白血球除去マトリックスを用いて全血から白血球を分画する段階;および分画された白血球を溶解してRNAを含む溶解物を得る段階を含む、RNAを含む白血球溶解物を得る方法。溶解時、白血球がマトリックス上に含まれる、請求項1記載の方法。溶解前に、白血球がマトリックスから流し出される、請求項1記載の方法。白血球の溶解前に、マトリックスを含む白血球がある期間保存される、請求項2記載の方法。分画された白血球が、溶解溶液と接触する、請求項1記載の方法。溶解溶液が、界面活性剤を含む、請求項5記載の方法。界面活性剤が、TritonX100、Tween20、SDS、サルコシル、またはデオキシコール酸である、請求項6記載の方法。溶解溶液がカオトロピック剤を含む、請求項5記載の方法。カオトロピック剤がグアニジン塩である、請求項8記載の方法。グアニジン塩がグアニジンチオシアネートである、請求項9記載の方法。溶解溶液がリボヌクレアーゼ阻害因子を含む、請求項5記載の方法。溶解溶液がプロテアーゼを含む、請求項5記載の方法。プロテアーゼがプロテイナーゼKである、請求項12記載の方法。溶解物からRNAを抽出する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。RNAを抽出する段階が有機抽出によって行われる、請求項14記載の方法。有機抽出がフェノールクロロフォルム抽出である、請求項15記載の方法。溶解物からRNAおよびDNAを抽出する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。溶解前に、白血球に浸透しかつ保存組成物で処理されていない細胞中のRNAと比較してRNAの安定性を増大させる塩を含むRNA保存組成物で、分画された白血球を処理する段階を含む、請求項1記載の方法。塩が硫酸塩である、請求項18記載の方法。塩が硫酸アンモニウムである、請求項19記載の方法。保存組成物中の最終塩濃度が、10g100mlから飽和濃度の間である、請求項18記載の方法。塩が、20g100mlから塩の飽和濃度の間の最終濃度で保存組成物中に存在する、請求項20記載の方法。塩が、30g100mlから80g100mlの間の最終濃度で保存組成物中に存在する、請求項20記載の方法。RNA保存組成物が、少なくとも2つの塩を含む、請求項18記載の方法。総塩濃度が、20g100mlから100g100mlの間の最終濃度で保存組成物中に存在する、請求項24記載の方法。分画された白血球が白血球除去マトリックス上に含まれ、マトリックスがRNA保存組成物と接触する、請求項18記載の方法。分画された白血球から有機抽出でRNAを抽出する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。抽出されたRNAが、RNA保存媒体で処理されなかった分画された白血球から抽出されたRNAよりも少ないDNA混入物を有する、請求項27記載の方法。網状赤血球の混入を減ずるために、分画された白血球を溶液で処理する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。溶液がRBC溶出緩衝剤である、請求項29記載の方法。溶液がRBC溶解溶液である、請求項29記載の方法。RBC溶解溶液が、水または塩化アンモニウム溶解溶液である、請求項31記載の方法。白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;溶解物を有機溶液で抽出して有機相および水相を形成させる段階;有機相および水相を分離する段階;および水相からRNAを単離する段階を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;白血球へ浸透する塩を含み、RNAの安定性を増大させるRNA保存組成物で、分画された白血球を処理する段階;分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;溶解物を有機溶液で抽出して有機相および水相を形成させる段階;有機相および水相を分離する段階;および水相からRNAを単離する段階を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;白血球へ浸透する塩を含み、RNAの安定性を増大させるRNA保存組成物で、分画された白血球を処理する段階;分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;および溶解物からRNAを単離する段階を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;および溶解物からRNAを単離する段階を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;網状赤血球の混入を減ずるために、分画された白血球を溶液で処理する段階;分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;有機溶液で溶解物を抽出して有機相および水相を形成させる段階;有機相および水相を分離する段階;および水相からRNAを単離する段階を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。