"ボルデテラブロンキセプティカBordetellabronchisepticaに対してイヌを保護するために有効な量のボルデテラブロンキセプティカp68抗原及びアヂュヴァントを含む、ボルデテラブロンキセプティカに対してイヌを保護するためのワクチン製剤であって、ここで当該ボルデテラブロンキセプティカp68抗原は配列番号1に示されるアミノ酸配列を含み及び組換えで作出され、そして当該アヂュヴァントはキラヤサポナリアAquillajasaponariaA及びコレステロールを含む前記ワクチン製剤。イヌヂステンパーCDウイルスの弱化された株、イヌアデノウイルス2型CAV-2の弱化された株、イヌパラインフルエンザCPIウイルスの弱化された株及びイヌパルヴォウイルスCPVの弱化された株の調製物;イヌコロナウイルスCCVの株の不活性化した全体の又は部分の細胞調製物、ボルデテラブロンキセプティカp68抗原、及びアヂュヴァントを含む、イヌ病原体に対してイヌを免疫化するための併合ワクチンであって、ここで当該ボルデテラブロンキセプティカp68抗原は配列番号1に示されるアミノ酸配列を含み及び組換えで作出され、そして当該アヂュヴァントはキラヤサポナリアAquillajasaponariaA及びコレステロールを含む前記併合ワクチン。イヌヂステンパーCDウイルスの弱化された株、イヌアデノウイルス2型CAV-2の弱化された株、イヌパラインフルエンザCPIウイルスの弱化された株及びイヌパルヴォウイルスCPVの弱化された株の調製物;イヌコロナウイルスCCVの株の不活性化した全体の又は部分の細胞調製物、ボルデテラブロンキセプティカBordetellabronchisepticap68抗原、レプトスピラブラチスラバLeptospirabratislava、レプトスピラキャニコーラLeptospiracanicola、レプトスピラグリポチフォサLeptospiragrippotyphosa、レプトスピライクテラヘモラジエLeptospiraicterhaemorrhagiae、及びレプトスピラポモナLeptospirapomonaから成る群から選ばれる少なくとも1のレプトスピラLeptospira種のレプトスピラLeptospira細胞調製物、及びアヂュヴァントを含む、イヌ病原体に対してイヌを免疫化するための併合ワクチンであって、ここで当該ボルデテラブロンキセプティカp68抗原は配列番号1に示されるアミノ酸配列を含み及び組換えで作出され、そして当該アヂュヴァントはキラヤサポナリアAquillajasaponariaA及びコレステロールを含む、前記併合ワクチン。前記レプトスピラLeptospira細胞調製物はレプトスピラブラチスラバLeptospirabratislava、レプトスピラキャニコーラLeptospiracanicola、レプトスピラグリポチフォサLeptospiragrippotyphosa、レプトスピライクテラヘモラジエLeptospiraicterhaemorrhagiae、及びレプトスピラポモナLeptospirapomonaの細胞調製物を含む、請求項3に記載の併合ワクチン。イヌヂステンパーCDウイルスの弱化された株、イヌアデノウイルス2型CAV-2の弱化された株、イヌパラインフルエンザCPIウイルスの弱化された株及びイヌパルヴォウイルスCPVの弱化された株の調製物;ボルデテラブロンキセプティカBordetellabronchisepticap68抗原、レプトスピラブラチスラバLeptospirabratislava、レプトスピラキャニコーラLeptospiracanicola、レプトスピラグリポチフォサLeptospiragrippotyphosa、レプトスピライクテラヘモテジエLeptospiraicterhaemorrhagiae及びレプトスピラポモナLeptospirapomonaから成る群から選ばれる少なくとも1のレプトスピラLeptospira種の細胞調製物を含むレプトスピラLeptospira細菌ワクチン;及びアヂュヴァントを含む、イヌ病原体に対してイヌを免疫化するための併合ワクチンであって、当該ボルデテラブロンキセプティカp68抗原は配列番号1に示されるアミノ酸配列を含み及び組換えで作出され、そして当該アヂュヴァントはキラヤサポナリアAquillajasaponariaA及びコレステロールを含む前記併合ワクチン。前記レプトスピラLeptospira細菌ワクチンはレプトスピラブラチスラバLeptospirabratislava、レプトスピラキャニコーラLeptospiracanicola、レプトスピラグリポチフォサLeptospiragrippotyphosa、レプトスピライクテラヘモテジエLeptospiraicterhaemorrhagiae、及びレプトスピラポモナLeptospirapomonaの細胞調製物を含む、請求項5に記載の併合ワクチン。発明の詳細な説明1の態様において、本発明はBordetellabronchisepticaにより引き起こされる疾患に対してイヌを保護することができるイヌへの投与に好適な一価のワクチンを提供する。本発明に係る一価のワクチンは組換えで作出されたBordetellabronchisepticap68抗原及びアヂュヴァントの如き獣医学的に許容される担体を含む。他の態様において、本発明はイヌに組換えで作出されたBordetellabronchisepticap68抗原及びアヂュヴァントの如き獣医学的に許容される担体を含む一価のワクチンを投与することによるBordetellabronchisepticaにより引き起こされる疾患に対してイヌを保護する方法を提供する。さらに他の態様において、本発明はイヌへの投与に好適な組み合わせワクチンを提供する。本発明に係る組み合わせワクチンは他の抗原により引き起こされる疾患に対してイヌにおいて保護性の免疫応答を誘導することができる少なくとも1の上記他の抗原との組み合わせの、組換えで作出されたBordetellabronchisepticap68抗原を含む。本発明に係る好ましい組み合わせワクチンはイヌヂステンパーCDウイルス、イヌアデノウイルス2型CAV-2、イヌパラインフルエンザCPIウイルス及びイヌパルヴォウイルスCPVの減衰された株;イヌコロナウイルスCCVの株の不活性化調製物;及びBordetellabronchisepticap68タンパク質を含む。本発明に係る他の好ましい組み合わせワクチンはイヌヂステンパーCDウイルス、イヌアデノウイルス2型CAV-2、イヌパラインフルエンザCPIウイルス及びイヌパルヴォウイルスCPVの減衰された株;イヌコロナウイルスCCVの株の不活性化調製物;Bordetellabronchisepticap68タンパク質、及び5のレプトスピラ血液型亜型Leptospirabratislava、Leptospiracanicola、Leptospiragrippotyphosa、Leptospiraicterohaemorrhagiae及びLeptospirapomonaの調製物を含む。本発明に係るさらに他の好ましい組み合わせワクチンはCDウイルス、CAV-2、CPIウイルス、CPV株の減衰された株;及びBordetellabronchisepticap68タンパク質を含む。本発明に係る他の好ましい組み合わせワクチンはCDウイルス、CAV-2、CPIウイルス、CPV株の減衰された株;Bordetellabronchisepticap68タンパク質;及びLeptospiracanicola及びLeptospiraicterohaemorrhagiaeの調製物を含む。本発明に係るさらに他の好ましい組み合わせワクチンはCDウイルス、CAV-2、CPIウイルス、CPV株の減衰された株、及び5のレプトスピラ血液型亜型Leptospirabratislava、Leptospiracanicola、Leptospiragrippotyphosa、Leptospiraicterohaemorrhagiae及びLeptospirapomonaの調製物を含む。本発明はまたイヌに本発明に係る組み合わせワクチンを投与することによるイヌ病原体により引き起こされる疾患に対してイヌを保護する方法をも提供する。開示の明瞭のために、及び限定のためでなく、本発明の詳細な説明は、本発明のいくつかの特徴、態様又は適用を示す又は例示する以下の小区分に分けられる。定義及び略語上記用語イヌ病原体により引き起こされる疾患に対してイヌを保護するは、本明細書中で使用されるとき、病原体による感染の危険性を減少させる若しくは消去すること、感染の症状を改善する若しくは緩和すること又は感染からの回復を加速させることを意味する。例えば、ウイルス又は細菌ロードにおける減少、ウイルス又は細菌発散における減少、感染の発生又は期間における減少、減少した急性相血清タンパク質値、減少した直腸温度、及び/又は食物摂取及び/又は成長における増大がある場合、保護は達成される。上記用語p68抗原はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される68kDaの分子量のタンパク質をいい、p68特異的モノクローナル抗体Bord2-7ATCCにより認識され、及び配列ID番号:1中に示されるアミノ酸配列又は配列ID番号:1に実質的に同一のアミノ酸配列を有する。実質的に同一により、少なくとも約90、好ましくは少なくとも約95又はより好ましくは少なくとも約98の配列同一性の程度が意味される。上記用語一価のワクチンは、本明細書中で使用されるとき、1の主要な抗原成分を有するワクチンをいう。例えば、p68一価ワクチンは上記ワクチンの主要な抗原成分としてBordetellabronchisepticap68抗原を含み、及びBordetellabronchisepticaにより引き起こされる疾患に対して上記ワクチンが投与された動物を保護することができる。上記用語組み合わせワクチンはイヌにおいて保護性の免疫応答を誘導することができる二価の又は多価の抗原の組み合わせを意味する。病原体単数又は病原体複数に対する組み合わせワクチンの保護効果は動物被検体において免疫応答、細胞仲介若しくは体液性免疫応答又は両方の組み合わせのいずれかを誘導することにより通常達成される。免疫原性により、特定の病原体に対してイヌにおいて免疫応答を引き起こす組成物の能力が意味される。上記免疫応答は細胞毒性T-細胞及びサイトカイン生成T-細胞により主に仲介される細胞性免疫応答又はヘルパーT-細胞により主に仲介される体液性免疫応答でありうる、及びそれは抗体生成を引き起こすB-細胞を活性化する。上記用語治療的に有効な量又は有効な量は、それが投与されたイヌにおいて保護性の免疫応答を誘発するのに十分な一価の又は組み合わせワクチンの量をいう。上記免疫応答は、非限定的に、細胞性及び/又は体液性免疫の誘導を含みうる。治療的に有効なワクチンの量はワクチン中に使用される特定の抗原、イヌの年齢及び状態、及び/又は感染の程度に因り変化しうる、及び獣医師により決定されうる。p68ワクチン本発明は、Bordetellabronchisepticap68抗原を含むワクチン組成物がBordetellabronchisepticaにより引き起こされる疾患に対してイヌを有効に保護したことをはじめて示した。本発明に係るワクチン組成物は顕著な予防接種後反応を引き起こさず、子イヌへの投与に安全であり、及び長期間続くイヌにおける保護性の免疫を誘導する。したがって、本発明の1の態様はイヌへの投与に好適な及びBordetellabronchisepticaにより引き起こされる疾患、例えば、感染性気管気管支炎犬舎咳に対してイヌを保護することができる、Bordetellabronchisepticap68抗原又はp68ワクチンを含むワクチン組成物に方向付けられる。本発明の目的のために、上記用語p68抗原はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される68kDaの分子量のタンパク質をいい、p68特異的モノクローナル抗体Bord2-7ATCCにより認識され、及び配列ID番号:1中に示されるアミノ酸配列又は配列ID番号:1に実質的に同一のアミノ酸配列を有する。