"一般式I式中、R1は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基を示す。R2はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。R3は低級アルキル基ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。で表される化合物を含有する、滑脳症治療又は予防剤。R1が、式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基である、請求項1に記載の滑脳症治療又は予防剤。R1が、式IIb式中、nは1~6の整数を示す。で示される基である、請求項1に記載の滑脳症治療又は予防剤。R1で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである、請求項1に記載の滑脳症治療又は予防剤。R1で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である、請求項1に記載の滑脳症治療又は予防剤。R3で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である、請求項1~5のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。一般式Iで表される化合物が、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルエステル、又は1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-ピリジン-2-イルエチルエステルである、請求項1に記載の滑脳症治療又は予防剤。経口剤、注射剤、又は点滴剤である、請求項1~7のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。一般式Iで表される化合物50~1200mgが、滑脳症患者に対して2~5日あたり1回投与されるように用いられることを特徴とする、請求項1~8のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。一般式I式中、R1は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基を示す。R2はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。R3は低級アルキル基ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。で表される化合物を、滑脳症患者又は滑脳症胎児を妊娠した妊婦へ投与する工程を含む滑脳症治療方法、あるいは、妊婦へ投与する工程を含む滑脳症予防方法。R1が、式IIb式中、nは1~6の整数を示す。で示される基である請求項10に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。滑脳症の治療又は予防における使用のための、一般式I式中、R1は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基を示す。R2はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。R3は低級アルキル基ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。で表される化合物、又は該化合物を含む医薬組成物。R1が、式IIb式中、nは1~6の整数を示す。で示される基である請求項12に記載の化合物、又は医薬組成物。滑脳症の治療又は予防のための医薬の製造における、一般式I式中、R1は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基を示す。R2はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。R3は低級アルキル基ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。で表される化合物の使用。R1が、式IIb式中、nは1~6の整数を示す。で示される基である請求項14に記載の使用。本発明は、滑脳症患者特に出生後の滑脳症患者を予防又は治療する薬剤及び方法を提供することを課題とする。本発明者らは、驚くべき事に、上記一般式Iで表される化合物を投与することにより、胎児期のみならず出生後であっても滑脳症を治療し得ること、及び当該化合物は毒性も小さいこと、を見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、例えば、以下の項に記載の滑脳症治療又は予防剤等を包含する。項A-1.一般式I式中、R1は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基を示す。R2はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。R3は低級アルキル基ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。で表される化合物を含有する、滑脳症治療又は予防剤。項A-2.R1が、式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基である、項A-1に記載の滑脳症治療又は予防剤。項A-3.R1が、式IIb式中、nは1~6の整数を示す。で示される基である項A-1に記載の滑脳症治療又は予防剤。項A-4.R1で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである項A-1に記載の滑脳症治療又は予防剤。項A-5.R1で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である項A-1に記載の滑脳症治療又は予防剤。項A-6.R3で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である項A-1~A-5のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。項A-7.一般式Iで表される化合物が、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルエステル、又は1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-ピリジン-2-イルエチルエステルである、項A-1に記載の滑脳症治療又は予防剤。項A-8.経口剤、注射剤、又は点滴剤である、項A-1~A-7のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。項A-9.一般式Iで表される化合物約50~約1200mgが、滑脳症患者又は妊婦に対して2~5日あたり1回投与されるように用いられることを特徴とする、項A-1~A-8のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。項B-1.一般式I式中、R1は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基を示す。R2はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。R3は低級アルキル基ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。で表される化合物又は当該化合物を含む医薬組成物を、滑脳症患者又は滑脳症胎児を妊娠した妊婦へ投与する工程を含む滑脳症治療方法、あるいは、妊婦へ投与する工程を含む滑脳症予防方法。項B-2.R1が、式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基である、項B-1に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。項B-3.R1が、式IIb式中、nは1~6の整数を示す。で示される基である項B-1に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。項B-4.R1で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである項B-1に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。項B-5.R1で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である項B-1に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。項B-6.R3で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である項B-1~B-5のいずれかに記載の滑脳症治療方法又は予防方法。項B-7.一般式Iで表される化合物が、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルエステル、又は1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-ピリジン-2-イルエチルエステルである、項B-1に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。項B-8.投与が、経口投与又は経血管投与好ましくは経静脈投与である、項B-1~B-7のいずれかに記載の滑悩症治療方法又は予防方法。項B-9.一般式Iで表される化合物約50~約1200mgが、滑脳症患者に対して2~5日あたり1回投与されるように用いられることを特徴とする、項B-1~B-8のいずれかに記載の滑脳症治療方法又は予防方法。項C-1.滑脳症の治療又は予防における使用のための、一般式I式中、R1は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基を示す。R2はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。R3は低級アルキル基ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。で表される化合物、又は該化合物を含む医薬組成物。項C-2.R1が、式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基である、項C-1に記載の化合物、又は医薬組成物。項C-3.R1が、式IIb式中、nは1~6の整数を示す。で示される基である項C-1に記載の化合物、又は医薬組成物。項C-4.R1で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである項C-1に記載の化合物、又は医薬組成物。項C-5.R1で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である項C-1に記載の化合物、又は医薬組成物。項C-6.R3で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である項C-1~C-5のいずれかに記載の化合物、又は医薬組成物。項C-7.一般式Iで表される化合物が、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルエステル、又は1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-ピリジン-2-イルエチルエステルである、項C-1に記載の化合物、又は医薬組成物。項C-8.経口投与又は経血管投与好ましくは経静脈投与により投与される、項C-1~C-7のいずれかに記載の化合物、又は医薬組成物。項C-9.一般式Iで表される化合物約50~約1200mgが、滑脳症患者又は妊婦に対して2~5日あたり1回投与されるように用いられることを特徴とする、項C-1~C-8のいずれかに記載の化合物、又は医薬組成物。項D-1.滑脳症の治療又は予防のための医薬の製造における、一般式I式中、R1は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基を示す。R2はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。R3は低級アルキル基ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。で表される化合物の使用。項D-2.R1が、式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基である、項D-1に記載の使用。項D-3.R1が、式IIb式中、nは1~6の整数を示す。で示される基である項D-1に記載の使用。項D-4.R1で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである項D-1に記載の使用。項D-5.R1で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である項D-1に記載の使用。項D-6.R3で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である項D-1~D-5のいずれかに記載の使用。項D-7.一般式Iで表される化合物が、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルエステル、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルエステル、又は1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-ピリジン-2-イルエチルエステルである、項D-1に記載の使用。項D-8.医薬が、経口剤、注射剤、又は点滴剤である、項D-1~D-7のいずれかに記載の使用。項D-9.医薬が、一般式Iで表される化合物約50~約1200mgが、滑脳症患者又は妊婦に対して2~5日あたり1回投与されるように用いられることを特徴とする医薬である、項D-1~D-8のいずれかに記載の使用。なお、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステルは、SNJ-1945とも呼ばれる。本発明の滑脳症治療剤を用いることにより、これまで治療が困難であった滑脳症を、母胎中の胎児のみならず、出生後であっても治療することが可能となる。具体的には、本発明の滑脳症治療剤は、母体のみならず、出生後の滑脳症患者に対して投与した場合であっても、滑脳症患者のLIS1タンパク質の減少を抑制させることができ、このために神経細胞の遊走が回復して滑脳症の症状を改善させることができる。また、出生前遺伝子診断等により、LIS1遺伝子のヘテロ変異が確認され、胎児が滑脳症を発症し得る可能性が高いことが判明した場合は、母体に上記一般式Iで表される化合物を投与することで滑脳症の発症を予防又は治療することもできる。さらに、出生前に胎児のLIS1遺伝子のヘテロ変異が確認されていてもいなくても、また、その他滑脳症発症に関する因子の存在が確認されていてもいなくても、子供が滑脳症を発症するのを予防するために、母体に上記一般式Iで表される化合物を投与することもできる。つまり、上記一般式Iで表される化合物は、胎児が滑脳症を患う可能性に関係なく、滑脳症の予防のために母胎に投与して用いることもできる。またさらに、本発明の滑脳症治療又は予防剤は、一回の投与により少なくとも3日間又はそれ以上効果が持続し得るため、投与対象母体又は滑脳症患者の負担を軽減することができる。このため、服薬コンプライアンスの向上も期待できる。以下、本発明について、さらに詳細に説明する。上記一般式I中、R1は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、又は複素環基で置換された低級アルキル基であり得る。つまり、R1は、低級アルキル基を示し得、ここで当該低級アルキル基は低級アルコキシ基又は複素環基で置換されている。当該低級アルキル基としては、炭素数1~61、2、3、4、5又は6の直鎖状又は分枝状アルキル基が好ましく、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、1,2-ジメチルプロピル、ヘキシル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1-エチル-2-メチルプロピル又は1,1,2-トリメチルプロピル等が例示できる。より好ましくは炭素数2又は3の直鎖状又は分枝状アルキル基である。とりわけエチルが好ましい。R1で示される低級アルキル基上に置換する低級アルコキシ基としては、炭素数1~61、2、3、4、5又は6の低級アルコキシ基が好ましい。すなわち、R1で示される、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基としては、炭素数1~6の低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基が好ましい。当該炭素数1~6の低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、tert-ペンチルオキシ、1-メチルブトキシ、2-メチルブトキシ、1,2-ジメチルプロポキシ、ヘキシルオキシ、1-メチルペンチルオキシ、2-メチルペンチルオキシ、3-メチルペンチルオキシ、4-メチルペンチルオキシ、1,1-ジメチルブトキシ、1,2-ジメチルブトキシ、1,3-ジメチルブトキシ、2,2-ジメチルブトキシ、2,3-ジメチルブトキシ、3,3-ジメチルブトキシ、1-エチルブトキシ、2-エチルブトキシ、1-エチル-2-メチルプロポキシ又は1,1,2-トリメチルプロポキシ等が例示でき、なかでもメトキシ、エトキシが好ましい。アルコキシ基は、更にアルコキシ基を構成する炭素原子上に低級アルコキシ基が置換されていてもよく、さらに後者の低級アルコキシ基に低級アルコキシ基が置換されていてもよい。当該置換は、数回繰り返されていてもよい。すなわち、R1は、式IIa式中、R4は低級アルキル基、R5は低級アルキレン基、mは1~6の整数を示す。で示される基でもあり得る。また、さらに好ましい基として、式IIbnは1~6の整数を示す。で示される基が挙げられる。上記式IIaのR4で示される低級アルキル基は、炭素数1~61、2、3、4、5又は6の直鎖状又は分枝状アルキル基が好ましく、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル又はtert-ブチル等が例示できる。好ましくはメチル、イソプロピル又はtert-ブチルであり、より好ましくはメチルである。上記式IIaのR5で示される低級アルキレン基としては、炭素数1~41、2、3又は4のアルキレン基が好ましく、具体的にはメチレン、エチレン、トリメチレン又はテトラメチレンが例示できる。より好ましくはエチレンである。R5で示される低級アルキレン基は置換基を有していてもよい。該置換基としては、低級アルキル基特に炭素数1~6の直鎖状又は分枝状アルキル基が挙げられ、例えばメチル又はエチル等が例示できる。上記式IIaのmは、1~6の整数1、2、3、4、5又は6であり、好ましくは2~5の整数である。上記式IIbのnは、1~6の整数1、2、3、4、5又は6であり、好ましくは1~5の整数であり、より好ましくは2~5の整数である。上記R1で示される低級アルキル基上に置換する複素環基としては、低級アルキル基を有していてもよいすなわち、低級アルキル基で置換されていてもよいピリジルが好ましい。すなわち、上記R1で示される、複素環基で置換された低級アルキル基としては、低級アルキル基を有していてもよいピリジルで置換された低級アルキル基が好ましい。ピリジルとしては、例えば2-ピリジル、3-ピリジル又は4-ピリジルが挙げられる。該ピリジルが有していてもよい低級アルキル基としては、炭素数1~3の低級アルキル基が好ましく、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルが挙げられる。特に制限されないが、該ピリジルが該低級アルキル基を有する場合、該ピリジルの5位又は6位に該低級アルキル基を有する即ち、該ピリジルの5位又は6位の水素原子が該低級アルキル基で置換されているのが好ましい。R1は、また、複素環基であり得る。R1で示される複素環基は、例えば、硫黄原子、酸素原子及び窒素原子からなる群より選択される原子を1~3個含む5~7員芳香族、又は部分若しくは完全還元型の飽和複素環基を示し、例えば、フリル、チエニル、ピロリル、アゼピニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、1,2,3-オキサジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、ピラニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル又はテトラヒドロチオフェニル等であり、好ましくは、飽和複素環基であり、更に好ましくは、酸素原子を含む5乃至6員飽和複素環基であり、更により好ましくは1,2若しくは3-テトラヒドロフラニル又は1,2,3若しくは4-テトラヒドロピラニルであり、特に好ましくは3-テトラヒドロフラニル又は4-テトラヒドロピラニルである。R2で示される低級アルキル基としては、上記したR1で示される低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基又は複素環基で置換された低級アルキル基における、低級アルキル基と同様のものが例示されるが、好ましくは、メチル、エチル又はイソブチルである。R2で示される低級アルキル基は、フェニル基で置換されていることが好ましい。R2で示されるフェニル基で置換された低級アルキル基の好ましい例は、ベンジル又はフェニルエチルである。R3で示される低級アルキル基としては、炭素数1~61、2、3、4、5又は6の直鎖状又は分枝状アルキル基が好ましく、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、1,2-ジメチルプロピル、ヘキシル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1-エチル-2-メチルプロピル又は1,1,2-トリメチルプロピル等が例示できる。より好ましくは炭素数2又は3の直鎖状又は分枝状アルキル基である。また、R3で示される低級アルキル基は、シクロアルキル基であってもよい。シクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシル等が例示でき、好ましくはシクロプロピル又はシクロブチルである。該低級アルキル基が置換されてもよいハロゲンとしては、フッ素、塩素又は臭素等が挙げられ、好ましくはフッ素である。該低級アルキル基がハロゲンにより置換されている場合、R3は好ましくはトリフルオロメチル又は2,2,2-トリフルオロエチルである。R3で示される、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基は、R1で述べた低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基と同様である。なかでもメトキシ基又はエトキシ基で置換された炭素数1~61、2、3、4、5又は6の低級アルコキシ基が好ましい。また、R3で示される、フェニル基で置換された低級アルキル基は、R2で述べたフェニル基で置換された低級アルキル基と同様である。R3で示される縮合多環式炭化水素基としては、例えばインダニル、インデニル、ナフチル、アントラニル、ペンタレニル又はアズレニル等が挙げられるが、インダニルが好ましい。さらに、本発明の滑脳症治療又は予防剤が含有する化合物は、上記化合物の各種の溶媒和や結晶多形の物質ならびにプロドラッグであってもよい。上記化合物は、例えば以下の方法で合成できる。また、上記化合物のうちいくつかの化合物は公知である上記特許文献1参照。式中Rは保護基を、その他の基は前記と同意義を示す。