白血球除去マトリックスで捕捉することにより血液から白血球を分画する段階;網状赤血球混入を減ずるために、分画された白血球を溶液で処理する段階;白血球へ浸透し、RNAの安定性を増大させる塩を含むRNA保存組成物で、分画された白血球を処理する段階;分画された白血球を溶解して溶解物を生じさせる段階;有機溶液で溶解物を抽出して有機相および水相を形成させる段階;有機相および水相を分離する段階;および水相からRNAを単離する段階を含むように、さらに定義される、請求項1記載の方法。溶解物中の1つまたは複数のRNAの存在または量をアッセイする段階をさらに含む、請求項1記載の方法。アッセイする段階が、Northernブロット、RNAase保護アッセイ、ハイブリダイゼーション反応、マイクロアレイ解析、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応解析を含む、請求項39記載の方法。アッセイする段階が、リアルタイムRTPCRまたはエンドポイントRTPCRとしてさらに定義される逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項40記載の方法。アッセイする段階が、マイクロアレイ解析を含む、請求項40記載の方法。マイクロアレイ解析が、cDNAアレイ、スポットオリゴヌクレオチドアレイ、インサイチュー合成オリゴヌクレオチドアレイの使用を含む、請求項42記載の方法。白血球除去マトリックス、および白血球溶解溶液を含む、白血球から総RNAを抽出するためのキット。白血球除去マトリックスが、使用中に血液がマトリックスを通過することを可能にするよう適合された担体中に含まれる、請求項44記載のキット。担体が、シリンジに合うよう適合される、請求項45記載のキット。全血が密閉された容器からマトリックスを通り、白血球除去血としてさらに密閉された容器の中に移動することを可能にする様式での機能に適合されるとさらに定義される、請求項44記載のキット。RBC溶解溶液およびまたはRBC溶出緩衝剤をさらに含む、請求項44記載のキット。白血球に浸透しかつ白血球中のRNAの安定性を増大させる塩を含むRNA保存組成物をさらに含む、請求項44記載のキット。有機抽出試薬をさらに含む、請求項44記載のキット。RNAの溶出前に、不純物を取り除くためにマトリックスを洗浄するための固相抽出マトリックスおよび試薬をさらに含む、請求項50記載のキット。発明の詳細な説明本発明者らは、白血球を分画し、それらからmRNAを抽出するための、新しい方法を考案した。これらの方法は、白血球を捕捉するために、Pall社により生産されているような白血球除去フィルタの使用に関し、これには捕捉された白血球からのRNAの単離が続く。本発明者らは、1つの態様において、Pall白血球除去フィルター、例えばLK4と称されるフィルターが、その後のRNA抽出のために全血からWBCを回収することができることを示している。20ml相当の全血量は、本方法を当技術分野におけるRNA抽出に修正可能にする手動のシリンジ形式を用いる採取の時点で迅速に濾過される。遠心分離または他の溶液と混合することは、必要とされない。さらに、本発明者らは、血液に運ばれる病原菌にさらされる最小の危険性を提供する、WBC分画のための密閉されたチューブ形式を開発した。血液採取の1~2分以内で完了させることができ、かつ細胞に遠心力の影響を供しないため、WBC濾過は、単離された白血球のmRNAプロファイルを乱すことが、任意の代替の白血球濾過方法よりも少ないことが期待される。この方法を用いて収集されたRNAの収率および質は優れている。RNAlaterは、Ambionで開発された試薬であり、組織試料中のRNAを安定化する。RNAlater、およびその様々な態様は、両者ともMethodsandReagentsforPreservingRNAinCellandTissueSamplesと題された米国特許第6204375号および同第6528641号に記載され、その全ての開示は全体が本明細書中に組み入れられる。本発明の1つの局面は、全血からのWBCの迅速な分画のため、かつRNAlaterを用いた分画された細胞中のmRNAの迅速な安定化のための手法である。血液からのWBCの単離の方法全血からWBCを単離するための様々な様式が存在し、その多くは上記に考察されている。しかしながら、本発明の関係において、好ましい単離の方法は、WBCを捕集するが、RBC、血漿、および他の非WBC血液成分は通過させることができるフィルター媒体の使用を含む。