"C反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ15ないし30核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、C反応性タンパク質をコードする核酸分子の最低8核酸塩基部分に100相補性であり、かつ、C反応性タンパク質のmRNAの発現を阻害し、かつ、配列番号186の配列またはその最低8核酸塩基のフラグメントを含むことを特徴とする、アンチセンスオリゴヌクレオチド。DNAオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。RNAオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。キメラオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。化合物の少なくとも一部分がRNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド-RNA二重鎖を形成する、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。最低1個の改変されたヌクレオシド間結合、糖部分若しくは核酸塩基を有する、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。最低1個の2’-O-メトキシエチル糖部分を有する、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。最低1個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。最低1個の5-メチルシトシンを有する、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。配列番号186の配列が、2ないし5個の隣接する2’O-メトキシエチルヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、かつ、全部のシチジン残基が5-メチルシチジンである、請求項4に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。一本鎖である、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。C反応性タンパク質の発現が阻害されるように、細胞若しくは組織を請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含んでなる、細胞若しくは組織中でのC反応性タンパク質の発現の阻害方法。請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなるキット若しくはアッセイ装置。請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含んでなるC反応性タンパク質と関連する疾患若しくは状態を有する動物の予防若しくは処置用の製薬学的製剤。疾患若しくは状態が心血管系障害である、請求項14に記載の製薬学的製剤。請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とするヒトC反応性タンパク質を発現する生物学的系におけるC反応性タンパク質の発現の阻害剤。生物学的系がヒトである、請求項16に記載の阻害剤。C反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ8ないし80核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドであって、前記分子の最低8核酸塩基部分に相補的であり、かつ、C反応性タンパク質のmRNAの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、哺乳動物組織中での脂肪細胞分化を阻害するための製剤。哺乳動物組織が代謝性疾患を有する哺乳動物からの組織である、請求項18に記載の製剤。代謝性疾患が、肥満、高脂血症、アテローム硬化症、アテローム発生、糖尿病および高血圧よりなる群から選択される、請求項19に記載の製剤。C反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ8ないし80核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドであって、前記分子の最低8核酸塩基部分に相補的であり、かつ、C反応性タンパク質のmRNAの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、幹細胞若しくは前駆細胞の多能性の表現型を維持するための製剤。C反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ8ないし80核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドであって、前記分子の最低8核酸塩基部分に相補的であり、かつ、C反応性タンパク質のmRNAの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、哺乳動物組織中でのアポトーシスを阻害するための製剤。哺乳動物組織が神経変性性障害を有する哺乳動物からの組織である、請求項22に記載の製剤。C反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ8ないし80核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドであって、前記分子の最低8核酸塩基部分に相補的であり、かつ、C反応性タンパク質のmRNAの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、哺乳動物組織中での血管新生を阻害するための製剤。哺乳動物組織が、癌、糖尿病性網膜症、心血管系疾患、慢性関節リウマチおよび乾癬よりなる群から選択される状態を有する哺乳動物からの組織である、請求項24に記載の製剤。C反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ8ないし80核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドであって、前記分子の最低8核酸塩基部分に相補的であり、かつ、C反応性タンパク質のmRNAの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、哺乳動物組織中での炎症応答を阻害若しくは低下するための製剤。哺乳動物組織が、慢性関節リウマチ、喘息および炎症性腸疾患よりなる群から選択される疾患を有する哺乳動物からである、請求項26に記載の製剤。C反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とする長さ8ないし80核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオドであって、前記分子の最低8核酸塩基部分に相補的であり、かつ、C反応性タンパク質のmRNAの発現を阻害するオリゴ若しくはポリヌクレオチドを有効成分として含んでなる、免疫不全を伴う哺乳動物被験体を処置するための製剤。心血管系疾患を包含する心血管系障害、代謝性疾患、肥満、高脂血症、アテローム硬化症、アテローム発生、糖尿病、高血圧、神経変性性障害、癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、喘息および炎症性腸疾患よりなる群から選択される1疾患の処置のための医薬品の製造における、C反応性タンパク質をコードする核酸分子を標的とし、前記分子の最低8核酸塩基部分に相補的であり、かつ、C反応性タンパク質のmRNAの発現を阻害する、長さ8ないし80核酸塩基のオリゴ若しくはポリヌクレオチドの使用。ヌクレオシドホスホルアミダイトの合成アミダイトおよびそれらの中間体を包含する以下の化合物は、米国特許第6,426,220号明細書および国際特許公開第WO02/36743号明細書に記述されるとおり製造した;5-メチルdCアミダイトの5’-O-ジメトキシトリチル-チミジン中間体、5-メチル-dCアミダイトの5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-5-メチルシチジン中間体、5-メチルdCアミダイトの5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジンの最後から2番目の中間体、[5’-O-4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル-2’-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3’-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト5-メチルdCアミダイト、2’-フルオロデオキシアデノシン、2’-フルオロデオキシグアノシン、2’-フルオロウリジン、2’-フルオロデオキシシチジン、2’-O-2-メトキシエチル修飾アミダイト、2’-O-2-メトキシエチル-5-メチルウリジン中間体、5’-O-DMT-2’-O-2-メトキシエチル-5-メチルウリジンの最後から2番目の中間体、[5’-O-4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル-2’-O-2-メトキシエチル-5-メチルウリジン-3’-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイトMOETアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-2-メトキシエチル-5-メチルシチジン中間体、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-2-メトキシエチル-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジンの最後から2番目の中間体、[5’-O-4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル-2’-O-2-メトキシエチル-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3’-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイトMOE5-Me-Cアミダイト、[5’-O-4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル-2’-O-2-メトキシエチル-N6-ベンゾイルアデノシン-3’-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイトMOEAアミダイト、[5’-O-4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル-2’-O-2-メトキシエチル-N4-イソブチリルグアノシン-3’-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイトMOEGアミダイト、2’-O-アミノオキシエチルヌクレオシドアミダイトおよび2’-O-ジメチルアミノオキシエチルヌクレオシドアミダイト、2’-ジメチルアミノオキシエトキシヌクレオシドアミダイト、5’-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2’-アンヒドロ-5-メチルウリジン、5’-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2’-O-2-ヒドロキシエチル-5-メチルウリジン、2’-O-[2-フタルイミドキシ]エチル-5’-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン、5’-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2’-O-[2-ホルムアドキシイミノオキシformadoximinooxyエチル]-5-メチルウリジン、5’-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2’-O-[N,N-ジメチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジン、2’-O-ジメチルアミノオキシエチル-5-メチルウリジン、5’-O-DMT-2’-O-ジメチルアミノオキシエチル-5-メチルウリジン、5’-O-DMT-2’-O-2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル-5-メチルウリジン-3’-[2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト]、2’-アミノオキシエトキシヌクレオシドアミダイト、N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2’-O-2-エトキシアセチル-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチルグアノシン-3’-[2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト]、2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ2’-DMAEOEヌクレオシドアミダイト、2’-O-[22-N,N-ジメチルアミノエトキシエチル]-5-メチルウリジン、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-[22-N,N-ジメチルアミノエトキシ-エチル]-5-メチルウリジン、ならびに5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-[22-N,N-ジメチルアミノエトキシ-エチル]-5-メチルウリジン-3’-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド合成本発明により使用されるアンチセンス化合物は、固相合成の公知の技術により便宜的かつ慣例に作成しうる。こうした合成のための機器は、例えばAppliedBiosystemsカリフォルニア州フォスターシティを包含するいくつかの製造供給元により販売されている。当該技術分野で既知のいかなる他のこうした合成手段も付加的に若しくは代替で使用しうる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドの類似の製造技術を使用することが公知である。オリゴヌクレオチド:未置換および置換ホスホジエステルP=Oオリゴヌクレオチドは、ヨウ素による酸化を用いる標準的ホスホルアミダイト化学を使用して自動DNA合成機AppliedBiosystemsモデル394で合成する。ホスホロチオエートP=Sは、以下を除いてホスホジエステルオリゴヌクレオチドに類似に合成する。すなわち、チア化thiationは、亜リン酸塩結合の酸化のためアセトニトリル中3,H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシドの10w/v溶液を利用することにより遂げた。チア化thiation反応段階の時間を180秒に増大させ、そして通常のキャッピング段階により先行させた。CPGカラムからの切断および濃水酸化アンモニウム中55°C12~16時間でのデブロッキング後に、1MNH4OAc溶液から>3容量のエタノールで沈殿させることによりオリゴヌクレオチドを回収した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは米国特許第5,508,270号明細書引用することにより本明細書に組込まれるに記述されるとおり製造する。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第4,469,863号明細書引用することにより本明細書に組込まれるに記述されるとおり製造する。3’-デオキシ-3’-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,610,289号若しくは同第5,625,050号明細書引用することにより本明細書に組込まれるに記述されるとおり製造する。ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,256,775号若しくは米国特許第5,366,878号明細書引用することにより本明細書に組込まれるに記述されるとおり製造する。アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、国際特許出願第PCT/US94/00902号および同第PCT/US93/06976号明細書それぞれ第WO94/17093号および同第WO94/02499号明細書として公開引用することにより本明細書に組込まれるに記述されるとおり製造する。3’-デオキシ-3’-アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,476,925号明細書引用することにより本明細書に組込まれるに記述されるとおり製造する。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,023,243号明細書引用することにより本明細書に組込まれるに記述されるとおり製造する。ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,130,302号および同第5,177,198号明細書双方とも引用することにより本明細書に組込まれるに記述されるとおり製造する。オリゴヌクレオシド:メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシドMMI結合オリゴヌクレオシドともまた同定される、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシドMDH結合オリゴヌクレオシドともまた同定される、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシドアミド-3結合オリゴヌクレオシドともまた同定される、ならびにメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシドアミド-4結合オリゴヌクレオシドともまた同定される、ならびに例えば交替するMMIおよびP=O若しくはP=S結合を有する混合バックボーン化合物は、米国特許第5,378,825号、同第5,386,023号、同第5,489,677号、同第5,602,240号および同第5,610,289号明細書それらの全部は引用することにより本明細書に組込まれるに記述されるとおり製造する。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,264,562号および同第5,264,564号明細書引用することにより本明細書に組込まれるに記述されるとおり製造する。エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,223,618号明細書引用することにより本明細書に組込まれるに記述されるとおり製造する。RNA合成一般に、RNA合成の化学は戦略的中間反応での多様な保護基の選択的組込みに基づく。当業者は有機合成における保護基の使用を理解しているであろうとは言え、有用な一分類の保護基はシリルエーテルを包含する。とりわけ、嵩高いシリルエーテルは、2’-ヒドロキシル上の酸不安定性のオルトエステル保護基とともに5’-ヒドロキシルを保護するのに使用される。保護基のこの組はその場合、標準的な固相合成技術とともに使用する。全部の他の合成段階後に該酸不安定性のオルトエステル保護基を最後に除去することが重要である。さらに、合成の間のシリル保護基の早期の使用は、2’-ヒドロキシルの望ましくない脱保護を伴わずに所望の場合に容易な除去を確実にする。差別的に除去されかつ差別的に化学的に不安定である保護基による2’-ヒドロキシルの保護とともに5’-ヒドロキシルの連続的保護のためのこの手順に従って、RNAオリゴヌクレオチドを合成した。RNAオリゴヌクレオチドは段階的様式で合成する。各ヌクレオチドは、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに連続的に3’から5’の方向に付加する。鎖の3’端の第一のヌクレオシドは固体支持体に共有結合されている。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび活性剤を添加して、第二の塩基を第一のヌクレオシドの5’端に結合させる。支持体を洗浄し、そして、いかなる未反応の5’-ヒドロキシル基も無水酢酸でキャッピングして、5’-アセチル部分を生じる。該結合をその後、より安定かつ最終的に所望のPV結合に酸化する。ヌクレオチド付加周期の終了時に、5’-シリル基をフッ化物で切断する。該周期を各その後のヌクレオチドについて反復する。合成後に、リン酸上のメチル保護基を、DMF中1Mの二ナトリウム2-カルバモイル-2-シアノエチレン-1,1-ジチオラート三水和物S2Na2を利用して30分で切断する。脱保護溶液は水を使用して固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドから洗浄する。支持体をその後、水中40メチルアミンで55°Cで10分間処理する。これがRNAオリゴヌクレオチドを溶液中に放出し、環外アミンを脱保護しかつ2’基を修飾する。該オリゴヌクレオチドをこの段階で陰イオン交換HPLCにより分析し得る。2’-オルトエステル基は除去されるべき最後の保護基である。DharmaconResearch,Inc.コネチカット州ラファイエットにより開発されたエチレングリコールモノアセテートオルトエステル保護基は、有用なオルトエステル保護基の一例であり、以下の重要な特性を有する。それはヌクレオシドホスホルアミダイト合成およびオリゴヌクレオチド合成の条件に対し安定である。しかしながら、オリゴヌクレオチド合成後にオリゴヌクレオチドをメチルアミンで処理する。メチルアミンは、オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断するのみならず、しかしまたアセチル基をオルトエステルから除去する。オルトエステル上の生じる2-エチル-ヒドロキシル置換基はアセチル化された前駆体よりも少なく電子を吸引する。結果として、修飾オルトエステルは酸で触媒される加水分解に対しより不安定になる。とりわけ、切断速度はアセチル基が除去された後におよそ10倍より速くなる。従って、このオルトエステルは、オリゴヌクレオチド合成と適合性であるために十分な安定性を有する。それでもなお、その後修飾される場合に、このオルトエステルは、最終のRNAオリゴヌクレオチド生成物と適合性の比較的穏やかな水性条件下で脱保護が実施されることを可能にする。加えて、RNA合成方法は当該技術分野で公知であるScaringe,S.A.Ph.D.Thesis、UniversityofColorado、1996;Scaringe,S.A.ら、J.Am.Chem.Soc.、1998、120、11820-11821;Matteucci,M.D.とCaruthers,M.H.J.Am.Chem.Soc.、1981、103、3185-3191;Beaucage,S.L.とCaruthers,M.H.TetrahedronLett.