"少なくとも1つのストレプトコッカスニューモニエ多糖体抗原と、PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択される少なくとも1つのストレプトコッカスニューモニエ蛋白抗原またはその免疫学的機能等価物とを含んで成る免疫原性組成物。多糖体抗原が多糖体蛋白担体接合物の形態で提供される請求項1記載の免疫原性組成物。担体蛋白がジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、CRM197、キーホールリンペットヘモシアニンKLH、ツベルクリンの蛋白誘導体およびH.インフルエンザ由来の蛋白Dから成る群から選択される請求項2記載の免疫原性組成物。ワクチンが少なくとも4つの別の血清型由来の肺炎球菌多糖体抗原を含む請求項1~3いずれか1項記載の免疫原性組成物。さらにアジュバントを含む前記請求項に記載の免疫原性組成物。アジュバントがアルミニウム塩を含む請求項5記載の免疫原性組成物。アジュバントがTH1応答の優先的誘導物質である請求項5記載の免疫原性組成物。アジュバントが少なくとも1つの3D-MPL、サポニン免疫活性化剤または免疫活性化CpGオリゴヌクレオチドを含む請求項7記載の免疫原性組成物。アジュバントが水中油型エマルジョン、リポソームおよびアルミニウム塩から成る群から選択される担体を含む請求項8記載の免疫原性組成物。医薬として用いる前記請求項に記載の免疫原性組成物。請求項1~9の免疫原性組成物を含んで成るワクチン。55歳を超える患者におけるストレプトコッカスニューモニエ感染症の防止または改善方法であって、有効量の、ストレプトコッカスニューモニエ多糖体およびPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択される少なくとも1つのストレプトコッカスニューモニエ蛋白、および任意にTH1誘発アジュバントを含むワクチンを投与することを特徴とする方法。55歳を超える患者における肺炎の予防または治療のための医薬の製造における、肺炎球菌多糖体抗原のPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択されるストレプトコッカスニューモニエ蛋白抗原、および任意のTH1誘発アジュバントとの組み合わせにおける使用。幼児または小児の中耳炎の予防または治療のための医薬の製造における、肺炎球菌多糖体抗原のPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択されるストレプトコッカスニューモニエ蛋白抗原、および任意のTH1誘発アジュバントとの組み合わせにおける使用。1つまたはそれ以上の肺炎球菌多糖体抗原複数でも可を選択する工程;1つまたはそれ以上のPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択されるストレプトコッカスニューモニエ蛋白を選択する工程;および上記多糖体および蛋白抗原を適当な賦形剤と混合する工程;を含む前記請求項記載の免疫原性組成物の製造方法。幼児における中耳炎の防止または改善方法であって、安全かつ有効な量の、ストレプトコッカスニューモニエ多糖体抗原およびPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択されるストレプトコッカスニューモニエ蛋白抗体と、任意にTH1アジュバントと共に含むワクチンを幼児に投与することを特徴とする方法。本発明は、特に高齢者および/または幼児および小児の肺炎球菌感染症の防止または改善のための改良ワクチンを提供する。本発明に関連して、患者が55歳以上、典型的には60歳を超える、より一般的には65歳を超える年齢である場合、高齢者とみなす。かくして、本発明の一の具体例において、高齢者および/または幼児および小児における使用に適した、少なくとも1つのストレプトコッカスニューモニエ多糖体抗原およびPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130andSp133PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択される少なくとも1つのストレプトコッカスニューモニエ蛋白抗原複数でも可を含むワクチン組成物を提供する。ワクチンは、所望によりTh1アジュバントを含んでいてもよい。好ましい第2の具体例において、本発明は、少なくとも1つ2、3、4、5、6,7、8、9または10のストレプトコッカスニューモニエ多糖体抗原複数でも可およびPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択される少なくとも1つのストレプトコッカスニューモニエ蛋白抗原および好ましくはTh1アジュバントを含むワクチン高齢者における肺炎の予防に適当なを提供する。上記具体例において、有利には本発明の上記した肺炎球菌蛋白を互いに、および他の肺炎球菌蛋白と組み合わせて含むワクチンも以下に記載するように想定する。また、ワクチンは幼児または小児のような他の高い危険性のある人々の群における肺炎球菌感染症例えば、中耳炎の治療においても有用であることが想定される。本発明のストレプトコッカスニューモニエ多糖体抗原典型的には、本発明のストレプトコッカスニューモニエワクチンは多糖体抗原好ましくは、担体蛋白に結合したものを含み、ここに多糖体は少なくとも4つの肺炎球菌の血清型から誘導される。好ましくは、4つの血清型は、6B、14、19Fおよび23Fを含む。より好ましくは、少なくとも7つの血清型、例えば血清型4、6B、9V、14、18C、19Fおよび23F由来のものが組成物に含まれる。さらにより好ましくは、少なくとも11の血清型が組成物に含まれ、例えば一の具体例における組成物は、1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23F好ましくは、担体蛋白に結合したもの由来の莢膜多糖体を含む。本発明の好ましい具体例において、さらに多糖体抗原、例えば23価例えば抗原型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fも本発明により考えられるが、少なくとも13の多糖体抗原好ましくは、担体蛋白に結合したものが含まれる。高齢者のワクチン接取例えば、肺炎の予防に関しては、血清型8および12Fおよび最も好ましくはさらに15および22を上記の11価の抗原性組成物に含み、15価ワクチンを形成することが有利であるのに対して、幼児または小児中耳炎の不安があるに関しては、有利には抗原型血清型6Aおよび19Aが13価ワクチンを形成するために含まれる。上記多糖体は全長、天然の形態で用いることができるが、また免疫原性がある大きさを減少させた多糖体も用いることができることは理解されるだろう例えば、EP497524および497525。高齢者55歳の人々の肺炎および幼児18ヶ月までならびに小児典型的には18ヶ月~5歳の中耳炎の予防/改善に関して、上記のような多価ストレプトコッカスニューモニエ多糖体とPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択されるストレプトコッカスニューモニエ蛋白またはその免疫学的機能等価物とを組み合わせることが本発明の好ましい具体例である。また、肺炎球菌蛋白の組み合わせも以下に記載のように有利に利用できる。本発明の肺炎球菌蛋白本発明の目的に関して、免疫学的機能等価物を本発明の蛋白由来の少なくとも1つの防御エピトープを含む蛋白のペプチドとして定義する。該エピトープは、特徴的には、表面が露出し、高保存性であり、宿主細胞の殺菌性抗体応答を誘発するか、または毒性作用を防止することができる。好ましくは、機能等価物は本発明の蛋白由来の少なくとも15個および好ましくは30個またはそれ以上の連続したアミノ酸を有する。最も好ましくは、蛋白のフラグメント、欠失、例えばその膜貫通型欠失変異体すなわち、蛋白の細胞外ドメインの使用、融合、化学的または遺伝学的脱毒性誘導体等を用いることができるが、ただし天然の蛋白と同様の免疫応答を実質的に惹起させることができることが条件である。蛋白配列における可能性あるB細胞エピトープの位置は、表面が露出し、抗原性であるペプチドを、2つの方法:2D構造予測および抗原指標予測を組み合わせて用いて同定することにより容易に決定できる。2D構造予測はPSIPREDプログラムDavidJonesBrunelBioinformaticsGroupDeptBiologicalSciencesBrunelUniversityUxbridgeUB83PHUKから入手を用いて行うことができる。