"酵素プロセスを実施する方法であって、前記プロセスの少なくとも2回目で酵素を再生およびリユースし、前記プロセスの各回は以下の工程:a基質が可溶性、一部可溶性、または不溶性の不均一基質溶液を用意する工程b酵素又は酵素混合物を前記不均一基質溶液に加える工程、及びc前記基質の酵素反応を進行させる工程を含み、各回の工程cが完了した後、以下の工程:d前記工程cで得られた反応混合物から酵素を分離するために、酵素を吸着する吸着剤と反応混合物とを接触させる工程を含む非充填床吸着プロセスを実施する工程e前記吸着剤に非結合の材料を任意で洗浄する工程、及びf前記吸着剤から酵素を脱着する工程に従って前記工程cで得られた混合物から酵素を再生し、さらには、前記工程fで得られた脱着酵素を、前記プロセスの次の少なくとも1回の工程bで用いることを特徴とする、酵素プロセスを実施する方法。酵素活性の低下と不活性化を補うために必要に応じて酵素をさらに追加し、前記リサイクルプロセスを2回又はそれ以上繰り返すことを特徴とする、請求項1に記載のリサイクルプロセスの方法。前記非充填床吸着プロセスが、膨張床吸着プロセスであることを特徴とする、請求項1に記載のプロセスの方法。前記非充填床吸着プロセスが、高密度、低密度もしくは磁性吸着粒子を用いたバッチ吸着プロセス、または膜吸着プロセスであることを特徴とする、請求項1に記載のプロセスの方法。前記酵素または酵素混合物をラベリングし、前記吸着剤への結合の特異性および/または強度を高めることを特徴とする、請求項1乃至4のいずれか一項に記載のプロセスの方法。前記酵素または酵素混合物のラベリングを遺伝子組み換えによって行うことを特徴とする、請求項4に記載のプロセスの方法。前記酵素または酵素混合物のラベリングを酵素の化学修飾によって行うことを特徴とする、請求項4に記載のプロセスの方法。前記化学修飾が染料、DNAオリゴマーまたはPNAやLNA等のアナログ、炭水化物成分、アセチル化、サクシニル化、アルキル化、還元的アミノ化、ビオチン化、ボロン酸、IDA等のキレート基、リガンドが結合したシクロデキストリン、ポリエチレングリコール、またはデキストランを含むことを特徴とする、請求項6に記載のプロセスの方法。前記基質がセルロース、セルロース含有材料、でんぷん、でんぷん含有材料、含油材料、または不溶性もしくは一部可溶性の植物性たんぱく質溶液であることを特徴とする、請求項1乃至8のいずれか一項に記載のプロセスの方法。本発明者らは、消化プロセスの最後にリユースできるよう酵素をリサイクルすることが望ましいことを見出した。これは、酵素をリサイクルすることが一般的に酵素の価格を下げるだけではなく、バイオ燃料の生産量を高め、利益性を改善するためである。消化プロセスにおけるバイオマスの起源は多種多様であり、可溶性、一部可溶性、ならびに不溶性の原材料で構成される。バイオマスの一部のみが二糖類あるいは単糖類へと変換され、可溶性および不溶性材料からなる混合溶液が残る。膜濾過や充填床クロマトグラフィーpackedbedchromatography等の従来の分離技術においては、大量の不溶性物質を付着や流閉塞を発生させること無く扱うことは不可能であるため、そのような混合物から消化酵素を抽出することは困難である。更に、酵素の活性や有用性を壊すことなく消化プロセスが終了した後に、残った混合物から酵素を再生するためには、酵素の変性や失活を引き起こさない穏和な条件下で行うことができる抽出方法を選ぶことが必要となる。本発明は、酵素プロセスを実施する方法であって、前記プロセスの少なくとも2回目で酵素を再生およびリユースし、前記プロセスの各回は以下の工程:a基質が可溶性、一部可溶性、または不溶性の不均一基質溶液を用意する工程b酵素又は酵素混合物を前記不均一基質溶液に加える工程、及びc前記基質の酵素反応を進行させる工程を含み、各回の工程cが完了した後、以下の工程:d前記工程cで得られた反応混合物から酵素を分離するため、酵素を吸着する吸着剤と反応混合物とを接触させる工程を含む非充填床吸着nonpackedbedadsorptionプロセスを実施する工程e前記吸着剤に非結合の材料を任意で洗浄する工程、及びf前記吸着剤から酵素を脱着する工程に従って前記工程cで得られた混合物から酵素を再生することを特徴とする、酵素プロセスを実施する方法を提供する。前記方法の前記プロセスは、少なくとも2回、例えば3回、5回、10回と繰り返すことが好ましい。不均一基質溶液中で望ましい酵素の活性レベルを維持するために、2回目以降の繰り返しにおいて用いられるリサイクルされた酵素に、必要に応じて追加の酵素を補うことが好ましい。これは、時間がたつにつれ、反応混合物からの酵素再生が不完全になり、再生された酵素の活性が使用に伴い低下することが予想されるためである。補給する酵素は既に用いられ再生された酵素、あるいは新しい、すなわち未使用の酵素であることが好適であると考えられる。前記方法は、脱着した酵素を吸着剤から工程fにおいて水溶液中で得た後、該水溶液に限外ろ過を行い、濃縮酵素溶液および水を得るステップを更に含むことが好適である。これにより、更なる経済的且つ環境的利益が得られる。酵素再生のために用いられた水をリサイクルし、例えば、酵素をさらに吸着剤から脱着するのに用いることができる。本発明の吸着工程dは、工程cから得られた混合物に対して行われるその他のプロセスと同時に行われることが好適である。