、1981、22、1859-1862;Dahl,B.J.ら、ActaChem.Scand、.1990、44、639-641;Reddy,M.P.ら、TetrahedronLett.、1994、25、4311-4314;Wincott,F.ら、NucleicAcidsRes.、1995、23、2677-2684;Griffin,B.E.ら、Tetrahedron、1967、23、2301-2313;Griffin,B.ら、Tetrahedron、1967、23、2315-2331。本発明のRNAアンチセンス化合物RNAオリゴヌクレオチドは、本明細書の方法により合成し得るか、若しくはDharmaconResearch,Incコネチカット州ラファイエットから購入し得る。一旦合成されれば、相補RNAアンチセンス化合物をその後、当該技術分野で既知の方法によりアニーリングして二本鎖二重鎖形成したアンチセンス化合物を生じ得る。例えば、二重鎖は、30μlのRNAオリゴヌクレオチドの相補鎖のそれぞれ50μMのRNAオリゴヌクレオチド溶液および15μlの5×アニーリング緩衝液100mM酢酸カリウム、30mMHEPES-KOHpH7.4、2mM酢酸マグネシウムを組合せること、次いで90°Cで1分間、その後37°Cで1時間加熱することにより形成させ得る。生じる二重鎖形成したアンチセンス化合物は、標的核酸の役割を検討するためのキット、アッセイ、スクリーニング若しくは他の方法で使用し得る。キメラオリゴヌクレオチドの合成本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド若しくは混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは数種の異なる型のものであり得る。これらは、結合されたヌクレオシドのギャップセグメントが結合されたヌクレオシドの5’および3’のウィングセグメントの間に配置されている第一の型、ならびにギャップセグメントが該オリゴマー化合物の3’若しくは5’いずれかの末端に位置する第二の開放端型を包含する。第一の型のオリゴヌクレオチドは当該技術分野でギャップマー若しくはギャップトオリゴヌクレオチドとしてもまた知られる。第二の型のオリゴヌクレオチドは当該技術分野でヘミマー若しくはウィングマーとしてもまた知られる。[2’-O-Me]--[2’-デオキシ]--[2’-O-Me]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド2’-O-アルキルホスホロチオエートおよび2’-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドは、上のとおりAppliedBiosystemsの自動DNA合成機モデル394を使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動合成機、ならびにDNA部分について2’-デオキシ-5’-ジメトキシトリチル-3’-O-ホスホルアミダイトならびに5’および3’ウィングについて5’-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-3’-O-ホスホルアミダイトを使用して合成する。5’-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-3’-O-ホスホルアミダイトについて増大した反応時間を伴う結合段階を組込むことにより、標準的合成周期を改変する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そして濃アンモニアNH4OH中55°Cで12~16時間脱保護する。脱保護したオリゴをその後、適切な方法沈殿、カラムクロマトグラフィーにより回収し、真空中で容量を減少させ、そしてキャピラリー電気泳動および質量分析により収量および純度について分光測光的に分析する。[2’-O-2-メトキシエチル]--[2’-デオキシ]--[2’-O-メトキシエチル]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド[2’-O-2-メトキシエチル]--[2’-デオキシ]--[-2’-O-メトキシエチル]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2’-O-メチルアミダイトの代わりの2’-O-メトキシエチルアミダイトの使用を伴い、2’-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上の手順のとおり製造した。[2’-O-2-メトキシエチルホスホジエステル]--[2’-デオキシホスホロチオエート]--[2’-O-2-メトキシエチルホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチド[2’-O-2-メトキシエチルホスホジエステル]--[2’-デオキシホスホロチオエート]--[2’-O-メトキシエチルホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチドは、2’-O-メチルアミダイトの代わりの2’-O-メトキシエチルアミダイトの使用、該キメラ構造のウィング部分内のホスホジエステルヌクレオチド間結合を生成させるためのヨウ素での酸化、および中央のギャップのためのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生成させるための3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシドBeaucage試薬を利用する硫化を伴い、2’-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上の手順のとおり製造する。他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,623,065号明細書引用することにより本明細書に組込まれるに従って合成する。C反応性タンパク質を標的とする二重鎖形成アンチセンス化合物の設計およびスクリーニング本発明により、本発明のアンチセンス化合物およびそれらの相補物を含んでなる一連の核酸二重鎖を、C反応性タンパク質を標的とするように設計し得る。該二重鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は表1の1オリゴヌクレオチドの最低8核酸塩基の部分を含んでなる。鎖の端は、オーバーハングを形成するための1個若しくはそれ以上の天然の若しくは修飾核酸塩基の付加により改変しうる。dsRNAのセンス鎖をその後アンチセンス鎖の相補物として設計かつ合成し、そして、いずれかの末端への修飾若しくは付加もまた含有しうる。例えば、一態様において、dsRNA二重鎖の双方の鎖が中央の核酸塩基で相補的であり、それぞれ一方若しくは双方の末端にオーバーハングを有する。該二重鎖のアンチセンスおよびセンス鎖は約17から25個までのヌクレオチド、若しくは約19から23個までのヌクレオチドを含んでなる。あるいは、該アンチセンスおよびセンス鎖は20、21若しくは22ヌクレオチドを含んでなる。例えば、配列CGAGAGGCGGACGGGACCG配列番号624を有しかつデオキシチミジンdTの2核酸塩基のオーバーハングを有するアンチセンス鎖を含んでなる二重鎖は、以下の構造を有するアンチセンス配列番号625、相補物配列番号626:オーバーハングは2から6個までの核酸塩基の範囲にわたることができ、また、これらの核酸塩基は標的核酸に相補的であっても若しくはなくてもよい。別の態様において、該二重鎖は一方の末端のみにオーバーハングを有しうる。別の態様において、同一の配列CGAGAGGCGGACGGGACCG配列番号624を有するアンチセンス鎖を含んでなる二重鎖を、示されるとおり平滑端一本鎖オーバーハングなしを伴い製造するアンチセンス配列番号624、相補物配列番号627:該RNA二重鎖は単分子若しくは二分子であり得る。すなわち、該二本の鎖は単一分子の一部であり得るか、若しくは別個の分子でありうる。該二重鎖のRNA鎖は、本明細書に開示される方法により合成し得るか、若しくはDharmaconResearch,Inc.,コネチカット州ラファイエットから購入し得る。一旦合成されれば、相補鎖をアニーリングする。該一本鎖を分注しそして50μMの濃度に希釈する。一旦希釈されれば、30μLの各鎖を15μLのアニーリング緩衝液の5×溶液と合せる。前記緩衝液の最終濃度は、100mM酢酸カリウム、30mMHEPES-KOHpH7.4および2mM酢酸マグネシウムである。最終容量は75μLである。この溶液を90°Cで1分間インキュベートし、そしてその後15秒間遠心分離する。チューブを37°Cで1時間静置させ、その時点でdsRNA二重鎖を実験で使用する。dsRNA二重鎖の最終濃度は20μMである。この溶液は凍結保存し-20°C得、そして5回まで凍結-融解し得る。一旦調製されれば、二重鎖形成したアンチセンス化合物を、C反応性タンパク質の発現を調節するそれらの能力について評価する。細胞が80コンフルエンシーに達した場合に、それらを本発明の二重鎖形成したアンチセンス化合物で処理する。96ウェルプレートで増殖させた細胞について、ウェルを200μLのOPTI-MEMTM-1減血清培地GibcoBRLで1回洗浄し、そしてその後、12μg/mLのリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬GibcoBRLおよび200nMの最終濃度の所望の二重鎖アンチセンス化合物を含有する130μLのOPTI-MEMTM-1培地で処理する。5時間の処理後に培地を新鮮培地と交換する。細胞を処理16時間後に収集し、この時点でRNAを単離しかつ標的の低下をRT-PCRにより測定する。オリゴヌクレオチドの単離微細孔性ガラス固体支持体からの切断、および濃水酸化アンモニウム中55°Cで12~16時間デブロッキングした後に、オリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオシドを1MNH4OAcからの>3容量のエタノールでの沈殿により回収する。合成したオリゴヌクレオチドを、電子スプレー質量分析法分子量測定およびキャピラリーゲル電気泳動により分析し、そして最低70の完全長の物質であると判断した。合成で得たホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量を、-16amu生成物/-32/-48に関する正しい分子量の比により決定した。いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをChiangら、J.Biol.Chem.1991、266、18162-18171により記述されるところのHPLCにより精製した。HPLCで精製した物質で得られた結果は、HPLCで精製していない物質で得られたものと同様であった。オリゴヌクレオチド合成-96ウェルプレート形式オリゴヌクレオチドは、96ウェル形式で同時に96配列を集成することが可能な自動合成機で、固相PIIIホスホルアミダイトの化学を介して合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は水性ヨウ素での酸化により提供した。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、水性アセトニトリル中での3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシドBeaucage試薬を利用する硫化により生成させた。標準的な塩基保護β-シアノエチル-ジイソ-プロピルホスホルアミダイトは商業的製造供給元例えばPE-AppliedBiosystems、カリフォルニア州フォスターシティ、若しくはPharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイから購入した。標準的でないヌクレオシドは標準的な若しくは特許を受けた方法に従って合成する。それらを塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトとして利用する。オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そして上昇された温度55~60°Cで濃NH4OHを用いて12~16時間脱保護し、そして遊離された生成物をその後真空中で乾燥した。乾燥した生成物をその後滅菌水に再懸濁してマスタープレートを提供し、それから全部の分析および試験プレートサンプルをその後、自動ピペッターを利用して希釈した。オリゴヌクレオチドの分析-96ウェルプレート形式各ウェル中のオリゴヌクレオチドの濃度は、サンプルの希釈およびUV吸収分光学により評価した。個々の生成物の完全長の完全性は、96ウェル形式BeckmanP/ACETMMDQ装置、若しくは個別に調製したサンプルについては商業的キャピラリー電気泳動CE装置例えばBeckmanP/ACETM5000、ABI270装置のいずれかでのCEにより評価した。塩基およびバックボーン組成は電子スプレー質量分析法を利用する化合物の質量分析により確認した。全部のアッセイ試験プレートを、単一および多チャンネル自動ピペッターを使用してマスタープレートから希釈した。プレートは、該プレート上の化合物の最低85が最低85の完全長であった場合に許容できると判断した。細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理標的核酸の発現に対するアンチセンス化合物の効果は多様な細胞型のいずれでも試験し得るが、但し、標的核酸が測定可能な濃度で存在する。これは、例えばPCR若しくはノーザンブロット分析を使用して慣例に測定し得る。以下の細胞型は具体的説明の目的上提供されるが、しかし他の細胞型を慣例に使用し得る。但し、標的が選ばれた細胞型で発現される。これは、当該技術分野で慣例の方法、例えばノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ若しくはRT-PCRにより容易に測定し得る。T-24細胞:ヒト移行細胞、膀胱癌細胞株T-24はAmericanTypeCultureCollectionATCCバージニア州マナサスから得た。T-24細胞は、10ウシ胎児血清InvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド、1mLあたり100単位のペニシリンおよび1mLあたり100マイクログラムのストレプトマイシンInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッドを補充した完全マッコイ5A基礎培地InvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド中で慣例に培養した。細胞はそれらが90コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。細胞を、RT-PCR分析での使用のため7000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレ―トFalcon-Primaria353872に接種した。ノーザンブロッティング若しくは他の分析のため、細胞を100mm若しくは他の標準的組織培養プレートに接種し、そして適切な量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理しうる。A549細胞:ヒト肺癌細胞株A549はAmericanTypeCultureCollectionATCCバージニア州マナサスから得た。A549細胞は、10ウシ胎児血清InvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド、1mLあたり100単位のペニシリンおよび1mLあたり100マイクログラムのストレプトマイシンInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッドを補充したDMEM基礎培地InvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド中で慣例に培養した。細胞はそれらが90コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。NHDF細胞:ヒト新生児皮膚線維芽細胞NHDFはCloneticsCorporationメリーランド州ウォーカーズビルから得た。NHDFは、供給元により推奨されるとおり補充した線維芽細胞増殖培地CloneticsCorporation、メリーランド州ウォーカーズビル中で慣例に維持した。細胞は、供給元により推奨されるとおり10回までの継代の間維持した。HEK細胞:ヒト胎児由来ケラチノサイトHEKはCloneticsCorporationメリーランド州ウォーカーズビルから得た。HEKは、供給元により推奨されるとおり処方したケラチノサイト増殖培地CloneticsCorporation、メリーランド州ウォーカーズビル中で慣例に維持した。細胞は、供給元により推奨されるとおり10回までの継代の間慣例に維持した。Hep3B細胞:ヒト肝癌細胞株Hep3BHep3B2.1-7はAmericanTypeCultureCollectionATCCカタログ番号HB-8064;バージニア州マナサスから得た。この細胞株は最初、8歳の黒人男性の肝細胞癌に由来した。該細胞は、形態学において上皮でありかつヌードマウスで腫瘍形成性である。これらの細胞は、LozanskiらCytokine、vol.8、1996pp.534-540により記述されるプロトコルに従い、1μMのデキサメサゾンSigma-カタログ番号D2915ミズーリ州セントルイス、400U/mlのIL1BSigma-カタログ番号I9401および200U/mlのIL6Sigma-カタログ番号I139を含有する培地の添加により、C反応性タンパク質を産生するように誘導し得る。Hep3B細胞を、アールの平衡塩溶液、2mML-グルタミン、1.5g/L重炭酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、1.0mMピルビン酸ナトリウムATCC20-2003、バージニア州マナサスおよび10熱不活性化ウシ胎児血清InvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッドを含む最小必須培地MEM中で慣例に培養した。細胞はそれらが90コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。誘導されたC反応性タンパク質のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を測定するために、Hep3B細胞を、10ウシ胎児血清を補充したMEM中6ウェルプレートPrimaria、ニュージャージー州フランクリン、カタログ番号3846の各ウェルに100,000細胞の密度でプレーティングし、そして一夜接着させた。翌日、上述されたところの最終濃度1μMのデキサメサゾン、400U/mlのIL1Bおよび200U/mlのIL6を補充した通常培地中で24時間、C反応性タンパク質を産生するよう細胞を誘導した。この誘導期間の終了時に培地を除去し、そして、3種のサイトカインを補充したMEM単独-血清中50~150nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび3.0~4.5μgのリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬で細胞を4時間処理した。4時間の薬物処理の終了時に培地を除去し、そしてFCSおよびサイトカインを含有する新鮮MEMを各ウェルに添加し、そして追加の20時間静置させた。オリゴヌクレオチドでの処理の24時間後に、キアゲン[QIAGEN]RRNeasyQiagenLtd、カリフォルニア州バレンシア処置を使用してRNAを収集し、そしてRT-PCR分析を使用してC反応性タンパク質のRNAを検出した。初代ラット肝細胞:初代ラット肝細胞は、CharlesRiverLabsマサチューセッツ州ウィルミントンから購入したSprague-Dawleyラットから調製し、そして10ウシ胎児血清InvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド、1mlあたり100単位のペニシリン、および1mlあたり100マイクログラムのストレプトマイシンInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッドを補充した高グルコースDMEMInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド中で慣例に培養した。細胞は、アンチセンスオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験での使用のため、80コンフルエンスまで培養した。初代ウサギ肝細胞:ニュージーランドホワイトラビットからの初代ウサギ肝細胞はInVitroTechnologiesメリーランド州ボルチモアから購入し、そして10ウシ胎児血清InvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド、1mlあたり100単位のペニシリン、および1mlあたり100マイクログラムのストレプトマイシンInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッドを補充した高グルコースDMEMInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド中で慣例に培養した。初代ウサギ肝細胞を購入しかつ100コンフルエンシーでトランスフェクトする。初代マウス肝細胞:初代マウス肝細胞は、CharlesRiverLabsマサチューセッツ州ウィルミントンから購入したBalb/cマウスから調製し、そして、10ウシ胎児血清InvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド、1mlあたり100単位のペニシリンおよび1mlあたり100マイクログラムのストレプトマイシンInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッドを補充した高グルコースDMEMInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド中で慣例に培養した。細胞は、アンチセンスオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験での使用のため80コンフルエンスまで培養した。初代ヒト肝細胞:プレーティング前の初代ヒト肝細胞をInVitroTechnologiesメリーランド州ボルチモアから購入した。細胞は、10ウシ胎児血清InvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド、100単位/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシンInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッドを補充した高グルコースDMEMInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド中で培養した。細胞は、製造供給元からの受領に際してオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。初代カニクイザル肝細胞:プレーティング前の初代カニクイザル肝細胞をInVitroTechnologiesメリーランド州ボルチモアから購入した。