"細胞試料または組織試料の血管新生シグネチャを特定する方法において、被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、a前記試料についてADAMTS-1、アンギオゲニンAngiogenin、アンギオポエチン-1Angiopoietin-1、アンギオスタチンAngiostatin、BMP-1、EGF、EG-VEGF、エンドスタチンEndostatin、FGFa、FGFb、PDGF-AA、PDGF-AB、プロラクチンProlactin、TIMP-1、プロコラーゲンI型、およびuPAからなる群から選択される少なくとも3種の血管新生関連因子の発現レベルを試験するステップ、を含むことを特徴とする方法。請求項1に記載の方法において、bステップaで測定された前記結果を基準発現レベルと比較するステップと、cステップbでの前記比較結果を基に前記被検者の血管新生促進能力を予測するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。請求項2に記載の方法において、ADAMTS-1、アンギオゲニンAngiogenin、アンギオポエチン-1Angiopoietin-1、アンギオスタチンAngiostatin、EGF、EG-VEGF、エンドスタチンEndostatin、PDGF-AA、PDGF-AB、プロラクチンProlactin、TIMP-1、プロコラーゲンI型、およびuPAのうちの1種以上のレべル増加が、基準レベルと比較して血管新生促進能力と負の相関を持つことを特徴とする方法。請求項2に記載の方法において、FGFa、FGFb、BMP-1のうちの1種以上のレべル増加が、基準レベルと比較して血管新生促進能力と正の相関を持つことを特徴とする方法。血管新生治療法の効能を予測する方法において、請求項2乃至4の何れか1項に記載の方法を使用して被検者の前記血管新生促進能力を測定するステップと、前記血管新生促進能力を、血管新生治療計画および被検者の結果に相関するモデルプロファイルと照合するステップと、を含むことを特徴とする方法。血管新生能力を予測する予見モデルの作成方法において、複数の被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、a各試料について、ADAMTS-1、アンギオゲニンAngiogenin、アンギオポエチン-1Angiopoietin-1、アンギオスタチンAngiostatin、BMP-1、EGF、EG-VEGF、エンドスタチンEndostatin、FGFa、FGFb、PDGF-AA、PDGF-AB、プロラクチンProlactin、TIMP-1、プロコラーゲンI型、およびuPAからなる群から選択される少なくとも3種の血管新生関連因子の発現レベルを試験するステップと、b前記各試料をインビトロおよび/またはインビボ血管新生アッセイで試験するステップと、cステップaの前記結果をステップbの前記結果と照合するステップと、を含むことを特徴とする方法。血管治療に用いる薬剤を同定する方法において、被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、a前記試料を前記薬剤に接触させるステップと、b前記試料について、ADAMTS-1、アンギオゲニンAngiogenin、アンギオポエチン-1Angiopoietin-1、アンギオスタチンAngiostatin、BMP-1、EGF、EG-VEGF、エンドスタチンEndostatin、FGFa、FGFb、PDGF-AA、PDGF-AB、プロラクチンProlactin、TIMP-1、プロコラーゲンI型、およびuPAからなる群から選択される少なくとも3種の血管新生関連因子の存在またはレベルを試験するステップと、c前記血管新生関連因子の発現の存在および/またはレベルを、前記薬剤に接触していない試料における同じ前記血管新生関連因子の発現の存在および/またはレベルと比較するステップと、を含むことを特徴とする方法。請求項1乃至7の何れか1項に記載の方法において、前記試料が前記被検者の心臓組織もしくは血管組織、ウォートンジェリーWharton’sJelly、臍帯、臍帯血、末梢血、骨髄、胚性細胞、またはiPS細胞から採取されたものであることを特徴とする方法。請求項8に記載の方法において、前記試料が心房生検、心室生検、または静脈血管もしくは動脈血管からの生検であることを特徴とする方法。