"本願明細書に記載された発明。発明の要旨イヌCanisfamiliarisのP-糖タンパク質をコードする核酸が、ここで、同定され、単離され、クローン化され、そして配列決定された。このPGPは、ヒトPGPと非常に関連している高い割合の同一性を有する。本発明は、単離された核酸分子、これらの分子の特有のフラグメント、上記のものを含む発現ベクター、およびこれらの分子を用いてトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。本発明はまた、単離されたポリペプチドならびに薬物輸送を減少する上記の核酸およびポリペプチドのインヒビターを提供する。このPGPの核酸およびポリペプチドは、薬物のバイオアベイラビリティを評価するためのアッセイ、ならびにこの薬物の最適化または発見のためのアッセイにおいて有用である。さらに、上記のものは、PGP活性によって特徴付けられる状態の診断または処置において使用され得、そしてPGP活性を増加または減少するための治療的に有用である方法に使用され得る。例えば、本願発明は、以下の項目を提供する。項目1単離された核酸分子であって、以下:a配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸分子、baの対立遺伝子改変体であって、ここで該対立遺伝子は、配列番号3および配列番号5を除く、対立遺伝子改変体、およびcaまたはbの相補体、からなる群より選択される、単離された核酸分子。項目2前記単離された核酸分子が配列番号2をコードする、項目1に記載の単離された核酸分子。項目3前記単離された核酸が配列番号1のヌクレオチド配列を含む、項目1に記載の単離された核酸分子。項目4前記単離された核酸が配列番号1のコード領域を含む、請求項1に記載の単離された核酸分子。項目5前記対立遺伝子改変体が、配列番号23、配列番号25、および配列番号27からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子である、項目1に記載の単離された核酸分子。項目6前記対立遺伝子改変体が、配列番号23をコードする、請求項5に記載の単離された核酸分子。項目7前記対立遺伝子改変体が、配列番号25をコードする、請求項5に記載の単離された核酸分子。項目8前記対立遺伝子改変体が、配列番号27をコードする、請求項5に記載の単離された核酸分子。項目9前記核酸分子が、配列番号22、配列番号24、および配列番号26からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目5に記載の単離された核酸分子。項目10前記ヌクレオチド配列が配列番号22を含む、項目9に記載の単離された核酸分子。項目11前記ヌクレオチド配列が配列番号24を含む、項目9に記載の単離された核酸分子。項目12前記ヌクレオチド配列が配列番号26を含む、項目9に記載の単離された核酸分子。項目13前記核酸分子が、配列番号22、配列番号24、および配列番号26からなる群から選択されるヌクレオチド配列のコード領域を含む、請求項5に記載の単離された核酸分子。項目14単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、配列番号2の25位、192位、197位、212位、288位、329位、532位、696位、1273位および1355位;配列番号25の25位;ならびに、配列番号27の25位および1148位からなる群から選択されるイヌP-糖タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸を含む、単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。項目15単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、配列番号2の3位、6位、8位、10位、12位、14~26位、36位、38位、48位、52位、56位、64位、74位、78位、84~92位、94位、96位、98位、99位、101位、103位、104位、106位、108位、112位、115位、147位、187位、197位、199位、233位、288位、321位、326位、347位、397位、450位、454位、455位、467位、472位、520位、633位、637位、643位、644位、650位、657位、658位、661位、666位、667位、674~677位、679位、685位、689位、691位、693位、694位、703位、707位、717位、731位、736位、740位、744位、745位、756位、759位、763位、853位、914位、920位、942位、943位、946位、968~970位、972位、974位、983位、1005位、1010位、1017位、1025位、1026位、1029位、1040位、1095位、1098位、1105位、1144位、1148位、1149位、1158位、1162位、1165位、1168位、1170位、1252位および1279位、ならびに配列番号27の329位からなる群から選択されるイヌP-糖タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸を含み、ここで該P-糖タンパク質は、イヌP-糖タンパク質の該少なくとも1つのアミノ酸を除いて、ヒトP-糖タンパク質と同一である、単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。項目16前記ヒトP-糖タンパク質が、配列番号7および配列番号8の群から選択される、項目15に記載の単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。項目17前記ポリペプチドまたはそのフラグメントのアミノ酸配列が、配列番号2、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号2のフラグメント、配列番号23のフラグメント、配列番号25のフラグメントおよび配列番号27のフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項14~16のいずれかに記載の単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。項目18項目14~17のいずれかに記載の単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、単離された核酸分子。項目19プロモーターに作動可能に連結された、項目1に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。項目20プロモーターに作動可能に連結された、項目18に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。項目21項目19に記載の発現ベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。項目22項目20に記載の発現ベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。項目23項目14に記載の単離されたポリペプチドを選択的に結合する、因子。項目24前記因子が、ヒトP-糖タンパク質もイヌP-糖タンパク質も結合しない、項目23に記載の方法。項目25前記因子がポリペプチドである、項目23に記載の因子。項目26項目25に記載の因子であって、ここで、前記ポリペプチドは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Fab抗体フラグメント、Fab2抗体フラグメントおよびCDR3領域を含む抗体フラグメントからなる群より選択される、因子。項目27項目1または項目18に記載の単離された核酸分子を選択的に結合する、因子。項目28前記因子が、前記単離された核酸分子に選択的に結合するアンチセンス核酸である、項目27に記載の因子。項目29化合物のバイオアベイラビリティを予測する方法であって、該方法は、以下:第1のP-糖タンパク質による試験化合物の膜貫通輸送を測定する工程、該第1のP-糖タンパク質および第2のP-糖タンパク質による該試験化合物の膜貫通輸送を比較し、該試験化合物のバイオアベイラビリティを予測する工程であって、ここで、該第1のP-糖タンパク質および該第2のP-糖タンパク質による相対的な輸送量または輸送速度は、該試験化合物のバイオアベイラビリティを予測する、工程、を包含する、方法。項目30前記第1のP-糖タンパク質が、イヌP-糖タンパク質および霊長類P-糖タンパク質からなる群より選択される、項目29に記載の方法。項目31前記第1のP-糖タンパク質が、項目14~17に記載のポリペプチドである、項目29に記載の方法。項目32前記第2のP-糖タンパク質が、ヒトP-糖タンパク質である、項目29に記載の方法。項目33哺乳動物細胞中のP-糖タンパク質トランスポーター活性を阻害する方法であって、該方法は、該哺乳動物細胞を、該哺乳動物細胞におけるP-糖タンパク質トランスポーター活性を阻害するに有効な量の項目27に記載の因子と接触させる工程を包含する、方法。項目34被験体中の薬物のバイオアベイラビリティを増加する方法であって、該方法は、このような処置が必要な被験体に、薬物のバイオアベイラビリティを増加するに有効な量で項目27に記載の因子を投与する工程を包含する、方法。項目35インヒビターが前記薬物を投与する前に投与される、請求項34に記載の方法。項目36インヒビターが前記薬物と同時に投与される、項目34に記載の方法。項目37細胞中のP-糖タンパク質トランスポーター活性を増加する方法であって、該方法は、該細胞を、項目1に記載の核酸分子および項目18に記載の核酸分子からなる群より選択される分子と、該細胞におけるP-糖タンパク質トランスポーター活性を増加するに有効な量で接触させる工程を包含する、方法。項目38P-糖タンパク質トランスポーター活性と関連する疾患の処置において有用な薬理学的因子に関するリード化合物を同定する方法であって、該方法は、以下:項目14または15に記載のP-糖タンパク質を含む、細胞または他の膜包囲空間を提供する工程;該細胞または他の膜包囲空間を、候補薬理学的因子の非存在下でP-糖タンパク質トランスポーター活性の第1の量をもたらす条件下で、該候補薬理学的因子と接触させる工程;該P-糖タンパク質トランスポーター活性に対する該薬理学的因子の効果の尺度として、P-糖タンパク質トランスポーター活性の第2の量を決定する工程であって、ここで、該第1の量よりも少ないP-糖タンパク質トランスポーター活性の第2の量は、該候補薬理学的因子がP-糖タンパク質トランスポーター活性を減少する薬理学的因子に関するリード化合物であることを示し、そしてここで、該第1の量よりも多いP-糖タンパク質トランスポーター活性の第2の量は、該候補薬理学的因子がP-糖タンパク質トランスポーター活性を増加する薬理学的因子に関するリード化合物であることを示す、工程、を包含する、方法。項目39項目38に記載の方法であって、該方法は、検出可能な化合物を前記細胞または他の膜包囲空間に負荷する工程であって、ここで該化合物は、前記P-糖タンパク質トランスポーター活性の尺度として検出される、工程、をさらに包含する、方法。項目40P-糖タンパク質を選択的に結合する化合物を同定する方法であって、項目14または15に記載のP-糖タンパク質を化合物と接触させる工程、該化合物の該P-糖タンパク質への結合を決定する工程、を包含する、方法。項目41前記P-糖タンパク質のP-糖タンパク質トランスポーター活性に対する前記化合物の効果を決定する工程をさらに包含する、項目40に記載の方法。項目42前記P-糖タンパク質のATPase活性に対する前記化合物の効果を決定する工程をさらに包含する、項目40に記載の方法。項目43P-糖タンパク質のATPase活性を決定する方法であって、該方法は、以下:項目21もしくは22に記載の宿主細胞またはその膜画分を、試験薬物と接触させる工程、および該P-糖タンパク質のATPase活性を測定する工程、を包含する、方法。項目44前記ATPase活性を測定する工程が、異なる時間に少なくとも2回実施される、項目43に記載の方法。項目45P-糖タンパク質による化合物の膜貫通輸送を決定する方法であって、該方法は、以下:項目21もしくは22に記載の宿主細胞またはその膜画分を、試験薬物と接触させる工程、および頂端側から側底側の方向および側底側から頂端側の方向からなる群より選択される少なくとも1つの輸送方向の傾斜条件下において、該試験薬物の輸送を測定する工程、を包含する、方法。項目46前記試験薬物の輸送を測定する工程が、異なる時間に少なくとも2回実施される、項目45に記載の方法。本発明の1つの局面に従って、a配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸分子、baの対立遺伝子改変体ここで、この対立遺伝子改変体は、配列番号3および配列番号5を除く、およびcaまたはbの相補体からなる群より選択される単離された核酸分子が提供される。好ましい対立遺伝子改変体は、配列番号23、配列番号25および配列番号27からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子、詳細には、配列番号22、配列番号24および配列番号26からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、この単離された核酸分子は、配列番号2をコードするか、または配列番号1のヌクレオチド配列を含む。特に好ましい実施形態において、この核酸分子は、上記のヌクレオチドのコード領域を含むか、あるいはこれらからなる。本発明の他の局面に従って、単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントが提供される。このポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸25、192、197、212、288、329、532、696、1273および1355;配列番号23のアミノ酸25;ならびに配列番号25のアミノ酸25および1148からなる群より選択されるイヌP-糖タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸を含む。他の単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号2のアミノ酸3、6、8、10、12、14~26、36、38、48、52、56、64、74、78、84~92、94、96、98、99、101、103、104、106、108、112、115、147、187、197、199、233、288、321、326、347、397、450、454、455、467、472、520、633、637、643、644、650、657、658、661、666、667、674~677、679、685、689、691、693、694、703、707、717、731、736、740、744、745、756、759、763、853、914、920、942、943、946、968~970、972、974、983、1005、1010、1017、1025、1026、1029、1040、1095、1098、1105、1144、1148、1149、1158、1162、1165、1168、1170、1252および1279;ならびに配列番号27のアミノ酸329からなる群より選択されるイヌP-糖タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸ここで、P-糖タンパク質は、イヌP-糖タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸を除いて、ヒトP-糖タンパク質に同一であるを含む。特定の実施形態において、ヒトP-糖タンパク質は、配列番号7および配列番号8の群から選択される。さらに他の単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントは、カニクイザルP-糖タンパク質とは異なるイヌP-糖タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸ここで、このP-糖タンパク質は、イヌP-糖タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸以外はカニクイザルP-糖タンパク質に同一であるを含む。さらに他のポリペプチドは、上記のイヌPGPポリペプチド、ヒトPGPポリペプチドおよびカニクイザルPGPポリペプチドの組み合わせを含む。好ましい実施形態において、この単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号2、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号2のフラグメント、配列番号23のフラグメント、配列番号25のフラグメント、および配列番号27のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のさらに他の実施形態に従って、上記の単離されたP-糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離された核酸分子が提供される。さらに、プロモーターに作動可能に連結された上記の単離された核酸分子を含む発現ベクター、ならびにこの発現ベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞が含まれる。本発明の別の局面において、単離されたPGPポリペプチドを選択的に結合する因子が、提供される。好ましくは、この因子は、本明細書中に提供されるもの以外はヒトP-糖タンパク質またはイヌP-糖タンパク質を結合しない。特定の実施形態において、この因子は、ポリペプチド、好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Fab抗体フラグメント、Fab2抗体フラグメントおよびCDR3領域を含む抗体フラグメントからなる群より選択されるものである。上記の単離された核酸分子に選択的に結合する因子、好ましくは単離された核酸分子を選択的に結合するアンチセンス核酸分子がまた提供される。本発明の別の局面に従って、化合物のバイオアベイラビリティを予測する方法が提供される。この方法は、第1のP-糖タンパク質による試験化合物の膜貫通輸送を測定する工程、この第1のP-糖タンパク質および第2のP-糖タンパク質によるこの試験化合物の膜貫通輸送を比較し、この試験化合物のバイオアベイラビリティを予測する工程であって、ここで、第1のP-糖タンパク質および第2のP-糖タンパク質による相対的な輸送量または輸送速度は、この試験化合物のバイオアベイラビリティを予測する、工程、を包含する。特定の実施形態において、第1のP-糖タンパク質は、イヌP-糖タンパク質および霊長類P-糖タンパク質からなる群より選択され、好ましくは上記のポリペプチドのうちの1つである。