抗原性指標はJamesonおよびWolfCABIOS41811861988により記載された方法に基いて計算できる。本発明の蛋白は以下の蛋白、肺炎球菌の外部表面に曝された全てのもの肺炎球菌の生活環の少なくとも一部の間に宿主の免疫系により認識され得るものまたは肺炎球菌により分泌されるか、または放出される蛋白である。本発明のストレプトコッカスニューモニエ蛋白は、好ましくはポリヒスチジントライアッドファミリーPht由来の蛋白、Lytファミリー由来の蛋白、コリン結合蛋白、LPXTFモチーフXはいずれかのアミノ酸、LXXCXはいずれかのアミノ酸タイプIIシグナル配列モチーフを有する蛋白およびタイプIシグナル配列モチーフを有する蛋白から成る群から選択される。これらのカテゴリーまたはモチーフの中の好ましい例は、以下の蛋白またはその末端切断物もしくは免疫学的機能等価物である:PhtポリヒスチジントライアッドファミリーはPhtA、PhtB、PhtD、PhtE蛋白を含む。このファミリーは、脂質化配列、プロリンに富む領域と金属またはヌクレオシドとの結合または酵素活性に関与している可能性のあるいくつかのヒスチジントライアッドにより分けられる二つのドメイン、3-5超らせん領域、保存されたN末端と異種C末端により特徴付けられている。これは検査された肺炎球菌の全ての系で存在した。同種の蛋白が、他の肺炎球菌とナイセリア属で発見された。このファミリーの好ましいメンバーはPhtA、PhtB、PhtDを含む。より好ましくはPhtA、PhtDを含む。しかしながら、PhtA、B、D、Eなる語は、下記の引用文献に開示されている配列を有する蛋白、ならびに対象となる蛋白と少なくとも90同一である配列相同性を有するその天然に存在するおよび人工的な変異体をいう、と解釈される。好ましくは少なくとも95同一、最も好ましくは97同一である。Pht蛋白に関して、PhtAはWO98/18930に開示されており、Sp36とも言う。上記したように、これはポリヒスチジントライアッドファミリー由来の蛋白で、LXXCのタイプIIシグナルモチーフを有する。PhtDはWO00/37105に開示されており、Sp036Dとも言う。上記したように、これもまたポリヒスチジントライアッドファミリー由来の蛋白で、LXXCのタイプIIシグナルモチーフを有する。PhtBはWO00/37105に開示されており、Sp036Bとも言う。PhtBファミリーのもう1つのメンバーはC3-分解ポリペプチドであり、WO00/17370に開示されている。この蛋白もまたポリヒスチジントライアッドファミリー由来で、LXXCのタイプIIシグナルモチーフを有する。好ましい免疫学的機能等価物は、WO98/18930に開示されているSp42蛋白である。PhtB末端切断物おおよそ79kDはWO99/15675に開示されており、PhtXファミリーのメンバーであると考えられる。PhtEはWO00/30299に開示されており、BVH-3と言う。SpsAはWO98/39450に開示されているコリン結合蛋白Cbpである。Lytファミリーは細胞溶解と関連する細胞膜結合蛋白である。N末端ドメインはコリン結合ドメインを含む。しかしながら、Lytファミリーは、下記のコリン結合蛋白ファミリーCbpファミリーにおいて見られる特徴をもっておらず、したがって本発明に関して、LytファミリーはCbpファミリーと異なると考えられる。Cbpファミリーとは対照的に、C末端ドメインはLyt蛋白ファミリーの触媒ドメインを含む。このファミリーはLytA、BおよびCを含む。Lytファミリーに関して、LytAはRondaら、EurJBiochem164621624において開示されている。LytBはWO98/18930に開示されており、Sp46とも言う。LytCもまたWO98/18930に開示されており、Sp91とも言う。ファミリーの好ましいメンバーはLytCである。もう一つの好ましい具体例は、Lyt末端切断物であり、Lytとは上記したとおりであり、末端切断物とはコリン結合領域の50またはそれ以上を欠く蛋白のことである。好ましくはそのような蛋白は全てのコリン結合領域を欠く。Sp125はLPXTGXはいずれかのアミノ酸の細胞壁固定モチーフを有する肺炎球菌表面蛋白の一例である。このモチーフを有する肺炎球菌表面蛋白のこの種の蛋白は全て、本発明の状況において有用であることが判り、そのため本発明の付加的な蛋白と見なされる。Sp125自体はWO98/18930に開示されており、ZmpB-亜鉛金属プロテイナーゼとして知られている。Sp101はWO98/06734整理番号y85993に開示されている。これはタイプIシグナル配列によって特徴付けられる。Sp133はWO98/06734整理番号y85992に開示されている。これもまたはタイプIシグナル配列によって特徴付けられる。Sp128およびSp130はWO00/76540に開示されている。本発明において用いられる蛋白は、好ましくは、PhtDおよびPhtA群、またはこれらの両方の蛋白の組合せから選択される。本発明の1つまたはそれ以上の肺炎球菌蛋白と他の肺炎球菌蛋白との有利な組合せ本発明のワクチンにおいて、本発明の各々の上記した蛋白好ましくは、PhtDおよびPhtAのいずれかまたは両方もまた1つまたはそれ以上の下記リスト:ニューモリシンまた、Plyとも称される好ましくは、化学処理または変異により弱化させる[WO96/05859、WO90/06951、WO99/03884]、PsaAおよびその膜貫通型欠失変異体BerryPatonInfectImmun1996Dec64525562、PspAおよびその膜貫通型欠失変異体米国特許第5804193号、WO92/14488、WO99/53940、Pspその膜貫通型欠失変異体WO97/09994、WO99/53940、コリン結合蛋白Cbpファミリーの一員[例えば、CbpAおよびその膜貫通型欠失変異体WO97/41151;WO99/51266]、グリセルアルデヒド-3-ホスフェート-デヒドロゲナーゼInfectImmun1996643544、HSO70WO96/40928、PcpASanchezBeatoら、FEMSMicrobiolLett199816420714、M様蛋白SB特許出願番号EP0837130および付着因子18627SB特許出願番号EP0834568由来の蛋白と有利に組み合わせることができる。また、本発明は該蛋白上記のようなの免疫学的機能等価物または末端切断物も含む。コリン結合蛋白ファミリーに関して、このファミリーのメンバーは、コリンアフィニティクロマトグラフィーによって精製されることができた肺炎球菌蛋白として初めて同定された。コリン結合蛋白は全て、細胞壁のタイコ酸および細胞膜結合リポタイコ酸のホスホリルコリン部分と共有結合していない。構造的にこれらは、蛋白の正確な性質アミノ酸配列、長さなどは多様であるが、全てのファミリーに共通したいくつかの領域を有している。一般的に、コリン結合蛋白は、N末端領域、保存反復領域R1および/またはR2、プロリンに富む領域P、複数の反復配列で形成されており、この蛋白のおよそ二分の一を構成する保存コリン結合領域Cを含む。本願明細書において使用されているコリン結合蛋白ファミリーCbpなる語は、WO97/41151で同定されているコリン結合蛋白であるPbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD、CbpGからなる群より選択される。CbpAはWO97/41151に開示されている。CbpDとCbpGはWO00/29434に開示されている。PspCはWO97/09994に開示されている。PbcAはWO98/21337に開示されている。好ましくは、コリン結合蛋白はCbpA、PbcA、SpsA、PspCからなる群より選択される。Cbpが利用できるさらなる蛋白である場合、これはCbp末端切断物であってもよく、ここにCbpは上記と同意義であり、末端切断物はコリン結合領域Cの50またはそれ以上が欠失している蛋白を意味する。好ましくは、該蛋白は完全なコリン結合領域が欠失している。より好ましくは、該末端切断蛋白はiコリン結合領域およびii蛋白のN末端の半分の一部を欠失しているが、少なくとも一つの反復領域を保持するR1またはR2。さらにより好ましくは、末端切断物は2つの反復領域を有するR1とR2。該好ましい具体例は、WO99/51266またはWO99/51188に記載のようにNR1xR2およびR1xR2であるが、類似のコリン結合領域が欠失している他のコリン結合蛋白もまた、本発明の範囲内に含まれる。また、Cbp末端切断物-Lyt末端切断物キメラ蛋白または融合蛋白も本発明のワクチンに用いることができる。好ましくは、これはCbpのNR1xR2またはR1xR2およびLyt例えば、LytCC末端またはSp91C末端のC末端部C末端、すなわちコリン結合領域が欠失しているを含む。