"以下の式のペグ化インスリンリスプロ化合物:P-A-B、またはその製薬上許容可能な塩、1またはそれ以上の製薬上許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体、および製薬上許容可能なフェノール系防腐剤および該ペグ化インスリンリスプロ化合物を6量体化するのに充分な量の亜鉛、を含む医薬組成物。以下の式のペグ化インスリンリスプロ化合物:P-A-B、またはその製薬上許容可能な塩、および1またはそれ以上の製薬上許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体、および治療的有効量のインスリンリスプロを含む医薬組成物。製薬上許容可能なフェノール系防腐剤および該ペグ化インスリンリスプロ化合物を6量体化するのに充分な量の亜鉛をさらに含む請求項2記載の医薬組成物。基礎インスリン補充レジメンに更に適した長時間作用性のインスリンが今でも必要とされているのは明白である。特に、食事インスリン製剤と混合可能であり、長期間持続性の時間-作用プロフィルすなわち1日1回またはそれ以下の頻度で注射することにより適切に血糖値を制御可能を有し、より平坦な作用および薬力プロフィルすなわちピーク/トラフ比が低いを有し、患者内変動が少なくすなわち時間-作用プロフィルが予想可能なので、低血糖および/または体重増加の発生率が減少、および/または注射部位刺激感または注射部位疼痛の少ない可溶性の基礎インスリンが必要とされている。我々はここに、インスリンリスプロが高分子量のポリエチレングリコール誘導体とペグ化することにより、治療上効果的な基礎インスリン活性を有し、長期間持続性の時間-作用プロフィルを有し、生理的pHで可溶性が高く、および/または一般的に使用される他の食事インスリン製剤と混合可能であるペグ化インスリンリスプロ化合物を提供できるという発見を報告する。本発明は式Iの化合物:P-A-B式中、Aはインスリンリスプロ配列番号1のA鎖、Bはインスリンリスプロ配列番号3のB鎖、Pは約20kDaから約40kDaの範囲の分子量を有するPEGであり、AおよびBは適切に架橋結合しており、Pは共有結合によって直接または間接に、Aの1位でグリシンのアルファアミノ基、Bの1位でフェニルアラニンのアルファアミノ基またはBの28位でリジンのイプシロンアミノ基に結合している、またはその製薬上許容可能な塩を提供する。本発明は、複数のモノおよびジペグ化インスリンリスプロ化合物を含む組成物であって、組成物中のペグ化インスリンリスプロ化合物の約75を超える量が、式Iのモノペグ化化合物である組成物も提供する。本発明は、式Iのモノペグ化インスリン化合物を含む組成物であって、組成物中のモノペグ化化合物の約50を超える量が、B鎖の28位でリジンのイプシロンアミノ基に直接または間接に共有結合しているPEGを有する組成物も提供する。本発明は、式Iのペグ化インスリンリスプロおよび1つ以上の製薬上許容可能な防腐剤、等張剤、金属イオンまたは緩衝剤を含む医薬組成物も提供する。本発明の特定の実施形態では、式Iのペグ化インスリンリスプロおよび1つ以上の製薬上許容可能な防腐剤、等張剤、金属イオンまたは緩衝剤を含む医薬組成物が、治療上有効量のインスリン類似体を更に含む。本発明は、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を含む治療上有効量の医薬組成物を患者に投与するステップを含む、高血糖症、真性糖尿病、または妊娠性糖尿病を治療する方法も提供する。本発明は、治療のために、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を使用するステップも含む。本発明は、低血糖症、真性糖尿病、または妊娠性糖尿病を治療するための医薬品製造のために、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を使用するステップも含む。本明細書では以下の略語が使用される。ACN:アセトニトリル、Boc:tert-ブトキシカルボニル、BSA:ウシ血清アルブミン、DCM:ジクロロメタン、メチレンクロライド、DMF:N,N-ジメチルホルムアミド、DMSO:ジメチルスルホキシド、DTT:ジチオトレイトール、EDTA:エチレンジアミン四酢酸、Et:エチル、EtOH:エタノール、Fmoc:9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、HCl:塩酸、Da:ダルトン、kDa:キロダルトン、Lilly:イーライリリー社インディアナ州インディアナポリス、mAb:モノクローナル抗体、Me:メチル、MeOH:メタノール、PBS:リン酸塩緩衝液生理食塩水、RP-HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィ、SEC:粒径排除クロマトグラフィ、SEM:平均値の標準誤差、SPA:シンチレーション近接アッセイ、TFA:トリフルオロ酢酸。本開示に使用されるアミノ酸の略語は全て、37C.F.R§1.822B2の記載通り、米国特許商標局が認めたものである。インスリンと言う用語は、あらゆる種の野生型インスリンを含むことがここでは意図されており、限定されないが、ブタのインスリン、ウシのインスリン、ヒトのインスリンなどが含まれる。天然または野生型インスリンとは、天然に見出されるインスリンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するインスリンを意味する。様々な種から得られるインスリンをコードするポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当業者には周知である。例えば、ヒトインスリンは21のアミノ酸のA鎖と30のアミノ酸のB鎖それぞれ配列番号1および2を有している。インスリンは天然から得てもよいつまり天然源から単離してもよいし、生物合成または合成によって産生してもよい。インスリンと言う用語は、あらゆるインスリン誘導体および/またはインスリン類似体を含むことも意図されている。本明細書で使用する場合、インスリン類似体またはインスリン誘導体と言う用語は、インスリン活性を有し、ヒトインスリンと実質的に同じアミノ酸配列を有してはいるが、1つ以上のアミノ酸の置換、欠失、反転または付加などのヒトインスリンの修飾によってヒトインスリンとは異なっている蛋白質であると定義される。かかる化合物は当業者には周知である。例えば、PCT特許出願国際公開公報第96/15804号および03/053339号、米国特許番号第3,528,960号、5,514,646号、5,618,913号、5,750,497号、6,011,007号、6,251,856号、欧州特許第254,516号および280,534号を参照の事。当業者に公知の典型的かつ非網羅的なインスリン類似体には、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリシンなどが含まれる。更に、本明細書で使用する場合、インスリンと言う用語には、インスリン誘導体とインスリン類似体の両方であると考えられる化合物も含まれる。かかる化合物の例は、米国特許第5,750,497号および6,011,007号に記載されている。当業者に公知のかかる化合物の具体的な例はインスリンデテミルである。種々のインスリン類似体および/または誘導体は、速効性または迅速に作用するインスリン類似体であることが知られている。本明細書で使用する場合、速効性および迅速に作用すると言う用語は、同じ意味で用いられる。迅速に作用するインスリン類似体によって生じる食事グルコース効果は、aヒトインスリンよりも皮下注射後早く始まる、および/またはbヒトインスリンよりも皮下注射後の作用期間が短いことを示す。典型的な速効性インスリン類似体には、生理的条件下で一般的に2量体化または自己会合しにくいので速効性である、単量体インスリン類似体が含まれる。単量体インスリン類似体は当業者には公知である。例えば、米国特許第5,700,662号および欧州特許第214,826号を参照の事。インスリンリスプロは迅速に作用する単量体インスリン類似体であり、野生型インスリンB鎖配列番号2の28位にあるプロリンと、野生型インスリンB鎖配列番号2の29位にあるリジンが入れ替わっている。従って、インスリンリスプロは、限定されないが、LysB28ProB29ヒトインスリン、LysB28ProB29ヒトインスリン、B28LysB29Proヒトインスリンなど、様々な名称によって当業者に知られている。架橋結合したと言う用語は、システイン残基間に存在するジスルフィド結合を意味する。例えば、適切に架橋結合したヒトインスリンは、配列番号1の7位におけるシステインと配列番号2の7位におけるシステイン間のジスルフィド結合、配列番号1の20位におけるシステインと配列番号2の19位におけるシステイン間のジスルフィド結合、および配列番号1の6位におけるシステインと配列番号1の11位におけるシステイン間のジスルフィド結合を含む。同様に、適切に架橋結合したインスリンリスプロ化合物は、配列番号1の7位におけるシステインと配列番号3の7位におけるシステイン間のジスルフィド結合、配列番号1の20位におけるシステインと配列番号3の19位におけるシステイン間のジスルフィド結合、および配列番号1の6位におけるシステインと配列番号3の11位におけるシステイン間のジスルフィド結合を含む。本明細書で使用する場合、PEG結合インスリンリスプロまたはペグ化インスリンリスプロと言う用語は、少なくとも1つのPEGと共有結合し、生体内でインスリン活性を有するヒトインスリンリスプロ、またはその誘導体を意味する。インスリンおよびインスリンリスプロの生物学的活性は既知である。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に関して用いられるインスリン活性と言う用語は、限定されないが、それぞれ実施例5および実施例6で以下に記載される1型および2型糖尿病の動物モデルなど、一般に評価の定まった少なくとも1つの生体内動物モデルにおいて、血糖値を有意に低下させる能力を意味することが意図されている。従って、インスリン活性には、STZ処置のラットにおいて、用量568nmol/kgを単回皮下注射した後約4時間から少なくとも約36時間、血糖を100mg/dL以下のレベルにまで低下させるペグ化インスリンリスプロ化合物の能力が含まれる。ポリエチレングリコールまたはPEGは、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を意味し、カップリング剤が存在してもしなくても、あるいはカップリング部分または活性化部分との誘導化が存在してもしなくてもよい。典型的な例として、PEGは末端にヒドロキシ基を持つ線形ポリマーであり、HO-CH2CH2-CH2CH2On-CH2CH2-OHの式を有している。PEG中の反復サブユニットnの数は、ダルトンで表される分子量に関して近似されたものである。ペグ化化合物を調製するのに使用されるPEG試薬は、一般的に、PEGポリマー中に異なる数nのエチレングリコールサブユニットを有するPEGの異種混合物を含んでいる。PEGの1つのエチレングリコールサブユニットである-CH2CH2Oの分子量は約44ダルトンである。従って、PEGポリマーの分子量はn数によって決定される。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に結合するPEGは、約400から約1000の範囲のサブユニット数nを有している。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に結合するPEGが、約400から約750の範囲のサブユニット数nを有しているのが好ましい。より好ましいのは、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に結合するPEGが、約400から約550の範囲のサブユニット数nを有している場合である。最も好ましいのは、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に結合するPEGが、約400から約500の範囲のサブユニット数nを有している場合である。PEGの数多くの誘導体、それを製造する方法およびインスリンやインスリンリスプロなどの蛋白質にそれを結合する方法は当業者には公知であり、本発明で使用するのに適している。例えば、PCT特許出願国際公開公報第01/62827号、2006/028745号、2006/096535号、2006/036825号、Zalipsky,S.BioconjugateChem.6:150-165,1995;Veroneseら,AppliedBiochem.andBiotech.11:141-152,1985;およびRoberts,M.ら,AdvancedDrugDeliveryReviews,54:459-476,2002を参照の事。本発明で使用される特に好ましい1つのPEGは、ポリマーの一端が下級C1-6アルコキシ基などの比較的不活性な基で終わっているPEGである。好ましくは、PEGはモノメトキシPEG一般的にmPEGと呼ばれるである。これは線形のPEGで、ポリマーの一端はメトキシ-OCH3基である。本発明で使用されるPEGは活性化m-PEGであるのが更に好ましい。この場合、線形PEGの一端はメトキシ基で終わり、他端は、好ましい活性化mPEGとのペグ化をインスリンリスプロ分子の特定の部位で促進させるため、インスリンリスプロまたはインスリンリスプロ誘導体の好ましい部位と結合するのに適した反応基で終わっている。PEGは一般的に分子量がある程度多様なPEG化合物の混合物として製造および使用されるので、当業者は通常、特定のペグ化化合物を生成するペグ化反応に使用されるPEG試薬の平均サイズによって、化合物に結合するPEGの分子量を表す。平均値を表すには数多くの方法が可能であるが、一般的には3つの方法が用いられている。すなわち、数平均分子量、重量平均分子量およびz平均分子量である。