"ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるためのインビトロ方法であって、a被験試料を調製し、そしてb工程aからの試料をi0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を含有する試薬、ii還元剤、およびiiiアルカリ化剤と混合し、これによりビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させることを含む方法。工程iによる試薬が、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるのに適した条件下で水溶液に可溶性である、請求項1に記載の方法。工程iによる試薬が、0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩を含有する、請求項1または2に記載の方法。工程iによる試薬が、0.1M~2.0Mの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を含有する、請求項1または2に記載の方法。加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質が、環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体である、請求項1、2および4のいずれか1項に記載の方法。試料が液体試料である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。試料が血液、血清または血漿である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。ビタミンD化合物を測定するためのインビトロ方法であって、a請求項1~7のいずれか1項に記載の方法に従ってビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させ、そしてb工程aで解離したビタミンD化合物を測定する工程を含む方法。ビタミンD化合物が、25-ヒドロキシビタミンD2、25-ヒドロキシビタミンD3、24,25-ジヒドロキシビタミンD2、24,25-ジヒドロキシビタミンD3、およびC3-エピ25-ヒドロキシビタミンDからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。ビタミンD化合物25-ヒドロキシビタミンD2および/または25-ヒドロキシビタミンD3を測定する、請求項9に記載の方法。ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質からなる群から選択される物質、および還元剤を含有する、試薬組成物。還元剤が、2-メルカプトエタノール、2-メルカプトエチルアミン-HCl、TCEP、システイン-HCl、ジチオトレイトールDTT、N-メチルマレイミド、エルマン試薬および1,2-ジチオラン-3-カルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項11に記載の試薬組成物。還元剤が、2-メルカプトエタノール、2-メルカプトエチルアミン-HCl、TCEP、システイン-HClおよびジチオトレイトールDTTからなる群から選択されることを特徴とする、請求項11に記載の試薬組成物。還元剤が2mM~30mMの濃度を有する、請求項11~13のいずれか1項に記載の試薬組成物。被験試料、請求項11~14のいずれか1項に記載の試薬組成物、およびアルカリ化剤を含む、試薬混合物。アルカリ化剤が、NaOH、KOH、CaOH2およびLiOHからなる群から選択されることを特徴とする、請求項15に記載の試薬混合物。ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための、請求項11~14のいずれか1項に記載の試薬組成物およびアルカリ化剤の使用。ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるためのキットであって、請求項11~14のいずれか1項に記載の試薬組成物を含むキット。ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から検出するためのキットであって、請求項11~14のいずれか1項に記載の試薬組成物およびアルカリ化剤を含むキット。したがって本発明の目的は、試料中のビタミンD化合物、特にヒドロキシビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための、先行技術の問題を少なくとも部分的に克服できる試薬組成物を開発することであった。ビタミンD化合物を解離させるのに適した試薬組成物、ビタミンD化合物を測定するためのインビトロ方法、その試薬組成物の使用、およびこの試薬組成物を用いてビタミンD化合物を測定するためのキットが以下に記載され、特許請求の範囲に包含される。本発明は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるためのインビトロ方法であって、a被験試料を調製し、そしてb工程aからの試料をi0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を含有する試薬、ii還元剤、およびiiiアルカリ化剤と混合し、これによりビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させる工程を含む方法に関する。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物を測定するためのインビトロ方法であって、a被験試料を調製し、b工程aからの試料をi0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を含有する試薬、ii還元剤、およびiiiアルカリ化剤と混合し、これによりビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させ、そしてc工程bで解離したビタミンD化合物を測定する工程を含む方法に関する。