"メチルグリオキサールMGOによって化学的に修飾されている、単離したアパルブミンタンパク質又はその断片。修飾されたアパルブミン1Apa1タンパク質又はその断片である請求項1に記載のタンパク質。マヌカハニーから単離される請求項1又は2に記載のタンパク質。MGOによって修飾された少なくとも17個のアミノ酸残基を有する請求項2又は3に記載のタンパク質。MGOによって修飾された17個~32個の間のアミノ酸残基を有する請求項2~4のいずれか一項に記載のタンパク質。MGOによって修飾された約32個のアミノ酸残基を有する請求項2~5のいずれか一項に記載のタンパク質。修飾される前記アミノ酸残基が、リジン又はアルギニンのいずれかである請求項2~6のいずれか一項に記載のタンパク質。修飾される前記アミノ酸残基がリジンである請求項2~7のいずれか一項に記載のタンパク質。請求項1~8のいずれか一項に記載の単離したタンパク質を含む組成物。配列番号1に記載のアミノ酸配列に少なくとも75の配列同一性で、アミノ酸配列を含む抗炎症能力を有する、単離されたMGO修飾アパルブミンタンパク質又はその断片。配列番号1に記載のアミノ酸配列に少なくとも85の配列同一性で、アミノ酸配列を含む抗炎症能力を有する、単離されたMGO修飾アパルブミンタンパク質又はその断片。配列番号1に記載のアミノ酸配列に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100の配列同一性で、アミノ酸配列を含む抗炎症能力を有する、単離されたMGO修飾アパルブミンタンパク質又はその断片。マヌカハニーから単離される、請求項10~12のいずれか一項に記載の単離したMGO修飾アパルブミンタンパク質又はその断片。請求項10~12のいずれか一項に記載の前記タンパク質を含む組成物。ローヤルゼリーを修飾することによって抗炎症性分子を生成する方法であって、ローヤルゼリーを少なくとも0.1のMGOと反応させる工程を含む方法。請求項15に記載の方法において、ローヤルゼリーを少なくとも0.5のMGOと反応させる工程を含む方法。ローヤルゼリーを少なくとも1.0のMGOと反応させる前記工程を含む請求項16に記載の方法。前記MGO修飾アパルブミンMRJP1タンパク質を前記ローヤルゼリー製品から単離する工程を更に含む請求項15~17のいずれか一項に記載の方法。細胞組織における炎症を低減する方法であって、請求項8又は14に記載の前記組成物を前記細胞組織に接触させる工程を含む方法。免疫系細胞による食作用の速度を低減する方法であって、請求項8又は14に記載の前記組成物を免疫系細胞に投与する工程を含む方法。免疫系細胞への食作用に関する受容体を阻害する方法であって、請求項8又は14に記載の前記組成物を免疫系細胞に投与する前記工程を含む方法。呼吸バースト及び活性酸素種の放出を低減する方法であって、請求項8又は14に記載の前記組成物を炎症細胞に投与する工程を含む方法。ハチミツの試料のi抗炎症能力又はiiMGO修飾アパルブミン濃度を同定する方法であって、a前記ハチミツ試料の前記蛍光をアッセイする工程と、b前記ハチミツ試料の蛍光の測定値及びハチミツの1つ以上の試料の前記抗炎症能力を、食作用を阻害するための先に測定された能力と比較することによって、前記ハチミツ試料の前記蛍光の測定値を、前記ハチミツ試料の前記抗炎症能力に相関させる工程とを含む方法。前記MGO修飾アパルブミンが、修飾されたアパルブミン1タンパク質修飾MRJP1である請求項23に記載の方法。所望の抗炎症能力又はMGO修飾アパルブミン含量を含有するハチミツ試料を得るために、ミツバチ管理者が巣箱からハチミツを収穫するための好期を決定することを可能にするよう使用される請求項23に記載の方法。所望の抗炎症能力又はMGO修飾アパルブミン含量を有するハチミツ試料を得るために、ハチミツ製造者がハチミツを保存するための所望の期間を決定することを可能にするよう使用される請求項23に記載の方法。MGO、ホルムアルデヒド、グリオキサール及び/又はグルタルアルデヒドで化学的に処置することにより、1つ以上のアパルブミンタンパク質の前記抗炎症能力を増大させる方法。ハチミツの試料の前記抗炎症能力とMGO修飾アパルブミンタンパク質含量を増大させる方法であって、MGO又はMGO-前駆体分子をハチミツ試料に添加する工程を含む方法。前記アパルブミンタンパク質が、修飾されたアパルブミン1タンパク質である請求項27又は29に記載の方法。本明細書に記載されるものは、メチルグリオキサールMGOによって化学的に修飾され、著しく増強された抗炎症効果を呈することがハチミツにおいて確認されたアパルブミンタンパク質である。一態様では、単離されたアパルブミンタンパク質又はその断片であり、メチルグリオキサールMGOによって化学的に修飾されたものを提供する。別の実施形態では、このタンパク質は、修飾アパルブミン1Apa1/MRJPタンパク質又はその断片である。他の実施形態では、修飾アパルブミンタンパク質又はその断片が、マヌカハニーから単離される。別の実施形態では、このタンパク質又はその断片は、MGOによって修飾された少なくとも17個のアミノ酸残基、又はMGOによって修飾された17個~32個の間のアミノ酸残基若しくはMGOによって修飾された約32個のアミノ酸残基を有する。別の実施形態では、この修飾されたアミノ酸残基は、1つ以上のリジン又はアルギニン残基のいずれかである。別の実施形態では、単離された、MGOに修飾されたアパルブミンタンパク質又はその断片を提供する。他の態様では、抗炎症能力を有する単離されたMGOに修飾されたアパルブミンタンパク質又はその断片を提供し、これらは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも75、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100の配列同一性でアミノ酸配列を含む。一実施形態では、単離された、MGOに修飾されたアパルブミンタンパク質又はその断片は、マヌカハニーから単離される。他の態様では、細胞組織における炎症を低減する方法を提供し、この方法は、上記記載の、単離され、MGOに修飾されたアパルブミンタンパク質を含む組成物を細胞組織に接触させる工程を含む。別の態様では、i免疫系細胞による食作用の速度を低減させる方法、又はii免疫系細胞上の食作用に関する受容体を阻害する方法を提供し、これらは、上記記載の、単離され、MGOに修飾されたアパルブミンタンパク質を含む組成物を免疫系細胞に投与する工程を含む。別の実施形態では、ローヤルゼリーを修飾することによって、抗炎症性分子を生成する方法が提供され、この方法は、ローヤルゼリーを少なくとも0.01のMGO、又は0.5のMGO若しくは1.0のMGOと反応させる工程を含む。この方法は、MGO修飾されたアパルブミンMRJP1タンパク質をローヤルゼリー生成物から単離する工程を更に含んでもよい。別の態様では、ハチミツ試料のi抗炎症能力又はiiMGOで修飾されたアパルブミン濃度を同定する方法を提供し、この方法は、aハチミツ試料の蛍光を評価分析する工程と、bハチミツの試料の蛍光の測定値と、先に測定された食作用を阻害するための能力を有する1つ以上のハチミツの試料の抗炎症能力とを比較することによって、ハチミツ試料の蛍光の測定値を、ハチミツ試料の抗炎症能力に相関させる工程と、を含む。一実施形態では、MGOに修飾されたアパルブミンは、修飾アパルブミン1タンパク質である。一実施形態では、この方法は、所望の抗炎症能力又はMGOに修飾されたアパルブミン含量を含有するハチミツ試料を獲得するために、ミツバチ管理者が巣箱からハチミツを収穫するための好期を決定することを可能にするよう用いられる。他の実施形態では、この方法は、所望の抗炎症能力又はMGOに修飾されたアパルブミン含量を含有するハチミツ試料を獲得するために、ハチミツ製造者が、ハチミツを貯蔵するための所望の期間を決定することを可能にするよう用いられる。1つ以上のアパルブミン/MRJPタンパク質の抗炎症特性及び蛍光特性を増加させる方法は、MGOで化学的に処理することによる。ハチミツの試料の抗炎症能力及びMGOで修飾されたアパルブミンタンパク質含量を増加させる方法は、MGO又はMGO前駆体分子をハチミツ試料に添加する工程を含む。別の実施形態では、MGO、ホルムアルデヒド、グリオキサール及び/又はグルタルアルデヒドデで化学的に処理することによって、1つ以上のアパルブミンタンパク質の抗炎症能力を増加させる方法が提供される。別の実施形態では、MGO、グリオキサール及び/又はグルタルアルデヒドデで化学的に処理することによって、1つ以上のアパルブミンタンパク質の抗炎症能力を増加させる方法が提供される。上述の簡単な概要は、本発明の特定の実施形態の特徴及び技術的利点を広く記述している。更なる技術的利点は、本発明の発明を実施するための形態及びそれに続く実施例で記載されるであろう。本発明の特性であると考えられる新規な特徴は、いずれかの添付される図面及び実施例に関連付けて考察される場合、本発明の発明を実施するための形態からより良く理解されるであろう。しかしながら、本明細書で提供される図面及び実施例は、本発明を説明することに役立つよう、又は本発明の理解を深めることで補助する意図されるものであり、本発明の範囲を限定するよう意図されるものではない。以下の説明は、多数の例示的構成、パラメータなどを記載する。しかしながら、このような説明は本発明の範囲を限定するものとして意図されておらず、それよりも例示的実施形態の説明として提供されるものであることが認識されるべきである。定義アパルブミンタンパク質は、糖タンパク質である。ハチミツ及びローヤルゼリーで見出される多数のアパルブミンがある。ハチミツで見出される主要なアパルブミンは、主ローヤルゼリータンパク質1MRJP1としても知られるアパルブミン1Apa1である。本明細書は、ハチミツで見出される主要なアパルブミンに焦点を当てているが、ハチミツで見出される他のアパルブミンもまた、それらが全て、Kimuraらにより、Biosci.Biotechnol.Biochem.に2000年に報告されているように、高マンノース型のグリコシル化を有する糖タンパク質であるために、同様な修飾潜在能力及び同様な抗炎症能力を呈し得ることを理解されたい。およそ9つの主ローヤルゼリータンパク質が存在し、この主ローヤルゼリータンパク質1~5の配列が以下に示される。ハチミツ又はアパルブミン又は主ローヤルゼリータンパク質に関して本明細書の全体を通して使用される用語蛍光とは、低波長の光によって励起される場合、主として440~560nmの範囲における光の最大放射に実質的に相当する波長である。