細胞は、10ウシ胎児血清InvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド、100単位/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシンInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッドを補充した高グルコースDMEMInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッド中で培養した。細胞は、製造供給元からの受領に際してオリゴヌクレオチドで処理した。アンチセンス化合物での処理:細胞が65~75コンフルエンシーに達した場合にそれらをオリゴヌクレオチドで処理した。96ウェルプレートで増殖させた細胞については、ウェルを100μLのOPTI-MEMTM-1減血清培地若しくは高グルコース無血清MEMInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッドで1回洗浄し、そしてその後、3.75μg/mLのリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬InvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッドおよび所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含有する130μLのOPTI-MEMTM-1培地で処理した。細胞は三重で処理しかつデータを得る。37°Cでの4~7時間の処理後に培地を新鮮培地と交換した。細胞はオリゴヌクレオチド処理の16~24時間後に収集した。使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は細胞株ごとに異なる。特定の細胞株の至適のオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞をある範囲の濃度の陽性対照オリゴヌクレオチドで処理する。ヒト細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドを、ヒトH-rasを標的とするISIS13920TCCGTCATCGCTCCTCAGGG、配列番号1若しくはヒトJun-N末端キナーゼ-2JNK2を標的とするISIS18078GTGCGCGCGAGCCCGAAATC、配列番号2のいずれかから選択する。双方の対照はホスホロチオエートバックボーンをもつ2’-O-メトキシエチルギャップマー2’-O-メトキシエチルを太字で示すである。マウス若しくはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスおよびラット双方のc-rafを標的とするホスホロチオエートバックボーンをもつ2’-O-メトキシエチルギャップマー2’-O-メトキシエチルを太字で示す、ISIS15770、ATGCATTCTGCCCCCAAGGA、配列番号3である。c-H-rasISIS13920について、JNK2ISIS18078について若しくはc-rafISIS15770についてmRNAの80阻害をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度をその後、その細胞株のその後の実験での新たなオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。80阻害が達成されない場合は、c-H-ras、JNK2若しくはc-rafmRNAの60阻害をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度をその後、その細胞株のその後の実験でのオリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。60阻害が達成されない場合、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に適しないとみなす。本明細書で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は50nMから300nMまでである。C反応性タンパク質発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析C反応性タンパク質発現のアンチセンス調節は当該技術分野で既知の多様な方法でアッセイし得る。例えば、C反応性タンパク質のmRNAレベルを、例えばノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応PCR、若しくはリアルタイムPCRRT-PCRにより定量し得る。リアルタイム定量的PCRが現在好ましい。RNA分析は全細胞RNA若しくはポリAmRNAで実施し得る。本発明の好ましいRNA分析方法は、本明細書の他の実施例で記述されるところの全細胞RNAの使用である。RNAの単離方法は当該技術分野で公知である。ノーザンブロット分析もまた当該技術分野で慣例である。リアルタイム定量的PCRは、PE-AppliedBiosystems、カリフォルニア州フォスターシティから入手可能かつ製造元の説明書に従って使用される商業的に入手可能なABIPRISMTM7600、7700若しくは7900配列検出装置を使用して便宜的に達成し得る。C反応性タンパク質のタンパク質レベルは、免疫沈降法、ウエスタンブロット分析イムノブロット、酵素結合免疫測定法ELISA若しくは蛍光標示式細胞分取FACSのような当該技術分野で公知の多様な方法で定量し得る。C反応性タンパク質に向けられた抗体は、MSRSの抗体カタログAerieCorporation、ミシガン州バーミングハムのような多様な供給源から同定しかつ得ることができるか、または、当該技術分野で公知の慣習的モノクローナル若しくはポリクローナル抗体生成方法を介して製造し得る。C反応性タンパク質阻害剤の使用のための表現型アッセイの設計C反応性タンパク質阻害剤が本明細書に開示される方法により一旦同定されれば、該化合物を、特定の疾患状態diseasestate若しくは状態conditionの処置における有効性を暗示する測定可能なエンドポイントをそれぞれ有する1種若しくはそれ以上の表現型アッセイでさらに検討する。表現型アッセイ、キットおよびそれらの使用のための試薬は当業者に公知であり、そして、健康および疾患時のC反応性タンパク質の役割および/若しくは関連を検討するために本明細書で使用する。いくつかの商業的製造供給元のいずれか1つから購入し得る代表的表現型アッセイは、細胞生存率、細胞傷害性、増殖若しくは細胞の生存を測定するためのものMolecularProbes、オレゴン州ユージーン;PerkinElmer、マサチューセッツ州ボストン、酵素アッセイPanvera,LLC、ウィスコンシン州マディソン;BDBiosciences、ニュージャージー州フランクリンレイクス;OncogeneResearchProducts、カリフォルニア州サンディエゴ、細胞調節、シグナル伝達、炎症、酸化的過程およびアポトーシスAssayDesignsInc.、ミシガン州アンアーバーを包含するタンパク質に基づくアッセイ、トリグリセリド蓄積Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス、血管新生アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイならびに代謝アッセイChemiconInternationalInc.、カリフォルニア州テメキュラ;AmershamBiosciences、ニュージャージー州ピスカタウェイを包含する。制限しない一例において、特定の表現型アッセイに適切であると決定された細胞すなわち乳癌研究に選択されたMCF-7細胞;肥満研究のための脂肪細胞を、上述された方法により決定される至適濃度のinvitro研究から同定されたC反応性タンパク質阻害剤ならびに対照化合物で処理する。処理期間の終了時に、処理および未処理細胞を、表現型の結果およびエンドポイントを決定するためのアッセイに特異的な1種若しくはそれ以上の方法により分析する。表現型のエンドポイントは、時間若しくは処理用量に対する細胞の形態学の変化、ならびにタンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖若しくは金属のような細胞成分のレベルの変化を包含する。pH、細胞周期の段階、該細胞による生物学的指標の取り込み若しくは排出を包含する細胞状態の測定値もまた目的のエンドポイントである。処理後の細胞の遺伝子型の分析細胞の遺伝子の1種若しくはそれ以上の発現の測定もまた、C反応性タンパク質阻害剤の有効性すなわち効力の指標として使用する。特徴遺伝子、すなわち特定の疾患状態diseasestate、状態condition若しくは表現型と関連することが疑われる遺伝子を、処理および未処理双方の細胞で測定する。本明細書に記述される表現型アッセイにかけられる細胞は、invitro培養物、またはヒトおよびヒト以外の双方の生存生物体から単離された組織若しくは液体由来である。ある態様において、組織およびその構成細胞は、限定されるものでないが血液例えばヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞のような造血細胞、CD34細胞CD4細胞、リンパ球および他の血液系統の細胞、骨髄、脳、幹細胞、血管、肝、肺、骨、乳房、軟骨、子宮頚部、結腸、角膜、胚、子宮内膜、内皮、上皮、食道、筋膜、線維芽細胞、小胞follicular、神経節細胞、膠細胞、杯細胞、腎、リンパ節、筋、ニューロン、卵巣、膵、末梢血、前立腺、皮膚、皮膚、小腸、脾、胃、精巣および胎児組織を挙げることができる。他の態様において、液体およびその構成細胞は、限定されるものでないが、血液、尿、滑液、リンパ液および脳脊髄液を挙げることができる。表現型アッセイは、exvivoでC反応性タンパク質阻害剤で処理した組織でもまた実施しうる。RNAの単離ポリAmRNAの単離ポリAmRNAはMiuraらClin.Chem.、1996、42、1758-1764に従って単離した。他のポリAmRNAの単離方法は当該技術分野で慣例である。簡潔には、96ウェルプレ―トで増殖させた細胞については、細胞から増殖培地を除去し、そして各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。60μLの溶解緩衝液10mMトリス-HCl、pH7.6、1mMEDTA、0.5MNaCl、0.5NP-40、20mMバナジル-リボヌクレオシド複合体を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌し、そしてその後室温で5分間インキュベートした。55μLのライセートを、オリゴdT被覆した96ウェルプレートAGCTInc.、カリフォルニア州アービンに移した。プレートを室温で60分間インキュベートし、200μLの洗浄緩衝液10mMトリス-HClpH7.6、1mMEDTA、0.3MNaClで3回洗浄した。最後の洗浄後にプレートの水気をペーパータオルで拭き取って過剰の洗浄緩衝液を除去しかつその後5分間風乾した。70°Cに前加熱した60μLの溶出緩衝液5mMトリス-HClpH7.6を各ウェルに添加し、プレートを90°Cのホットプレート上で5分間インキュベートし、そして溶出物をその後新しい96ウェルプレ―トに移した。100mm若しくは他の標準的プレート上で増殖させた細胞は、適切な容量の全部の溶液を使用して同様に処理しうる。全RNAの単離全RNAは、製造元の推奨する手順に従い、QiagenInc.カリフォルニア州バレンシアから購入したRNEASY96TMキットおよび緩衝液を使用して単離した。簡潔には、96ウェルプレ―ト上で増殖させた細胞については、細胞から増殖培地を除去し、そして各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。150μLの緩衝液RLTを各ウェルに添加し、そしてプレートを20秒間活発に攪拌した。150μLの70エタノールをその後各ウェルに添加し、そしてピペットで3回出し入れすることにより内容物を混合した。サンプルをその後、廃棄物収集トレイを取り付けかつ真空源に接続したQIAVACTMマニホールドに接続したRNEASY96TMウェルプレートに移した。真空を1分間適用した。500μLの緩衝液RW1をRNEASY96TMプレートの各ウェルに添加しかつ15分間インキュベートし、そして真空を再度1分間適用した。追加の500μLの緩衝液RW1をRNEASY96TMプレートの各ウェルに添加し、そして真空を2分間適用した。1mLの緩衝液RPEをその後RNEASY96TMプレートの各ウェルに添加し、そして真空を90秒間適用した。その後緩衝液PRE洗浄を反復し、そして真空を追加の3分間適用した。その後プレートをQIAVACTMマニホールドから取り外し、そしてペーパータオルで水分を拭き取った。プレートをその後、1.2mL収集チューブを含有する収集チューブラックに取り付けたQIAVACTMマニホールドに再接続した。その後、RNAを、140μLのRNアーゼを含まない水を各ウェルにピペットで入れること、1分インキュベートすること、およびその後真空を3分間適用することにより溶出した。反復ピペッティングおよび溶出段階は、QIAGENRBIO-ROBOTTM9604Qiagen,Inc.、カリフォルニア州バレンシアを使用して自動化しうる。本質的には、培養プレート上で細胞を溶解した後に、プレートをロボットデッキに移し、そこでピペッティング、DNアーゼ処理および溶出段階を実施する。C反応性タンパク質のmRNAレベルのリアルタイム定量的PCR分析C反応性タンパク質のmRNAレベルの定量は、製造元の説明書に従ってABIPRISMTM7600、7700若しくは7900配列決定装置PE-AppliedBiosystems、カリフォルニア州フォスターシティを使用するリアルタイム定量的PCRにより達成した。これは、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応PCR産物のハイスループット定量を可能にする、閉鎖管のゲルに基づかない蛍光検出装置である。増幅産物をPCRが完了した後に定量する標準的PCRと対照的に、リアルタイム定量的PCRでの産物はそれらが蓄積する際に定量される。これは、フォワードおよびリバースPCRプライマーの間で特異的にアニーリングしかつ2種の蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブをPCR反応に包含することにより達成される。レポーター色素例えば、PE-AppliedBiosystems、カリフォルニア州フォスターシティ、OperonTechnologiesInc.、カリフォルニア州アラメダ、若しくはIntegratedDNATechnologiesInc.、アイオワ州コーラルビルのいずれかから得られるFAM若しくはJOEはプローブの5’端に結合し、また、クエンチャー色素例えば、PE-AppliedBiosystems、カリフォルニア州フォスターシティ、OperonTechnologiesInc.、カリフォルニア州アラメダ若しくはIntegratedDNATechnologiesInc.、アイオワ州コーラルビルのいずれかから得られるTAMRAはプローブの3’端に結合する。プローブおよび色素が無傷である場合、レポーター色素の発色は3’のクエンチャー色素の近接により消光される。増幅の間は、標的配列への該プローブのアニーリングが、Taqポリメラーゼの5’-エキソヌクレアーゼ活性により切断され得る基質を創製する。PCR増幅周期の伸長期の間は、Taqポリメラーゼによるプローブの切断が、プローブの残部からおよびこれゆえにクエンチャー部分からレポーター色素を遊離し、そして配列特異的な蛍光シグナルが生成される。各周期で、付加的なレポーター色素分子がそれらのそれぞれのプローブから切断され、そして、蛍光強度を、ABIPRISMTM配列決定装置に作り付けのレーザー光学により定期的間隔でモニターする。各アッセイで、未処理の対照サンプルからのmRNAの連続希釈を含有する一連の同時反応が標準曲線を生成し、それを使用して、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パ―セントを定量する。定量的PCR分析前に、測定されている標的遺伝子に特異的なプライマー-プローブの組を、GAPDH増幅反応で多重化されるそれらの能力について評価する。多重化において、標的遺伝子および内的標準遺伝子GAPDHの双方が単一サンプル中で同時に増幅される。この分析では、未処理細胞から単離したmRNAを連続希釈する。各希釈を、GAPDHのみ、標的遺伝子のみ一重化若しくは双方多重化に特異的なプライマー-プローブの組の存在下で増幅する。PCR増幅後に、GAPDHおよび標的mRNAのシグナルの希釈の関数としての標準曲線を、一重化および多重化双方のサンプルから生成する。多重化したサンプルから生成したGAPDHおよび標的のシグナルの傾きおよび相関係数の双方が、一重化サンプルから生成したそれらの対応する値の10以内にある場合には、その標的に特異的なプライマー-プローブの組は多重化可能とみなされる。他のPCR方法もまた当該技術分野で既知である。遺伝子標的の量は逆転写リアルタイムPCRにより得られる。リアルタイムPCRの前に、相補DNAcDNAを生成する目的上、単離したRNAを逆転写RT反応にかける。逆転写酵素およびリアルタイムPCRの試薬はInvitrogenCorporation、カリフォルニア州カールズバッドから得た。RT、リアルタイムPCR反応は、30μLの全RNA溶液20~200ngを含有する96ウェルプレートに20μLのPCRカクテルMgCl2を含まない2.5×PCR緩衝液、6.6mMMgCl2、375μMのdATP、dCTP、dCTPおよびdGTPのそれぞれ、375nMのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのそれぞれ、125nMのプローブ、4単位のRNアーゼ阻害剤、1.25単位のPLATINUMRTaq、5単位のMuLV逆転写酵素および2.5×ROX色素を添加することにより実施した。RT反応は48°Cで30分間のインキュベーションにより実施した。PLATINUMRTaqを活性化するための95°Cで10分インキュベーション後に、40周期の2段階PCRプロトコル、すなわち95°C15秒間変性次いで60°C1.5分間アニーリング/伸長を実施した。遺伝子標的の相当量を得るこの方法を本明細書でリアルタイムPCRと称する。リアルタイムPCRにより得られる遺伝子標的の量は、発現が一定である遺伝子GAPDHの発現レベルを使用してか、若しくはRiboGreenTM試薬MolecularProbes,Inc.オレゴン州ユージーンを使用して全RNAを定量することによるかのいずれかで正規化する。GAPDH発現は、リアルタイムPCRにより、多重化する標的と同時に若しくは個別に実施されることにより定量する。全RNAはRiboGreenTMRNA定量試薬MolecularProbes,Inc.オレゴン州ユージーンを使用して定量する。RiboGreenTM試薬によるRNAの定量方法はJones,L.J.ら、AnalyticalBiochemistry、1998、265、368-374に教示されている。このアッセイにおいて、170μLのRiboGreenTM操作試薬10mMトリス-HCl、1mMEDTA、pH7.5で350倍希釈したRiboGreenTM試薬を、30μLの精製した細胞RNAを含有する96ウェルプレートにピペッティングする。該プレートは485nmの励起および530nmの測定でCytofluor4000読み取り装置PEAppliedBiosystemsで読み取る。ヒトC反応性タンパク質に対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報GENBANKR受託番号M11725.1、配列番号4として本明細書に組込まれるを使用して、ヒトC反応性タンパク質配列にハイブリダイズするように設計した。ヒトC反応性タンパク質について、PCRプライマーは:フォワードプライマー:TGACCAGCCTCTCTCATGCTT配列番号5リバースプライマー:TCCGACTCTTTGGGAAACACA配列番号6であり、また、PCRプローブは:FAM-TGTCGAGGAAGGCTT-TAMRA配列番号7であり、ここでFAMは蛍光色素でありかつTAMRAはクエンチャー色素である。ヒトGAPDHについて、PCRプライマーは:フォワードプライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC配列番号8リバースプライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC配列番号9であり、また、PCRプローブは:5’JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA3’配列番号10であり、ここでJOEは蛍光レポーター色素でありかつTAMRAはクエンチャー色素である。ラットC反応性タンパク質に対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報GENBANKR受託番号M83176.1、配列番号11として本明細書に組込まれるを使用して、ラットC反応性タンパク質配列にハイブリダイズするように設計した。ラットC反応性タンパク質について、PCRプライマーは:フォワードプライマー:AAGCACCCCCAATGTCACC配列番号12リバースプライマー:GGGATGGCAGAGCCAATGTA配列番号13であり、また、PCRプローブは:FAM-TCCTGGATTCAAGCTTCTATGTGCCTTCA-TAMRA配列番号14であり、ここでFAMは蛍光レポーター色素でありかつTAMRAはクエンチャー色素である。ラットGAPDHについて、PCRプライマーは:フォワードプライマー:TGTTCTAGAGACAGCCGCATCTT配列番号15リバースプライマー:CACCGACCTTCACCATCTTGT配列番号16であり、また、PCRプローブは:5’JOE-TTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA-TAMRA3’配列番号17であり、ここでJOEは蛍光レポーター色素でありかつTAMRAはクエンチャー色素である。C反応性タンパク質のmRNAレベルのノーザンブロット分析アンチセンス処理の18時間後に、細胞単層を冷PBSで2回洗浄し、そして1mLのRNAZOLTM試薬TEL-TESTBInc.、テキサス州フレンズウッド中で溶解した。製造元の推奨するプロトコルに従って全RNAを調製した。20マイクログラムの全RNAを、MOPS緩衝液系AMRESCO,Inc.、オハイオ州ソロンを使用して1.1ホルムアルデヒドを含有する1.2アガロースゲルを通過する電気泳動により分画した。RNAは、ノーザン/サザン転写緩衝液系TEL-TESTBInc.、テキサス州フレンズウッドを使用する一夜キャピラリー転写によりゲルからHYBONDTM-NナイロンメンブレンAmershamPharmaciaBiotech、ニュージャージー州ピスカタウェイに転写した。RNAの転写はUV可視化により確認した。メンブレンは、STRATALINKERTMUVCrosslinker2400装置Stratagene,Inc、カリフォルニア州ラホヤを使用してUV架橋により固定し、そしてその後、ストリンジェントな条件についての製造元の推奨を使用し、QUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液Stratagene、カリフォルニア州ラホヤを使用してプロービングした。