他の実施形態において、この第2のP-糖タンパク質は、ヒトP-糖タンパク質である。本発明のさらに他の局面において、哺乳動物細胞においてP-糖タンパク質トランスポーター活性を阻害する方法が、提供される。この方法は、哺乳動物細胞を、この哺乳動物細胞におけるP-糖タンパク質トランスポーター活性を阻害するのに有効な量の上記因子のうちの1つと接触させる工程を包含する。被験体中の薬物のバイオアベイラビリティを増加するための方法がまた、本発明に含まれる。この方法は、そのような処置が必要な被験体に、薬物のバイオアベイラビリティを増加するのに有効な量で上記因子のうちの1つを投与する工程を包含する。このインヒビターは、この薬物を投与する前またはこの薬物と同時に投与され得る。細胞中のP-糖タンパク質トランスポーター活性を増加する方法もまた、提供される。この方法は、この細胞を、上記核酸分子からなる群より選択される分子と、この細胞におけるP-糖タンパク質トランスポーター活性を増加するに有効な量で接触させる工程を包含する。この細胞は、P-糖タンパク質が発現される条件下で接触され得る。本発明のなお別の局面に従って、P-糖タンパク質トランスポーター活性と関連する疾患の処置において有用な薬理学的因子に関するリード化合物を同定する方法が提供される。この方法は、本明細書中に提供されるようなP-糖タンパク質を含む、細胞または他の膜包囲空間を提供する工程;この細胞または他の膜包囲空間を、候補薬理学的因子の非存在下でP-糖タンパク質トランスポーター活性の第1の量をもたらす条件下で、この候補薬理学的因子と接触させる工程;および、P-糖タンパク質トランスポーター活性に対するこの薬理学的因子の効果の尺度として、P-糖タンパク質トランスポーター活性の第2の量を決定する工程であって、ここで、第1の量よりも少ないP-糖タンパク質トランスポーター活性の第2の量は、候補薬理学的因子がP-糖タンパク質トランスポーター活性を減少する薬理学的因子に関するリード化合物であることを示し、そしてここで、第1の量よりも多いP-糖タンパク質トランスポーター活性の第2の量は、候補薬理学的因子がP-糖タンパク質トランスポーター活性を増加する薬理学的因子に関するリード化合物であることを示す工程、を包含する。この方法は、検出可能な化合物でこの細胞または他の膜包囲空間を負荷する工程であって、ここで、この化合物は、P-糖タンパク質トランスポーター活性の尺度として検出される工程をさらに包含し得る。P-糖タンパク質を選択的に結合する化合物を同定する方法もまた、含まれる。この方法は、本明細書中に提供されるP-糖タンパク質を化合物と接触させる工程、およびこの化合物のP-糖タンパク質への結合を決定する工程を包含する。この方法は、このP-糖タンパク質のP-糖タンパク質トランスポーター活性に対する化合物の効果を決定する工程、またはこのP-糖タンパク質のATPase活性に対する化合物の効果を決定する工程をさらに包含し得る。本発明に従って提供されるさらなる方法は、P-糖タンパク質のATPase活性を決定する方法を含む。この方法は、上記に提供されるような宿主細胞またはその膜画分を、試験薬物と接触させる工程、およびこのP-糖タンパク質のATPase活性を測定する工程を包含する。特定の実施形態において、このATPase活性を測定する工程は、異なる時間に少なくとも2回実施される。P-糖タンパク質による化合物の膜貫通輸送を決定する方法もまた、提供される。この方法は、上記に提供される宿主細胞またはその膜画分を、試験薬物と接触させる工程、および頂端側apicalから側底側basolateralの方向および側底側から頂端側の方向からなる群より選択される少なくとも1つの輸送方向の傾斜sink条件下において、試験薬物の輸送を測定する工程を包含する。特定の実施形態において、この試験薬物の輸送を測定する工程は、異なる時間に少なくとも2回実施される。本発明のこれらおよび他の局面は、より詳細に以下に記載される。配列の簡単な説明配列番号1は、イヌP-糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列遺伝子型Cである。配列番号2は、配列番号1によってコードされるイヌP-糖タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号3は、先行分野のイヌP-糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列GenBank登録番号AF045016である。配列番号4は、配列番号3によってコードされるイヌP-糖タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号5は、別の先行分野のイヌP-糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列GenBank登録番号AF092810である。配列番号6は、配列番号5によってコードされるイヌP-糖タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号7は、Genbank登録番号M14758を有する、先行分野のヒトP-糖タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号8は、Genbank登録番号AF016535またはNM_000927を有する第2の先行分野のヒトP-糖タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号9は、ヒトPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号10は、イヌPGP2に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号11は、イヌPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号12は、ヒトPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号13は、イヌPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号14は、ヒトPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号15は、イヌPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号16は、ヒトPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号17は、イヌPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号18は、ベクターに対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号19は、イヌPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号20は、ヒトPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号21は、イヌPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号22は、イヌP-糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列遺伝子型Aである。配列番号23は、配列番号22によってコードされるイヌP-糖タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号24は、イヌP-糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列遺伝子型Bである。配列番号25は、配列番号24によってコードされるイヌP-糖タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号26は、イヌP-糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列遺伝子型Dである。配列番号27は、配列番号25によってコードされるイヌP-糖タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号28は、MarathoncDNA増幅キットからのcDNA合成プライマーのヌクレオチド配列である。配列番号29は、MarathoncDNA増幅キットからのcDNAアダプタープライマー1のヌクレオチド配列である。配列番号30は、イヌPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号31は、イヌPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。配列番号32は、イヌPGP1に対して相同性のPCRプライマーのヌクレオチド配列である。発明の詳細な説明本発明は、1つの局面において、イヌのP-糖タンパク質本明細書中でイヌPGPというをコードする新規のcDNAの同定を含む。イヌPGP遺伝子型Cと称するのヌクレオチド配列は、配列番号1として示され、そしてこのイヌPGPのアミノ酸配列は、配列番号2として示される。遺伝子型CのイヌPGPの3つの対立遺伝子改変体が単離された遺伝子型A遺伝子型Bおよび遺伝子型D。遺伝子型Aのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号20および21として示される。遺伝子型Aのアミノ酸配列は、配列番号2のヌクレオチド607でのC→A変化に基づくアミノ酸197ヒスチジン→グルタミンにおいて、遺伝子型Cのアミノ酸配列と異なる。遺伝子型Bのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号22および23として示される。遺伝子型Bのアミノ酸配列は、配列番号2のヌクレオチド91でのT→A変化に基づくアミノ酸25アスパラギン→ロイシンにおいて、およびに配列番号2のヌクレオチド607でのT→A変化に基づくアミノ酸197ヒスチジン→グルタミンにおいて、遺伝子型Cのアミノ酸配列と異なる。遺伝子型Aのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号20および21として示される。遺伝子型Dのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号24および25として示される。遺伝子型Dのアミノ酸配列は、配列番号2のヌクレオチド91でのC→A変化に基づくアミノ酸25アスパラギン→リジンにおいて、配列番号2のヌクレオチド607でのC→A変化に基づくアミノ酸197ヒスチジン→グルタミンにおいて、配列番号2のヌクレオチド1001でのC→A変化に基づくアミノ酸329セリン→スレオニンにおいて、配列番号2のヌクレオチド3458でのC→A変化に基づくアミノ酸1148メチオニン→バリンにおいて、遺伝子型Cのアミノ酸配列と異なる。密接に関連した2つのヒトPGP配列は、GenBankにアクセッション番号AF045016完全cDNAおよびAF092810部分cDNAとして寄託された。本明細書中に示されるポリペプチドのほとんどが公知のイヌPGPに同一であるが、本発明のイヌPGP配列番号2、配列番号21、配列番号23および配列番号25は、先行技術の配列とは異なり、少なくとも1つの欠失を含む。P-糖タンパク質の非常に高度に保存されたタンパク質ドメインにおけるこれらの対立遺伝子の差異は、全く予想されない。本発明は、1つの局面において、イヌPGP核酸およびポリペプチド、ならびにこれらに関する治療を含む。本発明はまた、前述の核酸およびポリペプチド;前述の核酸の相補体;および前述の核酸およびポリペプチドに選択的に結合する分子の、単離された機能的に等価な改変体、有用なアナログおよびフラグメントを含む。本発明のイヌPGP核酸およびポリペプチドは単離される。本明細書中で核酸に関して使用される場合、用語単離されたされるは:i例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCRによってインビトロで増幅されたされる;iiクローニングによって組換え的に産生されたされる;iii切断およびゲル分離によるように精製されたされる;またはiv例えば、化学合成によって合成されたされる、ことを意味する。単離された核酸は、当該分野において周知の組換えDNA技術によって容易に操作可能であるものである。従って、5’制限部位および3’制限部位が公知であるベクターまたはポリメラーゼ連鎖反応PCRプライマー配列が開示されたベクターに含まれるヌクレオチド配列は、単離されたと認識されるが、その天然の宿主中にそのネイティブな状態で存在する核酸配列は、単離されたと認識されない。単離された核酸は、実質的に精製され得るが、実質的に精製される必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内に単離された核酸は、その核酸の存在する細胞中にその物質のほんの少しのパーセントを含み得るという点で純粋ではない。しかし、この用語が本明細書中で使用される場合、このような核酸は、単離されたされるである。なぜなら、当業者に公知の標準技術によって容易に操作可能であるからである。本明細書中で使用される場合、単離された核酸は、天然に存在する染色体ではない。ポリペプチドに関して本明細書中で使用される場合、単離されたされるは、そのネイティブの環境から分離され、そしてその同定または使用を可能にするに十分な量で存在することを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関していわれる場合、単離されたされるは、例えば:i発現クローニングによって選択的に産生されたされる、またはiiクロマトグラフィーまたは電気泳動によるように精製されたされる、ことを意味する。単離されたタンパク質またはポリペプチドは、実質的に純粋であり得るが、実質的に純粋である必要はない。用語実質的に純粋は、タンパク質またはポリペプチドが、その意図された使用に実用的および適切である範囲で、天然にかまたはインビボの系で見出され得る他の物質が本質的にないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当該分野において周知の技術によって産生され得る。単離されたタンパク質は薬学的調製物中に薬学的に受容可能なキャリアと混合され得るので、タンパク質は、調製物の少ない重量のみを含み得る。にもかかわらず、タンパク質は、生存系において関与し得る物質から分離されたすなわち、他のタンパク質から単離されたという点で、単離されたされるである。本明細書中で使用される場合、イヌPGP核酸は、単離された核酸分子をいう。これは、イヌPGPポリペプチドをコードする。このような核酸分子は、配列番号2、配列番号23、配列番号25および配列番号27ならびにこれらのフラグメントのアミノ酸配列を含む、イヌPGPポリペプチドをコードする。核酸分子は、配列番号1のヌクレオチド配列、ならびに、遺伝コードの縮重に起因するコドン配列において配列番号1の配列とは異なるヌクレオチド配列を含む。本発明のイヌPGP核酸はまた、前述の核酸配列番号22、24、26の対立遺伝子以前から公知のイヌPGP対立遺伝子例えば、配列番号3および5の核酸配列を除く、およびコードされたポリペプチドの対立遺伝子、ならびに前述の核酸およびポリペプチドのフラグメントの対立遺伝子を含む。このようなフラグメントは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして、および、ポリメラーゼ連鎖反応PCRにおけるプライマーとして、使用され得る。好ましいイヌPGP核酸は、配列番号1、配列番号22、配列番号24、配列番号26およびこれらのフラグメントの核酸配列を含む。前述の核酸の相補体はまた、本発明によって含まれる。本明細書中で使用される場合、イヌPGP活性は、細胞膜を横切って低分子を運び出すPGPポリペプチドの能力をいう。イヌPGP活性を阻害する分子アンタゴニストは、PGPを介して低分子の運び出しを阻害するものであり、そしてイヌPGP活性を増加する分子アゴニストは、PGPを介して低分子の運び出しを増加するものである。イヌPGP活性における変化は、細胞からの蛍光化合物の流出を含む、本明細書中に記載されるようなアッセイによって測定され得る。本発明のイヌPGP核酸の対立遺伝子は、慣用的な技術によって同定され得る。例えば、イヌPGPの対立遺伝子は、cDNAライブラリーとストリンジェントな条件下で、配列番号1のフラグメントを少なくとも含むプローブをハイブリダイズすること、および陽性クローンを選択することによって単離され得る。従って、本発明の1つの局面は、イヌPGPポリペプチドをコードする核酸配列およびストリンジェントな条件下で配列番号1からなる核酸分子にハイブリダイズする以前から公知のイヌPGP対立遺伝子例えば、配列番号3および5の核酸配列を除く核酸配列である。本明細書中で使用される場合、用語ストリンジェントな条件は、当業者が精通するパラメーターをいう。核酸ハイブリダイゼーションパラメーターは、このような方法を編集する参考文献中例えば、MolecularCloning:ALaboratoryManual,J.Sambrookら編、第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989、または、CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubelら編、JohnWileySons,Inc,NewYorkに見出され得る。より特定には、本明細書中で使用される場合、ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液3.5×SSC、0.02Ficoll、0.02ポリビニルピロリドン、0.02ウシ血清アルブミン、2.5mMNaH2PO4pH7、0.5SDS、2mMEDTA中で65°Cでのハイブリダイゼーションをいう。SSCは、0.15M塩化ナトリウム/0.15Mクエン酸ナトリウムpH7であり;SDSは、ドデシル硫酸ナトリウムであり;およびEDTAは、エチレンジアミン3酢酸である。ハイブリダイゼーション後、その上にDNAが転写される膜は、2×SSCで室温にて洗浄され、次いで、室温~68°Cまでの0.1~0.5×SSC/0.1×SDSで洗浄される。同程度のストリンジェンシーを生じる、使用され得る他の条件、試薬、などが存在する。当業者は、このような条件に精通しており、従って、本明細書中で示されない。しかし、当業者が、これらの条件を、本発明のイヌPGP核酸の対立遺伝子の明瞭な同定を可能にする様式で操作し得ることは明白である。当業者はまた、このような分子の発現のための細胞およびライブラリーのスクリーニング、次いで慣用的な単離、引き続く適切な核酸分子の単離および配列決定についての方法論に精通している。