"a二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIを測定し、測定値Aを得る工程、を含むPIVKA-IIの測定方法であって、前記a工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体として、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIに特異的な抗体を使用することを特徴とするPIVKA-IIの測定方法。b二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってPIVKA-IIを測定し、測定値Bを得る工程、及びc前記測定値A及び前記測定値Bを比較する工程、をさらに含み、前記b工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる一方の抗体として人肝がん細胞培養細胞株より精製したPIVKA-IIと反応する抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を使用し、前記b工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる他方の抗体としてヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使用することを特徴とする請求項1記載のPIVKA-IIの測定方法。前記a工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項1又は2記載のPIVKA-IIの測定方法。前記a工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体がいずれも、Ca2イオンの共存下における抗原固相ELISAにおいて、iプロトロンビンとは反応せず、且つiiプロトロンビンの脱炭酸処理を6時間したものに比べ、脱炭酸処理を30分したものに対する反応性が高い、ものの組み合わせであることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項記載のPIVKAIIの測定方法。前記ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIに特異的な抗体が、受託番号FERMBP-11258で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体及び受託番号FERMBP-11259で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項1~4のいずれか1項記載のPIVKA-IIの測定方法。二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIを測定するに当り、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIに特異的な抗体を使用することを特徴とするPIVKA-IIの測定試薬。前記二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体がいずれも、Ca2イオンの共存下における抗原固相ELISAにおいて、iプロトロンビンとは反応せず、且つiiプロトロンビンの脱炭酸処理を6時間したものに比べ、脱炭酸処理を30分したものに対する反応性が高い、ものの組み合わせであることを特徴とする請求項6記載のPIVKAIIの測定試薬。前記ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIに特異的な抗体が、受託番号FERMBP-11258で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体及び受託番号FERMBP-11259で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項6又は7記載のPIVKA-IIの測定試薬。受託番号FERMBP-11258で特定されるハイブリドーマにより産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。受託番号FERMBP-11259で特定されるハイブリドーマにより産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。受託番号FERMBP-11258で特定されることを特徴とするハイブリドーマ。受託番号FERMBP-11259で特定されることを特徴とするハイブリドーマ。請求項1記載の方法によって得られた値により、肝障害度を判定することを特徴とする肝障害度の判定方法。請求項2記載の方法によって得られた値により、肝がんを判定することを特徴とする肝がんの判定方法。前述のごとくPIVKA-IIには、肝臓において肝がん細胞が産出するPIVKA-IIと、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-II以下、肝がん細胞が産出するPIVKA-II以外のPIVKA-IIをビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIとする。があるが、従来の測定試薬ではそれらの区別が難しく、偽陽性が散見されるため、より偽陽性の少ない測定方法の開発が望まれていた。