ヒトC反応性タンパク質を検出するため、ヒトC反応性タンパク質特異的なプローブを、フォワードプライマーTGACCAGCCTCTCTCATGCTT配列番号5およびリバースプライマーTCCGACTCTTTGGGAAACACA配列番号6を使用するPCRにより製造した。負荷および転写の効率の変動について正規化するため、メンブレンを細片に切り、そしてヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素GAPDHRNAClontech、カリフォルニア州パロアルトについてプロービングした。ラットC反応性タンパク質を検出するためには、ラットC反応性タンパク質特異的なプローブを、フォワードプライマーTGACCAGCCTCTCTCATGCTT配列番号12およびリバースプライマーTCCGACTCTTTGGGAAACACA配列番号13を使用するPCRにより製造した。負荷および転写の効率の変動について正規化するため、メンブレンを細片に切り、そしてラットグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素GAPDHRNAClontech、カリフォルニア州パロアルトについてプロービングした。ハイブリダイズさせたメンブレンを、PHOSPHORIMAGERTM装置およびIMAGEQUANTTMソフトウェアV3.3MolecularDynamics、カリフォルニア州サニーベールを使用して可視化かつ定量した。データは未処理の対照でのGAPDHレベルに正規化した2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトC反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害本発明により、一連のアンチセンス化合物を、公表された配列GENBANKR受託番号M11725.1、配列番号4として本明細書に組込まれるを使用して、ヒトC反応性タンパク質RNAの多様な領域を標的とするよう設計した。該化合物を表1に示す。標的部位は、該化合物が結合する特定の標的配列の最初最も5’のヌクレオチド番号を示す。表1中の全化合物は、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。該化合物を、ヒトC反応性タンパク質のmRNAレベルに対するそれらの影響について、本明細書の他の実施例に記述されるところの定量的リアルタイムPCRにより分析した。表1に示されるデータは、サイトカインで誘導したHep3B細胞を150nMの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した3回の実験からの平均である。各データ点の陽性対照は配列番号により表中で同定される。存在する場合、N.D.はデータなしを示す。表1に示されるとおり、配列番号19、20、21、22、23、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、39、40、41、42、43、44、46、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、59、60、61、62、63、64、65、66、68、69、70および71は、このアッセイでヒトC反応性タンパク質発現の最低50の阻害を示し、そして従って好ましい。配列番号36、22および56がより好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的領域は、本明細書で好ましい標的セグメントと称され、そして従って本発明の化合物によるターゲッティングに好ましい。これらの好ましい標的セグメントを表4に示す。これらの配列はチミンTを含有することが示されているが、しかし、当業者は、チミンTはRNA配列中では一般にウラシルUにより置換されていることを認識するであろう。該配列は、表1に示される好ましいアンチセンス化合物の逆相補物reversecomplementを表す。標的部位は、該オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初最も5’のヌクレオチド番号を示す。好ましい標的セグメントのそれぞれが見出された種もまた表4に示す。本発明のさらなる態様において、第二の一連のアンチセンス化合物を、公表された配列GENBANKR受託番号M11725.1、配列番号4として本明細書に組込まれるを使用して、ヒトC反応性タンパク質RNAの多様な領域を標的とするように設計した。該化合物を表2に示す。標的部位は該化合物が結合する特定の標的配列上の最初最も5’のヌクレオチド番号を示す。表2中の全化合物は、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。該化合物を、公表された配列情報GENBANKR受託番号M11725.1、配列番号4として本明細書に組込まれるを使用して、ヒトC反応性タンパク質にハイブリダイズするように設計したプローブおよびプライマーの第二の組を使用する定量的リアルタイムPCRにより、ヒトC反応性タンパク質のmRNAレベルに対するそれらの効果について分析した。ヒトC反応性タンパク質について、PCRプライマーは:フォワードプライマー:GCTTCCCCTCTTCCCGAA配列番号73リバースプライマー:TGCGCCACTATGTAAATAATTTTCC配列番号74であり、また、PCRプローブは:FAM-TCTGACACCTGCCCCAACAAGCAATG-TAMRA配列番号75であり、ここでFAMは蛍光色素でありかつTAMRAはクエンチャー色素である。表2に示されるデータは、サイトカインで誘導したHep3B細胞を150nMの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した3回の実験からの平均である。各データ点の陽性対照は配列番号により表中で同定される。存在する場合、N.D.はデータなしを示す。表2に示されるとおり、配列番号85、95、112、121、122、129、135、136、137、145、147、149、150、154、157、159、161、162、164、166、167、170、171、173、174、175、177、178、179、180、183、185、186、190、192、193、194、196、197、198、199、201、202、203、204、205、207、208、209、210、211、212、214、215、217、220、221、222、224、228、229、234、236、237、238、240、241、242、243、244、245、246、247、249、250、252、253および255は、このアッセイにおいてヒトC反応性タンパク質発現の最低50阻害を示し、そして従って好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的領域を本明細書で好ましい標的セグメントと称し、そして従って本発明の化合物により標的とされるために好ましい。これらの好ましい標的セグメントを表4に示す。これらの配列はチミンTを含有することが示されるが、しかし、当業者は、チミンTはRNA配列中で一般にウラシルUにより置換されていることを認識するであろう。該配列は、表2に示される好ましいアンチセンス化合物の逆相補物を表す。標的部位は、該オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初最も5’のヌクレオチド番号を示す。好ましい標的セグメントのそれぞれが見出された種もまた表4に示す。2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるラットC反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害本発明により、一連のアンチセンス化合物を、公表された配列GENBANKR受託番号M83176.1、配列番号11として本明細書に組込まれるを使用して、ラットC反応性タンパク質RNAの多様な領域を標的とするように設計した。該化合物を表3に示す。標的部位は、該化合物が結合する特定の標的核酸上の最初最も5’のヌクレオチド番号を示す。表3中の全化合物は、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。該化合物を、本明細書の他の実施例で記述されるところの定量的リアルタイムPCRによりラットC反応性タンパク質のmRNAレベルに対するそれらの効果について分析した。表3に示されるデータは、初代ラット肝細胞を150nMの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した3回の実験からの平均である。存在する場合、N.D.はデータなしを示す。表3に示されるとおり、配列番号260、261、262、263、264、265、266、267、268、270、271、272、273、274、276、277,279、281、282、283、284、285、286、288および289は、この実験においてラットC反応性タンパク質発現の最低25の阻害を示し、そして従って好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的領域を本明細書で好ましい標的セグメントと称し、そして従って本発明の化合物によるターゲッティングに好ましい。これらの好ましい標的セグメントを表4に示す。これらの配列はチミジンTを含有することが示されるが、しかし、当業者は、チミジンTはRNA配列中で一般にウラシルUにより置換されていることを認識するであろう。該配列は表1、2および3に示される好ましいアンチセンス化合物の逆相補物を表す。標的部位は、該オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初最も5’のヌクレオチド番号を示す。好ましい標的セグメントのそれぞれが見出された種もまた表4に示す。これらの好ましい標的セグメントは、本発明のアンチセンス化合物とのハイブリダイゼーションに利用できかつそれらに到達可能であることが実験により見出されたため、本発明の知識を備えた当業者は、単に慣例の実験を使用して、これらの好ましい標的セグメントに特異的にハイブリダイズしかつ結果としてC反応性タンパク質の発現を阻害する他の化合物を包含する本発明のさらなる態様を認識することができるか、若しくは確認することが可能であることができる。本発明により、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、外部ガイド配列EGSオリゴヌクレオチド、選択的スプライス体、および標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他の短いオリゴマー化合物を包含する。C反応性タンパク質のタンパク質レベルのウエスタンブロット分析ウエスタンブロット分析イムノブロット分析は標準的方法を使用して実施する。細胞はオリゴヌクレオチド処理の16~20時間後に収集し、PBSで1回洗浄し、Laemmli緩衝液100μl/ウェルに懸濁し、5分間沸騰させかつ16SDS-PAGEゲルに負荷する。ゲルを150Vで1.5時間泳動し、そしてウエスタンブロッティングのためメンブレンに転写する。一次抗体種に向けられた放射標識若しくは蛍光標識した二次抗体とともに、C反応性タンパク質に向けられた適切な一次抗体を使用する。バンドをPHOSPHORIMAGERTM装置MolecularDynamics、カリフォルニア州サニーベールを使用して可視化する。2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるウサギC反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害本発明により、一連のアンチセンス化合物を、公表された配列GENBANKR受託番号M13497.1、配列番号439として本明細書に組込まれるを使用して、ウサギC反応性タンパク質のRNAの多様な領域を標的とするように設計した。該化合物を表5に示す。標的部位は、該化合物が結合する特定の標的核酸上の最初最も5’のヌクレオチド番号を示す。表5中の全化合物は、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。該化合物を、本明細書の他の実施例に記述されるところの定量的リアルタイムPCRによりウサギC反応性タンパク質のmRNAレベルに対するそれらの効果について分析した。ウサギC反応性タンパク質に対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報GENBANKR受託番号M13497.1、配列番号439として本明細書に組込まれるを使用して、ウサギC反応性タンパク質の配列にハイブリダイズするように設計した。ウサギC反応性タンパク質について、PCRプライマーは:フォワードプライマー:GGCGCGAGCTGACATATCA配列番号440リバースプライマー:CTTGGCAGAGCTCAGGGC配列番号441であり、また、PCRプローブは:FAM-TACGTGGTGAAGTACATGTCAAGCCCCAG-TAMRA配列番号442であり、ここでFAMは蛍光レポーター色素でありかつTAMRAはクエンチャー色素である。ウサギGAPDHについて、PCRプライマーは:フォワードプライマー:TGTTCTAGAGACAGCCGCATCTT配列番号443リバースプライマー:CACCGACCTTCACCATCTTGT配列番号444であり、また、PCRプローブは:5’JOE-TTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA-TAMRA3’配列番号445であり、ここでJOEは蛍光レポーター色素でありかつTAMRAはクエンチャー色素である。表5に示されるデータは、初代ウサギ肝細胞を10nMの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した3回の実験からの平均である。存在する場合、N.D.はデータなしを示す。表5に示されるとおり、配列番号494、495、498、501、502、503、506、507、508、509、510、511、513、514、515、516、517、518、519、520、521、523、524、525、526、528、529、530、531、532、533、534および535は、この実験でウサギC反応性タンパク質の発現の最低25の阻害を示し、そして従って好ましい。2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトC反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害:用量応答試験本発明のさらなる一態様において、5種のオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験のため選択した。サイトカインで誘導したHep3B細胞を50、100および150nMのISIS133712、133719、133726、140180および140177で処理し、そして、本明細書の他の実施例で記述されるとおりオリゴヌクレオチド処理の24時間後にmRNAレベルを測定した。未処理細胞が対照としてはたらいた。これらの試験の結果を表6に示す。データは2回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した対照の阻害パーセントとして表す。表6に示されるとおり、ISIS133712、ISIS133726およびISIS140180はヒトC反応性タンパク質のmRNAレベルの低下で用量依存性の様式で有効であり、そして従って本発明の好ましい化合物である。2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるラットC反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害:用量応答試験本発明のさらなる一態様において、3種のオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験に選択した。ラット初代肝細胞を50、150および300nMのISIS197181、197178、197183および197190で処理した。標的mRNAのレベルを、本明細書の他の実施例に記述されるとおりオリゴヌクレオチド処理後24時間に測定した。未処理の細胞が対照としてはたらいた。これらの試験の結果を表7に示す。データは3回の実験からの平均であり、そして対照の阻害パーセントとして表す。表7に示されるとおり、ISIS197181、ISIS197178、ISIS197183およびISIS197190は、ラットC反応性タンパク質のmRNAレベルの低下で用量依存性の様式で有効であり、そして従って本発明の好ましい化合物である。2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるラットC反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害:invivo用量応答試験本発明のさらなる一態様において、3種のオリゴヌクレオチドを付加的なinvivo用量応答試験に選択した。3月齢の雄性Sprague-Dawleyラットが、生理的食塩水または1、10若しくは25mg/kgのISIS197178配列番号275、ISIS197183配列番号280およびISIS197190配列番号287の皮下注入を週2回2週間受領した。処置期間の終了時に動物を殺し、そして肝の標的mRNAレベルを本明細書の他の実施例に記述されるところのリアルタイムPCRにより測定した。生理的食塩水で処置した動物が対照としてはたらいた。ラット肝のC反応性タンパク質のmRNAレベルは、ISIS197178の1回の1mg/kg投与後に5、また、ISIS197190の1回の10mg/kg投与後に18低下した。2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるウサギC反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害:用量応答試験本発明のさらなる一態様において、4種のオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験に選択した。ウサギ初代肝細胞を10、50150および300nMのISIS280279、280290、280298および282303で処理した。本明細書の他の実施例で記述されるとおり、オリゴヌクレオチド処理の24時間後にmRNAレベルを測定した。未処理の細胞が対照としてはたらいた。これらの試験の結果を表8に示す。データは2回の実験からの平均であり、そして対照の阻害パーセントとして表す。表8に示されるとおり、ISIS280303およびISIS280290は、C反応性タンパク質のmRNAレベルの低下で用量依存性の様式で有効であり、そして従って本発明の好ましい化合物である。カニクイザルの肝組織中でのC反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害ISIS133726さらなる一態様において、雄性カニクイザルをISIS133726配列番号36で処置し、そしてC反応性タンパク質のmRNAのレベルを肝組織中で測定した。雄性カニクイザルを2処置群すなわち対照動物n=4;生理的食塩水処置のみおよび処置動物n=8;ISIS133726で処置に分割した。処置群の動物にはそれぞれ10mg/kgおよび20mg/kgのISIS133726を皮下に週2回4週間投与した。対照群の動物は生理的食塩水のみで処置した。3日後に全動物を殺し、そしてC反応性タンパク質のmRNAの分析のため肝を採取した。mRNAのレベルは生理的食塩水で処置した動物のものに正規化した。10mg/kgおよび20mg/kgのISIS133726で処置した動物において、肝内のC反応性タンパク質のmRNAレベルはそれぞれ42および69低下した。肝酵素ALTおよびASTのレベルを毎週測定し、そして変化は示されず、オリゴヌクレオチド処置の進行中の毒性効果がないことを示す。本試験の結果は、ISIS133726での処置に際しての肝のC反応性タンパク質のmRNAの有意の低下を示す。2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスC反応性タンパク質発現の調節本発明により、一連のアンチセンス化合物を、公表された配列GENBANKR受託番号NM_007768.1、配列番号540として本明細書に組込まれるを使用して、マウスC反応性タンパク質RNAの多様な領域を標的とするように設計した。該化合物を表9に示す。標的部位は、該化合物が結合する特定の標的核酸上の最初最も5’のヌクレオチド番号を示す。表9中の全化合物が、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。該化合物を、本明細書の他の実施例に記述されるところの定量的リアルタイムPCRにより、マウスC反応性タンパク質のmRNAレベルに対するそれらの効果について分析した。マウスC反応性タンパク質に対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報GENBANKR受託番号NM_007768.1、配列番号540として本明細書に組込まれるを使用して、マウスC反応性タンパク質配列にハイブリダイズするように設計した。マウスC反応性タンパク質について、PCRプライマーは:フォワードプライマー:TGGATTGATGGGAAACCCAA配列番号541リバースプライマー:GCATCTGGCCCCACAGTG配列番号542であり、また、PCRプローブは:FAM-TGCGGAAAAGTCTGCACAAGGGC-TAMRA配列番号543であり、ここでFAMは蛍光レポーター色素でありかつTAMRAはクエンチャー色素である。マウスGAPDHについて、PCRプライマーは:フォワードプライマー:GGCAAATTCAACGGCACAGT配列番号544リバースプライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT配列番号545であり、また、PCRプローブは:5’JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA3’配列番号546であり、ここでJOEは蛍光レポーター色素でありかつTAMRAはクエンチャー色素である。表9に示されるデータは、初代マウス肝細胞を150nMの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した1回の実験からである。該データは対照の未処理細胞に関する発現パーセントとして提示する。存在する場合、N.D.はデータなしを示す。2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスC反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害:用量応答試験本発明のさらなる一態様において、7種のオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験に選択した。初代マウス肝細胞を10、50150および300nMのISIS133688、133697、133702、133708、147880、147868、147883で処理した。mRNAレベルは本明細書の他の実施例で記述されるとおりオリゴヌクレオチド処理の24時間後に測定した。未処理の細胞が対照としてはたらいた。これらの試験の結果を表10に示す。データは3回の実験からの平均であり、そして対照の阻害パーセントとして表す。表10に示されるとおり、ISIS113697および147868はC反応性タンパク質発現を用量依存性の様式で阻害した。