イヌPGP核酸についてのスクリーニングにおいて、サザンブロットは、放射活性なプローブとともに前述のストリンジェントな条件を使用して実施され得る。DNAが最終的に転写された膜の洗浄後に、この膜は、放射活性なシグナルを検出するためにX線フィルムに対して置かれ得る。本発明のイヌPGP核酸はまた、ネイティブな物質中に存在する核酸に対して代替的なコドンを含む縮重核酸を含む。例えば、セリン残基は、コドンTCA、AGT、TCC、TCG、TCTおよびAGCによってコードされる。これら6つのコドンの各々は、セリン残基をコードする目的について等価である。従って、セリンをコードするヌクレオチドトリプレットtripletのいずれもが、伸長するイヌPGPポリペプチドにセリン残基を組み込むための、インビトロまたはインビボでタンパク質合成装置を指向するために使用され得ることが、当業者に明白である。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない:CCA、CCC、CCGおよびCCTプロリンコドン;CGA、CGC、CGG、CGT、AGAおよびAGGアルギニンコドン;ACA、ACC、ACGおよびACTスレオニンコドン;AACおよびAATアルギニンコドン;ならびにATA、ATCおよびATTイソロイシンコドン。他のアミノ酸残基は、多様なヌクレオチド配列によって同様にコードされ得る。従って、本発明は、遺伝コードの縮重に起因するコドン配列において、生物学的に単離された核酸とは異なる縮重核酸を含む。本発明はまた、改変された核酸分子を提供する。これは、1つ以上のヌクレオチドの付加、置換および欠失を含む。好ましい実施形態において、これらの改変された核酸分子および/またはこれら核酸分子がコードするポリペプチドは、改変されなかった核酸分子および/またはポリペプチドの少なくとも1つの活性または機能例えば、トランスポーター活性などを保持する。特定の実施形態において、改変された核酸分子は、改変されたポリペプチド、好ましくは、本明細書中の他の場所で記載されるような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。改変された核酸分子は、改変されない核酸分子に構造的に関し、好ましい実施形態において、改変されない核酸分子に十分に構造的に関し、その結果、改変された核酸分子および改変されない核酸分子は、当業者に公知のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。例えば、単一のアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする改変された核酸分子は、調製され得る。これらの核酸分子の各々は、本明細書中で記載されるような遺伝コードの縮重に対応するヌクレオチド変化を除いて、1、2または3ヌクレオチド置換を有し得る。同様に、2アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする改変された核酸分子は、例えば2~6ヌクレオチド変化を有して調製され得る。これらのような多数改変された核酸分子は、当業者によって容易に想像され、例えば、アミノ酸2および3、2および4、2および5、2および6などをコードするコドン中のヌクレオチド置換を含む。前述の例において、2アミノ酸の各組合せは、改変された核酸分子ならびにアミノ酸置換をコードする全てのヌクレオチド置換のセット中に含まれる。さらなる置換すなわち、3以上、付加、または欠失例えば、停止コドンもしくはスプライシング部位の導入によってを有するポリペプチドをコードするさらなる核酸分子はまた、調製され得、そして当業者によって容易に想像されるように本発明によって含まれる。前述の核酸またはポリペプチドのいずれもが、本明細書中に開示される核酸および/またはポリペプチドに対する構造的な関係または活性の保持について、慣用的な実験によって試験され得る。本発明はまた、配列番号1の単離されたフラグメントを提供する。これらのフラグメントは、このような核酸を同定するためのサザンブロット分析におけるプローブとして使用され得るか、またはこれらを利用するPCRのような増幅アッセイにおいて使用され得る。より小さいフラグメントは、12、13、14、15、16、17、18、20、22、25、30、40、50または75およびこれらの間の全ての整数のヌクレオチドを含むフラグメントであり、例えば、核酸増幅手順についてのプライマーとして有用である。当業者に公知であるように、200、250、300、400以上のヌクレオチドのような大きいプローブは、サザンブロットのような特定の使用に好ましいが、小さいフラグメントは、PCRのような使用に好ましい。フラグメントはまた、抗体を作製するためかまたはポリペプチドフラグメントの結合を決定するための融合タンパク質を産生するために使用され得る。同様に、フラグメントは、例えば、抗体の調製、免疫アッセイなどにおいて有用な、イヌPGPポリペプチドの融合されないフラグメントを産生するために利用され得る。前述の核酸フラグメントはさらに、イヌPGP核酸およびポリペプチドの発現を阻害するためのアンチセンス分子として、以下により詳細に記載されるように、特に治療目的に使用され得る。本発明はまた、イヌPGPの機能的に等価な改変体を含む。これは、イヌPGPの1以上の機能的な特性を残す改変体核酸およびポリペプチドを含む。例えば、改変体は、分子を輸送する能力を保持するイヌPGPの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む融合タンパク質を含む。なお他の機能的に等価な改変体は、配列番号1の配列に対するアミノ酸の短縮、欠失、点変異または付加を含み例えば、本明細書中に示される対立遺伝子、これらは、配列番号2の機能を保持する。機能的に等価な改変体はまた、除去されたかまたは別のP-糖タンパク質からの同様のドメインによって置換された、N末端の一部を有するイヌPGP例えば、ドメイン交換swapping改変体を含む。他の機能的に等価な改変体は、このような改変体を調製する方法と同様に、当業者に公知である。機能的に等価な改変体の活性は、本明細書中および他の種のP-糖タンパク質を使用するアッセイを記載した参考文献中に提供される方法を使用して決定され得る。このような改変体は、イヌPGPの輸送機能を結合および/または調節する化合物の同定についてのアッセイにおいて、薬物のバイオアベイラビリティを評価するために、そして輸送活性が要求されるイヌPGPの部分を決定するためにとりわけ有用である。非機能的である改変体はまた、上記されるように調製され得る。このような改変体は、例えば、トランスポーター活性を試験する実験におけるネガティブコントロールとして有用である。1つの実施形態において、イヌPGP核酸は、真核生物細胞または原核生物細胞内にイヌPGP核酸の発現を指向する遺伝子発現配列に作動可能に連結される。遺伝子発現配列は、任意の調節核酸配列例えば、プロモーター配列またはプロモーター-エンハンサー組合わせこれは、作動可能に連結されるイヌPGP核酸の効果的な転写および翻訳を容易にするである。遺伝子発現配列は、例えば、哺乳動物またはウイルスのプロモーター例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。構成的哺乳動物プロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼHPTR、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼの遺伝子についてのプロモーター、β-アクチンプロモーターおよび他の構成的プロモーター。真核生物細胞に構成的に機能するウイルスプロモーターの例示としては、以下が挙げられる:例えば、シミアンウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルスHIV、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復LTR由来のプロモーター、および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターはまた、誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。一般には、遺伝子発現配列は、必要ならば、それぞれ転写の開始および翻訳の開始に関与する、5’非転写配列および5’非翻訳配列例えば、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列などを含む。特に、このような5’非転写配列は、作動可能に連結されたイヌPGP核酸の転写制御についてのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、必要ならば、所望されるようにエンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含む。イヌPGP核酸配列および遺伝子発現配列は、これらが共有結合されてこの遺伝子発現配列の影響下または制御下でイヌPGPコード配列を転写および/または翻訳する方向に置かれる場合、作動可能に連結されるされたといわれる。イヌPGP配列が機能的タンパク質に翻訳されることが所望される場合、2つのDNA配列は、5’遺伝子発現配列中のプロモーターの誘導がイヌPGP配列の転写を生じる場合、および2つのDNA配列の間の連結の特性が以下ではない場合、作動可能に連結されるといわれる:1フレームシフト変異の導入を生じる、2イヌPGP配列の転写を指向するプロモーター領域の能力を緩衝する、または3対応するRNA転写物がタンパク質中に翻訳される能力を緩衝する。従って、遺伝子発現配列がイヌPGP核酸配列の転写を影響し得その結果生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合、遺伝子発現配列は、イヌPGP核酸配列に作動可能に連結される。本発明のイヌPGP核酸分子およびイヌPGPポリペプチド以下に記載されるイヌPGPインヒビターを含むは、真核生物細胞または原核生物細胞に単独でかまたはベクターと組合わせて送達され得る。その最も広い意味において、ベクターは、以下を容易にし得る任意のビヒクルである:1標的細胞へのイヌPGP核酸またはポリペプチドの送達、2標的細胞によるイヌPGP核酸またはポリペプチドの取り込み、または3標的細胞でのイヌPGP核酸分子またはポリペプチドの発現。好ましくは、減少した分解を伴う、イヌPGP核酸もしくはポリペプチドの標的細胞へのベクター輸送は、ベクターの非存在を生じる分解の範囲に関する。必要ならば、標的リガンドは、ベクターに付着して、その標的リガンドに対する同属のレセプター例えば、抗体によって認識されるレセプター、抗原をその表面上に発現する細胞に選択的にベクターを送達し得る。この様式において、ベクターイヌPGP核酸またはイヌPGPポリペプチドを含むは、特定の細胞に選択的に送達され得る。一般には、本発明において有用なベクターは、2つのクラスに分けられる:生物学的ベクターおよび化学的/物理的ベクター。生物学的ベクターは、標的細胞へのイヌPGP核酸の送達、標的細胞によるイヌPGP核酸の取り込みについてより有用である。化学的/物理的ベクターは、標的細胞へのイヌPGP核酸またはイヌPGPタンパク質の送達、標的細胞によるイヌPGP核酸またはイヌPGPタンパク質の取り込みについてより有用である。生物学的ベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:プラスミド、ファージミド、ウイルス、本発明の核酸配列の挿入または組み込みによって操作されたウイルスまたは細菌の供給源由来の他のビヒクル、および本発明の核酸配列に連結され得る遊離核酸フラグメント。ウイルスベクターは、生物学的ベクターの好ましい型であり、以下のウイルス由来の核酸配列を含むがこれらに限定されない:モロニーマウス白血病ウイルスのようなレトロウイルス;Harveyマウス肉腫ウイルス;マウス哺乳動物腫瘍ウイルス;ラウス肉腫ウイルス;アデノウイルス;アデノ随伴ウイルス;SV40型ウイルス;ポリオーマウイルス;ポックスウイルス;レトロウイルス;エプスタイン-バーウイルス;パピローマウイルス;ヘルペスウイルス;ワクシニアウイルス;およびポリオウイルス。当該分野において名前はないが公知である他のベクターは、容易に利用され得る。好ましいウイルスベクターは、必須ではない遺伝子が目的の遺伝子と置換されている、非細胞傷害性真核生物ウイルスベースである。非細胞傷害性ウイルスは、レトロウイルスを含み、このウイルスの生活環は、引き続くプロウイルスの宿主細胞のDNAへの組み込みを有する、ゲノムウイルスRNAのDNAへの逆転写を含む。一般には、レトロウイルスは、複製欠損すなわち、所望のタンパク質の合成を指向し得るが、感染性粒子を製造し得ないである。このような遺伝的に変化されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボで高効率の遺伝子導入について一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的プロトコールプラスミドへの外因性遺伝物質の組み込み工程、プラスミドでのパッケージング細胞株のトランスフェクション工程、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生工程、組織培養培地からのウイルス粒子の回収工程、およびウイルス粒子での標的細胞の感染工程を包含するは、Kriegler,M.,GeneTransferandExpression,ALaboratoryManualW.H.FreemanC.O.,NewYork1990およびMurry,E.J.編、MethodsinMolecularBiology第7巻、HumanaPress,Inc.,Clifton,NewJersey1991に提供される。特定の適用についての別の好ましいウイルスは、二本鎖DNAウイルスであるアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作され得、そして広範な範囲の細胞型および種を感染し得る。これは、利点例えば、熱安定性および脂質溶媒安定性;多様な系統の細胞における高頻度の形質転換;および複数の一連の形質転換を可能にする重複感染阻害の欠失をさらに有する。すでに報告されるように、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的様式でヒト細胞性DNA中に組み込まれ得、これにより、挿入性変異の可能性および挿入された遺伝子の発現の可変性を最小化し得る。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択的圧力の非存在下で100パッセージを超える組織培養を継代した。このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みは、比較的安定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外様式で機能し得る。発現について必要な要素を全て含む発現ベクターは、市販されており、そして当業者に公知である。例えば、Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989を参照のこと。細胞は、イヌPGPポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体をコードする異種DNARNAの細胞への形質導入によって遺伝的に操作される。この異種DNARNAは、転写要素の作動可能な制御下に置かれ、宿主細胞での異種DNAの発現を可能にする。哺乳動物細胞におけるmRNA発現についての好ましい系は、pRc/CMVInvitrogen,Carsbad,CAから入手可能のような系である。pRc/CMVは、G418耐性を与える遺伝子のような選択マーカー安定にトランスフェクトされた細胞株の選択を容易にするおよびヒトサイトメガロウイルスCMVエンハンサー-プロモーター配列を含む。さらに、pCEP4ベクターはInvitrogenは、霊長類細胞株またはイヌ細胞株における発現について適切である。これは、多コピーの染色体外要素としてプラスミドの維持を容易にする、エプスタインバーウイルスEBV複製起点を含む。別の発現ベクターは、インビトロでの効率的な転写を刺激するポリペプチド延長因子1αのプロモーターを含むpEF-BOSプラスミドである。このプラスミドは、MishizumaおよびNagataNuc.AcidsRes.18:5322,1990によって記載され、トランスフェクション実験におけるその使用は、例えば、DemoulinMol.Cell.Biol.16:4710-4716,1996によって開示される。なお別の好ましい発現ベクターは、Stratford-Perricaudetによって記載されるアデノウイルスであり、E1タンパク質およびE3タンパク質を欠損するJ.Clin.Invest.90:626-630,1992。生物学的ベクターに加えて、化学的/物理的ベクターは、イヌPGP核酸またはポリペプチドを標的細胞に送達してそれにより取り込みを容易にするために使用され得る。本明細書中で使用される場合、化学的/物理的ベクターは、単離されたイヌPGP核酸またはポリペプチドを細胞に送達し得る、細菌性供給源またはウイルス性供給源由来の分子以外の天然の分子または合成分子をいう。本発明の好ましい化学的/物理的ベクターは、膠様分散系である。膠様分散系は、水中油乳濁液、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系を含む。本発明の好ましい膠様系は、リポソームである。リポソームは、インビボまたはインビトロでの送達ベクターとして有用である人工膜ビヒクルである。これは、サイズが0.2~4.0μの範囲である巨大な多層状のビヒクルLUVが巨大分子をカプセル化し得ることを示した。RNA、DNAおよびインタクトなビリオンは、水性の内部にカプセル化され得、そして生物学的に活性な形態で細胞中に送達され得るFraleyら、TrendsBiochem.Sci.,第6巻第77頁1981。リポソームが効果的な核酸輸送ベクターであるためには、1以上の以下の特性が存在すべきである:1生物学的活性の保持を有する、目的の核酸の高効率でのカプセル化;2非標的細胞に比べて、標的細胞に対する優先的および実質的な結合;3ビヒクルの水性内容物の標的細胞細胞質への高効率での送達;ならびに4遺伝情報の正確かつ効果的な発現。リポソームは、特異的なリガンド例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質へのリポソームの連結によって特定の組織に標的化され得る。特定の細胞へリポソームを標的化するために有用であり得るリガンドは、特定の細胞型または組織型に依存する。さらに、ベクターが核酸をカプセル化する場合、ベクターは、イヌPGP核酸を宿主細胞の核へ指向する核標的化ペプチドと連結され得る。