この目的を成し遂げるであろうフィルター媒体の任意の形態は、本発明の状況において有用であることが期待される。さらに、本明細書の教示に従うことにより、当業者は、実施例において教示されているようなアッセイ手法で可能性のあるフィルターを使用し結果を解析することによって、本発明の方法における適性について任意の可能性のあるフィルターを試験することができる。WBC単離に対して現在好ましいフィルターは、Leukosorb媒体という名前でPall社により販売されている白血球除去マトリックスである。Leukosorbは、輸血のために血液からWBCを除去するよう当初考案されていた繊維性の媒体である。Leukosorb製品およびその使用の記載は、以下の米国特許で見出され得、その全体の内容は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる:米国特許第5501795号、第5100564号、第4880548号、第4923620号、第4925572号、第5229012号、および第5344561号、ならびに米国特許出願第20030134417号。以下に考察される試験において、LK4Leukosorbフィルターが用いられた。WBCからRNAを単離する方法当業者に公知である、細胞からRNAを単離するための多くの方法が存在し、その多くまたは全ては本発明に適合できる。全血および分画された白血球から総RNAを抽出するための大部分の方法は、グアニジンチオシアネート、細胞膜を破壊しヌクレアーゼを含むタンパク質を変性させる強力なカオトロープ、中での試料の最初の溶解を含む。通常用いられる市販の試薬の1つ、TRIzolは、グアニジン塩およびフェノールの混合物からなる。標準的なプロトコルにおいて、全血は3倍量のTRIzol試薬と混合され、その後クロロフォルムが添加され、この調製物は有機相および水相中に分離するために遠心分離される。RNAは、イソプロパノールで水相から沈殿し、沈殿物は混入物を減ずるためにエタノールで洗浄される。血液からRNAを精製するためのもう1つの一般的な方法は、シリカマトリックスの上での固相抽出を含む。血液試料は、グアニジン溶液中または他の溶解溶液中で溶解され、細胞溶解物はエタノールと混合され、RNAを結合するシリカフィルター上に置かれる。フィルターは、混入物を取り除くために洗浄され、その後RNAは水で溶出される。DNase消化段階は、ゲノムDNA混入を排除するために全てのRNA単離方法で、通常推奨される。他の方法は、陽イオン界面活性剤中でまたは塩化リチウム尿素溶液中での全血の溶解に基づく。血液からRNAを単離するための市販製品は、AmbionRiboPureBloodキットおよびPAXgeneシステムを含む。RiboPureBloodキットの使用は、下記の実施例において記載されている。PAXgeneシステムにおいて、~25mlの血液試料が、溶解溶液の~75mlを含有する真空採血チューブの中に直接吸引される。室温で少なくとも2時間の試料の保存の後、RNAをペレット状にし、洗浄し、プロテアーゼで処理し、その後調製物をエタノールで混合し、その後上記のようにシリカフィルター上で精製する。WBCから単離されたRNAおよびDNAを使用する方法本発明の様式でWBCから単離されたRNAおよびDNAは、当業者により理解されているように、DNAまたはRNAが関与する任意の分子生物学的技術で用いられる可能性がある。発明のいくつかの好ましい態様は、下記に記載されたように、研究およびまたは診断目的のための発現プロファイリングを含む。他の態様は、その全体の開示が参照により本明細書に組み入れられる、Crudebiologicalderivativescompetentfornucleicaciddetectionと題されたPasloskeによる米国特許公報第20030170617号に記載されているような、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおける、WBCから単離されたRNAの使用を含む。発明の好ましい態様の1つにおいて、本明細書において記載された白血球除去フィルターを用いて単離されたWBCは、米国特許公報第20030170617号に記載された方法で処理される。他の使用は、1つまたはいくつかの遺伝子から転写されたmRNAの発現のレベルの解析、全体的なmRNA発現レベルの解析、マイクロRNAおよび低分子干渉RNAのような低分子内因性RNAおよび外因性RNA分子の発現レベルの解析、および変異およびSNPを含む遺伝的多型の発見および解析を含む。例えば、ノーザンブロット、RNase保護アッセイ、S1ヌクレアーゼ保護アッセイ、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応のようなアッセイは、1または数個のmRNAのレベルの解析において用いられる可能性がある。