invivoでのウサギC反応性タンパク質のアンチセンス阻害本発明のさらなる一態様において、ISIS280303配列番号533をウサギでのC反応性タンパク質に対するその効果について試験した。雄性ニュージーランドホワイトラビットは通常飼料を給餌され、そして20mg/kgのISIS280303の皮下注入を週2回3週間受領した。生理的食塩水を注入した動物が対照としてはたらいた。オリゴヌクレオチドおよび生理的食塩水注入群はそれぞれ4動物を包含した。処置期間の終了時に動物を殺し、そしてRNA抽出のため肝を単離した。肝でのC反応性タンパク質のmRNAレベルを、本明細書の他の実施例により記述されるところのリアルタイムPCRにより測定した。生理的食塩水対照に関して、ISIS280303はC反応性タンパク質のmRNA発現を52阻害した。アテローム硬化性斑形成の研究のためのウサギモデルワタナベ遺伝性高脂血症WHHL系統のウサギがアテローム硬化性斑形成のモデルとして使用されている。高脂肪飼料を給餌したニュージーランドホワイトラビットもまたアテローム硬化性斑形成のモデルとして使用されている。WHHL若しくは高脂肪飼料を給餌したニュージーランドホワイトラビットのC反応性タンパク質アンチセンス化合物での処置を、アテローム硬化性斑疾患の治療的若しくは予防的処置としてのそれらの可能性を試験するのに使用する。ウサギに、5、10、29若しくは50mg/kgのC反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを注入する。生理的食塩水単独若しくは対照オリゴヌクレオチドで処置した動物が対照としてはたらく。処置の間、血清サンプルを収集し、そしてコレステロール、LDLコレステロール、VLDLコレステロール、HDLコレステロールおよびトリグリセリドを包含する血清脂質について、慣例の臨床分析により評価する。肝組織のトリグリセリド含量はトリグリセリドGPOアッセイSigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイスを使用して測定する。肝、腎、心、大動脈および他の組織を獲得し、そして慣例の手順を使用して組織学的分析のため処理する。肝および腎組織を好塩基性顆粒および炎症浸潤の証拠について検査する。大動脈は、アテローム硬化を可視化するため、慣例の手順を使用してズダンIVのような色素で染色する。大動脈組織はまた、慣例の組織学的手順を使用してパラフィンに埋込みかつ切片に切断し、そして該切片を内膜病変の存在について評価する。アテローム硬化性斑形成のマウスモデル:LDL受容体遺伝子を欠くヒトC反応性タンパク質トランスジェニックマウスLDL受容体はC反応性タンパク質を含有するLDL粒子の消失の原因である。LDL受容体なしでは、動物はC反応性タンパク質を含有するLDL粒子を血漿から効果的に消失し得ず、従ってC反応性タンパク質およびLDLコレステロールの血清濃度が顕著に上昇する。ヒトC反応性タンパク質導入遺伝子を発現するマウスTgN-hApoB/およびLDL受容体について欠損のマウスLDLr-/-は双方ともアテローム硬化性斑発生の動物モデルとして使用されている。LDL受容体欠損の遺伝子型がヒトC反応性タンパク質トランスジェニックの遺伝子型と組合される場合TgN-hApoB/;LDLr-/-にアテローム硬化性斑が迅速に発生する。本発明により、この遺伝的背景のマウスを使用して、アテローム硬化症および斑形成を予防する化合物の能力を検討する。雄性TgN-hApoB/;LDLr-/-マウスを、10若しくは20mg/kgのC反応性タンパク質アンチセンスオリゴヌクレオチドで週2回12週間処置する。対照群は生理的食塩水若しくは対照オリゴヌクレオチドで処置する。血清総コレステロール、HDLコレステロール、LDLコレステロールおよびトリグリセリドを、Olympus臨床検査装置OlympusAmericaInc.、ニューヨーク州メルビルを使用する慣例の臨床分析により2、4、6、8および12週に測定する。肝中のマウスアポリポタンパク質mRNAを12週に測定する。加えて、12週試験で使用した処置条件を用い、4か月試験をTgN-hApoB/;LDLr-/-マウスで実施する。マウスはC反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドで4か月間処置して、アテローム硬化性斑の形成を予防するこうした化合物の能力を評価する。血清総コレステロール、HDLコレステロール、LDLコレステロールおよびトリグリセリドを、Olympus臨床検査装置OlympusAmericaInc.、ニューヨーク州メルビルを使用する慣例の臨床分析により2、4、6、8、12および16週に測定する。肝中のマウスC反応性タンパク質mRNAを16週にリアルタイムPCRにより測定する。4か月の処置期間の終了時に、追加の処置マウスを麻酔しかつ10ホルマリンで灌流する。灌流した動脈樹枝状分岐を単離し、そしてアテローム硬化性斑の存在について検査する。動脈樹枝状分岐の切片をパラフィンに埋込みかつ慣例の方法を使用する組織学的分析のため調製する。アテローム硬化性斑形成のマウスモデル:B6.129P-Apoetm1UncノックアウトマウスJacksonLaboratoryメーン州バーハーバーから得たB6.129P-ApoEtm1Uncノックアウトマウス本明細書でApoEノックアウトマウスと称するは、Apoetm1Unc突然変異についてホモ接合性であり、そして齢若しくは性により影響を受けない総血漿コレステロール濃度の顕著な増大を示す。これらの動物は3月齢で近位大動脈中に脂肪線条を提示する。これらの病変は齢とともに増大しかつより少ない脂質しかしより細長い細胞を伴う病変前アテローム硬化性病変のより進行した段階に典型的に進行する。これらのマウスにおける突然変異はアポリポタンパク質EApoE遺伝子に存する。ApoEタンパク質の主な役割はコレステロールおよびトリグリセリドを身体中に輸送することである。それはリポタンパク質構造を安定化し、低密度リポタンパク質受容体LDLRおよび関連タンパク質に結合し、そしてHDLの1サブクラスに存在してそれらにLDLRに結合する能力を提供する。ApoEは肝および脳中で最も豊富に発現されている。雌性B6.129P-Apoetm1UncノックアウトマウスApoEノックアウトマウスを以下の試験で使用して、アテローム硬化性斑形成を予防するための潜在的化合物としてC反応性タンパク質アンチセンスオリゴヌクレオチドを評価した。雌性ApoEノックアウトマウスは齢が5から7週までの範囲にわたり、そして試験開始前2週間、通常飼料を与える。ApoEノックアウトマウスにその後、0.15の追加したコレステロールを含む60脂肪飼料を任意に摂取させて脂質代謝異常および肥満を誘発させる。対照動物は、追加したコレステロールを含まない高脂肪飼料で維持する。一夜絶食後に各群からのマウスに5、25若しくは50mg/kgのC反応性タンパク質を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを3日ごとに6週間腹腔内に投与する。対照群は対照オリゴヌクレオチドを注入する動物および生理的食塩水を注入する動物よりなる。処置期間中および終了時に、血糖値、コレステロール総コレステロール、HDLコレステロールおよびLDLコレステロール、トリグリセリドならびに肝酵素レベルをOlympus臨床検査装置OlympusAmericaInc.、ニューヨーク州メルビルを使用する慣例の臨床分析により測定する。試験終了時および最終注入48時間後に動物を殺し、そしてリアルタイムPCRにより肝中の標的mRNAレベルについて評価する。処置期間の終了時に、追加の処置マウスを麻酔しかつ10ホルマリンで灌流する。灌流した動脈樹枝状分岐を単離しかつアテローム硬化性斑の存在について検査する。動脈樹枝状分岐の切片はパラフィンに埋込みかつ慣例の方法を使用する組織学的分析のため調製する。2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトC反応性タンパク質のmRNA発現のアンチセンス阻害:用量応答試験さらなる一態様において、4種のオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験に選択した。本明細書に記述されるとおり培養した、サイトカインで誘導したHep3B細胞を、25、50、75および150nMのISIS329956配列番号149、ISIS330012配列番号205、ISIS330031配列番号224およびISIS133726配列番号36で処理した。オリゴヌクレオチド処理の24時間後に、ヒトC反応性タンパク質のmRNAレベルを、本明細書に記述されるところのリアルタイムPCRを使用して定量した。ISIS113529CTCTTACTGTGCTGTGGACA;配列番号597として本明細書に組込まれるはC反応性タンパク質を標的とせず、そして対照としてはたらいた。細胞を150および300nMのISIS113529で処理した。ISIS113529は、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。C反応性タンパク質のmRNA発現のレベルは、オリゴヌクレオチドで処理されなかったサイトカインで誘導した細胞誘導およびサイトカイン処理もオリゴヌクレオチド処理も受領しない細胞基礎でもまた測定した。この用量応答試験の結果を表11に示す。データは3回の実験からの平均である。結果は、サイトカインで誘導した細胞からのC反応性タンパク質mRNAの発現に対して正規化した。基礎のC反応性タンパク質mRNAはサイトカインで誘導した発現の11であった。150および300nMのISIS113529で処理した細胞は、サイトカインで誘導したレベルのそれぞれ76および84のC反応性タンパク質mRNAを発現した。これらのデータは、ISIS329956、ISIS330012、ISIS330031およびISIS133726が、サイトカインで誘導したHep3B細胞におけるヒトC反応性タンパク質の発現を用量依存性の様式で阻害したことを示す。Hep3B細胞によるヒトC反応性タンパク質の分泌のアンチセンス阻害:用量応答試験本発明のさらなる一態様において、4種のオリゴヌクレオチドを、サイトカインで誘導したHep3B細胞からのC反応性タンパク質の分泌に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド処理の効果を測定するための付加的な用量応答試験に選択した。本明細書に記述されるとおり培養した、サイトカインで誘導したHep3B細胞を、150および300nMのISIS329956配列番号149、ISIS330012配列番号205、ISIS330031配列番号224およびISIS133726配列番号36で処理した。細胞を150および300nMの対照オリゴヌクレオチドISIS113529配列番号597で処理した。オリゴヌクレオチド処理の24時間後に、サイトカインで誘導したHep3B細胞から培地中に分泌されたヒトC反応性タンパク質を、商業的に入手可能なキットALerCHEKInc.、メーン州ポートランドを使用するELISAにより測定した。C反応性タンパク質分泌は、オリゴヌクレオチドで処理しなかったサイトカインで誘導した細胞誘導およびサイトカイン処理もオリゴヌクレオチド処理も受領しなかった細胞基礎でもまた測定した。この用量応答試験の結果を表12に示す。データは3回の実験からの平均である。結果は、サイトカインで誘導した細胞から分泌されたC反応性タンパク質レベルに対し正規化した。培地中の基礎C反応性タンパク質レベルは、サイトカインで誘導したレベルの8であった。これらのデータは、ISIS329956、ISIS330012およびISIS133726が、サイトカインで誘導したHep3B細胞からのC反応性タンパク質の分泌を用量依存性の様式で阻害したことを示す。ISIS330031はより低用量のオリゴヌクレオチドでC反応性タンパク質の分泌を阻害した。対照オリゴヌクレオチドISIS113529はC反応性タンパク質の分泌を阻害しなかった。多様な2’-デオキシギャップおよび多様な2’-MOEウィングを有するC反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドさらなる一態様において、C反応性タンパク質を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列番号36および205のヌクレオチド配列を使用しかつ多様なギャップおよびウィングセグメント長さを使用して設計した。該化合物を表13に示す。標的部位は、該化合物が結合する特定の標的配列上の最初最も5’のヌクレオチド番号を示す。表13中の全化合物は長さが16から20ヌクレオチドまでの範囲にわたるキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ギャップ領域は、2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成されるウィングにより一方若しくは双方の側5’および3’の方向で隣接されている2’-デオキシヌクレオチドよりなる。2’-デオキシギャップの長さは10から18ヌクレオチドまで変動し、また、2’-MOEウィングの長さは1から5ヌクレオチドまで変動する。各オリゴヌクレオチドの正確な構造を表13に配置として明示する。例えば3~14~3の明示は、最初最も5’の3ヌクレオチドおよび最後最も3’の3ヌクレオチドが2’-MOEヌクレオチドでありかつギャップ中の14ヌクレオチドが2’-デオキシヌクレオチドであることを示す。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。付加的なオリゴヌクレオチドを、配列番号36および205のヌクレオチド配列を使用しかつ均一に修飾したヌクレオチドを組込んで設計した。ISIS353489およびISIS353473それぞれ配列番号36および205として本明細書に組込まれる配列は、配列番号4のそれぞれ標的部位1671および1719にハイブリダイズする。これら2化合物は、均一に、該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートヌクレオシド間結合を伴う2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。全部のシトシンは5-メチルシトシンである。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの1サブセットを、サイトカインで誘導したHep3B細胞での試験に選択した。試験した全部のオリゴヌクレオチドは、配列番号205として本明細書で表される同一のヌクレオチド配列を共有し、かつ、糖部分の修飾に関して変動している。細胞を本明細書に記述されるとおり培養かつ誘導し、そしてその後、50、100および200nMのISIS353470、ISIS353512、ISIS353472、ISIS353473およびISIS330012で24時間処理した。サイトカインで誘導した細胞が対照としてはたらき、それに対してデータを正規化した。C反応性タンパク質のmRNAは本明細書に記述されるところのリアルタイムPCRにより測定した。表14に示されるデータは3回の実験の平均を表し、そしてサイトカイン処理のみを受領する細胞からのデータに対して正規化されている。ギャップマーについて、各オリゴヌクレオチドの配置を表13について記述されたと同一の様式で示す。均一に2’-MOEヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドは均一2’-MOEにより示す。付加的なオリゴヌクレオチドを、配列番号36および205のヌクレオチド配列を使用しかつ化合物中に異なるヌクレオシド間結合を使用して設計した。ISIS353514およびISIS353515それぞれ配列番号36および205として本明細書に組込まれる配列は配列番号4のそれぞれ標的部位1671および1719にハイブリダイズする。これら2化合物は、2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される3ヌクレオチドのウィングセグメントにより双方の側5’および3’で隣接されている2’-デオキシヌクレオチドから構成される14ヌクレオチドのギャップセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドである。ヌクレオチド2と3との間、およびヌクレオチド18と19との間のヌクレオシド間結合はホスホジエステルである。該化合物中の全部の他のヌクレオシド結合はホスホルチオエートである。全部のシトシンは5-メチルシトシンである。付加的なオリゴヌクレオチドを、ヒトC反応性タンパク質の公的に入手可能な配列配列番号4として本明細書に組込まれるを使用して設計した。該化合物を表15に示す。標的部位は、該化合物が結合する特定の標的配列上の最初最も5’のヌクレオチド番号を示す。これらの化合物は、ギャップセグメントがオリゴマー化合物の3’若しくは5’いずれかの末端に配置されかつ2’-デオキシヌクレオチドよりなる、長さ15ヌクレオチドのヘミマーすなわち開放端型の化合物である。残存するセグメントは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。各オリゴヌクレオチドの正確な構造は表15中に配置として明示する。例えば5~10という明示は、第一の化学修飾の5ヌクレオチドセグメントが5’末端にありかつ第二の化学修飾の10ヌクレオチドセグメントが3’末端にあることを示す。2’-MOE~2’-デオキシという明示は、5’末端が2’-MOEヌクレオチドから構成されかつ3’末端が2’-デオキシヌクレオチドから構成されることを示し;2’-MOEヌクレオチドはさらに太字で示す。存在する場合、Oはヌクレオシド間バックボーン結合がホスホジエステルであることを示す。全部の他のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトC反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害:用量応答試験さらなる一態様において、ヒトC反応性タンパク質を標的とするオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験に選択した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後に、C反応性タンパク質のmRNAおよび分泌されたタンパク質を、本明細書に記述されるとおり培養しかつHep3B細胞について本明細書に記述されるとおりサイトカインで誘導した初代ヒト肝細胞で測定した。初代ヒト肝細胞を、12.5、25、50、100および200nMのISIS330012配列番号205およびISIS133726配列番号36で処理した。オリゴヌクレオチド処理を受領しなかった、サイトカインで誘導した細胞が対照としてはたらき、全部のデータをそれに対して正規化した。いずれもC反応性タンパク質を標的としない、ISIS13650TCCCGCCTGTGACATGCATT、配列番号614およびISIS113529配列番号597が対照オリゴヌクレオチドとしてはたらいた。細胞を100および200nMのISIS113529およびISIS13650で処理した。ISIS13650は、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。C反応性タンパク質のmRNAレベルを、オリゴヌクレオチド処理の24時間後に、本明細書の他の実施例に記述されるところのリアルタイムPCRにより測定した。これらの試験の結果を表16に示す。データは3回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した細胞からのデータに関するmRNA発現のパーセントとして表す。存在する場合、N.D.は測定されなかったことを示す。表16に示されるとおり、25、50、100および200nMの用量のISIS330012および133726は、オリゴヌクレオチド処理の24時間後にC反応性mRNAの発現を用量依存性の様式で阻害した。さらなる一態様において、表16に提示される同一の実験で、サイトカインで誘導した初代ヒト肝細胞から組織培地中に分泌されたC反応性タンパク質を、オリゴヌクレオチド処理の24時間後に商業的に入手可能なキットALerCHEKInc.、メーン州ポートランドを使用するELISAにより測定した。表17に示されるデータは3回の実験からの平均であり、そして、サイトカインで誘導した対照に関する分泌されたタンパク質のパーセントとして表す。存在する場合、N.D.は測定されなかったことを示す。表17に示されるとおり、ISIS330012はオリゴヌクレオチド処理の24時間後のC反応性タンパク質の分泌を阻害した。さらなる一態様において、サイトカインで誘導した初代ヒト肝細胞中でのC反応性タンパク質のmRNAレベルを、オリゴヌクレオチド処理の48時間後に測定した。細胞を12.5、25、50、100および200nMのISIS330012およびISIS133726で処理した。ISIS13650およびISIS113529が対照オリゴヌクレオチドとしてはたらいた。細胞は100および200nMのISIS113529およびISIS13650で処理した。表18に示されるデータは3回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した対照細胞に関するmRNA発現のパーセントとして表す。存在する場合、N.D.は測定されなかったことを示す。表18に示されるとおり、ISIS330012および133726は、オリゴヌクレオチド処理の48時間後にC反応性mRNA発現を用量依存性の様式で阻害した。さらなる一態様において、48時間のISIS330012およびISIS133726での処理を反復し、そしてC反応性タンパク質のmRNAおよびタンパク質双方を測定した。C反応性タンパク質はオリゴヌクレオチド処理の48時間後にリアルタイムPCRにより測定した。表19に示されるデータは3回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した対照細胞に関するmRNA発現のパーセントとして表す。存在する場合、N.D.は測定されなかったことを示す。表19に示されるとおり、ISIS330012および133726は、オリゴヌクレオチド処理の48時間後にC反応性mRNA発現を用量依存性の様式で阻害した。さらなる一態様において、表19に提示される同一の実験で、サイトカインで誘導した初代ヒト肝細胞から組織培地中に分泌されたC反応性タンパク質を、オリゴヌクレオチド処理の48時間後に商業的に入手可能なキットALerCHEKInc.、メーン州ポートランドを使用するELISAにより測定した。表20に示されるデータは3回の実験からの平均であり、かつ、サイトカインで誘導した対照に関する分泌されたタンパク質のパーセントとして表す。存在する場合、N.D.は測定されなかったことを示す。表20に示されるとおり、ISIS330012および133726は、オリゴヌクレオチド処理の48時間後のC反応性タンパク質の発現を用量依存性の様式で阻害した。200nMの用量で、ISIS133726およびISIS330012は、サイトカインで誘導した細胞中でのC反応性タンパク質のmRNAを、基礎発現レベル、すなわちサイトカインで誘導されていない細胞で観察されるレベルより下のレベルに低下させることが可能であった。ノーザンおよびイムノブロット分析もまた、オリゴヌクレオチド処理の48時間後のC反応性タンパク質のmRNAおよびタンパク質の発現の低下を確認した。カニクイザルMacacafascicularisC反応性タンパク質mRNAの配列決定本発明により、当該技術分野で入手可能でないカニクイザルのC反応性タンパク質mRNAの一部分を増幅かつ配列決定した。