コレステロールを、リン脂質、及び、水混和性有機溶媒を含む水溶液と混合した混合物を加熱する工程を含むコレステロール溶解方法。しかし、上記従来の製法および当該製法にて得られたリポソームには、次のような問題がある。それは、リポソームの粒子径が均一ではない、あるいは均一な粒子径を持つリポソームを容易に作製することが難しいことである。粒子径が小さいものSmallUnilamellerVesiclesSUV、粒子径が大きいものLargeUnilamellerVesiclesLUVは、それぞれ利用価値があるが、両者が混在していると、利用価値が低い。従って、粒度分布をより狭くするために、粒度分布が広いリポソームを細孔を有するフィルタに通す処理が施される。しかし、かかる処理を採用すると、特定の必要粒度分布を持つリポソームの収率が低下するという問題がある。一方、脂質二重膜の膜強度を上げるため、コレステロールを脂質二重膜に組み込む方法が知られている。しかしながら、コレステロールは一般的に水混和性有機溶媒に溶解しにくい脂質であるため、コレステロールを溶解させる方法が求められている。本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、容易に粒径の揃ったリポソームを得ることができる方法を提供することを目的とする。また、本発明は、コレステロールの溶解性を高める方法を提供することを目的とする。上記目的を達成するために、本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、1以上の脂質と、水混和性有機溶媒を含む水溶液とを混合し、その混合物を加熱してから、所定温度まで冷却することにより、粒子径の揃ったリポソームを製造できることを見い出した。また、コレステロールを、リン脂質、及び、水混和性有機溶媒を含む水溶液と混合し、加熱することにより、コレステロールを当該水溶液中にて容易に溶解できることを見い出した。このようにして、本発明者は本発明を完成するに至った。すなわち、本発明のリポソーム製造方法は、1以上の脂質と、水と、有機溶媒とを含む混合物を加熱する加熱工程と、前記加熱工程後に、前記混合物を冷却する冷却工程とを含む。前記混合物は、例えば、前記脂質と、水混和性有機溶媒を含む水溶液とを混合した混合物である。前記水溶液は、全容量に対して5~30体積の前記水混和性有機溶媒を含むことが好ましい。前記水混和性有機溶媒としては、tブタノール、1プロパノール、2プロパノール、及び2ブトキシエタノールから選択された1又は2以上の有機溶媒などを用いることができる。さらに、本発明のコレステロール溶解方法は、コレステロールを、リン脂質、水、及び有機溶媒と混合した混合物を加熱する工程を含む。また、本発明のコレステロール溶解方法は、コレステロールを、リン脂質、及び、水混和性有機溶媒を含む水溶液と混合した混合物を加熱する工程を含む。前記水溶液は、全容量に対して5~30体積の前記水混和性有機溶媒を含むことが好ましい。前記水混和性有機溶媒としては、tブタノール、1プロパノール、2プロパノール、及び2ブトキシエタノールから選択された1又は2以上の有機溶媒などを用いることができる。さらに、本発明の、リポソーム製造に用いることのできる有機溶媒の選択方法は、候補となる有機溶媒を用いて上記のリポソームの製造方法によってリポソームを製造する工程と、前記リポソームが均一であるかどうか検査する工程とを含む。<関連出願へのクロスリファレンス>本願は、2008年12月24日付けで出願した日本国特願2008328724号に基づく優先権を主張する。この文献を本明細書に援用する。本発明によれば、容易に粒径の揃ったリポソームを得ることができる方法を提供することができる。また、本発明によれば、コレステロールの溶解性を高める方法を提供することができる。次に、本発明のリポソームの製造方法、ならびにコレステロール溶解方法の好適な実施の形態について説明する。なお、コレステロール溶解方法の実施の形態については、リポソームの製造方法の実施の形態の中で説明する。