より好ましくは、CbpはCbpA、PbcA、SpsAおよびPspCから成る群から選択される。さらにより好ましくはCbpAである。好ましくは、LytはLytCSp91とも言うである。コリン結合領域Cが欠失しており、Lytとの融合蛋白として発現されるPspAまたはPsaA末端切断物も用いることができる。好ましくは、LytはLytCである。本発明の目的の肺炎球菌蛋白の好ましい組合せ好ましくは、本発明の蛋白の組合せは、2またはそれ以上3または4の異なるカテゴリー、例えばLXXCXはいずれかのアミノ酸、例えばポリヒスチジントライアッドファミリーPhtのタイプIIシグナル配列モチーフ、コリン結合蛋白Cbp、タイプIシグナル配列モチーフ例えば、Sp101を有する蛋白、LPXTGモチーフXはいずれかのアミノ酸、例えばSp128、Sp130を有する蛋白、毒素例えばPly等から選択される。これらのカテゴリーまたはモチーフの中の好ましい例は、上記した蛋白、またはその免疫学的機能等価物である。毒素Pht、毒素Cbp、PhtCbpおよび毒素PhtCbpが好ましいカテゴリーの組合わせである。好ましい有利な組合せは、限定するものではないが、PhtDNR1xR2、PhtDNR1xR2-Sp91C末端キメラまたは融合蛋白、PhtDPly、PhtDSp128、PhtDPsaA、PhtDPspA、PhtANR1xR2、PhtANR1xR2-Sp91C末端キメラまたは融合蛋白、PhtAPly、PhtASp128、PhtAPsaA、PhtAPspA、NR1xR2LytC、NR1xR2PspA、NR1xR2PsaA、NR1xR2Sp128、R1xR2LytC、R1xR2PspA、R1xR2PsaA、R1xR2Sp128、R1xR2PhtD、R1xR2PhtAを含む。好ましくは、NR1xR2またはR1xR2はCbpAまたはPspC由来である。より好ましくは、CbpA由来である。肺炎球菌蛋白の特に好ましい組合せは、Plyまたはその末端切断物もしくは免疫学的機能等価物PhtDまたはその末端切断物もしくは免疫学的機能等価物NR1xR2またはR1xR2を含む。好ましくは、NR1xR2またはR1xR2はCbpAまたはPspC由来である。より好ましくは、CbpA由来である。理論に縛られることなく、組成物中の本発明の肺炎球菌蛋白または上記した組合せは、肺炎球菌による侵襲を阻害するための免疫系の体液性ブランチと協力する、肺炎球菌疾患-特に肺炎に対する保護を必要とする-に対するT細胞媒介応答を誘発すること、およびオプソニン食菌作用を刺激することに役立ち得る。蛋白抗原を含むことのさらなる利点は、オプソニン食菌作用プロセスに関するさらなる抗原を提示することである。したがって、本発明の具体例において、少なくとも4の血清型、好ましくは少なくとも7の血清型、より好ましくは少なくとも11の血清型由来の多糖体抗原を含む肺炎球菌多糖体接合ワクチン、およびPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133または上記のような肺炎球菌蛋白組合せから成る群から選択される少なくとも1つ好ましくは2、3または4のストレプトコッカスニューモニエ蛋白を含むストレプトコッカスニューモニエワクチンを提供する。好ましくは、蛋白の1つはPhtAまたはその免疫学的機能等価物である。最も好ましくは、蛋白の1つはPhtDまたはその免疫学的機能等価物である。上記したように、ワクチン接種への多糖体の用い方に関連した問題は、多糖体それ自体は免疫原性に乏しいという事実である。これを解決するため、多糖体をバイスタンダー細胞であるT細胞の助けを付与する蛋白キャリアに結合させてもよい。そのため、本発明で利用される多糖体はそのような蛋白キャリアに結合されていることが好ましい。現在、一般的に多糖体の免疫原性を生むために使われる、そのような蛋白の例として、ジフテリアとテターヌストキソイドDT、DTCRM197、他のDT変異体、キーホールリンペットヘモシアニンKLH、エヌメニンジティディス由来のOMPC、ツボクラリンの精製蛋白誘導体PPDが挙げられる。肺炎球菌多糖体を用いる免疫原性組成物またはワクチンのための他の担体は、ヘモフィルスインフルエンザEP594610-B由来の蛋白D、またはそのフラグメントである。使用に適したフラグメントはヘルパーT細胞エピトープを含むフラグメントである。特に、蛋白Dフラグメントは、好ましくは、蛋白のN末端3分の1を含むであろう。蛋白D担体は、意外にも、多肺炎球菌多糖体抗原が結合しているワクチンにおける担体として有用である。エピトープ抑制は、通常には、同様の担体が各々の多糖体に対して用いられる場合に生じやすい。意外にも、本発明者らは、蛋白Dが、特に、組合せワクチンにおける該エピトープ抑制効果を最小限にするのに適していることを見出した。組合せ中の1つまたはそれ以上の肺炎球菌多糖体は、蛋白D上に有利に結合でき、好ましくはすべての抗原は、該組合せワクチンにおいて蛋白Dに結合している。肺炎球菌多糖体に関するさらに好ましい担体は、肺炎球菌蛋白それ自体本発明の肺炎球菌蛋白の節に上記したようなである。多糖体は、あらゆる既知の方法例えば、Likhiteによる米国特許第4,372,945号およびArmorらによる米国特許第4,474,757号によって、キャリア蛋白に結合させることができる。好ましくは、CDPA結合を行うWO95/08348。好ましくは、結合の蛋白:多糖体重量:重量比は、0.3:1~1:1、より好ましくは0.6:1~0.8:1および、最も好ましくは約0.7:1である。本発明のワクチンはアジュバント処理されていることが好ましい。適当なアジュバントは水酸化アルミニウムゲルミョウバンまたはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩を含むが、カルシウム、マグネシウム、鉄または亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化されたチロシン、アシル化された糖、陽イオンまたは陰イオンに誘導された多糖体、ポリフォスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。アジュバントは、免疫応答の細胞媒介ブランチを補助するためにTH1型反応の優先的誘発因子であるように選ばれることが好ましい。本発明のTH1アジュバント高レベルなTh1型サイトカインは、与えられた抗原に対して細胞性免疫反応の誘発を引き起こす傾向にあるが、高レベルなTH2型サイトカインは、抗原に対して体液性免疫反応の誘発を引き起こす傾向にある。Th1型、Th2型免疫反応の区別は確固としたものでないことを認識することが重要である。現実には、個人は、優勢的にTh1であると、または優勢的にTh2であるとして記載される免疫反応を支持する。しかしながら、MosmannとCoffmanにより、ネズミCD4veT細胞クローンに記載されているサイトカインである点から、サイトカインファミリーを考察することが好都合であることが多いMosmannTRおよびCoffmanRLTH1andTH2cellsdifferentpatternsoflympholinesecretionleadtodifferentfunctionalpropertiesAnnualReviewofImmunology7、145‐173頁。伝統的に、Th1型反応は、Tリンパ球によるINF-γとIL-2サイトカインの産生と関連している。Th1型免疫反応の誘発としばしば直接的に関連している、IL-12のような他のサイトカインは、T細胞によって産生されない。対照的に、Th2型反応は、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10の分泌と関連している。Th1反応を優勢的に促進する適当なアジュバントは、モノホスホリル脂質Aまたはその誘導体、特に3-デ-O-アシル化モノホスホリル脂質A3D-MPLその調製についてのGB2220211Aを参考のこと、およびモノホスホリル脂質A、好ましくは3-デ-O-アシル化モノホスホリル脂質Aと、アルミニウム塩例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムまたは水中油型エマルジョンの一方との組み合わせを包含する。そのような組み合わせにおいては、抗原と3D-MPLは同じ粒状構造物中に含まれ、抗原性シグナルと免疫刺激シグナルのより効率的なデリバリーを可能とする。研究によると、3D-MPLはミョウバン吸着抗原の免疫原性を一層亢進することができる。