本明細書で使用する場合、平均分子量と言う用語は重量平均分子量を意味することが意図されるが、これは、限定されないが、マトリックス補助レーザー脱離イオン化時間MALDI-TOF質量分析法、ゲル浸透クロマトグラフィまたは他の液体クロマトグラフィ技術、光散乱技術、超遠心、粘度測定技術など、当業者に周知の技術を用いて測定できる。重量平均分子量を計算する式はΣMi2Ni/ΣMiNiで表されてもよく、式中、Niは混合物に分子量Miを有する分子のモル比率または数比率である。数平均分子量を計算する式はΣMiNi/ΣNiで表されてもよく、式中、Niは混合物に分子量Miを有する分子のモル比率または数比率である。重量平均分子量と数平均分子量の比は多重分散度指数PDIとして知られており、分布の大体の幅を示すものである。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を調製するのに適したPEG試薬は一般的に多重分散状態すなわちポリマーの重量平均分子量と数平均分子量は等しくないである。本発明の化合物または組成物を調製するのに使用されるPEG試薬のPDIは、約1.1未満であるのが好ましい。更に好ましくは、本発明の化合物または組成物を調製するのに使用されるPEG試薬のPDIは約1.05未満である。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物に関して、インスリンリスプロ分子に共有結合しているPEGの分子量は約17.5kDaから約40kDaの範囲nは約400から約1000の範囲、あるいはPEGの平均分子量は約17.5kDaから約40kDaである。好ましくは、インスリンリスプロ分子に共有結合しているPEGの分子量は約20kDaから約30kDaの範囲nは約450から約750の範囲、あるいはPEGの平均分子量は約20kDaから約30kDaである。更に好ましいのは、インスリンリスプロ分子に共有結合しているPEGの分子量は約17.5kDaから約25kDaの範囲nは約400から約550の範囲、あるいはPEGの平均分子量は約17.5kDaから約25kDaである。最も好ましいのは、インスリンリスプロ分子に共有結合しているPEGの分子量は約17.5kDaから約20kDaの範囲nは約400から約500の範囲、あるいはPEGの平均分子量は約17.5kDaから約20kDaである。特定の実施形態では、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、好ましい平均分子量を持った活性化mPEGをインスリンリスプロと共有結合させることにより調製される。ペグ化インスリンリスプロの反応条件は、使用される特定のPEG、インスリンリスプロの結合部位、インスリンリスプロ上で結合標的となる特定の種類の反応基、好ましいペグ化レベルなどによって異なり、当業者が容易に決定できる。特定のペグ化ストラテジーに最も適した実験条件は、一般的に、慣用の実験方法によって、当業者が容易に決定できる。好ましい実施形態では、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、mPEGマレイミドmPEG-MALやmPEGチオールmPEG-SHなど、比較的チオール選択的な活性化mPEGをインスリンリスプロに間接的に結合させることにより、すなわちN-スクシンイミジル-S-アセチルチオプロピオネートSATPやN-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテートSATAなどのアミン/チオール調整剤を使ってインスリンリスプロに導入したチオール官能基に、チオール選択的活性化mPEGを結合させることにより調製される。更に好ましいのは、インスリンリスプロ上のチオールスルフィドリル基にPEGを共有結合させるのに使用される活性化mPEGは、以下のa、b、cなどのmPEGマレイミドである。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を調製する好ましい方法は、マイケル付加反応を利用して安定したチオエーテル結合を形成する方法である。反応は非常に特異的であり、他の官能基の存在下、穏やかな条件下で生じる。例えば、mPEGマレイミドは、活性化mPEGとして、本発明のペグ化インスリンリスプロコンジュゲートを調製するのに役立つ。ペグ化工程は、反応を完結させるため、mPEGマレイミドに対してチオール誘導インスリンリスプロをモル過剰使用するのが好ましい。反応は、pH4.0と9.0の間で、室温で1時間から40時間行うのが好ましい。チオールを含むペグ化されていない過剰のペプチドは、通常の分離方法によりペグ化生成物から容易に分離される。活性化mPEGマレイミドを用いるインスリンリスプロのペグ化に要求される典型的な条件は、実施例1に記載される。特定の実施形態では、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、アミンに比較的特異的な活性化mPEGを結合させることにより調製される。インスリンリスプロの主なアミン特異的ペグ化に適した活性化mPEGには、mPEGスクシンイミジルプロピオネートmPEG-SPA、mPEGスクシンイミジルブタノエートmPEG-SBA、mPEGスクシンイミジルアルファメチルブタノエートmPEG-SMB、mPEGスクシンイミジルカーボネートmPEG-SC、mPEGベンゾトリアゾールカーボネート、mPEG-p-ニトロフェニルカーボネートmPEG-NPCなどが含まれる。本発明の好ましい実施形態では、インスリンリスプロのペグ化に使用される活性mPEGによって、加水分解的に安定した共有結合、例えば、アミド結合、ウレタンカルバメートとしても知られる結合、アミン結合、チオエーテルスルフィドとしても知られる結合、尿素カルバミドとしても知られる結合などにより、mPEGに共有結合的に結合するインスリンリスプロが生じる。更に好ましいのは、インスリンリスプロのペグ化に使用される活性化mPEGはmPEG-SCまたはmPEG-NPCである。いずれの場合も、ウレタンすなわちカルバメート結合によってPEGに共有結合するインスリンリスプロが生じる。種々の分子量のmPEG-NPCを用いるインスリンリスプロのペグ化に有効な典型的な条件は、実施例2に記載される。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、一般的に、イオン交換クロマトグラフィ、粒径排除クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィなど、1つ以上の精製技術を用いて精製される。試料中のペグ化インスリンリスプロ化合物の全体的な不均一性ペグ化反応により生成されたペグ化インスリンリスプロ化合物の数および割合は、クロマトグラフィ、電気泳動、質量分析、特にMALDI-MSおよびNMR分光技術のうち1つ以上を用いて評価できる。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物の調製に使用されるインスリンリスプロは、液相方法、固相方法、半合成法、組み換えDNA技法など、一般に評価の定まった種々のペプチド合成技術のうちいずれかを用いて調製してよい。例えば、米国特許第5,700,662号Chanceらおよび欧州特許第214,826Brangeらは、種々のインスリン類似体の調製を開示している。インスリンリスプロのA鎖およびB鎖は、組み換えDNA技法を用いて、プロインスリン様前駆体分子から調製してもよい。好ましい実施形態では、本発明のペグ化インスリンリスプロを作るのに使用されるインスリンリスプロが、プロインスリン様前駆体を使って生成される。本発明は式Iの化合物:P-A-B式中、Aはインスリンリスプロ配列番号1のA鎖、Bはインスリンリスプロ配列番号3のB鎖、Pは約17.5kDaから約40kDaの範囲の分子量を有するPEGであり、AおよびBは適切に架橋結合しており、Pは共有結合によって直接または間接に、A鎖の1位でグリシンのアルファアミノ基、B鎖の1位でフェニルアラニンのアルファアミノ基またはB鎖の28位でリジンのイプシロンアミノ基に結合している、またはその製薬上許容可能な塩を提供する。本発明の好ましい化合物は、aPがウレタン結合またはチオエーテル結合によってインスリンリスプロと共有結合し、bSTZ処置ラットにおいて、約568nmol/kgの用量で、ヒトインスリン受容体に対して約30nM、約20nM、約10nM、約5nMまたはそれ以下のKi値を有し、約6時間、約8時間、約10時間、約12時間または約14時間を超える除去半減期を有することによって特徴付けられる化合物、あるいはSTZ処置ラットにおいて、化合物を約568nmol/kgの用量で単回皮下注射した後、約4時間から少なくとも約36時間、約48時間、約60時間、約72時間、約84時間、約96時間、約108時間または約120時間、血糖値を約100mg/dL以下に低下させる活性によって特徴付けられる化合物である。更に好ましい化合物は、aPがウレタン結合によってインスリンリスプロと共有結合し、bヒトインスリン受容体に対して約10nM以下のKi値を有し、cSTZ処置ラットにおいて、約568nmol/kgの用量で、6時間を超える除去半減期を有することによって特徴付けられ、dSTZ処置ラットにおいて、化合物を約568nmol/kgの用量で単回皮下注射した後、約4時間から少なくとも約48時間、約60時間、約72時間、約84時間、約96時間、約108時間または約120時間、血糖値を約100mg/dL以下に低下させる活性によって特徴付けられる化合物である。更に好ましい化合物は、aPがウレタン結合によってインスリンリスプロと共有結合し、bヒトインスリン受容体に対して約10nM以下のKi値を有し、cSTZ処置ラットにおいて、約568nmol/kgの用量で、6時間を超える除去半減期を有することによって特徴付けられ、dSTZ処置ラットにおいて、化合物を約568nmol/kgの用量で単回皮下注射した後、約4時間から少なくとも約48時間、約60時間、約72時間、約84時間、約96時間、約108時間または約120時間、血糖値を約100mg/dL以下に低下させる活性によって特徴付けられ、e0.225mg/kgの用量で非経口的にヒトに単回投与した場合に、約24時間、約30時間、約32時間、約34時間、約36時間、約38時間、約40時間または約42時間を超える除去半減期を有することによって特徴付けられる化合物である。本発明に一貫する特徴および原理によれば、本発明の1つの実施形態は、インスリンリスプロのA鎖の1位におけるグリシンのアルファアミノ基PEG-GlyA1インスリンリスプロ、インスリンリスプロのB鎖の1位におけるフェニルアラニンのアルファアミノ基PEG-PhB1インスリンリスプロ、またはインスリンリスプロのB鎖の28位におけるリジンのイプシロンアミノ基PEG-LysB28インスリンリスプロに直接または間接に共有結合する、平均分子量約17.5kDa、約20kDa、約25kDa、約30kDaまたは約40kDaを有するPEGを含むモノペグ化インスリンリスプロ化合物を提供する。好ましくは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのB鎖の1位におけるフェニルアラニンのアルファアミノ基、またはインスリンリスプロのB鎖の28位におけるリジンのイプシロンアミノ基に直接または間接に共有結合する、平均分子量約17.5kDa、約20kDa、約25kDa、約30kDaまたは約40kDaを有するPEGを含む場合である。更に好ましいのは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのB鎖の28位におけるリジンのイプシロンアミノ基に結合する、平均分子量約17.5kDa、約20kDa、約25kDa、約30kDaまたは約40kDaを有するPEGを含む場合である。更に好ましいのは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのB鎖の28位におけるリジンのイプシロンアミノ基に結合する、平均分子量約17.5kDaまたは約20kDaを有するPEGを含む場合である20kDa-PEG-LysB28インスリンリスプロ。最も好ましいのは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのB鎖の28位におけるリジンのイプシロンアミノ基に結合する、平均分子量約20kDaを有するPEGを含む場合であるすなわち、PEG20kDa-LysB28インスリンリスプロ。本発明の他の実施形態は、インスリンリスプロのA鎖の1位におけるグリシンのアルファアミノ基、インスリンリスプロのB鎖の1位におけるフェニルアラニンのアルファアミノ基、またはインスリンリスプロのB鎖の28位におけるリジンのイプシロンアミノ基に直接または間接に共有結合する、平均分子量約17.5kDa、約20kDa、約25kDa、約30kDaまたは約40kDaを有するPEGを含むモノペグ化インスリンリスプロ化合物を提供する。好ましくは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのB鎖の1位におけるフェニルアラニンのアルファアミノ基、またはインスリンリスプロのB鎖の28位におけるリジンのイプシロンアミノ基に直接または間接に共有結合する、平均分子量約17.5kDa、約20kDa、約25kDa、約30kDaまたは約40kDaを有するPEGを含む場合である。更に好ましいのは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのB鎖の28位におけるリジンのイプシロンアミノ基に結合する、平均分子量約17.5kDa、約20kDa、約30kDaまたは約40kDaを有するPEGを含む場合である。