した。その結果、TMZ濃度10ならびに20μMそれぞれで、U373においては、ビメンチンsiRNA処理の方がcontrolsiRNA処理よりも有意に抗癌剤に感受性を示した。一方、A172では、ビメンチンsiRNA処理による抗癌剤感受性上昇は認められなかった。つまり、U373では、ビメンチンの発現量が減少すると抗癌剤感受性が上昇しているのに対し、A172では、この傾向は認めなかった。これは、ビメンチンの抗癌剤による影響が発現量だけによるものだけではなく、LOH-の状態に備わっている細胞内環境によるビメンチンの修飾によるものでないかと考えられる。図24は、ビメンチンを修飾する酵素群とそれら酵素群を制御する分子群の変動を検討すると同時に、それら分子群が1p19qに座位していることから、LOH-群においてビメンチンの修飾が活性化しているかどうかを調べた結果を示している。本実験でKeyMolnetによる解析と分子群の変動率ならびに有意差を再度見直したところ、次のような結果が得られた。まず、1p19qに座位している分子に注目すると、カルパインSS1、CaM、Cdc42、Rho、PI3K、Gタンパク質が座位していた。1p19qに座位し、かつビメンチンを切断する酵素として、カルパインSS1が有意に上昇していた。ビメンチンをリン酸化するキナーゼ群としてPAK、ROCK、CaMKIIがリストされたが、PAKの変動率が2。04倍p005と最も高い変動率であった。また、そのPAKを活性化する分子群として、Cdc42が上昇300倍、p001しており、1pに座位していた。さらに、Cdc42を活性化する分子として、Gタンパク質とEphA4がリストされた。Gタンパク質は1pに座位していた。また、EphA4はDNAマイクロアレイで最も上昇した分子149倍、p0001であった。これらの結果から、ビメンチンを修飾する分子群であって、かつ1p19qに座位している分子をリストしたところ、カルパインSS1、CaM、Cdc42、Rho、PI3KならびにGタンパク質が1p19qに座位していたことが確認された。その中で、カルパインSS1とCdc42の関与が示唆され、さらにGタンパク質の関与も考えられた。さらに、最上流として変動率の大きかったEphA4の関与が示唆された。その結果、EphA4Gprotein→Cdc42→PAK→ビメンチン→phosphoビメンチン→CalpainSS1→ビメンチン断片化の経路が活性化していることが考えられた。図25は、PAKインヒビターでグリオーマ細胞U373を処理した場合に、ビメンチンのPAKによるリン酸化が阻害されることによって起こるビメンチン2Dパターンの変化を示している。右図はPAKインヒビターでグリオーマ細胞U373を処理した図であり、内在性ビメンチンが観察されている。これに対して、左図はネガテイブコントロールを示す図であり、全長の内在性ビメンチンを加えて、切断を受けたビメンチンのスポットが観察されている。本実験は、レポータータンパク質としてGFPビメンチン全長14kbpを導入したU373細胞を1×105個を6ウエルデイッシュに播種し、72時間後にPAK1810μMとそのネガテイブコントロール10μMを刺激した。タンパクを回収後、2Dcleanupkitで脱塩処理し、Auto2Dにてビメンチンの2Dパターンを確認した。その結果、グリオーマ細胞U373において、GFP-ビメンチンと内在性ビメンチンは、PAK18によりリン酸化が阻害されていた。また内在性ビメンチンの切断は減少していた。つまり、ビメンチンは、PAKインヒビター刺激によるビメンチンのリン酸化によるspotの変化だけでなく、切断も減少していた。このことは、ビメンチンがリン酸化を受け、切断されやすくなっていると考えられる。図26は、PAKインヒビター処理がグリオーマ細胞U373の薬剤感受性を増加していることを示す図である。本実験では、グリオーマ細胞株において、PAKが関与しているビメンチンのリン酸化が抗癌剤感受性に与える影響を調べた。本実験は、グリオーマ細胞株を96ウエルプレートに100個ウエルの割合で播種し、5時間後にPAKインヒビター刺激とTMZを0-20μMの濃度で加え、6日間後にウエスタンブロッテイングを用い吸光度を測定した。TMZ濃度が0μMの時をコントロールとして、PAKインヒビター刺激の吸光度をそれぞれの基準とし、TMZの濃度ごとに生存細胞の割合をで表示した。TMZ濃度ごとのコントロールとPAKインヒビター刺激とを比べた。その結果、TMZ濃度5、10μMでPAKインヒビターで刺激したグリオーマ細胞は抗癌剤抵抗性が有意に低下した。このことは、グリオーマ細胞は、PAKによりビメンチンがリン酸化を受け、断片化されることでTMZに対する抵抗性を獲得していることを示している。図27は、グリオーマ細胞株U373中でのビメンチンの断片化を示す図である。実験は、カルパインは、CaiインヒビターおよびA23187によって活性化される。グリオーマ細胞株U373をカルパインインヒビターおよびA23187で刺激した後、ウエスタンブロッテイングで確認した。その結果、カルパインインヒビターはビメンチンの断片化を抑制し、A23187はビメンチンの断片化を促進することが分かった。つまり、ビメンチンはカルパインで切断されることが確認された。図28は、AOAOAのサンプルでのLOHの有無とビメンチンの切断についての評価結果を示している。本実験では、AOAOAの38サンプルのビメンチンをウエスタンブロッテイングで調べた。ビメンチンのバンドを上からグループA~Eに分け、LOHの有無による発現の違いを調べた。