"選択可能またはスクリーン可能なマーカーを発現させる分化反応性調節エレメントを含む第1外因性発現カセットおよびスクリーン可能なマーカーを発現させる薬物反応性調節エレメントを含む第2外因性発現カセットを含む多能性幹細胞系。前記多能性幹細胞系が誘導多能性幹iPS細胞系である、請求項1記載の多能性幹細胞系。前記多能性幹細胞系が外因性レトロウイルス遺伝因子を本質的に含まない、請求項1記載の多能性幹細胞系。前記第1または第2外因性発現カセットが多能性幹細胞系のゲノムの所定の位置で含まれる、請求項1記載の多能性幹細胞系。前記第1または第2外因性発現カセットがトランスポゾン系に含まれる、請求項4記載の多能性幹細胞。前記第1発現カセットがスクリーン可能なマーカーを含み、前記第1および第2発現カセットからの発現を、同じ方法を用いてスクリーンすることができる、請求項1記載の多能性幹細胞系。各スクリーン可能なマーカーが蛍光タンパク質であり、各蛍光タンパク質が異なる発光波長を含む、請求項6記載の多能性幹細胞系。前記第1発現カセットの前記分化反応性調節エレメントが細胞特異的プロモーターを含む、請求項1記載の多能性幹細胞系。前記細胞特異的プロモーターが、選択された細胞系統において優先的に発現された遺伝子のバイオインフォーマティクス分析によって同定される、請求項8記載の多能性幹細胞系。前記細胞特異的プロモーターが、神経前駆細胞特異的プロモーター、肝細胞前駆細胞特異的プロモーター、造血前駆細胞特異的プロモーター、または心筋前駆細胞特異的プロモーターである、請求項8記載の多能性幹細胞系。前記細胞特異的プロモーターが、選択された高分化型細胞について特異的なプロモーターである、請求項8記載の多能性幹細胞系。前記細胞特異的プロモーターが、心室心筋細胞特異的プロモーター、心房心筋細胞特異的プロモーター、結節心筋細胞特異的プロモーター、動脈内皮細胞特異的プロモーター、静脈内皮細胞特異的プロモーター、リンパ内皮細胞特異的プロモーター、血液脳関門内皮細胞特異的プロモーター、ドーパミン作動性ニューロン特異的プロモーター、コリン作動性ニューロン特異的プロモーター、GABA作動性ニューロン特異的プロモーター、または運動ニューロン特異的プロモーターである、請求項11記載の多能性幹細胞系。前記第1発現カセットの前記分化反応性調節エレメントが、組織特異的プロモーターを含む、請求項1記載の多能性幹細胞系。前記組織特異的プロモーターが、腎臓特異的プロモーター、腎臓髄質特異的プロモーター、腎臓皮質特異的プロモーター、心臓特異的プロモーター、汎心臓プロモーター、心房特異的プロモーター、心室特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、神経特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、内皮特異的プロモーター、血液特異的プロモーター、または腸特異的プロモーターを含む、請求項13記載の多能性幹細胞系。前記第2発現カセットの前記薬物反応性調節エレメントが、薬物受容体、薬物標的、または薬物シグナリング経路反応性調節エレメントを含む、請求項1記載の多能性幹細胞系。前記第2発現カセットの前記薬物反応性調節エレメントが薬物代謝酵素遺伝子のプロモーターを含む、請求項1記載の多能性幹細胞系。前記プロモーターが、チトクロムP450モノオキシゲナーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、またはジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子のプロモーターである、請求項16記載の多能性肝細胞系。前記第2発現カセットの前記薬物反応性調節エレメントが、選択された薬物シグナリング経路が活性化される細胞においてスクリーン可能なマーカーを発現させる薬物シグナリング経路反応性プロモーターを含む、請求項16記載の多能性肝細胞系。前記選択された薬物シグナリング経路が、チロシンキナーゼ経路、ヘテロトリマーGタンパク質経路、低分子量GTPase経路、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼ経路、ホスファターゼ経路、脂質キナーゼ経路、ヒドロラーゼ経路、サイクリックAMPcAMP介在経路、サイクリックGMPcGMP介在経路、ホスファチジルイノシトール三リン酸PIP3介在経路、ジアシルグリセロールDAG介在経路、イノシトール三リン酸IP3介在経路、カルモジュリンのEFハンドドメイン介在シグナリング経路、キナーゼタンパク質AKTのプレクストリン相同ドメイン介在シグナリング経路、クロマチン調節シグナリング経路、MAPKシグナリング経路、アポトーシス/オートファジー経路、翻訳制御経路、細胞周期/チェックポイント経路、DNA損傷経路、Jak/Statシグナリング経路、NF-κBシグナリング経路、TGF-β/Smadシグナリング経路、リンパ球シグナリング経路、脈管形成経路、小胞輸送経路、細胞骨格シグナリング経路、接着経路、グルコース代謝経路、Wnt/Hedgehog/Notchシグナリング経路、幹細胞系統特異化経路、核受容体介在経路、またはタンパク質フォールディングおよび安定性シグナリング経路である、請求項18記載の多能性幹細胞系。前記選択可能なマーカーが抗生物質耐性遺伝子または抗原性エピトープを含む、請求項1記載の多能性幹細胞系。前記スクリーン可能なマーカーが、蛍光、発光または生物発光タンパク質を発現する遺伝子としてさらに定義される、請求項1記載の多能性幹細胞系。請求項1記載の少なくとも2つの細胞系を含む細胞系のインビトロセットであって、前記第1または第2外因性発現カセットの前記調節エレメントが前記細胞系間で異なる、インビトロセット。応答を測定するための方法であって:a請求項1~22のいずれか1項に記載の多能性細胞系を、前記第1発現カセットの発現を引き起こすために十分な分化条件下で培養し;b細胞を薬物と接触させ;そしてc前記第2発現カセットの発現を測定することによって、薬物に対する応答を測定することを含む、方法。少なくとも第1および第2多能性幹細胞系を含む細胞系のインビトロセットであって、前記第1および第2系が、それぞれ、外因性発現カセットを含み、前記第1および第2系由来の前記外因性発現カセットが分化反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含み、前記第1細胞系の前記外因性発現カセットの前記分化反応性調節エレメントが、前記第2細胞系の前記外因性発現カセットの前記分化反応性調節エレメントと異なるので、前記第1細胞系における前記カセットの前記マーカーは、前記細胞が第1分化状態にある場合にのみ発現され、そして前記第2細胞系における前記カセットの前記マーカーは、前記細胞が第2分化状態にある場合にのみ発現され、前記第1および第2細胞系の前記外因性発現カセット由来の前記選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を、同じ方法を用いてスクリーンまたは選択することができる、インビトロセット。前記多能性幹細胞が1以上の誘導多能性幹iPS細胞を含む、請求項24記載の細胞系のインビトロセット。前記iPS細胞が本質的に外因性レトロウイルス遺伝因子を含まない、請求項25記載の細胞系のインビトロセット。前記第1または第2細胞系の前記外因性発現カセットが、前記多能性幹細胞のゲノムの所定の位置で含まれる、請求項24記載の細胞系のインビトロセット。前記セットの1以上の細胞系が、トランスポゾン系中に含まれるさらなる外因性発現カセットを含む、請求項27記載の細胞系のインビトロセット。各細胞系における前記さらなる外因性発現カセットが、薬物反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含む、請求項28記載の細胞系のインビトロセット。少なくとも5~10の異なる多能性幹細胞系を含み、それぞれが、異なる分化反応性調節エレメントを有する異なる外因性発現カセットを含む、請求項24記載の細胞系のインビトロセット。前記第1または第2細胞系の前記外因性発現カセットが少なくとも2つの別の外因性発現カセットを含み、それぞれが、異なる条件反応性調節エレメントを含む、請求項24記載の細胞系のインビトロセット。各多能性幹細胞系が、細胞系の前記セット中の他の細胞系と異なる別の容器中に含まれる、請求項24記載の細胞系のインビトロセット。前記分化反応性調節エレメントが組織特異的プロモーターを含む、請求項24記載の細胞系のインビトロセット。前記分化反応性調節エレメントが、前記細胞系の前記多能性幹細胞が選択された細胞系統に分化する場合に、選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こす細胞特異的プロモーターを含む、請求項24記載の細胞系のインビトロセット。細胞系の前記セットの1以上の細胞系が、薬物反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含むさらなる外因性発現カセットを含む、請求項24記載の細胞系のインビトロセット。前記さらなる外因性発現カセットがトランスポゾン系に含まれる、請求項35記載の細胞系のインビトロセット。前記細胞特異的プロモーターが、神経前駆細胞特異的プロモーター、肝細胞前駆細胞特異的プロモーター、造血前駆細胞特異的プロモーターまたは心筋前駆細胞特異的プロモーターである、請求項33記載の細胞系のインビトロセット。前記細胞特異的プロモーターが、選択された高分化型細胞について特異的なプロモーターである、請求項34記載の細胞系のインビトロセット。前記細胞特異的プロモーターが、心室心筋細胞特異的プロモーター、心房心筋細胞特異的プロモーター、結節心筋細胞特異的プロモーター、動脈内皮細胞特異的プロモーター、静脈内皮細胞特異的プロモーター、リンパ内皮細胞特異的プロモーター、血液脳関門内皮細胞特異的プロモーター、ドーパミン作動性ニューロン特異的プロモーター、コリン作動性ニューロン特異的プロモーター、GABA作動性ニューロン特異的プロモーター、または運動ニューロン特異的プロモーターである、請求項38記載の細胞系のインビトロセット。前記組織特異的プロモーターが、腎臓特異的プロモーター、腎臓髄質特異的プロモーター、腎臓皮質特異的プロモーター、心臓特異的プロモーター、汎心臓プロモーター、心房特異的プロモーター、心室特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、神経特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、内皮特異的プロモーター、血液特異的プロモーターまたは腸特異的プロモーターを含む、請求項33記載の細胞系のインビトロセット。前記薬物反応性調節エレメントが薬物代謝酵素遺伝子のプロモーターを含む、請求項29記載の細胞系のインビトロセット。前記プロモーターが、チトクロムP450モノオキシゲナーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、チオプリンメチルトランスフェラーゼまたはジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子のプロモーターである、請求項41記載の細胞系のインビトロセット。前記薬物反応性調節エレメントが、薬物反応性シグナリング経路が活性化される細胞において選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こす薬物シグナリング経路反応性プロモーターを含む、請求項29記載の細胞系のインビトロセット。前記薬物シグナリング経路が、チロシンキナーゼ経路、ヘテロトリマーGタンパク質経路、低分子量GTPase経路、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼ経路、ホスファターゼ経路、脂質キナーゼ経路、ヒドロラーゼ経路、サイクリックAMPcAMP介在経路、サイクリックGMPcGMP介在経路、ホスファチジルイノシトール三リン酸PIP3介在経路、ジアシルグリセロールDAG介在経路、イノシトール三リン酸IP3介在経路、カルモジュリンのEFハンドドメイン介在シグナリング経路、キナーゼタンパク質AKTのプレクストリン相同ドメイン介在シグナリング経路、クロマチン調節シグナリング経路、MAPKシグナリング経路、アポトーシス/オートファジー経路、翻訳制御経路、細胞周期/チェックポイント経路、DNA損傷経路、Jak/Statシグナリング経路、NF-κΒシグナリング経路、TGF-β/Smadシグナリング経路、リンパ球シグナリング経路、脈管形成経路、小胞輸送経路、細胞骨格シグナリング経路、接着経路、グルコース代謝経路、Wnt/Hedgehog/Notchシグナリング経路、幹細胞系統特異化経路、核受容体介在経路、またはタンパク質フォールディングおよび安定性シグナリング経路である、請求項43記載の細胞系のインビトロセット。前記選択可能なマーカーが、抗生物質耐性遺伝子もしくは抗原性エピトープを含むか、または前記スクリーン可能なマーカーが、蛍光、発光もしくは生物発光タンパク質を発現する遺伝子としてさらに定義される、請求項24記載の細胞系のインビトロセット。多能性幹細胞を提供する方法であって:a多能性幹細胞の細胞系のインビトロセットであって、それぞれが、細胞または組織特異的発現を調節する分化反応性調節エレメントの制御下で異なる外因性発現カセットを含むインビトロセットを提供するステップ;b薬物反応性調節エレメントの制御下で1以上のさらなる発現カセットを提供するステップ;およびc1以上のさらなる発現カセットを細胞系のインビトロセットに導入するステップを含む、方法。分化細胞を提供する方法であって:a請求項24~44のいずれか1項にしたがって、多能性幹細胞の細胞系のインビトロセットを提供するステップ;およびb多能性幹細胞を分化させる条件下で多能性幹細胞を培養して、分化細胞を提供するステップを含む、方法。化合物を、特定の細胞または組織型の分化に対するその影響について試験する方法であって:a請求項24~44のいずれか1項にしたがって、多能性幹細胞の細胞系のインビトロセットを提供するステップ;b多能性幹細胞を試験化合物の存在下、分化条件下で培養するステップ;およびc多能性幹細胞の選択された細胞系統または組織型への分化に対する試験化合物の影響について、選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を測定するステップを含む、方法。したがって、治療上および研究用の使用のために分析が容易な様式で種々の細胞型の産生が必要とされる。本発明は、1以上の条件反応性調節エレメントの制御下で1以上の選択可能またはスクリーン可能なマーカー複数可を発現する多能性幹細胞を提供する際の当該技術分野における主な欠点を克服する。第1の実施形態において、それぞれ、条件反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含む第1および第2外因性発現カセットを含む多能性幹細胞系が提供される。好ましくは、前記第1外因性発現カセットの条件反応性調節エレメントは、前記第2外因性発現カセットの条件反応性調節エレメントと異なる。例えば、条件反応性調節エレメントは、分化反応性調節エレメント例えば、組織もしくは細胞系統特異的プロモーターおよび薬物反応性調節エレメント、例えば薬物受容体、薬物標的、または薬物シグナリング経路反応性調節エレメントを含み得る。第2の実施形態において、少なくとも第1および第2細胞系を含む細胞系のインビトロセットであって、ある態様では、大規模での種々の細胞型の分化、薬物応答または薬物毒性を同時に研究することができるように、細胞系のインビトロセットが提供される。特定の態様において、第1および第2系は、それぞれ、条件反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含む外因性発現カセットを含む。好ましくは、第1細胞系の外因性発現カセットの条件反応性調節エレメントは、第2細胞系の外因性発現カセットの条件反応性調節エレメントと異なる。例えば、ある態様では、第1細胞系における外因性カセットのマーカーは、細胞が第1分化状態にある場合にのみ発現され、第2細胞系における外因性カセットのマーカーは、細胞が第2分化状態にある場合にのみ発現され、第1および第2分化状態は異なる。ある態様では、実施形態による細胞系は多能性幹細胞系、例えば誘導多能性幹iPS細胞系である。特に、iPS細胞系は、本質的に外因性ウイルス遺伝因子を含まない例えば、外因性レトロウイルス因子を含まない可能性があるか、または、さらに詳細には、外因性エピソームベクター、例えばOriPベースのベクターによって再プログラム化された誘導多能性幹細胞を含まない可能性がある。細胞系はさらに、体細胞系であり得る。いくつかの態様において、外因性発現カセットを多能性幹細胞系複数可のゲノム中に組み入れる。細胞系複数可は、例えば、ヒトまたはマウス細胞であり得る。本発明において想定されるように、実施形態による細胞系は、複数の細胞型における発現差異を制御する多種多様な条件反応性調節エレメントを含み得る。したがって、細胞を用いて、任意の発生経路における組織特異的プロモーターなどの任意の条件反応性調節エレメントの発現差異を追跡することができる。例えば、細胞系のセットは、少なくとも3、4、5、6、7、9、10、20、30、40、50、100、1000、10,000、20,000またはその範囲内で誘導することができる任意の範囲の異なる多能性幹細胞系を含み得、それぞれは異なる条件反応性調節エレメントを有する異なる外因性発現カセットを含む。さらなる態様において、細胞系は、少なくとも3、4、5、6、7、9、10、20、30、40、50、100、1000、10,000、20,000またはその範囲内で誘導することができる任意の範囲の異なる外因性発現カセットを含み得、それぞれは異なる条件反応性調節エレメントを含む。少なくとも2つの外因性発現カセットは、同じ細胞中に含まれる可能性があり、すなわち、第1または第2細胞系の外因性発現カセットは、少なくとも2つの別の外因性発現カセットを含み得、それぞれが異なる条件反応性調節エレメントを含む。異なる細胞系を同定するための便宜上、1つのセットの各多能性幹細胞系は、その細胞系セットの他の細胞系と異なる別の容器中に含めることができる。別の態様において、2以上の異なる多能性幹細胞系は、同じ容器中に含めることができる。プロモーターまたはエンハンサー配列などの所定の条件反応性調節エレメントによる異所性発現は、発現が公知の空間的および時間的方法で調節されることを可能にするという別の利点を有する。この態様の能力は、1つには、遺伝子発現を制御または調節することによって、内因性もしくは外因性因子に対して反応することができる、条件反応性調節エレメントの集合に存する。条件反応性調節エレメントの非限定的な例には、細胞系の多能性幹細胞が選択された細胞系統に分化する場合に、選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こす細胞特異的プロモーターなどの分化反応性プロモーターまたは組織特異的プロモーターが含まれる。条件反応性調節エレメントは、同様に、薬物反応性調節エレメント、例えば薬物代謝酵素のプロモーター、選択された薬物シグナリング経路、薬物標的もしくは薬物受容体またはそれらの組み合わせが活性化または抑制される細胞において選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こすシグナリング反応性プロモーターを含み得る。本明細書中で用いられる場合、薬物とは、これらに限定されないが、疾患に関連する表現型を変更するかまたは変更するための候補である、小分子、核酸およびタンパク質またはそれらの組み合わせを含む分子を指す。特に、条件反応性調節エレメントは、細胞系の多能性幹細胞が選択された細胞系統または組織型に分化する場合に、選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こす分化特異的プロモーターを含み得る。したがって、本発明のある態様において、各多能性幹細胞系は、異なる分化特異的プロモーターを有し、これを用いて、異なる細胞型への分化の状態を示すことができる。さらなる態様において、細胞特異的発現カセットまたは組織特異的発現カセット多能性幹細胞が選択された細胞系統に分化する場合に、選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こすを含む細胞系は、薬物反応性調節エレメント例えば、受容体、薬物標的、薬物代謝酵素またはシグナリング経路反応性エレメントなどのさらなる条件反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含むさらなる外因性発現カセットを含み得る。したがって、分化反応性プロモーターの制御下でのマーカー遺伝子の発現によって示されるように、これらの多能性幹細胞が選択された細胞系統に分化した後、そして場合によって所望の分化細胞の富化の選択後に、さらなる発現カセットを、所望の分化細胞の薬物応答またはシグナリング調節について試験することができる。さらなる外因性発現カセットは、いくつかの態様において、トランスポゾン系、例えば、piggyBac系中に含まれ得る。ある態様では、分化反応性プロモーターは、選択された細胞系統における優先的に発現された遺伝子のバイオインフォーマティクス分析によって、例えば、トランスクリプトーム配列分析またはゲノム分析によって同定することができる。そのようなバイオインフォーマティクス分析は、トランスクリプトームまたはゲノムデータを記憶するための構造であるデータ記憶装置、潜在的なプロモーター配列を問い合わせる構造であるサーバー、またはプロモーター分析結果を報告するための構造である端末の使用を含み得る。当該技術分野で組織特異的または細胞特異的プロモーターであることが知られている任意のプロモーターならびに化合物または細胞シグナリングの上方調節もしくは下方調節に対して反応性の任意のプロモーター、例えば表1に記載されている非限定的な例を、本発明の態様において使用することができる。例えば、プロモーターは、選択された前駆細胞に対して特異的であり得、例えば、神経前駆細胞特異的プロモーター、造血前駆細胞特異的プロモーター、肝細胞前駆細胞特異的プロモーター、または心筋前駆細胞特異的プロモーターである。他の態様において、プロモーターは、特定の程度の分化または選択された高分化型細胞、例えば肝細胞、心筋細胞、内皮細胞、もしくはニューロンについて特異的であり得る。さらなる態様において、プロモーターは、選択された高分化型細胞サブタイプ、例えば、心室心筋細胞、心房心筋細胞、結節心筋細胞、動脈内皮細胞、静脈内皮細胞、リンパ内皮細胞、血液脳関門内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、または運動ニューロンについて特異的であり得る。さらなる態様において、分化反応性調節エレメントは、組織特異的プロモーター、例えば、腎臓特異的プロモーター、腎臓髄質特異的プロモーター、腎臓皮質特異的プロモーター、心臓特異的プロモーター、汎心臓プロモーター、心房特異的プロモーター、心室特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、神経特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、内皮特異的プロモーター、血液特異的プロモーター、または腸特異的プロモーターを含み得る。さらなる態様において、外因性発現カセットを細胞系に挿入することができ例えば、1セットの系統中に1つの細胞系、ここで、さらなる発現カセットは、薬物反応性調節エレメント、例えば薬物代謝酵素遺伝子のプロモーターを含む。薬物代謝酵素遺伝子は、チトクロムP450モノオキシゲナーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、またはジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼであり得る。例えば、チトクロムP450モノオキシゲナーゼは、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、またはその任意の対立遺伝子変位型変異型を含み得る。このさらなる発現カセットを、マーカー遺伝子発現の上方もしくは下方調節を引き起こす任意の活性が細胞の外部で観察することができるように、マーカー遺伝子と機能的に連結させることができる。さらに別の態様において、発現カセットは、選択されたシグナリング経路が上方調節または下方調節される細胞においてマーカー遺伝子の発現を引き起こす薬物シグナリング特異的プロモーターを含み得る。