本発明は、肝がんにおける肝障害度の判定及び予後予測を可能とし、肝がんを感度良く検出することができるPIVKA-IIの測定方法、PIVKA-IIの測定試薬、肝障害度の判定方法及び肝がんの判定方法を提供することを目的とする。本発明者らは、鋭意検討を行い、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIと反応する2種の抗体を用いた二抗体サンドイッチ法によりPIVKA-IIを測定することで、肝がんにおける肝障害度の判定及び予後予測が可能となることを見出した。また、この抗体を用いて得られる測定値と従来の方法で行ったPIVKA-II測定値を比較することにより、アルコール性肝炎や肝硬変と肝がんを区別することが可能であり、肝がんの予後予測と、特異性の高い肝がんの検出が可能となることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明のPIVKA-IIの測定方法は、a二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIを測定し、測定値Aを得る工程、を含むPIVKA-IIの測定方法であって、前記a工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体として、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIに特異的な抗体を使用することを特徴とする。本発明のPIVKA-IIの測定方法は、b二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってPIVKA-IIを測定し、測定値Bを得る工程、及びc前記測定値A及び前記測定値Bを比較する工程、をさらに含み、前記b工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる一方の抗体として人肝がん細胞培養細胞株より精製したPIVKA-IIと反応する抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を使用し、前記b工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる他方の抗体としてヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使用することが好適である。前記a工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体が、人肝がん細胞培養細胞株より精製したPIVKA-IIと反応しないことが好ましい。前記a工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体が、ヒトトロンビンと反応しないことが好適である。前記a工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体がモノクローナル抗体であることが好適である。前記a工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体がいずれも、Ca2イオンの共存下における抗原固相ELISAにおいて、iプロトロンビンとは反応せず、且つiiプロトロンビンの脱炭酸処理を6時間したものに比べ、脱炭酸処理を30分したものに対する反応性が高い、ものの組み合わせであることが好適である。本発明のPIVKA-IIの測定試薬は、二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIを測定するに当り、抗体として、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIに特異的な抗体を使用することを特徴とする。本発明のビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIの測定試薬において、前記二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体がいずれも、Ca2イオンの共存下における抗原固相ELISAにおいて、iプロトロンビンとは反応せず、且つiiプロトロンビンの脱炭酸処理を6時間したものに比べ、脱炭酸処理を30分したものに対する反応性が高い、ものの組み合わせであることが好適である。本発明のモノクローナル抗体の第一の態様は、受託番号FERMBP-11258で特定されるハイブリドーマにより産生されることを特徴とする。本発明のモノクローナル抗体の第二の態様は、受託番号FERMBP-11259で特定されるハイブリドーマにより産生されることを特徴とする。本発明のハイブリドーマの第一の態様は、受託番号FERMBP-11258で特定されることを特徴とする。本発明のハイブリドーマの第二の態様は、受託番号FERMBP-11259で特定されることを特徴とする。本発明のPIVKA-IIの測定方法及び測定試薬において、前記ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIに特異的な抗体が、受託番号FERMBP-11258で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体及び受託番号FERMBP-11259で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることが好適である。