ローヤルゼリーは、ミツバチの働き蜂の下咽頭腺から分泌されるミツバチの分泌物である。水を除いて、タンパク質がローヤルゼリーの主成分である。炎症性である組織とは、その中で組織内の損傷又は感染に応答して免疫応答が生じた組織、並びにその中で組織が、痛み、浮腫、発熱、敏感性又は発赤の1つ以上の症状を有する組織として定義される。本明細書で使用するとき、抗炎症能力とは、細胞組織における炎症又は炎症の症状を臨床的に低減する能力として定義される。抗炎症能力は、以下に詳細に記載される食作用阻害アッセイPIA又は以下に詳細に記載されるDCFDAアッセイを使用して決定され得る。一次アミノ酸配列の修飾は、欠失すなわち、その中で1つ以上のアミノ酸残基が不在であるポリペプチド、付加すなわち、特定化されたポリペプチドと比較して、1つ以上の追加的アミノ酸残基を有するポリペプチド、置換すなわち、1つ以上のアミノ酸残基の置き換えから生じるポリペプチド、及び断片すなわち、特定化されたポリペプチドの一次配列の一部に同一である一次アミノ酸配列からなるポリペプチドを包含するよう理解される。修飾アパルブミンとは、アミノ酸上のメチルグリオキサールの化学反応によって、又はこのタンパク質を構成するアミノ基の側鎖上のメチルグリオキサールの化学反応によって修飾された、任意のアパルブミンタンパク質又はその断片を包含するよう理解される。メチルグリオキサール修飾は、アパルブミン及び末端アミノ酸内のリジン、アルギニン、及び/又はシステインアミノ酸の遊離アミノ基で起こる可能性が高く、このようなMGO修飾は、タンパク質内のおよそ1~40部位で生じることができる。例えば、修飾アパルブミン1とは、MGO修飾Apa1をもたらすために、そのアミノ酸配列上の1つ以上の部位で修飾されたApa1を意味する。アミノ酸配列類似性又は配列同一性とは、アミノ酸が同一であるか、又は同様な、電荷又は疎水性などの化学的及び/又は物理的特徴を有する場合、適切な場所での2つ又はそれ以上のポリペプチドのアミノ酸対アミノ酸の比較を指す。この比較に基づいて、次いで同一性パーセントが比較されたポリペプチド配列間で決定され得る。配列の簡単な説明配列番号1-http://www.uniprot.org/uniprot/O18330から得られたApa1主ローヤルゼリータンパク質1とも知られるのアミノ酸配列MGOによるグリケーションの可能な部位を識別するために、リジンKの22部位及びアルギニンRの17部位が強調されており、これによりMGOで修飾されたアパルブミンが生じる。配列番号2-http://http://www.uniprot.org/uniprot/O77061から得られる主ローヤルゼリータンパク質2のアミノ酸配列が、配列表に示される。配列番号3-http://www.uniprot.org/uniprot/Q17060-1から得られる主ローヤルゼリータンパク質3のアミノ酸配列が、配列表に示される。配列番号4-http://www.uniprot.org/uniprot/Q17060-1から得られる主ローヤルゼリータンパク質4のアミノ酸配列が、配列表に示される。配列番号5-http://www.uniprot.org/uniprot/097432から得られる主ローヤルゼリータンパク質5のアミノ酸配列が、配列表に示される。MGOで修飾されたアパルブミン1アパルブミン1Apa1又は主ローヤルゼリータンパク質1MRJP1ともしても知られるは、様々なハチミツ製品で、異なる濃度で見出されるタンパク質である。Apa1は、ミツバチによって分泌される48.9キロダルトンkDaのタンパク質であり、これはハチミツ、ローヤルゼリー、及び他のハチミツ製品において存在する。試験された様々なハチミツの全てが、Apa1を含有することが示されたJ.Simuthら、2004年。Apa1は、ローヤルゼリーにおけるタンパク質の48を構成すると概算されるB.Lerrerら、2007年。メチルグリオキサール又はMGOは、式C3H4O2を有する高化学反応性化合物である。MGOは、生物体内の複数の代謝経路によって形成される。活性マヌカハニーと呼ばれるマヌカハニーの特定の調製物は、他の様々なハチミツよりもより高い濃度のMGOを含有する。活性マヌカハニーは、他の様々なハチミツにおけるMGO濃度の1000倍を超えるまでのMGO濃度を含有することが決定されているE.Mavricら、2008年。MGOは、進行性グリケーション最終産物AGEsの形成プロセスを含む生物体内の様々な化学反応に関与する。グリケーションは、反応の触媒としての酵素の関与がない、糖のタンパク質又は脂質との反応である。MGOは、アミノ酸アルギニン、リジン及び/又はシステイン並びに末端アミノ酸の遊離アミノ基との反応によってタンパク質をグリケートすることができ、これによって、アルギニン及び/又はリジンを含有するタンパク質を化学的に修飾することが可能である。配列番号1から見られるように、Apa1は、MGOによって化学的に修飾され得る合計で約39個のアルギニンとリジン残基を含有する。MGO修飾Apa1は、活性マヌカハニーからの分子の単離によって誘導され得る。MGO修飾Apa1は、生化学的技術によって、ハチミツから単離されるか及び/又はハチミツから濃縮され得る。これら技術としては、濾過、遠心分離、並びにイオン交換、親和性、疎水性相互作用、サイズ排除、及び逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。MGO修飾Apa1はまた、ローヤルゼリーへのMGOの添加によって、様々な供給源から精製され得るか又は化学的に合成され得る。MGO修飾Apa1はまた、アミノ酸配列の配列番号1をコードする遺伝子を得ること、この遺伝子を適切なベクターにクローニングすること、細胞系をこのベクターで形質転換すること、ポリペプチドを発現させること、ポリペプチドを精製すること、このポリペプチドをMGOと混合して、MGOとこのポリペプチドとの間の反応を可能にすること、並びにMGO修飾ポリペプチドを精製することによって誘導され得る。発現系は、プロモーター、エンハンサーなどの制御配列と、様々な宿主に関して当該技術分野で既知であるものなどの終結制御とを含有してもよい例えば、その全体で参照により本明細書に組み込まれる、Sambrookら著、MolecularCloning:ALaboratoryManual、第2版、ColdSpringHarborPress1989を参照。この発現系はまた、遺伝子の発現及び/又はタンパク質の折りたたみを容易にするシグナルペプチド及びプロタンパク質配列を含有してもよい。Apa1配列番号1のアミノ酸変異体のMGO修飾形態もまた、抗炎症能力を呈し得る。当業者であれば理解されるように、配列番号1の一次アミノ酸配列のマイナーな修飾は、配列番号1に比較して実質的に等価な又は増強された抗炎症活性を有するポリペプチドをもたらす場合がある。Apa1修飾が1つ以上の置換を含む場合、好ましい置換は、保存的であるようなもので、すなわち、残基が別の同様な一般的なタイプによって置換されているものである。Apa1タンパク質に修飾を施すことにおいて、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る例えば、その全体で参照により本明細書に組み込まれる、Kyteら著、J.Mol.Biol.157,105~1321982を参照。特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシー指数又はスコアを有する他のアミノ酸で置換され得、そして依然として類似の生物学的活性を保持し得ることが当該技術分野で知られている。好ましくは、MGO修飾Apa1変異体は、非変異体Apa1配列に対して少なくとも約75の配列同一性を呈し、好ましくは、本明細書に記載の任意の野生型又は参照配列に対して少なくとも約80の同一性を呈し、より好ましくは、少なくとも約85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100の配列同一性を呈する。更により好ましくは、MGO修飾Apa1変異体は、非変異体MGO修飾Apa1のものにほぼ匹敵する抗炎症能力を呈する。ハチミツにおけるMGO修飾Apa1の形成は、i周囲温度での長期間貯蔵、又はii高い温度30~40°Cでのハチミツのインキュベーションによって刺激され得、これによって、ハチミツの試料の抗炎症能力を増加させる。ハチミツの試料へのMGOの添加、又はMGO前駆体をMGOに変換するための十分な時間及び/又は加熱を伴っての、ジヒドロキシアセトンDHAなどのMGO前駆体の添加もまた、ハチミツの試料中のMGO修飾Apa1の形成を刺激することが可能であり、並びにハチミツ試料におけるMGO修飾Apa1の発生によって、ハチミツの試料の抗炎症能力を増加させることも可能である。増強された抗炎症特性を有するApa1は、ハチミツの外部でも形成され得る。完全に又は部分的に精製されたApa1は、MGO修飾Apa1を産生するために、MGOで処理可能であることが見出されている。このMGO修飾Apa1は、非修飾Apa1に比較される場合、増強した抗炎症特性を呈する。MGO修飾Apa1及びその変異体は、医薬組成物中に治療的有効量で含まれ得る。本開示の医薬組成物は、以下に適合されるものを含む、固体又は液体形状での投与用に特別に処方化され得る:1経口投与、例えば、ドレンチ水性若しくは非水性溶液又は懸濁液、錠剤、例えば口腔、舌下、及び全身性吸収を目的とするもの、ボーラス、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト;2非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内又は硬膜外注射で、例えば、無菌溶液又は懸濁液、又は徐放性処方物;3局所適用、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、又は制御放出パッチ又はスプレーとして;4膣内又は直腸内投与、例えば、ペッサリー、クリーム又はフォーム;5舌下投与;6眼内投与;7経皮投与;8肺内投与、又は9鼻腔内投与。本発明の化合物が、ヒト及び動物に医薬品として投与される場合、これらはそれ自体で、又は例えば、薬学的に許容可能な担体と組み合わされて、約0.1~99、又は約1~50、又は約10~40、又は約10~30、又は約10~20、又は約10~15の活性成分を含有する医薬組成物として提供され得る。