請求項8または請求項9に記載の方法において、前記試料が、骨格系、心臓系、内皮系もしくは間質系の支持細胞、または間葉系もしくは造血系の幹細胞または始原細胞、ES細胞またはiPS細胞を含んで構成されることを特徴とする方法。請求項10に記載の方法において、前記心臓細胞が、心臓由来の始原細胞もしくは幹細胞、心筋細胞もしくは関連する心臓線維芽細胞、または血管細胞であることを特徴とする方法。請求項10に記載の方法において、前記内皮細胞がウォートンジェリーWharton’sJelly、臍帯、末梢血、微小血管系、ESまたはiPS由来の内皮細胞であることを特徴とする方法。請求項1乃至12の何れか1項に記載の方法において、前記試験が前記RNAレベルおよび/またはタンパク質レベルでの遺伝子発現の測定を含むことを特徴とする方法。請求項1乃至13の何れか1項に記載の方法において、前記試験がELISA、ウェスタンブロッティング、PCR、RT-PCR、または等温核酸増幅を含むことを特徴とする方法。請求項1乃至14の何れか1項に記載の方法において、試験に先立って前記試料からの細胞を細胞培養で伸張することを特徴とする方法。請求項1乃至15の何れか1項に記載の方法において、ADAMTS-1、アンギオゲニンAngiogenin、アンギオポエチン-1Angiopoietin-1、アンギオスタチンAngiostatin、BMP-1、EGF、EG-VEGF、エンドスタチンEndostatin、FGFa、FGFb、PDGF-AA、PDGF-AB、プロラクチンProlactin、TIMP-1、プロコラーゲンI型、およびuPAのうちの少なくとも5種を試験することを特徴とする方法。請求項1乃至16の何れか1項に記載の方法において、ADAMTS-1、アンギオゲニンAngiogenin、アンギオポエチン-1Angiopoietin-1、アンギオスタチンAngiostatin、BMP-1、EGF、EG-VEGF、エンドスタチンEndostatin、FGFa、FGFb、PDGF-AA、PDGF-AB、プロラクチンProlactin、TIMP-1、プロコラーゲンI型、およびuPAを全て試験することを特徴とする方法。細胞の前記血管新生促進能力を向上させる方法において、被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、a前記試料について、ADAMTS-1、アンギオゲニンAngiogenin、アンギオポエチン-1Angiopoietin-1、アンギオスタチンAngiostatin、BMP-1、EGF、EG-VEGF、エンドスタチンEndostatin、FGFa、FGFb、PDGF-AA、PDGF-AB、プロラクチンProlactin、TIMP-1、プロコラーゲンI型、およびuPAからなる群から選択される少なくとも3種の血管新生関連因子の発現レベルを試験するステップと、bステップaで測定された前記結果を基準発現レベルと比較するステップと、cステップbにおける比較の結果に基づいて前記被検者の血管新生促進能力を予測し、細胞培養における前記試料からの細胞を任意に伸張するステップと、d低酸素プレコンディショニング、ii薬理学的治療、およびiii遺伝子組み換えのうちの1つ以上を使用して前記細胞を処理するステップをさらに含むことを特徴とする方法。請求項18に記載の方法において、前記処理した細胞を前記被検者に移植するステップを、さらに含むことを特徴とする方法。内皮細胞ECおよび内皮コロニー形成細胞ECFCをエキソビボで伸長するための方法において、内皮生育条件での培養中に、ECおよびECFCを1種以上の血管新生関連因子に接触する前記ステップを含むことを特徴とする方法。請求項20に記載の方法において、細胞を少なくとも1週間維持することを特徴とする方法。請求項20または21に記載の方法において、前記血管新生関連因子が組み換え型ポリペチドまたはタンパク質であることを特徴とする方法。請求項20乃至22の何れか1項に記載の方法において、支持細胞が提供されることを特徴とする方法。請求項23に記載の方法において、前記支持細胞が、間質細胞、骨髄細胞、心臓組織細胞、臍帯血細胞、ウォートンジェリーWharton’sJelly、血管周囲細胞、脂肪組織、微小血管由来の間葉系/間質細胞、成体および胎児の皮線維芽細胞、胚性幹ES細胞、または人工多能性幹細胞iPS由来の支持間質細胞から選択されることを特徴とする方法。