本発明の肝障害度の判定方法は、本発明のPIVKA-IIの測定方法によって得られた値により、肝障害度を判定することを特徴とする。本発明の肝がんの判定方法は、本発明のPIVKA-IIの測定方法によって得られた値により、肝がんを判定することを特徴とする。本発明により、血液検査では従来は困難であった、肝がんにおける肝障害度の判定及び予後予測を的確に判定することができ、肝がんを感度良く検出することができる。さらに、本発明により、肝がんを発症していないアルコール性肝炎や肝硬変と肝がんを区別することが可能であり、肝がんの予後予測と、特異性の高い肝がんの検出が可能である。以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。本発明のPIVKA-IIの測定方法は、a二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIを測定し、測定値Aを得る工程、を含むPIVKA-IIの測定方法であって、前記a工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体として、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIに特異的な抗体を使用するものである。本願明細書において、前記a工程で測定されたビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIをNX-PVKAと称することがある。前記a工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体は、それぞれ、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIを抗原として作製されるビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIと反応する抗体であり、例えば、下記方法により製造される。非肝がん症例のクマジン血漿ビタミンK拮抗物質投与患者の血漿より精製したPIVKA-II、すなわち、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIを免疫原にして、公知の方法によりハイブリドーマを作製し、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIと反応するハイブリドーマ株を選択する。該ハイブリドーマ株選択時に、人肝がん細胞培養細胞株より精製したPIVKA-IIやヒトトロンビンと反応しないハイブリドーマ株を選択することが好ましい。特に、プロトロンビンの10個のグルタミン酸残基についてのγ-カルボキシル化の割合が高いPIVKA-IIに反応性が高いハイブリドーマを選択することが好適であり、具体的には、正常プロトロンビンの脱炭酸処理時間が短いPIVKA-IIに対して高い反応性を示すハイブリドーマを選択することが好適である。例えば、プロトロンビンより脱炭酸処理時間30分及び6時間で調製したPIVKA-IIに対する反応性を比較する場合、30分で調製したPIVKA-IIに対する反応性を6時間で調製したPIVKA-IIに対する反応性で割った場合に1より大きくなるハイブリドーマを選択することが好ましい。前記ハイブリドーマとしては、受託番号FERMBP-11258で特定されるハイブリドーマ及び受託番号FERMBP-11259で特定されるハイブリドーマが好ましい。前記選択したハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製し、該モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを用いて公知の方法によりビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIと反応するモノクローナル抗体を得ることが好ましい。前記a工程における二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法は、例えば、下記方法により実施される。前記方法により、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIを抗原として2種のモノクローナル抗体を調製し、一方を固相化して用い、他方を標識して用いる。該2種の抗体は、互いに交差反応しない抗体である。抗体を固相化する方法は特に制限はないが、例えば、磁気ビーズやマイクロプレート等の固相に固相化することが好適である。抗体を標識する方法は特に制限はないが、Ru等の標識物質により標識することが好ましい。前記固相化抗体及び標識抗体を用いて、検体中のビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIを測定する。測定は、二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法における通常の手順に従って行えばよい。なお、後述する実施例では、電気化学発光免疫測定法を用いた例を示したが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、化学発光法や放射性同位元素法等の公知の測定法を広く使用可能である。本発明において、前記a工程で測定されたNX-PVKAの測定値Aを得ることにより、肝がんにおける肝障害度を判定することができる。また、測定値Aを、従来の方法により測定されるPIVKA-IIの測定値と比較することにより、肝がんを発症していないアルコール性肝炎や肝硬変と肝がんを区別することができる。