リポソームは、例えば、LIPOFECTINTMおよびLIPOFECTACETMとしてGibcoBRLから市販される。これらは、N-[1-2,3ジオレイルオキシ-プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリドDOTMAおよびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドDDABのようなカチオン性脂質で形成される。リポソームを作製するための方法は、当該分野において公知であり、そして多くの刊行物に記載されている。標的細胞によるイヌPGP核酸の取り込みを容易にするために使用され得る他の例示的組成物としては、リン酸カルシウムおよび細胞内輸送の他の化学的メディエーター、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポレーションならびに例えば、イヌPGP核酸を標的細胞染色体内の予め選択された位置に組み込むための相同組換え組成物が挙げられる。本発明はまた、いわゆる発現キットを包含し、これは、技術者が所望の発現ベクターを調製することを可能にする。このような発現キットは、以前議論されたコード配列の少なくとも別個の部分を含む。必要とされる、以前に述べられた配列が含まれる限り、所望の場合、他の成分が添加され得る。本発明は、発現ベクターにおけるイヌのPGPcDNA配列の使用、ならびに宿主細胞および細胞株これらは、原核生物例えば、E.coli、または真核生物例えば、COS細胞、酵母発現系および、昆虫細胞における組換えバキュロウイルス発現であるをトランスフェクトすることを包含することも認識され得る。哺乳動物細胞例えば、ヒト、ブタ、ヤギ、霊長類などが、特に有用である。それらは、広範な種々な組織型であり得、そして始原細胞および細胞株を含む。特定の例としては、腸細胞および肝細胞が挙げられる。この発現ベクターは、適切な配列すなわち、前記されるそれらの核酸が、プロモーターに作動可能に連結されることを必要とする。本発明はまた、配列番号2のアミノ酸配列およびそれらのフラグメントを含む、単離されたイヌのPGPポリペプチドこれは、上記イヌのPGP核酸によりコードされるを提供する。イヌのPGPポリペプチドはまた、対立遺伝子例えば、配列番号23、25、および27配列番号3および5でないものを除く、機能的に等価な改変体およびアナログ1、2、3、4、5、またはそれ以上のアミノ酸により、開示されたイヌのPGPポリペプチド由来のアミノ酸配列において変化するそれらの非対立遺伝子ポリペプチドを包含し、但し、このようなポリペプチドは、イヌのPGP活性を保持する。非機能的改変体もまた、本発明により包含され;これらは、輸送体機能のアンタゴニストとして、アッセイにおけるネガティブコントロールとしてなどに有用である。このような対立遺伝子、改変体、アナログおよびフラグメントは、アッセイの成分として含む種々の目的のための、例えば、単独または融合タンパク質として有用である。ポリペプチドのフラグメントは、好ましくは、イヌのPGPポリペプチドの異なる機能的能力、特に種々の分子の輸送体として保持するそれらのフラグメントである。イヌのPGPポリペプチドのフラグメントにおいて保持され得る他の機能的能力としては、抗体との相互作用および他のポリペプチドとの相互作用例えば、タンパク質複合体において見出されるが挙げられる。当業者は、イヌのPGPの機能的能力を保持するフラグメントを選択するための方法において十分に精通する。このフラグメントの機能的能力の確認は、標準的な方法に従って、フラグメントの合成および能力を試験することにより行われ得る。例えば、イヌのPGPフラグメントの輸送体活性を試験するために、分子輸送体が、測定され得る細胞において、フラグメントを挿入または発現する。当該分野において標準的であるこのような方法が、本明細書中にさらに記載される。本発明は、上記のイヌのPGPポリペプチドの改変体を包含する。本明細書中に記載されるように、イヌのPGPポリペプチドの改変体は、イヌのPGPポリペプチドの主なアミノ酸配列に対する1つ以上の改変を含むポリペプチドである。イヌのPGP改変体を作製する改変は、種々の理由のためにイヌのPGPポリペプチドに対して作製され得、これは以下を含む:1イヌのPGPポリペプチドの活性例えば、輸送を低減するかまたは除去すること;2イヌのPGPポリペプチドの特性例えば、発現系におけるタンパク質安定性またはタンパク質-タンパク質結合の安定性を増強すること;3イヌのPGPポリペプチドに対する新規の活性または特性例えば、抗原エピトープの添加または検出可能部分の添加を提供すること;または4アミノ酸置換が分子輸送体活性に影響するかまたはしないことを確立すること、を含む。イヌのPGPポリペプチドに対する改変は、イヌのPGPポリペプチドをコードする核酸に対して代表的に作製され、そしてアミノ酸部分または非アミノ酸部分の欠失、点変異、短縮、アミノ酸置換および付加が挙げられ得る。あるいは、改変は、例えば、切断、リンカー分子の付加、検出可能部分の付加例えば、ビオチン、脂肪酸の付加などにより、ポリペプチドに直接作製され得る。改変はまた、イヌのPGPアミノ酸配列の全てまたは1部を含む融合タンパク質を含む。当業者は、タンパク質配列における変化のタンパク質構造に関する効果を予測するための方法に精通し、従って、公知の方法に従って、改変体イヌのPGPを設計し得る。このような方法の1つの例は、DahiyatおよびMayo、Science278:82-87,1997に記載され、これにより、タンパク質は、新規に設計され得る。方法は、ポリペプチド配列の1つの部分のみを変更するために公知のタンパク質に適用され得る。DahiyatおよびMayoの計算方法を適用することにより、イヌのPGPポリペプチドの特異的な改変体が提案され、そして改変体が所望の構造を保持するか否かを決定することが試験される。改変体としては、その生理学的活性に関連しないポリペプチドの特徴を変更するために特に改変されるイヌのPGPポリペプチドが挙げられる。例えば、システイン残基は、所望しないジスルフィド結合を防ぐために置換され得るかまたは欠失され得る。同様に、特定のアミノ酸は、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク質分解を除去することにより、イヌのPGPポリペプチドの発現を増強するために変化され得る例えば、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母発現系における二塩基性アミノ酸残基。イヌのPGPポリペプチドをコードする核酸の変異は、コード配列のアミノ酸リーディングフレームを好ましくは保存し、そして2次構造例えば、ヘアピンまたはループを形成するためにハイブリダイズしそうな核酸における領域これは、改変体ポリペプチドの発現に対して有害であり得るを好ましくは作製しない。変異は、アミノ酸置換を選択することによるか、またはこのポリペプチドをコードする核酸において選択される部位の無作為な変異誘発により作製され得る。次いで、改変体ポリペプチドは、どの変異体が所望の特性を有する改変体ポリペプチドを提供するかを決定するために発現され、そして1つ以上の活性について試験される。さらなる変異体が、ポリペプチドのアミノ酸配列に関してサイレントであるが、特定の宿主における翻訳のために好ましいコドンを提供する改変体に対してまたは、非改変体イヌのPGPポリペプチドに対して作製され得る。例えば、E.coliにおける核酸の翻訳のために好ましいコドンが、当業者に周知である。なお他の変異が、このポリペプチドの発現を増強するためにイヌのPGP遺伝子またはcDNAクローンの非コード配列に対して作製され得る。イヌのPGPポリペプチドの改変体の活性は、改変体イヌのPGPポリペプチドをコードする遺伝子を、細菌または哺乳動物発現ベクターへクローニングし、適切な宿主細胞中にこのベクターを導入し、改変体イヌのPGPポリペプチドを発現し、そして本明細書中に開示されるようなイヌのPGPポリペプチドの機能的能力について試験することにより、試験され得る。例えば、改変体イヌのPGPポリペプチドは、以下の例に示されるように、分子輸送体例えば、流出を提供する能力について試験され得る。他の改変体ポリペプチドの調製は、他の活性の試験に好まれ得、これは当業者に公知である。当業者はまた、保存的アミノ酸置換が、イヌのPGPポリペプチドにおいて、前述のポリペプチドの機能的に等価な改変体すなわち、イヌのPGPポリペプチドの機能的能力を保持する改変体を提供するために作製され得ることを認識する。本明細書中で使用される場合、保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸置換が作製されるポリペプチドに特徴的な、相対的な電荷または相対的なサイズを変更しないアミノ酸置換をいう。改変体は、このような方法を集めた参考文献例えば、MolecularCloning:ALaboartoryManual,J.Sambrookら、編、第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989、またはCurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubelら、編、JohnWileySons,Inc.,NewYorkにおいて見出されるような、当業者に公知のポリペプチド配列を変更するための方法に従って、調製され得る。イヌのPGPポリペプチドの例示的な機能的に等価な改変体としては、配列番号2または配列番号4の保存的アミノ酸置換が挙げられる。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸の中で作製される置換を含む:aM、I、L、V;bF、Y、W;cK、R、H;dA、G;eS、T;fQ、N;およびgE、D。イヌのPGPの機能的に等価な改変体を産生するためのイヌのPGPポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、代表的に、イヌのPGPポリペプチドをコードする核酸配列例えば、配列番号1の変更により作製される。このような置換は、当業者に公知の種々の方法により作製され得る。例えば、アミノ酸置換は、Kunkelの方法Kunkel、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.82:488-492、1985に従って、PCR指向性変異、部位指向性変異誘発により、またはイヌのPGPポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成により作製され得る。イヌのPGPポリペプチドの機能的に等価なフラグメントの活性が、化合物の膜貫通輸送を媒介するために、変更されたイヌのPGPポリペプチドをコードする遺伝子を、細菌性発現ベクターまたは哺乳動物発現ベクター中にクローニングし、このベクターを適切な宿主細胞中に導入し、この変更されたイヌのPGPポリペプチドを発現し、そしてイヌのPGPポリペプチドの能力を試験することにより、試験され得る。化学的に合成されるペプチドが、機能について直接試験され得る。当業者に周知の種々の方法論が、単離されたイヌのPGP分子を得るために利用され得る。ポリペプチドは、クロマトグラフィー手段または免疫学的認識により、このポリペプチドを天然に産生する細胞から精製され得る。あるいは、発現ベクターは、このポリペプチドの産生を引き起こすために細胞に導入され得る。別の手段において、mRNA転写物が、コードされたポリペプチドの産生を引き起こすために、細胞に微小注入されてもよいし、またはその他の手段で細胞導入されてもよい。無細胞系抽出物例えば、網状赤血球溶解産物系におけるmRNAの翻訳もまた、ポリペプチドを産生するために使用され得る。当業者はまた、イヌのPGPポリペプチドを単離するための公知の手段に容易に従い得る。これらとしては、免疫クロマトグラフィー、HPLC、サイズ排除クロマトグフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫親和性クロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中に記載されるような発明は、多数の使用を有し、そのいくつかは、その他で本明細書中に記載される。例えば、本発明は、例えば、標準的なプロトコールを使用して単離され得る多量のポリペプチドを産生するための組換え核酸の発現により、イヌのPGPポリペプチド分子の単離を可能にする。別の例として、イヌのPGP遺伝子の単離は、イヌのPGPが、分子輸送のアッセイのための方法例えば、薬物のバイオアベイラビリティ研究において使用されることを可能にする。これらの方法は、この薬物のバイオアベイラビリティを決定または予測するための方法として、最初の種のPGP例えば、イヌによる薬物の輸送を、他の種のPGP例えば、ヒトによる薬物の輸送に対する比較において、決定することを含む。従って、薬物の代謝における動物研究全体の結果が、薬物のP糖タンパク質輸送の、相対的速度または量の点で評価され得る。例えば、イヌに投与される薬物が、優れた経口バイオアベイラビリティおよびイヌPGPによる低い輸送を有する場合、ヒトPGPによる輸送もまた低い場合に、ヒトにおける薬物の経口バイオアベイラビリティは優れていることが予測され得る。逆に、ヒトPGPによる薬物の輸送が高い場合、次いで、薬物のバイオアベイラビリティは、低いことが予測される。本発明はまた、イヌのPGP核酸分子またはペプチドに選択的に結合する因子ならびに本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよび核酸の改変体およびフラグメントに結合する因子を包含する。この因子は、イヌのPGP、およびアンチセンス核酸に結合するポリペプチドを含み、この両方が、以下により詳細に記載される。この因子は、イヌのPGP活性を阻害または増大し得るそれぞれ、アンタゴニストおよびアゴニスト。この因子のいくつかは、インヒビターである。イヌのPGPインヒビターは、細胞膜を横切る分子のイヌのPGP媒介輸送を阻害する因子である。流出アッセイは、イヌのPGPインヒビターが、イヌのPGP活性を阻害する能力を有するか否か、およびこの阻害が選択的であるか否かを、スクリーニングおよび/または決定するために実施され得る。流出の例示的アッセイは、実施例において、以下に記載される。1つ実施形態において、イヌのPGPインヒビターは、細胞におけるイヌのPGPまたは他の種のPGPの発現を減少するために、イヌのPGP核酸分子に選択的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これは、実質的に任意の医学的条件において所望され、ここで、PGP輸送活性の減少は、例えば、細胞における細胞傷害性因子の維持を増加するために所望される。本明細書中に使用される場合、用語アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスは、生理学的条件下で、特定の遺伝子を含むDNAまたはその遺伝子のmRNA転写物にハイブリダイズし、そしてそれにより、その遺伝子の転写および/またはそのmRNAの翻訳を阻害する、オリゴヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、改変されたオリゴヌクレオチド、または改変されたオリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを記載する。このアンチセンス分子が設計され、その結果、標的遺伝子または転写物とのハイブリダイゼーションに関して、標的遺伝子の転写または翻訳を仲介する。当業者は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよびその標的との相補性のその程度は、選択された特定の標的に依存し、これは、この標的の配列およびその配列を含む特定の塩基を含むことを認識する。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、構築されかつ配置され、その結果、生理学的条件下で、標的と選択的に結合するすなわち、生理学的条件下で、標的細胞における任意の他の配列に対してより多く、標的配列に実質的にハイブリダイズすることが好ましい。配列番号1、または対立遺伝子配列番号3および5を除くもしくはホモログゲノム配列および/もしくはcDNA配列に基づいて、当業者は、本発明に従って、使用のために多数の適切なアンチセンス分子のいずれかを容易に選択し、かつ合成し得る。阻害に関して、十分選択的であり、かつ強力であるために、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドが、この標的に相補的である、少なくとも10、およびより好ましくは、少なくとも15の保存的塩基を含むべきであるが、特定の場合、7塩基長と同じくらい短い改変されたオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして首尾よく使用されたWagnerら、NatureBiotechnol.14:840-844、1996。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、20~30塩基の相補的な配列を含む。その遺伝子またはmRNA転写物の任意の領域に対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドが選択され得るが、好ましい実施形態において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、N末端部位または5’上流部位例えば、翻訳開始部位、転写開始部位、またはプロモーター部位に対応する。さらに、3’非翻訳領域が、標的化され得る。mRNAスプライシング部位に対する標的化もまた、当該分野において使用されていたが、代替のmRNAスプライシングが生じる場合、あまり好まれ得ない。さらに、このアンチセンスは、好ましくは、mRNA2次構造が期待されない部位例えば、Sainioら、CellMol.Neurobiol.145:439-457、1994を参照のことおよびポリペプチドが結合することが期待されない部位に、好ましくは、標的化される。従って、本発明はまた、配列番号1を含むイヌのPGP核酸に対応する対立遺伝子配列番号3および5を除くまたは相同なcDNAおよびゲノムDNAに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた提供する。実施形態の1つの組において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組み合わせからなり得る。つまり、あるネイティブなヌクレオチドの5’末端および別のネイティブなヌクレオチドの3’末端が、ホスホジエステルヌクレオシド内連結を介して、天然の系として共有結合され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、手動または自動合成により実施され得る、当該分野で認識される方法により、調製され得る。