ヒトC反応性タンパク質のmRNA配列GENBANKR受託番号M11725.1、配列番号4として本明細書に組込まれるの位置537ないし2201は、ISIS133726およびISIS330012がハイブリダイズする標的セグメントを含有する。カニクイザルC反応性タンパク質mRNAの対応するセグメントを、ヒト配列に対して設計した1連の8組のプライマーを使用して増幅かつ配列決定した。全RNAをカニクイザル初代肝細胞InVitroTechnologies、メリーランド州ゲイサーズバーグから精製した。逆転写を実施してcDNAを生じさせ、そして次いでおよそ40回のPCR増幅を実施した。カニクイザルフラグメントのゲル精製後に、RETROGENTMキットInvitrogenを使用して各生成物のフォワードおよびリバース配列決定反応を実施した。このキットを使用して一本鎖cDNAを創製し、そしてAMPLITAQTMPCR反応のための試薬を提供した。配列決定した生成物を集成して、カニクイザルC反応性タンパク質mRNAをほぼ完成した。このカニクイザル配列は配列番号615として本明細書に組込まれ、そしてヒトC反応性タンパク質mRNAの位置537ないし2201に93相同である。位置101-290からのヒトC反応性タンパク質と97の相同性を共有する付加的な一配列を配列番号616として本明細書に組込む。2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるカニクイザルC反応性タンパク質発現のアンチセンス阻害:用量応答試験さらなる一態様において、ヒトC反応性タンパク質を標的とするオリゴヌクレオチドを、追加の用量応答試験のため選択したを初代カニクイザル肝細胞中で標的mRNAを阻害するそれらの能力について試験した。ヒトおよびカニクイザルのC反応性タンパク質の間の高程度の同一性により、ISIS133726配列番号36およびISIS330012配列番号205は、本明細書に開示されるカニクイザルmRNA配列番号615のそれぞれ標的部位1147および1195でカニクイザルC反応性タンパク質に完全な相補性を伴いハイブリダイズする。初代カニクイザル肝細胞を、Hep3B細胞について本明細書に記述されるとおりサイトカインで誘導し、そして50、100および200nMのISIS330012配列番号205およびISIS133726配列番号36で処理した。ISIS113529配列番号597が対照オリゴヌクレオチドとしてはたらいた。細胞は150および300nMのISIS113529で処理した。C反応性タンパク質のmRNAレベルをオリゴヌクレオチド処理の24時間後に測定した。表21に示されるデータは3回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した対照に関するmRNA発現のパーセントとして表す。存在する場合、N.D.は測定されなかったことを示す。表21に示されるとおり、ISIS330012試験した全用量ならびにISIS133726150および300nMでは、オリゴヌクレオチド処理の24時間後にC反応性タンパク質のmRNA発現を用量依存性の様式で阻害した。さらなる一態様において、表21に提示される同一の実験で、サイトカインで誘導した初代カニクイザル肝細胞から組織培地中に分泌されたC反応性タンパク質を、オリゴヌクレオチド処理の24時間後に商業的に入手可能なキットALerCHEKInc.、メーン州ポートランドを使用するELISAにより測定した。表22に示されるデータは3回の実験からの平均であり、そしてサイトカインで誘導した対照細胞に関する分泌されたタンパク質のパーセントとして表す。存在する場合、N.D.は測定されなかったことを示す。表22に示されるとおり、ISIS330012および133726は、オリゴヌクレオチド処理の48時間後のC反応性タンパク質の分泌を用量依存性の様式で阻害した。これらのデータは、ISIS133726およびISIS330012が、ヒトC反応性タンパク質のmRNA発現を標的とするよう設計されている一方で、カニクイザル初代肝細胞中でのC反応性タンパク質のmRNAおよび分泌型タンパク質双方を阻害することが可能であり、そして従ってinvivoでカニクイザルC反応性タンパク質の阻害を試験するのに使用し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを示す。invivoでのC反応性タンパク質のアンチセンス阻害:カニクイザルカニクイザル雄性若しくは雌性は、C反応性タンパク質のmRNA若しくはタンパク質レベルを低下させるそれらの潜在能力、ならびに、限定されるものでないが心血管系指標、アテローム硬化症、脂質疾患、肥満および斑形成を挙げることができるC反応性タンパク質と関連する表現型のエンドポイントについてアンチセンスオリゴヌクレオチドを評価するのに有用である。一試験は、脂質およびコレステロールが正常であるか若しくは高い飼料を給餌された、正常および誘発された高コレステロール血症のサルを包含する。該試験期間中に観察するパラメータは:総血漿コレステロール、LDLコレステロール、HDLコレステロール、トリグリセリド、動脈壁のコレステロール含量および冠動脈内膜肥厚を包含する。さらなる一態様において、アテローム発生性飼料を給餌したカニクイザルは、ヒトのアテローム硬化症に対する多くの類似点を伴うアテローム硬化症を発症し、そしてアテローム硬化症を予防若しくは改善するアンチセンス化合物の潜在能力を評価するのに使用される。雌性カニクイザルはリポタンパク質および心血管系でいくつかの類似点をヒトと共有している。これらの特徴に加え、生殖生物学の類似点が存在する。カニクイザルのメスはヒトのものに類似の28日の月経周期を有する。血漿ホルモン濃度がカニクイザルの月経周期を通じて測定されており、また、卵胞期および黄体期の持続期間、ならびに周期にわたる血漿エストラジオールおよびプロテステロン濃度もまた女性のものに著しく類似している。C反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、カニクイザルで有効性および毒性について評価する。これらの試験のため選んだオリゴヌクレオチドは、ヒトおよびサル双方のC反応性タンパク質のmRNAの3’UTRの2個の別個の領域にハイブリダイズする。ISIS133726配列番号36およびISIS330012配列番号205は、本明細書に記述されるところの5~10~5の配置をもつキメラオリゴヌクレオチドである。ISIS353512配列番号36およびISIS353491配列番号205は、それぞれ本明細書に記述されるところの3~14~3の配置をもつ同一のキメラオリゴヌクレオチドである。カニクイザルは表23に記述されるとおり処置する。表23に提示される9群のそれぞれは5動物よりなり、そしてこれらの群のそれぞれ中の雄性および雌性の数は同一である。全動物に、試験第1、3、5、8、11、15、18、22、25および29日に皮下注入を介して投与する。投与の第一日を第1日と指定する。動物は全般的外観および挙動、飼料消費量ならびに体重の変化について評価する。血液サンプルは、試験の開始前に1、2および3週間隔で、第1日および第29日の投与直前、ならびに投与後1、2、4および24時間、ならびに第8、15および22日の投与直前に収集する。血液サンプルは血清化学、血液学、凝固および尿分析パラメータを包含する臨床病理学評価にかける。分析される血清化学パラメータは、ナトリウム、カリウム、塩素、二酸化炭素、総ビリルビン、アルカリホスファターゼALP、乳酸脱水素酵素LDH、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAST、アラニンアミノトランスフェラーゼALT、γ-グルタミルトランスフェラーゼGGT、カルシウム、リン、血液尿素窒素BUN、クレアチニン、総蛋白、アルブミン、グロブリン、アルブミン/グロブリン比、血糖値、コレステロールおよびトリグリセリドを包含する。血液学パラメータは、赤血球RBC数、白血球WBC数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、網状赤血球数、プラスモディウム数、平均赤血球ヘモグロビンMCH、平均赤血球容積MCV、平均赤血球ヘモグロビン濃度MCHC、血小板数および血球形態学を包含する。評価される凝固パラメータは、活性化部分トロンボプラスチン時間APTTおよびプロトロンジン時間PTを包含する。評価される尿分析パラメータは、色、特徴、pH、比重、白血球エステラーゼ、亜硝酸塩、ウロビリノーゲン、尿蛋白、尿糖、ケトン、ビリルビン、潜血および顕微鏡検査を包含する。血清中のC反応性タンパク質は免疫化学発光アッセイICMAを使用して測定する。全部の臨床パラメータは当該技術分野で既知の慣例の手順を使用して測定する。加えて、毒物動態分析を実施して血清中のC反応性タンパク質オリゴヌクレオチドの濃度を測定する。さらに、インターロイキン-1、インターロイキン-6、インターロイキン-8、インターフェロン-γ、腫瘍壊死因子-α、単球走化性因子-1MCP-1、マクロファージ炎症性タンパク質-1αMIP-1α、マクロファージ炎症性タンパク質-1βMIP-1β、ならびにRANTESを包含するサイトカインおよびケモカインの血清濃度を測定して、いかなる免疫若しくは炎症応答の程度も決定する。試験第30日の生理的食塩水若しくはオリゴヌクレオチドの最終投与24時間後に動物を殺す。最終体重を記録し、そして肉眼的剖検を実施して、死体、筋/骨格系、全部の外表面および開口部、頭蓋腔ならびに脳の外表面、関連する器官および組織を伴う頚部、関連する器官および組織を伴う胸腔、腹腔および骨盤腔を評価する。尿を膀胱から収集しかつ本明細書に前述されたとおり分析する。腎、肝、肺、心および脾重量を記録する。心血管系、消化器、リンパ系/造血系、尿生殖器および内分泌組織を収集し、そして10中性緩衝ホルマリン中で保存する。生理的食塩水および20mg/kgのオリゴヌクレオチドで処置した動物から収集した組織は、10中性緩衝ホルマリン中での保存後にパラフィンに埋込み、切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そして病理学的異常について検査する。骨髄切片が変化若しくは異常を示す症例では顕微鏡検査のため骨髄スメアを収集する。ホルマリン中で保存していない収集した肝組織の一部分を、RNアーゼ活性を阻害する緩衝液中でホモジェナイズし、そして本明細書に記述されるところのリアルタイムPCRによりC反応性タンパク質のmRNA発現について評価する。この試験で評価されるパラメータが、C反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性および毒性を決定する。invivoでのヒトC反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド:痩身マウス試験さらなる一態様において、ヒトC反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、血清脂質、血糖および毒性の指標に対するそれらの効果について試験した。雄性C57Bl/6マウスCharlesRiverLaboratories、マサチューセッツ州ウィルミントンに標準的げっ歯類飼料を給餌した。マウスに、25および50mg/kgの以下のアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわちISIS133726配列番号36、ISIS329956配列番号149、ISIS330012配列番号205およびISIS330031配列番号224のそれぞれの腹腔内注入を与えた。各オリゴヌクレオチド処置群は5マウスよりなった。合計10匹の生理的食塩水を注入した動物が対照としてはたらいた。注入は週2回4週間投与した。処置期間終了時にマウスを殺した。身体、肝および脾重量を記録し、そして有意の変化は表されなかった。ALT、AST、コレステロールCHOL、血糖GLUC、HDLコレステロールHDL、LDLコレステロールLDL、トリグリセリドTRIGおよび非エステル化遊離脂肪酸NEFAの慣例の臨床分析のため血清を収集した。これらのパラメータはOlympus臨床検査装置OlympusAmericaInc.、ニューヨーク州メルビルを使用する慣例の手順により測定した。データを表24に提示する。これらのデータは、50mg/kg用量のISIS330031のみが肝トランスアミナーゼALTおよびASTの有意の増大をもたらしたことを示し、最高用量のISIS330031での肝毒性効果を示唆する。50mg/kgのISIS330031での処置はまたコレステロールおよびLDLコレステロールの増大ももたらした。コレステロールの中程度の増大が50mg/kgのISIS329956で処置した動物で観察された。非エステル化遊離脂肪酸の増大は、この試験で使用した全部のオリゴヌクレオチドで処置したマウスで観察された。これらのデータは、ヒトC反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、明白な毒性を生じさせることなく痩身マウスで標的の発現を効果的に阻害したことを示す。invivoでのC反応性タンパク質のアンチセンス阻害:ラット試験さらなる一態様において、C反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを付加的な動物モデルで試験した。標準的げっ歯類飼料で維持した雄性SpragueDawleyラットCharlesRiverLaboratories、マサチューセッツ州ウィルミントンが、75および100mg/kgのISIS197178配列番号275の腹腔内注入を週あたり1回6週間受領した。生理的食塩水を注入した動物が対照としてはたらいた。各処置群は5動物よりなった。処置期間の終了時に動物を殺し、そしてC反応性タンパク質のmRNAおよびタンパク質発現ならびに肝、ならびに血清中のC反応性タンパク質発現について評価した。mRNAは本明細書の他の実施例により記述されるところのリアルタイムPCRにより測定した。タンパク質は商業的に入手可能なキットBDBiosciences、マサチューセッツ州ベッドフォードを使用するELISAにより測定した。各処置群の5動物から平均したデータを、生理的食塩水で処置した動物からの結果に対し正規化し、そして表25に提示する。これらのデータは、ISIS197178が、肝のC反応性タンパク質のmRNAおよびタンパク質ならびに血清タンパク質を顕著に減少させたことを示す。血清C反応性タンパク質濃度の低下は、ELISAキットからのラットC反応性タンパク質抗体を使用するイムノブロット分析により確認された。これらの結果は、肝のC反応性タンパク質のmRNAの低下が血清C反応性タンパク質濃度を低下させることを示し、肝のC反応性タンパク質産生と血清濃度との間の重要な関連を具体的に説明する。C反応性タンパク質を標的とするオリゴヌクレオチドの特異性さらなる一態様において、C反応性タンパク質mRNAに対するISIS330012の特異性を検討した。BLAST検索を実施して、ISIS330012がC反応性タンパク質以外の遺伝子にハイブリダイズし得るかどうかを決定した。この検索は、ISIS330012に対する潜在的結合部位をもつ配列を伴う数種の遺伝子を示した。これらの遺伝子を表26に示し、ここに不適合の数を示す。全部の潜在的なISIS330012の標的部位は、ISIS330012に関して2~3個の不適合ヌクレオチドを含有する。配列のUnigeneID受託番号双方とも米国国立バイオテクノロジー情報センターNationalCenterforBiotechnologyInformationデータベースにより入手可能であるもまた示す。遺伝子配列中で結合部位が反復されている回数を、表26の計数欄に示す。ISIS330012が表26中の遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうかを試験するために、本明細書に記述されるとおり培養した初代ヒト肝細胞を200nMのISIS330012で48時間処理した。表26中の遺伝子の発現を、公的に入手可能な配列に対し設計したプライマーおよびプローブを使用する、本明細書に記述されるところのリアルタイムPCRにより測定した。これらのデータは、ISIS330012が表26中の遺伝子のいずれの発現も調節しなかったことを示し、初代肝細胞中ではISIS330012がC反応性タンパク質のmRNAに特異的にハイブリダイズしかつ阻害することを具体的に説明した。C反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物で処理した細胞に応答する細胞の増殖および生存細胞周期の調節は多様な癌治療薬の基礎である。調節されない細胞増殖は癌細胞の特徴であり、従って、最新の化学療法剤は、例えば細胞分裂に必要とされる新たなDNAの合成を阻害することにより分裂細胞を標的とする。しかしながら、健康な組織中の細胞もまた、細胞増殖を調節する剤により影響を及ぼされる。いくつかの場合において、細胞周期阻害剤は癌細胞でアポトーシスを引き起こすがしかし正常細胞が増殖停止を受けそして従って影響を及ぼされないままとどまることを可能にするBlagosklonny、Bioessays、1999、21、704-709;Chenら、CancerRes.、1997、57、2013-2019;EvanとLittlewood、Science、1998、281、1317-1322;LeesとWeinberg、Proc.Natl.Acad.Sci,USA、1999、96、4221-4223。抗癌剤に対する感作の一例は、腫瘍抑制遺伝子p53の低下した若しくは非存在の発現を有する細胞で観察されるBunzら、Science、1998、282、1497-1501;Bunzら、J.Clin.Invest.、1999、104、263-269;Stewartら、CancerRes.、1999、59、3831-3837;Wahlら、Nat.Med.、1996、2、72-79。しかしながら、癌細胞はしばしばアポトーシスを逃れるLoweとLin、Carcinogensis、2000、21、485-495;Reed、CancerJ.Sci.Am.、1998、4Suppl1、S8-14。癌細胞中での細胞周期の検問所のさらなる破壊は、正常細胞がG1に避難しかつ影響を及ぼされないままとどまることを可能にしつつ化学療法に対する感受性を増大させ得る。その阻害が細胞を抗癌剤に対し感作するp53のような遺伝子を同定するのに細胞周期アッセイを使用する。細胞周期アッセイC反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物の効果を、正常ヒト乳腺上皮細胞HMECならびに2種の乳癌細胞株MCF7およびT47Dで検査した。細胞株の全部はAmericanTypeCultureCollectionバージニア州マナサスから得られる。後者の2細胞株は同様の遺伝子を発現する。MCF7細胞は腫瘍抑制因子p53を発現する一方、T47D細胞はp53が欠損している。MCF-7およびHMEC細胞を、10ウシ胎児血清InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッドを補充した低グルコースDMEMInvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッド中で慣例に培養する。T47D細胞は10ウシ胎児血清を補充したDMEM高グルコース培地InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッド中で培養した。細胞は、それらがおよそ90コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。細胞は、HMEC細胞についてウェルあたりおよそ50,000~60,000細胞、MCF-7についてウェルあたりおよそ140,000細胞、およびT47D細胞についてウェルあたりおよそ170,000細胞で24ウェルプレートにプレーティングし、そしてウェルに一夜接着させた。ISIS133726配列番号36を使用して、細胞周期の進行に対するC反応性タンパク質のアンチセンス阻害の効果を試験した。無作為化対照オリゴヌクレオチドISIS29848NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN;ここでNはA、T、C若しくはGであり;配列番号617として本明細書に組込まれるが、陰性対照すなわち細胞周期の進行を調節しない化合物を使用された。加えて、細胞増殖の阻害の陽性対照をアッセイした。陽性対照は、ヒトJagged2を標的としかつ細胞周期の進行を阻害することが既知であるISIS148715TTGTCCCAGTCCCAGGCCTC;配列番号618として本明細書に組込まれるであった。ISIS29248およびISIS148715は、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。オリゴヌクレオチドは、200nMのオリゴヌクレオチドおよび6μg/mLのリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッドの最終濃度を達成するように、OPTI-MEMTM媒体InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッド中でリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬と混合した。細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬およびOPTI-MEMTM媒体を徹底的に混合しかつ0.5時間インキュベートした。培地をプレートから除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。T47D若しくはMCF7細胞を含有する各ウェルを150μlのリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。HMECを含有する各ウェルは150μLのハンクス平衡塩溶液で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を100μLのオリゴヌクレオチド/OPTI-MEMTM媒体/リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬のカクテルで置き換えた。対照細胞はリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬のみを受領した。プレートを37°Cで4時間インキュベートし、その後培地を除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。100μlの完全増殖培地を各ウェルに添加した。72時間後に、慣例の手順を使用してフローサイトメトリー分析のため細胞を調製し、そして、フローサイトメーターを使用して細胞周期プロファイルを生成させるために細胞をヨウ化プロピジウムで染色した。細胞周期プロファイルはModFitプログラムVeritySoftwareHouse,Inc.、メーン州トプシャムで分析した。核DNAの断片化はアポトーシスの特質であり、そしてサブG1subG1として分類される低二倍体DNA内容物を伴う細胞の増大を生じさせる。G1期の細胞の増大はS期への進入前での細胞周期の停止を暗示し;S期の細胞の増大はDNA合成の間の細胞周期の停止を暗示し;そしてG2/M期の細胞の増大は有糸分裂直前若しくはその間の細胞周期の停止を暗示する。データを未処理の対照細胞の細胞周期プロファイルに関する各期の細胞のパーセントとして表し、そして表27に示す。これらのデータは、ISIS133726がHMEC、MCF7細胞若しくはT47D細胞中での細胞周期の進行に有意に影響を及ぼさなかったことを示す。カスパーゼアッセイプログラムされた細胞死すなわちアポトーシスは、正常細胞のターンオーバーを包含する多様な生物学的過程、ならびに免疫系および胚の発達の重要な一局面である。