1またはいくつかのmRNA種に対する特に有用なアッセイは、リアルタイムRTPCRとして公知のRTPCRの改変である。概して、これらのアッセイは、標識されたプローブ、例えば32Pまたはビオチンまたはジゴキシゲニンのような検出可能部分と結合しているヌクレオチドの取り込みにより標識されたRNAまたはDNAプローブへのRNA試料のハイブリダイゼーション、または続いてRCRまたはT7、T3およびSp6RNAポリメラーゼのようなRNAポリメラーゼ酵素を用いるcDNA標的の増幅を伴う、レトロウイルスによる逆転写酵素、例えばモロニー白血病ウイルスまたはトリ骨髄芽球症ウイルスまたはヒト免疫不全ウイルスから単離された、またはこれらに由来する逆転写酵素を用いRNA試料中の標的RNAの相補的DNAへの変換のいずれかに基づく。発現プロファイリングの方法本発明を用いて分画された血液細胞から回収されたRNAは、疾患、予後、および治療に対する反応と相互に関係があるmRNAレベルのパターンの発見を助ける発現プロファイリング実験のためのインプットとして使用され得る。概して、発現プロファイリングのために用いられるRNAは、逆転写活性を有する酵素により相補的DNAへ変換され、検出可能部、例えば蛍光標識されたdNPTまたはビオチン化されたdNTPが逆転写段階の間にcDNA中に取り込まれる。標識されたcDNAは、その後、検出可能なシグナル、例えば蛍光発光が特定のmRNAに対して特異的な要素と関連するように、固体支持体上に配置された要素にハイブリダイズされる。アレイ上の要素は、標的mRNAに対して相補的な、オリゴヌクレオチドまたはcDNAからなり得る。インプットRNAに対する必要条件は、逆転写酵素の阻害因子、または所望のmRNA標的の明確な検出を妨げ得るレベルのゲノムDNAを含有しないことである。白血球からの発現プロファイリングのために用いられるインプットRNAにおけるもう1つの望ましくない混入物は、αおよびβグロビン遺伝子からのmRNAである。分画されていない全血から抽出されたインプットRNAを用いる発現プロファイリングの複雑さの要因は、高レベルのαおよびβグロビンのmRNAを含む、網状赤血球として公知である、未成熟赤血球の多数の存在である。RNAが全血から抽出され、マイクロアレイ発現プロファイリングアッセイでの使用のために増幅された場合、グロビンmRNAの産物が増幅された物質において優勢をとなり、関心対象の他のmRNAの検出感度の劇的な減少をもたらす。。このグロビンmRNAの混入は、マイクロアレイプロファイリングのためのインプットとしてのRNAの使用を危うくする。本発明の特別の長所は、大部分の網状赤血球が白血球除去フィルター上での血液の分画過程の間に取り除かれることである。以下の実施例は、発明の様々な局面をさらに例示するために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するために、本発明者らにより発見された技術およびまたは組成物を提示し、したがってその実施のために好ましい様式の構成要素となると見なされうることが、当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして多くの変更が開示されている特定の態様において成されることができ、それでもなお、本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果をもたらすことを認識するべきである。実施例1白血球除去マトリックスの白血球の捕捉の有効性試験が、試作品デバイスを用いて全血から白血球が捕捉される有効性を明らかにするために実施された。6つのEDTA血液の10ml試料を、Pall社のLK4フィルターを通過させ、濾液を未使用のチューブ中に収集した。白血球層分画として捕捉されなかった任意のWBCを回収するために、濾液をその後スイングバケット遠心分離で3200rpmで15分間遠心分離した。白血球層を使い捨ての広径トランスファーピペットを用いて収集した。RNAをLK4フィルターおよび対応する白血球層分画からAmbionRiboPureBloodキットを用いて抽出した。簡潔に述べると、このプロトコルは、WBCをグアニジンチオシアネートを基礎にした溶解溶液中で溶解する段階、調製物のpHを減ずるために酢酸ナトリウムを添加する段階、低pHフェノールクロロフォルムを添加する段階、および調製物を完全にボルテックスしその後室温で5分間保存する段階を含む。その後混合物を水相と有機相に分離するために遠心分離し、上部の水相を新しい試験管へ取り除き、適当な量の無水エタノール、例えば2分の1量の無水エタノールで混合する。ヘムならびに血漿および細胞タンパク質の大部分の混入を含んでいる下位の有機相は廃棄される。水相エタノール混合物を、その後シリカ膜を通して濾過し、ここでRNAはシリカマトリックスに結合する。シリカマトリックスを、グアニジンおよび他の独自の成分を含む、第一の洗浄溶液で洗浄し、続いてエタノールと他の独自の成分を含む第二の洗浄溶液で洗浄する。