[Thoelenら、Vaccine19981670814EP689454-B1]亢進された系は、モノホスホリル脂質Aとサポニン誘導体の組み合わせ、特にWO94/00153に開示されているようにQS21と3D-MPLの組み合わせ、またはWO96/33739に開示されているようにQS21がコレステロールでクエンチされた小さい反応原性組成物を包含する。水中油型エマルジョン中にQS21、3D-MPLおよびトコフェロールを含む特に効力のあるアジュバントの処方は、WO95/17210に記載されており、好ましい処方である。好ましくは、ワクチンは付加的にサポニン、より好ましくはQS21を含む。処方はまた、水中油型エマルジョンとトコフェロールを含むWO95/17210。本発明はまた、本発明の蛋白と3D-MPLのような医薬上許容される賦形剤との混合よりなるワクチンの産生の方法を与える。オリゴヌクレオチドを含む非メチル化CpGWO96/02555はまた、TH1反応の優先誘発因子であり、本発明の利用に適している。本発明の特に好ましい組成物は、1つまたはそれ以上の結合肺炎球菌多糖体、1つまたはそれ以上の本発明の肺炎球菌蛋白およびTh1アジュバントを含む。理論に縛られることなく、肺炎球菌蛋白上記したによる細胞媒介応答の惹起および両免疫系の機構の間の共同作用はTh-1アジュバントを用いて補助することができ、その結果、高齢者における、一般的には肺炎球菌疾患に対して、および重要には、肺炎球菌ニューモニエに対して特に効果的なワクチンを与える。本発明のさらなる態様において、医薬において用いるためのイムノゲンまたは上記したワクチンを提供する。一の具体例において、高齢者55歳における肺炎の防止または改善方法であって、安全かつ有効な量の本明細書に記載のストレプトコッカスニューモニエ多糖体抗原およびPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択される肺炎球菌蛋白および所望によりTh1アジュバントを含むワクチンを該高齢者に投与することを含む方法を提供する。さらなる具体例において、幼児18ヶ月までまたは小児典型的には18ヶ月~5歳における中耳炎の防止または改善方法であって、安全かつ有効な量のストレプトコッカスニューモニエ多糖体抗原およびPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択されるストレプトコッカスニューモニエ蛋白抗原、ならびに所望によりTh1アジュバントを含むワクチンを該幼児または小児に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、上記したような本明細書の方法において、多糖体抗原は多糖体蛋白接合物として存在する。本発明のワクチンの調製法本発明のワクチン調製物は、当該ワクチンを全身性または粘膜性経路を介して投与することにより、感染に感受性の哺乳類好ましくはヒト患者を保護または治療するために使われる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路を介する注射、経口/食事、呼吸、尿生殖器への粘膜投与を含む。肺炎球菌の鼻咽頭での運搬はより効果的に妨げられ、そのためその初期段階で感染を減衰できるため肺炎または中耳炎を治療するのにワクチンを鼻内投与することが好ましい。本発明のワクチンは単回用量として投与されるが、その成分はまた同時に、または違う時に投与することもできる例えば、肺炎球菌多糖体は、同時に、または互いに関して免疫反応が最も良く協調するワクチンの細菌蛋白成分を投与した後1-2週間で別個に投与できる。共投与に関しては、所望によるTh1アジュバントは、異なる投与のいずれかまたはすべてにおいて存在できるが、ワクチンの細菌蛋白成分との組み合わせで存在することが好ましい。単一の投与経路に加えて、2つの異なる投与経路を利用してもよい。例えば、ウイルス性抗原はID皮内投与され、一方細菌蛋白はIM筋肉内またはIN鼻内投与することができる。多糖体はIMまたはID投与され、細菌蛋白はINまたはID投与することができる。加えて、本発明のワクチンは、初回抗原用量としてIM投与され、追加抗原用量としてIN投与され得る。各ワクチン中の結合抗原の量は、典型的なワクチン中で有意な副作用がなく免疫防御反応を誘発する量として選ばれる。そのような量は、どの特定の免疫原が利用され、どのように提示されたかによって異なる。一般的には、各々の投与量は、0.1~100μgの多糖体、好ましくは0.1~50μg、好ましくは0.1~10μgを含み、1~5μgが最も好ましい範囲であるだろうことが考えられる。ワクチン中の蛋白抗原の含有量は、典型的には1~100μg、好ましくは5~50μg、最も典型的には5~25μgの範囲である。特定のワクチンの成分の最適量は、対象での適当な免疫反応を観察することを含む標準的な実験で確かめることができる。最初のワクチン接種に続いて、対象は適当に時間を置いて一つまたはいくつかの追加抗原免疫処置を受ける。ワクチン調製物は一般的にVaccineDesignに記載されているThesubunitandadjuvantapproachPowerMFおよびNewmanMJ編1995PlenumPressNewYork。リポソーム内での莢膜化はFullertonの米国特許第4,235,877号に記載されている。本発明のワクチンはどんな経路でも投与されるが、本発明のワクチンの皮膚への投与IDは、本発明の一つの具体例を形成している。ヒトの皮膚は、角質層と呼ばれる、外側の角質表皮を含み、それが表皮の表面を覆っている。この表皮の真下が真皮と呼ばれる層で、これが順次皮下組織を覆っている。研究者は、皮膚、特に真皮へのワクチンの注射は免疫反応を刺激し、それは多くの付加的な有利性と関連していることを示している。本明細書に記載のワクチンでの皮内へのワクチン接種は、本発明の好ましい特徴を形成している。皮内注射の従来の技術であるマントー処置は、皮膚の洗浄、そして一方の手を伸ばし、狭いゲージの針26-31ゲージの斜面を上に向けて、10-15°の間の角度で針を挿入するという工程を含む。いったん針の斜面が挿入されたら、針の筒は押し下げ、針が皮下に入っていくように小さい圧力を与えつつさらに押し進める。それから液体を極めてゆっくりと注入し、それによって皮膚の表面に小気泡または衝撃を形成させ、続いて針をゆっくりと抜く。さらに最近では、液体作用薬を皮膚中または皮膚を横切って投与するよう特別に設計された装置が記載されており、例えばWO99/34850とEP1092444で記載されている装置や、また例えばWO01/13977、米国特許第5480381号、米国特許第5599302号、米国特許第5334144号、米国特許第5993412号、米国特許第5649912号、米国特許第5569189号、米国特許第5704911号、米国特許第5383851号、米国特許第5893397号、米国特許第5466220号、米国特許第5339163号、米国特許第5312335号、米国特許第5503627号、米国特許第5064413号、米国特許第5520639号、米国特許第4596556号、米国特許第4790824号、米国特許第4941880号、米国特許第4940460号、WO97/37705、WO97/13537で記載されているジェット式注射装置である。ワクチン調製物の皮内投与の代替的な方法は、従来のシリンジと針、固形ワクチンの弾道デリバリーWO99/27961のために設計された装置、経皮的なパッチWO97/48440、WO98/28037、皮膚の表面への塗布経皮的デリバリー、WO98/20734、WO98/28037を含む。本発明のワクチンが皮膚に投与された場合、またはより具体的には真皮に投与された場合、ワクチンは、液体容量が小さく、特に約0.05mlと0.2mlの間の容量である。皮膚にある抗原の含量、または本発明の皮内用ワクチンの含量は、筋肉内ワクチン上記参照で見られる従来の用量と類似していてもよい。しかしながら、処方を低用量としうることが皮膚または皮内用ワクチンの特徴である。そのため、好ましくは低用量のワクチン中の蛋白抗原は、用量当たり0.1から10μg、好ましくは0.1から5μgとほとんど配合されない。多糖体好ましくは接合体抗原は用量当たり多糖体が0.01~1μg、そして好ましくは0.01μgと0.5μgの間の範囲で存在する。本明細書で使用されるように、皮内デリバリーなる語は、皮膚の真皮の領域にワクチンをデリバリーすることを意味する。しかしながら、ワクチンは必ずしも真皮に独占的にある必要はない。真皮は、ヒトの皮膚の表面から約1.0mmと約2.0mmの間に位置する皮膚の層であるが、個体によって、および体の異なる部位によってある程度の違いがある。一般的に、皮膚の表面の下1.5mm行くことで真皮に達すると考えられる。真皮は、表面の角質層、表皮と下にある皮下層の間に位置する。