実質的に同一により、少なくとも約90、好ましくは少なくとも約95又はより好ましくは少なくとも約98の配列同一性の程度が意味される。配列ID番号:1に実質的に同一のアミノ酸配列を有するp68抗原の例は配列ID番号:3中に示される、WO92/17587中に示されるp68抗原である。本発明に係るp68特異的モノクローナル抗体は例えば、ネイティブp68タンパク質、組換えp68タンパク質及び細菌の表面上のp68タンパク質を認識する。本発明にしたがって、本発明における使用のために好適なp68抗原はネイティブp68タンパク質すなわち、Bordetellabronchisepticaから精製された天然p68タンパク質及び組換えで作出されたp68タンパク質の両方を含む。Bordetellabronchisepticaからのネイティブp68の精製は例えば、Montarazetal.,InfectionandImmunity47:744-7511985中に示され、及びまた本明細書中以下に提供される実施例中に例示される。p68の組換え生成は当業者に知られる分子クローニング及び組換え発現技術の1を用いて達成されうる。例えば、p68をコードする核酸分子は細菌、酵母細胞例えば、Pichia細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞例えば、CHO細胞の如き、適切な宿主細胞に導入されうる。上記p68をコードする核酸分子は上記宿主細胞においてp68抗原の発現を実行することができるプロモーターへの機能可能な結合で入れられうる。上記宿主細胞により発現されるp68はルーティンのタンパク質精製技術を用いて容易に精製されうる。本発明の好ましい態様においては、配列ID番号:1のアミノ酸配列を有するp68抗原をコードする配列ID番号:2中に示されるヌクレオチド配列は発現ベクター中にクローニングされ、及び温度感受性プロモーターへの機能可能な結合で入れられる。上記発現ベクターはEscherichiacoliへ導入され、及びp68抗原は熱誘導に際して発現される。上記細胞は溶解され、及びp68抗原が蓄積する封入体は遠心分離により分離される。上記封入体中の組換えp68はSDS又は尿素、塩酸グアニヂン、コール酸ナトリウム、タウロコール酸、及びデオキシコール酸ナトリウムの如き本分野において知られる他の可溶化剤を用いて可溶化される。本発明にしたがって、精製されたネイティブ又は組換えp68タンパク質は獣医学的に許容される担体と混合され、p68ワクチン組成物を形成する。上記用語獣医学的に許容される担体はいかなる及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、アヂュヴァント補助剤、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤等をも含む。希釈剤は水、塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を含みうる。等張剤は数ある中で、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを含みうる。安定化剤は数ある中で、アルブミンを含む。本発明にしたがう使用に好適なアヂュヴァントは、非限定的に、鉱物塩、例えば、アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウム;界面活性剤及び微粒子、例えば、非イオン性ブロック重合体界面活性剤例えば、コレステロール、人工ウイルス粒子virosomes、サポニン例えば、QuilA、QS-21及びGPI-0100、プロテオソーム、免疫刺激複合体、cochleates、第四アミンヂメチルヂオカタデシルアンモニウムブロミドDDA、アヴリヂン、ヴィタミンA、ヴィタミンE;RIBIアヂュヴァントシステムRibiInc.、Mycobacterumphleiの細胞壁骨格Detox商標、ムラミルヂペプチドMDP及びトリペプチドMTP、モノフォスフォリル脂質A、BacillusCalmete-Guerin、熱不安定性E.coliエンテロトキシン、コレラ毒素、トレハロースヂマイコレート、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの如き細菌製品;サイトカイン及びホルモン、例えば、インターロイキンIL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、デヒドロエピアンドロステロン、1,25-ヂヒドロキシヴィタミンD3;ポリアニオン、例えば、デキストラン;ポリアクリル酸例えば、ポリメチルメタクリル酸、Carbopol934P;担体、例えば、破傷風類毒素、ヂフテリア類毒素、コレラ毒素Bサブユニット、腸毒素産生性E.coliの突然変異体熱不安定性エンテロトキシンrmLT、熱ショックタンパク質;水中油エマルジョン、例えば、AMPHIGEN商標Hydronics,USA;及び例えば、Freund’s完全及び不完全アヂュヴァントの如き油中水エマルジョンの如き、いくつかのアヂュヴァントクラスを含む。本発明に係るワクチンにおける使用のために好ましいアヂュヴァントはQuilA及びコレステロールを含む。p68抗原及び獣医学的に許容される担体は、例えば、混合、溶解、懸濁、乳化、カプセル化、吸収等による、いかなる便利な及び実用的な様式でも混合され、ワクチン組成物を形成することができ、及び注入、埋入、吸入、摂取等に好適な錠剤、カプセル、粉末、シロップ、懸濁物の如き調剤中に作出されうる。好ましくは、上記ワクチンは、それが約0.1~5ml又は好ましくは約0.5~2.5mlの用量で又はさらにより好ましくは約1mlの用量で注入によりイヌに投与されうるように調合される。適切な場合、本発明に係る医薬組成物は周知の手順により滅菌されるべきである。上記ワクチン中のp68の量は免疫化に有効であるべきであり、及び一般的に1用量当たり0.5~1000μgの範囲内である。好ましくは、p68の量は1用量当たり1~260μgの範囲内である。より好ましくは、p68の量は1用量当たり10~100μgの範囲内である。さらにより好ましくは、p68の量は1用量当たり約15~25μgである。上記ワクチンにおける使用のために好適なアヂュヴァントの量は使用されるアヂュヴァントの性質に因る。例えば、QuilA及びコレステロールがアヂュヴァントとして使用されるとき、QuilAは一般的に1用量当たり約1~1000μg、好ましくは1用量当たり30~100μg、及びより好ましくは1用量当たり約50~75μgの量であり;及びコレステロールは一般的に1用量当たり約1~1000μg、好ましくは1用量当たり約30~100μg、及びより好ましくは1用量当たり約50~75μgの量である。他の態様において、本発明はイヌに本明細書中上記に示されるp68ワクチン組成物を投与することによりBordetellabronchisepticaにより引き起こされる疾患に対してイヌを保護する方法を提供する。本発明にしたがって、p68ワクチン組成物は少なくとも約4ヶ月間、好ましくは少なくとも約6ヶ月間又はさらにより好ましくは約1年間長期免疫をイヌに提供する。本発明にしたがって、p68ワクチンは経口、鼻内、粘膜、局所、経皮、及び非経口例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下又は筋内を含むいかなる既知の経路によってもイヌに投与されうる。投与はまた針なしデリバリー装置を用いても達成されうる。投与は経路の組み合わせを用いて、例えば、第一の投与は非経口経路を用い、及び続く投与は粘膜経路を用いて達成されうる。好ましい投与経路は皮下及び筋内投与を含む。本発明に係るp68ワクチン組成物は少なくとも6週齢、好ましくは少なくとも7週齢、及びより好ましくは少なくとも8又は9週齢のイヌに投与されうる。イヌは1用量で又は1超の用量のp68ワクチンで予防接種されうる。好ましくは、2用量のp68ワクチンが2の投与の間に約2~4週間、好ましくは約3週間の間隔を有してイヌに投与される。イヌが4月齢より前に予防接種される場合、母親の抗体が4月齢未満の子イヌにおいて十分な免疫応答の発展を妨害しうるので、それらは4月齢に達した際に単一の用量で再び予防接種されることが推奨される。イヌはまた単一の用量で毎年再び予防接種されうる。交配、搭乗乗船、乗車、及び展示状況のように、B.bronchiseptica暴露が起こりそうな場合、追加のブースターがこれらの事件の発生の1年又は好ましくは6ヶ月以内に与えられうる。p68組み合わせワクチン他の態様において、本発明は組み合わせワクチンを投与することによりBordetellabronchiseptica及び1以上の他のイヌ病原体に対してイヌを保護するための組み合わせワクチン及び方法を提供する。本発明に係る組み合わせワクチン組成物は有効性妨害を示さず、及び子イヌへの投与に安全である。本発明に係る組み合わせワクチンは、他の病原体により引き起こされる疾患に対してイヌにおいて保護性の免疫応答を誘導することができる上記他のイヌ病原体からの少なくとも1の抗原との組み合わせの、本明細書中上記に示されるように作出されうるBordetellabronchisepticap68抗原を含む。上記他の病原体は、非限定的に、イヌヂステンパーCDウイルス、イヌアデノウイルス2型CAV-2、イヌパラインフルエンザCPIウイルス、イヌパルヴォウイルスCPV、イヌコロナウイルスCCV、イヌヘルペスウイルス、及び狂犬病ウイルスを含む。本発明に係るワクチン組成物における使用のためのこれらの病原体からの抗原は改変された生きたウイルス調製物又は不活性化されたウイルス調製物の形態でありうる。これらのウイルスの悪性株を減衰させる方法及び不活性化ウイルス調製物を作出する方法は本分野において知られ、及び例えば、米国特許第4,567,042号及び第4,567,043号中に示される。他の病原体はまたLeptospirabratislava、Leptospiracanicola、Leptospiragrippotyphosa、Leptospiraicterohaemorrhagiae、Leptospirapomona、Leptospirahardjobovis、Porphyromonasspp.、Bacteriodesspp.、Leishmaniaspp.、Borreliaspp.、Ehrlichiaspp.、Mycoplasmaspp.及びMicrosporumcanisを含む。本発明に係るワクチン組成物における使用のためのこれらの病原体からの抗原は本分野において周知の方法を用いた、不活性化された全体の又は部分の細胞調製物の形態でありうる。例えば、不活性化された全体の又は部分のLeptospira細胞調製物の作出方法は本分野において知られ、及び例えば、Yan,K-T,AspectsofImmunitytoLeptospiraborgpeterseniiserovarhardjo,PhDThesis,AppendixI,1996.FacultyofAgricultureandFoodScience,TheQueen’sUniversityofBelfast;Mackintoshetal.,Theuseofahardjo-pomonavaccinetopreventleptospiruriaincattleexposedtonaturalchallengewithLeptospirainterrogansserovarhardjo,NewZealandVet.J.28:174-177,1980;Bolinetal.,EffectofvaccinationwithapentavalentleptospiralvaccineonLeptospirainterrogansserovarhardjotypehardjo-boivsinfectionofpregnantcattle,Am.J.Vet.Res.50:161-165,1989中に示される。本発明にしたがって、上記組み合わせワクチンは一般的に獣医学的に許容される担体を含む。