選択された薬物シグナリング経路の非限定的な例としては、チロシンキナーゼ経路、ヘテロトリマーGタンパク質経路、低分子量GTPase経路、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼ経路、ホスファターゼ経路、脂質キナーゼ経路、ヒドロラーゼ経路、サイクリックAMPcAMP介在経路、サイクリックGMPcGMP介在経路、ホスファチジルイノシトール三リン酸PIP3介在経路、ジアシルグリセロールDAG介在経路、イノシトール三リン酸IP3介在経路、カルモジュリンのEFハンドドメイン介在シグナリング経路、キナーゼタンパク質AKTのプレクストリン相同ドメイン介在シグナリング経路、クロマチン調節シグナリング経路、MAPKシグナリング経路、アポトーシス/オートファジー経路、翻訳制御経路、細胞周期/チェックポイント経路、DNA損傷経路、Jak/Statシグナリング経路、NF-κΒシグナリング経路、TGF-β/Smadシグナリング経路、リンパ球シグナリング経路、脈管形成経路、小胞輸送経路、細胞骨格シグナリング経路、接着経路、グルコース代謝経路、Wnt/Hedgehog/Notchシグナリング経路、幹細胞系統特異化経路、核受容体介在経路、またはタンパク質フォールディングおよび安定性シグナリング経路が挙げられる。ある態様では、実施形態による細胞系複数可は、薬物反応性調節エレメント例えば、薬物シグナリング経路に対して反応性の、または薬物代謝酵素遺伝子由来の調節エレメントなどの条件反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含むさらなる外因性発現カセットを含み得る。例えば、選択可能またはスクリーン可能なマーカーの細胞特異的または組織特異的発現での分化細胞の選択または富化後、さらなる外因性発現カセットを用いて、そのような分化細胞における経路、受容体または薬物応答を、異なる選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現でマークすることができる。薬物代謝または生物学的応答を試験するために、1以上の外因性発現カセットは、1以上の細胞受容体、シグナリング経路メディエーター、転写因子、新薬の開発につながるような標的またはチトクロムP450モノオキシゲナーゼの発現のためのコーディング配列をさらに含み得る。ある態様では、各外因性発現カセット、または特に、異なる細胞中の各細胞特異的もしくは組織特異的発現カセットは、同じ選択可能またはスクリーン可能なマーカー、好ましくは、同じ遺伝子送達系、例えば組換え媒介ベクター中に含まれるものを含み得る。したがって、カセットは条件反応性エレメントが異なるだけで、類似している可能性があるので、カセットの構築および例えば組換えによって同じ下にある細胞系のアリコートにそれらを導入すること、ならびに細胞系のセットのアセンブリは、多数で平行して実施することができる。異なる条件反応性調節エレメントの制御下での選択可能またはスクリーン可能なマーカーは、これらの調節エレメントの状態指標としての役目を果たすことができ、そのようなマーカーを発現する細胞の選択または富化を助けることができる。例えば、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ジェネティシン、テトラサイクリン、またはアンピシリンに対して耐性を付与する遺伝子としてさらに定義することができる。選択可能なマーカーはさらに、外因性抗原性エピトープ、特に外因性表面抗原エピトープ、例えばマウスCD44タンパク質またはヒト細胞系におけるエピトープでもあり得る。例えば、マウスCD44タンパク質を、磁気細胞分離抗マウスCD44抗体によって混合物から所望の細胞の選択または富化のために抗生物質耐性遺伝子の代わりに使用することができる。明らかに、任意の異所的に発現された表面抗原性エピトープを選択可能なマーカーとして使用することができる。例示的実施形態において、スクリーン可能なマーカーは、細胞表面マーカー、蛍光、発光もしくは生物発光タンパク質、エピトープ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT、ルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼを発現する遺伝子であり得る。例えば、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質GFP、赤色蛍光タンパク質RFP、青色蛍光タンパク質BFPもしくは黄色蛍光タンパク質YFP、NFATニトロレダクターゼまたはそれらの変異体であり得る。使用するマーカーに応じて、細胞の選択または富化は、選択された細胞系統においてもしくは選択された条件に反応して分化した細胞について選択するために、蛍光標識細胞分取FACS、CATアッセイ、ルミネッセンスアッセイまたはスクリーン可能なマーカー発現について検出またはスクリーニングするための当業者に公知の任意の方法を含み得る。代替的または相補的なアプローチは、子孫細胞においてスクリーン可能または選択可能なマーカーに対応する外因性転写物の存在を、RT-PCR、インサイツハイブリダイゼーション、RNAアレイ、またはハイブリダイゼーション例えば、ノザンブロットなどの通常の方法を用いて試験することである。特定の態様において、1以上の外因性発現カセットは、好ましくは多シストロン性転写単位に含まれる選択可能およびスクリーン可能なマーカーの両方を含み得る。同義遺伝子を同じ条件的反応性調節エレメント下で同時発現するために、発現カセットは多シストロン性転写単位を含み得る。そのような多シストロン性転写単位は、内部リボソーム導入部位IRESまたは少なくとも1つのプロテアーゼ切断部位をコードする配列および/または多シストロン性転写のための自己切断型ペプチドを含み得る。例えば、複数の自己切断型ペプチド、例えばウイルス2Aペプチドがある。さらなる実施形態において、操作された多能性幹細胞を提供するための方法であって、前述の実施形態にしたがって、幹細胞系または多能性幹細胞系のセットを提供することを含む方法が提供される。方法は、異なる外因性発現カセットを単一の細胞系またはそれぞれの異なる細胞に導入することを含み得る。例えば、外因性発現カセットを、遺伝子送達系によって細胞に導入することができる。遺伝子送達系は、ベクターであり得る。ベクターの非限定的な例としては、ウイルスベクター、エピソームベクター、トランスポゾンベースのベクター、またはリコンビナーゼ媒介カセット交換ベクターが挙げられる。特に、ベクターはリコンビナーゼ媒介カセット交換ベクターである。細胞世代にわたるスクリーン可能または選択可能なマーカーの発現のために、1以上の外因性発現カセットは、本発明のある態様において細胞のゲノムに組み入れられるかまたは含まれる可能性がある。例えば、1以上の外因性発現カセットは、細胞のゲノムの所定の位置またはランダムな位置で組み入れられるかまたは含まれる可能性がある。特に、所定の位置は、細胞のゲノムのRosa26座であり得る。Rosa26座は、ヒトRosa26座、特に前述の外因性発現カセットを含む修飾された座であり得る。そのような外因性発現カセットは、特に、Rosa26座へのカセットの組換え媒介交換のための組換え認識部位が隣接している可能性がある。さらなる態様において、セットの1以上の細胞系は、トランスポゾン系に含まれるさらなる外因性発現カセットを含み、この場合、さらなる発現カセットは、同じ細胞のRosa座に含まれる外因性発現カセットとは異なる。多能性幹細胞の有用な組を提供するために:a条件反応性外因性発現カセット例えば、細胞または組織特異的発現を調節する分化反応性調節エレメントの制御下のカセットを含む多能性幹細胞の細胞系のインビトロセットを提供するステップ;b受容体、薬物標的、薬物代謝酵素またはシグナリング経路遺伝子の薬物反応性調節エレメントなどの条件反応性調節エレメントの制御下で1以上のさらなる発現カセットを提供するステップ;およびc1以上のさらなる発現カセットを細胞系のインビトロセットに導入するステップを含む方法も含み得る。特定の態様において、細胞系は誘導多能性幹細胞系である。特に、iPS細胞系は、外因性レトロウイルス遺伝因子を本質的に含まない可能性があるか、またはさらに詳細には、エピソーム再プログラミングから誘導される可能性さえある。細胞系は、ある態様では、ヒトまたはマウス細胞であり得る。例えば、細胞特異的または組織特異的外因性発現カセットは、多能性幹細胞のゲノム中、特に、多能性幹細胞のゲノムの所定の位置、例えばRosa26座で含まれる可能性がある。さらなる態様において、細胞特異的または組織特異的外因性発現カセットを多能性幹細胞に、遺伝子送達系、例えば組換え媒介カセット交換ベクターによって導入することができる。他の態様において、さらなる発現カセットを多能性幹細胞に、トランスポゾン系、例えばpiggyBacトランスポゾン系によって導入することができる。細胞特異的または組織特異的外因性発現カセットまたはさらなる発現カセットは、各条件反応性調節エレメントの制御下でマーカー遺伝子を含み得る。そのようなマーカー遺伝子は選択可能なマーカー、スクリーン可能なマーカー、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの態様において、細胞特異的または組織特異的外因性発現カセット全てのマーカー遺伝子は同じである。ある態様では、さらなる発現カセット全てのマーカー遺伝子は同じである。異なる目的を満たすために、いくつかの態様において、同じ細胞系では、細胞特異的または組織特異的外因性発現カセットのマーカー遺伝子は、さらなる発現カセットのものとは異なり得る。さらなる態様において、分化細胞を提供する方法であって:a前述の多能性幹細胞または前述の方法にしたがって提供される多能性幹細胞の幹細胞系のインビトロセットを提供するステップであって、多能性幹細胞が、細胞または組織特異的調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含む細胞特異的または組織特異的外因性発現カセットを含むステップ;およびb多能性幹細胞を分化させる条件下で多能性幹細胞を培養し、かくして分化細胞を提供するステップを含む方法も提供され得る。多能性幹細胞系における組織特異的、細胞特異的または分子例えば、薬物経路特異的プロモーターが、分化中または高分化状態中のいずれかで、幹細胞または分化した娘細胞において活性化される場合、選択可能またはスクリーン可能なマーカーを発現させることができ、次いで検出または測定することができる。したがって、ある態様では、分化方法は、細胞または組織特異的調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを発現する分化細胞を選択または富化することをさらに含み得る。選択または富化は、ハイスループット精製、スクリーニングまたはイメージングを含み得る。例えば、選択または富化は、蛍光標識細胞分取FACS、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCATアッセイ、またはルミネッセンスアッセイを含む。ある態様では、試験化合物の分化細胞に対する影響を試験することを含む方法が提供され得る。例えば、試験化合物は、小分子薬物、核酸、またはペプチドである。この態様で使用されるそのような分化細胞は、薬物応答またはシグナリング経路活性化に対して反応する調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含む外因性発現カセットを、単独または細胞特異的もしくは組織特異的調節エレメントを有する外因性発現カセットと組み合わせて含む。特定の態様において、各異なる外因性発現カセットは、P450遺伝子のすべての変異体などの異なる薬物代謝酵素遺伝子のプロモーターの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含む。例えば、肝細胞特異的プロモーターの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を用いて選択または富化させることができる肝細胞に分化した場合、分化細胞を次いでP450応答などの様々な薬物応答について試験することができる。さらなる態様において、分化条件を試験する方法であって、:a多能性幹細胞が選択された細胞系統または組織に分化する場合に選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こす、条件反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含む外因性発現カセットを含む多能性幹細胞を提供するステップ;およびb試験条件下で多能性幹細胞を培養し、そして試験条件が多能性幹細胞を選択された細胞系統または組織に分化させるかどうかを判定するステップであって、選択された細胞系統または組織に分化する場合、多能性幹細胞の子孫細胞は選択可能またはスクリーン可能なマーカーを発現するステップを含む方法が提供され得る。この方法を用いて、分化によってある細胞型の細胞を提供するために使用することができる新規条件をスクリーンすることができる。試験条件は、薬物、ペプチド、核酸、または培養条件であり得る。この方法はさらに、同様の方法で分化転換または脱分化などのプログラミングの他の態様のために用いることもできる。この方法は、条件反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを発現する分化細胞を選択または富化することをさらに含むことをさらに含み得る。化合物を、特定の細胞または組織型の分化に対するその影響について試験する方法であって:a多能性幹細胞が選択された細胞系統または組織に分化する場合に選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こす条件反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含む外因性発現カセットを含む多能性幹細胞を提供するステップ;およびb試験化合物の存在下、分化条件下で、多能性幹細胞を培養するステップであって、ここで、分化条件は、多能性幹細胞を選択された細胞系統または組織自体に分化させることができるものである、ステップ;およびc多能性幹細胞の選択された細胞系統または組織への分化に対する試験化合物の影響について、選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を測定するステップを含む方法を含み得る。さらなる態様において、化合物例えば、薬物を試験する方法であって:ai分化反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含む第1外因性発現カセットおよびii薬物反応性調節エレメントの制御下でスクリーン可能なマーカーを含む第2外因性発現カセットを含む多能性幹細胞を提供し、そして第1発現カセットの発現を引き起こすために十分な分化条件下で細胞を培養するステップ;b細胞を薬物と接触させるステップ;およびc第2発現カセットの発現を測定することによって、薬物に対する応答を測定するステップを含む方法が提供される。ある態様では、そのような方法は、複数の化合物、例えば少なくとも約10、100、1,0000、10,000またはそれ以上の化合物を試験することを含み得る。本発明の方法および/または組成物に関連して検討される実施形態は、本明細書中で記載される任意の他の方法または組成物に関して用いることができる。したがって、1つの方法または組成物に関する実施形態は、本発明の他の方法および組成物にも同様に適用され得る。本明細書中で用いられる場合、核酸に関連したコード化するencodeまたはコード化しているencodingという用語は、当業者が本発明を容易に理解できるようにするために用いられるが、これらの用語は、それぞれ、含むcompriseまたは含んでいるcomprisingと交換可能に用いることができる。本明細書中で用いられる場合、aまたはanは1以上を意味する可能性がある。本明細書中、請求項複数可で用いられるように、含むという語とともに用いられる場合、このaまたはanという語は、1または複数を意味する可能性がある。請求項におけるまたはorという用語の使用は、明らかに別の代替物だけを指すか、または代替物が互いに排他的であることが明確に示されている場合をのぞいて、および/またはを意味するために用いられるが、本開示は、代替物のみ、およびおよび/またはを指す定義を支持する。本明細書中で用いられる場合、別のとは、少なくとも2番目以降を意味する可能性がある。本出願全体を通して、約という用語は、ある値が、その値を測定するために用いられる装置、方法の誤差に固有の変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。本発明の他の目的、特性および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のためだけに提示されると理解されるべきである。なぜなら、本発明の精神および範囲内の種々の変更および修飾は、この詳細な説明から当業者には明らかになるからである。例示的実施形態の説明本発明は、ヒトの身体における任意の生物学的応答を研究するために使用できる操作された多能性幹細胞に関連する方法および組成物を提供することによって、現在の技術に関するいくつかの重大問題を克服する。これらの操作された多能性細胞は、現在の技術によって適切に対処されない広範囲の適用を有するツールキットを提供する。例えば、2以上の外因性発現カセットであって、それぞれが異なる条件反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含むカセットを含む細胞が提供される。これらの細胞は、カセットからスクリーン可能または選択可能なマーカーの発現によって調査される2以上の異なる条件の同時試験を可能にする。したがって、操作された細胞は、例えば、新しい薬物候補の有効性および毒性の迅速な評価を可能にする。さらなる態様において、定方向directed細胞分化プロトコルを開発し、最適化するために細胞を用いることができる。一例において、実施形態による多能性幹細胞は少なくとも2つの外因性発現カセットを含む。第1カセットは、薬物候補などの対象の化合物に反応して発現を提供する条件反応性調節エレメントを含む。第2カセットは次に、細胞が選択された細胞系統に分化する場合に発現を提供する条件反応性調節エレメントを含む。したがって、細胞系を用いて、細胞を対象の系統に分化させるために細胞系を培養することによって、薬物候補に対する細胞応答を試験することができる。第2カセットからの発現は、したがって、対象の系統への分化を示すものである。分化細胞を次いで薬物候補と接触させ、第1カセットからの発現を測定して、薬物候補に対する応答を評価する。代替的にまたは付加的に、細胞を第2カセットからの発現に基づいて選択して、薬物候補の試験ための対象の系統の細胞の本質的に純粋な集団を提供する。したがって、細胞は、候補薬物分子の影響の系統特異的な読み取り値を提供する。関連する態様において、実施形態による多能性細胞系は、対象の化合物例えば、薬物候補に反応して発現を提供する条件反応性調節エレメントを有する第1外因性発現カセットを含む。この細胞系から、系のパネルを生成することができ、それぞれは、細胞が対象の選択された系統または細胞型に分化する場合だけ活性である条件反応性調節エレメントを有する少なくとも第2外因性発現カセット例えば、トランスポゾン系中に含まれるカセットを含む。したがって、パネル中の細胞系を、多数の細胞系統に分化させることができる。それぞれの場合、第2発現カセットからの発現に基づいて、細胞の分化状態を確認することができるか、または細胞を選択することができる。対象の化合物の影響は、それによって、分化細胞を化合物と接触させ、そして第1発現カセットの発現を検出することによって、あらゆる異なる細胞系統に関して測定することができる。この場合、パネル中の各細胞系は、異なる分化細胞型に関する情報を提供することができる。全体として、そのようなパネルは、対象の器官または組織における細胞系統の本質的に全てについての薬物効果および/または毒性に関する情報を提供することができる。反対に、特定の細胞系統に発現を提供する発現カセットを含む細胞系をベースとして用いて、細胞のパネルを生成させることができる。そのような細胞のパネルを次いで生成させ、各系は、対象の経路の活性化により発現を提供するさらなる発現カセットを含む。そのような細胞を次いで、ベース発現カセットからの発現によって確認または選択されるように、対象の細胞系統に分化させることができる。パネル中の種々の分化細胞を次いで薬物または薬物のパネルで処理し、そしてさらなる発現カセットからの発現を評価して、様々な異なる代謝経路に対する薬物複数可の影響を判定する。この例では、特定の細胞型における代謝経路のアレイを同時に分析して、特定の細胞型に対する薬物候補または候補のパネルの影響の完全なイメージを提供することができる。実施形態の操作された多能性幹細胞および幹細胞のパネルは、したがって、任意の種類の細胞または組織において、分化の実質的に任意の段階で細胞応答を調査するための、高度に適応可能なハイスループット系を提供する。細胞を使用して、例えば、複数の代謝経路に対する、および/または複数の異なる細胞型における薬物候補の影響を同時に試験することができる。同様に、操作された細胞を用いて、対象の細胞型を産生するための分化条件を試験し、改良することができる。この場合、複数の細胞系統の出現を同時に集団に統合できることにより、分化条件が改良されて、望ましくない細胞系統を除去するか、または対象の系統の割合を向上させることが可能になる。さらに、これらの細胞を使用して、所望の割合の異なる細胞型を有する分化細胞の集団を提供する分化プロトコルを開発することができる。操作された細胞は、したがって、以前には利用可能でなかった系統特異的分化および細胞応答に対処するための新規かつ強力なツールを構成する。本発明のさらなる実施形態および利点を以下に記載する。I.定義プログラミングは、プログラミングのない同じ条件下とは異なり、培養中またはインビボのいずれかで、少なくとも1つの新規細胞型の子孫を形成するように、細胞を変化させるプロセスである。これは、基本的にそのような子孫がプログラミング前に形成されない場合、十分な増殖後に、新規細胞型の表現型特性を有する子孫の測定可能な割合を意味するか;あるいは、新規細胞型の特性を有する割合がプログラミング前よりも測定可能に多いことを意味する。このプロセスは、分化、脱分化および分化転換を含む。分化は、あまり特殊化されていない細胞がより特殊化された細胞型になるプロセスである。脱分化は、部分分化型または高分化型細胞が、多能性または多分化能などの初期発生段階に逆戻りする細胞プロセスである。分化転換は、1つの分化細胞型を別の分化細胞型に変化させるプロセスである。ある条件下で、新規細胞型の特性を有する子孫の割合は、優先度が増す順で、少なくとも約1、5、25またはそれ以上であり得る。再プログラミングは、再プログラミングのない同じ条件下で得られるよりも、培養中またはインビボのいずれかで、少なくとも1つの新規細胞型の子孫を形成する、測定可能に増加した能力を細胞に付与するプロセスである。脱分化は、再プログラミングを含み得る。さらに具体的には、再プログラミングは、体細胞に多能性潜在能力を付与するプロセスである。これは、十分な増殖の後、再プログラミング前に基本的にそのような子孫が形成されない場合、新規細胞型の表現型特性を有する子孫のかなりの割合を意味し、それ以外は、新規細胞型の特性を有する割合が、再プログラミング前よりもはっきりと多いことを意味する。ある条件下で、新規細胞型の特性を有する子孫の割合は、優先度が増す順で、少なくとも約1、5、25またはそれ以上であり得る。外因性という用語は、細胞もしくは生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、もしくはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、細胞もしくは生物に人工的手段によって導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、もしくはポリヌクレオチドを指すか、または細胞に関しては、単離され、その後、他の細胞もしくは生物に人工的手段によって導入された細胞を指す。外因性核酸は、異なる生物もしくは細胞由来であり得るか、または生物もしくは細胞内で自然発生する核酸の1以上のさらなるコピーであり得る。外因性細胞は、異なる生物由来であり得るか、または同じ生物由来であり得る。非限定的な例として、外因性核酸は、天然の細胞とは異なる染色体位置にあるか、またはさもなければ自然界で見いだされるものとは異なる核酸配列が隣接している。発現構築物または発現カセットは、転写を導くことができる核酸分子を意味する。発現構築物は、少なくとも、1以上の所望の細胞型、組織または器官において発現をおこなう1以上の転写制御エレメント例えば、プロモーター、エンハンサーまたはそれらと機能的に同等の構造物を含む。さらなるエレメント、例えば転写終止シグナルも含まれる可能性がある。ベクターまたは構築物遺伝子送達系または遺伝子導入ビヒクルと称する場合もあるは、インビトロもしくはインビボのいずれかで、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を指す。一般的な種類のベクターであるプラスミドは、染色体DNAを独立して複製することができる染色体DNAとは別の染色体外DNA分子である。