"カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物であって、該粒子は、a25°Cで液相である油コア、およびbカチオン性脂質を含む、組成物。前記油コアが4°Cで液相である、請求項1に記載の組成物。前記粒子が界面活性剤をさらに含む、請求項1または2に記載の組成物。前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項3に記載の組成物。前記界面活性剤が、SPAN85ソルビタントリオレエート、Tween80ポリソルベート80、またはこれらの組合せである、請求項3または4に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.01~約2.5v/vの界面活性剤を含む、請求項3から5のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.08v/vのTween80を含む、請求項3から6のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.5v/vのTween80、および約0.5v/vのSPAN85を含む、請求項3から6のいずれか一項に記載の組成物。約0.005~約1.25v/vの界面活性剤を含む、請求項3から5のいずれか一項に記載の組成物。約0.04v/vのTween80を含む、請求項3から5および9のいずれか一項に記載の組成物。約0.25v/vのTween80、および約0.25v/vのSPAN85を含む、請求項3から5および9のいずれか一項に記載の組成物。前記界面活性剤がポリエチレングリコールPEG-脂質である、請求項3または4に記載の組成物。前記界面活性剤が、ポリエチレングリコールPEG2000PE、PEG5000PE、PEG1000DMG、PEG2000DMG、PEG3000DMG、またはこれらの組合せである、請求項12に記載の組成物。前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、請求項3から13のいずれか一項に記載の組成物。前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む、請求項3から14のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.2~約20v/vの油を含む、請求項3から15のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約4~約5v/vの油を含む、請求項3から16のいずれか一項に記載の組成物。約0.1~約10v/vの油を含む、請求項3から15のいずれか一項に記載の組成物。約2~約2.5v/vの油を含む、請求項3から16のいずれか一項に記載の組成物。前記粒子がリン脂質をさらに含む、請求項1または2に記載の組成物。前記リン脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDOPE、卵ホスファチジルコリン卵PC、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDPyPE、またはこれらの組合せである、請求項20に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml~約10mg/mlのDOPEを含む、請求項20または21に記載の組成物。約0.05mg/ml~約5mg/mlのDOPEを含む、請求項20または21に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml~約10mg/mlの卵PCを含む、請求項20または21に記載の組成物。約0.05mg/ml~約5mg/mlの卵PCを含む、請求項20または21に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml~約10mg/mlのDPyPEを含む、請求項20または21に記載の組成物。約0.05mg/ml~約5mg/mlのDPyPEを含む、請求項20または21に記載の組成物。前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、請求項20から27のいずれか一項に記載の組成物。前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む、請求項20から28のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.2~約20v/vの油を含む、請求項20から29のいずれか一項に記載の組成物。約0.1~約10v/vの油を含む、請求項20から29のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、該エマルジョンの水相中にポリマーまたは界面活性剤をさらに含む、請求項1または2に記載の組成物。前記ポリマーがポロキサマーである、請求項32に記載の組成物。前記ポリマーがPluronic登録商標F127である、請求項32または33に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1~約10v/vのポリマーを含む、請求項32から34のいずれか一項に記載の組成物。ポリマーまたは界面活性剤をさらに含む、請求項1または2に記載の組成物。前記ポリマーがポロキサマーである、請求項36に記載の組成物。前記ポリマーがPluronic登録商標F127である、請求項36または37に記載の組成物。約0.1~約10w/vポリマーを含む、請求項36から38のいずれか一項に記載の組成物。前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、請求項32から39のいずれか一項に記載の組成物。前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む、請求項32から40のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.2~約20v/vの油を含む、請求項32から41のいずれか一項に記載の組成物。約0.1~約10v/vの油を含む、請求項32から41のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性脂質が、1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンDOTAP、3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDCコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムDDA、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンDMTAP、ジパルミトイルC16:0トリメチルアンモニウムプロパンDPTAP、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパンDSTAP、および米国仮特許出願第61/284,787号に開示された脂質E0001~E0118からなる群より選択される、請求項1から43のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性脂質が、1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンDOTAP、3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDCコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムDDA、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンDMTAP、ジパルミトイルC16:0トリメチルアンモニウムプロパンDPTAP、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパンDSTAP、N-[1-2,3-ジオレイルオキシプロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリドDOTMA、N,N-ジオレオイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリドDODAC、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリンDOEPC、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパンDODAP、1,2-ジリノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパンDLinDMA、および米国仮特許出願第61/284,787号に開示された脂質E0001~E0118からなる群より選択される、請求項1から43のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDOTAPである、請求項1から45のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.8mg/ml~約3.0mg/mlのDOTAPを含む、請求項46に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.8mg/ml~約1.6mg/mlのDOTAPを含む、請求項46または47に記載の組成物。約0.4mg/ml~約1.5mg/mlのDOTAPを含む、請求項46に記載の組成物。約0.4mg/ml~約0.8mg/mlのDOTAPを含む、請求項43または44に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDCコレステロールである、請求項1から45のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.62mg/ml~約4.92mg/mlのDCコレステロールを含む、請求項51に記載の組成物。約0.31mg/ml~約2.46mg/mlのDCコレステロールを含む、請求項51に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDDAである、請求項1から45のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.73mg/ml~約1.45mg/mlのDDAを含む、請求項54に記載の組成物。約0.365mg/ml~約1.725mg/mlのDDAを含む、請求項54に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDOTMAである、請求項1から45のいずれか一項に記載の組成物。約0.4mg/ml~約0.8mg/mlのDOTMAを含む、請求項57に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDOEPCである、請求項1から45のいずれか一項に記載の組成物。約0.4mg/ml~約0.9mg/mlのDOEPCを含む、請求項59に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDODACである、請求項1から45のいずれか一項に記載の組成物。約0.365mg/ml~約0.725mg/mlのDODACを含む、請求項61に記載の組成物。約280mM~約300mMのスクロース、マンニトール、トレハロース、スクロース、ソルビトール、またはデキストロースを含む、請求項1から62のいずれか一項に記載の組成物。約280mMのスクロース、約10mMのNaCl、約1mMのクエン酸塩、および約0.5w/vのPluronicF127を含む、請求項1から63のいずれか一項に記載の組成物。前記RNA分子が、抗原をコードする自己複製RNA分子である、請求項1から64のいずれか一項に記載の組成物。前記自己複製RNAがアルファウイルス由来RNAレプリコンである、請求項65に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該カチオン性水中油型エマルジョンは、a約0.5v/vの油、およびbカチオン性脂質を含む、組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、a約0.25v/vの油、およびbカチオン性脂質を含む、組成物。前記負に荷電した分子が、抗原をコードする核酸分子である、請求項67または68に記載の組成物。前記核酸分子がRNA分子である、請求項69に記載の組成物。前記RNA分子が自己複製RNA分子である、請求項70に記載の組成物。前記自己複製RNAがアルファウイルス由来RNAレプリコンである、請求項71に記載の組成物。前記粒子が界面活性剤をさらに含む、請求項67から72のいずれか一項に記載の組成物。前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項73に記載の組成物。前記界面活性剤が、SPAN85ソルビタントリオレエート、Tween80ポリソルベート80、またはこれらの組合せである、請求項73または74に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.01~約2.5v/vの界面活性剤を含む、請求項73から75のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.08v/vのTween80を含む、請求項73から76のいずれか一項に記載の組成物。約0.005~約1.25v/vの界面活性剤を含む、請求項73から75のいずれか一項に記載の組成物。約0.04v/vのTween80を含む、請求項73から75および78のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性脂質が、1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンDOTAP、3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDCコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムDDA、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンDMTAP、ジパルミトイルC16:0トリメチルアンモニウムプロパンDPTAP、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパンDSTAP、および米国仮特許出願第61/284,787号に開示された脂質E0001~E0118からなる群より選択される、請求項67から79のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性脂質が、1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンDOTAP、3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDCコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムDDA、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンDMTAP、ジパルミトイルC16:0トリメチルアンモニウムプロパンDPTAP、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパンDSTAP、N-[1-2,3-ジオレイルオキシプロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリドDOTMA、N,N-ジオレオイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリドDODAC、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリンDOEPC、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパンDODAP、1,2-ジリノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパンDLinDMA、および米国仮特許出願第61/284,787号に開示された脂質E0001~E0118からなる群より選択される、請求項67から79のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDOTAPである、請求項67から81のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.8mg/ml~約3.0mg/mlのDOTAPを含む、請求項82に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.8mg/ml~約1.6mg/mlのDOTAPを含む、請求項82または83に記載の組成物。約0.4mg/ml~約1.5mg/mlのDOTAPを含む、請求項82に記載の組成物。約0.4mg/ml~約0.8mg/mlのDOTAPを含む、請求項82または85に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDCコレステロールである、請求項67から81のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.62mg/ml~約4.92mg/mlのDCコレステロールを含む、請求項87に記載の組成物。約0.31mg/ml~約2.46mg/mlのDCコレステロールを含む、請求項87に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDDAである、請求項67から81のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.73mg/ml~約1.45mg/mlのDDAを含む、請求項90に記載の組成物。約0.365mg/ml~約1.725mg/mlのDDAを含む、請求項90に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDOTMAである、請求項67から81のいずれか一項に記載の組成物。約0.4mg/ml~約0.8mg/mlのDOTMAを含む、請求項93に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDOEPCである、請求項67から81のいずれか一項に記載の組成物。約0.4mg/ml~約0.9mg/mlのDOEPCを含む、請求項95に記載の組成物。前記カチオン性脂質がDODACである、請求項67から81のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.365mg/ml~約0.725mg/mlのDODACを含む、請求項97に記載の組成物。前記油コアが25°Cで液相である、請求項67から98のいずれか一項に記載の組成物。前記油コアが4°Cで液相である、請求項67から99のいずれか一項に記載の組成物。前記油が、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、鉱油、またはこれらの組合せである、請求項67から100のいずれか一項に記載の組成物。前記油が、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、またはこれらの組合せである、請求項67から101のいずれか一項に記載の組成物。約280mM~約300mMのスクロース、マンニトール、トレハロース、スクロース、ソルビトール、またはデキストロースを含む、請求項67から102のいずれか一項に記載の組成物。約280mMのスクロース、約10mMのNaCl、約1mMのクエン酸塩、および約0.5w/vのPluronicF127を含む、請求項67から103のいずれか一項に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、a油コア、bカチオン性脂質、およびcリン脂質を含む、組成物。前記リン脂質が1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDPyPEである、請求項105に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml~約10mg/mlのDPyPEを含む、請求項106に記載の組成物。約0.05mg/ml~約5mg/mlのDPyPEを含む、請求項106に記載の組成物。前記リン脂質が卵PCである、請求項105に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml~約10mg/mlの卵PCを含む、請求項109に記載の組成物。約0.05mg/ml~約5mg/mlの卵PCを含む、請求項109に記載の組成物。前記リン脂質がDOPEである、請求項105に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml~約10mg/mlのDOPEを含む、請求項112に記載の組成物。約0.05mg/ml~約5mg/mlのDOPEを含む、請求項112に記載の組成物。前記負に荷電した分子が、抗原をコードする核酸分子である、請求項105から114のいずれか一項に記載の組成物。前記核酸分子がRNA分子である、請求項115に記載の組成物。前記RNA分子が自己複製RNA分子である、請求項116に記載の組成物。前記自己複製RNAがアルファウイルス由来RNAレプリコンである、請求項117に記載の組成物。前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、請求項105から118のいずれか一項に記載の組成物。前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、またはスクアレンを含む、請求項105から119のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.2~約20v/vの油を含む、請求項105から120のいずれか一項に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約4~約5v/vの油を含む、請求項105から121のいずれか一項に記載の組成物。約0.1~約10v/vの油を含む、請求項105から120のいずれか一項に記載の組成物。約2~約2.5v/vの油を含む、請求項105から120および123のいずれか一項に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、a油コア、およびbDOTAPを含み、該水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml~約3.0mg/mlのDOTAPを含む、組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.8mg/mlのDOTAPを含む、請求項125に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約1.2mg/mlのDOTAPを含む、請求項125に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約1.4mg/mlのDOTAPを含む、請求項125に記載の組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約1.6mg/mlのDOTAPを含む、請求項125に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、a油コア、およびbDOTAPを含み、該組成物は、約0.4mg/ml~約1.5mg/mlのDOTAPを含む、組成物。約0.4mg/mlのDOTAPを含む、請求項130に記載の組成物。約0.6mg/mlのDOTAPを含む、請求項130に記載の組成物。約0.7mg/mlのDOTAPを含む、請求項130に記載の組成物。約0.8mg/mlのDOTAPを含む、請求項130に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、a油コア、およびbDCコレステロールを含み、該水中油型エマルジョンは、約2.46mg/ml~約4.92mg/mlのDCコレステロールを含む、組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約2.46mg/mlのDCコレステロールを含む、請求項135に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、a油コア、およびbDCコレステロールを含み、該組成物は、約1.23mg/ml~約2.46mg/mlのDCコレステロールを含む、組成物。約1.23mg/mlのDCコレステロールを含む、請求項135に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、a油コア、およびbDDAを含み、該水中油型エマルジョンは、約0.73mg/ml~約1.45mg/mlのDDAを含む、組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約1.45mg/mlのDDAを含む、請求項139に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、a油コア、およびbDDAを含み、該組成物は、約0.365mg/ml~約0.725mg/mlのDDAを含む、組成物。約0.725mg/mlのDDAを含む、請求項139に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、a油コア、およびbDOTMAを含み、該組成物は、約0.4mg/ml~約0.8mg/mlのDOTMAを含む、組成物。約0.675mg/mlのDOTMAを含む、請求項143に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、a油コア、およびbDOEPCを含み、該組成物は、約0.4mg/ml~約0.9mg/mlのDOEPCを含む、組成物。約0.85mg/mlのDOEPCを含む、請求項145に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、a油コア、およびbDODACを含み、該組成物は、約0.365mg/ml~約0.725mg/mlのDODACを含む、組成物。約0.585mg/mlのDODACを含む、請求項106に記載の組成物。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法であって、A.カチオン性水中油型エマルジョンを調製するステップであって、該エマルジョンは、1約0.2~約20v/vの油、2約0.01~約2.5v/vの界面活性剤、ならびに3カチオン性脂質であって、i.約0.8mg/ml~約1.6mg/mlのDOTAP、ii.約2.46mg/ml~約4.92mg/mlのDCコレステロール、iii.約0.73mg/ml~約1.45mg/mlのDDA、iv.約0.8mg/ml~約1.6mg/mlのDOTMA、v.約0.8mg/ml~約1.8mg/mlのDOEPC、およびvi.約0.73mg/ml~約1.45mg/mlのDODACからなる群より選択される、カチオン性脂質を含む、ステップと、B.該負に荷電した分子が該エマルジョンの該粒子と複合体を形成するように、該負に荷電した分子を該カチオン性水中油型エマルジョンに添加するステップとを含む、方法。前記負に荷電した分子が、抗原をコードする核酸分子である、請求項149に記載の方法。前記核酸分子がRNA分子である、請求項150に記載の方法。前記RNA分子が自己複製RNA分子である、請求項151に記載の方法。RNA-カチオン性粒子複合体のRNA分子が、複合体を形成していないRNA分子と比較した場合に、RNase分解に対してより耐性である、請求項151または152に記載の方法。ステップBが、1前記RNA分子およびPluronic登録商標F127を含む溶液を調製することと、2該RNA/Pluronic登録商標F127溶液を前記水中油型エマルジョンに添加することとを含む、請求項151から153のいずれか一項に記載の方法。前記カチオン性水中油型エマルジョンが、1前記油および前記カチオン性脂質を合わせることによって、該エマルジョンの油相を形成するステップと、2該エマルジョンの水相を提供するステップと、3均質化によって該水相中に該油相を分散させるステップとを含むプロセスによって調製される、請求項149から154に記載の方法。前記油相および前記水相が合わされる前に、該油相にジクロロメタンDCMを添加するステップをさらに含む、請求項155に記載の方法。DCM中に前記カチオン性脂質を溶解させるステップをさらに含む、請求項155または156に記載の方法。均質化の前にDCMを蒸発させるステップをさらに含む、請求項156または157に記載の方法。均質化の後にDCMを蒸発させるステップをさらに含む、請求項156または157に記載の方法。ステップAが、1前記カチオン性脂質を適当な溶媒と混合することによって、リポソーム懸濁物を形成することと、2該リポソーム懸濁物を、前記油、前記界面活性剤、および水性溶液と混合することによって、水中油型エマルジョンを形成することとを含む、請求項149から155のいずれか一項に記載の方法。ステップBが、iRNA分子を含む水性溶液を提供することと、ii前記カチオン性水中油型エマルジョンおよび該RNA溶液を合わせて、前記組成物を調製することとを含む、請求項149から160のいずれか一項に記載の方法。前記カチオン性水中油型エマルジョンおよび前記RNA溶液が、約1:1v/vの比で合わされる、請求項161に記載の方法。前記RNA分子を含む前記水性溶液が塩を含む、請求項161または162に記載の方法。前記塩がNaClである、請求項163に記載の方法。前記水性溶液が約20mMのNaClを含む、請求項164に記載の方法。前記RNA分子を含む前記水性溶液がバッファーである、請求項161から165のいずれか一項に記載の方法。前記バッファーがクエン酸バッファーである、請求項166に記載の方法。前記バッファーが約2mMのクエン酸塩を含む、請求項167に記載の方法。前記RNA分子を含む前記水性溶液が重量オスモル濃度調整剤を含む、請求項161から168のいずれか一項に記載の方法。前記重量オスモル濃度調整剤が、スクロース、トレハロース、ソルビトール、またはデキストロースから選択される、請求項169に記載の方法。前記重量オスモル濃度調整剤がスクロースである、請求項170に記載の方法。前記水性溶液が約560mMのスクロースを含む、請求項171に記載の方法。前記RNA分子を含む前記水性溶液がポリマーを含む、請求項161から172のいずれか一項に記載の方法。前記ポリマーがPluronic登録商標F127である、請求項173に記載の方法。前記水性溶液が、約0.05~約20w/vのポリマーを含む、請求項173または174に記載の方法。前記水性溶液が、約1w/vのPluronic登録商標F127を含む、請求項173から175のいずれか一項に記載の方法。請求項149から176のいずれか一項に記載の方法によって調製される組成物。前記カチオン性水中油型エマルジョンの前記粒子の平均直径が200nm以下である、請求項1から148および177のいずれか一項に記載の組成物。前記エマルジョン粒子の平均直径が約80nm~約180nmであり、前記エマルジョンのN/P比が少なくとも4:1である、請求項1から104のいずれか一項に記載の組成物。前記負に荷電した分子がRNA分子であり、前記エマルジョン粒子の平均直径が約80nm~約180nmであり、前記エマルジョンのN/P比が少なくとも4:1である、請求項105から148のいずれか一項に記載の組成物。請求項179または180に記載の組成物であって、該組成物が、緩衝化されており、かつ約6.0~約8.0のpHを有する、組成物。前記pHが約6.2~約6.8である、請求項181に記載の組成物。請求項179から182のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が無機塩をさらに含み、無機塩の濃度が30mM以下である、組成物。請求項179から183のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が、非イオン性等張化剤をさらに含み、かつ等張性である、組成物。被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、免疫応答を必要とする被験体に、請求項1から148および177から184のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。したがって、核酸分子または他の負に荷電した分子の送達システムを提供する必要がある。送達システムは、核酸ベースのワクチン、特に、RNAベースのワクチンに有用である。本発明は、一般に、RNA分子などの負に荷電した分子を細胞に送達するのに使用することができるカチオン性水中油型エマルジョンに関する。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、核酸分子抗原をコードするRNA分子などを細胞に送達すること、および核酸ベースのワクチンを処方することに特に適している。一態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したcomplexRNA分子を含む組成物であって、粒子が、a25°Cで液相である油コア、およびbカチオン性脂質を含む、組成物を提供する。カチオン性水中油型エマルジョン粒子は、ナノ脂質ペプチド粒子NLPPではないことが好ましい。油コアは、4°Cで液相であることが好ましい。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、エマルジョンは、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、エマルジョンは、エマルジョンを等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤tonicifyingagentをさらに含む。ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤をさらに含む。例示的な非イオン性界面活性剤には、例えば、SPAN85ソルビタントリオレエート、Tween80ポリソルベート80;ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、またはこれらの組合せが含まれる。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.01~約2.5v/vの界面活性剤を含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.08v/vのTween80、または代わりに、約0.5v/vのTween80、および約0.5v/vのSPAN85を含むことができる。ポリエチレングリコールPEGまたはPEG-脂質、例えば、PEG2000PE、PEG5000PE、PEG1000DMG、PEG2000DMG、PEG3000DMG、またはこれらの組合せなども使用することができる。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物は、約0.005~約1.25v/vの界面活性剤を含むことができる。例えば、RNA-エマルジョン複合体を含む組成物は、約0.04v/vのTween80ポリソルベート80;ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、または代わりに、約0.25v/vのTween80、および約0.25v/vのSPAN85ソルビタントリオレエートを含むことができる。ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、リン脂質をさらに含む。例示的なリン脂質には、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDOPE、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDPyPE、または卵ホスファチジルコリン卵PCが含まれる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約20mg/ml好ましくは、約0.1mg/ml~約10mg/mlのDOPE、または代わりに、約0.1mg/ml~約20mg/ml好ましくは、約0.1mg/ml~約10mg/mlのDPyPE、または代わりに、約0.1mg/ml~約20mg/ml好ましくは、約0.1mg/ml~約10mg/mlの卵PCを含むことができる。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物は、約0.05mg/ml~約10mg/ml好ましくは、約0.05mg/ml~約5mg/mlのDOPE、または代わりに、約0.05mg/ml~約10mg/ml好ましくは、約0.05mg/ml~約5mg/mlのDPyPE、または代わりに、約0.05mg/ml~約10mg/ml好ましくは、約0.05mg/ml~約5mg/mlの卵PCを含むことができる。ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、エマルジョンの水相中でポリマーまたは界面活性剤をさらに含む。