工程aは、式IIIで示されるアミノ酸のアミノ基に保護基を付加し、これを混合酸無水物とした後、還元剤で還元し、式Vで示される化合物以下、化合物Vという。を得る工程である。上記保護基の付加、除去は公知の手段により行うことができる。上記保護基としては、例えば、ホルミル又はそれぞれ置換基を有していてもよいC1-6アルキルカルボニル例えば、アセチル、プロピオニル等、フェニルカルボニル、C1-6アルキル-オキシカルボニル例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル等、フェニルオキシカルボニル又はC7-10アラルキルオキシカルボニル例えば、ベンジルオキシカルボニル等のフェニル-C1-4アルキルオキシカルボニル等などが用いられる。これらの置換基としては、ハロゲン原子例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等又はニトロ基等が用いられ、置換基の数は1~3個程度である。当該保護基として最も好ましくは、tert-ブトキシカルボニルBocである。上記反応で用いられる還元剤としては例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム又は水素化ビス2-メトキシエトキシアルミニウムナトリウム等が挙げられる。好ましくは水素化ホウ素ナトリウムである。反応温度は-40°Cから30°C、好ましくは-20°Cから0°Cである。化合物Vは、式IVで示されるアミノアルコールに、上記アミノ基の保護基を同様に付加することによって得ることもできる工程a’。工程bは、化合物VをジメチルスルホキシドDMSOの活性化剤存在下、DMSO酸化することにより、式VIで示される化合物以下、化合物VIという。を得る工程である。DMSO酸化は、公知の方法により行うことができ、例えばDMSO単独、あるいはDMSOと酸化反応を阻害しない溶媒例えばテトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、エーテル等の混合溶媒に溶解し、化合物V1モルに対し通常約1~約10倍モルのジイソプロピルエチルアミンを添加する。上記におけるDMSOの使用量は、化合物V1gに対し約1~約20mLである。上記DMSOの活性化剤としては、例えば三酸化硫黄ピリジン錯体、オキサリルクロリド、ジシクロヘキシルカルボジイミド又は無水酢酸等が有利に使用でき、特に三酸化硫黄ピリジン錯体が好適である。工程cは、化合物VIを亜硫酸水素ナトリウムで処理した後、シアン化ナトリウムと反応させてシアノヒドリン体とし、このものを精製することなく酸又はアルカリ触媒存在下で加水分解し、α-ヒドロキシ-β-アミノ酸をジアステレオマーの混合物とし、次いで、このα-ヒドロキシ-β-アミノ酸のアミノ基に上記したアミノ基の保護基を再度同様に付加し、式VIIで示される化合物以下、化合物VIIという。をジアステレオマーの混合物として得る工程である。この加水分解は、酸塩酸、硫酸、酢酸、ギ酸等又はアルカリ水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム等と共に加熱又は、加熱還流下で行う。加熱温度は、約50~約100°C程度である。溶媒は、有機溶媒例えばジオキサン、テトラヒドロフラン等と水の混合溶媒を好ましく用いることができる。工程dは、化合物VIIを様々なアミンと縮合させて式VIIIで示される化合物以下、化合物VIIIという。を得る工程である。アミンとしては、目的とする化合物に即して適宜好ましいアミンを選択すればよく、例えばエチルアミン、プロピルアミン、シクロプロピルアミン、ブチルアミン、シクロブチルアミン、メトキシエチルアミン、2-フェノキシエチルアミン、2-アミノインダン又は2,2,2-トリフルオロエチルアミン等が挙げられる。上記縮合は、1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩及びN,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド等の脱水縮合剤の存在下で行うことが好ましい。縮合反応に使用される有機溶媒としてはN,N-ジメチルホルムアミド、DMSO、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒等が挙げられるが、好ましくはN,N-ジメチルホルムアミドである。反応温度は、氷冷下から室温の範囲である。工程eは、化合物VIIIを塩酸酸性下でアミノ保護基の脱離反応により式IXで示されるアミン塩酸塩以下、化合物IXという。を得る工程である。アミノ保護基の脱離反応は、公知の方法により行い得る。例えば、通常使用される有機溶媒に溶解し、酸の存在下攪拌するという方法によりアミノ保護基を脱離することができる。酸としては塩酸、トリフルオロ酢酸又はp-トルエンスルホン酸等が挙げられる。また、市販されている塩酸の酢酸エチル溶液もしくはジオキサン溶液等を用いて脱離することもできる。反応温度は、氷冷下から室温の範囲である。工程fは、化合物IXと式Xで示される化合物以下、化合物Xという。をトリエチルアミン存在下に縮合することにより式XIで示される化合物以下、化合物XIという。を得る工程である。上記化合物Xは、例えば、下記の一般的な反応ルートに従い製造することができる。式中、各記号は前記と同意義である。式XIIIで示されるアルコール以下、化合物XIIIという。と炭酸ジN-スクシンイミジルとを反応させることにより式XIVで示される混合炭酸エステル体とし、これをトリエチルアミン存在下、L-ロイシンエチルエステル塩酸塩と縮合すると、式XVで示される化合物が得られる。この化合物をアルカリでケン化することによって式XVIで示される化合物以下、化合物XVIという。が得られる。また、化合物XVIは、L-ロイシンとクロロギ酸エステルを直接反応させることによって得ることもできる。得られた化合物XVIはヒドロキシスクシンイミドHOSuと反応させ式Xで示されるスクシンイミドエステル体以下、化合物Xという。が製造できる。工程gは、化合物XIを酸化することによって式XIIで示される化合物以下、化合物XIIという。を得る工程である。該酸化方法としては、例えばクロム酸酸化に分類される二クロム酸ピリジニウムPDC酸化、クロロクロム酸ピリジニウムPCC酸化、ジョーンズJones酸化、コリンズCollins酸化、又はDMSO酸化に分類されるスワンSwern酸化、DMSO-三酸化硫黄ピリジン錯体による酸化、DMSO-ジシクロヘキシルカルボジイミドによる酸化、DMSO-塩化オキサリルによる酸化、又はデス-マーチン試薬Dess-Martinperiodinaneを用いるデス-マーチン酸化、次亜ハロゲン酸による酸化、N-ハロゲノカルボン酸アミドによる酸化等、公知の方法を使用することができるが、とりわけデス-マーチン酸化が好ましい。デス-マーチン酸化を用いて酸化する場合は、化合物XIを通常使用される有機溶媒に溶解し、デス-マーチン試薬を加えることで行うことができる。通常使用される有機溶媒としては、例えばジクロロメタン、N,N-ジメチルホルムアミド、DMSO、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン又は酢酸エチル等のような反応に悪影響をおよぼさない慣用の溶媒又はそれらの混合溶媒が挙げられるが、好ましくはジクロロメタンである。デス-マーチン試薬の使用量は化合物XIに対して約1~約20倍モル当量で、好ましくは約1~約3倍モル当量である。反応温度は、特に限定されず、氷冷下から室温付近である。このようにして得られる化合物XIIは、例えば濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶又はクロマトグラフィー等により公知の手段により単離精製することができる。化合物XIIは、一般式Iで表される化合物である。上記、各工程は、通常使用される反応に悪影響を与えない慣用の溶媒又はそれらの混合溶媒の存在下で行われる。反応に悪影響を与えない溶媒としては、例えばジクロロメタン、N,N-ジメチルホルムアミド、DMSO、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン又は酢酸エチルが挙げられる。上記方法によって製造される一般式Iで表される化合物のなかで、本発明の滑脳症治療又は予防剤に含まれる好ましい化合物としては、例えば1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-エチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物1、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-エチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステル化合物2、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-エチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸テトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルエステル化合物3、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物4、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステル化合物5、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸テトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルエステル化合物6、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-プロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物7、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロブチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物8、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-3-ブチルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物9、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-2,2,2-トリフルオロエチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物10、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-2-インダニルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物11、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-2-メトキシエチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物12、構造式を下に示す、1S-1-1S-2,3-ジオキソ-3-エチルアミノ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物13、構造式を下に示す、1S-1-1S-2,3-ジオキソ-3-エチルアミノ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステル化合物14、構造式を下に示す、1S-1-1S-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物15、構造式を下に示す、1S-1-1S-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステル化合物16、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステル化合物17、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルエステル化合物18、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルエステル化合物19、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸14-メトキシ-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカニルエステル化合物20、構造式を下に示す、1S-1-1S-2,3-ジオキソ-1-2-メチルプロピル-3-2-フェノキシエチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物21、構造式を下に示す、1S-1-1S-2,3-ジオキソ-1-2-メチルプロピル-3-2-フェノキシエチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステル化合物22、構造式を下に示す、1S-1-1RS-3-アミノ-1-ベンジル-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステル化合物23、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-ピリジン-2-イルエチルエステル化合物24、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-6-メチルピリジン-2-イルエチルエステル化合物25、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-5-エチルピリジン-2-イルエチルエステル化合物26、構造式を下に示す、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-tert-ブトキシエチルエステル化合物27、構造式を下に示す、及び1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-イソプロポキシエチルエステル化合物28、構造式を下に示す等が挙げられる。より好ましくは、化合物4、化合物17、化合物18、化合物19、化合物24であり、さらに好ましくは化合物17である。なお、上記化合物1~28については、上記特許文献1特開2006-76989号に具体的な製造方法及び物性値が記載されている。これらの化合物は特許文献1に示されるように、優れたカルパイン阻害活性を有しており、本発明の滑脳症治療又は予防剤の有効成分として好ましく用いることができる。本発明の滑脳症治療又は予防剤を用いることにより、これまで治療が困難であった滑脳症を、母胎中の胎児のみならず、出生後であっても治療することが可能となる。具体的には、本発明の滑脳症治療剤は、母体のみならず、出生後の滑脳症患者に対して投与した場合であっても、滑脳症患者のLIS1タンパク質の減少を抑制させることができ、このために神経細胞の遊走が回復して滑脳症の症状を改善させることができる。また、出生前遺伝子診断等により、LIS1遺伝子のヘテロ変異が確認され、胎児が滑脳症を発症し得る可能性が高いことが判明した場合は、母体に上記一般式Iで表される化合物を投与することで滑脳症の発症を予防又は治療することもできる胎児が滑脳症を発症していることが診断できている場合は治療であり、診断できていない場合は予防である。但し、胎児が滑脳症を発症しているか診断することは困難であるため、通常、母体に上記一般式Iで表される化合物を投与することは予防である。。さらに、出生前に胎児のLIS1遺伝子のヘテロ変異が確認されていてもいなくても、また、その他滑脳症発症に関する因子の存在が確認されていてもいなくても、子供が滑脳症を発症するのを予防するために、母体に上記一般式Iで表される化合物を投与することもできる。つまり、上記一般式Iで表される化合物は、胎児が滑脳症を患う可能性に関係なく、滑脳症の予防のために母胎に投与して用いることもできる。本発明の滑脳症治療又は予防剤は、ヒトのみならず、ヒト以外の哺乳動物例えばラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等に対しても用いることができる。また、上記化合物は組織移行性及び吸収性に優れ、血液脳関門も通過し得、かつ毒性も非常に低く安全性にも優れているので、滑脳症の治療又は予防にとって有利であり、よって当該化合物を含有する本発明の滑脳症治療又は予防剤は有利である。本発明の滑脳症治療又は予防剤は全身的又は局所的に投与され得る。全身的には経口投与の他、静脈内注射、皮下注射又は筋肉内注射等非経口的にも投与され得る。局所的には、皮膚、粘膜、鼻又は眼等に投与され得る。本発明の滑脳症治療又は予防剤は、上記化合物のみからなるものであってもよいし、当該化合物と薬学上許容される担体又は添加剤等とが配合された医薬組成物であってもよい。つまり、本発明は、上記化合物及び薬学上許容される担体又は添加剤等を含む医薬組成物も包含する。当該医薬組成物には、本発明の効果が損なわれない程度において、他の薬理活性物質や薬学上許容される任意成分が配合されていてもよい。このような担体、添加剤、任意成分、他の薬理活性物質等は、当業者が目的に応じて適宜選択することができ、また、添加量等の条件も適宜設定することができる。本発明の滑脳症治療又は予防剤が医薬組成物の場合、その製剤形態は、特に制限されないが、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は坐剤等の固形剤、及びシロップ剤、注射剤、点滴剤、点眼剤又は点鼻剤等の液剤等が例示できる。これらのなかでも、経口投与できる剤経口剤、注射剤、点滴剤があることが好ましい。これらは、公知の方法により製造することができる。例えば、顆粒剤及び錠剤として製造する場合には、薬学上許容される添加剤、例えば、賦形剤乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等、滑沢剤ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム等、崩壊剤デンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウム等又は結合剤デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液等などを用いることにより任意の剤形を製造することができる。また、顆粒剤及び錠剤には、適当なコーティング剤ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウ等又は腸溶性コーティング剤例えば、酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース等などで剤皮を施してもよい。カプセル剤として製造する場合には、公知の賦形剤、例えば、流動性及び滑沢性を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク又は軽質無水ケイ酸、加圧流動性のための結晶セルロースもしくは乳糖、或いは上記崩壊剤等を適宜選択し、本発明化合物と均等に混和又は粒状、もしくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものをカプセルに充填するか、適当なカプセル基剤ゼラチン等に必要に応じてグリセリン又はソルビトール等を加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形してもよい。これらカプセル剤には必要に応じて、着色剤、保存剤[例えば、二酸化イオウ、パラベン類パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等]等を加えることができる。カプセル剤は、通常のカプセル剤の他、腸溶性コーティングカプセル剤、胃内抵抗性カプセル剤又は放出制御カプセル剤とすることもできる。腸溶性カプセル剤とする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングした本発明化合物又は本発明化合物に上記の適当な賦形剤を添加したものを通常のカプセルに充填することができる。あるいは、腸溶性コーティング剤でコーティングしたカプセル、もしくは腸溶性高分子を基剤として成形したカプセルに本発明化合物又は本発明化合物に上記の適当な賦形剤を添加したものを充填することができる。坐剤として製造する場合には、坐剤基剤例えば、カカオ脂、マクロゴール等を適宜選択して使用することができる。シロップ剤として製造する場合には、例えば、安定剤エデト酸ナトリウム等、懸濁化剤アラビアゴム、カルメロース等、矯味剤単シロップ、ブドウ糖等又は芳香剤等を適宜選択して使用することができる。このような任意成分は、当業者が目的に応じて適宜選択することができ、また、添加量等の条件も適宜設定することができる。注射剤、点滴剤、点眼剤又は点鼻剤として製造する場合、薬学上許容される添加剤、例えば等張化剤塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等、緩衝剤リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等、保存剤パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等、増粘剤ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等、安定化剤亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等又はpH調整剤塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等などを適宜添加した溶液に、上記化合物を溶解又は分散することによって製造することができる。このような薬学上許容される添加剤は、当業者が目的に応じて適宜選択することができ、また、添加量等の条件も適宜設定することができる。上記注射剤、点眼剤又は点鼻剤における添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途等によって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。本発明の滑脳症治療又は予防剤の投与量は、対象となる滑脳症患者の疾患進行度合、年齢、投与方法等により異なるが、当該治療剤に含まれる有効成分である上記化合物量が、1日あたり約0.1~約2000mg、好ましくは約1~約1500mgを例示できる。特に経口投与又は経血管好ましくは経静脈投与する場合は、1日あたり約10~約1500mg、好ましくは約20~約1500mg、より好ましくは約50~約1200mg、さらに好ましくは約100~約1000mgを例示できる。投与は、例えば1日数回好ましくは1、2、又は3回に分けて行うことができる。なお、本発明の滑脳症治療剤は、出生後に投与する場合すなわち、出生後滑脳症治療剤として用いる場合、出生直後~死亡のいずれの時期においても投与可能であるが、治療効果の面を考慮して、できるだけ早期に可能であれば滑脳症と診断された直後から投与を開始することが好ましい。また、母体に投与して胎児を治療又は胎児の発症を予防する場合も同様に、胎児が滑脳症と又は滑脳症となる可能性が大きいと診断された時点から、できるだけ早期に投与を開始することが望ましい。胎児が滑脳症であるか否か検査を行うことなく予防目的で投与する場合は、妊娠確認後に投与を開始すればよい。母体への投与量については、例えば上記の投与量と同様であり得、また、当業者は上述の範囲内で、患者又は母体の条件に合わせて適宜選択することができる。また、本発明の滑脳症治療又は予防剤は、一度投薬すると比較的長時間効果が持続するという特徴も有している。例えば、上記化合物が、約50~約1200mg、好ましくは約100~約1000mg含まれる剤を、2日~5日好ましくは3日に1回投与するだけで効果が得られると考えられる。また、本発明の滑脳症治療又は予防剤に含まれる有効成分である上記化合物量は、特に制限されない。