請求項23または24に記載の方法において、血管新生関連因子を発現するように、前記支持細胞を遺伝的に修飾することを特徴とする方法。請求項20乃至25の何れか1項に記載の方法において、前記内皮細胞またはECFCが胎児、新生児、成人、またはウォートンジェリーWharton’sJelly、臍帯、臍帯血、末梢血、大血管もしくは小血管、微小血管系、ESもしくはiPS由来の内皮細胞、UCB、PB、または脈管系などの組織から採取されることを特徴とする方法。請求項26に記載の方法において、前記細胞は自系または同種異系であることを特徴とする方法。請求項20乃至27の何れか1項に記載の方法において、前記血管新生関連因子がADAMTS-1、アンギオゲニンAngiogenin、アンギオポエチン-1Angiopoietin-1、アンギオスタチンAngiostatin、BMP-1、EGF、EG-VEGF、エンドスタチンEndostatin、FGFa、FGFb、PDGF-AA、PDGF-AB、プロラクチンProlactin、TIMP-1、プロコラーゲンI型、およびuPAからなる群から選択されることを特徴とする方法。請求項20乃至28の何れか1項に記載の方法において、前記血管新生関連因子がBMP-1であるか、またはBMP-1と1種以上の血管新生関連因子との組み合わせであることを特徴とする方法。前記虚血症状治療用の前記薬剤調製における、伸張したECまたはECFCの使用。請求項30に記載の使用において、前記虚血症状が冠状動脈疾患CAD、末梢動脈疾患PAD、発作、脳虚血、創傷癒合、肝臓虚血、肺虚血、または腎虚血から選択されることを特徴とする使用。請求項30または31に記載の使用において、ADAMTS-1、アンギオゲニンAngiogenin、アンギオポエチン-1Angiopoietin-1、アンギオスタチンAngiostatin、BMP-1、EGF、EG-VEGF、エンドスタチンEndostatin、FGFa、FGFb、PDGF-AA、PDGF-AB、プロラクチンProlactin、TIMP-1、プロコラーゲンI型、およびuPAから選択される前記血管新生関連因子が生成されるように、前記ECまたは前記ECFCを修飾することを特徴とする使用。請求項30乃至32の何れか1項に記載の使用において、虚血症状を有する被検者の再内皮化を前記ECまたはECFCによって容易にすることを特徴とする方法。伸張したECもしくはECFC、または血管新生関連因子うちの1種以上を含んで構成されることを特徴とする、医療インプラント。請求項34に記載の医療インプラントにおいて、前記ECまたは前記ECFCが請求項20乃至29で定義された前記方法で調整されることを特徴とする、医療インプラント。請求項33、34または35の何れか1項に記載の医療インプラントにおいて、前記インプラントが人工組織移植、ステント生組織移植片、無細胞組織移植片、経皮パッチ、または薄膜から選択されることを特徴とする、医療インプラント。請求項34乃至36の何れか1項に記載の医療インプラントにおいて、前記血管新生関連因子がBMP-1であるか、またはBMP-1と1種以上の他の血管新生関連因子との組み合わせであることを特徴とする方法。伸張したECもしくはECFC、およびBMP-1のうちの1種以上、またはBMP-1および他の血管新生促進因子のうちの1種以上と、薬理学的に許容される希釈液、担体または賦形剤とを含んで構成されることを特徴とする、製薬用組成物。請求項38に記載の製薬用組成物において、前記組成物が固体、液体または懸濁液の形態であることを特徴とする、製薬用組成物。請求項38または39に記載の製薬用組成物において、前記組成物が短期または長期にわたって徐々に放出されるように処方されることを特徴とする、製薬用組成物。医療的治療または療法における、BMP-1、またはBMP-1および1種以上の他の血管新生関連因子の組み合わせの使用。前記虚血症状治療用の前記薬剤調製における、BMP-1、またはBMP-1および1種以上の他の血管新生関連因子の組み合わせの使用。請求項42に記載の使用において、前記虚血症状が冠状動脈疾患CAD、末梢動脈疾患PAD、発作、脳虚血、創傷癒合、肝臓虚血、肺虚血、または腎虚血から選択されることを特徴とする使用。実施例1ヒト心臓幹細胞/始原細胞の単離、伸張および特徴付けヒト心臓始原細胞を単離し、事前に細胞単離を行わずにその心筋細胞集塊形成能力を介してエキソビボで伸張させた。