最も好ましいのは、モノペグ化インスリンリスプロが、インスリンリスプロのB鎖の28位におけるリジンのイプシロンアミノ基に結合する、平均分子量約20kDaを有するPEGを含み、0.225mg/kgの化合物を単回皮下投与でヒトに投与した場合、PEG-LysB28インスリンリスプロが、約24時間、約30時間、約32時間、約34時間、約36時間、約38時間、約40時間または約42時間を超える除去半減期を有することにより特徴づけられる場合である。別の実施形態では、本発明は、PEGの結合が異なる部位で生じるペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物、および/またはモノペグ化インスリンリスプロ、ジペグ化インスリンリスプロおよびトリペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含む組成物を提供する。本発明による具体的な組成物は、iPEG-GlyA1インスリンリスプロ、iiPEG-PheB1インスリンリスプロ、iiiPEG-LysB28インスリンリスプロ、ivジPEG-GlyA1PheB1インスリンリスプロ、vジPEG-GlyA1LysB28インスリンリスプロ、viジPEG-PheB1LysB28インスリンリスプロおよびviiジPEG-GlyA1PheB1インスリンリスプロからなる群から選択される2つ以上のペグ化インスリンリスプロ化合物を含む。更に好ましいのは、本発明の組成物はペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、そのペグ化インスリンリスプロ化合物の約80、約85、約90、約95または約97を超える量が式Iのモノペグ化インスリンリスプロ化合物である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、そのペグ化インスリンリスプロ化合物の約80、約85、約90、約95または約97を超える量がモノペグ化インスリンリスプロ化合物であり、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約20、約15、約10、約5または約3未満がジペグ化されている場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、そのペグ化インスリンリスプロ化合物の約80、約85、約90、約95または約97を超える量がPEG-LysB28インスリンリスプロの場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、そのペグ化インスリンリスプロ化合物の約80、約85、約90、約95または約97を超える量がPEG-LysB28インスリンリスプロであり、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約20、約15、約10、約5または約3未満がPEG-GlyA1インスリンリスプロの場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、そのペグ化インスリンリスプロ化合物の約80、約85、約90、約95または約97を超える量がPEG-LysB28インスリンリスプロであり、全ペグ化インスリンスプロ化合物の約20、約15、約10、約5または約3未満がPEG-GlyA1インスリンリスプロであり、全ペグ化インスリンスプロ化合物の約10、約5または約3未満がジペグ化インスリンリスプロ化合物の場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約80がPEG-LysB28インスリンリスプロ、約10がPEG-GlyA1インスリンリスプロ、約10がジPEG-GlyA1LysB28インスリンリスプロの場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約90以上がPEG-LysB28インスリンリスプロ、約5以下がPEG-GlyA1インスリンリスプロ、約5以下がジPEG-GlyA1LysB28インスリンリスプロの場合である。更に好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約90以上がPEG-LysB28インスリンリスプロ、約5以下がPEG-GlyA1インスリンリスプロ、約5以下がジPEG-GlyA1LysB28インスリンリスプロであり、0.225mg/kgの化合物を単回皮下投与でヒトに投与した場合、PEG-LysB28インスリンリスプロが、約24時間、約30時間、約32時間、約34時間、約36時間、約38時間、約40時間または約42時間を超える除去半減期を有することにより特徴づけられる場合である。最も好ましいのは、本発明の組成物がペグ化インスリンリスプロ化合物の混合物を含み、全ペグ化インスリンリスプロ化合物の約95以上がPEG-LysB28インスリンリスプロ、約5以下がPEG-GlyA1インスリンリスプロであり、0.225mg/kgの化合物を単回皮下投与でヒトに投与した場合、PEG-LysB28インスリンリスプロが、約24時間、約30時間、約32時間、約34時間、約36時間、約38時間、約40時間または約42時間を超える除去半減期を有することにより特徴づけられる場合である。本明細書で使用する場合、塩基条件と言う用語は、ペグ化反応の塩基度を意味する。インスリンリスプロのB鎖の28位にリジンを有するペグ化インスリンリスプロに関して、反応は、より選択的に、実質的に脱プロトン化したインスリンリスプロのアルファアミノ基との間で行われるべきである。水性溶媒または共溶媒では、塩基条件とは7.0を超えるpHで反応が行われることを意味する。ペグ化反応が約8.5から約11.5のpHで行われるのが好ましい。有機溶媒では、反応は水中で10.75以上のpKaに等しい塩基度を有する塩基の存在下で行われる。本発明は、以下の式のペグ化インスリンリスプロ化合物、またはその製薬上許容可能な塩を製造する工程:P-A-B式中、Aはインスリンリスプロ配列番号1のA鎖、Bはインスリンリスプロ配列番号3のB鎖、Pは約20kDaから約40kDaの範囲の分子量を有するPEGであり、AおよびBは適切に架橋結合しており、Pはウレタン共有結合によってBの28位でリジンのイプシロンアミノ基に結合しているも含み、当該工程には、約25°Cと約30°Cの間の反応温度で、Bの28位におけるリジンのイプシロンアミノ基と、約20kDaと約40kDaの間の重量平均分子量を有するモノメトキシポリエチレングリコールp-ニトロフェニルカルボネートmPEG-NPCとをpH約8.5と約11.5の間の水性溶媒中で反応させるステップが含まれる。好ましくは、反応のpHは約10.5から約11.1の間に維持され、ペグ化反応は約25°Cと約30°Cの間の温度で約2時間から約12時間行われ、mPEG-NPC対インスリンリスプロの比率は約1.0から約5.0の範囲である。更に好ましいのは、mPEG-NPCの重量平均分子量が約20kDaで、反応のpHが約10.5と約11.1の間に維持され、ペグ化反応が約25°Cと約30°Cの間の温度で約2時間から約12時間行われ、mPEG-NPC対インスリンリスプロの比率が約1.0と約5.0の範囲にある場合である。更に好ましいのは、PEG対インスリンリスプロのモル比率が約2.5と約4.5の範囲にあり、mPEG-NPCの重量平均分子量が約20kDaで、ペグ化反応のpHが約10.5と約11.1の間に維持され、ペグ化反応が約25°Cと約30°Cの間の温度で約3時間から約6時間維持される場合である。最も好ましいのは、PEG対インスリンリスプロのモル比率が約2.6と約4.5の範囲にあり、mPEG-NPCの重量平均分子量が約20kDaで、ペグ化反応のpHが約10.5と約11.1の間に維持され、反応が約25°Cと約30°Cの間の温度で約3時間維持される場合である。異なる分子量を有する本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、必要に応じて、当業者に公知の種々の技法を用いて単離できる。かかる技法には、限定されないが、ゲル濾過クロマトグラフィおよび/またはイオン交換クロマトグラフィが含まれる。すなわち、ゲル濾過クロマトグラフィを用いて、異なる分子量本質的にペグ化反応に使用されるPEGの平均分子量に対応する差異に基づいて、モノペグ化インスリンリスプロ化合物、ジペグ化インスリンリスプロ化合物およびトリペグ化インスリンリスプロ化合物の画分に分けてもよい。例えば、平均分子量約20kDaを有する活性化mPEGにインスリンリスプロを結合させる典型的な反応では、反応混合物は分子量約5,808ダルトンを有する非修飾インスリンリスプロ、平均分子量約25,808ダルトンを有するモノペグ化インスリンリスプロ、平均分子量約45,808ダルトンを有するジペグ化インスリンリスプロ、および平均分子量約65,808ダルトンを有するトリペグ化インスリンリスプロが含まれる場合がある。しかし、ゲル濾過技法は流体力学的サイズに基づいて化合物を分離するので、平均分子量約20kDaを有するmPEGと結合したモノペグ化インスリンリスプロは、平均分子量が約25,808ダルトンであるにもかかわらず、ゲル濾過中約82kDaの蛋白質として移動する。当業者は、精製および/または定量化に際し、平均分子量約20kDaのmPEGとペグ化したジペグ化種およびトリペグ化種が、非常に異なる移動または保持時間を有することを予期するであろう。血漿半減期と言う用語は、体内の薬物の血漿濃度が半分に低下する時間を意味する。除去半減期と言う用語は代替的に使用され、除去の最終対数線形率に相当する。当業者は、半減期がクリアランスと分配量の両方の関数として変化する誘導パラメーターであることを理解している。血漿半減期または除去半減期に関して用いられる長期的、長期化、または増大と言う用語は、本明細書では同じ意味で使用され、比較条件化で測定した場合、基準分子例えばインスリンリスプロの半減期と比べて試験化合物例えばペグ化インスリンリスプロの半減期が統計学的に有意に増大する意味であることが意図されている。クリアランスは薬物を排除する体の能力の尺度である。例えば薬物の修飾によってクリアランスが低下すれば、半減期は増大することが予想される。しかし、この相互関係は、分配量に変化がない場合のみ正確である。最終対数線形半減期t1/2、クリアランスCLおよび分配量Vの間の有効な近似関係は、t1/2~0.693V/CLの式で表される。クリアランスは、除去を説明するにあたり、薬物がどれほど除去されたかではなく、むしろ、薬物を完全に無くすのに必要な血液や血漿などの生物学的流体の量を示すものである。クリアランスは単位時間当たりの量として表わされる。本明細書で使用する場合、治療または治療すると言う用語は、糖尿病、高血糖症、あるいは症状や合併症と闘うまたはそれを軽減する目的でインスリン投与を必要とする他の病状に罹患している患者の管理およびケアを意味する。治療には、症状または合併症の発症、症状または合併症の軽減、または病気、病状または疾患の排除のために、本発明の化合物または組成物を投与するステップも含まれる。治療対象の患者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。式1のペグ化インスリンリスプロ化合物は、1つ以上の式Iの化合物をそれを必要とする患者に治療上有効量投与して、高血糖症を治療するのに有効である。本明細書で使用する場合、治療上有効量と言う用語は、患者の血糖を調節するのに十分な式Iのペグ化インスリンリスプロ化合物またはその組成物の量を意味する。式Iのペグ化インスリンリスプロの好ましい治療上有効量は、約0.01nmol/kgから約100nmol/kgである。更に好ましいのは、治療上有効量が約0.01nmol/kgから約50nmol/kgの場合である。更に好ましいのは、治療上有効量が約0.01nmol/kgから約20nmol/kgの場合である。更に好ましいのは、治療上有効量が約0.01nmol/kgから約10nmol/kgの場合である。更に好ましいのは、治療上有効量が約0.1nmol/kgから約7.5nmol/kgの場合である。更に好ましいのは、治療上有効量が約0.1nmol/kgから約5nmol/kgの場合である。もっとも好ましいのは、治療上有効量が約0.5nmol/kgから約5nmol/kgの場合である。しかし、ペグ化インスリンリスプロ化合物または実際に投与される1つ以上のペグ化インスリンリスプロ化合物を含む組成物の量は、治療対象の病状を含む様々な関連状況すなわち高血糖症の原因、投与されるペグ化インスリンリスプロの特定の種またはペグ化インスリンリスプロ化合物の特定の混合物、同時投与される他の薬物、インスリンまたはその他、選択された非経口的投与経路、個々の患者の年齢、体重および反応、並びに患者の症状の重篤性を考慮して、医師が決定するものであることは理解されるべきである。従って、上述の用量範囲は、如何なる意味でも、本発明の範囲を制限するものではない。血糖を調節するのに十分と言う用語は、化合物または組成物を患者に投与することにより、正常な空腹時血漿グルコースレベルになることを意味する。臨床的に正常な空腹時血漿グルコースレベルは70-110mg/dLである。臨床的に正常な食後血漿グルコースレベルは140mg/dL未満である。インスリン構造の共有結合的化学変化が貯蔵中に起きることが知られている。その結果、活性の低下した分子、脱アミド化生成物のように潜在的に免疫原性的な生成物、および高分子量の転換生成物例えば、2量体、オリゴマー、ポリマーが形成される場合がある。インスリンの化学的安定性に関する総合的な研究がJensBrange,StabilityofInsulin,KluwerAcademicPublishers,1994に記載されている。インスリン組成物は一般的に約2-8°C以下という低温で貯蔵される低温貯蔵は、室温で貯蔵する場合と比べて貯蔵寿命をかなり改善するという事実があるにもかかわらず、インスリン製品の保存寿命は、可溶性の凝集体2量体、オリゴマー、ポリマーの形成によりやがて低下する。更に、インスリン製品は振動により例えば、患者がポケットに入れて持ち運んだり、輸送したりすることにより不溶性の凝集体フィブリルを形成する傾向にある。