例えば、該プロセスがバイオ燃料を製造するプロセスの一部である場合、吸着工程dは工程cで製造された糖の発酵が行われている間に行う。非充填床クロマトグラフィーnonpackedbedchromatographyは様々な方法が知られており、本発明で用いることが可能である。充填床クロマトグラフィー法は、吸着剤の充填カラムが不均一溶液、すなわち不溶性物質を含む溶液がカラムを通過する際にブロックする傾向を持つため、不適切であると考えられる。しかし、反応混合物のタンクが吸着剤に接触しており、酵素を吸着させ、続いて濾過等で吸着剤をタンクから分離するといった方法であれば、当技術分野で知られているその他の類似方法と同様に好適に用いることができる。しかし、本発明のステップdは膨張床expandedbedクロマトグラフィーで行うことが好ましい。膨張床吸着クロマトグラフィーEBAはアフィニティー分離工程を行って精製されていない原料から特定の物質を得るのに有効な方法である。この点において、EBAは、価値の高い酵素のバイオマス消化プロセスからの捕捉とリサイクルに適している。EBAカラムにおいて処理される物質は、消化プロセス完了後、未消化物質と可溶性消化産物を含む不均一溶液であると定義することができ、これは、0.1体積/体積vvを超える不溶性物質を含む水溶液である。工程dはバッチ処理として行われることが好適である。工程dにおいては、高密度粒子、低密度粒子または磁性粒子を含む吸着剤か、あるいは、膜吸着プロセスを用いることが好適である。酵素プロセスに用いられる基質には、セルロースあるいは木や藁といったセルロース含有材料、トウモロコシ、小麦、あるいは藻由来のでんぷんベースの材料、油糧種子、菜種、ひまわり、ヤトロファ、あるいは藻由来の含油材料、あるいは不溶性または一部可溶性の植物性たんぱく質溶液がある。バイオマスを含む不均一溶液あるいは懸濁液は、有機溶媒あるいはイオン性溶媒を含んでもよい。この場合、消化工程cを、これらの条件下でも活性を有する酵素を用いて行う必要がある。同様に、工程dにおいて酵素を吸着するために選択する吸着剤は、有機あるいはイオン性溶液においても安定するよう選ぶ必要がある。本発明のプロセスで用いるのに好適な酵素には、セルラーゼ、キシラナーゼおよびリグナーゼ酵素が含まれる。これらの酵素は、自然発生であるか、所望の特性を得るよう人工的に操作されたものである。酵素あるいは複数の酵素の混合物は、酵素の吸着剤との結合の特異性及び/又は強度を高めるためにラベリングされているのが好ましい。本発明で用いられる酵素あるいは複数の酵素は、特定の吸着剤により効果的に捕捉されるよう、遺伝子操作又は化学修飾されていることが好ましい。好適なラベリング方法および化学基としては、以下が挙げられる。His6タグと組み合わせて、固定化金属キレートと、あるいはその他の特定のペプチド配列と相互作用させる方法。この特定のペプチド配列は特異的に認識することが可能であり、あるいはCibacronBlueといった色素等の固定化成分と結合している。酵素と吸着剤の両方を色素でラベリングし、アルブミン等の架橋分子を用いて固定化する方法。酵素を色素でラベリングする方法。通常、これはデキストランやポリエチレングリコール等のスペーサー分子の末端に行うことができ、ラベリングされた酵素は、その後、吸着剤に固定化したアルブミンに結合することができる。特定の配列を酵素に結合する方法。この場合、特定の配列には吸着剤上に固定化した相補配列に結合するDNAオリゴマーやPNA、LNA等のアナログがある。酵素を炭水化物成分やアセチル化、サクシニル化、アルキル化あるいは還元的アミノ化で修飾する方法。および、酵素をビオチン、反応性色素あるいはボロン酸、IDA等のキレート基、リガンドが結合したシクロデキストリン、ポリエチレングリコールあるいはデキストラン等によりアフィニティーラベリングする方法。好ましい方法としては、酵素をフルオレセイン等の特定のリガンドでラベリングする方法、および、フルオレセイン特異的抗体等のリガンド特異的抗体を溶出で、その後pHを低下させて抗体/リガンド相互作用をリバースさせて吸収剤上に固定化する方法が挙げられる。植物由来材料等の低コストの抗体源あるいは植物抗体を使用するのが有益である。代替的アプローチとしては、酵素を修飾して、酵素活性を実質的に低減することなく、消化プロセス中に存在する他のたんぱく質とかぶらないようその等電点pIを実質的に変更することが挙げられる。その結果、クロマトグラフィー補足ステップに選択されたpH条件下で、修飾酵素は吸着剤と結合し、他のたんぱく質との結合はごくわずかとなる。吸着剤はイオン交換体であることが好ましく、結合した酵素の溶出は、溶出緩衝液のpHを変えることで行われることが好ましい。更なるアプローチとしては、十分に高い親和性で活性部位に結合した酵素に、吸着剤として固定化基質を用い、酵素を消化液から捕捉することが挙げられる。更なるアプローチとしては、デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ微粒子やマイクロ微粒子等の強磁性、常磁性あるいは超常磁性物質又は、酵素に強く結合することが可能なその他の高分子磁気複合体で酵素をラベリングすることが挙げられる。その他のアプローチとしては、吸着剤の合成リガンドを用いて、消化液中で酵素と直接結合し、とりわけリガンドと相互作用するよう酵素アミノ酸配列に挿入されたドメインと結合すること、あるいは化学誘導体化によって導入された部分と結合することが挙げられる。