ある場合では、円形および二本鎖である。~に対応するという用語は、本明細書中で用いられる場合、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部と相同性であるすなわち、厳密には進化上同一でないが、同一であること、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。対照的に、~に対して相補的という用語は、本明細書中で用いられる場合、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部に対して相同性であることを意味する。説明のために、ヌクレオチド配列TATACは、参照配列TATACに対応し、参照配列GTATAに対して相補的である。特定のタンパク質をコード化する遺伝子、ポリヌクレオチド、コーディング領域、配列、セグメント、フラグメントまたは導入遺伝子は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロまたはインビボで転写され、場合によってさらに、遺伝子産物、例えばポリペプチドに翻訳される核酸分子である。コーディング領域は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNA形態のいずれかで存在し得る。DNA形態で存在する場合、核酸分子は、一本鎖すなわち、センス鎖または二本鎖であり得る。コーディング領域の境界は、5’アミノ末端の開始コドンおよび3’カルボキシ末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子は、原核生物由来のcDNAまたは真核生物mRNA、原核性もしくは真核性DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列を含み得るが、これらに限定されるものではない。転写終結配列は、通常、遺伝子配列に対して3’側に位置するであろう。制御エレメントという用語は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム導入部位IRES、エンハンサー、スプライスジャンクションなどをまとめて指し、これらはあわせて受容細胞におけるコーディング配列の複製、転写、転写後プロセッシングおよび翻訳を提供する。選択されたコーディング配列が適切な宿主細胞において複製、転写および翻訳され得る限り、これらの制御エレメントのうちの全てが必ずしも存在する必要はない。プロモーターという用語は、本明細書中ではその通常の意味で用いられ、DNA調節配列を含むヌクレオチド領域を指し、ここで、調節配列は、RNAポリメラーゼに結合することができ、下流3’方向コーディング配列の転写を開始することができる遺伝子から誘導される。エンハンサーにより、プロモーターに近い位置にある場合に、エンハンサードメインの非存在下でプロモーターから得られる転写活性に対して増大した転写活性を付与する核酸配列を意味する。核酸分子に関連して機能的に連結されたにより、2以上の核酸分子例えば、転写される核酸分子、プロモーター、およびエンハンサーエレメントが、核酸分子の転写を可能にするような方法で連結されることを意味する。ペプチドおよび/またはポリペプチド分子に関して機能的に連結されたとは、2以上のペプチドおよび/またはポリペプチド分子が、融合物の各ペプチドおよび/またはポリペプチド成分の少なくとも1つの特性を有する、1つのポリペプチド鎖、すなわち融合ポリペプチドを生じるような方法で連結されていることを意味する。融合ポリペプチドは、好ましくはキメラであり、すなわち、異種分子から構成される。相同性とは、2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチド間の同一性のパーセントを指す。1つの配列と別のものとの間の対応は、当該技術分野で公知の技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、容易に入手可能なコンピュータープログラムを用いることにより、2つのポリペプチド分子間の配列情報の直接的比較によって決定することができる。別法として、相同性は、相同性領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、それに続いて1本鎖特異的ヌクレアーゼ複数可で消化し、消化されたフラグメントのサイズを決定することによって決定することができる。2つのDNA、または2つのポリペプチド、配列は、前記の方法を用いて測定して、少なくとも約80、好ましくは少なくとも約90、そして最も好ましくは少なくとも約95のヌクレオチド、またはアミノ酸が、それぞれ分子の所定の長さにわたって適合する場合に、互いに実質的に相同性である。細胞という用語は、本明細書中では当該技術分野におけるその最も広い意味で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、外界からそれを隔離する膜構造によって取り囲まれ、自己複製する能力を有し、そして遺伝情報およびそれを発現するための機序を有する生体を指す。本明細書中で用いられる細胞は、自然起源の細胞、合成細胞、または人工的に修飾された細胞例えば、融合細胞、遺伝子組換え細胞などであり得る。本明細書中で用いられる場合、幹細胞という用語は、少なくとも1種類のさらに特殊化した細胞を生じさせることができる細胞を指す。幹細胞は、自己再生する能力、すなわち、未分化状態を維持しながら、細胞分裂の多くのサイクルを経験する能力を有し、潜在能力、すなわち特殊化した細胞型に分化する能力を有する。典型的には、幹細胞は、損傷した組織を再生することができる。本明細書中の幹細胞は、胚幹ES細胞、誘導多能性幹iPS細胞、または組織幹細胞組織特異的幹細胞、もしくは体性幹細胞とも呼ばれるであり得るが、これらに限定されるものではない。前述の能力を有し得る人工的に産生された任意の細胞例えば、融合細胞、再プログラム化された細胞、および本明細書中で用いられる類似のものなどは、幹細胞であり得る。胚幹ES細胞は、初期胚から誘導される多能性幹細胞である。ES細胞は1981に初めて確立され、これはさらに、1989年からノックアウトマウスの産生に適用されてきた。1998年に、ヒトES細胞が確立され、これは現在、再生医療に利用可能になってきている。ES細胞とは異なり、組織幹細胞は限定された分化可能性を有する。組織幹細胞は、組織中の特定の位置で存在し、未分化の細胞内構造を有する。したがって、組織幹細胞の多能性は、典型的には低い。組織幹細胞は、さらに高い核/細胞質比を有し、細胞内小器官をほとんど有さない。ほとんどの組織幹細胞は、低い多能性、長い細胞周期、および個体の寿命を越える増殖能力を有する。組織幹細胞は、例えば、表皮系、消化系、骨髄系、神経系などの細胞が由来する部位に基づいてカテゴリーに分けられる。表皮系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛包幹細胞などが挙げられる。消化系の組織幹細胞としては、膵臓共通幹細胞、肝臓幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。誘導多能性幹細胞は、通常、iPS細胞またはiPSCと略記され、再プログラミング因子と称されるある遺伝子を挿入することによって、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞などの非多能性細胞、典型的には成人体細胞、または高分化型細胞から人工的に調製される多能性幹細胞の一種を指す。多能性とは、1以上の組織もしくは器官、または好ましくは、3つの胚葉:内胚葉胃内壁、消化管、肺、中胚葉筋肉、骨、血液、泌尿生殖、または外胚葉表皮組織および神経系のいずれかを構成する全ての細胞に分化する可能性を有する幹細胞を指す。本明細書中で用いられる多能性幹細胞とは、例えば、全能細胞または誘導多能性細胞の直系の子孫などの、3つの胚葉のいずれかに由来する細胞に分化することができる細胞を指す。本明細書中で用いられる場合、全能幹細胞とは、生物を構成する全ての細胞に分化する能力を有する細胞、例えば卵子と精子との融合から生成される細胞を指す。受精卵の最初の数回の分裂によって生成される細胞もまた全能である。これらの細胞は胚および胚外細胞型に分化し得る。多能性幹細胞は、任意の胎性または成体性細胞型を生じ得る。しかし、単独では、これらは胎児または成体動物に発育することができない。なぜなら、これらは、胎盤などの胚外組織に関係する可能性が欠如しているからである。対照的に、多くの前駆細胞は多能性幹細胞である。すなわち、これらは限定された数の細胞運命に分化することができる。多能性前駆細胞は、いくつかの他の細胞型を生じることができるが、それらの型は数が限定されている。多能性幹細胞の一例は、造血細胞、すなわち、数種の血液細胞に発達することができるが、脳細胞または他の種類の細胞に発達することができない血液幹細胞である。胚を形成する長期にわたる細胞分裂の最後は、高分化したか、または永久的に特定の機能を果たすと考えられる細胞である。本明細書中で用いられる場合、体細胞という用語は、例えば、卵子、精子などの生殖細胞以外の任意の細胞を指し、これはそのDNAを次世代へと直接伝えない。典型的には、体細胞は多能性が限定されるか、または多能性を有さない。本明細書中で用いられる体細胞は、自然起源、合成、または遺伝的に修飾されたものであり得る。II.細胞源本発明のある実施形態において、異なる外因性発現カセットを含む、幹細胞または分化細胞を含む細胞系のインビトロセットを提供するための方法および組成物が開示される。いくつかの実施形態において、細胞は、胚幹細胞、胎性幹細胞、または成体幹細胞を含むが、これらに限定されない幹細胞であり得る。さらなる実施形態において、細胞は任意の体細胞であり得る。したがって、ある態様では、実施形態による細胞系は、ヒト胚を破壊することなく作製されることが認められるであろう。B.幹細胞幹細胞は、全部ではなくても、ほとんどの多細胞生物で見出される細胞である。それらは、有糸細胞分裂によって自身を再生する能力、および様々な特殊化した細胞型への分化を特徴とする。2つの広範な種類のほ乳動物幹細胞は:胚盤胞で見出される胚幹細胞、および成体組織で見出される成体幹細胞である。発達中の胚では、幹細胞は特殊化した胚組織の全てに分化できる。成体生物では、幹細胞および前駆細胞は、身体の修復系として作用し、特殊化した細胞を補充するが、再生性器官、例えば血液、皮膚または腸組織の通常のターンオーバーも維持する。ヒト胚幹細胞ESCおよび誘導多能性幹細胞iPSCは、肝細胞をはじめとする身体の全ての細胞型に分化する可能性を保持しつつ、インビトロ長期増殖が可能である。したがって、これらの細胞は、種々の患者特異的分化細胞、例えば、研究、創薬および移植療法のための機能的肝細胞の無制限な供給を潜在的に提供することができる。2.胚幹細胞胚幹細胞系ES細胞系は、胚盤胞または初期桑実期胚の内部細胞塊ICMの外胚葉組織から誘導される細胞の培養物である。胚盤胞は、初期胚であり、ヒトでは約4~5日令であり、50~150細胞からなる。ES細胞は多能性であり、発達中に3つの一次胚葉:外胚葉、内胚葉および中胚葉の全ての誘導体を生じる。換言すれば、ES細胞は、特定の細胞型に十分かつ必要な刺激が与えられる場合、成体の身体の200を越える細胞型のそれぞれに発達し得る。ES細胞は、胚外膜または胎盤に寄与しない。現在までのほとんど全ての研究は、マウス胚幹細胞mESまたはヒト胚幹細胞hESを用いて行われてきた。どちらも必須の幹細胞特性を有するが、未分化状態を維持するために非常に異なる環境を必要とする。マウスES細胞は、ゼラチンの層上で成長させることができ、白血病阻害因子LIFの存在を必要とし得る。ヒトES細胞をマウス胚線維芽細胞MEFのフィーダー層上で成長させることができ、多くの場合、塩基性線維芽細胞成長因子bFGFまたはFGF-2の存在を必要とする。最適培養条件または遺伝子操作なしでChambersetal.,2003、胚幹細胞は急速に分化するであろう。ヒト胚幹細胞はまた、複数の転写因子および細胞表面タンパク質の存在によって定義することもできる。転写因子Oct-4、Nanog、およびSox-2は、分化に至る遺伝子の抑制および多能性の維持を保証するコア調節ネットワークを形成するBoyeretal.,2005。多能性幹細胞を同定するために最も一般的に用いられる細胞表面抗原は、糖脂質SSEA3およびSSEA4ならびにケラタン硫酸抗原Tra-1-60およびTra-1-81を含む。マウスES細胞を得るための方法は周知である。1つの方法において、マウスの129株からの移植前胚盤胞を、マウス抗血清で処理して、栄養外胚葉を除去し、そして内部細胞塊を、ウシ胎仔血清を含有する培地中で化学的に不活性化されたマウス胚線維芽細胞のフィーダー層上で培養する。発生した未分化ES細胞のコロニーを、ウシ胎仔血清の存在下、マウス胚線維芽細胞フィーダー層上で二次培養して、ES細胞の集団を産生する。いくつかの方法で、マウスES細胞をフィーダー層の非存在下で、サイトカイン白血病阻害因子LIFを血清含有培養培地に添加することによって成長させることができるSmith,2000。他の方法では、マウスES細胞を骨形成タンパク質およびLIFの存在下、無血清培地中で成長させることができるYingetal.,2003。ヒトES細胞は、胚盤胞からすでに記載された方法を用いて得ることができるThomsonetal.,1995;Thomsonetal.,1998;ThomsonandMarshall,1998;Reubinoffetal.,2000.。1つの方法において、第5日のヒト胚盤胞をウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に暴露し、次いで1:5希釈のモルモット補体に暴露して、栄養外胚葉細胞を溶解させる。溶解した栄養外胚葉細胞をインタクト内部細胞塊から除去した後、内部細胞塊を、ガンマ-不活性化マウス胚線維芽細胞のフィーダー層上、ウシ胎仔血清の存在下で培養する。9~15日後、内部細胞塊から誘導された細胞塊を、化学的にすなわち、トリプシンに暴露または機械的に解離させ、ウシ胎仔血清を含有する新鮮な培地およびマウス胚線維芽細胞のフィーダー層中に再播種する。さらに増殖したら、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットにより選択し、機械的に解離させて凝集塊にし、再播種する米国特許第6,833,269号を参照のこと。ES様形態は、明らかに高い核対細胞質比を有し、顕著な核小体を有する緻密なコロニーとして特徴付けられる。結果として得られるES細胞を、簡単なトリプシン処理によるか、またはマイクロピペットにより個々のコロニーを選択することによって、通常どおりに継代させることができる。いくつかの方法では、ヒトES細胞は、線維芽細胞のフィーダー層上、塩基性線維芽細胞成長因子の存在下でES細胞を培養することによって、血清なしで成長させることができるAmitetal.,2000。他の方法では、ヒトES細胞は、Matrigel商標またはラミニンなどのタンパク質マトリックス上、塩基性線維芽細胞成長因子を含有する馴化培地の存在下で細胞を培養することによって、フィーダー層なしに成長させることができるXuetal.,2001。培地は、線維芽細胞とともに同時培養することによって、あらかじめ条件付けられる。アカゲザルおよびコモンマーモセットES細胞の単離のための方法も公知であるThomson,andMarshall,1998;Thomsonetal.,1995;ThomsonandOdorico,2000。別のES細胞源は、確立されたES細胞系である。種々のマウス細胞系およびヒトES細胞系が公知であり、それらの成長および繁殖のための条件が規定されている。例えば、マウスCGR8細胞系をマウス株129胚の内部細胞塊から確立し、CGR8細胞の培養物をLIFの存在下、フィーダー層なしで成長させることができる。さらなる例として、ヒトES細胞系H1、H7、H9、H13およびH14はThompsonらによって確立された。加えて、H9系のサブクローンH9.1およびH9.2が開発された。当該技術分野で公知の実質的にいかなるESまたは幹細胞系、例えば、参照することによって本明細書中に組み込まれるYuandThompson,2008で記載されているものも、本発明で用いることができると予想される。本発明に関連して用いるためのES細胞源は、胚盤胞、胚盤胞の内部細胞塊の培養から誘導される細胞、または株化細胞系の培養から得られる細胞であり得る。したがって、本明細書中で用いられる場合、ES細胞という用語は、胚盤胞の内部細胞塊細胞、内部細胞塊の培養から得られるES細胞、およびES細胞系の培養から得られるES細胞を指す可能性がある。3.誘導多能性幹細胞誘導多能性幹iPS細胞は、ES細胞の特性を有するが、分化した体細胞の再プログラミングによって得られる細胞である。誘導多能性幹細胞は、種々の方法によって得られてきた。1つの方法において、成人ヒト皮膚線維芽細胞は、転写因子Oct4、Sox2、c-MycおよびKlf4で、レトロウイルス形質導入を用いて形質転換されるTakahashietal.,2007。形質転換された細胞をSNLフィーダー細胞LIFを産生するマウス細胞線維芽細胞系上、塩基性線維芽細胞成長因子bFGFを追加した培地中に蒔く。約25日後、ヒトES細胞コロニーに類似したコロニーが培養物中に出現する。ES細胞様コロニーを選択し、フィーダー上、bFGFの存在下で増殖させる。細胞特性に基づいて、ES細胞様コロニーの細胞は誘導多能性幹細胞である。誘導多能性幹細胞は、ヒトES細胞と形態学的に類似し、種々のヒトES細胞マーカーを発現する。さらに、ヒトES細胞の分化をもたらすことが知られている条件下で成長させた場合、誘導多能性幹細胞はそれに応じて分化する。例えば、誘導多能性幹細胞は、ニューロン構造およびニューロンマーカーを有する細胞に分化し得る。実質的にいかなるiPS細胞または細胞系も、例えば、YuandThompson,2008で記載されているものを、本発明で用いることができると考えられる。別の方法では、ヒト胎児または新生児線維芽細胞を4つの遺伝子、Oct4、Sox2、NanogおよびLin28でレンチウイルス形質導入を用いて形質転換することができるYuetal.,2007。感染後12~20日で、ヒトES細胞形態を有するコロニーは見えるようになる。コロニーを選択し、増殖させる。コロニーを形成する誘導多能性幹細胞は、ヒトES細胞と形態学的に類似し、種々のヒトES細胞マーカーを発現し、マウスに注射した後に、神経組織、軟骨および腸上皮を有する奇形腫を形成する。マウスから誘導多能性幹細胞を調製する方法も公知であるTakahashiandYamanaka,2006。iPS細胞の誘導は、典型的には、Soxファミリー由来の少なくとも1つのメンバーおよびOctファミリー由来の少なくとも1つのメンバーの発現またはこれらへの暴露を必要とする。SoxおよびOctは、ES細胞同一性を特定する転写調節階層にとって重要であると考えられる。例えば、Soxは、Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15、またはSox-18であり得;OctはOct-4であり得る。Nanog、Lin28、Klf4、またはc-Mycのようなさらなる因子は再プログラミング効率を増大させる可能性があり;再プログラミング因子の特定のセットは、Sox-2、Oct-4、Nanogおよび、場合によって、Lin-28を含むセットであるか;またはSox-2、Oct4、Klfおよび、場合によって、c-Mycを含むセットであり得る。iPS細胞は、ES細胞と同様に、免疫組織化学またはフローサイトメトリーによって、SSEA-1、SSEA-3およびSSEA-4DevelopmentalStudiesHybridomaBank,NationalInstituteofChildHealthandHumanDevelopment,BethesdaMd.、ならびにTRA-1-60およびTRA-1-81Andrewsetal.,1987の抗体を用いて同定または確認することができる特徴的な抗原を有する。胚幹細胞の多能性は、約0.5~10X106細胞を8~12週令のオスSCIDマウスの後肢筋肉中に注射することによって確認することができる。3つの胚葉のそれぞれの少なくとも1つの細胞型を示す奇形腫が発生する。本発明のある態様では、iPS細胞を、OctファミリーメンバーおよびSoxファミリーメンバー、例えばOct4およびSox2を前記のようなKlfまたはNanogと組み合わせて含む再プログラミング因子を用いて、体細胞の再プログラミングから作製する。再プログラミングのための体細胞は、多能性に誘導され得る任意の体細胞、例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝臓細胞、胃細胞、またはβ細胞であり得る。ある態様では、T細胞はまた、再プログラミングのため参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許出願第12/478,154号を参照のことまたはRNAトランスフェクションのため米国特許出願第12/735,060を参照のことの体細胞源として用いることもできる。再プログラミング因子を、組み込み型ベクターまたはエピソームベクターなどの1以上のベクターに含まれる外因性発現カセットから発現させることができる。さらなる態様において、再プログラミングタンパク質を、タンパク質形質導入によって体細胞中に直接導入することができる参照することによって本明細書中に組み込まれる、米国特許出願第61/172,079号を参照のこと。本発明のある態様で使用するための特定の種類の細胞源は、例えばEBVエレメントベースの系などの、エピソーム再プログラミングによって作製されるiPS細胞系であり得る参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許公開第2010/0003757号;Yuetal.,2009を参照のこと。エピソーム再プログラミングの結果、再プログラム化細胞を供与した患者の細胞と遺伝子的に同じiPS細胞が得られ、外来遺伝物質はこの方法によって再プログラム化細胞のゲノムに組み込まれない。エピソーム再プログラミング法は、十分に規定された条件下で実施することができ、信頼性が高く、効率的で、明確である。エピソーム再プログラミングによって作製されるiPS系は、任意の所望の系統に分化することができ、培養物中で無限に複製することができる。4.体細胞核移植によって誘導される胚幹細胞ある態様では、多能性幹細胞を体細胞核移植によって調製することができ、この場合、ドナー核をスピンドルのない卵母細胞に移す。核移植によって産生される幹細胞は、ドナー核と遺伝子的に同一である。1つの方法では、アカゲザルの皮膚線維芽細胞由来のドナー線維芽細胞核を、スピンドルのない成熟減数第2分裂中期アカゲザル卵母細胞の細胞質に電気融合によって導入するByrneetal.,2007。融合卵母細胞を、イオノマイシンへの暴露によって活性化し、次いで胚盤胞段階までインキュベートする。選択された胚盤胞の内部細胞塊を次いで培養して、胚幹細胞系を産生する。胚幹細胞系は、正常なES細胞形態を示し、種々のES細胞マーカーを発現し、インビトロおよびインビボの両方で複数の細胞型に分化する。本明細書中で用いられる場合、ES細胞という用語は、受精核を含有する胚から誘導される胚幹細胞を指す。ES細胞は、体細胞核移植により誘導される胚幹細胞と称される、核移植によって産生される胚幹細胞と区別される。5.他の幹細胞胎性幹細胞は、自己再生能力および多能性分化可能性を有する細胞である。それらは、胎性細胞栄養芽層細胞欧州特許第EP0412700ならびに絨毛膜絨毛、羊水および胎盤WO/2003/042405から単離することができ、増殖させることができる。これらはその全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる。胎性幹細胞の細胞表面マーカーは、CD117/c-kit、SSEA3、SSEA4およびSSEA1-を含む。体性幹細胞は、ほとんどの器官組織において同定されている。もっともよく特徴付けられているのは、造血幹細胞である。これは、細胞表面マーカーおよび機能的特徴に基づいて精製された中胚葉由来の細胞である。骨髄、血液、臍帯血、胎性肝臓および卵黄嚢から単離される造血幹細胞は、レシピエントの生命を救うために造血を再開始し、複数の造血系統を生成する前駆細胞である米国特許第5,635,387号;同第5,460,964号;同第5,677,136号;同第5,750,397号;同第5,759,793号;同第5,681,599号;同第5,716,827号;Hilletal.,1996を参照のこと。これらはその全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる。致死的に照射された動物またはヒトに移植される場合、造血幹細胞は、赤血球、好中球-マクロファージ、巨核球およびリンパ様造血細胞プールを再増殖することができる。