それらはまた、ベクターにより、組換え的に産生され得る。しかし、好ましい実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、改変されたオリゴヌクレオチドを含み得る。つまり、このオリゴヌクレオチドは、これらが、これらの標的にハイブリダイズすることを妨げないが、それらの安定性または標的化を増強するか、またはその他に、それらの治療的有効性を増強する多数の方法で改変され得る。本明細書中で使用される場合、用語改変されたオリゴヌクレオチドは、1そのヌクレオチドの少なくとも2つが、合成ヌクレオシド内連結すなわち、1つのヌクレオチドの5’末端と別のヌクレオチドの3’末端との間のホスホジエステル連結以外の連結を介して共有結合され、そして/または2核酸と通常会合しない化学基が、このオリゴヌクレオチドに共有結合されたオリゴヌクレオチドを記載する。好ましい合成ヌクレオシド内連結は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスフェートエステル、アルキルホスホロチオエートalkylphosphonothioate、ホスホラミデート、カルバメート、カルボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。用語改変されたオリゴヌクレオチドはまた、共有結合的に、改変された塩基および/または糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。例えば、改変されたオリゴヌクレオチドは、3’位置のヒドロキシル基以外および5’位置のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合される骨格糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。従って、改変されたオリゴヌクレオチドが、2’-O-アルキル化リボース基を含み得る。さらに、改変されたオリゴヌクレオチドは、リボースの代わりに、アラビノースのような糖を含み得る。従って、本発明は、生理学的条件下で、薬学的に受容可能なキャリアと一緒に、イヌのPGPポリペプチドをコードする核酸と相補的であり、そしてそれとハイブリダイズする改変されたアンチセンス分子を含む薬学的調製物を、企図する。イヌのPGPを結合する因子はまた、結合ペプチド、ならびにイヌのPGPポリペプチドおよびイヌのPGPポリペプチドを含む複合体に結合する他の分子を含む。この結合分子がインヒビターである場合、この分子は、イヌのPGPに結合し、その活性を阻害する。イヌのPGP結合因子が、イヌのPGPに結合するか否かを決定するために、任意の公知の結合アッセイが使用され得る。例えば、この結合因子は、表面に固定され得、次いで標識されたイヌのPGPポリペプチドと接触され得る。次いで、イヌのPGP結合因子と相互作用するイヌのPGPの量またはイヌのPGP結合因子に結合しない量は、イヌのPGP結合因子が、イヌのPGPに結合するか否かを決定するために定量され得る。イヌのPGP結合因子は、イヌのPGPポリペプチドに選択的または優先的に結合する多数のサイズおよび型の分子、ならびにイヌのPGPポリペプチドおよびそれらの結合パートナーの両方の複合体を含む。これらの分子は、種々の供給源に由来し得る。例えば、イヌのPGP結合因子は、固定された形態において、またはファージディスプレイライブラリーとして、溶液中で容易に調製され得る変性ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより提供され得る。1つ以上のアミノ酸を含むペプチドのコンビナトリアルライブラリーもまた、合成され得る。ペプチド合成部分および非ペプチド合成部分のライブラリーが、さらに合成され得る。ファージディスプレイが、本発明にしたがった有用な結合ペプチドを同定することにおいて特に有効であり得る。簡潔には、ファージライブラリー例えば、m13、fd、またはλファージを使用するを調製し、従来の方法を使用して、4~約80個のアミノ酸残基由来の挿入物をディスプレイする。この挿入物は、例えば、完全に変性したか、または偏ったアレイを示し得る。次いで、イヌのPGPポリペプチドに結合するファージ保有挿入物を選択し得る。このプロセスは、イヌのPGPポリペプチドに結合するファージの再選択のいくつかのサイクルを介して繰り返され得る。繰り返されるラウンドは、特定の配列を保有しているファージの富化に導く。DNA配列分析は、発現されたポリペプチドの配列を同定するために行われ得る。イヌのPGPポリペプチドに結合する配列の最小の線形部分が、決定され得る。1つ以上のさらなる変性残基をその上流または下流に加えた最小の線形部分の一部または全てを含む挿入物を含む偏ったライブラリーを使用して、この手順を繰り返し得る。酵母ツーハイブリッドスクリーニング法はまた、イヌのPGPポリペプチドに結合するポリペプチドを同定するために使用され得る。従って、本発明のイヌのPGPポリペプチドまたはそのフラグメントが、ペプチドライブラリーファージディスプレイライブラリーを含むをスクリーニングするために、本発明のイヌのPGPポリペプチドのペプチド結合パートナーを同定かつ選択するために、使用され得る。このような分子は、記載されるように、スクリーニングアッセイのために、精製プロトコールのために、イヌのPGPの機能と直接干渉するために、および当業者に明らかである他の目的のために使用され得る。従って、本発明は、一般的に、薬理学的因子または異常なPGP活性と関連する状態の処置に有用である因子についてのリード化合物ならびにそこで同定される化合物および因子を同定する有効な方法を提供する。一般的に、スクリーニング方法は、イヌのPGPを介した分子の輸送を阻害または増強する化合物についてのアッセイを包含する。このような方法は、化合物の、自動化されたハイスループットスクリーニングに適合される。このような方法の例は、米国特許第5,429,921号において記載される。薬理学的因子についての種々のアッセイが、提供され、これには、標識されたインビトロタンパク質結合アッセイ、検出可能な分子を使用した流出アッセイなどが含まれる。例えば、タンパク質結合スクリーニングが、イヌのPGPへの候補薬理学的因子の結合を迅速に調べるために使用される。この候補薬理学的因子は、例えば、コンビナトリアルペプチドライブラリーに由来し得る。このようなアッセイのための従来の試薬は、当該分野で公知である。流出の例示的細胞ベースアッセイは、検出可能に標識された分子の流出が生じ得る条件下で、候補薬理学的因子と、イヌのPGPを有する細胞とを接触することを含む。特定の条件は、当該分野で周知であり、そして例えば、Sharomら、Biochem.Pharmacol.58:571-586、1999およびそこで引用される参考文献に記載される。候補薬理学的因子の存在下における流出の減少は、この候補薬理学的因子が、イヌのPGPの流出活性を減少することを示す。候補薬理学的因子の存在下における流出の増加は、候補薬理学的因子が、イヌのPGPの流出活性を増大することを示す。本発明の方法において使用されるイヌのPGPは、単離されたポリペプチドとしてここで候補薬理学的因子の結合が、測定されるべきである、またはイヌのPGPポリペプチドを含む細胞または他の膜包囲空間として、アッセイ混合物に添加され得る。後者のアッセイ構成において、細胞または他の膜包囲空間は、予め負荷されるポリペプチドとして、または核酸としてイヌのPGPを含み得る例えば、イヌのPGPを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞。本明細書中に記載されたアッセイにおいて、イヌのPGPポリペプチドが、組換え的に産生され得るか、または生物学的抽出物から単離され得るが、好ましくは、インビトロで合成される。イヌのPGPポリペプチドは、別のポリペプチド例えば、タンパク質-タンパク質結合を提供もしくは増強するか、またはアッセイ条件下で、イヌのPGPポリペプチドの安定性を増強することが可能なポリペプチドとの、イヌのPGPポリペプチドの融合物を含むキメラタンパク質を含む。イヌのPGPポリペプチドに融合されたポリペプチドまたはそのフラグメントはまた、例えば、免疫学的認識によるか、または蛍光標識により、融合タンパク質を容易に検出する手段を提供し得る。アッセイ混合物はまた、候補薬理学的因子を含む。代表的には、複数のアッセイ混合物が、種々の濃度に対して異なる応答を得るために、異なる因子の濃度と平行して行われる。代表的に、これらの濃度の1つは、ネガティブコントロールすなわち、因子のゼロ濃度で、または、アッセイ検出の限度以下の因子の濃度でとして働く。候補因子は、多数の化学クラスを含むが、代表的に、それらは有機化合物である。好ましくは、候補薬理学的因子は、小さい有機化合物であり、すなわち、それらは、50より大きいが、約2500未満の分子量を有する化合物である。候補因子は、ポリペプチドと構造的な相互作用に必要である官能基の化学基を含み、そして代表的には、少なくとも1つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも2つの官能基の化学基およびより好ましくは少なくとも3つの官能基の化学基を含む。この候補因子は、1つ以上の上記同定された官能基で置換された環状炭素または複素環式構造および/または芳香族構造もしくは多芳香族構造を含み得る。候補因子はまた、生体分子例えば、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記の誘導体もしくは構造的アナログ、またはそれらの組み合わせなどであり得る。この因子が核酸である場合、この因子は、代表的にはDNAまたはRNA分子であるが、非天然結合またはサブユニットを有する改変された核酸もまた、企図される。候補因子は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む広範な種々の供給源から得られる。例えば、多数の手段が、広範な種々の有機化合物および生体分子の無作為および指向された合成に利用可能であり、これは、無作為化されたオリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、無作為ペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを含む。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態における天然の化合物のライブラリーが、利用可能であるかまたは容易に産生される。さらに、天然にそして合成的に産生されるライブラリーおよび化合物が、従来の化学的手段、物理学的手段、および生化学的手段を通じて容易に改変され得る。さらに、既知の薬理学的因子は、指向されるかまたは無作為の化学的改変例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化amidificationなどに供され、その因子の構造的アナログを産生し得る。従って、候補因子の供給源は、公知のP-糖タンパク質インヒビターに基づいた分子のライブラリーであり、ここで、このインヒビターの構造は、より多くもしくはより少ない化学的部分または異なった化学的部分を保有するように、分子の1以上の位置において変化している。アナログインヒビターのライブラリーを作成する際に分子になされる構造的変化は、方向付けられるか、無作為であるか、あるいは、方向付けられるかまたは無作為の両方の置換および/または付加の組合せであり得る。組換えライブラリーの調製の当業者は、既存のP-糖タンパク質インヒビターに基づいたこのようなライブラリーを容易に調製し得る。種々の他の試薬はまた、混合物中に含まれ得る。これらとしては、塩、緩衝液、中性タンパク質例えば、アルブミン、界面活性剤などの試薬が挙げられ、これらは、最適なタンパク質-タンパク質および/またはタンパク質-核酸結合を容易にするために使用され得る。このような試薬はまた、反応物成分の非特異的またはバックグラウンドの相互作用を減少し得る。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤などのようなアッセイの効率を改善する他の試薬もまた使用され得る。前述のアッセイ材料の混合物は、候補薬学的因子の存在を除き、イヌPGPが、薬物などの化合物の制御量の流出を媒介する条件下でインキュベートされる。候補薬学的因子のイヌPGPへの結合を決定するために、混合物を結合を可能にする条件下でインキュベートする。成分の添加の順序、インキュベーション温度、インキュベーションの時間、およびアッセイの他のパラメーターは、容易に決定され得る。このような実験法は単にアッセイパラメーターの最適化を含むのみであり、アッセイの基本的な組成物は含まない。インキュベーション温度は、代表的には、約4°Cと40°Cの間である。インキュベーション時間は、好ましくは、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最小化され、そして代表的には、1分と10時間との間である。インキュベーション後、流出のレベル、またはイヌPGPポリペプチドと候補薬学的因子との間の特異的な結合のレベルを、使用者に利用可能な任意の簡便な方法によって検出する。細胞遊離結合型アッセイについて、分離段階はしばしば、非結合成分から結合成分を分離するために使用される。この分離段階は、種々の方法によって達成され得る。簡便には、少なくとも1つの成分が固体基板上に固定され、そこから非結合成分は簡単に分離され得る。固体基板は、広範な種々の材料から作製され得、そして広範な種々の形状例えば、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、ビーズ粒子などであり得る。この基板は、好ましくは、SN比を最大にするために、主にバックグラウンド結合を最小化するため、ならびに、分離の容易さおよび費用のために選択される。分離は、例えば、リザーバからビーズまたはディップスティックを除去することによって、マイクロタイタープレートウェルなどのリザーバを空にするかもしくは希釈することによって、ビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラムまたはフィルターを洗浄溶液または溶媒を使用してリンスすることによって、もたれされ得る。分離段階は、好ましくは、多数のリンスまたは洗浄を含む。例えば、固体支持体がマイクロタイタープレートである場合、ウェルは洗浄溶液を使用して数回洗浄され得、この洗浄溶液は、代表的には、塩、緩衝液、界面活性剤、非特異的タンパク質などの、特定の結合において沈殿しないインキュベーション混合物のこれらの成分を含む。固体基板が磁性ビーズである場合、このビーズは、洗浄溶液を使用して1回以上洗浄され得、そして磁石を使用して単離され得る。膜貫通輸送アッセイなどの細胞ベースのアッセイのための任意の簡便な方法において、検出はもたらされ得る。直接的または間接的に検出可能な産物例えば、カルセインcalceinAMまたはローダミン123のような蛍光性分子の輸送が好ましい。細胞遊離結合アッセイについて、成分の1つは、通常、検出可能な標識を含むかまたはこれに結合される。直接的検出例えば、放射性活性、ルミネセンス、光学密度または電子密度などまたは間接的検出例えば、FLAGエピトープなどのエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素タグなどを提供するような広範な種々の標識が使用され得る。この標識は、イヌPGPポリペプチドまたは候補薬学的因子に結合し得る。種々の方法が標識を検出するために使用され得、標識の性質および他のアッセイ成分に依存する。例えば、固体基板に結合される間かまたは固体基板から続いて分離される間、標識は検出され得る。標識は、光学密度または電子密度、放射性放射、非放射性エネルギー伝達などを介して直接的に検出され得るかまたは抗体結合体、ストレプトアビジン-ビオチン結合体などを使用して間接的に検出され得る。これらの標識を検出する方法は、当該分野で周知である。イヌPGP結合因子はまた、抗体であり得るかまたは機能的に活性な抗体フラグメントであり得る。抗体は、免疫学の科学の当業者にとって周知である。本明細書で使用される場合、用語抗体は、インタクトな抗体分子だけではなく、イヌPGP結合能力を保持する抗体分子のフラグメントも意味する。このようなフラグメントはまた、当該分野で周知であり、インビトロおよびインビボの両方において調節的に使用される。特に、本明細書中で使用される場合、用語抗体は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性フラグメントFab’2、およびFabをも意味する。インタクトな抗体のFcフラグメントを欠くFab’2およびFabフラグメントは、循環からより迅速にクリアーし、そして、インタクトな抗体のあまり非特異的でない組織結合を有し得るWahlら、J.Nucl.Med.24:316-3251983。モノクローナル抗体は、免疫原としてイヌPGPまたはそのフラグメントを利用して当該分野で公知の任意の方法を使用して作成され得る。あるいは、抗体は、イヌPGP活性を阻害するイヌPGPに特異的なポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体の調製および使用はまた、当業者に公知である。当該分野で公知のように、抗体分子のごく一部;パラトープが、そのエピトープに対する抗体の結合に有意に関与している一般的には、Clark,W.R.1986TheExperimentalFoundationsofMedernImmunologyWileySons,Inc.,NewYork;Roitt,I.1991EssentialImmunology,第7版、BlackwellScientificPublications,Oxfordを参照のこと。pFc’およびFc領域は、例えば、相補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与していない。pFc’領域が酵素的に切断されているかまたはpFc’領域なしで産生された抗体Fab’2フラグメントと命名されるは、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Fc領域が酵素的に切断されたかまたはFc領域なしで産生された抗体Fabフラグメントと命名されるは、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の1つを保持する。さらに進むと、Fabフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖およびFdと示される抗体重鎖の一部からなる。Fdフラグメントは、抗体特異性の主要な決定因子であり単一のFdフラグメントは、抗体特異性を変更することなく10までの異なった軽鎖と関連し得るそしてFdフラグメントは単離の際、エピトープ結合能力を保持する。