例えば、当該治療又は予防剤全体に対して、0.01~100重量、好ましくは0.1~99重量、上記化合物が含まれ得る。本発明は、上記の通り、滑脳症患者又は母体に、本発明の滑脳症治療剤を投与することを特徴とする滑脳症治療又は予防方法も提供する。当該方法は、具体的には、前述の本発明の滑脳症治療又は予防剤を投与することで実施される。なお、当該方法における、投与対象、投与方法、投与時期、有効成分である上記化合物の投与量等の各条件は前述の通りである。なお、本発明の滑脳症治療又は予防剤に含有される上記化合物は、他のカルパイン阻害剤に比べ毒性が特に低く、副作用が比較的低減されている点でも有利である。また、他のカルパイン阻害剤は、出生後に投与しても血液脳関門を通過できないため滑脳症治療効果がほとんど得られず、この点でも本発明の滑脳症治療剤は優れている。以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。また、以下の検討では、基本的な操作等については、当該分野で著名な教科書例えば、MolecularCloning:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,、共焦点顕微鏡活用プロトコール羊土社、タンパク質実験ハンドブック羊土社、脳神経研究の進めかた羊土社等を適宜参考にすることができる。各化合物の合成上記引用文献1に記載の方法に従って、上記化合物1~28を合成し、結晶を得た。具体的には、次のようにして合成した。なお、以下の化合物の分析値において、融点はYanaco社製MP-500V型補正なしを用いて測定した。核磁気共鳴スペクトルNMRはVarian製Gemini2000型300MHzを用いて測定した。マトリックス支援イオン化-飛行時間型マススペクトルMALDI-TOFMSは、PerSeptive社製VoyagerDE質量分析装置を用いて測定し、質量数は標準物質α―シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸で補正した。比は容積比を示す。参考例1N-2-メトキシエトキシカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1L-ロイシン25g,0.19molを2M水酸化ナトリウム水溶液0.12Lに溶解し、この溶液にクロロギ酸2-メトキシエチルエステル30g,0.22molと1M水酸化ナトリウム水溶液を氷冷条件下で同時にゆっくりと加えた。この溶液を室温で18時間攪拌した後、水600mLを加え希釈し、ジエチルエーテル2×200mLで洗浄した。水層をアイスバスで冷却し、6M塩酸を加えることでpH3に調整した。この溶液を酢酸エチル5×150mLで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮しN-2-メトキシエトキシカルボニル-L-ロイシン41g,92を無色オイル状物として得た。2N-2-メトキシエトキシカルボニル-L-ロイシン20g,86mmolとN-ヒドロキシコハク酸イミド13g,0.11mmolをテトラヒドロフラン200mLに溶解し、そこへ、1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩21g,0.11molのジクロロメタン200mL懸濁液を加えた。この溶液を室温で18時間攪拌後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル300mLで溶解し、この溶液を1M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮し表題化合物27g,95を無色オイル状物として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.89d,3H,J=6.6,0.93d,3H,J=6.6,1.57-1.84m,3H,2.81s,4H,3.26s,3H,3.51t,2H,J=4.7,4.10t,2H,J=4.7,4.40m,1H,8.04d,1H,J=8.1.参考例2N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1S-3-ヒドロキシテトラヒドロフラン1.0g,11mmolのアセトニトリル50mL溶液を攪拌しながら、N,N’-ジスクシンイミジルカルボナート4.3g,17mmolとトリエチルアミン4.4g,17mmol,4.8mLを室温で加えた。この溶液を室温で18時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液100mLを加え、酢酸エチル200mLで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮しN-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナート2.6gを定量的に褐色オイル状物として得た。2L-ロイシンエチルエステル塩酸塩2.7g,14mmolとトリエチルアミン2.9g,28mmolのジクロロメタン溶液50mLにN-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナート2.6g,11mmolのジクロロメタン20mL溶液を加えた。この反応液を室温で18時間攪拌し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル200mLで溶解し、この溶液を1M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣をヘキサンで洗浄しN-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステル3.1g,98を白色固体として得た。3N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステル2.9g,11mmolのエタノール100mL溶液に1M水酸化ナトリウム水溶液33mLを加えた。この溶液を氷冷下で3時間攪拌した後、塩酸を加えることでpH3に調整した。エタノールを減圧留去し、酢酸エチルで抽出した。有機層を1M塩酸及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル/ヘキサン混液で結晶化しN-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシン2.6g,85を無色結晶として得た。融点:94.9-96.0°C.4N-2-メトキシエトキシカルボニル-L-ロイシンの代わりにN-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンを用いて参考例12と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.89d,3H,J=6.0,0.92d,3H,J=6.3,1.55-1.82m,3H,1.88m,1H,2.12m,1H,2.81s,4H,3.64-3.84m,4H,4.39m,1H,5.15m,1H,8.04d,1H,J=7.8.参考例3N-テトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルオキシカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1S-3-ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに4-ヒドロキシテトラヒドロ-4H-ピランを用いて参考例21と同様の反応を行い、N-スクシンイミジルテトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルカルボナートを褐色オイル状物として得た。2N-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにN-スクシンイミジルテトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルカルボナートを用いて参考例22と同様の反応を行い、N-テトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを無色固体として得た。3N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルの代わりにN-テトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを用いて参考例23と同様の反応を行い、N-テトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルオキシカルボニル-L-ロイシンを無色固体として得た。4N-2-メトキシエトキシカルボニル-L-ロイシンの代わりにN-テトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルオキシカルボニル-L-ロイシンを用いて参考例12と同様の反応を行い、表題化合物を無色固体として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.89d,3H,J=6.0,0.92d,3H,J=6.3,1.43-1.93m,7H,2.80s,4H,3.42m,2H,3.78-3.82m,2H,4.39m,1H,4.72m,1H,7.94d,1H,J=7.8.参考例4N-5-メトキシ-3-オキサペンチルオキシカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1S-3-ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにジエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例21と同様の反応を行い、5-メトキシ-3-オキサペンチルN-スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。2N-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに5-メトキシ-3-オキサペンチルN-スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例22と同様の反応を行い、N-5-メトキシ-3-オキサペンチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。3N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルの代わりにN-5-メトキシ-3-オキサペンチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを用いて参考例23と同様の反応を行い、N-5-メトキシ-3-オキサペンチルオキシカルボニル-L-ロイシンを無色オイル状物として得た。4N-2-メトキシエトキシカルボニル-L-ロイシンの代わりにN-5-メトキシ-3-オキサペンチルオキシカルボニル-L-ロイシンを用いて参考例12と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.90dd,6H,J=9.5,6.5,1.56-1.80m,3H,2.80s,4H,3.24s,3H,3.41-3.46m,2H,3.50-3.54m,2H,3.56-3.60m,2H,4.08-4.11m,2H,4.39m,1H,8.05d,1H,J=7.8.参考例5N-8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルオキシカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1S-3-ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにトリエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例21と同様の反応を行い、8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルN-スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。2N-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルN-スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例22と同様の反応を行い、N-8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。3N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルの代わりにN-8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを用いて参考例23と同様の反応を行い、N-8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルオキシカルボニル-L-ロイシンを無色オイル状物として得た。4N-2-メトキシエトキシカルボニル-L-ロイシンの代わりにN-8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルオキシカルボニル-L-ロイシンを用いて参考例12と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.89d,3H,J=6.3,0.92d,3H,J=6.3,1.56-1.82m,3H,2.81s,4H,3.24s,3H,3.43m,2H,3.52m,6H,3.59m,2H,4.10m,2H,4.40m,1H,8.06d,1H,J=7.8.参考例6N-11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルオキシカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1S-3-ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにテトラエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例21と同様の反応を行い、11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルN-スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。2N-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルN-スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例22と同様の反応を行い、N-11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。3N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルの代わりにN-11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを用いて参考例23と同様の反応を行い、N-11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルオキシカルボニル-L-ロイシンを無色オイル状物として得た。4N-2-メトキシエトキシカルボニル-L-ロイシンの代わりにN-11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルオキシカルボニル-L-ロイシンを用いて参考例12と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.91dd,6H,J=9.3,6.3,1.56-1.77m,3H,2.81s,4H,3.24s,3H,3.41-3.44m,2H,3.49-3.52m,10H,3.59t,2H,J=4.7,4.08-4.11m,2H,4.38m,1H,8.06d,1H,J=7.8.参考例7N-14-メトキシ-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカニルオキシカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1S-3-ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにペンタエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例21と同様の反応を行い、14-メトキシ-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカニルN-スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。2N-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに14-メトキシ-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカニルN-スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例22と同様の反応を行い、N-14-メトキシ-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカニルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。3N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルの代わりにN-14-メトキシ-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカニルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを用いて参考例23と同様の反応を行い、N-14-メトキシ-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカニルオキシカルボニル-L-ロイシンを無色オイル状物として得た。4N-2-メトキシエトキシカルボニル-L-ロイシンの代わりにN-14-メトキシ-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカニルオキシカルボニル-L-ロイシンを用いて参考例12と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.89d,3H,J=6.6,0.92d,3H,J=6.3,1.57-1.82m,3H,2.81s,4H,3.24s,3H,3.43m,2H,3.51m,14H,3.59m,2H,4.10m,2H,4.40m,1H,8.05d,1H,J=7.8.参考例83S-3-アミノ-N-エチル-2-ヒドロキシ-4-フェニルブタナミド塩酸塩1L-フェニルアラニノール50g,66mmolのテトラヒドロフラン1.3Lと水630mLの溶液にジ-t-ブチルジカルボナート140g,0.67molのテトラヒドロフラン500mL溶液と1M水酸化ナトリウム水溶液660mLを氷冷条件下で同時にゆっくりと加えた。この溶液を室温で18時間攪拌し、有機溶媒を減圧留去した後、酢酸エチル1Lを加えた。この溶液を1M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた白色固体を酢酸エチル/ヘキサン1:10混液から再結晶しN-tert-ブトキシカルボニル-L-フェニルアラニノール70g,84を無色結晶として得た。2N-tert-ブトキシカルボニル-L-フェニルアラニノール69g,0.28molをDMSO280mLとジクロロメタン140mLに溶解し、この溶液をアイスバスで冷却した。そこへ、N,N-ジイソプロピルエチルアミン110g,0.82molと精製した三酸化イオウピリジン錯体の130g,0.82molのDMSO100mL懸濁液を加えた。この溶液を氷冷下で1時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで1.5Lで希釈し、1M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル/ヘキサン混液から結晶化しN-tert-ブトキシカルボニル-L-フェニルアラニナール53g,77を無色結晶として得た。3N-tert-ブトキシカルボニル-L-フェニルアラニナール17g,67mmolをメタノール100mLに溶解し、この溶液を5°Cに冷却した。亜硫酸水素ナトリウム7.0g,67mmolを水150mLに溶解し、5°Cに冷却した。この溶液をアルデヒド溶液に加え5°Cで18時間撹拌した。青酸ナトリウム4.0g,81mmolを水100mLに溶かし、酢酸エチル300mLとともに上記の反応液へ加えた。この反応液を室温で5時間撹拌した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮し、シアノヒドリン体を無色オイル状物として得た。このシアノヒドリン体をジオキサン250mLと濃塩酸250mLに溶解し、これにアニソール10mLを加えた。この溶液を18時間緩やかに還流した。この反応液を室温に冷却後、減圧濃縮し褐色半固状物質を得た。これを水100mLに溶解し、ジエチルエーテル3×50mLで洗浄した。水層をDowex50X8カラム100-200mesh,H型;25×1.8cmに付し、pH5.5になるまで水で洗浄し、2Mアンモニウム水約1.5Lで溶出した。溶出したアンモニウム水を減圧濃縮して3S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸12g,88を白色固体として得た。43S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸11g,56.34mmolを1M水酸化ナトリウム水溶液70mLに溶解し、この溶液にジ-t-ブチルジカルボナート12g,57mmolのジオキサン70mL溶液を加えた。この溶液を、1M水酸化ナトリウム水溶液を適宜加えることでpH10~11に保持しながら、室温で18時間攪拌した。そこへ、水600mLを加え希釈し、ジエチルエーテル2×200mLで洗浄した。この水層をアイスバスで冷却しながら、1M塩酸を加えることによりpH2に調整し、ジエチルエーテル3×250mLで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水後、濃縮し3S-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸12g,72を無色固体のジアステレオマーの混合物として得た。53S-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸6.3g,21mmolと1-ヒドロキシベンゾトリアゾール3.0g,22.4mmolをDMF45mLに溶解し、アイスバスで冷却した。そこへ、1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩4.6g,24mmolを加えた後、さらにエチルアミン水溶液3.0mLを加えた。この溶液を18時間攪拌した。この溶液を酢酸エチル200mLで希釈した後、1M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮し1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル5.8g,84を白色固体として得た。61S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステル5.5g,17mmolを4N塩酸/ジオキサン溶液65mLに溶解し、この溶液を室温で3時間攪拌した。