湿潤剤、乳化剤及び、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤及び香料剤、防腐剤及び酸化防止剤もまた、本明細書に記載の医薬組成物中に存在することができる。これら組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントも含有してもよい。本発明の化合物への微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等によって確実にされ得る。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に封入することも望ましい場合がある。加えて、注射可能な医薬品形態の長期間の吸収は、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の封入によってもたらされ得る。実施例1-マヌカハニーからのMGO修飾アパルブミンタンパク質の単離ニュージーランドのHoneyResearchUnit、UniversityofWaikatoから入手され、12w/vのフェノールに等価な非過酸化物抗菌活性を有したマヌカハニーの試料を、以下のように分画した。1.1ハチミツの低分子量成分の排除25gのマヌカハニーを25mlの蒸留水中に懸濁させて、1リットルの水道水に対して、4°Cで48時間透析しCelluSepT1チューブ、MembraneFiltrationProducts,Inc.,Seguin,Tx;EEUU,3500Daの分子質量カットオフ、この間、1リットルの水を4回交換した。透析保持物を凍結乾燥し、次いで分析まで-20°Cで保存した。凍結乾燥試料を、0.3モル/lの酢酸アンモニウム緩衝液で2mlに再構成した。1.2セファデックスG-50上でのクロマトグラフィー分離次いで、透析からの再構成した保持物2mlを、セファデックスG-50カラム180ml上に充填し、物質を1mlフラクションで溶出した280nmで流速0.5ml/分。図3に示す2つのピークから得られたフラクションを凍結乾燥し、食作用アッセイにおける予備評価のために、純水で100μlに再構成した。このアッセイは、阻害活性が最初に溶出したピークにあることを示した。更なるクロマトグラフィー分離が行われ、より大量のタンパク質を生成した。セファデックスG-50カラム上のクロマトグラフィーを3回繰り返し行い、各実行からの溶出痕跡での最初のピークにおけるフラクションを一緒にプールし、ロータリーエバポレーターで200μlまで蒸発させて、次いでSuperose12カラム上で分離した。1.3Superose12上のタンパク質の高速タンパク質液体クロマトグラフィーFPLC分離セファデックスG-50溶出痕跡上の第1のピークを更に分画するために、100μlの量の再構成した試料を、Superose12FPLCカラム25ml上に注入し、リン酸塩緩衝生理食塩水pH7.11で1mlのフラクションとして、280nmで監視された、流速0.5ml/分、0.5cm/mlで溶出した。これらフラクションを、更なる使用まで-20°Cで凍結させた。得られた2つの明確に分離した主ピークフラクション8及び14を、食作用アッセイにおける阻害活性に関してアッセイした。これらフラクションを、10のSDS-PAGEゲル上で走行させて、MALDI-TOF質量分析同定用に処理した。1.4活性フラクションの逆相食作用阻害活性を有することが認められたSuperose12上のクロマトグラフィーからのフラクションフラクション8を、MALDI質量分析同定用に更にタンパク質を精製するために、逆相カラム上でクロマトグラフィーにかけた。クロマトグラフィーは、FPLCシステムPharmacia-LKB,Uppsala,スウェーデン上のカラムを使用して実施した。500μlの量のフラクション8試料を、カラムに注入し、260nmで監視された1ml/分の流速で、100の水~100のアセトニトリルの濃度勾配での移動相で溶出した。得られた2つの主ピークを含むフラクションフラクション23及び26をロータリーエバポレーターで50μlまで蒸発させた。このフラクション5μlを10のSDSミニゲル上に充填し可視化させて、以下に記載されるように、MALDI-TOF質量分析で処理した。実施例2:THP-1細胞を使用する食作用阻害アッセイPIA食作用は、細胞応答又は固体粒子を包み込むプロセスであり、免疫系において、これは病原菌及び細胞破壊片を除去するために使用される主要なメカニズムである。細菌、死滅組織細胞、及び小鉱物粒子は、細胞によって食作用され又は包み込まれ得る対象の全ての例である。食作用は、炎症のトリガに対する白血球の炎症応答の開始時に発生する。その中で食作用が活性化される場合に、細胞によって生成される活性酸素種及びサイトカインは、食作用と共に全てが開始する炎症応答である細胞事変のカスケードの一部として、より多くの食作用を動員しかつ活性化させる。したがって、食作用のいずれの阻害物質も、炎症応答を正にカスケードの開始時に効果的に停止する。ニュージーランドハチミツのタイプの範囲での食作用阻害活性を測定した。マヌカハニーは、以下の表1に示すように、他のタイプよりも非常に高い活性を有することが全体で見出され、表1は、LPS活性化THP-1細胞中のラテックス粒子の食作用に及ぼす異なるタイプのハチミツ0.5の効果を示す。このアッセイは、ラテックス粒子の添加後4時間で実施された。マヌカ及び人工ハチミツ濃度は、ハチミツを無菌RPMI1640完全培地で希釈することによって達成された。マヌカハニーは、ニュージーランドのHoneyResearchUnit、UniversityofWaikatoから入手し、12w/vのフェノールと等価の非過酸化物抗菌活性を有したAllen,Molanら、1991年。ハチミツを1.37gml当たりのハチミツの密度を重量測定し、無菌RPMI1640で使用する直前に、これを19mlのMilliQ水5V/V濃度で希釈することによって希釈し、花粉、ミツバチ組織などを除去するために、濾過した50μm、8μm及び3μm、MinisartSartoriusフィルター、Milliporecorporation。未希釈のハチミツを、酵素変性及び分解を防止するために、黒色の容器内で4°Cにて保持した。人工ハチミツは、ハチミツで見られる天然糖類の浸透効果のための対照を提供するよう使用された。この組成物は、公開されているWhite1975年。マヌカがニュージーランド全域にわたって広く生育し、ミツバチにとって花蜜の好まれる供給源であるために、ニュージーランドで生産されるハチミツの一部のタイプが、ミツバチによって生産されていると同時に、若干のマヌカの花蜜がまたその中に含まれていることは周知である。THP-1は、十分に特性決定が行われたヒトの単球系白血病細胞系である。この細胞は、数個の基準に関して単球に類似し、PMA、LPS又はVitDでの処置によってマクロファージ様細胞へと分化され得るAuwerxJ.,1991年。一旦活性化されると、マクロファージは、ラテックスビーズ又は同類物と共にマクロファージをインキュベートし、顕微鏡下で細胞を観察することにより食細胞吸収を記録することによって、食作用を考察することに使用されることが可能である。蛍光ラテックスビーズを使用することによって、食作用後に、このビーズは細胞の内部で見える。食作用を阻害する物質は、この物質が添加されていない食作用の量と、この物質が添加される場合の食作用の量を比較することによって考察され得る。細胞形態、食作用、細胞分裂の速度、及び選択された表面マーカーにおける変化が、LPS、PMA及びVit-Dによる活性化の後に、ハチミツに曝されたTHP-1細胞の培養で評価された。活性化速度がより短く、アッセイを30時間以内に完了させることが可能であるために、LPSが更なる研究のために選択された。LPS活性化細胞は、24時間でマクロファージになるが、一方PMA及びVitDで処置された細胞は、少なくとも72時間を要する。THP-1細胞の分化に関する基準は、細胞接着、細胞形態における変化、並びにLPS処置及び未処置細胞からのmRNAのqRT-PCRによって決定される、マクロファージ表現型に関連するヒト軟骨群タンパク質―39HCgp-39及びカルボキシペプチダーゼMCPMの細胞表面マーカー発現プロファイルにおける変化であった。THP-1細胞を、抗生物質を伴い、10のウシ胎児血清及び25mMのHEPESを含有するエンドトキシンを含まないRPMI1640培地中で、37°C、5のCO2、及び95の相対湿度RHで維持した。細胞を3日毎に継代培養し、細胞計数を106/ml周辺で維持し、処置前に、生存率をトリパンブルー排除法によって血球計算器で評価した。継代数は、常に40~55の間であった。1mgのLPSを無菌RPMI1640Invitrogen中に溶解することによって、LPSの100ug/ml原液を調製した。この原液を-20°Cで保した。使用直前に、LPS原液を融解し、新たに継代培養した細胞に添加し、生存率95又はそれ以上で、106/mlのTHP-1細胞を有して、500ng/mlの最終濃度にした。細胞を、24ウェルプレートCellstar,Greinerbio-oneにおいて、ウェル当たり1mlでプレートし、蒸発を回避するよう、このプレートを密閉した。プレートを37°C、5CO2、及び95の相対湿度RHで24時間インキュベートして、活性化させた。食作用アッセイに先立って、各々のウェルを倒立型顕微鏡でチェックし、有効な形質転換を示す形態学的変化を観察した。対照THP-1LPS非処置は丸い形状を維持し、集塊をなさず、又は培養プレート表面に接着しなかったが、一方LPSで処置された活性化THP-1細胞は凝集し、平坦になり、かつ明らかな偽足を有するアメーバ状になり、培養プレート表面に接着した。LPS活性化THP-1細胞の単層を無菌RPMI培地で2回洗浄し、懸濁した細胞を除去し、次いで、500μlのRPMI中で、ハチミツを含まないもの、人工ハチミツ0.25又はハチミツ0.25の3つの処置のいずれか1つで30分間インキュベートした。無菌の1.0μmのコーティングしたポリスチレンラテックスビーズSigmaL5405-1ml細胞当たり約25個のビーズを単層に添加し、プレートを37°C、5CO2、及び95RHでインキュベートした。各処置群は、実験当たり少なくとも3回の反復試験を有し、別の日に少なくとも2回繰り返した。