濾過および洗浄段階は、遠心分離または真空濾過により溶液をシリカフィルターに通過させることにより成し遂げられる。洗浄段階が完了した後、シリカフィルターを残りの流動体を取り除くために遠心分離し、フィルターを第2の試験管、例えば2ml微量遠心管チューブへ移す。その後RNAを、01mMEDTAを含む予熱されたヌクレアーゼが含まれていない水をシリカマトリックスに適用し、RNAを回収するために集合体を遠心分離することにより、シリカフィルターから溶出する。各試料からのRNAを200μlで溶出し、15μlの各調製物を図1に示すように、臭化エチジウム存在下で変性アガロースゲルで解析した。試料を、LK4で回収したRNAを第1のレーンに、対応する濾過で回収したRNAを隣接したレーンになるように、対でロードした。この形式においてフィルターマトリックスを用いる全血からのWBC捕捉の有効性は、図1に示すように、~75から85の範囲で変化した。この有効性は、マイクロアレイ発現プロファイリング試験においてインプットとして利用するための十分なRNAを得るために十分以上である。実施例2高品質RNAはフィルターマトリックスで分画された白血球から回収され得る図2、図3Aおよび図3Bは、本発明の方法を用いてLK4で分画された細胞から回収されたRNAの収率および質を示す。図2は、アガロースゲル電気泳動によるRNAの解析を示す。抗凝固処理した血液を、2つの形式のうち1つを用いて、口径25cmのLK4を通して濾過した。この試験において、最初の3レーンの試料を、LK4フィルターが使い捨てのシリンジデバイス中に残り、抽出試薬がRNAを遊離させるためにフィルターを通って流される形式を用いて処理した。図2中の最後のレーンの試料を、フィルターが処理のためにデバイスから取り除かれる、再利用可能なシリンジデバイス形式でLK4を用いて処理した血液から回収した。各試料からのRNAを、200μlの01mMEDTAを含むヌクレアーゼを含まない水で溶出し、15μlの各調製物を、臭化エチジウム存在下で変性1アガロースゲルで解析した。無傷の高品質RNAは、18Sおよび28SリボソームRNAの特徴に対応するエチジウム染色物質のはっきりしたバンドにより証明されるように、明らかである。LK4フィルターが取り除かれる形式を用いて回収されたRNAは、フィルターがインサイチュー処理されるもう1つの形式と比較して、ゲノムDNAによる混入物のより高いレベルを常に示した。LK4で捕捉された細胞から回収されたRNAの純度はまた、260nmおよび280nmでのUV吸光度値、高純度RNAであることを示す、1921の狭い範囲に及ぶ260280吸光度比を測定することでも評価した。図3Aおよび図3Bは、Agilent2100Bioanalyzerでマイクロフルイディクス分離によって解析されたRNAを示す。AgilentBioanalyzerでのRNAの解析は、この機械は18Sおよび28SrRNAのピークの高さの比に対して数値を与えるため、例えば、発明のいくつかの態様に対しては特に有用である。~5キロベース28SrRNAは、~2kb18SrRNAよりも分解を受けやすく、非常に高い28S18SrRNA値は、より高度に無傷であるRNAと関係する。マイクロアレイ試験のためのインプットとして使用ために十分な質のRNAを表す28S18SrRNA値の合意は未だ明らかになる途中であるが、RNAは本適用において最も成功裏に用いられるためには少なくとも1の28S18SrRNA比を有するべきであることが示唆されている。図3Aおよび図3Bは、フィルターが処理のためにデバイスから取り除かれる形式を用いてLK4で分画された白血球から抽出された、2つのRNA調製物に対する典型的なAgilentBioanalyzerデータを示す。これらの調製物を、溶出後、DNase1で処理した。1ミリリットルの各調製物を、RNAに特異的に結合する独自の色素を含有する試料ローディング溶液で混合し、Agilentチップに泳動した。28S18SrRNAピークの高さの比は、カットオフ値の1より十分に上であった。概して、Agilentsoftwareにより決定される、調製物のこの種類からのRNAの収率は、血液の10mlあたり~30から60μgの範囲にわたる。実施例3RNAlater処理は、分画されたWBC中のRNAを保存する図4で示されるデータは、未処理試料と比較した、RNAlaterで処理した試料における18Sおよび28SリボソームRNAバンドのより強い染色により示されるように、RNAが無傷であることを保つために、RNAlaterでLK4により捕捉された細胞を処理する事の利点を示す。LK4で捕捉された細胞をRNAlaterで処理する特定の長所は、該処理が、捕捉された細胞を含有するデバイスを、外界温度で試料採取地点からRNA抽出および解析のための離れた場所のラボへ移動させることを可能にすることである。