デリバリーの形態によって、ワクチンは最終的に単独でまたは優位的に真皮内に位置し、または最終的に表皮と真皮内において分配される。本発明はまた、一連の異なる病原体に対して防御を与える混合ワクチンを意図する。多くの小児ワクチンは、現在、子供が受けねばならない注射の数を減らすために混合型ワクチンとして投与される。かくして、小児用ワクチンの場合、他の病原体由来の他の抗原を本発明のワクチンと共に処方することができる。例えば、本発明のワクチンは、ジフテリアトキソイドDT、テターヌストキソイドTT、百日咳菌成分[典型的には任意のペルタクチンPRNおよび/または凝集素12により無毒化された百日咳菌毒素PTと糸状赤血球凝集素FHA]を含む、例えばDT、TT、PT、FHAおよびPRN抗原を含む市販ワクチンINFANRIX-DTPa登録商標SmithKlineBeechamBiologicalsなどの、周知の3価混合ワクチンと共に、または例えば、Tritanrix登録商標SmithKlineBeechamBiologicalsにより市販されているような全細胞百日咳菌ワクチンと共に、処方または別々ではあるが同時に投与され得る。混合ワクチンはまた、B型肝炎表面抗原HBsAg、ポリオウイルス抗原例えば不活化3価ポリオウイルスであるIPV、モラクセラカタラーリス膜外蛋白、分類不可能な特異的ヘモフィルスインフルエンザ蛋白、髄膜炎菌B膜外蛋白のような他の抗原も含むことができる。特に中耳炎の予防の為の混合ワクチンに配合することができるモラクセラカタラーリス蛋白抗原の好ましい例は、OMP106[WO97/41731AntexとWO96/34960PMC]、OMP21、LbpAおよび、またはLbpB[WO98/55606PMC]、TbpAおよび、またはTbpB[WO97/13785とWO97/32980PMC]、CopB[HelminenMEら1993InfectImmun61:2003-2010]、OmpCD、HasRPCT/EP99/03824、PilQPCT/EP99/03823、OMP85PCT/EP00/01468、lipo06GB9917977.2、lipo10GB9918208.1、lipo11GB9918302.2、lipo18GB9918038.2、P6PCT/EP99/03257、D15PCT/EP99/03822、Omp1A1PCT/EP99/06781、Hly3PCT/EP99/03257、OmpEである。特に中耳炎の予防の為の混合ワクチンに配合することができる非特異的ヘモフィルスインフルエンザ抗原の例は、フィンブリン蛋白[US5766608-オハイオ州研究財団]とそこから得られるペプチドよりなる融合蛋白[例えばLB1fペプチド融合蛋白;US5843464OSUまたはWO99/64067]、OMP26WO97/01638、P6[EP281673ニューヨーク州立大学]、TbpAおよび、またはTbpB、Hia、Hsf、Hin47、Hif、Hmw1、Hmw2、Hmw3、Hmw4、Hap、D15WO94/12641、蛋白DEP594610、P2、P5WO94/26304である。意図される他の組み合わせは、本発明の肺炎球菌PS蛋白と、例えばインフルエンザ弱毒化された、スプリットまたはそのサブユニット[例えば、表面糖蛋白ノイラミニダーゼNAと赤血球凝集素HA。例えばChaloupkaIらEurJournalClinMicrobiolInfectDis199615:121-127を参考のこと]、RSV例えば、FとG抗原またはF/G融合蛋白。例えばSchmidtACら、JVirolMay2001P45944603を参考のこと、PIV3例えば、HNとF蛋白。前掲のSchmidtらを参考のこと、水痘ウイルス例えば弱毒化されたもの、糖蛋白I―Vなど、MMR麻疹、おたふく風邪、風疹のいずれかのまたは全ての成分からのウイルス性抗原との組合せである。中耳炎の治療または予防に関して本発明により意図される好ましい小児用組合せは、1つまたはそれ以上のストレプトコッカスニューモニエ多糖体抗原複数でも可好ましくは蛋白Dに結合したもの、PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択される1つまたはそれ以上の肺炎球菌またはその免疫学的機能等価物、および1つまたはそれ以上のモラクセラカタラーリスおよび/または分類不可能なヘモフィルスインフルエンザからの表面露出抗原を含む。蛋白Dは、それ自体、分類不可能なエイチインフルエンザntHiに対するB細胞媒介保護を産生できるイムノゲンであるので、有利には、肺炎球菌多糖体に関する蛋白担体として用いることができ、エピトープ抑制問題上記したを解決できる。モラクセラカタラーリスおよび/または分類不可能なヘモフィルスインフルエンザ抗原は、サブユニット形態のワクチンに含まれることができ、または細菌由来の外膜小胞blebsの表面に存在する抗原として添加してもよい。好ましくは、上記した抗原性組成物およびワクチンは、使用直前まで凍結乾燥され、その時点で即時に希釈剤で復元される。より好ましくは、3D-MPLの存在下で凍結乾燥され、即時に食塩水溶液で復元される。別法として、蛋白および多糖体は、ワクチン接取キット成分のいずれか、または両方を凍結乾燥する中に別個に貯蔵してもよく、使用前に復元して混合してもよく、または患者に別に投与してもよい。Th1アジュバント好ましくは3D-MPLは、成分のいずれかまたは両方と共に存在できる。ワクチンの凍結乾燥は、当該分野においてよく知られている。典型的には、液体ワクチンは、例えばシュークロースやラクトースのような糖初期濃度は10~200mg/mLなどの固化防止剤の存在下で凍結乾燥される。凍結乾燥は、典型的には、一連の工程、例えば、69°Cで始まり、徐々に3時間かけて-24°Cとし、それからこの温度を18時間保持し、徐々に1時間かけて-16°Cとし、この温度を6時間保持し、徐々に3時間かけて34°Cとし、最終的にこの温度を9時間保持する、一のサイクルで起る。組成物を凍結乾燥するとより安定な組成物例えば、多糖体抗原の崩壊が防止されるとなる。また、意外にも、この処理は肺炎球菌多糖体に対する高い抗体力価の原因である。このことは、特にPS6B結合が十分であることを示している。したがって、本発明の別の態様は、3D-MPLとのPS6B接合アジュバント好ましくは、アルミニウム基材アジュバントを避けるおよびPhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133から成る群から選択される肺炎球菌蛋白を含む凍結乾燥した抗原性組成物である。実施例は本発明を説明するためのものであって、限定するものではない。実施例1エスニューモニエ莢膜多糖体11価の候補ワクチンは、実質的にEP72513に記載されているように調製した莢膜多糖体血清型1、3、4、5、6B,7F、9V、14、18C、19Fおよび23Fを含む。各々の多糖体を活性化し、CDAP化学WO98/08348を用いて誘導体化し、蛋白担体に結合させる。すべての多糖体は、血清型3これはその粘度を減少させるために大きさを小さくしたを除いてそれらの天然の形態で結合する。蛋白担体:選択した蛋白担体は分類不可能なヘモフィルスインフルエンザから、イーコリで発現した組換え蛋白DPDである。蛋白Dの発現ヘモフィルスインフルエンザD蛋白D発現に関する遺伝学的構築出発物質DNAをコードする蛋白D蛋白Dはすべての血清型および分類不可能な株のエイチインフルエンザの中に多く貯蔵される。完全な蛋白D遺伝子をDNA配列を含むpHIC348ベクターは、DrAForsgrenDepartmentofMedicalMicrobiologyUniversityofLundMalmoGeneralHospitalMalmoSwedenから得る。蛋白DのDNA配列は、JansonらInfectImmun59119125により公にされている。発現ベクターpMG1発現ベクターpMG1は異質挿入遺伝子の転写および翻訳に関する制御要素由来のバクテリオファージλを取り込んだpBR322の誘導体Grossら、1985である。加えて、アンピシリン耐性遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子と交換された。イーコリ株AR58イーコリ株AR58N99をSA500誘導体galETN10、ラムダKilcI857ΔH1でのP1ファージストック予備増殖で形質導入することにより生産した。N99およびSA500は国立保健研究所のDrMartinRosenbergの研究室から由来のイーコリK12株である。発現ベクターpMG1蛋白Dの産生に関して、蛋白をコードするDNAは発現ベクターpMG1にクローン化される。このプラスミドは挿入された異質遺伝子の複写および翻訳を誘発するラムダファージDNAからのシグナルを利用する。