本明細書中上記に示されるように、獣医学的に許容される担体はいかなる及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、アヂュヴァント補助剤、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤等を含む。希釈剤は水、塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を含みうる。等張剤は数ある中で、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを含みうる。安定化剤は数ある中で、アルブミンを含む。本発明にしたがう使用のために好適なアヂュヴァントは、非限定的に、鉱物塩、例えば、アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウム;界面活性剤及び微粒子、例えば、非イオン性ブロック重合体界面活性剤例えば、コレステロール、人工ウイルス粒子virosomes、サポニン例えば、QuilA、QS-21及びGPI-0100、プロテオソーム、免疫刺激複合体、cochleates、第四アミンヂメチルヂオカタデシルアンモニウムブロミドDDA、アヴリヂン、ヴィタミンA、ヴィタミンE;RIBIアヂュヴァントシステムRibiInc.、Mycobacterumphleiの細胞壁骨格Detox商標、ムラミルヂペプチドMDP及びトリペプチドMTP、モノフォスフォリル脂質A、BacillusCalmete-Guerin、熱不安定性E.coliエンテロトキシン、コレラ毒素、トレハロースヂマイコレート、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの如き細菌製品;サイトカイン及びホルモン、例えば、インターロイキンIL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、デヒドロエピアンドロステロン、1,25-ヂヒドロキシヴィタミンD3;ポリアニオン、例えば、デキストラン;ポリアクリル酸例えば、ポリメチルメタクリル酸、Carbopol934P;担体、例えば、破傷風類毒素、ヂフテリア類毒素、コレラ毒素Bサブユニット、腸毒素産生性E.coliの突然変異体熱不安定性エンテロトキシンrmLT、熱ショックタンパク質;水中油エマルジョン、例えば、AMPHIGEN商標Hydronics,USA;及びFreund’s完全及び不完全アヂュヴァントの如き油中水エマルジョンの如き、いくつかのアヂュヴァントクラスを含む。本発明にしたがう組み合わせワクチンにおける使用のための好ましいアヂュヴァントはQuilA及びコレステロールを含む。上記p68抗原、1以上の他の病原体からの抗原、及び獣医学的に許容される担体は、例えば、混合、溶解、懸濁、乳化、カプセル化、吸収等による、いかなる便利な及び実用的な様式でも混合され、組み合わせワクチン組成物を形成しうる、及び注入、埋入、吸入、摂取等に好適な錠剤、カプセル、粉末、シロップ、懸濁物の如き調剤中に作出されうる。好ましくは、上記ワクチンは、それが約0.1~5ml又は好ましくは約0.5~2.5mlの用量で又はさらにより好ましくは約1mlの用量で注入によりイヌに投与されうるように調合される。本発明にしたがって、p68組み合わせワクチンは少なくとも6週齢、好ましくは少なくとも7週齢、及びより好ましくは少なくとも8又は9週齢のイヌに投与されうる。上記投与は経口、鼻内、粘膜、局所、経皮、及び非経口例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下又は筋内を含む、いかなる既知の経路によってもなされうる。投与はまた針なしデリバリー装置を用いても達成されうる。投与はまた経路の組み合わせを用いて、例えば、第一の投与は非経口経路を用い、及び続く投与は粘膜経路を用いて達成されうる。好ましい投与経路は皮下及び筋内投与を含む。好ましいp68組み合わせワクチン及び予防接種方法本発明に係る好ましい組み合わせワクチンはCDウイルスの減衰された株、CAV-2の減衰された株、CPIウイルスの減衰された株、CPVの減衰された株、CCVの株の不活性化調製物、及びBordetellabronchisepticap68抗原を含む。特に好ましい組み合わせワクチンはSnyderHill株NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAと呼ばれる減衰されたCDウイルス株、Manhattan株NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAと呼ばれる減衰されたCAV-2株、NL-CPI-5NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAの名称を有する減衰されたCPIウイルス株、NL-35-DNationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAの名称を有する減衰されたCPV株、NL-18NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAの名称を有するCCV株の不活性化調製物、及び配列ID番号:1の配列を有する組換えBordetellabronchisepticap68抗原を含む。p68/5CV組み合わせワクチンとも本明細書中で呼ばれる、上記組み合わせワクチンは減衰されたウイルス株のフリーズドライ調製物及びウイルス調製物を液体調製物で再水和化することにより好ましく調製され、その液体調製物は滅菌塩水溶液中に溶解され及びQuilA及びコレステロールで補助されるp68抗原から成る。他の特に好ましい組み合わせワクチンはp68/5CV組み合わせワクチンの抗原成分、及び5のレプトスピラ種:Leptospirabratislava例えば、NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAから得られうるLeptospirabratislava株、Leptospiracanicola例えば、株C-5、NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IA、Leptospiragrippotyphosa例えば、株MAL1540、NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IA、Leptospiraicterohaemorrhagiae例えば、株NADL11403、NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IA及びLeptospirapomona例えば、株T262、NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAの不活性化全細胞調製物を含む。p68/5CV-Leptospira組み合わせワクチンとも本明細書中で呼ばれる、上記組み合わせワクチンは減衰されたウイルス株のフリーズドライ調製物又はスプレイ乾燥又は脱水の如き他の方法により作出される調製物及びウイルス調製物を液体調製物で再水和化することにより好ましく調製され、その液体調製物は滅菌塩水溶液中に溶解され、及びQuilA及びコレステロールで補助されたp68抗原及びレプトスピラの抗原から成る。本発明にしたがって、p68/5CV及びp68/5CV-Leptospira組み合わせワクチンは4週齢以上、好ましくは6週齢以上の健康なイヌに、及び好ましくはそれぞれ約3週間離れて投与される3用量で投与されうる。イヌは単一の用量で毎年再予防接種されうる。交配、搭乗乗船、乗車、及び展示状況のように、B.bronchiseptica及びイヌウイルス暴露が起こりそうな場合、追加のブースターはこれらの事件の発生の1年又は好ましくは6ヶ月以内に与えられうる。本発明に係るさらに他の好ましい組み合わせワクチンはCDウイルスの減衰された株、CAV-2の減衰された株、CPIウイルスの減衰された株、CPVの減衰された株、及び組換えBordetellabronchisepticap68抗原を含む。特に好ましい組み合わせワクチンはSynderHill株NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAと呼ばれる減衰されたCDウイルス株、Manhattan株NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAと呼ばれる減衰されたCAV-2株、NL-CPI-5NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAの名称を有する減衰されたCPIウイルス株、NL-35-DNationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAと呼ばれる減衰されたCPV株、及び配列ID番号:1の配列を有する組換えBordetellabronchisepticap68抗原を含む。p68/DA2PP組み合わせワクチンとも本明細書中で呼ばれる、上記組み合わせワクチンは減衰されたウイルス株のフリーズドライ調製物又はスプレイ乾燥又は脱水の如き他の方法により作出される調製物を液体調製物で再水和化することにより好ましく調製され、その液体調製物は滅菌塩水溶液中に溶解され、及びQuilA及びコレステロールで補助されるp68抗原から成る。他の特に好ましい組み合わせワクチンはp68/DA2PP組み合わせワクチンの抗原成分及び2のレプトスピラ種:Leptospiracanicola例えば、株C-51、NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IA、及びLeptospiraicterohaemorrhagiae例えば、株NADL11403、NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAの不活性化全細胞調製物を含む。あるいは、好ましい組み合わせワクチンはp68/DA2PP組み合わせワクチンの抗原成分及び5のレプトスピラ種:Leptospirabratislava、Leptospiracanicola、Leptospiragrippotyphosa、Leptospiraicterohaemorrhagiae及びLeptospirapomonaの不活性化全細胞調製物を含みうる。p68/DA2PP-Leptospira組み合わせワクチンとも本明細書中で呼ばれる、これらの組み合わせワクチンは減衰されたウイルス株のフリーズドライ調製物又はスプレイ乾燥又は脱水の如き他の方法により作出される調製物及びウイルス調製物を液体調製物で再水和化することにより好ましく調製され、その液体調製物は滅菌塩水溶液中に溶解され、及びQuilA及びコレステロールで補助されたp68抗原及びレプトスピラの抗原から成る。本発明にしたがって、p68/DA2PP及びp68/DA2PP-Leptospira組み合わせワクチンは6週齢以上又は好ましくは8週齢以上の健康なイヌに、及び好ましくはそれぞれ約3週間離れて投与される2用量で投与されうる。少なくとも12週齢のイヌに与えられる場合、単一用量は十分でありうる。イヌは単一の用量で毎年再予防接種されうる。交配、搭乗乗船、乗車、及び展示状況のように、B.bronchiseptica及びイヌウイルス暴露が起こりそうな場合、追加のブースターはこれらの事件の発生の1年又は好ましくは6ヶ月以内に与えられうる。他の好ましい組み合わせワクチンはCPIの減衰された株との組み合わせの、p68抗原、好ましくは配列ID番号:1を有する組換えp68抗原を含む。さらに他の好ましい組み合わせワクチンはp68抗原、好ましくは配列ID番号:1を有する組換えp68抗原、CPIの減衰された株、及びLeptospiracanicola例えば、株C-51、NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IA、及びLeptospiraicterohaemorrhagiae例えば、株NADL11403、NationalVeterinaryServiceLaboratory,Ames,IAの如き2の少なくとも2のレプトスピラ種を含む。