アポトーシスは、それらにより事象のカスケードが選ばれた一組のタンパク質の切断に至る、細胞内プロテアーゼの一ファミリーであるカスパーゼの活性化を必要とする。カスパーゼファミリーは2群、すなわち、カスパーゼ-8および-9のような開始体initiatorカスパーゼ、ならびに開始体カスパーゼにより活性化されるカスパーゼ-3、-6および-7のような実行体executionerカスパーゼに分割し得る。カスパーゼファミリーは、異なる基質の好みをもつ少なくとも14メンバーを含有するThornberryとLazebnik、Science、1998、281、1312-1316。カスパーゼアッセイは、その阻害が正常細胞に影響を及ぼすことなく乳癌細胞株においてアポトーシスを選択的に引き起こす遺伝子を同定するため、およびその阻害がp53欠損のT47D細胞中で細胞死をもたらしかつp53を発現するMCF7細胞中でもたらさない遺伝子を同定するために利用されているRossら、Nat.Genet.、2000、24、227-235;Scherfら、Nat.Genet.、2000、24、236-244。化学療法剤タキソール、シスプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、カンプトテシン、アフィジコリンおよび5-フルオロウラシルは、全部、カスパーゼ依存性の様式でアポトーシスを誘導することが示されている。本発明のさらなる一態様において、C反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物を、正常ヒト乳腺上皮細胞HMECならびに2種の乳癌細胞株MCF7およびT47Dで検査した。HMECおよびMCF7細胞はp53を発現する一方、T47D細胞はこの腫瘍抑制遺伝子を発現しない。細胞を、黒色側壁および平坦な透明底を伴う96ウェルプレートCorningIncorporated、ニューヨーク州コーニング中で、細胞周期アッセイについて記述されたとおり培養した。フェノールレッドを含むおよび含まないDMEM培地はInvitrogenLifeTechnologiesカリフォルニア州カールズバッドから得た。フェノールレッドを含むおよび含まないMEGM培地はCambrexBioscienceメリーランド州ウォーカーズビルから得た。ISIS133726配列番号36を使用して、カスパーゼ活性に対するC反応性タンパク質のアンチセンス阻害の効果を試験した。無作為化対照オリゴヌクレオチドISIS29848NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN;ここでNはA、T、C若しくはGであり;配列番号617として本明細書に組込まれるを陰性対照すなわちカスパーゼ活性を遂げない化合物として使用した。カスパーゼ活性化の陽性対照として、ヒトJagged2を標的とするオリゴヌクレオチドISIS148715配列番号618若しくはヒトNotch1を標的とするオリゴヌクレオチドISIS226844GCCCTCCATGCTGGCACAGG;配列番号619として本明細書に組込まれるもまたアッセイした。これらの遺伝子の双方は、阻害される場合にカスパーゼ活性およびその後アポトーシスを誘導することが既知である。ISIS29248、ISIS148715およびISIS226844は全部、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。オリゴヌクレオチドを、200nMのオリゴヌクレオチドおよび6μg/mLのリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッドの最終濃度を達成するように、OPTI-MEMTM媒体InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッド中でリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬と混合した。細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬およびOPTI-MEMTM媒体を徹底的に混合しかつ0.5時間インキュベートした。培地をプレートから除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。各ウェルを150μlのリン酸緩衝生理的食塩水HMEC細胞については150μLのハンクス平衡塩溶液で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を100μLのオリゴヌクレオチド/OPTI-MEMTM媒体/リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬カクテルで置き換えた。C反応性タンパク質を標的とする化合物ISIS226844およびISIS148715は三重で試験し、そしてISIS29248は6個までの複製ウェルで試験した。未処理の対照細胞はリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬のみを受領した。プレートを37°Cで4時間インキュベートし、その後培地を除去しかつプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。100μlのフェノールレッドを含まない完全増殖培地を各ウェルに添加した。カスパーゼ-3活性は、ペプチド配列DEVD中のアスパラギン酸残基の後の切断を検出する蛍光測定HTSカスパーゼ-3アッセイカタログ番号HTS02;EMDBiosciences、カリフォルニア州サンディエゴで評価した。DEVD基質は、カスパーゼ-3による切断に際して蛍光の青色から緑色へのシフトを表す蛍光分子で標識されている。オリゴヌクレオチド処理した細胞中の活性のカスパーゼ-3を、製造元の説明書に従ってこのアッセイにより測定する。オリゴヌクレオチド処理の48時間後に、10μMジチオスレイトールを含有する50μLのアッセイ緩衝液を各ウェルに添加し、次いで20μLのカスパーゼ-3蛍光基質複合物を添加した。ウェル中の蛍光を、蛍光プレートリーダーSPECTRAMAXTMGEMINIXSTM読み取り装置、MolecularDevices、カリフォルニア州サニーベールを使用して即座に検出した励起/測定400/505nm。プレートを覆い、そして37°Cでそして追加の3時間インキュベートし、その後蛍光を再度測定した励起/測定400/505nm。時間0での値を3時間で得た測定値から減算した。未処理の対照細胞から得た測定値を100活性と指定した。実験は3種の細胞型すなわちHMEC、T47DおよびMCF7のそれぞれで複製し、そして表28に結果を示す。これらのデータから、100より上若しくは下のカスパーゼ活性の値は、該化合物がカスパーゼ活性をそれぞれ刺激若しくは阻害する能力を有することを示すと考えられる。データは未処理の対照値に関する蛍光の増大パーセントとして示す。これらのデータから、ISIS133726によるC反応性タンパク質発現の阻害が、未処理の対照細胞の対照に比較してMCF7細胞中でのアポトーシスの阻害をもたらしたことが明らかである。これらのデータは、このオリゴマー化合物が、アポトーシスの阻害が望ましい状態の処置、例えば神経変性性障害における応用を伴う候補の剤であることを示す。C反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物を使用する血管新生の阻害のアッセイ血管新生は内皮細胞による新たな血管静脈および動脈の成長である。この過程は多数のヒト疾患の発症において重要であり、そして充実性腫瘍の増殖の調節においてとりわけ重要であると考えられている。新たな血管形成を伴わなければ、腫瘍は数ミリメートルの大きさ以上に成長しないであろうと考えられている。抗癌剤としてのそれらの使用に加え、血管新生の阻害剤は、糖尿病性網膜症、心血管系疾患、慢性関節リウマチおよび乾癬の処置に対する潜在能力を有するCarmelietとJain、Nature、2000、407、249-257;FreedmanとIsner、J.Mol.Cell.Cardiol.、2001、33、379-393;Jacksonら、FasebJ.、1997、11、457-465;Saaristoら、Oncogene、2000、19、6122-6129;WeberとDeBandt、JointBoneSpine、2000、67、366-383;Yoshidaら、Histol.Histopathol.、1999、14、1287-1294。血管新生の尺度としての内皮管形成アッセイ血管新生は、内皮細胞の相互とのおよび細胞外マトリックス分子との相互作用を促進する多数の因子により刺激されて毛細管の形成をもたらす。この形態形成過程は付近の組織への酸素の送達に必要であり、そして胚の発達、創傷治癒および腫瘍増殖において不可欠の役割を演じているCarmelietとJain、Nature、2000、407、249-257。さらに、この過程は、内皮細胞による管様構造の形成を評価した組織培養アッセイで再現し得る。細胞の増殖支持体として、コラーゲンIKanayasuら、Lipids、1991、26、271-276、マトリゲルMatrigelYamagishiら、J.Biol.Chem.、1997、272、8723-8730およびフィブリンBachら、Exp.CellRes.、1998、238、324-334のような多様なマトリックスを使用するアッセイのいくつかの異なる変形物が存在する。このアッセイにおいて、HUVECを、マトリゲルMatrigelに非常に類似であるエンゲルブレス-ホルム-スワムマウス腫瘍由来のマトリックスKleinmanら、Biochemistry、1986、25、312-318;MadriとPratt、J.Histochem.Cytochem.、1986、34、85-91上にプレーティングする。未処理のHUVECは、この支持体上で増殖される場合に管様構造を形成する。invitroでの管形成の喪失がinvivoでの血管新生の阻害と相互に関連づけられておりCarmelietとJain、Nature、2000、407、249-257;Zhangら、CancerRes.、2002、62、2034-2047、これは血管新生についてのエンドポイントとしてのinvitro管形成の使用を支持する。さらなる一態様において、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞HuVECを使用して、管形成活性に対するC反応性タンパク質を標的としたオリゴマー化合物の効果を測定した。HuVECは、SingleQuots補助物質CloneticsCorporation、メリーランド州ウォーカーズビルを補充したEBMCloneticsCorporation、メリーランド州ウォーカーズビル中で慣例に培養した。細胞はそれらがおよそ90コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代し、そして15継代までの間維持した。HuVECはおよそ3000細胞/ウェルで96ウェルプレートにプレーティングする。1日後に細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトする。管形成アッセイはinvitro血管新生アッセイキットChemiconInternational、カリフォルニア州テメキュラを使用して実施する。ISIS133726配列番号36を使用して、内皮管形成に対するC反応性タンパク質の阻害の効果を試験した。無作為化対照オリゴヌクレオチドISIS29848NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN;ここでNはA、T、C若しくはGであり;配列番号617として本明細書に組込まれるが陰性対照すなわち管形成に影響を及ぼさない化合物としてはたらいた。インテグリン-β3を標的としかつ内皮管形成を阻害することが既知であるISIS196103AGCCCATTGCTGGACATGCA、配列番号620として本明細書に組込まれるを陽性対照として使用した。オリゴヌクレオチドを、75nMのオリゴヌクレオチドおよび2.25μg/mLのリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッドの最終濃度を達成するように、OPTI-MEMTM媒体InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッド中でリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬と混合した。細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬およびOPTI-MEMTM媒体を徹底的に混合しそして0.5時間インキュベートした。未処理の対照細胞はリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬のみを受領した。培地をプレートから除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。各ウェルを150μlのリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を100μLのオリゴヌクレオチド/OPTI-MEMTM媒体/リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬カクテルで置き換えた。ISIS133726およびISIS196103は三重で試験し、また、ISIS29848は6個までの複製物で試験した。プレートを37°Cで4時間インキュベートし、その後培地を除去しかつプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。100μlの完全増殖培地を各ウェルに添加した。トランスフェクションの50時間後に、細胞をECMa-trixTMChemiconInternationalで被覆した96ウェルプレートに移す。これらの条件下で、未処理のHUVECは管様構造を形成する。37°Cで一夜インキュベーション後に、処理および未処理細胞を光学顕微鏡法により検査する。個々のウェルに、管形成の程度に依存して1から5までの個別のスコアを割り当てる。1のスコアは管形成を伴わないウェルを指す一方、5のスコアは全細胞が広範囲の管の網状構造を形成しつつあるウェルに与える。結果は未処理の対照サンプルに関する管形成のパーセントとして表す。ISIS133726、ISIS29848およびISIS196103での処理はそれぞれ81、100および51の管形成をもたらした。これらの結果は、ISIS133726が管形成を阻害し、そして従って血管新生の阻害が望ましい状態の処置、例えば癌、糖尿病性網膜症、心血管系疾患、慢性関節リウマチおよび乾癬の処置における応用を伴う候補の剤であることを具体的に説明する。マトリックスメタロプロテイナーゼ活性血管新生の間、内皮細胞は細胞外マトリックスECMを分解しなければならず、そして従ってこの分解を達成するためにマトリックスメタロプロテイナーゼMMPを分泌しなければならない。MMPは、8種の異なる分類にある亜鉛依存性エンドペプチダーゼの一ファミリーであり、5種は分泌型でありかつ3種は膜型MMPMT-MMPであるEgebladとWerb、J.CellScience、2002、2、161-174。MMPは、細胞外マトリックスの構造的成分のみならずしかしまた増殖因子結合タンパク質、増殖因子前駆体、受容体チロシンキナーゼ、細胞接着分子および他のプロテイナーゼも包含する広範な一群の基質を切断することによりそれらの効果を発揮するXuら、J.CellBiol.、2002、154、1069-1080。さらなる一態様において、アポリポタンパク質Bのアンチセンス阻害を、ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECの上の培地中のMMP活性に対する効果について評価した。MMP活性はEnzChekゼラチナーゼ/コラゲナーゼアッセイキットMolecularProbes、オレゴン州ユージーンを使用して測定した。HUVECは管形成アッセイについて記述されたとおり培養する。HUVECをウェルあたりおよそ4000細胞で96ウェルプレートにプレーティングし、そして1日後にトランスフェクトする。HUVECをISIS133726配列番号36で処理してC反応性タンパク質発現を阻害した。無作為化配列をもつオリゴヌクレオチドISIS29848NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN;ここでNはA、T、C若しくはGであり;配列番号617として本明細書に組込まれるが陰性対照すなわちMMP活性に影響を及ぼすことが期待されない処理としてはたらいた。ISIS25237GCCCATTGCTGGACATGC、配列番号621はインテグリンβ3を標的とし、そしてMMP活性の阻害の陽性対照として使用した。ISIS25237は、4ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ18ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。細胞を、75nMのオリゴヌクレオチドおよび2.25μg/mLのリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬で、管形成アッセイについて記述されたとおり処理した。ISIS133726およびISIS25237は三重で試験し、また、ISIS29848は6個までの複製物で試験した。プレートを37°Cでおよそ4時間インキュベートし、その後培地を除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。100μlの完全増殖培地を各ウェルに添加した。トランスフェクションのおよそ50時間後に、Corning-Costar96ウェル透明底プレートVWRInternational、カリフォルニア州ブリスベーンの各ウェルに酢酸p-アミノフェニル水銀APMA、Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス溶液を添加する。APMA溶液は不活性のMMP前駆体タンパク質の切断を促進するのに使用する。HUVEC上の培地をその後96ウェルプレートのウェルに移す。30分後にクエンチした蛍光発生性のMMP切断基質を添加し、そして基礎蛍光を直ちに485nm励起/530nm測定で読取る。暗所で37°Cでの一夜インキュベーション後に、プレートを再度読取ってMMP活性に対応する蛍光の量を測定する。HUVECライセートからの全タンパク質を使用して測定値を正規化し、そして、MMP活性を、オリゴヌクレオチド処理を受領しなかった未処理の対照細胞からのMMP活性に関するパーセントとして表す。MMP活性は、ISIS133726、ISIS29848およびISIS25237で処理した細胞からの培地中で78、82および58であった。これらのデータは、ISIS133726がMMP活性を阻害しなかったことを示す。C反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物の脂肪細胞アッセイインスリンは身体全体で不可欠のシグナル伝達分子であるが、しかしその主要な標的器官は肝、骨格筋および脂肪組織である。インスリンはグルコース恒常性の主要調節物質であり、そして末梢のグルコース利用および肝のグルコース産生の均衡を維持するのを助ける。正常循環濃度のインスリンのグルコース恒常性を維持する低下した能力は、糖尿病、中心性肥満、高血圧、多嚢胞性卵巣症候群、脂質代謝異常およびアテローム硬化症としばしば関連するインスリン抵抗性に現れるSaltiel、Cell、2001、104、517-529;SaltielとKahn、Nature、2001、414、799-806。インスリンに対する未分化脂肪細胞の応答インスリンは前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を促進する。脂肪細胞数の増大をもたらす肥満の状態は、インスリンの抗脂質溶解効果によりグルコース輸送が損なわれているインスリン抵抗性状態でさえ起こる。トリグリセリド分解の阻害は、グルコース輸送の刺激よりもはるかにより低いインスリン濃度を必要として、脂肪貯蔵の維持若しくは拡張をもたらすKitamuraら、Mol.Cell.Biol.、1999、19、6286-6296;Kitamuraら、Mol.Cell.Biol.、1998、18、3708-3717。細胞分化の特質の1つは遺伝子発現のアップレギュレーションである。脂肪細胞分化の間、脂肪細胞における遺伝子発現パターンはかなり変化する。脂肪細胞分化の間にアップレギュレートされることが既知の数種の遺伝子は、ホルモン感受性リパーゼHSL、脂肪細胞脂質結合タンパク質aP2、グルコース輸送体4Glut4およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γPPAR-γを包含する。インスリンシグナル伝達は、脂肪細胞分化の重要な調節因子PPAR-γを結合しかつ不活性化する化合物により改善されるOlefsky、J.Clin.Invest.、2000、106、467-472。インスリンは脂肪細胞の細胞表面へのGLUT4の転位を誘導し、そこでそれはグルコースを細胞中に輸送するトリグリセリド合成に必要な活性。全部の形態の肥満および糖尿病において、脂肪細胞での損なわれたインスリン刺激性のグルコース輸送に寄与する主要な一因子はGLUT4のダウンレギュレーションである。インスリンはまた、脂肪酸合成および脂質生合成を促進するように機能する脂肪細胞中の優勢なリパーゼであるホルモン感受性リパーゼHSLも誘導するFredriksonら、J.Biol.Chem.、1981、256、6311-6320。脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質aP2は脂肪酸およびレチノイド輸送タンパク質の多遺伝子ファミリーに属する。aP2は、脂質シャトルとしてはたらき、疎水性脂肪酸を可溶化しかつそれらを利用のため適切な代謝系に送達すると主張されているFuら、J.LipidRes.、2000、41、2017-2023;Peltonら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、1999、261、456-458。一緒に、これらの遺伝子はグルコースの取り込みならびに脂肪の代謝および利用で重要な役割を演じている。レプチン分泌およびトリグリセリド含量の増大もまた脂肪細胞分化の十分に確立されたマーカーである。それは分化した脂肪細胞のマーカーとしてはたらく一方、レプチンは、エネルギーの貯蔵および放出における脂肪細胞の役割と独立の機構オ―トクリン、パラクリン、内分泌および神経系によりグルコース恒常性もまた調節する。脂肪細胞が分化する際に、インスリンは、トリグリセリド合成を促進することおよびトリグリセリド分解を阻害することの双方によりトリグリセリド蓄積を増大させるSpiegelmanとFlier、Cell、2001、104、531-543。トリグリセリド蓄積は細胞の大きさおよび細胞数としっかりと相関するため、それは分化した脂肪細胞の優れた指標である。細胞分化のマーカーの発現に対するによるC反応性タンパク質のアンチセンス阻害の効果を前脂肪細胞で検査した。ヒト白色前脂肪細胞Zen-BioInc.、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパークを前脂肪細胞培地ZenBioInc.、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク中で増殖させた。トランスフェクション1日前に、96ウェルプレートにおよそ3000細胞/ウェルを接種した。