マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体からなる、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫誘導調節用アジュバント。本発明の課題は、マラリア感染における宿主とマラリア原虫の相互作用を解明し、該知見により、マラリア感染症の診断のための、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾインHemozoin:HZの誘導を利用したマラリア感染症の検出測定方法、該検出測定法を用いたマラリア感染症のワクチン及びマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法、及び該HZ又は合成HZ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いる自然免疫誘導の調節手段等を提供することにある。赤血球内のマラリア原虫は、宿主ヘモグロビンを、ヘモゾインHZとして知られる疎水性ヘムポリマーhydrophobichemepolymerに消化し、かかるポリマーはその後血流に放出され、細網内皮系で捕獲され、そこに蓄積される。本発明者は、マラリア原虫-宿主間の相互作用について、HZが自然免疫を活性化する免疫反応のメカニズムを分子レベルで解明すべく研究する中で、ヒト熱帯熱マラリア原虫の該ヘム代謝産物であるHZが自然免疫の受容体であるToll様受容体9TLR9を強く刺激する新規のリガンドであることを見い出した。すなわち、Pfalciparumから精製したHZが、インビトロ、インビボの両方でTLR9を介し、MyD88に依存するマウス免疫細胞を活性化することを見い出した。そして、この活性化は、公知の抗マラリア薬であるクロロキンにより阻害されることを確認した。そして、これらの知見に基いて本発明者は、該HZの誘導による、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫活性を検出測定することにより、マラリア感染症の検出測定を行なうことが可能であり、該マラリア感染症の検出測定をマラリア感染症の診断のために用いることが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。また、該HZの誘導による自然免疫活性の検出測定によるマラリア感染症の検出測定方法を用いて、マラリア感染症のワクチン或いはマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニングを行うことが可能であることを見い出し、本発明をなした。更に、上記知見に基いて、HZ又は合成HZ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いて、HZの誘導によるTLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫誘導の調節を行うことが可能であることを見い出した。すなわち、ヘモゾインが、TLR9-MyD88依存経路を経由して、Th1を誘導する選択的な免疫応答制御活性化効果を持つリガンドであり、他のTLRファミリーや非MyD88依存経路であるTRIF依存経路を活性化しないことを初めて実証した。本発明は以上の知見により完成するに至ったものである。すなわち本発明は、1マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン誘導による、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫活性を検出測定することを特徴とするマラリア感染症の検出測定方法や、2ヘモゾイン誘導による、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫活性の検出測定が、ヘモゾインによる、TLR9を介し、MyD88に依存する免疫細胞の活性化であることを特徴とする前記1記載のマラリア感染症の検出測定方法や、3ヘモゾイン誘導による、TLR9を介し、MyD88に依存する免疫細胞の活性化の検出測定が、ヘモゾインの誘導による免疫細胞のサイトカインの産生の検出測定であることを特徴とする前記2記載のマラリア感染症の検出測定方法や、4ヘモゾインの誘導による免疫細胞のサイトカインの産生の検出測定が、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-6、及びIFNαのいずれか1以上のサイトカインの産生の検出測定であることを特徴とする前記3記載のマラリア感染症の検出測定方法や、5TLR9を介し、MyD88に依存する免疫細胞の活性化が、TLR9を介し、MyD88に依存する脾臓細胞又は樹状細胞の活性化であることを特徴とする前記2~4のいずれか記載のマラリア感染症の検出測定方法や、6前記1~5のいずれか記載のマラリア感染症の検出測定方法を、被検ワクチンの評価方法として用いることを特徴とするマラリア感染症のワクチンのスクリーニング又は品質検査方法や、7被検物質の存在下、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体の誘導による、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫活性を検出測定することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、8TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫活性を検出測定する方法が、前記2~5のいずれか記載のTLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫活性の測定方法であることを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。