抗体の抗原結合部分内には、当該分野で周知のように、相補性決定領域CDRが存在し、これは、抗原のエピトープおよび枠組み領域FRと直接的に相互作用し、この枠組み領域は、パラトープの三次構造を維持する一般的には、Clark,1986;Roitt,1991を参照のこと。IgG免疫グロブリンの重鎖Fdフラグメントおよび軽鎖の両方において、3つの相補性決定領域CDR1からCDR3によってそれぞれ分離された4つの枠組み領域FR1からFR4が存在する。CDR、特にCDR3領域、より特定には重鎖CDR3が、抗体特異性の主な原因である。一般的には、インタクトな抗体は、FcおよびFab領域を含むといわれている。このFc領域は、相補体活性化に関与しており、そして、抗原結合に関与していない。Fc’領域が酵素的に切断されたかまたはFc’領域なしで産生された抗体Fab’2として命名されるは、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Fc領域が酵素的に切断されたかまたはFc領域なしで産生された抗体Fab’フラグメントとして命名されるは、インタクトな抗体の抗原結合部位の1つを保持する。Fab’フラグメントは、共有結合した抗体軽鎖および抗体重鎖の一部からなり、Fdと示される。Fdフラグメントは、抗体特異性の主要な決定因子である単一のFdフラグメントは、抗体特異性を変更することなく10までの異なった軽鎖と関連し得る。単離されたFdフラグメントは、抗原エピトープに特異的に結合する能力を保持する。上記に提供されたアッセイにおいて本発明に従って有用であると同定された抗イヌPGPモノクローナル抗体の抗原結合Fab’部分、ならびに関連したFRおよびCDR領域の配列は、当該分野で慣例的なアミノ酸配列決定方法を使用して決定され得る。哺乳動物抗体の非CDR領域は、元の抗体のエピトープ特異性を保持する限り、非特異的または異種特異的抗体の対応する領域と置換され得ることが確立されている。非ヒトCDRがヒトFRおよび/またはFc/pFc’領域に共有結合され機能的な抗体を産生するヒト化抗体の開発および使用のために、この技術は有用である。イヌPGP活性を阻害する非ヒト動物例えば、マウス抗体が同定される場合、抗体をヒト化する技術は特に有用である。これらの非ヒト化動物抗体は、本発明に従う方法において、ヒト被験体の処置における使用のためにヒト化され得る。マウス抗体をヒト化するための方法の例は、米国特許第4,816,567号、同第5,225,539号、同第5,585,089号、同第5,693,762号および同第5,859,205号において提供される。他の抗体抗原結合能力を有するインタクトな抗体のフラグメントを含むは、しばしば、キメラ抗体といわれる。従って、当業者に明らかなように、本発明はまた、抗イヌPGPモノクローナル抗体のFab’2、およびFabフラグメント;抗イヌPGP抗体のFcおよび/またはFRおよび/またはCDR1および/またはCDR2および/または軽鎖CDR3領域が相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換されたキメラ抗体;抗イヌPGP抗体のFRおよび/またはCDR1および/またはCDR2および/または軽鎖CDR3領域が、相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換されたキメラFab’2フラグメント抗体;ならびにFRおよび/またはCDR1および/またはCDR2および/または軽鎖CDR3領域が相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換されたキメラFabフラグメント抗体を提供する。本発明に従って、イヌPGPインヒビターはまた、配列番号2由来のドミナントネガティブなポリペプチドを含む。ドミナントネガティブなポリペプチドは、細胞性機構と相互作用することにより、活性ポリペプチドが細胞性機構と相互作用することを妨げるかまたは活性ポリペプチドと競合する、ポリペプチドの不活性な改変体であり、これによって、活性ポリペプチドの効果を減少する。例えば、リガンドと結合するが、リガンドの結合に応答してシグナルを伝達しないドミナントネガティブなレセプターは、リガンド発現の生物学的効果を減少し得る。本発明のドミナントネガティブなイヌPGPポリペプチドの細胞中における発現の最終結果は、分子輸送のようなPGP活性の減少である。当業者は、1つ以上のドミナントネガティブな改変体ポリペプチドを作製する標準的な変異誘発技術を使用して、イヌPGPポリペプチドのドミナントネガティブ改変体の能力を評価し得る。例えば、イヌPGPポリペプチドの本明細書中に含まれる教示を考えれば、当業者は、部位特異的変異誘発、走査変異誘発、部分的な遺伝子欠損または短縮などによって、イヌPGPポリペプチドの配列を改変し得る。例えば、米国特許第5,580,723号およびSambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989を参照のこと。次いで、当業者は、変異誘発されたポリペプチドの集団を、イヌPGP活性における減少および/またはこのような活性の保持について試験し得る。イヌPGPポリペプチドのドミナントネガティブな改変体を作製および試験するための方法は、当業者に明らかである。本発明の組成物の各々は、種々の治療目的または非治療目的に有用である。例えば、本発明のイヌPGP核酸は、オリゴヌクレオチドプローブとして有用である。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、同一または実質的に類似の核酸配列を有するゲノムライブラリークローンまたはcDNAライブラリークローンを同定するために、本明細書中で使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で所望の配列にハイブリダイズし得る、適切なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット、そのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットの改変体もしくはそのフラグメントあるいはアンチセンス相補体は、当該分野で周知の手段によって合成され得例えば、SynthesisandApplicationofDNAandRNA,S.A.Narang編、1987、AcademicPress,SanDiego,CAを参照のこと、そして当該分野で公知の技術によって、その所望の配列、その改変体またはフラグメントを同定および単離するためのプローブとして使用され得る。核酸ハイブリダイゼーションおよびクローン同定の技術は、Sambrookら、MolecularCloning、ALaboratoryManual、第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview、NY1989に開示される。所望の核酸配列、あるいはその改変体またはフラグメントの検出を容易にするためにクローニング目的または配列の存在の単なる検出に関わらず、上記のプローブは、検出可能な基で標識され得る。このような検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質であり得る。このような物質は、核酸ハイブリダイゼーションの分野で良く開発されており、一般に、このような方法において有用な多くの標識が、本発明に適用され得る。特に有用なのは、放射性標識である。十分なシグナルを提供しそして十分な半減期を有する任意の放射性標識が、使用され得る。一本鎖の場合、オリゴヌクレオチドは、キナーゼ反応を使用して放射性標識され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドはまた、ビオチン、酵素または蛍光基のような非放射性マーカーで標識された場合にも、核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。例えば、Leary,J.J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:40451983;Renz,M.ら、Nucl.AcidsRes.12:34351984;およびRenz,M.EMBOJ.6:8171983を参照のこと。さらに、イヌPGP核酸の相補体が、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして有用であり得る。例えば、これは、イヌPGPノックアウト表現型を誘導するために、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを動物に送達することによる。遺伝子発現をブロックするためのアンチセンスRNAプローブの投与は、Lichtenstein,C.,Nature333:801-8021988に議論される。あるいは、本発明のイヌPGP核酸は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。トランスジェニック動物は、細胞内に人工的に挿入されたDNAを含む細胞を有する動物であり、DNAは、その細胞から発生する動物のゲノムの一部となる。好ましいトランスジェニック動物は、霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコである。トランスジェニック実験に適切な動物は、CharlesRiverWlimington,MA、TaconicGermantown,NY、HarlanSpragueDawleyIndianapolis,INなどの標準的な商業的供給源から入手され得る。特定の疾患に関連する特定の特性を有するトランスジェニック動物は、それらの疾患に対する種々の薬物および処置方法の影響を研究するために使用され得、従って、多くのヒト疾患の研究の遺伝モデルとして機能し得る。従って、本発明は、細胞膜を通過する分子の輸送に関与する障害の研究のためのモデルとしての、イヌPGPノックアウト動物およびトランスジェニック動物の使用を意図する。当業者に公知の種々の方法が、本発明に関連するトランスジェニック動物の作製に利用可能である。内因性PGP/MDR1の不活性化または置換は、胚性幹細胞を使用する相同組換え系によって達成され得る。PGPノックアウト表現型を有する、得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、イヌPGPについてトランスジェニックにされ得、そしてイヌPGPのモジュレーターアゴニストまたはアンタゴニスト/インヒビターとしての化合物のスクリーニングのモデルとして使用され得る。この様式で、このような治療薬物が同定され得る。さらに、イヌPGPの正常または変異体バージョンを生殖系列に挿入し、イヌPGPの正常または変異体形態を構成的または誘導的に発現するトランスジェニック動物を作製し得る。これらの動物は、細胞におけるイヌPGPの役割および機能を規定するための研究において有用である。本発明の組成物はまた、治療目的に有用である。従って、本発明は、哺乳動物細胞においてイヌPGP活性を阻害するための方法を包含する。本発明はさらに、細胞におけるイヌPGP活性を減少または増加するための方法を提供する。1つの実施形態において、この方法は、哺乳動物細胞に、その哺乳動物細胞の分子輸送を阻害するのに有効な量のイヌPGPの核酸またはポリペプチドを接触させる工程を包含する。このような方法は、例えば、薬物耐性および薬物バイオアベイラビリティの減少に関与する機構を解明する目的のために、インビトロで有用である。本発明はまた、細胞または被験体においてPGP発現を増加するための方法を包含する。イヌPGPの量は、細胞または被験体における膜貫通輸送を増加するのに有効な量の本発明のPGP核酸またはPGPポリペプチドを、細胞に接触させるかまたは被験体に投与することによって、このような細胞または被験体において増加され得る。PGP活性の増加は、本明細書中に記載のアッセイ例えば、膜貫通輸送のアッセイによって測定され得る。本発明の調製物は、有効量で投与され得る。有効量とは、単独でかまたはさらなる用量と共に、所望の応答を生成する薬学的調製物の量である。もちろん、このような量は、処置される特定の状態、その状態の重篤度、個々の患者のパラメーター年齢、身体的条件、サイズおよび体重を含む、処置の継続時間、併用治療もしあればの特性、特定の投与経路、およびこのような医療従事者の知識および技術内の因子に依存する。最大用量すなわち、正確な医学的判断に従う、最も高い安全用量が使用されることが、一般的に好ましい。しかし、患者が、医学的理由、心理学的理由または実質的に任意の他の理由のために、より低用量または許容可能な用量を要求し得ることは、当業者に理解される。一般に、活性化合物の用量は、約0.01mg/kg/日~1000mg/kg/日である。50~500mg/kgの範囲の用量が適切であり、そして1日あたり1回または数回で投与されることが期待される。より低い用量は、他の投与形態例えば、静脈内投与から生じる。被験体における応答が適用した初回用量で不十分である場合には、より高い用量すなわち、異なるより局在化した送達経路による、効果的なより高い用量が、患者の耐性が許容する程度に使用され得る。1日あたり複数回の用量が、適切な全身の化合物レベルを達成するために意図されるが、化合物が、徐放性医薬または持続放出医薬として調製される場合には、より少数回の用量が代表的に与えられる。投与される場合、本発明の薬学的調製物は、薬学的に受容可能な量でかつ薬学的に受容可能な組成物において適用され得る。このような調製物は、塩、緩衝化剤、保存剤、適合性のキャリア、および必要に応じて他の治療剤を、慣用的に含み得る。医薬において使用される場合、塩は、薬学的に受容可能であるが、薬学的に受容可能でない塩が、その薬学的に受容可能な塩を調製するために都合よく使用され得、そして本発明の範囲から排除されない。このような薬理学的かつ薬学的に受容可能な塩としては、以下の酸から調製される塩が挙げられるが、これらに限定されない:塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に受容可能な塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩例えば、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩として調製され得る。本発明に従う有用なイヌPGPインヒビターまたはイヌPGPの核酸およびポリペプチドは、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアと合わせられ得る。本明細書中で使用される場合、用語薬学的に受容可能なキャリアとは、ヒトへの投与に適切な、1以上の適合性の固体充填剤または液体充填剤、希釈剤あるいは包囲物質を意味する。用語キャリアとは、適用を容易にするために活性成分と合わせられる、有機成分または無機成分天然性または合成性を示す。薬学的組成物の成分は、所望の薬学的効力を実質的に損なう相互作用が存在しない様式で、本発明の分子と、および互いに、混合され得る。薬学的組成物は、適切な緩衝化剤を含み得、これらとしては、酢酸塩;クエン酸塩;およびリン酸塩が挙げられる。薬学的組成物はまた、必要に応じて、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールのような、適切な保存剤を含み得る。種々の投与経路が利用可能である。もちろん、選択される特定の様式は、選択される特定の化合物、処置される状態の重篤度、および治療効力に必要とされる投薬量に依存する。一般的に言うと、本発明の方法は、医学的に受容可能な任意の投与様式を使用して行われ得、この様式は、臨床的に受容可能でない有害な効果を引き起こすことなく効果的なレベルの活性化合物を生成する任意の様式を意味する。このような投与様式としては、経口経路、直腸経路、局所経路、鼻内経路、経皮interdermal経路または非経口経路が挙げられる。用語非経口とは、皮下、静脈内、髄腔内、筋内または注入が挙げられる。静脈内経路または筋内経路が、特にではないが、長期の治療および予防に適切である。薬学的組成物は、単位投薬形態で都合よく存在し得、そして薬学分野で周知の任意の方法によって調製され得る。全ての方法は、活性因子を、1以上の補助的成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、組成物は、活性化合物を、液体キャリア、細粒固体キャリアまたは両方と、均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。経口投与に適切な組成物は、個別の単位例えば、カプセル剤、錠剤、ロゼンジとして存在し得、これらは各々、所定の量の活性化合物を含む。他の組成物としては、水性の液体または非水性の液体例えば、シロップ、エリキシルまたはエマルジョン中の懸濁液が挙げられる。非経口投与に適切な組成物は、都合よくは、イヌPGPインヒビターまたはイヌPGPの核酸およびポリペプチドの滅菌水性調製物を含み、この調製物は、好ましくは、レシピエントの血液と等張性である。この水性調製物は、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、公知の方法に従って処方され得る。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌の注射可能な溶液または懸濁液例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒としては、とりわけ、水、リンゲル溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として都合よく使用される。この目的のために、任意の無菌のbland不揮発性油が使用され得、これには、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドが挙げられる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が、注射剤の調製物に使用され得る。経口投与、皮下投与、静脈内投与、髄腔内投与、筋内投与などに適切なキャリア処方物は、Remington’sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,Paに見い出され得る。他の送達系としては、時限放出time-release、遅延放出delayedreleaseまたは持続放出sustainedrelease送達系例えば、上記で議論される生物学的/化学的ベクターが挙げられ得る。このような系は、活性化合物の繰り返しの投与を回避し得、これが、被験体および主治医に対する簡便性を増加する。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。