"β2mまたは該タンパク質の機能変異体を活性成分として含む医薬品。β2mまたは該タンパク質の機能変異体を単一活性成分として含む請求項1に記載の医薬品。医薬として許容され得る担体中のβ2mまたは該タンパク質の機能変異体から構成される請求項2に記載の医薬品。活性成分はヒトβ2mタンパク質である請求項1~3のいずれか1項に記載の医薬品。活性成分はヒトβ2mタンパク質と少なくとも70、好ましくは80、より好ましくは90の同一性を示すβ2mタンパク質の機能変異体である請求項1~3のいずれか1項に記載の医薬品。自己免疫疾患の治療において使用するための請求項1~5のいずれか1項に記載の医薬品。治療を受ける自己免疫疾患はリウマチ性多発性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、線維筋痛、筋炎、強直性脊椎炎、I型インスリン依存性糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、クローン病、セリアック病、多発性硬化症または筋萎縮性側索硬化症である請求項6に記載の医薬品。筋萎縮性側索硬化症ALTの治療において使用するための請求項1~7のいずれか1項に記載の医薬品。多発性硬化症の治療において使用するための請求項1~7のいずれか1項に記載の医薬品。クローン病の治療において使用するための請求項1~7のいずれか1項に記載の医薬品。リウマチ性多発性関節炎の治療において使用するための請求項1~7のいずれか1項に記載の医薬品。I型インスリン依存性糖尿病の治療において使用するための請求項1~77のいずれか1項に記載の医薬品。血液β2mの比を2.5~12mg/lの間、好ましくは3~8mg/lの間、より好ましくは3~5mg/lの間の濃度に上昇させるために使用される請求項1~12のいずれか1項に記載の医薬品。患者中のMHC-I複合体のHC/β2mモル比を下げるために使用される請求項1~13のいずれか1項に記載の医薬品。MHC-I複合体中のβ2m欠乏を患っている患者の治療において使用するための請求項1~13のいずれか1項に記載の医薬品。β2mまたは該タンパク質の機能変異体が負荷されているリポソームから構成されている請求項1~13のいずれか1項に記載の医薬品。食塩水形態で調製し、治療しようとする患者の血液、血清またはリンパ球と前もってエキソビボで接触させてインキュベートする請求項1~15のいずれか1項に記載の医薬品。請求項1~17のいずれか1項に記載の医薬品を含む組成物。患者中のMHC-I複合体の細胞内または膜HC/β2m比を測定することからなるステップを含む自己免疫疾患の診断方法。MHC-I複合体のHC/β2m比は膜比である請求項19に記載の診断方法。i自己免疫疾患をスクリーニングしようとする患者から細胞、好ましくはリンパ球を採取するステップ;iiこれらの細胞からMHC-I複合体を抽出するステップ;iiiMHC-I複合体中に含有されているHC及びβ2mのそれぞれの量を測定するステップ;ivMHC-I複合体のHC/β2mモル比を算定するステップ;v得られたHC/β2m比を対照サンプルのHC/β2m比と比較するステップ;を含む請求項20に記載の方法。よって、本発明は、β2mタンパク質の特に薬剤を製造するための活性成分としての使用に関する。β2mタンパク質は、好ましくは精製または組換体のタンパク質のヒト形態であり、その参照ポリペプチド配列及び遺伝子決定基はGENEBANKデーターベースに寄託番号CAG33347で記載されている。精製されているならば、β2mは健康なドナーの血清から得ることができる。タンパク質は非グリコシル化形態で使用され得るので、化学合成に頼ることも予想され得る。本発明のβ2mの治療的使用は、野生型タンパク質と同一の機能性を有する、すなわち本明細書に記載されているのと同じ治療効果を有するが、効果が野生型タンパク質に比してその強度が低いまたは高いことがあり得る該タンパク質の機能変異体、すなわちそのイソフォーム、該タンパク質の変異コピーまたは断片に及ぶ。機能変異体は、より詳しくは細胞の表面上に存在するMHC複合体と会合し得るポリペプチドを意味し、そのポリペプチド配列はヒトβ2mタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも70、好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも90、更により好ましくは少なくとも95同一である配列の比較は、例えばClustalWソフトウェアアプリケーションを用いてなされる。β2mの機能変異体は、好ましくは同じ治療効果または同じ生理活性を示すβ2mタンパク質の断片から構成される。このような機能変異体は、発現ベクターまたは遺伝子治療ベクターにクローン化したヌクレオチド配列を発現させることによっても生じ得る。複数の刊行物が、例えば齧歯類[GodingJ.W.andWalkerI.D.,Allelicformsofβ2-microglobulininmouse1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:7395-7399]及びヒト[DavidssonP.ら,ProteomeanalysisofcerebrospinalfluidproteinsinAlzheimerpatients2002,ClinicalNeuroscienceandPathology,13:611-615;HanssonS.F.