外界温度での試料の移動は、RNA解析に関連する費用を減ずる。これらのデータを得るために、3人の健康なドナーからの二重の10mlEDTA血液試料を使い捨てシリンジフィルター単位中に含まれるLK4白血球除去マトリックス上で濾過した。試料の各一対の1つは、リングモールドと呼ばれる設計を有する使い捨て可能なフィルター単位デバイス上で濾過し、もう1つは、psfと呼ばれるもう1つの設計を有する使い捨てフィルター単位を通して濾過した。血液を濾過した後、フィルター上に捕捉された細胞を、LK4マトリックスに2mlのRNAlaterを通すことによりRNAlaterで処理し、RNAlaterは、捕捉された細胞を伴うLK4マトリックスを含有するフィルター単位に結合された3mlシリンジを経て送達された。LK4に捕捉された細胞を含有するフィルター単位を、シリンジから取り除き、外界温度での夜通しの宅配業者を経て試料採取地点から実験室へ輸送された。RNAを、LK4により捕捉された細胞から抽出し、01mMEDTAを含有する230μlの水で溶出し、15μlを、10μgml臭化エチジウムを含む8μlの変性ゲルローディング溶液で混合し、変性アガロースゲル上に電気泳動により分離した。各レーンの試料は、以下の通りであった:レーン1ドナー1、リングモールドデバイスを通して濾過し、RNAlaterで処理した試料;レーン2ドナー1、psfデバイスを通して濾過し、RNAlaterで処理した試料;レーン3ドナー2、リングモールドデバイスを通して濾過し、RNAlaterで処理した試料;レーン4ドナー2、psfデバイスを通して濾過し、RNAlaterで処理した試料;レーン5ドナー3、リングモールドデバイスを通して濾過し、RNAlaterで処理しない試料;レーン6ドナー3、psfデバイスを通して濾過し、RNAlaterで処理しない試料;およびレーン7同じ時間に他の試料の様に処理しなかった、参照RNA試料。図4中のデータで見られ得るように、RNAlaterで処理しなかった試料は、RNAlaterで処理した試料とは対照的に、RNAを著しく分解していた。これらのデータは、RNAlater処理は、発明の状況で重要な長所をもたらす。実施例4RNAlater処理はゲノムDNA混入を減ずる図5は、ゲノムDNA混入を減ずるための、濾過した白血球のRNAlaterへの曝露の長所を示す。全ての試料は、示されたように、直径25cmLK4フィルターを通して濾過し、室温で4日間保存した、10mlのEDTA血液に由来する。各調製物から回収されたRNAの約7を変性アガロースゲルで解析した。レーン1では、フィルターは処理していない。レーン2では、フィルターを、24mlのグアニジンチオシアネート溶解溶液中で保存した。レーン3では、フィルターを保存前に、3mlのRNAlaterで処理した。レーン4は、処理していない、保存していない、および溶出後DNaseで処理したフィルターでの陽性対照RNAを示す。GuSCN溶液中に室温で4日間保存したフィルター中のRNAの深刻な分解があったことに留意されたい。さらに、DNAの混入は、抽出前にRNAlaterで処理した試料で著しく減ぜられたことに留意されたい。実施例5WBCのフィルターマトリックス分画はグロビンmRNAの混入を減ずる全血からまたは遠心分離によって分画したWBCからのグロビンmRNAに由来する増幅されたRNAの量と比較して、混入しているグロビンmRNAの望ましくない産物をLK4分画が増幅されたRNAにおいて減ずる程度を評価するために、試験を実施した。単一のドナーからのEDTA抗凝固処理した血液のいくつかのチューブを処理した。総RNAを、LK4で分画されたWBCから、全血から、および遠心分離により分画されたWBCから、抽出した。これら3種類の試料からのRNAは、AmbionMessageAmpキットを用いる、T7RNAポリメラーゼにより媒介される直線的増幅のためのインプットとして用いた。キットからの非血液由来RNAが、陽性対照として含まれた。第1鎖および第2鎖合成の後、二本鎖cDNAをT7RNAポリメラーゼで転写し、aRNA反応産物を独自のRNA結合蛍光色素マトリックスと混合し、Agilent2100Bioanalyzerで解析された。この機械は、より大きな分子よりもより小さな分子が早く移動することを用いて、サイズに従って異種RNA分子を分離する。図6A、図6B、図6C、図6D、図6Eおよび図6Fはこの試験からのデータを示す。これらの各々において、横軸は時間を示し、縦軸は蛍光強度を示す。各パネル中の矢印は、αおよびβグロビンmRNAから誘導される増幅されたRNAのスパイクを示す。血液由来RNAから増幅されていないので、陽性対照HeLaRNAからの試料は、グロビンaRNAのスパイクを有することは予測されない。LK4で分画されたWBCから増幅されたRNAを含む図6Aおよび図6B中のグロビンaRNAのスパイクの大きさは、分画されていない全血からのaRNAを含む図6Cおよび図6D中のグロビンaRNAのスパイクの大きさと比較して著しく減ぜられる。