本発明に係る組み合わせワクチンにおけるp68抗原及び1以上の他の病原体からの抗原単数又は複数の量は免疫化に有効であるべきである。一般的に、組み合わせワクチンにおけるp68抗原は1用量当たり少なくとも約0.5μgの量であるべきである。上記減衰されたCDウイルスは1用量当たり少なくとも約102~約109TCID50組織培養感染性用量50細胞障害効果の量で、及び好ましくは1用量当たり約104~約106TCID50の範囲内であるべきである。上記減衰されたCAV-2は1用量当たり少なくとも約102TCID50~約109TCID50の量で、好ましくは1用量当たり1040~約1060TCID50の範囲内であるべきである。上記減衰されたCPIウイルスは1用量当たり少なくとも約102TCID50~約109TCID50の量で、及び好ましくは1用量当たり106~約108TCID50の範囲内であるべきである。上記減衰されたCPVは1用量当たり少なくとも約102TCID50~約109TCID50の量で、好ましくは1用量当たり107~約109TCID50の範囲内の量であるべきである。不活性化ウイルス調製物中のCCVの量は1用量当たり少なくとも約100相対ユニット、及び好ましくは1用量当たり1000~4500相対ユニットの範囲内であるべきである。上記ワクチン中のそれぞれのレプトスピラ種は1ワクチン用量当たり約100~3500NU比濁単位の範囲内で、及び好ましくは1用量当たり200~2000NUの範囲内であるべきである。上記組み合わせワクチンは、上記ワクチンが0.1ml~5ml、好ましくは0.5ml~2.5ml、及びより好ましくは、約1mlの用量で注入によりイヌに投与されうるよう調合される。本発明は以下の非限定的な実施例によりさらに例示される。実施例1イヌBordetellap68組換え抗原用量滴定研究ワクチン:実験のワクチン抗原はE.coli株LW68により生成されるB.bronchisepticaの組換えp68外膜タンパク質配列ID番号:1であった。上記ワクチンは1mL用量中に50μgのQACQuilA/50μgコレステロールで補助されたさまざまな値のSDSドデシル硫酸ナトリウム可溶化p68を含んだ。チャレンジ物質:Bordetellabronchisepticaのエーロゾル、イヌ単離物85B、パッセージ3、ロット051597をチャレンジ物質として使用した。平均プレートカウントは1.59×108CFU/mlであった。動物:60の雄及び雌の子イヌを6処置群の1にランダムに割り当てた1群当たり10頭の子イヌ。子イヌを出血させ、及び気管綿棒を第一の予防接種の41日前に及び再び第一の予防接種の28日前に取り、及び血清反応陽性の又は培養陽性の動物を研究から除去した。動物をランダム化完全ブロック設計にしたがって処置及び部屋にランダムに割り当てた。予防接種後観察をワクチン割当て群の知識なしに行った。手順:IVP投与:動物をプラシーボ又は実験ワクチンのいずれかで0日目に予防接種した。第二の予防接種を21日目に投与した。第一の予防接種は右の首に皮下投与し、及び第二の予防接種は左の首に皮下投与した。チャレンジ投与:全ての動物を第二の予防接種28日後にBordetellabronchisepticaのエーロゾルでチャレンジした。動物をチャレンジ後2~14日目の間51~63日目毎日2回午前中に1回及び午後に1回30分間咳についてモニターした。観察及びサンプル回収:全ての注入部位をそれぞれの予防接種後7日間0~7及び21~28日目及びそれぞれの予防接種後14日目14及び35日目に触診し、及び3次元的に計測した。直腸温度を予防接種の日及びそれぞれの予防接種後3日間0~3及び21~24日目記録した。血液を予防接種の日0及び21日目及び42、50、及び63日目に回収し、及びB.bronchisepticaから精製したp68タンパク質に対する特異的抗体についてELISAにより分析した。血液をまた42、49、50、52、54、56及び58日目に回収し、及びSerumAmyloidA血清アミロイドASAAについて分析した。全ての動物についてB.bronchiseptica単離のために気管綿棒を行い、及び血液を予防接種前業者で、-41日目及び-28日目に及び49日目にB.bronchiseptica凝集タイターのために回収した。Bordetellap68イヌ及びマウス抗体滴定DABELISA精製したネイティブp68を0.01MBorateBuffer中に600ng/mLに希釈し、及び100μL/ウェルでそれぞれのウェルに添加した。上記プレートを4°Cで一晩インキュベートした。上記プレートをその後過剰のPBS-Tween20で1回洗浄した。PBS中の1無脂肪乾燥乳を200μL/ウェルで上記プレートに添加した。上記プレートをその後37°Cで1時間インキュベートした。上記プレートをその後過剰のPBS-Tween20で1回洗浄した。イヌ又はマウス血清を上記ELISAプレートの上の横行に1:50希釈で添加し、及び2倍連続希釈血清を上記プレートの全てにわたり添加した。上記プレートを37°Cで1時間インキュベートした。続いて、上記プレートを過剰のPBS-Tween20で3回洗浄した。上記のイヌ血清でインキュベートしたプレートに、1:2000希釈に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗イヌIgGHLを100μL/ウェルで添加した。上記プレートをその後37°Cで1時間インキュベートした。上記のマウス血清でインキュベートしたプレートに、1:4000希釈に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgGHLを100μL/ウェルで添加した。上記プレートをその後37°Cで1時間インキュベートした。上記プレートをその後過剰のPBS-Tween20で3回洗浄した。ABTS基質を100μL/ウェルで添加した。約20分後、上記プレートを405~490nmでMolecularDevices又は同等のプレートリーダーで読んだ。データ分析:咳をするイヌの数における処置差をFisher’sExactTestを用いて試験した。5値の有意性を使用した。ELISAタイターを一般的な直線混合モデルを用いて分析前にログ変換した。95値の信頼性を処置差を評価するために使用した。チャレンジ観察を毎日2回それぞれ30分間モニターした。結果:気管綿棒培養及び凝集タイター気管綿棒培養及び凝集タイターを研究に含まれる動物のB.bronchiseptica状態をモニターするために評価した。何頭かのイヌはさまざまな時点で増大したタイターを示したが、タイターがチャレンジ前に128超に増大したことはなかった。注入部位観察第一の予防接種後の注入部位反応は表1中に示される。最も大きな注入部位反応はT0564μg予防接種動物において観察され、最も大きな平均注入部位反応はわずかに14.69cm3を計測した予防接種2日後。T034μg、T0416μg及びT06256μg予防接種動物は予防接種7日後までさまざまな注入部位反応を示した。T021μg予防接種動物は予防接種後1日目にのみ反応を示した。予防接種後7日目には、処置群間で注入部位反応における統計的な有意差はなかった。14日目には、全ての注入部位反応は消散していた。第二の予防接種後の注入部位反応は表2中に示される。第二の予防接種後、最も大きな平均注入部位反応はT06256μgにおいて観察され、最も大きな平均注入部位反応は50.03cm3を計測した予防接種1日後。注入部位反応は第二の予防接種7日後までT0564μg及びT0416μg動物において示された。極小の注入部位反応が予防接種7日後までT034μg及びT021μg動物において示された。プラシーボ群と統計的に異ならなかった注入部位反応が予防接種後T021μg及びT034μgにおいて示された。第二の予防接種14日後、注入部位反応は観察されなかった。第一の予防接種後の注入部位反応の頻度は表3中に示される。第一の予防接種後のいつ時でも反応を示した注入部位の最も高い全体LSM頻度、76はT06256μgでの予防接種に由来した。次に最も頻繁なものはT0564μgで第一の予防接種後に反応を示した注入部位の72、T0416μgで第一の予防接種後の69、及びT034μgで第一の予防接種後の63であった。最も低い頻度、38はT021μgの第一の予防接種に続いた。第二の予防接種後の注入部位反応の頻度は表4中に示される。それぞれのワクチンについての全体LSM頻度は第一の予防接種後に見られたものと一致した。予防接種後の注入部位反応の発生及び期間は表5中に要約される。計測可能な注入部位反応の発生又はいつ時でも反応を示すイヌの数は第一の及び第二の予防接種後T03、T04、T05及びT06それぞれ、4μg、16μg、64μg、及び256μgについて100であった。T021μgを受けた動物は予防接種後注入部位反応の最も少ない発生を示した57.1。反応の期間表5中に示される反応を有する日の最小二乗法平均として表されるは第一の及び第二の予防接種後第一の予防接種2.7~5.1日後及び第二の予防接種6.0~6.7日後のT04、T05及びT06それぞれ、16μg、64μg、及び256μg予防接種動物について、より長かった。T02及びT03それぞれ、1μg及び4μg予防接種動物は第一の及び第二の予防接種後第一の予防接種0.3及び1.3日後及び第二の予防接種1.9及び4.5日後の注入部位反応について最も少ない日数を示した。直腸温度平均直腸温度計測は表6中に要約される。1及び24日目のT021μgについての、1、21、及び24日目のT034μgについての、2及び24日目のT0416μgについての、23日目のT0564μgについての、及び0、1、及び24日目のT06256μgについてのLSM直腸温度はプラシーボとは有意に異なった。23日目には、全ての比較はプラシーボと統計的に有意P>0.05でなかった。p68ELISA血清学p68ELISAデータの要約は表7中に示される。全ての群におけるp68ELISA特異的抗体の予防接種前幾何平均ウイルスタイターは低く24.9~28.9に及ぶ、及びプラシーボについてのタイターは研究の期間をとおして低いままであった。第一の予防接種21日後、p68ELISA幾何平均タイターは予防接種処置において増大した55.2~4,411.7に及ぶ、しかしながら、T021μgタイターはプラシーボT01と統計的に異ならなかった。第二の予防接種42日後、幾何平均タイターは全ての予防接種群においてさらに増大され674.6~48,382.0に及ぶ、予防接種に対する優れた血清反応を示した。血清アミロイドASAA血清学SAAタイターは表8中に要約される。チャレンジ前に、幾何平均SAAタイターは全ての処置群において低かった0.1~0.5に及ぶ。チャレンジ後、T01GMTタイターは1.5~146.0に及び、ここでp68処置群は0.3~23.1に及んだ。全ての処置群は50、52、54、及び56日目にプラシーボと統計的に異なった。統計的な差は、それが全ての他のp68処置群と統計的に異なる幾何平均を示した52日目のT021μgを除いては、p68ワクチン群間では示されなかった。チャレンジ応答チャレンジ応答データは表9中に示される。上記応答はチャレンジ後の咳をモニターすることにより決定され、及び上記観察は2の方法:咳をした日数の最小二乗法平均及び咳をした2の連続した日疾患の発生を用いて分析された。咳をした日数の平均の分析はp68処置群間で統計的に有意な差を示さなかった;しかし、プラシーボで予防接種されたイヌは平均8.6日間咳をし、一方、p68ワクチンを投与されたイヌは有意に咳が少なく、平均は2.2~4.7日間に及んだ。イヌが疾患の発生を用いて評価されたとき、全てのT01プラシーボは2の連続した日に咳をしたことが観察された100疾患の発生。T0416μg及びT0564μg予防接種イヌはそれぞれ55.6及び66.7の疾患の発生を示した。T021μg予防接種イヌのわずかに28.6、T034μgの50、及びT06256μgの33.3は2の連続した日に咳をしたことが観察された。