インキュベーションの4時間後に、懸濁した細胞を除去し、単層を氷冷した無菌リン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄することによって、食作用を停止させた。100μlのPBSをプレートの壁に上下に穏やかにピペッティングすることによって、接着細胞をプレートから外した。40倍のレンズを有するAxostarplusZeiss蛍光顕微鏡フェーズIIを使用して、各試料から少なくとも200個の細胞を血球計算器上で計測した。少なくとも3個のビーズを含有した細胞が、食作用に関して陽性であると考えられた。非活性化THP-1細胞単球は、予備アッセイにおいて観察された5未満の食作用速度を有した。アッセイ後に、トリパンブルー排除法を使用して生存率をチェックし、処置又はハチミツがアポトーシスを誘導しなかったことを確認した。THP-1細胞がラテックスビーズを食作用する能力は、ハチミツ処置物/ハチミツを含まない対照のパーセンテージで定量化される。第1の活性化速度が、食作用細胞の数を血球計算器上で計測された細胞の数で割ることによって得られた。4時間のインキュベーションに関する許容可能な活性化速度は70以上であった。ハチミツ処置物もまた、この方法で計測され、次いで食作用の減少パーセンテージが、以下の式に従って計算された。食作用の減少=ハチミツ処置の食作用速度/対照×100-100例示的計算は以下のとおりである:対照、75細胞の75が少なくとも3個のビーズを食作用したハチミツ処置物1、25細胞の25が少なくとも3個のビーズを食作用したハチミツ処置物1、食作用阻害活性=25/75×100-100=66.7この結果は、ハチミツ処置物1が、ラテックスビーズの食作用吸収に及ぼす66.7の阻害効果を有したことを示す。試料のロットのスクリーニングについては、このアッセイは、Wan,Parkら、1993年によって述べられた修正プロトコルを使用して、96ウェルプレートで実行するよう修正され得る。このアッセイは、THP-1及びその生育条件/培地並びに同じラテックスビーズを使用するよう修正された。ハチミツとのインキュベーション後に、ウェルをPBSで洗浄し、プレートリーダー又はLAS-1000のいずれかでの測定前に、懸濁した細胞及び遊離ラテックスビーズを除去した。両方法が比較され、非常に類似した結果を得る。実施例3:蛍光強度の測定ハチミツの蛍光強度を、高機能ダークボックスIIAlphatechを装備したフジフィルムLAS-100で測定する。データを、提供されたソフトウェア、ImageReaderLAS-1000プラス簡易版1.5及びImageGauge4.0を使用して分析する。ハチミツを室温に戻し、二回蒸留したH2O中で10v/vまで希釈する1mlのハチミツ=1.37gm。次いで、希釈ハチミツ5mlを0.2μmのMinisart無菌単回使用注射器フィルターSartorisを通して濾過した。希釈ハチミツの100μlを96ウェルブラックプレートnuncCAT137101の5つのウェルにピペットで入れる。既知の蛍光を有する標準ハチミツもまた、バックグラウンド読取り値のために、水を含むウェルと空のウェルにプレートする。プレートをダークボックスレベル4の内側に配置し、ImagereaderLAS1000とプログラムを使用して焦点を合わせる。およそ30秒である必要な照射時間を判断するために、前照射が行われる。一旦画像が撮影されると、提供されたImageGauge4.0を使用して結果が得られる。簡単に言うと、蛍光がウェルを横切って任意単位AUで測定され、バックグラウンド強度が減算され、40000AUから260000AUの範囲での読取り値をもたらす。試料が平均化され、典型的標準偏差/-1500AUを有する最終読取り値を得る。蛍光強度が高過ぎる場合には、過照射を回避するために、照射時間が減らされる。標準ハチミツAUは、これらハチミツの正確なAUを誘導するために使用される少数のハチミツだけがこの蛍光を有するにすぎないために、これはほとんど実行されない。1の濃度で、それらはハチミツ中に存在した。ハチミツの分画化からの使用可能なタンパク質の量がより少ないために、200μlのアッセイ試料サイズを使用した。上記のように得られたフラクション8及び14を、食作用阻害活性に関してアッセイした。フラクション8は、強い食作用阻害活性を有したが、フラクション14は、活性をほとんど有さなかった。両フラクションを、以下に記載されるように、MALDI-TOF質量分析によって、有意なヒットで同定した。抗炎症活性の大部分を有するフラクションフラクション8は、修飾アパルブミン1MRJP-1であった。フラクション14は2つのヒットを返し、1つは有意であり、これはアパルブミン3MRJP-3であった。非有意なヒットは、大部分がMGOによって修飾されていない蛍光が高い、アパルブミン1MRJP-1であった。実施例4SDSミニゲル上の電気泳動ハチミツの分画化から得られたタンパク質を、可視化しかつ分子量推定値を提供するために、SDS-PAGEゲル上を走行させた。10及び12のアクリルアミドを有する分離ゲルを、異なる範囲のタンパク質を分離するために使用した。10ゲルは、14~205kDのタンパク質を分離するために最適であり、12ゲルは、14~66kDaのタンパク質に最適である。このゲルは、組み立てられた清浄なガラスプレートを使用して、OWLSeparationSystemゲルキャスターBioLabScientificLTDで作成された。分離ゲルを先ず、注射器を使用して注ぎ、均一なゲル表面を確保するために、ブタノールの層で覆って硬化するよう放置した。ゲルが硬化した際に、ブタノールを除去し、積層ゲルを注ぎ、ゲルコームを挿入し、試料充填のためのウェルを作成した。ゲルの組成物は:10分離ゲル37のアクリルアミド6.8ml1MのトリスpH9.02ml水5.9ml10のドデシル硫酸ナトリウムSDS150μlN,N,N’,N’テトラメチレンジアミンTEMED15μl10の過硫酸アンモニウムAPS150μl12分離ゲル37のアクリルアミド8.2ml1MのトリスpH9.02ml水4.5ml10のSDS150μlTEMED15μl10のAPS150μl5積層ゲル37のアクリルアミド0.66ml0.5MのトリスpH6.81.25ml水3.0ml10のSDS50μlTEMED5μl10のAPS50μlであった。積層ゲルをセットしたときに、ゲルを電気泳動チャンバに挿入し、移動緩衝液1lのMilliQ水中、3.0gのトリス、14.4gのグリシン、1gのSDSをチャンバの上部及び底部に添加した。コームを取り外し、試料ウェルを電気泳動緩衝液で洗浄した。次いでゲルを10mAで10分間走行させて、重合されなかったアクリルアミドを除去した。ゲル上に充填される試料を、2XTricineSampleBuffer0.1モル/lのトリスpH6.8、24w/vのグリセロール、8w/vのSDS、0.2モル/lのジチオスレイトール、0.02w/vのCoomassieBlueG-250と1:1で混合し、99°Cで5分間加熱し、冷却するよう放置した。試料を遠心分離し2000×gで20秒間いかなる沈殿物もペレット化し、10μlの試料をレーン毎に充填した。BIORADPrecisionPlusDualColourタンパク質標準ラダーCat.No.161-0374を試料と一緒に走行させて、試料に推定されたタンパク質サイズを提供した。10~250kDaにサイズ設定されたタンパク質を含有する標準の6μlを、ゲルの両端で充填した。試料が積層ゲルを経て分離ゲルに移動してしまうまで、ゲルを10mAで走行させた。次いで電流を20mAまで増加させた。試料中の染料がゲルの両端から流出した場合、電流を切り、ゲルを除去し、染色した。バンドを可視化するために2つの方法が使用された。より微弱なバンドを同定するために、より感度が高いため銀染色が使用された。染色剤が銀よりもより容易に除去されるために、MALDI-TOF質量分析法の実行に先立って、ファーストブルー法が使用された。ファーストブルーは、糖タンパク質により小さな親和性で結合するCoomassieBrilliantBlueを使用する染色剤であり、かなりの糖タンパク質を有するハチミツには理想的である。残留する染色剤は、定量を妨害する可能性があるために、このことは、タンパク質MALDI質量分析法の実行に先立って、より良好な染色剤除去を可能にするDeutscher1990年。全ての試薬は、染色が実施される前5分に新たに生成され、必要になるまで4°Cで保管した。ゲルを、最初に、50のエタノール/12の酢酸中で30分間固定化し、次いで30のエタノール中に15分間浸漬させた。次いで、100mlの0.02チオ硫酸ナトリウムを添加し、1~2分間放置した。ゲルを0.1硝酸銀100mlホルムアルデヒド100μl中に10分間浸漬した。次いで、これを水で10秒間洗浄し、100mlの顕色剤MilliQ水100ml中、炭酸ナトリウム3g、ホルムアルデヒド100μl、1チオ硫酸ナトリウム40μlを添加した。バンドが可視となった後に、顕色を10酢酸で停止した。顕色されたゲルを、必要になるまで、MilliQ水中で保存した。ファーストブルーはFisherBiotecから入手されたCat.No.FS-100。使用前に、ファーストブルーを希釈したファーストステイン濃縮物8ml、MilliQ水32ml、10酢酸を伴う45メタノール10ml。まず初めにゲルを、10酢酸を含む40メタノールで10~20分間洗浄し、続いて、MilliQ水で濯いだ。次いで、希釈したファーストブルー100mlを添加し、ゲルをこの溶液中で、20分間穏やかにかき混ぜた。ゲルを10酢酸で10分間脱染色し、次いで、必要になるまでMilliQ水中で保存した。SDSゲルから推測されたフラクション8Apa1/MRJP-1に関する分子量は、60kDaであり、これは、タンパク質サイズをわずか48.9kDaと報告したスイスプロットとして予期されたものよりも10kDa大きい。このサイズの不一致は、グリコシル化及び/又は架橋結合によって説明され得る。3つの予測されたN-結合グリコシル化部位が、MRJP-1で報告されているSrisuparbh,Klinbungaら、2003年。これらの部位のグリケーションは、分子量を増加させるであろう。フラクション8は、空容積内にあるためにカラムから排除されるような十分に大きなマクロ分子は、カラムから先ず初めに溶出することを意味するSuperose12カラムの空容積は11mlである、このことは、48.9kDaAp1/MRJP-1の分子量でモノマータンパク質は容易にカラムに入るはずであるので、Apa1/MRJP-1は高度にグリコシル化及び/又は架橋結合されていることを示唆することができる。