化学的または物理的影響により可溶性および不溶性の凝集体が形成される傾向を最小限にまで減らすことが、インスリン製品の質にとって非常に重要である。従って、インスリン組成物を治療に使用するためには、化学的および物理的な安定特性を証明しなければならない。本明細書で使用する場合、安定性と言う用語は、ペグ化インスリンリスプロ化合物の調剤の物理的および/または化学的安定性を意味する。ペグ化インスリンリスプロ調剤の物理的不安定は、蛋白質分子の凝集により高位のポリマーや更には沈殿物を形成することにより生じる場合がある。安定した調剤では、蛋白質の凝集度が受容可能なレベルに制御されており、時間とともに受容不可能なレベルにまで増大するということがない。本発明の特定の実施形態では、ペグ化インスリンリスプロ調剤は、凝集度が出発物質の凝集度の約1、2、3、4、5、10、15、20、25または30以内であれば、特定の期間安定であると考えられる。本発明の特定の実施形態では、ペグ化インスリンリスプロ調剤は、ポリペプチドの生物学的活性が出発物質の活性の少なくとも約99、95、90、85、80、75、70、65、60、55または50であれば、特定の期間安定であると考えられる。本明細書で使用する場合、化学的安定性と言う用語は、ペグ化インスリンリスプロ組成物が、貯蔵中に、約2-8°Cの低温貯蔵および約20-40°Cの高温貯蔵を含む静止条件下で、可溶性の蛋白質凝集体を形成する傾向にあることを意味する。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物の化学的安定性は、特定の条件化で例えば、特定の温度および湿度条件で特定の期間、製剤の分析属性を決定することにより測定できる。測定可能な分析属性には、例えば、粒径排除HPLCを用いる高分子量種の形成などが含まれる。その結果は、次にモニターし、予め特定されたパラメーターと比較できる。本明細書で使用する場合、物理的安定性と言う用語は、ペグ化インスリンリスプロ組成物の振動など、物理的な行為の結果として不溶性の蛋白質凝集体が形成される傾向にあることを意味する。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を種々の医薬調剤の形で、一定期間、種々の温度で貯蔵した場合の物理的安定性は、当業者に周知の方法により評価してよい。試料の見かけの光減衰吸光度または光学密度の測定もその中に含まれる。かかる光減衰の測定は、製剤の混濁に関係している。混濁は製剤中の蛋白質または複合体の凝集や沈殿により生じる。物理的安定性を評価する他の方法は当業者には周知であり、粒子の存在または不在の視覚的評価やチオフラビンT蛍光顕微鏡検査法によるフィブリル/ゲル形成の検出などもその中に含まれる。本発明の他の実施形態は、患者特にヒトに投与するのに適しており、式Iに示した少なくとも1つのペグ化インスリンリスプロ化合物の治療上有効量および1つ以上の製薬上許容可能な賦形剤、希釈剤、緩衝液、金属イオンまたは担体を含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物はその性質上一般的に非経口的そうでない場合もあるであり、当業者に周知の従来の非経口製品用賦形剤、緩衝液、希釈剤、金属イオンまたは担体を使用し、種々の技術のいずれかによって調製してもよい。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物はきわめて水溶性であるので、本発明の医薬組成物は水を主要溶媒として包含する組成物を含んでおり、ペグ化インスリンリスプロ化合物の全濃度は、少なくとも1mg/mL、少なくとも2mg/mL、少なくとも5mg/mL、少なくとも10mg/mL、少なくとも15mg/mL、少なくとも20mg/mL、少なくとも25mg/mL、少なくとも30mg/mL、少なくとも35mg/mL、少なくとも40mg/mL、少なくとも45mg/mL、少なくとも50mg/mLまたはそれ以上であり、製薬上許容可能な緩衝液を含み、医薬組成物のpHは約4.0から約8.5である。本発明の医薬組成物のpHは約6.0から約8.5であるのが好ましい。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、全濃度が約2.5mg/mLから約60mg/mLの範囲のペグ化インスリンリスプロ化合物および緩衝液を含み、組成物のpHが約6.0から約8.5の範囲の場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、全濃度が約5mg/mLから約50mg/mLの範囲のペグ化インスリンリスプロ化合物および緩衝液を含み、医薬組成物のpHが約6.5から約7.5の範囲の場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、全濃度が約10mg/mLから約40mg/mLの範囲のペグ化インスリンリスプロ化合物および緩衝液を含み、医薬組成物のpHが約6.5から約7.5の範囲の場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、全濃度が約15mg/mLから約40mg/mLの範囲のペグ化インスリンリスプロ化合物および緩衝液を含み、医薬組成物のpHが約7.0から約7.5あるいは約7.0から約8.0の範囲の場合である。本発明の医薬組成物が更に治療上有効量のインスリンを含んでいるのが更に好ましい。更に好ましいのは、上記インスリンがインスリン類似体の場合である。更に好ましいのは、インスリン類似体が迅速に作用するインスリン類似体の場合である。最も好ましいのは、迅速に作用するインスリン類似体がインスリンリスプロの場合である。緩衝液と言う用語は、酸塩基共役成分の作用によりpHの変化に抵抗する溶液を意味する。使用される緩衝液は製薬上許容可能な緩衝液であるのが好ましい。製薬上許容可能な緩衝液と言う用語は、インスリン製剤に使用しても安全であり、医薬組成物のpHを目的のpHへ制御する効果のある溶液を意味する。好ましい実施形態では、緩衝液は約6.0から約8.5の範囲のpHを有している。更に好ましいのは、緩衝液が約7.0から約8.0の範囲のpHを有している場合である。本発明の組成物をこの範囲のpHに制御するのに用いられる製薬上許容可能な緩衝液は、限定されないが、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、アルギニン緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびそれらの組み合わせを含む。トリスは2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオールおよびその薬理学的に許容可能な塩を意味する。遊離塩基および塩酸塩すなわちトリスHClが、トリスの一般的な2つの形態である。トリスはトリメチロールアミノメタン、トロメタミン、およびトリスヒドロキシメチルアミノメタンとしても当業者に知られている。本発明の医薬組成物は、約2.5mMから約50mMのリン酸塩緩衝液またはトリス緩衝液を含むのが好ましい。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約5mMから約20mMのリン酸塩緩衝液またはトリス緩衝液を含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約5mMから約10mMのリン酸塩緩衝液を含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約5mMのリン酸塩緩衝液を含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約7.5mMから約50mMのトリス緩衝液を含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約10mMから約25mMのトリス緩衝液を含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が約15mMから約20mMのトリス緩衝液を含む場合である。最も好ましいのは、本発明の医薬組成物が約16mMのトリス緩衝液を含む場合である。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物および組成物は、非経口的に患者に投与される既知のインスリン製剤と同様の方法で製剤化してもよい。かかる製剤化は当業者には周知である。式Iのペグ化インスリンリスプロ化合物をHUMALOG登録商標インスリンリスプロまたはHumulin登録商標の製剤化と同様に製剤化するのが好ましい。従って、本発明の好ましい医薬組成物は、水、式Iのペグ化インスリンリスプロ化合物、等張剤および製薬上許容可能な緩衝液を含んでもよい。本発明の医薬組成物は製薬上許容可能な防腐剤を更に含むのが好ましい。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、インスリンの6量体化を促進し得る二価の陽イオン、例えば亜鉛および/またはコバルトを更に含む場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、少なくとも1つの6量体安定化剤を更に含む場合である。更に、pHを調整するため、塩酸および/または水酸化ナトリウムを添加してもよい。等張剤は生理学的に寛容な化合物で、製剤に適切な等張性を与えることにより、投与された医薬組成物に接触する細胞膜に水の正味の流れが生じるのを防ぐ。グリセリンとしても知られるグリセロールは等張剤として一般的に使用される。他の等張剤としては、i限定されないが、マンニトールやソルビトールなどの他の糖アルコール、ii限定されないが、NaClなどの塩、iii限定されないが、デキストロースなどの単糖類、iv限定されないが、ラクトース、ショ糖、トレハロースなどの二糖類などが含まれる。本発明の医薬組成物には1つ以上の等張剤を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、約270ミリオスモルから約330ミリオスモルの範囲の等張性を持つ製剤を生成することのできる1つ以上の等張剤を有するのが好ましい。等張剤がグリセロール、ソルビトール、ショ糖、NaCl、トレハロースおよび/またはマンニトールであれば更に好ましい。更に好ましいのは、等張剤がグリセロール、ソルビトール、ショ糖、NaClおよび/またはトレハロースの場合である。更に好ましいのは、グリセロール、ソルビトール、ショ糖、NaClまたはトレハロースが、約100mMから約200mMの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。更に好ましいのは、グリセロールが、約100mMから約200mMの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。更に好ましいのは、グリセロールが、約150mMから約180mMの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。更に好ましいのは、グリセロールが、約130mMから約175mMの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。更に好ましいのは、NaClが、約50mMから約300mMの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。更に好ましいのは、NaClが、約100mMから約200mMの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。最も好ましいのは、NaClが、約150mMの濃度で、本発明の医薬組成物の中に存在する場合である。本発明の医薬組成物は6量体安定化化合物を含んでもよい。6量体安定化化合物と言う用語は、6量体会合状態にある本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を安定化させる、非蛋白質様の小分子量の化合物である。インスリン分子用の既知の6量体安定化化合物は、カルシウムイオン、亜鉛、コバルト、銅、ニッケル、鉄、マグネシウム、マンガン、陰イオン、特に塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアネート、およびフェノール系化合物、特にフェノール、フェノール系防腐剤、レゾルシノール、4’-ヒドロキシアセトアニリド、4-ヒドロキシベンズアミドおよび2,7-ジヒドロキシナフタレンである。好ましくは、6量体安定化化合物は、フェノール、m-クレゾール、o-クレゾール、p-クレゾール、クロロクレゾール、メチルパラベン、カルシウム、塩化物、または2つ以上の当該化合物の組み合わせである。6量体安定化化合物はフェノール、m-クレゾール、カルシウム、塩化物、またはそれらの組み合わせであるのが更に好ましい。好ましくは、本発明の医薬組成物は、約1mMと75mMの間のカルシウム、約1mMと約50mMの間のカルシウム、約1mMと約25mMの間のカルシウム、約5mMと約50mMの間のカルシウム、約2.5mMと約30mMの間のカルシウム、約2.5mMと約15mMの間のカルシウム、約2.5mMと約10mMの間のカルシウム、約5mMと約30mMの間のカルシウム、約5mMと約15mMの間のカルシウムを含む。より好ましくは、本発明の医薬組成物は約2.5mMと10mMの間のカルシウムを含む。本発明の医薬組成物の多用途製剤は防腐剤を含んでいてもよい。防腐剤と言う用語は、医薬製剤に添加され、抗菌薬として作用する化合物を意味する。非経口製剤として有効で許容可能な、当業者に公知の防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、m-クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、o-クレゾール、p-クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサル、安息香酸、およびそれらの種々の混合物が含まれる。