"植物栽培地で望ましくない植物生育を防除するための方法であって、以下のステップ、a前記栽培地において、ベンゾオキサジノン誘導体除草剤に対して抵抗性もしくは耐性を持つ、野生型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、もしくは変異したプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼmutPPOをコードするヌクレオチド配列を含む、少なくとも1つの核酸を含有する植物を提供するステップ、およびまたはb有効量の前記除草剤を前記栽培地に施用するステップ、を含む、前記方法。aのヌクレオチド配列が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、もしくは45の配列、またはそれらのバリアントもしくは誘導体を含む、請求項1に記載の方法。植物が、除草剤耐性酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、少なくとも1つの追加の異種核酸を含有する、請求項1または2に記載の方法。ベンゾオキサジノン誘導体除草剤が1つもしくは複数の他のPPOを標的とする除草剤と併せて施用される、請求項1~3のいずれか1つに記載の方法。配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、もしくは45のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされるmutPPO、またはそれらのバリアントもしくは誘導体を使用することによって、ベンゾオキサジノン誘導体除草剤を同定するための方法。amutPPOをコードする核酸を含有し、そのmutPPOを発現する、トランスジェニック細胞もしくは植物を作製するステップ;baのトランスジェニック細胞もしくは植物、および同一品種の対照細胞もしくは植物に対して、ベンゾオキサジノン誘導体を施用するステップ;c前記テスト化合物の施用後に、トランスジェニック細胞もしくは植物、および対照細胞もしくは植物の生長または生存能力を測定するステップ、ならびにdトランスジェニック細胞もしくは植物の生長に比べて、対照細胞もしくは植物に対して生長の低下をもたらすテスト化合物を選択するステップ、を含む、請求項5に記載の方法。ベンゾオキサジノン誘導体除草剤に対して抵抗性もしくは耐性を持つ、mutPPOをコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、amutPPOをコードする核酸のライブラリーを作製すること、bその結果得られたmutPPOをコードする核酸の集団を、細胞もしくは植物においてそれぞれの前記核酸を発現させ、前記細胞もしくは植物をベンゾオキサジノン誘導体で処理することによって、スクリーニングすること、c前記のmutPPOをコードする核酸集団により与えられるベンゾオキサジノン誘導体耐性レベルを、対照PPOをコードする核酸により与えられるベンゾオキサジノン誘導体耐性レベルと比較すること、d対照PPOをコードする核酸によってもたらされる耐性レベルと比較して、ベンゾオキサジノン誘導体に対する耐性レベルの有意な増加をもたらす、少なくとも1つのmutPPOをコードする核酸を選択すること、を含む、前記方法。ステップdで選択されるmutPPOコード核酸が、ベンゾオキサジノン誘導体除草剤に対して、対照PPOコード核酸により与えられる耐性と比較して、少なくとも2倍の耐性をもたらす、請求項7に記載の方法。ステップaのライブラリーの核酸配列を含有するトランスジェニック植物を作製すること、ならびにこのトランスジェニック植物を対照植物と比較することによって、抵抗性もしくは耐性が判定される、請求項7または8に記載の方法。mutPPOをコードする単離された核酸であって、その核酸が請求項7~9のいずれか1つに記載の方法によって同定可能である、前記核酸。請求項10に記載の核酸であって、それによってコードされるmutPPOは配列番号2のバリアントであるが、それは次のうち1つもしくは複数を含んでおり、すなわち:128位のアミノ酸はアルギニン以外である;175位のアミノ酸はグリシン以外である;209位のアミノ酸はグリシン以外である;210位のアミノ酸はグリシン以外である;295位のアミノ酸はロイシン以外である;296位のアミノ酸はセリン以外である;334位のアミノ酸はロイシン以外である;353位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である;382位のアミノ酸はグリシン以外である;384位のアミノ酸はロイシン以外である;397位のアミノ酸はロイシン以外である;398位のアミノ酸はグリシン以外である;399位のアミノ酸はスレオニン以外である;400位のアミノ酸はロイシン以外である;402位のアミノ酸はセリン以外である;403位のアミノ酸はセリン以外である;404位のアミノ酸はメチオニン以外である;405位のアミノ酸はメチオニン以外である;420位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である;439位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である、前記核酸。野生型もしくはmutPPO核酸で形質転換されたトランスジェニック植物細胞であって、その植物細胞における前記核酸の発現が、野生型品種の植物細胞と比べて、ベンゾオキサジノン誘導体除草剤に対する抵抗性もしくは耐性の増加をもたらす、前記トランスジェニック植物細胞。請求項12に記載のトランスジェニック植物細胞であって、その野生型もしくはmutPPO核酸が、a配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、もしくは45に示すポリヌクレオチド、またはそれらのバリアントもしくは誘導体;b配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、もしくは46に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそれらのバリアントもしくは誘導体;caもしくはbのいずれかの少なくとも60個の連続したヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド;ならびにdaからcまでのいずれかのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、からなる1群から選択されるポリヌクレオチド配列を含んでなる、前記トランスジェニック植物細胞。請求項13に記載のトランスジェニック植物細胞であって、bの配列番号2のポリペプチドのバリアントが、次のうち1つもしくは複数を含んでおり、すなわち:175位のアミノ酸はグリシン以外である;209位のアミノ酸はグリシン以外である;210位のアミノ酸はグリシン以外である;295位のアミノ酸はロイシン以外である;296位のアミノ酸はセリン以外である;334位のアミノ酸はロイシン以外である;353位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である;382位のアミノ酸はグリシン以外である;384位のアミノ酸はロイシン以外である;397位のアミノ酸はロイシン以外である;398位のアミノ酸はグリシン以外である;399位のアミノ酸はスレオニン以外である;400位のアミノ酸はロイシン以外である;402位のアミノ酸はセリン以外である;403位のアミノ酸はセリン以外である;404位のアミノ酸はメチオニン以外である;405位のアミノ酸はメチオニン以外である;420位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である;439位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である、前記トランスジェニック植物細胞。請求項12~14に記載の植物細胞を含んでなるトランスジェニック植物であって、その植物における核酸の発現が結果として、野生型品種の植物と比較して、ベンゾオキサジノン誘導体除草剤に対する植物の抵抗性の増加をもたらす、前記トランスジェニック植物。配列番号2を含んでなる突然変異もしくは組換えmutPPOを発現する植物であって、そのアミノ酸配列は、対応する野生型植物の野生型PPOのアミノ酸配列と、1つもしくは複数のアミノ酸位置で異なっており、その175位のアミノ酸はグリシン以外である;209位のアミノ酸はグリシン以外である;210位のアミノ酸はグリシン以外である;295位のアミノ酸はロイシン以外である;296位のアミノ酸はセリン以外である;334位のアミノ酸はロイシン以外である;353位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である;382位のアミノ酸はグリシン以外である;384位のアミノ酸はロイシン以外である;397位のアミノ酸はロイシン以外である;398位のアミノ酸はグリシン以外である;399位のアミノ酸はスレオニン以外である;400位のアミノ酸はロイシン以外である;402位のアミノ酸はセリン以外である;403位のアミノ酸はセリン以外である;404位のアミノ酸はメチオニン以外である;405位のアミノ酸はメチオニン以外である;420位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である;439位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である、さらに前記PPOが、植物で発現されたとき、対応する野生型品種の植物と比べて高い除草剤耐性をその植物に与える、前記植物。請求項12~14に記載の植物細胞を含んでなるトランスジェニック植物によって、または請求項15もしくは16に記載の植物によって生産される種子であって、その種子が、野生型品種の種子と比べて増大した、ベンゾオキサジノン誘導体除草剤への抵抗性について、何世代にもわたって同じ特徴を示す、前記種子。mutPPO核酸を含有する発現カセットで植物細胞を形質転換することを含む、野生型品種の植物細胞より高いベンゾオキサジノン誘導体除草剤への抵抗性を示すトランスジェニック植物細胞を作製する方法。mutPPO核酸を含有する発現カセットで植物細胞を形質転換すること、ならびにその植物細胞から、ベンゾオキサジノン誘導体除草剤への抵抗性の高まった植物体を生成させることを含む、トランスジェニック植物を作製する方法。mutPPO核酸が、a配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、もしくは45に示すポリヌクレオチド、またはそれらのバリアントもしくは誘導体;b配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、もしくは46に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそれらのバリアントもしくは誘導体;caもしくはbのいずれかの少なくとも60個の連続したヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド;ならびにdaからcまでのいずれかのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、からなる1群から選択されるポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項18または19に記載の方法。発現カセットが、植物体内で機能する転写開始制御領域、および翻訳開始制御領域を追加して含んでなる、請求項18~20のいずれか1つに記載の方法。形質転換された植物細胞、植物組織、植物体、またはその一部を同定し、または選択する方法であって、i形質転換された植物細胞、植物組織、植物体、またはその一部を提供するが、その形質転換植物細胞、植物組織、植物体、またはその一部は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、もしくは45に示すポリヌクレオチド、またはそれらのバリアントもしくは誘導体を含んでなるものであって、そのポリヌクレオチドは、選択マーカーとして使用されるmutPPOポリペプチドをコードしており、さらに前記形質転換植物細胞、植物組織、植物体、またはその一部は、他の単離されたポリヌクレオチドをさらに含有していてもよい、前記の形質転換された植物細胞、植物組織、植物体、またはその一部を提供すること;ii形質転換された植物細胞、植物組織、植物体、またはその一部を、少なくとも1つのベンゾオキサジノン誘導体化合物と接触させること;iii植物細胞、植物組織、植物体、またはその一部がその阻害化合物によって影響を受けるかどうかを判定すること;ならびにiv形質転換された植物細胞、植物組織、植物体、またはその一部を同定し、または選択すること、を含む、前記方法。現在までに、先行技術は、少なくとも一種の野生型又は突然変異PPO核酸を含有する、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤耐性植物を記載してはいない。先行技術は、PPO遺伝子が由来するゲノム以外のゲノムにおいて突然変異を含有する、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤耐性作物もまた記載していない。したがって、当分野において必要とされるものは、追加のゲノム及び種に由来するベンゾオキサジノン誘導体系除草剤耐性遺伝子の同定である。当分野においてさらに必要とされるものは作物であり、作物はベンゾオキサジノン誘導体系除草剤などの除草剤に対する耐性が増加し、少なくとも一種の野生型及び/又は突然変異PPO核酸を含有する。さらに、このような作物の近傍及び作物における雑草の成長を防除する方法が必要である。除草剤を作物を含有する範囲又は作物に適用する場合、これらの組成物及び方法は、散布技術の使用が可能である。上記問題は、本発明により解決され、本発明は、植物栽培地域における望ましくない植生を防除抑制する方法であって、a前記地域において、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対して抵抗性若しくは耐性である、野生型プロトポルフィリノゲンオキシダーゼ若しくは突然変異プロトポルフィリノゲンオキシダーゼをコードするヌクレオチド配列、を含む少なくとも一種の核酸を含む植物を提供するステップ、b前記地域に、有効量の前記除草剤を適用するステップを含む方法に言及する。加えて、本発明は、配列番号135791113151719212325272931333537394143または45のヌクレオチド配列又はそれらの変異体を含む核酸によりコードされる野生型又はmutPPOを使用することによってベンゾオキサジノン誘導体系除草剤を同定する方法に言及する。前記方法は、amutPPOをコードする核酸を含み、mutPPOが発現されるトランスジェニック細胞又は植物を作製するステップ、bベンゾオキサジノン誘導体系除草剤を、aのトランスジェニック細胞又は植物及び同じ変種の対照細胞又は植物に適用するステップ、c前記試験化合物の適用後、トランスジェニック細胞又は植物及び対照細胞又は植物の成長又は生存能力を決定するステップ、並びにdトランスジェニック細胞又は植物の成長と比較して、対照細胞又は植物の成長を減少させる試験化合物を選択するステップを含む。別の目的は、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対して抵抗性又は耐性であるmutPPOをコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、amutPPOコード核酸のライブラリーを作製するステップ、b細胞又は植物において個々の前記核酸を発現させ、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤を用いて前記細胞又は植物を処理するステップにより、得られたmutPPOコード核酸の集団をスクリーニングするステップ、cmutPPOコード核酸の前記集団により提供されるベンゾオキサジノン誘導体系除草剤耐性レベルと、対照PPOコード核酸により提供されるベンゾオキサジノン誘導体系除草剤耐性レベルとを比較するステップ、d対照PPOコード核酸により提供されるベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する耐性のレベルと比較して、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する有意に増加したレベルの耐性を提供する、少なくとも一種のmutPPOコード核酸を選択するステップを含む方法に言及する。好ましい実施形態において、ステップdにおいて選択されたmutPPOコード核酸は、対照PPOコード核酸により提供されるベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する耐性と比較して、少なくとも二倍2フォールド高いベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する耐性を提供する。抵抗性又は耐性は、ステップaのライブラリーの核酸配列を含むトランスジェニック植物を作製し、前記トランスジェニック植物と対照植物とを比較することよって決定することができる。別の目的は、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対して抵抗性又は耐性であるmutPPOをコードする核酸を含有する植物又は藻類を同定する方法であって、a植物細胞又は緑藻類の培養液において有効量のベンゾオキサジノン誘導体系除草剤を同定するステップ、b前記植物細胞又は緑藻類を、突然変異誘発剤を用いて処理するステップ、c前記突然変異誘発細胞の集団と、aにおいて同定された有効量のベンゾオキサジノン誘導体系除草剤とを接触させるステップdこれらの試験条件で生存する少なくとも一つの細胞を選択するステップ、eステップdにおいて選択された細胞由来のPPO遺伝子をPCR増幅及び配列決定し、このような配列と野生型のPPO遺伝子配列とをそれぞれ比較するステップを含むに言及する。好ましい実施形態において、突然変異誘発剤は、エチルメタンスルホン酸である。別の目的は、mutPPOをコードする単離された核酸であって、上記の方法によって同定可能である核酸に言及する。別の実施形態において、本発明は、野生型若しくはmutPPOの核酸により形質転換された植物細胞、又は野生型若しくはmutPPOの核酸を発現する、好ましくは過剰発現する植物を得るような突然変異を起こした植物であって、植物細胞における核酸の発現が、野生型変種の植物細胞と比較して、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する抵抗性又は耐性の増加をもたらす植物に言及する。別の実施形態において、本発明は、本発明による植物細胞を含む植物であって、植物における核酸の発現が、野生型変種の植物と比較して、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する植物の抵抗性の増加をもたらすトランスジェニック植物に言及する。本発明の植物は、トランスジェニック植物であっても、又は非トランスジェニック植物であってもよい。好ましくは、植物における核酸の発現が、野生型変種の植物と比較して、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する植物の増加した抵抗性をもたらす。別の実施形態において、本発明は、本発明の植物細胞を含むトランスジェニック植物により産生された種子であって、野生型変種の種子と比較してベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する抵抗性の増加のための純粋育種である種子に言及する。別の実施形態において、本発明は、野生型変種の植物細胞と比較してベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する抵抗性が増加したトランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、野生型又はmutPPO核酸を含む発現カセットにより植物細胞を形質転換するステップを含む方法に言及する。別の実施形態において、本発明は、野生型又はmutPPO核酸を含む発現カセットを用いて植物細胞を形質転換するステップ、及び植物細胞から、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する抵抗性が増加した植物を作製するステップを含む方法に言及する。好ましくは、発現カセットは、植物において機能性である転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域をさらに含む。別の実施形態において、本発明は、選択可能なマーカーとして本発明のmutPPOを使用することに関する。本発明は、形質転換された植物細胞、植物組織、植物又はこれらの一部を同定又は選択するための方法であって、a形質転換された植物細胞、植物組織、植物又はこれらの一部を提供するステップであって、前記形質転換された植物細胞、植物組織、植物又はこれらの一部が以下に記載の本発明のmutPPOポリペプチドをコードする単離された核酸を含み、このポリペプチドが選択マーカーとして使用され、前記形質転換された植物細胞、植物組織、植物又はこれらの一部が対象となる単離された核酸を場合によりさらに含み得るステップ、b形質転換された植物細胞、植物組織、植物又はこれらの一部と、少なくとも一種のベンゾオキサジノン誘導体阻害化合物とを接触させるステップ、c植物細胞、植物組織、植物又はこれらの一部が、阻害剤又は阻害化合物により影響を受けたかどうか決定するステップ、及びd形質転換された植物細胞、植物組織、植物又はこれらの一部を同定又は選択するステップを含む方法を提供する。本発明は、また、本明細書に記載の突然変異を含有する、精製されたmutPPOタンパク質において実施され、これらは除草剤耐性に対するさらなる改良を設計するための分子モデリング研究において有用である。タンパク質精製の方法は周知であり、市販の製品又は例えば、ProteinBiotechnology、Walsh及びHeadonに説明されているような、特別に設計された方法を使用して容易に達成できる。配列リスト詳細な説明本明細書において使用される冠詞a及びanは、冠詞の文法的目的語の一つ又は複数を指す。例としては、ある要素は一つ又は複数の要素を意味する。本明細書において使用する場合、含むという単語又は含む若しくは含むなどの変形は、述べられた要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を組み入れるが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の除外を意味するものではないことは理解されるであろう。本発明は、植物栽培地域における望ましくない植生を防除する方法であって、a前記地域において、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対して抵抗性若しくは耐性である、野生型プロトポルフィリノゲンオキシダーゼ若しくは突然変異プロトポルフィリノゲンオキシダーゼをコードするヌクレオチド配列、及び又はを含む少なくとも一種の核酸を含む植物を提供するステップ、b前記地域に、有効量の前記除草剤を適用するステップを含む方法に言及する。望ましくない植生の防除抑制という用語は、雑草の死滅及び又は、さもなければ雑草の正常な成長の遅延若しくは阻害の意味として理解されるべきである。最も広い意味において、雑草は、その植物が望ましくない場所において成長する、すべての植物を意味すると理解される。本発明の雑草は、例えば、双子葉植物及び単子葉植物の雑草を含む。双子葉植物の雑草は、限定するものではないが、下記の属の雑草を含むシロガラシ属、マメグンバイナズナ属、ヤエムグラ属、ハコベ属、シカギク属、ローマカツミレ属、コゴメギク属、アカザ属、イラクサ属、キオン属、ヒユ属、スベリヒユ属、オモナミ属、セイヨウヒルガオ属、サツマイモ属、タデ属、ツノクサネム属、ブタクサ属、アザミ属、ヒレアザミ属、ノゲシ属、ナズ属、イヌガラシ属、キカシグサ属、アゼナ属、オドリコソウ属、クワガタソウ属、イチビ属、エメクス属、チョウセンアサガオ属、スミレ属、チシマオドリコ属、ケシ属、ヤグルマギク属、シャジクソウ属、キンポウゲ属及びタンポポ属。単子葉植物の雑草は、限定するものではないが、下記の属の雑草を含むヒエ属、エノコログサ属、キビ属、メシヒバ属、アワガエリ属、イチゴツナギ属、ウシノケグサ属、オシヒバ属、ビローソキビ属、ソクムギ属、スズメノチャヒキ属、カラスムギ属、カヤツリグサ属、モロコシ属、カモジグサ属、ギョウギシバ属、ミズアオイ属、テンツキ属、オモダカ属、ハリイ属、ホタルイ属、スズメノヒエ属、カモノハシ属、ナガボノウルシ属、タツノツメガヤ属、コヌカグサ属、スズメノテッポウ属及びアペラ属。加えて、本発明の雑草は、例えば、望ましくない場所において成長する作物を含み得る。例えば、大豆植物の畑においてトウモロコシ植物が望ましくない場合、大豆植物を優勢に含む畑に存在する自生のトウモロコシ植物は、雑草と考えることができる。植物という用語は、最も広い意味において、有機材料に属し、植物界のメンバーである真核生物を包含することが意図され、これらの例は、限定するものではないが、維管束植物、野菜、穀物、花、樹木、ハーブ、灌木、牧草、蔓植物、シダ、コケ、菌類及び藻など並びに分枝系、側枝、並びに無性繁殖に使用される植物の一部、シュート、根茎、地下茎、木立、樹冠、球根、鱗茎、塊茎、根茎、組織培養において作製された植物組織などを含む。