この溶液を減圧濃縮して表題化合物4.4gを定量的に白色固体として得た。融点:162.8-163.3°C.Major,1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ1.02t,3H,J=7.2,2.93m,2H,3.05-3.20m,2H,3.60m,1H,3.88m,1H,6.75d,1H,J=6.0,7.19-7.37m,5H,8.08m,1H,8.17brs,3H.Minor,1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.97t,3H,J=7.4,2.80d,2H,J=6.9,3.00m,2H,3.69m,1H,4.26m,1H,6.53d,1H,J=5.4,7.19-7.37m,5H,8.03t,1H,J=5.7,8.17brs,3H.参考例93S-3-アミノ-N-シクロプロピル-2-ヒドロキシ-4-フェニルブタナミド塩酸塩エチルアミン水溶液の代わりにシクロプロピルアミンを用いて参考例85と同様の反応を行い、1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルの代わりに1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを用いて参考例86と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。融点:162.9-163.3°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.44m,2H,0.57m,2H,2.50m,0.5H,2.65m,0.5H,2.82d,1H,J=6.9,2.94m,1H,3.60m,0.5H,3.70m,0.5H,3.87m,0.5H,4.26d,0.5H,J=2.4,6.45brs,0.5H,6.69brs,0.5H,7.23-7.35m,5H,7.99d,0.5H,J=4.2,8.08brs,1.5H,8.09d,0.5H,J=4.5,8.23brs,1.5H.参考例103S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニル-N-プロピルブタナミト塩酸塩エチルアミン水溶液の代わりにプロピルアミンを用いて参考例85と同様の反応を行い、1S-1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-オキソ-3-プロピルアミノプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルの代わりに1S-1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-オキソ-3-プロピルアミノプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを用いて参考例86と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。融点:127.8-129.5°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.82m,3H,1.35-1.47m,2H,2.82m,0.5H,2.95m,3H,3.09m,0.5H,3.58m,0.5H,3.70m,0.5H,3.92m,0.5H,4.31m,0.5H,6.55d,0.5H,J=4.8,6.77d,0.5H,J=6.6,7.21-7.36m,5H,7.98-8.15m,2.5H,8.24brs,1.5H.参考例113S-3-アミノ-N-シクロブチル-2-ヒドロキシ-4-フェニルブタナミド塩酸塩エチルアミン水溶液の代わりにシクロブチルアミンを用いて参考例85と同様の反応を行い、1S-1-ベンジル-3-シクロブチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルの代わりに1S-1-ベンジル-3-シクロブチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを用いて参考例86と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。融点:162.5-163.7°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ1.59m,2H,1.88-2.18m,4H,2.80d,1H,J=6.6,2.91m,1H,3.58m,0.5H,3.69m,0.5H,3.87m,0.5H,4.08m,0.5H,4.16-4.24m,1H,6.50d,0.5H,J=5.4,6.72d,0.5H,J=6.0,7.21-7.33m,5H,8.05brs,1.5H,8.19d,0.5H,J=7.8,8.20brs,1.5H,8.29d,0.5H,J=8.1.参考例123S-3-アミノ-N-ブチル-2-ヒドロキシ-4-フェニルブタナミド塩酸塩エチルアミン水溶液の代わりにブチルアミンを用いて参考例85と同様の反応を行い、1S-1-ベンジル-3-ブチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルの代わりに1S-1-ベンジル-3-ブチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを用いて参考例86と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。融点:141.0-141.4°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.86m,3H,1.16-1.47m,4H,2.80m,0.5H,2.99m,3H,3.13m,0.5H,3.57m,0.5H,3.70m,0.5H,3.92m,0.5H,4.30m,0.5H,6.53brs,0.5H,6.77d,0.5H,J=6.6,7.19-7.39m,5H,7.97-8.15m,2.5H,8.22s,1.5H.参考例133S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニル-N-2,2,2-トリフルオロエチルブタナミド塩酸塩エチルアミン水溶液の代わりに2,2,2-トリフルオロエチルアミンを用いて参考例85と同様の反応を行い、1S-1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-オキソ-3-2,2,2-トリフルオロエチルアミノプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルの代わりに1S-1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-オキソ-3-2,2,2-トリフルオロエチルアミノプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを用いて参考例86と同様の反応を行い、3S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニル-N-2,2,2-トリフルオロエチルブタナミド塩酸塩を白色固体として得た。融点:103.0-108.5°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ2.71-2.85m,1H,2.88-2.97m,1H,3.60-3.82m,2.5H,3.91-4.05m,1H,4.45m,0.5H,6.75d,0.5H,J=5.7,6.98d,0.5H,J=6.3,7.20-7.35m,5H,8.12brs,1.5H,8.25brs,1.5H,8.70m,1H.参考例143S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-N-2-インダニル-4-フェニルブタナミド塩酸塩エチルアミン水溶液の代わりに2-アミノインダンを用いて参考例85と同様の反応を行い、1S-1-ベンジル-3-2-インダニルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルの代わりに1S-1-ベンジル-3-2-インダニルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを用いて参考例86と同様の反応を行い、3S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-N-2-インダニル-4-フェニルブタナミド塩酸塩を白色固体として得た。融点:183.0-184.8°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ2.76-2.96m,4H,3.01-3.18m,2H,3.62m,0.5H,3.74m,0.5H,3.92m,0.5H,4.25-4.39m,1H,4.49m,0.5H,6.48d,0.5H,J=5.7,6.72d,0.5H,J=5.7,7.13-7.35m,9H,8.15m,3.5H,8.26d,0.5H,J=7.2.参考例153S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-N-2-メトキシエチル-4-フェニルブタナミド塩酸塩エチルアミン水溶液の代わりにメトキシエチルアミンを用いて参考例85と同様の反応を行い、1S-1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-2-メトキシエチル-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルの代わりに1S-1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-2-メトキシエチル-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを用いて参考例86と同様の反応を行い、3S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-N-2-メトキシエチル-4-フェニルブタナミド塩酸塩を白色固体として得た。融点:113.9-117.7°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ2.82d,1H,J=6.6,2.95m,1H,3.10-3.19m,2H,3.22s,1.5H,3.23s,1.5H,3.28-3.34m,2H,3.57m,0.5H,3.70m,0.5H,3.92m,0.5H,4.32m,0.5H,6.59d,0.5H,J=4.5,6.87d,0.5H,J=6.0,7.22-7.36m,5H,7.92t,0.5H,J=5.7,7.98t,0.5H,J=5.1,8.09brs,1.5H,8.24brs,1.5H.参考例163S-3-アミノ-N-エチル-2-ヒドロキシ-5-フェニルペンタナミド塩酸塩1Boc-L-ホモフェニルアラニン20g,72mmolのジメトキシエタン100mL溶液にN-メチルモルホリン7.2g,72mmolとクロロギ酸イソブチル9.8g,72mmolを氷冷条件下で加えた。攪拌1時間後、反応液をろ過し、ろ液をアイスバスで冷却し、水素化ホウ素ナトリウム4.1g,107mmolの水溶液10mLを加え、さらに水300mLを加えた。生じた沈殿物をろ取して、これを水及びメタノールで洗浄しN-tert-ブトキシカルボニル-L-ホモフェニルアラニノール15g,79を無色結晶として得た。2N-tert-ブトキシカルボニル-L-フェニルアラニノールの代わりにN-tert-ブトキシカルボニル-L-ホモフェニルアラニノールを用いて参考例82と同様の反応を行い、N-tert-ブトキシカルボニル-L-ホモフェニルアラニナールを無色オイル状物として得た。3N-tert-ブトキシカルボニル-L-フェニルアラニナールの代わりにN-tert-ブトキシカルボニル-L-ホモフェニルアラニナールを用いて参考例83と同様の反応を行い、3S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸を白色固体として得た。43S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸の代わりに3S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸を用いて参考例84と同様の反応を行い、3S-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸を無色オイル状物として得た。53S-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸の代わりに3S-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸を用いて参考例85と同様の反応を行い、1S-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソ-1-フェニルエチルプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。61S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルの代わりに1S-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソ-1-フェニルエチルプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを用いて参考例86と同様の反応を行い、3S-3-アミノ-N-エチル-2-ヒドロキシ-5-フェニルペンタナミド塩酸塩を白色固体として得た。融点:134.4-134.9°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.99-1.06m,3H,1.65-1.96m,2H,2.54-2.76m,2H,3.07-3.23m,2H,4.15brs,0.5H,4.25brs,0.5H,6.44brs,0.5H,6.55brs,0.5H,7.17-7.33m,5H,7.99brs,1.5H,8.15t,1H,J=6.2,8.23brs,1.5H.参考例173S-3-アミノ-N-シクロプロピル-2-ヒドロキシ-5-フェニルペンタナミド塩酸塩エチルアミン水溶液の代わりにシクロプロピルアミンを用いて参考例165と同様の反応を行い、1S-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソ-1-フェニルエチルプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルの代わりに1S-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソ-1-フェニルエチルプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを用いて参考例166と同様の反応を行い、3S-3-アミノ-N-シクロプロピル-2-ヒドロキシ-5-フェニルペンタナミド塩酸塩を白色固体として得た。融点:140.2-141.3°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.46-0.64m,4H,1.64-1.99m,2H,2.54-2.78m,3H,3.35m,1H,4.13brs,0.5H,4.26brs,0.5H,6.37brs,0.5H,6.51brs,0.5H,7.17-7.33m,5H,8.05brs,1.5H,8.15d,0.5H,J=4.5,8.20d,0.5H,J=4.8,8.27brs,1.5H.参考例183S-3-アミノ-2-ヒドロキシ-5-メチル-N-2-フェノキシエチルヘキサナミド塩酸塩1L-フェニルアラニノールの代わりにL-ロイシノールを用いて、参考例81と同様の反応を行い、N-tert-ブトキシカルボニル-L-ロイシノール70g,84を無色オイル状物として得た。2N-tert-ブトキシカルボニル-L-フェニルアラニノールの代わりにN-tert-ブトキシカルボニル-L-ロイシノールを用いて参考例82と同様の反応を行い、N-tert-ブトキシカルボニル-L-ロイシナールを無色オイル状物として得た。3N-tert-ブトキシカルボニル-L-フェニルアラニナールの代わりにN-tert-ブトキシカルボニル-L-ロイシナールを用いて参考例83,4と同様の反応を行い、3S-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-5-メチルヘキサン酸を無色オイル状物として得た。43S-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸の代わりに3S-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-ヒドロキシ-5-メチルヘキサン酸を用い、エチルアミン水溶液の代わりに2-フェノキシエチルアミンを用いて参考例85と同様の反応を行い、1S-2-ヒドロキシ-1-2-メチルプロピル-3-オキソ-3-2-フェノキシエチルアミノプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを無色オイル状物として得た。51S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルの代わりに1S-2-ヒドロキシ-1-2-メチルプロピル-3-オキソ-3-2-フェノキシエチルアミノプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを用いて参考例86と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。融点:93.6-96.2°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.71-0.89m,6H,1.35-1.47m,2H,1.72m,1H,3.48-3.54m,4H,4.00-4.07m,2H,4.12d,0.5H,J=3.6,4.33d,0.5H,J=1.8,6.91-6.96m,3H,7.27-7.32m,2H,7.95brs,1.5H,8.19-8.29m,2.5H.参考例193-アミノ-2-ヒドロキシ-5-フェニルペンタナミド塩酸塩エチルアミン水溶液の代わりにアンモニアガスを用いて参考例85と同様の反応を行い、1-ベンジル-3-アミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルの代わりに1-ベンジル-3-アミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルカルバミン酸1,1-ジメチルエチルエステルを用いて参考例86と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ2.82m,1H,2.93m,1H,3.61m,1H,3.85m,0.5H,4.26m,0.5H,6.48d,0.5H,J=4.8,6.75d,0.5H,J=5.7,7.24-7.35m,5H,7.52m,2H,8.04brs,1.5H,8.17brs,1.5H.参考例20N-2-ピリジン-2-イルエチルカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1S-3-ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに2-ピリジルエタノールを用いて参考例21と同様の反応を行い、N-スクシンイミジル2-ピリジン-2-イルエチルカルボナートを褐色オイル状物として得た。2N-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにN-スクシンイミジル2-ピリジン-2-イルエチルカルボナートを用いて参考例22と同様の反応を行い、N-2-ピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。3N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルの代わりにN-2-ピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを用いて参考例23と同様の反応を行い、N-2-ピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンを白色固体として得た。4N-2-メトキシエトキシカルボニル-L-ロイシンの代わりにN-2-ピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンを用いて参考例12と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.82-0.91m,6H,1.42-1.76m,3H,2.76-2.81m,4H,3.00-3.06m,2H,4.30-4.40m,3H,7.23dd,1H,J=7.1,5.3,7.30d,1H,J=7.8,7.71m,1H,7.90d,1H,J=8.1,8.50d,1H,J=4.5.参考例21N-2-6-メチルピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1S-3-ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに2-6-メチル-2-ピリジルエタノールを用いて参考例21と同様の反応を行い、N-スクシンイミジル2-6-メチルピリジン-2-イルエチルカルボナートを褐色オイル状物として得た。2N-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにN-スクシンイミジル2-6-メチルピリジン-2-イルエチルカルボナートを用いて参考例22と同様の反応を行い、N-2-6-メチルピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。3N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルの代わりにN-2-6-メチルピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを用いて参考例23と同様の反応を行い、N-2-6-メチルピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンを無色オイル状物として得た。4N-2-メトキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンの代わりにN-2-6-メチルピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンを用いて参考例12と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.83-0.92m,6H,1.49-1.77m,3H,2.43s,3H,2.81s,4H,2.99t,2H,J=6.5,4.29-4.42m,3H,7.07-7.09m,2H,7.58t,1H,J=7.7,7.91d,1H,J=8.4.参考例22N-2-5-エチルピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1S-3-ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに5-エチルピリジン-2-イルエタノールを用いて参考例21と同様の反応を行い、N-スクシンイミジル2-5-エチルピリジン-2-イルエチルカルボナートを褐色オイル状物として得た。2N-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにN-スクシンイミジル2-5-エチルピリジン-2-イルエチルカルボナートを用いて参考例22と同様の反応を行い、N-2-5-エチルピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。