特定のフェノール系防腐剤、例えばメチルパラベン、フェノールおよびm-クレゾールは、インスリンおよびインスリン様化合物と結合し、物理的または化学的安定性あるいは両方の安定性を増大させる立体配座的変化を誘起することが知られている例えば、Birnbaum,D.T.ら,Pharmaceutical.Res.14:25-361997;Rahuel-Clermont,S.ら,Biochemistry36:5837-58451997を参照。フェノール系防腐剤には、フェノール、m-クレゾール、o-クレゾール、p-クレゾール、クロロクレゾール、メチルパラベンの化合物、およびそれらの混合物が含まれる。本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物の製剤に使用される防腐剤は、フェノール系防腐剤であってもよいし、6量体安定化化合物と同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、フェノール系防腐剤はm-クレゾールまたはフェノールである。本発明の医薬組成物は、約0.1mMから約75mMの濃度のフェノールおよび/またはm-クレゾールを、防腐剤として、約7.0から約8.0のpHで含んでいるのが更に好ましい。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、約1mMから約60mMの濃度のフェノールおよび/またはm-クレゾールを、防腐剤として、約7.0から約8.0のpHで含んでいる場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、約10mMから約40mMの濃度のフェノールおよび/またはm-クレゾールを、防腐剤として、約7.0から約8.0のpHで含んでいる場合である。更に好ましいのは、本発明の医薬組成物が、約30mMの濃度のフェノールおよび/またはm-クレゾールを、約7.0から約8.0のpHで含んでいる場合である。最も好ましいのは、本発明の医薬組成物が、約30mMの濃度のフェノールおよび/またはm-クレゾールを、約7.3から約7.5のpHで含んでいる場合である。上述したように、本発明の医薬組成物は、インスリンの6量体化を促進あるいはインスリン化合物を安定化する二価の金属陽イオン、例えば亜鉛またはコバルトを含んでいてもよい。二価の金属陽イオンと言う用語は、複数の蛋白質分子と複合体を形成するために共有するイオンまたはイオン群を意味する。遷移金属、アルカリ金属およびアルカリ土類金属は、インスリン化合物と複合体を形成することが知られている金属の例である。遷移金属が好ましい。二価の金属陽イオンは、亜鉛、銅、コバルト、ニッケル、マンガン、マグネシウム、カドミウムおよび鉄からなる群から選択される1つ以上の陽イオンであるのが好ましい。二価の金属陽イオンが亜鉛であるのが更に好ましい。亜鉛は、インスリンおよびインスリンリスプロを含む種々のインスリン類似体および/または誘導体の6量体形成を促進することが知られている。本発明の医薬組成物に含まれる亜鉛やコバルトなどの二価の陽イオンの主要な役割は、本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物および/または本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物を含む医薬組成物に含まれる他のインスリンまたはインスリン類似体の6量体形成を促進することである。フェノール系防腐剤が存在する場合、本発明の医薬組成物を含む溶液のpHを亜鉛IIイオンの存在下で中性領域に調整することにより、あるいはpHを中性領域に調整した後に亜鉛IIを添加することにより、6量体形成を促進できる場合がある。亜鉛対インスリン化合物、インスリン類似体および/またはペグ化インスリンリスプロ化合物の比率は、下限として約0.33に固定するのが好ましい。すなわち、2つの亜鉛原子に対して1つのインスリン6量体、インスリン類似体6量体および/またはペグ化インスリンリスプロ6量体が好ましい。更に好ましいのは、亜鉛対インスリン化合物、インスリン類似体および/またはペグ化インスリンリスプロ化合物の比率が約0.33から約0.67の場合である。亜鉛結合で蛋白質と競合する化合物、例えばクエン酸塩やリン酸塩が存在する場合は、処理中に追加の亜鉛を使用してもよい。6量体化に必要な量を超える過剰の亜鉛例えば、亜鉛対インスリン化合物、インスリン類似体および/またはペグ化インスリンリスプロ化合物の比率が約0.33から約0.83の場合が、6量体化を更に促進するのに好ましい場合がある。6量体化に必要な量を超える過剰の亜鉛を本発明の医薬組成物に存在させてもよく、それが化学的および物理的安定性の改善、懸濁性の改善、および時間-作用の更なる拡張にとって好ましい場合がある。一方、クエン酸塩緩衝液またはリン酸塩緩衝液中の過剰の亜鉛は、それぞれクエン酸亜鉛またはリン酸亜鉛並びにインスリンの沈殿の原因となる場合がある。本発明によれば、インスリン、インスリン類似体およびペグ化インスリンリスプロ6量体1モル当たり約0.3モルから約3モルの亜鉛を製剤中に存在させてもよい。全インスリン、インスリン類似体およびペグ化インスリンリスプロの6量体1モル当たり約0.3モルから約1モルの亜鉛を本発明の医薬組成物中に存在させるのが、更に好ましい。更に好ましいのは、全インスリン、インスリン類似体およびペグ化インスリンリスプロの6量体1モル当たり約0.3モルから約0.7モルの亜鉛を本発明の医薬組成物中に存在させる場合である。最も好ましいのは、インスリン、インスリン類似体およびペグ化インスリンリスプロの6量体1モル当たり約0.3モルから約0.55モルの亜鉛を本発明の医薬組成物中に存在させる場合である。本発明に亜鉛を提供する亜鉛化合物は、製薬上許容可能な亜鉛化合物であればどれでもよい。インスリン製剤への亜鉛の添加は、製薬上許容可能な亜鉛源同様、当業者には公知である。亜鉛は塩として供給されるのが好ましい。例えば、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、クエン酸亜鉛、酸化亜鉛、硝酸亜鉛などである。本発明の更なる実施形態では、本発明の医薬組成物は更に1つ以上の表面活性剤を含む。本明細書で使用する場合、表面活性剤と言う用語は、気相液相界面の吸着により液相の表面張力を減少させる試剤を含む。表面活性剤の例には、限定されないが、非イオン性の表面活性剤、例えば、ポリソルベートポリソルベート80やポリソルベート20など、ポロキサマーポロキサマー188など、トリトン商標トリトン商標X-100など、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、エチレンとプロピレングリコールのコポリマープルロニックスやPF68などが含まれる。例えば、本発明の医薬組成物には、約0.001-0.5例えば、0.05-0.3の表面活性剤が存在してもよい。本発明の医薬組成物に使用される表面活性剤はポロキサマー188であるのが好ましい。更に好ましいのは、表面活性剤がポロキサマー188で、その濃度が約0.5mg/mLと約10mg/mLの間、約1mg/mLと約10mg/mLの間、約2mg/mLと約10mg/mLの間、約3mg/mLと約10mg/mLの間、約4mg/mLと約10mg/mLの間、約1mg/mLと約5mg/mLの間、約2mg/mLと約5mg/mLの間、約3mg/mLと約5mg/mLの間、および約4mg/mLと約5mg/mLの間の場合である。本発明は、好ましくはヒトにおいて、低血糖症および/または糖尿病の治療に使用される、式Iのペグ化インスリンリスプロ化合物またはその製薬上許容可能な塩も提供する。本発明は、好ましくはヒトにおいて、低血糖症および/または糖尿病の治療用の医薬品の製造に使用される、式Iのペグ化インスリンリスプロ化合物またはその製薬上許容可能な塩も提供する。本発明のペグ化インスリンリスプロを含む医薬組成物は、それを必要とする患者に非経口的に投与してもよい。非経口投与は、注射器、任意にペンタイプの注射器または機械駆動の注入器を用いて、皮下、筋肉内または静脈内注射によって行ってもよい。あるいは、非経口投与は輸液ポンプを用いて行ってもよい。調製1:GlyA1-HSCH2CH2COインスリンリスプロ3およびLysB28-HSCH2CH2COインスリンリスプロ4Trt-SCH2CH2CO-OH、N-ヒドロキシスクシンイミドNHSおよびジイソプロピルカルボジイミドDICを1mmolずつDMF2mL中で30分混合して、Trt-SCH2CH2CO-NHSエステルを調製する。1/10mmolのインスリンリスプロを5トリエチルアミンTEAのDMSO溶液10mLに溶解する。その溶液に、活性化したTrt-SCH2CH2CO-NHSを0.2mmol加える。室温で2時間反応させた後、反応を終了させるため、エタノールアミン0.2mLを添加する。次に反応混合物を90mLの水で希釈し、RP-C18カラムで精製する。目的のLysB28-Trt-SCH2CH2COインスリンリスプロ2の画分をプールし凍結乾燥する。それとは別に、目的のGlyA1-Trt-SCH2CH2COインスリンリスプロ1の画分をプールし凍結乾燥する。0.2mLのチオアニソールと0.4mLのトリイソプロピルシランを含むTFA5mLに、1/10mmolの1または2を溶解する。30分後、TFAを蒸発によって除去し、残留性のペプチドを10ACNの水溶液50mLに移す。その結果得られる溶液をRP-C18カラムで精製する。目的の3または4の画分をプールし、任意に凍結乾燥する。調製2:PheB1-HSCH2CH2COインスリンリスプロ71/10mmolのインスリンリスプロを5TEAのDMSO溶液10mLに溶解する。その溶液に、ジ-tert-ブチルカーボネートのDMSO溶液0.2mmolを添加する。室温で1時間反応させた後、反応を終了させるため、エタノールアミン0.2mLを添加する。次に反応混合物を90mLの水で希釈し、RP-C18カラムで精製する。目的のBoc-GlyAlおよびBoc-LysB28インスリンリスプロの画分をプールし、凍結乾燥して5を得る。1/10mmolの5を5TEAのDMSO溶液10mLに溶解する。その溶液に、活性化したTrt-SCH2CH2CO-NHSを0.2mmol加える。室温で2時間反応させた後、反応を終了させるため、エタノールアミン0.2mLを添加する。次に反応混合物を90mLの水で希釈し、RP-C18カラムで精製する。目的の画分をプールし凍結乾燥すると、Trt-SCH2CH2CO-PheB1、Boc-GlyA1およびBoc-LysB28インスリンリスプロ6が得られる。0.2mLのチオアニソールと0.4mLのトリイソプロピルシランを含むTFA5mLに、1/10mmolの6を溶解する。30分後、TFAを蒸発によって除去し、残留性のペプチドを10ACNの水溶液50mLに移す。その結果得られる溶液をRP-C18カラムで精製する。目的の画分をプールし凍結乾燥すると、7が得られる。実施例1:チオール誘導化インスリンリスプロ中間体のペグ化平均分子量約20kDab、30kDaa、40kDaaまたは60kDacを有するモノメトキシPEG-MALを100mMのNH4Ac緩衝液pH4.69とACNの1対1混合液に溶解する。チオール誘導化インスリンリスプロ例えば、化合物3、4または7の凍結乾燥粉末を上記溶液に添加する。反応は分析用RP-HPLCを使ってモニターしてもよい。反応が完結通常約4時間後したら、混合物は水で希釈し、RP-HPLCカラムを使って精製する。目的の画分をプールし凍結乾燥すると、ペグ化インスリンリスプロ化合物が得られる。実施例1に記載の方法で調製した典型的なペグ化インスリンリスプロ化合物は、8a、8b、9a、9b、10a、10bおよび15cとして以下に示してある。これらのペグ化インスリンリスプロ化合物は、約400から約1000の範囲のnを有しているのが好ましい。更に好ましいのは、これらのペグ化インスリンリスプロ化合物が、約400から約750の範囲のnを有している場合である。更に好ましいのは、これらのペグ化インスリンリスプロ化合物が、約400から約550の範囲のnを有している場合である。更に好ましいのは、これらのペグ化インスリンリスプロ化合物が、約400から約500の範囲のnを有している場合である。更に好ましいのは、これらのペグ化インスリンリスプロ化合物が、約450から約500の範囲のnを有している場合である。最も好ましいのは、これらのペグ化インスリンリスプロ化合物が約450のnを有している場合である。実施例2:モノメトキシポリエチレングリコールp-ニトロフェニルカルボネートmPEG-NPCを用いたインスリンリスプロのペグ化1/10mmolのインスリンリスプロを20mLの0.2Mホウ酸塩緩衝液にpH10.5で溶解し、ACN20mL中の平均分子量約20kDaを有するmPEG-NPC1.98gを激しく攪拌しながら上記溶液に添加する。反応はRP-HPLCおよびSECでモニターする。約4時間後、反応混合物を酢酸を使ってpH5-7に酸性化し、RP-HPLCカラムを使って精製する。目的の画分をプールし凍結乾燥すると、モノペグ化PEG20Kインスリンリスプロが20から45の範囲の収率で得られる。RP-HPLC、SECおよびMALDI-MSで同定し、純度を確認する。A鎖またはB鎖に結合するmPEGの割合は、得られたコンジュゲートをトリス2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩TCEPで処理した後に放出される遊離のA鎖およびB鎖の領域積分によって決定する。mPEG-NPC対インスリンリスプロの比率は、モノペグ化種とジペグ化種の生成物分布を決定する。反応pHはペグ化の部位特異性を支配する。pHが約8から約12に上がると、化合物11が主要生成物になる。pH10.5で、約20kDaの平均分子量nは約450を有するmPEG-NPCを用いて反応を行うと、11対12の比率は約85対15になる。