例示的なポリマーには、Pluronic登録商標F127エチレンオキシド/プロピレンオキシドブロックコポリマー:HOCH2CH2xOCH3CHCH3yOCH2CH2zOHなどのポロキサマーが含まれる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.05~約20w/vのポリマー、または約0.1~約10w/vのポリマー、例えば、0.5w/vまたは1w/vのPluronic登録商標F127などを含むことができる。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物は、約0.025~約10v/vのポリマー、または約0.5~約5v/vのポリマー、例えば、0.25w/v、または0.5w/vのPluronic登録商標F127などを含むことができる。エマルジョンは、粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、負に荷電した分子RNA分子などの適切な脱複合体形成decomplexation/放出を促進し、負に荷電した分子の安定性を増大させ例えば、RNA分子の分解を防止し、またはエマルジョン粒子の凝集を防止することができる成分を含むことができる。ある特定の実施形態では、油コアは、以下、すなわち、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、鉱油、またはこれらの組合せから選択される油を含むことができる。油は、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、またはこれらの組合せであることが好ましい。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.2~約20v/vの油、好ましくは、約0.08~約5の油、約0.08の油、約4~約5の油、約4の油、約4.3の油、または約5の油を含むことができる。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物は、約0.1~約10v/vの油、好ましくは、約2~約2.5v/vの油を含むことができる。ある特定の実施形態では、カチオン性脂質は、以下のうちの1つから選択される:1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンDOTAP、3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDCコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムDDA、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンDMTAP、ジパルミトイルC16:0トリメチルアンモニウムプロパンDPTAP、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパンDSTAP、WO2011/076807参照により本明細書に組み込まれているの表6112~139頁に開示されている脂質E0001~E0118もしくはE0119~E0180、またはこれらの組合せ。特に好適なカチオン性脂質として、DOTAP、DCコレステロール、およびDDAが挙げられる。ある特定の実施形態では、カチオン性脂質は、以下のうちの1つから選択される:1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンDOTAP、3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDCコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムDDA、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンDMTAP、ジパルミトイルC16:0トリメチルアンモニウムプロパンDPTAP、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパンDSTAP、WO2011/076807参照により本明細書に組み込まれているの表6112~139頁に開示されている脂質E0001~E0118もしくはE0119~E0180、N-[1-2,3-ジオレイルオキシプロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリドDOTMA、N,N-ジオレオイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリドDODAC、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリンDOEPC、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパンDODAP、1,2-ジリノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパンDLinDMA、またはこれらの組合せ。特に好適なカチオン性脂質として、DOTAP、DCコレステロール、DDA、DOTMA、DOEPC、DSTAP、DODAC、DODAP、およびDLinDMAが挙げられる。ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml~約3mg/ml、好ましくは、約0.8mg/ml~約1.6mg/mlのDOTAPを含む。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物は、約0.4mg/ml~約1.5mg/ml、好ましくは、約0.4mg/ml~約0.8mg/mlのDOTAPを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.62mg/ml~約4.92mg/mlのDCコレステロールを含む。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物は、約0.31mg/ml~約2.46mg/mlのDCコレステロールを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.73mg/ml~約1.45mg/mlのDDAを含む。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物は、約0.365mg/ml~約0.725mg/mlのDDAを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml~約3mg/ml、好ましくは、約0.8mg/ml~約1.6mg/mlのDOTMAを含む。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物は、約0.4mg/ml~約1.5mg/ml、好ましくは、約0.4mg/ml~約0.8mg/mlのDOTMAを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml~約3mg/ml、好ましくは、約0.8mg/ml~約1.8mg/mlのDOEPCを含む。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物は、約0.4mg/ml~約1.5mg/ml、好ましくは、約0.4mg/ml~約0.9mg/mlのDOEPCを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.73mg/ml~約1.45mg/mlのDODACを含む。カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物は、約0.365mg/ml~約0.725mg/mlのDODACを含むことができる。任意選択により、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。一例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、カチオン性水中油型エマルジョンが、a約0.5v/vの油、およびbカチオン性脂質を含む、組成物を提供する。一例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、a約0.25v/vの油、およびbカチオン性脂質を含む、組成物を提供する。別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、a油コア、bカチオン性脂質、およびcリン脂質を含む、組成物を提供する。好適なリン脂質には、例えば、DPyPE、DOPE、および卵PCが含まれる。好ましくは、組成物負に荷電した分子-エマルジョン複合体は、約0.05mg/ml~約10mg/mlより好ましくは、約0.05mg/ml~約5mg/mlのDOPE、または代わりに、約0.05mg/ml~約10mg/mlより好ましくは、約0.05mg/ml~約5mg/mlのDPyPE、または代わりに、約0.05mg/ml~約10mg/mlより好ましくは、約0.05mg/ml~約5mg/mlの卵PCを含む。別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、a油コア、およびbDOTAPを含み、水中油型エマルジョンが、約0.8mg/ml~約3.0mg/mlのDOTAP、好ましくは、約0.8mg/ml~約1.6mg/mlのDOTAPを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はRNAであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、a油コア、およびbDOTAPを含み、組成物が、約0.4mg/ml~約1.5mg/ml、例えば、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/mlなどのDOTAPを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はRNAであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、a油コア、およびbDCコレステロールを含み、水中油型エマルジョンが、約2.46mg/ml~約4.92mg/mlのDCコレステロールを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はRNAであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、a油コア、およびbDCコレステロールを含み、組成物が、約1.23mg/ml~約2.46mg/ml、例えば、1.23mg/mlなどのDCコレステロールを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はRNAであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、a油コア、およびbDDAを含み、水中油型エマルジョンが、約0.73mg/ml~約1.45mg/mlのDDAを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はRNAであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、a油コア、およびbDDAを含み、組成物が、約0.365mg/ml~約0.725mg/ml、例えば、0.725mg/mLなどのDDAを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はRNAであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、a油コア、およびbDOTMAを含み、組成物が、約0.4mg/ml~約1.5mg/ml、好ましくは、約0.4mg/ml~約0.8mg/mlのDOTMAを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はRNAであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、a油コア、およびbDOEPCを含み、組成物が、約0.4mg/ml~約1.5mg/ml、好ましくは、約0.4mg/ml~約0.9mg/mlのDOEPCを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はRNAであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。別の例では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、粒子が、a油コア、およびbDODACを含み、組成物が、約0.365mg/ml~約0.725mg/mlのDODACを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はRNAであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。負に荷電した分子の例には、負に荷電したペプチドを含有する抗原、1つまたは複数のペプチド含有抗原をコードする核酸分子例えば、RNAまたはDNA、負に荷電した小分子、および負に荷電した免疫学的アジュバントが含まれる。負に荷電した免疫学的アジュバントには、例えば、免疫賦活性オリゴヌクレオチド例えば、CpGオリゴヌクレオチド、一本鎖RNA、小分子免疫増強因子SMIPなどが含まれる。負に荷電した小分子には、例えば、ホスホネート、フルオロホスホネートなどが含まれる。ある特定の実施形態では、負に荷電した分子は、抗原をコードする、RNA分子などの核酸分子である。ある特定の実施形態では、RNA分子は、アルファウイルス由来RNAレプリコンなどの自己複製RNA分子である。別の態様では、本発明は、油コア好ましくは、25°Cで液相であるおよびカチオン性脂質を含有するエマルジョン粒子、ならびにエマルジョン粒子と複合体を形成する核酸分子を含み、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm~約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンを提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、自己複製RNAなどのRNAである。好ましくは、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンは、緩衝化されており例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで、約6.0~約8.0、好ましくは、約6.2~約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩例えば、NaClを含有する。好ましくは、免疫原性カチオン性水中油型エマルジョンは、エマルジョンを等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法であって、Aカチオン性水中油型エマルジョンを調製するステップであって、エマルジョンは、1約0.2~約20v/vの油、2約0.01~約2.5v/vの界面活性剤、ならびに3i約0.8mg/ml~約1.6mg/mlのDOTAP、ii約2.46mg/ml~約4.92mg/mlのDCコレステロール、およびiii約0.73mg/ml~約1.45mg/mlのDDAからなる群より選択されるカチオン性脂質を含む、ステップと、B負に荷電した分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、負に荷電した分子をカチオン性水中油型エマルジョンに添加するステップとを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法であって、Aカチオン性水中油型エマルジョンを調製するステップであって、エマルジョンは、1約0.2~約20v/vの油、2約0.01~約2.5v/vの界面活性剤、ならびに3i約0.8mg/ml~約1.6mg/mlのDOTAP、ii約2.46mg/ml~約4.92mg/mlのDCコレステロール、iii約0.73mg/ml~約1.45mg/mlのDDA、iv約0.8mg/ml~約1.6mg/mlのDOTMA、v約0.8mg/ml~約1.8mg/mlのDOEPC、およびvi約0.73mg/ml~約1.45mg/mlのDODACからなる群より選択されるカチオン性脂質を含む、ステップと、B負に荷電した分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、負に荷電した分子をカチオン性水中油型エマルジョンに添加するステップとを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、1油およびカチオン性脂質を合わせることによって、エマルジョンの油相を形成するステップと、2エマルジョンの水相すなわち、連続相を提供するステップと、3均質化によって水相中に油相を分散させるステップとを含むプロセスによって調製される。カチオン性脂質は、油中に直接溶解させることができる。あるいは、カチオン性脂質は、任意の適当な溶媒、例えば、クロロホルムCHCl3またはジクロロメタンDCMなどの中に溶解させることができる。イソプロピルアルコールも使用することができる。溶媒は、油相が水相に添加される前、または油相が水相に添加された後であるが、均質化の前に蒸発させることができる。あるいは、脂質の溶解度が問題となり得る事例では、依然として油相において溶媒例えば、DCMを用いて一次エマルジョンを作製することができる。この場合では、溶媒は、第2の均質化の前にエマルジョンから直接蒸発させられる。粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、負に荷電した分子の安定性を増大させ例えば、RNA分子の分解を防止し、負に荷電した分子RNA分子などの適切な脱複合体形成/放出を促進し、またはエマルジョン粒子の凝集を防止するための追加の任意選択のステップを含めることができる。例えば、ポリマー例えば、Pluronic登録商標F127または界面活性剤を、エマルジョンの水相に添加することができる。例示的な一実施形態では、Pluronic登録商標F127は、エマルジョン粒子との複合体形成の前に、RNA分子に添加される。Pluronic登録商標F127を添加すると、RNA分子の安定性を増大させ、RNA分解をさらに低減することができる。ポロキサマーポリマーも、RNA分子の放出を促し、エマルジョン粒子の凝集を防止することができる。最後に、ポロキサマーポリマーは、免疫調節効果も有する。例えば、Westerinkら、Vaccine、2001年12月12日;20巻5~6号:711~23頁を参照。好ましくは、RNA-カチオン性粒子複合体のRNA分子は、複合体を形成していないRNA分子と比較した場合、RNase分解に対してより耐性である。別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含み、1つまたは複数の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、または賦形剤をさらに含むことができる医薬組成物を提供する。好適な実施形態では、医薬組成物はワクチンである。別の態様では、本発明は、被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書に記載される組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。本発明はまた、療法において使用するための本明細書に記載される医薬組成物、および免疫応答を強化するか、または生じさせるための薬剤を製造するための、本明細書に記載される医薬組成物の使用に関する。1.概要本発明は、一般に、RNA分子などの負に荷電した分子を細胞に送達するのに使用することができるカチオン性水中油型エマルジョンに関する。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、例えば、静電気力および疎水性/親水性相互作用を通じて、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、RNA分子例えば、タンパク質またはペプチドをコードするRNA、低分子干渉RNA、自己複製RNAなどなどの核酸分子を、invivoで細胞に送達するのに特に適している。本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンを、負に荷電した分子を細胞に送達するのに使用することができるという発見に基づく。エマルジョン粒子は、油コア、および負に荷電した分子と相互作用することができるカチオン性脂質を含む。好適な実施形態では、RNA分子は、例えば、静電気力および疎水性/親水性相互作用を通じて、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成する。複合体を形成したRNA分子は、遊離RNAと比べて、安定化され、RNase媒介分解から保護され、細胞によってより効率的に取り込まれる。さらに、RNAが、RNAワクチンとの関連などで、コードされるタンパク質の発現を誘導するために送達される場合、コードされるタンパク質の免疫原性は、エマルジョンのアジュバント効果により増強され得る。したがって、負に荷電した分子例えば、抗原をコードするRNA分子のより効率的な送達に加えて、カチオン性エマルジョンは、アジュバント活性を通じて免疫応答を増強することもできる。例えば、本明細書に記載および例示されるように、本発明者らは、RSウイルスRSV免疫化のマウスモデルおよびコットンラットモデルを使用して、一連のカチオン性水中油型エマルジョンのinvivo効果を評価した。結果は、RNA分子がカチオン性エマルジョンと複合体を形成した処方物が、遊離RNA処方物と比較した場合、著しく高い免疫応答を生じることを実証する。いくつかの場合では、カチオン性水中油型エマルジョンと複合体を形成したRNA1μgを投与した後に得られた、RNAでコードされるタンパク質に対する平均抗体力価は、10倍多い遊離RNA10μgの用量の遊離RNAを使用して得られる力価と同等であった。宿主におけるより高い免疫応答に加えて、本明細書に記載される処方物の別の利点は、遊離未処方RNAと比較した場合、異なる試験間および異なる宿主動物間で、宿主動物における免疫応答の変動がより少ないことである。したがって、一態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物であって、粒子が、a25°Cで液相である油コア、およびbカチオン性脂質を含む、組成物を提供する。カチオン性水中油型エマルジョン粒子は、ナノ脂質ペプチド粒子NLPPではないことが好ましい。油コアは、4°Cで液相であることが好ましい。カチオン性エマルジョン粒子は、界面活性剤例えば、Tween80ポリソルベート80;ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、SPAN85ソルビタントリオレエート、もしくはこれらの組合せ、リン脂質、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。エマルジョンは、エマルジョンの水相連続相中にポリマー例えば、Pluronic登録商標F127を含むこともできる。別の態様では、本発明は、負に荷電した分子を送達するのに使用することができるカチオン性水中油型エマルジョンのいくつかの特定の処方物も提供する。別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法を提供する。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンを生成するための一例示的な手法は、均質化によって水相中に油相を分散させることによるものである。粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、負に荷電した分子の安定性を増大させ例えば、RNA分子の分解を防止し、負に荷電した分子RNA分子などの適切な脱複合体形成/放出を促進し、またはエマルジョン粒子の凝集を防止するための追加の任意選択のステップとして、例えば、油相中にジクロロメタンDCMもしくは塩化メチレンを添加し、均質化の前もしくは後にDCMを蒸発させること;カチオン性脂質を適当な溶媒と混合することによって、リポソーム懸濁物を形成すること;またはエマルジョンの水相に、ポリマー例えば、Pluronic登録商標F127もしくは界面活性剤を添加することが挙げられる。あるいは、カチオン性脂質を、油中に直接溶解させることができる。本発明のカチオン性エマルジョンは、核酸例えば、RNAなどの負に荷電した分子を送達するのに使用することができる。組成物は、それを必要とする被験体に投与することによって、免疫応答を生じさせるか、または強化することができる。組成物は、誘導される免疫応答の有効性を増強するために、別の免疫原性分子、免疫原性組成物、またはワクチンとともに共送達co-deliverすることもできる。2.定義本明細書において、単数形のaanおよびtheは、内容が明らかに別段の指示をしていない限り、複数形への参照を含む。用語約は、本明細書において使用される場合、値の/-10を指す。用語界面活性剤は、専門用語であり、一般に、エネルギー的に水による溶媒和を選り好む親水性基例えば、極性基、および水によってあまり溶媒和にならない疎水性基の両方を有する任意の分子を指す。用語非イオン性界面活性剤は、当技術分野で公知の用語であり、一般に、親水性基例えば、極性基が静電気的に荷電していない界面活性剤分子を指す。用語ポリマーは、一緒に結合されている個々の化学物質部分同じであっても異なっていてもよいからなる分子を指す。本明細書において、用語ポリマーは、末端間で結合されて直鎖状分子を形成している個々の化学物質部分、ならびに分岐例えば、マルチアームまたは星形構造の形態で一緒に結合された個々の化学物質部分を指す。例示的なポリマーには、例えば、ポロキサマーが含まれる。ポロキサマーは、ポリオキシエチレンポリエチレンオキシドの2本の親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレンポリプロピレンオキシドの中心の疎水性鎖を有する非イオン性トリブロックコポリマーである。バッファーは、溶液のpHの変化に抵抗する水性溶液を指す。本明細書において、ヌクレオチド類似体または修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシドの窒素塩基例えば、シトシンC、チミンTもしくはウラシルU、アデニンA、またはグアニンGにおいて、またはこの窒素塩基上に1つまたは複数の化学修飾例えば、置換を含有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオシドの糖部分例えば、リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、6員糖類似体、もしくは開鎖糖類似体において、もしくはこの糖部分上、またはホスフェートにおいて、もしくはホスフェート上にさらなる化学修飾を含有することができる。本明細書において、サッカリドは、直鎖形態もしくは環形態での単糖、オリゴ糖、もしくは多糖、または糖鎖を形成するこれらの組合せを包含する。オリゴ糖は、2個以上の単糖残基を有するサッカリドである。サッカリドの例には、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、スクロース、およびトレハロースが含まれる。用語自己複製RNA、RNAレプリコンまたはRNAベクターは、専門用語であり、一般に、invivoで、一般的に標的細胞内で、それ自体の増幅または自己複製を指示することができるRNA分子を指す。RNAレプリコンは、細胞内へのDNAの導入、および転写が起こる核への輸送の必要性を伴うことなく、直接使用される。宿主細胞の細胞質内に直接送達するのにRNAベクターを使用することによって、異種核酸配列の自律複製および翻訳が効率的に起こる。アルファウイルス由来自己複製RNAは、連続した順序で以下のエレメントを含有することができる:複製のためにシスで必要とされる5’ウイルス配列バックグラウンドでは5’CSEとも呼ばれる、発現されると、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質例えば、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4をコードする配列、複製のためにシスで必要とされる3’ウイルス配列バックグラウンドでは3’CSEとも呼ばれる、およびポリアデニレートトラクトpolyadenylatetract。アルファウイルス由来自己複製RNAは、ウイルスサブゲノムのジャンクション領域プロモーター、1つまたは複数の構造タンパク質遺伝子に由来する配列またはこれらの部分、組換えアルファウイルス粒子の産生を可能にするのに十分なサイズの外来性核酸分子複数可、ならびに発現される異種配列複数可も含有することができる。用語アジュバントは、それだけに限らないが、抗原に対する免疫応答を増大させ、かつ/または多様化させる免疫学的アジュバントを含めて、医薬品の作用を補助または改変する任意の物質を指す。したがって、免疫学的アジュバントは、抗原に対する免疫応答を強化することができる化合物を含む。免疫学的アジュバントは、体液性免疫および/または細胞性免疫を強化することができる。先天性免疫応答を刺激する物質は、本明細書の免疫学的アジュバントの定義内に含まれる。免疫学的アジュバントは、免疫強化物質と呼ばれる場合もある。本明細書において、抗原または免疫原は、免疫応答を誘発する1つまたは複数のエピトープ例えば、直鎖状、コンフォメーション、または両方を含有する分子を指す。本明細書において、エピトープは、その免疫学的特異性を決定する所与の種例えば、抗原分子または抗原複合体の一部である。エピトープは、抗原の本定義の範囲内である。用語抗原または免疫原は、本明細書において、サブユニット抗原、すなわち、抗原が自然において会合している生物体全体から分離され、別々になっている抗原を含む。抗イディオタイプ抗体などの抗体、またはこれらの断片、抗原もしくは抗原決定基を模倣することができる合成ペプチドミモトープも本明細書において、抗原の定義に取り込まれる。免疫応答immunologicalresponseまたは免疫応答immuneresponseは、抗原または免疫学的アジュバントに対する体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答の被験体における発生である。免疫応答には、先天性免疫応答および適応免疫応答が含まれる。先天性免疫応答は、免疫系の防御の第一線をもたらす即効性の応答である。対照的に、適応免疫は、所与の病原体または障害例えば、腫瘍に由来する抗原を認識する体細胞性再構成受容体遺伝子例えば、T細胞受容体およびB細胞受容体を有する免疫細胞の選択およびクローン性増殖を使用し、それによって、特異性および免疫記憶がもたらされる。先天性免疫応答は、その多くの作用の中でも、炎症性サイトカインの急速なバースト、ならびにマクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞APCの活性化をもたらす。病原体を自己成分と区別するために、先天性免疫系は、病原体関連分子パターン、またはPAMPとして公知の病原体からのシグネチャーsignatureを検出する様々な相対的に不変の受容体を使用する。微生物成分を実験的なワクチンに添加すると、堅調で耐久性のある適応免疫応答が発生することが公知である。免疫応答のこの増強作用の背後の機構は、パターン認識受容体PRRを伴うことが報告されており、PRRは、好中球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、B細胞を含めた様々な免疫細胞、ならびに上皮細胞および内皮細胞などのいくつかの非免疫細胞上で異なって発現される。PRRの関与engagementは、これらの細胞の一部の活性化、ならびにこれらのサイトカインおよびケモカインの分泌、ならびに他の細胞の成熟および遊走をもたらす。相前後して、これは、適応免疫応答を確立する炎症性環境を作り出す。PRRには、非食作用受容体、例えば、トル様受容体TLR、およびヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメインNODタンパク質など、ならびに食作用を誘導する受容体、例えば、スカベンジャー受容体、マンノース受容体、およびβ-グルカン受容体などが含まれる。報告されたTLR本発明の様々な実施形態おいて免疫原性分子として使用することができる、いくつかの報告されたリガンドの例とともにとして、とりわけ、以下のものが挙げられる:TLRlMycobacteria、Neisseria由来の細菌リポタンパク質、TLR2ザイモサン酵母粒子、ペプチドグリカン、リポタンパク質、リポペプチド、糖脂質、リポ多糖、TLR3ウイルス二本鎖RNA、ポリ:IC、TLR4細菌リポ多糖、植物生成物タキソール、TLR5細菌性フラジェリン、TLR6酵母ザイモサン粒子、リポテイコ酸lipotechoicacid、マイコプラズマ由来のリポペプチド、TLR7一本鎖RNA、イミキモド、レシミキモドresimiquimod、ならびにロキソリビンおよびブロピリミンなどの他の合成化合物、TLR8一本鎖RNA、レシミキモド、およびTLR9CpGオリゴヌクレオチド。樹状細胞は、ナイーブCD4ヘルパーTTH細胞のプライミングを開始し、CD8T細胞のキラー細胞への分化を誘導するための最も重要な細胞型の一部として認識される。TLRシグナル伝達は、例えば、観察される特定の型のTH応答例えば、TH1応答対TH2応答を決定するTLRシグナルの性質とともに、これらのヘルパーT細胞応答の質の決定において重要な役割を果たすことが報告されている。抗体体液および細胞性免疫の組合せが、THI型応答の一部として生成され、一方、TH2型応答は、大部分は抗体応答である。CpGDNATLR9、およびイミダゾキノリンTLR7、TLR8などの様々なTLRリガンドが、invitroで免疫細胞からのサイトカイン産生を刺激することが立証されている。イミダゾキノリンは、TLRアゴニストであることが示された最初の小さな薬物様化合物である。さらなる情報については、例えば、A.Pashine、N.M.Valiante、およびJ.B.Ulmer、NatureMedicine11巻、S63~S68頁2005年、K.S.RosenthalおよびD.H.Zimmerman、ClinicalandVaccineImmunology、13巻8号、821~829頁2006年、ならびにこれらに引用された参考文献を参照。本発明の目的に関して、体液性免疫応答は、抗体分子によって媒介される免疫応答を指し、一方、細胞性免疫応答は、Tリンパ球および/または他の白血球によって媒介されるものである。細胞性免疫の重要な一様相は、細胞溶解性T細胞CTLによる抗原特異的応答を伴う。CTLは、主要組織適合複合体MHCによってコードされ、細胞の表面上で発現されるタンパク質に会合して提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。CTLは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導し、促すのを助ける。細胞性免疫の別の様相は、ヘルパーT細胞による抗原特異的応答を伴う。ヘルパーT細胞は、その表面上でMHC分子と会合したペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的効果細胞の機能を刺激することを助けるように作用し、この細胞の活性に集中する。細胞性免疫応答は、活性化T細胞および/または他の白血球CD4T細胞およびCD8T細胞に由来するものを含むによって産生されるサイトカイン、ケモカイン、および他のこのような分子の産生も指す。したがって、細胞性免疫応答を誘発する免疫原性組成物などの組成物またはワクチンは、細胞表面のMHC分子との会合における抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作させるように機能することができる。細胞媒介免疫応答は、その表面で抗原を提示する細胞に、またはこの細胞付近に向けられる。さらに、抗原特異的Tリンパ球を生成することによって、免疫化された宿主の将来の保護を可能にすることができる。特定の抗原または組成物の細胞媒介免疫応答を刺激する能力は、当技術分野で公知のいくつかのアッセイによって、例えば、リンパ球増殖リンパ球活性化アッセイ、CTL細胞傷害性細胞アッセイ、感作された被験体における抗原に特異的なTリンパ球についてのアッセイ、または抗原での再刺激に応答したT細胞によるサイトカイン産生の測定などによって判定することができる。このようなアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、Ericksonら1993年J.Immunol、151巻:4189~4199頁;Doeら1994年Eur.J.Immunol、24巻:2369~2376頁を参照。したがって、免疫応答は、本明細書において、CTLの産生および/またはヘルパーT細胞の産生もしくは活性化を刺激するものである場合がある。目的の抗原は、抗体媒介免疫応答も誘発することができる。したがって、免疫応答として、例えば、とりわけ、以下の作用のうちの1つまたは複数を挙げることができる:例えば、B細胞による抗体の産生、ならびに/または目的の組成物もしくはワクチン中に存在する1つまたは複数の抗原に特異的に向けられるサプレッサーT細胞および/もしくはγδT細胞の活性化。