3N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルの代わりにN-2-5-エチルピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを用いて参考例23と同様の反応を行い、N-2-5-エチルピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンを無色オイル状物として得た。4N-2-メトキシエトキシカルボニル-L-ロイシンの代わりにN-2-5-エチルピリジン-2-イルエチルオキシカルボニル-L-ロイシンを用いて参考例12と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.75-0.92m,6H,1.12-1.25m,3H,1.36-1.72m,3H,2.54-2.63m,2H,2.81-2.83m,4H,2.96-3.02m,2H,4.04m,1H,4.29-4.37m,2H,7.21d,1H,J=7.8,7.53m,1H,7.90d,1H,J=7.8,8.34m,1H.参考例23N-2-tert-ブトキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1S-3-ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにエチレングリコールtert-ブチルエーテルを用いて参考例21と同様の反応を行い、N-スクシンイミジル2-tert-ブトキシエチルカルボナートを無色オイル状物として得た。2N-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにN-スクシンイミジル2-tert-ブトキシエチルカルボナートを用いて参考例22と同様の反応を行い、N-2-tert-ブトキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。3N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルの代わりにN-2-tert-ブトキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを用いて参考例23と同様の反応を行い、N-2-tert-ブトキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンを無色オイル状物として得た。4N-2-メトキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンの代わりにN-2-tert-ブトキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンを用いて参考例12と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.89d,3H,J=6.3,0.92d,3H,J=6.3,1.13s,9H,1.61m,1H,1.74m,2H,2.81s,4H,3.48t,2H,J=4.7,4.04m,2H,4.40m,1H,8.00d,1H,J=7.8.参考例24N-2-イソプロポキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル1S-3-ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにエチレングリコールイソプロピルエーテルを用いて参考例21と同様の反応を行い、N-スクシンイミジル2-イソプロポキシエチルカルボナートを無色オイル状物として得た。2N-スクシンイミジル3S-3-テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにN-スクシンイミジル2-イソプロポキシエチルカルボナートを用いて参考例22と同様の反応を行い、N-2-イソプロポキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。3N-3S-テトラヒドロフラン-3-イルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルの代わりにN-2-イソプロポキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンエチルエステルを用いて参考例23と同様の反応を行い、N-2-イソプロポキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンを無色オイル状物として得た。4N-2-メトキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンの代わりにN-2-イソプロポキシエチルオキシカルボニル-L-ロイシンを用いて参考例12と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.89d,3H,J=6.6,0.92d,3H,J=6.3,1.08d,6H,J=6.3,1.61m,1H,1.74m,2H,2.81s,4H,3.53m,2H,3.57m,1H,4.07m2H,4.40m,1H,8.02d,1H,J=7.8.製造例11S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-エチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物1参考例1の化合物1.2g,3.6mmolと参考例8の化合物1.0g,4.0mmolのDMF溶液にトリエチルアミン1.1g,11mmolを加えた。この溶液を室温で18時間攪拌し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで溶解し、この溶液を1M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた固体を酢酸エチル/ヘキサン1:9混液で洗浄し1S-1-1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル0.75g,47を白色固体として得た。1S-1-1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル0.7g,1.6mmolのジクロロメタン70mL溶液にデスマーチン試薬1.0g,2.4mmolを加えた。この溶液を室温で18時間攪拌した。そこへ、10チオ硫酸ナトリウム水溶液35mLと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液35mLを加え、この溶液を室温で30分攪拌した。有機層を分離し、これを1M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル/ヘキサン混液で結晶化し表題化合物0.62g,88を無色結晶として得た。融点:138.0-138.3°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.83d,3H,J=7.5,0.85d,3H,J=7.2,1.04t,3H,J=7.1,1.35m,2H,1.56m,1H,2.82m,1H,3.14m,3H,3.25s,3H,3.47t,2H,J=4.5,4.04m,3H,5.19m,1H,7.16-7.33m,6H,8.24d,1H,J=7.2,8.70m,1H.MALDI-TOF-MS:C22H33N3O6MNa,458.2267,実測値,458.2361.製造例21S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-エチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステル化合物2参考例1の化合物の代わりに参考例2の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:158.9-160.7°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.83d,3H,J=6.6,0.85d,3H,J=6.9,1.04t,3H,J=7.1,1.35m,2H,1.55m,1H,1.83m,1H,2.08m,1H,2.82m,1H,3.14m,3H,3.61-3.78m,4H,4.01m,1H,5.07m,1H,5.19m,1H,7.17-7.33m,6H,8.22d,1H,J=7.2,8.69t,1H,J=5.7.MALDI-TOF-MS:C23H33N3O6MH,448.2447,実測値,448.2509.製造例31S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-エチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸テトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルエステル化合物3参考例1の化合物の代わりに参考例3の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸テトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:140.0-141.8°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.84m,6H,1.04t,3H,J=7.2,1.35m,2H,1.49m,3H,1.79m,2H,2.82m,1H,3.14m,3H,3.41m,2H,3.78m,2H,4.02m,1H,4.66m,1H,5.19m,1H,7.15-7.33m,6H,8.22d,1H,J=7.2,8.69t,1H,J=5.7.MALDI-TOF-MS:C24H35N3O6MNa,484.2424,実測値,484.2486.製造例41S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物4参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:112.4-113.5°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.58m,2H,0.65m,2H,0.83d,3H,J=6.6,0.85d,3H,J=6.6,1.35m,2H,1.56m,1H,2.68-2.88m,2H,3.11m,1H,3.25s,3H,3.47t,2H,J=4.5,4.04m,3H,5.17m,1H,7.17-7.34m,6H,8.25d,1H,J=7.2,8.73d,1H,J=4.8.MALDI-TOF-MS:C23H33N3O6MNa,470.2267,実測値,470.2441.[α]D256.3°c0.20,DMSO製造例51S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステル化合物5参考例1の化合物の代わりに参考例2の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:169.2-170.5°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.58m,2H,0.65m,2H,0.83d,3H,J=8.1,0.85d,3H,J=6.9,1.34m,2H,1.55m,1H,1.83m,1H,2.08m,1H,2.79m,2H,3.12m,1H,3.61-3.80m,4H,4.02m,1H,5.08m,1H,5.17m,1H,7.22-7.35m,6H,8.24d,1H,J=6.6,8.74d,1H,J=5.1.MALDI-TOF-MS:C24H33N3O6MNa,482.2267,実測値,482.2586.製造例61S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸テトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルエステル化合物6参考例1の化合物の代わりに参考例3の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸テトラヒドロ-4H-ピラン-4-イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:137.0-138.2°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.58m,2H,0.65m,2H,0.84m,6H,1.35m,2H,1.48m,3H,1.80m,2H,2.79m,2H,3.11m,1H,3.41m,2H,3.79m,2H,4.03m,1H,4.65m,1H,5.18m,1H,7.15-7.30m,6H,8.23d,1H,J=6.9,8.73d,1H,J=5.4.MALDI-TOF-MS:C25H35N3O6MH,474.2604,実測値,474.2643.製造例71S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-プロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物7参考例8の化合物の代わりに参考例10の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-オキソ-3-プロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:108.8-109.9°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.83m,9H,1.35m,2H,1.46m,2H,1.55m,1H,2.83dd,1H,J=14.0,9.2,3.08m,3H,3.25s,3H,3.48t,2H,J=4.4,4.04m,3H,5.19m,1H,7.22-7.28m,6H,8.24d,1H,J=6.9,8.68t,1H,J=5.6.MALDI-TOF-MS:C23H35N3O6MH,450.2604,実測値,450.2832.製造例81S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロブチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物8参考例8の化合物の代わりに参考例11の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロブチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:114.2-115.3°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.84m,6H,1.34m,2H,1.49-1.72m,3H,2.10m,4H,2.81dd,1H,J=13.8,9.3,3.10m,1H,3.25s,3H,3.47m,2H,4.03m,3H,4.22m,1H,5.15m,1H,7.24m,6H,8.24d,1H,J=7.2,8.91d,1H,J=7.8.MALDI-TOF-MS:C24H35N3O6MNa,484.2424,実測値,484.2400.製造例91S-1-1S-1-ベンジル-3-ブチルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物9参考例8の化合物の代わりに参考例12の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-ブチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:94.0-95.2°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.85m,9H,1.25m,2H,1.35m,2H,1.42m,2H,1.56m,1H,2.83dd,1H,J=13.8,9.0,3.10m,3H,3.25s,3H,3.47t,2H,J=4.5,4.04m,3H,5.18m,1H,7.21-7.29m,6H,8.23d,1H,J=6.6,8.67t,1H,J=6.0.MALDI-TOF-MS:C24H37N3O6MH,464.2760,実測値,464.2870.製造例101S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-2,2,2-トリフルオロエチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物10参考例8の化合物の代わりに参考例13の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-オキソ-3-2,2,2-トリフルオロエチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:152.5-153.9°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.84m,6H,1.34m,2H,1.55m,1H,2.86dd,1H,J=14.0,8.6,3.10dd,1H,J=14.1,4.8,3.25s,3H,3.48t,2H,J=4.7,3.90m,2H,4.04m,3H,5.14m,1H,7.21-7.31m,6H,8.34d,1H,J=6.9,9.29m,1H.MALDI-TOF-MS:C22H30F3N3O6MH,490.2165,実測値,490.2434.製造例111S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-2-インダニルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物11参考例8の化合物の代わりに参考例14の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-2-インダニルアミノ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:141.9-143.5°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.83d,3H,J=6.9,0.86d,3H,J=6.9,1.36m,2H,1.57m,1H,2.80-2.96m,3H,3.10-3.18m,3H,3.24s,3H,3.47t,2H,J=4.7,4.04m,3H,4.50m,1H,5.19m,1H,7.13-7.30m,10H,8.29d,1H,J=6.9,8.97d,1H,J=7.2.MALDI-TOF-MS:C29H37N3O6MH,524.2760,実測値,524.2810.製造例121S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-2-メトキシエチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物12参考例8の化合物の代わりに参考例15の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-2-メトキシエチルアミノ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:127.0-127.9°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.83d,3H,J=6.9,0.86d,3,J=6.9,1.35m,2H,1.56m,1H,2.83dd,1H,J=13.8,9.0,3.11dd,1H,J=14.0,4.4,3.24s,3H,3.25s,3H,3.16-3.34m,2H,3.39m,2H,3.48t,2H,J=4.5,4.04m,3H,5.20m,1H,7.18-7.30m,6H,8.21d,1H,J=6.9,8.66t,1H,J=5.4.MALDI-TOF-MS:C23H35N3O7MNa,488.2373,実測値,488.2680.製造例131S-1-1S-2,3-ジオキソ-3-エチルアミノ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物13参考例8の化合物の代わりに参考例16の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:119.1-120.4°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.89t,6H,J=6.3,1.03t,3H,J=7.2,1.43t,2H,J=7.2,1.61-1.85m,2H,2.07m,1H,2.56-2.74m,2H,3.07-3.17m,2H,3.25s,3H,3.49t,2H,J=4.7,4.05-4.14m,3H,4.89m,1H,7.16-7.36m,5H,7.34d,1H,J=8.4,8.33d,1H,J=6.9,8.65t,1H,J=5.9.MALDI-TOF-MS:C23H35N3O6MH,450.2604,実測値,450.2701.製造例141S-1-1S-2,3-ジオキソ-3-エチルアミノ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステル化合物14参考例1の化合物の代わりに参考例2の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例16の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-3-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:111.9-114.5°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.89t,6H,J=6.3,1.03t,3H,J=7.2,1.43t,2H,J=7.4,1.60-1.91m,3H,2.09m,2H,2.56-2.76m,2H,3.07-3.17m,2H,3.63-3.82m,4H,4.02-4.13m,1H,4.88m,1H,5.09-5.13m,1H,7.16-7.31m,5H,7.34d,1H,J=8.4,8.34d,1H,J=6.9,8.66t,1H,J=5.7.MALDI-TOF-MS:C24H35N3O6MH,462.2604,実測値,462.2870.製造例151S-1-1S-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物15参考例8の化合物の代わりに参考例17の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:109.7-111.1°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.53-0.68m,4H,0.87-0.91m,6H,1.43t,3H,J=7.2,1.59-1.85m,2H,2.01-2.13m,1H,2.56-2.74m,3H,3.25s,3H,3.48-3.51m,2H,4.05-4.14m,3H,4.87m,1H,7.17-7.36m,6H,8.34d,1H,J=6.6,8.69d,1H,J=5.1.MALDI-TOF-MS:C24H35N3O6MH,462.2604,実測値,462.2742.