規定されたプロトコールに従い、オフポンプ心臓手術を受けた患者からの組織生検心房および心室から細胞を単離したSmith,Barileetal.2007、および図1Aを参照。平板培養後の7~14日、フェーズブライトPhase-bright細胞を、間質様細胞の単層を通じて脱落させた。これらの細胞は、サイトカインの存在下で培養すると、心筋細胞集塊と呼ばれる3次元構造を形成する。フェーズブライトPhase-bright細胞の数、および心筋細胞集塊の数および寸法は、平板培養された細胞の数の関数として記録された。集団倍加時間および心筋細胞集塊由来の細胞CDCの細胞成長速度を定量し、フローサイトメトリーで表現型解析を実行した図1Dを参照。心房黒および心室グレーの生検で得られたCDCは、造血CD45および内皮CD31マーカーの発現を欠くが、CD90およびCD105間葉マーカーに対して陽性であった。一部の細胞は、CD117c-kit、幹細胞マーカーも発現した。心筋細胞集塊の形成能力および血管新生促進能力を共に有する心臓由来細胞を、心房生検で富化されたことを確認し、その後で心室試料と比較した。2人の患者からの分化CDC骨、脂肪、および軟骨の形成系列は外観上、対照群である骨髄間葉原種BMSCと類似していた図1E。GATA4の発現図1FおよびACTA2α-平滑筋アクチン、図1Gの発現を、5人の患者における心臓細胞マーカーおよび平滑筋細胞マーカーの例としてRT-PCR法で評価した。ハウスキーピング遺伝子の発現は、β-2-ミクログロブリンに対する相対パーセンテージで報告された。骨髄間葉間質細胞BMSC、ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC、臍帯血UBCCD133陽性細胞、およびヒト心臓からの総mRNAが、RT-PCR分析用の対照群として用いられた。結果から、心筋細胞集塊形成細胞がヒト心臓の心房内で富化されたことと、これらの細胞が系列特異的マーカー発現および分化能力の点で間葉原種に似ていることが立証された。実施例2血管網の形成または支持に関する評価CDCの血管および間葉能力を、血液または骨髄から誘導されたEPC/MSCと比較し、これを血管新生の確立済みインビトロモデルを使用して調査したZhangetal.,2009。ヒト内皮細胞を、低感染多重度MOI1~3にて、GFP細胞を発現するVSV-G偽型レンチウイルスlentiviralベクターで形質導入し、細胞増殖に有害な影響を及ぼすことなしに形質導入効率が95を超えるようにしたMartin-Rendon、結果は非公開。形質導入された細胞は、内皮成長生育培地で14日間支持細胞と共培養された。これにより、脈管管状構造の形成が可能になる。この期間中に管状構造の成長が監視された。AngioSysソフトウェアパッケージTSC生物製剤を使用して、形成された細管の数、細管の総数、細管の平均長さ、および接合部の数を定量した。結果図2は、BMSCが、インビトロの血管図2Aに似た管状構造の形成を支持し得ることを示している。CDCは血管形成も支持し得る図2Bおよび図2Cが、患者の試料同士の間では有意な差異が観測された。血管新生促進能力が強い患者26Pt26のCDCで支持された血管、および血管新生促進能力が弱い患者25Pt25のCDCで支持された血管の各典型画像をそれぞれ、図2Dおよび図2Eに示す。実施例3プロコラーゲンI型の発現および血管新生能力血管新生能力の強い患者および弱い患者におけるプロコラーゲンI型の発現を調査する実験にて、それらの患者間で発現に差異を生じたことが立証された図2Fおよび図2G。患者10人から採取されたCDC内のプロコラーゲンI型免疫反応性は、弱い群と強い群とで有意に異なる図2G。これらの結果は、ヒトCDCがインビトロでの脈管構造の形成を支持すること、さらにはその血管新生促進能力が、細胞外基質成分の発現および析出と反比例的に相関することを立証している。実施例4虚血性心疾患患者からの心臓由来細胞CDCの血管新生促進能力さらに実験を実施し、虚血性心疾患患者10人からそれぞれ単離された心臓由来細胞の血管新生促進能力を調査した。10人の患者から採取された骨髄由来間葉細胞BMSCおよびCDCを、内皮生育培地でGFP標識ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECと14日間共培養した。