結合した酵素は、その後、pHやイオン強度等の条件変更を適切に行うことで、吸着剤から放出することが可能である。EBAプロセスにおいて、流速、粒子のサイズ、粒子の密度は全て流動床の膨張に影響を持ち、粒子をカラム内に閉じ込める方法で膨張度を調節することが重要となる。膨張度はH/HOと定義することができ、HOは充填床モードにおける床の高さを表し、Hは膨張モードにおける床の高さを表す。本発明の好ましい実施形態においては、膨張度H/HOは1.0~20の範囲内であり、例えば1.0~10例:1.0~6、1.2~5例:1.5~4、4~6、3~5例:3~4、4~6等の範囲が挙げられる。その他の本発明の好ましい実施形態においては、膨張度H/HOは少なくとも1.0であり、例えば少なくとも1.5例:少なくとも2、少なくとも2.5例:少なくとも3、少なくとも3.5、例:少なくとも4、少なくとも4.5例:少なくとも5、少なくとも5.5例:少なくとも6、少なくとも10例:少なくとも20等が挙げられる。EBA吸着剤粒子の密度は、典型的なEBAカラム内で可能な吸着剤床の最大膨張度例:最大3~5のH/HOと関連して、適用可能な流速にとって非常に重要なことが明らかである。高いプロセス生産性を得るため、EBA吸着剤粒子の密度は少なくとも1.3g/mL好ましくは少なくとも1.5g/mLであり、更に好ましくは少なくとも1.8g/mLであり、更に好ましくは少なくとも2.0g/mLであり、更に好ましくは少なくとも2.3g/mLであるである必要がある。吸着剤粒子の密度は、完全に溶媒和された例えば水和した状態にある吸着剤の密度を表しており、乾燥させた吸着剤の密度とは対照的である。本発明の好ましい実施形態においては、吸着剤粒子の平均粒径は最大でも150μmであり、好ましくは最大でも120μmであり、より好ましくは最大でも100μmであり、より好ましくは最大でも90μmであり、より好ましくは最大でも80μmであり、より好ましくは最大でも70μmである。通常、吸着剤粒子の平均粒径の範囲は40~150μmであり、例えば、40~120μm例:40~100μm、40~75μm例:40~50μm等が挙げられる。好ましい実施形態を組み合わせ、平均粒径を120μm以下とした場合、粒子密度は少なくとも1.6g/mLであり、より好ましくは少なくとも1.9g/mLである。平均粒径が90μm未満の場合、密度は少なくとも1.8g/mLである必要があり、より好ましくは少なくとも2.0g/mLである。平均粒径が75μm未満の場合、密度は少なくとも2.0g/mLである必要があり、より好ましくは少なくとも2.3g/mLであり、最も好ましくは少なくとも2.5g/mLである。多くの場合、吸着剤粒子は、高密度無孔質コア材料を一定の比率で含有することで、高い密度を得ることができる。吸着剤粒子の密度は、好ましくは少なくとも4.0g/mL例:少なくとも5.0である。通常、無孔質コア材料の密度の範囲は約4.0~25g/mlであり、例えば約4.0~20g/ml例:約4.0~15g/mL、12~19g/ml例:14~18g/ml、約6.0~15.0g/mL例:約6.0~10g/ml等が挙げられる。酵素含有混合物は、少なくとも3cm/minの線流速で吸着剤カラムに適用することができ、例えば、少なくとも5cm/分例:少なくとも8cm/分、少なくとも10cm/分例:20cm/分等で塗布することが可能である。通常、流速は5~50cm/分の範囲から選ばれ、例えば、5~30cm/分例:10~30cm/分や25~50cm/分等の範囲が挙げられる。吸着剤粒子のサイズが小さいため、流速は大きく上げることができる。その結果、消化されたバイオマスおよび酵素の吸着剤カラムへの適用は少なくとも200cm/hの線流速を伴い、例えば少なくとも300cm/h、より好ましくは少なくとも400cm/h、あるいは少なくとも500または600cm/hや少なくとも900cm/hの線流速が挙げられる。本発明の特に好ましい実施形態を組み合わせ、消化されたバイオマス材料を適用する際の線流速を300cm/hより上とした場合、好ましい平均粒径は150μmより下である。通常、酵素再生プロセスを500cm/分超の線流速で行う実施形態において、平均粒径は120μmより下であり、好ましくは90μmより下である。あるいは、酵素再生プロセスを600cm/h超の線流速で行う実施形態において、通常、平均粒径は好ましくは85μmより下であり、より好ましくは75μmより下である。本発明に用いられる吸着剤粒子は、大きな結合能を確保するため、標的分子のみと表面で結合し、その結果比較的低い結合能を有する不浸透性粒子とは対照的に、再生される酵素を少なくとも部分的に通すことが好ましい。吸着剤粒子は多数の異なる構造や組成、形状を有してもよい。従って、吸着剤粒子は、与えられた流速それ自体で作用するのに必要な密度と結合能を有する、化学的に誘導体化された複数の多孔質材料によって構成されていてもよい。粒子は、WO1092/00799で開示されているような、多孔質材料によって覆われた少なくとも2つの無孔質コアを有する集合体タイプ、あるいは、多孔質材料によって覆われた1つの無孔質コアを持つ薄膜タイプのいずれかである。