ら,Validationofaprefractionationmethodfollowedbytwo-dimensionalelectrophoresis-Appliedtocerebrospinalfluidproteinfromfrontotemporaldementiapatients2004,ProteomeScience,2:1-11]におけるβ2mのイソフォームの存在を記載している。等電点pIが異なることにより特に区別されるこれらのイソフォームはβ2mの機能変異体と見なされる。上記機能変異体は、精製ヒトタンパク質に対する生成物またはその処方物の有効性溶解度、より高い安定性、少ないタンパク質分解の点である利点を有し得る。本発明は、β2mまたはβ2mの機能変異体の1つを活性成分として含む医薬組成物に関する。好ましくは、β2mまたはその機能変異体は前記組成物の単一活性成分を形成する。本発明の意味の範囲内で、活性成分は薬剤の組成物に含まれ、その薬力学的または治療特性に関与し得る物質である。本発明の意味の範囲内で、アジュバントは活性成分と見なされない。より好ましくは、本発明は、医薬的に許容され得る担体またはビヒクル中に含まれているβ2mまたはβ2mの機能変異体から構成される医薬組成物に関し、前記した医薬的に許容され得る担体またはビヒトルは好ましくはリポソームである。本発明の好ましい態様によれば、β2mは規制推奨及び要件に従って医薬的に許容され得る担体または生理学的溶液と共に投与される。本発明によれば、β2mは患者における膜MHC-I複合体内のHC/β2m比を正常に戻す能力を有しているためにより特に使用される。HC/β2m比は、好ましくはリンパ球、特にB細胞に関して論じられる。HC/β2m比は精製MHCI複合体中のHC及びβ2mサブユニットのモル比に相当する。好ましくは、この比は病気を患っていない患者のレベルに匹敵するレベルに戻される。より好ましくは、β2mは1に近いモル比を達成するために患者におけるHC/β2m比を低下させる目的で使用される。本発明は、より特に自己免疫疾患を患っている患者におけるMHC-I複合体中のβ2mの欠乏が生ずるのを防止することに関する。よって、本発明に従うβ2mの使用は自己免疫疾患の治療のためにより特に意図されている。本発明者らは、自己免疫疾患を患っているいくつかの患者では細胞内または膜β2mの欠乏によりHC/β2m比は1以上、または2以上にもなることを確認することができた。よって、本発明は、HC/β2m比を生理学的値に近い値、すなわち好ましくは2未満、より好ましくは1.5未満、更により好ましくは1.2未満に戻すことに関する。勿論、本発明は自己免疫疾患以外のMHCI複合体中のHC/β2m比のアンバランスにリンクしている疾患に適用される。本発明の意味の範囲内で、臓器移植片または移植片拒絶にリンクする病変は自己免疫疾患とも、免疫系による非自己の認識の欠陥に起因する疾患とも見なされない。正確に言うと、ここでは移植片拒絶は免疫系による非自己の認識により生じると見なされ、自己の認識の欠陥とは見なされない。本発明者らがいろいろな患者において実施した分析は、全リンパ球タンパク質に基づいて計算して1.2超のHC/β2m比が少なくとも以下の疾患、すなわちリウマチ性多発性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、線維筋痛、筋炎、強直性脊椎炎、I型インスリン依存性糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、クローン病、セリアック病、筋萎縮性側索硬化症ALS及び多発性硬化症MSで観察され得ることを示している。科学界でなお論争中の問題であるが、ALSは得られた結果にてらして自己免疫疾患に似ている。本発明は、より特に膜MHC-I複合体のHC/β2m欠乏を軽減するために血液β2mの比を2.5~12mg/lの間、好ましくは3~8mg/lの間、より好ましくは3~5mg/lの間の濃度に上昇させるための薬剤の開発に関する。下記するように、本明細書の実験部分では、本発明の薬剤はβ2mまたはその機能変異体を含むリポソーム調製物から構成され得る。リポソームは、本明細書の実施例の欄に例示されているような当業者に公知の各種技術を用いて製造され得る。リポソームを構成する各種脂質を使用し得る[MedicalApplicationofLiposomes1986,KunioYagi編,JapanScientificSocietiesPress,Tokyo,Karger]。この点で、本発明の好ましい薬剤はβ2mを負荷したリポソームから構成される。好ましくは、β2mまたは該タンパク質の機能変異体が上記リポソーム調製物中に含有される唯一の活性成分を構成する。β2mを起こり得るタンパク質分解攻撃から保護でき、また特に細胞膜を構成するリン脂質とリポソームの融合によりMHC-I複合体を標的とするようにβ2mをデリバリーできるので、本発明に従うリポソームは薬剤として使用することが有利である。本発明の別の態様によれば、β2mまたはその機能変異体の1つをコードする遺伝子治療ベクターはインビボで、好ましくはMHC複合体の環境でタンパク質を合成するために使用される。このような遺伝子治療ベクターはリポソーム中に含有され得る。よって、本発明は、β2mまたはその機能変異体を活性成分としてインビボまたはエキソビボで発現させるステップを含む遺伝子治療方法にも関する。