また本発明は、9マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体からなる、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫誘導調節用アジュバントや、10マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体を活性成分とする、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫誘導用免疫賦活剤からなる。また本発明は、11MyD88/及びTLR9/の非ヒト動物に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量と、MyD88-/-及び/又はTLR9-/-の非ヒト動物に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量とを測定評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、12非ヒト動物におけるサイトカインの産生量を、非ヒト動物における血清サイトカインの量としてELISAにより測定することを特徴とする前記11に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、13非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする前記11又は12に記載のスクリーニング方法や、14MyD88/及びTLR9/の遺伝子が発現している細胞に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量と、MyD88-/-及び/又はTLR9-/-の遺伝子が発現している細胞に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量とを比較評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、15細胞が、脾臓細胞又は樹状細胞であることを特徴とする前記14に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、16細胞におけるサイトカインの産生量を、細胞の培養上澄中のサイトカインの量としてELISAにより測定することを特徴とする前記14又は15に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、17サイトカインの産生量の測定が、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-6、及びIFNαのいずれか1以上のサイトカインの産生量の測定であることを特徴とする前記11~16のいずれかに記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。また本発明は、18ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体からなるリガンドに対する、以下のa又はbに記載のタンパク質の受容体としての使用方法や、a配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;b配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質;19タンパク質が、配列番号1に示される塩基配列又はその相補的配列を含むDNAにコードされることを特徴とする前記18に記載の使用方法や、20タンパク質が、配列番号1に示される塩基配列又はその相補的配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされることを特徴とする前記18記載の使用方法や、21以下のa又はbに記載の受容体タンパク質に対する、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体のリガンドとしての使用方法や、a配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;b配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質;22タンパク質が、配列番号1に示される塩基配列又はその相補的配列を含むDNAにコードされることを特徴とする前記21に記載の使用方法や、23タンパク質が、配列番号1に示される塩基配列又はその相補的配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつヘモゾインに対して反応性を有するタンパク質であることを特徴とする前記21記載の使用方法に関する。