本明細書において、集合体タイプという用語は粒子状材料でできた粒子に関連し、該粒子は、タイプやサイズが異なり、高分子ベースマトリクスによって結合した、コア材料のビーズを含む。一例としては、アガロースの覆い=高分子ベースマトリクスによって結合した2つ以上の高密度粒子からなるコア粒子が挙げられる。本明細書において薄膜タイプという用語は複合粒子に関連し、各粒子は、多孔質高分子ベースマトリクスの層で覆われた高密度コア材料一種類のみからなリ、例えば、アガロースでコーティングした高密度ステンレスビーズが挙げられる。従って、少なくとも1つの高密度無孔質コアという用語は、1つの高密度無孔質粒子からなる薄膜コアに関連するか、あるいは、1より多い高密度無孔質粒子からなる集合体コアに関連したものである。上記のように、吸着剤粒子は、高密度無孔質コアとそれを取り巻く多孔質材料を含み、該多孔質材料は外表面にリガンドを有していてもよい。本明細書において、コアという用語は、前記無孔質コア粒子、あるいは前記吸着剤粒子の内側に存在するコア粒子に関連したものである。コア粒子は、多孔質材料内でランダムに分布することができ、吸着剤粒子の中心に位置することを制限されない。通常、無孔質コアは、最大でも吸着剤粒子の全体積の50を構成しており、例えば最大でも40、好ましくは最大でも30である。好適な無孔質コア材料の例としては無機化合物、金属、重金属、非金属元素、金属酸化物、非金属酸化物、金属塩、金属合金等が挙げられる。これらは、上記密度基準が満たされている限り、用いられることができる。そのようなコア材料の例としては、以下が挙げられる。金属ケイ酸塩、金属ホウケイ酸塩;二ホウ化チタン、炭化チタン、ホウ化ジルコニウム、炭化ジルコニウム、炭化タングステン、炭化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化ケイ素、窒化チタン、酸化イットリウム、粉末シリコン金属、二珪化モリブデン等のセラミック;マグネシウム、アルミニウム、チタニウム、バナジウム、クロム、ジルコニウム、ハフニウム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅および銀酸化物等の金属酸化物および金属硫化物;非金属酸化物;硫酸バリウム等の金属塩;タングステン、ジルコニウム、チタン、ハフニウム、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、インジウム、銅、銀、金、パラジウム、プラチナ、ルテニウム、オスミウム、ロジウムおよびイリジウム等の金属元素、および前記金属元素を用いて形成された合金等の金属元素の合金例:ステンレス;グラファイト、カーボンブラックおよびチャコール等の結晶性および非晶質炭素。好ましい無孔質コア材料としては、炭化タングステン、タングステン、および、ステンレスビーズ等のスチールおよびチタンのビーズが挙げられる。多孔質材料とは、コアを覆い、また必要に応じて複数あるいは単数のコア材料を結びつけるために用いられる高分子ベースマトリクスであり、且つ、吸着リガンドを結合するために用いられる高分子ベースマトリクスである。高分子ベースマトリクスはある種の天然あるいは合成有機ポリマーから探すことができ、通常は以下からえらばれるものである。i寒天、アルギン酸塩、カラギナン、グァーガム、アラビアゴム、ガティゴム、トラガカントゴム、カラヤゴム、ローカストビーンゴム、キサンタンゴム、アガロース、セルロース、ペクチン、ムチン、デキストラン、でんぷん、ヘパリン、キトサン、ヒドロキシでんぷん、ヒドロキシプロピルでんぷん、カルボキシメチルでんぷん、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロース等の天然および合成多糖類及びその他の炭水化物ベースのポリマー。iiアクリルポリマー、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステル、ポリエーテル、高分子ビニル化合物、ポリアルケン、およびこれらの置換誘導体、ならびに1より多いこれらのポリマー基を含む共重合体、およびこれらの置換誘導体、等の合成有機ポリマーおよびポリマーとなるモノマー。iiiこれらの混合物。好ましい高分子ベースマトリクスの一群としては、アガロース等の多糖類が挙げられる。生産性の観点から、吸着剤が、その体積単位につき、リサイクルされる酵素を大量に結合できることが重要である。その結果、我々は、吸着剤粒子体積の少なくとも50、好ましくは少なくとも70、より好ましくは少なくとも80、最も好ましくは少なくとも90を構成する高分子相すなわち、リガンドがあり、吸着が実際に発生する透過性骨格を有する吸着剤を用いるのが好ましいことを見出した。本発明の発明者らは、流速が高い場合においても効率的な吸着を実現するためには、吸着剤粒子の平均粒径を最小化するのが好ましいことを見出した。各吸着剤粒子の形状は実質的に球状であることが好ましい。しかし、粒子の全体の形は通常はそれほど重要ではなく、したがって、その他の円形を有していてもよい。例えば、楕円形や液滴形、豆の形等が挙げられる。しかし、ある種の特定の用途例えば粒子が流動床の準備に用いられる場合においては、少なくとも粒子の95が実質的な球形であることが好ましい。本発明においては、粒子状材料の調製は、当業者が周知の従来のプロセス例えば、EP0538350B1あるいはWO97/17132参照など、それ自体が周知の各種方法で行うことができる。