"少なくとも5kDaの分子量を有する非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質であって、アミノ酸の少なくとも80がGly-Xaa-Yaaトリプレットとして存在し、Glyがグリシンであり、そしてXaaおよびYaaが、独立に、任意のアミノ酸であり、前記タンパク質が配列GLAおよびGAAを欠き、そして少なくとも7の計算等電点を有する、前記タンパク質。RGDモチーフ中に存在する残基以外のアスパラギン酸残基のパーセントの数が1未満である、請求項1記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質。セリンおよびスレオニンアミノ酸残基を含まない、請求項1または請求項2いずれか記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質。配列5kDa分子量あたり少なくとも1つのXRGDモチーフを含み、XがDAspおよびPProまたはOヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である、請求項1~3のいずれか記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質。Xが、Y、W、F、C、M、K、L、I、R、H、V、A、G、NおよびEからなる群より選択される、請求項4記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質。非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の各5kDa部分が、少なくとも2つのXRGDモチーフを含む、請求項4または5記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質。アミノ酸残基の5未満がヒドロキシプロリンである、請求項1~6のいずれか一項に記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質。配列番号1に少なくとも85の配列同一性を有する、請求項1~7のいずれか一項に記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質。請求項1~8のいずれか一項に記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の少なくとも2つの反復を含むかまたは該反復からなる、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質。前記反復が、同じモノマー単位配列の反復である、請求項9記載のポリマー性非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質。モノマー反復単位間の介在アミノ酸が7未満である、請求項9または請求項10のいずれか記載のポリマー性非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質。請求項1~11のいずれか一項に記載されるような、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む細胞支持体。非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質でコーティングされたインプラントまたは移植片材料、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質でコーティングされた組織操作用足場、歯科製品の一部、創傷治癒製品の一部、人工皮膚マトリックス材料の一部および組織接着剤の一部からなる群より選択される、請求項12記載の細胞支持体。請求項1~11のいずれか一項に記載されるような非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む、徐放組成物。請求項1~11のいずれか一項に記載されるような非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む、止血組成物。請求項1~11のいずれか一項に記載されるような非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む、皮膚充填剤組成物。癌転移の阻害において、そして血小板凝集の防止のために、または手術後に組織接着を防止するために使用するための、請求項1~11のいずれか一項に記載されるような非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質。疼痛、癌療法、心臓血管疾患、心筋修復、血管新生、骨修復および再生、創傷治療、神経刺激/療法および糖尿病の治療において使用するための、請求項14に記載されるような徐放組成物。請求項1~11のいずれか一項に記載されるような非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を産生するための方法であって:a適切なプロモーターに機能可能であるように連結された、請求項1~11のいずれか一項に記載されるようなタンパク質をコードする核酸配列を含む、発現ベクターを調製し、b前記発現ベクターで酵母種を形質転換し、c前記酵母種を、適切な発酵条件下で培養して、前記核酸配列の発現を可能にし;d場合によって、培地および/または宿主細胞から前記タンパク質を単離する工程を含む、前記方法。大部分の発現系におけるプロテアーゼは知られていない。これらのプロテアーゼのターゲットおよびその基質特異性に関しては、さらにより少ない情報しか入手可能でない。したがって、大部分の場合、タンパク質分解攻撃に耐性である配列を、実験的に決定しなければならない。本特許出願において、本発明者らは、以前は同定されていなかったタンパク質分解ターゲット部位を排除することによって、改善された収量および品質で産生可能な、新規Gly-Xaa-Yaaタンパク質を開示する。本発明は、少なくとも5kDaの分子量を有する非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質であって、アミノ酸の少なくとも80がGly-Xaa-Yaaトリプレットとして存在し、Glyがグリシンであり、そしてXaaおよびYaaが、独立に、任意のアミノ酸であり、前記タンパク質が配列GLAおよびGAAを欠き、そして少なくとも7の計算等電点を有する、前記タンパク質を提供する。好ましくは、非天然タンパク質は、本質的に完全にGly-Xaa-Yaaトリプレットからなる。これらの非天然タンパク質の配列は、天然存在ゼラチンに類似であり、すべての第三のアミノ酸としてグリシン残基を有し、そしてXaaおよびYaa位、特にYaa位に比較的高い比率でプロリン残基を有する。本発明者らは、驚くべきことに、本発明記載のタンパク質が、付随するタンパク質分解産物を低レベルしか伴わずに、高収量で微生物によって分泌されることを見出した。多様な最終使用適用のため、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質中にRGDモチーフを含むことが好適である。本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、したがって、好ましくはRGD配列がリッチである。したがって、1つの態様において、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、1またはそれより多いRGDモチーフを含む。RGDリッチの定義を以下に示すが、例えば約300アミノ酸の長さを持つゼラチンに関しては、少なくとも2つのRGDモチーフ、より好ましくは少なくとも3つのRGD、そして特に少なくとも4またはそれより多いRGDモチーフを含むことが好ましい。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の組換え非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質が、特定の微生物における組換え体産生の間、そしてそれに続く単離および精製法の間、より安定であることを見出した。