インビトロで、造血幹細胞を少なくとも数回自己再生細胞分裂するように誘導することができ、インビボで見られるのと同じ系統に分化するように誘導することができる。したがって、この細胞は幹細胞の基準を満たす。2番目によく特徴付けられているのは、最初は胚中胚葉から誘導され、成人骨髄から単離された間葉系幹細胞MSCであり、これは分化して、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄基質、および腱を形成することができる。胚形成の間、中胚葉は、骨、軟骨、脂肪、骨格筋およびおそらくは内皮を生成する組織である、肢芽中胚葉に発達する。中胚葉はまた、内臓中胚葉にも分化し、これは、心筋、平滑筋、または内皮および造血前駆細胞からなる血島を生じることができる。原始中胚葉または間葉系幹細胞は、したがって、多くの細胞および組織型源を提供することができる。多くの間葉系幹細胞が単離されている例えば、米国特許第5,486,359号;同第5,827,735号;同第5,811,094号;同第5,736,396号;米国特許第5,837,539号;同第5,837,670号;同第5,827,740号;Jaiswaletal.,1997;Cassiedeetal.,1996;Johnstoneetal.,1998;Yooetal.,1998;Gronthos,1994;Makinoetal.,1999を参照のこと。これらはその全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる。記載された多くの間葉系幹細胞のうち、全てが限定された分化を示し、一般的に間葉起源であると考えられる分化細胞のみを形成する。今日まで、最も多能性の間葉系幹細胞は、SH2SH4CD29CD44CD71CD90CD106CD120aCD124CD14-CD34-CD45-表現型を発現する。他の幹細胞、例えば胃腸幹細胞、表皮幹細胞、神経および卵形細胞と称される肝臓幹細胞も同定されているPotten,1998;Watt,1997;Alisonetal.,1998。いくつかの実施形態において、本明細書中で記載されている方法に有用な幹細胞としては、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来幹細胞、造血幹細胞、軟骨細胞前駆細胞、表皮幹細胞、胃腸幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞脂肪誘導間葉系幹細胞、膵臓前駆細胞、毛包幹細胞、内皮前駆細胞および平滑筋前駆細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、本明細書中で記載される方法に使用される幹細胞は、臍帯、胎盤、羊水、コリオン絨毛、胚盤胞、骨髄、脂肪組織、脳、末梢血、消化管、臍帯血、血管、骨格筋、皮膚、肝臓および月経血から単離される。月経血で調製される幹細胞は、子宮内膜新生細胞MedistemInc.と呼ばれる。当業者は、そのような幹細胞を位置決定し、単離し、そして増殖することができる。ヒト幹細胞を種々の供給源から単離するための詳細な手順は、CurrentProtocolsinStemCellBiology2007に記載され、これは、その全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる。別法として、商業的キットおよび単離システムを用いることができる。例えば、BDBiosciences製のBDFACSAria細胞分取システム、BDIMag磁気細胞分離システム、およびBDIMagマウス造血前駆細胞富化セット。幹細胞を種々の供給源から単離および培養する方法はまた、5,486,359、6,991,897、7,015,037、7,422,736、7,410,798、7,410,773、7,399,632に記載され、これらはその全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる。C.体細胞本発明のある態様において、外因性発現カセットを有する操作された体細胞系も提供することができる。体細胞系を、分化転換の方法、すなわち、1つの体細胞型から別の体細胞型への直接変換、例えば、他の体細胞からの肝細胞の誘導で用いることができる。しかし、ヒト体細胞は、供給が、特に生体ドナーからのものに限定される可能性がある。出発細胞の無制限の供給を提供するある態様において、体細胞を、hTERTまたはオンコジーンなどの不死化遺伝子またはタンパク質の導入によって体細胞を不死化することができる。細胞の不死化は、可逆的例えば、除去可能な発現カセットを使用または誘導性例えば、誘導性プロモーターを使用であり得る。本発明のある態様における体細胞は、一次細胞非不死化細胞、例えば動物から新たに単離されたものであり得るか、または細胞系不死化細胞から誘導することができる。細胞は、それらを対象から単離した後に細胞培養物中に維持することができる。ある実施形態において、細胞を、本発明の方法においてそれらを使用する前に1回以上例えば、2~5、5~10、10~20、20~50、50~100回またはそれ以上継代させる。いくつかの実施形態において、細胞を、本発明の方法での使用前に、1、2、5、10、20、または50回だけ継代させる。それらを凍結、解凍などすることができる。使用され、本明細書中で記載される体細胞は、天然体細胞、または操作された体細胞、すなわち、遺伝子的に改変された体細胞であり得る。本発明の体細胞は、典型的には哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、霊長類細胞またはマウス細胞である。それらは、周知の方法によって得ることができ、生きている体細胞を含有する任意の器官または組織、例えば、血液、骨髄、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、繁殖器官、膀胱、腎臓、尿道および他の泌尿器などから得ることができる。本発明で有用な哺乳動物体細胞としては、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒層上皮、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球BおよびTリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、および他の筋肉細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、細胞は、所望の細胞型においてのみ、もしくは所望の細胞型において主に発現されることが知られている内因性マーカーのそれらの発現、または条件反応性調節エレメントの制御下での発現カセットの発現に基づいて選択される。例えば、ビメンチンは線維芽細胞マーカーである。他の有用なマーカーとしては、種々のケラチン、細胞接着分子、例えばカドヘリン、フィブロネクチン、CD分子などが挙げられる。体細胞の集団は、18~96時間、例えば、24~48時間、48~72時間などの平均細胞周期を有し得る。いくつかの実施形態において、少なくとも90、95、98、99またはそれ以上の細胞が、例えば24、48、72、または96時間などの所定の時間以内で分裂することが予想される。本明細書中で記載される方法を用いて、1以上の体細胞、例えば体細胞のコロニーまたは集団を肝細胞にプログラムすることができる。いくつかの実施形態において、本発明の細胞の集団は、少なくとも90の細胞が対象の表現型または特性を示す点で、実質的に均一である。いくつかの実施形態において、少なくとも95、96、97、98、99、99.5、99.8、99.9、99.95またはそれ以上の細胞が対象の表現型または特性を示す。本発明のある実施形態において、体細胞は、分裂する能力を有する。すなわち、体細胞は有糸分裂後でない。体細胞を部分的または完全に分化させることができる。分化は、あまり特殊化していない細胞がより特殊化した細胞型になるプロセスである。細胞分化は、サイズ、形状、極性、代謝活性、遺伝子発現および/または細胞のシグナルに対する反応性の変化を含み得る。例えば、造血幹細胞は分化して、骨髄単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞およびリンパ様系統T細胞、B細胞、NK細胞をはじめとする全ての血液細胞型を生じさせる。分化の経路にそって進行する間、細胞の最終的な運命はさらに固定されるようになる。本明細書中に記載するように、部分的に分化した体細胞および完全に分化した体細胞はどちらも本明細書中に記載するようにしてプログラムして、肝細胞などの所望の細胞型を産生することができる。III.条件反応性調節エレメント本発明のある態様は、インビトロで培養された細胞集団における標的組織型に対する生物学的応答および/または薬理学的効果を判定するための方法および組成物を提供する。細胞は、分化状態における変化のような細胞における状態変化、または培養培地中に存在する薬物候補によって引き起こされ得るものなどの毒物学的もしくは代謝変化を反映する選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を制御する異なる条件反応性調節エレメントを含む種々の発現カセットを含有する。条件反応性調節エレメントを、組織特異的、細胞特異的、分化特異的、もしくは分子-経路特異的応答が活性化されるか、または特定の毒物学的または他の代謝効果が細胞において起こる場合に上方調節されることが知られている遺伝子から得ることができる。これは、調節エレメント活性を示すものとしてモニターすることができる外部シグナルを提供するマーカー遺伝子の転写を制御する。この系は、定方向分化の培養条件のパネルまたは細胞に対する潜在的な毒性および他の代謝効果についての試験薬剤のパネルの迅速なハイスループットスクリーニングを可能にする。条件反応性調節エレメントは、本明細書中で用いられる場合、特定の細胞条件、例えば、特定の細胞型または細胞シグナリング経路の活性化のためのプログラミングを含む条件に反応して転写を調節例えば、上方調節または下方調節するヌクレオチド配列を指す。例えば、これらの配列は、本来はモジュラーで有り得、特定の転写因子と相互作用する短い10~12塩基対認識エレメントのアレイからなる。特定の細胞型においてのみ、または細胞外インデューサーに反応して機能する正および負の調節エレメントは、バイオインフォーマティック分析によって同定され、予想することができる。誘導性および組織特異的遺伝子発現の多くの例は、新しいタンパク質の合成よりもむしろ、あらかじめ存在する転写因子の活性化を含む。この活性化は、タンパク質の共有結合修飾またはその構造におけるアロステリック変化を含み得る。B.条件反応性調節エレメント細胞系のセットにおける外因性発現カセットは、任意の条件反応性調節エレメント、特に、選択された組織もしくは細胞系統、または選択されたシグナリング経路について特異的なプロモーターもしくはエンハンサー、例えば、表1に列挙した遺伝子のプロモーターを含み得る。下記表で示すように、組織または系統特異的プロモーターは、器官、一般的な細胞型または特定の細胞型に対して特異的であり得る。したがって、トロポニンTまたはアルファミオシン重鎖のようなプロモーターは、汎心臓性であり得るか、または全ての種類の心臓細胞で発現し、一方、サルコリピンのようなプロモーターは、心房細胞のみを特定するために用いることができる。例示的組織特異的調節エレメントは、以下のものについて特異的な遺伝子の1以上の調節エレメント、それらの全てさえも含み得るが、これらに限定されるものではない:1器官:ヒト体内の全ての器官。例えば、腎臓、心臓、肝臓、膵臓、腸など。2器官サブフラクション:ヒト体内の全ての器官サブフラクション。例えば、腎臓髄質、腎臓皮質、心房、心室など。細胞型特異的カテゴリーの例としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる:1細胞前駆体:すべての関連する前駆細胞サブタイプ。例えば、神経前駆細胞、造血前駆細胞、肝細胞前駆細胞、心筋前駆細胞など。2最終TERMINAL細胞型:ヒト体内の全ての最終細胞型。例えば、肝細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロンなど。3最終細胞サブタイプ:ヒト体内の全ての最終細胞サブタイプ。例えば、心室心筋細胞、心房心筋細胞、結節心筋細胞、動脈内皮細胞、静脈内皮細胞、リンパ内皮細胞、血液脳関門内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、運動ニューロンなど。種々のシグナリング経路に関与する遺伝子のプロモーターまたはコーディング配列を本発明のある態様で用いることができる。特に、培養物または細胞条件における変化特に、一種の試験薬物の存在ならびにシグナリング経路の上方調節または下方調節に反応して上方調節または下方調節される遺伝子を制御する任意のプロモーターまたは転写制御エレメントは、本発明のある態様における使用に好適であり得る。これらのシグナリング経路遺伝子は当該技術分野で公知であり、例えば、ワールドワイドウェブによりinvitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-and-Tissue-Analysis/Signaling-Pathways.htmlで入手可能である。例示的シグナリング経路遺伝子は、細胞内シグナリング経路に関与する可能性があり:チロシンキナーゼ、ヘテロトリマーGタンパク質、低分子量GTPase、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、脂質キナーゼ、ヒドロラーゼ、クロマチン調節、MAPKシグナリング、アポトーシス/オートファジー、翻訳制御,細胞周期/チェックポイント、DNA損傷、Jak/Stat経路、NF-κΒシグナリング、TGF-β/Smadシグナリング、リンパ球シグナリング、脈管形成、小胞輸送、細胞骨格シグナリング、接着、グルコース代謝、Wnt/Hedgehog/Notch、幹細胞/系統マーカー、核受容体、またはタンパク質フォールディングおよび安定性を包含するが、これらに限定されるものではない。第2のメッセンジャー、例えば:サイクリックAMPcAMP、サイクリックGMPcGMP、ホスファチジルイノシトール三リン酸PIP3、ジアシルグリセロールDAG、イノシトール三リン酸IP3。アダプタータンパク質、例えば:カルモジュリンのEFハンドドメイン、キナーゼタンパク質AKTのプレクストリン相同ドメインなど。好適な特性を有するプロモーターの例としてはさらに、以下のものが挙げられる:PUMA遺伝子などのアポトーシスに反応する遺伝子のプロモーター。アポトーシスを誘発する薬物は、このカテゴリーのプロモーターを誘発し得る。他の候補は、Gadd34、PUMA、GAHSP40、TRAIL-R2/DR5、c-fos、Gadd153、APAF-1、Gadd45、BTG2/PC3、Peg3/Pwl、Siah1a、S29リボソームタンパク質、FasL/CD95L、組織トランスグルタミナーゼ、GRP78、Nur77/NGFI-B、シクロフィリンD/CYPD、およびP73である。p21、p21/WAFl、またはPig3遺伝子などの、DNA損傷に反応する遺伝子のプロモーター。突然変異原またはテラトゲンは、このカテゴリーのプロモーターを誘発することができる。Ki-67またはAuroraA遺伝子などの過形成に反応する遺伝子のプロモーター。増殖を刺激する薬剤は、このカテゴリーのプロモーターを誘発することができる。酸化的ストレスに反応する遺伝子のプロモーター。ヘムオキシゲナーゼ1Hmox1、およびスーパーオキシドジスムターゼMnSODは、低い酸素レベルで上方調節され;γ-グルタミルシステイニルリガーゼGCL、ならびにメタロチオニンIおよびIIは、グルタチオンの枯渇、または金属イオンの存在によってそれぞれ上方調節される。他の候補は、IkB、ATF4、キサンチンオキシダーゼ、COX2、iNOS、Ets-2、シクロフィリンA/CYPA、NQO1、およびbNIP3である。これらの事象のいずれかの開始に際して遺伝子発現プロフィールにおける変化を反映する転写因子のプロモーター、例えばPXR、CAR、アリール炭化水素受容体AhR、またはNrf2遺伝子。肝臓毒性において上方調節される他の肝細胞マーカーのプロモーター、例えば、Lrg-21、SOCS-2、SOCS-3、PAI-I、GBP28/アジポネクチン、α1-酸糖タンパク質、ATF3、およびIgfbp-3。アンドロゲン、エストロゲン、およびpPAG反応性遺伝子によって例示される、核において作用する受容体に対して反応する遺伝子のプロモーター。一例は、前立腺特異抗原PSAの遺伝子である。薬物代謝に関与する肝細胞酵素のプロモーターであって、これも基質の存在下で上方調節される。例は、チトクロムP450遺伝子、例えばCYP3A4およびCYP1A1である。MDR1などの基質によって上方調節される薬物トランスポーター遺伝子のプロモーター。カルシウム流動遺伝子などの、心臓の収縮速度またはQT間隔に影響を及ぼす遺伝子のプロモーター。ある臨床状態で不足し、そのために発現を調節できる薬物をスクリーニングすることが有用であり得る、生成物を制御する遺伝子のプロモーター。例は、ホルモン発現例えば、インスリン、またはコルチゾールを制御する遺伝子、ならびに神経伝達物質の合成、放出、代謝、または再取り込みを制御する遺伝子例えば、セロトニントランスポーターおよびチロシンヒドロキシラーゼである。本開示で記載されるこれらおよび他のプロモーターを、GenBankなどのソースから得られる配列データを用いて構築された所望の配列について特異的なプライマーを用いて、好適なゲノムライブラリから増幅によってクローンすることができる。特定の例では、特にプログラミングから誘導される肝細胞におけるマーカー遺伝子発現のための組織特異的導入遺伝子発現が、誘導された肝細胞を同定するための方法として望ましい。特異性および活性の両方を増大させるために、シス作用性調節エレメントの使用が想定されてきた。例えば、アルブミン、α-1-抗トリプシンAAT、チトクロムP4503A4CYP3A4、アポリポタンパク質A-I、またはAPOEのプロモーターなどの肝細胞特異的プロモーターを使用することができる。ある態様では、これはまた、エンハンサー配列、すなわち、プロモーターの活性を増大させ、シスで、それらの配向に関係なく、比較的長い距離にわたってさえも標的プロモーターから数キロベースまで離れて作用する可能性を有する核酸配列に関する。しかし、エンハンサー機能は、必ずしもそのような長い距離に限定されるわけではない。というのは、それらはまた、所与のプロモーターに非常に近接して機能することができるからである。肝臓については、そのような器官特異的調節配列をレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターに多くの場合、ハウスキーピング肝細胞特異的細胞プロモーターに加えて組み入れるための多くのアプローチが今までに報告されているFerryetal.,1998;Ghoshetal.,2000;Miaoetal.,2000;Follenzietal.,2002。肝臓特異的遺伝子のいくつかのエンハンサー配列が文書化されている。WO2009130208は、いくつかの肝臓特異的調節エンハンサー配列を記載する。WO95/011308は、プロモーターおよび導入遺伝子に連結された肝細胞特異的制御領域HCRエンハンサーを含む遺伝子療法ベクターを記載する。ヒトアポリポタンパク質E-肝細胞制御領域ApoE-HCRは、アポリポタンパク質EApoE遺伝子の肝臓特異的発現の遺伝子座制御領域LCRである。ApoE-HCRは、ApoE/CI/CII座に位置し、771bpの全長を有し、肝臓における遺伝子ApoEおよびApoC-1の発現において重要であるSimonetetal.,1993。WO01/098482では、この特異的ApoEエンハンサー配列またはそのトランケート型の肝臓プロモーターとの組み合わせが示唆されている。非トランケート型ApoE-HCRエンハンサーをヒトアルファ-抗トリプシンAATプロモーターと組み合わせるベクター構築物は、最高レベルの治療用タンパク質をインビボで産生することができMiaoetal.,2000、異種導入遺伝子と組み合わせて用いられる場合、持続性発現を付与し得るMiaoetal.,2001ことが示された。他のキメラ肝臓特異的構築物がさらに、例えば、AATプロモーターおよびアルブミンまたはB型肝炎エンハンサーKrameretal.,2003、またはアポリポタンパク質Eエンハンサーエレメントの2つのタンデムコピーに連結されたアルコールデヒドロゲナーゼ6ADH6基礎プロモーターGehrkeetal.,2003に関して文献で提案されている。後者の刊行物の著者らは、比較的小さなサイズ1068bpのこのエンハンサー-プロモーター組み合わせの重要性を強調している。C.プロモーター同定および特性化現在、17,000を越えるヒトプロモーターの集合SwitchGearGenomicsから入手可能を本発明の外因性発現カセットに組み入れることができる。調節は、ホルモンなどの細胞外シグナルで始まり、1以上のタンパク質の活性の増加または減少に至る事象の複雑な編成である。バイオインフォーマティクス技術を適用して、このプロセスにおける種々のステップを調査することができる。例えば、プロモーター分析は、遺伝子のコーディング領域を取り囲むDNA中の配列モチーフの同定および研究を含む。これらのモチーフは、その領域がmRNAに転写される程度に影響を及ぼす。発現の調節は、個々の遺伝子および/またはエンハンサーのプロモーター配列によって大部分が決定される。ヒトゲノムの完全配列は、現在、多くの調節領域の同定のための分子基盤を提供する。例えば、特定のcDNAのプロモーター配列は、ゲノム配列から、エキソンマッピングによって確実に得ることができる。cDNAが5’-不完全である多くの場合では、高品質のプロモーター予測ツールを用いて、ゲノム配列中でプロモーターを直接位置づけることができる。プロモーター予測における重大な改善がここ数年間でなされてきた。PromoterScanPrestridge,1995は、許容可能に高い特異性を有する第1プロモーター予測アルゴリズムの1つとして見られてきた。最近では、PromoterInspectorScherfetal.,2000およびDragonPromoterFinderBajicetal.,2002が、プロモーター予測アルゴリズムの特異性および感受性においてさらなる進展を遂げた。PromoterScanは、特定の転写因子結合部位の密度と組み合わされたTATAボックス位置重みマトリックスを用いてプロモーターを特定する。アルゴリズムは、比較的高い特異性であるが、低い感受性のものであることが示された。PromoterExplorerと呼ばれる、有効なプロモーター同定アルゴリズムが、最近、Xieら2006によって提案されている。このアプローチでは、種々の特徴、例えば、ペンタマーの局所分布、位置的CpG島特徴およびデジタル化されたDNA配列を組み合わせて、高次元インプットベクターを構築し、次いでカスケードAbaBoostアルゴリズムを使用して、属性選択および分類子トレーニングの両方を実施する。発現データは、遺伝子調節を意味するためにも使用することができ:生物の多種多様な状態からのマイクロアレイデータを比較して、各状態に関与する遺伝子について仮説を立てることができる。単細胞生物において、細胞周期の段階を、種々のストレス状態熱ショック、飢餓などと比較することができる。次いで、クラスタリングアルゴリズムをその発現データに適用して、どの遺伝子が同時発現されるかを判定することができる。例えば、同時発現された遺伝子の上流領域プロモーターを多すぎる調節エレメントについて検索することができる。IV.発現カセット本発明は、調節エレメント活性をモニターするための外部シグナルを提供する選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を調節する条件反応性調節エレメントを含む外因性発現カセットの使用を含む。ある態様では、発現カセットは、同義遺伝子の効率的な同時発現のための多シストロン性メッセージを伝達することができる。B.多シストロン性メッセージ本発明のある態様において、この多シストロン性系からの柔軟性および効率的な発現がその利点の基礎をなし、それを操作された細胞を提供するための有用なツールとして確立する。この系の種々の置換は:1多シストロン性転写物中に少なくとも2つのマーカー、例えば選択可能なマーカーおよびスクリーン可能なマーカーの両方、2つの異なる選択可能なマーカーまたは2つの異なるスクリーン可能なマーカーを含むこと、2薬物代謝酵素遺伝子またはプログラミング遺伝子などの非マーカーコーディング配列と組み合わせて1以上のマーカーを含むこと、または3少なくとも3つのコーディング配列を有するカセットを、例えば少なくとも2つのIRES部位または2Aペプチドを用いて作成することを含むが、これに限定されるわけではない。2.多シストロン性発現のためのプロテアーゼ切断部位または自己切断型ペプチドある態様では、本発明にしたがって、マーカーまたは他のタンパク質をコード化する遺伝子を、プロテアーゼ切断部位すなわち、プロテアーゼの認識部位を含む配列または少なくとも1つの自己切断型ペプチドをコードする配列2以上ある可能性があるによって互いに連結させることができる。