例えば、モノマーのブロック重合;モノマーの懸濁重合;ゲル形成材料のブロックゲル化または懸濁ゲル化例えばアガロース等の加熱冷却、あるいはゲル化触媒の添加例えば適切な金属イオンのアルギン酸塩またはカラギナンへの添加;適切な可溶性材料のブロック架橋または懸濁架橋例えばデキストラン、セルロース、でんぷん、ゼラチンまたはその他の有機ポリマーとエピクロロヒドリン、ジビニルスルホン等との架橋;シリカ溶液ブロック溶液、懸濁溶液等の酸性化によるシリカポリマーの形成;複数の手順を組み合わせたもの重合とゲル化の組み合わせ等;スプレー法;および密度調整粒子の流動床コーティング;高分子ベースマトリクス中で懸濁した密度調整粒子のエマルジョンを熱した油溶剤中で冷却する方法;あるいは密度調整粒子と活性物質を適切なモノマー溶液または共重合体溶液の中で懸濁し、重合する方法、等が挙げられる。本発明における、粒子状材料の調製に一般的に適用可能な、特に好適な実施形態においては、アガロースと水の混合物を熱し約95°Cまで、スチールビーズを加え、混合物を熱した油植物油等に移し、激しく撹拌して乳化させ任意で一般的な乳化剤を加えることもできる、混合物を冷却すすることによって、高分子ベースマトリクスとしてアガロースを含み、コア材料としてスチールビーズを含む粒子状材料を得る。このプロセスは連続的に行うこともできるし、あるいは連続的なプロセス中に乳化重合することによって行うこともできるWO2009071560参照。当業者は、粒子サイズ各粒子に導入される高分子ベースマトリクスの量、ここではアガロースはミキサーの速度と冷却プロセスを変えることで調整できることが分かる。通常、粒子の一次生産に続き、ふるい分け及び/あるいは流動層洗浄を行い、粒度分布をさらに決定する。酵素を高分子アガロース等の多孔質マトリクスに結合する方法は、リサイクルする酵素に親和性を有する低分子量リガンドで化学的に誘導体化することである。リガンドは吸着性媒体の吸着機能を担うか、あるいは、吸着剤粒子の高分子骨格が導入された結合機能それ自体を有する。そのような親和性リガンドは、ImmobilizedAffinityLigandTechniquesHermansonetalAcademicPressIncSanDiego1992で説明されているような当業者に周知の方法でベースマトリクスに結合してもよい。この目的に用いることが可能なそれ自体が既知のあらゆる種類の共有結合、例えば、リガンドと固相材料の直接化学反応、あるいは、マトリクス骨格をリガンドに結合可能なそれ自体が既知の好適な試剤で、固相材料またはリガンドを先行して活性化することで、リガンドを固相材料に付着させてもよい。そのような好適な活性化剤の例としては、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリルグリシジルエーテル;ブタンジオールジグリシジルエーテル等のビスエポキシド;ジクロロプロパノール、ジビニルスルホン等のハロゲン置換脂肪族化合物;カルボニルジイミダゾール;グルタルジアルデヒド等のアルデヒド;キノン;臭化シアン;メタ過ヨウ素酸ナトリウム等の過ヨウ素酸塩;カルボジイミド;塩化シアヌル等のクロロトリアジン;塩化トシル及び塩化トレシル等のスルホニルクロリド;N-ヒドロキシスクシンイミド;2-フルオロ-1-メチルピリジニウムトルエン-4-スルホネート;オキサゾロン;マレイミド;ピリジルジスルフィド;及びヒドラジドが挙げられる。これらのうち、単結合とは異なるスペーサー基を生じる活性化剤が好ましく、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリル-グリシジルエーテル;ビスエポキシド;ハロゲン置換脂肪族化合物;ジビニルスルホン;アルデヒド;キノン;臭化シアン;クロロトリアジン;オキサゾロン;マレイミド;ピリジルジスルフィド;及びヒドラジドが挙げられる。特に興味深い活性化剤は、エピクロロヒドリン、アリルグリシジルエーテルおよびブタンジオールジグリシジルエーテル等のエポキシ化合物であると考えられる。場合によっては、活性化剤は、酵素の固相マトリクスへの結合に寄与する機能性の一部を担うこともでき、例えば、ジビニルスルホンを活性化剤として使用するケースがある。その他には、官能基とマトリクスの反応の間に、活性化剤をマトリクスから放出するケースがある。これはカルボジイミダゾールおよびカルボジイミドが用いられる場合である.上記可能性はマトリクスMとリガンドLをつなげる任意のスペーサーSP1の存在を定義することに関係している。本明細書においては、スペーサーSP1はマトリクスとリガンドの間に結合を形成する活性化剤の部分であると考えられる。結果、スペーサーSP1は活性化剤とそれに伴うカップリング反応に相当する。時として、例えばカルボジイミドを使用した場合など、活性化剤は活性型マトリクスあるいは活性型リガンドを形成する。カップリング後は、活性化剤はリガンドとマトリクスの間に全く残っておらず、したがって、SP1は単に単結合である。その他の場合では、スペーサーSP1は結合特性に影響する官能基、すなわちリガンド、に不可欠な部分であり、スペーサーSP1が機能的に活性な部位や置換基を含むかどうかは非常に重要となる。