この結果、断片はより少なくしか付随せず、ゼラチンポリペプチドの望ましい分子種がより高い収量で生じる。この単分散度は、少なくとも7、好ましくは少なくとも8、より好ましくは少なくとも9、そして特に10またはそれより大きい計算等電点を有する非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質でより改善されることもまた見出された。好ましくは、本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質はまた、RGDモチーフ中に存在する残基とは別に、低いアスパラギン酸残基含量も有する。好ましくは、RGDモチーフ中に存在する残基以外のアスパラギン酸残基のパーセントの数は1未満である。組換え非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質中の1またはそれより多いRGD配列には、プロリンPまたはヒドロキシプロリンOが先行しないこともまた好ましい。本発明の1つの態様において、配列5kDa分子量あたり少なくとも1つのXRGDモチーフを含み、XがDAspおよびPProまたはOヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を提供する。好ましくは、Xは、Y、W、F、C、M、K、L、I、R、H、V、A、G、NおよびEからなる群より選択され、特にEである。好ましくは、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の各5kDa部分は、少なくとも2つのXRGDモチーフを含む。非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質配列ならびにこれらのいずれかの変異体および断片の高いそして安定した発現レベルは、遺伝子操作された微生物において得られうる。選択された微生物において、これらのタンパク質は高収量で分泌される。特に適切な微生物は、操作された核酸配列DNAまたはRNAによって修飾された、メチロトローフ酵母である。これらの修飾酵母は、高収量で、人工的なRGDを含む非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を産生するため、大規模発酵を可能にする。一般的な定義非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、連続するGly-Xaa-Yaaトリプレットを含むセグメントを含み、Glyがグリシン残基であり、そしてXaaおよびYaaが、独立に任意のアミノ酸残基である、ポリペプチドである。非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、天然に見られうる配列の構成要素を含んでもよい。ゼラチンは、動物由来のGly-Xaa-Yaaタンパク質の周知のクラスを構成するが、Gly-Xaa-Yaaタンパク質はまた、原核生物においても見られうる。しばしば、用語コラーゲン、コラーゲン関連、コラーゲン由来等もまた、当該技術分野において用いられるが、本説明の残りを通じて、用語ゼラチンまたはゼラチン様タンパク質が用いられるであろう。天然ゼラチンは、5,000~最大400,000ダルトンを超える範囲のMWを持つ個々のポリマーの混合物である。用語細胞接着および細胞付着は、交換可能に用いられる。用語RGD配列およびRGDモチーフおよびArg-Gly-Aspは、交換可能に用いられる。用語RGDリッチは、本明細書において、少なくとも1つのRGDモチーフを含むアミノ酸配列を指す。用語RGDリッチは、本発明の背景において、分子あたりのアミノ酸総数のあるパーセントとして計算される、RGDモチーフの特定のレベルが存在し、そしてアミノ酸配列中に、多かれ少なかれ、特定の規則正しいRGD配列の分布があることを意味する。RGD配列のレベルは、パーセントとして表現されうる。このパーセントは、RGDモチーフの数をアミノ酸総数で割って、そして結果に100を乗じることによって計算される。また、RGDモチーフの数は、1、2、3、等で始まる整数である。特に、RGDリッチは、本明細書において、アミノ酸総数に関連したRGDモチーフのパーセントが少なくとも0.4であり、そしてアミノ酸配列が250アミノ酸またはそれより多くを含む場合、250アミノ酸の各ストレッチが少なくとも1つのRGDモチーフを含有する、アミノ酸配列を指す。好ましくは、RGDモチーフのパーセントは、少なくとも0.6であり、より好ましくは少なくとも0.8であり、より好ましくは少なくとも1.0であり、より好ましくは少なくとも1.2であり、より好ましくは少なくとも1.5であり、そして最も好ましくは少なくとも1.8である。好ましくは、RGDリッチは、分子量5kDaあたり少なくとも1つのRGD配列を有するポリペプチドを指す。本発明の背景において、分子量は、特に一次アミノ酸配列の、計算分子量を指し、したがって、本ポリペプチドが組換え的に産生される特定の宿主微生物のありうる翻訳後修飾は考慮に入れない。本明細書に示す好ましい微生物のうち、特に酵母において、Gly-Xaa-Yaaタンパク質の翻訳後修飾はまったく起こらないと仮定される。本非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、RGD配列を含まない5kDa部分を含有しないことが好ましい。少なくとも0.4より大きいRGDモチーフのパーセントは、250アミノ酸あたり少なくとも1つのRGD配列より多くに相当する。RGDモチーフの数は整数であり、したがって、0.4の特徴を満たすためには、251アミノ酸からなるアミノ酸配列が、少なくとも2つのRGD配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のRGDリッチGXYタンパク質は、250アミノ酸あたり少なくとも2つのRGD配列、より好ましくは、250アミノ酸あたり少なくとも3つのRGD配列、最も好ましくは、250アミノ酸あたり少なくとも4つのRGD配列を含む。さらなる態様において、本発明記載のRGDリッチゼラチン様タンパク質は、30kDの計算分子量あたり少なくとも4つのRGDモチーフ、好ましくは30kDあたり少なくとも6つのRGDモチーフを含む。XaaおよびYaa位におけるプロリン残基の比較的大きな比率は、Gly-Xaa-Yaaトリプレットの少なくとも3分の1が、プロリン残基を含有することを意味する。断片は、より長い核酸またはポリペプチド分子の部分である。天然または自然コラーゲンまたはコラーゲン性ドメインは、天然に、例えばヒトまたは他の哺乳動物において見られる核酸またはアミノ酸配列を指す。本発明記載の非天然ポリペプチドまたはタンパク質は、コラーゲンなどの天然分子の部分である同じ長さのポリペプチド配列とある度合いの相同性を有しうる。しかし、組換え非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質自体は、天然には生じない。用語タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、交換可能に用いられ、そしてアミノ酸鎖からなる分子を指し、特定の作用様式、サイズ、三次元構造または起源には関わりない。単離タンパク質は、天然環境で見られないタンパク質であり、例えば培地から精製されたタンパク質である。用語支持体または細胞付着支持体は、本明細書において、細胞付着および/または増殖を容易にするために使用可能な任意の支持体、例えば培養プレート、マイクロキャリアー例えばマイクロキャリアービーズ、ステント、インプラント、プラスター等を指す。用語実質的に同一な、実質的同一性または本質的に類似のまたは本質的類似性は、2つのポリペプチドが、デフォルトパラメータでSmith-Watermanアルゴリズムを用いて対に整列された場合、少なくとも60、70、80、より好ましくは少なくとも85、90、95、96、または97、そして特に少なくとも98、99、またはそれより多いアミノ酸配列同一性を含むことを意味する。