無作為化対照オリゴヌクレオチドISIS29848NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN;ここでNはA、T、C若しくはGであり;配列番号617として本明細書に組込まれるを陰性対照すなわち脂肪細胞分化を調節しない化合物として使用した。脂肪細胞分化を阻害する腫瘍壊死因子-αTNF-αを、レプチン分泌により評価されるところの脂肪細胞分化の阻害の陽性対照として使用した。測定した全部の他のパラメータについて、PPAR-γの阻害剤、ISIS105990AGCAAAAGATCAATCCGTTA、配列番号622として本明細書に組込まれるが脂肪細胞分化の阻害の陽性対照としてはたらいた。ISIS29848およびISIS105990は、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。オリゴヌクレオチドを、250nMのオリゴヌクレオチドおよび7.5μg/mLのリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッドの最終濃度を達成するように、OPTI-MEMTM媒体InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッド中でリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬と混合した。細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬およびOPTI-MEMTM媒体を徹底的に混合し、そして0.5時間インキュベートした。未処理の対照細胞はリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬のみを受領した。培地をプレートから除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。各ウェルを150μlのリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を100μLのオリゴヌクレオチド/OPTI-MEMTM媒体/リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬カクテルで置き換えた。ISIS133726およびISIS105990は三重で試験し、ISIS29848は6個までの複製ウェル中で試験した。プレートを37°Cで4時間インキュベートし、その後培地を除去しそしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。100μlの完全増殖培地を各ウェルに添加した。細胞がコンフルエンスに達したおよそ3日後に、PPAR-γアゴニスト、IBMX、デキサメサゾンおよびインスリンを含有する分化培地Zen-Bio,Inc.にそれらを3日間曝露した。細胞にその後脂肪細胞培地Zen-Bio,Inc.を供給し、該培地は2ないし3日間隔で交換した。脂肪細胞を培養している培地中へのレプチン分泌をタンパク質ELISAにより測定した。トランスフェクション後第9日に、96ウェルプレートをヒトレプチンに対するモノクローナル抗体RDSystems、ミネソタ州ミネアポリスで被覆しかつ4°Cで一夜放置した。プレートをウシ血清アルブミンBSAでブロッキングし、そして処理した脂肪細胞の培地の希釈をプレート中で室温で2時間インキュベートした。未結合成分を除去するための洗浄後に、ヒトレプチンに対する二次モノクローナル抗体ビオチンと結合を添加した。その後プレートをストレプトアビジン結合ワサビペルオキシダーゼHRPとともにインキュベートし、そして、HRPにより切断される場合に青色になる3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンとのインキュベーションにより酵素レベルを測定した。OD450色素の吸光度が細胞ライセート中のレプチン濃度に比例するを各ウェルについて読み取った。表29に示される結果は、未処理の対照サンプルに関する対照のパーセントとして表す。レプチン分泌に関して、100より上若しくは下の値は、該化合物がレプチン分泌をそれぞれ刺激若しくは阻害する能力を有することを示すと考えられる。トリグリセリド蓄積アッセイは脂肪細胞によるトリグリセリドの合成を測定する。トリグリセリドの蓄積は、InfinityTMトリグリセリド試薬キットSigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイスを使用して測定した。トランスフェクション後第9日に細胞を洗浄しかつ室温で溶解し、そしてトリグリセリドアッセイ試薬を添加した。トリグリセリドの蓄積は、酵素リポタンパク質リパーゼによりトリグリセリドから遊離されるグリセロールの量に基づき測定した。遊離されるグリセロールはグリセロールキナーゼによりリン酸化され、そしてグリセロールリン酸酸化酵素によるグリセロール-1-リン酸のジヒドロキシアセトンリン酸への酸化の間に過酸化水素が生成される。ワサビペルオキシダーゼHRPがH2O2を使用して4-アミノアンチピリンおよび3,5-ジクロロ-2-ヒドロキシベンゼンスルホン酸を酸化して赤色色素を生じさせる。グリセロールの濃度に比例する色素の吸光度を、UV分光光度計を使用して515nmで測定した。グリセロール濃度を各アッセイの標準曲線から計算し、そしてデータをブラッドフォードアッセイBio-RadLaboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズにより測定されるところの全細胞タンパク質に対し正規化した。表29に表示される結果は、未処理の対照サンプルに関する対照のパーセントとして表す。これらのデータから、100より上若しくは下のトリグリセリドTRIG蓄積の値は、該化合物がトリグリセリドの蓄積をそれぞれ刺激若しくは阻害する能力を有することを示すと考えられる。4種の特質遺伝子すなわちHSL、aP2、Glut4およびPPARγの発現もまた、本発明の化合物でトランスフェクトした脂肪細胞中で測定した。細胞をトランスフェクション後第9日にグアニジウム含有緩衝液中で溶解し、そして全RNAを収集する。各サンプル中の全RNAの量はRibogreenアッセイInvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッドを使用して測定した。脂肪細胞分化の特質遺伝子Glut4、HSL、aP2およびPPAR-γについてのプライマー/プローブの組を使用して、該全RNAでリアルタイムPCRを実施した。表29に示されるmRNAレベルは未処理の対照の値に関する対照のパーセントとして表す。4種の脂肪細胞分化の特質遺伝子に関して、100より上若しくは下の値は、該化合物がそれぞれ脂肪細胞分化を刺激する若しくはそれを阻害する能力を有することを示すと考えられる。ISIS133726は発現レベルレプチン、トリグリセリドおよびGLUT4を低下させ、このアンチセンスオリゴヌクレオチドが、脂肪細胞分化の阻害が望ましい応用、例えば肥満、高脂血症、アテローム硬化症、アテローム発生、糖尿病、高血圧若しくは他の代謝性疾患のための、ならびに幹細胞若しくは前駆細胞の多能性の表現型の維持における潜在的応用を有する候補の剤であることを示唆する。C反応性タンパク質を標的とするオリゴマー化合物を使用する炎症アッセイ炎症アッセイは、適応免疫応答の活性化およびエフェクター期を調節する遺伝子を同定するよう設計されている。活性化期の間、適切な抗原からのシグナルを受領するTリンパ球T細胞としてもまた知られるはクローン拡張を受け、サイトカインを分泌し、そして可溶性増殖因子、サイトカインおよび同時刺激分子のそれらの受容体をアップレギュレートするCantrell、Annu.Rev.Immunol.、1996、14、259-274。これらの変化はT細胞の分化およびエフェクター機能を駆動する。エフェクター期では、非免疫エフェクター細胞によるサイトカインに対する応答が、宿主組織に対し広範囲の損傷をなし得る炎症メディエータの産生を制御する。適応免疫系の細胞、それらの産物、ならびに炎症に関与する多様な酵素カスケード例えば補体、凝固、フィブリン溶解およびキニンカスケードとのそれらの相互作用は、炎症性疾患の潜在的な介入点を表す。ここに提示する炎症アッセイは、免疫応答の活性化期の特質を測定する。アンチセンス化合物で処理した樹状細胞を使用して、樹状細胞媒介性のT細胞同時刺激の調節因子を同定する。T細胞活性化の決定的な結果であるDeSilvaら、J.Immunol.、1991、147、3261-3267;SalomonとBluestone、Annu.Rev.Immunol.、2001、19、225-252T細胞によるインターロイキン-2IL-2産生のレベルを、T細胞活性化についてのエンドポイントとして使用する。Tリンパ球は病理学的炎症応答を媒介する重要な免疫調節細胞である。Tリンパ球の至適の活性化は、一次抗原認識事象ならびに抗原提示細胞APCからの二次すなわち同時刺激シグナルの双方を必要とする。樹状細胞は知られている最も効率的なAPCであり、そして主としてT細胞への抗原提示、感染および疾患の間の高レベルの同時刺激分子の発現、ならびに免疫学的記憶の誘導および維持の原因であるBanchereauとSteinman、Nature、1998、392、245-252。多数の同時刺激リガンド-受容体対がT細胞活性化に影響することが示されている一方、主要な一シグナルは、APC上のCD80B7-1およびCD86B7-2によるT細胞上のCD28の会合engagementにより送達されるBoussiotisら、Curr.Opin.Immunol.、1994、6、797-807;Lenschowら、Annu.Rev.Immunol.、1996、14、233-258。APCによるT細胞同時刺激の阻害は、免疫抑制の新規かつより特異的な戦略に期待できる。加えて、同時刺激シグナルを遮断することは、移植を促進若しくは自己免疫を弱めるための利用性を提供するとみられる長期の免疫学的アネルギー無応答性すなわち寛容の発生に至るとみられる。T細胞アネルギーは、増殖因子IL-2を産生するT細胞の不全の直接の結果であるDeSilvaら、J.Immunol.、1991、147、3261-3267;SalomonとBluestone、Annu.Rev.Immunol.、2001、19、225-252。免疫応答の活性化期の尺度としての樹状細胞のサイトカイン産生本発明のさらなる一態様において、ISIS133726配列番号36の効果をT細胞の樹状細胞媒介性の同時刺激で検査した。樹状細胞DC、CloneticsCorp.、カリフォルニア州サンディエゴを、500U/mLの顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子GM-CSFおよびインターロイキン-4IL-4中、抗CD3UCHT1、Pharmingen-BD、カリフォルニア州サンディエゴ被覆した96ウェルプレート上でおよそ6500細胞/ウェルでプレーティングした。DCをプレーティング24時間後にアンチセンス化合物で処理した。無作為化対照オリゴヌクレオチドISIS29848NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN;ここでNはA、T、C若しくはGであり;配列番号617として本明細書に組込まれるが、陰性対照すなわち樹状細胞媒介性のT細胞同時刺激に影響を及ぼさない化合物としてはたらいた。CD86の阻害剤、ISIS113131CGTGTGTCTGTGCTAGTCCC、配列番号623として本明細書に組込まれるが、樹状細胞媒介性のT細胞同時刺激の阻害の陽性対照としてはたらいた。ISIS29848およびISIS113131は、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。オリゴヌクレオチドは、200nMのオリゴヌクレオチドおよび6μg/mLのリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッドの最終濃度を達成するように、OPTI-MEMTM媒体InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッド中でリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬と混合した。細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬およびOPTI-MEMTM媒体を徹底的に混合し、そして0.5時間インキュベートした。培地を細胞から除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。各ウェルを150μlのリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を100μLのオリゴヌクレオチド/OPTI-MEMTM媒体/リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬カクテルで置き換えた。未処理の対照細胞はリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬のみを受領した。ISIS133726および陽性対照は三重で試験し、また、陰性対照のオリゴヌクレオチドは6個までの複製物で試験した。プレートをオリゴヌクレオチドとともに37°Cで4時間インキュベートし、その後培地を除去しかつプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。新鮮増殖培地およびサイトカインを添加し、そしてDC培養を追加の48時間継続した。DCをその後、10熱不活性化ウシ胎児血清SigmaChemicalCompany、ミズーリ州セントルイスを補充したRPMI培地InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッド中でJurkatT細胞と共培養する。培養上清を24時間後に収集し、そしてIL-2レベルについてアッセイしIL-2DUOSETTMキット、RDSystems、ミネソタ州ミネアポリス、未処理の対照サンプルに関するパーセントとして表す。100より大きい値は炎症応答の誘導を示す一方、100未満の値は炎症応答の低下を示す。ISIS133726、ISIS29848およびISIS113131で処理した細胞の培養上清は、未処理の対照細胞からの培養上清で見出されたIL-2濃度のそれぞれ84、83および55のIL-2を含有した。これらの結果は、ISIS133726がT細胞同時刺激を阻害しなかったことを示す。炎症応答のエフェクター期の尺度としてのサイトカインシグナル伝達サイトカインシグナル伝達アッセイは、IL-1βおよびTNF-α双方に対する非免疫エフェクター細胞最初は内皮細胞の炎症応答を調節する遺伝子を同定するように設計されているHeyninckら、JCellBiol、1999、145、1471-1482;Zetouneら、Cytokine、2001、15、282-298。サイトカイン刺激に対する応答は、4種の遺伝子すなわちA20、細胞内接着分子1ICAM-1、インターロイキン-9IL-8およびマクロファージ炎症性タンパク質2MIP2αの発現レベルをたどることによりモニターする。下述されるとおり、これらの遺伝子は炎症応答の多数のパラメータを調節する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、これらのサイトカインに対する細胞性応答を変える遺伝子を同定する。A20は、TRAF2で刺激したNK-κBのシグナル伝達を遮断することにより炎症前遺伝子の転写を制限するジンクフィンガータンパク質である。マウスでの研究は、TNF-αがマウスにおけるA20発現を劇的に増大させること、およびA20発現がそれらの生存に決定的に重要であることを示しているLeeら、Science、2000、289、2350-2354。ICAM-1は、腫瘍壊死因子-αTNF-α、インターロイキン-1βIL-1βおよびインターフェロン-γIFN-γのような炎症メディエータに応答して顕著にアップレギュレートされる、休止内皮細胞上で低レベルで発現されている接着分子であるSpringer、Nature、1990、346、425-434。ICAM-1発現は炎症部位に循環白血球を誘引するはたらきをする。IL-8は、ケモカイン遺伝子スーパーファミリーそのメンバーは、マクロファージ、血管平滑筋細胞および内皮細胞の炎症前の表現型を促進するの1メンバーであるKochら、Science、1992、258、1798-1801。IL-8は、好中球を炎症部位に誘引する能力をもつ主要な誘導可能なケモカインの1種として知られている。より最近、IL-8は、急性の好中球媒介性の炎症の主要メディエータに関係があるとされており、そして従って潜在的な抗炎症標的であるMukaidaら、CytokineGrowthFactorRev、1998、9、9-23。白血球溢出において中心的な役割を演じていることが既知の別のケモカインMIP2αは、より最近、急性炎症に関与していることが示されたLukacsら、ChemImmunol、1999、72、102-120。MIP2αは、微生物感染、リポ多糖LPSの注入、ならびにIL-1βおよびTNF-αのような炎症前メディエータでの細胞の刺激に応答して発現されるKopydlowskiら、JImmunol、1999、163、1537-1544。内皮細胞は、MIP2αの供給源である数種の細胞型の1つであるRudnerら、JImmunol、2000、164、6576-6582。C反応性タンパク質を標的とするISIS133726の効果をヒト臍帯血管内皮細胞HUVECATCC、バージニア州マナサスで検査した。HUVECは供給元の推奨に従って培養する。HUVECはウェルあたりおよそ3000細胞の接種密度で96ウェルプレートにプレーティングし、そしてアンチセンス化合物で24時間後に処理する。無作為化対照オリゴヌクレオチド、ISIS29848NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN;ここでNはA、T、C若しくはGであり;配列番号617として本明細書に組込まれるを陰性対照すなわちサイトカインシグナル伝達に影響を及ぼさない化合物として使用した。ISIS29848は、5ヌクレオチドのウィングにより双方の側5’および3’の方向で隣接されている10個の2’-デオキシヌクレオチドよりなる中央のギャップ領域から構成される、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。ウィングは2’-O-メトキシエチル2’-MOEヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間バックボーン結合は該オリゴヌクレオチドを通じてホスホロチオエートP=Sである。全部のシチジン残基は5-メチルシチジンである。オリゴヌクレオチドは、75nMのオリゴヌクレオチドおよび2.25μg/mLのリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッドの最終濃度を達成するように、OPTI-MEMTM媒体InvitrogenLifeTechnologies、カリフォルニア州カールズバッド中でリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬と混合した。細胞に添加する前に、オリゴヌクレオチド、リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬およびOPTI-MEMTM媒体を徹底的に混合し、そして0.5時間インキュベートした。培地を細胞から除去し、そしてプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。各ウェルを150μLのリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。各ウェル中の洗浄緩衝液を100μLのオリゴヌクレオチド/OPTI-MEMTM媒体/リポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬カクテルで置き換えた。未処理の対照細胞はリポフェクチン[LIPOFECTIN]TM試薬のみを受領した。ISIS133726は三重で試験し、また、ISIS29848は6個までの複製ウェル中で試験した。プレートをオリゴヌクレオチドとともに37°Cで4時間インキュベートし、その後培地を除去しかつプレートを滅菌ガーゼ上で叩いた。新鮮増殖培地およびサイトカインを添加し、そしてDC培養を追加の46時間継続し、その後HUVECSを0.1ng/mLのIL-1β若しくは1ng/mLのTNF-αで2時間刺激した。全RNAをトランスフェクション後48時間に収集し、そして、A20、ICAM-1、IL-8およびMIP2αのmRNA発現を検出するためのプライマー/プローブの組を使用するリアルタイムPCRを実施する。表30に示される各遺伝子の発現レベルは全RNAに対し正規化されており、そして値は未処理の対照サンプルに関するパーセントとして表す。100以上の値は炎症応答の誘導を示す一方、100未満の値は炎症応答の低下を示す。ISIS133726は、IL-1β刺激に応答してICAM-1、IL-8およびMIP2αの発現を阻害し、そして従って、炎症応答の阻害若しくは低下が望ましい状態、例えば慢性関節リウマチ、喘息および炎症性腸疾患のような状態の処置のための候補の剤である。逆に、ISIS133726はTNF-αの存在下でIL-8の応答を刺激し、この刺激経路ではC反応性タンパク質の阻害が免疫応答を刺激し得、そして、免疫応答の刺激が望ましい状態、例えば免疫不全を特徴とする状態の処置のための候補の剤であることを示唆する。invivoでのマウスC反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド:痩身マウス試験さらなる一態様において、マウスC反応性タンパク質を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、標的発現、血清脂質、血糖および毒性の指標に対するそれらの効果について試験した。雄性C57Bl/6マウスCharlesRiverLaboratories、マサチューセッツ州ウィルミントンに標準的げっ歯類飼料を給餌した。マウスに50mg/kgのISIS147868配列番号580およびISIS147880配列番号592のそれぞれの腹腔内注入を与えた。各オリゴヌクレオチド処置群は5マウスよりなった。合計5匹の生理的食塩水を注入した動物が対照としてはたらいた。注入は週2回2週間投与した。処置期間の終了時にマウスを殺した。週1回記録した体重、また、剖検で記録した肝および脾重量にも有意の変化は観察されなかった。肝でのC反応性タンパク質のmRNA発現を、本明細書の他の実施例により記述されるところのリアルタイムPCRにより測定した。50mg/kg用量のISIS147868およびISIS147880はマウスC反応性タンパク質mRNAのそれぞれ48および5の減少をもたらした。ALT、AST、コレステロールCHOL、血糖GLUC、HDLコレステロールHDL、LDLコレステロールLDLおよびトリグリセリドTRIGの慣例の臨床分析のため血清を収集した。これらのパラメータはOlympus臨床検査装置PlympusAmericaInc.、ニューヨーク州メルビルを使用する慣例の手順により測定した。データを表31に提示する。これらのデータは、ISIS147868若しくはISIS147880での処置が測定した血清パラメータの変化をもたらさなかったことを示す。一緒に、これらの結果は、ISIS147868が毒性を引き起こすことなくinvivoでC反応性タンパク質のmRNA発現を低下させたことを具体的に説明する。ISIS147880はマウスで毒性を引き起こさなかった。"