実施例5活性ハチミツタンパク質のMALDI-TOF質量分析同定以下に記載のMALDI-TOF作業は、WaikatoMassSpectrometryFacility、UniversityofWaikatoで完了した。5.1タンパク質の調製清潔な解剖用メスを使用して、バンドを切除し、次いでこれを30のエタノールで脱染色し、60°Cで15分間インキュベートすることで、又はゲル片が無色になるまで、ファーストブルー染料を除去した。バンドを30のエタノール中で2回洗浄し、次いで100アセチルニトリルで10分間収縮させた。吸引によってアセチルニトリルを除去し、ゲル片をSpeedVac内で真空により乾燥させて、残留水分を30分にわたり除去した。ゲル片中のタンパク質をトリプシンで消化させることによって、MALDI-TOF質量分析法による分析用に、ゲル片中のタンパク質をペプチドに開裂させた。使用された方法は、UniversityofWaikatoのJoMcKenzieによって提供された詳細から適応された。それぞれのゲル片に、25ミリモル/lの重炭酸アンモニウムの10μlを添加し、続いて配列決定品質のトリプシン溶液10アセチルニトリル中25ミリモル/lの重炭酸アンモニウムの49μl、1μlの配列決定用トリプシン1mg/mlPromegaCat.No.V511110μlを添加した。次いで、管を37°Cで一晩放置した。それぞれの管に、0.3トリフルオロ酢酸を有する50アセチルニトリルを14μl添加し、管をボルテックス混合し、10分間超音波処理した。ゲル片を廃棄し、溶液を使用まで冷蔵した。5.2マトリックスの調製使用された方法は、WaikatoMassSpectrometryFacility、UniversityofWaikatoから得られた。5mgのα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸CHCAを1トリフルオロ酢酸を有する65アセチルニトリルの500μlに添加した。この溶液をボルテックス混合し、10分間超音波処理し、再度2分間ボルテックス混合し、次いで12,000rpmで5分間遠心分離した。調製したタンパク質消化溶液とマトリックスを合わせて2:1、その1μlをMALDIアンカーチップターゲットプレートにスポットした。このスポットを空気乾燥させて、次いで1トリフルオロ酢酸の5μlを乾燥したマトリックススポット上又はその周辺部分にピペット操作し、乾燥させた。5.3オートフレックス操作手順分析に先立って、BrukerDaltonicsPeptide標準206195で外部較正を実行した。モノアイソトープペプチド較正は、±0.1の縮小拡大を使用した。一旦、良好でクリーンなスペクトルが採取されたら、質量分析計は自動的に再較正される。誤差がわずか±10ppmの場合、適合結果は許容される。内部較正は、トリプシンの自己消化から得られる生成物が存在する場合は、実行され得る。これら生成物は、842及び2211でピークを産生する。このピークはフレックス分析プログラムにおける内部較正として割り当てられる。BrukerAutoflexIITOF/TOF質量分析計が、ペプチド消化を分析するよう使用された。サンプル当たり平均で30ショットが取られ、ペプチド質量フィンガープリントスペクトルを構築した。質量範囲セレクターを低い範囲で設定し、検出器ゲイン電圧オフセットを1400vで設定した。検出設定は、480~3540Daの範囲で設定した。機器は、フレックスコントロールソフトウェアを使用して手動で操作された。好適なスペクトルが保存され、フレックス分析にエクスポートされた。5.4MALDIスペクトルの分析Biotoolsソフトウェアを使用して、採取したスペクトルが、様々なタンパク質データベースに対して検索され得る。好ましい使用のデータベースは、SWISProt及びNCBInrである。SWISProtにおける真核生物タンパク質の検索のためのパラメータは、±200ppmのペプチド耐性と1つの欠落した開裂である。64を超えるタンパク質スコアは、SwisProtに有意である。NCBInrにおける真核生物タンパク質の検索のためのパラメータは、1つの欠落した開裂及び±200ppmのペプチド耐性である。NCBInrにおける有意なヒットに必要とされるタンパク質スコアは、78である。これらパラメータは、少なくとも2009年5月までは正確である。分子質量は、分子/ペプチドの総分子質量の0.01の精度の範囲内で測定され得る。これは、少量の質量変化、例えば、1つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換又は翻訳後の修飾が検出されるのに十分である。質量分析装置の主要な機能は、質量対電荷比による質量分析計のイオン化供給源において形成されたイオンを分離又は解像することである。トリプシン消化によって生成されたペプチドは、それらの質量のためにイオン化によって分離され、この質量が計算され得る。検出器がイオン電流を監視し、それを増幅し、次いでこのシグナルがデータシステムに送られ、そこでこれが質量スペクトルの形態で記録される。イオンの電荷に対する質量値がそれらの強度に対してプロットされ、試料中の成分の数、各成分の分子質量、及び試料中の様々な成分の相対量を示す。MALDI-TOFがタンパク質を同定するよう使用される場合、発生したイオンは、強いピークを伴うクリアーな質量スペクトルを形成するはずであり、これは、1つのみのタンパク質少なくともかなりの量でがSDS電気泳動ゲルからのバンド切断部中に存在することを示唆する。1つ以上のタンパク質が試料中に存在する場合、典型的には、大量の同一のペプチドに相関するクリアーなピークは存在しない。5.5活性タンパク質のMALDI-TOF質量分析同定上記のようなSDS電気泳動からのゲル中の切除したバンドから回収されたタンパク質、Superose12クロマトグラフィー分離からのフラクション8及び14を、同定のために、MALDI-TOF質量分析用にトリプシン消化にかけた。上記のAutoflex操作手順を使用して、Superose12クロマトグラフィーカラムから単離されたフラクション14のペプチド質量フィンガープリントスペクトルを得た。図7に示すようなMALDI-TOF質量分析法から生じた質量スペクトルは、各ペプチドに関する分子量を提供し、これをSWISProtライブラリに挿入し、一致を検索した。SWISProtライブラリに対するトリプシンペプチドの分子量の2つのヒット/一致が得られた。最も有意なヒット/一致は、タンパク質アパルブミン3MRJP-3についてであった。第2のヒットのアパルブミンMRJP-1は、それ自体では有意な一致ではないが、この一致に対応する質量スペクトルピークが、MRJP-3に関する一致に起因するものとは異なるために、試料中にこれが存在する可能性は非常に高い。同一の手順がまた、Superose12クロマトグラフィーカラムから単離されたフラクション8に関して実行された。図6に示すようなフラクション8からのペプチドのMALDI質量スペクトルは、質量ペクトルへの1つの有意なヒット、すなわちMRJP-1への一致をもたらした。実施例6-MGOの存在下でのハチミツのインキュベーションマヌカハニー又は非マヌカハニーの双方がインキュベートされた。インキュベーションのためのマヌカハニーは、その初期の高いMGOレベル及び低い蛍光に基づいて選択された。非マヌカハニーは、その低い蛍光及びMGOの欠如に基づいて選択された。ハチミツは3ヶ月にわたってインキュベートされ、その間、蛍光読取り値が追跡された。インキュベートされたそれぞれのハチミツはまた、元の品質を維持するために凍結された試料も有した。インキュベートされたハチミツ及び凍結ハチミツを、食作用の阻害についてアッセイし、インキュベーションに起因する任意のタンパク質サイズ修正を決定するためにミニゲル上でのSDS電気泳動にかけられた。高蛍光を有するマヌカハニーと低蛍光を有するマヌカハニーもまた、インキュベートされたハチミツとインキュベートされないハチミツとの比較のために、SDS電気泳動にかけられた。全クローバー及び牧草ハチミツをMGOと共に又はMGOなしで、37°Cで3ヶ月にわたりインキュベートし、MGOの存在が非蛍光ハチミツにおいて経時的に蛍光を発生し、食作用阻害活性を増加させるかどうかを決定した。このハチミツは、食作用阻害活性に関して先アッセイし、低活性を有したものである。ハチミツをSDSミニゲル上で電気泳動し、インキュベーションに起因する任意のタンパク質サイズ修正を決定した。MGO処置ハチミツを、食作用アッセイにおいてアッセイし、有効なインキュベーションが食作用阻害活性を有することを決定した。メチルグリオキサール40をSigma-AldrichCat.No.M0252から購入し、15の非過酸化物抗菌活性およそ400μg/gmのハチミツ又は40のMGO/kgハチミツの1mlに相当する最終濃度で使用した。6.1ハチミツインキュベーション全マヌカハニーMSB20の20g、NPA20、牧草ハチミツ20g及びクロバーハチミツ20gを37°Cで3ヶ月にわたりインキュベートした。400μg/gのMGOで処置されたクロバーハチミツ20gをそれに混合し、これをまた、37°Cで3ヶ月間インキュベートした。全てのハチミツの対照試料20gをこの持続時間で凍結した。ハチミツの蛍光をMGOの添加直後に測定し、ハチミツに添加された濃度では、蛍光は、添加されたMGOによる増加は認められなかった。ハチミツのインキュベーションの6週間後及び3ヶ月後に、蛍光を測定した。6.2インキュベートしたハチミツのSDSゲル電気泳動上記のハチミツ試料を、12のSDSミニゲル上を走行させた上記のとおり調製かつ実行された。比較のために更に含まれたものは、高蛍光を有するマヌカハニーと低蛍光を有するマヌカハニーであった。ハチミツを10に希釈した。ゲルに充填される試料を2XTricineSampleBufferと1:1で混合し、99°Cで5分間加熱し、次いで充填に先立って冷却した。染色前に、ゲルをUVゲル照明装置で撮像し、タンパク質バンドの蛍光を観察したこの蛍光は、染色後見えなかった。SDSミニゲルを銀染色した。以下の表2は、天然MGOレベルマヌカと、又は400mg/kgのMGOが添加されたもの牧草及びクローバーとの37°Cで3ヶ月間のインキュベーション前、インキュベーション中、及びインキュベーション後の選択されたハチミツに関する蛍光測定値を示す。