配列整列および配列同一性パーセントに関するスコアは、AccelrysInc.,9685ScrantonRoad,SanDiego,CA92121-3752,USAより入手可能なGCGWisconsinパッケージ、バージョン10.3などのコンピュータプログラムを用いて、またはEmbrossWIN例えばバージョン2.10.0を用いて、決定可能である。2つの配列間で配列同一性を比較するため、例えばEmbossWINプログラムwaterで用いられる、SmithWatermanアルゴリズムSmithTF,WatermanMS1981J.Mol.Biol1471;195-7などの局所整列アルゴリズムを用いることが好ましい。デフォルトパラメータは、タンパク質用のBlosum62置換マトリックスを用い、ギャップ開始ペナルティ10.0およびギャップ伸長ペナルティ0.5であるHenikoffHenikoff,1992,PNAS89,915-919。用語含むは、言及する部分、工程または構成要素の存在を明記すると解釈されるものとするが、1またはそれより多いさらなる部分、工程または構成要素の存在を排除しない。さらに、不定冠詞aまたはanによる要素への言及は、1であり、そして1のみの要素があることを文脈が明らかに必要としない限り、1より多い要素が存在する可能性を排除しない。不定冠詞aまたはanは、したがって、通常、少なくとも1つを意味する。モノマーは、ポリペプチド単位またはそれをコードする核酸配列であって、該単位を直線方式で反復して、より長いポリペプチドを生じることによって、マルチマーまたは交換可能に用いられるポリマーを生成するように使用可能な前記単位を指す。モノマー単位は、好ましくは、介在するアミノ酸を伴わずに反復されるが、場合によって、1、2、3、4、5、またはそれより多い連結アミノ酸がモノマー単位間に存在してもよい。用語改善された安定性は、タンパク質が、酵母発現宿主の通常の培養条件下、およびタンパク質が単離される通常の条件下で、天然存在構造由来の対応する配列と比較して、加水分解されないか、または、好ましくは少なくとも10またはそれより多く、より低い度合いに加水分解されることを意味する。三重らせんを含まない構造は、円二色スペクトルにおいて、コラーゲン三重らせんに特徴的な陽性ピークが本質的に存在しないことを指す。円二色分光法は、Wertenら2001,ProteinEngineering14:447-454に記載されるように実行可能である。発明の詳細な説明驚くべきことに、高収量の改善された非常に安定したペプチドまたはポリペプチドを得ることが可能であることが見出された。これは、Gly-Xaa-Yaaタンパク質の産生プロセスを経済的に実行可能にする、非常に大きな利点を有する。本発明はしたがって、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質に関する。本タンパク質の安定性は、ゼラチンが用いられている適用、特にゼラチン/Gly-Xaa-Yaaタンパク質の完全性に頼る適用に有益である。ポリペプチドはまた、いかなる健康関連リスクも示さず、これは、これらが低い抗原性しか持たないためであり、すなわちこれらのポリペプチドは、ウイルス、プリオン等の病原性因子を伝達するリスクを最小限にしか伴わずに使用可能である。本発明は、臨床的、医学的および/またはバイオテクノロジー的適用において用いるのに非常に適したペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に、特にゼラチンまたはゼラチン様タンパク質に、関する。例えば、損なわれていないintact分子を循環中に維持する血漿増補液としての使用に関心が持たれ、そしてこれは本タンパク質が好適に適している適用である。また、特に、止血剤、皮膚充填剤および細胞接着における使用が関心領域である。1つの態様において、本発明は、例えばUS2006/0241032に記載されるものなど、特に配列番号2として該特許中に示される配列など、既知のGly-Xaa-Yaa-RGDを含むポリペプチドに比較した際、改善された特性を有する、細胞結合ペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明の非天然タンパク質は、天然存在配列とは異なるが、コラーゲンにある程度の相同性を示しうる。したがって、該非天然タンパク質配列が、天然コラーゲンアミノ酸配列と50を超える相同性を示すことも可能である。Gly-Xaa-Yaaタンパク質中のアミノ酸の三連構造の大部分、好ましくは少なくとも80は、配列Gly-Xaa-Yaaを有するべきであるが、場合による逸脱した三連構造、例えばA-XaaYaaA=アラニンは、必要な特性を改変しない。Gly-Xaa-Yaaトリプレットのかなりの数は、配列Gly-Xaa-PまたはGly-P-Yaa式中、Pはプロリンであるを有するべきである。好ましくは、半数を超えるGly-Xaa-Yaaトリプレットは、プロリン残基を含有する。好ましくはシステインは回避される。本発明にしたがって、優れた細胞付着特性を持ち、そして改善された安定性、改善された細胞付着および組織支持特性などの利点を示す、組換えゼラチンを提供する。1つの態様において、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、配列番号1に少なくとも60の配列同一性を有する。この配列はまた、本明細書において、ICPモノマーとも称される。1つの態様において、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質はまた、配列番号1またはその断片に、少なくとも70、好ましくは少なくとも80、そしてより好ましくは少なくとも90またはそれより多いアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも92、95、96、98、99配列同一性またはそれより多くを有するアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるタンパク質と定義可能である。断片は、1000アミノ酸未満、例えば800、600、500、300、250、200、100、50、30またはそれより少ない連続アミノ酸の部分であるが、好ましくは少なくとも10、15または20アミノ酸である。1つの態様において、本発明は、少なくとも5kDaの分子量を有し、そして分子量5kDaあたり少なくとも1つのRGD配列を含む、非天然組換え産生Gly-Xaa-Yaaタンパク質を提供する。好ましくは、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、少なくとも15kDa、好ましくは少なくとも20kDa、そしてより好ましくは少なくとも25kDaの計算分子量を有する。好ましくは、5kDaの非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の各部分は、少なくとも1つのRGD配列を含む。好ましくは、分子量は、200kDa未満、より好ましくは150kDa未満である。こうした非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、さらに改善された安定性を有することが見出された。本発明の非天然タンパク質を得るため、例えば天然ゼラチン配列をコードする核酸配列を部位特異的突然変異誘発によって修飾して、本明細書に定義するようなRGDモチーフを有する配列を得てもよい。もちろん、単純に、連続Gly-Xaa-Yaaモチーフ、例えば少なくとも5、10、15、20、30、50、100、200、300またはそれより多い連続Gly-Xaa-Yaaモチーフを含むアミノ酸配列を設計することも可能であり、それによって、少なくとも1つであるが、好ましくはそれより多いRGDモチーフが配列中に含まれる。こうして設計されたポリペプチドは、ルーチンの分子生物学技術を用いてこれらをコードする核酸配列を作製し、そして組換え宿主細胞においてこれらを発現することによって、作製可能である。