上記のペグ化反応は、0.2MのNaOHを連続添加して反応混合物のpHを維持することにより、非緩衝水溶液中で行うこともできる。pHを約11.5に維持しながら、約20kDaの平均分子量を有するmPEG-NPCを用いて、非緩衝水溶液中で反応を行わせると、ペグ化反応生成物は、11と12を約92対8の割合で含む。化合物11は、約400から約1000の範囲のnを有するのが好ましい。更に好ましいのは、化合物11が約400から約750の範囲のnを有する場合である。更に好ましいのは、化合物11が約400から約550の範囲のnを有する場合である。更に好ましいのは、化合物11が約400から約500の範囲のnを有する場合である。更に好ましいのは、化合物11が約450から約500の範囲のnを有する場合である。最も好ましいのは、化合物11が約450のnを有する場合である。実施例3:インビトロ受容体親和性受容体結合アッセイは、ヒトインスリン受容体hIRまたはヒトIGF-1受容体hIGF-1Rを過剰発現している、安定的に形質移入された293EBNAHEK細胞から調製したP1膜上で行われる。結合親和性は、ヒト組み換え3-[125I]ヨードチロシルA14インスリン2000Ci/mmolまたはヒト組み換え[125I]インスリン様成長因子2000Ci/mmolのいずれかを用いて、競合放射性リガンド結合アッセイで決定する。アッセイは、PVTPEI処置タイプA麦芽アグルチニン結合SPAビーズを用いてSPA法で行った。全ての試薬調製にSPAアッセイ緩衝液50mMトリスHCl、pH7.5、150mMNaCl、0.1BSAを用いた。化合物の3倍段階希釈100nMから2pMはFreedom/EvoロボットTecanを用いてアッセイ緩衝液で調製し、マルチメクBeckmanCoulterを用いて96ウェル白色透明ボトムマイクロプレートCorning/Costarに添加した。放射性リガンド、膜およびSPAビーズをマルチドロップ装置Titertekを使って添加する。室温で10時間インキュベーションした後、マイクロベータトリラックスシンチレーションカウンターを用いて放射線を測定する。非標識インスリンリスプロと非標識IGF-Iをそれぞれ陽性対照および陰性対照として各実験に含める。IC50値は4パラメーター非線形ロジスティック回帰分析により決定する。親和定数Kiは、Ki=IC50/1D/Kdの式に基づいてIC50値から計算する。式中、Dは実験に使用される放射性リガンドの濃度に等しく、Kdは飽和結合解析で決定される放射性リガンドの平衡結合親和定数に等しいhIRとhIGF-1RのKdはそれぞれ0.124nMおよび0.130nMである。以下に報告する幾何平均Kiは10^平均対数Kiであり、式中、平均対数Ki=平均Ki1Ki2Ki3...Kinであり、独立実験の数nは3以上である。しかし、ヒトIGF-1に関して以下に記載する場合、nは2である。実施例1に記載する方法で調製した以下のペグ化インスリンリスプロ化合物は、上述のhIR結合アッセイにおいて30nM未満の幾何平均Kiを有している。そのペグ化インスリンリスプロ化合物とは、平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物10a、平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物8a、平均分子量約60kDaを有する分岐mPEG-MALを用いて調製した化合物15c、平均分子量約30kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9a、平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9a、および平均分子量20kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9bである。hIRおよびhIGFR結合アッセイでは、平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9aの幾何平均Kiは、それぞれ3.07nM/-0.32nM/-S.E.M、n=6および84.3nM超SEM=未決定、n=6である。更に、40kDa、30kDaまたは20kDaの線形mPEG-NPCを用いて実施例2に記載の方法で調製した異種ペグ化インスリンリスプロ生成物も、上述のhIR結合アッセイにおいて30未満の幾何平均Kiを有している。上述のhIR結合アッセイでは、インスリンリスプロの幾何平均Kiは0.22/-0.072nM/-SEM、n=4である。上述のhIGFR結合アッセイにおいては、上記の全化合物が75nMを超える幾何平均Kiを有しており、ヒトIGF-1の幾何平均Kiは1.51/-0.23nM/-SEM、n=2である。ペグ化位置B28はhIR親和性を約10倍減少させ、これらインスリンリスプロのペグ化種をhIRの弱いアゴニストにしていることを、このデータは示している。更に、これらペグ化インスリンリスプロ種は、上述の条件下のアッセイにおいて、測定可能なIGFR-1結合特性を全く有していない。実施例4:インスリン受容体リン酸化全細胞アッセイを用いたペグ化インスリンリスプロの効力評価本発明のペグ化インスリンリスプロ化合物は、商業的に入手可能な異種時間分解蛍光測定アッセイであるDELFIA登録商標Perkin-Elmerを用いて、機能活性を評価してもよい。簡単に言えば、ヒトインスリン受容体を過剰表現している293HEK細胞をトリプシン処理し、無血清培地SFM脂肪酸のない0.1BSAを含むDMEMを用いて、ポリDリジンコートCostar96ウェルハーフエリア組織培養プレートの60,000細胞/ウェルで平板培養する。その細胞培養プレートをCO2インキュベーター中37°Cで一晩インキュベーションする。抗インスリン受容体A鎖mAb8314キャプチャープレートも、Costar96ウェル黒色ハーフエリアマイクロタイタープレートを使って前の晩に調製し、30μLの抗インスリン受容体A鎖mAb8314Soos,M.A.ら,BiochemJ235:199-2081986、マサチューセッツ州ケンブリッジのアブカム社などから商業的に入手可能を用いて4°Cで一晩処理し、10mM炭酸ナトリウムで1μg/mLに希釈する。結合していないmAb8314を除去するため、mAb8314キャプチャープレートを50mMトリス、pH7.5、150mMのNaClおよび0.1ツイーンTBSTで4度洗浄する。次にTBST中の1BSAを用いて4°Cで1時間を超える間、mAb8314キャプチャープレートをブロックする。ブロッキング後、キャプチャープレートをTBSTで2度洗浄して過剰のBSA溶液を除去する。キャプチャープレートをブロッキング緩衝液に浸漬したら、細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、温度を室温と同じにする。試験化合物をSFMで連続的に希釈する。インスリン受容体の自己リン酸化を刺激するため、希釈したテスト試薬50μLを細胞単層に加える。室温で30分反応させた後、試験化合物を吸引除去し、50μLの2x溶解緩衝液2NP40、100mMトリス、pH7.4、300mMのNaCl、EDTAを含むRocheComplete商標プロテアーゼインヒビターおよび4mMバナジン酸塩を添加することにより、反応を停止させる。溶解緩衝液中、室温で30分反応させた後、30μLの溶解物を30μLのユウロピウムN1抗ホスホチロシンPY20抗体であるEu-N1-Py20PerkinElmerを含むブロックされたキャプチャープレートに移し、10mMのヘペス緩衝液、140mMのNaClおよび0.1ツイーンで50ng/mLに希釈する。この混合液を室温で1時間インキュベーションし、その後TBSTで6度洗浄して、結合しなかったEu-N1-Py20および細胞分解物を除去する。その後10分間、発生するシグナルに合わせて間歇的に振盪しながら、50μLのEnhancementSolutionPerkinElmerでインキュベーションする。リン酸化したインスリン受容体は、時間分解蛍光測定ユウロピウム設定でWallacVictorを用いて定量化する。リン酸化レベルはインスリン100nMの最大刺激用量に対する応答として計算される。インスリン類似体の効力は、用量応答の4パラメーター適合を用いて、EC50用量として計算される。実施例4に記載されるアッセイにおいて、実施例1に記載される方法で調製した、15nM未満のEC50を有するペグ化インスリンリスプロ化合物には、平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物10a、平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9a、平均分子量約30kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9aおよび平均分子量約20kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9bが含まれる。実施例4に記載されるアッセイでは、線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9aのEC50は10.88nMである。約40kDa、約30kDaまたは約20kDaの平均分子量を有する線形mPEG-NPCを用いて実施例2に記載の方法で調製した異種ペグ化インスリンリスプロ生成物も、実施例4に記載のアッセイにおいて15nM未満のEC50を有している。約40kDaの平均分子量を有する線形mPEG-MALを使って調製した化合物8aと約40kDaの平均分子量を有する線形mPEG-MALを使って調製した化合物9aの50対50および70対30の混合物も、実施例4に記載のアッセイにおいて15nM未満のEC50を有している。同じアッセイにおいて、ヒトインスリンとインスリンリスプロのEC50はそれぞれ2.3nMおよび0.7nMである。ペグ化位置B28はhIRインビトロ活性を約10倍から20倍減少させ、これらインスリンリスプロのペグ化種をhIRの弱いアゴニストにしていることを、このデータは示している。更に、これらペグ化インスリンリスプロ種は、測定可能なIGFR-1結合特性を全く有していない。実施例5:1型糖尿病ラットモデルを用いた、ペグ化インスリンリスプロのインビボ効力および薬物動態学的プロフィルの評価試験開始3日前に、10週目のHarlanSprague-Dawley雄ラットHarlan,Indianapolis体重250-280gの尾静脈に0.5Mクエン酸pH4.5中のストレプトゾトシンSTZ45mg/kgを静脈内投与する。試験開始時に、ラットを体重および血糖に基づいて群分けする。この研究には、血糖が400mg/dLと550mg/dLの間のラットだけを含める。試験開始日の朝、試験化合物をいくつかの所定用量の1つでラットに単回皮下注射する。尾静脈から定期的に血液の重複抜き取りを行い、EDTA二ナトリウムを含むチューブに集める。血糖値をグルコメーターで測定する。静脈血試料から血漿も集め、商業用のラットインスリンラジオイムノアッセイを用いて、投与された薬物の血漿濃度を測定する。経時的血糖mgh/dL曲線の下の面積を各ラットについて計算し、それを4パラメーターロジスティック回帰分析に使用してED50を決定する。このアッセイでは、平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9a、平均分子量約30kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9aおよび平均分子量約20kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9bの効力ED50は、典型的な用量応答曲線に基づいて、それぞれ241nmol/kg、138nmol/kgおよび69nmol/kgである。更に、当該化合物は、568nmol/kgの単回皮下注射によって、STZ処置ラットの血糖値を少なくとも36時間、この種のラットにとっては正常なレベル100mg/dL以下にまで低下させることができた。一方、インスリンデテミルは、上記のエッセイにおいて、568nmol/kg単回投与によって血糖値を5-6時間正常化する。薬価パラメーターの評価に加えて、ラットにおける試験化合物の平均薬物動態パラメーター値も重複血液試料を用いて測定する。薬物動態パラメーターは、モデル非依存性の方法WinNonlinProを用いて計算する。得られる薬物動態パラメーター値は、用量の関数として非線形を示す。報告される値の範囲は、テストされる最高用量568nmol/kgと最低用量5.6nmol/kgの間の薬物動態パラメーター値に対応する。平均分子量約20kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9bの薬物動態的結果は、最高濃度に至るまでの時間T最大が6時間から12時間の範囲、見かけのクリアレンス速度CL/Fが0.05L/h/kgから0.14L/h/kgの範囲、見かけの分配量V/Fが0.6L/kgから7.2L/kgの範囲、除去半減期t1/2が8.5時間から34.5時間を示した。平均分子量約30kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9aの薬物動態的結果は、T最大が12時間、CL/Fが0.05L/h/kgから0.13L/h/kgの範囲、V/Fが0.6L/kgから2.0L/kgの範囲、t1/2が8.3時間から11.0時間を示した。平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9aの薬物動態的結果は、T最大が12時間から24時間の範囲、CL/Fが0.06L/h/kgから0.2L/h/kgの範囲、V/Fが1.0L/kgから7.5L/kgの範囲、t1/2が11.1時間から48.5時間を示した。568nmol/kgのインスリンリスプロをSTZ処置雄ラットに同様にして投与すると、測定値は、t1/2が約1時間、CL/Fが約1.2L/h/kgである。