グロビンaRNAのスパイクはまた、図6E中の白血球層から分画された試料中のグロビンaRNAと比較された、LK4で分画された試料において劇的に低い。図6Fは、HeLa細胞株対照RNAからのaRNAを含み、よってグロビン産物のいかなるスパイクも示さない。実施例6網状赤血球の溶解はグロビンmRNAの混入を減ずるさらなる試験を、網状赤血球の溶解が血液からのRNA調製物中のαおよびβグロビン転写産物のレベルを減じ得るかどうか示すために実施した。RNAを、全血またはあらかじめRBC溶解溶液洗浄した白血球除去フィルターで捕捉された細胞から抽出した。混入しているRNAをレベルを、反応当たり総RNAの10ngのインプットを用いる、一段階定量RTPCRにより評価した。増幅プライマーは、αまたはβグロビン配列のどちらかに特異的であり、反応産物は、ABIからのAssaysOnDemendプローブおよびプライマーを用いて製造元プロトコルに従い検出された。これらの試験の結果は表1に示される。データは、WB試料と比較した、LDF試料中のαおよびβグロビンのmRNAの減ぜられたレベルを示す。Ctの減少は、αグロビンRNAで428およびβグロビンRNAで554であることが計算された。これらの値は、それぞれ、~20倍および~48倍のグロビンRNAの減少に対応する。したがって、除去マトリックスへの白血球の結合、およびRBC溶解溶液でのマトリックスの洗浄は、グロビンRNAの混入の減少において極めて有効である。実施例7白血球からmRNAを単離するための例示的な手法本発明の好ましい方法において、白血球除去フィルター、例えばLK4フィルターは、血液を濾過した後に、フィルターが回収されることを可能にするシリンジフィルター単位に合うよう切断または提供される。この方法は、フィルターが目詰ますることなく、40mlまたはより多くの血液を濾過するために用いられ得る。例示的な段階は以下の通りである。1.任意の公知の様式、例えば抗凝固剤としてEDTAを用い、かつ標準的な真空チューブ、すなわちVacutainerチューブ中に血液を収集する方法を用いて、例えば10から20mlの抗凝固処理した全血の試料を得る。2.血液をシリンジ、例えば20から30mlシリンジまたは他の適当な容器へ試料を移す。いくつかの態様において、これは、採血チューブの栓を通じて挿入され、かつシリンジに適合しているルアーを経て取り付けられるベントスパイクを用いることにより、血液チューブを開けることなしに行われる。3.白血球除去フィルター、例えばフィルターの円直径~25cmを含有するフィルターデバイスをシリンジに取り付け、血液をフィルターに通過させる。発明者らは通常、秒当たり~2から4滴で滴下するような速度で、血液をフィルターに通過させる。白血球を除去された血液は、処分のための廃棄容器週に収集され得るか、または他の臨床アッセイでの使用のために収集および保管され得る。全ての血液が通過した後に、残った血液の大部分を流し出すために、~10mlの空気をフィルターを通して注入する。この段階は、白血球をフィルター上に分画し、試料を~50倍濃縮する。この段階を実施するためのもう1つの構造は、白血球除去フィルターデバイスを、採血チューブの中に挿入されたベントスパイクとフィルターを通じて血液を抜き取るために用いられるシリンジとの間に配置することである。この場合は、白血球はフィルターの遠位側表面上に収集され、白血球を除去された血液はシリンジ中へ移され、その後処分される。4.捕捉された白血球を含有する白血球除去フィルターをRBC溶解緩衝剤で処理する。RBC溶解緩衝剤は、フィルターを通過する事ができ、その後網状赤血球および赤血球溶解物を含有する溶出物が廃棄され得る。5.捕捉された白血球を含有する白血球除去フィルターをRNAlaterで処理する。これを行うための1つの方法は、RNAlaterを含有するシリンジをフィルターを含有するフィルターデバイスへ取り付け、フィルターを通してRNAlaterを流す方法である。通常、2から3mlのRNAlaterで十分量である。全ての流体が流され得るが、フィルターを通しての過剰な空気の通過は、フィルターの乾燥を妨ぐために避けるべきである。フィルターを、RNAlaterで湿らせたままとするべきである。これを行うためのもう1つの方法は、上記のベントスパイクをRNAlaterを備える容器の中に挿入し、フィルターを通じてシリンジの中までRNAlaterを吸引する方法である。6.フィルターを収容するデバイスを開け、鉗子でフィルターを取り除き、それを例えば15mlポリプロピレン使い捨て円錐形遠心管中に置く。RNAlaterで安定化された白血球を伴うフィルターは、RNA単離前に、外界温度で少なくとも一週間、保存される場合がある。7.RNAを抽出するために、AmbionRiboPureBloodキットの試薬、または任意の他の適切なRNA抽出手法を使用する。