好ましくは、RGDモチーフのスペーシングは、少なくとも約0、10、15、20、25、30またはそれより多い介在アミノ酸が存在するようなものである。配列中にいくつかのRGDモチーフが存在する場合、これらは、考慮中の適用に応じて、規則的にまたは不規則にスペーシングされていてもよい。好ましくは、XRGDモチーフは、Gly-Xaa-Yaaモチーフの一部であり、すなわちGly-Xaa-YaaトリプレットはRGDモチーフ単数または複数によって破壊されない。例えば、配列GlyXaaYaa-GlyXaaYaa-GlyXaaR-GDYaa-GlyXaaYaa-GlyXaaYaaにおいて、RGDモチーフは、連続するGly-Xaa-Yaaトリプレットを破壊しない。非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質中に、少なくとも1つのXRGDモチーフXはDまたはPまたはOではないがあることもまた好ましい。より好ましくは、2より多い、例えば3、4、5、6またはそれより多いXRGDモチーフが、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質中に存在してもよく、ここでXは再び、D、PまたはOを除く任意のアミノ酸である。さらなる態様において、本発明は、グリコシル化されていない非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質に関する。グリコシル化は、好ましくは、免疫反応が望ましくない適用に関しては防止されるべきである。好ましい態様において、本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、セリンSer、SおよびスレオニンThr、T残基を含まない。アミノ酸配列におけるセリンおよびスレオニンの欠如は、例えば、酵母細胞培養を用いたバイオテクノロジー産生系において、グリコシル化を防止する有効な方法でありうると考えられる。非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質モノマーは、一端または両端、例えばNおよび/またはC末端で、さらなるアミノ酸を含んでもよい。例えば、1、2、3、6、9、12、15またはそれより多いアミノ酸が存在してもよい。これらは、Gly-Xaa-Yaaトリプレットの形であってもよい。末端、特にC末端のさらなるアミノ酸は、例えばC末端分解、例えばアミノ酸1つずつの切断を防止することによって、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の安定性を増進する。また、末端でのさらなるアミノ酸は、マルチマー構築を容易にし、マルチマー性非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質ポリペプチドは、反復アミノ酸配列の一部ではないN末端およびC末端アミノ酸を含んでもよい。1つの態様において、本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、グリシン-プロリン-プロリンGPPトリプレットに先行され、そしてカルボキシ末端で2つのグリシン残基GGによって伸長される。本発明記載の上記非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、酵素および/または化学的タンパク質分解に対して優れた安定性を有する。好ましくは、本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を用いると、例えばSDS-PAGEゲル上でまたはLC-MSなどの他の方法によって、安定性アッセイにおいて/該アッセイ後、分解または切断産物、すなわちコードされる全長非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質のものより小さいサイズのポリペプチドは、見られないかまたは減少して見られる。安定性は、例えば、ポリペプチドが酵母宿主の培地内に分泌された後に試験可能であり、そのため実質的にすべて少なくとも95、好ましくは少なくとも98、99または最も好ましくは100の組換えポリペプチドが完全サイズである場合、ポリペプチドは安定である。酵素的または化学的加水分解に対する安定性はまた、ポリペプチドを、1またはそれより多いタンパク質分解酵素または加水分解化学物質とインキュベーションすることによって、そして処理の明記した期間後、生じる分子量を分析することによっても、試験可能である。例えば、組換え天然ゼラチンおよび同じ酵母宿主において産生される本発明記載のゼラチンの分子量を発酵後に比較する際、本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、同じ条件下で、そして同じ方法で産生された天然ゼラチンよりもより分解されない。分解はまた、例えば、同じ量の試料を装填したSDS-PAGEゲル上のバンド強度を分析することによっても定量化可能である。例えば、Wertenら1999上記を参照されたい。本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の遺伝子は、本明細書の別の箇所に記載するアミノ酸配列基準を満たすさらなる修飾を伴う、天然コラーゲン性配列をコードする遺伝子由来であってもよい。あるいは、本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の遺伝子は、デノボで合成可能である。遺伝子合成は、多様な企業によって提供される。Gly-Xaa-Yaaタンパク質マルチマーさらなる態様において、上記のモノマーのマルチマーを提供する。したがって、本発明は、上記のような非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の少なくとも2つの反復を含むかまたは該反復からなる非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む。こうしたマルチマーは、したがって、モノマー配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10反復を含むかまたは該反復からなる。したがって、上記モノマー配列のマルチマーを含むかまたは該マルチマーからなる非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質ポリペプチドを提供する。好ましくは、モノマー反復は、同じモノマー単位配列の反復である反復はアミノ酸配列中で同一であるが、場合によってまた、異なるモノマー単位の組み合わせ各々が上記基準に属する異なるアミノ酸配列を有するものを用いてもよい。好ましくは、モノマー単位は、スペーシングアミノ酸によって分離されないが、短い連結アミノ酸、例えば1、2、3、4または5アミノ酸が、1またはそれより多いモノマーの間に挿入されてもよい。好ましくは、モノマー反復単位間には7未満の介在アミノ酸、より好ましくは3未満のアミノ酸がある。1つの態様において、マルチマーは、上記のようなモノマーの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10反復を含むかまたは該反復からなる。1つの態様において、マルチマーは、配列番号1またはその断片に対して少なくとも60、好ましくは少なくとも70、80、85、90、95、96、97、98、99またはそれより多いアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは実質的に同一である配列の、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10反復を含むかまたは該反復からなる配列類似性は、上に概略するように決定される。したがって、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質には、配列番号1nが含まれ、式中、nは1およびそれより大きいものより選択される整数であり、好ましくはnは1~10またはそれより大きい。