議論:この研究において、目的はイヌにおける抗原用量、免疫応答、及び保護の間の関係を確立することであった。調べられたp68抗原用量は1μg、4μg、16μg、64μg、及び256μgであった。注入部位反応計測の分析は、第二の予防接種後1日目のT06256μgを除いては、p68処置群においてごくわずかな反応しか示さなかった。観察された反応は小さい傾向があり、一般的に観察期間中に大きさが減少した。これらの反応の大きさは臨床的にほんのわずかであり、及び毛を剃られていないイヌにおいてはほとんど気付かれなかったであろう。予防接種後直腸温度は普通であり、及び全ての群における全てのイヌについて正常の限界内であった。予防接種に対する血清応答はT03~T06群において優れていた。これらの処置群において、全てが21日目~63日目でプラシーボに比較されたとき有意に高いp68ELISAタイターを示した。T021μgは42日目~63日目でT01プラシーボに比較して有意なp68ELISAタイターを示した。最も高いタイターはT0564μg及びT06256μgにおいて観察された。チャレンジ後の全てのp68予防接種イヌにおけるSAA応答の調査はコントロールイヌに比較されたときチャレンジ後のSAAにおける非常により小さな上昇を示した。全ての他のp68処置群と統計的に異なる幾何平均を示した52日目のT021μgを除いては、チャレンジ後のp68ワクチン用量値の間に差は示されなかった。チャレンジ後の咳観察は咳をした日数の最小二乗法平均LSM又は咳をした2の連続した日疾患の発生を用いて分析された。咳をした日数のLSMを用いて、有意差がプラシーボ及び全てのp68予防接種群の間で示されたが、異なるp68ワクチン用量値の間で差は示されなかった。疾患の発生を用いて、T021μg、T034μg及びT06256μg予防接種イヌはプラシーボより有意に咳が少なかった。結論:上記研究はイヌにおける抗原用量、免疫応答、及び保護の間の関係を確立するために行われた。調べられたp68抗原用量は1μg、4μg、16μg、64μg、及び256μgであった。全てのワクチンは極小の注入部位反応、正常な直腸温度及び予防接種への悪い応答の不在により示されるように安全であった。注入部位反応の大きさ及びこれらの反応の期間はより低い抗原処置群において小さかった短かった。ELISAタイターにより計測される予防接種への血清応答は、より高い血清応答を示すより高い抗原用量群で優れていた。比較の方法として咳をした日数のLSMを用いたとき、全ての処置群はプラシーボと比較されたとき咳をすることにおける有意な減少を示した。処置群間では差は見られなかった。咳をした2の連続した日又は疾患の発生が比較のために使用されたとき、T021μg、T034μg及びT06256μg予防接種イヌはプラシーボより有意に咳が少なかった。実施例2イヌBordetellap68免疫原性研究動物45頭の雄及び雌混合飼育イヌを購入した。MLVパルヴォウイルスワクチンを子イヌが研究場所に到着した日に全ての子イヌに投与した。実験製品以外の他のワクチンは研究中上記子イヌに投与されなかった。イヌは0日目第一の予防接種の日に約9週齢±1週であった。イヌをチャレンジ前にBordetella及び他のイヌ病原体への暴露を避けるために必要な隔離施設内に保った。Bordetellaでのエーロゾルチャレンジ後、隔離手順を他のイヌ病原体への暴露を避けるために続けた。ワクチン滅菌塩水を処置群T01及びT02においてプラシーボワクチンとして使用した。イヌ組換えp68Bordetellabronchisepticaワクチンを処置群T03及びT04において使用した。p68抗原の構造遺伝子をEscherichiacoli中にクローニングし、及び遺伝子発現を温度感受性プロモーターにより制御させた。上記細胞を溶解し、及び封入体を遠心分離により分離した。上記封入体中の組換えp68をSDS処理により可溶化した。上記組換えp68mL当たり15μgを希釈剤としての滅菌塩水中でmL当たり50μgのQuilA及び50μgのコレステロールと混合した。それぞれの1mL用量は0.28エタノール及び0.01チメロサールを含んだ。チャレンジ接種物BordetellabronchisepticaBihrCat株をBiologicsControlLaboratories-Microbiologyにより最近使用される方法を用いてチャレンジ接種物として調製した。Bordet-GenouアガープレートにBordetellabronchiseptica-BihrCat株のコンフルエント成長をまき、及び37.5/-2.5°Cで48時間インキュベートした。悪性相Iコロニーを選択し、及びBordet-Genouアガー上にすじを書き、及び37.5/-2.5°Cで24時間インキュベートした。インキュベーション後、Bordetella塩水を上記アガーからコロニーを洗浄するために使用し、及び抗原を600nmで0.80の光学濃度まで希釈した。細胞カウントを比濁計の計測の確認のためにチャレンジ前及び後に行った。チャレンジ標的濃度は約1×109CFUであった。チャレンジ前濃度は2.37×109CFU100相Iであり、及びチャレンジ後濃度は1.35×109CFU100相Iであった。研究設計要約表ランダム化/盲検予防接種からチャレンジの日までの期間中、動物を一般化ブロック設計にしたがって処置に割り当てた。処置を部屋にランダムに割り当てた。チャレンジの日に、動物をブロックによりチャレンジ部屋にランダムに割り当てた。割り当てられた処置群を知らない、適任な個人が微生物学及び血清学分析及び注入部位の評価、直腸温度の計測、及び咳の観察を行った。データ分析予防接種後応答変数は注入部位データ、直腸温度及びp68ELISAタイターから成った。注入部位データを以下の方法で要約した:1処置により計測可能な反応を有する動物数及び研究の日、2処置により計測可能な反応を有する動物時点の数、3処置によりどの時点でも計測可能な反応を有する動物数。第一の及び第二の予防接種について別々に、注入部位体積立方cm、直腸温度及び自然対数変換p68ELISAタイターデータを一般直線混合モデルを用いて分析した。観察時点最小二乗法平均による処置のpriori直線対照をそれぞれの観察時点での処置群差を試験するために、及びそれぞれの処置内の時点を比較するために構築した。5値の有意性を全ての比較について使用した。チャレンジ後応答変数は毎日の咳観察、p68ELISAタイター及び血清アミロイドAタイターから成った。チャレンジ後の期間中の咳をした日数を一般直線混合モデルを用いて分析した。処置最小二乗法平均のpriori対照を処置群差を試験するために構築した。5の有意性を全ての比較について使用した。第一の及び第二の予防接種について別々に、Fisher’sExact試験を、咳をした2の連続した日の発生について処置群を比較するために使用した。5値の有意性を全ての比較について使用した。チャレンジ後の血清アミロイドASAAタイターデータについて、自然対数変換を一般直線混合モデルを用いる分析前にタイター値に適用した。観察時点最小二乗法平均による処置のpriori直線対照をそれぞれの観察時点での処置群差を試験するために及びそれぞれの処置内の時点を比較するために構築した。5値の有意性を全ての比較について使用した。研究手順詳細な動物手順45頭の血清反応陰性及び培養陰性子イヌを4の処置群の1にランダムに割り当てた。8及び7頭のイヌをそれぞれ筋内IM又は皮下SCコントロール群に割り当て、全部で15頭のコントロールイヌとした。15頭のイヌをp68SC処置群に割り当て、及び15頭のイヌをp68IM処置群に割り当てた。処置群は上記の研究設計の節において詳述される。0日目を第一の予防接種の日とした。予防接種を0日目に投与し、及び21日後に繰り返した。第一の予防接種のために、首の右側を使用し、及び第二の予防接種のために、首の左側を使用した。筋内注入をそれぞれ、第一の及び第二の予防接種について右及び左の半膜様の筋肉内に投与した。全ての注入部位をそれぞれの予防接種後7日間三次元的に計測し、及びフォローアップ計測を予防接種14日後に行った。直腸温度を予防接種の日に予防接種前に及びそれぞれの予防接種後3日間モニターした。35日目に、全ての動物についてB.bronchiseptica培養のために気管綿棒を行い、及び血液を凝集タイターのために回収した。全ての動物は気管綿棒により陰性であり、及びBordetellaについて血清反応陰性であり、及びチャレンジに適格であると考えられた。第二の予防接種24日後である45日目に、B.bronchisepticaのエーロゾルチャレンジを全てのイヌに投与した。鎮静されたイヌを、上記鎮静されたイヌの鼻口部にわたり沿うようフィットされた使い捨て鼻コーンを用いてチャレンジした。上記鼻コーンを5.5~6.0psiに設定された真空圧ポンプに取り付けられた噴霧器に取り付けた。1mLのチャレンジ物質を上記噴霧器中に入れ、及びエーロゾル化されたチャレンジ物質をそれぞれのイヌに4分間投与した。観察を行う人員は処置群割当てを知らなかった。動物をチャレンジ後14日間46~59日目咳についてモニターした。観察をそれぞれの日のおよそ同じ時間に、2回、約30分間行い、1回はAMに、及び1回はPMに行い、及び結果を記録した。血液回収凝集タイターのための血液を第一の予防接種前及びチャレンジ前に回収した。抗-p68ELISA評価のための血液を0及び21日目の予防接種前に及び35、45、及び59日目に回収した。血清アミロイドASAA分析のための血液をチャレンジの日45日目に及び46、48、50、52及び54日目に回収した。サンプルについて行われた試験気管綿棒を培養によりB.bronchisepticaの存在について評価した。それぞれの気管綿棒でBordetellaSelectiveAgarプレート上にすじを書いた。陽性及び陰性コントロールを含めた。上記プレートを37.5±2.5°Cで48±4時間インキュベートした。それぞれのプレート上の生ずるコロニーを上記陽性コントロールと比較し、及び上記陽性コントロールと同一に見えるコロニーをB.bronchisepticaの存在を確認するためにさらに試験した。確認試験はTSI、CitrateandUreaAgar及びNitrateRed培地の使用を含んだ。血清を以下の方法を用いて凝集タイター、p68ELISA分析又はSAA分析について評価した:凝集タイター-血清をBordetella塩水を用いてマイクロタイタープレート中に連続希釈した。陽性及び陰性コントロールをそれぞれのプレート上に含めた。B.bronchiseptica株87BordetGenouアガー上で生育した、回収された、不活性化された及び630nmで20Tまで希釈されたを凝集抗原として使用し、及びそれぞれのウェルに添加した。プレートを35±2°Cで2時間振り及びインキュベートした。プレートを室温で22時間の第二のインキュベーション後に読んだ。終点タイターを、50凝集を示すよう最終ウェルを用いて決定した。p68ELISAタイター-組換えp68抗原をBordetellap68抗原に特異的なポリクローナル抗血清でコーティングした96ウェルマイクロタイタープレート上に捕えた。イヌ血清の連続2倍希釈物を上記プレートに添加し、及びインキュベートした。1:1000希釈の陽性及び陰性コントロールをそれぞれのプレート上に含めた。ペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗-イヌIgGインディケーター結合物をp68抗原に特異的な抗体を検出するために使用した。発色性基質ABTSをその後添加し、及び上記プレートを上記陽性コントロールウェルが1.2±0.2のO.D.を有したとき読んだ。あるサンプルのタイターを陰性コントロール血清希釈の平均5標準偏差より大きな光学濃度を有する最終希釈の逆数として計算した。SAAタイター-イヌ血清アミロイドAタイターをAccuplexCo.,UniversityofNebraskaMedicalCenter,Omaha,NE68198から購入したキットを用いて評価した。簡単に述べると、イヌSAAをモノクローナル抗-イヌSAA抗体でコーティングしたマイクロタイタープレート上に捕えた。