1リポソームリポソームには、その小胞内部に薬剤等の生理活性物質を含まない空リポソームEmptyLiposomeおよび生理活性物質を内包するリポソームが含まれる。また、リポソームには、一重の脂質二重膜から成る比較的粒子の小さなベシクルSmallUnilamellerVesiclesSUV、一重の脂質二重膜から成る比較的粒子の大きなベシクルLargeUnilamellerVesiclesLUVの他、複数の膜から成るベシクルMultiLamellerVesiclesMLVも含まれる。リポソームは、いかなる大きさのものを含んでいてもよいが、平均粒径が50~2000nmであることが好ましく、平均粒径が100~700nmであることが特に好ましい。ここでいう粒径は、動的光散乱によって測定された粒子の直径を意味する。また、好ましい多分散指数PDIは、0.3以下である。リポソームの内部に封入され得る生理活性物質としては、種々の薬剤、化粧料等を採用できる。それらの一例を挙げると、シスプラチンや5-フルオロウラシル等を含む抗がん剤の他、抗酸化剤、抗菌剤、抗炎症剤、血行促進剤、老化防止剤、ホルモン剤、ビタミン剤、ヘモグロビン、DNA、RNA、ペプチド、タンパク質、ワクチン、発毛剤、保湿剤、色素類、美白剤、顔料、生理食塩水、水の1または2以上の組み合わせなどがある。ただし、生理活性物質は、上記例示のものに限定されない。また、リポソームの表面を官能基等で修飾しても良い。かかる官能基による修飾は、リン脂質等に予め官能基を結合させ、あるいはリポソーム形成後に官能基を結合させることにより実現できる。2リポソームの製造方法本実施の形態に係るリポソームの製造方法は、1以上の脂質と、水混和性有機溶媒を含む水溶液を混合した混合物を加熱する加熱工程と、加熱工程後に混合物を冷却する冷却工程とを含む限り、公知の製造方法を応用しても良い。より具体的には、リポソームの粒子径を調節するために、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を本発明の方法に組み合わせてもよい。本発明のリポソームの製造においては、大豆レシチン、水添大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファスフィンゴミエリン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類、ステロール類等の1または2以上の脂質を用いることができる。ホスファチジルコリン類としては、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等を例示することができる。ホスファチジルセリン類としては、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリンナトリウム、ウシ脳由来のホスファチジルセリンナトリウム等を例示することができる。ホスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等を例示することができる。ホスファチジルイノシトール類としては、小麦由来のホスファチジルイノシトールナトリウム等を例示することができる。ホスファスフィンゴミエリン類としては、ウシ脳由来のスフィンゴミレリン等を例示することができる。ホスファチジン酸類や長鎖アルキルリン酸塩類としては、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジセチルリン酸等を含む。ガングリオシド類は、ガングリオシドGM1、ガングリオシドGD1a、ガングリオシドGT1b等を例示することができる。糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスファチド、グロボシド等を例示することができる。ホスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等を例示することができる。ステロール類としてはコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、及びこれらの混合物であるフィトステロール、並びに、水素添加フィトステロール、さらに、3βNカルバモイルコレステロール、Nトリメチルアンモニオエチルカルバモイルコレステロールのような陽性荷電を有するステロール類等を例示することができる。