他の態様において本発明は、0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質、および還元剤を含む、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物に関する。他の態様において本発明は、被験試料、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物、すなわち0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質および還元剤、ならびにアルカリ化剤を含む、試薬混合物に関する。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるためのキットであって、0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質および還元剤を含む試薬組成物を含むキットに関する。本発明は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるためのインビトロ方法であって、a被験試料を調製し、そしてb工程aからの試料をi0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を含有する試薬、ii還元剤、およびiiiアルカリ化剤と混合し、これによりビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させる工程を含む方法に関する。本明細書中で用いる下記の用語はそれぞれ、このセクションに関連する意味をもつ。冠詞aおよびanは、本明細書中で1または1より多いすなわち、少なくとも1その冠詞をもつ目的語を表わすために用いられる。1以上という表現は、1~50、好ましくは1~20、同様に好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、または15を表わす。別に記載しない限り、ビタミンD化合物は、下記の構造式IおよびIIに従ったビタミンD2主鎖またはビタミンD3主鎖を含むすべての天然化合物を含むと解釈すべきである。構造式IおよびIIにおいて、ビタミンDの位置はステロイド命名法に従って記載される。25-ヒドロキシビタミンDは構造式IおよびIIの位置25においてヒドロキシル化されたビタミンD代謝産物、すなわち25-ヒドロキシビタミンD2および25-ヒドロキシビタミンD3を表わす。他の既知のヒドロキシビタミンD化合物は、たとえば1,25-ジヒドロキシビタミンDおよび24,25-ジヒドロキシビタミンDの形態である。1,25-ジヒドロキシビタミンDは、構造式IおよびIIの位置25のほかに位置1におけるヒドロキシル化をもつ活性形態のビタミンDいわゆるDホルモンを表わす。他の周知のD化合物は、24,25-ジヒドロキシビタミンD2、24,25-ジヒドロキシビタミンD3およびC3-エピ25-ヒドロキシビタミンDである。意外にも、本発明に開示するインビトロ法で、炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質の存在により、アルカリ性条件下でビタミンD化合物がビタミンD結合タンパク質から解離することを本発明者らは見出した。本発明による炭酸水素イオンは、実験式HCO3-および分子質量61.01ダルトンをもつ陰イオンである。本発明による炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウムNaHCO3、炭酸水素カリウムKHCO3、炭酸水素アンモニウムNH4HCO3、炭酸水素カルシウムCaHCO32および炭酸水素マグネシウムMgHCO32からなる群から選択される化合物である。本発明による加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質は、炭酸エステルまたはピロカーボネートからなる群から選択される化合物である。本発明による炭酸エステルは、カルボニル基に2つのアルコキシ基が隣接したものである。これらの炭酸エステルの一般式はR1OC=OOR2である。環式炭酸エステルたとえば炭酸エチレンまたは非環式炭酸エステルたとえば、炭酸ジメチル、およびそのヒドロキシル化またはハロゲン化誘導体を使用できる。好ましくは、前記方法の工程iによる炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質は、それぞれ0.1M~1.5M、または0.2M~1.0M、または少なくとも0.1、0.2、0.3もしくは0.4M、または多くとも2.0、1.7、1.5、1.3、1.0もしくは0.75Mの濃度をもつ。ある態様において本発明は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるためのインビトロ方法であって、a被験試料を調製し、そしてb工程aからの試料をi0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩を含有する試薬、ii還元剤、およびiiiアルカリ化剤と混合し、これによりビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させる工程を含む方法に関する。好ましくは、前記方法の工程iによる炭酸水素塩は、それぞれ0.1M~1.5M、または0.2M~1.0M、または少なくとも0.1、0.2、0.3もしくは0.4M、または多くとも2.0、1.7、1.5、1.3、1.0もしくは0.75Mの濃度をもつ。