血管形成を14日間にわたってモニターし、NikonTE300顕微鏡およびPCIソフトウェアを使用して画像を撮影した。AngiosysソフトウェアTCSCellworks,UKを使用して、細管の数、接合部および細管の総長さを数量化した。患者の細胞を、血管新生促進能力に応じて、2つの別個の群強い群および弱い群に分類した。患者2、8、10、23および26から取り出されたCDCが、強い血管新生能力を示したのに対して、患者13、14、25、27および28から取り出されたCDCは弱い血管新生能力を示した図3A。実施例5骨形成タンパク質1の発現および血管新生促進能力虚血性心疾患患者10人から採取されたCDC、およびBMSCの各々にて、骨形成タンパク質BMP1タンパク質の発現を調査した。上記と同じ条件の下で細胞を生育し、細胞溶菌液を調合した。SDS-PAGEゲル上には総タンパク約30μgを装填した。タンパク質をナイロン製膜、ならびに抗ヒトBMP-1抗体RDシステムおよび抗チューブリン抗体でプローブされた膜へ移した図3B。図3Cに示すように、BMP1タンパク質の相対濃度をデンシトメトリーで測定した。患者の試料中のBMP1タンパク質レベルを、健常ドナー白いバーからのBMSC中のBMP1発現レベルに正規化した。患者10人のうちの9人において、血管新生促進能力とBMP1タンパク質レベルとの間に、正相関が認められた。概して、血管新生促進能力の強いCDC黒いバーのBMP-1レベルは、中央値レベルに等しいかそれを上回った約75以上は横線でマークされた。対照的に、血管新生促進能力の弱いCDCグレーのバーは、中央値を下回るBMP1タンパク質レベルを示した。Pt28は例外である。以上の結果をまとめると、慢性虚血性心疾患患者から採取されたCDCにおける血管新生促進能力と、その細胞内のBMP1タンパク質レベルとの間には相関があることが示される。阻害剤を使用して、血管新生に対するBMP1の影響をさらに調査した。上記と同様に、2人の患者Pt05およびPt07から採取されたBMSCおよびCDCを、内皮生育培地で14日間GFP標識HUVECと共培養した。培養菌を10uMのBMP1阻害剤で14日間処理した。培地を3日ごとに入れ替えて、新鮮な阻害剤を添加した。Angiosysソフトウェアを使用して、細管の数、接合部、および細管の総長さを上記のように数量化した。阻害剤p<0.05で処理された細胞内の細管、接合部および細管長さが有意な低下を呈した場合の、健常なドナーおよび2人の患者の結果を、図4Aに示す。BMP1阻害剤の非存在下および存在下での共培養14日目の典型画像を、図4Bに示す。BMP1活性を阻害すると、血管新生に悪影響が及ぶ。BMP1阻害剤で処理された後の細胞において血管形成能力の低下が認められたことは、BMP1が、血管形成を抑制する因子の1つであることを示す。血管新生に対するBMP1の影響を、小さい阻害性RNAを使用して、さらに調査した。Lipofectamineを製造元の指示に従い使用して、2人の患者からPt05およびPt07採取された健常ドナーおよびCDCからのBMSCを、siRNAオリゴでトランスフェクションした。約24時間のポスト形質移入にて、4日間および7日間、細胞が内皮生育培地でGFP標識HUVECと共培養された。非標的対照群対照群-白いバーまたは特異的BMP1濃いバーのsiRNAオリゴのどちらかで処理された細胞内の相対的な血管新生を、図5Aに示す。BMP1のsiRNAp<0.05で処理された培地では、非標的対照群のsiRNAで処理された培地と比較して、細管、接合部および細管長さが有意な低下を呈した図5Bに、4日目で採取した血管網の典型画像を示す。siRNAの発現が一時的であったため、4日間および7日間に限定して培養をモニターした。このため、この血管網および図4Bに示す網14日目で採取されたが成長しなかったことは、注目に値する。にもかかわらず、管状構造が形成されたことは明らかであった。血管新生促進細胞におけるBMP1の発現の特異的減少によって、血管新生が減衰した。このことは、BMP1が心臓における血管新生の調整因子の1つとなり得ることを示唆している。実施例6さらなる血管新生因子の発現および血管新生促進能力データは、少なくとも2つの患者群血管新生能力が高度の患者群と低度の患者群が存在し得ることを示唆している。データを総括すると、心臓由来細胞の血管新生を支持する能力と、それらの細胞における一部の細胞外基質成分例えば、プロコラーゲンI型の発現との間には、逆相関があると思われる図2。