対照においては、これは、4°Cで3ヶ月間保持されたマヌカハニー高い天然MGO含量を有する、並びに4°Cで3ヶ月間保持された、400mg/kgのMGOを添加された牧草及びクローバーハチミツ、又はMGOを添加されていないハチミツ牧草及びクローバーは、蛍光での増加は存在しなかった結果は図示せず。6.3インキュベートされたハチミツのSDS電気泳動ゲル画像MGOでインキュベートされたハチミツの電気泳動の結果を図9及び10に示す。図9は、クローバーハチミツとマヌカハニーとの間の主要タンパク質60~65Dkaのサイズ差を示す。図10は、MGOと共にハチミツをインキュベートすることが、双方のハチミツタイプにおいて、主要タンパク質のサイズを増加させた約5~10kDaまでことを示す。上記に詳細に説明されたように、活性誘導分画化が、マヌカハニーの試料の成分を単離するために使用された。食作用阻害活性を有するマヌカハニーの単離された成分が蛍光であることが本発明者によって見出された。ハチミツをフラクションに分離するそれぞれの段階で、各フラクションが、約490nmで成分の蛍光を測定することによって、どれほどの食作用阻害活性がそれに存在するかを測定するよう試験された。図1aから見られるように、放射波長は450~550nmの間である。活性であるマヌカハニーを透析した後に、この活性は、透析保持物中にあり、これは3.5kDaを超える分子量の成分を含有するフラクションであり、3.5kDaより低い分子量の成分を含有するフラクションである透析物中にはないことが確認された。食作用阻害活性は、溶出トレース上の第1のピークとして見られたフラクションフラクション8中に大部分が見出され、これはカラムの空容積を超える容積で溶出することが見出された。少量の活性が、溶出トレース上の次のピークとして見られるフラクション中にあることが認められた。Superose12のカラムから溶出された第1及び第2のピークにおけるマヌカハニーのフラクションを、次いでSDS-PAGEドデシル硫酸ナトリウムが存在するポリアクリルアミドゲル電気泳動上を走行させた。銀染色は、1つのバンドが存在することを示した。ゲルの対応する部分をゲルの未染色の部分から切除し、タンパク質をトリプシンで消化させて、このように得られたペプチドをMALDI-TOFMSマトリックス補助レーザー脱着飛行時間型質量分析を走行させた。ペプチドのこの質量をSwiss-Protデータベース内のデータと比較し、Superose12クロマトグラフィーからの第1のピークにおけるタンパク質に関して主ローヤルゼリータンパク質-1アパルブミン-1としても知られると一致すること、並びにSuperose12クロマトグラフィーからの第1のピークにおけるタンパク質に関して主ローヤルゼリータンパク質-3アパルブミン-3としても知られると一致することを見出した。Apa1又はMRJP-1タンパク質が抗炎症活性の原因の成分であることが活性誘導分画化によって発見されたこと、並びに他のハチミツが主ローヤルゼリータンパク質を有することが解明されたことで、マヌカハニーにおける高レベルのMGOの存在がApa1/MJRPタンパク質を修飾するかどうかを決定するために、更なる研究が実施された。マヌカハニーは、他のハチミツでは同程度まで見られない高蛍光を有し、この蛍光が、MGOがハチミツ中のタンパク質を修飾していることに起因することが見出された。特定の理論に束縛されようとするものではないが、マヌカハニーの独特な特徴である高レベルのMGOは、Apa1/MRJPタンパク質のグリケーションを誘起し、Schmittら著、AnalyticalBiochemistry,2005で報告されているように蛍光性である進行性グリケーション最終産物受容体AGEsを形成すると考えられる。ハチミツのMGOとのインキュベーションは、ウシ血清アルブミンがMGOと共にインキュベーションされた場合、ウシ血清アルブミンにおいて発生される蛍光と同一の放射波長の蛍光での増加をもたらすことが、本発明者によって見出された。更なる分析は、抗炎症活性もまた、この処置の結果として増加することを示した。図2に示すように、ハチミツの試料の蛍光と抗炎症活性との間の相関性が見出された。MGOでの処置はまた、Apa1/MRJPタンパク質の分子量SDS電気泳動上を増加させ、図8及び10で示すように、増加した分子量のバンドは蛍光性であった。MGO修飾アパルブミンに関する使用法組織における炎症は、1つ以上の精製したMGO修飾アパルブミンポリペプチド又はMGO修飾アパルブミン含有組成物を炎症した組織に投与することによって軽減され得る。MGO修飾アパルブミンは、免疫細胞による食作用の速度を低減することによって、並びに食作用のトリガである免疫細胞上のマンノース受容体を遮断することによって、組織における炎症を軽減する。免疫細胞は、マクロファージ、単球、樹状細胞、及び顆粒球細胞を含む。MGO修飾アパルブミンは、様々な形態で炎症した組織に投与されてもよく、これらは、他の成分から精製されたMGO修飾アパルブミン、及び薬学的に許容可能な担体、アジュバント、又は治療的分子などの1つ以上の他のタイプの成分を含有する組成物の形態であるMGO修飾アパルブミンが挙げられる。MGO修飾アパルブミンは、活性マヌカハニーから精製されてもよく、又はMGO若しくはMGO前駆体がアパルブミンを修飾するために添加されたマヌカハニー又は他のタイプのハチミツから精製されてもよく、あるいはこれは、その中でアパルブミンが遺伝子組み換え的に発現され、次いでMGOで処置されたローヤルゼリー又はその系から精製されてもよい。1つ以上の他のタイプの化合物を含有する組成物におけるMGO修飾アパルブミンとしては、ハチミツ中のMGO修飾アパルブミン又はMGO修飾アパルブミンが強化されたハチミツ抽出物、アパルブミンの組換え生成に関連する抽出物中のMGO修飾アパルブミン、及びMGOでのアパルブミンの化学的修飾物が挙げられる。精製したMGO修飾アパルブミン又はMGO修飾アパルブミン1含有組成物は、様々な異なる形態で炎症した組織に投与されることができ、これらは、クリーム、ローション、液体溶液、又はパップ剤が挙げられるが、これらに限定されない。MGO修飾アパルブミンは、MGO修飾アパルブミンを食用製品に封入することによってなどで炎症した組織に投与されてもよい。このような製品としては、飲料、キャンディー、シロップ、トローチ剤、ピル及び食品が挙げられるが、これらに限定されない。MGO修飾アパルブミンを検出する方法及びハチミツの特徴の特性評価ハチミツの試料の抗炎症能力は、MGO修飾アパルブミンの検出を通して決定され得る。MGOによるApa1の化学的修飾は、MGOによって修飾されていないApa1のものよりもより大きな蛍光を呈するMGO修飾アパルブミンを生じる。Apa1はハチミツ中に存在するために、ハチミツの試料の蛍光を測定することによって、ハチミツ試料中のMGO修飾Apa1の相対的濃度の測定を得ることができる。ハチミツの試料中のMGO修飾Apa1の濃度の測定は、ハチミツの試料の抗炎症能力に直接関連する。図2は、蛍光、したがってMGO修飾Apa1含量と食作用阻害能力との間の相関性を示す。Apa1などの既知の低い濃度のMGO修飾アパルブミンを有するハチミツの試料の蛍光を測定することによって、並びに既知の高濃度のMGO修飾Apa1を有するハチミツの試料の蛍光も測定することによって、標準スケールが生成され、これがハチミツの試料の蛍光を、そのハチミツの試料中のMGO修飾Apa1の濃度に相関させる。蛍光試験及び標準スケール生成に使用され得る既知のMGO修飾Apa1濃度を含有するハチミツの試料を得るために、ハチミツの試料のMGO修飾Apa1濃度が、質量分析法などの標準分析化学的技術によって決定され得る。ハチミツの試料の蛍光をハチミツの試料中のMGO修飾Apa1濃度に相関させる標準スケールが一旦生成されたら、ハチミツ生産及び分析で有用な様々なタイプの情報を生成するために、この標準スケールがハチミツの試料の蛍光試験と組み合わせて使用されてもよい。例えば、未知のMGO修飾Apa1濃度を有するハチミツの試料の蛍光が測定されることができ、この蛍光測定値及び標準スケールに基づいて、試験ハチミツ試料中のMGO修飾Apa1の濃度が決定されることが可能である。ハチミツの試料中のMGO修飾Apa1の濃度を決定するこの蛍光法は、質量分析法などの他の分析化学的技術よりも非常に安価でありかつ速い。このような方法でハチミツ試料中のMGO修飾Apa1の濃度を測定することによって、ハチミツ試料の抗炎症能力もまた迅速に決定される。高MGO濃度が、全てのハチミツ品種の中でマヌカハニーに独特な特性であるために、ハチミツ生産者は、MGOを所望の濃度のMGOを天然には含有しないハチミツの試料に添加することによって、活性マヌカハニーを疑似しようとする場合がある。消費者は、処置されたハチミツよりもはるかに天然のハチミツを好む。精製された活性MGOは、商業的化学薬品製造業者から容易に入手可能であり例えば、Sigma-Aldrich,St.Louis,MOは、約40のメチルグリオキサール水溶液を販売する、ハチミツ製造者は、ハチミツ中のMGOの濃度を所望のレベルまで引き上げるために、MGOの所望の濃度を天然には含有しないハチミツの試料にMGOを添加することもできる。天然ハチミツ形成に非依存的なプロセスは、ミツバチによって実行されないいずれかの活動を含み、したがって、これは精製MGOのハチミツ試料への添加などの作用が挙げられる。天然ハチミツ形成に非依存的なプロセスは、ミツバチが、高レベルのMGO又はMGO前駆体分子を含有する花蜜、花粉、又は他の植物生成物を収集するなどの活動を含まない。ハチミツの蛍光はまた、所望の抗炎症特性を有するハチミツを得るために、巣箱からハチミツを収穫するのに適した時期又は収穫したハチミツを保存するのに適した時間を決定するために使用されてもよい。ハチミツにおけるMGOによるアパルブミンの修飾は、ある期間にわたって発生し得るので、ハチミツ製造者は、ハチミツが所望の抗炎症能力及びMGO修飾アパルブミンの濃度を含有するまで、巣箱内にハチミツを保持するよう選択することが可能である。異なる時間間隔で巣箱からのハチミツ試料の蛍光を測定することによって、ハチミツ製造者は、ハチミツの蛍光の測定値を、ハチミツ中に所望の抗炎症特性を有するハチミツを得るために、巣箱からハチミツを収穫するための最適な時期を決定するための方法として使用することが可能である。同様に、ハチミツ製造者は、ハチミツ試料が抗炎症特性の所望のレベルを有するかどうかを決定するために、巣箱の外側で保存されたハチミツの蛍光を測定することもできる。