好ましい態様において、炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸水素マグネシウムからなる群から選択される。さらに好ましい態様において、炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素アンモニウムからなる群から選択される。さらに好ましくは、炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウムからなる群から選択される。ある態様において本発明は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるためのインビトロ方法であって、a被験試料を調製し、そしてb工程aからの試料をi0.1M~2.0Mの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を含有する試薬、ii還元剤、およびiiiアルカリ化剤と混合し、これによりビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させる工程を含む方法に関する。好ましくは、前記方法の工程iによる、加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質は、それぞれ0.1M~1.5M、または0.2M~1.0M、または少なくとも0.1、0.2、0.3もしくは0.4M、または多くとも2.0、1.7、1.5、1.3、1.0もしくは0.75Mの濃度をもつ。好ましい態様において、加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質は、環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体である。好ましい態様において、加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質は、環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのハロゲン化誘導体である。他の好ましい態様において、環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、二炭酸エリトリトール、1,2-炭酸グリセロール、4-クロロ-1,3-ジオキソラン-2-オン、4,5-ジクロロ-1,3-ジオキソラン-2-オン、2,5-ジオキサヘキサンジ酸ジメチルエステル、ピロカーボネート、炭酸1,2ブチレン、炭酸シス2,3ブチレンおよび炭酸トランス2,3ブチレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、二炭酸エリトリトール、1,2-炭酸グリセロール、4-クロロ-1,3-ジオキソラン-2-オンおよび4,5-ジクロロ-1,3-ジオキソラン-2-オンからなる群から選択される。さらに好ましくは、環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、1,2-炭酸グリセロール、炭酸プロピレンおよび炭酸ビニレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、1,2-炭酸グリセロールおよび炭酸プロピレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチルおよび1,2-炭酸グリセロールからなる群から選択される。ある態様において、前記方法の工程iによる環式もしくは非環式の炭酸エステルは0.1M~2.0Mの濃度をもつ。好ましくは、環式もしくは非環式の炭酸エステルは、それぞれ0.1M~1.5M、または0.2M~1.0M、または少なくとも0.1、0.2、0.3もしくは0.4M、または多くとも2.0、1.7、1.5、1.3、1.0もしくは0.75Mの濃度をもつ。ある態様において、本発明による方法の工程iの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を含有する試薬は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるのに適した条件下で水溶液中に少なくとも2Mまで溶解できる。他の態様において、本発明による方法の工程iの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を含有する試薬は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるのに適した条件下で水溶液中に少なくとも1.5Mまで溶解でき、またはより好ましくは少なくとも1.0Mまで溶解できる。本発明による方法の工程iの試薬を得るために、炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を水に可溶化する方法は当業者に既知である。炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質は、25°Cの水に可溶性でなければならない。水溶液中に可溶化した炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質は、沈降または結晶化することなく4°Cで保存できなければならない。炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質それぞれと、アルカリ化剤とのモル比は、好ましくは1:3~3:1、より好ましくは1:2~2:1、より好ましくは1:1.5~1.5:1である。アルカリ化剤と炭酸水素塩およびまたは加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質とのモル比が反応性イオンOH-またはHCO3-の濃度に基づいて計算されることも、当業者に自明である。