その結果、LOH-では、ビメンチンは、全体の発現だけでなく、切断を受けたそれぞれのバンドでも発現が増加していたことが確認された。このことから、LOH-では、ビメンチンの発現量だけでなく、ビメンチンが切断を受けることによって、予後が悪化している可能性があることを示唆している。図29は、ビメンチンの断片化がグリオーマ細胞株U373の薬剤抵抗性を増加させることを示している。この実験では、グリオーマ細胞株において、カルバイン阻害剤Calpiによる刺激ならびにカルシウムイオノフォアCaiA23187による刺激が、抗癌剤抵抗性に及ぼす影響を調べた。実験は、グリオーマ細胞株を96ウエルプレートに100個ウエルの割合で播種し、5時間後にCalpi1μMまたはA231871μM刺激とTMZを0-40μMの濃度で加えた。6日間後にウエスタンブロッテイングを用い吸光度を測定した。TMZ濃度が0μMの時をコントロールとして、Calpi刺激およびA23187刺激の吸光度をそれぞれの基準とし、TMZの濃度ごとに生存細胞をで表示した。TMZ濃度ごとのコントロールとCalpi刺激およびA23187刺激を比べた。その結果、TMZ濃度5、10、20μMでCai刺激したグリオーマ細胞は抗癌剤抵抗性が有意に低下し、TMZ濃度20、40μMでA23187刺激により抗癌剤抵抗性が有意に増加した。このことは、グリオーマ細胞においては、ビメンチンがカルバインにより断片化を受けることでTMZに対する抵抗性を獲得していることを示している。フラグメント化したビメンチンの生物学的役割を検証するために、まず、フラグメントの局在をU373細胞およびA172細胞を用いて検証した。6ウェルガラスプレートにて培養したU373細胞ならびにA172細胞をPBSで洗浄した加後、4パラフォルムアルデヒドで固定した。PBSで3回洗浄後、01TritonX100PBSで5分間処理した後、3BSAPBSで20分間一晩ブロッキングした。ついで、PBSで2回洗浄後、3BSAPBSで希釈した抗N末端ビメンチン抗体および抗C末端ビメンチン抗体を添加して室温で60分間反応させた。さらに、PBSで2回洗浄後、3BSAPBSで希釈したAlexa488標識抗マウス二次抗体およびAlexa546標識抗ウサギ二次抗体を添加して室温で60分間反応させた。反応終了後、PBSで2回洗浄して共焦点顕微鏡にてビメンチンの細胞内局在を観察した。その結果、抗C末端ビメンチン抗体を用いた場合、U373細胞およひA172細胞はともに細胞質のみが染色されていた。抗N末端ビメンチン抗体を用いて場合、U373細胞およびA172細胞はともに細胞質の染色像に加えて、興味深いことに、核内がスポット状に染色されているのが観察された図30。抗N末端ビメンチン抗体にて細胞の核内が染色されたことから、切断されたビメンチンのN末端切片の核への移行が示唆された。図31Aは、ビメンチンのN末端断片がグリオーマ細胞の核中へ移行していることを、図31Bは、ビメンチンのN末端断片が悪性グリオーマ細胞の核に局在していることを、また図31Cは、ビメンチンのN末端断片がグリオーマ細胞の核に移行していることを示している。グリオーマ細胞株およびAOAOA組織でビメンチンN末端の局在を調べた。グリオーマ細胞をビメンチンC末抗体およびビメンチンN末端抗体で同時染色したところ、グリオーマ細胞にN末端抗体で核内部が粒状に染色されたことが確認された。このことは、ビメンチンのN末端が核に移行していることを示している図30、図31A。また、LOH-組織では核内のN末端抗体による強い反応が見られた図31B。次に、グリオーマ細胞にレポータータンパク質としてGFP-ビメンチン全長、GFP-N末端ビメンチン、ビメンチン全長-GFP、およびN末端ビメンチン-GFPを発現させて観察したところ、GFPタンパク質を融合させたN末端ビメンチンが特異的に核に移行したことが確認された図31C。図32Aは、グリオーマ細胞株において、N末端ビメンチンにより、EphA4mRNAの発現が上昇するかどうかを確認した結果を示している。U373細胞にGFP-N末端ビメンチン発現ベクターをエレクトロポレーションにより導入した。細胞1×1055個当たり05μgのベクターを導入し、細胞1×105個ウエルで12ウェルに播種した。播種後、0、1、3、6、9、12、18、24時間後にmRNAを回収して、qRTPCRにてEphA4のmRNAの発現量を定量した。その結果、N末端ビメンチンがEphA4mRNAを上昇させていることが確認された。図32Bは、U373を用いたEphrinA1EphA4レセプターのリガンド刺激によるEphA4mRNAへの影響を示している。U373細胞を2×104個ウエルで12ウエルに播種し、一晩培養後、EphrinA1終濃度:3μgmLを添加した。0、1、3、24時間後にmRNAを回収して、qRTPCRにてEphA4およびビメンチンのmRNAの発現量を定量した結果、EphA4がEphA4mRNAを上昇させていることが確認された。図33は、グリオーマ細胞株において、エフリンならびにセロトニン刺激が、抗癌剤抵抗性に及ぼす影響を調べた結果、エフリンとセロトニンがグリオーマ細胞U373の薬剤抵抗性を増加することを示している。グリオーマ細胞株を96ウェルプレートに100個ウェルの割合で播種し、5時間後にエフリン3μgmlまたはセロトニン30μM刺激とTMZを0-40μMの濃度で加えた。6日間後にウエスタンブロッテイングを用い吸光度を測定した。TMZ濃度が0μMの時をコントロールとして、ephrinA1刺激、セロトニン刺激の吸光度をそれぞれの基準とし、TMZの濃度ごとに生存細胞をで表示した。