植物という用語は、全植物、植物の祖先及び子孫並びに種子、シュート、茎、葉、根、花、小花、果実、小花柄、花柄、雄ずい、葯、柱頭、花柱、子房、花弁、萼片、心皮、根端、根冠、根毛、葉毛、種子毛、花粉粒、小胞子、子葉、胚軸、上胚軸、木部、師部、柔組織、内胚乳、伴細胞、孔辺細胞を含む植物の一部並びに植物の任意の他の公知の器官、組織及び細胞並びに組織及び器官をさらに包含し、前述のそれぞれが対象となる遺伝子核酸を含むものとして使用される。植物という用語はまた、植物細胞、懸濁培養液、カルス組織、胚、成長点領域、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子を包含し、これらもまた前述のそれぞれが対象となる遺伝子核酸を含む。本発明の方法において特に有用な植物は、カエデ属の種、マタタビ属の種、トロロアオイ属の種、サイザルアサ、カモジグサ属の種、ハイコヌカグサ、アリウム属の種、ヒユ属の種、アンモフィラアレナリア、パイナップルバンレイシ属の種、セロリ、ラッカセイ属の種、パンノキ属の種、アスパラガス、カラスムギ属の種、カラスムギ、レッドオート、アベナファツアvarサチバ、アベナヒブリダ、スターフルーツ、ホウライチク属の種、トウガン、ブラジルナッツ、サトウダイコン、アブラナ属の種、カブ属の種キャノーラ、アブラナ、ナバナ、カダバファリノーサ、チャノキ、カンナインディカ、アサ、トウガラシ属の種、カレックスエラータ、パパイヤ、カリッサマクロカルパ、ペカン属の種、ベニバナ、クリ属の種、パンヤノキ、エンダイブ、ニッケイ属の種、スイカ、シトラス属の種、ココス属の種、コーヒーノキ属の種、サトイモ、コラノキ属の種、シナノキツナソ属の種、コリアンダー、ハシバミ属の種、サンザシ属の種、サフラン、カボチャ属の種、キュウリ属の種、チョウセンアザミ属の種、ニンジン、ヌスビトハギ属の種、リュウガン、ヤマノイモ属の種、カキノキ属の種、ヒエ属の種、アブラヤシ属、アメリカアブラヤシ、エレウシンコラカナ、エラグロスティステフ、エリアンサス属の種、ビワ、ユーカリ属の種、ビタンガ、ソバ属の種、ブナ属の種、オニウシノケグサ、イチジク、キンカン属の種、フラガリア属の種、ギンコビローバ、グリシン属の種、ワタ、ヒマワリ属の種、ノカンゾウ、ハイビスカス属の種、オオムギ属の種、サツマイモ、クルミ属の種、レタス、ラチルス属の種、レンズマメ、アマ、レイシ、ハス属の種、トカドヘチマ、ルピナス属の種、ルズラシルバチカ、トマト属の種、リコペルシコンリコペルシカム、リコペルシコンピリフォルメ、マクロチローマ属の種、リンゴ属の種、アセロラ、マミーアップル、マンゴー、キャッサバ属の種サポジラ、ムラサキウマゴヤシ、シナガワハギ属の種、ハッカ属の種、ススキ、ツルレイシ属の種、クロミグワ、バショウ種、タバコ種、オリーブ属種、オプンティア属の種、オルニトプス属の種、オリザ属の種、キビ、スイッチグラス、パッションフルーツ、バースニップ、チカラシバ属の種、ワニナシ属の種、イタリアンパセリ、クサヨシ、インゲンマメ属の種、オオアワガエリ、ナツメヤシ属の種、ヨシ、ホオズキ属の種、マツ属の種、ピスタチオ、エンドウ属の種、イチゴツナギ属の種、ハコヤナギ属の種、プロソピス属の種、サクラ属の種、パンジロウ属の種、ザクロ、セイヨウナシ、コナラ属の種、ラディッシュ、ショクヨウダイオウ、スグリ属の種、トウゴマ、キイチゴ属の種、サトウキビ属の種、ヤナギ属の種、ニワトコ属の種、ライムギ、ゴマ属の種、シナピス属の種、ナス属の種、ヒラナス又はトマト、モロコシ、ホウレンソウ属の種、シジジウム属の種、マンジュギク属の種、タマリンディスインディカ、テオブロマカカオ、トリフォリウム属の種、トリプサカムダクチロイデス、トリチコセケルリンパウイ、コムギ属の種、リベットコムギ、トリチカムヒベルナム、トリチカムマチャ、トリチカムサチバム、マカロニコムギ又はトリチカムバルガレ、トロパエオルムミヌス、トロパエオルムマジャス、スノキ属の種、ソラマメ属の種、ササゲ属の種、ニオイスミレ、ブドウ属の種、トウモロコシ、ワイルドライス、ナツメ属の種、アマランス、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリ、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードグリーン、アマ、ケール、レンズマメ、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、大豆、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、カボチャ、茶及び藻などを含むリストから選択される、上科の緑色植物亜界に属するすべての植物、特に、飼葉若しくはマメ科牧草を含む単子葉植物及び双子葉植物、観賞植物、食用作物、樹木若しくは低木を含む。本発明の好ましい実施形態に従って、植物は作物である。作物の例は、特に、大豆、ヒマワリ、キャノーラ、アルファルファ、ナタネ、ワタ、トマト、ジャガイモ又はタバコを含む。さらに好ましくは、植物は、サトウキビなどの単子葉植物である。さらに好ましくは、植物は、イネ、トウモロコシ、小麦、大麦、雑穀、ライ麦、モロコシ又はオート麦などの穀類である。好ましい実施形態において、植物は、これ以下により詳細に記載のように、野生型若しくはmutPPOの導入遺伝子を導入又は過剰発現させることにより植物を組換えによって調製するステップを含む方法によってあらかじめ作製されている。別の好ましい実施形態において、植物は、insituで植物細胞を突然変異誘発させ、mutPPOを発現する植物細胞を得るステップを含む方法によってあらかじめ作製されている。本明細書に開示するように、本発明の核酸は、それらのゲノム中に除草剤耐性の野生型若しくはmutPPOのタンパク質をコードする遺伝子を含む植物の、除草剤耐性の強化への使用が見出される。これ以下に記載のように、このような遺伝子は、内因性遺伝子であっても、又は導入遺伝子であってもよい。さらに、特定の実施形態において本発明の核酸は、所望の表現型を有する植物を創造するために、対象となるポリヌクレオチド配列の任意の組み合わせで積み重ねられてもよい。例えば、本発明の核酸は、殺有害生物性及び又は殺虫性の活性を有するポリペプチド、例えば、バチルスチューリンゲンシス毒タンパク質などをコードする任意の他のポリヌクレオチドを積み重ねてもよいGene48109に記載。作製された組み合わせは、対象となるポリヌクレオチドの任意の一つの複数のコピーをさらに含んでいてよい。特に好ましい実施形態において、植物は、例えば5エノールピルビルシキミ酸3リン酸合成酵素、グリホセートアセチルトランスフェラーゼ、チトクロームP450、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、アセトヒドロキシ酸合成酵素、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、フィトエンデサチュラーゼ及びWO02068607に開示のジカンバ分解酵素またはWO2008141154若しくはWO2005107437に開示されているフェノキシ酢酸およびフェノキシプロピオン酸誘導体分解酵素からなる群から選択される除草剤耐性酵素をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも一種の追加の異種核酸を含む。概して、除草剤という用語は、死滅、防除又はさもなければ植物の成長を不利に修正する有効成分を意味するために本明細書において使用される。除草剤の好ましい量又は濃度は、有効量又は有効濃度である。有効量及び有効濃度は、それぞれ同様の野生型、植物、植物組織、植物細胞又は宿主細胞の成長を死滅又は阻害するために十分であるが、前記量が本発明の除草剤抵抗性の植物、植物組織、植物細胞及び宿主細胞の成長を死滅又は激しく阻害しない量及び濃度を意図する。通常、有効量の除草剤は、対象となる雑草を死滅させるために農業生産系において日常的に使用される量である。このような量は、当業者には公知である。成長の任意の段階又は植え付け若しくは出芽前に植物又は植物遺伝子座に直接用いた場合、除草剤の活性は、本発明のベンゾオキサジノン誘導体系除草剤により示される。観察される効果は、防除される植物種、植物の成長段階、希釈及びスプレー液滴サイズの適用パラメーター、固体成分の粒径、使用時の環境条件、用いる具体的な化合物、用いる具体的なアジュバント及び担体、土壌の型など、並びに用いる化学物質に依存する。これら及び他の因子は、当分野において公知のように調整可能であり、非選択性又は選択性除草剤の作用を促進する。概して、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤を出芽後に、比較的未熟な望ましくない植生に適用し、雑草の最大防除を達成することが好ましい。除草剤耐性又は除草剤抵抗性の植物は、正常な又は野生型の植物の成長を正常に死滅又は阻害すると思われるレベルで、少なくとも一種の除草剤に耐性又は抵抗性である植物を意図する。PPO活性に干渉されることが公知である少なくとも一種の除草剤の存在下、及び野生型mutPPOタンパク質のPPO活性を阻害することが公知である除草剤の濃度又はレベルの場合、除草剤耐性mutPPOタンパク質又は除草剤抵抗性mutPPOタンパク質は、このようなmutPPOタンパク質が、野生型mutPPOタンパク質のPPO活性と比較して、より高いPPO活性を示すことを意図する。さらに、このような除草剤耐性又は除草剤抵抗性のmutPPOタンパク質のPPO活性は、本明細書において除草剤耐性又は除草剤抵抗性のPPO活性と称することができる。本発明のベンゾオキサジノン誘導体除草剤は、下記に示すような式Iのベンゾオキサジノンを含む:式中R1は水素もしくはハロゲンである;R2はハロゲンである;R3は水素もしくはハロゲンである;R4は水素、C1C6アルキル、C1C6ハロアルキル、C3C6シクロアルキル、C3C6アルケニル、C3C6ハロアルケニル、C3C6アルキニル、C3C6ハロアルキニル、C1C6アルコキシ、もしくはC3C6シクロアルキルC1C6アルキルである;R5は水素、NH2、C1C6アルキル、もしくはC3C6アルキニルである;R6は水素もしくはC1C6アルキルである;ならびにWはOもしくはSである;ZはOもしくはSである。別の好ましい実施形態において、本発明のベンゾオキサジノン誘導体除草剤は、下記のAに示すような式Iのベンゾオキサジノン、およびBから選択される少なくとも1つの他の活性化合物、およびC毒性緩和剤を含む:A式Iの少なくとも1つのベンゾオキサジノン式中R1は水素もしくはハロゲンである;R2はハロゲンである;R3は水素もしくはハロゲンである:R4は水素、C1C6アルキル、C1C6ハロアルキル、C3C6シクロアルキル、C3C6アルケニル、C3C6ハロアルケニル、C3C6アルキニル、C3C6ハロアルキニル、C1C6アルコキシ、もしくはC3C6シクロアルキルC1C6アルキルである;R5は水素、NH2、C1C6アルキル、もしくはC3C6アルキニルである;R6は水素もしくはC1C6アルキルである:ならびにXはOもしくはSである;YはOもしくはSである;B分類群b1からb15までの除草剤:b1脂質生合成阻害剤;b2アセト乳酸合成酵素阻害剤ALS阻害剤;b3光合成阻害剤;b4プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害剤;b5白化除草剤;b6エノールピルビルシキミ酸3リン酸合成酵素阻害剤EPSP阻害剤;b7グルタミン合成酵素阻害剤;b878ジヒドロプテロイン酸合成酵素阻害剤DHP阻害剤;b9有糸分裂阻害剤;b10超長鎖脂肪酸合成阻害剤VLCFA阻害剤;b11セルロース生合成阻害剤;b12脱共役剤除草剤;b13オーキシン除草剤;b14オーキシン移動阻害剤;ならびにb15下記からなる一群から選択される他の除草剤:ブロモブチド、クロルフルレノール、クロルフルレノールメチル、シンメチリン、クミルロン、ダラポン、ダゾメット、ジフェンゾコート、ジフェンゾコートメチルスルファートdifenzoquatmetilsulfate、ジメチピン、DSMA、ダイムロン、エンドタールおよびその塩、エトベンザニド、フラムプロップ、フラムプロップイソプロピル、フラムプロップメチル、フラムプロップMイソプロピル、フラムプロップMメチル、フルレノール、フルレノールブチル、フルルプリミドール、ホサミン、ホサミンアンモニウム、インダノファン、インダジフラム、マレイン酸ヒドラジド、メフルイジド、メタム、アジ化メチル、臭化メチル、メチルダイムロン、ヨウ化メチル、MSMA、オレイン酸、オキサジクロメホン、ペラルゴン酸、ピリブチカルブ、キノクラミン、トリアジフラム、トリジファン、ならびに6クロロ34ピリダジノールおよびその塩およびエステル。本発明に有用なベンゾオキサジノン誘導体除草剤は、除草作用のある作物保護組成物の形をとる組成物とすることができるが、これは除草剤として有効な量の活性化合物配合剤を含むものであって、それは少なくとも1つの式Iのベンゾオキサジノン、および除草剤Bから選択される少なくとも1つの他の化合物、および毒性緩和剤Cを上記のように含有し、さらにまた少なくとも1つの液体およびまたは固体担体、およびまたは1つもしくは複数の界面活性剤、ならびに、必要ならば、作物保護組成物に通常使用される1つもしくは複数の追加の補助剤も含有するものである。さらに、本発明に有用なベンゾオキサジノン誘導体除草剤は、1成分組成物として調剤された、作物保護組成物の形をとる組成物とすることもできるが、これは活性化合物配合剤を含むものであって、それは少なくとも1つの式Iのベンゾオキサジノン、および除草剤Bから選択される少なくとも1つの他の活性化合物、および毒性緩和剤Cを含有し、さらに少なくとも1つの固体およびまたは液体担体、およびまたは1つもしくは複数の界面活性剤、ならびに、必要ならば、作物保護組成物のために通常使用される1つもしくは複数の追加の補助剤を含有するものである。さらに、本発明に有用なベンゾオキサジノン誘導体除草剤は、2成分組成物として調剤された、作物保護組成物の形をとる組成物とすることもできるが、これは、少なくとも1つの式Iのベンゾオキサジノン、固体もしくは液体担体、およびまたは1つもしくは複数の界面活性剤を含有する第1成分、ならびに除草剤Bから選択される少なくとも1つの他の活性化合物、および毒性緩和剤C、および固体もしくは液体担体、およびまたは1つもしくは複数の界面活性剤を含有する第2成分を含有するものであって、この2つの成分はいずれも、作物保護組成物のために通常使用される追加の補助剤をさらに含有していてもよい。本明細書に記載の式Iのベンゾオキサジノンが、幾何異性体、たとえばEZ異性体を形成しうるならば、純粋な異性体およびそれらの混合物をいずれも、本発明の組成物に使用することができる。本明細書に記載の式Iのベンゾオキサジノンが、1つもしくは複数の不斉中心を有しており、その結果、鏡像異性体またはジアステレオマーとして存在するならば、純粋な鏡像異性体およびジアステレオマー、ならびにそれらの混合物はいずれも、本発明の組成物に使用することができる。変更可能な基、R1からR6の定義で言及される有機部分は、ハロゲンという用語のように、それぞれの基を構成するものを個別に列挙したものに対する総称である。ハロゲンという用語は、いずれの場合も、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を表す。すべての炭化水素鎖、すなわちすべてのアルキルは、直鎖もしくは分岐とすることができ、CnCmの添え字は、いずれの場合も、その基の、可能性のある炭素原子数を示す。そうした意味の例は下記の通りである:C1C4アルキル、およびC3C6シクロアルキルC1C4アルキルのC1C4アルキル部分:たとえばCH3、C2H5、nプロピルおよびCH2、nブチル、CHC2H5、CH2CH2およびC3;C1C6アルキル、およびC1C6アルコキシC1C6アルキルのC1C6アルキル部分:上記のC1C4アルキル、ならびに、たとえばnペンチル、1メチルブチル、2メチルブチル、3メチルブチル、22ジメチルプロピル、1エチルプロピル、nヘキシル、11ジメチルプロピル、12ジメチルプロピル、1メチルペンチル、2メチルペンチル、3メチルペンチル、4メチルペンチル、11ジメチルブチル、12ジメチルブチル、13ジメチルブチル、22ジメチルブチル、23ジメチルブチル、33ジメチルブチル、1エチルブチル、2エチルブチル、112トリメチルプロピル、122トリメチルプロピル、1エチル1メチルプロピルもしくは1エチル2メチルプロピル、好ましくはメチル、エチル、nプロピル、1メチルエチル、nブチル、11ジメチルエチル、nペンチル、もしくはnヘキシル;C1C4ハロアルキル:フッ素、塩素、臭素、およびまたはヨウ素により、部分的もしくは完全に置換された、上記のC1C4アルキル基、たとえば、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロフルオロメチル、ジクロロフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、ブロモメチル、ヨードメチル、2フルオロエチル、2クロロエチル、2ブロモエチル、2ヨードエチル、22ジフルオロエチル、222トリフルオロエチル、2クロロ2フルオロエチル、2クロロ22ジフルオロエチル、22ジクロロ2フルオロエチル、222トリクロロエチル、ペンタフルオロエチル、2フルオロプロピル、3フルオロプロピル、22ジフルオロプロピル、23ジフルオロプロピル、2クロロプロピル、3クロロプロピル、23ジクロロプロピル、2ブロモプロピル、3ブロモプロピル、333トリフルオロプロピル、333トリクロロプロピル、22333ペンタフルオロプロピル、ヘプタフルオロプロピル、上記のC1C3ハロアルキル基、ならびに、さらに、たとえば12フルオロエチル、12クロロエチル、12ブロモエチル、4フルオロブチル、4クロロブチル、4ブロモブチル、ノナフルオロブチル、1122テトラフルオロエチル、および1トリフルオロメチル1222テトラフルオロエチル;C1C6ハロアルキル:上記のようなC1C4ハロアルキル、ならびに、さらに、たとえば5フルオロペンチル、5クロロペンチル、5ブロモペンチル、5ヨードペンチル、ウンデカフルオロペンチル、6フルオロヘキシル、6クロロヘキシル、6ブロモヘキシル、6ヨードヘキシル、およびドデカフルオロヘキシル;C3C6シクロアルキル、およびC3C6シクロアルキルC1C4アルキルのシクロアルキル部分:3~6環員を有する単環式飽和炭化水素、たとえばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシル;C3C6アルケニル:たとえば、1プロペニル、2プロペニル、1メチルエテニル、1ブテニル、2ブテニル、3ブテニル、1メチル1プロペニル、2メチル1プロペニル、1メチル2プロペニル、2メチル2プロペニル、1ペンテニル、2ペンテニル、3ペンテニル、4ペンテニル、1メチル1ブテニル、2メチル1ブテニル、3メチル1ブテニル、1メチル2ブテニル、2メチル2ブテニル、3メチル2ブテニル、1メチル3ブテニル、2メチル3ブテニル、3メチル3ブテニル、11ジメチル2プロペニル、12ジメチル1プロペニル、12ジメチル2プロペニル、1エチル1プロペニル、1エチル2プロペニル、1ヘキセニル、2ヘキセニル、3ヘキセニル、4ヘキセニル、5ヘキセニル、1メチル1ペンテニル、2メチル1ペンテニル、3メチル1ペンテニル、4メチル1ペンテニル、1メチル2ペンテニル、2メチル2ペンテニル、3メチル2ペンテニル、4メチル2ペンテニル、1メチル3ペンテニル、2メチル3ペンテニル、3メチル3ペンテニル、4メチル3ペンテニル、1メチル4ペンテニル、2メチル4ペンテニル、3メチル4ペンテニル、4メチル4ペンテニル、11ジメチル2ブテニル、11ジメチル3ブテニル、12ジメチル1ブテニル、12ジメチル2ブテニル、12ジメチル3ブテニル、13ジメチル1ブテニル、13ジメチル2ブテニル、13ジメチル3ブテニル、22ジメチル3ブテニル、23ジメチル1ブテニル、23ジメチル2ブテニル、23ジメチル3ブテニル、33ジメチル1ブテニル、33ジメチル2ブテニル、1エチル1ブテニル、1エチル2ブテニル、1エチル3ブテニル、2エチル1ブテニル、2エチル2ブテニル、2エチル3ブテニル、112トリメチル2プロペニル、1エチル1メチル2プロペニル、1エチル2メチル1プロペニル、および1エチル2メチル2プロペニル;C3C6ハロアルケニル:フッ素、塩素、臭素、およびまたはヨウ素により、部分的もしくは完全に置換された、上記のC3C6アルケニル基、たとえば、2クロロプロパ2エン1イル、3クロロプロパ2エン1イル、23ジクロロプロパ2エン1イル、33ジクロロプロパ2エン1イル、233トリクロロプロパ2エン1イル、23ジクロロブタ2エン1イル、2ブロモプロパ2エン1イル、3ブロモプロパ2エン1イル、23ジブロモプロパ2エン1イル、33ジブロモプロパ2エン1イル、233トリブロモプロパ2エン1イル、または23ジブロモブタ2エン1イル;C3C6アルキニル:たとえば、1プロピニル、2プロピニル、1ブチニル、2ブチニル、3ブチニル、1メチル2プロピニル、1ペンチニル、2ペンチニル、3ペンチニル、4ペンチニル、1メチル2ブチニル、1メチル3ブチニル、2メチル3ブチニル、3メチル1ブチニル、11ジメチル2プロピニル、1エチル2プロピニル、1ヘキシニル、2ヘキシニル、3ヘキシニル、4ヘキシニル、5ヘキシニル、1メチル2ペンチニル、1メチル3ペンチニル、1メチル4ペンチニル、2メチル3ペンチニル、2メチル4ペンチニル、3メチル1ペンチニル、3メチル4ペンチニル、4メチル1ペンチニル、4メチル2ペンチニル、11ジメチル2ブチニル、11ジメチル3ブチニル、12ジメチル3ブチニル、22ジメチル3ブチニル、33ジメチル1ブチニル、1エチル2ブチニル、1エチル3ブチニル、2エチル3ブチニル、および1エチル1メチル2プロピニル;C3C6ハロアルキニル:フッ素、塩素、臭素、およびまたはヨウ素により、部分的もしくは完全に置換された、上記のC3C6アルキニル基、たとえば、11ジフルオロプロパ2イン1イル、3クロロプロパ2イン1イル、3ブロモプロパ2イン1イル、3ヨードプロパ2イン1イル、4フルオロブタ2イン1イル、4クロロブタ2イン1イル、11ジフルオロブタ2イン1イル、4ヨードブタ3イン1イル、5フルオロペンタ3イン1イル、5ヨードペンタ4イン1イル、6フルオロヘキサ4イン1イル、または6ヨードヘキサ5イン1イル;C1C4アルコキシ、およびヒドロキシカルボニルC1C4アルコキシ、C1C6アルコキシカルボニルC1C4アルコキシのC1C4アルコキシ部分:たとえば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、1メチルエトキシ、ブトキシ、1メチルプロポキシ、2メチルプロポキシ、および11ジメチルエトキシ;C1C6アルコキシ、およびC1C6アルコキシカルボニルC1C4アルコキシのC1C6アルコキシ部分:上記のC1C4アルコキシ、ならびに、たとえば、ペントキシ、1メチルブトキシ、2メチルブトキシ、3メチルブトキシ、11ジメチルプロポキシ、12ジメチルプロポキシ、22ジメチルプロポキシ、1エチルプロポキシ、ヘキソキシ、1メチルペントキシ、2メチルペントキシ、3メチルペントキシ、4メチルペントキシ、11ジメチルブトキシ、12ジメチルブトキシ、13ジメチルブトキシ、22ジメチルブトキシ、23ジメチルブトキシ、33ジメチルブトキシ、1エチルブトキシ、2エチルブトキシ、112トリメチルプロポキシ、122トリメチルプロポキシ、1エチル1メチルプロポキシ、および1エチル2メチルプロポキシ。本発明の好ましい実施形態によれば、変更可能な基が、相互に無関係に、または互いに組み合わせて、下記の意味を有する、式Iのベンゾオキサジノン誘導体も好ましい:R1は水素であるが;ハロゲンも好ましく、具体的にはFもしくはCl、特にFが好ましい;R2はFである;R3は水素もしくはFであって、好ましくは水素であるが;Fも好ましい;R4はC3C6アルキニルもしくはC3C6ハロアルキニルであるが、好ましくはC3アルキニルもしくはC3ハロアルキニルであって、具体的にはCH2C≡CH、CH2C≡CCl、もしくはCH2C≡CBrが好ましく;また、C3C6アルキニル、もしくはC3C6シクロアルキルC1C6アルキル、特にプロパギルもしくはシクロプロピルメチルも好ましく;また、C3C6アルキニル、好ましくはC3アルキニル;特にCH2C≡CHも好ましく;また、C3C6ハロアルキニル、好ましくはC3ハロアルキニル、特にCH2C≡CClもしくはCH2C≡CBrも好ましい;R5はNH2、C1C6アルキル、もしくはC3C6アルキニルであるが;好ましくはC1C6アルキルであり;C1C4アルキルがさらに好ましく;CH3がもっとも好ましい;R6はC1C6アルキル;好ましくはC1C4アルキルであり、もっとも好ましいのはCH3である;WはOであるが、Sも好ましい;ZはOであるが;Sも好ましい。特に好ましいのは、式IaR2がFであり、R5およびR6がCH3であって、WがO、ZがSである、式Iに相当するのベンゾオキサジノンであって、式中、変更可能な基R1、R3、およびR4は上記の意味、特に好ましい意味を有する。もっとも好ましいのは、下記の表Aの式Ia1からIa48までのベンゾオキサジノン誘導体であって、この変更可能な基R1、R3、およびR4はともに、表AベンゾオキサジノンIa1からIa54の一列で与えられる意味を有するが;変更可能な基R1、R2、R3、およびR4は、相互の組み合わせだけでなく、いずれの場合も単独でも、本発明の化合物にとって特に重要である。