長期持続放出移植片の使用が所望され得る。本明細書中で使用される長期放出とは、その移植片が、少なくとも30日間、そして好ましくは60日間、治療レベルの活性成分を送達するように構築および配置されることを意味する。長記持続放出移植片は、当業者に周知であり、そしてこれらには、上記の放出系のいくらかが含まれる。本発明は、以下の実施例を参照してより完全に理解される。しかし、これらの実施例は、本発明の実施形態を例示するために単に意図され、本発明の範囲を限定すると解釈されない。実施例実施例1:イヌP-糖タンパク質の単離cDNAライブラリーを、標準的な手順に従って、イヌCanisfamiliarismRNAを使用して調製した。ヒトP-糖タンパク質DNAプローブを用いて、P-糖タンパク質クローンについて、このライブラリーをスクリーニングした。クローンを、以下に記載されるような標準的な手順に従って、単離し、精製し、そして配列決定した。肝臓および肺の組織を、ビーグル犬の組織サンプルから切除し、そして液体窒素中で瞬間凍結した。イヌPGP1の890bpのフラグメントを、Stratageneに発注されたλgt11ベクターcDNAライブラリーからPCR増幅した。Clontechからの試薬を用いて、PCRを実施した。プライマーをカスタムデザインした一方はヒトPGP1に対して相同な配列に対して特異的、他方はイヌPGP2に相同な配列に対して特異的。PCRを、PerkinElmer9700サーモサイクラーで実施した。PCRを、94°Cにて2分間、次いで、94°Cにて30秒間、40°Cにて20秒間、および72°Cにて2分30秒間の40サイクルで実施し、次いで、72°Cにて3分間インキュベートした。PCR産物を、1アガロースゲルにおいて泳動し、そしてEtBrで染色した。917bpのDNAバンドを切り出し、そしてQiagenInc.からのQIAquickGelExtractionkitを用いて精製した。次いで、このDNAを、InvitrogenからのOriginalTACloningkitを用いてベクターpCR2.1に連結した。INVαF’細胞を、連結保持物retainで形質転換し、コロニーを選択し、アンピシリンを含む100mLのLブロス中で増殖させた。DNA精製を、QiagenからのPlasmidMidipurificationkitを用いて実施した。挿入物を、ABI377シークエンサーを使用して配列決定した。この配列は、イヌPGPの890bpフラグメントオープンリーディングフレームにおける塩基816~塩基1706に対応する。他の5つのフラグメントを、以下に記載する手順における任意の差異を伴って上述と同じ方法を使用して、単離し、クローン化し、そして配列決定した。イヌ肺組織からのRNA抽出を、ClontechからのNucliobondRNAMaxiPrep.purificationkitを用いて実施した。cDNAを、LifeTechnologiesからのSuperscriptPreamplificationSystemforFirstStrandcDNASynthesisを用いて、RNA調製物から合成した。これは、オープンリーディングフレームにおける塩基1364~塩基2345のイヌPGPの981bpフラグメントに対応する。これは、オープンリーディングフレームにおける塩基1635~塩基3362のイヌPGPの1728bpフラグメントに対応する。これは、オープンリーディングフレームにおける塩基3004~塩基3783のイヌPGPの779bpフラグメントに対応する。イヌ肝臓組織からのRNA調製物を、先に使用したのと同じ方法を使用して、実施した。cDNAを、このRNA調製物から、SMARTIIオリゴヌクレオチドを用いて、ClontechからのSMARTRACEcDNAAmplificationKitを使用して作製した。PCR条件を、以下の通りに変更した:94°Cにて5分間、次いで、以下の5サイクル94°Cにて30秒間、および72°Cにて2分間。次いで、94°Cにて30秒間、70°Cにて45秒間、および72°Cにて2分間の5サイクルを実施した。最後の30サイクルは、94°Cにて30秒間、68°Cにて45秒間、および72°Cにて2分間であった。このPCRを、72°Cにて7分間で終えた。これは、オープンリーディングフレームにおける塩基3212~塩基4264のイヌPGPの3’末端フラグメントに対応する。イヌ肝臓組織由来のRNA調製物を、先に使用したのと同じ方法を使用して、実施した。cDNAを、このRNA調製物から、遺伝子特異的プライマーDM1680RL5’-cgcagccactgttcccaaccagcgccact-3’,29マー,配列番号19,イヌPGP1を用いて、ClontechからのSMARTRACEcDNAAmplificationKitを使用して作製した。これは、オープンリーディングフレームにおける塩基-15~塩基945のイヌPGPのATGフラグメントに対応する。クローンのアセンブリ1Kbフラグメント890bpおよび981bpフラグメントDNAプレップを、各フラグメントから作製した。両方のフラグメントを、NcoI制限酵素で切断した。1Kbフラグメントをまた、EcoRIで切断した。981bpフラグメントをまた、BamHIで切断した。各フラグメントを精製し、共に連結し、次いで末端を切断し、切断分子をゲル精製し、そしてEcoRIおよびBamHIで切断したpUC19中に連結した。1Kbフラグメント890bp/981bpフラグメントおよび1728bpフラグメント両方のフラグメントをBamHIで切断し、そして1728bpフラグメントもまたXbaIで切断したことを除いて、これらのフラグメントを上記の通りにアセンブルした。1Kbフラグメント890bp/981bpフラグメント/1728bpフラグメントおよびATGフラグメント3’末端および779bpフラグメント1Kbフラグメント890bp/981bpフラグメント/1728bpフラグメントATGフラグメントおよび3’末端/779bpフラグメントいくつかの場合では、フラグメントをそのヌクレオチド配列に従って、異なる制限酵素で切断したことを除いて、これらのすべてのフラグメントを上記の通りにアセンブルした。イヌP-糖タンパク質のヌクレオチド配列を、配列番号1として表す。コード配列は、ヌクレオチド17~3859からなり、1281アミノ酸のポリペプチド配列番号2を産生する。実施例2:イヌP-糖タンパク質の活性材料および方法イヌPGPcDNA配列番号1を、ハイグロマイシンBに対する耐性を付与するベクター中のLLC-PK1細胞のクローン化集団中に導入する。LLC-PK1細胞を、AmericanTypeCultureCollectionsから得て、そして7胎仔ウシ血清を補充した培地199中で増殖する。LLC-PK1細胞を、トランスフェクション前に再クローン化して、細胞集団の均質性を確証する。簡潔には、イヌPGPcDNAを、p222CMVベクター中に組み込む。このベクターは、エプスタインバーウイルスについてのOriP配列およびEBNA-1遺伝子産物に基づいたp220.2エピソームベクター系に由来するSugdenら、Mol.CellBiol.5:410-413、1985;Yatesら、NatureLond.313:812-815、1985。PGPcDNAを、サイトメガロウイルスCMV極初期プロモーターの制御下におく。このベクターは、ハイグロマイシンBに対する耐性を付与する。細胞0.4mL中およびDNA10~20μgを、2mmギャップgap細胞、100V、2500μFキャパシタンスおよび72ohm抵抗を使用して、BTXElectrocellmanipulatormodel600を用いるエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、細胞を、10コンフルエンスでマルチウェルプレート48ウェル、CorningCostarにプレーティングした。トランスフェクションの1~2日後、ハイグロマイシンBを、最終濃度400~600μg/mlで導入する。細胞に、2~4日おきに再給餌し、そして400~600μg/mlハイグロマイシンB中で6~8日間増殖させ、この時点で野生型細胞のバルクを剥離した。ハイグロマイシンBを、100μg/mlまで減少させ、そしてこの濃度のハイグロマイシンB中で維持する。14~18日後、このウェルを検査し、そして単一コロニーを含むウェルをトリプシン処理し、そしてバルク培養物へとスケールアップする。PGPの発現を、TranswellsTM中のビンブラスチン0.1μM輸送の分極polarizationによって測定する。LLC-PK1細胞に基づく輸送研究を、24ウェルTranswellsTMCorningCostar、カタログ番号3415中で実施する。TranswellsTMを、側底側空間basolateralspaceに0.6mL培地を添加し、そして頂端側空間apicalspaceに0.1mL培地を添加することによって調製する。細胞を、1挿入物あたり4×104細胞で播種し代表的に0.05mL~0.15mL中、2~4日おきに新鮮培地で再給餌し、そして播種後4~8日目に輸送研究に使用する。輸送アッセイを、10mMHEPESで緩衝化したハンクス平衡生理食塩水HBSS中で実施するpH7~7.2。細胞単層を、輸送アッセイにおいて使用する前に、HBSSでリンスする。輸送を、頂端側から側底側A→Bおよび側底側から頂端側B→Aの方向の両方の傾斜条件下で測定する。1回の決定につき、少なくとも二連の単層を使用する。所望される時点で、サンプルを、レシーバーチャンバー頂端側チャンバーまたは側底側チャンバーから回収する。輸送された化合物の量の定量は、UVまたは質量分析検出での液体シンチレーション計数ビンブラスチンまたはHPLCによる。イヌPGPcDNAを、バキュロウイルスベクターを用いて、昆虫細胞中で発現させる。Sarkadiら、J.Biol.Chem.267:4854-4858、1992の方法に従って、膜を調製し、そして使用まで-80°Cで保存する。ATPaseアッセイを、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて実施する。アッセイを、Sarkadiら、1992、およびDruekesら、Anal.Biochem.230:173-177、1995の方法の改変版を使用して実施する。96ウェルプレートの各ウェルについての詳細な方法は、以下を包含する:50mMTris-MES、2mMEGTA、50mMKCl、2mMジチオトレイトール、および5mMアジ化ナトリウムを含有する緩衝液中に40μg膜、20μMベラパミルポジティブコントロールまたは試験薬物、および3~5mMMgATPを含む0.06mlの反応混合物を、37°Cで20分間インキュベートする。100μMオルトバナジン酸ナトリウムを含む同一の反応混合物を、並行してアッセイする。オルトバナジン酸塩は、ヌクレオチド結合部位にMgADPを捕捉することによって、PGPを阻害する。従って、オルトバナジン酸塩の存在下で測定されるATPase活性は、非PGPATPase活性を表し、そしてオルトバナジン酸塩なしで生成された活性から差し引かれて、バナジン酸塩感受性ATPase活性を生成し得る。30μlの10SDS消泡剤Aの添加によって、反応を停止する。2つのさらなる反応混合物オルトバナジン酸塩および-しかし、MgATPを含まないもまた調製し、そして他のものと共にインキュベートし、次いで、SDSおよびMgATPを補充して、時間=0分目の反応を表す。インキュベーションに次いで、15mM酢酸亜鉛:10アスコルビン酸1:4中の35mMモリブデン酸アンモニウムを200μl添加し、そしてさらに20分間37°Cにてインキュベートする。無機ホスフェートの遊離を、800nmでのその吸光度によって検出し、そしてホスフェートの検量線に対してこの吸光度を比較することによって、定量する。リガンド結合アッセイおよび蛍光色素取り込みの阻害を測定するためのアッセイを、SharomらBiochem.Pharmacol.58:571-586、1999によって記載されたように実施する。I.LLC-PK1細胞における安定なPGP発現イヌPGPの機能的発現を、ビンブラスチンの輸送の分極によって測定する。コントロール細胞は、代表的に、1と3との間のB→A/A→B比を示す。PGPトランスフェクト細胞は、より高い比率を示す。cDNA由来のイヌの発現は安定である。II.PGP膜におけるATPase活性の活性化ATPaseアッセイの刺激によって、薬物とPGPとの任意の相互作用の濃度依存性の迅速な測定が提供される。遊離の無機ホスフェートを、マイクロタイタープレート形式で実施される単純な分光光度学的アッセイによって測定する。複数の薬物濃度を試験することによって、PGPに対する薬物の親和性を推定すること、およびその応答の飽和が観察されたか否かを推定することが可能となる。III.細胞単層を横断する薬物輸送ATPaseアッセイは、直接的には、薬物輸送を測定しない。ATPase活性と実際の輸送との間の一致を試験するために、薬物の輸送速度を、コントロールLLC-PK1およびイヌPGP細胞単層において測定する。各薬物濃度について、4つの測定をなす:A:A→Bコントロール細胞B:B→Aコントロール細胞C:A→BPGP細胞D:B→APGP細胞。輸送の分極を、コントロール細胞B/AおよびPGP細胞D/Cにおいて算出する。PGPの内因的活性IAを、コントロール細胞と比較してPGP細胞中でPGPがB→A輸送を容易にした量D-Bと、コントロール細胞と比較してPGP細胞中でPGPがA→B輸送を妨害した量A-Cとの合計として算出する。PGPの内因的クリアランスを、非飽和条件下の線のスロープを算出することか、または飽和が観察された場合に算出された見かけ上のKmおよびVmax値からのいずれかによって、濃度依存性データのプロットから算出する。内因的クリアランスを、mL/m2/分として表す。ATPaseデータは、有用な濃度応答データを表す。例えば、いくつかの化合物についての見かけ上のKm値は、ATPaseと輸送系との間で良好な一致する。しかし、他の薬物はATPase活性を活性化するが、PGPによる輸送は検出可能ではない。少なくとも、ATPaseアッセイは、下回るとPGPによる輸送に対する応答が薬物濃度に対して線形となる濃度範囲を同定し得る。これは、PGPの内因的クリアランスを測定するための実験設計の単純化を可能にし、これは、大量の化合物を試験する場合に重要な考慮事項となる。IV.バイオアベイラビリティバイオアベイラビリティ研究を、2つ以上の異なるPGP型を用いる上記アッセイの1つ以上を実施することによって行う。異なるPGP型は、異なる種例えば、イヌおよびヒト、カニクイザルおよびヒト、イヌおよびカニクイザルなどにより得るか、または同一種の異なる対立遺伝子であり得る。これらのアッセイの結果を比較して、異なる種の個体または異なるPGP対立遺伝子を発現する個体における薬物のバイオアベイラビリティを決定または推定する。1つの決定の結果はまた、過去のhistoricalコントロールとして、例えば、ATPaseまたは輸送に関して以前に決定された値に対して比較され得る。プロトコールおよび手順RNAの単離凍結したビーグルの肝臓を乳鉢および乳棒を用いて粉砕した。粉砕化された組織300mgを、ダンス型ホモジナイザーに移した。TRIsol試薬3mL;カタログ番号15596LifeTechnologiesからを添加して、この組織をホモジネートし、次いで、室温で15分間インキュベートした。溶液のアリコート1mLを3つのミクロチューブmicrofugetubeに移し、そして200μLのクロロホルムを各チューブに添加した。各チューブを高設定で15秒間ボルテックスし、次いで、室温で3分間インキュベートし、次いで、10000gで15分間4°Cにて遠心分離した。上部の水性層を新しいミクロチューブに移し、一方、残存する下部および間の層を捨てた。500μLのイソプロパノールを新しいチューブの各々に添加し、そしてこのチューブを数回反転させることによって混合した。次いで、各チューブを室温で10分間インキュベートし、次いで、10000gでさらに10分間4°Cにて遠心分離した。小さな白色ペレットが観察され、そして上清を捨てた。1mLの75エタノールを各チューブに添加した。このチューブを手短にボルテックスし、次いで、10000gで10分間4°Cにて遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを室温で5分間乾燥させた。50μLのDEPC処理滅菌脱イオン水を、各チューブに添加した。各ペレットを再懸濁し、そして各チューブの内容物をプールした。再懸濁されたペレットの光学密度を、HitachiU3010分光光度計を用いて分析し、単離されたRNAの量を決定した。次いで、このRNAをDEPC処理滅菌脱イオン水を用いて、0.55μg/μLの濃度まで希釈した。2mLのこのRNAを2つのミクロチューブに均等に分けた。次いで、100μLの5MNaClを各チューブに添加した。両方のチューブを15分間65°Cまで加温し、次いで、氷上に5分間配置した。MessageMakermRNAIsolationSystemカタログ番号10551-018LifeTechnologiesからからの500μLのOligodTCelluloseSuspensionを、両方のチューブに添加した。次いで、これらのチューブを10分間37°Cでインキュベートした。このチューブの内容物を、MessageMakermRNAIsolationSystemに提供されたFilterSyringeに移した。液体内容物を排出した後、シリンジ中のペレットを、製造業者の指示書に従って、WashBuffer1およびWashBuffer2を使用して洗浄した。シリンジ中のRNAペレットを1mLのDEPC処理滅菌脱イオン水65°C中に再懸濁し、次いで、2.5μLの50μg/mLグリコゲンおよび100μLの7.5M酢酸アンモニウムを添加し、そして反転によって混合した。次いで、チューブの内容物を、2つのミクロチューブに移し、そして1mLのエタノールを各チューブに添加した。両方のチューブの内容物を、反転によって混合し、次いで、-20°Cで一晩インキュベートした。このチューブを、10000gで30分間4°Cにて遠心分離した。この上清を捨て、そして200μLの75エタノールを各チューブに添加した。このチューブを10秒間ボルテックスし、次いで、10000gで15分間4°Cにて遠心分離した。この上清を捨て、そして残存するすべての液体を注意深くピペッティングで取り出した。このペレットを、10μLのDEPC処理滅菌脱イオン水中に再懸濁した。cDNAの調製cDNAを、以下のように、MarathoncDNAAmplificationKitカタログ番号K1802-1ClontechLaboratories,Inc.,PaloAlto,CAからを用いて調製した。4μLの再懸濁mRNAを、新しいミクロチューブに移し、そして以下のプライマー10μM濃度のうちの1つ1μLを添加した:Dm1680RLcgcagccactgttcccaaccagcgccact配列番号19;カスタムデザイン,OperonTechnologies,Inc.