ベクターはプロモーターPL、オペレーターOLおよび2つの利用部位NutLおよびNutRを含み、N蛋白が供給される場合、転写極性効果を軽減するGrossら、1985。PLプロモーターを含むベクターはイーコリ溶原性宿主に誘導され、プラスミドDNAを安定化させる。溶原性宿主株はゲノムを取り入れた複製欠損ラムダファージDNAを含むShatzmanら、1983。染色体ラムダファージDNAは、ベクターのOLリプレッサーに結合しリプレッサー蛋白の合成を導き、RNAポリメラーゼがPLプロモーターに結合して、それにより挿入された遺伝子の転写を防止する。発現株AR58のcI遺伝子は、温度感受性変異体を含み、したがって、転写を指示されるPLは温度変化により制御することができ、すなわち、培養温度を増加させることによりリプレッサーを不活性化し、異質蛋白の合成が開始される。この発現系は、特に、細胞への毒性があり得るこれらの異質蛋白の制御された合成を可能にするShimatakaRosenberg1981。イーコリ株AR58蛋白D担体の産生に用いられるAR58溶原性イーコリ株は、標準NIEイーコリK12株N99FsugalK2、lacZthrの誘導体である。これは欠損溶原性ラムダファージgalETN10、ラムダKilcI857ΔH1を含む。Kil-表現型は宿主マクロ分子合成の遮断を妨げる。cI857変異体は、温度感受性障害をcIリプレッサーに与える。ΔH1欠失は、ラムダファージライトオペロンおよび宿主バイオ、uvr3、およびchlA座を排除する。AR58株をSA500誘導体galETN10、ラムダKilcI857ΔH1でのP1ファージストック予備増殖で形質導入することにより生産した。欠損溶原のN99への導入は、近接したgalE遺伝子にテトラサイクリン耐性に関するTN10トランスポゾンコーディングの存在の効力によりテトラサイクリンで選択された。pMGMDPPrDベクターの構築インフルエンザウイルスpMGNSIの非構造的S1蛋白をコードする遺伝子を含むpMG1ベクターをpMGMDPPrDを構築するために用いた。蛋白D遺伝子は、pHIC348ベクターJansonら、1991から各々5’および3’末端でのNcoIおよびXbaI制限部位を含むPCRプライマーでPCRすることにより増幅させた。ついで、NcoI/XbaIフラグメントをNcoIとXbaIの間のpMGNS1に導入し、かくしてNS1蛋白のN末端の81個のアミノ酸ついでPD蛋白を含む融合蛋白を作成した。このベクターは標識pMGNS1PrDである。上記した構築物に基いて、蛋白D発現の最終的な構築物を生成した。BamHI/BamHIフラグメントをpMGNS1PrDから除去した。このDNA加水分解は、最初の3つのN末端残基意外のNS1コーディング領域を除去した。ベクターの再ライゲーションで、続くN末端アミノ酸配列で融合蛋白をコードする遺伝子を生成した:MDPSSHSSNMANTNS1蛋白D蛋白Dは脂質鎖が正常に結合しているリーダーペプチドまたはN末端システインを含まない。したがって、該蛋白はペリプラズムに排泄されることも、脂質化されることもなく、可溶性形態の細胞質中に保持される。最終構築物pMG-MDPPrDをAR58宿主株に、37°Cで貯蔵物を加熱することより導入する。細菌を含むプラスミドをカナマイシンの存在下で選択した。蛋白DコーディングDNA挿入の存在が、単離されたプラスミドDNAを選択されたエンドヌクレアーゼで消化することにより示された。組換えイーコリ株はECD4として称される。蛋白Dの発現はラムダPLプロモーター/OLオペレーターの制御下で行う。宿主株AR58は、温度感受性cI遺伝子を、OLに結合することによる低温度でのラムダPLからの発現を遮断するゲノム中に含む。一旦温度を上げると、cIはOLから放出され、蛋白Dが発現される。発酵の最後で、細胞を濃縮し、冷凍する。収穫した細胞からの抽出および蛋白Dの精製は以下のように行った。冷凍細胞培養ペレットを解凍し、細胞破壊溶液中クエン酸緩衝液、pH6.0に再懸濁させ、最終的なOD650=60とした。懸濁液をP=1000バールで高圧ホモジナイザーに2回通した。細胞培養ホモジネートを遠心分離により浄化し、細胞の破片を濾過により除去する。第1の精製工程において、濾過した溶解物をカチオン交換クロマトグラフィーカラムSPSepharoseFastFlowに付す。PDをゲルマトリックスにイオン相互作用により結合させ、溶出緩衝液のイオン強度を増加させる工程により溶出する。第2の精製工程において、不純物をアニオン交換マトリックスQSepharoseFastFlowに保持させる。PDはゲルに結合せず、通りぬけた液体中に回収することができる。両方のカラムクロマトグラフィー工程において、フラクション回収物をODによりモニターする。アニオン交換カラムクロマトグラフィーの精製蛋白Dを含む通りぬけた液体を限外濾過により濃縮する。限外濾過保有物を含む蛋白Dを最終的に0.2μmの膜に通す。化学:活性化およびカップリング化学:活性化およびカップリング化学は各々の多糖体に固有のものである。これらを表1に示す。天然の多糖体PS3を除くを2MのNaClまたは注射用水に溶解した。最適多糖体濃度をすべての血清型に関して評価した。アセトニトリル中の100mg/mlの貯蔵物から、CDAPCDAP/PS比0.75mg/mgPSを多糖体溶液に加えた。1.5分後、0.2Mのトリエチルアミンを加え、特定の活性化pHを得た。多糖体の活性化は、このpHで2分間25°Cで行った。蛋白D質量は初期PS/PD比に依存するを活性化多糖体に加え、カップリング反応を特定のpHで1時間行った。ついで、反応を、グリシンで30分間25°Cおよび4°Cで一晩でクエンチした。結合物を2MのNaClで平衡化したSephacryl500HRゲル濾過カラムを用いてゲル濾過により精製した。溶出したフラクションの炭水化物および蛋白含有量を測定した。結合物をプールし、0.22μmの滅菌膜で滅菌濾過した。結合調製物のPS/蛋白比を測定した。特徴付け:各々の結合物を特徴付け、表2に記載した詳細に対応させた。多糖体含有量μg/mlをResorcinol試験により、および蛋白含有量μg/mlをLowly試験により測定した。最終PS/PD比w/wを濃度の比により測定する。残余DMAP含有量ng/ngPS:多糖体のCDAPでの活性化は多糖体中のシアネート基を誘導し、DMAP4-ジメチルアミノ-ピリジンを遊離させる。残余DMAP含有量をSBで開発された特定のアッセイにより測定した。遊離多糖体含有量:4°Cに維持するか、または37°Cで7日保存した結合物の遊離多糖体含有量を、α-PD抗体および飽和硫酸アンモニウムでインキュベートし、ついで遠心分離して得られた上清で測定した。α-PS/α-PSELISAを上清中の遊離多糖体の定量化に用いた。また、結合物の欠乏をα-PD/α-PSELISAにより制御した。遊離多糖体の量を減少させて改善結合ワクチンを得る。抗原性:同様の結合物における抗原性を、抗体の捕獲および検出が、各々α-PSおよびα-PDであるサンドイッチ型ELISAで分析した。遊離蛋白含有量:遊離残余蛋白Dのレベルを試料のSDS処理が有る方法を用いて測定した。結合物を10分間100°Cに、SDS0.1の存在下加熱し、SEC-HPLCゲル濾過カラムTSK3000PWXLに注入した。蛋白Dは二量体であるので、SDSとの構築物を分離することによる遊離蛋白Dのレベルを過大評価する危険性がある。分子の大きさKav:分子の大きさはSEC-HPLCゲル濾過カラムTSK5000PWXLで測定した。安定性:安定性を4°Cに維持した結合物および37°Cで7日間貯蔵した結合物に関してHPLC-SECゲル濾過TSK6000PWXLで測定した。11価特徴付けを表2に示す。蛋白結合物をリン酸アルミニウムに吸着させ、プールして最終ワクチンを形成できる。結論:免疫原性結合物は生産せ、有望なワクチンの成分であることが示されている。最良の性質の最終結合肺炎球菌多糖体生成物に関する最適化CDAP条件が11のワクチンの各々に関して見出された。実施例2-本発明の1またはそれ以上の肺炎球菌蛋白/-3D-MPLの添加の、マウスでの肺炎球菌肺コロニー形成に対するPD-接合した11-価の多糖体ワクチンの防御的効能における有益な効果免疫学的表示肺炎球菌特異的血清IgGのエライザ投与量MaxisorpNuncイムノプレートを、37°Cで2時間、PBSで希釈した2μg/mlの蛋白で、100μl/ウェルにてコーティングする。プレートをNaCl0.9ツィーン-200.05バッファーで3回洗浄する。ついで、標準曲線物として加えられた抗-蛋白血清対照670ng/mlのIgGで開始するおよび血清サンプル1/10の希釈度で開始するの連続的な二倍希釈体PBS/ツィーン-200.05中、ウェル当たり100μlを攪拌しながら20°Cで30分間インキュベートする。