イヌ血清の希釈サンプル、続いてビオチン標識抗-イヌ抗体結合物を上記プレートに添加した。インキュベーション後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアヴィヂン発色性基質を添加した。上記プレートを30分後に読んだ。結果直腸温度直腸温度計測の要約は表10及び11中に示される。第一の予防接種後のいずれの日にもいずれの群間にも有意差は見られなかった。21日目に塩水予防接種イヌ及び全てのp68予防接種イヌの間に有意差が見られたT01T02対T03T04についてp=0.0053。p68SC及びIM予防接種群間の有意差p=0.0124が24日目に示された。注入部位反応注入部位反応は表12及び13中に要約される。技術的な見落としのために、注入部位観察は第二の予防接種後の14日目観察で行われなかった35日目。計測可能な部位反応はT03p68SCにおいて観察され、及び大きさは極小であった。小さな注入部位反応が3日目にT04p68IMにおける1のイヌにおいて見られたが、上記計測の極小の影響は上記群についての全体の平均においては反映されない。注入部位計測における有意差は表14中に要約される。T02塩水SC対T03p6815μgSC間の注入部位計測における有意差は第一の予防接種後6日間見られた。7日目までに及び再び14日目に2週再評価観察、どの処置群間でも有意差は見られなかった。T02塩水SC対T03p6815μgSC間の注入部位計測における有意差は第二の予防接種後7日間見られた。p68ELISAタイターp68ELISAデータは表15及び図1中に要約される。予防接種されたイヌにおけるp68に対するかなりのタイター応答のために、さまざまな滴定最小値が研究中の異なる時点で使用された。0及び21日目についての滴定は50で開始された。35、45及び59日目について、滴定は200で開始された。未満として報告される値は分析前に2で割られた。研究の過程中コントロール群T01及びT02についてのp68ELISA値において観察された増大する上昇はこれらの最小滴定値のためである。凝集タイターは<4のままであった。全てのp68予防接種動物はプラシーボ予防接種動物に比較されたとき予防接種のはじめの日からチャレンジの日まで0日目対45日目のタイターにおいて少なくとも4倍の増大を示した。予防接種後及びチャレンジ後ELISAタイターの最小二乗法平均についての有意差は表16中に列挙される。予防接種が完了した後、p68SC及びp68IM予防接種動物の間に有意差は見られなかった。血清アミロイドAタイターSAA値をチャレンジ後0、1、3、5、7及び9日目に決定した。血清アミロイドA値は表17中に示され及び図2中に表示される。SAAタイターにおける有意差は表18中に要約される。塩水コントロールはチャレンジ後1、3及び5日目に、予防接種されたイヌより高いSAAタイターを示した。塩水SCコントロールはチャレンジ後7及び9日目に、予防接種されたSCイヌに比較されたとき、有意に高いSAAタイターを示し続けた。咳観察全ての処置群についてのエーロゾルチャレンジは第二の予防接種24日後に起こった45日目。咳観察を2の方法-咳をした2の連続した日に基づいた疾患状態表19中に示される及び咳をした日の割合表20及び21中に示される-を用いて調べた。イヌが、咳をした2の連続した日の基準を用いて評価されたとき、塩水SC及び塩水IM予防接種イヌがそれぞれ100及び87.5咳をした一方で、80のp68予防接種イヌSC及びIMが少なくとも2の連続した日に咳をした。イヌが、咳を観察された日の割合を用いて評価されたとき、p68SC及びIM予防接種イヌはそれぞれ観察された日の38.72及び41.05咳をした。塩水SC及び塩水IM予防接種イヌはそれぞれ69.04及び62.66咳をした。疾患状態が咳をした2の連続した日に基づいたとき、塩水予防接種及びp68予防接種イヌの間に有意差は示されなかった。T02塩水SC及びT03p6815μgSC間で有意差p=0.0112が示された。T01塩水IM及びT04p6815μgIM間では有意差は示されなかった。塩水コントロール及びp68-予防接種イヌの間で有意差p=0.0022が示された。議論上記研究はイヌにおけるp68Bordetella15μg/用量ワクチンの安全性及び有効性を示すために設計された。安全性は注入部位及び直腸温度観察を用いて調べられた。注入部位反応計測の分析はIM予防接種群におけるわずかな反応及びSC予防接種群における極小の反応を示した。観察された反応は小さい傾向があり、一般的に観察期間中に大きさが減少した。これらの反応の大きさは毛を剃られていないイヌにおいてはほとんど気付かれなかったであろう。21日目に塩水及び予防接種群の間で及び24日目にIM及びSC予防接種群の間で有意差が観察されたが、直腸温度は臨床的に普通であり、及び全ての群における全てのイヌについて正常限界内であった。有効性はp68ELISA終点タイターの計測及び咳の観察を用いて調べられた。投与経路に関わらず、優れたp68抗体応答が35日目までp68-予防接種群において示された。優れた既往応答がチャレンジ後に予防接種群において観察された。より高い抗体応答がSC経路に比較してより血管性の及びより脂肪が少ないIM経路で伝統的に得られているが、p68SC及びIM予防接種群間の差は研究の過程をとおして有意でなかった。チャレンジ後の予防接種及び非予防接種p68BordetellaイヌにおけるSAA応答の調査は特にチャレンジ後1、3及び5日目の予防接種動物群においてSAA値における非常により小さな上昇を示した。結論この研究において、15μg/用量p68イヌBordetellaワクチンの有効性が予防接種24日後のイヌチャレンジモデルを用いて調べられた。上記ワクチンは正常な直腸温度、極小の注入部位反応により示されるように安全であり、及び有効性は混合したIM及びSC群において示された。SAA値の比較はエーロゾルチャレンジ後1、3及び5日目の塩水及びp68予防接種イヌの間で有意差を示した。実施例3イヌBordetellap68ワクチンの6ヶ月間免疫研究動物90頭の雄及び雌混合飼育イヌを購入し、及び大部分の子イヌは第一の予防接種の日に9週齢±1週であった。MLVパルヴォウイルスワクチンを研究場所への到着の際にイヌに投与した。研究に適格であるために、動物は気管綿棒及び凝集タイターによりB.bronchisepticaに陰性であることを決定された。実験製品以外のワクチンは研究の間投与されなかった。イヌをチャレンジ前にB.bronchiseptica及びイヌ病原体への暴露を避けるために必要な隔離施設内で保った。B.bronchisepticaでのエーロゾルチャレンジ後、隔離手順を他のイヌ病原体への暴露を避けるために続けた。ワクチン滅菌塩水を処置群T01及びT02においてプラシーボワクチンとして使用した。イヌ組換えp68Bordetellabronchisepticaワクチンを処置群T03及びT04において使用した。p68抗原の構造遺伝子をEscherichiacoli中にクローニングし、及び遺伝子発現を温度感受性プロモーターにより制御させた。上記細胞を溶解し、及び封入体を遠心分離により分離した。上記封入体中の組換えp68をSDS処理により可溶化した。別々に、15μgp68及び60μgp68を希釈剤としての滅菌Lepto塩水中でmL当たり50μgのQuilA及び50μgのコレステロールと混合した。上記混合された成分を4°Cで24時間混合し、及びマイクロフルイダイザーを3回とおした。それぞれの1mL用量は2.7μlのエタノール及び0.0001のチメロサールを含んだ。実験ワクチン中のp68濃度をp68ELISAにより計測した。全ての分析は5重で行った。全てのワクチンを6ヶ月のアセンブリー内に使用した。チャレンジ接種物Bordet-GenouアガープレートにBordetellabronchiseptica-BihrCat株をまき、及び37.5/-2.5°Cで48時間インキュベートした。悪性相Iコロニーを選択し、及びBordet-Genouアガー上にすじを書き及び37.5/-2.5°Cで24時間インキュベートした。インキュベーション後、Bordetella塩水をアガーからコロニーを洗浄するために使用し、及び上記細胞を600nmで0.80の光学濃度まで希釈した。細胞カウントを比濁計の計測の確認のためにチャレンジ前及び後に行った。チャレンジ標的濃度は約1×109CFUであった。群Iについて、チャレンジ前濃度カウントは1.94×109であり、及びチャレンジ後濃度カウントは1.43×109であった。群IIについて、チャレンジ前濃度カウントは2.55×109であり、及びチャレンジ後濃度カウントは2.13×109であった。研究設計要約表上記研究を群I中の48頭のイヌ及び群II中の42頭のイヌから成る2の相又は群で行った。予防接種1はそれぞれの群について0日目に起こった。予防接種2は20日後に起こった。群Iにおける事件は約15日、群IIにおける事件から相殺された。イヌを最後の予防接種181日後B.bronchisepticaでエーロゾルチャレンジした。ランダム化/盲検動物を完全ランダム化設計にしたがって処置及び部屋にランダムに割り当てた。それぞれの研究群内の予防接種1からチャレンジの日までの期間について、動物をランダム化プランを用いて処置及び部屋1部屋当たり3~5頭のイヌにランダムに割り当てた。チャレンジの日に、以前に処置した動物を一般化ブロック設計を用いて研究群内のチャレンジ部屋にランダム化した。割り当てられた処置群を知らない、適任の個人が微生物学及び血清学分析及び咳及び注入部位の評価を行った。データ分析予防接種後応答変数は注入部位データ、直腸温度及びp68ELISAタイターから成った。注入部位データは以下のように要約される:1処置により計測可能な反応を有する動物数及び研究の日、2処置により計測可能な反応を有する動物時点の数、3処置によりどの時点でも計測可能な反応を有する動物数、4それぞれの動物についての計測可能な反応の期間。第一の及び第二の予防接種について別々に、注入部位体積立方cm、直腸温度及び自然対数変換p68ELISAタイターデータを一般直線混合モデルを用いて分析した。観察時点最小二乗法平均による処置のpriori直線対照をそれぞれの観察時点での処置群差を試験するために及びそれぞれの処置内の時点を比較するために構築した。特に興味深い比較はT01対T03、T01対T05、T03対T05、T02対T04、T02対T06、及びT04対T06であった。時点-処置-研究群関係項がP<0.05で有意であった場合、それぞれの時点での処置群間の及び処置群内の時点間の対照はそれぞれの研究群内であり、そうでなければ、これらの対照は時点-処置関係効果最小二乗法平均に基づいた。5値の有意性を全ての比較について使用した。チャレンジ後応答変数はp68ELISAタイター、血清アミロイドAタイター及び毎日の咳観察から成った。チャレンジ後p68ELISAタイターを以前に示されるように分析した。チャレンジ後の血清アミロイドASAAタイターデータについて、自然対数変換を一般直線混合モデルを用いる分析前にタイター値に適用した。咳の分析をUSDA要求を反映するよう修正した。それぞれのイヌについて、咳が観察された観察期間の割合を計算した。分析前に、割合をアークサイン平方根変換を用いて変換した。一般直線混合モデルを咳の分析に使用した。この分析からの最小二乗法平均を割合に変換し戻し、及び咳におけるパーセント減少を:のように計算した。処置最小二乗法平均のpriori直線対照を処置群差を試験するために構築した。特に興味深い比較はT01対T03、T01対T05、T03対T05、T02対T04、T02対T06、及びT04対T06であった。処置-研究群関係項がP<0.05で有意であった場合、処置群間の対照はそれぞれの研究群内であり、そうでなければ、処置群間の対照は処置主要効果最小二乗法平均に基づいた。5値の有意性を全ての比較について使用した。研究手順詳細な動物手順研究場所への到着前に及び第一の予防接種前に、子イヌについてB.bronchiseptica培養のために気管綿棒を行い、及び血液を凝集タイターのために回収した。