また、細胞増殖と血管新生促進能力との間にも相関が存在するMartin-Rendon、結果は非公開。管状構造の成長を支持するため、血管新生促進能力の良好な患者と不良患者のそれぞれからの心臓由来細胞を、標準条件下にて内皮生育培地で生育した。次いで、細胞を遠心し、前述したように細胞溶菌液を調合した。総タンパクは標準技術で数量化された。タンパク質アレイをプローブするために、細胞溶菌液RDSystems製のProteomeProfilerアレイを使用した。ここで、55種の血管新生関連タンパク質に対して選択された捕捉抗体は、ニトロセルロース膜上に複製して観測された。非特異的に結合する抗体に対しては、膜をブロックした後、約100gの総タンパクでインキューベートした。次いで、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼStreptavidin-HorseradishPeroxidaseStrep-HRPおよび化学発光検出試薬を使用して、膜上に固定された捕捉抗体に結合した検体複合体が検出された。生成された化学発光信号は、結合された検体の量に直接相関していた。陽性信号をX線フィルム上に現像し、画像分析ソフトウェアを用いてさらにスキャンし、数量化した。各血管新生関連のタンパク質を表す複製スポット対の信号を平均し、形態陰性対照スポットから信号を減じることによって、平均ピクセル密度MPDを定量した。得られた結果を図6および7に示す。ADAMTS-1図6A、アンギオゲニンAngiogenin図6B、アンギオポエチン-1Angiopoietin-1図6C、アンギオスタチンAngiostatin図6D、EGF図6E、EG-VEGF図6F、エンドスタチンEndostatin図6G、PDGF-AA図6H、PDGF-AB図6I、プロラクチンProlactin図6J、TIMP-1図6K、uPA図6Lの発現は、細胞の血管新生促進能力と負の相関を持つすなわち、これらの因子の発現は、弱い血管新生能力を呈する細胞においてより顕著であった。FGFa図7AおよびFGFb図7Bの発現は、心臓由来細胞血管新生促進能力と正の相関を持つすなわち、これらの因子の発現は、強い血管新生能力を呈する細胞においてより顕著であった。実施例7血液からの内皮コロニー形成細胞ECFCの単離臍帯血UCBまたは成体末梢血PBから、ECFC/遅発性生成細胞を単離した。概して、50~120mlのUCBまたは50mlのPBを使用した。前述したプロトコールZhangetal.2009に従って、UCBおよびPBに存在する単核細胞MNC分画をフィコール密度勾配遠心分離で単離した。コラーゲンコーティングした6穴ウェルプレートでMNC類を2×106/ウェルの密度にて平板培養し、EGM-2などの内皮生育培地で2~4週間培養した。内皮様コロニー図8Aを同定し、計数した。個々のコロニーをプラスチック製のクローニングリングで単離し、内皮生育培地でさらに集密度になるように伸張した図8B。UCBおよびPBのECFCは、HUVECなどの内皮細胞に特徴的な玉石状の単層を形成する図C。UCBおよび成体のPBから採取されたECFCの数を図8Dに示す。実施例8内皮細胞およびECFCの伸長方法実施例7に従って、臍帯HUVECから、もしくは臍帯血のMNC分画から、内皮細胞ECおよび内皮コロニー形成細胞ECFCをエキソビボで単離するか、または成体の末梢血ECFCMNCをコラーゲンコーティングしたプレートで平板培養し、支持細胞と共培養した。内皮生育条件での培養中に1種以上の血管新生関連因子、好ましくはBMP-1にECまたはECFCを接触させ、少なくとも1週間またはそれ以上、好ましくは2週間維持し得る。血管新生関連因子を、組み換え型ポリペチドまたはタンパク質として細胞培地に添加してもよいし、支持細胞によって生成してもよい。ECまたはECFCを、支持細胞を以前に培養した調整培地に接触してもよい。支持細胞を、ウイルスベクターシステムを使用して短期間または長期間でこの種の因子を生成するように遺伝的に修飾しておくことも、またはこの種の血管新生関連因子の発現を修飾するための薬剤で処理しておくこともできる。データは、成体ヒトPB内のECおよびECFCの数が少ないことを示唆している。治療的血管新生においてECおよびECFCを大量に使用するうえでの課題の1つは、これらの細胞をエキソビボで伸張することである。