18.9nmol/kgから568nmol/kgの範囲のインスリンデテミルをSTZ処置雄ラットに同様にして投与すると、t1/2が1.9時間から3.1時間の範囲、CL/Fが約0.8L/h/kgから1.7L/h/kgの範囲が観察される。デテミルと例示のペグ化インスリンリスプロ化合物の間の見かけのCL比は、薬物動態学的な複雑性の故に、測定に使用される用量によって結果が異なる。しかし、20kDaまたは40kDaのPEGと結合した例示のペグ化インスリンリスプロ化合物は、STZ誘発糖尿病ラットにおいて、見かけのクリアランスがデテミルよりも約5倍から30倍緩慢であることを、実施例5に記載の試験が示している。実施例6:2型糖尿病ラットモデルを用いた、ペグ化インスリンリスプロのインビボ作用期間および薬物動態学的特性の評価40kDa線形PEGを有する化合物9aのグルコダイナミックGlucodynamic活性は、ビヒクル対照PBSまたは平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9a517nmol/kgの単回皮下投与後、雄のZDFfa/faラットn=4ラット/群で評価する。薬物動態特性および薬価特性を評価するため、試料を連続して集める。平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9a517nmol/kgを雄のZDFfa/faラットに単回皮下投与することにより、血糖値が統計学的に有意なレベルまで低下し、それが少なくとも7日間持続した偽薬に対してp<0.05。平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-MALを用いて調製した化合物9aへの曝露も7日間検証可能である。実施例7:コバルトイオンの存在下でフェノールを含むPEG-B2892.4A17.6インスリンリスプロ、インスリンリスプロまたはその混合物70PEG20kDaB2892.4A17.6インスリンリスプロ対30インスリンリスプロのフェノール系防腐剤滴定PEG20kDaB2892.4A17.6インスリンリスプロまたはインスリンリスプロを、20mMのKSCNおよび50mMのトリスClO4を含む溶液にpH8.0で溶解する。上記蛋白質の標的濃度は、蛋白質含有量ε280=1.05mg/mL-1cm-1に基づいて約4mg/mLである。塩化コバルト41.9mgを水1mLで溶解し、コバルトイオン濃度0.176Mの原液を得る。コバルトイオン対インスリン6量体の最終モル比が4になるように、コバルト原液のアリコート蛋白質の濃度によって異なるが、約2μLを0.8mLの蛋白質溶液に添加する。6量体化を評価するため、コバルト配位化学における歪みをフェノール系防腐剤濃度の関数として574nmでモニターした。具体的には、滴定終了時点での最終容量が0.84mLを超えないように、濃縮フェノール溶液0.564Mをマイクロリットルアリコート用いて、蛋白質溶液0.8mLを滴定する。フェノールの各アリコートと400nmから800nmまでの可視スペクトルの溶液を集めた後、最終溶液を最低20分間攪拌する。574nmで記録した吸光度は、HISB10配位結合コバルトモル濃度、すなわちインスリン6量体のHISB10部分は二価の金属イオン2つと配位結合するという知識に基づいて6量体蛋白質濃度掛ける2でその吸光度を割ることによって、モル吸光係数に変換する。PEG20kDaB2892.4A17.6インスリンリスプロとインスリンリスプロの70/30モル対モル混合製剤を調製するには、蛋白質をまず混合し、次にコバルトを添加し、それからフェノール系防腐剤で滴定する。インスリンリスプロでは、天然の配列であるB28の位置のプロリンとB29の位置のリジンが、野生型のヒトインスリンと比較して逆転している。この逆転によりB鎖のC末端で立体配座的な移動が生じ、その結果、2量体を形成するリスプロインスリン単量体の能力が立体的に妨害される。従って、2量体会合定数が野生型ヒトインスリンの2量体会合定数と比べて300倍減少する。驚いたことにかつ予想外にも、表1に示されるように、野生型のヒトインスリンと比べて既に脆弱化しているインスリンリスプロの2量体化ドメインの近くで6つの20kDaPEG部分が結合しているにもかかわらず、PEG20kDaB2892.4A17.6インスリンリスプロは、Humalog登録商標で使用される調剤条件と類似の条件で、二価の金属イオンおよびフェノール系防腐剤の存在下、6量体の複合体として会合することを結果が示している。更に、PEG20kDaB2892.4A17.6インスリンリスプロとインスリンリスプロの70/30混合物も6量体の複合体を形成する能力が証明されており、基礎インスリンおよび迅速に作用するインスリンの予備混合製剤を即座に、および/または安定して調製できることをこの事実は支持している。表I実施例8:亜鉛、フェノールおよび/またはカルシウムと共に製剤されたPEG20kDaB2892.4/A17.6インスリンリスプロの6量体状態の分析インスリンおよび特定のインスリン類似体の化学的貯蔵安定性および使用時安定性は、溶液中で個別の6量体複合体を形成する能力によって促進される。二価の金属イオンZn2またはCo2およびフェノール系防腐剤フェノールまたはm-クレゾールの存在下でインスリンまたはインスリンリスプロを6量体化する能力は、AsnA21の脱アミド化を遅らせ、その結果、高分子量の粒子HMWPの形成を最小限に抑える。PEG20kDa-LysB28インスリンリスプロが6量体を形成する能力を評価するため、A276nm=8.6mgインスリンリスプロ/mLまたは38.2mgペグ化インスリンリスプロコンジュゲート/mLに基づく最初の蛋白質濃度を有する、PEG20kDaB2892.4/A17.6インスリンリスプロをpH6.7で一晩、水中で透析する。次に、透析した蛋白質を水で希釈して、蛋白質濃度を4.6mg/mLまたは20.6mgのペグ化蛋白質コンジュゲート/mLに調整する。4x緩衝液原液をpH7.0で調製する。リン酸塩緩衝液の最終濃度は40mM、m-クレゾールの最終濃度は12.8mg/mLとする。酸化亜鉛原液は酸化亜鉛を1NのHCl0.5mLに溶解し、次に水で希釈することにより調製し、最終亜鉛濃度を0.097Mとする。蛋白質濃度4.6mg/mLのPEG20kDaB2892.4/A17.6インスリン450μLを亜鉛原液のアリコート添加される亜鉛原液の最大全容量=2.5μL、またはPEG20kDaB2892.4/A17.6インスリン6量体当たり4亜鉛イオンに相当する量および4xリン酸塩緩衝液原液150μLと混合することにより、種々の亜鉛濃度0μMから400μMを有する、近UV円偏光二色性CD分析用の溶液試料を調製する。最終pHは、必要に応じてpH約7.0に調整する。PEG20kDaB2896/A14インスリンリスプロまたはインスリンリスプロの6量体会合を、0.2cmセルを用いて、近UV円偏光二色性により、ジスルフィド変化に感応性の高い250nmでモニターする。平均残基楕円率をモル6量体当たりのモル亜鉛の比率に対してプロットする。驚いたことにかつ予想外にも、表IIに示されるように、野生型のヒトインスリンと比べて既に脆弱化しているインスリンリスプロの2量体化ドメインの近くで6つの20kDaPEG部分が結合しているにもかかわらず、PEG20kDaB2892.4/A17.6インスリンは、Humalog登録商標の調剤条件と類似の条件で、二価の金属イオンおよびフェノール系防腐剤の存在下、6量体の複合体として会合することを結果が更に示している。6量体促進テスト製剤において、6量体化およびリガンド結合がPEG20kDaB2892.4/A17.6インスリンの熱安定性に及ぼす影響についても、CD熱変性実験で調べた。全体的な信号変化はZn2結合試験で使用した250nmよりも240nmの方が大きかったが、全溶液吸光度が高品質のCDデータが得られるほど十分低かったので、熱変性試験で用いた波長は240nmであった。1mmのキュベット中、240nmにおける熱スキャンデータを5°Cから約95°Cの間で集めた最終温度は試料間でわずかな違いがあった。スキャン速度およびデータピッチは1°C/分、周波数帯域幅は1.5nm、応答時間は8秒であった。熱変性データは、生信号240nmにおける1000分の1度単位およびFunfT=[YobsT-YnatT]/[YunfT-YnatT]の式で与えられる見かけの変性割合Funfの両方としてプロットしてよい。式中、YobsTは温度の関数として観察される信号であり、YnatTおよびYunfTは、それぞれ未変性ベースラインおよび変性ベースラインの直線的外挿値である。変性開始温度は、Funfが未変性ベースラインFunf=0から増加し始める温度として定義され、中間温度はFunf=0.5の温度である。本質的に上述の方法で行われるCD熱変性実験が示すところによれば、PEG20kDaB2892.4/A17.6インスリン6量体とインスリンリスプロ6量体を16mMトリス、pH7.2、3.1mg/mLのm-クレゾールおよび亜鉛で同様に製剤した場合、前者の熱安定性は後者の熱安定性よりも実質的に減少した。更に、上述のCD熱変性試験は、PEG20kDaB2892.4/A17.6インスリンリスプロの融点がカルシウムと塩化物イオンの濃度に依存して有意に上昇することも見出したデータ省略。具体的には、変性開始温度は16mMトリス、pH7.2、3.1mg/mLのm-クレゾールおよび亜鉛中では約30°Cであるが、75mM塩化カルシウムを含む同じ製剤中では劇的に約50°Cまで上昇する。製剤に塩化カルシウムの代わりにNaCl25mMから150mMのNaClを加えた場合も同様の効果が観察された。従って、PEG20kDaB28インスリンリスプロ化合物を含む医薬組成物において、カルシウムおよび/または塩化物は非常に有効な6量体促進賦形剤であり、貯蔵中に当該医薬組成物の化学的および/または物理的安定性を増大する効果があろう。表II:亜鉛/6量体比の関数としての平均残基楕円率MRE変動実施例9:PEG20kDaB28約95/A1約5インスリンリスプロの生成150mMの第二リン酸ナトリウムおよび50mMのEDTAを含む緩衝液を約4°Cから約6°Cで150mMの第三リン酸ナトリウムと混合し、10.85と11.10の間のpHを持つ緩衝液を得る。インスリンリスプロ結晶30-60mg/mLを約4°Cから約6°Cで緩衝液に徐々に添加し、結晶溶解中に凝集物の形成が生じるのを避けるため穏和に攪拌する。重量平均分子量約20kDa/-約2kDaのPEGを有するモノメトキシポリエチレングリコールp-ニトロフェニルカーボネートmPEG-NPCを60mg/mLから120mg/mLの濃度で、冷水4-6°Cに溶解する。その場合、必要量の冷水を容器に入れ、攪拌して渦流を作り、適切かつ急速な分散が起きるように、mPEG-NPCを渦流の眼に徐々に注ぐ。mPEG-NPC粉末は細かい粉末であり、分散させるとかなりの量の気泡が容器中に放出される。容器中のmPEG-NPC溶液は、容量に応じて30分間から60分間脱泡する。上記の方法で調製したインスリンリスプロ溶液は機械的攪拌用の冷却塔付き容器に移す。その容器には温度とpH測定用の装置が備わっている。攪拌は、レイノルズ数に基づいて乱流部分で操作される標準回転翼を用いて行う。mPEG-NPCPEG溶液は、全PEG添加時間が3時間から5時間になる速度で、容器中で測定する。冷却塔の温度は4°Cから6°Cに維持し、混合は継続して行う。反応液のpHは、必要量の150mM第三リン酸ナトリウムを添加することにより、10.85から11.10の間に維持する。PEG対インスリンリスプロの最終モル比が2.5から4.5の範囲になるまで、PEGを添加する。PEG添加の終了時点で、冷却塔の温度を60分以内に25°Cから30°Cに上昇させ、pHを約10.7から約11.0に維持しながら、反応混合物をその温度で約3時間から約6時間インキュベーションする。インキュベーション期間の終了時点で、2x緩衝液100mM酢酸/酢酸ナトリウム、pH4.0を添加することにより反応混合物をクエンチし、同じ2X緩衝液で希釈することにより伝導率2.5mS/cmおよび濃度3-5mg/mLを調節する。反応混合物は、適切な樹脂高速流通SPセファロース樹脂などを充填した陽イオン交換クロマトグラフィCEXカラムを使って精製する。樹脂は層高約15cmから約30cmになるまでカラムに充填し、100mMの酢酸ナトリウム緩衝液Aで平衡化し、希釈した反応混合物生成物5-8g/樹脂Lを低いpH約2.5から約4.0かつ適切な流速約50cm/時間から約90cm/時間で充填する。モノペグ化生成物および未反応の蛋白質が樹脂上で選択的に結合するが、マルチペグ化した副生成物および過剰の試薬のほとんどはカラムを通過する。希釈した塩濃度20-30mMの緩衝液Aを用いて弱く吸着したマルチペグ化副生成物を洗い流し、次に塩濃度の高い50-70mM緩衝液8-12CVを使った勾配溶出によってペグ化生成物を樹脂から優先的に除去すると同時に、未反応の蛋白質はカラムに残ったままになる。生成物を集め3-5CV、カラムは塩濃度の高い100mM緩衝液Aで洗浄して未反応の蛋白質を除去する。3-5mg/mLのCEXカラム主流3-5CVは、接線流濾過により、標準のフラットシート膜3-5kDa分子量カットオフを用いて40-80mg/mLまで濃縮する。この工程は、初期濃度を経て、緩衝液を交換し、目的の最終濃度まで行われる。操作フラックスは、工程中ずっと10-20L/m2フィルター面積/時間LMHに維持し、膜間差圧TMPは約15psiから約35psiに維持する。最終濃度のバルク活性医薬成分溶液は、適切な温度-20°Cから-70°Cで凍結させ、適切な温度-20°Cから-70°Cで保存する。実施例10:イヌにおけるペグ化インスリンリスプロの薬物動態学的プロフィル2歳から4歳の雌のビーグル犬体重7-10kgに、例示の試験化合物18.9nmol/kgを皮下投与する。血液試料を定期的に腕頭静脈または伏在静脈から得て、それをEDTA二ナトリウムを含むチューブに集める。