本発明の好ましい実施形態によると、多シストロン性メッセージを構成する遺伝子を連結する配列複数可によってコード化される切断部位を切断することができるプロテアーゼ複数可は、本発明のポリヌクレオチドによってコード化される。さらに好ましくは、プロテアーゼ複数可をコード化する遺伝子複数可は、少なくとも1つの多シストロン性メッセージの一部である。好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドは、当業者に公知である例えば、Ryanetal.,1997;Scymczaketal.,2004を参照のこと。プロテアーゼ切断部位の好ましい例は、ポティウイルスNIaプロテアーゼ例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、ポティウイルスHCプロテアーゼ、ポティウイルスP1P35プロテアーゼ、ビオウイルスbyovirusNlaプロテアーゼ、ビオウイルスRNA-2コード化プロテアーゼ、アフトウイルスLプロテアーゼ、エンテロウイルス2Aプロテアーゼ、ライノウイルス2Aプロテアーゼ、ピコルナ3Cプロテアーゼ、コモウイルス24Kプロテアーゼ、ネポウイルス24Kプロテアーゼ、RTSVricetungrosphericalvirus3C様プロテアーゼ、PY\IFparsnipyellowfleckvirus3C様プロテアーゼ、トロンビン、第Xa因子およびエンテロキナーゼの切断部位である。その高い切断ストリンジェンシーのために、TEVタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位が特に好ましい。したがって、本発明によるポリジーンの遺伝子は、一般的な、形態EXYXQG/Sここで、Xは任意のアミノ酸を表すTEVによる切断は、QおよびGまたはQおよびS間で起こるのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を含むヌクレオチドの鎖によって好ましくは連結される。最も好ましいのは、それぞれ、ENLYFQGおよびENLYFQSをコードするリンカーヌクレオチド配列である。好ましい自己切断型ペプチドシス作用性加水分解性エレメント、CHYSELとも呼ばれる;deFelipe2002を参照のことは、ポティウイルスおよびカルジオウイルス2Aペプチドから誘導される。特に好ましい自己切断型ペプチドは、FMDV口蹄疫ウイルス、ウマ鼻炎Aウイルス、ゾーシーアシグナThoseaasignaウイルスおよびブタテスコteschoウイルスから誘導される2Aペプチドから選択される。本発明の多シストロン性メッセージを構成するヌクレオチド配列によってコード化されるポリペプチドは、同一であってもよいし、または異なっていてもよい。したがって、本発明の構築物中に存在する各ポリジーンは、対象のタンパク質をコード化する各ヌクレオチド配列の1以上のコピーを含有し得る。3.IRES本発明のある実施形態において、内部リボソーム導入部位IRESエレメントを使用して、多重遺伝子または多シストロン性メッセージを形成する。IRESエレメントは、5’メチル化Cap依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを回避することができ、内部部位での翻訳を開始することができるPelletierandSonenberg,1988。ピコルナウイルスファミリーポリオおよび脳心筋炎の2つのメンバーからのIRESエレメントが記載されPelletierandSonenberg,1988、哺乳動物メッセージからのIRESも同様に記載されているMacejakandSarnow,1991。IRESエレメントを異種オープンリーディングフレームに連結させることができる。複数のオープンリーディングフレームをあわせて転写することができ、それぞれはIRESによって隔てられ、多シストロン性メッセージを形成する。IRESエレメントによって、各オープンリーディングフレームは効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。同義遺伝子を、1つのプロモーター/エンハンサーを用いて効率的に発現して、単一のメッセージを転写することができるそれぞれ、参照することによって本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,925,565号および同第5,935,819号を参照のこと。ほとんどの真核生物およびウイルスメッセージは、mRNAの5’末端で7-メチルグアノシンキャップの認識を含む機序によって翻訳を開始する。しかし、数例では、mRNAのキャップ領域から翻訳された遺伝子の3’下流に位置する内部リボソーム導入部位IRESがリボソームによって認識され、転写物からの第2のコーディング領域の翻訳を可能にする、キャップ非依存的機序によって翻訳が起こる。したがって、IRESエレメントは、5’メチル化キャップ依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルを回避することができ、内部部位での翻訳を開始することができるPelletierandSonenberg,1988。これは本発明で特に重要である。なぜなら、IRES配列は、1つの遺伝子座から複数のタンパク質の同時発現を可能にするからである。IRESエレメントを異種オープンリーディングフレームに連結することができる。複数のオープンリーディングフレームをあわせて転写することができ、それぞれはIRESによって隔てられ、多シストロン性メッセージを形成する。IRESエレメントによって、各オープンリーディングフレームは効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。同義遺伝子を、1つのプロモーター/エンハンサーを用いて効率的に発現して、1つのメッセージを転写することができる米国特許第5,925,565号および同第5,935,819号それぞれは参照することによって本明細書中に組み込まれるを参照のこと。特に好ましい実施形態は、同じ多シストロン性転写物内に所望の組換え産物および選択可能またはスクリーン可能なマーカー両方のコーディング配列を含むことを含む。有効な変換事象は、所望の再プログラミング因子または薬物反応性遺伝子および容易に検出可能な選択可能またはスクリーン可能なマーカーの両方の発現によってマークされ、うまくトランスフェクトされた細胞の選択を促進する。ピコルナウイルスファミリーの2つのメンバーからのIRESエレメントポリオおよび脳心筋炎が記載されPelletierandSonenberg,1988、哺乳動物メッセージからのIRESも同様に記載されているMacejakandSarnow,1991。ある例には、I型ポリオウイルスからのIRESエレメント、脳心筋炎ウイルスEMVの5’UTR、セーラーThelierのネズミ脳脊髄炎ウイルスTMEVの5’UTR、口蹄疫ウイルスFMDVの5’UTR、ウシエンテロウイルスBEVの5’UTR、コクサッキーBウイルスCBVの5’UTR、もしくはヒトライノウイルスHRVの5’UTR、またはヒトイムノグロブリン重鎖結合タンパク質BIP5’UTR、ショウジョウバエアンテナペディアDrosophilaantennapediae5’UTRもしくはショウジョウバエウルトラビソラクスDrosophilaultrabithorax5’UTR、または前記配列から得られる遺伝的ハイブリッドもしくはフラグメントが含まれる。IRES配列は、Kimら1992およびMcBratneyら1993で記載されている。ある実施形態において、多シストロン性転写物は、1以上の内部リボソーム導入部位IRESを採用することによって用いることができる。例示的IRESは、脳心筋炎ウイルスIRES、ピコルナウイルスIRES、口蹄疫ウイルスIRES、A型肝炎ウイルスIRES、C型肝炎ウイルスIRES、ヒトライノウイルスIRES、ポリオウイルスIRES、ブタ水疱病ウイルスIRES、カブモザイクポティウイルスIRES、ヒト線維芽細胞成長因子2mRNAIRES、ペスチウイルスIRES、リーシュマニアLeishmaniaRNAウイルスIRES、マローニーネズミ白血病ウイルスIRESヒトライノウイルス14IRES、アフトウイルスIRES、ヒトイムノグロブリン重鎖結合タンパク質mRNAIRES、ショウジョウバエアンテナペディアmRNAIRES、ヒト線維芽細胞成長因子2mRNAIRES、G型肝炎ウイルスIRES、トバモウイルスIRES、血管内皮成長因子mRNAIRES、コクサッキーB群ウイルスIRES、c-mycプロトオンコジーンmRNAIRES、ヒトMYT2mRNAIRES、ヒトパレコウイルス1型ウイルスIRES、ヒトパレコウイルス2型ウイルスIRES、真核生物開始因子4GImRNAIRES、チャバアオカメムシPlautiastali腸ウイルスIRES、セーラーのネズミ脳脊髄炎ウイルスIRES、ウシエンテロウイルスIRES、コネキシン43mRNAIRES、ホメオドメインタンパク質GtxmRNAIRES、AML1転写因子mRNAIRES、NF-カッパB抑制因子mRNAIRES、アポトーシスX連鎖阻害因子mRNAIRES、クリケット麻痺ウイルスRNAIRES、p58PITSLREタンパク質キナーゼmRNAIRES、オルチニンデカルボキシラーゼmRNAIRES、コネキシン-32mRNAIRES、ウシウイルス性下痢ウイルスIRES、インスリン様成長因子I受容体mRNAIRES、ヒト免疫不全ウイルス1型gag遺伝子IRES、ブタコレラウイルスIRES、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスIRES、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリから選択される短IRES、ジェンブラナ病ウイルスIRES、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子1mRNAIRES、ムギクビレアブラムシRhopalosiphumpadiウイルスIRES、カチオン性アミノ酸トランスポーターmRNAIRES、ヒトインスリン様成長因子IIリーダー2mRNAIRES、ジアルジアウイルスIRES、Smad5mRNAIRES、ブタテスコウイルス-1タルファンIRES、ショウジョウバエヘアレスHairlessmRNAIRES、hSNM1mRNAIRES、Cbfa1/Runx2mRNAIRES、エプスタインバーウイルスIRES、ハイビスカス退緑斑ウイルスIRES、ラット下垂体バソプレッシンVlb受容体mRNAIRES、ヒトhsp70mRNAIRES、またはその変異体であり得る。C.選択およびスクリーン可能なマーカー本発明のある実施形態において、本発明の核酸構築物を含有する細胞は、発現カセット中にマーカーを含めることによって、インビトロまたはインビボで同定することができる。そのようなマーカーは、細胞に特定可能な変化を与え、発現カセットを含有する細胞の容易な同定を可能にする。一般的に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。正の選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、一方、負の選択マーカーは、その存在がその選択を妨害するものである。正の選択マーカーの一例は薬物耐性マーカーである。通常、薬物選択マーカーの包含は、形質転換体のクローニングおよび同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ジェネティシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体の判別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、その基礎が比色分析である、GFPなどのスクリーン可能なマーカーをはじめとする他の種類のマーカーも企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼtkまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCATなどの負の選択マーカーとしてのスクリーン可能な酵素を利用することができる。当業者は、免疫学的マーカーを、おそらくはFACS分析と関連して用いる方法も知っている。遺伝子産物をコード化する核酸と同時に発現することができる限り、使用されるマーカーは重要ではないと考えられる。選択およびスクリーン可能なマーカーのさらなる例は、当業者には周知である。本発明のある実施形態は、スクリーン可能なレポーター遺伝子を利用して、細胞の特定の特性、例えば、レポーターマーカー遺伝子発現を制御する条件反応性調節エレメントを活性化することによる、所定の細胞系統にそった分化を示す。そのようなレポーターの例としては、細胞表面タンパク質例えば、CD4、HAエピトープ、蛍光タンパク質、抗原性決定因子および酵素例えば、β-ガラクトシダーゼまたはニトロレダクターゼをコード化する遺伝子が挙げられる。ベクター含有細胞を、例えば、ベクターでコード化された酵素により蛍光生成物に変えることができる細胞表面タンパク質または基質に対する蛍光標識された抗体を用いたFACSによって、単離することができる。ある態様において、細胞透過性色素を用いてレスポーターresporterを発現する細胞を同定することができる。例えば、NFATニトロレダクターゼ遺伝子の発現は、細胞透過性蛍光発生促進pro-fluorogenic基質、例えばCytoCy5Sを用いることによって検出することができる例えば、それぞれ参照することによって本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,633,158号、同第5,780,585号、同第5,977,065号および欧州特許第EP1252520号を参照のこと。具体的な実施形態において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質である。ほとんど全ての可視光スペクトルに及ぶ蛍光発光スペクトルプロフィールを特徴とする様々な蛍光タンパク質遺伝子変異体が開発されている非限定的な例については表2を参照のこと。最初のオワンクラゲ緑色蛍光タンパク質における突然変異誘発研究の結果、青色から黄色まで及び、生物学的研究で最も広く用いられるインビボレポーター遺伝子のいくつかである新しい蛍光プローブが得られた。オレンジ色および赤色スペクトル領域で発光する、さらに長い波長の蛍光タンパク質が、イソギンチャク、赤サンゴDiscosomastriata、および花虫Anthozoa綱に属する珊瑚礁から開発された。シアン、緑色、黄色、オレンジ色、および深紅色蛍光発光を有する類似したタンパク質を産生するために、さらに他の種が採掘されている。蛍光タンパク質の輝度および安定性を改善し、かくしてそれらの全体的な有用性を改善するための開発的研究努力が継続中である。D.対立遺伝子変異型本発明のある態様において、細胞系のセットまたは発現カセットは、薬物代謝酵素または薬物標的のさらなるコーディング配列およびその変異体をさらに含み得る。多能性幹細胞を使用する1つの利点は、それらが、特定の対象の薬物代謝酵素または薬物標的をコード化する遺伝子において特定の変動を有することを除いて、すべての点で同一である細胞を作製する能力である。これは薬物スクリーニングに関して重要である。なぜなら、特定の種類の薬物に反応するかまたは代謝する個体の能力に影響を及ぼすいくつかの自然起源の対立遺伝子変異型が存在するからである。細胞は、それ以外は同じであるので、使用者は、アロタイプ特異的な方法でスクリーニングされる化合物の効果を決定することができる。公開された米国特許出願第2003/0003573号を参照のこと。重要な既知対立遺伝子変異型を有する薬物代謝酵素の例は、Wolfら,2000;Wolfら,1999;およびWebber,1997によって記載されている。既知の変異体を有する別の酵素はCYP3A4であり、これは、テストステロンの不活性化に関与し、前立腺ガンにかかりやすさに関与するParisetal.,1999。本発明のこの実施形態を実施するために、多能性幹細胞を2以上の独立したサブセットに分割することができる。1以上の細胞系を遺伝的に改変して、薬物代謝酵素または薬物標的の遺伝子の変異体を導入することができる外因性発現カセットの導入の前または後。遺伝子をランダム形質導入によって導入することができるが、より典型的には、変異体を相同性組換えによって天然遺伝子と置換する。これは、内因性遺伝子を発現停止させ、かつ変異体を条件反応性調節エレメント、例えば、細胞特異的または誘導性プロモーターの制御下に置く。あるいは、自然起源の変異体が点突然変異によって通常の遺伝子とは異なることが知られている場合、変異体発現を調節するための条件反応性転写調節エレメントを導入しながら、同じ表現型を付与するように内因性遺伝子を突然変異させることができる。使用者は、同じ変異体を発現するように反対の対立遺伝子を改変するか、または例えば、相同性組換えにより、それを不活性化する選択肢を有する。細胞を次いで分化させることができ、以下のセクションで記載するように薬物スクリーニングに使用することができる。V.遺伝子または遺伝子産物の送達ある実施形態において、外因性条件反応性発現カセットをコード化する核酸の送達のためのベクターを構築して、細胞においてこれらの因子を発現することができる。特定の態様において、以下の系および方法を、所望の細胞型の特定のための発現カセットの送達で使用することができる。特に、幹細胞系のセットは、異なる発現カセットのセットを含み得、それぞれは、所定の細胞系統への分化などの所定の条件に反応した発現のための異なる条件反応性調節エレメントの制御下にある。B.相同性組換え本発明のある態様において、条件反応性発現カセットまたは再プログラミングカセットなどの外因性発現カセットを特定の方法で、例えば、相同性組換えにより、細胞に導入することができる。幹細胞において遺伝子を発現するための現行のアプローチは、ゲノム中にランダムに組み込まれるウイルスベクターまたは導入遺伝子の使用を含む。1つには、ランダムに組み込まれたベクターが、内因性遺伝子発現、および/または導入遺伝子発現のサイレンシングを活性化または抑制する可能性があるので、これらのアプローチは成功しなかった。ランダムな組み込みに関連する問題は、標的ゲノム中の特定の座、例えば、Rosa26座に対する相同性組換えによって、部分的に克服することができる。Rosa26座は容易にアクセス可能であり、相同性組換えを受けやすい。Rosa26座に対する相同性組換えによって標的とされる導入遺伝子は、未分化細胞ならびにマウスまたはヒト多能性幹細胞などの幹細胞から生成した分化細胞型において安定かつ効率的に発現される。一般的組換えとしても知られる相同性組換えHRは、ヌクレオチド配列がDNAの2つの類似または同一鎖間で交換される全ての生命の形態で用いられる遺伝子組換えの一種である。この技術は、1980年代半ばから、哺乳動物細胞におけるゲノムエンジニアリングの標準的方法である。このプロセスは、DNAの物理的破壊および最終的再結合のいくつかのステップを含む。このプロセスは、DNAにおいて致死的となり得る2本鎖切断を修復するために最も広く用いられている。加えて、相同性組換えは、減数分裂の間にDNA配列の新しい組み合わせを産生し、このプロセスによって、真核生物は精子や卵子のような生殖細胞を作製する。DNAのこれらの新しい組み合わせは、子孫における遺伝的変異を表し、これにより集団は時間とともに変化する環境条件に進化的に適応することが可能になる。相同性組換えをさらに、遺伝子水平伝播に用いて、細菌およびウイルスの異なる株および種間で遺伝物質を交換する。相同性組換えはさらに、標的生物への遺伝子変化の導入のための分子生物学における技術として用いられる。相同性組換えを標的化ゲノム修飾として用いることができる。哺乳動物細胞における標準的HRの効率は、10-6~10-9の処理された細胞にすぎないCapecchi,1990。メガヌクレアーゼ、またはホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばI-SceIを使用して、HRの効率を増大させた。天然のメガヌクレアーゼならびに修飾されたターゲティング特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼはどちらも、HR効率を増大させるために利用されてきたPingoudandSilva,2007;Chevalieretal.,2002。HRの効率を増大させるための別の経路は、プログラム可能なDNA特異性ドメインを有するキメラエンドヌクレアーゼを操作することであったSilvaetal.,2011。亜鉛フィンガーヌクレアーゼZFNは、亜鉛フィンガーDNA結合ドメインがFokIなどのIIS型制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合した、そのようなキメラ分子の一例であるDuraietal.,2005;PCT/US2004/030606で概説されているとおり。そのような特異性分子の別の種類には、FokIなどのIIS型制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合した転写アクチベーター様エフェクターTALEDNA結合ドメインが含まれるMilleretal.,2011:PCT/IB2010/000154。C.核酸送達系当業者は、標準的組換え技術によってベクターを十分に構築する能力がある例えば、どちらも参照することによって本明細書中に組み込まれる、Sambrooketal.,2001およびAusubeletal.,1996を参照のこと。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルスバクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス、ならびに人工染色体例えば、YAC、例えば、レトロウイルスベクター例えば、マローニーネズミ白血病ウイルスベクターMoMLV、MSCV、SFFV、MPSV、SNVなど由来、レンチウイルスベクター例えば、HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIVなど由来、アデノウイルスAdベクター、例えば複製コンピテント、複製欠損およびその弱小gutless形態、アデノ関連ウイルスAAVベクター、シミアンウイルス40SV-40ベクター、ウシ乳頭腫ウイルスベクター、エプスタインバーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハービーネズミ肉腫ウイルスベクター、ネズミ乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。2.エピソームベクタープラスミド-またはリポソームベースの染色体外すなわち、エピソームベクターの使用はさらに、本発明のある態様において、例えば、体細胞の再プログラミングのために提供される可能性がある。そのようなエピソームベクターは、例えば、oriPベースのベクター、および/またはEBNA-1の誘導体をコード化するベクターを含み得る。これらのベクターは、DNAの大フラグメントが細胞に導入され、染色体外に維持され、細胞周期ごとに1回複製され、効率的に娘細胞に分割され、そして実質的に免疫応答を誘発しないことを可能にし得る。特に、oriPベースの発現ベクターの複製に必要な唯一のウイルスタンパク質であるEBNA-1は、細胞性免疫応答を誘発しない。なぜなら、これはMHCクラスI分子上のその抗原の提示に必要なプロセッシングを回避するための効率的な機序を発生させるからであるLevitskayaetal.,1997。さらに、EBNA-1は、トランスで作用することができ、クローン化遺伝子の発現を増強し、いくつかの細胞系において100倍までクローン化遺伝子の発現を誘発するLangle-Rouaultetal.,1998;Evansetal.,1997。最後に、そのようなoriPベースの発現ベクターの製造は安価である。他の染色体外ベクターには、他のリンパ栄養ヘルペスウイルスベースのベクターが含まれる。リンパ栄養ヘルペスウイルスは、リンパ芽球例えば、ヒトBリンパ芽球において複製し、その天然の生活環の一部のプラスミドになるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルスHSVは、リンパ栄養ヘルペスウイルスではない。例示的リンパ栄養ヘルペスウイルスとしては、EBV、カポジ肉腫ヘルペスウイルスKSHV;ヘルペスウイルスサイミリHSおよびマレック病ウイルスMDVが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、他のエピソームベースのベクター源、例えば、酵母ARS、アデノウイルス、SV40、またはBPVが想定される。