これらの応答は、例えば、感染力を中和するように、かつ/または抗体-補体もしくは抗体依存性細胞毒性ADCCを媒介して、免疫化された宿主に対して保護をもたらすように、機能することができる。このような応答は、当技術分野で周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを使用して判定することができる。本発明による組成物は、異なる組成物中の等価な量の抗原例えば、抗原が可溶性タンパク質として投与されるに誘発される免疫応答より、免疫応答を誘発する能力が大きい場合、所与の抗原について免疫原性の増強を示す。したがって、例えば、組成物がより強い免疫応答を生じさせることによって、または抗原が投与される被験体において免疫応答を達成するのにより低い用量もしくはより少ない投与の抗原で済むことによって、組成物は、免疫原性の増強を示すことができる。このような免疫原性の増強は、例えば、動物に本発明の組成物および抗原対照を投与し、この2つのアッセイ結果を比較することによって判定することができる。3.カチオン性水中油型エマルジョン本明細書に開示されるカチオン性水中油型エマルジョンは、一般に、エマルジョンを調製するのに使用される成分の濃度によって、当技術分野で慣例的な様式で記述される。滅菌および他の下流プロセスを含めたエマルジョンを生成するプロセスの間に、少量の油例えば、スクアレン、カチオン性脂質例えば、DOTAP、または他の成分が失われる場合があり、最終生成物例えば、投与の準備ができているパッケージング、滅菌されたエマルジョン中のこれらの成分の実際の濃度は、場合により、出発量よりわずかに低い場合があることが最大約10または最大約20、当技術分野において理解されている。本発明は一般に、RNA分子などの負に荷電した分子を送達するのに使用することができるカチオン性水中油型エマルジョンに関する。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、例えば、静電気力、および疎水性/親水性相互作用を通じて負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、負に荷電した分子、例えば、抗原をコードするRNA分子、または低分子干渉RNAなどを、invivoで細胞に送達するのに特に適している。例えば、本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、ワクチンとして、自己複製RNAを含めた抗原をコードするRNAを送達することについて利点をもたらす。水中油型エマルジョンの粒子は、油の中心コアを有するミセルに類似する。油コアは、カチオン性脂質でコーティングされており、カチオン性脂質は、ミセル様液滴として水性連続相中に油滴を分散させる。以下に記載される界面活性剤および/またはリン脂質などの1つまたは複数の任意選択の成分が、エマルジョン中に存在することができる。例えば、1つまたは複数の界面活性剤を、粒子形成を促し、かつ/またはエマルジョン粒子を安定化させるのに使用することができる。その場合、油コアは、カチオン性脂質ならびに界面活性剤複数可でコーティングされることによって、ミセル様液滴を形成する。同様に、1つまたは複数の脂質例えば、中性脂質、グリコール脂質、またはリン脂質も、このような脂質が油滴を分散させるための乳化剤として使用される場合、エマルジョン粒子の表面上に存在することができる。水中油型エマルジョンの粒子は、1マイクロメートル以下の平均直径すなわち、数平均直径を有する。カチオン性エマルジョンの平均粒子サイズすなわち、数平均直径は、約900nm以下、約800nm以下、約700nm以下、約600nm以下、約500nm以下、約400nm以下、300nm以下、または200nm以下、例えば、約1nm~約1μm、約1nm~約900nm、約1nm~約800nm、約1nm~約700nm、約1nm~約600nm、約1nm~約500nm、約1nm~約400nm、約1nm~約300nm、約1nm~約200nm、約1nm~約175nm、約1nm~約150nm、約1nm~約125nm、約1nm~約100nm、約1nm~約75nm、または約1nm~約50nmであることが特に望ましい。カチオン性エマルジョンの平均粒子直径は、約180nm以下、約170nm以下、約160nm以下、約150nm以下、約140nm以下、約130nm以下、約120nm以下、約110nm以下、または約100nm以下、例えば、約80nm~180nm、約80nm~170nm、約80nm~160nm、約80nm~150nm、約80nm~140nm、約80nm~130nm、約80nm~120nm、約80nm~110nm、または約80nm~100nmであることが特に望ましい。特に好適な平均粒子直径は、約100nmである。エマルジョン粒子のサイズは、油に対する界面活性剤の比比を高くすると、液滴サイズが減少する、均質化の運転圧均質化の運転圧を上昇させると、一般的に、液滴サイズが低減する、温度温度を上昇させると、液滴サイズが減少するを変化させることによって、油のタイプ、および以下に詳細に記載される他のプロセスパラメータを変化させることによって、変更することができる。水相中にある特定のタイプのバッファーを含めると、粒子サイズに影響する場合もある。いくつかの場合では、RNAワクチンとの関連で、エマルジョン粒子のサイズが、RNA-エマルジョン複合体の免疫原性に影響する場合がある。したがって、エマルジョンの平均粒子サイズの好適な範囲は、直径で、約80nm~約180nmであるべきである。本明細書に記載されるエマルジョン粒子は、負に荷電した分子と複合体を形成することができる。負に荷電した分子との複合体形成の前に、粒子の全正味電荷一般的にゼータ電位として測定されるは、正カチオン性であるべきである。粒子の全正味電荷は、エマルジョン中のカチオン性脂質のタイプおよびカチオン性脂質の量、エマルジョン中の油の量例えば、油の百分率が高いと、一般的に、粒子の表面上の電荷が減少するに応じて変化する場合があり、エマルジョン中に存在する任意の追加の成分例えば、界面活性剤複数可および/またはリン脂質複数可によっても影響され得る。例示的な実施形態では、複合体形成前の粒子のゼータ電位は、一般的に、10mV超である。複合体形成前の粒子のゼータ電位は、約50mV以下、約45mV以下、約40mV以下、約35mV以下、約30mV以下、約25mV以下、約20mV以下;約5mV~約50mV、約10mV~約50mV、約10mV~約45mV、約10mV~約40mV、約10mV~約35mV、約10mV~約30mV、約10mV~約25mV、または約10mV~約20mVであることが好ましい。ゼータ電位は、iエマルジョンのpH、iiエマルジョンの伝導率例えば、塩分、およびiiiエマルジョンの様々な成分ポリマー、非イオン性界面活性剤などの濃度によって影響され得る。CNEのゼータ電位は、MalvernNanoseriesZetasizerWestborough、MAを使用して測定される。試料は、水中で1:100に希釈され粘度:0.8872cp、RI:1.330、誘電率:78.5、ポリスチレンラテックスキャピラリーセルMalvern、Westborough、MAに添加される。ゼータ電位は、2分の平衡時間とともに25°Cで測定され、SmoluchowskiモデルFKa値=1.5を使用して分析される。データは、mVで報告される。本発明の例示的なカチオン性エマルジョンは、CNE17である。CNE17の油コアは、スクアレン4.3w/vであり、カチオン性脂質は、DOTAP1.4mg/mLである。CNE17は、界面活性剤のSPAN850.5v/vのソルビタントリオレエートおよびTween800.5v/vのポリソルベート80;ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートも含む。したがって、CNE17の粒子は、SPAN85、Tween80、およびDOTAPでコーティングされたスクアレンのコアを含む。RNA分子は、4:1のN/P比および10:1のN/P比で効率的にCNE17粒子と複合体を形成することが示された。他の例示的なカチオン性エマルジョンとして、例えば、CNE050.5w/vのスクアレン、0.08のTween80、および1.2mg/mLのDOTAP、CNE124.3のスクアレン、0.5のSPAN85、0.5のTween80、および2.46mg/mLのDCコレステロール、CNE134.3のスクアレン、0.5のSPAN85、0.5のTween80、および1.45mg/mLのDDA、ならびに本明細書に記載される他のエマルジョンが挙げられる。本発明の水中油型エマルジョンの個々の成分は、当技術分野で公知であるが、このような組成物が、本明細書に記載される様式で組み合わされたことはない。したがって、個々の成分は、好適な実施形態のために一般に、および少し詳しくの両方で以下に記載されているが、当技術分野で周知であり、本明細書で使用される用語、例えば、油コア、界面活性剤、リン脂質などは、さらなる説明なしで、十分に当業者に周知である。さらに、エマルジョンの個々の成分の量の好適な範囲が提供されているが、特定のエマルジョンの成分の実際の比は、所望のサイズおよび物理的特性のエマルジョン粒子が適切に形成され得るように調整される必要がある場合がある。例えば、特定の量の油が使用される場合例えば、5v/vの油、界面活性剤の量は、安定なエマルジョンを形成するように水相中に油滴を分散させるのに十分なレベルであるべきである。水相中に油滴を分散させるのに必要とされる界面活性剤の実際の量は、エマルジョンに使用される界面活性剤のタイプおよび油コアのタイプに依存し、油の量も、液滴サイズによって変化する場合があるこれが、2つの相の間の表面積を変化させるので。所望のエマルジョンの成分の実際の量および相対的な比率は、当業者によって容易に決定することができる。A.油コアカチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、油コアを含む。好ましくは、油は、代謝可能な無毒性の油であり、より好ましくは、それだけに限らないが、アルカン、アルケン、アルキン、ならびにこれらの対応する酸およびアルコール、これらのエーテルおよびエステル、ならびにこれらの混合物を含めた、約6~約30炭素原子のうちの1つである。油は、エマルジョンが投与されることになる被験体の体によって代謝され得、被験体に毒性ではない任意の植物油、魚油、動物油、または合成的に調製された油とすることができる。被験体は、動物、一般的に、哺乳動物、好ましくは、ヒトとすることができる。ある特定の実施形態では、油コアは、25°Cで液相である。油コアは、25°Cで貯蔵されるとき、流体の特性を示す場合固体および気体から区別され、明確な容積を有するが、明確な形状を有さない場合、25°Cで液相である。しかし、エマルジョンは、任意の適当な温度で貯蔵および使用することができる。油コアは、4°Cで液相であることが好ましい。油は、任意の長鎖のアルカン、アルケン、もしくはアルキン、または遊離酸、その塩もしくはエステルとしてのこれらの酸誘導体もしくはアルコール誘導体、例えば、トリグリセリド、および1,2-プロパンジオールまたは同様のポリヒドロキシアルコールのエステルなどのモノエステル、またはジエステル、またはトリエステルなどとすることができる。アルコールは、一官能性酸または多官能性酸、例えば、酢酸、プロパン酸、クエン酸などを使用してアシル化することができる。油であり、本明細書に示される他の基準を満たす長鎖アルコールに由来するエーテルも使用することができる。個々のアルカン、アルケン、またはアルキンの部分、およびその酸誘導体またはアルコール誘導体は、一般に、約6~約30炭素原子を有することになる。この部分は、直鎖または分岐鎖の構造を有することができる。これは、完全に飽和していても、1つまたは複数の二重結合または三重結合を有していてもよい。モノエステルもしくはポリエステル、またはモノエーテルもしくはポリエーテルに基づく油が使用される場合、約6~約30炭素の制限は、個々の脂肪酸または脂肪アルコール部分に適用し、合計炭素数に適用しない。油は、エマルジョンが投与される宿主によって代謝され得ることが特に望ましい。動物、魚、または植物の供給源からの任意の適当な油を使用することができる。植物油の供給源には、堅果、種子、および穀類が含まれ、適当な油には、ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油などが含まれる。他の適当な種子油として、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀類の群では、トウモロコシ油、および他の穀物、例えば、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなどの油も使用することができる。植物油を得るための技術は、十分に開発されており、周知である。これらの油および他の同様の油の組成は、例えば、メルクインデックス、および食品原料、栄養食品技術sourcematerialsonfoods、nutritionandfoodtechnologyに見出すことができる。グリセロールと1,2-プロパンジオールの約6~約10炭素の脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製することができる。これらの製品は、PVOInternational、Inc.、ChemicalSpecialtiesDivision、416DivisionStreet、Boongon、N.J.からNEOBEESの名称で、およびその他で市販されている。動物油および動物性脂肪は、トリグリセリドとして存在し、魚または植物に由来する油より高い程度の飽和度を有するという事実のために、生理的温度で固相であることが多い。しかし、脂肪酸は、部分的または完全にトリグリセリドをけん化することによって動物性脂肪から得られ、このけん化は、遊離脂肪酸をもたらす。哺乳動物乳に由来する脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るのに必要な分離、精製、けん化、および他の手段の手順は、当技術分野で周知である。ほとんどの魚は、容易に収集することができる代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書で使用することができる魚油のいくつかを例示する。いくつかの分岐鎖油は、5炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般に、テルペノイドと呼ばれる。スクアレン2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエンは、分岐、不飽和のテルペノイドであり、本明細書で特に好適である。スクアレンの主要な供給源はサメ肝油であるが、アマランサス種子、米糠、コムギ胚芽、およびオリーブ油を含めた植物性油plantoil主に植物油vegetableoilも適当な供給源である。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好適である。スクアレンおよびスクアランを含めた魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であり、または当技術分野で公知の方法によって得ることができる。ある特定の実施形態では、油コアは、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む。例示的な実施形態では、油コアは、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、またはこれらの組合せを含む。スクアランも、油として使用することができる。例示的な実施形態では、油コアは、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む。エマルジョンの油成分は、約0.2~約20v/vの量で存在することができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.2~約20v/vの油、約0.2~約15v/vの油、約0.2~約10v/vの油、約0.2~約9v/vの油、約0.2~約8v/vの油、約0.2~約7v/vの油、約0.2~約6v/vの油、約0.2~約5v/vの油、約0.2~約4.3v/vの油、約0.3~約20v/vの油、約0.4~約20v/vの油、約0.5~約20v/vの油、約1~約20v/vの油、約2~約20v/vの油、約3~約20v/vの油、約4~約20v/vの油、約4.3~約20v/vの油、約5~約20v/vの油、約0.5v/vの油、約1v/vの油、約1.5v/vの油、約2v/vの油、約2.5v/vの油、約3v/vの油、約3.5v/vの油、約4v/vの油、約4.3v/vの油、約5v/vの油、または約10v/vの油を含むことができる。あるいは、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.2~約10w/vの油、約0.2~約9w/vの油、約0.2~約8w/vの油、約0.2~約7w/vの油、約0.2~約6w/vの油、約0.2~約5w/vの油、約0.2~約4.3w/vの油、または約4.3w/vの油を含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5v/vの油を含む。別の例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約4.3v/vの油を含む。別の例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約5v/v油を含む。別の例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約4.3w/vのスクアレンを含む。上記に言及したように、上述した油の百分率は、エマルジョンを調製するのに使用される油の最初の量に基づいて決定される。最終生成物例えば、投与の準備ができているパッケージング、滅菌されたエマルジョン中の油の実際の濃度は、場合により、わずかに低い場合があることが最大約10または最大約20、当技術分野において理解されている。B.カチオン性脂質本明細書に記載されるエマルジョン粒子は、カチオン性脂質を含み、これは、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。任意の適当なカチオン性脂質を使用することができる。一般に、カチオン性脂質は、生理的条件下で正に荷電した窒素原子を含有する。適当なカチオン性脂質として、塩化ベンザルコニウムBAK、塩化ベンゼトニウム、セトリマイドこれは、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ならびに場合により少量のドデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する、塩化セチルピリジニウムCPC、セチルトリメチルアンモニウムクロリドCTAC、1級アミン、2級アミン、それだけに限らないが、N,N’,N’-ポリオキシエチレン10-N-タロウ-1,3-ジアミノプロパンを含めた3級アミン、他の4級アミン塩、例えば、それだけに限らないが、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチル-アンモニウムブロミド、混合アルキル-トリメチル-アンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシル-アンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドDDAB、メチルベンゼトニウムクロリド、塩化デカメトニウム、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、N,N-ジメチル-N-[22-メチル-4-1,1,3,3テトラメチルブチル-フェノキシ]-エトキシエチル]-ベンゼンメタ-ナミニウムbenzenemetha-naminiumクロリドDEBDA、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、[1-2,3-ジオレイルオキシ-プロピル]-N,N,N,トリメチルアンモニウムクロリド、1,2-ジアシル-3-トリメチルアンモニオプロパンアシル基=ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル、1,2-ジアシル-3ジメチルアンモニオプロパンアシル基=ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル、1,2-ジオレオイル-3-4’-トリメチル-アンモニオブタノイル-sn-グリセロール、1,2-ジオレオイル3-スクシニル-sn-グリセロールコリンエステル、コレステリル4’-トリメチルアンモニオブタノエート、N-アルキルピリジニウム塩例えば、臭化セチルピリジニウムおよび塩化セチルピリジニウム、N-アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラフォームbolaform電解質C12Me6;C12Bu6、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リゾレシチン、L-αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミコハク酸コリンエステル、リポポリアミン、例えば、それだけに限らないが、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミンDOGS、ジパルミトイルホスファチジルエタノール-アミドスペルミンDPPES、リポポリ-LまたはD-リシンLPLL、LPDL、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートされたポリLまたはD-リシン、ペンダントアミノ基を有するグルタミン酸ジドデシルエステルC12GluPhCnN、ペンダントアミノ基を有するグルタミン酸ジテトラデシルエステルC14GluCnN、コレステロールのカチオン性誘導体、例えば、それだけに限らないが、コレステリル-3β-オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル-3β-オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル-3β-カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル-3β-カルボキシアミドエチレンジメチルアミン、および3γ-[N-N’,N-ジメチルアミノエタンカルボモイル]コレステロールDC-コレステロール、1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンDOTAP、ジメチルジオクタデシルアンモニウムDDA、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンDMTAP、ジパルミトイルC16:0トリメチルアンモニウムプロパンDPTAP、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパンDSTAP、ならびにこれらの組合せが挙げられる。本発明で使用するのに適した他のカチオン性脂質には、例えば、米国特許公開第2008/0085870号2008年4月10日公開および同第2008/0057080号2008年3月6日公開に記載されたカチオン性脂質が含まれる。本発明で使用するのに適した他のカチオン性脂質には、例えば、WO2011/076807の表6112~139頁に開示された脂質E0001~E0118またはE0119~E0180が含まれるWO2011/076807は、これらのカチオン性脂質を作製する方法、および使用する方法も開示している。追加の適当なカチオン性脂質には、N-[1-2,3-ジオレイルオキシプロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリドDOTMA、N,N-ジオレオイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリドDODAC、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリンDOEPC、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパンDODAP、1,2-ジリノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパンDLinDMAが含まれる。エマルジョンは、本明細書に記載されるカチオン性脂質の2つ以上の任意の組合せを含むことができる。好適な実施形態では、カチオン性脂質は、1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンDOTAP、3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDCコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムDDA、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンDMTAP、ジパルミトイルC16:0トリメチルアンモニウムプロパンDPTAP、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパンDSTAP、WO2011/076807の表6112~139頁に開示されている脂質E0001~E0118もしくはE0119~E0180、およびこれらの組合せからなる群より選択される。他の好適な実施形態では、カチオン性脂質は、1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンDOTAP、3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDCコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムDDA、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンDMTAP、ジパルミトイルC16:0トリメチルアンモニウムプロパンDPTAP、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパンDSTAP、N-[1-2,3-ジオレイルオキシプロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリドDOTMA、N,N-ジオレオイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリドDODAC、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリンDOEPC、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパンDODAP、1,2-ジリノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパンDLinDMA、WO2011/076807の表6112~139頁に開示されている脂質E0001~E0118もしくはE0119~E0180、およびこれらの組合せからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はDOTAPである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/mlのDOTAPを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/ml、約0.6mg/ml~約25mg/ml、約0.7mg/ml~約25mg/ml、約0.8mg/ml~約25mg/ml、約0.9mg/ml~約25mg/ml、約1.0mg/ml~約25mg/ml、約1.1mg/ml~約25mg/ml、約1.2mg/ml~約25mg/ml、約1.3mg/ml~約25mg/ml、約1.4mg/ml~約25mg/ml、約1.5mg/ml~約25mg/ml、約1.6mg/ml~約25mg/ml、約1.7mg/ml~約25mg/ml、約0.5mg/ml~約24mg/ml、約0.5mg/ml~約22mg/ml、約0.5mg/ml~約20mg/ml、約0.5mg/ml~約18mg/ml、約0.5mg/ml~約15mg/ml、約0.5mg/ml~約12mg/ml、約0.5mg/ml~約10mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約2mg/ml、約0.5mg/ml~約1.9mg/ml、約0.5mg/ml~約1.8mg/ml、約0.5mg/ml~約1.7mg/ml、約0.5mg/ml~約1.6mg/ml、約0.6mg/ml~約1.6mg/ml、約0.7mg/ml~約1.6mg/ml、約0.8mg/ml~約1.6mg/ml、約0.8mg/ml~約3.0mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml、約1.0mg/ml、約1.1mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約12mg/ml、約18mg/ml、約20mg/ml、約21.8mg/ml、約24mg/mlなどでDOTAPを含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml~約1.6mg/ml、例えば、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、または1.6mg/mlなどのDOTAPを含む。ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はDCコレステロールである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約5mg/mlのDCコレステロールでDCコレステロールを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約5mg/ml、約0.2mg/ml~約5mg/ml、約0.3mg/ml~約5mg/ml、約0.4mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.62mg/ml~約5mg/ml、約1mg/ml~約5mg/ml、約1.5mg/ml~約5mg/ml、約2mg/ml~約5mg/ml、約2.46mg/ml~約5mg/ml、約3mg/ml~約5mg/ml、約3.5mg/ml~約5mg/ml、約4mg/ml~約5mg/ml、約4.5mg/ml~約5mg/ml、約0.1mg/ml~約4.92mg/ml、約0.1mg/ml~約4.5mg/ml、約0.1mg/ml~約4mg/ml、約0.1mg/ml~約3.5mg/ml、約0.1mg/ml~約3mg/ml、約0.1mg/ml~約2.46mg/ml、約0.1mg/ml~約2mg/ml、約0.1mg/ml~約1.5mg/ml、約0.1mg/ml~約1mg/ml、約0.1mg/ml~約0.62mg/ml、約0.15mg/ml、約0.3mg/ml、約0.6mg/ml、約0.62mg/ml、約0.9mg/ml、約1.2mg/ml、約2.46mg/ml、約4.92mg/mlなどのDCコレステロールを含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.62mg/ml~約4.92mg/ml、例えば、2.46mg/mlなどのDCコレステロールを含む。ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はDDAである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約5mg/mlのDDAを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約5mg/ml、約0.1mg/ml~約4.5mg/ml、約0.1mg/ml~約4mg/ml、約0.1mg/ml~約3.5mg/ml、約0.1mg/ml~約3mg/ml、約0.1mg/ml~約2.5mg/ml、約0.1mg/ml~約2mg/ml、約0.1mg/ml~約1.5mg/ml、約0.1mg/ml~約1.45mg/ml、約0.2mg/ml~約5mg/ml、約0.3mg/ml~約5mg/ml、約0.4mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.6mg/ml~約5mg/ml、約0.73mg/ml~約5mg/ml、約0.8mg/ml~約5mg/ml、約0.9mg/ml~約5mg/ml、約1.0mg/ml~約5mg/ml、約1.2mg/ml~約5mg/ml、約1.45mg/ml~約5mg/ml、約2mg/ml~約5mg/ml、約2.5mg/ml~約5mg/ml、約3mg/ml~約5mg/ml、約3.5mg/ml~約5mg/ml、約4mg/ml~約5mg/ml、約4.5mg/ml~約5mg/ml、約1.2mg/ml、約1.45mg/mlなどでDDAを含むことができる。あるいは、カチオン性水中油型エマルジョンは、約20mg/ml、約21mg/ml、約21.5mg/ml、約21.6mg/ml、約25mg/mlでDDAを含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.73mg/ml~約1.45mg/ml、例えば、1.45mg/mlなどのDDAを含む。ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はDOTMAである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/mlのDOTMAを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/ml、約0.6mg/ml~約25mg/ml、約0.7mg/ml~約25mg/ml、約0.8mg/ml~約25mg/ml、約0.9mg/ml~約25mg/ml、約1.0mg/ml~約25mg/ml、約1.1mg/ml~約25mg/ml、約1.2mg/ml~約25mg/ml、約1.3mg/ml~約25mg/ml、約1.4mg/ml~約25mg/ml、約1.5mg/ml~約25mg/ml、約1.6mg/ml~約25mg/ml、約1.7mg/ml~約25mg/ml、約0.5mg/ml~約24mg/ml、約0.5mg/ml~約22mg/ml、約0.5mg/ml~約20mg/ml、約0.5mg/ml~約18mg/ml、約0.5mg/ml~約15mg/ml、約0.5mg/ml~約12mg/ml、約0.5mg/ml~約10mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約2mg/ml、約0.5mg/ml~約1.9mg/ml、約0.5mg/ml~約1.8mg/ml、約0.5mg/ml~約1.7mg/ml、約0.5mg/ml~約1.6mg/ml、約0.6mg/ml~約1.6mg/ml、約0.7mg/ml~約1.6mg/ml、約0.8mg/ml~約1.6mg/ml、約0.8mg/ml~約3.0mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml、約1.0mg/ml、約1.1mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.35mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約12mg/ml、約18mg/ml、約20mg/ml、約22.5mg/ml、約25mg/mlなどでDOTMAを含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml~約1.6mg/ml、例えば、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、または1.6mg/mlなどのDOTMAを含む。ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はDOEPCである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/mlのDOEPCを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/ml、約0.6mg/ml~約25mg/ml、約0.7mg/ml~約25mg/ml、約0.8mg/ml~約25mg/ml、約0.9mg/ml~約25mg/ml、約1.0mg/ml~約25mg/ml、約1.1mg/ml~約25mg/ml、約1.2mg/ml~約25mg/ml、約1.3mg/ml~約25mg/ml、約1.4mg/ml~約25mg/ml、約1.5mg/ml~約25mg/ml、約1.6mg/ml~約25mg/ml、約1.7mg/ml~約25mg/ml、約0.5mg/ml~約24mg/ml、約0.5mg/ml~約22mg/ml、約0.5mg/ml~約20mg/ml、約0.5mg/ml~約18mg/ml、約0.5mg/ml~約15mg/ml、約0.5mg/ml~約12mg/ml、約0.5mg/ml~約10mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約4mg/ml、約0.5mg/ml~約3mg/ml、約0.5mg/ml~約2mg/ml、約0.5mg/ml~約1.9mg/ml、約0.5mg/ml~約1.8mg/ml、約0.5mg/ml~約1.7mg/ml、約0.5mg/ml~約1.6mg/ml、約0.6mg/ml~約1.7mg/ml、約0.7mg/ml~約1.7mg/ml、約0.8mg/ml~約1.7mg/ml、約0.8mg/ml~約3.0mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml、約1.0mg/ml、約1.1mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約1.7mg/ml、約1.8mg/ml、約1.9mg/ml、約2.0mg/ml、約12mg/ml、約18mg/ml、約20mg/ml、約22.5mg/ml、約25mg/mlなどでDOEPCを含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml~約1.8mg/ml、例えば、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、または1.8mg/mlなどのDOEPCを含む。ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はDSTAPである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約50mg/mlのDSTAPを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/ml、約0.6mg/ml~約25mg/ml、約0.7mg/ml~約25mg/ml、約0.8mg/ml~約25mg/ml、約0.9mg/ml~約25mg/ml、約1.0mg/ml~約25mg/ml、約1.1mg/ml~約25mg/ml、約1.2mg/ml~約25mg/ml、約1.3mg/ml~約25mg/ml、約1.4mg/ml~約25mg/ml、約1.5mg/ml~約25mg/ml、約1.6mg/ml~約25mg/ml、約1.7mg/ml~約25mg/ml、約0.5mg/ml~約24mg/ml、約0.5mg/ml~約22mg/ml、約0.5mg/ml~約20mg/ml、約0.5mg/ml~約18mg/ml、約0.5mg/ml~約15mg/ml、約0.5mg/ml~約12mg/ml、約0.5mg/ml~約10mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約4mg/ml、約0.5mg/ml~約3mg/ml、約0.5mg/ml~約2mg/ml、約0.5mg/ml~約1.9mg/ml、約0.5mg/ml~約1.8mg/ml、約0.5mg/ml~約1.7mg/ml、約0.5mg/ml~約1.6mg/ml、約0.6mg/ml~約1.7mg/ml、約0.7mg/ml~約1.7mg/ml、約0.8mg/ml~約1.7mg/ml、約0.8mg/ml~約3.0mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml、約1.0mg/ml、約1.1mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約1.7mg/ml、約1.8mg/ml、約1.9mg/ml、約2.0mg/ml、約12mg/ml、約18mg/ml、約20mg/ml、約22.5mg/ml、約25mg/mlなどでDSTAPを含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml~約1.6mg/ml、例えば、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、または1.6mg/mlなどのDSTAPを含む。ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はDODACである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約50mg/mlのDODACを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/ml、約0.6mg/ml~約25mg/ml、約0.7mg/ml~約25mg/ml、約0.8mg/ml~約25mg/ml、約0.9mg/ml~約25mg/ml、約1.0mg/ml~約25mg/ml、約1.1mg/ml~約25mg/ml、約1.2mg/ml~約25mg/ml、約1.3mg/ml~約25mg/ml、約1.4mg/ml~約25mg/ml、約1.5mg/ml~約25mg/ml、約1.6mg/ml~約25mg/ml、約1.7mg/ml~約25mg/ml、約0.5mg/ml~約24mg/ml、約0.5mg/ml~約22mg/ml、約0.5mg/ml~約20mg/ml、約0.5mg/ml~約18mg/ml、約0.5mg/ml~約15mg/ml、約0.5mg/ml~約12mg/ml、約0.5mg/ml~約10mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約4mg/ml、約0.5mg/ml~約3mg/ml、約0.5mg/ml~約2mg/ml、約0.5mg/ml~約1.9mg/ml、約0.5mg/ml~約1.8mg/ml、約0.5mg/ml~約1.7mg/ml、約0.5mg/ml~約1.6mg/ml、約0.6mg/ml~約1.7mg/ml、約0.7mg/ml~約1.7mg/ml、約0.8mg/ml~約1.7mg/ml、約0.8mg/ml~約3.0mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml、約1.0mg/ml、約1.1mg/ml、約1.15mg/ml、約1.16mg/ml、約1.17mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約1.7mg/ml、約1.8mg/ml、約1.9mg/ml、約2.0mg/ml、約12mg/ml、約18mg/ml、約20mg/ml、約22.5mg/ml、約25mg/mlなどでDODACを含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、0.73mg/ml~約1.45mg/ml、例えば、1.45mg/mlなどのDODACを含む。ある特定の実施形態では、カチオン性脂質はDODAPである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約50mg/mlのDODAPを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/ml、約0.6mg/ml~約25mg/ml、約0.7mg/ml~約25mg/ml、約0.8mg/ml~約25mg/ml、約0.9mg/ml~約25mg/ml、約1.0mg/ml~約25mg/ml、約1.1mg/ml~約25mg/ml、約1.2mg/ml~約25mg/ml、約1.3mg/ml~約25mg/ml、約1.4mg/ml~約25mg/ml、約1.5mg/ml~約25mg/ml、約1.6mg/ml~約25mg/ml、約1.7mg/ml~約25mg/ml、約0.5mg/ml~約24mg/ml、約0.5mg/ml~約22mg/ml、約0.5mg/ml~約20mg/ml、約0.5mg/ml~約18mg/ml、約0.5mg/ml~約15mg/ml、約0.5mg/ml~約12mg/ml、約0.5mg/ml~約10mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約4mg/ml、約0.5mg/ml~約3mg/ml、約0.5mg/ml~約2mg/ml、約0.5mg/ml~約1.9mg/ml、約0.5mg/ml~約1.8mg/ml、約0.5mg/ml~約1.7mg/ml、約0.5mg/ml~約1.6mg/ml、約0.6mg/ml~約1.7mg/ml、約0.7mg/ml~約1.7mg/ml、約0.8mg/ml~約1.7mg/ml、約0.8mg/ml~約3.0mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml、約1.0mg/ml、約1.1mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約1.7mg/ml、約1.8mg/ml、約1.9mg/ml、約2.0mg/ml、約12mg/ml、約18mg/ml、約20mg/ml、約22.5mg/ml、約25mg/mlなどでDODAPを含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml~約1.6mg/ml、例えば、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、または1.6mg/mlなどのDODAPを含む。いくつかの場合では、油コアにおいて可溶性であるカチオン性脂質を使用することが望ましい場合がある。例えば、DOTAP、DOEPC、DODAC、およびDOTMAは、スクアレンまたはスクアラン中に可溶性である。他の場合では、油コアにおいて可溶性ではないカチオン性脂質を使用することが望ましい場合がある。例えば、DDAおよびDSTAPは、スクアレン中に可溶性ではない。特定の脂質が油において可溶性であるか不溶性であるかを判定し、それに応じて適切な油と脂質の組合せを選ぶことは、当技術分野の知識の範囲内である。例えば、溶解度は、脂質および油の構造に基づいて予想することができる例えば、脂質の溶解度は、そのテールの構造によって決定され得る。例えば、1つまたは2つの不飽和脂肪酸鎖例えば、オレオイルテールを有する脂質、例えば、DOTAP、DOEPC、DODAC、DOTMAなどは、スクアレンまたはスクアランにおいて可溶性であり、一方、飽和脂肪酸鎖例えば、ステアロイルテールを有する脂質は、スクアレンにおいて可溶性ではない。あるいは、溶解度は、所与の量の油中に溶解して飽和溶液を形成する脂質の量によって求めることができる。上記に言及したように、上述した脂質の濃度は、エマルジョンを調製するのに使用される脂質の最初の量に基づいて求められる。最終生成物例えば、投与の準備ができているパッケージング、滅菌されたエマルジョン中の油の実際の濃度は、場合により、わずかに低い場合があることが最大約20、当技術分野において理解されている。C.追加の成分本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンは、追加の成分をさらに含むことができる。例えば、エマルジョンは、粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、または負に荷電した分子の安定性を増大させる例えば、RNA分子の分解を防止することができる成分を含むことができる。界面活性剤ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、界面活性剤をさらに含む。相当な数の界面活性剤が医薬品科学において使用されている。これらには、天然に由来する材料、例えば、樹木からのゴム、植物タンパク質、アルギネートおよびセルロースなどの糖ベースのポリマーなどが含まれる。炭素主鎖上にヒドロキシドまたは他の親水性置換基を有するある特定のオキシポリマーまたはポリマー、例えば、ポビドン、ポリビニルアルコール、およびグリコールエーテルベースの一官能性化合物および多官能性化合物は、界面活性剤活性を有する。長鎖脂肪酸由来化合物は、本発明で使用することができる乳化剤および懸濁剤の第3の実質的な群を形成する。適当な界面活性剤の具体例として、以下のものが挙げられる:1.高級脂肪酸C10~C22のナトリウム、カリウム、アンモニウム、およびアルカノール-アンモニウムの塩などの水溶性石けん、特に、ナトリウムタロウおよびカリウムタロウならびにココナツ石けん。2.その分子構造内に約8~22個の炭素原子を含有するアルキルラジカル、ならびにスルホン酸ラジカルおよび硫酸エステルラジカルからなる群より選択されるラジカルを有する有機硫酸反応生成物の水溶性塩によって代表され得るアニオン性合成非石けん界面活性剤。これらの例は、タロウまたはヤシ油に由来するナトリウムまたはカリウムアルキルスルフェート;ナトリウムまたはカリウムアルキルベンゼンスルホネート;ナトリウムアルキルグリセリルエーテルスルホネート;ナトリウムヤシ油脂肪酸モノグリセリドスルホネートおよびスルフェート;高級脂肪アルコール1モルとエチレンオキシド約1~6モルとの反応生成物の硫酸エステルのナトリウムまたはカリウム塩;1分子当たり1~10単位のエチレンオキシドを有し、アルキルラジカルが8~12個の炭素原子を含有するナトリウムまたはカリウムアルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホネート;イセチオン酸でエステル化され、水酸化ナトリウムで中和された脂肪酸の反応生成物;メチルタウリドmethyltaurideの脂肪酸アミドのナトリウムまたはカリウム塩;ならびにSO3-スルホン化されたC10~C24α-オレフィンのナトリウムまたはカリウム塩である。3.アルキレンオキシド基を有機疎水性化合物と縮合することによって作製される非イオン性合成界面活性剤。一般的な疎水性基には、プロピレンオキシドのプロピレングリコールとの縮合生成物、アルキルフェノール、プロピレンオキシドとエチレンジアミンの縮合生成物、8~22個の炭素原子を有する脂肪族アルコール、および脂肪酸のアミドが含まれる。4.半極性特性を有する非イオン性界面活性剤、例えば、アミンオキシド、ホスフィンオキシド、およびスルホキシドなど。長鎖3級アミンオキシドの具体例には、ジメチルドデシルアミンオキシド、およびビス-2-ヒドロキシエチルドデシルアミンが含まれる。ホスフィンオキシドの具体例は、1967年2月14日に発行された米国特許第3,304,263号に見出され、これらには、ジメチルドデシルホスフィンオキシドおよびジメチル-2ヒドロキシドデシルホスフィンオキシドが含まれる。5.式R1-SO-R2式中、R1およびR2は、置換または非置換のアルキル基であり、前者は、約10~約28個の炭素原子を含有し、一方、R2は、1~3個の炭素原子を含有するに対応するものを含めた長鎖スルホキシド。これらのスルホキシドの具体例には、ドデシルメチルスルホキシド、および3-ヒドロキシトリデシルメチルスルホキシドが含まれる。6.ナトリウム3-ドデシルアミノプロピオネート、およびナトリウム3-ドデシルアミノプロパンスルホネートなどの両性合成界面活性剤。7.3-N,N-ジメチル-N-ヘキサデシルアンモニオプロパン-1-スルホネート、および3-N,N-ジメチル-N-ヘキサデシルアンモニオ-2-ヒドロキシプロパン-1-スルホネートなどの双性イオン性合成界面活性剤。さらに、以下のタイプの界面活性剤のすべてを、本発明の組成物中に使用することができる:a脂肪酸、ロジン酸、およびトールオイルの石けんすなわち、アルカリ塩;bアルキルアレーンスルホネート;c分岐鎖および直鎖疎水性基の両方、ならびに1級および2級スルフェート基を有する界面活性剤を含めたアルキルスルフェート;d疎水性基と親水性基との間に中間連結を含有するスルフェートおよびスルホネート、例えば、脂肪アシル化メチルタウリドおよび硫酸化脂肪モノグリセリドなど;eポリエチレングリコールの長鎖の酸エステル、特にトールオイルエステル;fアルキルフェノールのポリエチレングリコールエーテル;g長鎖アルコールとメルカプタンのポリエチレングリコールエーテル;ならびにh脂肪アシルジエタノールアミド。界面活性剤は、1つを超える様式で分類することができるので、この段落で示した界面活性剤のいくつかのクラスは、以前に記載した界面活性剤のクラスと重複する。生物学的状況のために具体的に設計され、その状況において一般に使用されるいくつかの界面活性剤が存在する。このような界面活性剤は、4つの基本タイプ、すなわち、アニオン性、カチオン性、双性イオン性両性、および非イオン性に分けられる。例示的なアニオン性界面活性剤として、例えば、ペルフルオロオクタノエートPFOAもしくはPFO、ペルフルオロオクタンスルホネートPFOS、アルキル硫酸塩、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムSDS、または硫酸ラウリルアンモニウム、硫酸ラウレスナトリウムナトリウムラウリルエーテルスルフェート、SLESとしても公知、アルキルベンゼンスルホネート、および脂肪酸塩が含まれる。例示的なカチオン性界面活性剤には、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドCTAB、またはヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化セチルピリジニウムCPC、ポリエトキシ化タロウアミンPOEA、塩化ベンザルコニウムBAC、塩化ベンゼトニウムBZTが含まれる。例示的な双性イオン性両性界面活性剤には、例えば、ドデシルベタイン、コカミドプロピルベタイン、およびココアンホcocoamphoグリシネートが含まれる。例示的な非イオン性界面活性剤として、例えば、アルキルポリエチレンオキシド、アルキルフェノールポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドのコポリマーポロキサマーまたはポロキサミンと商業的に呼ばれる、アルキルaaylポリグルコシド例えば、オクチルグルコシドまたはデシルマルトシド、脂肪アルコール例えば、セチルアルコールまたはオレイルアルコール、コカミドMEA、コカミドDEA、Pluronic登録商標F-68ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、およびポリソルベート、例えば、Tween20ポリソルベート20、Tween80ポリソルベート80;ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ドデシルジメチルアミンオキシド、およびビタミンEトコフェロールプロピレングリコールコハク酸ビタミンETPGSが挙げられる。界面活性剤の特に有用な群は、ソルビタンベースの非イオン性界面活性剤である。これらの界面活性剤は、ソルビトールを脱水して1,4-ソルビタンを得、次いでこれを、1つまたは複数の当量の脂肪酸と反応させることによって調製される。脂肪酸置換部分を、エチレンオキシドとさらに反応させることによって、第2の群の界面活性剤を得ることができる。脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤は、1,4-ソルビタンを、脂肪酸、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、または同様の長鎖脂肪酸などと反応させて、1,4-ソルビタンモノエステル、1,4-ソルビタンセスキエステル、または1,4-ソルビタントリエステルを得ることによって作製される。これらの界面活性剤の一般名称には、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレートsorbitanmonoestearate、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエート、およびソルビタントリオレエートが含まれる。これらの界面活性剤は、通常、様々なモノエステル、ジエステル、およびトリエステル置換ソルビタンを区別する文字または数値が指定されて、SPAN登録商標、またはARLACEL登録商標の名称で市販されている。SPAN登録商標およびARLACEL登録商標界面活性剤は、親水性であり、一般に、油中に可溶性または分散性である。これらはまた、ほとんどの有機溶媒中に可溶性である。水中で、これらは、一般に不溶性であるが分散性である。一般に、これらの界面活性剤は、1.8~8.6の親水性親油性バランスHLB数を有することになる。このような界面活性剤は、当技術分野で公知の手段によって容易に作製することができ、または市販されている。界面活性剤の関係した群は、ポリオキシエチレンolyoxyethyleneソルビタンモノエステル、およびポリオキシエチレンソルビタントリエステルを含む。これらの材料は、1,4-ソルビタンモノエステルmonesterまたはトリエステルにエチレンオキシドを付加することによって調製される。ポリオキシエチレンを付加すると、親油性のソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤が、一般に水中で可溶性または分散性であり、有機液体中で様々な程度に可溶性である親水性界面活性剤に変換される。これらの材料は、TWEEN登録商標の商標で市販されており、水中油型エマルジョンおよび分散物の調製、または油の可溶化、および水溶性または洗浄可能な無水軟膏の作製に有用である。TWEEN登録商標界面活性剤は、関係したソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤と合わせることによって、エマルジョン安定性を促すことができる。TWEEN登録商標界面活性剤は、一般に、9.6~16.7に入るHLB値を有する。TWEEN登録商標界面活性剤は、市販されている。単独で、またはSPAN、ARLACEL登録商標、およびTWEEN界面活性剤とともに使用することができる非イオン性界面活性剤の第3の群は、エチレンオキシドを長鎖脂肪酸と反応させることによって作製されるポリオキシエチレン脂肪酸である。このタイプの最も一般に入手可能な界面活性剤は、MYRJの名称で販売されており、ステアリン酸のポリオキシエチレン誘導体である。MYRJ登録商標界面活性剤は、TWEEN登録商標界面活性剤のように、親水性であり、水中で可溶性または分散性である。MYRJ登録商標界面活性剤は、エマルジョンを形成するのに使用するために、TWEEN登録商標界面活性剤と、またはTWEEN登録商標/SPAN登録商標もしくはARLACEL登録商標界面活性剤の混合物とブレンドすることができる。MYRJ登録商標界面活性剤は、当技術分野で公知の方法によって作製することができ、または市販されている。ポリオキシエチレンベースの非イオン性界面活性剤の第4の群は、ラウリルアルコール、アセチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪酸エーテルである。これらの材料は、脂肪アルコールにエチレンオキシドを付加することによって、上記のように調製される。これらの界面活性剤の商業的な名称は、BRIJ登録商標である。BRIJ登録商標界面活性剤は、界面活性剤中のポリオキシエチレン部分のサイズに応じて、親水性または親油性となり得る。これらの化合物の調製物は、当技術分野から利用可能であるが、これらは、商業的供給源からも容易に入手可能である。潜在的に使用することができる他の非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンを含有する蜜ろう誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、グリセロール脂肪酸エステル、または他の12~22炭素原子の長鎖脂肪酸のポリオキシエチレンの酸アルコールもしくはエーテル誘導体である。多相系であることが意図された本発明のエマルジョンおよび処方物として、約7~16の範囲内のHLB値を有するエマルジョン形成非イオン性界面活性剤を選ぶことが好ましい。この値は、TWEEN登録商標界面活性剤などの単一の非イオン性界面活性剤の使用を通じて得ることができ、あるいはソルビタンモノエステル、ジエステル、もしくはトリエステルベースの界面活性剤などとの界面活性剤のブレンド;ソルビタンエステルポリオキシエチレン脂肪酸;ポリオキシエチレンラノリン由来界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル;高HLBポリオキシエチレン脂肪エーテル界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル界面活性剤;またはポリエチレン脂肪エーテル界面活性剤、もしくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸を使用することによって達成することができる。ある特定の実施形態では、エマルジョンは、エマルジョン安定化非イオン性界面活性剤として、単一の非イオン性界面活性剤、最も特にTWEEN登録商標界面活性剤を含む。例示的な実施形態では、エマルジョンは、ポリソルベート80またはポリオキシエチレン20ソルビタンモノオレエートとして別に公知であるTWEEN登録商標80を含む。他の実施形態では、エマルジョンは、2つ以上の非イオン性界面活性剤、特に、TWEEN登録商標界面活性剤、およびSPAN登録商標界面活性剤を含む。例示的な実施形態では、エマルジョンは、TWEEN登録商標80およびSPAN登録商標85を含む。水中油型エマルジョンは、約0.01~約2.5の界面活性剤v/vもしくはw/v、約0.01~約2の界面活性剤、0.01~約1.5の界面活性剤、0.01~約1の界面活性剤、0.01~約0.5の界面活性剤、0.05~約0.5の界面活性剤、0.08~約0.5の界面活性剤、約0.08の界面活性剤、約0.1の界面活性剤、約0.2の界面活性剤、約0.3の界面活性剤、約0.4の界面活性剤、約0.5の界面活性剤、約0.6の界面活性剤、約0.7の界面活性剤、約0.8の界面活性剤、約0.9の界面活性剤、または約1の界面活性剤を含有することができる。代わりにまたはさらに、水中油型エマルジョンは、0.05~約1、0.05~約0.9、0.05~約0.8、0.05~約0.7、0.05~約0.6、0.05~約0.5、約0.08、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、または約1のTween80ポリソルベート80;ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含有することができる。例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、0.08のTween80を含有する。代わりにまたはさらに、水中油型エマルジョンは、0.05~約1、0.05~約0.9、0.05~約0.8、0.05~約0.7、0.05~約0.6、0.05~約0.5、約0.08、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、または約1のSPAN85ソルビタントリオレエートを含有することができる。代わりにまたはさらに、水中油型エマルジョンは、本明細書に記載される界面活性剤の組合せを含有することができる。例えば、Tween80ポリソルベート80;ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとSPAN85ソルビタントリオレエートの組合せを使用することができる。エマルジョンは、等しい量のこれらの界面活性剤を含めて、様々な量のTween80およびSPAN85例えば、上記に例示したものを含有することができる。例えば、水中油型エマルジョンは、約0.05のTween80と約0.05のSPAN85、約0.1のTween80と約0.1のSPAN85、約0.2のTween80と約0.2のSPAN85、約0.3のTween80と約0.3のSPAN85、約0.4のTween80と約0.4のSPAN85、約0.5のTween80と約0.5のSPAN85、約0.6のTween80と約0.6のSPAN85、約0.7のTween80と約0.7のSPAN85、約0.8のTween80と約0.8のSPAN85、約0.9のTween80と約0.9のSPAN85、または約1のTween80と約1.0のSPAN85を含有することができる。ポリエチレングリコールPEG-脂質、例えば、ジアルキルオキシプロピルにカップリングしたPEGPEG-DAA、ジアシルグリセロールにカップリングしたPEGPEG-DAG、ホスファチジルエタノールアミンPEPEG-PEもしくはいくつかの他のリン脂質PEG-リン脂質とカップリングしたPEG、セラミドとコンジュゲートしたPEGPEG-Cer、またはこれらの組合せなども、界面活性剤として使用することができる例えば、米国特許第5,885,613号;米国特許出願公開第2003/0077829号、同第2005/0175682号、および同第2006/0025366を参照。他の適当なPEG-脂質には、例えば、PEG-ジアルキルオキシプロピルDAA脂質、またはPEG-ジアシルグリセロールDAG脂質が含まれる。例示的なPEG-DAG脂質として、例えば、PEG-ジラウロイルグリセロールC12脂質、PEG-ジミリストイルグリセロールC14脂質、PEG-ジパルミトイルグリセロールC16脂質、またはPEG-ジステアロイルグリセロールC18脂質が挙げられる。例示的なPEG-DAA脂質として、例えば、PEG-ジラウリルオキシプロピルC12脂質、PEG-ジミリスチルオキシプロピルC14脂質、PEG-ジパルミチルオキシプロピルC16脂質、またはPEG-ジステアリルオキシプロピルC18脂質が挙げられる。PEGは、その分子量によって分類される。例えば、PEG2000は、約2,000ダルトンの平均分子量を有し、PEG5000は、約5,000ダルトンの平均分子量を有する。PEGは、SigmaChemicalCo.ならびに他の会社から市販されており、これらには、例えば、以下のものが含まれる:モノメトキシポリエチレングリコールMePEG-OH、モノメトキシポリエチレングリコール-コハク酸MePEG-S、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシンイミジルコハク酸MePEG-S-NHS、モノメトキシポリエチレングリコール-アミンMePEG-NH2、モノメトキシポリエチレングリコール-トレシレートMePEG-TRES、およびモノメトキシポリエチレングリコール-イミダゾリル-カルボニルMePEG-IM。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール-酢酸MePEG-CH2COOHは、例えば、PEG-DAAコンジュゲートを含めた、PEG-脂質コンジュゲートの調製に特に有用である。好ましくは、PEGは、約1000~約5000ダルトンの平均分子量を有する例えば、PEG1000、PEG2000、PEG3000、PEG4000、PEG5000。PEGは、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、またはアリール基によって任意選択により置換されている場合がある。PEGは、脂質に直接コンジュゲートすることができ、またはリンカー部分を介して脂質に連結することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含めた、PEGを脂質にカップリングさせるのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。例示的な実施形態では、PEG2000PE、PEG5000PE、PEG1000DMG、PEG2000DMG、PEG3000DMG、またはこれらの組合せが、界面活性剤として使用される。ある特定の例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、約1mg/ml~約80mg/mlのPEG2000PE、PEG5000PE、PEG1000DMG、PEG2000DMG、またはPEG3000DMGを含有する。リン脂質ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、リン脂質をさらに含む。リン脂質は、分子のアルコール成分がホスフェート基を含有する脂肪酸のエステルである。リン脂質には、グリセロホスファチドグリセロールを含有する、およびスフィンゴミエリンスフィンゴシンを含有するが含まれる。例示的なリン脂質として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、およびスフィンゴミエリン;ならびにジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、およびジパルミトイルセリンを含む合成リン脂質が挙げられる。以下の例示的なリン脂質を使用することができる。ある特定の実施形態では、中性脂質を使用することが有利である場合がある。双性イオン性リン脂質、例えば、長さが約12~約22炭素例えば、約12~約14、~約16、~約18、~約20、~約22炭素の1つまたは複数のアルキルラジカルまたはアルケニルラジカルを含有し、このラジカルは、例えば、0~1~2~3個の二重結合を含有していてもよいリン脂質を含めたリン脂質を使用することが有利である場合もある。双性イオン性リン脂質を使用することが有利である場合がある。好適なリン脂質として、例えば、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDOPE、卵ホスファチジルコリン卵PC、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリンPOPC、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジオレオイルホスファチジルコリンDOPC、DPPC、ジパルミトイルホスファチジルコリンDPPC、パルミトイルリノレイルホスファチジルコリンPLPC、DPyPE、またはこれらの組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、リン脂質はDOPEである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約20mg/mlのDOPEを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約10mg/ml、約0.1mg/ml~約10mg/ml、または約1.5mg/ml~約7.5mg/mlのDOPEでDOPEを含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約1.5mg/mlのDOPEを含む。ある特定の実施形態では、リン脂質は卵PCである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約20mg/mlの卵PCを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約10mg/ml、約1.0mg/ml~約10mg/ml、または約1.5mg/ml~約3.5mg/mlの卵PCで卵PCを含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約1.55mg/mlの卵PCを含む。ある特定の実施形態では、リン脂質はDPyPEである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約20mg/mlのDPyPEを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約10mg/ml、約1.5mg/ml~約10mg/ml、または約1.5mg/ml~約5mg/mlのDPyPEでDPyPEを含むことができる。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約1.6mg/mlのDPyPEを含む。ある特定の実施形態では、エマルジョン粒子は、本明細書に記載される界面活性剤とリン脂質の組合せを含むことができる。D.水相連続相水中油型エマルジョンの水相連続相は、緩衝化塩溶液例えば、食塩水または水である。緩衝化塩溶液は、塩例えば、NaCl、バッファー例えば、クエン酸バッファーを含む水性溶液であり、重量オスモル濃度調整剤osmolalityadjustingagent例えば、サッカリド、ポリマー、界面活性剤、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。エマルジョンが非経口投与用に処方される場合、組成物の投与後の膨張または急速な吸収などの望まれない投与後の結果を防止するために、張性、すなわち、重量オスモル濃度が正常な生理学的な液と本質的に同じであるように、最終的な緩衝化溶液を作製することが好ましい。正常な生理的条件と適合性のpHを維持するために、水相を緩衝化することも好ましい。また、ある特定の事例では、エマルジョンのある特定の成分の安定性を保証するために、pHを特定のレベルに維持することが望ましい場合がある。例えば、等張性すなわち、体の正常細胞および血液と同じ浸透性溶質例えば、塩濃度であり、等浸透圧であるエマルジョンを調製することが望ましい場合がある。張性を制御するために、エマルジョンは、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことができる。例えば、塩化ナトリウムNaClを約0.9w/v生理食塩水で使用することができる。存在し得る他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。非イオン性等張化剤も張性を制御するのに使用することができる。いくつかの非イオン性張性調整剤が、通常、当業者に公知である。これらは一般的に様々な分類の炭水化物である例えば、VoetおよびVoet1990年BiochemistryJohnWileySons、NewYorkを参照。アルドースとして分類される単糖、例えば、グルコース、マンノース、アラビノース、およびリボースなど、ならびにケトースとして分類されるもの、例えば、フルクトース、ソルボース、およびキシルロースなどを、本発明における非イオン性等張化剤として使用することができる。二糖、例えば、スクロース、マルトース、トレハロース、およびラクトースなども使用することができる。さらに、アルジトール非環式ポリヒドロキシアルコール、糖アルコールとも呼ばれる、例えば、グリセロール、マンニトール、キシリトール、およびソルビトールなどは、本発明において有用な非イオン性等張化剤である。非イオン性張性調整剤は、使用される作用物質に応じて、約0.1~約10または約1~約10の濃度で存在し得る。水相を、緩衝化することができる。