製造例161S-1-1S-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステル化合物16参考例1の化合物の代わりに参考例2の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例17の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソ-1-フェニルエチルプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸3S-テトラヒドロフラン-3-イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:115.8-116.2°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.56-0.59m,4H,0.88t,6H,J=6.3,1.42t,2H,J=7.4,1.60-1.91m,3H,2.09m,2H,2.56-2.76m,3H,3.63-3.81m,4H,4.05-4.13m,1H,4.87m,1H,5.09-5.13m,1H,7.20-7.35m,6H,8.34d,1H,J=6.9,8.69d,1H,J=5.1.MALDI-TOF-MS:C25H35N3O6MH,474.2604,実測値,474.2598.製造例171S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステル化合物17参考例1の化合物の代わりに参考例4の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:127.9-128.7°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.54-0.66m,4H,0.81-0.86m,6H,1.30-1.42m,2H,1.57m,1H,2.73m,1H,2.82dd,1H,J=14.3,9.2,3.11dd,1H,J=13.8,4.2,3.24s,3H,3.42-3.44m,2H,3.50-3.57m,4H,3.99-4.04m,3H,5.17m,1H,7.22-7.30m,6H,8.22d,1H,J=6.9,8.71d,1H,J=4.8.MALDI-TOF-MS:C25H37N3O7MNa,514.2530,実測値,514.2944.[α]D2513.9°c0.20,DMSO製造例181S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルエステル化合物18参考例1の化合物の代わりに参考例5の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸8-メトキシ-3,6-ジオキサオクチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:116.0-117.2°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.58m,2H,0.65m,2H,0.83d,3H,J=7.8,0.85d,3H,J=6.9,1.35m,2H,1.57m,1H,2.73-2.86m,2H,3.11m,1H,3.24s,3H,3.44m,2H,3.51m,6H,3.56t,2H,J=4.7,4.04m,3H,5.17m,1H,7.22-7.31m,6H,8.25d,1H,J=6.9,8.73d,1H,J=5.1.MALDI-TOF-MS:C27H41N3O8MNa,558.2792,実測値,558.2717.[α]D252.5°c0.20,DMSO製造例191S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルエステル化合物19参考例1の化合物の代わりに参考例6の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸11-メトキシ-3,6,9-トリオキサウンデカニルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:97.5-98.5°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.54-0.66m,4H,0.81-0.86m,6H,1.32-1.37m,2H,1.56m,1H,2.73m,1H,2.82dd,1H,J=14.0,9.2,3.11dd,1H,J=14.1,4.2,3.24s,3H,3.41-3.44m,2H,3.50-3.51m,10H,3.54-3.57m,2H,3.99-4.08m,3H,5.16m,1H,7.22-7.31m,6H,8.25d,1H,J=7.2,8.73d,1H,J=5.1.MALDI-TOF-MS:C29H45N3O9MNa,602.3054,実測値,602.3427.[α]D256.9°c0.20,DMSO製造例201S-1-1S-1-ベンジル-2,3-ジオキソ-3-シクロプロピルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸14-メトキシ-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカニルエステル化合物20参考例1の化合物の代わりに参考例7の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸14-メトキシ-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカニルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:98.5-99.9°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.58m,2H,0.65m,2H,0.83d,3H,J=6.9,0.85d,3H,J=7.8,1.35m,2H,1.57m,1H,2.73-2.86m,2H,3.11m,1H,3.24s,3H,3.42m,2H,3.51m,14H,3.56t,2H,J=3.3,4.04m,3H,5.17m,1H,7.22-7.30m,6H,8.24d,1H,J=6.9,8.72d,1H,J=4.5.MALDI-TOF-MS:C31H49N3O10MNa,646.3316,実測値,646.3404.製造例211S-1-1S-2,3-ジオキソ-1-2-メチルプロピル-3-2-フェノキシエチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステル化合物21参考例8の化合物の代わりに参考例18の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-2-ヒドロキシ-1-2-メチルプロピル-3-オキソ-3-2-フェノキシエチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:99.7-100.5°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.88dd,12H,J=12.0,6.3,1.35-1.54m,4H,1.58-1.75m,2H,3.25s,3H,3.46-3.53m,4H,4.03-4.07m,5H,5.06m,1H,6.91-6.95m,3H,7.26-7.31m,3H,8.15d,1H,J=7.2,8.81t,1H,J=5.9.MALDI-TOF-MS:C25H39N3O7MH,494.2866,実測値,494.2967.製造例221S-1-1S-2,3-ジオキソ-1-2-メチルプロピル-3-2-フェノキシエチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステル化合物22参考例1の化合物の代わりに参考例4の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例18の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-2-ヒドロキシ-1-2-メチルプロピル-3-オキソ-3-2-フェノキシエチルアミノプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:53.3-54.1°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.87dd,12H,J=12.2,6.5,1.35-1.54m,4H,1.58-1.75m,2H,3.24s,3H,3.41-3.45m,2H,3.47-3.57m,6H,4.03-4.07m,5H,5.06m,1H,6.91-6.96m,3H,7.26-7.31m,3H,8.17d,1H,J=6.9,8.83t,1H,J=5.7.MALDI-TOF-MS:C27H43N3O8MH,538.3128,実測値,538.3140.製造例231S-1-1RS-3-アミノ-1-ベンジル-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステル化合物23参考例1の化合物の代わりに参考例4の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例19の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1RS-3-アミノ-1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸5-メトキシ-3-オキサペンチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.77d,3H,J=6.3,0.83d,1.5H,J=6.6,0.86d,1.5H,J=6.9,1.05-1.63m,3H,2.68-2.85m,1H,3.12m,1H,3.23s,3H,3.42m,2H,3.51-3.56m,4H,4.03m,3H,5.22m,1H,7.21-7.31m,6H,7.81d,1H,J=14,8.06d,1H,J=18,8.19d,0.5H,J=6.9,8.26d,0.5H,J=7.5.製造例241S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-ピリジン-2-イルエチルエステル化合物24参考例1の化合物の代わりに参考例20の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-ピリジン-2-イルエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.58-0.66m,4H,0.83t,6H,J=7.1,1.31-1.35m,2H,1.53m,1H,2.74m,1H,2.81dd,1H,J=14.1,9.3,3.02t,2H,J=6.3,3.11dd,1H,J=14.0,4.1,4.01m,1H,4.28-4.32m,2H,5.17m,1H,7.14-7.34m,8H,7.75t,1H,J=6.8,8.23d,1H,J=7.2,8.51d,1H,J=4.2,8.71d,1H,J=4.5.製造例251S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-6-メチルピリジン-2-イルエチルエステル化合物25参考例1の化合物の代わりに参考例21の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-6-メチルピリジン-2-イルエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:162.0-163.6°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.54-0.66m,4H,0.76-0.86m,6H,1.54m,1H,2.43s,3H,2.73-2.86m,2H,2.96t,2H,J=6.5,3.11m,1H,4.03m,1H,4.21-4.34m,2H,5.17m,1H,7.07-7.30m,8H,7.58t,1H,J=7.7,8.23d,1H,J=6.9,8.72d,1H,J=4.8.製造例261S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-5-エチルピリジン-2-イルエチルエステル化合物26参考例1の化合物の代わりに参考例22の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-5-エチルピリジン-2-イルエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。融点:119.9-121.0°C.1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.58-0.66m,4H,0.75-0.85m,6H,1.17t,3H,J=7.7,1.33-1.36m,2H,1.53m,1H,2.58dd,2H,J=15.5,8.3,2.74-2.85m,2H,2.94-2.98m,2H,3.12m,1H,4.04m,1H,4.28-4.29m,2H,5.17m,1H,7.13-7.26m,7H,7.55d,1H,J=8.1,8.22-8.35m,2H,8.75m,1H.製造例271S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-tert-ブトキシエチルエステル化合物27参考例1の化合物の代わりに参考例23の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-tert-ブトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.58m,2H,0.65m,2H,0.83d,3H,J=7.5,0.85d,3H,J=6.9,1.12s,9H,1.35m,2H,1.57m,1H,2.74m,1H,2.82m,1H,3.11m,1H,3.45m,2H,3.98m,3H,5.17m,1H,7.24m,6H,8.23d,1H,J=6.6,8.71d,1H,J=4.8.製造例281S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2,3-ジオキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-イソプロポキシエチルエステル化合物28参考例1の化合物の代わりに参考例24の化合物を、参考例8の化合物の代わりに参考例9の化合物を用いて製造例1と同様の反応を行い、1S-1-1S-1-ベンジル-3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-3-オキソプロピルアミノカルボニル-3-メチルブチルカルバミン酸2-イソプロポキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。1H-NMR300MHz,DMSO-d6δ0.58m,2H,0.65m,2H,0.83d,3H,J=7.2,0.85d,3H,J=6.9,1.07d,6H,J=5.7,1.35m,2H,1.57m,1H,2.74m,1H,2.82m,1H,3.12m,1H,3.50m,2H,3.55m,1H,4.01m,3H,5.17m,1H,7.24m,6H,8.22d,1H,J=6.9,8.71d,1H,J=3.6.μ-カルパイン及びm-カルパイン阻害活性の測定μ-及びm-カルパインの阻害活性を文献Anal.Biochem.,1993年、第208巻,p.387-392に記載された方法に準じて測定した。すなわち、種々の濃度の被験化合物を含むDMSO溶液2.5μLに、0.5mg/mLのカゼイン、50mMのトリス塩酸緩衝液pH7.4、20mMのジチオスレイトール及び1.0nmolのμ-カルパインヒト赤血球由来、コスモバイオ株式会社製又はm-カルパインブタ腎臓由来、コスモバイオ株式会社製を含む反応液200μLを96穴プレート上で加えた。そこへ、20mMの塩化カルシウム水溶液50μLを加え、30°Cで60分間反応させた。この反応液100μLを別の96穴プレートに移し、精製水50μLと50のProteinAssayDyeReagentバイオラド社製;カタログNo.500-0006水溶液100μLを加えて室温で15分間放置した後、595nMで吸光度を測定した。被験化合物を含まず同様に処理したものをコントロール値、20mM塩化カルシウム水溶液の代わりに1mMEDTA水溶液50μLを加え同様に処理したものをブランク値とし、下記の式より算出される阻害率を計算し、50阻害に必要な濃度IC50を求めた。阻害率={1-測定値-ブランク値/コントロール値-ブランク値}×100当該濃度IC50を酵素カルパイン阻害活性μMとして、表1に示した。各化合物はμ-カルパイン及びm-カルパインの活性を阻害した。これらの化合物のうち、化合物17を以下の検討に用いた。化合物17はSNJ-1945である。以下、化合物17をSNJ-1945とも表記する。なお、以下の検討において用いた実験動物や実験細胞は、基本的に上記非特許文献1MasamiYamadaet.al.,NatureMedicine15,1202-12072009と同様にして調製した。また、実験動物を死亡させる場合には、まず致死量のエーテルを用いて麻酔を施し、安楽死させた。また、以下の実験でDAPI染色法を用いる場合があるが、DAPIが核を染色する蛍光色素であることはよく知られている。LIS1遺伝子ヘテロ欠損型マウスLIS1ヘテロ変異マウスの作製LIS1ヘテロ変異マウスは以下の方法で作製した。LIS1のコンディショナルノックアウトマウスとして129S-Pafah1b1tm2Awb/JTheJacksonLabolatoryを使用した。このマウスは、イントロンIIとイントロンVの中にloxP配列を挿入し、Cre-loxPシステムでエクソンIII-エクソンVIを欠失させLIS1を不活化するシステムを有するマウスである。この129S-Pafah1b1tm2Awb/Jの雌をホモ型のEII-Cre形質転換マウスFVB/N-TgEIIa-creC5379Lmgd/J、TheJacksonLaboratoryの雄と交配し、Cre蛋白質を部分的に反応させることで129S-Pafah1b1tm2Awb/JTheJacksonLabolatoryが持っているES細胞のセレクションに用いたneo遺伝子を除いた。このneo遺伝子を持たない129S-Pafah1b1tm2Awb/Jどうしを交配し、129S-Pafah1b1tm2Awb/Jのホモマウスを作製した。このneo-129S-Pafah1b1tm2Awb/Jホモマウスの雄をFVB/N-TgEIIa-creC5379Lmgd/JTheJacksonLaboratoryの雌と交配し、LIS1ヘテロ変異マウスを作製した。野生型マウスは、日本クレア株式会社から購入したFVB/NJclマウスを使用した。SNJ-1945による細胞内のLIS1タンパク質量の変化の検討LIS1遺伝子ヘテロ欠損あるいは野生型マウス12.5-14.5日目の胎児各々5匹から線維芽細胞MEF;mouseembryonicfibloblastをそれぞれ樹立した。線維芽細胞は下記の方法により樹立した。妊娠マウスを頸椎脱臼によって殺し、無菌的に直ちにマウス胎児を単離し、ピンセットで頭部および内臓組織を取り除いた後、ハサミでマウス胎児を細かく裁断した。裁断された組織片にTripsin-EDTAGIBCO,2520010mlを加えて50mlのプラスチックチューブNUNC,373687に入れて37°Cで30分インキュベーションした。30分インキュベーションした後、10mlのFetalBovineSerumEQUITECH-BIO,Inc.、SFBM30-1798を加え、10mlピペットNUNC,159633でピペッティングし、細胞を単離した。室温で5分間静置した後に上清を回収し、50mlのプラスチックチューブNUNC,373687に移し替えた後、5分間1000RPMで遠心分離し、上清を捨てた。その後、細胞ペレットをD-MEMWAKO,041-29775,10相当のFetalBovineSerumEQUITECH-BIO,Inc.、SFBM30-1798と1相当のL-GlutamineGIBOCO,25030、PenStrepGIBOCO,15140を加えた細胞培養液で10cm細胞培養シャーレGreinerbio-one,664160で培養した。細胞は3日ごとに10cm細胞培養シャーレGreinerbio-one,664160をPBSで洗浄した。次いでこの細胞培養シャーレに、1mlのTripsin-EDTAGIBCO,252001mlを加えて37°Cで5分インキュベーションして細胞を単離し、D-MEMWAKO,041-29775,10相当のFetalBovineSerumEQUITECH-BIO,Inc.、SFBM30-1798及び1相当のL-GlutamineGIBOCO,25030、PenStrepGIBOCO,15140を加えた細胞培養液9mlを加えて10mlピペットNUNC,159633でピペッティングし、10cm細胞培養シャーレGreinerbio-one,6641605枚に各々2mlずつ加えた。さらに、この細胞培養シャーレに、D-MEMWAKO,041-29775,10相当のFetalBovineSerumEQUITECH-BIO,Inc.、SFBM30-1798及び1相当のL-GlutamineGIBOCO,25030、PenStrepGIBOCO,15140を加えた細胞培養液8mlを加えて計10mlの細胞培養液とし、37°C、5CO2の条件で細胞培養器を用いて培養した。当該細胞を用いて、以下の手順で各細胞においてSNJ-1945が細胞内のLISタンパク質量にどのように影響するかを検討した。具体的には、次のようにしてウエスタンブロットを行うことにより検討した。すなわち、調製した線維芽細胞を蛋白質抽出バッファーで抽出し20mMTris-HClpH7.5,100mMNaCl,5mMEDTA,0.1Triton-X100、蛋白質を定量し、一レーン当たり10μgの蛋白質をのせ、10アクリルゲルで分離SDS-PAGEしたのちに、Immobilon膜Millipore、IPVH00010に転写し、LIS及びDICdyneinintermediatechain:ダイニン量を反映するを検出した。なお、βアクチンは蛋白質量のリファレンスとして利用するため検出した。なお、当該ウエスタンブロットに用いた抗体は以下の通りである。抗LIS1抗体N-19,SC-7577,ヤギポリクローナル抗体、SantaCruzBiotechnology;1:100希釈、抗細胞質ダイニン中鎖抗体74.1,マウスモノクローナル抗体、Millipore;1:100希釈、抗βCOP抗体マウスモノクローナル抗体、Sigma;1:100希釈、抗βアクチン抗体SC-7210,ウサギポリクローナル抗体、SantaCruzBiotechnology;1:100希釈。結果を図1に示す。aに検出されたバンドを、bにバンドのインテンシティーをグラフにしたものを示す。Lis1/-の細胞ではLISタンパク質量が著しく低下しているのに対し、SNJ-1945で処理したLis1/-の細胞ではLISタンパク質量の回復がみられた。このことから、SNJ-1945により脳滑症を治療し得ることが示された。SNJ-1945による細胞内のタンパク質局在の変化の検討LIS1遺伝子ヘテロ欠損あるいは野生型マウス12.5-14.5日目の胎児各々5匹をまとめて一つのグループとし、上述と同様の方法を用いて、線維芽細胞MEF;mouseembryonicfibloblastをそれぞれのグループから樹立した。すなわち、同じ遺伝子型のマウスをまとめて線維芽細胞を確立した。当該細胞を用いて、以下の手順で免疫細胞染色を行ない、各細胞においてSNJ-1945が細胞内のタンパク質局在にどのように影響するかを検討した。まず、6穴プレートNuncにあらかじめ0.1N塩酸で洗浄したスライドガラス24×24mm;松浪硝子を敷き、MEF細胞を1.0×105細胞/穴になるようにD-MEM培養液10ウシ胎児血清を含む,和光純薬中に蒔いた。次いで、この6穴プレートを37°C、5CO2存在下で一晩培養した後、最終濃度が200μMになるようにSNJ-1945を添加した。さらに2時間、同条件下でインキュベーションした。対照実験として、1ジメチルスルホキシドDMSOを添加し同様の実験を行なった。MEF細胞は、リン酸緩衝液PBSで洗浄後、4パラホルムアルデヒドWAKO:162-16065で固定した室温、15分間。このMEF細胞を、0.2TritonX-100で処理後室温、10分間、5ウシ血清アルブミン和光純薬/ブロックエース雪印乳業で室温、1時間ブロッキングした。