従来の肝がんで上昇するPIVKA-IIの測定方法としては特に制限はないが、例えば、b二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってPIVKA-IIを測定し、測定値Bを得る工程を含み、前記b工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる一方の抗体として人肝がん細胞培養細胞株より精製したPIVKA-IIと反応する抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を使用し、前記b工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる他方の抗体としてヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使用する方法が挙げられる。前記測定値Aと前記測定値Bを比較する手段は特に制限はなく、例えば、比や差を算出する方法が挙げられるが、測定値Bを測定値Aで除算してレシオ値を求めることが好適である。以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。実施例1モノクローナル抗体の調製1ハイブリドーマの調製クマジン血漿UNIGLOBERESEARCHCORPORATION社製より精製したPIVKA-II1mg/mLとフロイドの完全アジュバントGIBCO社製とを1対1で混和乳化し、50μg/100μmLエマルジョンで8週齢の雌BALB/Cマウス日本チャールズリバー株製の皮下に2週間間隔で4回投与後、最終免疫の3日後に脾臓を摘出した。摘出した脾臓から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞SP2/O-Ag14とを10対1の割合で混合し、50ポリエチレングリコール1540和光純薬工業株製存在下にて細胞融合させた。融合細胞は脾臓細胞として2.5x106/mLになるようにHAT培地に懸濁し、96穴培養プレートCORNING社製に0.2mLずつ分注した。これを5CO2インキュベーター中で37°Cにて培養し、おおよそ2週間後に、ハイブリドーマの生育してきたウェルの培養上清を、次に示すELISA法にしたがって評価し、PIVKA-IIに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。具体的には、まず、マイクロプレートNUNC社製に前記のPIVKA-IIを0.1μg/mL固相化した。これに、各培養上清を反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスIgGヤギ抗体を反応させ、次いでオルトフェニレンジアミン東京化成工業株製を含むペルオキシダーゼ基質溶液を加え発色させ、1.5N硫酸を加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダーAbs.492nmで測定し、PIVKA-IIと反応するハイブリドーマ株を選択した。このハイブリドーマを限界希釈法によりクローン化を行った後、その培養上清から、プロテインAカラムファルマシアを用いIgGを精製した。獲得したモノクローナル抗体の特異性を調べるため、プロトロンビンEnzymeResearchLaboratories社からBajahらの方法SPaulBajahPaulAPriceandWilliamARussellDecarboxylationofγCarboxyglutamicAcidResiduesinHumanProthrombinJournalofBiologicalChemistry25737261982に記載の方法に従い、脱炭酸時間の異なる各種PIVKA-IIを調製した。具体的には、4.6mg/mLのプロトロンビン溶液0.22mLに0.78mLの重炭酸アンモニウム溶液0.1mol/L、pH8.0を添加し、これを更に重炭酸アンモニウム溶液で4°Cにおいて一夜透析した。透析後の溶液に終濃度が10mmol/Lになるように0.1mol/LEDTA2Naを添加し、室温で30分間静置した。この溶液を再び重炭酸アンモニウム溶液で4°Cにおいて2時間透析した。透析後の溶液をスクリューキャップ付きの耐熱性バイアル6本に等量ずつ分注し、凍結乾燥した。次にバイアル内を窒素ガスで充満させ、110°Cで各時間0分、30分、1時間、2時間、6時間、23時間加熱した。各バイアルに1mLの生理食塩水を加え、内容物を溶解させ、使用するまで-80°Cで凍結保存した。前記の各種PIVKA-IIのうち、脱炭酸処理時間30分及び6時間のPIVKA-II、及びプロトロンビンを0.1μg/mL固相化したマイクロプレートを用いて、塩化カルシウムを4mmol/Lの濃度で共存させた条件で、選択したハイブリドーマの精製IgGの反応性を測定した。この条件でプロトロンビンに反応せず、且つ脱炭酸処理時間6時間のPIVKA‐IIに比べて脱炭酸処理時間30分のPIVKA‐IIに対して高い反応性を示すハイブリドーマを選択し、2種類のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ24211と24216以下、それぞれハイブリドーマ11及びハイブリドーマ16と表記することがあるを獲得した。