表A成分Aとして本発明の組成物の一部をなす、特に好ましい式Iのベンゾオキサジノンは、下記の式Ia35のベンゾオキサジノンである。本発明の特に好ましい実施形態によれば、本発明の方法に有用な組成物は、成分Aとして式Ia35のベンゾオキサジノンを含有する。上記のベンゾオキサジノン誘導体および組成物は、ヨーロッパ特許出願091632422、特にベンゾオキサジノン誘導体に言及している1から7ページの明細に、詳細に記載されており、それらの可能性のある置換基は、参考としてその全体を組み入れるものとする。本発明のベンゾオキサジノン誘導体は、より広範囲の望ましくない植生の防除を得るために、一種又は複数種の他の除草剤と併せて適用することが多くの場合最も良い。他の除草剤と併せて使用する場合、現在特許請求されている化合物は、他の除草剤又は除草剤と一緒に製剤化でき、他の除草剤又は除草剤と一緒にタンクで混合でき又は他の除草剤又は除草剤と一緒に連続して適用できる。本発明の除草剤化合物は、さらに、作物が天然に耐性である追加の除草剤又は上述の一種又は複数種の追加の導入遺伝子の発現を介して抵抗性である追加の除草剤と併せて使用できる。本発明の化合物を併せて用いることができる除草剤の一部は、メトスラム、フルメツラム、クロランスラムメチル、ジクロスラム、ペンキススラム及びフロラスラムなどのスルホンアミド類、クロリムロン、トリベヌロン、スルホメチュロン、ニコスルフロン、クロルスルフロン、アミドスルフロン、トリアスルフロン、プロスルフロン、トリトスルフロン、チフェンスルフロン、スルホスルフロン及びメトスルフロンなどのスルホニルウレア類、イマザキン、イマザピック、イマゼタピル、イマザピル、イマザメタベンズ及びイマザモックスなどのイミダゾリノン類、24D、MCPA、ジクロルプロップ及びメコプロップなどのフェノキシアルカン酸類、トリクロピル及びフルロキシピルなどのピリジニルオキシ酢酸類、クロピラリド、ピクロラム、アミノピラリド及びジカンバなどのカルボン酸類、トリフルラリン、ベネフィン、ベンフルラリン及びペンジメタリンなどのジニトロアニリン類、アラクロール、アセトクロル及びメトラクロルなどのクロロアセトアニリド類、クロルフルレノール及びジフルフェンゾピルなどのセミカルバゾン類、フレアジホップ、ハロキシホップ、ジクロホップ、クロジナホップ及びフェノキサプロップなどのアリールオキシフェノキシプロピオネート類並びにグリホセート、グルホシネート、アシフルオルフェン、ベンタゾン、クロマゾン、フミコロラック、フルオメチュロン、ホメサフェン、ラクトフェン、リニュロン、イソプロチュロン、シマジン、ノルフルラゾン、パラコート、ジウロン、ジフルフェニカン、ピコリナフェン、シニドン、セトキシジム、トラルコキシジム、キンメラック、イソキサベン、ブロモキシニル、メトリブジン及びメソトリオンを含む他の一般的除草剤を含む。例えば本発明を実施するために有用なベンゾオキサジノン誘導体系除草剤は、グリホセート及びグルホシネートと併せて、グリホセート耐性又はグルホシネート耐性の作物に使用できる。上記明細書にまだ含まれていなければ、本発明を実施するのに有用なベンゾオキサジノン誘導体除草剤は、さらに、次の化合物と併せて使用することができる:b1脂質生合成阻害剤の一群から:ACC除草剤、たとえば、アロキシジム、アロキシジムナトリウム、ブトロキシジム、クレトジム、クロジナホップ、クロジナホッププロパルギル、シクロキシジム、シハロホップ、シハロホップブチル、ジクロホップ、ジクロホップメチル、フェノキサプロップ、フェノキサプロップエチル、フェノキサプロップP、フェノキサプロップPエチル、フルアジホップ、フルアジホップブチル、フルアジホップP、フルアジホップPブチル、ハロキシホップ、ハロキシホップメチル、ハロキシホップP、ハロキシホップPメチル、メタミホップ、ピノキサデン、プロホキシジム、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップエチル、キザロホップテフリル、キザロホップP、キザロホップPエチル、キザロホップPテフリル、セトキシジム、テプラロキシジムおよびトラルコキシジム、ならびに非ACC除草剤、たとえばベンフレセート、ブチレート、シクロエート、ダラポン、ジメピペレート、EPTC、エスプロカルブ、エトフメセート、フルプロパネート、モリネート、オルベンカルブ、ペブレート、プロスルホカルブ、TCA、チオベンカルブ、チオカルバジル、トリアレート、およびベルノレート;b2ALS阻害剤の一群から:スルホニルウレア系、たとえばアミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、ベンスルフロンメチル、クロリムロン、クロリムロンエチル、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エタメトスルフロンメチル、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルセトスルフロン、フルピルスルフロン、フルピルスルフロンメチルナトリウム、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、ハロスルフロンメチル、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、ヨードスルフロンメチルナトリウム、メソスルフロン、メタゾスルフロン、メトスルフロン、メトスルフロンメチル、ニコスルフロン、オルソスルファムロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、プリミスルフロンメチル、プロピリスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホメツロンメチル、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、チフェンスルフロンメチル、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリベヌロンメチル、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリフルスルフロンメチル、およびトリトスルフロン;イミダゾリノン系、たとえば、イマザメタベンズ、イマザメタベンズメチル、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、およびイマゼタピル、トリアゾロピリミジン除草剤およびスルホンアニリド系、たとえば、クロランスラム、クロランスラムメチル、ジクロスラム、フルメトスラム、フロラスラム、メトスラム、ペノキススラム、ピリミスルファン、およびピロキシスラム、ピリミジニル安息香酸系、たとえば、ビスピリバック、ビスピリバックナトリウム、ピリベンゾキシム、ピリフタリド、ピリミノバック、ピリミノバックメチル、ピリチオバック、ピリチオバックナトリウム、42オキシフェニルメチルアミノ安息香酸1メチルエチルエステル、42オキシフェニルメチルアミノ安息香酸プロピルエステル、N2オキシベンゼンメタンアミン、ならびにスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤、たとえばフルカルバゾン、フルカルバゾンナトリウム、プロポキシカルバゾン、プロポキシカルバゾンナトリウム、チエンカルバゾン、およびチエンカルバゾンメチル。これらのうち、本発明の好ましい実施形態は、少なくとも1つのイミダゾリノン除草剤を含有する組成物に関する;b3光合成阻害剤の一群から:アミカルバゾン、光化学系IIの阻害剤、例を挙げると、トリアジン除草剤クロロトリアジン、トリアジノン、トリアジノンジオン、メチルチオトリアジン、およびピリダジノンなど、たとえば、アメトリン、アトラジン、クロリダゾン、シアナジン、デスメトリン、ジメタメトリン、ヘキサジノン、メトリブジン、プロメトン、プロメトリン、プロパジン、シマジン、シメトリン、テルブメトン、テルブチラジン、テルブトリン、およびトリエタジン、アリール尿素系、たとえばクロルブロムロン、クロロトルロン、クロロクスロン、ジメフロン、ジウロン、フルオメツロン、イソプロツロン、イソウロン、リヌロン、メタミトロン、メタベンズチアズロン、メトベンズロン、メトクスロン、モノリニュロン、ネブロン、シデュロン、テブチオウロン、およびチアジアズロン、フェニルカーバメート系、たとえば、デスメディファム、カルブチレート、フェンメディファム、フェンメディファムエチル、ニトリル系除草剤、たとえば、ブロモフェノキシム、ブロモキシニルおよびその塩およびエステル、イオキシニルおよびその塩およびエステル、ウラシル系、たとえば、ブロマシル、レナシルおよびターバシル、およびベンタゾンおよびベンタゾンナトリウム、ピリデート、ピリダフォール、ペンタノクロル、およびプロパニル、ならびに光化学系I阻害剤、たとえば、ジクワット、ジクワットジブロミド、パラコート、パラコートジクロリドおよびパラコートジメチルスルフェート。これらの中で、本発明の好ましい実施形態は、少なくとも1つのアリール尿素系除草剤を含有する組成物に関する。同様に、上記のうちで、本発明の好ましい実施形態は、少なくとも1つのトリアジン系除草剤を含有する組成物に関する。さらに上記のうちで、本発明の好ましい実施形態は、少なくとも1つのニトリル系除草剤を含有する組成物に関する。b4プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害剤の一群から:アシフルオルフェン、アシフルオルフェンナトリウム、アザフェニジン、ベンカルバゾン、ベンズフェンジゾン、ビフェノックス、ブタフェナシル、カルフェントラゾン、カルフェントラゾンエチル、クロメトキシフェン、シニドンエチル、フルアゾレート、フルフェンピル、フルフェンピルエチル、フルミクロラック、フルミクロラックペンチル、フルミオキサジン、フルオログリコフェン、フルオログリコフェンエチル、フルチアセット、フルチアセットメチル、ホメサフェン、ハロサフェン、ラクトフェン、オキサジアギル、オキサジアゾン、オキシフルオルフェン、ペントキサゾン、プロフルアゾール、ピラクロニル、ピラフルフェン、ピラフルフェンエチル、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、チジアジミン、32クロロ4フルオロ5フェノキシ2ピリジルオキシ酢酸エチル、Nエチル35メチル1Hピラゾール1カルボキサミド、Nテトラヒドロフルフリル35メチル1Hピラゾール1カルボキサミド、Nエチル35メチル1Hピラゾール1カルボキサミド、Nテトラヒドロフルフリル35メチル1Hピラゾール1カルボキサミド、および37フルオロ3オキソ434ジヒドロ2Hベンゾ14オキサジン6イル15ジメチル6チオキソ135トリアジナン24ジオン;b5白化除草剤の一群から:PDS阻害剤:ベフルブタミド、ジフルフェニカン、フルリドン、フルロクロリドン、フルルタモン、ノルフルラゾン、ピコリナフェン、および42ピリミジン、HPPD阻害剤:ベンゾビシクロン、ベンゾフェナップ、イソキサフルトール、メソトリオン、ピラスルホトール、ピラゾリネート、ピラゾキシフェン、スルコトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン、トプラメゾン、およびビシクロピロン、白化剤、未確認の対象:アクロニフェン、アミトロール、クロマゾン、およびフルメツロン;b6EPSP合成酵素阻害剤の一群から:グリホサート、グリホサートイソプロピルアンモニウム、およびグリホサートトリメシウムスルホサート;b7グルタミン合成酵素阻害剤の一群から:ビラナホスビアラホス、ビラナホスナトリウム、グルホシネート、グルホシネートP、およびグルホシネートアンモニウム;b8DHP合成酵素阻害剤の一群から:アシュラム;b9有糸分裂阻害剤の一群から:K1グループの化合物:ジニトロアニリン系、たとえば、ベンフルラリン、ブトルアリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、フルクロラリン、オリザリン、ペンディメタリン、プロジアミン、およびトリフルラリン、ホスホロアミデート系、たとえば、アミプロホス、アミプロホスメチル、およびブタミホス、安息香酸系除草剤、たとえば、クロルタール、クロルタールジメチル、ピリジン系、たとえば、ジチオピル、およびチアゾピル、ベンズアミド系、たとえば、プロピザミド、およびテブタム;K2グループの化合物:クロルプロファム、プロファム、およびカルベタミド、これらのうち、K1グループ、特にジニトロアニリン系が好ましい;b10VLCFA阻害剤の一群から:クロロアセトアミド系、たとえば、アセトクロール、アラクロール、ブタクロール、ジメタクロル、ジメテナミド、ジメテナミドP、メタザクロール、メトラクロール、メトラクロールS、ペトキサミド、プレチラクロール、プロパクロール、プロピソクロール、およびテニルクロール、オキシアセトアニリド系、たとえば、フルフェナセット、およびメフェナセット、アセトアニリド系、たとえば、ジフェナミド、ナプロアニリド、およびナプロパミド、テトラゾリノン系、たとえば、フェントラザミド、ならびに他の除草剤、たとえば、アニロホス、カフェンストロール、フェノキサスルホン、イプフェンカルバゾン、ピペロホス、ピロキサスルホン、および式IIのイソキサゾリン化合物、式中、R7、R8、R9、R10、W、Z、およびnは以下の意味を有する:R7、R8、R9、R10は互いに無関係に、水素、ハロゲン、もしくはC1C4アルキルであるXは酸素もしくはNHである;Yはフェニル、または単環式5、6、7、8、9もしくは10員環ヘテロシクリルであるが、これは環員炭素原子に加えて、1、2、もしくは3個の、同一の、もしくは異なるヘテロ原子を含有するものであって、ヘテロ原子は環員として酸素、窒素、および硫黄から選択される;このフェニルおよびヘテロシクリルは、未置換であるか、または1、2、もしくは3個の置換基Ryyを有しており、これはハロゲン、C1C4アルキル、C1C4アルコキシ、C1C4ハロアルキル、およびC1C4ハロアルコキシから選択される;好ましいのは、フェニル、または5もしくは6員環芳香族ヘテロシクリルヘタリールであって、これは環員炭素原子に加えて、1、2、もしくは3個の窒素原子を環員として含有するが、このフェニルおよびヘタリールは未置換であるか、または1、2、もしくは3個の置換基Ryyを有し;さらにnは0もしくは1である;式IIのイソキサゾリン化合物の中で、好ましいのは、次のような式IIのイソキサゾリン化合物である、すなわちR7、R8、R9、R10は互いに無関係に、H、F、Cl、もしくはメチルである;Xは酸素である;nは0もしくは1である;さらにYは、フェニル、ピラゾリル、もしくは123トリアゾリルであって、最後に述べた3つの基は、未置換であるか、または1、2、もしくは3個の置換基Ryy、特に以下の基のうち1つを有する;式中R11は、ハロゲン、C1C4アルキル、もしくはC1C4ハロアルキルである;R12は、C1C4アルキルである;R13は、ハロゲン、C1C4アルコキシ、もしくはC1C4ハロアルコキシである;R14は、ハロゲン、C1C4アルキル、C1C4ハロアルキル、もしくはC1C4ハロアルコキシである;mは、0、1、2、もしくは3である;さらには、CR13R14基への結合ポイントを示す;式IIのイソキサゾリン化合物の中で、特に好ましいのは、次のような式IIのイソキサゾリン化合物である、すなわちR7は、水素である;R8は、フッ素である;R9は、水素もしくはフッ素である;R10は、水素もしくはフッ素である;Xは、酸素である;Yは、式Y1、Y2、Y3、もしくはY4の基の1つであって、式中、は、CR9R10基への結合ポイントを示し;nは、0もしくは1、なかでも1である;さらにこれらのうちで、特に好ましいのは、式II1、II2、II3、II4、II5、II6、II7、II8およびII9のイソキサゾリン化合物である;式IIのイソキサゾリン化合物は、たとえばWO2006024820、WO2006037945、WO2007071900、およびWO2007096576で、当技術分野に知られているが;VLCFA阻害剤の中で、好ましいのはクロロアセトアミド系およびオキシアセトアミド系、特にピロキサスルホンである;b11セルロース生合成阻害剤の一群から:クロルチアミド、ジクロベニル、フルポキサム、イソキサベン、1シクロヘキシル5ペンタフルオロフェニルオキシ141246チアトリアジン3イルアミン、および式IIIのピペラジン化合物、式中Aは、フェニルもしくはピリジルであって、RaはAの結合ポイントにオルト位で炭素原子に結合している;RaはCN、NO2、C1C4アルキル、DC3C6シクロアルキル、C1C4ハロアルキル、C1C4アルコキシ、C1C4ハロアルコキシ、ODC3C6シクロアルキル、SqRy、C2C6アルケニル、DC3C6シクロアルケニル、C3C6アルケニルオキシ、C2C6アルキニル、C3C6アルキニルオキシ、NRARB、トリC1C4アルキルシリル、DCRa1、DP2、フェニル、ナフチル、3員から7員の単環式もしくは9員から10員の二環式の、飽和、不飽和、もしくは芳香族ヘテロ環であって、これは、炭素もしくは窒素を介して結合しており、O、N、およびSからなる1群から選択される1、2、3、もしくは4個のヘテロ原子を含有するが、一部もしくは全部が、RaaおよびまたはRa1で置換されていてもよく、Raが炭素原子に結合しているならば、ハロゲンで置換されていてもよい;Ryは、C1C6アルキル、C3C4アルケニル、C3C4アルキニル、NRARBもしくはC1C4ハロアルキルであり、qは0、1、もしくは2である;RA、RBは、互いに無関係に、水素、C1C6アルキル、C3C6アルケニル、およびC3C6アルキニルである;RA、RBは、それらが結合している窒素原子とともに、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和の5員環もしくは6員環を形成していてもよく、こうした環は炭素原子に加えて、O、N、およびSからなる一群から選択される1、2、もしくは3個のヘテロ原子を含有してもよく、1から3個のRaa基で置換されていてもよい;Dは、共有結合、C1C4アルキレン、C2C6アルケニル、もしくはC2C6アルキニルである;Ra1は、水素、OH、C1C8アルキル、C1C4ハロアルキル、C3C6シクロアルキル、C2C8アルケニル、C5C6シクロアルケニル、C2C8アルキニル、C1C6アルコキシ、C1C4ハロアルコキシ、C3C8アルケニルオキシ、C3C8アルキニルオキシ、NRARB、C1C6アルコキシアミノ、C1C6アルキルスルホニルアミノ、C1C6アルキルアミノスルホニルアミノ、ジアルキルアミノスルホニルアミノ、C3C6アルケニルアミノ、C3C6アルキニルアミノ、NNアミノ、NNアミノ、NNアミノ、NNアミノ、NNアミノ、C1C6アルキルスルホニル、トリC1C4アルキルシリル、フェニル、フェノキシ、フェニルアミノ、あるいは5員もしくは6員の単環式、または9員もしくは10員の二環式ヘテロ環であって、これはO、N、およびSからなる1群から選択される1、2、3、もしくは4個のヘテロ原子を含み、この環状基は未置換であるか、または1、2、3、もしくは4個のRaa基で置換されている;Raaはハロゲン、OH、CN、NO2、C1C4アルキル、C1C4ハロアルキル、C1C4アルコキシ、C1C4ハロアルコキシ、SqRy、DCRa1およびトリC1C4アルキルシリルである;Rbは、相互に無関係に、水素、CN、NO2、ハロゲン、C1C4アルキル、C1C4ハロアルキル、C2C4アルケニル、C3C6アルキニル、C1C4アルコキシ、C1C4ハロアルコキシ、ベンジル、もしくはSqRyであり、Rbは、隣接する環原子に結合したRaもしくはRb基とともに、飽和、もしくは部分不飽和、もしくは完全不飽和の5員環もしくは6員環を形成していてもよいが、これは炭素原子の他にO、N、およびSからなる1群から選択される1、2、もしくは3個のヘテロ原子を含んでいてもよく、その環はRaaで部分的もしくは完全に置換されていてもよい;pは0、1、2、または3である;R15は、水素、OH、CN、C1C12アルキル、C3C12アルケニル、C3C12アルキニル、C1C4アルコキシ、C3C6シクロアルキル、C5C6シクロアルケニル、NRARB、SnRy、SnNRARB、CR25、CONRARB、フェニル、または5員もしくは6員の単環式、または9員もしくは10員の二環式芳香族ヘテロ環であって、これはO、N、およびSからなる1群から選択される1、2、3、もしくは4個のヘテロ原子を含有するが、この環状基はD1を介して結合しており、未置換であるか、または1、2、3、もしくは4個のRaa基によって、ならびに部分的もしくは完全にRaaで置換された以下の基:C1C4アルキル、C3C4アルケニル、C3C4アルキニル、C1C4アルコキシ、C3C6シクロアルキル、C5C6シクロアルケニル、NRARB、SnRy、SnNRARB、CR25、CONRARBによっても、置換されていてる;R15は好ましくは、水素、OH、CN、C1C12アルキル、C3C12アルケニル、C3C12アルキニル、C1C4アルコキシ、C3C6シクロアルキル、C5C6シクロアルケニル、NRARB、SnRy、SnNRARB、CR25、CONRARB、フェニル、または5員もしくは6員の単環式、または9員もしくは10員の二環式芳香族ヘテロ環であって、これはO、N、およびSからなる1群から選択される1、2、3、もしくは4個のヘテロ原子を含有するが、この環状基はD1を介して結合しており、未置換であるか、または1、2、3、もしくは4個のRaa基によって、ならびに部分的もしくは完全にRaaで置換された以下の基:C1C4アルキル、C3C4アルケニル、およびC3C4アルキニルによっても、置換されていてる;R25は、水素、C1C4アルキル、C1C4ハロアルキル、C1C4アルコキシ、もしくはC1C4ハロアルコキシである;D1は、カルボニル、もしくはD基である;このR15基、Ra基およびそれらのサブ置換基において、炭素鎖およびまたは環状基は、1、2、3、もしくは4個の置換基RaaおよびまたはRa1を有していてもよい;R16は、C1C4アルキル、C3C4アルケニル、もしくはC3C4アルキニルである;R17は、OH、NH2、C1C4アルキル、C3C6シクロアルキル、C3C6アルケニル、C3C6アルキニル、C1C4ヒドロキシアルキル、C1C4シアノアルキル、C1C4ハロアルキル、C1C4アルコキシC1C4アルキル、もしくはCR25である;R18は、水素、ハロゲン、C1C4アルキル、もしくはC1C4ハロアルキルであり、またはR18はR19とともに1つの共有結合となる;R19、R20、R21、R21は互いに無関係に、水素、ハロゲン、OH、CN、NO2、C1C4アルキル、C1C4ハロアルキル、C2C6アルケニル、C2C6アルキニル、C1C4アルコキシ、C1C4ハロアルコキシ、C3C6シクロアルキル、C3C6シクロアルケニル、およびC3C6シクロアルキニルである;R23、R24は互いに無関係に、水素、ハロゲン、OH、ハロアルキル、NRARB、NRACR26、CN、NO2、C1C4アルキル、C1C4ハロアルキル、C2C4アルケニル、C3C6アルキニル、C1C4アルコキシ、C1C4ハロアルコキシ、OCR26、フェニル、もしくはベンジルオキシであるが、このR23およびR24基において、炭素鎖およびまたは環状基は、1、2、3、もしくは4個の置換基Raaを有していてもよい;R26はC1C4アルキル、もしくはNRARBである;式IIIのピペラジン化合物のうち、好ましいのは次のような式IIIのピペラジン化合物である、すなわちAは、フェニルもしくはピリジルであって、RaはAの結合ポイントにオルト位で炭素原子に結合している;RaはCN、NO2、C1C4アルキル、C1C4ハロアルキル、C1C4アルコキシ、C1C4ハロアルコキシ、もしくはDCRa1である;Ryは、C1C6アルキル、C3C4アルケニル、C3C4アルキニル、NRARBもしくはC1C4ハロアルキルであり、qは0、1、もしくは2である;RA、RBは、互いに無関係に、水素、C1C6アルキル、C3C6アルケニル、およびC3C6アルキニルである;RA、RBは、それらが結合している窒素原子とともに、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和の5員環もしくは6員環を形成していてもよく、こうした環は炭素原子に加えて、O、N、およびSからなる一群から選択される1、2、もしくは3個のヘテロ原子を含有してもよく、1から3個のRaa基で置換されていてもよい;Dは、共有結合、もしくはC1C4アルキレンである;Ra1は、水素、OH、C1C8アルキル、C1C4ハロアルキル、C3C6シクロアルキルである;Raaは、ハロゲン、OH、CN、NO2、C1C4アルキル、C1C4ハロアルキル、C1C4アルコキシ、C1C4ハロアルコキシ、SqRy、DCRa1およびトリC1C4アルキルシリルである;Rbは、相互に無関係に、CN、NO2、ハロゲン、C1C4アルキル、C1C4ハロアルキル、C2C4アルケニル、C3C6アルキニル、C1C4アルコキシ、C1C4ハロアルコキシ、ベンジル、もしくはSqRyであり、Rbは、隣接する環原子に結合したRaもしくはRb基とともに、飽和、もしくは部分不飽和、もしくは完全不飽和の5員環もしくは6員環を形成していてもよいが、これは炭素原子の他にO、N、およびSからなる1群から選択される1、2、もしくは3個のヘテロ原子を含んでいてもよく、その環はRaaで部分的もしくは完全に置換されていてもよい;pは0、もしくは1である;R15は、水素、C1C12アルキル、C3C12アルケニル、C3C12アルキニル、C1C4アルコキシ、もしくはCR25であるが、これはRaa基によって、部分的もしくは完全に置換されていてもよい;R15は好ましくは、水素、C1C12アルキル、C3C12アルケニル、C3C12アルキニル、C1C4アルコキシ、もしくはCR25である;R25は、水素、C1C4アルキル、C1C4ハロアルキル、C1C4アルコキシ、もしくはC1C4ハロアルコキシである;このR15基、Ra基およびそれらのサブ置換基において、炭素鎖およびまたは環状基は、1、2、3、もしくは4個の置換基RaaおよびまたはRa1を有していてもよい;R16は、C1C4アルキルである;R17は、OH、NH2、C1C4アルキル、C3C6シクロアルキル、C1C4ハロアルキル、もしくはCR25である;R18は、水素であり、またはR18はR19とともに1つの共有結合となる;R19、R20、R21、R21は互いに無関係に、水素である;R23、R24は互いに無関係に、水素、ハロゲン、もしくはOHである;b12脱共役剤除草剤の一群から:ジノセブ、ジノテルブ、ならびにDNOCおよびその塩;b13オーキシン除草剤の一群から:24Dおよびその塩およびエステル、24DBおよびその塩およびエステル、アミノピラリドおよびその塩、たとえばアミノピラリドトリスアンモニウムおよびそのエステル、ベナゾリン、ベナゾリンエチル、クロランベンおよびその塩およびエステル、クロメプロップ、クロピラリドおよびその塩およびエステル、ジカンバおよびその塩およびエステル、ジクロルプロップおよびその塩およびエステル、ジクロルプロップPおよびその塩およびエステル、フルロキシピル、フルロキシピルブトメチルbutometyl、フルロキシピルメプチルmeptyl、MCPAおよびその塩およびエステル、MCPAチオエチル、MCPBおよびその塩およびエステル、メコプロップおよびその塩およびエステル、メコプロップPおよびその塩およびエステル、ピクロラムおよびその塩およびエステル、キンクロラック、キンメラック、TBAおよびその塩およびエステル、トリクロピルおよびその塩およびエステル、ならびにアミノシクロピラクロールおよびその塩およびエステル;b14オーキシン移動阻害剤の一群から:ジフルフェンゾピル、ジフルフェンゾピルナトリウム、ナプタラム、およびナプタラムナトリウム;b15他の除草剤群から:ブロモブチド、クロルフルレノール、クロルフルレノールメチル、シンメチリン、クミルロン、ダラポン、ダゾメット、ジフェンゾコート、ジフェンゾコートメチル硫酸、ジメチピン、DSMA、ダイムロン、エンドタールおよびその塩、エトベンザニド、フラムプロップ、フラムプロップイソプロピル、フラムプロップメチル、フラムプロップMイソプロピル、フラムプロップMメチル、フルレノール、フルレノールブチル、フルルプリミドール、ホサミン、ホサミンアンモニウム、インダノファン、インダジフラム、マレイン酸ヒドラジド、メフルイジド、メタム、アジ化メチル、臭化メチル、メチルダイムロン、ヨウ化メチル、MSMA、オレイン酸、オキサジクロメホン、ペラルゴン酸、ピリブチカルブ、キノクラミン、トリアジフラム、トリジファン、ならびに6クロロ34ピリダジノールおよびその塩およびエステル。