ICPモノマーの2つの反復は、二量体配列番号2を生じ;ICPモノマーの4つの反復は四量体配列番号3を生じる。1つの態様において、本発明記載のマルチマー非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、グリシン-プロリン-プロリンGPPトリプレットに先行され、そしてカルボキシ末端で2つのグリシン残基GGによって伸長される。したがって、本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質には、GPP配列番号1nGG、式中、nは1およびそれより大きいものより選択される整数であり、好ましくはnは1~10またはそれより大きい、が含まれる。n=1の場合、ICP配列番号4と称される本発明記載のゼラチンが得られる。上記式において、n=2の場合、配列ICP2配列番号5が得られ;上記式において、n=3は、配列ICP3配列番号6を生じ;上記式において、n=4の場合、配列ICP4配列番号7が得られる。こうしたマルチマーは、既知の標準分子生物学法を用いて生成可能である。モノマーおよび/またはマルチマーを含む材料および組成物本発明は、細胞接着に適しており、そして医学的またはバイオテクノロジー的適用に使用可能である、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に、特に、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質に関する。本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、バイオテクノロジープロセスまたは医学的適用において使用可能な細胞培養支持体をコーティングするのに非常に適していることが見出された。ゼラチン中のRGD配列は、インテグリンと称される細胞壁上の特異的受容体に接着可能である。これらのインテグリンは、細胞結合アミノ酸配列を認識する際に特異性が異なる。天然ゼラチン、および例えばフィブロネクチンはどちらも、RGD配列を含有しうるが、ゼラチンはフィブロネクチンに結合しない細胞に結合可能であるし、そして逆もまた当てはまる。したがって、RGD配列を含むフィブロネクチンは、細胞接着目的のため、ゼラチンに常に代用できるわけではない。組換え的に産生されたゼラチンは、動物由来ゼラチンの不都合な点、例えばゼラチンが由来する動物から生じる病原体の潜在的な混入を伴わない。細胞培養支持体として、または細胞培養支持体と組み合わせて用いた場合、本発明記載のゼラチン様ポリペプチドは、細胞結合ポリペプチドとして機能する。これらは、これらの上に増殖する細胞によってもまた代謝されうる点で、他のポリペプチドよりも優れている。組換え産生ゼラチンのさらなる利点は、その分子量MWが均一に維持されうることである。天然ゼラチン、特に天然供給源より単離されるゼラチンは、不可避的に、5kDaより小さく、400kDaを超える分子量の巨大ポリマーまでのペプチドの、広い分子量分布を有する。特に、細胞培養支持体としてマイクロキャリアーコアビーズと組み合わせた場合、より小さいペプチドの不都合な点は、細胞が到達不能である、マイクロキャリアーのより細かい孔の内部に該ペプチドが接着し、したがって、添加されるゼラチンの一部が用いられないことである。組換え産生法を用いると、ゼラチンは望ましい分子量を持つように設計可能であり、この望ましくない効果が防止される。本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む細胞支持体を提供する。こうした細胞支持体は、11またはそれより多い本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含むコーティングでコーティングされた、コアビーズ例えばマイクロキャリアービーズまたはペトリ皿等の細胞培養支持体;21またはそれより多い本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含むコーティングでコーティングされた、インプラントまたは移植片デバイス例えば股関節、歯科、または他のインプラント、ステント等、31またはそれより多い本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含むコーティングでコーティングされた、組織操作用の足場またはマトリックス、例えば人工皮膚マトリックス材料;41またはそれより多い本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含むコーティングでコーティングされた、創傷治癒製品;51またはそれより多い本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含むかまたは該タンパク質からなる、組織接着剤からなる群より選択されうる。好ましくは、細胞支持体は、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質でコーティングされたインプラントまたは移植片材料、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質でコーティングされた組織操作用足場、歯科製品の一部、創傷治癒製品の一部、人工皮膚マトリックス材料の一部および組織接着剤の一部からなる群より選択される。1つの態様において、本明細書に提供する細胞支持体は、好ましくは、本発明記載のただ1つの非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む。産物は、したがって、アミノ酸配列、分子量等が均一である。場合によって、ペプチドは、例えば、化学的架橋によって架橋されてもよい。異なる態様において、本発明記載のポリペプチドの混合物は、例えば、2、3、4、5、またはそれより多い本発明記載の異なるアミノ酸配列を使用可能である。混合物の比は多様であってもよく、例えば1:1、または10:1、50:1、100:1、1:100、1:50、1:10、およびその間の比であってもよい。場合によって、タンパク質のこれらの混合物、またはその一部がまた、架橋されていてもよい。多孔マイクロキャリアービーズをコーティングするために非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質モノマー単数または複数および/またはマルチマーを用いる場合、好ましくは少なくとも約30kDaの分子量のポリペプチド、より好ましくは少なくとも約40kDa、特に少なくとも約50kDa、さらに特に少なくとも約60kDa、そして特に少なくとも約70kDaまたはそれより多い分子量のポリペプチドを用いる。これは、より小さいポリペプチドは、ビーズ上の孔に進入し、それによって、コーティングされるビーズの細胞付着特性に寄与しない可能性があるためである。したがって、特に、ビーズをコーティングするために低濃度のタンパク質を用いる場合には、コーティングプロセスが不十分になる可能性もある。好ましくは、用いる非天然Gly-Xaa-Yaaまたはゼラチン様タンパク質の分子量は均一であり、75を超える、好ましくは85を超える、より好ましくは95を超える、そして特に少なくとも98のタンパク質が、選択した分子量から20以内の均一なMWを有する。上に明記した範囲内に分子量を選択することによって、コーティングプロセスにおいて、非天然Gly-Xaa-Yaaまたはゼラチン様タンパク質コーティング溶液の粘度が、実際に制御可能となる。こうしたゼラチン溶液のゼラチン濃度を可能な限り高く選択することが可能である一方、完全な、またはより重要なことに、部分的ゲル化が、防止されうる。均一なゼラチンによって、マイクロキャリアーを同一にコーティングするプロセスが確実になる。均一なコーティングプロセスによって、ゼラチンを最小量で使用し、そしてゼラチンコーティング溶液を最小体積で使用することが可能になる。これは、当該技術分野に知られるよりも、より効率的なコーティングプロセスを生じる。