提示されたデータは、支持細胞における血管新生とBMP-1のタンパク質発現レベルとの間に直接的な正相関があることを示唆している図3。ヒトBMP-1遺伝子のcDNAは、哺乳類発現ベクターpEZM09中のLabOmicsGeneCopoeia,Rockville,MD,USAから採取された。BMP-1cDNAを適切な制限酵素で消化し、親プラスミドから切除し、AdrianThrasher教授の好意により提供されたレンチウイルスlentiviralベクターLVゲノム含有のプラスミドに若干の修正を加えてクローンした。このシステムで、ベクターゲノム内の脾臓フォーカス形成ウイルスsFFvプロモータの制御下にてヒトBMP-1cDNAを発現した図9A。上述のGFPに使用したものと同じパッケージングレンチウイルスlentiviralベクタープラスミド図9Bおよび同じVSV-G発現プラスミド図9Cを使用し、3種のプラスミド同時トランスフェクション方法を用いて、LV-BMP1ウイルス粒子を生成した図9DSoneokaetal.,1995。約48時間のポスト形質移入にて、HEK293T細胞の上澄みから粒子を採取した図9D。LV-BMP1ウイルス株をLV-GFPウイルス株と平行して滴定した。約2×106~2×107/mlの形質導入単位が採取された。骨髄BMSCまたは心臓組織CDCの何れかから取り出された支持間質細胞を、1~10の範囲のMOIの各々にて形質導入した。形質導入から2日後に、支持細胞をGFP標識HUVECまたはUCBのECFCと2週間共培養した。支持細胞がBMP1を発現する培養において、緑色のECFCおよびHUVECの数図10Aは、擬形質導入された細胞と比較して有意に増加した図10A。実施例9内皮細胞の代謝促進実施例8に記載されているように、漸増して示したMOIMOI1~10の各々にて、骨髄由来または心臓由来の間葉/間質細胞をLV-BMP1粒子で形質導入した。約48時間のポスト形質導入にて培地を入れ替え、さらに48時間放置した。形質導入された細胞および形質導入されなかった細胞の調整培地を収集し、その細胞片を低速遠心分離にて取り除き、HUVECの培養に使用した。MTTアッセイなどの標準アッセイを使用して、内皮細胞の代謝期が特定された。HUVECは96穴ウェルプレートに500細胞/ウェルにて播種された。200μlの調整培地を細胞自体に添加したか、または新鮮な培地と1:1の比率で混合した。HUVECを調整培地と共に2~4日間インキューベートし、その後、1ウェルあたり50μlのMTTで細胞を処理し、37°Cで3~4時間インキューベートした。上澄みを吸引し、約100μlのDMSOをウェルに添加した。570nmでの吸光度には、対照群と比較した細胞の代謝状態が反映されている。BMP-1で形質導入された細胞の調整培地でHUVECを処理すると、570nmでの吸光度が有意に上昇する。このことは、調整培地含有BMP-1のHUVEC代謝の上昇を示している図11。実施例10内皮細胞増殖の促進漸増して示したMOIMOI1~10の各々にて、骨髄由来または心臓由来間葉/間質細胞をLV-BMP1粒子で形質導入した。形質導入細胞および形質導入されなかった細胞の調整培地を使用してHUVECを培養し、HUVEC増殖に対する影響を定量した。HUVECを約5×104細胞/ウェルとなるように6穴ウェルプレートに播種し、2mlの調整培地と共に37°C、5CO2で2~4日間インキューベートした。次いで、細胞を回収し、計数した。細胞周期解析用に、細胞を0.1のTrironX-100で透過処理し、ヨウ化プロピジウムPIおよびDAPIで染色した。その際、以前に発行したプロトコールPozarowskiおよびDarzyhiewiczに従った。HUVEC処理細胞のDNA含有量をフローサイトメトリーで分析した図12。典型的なヒストグラムに、細胞周期のG1期、S期、またはG2/M期における細胞のパーセンテージを条件ごとに示す。結果によると、BMP-1含有の調整培地で処理されたHUVECがG2/Mにおける細胞の比率の増加を示したことが示唆される。この比率は、MOI=0の形質導入からの調整培地で処理された細胞における13.6から、MOI=1の形質導入からの培地で処理された細胞における18.1に増加した。G2/Mにおけるこの増加は、MOI=3および10の形質導入から培地で細胞を処理した場合に維持される。