そのような部位や置換基としては、例えば、チオール、アミン、酸性基、スルホン基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ニトリル基、水素結合や静電結合や反発作用を通しての相互作用等が可能なその他の基、あるいは電荷移動等が可能なその他の基等が挙げられる。その他の場合、スペーサーSP1は、固相マトリクスの結合特性に重要な役割を果たす芳香環あるいは芳香族複素環を含んでもよい。例えば、キノンあるいはクロロトリアジンを固相マトリクスやリガンドの活性化剤として用いる場合が考えられる。好ましくは、スペーサーSP1は単結合か、あるいはエピクロロヒドリン、アリルグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル等のビスエポキシド、1,3-ジクロロプロパン-2-オール等のハロゲン置換脂肪族化合物、グルタルジアルデヒド等のアルデヒド、ジビニルスルホン、キノン、臭化シアン、塩化シアヌル等のクロロトリアジン、2-フルオロ-1-メチルピリジニウムトルエン-4-スルホネート、マレイミド、オキサゾロン、およびヒドラジドから選ばれる活性化剤に由来のビラジカルであることが好ましい。スペーサーSP1は短鎖脂肪族ビラジカルから選ばれることが好ましい。短鎖脂肪族ビラジカルの例としては、式CH2CHOHCH2エピクロロヒドリン由来、CH23OCH2CHOHCH2アリルグリシジルエーテル由来あるいはCH2CHOHCH2OCH24OCH2CHOHCH2ブタンジオールジグリシジルエーテル由来であらわされる短鎖脂肪族ビラジカル、あるいは単結合が挙げられる。また、リガンドの構造は芳香族構造でも複素環芳香族構造であってもよく、以下のタイプの芳香環あるいは芳香族複素環や芳香族基あるいは複素環芳香族基ラジカルに1又はそれ以上の置換基を官能基として任意に有する、非常に様々な異なる構造をカバーすることもできる。2-アミノ安息香酸、3-アミノ安息香酸、4-アミノ安息香酸、2-メルカプト安息香酸、4-アミノ-2-クロロ安息香酸、2-アミノ-5-クロロ安息香酸、2-アミノ-4-クロロ安息香酸、4-アミノサリチル酸、5-アミノサリチル酸、3,4-ジアミノ安息香酸、3,5-ジアミノ安息香酸、5-アミノイソフタル酸、4-アミノフタル酸等の安息香酸;ヒドロキシ桂皮酸等の桂皮酸;2-メルカプトニコチン酸等のニコチン酸;2-ヒドロキシ-1-ナフトエ酸等のナフトエ酸;2-メルカプトキノリン等のキノリン;5-メルカプト-1-酢酸テトラゾール等の酢酸テトラゾール;2-メルカプト-5-メチル-1,3,4-チアジアゾール等のチアジアゾール;2-アミノ-ベンズイミダゾール、2-メルカプトベンズイミダゾールおよび2-メルカプト-5-ニトロ-ベンズイミダゾール等のベンズイミダゾール;2-アミノベンゾチアゾール、2-アミノ-6-ニトロベンゾチアゾール、2-メルカプトベンゾチアゾールおよび2-メルカプト-6-エトキシベンゾチアゾール等のベンゾチアゾール;2-メルカプトベンゾキサゾール等のベンゾオキサゾール;チオフェノールおよび2-アミノチオフェノール等のチオフェノール;2-4-アミノフェニルチオ酢酸;1-アミノ-2-ナフトール-4-スルホン酸等の芳香族あるいは複素環芳香族スルホン酸およびホスホン酸、および2-アミノ-4-ニトロフェノール等のフェノール。リガンドは更に式-SP2-ACIDで表される置換基を有してもよい。SP2は任意の第2のスペーサーを意味し、ACIDは酸性基を表す。本明細書においては、酸性基は約6.0未満のpKa値を有する基を意味し、例えば、カルボン酸基COOH、スルホン酸基SO2OH、スルフィン酸基SOOH、ホスフィン酸基PHOOH、ホスホン酸モノエステル基POOHOR、およびホスホン酸基POOH2等が挙げられる。酸性基のpKa値は1.0から6.0の範囲内であることが好ましい。酸性基はカルボン酸、スルホン酸およびホスホン酸から選ばれることが好ましい。SP2基はC1-12-アルキル、C1-6-アルキレンおよびC2-6-アルケニレンから選ばれるか、もしくは、SP2は単結合である。関連するビラジカルの例としては、メチレン、エチレン、プロピレン、プロペニレン、イソプロピレンおよびシクロヘキシレンが挙げられる。SP2はメチレン、エチレンまたは単結合であることが好ましい。本明細書では、C1-12-アルキルは直鎖、分岐鎖あるいは環状の1~12個の炭素原子を有するアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、シクロペンチル、シクロヘキシル、デカリニル等が挙げられる。C1-12-アルキルは、1又はそれ以上の、好ましくは1~3の、以下から選ばれる基で置換されてもよい。カルボキシ;カルボキシエステル等の保護カルボキシ例:C1-6-アルコキシカルボニル;アミノカルボニル;モノ-およびジC1-6-アルキル-アミノカルボニル;アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル;モノ-およびジC1-6-アルキルアミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル;アミノ;モノ-およびジC1-6-アルキルアミノ;C1-6-アルキルカルボニルアミノ;ヒドロキシ;アシルオキシ等の保護ヒドロキシ例:C1-6-アルカノイルオキシ;スルホノ;C1-6-アルキルスルホニルオキシ;ニトロ;フェニル;フェニル-C1-6-アルキル;ハロゲン;ニトリロ;およびメルカプト。