全ての動物は気管綿棒により陰性であり、及びBordetellaに血清反応陰性であり、及び研究に適格であると考えられた。48頭の子イヌを群Iについての6処置群の1にランダムに割り当てた。上記手順を群IIについて42頭のイヌを用いて繰り返した。動物を少なくとも5日間研究場所に順応させた。群及び処置は節7.4.A中に詳述される。施設の制約のために及びチャレンジ後の咳観察の正確さを高めるために、予防接種及びそれぞれのチャレンジ期間を2のイヌ群を作出するよう15日で交替させた。0日目は群I及びIIの両方について予防接種1の日をいう。予防接種2は20日後に起こった。処置T01、T03、及びT05を皮下経路を介して投与した。処置T02、T04、及びT06を筋内経路を介して投与した。皮下注入を首の側背面中に投与した。予防接種1について、首の右側を使用し、及び予防接種2について、首の左側を使用した。筋内注入をそれぞれ予防接種1及び予防接種2について右及び左の半膜様筋肉中に投与した。全ての注入部位をそれぞれの予防接種後7日間三次元的に計測し、及びフォローアップ計測を予防接種14日後に行った。直腸温度を予防接種の日に予防接種前に及びそれぞれの予防接種後3日間モニターした。血液をp68ELISAタイター決定のためにそれぞれの予防接種前-1日目及び19日目に及び50日目に回収した。それぞれの月に、全てのイヌについてB.bronchiseptica陰性状態を確認するために鎮静作用下でB.bronchiseptica培養のために気管綿棒を行った。血液をまた凝集及びELISAタイターのために回収した。上記手順をそれぞれの群についてチャレンジ7日前に繰り返した。陽性気管綿棒培養物又は上昇する凝集タイターの証拠は上記研究から動物を除外した。チャレンジを予防接種2の181日後にイヌに投与した。鎮静されたイヌを、上記鎮静されたイヌの鼻口部にわたり沿ってフィットされた使い捨て鼻コーンを用いてチャレンジした。上記鼻コーンは、5.5~6.0psiに設定された真空圧ポンプに取り付けられた噴霧器に取り付けられた。1mLのチャレンジ物質を上記噴霧器内に入れ、及びエーロゾル化チャレンジ物質をそれぞれのイヌに4分間投与した。チャレンジ後咳観察をUSDA推奨に従うようチャレンジ前に修正した。チャレンジ後、それぞれのイヌの群をチャレンジ後3日目~10日目の間、全部で8日間観察した。動物を毎日2回それぞれの観察期間に約45分間咳について観察した。観察期間の間隔は約12時間であった。割り当てられた処置群を知らない人員が咳観察を記録した。血液回収凝集タイターのための血液をそれぞれの群について第一の予防接種前に、毎月、及びチャレンジ前に回収した。抗-p68ELISA評価のための血液をそれぞれの群について予防接種1及び2の前日に、50日目に及びその後約30日間隔で回収した。血液をまたチャレンジの日及びチャレンジ後観察の最終日に回収した。血清アミロイドASAA分析のための血液をそれぞれの群についてチャレンジの日にチャレンジの前に及びチャレンジ1、3、5、7、及び9日後に回収した。サンプルについて行った試験気管綿棒を培養によりB.bronchisepticaの存在について評価した。それぞれの気管綿棒でBordetellaSelectiveAgarプレート上にすじを書いた。陽性及び陰性コントロールを含めた。上記プレートを37.5±2.5°Cで48±4時間インキュベートした。それぞれのプレート上に生ずるコロニーを陽性コントロールと比較し、及び陽性コントロールと同一であるように見えるコロニーをB.bronchisepticaの存在を確認するためにさらに試験した。確認試験はTSI、CitrateandUreaAgar及びNitrateRed培地の使用を含んだ。血清を以下の方法を用いて凝集タイター、p68ELISA分析又はSAA分析について評価した:凝集タイター-血清をBordetella塩水を用いてマイクロタイタープレート中に連続希釈した。陽性及び陰性コントロールをそれぞれのプレート上に含めた。B.bronchiseptica株87BordetGenouアガー上で生育され、回収され、不活性化され及び630nmで20Tまで希釈されたを凝集抗原として使用し、及びそれぞれのウェルに添加した。プレートを35±2°Cで2時間振り及びインキュベートした。プレートを室温で22時間の第二のインキュベーション後に読んだ。終点タイターを50凝集を示すよう最終ウェルを用いて決定した。p68ELISAタイター-組換えp68抗原をBordetellap68抗原に特異的なポリクローナル抗血清でコーティングした96ウェルマイクロタイタープレート上に捕えた。イヌ血清の連続2倍希釈物を上記プレートに添加し、及びインキュベートした。1:1000希釈の陽性及び陰性コントロールをそれぞれのプレート上に含めた。ペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗-イヌIgGインディケーター結合物をrp68抗原に特異的な抗体を検出するために使用した。発色性基質ABTSをその後添加し、及び陽性コントロールウェルが1.2±0.2のO.D.を有したとき上記プレートを読んだ。あるサンプルのタイターを陰性コントロール血清希釈の平均5標準偏差より大きな光学濃度を有する最終希釈の逆数として計算した。SAAタイター-イヌ血清アミロイドAをモノクローナル抗-イヌSAA抗体でコーティングした96ウェルマイクロタイタープレート上に捕えた。イヌ血清の希釈サンプルを上記プレートに添加し、及びインキュベートした。リファレンス標準を0.31ng/ml~20ng/mlの標準曲線を得るために添加した。ビオチン標識抗-イヌ抗体結合物を添加した。上記ビオチン標識抗-イヌ抗体のインキュベーション後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアヴィヂンを添加した。発色性基質TMBを添加し、及び上記プレートを30分後に読んだ。血清アミロイドAの濃度を標準曲線に対するサンプルの比較及び適切な希釈因子の乗法により決定した。結果別段の定めなき限り、結果は群I及びIIからの混合されたデータである。気管綿棒培養物及び凝集タイター陽性気管綿棒培養物及び/又は上昇する凝集タイターは研究の過程中11頭のイヌにおいて示された。これらのイヌ及び陽性イヌと共に飼われたイヌは研究から除去され、20頭のイヌの喪失をもたらした。それぞれの群から除去されたイヌの数は:T01-4頭、T02-2頭、T03-3頭、T04-1頭、T05-5頭、T06-5頭であった。注入部位観察注入部位反応は表22~25中に要約される。注入部位情報は技術的な見落としのために群Iについて21日目にイヌ81595について回収されなかった。上記プロトコルは、注入部位反応データが22日目の群IIにおけるイヌについて回収されなかったように修正され、それゆえ、22日目からのデータの要約は群Iにおける処置群当たり8頭のイヌからの情報のみを含む。注入部位反応はIM処置を受けたどのイヌについても観察されなかった。注入部位計測はSC予防接種処置群T03及びT05の両方について極小であった。注入部位計測における有意差は表26中に要約される。T01塩水SC対T0360μgSC間の注入部位計測における有意差は第一の予防接種後7日間見られた。T01塩水SC及びT0515μgSC間の有意差は第一の予防接種後はじめの4日間のみ見られた。3~7日目にT0360μgSC及びT0515μgSC間で有意差が見られた。14日目には2週再評価観察、いずれの群の間にも差は見られなかった。T01塩水SC対T0360μgSC及びT0515μgSCの間の注入部位計測における有意差P=0.0138は第二の予防接種後7日間見られた。23~27日目にT0360μgSC及びT0515μgSC間に有意差が見られた。34日目には2週再評価観察、いずれの群の間にも差は見られなかった。直腸温度直腸温度計測は表27及び28中に要約される。上記プロトコルは、直腸温度データが22日目の群IIイヌについて回収されなかったように修正され、それゆえ、22日目からのデータの要約は群Iにおける処置群当たりのイヌからの情報のみを含む。第一の予防接種後1日目のT02塩水IM及びT0460μgIM間の直腸温度において有意差が見られた。第二の予防接種後どの日のどの群間でも直腸温度において有意差は見られなかった。p68ELISAタイターチャレンジ前p68ELISAデータは表29中に要約される。19日目のT06における群Iイヌの応答のために、群に帰すべき影響がp68ELISAタイターのデータ分析において観察された。上記影響は小さく、及び他の分析された時点に影響しなかった。それゆえ、群I及びIIからのデータは報告目的のために混合される。予防接種イヌにおけるp68に対するかなりのタイター応答のために、さまざまな滴定最小値が研究における異なる時点で使用された。-1及び19日目についての滴定は50で開始された。50~195日目について、滴定は200で開始された。201及び211日目に回収されたサンプルについての滴定は1000で開始された。未満として報告された値は分析前に2で割られた。研究の過程中コントロール群T01及びT02についてのp68ELISA値において観察された増大する上昇はこれらの最小滴定値のためである。凝集タイターは、以前に示されたものを除いては、<4のままであった。全てのプラシーボ予防接種イヌは50日目に<200のp68タイターを有した。全てのp68予防接種動物はプラシーボ予防接種動物と比較されたとき、第二の予防接種後0日目対50日目のタイターにおいて少なくとも4倍増大を示した。予防接種後のELISAタイターの最小二乗法平均についての有意差は表30中に列挙される。予防接種前-1日目にSCコントロール群及びSC予防接種群又はIMコントロール群及びIM予防接種群の間にp68ELISAタイターにおける有意差は観察されなかった。研究の過程中に計測されたp68ELISAタイターは表31中に要約され、及び図3中に例示される。研究の過程中、群I及びII間で活動を協調させるよう毎回の試みがなされた。中枢のデータ回収時点すなわち、予防接種及びチャレンジを取り巻く事件について、これは達成された。研究の合間中の3の場合において、血液及び気管綿棒回収は群間で1又は2日変化した。この合間期間についてp68ELISAデータを要約し及び報告するために、これらの日からのデータを混合した。それゆえ、79日目は79日目群I及び81日目群IIからの混合したデータを含み、111日目は110日目群II及び111日目群Iに対応し、及び169日目は169日目群II及び170日目群Iに対応する。プロトコルごとに、データ分析は50日目を過ぎてp68ELISAデータについて行われなかった。咳観察両方の群についてのエーロゾルチャレンジは第二の予防接種181日後に起こった。USDA推奨にしたがうために、咳基準はチャレンジ後3日目~8日目の約12時間離れた約45分間の観察に修正された。咳観察は表32及び33中に要約される。塩水コントロールに比較されたとき咳におけるパーセント減少は15μg/用量群について51.55及び60μg/用量群について11.09であった。統計的な有意差は表34中に要約される。血清アミロイドASAA値はチャレンジ後0、1、3、5、7及び9日目に決定された。血清アミロイドA値は表35中に示され及び図4中に表示される。SAAタイターにおける有意差は表36中に要約される。議論上記研究はイヌにおける組換えp68Bordetellaワクチンの安全性及び6ヶ月有効性を示すために設計された。15μg/用量及び60μg/用量ワクチンの安全性が示された。15μg/用量の有効性及び免疫の6ヶ月の期間は上記研究において十分に支持された。安全性は注入部位及び直腸温度観察を用いて調べられた。注入部位反応計測の分析はIM予防接種群における無反応及び15μg/用量及び60μg/用量SC予防接種群における極小反応を示した。観察された反応は15μg/用量SC予防接種イヌにおいてより小さい傾向があった。見られた上記反応は一過性であり、一般的に14日以内に消散した。これらの反応の大きさは注入部位が剃られていないイヌにおいてはほとんど気付かれなかったであろう。