TMZ濃度ごとのコントロールとephrinA1刺激、セロトニン刺激を比べた。その結果、図示するように、TMZ濃度5、10、20、40μMそれぞれでephrinA1刺激、セロトニン刺激により抗癌剤抵抗性が有意に増加したことが確認できた。つまり、グリオーマ細胞株ではエフリン刺激ならびにセロトニン刺激により抗癌剤感受性が上昇していることが確認された。図15および図16に示すように、TMZのグリオーマ細胞中での代謝で得られる代謝産物の中でも、特にビメンチンの修飾部位が同定されたPAKとCalpainSS1に注目した。このPAKの活性化因子で上流につながる分子として、今回の解析からCdc42ならびにEphA4が有意に発現上昇しており、それぞれのシグナルにつながる分子の活性化カスケードは、インヒビターを用いたウェスタンブロッティングの検証実験によりグリオーマ細胞内で有意に活性化していることが確認された。最終的に、フィラメントフォームのビメンチンはリン酸化されることによって、安定なsolubleformとなって特異的に切断されやすくなること、さらには、その切断責任酵素はカルパインcalpainであることが判明した。さらに興味深いことに、この特異的に切断されたビメンチンN末端断片は、グリオーマ細胞内で核移行を示すことが判明した。本発明の統合プロテオミクス解析によって、グリオーマ細胞の薬剤耐性機構が明らかになった。抗がん剤のTMZを例にとって説明すると、TMZは、5imidazole4carboxamideに先ず代謝されて、次に5aminoimidazole4carboxamideとmethylhydrazineに代謝される。この代謝産物により、核内ビメンチンN末端断片に多数存在するアルギニンがメチル化されることで、TMZによるDNAメチル化グアニン修飾を拮抗的に阻害すると考えられる。また、ビメンチンN末端断片は、DNAのグアニンに富む領域に直接結合することができるので、その結果、構造的にTMZによるDNAのメチル化が阻害されることも予想される図16。さらに、EphA4-ビメンチン分子ネットワークにより、ビメンチンのN末端断片は、核内のビメンチンのN末端断片量を自立的に増加させる。それによって抗がん剤耐性を増大させることが分かった。今回の解析によって、抗癌剤耐性のグリオーマ細胞内で活性化しているビメンチンシグナルが判明した。特に、細胞外からのEphA4を介してのCdc42の活性化、それによって活性化したPAKによるビメンチンのリン酸化、さらにリン酸化によってsolubleformとなったビメンチンのカルパインによる切断が起こっていることが確認された。また、切断されたビメンチンN末端側の核への移行も確認された。それぞれのシグナルにつながる分子の活性化カスケードは、インヒビターを用いたウェスタンブロッティングの検証実験によりグリオーマ細胞内で有意に活性化していることが確認された。最終的に、フィラメントフォームのビメンチンはリン酸化されることによって、安定な可溶化フォームsolubleformとなって特異的に切断されやすくなること、さらには、その切断責任酵素はカルパインであることが確認された。さらに興味深いことに、この特異的に切断されたN末端断片は、グリオーマ細胞内で核移行を示すことが分かった。つまり、グリオーマ細胞にGFP-ビメンチン全長およびGFP-N末端側ビメンチンを発現させた場合、全長は細胞質全体に繊維状に発現するのに対して、GFP-N末端側ビメンチンは有意に核へ移動していることが判明した。グリオーマの臨床切片においても、LOH-の患者組織においてN末端ビメンチンが有意に核に蓄積していることが確認された図31B、31C。本実施例は、日本人女性舌癌患者の舌癌局所再発部位組織から得た性質の異なる2種類の細胞SQUU-A細胞およびSQUU-B細胞を株化した細胞株を使用した。SQUU-A細胞は、膨張性増殖も脈管内浸潤もなく、低転移性癌細胞であり、SQUU-B細胞は、浸潤性増殖も、脈管内浸潤もある高転移性癌細胞である。SQUUB細胞はSQUUA細胞との混合培養条件下で優勢に発育する。SQUU-B細胞において、発現が高くなっている分子、すなわち転移能やSQUUA細胞との混合条件でも優勢発育に関与していると考えられる分子をプロテオーム解析とDNAアレイを用いて解析した。このプロテオーム解析の結果、41個のタンパク質の発現が、またDNAアレイを用いた解析の結果、2665個のmRNAの発現が有意に高くなっていることを確認した。これらのデータを、上記に従ってMANGOおよびiPEACHによる解析をして、SQUU-B細胞において発現が上昇したタンパク質が関係している経路を分子ネットワーク解析KeyMolnetによりランク付けをした。その結果、HIFを用いて検証した。3DCCシステムは、96ウェルプレートの各ウェルに2マトリゲルMatrigelを注入した実験系であって、各ウエルにそれぞれ細胞数2x104個ずつSQUU-A細胞単独、SQUU-B細胞単独、ならびに細胞混合を播種して培養した。本実験の結果、SQUU-A細胞単独およびSQUU-B細胞単独を培養した実験系では、経時的観察をしたところ、いずれの細胞も大きな細胞塊を形成したが、SQUU-B細胞の方が、SQUU-A細胞よりも細胞同士が固く接着し球状の細胞塊を形成した図36。SQUU-A細胞およびSQUU-B細胞を混合して培養した実験系では、SQUU-A細胞が経時的に減少するとともに、細胞塊の中心部から辺縁部へ局在が変化した。