また本発明は、24ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有することを特徴とするTLR9作動剤や、25MyD88を活性化することを特徴とする前記24記載のTLR9作動剤や、26TLR-MyD88依存経路による免疫応答を誘導することを特徴とする前記25記載のTLR9作動剤や、27TLR-MyD88依存経路による免疫応答が、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-6、及びIFNαのいずれか1以上のサイトカインの産生であることを特徴とする前記26記載のTLR9作動剤や、28TLR9を選択的に活性化することを特徴とする前記24~27のいずれか記載のTLR9作動剤や、29TLR2、TLR4、TLR7、TRIFを活性化しないことを特徴とする前記28記載のTLR9作動剤や、30自然免疫制御剤として用いられることを特徴とする前記24~29のいずれか記載のTLR9作動剤に関する。また本発明は、31ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体をTLR9のリガンドとして使用する方法や、32TLR9-MyD88依存経路による免疫応答を誘導させる方法を含むことを特徴とする前記31記載の使用する方法や、33TLR-MyD88依存経路による免疫応答が、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-6、及びIFNαのいずれか1以上のサイトカインの産生であることを特徴とする前記32記載の使用する方法や、34自然免疫の制御方法を含むことを特徴とする前記31~33のいずれか記載の使用する方法に関する。本発明は、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのHZ誘導による、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫活性を検出測定することによりマラリア感染症の検出測定を行う方法よりなるものである。本発明において、HZ誘導による自然免疫活性の検出測定には、脾臓細胞又は樹状細胞のような免疫細胞のHZによる、TLR9を介し、MyD88に依存する活性化の状況を検出測定することにより行うことができる。該HZによる、TLR9を介し、MyD88に依存する活性化の検出測定は、HZの誘導による免疫細胞のサイトカインの産生を検出測定することにより行うことができる。該サイトカインの産生の検出測定としては、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-6、及びIFNαのいずれか1以上のサイトカインの産生の検出測定により行うことができる。該サイトカインの産生の検出測定には、サイトカインELISA法のような公知のサイトカインの検出測定法を用いることができる。本発明のマラリア感染症の検出測定方法により、マラリア感染症の診断を行うことが可能である。また本発明は、本発明のHZ誘導によるマラリア感染症の検出測定方法を、被検ワクチンの評価方法として用い、マラリア感染症のワクチンのスクリーニング方法又は検査方法として用いることからなる。該ワクチンのスクリーニング又は検査方法は、ワクチンの開発或いは開発したワクチンの製造に際しての検査等における被検ワクチンの評価方法として用いることができる。更に、本発明は、本発明のマラリア感染症の検出測定方法を、マラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法として用いることよりなる。該スクリーニング方法は、被検物質の存在下、HZ又は合成HZ或いはその誘導体の誘導による、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫活性を検出測定する本発明の方法により行うことができる。また、本発明は、本発明においてTLR9の新規リガンドとして見い出されたHZ又は合成HZ或いはその誘導体を、自然免疫誘導調節用アジュバントとして、或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤として用いることよりなる。HZ又は合成HZ或いはその誘導体を自然免疫誘導調節用アジュバント或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤として用いることにより、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫誘導の調節を行うことができる。本発明において、HZは不溶性クリスタロイド構造は、Pfalciparumで感染した赤血球から精製する方法で調製することができるInfectImmun70393939432002ProcNatlAcadSciUSA9311865118701996ProcNatlAcadSciUSA883253291991。また、合成HZβヘマチンは、酢酸処理及びアルカリ炭酸水素塩洗浄に基づくJaramilloetalのプロトコールJImmunol17231013110を用いて精製し、製造することができる。