により合成またはMarathoncDNAAmplificationKitからのcDNASynthesisPrimer,nnttttttttttttttttttttttttttttttcgccggcgacttaagatctt配列番号28。チューブを70°Cで2分間インキュベートし、次いで、氷上に5分間配置した。2μLの5×First-StrandBuffer,1μLの10mMdNTPMixおよび1μLの20U/μLAMVReverseTranscriptaseを各チューブに添加し、そして穏やかに混合した。このチューブを42°Cにて1時間インキュベートし、次いで、氷上に配置した。2μLの各一本鎖cDNAを、PCRにおけるテンプレートとして使用した以下のPCR条件を参照のこと。48.4μLのDEPC処理脱イオン水、16μLの5×Second-StrandBuffer,1.6μLの10mMdNTPMixおよび4μLの20×Second-StrandEnzymeCocktailを、残存するcDNAサンプルに添加した。このチューブを、16°Cにて1.5時間インキュベートした。2μLの5U/μLT4DNAポリメラーゼをこのチューブに添加し、次いで、このチューブを16°Cにてさらに45分間インキュベートした。20×EDTA/GlycogenMix4μLを添加し、次いで、QIAquickNucleotideRemovalKitカタログ番号28304QIAGENInc.,Valencia,CAからからの430μLのBufferPNを添加した。次いで、このサンプルをQIAquickSpinColumnにローディングし、そして10000gで1分間遠心分離した。収集チューブを空にし、そして750μLのPEBufferQIAGENをQIAquickSpinColumnに添加し、これを再度10000gで1分間遠心分離した。収集チューブを、もう一度空にし、そしてQIAquickSpinColumnを10000gで1分間遠心分離して、カラムメンブレンを乾燥させた。50°Cまで加熱した50μLの滅菌脱イオン水をQIAquickSpinColumnに添加し、そして室温で1分間インキュベートして、次いで、きれいなミクロチューブに、10000gで1分間遠心分離した。核酸を沈殿するために、10.8μLの7.5M酢酸アンモニウムおよび144μLのエタノールをチューブに添加し、次いで、これを10000gで20分間遠心分離した。この上清を除去し、次いで、300μLの75エタノールを添加した。チューブをボルテックスし、そして10000gで20分間遠心分離した。この上清を除去し、そしてこのサンプルを12μLの滅菌脱イオン水中に再懸濁した。5μLのこのcDNAを、きれいなミクロチューブに配置した。MarathoncDNAAmplificationKitからの2μLの10μMMarathoncDNAAdapter,2μL5×DNALigationBufferおよび1μLの400U/μLT4DNALigaseを、このcDNAに添加し、そして穏やかに混合した。この混合物を16°Cにて一晩インキュベートした。リガーゼを、70°Cで5分間、熱不活化した。PCRを、テンプレートとしてこのサンプルを用いて実施した。PCR条件PCRを、ClontechAdvantage2kitClontech,paloAlto,CAで供給された試薬を用いて実施した。簡潔には、2μLのcDNAを200μLMicroAmp反応チューブカタログ番号N801-0540,PEBiosystems中に配置し、次いで、34μLの滅菌脱イオン水、5μLの10×ClontechAdvantage2PolymeraseMixカタログ番号4700-1ClontechLaboratories,Inc.、3μLの10mMAdvantageUltraPurePCRDeoxynucleotideMixカタログ番号8430-1ClontechLaboratories,Inc.、および各々2μLの順方向および逆方向プライマー10mM濃度を添加した。プライマーは、以下のいずれかであった:MarathoncDNAAmplificationKitからのMarathoncDNAAdapterPrimer1,ccatcctaatacgactcactgtagggc配列番号29、またはOperonTechnologiesInc.によって作製された種々のカスタム遺伝子特異的プライマー。カスタムプライマーとしては、以下が挙げられるすべて、5’-3’として列挙した:Dm409FL:ggagcgcgaggtcgggatggatc配列番号20,Dm1455RL:gcaaatgcttcaatgcttggggatgcctgtccaa配列番号30,Dm2037F:agaaacagagaatcgccattgctc配列番号13,Dm3920RL:gagctgggttcctttgtctcctactctggtgtt配列番号31,Dp1216F:gaactgtgattgcgtttggaggac配列番号9およびDp2587R:gcaaatgctggttgcaggcctcc配列番号32。熱サイクルを、94°Cにて30秒間、次いで、94°Cにて5秒間および72°Cにて4分間の2サイクル、次いで、94°Cにて5秒間および68°Cにて4分間の16サイクルで、PerkinElmer9700を使用して実施した。4つのフラグメントを、各遺伝子型についてのPCRによって獲得した。フラグメント1は、プライマーにMarathoncDNAAdapterPrimer1およびDm1455RLを使用して生成された。フラグメント2は、プライマーDp1216FおよびDp2587Rを使用して生成された。フラグメント3は、プライマーDm2037FおよびDm3920RLを使用して生成された。フラグメント4は、プライマーDp3612FLおよびMarathoncDNAAdapterPrimer1を使用して生成された。PCR後サンプリングプロセス電気泳動を、10×ゲルローディング緩衝液IVMolecularCloning:ALaboratoryManual,J.Sambrookら編,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989,6.12頁を使用して、EtBrを含有する0.5×TBE緩衝液Sambrookら,B-23頁中における1アガロースゲルにおいて、すべてのPCR産物に対して実施した。PCR産物を含有するゲルのフラグメントを切り出し、そして2mLのミクロチューブ中に配置した。各フラグメントの質量を決定し、そしてQIAquickGelExtractionKitカタログ番号28704QIAGENInc.からからの3μL/mgのBufferQX1を添加した。次いで、各チューブを、2分毎に混合しつつ、50°Cで10分間インキュベートした。1μL/mgのイソプロパノールを各チューブに添加し、そして混合した。生じた溶液をQIAquickGelExtractionKitからのQIAquickspincolumnに移した。これらのカラムを、室温にて1分間10000gで遠心分離した。QIAquickGelExtractionKitからの750μLのBufferPEを、各チューブに添加し、次いで、室温にて1分間10000gで遠心分離した。各カラムを、再度、室温にて1分間10000gで遠心分離して、あらゆる残留緩衝液を除去した。30μLの滅菌脱イオン水50°Cを各カラムに添加し、そして室温にて1分間インキュベートした。次いで、各カラムをミクロチューブ中に配置し、そして1分間10000gで遠心分離した。次いで、6μLの精製PCR産物を、きれいなミクロチューブに移し、そして1μLの10×LigationBuffer,2μLのpCR2.1ベクターおよび1μLのT4DNALigaseすべて、OriginalTACloningKitカタログ番号K2000-J10Invitrogen,Carlsbad,CAからをこのミクロチューブに添加し、そして混合した。この反応物を、16°Cで一晩インキュベートした。凍結したOneShotコンピテント細胞Invitrogenの1つの50μLバイアルを、各連結反応のために、氷上で解凍した。3.5μLの連結反応混合物を、コンピテント細胞に添加し、そして穏やかに混合した。この細胞を、30分間氷上でインキュベートし、次いで、42°Cで30秒間熱ショックを与えた。再度氷上で冷却した後、250μLのSOC培地Invitrogenを各バイアルに添加し、そしてこのバイアルを直接、37°Cの水浴中に1時間配置した。各形質転換反応物の50μLおよび200μLのアリコートを、1アガロース,1mg/mLグルコース,50ng/mLアンピシリンおよび1.6ng/mLX-galを含有するLuria-BertaniMediumSambrookら,A-1頁に配置した。次いで、接種したプレートを、37°Cで一晩インキュベートした。白色化コロニーを選択し、そして50ng/mLアンピシリンを含有するL-B培地の個々の100mL培養物を接種するために使用した。これを、100rpmで撹拌しつつ、37°Cで一晩インキュベートした。プラスミドDNAを、以下のように製造業者の指示書に従って、QIAGENMidiPlasmidKitカタログ番号12143QIAGENInc.からを用いて調製した。各100mLの培養物を、2つの50mL円錐状バイアル中に等分し、そして3000gで10分間4°Cにて遠心分離した。上清を注ぎ出し、そして4mLのBufferP1を用いて、2つのバイアルの一方で、このペレットを再懸濁した。この上清を他のチューブに移し、そしてこのペレットを再懸濁するために使用した。BufferP24mLを添加し、混合し、そしてこの懸濁物を室温で5分間インキュベートした。BufferP34mLを添加し、混合し、そして懸濁物を4°Cで15分間インキュベートした。このサンプルを、3000gで15分間4°Cにて遠心分離した。すべての上清を、4mLのBufferQBTで予め処理されたQIAgen-tip100に移した。この上清をカラムから流出させた。BufferQC10mLをこのカラムに添加し、そして流出させた。さらなる10mLのBufferQCを添加し、そして流出させた。最後に4mLのBufferQFをカラムに添加して、そしてきれいな15mLの円錐状チューブ中に流出させた。2.8mLのイソプロパノールを添加し、そしてこの溶液と混合した。これを、ミクロチューブに等分し、4°Cにて10分間インキュベートし、そして10000gで15分間4°Cにて遠心分離した。上清を除去し、次いで、1mLの70エタノールを各ミクロチューブに添加した。各チューブを、手短にボルテックスし、次いで、10000gで15分間4°Cにて遠心分離した。この上清を除去し、そして100μLの滅菌1×TE緩衝液Sambrookら,B-20頁を添加した。制限消化を、精製DNAにおいて実施した。フラグメントを切り出すために使用された酵素は、以下の通りであった:フラグメント1,KpnIカタログ番号R0142SNewEnglandBiolabs,Inc.,Beverly,MAからおよびNsiIカタログ番号R0127SNewEnglandBiolabs,Inc.から;フラグメント2,NsiIおよびHindIIIカタログ番号R0104SNewEnglandBiolabs,Inc.から;フラグメント3,HindIIIおよびPstIカタログ番号V0279SNewEnglandBiolabs,Inc.から;ならびに、フラグメント4,PstIおよびNotIカタログ番号R0189SNewEnglandBiolabs,Inc.から。すべての制限消化を、NewEnglandBiolabsによって推奨される消化緩衝液中で37°Cにて実施した。電気泳動を、10×ゲルローディング緩衝液IVSambrookら、6.12頁を使用して、EtBrを含有する0.5×TBE緩衝液Sambrookら、B-23頁中における1アガロースゲルにおいて、すべての制限消化産物に対して実施した。制限消化産物を含有するゲルのフラグメントを切り出し、そして2mLのミクロチューブ中に配置した。DNAフラグメントを、製造業者の指示に従って、QIAquickGelExtractionKitカタログ番号28704QIAGENInc.からを使用して、ゲルスライスから抽出した。各フラグメントの質量を決定し、そして3μL/mgのBufferQX1を添加した。次いで、各チューブを、2分毎に混合しつつ、10分間50°Cでインキュベートした。1容量のイソプロパノールを各チューブに添加して、そして混合した。生じた溶液を、QIAquickspincolumnに移し、そして1分間10000gで室温にて遠心分離した。BufferPE750μLを各カラムに添加し、次いで、1分間10000gで室温にて遠心分離した。各カラムを、再度1分間10000gで室温にて遠心分離して、あらゆる残留緩衝液を除去する。30μLの滅菌脱イオン水50°Cを各カラムに添加し、そして1分間室温にてインキュベートする。次いで、各カラムを、ミクロチューブ中に配置し、そして1分間10000gで遠心分離する。2μLの各フラグメントを、ミクロチューブに添加し、同様に1μLの10×LigationBufferおよび1μLのT4DNALigaseカタログ番号M0202SNewEnglandBiolabs,Inc.からを添加した。この反応物を、16°Cで一晩インキュベートした。制限酵素KpnIおよびNotI各々1μLを反応に添加し、そして37°Cで1時間インキュベートした。電気泳動を、10×ゲルローディング緩衝液IVを用いて、EtBrを含有する0.5×TBE緩衝液中において1アガロースゲルにおいて実施した。アセンブルした産物を含有するフラグメントを切り出し、そして上記のようにQIAquickGelExtractionKitを使用して、DNAフラグメントを抽出した。フラグメントを、以下のように、OriginalTACloningKitを使用して、ベクター中に連結した:6μLの精製DNAを、きれいなミクロチューブに移し、そして1μLの10×LigationBuffer,2μLのpCR2.1ベクター予め、KpnIおよびNotIで消化,および1μLのT4DNALigaseを添加し、そして混合した。この反応物を、16°Cにて一晩インキュベートした。連結反応混合物3.5μLを用いて、上記のようにOneShotコンピテント細胞を形質転換するために使用した。形質転換反応物の50μLおよび200μLのアリコートを、1アガロース,1mg/mLグルコース,50ng/mLアンピシリンおよび1.6ng/mLX-galを含有するLuria-BertaniMediumに配置し、そして上記のように増殖した。白色化コロニーを、上記のように選択し、そして増殖した。プラスミドDNAを、上記のようにQIAGENMidiPlasmidKitを用いて単離し、そして精製した。DNAを、100μLの滅菌1×TE緩衝液中に再懸濁した。次いで、このDNAを、TuftsUniversityCoreFacilityによるABI100DNAシーケンサーABIからを使用して、配列決定した。イヌP-糖タンパク質の4つの遺伝子型の同定実施例1において同定されたイヌP-糖タンパク質を、ここで、遺伝子型Cと命名した。本実施例に記載されたようなビーグル肝臓から単離されたDNAの配列決定によって、イヌP-糖タンパク質の3つのさらなる対立遺伝子改変体遺伝子型A、B、およびDと命名の同定が可能となった。DNA配列における対立遺伝子差異を、以下の表1に示す。遺伝子型Aは、配列番号2に対して塩基番号607に、異なるヌクレオチドを有する。これは、DNA配列におけるCからAへの塩基変化であり、これによって、アミノ酸197位でのヒスチジンからグルタミンへのアミノ酸変化が引き起こされる。遺伝子型Bは、配列番号2に対して塩基番号91および607で異なるヌクレオチドを有する。91位での塩基変化は、TからAへであり、そしてアミノ酸25位でのアスパラギンからリシンへのアミノ酸変化を引き起こす。607位での塩基変化は、遺伝子型Aにおける変化と同一である。遺伝子型Dは、配列番号2に対して塩基番号91、607、1001、および3458に、異なるヌクレオチドを有する。91位および607位での塩基変化は、遺伝子型Bにおける変化と同一である。1001位での塩基変化は、TからAへであり、そしてアミノ酸329位でのセリンからスレオニンへのアミノ酸変化を引き起こす。3458位での塩基変化は、AからGへであり、そしてアミノ酸1148位でのメチオニンからバリンへのアミノ酸変化を引き起こす。以前に同定されたイヌP-糖タンパク質配列番号3および4;GenBank登録番号AF045016は、遺伝子型CイヌP-糖タンパク質ヌクレオチド配列配列番号1とは異なる13個のヌクレオチドを有している。AATを取り去る塩基89~塩基91配列番号1に対してに3塩基欠失が存在し、これによって、アミノ酸25位のアスパラギンの欠失が引き起こされる。590位でのAからGへの塩基変化が存在し、これによって、アミノ酸192位でのイソロイシンからバリンへのアミノ酸変化が引き起こされる。607位でのCからAへの塩基変化が存在し、これによって、アミノ酸197位でのヒスチジンからグルタミンへのアミノ酸変化が引き起こされる。651位でのGからCへの塩基変化が存在し、これによって、アミノ酸212位でのアルギニンからプロリンへのアミノ酸変化が引き起こされる。878位でのGからAへの塩基変化が存在し、これによって、アミノ酸288位でのグリシンからアルギニンへのアミノ酸変化が引き起こされる。1001位でのTからAへの塩基変化が存在し、これによって、アミノ酸329位でのセリンからスレオニンへのアミノ酸変化が引き起こされる。1012位でのAからGへの塩基変化が存在する。これによっては、アミノ酸変化は引き起こされない。これは、アミノ酸332位のグルタミンでのサイレントな点変異である。1611位でのAからGへの塩基変化が存在し、これによって、アミノ酸532位でのグルタミンからアルギニンへのアミノ酸変化が引き起こされる。2098位でのAからTへの塩基変化が存在する。これによっては、アミノ酸変化は引き起こされない。これは、アミノ酸694位のバリンでのサイレントな点変異である。2102位でのCからTへの塩基変化が存在し、これによって、アミノ酸696位でのプロリンからセリンへのアミノ酸変化が引き起こされる。3808位でのCからTへの塩基変化が存在する。これによっては、アミノ酸変化は引き起こされない。これは、アミノ酸1264位のアラニンでのサイレントな点変異である。3833位でのGからAへの塩基変化が存在し、これによって、アミノ酸1273位でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸変化が引き起こされる。4080位でのCからTへの塩基変化が存在し、これによって、アミノ酸1355位でのスレオニンからイソロイシンへのアミノ酸変化が引き起こされる。前述の特許、特許出願、および参考文献の各々が、本明細書中で参考として援用される。本発明を、特定の実施形態に関して記載してきたが、多くの改変および変更が、本発明の意図から逸脱することなく当業者によってなされ得ることが理解されるべきである。このような改変、変更、および等価物は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。"