リポソームを構成する脂質として好ましいものは、リンを含むリン脂質と、コレステロールとの組み合わせである。特に、リン脂質の一種であるホスファチジルコリン類とコレステロールとの組み合わせが、より好ましい。リン脂質とコレステロールを用いてリポソームを製造する場合、リン脂質とコレステロールとのモル比は、1:0~1:1.5の範囲内であることが好ましく、1:0.5~1:1.25の範囲内であることがより好ましい。水混和性有機溶媒は、アルコール類、エーテル類、エステル類、ケトン類、アセタール類などの水に混合可能な有機溶媒をいう。水混和性有機溶媒としては、tブタノール、1プロパノール、2プロパノール、及び2ブトキシエタノールから選択された1又は2以上の有機溶媒を用いることが好ましい。混合方法は、手動による揺動、攪拌子、攪拌羽根を用いた攪拌の他、超音波振動機等を用いて行うことができる。上記水溶液における水混和性有機溶媒の濃度としては、脂質組成と脂質濃度に依存した最適な濃度領域を選ばなければならない。水混和性有機溶媒の濃度を高くすると脂質の溶解性が高くなるが、リポソームは形成されなくなるためである。また、同時に水混和性有機溶媒が残留しやすくなるので、生体内にリポソームを供給した場合に生体にとって好ましくない。したがって、水混和性有機溶媒は、1以上の脂質と水溶液を混合した混合物を加熱した際に脂質を溶解できる最低濃度であるのが好ましい。具体的には、水混和性有機溶媒は、水溶液全容量に対して5~30体積とするのが好ましい。水混和性有機溶媒がtブタノールである場合、水溶液全容量に対して12~18体積であることが特に好ましい。水混和性有機溶媒が1プロパノールである場合、水溶液全容量に対して5~19体積であることが特に好ましい。水混和性有機溶媒が2プロパノールである場合、水溶液全容量に対して13~26体積であることが特に好ましい。水混和性有機溶媒が2ブトキシエタノールである場合、水溶液全容量に対して6~9体積であることが特に好ましい。また、上記水混和性有機溶媒はあらかじめ上記水混和性有機溶媒濃度に調製された水溶液を脂質に添加しても良く、脂質に水混和性有機溶媒を添加して一旦脂質成分を溶解させた後上記濃度になるように水溶媒を添加しても良い。加熱方法は、特に限定されるものではないが、例えば、容器を、温水を入れた浴槽内に入れる温浴の他、容器内に混合物を入れた状態で当該容器を直火で加熱する方法、容器を電熱器内に入れる方法などを採用できる。加熱温度は、脂質が、水混和性有機溶媒を含む水溶液に溶解する温度あるいは当該温度以上であって水溶液が白濁しない温度であれば、特定の温度に限定されるものではない。加熱温度としては、脂質の種類、脂質の濃度、水混和性有機溶媒の種類などによって異なるが、一般的に62~80°Cの範囲、特に65~72°Cの範囲が好ましい。但し、水混和性有機溶媒としてt-ブタノールを、脂質としてホスファチジルコリン及びコレステロールをそれぞれ用いた場合には、加熱温度は、62~72°Cの範囲であることが好ましい。冷却方法は、特に限定されるものではないが、例えば、容器を、冷水を入れた浴槽内に入れる方法の他、容器内に混合物を入れた状態で当該容器を冷蔵庫等に入れる方法などを採用できる。冷却温度は、加熱温度より低く、リポソームが生成する温度であれば限定されるものではない。一例を挙げると、脂質にホスファチジルコリンとコレステロールを用いた場合には、冷却温度としては、62°C以下にするのが好ましい。特に、72°C以上に加熱した後に、62°C以下に冷却するのが好ましい。また、冷却速度としては、0.5°C/min以上が好ましく、さらには、1°C/min以上が好ましい。脂質と水混和性有機溶媒を含む水溶液を混合する際に、浸透圧調整剤として、二糖類、多糖類等の糖を加えても良い。好ましい糖は、二糖類のスクロースである。スクロースは、水溶液の形態で水混和性有機溶媒を含む水溶液と混ぜて使用することもできる。