一次抗体として、抗LIS1抗体N-19,SC-7577,ヤギポリクローナル抗体、SantaCruzBiotechnology;1:100希釈、抗細胞質ダイニン中鎖抗体74.1,マウスモノクローナル抗体、Millipore;1:100希釈、抗βCOP抗体マウスモノクローナル抗体、Sigma;1:100希釈、をそれぞれブロッキング溶液で希釈し、室温で1時間反応させた。反応後、このMEF細胞をリン酸緩衝液PBSで洗浄し、二次抗体としてAlexa546抗マウスIgGInvitrogenあるいはAlexa546抗ヤギIgGInvitrogenをリン酸緩衝液PBSで1:2000希釈したものと室温で1時間反応させた。核染色のために、最終濃度が0.2μMになるようにDAPI4’,6-diamino-2-phenylindole,Invitrogen:D1306を添加し、さらに室温で15分間インキュベーションした。インキュベーション後、この細胞をPBSでよく洗浄し、蛍光顕微鏡観察用グリセロールMerckを用いて包埋した。また、微小管のマイナス端が集積している部位の位置情報を得るため、中心体のマーカーであるγチューブリンについても同様に免疫染色を行った。抗ガンマチューブリン抗体としてはSantaCruzmousemonoclonalantibodyマウスマウスモノクローナル抗体、1:100希釈、二次抗体としては蛍光標識されたInvitrogenAlexa488抗マウスIgG,1:1000希釈を用いた。共焦点レーザー顕微鏡TCS-SP5,Leicaにて丁寧に観察を行った後、各々の因子のそれぞれの条件下でのMEF細胞における細胞内局在を核周辺に集積している細胞と細胞質全体に分布している細胞に2大別して、それぞれの細胞群に対して10標本ずつ、1標本当たり10個の細胞を任意に抽出し、計100個の細胞について評価し、平均値±標準偏差を算出し、スチューデントt-テストunpairedにより有意差検定を行った。結果を図2~図4に示す。図4中の記号は次の意味を表す;N.S.:有意差なし,:P<0.05,:P<0.01,:P<0.001。なお、図2b、図3b、図4bは、細胞を核辺縁部から細胞の辺縁部まで放射状に十分割し、各々の領域での蛍光強度を測定してつまり、核辺縁部から細胞の辺縁部まで等間隔で直線状に10点の蛍光強度を測定して定量化した結果をグラフ化したものである。蛍光強度は所定の蛋白質の量を反映しており、各々の領域にどれだけの蛋白質が存在しているかを示す。LIS1は中心体周辺に多く存在するべきところ、LIS1ヘテロ変異マウスから確立した線維芽細胞は中心体周辺であってもLIS1量が低下している。しかし、SNJ-1945により、LIS1量は正常に戻ることがわかる図2。また、細胞質ダイニンは中心体周辺をピークになだらかなスロープを形成しているのに対して、LIS1ヘテロ変異マウスから確立した線維芽細胞は中心体周辺をピークに急激に低下しており、細胞周辺では正常に比較して枯渇している。しかし、SNJ-1945により、細胞質ダイニン量も正常に戻ることがわかる図3。また、β-COPはゴルジ体線維芽細胞では中心体周辺に局在しているのマーカーの一つであり、細胞質ダイニンの機能をみる指標として一般的に用いられており、正常では中心体に高い密度をもちつつ、細胞周辺に一定の分散を示す。LIS1のヘテロ変異マウスから確立した線維芽細胞では、細胞質ダイニンと同様に細胞の中心に偏在した分布を示す図4。この分布異常は細胞質ダイニンの偏在を反映したものであり、SNJ-1945の投与によって細胞質ダイニンの局在が正常化することに伴って分布が正常化しているのがわかる図4。SNJ-1945による小脳顆粒神経細胞の遊走能の変化の検討LIS1遺伝子ヘテロ欠損あるいは野生型マウス生後3-7日後の小脳それぞれ10匹分を軽くピペッティングにより組織片を破砕した後、0.025トリプシンGIBCO:25200/0.0013DNaseISigma:DN-25で37°C、20分間処理した。遠心後、10ウマ血清を含むBME培養液Gibco:21010を加えて洗浄し、反応を停止した。その後、0.0052DNaseI/10ウマ血清を含むBME培養液を加えてピペッティングし、細胞用メッシュCellstrainer,径70μm;BectonDickinsonを通した後、未処理の24穴プレートに細胞を蒔き、37°C、5CO2で30分間プレインキュベーションした。さらに、DNaseIを含まない10ウマ血清を含むBME培養液中で、8-12時間同様にインキュベーションして、小脳顆粒細胞の凝集塊を形成させた。その後、6穴プレートNunc中に、ポリ-L-リジンSigma:P4707及びラミニンSigma:L4544で処理したカバーガラス24×24mm;松浪硝子を敷き、NutritionalsupplementN-2supplement;Gibco:17502048を含むBME培養液中に小脳顆粒神経細胞の凝集塊を移し、最終濃度が200μMになるようにSNJ-1945を添加した。この凝集塊を18-24時間、37°C、5CO2でインキュベーションした。対照実験として、1ジメチルスルホキシドDMSO,Sigma:D8779を添加し同様の実験を行った。インキュベーション後、凝集塊をリン酸緩衝液PBSで洗浄後、4パラホルムアルデヒドWAKO:162-16065で固定した室温、15分間。次いで、0.2TritonX-100で処理後室温、10分間、核染色の為に、最終濃度が0.2μMになるようにDAPI4’,6-diamino-2-phenylindole,Invitrogen:D1306を添加し、さらに室温で15分間インキュベーションした。その後、PBSで繰り返しよく洗浄し、凝集塊が壊れないように丁寧に蛍光顕微鏡観察用グリセロールMerckを用いて包埋した。共焦点レーザー顕微鏡TCS-SP5,Leicaにて丁寧に観察を行った後、それぞれの細胞群について、小脳顆粒細胞凝集塊の辺縁からの神経細胞の移動した距離μmを測定し、10-210μmを20μmずつに分けて、それぞれの移動距離の範囲内に分布する細胞数を全体の細胞数に対するパーセントで表した。また、平均移動距離μmを算出し、平均移動距離μm±標準偏差で表した。有意差検定は、スチューデントt-テストunpairedにより行った。結果を図5に示す。図5に示されるように、Lis1/-の神経細胞はほとんど遊走しないのに対し、SNJ-1945で処理したLis1/-の神経細胞では遊走能の回復がみられた。このことから、SNJ-1945により脳滑症を治療し得ることが示された。SNJ-1945腹腔内投与によるマウス胎児脳でのLIS1蛋白質の変化の検討ホモ型のEII-Cre形質転換マウスFVB/N-TgEIIa-creC5379Lmgd/J、TheJacksonLaboratoryの雌5匹に対して、neo遺伝子を持たないneo-129S-Pafah1b1tm2Awb/Jホモマウスの雄1匹を同一のマウスケージで飼育することで交配させ、このマウスケージを計6セット用意して交配実験を開始した。なお、neo-129S-Pafah1b1tm2Awb/Jホモマウスは、上述の方法と同様にして作製した。毎朝7-10時の間にプラーク確認交尾の確認を行い、妊娠周期を決定した。SNJ-1945を100mg/mlの濃度でdimethylsulfoxideDMSO,Sigma:D8779に溶かし、胎生12日E12の時点で妊娠母体の腹腔内に投与量が100μg/体重gになるように注入腹腔内投与した。SNJ-1945の投与による効果を判定するために、正常マウス胎児、及びLIS1ヘテロ変異マウス胎児SNJ-1945投与のLIS1の蛋白質を測定した。SNJ-1945投与群においては、時間経過に伴うSNJ-1945の効果を判定するために、投与後0時間投与直後、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、16時間、24時間、48時間、及び72時間の各時間後に脳組織を取り出してLIS1の蛋白質を測定した。なお、LIS1蛋白質の各測定には、マウスを6匹ずつ用いたn=6。母体を頸椎脱臼によって死亡させた後、直ちに胎児を分離し脳組織を単離した。LIS1の蛋白質量の測定はマウス脳を取り出した後、直ちに重量を測定し、マウス脳の重量に対して2倍量の蛋白質溶解液30mMTris-HClpH.6.8,1.5sodiumdodecylsulfateSDS,0.3bromophenolblueBPB,Sigma:B5525-10G,0.32-mercapto-ethanol2-ME,WAKO:135-07522,15glycerolを加え、さらに超音波処理によって完全に可溶化させた。95°C、5分間の熱処理の後、脳組織に由来する蛋白質溶解液1μlを12.5のSDS-アクリルアミド電気泳動によって分離し、抗LIS1抗体N-19,SC-7577,ヤギポリクローナル抗体、SantaCruzBiotechnology;1:100希釈を用いたウエスタンブロティングによって検出した。結果を図6に示す。LIS1ヘテロ変異マウス胎児のLIS1タンパク質量は正常マウス胎児の半分程度であるが、SNJ-1945投与により正常程度にまで回復した。また、一回の投与により、その効果は少なくとも3日間持続することが解った。このことから、SNJ-1945により脳滑症を治療し得ることが示された。SNJ-1945経口投与によるマウス新生児脳でのLIS1蛋白質の変化の検討ホモ型のEII-Cre形質転換マウスFVB/N-TgEIIa-creC5379Lmgd/J、TheJacksonLaboratoryの雌5匹に対して、neo遺伝子を持たないneo-129S-Pafah1b1tm2Awb/Jホモマウスの雄1匹を同一のマウスケージで飼育することで交配させ、このマウスケージを計6セット用意して交配実験を開始した。毎朝出産を確認し、出産確認時を新生児と定義した。SNJ-1945を100mg/mlの濃度でdimethylsulfoxideDMSOに溶かし、投与量が200μg/体重gになるようにピペットを用いて経口で投与した。SNJ-1945の投与による効果の判定のために、正常マウス新生児、及びLIS1ヘテロ変異マウス新生児SNJ-1945投与のLIS1の蛋白質を測定した。SNJ-1945投与群においては、時間経過に伴うSNJ-1945の効果を判定するために、投与後0時間投与直後、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間の各時間後に脳組織を取り出してLIS1の蛋白質を測定した。なお、LIS1蛋白質の各測定には、それぞれマウスを6匹ずつ用いたn=6。新生児マウスを断頭して死亡させた後、直ちに脳組織を単離した。LIS1の蛋白質量の測定は、マウス脳を取り出した後、直ちに重量を測定しマウス脳の重量に対して2倍量の蛋白質溶解液30mMTris-HClpH.6.8,1.5sodiumdodecylsulfateSDS,0.3bromophenolblueBPB,0.32-mercapto-ethanol2-ME,15glycerolを加え、さらに超音波処理によって完全に可溶化させた。95°C、5分間の熱処理の後、脳組織に由来する蛋白質溶解液1μlを12.5のSDS-アクリルアミド電気泳動によって分離し、抗LIS1抗体N-19,SC-7577,ヤギポリクローナル抗体、SantaCruzBiotechnology;1:100希釈を用いたウエスタンブロティングによって検出した。結果を図7に示す。LIS1ヘテロ変異マウス新生児のLIS1タンパク質量は正常マウス新生児の半分程度であるが、SNJ-1945投与により正常程度にまで回復した。また、一回の投与により、その効果は少なくとも3日間持続することが解った。このことから、出生後であっても、SNJ-1945の経口投与により脳滑症を治療し得ることが示された。SNJ-1945腹腔内投与によるマウス成体脳でのLIS1蛋白質の変化の検討LIS1-テロ変異マウスに対してSNJ-1945を100mg/mlの濃度でdimethylsulfoxideDMSOに溶かし、生後3週間の時点で投与量が100μg/体重gになるように腹腔内に注入した。SNJ-1945の投与による効果の判定のために、正常マウス成体、及びLIS1ヘテロ変異マウス成体SNJ1945投与のLIS1の蛋白質を測定した。SNJ-1945投与群においては、時間経過に伴うSNJ-1945の効果を判定するために、投与後0時間投与直後、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間の各時間後に脳組織を取り出してLIS1の蛋白質を測定した。なお、LIS1蛋白質の各測定には、それぞれマウスを6匹ずつ用いたn=6。生体マウスを頸椎脱臼によって死亡させた後、脳組織を直ちに単離した。LIS1の蛋白質量の測定は、マウス脳を取り出した後、直ちに重量を測定しマウス脳の重量に対して2倍量の蛋白質溶解液30mMTris-HClpH.6.8,1.5sodiumdodecylsulfateSDS,0.3bromophenolblueBPB,0.32-mercapto-ethanol2-ME,15glycerolを加え、さらに超音波処理によって完全に可溶化させた。95°C、5分間の熱処理の後、脳組織に由来する蛋白質溶解液1μlを12.5のSDS-アクリルアミド電気泳動によって分離し、抗LIS1抗体N-19,SC-7577,ヤギポリクローナル抗体、SantaCruzBiotechnology;1:100希釈を用いたウエスタンブロティングによって検出した。結果を図8に示す。LIS1ヘテロ変異マウス成体のLIS1タンパク質量は正常マウス成体の半分程度であるが、SNJ-1945投与により正常程度にまで回復した。また、一回の投与により、その効果は少なくとも3日間持続することが解った。このことから、出生後であっても、SNJ-1945の投与により脳滑症を治療し得ることが示された。SNJ-1945腹腔内投与によるマウス胎児脳のアポトーシスに与える影響の検討ホモ型のEII-Cre形質転換マウスFVB/N-TgEIIa-creC5379Lmgd/J、TheJacksonLaboratoryの雌5匹に対して、neo遺伝子を持たないneo-129S-Pafah1b1tm2Awb/Jホモマウスの雄1匹を同一のマウスケージで飼育することで交配させ、このマウスケージを計6セット用意して交配実験を開始した。毎朝7-10時の間にプラーク確認交尾の確認を行い、妊娠周期を決定した。SNJ-1945を100mg/mlの濃度でdimethylsulfoxideDMSOに溶かし、隔日でE9.5日妊娠9.5日より100μg/体重gを、LIS1変異マウスLis1/-およびコントロールマウス正常胎児マウスの妊娠マウス母体の腹腔内に投与した。E15.5妊娠15.5日において、マウス母体を頸椎脱臼によって死亡させた後、マウス胎児を取り出し4パラホルムアルデヒドWAKO:162-16065で24時間固定し、PBSに置換後、乗法に従ってパラフィン包埋を行った。組織ブロックを5μm厚の切片にし、APSコートのスライドグラスの上に接着させた。脱パラフィン操作の後、20μg/mlのproteinaseK/PBS処理を室温で15分行い3のH2O2/PBS処理を室温で10分行った。ApopTagApoptosisDetectionKitMillipore:S7100を用いてTUNNELTdT-mediateddUTPnickendlabelingstainを行いアポトーシスを検出した。なお、TUNNELstainは断片化DNAを検出することによりアポトーシスを検出することができる方法として知られている。結果を図9に示す。正常マウスではほとんどアポトーシスは見られないが、LIS1変異マウスでは高頻度にアポトーシスが見られた。さらに、SNJ-1945の投与により、LIS1変異マウスに見られるアポトーシスは有意に軽減することがわかった。このことから、SNJ-1945の投与により滑脳症の症状が軽減され得ると考えられた。滑脳症モデルマウスLIS1遺伝子ヘテロ欠損マウスの行動解析滑脳症患者は、運動機能が著しく低下している。そこで、滑脳症の治療効果を確認するため、滑脳症モデルマウスの運動機能を指標とした検討を行った。<行動解析実験用マウスの準備>行動解析実験に当たり、野生型マウスとLis1/-のヘテロ変異体マウスを5つの群C群、M1群、M2群、M3群、及びM4群へと群分けした。各群に属するマウスの詳細は、次の通りである。なお、餌としてはCE-2、日本クレアを用いた。使用した野生型マウス及びヘテロマウスの作製方法は、上述のLIS1遺伝子ヘテロ欠損型マウスLIS1ヘテロ変異マウスの作製と同様である。C群:コントロール群の野生型マウスM1群:SNJ-1945の非投与のLis1ヘテロマウスM2群:SNJ-1945を100mg/mlの濃度でdimethylsulfoxideSigmaD-5879に溶かし、胎生9.5日E9.5の時点で、投与量が200μg/母体体重g/日になるよう、妊娠母体の餌にSNJ-1945を加えて投与し、さらに出生後は下記M3群と同様の投与を行った、Lis1ヘテロマウスM3群:生後当日より0.5CMCcarboxymethylcellulosesodiumsalt:和光039-01335にSNJ-1945を50mg/mlの濃度で溶解したものを200μg/体重g/日になるように強制経口投与を行い、さらに生後21日目からは投与量が200μg/体重g/日になるように餌にSNJ-1945を加えたものを投与した、Lis1ヘテロマウスM4群:生後10日目より0.5CMCcarboxymethylcellulosesodiumsaltにSNJ-1945を50mg/mlの濃度で溶解したものを200μg/体重g/日になるように強制経口投与を行い、さらに生後21日目からは投与量が200μg/体重g/日になるように餌にSNJ-1945を加えたものを投与した、Lis1ヘテロマウス食餌CE-2、日本クレアにSNJ-1945を混ぜ、SNJ-1945投与量が200μg/体重g/日になるように継続的に各マウスに経口投与した。行動解析実験は、各群12~16匹のマウスを用意し、行動実験施設で1~2週間予備飼育した後、約9週齢から12週齢の期間に行った。行動解析実験終了後は、遺伝子型の判定を行い、全てのマウスについて遺伝子型を確認した。なお、行動解析の結果が各群の違いに起因することを保証するため、行動解析開始前に、以下のi~ivの点において、異常を示すマウスがいないことを確認した。i健康状態直腸温測定、体重測定を行い、直腸温や体重において各群に異常、有意差がないことを確認した。また、ひげの状態ひげが短くなっていないか、なくなっていないか、体毛の状態体毛がはげていないか、毛並みがきちんと整えられているかの確認を行った。問題のある個体はいなかった。ii神経学的な異常神経学的な異常がないか、以下の項目について確認した。RightingReflexひっくり返して元に戻るかWhisker-Twitchひげを触ったときに、振り返る等の反応があるかEar-Twitch耳を触ったときに、振り返る等の反応があるかReaching宙づりしたときに前の机に手を伸ばすか、視覚の確認KeyJangling鍵束を振る音への反応があるか、聴覚、痙攣感受性の確認。これらの項目について、反応に異常があるマウスはいなかった。iii握力と筋力握力測定と筋力測定を行い、握力、筋力に問題がないか、以下の項目について確認した。Wirehangtestマウスを金網にしがみつかせてから、金網をひっくり返すテストGripStrengthtestマウスを金網にしがみつかせて引っ張り、マウスの筋力を測定するテストこれらの試験の結果、各群には有意な差はなく、握力や筋力に問題がないことがわかった。iv不安様行動不安様行動のテストとして、明暗選択テストを行った。明るい箱と暗い箱が、一か所で接続されている装置を用意し、マウスを暗箱の中に置く。マウスは一般的に暗い場所を好むが、探索行動を行うために明るい箱にも侵入する。10分間に明箱と暗箱にそれぞれ滞在していた時間、明箱と暗箱を行き来した回数、最初に明箱に入るまでの潜時、移動距離を測定した。明箱の滞在時間が短い、行き来した回数が少ない、最初に明箱に入るまでの潜時が長いなどのときは、不安様行動が亢進していると考えられる。実験の結果、各群に有意差がなく、また、明箱、暗箱それぞれの滞在時間に差がなかった。不安様行動は亢進していないと考えられ、実験環境、実験者等に訓化していることが確認できた。<統計処理>マウスの行動解析実験データの統計処理は、統計ソフトStatViewSASinstituteを用いて行った。前記5群全体についてANOVA解析多群の分散分析を行い、危険率p値が5以下p<0.05のものについて有意差ありと判定した。ANOVA解析で比較対象決定後の多重比較事後比較には、Fisher’sPLSD法を用いた。<行動解析実験1:ローターロッドテスト>協調運動運動学習のテストとして、ローターロッドテストを行った。当該テストの概要は次の通りである。円柱状の棒ロッドが一定の速度で回転する装置を用意し、マウスを回転するロッドにのせると、マウスは落ちないようにロッドの上を歩く。ロッドの回転スピードを5分間の間で、5rpmから40rpmまで加速していった。1試行は、マウスがロッドから落ちるか、5分が経過するまで行った。実験は1日3試行で2日間合計6試行行った。試行を繰り返すにつれ、マウスはロッドからなかなか落ちなくなるため、ロッドの上での滞在時間が長くなる。運動学習能力が減少している劣るマウスは、ロッドから落ちないような運動の上達が悪くなり、ロッドの上での滞在時間が長くならない。実験の結果、C群が、もっとも運動の上達が早く、滞在時間が長かった図10、11。M1群はC群と比べて、運動の上達が遅く、滞在時間が有意に減少しており、よって運動学習能力が減少していることがわかった図10、11。SNJ-1945投与を行ったM2、M3群は、運動の上達曲線がM1群とC群の中間にあり図10、総合滞在時間は、C群と有意差がないレベルまで長くなっており、SNJ-1945の経口投与による運動学習能力の改善が確認できた図11。<行動解析実験2:GaitAnalysis>運動機能の異常や小脳失調などを調べるため、歩行足跡を解析するテストGaitAnalysisを行った。具体的には、24cm/秒で回転する透明なトレッドミル上にマウスを乗せて、歩行させ、下から高速カメラ150flame/秒で撮影して足跡を専用ソフトDigiGait,MOUSESPECIFICS,Inc.で解析した。このテストで、歩幅や足の角度の他、足の付き方や離れ方など多種の指標を評価した。GaitAnalysisの主な解析項目SwingDuration:足が空中に浮いている時間Swing:一歩踏み出す動作において、足が空中に浮いている時間の割合BrakingDuration:ベルトに足がついてから、完全に足がベルトに密着するまでの時間Braking:一歩踏み出す動作において、ベルトに足がついてから、完全に足がベルトに密着するまでの時間の割合BrakeofStance:足がベルトに接している動作において、ベルトに足がついてから、完全に足がベルトに密着するまでの時間の割合PropulsionDuration:完全に足がベルトに密着してから、足がベルトから離れる直前までの時間Propulsion:一歩踏み出す動作において、完全に足がベルトに密着してから、足がベルトから離れる直前までの時間の割合PropelofStance:足がベルトに接している動作において、完全に足がベルトに密着してから、足がベルトから離れる直前までの時間の割合StanceDuration:足がベルトに接している時間Stance:一歩踏み出す動作において、足がベルトに接している時間の割合StrideDuration:一歩踏み出すのにかかる時間Swing-to-stanceration:足が空中に浮いている時間と足がベルトに接している時間の比有意差があったのは、Swing一歩踏み出す動作において、足が空中に浮いている時間の割合とSwing-to-stanceratio足が空中に浮いている時間と足がベルトに接している時間の比であった。そこで、これらを指標とした検討を行うこととした。なお、Swingは、関節炎などがある動物の場合、値が上昇することが知られている。これは、空中で足を踏み出す場合に、関節がスムーズに動かないためと考えられている。C群に比べて、M1群は有意にSwingが上昇しており、足を踏み出す運動機能に異常があると考えられた図12。SNJ-1945投与を行ったM2,M3,M4群は、C群と有意差がなく、運動機能の改善が確認できた。Swing-to-stance-ratioは、歩き方が変わる時に変化する値で、走っている状態に近づくほど1に近くなる。