少なくとも2種類の異なる炭酸水素塩および/または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる異なる物質それぞれの混合物を本発明による方法に使用できることは、当業者に分かる。炭酸水素塩および/または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質の混合物と、アルカリ化剤とのモル比は、好ましくは1:3~3:1、より好ましくは1:2~2:1、より好ましくは1:1.5~1.5:1である。この理論に拘束されるのは望まないが、試薬組成物中に炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質が存在するとpHシフトが誘発される可能性は十分にある。試薬組成物中の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質の濃度が低いほど、前処理反応に際しての試薬混合物のpH低下がより遅くなる。試薬組成物中の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質の濃度が高いほど、前処理反応に際しての試薬混合物のpH低下がより速やかになる。アルカリ性緩衝条件下での炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質と還元剤との協奏作用のため、ビタミンD結合タンパク質の不可逆的な変性が達成され、これによりその後のビタミンD化合物の検出が容易になるとも思われる。ある態様において、前記方法による工程iiの還元剤は、2-メルカプトエタノール、2-メルカプトエチルアミン-HCl、TCEP、システイン-HCl、ジチオトレイトールDTT、N-メチルマレイミド、エルマン試薬および1,2-ジチオラン-3-カルボン酸からなる群から選択される。他の態様において、前記方法による工程iiの還元剤は、工程iiの還元剤がチオール基を含むことを特徴とする。他の態様において、前記方法による工程iiの還元剤は、2-メルカプトエタノール、2-メルカプトエチルアミン-HCl、TCEP、システイン-HClおよびジチオトレイトールDTTからなる群から選択される。前記方法による工程iiの還元剤は、ある態様において2mMから30mMまで、他の態様において3mMから20mMまで、他の態様において3.5mMから15mMまで、他の態様において4mMから10mMまでの濃度をもつ。アルカリ化剤は、アルカリ水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物すなわち水溶液中であってもよい。アルカリ化剤は、アルカリ水酸化物および/またはアルカリ土類金属水酸化物の混合物、すなわちNaOHとKOH、NaOHとLiOH、NaOHとCaOH2、KOHとCaOH2、KOHとLiOH、ならびに他の組合わせも含むことができる。アルカリ水酸化物は、アルカリ金属陽イオンとヒドロキシド陰イオンOH-から構成される一群の化学物質である。アルカリ水酸化物は、たとえばNaOH、KOH、LiOH、RbOHおよびCsOHである。アルカリ金属は、周期表の1族IUPAC方式を形成する一連の元素である:リチウムLi、ナトリウムNa、カリウムK、ルビジウムRb、セシウムCs、およびフランシウムFr。アルカリ土類金属水酸化物は、アルカリ土類金属陽イオンと2つのヒドロキシド陰イオンOH-から構成される一群の化学物質である。アルカリ土類金属は、周期表の2族IUPAC方式IIA族を構成する:ベリリウムBe、マグネシウムMg、カルシウムCa、ストロンチウムSr、バリウムBaおよびラジウムRa。ある態様において、前記方法による工程iiiのアルカリ化剤は、NaOH、KOH、CaOH2およびLiOHからなる群から選択される。他の態様において、前記方法による工程iiiのアルカリ化剤は、それぞれ0.1M~2.0M、または0.1M~1.5M、または0.2M~1.75M、または0.2M~1.0M、または少なくとも0.1、0.2、0.3もしくは0.4M、または多くとも2.0、1.7、1.5、1.3、1.0もしくは0.75Mの濃度をもつ。他の態様において、前記方法による工程iiiのアルカリ化剤は、NaOHおよびKOHからなる群から選択される。他の態様において、本発明による方法に用いるアルカリ化剤は、試料試薬i還元剤iiアルカリ化剤iiiの混合物中において、それぞれ0.1M~0.6M、または0.2M~0.5M、または少なくとも0.1もしくは0.2M、または多くとも0.6もしくは0.5Mの最終濃度をもつ。前記方法の他の態様において、工程i、iiおよびiiiそれぞれの3種類の試薬と被験試料との混合比は、好ましくは1:3~3:1である。ある態様において、前記方法による工程aの試料、工程iの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を含む試薬工程iiの還元剤工程iiiのアルカリ化剤は、いかなるピペッティング順序で添加してもよい。混合した時点で本発明の方法による工程bは他の態様において少なくとも10、12、15または20秒間、9.5~14のpHをもつことを特徴とするものであってもよく、さらに好ましくは工程bは混合した時点で少なくとも10、12、15または20秒間、10.5~14のpHをもつ。前記方法のある態様において、工程aの被験試料を、工程bで、工程iの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を含む試薬、工程iiの還元剤、工程iiiのアルカリ化剤と混合し、インキュベートする。インキュベーション工程bは必要な長さであってよい。インキュベーション時間は、たとえば15秒から24時間までである。ある態様において、本発明方法による工程bの混合物を1~60分間インキュベートし、これによりビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させる。