本発明の1つの態様において、非多孔コアビーズを本発明のゼラチンでコーティングする。適切な非多孔コアビーズは、ポリスチレンまたはガラスで作製される。他の適切な非多孔材料が当業者に知られる。本発明の特定の好適な態様は、多孔コアビーズ、例えば修飾デキストランまたは架橋セルロース、または多孔ポリスチレン、特にDEAE-デキストラン由来のビーズを、本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質でコーティングするプロセスである。他の適切な多孔材料が当業者に知られ、そしてこれには、例えば他の化学的に修飾されるかまたは修飾されない多糖が含まれる。ビーズサイズは、50μm~500μmで多様でありうる。典型的な平均マイクロキャリアービーズサイズは、生理食塩水中、約100μm、約150μmまたは約200μmである。ビーズの少なくとも90が範囲内にあるサイズ範囲は、80~120μm、100~150μm、125~175μmまたは150~200μmで多様でありうる。広範囲の細胞がマイクロキャリアー上で培養可能である。例えば、無脊椎動物、魚類、鳥類由来の細胞、および哺乳動物起源の細胞がすべて培養可能である。形質転換および正常細胞株、線維芽細胞および上皮細胞、そしてさらに遺伝子操作細胞もまた、多様な生物学的適用のため、例えばインターフェロン、インターロイキン、増殖因子等の免疫学的剤の産生のため、マイクロキャリアー上で培養可能である。マイクロキャリアー上で培養する細胞はまた、口蹄疫または狂犬病のようなワクチンとして用いられる多様なウイルスの宿主としても働く。マイクロキャリアー培養は、大量培養以外の非常に多数の適用を有する。マイクロキャリアー上で増殖している細胞は、細胞間または細胞基層相互作用などの細胞生物学の異なる側面を研究するための優れたツールとして働く。細胞分化および成熟、代謝研究もまた、マイクロキャリアーを用いて実行可能である。こうした細胞はまた、電子顕微鏡研究のため、または細胞膜などの細胞内小器官の単離のためにも使用可能である。また、この系は、本質的に三次元の系であり、そして優れた3Dモデルとして働く。同様に、この系を用いて、細胞の共培養を行ってもよい。したがって、適用には、多量の細胞、ウイルスおよび細胞産物例えばインターフェロン、酵素、核酸、ホルモンの産生、細胞接着、分化および細胞機能に関する研究、灌流カラム培養系、顕微鏡研究、有糸分裂細胞の採取、細胞の単離、膜研究、細胞の保存および輸送、細胞トランスファーに関するアッセイ、ならびに標識化合物の取り込みに関する研究が含まれる。マイクロキャリアーはまた、脾臓細胞集団からのマクロファージの枯渇にも使用可能である。本発明の組換え非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質でコーティングされたDEAE-デキストランマイクロキャリアーは、コンカナバリンAconAによるリンパ球の刺激を増強可能である。同種腫瘍細胞で集密となったマイクロキャリアービーズをマウスに注入して、体液性および細胞仲介免疫を増加させることも可能である。植物プロトプラストを、本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質でコーティングされたDEAE-デキストランマイクロキャリアー上に固定することも可能である。マイクロキャリアーが提供する、高い表面積対体積比の結果として、これらは、多様な生物学的産物を、実験室規模、ならびに例えばさらに4000リットルまたはそれより多い産業規模で成功裡に使用可能である。ゼラチンコーティングマイクロキャリアーを用いて、発現される産物の大規模産生を達成することも可能である。産生規模バイオリアクターにおけるマイクロキャリアーの装填は、一般的には20g/lであるが、最大40g/lまで増加させうる。マイクロキャリアーは、バッチおよび灌流系において、攪拌培養において、そしてウェーブバイオリアクターで使用可能であり、それとともに、伝統的な静置単層およびローラー培養の表面積を増加させうる。さらなる好ましい態様において、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、本質的に、ヒドロキシプロリン残基を含まない。プロリンのヒドロキシル化は、コラーゲンにおける三重らせんの形成に関する必要条件であり、そしてゼラチンのゲル化において役割を果たす。非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質のアミノ酸残基の、特に10未満、好ましくは5未満、より好ましくは3未満、そして特に1未満が、ヒドロキシプロリンである。最も好ましくは、タンパク質はヒドロキシプロリンを含まない。非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質のゲル化能が好ましくない適用においては、より高い濃度のヒドロキシプロリン不含タンパク質を用いてもよく、そして溶液は、より粘度が低く、より激しい攪拌を必要とせず、培養細胞に対して、より少ない剪断力しか生じないであろう。WO02/070000A1に記載されるように、ヒドロキシプロリンを本質的に含まない非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、天然ゼラチンとは対照的に、IgEを伴う免疫反応を示さない。ヒドロキシプロリンの非存在は、例えば、形質転換されておらず、または機能するプロリル-4-ヒドロキシラーゼ酵素を含まない、ピキア属宿主、例えばピキアパストリスにおいて発現することによって達成可能である。ヒドロキシプロリンの量を、任意の標準的アミノ酸分析法、例えばHPAminoQuantシリーズII、操作者ハンドブック、1990、Hewlett-PackardGmbH、ドイツ連邦共和国、ヴァルドブロン分析部門、HP部品番号01090-90025に記載されるような方法によって決定してもよい。1つの態様において、本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、三重らせん構造を含まない。さらなる態様において、本発明は、細胞上の表面受容体をブロッキングするための、そしてこうした受容体をブロッキングするための組成物を作製するための、本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の使用に関する。例えば、血管新生の阻害において、または心臓線維芽細胞上のインテグリンのブロッキングにおいて、細胞受容体のブロッキングを適用する。細胞が増殖している、本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質でコーティングされた細胞支持体は、例えば、皮膚移植または創傷治療中に、あるいは骨または軟骨再増殖を増進するために、適用可能である。本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質でインプラント材料をコーティングして、細胞を接着させ、そしてしたがって移植を促進することもまた可能である。1つの態様において、本発明は、本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む組成物に関する。該組成物は、薬学的組成物あるいは栄養または栄養補助組成物であってもよい。例えば、本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質、特にマルチマーは、代用血液中の血漿増補液として使用可能である。本発明のさらに別の態様において、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む徐放組成物を提供する。組成物は、したがって、1またはそれより多い薬剤をさらに含んでもよい。徐放配合物は、当該技術分野において作製可能であり、例えば、1またはそれより多い薬剤を取り巻くコーティング層として、あるいは薬剤を封入するかまたは取り込むマトリックスを作製するために、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質またはこれらを含む組成物を用いることによって作製可能である。