一方、SQUU-B細胞は優勢発育をしているのが観察された図37。そこで、SQUU-A細胞およびSQUU-B細胞を混合して培養した実験系において、SQUU-A細胞とSQUU-B細胞との細胞隗の体積比率を共焦点レーザー顕微鏡を使用して測定した。その結果、SQUU-B細胞の割合が経時的に増加し、SQUU-A細胞の割合が減少しているのか分かった図38。一方、HIF1が癌細胞の転移能に影響を及ぼす分子について検討した。そのために、3DCCにおけるマトリゲル内細胞塊のHIF1の活性化状態を評価するために、HIF1によってGFPを発光する遺伝配列を持つGFPリポーター遺伝子を持つベクターを細胞に組み込んで、細胞内HIF1の活性化状態を評価した。その結果、SQUU-B細胞の細胞隗では、その中心部においてGFPの発現が認められたが、SQUU-A細胞ではGFPの発現は認められなかった。SQUU-A細胞とSQUU-B細胞とのHIF1に対する応答性の違いがSQUU-B細胞の優勢発育に関与しているのではないかと考えられる図39。つぎに、SQUU-A細胞とSQUU-B細胞との転移能の違いを評価するために、HIF1とカドヘリンECadherinのICCによる発現の比較ををした。この実験で、塩化コバルトを用いてHIF1の分解を抑制したところ、HIF1が蓄積活性化されている部位でカドヘリンの発現が抑制されていることが分かった。上記の実験結果から、高転移性癌細胞SQUUBでは腫瘍増殖に伴い次第にHIF1が発現するのに対し、低転移性癌細胞SQUUAではHIF1の発現は見られなかった。また、SQUUA細胞は徐々に細胞数を減らし、細胞塊の中心部から辺縁部へと局在を変えてゆく一方で、SQUUB細胞は発育に伴いその数が増加することが確認された。さらに、SQUUB細胞では、HIF1の発現に伴いカドヘリンEcadherinの発現が低下した。このことは、高転移性癌細胞SQUUBの優勢発育と低転移性癌細胞SQUUAの減少にHIF1が関与しているのではないかと考えられる。その上、転移能の高い細胞は環境の変化によって接着分子の発現を制御することでEMTを引き起こすことができるのではないか考えられる。上述したように、iPEACHプログラムによって、KeyMolnetを用いてシグナルネットワークを解析した。図11に示すように、LOH―細胞群の発現増加タンパク質データから抽出したネットワークは、LOH細胞群よりも非常に密集していることが確認されている。このネットワークから、発現が最大増加をしかつ修飾されているコアとなるタンパク質はビメンチンであることが同定された。つまり、2D-DIGE解析によって2~12個のスポットが検出され、それらの発現増加率は16倍~284倍であった。また、34種類の修飾を持つ発現増加した12タンパク質スポットには、5つのfoldchangeが質量分析で同定されたESIで45倍、またMALDIで26倍。さらに、上流の責任修飾酵素群は、いくつかのキナーゼやキナーゼアクチベータ例えば、PAKP13KPKCRhocdc42等やプロテアーゼ例えば、カルパイン等に連結していることが分かった。興味深いことは、発現増加したこれらの責任修飾酵素群の染色体上の遺伝子座が1pと19qにあったことである。さらに、これらのネットワークの最も上流の分子がエフリンA4であることが同定されたDNAマイクロアレイ解析でLOH-組織中で14倍もの発現増加が認められた。このエフリンA4は、cdc42の発現増加に連結し、続いてPAK1の活性化を促進し、ビメンチンのリン酸化を生起する。リン酸化ビメンチンは、カルパインによるタンパク質分解の標的であることが知られている。ビメンチンのタンパク質分解酵素であると知られるカルパインの抑制サブユニットであるcalpainsmallsubunit1がLOH-組織中で有意に発現増加したタンパク質群中に同定され、このタンパク質もまた染色体19q上に座位していた。ビメンチン-エフリンA4ネットワークの1p19qLOH―のAOAOA組織ならびにグリオーマ細胞株中における活性化について説明する。1p19qLOH―のAOAOA組織中の発現増加したある特定のネットワークで抽出同定された、エフリンA4、cdc42、PAK1、カルパインならびにビメンチンからなる分子ネットワークについて調べた。1p19qLOH―のAOAOA組織ならびにグリオーマ細胞株中のエフリンA4とビメンチンの発現レベルは、これらに対する特定の抗体を用いたウエスタンブロッテイングにより定量した。LOH―組織中のエフリンA4発現の平均レベルは、LOH組織中よりも25倍も高かった図40a,b。また、U-251ならびにU-373細胞中のエフリンA4発現の平均レベルは、A172ならびにU-87細胞中よりも23倍高かった図40c、d。同様に、LOH―組織中のビメンチン発現の平均レベルは、LOH組織中よりも31倍も高かった図40e,f。また、LOH―グリオーマ細胞中のビメンチン発現の平均レベルは、LOH細胞中よりも27倍高かった図40g、h。興味深いことに、ビメンチンの高い発現増加に加えて、特定のビメンチンタンパク質分解フラグメントが1p19qLOH-組織の細胞株中に観察された図40e、g。また、cdc42の平均発現レベルは、1p19qLOH-組織中で12倍、また1p19qLOH-グリオーマ細胞株中で14倍高かった図40i,j。さらに、1p19qLOH-グリオーマ細胞中において、cdc42の活性化がエフリンA4を経由して増加するかどうかを調べるために、エフリンA4のリガンドであるエフリンA1による刺激後にcdc42活性化レベルを解析した。