前記方法による工程bの成分の濃度は、被験試料と共にインキュベートする際に、特定したpH範囲、ならびに炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質、還元剤、およびアルカリ化剤のそれぞれの目的濃度が、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるのに適切になるように、当業者が容易に選択できる。アルカリ性条件により、被験試料中に存在するビタミンD結合タンパク質が変性してビタミンDが解離する。アルカリ化剤の濃度は、前処理反応において試薬混合物=被験試料本発明による試薬組成物アルカリ化剤のpHを少なくともpH10.0、好ましくは少なくともpH10.5、好ましくは少なくとも11.0にまで高めるのに十分でなければならない。試薬混合物のpHは、被験試料本発明による試薬組成物アルカリ化剤を混合した時点で測定しなければならないことは、当業者に自明である。炭酸水素塩および/または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質が加水分解されるため、試薬混合物においてpHは低下するであろう図1および実施例1.5を参照。本明細書中で用いる用語試料は、インビトロ評価の目的のために個体から得られる生体試料を表わす。本発明の方法において、被験試料は、ある態様では液体試料である。試料は、本発明の他の態様においてはいずれかの体液を含むことができる。他の態様において、被験試料は血液、血清または血漿であり、血清または血漿が最も好ましい。他の態様において、液体試料を濾紙またはメンブレン上で乾燥させる。ある態様において、本発明に用いる試料は、個体から得られた試料のうちの一定部分を表わす。本発明は、他の態様において、ビタミンD化合物を測定するためのインビトロ方法であって、aビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させ、そしてb工程aで解離したビタミンD化合物を測定する工程を含む方法を含む。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物を測定するためのインビトロ方法であって、a目的とする試料中のビタミンD結合タンパク質に結合しているビタミンD化合物を解離させ、そしてb工程aで解離したビタミンD化合物を測定する工程を含む方法を含む。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物を測定するためのインビトロ方法であって、a被験試料を調製し、b工程aからの試料をi0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質を含有する試薬、ii還元剤、およびiiiアルカリ化剤と混合し、これによりビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させ、そしてc工程bで解離したビタミンD化合物を測定する工程を含む方法に関する。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物を測定するためのインビトロ方法であって、測定するビタミンD化合物が25-ヒドロキシビタミンD2、25-ヒドロキシビタミンD3、24,25-ジヒドロキシビタミンD2、24,25-ジヒドロキシビタミンD3、およびC3-エピ25-ヒドロキシビタミンDを含む群から選択される方法を含む。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物を測定するためのインビトロ方法であって、測定するビタミンD化合物が25-ヒドロキシビタミンD2、25-ヒドロキシビタミンD3、24,25-ジヒドロキシビタミンD2、および24,25-ジヒドロキシビタミンD3を含む群から選択される方法を含む。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物を測定するためのインビトロ方法であって、ビタミンD化合物25-ヒドロキシビタミンD2および/または25-ヒドロキシビタミンD3を測定する方法を含む。試薬組成物:1態様において本発明は、被験試料中のビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。1態様において本発明は、被験試料中のビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、0.1M~1.5Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、0.2M~1.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、少なくとも0.1、0.2、0.3もしくは0.4Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、多くとも2.0、1.7、1.5、1.3、1.0もしくは0.75Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。好ましくは、試薬組成物はそれぞれ0.1M~1.5M、または0.2M~1.0M、または少なくとも0.1、0.2、0.3もしくは0.4M、または多くとも2.0、1.7、1.5、1.3、1.0もしくは0.75Mの濃度の炭酸水素塩、および還元剤を含有する。他の好ましい態様において、試薬組成物中の炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸水素マグネシウムからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素アンモニウムからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウムおよび/または炭酸水素カリウムである。