前記得られたハイブリドーマ11及び16は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6に寄託され受領日:2010年5月28日、ハイブリドーマ11の受託番号はFERMBP-11258であり、ハイブリドーマ16の受託番号はFERMBP-11259である。脱炭酸処理時間を表1及び図1に示した如く変更した以外は上記と同様の方法でプロトロンビンの脱炭酸処理を行い、5種類のPIVKA-IIを調製した。ハイブリドーマ11から調製したP-11モノクローナル抗体、ハイブリドーマ16から調製したP-16モノクローナル抗体、及び従来試薬ピコルミPIVKA-IIエーディア株製の抗PIVKA-IIモノクローナル抗体の前記5種類のPIVKA-II及びプロトロンビン脱炭酸処理時間0分に対する反応性を上記と同様の方法で測定した。結果を表1及び図1に示す。表1及び図1において、1はP-11モノクローナル抗体、2はP-16モノクローナル抗体、3は従来試薬の抗PIVKA-IIモノクローナル抗体MU-3である。なお、P-11モノクローナル抗体及びP-16モノクローナル抗体の調製は後述する方法により行った。2モノクローナル抗体の調製ハイブリドーマ11及びハイブリドーマ16からそれぞれ下記方法によりP-11モノクローナル抗体及びP-16モノクローナル抗体を調製した。あらかじめ2週間前にプリスタン0.5mLを腹腔内に注射しておいた12週齢の雌BALB/Cマウスに、ハイブリドーマを細胞数0.5x106個の量で腹腔内に投与した。約14日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液3mol/LNaCl-1.5mol/LGlycine-NaOH,pH8.5と混和後、濾過した。このろ液を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインAカラムファルマシア社製に通して抗体をカラムに吸着させた後、0.1mol/Lクエン酸緩衝液pH3.0で溶出させてモノクローナル抗体を精製した。実施例2実施例1で得たP-16モノクローナル抗体及びP-11モノクローナル抗体を用い、下記方法により、ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIの測定を行った。1P-16モノクローナル抗体固相磁気ビーズの調製磁気ビーズ4.5ミクロン30mg/mLの1mLを試験管にとり、磁石でトラップし、上清液を捨てたあと、磁気ビーズにP-16モノクローナル抗体0.5mg/mL150mMリン酸緩衝液、pH7.8を1mL加え、室温で一昼夜撹拌しながら反応させた。磁気ビーズを洗浄したあと、1BSAリン酸緩衝液を2mL加え、室温で1昼夜撹拌しながらブロッキングし、P-16モノクローナル抗体固相磁気ビーズを調製した。使用時、ビーズ希釈液で磁気ビーズ量1mg/mLに希釈して用いた。ビーズ希釈液の組成を下記に示す。ビーズ希釈液の組成:0.05mol/Lトリス緩衝液pH7.5、0.150mol/LNaCl、0.01Tween20、0.1NaN3、10ウサギ血清加熱、0.1マウス血清清澄化2Ru標識P-11モノクローナル抗体の調製P-11モノクローナル抗体1mg/mLに調製した1mLに、サクシニミド基修飾ルテニウムトリジピリジルのRu錯体化合物を68μL加え、室温で30分撹拌しながら反応させたのち、2mol/Lグリシンを50μL加え、反応を停止し、さらに室温で10分間撹拌しながら反応させた。最後に試料をセファデックスG-2510mmol/Lリン酸緩衝液で平衡化に流し、Ru結合の蛋白分画を集め、Ru標識P-11モノクローナル抗体を調製した。得られたRu標識P-11モノクローナル抗体は、使用時、Ru希釈溶液で1μg/mLに希釈して用いた。Ru希釈液の組成を下記に示す。Ru希釈液の組成:0.015mol/Lヘペス緩衝液pH7.8、0.150mol/LNaCl、0.013mol/LCaCl2、0.1界面活性剤,0.1NaN3、0.1ベンザミジン、1μg/mL、5ウサギ血清加熱、0.01マウスIgG3ビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IIの測定前記調製したP-16モノクローナル抗体固相磁気ビーズ及びRu標識P-11モノクローナル抗体を用い、電気化学発光免疫測定法により検体中のビタミンK欠乏に起因するPIVKA-IINX-PVKAの測定値Aを求めた。検体として、手術を行っておらず、5年後の予後が判明している肝細胞癌患者63名の血清試料を用い、下記方法に従いNX-PVKA量を測定した。各検体50μLにP-16モノクローナル抗体固相磁気ビーズを25μLと1μg/mLのRu標識P-11モノクローナル抗体を含むRu標識抗体液150μLを加え、30°Cで9分間反応させた。反応後、磁気ビーズを磁石でトラップしながらピコルミBF洗浄液エーディア株製で3回洗浄した。0.1mol/Lトリプロピルアミンを含むピコルミ発光電解液エーディア株製を300μL加えて、電極表面に送り、磁気ビーズに結合したRuの発光量を自動分析装置ピコルミIIIエーディア株製で測定し、検体中のNX-PVKA量を求めた。実施例2の測定値をChild-Pugh分類別に平均値を算出した結果を表2及び図2aに示した。測定値について判別群を死亡例、対照群を生存例としてROC分析を行った。得られたROC曲線を図3に示す。ROC分析における曲線下面積は、0.710であった。比較例1ピコルミPIVKA-II測定キットエーディア株製を用いて、PIVKA-IIの測定を行った。結果を表2、図2b及び図3に示した。ROC分析における曲線下面積は、0.653であった。