この目的のためにβ2mタンパク質を発現させるべく文献に記載されている各種タイプのウイルスまたは非ウイルスベクターが改変され得る[Urnovら2005,Highlyefficientendogenoushumangenecorrectionusingdesignedzinc-fingernucleases,Nature,435:577-579]。好ましくは、本発明に従う遺伝子治療ベクターにより、他の活性成分、好ましくは他のポリペプチドを除くβ2mタンパク質またはその機能変異体をヒト体内で発現させることができる。本発明の態様によれば、患者はβ2mまたは該タンパク質を発現するベクターを含有するリポソームの溶液を潅流させることにより、または前もってβ2mと接触させた患者のリンパ球を輸注することにより治療され得る。この接触配置は同一患者から予め採取した血液のサンプルから抽出したリンパ球をエキソビでインキュベートすることにより実施され得る。本発明の好ましい態様によれば、β2mを含む薬剤は食塩水形態で調製される。薬剤を製造するための好ましい方法は、食塩水形態のβ2mを薬物治療しようとする患者の血清と接触させてエキソビボでインキュベートすることからなる。本発明に従う上記した医薬組成物は、経口投与、注射、輸注または吸入のために当業者に公知の適切な形態をとり得る。本発明の別の態様は、MHCI複合体のHC/β2m比をインビボまたはインビトロで測定することによる自己免疫疾患の診断、より特に上に挙げた疾患の診断に関する。本発明に従う診断方法は、好ましくはi自己免疫疾患をスクリーニングしようとする患者から細胞、好ましくはリンパ球を採取する;iiこれらの細胞からMHCI複合体を抽出する;及び所要によりiii複合体中に含有されているHC及びβ2mのそれぞれの量を測定する;ivHC/β2mモル比を算定する;及びv得られたHC/β2m比を予め他の患者から得た結果と比較する;から構成されるステップの1つ以上を含む。HC/β2m比は、細胞の全体HC/β2m細胞比、または好ましくは膜膜MHCI複合体のHC/β2m比について算定され得る。好ましくは、本発明に従う診断方法は、HC/β2m比を対照のものと比較する、または患者のモニターに関連しては他の前もって求めた比と比較するステップを含む。HC及びβ2mのタンパク質のそれぞれの量は当業者に公知の方法に従って、例えば定量的免疫検出例えば、ELISA、イムノブロット、ウェスタンブロット、自己抗原マイクロアレー等により標準方式で測定され得る。MHC-I複合体の抽出は細胞及び膜タンパク質を抽出する公知プロトコルに従って実施する。本発明に従う診断方法は、各種自己免疫疾患を患っている患者の治療モニタリングに関連して実行され得る。下記実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明の説明を補足するために意図されている。1-自己免疫疾患を患っている患者におけるリンパ球のHLA-I膜複合体の成分の分析理論に束縛されないが、本発明者らはHC/β2m比が上昇すると自己免疫タイプの反応が生じる恐れがあるという作業仮説を展開した。特に、本発明者らはMHC-I複合体のレベルでのHCの過剰及び/またはβ2mの低下によりTcRに対する自己の露出過度の現象が生じ得ると考えた。β2mはHCのある領域を保護し、CD8T-細胞に対する非自己の提示を特異的に決定することに注目されたい[Hill,D.M.ら2003,Adominantnegativemutantβ2-microgobulinblockstheextracellularfoldingofmajorhistocompatibilitycomplexclassIheavychain,JBC,278:5630-5638]。この仮説を確かめるために、4人の患者のリンパ球から抽出したMHCI複合体中のHC及びβ2mのモル量を測定する第1の分析を行った。これらの分析の結果を表1に示し、注釈を加えた。リンパ球を健康なドナー及び患者の血液からHofmanF.M.ら[Ann.J.Clin.Pathol.1982,77:710-716]が改変したLightbodyJ.[ManualofClinicalImmunology,RoseNR.,FriedmanH.編集者,AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonDC,1976,p.851-857]の方法に従って単離した。MHC-I複合体を全リンパ球または少し改変したWarleyA.ら[Biochim.Biophys-Acta1973,323:55-66]の方法に従って作成した血漿膜上で検出する。MHC-Iのタンパク質成分の検出はLaemmliU.K.[Nature1970,227:680-685]に従って電気泳動SDS-PAGE系することにより、次いでTowbinH.ら[Proc.Natl.Acad.Sci.USA1979,76:4350-4354]の方法に従ってPVDFの膜に電気伝達し、イムノブロッティングすることにより実施した。暴露はNBT-DCIP混合物を用いてアルカリホスファターゼにカップリングした二次抗体により実施した。血漿膜を単離し、後記するグルタルアルデヒドへの結合方法を使用することにより多くの重鎖が実際膜起源であることを確認した。先に示したように、MSの4つの他の症例及びクローン病の2つの症例はHC/β2m>1の細胞比を示す。