自然免疫誘導調節用アジュバント或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤の利用は、いずれも公知の利用形態にしたがって行うことができる。また本発明は、野生型マウス等のMyD88/及びTLR9/の非ヒト動物に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量と、MyD88-/-及び/又はTLR9-/-の非ヒト動物に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量とを測定評価するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、MyD88/及びTLR9/の遺伝子が発現している脾臓細胞、樹状細胞等の細胞に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量と、MyD88-/-及び/又はTLR9-/-の遺伝子が発現している細胞に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量とを比較評価するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関し、上記サイトカインとしては、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-6、IFNα等を例示することができ、また、上記非ヒト動物におけるサイトカインの産生量は、非ヒト動物における血清サイトカインの量としてELISAにより測定することができ、細胞におけるサイトカインの産生量は、細胞の培養上澄中のサイトカインの量としてELISAにより測定することができる。そして、MyD88-/-マウスやMyD88-/-の遺伝子が発現している細胞はWO00/41561号公報に記載の方法により、TLR9-/-マウスやTLR9-/-の遺伝子が発現している細胞は特開2002-34565号公報に記載の方法により調製することができる。また本発明は、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体からなるリガンドに対する、a配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;又はb配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質;の受容体としての使用方法に関する。上記タンパク質としては、配列番号1に示される塩基配列又はその相補的配列を含むDNAにコードされるタンパク質;配列番号1に示される塩基配列又はその相補的配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質;を用いることができる。ここで、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、50~70以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である65°C、1×SSC、0.1SDS、又は0.1×SSC、0.1SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。上記本発明の使用方法の具体的態様としては、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体誘導による、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫活性を検出測定するマラリア感染症の検出測定方法や、マラリア感染症のワクチンのスクリーニング又は品質検査方法や、ヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体の誘導による、TLR9を介し、MyD88に依存する自然免疫活性を検出測定するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、MyD88/及びTLR9/の非ヒト動物に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量と、MyD88-/-及び/又はTLR9-/-の非ヒト動物に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量とを測定評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、MyD88/及びTLR9/の遺伝子が発現している細胞に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量と、MyD88-/-及び/又はTLR9-/-の遺伝子が発現している細胞に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量とを比較評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、TLR9-MyD88依存経路による免疫応答誘導のメカニズムを解明する方法等を挙げることができる。