比較例2レーザー誘起蛍光検出法LAB法による、ミュータスワコーAFP-L3測定キット和光純薬工業株製を用いて,AFPの測定を行った。結果を表2、図2c及び図3に示した。ROC分析における曲線下面積は、0.651であった。比較例3比較例2と同様の方法により、AFP-L3AFPのレクチン反応性による分画比の測定を行った。結果を表2、図2d及び図3に示した。ROC分析における曲線下面積は、0.665であった。表2及び図2に示した結果から明らかなように、実施例2のNX-PVKAのみがChild-Pugh分類肝機能を評価するための分類を反映していた。また、図3の結果から明らかなように、実施例2のNX-PVKAが最も予後予測を反映していた。実施例3検体として肝細胞癌患者28人、肝硬変患者20人、慢性肝炎患者9人の血清試料を用い、PIVKA-IIとNX-PVKA量を測定した。PIVKA-II測定値をNX-PVKA測定値で割ったレシオ値NX-PVKA-Rを算出した。NX-PVKA量の測定は実施例2と同様の方法で行った。PIVKA-IIの測定は、ピコルミPIVKA-II測定キットエーディア株製を用いて行った。測定値を表3に示す。PIVKA-II測定値をグラフにしたものを図4に示した。PIVKA-II測定値をNX-PVKA測定値で割ったレシオ値の結果をグラフにしたものを図5に示した。表3、図4及び図5において、HCCは肝細胞癌、CHは慢性肝炎、LCは肝硬変、BはB型肝炎、CはC型肝炎、NBNCは非B型非C型肝炎、NASHは非アルコール性肝障害、AIHは自己免疫性肝炎、ALDはアルコール性肝障害である。表3、図4、図5に示した結果から明らかなように、従来の測定方法で得たPIVKA-II測定値をNX-PVKA測定値で割ったレシオ値図5のNX-PVKA-Rにより、従来の測定方法では偽陽性となっていた検体を区別することができ、肝がんに高い特異性を示した。実施例4実施例1で得たP-16モノクローナル抗体及びP-11モノクローナル抗体のエピトープを下記方法により調べた。1Gla残基含有ペプチドに対する反応性PIVKA-IIのN末端16残基に存在すると考えられるGla残基γと表示を含む下記配列番号1~3で表わす3種のペプチドPV002、PV003、PV004を合成した。PV002:ANTFLEγVRKGNLγRγPV003:ANTFLEEVRKGNLγRγPV004:ANTFLEEVRKGNLERγPV002のアミノ酸配列AlaAsnThrPheLeuGluGlaValArgLysGlyAsnLeuGlaArgGla配列番号1PV003のアミノ酸配列AlaAsnThrPheLeuGluGluValArgLysGlyAsnLeuGlaArgGla配列番号2PV004のアミノ酸配列AlaAsnThrPheLeuGluGluValArgLysGlyAsnLeuGluArgGla配列番号3この3種のペプチドに対する反応性を調べるため次の方法で競合ELISAを行った。脱炭酸処理時間1時間のPIVKA-IIをPBSで0.1μg/mLの濃度に希釈した後、ELISA用96穴プレートに50μL/wellずつ分注し、4°Cで一夜静置した。各wellを0.05Tween20含有PBS以下、PBSTというで3回洗浄後400μL/well、1BSA含有PBST以下、BSA-PBSTというを100μL/wellずつ分注し、室温で1時間静置してブロッキングを行った。PBSTで3回洗浄後、各wellにBSA-PBSTで希釈した各濃度20、4、0.8、0.16、0.032μmol/Lのペプチド溶液を25μL/wellずつ分注し、続いてBSA-PBSTで200ng/mLの濃度に希釈した各モノクローナル抗体P-16、P-11溶液を25μL/wellずつ分注し、室温で1時間静置した。PBSTで3回洗浄後、BSA-PBSTで3000倍希釈したHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体DAKO社製溶液を50μL/wellずつ分注し、室温で1時間静置した。PBSTで3回洗浄後、オルトフェニレンジアミン東京化成工業社製を含む基質溶液を50μL/wellずつ分注し、室温で10分間静置した。これに1.5N硫酸を50μL/wellずつ分注して反応を停止後、マイクロプレートリーダー492nmにおける吸光度を測定した。その結果を図6に示す。まず、P-16モノクローナル抗体は3種のペプチド全てに同等の反応性を示した。このことから、P-16モノクローナル抗体のエピトープは3種のペプチドの共通部位であるPIVKA-IIのN末端の1~6残基図7に示すaa1-6、又はPIVKA-IIのアミノ酸配列のN末端から8~13残基図7に示すaa8-13であることが示唆された。一方、P-11モノクローナル抗体は何れのペプチドとも反応しないことが判明した。本願明細書において、PIVKA-IIのN末端からX~Y残基のものをaaX-Yと称する。2変性PIVKA-II、変性プロトロンビン、及び変性トロンビンに対する反応性変性状態のPIVKA-II、プロトロンビン、及びトロンビンに対する各モノクローナル抗体の反応性をウエスタンブロット法により調べた。具体的には、脱炭酸処理時間2時間のPIVKA-II、0分のプロトロンビン、及び市販精製トロンビンベネシス社製に対する反応性を次の方法で調べた。0.1mg/mLPIVKA-II、0.1mg/mLプロトロンビン、及び10U/mLトロンビンを、それぞれメルカプトエタノール含有のSDS処理液コスモバイオ社製と1対1で混和後、10分間煮沸処理した。