AmbionRiboPureBloodキットを用いる場合、単離の段階は、おおよそ以下の通りである。明らかに、これらの手法における、段階、量、および濃度は、当業者により改良または代替されうる。a24mlのグアニジンチオシアネート溶解溶液および015mlの酢酸ナトリウム溶液を、フィルターを備える15mlチューブに加え、30秒間振とうさせる。b15mlの酸性フェノールクロロフォルムをチューブへ加えて30秒間振とうさせ、その後調製物を室温で5分間保つ。c調製物を卓上遠心分離器で、10分間、3200rpmで遠心分離する。d水相を第2の15mlチューブの中に吸引または流し出し、12量のエタノールを加え、ボルテックスして混合する、この段階での調製物の量は~45mlである。e調製物をマイクロ遠心分離カートリッジ形式中のシリカフィルター上に通過させ、これは、それぞれ10秒間回転する~6回の通過を必要とするが、遠心機を用いる場合、真空多岐管またはシリンジ形式を用いてより簡単に行い得る。fフィルターを07mlの洗浄溶液1で洗浄する。gフィルターを2回、各回で07mlの洗浄溶液23で洗浄し、その後フィルターを1分間遠心分離して乾燥させる。hフィルターからRNAを、~75°Cに予熱された~200μlの溶出溶液で溶出する。8望ましければ、残りのゲノムDNAを排除するためにDNase1でRNAを処理し、DNAを含まない樹脂でDNAaseを不活性にする。実施例8WBCの迅速な分画のための例示的な閉鎖システム本発明は、全血からのWBCの迅速な分画のための密閉されたシステムを可能にさせる。例えば、標準的な真空チューブチューブ、BectonDickinsonで収集された、抗凝固処理した全血から白血球を濾過する事ができる。この点において、チューブのゴムの閉鎖物が、円直径25cmの白血球除去マトリックスを含むシリンジフィルターデバイスの入口に適合するルアーを経て取り付けられる、ベントトランスファースパイクにより刺し通される。標準の10ml使い捨てシリンジは、フィルターデバイスの出口に取り付けられ、血液はシリンジの中へフィルターを通じて吸い込まれる。濾液は、いかなる溶血も示さず、血液化学試験または他のアッセイのために保持され得る。他の構造もまた、血液濾過のために用いる事ができ、例えば血液はシリンジの中に注ぎ込まれ、陽圧により濾過する事ができる。いずれにしても、残留網状赤血球および赤血球を取り除くために、RBC溶解溶液はフィルターを通過さし、続いて血液から白血球を収集してもよい。25cmLK4フィルターを通じての10ml血液試料の移動は、通常、1分未満の時間を要する。本方法の長所は、迅速であり、血液に運ばれる病原菌への曝露を排除し、かつ遠心機のようないかなる装置も必要としないことである。この後者の事項は、本方法が、電力が入手できない現場状況、および大きな装置に対空間が制限されるB3バイオハザード封じ込めフードのような、遠心分離が実行できない状況での利用に修正可能であることを意味する。代替の形式がまた、閉鎖システムで、またはたとえ例えば採血チューブが開かれ、かつ血液が取り付けられたフィルターデバイスが取り付けられたシリンジ円筒部に注ぎ込まれる開放システムでも、フィルターに全血を通過させるために用いられ得ることが当業者に認識されると考えられる。本発明のいくつかの態様において、フィルター媒体は、WBC分画およびRNA抽出過程の間、収納容器内に留まる。この形式は、いくつかの適用において、容易さおよび混入防止の長所を提供する。しかしながら、他の態様において、フィルター媒体は、分画後だがRNA抽出前に、収納容器から取り除いてもよい。本明細書において開示および請求される全ての方法は、本開示に照らして過度の実験なしに成されかつ達成され得る。本発明の方法は、好ましい態様に関して記載されているが、方法およびまたは段階においてまたは本願明細書において記載された方法の段階の順序において、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく変更が適用される可能性があることは、当業者に明らかである。さらに詳細には、同様のまたは類似の結果が達成される限り、化学的におよび生理学的に関連する特定の作用物質が、本明細書において記載される作用物質の代わりに用いられ得ることが明らかである。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換および改良は、添付の特許請求の範囲により定義されている、本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。参考文献以下の参考文献が、本願明細書の内容に対して、例示的な手順を提供する、または他の補助的な詳細を提供する範囲内で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。