その結果、エフリンA1による刺激後、cdc42活性化レベルは、U373細胞では、A172細胞に対して、平均16倍有意に増加した図40i,l。上記の結果は、cdc42が、1p19qLOH-グリオーマ細胞株中のエフリンA4シグナルを経由して特異的に発現増加して活性化されることを示唆している。同時に行った実証実験で、カルパインSS1CAPNS1もまた1p19qLOH-グリオーマ細胞株中で発現増加した図40m,n,o,p。さらに、これらのことは、エフリンA4、cdc42、カルパインならびにビメンチンが1p19qLOH-グリオーマ細胞株中で特異的に発現増加することを示唆している。つぎに、1p19qLOH-AOAOA組織中でPAK1ならびにカルパインが活性化することによってビメンチンのリン酸化と断片化が発生することを確認するために、ProQDiamondを用いた2D-DIGE法で同定されたビメンチンタンパク質スポットを2Dウエスタンブロッテイング法で解析した。二次元ゲル上に現れた4000個のスポットのうち、全体で16個のスポットpI47-51かつMW37-51KDaをビメンチンとして同定した図41a、図42。16のビメンチンスポットのうち、1p19qLOH-AOAOA組織群の9スポットの強度が1p19qLOHAOAOA組織よりも高かった図41b。興味深いことに、酸性側に移動した16ビメンチンスポットのうち、13スポットがProQDiamondに対して陽性であり、それらのスポットはリン酸化されたビメンチンであることを示していた図42。これらのスポットを、分子量別に5つのグループに分類した:グループAは51kDa、グループBは48kDa、グループCは45kDa、グループDは41kDaならびにグループEは37-39kDa図41a、b。また、神経膠芽腫glioblastoma:GBM組織由来のビメンチンスポットは、AOAOA組織と同様に、質量分析解析とN末端アミノ酸配列分析によって解析した。その解析結果から、16ビメンチンスポットの全ての一次構造は、GBM組織でもAOAOA組織でもほとんど同じであった図41d。GBM組織ならびにAOAOA組織中で検出された16ビメンチンスポットは、2D-PAGEならびにウエスタンブロッテイングによるパターンは完全に同じであった図43a-c。したがって、AOAOA組織中でのビメンチンのリン酸化ならびに断片化は、GBM組織中とほとんど同じであることを確認した。それに加えて、PAK1による修飾部位として知られるSer26、Ser27、Ser39ならびにSer73を含むビメンチンの21個の異なるリン酸化部位がMSMS分析によって同定された図44。グループAのN末端セリン残基はアセチル化されるが、グループB、グループCならびにグループDのビメンチンフラグメントのN末端アミノ酸配列は、カルパインで切断可能であることが知られている図41d、図45。そこで、ビメンチンのリン酸化とN末端切断がPAK1ならびにカルパインによって生起されることを確認するために、GFP-ビメンチン1-464aa全長が過発現増加したU373グリオーマ細胞株におけるビメンチンスポットのパターンをC末抗ビメンチン抗体を用いた2Dウエスタンブロッテイング法を用いて分析した。この結果、興味深いことに、PAKのインヒビターペプチドてあるPAK18がGFP-ビメンチンのリン酸化ばかりではなく、過発現増加したビメンチンと内在性ビメンチンの両者のタンパク質分解による断片化をも抑制することが分かった図25。また、このビメンチンの特定の断片化はカルパインインヒビターによっても抑制される図27。これらの結果は、ビメンチンがPAK1によってリン酸化され、続いてカルパインで断片化されることを示唆している。続いて、N末端ビメンチンフラグメントが1p19qLOH-AOAOAグリオーマ細胞の核に移行することを説明する。2D-DIGEによる分析によって、D11番のビメンチンフラグメントVim72-464のスポットの強度比のp値が、LOH-細胞とLOH細胞の間の全ビメンチンスポットの中でも最低であることが観察された。そこで、LOH-細胞中のビメンチンフラグメントの機能変化についてN末端ビメンチンを認識可能でかつD11-E16とは反応しないビメンチン抗体およびC末ビメンチン抗体V6417近辺;抗C末Vimを使用して調べた結果、ビメンチンフラグメントがLOH-U373グリオーマ細胞の細胞質および核に局在していることを確認した。両方の抗体はいずれも細胞質中のビメンチン骨格線維を認識したが図46a-d、抗N末端ビメンチン抗体H84だけが細胞の核領域を認識した図46b-d。これらの結果は、ビメンチンが断片化した後、ビメンチンのN末端フラグメントが核に移行することを示唆している。このことを確認するために、GFP-N末端ビメンチンフラグメント、GFP-C末ビメンチンフラグメントならびにGFP融合全長ビメンチンを含むビメンチン過発現プラスミドベクター図46eを構築して、このプラスミドをU373グリオーマ細胞に誘発させた。その結果、予想通りに、GFP-C末ビメンチンフラグメントとGFP融合全長ビメンチンは、細胞質領域に過発現し、内在性ビメンチンと同様に線維形成をした図46f、g。しかしながら、GFP-N末端ビメンチンフラグメントは細胞核領域に有意に移行していた図46h。さらに生化学的に検証するために、GFP-全長ビメンチンを過剰発現させた後にU373細胞から核タンパク質を作製し、抗N末端ビメンチン抗体H84ならびに抗GFP抗体を用いて2Dウエスタンブロッテイングを行った。