任意の生理学的に許容されるバッファー、例えば、水、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、トリスバッファー、ビカルボネートバッファー、カルボネートバッファー、コハク酸バッファーなどを、本明細書で使用することができる。水性成分のpHは、好ましくは、6.0~8.0、好ましくは、約6.2~約6.8である。例示的な実施形態では、バッファーは、6.5のpHを有する10mMのクエン酸バッファーである。別の例示的な実施形態では、水相は、RNaseフリー水またはDEPC処理水を使用して調製されるか、またはこうして調製されるバッファーである。いくつかの場合では、バッファー中の高濃度の塩は、負に荷電した分子のエマルジョン粒子への複合体形成に干渉する場合があり、したがって、回避される。他の場合では、バッファーにおいてある特定の量の塩を含めることができる。例示的な実施形態では、バッファーは、6.5のpHを有する10mMのクエン酸バッファーである。別の例示的な実施形態では、水相は、RNaseフリー水またはDEPC処理水を使用して調製されるか、またはこうして調製されるバッファーである。水相は、追加の成分、例えば、水相の容量オスモル濃度を変化させる分子、または複合体形成後の負に荷電した分子を安定化させる分子なども含むことができる。水相の容量オスモル濃度は、非イオン性等張化剤、例えば、糖例えば、トレハロース、スクロース、デキストロース、フルクトース、還元パラチノースなど、糖アルコールマンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、マルチトール、グリセロールなど、またはこれらの組合せなどを使用して調整していることが好ましい。必要に応じて、非イオン性ポリマー例えば、ポリアルキルグリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリブチレングリコールなど、または非イオン性界面活性剤を使用することができる。いくつかの場合では、エマルジョンが最初に調製される際、純水unadulteratedwaterが、エマルジョンの水相として好適となり得る。例えば、塩濃度を上昇させると、望ましい粒子サイズ例えば、約200nm未満を達成することがより困難になり得る。ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの水相は、ポリマーもしくは界面活性剤、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、ポロキサマーを含有する。ポロキサマーは、ポリオキシエチレンポリエチレンオキシドの2本の親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレンポリプロピレンオキシドの中心の疎水性鎖を有する非イオン性トリブロックコポリマーである。ポロキサマーは、商標名Pluronic登録商標ポリマーによっても公知である。ポロキサマーポリマーは、RNA複合体形成後のRNA分子の安定性をより大きくし、RNase耐性を増大させることができる。代わりにまたはさらに、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1~約20w/vのポリマー、または約0.05~約10w/vのポリマーを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1~約20w/v、約0.1~約10w/v、約0.05~約10w/v、または約0.05~約5w/vでポリマー例えば、Pluronic登録商標F127などのポロキサマーを含むことができる。例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、約4w/v、または約8w/vのPluronic登録商標F127を含む。これらの組成物中に使用される水性成分の量は、組成の値を1にするのに必要な量となる。すなわち、100にするのに十分な水性成分の量が、上記に列挙された他の成分と混合されることによって、その組成物の容積となる。4.負に荷電した分子負に荷電した分子が送達される場合、これは、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成させることができる。負に荷電した分子は、例えば、負に荷電した分子と粒子の表面上のカチオン性脂質との間の相互作用、ならびに負に荷電した分子と粒子の表面との間の疎水性/親水性相互作用によって、エマルジョン粒子と複合体を形成する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望まないが、負に荷電した分子は、非共有結合性イオン電荷相互作用静電気力を通じてカチオン性脂質と相互作用し、複合体の強度、ならびに粒子と複合体を形成することができる負に荷電した化合物の量は、粒子中のカチオン性脂質の量に関係すると考えられる。さらに、負に荷電した分子と粒子の表面との間の疎水性/親水性相互作用も、役割を果たす場合がある。負に荷電した分子の例には、負に荷電したペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、核酸分子例えば、一本鎖もしくは二本鎖RNAもしくはDNA、小分子例えば、小分子免疫増強因子SMIP、ホスホネート、フルオロホスホネートなどなどが含まれる。好適な態様では、負に荷電した分子は、自己複製RNA分子、または低分子干渉RNAを含めた、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするRNAなどのRNA分子である。複合体は、当技術分野で公知の技法を使用して形成することができ、その例は、本明細書に記載されている。例えば、核酸-粒子複合体は、例えば、ボルテックスすることによって、カチオン性エマルジョンを核酸分子と混合することによって形成することができる。負に荷電した分子およびエマルジョン中のカチオン性脂質の量を調整または最適化することによって、所望の結合強度および結合能力をもたらすことができる。例えば、本明細書に記載され、例として示されているように、例示的なRNA-粒子複合体は、RNA:カチオン性脂質の比N/P比で測定した場合を変更することによって生成された。用語N/P比は、RNA上のホスフェートの量モルによって除された、カチオン性脂質中のプロトン化可能なprotonatable窒素原子の量モルを指す。好適なN/P比は、約1:1~約20:1、約2:1~約18:1、約3:1~16:1、約4:1~約14:1、約6:1~約12:1、約3:1、約4:1、約5:1、約6:1、約7:1、約8:1、約9:1、約10:1、約11:1、約12:1、約13:1、約14:1、約15:1、または約16:1である。あるいは、好適なN/P比は、少なくとも約3:1、少なくとも約4:1、少なくとも約5:1、少なくとも約6:1、少なくとも約7:1、少なくとも約8:1、少なくとも約9:1、少なくとも約10:1、少なくとも約11:1、少なくとも約12:1、少なくとも約13:1、少なくとも約14:1、少なくとも約15:1、または少なくとも約16:1である。より好適なN/P比は、約4:1以上である。各エマルジョンは、所望の効果例えば、複合体を形成したRNAの所望のレベルの発現を生じさせるために、それ自体の最適または好適なN/P比を有することができ、これは、実験的に例えば、RNAによってコードされるタンパク質の発現レベルの測定、またはヘパリンの存在下で複合体から放出されるRNA分子の百分率の測定など、本明細書に記載されるアッセイ、または他の当技術分野で公知の技法を使用して求めることができる。一般に、N/P比は、RNA-粒子複合体が細胞によって取り込まれる場合、RNA分子の少なくとも約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、または約95が、RNA-粒子複合体から放出される値であるべきである。少なくとも4:1のN/P比が好適である。本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンは、核酸ベースのワクチン例えば、DNAワクチン、RNAワクチンを処方するのに特に適している。核酸-エマルジョン粒子複合体の形成は、核酸の宿主細胞への取り込みを促進し、核酸分子をヌクレアーゼ分解から保護する。次いで、トランスフェクション細胞は、核酸分子によってコードされる抗原を発現することができ、抗原への免疫応答を生じさせることができる。生ウイルスまたは弱毒化ウイルスのように、核酸ベースのワクチンは、MHC-I経路およびMHC-II経路の両方に有効に関与し、CD8T細胞応答およびCD4T細胞応答の誘導を可能にすることができ、一方、組換えタンパク質などの可溶性形態で存在する抗原は、一般に、抗体応答のみを誘導する。RNA分子の配列は、ヒト細胞などの所望の宿主における発現について最適化または脱最適化されたdeoptimizedコドンとすることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される負に荷電した分子は、RNA分子である。ある特定の実施形態では、RNA分子は、抗原ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードし、カチオン性水中油型エマルジョンは、RNAベースのワクチンとして使用するのに適している。組成物は、抗原をコードする1つを超えるRNA分子、例えば、エマルジョン粒子と複合体を形成している2、3、5、または10のRNA分子を含有することができる。すなわち、組成物は、それぞれが異なる抗原をコードする、1つまたは複数の異なる種のRNA分子を含有することができる。代わりにまたはさらに、1つのRNA分子、例えば、異なるかまたは同一の抗原をコードするバイシストロニックまたはトリシストロニックなRNA分子は、1つを超える抗原をコードすることもできる。したがって、カチオン性水中油型エマルジョンは、一価または多価であるRNAベースのワクチンとして使用するのに適している。RNA分子の配列は、例えば、RNAの発現もしくは複製の効率を増大させ、または分解に対する追加の安定性もしくは耐性をもたらすために、必要に応じて修飾することができる。例えば、RNA配列は、例えば、RNAの翻訳効率および半減期を増大させるために、そのコドン使用頻度に関して修飾することができる。ポリAテール例えば、約30アデノシン残基またはそれ以上のは、RNAの3’テールに結合することによって、RNAの半減期を増大させることができる。RNAの5’テールを、構造m7G5’ppp5’Nキャップ0構造を有する修飾されたリボヌクレオチドまたはその誘導体でキャッピングすることができ、これは、RNA合成の間に組み込むことができ、またはRNA転写後に酵素的に操作することができる例えば、N7-モノメチル化キャップ0構造の構築を触媒するmRNAトリホスファターゼ、グアニリル-トランスフェラーゼ、およびグアニン-7-メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素VCEを使用することによって。キャップ0構造は、RNA分子の安定性および翻訳効率の維持に重要な役割を果たす。RNA分子の5’キャップを、2’-O-メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾することができ、これは、キャップ1構造m7Gppp[m2’-O]Nの生成をもたらし、この構造は、翻訳効率をさらに増大させることができる。必要に応じて、RNA分子は、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。これは、任意の5’キャップ構造に加えてのものとすることができる。哺乳動物RNAに96を超える天然に存在するヌクレオシド修飾が見つかっている。例えば、Limbachら、NucleicAcidsResearch、22巻12号:2183~2196頁1994年を参照。ヌクレオチドならびに修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオシドの調製は、例えば、米国特許第4373071号、同第4458066号、同第4500707号、同第4668777号、同第4973679号、同第5047524号、同第5132418号、同第5153319号、同第5262530号、同第5700642号から当技術分野で周知であり、これらの特許のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれており、多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドが市販されている。修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチド中に組み込むことができ、RNA分子中に存在し得る修飾核酸塩基として、m5C5-メチルシチジン、m5U5-メチルウリジン、m6AN6-メチルアデノシン、s2U2-チオウリジン、Um2’-O-メチルウリジン、m1Al-メチルアデノシン;m2A2-メチルアデノシン;Am2-1-O-メチルアデノシン;ms2m6A2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン;i6AN6-イソペンテニルアデノシン;ms2i6A2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン;io6AN6-cis-ヒドロキシイソペンテニルアデノシン;ms2io6A2-メチルチオ-N6-cis-ヒドロキシイソペンテニルアデノシン;g6AN6-グリシニルカルバモイルアデノシン;t6AN6-トレオニルカルバモイルアデノシン;ms2t6A2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン;m6t6AN6-メチル-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン;hn6AN6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;ms2hn6A2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;Arp2’-O-リボシルアデノシンホスフェート;Iイノシン;m1I1-メチルイノシン;m’Im1,2’-O-ジメチルイノシン;m3C3-メチルシチジン;Cm2T-O-メチルシチジン;s2C2-チオシチジン;ac4CN4-アセチルシチジン;f5C5-ホンニルシチジン;m5Cm5,2-O-ジメチルシチジン;ac4CmN4アセチル2TOメチルシチジン;k2Cリシジン;m1G1-メチルグアノシン;m2GN2-メチルグアノシン;m7G7-メチルグアノシン;Gm2’-O-メチルグアノシン;m22GN2,N2-ジメチルグアノシン;m2GmN2,2’-O-ジメチルグアノシン;m22GmN2,N2,2’-O-トリメチルグアノシン;Grp2’-O-リボシルグアノシンホスフェート;yWワイブトシン;o2yWペルオキシワイブトシン;OHyWヒドロキシワイブトシン;OHyW修飾未満undermodifiedヒドロキシワイブトシン;imGワイオシン;mimGメチルグアノシン;Qクエウオシン;oQエポキシクエウオシン;galQガラクトシル-クエウオシン;manQマンノシル-クエウオシン;preQo7-シアノ-7-デアザグアノシン;preQi7-アミノメチル-7-デアザグアノシン;Gアルカエオシン;Dジヒドロウリジン;m5Um5,2’-O-ジメチルウリジン;s4U4-チオウリジン;m5s2U5-メチル-2-チオウリジン;s2Um2-チオ-2’-O-メチルウリジン;acp3U3-3-アミノ-3-カルボキシプロピルウリジン;ho5U5-ヒドロキシウリジン;mo5U5-メトキシウリジン;cmo5Uウリジン5-オキシ酢酸;mcmo5Uウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル;chm5U5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン;mchm5U5-カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル;mcm5U5-メトキシカルボニルメチルウリジン;mcm5UmS-メトキシカルボニルメチル-2-O-メチルウリジン;mcm5s2U5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン;nm5s2U5-アミノメチル-2-チオウリジン;mnm5U5-メチルアミノメチルウリジン;mnm5s2U5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン;mnm5se2U5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン;ncm5U5-カルバモイルメチルウリジン;ncm5Um5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン;cmnm5U5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン;cnmm5Um5-カルボキシメチルアミノメチル-2-L-Oメチルウリジン;cmnm5s2U5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン;m62AN6,N6-ジメチルアデノシン;Tm2’-O-メチルイノシン;m4CN4-メチルシチジン;m4CmN4,2-O-ジメチルシチジン;hm5C5-ヒドロキシメチルシチジン;m3U3-メチルウリジン;cm5U5-カルボキシメチルウリジン;m6AmN6,T-O-ジメチルアデノシン;rn62AmN6,N6,O-2-トリメチルアデノシン;m2’7GN2,7-ジメチルグアノシン;m2’2’7GN2,N2,7-トリメチルグアノシン;m3Um3,2T-O-ジメチルウリジン;m5D5-メチルジヒドロウリジン;f5Cm5-ホルミル-2’-O-メチルシチジン;m1Gm1,2’-O-ジメチルグアノシン;m’Am1,2-O-ジメチルアデノシンイリノメチルウリジン;tm5s2US-タウリノメチル-2-チオウリジン;imG-144-ジメチルdemethylグアノシン;imG2イソグアノシン;ac6AN6-アセチルアデノシン、ヒポキサンチン、イノシン、8-オキソ-アデニン、その7-置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-アミノウラシル、5-C1~C6-アルキルウラシル、5-メチルウラシル、5-C2~C6-アルケニルウラシル、5-C2~C6-アルキニルウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、5-クロロウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシシトシン、5-C1~C6-アルキルシトシン、5-メチルシトシン、5-C2~C6-アルケニルシトシン、5-C2~C6-アルキニルシトシン、5-クロロシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、N2-ジメチルグアニン、7-デアザグアニン、8-アザグアニン、7-デアザ-7-置換グアニン、7-デアザ-7-C2~C6アルキニルグアニン、7-デアザ-8-置換グアニン、8-ヒドロキシグアニン、6-チオグアニン、8-オキソグアニン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,4-ジアミノプリン、2,6-ジアミノプリン、8-アザプリン、置換7-デアザプリン、7-デアザ-7-置換プリン、7-デアザ-8-置換プリン、水素無塩基残基、m5C、m5U、m6A、s2U、W、または2’-O-メチル-Uが挙げられる。これらの修飾核酸塩基およびこれらの対応するリボヌクレオシドの多くは、商業的供給者から入手可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれているWO2011/005799を参照。本発明で使用されるRNAは、ヌクレオシド同士間でホスホジエステル連結のみを含むことが理想的であるが、いくつかの実施形態では、これは、ホスホラミデート連結、ホスホロチオエート連結、および/またはメチルホスホネート連結を含有することができる。いくつかの実施形態では、RNA分子は、修飾ヌクレオチドを含まず、例えば、修飾核酸塩基を含まず、RNA分子中のヌクレオチドのすべては、例えば、7-メチルグアノシンを含むことができる任意選択の5’キャップを例外として、従来の標準的なリボヌクレオチドA、U、G、およびCである。他の実施形態では、RNAは、7’-メチルグアノシンを含む5’キャップを含むことができ、最初の1、2、または3つの5’リボヌクレオチドは、リボースの2’位でメチル化されている場合がある。A.自己複製RNAいくつかの態様では、カチオン性水中油型エマルジョンは、自己複製RNA分子を含有する。ある特定の実施形態では、自己複製RNA分子は、アルファウイルスに由来し、またはこれに基づく。自己複製RNA分子は、当技術分野で周知であり、例えば、アルファウイルスに由来する複製エレメントを使用し、ウイルスの構造タンパク質を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と置換することによって生成することができる。自己複製RNA分子は、一般的に、細胞に送達された後に直接翻訳され得る鎖分子であり、この翻訳は、RNA依存性RNAポリメラーゼをもたらし、次いでこれは、送達されたRNAからのアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を生成する。したがって、送達されたRNAにより、複数の娘RNAが産生される。これらの娘RNA、ならびに共線的なcollinearサブゲノムの転写物は、これら自体が翻訳されて、コードされる抗原のinsitu発現をもたらすことができ、または転写されて、送達されたRNAと同じセンスを有するさらなる転写物をもたらすことができ、これらが翻訳されて、抗原のinsitu発現をもたらす。この一連の転写の全体的な結果は、導入されたレプリコンRNAの数の大規模な増幅であり、コードされる抗原は、細胞の主なポリペプチド産物となる。自己複製RNAをトランスフェクトされた細胞は、アポトーシス死を起こす前に、短期間、抗原を産生する。この死は、要求される二本鎖dsRNA中間体の結果である可能性があり、これらはまた樹状細胞を超活性化することが示されている。したがって、自己複製RNAの増強された免疫原性は、炎症促進性pro-inflammatorydsRNAの生成の結果である場合があり、これは宿主細胞のRNA-ウイルス感染を模倣する。有利には、細胞の機構が自己複製RNA分子により使用されることによって、タンパク質または抗原などのコードされる遺伝子産物の指数関数的増加が生じ、これらは、細胞内に蓄積することができ、または細胞から分泌され得る。自己複製RNA分子によるタンパク質の過剰発現は、RNAの複製および増幅、ならびにトランスフェクション細胞のアポトーシスを誘導する翻訳の産物による、トル様受容体TLR3、7、および8、ならびに非TLR経路例えば、RIG-1、MD-5の刺激を含めた免疫賦活性アジュバント効果を活用する。自己複製RNAは、一般に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質からなる群より選択される少なくとも1つまたは複数の遺伝子を含有し、5’-末端および3’-末端のシス活性複製配列、ならびに必要に応じて、所望のアミノ酸配列例えば、目的の抗原をコードする異種配列も含む。異種配列の発現を指示するサブゲノムプロモーターを、自己複製RNA中に含めることができる。必要に応じて、異種配列例えば、目的の抗原を、自己複製RNA中の他のコード領域にインフレームで融合することができ、かつ/または内部リボソーム進入部位IRESの制御下とすることができる。ある特定の実施形態では、自己複製RNA分子は、ウイルス様粒子内に被包されない。本発明の自己複製RNA分子は、自己複製RNA分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘導することができないように設計することができる。これは、例えば、自己複製RNA中でウイルス粒子を産生するのに必要な構造タンパク質をコードする1つまたは複数のウイルス遺伝子を除外することによって達成することができる。例えば、自己複製RNA分子がアルファウイルス、例えば、シンドビスSinebisウイルスSIN、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスVEEなどに基づく場合、ウイルス構造タンパク質、例えば、カプシドおよび/またはエンベロープ糖タンパク質などをコードする1つまたは複数の遺伝子を除外することができる。必要に応じて、本発明の自己複製RNA分子を、弱毒化された、もしくは伝染性の強い感染性ウイルス粒子の産生を誘導するように、またはその後に1ラウンド感染させることができるウイルス粒子を生成するように、設計することもできる。本様式において、自己複製を達成するための1つの適当なシステムは、アルファウイルスベースのレプリコンを使用することである。アルファウイルスは、トガウイスル科の一連の遺伝的、構造的、および血清学的に関係した節足動物媒介性ウイルスを含む。シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスを含めた26の公知のウイルスおよびウイルスサブタイプが、アルファウイルス属に分類されている。したがって、本発明の自己複製RNAは、セムリキ森林ウイルスSFV、シンドビスウイルスSIN、ベネズエラウマ脳炎ウイルスVEE、ロスリバーウイルスRRV、東部ウマ脳炎ウイルス、またはアルファウイルス科に属する他のウイルスに由来するRNAレプリカーゼを組み込むことができる。アルファウイルスベースのレプリコン発現ベクターを、本発明において使用することができる。レプリコンベクターは、DNA、RNA、および組換えレプリコン粒子を含めたいくつかの形式で利用することができる。このようなレプリコンベクターは、例えば、シンドビスウイルスXiongら1989年Science243巻:1188~1191頁;Dubenskyら、1996年J.Virol.70巻:508~519頁;Hariharanら1998年J.Virol.72巻:950~958頁;Poloら1999年PNAS96巻:4598~4603頁、セムリキ森林ウイルスLiljestrom1991年Bio/Technology9巻:1356~1361頁;Berglundら1998年Nat.Biotech.16巻:562~565頁、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスPushkoら1997年Virology239巻:389~401頁を含むアルファウイルスから得られている。アルファウイルス由来レプリコンは一般的に、全体的な特性例えば、構造、複製がかなり類似しており、個々のアルファウイルスは、ユニークであるいくつかの特性例えば、受容体結合、インターフェロン感受性、および疾患プロファイルを示すことができる。したがって、多岐にわたるウイルス科から作製されるキメラアルファウイルスレプリコンも有用となり得る。アルファウイルスベースのRNAレプリコンは、一般的に、細胞に送達された後に、レプリカーゼまたはレプリカーゼ-転写酵素の翻訳をもたらす鎖RNAである。レプリカーゼは、ポリタンパク質として翻訳され、これは、自己切断して鎖で送達されたRNAのゲノム-鎖コピーを作り出す複製複合体をもたらす。これらの-鎖転写物は、それ自体が転写されることによって、鎖親RNAのさらなるコピーを与え、また、抗原をコードするサブゲノム転写物を与えることができる。したがって、サブゲノム転写物が翻訳されると、感染細胞によって抗原がinsituで発現される。適当なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。RNAレプリコンは、1つまたは複数の構造タンパク質遺伝子を、目的の産物をコードする、選択された異種核酸配列と置換することによって修飾された、ピコルナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、黄熱病ウイルス、またはアルファウイルス例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、もしくはロスリバーウイルスに由来するRNAゲノムを含むことが好ましい。好適なレプリコンは、iレプリコンからRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼ、およびii抗原をコードする。ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質nsP1、nsP2、nsP3、およびnsP4の1つまたは複数を含むアルファウイルスレプリカーゼとすることができる。天然のアルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリタンパク質に加えて、構造ビリオンタンパク質をコードするが、レプリコンは、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好適である。したがって、好適なレプリコンは、細胞内でそれ自体のゲノムRNAコピーの産生をもたらすことができるが、RNA含有ビリオンの産生をもたらすことはできない。これらのビリオンを生成することができないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、好適なレプリコンは、感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスの永続に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、好適なレプリコンにはなく、その場所は、目的の抗原をコードする遺伝子複数可によって奪われており、その結果、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく抗原をコードする。本発明で有用なレプリコンは、2つのオープンリーディングフレームを有することができる。第1の5’オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし、第2の3’オープンリーディングフレームは、抗原をコードする。いくつかの実施形態では、RNAは、例えば、追加の抗原をコードするか、またはアクセサリーポリペプチドをコードするための追加の例えば、下流オープンリーディングフレームを有することができる。好適なレプリコンは、5’キャップ例えば、7-メチルグアノシンを有し、これは、多くの場合、RNAのinvivo翻訳を増強することができる。いくつかの実施形態では、レプリコンの5’配列は、コードされるレプリカーゼとの適合性を保証するように選択される必要がある場合がある。レプリコンは、3’ポリAテールを有することができる。これは、その3’末端付近にポリAポリメラーゼ認識配列例えば、AAUAAAも含むことができる。レプリコンは、様々な長さを有することができるが、これらは一般的に、5000~25000ヌクレオチドの長さ、例えば、8000~15000ヌクレオチド、または9000~12000ヌクレオチドである。レプリコンは、好都合なことには、invitro転写IVTによって調製することができる。IVTは、細菌内で、プラスミド形態で作り出され、増幅させられるか、または合成的に例えば、遺伝子合成および/もしくはポリメラーゼ連鎖反応PCR操作法によって作り出されるcDNA鋳型を使用することができる。例えば、DNA依存性RNAポリメラーゼバクテリオファージT7、T3、またはSP6RNAポリメラーゼなどを、DNA鋳型からレプリコンを転写するのに使用することができる。適切なキャッピングおよびポリA付加反応を、必要に応じて使用することができるしかし、レプリコンのポリAは、通常、DNA鋳型内でコードされる。これらのRNAポリメラーゼは、転写される5’ヌクレオチド複数可についてストリンジェントな要求事項を有する場合があり、いくつかの実施形態では、これらの要求事項は、IVT転写RNAが、自己コードレプリカーゼの基質として効率的に機能することができることを保証するために、コードされるレプリカーゼの要求事項と整合されなければならない。具体例には、例えば、米国特許第5,814,482号、および同第6,015,686号、ならびに国際公開第WO97/38087号、同第WO99/18226号、および同第WO02/26209号に記載された、pSINCPなどのシンドビスウイルスベースのプラスミドpSINが含まれる。このようなレプリコンの構築物は、一般に、米国特許第5,814,482号、および同第6,015,686号に記載されている。他の態様では、自己複製RNA分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくは、プラス鎖RNAウイルス、より好ましくは、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリチウイルス、またはコロナウイルスから、またはこれらに基づいて得られる。適当な野生型アルファウイルス配列は、周知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、Mdなどの配列受託機関から入手可能である。適当なアルファウイルスの代表的な例として、アウラATCCVR-368、ベバルウイルスATCCVR-600、ATCCVR-1240、カバッソウCabassouATCCVR-922、チクングニアウイルスATCCVR-64、ATCCVR-1241、東部ウマ脳脊髄炎ウイルスATCCVR-65、ATCCVR-1242、フォートモーガンATCCVR-924、ゲタウイルスATCCVR-369、ATCCVR-1243、キジラガハKyzylagachATCCVR-927、マヤロATCCVR-66、マヤロウイルスATCCVR-1277、ミドルバーグATCCVR-370、ムカンボウイルスATCCVR-580、ATCCVR-1244、ヌドゥムATCCVR-371、ピクスナウイルスATCCVR-372、ATCCVR-1245、ロスリバーウイルスATCCVR-373、ATCCVR-1246、セムリキ森林ATCCVR-67、ATCCVR-1247、シンドビスウイルスATCCVR-68、ATCCVR-1248、トナテTonateATCCVR-925、トリニチTrinitiATCCVR-469、ウナATCCVR-374、ベネズエラウマ脳脊髄炎ATCCVR-69、ATCCVR-923、ATCCVR-1250ATCCVR-1249、ATCCVR-532、西部ウマ脳脊髄炎ATCCVR-70、ATCCVR-1251、ATCCVR-622、ATCCVR-1252、ワタロアATCCVR-926、およびY-62-33ATCCVR-375が挙げられる。本発明の自己複製RNA分子は、修飾ヌクレオチドを使用して調製された他のタイプのRNA例えば、mRNAより大きい。一般的に、本発明の自己複製RNA分子は、少なくとも約4kbを含有する。例えば、自己複製RNAは、少なくとも約5kb、少なくとも約6kb、少なくとも約7kb、少なくとも約8kb、少なくとも約9kb、少なくとも約10kb、少なくとも約11kb、少なくとも約12kb、または12kb超を含有することができる。ある特定の例では、自己複製RNAは、約4kb~約12kb、約5kb~約12kb、約6kb~約12kb、約7kb~約12kb、約8kb~約12kb、約9kb~約12kb、約10kb~約12kb、約11kb~約12kb、約5kb~約11kb、約5kb~約10kb、約5kb~約9kb、約5kb~約8kb、約5kb~約7kb、約5kb~約6kb、約6kb~約12kb、約6kb~約11kb、約6kb~約10kb、約6kb~約9kb、約6kb~約8kb、約6kb~約7kb、約7kb~約11kb、約7kb~約10kb、約7kb~約9kb、約7kb~約8kb、約8kb~約11kb、約8kb~約10kb、約8kb~約9kb、約9kb~約11kb、約9kb~約10kb、または約10kb~約11kbである。本発明の自己複製RNA分子は、1つまたは複数のタイプの修飾ヌクレオチド例えば、シュードウリジン、N6-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、5-メチルウリジンを含むことができる。自己複製RNA分子は、単一の異種ポリペプチド抗原、または任意選択により、配列のそれぞれが、アミノ酸配列として発現される場合に、その同一性を保持するように一緒に連結された例えば、連続して連結された2つ以上の異種ポリペプチド抗原をコードすることができる。次いで、自己複製RNAから生成される異種ポリペプチドを、融合ポリペプチドとして生成し、または別個のポリペプチドまたはペプチド配列をもたらす様式で操作することができる。本発明の自己複製RNAは、様々なエピトープを含有する1つまたは複数のポリペプチド抗原をコードすることができる。エピトープは、ヘルパーT細胞応答、もしくは細胞傷害性T細胞応答、またはその両方を誘発することができることが好ましい。本明細書に記載される自己複製RNA分子を、2つ以上のオープンリーディングフレームから複数のヌクレオチド配列を発現するように操作することができ、それによって、免疫応答の生成を増強することができるサイトカインまたは他の免疫調節剤を伴った、2つ以上の抗原などのタンパク質の共発現を可能にする。このような自己複製RNA分子は、例えば、二価ワクチンまたは多価ワクチンとして、例えば、様々な遺伝子産物例えば、タンパク質を同時に生成することにおいて特に有用となり得る。本発明の自己複製RNA分子は、任意の適当な方法を使用して調製することができる。修飾ヌクレオチドを含有するRNA分子を生成するためのいくつかの適当な方法が当技術分野で公知である。