また本発明は、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有する、TLR9と相互作用して全活性の細胞内シグナル伝達を引き起こす物質であるTLR9作動剤アゴニストに関し、かかるTLR9作動剤は、MyD88を活性化することや、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-6、及びIFNαのいずれか1以上のサイトカインの産生等を伴うTLR-MyD88依存経路による免疫応答を誘導することや、TLR2、TLR4、TLR7、TRIFを活性化することなく、TLR9を選択的に活性化することが可能で、自然免疫制御剤として用いることができる。さらに本発明は、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体をTLR9のリガンドとして使用する方法に関し、かかる方法は、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-6、及びIFNαのいずれか1以上のサイトカインの産生等を伴うTLR9-MyD88依存経路による免疫応答を誘導させる方法や、自然免疫の制御方法を含み、その具体的態様としては、前記の本発明の使用方法の具体的態様として例示した方法を挙げることができる。以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。HZの自然免疫活性の活性化とその調節[材料及び方法]マウス変異マウスMyD88-、TRIF-、TLR2-、TLR4-、TLR7-、TLR9欠損マウスを、129/Ola×C57/BL6又はC57/BL6をバックグランドとし、文献Immunity91431501999Immunity114434511999Nature4087407452000NatImmunol31962002002Science3016406432003記載の通りに産出した。同年齢の野生型マウスと変異マウスを実験に使用した。インビボの研究には、Pfalciparum培養物から精製したHZ1500μgと合成HZβヘマチンとを、野生型マウス、MyD88-/-マウス又はTLR9-/-マウスの腹腔内に注入したJImmunol172310131102004。サイトカインELISA用に、1、2、4及び6時間後に尾から血清を収集した。試薬合成CpGオリゴデオキシヌクレオチドODND35は、北海道システムサイエンス株式会社より購入、合成した。SalmonellaminnesotaRe595由来リポポリサッカリドLPS、塩化ヘミンheminchloride及びクロロキンCQはSigmaAldrichより購入した。DNaseはInvitrogenから購入した。HZ及び合成HZβヘマチンの調製HZ不溶性クリスタロイド構造は、Pfalciparumで感染した赤血球から精製したInfectImmun70393939432002ProcNatlAcadSciUSA9311865118701996ProcNatlAcadSciUSA883253291991。要約すると、赤血球をサポニンで溶解した後、原虫を超音波処理し、2のドデシル硫酸ナトリウムSDSで7~8回洗浄した。次に、ペレットをプロテイナーゼK2mg/mlと共に、37°Cで一晩インキュベートした。ペレットはその後、2のSDS内で3回洗浄し、6Mの尿素内で室温で3時間、シェーカー上でインキュベートした。HZペレットを2のSDSで洗浄した後、蒸留水で3~5回洗浄し、蒸留水に再懸濁し、使用前に再び超音波処理した。いくつかの実験において、文献JImmunol167260226072001記載の通りに、HZは、95°Cで15分間の熱失活を行うか又は、100U/mlのDNaseIで1時間処理を行った。DNaseI処理は、P.falciparumの粗抽出物から完全にゲノムDNAを除去することによって行った図5a。核酸、タンパク質の定量化は、分光光度計を使用するか、又はアガロースゲル内の臭化エチジウム染色法、BCA法Biorad若しくはピロガロールレッド方法和光純薬工業によって行った。全脂質TPは、BlighDyer法東レリサーチセンターによるTLC薄層クロマトグラフィー又はIatronLQ三菱化学ヤトロンを使用した酵素方法によって測定した。合成HZβヘマチンは、酢酸処理及びアルカリ炭酸水素塩洗浄に基づくJaramilloetalのプロトコールJImmunol17231013110を用いて精製した。エンドトキシンの混入を避けるために、全ての溶液はエンドトキシンを含まないPBS又は蒸留水を用いて調製した。LAL分析BioWhittakerにより測定したエンドトキシンの量は、使用したHZ1nmole当たり0.001EU未満であった。HZ又は合成HZbヘマチンの定量化HZ又は合成HZの濃度は、ヘムポリマーを、20mM水酸化ナトリウム/2SDSの溶液内で、室温で、2時間脱重合して定量し、O.D.は400nmであったProcNatlAcadSciUSA9311865118701996。ヘムのモラー吸光係数は400nmで1×105であり、25μgのPfalciparumHZは、ヘム含有量29nmoleと同等である。細胞脾臓細胞の単一細胞懸濁液singlecellsuspension5×105細胞/ウェルを、10のFCSを添加した完全RPMI1640培地内で48時間培養した。