その結果、図46i-nに示すように、N末端ビメンチンフラグメントに対するスポットが両抗体によって核フラクションpI76-83;MW33KDaに同定された図46o-t;矢印で示した。更に興味深いことに、核フラクション中に同定されたN末端ビメンチンフラグメントは、ephA1-Fcによる刺激によって増加し図46j,k,m,n、PAK18による刺激図46p、sおよびカルパインインヒビターによる刺激図46q、tによって消失した。これらの結果は、LOH-グリオーマ細胞においてPAKによってリン酸化されたビメンチンのカルパインによる断片化が増加し、次いでビメンチンN末端フラグメントが、LOH-グリオーマ細胞の細胞核中に容易に移行したことを示している。さらに、N末端ビメンチンフラグメントのグリオーマ組織の細胞核中への移行を確認するために、AOAOAグリオーマ腫瘍組織n=30について、抗N末端ビメンチン抗体H84およびC末ビメンチン抗体V9を用いて免疫組織学的分析を行った。図47a、bに示すように、LOH-AOAOA患者n=16の組織中のN末端ビメンチンフラグメントは有意な核染色がされていることが観察された。抗N末端ビメンチン抗体によって高核染色がされたLOH-AOAOA患者の全生存期間ならびに非進行性の生存期間の平均は、抗N末端ビメンチン抗体によって高核染色がされたLOH-AOAOA患者の方が、抗N末端ビメンチン抗体によって低核染色がされたLOH-AOAOA患者に比べて非常に短かいことが分かった。これらの結果は、LOH-AOAOA患者とLOHAOAOA患者のOSでも、PFSでもほとんど同じであることが分かった図47c-f。このことから、AOAOAグリオーマ腫瘍組織中のN末端ビメンチンフラグメントの核内移行と蓄積は、患者生存の良好な診断マーカーとして有用であると言える。さらに、AOAOAグリオーマ細胞中の核内に移行したN末端ビメンチンフラグメントが転写因子制御剤となりりうるかどうかを調べた。統合プロテオーム解析のデータから、LOH-組織の抽出ネットワークシグナル内の発現もしくは活性化により増加したエフリンA4、cdc42、PAKおよびカルパインCAPNS1は、核内のN末端ビメンチンフラグメントの転写標的遺伝子の候補となりうることが分かった。A172グリオーマ細胞を用いて、GFP-N末端ビメンチンフラグメントの過剰発現の後に、エフリンA4、cdc42、PAKおよびカルパインCAPNS1のRT-PCRを行った。その結果、GFP-N-Vim細胞中のエフリンA4mRNAだけが時間依存的に増殖した図48a。一方、他は変化がなかった図48b-d。このことは、エフリンA4がGFP-N末端ビメンチンの責任遺伝子の候補となりうることを示唆している。さらにエフリンA4遺伝子がN-Vimの転写候補となりうるかどうかを確認するたるに、U373細胞中でのエフリンA1による刺激後のエフリンA4mRNAの発現を解析し、siRNAによってビメンチンをノックダウンした細胞と比較した。エフリンA1刺激後、エフリンA4mRNAの時間依存的な発現増加がコントロールsiRNA処理U373細胞で観察されたが、エフリンA4mRNAで処理したU373細胞では、エフリンA4mRNAの発現は完全に抑制された図48e。そこで、N末端ビメンチンフラグメントがエフリンA4の転写因子となりうるかどうかを解明するために、N-VimのエフリンA4プロモーター中のコンセンサス部位への結合活性をクロマチン免疫沈降ChIPアッセイにより分析した。その結果、U373細胞中の内在性ビメンチンも、抗N末端ビメンチンフラグメント抗体H84ならびにGFP抗体でそれぞれ免疫沈降させたU373細胞中で一時的に過剰発現したビメンチンもエフリンA4プロモーターDNAを有意に増幅することができた。このことは、N-VimがエフリンA4遺伝子のプロモーター部位に結合することができ、その転写を活性化したことを示唆している図48f、g。その上、N-VimによるエフリンA4の転写活性化とグリオーマ細胞の化学療法感受性との関係を検討するために、ephrinA1による刺激またはsiRNAによるエフリンA4ノックダウン後における悪性グリオーマ患者の治療に最も臨床で適用されているアルキル化剤であるTMZに対するU373細胞の感受性を分析した。その結果、ephrinA1による刺激によりU373細胞のTMZに対する感受性が低下した図48h。一方、エフリンA4siRNAによる形質導入後は、U373細胞のTMZに対する感受性は増加した図48i。これらの結果は、エフリンA4の活性化はグリオーマ細胞の化学療法耐性を増加することを示している。このことをビメンチンをノックダウンしたグリオーマ細胞がTMZに対する化学療法耐性を増加するとの本発明者らの研究結果と合わせると、ビメンチン活性化ループ図15によるエフリンA4の活性化に伴ったcdc42ならびにPAKの活性化、この活性化によるカルパインの活性化によるビメンチンのリン酸化、さらに核内移行によるエフリンA4の転写活性化が生起されることから、N末端ビメンチンフラグメントは、グリオーマ細胞の化学療法に対する耐性を増強する転写因子となりうる。上述したように、本発明は、アプリケーションソフトiPEACHを構築することによって腫瘍特異的な活性化ネットワーク解析のための統合プロテオミクスを確立した。本ソフトウエアは、DNAマイクロアレイ法、iTRAQ法、2D-DIGE法などの数種類のmRNAデータ、プロテオーム発現データならびに修飾データから別個に得られた分子リストを同一プラットフォーム上に統合可能である。