他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、0.1M~2.0Mの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。好ましくは、試薬組成物はそれぞれ0.1M~1.5M、または0.2M~1.0M、または少なくとも0.1、0.2、0.3もしくは0.4M、または多くとも2.0、1.7、1.5、1.3、1.0もしくは0.75Mの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質、および還元剤を含有する。他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、0.1M~2.0Mの濃度の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。好ましくは、試薬組成物はそれぞれ0.1M~1.5M、または0.2M~1.0M、または少なくとも0.1、0.2、0.3もしくは0.4M、または多くとも2.0、1.7、1.5、1.3、1.0もしくは0.75Mの濃度の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体、および還元剤を含有する。他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、0.1M~2.0Mの濃度の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのハロゲン化誘導体、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。好ましくは、試薬組成物はそれぞれ0.1M~1.5M、または0.2M~1.0M、または少なくとも0.1、0.2、0.3もしくは0.4M、または多くとも2.0、1.7、1.5、1.3、1.0もしくは0.75Mの濃度の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのハロゲン化誘導体、および還元剤を含有する。他の好ましい態様において、試薬組成物中の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、二炭酸エリトリトール、1,2-炭酸グリセロール、4-クロロ-1,3-ジオキソラン-2-オン、4,5-ジクロロ-1,3-ジオキソラン-2-オン、2,5-ジオキサヘキサンジ酸ジメチルエステル、ピロカーボネート、炭酸1,2ブチレン、炭酸シス2,3ブチレンおよび炭酸トランス2,3ブチレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、二炭酸エリトリトール、1,2-炭酸グリセロール、4-クロロ-1,3-ジオキソラン-2-オン、および4,5-ジクロロ-1,3-ジオキソラン-2-オンからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、1,2-炭酸グリセロール、炭酸プロピレンおよび炭酸ビニレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、1,2-炭酸グリセロールおよび炭酸プロピレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチルおよび1,2-炭酸グリセロールからなる群から選択される。本発明は、他の態様において、還元剤が2-メルカプトエタノール、2-メルカプトエチルアミン-HCl、TCEP、システイン-HCl、ジチオトレイトールDTT、N-メチルマレイミド、エルマン試薬および1,2-ジチオラン-3-カルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする試薬組成物に関する。他の態様において本発明は、還元剤がチオール基を含むことを特徴とする試薬組成物に関する。他の態様において本発明は、還元剤が2-メルカプトエタノール、2-メルカプトエチルアミン-HCl、TCEP、システイン-HClおよびジチオトレイトールDTTからなる群から選択されることを特徴とする試薬組成物に関する。還元剤の濃度は、本発明のある態様において2mMから30mMまで、他の態様において3mMから20mMまで、他の態様において3.5mMから15mMまで、他の態様において4mMから10mMまでである。還元剤の能力が官能基、すなわち還元基の存在に依存することは当業者に既知である。したがって、適切な濃度の還元剤をそれの活性還元基の数を考慮に入れて選択することは当業者に知られている。ビタミンD結合タンパク質をコードする遺伝子は、ヒト集団において種々の対立遺伝子の形態でみられる。これらの対立遺伝子がコードするポリペプチドは生化学的に異なること、すなわちそれらが異なる表現型を生じることは知られている。これらの生化学的相異はビタミンD化合物の結合および解離にも影響を及ぼす。本発明による試薬組成物は、ビタミンD結合タンパク質の表現型とは独立してビタミンD化合物を解離させるのに適している。したがって、本発明の好ましい態様は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための、本発明による試薬組成物の使用である。本発明による試薬組成物は、1態様において、ビタミンD結合タンパク質の表現型とは無関係に独立して被験試料中のビタミンD結合タンパク質からビタミンD化合物を解離させるために使用される。ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させる目的のために、本発明による試薬組成物を被験試料、たとえば血清または血漿、およびアルカリ化剤と混合する。試薬混合物:本明細書中で以下において用いる用語試薬混合物は、被験試料、本発明による試薬組成物、およびアルカリ化剤を含む。他の態様において試薬混合物は、アルカリ化剤がNaOH、KOH、CaOH2およびLiOHからなる群から選択されることを特徴とする。