予防接種後の直腸温度は普通であり、及び全ての群における全てのイヌについて正常限界内であった。免疫の有効性及び期間は咳の観察及びp68ELISA終点タイターの計測を用いて予防接種から181日間調べられた。塩水コントロール群における咳の割合78.26は、研究動物に投与されたチャレンジは許容可能であったことを示した。15μg/用量群についての咳をした時点の割合37.92はコントロール群と比較されたとき咳における51.55減少を示し、USDAにより要求される有効性要求を満たす。コントロール群に比較されたとき咳における極小減少を示すイヌを有する60μg/用量群においては保護は示されなかった69.58。統計的に比較されないが、SC予防接種群はIM予防接種群に比較されたときより高い抗体応答を有する傾向があったことが表29及び31から見られうる。議論の目的のために、異なる用量群に関するさらなるコメントはIM及びSC投与経路の結果を結合する。投与経路に関わらず、優れたp68抗体応答が50日目までに両方の予防接種群において示され、及び研究の過程をとおして予防接種群により維持された。優れた既往応答がチャレンジ後の予防接種群において観察された。研究の過程中の15μg/用量及び60μg/用量のp68ELISAタイターの比較は、60μg/用量群がわずかに高いタイター応答を示したことを示した図3。この応答は、優れているが、エーロゾルチャレンジ後の保護とは相関しなかった。p68ELISAタイター応答は陽性気管綿棒又は上昇する凝集タイターで研究から除去されたイヌにおいては変動した。陽性気管綿棒培養物及び/又は上昇する凝集タイターで研究から除去された6のコントロールのうちの3は<200のp68ELISAタイターを維持した。研究から除去されたイヌの気管綿棒又は凝集タイター状態に対するp68ELISAタイターの相関はないように見える。チャレンジ後の予防接種及び非予防接種p68BordetellaイヌにおけるSAA応答の調査は、特にチャレンジ後5及び7日目に15μg/用量群においてSAA値における非常により小さな上昇を示した。結論この研究において、p68イヌBordetellaワクチンの15μg/用量及び60μg/用量の有効性が予防接種6ヶ月後イヌチャレンジモデルを用いて調べられた。両方のワクチンは正常な直腸温度及び極小の注入部位反応により示されるように安全であった。15μg/用量及び60μg/用量予防接種イヌはp68ELISAタイターにより計測されるように予防接種に対する優れた血清応答を示したが、上記応答は60μg/用量予防接種イヌにおいて臨床保護と相関しなかった。60μg/用量予防接種イヌは非予防接種コントロールに比較されたとき咳における有意差を示さなかった。15μg/用量ワクチンの優れた有効性はコントロール群と比較されたとき咳における50超の減少により示された。60μg/用量ワクチン中のSDSの増大した値は保護における示された差をもたらしうることが仮定される。SAA値の比較は予防接種群及びコントロール群間の差を示した。実施例4VANGUARD商標Plus5/CV-Lの安全性及び有効性VANGUARD商標Plus5/CV-Lはアヂュヴァントを伴うCDウイルス、CAV-2、CPIウイルス、CPVの減衰された株のフリーズドライ調製物、及びL.canicola及びL.icterohaemorrhagiaeの不活性化全体培養物、及び不活性化CCVの液体調製物である。全てのウイルスは確立された細胞系上で増殖された。CPV画分は、表38中に示される値で母親の抗体妨害をくつがえすことができる免疫原性特性をそれに与えるイヌ細胞系上で少ない継代により減衰された。液体成分は、真空の代わりに不活性気体と共に包装された上記フリーズドライ成分を再水和化するために使用された。研究室評価は、VANGUARD商標Plus5/CV-LはCD、ICH、CAV-2及びCPI呼吸疾患、CCV及びCPVにより引き起こされる腸炎、及びL.canicola及びL.icterohaemorrhagiaeにより引き起こされるレプトスピラ症に対してイヌに免疫性を与えたこと、及び上記ワクチン画分中には免疫妨害は存在しなかったことを示した。広い分野の安全性試験は、それが通常の使用条件下では6週齢の若いイヌにおいて安全であり、及び本質的に反応を伴わないことを示した。また、CAV-2ワクチンはCAV-1により引き起こされるICHに対してクロス保護をすることも示された。研究は、CAV-2はICHに対してのみでなく、CAV-2呼吸疾患に対しても保護することを示した。イヌアデノウイルス2型チャレンジウイルスは行われた試験におけるCAV-2予防接種イヌから回復されなかった。VANGUARD商標Plus5/CV-L中のCPV画分を包括的な安全性及び有効性試験にかけた。それは研究室試験において及び実地条件下の臨床試験において安全であり及び本質的に反応を伴わないことが示された。製品安全性は、それらの全てが正常なままであった、かかりやすいイヌへの多用量の上記ワクチン株の経口投与を含んだ直腸研究によりさらに示された。研究は、増大したCPVウイルスタイターを有する3用量の上記ワクチンは母親の抗体に関連する血清中和SNタイターを克服しうることを示した。1:4の低い血清中和タイターは慣用の改変された生存ワクチンを用いた活性免疫化を妨害することが他の者により示された。臨床試験を50頭の6週齢の子イヌ[25頭の予防接種群SNタイター範囲-256及び25頭の非予防接種コントロール群SNタイター範囲4-1024]で行った表37。予防接種の群は3用量を受け、及び予防接種は6週齢で開始して3週間離して投与された。1の予防接種後、13/25の子イヌはCPVSNタイターセロコンヴァージョンにおける4倍以上の増大を示した表38。これらの13頭の子イヌのうちの12頭は第一の予防接種の時点で母親のSNタイター≦1:16を有し、及び残りの子イヌは1:64のSNタイターを有した。1:16~1:256の開始SNタイターを有する他の9頭の子イヌは第二の予防接種後にセロコンヴァートされた。それらの母親の抗体SNタイターは第二の予防接種の時点で≦1:64まで減少した。同様に、1:128の開始SNタイターを有する、最後の3頭の予防接種イヌは、それらの母親の抗体CPVタイターが≦1:64に落ちた後に、第三の予防接種後にセロコンヴァートされた。それゆえ、この研究において、3用量のワクチンが6週齢で開始されて与えられたとき、全ての25頭の予防接種イヌは、最も高い母親抗体値を有するものでさえも、活性免疫化されたGM=1:1176;SNタイターの範囲128~4096。全ての50頭のイヌを異種のCPVチャレンジウイルスで第三の予防接種3週間後にチャレンジした。25頭の非予防接種コントロールイヌのうちの14頭は死亡し又は安楽死を正当化するのに十分重篤な疾患を示し、一方で、全ての25頭の予防接種イヌは本質的に健康なままであった。VANGUARD商標Plus5/CV-Lにおける高いタイターの、少ない継代のワクチンウイルスはそれゆえ、高く免疫原性であり、及び母親抗体の存在下で活性免疫を刺激することができた。VANGUARD商標Plus5/CV-LのCCV画分の有効性は広い範囲の予防接種チャレンジ研究において示された。16頭の7~8週齢の子イヌをVANGUARD商標Plus5/CV-Lで予防接種群及び17頭をVanguard商標Plus5/Lでコントロール群予防接種した。全ての子イヌは3の1mL用量を3週間隔で受けた。第三の予防接種3週間後、子イヌをCCVの悪性株CV-6でチャレンジした。臨床観察、温度、体重、及び血液パラメーターを感染後21日間モニターした。CCV予防接種群はコントロール群と比較されたとき下痢の発生及び悪性CCVの抜け殻の量における減少を示した。チャレンジ後21日で、小腸切片の悪性CCVについての蛍光抗体染色はCCV予防接種群及びコントロール群の間で検出可能なCCV抗原における有意な減少Pを示した表39。結論この研究において、CDウイルス、CAV-2、CPIウイルス、CPV及びL.canicola及びL.icterohaemorrhagiaeの不活性化全体培養物及びCCVを含む補助された組み合わせワクチンは子イヌにおいて使用されたときワクチンとして安全で及び有効であることが示された。上記組み合わせワクチンはまた母親抗体に関連する血清中和SNタイターを克服することも示された。実施例5イヌBordetellaネイティブp68免疫原性研究動物上記研究は2の同腹のSPFビーグル及び2の同腹のランダムな源のイヌを含んだ。イヌを予防接種又は非予防接種群にランダムに割り当てた。上記研究は全部で10頭の予防接種及び11頭の非予防接種イヌを含んだ。実験ワクチンの調製B.bronchiseptica株110Hをプレート表面を5~10mlの熱抽出緩衝液で洗浄することにより48時間Bordet-Genou血液アガースプレッドプレートから回収した。あるいは、両方の培養CharlotteParkerDefinedMediumにおいて生育した細胞を遠心分離及び上清画分を捨てることにより回収した。回収された細胞を25mMTris-HCl、pH8.8中に懸濁し、及び60°Cで1時間インキュベートした。細胞くずを4°Cで30分間の20,000×gでの遠心分離により熱抽出物から分離した。ナトリウムアジド0.01を上記熱抽出上清画分に添加し、それをその後微孔ろ過によりさらに不純物除去した。モノクローナル抗体アフィニティ樹脂を標準の手順を用いたCNBr活性化Sepharose4Bへのモノクローナル抗体Bord2-7といわれるの結合により調製した。約30.35mgのモノクローナル抗体を1グラムのアフィニティ樹脂に結合した。不純物除去した熱抽出上清画分上記及びBord2-7アフィニティ樹脂を1リットル抽出物対20ml樹脂のおよその割合で混合した。上記樹脂へのネイティブp68の結合を、上記混合物を環境温度でおだやかに攪拌しながら一晩インキュベートすることにより促進し、続いて樹脂を沈殿させ及び上清画分を吸引した。上記樹脂をその後2.6cm直径カラムに詰め、及び上記カラムをPBS、pH7.5及び10mMリン酸緩衝液、pH8.0で連続して5ml/分の流速で洗浄した。280nmでの吸収が基礎値に達したとき、結合物質を100mMトリエチルアミンを用いて溶離し、及び280nm吸収の単一の大きなピーク下の画分を回収し、及びELISAによりp68の存在について試験した。p68を含む画分を集め、及びトリエチルアミンを除去するためにPBSに対して透析した。調合された実験ワクチンシリアルは約100μgの精製p68及び1水酸化アルミニウムゲルを含むよう調合された。フォルマリン0.01を1mLの最終ワクチン用量体積中に保存剤として使用した。チャレンジ接種物チャレンジ物質を本質的に上記の実施例中に示されるように調製した。研究手順21頭の血清反応陰性及び培養陰性子イヌを2の処置群の1にランダムに割り当てた。11頭のイヌを非予防接種、コントロール群に、及び10頭のイヌを予防接種群に割り当てた。0日目を第一の予防接種の日とした。1mLのワクチンを0日目に皮下投与し、及び21日後に繰り返した。血液を第一の及び第二の予防接種前に血清学p68ELISAのために回収した。第二の予防接種14日後である35日目に、B.bronchisepticaのエーロゾルチャレンジを上記に示されるように全てのイヌに投与した。動物を以前に実施例中に示されるようにチャレンジ後14日間咳についてモニターした。結果臨床観察及びp68への血清応答の要約は表40中に示される。議論この研究において、10頭のコントロールイヌのうちの10頭は少なくとも2の連続した日に咳をした。イヌが2の連続した日に咳をする場合は、そのイヌを臨床的に病気にかかっていると考える。この基準により、100の非予防接種コントロールイヌは病気にかかった。予防接種群においては、1頭のイヌはチャレンジ後4日目に咳をし、及び1頭のイヌはチャレンジ後4及び6日目に咳をした。2頭のイヌは14日目に咳をした。2の連続した日に咳をした予防接種イヌはなかった。それゆえ、ネイティブp68予防接種群中の100のイヌはチャレンジ後正常のままであると判断された。結論この試験はネイティブp68ワクチンのB.bronchiseptica疾患に対して保護する能力を示す。"