これらの所見は、出願人に特にリポソームを使用することによりHC/β2mMHC-Iのバランスを戻すことができる実験的アプローチを開発することを刺激した。2-β2mを負荷したリポソームの作成2.1患者にデリバリーしようとするβ2mの量の評価リンパ球の表面上のβ2mを過剰とするためには、増殖の可能性を有する細胞上のシグナリングチャネルをトリガーしないように血液中のその濃度を合理的限界の範囲内で上昇させなければならない。β2mが膜から脱離して、血液及び腎臓系中を循環する能力を考えると、血液β2m濃度を3mg/l~8mg/l正常濃度は約2mg/l-血液で変わるの範囲内としなければならない。このように上昇させると、β2mは細胞の表面に吸着する。I型の主要組織適合遺伝子複合体はモル/モルの重鎖MW≒43kDa及びβ2mMW≒12kDaから構成されていることに注目されたい。よって、複合体MW≒55kDaは重量基準で79の重鎖及び21の軽鎖から構成される。リンパ球の平均タンパク質含量は650×10-12gであり、その血漿膜のタンパク質含量はその全含量の1のみ、すなわち6.5×10-12gに相当する。MHC-Iのみは静止期リンパ球の膜タンパク質の全含量の多くとも1に相当し、よってβ2m含量は約1.4×10-14g/リンパ球であると考えられる。平均生理学的パラメーター2×106リンパ球/ml-血液及び5リッターの血液/個人を採用することにより、全MHC-I/個人リンパ球に関しての重量範囲は1.4×10-6g~1.8×10-6gのリンパ球β2mである。これらの数字は、我々の最初の推定が優先的に患者において平均で0.2×10-9~500×10-9gの範囲の値を示している最大数てある。血液中の平均量は10mgのβ2m/個人、すなわちリンパ球の表面上に存在するより非常に実質的に多い量であるので、正常な状態では実質的に1未満の比が既に膜β2mと血清β2m間で存在すると思われる。よって、β2mの膜欠乏を補うために血液循環中のβ2mの比を上昇させるそのコロイド浸透分圧を高めることは合理的である。β2mの投与は2つの方法で実施し得る:1β2mを負荷したリポソームの投与。このタイプの医薬担体はペプチド、抗体、遺伝物質等の投与のために流通している。リポソーム人工または合成膜を使用すると、細胞表面と活性成分間の接触が促進される;2食塩水形態の活性成分を投与前に患者の血清とインキュベートする。このインキュベーションの目的は、血清のリポタンパク質をりポソームのようにベクターとして働かせることである。方法1または2による投与のためのβ2mのリンパ球への取り込みの程度を対照の投与と比較し得る。後者の場合、β2m食塩水潅注を0.10mg/ml全容量150mlで投与し、これにより3mgのβ2m/L-血液バッチ15と称される15mgのβ2m/150mlのリポソーム溶液のバッチが与えられる。2.2リポソームの製剤化リポソーム1mlの場合を製造するために、成分を含有するジクロロメタンCH2Cl2を窒素下で蒸発乾固させた後、場合によりコレステロールを添加して、場合によりスフィンゴミエリンを添加して、またはコレステロール及びスフィンゴミエリンを添加して、ホスファチジルコリンを含有するフィルムを形成する。3つの化合物ホスファチジルコリン、コレステロール及びスフィンゴミエリンについて、割合はそれぞれ10M、2M及び1M、すなわち最終溶液1mlにつき7.60mg、0.76mg及び0.38mgである。このフィルムに対して2mgのβ2mを含有する食塩水溶液PBS10mM,pH=7.4;ハンクス,トリス/グリシンまたはDMEMを1ml添加する。リポソームをホスファチジルコリン10M、ホスファチジルコリン10M及びコレステロール2M、ホスファチジルコリン10M及びスフィンゴミエリン1Mから作成したならば、各化合物に対するモル濃度は同一のままである。しかしながら、脂質成分に対して他のモル濃度を使用してもよい。タンパク質の量は異なっていてもよく、pHはケースに応じて7.4超でもよい。脂質フィルムの分散は20~37°Cの間の温度で最長3時間撹拌することにより実施する。リポソームを所謂洗浄剤/透析方法により、または所謂抽出方法により形成する。後者の場合、溶液Lipofast登録商標,SodeximS.A.,51140ミュイゾン,フランス国を69バールの圧力下でポリカーボネート中に100nmのフィルター膜を介して41回通す。得られたリポソームは均質なサイズを有している。この場合、リポソームを4°Cで2日間保持し、リンパ球懸濁液直径<100nm;図4に添加する。より大規模では、溶液3l/時;sodexim2770;emulsifflexc3;sodexims.a.を450バールの圧力下で4回通して、SUV単ラメラ小胞を得る。プレパイロットアッセイでは、β2mのリポソームへの取り込み、リポソームの細胞表面への吸着及びタンパク質のリポソームから細胞の内部への移動を示すために、我々は蛍光リポソームを作成した。アッセイに従って、520nmまたは572nmで蛍光を発するリポソームを作成した。このために、脂質混合物に0.5MのNBD-PC1-オレイル-2--6-7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾル-4-イルアミノヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン490nmで励起、520nmで放出または0.5MLissRhodPE1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミン-N-リサミンローダミンBスルホニルアンモニウム塩541nmで励起、572nmで放出を添加した後、蒸発させ、脂質フイルムを得た上記を参照されたい。