Flt3リガンド誘導骨髄由来DCFL-DC1×105細胞/ウェルは、骨髄細胞とFlt3リガンド100ng/ml;PeproTech社製とを、10のFCSを含むDMEM培地内で8~9日間培養して産出した。細胞を、指定の刺激によって刺激し、サイトカインELISA用に、上澄みを回収した。サイトカインELISAマウスのTNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-6及びIFNαPBLBioLab社製を、上澄み又は血清のいずれかで、製造者の指示に従ってELISAで測定した。共刺激による分子発現のフローサイトメトリー分析刺激した細胞の細胞表面の分子発現を、文献JExpMed1962692742002記載の通り測定した。要約すると、刺激した細胞を、冷却したPBS内で洗浄し、固定し、抗CD16抗体の存在下で、FITC標識抗体、PE標識抗体、Cy-Chrome標識抗体及びAPC標識抗体で、室温で30分染色した。染色した細胞を洗浄し、PBS/0.1BSA/0.1NaN3内に再懸濁し、FACSCalliberで分析した後、CellQuestsoftwareで分析した。全ての抗体は、BDより入手した。統計的分析統計的な有意差は、Student’sttestを用いて分析した。P<0.05は有意とみなした。[試験、結果及び評価]Pfalciparum由来の精製HZの、MyD88依存性経路を通してのマウスの脾臓細胞及び樹状細胞の活性化Pfalciparum由来の精製HZが、マウス免疫システムを活性化するかどうかを調べるために、脾臓細胞及びDCマウス骨髄樹状細胞を、インビトロで精製HZで刺激し、培養上澄み中の炎症誘導性サイトカインの産出をELISAによって測定した。FL-DCFit3リガンド誘導骨髄由来DCは、HZに応答して、TNFα、IL-12p40、単球走化性因子-1MCP-1及びIL-6を、用量依存的に大量に産出し、その量はCpGODNとほぼ同様の値だった図1a。HZ誘導性の自然免疫活性化における、TLRの役割を調べるために、多数のTLRが介するサイトカイン誘導に必須の分子アダプターであるMyD88が欠損しているマウスを用いたNatRevImmunol44995112004。MyD88-/-マウス由来のFL-DCでは、HZ刺激により、TNFα、IL12p40、MCP-1及びIL-6の産出が著しく障害された図1b。同様に、MyD88-/-脾臓細胞では、HZに応答して、MCP-1、IL-6、TNFα、IL-12p40及びIFN誘導性タンパク質10IP-10を産出する応答が障害されていた図1c。更に、ヘモゾインは、FL-DCのCD11c、B220plasmacytoidDCサブセット及びCD11c、B220-骨髄DCサブセットの両方を刺激し、MyD88-/-マウスにおいて、FL-DCの両サブセットで阻害されていたCD40及びCD86の発現をアップレギュレートした図1d。自然免疫応答のHZ活性化のTRIF依存性HZ誘導性の自然免疫の活性化が、MyD88にのみ依存的であることを確認するために、MyD88非依存性経路に必須のアダプター分子であるTRIFToll/IL-1レセプターTIR領域含有アダプターが欠損しているマウスを用いたNatRevImmunol44995112004。MyD88-/-マウスとは対照的に、TRIF-/-マウスのFL-DCは、HZに応答し、TNFα及びIL-12p40p<0.05、TRIF-/-vs培地を産出し、野生型マウスp>0.05の値とほぼ同じであった図2。LPS誘導性のTNFα及びIL-12p40は、TRIF-/-マウスのFL-DCで障害され、Pfalciparum培養物から精製した多量のHZに、LPSが混入していないことを示唆した。これらのデータは、HZがMyD88を通してマウスにおける炎症誘発性応答を活性化することを示し、MyD88依存性TLRの1つがHZの認識に関与していることを示した。自然免疫応答のHZ活性化のTLR-9依存性TLR2-/-マウス、TLR4-/-マウス、TLR7-/-マウス及びTLR9-/-マウスから得た脾臓細胞及びDCを用いて、HZ誘導性の自然免疫活性化が障害されているか、又は変更されているかを調べるために、さらに実験を行った。HZは、野生型マウス、TLR2-/-マウス、TLR4-/-マウス、TLR7-/-マウスにおいて、FL-DCを刺激し、CD11c、B220plasmacytoidDCサブセット及びCD11c、B220-骨髄DCサブセットの両方で、CD40及びCD86をアップレギュレートした図3a。対照的に、TLR9-/-マウス由来のFL-DCの両サブセットでは、HZに応答してCD40及びCD86をアップレギュレートしなかった図3a。同様に、野生型マウス、TLR2-/-マウス、TLR4-/-マウス、TLR7-/-マウス由来のFL-DCは、HZに応答して、TNFα、IL-12p40、MCP-1及びIL-6を産出したが、TLR9-/-マウスでは産出しなかった図3b。HZはFL-DCによってIFNαを誘導しなかった点は注目すべきであり、HZ誘導性サイトカインの特性が、K型CpGODNB型としても知られていると同様であるが、D型OCNA型としても知られている、細菌性若しくはウイルス性DNA等のTLR9の既知の天然DNAリガンドとは異なることを示唆している図3cNatRevImmunol42492582004。