当業者は、標準的組換え技術によってベクターを十分に構築する能力がある例えば、どちらも参照することによって本明細書中に組み込まれる、Maniatisetal.,1988およびAusubeletal.,.1994を参照のこと。ベクターは、遺伝子送達および/または遺伝子発現をさらに調節するか、または他の方法で標的化細胞に有益な特性を提供する、他の成分または機能も含み得る。そのような他の成分としては、例えば、細胞に対する結合またはターゲティングに影響を及ぼす成分細胞型または組織特異的結合を媒介する成分を含む;細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす成分;取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす成分例えば、核局在化を媒介する薬剤;およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分が挙げられる。そのような成分はまた、ベクターによって送達される核酸を取り込み、発現する細胞を検出または選択するために用いることができる検出可能および/または選択マーカーなどのマーカーを含み得る。そのような成分は、ベクターの自然の特徴として提供することができ例えば、結合および取り込みを媒介する成分または機能を有するあるウイルスベクターの使用、またはベクターは、そのような機能を提供するように修飾することができる。様々なそのようなベクターは当該技術分野で公知であり、一般的に利用可能である。ベクターが宿主細胞中に維持される場合、ベクターは、自律構造として有糸分裂中に細胞によって安定して複製されるか、宿主細胞のゲノム内に組み込まれるか、または宿主細胞の核もしくは細胞質中に維持されるかのいずれかであり得る。3.トランスポゾンベースの系特定の実施形態によれば、核酸の導入は、トランスポゾン-トランスポザーゼ系を使用し得る。使用したトランスポゾン-トランスポザーゼ系は、周知のスリーピングビューティーSleepingBeauty、フロッグプリンスFrogPrinceトランスポゾン-トランスポザーゼ系後者の説明については、例えば、EP1507865を参照のこと、またはTTAA特異的トランスポゾンpiggyBac系であり得る。トランスポゾンは、単一細胞のゲノム内の異なる位置の周りを動くことができるDNAの配列であり、このプロセスは転位と呼ばれる。このプロセスにおいて、トランスポゾンは突然変異を引き起こすことができ、ゲノム中のDNAの量を変えることができる。トランスポゾンは、かつてはジャンピング遺伝子とも呼ばれ、可動性遺伝因子の例である。様々な可動性遺伝因子があり、それらは、それらの転位機序に基づいて分類することができる。クラスI可動性遺伝因子、またはレトロトランスポゾンは、まずRNAに転写されることにより自身を複製し、次いで逆転写酵素により逆転写されてDNAに戻り、次いでゲノム中の別の位置で挿入される。クラスII可動性遺伝因子は、トランスポザーゼを用いて1つの位置から別の位置へと直接移動して、ゲノム内でそれらをカットアンドペーストする。4.ウイルスベクター組換えウイルスベクターの生成において、非必須遺伝子は、典型的には、異種もしくは非天然タンパク質の遺伝子またはコーディング配列で置換される。ウイルスベクターは、核酸およびおそらくはタンパク質を細胞に導入するためにウイルス配列を利用する一種の発現構築物である。あるウイルスが細胞に感染するか、または受容体依存性エンドサイトーシスにより細胞に侵入し、そして宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定して効率的に発現する能力により、それらは細胞例えば、ほ乳動物細胞中への外来核酸の移動のための魅力的な候補となった。本発明のある態様の核酸を送達するために使用することができるウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノム中に組み込み、多量の外来遺伝物質を移動させ、広範囲の種および細胞型に感染するそれらの能力のために遺伝子送達ベクターとして有望であり、特別な細胞系にパッケージされるものであるMiller,1992。レトロウイルスベクターを構築するために、ウイルスゲノム中のあるウイルス配列の場所に核酸を挿入して、複製欠損であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、gag、pol、およびenv遺伝子を含有するが、LTRおよびパッケージング成分のないパッケージング細胞系を構築するMannetal.,1983。cDNAを、レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列とともに含有する組換えプラスミドを特別な細胞系に導入する場合例えば、リン酸カルシウム沈殿によってなど、パッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子中にパッケージされるのを可能にし、これは次いで培養培地中に分泌されるNicolasandRubenstein,1988;Temin,1986;Mannetal.,1983。組換えレトロウイルスを含有する培地を次いで集め、場合によって濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、さまざまな細胞型に感染することができる。しかし、組み込みや安定な発現は、宿主細胞の分割を必要とするPaskindetal.,1975。レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、これは一般的なレトロウイルス遺伝子gag、pol、およびenvに加えて、調節または構造上の機能を有する他の遺伝子を含有する。レンチウイルスベクターは、当該技術分野で周知である例えば、Naldinietal.,1996;Zuffereyetal.,1997;Blomeretal.,1997;米国特許第6,013,516号および同第5,994,136号を参照のこと。組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボおよびエクスビボ両方の遺伝子導入および核酸配列の発現に使用することができる。例えば、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスであって、好適な宿主細胞がパッケージング機能を有する2以上のベクターでトランスフェクトされているもの、すなわち、gag、polおよびenv、ならびにrevおよびtatは、参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許第5,994,136号に記載されている。D.核酸送達DNAまたはRNAなどの核酸の、本発明でプログラムされる細胞への導入は、本明細書中に記載するような、または当業者に公知のような、細胞の形質転換のための核酸送達の任意の好適な方法を使用することができる。そのような方法には、限定されるものではないが、例えば、エクスビボトランスフェクションによるWilsonetal.,1989,Nabeletal.,1989、注入によるそれぞれ参照することによって本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号および同第5,580,859号、例えばマイクロインジェクションによるHarlandandWeintraub,1985;米国特許第5,789,215号参照することによって本明細書中に組み込まれる;エレクトロポレーションによる米国特許第5,384,253号参照することによって本明細書中に組み込まれる;Tur-Kaspaetal.,1986;Potteretal.,1984;リン酸カルシウム沈殿によるGrahamandVanDerEb,1973;ChenandOkayama,1987;Rippeetal.,1990;DEAE-デキストランを使用し、続いてポリエチレングリコールを使用することによるGopal,1985;直接音波負荷によるFechheimeretal.,1987;リポソーム媒介性トランスフェクションNicolauandSene,1982;Fraleyetal.,1979;Nicolauetal.,1987;Wongetal.,1980;Kanedaetal.,1989;Katoetal.,1991および受容体媒介性トランスフェクションによるWuandWu,1987;WuandWu,1988;微粒子銃によるPCT出願番号第WO94/09699号および同第95/06128号;米国特許第5,610,042号;同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号および同第5,538,880号それぞれ、参照することによって本明細書中に組み込まれる;炭化ケイ素繊維とともに撹拌することによるKaeppleretal.,1990;米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号それぞれ参照することによって本明細書中に組み込まれる;アグロバクテリウム媒介変換による米国特許第5,591,616号および同第5,563,055号、それぞれ参照することによって本明細書中に組み込まれる;乾燥/阻害媒介DNA取り込みによるPotrykusetal.,1985、ならびにそのような方法の任意の組み合わせによるDNAの直接送達が含まれる。これらなどの技術を適用することによって、細胞小器官複数可、細胞複数可、組織複数可または生物複数可を安定に、または一時的に形質転換することができる。2.リポソーム媒介性トランスフェクション本発明のある実施形態において、核酸は、例えば、リポソームなどの脂質複合体中にトラップされる可能性がある。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。マルチラメラリポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。これらは、脂質が過剰の水溶液中に懸濁される場合に自発的に形成する。脂質成分は自己再編成した後、閉じた構造を形成し、脂質二重層間に水および溶解した溶質を封入するGhoshandBachhawat,1991。LipofectamineGibcoBRLまたはSuperfectQiagenと複合体形成した核酸も企図される。使用したリポソームの量は、リポソームならびに使用した細胞の性質によって変化し得、例えば、100万~1000万個の細胞あたり約5~約20μgのベクターDNAを企図することができる。インビトロの外来性DNAのリポソーム媒介性核酸送達および発現は非常に成功を収めてきたNicolauandSene,1982;Fraleyetal.,1979;Nicolauetal.,1987。培養されたニワトリ胚、HeLaおよび肝細胞腫細胞における外来性DNAのリポソーム媒介性送達および発現の実現可能性も示されているWongetal.,1980。本発明のある実施形態において、リポソームは、血球凝集ウイルスHVJと複合体形成され得る。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソーム被包性DNAの細胞内移行を促進することが示されているKanedaetal.,1989。他の実施形態において、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質HMG-1と複合体形成し得るか、または核非ヒストン染色体タンパク質HMG-1とともに使用し得るKatoetal.,1991。さらに別の実施形態において、リポソームは、HVJおよびHMG-1の両方と複合体形成し得るか、またはHVJおよびHMG-1の両方ととともに使用し得る。他の実施形態において、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。3.エレクトロポレーション本発明のある実施形態において、核酸を細胞小器官、細胞、組織または生物にエレクトロポレーションによって導入する。エレクトロポレーションは、細胞およびDNAの懸濁液の高圧放電への暴露を含む。受容細胞は、機械的損傷によって、より形質転換しやすくすることができる。さらに、使用するベクターの量は、使用する細胞の性質によって変化し得、例えば、100万から1000万個の細胞あたり約5~約20μgのベクターDNAが企図され得る。エレクトロポレーションを用いた真核生物細胞のトランスフェクションは、かなり成功している。このようにして、マウスpre-Bリンパ球がヒトカッパ-免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされPotteretal.,1984、ラット肝細胞がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされているTur-Kaspaetal.,1986。4.リン酸カルシウム本発明の他の実施形態において、リン酸カルシウム沈殿を用いて核酸を細胞に導入する。この技術を用いてヒトκB細胞がアデノウイルス5DNAでトランスフェクトされているGrahamandVanDerEb,1973。さらに、このようにして、マウスLA9、マウスCI27、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3およびHeLa細胞がネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされChenandOkayama,1987、ラット肝細胞が種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされたRippeetal.,1990。5.DEAE-デキストラン別の実施形態において、DEAE-デキストランと、続いてポリエチレングリコールを用いて、核酸を細胞中に送達する。このようにして、レポータープラスミドがマウス骨髄腫および赤白血病細胞に導入されたGopal.,1985。VI.細胞培養一般的に,本発明の細胞を、細胞成長を支持することができる栄養分に富んだ緩衝液である培養培地中で培養する。本明細書中で記載される方法にしたがった幹細胞の単離、増殖および分化に好適な培養培地としては、高グルコースダルベッコ変法イーグル培地DMEM、DMEM/F-15、リーボヴィッツL-15、RPMI1640、イスコブ変法ダルベッコ培地IMDM、およびOpti-MEMSFMInvitrogenInc.が挙げられるが、これらに限定されるものではない。化学的限定培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトExCyteリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須および非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミンおよびマイトジェンを追加した、イスコブ変法ダルベッコ培地IMDMGibcoなどの最小必須培地を含み、これもまた好適である。本明細書中で用いられる場合、マイトジェンは、細胞の細胞分裂を刺激する薬剤を指す。薬剤は、化学物質であり得、通常、細胞に細胞分裂を開始させて、有糸分裂を誘発するタンパク質のある形態であり得る。1つの実施形態では、無血清培地、例えば米国特許出願番号第08/464,599号およびWO96/39487で記載されているもの、および米国特許第5,486,359号で記載されているような完全培地が、本明細書中で記載される方法での使用について企図される。いくつかの実施形態において、培養培地に、10ウシ胎仔血清FBS、ヒト自家血清、ヒトAB血清またはヘパリン2U/mlを追加した血小板豊富な血漿を追加する。細胞培養物を、CO2雰囲気、例えば5~12中に維持して、培養液のpHを維持し、37°Cにて湿った雰囲気中でインキュベートし、そして継代して、85より低いコンフルエンスを維持することができる。分化させる多能性幹細胞を、多能性を維持するために十分な培地中で培養することができる。本発明のある態様で生成した誘導多能性幹iPS細胞の培養を用いて、種々の開発された培地および技術を使用して、霊長類多能性幹細胞、さらに詳細には、米国特許出願第20070238170号および米国特許出願第20030211603号で記載されるような、胚幹細胞を培養することができる。例えば、ヒト胚幹hES細胞のように、iPS細胞を、80のDMEMGibco10829-018または11965-092、熱不活化されていない20の限定ウシ胎仔血清FBS、1非必須アミノ酸、1mMのL-グルタミン、および0.1mMのベータ-メルカプトエタノール中に維持することができる。あるいは、ES細胞を、80ノックアウトDMEMGibco10829-018、20血清代替物Gibco10828-028、1非必須アミノ酸、1mMのL-グルタミン、および0.1mMのベータ-メルカプトエタノールで作製された、無血清培地中に維持することができる。使用直前に、ヒトbFGFを、約4ng/mLの最終濃度になるように添加することができるWO99/20741。VII.所望の組織型への細胞の分化一旦、多能性幹細胞が試験細胞集団における条件反応性発現のために設計された外因性発現カセットで導入されると、集団を必要とされる任意の程度まで膨張させことができ、次いで所望の組織型に分化させることができる。B.肝臓細胞米国特許第6,458,589号およびPCT公開第WO01/81549号GeronCorporationで記載されているように、肝細胞を多能性幹細胞、例えばhES細胞からヒストンデアセチラーゼの阻害剤を用いて分化させることができる。未分化多能性幹細胞をヒストンデアセチラーゼの阻害剤の存在下で培養することができる。例示的方法においては、1DMSOで、次いで2.5mMのヒストンデアセチラーゼ阻害剤n-ブチレートで分化を開始させる。得られた細胞を、4日、n-ブチレート、DMSOと成長因子、例えばEGF、肝細胞成長因子、およびTGF-αを含有する肝細胞培養培地中で培養することによって成熟させることができる。多能性幹細胞、例えばhES細胞を肝細胞に分化させるための段階的プロトコルは、US2005/0037493AlGeronCorp.に記載されている。細胞を分化および成熟剤の複数の組み合わせとともに順番に培養して、多能性幹細胞、例えばhES細胞を、まず初期内胚葉または肝細胞前駆体に、次いで成熟肝細胞様細胞に成熟させる。内胚葉様細胞への分化は、ブチレート、DMSOまたはウシ胎仔血清のいずれかを、場合によって線維芽細胞成長因子と組み合わせて用いて開始することができる。分化を次いで、肝細胞成長因子HGF、上皮成長因子EGF、および/または骨形態発生タンパク質例えば、BMP-2、4、もしくは7などの因子を種々の組み合わせで含む市販の肝細胞培養培地を用いて継続することができる。最終的成熟は、デキサメタゾンまたはオンコスタチンMなどの薬剤の存在によって増強することができる。US2005/0037493A1からのDMSOプロトコルの説明を、本発明のレポーター肝細胞に適用される場合で、実施例3において後述する。改良された肝細胞分化プロトコルでは、Activin活性を有するタンパク質を用いて、典型的にはブチレートおよび/またはDMSOのような他の因子の存在下または他の因子で順次分化を開始する実施例6。細胞を次いで、HGF、EGF、および/またはBMPを用いて段階的に成熟させることができ、薬剤、例えばデキサメタゾン、続いてオンコスタチンMの存在によって増強することができる。本発明のある態様における肝細胞は、多能性幹細胞または他の非肝細胞を、培地中、細胞の肝細胞へのプログラミングを促進するために十分な肝細胞プログラミング因子の細胞内レベルを増大させる条件下で培養することによって作製することができる参照することによって本明細書中に組み込まれる、米国特許出願第61/323,689号を参照のこと。培地は、様々な種類の成長因子のような1以上の肝細胞分化および成熟剤も含有し得る。しかし、肝細胞プログラミング転写因子の細胞内レベルを増大させることにより、本発明の態様は、段階のそれぞれについて培地の変更を必要とせずに成熟肝細胞に対するほとんどの段階を回避する。したがって、本発明によって提供される利点を考慮すれば、特定の態様において、細胞を肝細胞プログラミング下で培養するための培地は、1以上の肝細胞分化および成熟剤を本質的に含まない可能性があるか、またはそのような薬剤の異なる組み合わせを含有する培地で連続的変化を受けない可能性がある。これらの薬剤は、細胞をさらに成熟した表現型に誘導する助けとなるか、または成熟細胞の生存を優先的に促進するか、またはこれらの効果の両方の組み合わせを有するかのいずれかであり得る。本開示で説明される肝細胞分化および成熟剤は、肝細胞系統の細胞の成長を促進できる可溶性成長因子ペプチドホルモン、サイトカイン、リガンド-受容体複合体、および他の化合物を含み得る。そのような薬剤の非限定的な例としては、上皮成長因子EGF、インスリン、TGF-α、TGF-β,線維芽細胞成長因子FGF、ヘパリン、肝細胞成長因子HGF、オンコスタチンMOSM、IL-1、IL-6、インスリン様成長因子IおよびIIIGF-I、IGF-2、ヘパリン結合成長因子1HBGF-1、ならびにグルカゴンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。オンコスタチンMが白血病阻害因子LIF、インターロイキン-6IL-6、および毛様体神経栄養因子CNTFと構造的に関連することを、当業者はすでに理解しているであろう。さらなる例は、以前の特許情報開示米国特許第6,458,589号、米国特許第6,506,574号;WO01/81549で記載されているように、n-ブチレートである。類似の効果を有し、本発明の実施において代替物として使用できるn-ブチレートのホモログを容易に同定することができる。いくつかのホモログ:3~10個の炭素原子を含む酸性炭化水素、ならびにカルボン酸塩、スルホン酸塩、ホスホン酸塩、および他のプロトンドナーからなる群から選択される共役塩基は、n-ブチレートと類似した構造的および物理化学的特性を有する。例としては、イソ酪酸、ブテン酸、プロパン酸、他の短鎖脂肪酸、およびジメチルブチレートが挙げられる。イソテリックisoteric炭化水素スルホン酸塩またはホスホン酸塩、例えばプロパンスルホン酸およびプロパンホスホン酸、ならびにアミド、サッカライド、ピペラジンおよび環状誘導体などの接合体も含まれる。さらなる種類のブチレートホモログは、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤である。非限定的な例としては、トリコスタチンA、5-アザシチジン、トラポキシンA、オキサムフラチン、FR901228、シスプラチン、およびMS-27-275が挙げられる。別の種類の薬剤は、DMSOのような有機溶媒である。類似した特性を有する代替物としては、ジメチルアセトアミドDMA、ヘキサメチレンhexmethyleneビスアセトアミド、および他のポリメチレンビスアセトアミドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。この種類の溶媒は、一部には、細胞の膜透過性を増大させる特性によって関連付けられる。ニコチンアミドなどの溶質も興味深い。肝細胞または肝細胞系統細胞という用語は、本開示で用いられる場合、1以上、好ましくは少なくとも3、さらに好ましくは5~7の以下の特性:α1-抗トリプシン;アシアロ糖タンパク質、グリコーゲン貯蔵、チトクロムP450酵素発現;グルコース-6-ホスファターゼ活性、低~極少量のα-フェトタンパク質、および肝細胞の形態学的特徴立方細胞、おそらくはそれらの間に細管状空間があるを有する細胞を意味する。ヒト肝臓から単離された成熟肝細胞の他の特徴が存在し得るが、この定義内の肝細胞として細胞を認定するために必要ではない。細胞マーカーを同定するためのアッセイ法は、米国特許第6,458,589号で詳細に記載されている。本発明の肝細胞は、明らかにこれが必要とされない限り、ヒト胚幹細胞を分化させることによって得ることができるが、必ずしも得られるわけではない。薬物スクリーニングに関して、使用者がチトクロムP450酵素などの特定の薬物代謝酵素の活性を試験しようとする可能性もある。チトクロムP450の活性を調査する便利な方法は、細胞を、基質:例えば、ミダゾラムCYP3A4によって代謝される、トルブタミドCYP2C9によって代謝される、フェナセチンCYP1A2、およびブフラロールCYP2D6のカセットと組み合わせることである。活性は、参照細胞系、例えばHepG2細胞の約0.1、1、または10倍であると定量され得る。カセット中の全ての薬物の代謝産物を同時にモニターする便利な方法は、GCMSによる。望ましい場合、細胞をデキサメタゾンまたはリファンピシンなどの化合物で、薬物スクリーニングにおける使用前または使用中に処理して、細胞におけるチトクロムP450発現または活性を増大させることができる。C.神経細胞神経細胞を、多能性幹細胞、例えばhES細胞から、米国特許第6,833,269号;Carpenteretal.,2001;およびWO03/000868GeronCorporationで記載される方法にしたがって生成させることができる。