細胞増殖を定量するために、第2の方法も使用された。細胞を70エタノール中で2時間固定した。細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、100μl中107細胞/mlとなるように再懸濁させた。次いで、細胞をアイソタイプ対照抗体またはKi67抗体両方の抗体はFITCと共役されていると共に30分間インキューベートした。図12に示すように、細胞に結合されたるFITC共役Ki67をフローサイトメトリーで検出した。結果によると、形質導入された細胞からの調整培地でHUVECを処理した場合に、形質導入されなかった細胞と比較して、Ki67陽性細胞のパーセンテージに増加があることが示唆される。以上の結果をまとめると、内皮細胞の代謝、細胞周期の進行、ならびに細胞増殖および/または細胞生存が促進されるのは、これらの細胞をBMP-1の存在下で培養した場合であることが示唆される。ECまたはECFCの代謝を上昇し得る血管新生関連因子は、ECまたはECFCに対して増殖を誘発するか、細胞生存を増強する。参考文献1Freedman,S.B.,andIsner,J.M;TherapeuticAngiogenesisforCoronaryArteryDisease;AnnalsofInternalMedicine2002;1361:54-71.2RivardA,FabreJE,SilverM,ChenD,MuroharaT,KearneyM,etal.Age-dependentimpairmentofangiogenesis.Circulation.1999;99:111-20.3RivardA,SilverM,ChenD,KearneyM,MagnerM,AnnexB,etal.Rescueofdiabetes-relatedimpairmentofangiogenesisbyintramusculargenetherapywithadeno-VEGF.AmJPathol.1999;154:355-63.4CouffinhalT,SilverM,KearneyM,SullivanA,WitzenbichlerB,MagnerM,etal.ImpairedcollateralvesseldevelopmentassociatedwithreducedexpressionofvascularendothelialgrowthfactorinApoE-/-mice.Circulation.1999;99:3188-98.5SchultzA,LavieL,HochbergI,BeyarR,StoneT,SkoreckiK,etal.InterindividualheterogeneityinthehypoxicregulationofVEGF:significanceforthedevelopmentofthecoronaryarterycollateralcirculation.Circulation.1999;100:547-552.6Martin-Rendon,E.,Snowden,J.A.,andWatt,S.M.Stemcell-relatedtherapiesforvasculardiseases.TransfusionMedicine.2009;194:159-171.7PassanitiA,TaylorRM,PiliR,GuoY,LongPV,HaneyJA,PaulyRR,GrantDS,MartinGR.Asimple,quantitativemethodforassessingangiogenesisandantiangiogenicagentsusingreconstitutedbasementmembrane,heparin,andfibroblastgrowthfactor,LabInvest.1992Oct;674:519-28.8Antibodies:ALaboratoryManualHarlowandLaneEds.ColdSpringHarborPress9Smith,R.R.,Barile,L.,Cho,H.C.,Leppo,M.K.,Hare,J.M.,Messina,E.,Giacomello,A.,Abraham,M.R.,andMarban,E.RegenerativePotentialofCardiosphe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