C群に比べて、M1群は有意にSwing-to-stance-ratioが減少し、1に近づいているが、SNJ-1945を投与したM2群は、C群と有意差がないレベルに戻り、M3及びM4群でもM1群に比べ1に近づいていた図13。これらの結果から、胎児期、および生後のSNJ-1945の経口投与による運動機能の改善が確認できた。ヒト滑脳症患者由来細胞の解析<ヒト滑脳症患者の遺伝子診断>滑脳症患者および両親より血液1mlを採取し、1.5ml用のサンプルカップBio-BIK:SC-015用いて4°C、3000回転/分で遠心分離を行った。白血球を含む沈殿表層を50μl採取し、DNA抽出buffer250μl10mMTris-HClpH7.5、0.5sodiumdodecylsulfate,10mMethylenediaminetetraaceticacid,ProteinaseK10μg/mlRoche03-115-852-001に溶解し、37°Cで1時間反応させた。その後、Phenol100μl、Chloroform100μlを加え、激しく混和したのち4°C、15,000回転/分で5分間遠心分離を行った。上清250μlを新たな1.5ml用のサンプルカップBio-BIK:SC-015に移し、3M酢酸ナトリウム30μl、エタノール700μlを加え、混和したのち4°C、15,000回転/分で5分間遠心分離を行った。上清を捨て、沈殿したDNAを溶解バッファー100μl10mMTris-HClpH7.5、1mMethylenediaminetetraaceticacidに溶かし、遺伝子診断に用いた。遺伝子診断は、tctaaaatagttatcctttgttacとaggtgaataaaggaacactgtacaをプライマーとしてPCRで遺伝子を増幅して行った。患者のDNA1μl、10mMdNTP1μl,100μMプライマー1μl,BIOTAGBiolineBio210400.5μlを計50μlの反応液に加え、94°C:20秒、55°C:30秒、72°C:60秒を35サイクル回すPCRAppliedBiosystemsGeneAmp9700で増幅し、DNAの塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定はtctaaaatagttatcctttgttacとaggtgaataaaggaacactgtacaをプライマーとしてBigDyeTerminatorv3.1AppliedBiosystems4336917を用いて行った。サイクルシーケンスは、94°C:20秒、55°C:30秒、60°C:4分を35サイクルAppliedBiosystemsGeneAmp9700で行い、反応物をABI3500xLAppliedBiosystemsで判読した。その結果、タンパク質翻訳領域の460番目のcytosineがthymineに置き換わっており、これによりストップコドンが生じ、タンパク質の翻訳がそこで終了することによって機能的に不活性なLIS1ができることが分かった図14。<ヒト滑脳症患者由来線維芽細胞の確立>線維芽細胞の確立は次のようにして行った。即ち、無菌的に上記滑脳症患者から表皮の一部5mm四角を提供してもらい、培養液E-MEM和光051-07615、10ウシ胎児血清Equitech-BioInc、SFBM30-1798、1xL-GlutamineGibco25030,1xPenStrepGibco15140;以下、培養液として当該組成のものを使用した中に保存して室温で4時間輸送した。輸送後、組織片を1mm四角に裁断し、培養フラスコBectonDickinson353009に固着させ、培養液6ml中で3週間培養した。3週間培養の後、組織片からの線維芽細胞が増殖を確認の後、Phosphatebufferedsaline、PBS-、137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.4で洗浄しTrypsin-EDTAGibco25200を0.5ml加えて37°Cで5分間反応させ細胞を分離したのち、培養液を10ml加え、10cmシャーレGreiner664-160に移して培養した。<細胞蛍光免疫染色>細胞を顕微鏡で観察するために、カバーガラス上で細胞を培養した。カバーガラス24x24No.1、マツナミを、0.1M塩酸に20分浸けて、水洗後、70エタノールにいれてクリーンベンチ内で保存した。クリーンベンチ内で6wellプレートFALCON353046の各well底に当該カバーガラスを一枚ずつ置き、エタノールを乾燥させた後、1wellあたり0.5x105個の線維芽細胞を添加し、16時間培養して、カバーガラス上に細胞を接着させた。SNJ-1945含有培養液を用意した。具体的には、DIMETHYLSULFOXIDESIGMAD-5879に溶解したSNJ-1945を培養液に最終濃度200μMとなるように混合し、1時間37°Cに静置し、SNJ-1945を培地に溶解させて、SNJ-1945含有培養液とした。上述の6wellプレートで培養した細胞に対し、well中の培地を捨てた後SNJ-1945含有培養液を2ml/wellで加えて、2時間培養を行った。またコントロールとして、同量のDIMETHYLSULFOXIDEを添加した培養液を用いて、同様に培養を行った。2時間培養後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水Phosphatebufferedsaline、PBS-、137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.4で洗浄し、4ParaformaldehydePFAinPBS-和光163-20145を加え、室温で15分おいて、細胞を固定した。PBS-で洗浄し、0.2tritonX-100Polyoxyethylen10OctylphenylEther,和光168-11805inPBS-を加え、室温で10分おいて、細胞の浸透化を行った。さらに細胞をPBS-で洗浄し、Blockingsolution3BSASigmaA3156-5G、4ブロックエース粉末雪印乳業株式会社、PBS-を添加し、室温で一時間おいて、非特異的結合をブロックできるようにしたブロッキング処理。一次抗体は、15000rpm、4°C、5分遠心したものの上清をBlockingsolutionで100倍希釈して使用した。Wetchamberにパラフィルムをひいて、抗体溶液を300μlのせ、カバーガラスの細胞面が下になるように当該抗体溶液上において、室温で1時間静置して反応させた。PBS-を入れた6wellプレートに細胞の接着したカバーガラスを戻し、5分間振とうする洗浄を4回繰り返した。二次抗体と、核を染色するための色素10mMDAPI4’,6-diamidino-2-phenylindole,同仁28718-90-3は、15000rpm、4°C、5分遠心したものの上清をPBS-で1000倍DAPIは500倍希釈し、1wellあたり1.5ml加えて、遮光し、室温で1時間ゆっくり振とうさせながら反応させた。PBS-を加えて、5分振とうする洗浄を4回繰り返した。スライドガラス蛍光染色用S0318、マツナミに封入液FluorSaveReagent、CALBIOCHEMを一滴ずつ滴下し、細胞面が下になるようにカバーガラスをかぶせて封入した。空気の侵入を防ぐために、カバーガラスの周囲をラッカーで密封した。30分~1時間程度固定して、カバーガラス表面を、水を含ませた麺棒で洗浄した後、エタノールを含ませた麺棒でクリーニングを行い、観察試料とした。なお、蛍光染色用に用いた抗体の一覧を以下の表2に示す。<共焦点顕微鏡観察>蛍光免疫染色を行った細胞の観察を共焦点顕微鏡TCSFP5S,Leicaで行った。3種類のレーザーDiode405nm,Argon488nm出力30,HeNe543nmを用いて、蛍光色素を励起し、油振対物レンズHCXPLApolambdablue63x1.4Oilを使用して観察した。画像の撮影には専用ソフトウェアLASAF,Leicaを使い、Zoomx2,512x512pixel,scanspeed400Hz,frameaverage4の条件で撮影した。細胞の境界は、微分干渉像を同時に撮影して得た。撮影画像は、LIFLeicaImageFormatファイルから、TIFF形式のファイルに変換して画像解析を行った。蛍光顕微鏡画像の解析は、ImageJNIHを用いて行った。LIS1の分布:図15及び図16抗Lis1抗体を用いて蛍光免疫染色した培養細胞を用いて、LIS1の細胞内の分布を観察した。その結果、正常なLis1/細胞では、LIS1は、核および中心体周辺に局在しており、細胞辺縁部には、ほとんど見られなかった。Lis1/-細胞では、Lis1/細胞で見られた核周辺へのLIS1の集積が失われ、核周辺から細胞辺縁部まで、一様に分布していた。特にLis1/細胞ではほとんど見られなかった、細胞の縁に沿った分布が顕著に観察された。このLis1/-細胞をSNJ-1945で処理すると、再びLis1/と同様に、核および中心体周辺へLIS1が集積することが確認できた。このことから、SNJ-1945処理によって、ヒト滑脳症患者由来細胞のLIS1の細胞内分布を、正常な細胞と同様の分布へと回復させることができることがわかった。細胞質ダイニンの分布:図17及び図18抗DIC細胞質ダイニン中間鎖抗体を用いて蛍光免疫染色した培養細胞を用いて、細胞質ダイニンの細胞内の分布を観察した。その結果、Lis1/細胞では、細胞質ダイニンは、核および中心体周辺から、細胞辺縁部にかけて、ゆるやかな勾配を持ちながら、全体に分布していた。一方、Lis1/-細胞では、周辺部への細胞質ダイニンの拡散が失われて、核および中心体周辺に細胞質ダイニンの強い局在が見られた。このLis1/-細胞をSNJ-1945で処理すると、再びLis1/細胞と同様に、核周辺から細胞辺縁部にかけて、細胞質ダイニンが全体に分布するようになった。このことから、SNJ-1945処理によって、ヒト滑脳症患者由来細胞の細胞質ダイニンの細胞内分布を、正常な細胞と同様の分布へと回復させることができることがわかった。β-COP小胞の分布:図19及び図20β-COP小胞の細胞内の分布を、抗β-COP抗体を用いて観察した。その結果、Lis1/細胞では、β-COP小胞は、核および中心体周辺から、細胞辺縁部にかけて、ゆるやかな勾配を持ちながら、全体にほぼ均一に分布していた。Lis1/-細胞では、核周辺以外へのβ-COP小胞の拡散が失われて、核および中心体周辺に大きくβ-COP小胞が局在していた。このLis1/-細胞をSNJ-1945で処理すると、再びLis1/細胞と同様に、核周辺から細胞辺縁部にかけて、β-COP小胞がほぼ一様に分布するようになった。このことから、SNJ-1945処理によって、ヒト滑脳症患者由来細胞のβ-COP小胞の細胞内分布を、正常な細胞と同様の分布へと回復させることができることがわかった。なお、図16、18、20は、図2b、図3b、図4bと同様の解析結果を示すグラフである。すなわち、具体的には、次のようにして作成したグラフである。LIS1、細胞質ダイニン、β-COP小胞それぞれの細胞内局在を、核辺縁部から細胞の辺縁部まで等間隔で直線状に10点の蛍光強度を測定した。各条件においてそれぞれ20個の細胞を計測し、各点の蛍光強度は細胞全体の蛍光強度を1として規格化した値をグラフ化した。誤差線は標準誤差を示す。LIS1の分布は、正常な細胞で核周辺部に集積し、Lis1/-細胞では、細胞全体に拡散してしまうが、SNJ-1945処理によって、正常な細胞と同レベルまで核周辺部への集積が回復した図16。細胞質ダイニンとβ-COP小胞は、正常な細胞では細胞全体に分布しているが、Lis1/-細胞では、細胞核周辺部への集積が起こる。SNJ-1945処理によって、正常な細胞と同様の細胞内分布に回復させることができた図18、20。<タンパク質定量>細胞抽出液の調製クリーンベンチ内で6wellプレートに1wellあたり3x105個の細胞を添加し、16時間培養し、プレートの各wellに細胞を接着させた。Well中の培地を捨て、上記SNJ-1945含有培養液DIMETHYLSULFOXIDEにSNJ-1945を溶解させたものを、SNJ-1945終濃度が200μMとなるよう加えた培養液を2ml/wellの割合で加え、2時間培養を行った。またコントロールとして、同量のDIMETHYLSULFOXIDESIGMAD-5879を添加した培地を用いて同様に培養を行った。SNJ-1945を添加して2時間培養した後、細胞をPBS-で2回洗浄し、PBS-500μlを加えて、セルスクレイパーで細胞を掻き取った。1.5mlチューブに回収し、15000rpm、5分、4°Cで、遠心し、上清を捨て、細胞の沈澱を得た。PBS-500μlを、細胞を掻きとったあとのwellに入れて、再度セルスクレイパーで残った細胞を掻き取り、沈殿に加えた。15000rpm、5分、4°Cで、遠心し、上清を捨て、細胞の沈澱を得た。さらに、PBS-500μlを、細胞を掻きとったあとのwellに入れて、残った細胞を回収し、沈殿に加え、15000rpm、5分、4°Cで、遠心し、上清を捨て、細胞の沈澱を回収した。細胞を回収したチューブに70μlずつLysatebufferを加え、ピペッティングして細胞を溶解し、細胞懸濁液を得た。なお、Lysatebufferは用時調整とし、組成は次の通りである。20mMtris-HCl2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol,pH7.5,100mMNaCl,5mMEDTA,0.1tritonX-100,10μg/mlpepstatinA,10μg/mlaprotinin,10μg/mlLeupeptin,1mMPMSFBenzylsulfonylFluoride,SIGMAP7626-5G次に、当該細胞懸濁液を液体窒素で凍結させた。そして、凍結させた細胞懸濁液をもう一度溶かした。この細胞懸濁液をさらにピペッティングし、超音波処理を行い、細胞を溶解させた。この液体窒素凍結、ピペッティング、超音波の一連の処理を3回繰り返した。その後、15000rpm、5分、4°Cで、遠心し、上清を回収し、新しいチューブに入れた。これを細胞抽出液として実験に用いた。Westernblotting細胞抽出液の吸光度を測定し、溶液全体のタンパク定量を行った。Lysatebufferに溶かしたウシ血清アルブミンBovineserumalbumin,BSA,SigmaA3156-5Gを標準試料として用いた。96wellplateに、ブラッドフォード試薬を200μl入れ、細胞抽出液2μlを加えて、595nmの吸光度を96wellplatereaderARVOSxPerkinElmerで測定し、全体のタンパク量を定量した。次に、SDS-PAGEを行った。10ポリアクリルアミドミニスラブゲルを用意し、細胞抽出液をサンプルバッファ250mMTris-HClpH6.8,40glycerol,8sodiumdodecylsulfateSDS,52-mercaptoethanol,5Bromophenolblueと3:1で混合した。ブラッドフォード法で定量したタンパク量をもとに、10μg/wellをとなるように、ゲルの各wellにLoadした。同時に電気泳動用タンパク質マーカーPrecisionPlusProteinStandardsdualColor161-0373,BIO-RADを5μlLoadした。泳動buffer25mMtris,192mMglycine,0.1sodiumdodecylsulfateSDSを用いて、ミニスラブゲル1枚当たり20mA,85分の条件で電気泳動を行った。電気泳動終了後のゲルからPVDFメンブレンImmobilon-PIPVH00010,MILLIPOREにタンパク質を転写した。150mA,90分の条件で転写を行った。なお、転写のために用いたTransferbufferの組成は次の通りである。A液:0.3Mtris-HClpH9.6,0.02SDS,B液:25mMtris-HClpH10.2,0.02SDS,C液:25mMtris-HClpH10.2,0.02SDS,2mM6-アミノヘキサン酸タンパク質転写後のメンブレン1枚当たり30mlのBlockingbuffer5BSA,4ブロックエース、25mMtris-HClpH7.6,137.7mMNaCl,0.1tween-20にメンブレンを入れて、室温で1時間振とうして、非特異的結合をブロックしたブロッキング処理。一次抗体は、15000rpm、4°C、5分遠心したものの上清をBlockingsolutionで100~300倍希釈して使用した。一次抗体は、WetChamber内で室温下、1時間メンブレンと反応させた。一次抗体反応後、TTBSbuffer25mMtrispH7.6,137.7mMNaCl,0.1tween-20で10分間振とうし、3回メンブレンの洗浄を行った。二次抗体は、15000rpm、4°C、5分遠心したものの上清をTTBSに1000倍希釈して使用した。二次抗体は、WetChamber内で室温下、1時間メンブレンと反応させた。TTBSbufferで10分間振とうし、3回洗浄した。MilliQ水で3分間振とうし、3回洗浄した。APbuffer100mMtrispH9.5,100mMNaCl,5mMMgCl2にNBT/BCIP液NBT/BCIPStockSolution,Rocheを1加えたものを発色液として、メンブレンを発色液に浸し、10分から30分発色させた。MilliQ水で3分間振とうし、3回洗浄した。キムタオルで画面をはさんでメンブレンを乾燥させた。なお、当該Westernblottingに用いた一次抗体及び二次抗体の一覧を、以下の表3に示す。ルミノイメージアナライザーLAS-3000富士フィルムを用いて、乾燥させたメンブレンを解析し、画像の取り込みを行った。専用ソフトLAS3000IR富士フィルムを用いて、Exposuretype-Precision,Exposuretime-Auto,Sensitivity-Standard,Brightness-5の条件で、Method-DigitizeEPIモードで撮影した。撮影した画像TIFF形式で保存し、専用の画像解析ソフトウェアMultiGaugeV3.1富士フィルムを用いて、目的のタンパク質のバンドの吸光度を測定した。ヒト線維芽細胞内のLIS1,細胞質ダイニン、β-actinそれぞれのタンパク質の総量をWesternblottingのバンドによって確認した図21。また、実験を4回行った結果の平均をグラフ化した図22:誤差線は標準誤差を示し、有意差は危険率5でt検定を行って判定した。その結果、Lis1/-の細胞のLIS1の量は、正常な細胞のLis1/と比べて半分以下に減少していたが、薬剤処理を行った後のLIS1の量は、Lis1/のLIS1のレベル近くまで回復していた。細胞質ダイニン中間鎖の量も増加がみられた。コントロールタンパク質として観察したβ-actinの量の変化は見られなかった。このことから、SNJ-1945によって、タンパク質分解酵素であるカルパインの機能を阻害することで、LIS1の分解が抑えられて、細胞内のLIS1の量が正常細胞に近いレベルにまで増加したことが確認できた。SNJ-1945以外のカルパイン阻害剤を用いた検討参考検討例正常マウス及びLis1/-のヘテロ変異体マウス各群8匹を、通常食餌CE-2、日本クレアで飼育し、生後3週齢で、カルパイン阻害剤であるALLNMerck208719を10mg/mlとなるようdimethylsulfoxideに溶かし、ALLN40μg/g体重相当量をマウス腹腔内に注入した。また他のカルパイン阻害剤であるE64dRoche1585681を10mg/mlとなるようdimethylsulfoxideに溶かし、E64d20μg/g体重相当量をマウス8匹の腹腔内に注入した。注入後、6時間及び24時間後に投与マウスを麻酔処置後頸椎脱臼によって死亡させ、直ちに脳組織を単離した。LIS1の蛋白質量の測定はマウス脳を取り出した後、直ちに重量を測定し、マウス脳の重量に対して2倍量の蛋白質溶解液30mMTris-HClpH.6.8,1.5sodiumdodecylsulfateSDS,0.3bromophenolblue,0.32-mercapto-ethanol,15glycerolを加え、さらに超音波処理によって完全に可溶化させた。95°C、5分間の熱処理の後、脳組織に由来する蛋白質溶解液1μlを12.5のSDS-アクリルアミド電気泳動によって分離し、抗LIS1抗体を用いたウエスタンブロッティングによってLIS1を検出した。なお、抗体は上記表3に記載したものを用いた。なお、以下にALLN及びE64dの構造式を示す。結果を図23に示す。Lis1ヘテロ変異マウス胎児のLIS1タンパク質量は正常マウス胎児の半分程度であるところ、ALLN,E64dを投与してもLIS1タンパク質の量の改善は認められず、ALLN,E64dは滑脳症治療薬として期待できないことが分かった。各カルパイン阻害剤の毒性の検討生後4~5日目のFVBマウス15匹より小脳を切り出し、Ca2-freeHank’sbalancedsaltsolutionCF-HBSS;Ca2,Mg2-freeHank’sbalancedsaltsolutionCMF-HBBS,SIGMAに5mM塩化マグネシウムMgCl2,Wakoおよび4mg/mLGlucoseWakoを含ませたもの内で髄膜を取り除き、細かく切断した。小脳片をCF-HBSSで洗浄後、0.025トリプシンinvitrogenおよび6.25μg/mLDeoxyribonucleaseDNase,SIGMAを含むCF-HBSS内にて37°Cで20分放置して、遠心した。得られた組織を10HS/BMEDNaseMedium10HorseSerumHS,invitrogenを含むBasalMediumEagleBME,invitrogen10HS/BMEに5mMMgCl2および25μg/mLDNaseを添加したもので洗浄遠心し、細胞にDNaseMediumを加えて24well-platenuncに移し、5CO2を含む大気下37°Cで30分静置し、細胞を浮遊させた。細胞浮遊液を回収後10HS/BMEで洗浄し、再び24well-platに移し5CO2含む大気下37°Cで16時間培養した。細胞を1BovineSerumAlbuminBSA、SIGMAおよび0.5N2supplementinvitrogenを含むBME内に回収し、細胞浮遊液を、あらかじめPoly-L-lysineSIGMAおよびLamininSIGMAでコートした35mmGlassBaseDishIWAKIに、5×105cells/mLとなるようにまき、5CO2を含む大気下37°Cで8時間培養した。培養された神経細胞を被験神経細胞とした。SNJ-1945、E64d、又はALLNを含む培養液10HS/BMEを次のようにして調製した。DIMETHYLSULFOXIDESIGMAD-5879に溶解したSNJ-1945を培養液に最終濃度200μMとなるように混合し、1時間37°Cに静置し、SNJ-1945を培地に完全に溶解させた。ALLNとE64dも同様に培地に溶解させた。但し、ALLNとE64dはそれぞれ最終濃度が50μMと100μMになるように、培地に添加した。用意していた被験神経細胞に、各化合物が溶けた培地を2ml/wellで加えて、16時間培養を行った。またコントロールとして、同量のDIMETHYLSULFOXIDESIGMAD-5879を添加した培地を用いて同様に培養を行った。培養後、細胞を倒立型顕微鏡TCSFP5S、Leicaで観察した。対物レンズは20倍のものを使用した。画像の撮影には専用ソフトウェアLASAF、Leicaを使い、512x512pixelの条件で撮影した。結果を図24に示す。図24に示されるように、DIMETHYLSULFOXIDEDMSOのみを添加したコントロールの細胞では、神経突起が正常に伸長し、細胞の遊走が起こって、細胞が周囲に拡散していた。SNJ1945を添加した細胞も、神経突起が伸展し、細胞が遊走しており、コントロールとの差はなかった。一方、ALLNを添加した細胞では、細胞が丸く凝集しており、神経突起を伸ばしているものはほとんどなかった。細胞は中央に集積したままで、遊走もほとんど観察できなかった。E64dを添加した細胞も同様に、中央に凝集しており、突起をのばすことができない細胞が多かった。遊走もコントロールに比較するとほとんど起こらず、周辺部への細胞の移動はわずかだった。このことから、SNJ-1945は、他のカルパイン阻害剤に比べて、高い濃度でも細胞毒性がまったく観察されず、細胞に対する安全性が高いことが確認できた。[配列表]"