さらに、式Iのベンゾオキサジノンを毒性緩和剤と併せて施用することは有用であると考えられる。毒性緩和剤は、好ましからざる植物に対する、式Iのベンゾオキサジノンの除草作用に大きな影響を及ぼすことなく、有用植物へのダメージを防ぎ、または少なくする化合物である。毒性緩和剤は、有用植物の播種前たとえば種子処理、シュート、または実生にも、発芽前散布でも、発芽後散布でも施用することができる。さらに、毒性緩和剤C、ベンゾオキサジノンIおよびまたは除草剤Bは、同時に施用することができるが、順次連続して施用してもよい。適当な毒性緩和剤は、たとえば、酢酸、1フェニル5ハロアルキル1H124トリアゾル3カルボン酸、1フェニル45ジヒドロ5アルキル1Hピラゾール35ジカルボン酸、45ジヒドロ55ジアリール3イソキサゾールカルボン酸、ジクロロアセトアミド、αオキシイミノフェニルアセトニトリル、アセトフェノンオキシム、46ジハロ2フェニルピリミジン、N4フェニルスルホニル2安息香酸、18ナフタル酸無水物、2ハロ45チアゾールカルボン酸、ホスホルチオレート、およびNアルキルOフェニルカルバミン酸、ならびにそれらの農業上許容される塩、および農業上許容される誘導体、たとえばアミド、エステル、およびチオエステルただし、それらが酸基を有するならばである。好ましい毒性緩和剤Cの例は、ベノキサコール、クロキントセット、シオメトリニル、シプロスルファミドcyprosulfamide、ジクロルミド、ジシクロノンdicyclonon、ジエトレートdietholate、フェンクロラゾール、フェンクロリム、フルラゾール、フルキソフェニム、フリラゾール、イソキサジフェン、メフェンピル、メフェネートmephenate、ナフタル酸無水物、オキサベトリニル、41オキサ4アザスピロ45デカンおよび225トリメチル313オキサゾリジン、およびN4アミノベンゼンスルホンアミドである。特に好ましい毒性緩和剤Cは、ベノキサコール、クロキントセット、シプロスルファミドcyprosulfamide、ジクロルミド、フェンクロラゾール、フェンクロリム、フルラゾール、フルキソフェニム、フリラゾール、イソキサジフェン、メフェンピル、ナフタル酸無水物、オキサベトリニル、41オキサ4アザスピロ45デカン、および225トリメチル313オキサゾリジン、およびN4アミノベンゼンスルホンアミドである。なかでも好ましい毒性緩和剤Cは、ベノキサコール、クロキントセット、シプロスルファミドcyprosulfamide、ジクロルミド、フェンクロラゾール、フェンクロリム、フリラゾール、イソキサジフェン、メフェンピル、41オキサ4アザスピロ45デカン、および225トリメチル313オキサゾリジン、およびN4アミノベンゼンスルホンアミドである。成分Cとして本発明の組成物の構成成分となる、特に好ましい毒性緩和剤Cは、上記のような毒性緩和剤Cである;具体的には下記の表Cに記載の毒性緩和剤C1C13である:表Cグループb1からb15までの活性化合物b、および活性化合物Cは既知の除草剤および毒性緩和剤であって、たとえば、TheCompendiumofPesticideCommonNamesFarmChemicalsHandbook2000volume86MeisterPublishingCompany2000BHockCFedtkeRRSchmidtHerbizideHerbicidesGeorgThiemeVerlagStuttgart1995WHAhrensHerbicideHandbook7theditionWeedScienceSocietyofAmerica1994およびKKHatziosHerbicideHandbookSupplementforthe7theditionWeedScienceSocietyofAmerica1998を参照されたい。225トリメチル313オキサゾリジンCAS52836314は、R29148とも称される。41オキサ4アザスピロ45デカンCAS71526073は、AD67およびMON4660とも称される。さらに他の除草活性化合物が、WO9626202、WO9741116、WO9741117、WO9741118、およびWO0183459から知られており、さらにWKrameretalModernCropProtectionCompoundsVol1WileyVCH2007およびそこに引用された文献からも、知られている。概して、本発明の化合物は、処理される作物に選択的であり、これらの化合物を施用量で用いて防除される雑草の範囲を補う除草剤と組み合わせて使用することが好ましい。概して、本発明の化合物及び他の補足的な除草剤を、配合剤又はタンク混合物のいずれかとして、同時に適用することが、さらに好ましい。mutPPO核酸という用語は、野生型PPO核酸から突然変異を起こした配列を有し、それが発現した植物にベンゾオキサジノン誘導体系除草剤耐性の増加をもたらすPPO核酸を指す。さらに、突然変異プロトポルフィリノゲンオキシダーゼは、野生型の一次配列の配列番号2468101214161820222426283032343638404244または46のアミノ酸、それらの変異体、誘導体、ホモログ、オルソログ又はパラログと、別のアミノ酸との交換を指す。突然変異アミノ酸という表現は、別のアミノ酸により交換されたアミノ酸を示し、それによってタンパク質の一次配列中の突然変異部位を示すために、以下に使用するものとする。好ましい実施形態において、該PPOヌクレオチド配列は、配列番号12537若しくは39の配列又はそれらの変異体若しくは誘導体を含む。さらに、該PPOヌクレオチド配列は、それぞれ、これ以降定義される配列番号12537又は39のホモログ、パラログ及びオルソログを包含することは、当業者に理解されると思われる。配列に関する変異体という用語は、実質的に同様の配列を意味することを意図する。オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列に関しては、変異体は、遺伝子コードの縮重のために、天然タンパク質と同一のアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらのような天然の対立遺伝子変異体は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応及びハイブリダイゼーション技術を用いた周知の分子生物学技術の使用により同定可能である。変異体ヌクレオチド配列は、例えば、オープンリーディングフレームに関する部位特異的突然変異誘発法の使用により作製された、天然タンパク質をコードするヌクレオチド配列並びに天然タンパク質と比べてアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列などの、合成的に誘導されたヌクレオチド配列をさらに含む。概して、本発明のヌクレオチド配列変異体は、配列番号135791113151719212325272931333537394143又は45のヌクレオチド配列と、少なくとも30、40、50、60から70例えば、好ましくは、71、72、73、74、75、76、77、78から79、概して、少なくとも80、例えば、8184、少なくとも85、例えば、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97から98及び99のヌクレオチド配列同一性を有すると思われる。変異体ポリペプチドは、天然タンパク質のN末端及び又はC末端への一個又は複数個のアミノ酸の欠失若しくは付加、天然タンパク質の一つ又は複数の部位における一個又は複数個のアミノ酸の欠失若しくは付加、又は天然タンパク質の一つ又は複数の部位における一個又は複数個のアミノ酸の置換により、配列番号2468101214161820222426283032343638404244又は46のタンパク質から生じたポリペプチドを意図する。このような変異体は、例えば、遺伝的多型又はヒトの操作による結果であり得る。このような操作の方法は、当分野において周知である。本発明のポリヌクレオチド分子及びポリペプチドは、配列番号135791113151719212325272931333537394143若しくは45で表されるヌクレオチド配列又は配列番号2468101214161820222426283032343638404244若しくは46で表されるアミノ酸配列と十分に同一であるヌクレオチド又はアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド分子及びポリペプチドを包含することが認識される。十分に同一という用語は、第1及び第2のアミノ酸又はヌクレオチド配列が共通の構造ドメイン及び又は共通の機能活性を有するような、十分又は最小数の、第2のアミノ酸又はヌクレオチド配列と同一又は等価のアミノ酸残基又はヌクレオチドを含有する第1のアミノ酸又はヌクレオチド配列を指すように、本明細において使用する。配列同一性は、二つの最適にアライメントされたDNA又はアミノ酸配列が、成分、例えばヌクレオチド又はアミノ酸のアライメントのウインドウを通して不変である程度を指す。試験配列及び参照配列のアライメントされたセグメントに関する同一性割合は、参照配列セグメント中、すなわち、全参照配列又は参照配列のより小さい定義された部分の成分の合計数で割った、二つのアライメントされた配列により共有される同一成分の数である。同一性パーセントは、同一性割合×100である。比較ウインドウをアライメントするための配列の最適アライメントは当業者に周知であり、Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム、Needleman及びWunschの相同性アライメントアルゴリズム、Pearson及びLipmanの類似性方法に関する検索などのツールにより、並びに好ましくは、GAP、BESTFIT、FASTA及びGCGWisconsinPackageの一部として利用可能なTFASTAなどのこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行により実施できる。ポリヌクレオチド、核酸配列、ヌクレオチド配列、核酸、核酸分子という用語は、本明細書において交換可能に使用され、任意の長さの非分枝型ポリマー形態の、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、又は両方の組み合わせのヌクレオチドを指す。タンパク質の誘導体は、問題となる未修飾のタンパク質と比べてアミノ酸の置換、欠失及び又は挿入を有し、それらが由来する未修飾のタンパク質と同様の生物学活性及び機能活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。タンパク質のホモログは、問題となる未修飾のタンパク質と比べてアミノ酸の置換、欠失及び又は挿入を有し、それらが由来する未修飾のタンパク質と同様の生物学活性及び機能活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。欠失は、タンパク質からの一個又は複数個のアミノ酸の除去を指す。挿入は、一個又は複数個のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位へ導入されることを指す。挿入は、N末端及び又はC末端の融合並びに単一若しくは複数のアミノ酸の配列内挿入を含み得る。概して、アミノ酸配列内の挿入は、N末端若しくはC末端の融合より小さい、約一個から十個の残基の大きさである。N末端又はC末端融合のタンパク質又はペプチドの例は、酵母ツーハイブリッド系に使用される転写活性化因子の結合ドメイン若しくは活性化ドメイン、ファージコートタンパク質、6タグ、グルタチオンSトランスフェラーゼタグ、プロテインA、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Tag100エピトープ、cmycエピトープ、FLAGエピトープ、lacZ、CMP、HAエピトープ、プロテインCエピトープ及びVSVエピトープを含む。置換は、タンパク質のアミノ酸と、同様の特性を有する他のアミノ酸との交換を指す。アミノ酸置換は、通常、単一の残基であるが、ポリペプチドに配置された機能的制約によりクラスター化されてもよく、一個から十個のアミノ酸範囲であってもよく、挿入は、普通、約一個から十個のアミノ酸残基の大きさである。アミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的置換の表は、当分野において周知であるProteinsWHFreeman及びCompanyを参照されたい。アミノ酸の置換、欠失及び又は挿入は、固相ペプチド合成法などの当分野において周知のペプチド合成技術を使用して、又は組換えDNA操作により容易に作ることができる。タンパク質の置換、挿入又は欠失変異体を作るためにDNA配列を操作する方法は、当分野において周知である。例えば、DNAの所定の部位における置換突然変異を作る技術は、当業者に周知であり、M13突然変異誘発、T7Geninvitromutagenesis、QuickChangeSiteDirectedmutagenesis、PCR媒介部位特異的突然変異誘発又は他の部位特異的突然変異誘発プロトコルを含む。誘導体は、対象となるタンパク質などのタンパク質の天然型のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸と非天然のアミノ酸残基との置換又は非天然アミノ酸残基の付加を含み得るペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドをさらに含む。タンパク質の誘導体は、ポリペプチドの天然型のアミノ酸配列と比較して、天然に改変された又は非天然に改変されたアミノ酸残基を含むペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドもまた包含する。誘導体は、それが由来したアミノ酸配列と比較して、一個又は複数個の非アミノ酸置換基又は付加、例えば、その検出を容易にするために結合させたリポーター分子などの、アミノ酸配列に共有結合若しくは非共有結合したリポーター分子若しくは他のリガンド及び天然タンパク質のアミノ酸配列と比べて非天然のアミノ酸残基を含んでよい。さらに、誘導体は、FLAG、HIS6又はチオレドキシンなどのペプチドのタグ付を有する天然型のタンパク質の融合もまた含む。オルソログ及びパラログは、遺伝子の組先の関係を記載するために使用される進化的概念を包含する。パラログは、祖先の遺伝子の複製を介して起こった同じ種内の遺伝子であり、オルソログは、種分化を介して起こり、さらに共通の祖先の遺伝子に由来する異なる生物由来の遺伝子である。このようなオルソログの例の、限定されない一覧表を、表1に示す。パラログ及びオルソログが、特定の基質のための結合ポケット又は他のタンパク質との相互作用のための結合モチーフなどの所与の部位に、適切なアミノ酸残基を有する異なるドメインを共有できることは、当分野において周知である。ドメインという用語は、進化的に関連のあるタンパク質の配列のアライメントに沿った特定の位置において保存されたアミノ酸のセットを指す。一方、他の位置にあるアミノ酸はホモログの間で変化してもよく、特定の位置において高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性又は機能において必須であると思われるアミノ酸を示す。タンパク質ホモログのファミリーのアライメントされた配列において、それらの高度な保存が同定されると、問題となる任意のポリペプチドがすでに同定されたポリペプチドファミリーに属する場合、それらは、決定の識別子として使用できる。モチーフ又はコンセンサス配列という用語は、進化的に関連のあるタンパク質の配列中の短い保存領域を指す。モチーフは、ドメインの高い頻度で高度に保存された部分であるが、ドメインのほんの一部を含んでもよく、又は保存されたドメインの外側に位置してもよい。専門的なデータベースがドメインの同定のために存在する、例えば、SMARTProcNatlAcadSciUSA95、58575864Letunicら、NucleicAcidsRes30、242244、InterProNuclAcidsRes31、315318、Prosite、AgeneralizedprofilesyntaxforbiomolecularsequencesmotifsanditsfunctioninautomaticsequenceinterpretationISMB94Proceedings2ndInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiologyAltmanR、BrutlagD、KarpP、LathropR、SearlsD編、5361頁、AAAIPressMenloParkHuloら、NuclAcidsRes32D134D137又はPfam276280。タンパク質配列のinsilico分析のためのツールのセットが、ExPASyproteomicsserverにおいて利用可能である。ドメイン又はモチーフは、配列アライメントなどの日常の技術を使用しても同定できる。比較のための配列アライメント方法は当分野において周知であり、このような方法は、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及びTFASTAを含む。GAPは、Needleman及びWunschのアルゴリズムJMolBiol48443453を使用し、包括的な一致数を最大にし、ギャップ数を最小にする、二つの配列のアライメントを見出す。BLASTのアルゴリズムJMolBiol21540310は、配列同一性パーセントを計算し、二つの配列の間の類似性の統計分析を実施する。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、NationalCentreforBiotechnologyInformationを介して公的に利用可能である。ホモログは、例えば、ClustalW多重配列アライメントアルゴリズム及びデフォルトペアワイズアライメントのパラメーター並びに百分率でのスコア付け方法を使用して容易に同定できる。類似性及び同一性の包括的百分率もまた、MatGATソフトウェアパッケージにおいて利用可能な方法の一つを使用して決定できる。小さな手作業の編集が、保存モチーフ間のアライメントを最適化するために実施でき、このことは当業者には明らかである。さらに、ホモログの同定のために完全長配列を使用する代わりに、特異的ドメインを使用することもできる。配列同一性の値は、全核酸若しくはアミノ酸配列にわたって、又は選択されたドメイン若しくは保存モチーフにわたって、上述のプログラムを使用して、デフォルトパラメーターを使用して決定できる。局所アライメントに関しては、SmithWatermanのアルゴリズムが特に有用であるJMolBiol1471957。本発明の発明者らは、驚くべきことに、一個又は複数個の鍵となるアミノ酸残基を置換することによって、配列番号2468101214161820222426283032343638404244又は46の野生型PPO酵素の活性と比較して除草剤耐性又は除草剤抵抗性を著しく増加させ得ることを見出した。mutPPOの好ましい置換は、植物の除草剤耐性を増加するが、オキシダーゼ活性の生物学的活性はそのままで、実質的に影響を受けないものである。したがって、本発明の別の目的において、PPO酵素、それらの変異体、誘導体、オルソログ、パラログ又はホモログの鍵となるアミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸により置換される。好ましい実施形態において、PPO酵素、それらの変異体、誘導体、オルソログ、パラログ又はホモログの鍵となるアミノ酸残基は、上記の表2に表された保存アミノ酸により置換される。以下に述べるアミノ酸の位置に密接して位置するアミノ酸もまた置換できることは、当業者に理解されるものと思われる。したがって、別の実施形態において、配列番号2468101214161820222426283032343638404244又は46の変異体、それらの変異体、誘導体、オルソログ、パラログ又はホモログは、mutPPOを含み、鍵となるアミノ酸からアミノ酸からアミノ酸±3、±2又は±1個のアミノ酸位が、任意の他のアミノ酸により置換される。当分野において周知の技術に基づいて、高度に特徴的な配列パターンが開発でき、これを用いて、所望の活性を有するさらなるmutPPO候補を調査できる。適切な配列パターンの適用によるさらなるmutPPO候補の調査もまた、本発明に包含される。本配列パターンは、前記パターンの二つの隣接するアミノ酸残基の間の正確な距離を制限するものではないことは当業者には理解されるであろう。上記のパターンにおける二個の隣接アミノ酸の間のそれぞれの距離は、所望の活性に実質的に影響することなく、例えば、互いに独立して±10、±5、±3、±2又は±1個のアミノ酸位置まで変動してよい。本発明に従って得られた結晶学的データに基づく個別のアミノ酸残基の、上記機能的及び空間的分析に沿って、本発明の潜在的に有用なmutPPO候補の特徴的な固有の部分的アミノ酸配列を同定できる。特に好ましい実施形態において、配列番号2のmutPPOの変異体又は誘導体は下記の表3aから選択され、配列番号2のmutPPOの組み合わされたアミノ酸置換は表3bから選択される。表3a単一アミノ酸置換表3b配列番号2上記の表に述べられたアミノ酸のそばの任意のアミノ酸は、置換基として使用できることは理解されるべきである。このような変異体の機能性を試験するアッセイは、当分野において容易に利用可能であり、それぞれ、本発明の実施例の項に記載している。好ましい実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号2のPPOのアミノ酸配列とは、次の位置のうち1箇所または複数箇所で異なっている:128、175、209、210、295、296、334、353、382、384、397、398、399、400、402、403、404、405、420、439。これらのアミノ酸位置での相違の例は、次のうち1つもしくは複数を含むが、それに限定されない:128位のアミノ酸はアルギニン以外である;175位のアミノ酸はグリシン以外である;209位のアミノ酸はグリシン以外である;210位のアミノ酸はグリシン以外である;295位のアミノ酸はロイシン以外である;296位のアミノ酸はセリン以外である;334位のアミノ酸はロイシン以外である;353位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である;382位のアミノ酸はグリシン以外である;384位のアミノ酸はロイシン以外である;397位のアミノ酸はロイシン以外である;398位のアミノ酸はグリシン以外である;399位のアミノ酸はスレオニン以外である;400位のアミノ酸はロイシン以外である;402位のアミノ酸はセリン以外である;403位のアミノ酸はセリン以外である;404位のアミノ酸はメチオニン以外である;405位のアミノ酸はメチオニン以外である;420位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である;439位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である。