血漿を静脈血サンプリングで集め、商業用のインスリンラジオイムノアッセイを用いて血漿中の投与薬の濃度を測定する。本質的に実施例2に記載した方法で調製した例示化合物である、平均分子量約40kDa、約30kDaおよび約20kDaを有する線形mPEG-NPCを用いて調製した化合物11の各々について、薬物動態学的プロフィルおよびパラメーターを決定した。薬物動態学的パラメーターは、モデル非依存性の方法WinNonlinProを用いて計算した。平均分子量約20kDaを有する線形mPEG-NPCを用いて調製した化合物11は、最高濃度に至るまでの時間T最大が約12時間、見かけのクリアレンス速度CL/Fが約0.046L/h/kg、最大濃度C最大が約14nM、除去半減期t1/2が約14時間を示した。平均分子量約30kDaを有する線形mPEG-NPCを用いて調製した化合物11は、T最大が約24時間、CL/Fが約0.027L/h/kg、C最大が約18nM、t1/2が約23時間を示した。平均分子量約40kDaを有する線形mPEG-NPCを用いて調製した化合物11は、T最大が約24時間、CL/Fが約0.026L/h/kg、C最大が約15nM、t1/2が約20時間を示した。インスリンデテミルも同様に18.9nmol/kgを雌のビーグル犬に投与し、T最大が約1.3時間、CL/Fが約0.12L/h/kg、C最大が約23nM、t1/2が約3.5時間を示した。表IIIはイヌにおける比較パラメーターを示す。この試験に使用したインスリン特異的なRIAは、ペグ化インスリンリスプロと内生的インスリンの両方を検出する。表III:イヌにおけるペグ化インスリンリスプロのPKパラメーター18.9nmol/kg皮下投与、n=3/群実施例11:ヒトにおける平均平坦化および用量の推定改善された基礎インスリン療法の主要な基準は、患者への1日1回の投与に適した、真に平坦なプロフィルを達成する能力である。十分な平坦さはピーク/トラフPT比が2未満の場合であると定義される。比較目的で述べると、公表されているPKプロフィルに基づいて計算したPT比は、デテミルで約4から9、グラルギンで約1.2から2.6である。18.9nmol/kgの例示化合物および同量のインスリンデテミルに関するラットとイヌのPKデータそれぞれ実施例5および10を参照は1-CMTPKモデルに適合させ、ka、CL/FおよびV/Fのパラメーターで表示した。次に各PKパラメーターを相対成長式P=aBWbに適合させる。式中、bはka、CL/FおよびV/Fに関して各々-0.25、0.75および1に固定し、aは適合パラメーターである。ヒト平均推定値を各PKパラメーターについて取得し、ヒトに1日量を投与後、シミュレーションは平均プロフィルを生成した。30kDaおよび40kDaペグ化インスリンリスプロコンジュゲートは類似しているので、シミュレーションは20kDaペグ化インスリンリスプロ、40kDaペグ化インスリンリスプロおよびインスリンデテミルだけを示してある。20kDaおよび40kDaペグ化インスリンリスプロ化合物のピーク/トラフPT比は、インスリンデテミルのピーク/トラフPT比よりも劇的に平坦であることを、生成されたシミュレーションが示している。図1はシミュレーションの結果を示す。効能に要求されるペグ化インスリンリスプロのヒト用量を推定するストラテジーは、ラットモデルにおけるペグ化インスリンリスプロとインスリンデテミルとの間の相対効力が臨床における相対効力と類似しているという推定の下に、既知の臨床コンパレーターインスリンデテミルをラット効能モデルの内部対照として用いることである。臨床におけるペグ化インスリンリスプロの1日必要量は、以下の式を用いて計算できる。表IVは各ペグ化インスリンリスプロコンジュゲートの相対効力比を示してある。表Vは、ラット、イヌおよびヒト推定における例示ペグ化インスリンリスプロ対デテミルの見かけの相対クリアランス比を示してある。表IV:ラットにおけるペグ化インスリンリスプロコンジュゲートおよびインスリンデテミルの相対濃度ベース効力表V:インスリンデテミル対ペグ化インスリンリスプロ化合物の相対CL/F比表IVの相対効力推定および表Vの相対CL/F推定を用いると、ヒトにおけるペグ化インスリンリスプロコンジュゲートの平均用量推定値は、20kDaペグ化インスリンリスプロ化合物と40kDaペグ化インスリンリスプロ化合物に関して、それぞれ4.2nmol/kgおよび6.9nmol/kgである。かかる推定値は、2型糖尿病患者に関してデテミルのラベルに記載されている臨床平均1日量18.5nmol/kgのインスリンデテミルに基づいている。時間作用および効力の両方を考慮した場合、臨床最大平均投与推定量はインスリンデテミルよりも約3倍低い。最善のケースでは、20kDaペグ化インスリンリスプロコンジュゲート、30kDaペグ化インスリンリスプロコンジュゲートおよび40kDaペグ化インスリンリスプロコンジュゲートの臨床平均投与推定量は、インスリンデテミルよりも約20倍および約45倍低い。実施例12:PEG20kDaB28約95以上/A1約5以下インスリンリスプロおよびグラルギンを健康なボランティアに単回投与した後のグルコース注入速度本質的に実施例9に記載の方法で調製したPEG20kDaB28約95以上/A1約5以下インスリンリスプロLYの単回用量を用いて、3部分からなる最初のヒト用量試験を行った。パートAは3つの試験期間からなり、第1期間で被験者にはLY用量が皮下SC注射され、第2期間でインスリングラルギン用量0.5U/kgが注射され、第3期間で別のLY用量が注射された。パートBは非盲検、単回用量、2回の反復期間試験で、被験者には24時間および36時間のグルコースクランプ法を用いて、両期間ともLYの単回用量が投与された。パートCは非盲検、2期間、単回用量、一定のシーケンス、コンパレーター制御試験で、第1期間で被験者にはLYのSC用量0.5mg/kgが単回投与され、第2期間ではインスリングラルギンのSC用量0.8U/kgが単回投与された。被験者にはパートAとパートCの各期間で24時間のグルコースクランプ法が施され、パートBの各期間ではより長い期間36時間までグルコースクランプ法が施された。パートA、BおよびCにおいて、LYは以下のような単回用量が皮下投与された。パートA用量:0.0025、0.0125、0.075、0.325mg/体重kgパートB用量:0.15、0.225mg/kgパートC用量:0.5mg/kg被験者には、ペグ化インスリンリスプロ化合物の単回用量またはコンパレーターとしてインスリングラルギンの単回用量0.5U/kg、そして第3期間にLYの別の単回用量が投与される。全ての治療期間で、各インスリン化合物の注射後、被験者にはオイグリセミッククランプ法を最高24/36時間施す。インスリン作用のグルコダイナミックGD尺度を提供する立証済みの経時的GIRを参考にして、グルコース注入速度GIRを正常血糖を維持するように調節する。オイグリセミックグルコースクランプ法の狙いは、インスリン化合物の用量を投与後、グルコース注入期間中ずっと、正常血糖が維持されることである。ここでは、内因性のインスリン分泌および肝グルコース産生が最少であり、グルコーススペースから輸送されるグルコースすなわち代謝されたグルコースは全て投与された外因性インスリンの直接の結果であることが想定されている。この場合のGIRは、経時的なインスリン作用のGD尺度となる。グルコースクランプ試験は全て、一晩約8時間の絶食後行われる。試験日の朝、容量ポンプの制御下で20デキストロース溶液緩衝液でpHを中性近くに調整を投与する目的で、小さいカテーテルを1本の腕理想的には肘窩の静脈に挿入する。静脈グルコース採取のため、別のカテーテルを理想的には手首または手に挿入する。動脈血化した静脈血を採取するため、その部分を加熱装置で約55-60°Cに加熱する。血液試料をベッドサイドで採取し、自動グルコースオキシダーゼ法を用いて直ちに全血中グルコース濃度を測定する。基礎血液採取および約30分間の安定期間の後、各被験者にインスリン化合物の用量が皮下投与される。インスリン化合物の皮下投与開始を時間ゼロと定義する。インスリン投与完了後、血糖を測定するために頻繁に血液を採取しながら、最高24時間または36時間正常血糖を維持するため、グルコースを種々の速度で静脈内に注入する。血液採取は、投与前約30分間約10分ごとに行い、投与後最初の2時間、5-10分ずつ継続任意に、2.5分ずつの頻度で採取してもよいし、その後クランプの最後まで10-30分間隔に頻度を下げる。グルコースクランプ中、グルコース注入速度を調節して、個々の被験者の所定標的血糖濃度を維持する。標的濃度は空腹時血糖値に近い値が好ましい。グルコースクランプの狙いは、投与前標的値空腹時平均血糖値よりも5mg/dL下回る値として定義されるの5内に血糖濃度を維持することである。従って、GIRは変動しても、血糖濃度は一定に保たれる。だから、変動するグルコース注入速度は、試験インスリン化合物の活性を反映している。試料の血糖値および注入速度がクランプ中変動することは立証済みである。本質的に実施例12に記載の方法で行われた試験は、LYが理想的な基礎インスリンであり、作用期間が長く、見かけの半減期が24時間と44時間の範囲にあり、基礎特性すなわちピーク/トロフ比が2未満図2であるという特徴を有することを、ヒトにおいて実証した。更に、LYの作用期間はインスリングラルギンの作用期間よりも長い図2。グルコダイナミックスにおける被験者内変動は30未満データ省略であり、これはグラルギンと同等またはそれよりも優れている。最後に、試験のパートC0.5mg/kgからのグルコダイナミックGDデータは、LYのGIRプロフィルをピークなしと示し、36時間を超える期間GDを維持し、グラルギンのピークGIR応答0.5U/kg、データ省略を凌駕した。実施例13:PEG20kDaB28約95/A1約5インスリンリスプロ医薬組成物の化学的および物理的安定性実施例7および8で上述したように、PEG20kDaB28約95/A1約5インスリンリスプロは、Humalog登録商標と類似の製剤条件において、二価の金属イオンおよびフェノール系防腐剤の存在下、6量体複合体として会合できる。従って、インスリンリスプロの商業用溶液製剤すなわちHumalog登録商標溶液製剤と類似のPEG20kDaB28インスリンリスプロ製剤に関して、化学的安定試験および物理的安定試験が行われた。試験対象の医薬製剤の化学的安定性は、指示された貯蔵期間中、様々な温度において、最初の時点と有意に異なる変化が種々の分析特性で検出されない場合、許容可能であると見なされる。試験対象の医薬製剤の物理的安定性は、視覚評価において粒子が全く観察されず、チオフラビンT蛍光顕微鏡検査法による検査でフィブリルやゲル形成が観察されない場合に、許容可能であると見なされる。PEG20kDaB28インスリンリスプロ1モル当たり0.5モルの亜鉛、16mg/mLのグリセリンおよび3.15mg/mLのm-クレゾールリン酸塩緩衝液またはクエン酸塩緩衝液でそれぞれpH7.0またはpH6.5に調整を含むPEG20kDaB28インスリンリスプロ製剤を調製し、化学的安定性および物理的安定性の両方を試験した。安定性への亜鉛の影響を評価するため、亜鉛を含まない類似の製剤も試験した。35°Cの試料は約1ヶ月間貯蔵後ゲル粒子を形成し、25°Cの試料は約2ヶ月の貯蔵後有意な数の粒子および気泡を形成した。視覚的評価ではクエン酸塩緩衝液の試料の方がリン酸塩緩衝液の試料よりもひどいように見えたが、クエン酸塩緩衝液とリン酸塩緩衝液の両方並びに亜鉛を含む製剤と亜鉛を含まない製剤の両方が、35°Cの加速条件で類似の化学的/物理的安定性を示した。インスリンリスプロ対照製剤は透明であった。クエン酸塩緩衝液とリン酸塩緩衝液の両方が、5°Cで少なくとも13ヶ月間、許容可能な化学的安定性を示した。その後の調査では、フェノール系防腐剤であるm-クレゾールは、高温>25°Cに曝されたPEG20kDaB28インスリンリスプロと組み合わせた場合、ゲル化を促進することが示された。興味深いことに、m-クレゾールをmPEGだけ活性化しているか否かに関係なくに添加した場合、高温に曝しても、ゲル粒子は生じなかった。インスリンリスプロの基本的調剤方法では、高温でPEG20kDaB28インスリンリスプロ化合物に許容可能な安定性が与えられなかったので、PEG20kDaB28約95/A1約5インスリンリスプロ化合物を含み、改善された化学的および物理的安定性を示し、非経口的に投与される医薬組成物として商業化に適した医薬組成物を開発した。PEG20kDaB28約95/A1約5インスリンリスプロ15mg/mLの以下の製剤は、40°Cで1週間、30°Cで1ヶ月、25°Cで3ヶ月および5°Cで8ヶ月以上、化学的および物理的に許容可能な安定性を示した。116mMのトリス緩衝液、pH7.0-8.0、10mMの塩化カルシウム、20mg/mLの砂糖ショ糖またはトレハロース、3mg/mL28mMのm-クレゾールおよびPEG20kDaB28約95/A1約5インスリンリスプロ1.0モル当たり0.5モルの亜鉛。216mMのトリス緩衝液、pH7.0-8.0、10mMの塩化カルシウム、3mg/mLのポロキサマー、3mg/mL28mMのm-クレゾールおよびPEG20kDaB28約95/A1約5インスリンリスプロ1.0モル当たり0.5モルの亜鉛。35mMのリン酸塩緩衝液、pH7.0、130mMのグリセリン、3mg/mL28mMのm-クレゾール、3mg/mLのポロキサマーおよびPEG20kDaB28約95/A1約5インスリンリスプロ1.0モル当たり0.3モルの亜鉛。亜鉛、m-クレゾール、カルシウムなどの6量体促進賦形剤を含むPEG20kDaB28約95/A1約5インスリンリスプロ製剤は、一般的に、物理的および化学的に高い安定性を示す。特に高温状態ではそうである。亜鉛およびm-クレゾールを含むPEG20kDaB28約95/A1約5インスリンリスプロ製剤にカルシウム、塩化物および/またはNaClを添加すると、40°C以上の温度に曝された製剤の物理的安定性が更に向上する。更に、リン酸塩緩衝液およびクエン酸塩緩衝液を用いた製剤は、一般的に、トリス緩衝液を用いた製剤よりも物理的安定性が低かった。"