例えば、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製RNA分子は、適当なDNA依存性RNAポリメラーゼ、例えば、T7ファージRNAポリメラーゼ、SP6ファージRNAポリメラーゼ、T3ファージRNAポリメラーゼなど、またはRNA分子中への修飾ヌクレオチドの効率的な組込みを可能にする、これらのポリメラーゼの変異体を使用して、自己複製RNA分子をコードするDNAを転写例えば、invitro転写することによって調製することができる。転写反応物は、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド、ならびに適当なバッファー、および適当な塩などの選択されたポリメラーゼの活性を支持する他の成分を含有することになる。自己複製RNA中へのヌクレオチド類似体の組込みは、例えば、このようなRNA分子の安定性を変更し、RNaseに対する耐性を増大させ、適切な宿主細胞内に導入した後の複製RNAの感染力を確立し、かつ/または先天性免疫応答および適応免疫応答を誘導もしくは低減するように操作することができる。本発明の自己複製RNA分子を生成するために、適当な合成法を単独で、または1つもしくは複数の他の方法例えば、組換えDNA技術もしくは組換えRNA技術と組み合わせて、使用することができる。denovo合成のための適当な方法は、当技術分野で周知であり、特定の用途に適応させることができる。例示的な方法には、例えば、CEMなどの適当な保護基を使用する化学合成Masudaら2007年NucleicAcidsSymposiumSeries51巻:3~4頁、β-シアノエチルホスホラミダイト法BeaucageSLら1981年TetrahedronLett22巻:1859頁;ヌクレオシドH-ホスホネート法GareggPら1986年TetrahedronLett27巻:4051~4頁;FroehlerBCら1986年NuclAcidRes14巻:5399~407頁;GareggPら1986年TetrahedronLett27巻:4055~8頁;GaffneyBLら1988年TetrahedronLett29巻:2619~22頁が含まれる。これらの化学法を、市販されている自動核酸シンセサイザーとともに実施するか、またはこれとともに使用するのに適応させることができる。追加の適当な合成法は、Uhlmannら1990年ChemRev90巻:544~84頁、およびGoodchildJ1990年BioconjugateChem1巻:165頁に開示されている。核酸合成は、クローニング、プロセシング、ならびに/またはポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現を含めた、当技術分野で周知であり、慣例的である適当な組換え法を使用して実施することもできる。ランダム断片化ならびに遺伝子断片および合成ポリヌクレオチドのPCR再構築によるDNAシャッフリングは、ポリヌクレオチド配列を設計および操作するのに使用することができる公知の技法の例である。核酸およびコードされるタンパク質を変更する、例えば、新しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変更し、コドン選択を変化させ、スプライスバリアントを生成し、変異を導入するためなどに、部位特異的変異誘発を使用することができる。核酸配列の転写、翻訳、および発現のための適当な方法は、当技術分野で公知であり、慣例的である。一般に、CurrentProtocolsinMolecularBiology、2巻、Ausubelら編、GreenePublish.Assoc.WileyInterscience、13章、1988年;Glover、DNACloning、II巻、IRLPress、Wash.、D.C.、3章、1986年;Bitterら、MethodsinEnzymology153巻:516~544頁1987年;TheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces、Strathernら編、ColdSpringHarborPress、I巻およびII巻、1982年;ならびにSambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual、ColdSpringHarborPress、1989年を参照。自己複製RNA分子中の1つまたは複数の修飾ヌクレオチドの存在および/または量を、任意の適当な方法を使用して判定することができる。例えば、自己複製RNAを消化してモノホスフェートにし例えば、ヌクレアーゼP1を使用して、脱リン酸化することができ例えば、CIAPなどの適当なホスファターゼを使用して、得られるヌクレオシドを、逆相HPLC例えば、YMCPackODS-AQカラム5ミクロン、4.6×250mmを使用して、勾配30のB0~5分から100のB5~13分および100のB13~40分、流量0.7ml/分、UV検出波長:260nm、カラム温度30°C、バッファーA20mMの酢酸-酢酸アンモニウムpH3.5、バッファーB20mMの酢酸-酢酸アンモニウムpH3.5/メタノール[90/10]を使用して溶出するによって分析することができる。任意選択により、本発明の自己複製RNA分子は、自己複製RNA分子が、修飾ヌクレオチドを含有しない対応する自己複製RNA分子と比較して、宿主細胞例えば、ヒト細胞内に導入または進入した際により低い免疫調節活性を有することになるように、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。必要に応じて、自己複製RNA分子をスクリーニングまたは分析することによって、当業者に公知である様々なinvitroまたはinvivo試験法を使用して、その治療特性および予防特性を確認することができる。例えば、自己複製RNA分子を含むワクチンを、目的の特定のリンパ球型、例えば、B細胞、T細胞、T細胞株、およびT細胞クローンの増殖またはエフェクター機能の誘導に対する、ワクチンの効果について試験することができる。例えば、免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞を単離することができる。細胞傷害性Tリンパ球の、ポリペプチド抗原をコードする自己複製RNA分子を含有する自己標的細胞を溶解する能力。さらに、Tヘルパー細胞分化を、ELISAにより、TH1IL-2およびIFN-γサイトカインならびに/もしくはTH2IL-4およびIL-5サイトカインの増殖もしくは産生を測定することによって、または細胞質サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによってCD4T細胞内で直接に分析することができる。ポリペプチド抗原をコードする自己複製RNA分子は、例えば、目的の抗原に特異的な抗体のB細胞産生の誘導によって立証されるような、体液性免疫応答を誘導する能力についても試験することができる。これらのアッセイは、例えば、免疫化された個体に由来する末梢Bリンパ球を使用して行うことができる。このようなアッセイ法は、当業者に公知である。本発明の自己複製RNA分子を特徴付けるのに使用することができる他のアッセイでは、標的細胞による、コードされる抗原の発現の検出を伴う場合がある。例えば、FACSを使用することによって、細胞表面上または細胞内で抗原発現を検出することができる。FACS選択の別の利点は、異なるレベルの発現について選別することができることである。場合により、より低い発現が望まれる場合がある。特定の抗原を発現する細胞を同定するための他の適当な方法は、プレート上のモノクローナル抗体を使用するパニング、またはモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用する捕捉を伴う。B.抗原ある特定の実施形態では、本明細書に記載される負に荷電した分子は、抗原をコードする核酸分子例えば、RNA分子である。適当な抗原には、それだけに限らないが、細菌性bactertial抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、原生動物protazoan抗原、植物抗原、がん抗原、またはこれらの組合せが含まれる。適当な抗原には、病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、植物、または腫瘍に由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。自己複製RNA分子によってコードされ得るウイルス抗原ならびに免疫原として、それだけに限らないが、オルソミクソウイルス、例えば、インフルエンザA、B、およびCなど;パラミクソウイルス科ウイルス、例えば、ニューモウイルスRSV、パラミクソウイルスPIV、メタニューモウイルス、および麻疹ウイルスMorbillivirus例えば、麻疹measlesなど;ニューモウイルス、例えば、RSウイルスRSV、ウシRSウイルス、マウスの肺炎ウイルス、およびシチメンチョウ鼻気管支炎ウイルスなど;パラミクソウイルス、例えば、パラインフルエンザウイルス1~4型PIV、ムンプスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス5、ウシパラインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘニパウイルス、およびニューカッスル病ウイルスなど;真正痘瘡それだけに限らないが、大痘瘡および小痘瘡を含むなどのオルソポックスウイルスを含めたポックスウイルス科;メタニューモウイルス、例えば、ヒトメタニューモウイルスhMPVおよびトリメタニューモウイルスaMPVなど;麻疹measlesなどの麻疹ウイルスMorbillivirus;ピコルナウイルス、例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、パレコウイルス、カルジオウイルス、およびアフタウイルスなど;エンテロウイルス、例えば、ポリオウイルス1型、2型、または3型、コクサッキーAウイルス1~22型および24型、コクサッキーBウイルス1~6型、エコーウイルスECHOウイルス1~9型、11~27型、および29~34型、ならびにエンテロウイルス68~71など、カリフォルニア脳炎ウイルスなどのオルソブニヤウイルスを含めたブニヤウイルス;リフトバレー熱ウイルスなどのフレボウイルス;クリミアコンゴ出血熱ウイルスなどのナイロウイルス;A型肝炎ウイルスHAVなどのヘパルナウイルス;トガウイルス風疹、例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスなど;フラビウイルス、例えば、ダニ媒介脳炎TBEウイルス、デング熱1型、2型、3型、もしくは4型ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポーワッサン脳炎ウイルスなど;ペスチウイルス、例えば、ウシウイルス性下痢症BVDV、古典的ブタ熱CSFV、またはボーダー病BDVなど;ヘパドナウイルス、例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスなど;ラブドウイルス、例えば、リッサウイルス狂犬病ウイルス、およびベシクロウイルスVSVなど、カリシウイルス科、例えば、ノーウォークウイルスなど、ならびにノーウォーク様ウイルス、例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなど;コロナウイルス、例えば、SARS、ヒト呼吸器コロナウイルス、トリ感染性気管支炎IBV、マウス肝炎ウイルスMHV、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルスTGEVなど;レトロウイルス、例えば、オンコウイルス、レンチウイルス、またはスプマウイルスなど;レオウイルス、例えば、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスなど;パルボウイルスB19などのパルボウイルス;デルタ肝炎ウイルスHDV;E型肝炎ウイルスHEV;G型肝炎ウイルスHGV;ヒトヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルスHSV、水痘-帯状疱疹ウイルスVZV、エプスタイン-バーウイルスEBV、サイトメガロウイルスCMV、ヒトヘルペスウイルス6HHV6、ヒトヘルペスウイルス7HHV7、およびヒトヘルペスウイルス8HHV8など;パポバウイルス、例えば、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなど、アデノウイルスAdenoviruess、ならびにアレナウイルスに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原は、魚に感染するウイルス、例えば、伝染性サケ貧血ウイルスISAV、サケ膵臓病ウイルスSPDV、伝染性膵臓壊死症ウイルスIPNV、アメリカナマズウイルスCCV、魚のリンホシスチス病ウイルスFLDV、伝染性造血器壊死症ウイルスIHNV、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス大西洋サケのピコルナ様ウイルスとしても公知、ヤマメウイルスLSV、大西洋サケロタウイルスASR、マスイチゴ病ウイルスTSD、銀サケ腫瘍ウイルスCSTV、またはウイルス性出血性敗血症ウイルスVHSVなどに対する免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、抗原は、Plasmodium属、例えば、P.falciparum、P.vivax、P.malariae、またはP.ovaleなどに由来する寄生虫に対する免疫応答を誘発する。したがって、本発明は、マラリア対して免疫化するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、抗原は、Caligidae科、特に、Lepeophtheirus属およびCaligus属に由来する寄生虫、例えば、LepeophtheirussalmonisまたはCaligusrogercresseyiなどのフナムシに対する免疫応答を誘発する。自己複製RNA分子によってコードされ得る細菌性抗原および免疫原として、それだけに限らないが、Neisseriameningitides、Streptococcuspneumoniae、Streptococcuspyogenes、Moraxellacatarrhalis、Bordetellapertussis、Burkholderiasp.例えば、Burkholderiamallei、Burkholderiapseudomallei、およびBurkholderiacepacia、Staphylococcusaureus、Staphylococcusepidermis、Haemophilusinfluenzae、Clostridiumtetani破傷風、Clostridiumperfringens、Clostridiumbotulinumsボツリヌス中毒、Cornynebacteriumdiphtheriaeジフテリア、Pseudomonasaeruginosa、Legionellapneumophila、Coxiellaburnetii、Brucellasp.例えば、B.abortus、B.canis、B.melitensis、B.neotomae、B.ovis、B.suis、およびB.pinnipediae、Francisellasp.例えば、F.novicida、F.philomiragia、およびF.tularensis、Streptococcusagalactiae、Neiserriagonorrhoeae、Chlamydiatrachomatis、Treponemapallidum梅毒、Haemophilusducreyi、Enterococcusfaecalis、Enterococcusfaecium、Helicobacterpylori、Staphylococcussaprophyticus、Yersiniaenterocolitica、E.coli腸毒素産生性E.coliETEC、腸管凝集性E.coliEAggEC、分散接着性E.coliDAEC、腸管病原性E.coliEPEC、腸外病原性E.coliExPEC;尿路疾患性E.coliUPEC、および髄膜炎/敗血症関連E.coliMNECなど、ならびに/または腸管出血性E.coliEHEC、Bacillusanthracis炭疽、Yersiniapestisペスト、Mycobacteriumtuberculosis、Rickettsia、Listeriamonocytogenes、Chlamydiapneumoniae、Vibriocholerae、Salmonellatyphi腸チフス、Borreliaburgdorfer、Porphyromonasgingivalis、Klebsiella、Mycoplasmapneumoniaeなどに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。自己複製RNA分子によってコードされ得る真菌抗原および免疫原として、それだけに限らないが、皮膚糸状菌Dermatophytres、例えば、に由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。自己複製RNA分子によってコードされ得る原生動物抗原および免疫原には、それだけに限らないが、Entamoebahistolytica、Giardialambli、Cryptosporidiumparvum、Cyclosporacayatanensis、およびToxoplasmaに由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。自己複製RNA分子によってコードされ得る植物抗原および免疫原には、それだけに限らないが、Ricinuscommunisに由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。適当な抗原として、ウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルスHIV、A型肝炎ウイルスHAV、B型肝炎ウイルスHBV、C型肝炎ウイルスHCV、単純ヘルペスウイルスHSV、サイトメガロウイルスCMV、インフルエンザウイルスインフルエンザ、RSウイルスRSV、パルボウイルスparvovorus、ノロウイルス、ヒトパピローマウイルスHPV、ライノウイルス、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス、デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エンテロウイルス例えば、エンテロウイルス71、エボラウイルス、およびウシ下痢症ウイルスなどに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。抗原性物質は、HSV糖タンパク質gD、HIV糖タンパク質gp120、HIV糖タンパク質gp40、HIVp55gag、ならびにpol領域およびtat領域に由来するポリペプチドからなる群より選択されることが好ましい。本発明の他の好適な実施形態では、抗原は、細菌、例えば、Helicobacterpylori、Haemophilusinfluenza、Vibriocholeraeコレラ、C.diphtheriaeジフテリア、C.tetani破傷風、Neisseriameningitidis、B.pertussis、Mycobacteriumtuberculosisなどに由来するタンパク質またはペプチドである。本発明の自己複製RNA分子によってコードされ得るHIV抗原は、1990年3月9日に出願された米国出願第490,858号、公開された欧州出願第181150号1986年5月14日、ならびに米国出願第60/168,471号;同第09/475,515号;同第09/475,504号;および同第09/610,313号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本発明の自己複製RNA分子によってコードされ得るサイトメガロウイルス抗原は、米国特許第4,689,225号、1989年6月16日に出願された米国出願第367,363号、およびPCT公開第WO89/07143号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本発明の自己複製RNA分子によってコードされ得るC型肝炎抗原は、PCT/US88/04125、公開された欧州出願第318216号1989年5月31日、1988年11月18日に出願された、公開された日本国出願第1-500565号、カナダ国出願第583,561号、およびEPO388,232に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。異なるセットのHCV抗原は、1990年3月16日に出願された欧州特許出願第90/302866.0号、および1989年12月21日に出願された米国出願第456,637号、およびPCT/US90/01348に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。いくつかの実施形態では、抗原は、アレルゲン、例えば、花粉アレルゲン樹木、ハーブ、雑草、および草の花粉アレルゲン;昆虫またはクモ形類のアレルゲン吸入アレルゲン、唾液アレルゲン、および毒液アレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリおよび小昆虫のアレルゲン、膜翅目hymenopthera毒液アレルゲン;動物の毛アレルゲンおよびフケアレルゲン例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどからの;ならびに食物アレルゲン例えば、グリアジンから得られる。樹木、草、ならびにハーブに由来する重要な花粉アレルゲンは、それだけに限らないが、カバノキBetula、ハンノキAlnus、ハシバミCorylus、シデCarpinus、およびオリーブOlea、シーダーCryptomeriaおよびJuniperus、プラタナスPlatanusを含めたFagales、Oleales、Pinalesの分類学上の目およびスズカケノキ科、Lolium属、Phleum属、Poa属、Cynodon属、Dactylis属、Holcus属、Phalaris属、Secale属、およびSorghum属の草を含むPoales目、Ambrosia属、Artemisia属、およびParietaria属のハーブを含むAsterales目およびUrticales目が起源であるものである。他の重要な吸入性アレルゲンは、Dermatophagoides属およびEuroglyphus属のイエダニ、貯蔵庫ダニ、例えば、Lepidoglyphys、Glycyphagus、およびTyrophagusに由来するもの、ゴキブリ、小昆虫、およびノミ、例えば、Blatella、Periplaneta、Chironomus、およびCtenocepphalidesに由来するもの、ならびに哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、およびウマなどに由来するもの、ミツバチApidae、スズメバチVespidea、およびアリFormicoidaeを含む膜翅目の分類学上の目からのものなどの刺咬昆虫stingingorbitinginsectが起源であるものを含めた毒液アレルゲンである。ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原もしくは抗原、またはがん免疫原もしくは抗原は、自己複製RNA分子によってコードされ得る。ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原および抗原は、ペプチド含有腫瘍抗原、例えば、ポリペプチド腫瘍抗原または糖タンパク質腫瘍抗原である。本明細書で使用するのに適した腫瘍免疫原および抗原は、aポリペプチドこれは、例えば、長さが8~20アミノ酸の範囲とすることができるが、この範囲外の長さも一般的である、リポポリペプチド、および糖タンパク質を含めたポリペプチド含有腫瘍抗原などの多種多様な分子を包含する。ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原は、例えば、aがん細胞に関連する全長分子、b欠失、付加および/または置換された部分を有する分子を含めた、この全長分子の相同体および修飾形態、ならびにcこの全長分子の断片である。腫瘍免疫原には、例えば、CD8リンパ球によって認識されるクラスI制限抗原、またはCD4リンパ球によって認識されるクラスII制限抗原が含まれる。ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原として、それだけに限らないが、aがん精巣抗原、例えば、NY-ESO-1、SSX2、SCP1、ならびにRAGE、BAGE、GAGE、およびMAGEファミリーポリペプチド、例えば、GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、およびMAGE-12などこれらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、NSCLC、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用することができる、b変異抗原、例えば、p53様々な固形腫瘍、例えば、結腸直腸、肺、頭頸部のがんに関連する、p21/Ras例えば、黒色腫、膵がん、および結腸直腸がんに関連する、CDK4例えば、黒色腫に関連する、MUM1例えば、黒色腫に関連する、カスパーゼ-8例えば、頭頸部がんに関連する、CIA0205例えば、膀胱がんに関連する、HLA-A2-R1701、βカテニン例えば、黒色腫に関連する、TCR例えば、T細胞非ホジキンリンパ腫に関連する、BCR-abl例えば、慢性骨髄性白血病に関連する、トリオースリン酸イソメラーゼ、KIA0205、CDC-27、およびLDLR-FUT、c過剰発現抗原、例えば、ガレクチン4例えば、結腸直腸がんに関連する、ガレクチン9例えば、ホジキン病に関連する、プロテイナーゼ3例えば、慢性骨髄性白血病に関連する、WT1例えば、様々な白血病に関連する、炭酸脱水酵素例えば、腎がんに関連する、アルドラーゼA例えば、肺がんに関連する、PRAME例えば、黒色腫に関連する、HER-2/neu例えば、乳房、結腸、肺、および卵巣のがんに関連する、アルファ-フェトプロテイン例えば、肝細胞がんに関連する、KSA例えば、結腸直腸がんに関連する、ガストリン例えば、膵がん、および胃がんに関連する、テロメラーゼ触媒タンパク質、MUC-1例えば、乳がん、および卵巣がんに関連する、G-250例えば、腎細胞がんに関連する、p53例えば、乳がん、結腸がんに関連する、およびがん胎児性抗原例えば、乳がん、肺がん、および結腸直腸がんなどの胃腸管のがんに関連する、d共通抗原、例えば、黒色腫-メラノサイト分化抗原、例えば、MART-1/メランA、gp100、MC1R、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質-1/TRP1、およびチロシナーゼ関連タンパク質-2/TRP2など例えば、黒色腫に関連する、e例えば、前立腺がんに関連する前立腺関連抗原、例えば、PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2など、f免疫グロブリンイディオタイプ例えば、骨髄腫およびB細胞リンパ腫に関連するが挙げられる。ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原として、それだけに限らないが、p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、エプスタインバーウイルス抗原、EBNA、E6およびE7を含めたヒトパピローマウイルスHPV抗原、B型肝炎ウイルス抗原およびC型肝炎ウイルス抗原、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス抗原、Mac-2結合タンパク質/サイクロフィリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、TPSなどが挙げられる。C.負に荷電した分子についての水性溶液負に荷電した分子RNAなどは、一般に、水性溶液の形態、または水性溶液中に容易に溶解することができる形態例えば、凍結乾燥したで提供される。水性溶液は、水、または塩例えば、NaCl、バッファー例えば、クエン酸バッファー、重量オスモル濃度もしくは張性の調整剤例えば、サッカリド、ポリマー、界面活性剤、もしくはこれらの組合せを含む水性溶液とすることができる。処方物がinvivo投与のために意図されている場合、水性溶液は、正常な生理的条件と適合性であるpHを維持する生理学的に許容されるバッファーであることが好ましい。また、ある特定の場合では、処方物のある特定の成分の安定性を保証するために、pHを特定のレベルに維持することが望ましい場合がある。例えば、等張性および/または等浸透圧である水性溶液を調製することが望ましい場合がある。高張性および低張性の溶液は、注入されたとき、組成物と生理学的な液との間でイオン濃度が異なるために、組成物の投与後の膨張または急速な吸収などの厄介な問題および望ましくない影響を場合により引き起こすことがある。張性を制御するために、エマルジョンは、ナトリウム塩などの生理的な塩を含むことができる。例えば、塩化ナトリウムNaClを、約0.9w/v生理食塩水で使用することができる。存在する場合がある他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。例示的な実施形態では、水性溶液は、10mMのNaCl、および他の塩、または非イオン性等張化剤を含む。本明細書に記載されるように、非イオン性等張化剤も、張性を制御するのに使用することができる。水性溶液を、緩衝化させることができる。任意の生理学的に許容されるバッファー、例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、トリスバッファー、ビカルボネートバッファー、カルボネートバッファーなどを本明細書で使用することができる。水性溶液のpHは、好ましくは、6.0~8.0、好ましくは、約6.2~約6.8となる。いくつかの場合では、ある特定の量の塩をバッファー中に含めることができる。他の場合では、バッファー中の塩は、負に荷電した分子のエマルジョン粒子への複合体形成に干渉し得、したがって、回避される。水性溶液は、追加の成分、例えば、水性溶液の容量オスモル濃度を変化させる分子、または複合体形成後の負に荷電した分子を安定化させる分子なども含むことができる。例えば、一般に炭水化物であるが、ポリマーとすることもできる非イオン性等張化剤を使用して、重量オスモル濃度を調整することができる。例えば、VoetおよびVoet1990年BiochemistryJohnWileySons、NewYorkを参照。適当な非イオン性等張化剤の例には、糖例えば、トレハロース、スクロース、デキストロース、フルクトース、還元パラチノースなど、糖アルコールマンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、マルチトール、グリセロールなど、およびこれらの組合せが含まれる。必要に応じて、非イオン性ポリマー例えば、ポリアルキルグリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリブチレングリコールなど、または非イオン性界面活性剤を使用することができる。これらのタイプの作用物質、特に、糖および糖アルコールは、凍結乾燥されたとき、RNA、および他の負に荷電した分子を保護することができる凍結保護物質でもある。例示的な実施形態では、バッファーは、約560nM~600mMのトレハロース、スクロース、ソルビトール、またはデキストロースを含む。いくつかの場合では、高張性溶液として、負に荷電した分子を含む水性溶液を調製し、純水または低張性バッファーを使用してカチオン性エマルジョンを調製することが好ましい場合がある。エマルジョンと負に荷電した分子が合わされると、混合物は、等張性となる。例えば、RNAを含む水性溶液を2×高張性溶液とすることができ、カチオン性エマルジョンを、10mMのクエン酸バッファーを使用して調製することができる。RNA溶液とエマルジョンが1:1v/vの比で混合されると、組成物は等張性となる。エマルジョンと負に荷電した分子を含む水性溶液の所望の相対量例えば、1:1v/vの混合、2:1v/vの混合、1:2v/vの混合などに基づいて、等張性の混合物を達成するのに必要とされる水性溶液の張性を容易に決定することができる。同様に、生理的な重量オスモル濃度を有する組成物が、invivo投与にとって望ましい場合がある。生理的な重量オスモル濃度は、水1kg当たり約255mOsm~水1kg当たり約315mOsmである。場合により、高浸透圧性溶液として、負に荷電した分子を含む水性溶液を調製し、純水または低浸透圧性バッファーを使用してカチオン性エマルジョンを調製することが好ましい場合がある。エマルジョンと負に荷電した分子が合わされると、生理的な重量オスモル濃度が達成される。エマルジョンと負に荷電した分子を含む水性溶液の所望の相対量例えば、1:1v/vの混合、2:1v/vの混合、1:2v/vの混合などに基づいて、等浸透圧性の混合物を達成するのに必要とされる水性溶液の重量オスモル濃度を容易に決定することができる。ある特定の実施形態では、負に荷電した分子を含む水性溶液は、ポリマー、もしくは界面活性剤、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。例示的な実施形態では、水中油型エマルジョンは、ポロキサマーを含有する。特に、本発明者らは、カチオン性エマルジョン粒子との複合体形成の前に、RNA水性溶液にPluronic登録商標F127を添加すると、RNA分子の安定性がより大きくなり、RNA分子のRNase耐性が増大することを観察した。RNA水性溶液にpluronicF127を添加すると、RNA/CNE複合体の粒子サイズが小さくなることも見出された。ポロキサマーポリマーはまた、RNA分子の適切な脱複合体形成/放出を促進し、エマルジョン粒子の凝集を防止し、免疫調節効果を有することができる。使用することができる他のポリマーには、例えば、Pluronic登録商標F68、またはPEG300が含まれる。代わりにまたはさらに、負に荷電した分子を含む水性溶液は、約0.05~約20w/vのポリマーを含むことができる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.05~約10w/v、例えば、0.05、0.5、1、または5などで、ポリマー例えば、ポロキサマー、例えば、Pluronic登録商標F127、Pluronic登録商標F68、またはPEG300を含むことができる。緩衝系は、2つ以上の上述した分子塩、バッファー、サッカリド、ポリマーなどの任意の組合せを含むことができる。好適な実施形態では、バッファーは、560mMのスクロース、20mMのNaCl、および2mMのクエン酸塩を含み、これを、本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンと混合することによって、280mMのスクロース、10mMのNaCl、および1mMのクエン酸塩を含む最終的な水相を生成することができる。5.調製方法別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンを調製するステップであって、エマルジョンが、1約0.2~約20v/vの油、2約0.01~約2.5v/vの界面活性剤および3カチオン性脂質を含む、ステップと、負に荷電した分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、負に荷電した分子をカチオン性水中油型エマルジョンに添加するステップとを含む、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法を提供する。カチオン性水中油型エマルジョンを作製するための例示的な一アプローチは、1油およびカチオン性脂質を合わせて、エマルジョンの油相を形成するステップと、2水性溶液を提供して、エマルジョンの水相を形成するステップと、3例えば、均質化によって水相中に油相を分散させるステップとを含むプロセスによるものである。均質化は、任意の適した方法で、例えば、市販のホモジナイザー例えば、IKAT25ホモジナイザー、VWRInternationalWestChester、PAで入手可能を使用して達成され得る。カチオン性脂質を、クロロホルムCHCl3、ジクロロメタンDCM、エタノール、アセトン、テトラヒドロフランTHF、2,2,2トリフルオロエタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ヘキサン、ジメチルホルムアミドDMF、ジメチルスルホキシドDMSOなどといった適した溶媒に溶解させ、エマルジョンの油成分に直接的に添加してもよい。あるいは、カチオン性脂質を、適した溶媒に添加してリポソーム懸濁物を形成し、次いで、リポソーム懸濁物をエマルジョンの油成分に添加してもよい。カチオン性脂質はまた、油中に直接的に溶解させてもよい。脂質の溶解を促進するために、油を約30°C~約65°Cの温度に加熱することが望ましい場合がある。カチオン性脂質例えば、DOTAPの所望の量を測定し、本明細書において記載され、例示されるような所望の最終濃度に達するように、溶媒中、水中、または油中に直接的に溶解してもよい。クロロホルムCHCl3またはジクロロメタンDCMなどの溶媒は、水相および油相を合わせる前に、または均質化の前に、例えば、蒸発によって油相から除去してもよい。