その場合、スクロース水溶液の好適な濃度は5~70wtvolであり、より好ましい濃度は8~50wtvolである。本発明のリポソームの製造において、リポソーム懸濁液の粒度をさらに均一なものとするために、公知の整粒手段を併用しても良い。例えば、リポソーム懸濁液を、ガス圧にて特定孔径の膜に通し、望ましい孔径のリポソームを作製してもよい。当該特定孔径の膜を通す処理は、1回あるいは複数回行ってもよい。3コレステロール溶解方法水混和性有機溶媒を含む水溶液に対するコレステロールの溶解量を増大させる方法脂質の一種であるコレステロールは、通常、水に溶けにくく、上述の水混和性有機溶媒に溶解する割合が低い。しかし、上述の水混和性有機溶媒を含む水溶液にリン脂質を共存させると、加熱によりコレステロールが溶解しやすくなる。具体的には、リン脂質とコレステロールとを、上述の水溶液に混合した混合物を加熱すると、コレステロールを水溶液中に容易に溶解させることができる。加熱温度は、コレステロールが、リン脂質、水混和性有機溶媒などを含む水溶液に溶解する温度あるいは当該温度以上であって水溶液が白濁しない温度であればよい。例えば、水混和性有機溶媒としてt-ブタノールを、リン脂質としてLαジパルミトイルホスファチジルコリンをそれぞれ用いた場合には、62~72°Cの温度にて、コレステロールを水溶液中に十分に溶解させることができる。コレステロールは、リン脂質1モルに対して0.8~1.5モルの範囲内であると、より溶解しやすい。62~72°Cの温度範囲では、コレステロールはt-ブタノールを含む水溶液に溶解し、液全体が透明である。その温度より冷却し、混合液の温度が62°Cより低くなると、白く濁ってきて、リン脂質とコレステロールの組成を持つリポソームの懸濁液が形成される。逆に、72°Cより温度が高くても、混合液は白い懸濁液となる。4使用できる有機溶媒の選択方法以上のような製造方法によって、粒径の揃ったリポソームを得ることができる。しかしながら、有機溶媒によっては適用できないものもある。そこで、候補となる有機溶媒を用いて上記のリポソームの製造方法によってリポソームを製造し、製造されたリポソームが均一であるかどうか検査することによって、この製造方法で使用できる有機溶媒かどうかを判定し、実際に適用可能な有機溶媒を選択することができる。以下に、本発明の実施例について説明するが、本発明は、下記の実施例に何ら限定されるものではない。1.リポソームの原料aリン脂質日油株式会社製のLαジパルミトイルホスファチジルコリンDPPCを用いた。bコレステロールSIGMA社製のコレステロールCholを用いた。c安定化剤和光純薬工業株式会社製のスクロースを用いた。d水混和性有機溶媒和光純薬工業株式会社製のt-ブタノールtBuOH;特級、和光純薬工業株式会社製の1プロパノール特級、和光純薬工業株式会社製の2プロパノール特級、和光純薬工業株式会社製の2ブトキシエタノール特級を用いた。ea及びb以外の脂質DPPGジパルミトイルホスファチジルグリセロール、DPPEジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、及びHSPCHydrogenatedsoyphosphatidylcholineは、日油株式会社から購入した。ステアリルアミンSA及びDCPジセチルホスフェートは、和光純薬工業株式会社及びシグマ社からそれぞれ購入した。2.リポソームの粒度分布測定法リポソームの粒度分布の測定は、動的光散乱による粒度分布計マルバーン社製、ZETASIZERNanoZSを用いて行った。後述の実験例において調製されたリポソームは、リン酸緩衝化生理食塩水PBSで希釈してから測定した。希釈倍率は5000から10000倍程度とした。ZETASIZERNanoZSによる測定値は、平均粒子径ZAverageとして算出され、同時に算出される多分散指数PDIの値を指標としてリポソームの粒度分布の均一性を評価した。また、上記粒度分布計のResultqualityに表示される測定結果を、均一な粒度分布を持つリポソームが生成したかどうかの判断基準とした。すなわち、マルバーン社の粒子径測定の品質判定基準を満たす場合、ResultqualityはGoodと表示される。