上記したように洗浄した後、PBS/ツィーン-200.05中5000倍に希釈したペルオキシダーゼ接合ヤギ抗-マウスIgGJacksonを攪拌しながら20°Cで30分間インキュベート100μl/ウェルする。洗浄後、プレートを室温で100μl/ウェルのレベレーションrevelationバッファー100mMのクエン酸バッファーpH4.5中のOPDA0.4mg/mlおよびH2O20.05と一緒にインキュベートする。50μl/ウェルの1N塩酸を添加することでレベレーションを止める。光学濃度をEmaxイムノリーダーMolecularDevicesを用いて490および620nmで読み取る。抗体力価をSoftMaxProソフトウェアを用いる4変数の数学的方法により算定する。オプソニン食菌作用アッセイこのアッセイの目的は、CDCの公開されている標準的方法に適合する方法Steinerら、ClinicalandDiagnosticLaboratoryImmunology4:415、1997を用いて、試験血清サンプルの、ストレプトコッカスニュモニエ血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fまたは23Fに拮抗するオプソニンの作用能を再現的に測定することである。このアッセイは侵入するストレプトコッカスニュモニエまたはニュモコッカスを排除する第一機構としてインビボにて起ることをインビトロにて再現する。それはニュモコッカスをオプソニン化し、つづいて食作用に付し、ついで殺菌するものである。食作用とは細胞が物質を飲み込み、細胞質にある小胞ファゴソーム中にそれを取り囲む過程である。肺炎球菌は健康な哺乳動物の食細胞によって食菌されると、当該細菌は死滅する。オプソニン化とは、オプソニン、例えば、抗体および補体を抗原上に堆積させることにより食作用が促進される過程である。文献にて報告されている多数のオプソニン食菌作用アッセイがある。CDCの標準的方法はマルチ-ラブセッティングにて試験されるSteinerら、ICAAC、トロント、2000年9月16日-20日。この後者のアッセイはSBで適合された。というのも、他の実験室にて比較するための基礎を提供し、それは一般に入手可能な試薬および対照を用い、生存肺炎球菌の50の死滅を促進する能力のある血清の力価希釈度、この型のアッセイに一般に使用される単位としての結果を表すからである。実際、その使用されたアッセイが4ヵ所の別の実験室で十分によく対応する結果を形成しうることが明らかにされたSteinerら、ICAAC、トロント、2000年9月16日-20日。このアッセイで使用される食作用細胞はHL60細胞系であり、それは前骨髄球性白血病の個体から由来するものであり、Collinsらにより、1977年Nature270:347-9にて連続する細胞系として確立された。この細胞系は、未分化の造血細胞、すなわち、85の芽細胞および前骨髄球、6の骨髄球および9の分化細胞からなる。極性化合物は該細胞の分化を少なくとも2つの異なる系統で誘発させることができる。N,N-ジメチルホルムアミドは顆粒細胞の分化を誘発し、多形核様細胞44の骨髄球およびメタ骨髄球ならびに53バンドおよびセグメントのPMNを生成する。該アッセイにおけるバージョンA2において、試験すべき血清を熱不活化し、1/4で開始して連続的2倍希釈を8回、96-ウェルマイクロプレートのHBSS培地0.3BSAを含有するにて行った。各ウェルにおける希釈された血清の最終容量は25μlである。107個の細胞/mlの4容量のHL60細胞ジメチルホルムアミドで分化した5または6日後、2容量のエスニュモニエ菌適当な希釈度および1容量の新生児ウサギの補体を使用直前に混合し、その25μlの混合物を96-ウェルのマイクロプレートの希釈血清を含有する各ウェルに加える。血清型1および6Bでは、補体の量を最終濃度12.5にまで上げ、該アッセイのバージョンA3を得る。軌道振盪の下、37°Cで2時間インキュベーションした後、プレートを氷上に置き、オプソニン食菌反応を停止させる。37°Cで一夜インキュベートすることで、各ウェルにおけるコロニー形成単位CFUを評価する。オプソニン力価OTをウェル中のエスニュモニエ菌の数を少なくとも50まで減少させることができる血清の相互希釈度reciprocaldilutionとしてすなわち、50死菌として定義する。死菌=対照ウェルの平均CFU-サンプルのCFU/対照ウェルの平均CFUx100OF1マウスにおける肺炎球菌鼻腔内攻撃7週齢の雌のOF1マウスに、麻酔状態の下、5x105個のCFUのマウス適合エスニュモニエ血清型2、4または6Bを鼻腔内に接種する。肺を攻撃の6時間後に摘出し、ToddHewithBrothTHB、Gibco培地にて均質化する。肺ホモジネートの連続した10倍希釈体を、酵母抽出物補足THB寒天上、37°Cで一夜平板培養する。肺炎球菌肺感染を、対数加重平均値として表される、CFU/マウスの数として測定する。実施例2A3D-MPLアジュバントの抗蛋白免疫反応についての効果この実施例において、本発明者らは3D-MPLアジュバント処理の本発明の蛋白に対する免疫応答の効果を評価することができる。一群10匹の雌の6週齢のBalb/cマウスを、A:AIPO4100μg;またはB:AIPO4100μg5μg3D-MPL3デ-O-アシル化モノホスホリル脂質A、RibiImmunochemから購入のいずれかを含有する1μgの蛋白で0、14および21日目に筋肉内に免疫処理する。エライザIgGをポスト-III血清にて測定する。いずれの抗原であっても、3D-MPLを補足した処方でワクチン処理した動物にて最良の免疫応答が誘発されることがわかる。実施例2B本発明の蛋白/-3D-MPLアジュバントを添加した、血清型2、4または6Bで鼻腔内攻撃したOF1マウスにおける肺炎球菌肺コロニー形成に対するPD-接合の11-価の多糖体ワクチンの防御作用に対する有利な効果この実施例において、本発明者らは、古典的なAIPO4吸着の11-価の多糖体-蛋白D接合体処方と比べて、11-価の多糖体-蛋白D接合体、本発明の蛋白およびAIPO43D-MPLアジュバントを含有するワクチンの予防的効能を評価することができる。一群12匹の雌の4週齢のOF1マウスを、A:50μgのAIPO4;B:0.1μgのPS/PD-接合した11-価の多糖体ワクチンの血清型50μgのAIPO4;またはC:0.1μgのPS/PD-接合した11-価の多糖体ワクチンの血清型10μgの本発明の蛋白50μgのAIPO45μgの3D-MPLRibiImmunochemから購入を含有する処方で0および14日目に皮下的に免疫処理する。攻撃を上記したように21日目に行う。この方法から判るように、本発明の蛋白を補足し、AIPO4MPLでアジュバント処理した11-価の多糖体接合体ワクチンで有意な防御が得られる。反対に、11-価の多糖体接合体/AIPO4処方で免疫処理した動物では有意な防御は観察されない。この結果により、本発明の蛋白および3D-MPLアジュバントの添加が11-価の多糖体接合体ワクチンの肺炎に対する効力を亢進することを明らかにすることができる。実施例2C実施例2Bに示される防御の免疫相関性本発明の蛋白および3D-MPLを補足した11-価の多糖体接合体ワクチンによる、実施例2Bで得られた防御の免疫相関性を確立するために、上記したように、多糖体2、4または6Bおよび本発明の蛋白に対する攻撃前の血清抗体反応を測定することができる。ついで、抗体力価を、攻撃の6時間後に集めた対応する動物の肺で測定された細菌性コロニーの数と比較する。Log/Logの直線回帰上でR2を算定する。算定されたR2から、体液性免疫応答と両抗原の防御との間に相関関係のないことが判る。抗-6Bあるいは2または4抗体価は、11-価の接合体ワクチンで、あるいは本発明の蛋白および3D-MPLを補足した同じワクチンで免疫処理した群にてあまり違わない。したがって、処方Cで認められる防御の改善は、多糖体6Bあるいは2または4に対するより高い抗体力価によるだけではない。総合すれば、これらの結果は、防御が体液性免疫応答だけで媒介されるものではなく、むしろ蛋白抗原好ましくは3-MPLの存在下で誘発される細胞介在免疫性によっても媒介されることを示唆しうる。このことは、免疫系の両腕が協調して最適な防御を得るのに、肺炎球菌多糖体接合体ワクチンに蛋白抗原複数でも可および強力なアジュバントを添加することにさらなる支持を与えることができる。