それにもかかわらず、これらのデータは、TLR9及びMyD88が、マウス脾臓細胞及びDCにおけるHZ誘導性の活性化に重要であることを、明らかに証明している。炎症誘導性サイトカインのHZ活性化のインビボにおけるMyD88/TLR9依存性HZ活性化が、インビボで、TLR9に介され、MyD88に依存的であることを確認するために、Pfalciparum精製HZを、野生型マウス及びMyD88-/-マウス又はTLR9-/-マウスの腹腔内に注入し、血清サイトカインの産出をモニターした。HZの注入により、野生型マウスのMCP-1及びIL-6の血清量が著しく上昇し、その値は1~4時間に最大となり、6時間以内に減少した図4a。対照的に、MyD88-/-マウス及びTLR-/-マウスでは、この上昇は、完全に阻害されていた。6時間後、サイトカインの量は、野生型マウスで減少した。これらのデータは、インビボ及びインビトロの両方で、HZ誘導性の炎症誘導性応答が、TLR9及びMyD88によって介されていることを明確に示している。合成HZβヘマチン、実験室条件で短量体ヘムより合成は、原虫で天然に形成されたHZと構造が似ておりProcNatlAcadSciUSA9311865118701996ProcNatlAcadSciUSA883253291991、原虫又は培養物由来の混入物を含んでいない。合成HZがTLR9依存形式で、自然免疫システムを活性化しているかどうか調べるために、野生型マウス又はTLR9-/-マウスに、合成HZを注入し、血清内のIL-6及びMCP-1産生量をモニターした。野生型マウスへの合成HZの注入は、血清内のMCP-1及びIL-6産出を誘導し、その量は1~4時間に最大となった図4b。対照的に、この応答は、TLR9-/-マウスでは阻害されていた図4b。これらのデータは、合成HZと同様Pfalciparum由来精製天然HZも、マウスの自然免疫システムを刺激していることを示唆し、HZ誘導性の、TLR9仲介自然免疫活性化に他の混入物が関与している可能性を排除している。Pfalciparumの培養物中、又はPfalciparum培養物からHZ調製中に混入物が入る可能性を排除するために、上記の多くの精製方法に加えて、HZの精製度を定量するために、一連の分析を行ったInfectImmun70393939432002。臭化ブロマイド染色アガロースゲル図5でも、分光光度計でも、HZ又はDNase処理HZ溶液1mMにおいて、DNAもRNAも検出されなかった。DNase処理又は熱失活も、TNFα及びIL-12p40のHZ誘導DC産出に影響しなかった図5b。さらに、Pfalciparumから単離したゲノムDNA及びRNAは、TNFα及びIL-12の産出を含む自然免疫応答を著しく活性化しなかった未公表の実験及びJImmunol172398939932004。どの方法でも、HZ溶液1mM内に、タンパク質も脂質も検出されなかった。つまり、これらのデータを合わせると、HZ誘導性、TLR9-仲介性の自然免疫活性は、他の混入物に起因するものではないことを、強く示唆している。HZ誘導性自然免疫の活性化のクロロキン感受性抗マラリア製剤クロロキンCQは、エンドソーム/リソソームの成熟、マラリアヘモゾインのクリスタル形成crystalformationを阻害するほか、マラリア感染中の炎症誘導性応答を阻害することが報告されているが、CQの抗マラリア効果の正確なメカニズムは、未だに論争中であるIntJParasitol32164516532002LifeSci74195719722004。最近の論拠は、CQは、TLR9仲介性自然免疫活性化も阻害することを示唆しているJImmunol160112211311998。HZ誘導性の炎症誘導性応答に対するCQの効果を調べるために、CQの存在下で、FL―DCをHZで刺激した。HZ誘導性のTNFα及びIL-12p40の産出は、CQにより減少した図5b。これらは、既知のメカニズムである、マラリア病原体によるCQ阻害に加えて、CQが、マラリア感染中のHZ誘導性、TLR9仲介性の自然免疫応答を阻害することができ、それは治療効果に貢献する可能性があることを示唆している。さらなる研究が必要ではあるが、HZ形成を阻害する能力に加えて、CQがHZとTLR9の相互作用に干渉し、又は食胞を含むHZの成熟を阻害し、結果的に以下の自然免疫活性化を阻害する可能性がある。TLR9が特異的IgGにより、細菌性DNA又は自己DNAクロマチン複合体中にCpGモチーフを認識することは報告されているが、TLR9リガンドとしての非DNA分子は報告されていないTrendsImmunol253813862004AnnuRevImmunol207097602002。最近の研究によって、TLR9により認識される非DNAリガンドの最初の論拠が報告されている。HZは、赤血球からヘモグビンが分解される間に寄生虫の食胞に産出した重合ヘムferriprotoporphyrinIXの結晶形である。マクロファージ、DC等の貪食細胞に捕獲されると、HZは、TLR9がP13キナーゼを経由して、小胞体から補充されることがあるファゴソーム内に蓄積するJExpMed1962692742002NatImmunol51901982004。これは、TLR9が、ファゴソーム内でHZを認識しうることを示唆している。