各サンプルをコスモバイオ社製のポリアクリルアミドゲルマルチゲルIIミニ4/20に5μL/wellずつ添加し、30mAで1時間電気泳動SDS-PAGEを行った。泳動後のゲルをセミドライブロッタ-コスモバイオ社製を用いPVDF膜に転写を行った100mA、45分間。該PVDF膜をレーン毎に切り分けた後、BSA-PBSTに浸し、4°Cで一夜ブロッキングを行った。PBSTで1回洗浄後、5μg/mLの濃度の各モノクローナル抗体液をPVDF膜と接触させ、室温で1時間静置した。PBSTで3回洗浄後、BSA-PBSTで2000倍希釈したHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体DAKO社製溶液入りの容器に移し、室温で1時間緩やかに振とうさせた。各PVDF膜をPBSTで3回、更にPBSで1回洗浄後、ジアミノベンチジン同仁化学研究所社製を含む基質溶液に浸して3分間反応させた後、精製水に移し反応を停止した。得られた染色像の結果を図8に示す。まず、従来試薬の抗体はPIVKA-IIのみに反応しプロトロンビンには反応しなかったのに対し、P-11及びP-16モノクローナル抗体は何れもPIVKA-IIとプロトロンビンに対し同等に反応した。一方、トロンビンに対しては、何れの抗体も反応しなかった。このことから、P-11及びP-16モノクローナル抗体はPIVKA-IIとプロトロンビンの一次アミノ酸配列の共通部位即ちGla残基を含まない部位を認識していることが示唆された。3フラグメント1及びフラグメント2に対する反応性プロトロンビンのフラグメント1及び2に対する各モノクローナル抗体の反応性をウエスタンブロット法により調べた。フラグメント1及び2EnzymeResearchLaboratories社製をPBSでそれぞれ0.05mg/mLの濃度に調製し、メルカプトエタノール含有のSDS処理液コスモバイオ社製とそれぞれ1対1で混和後、10分間煮沸処理した。調製したフラグメント1及び2を用い、上記2のウエスタンブロット法と同様の方法で各モノクローナル抗体のフラグメント1及び2に対する反応性を調べた。得られた染色像の結果を図9に示す。従来試薬の抗体MU-3はプロトロンビン由来のフラグメント1及び2のどちらにも反応しなかった。フラグメント1に対し、P-16モノクローナル抗体は強い反応性が、P-11モノクローナル抗体は弱いながらも反応性が認められた。一方、フラグメント2に対しては、P-11及びP-16モノクローナル抗体のどちらも反応性が認められなかった。このことから、P-11及びP-16モノクローナル抗体のエピトープは、フラグメント1即ちプロトロンビンのN末端から156残基aa1-156の中に存在することが示唆された。4Gla残基非含有ペプチドに対する反応性プロトロンビンのN末端から70番目まででGla残基を含まない10個のGla残基全てがGul残基のままのPIVKA-II配列番号4~13で表わされる部分ペプチド10本を合成した。aa1-16のアミノ酸配列AlaAsnThrPheLeuGluGluValArgLysGlyAsnLeuGluArgGlu配列番号4aa7-22のアミノ酸配列GluValArgLysGlyAsnLeuGluArgGluCysValGluGluThrCys配列番号5aa13-28のアミノ酸配列LeuGluArgGluCysValGluGluThrCysSerTyrGluGluAlaPhe配列番号6aa19-34のアミノ酸配列GluGluThrCysSerTyrGluGluAlaPheGluAlaLeuGluSerSer配列番号7aa25-40のアミノ酸配列GluGluAlaPheGluAlaLeuGluSerSerThrAlaThrAspValPhe配列番号8aa31-46のアミノ酸配列LeuGluSerSerThrAlaThrAspValPheTrpAlaLysTyrThrAla配列番号9aa37-52のアミノ酸配列ThrAspValPheTrpAlaLysTyrThrAlaCysGluThrAlaArgThr配列番号10aa43-58のアミノ酸配列LysTyrThrAlaCysGluThrAlaArgThrProArgAspLysLeuAla配列番号11aa49-64のアミノ酸配列ThrAlaArgThrProArgAspLysLeuAlaAlaCysLeuGluGlyAsn配列番号12aa55-70のアミノ酸配列AspLysLeuAlaAlaCysLeuGluGlyAsnCysAlaGluGlyLeuGly配列番号13上記1と同様の競合ELISAで各モノクローナル抗体と各ペプチドの反応性を調べた。その結果を表4に示す。まず、P-16モノクローナル抗体はaa1-16のペプチドに反応性を示し、aa7-22及び他のペプチドに対しては反応性を示さなかった。一方、P-11モノクローナル抗体は何れのペプチドとも反応しないことが判明した。以上の結果をまとめると、次の通りである。P-16モノクローナル抗体のエピトープは、該抗体の上記1と4に記載のペプチドに対する反応性、及び上記2に記載したPIVKA-IIとプロトロンビンに対する反応性から、プロトロンビンフラグメント1のN末端から5残基配列番号14で表わすaa1-5の範囲であることが判明した。aa1-5のアミノ酸配列AlaAsnThrPheLeu配列番号14また、P-11モノクローナル抗体のエピトープは、上記3でフラグメント1aa1-156に反応すること、及び上記4でaa1-70に含まれる各ペプチドに反応しないことから、プロトロンビンフラグメント1のaa60-156の範囲に存在することが考えられた。"