プレパイロット規模で、リポソームを洗浄剤/透析方法により作成した。この技術によっても、よく検定された安定なSUVが得られた。簡単に説明すると、20~37°Cの間の温度で最長3時間撹拌した後、ミセル懸濁液を微小透析装置においてβ2m及び4μΜ0.8mg/mlのn-ヘキシル-βD-グルコピラノシドを含有する食塩水溶液に対して4°Cで12時間透析する。透析膜は3.5kDaのカットオフを有し、n-ヘキシル-βD-グルコピラノシド洗浄剤を最終溶液中最小1ppmまで希釈する。得られたリポソームは直径約200nmのサイズを有している。これらは周囲温度で少なくとも3ヶ月にわたり安定であり、少なくとも0.1mgのβ2m/ml-初期溶液を含有している。2.3被験リポソームのエキソビボで培養維持したリンパ球に対する適用リンパ球のMHC複合体を標的化する目的でβ2mタンパク質をリポソーム懸濁液の形態で製剤化する適切さを示すために、リンパ球を比較的簡単な技術を用いて蛍光により検出することができるタンパク質であるアルブミンを負荷したリポソームとインキュベートした。ホスファチジルコリンに基づいて上記したプロトコルに従って作成したリポソームへのタンパク質の取り込み及びリポソームの適用をLissRhodPEを用いてエキソビボで試験した。DAPIジアミノフェニルインドール;372nmで励起、456nmで放出の蛍光に匹敵する蛍光を示す化合物であるフルオレスカミンでマーキングすることによりタンパク質を蛍光性とした。ウシ血清から結晶化したアルブミンを、HamesB.D.ら[GelElectrophoresisofProteins,apracticalapproach,HamesBD.andRickwoodD.編,ThepracticalApproachSeries,第2版,IRLPress,Oxford,NewYork,Tokyo,p.67]に記載されている方法を用いてタンパク質のN末端上にフルオレスカミンを共有結合により結合させることにより蛍光性とした。ただし、マーキングは洗浄剤SDSを含有していないトリス-HCl25mM/グリシン192mMpH=8.3緩衝液を用いて実施した。先に記載したように、形成されたリポソームは2mgの蛍光アルブミン/ml-リポソーム溶液を含有している。次いで、0.2mlの250000個のリンパ球を含有するリンパ球の懸濁液ハンクス/0.5mMEDTA,pH=7.4を0.2mlのアルブミン緩衝液25mMトリス-HCl/192mMグリシン,pH=8.3を含有する形成されたリポソームとCO25を飽和させた湿潤雰囲気中で37°Cで1時間インキュベートした。最後に、対照リポソーム200μl、対照リンパ球200μl、及びタンパク質を負荷したリポソームで処理したリンパ球200μlをRakotoariveloC.ら[Receptorstosteroidhormonesandaromataseareexpressedbyculturedmotoneuronsbutnotbyglialcellsderivedfromratembryospinalcord2004,Neuroendocrinology,80:284-297]に記載されている方法を用いて処理し、ポリリシン及びラミニンで被覆したカバーガラス上に載せた。調製物を落射蛍光顕微鏡Axiovert;Zeiss,ドイツ国により直接観察するか、または水中4plvパラホルムアルデヒドの溶液で30分間固定し、カバーガラスをPBS160mM,pH=7.2で3回濯いだ。調製物をPBS中で調製した0.1トリトンX-100v/vを用いて5分間で優しく透過性とした。細胞を一次抗HLA-ABC抗体によりマーキングした。ある例では、細胞核をHoechst蛍光450nm青色放射,DAPIでマーキングした。家兎で産生させた一次抗体はウェスタンブロットのために使用したものと同一である。一次抗体を1/50に希釈し、ヤギにおいて産生させたFITC緑色蛍光に結合させた二次抗体を1/160に希釈する。抗体のインキュベーションは2ウシ血清アルブミンを含有するPBS中で実施した。×63レンズの場合、カバーガラスにFluorsaveCalbiochem,米国を載せた。図2及び3の写真は、リポソームがリンパ球の表面上に吸着されており、リポソーム中に含有されているマーキングしたタンパク質がリンパ球の膜表面上に沈着していることを示している。結果は、我々がHC/β2m膜平衡を戻すことを提案する実験アプローチの実現可能性を明らかに立証している。尿から精製したヒトβ2mSigma,米国を0.6mg/mlの濃度で含有している緑色蛍光を有する他のリポソームを抽出方法に従っても作成した。β2mを赤色蛍光励起:540nm;蛍光:625nmを有するローダミンBイソチオシアネートでマーキングした。β2m-ローダミンB結合をRiggsら[1958,Am.J.Pathol.,34:1081-1097]に記載されている方法を用いて形成した。結合後、タンパク質をセファデックスカラムPharmacia,スウェーデン国,G-10:床容量9ml;カラムの内径0.7mmを用いて精製した。