置換C1-12アルキル基の例としては、カルボキシ-C1-12-アルキル例:カルボキシメチルおよびカルボキシエチル、エステル化されたカルボキシ-C1-6-アルキル等の保護カルボキシ-C1-12-アルキル例:メトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、およびメトキシカルボニルエチル等のC1~6アルコキシカルボニル-C1-12-アルキル、アミノカルボニル-C1-12-アルキル例:アミノカルボニルエチル、アミノカルボニルエチルおよびアミノカルボニルプロピル、C1-6-アルキルアミノカルボニル-C1-12-アルキル例:メチルアミノカルボニルメチルおよびエチルアミノカルボニルメチル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル-C1-12-アルキル例:アミノメチルアミノカルボニルメチルおよびアミノエチルアミノカルボニルメチル、モノ-またはジC1-12-アルキルアミノ-C1-6-アルキルアミノカルボニル-C1-12-アルキル例:ジメチルアミノメチルアミノカルボニルメチルおよびジメチルアミノエチルアミノカルボニルメチル、モノ-またはジC1-6-アルキルアミノ-C1-12-アルキル例:ジ-メチルアミノメチルおよびジメチルアミノエチル、ヒドロキシ-C1-12-アルキル例:ヒドロキシメチルおよびヒドロキシエチル、アシルオキシ-C1-12-アルキル等の保護ヒドロキシ-C1-12-アルキル例:アセチルオキシエチル、アセチルオキシプロピル、アセチルオキシブチル、アセチルオキシペンチル、プロピオニルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、およびヘキサノイルオキシメチル等のC1-6-アルカノイルオキシ-C1-12-アルキル。本明細書において、C2-12-アルケニルは、直鎖、分岐鎖あるいは環状でもよく、二重結合は鎖あるいは環内のどこにあってもよい2~12個の炭素原子を有するモノ-、ジ-あるいはポリ不飽和アルキル基を意味し、例えば、ビニル、1-プロペニル、2-プロペニル、ヘキセニル、デセニル、1,3-ヘプタジエニル、シクロヘキセニル等が挙げられる。置換基のうちのいくつかはシス構造およびトランス構造の両方で存在する。本発明はシス型およびトランス型の両方を含む。本明細書において、C2-12-アルキニルは、2~12個の炭素原子を有し、1又はそれ以上の三重結合が導入された直鎖、分岐鎖アルキル基を意味し、例えば、エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、2-ブチニル、1,6-ヘプタジイニル等が挙げられる。リガンド構造は特定の理論にとらわれるべきではないが、1又はそれ以上のヘテロ原子と芳香族あるいは複素環芳香族部分の特別な電子配置は、複素環芳香族システム中あるいは置換基としてその上に配置することができ、酵素の特定の結合に関与するものと予測される。免疫吸着を介した固定化された抗フルオレセイン抗体への、酵素のフルオレセイン-アフィニティーラベリング及びリサイクル<ヒツジ-抗フルオレセイン抗体の準備>精製したウシ血清アルブミンSigma社製、カタログ番号:A4503を、製品の説明書に記載のガイドラインに従い、フルオレセインイソチオシアネートSigma社製、カタログ番号:F4274でラベリングし、280nmと495nmで複合体吸光度をそれぞれ測定し判明した約1のフルオレセイン/たんぱく質比を有するフルオレセイン-BSA複合体を得る。その後、AntibodiesVolumeIApracticalapproachChapter2pp1978DCattyIRLPressLtd1988に記載のガイドラインに従い、このフルオレセイン-BSA複合体をヒツジの免疫付与に用いる。数ヶ月間にわたり免疫付与を繰り返した後、ヒツジの血から高い力価の抗フルオレセインヒツジ血清を生成する。<高密度ビーズのジビニルスルホン活性化>アガロースおよび炭化タングステンを含む高密度ビーズを、基本的にWO2009071560A1の記載に従い調製し、4のアガロースを含み、約2.6g/mlの密度と約150ミクロンの平均粒子サイズを有する規則性の高いビーズを得る。高密度アガロースビーズと水が1:1の懸濁液約1400mlを、焼結したガラス漏斗の上で脱塩水を使って洗浄し、1分間の吸引脱水を行った。700mlの濡れたしかし脱水済みのアガロースビーズをpH11.5の0.5Mリン酸カリウム緩衝剤450mlと混合する。35mlのジビニルスルホンSigmaAldrich社製、カタログ番号:V3700を加え、得られた懸濁液を室温で2時間パドル撹拌する。その後、マトリクスを焼結したガラス漏斗に移し、まず20リットルの水で、続いて30エタノールと水の混合液5リットルで、最後に5リットルの水で洗浄する。得られた活性マトリクスは吸引脱水されたビーズ1mlあたり約20μmolの活性ビニル基を含有する。<抗フルオレセイン抗体の固定化>500mlのジビニルスルホン活性化された高密度のアガロースビーズを1500mlの上記に従って調製したヒツジ-抗フルオレセイン血清と混合する。この懸濁液に110gのポリエチレングリコールをパドル撹拌器でやさしく撹拌しながら加える。1Mの水酸化ナトリウムを徐々に加え、懸濁液のpHをpH9.0に調整する.