また、このソフトウエアは、GO解析やネットワーク解析などの機能解析のための新規なデータセットを処理するために有用である。これらの連続的な解析によって、膨大な全ての分子情報から更なる研究のために容易に焦点を合わせたりまたは絞り込んだりすべき重要な分子の情報を抽出することも可能である。本発明では、これらのストラテジーを利用して、悪性腫瘍、特に1p19qLOH―ならびに1p19qLOHAOAOAの化学療法に対する感受性について分析した。また、これらの染色体の腕に存在する関連遺伝子や1p19q欠失の診断上の重要性に関連する分子機構はまだ不明である。本発明では、本発明者らが確立したデータマイニングソフトウエアiPEACHを使用した包括的な分子解析によりAOAOAを分析して悪性腫瘍の化学療法に対する感受性に関連する異常に活性化した新規ネットワークであるEphA4-ビメンチン活性化ループを同定した。上述したように、このネットワークは、EphA4-cdc42-PAKからなる連続的な活性化カスケード、そのN末端フラグメントが核中に移行するビメンチンのリン酸化ならびにカルパインによる断片化からなり、EphA4転写を活性化している。興味深いことに、化学療法耐性の1p19qLOH―群にて発現増加するcdc42、PAKならびにCalpainsmallsubunitCAPNS1の遺伝子は、染色体1pまたは19q上に局在し、cdc42、PAKならびにカルパインの発現増加によるEphA4-ビメンチン活性化ループが1p19qの片アレル欠失に有意に関連しているとともに、化学療法による治療後の患者の非進行性の余命に深く関わっていることである。本発明により、グリオーマ細胞ならびに患者のグリオーマ組織中のN末端ビメンチンフラグメントの核移行の証拠が、核抽出物のウエスタンブロッテイングにより特定のN末端ビメンチン抗体を用いて免疫細胞学的ならびに免疫組織学的、さらには生化学的に初めて示された。興味深いことに、ChIPならびにRT-PCR分析により、移行したN末端ビメンチンフラグメントは、EphA4の転写因子として作用していた。グリオーマ細胞においては、EphA4mRNAの発現は、N末端ビメンチンフラグメントの過発現によって強化されていて、このEphA4はEphA1刺激によりその発現が増加し、またEphA4mRNAでの処理により抑制された。その上、EphA1刺激によるEphA4の発現増加または化学療法剤TMZ処理によるEphA4の発現低下は、TMZ処理に対する感受性の低下または増加にそれぞれ強く関連している。これらの結果を合わせると、新規なEphA4-ビメンチン活性化ループが化学療法剤の感受性に関連していることは明らかである。このループは、cdc42-PAK-カルパイン活性化カスケードcdc42のビメンチン活性化、PAKによるビメンチンのリン酸化、カルパインによるビメンチンの断片化、ならびにEphA4転写の発現増加をするN末端ビメンチンフラグメントの核内移行からなる一連の反応の発現増加をするN末端ビメンチンフラグメントの核移行の発現を増加している。本発明によって、細胞内フィラメントタンパク質であるN末端ビメンチンフラグメントが悪性グリオーマに対する化学療法耐性を増加する転写因子として作用することが初めて示された。タイプIII中間径フィラメントIFタンパク質であるビメンチンは、間葉細胞中の主要なIFタンパク質であり、細胞ならびに組織のマーカーとして汎用されている。ビメンチンは、種間で高度な配列相同性を有していることから、重要な生理学的な役割を有していることを示唆している。最近、ビメンチンは、胚形成および転移中に発生する上皮間葉転換epithelialtomesenchymaltrasitionEMTの因子として注目されているが、その機能はまだ詳細には解明されていない。IFタンパク質で見られるような典型的なヘッドとテールの関係にあるN末端とC末ビメンチンは、種々の構造およびシグナル分子と相互反応をし、またビメンチンのリン酸化は、ビメンチン依存IFダイナミックスのキーレギュレーターであり、IFネットワークの構成ならびにIFタンパク質の細胞内分布をを調整している。また、ビメンチンは、非常に複雑なリン酸化パターンを持っていることが知られている。cAMP依存性プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼC、Ca2カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII、PAK、Cdk1Cdc2キナーゼ、Rhoキナーゼ、AuroraBならびにポロ様キナーゼ1は、有糸分裂、分化、ストレスなどの異なる細胞状態に特異的な部位やキナーゼを持っている。ホスホキナーゼ、PAKならびにCdc42Racの標的は、デスミン。つまり筋肉特異的タイプIIIIFタンパク質であるビメンチンに対するカギとなるキナーゼであることが分かった。生化学的には、アミノ酸端末ヘッドドメイン中のビメンチンのSer25、Ser38、Ser50、Ser65ならびにSer72は、PAKによる主要なリン酸化部位であり、またリン酸化ビメンチンは10nmフィラメントを生成する能力を喪失していて、それでこの可溶性形solubleformはフィラメント精製能力が消失するとともに、フィラメント再構築、可溶性ならびに安定性を生起しているとの報告がある。IFタンパク質のリン酸化は、その平衡を可溶性形の方に移動させ、タンパク質分解から保護することによって大きなプールを維持し、IFタンパク質の再生成を促進している。