カラムをPBSBio-rad,10mMホスフェート,150mMNaCl,pH=8.3中で水和した。タンパク質をmilli-QH2Oで1:1希釈したPBS中に溶離した4.5~7.0ml。形成されたリポソーム図4を類似カラムを用いて精製し2.5~6.5ml、回転蒸発器Buchi,スイス国を用いて2回濃縮した。患者P1の血液から単離したリンパ球を先に記載したように90分間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。結果はβ2mのリンパ球の89への取り込みを示している図5。2.4リポソームの安定性図6~8上で得たアルブミンを含有する被験リポソームを各種条件下で試験して、その経時的安定性を評価した。安定性は、バッチ30150mlのリポソームにつき30mgのアルブミンに相当及び60150mlのリポソームにつき60mgのアルブミンに相当について時間及びインキュベーション温度に対して試験した。リポソームを構成する脂質は636nmolのPC及び31.8nmolのNBD-PC-オレイルから構成した。窒素流下で蒸発乾固した後、脂質の混合物を1mlの200または400μgのアルブミンSigma,米国を含有するPBSpHを7.2に調節したそれぞれ、バッチ30及び60を1滴ずつ用いて強く撹拌しながら可溶化する。次いで、リポソファスト-塩基系Sodexim,フランス国を用いて機械的に抽出することによりリポソームを得た。次いで、各バッチをセファデックスG10カラムで精製した。設定した時間に、50μlの各バッチをポリ-D-リシン/ラミニンを被覆したカバーガラス上に載せ、37°Cで12時間インキュベートした。次いで、生物材料を4°Cでグルタルアルデヒドを30間用いることにより結合させた。画像1ヶ月保存時の安定性,図6をAxiovert200Zeiss落射蛍光顕微鏡を用いて撮影し、Axionvisionソフトウェアアプリケーションを用いて記録した。統計研究図7に関して、リポソームの直径はSerfソフトウェアhttp://www.org/serfを用いて測定した。各バッチの研究毎に、リポソーム集団を3つのクラス:直径<50、50~100nm及び>100nmに分けた。バチャートの高さは各サイズの亜群を表す。37°Cで保持したバッチ60は、60日間の保存で最高の安定性を示す:リポソームの95が<100nmの直径を有しており、これは細胞表面へのタンパク質の移動のための理想的直径である。バッチ8080mgのβ2m;図8に関して、バッチ80を汚染及び蒸発を最小限とするために25°Cで6及び40日間の保存について試験した。作成方法はバッチ30及び60アルブミンに関して上記した方法と同じであり、ただし非蛍光β2m533μg/ml-PBSを使用し、精製は透析カセット20kDaカットオフの膜,ThermoScientific,米国により実施した。図8のバーチャートは、この段階の保存でβ2mのリンパ球への移動のためにリポソームの98が理想的サイズすなわち、直径<100nmを維持し、これは最長40日間維持されることを示している。2.5リポソームにより付与される外因性β2mのヒト血清によるタンパク質分解に対する保護図9血清を健康なドナー及び自己免疫疾患橋本甲状腺炎、リウマチ性多発性関節炎を患っているドナーから採取した。これらの血清90μlを2μgの純粋なβ2mSigma-Aldrich,米国またはリポソーム形態のβ2m150mlのリポソームにつき30mgのβ2mに相当するバッチ30リポソームの存在下25°Cで15日間インキュベートした。全反応容量は130μlであり、所要によりPBSリン酸ナトリウム10mM,塩化ナトリウム150mM,pH=7.2を補充した。6M尿素を含有する変性緩衝液SDS-PAGE,レムリで30μlとした反応培地から10μl150ngに相当するを0、1、2、3、6、10及び15日目に順次取り出した。サンプルを分析まで-20°Cで保持した。すべてのサンプルを収集した後、これらを50°Cで1時間インキュベートした。次いで、タンパク質を4M尿素を含有する12アクリルアミドゲルT=12,C=2.6を用いてSDS-PAGEにより分離した。ポリビニリデンジフロリドPVDF膜を用いて電気泳動溶出させた後、β2mの存在をイムノブロッティングにより検出し、対応するバンドの強度をImageJNIH,米国を用いて定量した。標準曲線を用いることにより、得られたピクセルの数をβ2mのピコモル10-12モルに変換した。図9A~Fに示すグラフは得られた結果の例を表し、β2mの量単位ピコモルを経時的に表す。自己免疫疾患を患っている人では血清に添加した遊離β2mが経時的に分解し、対照ではそうではないことが注目され得る。結論として、遊離β2mが自己免疫患者の血清により段階的に大きく分解するが、対照では見られない。他方、この分解はβ2mをリポソーム中にカプセル化したときには観察されない。正確に言うと、量の有意な減少が観察されなかったので、リポソームはβ2mを血清による分解から保護すると見られる。結論として、リポソームはβ2mを血清による分解から保護する。2.6リポソーム中に含有されているβ2mの膜表面上に位置するHLAI重鎖との会合図10健康な人及び生理学的状態では、リンパ球表面上で発現させたβ2mの分子は1:1の比でHLA重鎖に対して非共有的に結合している。これらのタンパク質会合を観察し、定量するために、我々は上記タンパク質の中でHLA-β2mダイマーを一緒に共有的に連結できる技術を開発した。