あるいは、脂質溶解度が問題であり得る場合には、一次エマルジョンを依然として油相において溶媒例えば、DCMを用いて作製してもよい。このような場合には、溶媒は、第2の均質化の前に一次エマルジョンから除去することができる例えば、蒸発させる。エマルジョンが1種または複数の界面活性剤を含む場合には、界面活性剤複数可は、当技術分野における従来の慣例に従って油相に含まれる場合も、水相に含まれる場合もある。例えば、SPAN85は、油相例えば、スクアレンに溶解させることができ、Tween80は、水相例えば、クエン酸バッファーに溶解させてもよい。別の態様では、本発明は、i本明細書に記載されるようなカチオン性水中油型エマルジョンを提供するステップと、ii負に荷電した分子RNAなどを含む水性溶液を提供するステップと、iii負に荷電した分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、iの水中油型エマルジョンおよびiiiの水性溶液を合わせるステップとを含む、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子RNAなどを含む組成物を調製する方法を提供する。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンを、負に荷電した分子を含む水性溶液例えば、RNA水性溶液と、任意の所望の相対量、例えば、約1:1v/v、約1.5:1v/v、約2:1v/v、約2.5:1v/v、約3:1v/v、約3.5:1v/v、約4:1v/v、約5:1v/v、約10:1v/v、約1:1.5v/v、約1:2v/v、約1:2.5v/v、約1:3v/v、約1:3.5v/v、約1:4v/v、約1:1.5v/vまたは約1:1.10v/vなどで合わせてもよい。複合体形成後組成物例えば、RNA-エマルジョン複合体の各成分の濃度は、使用される、複合体形成前水中油型エマルジョンおよび負に荷電した分子を含む水性溶液例えば、RNA水性溶液の相対量に従って、容易に決定できる。例えば、カチオン性水中油型エマルジョンが、1:1v:v比で負に荷電した分子を含む水性溶液例えば、RNA水性溶液と合わされる場合には、油およびカチオン性脂質の濃度は、複合体形成前エマルジョンのものの1/2となる。したがって、4.3w/vスクアレン、1.4mg/mLDOTAP、0.5v/vSPAN85および0.5v/vTween80を含むエマルジョン本明細書においてCNE17と呼ばれるが、560mMスクロース、20mMNaCl、2mMクエン酸塩および1w/vPluronicF127を含むRNA水性溶液と、1:1v:vで合わされる場合には、複合体形成後組成物は、2.15w/vスクアレン、0.7mg/mLDOTAP、0.25v/vSPAN85、0.25v/vTween80、280mMスクロース、10mMNaCl、1mMクエン酸塩および0.5w/vPluronicF127を含む。粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、負に荷電した分子の安定性を増大し例えば、RNA分子の分解を防ぎ、負に荷電した分子RNA分子などの適当な脱複合体形成/放出を促進し、またはエマルジョン粒子の凝集を防ぐ、さらなる任意選択のステップが含まれてもよい。例えば、ポリマー例えば、Pluronic登録商標F127または界面活性剤を、負に荷電した分子RNAなどを含む水性溶液に添加してもよい。例示的一実施形態では、エマルジョン粒子との複合体形成の前に、Pluronic登録商標F127がRNA分子に添加される。エマルジョン粒子のサイズは、油に対する界面活性剤の比比を増大すると、液滴のサイズが減少する、運転圧力運転圧力を増大すると、液滴のサイズが減少する、温度温度を高めると、液滴のサイズが減少するおよびその他の処理パラメータを変更することによって変えることができる。実際の粒子サイズは、使用される特定の界面活性剤、油およびカチオン性脂質によって、選択された特定の運転条件によっても変わる。エマルジョン粒子サイズは、CoulterCorporationによって製造された、市販のSub-MicronParticleAnalyzerモデルN4MDなどの分粒機器sizinginstrumentを使用することによって確認でき、粒子の平均直径が、1μm未満、0.9μm未満、0.8μm未満、0.7μm未満、0.6μm未満、0.5μm未満、0.4μm未満、0.3μm未満、0.2μm未満または0.1μm未満となるまで、パラメータを上記で記載されたガイドラインを使用して変更することができる。好ましくは、粒子は、約400nm以下、約300nm以下、約200nm以下、約180nm以下、約150nm以下または約140nm以下、約50nm~180nm、約60nm~180nm、約70nm~180nmまたは約80nm~180nm、約80nm~170nm、約80nm~160nm、約80nm~150nmまたは約80nm~140nmの平均直径を有する。いくつかの場合には、カチオン性エマルジョンの平均粒子サイズが、無菌濾過を可能にする200nm以下であることが望ましい場合がある。その他の場合には、無菌濾過は、必要ではなく、カチオン性エマルジョンの平均粒子サイズは、200nm超であってもよい。カチオン性水中油型エマルジョン複合体形成前エマルジョンまたは負に荷電した分子-エマルジョン複合体を調製するための任意選択のプロセスとして、例えば、滅菌、粒子サイズ選択例えば、大きな粒子を除去すること、充填、パッケージングおよび標識などが挙げられる。例えば、複合体形成前エマルジョンまたは負に荷電した分子-エマルジョン複合体が、invivo投与のために処方される場合には、例えば、滅菌グレードフィルターを通した例えば、0.22ミクロンフィルターを通した濾過によって滅菌され得る。その他の滅菌技術として、熱プロセスまたは放射線滅菌プロセスまたは滅菌組成物を製造するためにパルス光を使用することが挙げられる。本明細書に記載されたカチオン性水中油型エマルジョンを使用してワクチンを製造してもよい。MF59について記載されたような同様の方法を使用して、滅菌および/または臨床グレードのカチオン性水中油型エマルジョンを調製できる。例えば、VACCINEADJUVANTSO’Hagan編、HumanaPress中の、Ottら、MethodsinMolecularMedicine、2000年、第42巻、211~228頁参照のこと。例えば、MF59の製造プロセスと同様に、エマルジョンの油相および水相を合わせ、インラインホモジナイザーにおいて処理して、粗エマルジョンを得ることができる。次いで、粗エマルジョンをマイクロフルイダイザー中に送り、そこでさらに処理して、安定なサブミクロンエマルジョンを得ることができる。粗エマルジョンを、所望の粒子サイズが得られるまで、マイクロフルイダイザーの相互作用チャンバーに繰り返し通してもよい。次いで、バルクエマルジョンを濾過して例えば、窒素下で0.22μmフィルターを通して、大きな粒子を除去し、エマルジョンバルクを得、これを適した容器例えば、ガラス瓶中に充填してもよい。自己貯蔵selfstorageについて、水中油型エマルジョンの存在下での長期の安定性を実証したワクチン抗原については、抗原およびエマルジョンを合わせ、無菌濾過例えば、0.22μmフィルターメンブランを通してしてもよい。合わせた単一バイアルワクチンを、単回用量容器中に充填してもよい。長期の安定性が実証されていないワクチン抗原については、エマルジョンを別個のバイアルとして供給することができる。このような場合には、エマルジョンバルクを濾過滅菌例えば、0.22μmフィルターメンブランを通してし、最終単回用量バイアルに充填し、パッケージングしてもよい。品質管理は、場合により、エマルジョンバルクまたは混合ワクチンの小サンプルで実施してもよく、サンプルが品質管理試験に合格する場合にのみ、バルクまたは混合ワクチンを用量にパッケージングする。6.医薬組成物および投与別の態様では、本発明は、本明細書に記載される、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む医薬組成物を提供し、1種または複数の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ワクチンとして使用することができる免疫原性組成物である。あるいは、本明細書において記載された組成物を使用して、負に荷電した分子を細胞に送達してもよい。例えば、種々の目的のために、例えば、遺伝子療法などのために、所望の遺伝子産物例えば、タンパク質の産生を誘導するために、遺伝子の発現を調節するために、核酸分子例えば、DNAまたはRNAを細胞に送達することができる。また、本明細書に記載された組成物を使用して、治療目的で、例えば、がんまたは増殖性障害、代謝疾患、心血管疾患、感染、アレルギーなどの疾患を処置するために、免疫応答を誘導するなどのために、核酸分子例えば、DNAまたはRNAを細胞に送達してもよい。例えば、標的遺伝子の発現を阻害するために、核酸分子を細胞に送達してもよい。このような核酸分子として、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNAなどの二本鎖RNAなどが挙げられる。低分子干渉RNAなどの二本鎖RNA分子は、対応する標的遺伝子を特異的にサイレンシングする遺伝子ノックダウンRNA干渉を引き起こし得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に相補的であるDNAまたはRNAの一本鎖である。一般に、アンチセンスRNAは、特定のメッセンジャーRNA鎖のタンパク質翻訳を、それと結合することによって妨げることができる。アンチセンスDNAを使用して、特異的な、相補的なコーディングまたは非コーディングRNAを標的とすることができる。したがって、本明細書に記載されたカチオン性エマルジョンは、例えば、がんの処置のために腫瘍学標的の産生を阻害することによる、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは二本鎖RNAを送達するのに有用である。本明細書において提供された医薬組成物は、単独で投与しても、1種または複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与してもよい。投与法として、それだけには限らないが、経口投与、直腸投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、硝子体内投与、筋肉内投与、吸入、鼻腔内投与、局所投与、眼部投与または耳への投与が挙げられる。本明細書に記載された組成物の治療上有効な量は、とりわけ、示された疾患、疾患の重篤度、被験体の年齢および関連のある健康状態、投与される化合物の効力、投与様式および所望の処置に応じて変わる。その他の実施形態では、本明細書に記載された医薬組成物は、1種または複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与してもよい。さらなる治療薬として、それだけには限らないが、抗生物質または抗菌薬、制吐薬、抗真菌薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、サイトカイン、抗うつ剤、ホルモン、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、有糸分裂阻害薬、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞増殖抑制剤、抗浸潤薬anti-invasionagent、抗血管新生薬、ウイルス複製の増殖因子機能阻害剤の阻害剤、ウイルス酵素阻害剤、抗がん剤、α-インターフェロン、β-インターフェロン、リバビリン、ホルモンおよびその他のトル様受容体モジュレーター、免疫グロブリンIgおよびIg機能を調節する抗体抗IgEオマリズマブなどが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、それだけには限らないが、性器疣贅、尋常性疣贅、足底疣贅、狂犬病、RSウイルスRSV、B型肝炎、C型肝炎、デングウイルス、黄熱病、単純ヘルペスウイルスほんの一例として、HSV-I、HSV-II、CMVまたはVZV、伝染性軟属腫、ワクシニア、痘瘡、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルスHIV、ヒトパピローマウイルスHPV、肝炎ウイルスC型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルスCMV、水痘帯状疱疹ウイルスVZV、ライノウイルス、エンテロウイルス例えば、EV71、アデノウイルス、コロナウイルス例えば、SARS、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、アレナウイルスほんの一例として、LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルスおよびラッサ熱およびフィロウイルスほんの一例として、エボラウイルスまたはマールブルグウイルスなどのウイルス性疾患をはじめとする、本明細書に開示された病原体によって引き起こされる疾患をはじめとする感染性疾患の処置において使用される。特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、それだけには限らないが、マラリア、結核およびmycobacteriumavium、ハンセン病;pneumocystiscarnii、クリプトスポリジウム症、ヒストプラスマ症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ感染、リーシュマニア症、Escherichia属、Enterobacter属、Salmonella属、Staphylococcus属、Klebsiella属、Proteus属、Pseudomonas属、Streptococcus属およびChlamydia属の細菌によって引き起こされる感染ならびにカンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症およびクリプトコッカス髄膜炎などの真菌感染症をはじめとする細菌感染症、真菌感染症および原生動物感染症の処置において使用される。特定の実施形態では、本明細書において提供された医薬組成物は、同種移植片拒絶、自己免疫およびアレルギー、がん、または瘢痕および皺などの損傷を受けた皮膚もしくは加齢皮膚をはじめとする、呼吸器疾患および/または障害、皮膚科障害、眼性疾患および/または障害、泌尿生殖器疾患および/または障害の処置において使用される。別の態様では、本発明は、有効量の本明細書に開示された組成物を投与するステップを含む、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において、免疫応答を発生させるかまたは強化する方法を提供する。免疫応答は、好ましくは、保護的であり、好ましくは、抗体および/または細胞媒介性免疫を含む。本方法は、一次免疫応答を誘導するため、および/または免疫応答をブーストboostするために使用してもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、例えば、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において免疫応答を引き起こすかまたは増強することにおいて使用するための、医薬として使用してもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、哺乳動物などのそれを必要とする被験体において免疫応答を発生させるかまたは強化するための医薬の製造において使用してもよい。本発明はまた、本明細書に開示された組成物またはワクチンを予め充填された送達デバイスを提供する。哺乳動物は、好ましくは、ヒトであるが、本明細書の範囲内の病原体は、広範な種にわたって問題となり得るので、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ネコまたはイヌであってもよい。ワクチンが、予防的使用のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、小児例えば、幼児または乳児、十代の若者または成人であり;ワクチンが、治療的使用のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、十代の若者または成人である。小児を対象としたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために成人に投与してもよい。治療的処置の有効性を調べる1つの方法は、本明細書に開示された組成物またはワクチンの投与後に病原体感染をモニタリングすることを含む。予防的処置の有効性を調べる1つの方法は、抗原に対する免疫応答を全身的にモニタリングすることIgG1およびIgG2a産生のレベルをモニタリングすることなどおよび/または粘膜的にモニタリングすることIgA産生のレベルをモニタリングすることなどを含む。通常、抗原特異的粘膜抗体応答は、免疫化後およびチャレンジ後に決定されるのに対し、抗原特異的血清抗体応答は、免疫化後であるが、チャレンジ前に決定される。核酸分子例えば、RNAがタンパク質抗原をコードする、本明細書に開示された組成物またはワクチンの免疫原性を評価する別の方法は、免疫ブロットおよび/またはマイクロアレイによって患者の血清または粘膜分泌物をスクリーニングするために組換えによってタンパク質抗原を発現させることである。タンパク質と患者サンプルとの間の陽性反応は、患者が、問題のタンパク質に対する免疫応答を開始したことを示す。この方法はまた、免疫優性抗原および/またはタンパク質抗原内のエピトープを同定するために使用してもよい。組成物の有効性はまた、目的の感染症の病原体の適当な動物モデルをチャレンジすることによってinvivoで決定できる。投与量は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫化スケジュールおよび/またはブースタースケジュールにおいて使用してよい。複数回用量スケジュールでは、種々の用量を、同一または異なる経路、例えば、非経口の一次免疫および粘膜のブースト、粘膜の一次免疫および非経口のブーストなどによって与えてもよい。複数回用量は、通常、少なくとも1週間例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間などの間隔で投与する。1種もしくは複数の抗原を含むか、または1種もしくは複数の抗原と組み合わせて使用される本明細書に開示された組成物は、小児および成人の両方を処置するために使用できる。したがって、ヒト被験体は、1歳未満、1~5歳、5~15歳、15~55歳または少なくとも55歳であり得る。組成物を受け取るのに好ましい被験体は、高齢者例えば、>50歳、>60歳、好ましくは、>65歳、若年者例えば、<5歳、入院患者、医療従事者、軍職員および軍人、妊婦、慢性疾患患者または免疫不全患者である。しかし、組成物は、これらの群にのみ適しているのではなく、集団においてより全般的に使用してもよい。1種もしくは複数の抗原を含むか、または1種もしくは複数の抗原と組み合わせて使用される本明細書に開示された組成物は、その他のワクチンと実質的に同時に例えば、同一の医療相談または医療専門家もしくは予防接種センターへの訪問の際に、例えば、麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、MMRワクチン、水痘ワクチン、MMRVワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、DTPワクチン、結合型H.インフルエンザb型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、B型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン四価ACW135Yワクチンなど、RSウイルスワクチンなどと実質的に同時に患者に投与してもよい。特定の実施形態では、本明細書において提供された組成物は、1種もしくは複数のアジュバントなどの免疫調節剤を含むか、または場合により含んでもよい。例示的アジュバントとして、それだけには限らないが、以下でさらに論じるTH1アジュバントおよび/またはTH2アジュバントが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書において提供された免疫原性組成物において使用されるアジュバントとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる:1.ミネラル含有組成物;2.油エマルジョン;3.サポニン処方物;4.ビロソームおよびウイルス様粒子;5.細菌または微生物誘導体;6.生体接着剤bioadhesiveおよび粘膜付着剤mucoadhesive;7.リポソーム;8.ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物;9.ポリホスファゼンPCPP;10.ムラミルペプチド;11.イミダゾキノロン化合物;12.チオセミカルバゾン化合物;13.トリプタントリン化合物;14.ヒト免疫調節物質;15.リポペプチド;16.ベンゾナフチリジン;17.微粒子18.免疫賦活性ポリヌクレオチドRNAまたはDNAなど;例えば、CpG含有オリゴヌクレオチド。ここで、一般的に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されよう。これらは、単に本発明の特定の態様および実施形態を例示する目的で含まれるのであって、本発明を制限しようとするものではない。実施例1カチオン性水中油型エマルジョンの開発自己複製RNAの送達のために、3種のカチオン性ナノエマルジョンCNEを開発した。タイプ1エマルジョンは、MF59様エマルジョンである。これらのエマルジョンは、カチオン性脂質が添加された点を除いてMF59と同一成分から作製した。タイプ2エマルジョンは、MF59中のSpan85およびTween80をリン脂質で置き換えたエマルジョンである。タイプ3エマルジョンは、脂質またはその他の界面活性剤のいずれかによって安定化され、エマルジョンの水相中にさらなるポリマーまたは界面活性剤を有し得るハイブリッドエマルジョンである。タイプ1エマルジョンの調製では、3種の異なる脂質を使用した:1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン塩化物DOTAP、3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロール塩酸塩DCコレステロールおよびジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩DDA。タイプ2およびタイプ3エマルジョンの調製では、DOTAPを使用した。用語N/P比とは、RNA上のリン酸の量に対するカチオン性脂質中の窒素の量を指す。窒素は、試験されるカチオン性脂質内で電荷を有する元素である。リン酸はRNA骨格上に見られ得る。10/1というN/P電荷比は、RNA上の負に荷電したリン酸各々に対して、カチオン性脂質に由来する10個の正に荷電した窒素があることを示す。タイプ1CNE:このクラスのエマルジョンについては、Tween80、Span85、スクアレンおよびクエン酸バッファーの比は、変更しなかった。これらのエマルジョンは、MF59と同一濃度で調製した。用量あたりの与えられるカチオン性脂質の全量は、脂質濃度にかかわらず、一定のままである。例えば、10/1のN/P比で0.8mg/mlDOTAPエマルジョンを用いてエマルジョンにおいて送達されるRNAの10μgの用量は、2×希釈を必要とする。したがって、送達されるスクアレンの量は、MF59を用いる免疫化の際に普通に投与されるものの1/2となる。あるいは、10/1のN/P比で1.6mg/mlDOTAPを用いたエマルジョンにおいて送達されるRNAの10μgの用量は、4×希釈を必要とする。この実施例では、タイプ1エマルジョンの17種の異なる処方物を調製した。エマルジョンを作製することができたカチオン性脂質の範囲を以下に列挙する:0.8mg/mlから最大1.6mg/mlのDOTAP濃度を有する処方物はすべて、安定なエマルジョンをもたらした。0.62mg/mlから最大2.46mg/mlのDCコレステロール濃度を有する処方物はすべて、安定なエマルジョンをもたらした。0.73mg/mlから最大1.64mg/mlのDDA濃度を有する処方物はすべて、安定なエマルジョンをもたらした。タイプ2CNE:スクアレンの百分率は、タイプ2CNEの場合には変動した。MF59からのもう1つの相違は、これらのエマルジョンは、クエン酸バッファー中ではなく水中で作製したという点である。これらのエマルジョンは、脂質安定化剤として1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDOPEおよびホスファチジルコリン卵PCを用いて作製した。エマルジョンは、タイプ1エマルジョン研究から得られた最適濃度のDOTAP、DCコレステロールまたはDDAのいずれかとともにDOPEおよび卵PCを使用して作製した。安定化剤としてDOTAPのみを使用して別個のシリーズのエマルジョンを作製した。これらのエマルジョンは、種々の量のスクアレン0.43w/wから最大4.3w/wのMF59濃度を含有していた。タイプ3CNE:DOTAP/卵PCエマルジョンとの複合体形成の前の、RNAへのPluronic登録商標F127ポロキサマーの添加は、ポロキサマーが添加されなかったサンプルと比較して、より大きなRNase安定性につながった。これは、油滴とのより良好なRNA複合体形成を可能にすることにおけるこのポリマーの役割を示す。DOTAPのみのエマルジョンの乳化ステップの間の少量のtween800.08w/wの添加は、より小さな液滴につながった。カチオン性エマルジョンを調製する方法:スクアレン、ソルビタントリオレエートSpan85、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTween80は、SigmaSt.Louis、MO、USAから入手した。ジメチルジオクタデシルアンモニウムDDA、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDOPE、3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロール塩酸塩DC-コレステロールHClは、AvantiLipidsから購入した。L-α-リゾホスファチジルコリン卵、ニワトリおよび1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパンDOTAPは、LipoidLudwigshafenGermanyから購入した。カチオン性ナノエマルジョンCNEは、電荷を有するMF59と同様に、先に記載されたとおりであるが、わずかに改変を加えて調製したOtt、Singhら2002年。手短には、油溶性成分すなわち、スクアレン、span85、カチオン性脂質、脂質界面活性剤をビーカー中で合わせ、脂質成分をクロロホルムCHCl3またはジクロロメタンDCMに溶解した。得られた脂質溶液を、油およびspan85に直接添加した。エマルジョンのサブセットCNE01、02、17については、溶媒をドラフト中、室温で2時間蒸発させ、その後、水相を合わせ、サンプルをホモジナイズした。残りのエマルジョンCNE12、13、27、32、35については、油相を水相と合わせ、IKAT25ホモジナイザーを24KRPMで使用して直ちに2分間ホモジナイズして、均一な原料を提供した。CNE05は、リポソームストック溶液を調製することによって調製した。リポソームは、50°Cの温度で、ロータリーエバポレーターBuchiモデル番号R200を300milliTorrの圧力で30分使用して、10mg/mlDOTAPクロロホルム溶液を蒸発させることによって調製した。残りのクロロホルム蒸発は、サンプルを一晩Labconco凍結乾燥機中に入れることによって確実にした。脂質フィルムを、1.0mLの濾過した脱イオン化蒸留水を添加することによって水和させ、分散させ、脂質の完全な懸濁を確実にするために50°Cで静置した。得られたリポソームをスクアレンに直接加え、IKAT25ホモジナイザーを24KRPMで使用して直ちに2分間乳化した。次いで、エマルジョンを、ドラフト中で、第1の均質化後2~3時間、撹拌プレートstirplate上に室温で放置した。一次エマルジョンを、およそ15k~20kPSIの均質化圧で、氷浴冷却コイルを備えたマイクロフルイダイザーM110SホモジナイザーMicrofluidics、Newton、MAに3回から5回通した。ユニットから20mlのバッチサンプルを取り出し、4°Cで保存した。表2には、エマルジョンの成分が記載されている。エマルジョンの油相中に脂質を添加する一方法は、油相中にジクロロメタンDCMまたは塩化メチレンを添加することであった。一旦添加されたDCMは、完全に蒸発させることができた。蒸発させた後、次いで、エマルジョンをマイクロフルイダイザーに通した。あるいは、脂質溶解度が問題である場合には、一次エマルジョンを、依然として有機相においてDCMとともに作製してもよい。その場合には、DCMは、第2の均質化の前にエマルジョンから直接的に蒸発させる。脂質を安定化剤として含有したエマルジョンのための代替法は、脂質がリポソームを形成するように、脂質フィルムを作製し、フィルムを再水和することであった。次いで、リポソームを油相に添加し、標準MF59が処理されるように処理した。実施例2RNA-粒子複合体の調製1.材料および方法RNA合成アルファウイルスレプリコン自己複製RNAをコードするプラスミドDNAを、invitroでのRNAの合成のための鋳型として使用した。各レプリコンは、RNA複製に必要な遺伝子エレメントを含有するが、粒子アッセンブリに必要な遺伝子産物をコードする配列を欠く。アルファウイルスゲノムの構造遺伝子を異種タンパク質その発現が、アルファウイルスサブゲノムプロモーターによって駆動されるをコードする配列によって置換した。レプリコンが真核細胞へ送達されると、プラス鎖RNAが翻訳されて、4種の非構造タンパク質が生じ、これはゲノムRNAを一緒に複製し、異種タンパク質をコードする大量のサブゲノムmRNAを転写する。アルファウイルス構造タンパク質の発現がないために、レプリコンは、感染粒子を生成できない。バクテリオファージT7プロモーターを、アルファウイルスcDNAの上流に配置して、invitroでレプリコンRNAの合成を促進し、ポリAテールのすぐ下流に位置するデルタ肝炎ウイルスHDVリボザイムが、その自己切断活性によって正しい3’末端を作製する。実施例において使用された4種のプラスミドの配列が図7A~7B中に示されている。適した制限エンドヌクレアーゼを用いて、HDVリボザイムの下流でプラスミドDNAを線状化した後、T7またはSP6バクテリオファージ由来DNA依存性RNAポリメラーゼを使用してinvitroでランオフ転写物を合成した。転写は、製造業者Ambion、Austin、TXによって提供された使用説明書に従って、7.5mMT7RNAポリメラーゼまたは5mMSP6RNAポリメラーゼ最終濃度の各ヌクレオシド三リン酸ATP、CTP、GTPおよびUTPの存在下、37°Cで2時間実施した。転写後、鋳型DNAをTURBODNaseAmbion、Austin、TXを用いて消化した。レプリコンRNAを、LiClを用いて沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水中で再構成した。非キャッピングRNAを、ユーザーマニュアルに概説されるように、ScriptCapm7GキャッピングシステムEpicentreBiotechnologies、Madison、WIを使用してワクシニアキャップ形成酵素VacciniaCappingEnzymeVCEを用いて転写後にキャッピングした。転写後キャッピングRNAをLiClを用いて沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水中で再構成した。あるいは、レプリコンを、6mMT7RNAポリメラーゼに対してまたは4mMSP6RNAポリメラーゼに対してのm7G5’ppp5’G、非可逆性キャップ構造類似体NewEnglandBiolabs、Beverly、MAを転写反応物に補充すること、およびグアノシン三リン酸の濃度を1.5mMT7RNAポリメラーゼに対してまたは1mMSP6RNAポリメラーゼに対してに低下させることによってキャッピングしてもよい。次いで、転写物をTURBODNaseAmbion、Austin、TX消化と、それに続くLiCL沈殿および75エタノールでの洗浄によって精製してもよい。RNAサンプルの濃度は、260nmで光学濃度を測定することによって決定した。invitro転写物の完全性は、全長構築物の存在について変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。RNA複合体形成溶液中の窒素数を、カチオン性脂質濃度から算出した。例えば、DOTAPは、分子あたり1個のプロトン化され得る窒素を有する。RNA濃度を使用し、RNA1マイクログラムあたり3nmolのリン酸という推定値を使用して溶液中のリン酸量を算出した。RNA:脂質の量を変えることによって、N/P比を改変することができる。RNAを様々な窒素/リン酸比N/PでCNEと複合体形成させた。N/P比の算出は、1ミリリットルあたりのエマルジョン中のプロトン化できる窒素のモル数を算出することによって行った。リン酸数を算出するために、RNA1マイクログラムあたり3nmolのリン酸という定数を使用した。値を決定した後、RNAに適当な割合のエマルジョンを添加した。これらの値を使用して、RNAを適当な濃度に希釈し、軽くボルテックス処理しながら等容積のエマルジョン中に直接添加した。溶液をおよそ2時間室温に放置した。複合体形成後、得られた溶液を適当な濃度に希釈し、1時間以内に使用した。ゲル電気泳動変性ゲル電気泳動を実施して、RNAのカチオン性処方物との結合およびRNaseAの存在下での安定性を評価した。ゲルは以下のとおりに成型した:2gのアガロースBio-Rad、Hercules、CAを180mlの水に添加し、溶解するまで電子レンジ中で加熱し、次いで、60°Cに冷却した。次いで、アガロース溶液に20mlの10×変性ゲルバッファーAmbion、Austin、TXを添加した。ゲルを注ぎ、室温で少なくとも45分間放置した。次いで、ゲルをゲルタンク中に入れ、1×MOPSランニングバッファーAmbion、Austin、TXを添加してゲルを数ミリメートル覆った。RNase保護アッセイRNase消化は、RNA1マイクログラムあたり6.4mAUのRNaseAAmbion、Hercules、CAとともに室温で30分間インキュベートすることによって達成した。RNaseは、プロテイナーゼKNovagen、Darmstadt、Germanyとともにサンプルを55°Cで10分間インキュベートすることによって不活化した。RNase不活性化後、サンプルと、25:24:1、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールとの1:1混合物を用いて、サンプルを脱複合体化した。サンプルを数回反転させて混合し、次いで、12kRPMで遠心機に15分間かけた。有機相から水相を収集し、RNAを分析するために使用した。ローディングウェルあたり460ngの前に、すべてのサンプルをホルムアルデヒドローディング色素とともにインキュベートし、65°Cで10分間変性させ、室温に冷却した。RNA構築物の分子量を見積もるためにAmbionMillenniumマーカーを使用した。ゲルは、130Vで泳動した。ゲルを、水中で、0.1SYBRゴールドを製造業者のガイドラインInvitrogen、Carlsbad、CAに従って使用し、室温で1時間振盪することによって染色した。ゲル画像は、Bio-RadChemidocXRSイメージングシステムHercules、CAで取得した。すべての研究は、ClonetechMountainView、CA製のマウス胸腺RNAを使用した。ヘパリン結合実験RNAを上記のように複合体形成させた。RNA/CNE複合体を、種々の濃度のヘパリンスルフェートAlfaAesar、WardHillMAとともに室温で30分間インキュベートした。得られた溶液を、15~20分間遠心分離した。遠心管をツベルクリンシリンジで穿刺し、下層部subnatantを収集した。次いで、Quant-itRibogreenRNAアッセイキットInvitrogen、CarlsbadCAを製造業者の指示に従って使用して、溶液をRNA濃度についてアッセイした。サンプルをBiotekSynergy4Winooski、VT蛍光プレートリーダーで分析した。遊離RNA値を標準曲線を使用して算出した。粒子サイズアッセイエマルジョンの粒子サイズは、ZetasizerNanoZSMalvernInstruments、Worcestershire、UKを製造業者の使用説明書に従って使用して測定した。粒子サイズは、多分散指数pdiとともにZ平均ZAveとして報告した。測定の前にすべてのサンプルを水で希釈した。さらに、エマルジョンの粒子サイズは、HoribaLA-930粒子サイズ分析計HoribaScientific、USAを使用して測定した。測定の前にサンプルを水で希釈した。ゼータ電位は、ZetasizerNanoZSを使用し、希釈サンプルを使用して製造業者の使用説明書に従って測定した。分泌型アルカリホスファターゼSEAPアッセイ抗原産生の動態および量を評価するために、SEAPをコードするRNAレプリコンを、処方物とともにおよび処方物を伴わずにマウス筋肉内に投与した。8~10週齢の、約20gの体重の3または5匹の雌性のBalb/Cマウスの群を、示されたN/P比でSEAPをコードするレプリコンRNAと複合体を形成したCNEを用いて免疫化した。裸のRNAを、RNaseフリー1×PBS中で処方した。