測定結果がGoodを示さなかった場合は動的光散乱に適さない粒度分布が不均一なサンプルであると判断した。3.実験例3.1:リン脂質およびコレステロールの溶解温度範囲の検討380mgのDPPCおよび200mgのコレステロールをガラスバイアル中に秤量し、20mLの10wtvolスクロースおよび425mLのtBuOHの混合液を添加した。このバイアルをウオータバス中で80°Cに保温しながら10分間撹拌した。80°Cにおける溶液は白濁状態であった。次に、撹拌を継続しながらウオータバスの保温を止め、室温下にて自然冷却を行った。ウオータバスの水温は、80°Cから35°Cまで冷却されるのに約90分間を要した。80°Cにおける溶液は白濁状態であったが、72°C付近から溶液はわずかに青白い透明状態となり62°C付近までその透明状態を維持した。62°C付近から溶液は白く濁り始め、58°Cで完全に白濁状態となった。以上の状態変化は可逆的であり、室温から段階的に昇温した場合も同様の状態変化が観察された。3.2:リン脂質単独およびコレステロール単独の溶解有無の検討759mgのDPPCもしくは40mgのコレステロールをそれぞれガラスバイアル中に秤量し、それぞれのガラスバイアル中に4mLの10wtvolスクロースと085mLのtBuOHの混合液を添加し、3.1と同様の実験を行った。DPPCのみを用いた場合には、80°Cから50°Cまでの間、水溶液は透明状態であった。48°C付近でわずかに青白い透明液状態となり約35°Cまでその状態を維持し、約35°Cから急激に白濁状態となった。一方、コレステロールのみを用いた場合には、いずれの温度においても、バイアル壁に付着したコレステロールの凝集塊が認められ、透明状態とはならなかった。3.3:tBuOHの濃度の検討ガラスバイアル中に、327mgのDPPCと172mgのコレステロールを加えた。この脂質混合物に、表1に示す容量比でtBuOHと2mLの50スクロース溶液を混合後、純水を添加して終容積10mLとすることにより、tBuOHの濃度を種々変化させた溶液を調製した。各バイアルを90°Cの温浴中で10分間攪拌後、温浴から取り出し、室温下で撹拌冷却した。冷却後、生じたリポソーム懸濁液の一部を分取してPBSあるいは10wtvolスクロースで希釈し、ZETASIZERNanoZSによる粒度分布測定を行った。その結果を表2に示す。また、一例として、図1に、tBuOHの濃度が16volの条件で作製したリポソーム懸濁液の粒度分布チャートを示す。表2中、スターマークは、マルバーン社の粒子径測定の品質判定基準を満たさない不均一な粒子であることを示す。表2および図1に示すように、tBuOHの濃度12~18volの範囲において、特に、粒子径が極めて均一なリポソームを作製することができた。3.4:1プロパノール、2プロパノール、2ブトキシエタノール等の濃度の検討tBuOHを1プロパノール、2プロパノール、又は2ブトキシエタノールに変更する他は、3.3と同様の方法により、好ましい水混和性溶媒の濃度範囲を調べた。その結果を表3~5に示す。表3~5に示すように、1プロパノールは5~19volの範囲内で、2プロパノールは13~26volの範囲内で、2ブトキシエタノールは6~9volの範囲内で、粒子径が極めて均一なリポソームを作製することができた。3.5:脂質の組成の変化による検討1759mgのDPPC、400mgのコレステロール、及び、143mgのステアリルアミン又は0772mgのDPPGを各バイアルに加えた。その後、各バイアルに、17volのtBuOHを含む10wtvolスクロース溶液、17volの1プロパノールを含む10wtvolスクロース溶液、25volの2プロパノールを含む10wtvolスクロース溶液、又は8volの2ブトキシエタノールを含む10wtvolスクロース溶液をそれぞれ485mL添加した。各バイアルを70°Cの温浴中で30分間攪拌し、攪拌しながら室温下で冷却した。冷却後、リポソーム懸濁液の一部を分取し、PBSで希釈してZETASIZERNanoZSによる粒度分布測定を行った。その結果を表6~7及び図2~3に示す。