この技術の開発は、正確な膜HC/β2m比を計算し、リポソーム形態のβ2mの添加がHLA-Iの重鎖に特異的に会合することを示すために必要であった。このために、ジアルデヒドであるグルタルアルデヒドの2個のアルデヒド基によりタンパク質のアミノ基を結合させる能力を利用した。これらのアルデヒド基は、グルタルアルデヒドを2つの相互作用するタンパク質に由来する2個のアミノ基と統計的に架橋させ得る3つのメチレンの可変鎖により一緒に連結されるSun、T.T.ら1974,Protein-proteinproximityintheassociationofribosomalsubunitsofEscherichiacoli:crosslinkingof30SproteinS16to50Sproteinsbyglutaraldehydeorformaldehyde,J.Mol.Biol.,873:509-22。この手順に従って、MSLにより精製した500万個のリンパ球を可能性ある痕跡量の遊離アミンを除去するためにPBSpH=7.2で1回洗浄した後、10000gで10分間遠心することによりペレット化し、上清液体は除去した。次いで、細胞を0.25グルタルアルデヒドを含有するPBS1ml中周囲温度で5分間インキュベートした。このインキュベーション中、管を数回ひっくり返した。トリス1MpH=7.2100μlを添加することにより反応を停止し、過剰アミン基はグルタルアルデヒドを中和トリス緩衝液より与えられた。10000gで10分間遠心することによりリンパ球を回収した後、痕跡量のグルタルアルデヒドを除去するためにPBS1mlで洗浄した。遠心後、ペレットを4M尿素を含有し、アンチプロテアーゼRocheDiagnosticsGmBH,ドイツ国及び5β-メルカプトエタノールを含むレムリ緩衝液400μl中に回収し、分析するまで-20°Cで保持した。細胞を溶解させるために、サンプルに3回の凍結-融解サイクルを施し、強く回転させた。次いで、サンプルを95°Cで5分間インキュベートし、不溶性残渣を除去するために4000gで10分間遠心した。タンパク質125000個のリンパ球に相当する10μlのホモジネートを定電圧120V下で4M尿素を含有する10T=10,C=2.6のアクリルアミドゲルを用いるSDS-PAGEにより分離した。こうして分離したタンパク質をトリス-グリシン緩衝液の存在下、13Vで前もってメタノールで活性化したPVDF膜上に半乾燥で40分間かけて移した。1/600に希釈した一次抗β2m抗体DakoCytomation,デンマーク国と周囲温度で1時間、次いでアルカリホスファターゼにカップリングさせ、1/20000に希釈した二次抗家兔抗体Sigma-Aldrich,米国と再び1時間インキュベートすることによりβ2mを検出した。得られたバンドの強度の定量はImageJソフトウェアアプリケーションNIH,米国を用いて実施した。図10Aは得られたゲルの写真を示す。グルタルアルデヒドの存在下で、12kDaの通常のバンドに加えて55kDaにバンドが見られる。この55kDaのバンドは、分子量がβ2m分子及び重鎖の分子量の付加:1243kDa=55kDaに相当するHLA-β2m複合体に相当する。同一レーン上の12kDaのバンドは遊離非複合化β2mに相当する。各バンドの強度を定量した後、12及び55kDのこれらの2つのバンドの累積強度がグルタルアルデヒドなしのレーン中の12kDaのバンドの強度に相当し、全β2mに相当する。グルタルアルデヒドあり及びなしのいずれのレーンでも、同一数のリンパ球に相当する全タンパク質の同一量が沈着した。55kDaのバンドの定量が実際リンパ球表面上に存在するHLA-β2m複合体の量を与えるという証拠を得るために、平行してリンパ球から血漿膜を精製するための技術を使用した。この技術により、我々は明確にリンパ球血漿膜のタンパク質を研究できた。膜β2mの存在を調べ、定量した図10Bを参照されたい。得られた結果は55kDaのバンドの定量に匹敵し、このバンドが実際膜HLA-β2m複合体に相当することを確認する。更に、全β2mに対する膜β2mの割合図10Bは55kDaバンド/全β2m12kDaバンドの強度の比に等しい図10A。こうして確認されたグルタルアルデヒド技術を使用して、ヒト血液から単離したリンパ球へのリポソームにより運ばれるβ2mの取り込みの程度を調べ、定量した。対照として使用される一人の健康なドナー及び多発性硬化症を患っている他のドナーの2人のドナーを選択した。第2のドナーはHLA-Iの重鎖に比して膜β2mが欠乏しているために選択された。この患者は1.7に等しい膜HC/β2m比を有し、これはリンパ球膜がβ2mよりも重鎖を69より多く含有していることを意味する。2人のドナー25mlの血液からのリンパ球を各4mlの2つのバッチに分離した。150mlにつき40mgの濃度でβ2mを含有している2mlのリポソームバッチ40を4mlのリンパ球に添加した。T0リンパ球を直ちに集め、PBSで洗浄した。T90でサンプリングしたリンパ球をリポソームと37°Cで90分間インキュベートした後、収集し、未反応の過剰のリポソームを除去するためにPBSで洗浄した。2つの条件の各々の下で、我々はグルタルアルデヒドで処理したまたは処理しなかったリンパ球の2つの集団を分析した上述のプロトコルを参照されたい。各条件下で、全タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットにより明らかにした。