未分化hES細胞または胚様体細胞を、1以上のニューロトロフィンおよび1以上のマイトジェンを含有する培地中で培養して、少なくとも約60の細胞がA2B5、ポリシアル酸付加NCAM、またはNestinを発現し、培養において少なくとも20倍増が可能である細胞集団を生成させる。例示的マイトジェンは、EGF、塩基性FGF、PDGF、およびIGF-1である。例示的ニューロトロフィンは、NT-3およびBDNFである。TGF-βスーパーファミリーアンタゴニスト、またはcAMPおよびアスコルビン酸の組み合わせを使用して、ドーパミン作動性ニューロンの特徴である、チロシンヒドロキシラーゼについて陽性である神経細胞の割合を増大させることができる。増殖細胞を次いで、ニューロトロフィンとともにマイトジェンの非存在下で培養することによって最終分化させることができる。オリゴデンドロサイトは、hES細胞などの多能性幹細胞から、これらを細胞凝集体として培養し、FGFなどのマイトジェン、ならびに例えばトリヨードチロニン、セレン、およびレチノイン酸などのオリゴデンドロサイト分化因子を含有する培地中に懸濁させることによって、生成させることができる。細胞を次いで固体表面上に蒔き、レチノイン酸を抜き取り、集団を増殖させる。高分化は、ポリ-L-リシン上に蒔き、全成長因子を除去することによって、おこなうことができる。80を越える細胞がオリゴデンドロサイトマーカーNG2プロテオグリカン、A2B5、およびPDGFRαについて陽性であり、ニューロンマーカーNeuNについて陰性である集団を得ることができる。PCT公開第WO04/007696号およびKeirsteadら,2005を参照のこと。網膜色素上皮細胞の誘導も報告されているKlimanskayaetal.,2004。D.心臓細胞心筋細胞または心筋細胞前駆体は、hES細胞などの多能性幹細胞から、WO03/006950で提供される方法にしたがって生成させることができる。細胞を、ウシ胎仔血清または血清代替物、場合によってDNA-メチル化に影響を及ぼす心臓作用性cardiotrophic因子、例えば、5-アザシチジンを含む懸濁液中で培養する。あるいは、固体基質上でActivinAとともに培養し、続いてBMP4のような骨形成タンパク質とともに培養し、場合によって、IGF-1のようなインスリン様成長因子とともにさらに培養することによって、心筋細胞クラスターを生成させることができる。所望により、自発的に収縮する細胞を次いで集団中の他の細胞から、密度遠心分離によって分離することができる。さらなるプロセスステップは、細胞を培養して、CardiacBodies商標として知られるクラスターを形成し、単一細胞を除去し、次いでCardiacBodies商標を連続して繰り返して分散させ、改良することを含み得る。cTnI、cTnT、心臓特異的ミオシン重鎖MHC、および転写因子Nkx2.5について陽性に染色する細胞の割合が高い集団が得られる。WO03/006950、Xuら,2002;およびUS2005/0214939AlGeronCorporationを参照のこと。E.他の細胞型島細胞を、ActivinA、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤例えばブチレート、マイトジェン例えばbFGF;およびTGF-βスーパーファミリーアンタゴニスト例えばnogginから選択される複数の因子の組み合わせを含有する培地中で培養することにより分化を開始することによって、hES細胞WO03/050249号、GeronCorp.などの多能性幹細胞から分化させることができる。細胞を次いで、ニコチンアミドとともに培養することによって成熟させることができ、細胞の少なくとも5がPdx1、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドを発現する細胞集団を得る。細胞クラスターは、インスリン産生細胞について富化された芽体を形成する可能性があり、これはろ過によって回収することができる。WO03/050249GeronCorp.を参照のこと。造血細胞は、hES細胞などの多能性幹細胞を、ネズミ骨髄細胞とともに同時培養することによって作製することができるか、または卵黄嚢内皮細胞を用いて、造血マーカーを有する細胞を生成した米国特許第6,280,718号。US2003/0153082A1およびWO03/050251RobartsInstituteで記載されるように、造血細胞はまた、幹細胞を造血サイトカインおよび骨形態形成タンパク質とともに培養することによっても作製することができる。間葉前駆体および線維芽細胞は、hES細胞などの多能性幹細胞からWO03/004605で記載される方法にしたがって生成させることができる。hES由来間葉細胞を次いで、骨形成因子、例えば骨形態形成タンパク質特に、BMP4、ヒトTGF-β受容体のリガンド、またはヒトビタミンD受容体のリガンドを含有する培地中で骨芽細胞系統細胞にさらに分化させることができるWO03/004605;Sotileetal.,2003。US2004/0009589A1Iskovitz-Elderetal.およびUS2003/0166273A1Kaufmanetal.,Wisconsinは、ヒト胚幹細胞から誘導される内皮細胞を報告している。軟骨細胞またはそれらの前駆体は、WO03/050250GeronCorp.で記載される分化因子の有効な組み合わせを有するミクロ凝集体中で肝細胞を培養することによって生成させることができる。当該技術分野で公知であるか、またはその後に開発された他の分化法を、本発明とともに使用して、他の組織の代表的な操作された細胞を作製することができる。VIII.スクリーニングプラットフォームおよび方法本発明のある態様において、操作された細胞集団またはそれから誘導される細胞を様々な用途で用いることができる。これらとしては、いくつかを挙げると、生物学的応答または薬物応答の研究;細胞毒性化合物、発ガン性物質、突然変異原成長/調節因子、薬剤化合物などのインビトロでのスクリーニング;細胞プログラミングまたは発生経路の機序または条件の解明;薬物および/または成長因子が機能する機序の研究;ならびに生物学的に活性な生成物の産生が挙げられるが、これらに限定されるものではない。B.試験化合物スクリーニング本発明のある態様の操作された細胞またはそれから誘導される細胞を用いて、本明細書中で提供される条件反応性調節エレメントを含む外因性発現カセットの発現特性に影響を及ぼす因子例えば、溶媒、小分子薬物、ペプチド、およびポリヌクレオチドまたは環境条件例えば、培養条件もしくは操作についてスクリーンすることができる。いくつかの適用では、幹細胞分化または未分化を用いて、肝細胞系統などの選択された細胞系統にそって細胞の成熟を促進するか、または長期培養においてそのような細胞の増殖および維持を促進する因子をスクリーンする。細胞のさらなる培養および使用の望ましい基準にしたがって、例えば、候補肝細胞成熟因子または成長因子は、それらを異なるウェル中の肝細胞に添加し、次いで結果として生じる任意の表現型変化を測定することによって試験される。本発明の特定のスクリーニング適用は、薬物研究における薬剤化合物の試験に関する。読者は、一般的に、標準的テキスト、InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch,AcademicPress,1997、および米国特許第5,030,015号を参照する。本発明のある態様において、肝細胞系統にプログラムされた細胞は、短期培養における肝細胞系または一次肝細胞に対してあらかじめ実施されたように、標準的薬物スクリーニングおよび毒性アッセイについての試験細胞の役割を果たす。候補薬剤化合物の活性の評価は、一般的に、本発明のある態様で提供された肝細胞を候補化合物と組み合わせ、化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、または代謝活性における任意の変化を測定し非処理細胞または不活性化合物で処理された細胞と比較して、次いで化合物の効果を観察された変化と関連づけることを含む。化合物が肝臓細胞に対して薬理学的効果を有する様に設計されるため、または他の場所で影響を有するように設計された化合物が予想外の肝臓副作用を有し得るために、スクリーニングを実施することができる。2以上の薬物を組み合わせて試験し細胞と同時または連続的に組み合わせることにより、可能な薬物-薬物相互作用効果を検出することができる。2.毒性試験毒性試験における、条件反応性発現カセットを含む本発明の細胞の使用は、細胞集団をスクリーンされる薬剤と組み合わせることを含む典型的には、それを培地に添加することによる。そのような薬剤の例としては、薬剤化合物、農薬、特別な化学物質、化粧品および食品添加物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。薬剤の外因性発現カセットに対する効果は、典型的には、マーカー遺伝子からのシグナルを、その薬剤の存在下および非存在下で、選択された選択可能またはスクリーン可能なマーカーについて適切な検出系を用いて比較することによって追跡される。例として、iPS細胞を遺伝的に修飾し、分化させて、緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子に結合した、ヘムオキシゲナーゼ1のプロモーターを含有する肝細胞の集団を作製する。細胞を同じ培地中で試験薬剤と組み合わせ、そして試験薬剤の非存在下での蛍光と比較して、蛍光を測定する。蛍光レベルの増加は、試験薬剤によって誘発された酸化的ストレスに対してあきらかに反応して、ヘムオキシゲナーゼ1遺伝子が上方調節されることを示す。異なる薬剤および薬剤の組み合わせを、高速スループットプロセスで、例えば、マイクロタイタープレートのウェル中で細胞を確立させることによって、スクリーンすることができる。この系にしたがって試験した薬剤を、さらなる開発、試験、または使用のために同定し、選択することができる。なぜなら、それらはレポーター発現のレベルで実質的な増加または変更を引き起こさないからであるこのことは、試験薬剤の存在に起因する影響があるならば、それは使用者が許容されると見なす閾値よりも低いことを意味する。分化プロトコルに応じて、対象の細胞型について少なくとも50、80、または90同種である細胞集団を用いることができる。細胞集団が比較的純粋である場合、または選択されたプロモーターが対象の細胞型でのみ活性である場合例えば、肝細胞中のCYP3A4プロモーター、試験薬剤の標的細胞に対する影響は、全体として細胞集団中のレポーター遺伝子からのシグナルを単に追跡することによって測定することができる。しかし、細胞集団がより異種であり、プロモーターが存在する2以上の細胞型で誘導され得る場合、細胞ごとに基づいて効果を追跡することが好ましい可能性がある。代謝反応性発現カセットおよび組織特異的発現カセットの両方を含有する細胞は、これを特にうまくおこなう能力を有する。試験薬剤を全体として細胞集団と組み合わせるが、アッセイのアウトプットは、組織特異的発現カセットで標識された細胞中に存在する場合、代謝反応性マーカーの変化として測定される。このアプローチの利点は、標的細胞型が試薬細胞集団に勝る必要がないことである。20、10、または5未満の標的細胞を含む集団を使用することができる。なぜなら、薬物で誘導される効果は、検出可能細胞がある場合に示されるからで、この場合、両マーカーが発現される。これにより、比較的まれな細胞型またはサブタイプ、例えば、インスリン産生膵島細胞、または特定の神経伝達物質を利用する神経細胞で本発明の薬物スクリーニング技術を使用することが可能になる。選択可能またはスクリーン可能なマーカー遺伝子の生成物が区別可能である限り、複数の代謝または毒物学的に反応性の発現カセット単細胞系において異なる外因性発現カセットとして、または異なる外因性発現カセットを含有する混合細胞の集団においてを備えた細胞集団を用いて、複数の攻撃経路を同時にモニターすることができる。いくつかの特定の適用において、化合物をまず潜在的な肝臓毒性についてスクリーンするCastelletal.,1997。細胞毒性は、まず第1に、細胞生存度、生存、形態、および酵素の培養培地への漏出に対する影響によって測定することができる。さらに詳細な分析を実施して、化合物が、毒性を生じることなく、細胞機能例えば、糖新生、尿素形成、および血漿タンパク質合成に影響を及ぼすかどうかを判定する。乳酸デヒドロゲナーゼLDHは良好なマーカーである。なぜなら、肝臓イソ酵素V型は培養条件で安定であり、12~24時間のインキュベーション後の培養上清中の再現可能な測定を可能にするからである。ミトコンドリアグルタメートオキサロアセテートトランスアミナーゼおよびグルタメートピルベートトランスアミナーゼなどの酵素の漏出も用いることができる。Gomez-Lechonら1996は、グリコーゲンを測定するためのミクロアッセイを記載し、これを用いて、肝細胞糖新生に対する薬剤化合物の効果を測定することができる。肝臓毒性を評価するための他の現行法は、アルブミン、コレステロール、およびリポタンパク質の合成および分泌;抱合胆汁酸およびビリルビンの輸送;尿素形成;チトクロムP450レベルおよび活性;グルタチオンレベル;α-グルタチオンs-トランスフェラーゼの放出;ATP、ADP、およびAMP代謝;細胞内KおよびCa2濃度;核マトリックスタンパク質またはオリゴヌクレオソームの放出;ならびにアポトーシスの誘導細胞ラウンディング、クロマチンの凝集、および核フラグメンテーションにより示されるの測定を含む。DNA合成は、[3H]-チミジンまたはBrdU組み入れとして測定することができる。薬物のDNA合成または構造に対する影響は、DNA合成または修復を測定することによって決定することができる。特に細胞周期の予定外の時間での、または細胞複製に必要なレベルを上回る[3H]-チミジンまたはBrdU組み入れは薬物効果と一致する。有害反応はまた、中期延展体によって測定される、姉妹染色分体交換の異常な速度を含み得る。読者は、さらなる検討のためにVickers1997を参照する。3.正の薬理学的効果についてのスクリーニング毒物学、薬物代謝、および素因についてのスクリーニング試験化合物の他に、本発明の細胞を用いて、正の薬理学的効果についてスクリーンすることもできる。例えば、インスリンプロモーターによって駆動される選択可能またはスクリーン可能なマーカー系を含有する膵臓細胞を用いて、インスリン分泌を誘導できる薬物をスクリーンすることができる。神経伝達物質合成、放出、または取り込みにおいて遺伝子のプロモーターにより駆動される選択可能またはスクリーン可能なマーカー系を含有する神経細胞を用いて、潜在的に有益な神経学的効果を有する薬物をスクリーンすることができる。正のスクリーニングのための本発明の細胞、キット、および方法の使用は、毒性試験に匹敵し、適切なプロモーター構築物を選択し、必要に応じてアッセイを適応させる。別の例において、化合物を別の薬物または培養条件に対する細胞保護作用について試験することができる。例えば、アポトーシスまたはストレスにおいて上方調節される遺伝子PUMAまたはヘムオキシゲナーゼ1などの外因性発現カセットを含有する細胞をストレッサー、例えばメナジオン、3級ブチルヒドロキノンTBHQ、ヒドロペルオキシダーゼ、キノン、または異常な酸素レベルの存在下で培養して、選択可能またはスクリーン可能なマーカーシグナルをオンにする。一旦確立されると、ストレッサーとともに培養された細胞を用いて、選択可能またはスクリーン可能なマーカーシグナリングを防止、低下、または逆転させる薬物をスクリーニングすることができ、それによって低レベルの遺伝子発現、ひいては保護効果を示す。これを多能性幹細胞誘導心筋細胞とともに用いて、例えば、心虚血の治療における適合性について薬物を試験することができる。効能についての薬物のスクリーニングと同時に、肝細胞レポーター細胞の適合した集団を用いて、同じ化合物の毒物学的効果についてスクリーニングすることができる。4.薬物標的および薬物代謝酵素の検証毒物学的または薬物的効果についてのスクリーニングの過程で、使用者は、特定の薬物の推定される標的、またはその代謝に関与すると考えられる酵素を検証したいと思う可能性がある。これは、薬物を外因性発現カセット含有細胞と、薬物標的または代謝酵素の転写または翻訳を活性化または阻害する物質の存在下または非存在下で組み合わせることによっておこなうことができる。外因性発現カセットを選択して、試験される活性から下流の遺伝子活性を反映する。使用者は、次いで、薬物が問題の薬物標的または酵素に影響を及ぼすかどうかの徴候として、RNAiを有するかまたは有さない薬物の存在下で選択可能またはスクリーン可能なマーカー遺伝子の発現に差があるかどうかを判定する。これに関連する使用に好適な阻害剤は、遺伝子特異的な方法で翻訳を不活性化することを可能にする配列を有する一本鎖または二本鎖型のRNA分子RNAiである。これに関連した使用に好適なRNAi分子および他の阻害剤の合成および使用は、当該技術分野で十分に記載されている。例えば、Huanetal.,CancerRes.64:4294,2004;Chanetal.,2005;Manoharan,2004;WO04/094595;WO05/014782を参照のこと。他の好適なアクチベーターおよび阻害剤としては、転写レベルで遺伝子を上方調節または下方調節することが知られている小分子薬物が挙げられるCampbelletal.,1996。公知薬物標的としては、TNFなどのリガンドによって活性化されたGタンパク質共役型受容体GPCR;ムラグリタザールmuraglitazarおよび他の化合物と結合するペルオキシソーム増殖活性化受容体PPAR;デキサメタゾン、リファンピシン、またはプレグネナロンpregnenalone16α-カルボニトリルによって活性化される、PXRなどのチトクロムP450調節剤;フェノバルビタールおよび他のバルビツール酸塩によって活性化される核受容体CAR;ポリ塩化ビフェニル化合物を処理する、グリコシルトランスフェラーゼなどの第二相酵素;ベンゾ[a]ピレンおよびβ-ナフトフラボンと結合するアリール炭化水素Ah受容体;ならびにタモキシフェンなどのエストロゲンアナログと結合するエストロゲン受容体が挙げられる。公知の薬物代謝酵素としては、チトクロムP450系OrtizdeMontellanoetal.、同上、N-アセチルトランスフェラーゼ、および胆汁酸と他の化合物との抱合結合に関与する酵素が挙げられる。本発明のこの態様を説明するために、酸化的ストレスに応答する外因性発現カセットを有する肝細胞を用いて、肝臓における薬物代謝を研究することができる。チトクロムP450系によって代謝される薬物例えば、フェノバルビタールを、CYP3A4のような特定のP450酵素に対して特異的なRNAiの存在下および非存在下で細胞と組み合わせることができる。RNAiの存在下で薬物によって誘導されるより高い選択可能またはスクリーン可能なマーカー活性があるならば、RNAiによって引き起こされるCYP3A4活性の低下は、薬物の代謝経路におけるCYP3A4に関与するストレスの増加をもたらす。同様に、薬物の薬剤活性におけるエストロゲン受容体の役割は、エストロゲンによって上方調節される遺伝子の転写を反映する外因性発現カセットを有する細胞を用いて評価することができる。エストロゲン受容体に対して特異的なRNAiの存在下で薬物により誘導されるより低い選択可能またはスクリーン可能なマーカー活性が存在する場合、エストロゲン受容体は、試験される薬物の標的として認証される。5.対立遺伝子変異型に対する影響同じ多能性幹細胞系から作製されるが、薬物代謝酵素の異なる変異体を含有するように操作された外因性発現カセット含有細胞を使用して、酵素によって代謝されると考えられる薬物のプロセッシングまたは効果を比較することができる。例えば、CYP2D6遺伝子の通常の形態を有する同じiPS細胞から誘導された肝細胞を、デクストロメトルファンのような薬物の影響について、集団の6で存在する変異体を有する肝細胞と比較することができる。変動に起因する薬物代謝における差異は、細胞における代謝もしくは毒性学的変化に反応して外因性発現カセットにより生成するシグナルに影響を及ぼすか、または薬物の代謝に関与する遺伝子産物の発現を反映する。同様に,薬物標的の異なる変異体を含むように操作された細胞を用いて、標的変異体に対する薬物の影響を比較することができる。例えば、神経伝達物質の取り込みに関与する酵素において変動を有する神経細胞を、取り込みに影響を及ぼすことが知られている薬物例えば、ブプロピオンの影響について比較することができる。変動に起因する薬物の薬理学的効果の差異は、神経伝達物質の存在に応答する外因性発現カセットにより生成するシグナルに影響を及ぼすであろう。薬物標的または薬物代謝酵素の異なる変異体を有する別の細胞集団を薬物で平行して試験することができる。場合によって、各変異体を、異なる選択可能またはスクリーン可能なマーカー遺伝子を有する細胞集団中に置くことができる。これにより、使用者は、2つの細胞集団を組み合わせることが可能になり、そして両変異体に対する薬物の影響を一緒に測定することが可能になる。C.プログラミングを試験するための細胞および方法所望の細胞型の同定を助けるために、細胞特異的または組織特異的マーカー発現カセットを含む細胞を用いて、プログラミング条件、さらに詳細には、分化条件を試験することができる。発現カセットは、所望の細胞型について特異的な転写調節エレメントに機能的に連結された選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含み得る。例えば、発現カセットは、肝細胞産生、単離、選択、または富化のための肝細胞特異的プロモーターを含み得る。したがって、ある態様では、特定の候補遺伝子または候補遺伝子の組み合わせが、多能性幹細胞の分化などのプログラミングから決して作製されなかった特定の細胞型、例えば肝細胞もしくは新規細胞型のプログラミング因子として作用する能力を、本開示で提供される方法および細胞を用いて試験することができる。プログラミングにおける特定の候補遺伝子または候補遺伝子の組み合わせの有効性を、細胞形態、マーカー発現、酵素活性、増殖能力、または対象の他の特性に対するそれらの影響によって評価することができ、これを次いで候補遺伝子または組み合わせを含まない平行培養物との比較で判定する。候補遺伝子は、所望の細胞型への分化について、または所望の細胞型の機能について重要な転写因子であり得る。ある実施形態において、出発細胞、例えば、条件反応性発現カセットを含む多能性幹細胞は、候補遺伝子または候補遺伝子の組み合わせの発現のための少なくとも1つの発現カセットをさらに含み得る。候補発現カセットは、外部から制御可能な転写調節エレメント、例えば誘導性プロモーターを含み得る。これらのプロモーターの活性は、生物または非生物因子の存在または非存在によって誘導することができる。誘導性プロモーターは遺伝子操作において非常に強力なツールである。なぜなら、それらに機能的に連結された遺伝子の発現は、生物の発生のある段階で、または特定の組織において、オンまたはオフにすることができるからである。大腸菌E.coliテトラサイクリン耐性オペロンの必須調節成分に基づくTet-OnおよびTet-Off誘導性遺伝子発現系を使用することができる。出発細胞において一旦確立されると、インデューサードキシサイクリンDox、テトラサイクリン誘導体は、用量に依存した方法で発現系を制御することができ、候補遺伝子の発現レベルを正確に調節することを可能にする。VIII.実施例以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例で開示される技術は本発明の実施においてよく機能することが本発明者らによって発見された技術であり、したがってその実施の好ましい様式を構成し得ることは、当業者には理解されるはずである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変更をなすことができ、それでも本発明の精神および範囲を逸脱することなく同様または類似の結果を得ることを理解するはずである。実施例1-操作された幹細胞系の産生本発明者らは、ヒトの体内での任意の生物学的応答を研究するためのセットとして使用することができる操作された幹細胞系の集合を企図した。このセットの構造についての基本的細胞系は、ヒト組織試料から作製された、エピソーム由来のiPS細胞系である。このエピソーム系に、相同性組換え方策を使用して、リコンビナーゼ認識部位を親iPS系のRosa26座に導入した。公開された米国特許出願第20100011455号で開示されているこの方策を図1に示す。ヒト第3染色体上の天然Rosa26座においてイントロンIおよびII間に挿入するようにRosa26ターゲティングカセットを作製した。カセットは、5’→3’配列中に、ターゲティングのための5’相同性アーム、スペーサー、リコンビナーゼ認識部位白い三角、転写を開始するためのATGで始まるチミジンキナーゼ遺伝子からのタンパク質コーディング配列、2A配列、ネオマイシンに対する耐性についての抗生物質耐性遺伝子の第2のタンパク質コーディング配列、第2のリコンビナーゼ認識部位黒い三角および3’相同性アームを含んでいた。