HZは、高疎水性であり、最近提案された仮説に従うと、免疫刺激効果に関与する可能性があるNatRevImmunol44694782004。HZは本来、宿主赤血球内のヘモグロビンに由来しているが、生存し続けるために、原虫によって、毒性のヘムから、原虫に無毒の代謝物であるHZへと、変更されることは興味深い。これは、不活性自己分子inertselfmoleculeヘムが、マラリア感染中に不活性免疫システム内において、活性化した非自己分子となることを示唆している。マラリア感染中のHZ誘導性、TLR9仲介性の自己免疫活性化及びそれに対する宿主の防御の生物学的な役割は現在調査中である。予備的な結果により、マラリア原虫に対する自然免疫応答は、TLRを含む宿主やPlasmodiumの複数の要因に依存していることを示唆している。最近の研究を含む、マラリア感染中のTLR仲介性の自然免疫活性化が、宿主防御免疫hostprotectiveimmunityに寄与しているのか、マラリア免疫逃避メカニズムに寄与しているのかを、研究することは重要である。また、TLR9がCpGDNA及びHZを識別する分子メカニズムを研究することも重要である。それにもかかわらず、現在までの観察により、マラリア感染中のヘム代謝物であるHZは、TLR9仲介性、MyD88依存性及びクロロキンビン敏感性の経路を通して、不活性免疫システムを活性化することを確かに証明しており、これは、不活性免疫におけるマラリア寄生虫-宿主相互作用をさらに理解する鍵となる。[図の説明]図1.PFalciparum由来精製HZは、MyD88依存性経路を通して、炎症誘発性応答を活性化する:a野生型WTマウスのFL-DCを、精製ヘモゾインHZ30及び100μMで24時間刺激した。ELISAで、上澄み中のTNFα、IL-12p40、MCP-1又はIL-6の産生を測定した。コントロールとして、3μMのCpGDNAD35を用いた。野生型黒いバー、MyD88-/-マウス白いバーのbFL-DC、及びc脾臓細胞を、30μMのHZ及びCpGDNAD35、3μM又はLPS100ng/mlで、24時間刺激した。培養上澄み中のTNFα、IL-12p40、MCP-1又はIL-6の産生をELISAで測定した。dCD40及びCD86の発現を調べるために、骨髄DCCD11c、B220-及びplasmacytoidDCCD11c、B220を、フローサイトメトリーによって分析した。斜線部分は、HZで刺激されていない細胞を現し、実線はHZで刺激された細胞を現す。結果は、2度の培養の平均値S.D.を現し、少なくとも5回の別個の実験の代表例である。ndは、検出されずを意味する。図2.HZ誘導性のDC活性化はTRIF非依存的である:野生型WTマウス及びTRIF-/-マウスのFL-DCは、30μMのHZ及びLPS100ng/mlで24時間インキュベートし、その後上澄みをELISAで分析し、TNFα又はIL-12p40の産生量を定量した。結果は、平均値4回の別個の実験のSEMn=4である。P>0.05、HZWTvsHZTRIF-/-。ndは、検出されずを意味する。図3.TLR9はHZ誘導性の自然免疫活性化を仲介する:a野生型WTマウス及びTLR2-/-マウス、TLR4-/-マウス、TLR7-/-マウス、TLR9-/-マウスの骨髄DCCD11c、B220-及びplasmacytoidDCCD11c、B220を、フローサイトメトリーで分析し、CD40及びCD88の発現を定量した。斜線部分はHZで刺激されていない細胞を現し、実線はHZで刺激された細胞を現す。野生型及びTLR9-/-細胞は指定の刺激でインキュベートし、b脾臓細胞によるTNFα、IL-12p40、MCP-1又はIL-6の産生、及びcFL-DCによるIFNα産生を、ELISAで分析した。結果は、少なくとも5回の別個の実験の代表例である。ndは、検出されずを意味する。図4.インビボのHZ及び合成HZβヘマチンによる血清サイトカインの産生はMyD88及びTLR9依存的である:1500μgのaPfalciparum精製HZ、又はb合成HZsHZのいずれかを、MyD88-/-マウス、TLR9-/-マウス又は野生型WTマウスの腹腔内に注入した。MCP-1及びIL-6の血清量は指定の時点においてELISAで測定した。図5.ヘモゾインはDNAを含まず、HZ誘導性の炎症誘導性サイトカインの産生は、DNase耐性及び熱耐性であるが、クロロキン感受性である:aDNAの混入を検出するために、HZをアガロースゲル上に移し、臭化ブロマイドで染色した。M、マーカー;レーン1、HZ溶液1mM、5μl;レーン2、熱失活HZ1mM、5μl;レーン3、DNase処理HZ1mM、5μl;レーン4Pfalciparum粗抽出物4.5の寄生虫血症を含む100mlの濃縮培養物から5μl;DNase処理粗抽出物5μl。bC57/B6マウスのFL-DCを、30μMのHZ又はDNase処理、熱失活、及び/又はCQ10μMで24時間インキュベートした。その後、上澄みを回収し、ELISAでTNFα又はIL-12p40を測定した。コントロールとして、CpGODND35を3μMで用いた。D35のTNFαの値を図に示す。結果は、2度ずつ行った、3回の別個の実験の内の1つの代表例である平均S.D.。P.<0.05、HZvsHZCQ;P.<0.05、CpGODNvsCpGODNCQ。ndは、検出されずを意味する。