注射によって皮下、静脈内または筋内または経口的にまたは吸入によって、徐放組成物を投与してもよい。手術によって、徐放組成物を移植してもよい。さらに別の適切な投与経路は、外部創傷ドレッシング材を通じるか、または経皮的であってもよい。徐放組成物は、好ましくは、架橋型、例えば化学的に架橋された非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む。本発明はさらに、疼痛、癌療法、心臓血管疾患、心筋修復、血管新生、骨修復および再生、創傷治療、神経刺激/療法および糖尿病の治療において使用するための、本明細書に記載するような徐放組成物の使用を提供する。本発明の別の態様は、上述のような非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む止血組成物を提供する。止血剤として用いるため、本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、好ましくは、当該技術分野に知られる技術を用いて、スポンジ様材料にトランスファーされる。スポンジに、適切な抗出血化合物を含浸させてもよい。さらに、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質スポンジを他のスポンジ様材料と組み合わせてもよいし、または本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の水溶液の蒸発によってスポンジを作製してもよく、ここで溶液は、創傷への接着、血液吸収能等のようなスポンジ特性を改善する他の構成要素を含んでもよい。本発明の組換え非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質と組み合わせるのに適した化合物は、例えば、キトサンまたは酸化再生セルロースORCである。場合によって、本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、スポンジ形成中または形成後に、ある程度、架橋される。当該技術分野に知られる任意の方法によって、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の架橋を行ってもよい。1つの例は、水中で、架橋剤を本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の溶液に添加し、その後、水を蒸発させることである。また、スポンジ材料が形成された後に、架橋材料をスポンジに含浸させ、そしてスポンジが乾燥するまで蒸発させることによって、架橋剤を添加してもよい。適切な架橋剤は、例えば、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドのようなアルデヒドである。本発明記載のスポンジには、多くの医学的使用がある。スポンジは、高血圧で、非常に広い出血面積の出血を停止するだけでなく、滲出性の出血を停止させるのに用いてもよい。以下の内部または外部手術法は、本発明記載の止血スポンジを用いて成功裡に実行される:全身手術、例えば、実質性臓器肝臓、腎臓、脾臓等の手術、心臓血管手術、胸部手術、移植手術、整形外科手術、骨手術、形成手術、耳、鼻および喉の手術、脳外科、泌尿器科および婦人科の手術、ならびに創傷治療におけるような止血。別の態様は、上記のような非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を含む皮膚充填剤を提供する。本出願において、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質をまず水に溶解し、そして次いで、より親水性でない溶媒、例えばアセトンを添加することによって水溶液から沈殿させる。調製中、例えば2つのリジン残基を架橋するグルタルアルデヒドのような架橋剤が存在してもよい。別の周知の生体適合性架橋剤は、1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩EDCである。これらの架橋剤または架橋剤の組み合わせは、ポリペプチド溶液に添加したら自発的に架橋を開始するか、または例えばpHを調整した後、または光開始によって、または他の活性化機構によって、架橋を開始する、剤を含んでもよい。適切な架橋剤は、好ましくは、生物分解中に放出された際、毒性または抗原性効果を誘発しないものである。適切な架橋剤は、例えば、1またはそれより多いグルタルアルデヒド、水溶性カルボジイミド、ビスエポキシ化合物、ホルマリン、1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、N-ヒドロキシ-スクシンイミド、グリシジルエーテル、例えばアルキレングリコールジグリシジルエーテルまたはポリグリセロールポリグリシジルエーテルである。非常に小さい粒子が得られうる1~500ミクロンの平均サイズ。これらの小さい粒子は、注射可能組織充填剤として、あるいは組織増大または美容手術に適している。こうした適用のため、平均粒子サイズは、好ましくは100ミクロンより大きいかまたはこれに等しい。150~500の範囲の平均粒子サイズもまた好ましい。他の適切な平均粒子サイズは、220、250、300、350、400および450ミクロンである。組織充填剤または増大剤として適した粒子は、粒子注射後に、塊形成が生じないが、自然な印象が得られるように、変形可能でなければならない。本発明はまた、癌転移阻害において使用するための、そして血小板凝集を防止するための、または組織接着を防止するために手術後に使用するための、上述のような非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質も提供する。EP-A-0926543、EP-A-1014176またはWO01/34646に開示されるような組換え法によって、本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を産生してもよい。また、本発明のタンパク質の産生および精製を可能にするため、本明細書に援用されるEP-A-0926543およびEP-A-1014176の実施例も参照されたい。したがって、適切な微生物によって、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させることによって、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を産生することも可能である。反復配列の不適切な発現により感受性でないため、細菌よりも真菌および酵母細胞が好ましい。該プロセスは、真菌細胞または酵母細胞で最適に実行可能である。適切には、宿主細胞は、高発現宿主細胞、例えばハンゼヌラ属、トリコデルマ属Trichoderma、アスペルギルス属Aspergillus、アオカビ属Penicillium、サッカロミセス属Saccharomyces、クロイベロミセス属Kluyveromyces、ニューロスポラ属Neurosporaまたはピキア属種である。最も好ましくは、宿主は、発現されたタンパク質を攻撃するプロテアーゼを高レベルには持たない。メチロトローフ酵母細胞、例えばピキア属またはハンゼヌラ属種の使用が好ましい。発現系としてのピキアパストリスの使用が、EP-A-0926543およびEP-A-1014176に開示される。1つの態様において、微生物は、活性翻訳後プロセシング機構、例えば特にプロリンのヒドロキシル化およびまたリジンのヒドロキシル化は含まない。別の態様において、宿主系は、非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質が非常に有効な方式でヒドロキシル化される、内因性プロリンヒドロキシル化活性を有する。