ある実施形態において、配列番号2のPPO酵素は、下記のうち1つもしくは複数を含む:128位のアミノ酸は、Leu、Ala、Val、Ile、Phe、Trp、Asp、もしくはAsnである;175位のアミノ酸は、欠失、Ala、Val、Pro、Leu、Ile、Met、Ser、もしくはThrである;209位のアミノ酸は、欠失、Ala、Val、Pro、Leu、Ile、Met、Ser、もしくはThrである;210位のアミノ酸は、欠失、Ala、Val、Pro、Leu、Ile、Met、SerもしくはThrである;295位のアミノ酸は、Ser、Met、Ala、Val、Asp、Asn、もしくはThrである;296位のアミノ酸は、Leu、Met、Gly、Val、Asp、Asn、もしくはThrである;334位のアミノ酸は、Val、Ile、Phe、Tyr、Asn、Asp、もしくはThrである;353位のアミノ酸は、Tyr、Leu、Val、Ile、もしくはAsnである;382位のアミノ酸は、Ala、Ser、Thr、Cys、Val、もしくはAspである;384位のアミノ酸は、Ala、Val、Ile、Asn、Asp、もしくはThrである;397位のアミノ酸は、Ala、Val、Ile、Asn、Asp、もしくはThrである;398位のアミノ酸は、Ala、Ser、Thr、Cys、Val、もしくはAspである;399位のアミノ酸は、Ser、Cys、Met、Ala、もしくはAsnである;400位のアミノ酸は、Ala、Val、Ile、Phe、Asn、Asp、もしくはThrである;402位のアミノ酸は、Gly、Ala、Cys、Asp、もしくはHisである;403位のアミノ酸は、Gly、Ala、Cys、Asp、もしくはHisである;404位のアミノ酸は、Ser、Cys、Thr、Gly、もしくはAlaである;405位のアミノ酸は、Leu、Ala、Val、Gly、Cys、もしくはSerである;420位のアミノ酸は、Met、Cys、Ile、Tyr、Trp、Leu、もしくはThrである;439位のアミノ酸は、Tyr、Trp、Ala、Val、もしくはIleである。さらに好ましい実施形態において、アミノ酸配列は、389位で、配列番号26のPPOのアミノ酸配列と異なる。好ましくは389位のアミノ酸は、バリン以外である。より好ましくは、389位のアミノ酸はMet、Ala、Cys、もしくはHisである。他に好ましい実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号38のPPOのアミノ酸配列とは、次の位置のうち1箇所もしくは複数箇所で異なっている:220、305、426。好ましくは220位のアミノ酸はアラニン以外であり、305位のアミノ酸はセリン以外であり、426位のアミノ酸はチロシン以外である。より好ましくは、220位のアミノ酸は、欠失、Val、Thr、Leu、Cys、Ile、もしくはMetである;305位のアミノ酸は、Leu、Ala、Valである;426位のアミノ酸は、Met、Cys、Ile、Leu、もしくはThrである。他に好ましい実施形態において、アミノ酸配列は、次の位置のうち1箇所もしくは複数箇所で、配列番号40のPPOのアミノ酸配列と異なる:178、179、372、392。好ましくは、178位のアミノ酸はグリシン以外であり、179位のアミノ酸はグリシン以外であり、372位のアミノ酸はフェニルアラニン以外であり、392位のアミノ酸はフェニルアラニン以外である。より好ましくは、178位のアミノ酸は、欠失、Ala、Val、Pro、Leu、Ile、Met、Ser、もしくはThrである;179位のアミノ酸は、欠失、Ala、Val、Pro、Leu、Ile、Met、Ser、もしくはThrである;372位のアミノ酸は、Met、Cys、Ile、Tyr、Trp、Phe、Leu、もしくはThrである;392位のアミノ酸は、Met、Cys、Ile、Tyr、Trp、もしくはLeuである。表1に表されるような、配列番号135791113151719212325272931333537394143又は45のホモログ、オルソログ及びパラログ並びにそれぞれ配列番号7又は9に共有される保存された領域及びモチーフの同定は、当業者の見識の範囲内であると思われる。適切な結合モチーフを提示できるこのような保存領域を同定すると、表3a及び3bに記載したアミノ酸に対応するアミノ酸は任意の他のアミノ酸、好ましくは表2に示す保存アミノ酸、より好ましくは表3a及び3bのアミノ酸による置換のために選択され得る。加えて、本発明は、配列番号135791113151719212325272931333537394143又は45のヌクレオチド配列又はそれらの変異体若しくは誘導体を含む核酸によりコードされるmutPPOを使用することによって、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤を同定する方法に言及する。前記方法は、amutPPOコード核酸を含み、mutPPOをが発現されするトランスジェニック細胞又は植物を作製するステップ、bベンゾオキサジノン誘導体系除草剤を、aのトランスジェニック細胞又は植物及び同じ変種の対照細胞又は植物に適用するステップ、c前記ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤の適用後、トランスジェニック細胞又は植物及び対照細胞又は植物の成長又は生存能力を決定するステップ、並びにdトランスジェニック細胞又は植物の成長と比較して、対照細胞又は植物に成長の減少をもたらすベンゾオキサジノン誘導体系除草剤を選択するステップを含む。対照細胞又は同様の野生型の、植物、植物組織、植物細胞又は宿主細胞は、除草剤抵抗性特徴及び又は本明細書に開示の本発明の特定のポリヌクレオチドを欠いた、それぞれ、植物、植物組織、植物細胞又は宿主細胞を意図する。したがって、野生型という用語の使用は、そのゲノム中に組換えDNAを欠いた、及び又は本明細書に開示のものとは異なる除草剤抵抗性特徴を保有しない植物、植物組織、植物細胞又は他の宿主細胞を意味することを意図しない。別の目的は、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対して抵抗性又は耐性であるmutPPOをコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、amutPPOコード核酸のライブラリーを作製するステップ、b細胞又は植物において個々の前記核酸を発現させ、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤を用いて前記細胞又は植物を処理することによって、得られたmutPPOコード核酸の集団をスクリーニングするステップ、cmutPPOコード核酸の前記集団により提供されるベンゾオキサジノン誘導体系除草剤耐性レベルと、対照PPOコード核酸により提供されるベンゾオキサジノン誘導体系除草剤耐性レベルとを比較するステップ、d対照PPOコード核酸により提供されるものと比較して、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する耐性レベルの有意な増加を提供する、少なくとも一種のmutPPOコード核酸を選択するステップを含む方法に言及する。好ましい実施形態において、ステップdにおいて選択されたmutPPOコード核酸は、対照PPOコード核酸により提供されるものと比較して、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する少なくとも2倍高い細胞又は植物の抵抗性又は耐性を提供する。さらに好ましい実施形態において、ステップdにおいて選択されたmutPPOコード核酸は、対照PPOコード核酸により提供されるものと比較して、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍高いベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する細胞又は植物の抵抗性又は耐性を提供する。抵抗性又は耐性は、ステップaのライブラリーの核酸配列を含むトランスジェニックな植物又は宿主細胞、好ましくは植物細胞を作製し、前記トランスジェニック植物と、対照の植物又は宿主細胞、好ましくは植物細胞とを比較することによって決定することができる。別の目的は、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対して抵抗性又は耐性である野生型又はmutPPOをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含有する植物又は藻を同定する方法であって、a植物細胞又は緑藻類の培養液における、前記細胞の死につながる有効量のベンゾオキサジノン誘導体系除草剤を同定するステップ、b前記植物細胞又は緑藻類を、突然変異誘発剤を用いて処理するステップ、c前記突然変異誘発細胞の集団と、aで同定された有効量のベンゾオキサジノン誘導体系除草剤とを接触させるステップ、dこれらの試験条件で生存する少なくとも一種の細胞を選択するステップ、edにおいて選択された細胞からPPO遺伝子のPCR増幅及び配列決定をし、このような配列と野生型のPPO遺伝子配列とをそれぞれ比較するステップ、を含む方法に言及する。好ましい実施形態において、前記突然変異誘発剤はエチルメタンスルホン酸である。技術者に周知の多くの方法が、微生物、植物、菌類、藻、混合培養液などを含むさまざまな異なる潜在的供給源生物並びに土壌などのDNAの環境的供給源由来のmutPPOをコードするヌクレオチド配列を同定するための、適切な候補核酸を得るために利用可能である。これらの方法は、特に、cDNA又はゲノムDNAライブラリーの調製、適切に縮重されたオリゴヌクレオチドプライマーの使用、公知の配列又は相補性アッセイに基づくプローブの使用並びに組換えられた、又はシャッフルされたmutPPOコード配列を提供するための、突然変異誘発及びシャッフリングの使用を含む。候補及び対照のPPOコード配列を含む核酸は、酵母、細菌宿主株、藻類又はタバコ又はシロイヌナズナなどの高等植物において発現可能であり、スクリーニングされたPPOコード配列の先天的耐性の相対的レベルは、選択されたベンゾオキサジノン誘導体系除草剤のさまざまな濃度の存在下で、形質転換された菌株又は植物の目に見える指標となる表現型に一致する。これらの指標となる表現型に伴う用量応答及び用量応答における相対的移行、例えば、GR50又は値の増加が発現されたPPOの先天性耐性の増加と一致するMIC値の用量応答及び用量応答における相対的移行は、都合の良いことに、明確に発現される。例えば、大腸菌などの細菌の形質転換に基づく比較的高速なアッセイ系において、個々のmutPPOコード配列は、例えば、lacZプロモーターなどの調節可能なプロモーターの発現調節下のDNA配列として、例えば合成DNAの使用により、異なるPPO配列のレベルと可能な限り同等のレベルの発現を得るためのコドンの使用などの問題を適切に考慮して発現できる。別の候補PPO配列を含む核酸を発現するような菌株は、場合によりチロシンを添加した培地中のさまざまな濃度の選択されたベンゾオキサジノン誘導体系除草剤にプレーティングでき、発現されたPPO酵素の先天的耐性の相対的レベルを、茶色の、組織褐変性色素の形成の阻害に関する程度及びMICに基づいて推定した。別の実施形態において、候補核酸を植物材料内に形質転換し、トランスジェニック植物を作製し、選択されたベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する差次的耐性がその後測定され、形態的に正常な繁殖性植物が再生される。カナマイシンなどの適切な選択マーカー、アグロバクテリウム属由来などのバイナリーベクター及び例えば、タバコのリーフディスク法などの植物再生を使用する、形質転換のための多くの適切な方法が、当分野において周知である。場合により、植物の対照集団は、対照PPOを発現する核酸を用いて同様に形質転換される。代替的に、非形質転換のシロイヌナズナ又はタバコなどの双子葉植物を、これはどんな場合にもその自分の内因性PPOを発現するので、対照として使用できる。上記に記載されたベンゾオキサジノン誘導体に対する、さまざまな一次植物形質転換事象又はそれらの子孫の除草剤耐性レベルの平均及び分布は、さまざまな異なる濃度の除草剤における、植物の損傷、成長点漂白化症状などに基づく正常な様式で評価される。これらのデータは、例えば、用量をx軸にプロットし、死滅百分率、除草剤効果新生緑色植物の数などをy軸にプロットした用量応答曲線に由来するGR50値に関して表すことができ、GR50値の増加は、発現されたPPOの先天的耐性レベルの増加に一致する。除草剤は、出芽前又は出芽後に適切に適用される。別の目的は、mutPPOをコードする単離された核酸であって、上記の方法により同定可能である核酸に言及する。別の実施形態において、本発明は、野生型若しくはmutPPO核酸により形質転換された植物細胞又は野生型若しくはmutPPO核酸を発現する植物を得るために突然変異を起こした植物細胞であって、植物細胞における核酸の発現は、野生型変種の植物細胞と比較して、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する抵抗性若しくは耐性の増加をもたらす植物細胞に言及する。発現発現する又は遺伝子発現という用語は、特定の遺伝子若しくは特定の遺伝子又は特定の遺伝子構築体の転写を意味する。発現又は遺伝子発現という用語は、具体的には、遺伝子若しくは遺伝子又は遺伝子構築体の、構造RNA又はmRNAへの、後者のタンパク質へのその後の翻訳を伴う又は伴わない転写を意味する。この過程は、DNAの転写及び得られたmRNA産物のプロセシングを含む。所望の効果、すなわち、本発明のベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対して耐性又は抵抗性である植物を得ることは、少なくとも一種の核酸が、当業者に公知の方法及び手段により過剰発現されることは理解されるであろう。本明細書において使用する場合、発現の増加又は過剰発現という用語は、もともとの野生型の発現レベルに追加される、任意の形態の発現を意味する。遺伝子又は遺伝子産物の発現を増加させる方法は、当分野において十分文書化されており、例えば、適切なプロモーターにより駆動される過剰発現、転写エンハンサー又は翻訳エンハンサーの使用を含む。プロモーター又はエンハンサー要素として機能する単離核酸は、対象となるポリペプチドをコードする核酸の発現を上方制御するように、ポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置に導入できる。例えば、内因性プロモーターは、突然変異、欠失、及び又は置換によりinvivoで改変でき又は単離プロモーターは、遺伝子の発現が調節されるように、固有の配向及び本発明の遺伝子から離れて植物細胞に導入できる。ポリペプチドの発現が望ましい場合、概して、ポリヌクレオチドコード領域の3末端にポリアデニル化領域を含むことが望ましい。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、さまざまな他の植物遺伝子又はTDNAに由来してよい。加えられる3末端配列は、例えば、ノパリン合成酵素若しくはオクトピン合成酵素の遺伝子又は代替的には、別の植物遺伝子又はあまり好ましくはないが任意の他の真核性遺伝子に由来してよい。イントロン配列もまた、サイトゾル中に蓄積した成熟メッセージの量を増加するために、5非翻訳領域又は部分的コード配列のコード配列に加えることができる。植物及び動物の両方の発現構築体の転写ユニット中にスプライシング可能なイントロンを含むことで、mRNA及びタンパク質の両方の遺伝子発現レベルが、1000倍まで増加することが示されているMolCellbiol843954405CallisらGenesDev111831200。転写ユニットの5末端近くに配置された場合、遺伝子発現のこのようなイントロン強化が通常最も高い。トウモロコシのイントロンである、Adh1Sイントロン1、2及び6、Bronze1イントロンの使用が、当分野において公知である。概説に関しては、TheMaizeHandbookChapter116、Freeling及びWalbot編、Springer、NYを参照されたい。本明細書において言及される導入又は形質転換という用語は、移入に使用する方法にかかわりなく、外因性のポリヌクレオチドの宿主細胞への移入を包含する。器官形成によってであろうと胚形成によってであろうと、その後クローン増殖可能な植物組織は、本発明の遺伝子構築体を用いて形質転換でき、それから植物全体を再生できる。選択された特定の組織は、形質転換される特定の種に利用可能で、最も適したクローン増殖系に依存して変更される。例示的組織標的は、リーフディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織及び誘導性分裂組織を含む。ポリヌクレオチドは、一時的に、又は安定して宿主細胞に導入でき、非統合的に、例えば、プラスミドとして維持され得る。代替的には、ポリヌクレオチドは宿主ゲノムに統合され得る。得られた形質転換された植物細胞は、その後、当業者に公知の様式で形質転換された植物を再生するために使用できる。外来遺伝子の植物ゲノムへの移入を、形質転換と呼ぶ。植物種の形質転換は、現在きわめて日常の技術である。有利なことに、任意のいくつかの形質転換方法は、対象となる遺伝子を適切な祖先細胞に導入するために使用できる。植物組織又は植物細胞から植物の形質転換及び再生に関して記載された方法は、一時的な、又は安定した形質転換に利用できる。形質転換方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離のDNAの取り込みを増加する化学物質的、植物へのDNAの直接注入、微粒子銃、ウイルス又は花粉を使用する形質転換及び顕微鏡投影の使用を含む。方法は、プロトプラストのためのカルシウムポリエチレングリコール法Nature296、7274NegrutiuIらPlantMolBiol8363373プロトプラストのエレクトロポレーションBioTechnol3、10991102植物材料へのマイクロインジェクションMolGenGenet202179185DNA又はRNAによりコーティングされた粒子衝撃Nature32770ウイルスによる感染などから選択できる。トランスジェニック作物を含むトランスジェニック植物は、好ましくは、アグロバクテリウム属媒介形質転換を介して作製される。有利な形質転換方法は、植物体における形質転換である。この目的のために、例えば、アグロバクテリアを植物種子に作用させる、又は植物分裂組織にアグロバクテリアを接種することが可能である。形質転換されたアグロバクテリアの懸濁液を無傷の植物若しくは少なくとも花原基に作用させることは、本発明に従って特に好都合に証明されている。植物は、処理した植物の種子が得られるまで続けて成長させる。16、735743。コメのアグロバクテリウム属媒介形質転換の方法は、下記のいずれかに記載の方法などの、コメの形質転換の周知の方法を含む欧州特許出願EP1198985A1、Aldemita及びHodgesChanら、491506、1993年、Hieiら、271282、1994年、これらの開示は、完全に説明されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。コーンの形質転換の場合、好ましい方法は、Ishidaら74550、1996年又はFrameら1322、2002年のいずれかに記載の方法であり、これらの開示は、完全に説明されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。前記方法は、BJenesら、TechniquesforGeneTransfer、TransgenicPlants、1巻、EngineeringandUtilization、SDKung及びRWu編、AcademicPress128143及びPotrykusAnnuRevPlantPhysiolPlantMolecBiol42205225に例としてさらに記載されている。発現される核酸又は構築体は、好ましくは、アグロバクテリウムツメファシエンシスの形質転換に適切なベクター、例えば、pBin198711内にクローニングされる。このようなベクターにより形質転換されたアグロバクテリアは、その後、シロイヌナズナのようなモデルとして使用される植物などの植物、例としてタバコ植物などの作物などの作物の形質転換のための公知の様式に、例えば、傷ついた葉又は刻んだ葉をアグロバクテリアの溶液に浸し、その後それらを適切な培地において培養することによって使用できる。アグロバクテリウムツメファシエンシスを用いた植物の形質転換が、例えば、Hoefgen及びWillmitzerによるNuclAcidRes16、9877により記載され、又は特に、FFWhite、VectorsforGeneTransferinHigherPlantsinTransgenicPlants、1巻、EngineeringandUtilization、SDKung及びRWu編、AcademicPress、1993年、1538頁により公知である。その後、無傷の植物に再生されなければならない体細胞の形質転換に加えて、植物分裂組織の細胞、特に配偶子に生育するそれらの細胞もまた形質転換できる。この場合、形質転換された配偶子は天然の植物の生育をたどり、トランスジェニック植物を生じる。したがって、例えば、シロイヌナズナの種子をアグロバクテリアを用いて処理し、種子が、特定の部分が形質転換された、したがってトランスジェニックな生育中の植物から得られるFeldmanKA及びMarksMD。MolGenGenet208274289FeldmannKCKoncz、NHChua及びJShell編、MethodsinArabidopsisResearch。WordScientific、Singapore、274289頁。代替の方法は、花序の反復除去及びロゼットの中心の切除部位と形質転換されたアグロバクテリアとのインキュベーションに基づき、それによって、形質転換された種子を同様にのちの時点で得ることができる。PlantJ5551558Katavic。MolGenGenet、245363370。しかし、特に有効な方法は、減圧浸潤法及びフローラルディップ法などのその変形である。シロイヌナズナの減圧浸潤の場合、減圧下で無傷の植物をアグロバクテリアの懸濁液を用いて処理しBechtholdN。CRAcadSciParisLifeSci、31611941199、一方、フローラルディップ法の場合、生育中の花の組織を、界面活性剤により処理されたアグロバクテリアの懸濁液と一緒に少しの間インキュベートするCloughSJ及びBentAFThePlantJ16、735743。両方の場合に、トランスジェニック種子特定の集団を収穫し、これらの種子は、上記の選択的条件下で成長した非トランスジェニック種子とは識別可能である。加えて、母方から遺伝する色素体は、大部分の作物において導入遺伝子が花粉に流入する危険性を減少又は排除するので、色素体の安定した形質転換が有利である。葉緑体ゲノムの形質転換は、概して、Klausら、2004年NatureBiotechnology22、225229に概略的に表示されている方法によって達成される。簡潔に言うと、形質転換された配列を、葉緑体ゲノムに相同な隣接配列の間に、選択可能なマーカー遺伝子と一緒に、クローニングする。これらの相同な隣接配列は、プラストーム内に部位特異的統合に向かう。色素体の形質転換は、多数のさまざまな植物種に関して記載されており、概要は、BockTransgenicplastidsinbasicresearchandplantbiotechnologyJMolBiol2001年9月21日31242538又はMaligaPProgresstowardscommercializationofplastidtransformationtechnologyTrendsBiotechnol21、2028に示されている。さらなるバイオテクノロジーの進歩が、無マーカー色素体形質転換体の形態で近年報告されており、これらは一次的に共組込みされたマーカー遺伝子により作製できる、225229。遺伝子組換え植物細胞は、技術者によく知られたすべての方法を介して再生できる。適切な方法は、SDKung及びRWuPotrykus又はHoefgen及びWillmitzerによる上記の刊行物に見出すことができる。概して形質転換後、植物細胞又は細胞のグループは、対象となる遺伝子とともに同時移入される、植物の発現可能な遺伝子によりコードされる、一種又は複数種のマーカーの存在に関して選択され、その後、形質転換された材料を植物全体に再構成する。形質転換植物の選択のために、形質転換により得られた植物材料は一般に、形質転換された植物が、非形質転換植物と識別できるような選択条件に供される。例えば、上記の様式において得られた種子を植え付け、初期成長後、スプレーによる適切な選択に供することができる。さらなる可能性は、滅菌後適切な場合、形質転換された種子だけが植物に成長できるように、適切な選択剤を使用して寒天プレート上で種子を成長させることにある。