各マウスに、四頭筋中に100μl用量を投与した部位あたり50μl。注射の1、3および6日後に血液サンプルを採取した。採取後直ちに血清を血液から分離し、使用まで-30°Cで保存した。化学発光SEAPアッセイPhospha-LightシステムAppliedBiosystems、Bedford、MAを使用して、血清を分析した。マウス血清を、1×Phospha-Light希釈バッファーで1:4希釈した。サンプルを水浴中に入れ、アルミニウム密閉ホイルで密閉し、65°Cで30分間熱不活化した。氷上で3分間冷却し、室温に平衡化した後、ウェルに50μLのPhospha-Lightアッセイバッファーを添加し、サンプルを室温で5分間静置した。次いで、1:20CSPD登録商標化学発光アルカリホスファターゼchemiluminecentalkalinephosphate基質基質を含有する50μLの反応バッファーを添加し、室温で20分インキュベートした後、発光を測定した。発光は、BertholdCentroLB960ルミノメーターOakRidge、TNで、ウェルあたり1秒の積算を用いて測定した。各サンプル中のSEAPの活性は、2連で測定し、これら2回の測定値の平均が示されている。エレクトロポレーションエレクトロポレーションは、プラスミドDNAワクチンの送達にとって極めて効果的な方法であり、この技術を使用して、自己複製RNAを送達した。イソフルオラン下でマウスを麻酔し、念入りに両後肢の毛を剃り、処理される肢上の領域を露出させた。ワクチンの30μlの用量を、1/2ccインスリン用シリンジを使用して後肢の四頭筋に注射した。Elgen登録商標DNADeliverySystemInovio、SanDiegoを使用して筋肉にエレクトロポレーションした。機器パラメータは以下のとおりである:60V、各60msで2パルス。第2の肢に別の用量を同様に送達し、続いて、エレクトロポレーションを行った。ウイルスレプリコン粒子VRP本発明者らは、RNAワクチンを、リポーター遺伝子または抗原のinvivo発現を達成するための伝統的なRNAベクターによるアプローチと比較するために、Perriらによって記載された方法によってBHK細胞において産生されたウイルスレプリコン粒子VRPを利用した。この系では、抗原またはリポーター遺伝子レプリコンは、シンドビスウイルスの3’末端配列3’UTRおよびシンドビスウイルスパッケージングシグナルPSPerriS.ら、JVirol第77巻:10394~10403頁2003年の図2参照のことを含有するよう遺伝子操作されたベネズエラウマ脳炎ウイルスVEEVのゲノムに由来するアルファウイルスキメラレプリコンVCRからなるものであった。これらのレプリコンを、ベビーハムスター腎臓BHK細胞中に、シンドビスウイルスカプシドおよび糖タンパク質遺伝子Perriらの図2参照のことをコードする欠損ヘルパーRNAとともに共エレクトロポレーションすることによってVRPにパッケージングした。次いで、標準方法によってVRPを収集し、力価測定し、培養液またはその他の等張性バッファー中で動物に接種した。2.水中油型エマルジョンの粒子サイズ分析作製後、エマルジョンを粒子サイズおよびゼータ電位について分析した。表3および4は、4:1および10:1のN/P比での複合体形成前および複合体形成後に得られたデータ粒子サイズおよびゼータ電位データを要約している。エマルジョンの粒子サイズは、NanoZS粒子サイズ分析計で測定された場合に、試験された処方物のすべてについて160nm未満であった。複合体形成後、一部の粒子サイズは、特に、4:1N/P比で大幅に増大した。これは、凝集および複数のエマルジョン液滴間のRNAの架橋による可能性が高い。Horribaデータは、全般的に、nanoZSで分析され得ない大きな粒子集団があると思われる2、3の場合CNE02およびCNE32を除いて、NanoZS測定値とよく一致していた。CNE02およびCNE32を除くすべてのCNEは、Horiba粒子サイズ分析計で測定した場合に190nm未満のサイズであった。サイズにおける変動性が小さいことから、添加されるカチオン性脂質の量またはタイプにかかわらない堅調な処理方法が示される。平均粒子サイズは、無菌濾過を可能にするよう200nm未満のサイズであることが特に望ましい。試験したすべてのサンプルがこの基準を通過する。ゼータ電位は、粒子サイズデータよりもわずかに変動性であった表4。これは、本発明者らの予想と一致しているが、これは、これらの処方物におけるいくつかの相違が、カチオン性脂質濃度の変化であるからである。例えば、CNE01、CNE02およびCNE17は、各々、0.8、1.6および1.2mg/mlのDOTAPをそれぞれ含有する。これらのロットのゼータ電位は、予想と一致しており、複合体形成前に15.9mVの最低ゼータ電位を有するCNE01、続いて、33.4mVの複合体形成前ゼータ電位を有するCNE17、最後に、43mVのゼータ電位を有するCNE02であった。上記複合体形成後ゼータ電位は、おそらくはエマルジョンにおける過剰の電荷のために、一般に、複合体形成前ゼータ電位から大きくは変化しない。3.RNase安定性アッセイ:エマルジョンの、RNase分解から保護する能力を評価するために、処方物をスクリーニングするためのin-vitroアッセイを開発した。図1は、10:1および4:1N/P比のCNE01およびCNE17のRNase保護アッセイの結果を示す。CNE01は、4:1比と比較して10:1比でRNAを良好に保護した。CNE17は、10:1で良好な保護を示した。図2は、CNE17がまた、4:1のN/P比でRNAを保護できることを示す。CNE12および13もまた、両電荷比でRNAを保護したCNE17と同様に図2。図3は、4:1N/P比で、あまり良好には保護しないCNE01を用いた図1と同様の結果を示す。CNE02は、試験した両N/P比でRNaseを極めて良好に保護した図3および4。CNE04は、RNAをRNase消化から保護しなかったが、CNE05は、試験した両電荷比でRNAを保護できた図5。CNE27が、極めて少ないRNase保護を示したのに対し、CNE32は、わずかにより多い保護を示したが、これまでに記載された処方物より全体的に少なかった。CNE35図6は、RNAをRNaseからの分解からわずかに保護できた。5種の異なる処方物全部が、invitroでRNAの分解を防ぐことができた。4.InvivoSEAPスクリーニング:分泌型アルカリホスファターゼSEAPを発現するA306レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のinvivoでのタンパク質発現レベルを決定した。BALB/cマウス、群あたり5匹の動物に、SEAP5×105IUを発現するVRP、裸の自己複製RNAA306、1μg、エレクトロポレーションを使用して送達される自己複製RNAA306EP、それぞれ、1および0.1μg、ならびに先に記載したように作製された、10:1のN/P比でCNE17、CNE05およびCNE35を用いて処方した自己複製RNA1μgまたは0.1μgA306を用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種下肢あたり50μLを行った。0日目の筋肉内ワクチン接種の1、3および6日後の血清SEAPレベル相対光単位relativelightunit、RLUが表5に示されている。データは、群あたり5匹の個々のマウスの算術平均力価として表されている。表5は、同様の用量の裸のRNA対照に対して、RNAがCNE17中に処方された場合に血清SEAPレベルが増大したことを示す。SEAP発現は、VRP対照に対して、RNAがCNE中に処方された場合に増大したが、発現の動態は極めて様々であった。エレクトロポレーションを用いる送達は、裸のRNA対照に対して、SEAP発現の増大をもたらしたが、これらのレベルは、RNAがCNE17を用いて処方された場合のSEAP発現レベルと比較して低かった。CNE05およびCNE35は、タンパク質発現レベルを低下させた。5.SEAP発現に対するN/P比の影響CNE17分泌型アルカリホスファターゼSEAPを発現するA306レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のinvivoでのタンパク質発現レベルを決定した。BALB/cマウス、群あたり5匹の動物に、裸の自己複製RNAA306、1μg、以下のN/P比6:1、7:1、8:1、10:1、12:1、13:1、14:1、16:1において、記載したように作製されたCNE17を用いて処方した自己複製RNAA306、1μgを用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種下肢あたり50μLを行った。0日目の筋肉内ワクチン接種の1、3および6日後の血清SEAPレベル相対光単位、RLUが表6に示されている。データは、群あたり5匹の個々のマウスの算術平均力価として表されている。6日目SEAP発現と比較した、ヘパリンスルフェート結合の相関が、表7に概説されている。それぞれ、6×、8×および10×ヘパリンスルフェートで複合体から放出されたRNAの百分率が示されている。表6および7は、同様の用量の裸のRNA対照に対して、10:1のN/P比でRNAが処方された場合に血清SEAPレベルが増大したことを示す。試験したその他のN/P比は、10:1N/P比と比較して低い量のタンパク質発現を示したが、すべてが、裸のRNAよりは高い応答を示した。裸のRNAから得られた平均SEAP値は、相当に変動したということは強調されなくてはならず、これは、表5および6中に例示され、一実験では、およそ35,000で、別のものでは5,000の発現である。6日目のタンパク質発現レベルは、ヘパリン放出と良好に相関していた。6.SEAP発現に対するN/P比の影響CNE13分泌型アルカリホスファターゼSEAPを発現するA306レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のinvivoでのタンパク質発現レベルを決定した。BALB/cマウス、群あたり5匹の動物に、裸の自己複製RNAA306、1μg、以下のN/P比6:1、8:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1において、先に記載したように作製したCNE13を用いて処方した自己複製RNA1μgA306を用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種下肢あたり50μLを行った。0日目の筋肉内ワクチン接種の1、3および6日後の血清SEAPレベル相対光単位、RLUが表8に示されている。データは、群あたり5匹の個々のマウスの算術平均力価として表されている。6日目SEAP発現と比較したヘパリンスルフェート結合の相関が、表9に概説されている。それぞれ、6×、8×および10×ヘパリンスルフェートで複合体から放出されたRNAの百分率が示されている。表8および9は、同様の用量の裸のRNA対照に対して、RNAが試験されたすべてのN/Pで処方された場合に、血清SEAPレベルが増大したことを示す。6日目でのタンパク質発現は、ヘパリン放出と良好に相関していた。7.SEAP発現に対するN/P比の影響CNE01分泌型アルカリホスファターゼSEAPを発現するA306レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のinvivoでのタンパク質発現レベルを決定した。BALB/cマウス、群あたり5匹の動物に、裸の自己複製RNAA306、1μg、以下のN/P比4:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1において、先に記載したように作製したCNE01を用いて処方した自己複製RNA1μgA306を用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種下肢あたり50μLを行った。0日目の筋肉内ワクチン接種の1、3および6日後の血清SEAPレベル相対光単位、RLUが表10に示されている。データは、群あたり5匹の個々のマウスの算術平均相対光単位RLUとして表されている。6日目SEAP発現と比較した、ヘパリンスルフェート結合の相関が、表11に概説されている。それぞれ、6×、8×および10×ヘパリンスルフェートで複合体から放出されたRNAの百分率が示されている。表10および11は、同様の用量の裸のRNA対照に対して、RNAが処方された場合に試験されたすべてのN/P比において、血清SEAPレベルが増大したことを示す。実施例3種々の油を用いたタンパク質発現レベルの評価種々の油を使用するが、CNE17の基本処方、すなわち、5油、0.5Tween80、0.5span85および1.4mg/mlDOTAPにおいて、一連のエマルジョンを作製した。以下の表12には、群の各々の油の変化が概説されている。油の分類も表12に列挙されている。10:1N/P比でエマルジョンを試験し、先に記載したように複合体を形成した。BALB/cマウス、群あたり5匹の動物に、SEAPを発現するVRP5×105IU、裸の自己複製RNAA306、1μg、エレクトロポレーションを使用して送達される自己複製RNAA306EP、1および0.1μg、ならびに先に記載したように作製したCNE36、CNE37、CNE38およびCNE41を用いて処方された自己複製RNA1μgA306を用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種下肢あたり50μLを行った。0日目の筋肉内ワクチン接種の1、3および6日後の血清SEAPレベル相対光単位、RLUが表13に示されている。データは、群あたり5匹の個々のマウスの算術平均RLUとして表されている。表13に示されるように、CNE17は、研究を通じて最高レベルの発現を示す。その他のエマルジョンのすべてが、裸のRNAの1μg用量よりも低かった。CNE36は、新規油の最高発現をもたらし、それに続いて、CNE41およびCNE38であった。MF59に直接添加した1μgの用量のRNAは、応答を弱めた。実施例4マウスモデルにおける、RSV-F抗原のCNE17によって増強された免疫原性1.方法マウス免疫原性研究この研究には、RSVの表面融合糖タンパク質RSV-Fを発現するA317レプリコンを使用した。8~10週齢で、体重約20gのBALB/cマウス、群あたり10匹の動物に、両側筋肉内ワクチン接種を行った。すべての動物に、RSV-Fを発現するVRP1×106IU、裸の自己複製RNAA317、1μg、エレクトロポレーションを使用して送達される自己複製RNA10μgA317EPまたはCNE17中に処方された自己複製RNA0.1μgまたは1μgA317を用いて、0日目および21日目に、2本の後肢中、四頭筋に注射し、各々等容積下肢あたり50μLを投与した。14日目2wp1、35日目2wp2および49日目4wp2に抗体分析のために血清を採取した。T細胞応答の測定が必要であった場合には、T細胞分析のために35日目または49日目に群あたり5匹のマウスから脾臓を摘出した。マウスT細胞機能アッセイ:細胞内サイトカイン免疫蛍光アッセイ等しくワクチン接種されたBALB/cマウスから得た2から5個の脾臓を、プールし、培養のために単細胞懸濁物を調製した。各脾細胞プールについて、2つの抗原によって刺激された培養物および2つの非刺激培養物を確立した。抗原によって刺激された培養物は、1×106個の脾細胞、RSVFペプチド85~931×10-6M、RSVFペプチド249~2581×10-6M、RSVFペプチド51~661×10-6M、抗CD28mAb1mcg/mLおよびブレフェルジンA1:1000を含有していた。非刺激培養物は、RSVFペプチドを含有しておらず、その他の点では、刺激された培養物と同一であった。37°Cで6時間培養した後、培養物を免疫蛍光のために処理した。細胞を洗浄し、次いで、蛍光標識された抗CD4および抗CD8モノクローナル抗体mAbを用いて染色した。細胞を再度洗浄し、次いで、Cytofix/cytopermを用いて20分間固定した。次いで、Perm洗浄バッファーを用いて固定された細胞を洗浄し、次いで、IFN-g、TNF-a、IL-2およびIL-5に特異的な蛍光標識mAbを用いて染色した。染色された細胞を洗浄し、次いで、LSRIIフローサイトメーターで分析した。FlowJoソフトウェアを使用して、取得したデータを分析した。CD48-およびCD84-T細胞サブセットを、別個に分析した。所与のサンプル中の各サブセットについて、サイトカイン陽性細胞を決定した。RSVF抗原特異的T細胞を、抗原によって刺激された培養物中のサイトカイン陽性細胞と非刺激培養物中のサイトカイン陽性細胞との間の相違として算出した。抗原特異的細胞の95信頼限界は、標準法StatisticalMethods、第7版、G.W.SnedecorおよびW.G.Cochranを使用して決定した。マウスT細胞機能アッセイ:分泌型サイトカインアッセイ分泌型サイトカインアッセイのための培養物は、ブレフェルジンAが省かれた点を除いて細胞内サイトカイン免疫蛍光アッセイのものと同様であった。37°Cで一晩培養した後に培養上清を収集し、MesoScaleDiscovery製のマウスTh1/Th2サイトカインキットを使用して複数のサイトカインについて分析した。培養物あたりの各サイトカインの量を、製造業者によって供給された精製組換えサイトカインを使用して作成した標準曲線から決定した。2.マウスモデルにおける、RSV-F抗原のCNE17によって増強された免疫原性14、35および49日目のF特異的血清IgG力価が、表14、15および16に示されている。35および49日目のRSV血清中和力価が表17に示されており、49日目のT細胞応答が表18および19に示されている。14日目2wp1に抗体分析のために血清を収集した。データは、個々の動物および群あたり10匹の個々のマウスの幾何平均力価として表されている。個々の動物が、<25の力価検出限界を有していた場合、5の力価を割り当てた。35日目2wp2に抗体分析のために血清を収集した。データは、個々の動物および群あたり10匹の個々のマウスの幾何平均力価として表されている。個々の動物が、<25の力価検出限界を有していた場合、5の力価を割り当てた。49日目4wp2に抗体分析のために血清を収集した。データは、個々の動物および群あたり10匹の個々のマウスの幾何平均力価として表されている。個々の動物が、<25の力価検出限界を有していた場合、5の力価を割り当てた。35日目2wp2および49日目4wp2に分析のために血清を収集した。データは、個々のマウスの60プラーク減少中和力価および群あたり10匹の個々のマウスの幾何平均力価として表されている。個々の動物が、<40の力価検出限界を有していた場合、20の力価を割り当てた。NA=アッセイされていない。正味の抗原特異的サイトカイン陽性頻度±95半信頼区間confidencehalf-intervalが示されている。太字で示される正味の頻度は、統計上有意に>0である刺激応答を示す。正味の抗原特異的サイトカイン陽性頻度±95半信頼区間が示されている。太字で示される正味の頻度は、統計上有意に>0である刺激応答を示す。表14~19に示されるように、CNE17処方物は、裸のRNA対照に対して、F特異的IgG力価の増大5倍増大4wp2によって決定される免疫原性、中和力価ならびにCD4およびCD8T細胞応答を増強した。RNAのエレクトロポレーションは、裸のRNA対照に対して、免疫原性を増強したが、CNE17送達より低かった。重要なことに、CNE17群において誘発された免疫応答は、裸のRNAのものと比較して変動が非常に少なかった。例えば、1μgの裸の自己複製RNA群から得た14日目のサンプルは、529から5110の抗体力価をもたらしたが、CNE17を用いて処方されたRNAサンプルは、1μgの用量で、1927から5731の抗体力価をもたらした。さらに、CNE17群中のすべての動物は、堅調な応答で応答し、非常に良好にブーストされた。対照的に、裸のRNA群中の一部の動物は、顕著にはブーストされなかった。実施例5ラットモデルにおけるRNA-粒子複合体の免疫原性1.方法RSV-F三量体サブユニットワクチンRSVF三量体は、融合ペプチド領域が欠失したその他の三量体との会合を防ぐ、RSVFの外部ドメインを含む組換えタンパク質である。得られた構築物は、同種三量体を形成することがサイズ排除クロマトグラフィーによって観察され、融合後Fコンホメーションと一致する予測された表現型を有することが電子顕微鏡によって観察された。タンパク質は、昆虫細胞において発現され、構築物のC末端と融合したHISタグ、さらに、従来の技術を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。得られたタンパク質サンプルは、95超の純度を示す。F-サブユニットワクチンのinvivo評価のために、100μg/mL三量体タンパク質を、10mMヒスチジンバッファー、pH6.3を使用して2mg/mLアラムalum上に吸着させ、塩化ナトリウムを用いて等張へ調整した150mMに。F-サブユニットタンパク質を、2~8°Cで穏やかに撹拌しながらアラム上に一晩吸着させた。コットンラットのワクチン接種およびチャレンジ雌性のコットンラットSigmodonhispidisは、HarlanLaboratoriesから入手した。すべての研究は、Novartisの動物の管理および使用に関する委員会NovartisAnimalCareandUseCommitteeによって承認され、これに従って実施した。0日目および21日目に、示されたワクチンを用いて、動物の群を、筋肉内で免疫化したi.m.、100μl。第1の免疫化の3週間後および第2の免疫化の2週間後に血清サンプルを採取した。免疫化された動物またはワクチン接種されていない対照動物に、最終免疫化の4週間後に、1×105PFURSVを用いて鼻腔内i.n.チャレンジを行った。精密気化器precisionvaporizerを使用し、3イソフルランを用いる採血および麻酔下でのRSVチャレンジを実施した。RSVF特異的ELISA個々の血清サンプルを、酵素結合イムノソルベント検定法ELISAによってRSVF特異的IgGの存在についてアッセイした。ELISAプレートMaxiSorp96ウェル、Nuncを、PBS中、1μg/mlの精製RSVFdelp23-furdel-trunc非切断型を用いて4°Cで一晩コーティングした。洗浄0.1Tween-20を含むPBS後、プレートを、PBS中のSuperblockブロッキングバッファーThermoScientificを用いて、37°Cで少なくとも1.5時間ブロッキングした。次いで、プレートを洗浄し、実験または対照コットンラットから得た、アッセイ希釈剤0.1Tween-20および5ヤギ血清を含むPBSでの血清の段階希釈物を添加し、プレートを37°Cで2時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、セイヨウワサビペルオキシダーゼHRP結合ニワトリ抗コットンラットIgGImmunologyConsultantsLaboratory、Inc、アッセイ希釈剤で1:5,000希釈とともに37°Cで1時間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、各ウェルに100μlのTMBペルオキシダーゼ基質溶液KirkegaardPerryLaboratories、Incを添加した。100μlの1MH3PO4を添加することによって反応を停止させ、プレートリーダーを使用して450nmで吸光度を読み取った。各血清サンプルについて、光学濃度OD対血清希釈の逆数の対数のプロットを、非線形回帰GraphPadPrismによって作成した。力価は、およそ0.5のODでの血清希釈の逆数として定義した各プレートに含まれていた、1:2500の定義された力価を有する、RSV感染したコットンラットから得たプールされた標準の血清に正規化された。マイクロ中和アッセイ血清サンプルを、プラーク減少中和試験PRNTによって中和抗体の存在について試験した。HI-血清の2倍段階希釈物5HI-FBSを含むPBS中を、以前に力価測定された等容積のRSVLongに添加したおよそ115PFU/25μlを生じる。血清/ウイルス混合物を37°Cおよび5CO2で2時間インキュベートして、ウイルス中和が生じるのを可能にし、次いで、25μlのこの混合物およそ115PFUを含有するを96ウェルプレート中のHEp-2細胞の2連のウェルに接種した。37°Cおよび5CO2で2時間後、細胞を0.75メチルセルロース/EMEM5HI-FBSで覆い、42時間インキュベートした。免疫染色とそれに続く自動計数によるシンシチウム形成の検出によって感染性ウイルス粒子の数を決定した。中和力価は、対照血清なしに対して、ウェルあたりのシンシチウムsynctiaの数の少なくとも60の減少を生じる、血清希釈の逆数として定義される。ウイルス量肺中のウイルス量は、プラークアッセイによって決定した。具体的には、RSV感染の5日後に肺を摘出し、1つの右葉を、2.5mlの25スクロースを含むダルベッコの改変イーグル培地DMEM、Invitrogen中に入れ、組織ホモジナイザーを用いて破壊した。これらのサンプルから得た細胞不含上清を、-80°Cで保存した。感染性ウイルスのアッセイのために、清澄化した肺ホモジネートの希釈物5熱不活化ウシ胎仔血清を含むPBS、HI-FBS中を、200μl/ウェル12ウェルプレートの容積で集密なHEp-2細胞単層上に接種した。周期的に穏やかに振盪し37°C、5CO2、2時間後、接種材料を除去し、細胞を、1.5mlの、5HI-FBS、グルタミンおよび抗生物質が補充されたイーグルの最小必須培地EMEM、Lonza中の1.25のSeaPlaqueアガロースLonzaで覆った。3~4日間インキュベートした後、細胞を、1mlの、0.1ニュートラルレッドSigmaを含有するEMEMSigma中の1.25のアガロースで再度覆った。プラークは、1日後にライトボックスを用いて計数する。コットンラットの肺の病理RSVチャレンジの5日後、肺を摘出し、各動物から得た4葉を集め、穏やかな気管内注入とそれに続く浸漬固定によって、10中性緩衝化ホルマリンNBFを用いて固定化した。組織を慣例的に処理して、顕微鏡検査のためのヘマトキシリンエオシン染色切片を調製した。以下のパラメータ:細気管支周囲炎、肺胞炎、気管支炎、血管周囲細胞性浸潤および間質性肺炎についてのこれまでに公開された基準[PrinceGAら、2001年]の改変を使用して、所見を評価した。病変は4点の半定量的スケールで類別した。最小変化は、1つまたは2、3個の小さい病巣を含有していた;軽度変化は、小~中程度のサイズの病巣からなっていた;中程度変化は、高頻度の、および/または中程度のサイズの病巣を含有していた;著しい変化は、組織のほとんど/すべてに影響を及ぼす広範な病巣から集密的な病巣を示した。2.コットンラットRSVチャレンジ研究この研究には、RSVの表面融合糖タンパク質RSV-Fを発現するA317レプリコンを使用した。コットンラットSigmodonhispidus、群あたり8匹の動物に、裸の自己複製RNAA317、1μgまたは10μg、CNE17を用いて処方された自己複製RNAA317、0.1μgまたは1μg、RSV-Fを発現するVRP5×106IU、F三量体/アラムサブユニット10μgまたはホルマリン不活化RSVワクチン5200FI-pfuを用いて0日目および21日目に両側筋肉内ワクチン接種下肢あたり50μLを行った。14日目2wp1および35日目2wp2に抗体分析のために血清を採取した。すべての動物を、49日目に1×105pfuのRSVを用いて鼻腔内でチャレンジし、ウイルス量および肺の病理の決定のために54日目5dpcに肺を採取した。14日目および35日目のF特異的血清IgG力価が、表20に示されており;2wp2での選択された群に由来する8匹の動物の個々の抗体力価が、表21に示されており;14日目および35日目のRSV血清中和力価が、表22に示されており;RSVチャレンジの5日後の肺のウイルス力価が、表23に示されており;RSVチャレンジの5日後の肺の肺胞炎スコアが、表24に示されている。群あたり8匹の動物、0日目および21日目の筋肉内ワクチン接種後。14日目2wp1および35日目2wp2に抗体分析のために血清を採取し、すべての動物を、49日目に1×105pfuのRSVを用いて鼻腔内でチャレンジした。ウイルス量および肺の病理の決定のために54日目5dpcに肺を採取した。データは、群あたり8匹の個々のコットンラットの幾何平均力価として表されている。個々の動物が、<25の力価検出限界を有していた場合には、5の力価を割り当てた。選択された群に由来する8匹の動物の個々の抗体力価裸のRNAおよびCNE処方されたRNA。群あたり8匹の動物、0日目および21日目の筋肉内ワクチン接種後。14日目2wp1および35日目2wp2に分析のために血清を採取した。データは、60プラーク減少中和力価として表されている。群あたり4匹のコットンラットの2つのプールの幾何平均力価。個々の動物が、<25の力価検出限界を有していた場合には、5の力価を割り当てた。群あたり8匹の動物、0日目および21日目の筋肉内ワクチン接種後。14日目2wp1および35日目2wp2に分析のために血清を採取した。データは、60プラーク減少中和力価として表されている。群あたり4匹のコットンラットの2つのプールの幾何平均力価。個々の動物が、<25の力価検出限界を有していた場合には、5の力価を割り当てた。群あたり8匹の動物、0日目および21日目の筋肉内ワクチン接種後。すべての動物を、49日目に1×105pfuのRSVを用いて鼻腔内でチャレンジした。ウイルス量および肺の病理の決定のために54日目5dpcに肺を採取した。病変は、4点の半定量的スケールで類別した。最小1変化は、1つまたは2、3個の小さい病巣を含有していた;軽度2変化は、小~中程度のサイズの病巣からなっていた;中程度3変化は、高頻度の、および/または中程度のサイズの病巣を含有していた;著しい4変化は、組織のほとんど/すべてに影響を及ぼす広範な病巣から集密的な病巣を示した。この研究は、コットンラットRSVモデルにおけるレプリコンRNAの免疫原性および保護能力を示す。処方されていないレプリコンRNAは、1回のワクチン接種後、血清F特異的IgGおよびRSV中和抗体を誘導し、これらの応答は、2回目のワクチン接種によってブーストされた。CNEは、このモデルにおいて効果的であり、2回目のワクチン接種後に、1μgのレプリコンRNAへのF特異的IgG力価をおよそ9倍に、中和力価を4倍にブーストした。さらに、CNE17は、用量0.1または1μgにかかわらず、裸のRNAが使用された場合に観察された免疫応答の相当な変動を低減し、すべての動物は、ワクチン接種に応答した。すべてのレプリコンRNAワクチンは、鼻へのRSVチャレンジからの保護を提供し、RSVチャレンジの5日後の肺のウイルス量を3桁を越えて低減させた。CNEを用いて処方された1μgのレプリコンRNAによって生じた免疫応答の大きさおよび保護能力は、5×106VRPによって誘発される応答の2倍以内であった。実施例6免疫原性に対する粒子サイズの影響この実施例は、粒子サイズが、CNE/RNA処方物の免疫原性に影響を及ぼすことを示す。粒子サイズアッセイおよびinvivoSEAPアッセイのプロトコールは、実施例2に記載されている。マウス免疫原性研究のプロトコールは、実施例3に記載されている。図8Aは、invivoSEAPアッセイの結果算術平均を示す。図8Bは、2wp1および2wp2の時点でのBALB/cマウスにおける個々の動物の全IgG力価を示す。CNE17とRNAの複合体形成は、約220nmから約300nmへ粒子サイズを増大させた示されていないデータ。図8Aおよび8Bに示されるように、粒子サイズが増大するにつれ、SEAPの発現レベルは低下し、宿主免疫応答も減少した。実施例7免疫原性に対する代替カチオン性脂質の影響の評価1.材料および方法CNEの調製以下のカチオン性脂質:DLinDMA、DOTMA、DOEPC、DSTAP、DODACおよびDODAPを使用して一連のエマルジョンを作製した。表25には、エマルジョンの成分が記載されている。CNEは、実施例1に記載したプロトコールに従って調製した。RNA/CNE複合体は、実施例2に記載したプロトコールに従って調製した。マウス免疫原性研究エマルジョンを10:1N/P、12:1N/Pまたは18:1N/P比で試験した表26参照のこと。そこで、RNAレプリコンおよびエマルジョンを、実施例2に先に記載したように複合体形成させた。BALB/cマウス、群あたり5~10匹の動物に、裸の自己複製RNAA317、1μg、RV011540DlinDMA、10DSPC、48Chol、2PEGDMG2000を含有するリポソーム中に処方された1μgのA317、CNE13、CNE17、CMF37、CMF38またはCMF42を用いて処方された自己複製RNAA317、1μgを用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種下肢あたり50μLを行った。2.CNE処方されたRNAは、マウスモデルにおいてRSV-F抗原の免疫原性を増強した14日目および35日目にBALB/cマウスの群から得た全血清IgG力価幾何平均力価が表26に示されている群1~8。CMF37DOTMAを用いて処方されたRNAは、宿主免疫応答を良好に増強し、IgG力価は、CNE17DOTAPのものと同等であった。CMF38DOEPCを用いて処方されたRNAは、CNE17のものよりもわずかに高いIgG力価を誘発したが、増強は、統計上有意ではなかった。DSTAPを用いて処方されたRNAは、宿主免疫応答を有意に増強せず、この低いIgG力価は、スクアレンにおけるDSTAPの低い溶解度による可能性が高い。CNE13を用いて処方されたRNAは、IgG力価を、リポソームDDAを用いて処方されたRNAのものよりも、約1.5倍高く増強した。CMF43DODACを用いて処方されたRNAによって誘導された全抗体力価は、CNE17のものよりも低かった表28、群7および8。群1~8は、5匹の動物/群を有しており、群9~12は、10匹の動物/群を有していた。実施例8免疫原性に対するバッファー組成の影響の評価この実施例では、CNE17をベースとするが、異なるバッファー成分を含む種々のエマルジョンを調製した。表27は、バッファーが改変されたエマルジョンの組成を示す。Invitro結合アッセイは、クエン酸バッファーの濃度の低減が、RNAをより緊密に結合させたことを示した示されていないデータ。マウス免疫原性研究から得られた結果は、CNE17に糖を添加することは、CNE17を用いて処方されたRNAの免疫原性に大きく影響を与えなかったことを示した表26、群9~12。ソルビトールおよびデキストロースの添加でIgG力価のわずかな増大が観察された。表28には、CNE17を用いて処方されたRNAが種々のバッファー系を使用して調製された場合の、マウス免疫原性研究の結果が要約されている。vA375レプリコン、vA317レプリコン。レプリコンは、HEPESバッファー中で転写されたAmbionであり、iLiCl沈殿され、iiトリスバッファー中でキャッピングされ、iiiLiCl沈殿された。すべての群は、8匹の動物/群を有していた。種々のバッファー組成も粒子サイズに影響を及ぼした。図9に示されたように、糖スクロースの添加は、RNA/CNE複合体図9Aの粒子サイズを減少させ、低濃度の10mMのNaClの添加もRNA/CNE複合体の粒子サイズを減少させた図9A。クエン酸バッファーは、RNA/CNE複合体の粒子サイズに影響を及ぼさなかった図9B。粒子サイズに対するポリマーの影響が、図9Cに示されている。特に、RNAバッファーへの0.5pleuronicF127の添加は、RNA/CNE複合体の粒子サイズを複合体形成前のサイズRNAを含まないCNE粒子に減少させた。好ましいバッファー系、280mMスクロース、10mMNaClおよび1mMクエン酸塩;または280mMスクロース、10mMNaCl、1mMクエン酸塩および0.5w/vPluronicF127におけるCNE17の全抗体力価および中和抗体力価が、表28に示されている群4および5。実施例9免疫原性に対するPEG脂質の影響の評価この実施例では、PEG脂質を使用して一連のエマルジョンを製造した。表29には、これらのPEG脂質をベースとするエマルジョンの組成が示されている。すべてのエマルジョンについて、DCM中、10mg/mLDOTAPのストック溶液を使用し、第1の均質化の後に溶媒を蒸発させた。マウス免疫原性研究は、実施例7において上に記載されるように実施した。表30は、2wp1および4wp2時点でプールされた抗体力価を示す。CNE13群について、個々の動物の力価の平均および幾何平均力価が示されている。表30に示されるように、PEG-脂質を用いて作製されたエマルジョンは、RSV-F抗原に対する免疫応答の誘導において効果的であったが、全抗体力価は、CNE17を用いて処方されたRNAと比較して低レベルであった。さらに、PEG脂質の濃度の増大は、抗体力価の低減をもたらした。vA317レプリコン、群1~10は、5匹の動物/群を有し、群11は、10匹の動物/群を有していた。本明細書は、本明細書内に引用される参考文献の教示を踏まえると、最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するものであって、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。当業者ならば、多数のその他の実施形態が、本発明によって包含されることは容易に認識しよう。本開示内容中に引用されるすべての刊行物および特許は、参照によりその全文が組み込まれる。参照によって組み込まれる材料が、この明細書と相反するかまたは矛盾する範囲においては、本明細書が任意のこのような材料に優先する。本明細書における任意の参考文献の引用は、このような参考文献が本発明の先行技術であると認めることではない。当業者ならば、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識するだろうし、慣例的な実験程度を使用して確認できる。このような等価物は、以下の実施形態によって包含されるものとする。"