ハチミツ試料の蛍光を測定することによって、所望の抗炎症能力を含有するハチミツ試料を得ようとするハチミツ製造者は、ハチミツがMGO修飾アパルブミンの形成によって所望のレベルの抗炎症能力を進展させるまで、ハチミツを保存することが可能である。MGOによるローヤルゼリーの修飾及び得られた分子量変化の評価ローヤルゼリーを採取し、シナピン酸をマトリックスとして使用し、陽イオンモードでMALDI-TOFによって分析した。およそ52.4kDaのm/zでの1つの有意なピークを同定した。このピークは、主ローヤルゼリータンパク質として前に同定されたものである逆相単離されたフラクションから得られた52.4kDaのm/zと一致した。分析RPHPLCプロトコルを、PhenomenexSecurityGuardC-18ガードカラムを備えたPhenomenexProteo90カラム3μ、90Å、C18、250×4.06mmで実施した。カラムを緩衝液A:Nanopure水中0.1のTFAで、1mL/分の流速で平衡化した。緩衝液B0.1のTFAを含有する100のアセトニトリルのグラディエントを以下のように適用し、吸光度を214nmで監視した表1。次いで、ローヤルゼリーを、メチルグリオキサールと0.1、0.5及び1.0で反応させた。ローヤルゼリータンパク質溶液を、PBS中に、部分的に解凍した調製液を10mg/mLの濃度で溶解することによって調製した。MGO溶液を、原液Sigma、40をPBSで希釈して、0.1、0.5及び1.0の範囲で最終濃度を得ることによって調製した。900μLのタンパク質溶液に、100μlの必要な濃度のMGO溶液を添加し、混合物を60°Cで一晩インキュベートした。得られた反応生成物をまた、MALDI-TOFMSで検討した。MALDI-TOFMSの使用では、0.5及び1.0のMGO反応生成物において、1つのみのピークが見られ、これは、およそ55.1kDaでの修飾されたMRJP1主タンパク質であった。0.1のMGO反応では、非誘導化タンパク質の存在ばかりでなく、修飾MRJP-1主タンパク質の存在もあることが、MALDI-TOFスペクトルから明らかであった。このことは、MGOのレベルが、MRJP-1との反応を完了するのに十分ではなかったことを示唆した。52.4kDaから55.1kDaまでのm/zにおけるシフトは、Arg上の72.07Da付加物を占める単一のMGO単位の添加がメチルグリオキサール由来ジヒドロキシイミダゾリジンMGDHを生成したことに基づいて説明することができ、並びに70.05の質量シフトは、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾリンMG-HIに基づいて説明することができる。リジンとの反応は、CEL、Nε-カルボキシルメチルリジンに関する72.07の質量シフトを伴ってCELを形成し、MOLDメチルグリオキサールリジンダイマーに関して180.25Daの増加をもたらして、MOLDを形成する。他のアルギニン修飾及びそれらの質量変化は、2-アンモニオ-6-[2-[4-アンモニオ-5-オキシド-5-オキソペンチルアミノ]-4-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-5-イリデン]アミノヘキサノエートMODICの166.23Daの増加、160.18Daの質量変化を有するテトラヒドロピリミジンTHP、及び80.09の質量変化を伴うアルグピリミジンである。WileyInterScienceで2006年12月4日にオンラインで公開された、Brockら著、J.MassSpectrom.2007;42:89~100のDetectionandidentificationofargininemodificationsonmethlglyoxal-modifiedribonucleasebymassspectrometricanalysisを参照されたい。多くの付加物が可能であり、それぞれの形成で異なる傾向があるので、82の平均数が、MRJP1でのMGO修飾の相対的レベルを決定するよう使用された。部分的に反応したMRJP1タンパク質をもたらす0.1のMGOレベルでは、未反応MRJP1と比較された質量単位での差は1422.0Daであって、これはMRJP1上におよそ17個のMGO付加物が形成されたことになる。0.5及び1.0のMGO反応生成物の場合では、質量単位における差は、以下の表4で見ることができる。0.5及び1.0のMGOの双方が、MRJP1上に形成されたおよそ31~32個のMGO付加物を提供した。MGOがMRJP1上に付加物を形成することができる最大で39個の部位があるCys残基を除くことも注目に値する。22個のアルギニン部位と17個のリジン部位がある。この結果が示唆することは、MGO付加物形成に可能である部位のおよそ82が、MGOによって修飾されていることを示唆する。図11に示されるように、0.5及び1.0のMGOの双方が、MRJP1とほぼ等しく反応したために、この反応が完了まで進んだと結論付けることが可能である。更には、マヌカハニー中の天然レベルのMGOがおよそ0.4~0.5まで蓄積する傾向があることも注目に値する。次いで、DCFDAアッセイ以下に詳説によって、0.5及び1のMGO反応生成物の生物学的活性は、対照に勝って統計的に有意であったが、一方0.1のMGO反応生成物はそうではなかった図12参照。このことは、修飾されたMRJP1反応生成物において活性を確認するためには、少なくとも17個のMGO部位修飾が存在する必要があることを示唆する。DCFDAROS活性アッセイ細胞は、好気性代謝中に、活性酸素種ROSを定常的に発生させる。このROS発生は、免疫系において重要な保護的及び機能的役割を果たす。細胞は、ROSの過剰な生成と戦うための強力な抗酸化防御系を備える。ROSの発生が細胞の天然の抗酸化防御を圧倒する場合、酸化的ストレスが細胞内で生じる。ROS及び酸化的損傷は、癌、アテローム性硬化症、他の神経変性疾患及び糖尿病を含む多くのヒトの疾患で重要な役割を果たすと考えられている。したがって、それらの正確な役割を確立することは、ROS及びそれらが引き起こす酸化的損傷を正確に測定する能力を必要とする。細胞中のフリーラジカル生成を測定するための多くの方法がある。ROS生成は、炎症応答へ本質的に導く。最も単純な技術は、細胞透過性蛍光及び化学発光プローブを使用する。2’-7’-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートDCFDA酸化は、細胞のレドックス状態を直接的に測定するために最も広範に使用されている技術である。これは、開発された他の技術に勝るいくつかの利点を有する。これは使用が容易であり、細胞のレドックス状態における変化に非常に敏感であり、安価であり、かつ経時的にROSにおける変化を追跡するよう使用され得るからである。細胞における炎症応答の指標測定値である、活性酸素種ROS生成に関するDCFDAアッセイは、上記の食作用試験に対する代替の生物学的活性試験として開発されたものである。このアッセイを、90μLのリン酸塩緩衝生理食塩水PBS及び目的とする試料を伴う10μLの細胞を三組の96ウェルプレート中に配置させ、続いて50μLのDCFDA溶液を添加することによって調製した。DCFDAは、1mLのDMSO中に3mgを溶解することで調製した。次いで、100μLのDMSO溶液を10mLのPBSと混合した。フルオレセインへのDCFDAの酸化を、Ex473nmとEm520nmを使用してのSpectraMaxM4プレートリーダーにおける発光を用いて監視した。アッセイは、0分、2分、5分及び10分の時間で監視された。初期アッセイを、細胞の存在下及び細胞の不在下で5分間の時間で10秒毎に測定が実施された速度論解析を使用して実施した。初期プレートを使用して、どれほどの数の細胞が必要であるか、並びに使用される試料の容量はどれほどであるかを決定した。全96ウェルプレートにわたる平均値の標準誤差は、わずか5であった。複数チャンネルピペットを使用することで、我々は、自信を持って全プレートの分析を10分以内に実行することができた。目的とするタンパク質及びペプチドを同定しようと試みるためには、迅速な処理時間が、生成した試料を分析し、かつアッセイ誘導された試料の分画化を実行するために必要であった。10μLの細胞を使用するDCFDAアッセイの速度論的解析が、図13に示されている。LPS及び1μmの球状体によるヒツジの脾臓細胞の活性化は、無菌技術を使用することなく試料が調製されかつ即時に使用されるので、必要がないように思われる。図1に示すように、DCFDAの線形酸化が、細胞のみの存在下で得られ、DCFDAは、使用された条件に対して安定であるように見えた。DCFDAROS活性アッセイ用の細胞の調製新鮮な全脾臓を、地方の食肉解体処理場TaylorPrestonWellingtonから入手した。細胞は、典型的には採取の1時間以内に得られたが、4°Cで24時間貯蔵後の脾臓の処理加工もまた実施した。脾臓を、切り込み間1cmのギャップで縦方向にスライスし、次いでゲルナイフを使用して、脾臓から赤血球塊をかき落とした。細胞を200mLのPBSと混合し、次いで、ハンドブレンダーで間単にホモゲナイズし、細胞塊を個々の細胞に分けた。次いで混合物を4層のモスリン布を通して注いだ。次いで細胞を使用まで4°Cで保存した。リジン残基の有意性アセチル化は、リジン残基を選択的に遮断する。1.2814gの解凍したRJP混合物を、6Mの尿素を含有する50mLのトリス/HCl0.1M、pH8.5中で溶解した。この溶液を氷水浴上で冷却した。無水酢酸を、0.5mLのアリコートで20分毎に2時間にわたって添加した。毎添加前に溶液のpHを決定し、トリス/HCl1M、pH8.5を使用してpHを7.5超に調整した。次いで、試料を透析管10kDaの分子量カットオフに移し、透析液を3回交換して、1.6リットルの水に対して一晩透析した。透析管の内容物を凍結させて、凍結乾燥させた。239.9mgの白色の僅かに粘着性の物質を回収した。アセチル化試料は、MGO処置後にDCFDAアッセイにおける活性をもはや有さないことが見出された。このことは、リジン残基のMGO修飾が、修飾MRJPによって見られる機能的活性に必須であることを示唆した。LysC消化:ローヤルゼリーの試料を以下のプロトコルを使用して、加水分解した。4μgのLysCを100μLの炭酸アンモニウムpH8.4中に溶解した。10μLのLysC原液を、100μL中の100μgのMRJP抽出物に直接添加した。反応を、室温で72時間実施した。