代替的には、形質転換された植物を、上記の一種などの選択可能なマーカーの存在に関してスクリーニングする。DNAの移入及び再生後、推定上形質転換された植物を、例えば、サザン分析を使用して、対象となる遺伝子、コピー数及び又はゲノムの組織化の存在に関してさらに評価することができる。代替的には又は追加的に、新しく導入されたDNAの発現レベルはノーザン分析及びまたウエスタン分析を使用してモニターすることができ、双方とも当業者に周知の技術である。作製された形質転換植物は、クローン増殖又は伝統的な育種技術などのさまざまな手段により繁殖させることができる。例えば、第1世代形質転換植物は自家受粉でき、ホモ接合性の第2世代形質転換体を選択し、T2植物は、その後伝統的な育種技術を介してさらに繁殖させることができる。作製された形質転換生物は、さまざまな形態をとり得る。例えば、それらは、形質転換細胞及び非形質転換細胞のキメラ、クローン性形質転換体、形質転換組織及び非形質転換組織のグラフトであってよい。好ましくは、野生型若しくはmutPPOの核酸は、a配列番号135791113151719212325272931333537394143又は45で示されるポリヌクレオチド又はそれらの変異体若しくは誘導体、b配列番号2468101214161820222426283032343638404244若しくは46で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれらの変異体若しくは誘導体、caまたはbからの任意の少なくとも60個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、並びにdaからcの任意のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。好ましくは、植物における核酸の発現は、野生型変種の植物と比較して、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する植物の抵抗性の増加をもたらす。別の実施形態において、本発明は、本発明による植物細胞を含む植物、好ましくはトランスジェニック植物であって、植物における核酸の発現が、野生型変種の植物と比較して、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する植物の抵抗性の増加をもたらす植物に言及する。本明細書に記載の植物は、トランスジェニック作物又は非トランスジェニック植物のいずれであってもよい。本発明の目的に関して、トランスジェニック、導入遺伝子又は組換え体は、例えば、核酸配列、発現カセット、遺伝子構築体又は核酸配列を含むベクター若しくは本発明に従った核酸配列、発現カセット若しくはベクターを用いて形質転換された生物に関して意味し、それらすべての構築は組換え法により引き起こされ、本発明の方法に有用なタンパク質をコードする核酸配列、又は本発明に従った核酸配列と動作可能に連結された遺伝子調節配列、例えばプロモーター、又はa及びbのいずれかが、それらの天然の遺伝子環境に配置されていない、又は組換え法により修飾されており、例えば、一個又は複数個のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、反転又は挿入の形態をとる修飾が可能である。天然の遺伝子環境は、もともとの植物の天然のゲノム若しくは染色体の遺伝子座又はゲノムライブラリー中の存在の意味と理解される。ゲノムライブラリーの場合、核酸配列の天然の遺伝子環境は、少なくとも一部保有されることが好ましい。核酸配列に隣接する環境は、少なくとも片側であり、少なくとも50bp、好ましくは少なくとも500bp、特に好ましくは少なくとも1000bp、最も好ましくは少なくとも5000bpの配列長を有する。天然の発現カセット、例えば、上記のような、核酸配列の天然プロモーターと、本発明の方法に有用なポリペプチドをコードする、対応する核酸配列との天然の組み合わせは、この発現カセットが、例えば、変異原性処理などの非天然の、合成方法により修飾された場合、トランスジェニック発現カセットとなる。適切な方法は、例えば、米国特許第5565350号又はWO0015815に記載されている。本発明の目的のためのトランスジェニック植物は、したがって上記のように、本発明の方法に使用する核酸が前記植物のゲノム中のそれらの天然の遺伝子座にはないという意味であり、核酸が相同又は非相同に発現される可能性があることが理解されるべきである。しかし、上述のように、トランスジェニックは、本発明に従った核酸又は本発明の方法に使用する核酸は、植物のゲノムのそれらの天然の位置にあるが、この配列が天然配列に関して修飾されている、及び又は天然配列の制御配列が修飾されているということも意味する。トランスジェニックは、好ましくは、ゲノム中の非天然遺伝子座における、本発明に従った核酸の発現、すなわち、核酸の相同又は好ましくは非相同の発現が起こるという意味に理解されるべきである。好ましいトランスジェニック植物を、本明細書において述べる。さらにトランスジェニックという用語は、少なくとも一種の組換えポリヌクレオチドのすべて又は一部を含有する任意の植物、植物細胞、カルス、植物組織又は植物部分を指す。多くの場合、組換えポリヌクレオチドのすべて又は一部は、後続世代に伝わるように染色体又は安定した染色体外の要素に安定に統合される。本発明の目的のために、組換えポリヌクレオチドという用語は、遺伝子操作により改変、再構成又は修飾されたポリヌクレオチドを指す。例は、任意のクローニングされたポリヌクレオチド、又は非相同配列に連結又は結合されたポリヌクレオチドを含む。組換えという用語は、自発的突然変異などの天然事象によりもたらされるポリヌクレオチドの改変又は非自発的突然変異誘発に続く選択的育種によりもたらされるポリヌクレオチドの改変を指すものではない。本明細書において非自発的突然変異誘発及び選択的育種のために起こる突然変異を含有する植物は、本明細書において非トランスジェニック植物と称され、本発明に含まれる。植物がトランスジェニックであり、複数種のmutPPO核酸を含む実施形態において、核酸は異なるゲノムに由来しても、又は同じゲノムに由来してもよい。代替的には、植物が非トランスジェニックであり、複数種のmutPPO核酸を含む実施形態において、核酸は異なるゲノム上に配置されても、又は同じゲノム上に配置されてもよい。特定の実施形態において、本発明は、突然変異育種により作製された除草剤抵抗性植物を含む。このような植物は、mutPPOをコードするポリヌクレオチドを含み、一種又は複数種のベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対して耐性である。このような方法は、例えば、植物又は種子を、突然変異原、特に、例えば、エチルメタンスルホン酸などの化学的突然変異原に曝露するステップ及び少なくとも一種又は複数種のベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する耐性が強化された植物を選択するステップを含む。しかし、本発明は、化学的突然変異原EMSを含む突然変異誘発方法により作製された除草剤耐性植物に限定するものではない。当分野において公知の任意の突然変異誘発方法が、本発明の除草剤抵抗性植物の作製に使用できる。このような突然変異誘発方法は、例えば、任意の一種又は複数種の下記の突然変異原の使用を含み得るX線、ガンマ線、中性子線、ベータ照射及び紫外線照射などの照射並びに塩基類似体、関連化合物、抗生物質、アルキル化剤、アジ化物、ヒドロキシルアミン、亜硝酸又はアクリジンなどの化学的突然変異原。除草剤抵抗性植物は、組織培養法を使用して除草剤抵抗性突然変異を含む植物細胞を選択し、その後、それらから除草剤抵抗性植物を再生することによって作製してもよい。例えば、米国特許第5773702号及び第5859348号を参照されたく、これらは両方とも、その全体を参照により本明細書に組み込む。突然変異育種のさらなる詳細は、PrincipalsofCultivarDevelopmentFehr、1993年MacmillanPublishingCompanyに見出すことができ、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。上の定義に加えて、植物という用語は、文脈において明示されていない限り、成熟又は生育の任意の段階の作物並びにこのような植物からとられた又はこのような植物に由来する任意の組織又は器官を包含することを意図する。植物部分は、限定するものではないが、茎、根、花、胚珠、雄ずい、葉、胚、成長点領域、カルス組織、葯培養、配偶体、胞子体、花粉、小胞子、プロトプラストなどを含む。本発明の植物は、少なくとも一種のmutPPO核酸又は過剰発現された野生型PPO核酸を含み、野生型変種の植物と比較してベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する耐性が増加している。これらの植物は複数のゲノムを含有できるので、本発明の植物は、異なるゲノムに由来する複数の野生型又はmutPPO核酸を有することが可能である。例えば、植物は二種のゲノムを含有し、普通はAゲノム及びBゲノムと称される。PPOは代謝に必要な酵素であるので、各ゲノムはPPO酵素をコードする少なくとも一種の遺伝子を有すると想定される。本明細書において使用する場合、PPO遺伝子の遺伝子座という用語は、ゲノム上のPPO遺伝子の位置を指し、PPO遺伝子及びPPO核酸という用語は、PPO酵素をコードする核酸を指す。各ゲノム上のPPO核酸は、別のゲノム上のPPO核酸とはそのヌクレオチド配列が異なる。当業者は、遺伝子交雑及び又は当業者に公知の配列決定法又はエクソヌクレアーゼ消化法のいずれかを介して各PPO核酸の起源のゲノムを決定できる。本発明は、一、二、三種以上のmutPPO対立遺伝子を含む植物を含み、植物は、野生型変種の植物と比較してベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する耐性が増加している。mutPPOの対立遺伝子は配列番号135791113151719212325272931333537394143若しくは45で定義されるポリヌクレオチド又はそれらの変異体若しくは誘導体、配列番号2468101214161820222426283032343638404244若しくは46で定義されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれらの変異体若しくは誘導体、ホモログ、オルソログ、パラログ、任意の前述のポリヌクレオチドの少なくとも60個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド及び任意の前述のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むことができる。対立遺伝子又は対立遺伝子変異体は、同じ染色体位置に配置された所与の遺伝子の代替の形態である。対立遺伝子変異体は、一塩基多型並びに小規模挿入欠失多型を包含する。INDELのサイズは、普通100bp未満である。SNP及びINDELは、大部分の生物の天然の多型系統中の最も大きなセットの配列変異体を形成する。変種という用語は、一つの栽培品種又は変種と、別の栽培品種又は変種とを識別するために十分な、当業者に認められた特徴又は形質の共通セットの共有により定義される、種内の植物の群を指す。いずれの用語においても、任意の所与の栽培品種又は変種のすべての植物が、全遺伝子若しくは分子レベルのいずれかで遺伝的に同一であると思われる、又は任意の所与の植物が、すべての遺伝子座においてホモ接合性であると思われるという意味ではない。栽培品種又は変種は、特定の形質の純粋育種と考えられ、純粋育種の栽培品種又は変種が自家受粉である場合、すべての子孫がその形質を含有する。育種系統又は系統という用語は、一つの育種系統又は系統と、別の育種系統又は系統とを識別するために十分な、当業者に認められた特徴又は形質の共通セットの共有により定義される栽培品種内の植物の群を指す。いずれの用語においても、任意の所与の育種系統又は系統のすべての植物が、全遺伝子若しくは分子レベルのいずれかで遺伝的に同一であると思われる、又は任意の所与の植物が、すべての遺伝子座においてホモ接合性であると思われるという意味ではない。育種系統又は系統は、特定の形質の純粋育種と考えられ、純粋育種系統又は育種系統が自家受粉である場合、すべての子孫がその形質を含有する。本発明において、形質は植物又は種子のPPO遺伝子における突然変異により起こる。mutPPOポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む本発明の除草剤抵抗性植物は、有性生殖を伴う従来の植物育種を介して植物の除草剤抵抗性を増加する方法における使用もまた見出されている。本方法は、本発明の除草剤抵抗性植物である第一の植物と、同じ除草剤又は除草剤に対して抵抗性であっても抵抗性でなくてもよく、又は第一の植物とは異なる除草剤若しくは除草剤に対して抵抗性であってもよい第二の植物とを交雑するステップを含む。第二の植物は、第一の植物と交雑する場合、生存能力のある子孫植物を産生できる任意の植物であってよい。通常、必ずしも必要ではないが、第一及び第二の植物は同じ種の植物である。本方法は、場合により、第一の植物のmutPPOポリペプチド及び第二の植物の除草剤抵抗性特徴を含む子孫植物を選択するステップを含む。本発明のこの方法により作製された子孫植物は、第一の植物若しくは第二の植物のいずれか又は両方と比較した場合、除草剤に対する抵抗性が増加している。第一の植物及び第二の植物が、異なる除草剤に対して抵抗性である場合、子孫植物は、第一の植物及び第二の植物の組み合わされた除草剤耐性特徴を有すると思われる。本発明の方法は、初回交雑の子孫植物と第一の植物又は第二の植物のいずれかと同じ系統又は遺伝子型の植物との戻し交雑の、一つ又は複数の世代をさらに含むことができる。代替的には、初回交雑又は任意のその後の交雑の子孫を、第一の植物又は第二の植物のいずれかと異なる系統又は遺伝子型の第三の植物と交雑できる。本発明は、本発明の少なくとも一種のポリヌクレオチド分子、発現カセット又は形質転換ベクターを用いて形質転換された植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子及び非ヒト宿主細胞をさらに提供する。このような形質転換された植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子及び非ヒト宿主細胞は、それぞれ、非形質転換の植物、植物組織、植物細胞又は非ヒト宿主細胞の成長を死滅させる、又は阻害する除草剤レベルにおいて、少なくとも一種の除草剤に対する耐性又は抵抗性が強化している。好ましくは、本発明の形質転換された植物、植物組織、植物細胞、種子はシロイヌナズナ及び作物である。本発明の植物が、mutPPO核酸に加えて野生型PPO核酸を含み得ることは理解されるであろう。ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤耐性系統は、複数のPPOアイソザイムの一種のみに突然変異を含有できることが企図される。したがって、本発明は、一種又は複数種の野生型PPO核酸に加えて一種又は複数種のmutPPO核酸を含む植物を含む。別の実施形態において、本発明は、本発明の植物細胞を含むトランスジェニック植物により産生された種子に言及し、この種子は、野生型変種の種子と比較してベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する抵抗性の増加に関して純粋育種である。別の実施形態において、本発明は、野生型変種の植物細胞と比較して、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する抵抗性が増加したトランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、mutPPO核酸を含む発現カセットにより植物細胞を形質転換するステップを含む方法に言及する。別の実施形態において、本発明は、mutPPO核酸を含む発現カセットにより植物細胞を形質転換するステップ、及び植物細胞からベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する抵抗性が増加した植物を作製するステップを含む、トランスジェニック植物を作製する方法に言及する。結果として、本発明のmutPPO核酸は、対象となる植物における発現のための発現カセット中に提供される。このカセットは、本発明のmutPPO核酸配列に動作可能に連結された制御配列を含むものとする。制御要素という用語は、本明細書において使用する場合、動作可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を制御できるポリヌクレオチドを指す。制御要素は、限定するものではないが、プロモーター、エンハンサー、イントロン、5UTR及び3UTRを含む。動作可能に連結されたは、プロモーターと第二の配列の間の機能的連結を意図し、プロモーター配列は第二の配列に対応するDNA配列の転写を開始し、媒介する。概して、動作可能に連結するは、連結されている核酸配列が隣接しており、二つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合、同じリーディングフレームにおいて隣接していることを意味する。カセットは、さらに、生物に同時形質転換するための、少なくとも一種の追加の遺伝子を含有することができる。代替的には、追加の遺伝子は、複数の発現カセットに提供することができる。このような発現カセットは、制御領域の転写制御下にある、mutPPO核酸配列の挿入のための複数の制限部位を備えている。この発現カセットは、選択可能なマーカー遺伝子をさらに、含有することができる。発現カセットは、転写の53方向に、転写開始領域及び翻訳開始領域、本発明のmutPPO核酸配列及び植物において機能的な転写終止領域及び翻訳終止領域を含むものとする。プロモーターは、植物宿主に対して、及び又は本発明のmutPPO核酸配列に対して、天然若しくはアナログ又は外来性若しくは異種であってもよい。さらに、プロモーターは、天然配列又は代替的には合成配列であってよい。プロモーターが、植物宿主に対して外来性又は異種である場合、プロモーターは、プロモーターが導入される天然植物において見出されないことが意図される。プロモーターが、本発明のmutPPO核酸配列に対して外来性又は異種である場合、動作可能に連結された本発明のmutPPO核酸配列に対して天然又は天然に発生したプロモーターではないことが意図される。本明細書において使用する場合、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域に動作可能に連結されたコード配列を含む。異種プロモーターを使用して本発明のmutPPO核酸を発現させることが好ましいと思われるが、天然プロモーター配列も使用できる。このような構築体は、植物又は植物細胞においてmutPPOタンパク質の発現レベルを変化させる。したがって、植物又は植物細胞の表現型は改変される。終止領域は、転写開始領域に天然であってもよく、動作可能に連結された対象となるmutPPO配列に天然であってもよく、植物宿主に天然であってもよく、又は別の供給源に由来してもよい。都合の良い終止領域は、オクトピン合成酵素及びナポリン合成酵素の終止領域などの、AツメファシエンスのTiプラスミドから利用可能である。GuerineauらMoIGenGenet262141144ProudfootCell64671674SanfaconらGenesDev5141149MogenPlantCell212611272MunroeらGene91151158BallasらNucleicAcidsRes1778917903及びJoshialphaNucleicAcidRes1596279639もまた参照されたい。必要に応じて、遺伝子は、形質転換された植物における発現の増加のために最適化され得る。すなわち、遺伝子は、発現の改良のための植物優先型コドンを使用して合成できる。例えば、宿主優先型コドンの使用の考察に関してはCampbell及びGowriPlantPhysiol92111を参照されたい。植物優先型遺伝子を合成するための方法が、当分野において利用可能である。例えば、米国特許第5380831号及び第5436391号並びにMurrayらNucleicAcidsRes17477498を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる。追加の配列修飾は、細胞宿主における遺伝子発現を強化することが公知である。これらは、疑似ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エクソンイントロンスプライシング部位のシグナル、トランスポゾン様反復及び遺伝子発現に有害であり得る、十分特徴付けられた他の配列の除去を含む。配列のGC含有量は、宿主細胞において発現された公知の遺伝子に対する参照により計算された、所与の細胞宿主にとって平均的なレベルに調整できる。可能であれば、配列を、予測されるヘアピン二次mRNA構造を避けるように修正する。遺伝子発現を強化するためのヌクレオチド配列は、植物の発現ベクターにおいても使用することができる。これらは、トウモロコシのAdhlのイントロン、intronl遺伝子及びタバコモザイクウイルス、トウロコシ緑斑病ウイルス及びアルファルファモザイクウイルス由来のリーダー配列、を含む。トウモロコシのshrunken1遺伝子座から最初のイントロンは、キメラ遺伝子構築体中の遺伝子の発現を増加させることが示されている。米国特許第5424412号及び第5593874号は、遺伝子発現構築体における特定のイントロンの使用を開示しており、Gallieらもまた、イントロンが、組織特異的基準において遺伝子発現を制御するために有用であることを示している。mutPPO遺伝子の発現をさらに強化するため、又は最適化するために、本発明の植物発現ベクターは、マトリックス結合領域を含有するDNA配列をさらに含有することができる。このような修飾された発現系を用いて形質転換された植物細胞は、その後、本発明のヌクレオチド配列の過剰発現又は構成的発現を示し得る。発現カセットは、発現カセット構築体中に5リーダー配列をさらに含有することができる。このようなリーダー配列は、翻訳を強化するために作用できる。翻訳リーダーは当分野において公知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、EMCVリーダーProcNatlAcadScLUSA8661266130ポチウイルスリーダー、例えば、TEVリーダーGene165233238、MDMVリーダー及びヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Nature3539094アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質mRNA由来の非翻訳リーダーNature325622625タバコモザイクウイルスリーダーMolecularBiologyofRNA、Cech編、237256頁並びにトウモロコシ緑斑病ウイルスリーダーVirology81382385を含む。DellaCioppaら、PlantPhysiol84965968もまた参照されたい。翻訳を強化することが公知の他の方法、例えば、イントロンなどもまた利用できる。発現カセットの調製において、さまざまなDNA断片を、適切な配向で、必要に応じて、適切なリーディングフレーム中にDNA配列を提供するように操作することができる。このような目的で、アダプター又はリンカーを用いてDNA断片をつなぐことができ、又は他の操作により、都合の良い制限部位の提供、無関係なDNAの除去、制限部位の除去などを伴うことができる。この目的のために、invitroの突然変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、転位及び転換を伴うことができる。多数のプロモーターを本発明の実践に使用することができる。プロモーターは、所望の成果に基づいて選択できる。核酸は、構成的プロモーター、組織優先型プロモーター又は植物における発現のための他のプロモーターと組み合わせることができる。このような構成的プロモーターは、例えば、Rsyn7プロモーターのコアプロモーター及びWO9943838及び米国特許第6072050号に隠された他の構成的プロモーターコアCaMV35SプロモーターNature313810812コメアクチンPlantCell2163171ユビキチンPlantMoIBiol12619632及びChristensenら、PlantMoIBiol18675689pEMUTheorApplGenet81581588MASEMBOJ327232730ALSプロモーターなどを含む。他の構成的プロモーターは、例えば、米国特許第5608149号、第5608144号、第5604121号、第5569597号、第5466785号、第5399680号、第5268463号、第5608142号及び第6177611号を含む。組織優先型プロモーターは、特定の植物組織内でmutPPO発現の強化を標的とするために利用できる。このような組織優先型プロモーターは、限定するものではないが、葉優先型プロモーター、根優先型プロモーター、種子優先型プロモーター及び茎優先型プロモーターを含む。