この懸濁液を室温で18時間撹拌し、この間に、ここでビニルスルホン基との反応を介して、ヒツジ血清中の免疫グロブリン抗体を高密度ビーズに選択的に共有結合で固定化する。カップリング後、焼結したガラスフィルターの上で、最初に5Lの0.5M塩化ナトリウム、次に5Lの0.1Mリン酸カリウムpH11.0、その次に5Lの0.5M塩化ナトリウムと0.1Mのリン酸カリウムの混合液pH7.0でビーズを洗浄する。<セルラーゼのフルオレセインのラベリング>酸性セルラーゼである50mlのCelluclast1.5LSigma社製、カタログ番号:C2730を、分子量5000ダルトンカットオフ中空ファイバーモジュールであるポリスルホン限外ろ過膜GEヘルスケア社製を用いて100mlの水で透析ろ過を5回行った。この作業で、フルオレセインイソチオシアネートとの後続反応を妨げるおそれのある全ての低分子量物質を取り除く。透析濾過の後、酵素の調製液において最終たんぱく質濃度を10mg/mlに調整しタンパク質濃度の測定にBioRadLaboratories社カリフォルニア州リッチモンド製のクマシーブルー試薬を用い、ウシ血清アルブミンを標準たんぱく質として用いる、pHをpH8.5に調整する。この直後、酵素溶液1mlあたり100マイクロリットルに相当する量のフルオレセインイソチオシアネートの溶液ジメチルスルホキシド中2mg/mlを添加し、得られた溶液を室温で4時間反応させる。反応に続き、pHを1Mリン酸の残りでpH7.0に調整し、未反応のフルオレセインイソチオシアネートを上記の透析濾過で酵素溶液から取り除くが、水の代わりに20mMのリン酸カリウムpH7.0を透析ろ過の緩衝剤として用いる。<基質の調製と酵素消化処理>乾燥したトウモロコシの茎葉を挽いて微粉末にし、1.4wtの硫酸を使用し165°Cと107psiで8分間前処理を行う。割合はトウモロコシ茎葉1部に対して硫酸3部である。その後、焼結したグラスフィルターの上で不溶性物質を20部の脱塩水で洗い、吸引して余分な水分を除く。乾物含量は約25である。前処理したトウモロコシ茎葉が50mMの酢酸ナトリウムpH5.0中10重量/体積wvとなるよう懸濁液を調製し、SOFTANOL90商品名、INEOSOxide社製ベルギー、ズワイドレヒトを加えて最終濃度を1体積/体積vvとする。フルオレセインでラベリングされたCelluclast商品名1.5Lを加えて酵素濃度を前処理したトウモロコシ茎葉10mg/gとし、24時間やさしく撹拌しながら懸濁消化反応混合物をセ氏50度まで加熱する。続いて、p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド分析LeverM1973ColorimetricandfluorometriccarbohydratedeterminationwithphydroxybenzoicacidhydrazideBiochemicalMedicine7274281を用い、還元糖を形成する。酵素処理に続き、不均一反応混合物を1M水酸化ナトリウムでpH7に調整し、以下に説明する膨張床吸着expandedbedadsorptionを用いて懸濁液から酵素を捉えてリサイクルする。<膨張床吸着および新しい基質バッチへの溶出を用いた酵素リサイクル>リサイクル処理は膨張床吸着カラムFastLine登録商標20、内径id=2cm、UpFrontChromatographyAS社製デンマーク、コペンハーゲンで行う。Fastline20カラムに対する一般的な指示に従い、最初に、上記調製した抗フルオレセイン吸着剤157ml50cmをカラムに詰め、使用前に蠕動ポンプによる上向線流速10cm/分で25°Cの50mMのリン酸カリウムpH7.0で洗浄して平衡化する。その次に、酵素処理したpH7.0のトウモロコシ茎葉を前記膨張床カラムを通して10cm/分の線流速で送り出し、それにより、固定化抗フルオレセインヒツジ抗体を介して、フルオレセインでラベリングされたセルラーゼ酵素を選択的に吸着剤に結合する。処理を施している膨張床カラムから定期的に回収した、遠心分離したサンプル10000rpm、5分間について、フルオレセインの吸収極大である495nmでの吸光度を測定する。これにより、カラムを通過する非結合のフルオレセインでラベリングされたたんぱく質の量を推定する。カラムに酵素処理したトウモロコシ茎葉を装填する。これは、処理サンプルの495nmにおける吸光度が、膨張床カラム装填前の、遠心分離と酵素処理を施したトウモロコシ茎葉懸濁液の吸光度の約20になるまで続ける。続いて、基本的に全ての結合したフルオレセインでラベリングされたたんぱく質が放出されるまで膨張床カラムを0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝剤pH3.0で洗浄することで、結合したフルオレセインでラベリングされたセルラーゼを放出し、前処理と脱水を施したトウモロコシ茎葉の新しいバッチへとリサイクルする。これに続き、最終乾物調整と最終pH調整を行い、トウモロコシ茎葉の乾物を10、pHを5.0にして、新しい消化プロセスを始める。前の消化リサイクルプロセス全体における酵素活性のロスは、追加の新たな結合したフルオレセインでラベリングされた酵素を添加し、バランスを取る。図1は実施例1に記載されたリサイクル原理を示している。"