宿主細胞および発現しようとする配列に関する知識と組み合わせて、宿主細胞を本発明記載の組成物において適切な非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質の発現に適したものにする、本明細書記載の必要なパラメータに基づく、既知の産業酵素産生真菌宿主細胞、特に酵母細胞からの適切な宿主細胞の選択は、当業者には可能であろう。したがって、本発明の1つの側面において、本発明記載の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を産生するための方法であって、a適切なプロモーターに機能可能であるように連結された、上述のようなタンパク質をコードする核酸配列を含む、発現ベクターを調製し、b前記発現ベクターで酵母種を形質転換し、c前記酵母種を、適切な発酵条件下で培養して、前記核酸配列の発現を可能にし;d場合によって、培地および/または宿主細胞から前記タンパク質を単離する工程を含む、前記方法を提供する。非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質を培地から単離することが好ましい。好ましくは、前記非天然組換えゼラチンは、少なくとも5g/l上清、好ましくは少なくとも7g/lのレベルで、そしてより好ましくは9g/l上清より多い量で産生される。12、13、15または17あるいは19g/lまたはそれより高い分泌レベルであってさえ、達成されている。好ましくは、本発明の非天然Gly-Xaa-Yaaタンパク質は、単離され、そして精製される。突然変異体宿主株、例えば1またはそれより多いタンパク質分解酵素が欠損している株もまた用いてもよいが、本発明にしたがって、その必要はなく、これは組換えポリペプチドが非常に安定であり、そしてタンパク質分解に耐性であるためである。本発明は、以下の限定されない実施例において、より詳細に説明されるであろう。配列配列番号1:ICPモノマーの配列。配列番号2:ICP二量体の配列。配列番号3:ICP四量体の配列。配列番号4:ICPの配列。配列番号5:ICP2の配列。配列番号6:ICP3の配列。配列番号7:ICP4の配列。配列番号8:プラスミドpFFZαAの配列。配列番号9:ICP3変異体1の配列。配列番号10:ICP3変異体2の配列。配列番号11:ICP3変異体3の配列。配列番号12:ICP3変異体4の配列。配列番号13:ICP3変異体6の配列。配列番号14:ICP3変異体7の配列。配列番号15:ICP3変異体8の配列。用いた株および遺伝子ベクター本実施例において、ピキアパストリス株CBS7435を宿主株として用いた。プラスミドpFFZαAを、合成ゼラチンをコードする遺伝子のベクターとして用いた。該ベクターは、以下の要素を含有する:大腸菌E.coliにおけるプラスミド維持のための複製起点、大腸菌またはピキアパストリスいずれかにおいて使用可能なゼオシン耐性マーカー、およびAOX1プロモーター、AOX1ターミネーター、ならびに関心対象の遺伝子のメタノール誘導性発現および分泌を制御するための、サッカロミセスセレビシエ由来の酵母フェロモン接合因子アルファのプレプロ配列。プラスミドのDNA配列を配列番号8として開示する。ゼラチン様タンパク質産生のための遺伝子構築物の調製細胞結合増進のため、ICP3と称される合成ゼラチンを設計した。ICP3の配列を配列番号6として開示する。該配列には、細胞結合配列RGDがリッチである。合成ゼラチンICP3のためのコドン最適化遺伝子を合成した。この遺伝子を、XhoI-XbaI断片として、同じ酵素で消化したpFFZαA中にサブクローニングした。これによって、プラスミドpFFZ-ICP3が生じた。このプラスミドは、MFα-ICP3をコードし、この中で、ICP3ゼラチン配列は、接合因子アルファのプレプロ配列に融合している。このプラスミドを含有する宿主細胞を用いて、MFα-ICP3を産生し、そして分泌させた。ピキアパストリスにおける異種タンパク質の産生および分泌、ならびにその成熟分泌シグナルの除去の原理は、当該技術分野に周知である。宿主細胞の形質転換プラスミドpFFZ-ICP3を制限酵素PmeIで直線化して、宿主細胞のAOX1プロモーターにおける組込みを促進した。エレクトロポレーションによって、直線化プラスミドを宿主細胞に導入した。0.5mg/mlの濃度でゼオシンを補充したYPD寒天プレート水中の10g/l酵母エキス、20g/lペプトン、20g/lデキストロースおよび20g/l寒天上に形質転換混合物をプレーティングすることによって、形質転換体を選択した。ゼラチン様タンパク質の組換え産生以下のように、振盪フラスコ培養において、いくつかの形質転換体によるICP3産生を分析した。エルレンマイヤー100mLに10mLのYPD培地水中の10g/l酵母エキス、20g/lペプトンおよび20g/lデキストロースを満たした。これらの培養に、形質転換後に見られるコロニー由来の細胞を接種した。培養を一晩、飽和に到達させた。翌日、遠心分離3000xg、10分間によって細胞を採取し、そして消費された培地をデカントした。細胞を緩衝最小メタノール培地100mMリン酸カリウム、pH6.0、1.34酵母窒素基剤、4x10-5ビオチン、0.5メタノール中に再懸濁し、そしてこの培地上で一晩増殖させた。次の2日間、各培養に最終濃度1までメタノールを添加した。5日目、遠心分離によって細胞を除去し、そしてMultiphorII電気泳動系GEHealthcareを用いて、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEによって、上清を分析した。いくつかの代表的な形質転換体によるICP3産生を図1Aに示す。比較のため、同じ条件下で増殖させる宿主株の2つの培養の上清もまた示す。図1から、ICP3産物にはいくつかのより小さいタンパク質分解産物が付随すると推測されうる。分解産物の性質決定切断部位を同定するため、質量分析を行うことを決定した。ICP3は、非常に反復性の配列を有するため、質量分析をICP3に対してでなく、ICPに対して行った。ICPの配列を配列番号4として開示する。ICPを上述の方法で産生し、そして陰イオン交換クロマトグラフィーによって部分的に精製した。分析液体クロマトグラフィーカップリング質量分析LC-MSを用いて、損なわれていないタンパク質ICP3およびその分解産物の質量を決定した。ICPの理論的質量は17617ダルトンである。得られた分子質量を表1に列挙する。観察質量を、ICPから理論的に得られうる質量と比較した。この分析によって、配列GLAGおよびGAAGがタンパク質分解的切断に特に感受性であることが示唆された。さらに、アルギニン残基のC末端側のアミノ酸に応じて、タンパク質分解はしばしば、配列GERの後で起こる。タンパク質分解はまた、配列PGKEGV中のリジン残基の後で起こることも見出された。さらに、LC-MSデータによって、切断が特定のアスパラギン酸残基の後で起こることが示唆される。タンパク質分解に耐性である変異体の開発このタンパク質分解的分解により耐性である組換えゼラチン様タンパク質を開発し、そしてどの配列がタンパク質分解活性によってターゲットとされるのかを決定するため、一連のICP3変異体配列番号9~15を設計し、そして合成した。これらの変異体を産生し、そして上述のようにSDS-PAGEによって分析した。変異体1、2、3および4配列番号9~12は、RGDおよびGER配列周囲に突然変異を含有する。しかし、これらの変異体は、元来のICP3に比較した際、分解バンドの数の有意な減少を示さなかった。ICP3変異体6配列番号13は、すべてのGLAトリプレットが欠失していることを除き、ICP3と同一である。ICP3変異体8配列番号15は、すべてのGAAトリプレットがGAPトリプレットで置換されていることを除き、ICP3変異体6と同一である。驚くべきことに、GLAトリプレットの除去およびGAPトリプレットによるGAAトリプレットの置換は、図1Bに見られうるように、元来のICP3タンパク質に関して観察された分解バンドを消滅させた。ICP3変異体7配列番号14は、アスパラギン酸残基の数を限定するために欠失されているRGDトリプレットを除き、ICP3と同一である。しかし、この変異体は、分解の望ましくない増加を示し、これはおそらくこの変異体の全体の疎水性が増加したことによって引き起こされた。"