次いで、試料をシナピン酸溶液と1:1で混合し、MALDITOF384ウェルプレート上に、2通りで1μLスポットした。AppliedBiosystemVoyager5800を使用して、ペプチドを分析し、質量及びMSMSスペクトルを決定した。0.1、0.5及び10でのMGOを使用しての修飾からのLysC抽出物を、質量分析法によって検討し、そのMSプロットを図15~19に示す。MRJP1のMGO修飾後に、LysCからより大きなピーク及びより多数のピークが同定された。MGO濃度がより高くなるにつれて更に大きな数のより大きなピークが観測されることも認められた。これらLysCの結果は、MRJP1の全体にわたって様々なLys残基上で複数の修飾が発生したことを示唆している。MRJP1及びMGO修飾MRJP1のトリプシンスピンカラム加水分解:ローヤルゼリーの試料10mg/mLを、SigmaのトリプシンスピンカラムTT0010を使用して、製造者の使用説明書を用いて、トリプシン加水分解にかけた。加水分解を、重炭酸アンモニウム緩衝液中で、MRJP100μgの2つのパスで、室温で30分にわたり実施した。MRJPはまた、MGOと0.1、0.5及び1.0の濃度で、60°Cで一晩にわたって反応させた。このMGO修飾MRJPもまた、天然酵素について記載されたものと同一の条件下で、トリプシン加水分解にかけた。MGO修飾MRJP試料はまた、DCFDAの酸化速度を低減するそれらの能力についても試験した。2つのより高い濃度は、より高い活性であることを示した。活性のより低い量は、0.1のMGOで処置された試料で観察された。修飾MGO0.1、0.5及び1.0トリプシン消化は、質量分析法によって検討され、そのMSプロットを図21~23に示す。非修飾のトリプシン消化のMSプロットを、図20に示す。このタンパク質がその天然の状態で加水分解された場合、MRJP1に関するシーケンスカバレッジは広範囲であり、多数の小断片が検出された。しかしながら、MGO修飾が、MRJP1上の様々なLys及びArg残基で発生する場合、6個までの異なる付加物が形成することが可能であり、付加物の位置的部位に基づいて発生した多くの組み合わせが、より多くのペプチドを生じさせた。この修飾はまた、トリプシンに関する開裂部位を遮断するので、このことが生じるペプチドのポテンシャル数を減少させる。Lys及びArg残基の修飾を介して、特定の部位が開裂されることが阻止されるとともに、観察されるものは非常に多数のより大きなペプチドである。多数のペプチドは、MGO処置MRJP1に関して観察された。このことは、Lys及びArg残基の予期されたランダムな反応性及び目的の活性物質をもたらす様々な部位の複数の付加物の発生に関する傾向性と一致している。MRJP抽出物の加水分解を、トリプシンを含む様々な酵素で実施し、消化物のMGO修飾を実行した。得られた加水分解抽出物は、DCFDAアッセイにおいて良好な活性を有することが見出された結果は示されず。代替試薬による未処置RJPの修飾グリオキサール及びグルタルアルデヒドを含むタンパク質と架橋結合する多くの他の化合物もまた、これら薬剤を使用して少量レベルの抗食作用活性が発生する可能性があるかどうかを決定するために検討が行われた。未処置MRJPを、ペプチド及びタンパク質と架橋結合するとして既知である他の試薬で処置した。これら試薬としては、グリオキサール、グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドが挙げられる。グリオキサールの溶液を、PBSを使用して10mg/mLの最終濃度にまで構成した。グルタルアルデヒドの原液25及びホルムアルデヒドの原液37を、PBSを使用して、それぞれ2.5倍及び3.7倍に希釈し、10の最終濃度を提供した。これら試薬溶液の500μlを、4.5mlのRJP溶液10mg/mLに添加し、60°Cで一晩インキュベートした。RJPはまた、グルコース及びフルクトースと以下のように反応させた。PBS中4.5mlのタンパク質溶液10mg/mLに、PBS中それぞれの炭水化物の500μL溶液10mg/mLを添加し、混合物を60°Cで一晩インキュベートした。MRJPを、PBS中10mg/mLで調製し、以下の試薬で、60°Cで一晩修飾させた:1グリオキサール、2グルコース102mL10mg/mL19.71.97、3フルクトース102mL10mg/mL24.12.41、4グルタルアルデヒド25希釈2.5×2mL800マイクロL12mLのPBS、5MGO40希釈4×2mL500マイクロL1.5mLPBS及び未処置ブランク。試料をROS生成に関してDCFDアッセイで試験し、その結果を図14に示した。MRJPがMGO又はグルタルアルデヒドのいずれかで修飾された場合、統計的に有意な結果が確認された。グルコース又はフルクトースが架橋結合剤として使用された場合、活性は認められなかった。このことは、抗食作用活性は、共有結合又は架橋結合を形成する能力に直接的に関連することを示唆している。この活性は、最初の試料で存在していた遊離MGOに対応するために、試料の1:1000希釈で観察された。このセクションで記載されたMALDI-TOF研究は、ニュージーランドのウェリントンにあるUniversityofVictriaMassSpectrometryFacilityで完了した。本発明及びその実施形態が詳細に説明されてきた。しかしながら、本発明の範囲は、本明細書に記載されたいずれかのプロセス、製造、物質の組成物、化合物、手段、方法、及び/又は工程の特定の実施形態に限定されるよう意図されるものではない。様々な修正、置き換え、及び変形が、本発明の精神及び/又は本質的特性から逸脱しない範囲で開示された材料になされ得る。結果的に、当業者であれば、本明細書に記載された実施形態と同様な機能を実質的に実施するか又は同様な結果を実質的に達成するような後の修正、置き換え、及び/又は変形が、本発明のこのような関連する実施形態に従って利用し得ることが、本開示から容易に理解されるであろう。したがって、以下の特許請求の範囲は、本明細書に開示されるプロセス、製造、物質の組成物、化合物、手段、方法、及び/又は工程へのこれら範囲の修正、置き換え、及び変形を包含するよう意図されている。参照文献K.Kohno,I.Okamoto,O.Sano,N.Arai,K.Iwaki,M.Ikeda,andM.Kurimoto,RoyalJellyInhibitstheProductionofProinflammatoryCytokinesbyActivatedMacrophages,Biosci.Biotechnol.Biochem.,681,2004pp.138-145.KimuraY,MiyagiC,KimuraM,NitodaT,KawaiN,SugimotoH.StructuralfeaturesofN-glycanslinkedtoroyaljellyglycoproteins:structuresofhigh-mannosetype,hybridtype,andbiantennarytypeglycans.Biosci.Biotechnol.Biochem.,64102000pp2109-20.J.Simuth,K.Bilikova,E.Kovacova,Z.Kuzmova,andW.Schroder,Immunochemicalapproachtodetectionofadulterationinhoney:physiologicallyactiveRoyalJellyproteinstimulatingTNF-alphareleaseisaregularcomponentofhoney;JournalofAgricultureandFoodChemistry,528,2004;pp.2154-8.B.Lerrer,K.Zinger-Yosovich,B.Avrahami,andN.Gilboa-Garber,Honeyandroyaljelly,likehumanmilk,abrogatelectin-dependentinfection-precedingPseudomonasaeruginosaadhesion;ISMEJournal,1,2007;pp.149-155.E.Mavric,S.Wittmann,G.Barth,andT.HenleIdentificationandquantificationofmethylglyoxalasthedominantantibacterialconstituentofManukaLeptospermumscopariumhoneysfromNewZealand;Mol.Nutr.FoodRes.52,2008.AuwerxJ.1991.Thehumanleukemiacellline,THP-1:amultifacetedmodelforthestudyofmonocyte-macrophagedifferentiation.Experientia.47:2231.Wan,C.P.,C.S.Park,etal.1993.Arapidandsimplemicrofluorometricphagocytosisassay.JournalofImmunologicalMethods1621:1-7.Allen,K.L.,P.C.Molan,etal..1991.AsurveyoftheantibacterialactivityofsomeNewZealandhoneys.JournalofPharmacyandPharmacology4312:817-22.White,J.1975.Honey:acomprehensivesurvey.London,Heinemann.Schmitt,A.,J.Schmitt,etal..2005.Characterizationofadvancedglycationendproductsforbiochemicalstudies:sidechainmodificationsandfluorescencecharacteristics.AnalyticalBiochemistry338:201-215.JonathanW.C.Brock,1WilliamE.Cotham,1SuzanneR.Thorpe,1JohnWBaynes1andJenniferM.Ames2.2007.Detectionandidentificationofargininemodificationsonmethylglyoxal-modifiedribonucleasebymassspectrometricanalysis.J.MassSpectrom.2007;42:89100"