カセットは、iPS系の細胞に導入されるように設計され、成功した所望の組換え事象は、ネオマイシンに対する耐性によって同定される。このカセットは、エピソームにより再プログラム化されたiPS系のRosa26座に成功裡に移された。この基礎Rosa26ノックイン系は、PCRによって検証され、拡張され、アリコートで寄託された。基礎Rosa26ノックインiPS系を入手したら、任意の所望の遺伝子構築物をこの部位に導入することが便利になる。Rosa26座は本質的に全ての組織で発現されるので、この座での発現はiPS系が分化する細胞系統に関係なく抑制されない。図1には、この基礎Rosa26iPS系から作製された第2の操作されたiPS系のエレメントも示す。この特定の系は、肝細胞の選択のために構築される。まず、遺伝子構築物をアセンブルし、これは2つの発現カセットを含み、1つのカセットは所望の組換え事象の選択を可能にし、もう1つのカセットは所望の組織型、すなわち肝細胞の組織特異的選択を可能にする。構築物の5’末端には、左の組換え認識部位と、それに続いて、本明細書中ではiPSセレクターと表示される、別の抗生物質耐性遺伝子のタンパク質コーディング配列があった。このコーディング配列は、天然Rosa26プロモーターにより駆動されて、良好な所望の組換え細胞を、iPSセレクターが耐性を付与する抗生物質に対する耐性によって同定することが可能になる。反対方向に配向した構築物においても、第2の抗生物質選択遺伝子の発現をおこなうアルファ-1抗トリプシンpAATのプロモーターを含む構築物があり、これは細胞が肝細胞に分化した場合に細胞を選択するために用いられる。この特定の構築物において、複数のエンハンサーエレメントApoEl~4と表示も存在し、これらは、肝細胞においてこの特定のプロモーターの発現レベルを向上させることが見いだされた。この構築物を構築し、基礎Rosa26iPS系にトランスフェクトし、そして抗生物質耐性コロニーを回収した。その後の特性化により、適切な挿入事象が同定され、これらのクローンが拡張され、寄託される。次いで、この同じ方策を用いて、本明細書中で想定される系の集合における系のそれぞれを作成することができる。図2で示されるのは、集合のiPS系中に入る遺伝子構造のデザインの一般的な形式の一例である。各挿入について、所望の組換え挿入の選択を可能にするiPSセレクターがある。各挿入について、組織特異的プロモーターがあり、このプロモーターは、セットの異なるエレメントで異なるが、プロモーターのそれぞれは、組織特異的発現について選択される。組織特異的発現は、数例では、器官、例えば汎心臓であり、数例では、器官サブタイプ、例えば心房細胞であり、数例では、全身性細胞型、例えば内皮細胞であるか、または数例では、分化のレベル、例えば心筋前駆細胞である。組織特異的プロモーターは、図2で細胞型セレクターと表示される、第2の抗生物質耐性遺伝子に対する耐性についての第2の遺伝子を発現させる。細胞型セレクターを用いて、組織特異的プロモーターを発現する細胞の生存を可能にすることによって、対象の細胞を精製する。マーカー遺伝子、例えば蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、登録商標のマーカー系、例えばHaloTagまたはSNAPを発現において細胞型セレクターと2Aリンカーによって連結させ、これは、共通のプロモーターによって駆動される2つの別個のタンパク質を同時発現するように作用する。集合は、多数の異なるiPS細胞系を有し、それぞれを異なる組織特異的プロモーターエレメントで操作し、したがって、その構築物中の条件反応性プロモーターエレメントが活性である場合、各系は、レポートするか蛍光もしくは選択可能抗生物質耐性であるかのいずれか、またはその両方である。選択された系統の精製可能な分化細胞になるようにあらかじめ操作された各系のこのセットを考慮すると、細胞における任意の所望の薬物標的、細胞受容体または経路をタグ付けまたはマークすることが可能になる。製薬業界に対する対象の新薬の開発につながるような既知標的および経路の数は、かなり少なく、100未満の経路よび標的である。これらの標的および経路のそれぞれのベクターを、その標的または経路が細胞中で活性である場合、第2の異なる蛍光マーカーなどのマーカー遺伝子を示す遺伝子構築物を含有するpiggyBacベクターに組み立てる。piggyBacベクターをサイレンシングなしで容易にiPS細胞に効率的に形質転換することができ、piggyBacベクターにおいて条件付きで反応性のプロモーターの適切な発現を有する、このpiggyBacベクターを含有するクローンを容易に同定することができる。piggyBacベクターのセットを次いで、必要に応じて、iPS系のセットと混合し、適合させることができる。結果として、iPS系のセットが組織特異的プロモーターを同定することができるヒト体内の任意の細胞型の分化および精製を可能にし、piggyBacベクターの使用は、これらの細胞において、任意の新薬開発につながるような標的または経路についてのスクリーニングが可能になる。この系は、したがって、薬物スクリーニングを医薬品発見努力が望み得る任意の標的に対するヒト体内の任意の細胞型に関して実施することを可能にする。身体の細胞の全ておよびこれらの細胞中の経路の全てが、現在、ヒト身体自体の外側で可能な最も適切な生物学的関連において、薬物発見のために利用可能である。iPS系のこのセットについての別の使用は、分化プロセスの発見のためである。幹細胞の科学が発展するにつれ、ゆっくりと幹細胞を多くの分化細胞型に分化させる方法が見いだされつつある。前述のiPS系のセットを含むツールは、プロセスが劇的に加速されるのを可能にする。細胞が所与の子孫細胞に分化する場合に、その挿入されたマーカー遺伝子を発現するiPS系を用いることにより、分化条件に関してランダムまたは半ランダムなスクリーンを実施することが可能になる。なぜなら、未分化幹細胞を対象の標的細胞に分化させる任意の条件は、図2のマーカー遺伝子の活性化により検出できるからである。一旦1つの分化方法が同定されたら、たとえそれが低い有効性で作用する場合でも、同じツールが初期方法に関する帰納的な実験を有効性および収率を増大させるために実施することを可能にし、一方、プロセスの有効性の全レベルで、対象の細胞の精製された培養物を抗生物質精製によって簡単に得ることができる。したがって、現在、体内で任意の細胞型の精製された培養物を産生するためのプロセスの開発が可能である。ツールラインのセットの別の使用は、発達毒物学のアッセイとしての使用のためである。iPS細胞は、それらが標的細胞型に分化する場合にのみマーカー遺伝子を示すので、一旦分化プロセスがある有効性レベルで作用したら、潜在的に発生毒性である分子を添加することによって、そのプロセスを摂動させて、分子が標的細胞の収率に影響を及ぼすかどうかを確認することが可能である。例えば、図1の肝細胞肝臓例を用いて、肝細胞の分化に有利なプロセスで、図1の細胞系は、20~70の肝細胞をどこでも産生し、その有効性レベルは、細胞が肝細胞になる際に、これらから観察される蛍光によって測定することができる。任意のプロセスについて、レベルは幾分変わるが、統計的基準付近の範囲内で変化するであろう。次いで、マルチウェル培養プレート中でプロセスをセットアップし、潜在的テラトゲンまたは他の潜在的な発生的に毒性の薬剤を各ウェルに添加することが可能になる。肝細胞の正常な収量を産生しないウェルは、それらの特定のウェルで使用した薬剤が、その細胞型の発達に潜在的に有害であることを示す。この系を多くの異なる細胞型について複製して、任意の形態の発生生物学を妨げる既知または新規薬剤を同定することができる。最も網羅的な変異体は、任意の細胞型で異なって発現される体内の全てのプロモーターが含まれる、おそらく10,000の系のセットであるすなわち、全部またはほとんどの細胞で同じように発現する全てのプロモーターを除く。このセットを次いで用いて、任意の発生経路における任意のプロモーターの発現特性を追跡することができる。このデザインは、ルシフェラーゼレポーターを用いたハイスループットスクリーニング、GFPレポーターを用いた高含有量イメージングまたはハイスループットFACS、または抗生物質耐性遺伝子を用いた精製を可能にし、その全ての発現は、遺伝子構築物における遺伝子調節エレメントによって制御される。加えて、特定の細胞型の遺伝子発現パターンにおける変動の調査は、このツールで調査することができる。本発明者らは、全ての肝臓P450遺伝子からの全てのプロモーターでiPS細胞系のセットを構築する。次いで、iPS細胞を肝細胞に分化させ、適用される薬物に対するP450応答の範囲を調査するために用いる。本明細書中で開示され、請求される全ての方法は、本開示を考慮して過度の実験なしに作成することができ、実施することができる。本発明の組成物および方法を、好ましい実施形態に関して記載したが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中で記載される方法の方法およびステップまたは一連のステップにおいて変更を加えることができることは、当業者には明かであろう。さらに具体的には、化学的および物理的に関連するある薬剤は、本明細書中に記載される薬剤と置換することができ、その際、同じかまたは類似した結果が達成されることは明らかであろう。当業者に明らかな、全てのそのような類似した代替および修飾は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内に含まれると考えられる。参考文献以下の参考文献は、それらが本明細書中に記載するものに補足的な例示的手順または他の詳細を提供する程度まで、参照することによって本明細書中に特に組み込まれる。米国特許第5,030,015号米国特許第5,302,523号米国特許第5,322,783号米国特許第5,384,253号米国特許第5,460,964号米国特許第5,464,765号米国特許第5,486,359号米国特許第5,486,359号米国特許第5,486,359号米国特許第5,538,877号米国特許第5,538,880号米国特許第5,538,880号米国特許第5,550,318号米国特許第5,550,318号米国特許第5,563,055号米国特許第5,563,055号米国特許第5,580,859号米国特許第5,589,466号米国特許第5,591,616号米国特許第5,610,042号米国特許第5,610,042号米国特許第5,635,387号米国特許第5,656,610号米国特許第5,677,136号米国特許第5,681,599号米国特許第5,702,932号米国特許第5,716,827号米国特許第5,736,396号米国特許第5,736,524号米国特許第5,750,397号米国特許第5,759,793号米国特許第5,780,448号米国特許第5,789,215号米国特許第5,811,094号米国特許第5,827,735号米国特許第5,827,740号米国特許第5,837,539号米国特許第5,837,670号米国特許第5,925,565号米国特許第5,935,819号米国特許第5,945,100号米国特許第5,981,274号米国特許第5,994,136号米国特許第5,994,624号米国特許第6,013,516号米国特許第6,280,718号米国特許第6,458,589号米国特許第6,458,589号米国特許第6,458,589号米国特許第6,506,574号米国特許第6,833,269号米国特許第6,833,269号米国特許第6,991,897号米国特許第7,015,037号米国特許第7,399,632号米国特許第7,410,773号米国特許第7,410,798号米国特許第7,422,736号米国特許出願第61/323,689号米国特許出願第08/464,599号米国特許出願第61/172,079号米国特許出願第61/184,546号米国特許公開第2003/0003573号米国特許公開第2003/0153082A1号米国特許公開第2003/0166273A1号米国特許公開第20030211603号米国特許公開第2004/0009589A1号米国特許公開第2005/0037493A1号米国特許公開第2005/0214939A1号米国特許公開第20070238170号米国特許公開第2010/0003757号米国特許公開第2010/0011455号Alisonetal.,Hepatol,29:678-83,1998.Amitetal.,Dev.Bio.,227:271-278,2000.Andrewsetal.,In:TeratocarcinomasandEmbryonicStemCells,RobertsonEd.,IRLPress.,207-246,1987.Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePubl.Assoc.Inc.JohnWileySons,Inc.,MA,1996.Ausubeletal.,In:CurrentProtocolsinMolecularBiology,John,WileySons,Inc,NewYork.,1994.Bajicetal.,Bioinformatics,18:198-199,2002.Blomeretal.,J.Virol,719:6641-6649,1997.Boyeretal.,Cell,1226:947-56,2005.Byrneetal.,Nature,4507169:497-502,2007.Campbelletal.,J.CellSci.,109:2619,1996Carpenteretal.,Exp.Neurol,1722:383-97,2001.Cassiedeetal.,J.BoneMiner.Res.,119:1264-1273,1996.Castelletal.,In:InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch,AcademicPress,375-410,1997.Chambersetal.,Cell,1135:643-55,2003.Chanetal.,DrugDiscov.Today,10:587,2005.ChenandOkayama,Mol.CellBiol,78:2745-2752,1987.CurrentProtocolsinStemCellBiology,Bhatiaet.al.Ed.,JohnWileyandSons,Inc.,2007.deFelipe,Curr.GeneTher.,2:355-378,2002.欧州特許第EP0412700号欧州特許第EP1507865号Evans,etal.,In:CancerPrinciplesandPracticeofOncology,Devitaetal.Eds.,Lippincot-Raven,NY,1054-1087,1997.Fechheimeretal.,ProcNatl.Acad.Sci.USA,84:8463-8467,1987.Ferryetal.,Hum.GeneTher.,914:1975-81,1998.Follenzietal.,Hum.GeneTher.,132:243-60,2002.Fraleyetal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA,76:3348-3352,1979.Gehrkeetal.,Gene,322:137-43,2003.GhoshandBachhawat,In:LiverDiseases,TargetedDiagnosisandTherapyUsingSpecificReceptorsandLigands,Wuetal.Eds.,MarcelDekker,NY,87-104,1991.Ghoshetal.,J.Hepatol,32lSuppl:238-52,2000.Gomes-Lechonetal.,In:InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch,AcademicPress,129-153,1997.Gopal,Mol.CellBiol,5:1188-1190,1985.GrahamandVanDerEb,Virology,52:456-467,1973.Gronthos,Blood,8412:41644173,1994.HarlandandWeintraub,J.CellBiol,1013:1094-1099,1985.Hilletal.,Exp.Hematol,248:936-943,1996.Huanetal.,CancerRes.,64:4294,2004.Irionetal.,NatBiotechnol,2512:1477-82,2007Jaiswaletal.,J.CellBiochem.,642:295-312,1997.Johnstoneetal.,238l:265-272,1998.Kaeppleretal.,PlantCellRep.,8:415-418,1990.Kanedaetal.,Science,243:375-378,1989.Katoetal.,J.BiolChem.,266:3361-3364,1991.Keirsteadetal.,J.Neurosci.,2519:4694-705,2005.Kimetal.,MolCellBiol,128:3636-43,1992.Kleinetal.,Nature,327:70-73,1987.Klimanskayaetal.,CloningStemCells,6:217,2004.Krameretal.,Mol.Ther.,73:375-85,2003.Langle-Rouaultetal.,J.Virol,727:6181-6185,1998.Levitskayaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,9423:12616-12621,1997.M.Manoharan,Curr.Opin.Chem.Biol,8:570,2004.MacejakandSarnow,Nature,353:90-94,1991.Makinoetal.,J.Clin.Invest.,1035:697-705,1999.Maniatis,etal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1988.Mannetal.,Cell,33:153-159,1983.McBratneyetal.Curr.Opin.CellBiol.,56:961-5,1993.Miaoetal.,TrendsBiotechnol,199:349-55,2001.Miaoetal.,Mol.Ther.,l6:522-32,2000.Milleretal.,Am.J.Clin.Oncol,153:216-221,1992.Nabeletal.,Science,2444910:1342-1344,1989.Naldinietal.,Science,2725259:263-267,1996.NicolasandRubenstein,In:Vectors:Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,RodriguezandDenhardt,eds.,Stoneham:Butterworth,pp.494-513,1988.NicolauandSene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190,1982.Nicolauetal.,MethodsEnzymol,149:157-176,1987.Parisetal.,CancerEpidemiol.BiomarkersPrev.,8:901,1999.Paskindetal.,Virology,67:242-248,1975.PCT出願第WO01/098482号PCT出願第WO01/81549号PCT出願第WO01/81549号PCT出願第WO03/000868号PCT出願第WO03/004605号PCT出願第WO03/006950号PCT出願第WO03/042405号PCT出願第WO03/050249号PCT出願第WO03/050250号PCT出願第WO03/050251号PCT出願第WO04/007696号PCT出願第WO04/094595号PCT出願第WO05/014782号PCT出願第WO09/130208号PCT出願第WO94/09699号PCT出願第WO94/09699号PCT出願第WO95/011308号PCT出願第WO95/06128号PCT出願第WO96/39487号PCT出願第WO99/20741号PelletierandSonenberg,Nature,334:320-325,1988.Potrykusetal.,Mol.Gen.Genet.,1992:169-177,1985.Potten,Philos.Trans.RSoc.Lond.BBiol.Sci,353:821-30,1998.Potteretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:7161-7165,1984.Prestridge,J.Mol.Biol,249:923-932,1995Reubinoffetal.,Nat.Biotechnol,18:399B404,2000.Rippe,etal.,Mol.CellBiol,10:689-695,1990.Ryanetal.,J.Gener.Virol,78:699-722,1997.SambrookandRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEd.ColdSpringHarborLab.Press,2001.Scherfetal.,J.Mol.Biol,297:599-606,2000.Scymczaketal.,NatureBiotech.,5:589-594,2004.Simonetetal.,J.BiolChem.,26811:8221-9,1993.Smith,In:OriginsandPropertiesofMouseEmbryonicStemCells,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol,2000.Sotileetal.,CloningStemCells,52:149-55,2003.TakahashiandYamanaka,Cell,126:663-676,2006.Takahashietal.,Cell,1264:663-76,2007.Takahashietal.,Cell,131:861-872,2007.Temin,In:GeneTransfer,KucherlapatiEd.,NY,PlenumPress,149-188,1986.ThomsonandMarshall,Curr.Top.Dev.Biol,38:133-165,1998.ThomsonandOdorico,J.Trends.Biotechnol,18:53B57,2000.Thomsonetal.Proc.Natl.Acad.Scie.USA,92:7844-7848,1995.Thomsonetal.,Science,282:1145,1998.Tur-Kaspaetal.,Mol.CellBiol,6:716-718,1986.VickersIn:InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch,AcademicPress,375-410,1997.Watt,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.,353:831,1997.Webber,In:Pharmacogenetics,OxfordUniv.Press,1997.Wilsonetal.,Science,244:1344-1346,1989.Wolfetal.,Br.Med.Bull,55:366,1999.Wolfetal.,Br.Med.J,320:987,2000.Wongetal.,Gene,10:87-94,1980.WuandWu,Biochemistry,27:887-892,1988.WuandWu,J.Biol.Chem.,262:4429-4432,1987.Xieetal.,Bioinformatics,2222:2722-2728,2006.Xuetal.,Circ.Res.,916:501-8,2002.Xuetal.,Nat.Biotechnol,19:971-974,2001.YangandRussell,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:4144-4148,1990.Yingetal.,Cell,115:281-292,2003.Yooetal.,J.BoneJointSure.Am.,8012:1745-1757,1998.YuandThompson,GenesDev.,2215:1987-97,2008.Yuetal.,Science,318:1917-1920,2007.Zuffereyetal.,Nat.Biotechnol,159:871-875,1997."