組織優先型プロモーターは、Yamamotoら、PlantJ12255265Kawamataら、PlantCellPhysiol38792803Hansenら、MoIGenGenet254337343Russellら、TransgenicRes6157168Rinehartら、PlantPhysiol11213311341VanCampら、PlantPhysiol112525535Canevasciniら、PlantPhysiol112513524Yamamotoら、PlantCellPhysiol35773778LamResultsProblCellDiffer20181196Orozcoら、PlantMoIBiol2311291138MatsuokaealphaProcNatlAcadSciUSA9095869590及びGuevaraGarciaら、PlantJ4495505を含む。このようなプロモーターは、必要であれば、弱い発現のために修飾できる。一実施形態において、対象となる核酸は、発現に関して葉緑体を標的化する。この様式において、対象となる核酸が、葉緑体に直接挿入されない場合、発現カセットは、対象となる遺伝子産物を葉緑体に向ける葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、葉緑体標的化配列をさらに含有する。このような輸送ペプチドは当分野において公知である。葉緑体標的化配列に関しては、動作可能に連結されたは、輸送ペプチドをコードする核酸配列が、本発明のmutPPO核酸と、二つの配列が隣接し、同じリーディングフレーム内にあるように連結されることを意味する。例えば、VonHeijneら、PlantMoIBiolRep9104126Clarkら、JBiolChem2641754417550DellaCioppaら、PlantPhysiol84965968Romerら、BiochemBiophysResCommun19614141421及びShahら、Science233478481を参照されたい。本発明のmutPPOタンパク質にはネイティブの葉緑体輸送ペプチドが含まれる一方で、当分野において公知の任意の葉緑体輸送ペプチドは、葉緑体標的化配列を、本発明の成熟mutPPOタンパク質をコードするヌクレオチド配列の5末端に、動作可能に連結することによって、本発明の成熟mutPPOタンパク質のアミノ酸配列と融合できる。葉緑体標的化配列は当分野において公知であり、リブロースl5二リン酸カルボキシラーゼの葉緑体小サブユニットPlantMoIBiol30769780Schnellら、JBiolChem266333533425シキミ酸3リン酸合成酵素JBioenergBiomemb22789810トリプトファン合成酵素JBiolChem27060816087プラストシアニンJBiolChem2722035720363コリスミ酸合成酵素JBiolChem2682744727457及び集光性葉緑素ab結合タンパク質JBiolChem2631499614999を含む。VonHeijneら、PlantMoIBiolRep9104126Clarkら、JBiolChem2641754417550DellaCioppaら、PlantPhysiol84965968Romerら、BiochemBiophysResCommun19614141421及びShahら、Science233478481もまた参照されたい。葉緑体の形質転換の方法は、当分野において公知である。例えば、SvabらProcNatlAcadScLUSA8785268530Svab及びMaligaProcNatlAcadSciUSA90913917Svab及びMaligaEMBOJ12601606を参照されたい。この方法は、選択可能なマーカーを含有するDNAの粒子銃送達及び相同組換えを介した色素体ゲノムへのDNAの標的化に頼っている。さらに、色素体の形質転換は、核によりコードされた、色素体指向性RNAポリメラーゼの組織優先型発現によるサイレントな色素体担持導入遺伝子のトランス活性化により達成できる。このような系は、McBrideらProcNatlAcadSciUSA9173017305に報告されている。葉緑体を標的とする対象となる核酸は、葉緑体において発現が最適化され、植物の核とこの細胞小器官との間のコドン使用頻度の差を説明できる。この様式において、対象となる核酸は葉緑体優先型コドンを使用して、合成され得る。例えば、米国特許第5380831号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態において、mutPPO核酸は、a配列番号135791113151719212325272931333537394143若しくは45で示されるポリヌクレオチド又はそれらの変異体若しくは誘導体b配列番号2468101214161820222426283032343638404244若しくは46で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれらの変異体若しくは誘導体caまたはbからの任意の少なくとも60の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド並びにdaからcの任意のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。好ましくは、発現カセットは、植物において機能性である転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域をさらに含む。本発明のポリヌクレオチドは、植物形質転換のための選択可能なマーカー遺伝子としての使用を見出したが、本発明の発現カセットは、形質転換された細胞の選択のための別の選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。本発明のものを含む選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換された細胞又は組織の選択に利用される。マーカー遺伝子は、限定するものではないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子などの抗生物質抵抗性をコードする遺伝子並びにグルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン及び24ジクロロフェノキシ酢酸などの除草剤化合物に対する抵抗性をもたらす遺伝を子含む。一般には、YarrantonCurrOpinBiotech3506511ChristophersonらProcNatlAcadScLUSA8963146318YaoらCell716372ReznikoffMoIMicrobiol624192422BarkleyらTheOperon、177220頁HuらCell48555566BrownらCell49603612FiggeらCell52713722DeuschleらProcNatlAcadAcLUSA8654005404FuerstetalProcNatlAcadScLUSA8625492553DeuschleetalScience248480483GossenPhDThesis、UniversityofHeidelbergReinesらProcNatlAcadScLUSA9019171921LabowらMoICellBiol1033433356ZambrettiらProcNatlAcadScLUSA8939523956BairnらProcNatlAcadScLUSA8850725076WyborskiらNucleicAcidsRes1946474653HillenandWissmanTopicsMoIStrucBiol10143162DegenkolbらAntimicrobAgentsChemother3515911595KleinschnidtらBiochemistry2710941104BoninPhDThesis、UniversityofHeidelbergGossenらProcNatlAcadScLUSA8955475551OlivaらAntimicrobAgentsChemother36913919HlavkaらHandbookofExperimentalPharmacology、78巻GillらNature334721724を参照されたい。このような開示は、参照により本明細書に組み込む。選択可能なマーカー遺伝子の上記の一覧表は、限定する意味ではない。任意の選択可能なマーカー遺伝子が、本発明において使用できる。本発明は、上記のmutPPO核酸を含有する発現カセットを含む単離された組換え発現ベクターをさらに提供し、宿主細胞においてベクターの発現は、野生型変種の宿主細胞と比較してベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する耐性の増加をもたらす。本明細書において使用する場合、ベクターという用語は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ベクターの一種はプラスミドであり、追加のDNAセグメントをライゲーションできる環状二本鎖DNAループを指す。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、追加のDNAセグメントをウイルスゲノム内にライゲーションできる。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律的複製できる。他のベクターは、宿主細胞内への導入において、宿主細胞のゲノムに統合され、それによって、宿主ゲノムにとともに複製される。さらに、あるベクターは、動作可能に連結された遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは発現ベクターと称される。概して、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態である。プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態なので、本明細書において、プラスミド及びベクターは交換可能に使用できる。しかし、本発明は、他の形態の発現ベクター、例えば、同等の機能を果たすウイルスベクターを含むことを意図する。本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で本発明の核酸を含み、これは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に動作可能に連結される一種又は複数種の制御配列を含むことを意味する。制御配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列及び特定の宿主細胞において、又は特定の条件下でだけヌクレオチド配列の発現を指示する配列を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベルなどの因子に依存し得ることは当業者により理解されるものと思われる。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それによって、本明細書に記載の核酸によりコードされる、融合ポリペプチド又は融合ペプチドを含むポリペプチド又はペプチドを産生できる。本発明の好ましい実施形態において、mutPPOポリペプチドは、単細胞植物細胞239251及びその中の参考文献を参照されたい及び高等植物由来の植物細胞などの植物及び植物細胞において発現される。mutPPOポリヌクレオチドはトランスフェクトション、形質転換又はトランスダクション、エレクトロポレーション、粒子衝撃、アグロインフェクション、微粒子銃などを含む任意の手段により植物細胞に導入され得る。植物細胞を含む宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする適切な方法は、Sambrookら及びMethodsinMolecularBiology、1995年、44巻、Agrobacteriumprotocols、Gartland及びDavey編、HumanaPress、Totowa、NewJerseyなどの他の実験マニュアルにおいて見出すことができる。ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する耐性の増加は、トウモロコシ、小麦、ライ麦、オート麦、ライコムギ、コメ、大麦、大豆、落花生、ワタ、ナタネ及びキャノーラ、キャッサバ、コショウ、ヒマワリ及びマンジュギクのような広範囲の植物、ジャガイモ、タバコ、ナス及びトマトのようなナス科植物、ソラマメ属の種、エンドウ、アルファルファ、灌木植物、シダレヤナギ属の種、樹木、多年生牧草並びに飼料作物に遺伝されることが望まれる一般的形質であるので、これらの作物また、本発明の一つのさらなる実施形態として、遺伝子操作のための好ましい標的植物である。好ましい実施形態において、この植物は作物である。飼料作物は、限定するものではないが、小麦の草、カナリアクサヨシ、ブロムグラス、ワイルドライグラス、イナゴツナギ、カモガヤ、アルファルファ、サルホイン、ミヤコグサ、タチクローバー、アカツメクサ及びスイートクローバーを含む。本発明の一実施形態において、mutPPOポリヌクレオチドの植物へのトランスフェクトションは、アグロバクテリウム属媒介の遺伝子移入により達成される。当業者に公知の一形質転換方法は、開花植物のアグロバクテリア溶液への浸漬であり、アグロバクテリアは、mutPPO核酸を含有し、次いで形質転換された配偶子の育種である。アグロバクテリウム属媒介の植物形質転換は、例えば、GV3101又はLBA4404アグロバクテリウムツメファシエンス株を使用して実施できる。形質転換は、標準的な形質転換及び再生の技術により実施できる。例えば、ナタネは、子葉又は胚軸の形質転換を介して形質転換され得る。アグロバクテリウム属に対する抗生物質の使用及び植物の選択は、形質転換のために使用するバイナリーベクター及びアグロバクテリウム属株に依存する。ナタネの選択は、選択可能な植物マーカーとしてカナマイシンを使用して正常に実施される。亜麻へのアグロバクテリウム属媒介性遺伝子移入は、例えば、Mlynarovaら、1994年、PlantCellReport13282285に記載の技術を使用して実施できる。さらに、大豆の形質転換は、例えば、欧州特許第0424047号、米国特許第5322783号、欧州特許第0397687号、米国特許第5376543号又は米国特許第5169770号に記載の技術を使用して実施できる。トウモロコシの形質転換は、粒子衝撃、ポリエチレングリコール媒介のDNAの取り込みにより、又は炭化ケイ素線維技術を介して達成できる。ISBN3540978267を参照されたい。トウモロコシの形質転換の具体的な例は、米国特許第5990387号に見出され、小麦の形質転換の具体例は、PCT出願WO9307256に見出される。本発明に従って、導入されたmutPPOポリヌクレオチドは、それが非染色体の自律的レプリコンに組み込まれた場合、又は植物染色体に統合された場合、植物細胞において安定に維持され得る。代替的には、導入されたmutPPOポリヌクレオチドは、染色体外の非複製ベクターに存在でき、一時的に発現され得る、又は一時的に活性であり得る。一実施形態において、相同組換え微生物を作り出すことができ、その際に、mutPPOポリヌクレオチドが染色体に統合され、その結果として内因性PPO遺伝子が改変、例えば機能的に破壊され、mutPPO遺伝子が作り出されるように、欠失、付加又は置換が導入されているPPO遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターが調製される。相同組換えを介して点突然変異を作り出すために、DNARNAハイブリッドを、キメラ形成法として公知の技術に使用することができる13231330及びKmiec、1999年、GenetherapyAmericanScientist87240247。コムギ属の種における他の相同組換え手順もまた、当分野において周知であり、本発明における使用が企図される。相同組換えベクターにおいてmutPPO遺伝子は、その5末端及び3末端において追加のPPO遺伝子の核酸分子に隣接され、微生物又は植物において、ベクターにより運ばれる外因性mutPPO遺伝子及び内因性PPO遺伝子の間に起こる相同組換えを可能にさせる。追加の隣接PPO核酸分子は、内因性遺伝子との相同組換えが成功するために十分な長さである。通常、隣接DNAの、最大キロベースの数百塩基対がベクターに含まれる43684373を参照されたい。しかし、普通はmutPPO遺伝子はPPO遺伝子と異なるアミノ酸がほとんどないので、隣接配列は必ずしも必要ではない。相同組換えベクターは、微生物又は植物細胞に導入され、mutPPO遺伝子が導入された細胞は、当分野において公知の技術を使用して選択された内因性PPO遺伝子を用いて相同的に組換えられている。別の実施形態において、導入された遺伝子の発現の制御が可能な、選択された系を含有する組換え微生物が作製できる。例えば、mutPPO遺伝子をlacオペロンの調節下に配置してベクターに組み入れることで、IPTGの存在下でmutPPO遺伝子のみの発現が可能である。このような制御系は当分野において周知である。本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。宿主細胞及び組換え宿主細胞という用語は、本明細書において交換可能に使用される。このような用語が、特定の対象細胞だけを指すものではなく、このような細胞の子孫又は潜在的子孫にも適用されることは理解されるであろう。特定の修飾が、突然変異又は環境的影響のいずれかのためにその後の世代に起こり得るので、このような子孫は、実際、親細胞とは同一ではないと思われるが、本明細書において使用する場合、それでもやはりこの用語の範囲内に含まれる。宿主細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞であってよい。例えば、mutPPOポリヌクレオチドは、コリネバクテリウムグルタミクムなどの細菌細胞、昆虫細胞、菌類細胞又は哺乳動物細胞又はCOS細胞など、藻類、絨毛虫、植物細胞、菌類又はコリネバクテリウムグルタミクムのような他の微生物において発現可能である。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。培養液中の原核宿主細胞又は真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞は、mutPPOポリヌクレオチドの作製のために使用できる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を使用してmutPPOポリペプチドを作製する方法を、さらに提供する。一実施形態において、本方法は、発明の宿主細胞を、適切な培地においてmutPPOポリペプチドが産生されるまで培養するステップを含む。別の実施形態において、本方法は、培地又は宿主細胞からmutPPOポリペプチドを単離するステップをさらに含む。本発明の別の態様は、単離されたmutPPOポリペプチド及びそれらの生物学的に活性な部分に関する。単離された又は精製されたポリペプチド又はそれらの生物学的に活性な部分は、組換えDNA技術より作製された場合、細胞材料の一部を含まず、又は化学的に合成された場合、化学的前駆物質若しくは他の化学物質を含まない。細胞材料を実質的に含まないという専門用語は、ポリペプチドが、天然に又は組換え的に作製された細胞の細胞成分の一部から分離された、mutPPOポリペプチドの調製を含む。一実施形態において、細胞材料を実質的に含まないという専門用語は、約30未満の非mutPPO材料、より好ましくは約20未満の非mutPPO材料、さらにより好ましくは約10未満の非mutPPO材料及び最も好ましくは約5未満の非mutPPO材料を有するmutPPOポリペプチドの調製を含む。mutPPOポリペプチド又はそれらの生物学的に活性な部分が組換え的に作製された場合、mutPPOポリペプチド又はそれらの生物学的に活性な部分はまた、好ましくは、培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地が、約20未満、より好ましくは約10未満及び最も好ましくは約5未満の体積のポリペプチドの調製を表す。化学的前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まないという専門用語は、ポリペプチドが、ポリペプチドの合成に伴われる化学的前駆物質又は他の化学物質から分離されたmutPPOポリペプチドの調製を含む。一実施形態において、化学的前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まないという専門用語は、約30未満の化学的前駆物質又は非mutPPO化学物質、より好ましくは約20未満の化学的前駆物質又は非mutPPO化学物質、さらにより好ましくは約10未満の化学的前駆物質又は非mutPPO化学物質、及び最も好ましくは約5未満の化学的前駆物質又は非mutPPO化学物質を有するmutPPOポリペプチドの調製を含む。好ましい実施形態において、単離されたポリペプチド又はそれらの生物学的に活性な部分は、mutPPOポリペプチドが由来する同じ生物からの混入ポリペプチドを欠いている。通常、このようなポリペプチドは、植物において、又はそれ以外にはコリネバクテリウムグルタミクムなどの微生物、絨毛虫、藻類又は菌類において、例えば、mutPPOポリペプチドの組換え発現により作製される。上記のように、本発明は、野生型変種の植物又は種子と比較して、作物又は種子のベンゾオキサジノン誘導体耐性を増加させるための組成物及び方法を教示する。好ましい実施形態において、作物又は種子のベンゾオキサジノン誘導体耐性は、植物又は種子が、好ましくはおよそ11000gaiha1、より好ましくは20160gaiha1、及び最も好ましくは、4080gaiha1のベンゾオキサジノン誘導体系除草剤の適用に耐え得るように増加される。本明細書において使用する場合、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤の適用に耐えることは、植物が、このような適用により死滅、又は損傷のいずれもされないことを意味する。さらに、本発明は、上記に記載した少なくとも一種のベンゾオキサジノン誘導体系除草剤の使用を伴う方法を提供する。これらの方法において、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤は、限定するものではないが、種子処理、土壌処理及び茎葉処理を含む、当分野において公知の任意の方法により適用され得る。適用前に、ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤は、慣例の製剤、例えば、溶液、エマルジョン、懸濁液、細粉、散剤、ペースト及び顆粒に変換できる。使用形態は、特定の意図される目的に依存し、各々の事例において、本発明に従った化合物の細かく均等な分配を確実にするべきである。ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤に対する耐性が増加した植物を提供することで、広範囲の製剤を、植物の成長を強化し、栄養に対する競合を減少させるように、雑草から植物を保護するために用いることができる。ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤は、本明細書に記載の作物の周囲の地域において、出芽前、出芽後、植え付け前及び植え付け時の雑草の防除に、単独で使用でき、又は他の添加剤を含有するベンゾオキサジノン誘導体系除草剤製剤も使用できる。ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤は、種子処理としても使用できる。ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤製剤中に見出される添加剤は、他の除草剤、界面活性剤、アジュバント、展着剤、固着剤、分解防止剤などを含む。ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤製剤は、湿潤調製品であっても、又は乾燥調製品であってもよく、限定するものではないが、流動性散剤、乳化可能濃縮物及び液体濃縮物を含み得る。ベンゾオキサジノン誘導体系除草剤及び除草剤製剤は、従来の方法に従って、例えば、スプレー噴霧、灌水、散粉などにより適用できる。適切な製剤は、PCTEP2009063387及びPCTEP2009063386に詳細に記載され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。前述は、本発明の好ましい実施形態に関し、多数の変形が本発明の範囲を逸脱することなくその中で作ることができることもまた、理解すべきである。本発明を、下記の実施例によりさらに例示するが、これらは、本発明の範囲に限定を課すものとは、決して解釈すべきではない。対照的に、本明細書の記載の読後、本発明の精神及び又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、それら自体を当業者に示唆することができる、さまざまな他の実施形態、それらの変形及び等価物に対する報告ができることは明らかに理解されるべきである。実施例ヒユ属AmaranthusPPOの部位特異的変異誘発ヒユ属PPOのクローニングヒユモドキAmaranthustuberculatusのPPO感受性、および耐性アイソフォームのコード配列配列番号1、3、5、7を合成し、Geneartによりクローニングした。プラスミドミニプレップを行って、プラスミドを大腸菌TOP10から分離し、DNA配列決定により確認した。