実施例3-本発明の蛋白で能動的に免疫処理され、肺炎球菌PSに対する抗体で受動的に免疫処理されたマウスにおける免疫系の両腕の協調実施例3A-肺炎に拮抗して保護する受動的に投与される抗-6B-多糖体抗-PSの濃度の測定方法ワクチン群:一群16匹の4群のマウスを-1日目に以下に詳説した群に従って希釈されていないラット抗-多糖体抗血清100μlで受動的免疫処理i.p.に付した合計64匹のマウス。動物:カナダ、CharlesRiverから由来の64匹の雄のCD-1マウスであり、体重は約35g約10週齢である。麻酔状態:イソフルラン3O21L/分でマウスを麻酔に付した。生物:エスニュモニエN1387血清型6を5ウマ血を補足したトリプチケース大豆寒天TSAプレートから収穫し、6mlのPBSに懸濁させた。感染の直前に1mlの細菌懸濁液を9mlの冷却した融解滋養寒天BBL中に希釈し、41°Cで保持した。マウスに50μlの容量にて約6.0対数10cfu/マウスを投与した。感染:0日目に、マウスを上記したように麻酔処理に付し、手術を伴わない気管内挿管を介する気管支内注入によりエスニュモニエN138750μlの冷却細菌懸濁液に感染させた。この方法はWooduntおよびBerryによって記載されているAntimicrobAgChemotherap43:291999。サンプル:感染の3日目に、8匹のマウス/群をCO2を過剰に摂取させて殺し、肺を摘出して1mlのPBSにホモジネートさせた。PBSの10倍連続希釈体を調製し、生存している細菌の数を数えた。サンプルを5ウマ血を補足したTSAプレート上に3通りにて播種20μlし、37°Cで一夜インキュベートし、評価した。さらに一連のマウスを7日目に殺し、上記したようにサンプリングした。結果:括弧内の数字はサンプリング時間の前に死んだ動物の数である。結論:一般に、いずれかの処理群より単離した細菌数には有意な違いはない。これは測定可能な防御が5μg/mlを含むそれまでの濃度の抗-多糖体抗体で得られなかったことを示す。これは数人のヒト臨床実験で観察されたことと類似しており、すなわち、抗-多糖体抗体はある集団におけるニュモコッカス肺炎に対する保護を付与するのに十分ではない。実施例3B-本発明の蛋白をアジュバントと共にまたは無しで能動的に投与することにより得られる肺炎からの防御、および最適下限の抗-PS抗体との相乗作用の測定方法動物:カナダ、ケベック州、セントコンスタント、CharlesRiverからの128匹の雄のCD-1マウス免疫処理の際に6週齢で、感染の際に10週齢であるであり、体重は6週で約20gであり、10週で約38gであった。免疫処理:一群16匹のマウス6群を、-22日目および-14日目に、以下に詳説する100μlのワクチンで皮下注射して免疫処理する。合計128匹のマウス。3D-MPLをRibi/Corixaから入手する。-1日目に、特定の群以下の表を参照のことを4.26μg/ml4mlの5μg/ml1.3mlの2μg/mlの濃度のマウス抗-多糖体抗体で受動的に免疫処理i.p.100μlする。感染:0日目に、マウスを上記したように麻酔処理3イソフルラン1L/分のO2に付す。エスニュモニエN1387血清型6の培養体を5ウマ血を補足したトリプチケース大豆寒天TSAプレートから収穫し、6mlのPBSに懸濁させることにより細菌接種体を調製する。感染直前に、冷却した溶融滋養寒天41°Cに保持にて10倍希釈体1ml9mlを調製する。マウスを気管内挿管を介する気管支内注入により感染させ、50μlの容量にて約6.0対数10cfu/マウスを投与する。この方法はWooduntおよびBerryによって記載されているAntimicrobAgChemotherap43:291999。サンプル:感染後72時間で、8匹のマウス/群をCO2を過剰に摂取させて殺し、肺を摘出して1mlのPBSにホモジネートさせた。PBSの10倍連続希釈体を調製し、生存している細菌の数を数えた。サンプルを5ウマ血を補足したTSAプレート上に3通りにて播種20μlし、37°Cで一夜インキュベートし、評価した。さらに一連のマウスを8日目に殺し、上記したようにサンプリングした。データ分析治療効果を比較するための指標が感染した3および7日目に肺に存在する細菌の数である。結果を平均値と標準偏差として表すことができる。統計学的分析はスチューデントt-試験P値が<0.05で有意であると考えられるを用いて行うことができる。上記したように、抗-多糖体抗体単独群1-5では肺における肺炎球菌の増殖に対する防御を付与できないことがわかる。AlPO4でアジュバント処理した肺炎球菌蛋白群1-1は保護を与えることができないが、蛋白を3D-MPLと組み合わせた場合群1-2ではその効果はよくなるであろう。最も有意な防御が抗-多糖体抗体と蛋白の両方の群で、特に3つのすべての要素、蛋白、3D-MPLおよび受動的に投与された抗-多糖体抗体を有する群群1-4で認められる。この結論はまた、死亡率でも支持され得る。群1-3、特に1-4は他の群と比べて死亡率が低いであろう。結論:受動的に免疫処理した動物を用いて実験するため、さらに蛋白/-MPLを用いて能動的に免疫処理することによる相乗作用は、多糖体抗原に対する抗体のレベルの増加によるものとすることができない。肺炎球菌肺炎に対する有意な防御が、蛋白と受動的投与した抗-多糖体抗体の両方で免疫処理した群で観察され、特に3D-MPLも存在する場合に、この組み合わせが相乗作用を示すことがわかる。抗-多糖体免疫処理を好ましくは、多糖体との接合体を用いて能動的に行うならば、この効果は、B-細胞記憶の効果として、さらに著しくなるであろうし、実験全体を通して抗-PS抗体の定常レベルが免疫反応協調に寄与するであろう。実施例4-防御の相互作用による相乗効果の測定方法人体が感染性肺炎球菌を排除するのに用いる原理機構は抗体介在のオプソニン食菌作用であるBruynら、ClinInfectDis14:2511992。防御との相関関数として莢膜多糖体に対する抗体濃度を測定するための、数種のエライザ法が開発されており、インビトロでのオプソニン食菌作用アッセイが防御とより相関していることが明らかとなったMusherら、JInfectDis182:1582000。本発明の肺炎球菌蛋白は、抗体介在のオプソニン食菌作用とは異なる機構により肺炎球菌感染に対する防御を提供する。実施例2において、接合体および蛋白の両方での能動的免疫処理が、抗体濃度が両方の群で同じであるため、その違いで説明できない、相乗効果を示し得る。すなわち、観察され得る残りの防御作用は相乗作用に由来するものでなければならない。同様に、抗体が能動的に投与されているため、実施例3において同じ結論に到達することができる。多くの場合において、本発明の肺炎球菌蛋白は表面に結合し、それ自体がオプソニン活性を提供すると考えられる。この場合、オプソニン活性の他の防御の相乗的機構に対する相対的寄与を評価するのに用いることができる、抗-肺炎球菌蛋白のオプソニン作用能を定量的に測定することで防御機構を区別することが可能である。マウス肺コロニー形成モデルにおいて、各ワクチンの相対的保護を細菌の肺からのクリアランスで評価することができる。あるいは別法として、ワクチンの効力を、ワクチンで一般に測定される、症状率から評価することもできる。防御=CFU/対照となる肺-CFU/ワクチン処理した肺/CFU/対照となる肺効力=対照となる症状-ワクチン処理した症状/対照となる症状相乗作用に由来する防御または効力の部分を測定するために、オプソニン力価の割合に基づき、効力の部分と考えられる部分を決定することが問題である。上記した実施例3において、蛋白または抗-多糖体単独ではそれ自体大きな防御を提供できないため、組み合わせたことによる防御は、蛋白/抗体成分の間の相乗作用によるものである。オプソニンの相対活性に基づいて、相乗作用の防御の量を評価することが可能である。抗-莢膜多糖体抗体により得られるオプソニン活性がXであり、抗-肺炎球菌蛋白抗体により得られるオプソニン活性がYであるとしたならば、オプソニン活性の合計はXYであることがわかり、蛋白のオプソニン活性の相対的部分はY/XYである。これをワクチンの相対的防御効力ワクチンの抗-多糖体部分がAの防御効力を提供し、ワクチンの多糖体蛋白の防御効力がBであると比較する。そして、オプソニン活性により説明することができない付加的な効力を残りの防御活性相乗作用=B-A-BY/XYとして評価する。この実施例は相乗効果を評価するための方法を限定するものではない。防御との他の相関関係が同定されれば、この相乗作用を評価するのにその相関性を用いることができる。本明細書に引用されている、特許および特許出願これらの限定されないを含め、すべての刊行物は、たとえ、個々の刊行物が、その内容を十分に開示している場合に、出典を明示することにより明細書の一部とすることを、具体的かつ個別的に意図するものであったとしても、その出典を明示することにより本明細書の一部とされる。"