ビメンチンの場合は、GFAPの場合と同様に、ビメンチンのリン酸化は、その分解を遅延させるが、別の細胞機能に関連するであろう特異的タンパク質切断の可能性を増加させている。カルパイン-1およびカスパーゼは、ビメンチンの切断酵素として報告されている。本発明者らは、血管平滑筋細胞に対して報告されているビメンチン切断部位71Rを悪性グリオーマで観察した。これらの結果を合わせると、カルパインによるビメンチン特異的断片化は、PAKによるビメンチンのリン酸化によって抑制できることを示唆している。ビメンチンは、専門化されたDNA構造、例えばサテライトDNA、テロメアDNAレトロポゾン、ミトコンドリアDNAなどとの相互反応力を有すると示唆する報告がある。また、ビメンチンのN末端ヘッドは、invitroでのDNA結合の責任領域であるとして同定されている。さらに、ビメンチンは、核マトリックス付着領域結合タンパク質に関連していて、DNAを含むMARモチーフと顕著に関連していることが明らかになっている。本発明は、invivoで初めて、グリオーマ細胞核DNAにinvivoで結合しているN末端ビメンチンフラグメントを化学療法に関連する転写因子として同定した。エフリンレセプターEphは、レセプター型チロシンキナーゼという最大のファミリーを表していて、そのリガンドであるエフリンephrinと相互作用している。Eph-ephrinシグナル伝達は、細胞骨格構築ならびに細胞接着を規制することによって主に細胞の形態ならびに運動能に影響するとともに、細胞増殖ならびに細胞運命の決定に影響を及ぼしている。したがって、Ephシグナル伝達は、腫瘍発生に何らかの役割を果たしていると考えられる。最近になって、Ephレセプターならびにephrinの遺伝子が、様々なヒト腫瘍、例えば、悪性メラノーマ、グリオーマ、前立腺がん、乳がん、肺小細胞がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、直腸結腸がんに分化的に発言しているのが認められた。発現パターンの重大な歪曲は、侵襲性の増加や転移力の増加などの腫瘍の挙動の変化による患者の予後の悪化に関連していると考えられる。Ephレセプターの過剰発現において広く観察されている減少にもかかわらず、その悪性表現型の過程における役割については完全には解明されていない。しかしながら、最近の証拠では、Ephシグナル伝達経路が腫瘍進行に関与していることを示している。遺伝子発現解析研究では、高度なアストロサイト腫瘍におけるEphA4レセプターの異常な発現が示唆されていて、FGFR1fibroblastgrowthfactorreceptor1との相互作用による増殖および移入増進によって過剰発現したEphA4が腫瘍細胞の悪性表現型に影響していることが示唆されている。それに加えて、活性型のRac-1およびCdc42がEphA4過剰発現細胞中に増加したという報告もある。しかしながら本発明は、グリオーマに対する化学療法耐性に関与するビメンチンを介した活性化ループによって規制される最も有力な候補であることを示す最初の報告である。上述したように、定量的プロテオミクスストラテジーは、生物学的現象の網羅的特長を示すために強力で有効である。これらの手法は、腫瘍バイオマーカーならびに創薬標的探索に応用されてきたが、生物学的な解明や機能解明の方法に使用する場合には、実験によって得られる膨大なデータを処理する際に生じる技術的問題のために、その処理方法が限定されていた。その技術的問題点しては次の4つが挙げられる。1LCショットガンをベースにしたMSシステムや2Dゲルをベースにした解析のような1つの形のプロテオミクスによる定量的同定は、解析方法の特異性に起因する分子同定範疇の違いによって全体のプロテオームを網羅することができないため、プロテオーム適用範囲に理論的な制限があること;2公共のタンパク質データベースは、そのアクセッション番号や同義語が独自のものであったり、入手できる遺伝子情報が限定されていたり、サーチエンジンが実験から得られるオリジナルデータRawdataを効率的/網羅的に解析するのに適していない場合が多く、更に一括して膨大な量の分子情報を探索するのに使い勝手が悪くかつ複雑すぎること;3数千種類ものタンパク質の発現解析結果に関する情報処理は、GO、ゲノム遺伝子座、OMIM、インタラクトームなどのアノテーション付与を自動化するための単純で使い勝手が良いソフトウエアがないために膨大な量の仕事が要求されることと同時に、遺伝子情報が完全に解明されていない生物種の解析結果をヒトオルソログに変換して自動的に機能情報を得るなどの工夫がなされていないこと。;4DNAアレイなどによるトランスクリプトームデータは、それらの定量法ならびに解析結果の様式がプロテオームデータと相違があるために、その元となる材料が同一サンプルから入手されたにもかかわらず、プロテオームデータと統合することが容易でないこと。したがって、本発明に係るプロテオーム解析用データ群ならびにプログラムは、翻訳後修飾を含む網羅的プロテオームデータ、網羅的トランスクリプトームデータ、および数種類の公共データベースから選別した分子機能情報を、オリジナルデータRawdataの情報を損なうことなく統合するとともに、それらのデータを再構築し、補強し、かつ分類データマイニングして、他の処理に関連する候補分子を明示するための単純でかつ迅速なツールを備えている。この発明により、このプロテオーム解析用データ群を利用することによって、はじめて、グリオーマのような悪性腫瘍組織や細胞の化学療法耐性についての機序の研究を完成させることが可能となった。"