野生型および変異型PPO組換え体の発現および精製FranckEDayanPankajRDagaStephenODukeRyanMLeePatrickJTranelRobertJDoerksenBiochemicalandstructuralconsequencesofaglycinedeletionintheα8helixofprotoporphyrinogenoxidaseBiochimicaetBiophysicaActa1804154856より引用pRSETベクター中のクローンを大腸菌EcoliBL21pLysS株に形質転換した。細胞は、100μgmLカルベニシリンを含有する250mLLB中で、37°Cにて一晩振盪しながら増殖させた。培養物を、抗生物質含有LB1L中に希釈し、37°Cにて2時間振盪しながら培養し、1mMIPTGで誘導して、25°Cにてさらに5時間振盪培養した。細胞を1600×gの遠心により収集し、009NaClで洗浄し、80°Cで保存した。細胞は50mMリン酸ナトリウムpH75、1MNaCl、5mMイミダゾール、5グリセロール、および1μgmLロイペプチン中で140MPaにてフレンチプレスを用いて溶解した。溶解後、05UのベンゾナーゼNovagenEMDChemicalsIncGibbstownNJおよびPMSF最終濃度1mMを添加した。細胞片を3000×gの遠心により除去した。20mMリン酸ナトリウムpH80、50mMNaCl、5mMイミダゾール、5mMMgCl2、01mMEDTA、および17グリセロールで平衡化した、ニッケル活性化HitrapChelatingHPカラムGEHealthcareBioSciencesCorpPiscatawayNJで、HISタグ付きPPOタンパク質を精製した。PPOは250mMイミダゾールで溶出した。20mMリン酸ナトリウムバッファー、pH75、5mMMgCl2、1mMEDTA、および17グリセロールで平衡化したPD10カラムGEHealthcareBioSciencesCorpPiscatawayNJで、活性タンパク質を脱塩した。培養物1リットルあたり約10mgの高純度PPOが与えられ、これをアッセイに使用するまで20°Cで保存した。PPO活性アッセイPPO酵素アッセイ非組換え型。PPOタンパク質EC1334は、暗所生育トウモロコシ、イヌホオズキ、アサガオ、およびベルベットリーフ苗の子葉鞘もしくは芽生重量150gから、既述Grossmannetal2010のように抽出した。苗は、低クロロフィル濃度のチラコイド画分で最高の酵素比活性を達成するために、収穫前に2時間、明所において緑化した。高クロロフィル濃度では、蛍光の有意なクエンチングが生じるので、テストに使用することができる緑色のチラコイドの量が制限される。植物材料を、寒冷下でブラウンBraunブレンダーを用いて生重量対体積比、14でホモジナイズした。ホモジナイズバッファーは、トリスアミノメタンHCl、スクロース、塩化マグネシウム、エチレンジアミンテトラ酢酸、およびウシ血清アルブミンで構成されるものとした。4枚重ねたミラクロスMiraclothを通して濾過した後、10000xgで5分間遠心し、ホモジナイズバッファー中に再懸濁してから、150xgで2分間遠心して粗細胞残渣を除去した後、プラスミドの粗標品が得られた。上清を4000xgで15分間遠心し、ペレット部分を、TrisHCl、EDTA、ロイペプチン、ペプスタチンおよびグリセロールを含有するバッファー1mL中に再懸濁して、使用するまで80°Cで保存した。ウシ血清アルブミンを標準として、酵素抽出物中のタンパク質を測定した。PPO活性は、蛍光分析により、初速条件下で、化学的に還元されたプロトポルフィリノーゲンIXからのProto生成速度をモニターすることによって、アッセイした。アッセイ混合物は、総容量200μL中、TrisHCl、EDTA、ジチオスレイトール、Tween80、プロトポルフィリノーゲンIX、および40μg抽出タンパク質からなるものとした。反応は、22°Cにて基質プロトポルフィリノーゲンIXの添加により開始した。ジメチルスルホキシドDMSO溶液中でサフルフェナシル、フルミオキサジン、およびブタフェナシルを調製しアッセイでDMSOについて01mMの濃度、インキュベート前に、アッセイ混合物に、0005pMから5μMの濃度で添加した。POLARstarOptimaGalaxyを用いて、アッセイ混合物から蛍光を直接モニターしたが、405nmで励起し、630nmで発光をモニターした。熱失活抽出物の存在下での非酵素的活性は、無視することが可能であった。除草剤によって引き起こされる酵素活性の阻害は、未処理対照に対する阻害パーセントとして表された。50酵素阻害のために必要な化合物のモル濃度IC50値は、非線形回帰分析で、用量反応式に対して値をフィッティングすることによって算出した。PPO酵素アッセイ組換え型。ProtoはSigmaAldrichから購入した。Protogenは、JacobsandJacobs206219にしたがって調製した。アッセイは、01mMEDTA、01Tween20、5μMFAD、および500mMイミダゾールを含有する100mMリン酸ナトリウム、pH74中で実施した。PPO阻害剤、アシフルオルフェン、ラクトフェン、ベンゾオキサジノンIa35、または好ましいベンゾオキサジノン誘導体このXはOもしくはSであり、R4は水素、C1C6アルキル、C1C6ハロアルキル、C3C6シクロアルキル、C3C6アルケニル、C3C6ハロアルケニル、C3C6アルキニル、C3C6ハロアルキニル、C1C6アルコキシ、もしくはC3C6シクロアルキルC1C6アルキルであり、R5は水素、NH2、C1C6アルキル、もしくはC3C6アルキニルであり、R6は水素、もしくはC1C6アルキルであり、またはそれらの組み合わせであるを用いた用量反応曲線を、150μMProtogenの存在下で測定した。励起および発光の帯域幅はそれぞれ15および30nmに設定した。アッセイはすべて、二連または三連で行い、POLARstarOptimaGalaxyを用いて、405nmで励起し、630nmで発光をモニターして測定した。置換PPO酵素の用量反応IC50値は、野生型未置換PPO酵素のIC50値より大きい表4aおよび4b。これは、これらの置換PPO酵素がベンゾオキサジノン、およびテストしたベンゾオキサジノン誘導体の一部に対して、自然耐性を有することを示す。置換PPO酵素dG210およびR128Lは、ヒユモドキAmaranthustuberculatus中に存在する既知の置換PPO酵素であって、さまざまなPPO除草剤に対するinplantaPPO耐性の原因となることが判明しているDayanetal2010BiochimicaetBiophysicaActa18041548。このことは、dG210またはR128Lより高いIC50値を有する、記載された他の置換PPO酵素も、ベンゾオキサジノン1a35表4aおよび記載のベンゾオキサジノン誘導体表4bを含めて、さまざまなPPO除草剤に対するinplanta耐性の原因となる置換PPO酵素であることを示す。置換PPO酵素はすべて、野生型PPO酵素と同等の酵素活性、蛍光ユニット変化分FUminを示す表4a。さらに、置換PPO酵素の活性の値はすべて、置換PPO酵素dG210より大きい。置換PPO酵素dG210は、inplanta機能に十分な活性がある。このことは、記載の他の置換PPO酵素もすべて、inplanta機能に十分な活性があることを示す。表4a:野生型およびアミノ酸置換PPO酵素の、阻害剤ベンゾオキサジノン1a35に関するIC50値M表4b:野生型およびアミノ酸置換PPO酵素の、記載されたベンゾオキサジノン誘導体に関するIC50値M除草剤耐性クローンを同定しPPO遺伝子中の原因変異を特定するための、変異誘発藻類細胞のスクリーニングPPO遺伝子中で、ベンゾオキサジノン誘導体除草剤耐性を与える変異を生じさせるために、化学的もしくはUV突然変異誘発を用いることができる。特にコナミドリムシChlamydomonasreinhardtiiまたはScenedesmusobliquusのような単細胞生物は、除草剤耐性の主要な突然変異を同定するために有用である。コナミドリムシChlamydomonasreinhardtii株CC503およびCC1691の藻類細胞は、TAP培地GormanandLevinePNAS5416651669中で、22°Cにて100rpmで、30μmolPhotm2s2で光照射して、定常的に振盪することにより増殖させる。Scenedesmusobliquusは、下記BogerandSandmannInTargetassaysformodernherbicidesand15relatedphytotoxiccompoundsLewisPublishersのような藻類培地中で、クラミドモナスChlamydomonasに関する記載と同じ培養条件で増殖させた。化合物スクリーニングは450μmolPhotm2s2照射で行った。コナミドリムシChlamydomonasreinhardtiiまたはScenedesmusobliquusの感受性株を、Loppesに記載のように14Mメタンスルホン酸エチルで1時間、変異させる。個別の藻類細胞株における化合物活性に応じて、低濃度から致死濃度までの濃度の当該ベンゾオキサジノン誘導体除草剤を含有する固体栄養溶液プレート上で、変異誘発した細胞をスクリーニングすることによって、耐性株を同定する。野生型および耐性コナミドリムシChlamydomonasreinhardtii由来のPPO遺伝子の、鋳型としてゲノムDNAもしくはコピーDNAからの増幅は、標準的なPCR技術により、DNAオリゴヌクレオチドを用いて実施される。変異は、配列アラインメントツールAlignXを用いて、野生型と変異型のPPO配列を比較することによって特定される。図2は、ベンゾオキサジノン誘導体1a35除草剤に耐性を持つコナミドリムシChlamydomonasreinhardtii株の選択を示す。選択薬剤を含有しない固体培地上にプレーティングした変異誘発細胞。1x107Mベンゾオキサジノン誘導体Ia35含有固体培地上にプレーティングした変異誘発細胞。ベンゾオキサジノン誘導体除草剤に耐性を持つ細胞はコロニーを形成する丸で囲んで番号33、34、35、および36を付したが、感受性細胞は生育しない。プレートBよりA上でコロニー数が多いことは、プレートB上のコロニーがベンゾオキサジノン誘導体Ia35に耐性であることを示す。図3は、ベンゾオキサジノン誘導体Ia35除草剤に耐性を持つ、選択されたコナミドリムシChlamydomonasreinhardtii株の再増殖を示す。選択薬剤を含有しない液体培地中の野生型細胞。ベンゾオキサジノン誘導体Ia35を含有し、その濃度を増加させた1x109から5x106Mまで液体培地中の野生型細胞。選択薬剤を含有しない液体培地中の変異誘発細胞。ベンゾオキサジノン誘導体Ia35を含有し、その濃度を増加させた1x109から5x106Mまで液体培地中の、変異誘発され選択された細胞。ベンゾオキサジノン誘導体Ia35除草剤に耐性を持つ株は、色が濃くなるまで培養で増殖し、これは生育を示す。感受性株は増殖せず、色は淡いままである。生育細胞を含む液体培地では、細胞密度が高いほど、濃い色をもたらす原因となる。培養物の密度が低いほど、色は淡く、あるいは完全に透明に見える。除草剤耐性植物を同定するためのEMS変異誘発シロイヌナズナArabidopsisthaliana群のスクリーニングおよびPPO遺伝子内の原因変異の特定EMS処理したシロイヌナズナ植物のM2集団がLehleSeedsから得られる。スクリーニングは、05ゲル化剤Gelrite登録商標およびベンゾオキサジノン誘導体除草剤01~500μMを化合物の活性に応じて含有するムラシゲスクーグ栄養溶液上に、シロイヌナズナ種子をプレーティングすることによって行われる。植物は栽培室内で、168時間の明暗サイクルで22°Cにて最長で3週間インキュベートする。白化という表現型の強さの低下を示す耐性植物を土壌に移植し、温室条件下で成熟するまで栽培する。ロゼット植物の段階で、DNeasyPlantMiniKitを用いてゲノムDNAを分離するために、またはRNeasyPlantMiniKitを用いて全mRNAを分離するために、ベンゾオキサジノン誘導体除草剤耐性植物からリーフディスクを採取する。標準的なPCR技術により、ゲノムDNAから、それぞれのオリゴヌクレオチドを用いて、PPO配列を増幅する。mRNAからPPOを増幅するためには、SuperscriptIIIReverseTranscriptaseを用いてinvitroでコピーDNAを合成する。標準的なシークエンシングプラスミドでPCR産物をクローニングした後、変異したPPO遺伝子のDNA配列を、標準的な配列決定法により確定する。配列アラインメントツールAlignXを使用することによって、野生型と変異型のPPO配列を比較することにより変異を特定する。野生型および変異したPPO配列を有するベンゾオキサジノン誘導体除草剤耐性植物の作製ベンゾオキサジノン誘導体除草剤耐性ダイズGlycinemax植物を、Olhoftetalに記載の方法により作製する。ユビキチンプロモーターPcUbiとノパリンシンターゼターミネーターNOS配列の間に、耐性マーカー遺伝子カセットAHASおよび変異したPPO配列GOIと記すを含有するバイナリーベクターにおいて、SambrooketalColdSpringHarborLaboratoryPressに記載の標準的なクローニング法を用いて、変異したPPO配列をクローニングする。植物形質転換のためにバイナリープラスミドをAgrobacteriumtumefaciensに導入する。アグロバクテリウムAgrobacteriumを介した形質転換によって、実生外植片の第1節で、プラスミド構築物をダイズの腋芽分裂組織細胞に導入する。アグロバクテリウムAgrobacteriaを接種して共培養した後、外植片を、1週間、選択なしでシュート誘導培地に移す。その外植片を次に、形質転換細胞を選択するために、3週間、13μMイマザピルArsenalを含有するシュート誘導培地に移す。第1節に健全なカルスシュートの盛り上がりを有する外植片を次に、シュートが伸びるまで、または外植片が死滅するまで、13μMイマザピルArsenalを含有するシュート伸長培地に移す。トランスジェニック小植物を発根させ、導入遺伝子の存在についてTaqMan分析に供し、土壌に移して、温室内で成熟するまで生長させる。トウモロコシ植物の形質転換は、McElverandSinghに記載の方法によって行う。変異したPPO配列を含有する植物形質転換ベクター構築物は、アグロバクテリウムAgrobacteriumを介した形質転換により、トウモロコシ未熟胚に導入される。形質転換された細胞は、34週間、0515μMイマゼタピルを添加した選択培地中で選択される。トランスジェニック小植物を植物再生培地上で再生させ、その後、発根させる。トランスジェニック小植物を、導入遺伝子の存在についてTaqMan分析に供した後、鉢植え培養土に移して温室内で成熟するまで生育させる。変異したPPO配列を用いて、McElverandSinghに記載のように、Floraldip法によってシロイヌナズナArabidopsisthalianaを形質転換する。イネOryzasativaの形質転換は、Pengetalに記載のプロトプラスト形質転換により行われる。変異したPPO配列を有するダイズ、トウモロコシ、イネ、およびシロイヌナズナArabidopsisthalianaのT0もしくはT1トランスジェニック植物は、PPO関連除草剤に対するPPO耐性の向上についてテストした。機能的相補性およびスクリーニングアッセイ下記も参照されたい:WilliamLPatzoldtAaronGHagerJoelSMcCormickandPatrickJTranelAcodondeletionconfersresistancetoherbicidesinhibitingprotoporphyrinogenoxidasePNAS1031232934PPOライブラリー作製:PPO遺伝子ライブラリーは、PPO遺伝子GeneartAGRegensburgGermanyのランダム突然変異誘発エラープローンPCRまたは飽和突然変異誘発によって作製し、invivoスクリーニングのために発現ベクターpBADTOPOにクローニングする。さらに、短縮型の野生型および変異型PPO遺伝子を、翻訳が第2のATG開始コドンから始まるように、pBADTOPO発現ベクターInvitrogenにクローニングする。リボソーム結合部位AGGAおよびATG開始コドンをともに含有するフォワードプライマー5CAGGAATAAGTAATGGGCAACATTTCTGAG3、ならびに終止コドンを含有するリバースプライマー5GAAGAATTACGCGGTCTTCTCATC3を使用することによって、PPOcDNAをPCR増幅する。感受性PPOおよび推定耐性PPOプラスミドを用いて、HarryDaileyにより分譲された大腸菌EcoliSASX38hemG変異株を形質転換する。SASX38大腸菌株は、20μgmlヘマチン添加LB培地で維持する。SASX38の形質転換コロニー、および未形質転換対照は、LB培地単独、または20μgmlヘマチンを添加、もしくはPPO阻害剤ラクトフェンおよび001から500μMまでのベンゾオキサジノン誘導体除草剤を添加したLB培地上での増殖能力を調べ、37°Cにて14時間インキュベートする。相補性およびスクリーニングアッセイは、PPO除草剤への反応に対するPPO変異の効果を評価するために、大腸菌SASX38のhemGPPO変異株SasarmanAChartrandPLavoieMTardifDProschekRLapointeCJGenMicrobiol113297303を使用する。SASX38株は外部からヘムを補うか、またはPPOの代替源で救済しない限り、ごくゆっくりしか増殖しない。その上、野生型大腸菌は本来、PPO阻害剤に耐性を有するので、SASX38株の使用は、ヒユモドキAtuberculatus由来の野生型および変異型PPOの除草剤感受性について、比較して直接分析することを可能にする。野生型および変異型PPOをコードするプラスミド構築物で大腸菌SASX38株を形質転換する。構築物は大腸菌SASX38株の増殖を助けることができるので、これはPPO遺伝子が機能的タンパク質をコードすることを示す。しかしながら、増殖培地にベンゾオキサジノン誘導体除草剤を添加すると、野生型PPOで形質転換された大腸菌の増殖は劇的に阻害されたが、変異型PPOで形質転換された大腸菌はそうではなかった。組織培養条件プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを阻害する除草剤たとえば、サフルフェナシル、ビフェノックス、ジウロン、ラクトフェン、ブタフェナシルに耐性を有する植物組織たとえば、トウモロコシ、イネ組織を分離して特性を明らかにするために、invitro組織培養変異誘発アッセイが開発された。このアッセイは、invitro組織培養で見いだされるソマトクローナルバリエーションを利用する。ソマトクローナルバリエーションから生じる自然突然変異は、化学的突然変異誘発およびその後の段階的な選択によって、除草剤濃度の増加に対して増強することができる。本発明は、トウモロコシもしくはイネの、再生可能な、脆弱な胚発生カルスの増殖を促進するための組織培養条件を与える。カルスは、それぞれトウモロコシZeamaysおよびジャポニカTaipei309、日本晴、コシヒカリおよびインディカIndica1品種をそれぞれ含む、4つの異なるトウモロコシもしくはイネ栽培品種から開始する。種子は70エタノール中で約1分間、続いて市販の20Clorox漂白剤で20分間、表面殺菌する。種子を滅菌水ですすぎ、カルス誘導培地上に蒔く。さまざまなカルス誘導培地をテストする。テストした培地の成分一覧を表5に示す。数多くのバリエーションをテストした後、R001Mカルス誘導培地を選択する。培養は暗下で30°Cに保たれる。胚発生カルスは1014日後、新鮮培地に継代する。除草剤耐性カルスの選択組織培養条件を決定したら、さらに、サフルフェナシル、ビフェノックス、ジウロン、ラクトフェン、ブタフェナシル、アシフルオルフェン、ベンゾオキサジノン誘導体除草剤による死滅曲線で組織の生存を分析することによって、選択条件を確立する。組織における除草剤の蓄積、ならびに細胞内および培地中のその存在および安定性について、慎重に検討する。こうした実験を通じて、変異した材料の最初の選択のために、致死量以下の用量が確立された。選択培地中の、サフルフェナシル、ビフェノックス、ジウロン、ラクトフェン、ブタフェナシル、アシフルオルフェン、およびベンゾオキサジノン誘導体除草剤の開始用量を定めた後、毒性を示す用量の存在下で旺盛に生育する細胞が回収されるまで、段階的に、移植ごとにPPO阻害剤の濃度を増加させることによって、組織を選択する。その結果得られたカルスをさらに34週間ごとに、選択薬剤を含有するR001Mに継代する。選択圧が、死滅曲線および継続培養観察により決定された毒性量を超えるまで、26,000を越えるカルスを、45代の継代培養の間、選択に供する。あるいはまた、MS711R中でゆっくり振盪しながらカルスから液体培養を開始し、毎週継代する。液体培養が確立されたら、継代ごとにフラスコに直接、選択薬剤を添加する。液体選択を24回繰り返した後、培養物をさらに生育させるためにR001M固体培地上のフィルターに移す。植物の再生耐性組織を再生させて、PPO遺伝子配列の変異に関する分子的特性、およびまたは選択薬剤存在下でのPPO活性の変化に関する生化学的特性を明らかにする。それに加えて、直接およびまたは間接にテトラピロール生合成およびまたは代謝経路に関与する遺伝子も配列決定し、変異の特徴を明らかにする。最終的に、運命たとえば、代謝、トランスロケーション、輸送を変える酵素も配列決定し、変異の特徴を明らかにする。除草剤選択後、R025M培地で1014日間、R026M培地で約2週間、形の整ったシュートが発生するまでR327M培地、そしてシュートが温室への移植のために十分発根するまでR008S培地、という培養計画で、カルスを再生させる。再生は明下で行う。再生中は、選択薬剤は含まない。強い根が成立したら、M0再生個体を、四角い、または丸い鉢にいれて温室に移植する。移植個体は、温室の環境に適応するまで、透明のプラスチックカップで覆って維持する。温室は、14時間の日長を維持するために600W高圧ナトリウムライトで光を補って、27°C21°C80°F70°Fの昼夜サイクルに設定する。植物は、天候に合わせて、必要に応じて水をやり、毎日施肥する。配列分析移植するために分離されたクローン植物から、葉の組織を収集し、個別に分析する。Wizard登録商標96MagneticDNAPlantSystemキットPromega、米国特許第6027945号および第6368800号を使用し、メーカーの説明書に従って、ゲノムDNAを抽出する。単離したDNAは、適当なフォワードおよびリバースプライマーを用いてPCR増幅する。PCR増幅は、HotStarTaqDNAPolymeraseを用いて、次のようなタッチダウンサーマルサイクリングプログラムにより実施する:96°Cで15分、続いて35サイクル96°C、30秒;58°Cからサイクルごとに02°C下げた温度、30秒;72°C、3分30秒、72°Cで10分。アガロースゲル電気泳動により、PCR産物の濃度およびフラグメントサイズを検証する。脱リン酸化したPCR産物を、PCRプライマーを用いたダイレクトシークエンスによって分析するDNALandmarks、またはEntelechon。VectorNTIAdvance10商標名を用いて、変異について野生型遺伝子と比較してクロマトグラムトレースファイルscfを分析する。配列情報に基づいて、複数の個体で変異を特定する。配列分析は、代表的なクロマトグラムおよび対応するAlignXアラインメントに基づいてデフォルト設定で行われ、二次ピークを呼び出すように編集される。除草剤耐性の立証選択された変異体、および逸出植物を小ポットに移す。野生型栽培品種は種子から発芽させ、対照としての役割を果たす。移植後約3週間ののち、M0再生個体に、track噴霧器を用いて、01メチル化種油を添加したサフルフェナシルBAS800Hまたはベンゾオキサジノン誘導体Ia35を噴霧する。植物が温室条件に順応した後、その一部に、追加のサフルフェナシルBAS800Hまたはベンゾオキサジノン誘導体Ia35を噴霧する。噴霧したら植物を24時間渇水状態に保ち、それから再び水をやり肥料を施す。噴霧された植物は、写真に撮り、処理の1週間後および2週間後に除草剤損傷について評価する。組織培養を用いた除草剤選択使用するための培地を選択し、上記のように死滅曲線を作製する。選択のためにさまざまな技法を使用する。段階的選択を適用するか、または即時致死レベルの除草剤を使用する。いずれの場合も、すべてのカルスは、それぞれ新たな選択ラウンドのために移植される。選択は、各サイクル35週間で45サイクルの培養とする。カルスは移植を容易にするためにナイロン膜上に置く200ミクロン細孔シート、BiodesignSacoMaine。膜は、100x20mmペトリ皿に合うようにカットし、使用前にオートクレーブ滅菌する。どのプレートにも、2535個のカルスカルス当たりの平均重量は22mgを使用する。さらに、一組のカルスは、液体培地での選択に供し、毎週継代した後、半固体培地上でさらに選択する。サフルフェナシルBAS800Hまたはベンゾオキサジノン誘導体Ia35を用いて、変異体系統を選択する。変異体が得られる効率は、再生可能な変異体系統を生じさせるカルスのパーセンテージ、または、使用される組織のグラム数から確定される系統の数、のいずれに基づいても高い。全体として、変異率は、芝seashorepaspalumと比較して5倍であり、トウモロコシと比較して2倍である。"