得られた結果を図10Cに示し、我々は定量後、対照とは対照的にグルタルアルデヒドの存在下でHLA-β2m複合体を表す55kDaバンドの強度がT0に比してT90で55増加することを知見した。この増加は、患者におけるリンパ球表面上に遊離HLA-1鎖を存在させるβ2mの欠乏と一致する。すなわち、重鎖は実際リポソームにより与えられる外因性β2mと会合している。実行した実験アプローチにより、本発明の治療概念を提供することを証明できた。すなわち、リンパ球表面にリポソーム形態の外因性β2mを付加することによりHLA-β2mバランスを再構築することができる。β2mが欠乏している患者はβ2mの取り込みを必要としない対照よりもより多くのβ2mを取り込むことができる。取り込まれたβ2mは実際遊離HLA分子と会合してHLA-β2mダイマーを形成する。要するに、得られた実験データから、β2mのリポソーム調製物を使用すると生理学的正常に近い、すなわち1に近似のHC/β2m比を再構築する目的で遊離重鎖HC/β2m>1を提示するリンパ球を標的することができることが確認される。3-β2mのリポソーム組成物の毒性分析リポソーム形態のβ2mを、ヒト起源の肝臓、腎臓、骨格筋及び心臓細胞の培養物に対するその可能性ある毒性についてインビトロで試験した。3.1被験細胞の型被験細胞及び培地はSciencellResearchLaboratories6076CorteDelCedro,カリフォルニア州カールズバッドから購入した。a.HCF:初代ヒト心臓線維芽細胞,バッチNo.2136培地:FM線維芽細胞培地,バッチNo.5673線維芽細胞増殖溶液,バッチNo.5863FBS10ペニシリン溶液100U/ml-ストレプトマイシン100μg/ml,バッチNo.5917b.HREpiC:初代ヒト腎臓上皮細胞,バッチNo.0546培地:上皮細胞培地,バッチNo.5967上皮細胞増殖溶液,バッチNo.5855FBS10PSc.HH:初代ヒト肝細胞,バッチNo.4607培地:HM肝細胞培地,バッチNo.5933肝細胞増殖溶液,バッチNo.5722FBS10PSd.HSkMC:初代ヒト骨格筋細胞,バッチNo.5606培地:骨格筋細胞培地SkMGSFBS10PS培養フラスコまたは皿を37°C、5CO2及び飽和湿度のインキュベーターSanyo中に置いたバッチは0.22μm,Nanopure,Thermo-Fisherで濾過した超純水を含有している。初代ヒト細胞のための培養基質は、インキュベーターにおいて2μg/cm2のポリ-L-リシンClinisciences;SciencellResearchLaboratories,バッチNo.5826,溶液:10mg/mlと一晩インキュベートし、接種前に滅菌超純水で2回濯いだ細胞培養処理プラスチックTPP,スイス国である。3.2細胞層の脱離及び解離作成した培地を培養フラスコから取り出し、層を滅菌PBSSIGMA,バッチNo.088K2356で濯ぎ、次いで0.05トリプシンSIGMAトリプシンRefT-1426,バッチNo.020M7354、EDTA0.2g、NaCl8g、KCl0.4g、NaHCO30.58g、グルコース1gSIGMA、1リッターまで超純水の溶液で処理することにより、細胞層の脱離を実施した。溶液は0.22μ孔径の膜濾過PES,CMLバッチNo.668919により滅菌し、トリプシン溶液の容量をフラスコの種類に調節し例えば、25cm2のフラスコの場合1ml、培養フラスコは37°CSanyoインキュベータで3~4分間放置した。細胞をその基質から脱離させたら、脱離を培地の存在下で血清トリプシンの酵素作用の阻害をピペット細胞型応じて5~10mlに出し入れしながら実施した。3.3毒性試験細胞を光学顕微鏡Nikonの下Thoma細胞ThermoFisherを用いてカウントし、96ウェルの細胞培養処理プラスチックNUNC,バッチNo.114754の平底培養皿を用いて200μlのそれぞれの培地中に5000細胞/ウェルの量で接種し、作成後皿をインキュベーター中に24時間置いた。被験物質の各種希釈物を100μlの抗生物質なしの培地において3回濃縮し、抗生物質は処理のため200μlの各ウェルに添加した全容量:300μl。24時間、48時間及び72時間目に、処理ウェル及び対照ウェルを細胞毒性を評価するためにプロトコルに従ってMTTブルーテトラゾリウム臭化チアゾリル[LiuY.ら1997,MechanismofcellularMTTreduction,J.Neurochem.,69:581-593]及びタンパク質の量Ref23227、BCAタンパク質アッセイキット;Pierceについて調べた。最終濃度25μg/mLのためにMTT溶液の添加、37°Cで1時間のインキュベーション培地の吸引、100μL飽和DOならば200μLのDMSOの添加、皿Bioradの490nmでの測定、Excelを用いるコンピューター処理、空ウェルブランクを用いるバックグラウンドノイズの引き算、DOXウェル/DO対照ウェルの比を決定する、前記比の薬物濃度に対する曲線をトレースする。毒性を治療の24時間及び48時間目、すなわちto48h及びt072hに調べた。図11及び12は、たとえ高量バッチ132でもリポソーム被覆β2mは、β2mに対して感受性である肝細胞及び腎細胞の生存率に悪影響を与えないことを明らかに示している。同じことが心臓起源の細胞及び骨格筋細胞結果示さずにも当てはまる。"