さらに、リポソーム懸濁液をPBSで希釈し、遠心分離によりリポソームを沈殿させて上澄み液をPBSに置換した遠心洗浄。遠心洗浄を3回繰り返すことにより、リポソーム分散液をPBSに置換すると共に、水混和性有機溶媒及びリポソーム外のスクロースを除去した。それから、リポソーム懸濁液のコレステロール定量を行なった後、リポソーム内に封入保持された、リポソームの調製に用いた糖スクロースの含量をフェノール硫酸法にて測定した。なお、表中の糖封入率は式:遠心洗浄後の糖濃度とコレステロール濃度の比/遠心洗浄前の糖濃度とコレステロール濃度の比により求めた。表6~7及び図2~3に示すように、tBuOHと2ブトキシエタノールを水混和性有機溶媒として用いた場合、リポソームは同程度の粒径で、糖封入率も同程度であった。特にtBuOHを使用した場合は、リポソーム調製時に用いたスクロース糖が40以上という極めて高い効率でリポソームに封入されていた。このことは、リポソーム調製時の溶液中に封入すべき物質を溶解させておけば、スクロースと同様に極めて高い効率でリポソーム内に物質が封入されることを強く示唆している。3.6:脂質の組成の変化による検討276mgのDPPC及び40mgのコレステロールをバイアルに加えた後、4mLの10wtvolスクロース溶液と085mLのtBuOHを加え、混合液を調製した。76mgのDPPC、40mg又は30mgのコレステロール、及び077mgのDPPGをバイアルに加えた後、4mLの10wtvolスクロース溶液と085mLのtBuOHを加え、混合液及びを調製した。677mgのDPPC、406mgのコレステロール、91mgのDPPE、及び73mgのDCPをバイアルに加えた後、4mLの10wtvolスクロース溶液と085mLのtBuOHを加え、混合液を調製した。76mgのDPPC、40mgのコレステロール、及び143mgのSAをバイアルに加えた後、4mLの10wtvolスクロース溶液と085mLのtBuOHを加え、混合液を調製した。76mgのHSPC及び40mgのコレステロールをバイアルに加えた後、4mLの10wtvolスクロース溶液と085mLのtBuOHを加え、混合液を調製した。各バイアルを70°Cの温浴中で30分間攪拌し、攪拌しながら室温下で冷却した。冷却後、リポソーム懸濁液の一部を分取し、PBSで希釈してZETASIZERNanoZSによる粒度分布測定を行い、リポソームの平均粒度を求めた。その結果を表8に示す。その結果、脂質の組成により平均粒度が異なることが明らかになった。3.7:冷却速度の検討175mLのtBuOH、2mLの50スクロース水溶液、終容量が10mLになるように純水を添加し、175volのtBuOHを含む溶液を調製した。続いて、ガラスバイアル中に327mgのDPPCと172mgのコレステロールを加えた。この脂質混合物に、175volのtBuOHを含む溶液を2mL添加した。当該バイアルをウオータバス中で70°Cに保温しながら10分間撹拌した。その後、当該バイアルを50°C、40°Cおよび30°Cのウオータバスに移し、冷却速度:1°Cmin以上にて冷却した。50°C、40°Cおよび30°Cになった時点でリポソーム懸濁液の一部をそれぞれ分取して、PBSで希釈し、ZETASIZERNanoZSによる粒度分布測定を行った。また、比較のため、上記と同じ脂質混合物に、175volのtBuOHを含む溶液を2mL添加したバイアルをウオータバス中で80°Cに保温しながら10分間撹拌し、撹拌を継続しながらウオータバスの保温を止め、室温下で自然冷却を行った。80°Cから35°Cまでの冷却に90分を要した冷却速度:05°Cmin。35°Cになった時点でリポソーム懸濁液の一部を分取して、PBSで希釈し、ZETASIZERNanoZSによる粒度分布測定を行った。その結果を表9に示す。表9に示すように、急冷にて50°C、40°Cおよび30°Cまで冷却したリポソーム懸濁液中のリポソームは、平均粒径約500nmの非常に均一な粒径を有していた。一方、自然冷却にて処理を行ったリポソーム懸濁液中のリポソームは、上記3種のリポソームに比べると、粒径の均一性は低かった。