他の態様において試薬混合物は、用いるアルカリ化剤がそれぞれ0.1M~2.0M、または0.1M~1.5M、または0.2M~1.75M、または0.2M~1.0M、または少なくとも0.1、0.2、0.3もしくは0.4M、または多くとも2.0、1.7、1.5、1.3、1.0もしくは0.75Mの濃度をもつことを特徴とする。他の態様において試薬混合物は、アルカリ化剤がNaOHおよびKOHからなる群から選択されることを特徴とする。他の態様において、本発明による方法に用いるアルカリ化剤は、試薬混合物中においてそれぞれ0.1M~0.6M、または0.2M~0.5M、または少なくとも0.1もしくは0.2M、または多くとも0.6もしくは0.5Mの最終濃度をもつ。試薬組成物およびアルカリ化剤と被験試料との混合比は、ある態様において好ましくは1:3~3:1である。被験試料、開示した試薬組成物およびアルカリ化剤をいずれかのピペッティング順序で添加して、試薬混合物を調製することができる。混合した時点で試薬混合物は他の態様においてそれが少なくとも10、12、15または20秒間、9.5~14のpHをもつことを特徴とし、さらに好ましくは試薬混合物は混合した時点で少なくとも10、12、15または20秒間、10.5~14のpHをもつ。被験試料を、本発明による試薬組成物およびアルカリ化剤と混合し、そしてインキュベートする。この工程を前処理工程とも呼ぶことができる。前処理工程は、必要な長さで実施できる。インキュベーション時間は、たとえば15秒~24時間である。試薬混合物を1態様において1~60分間インキュベートして、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させる。試薬混合物を他の態様において4~10分間インキュベートして、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させる。試薬混合物およびそれの成分の濃度は、被験試料と共にインキュベートする際に、特定したpH範囲、ならびに炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質、還元剤、およびアルカリ化剤のそれぞれの目的濃度が、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるのに適切になるように、当業者が容易に選択できる。試薬混合物は、ある態様において、本発明の試薬組成物について記載した炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質の、好ましい物質を同様に含む。ビタミンD化合物の検出は、好ましくは25-ヒドロキシビタミンD2、25-ヒドロキシビタミンD3、24,25-ジヒドロキシビタミンD2、24,25-ジヒドロキシビタミンD3、およびC3-エピ25-ヒドロキシビタミンDを含む群から選択される少なくとも1種類のビタミンD化合物が検出されるように実施される。ビタミンD化合物の特異的検出において、前処理工程の後にさらにインキュベーション工程を伴う。試薬混合物中に存在する還元剤の残りは、非特異的タンパク質、好ましくはたとえばヒト血清アルブミンHSAの添加により遮蔽することができる。この非特異的タンパク質は別個に添加してもよく、あるいは検出剤をも含む溶液に単純に含有させてもよい。還元剤の残留還元能を遮蔽することにより、ビタミンD化合物に対するタンパク質系の特異的結合剤を用いて支障なくビタミンD化合物を検出することができる。当業者に認識されるように、特異的結合剤を含む溶液はpH緩衝剤系を含有し、これによって、特異的結合剤を含有する溶液を試薬混合物に添加した後、pHはビタミンD化合物が特異的結合剤へ結合するための前提条件のものであることが保証されるであろう。ビタミンD化合物への特異的結合が行なわれる限り、必ず必要な緩衝剤系も最終pHも決定的ではない。ビタミンD結合タンパク質を特異的結合剤として用いる場合、このインキュベーション工程中のpHは好ましくはpH6.0~pH9.0に選択される。抗体をビタミンD化合物の特異的結合剤として用いる場合、このインキュベーション工程中のpHは好ましくはpH5.5~pH7.5であろう。特異的結合剤を含む溶液は、好ましくは20mM~400mMの緩衝剤系を含有する。同様に好ましくは、緩衝剤は50mM~350mMまたは100mM~300mMのモル濃度をもつ。ビタミンD化合物を検出するためのインビトロ方法は、-本発明の開示に基づいて-多様な様式で実施できる。原則として、1種類以上のビタミンD化合物に結合するすべてのタンパク質系結合パートナー、たとえば特異的に結合するポリペプチドを特異的結合剤として使用できる。特異的結合剤は抗体またはビタミンD結合タンパク質そのものであってもよい。多くの市販検査システムがアビジンまたはストレプトアビジンSAでコートした固相、たとえばSA-コートしたマイクロタイタープレートまたはSA-コートしたラテックスの使用に基づく。被分析体のビオチニル化誘導体を、検査操作の前または途中で、たとえばこのSA固相に結合させる。ビタミンD化合物を検出する場合、被分析体のこのビオチニル化誘導体化合物は、たとえばビオチニル化25-ヒドロキシビタミンD2および/またはビオチニル化25-ヒドロキシビタミンD3であってもよい。本発明の1態様において、インビトロ検出方法を競合アッセイとして実施する。そのような競合検査法において、一定量で検査に添加したビタミンD化合物誘導体は、特異的結合剤の結合部位に対して、試料に由来する対応するビタミンD化合物と競合する。試料中に多量のビタミンD化合物が存在するほど、検出信号はより小さくなる。1態様において、ビタミンD化合物の誘導体はビオチニル化ビタミンD化合物である。他の態様において、ビオチニル化ビタミンD化合物はビオチニル化25-ヒドロキシビタミンD2および/またはビオチニル化25-ヒドロキシビタミンD3である。他の態様において、ビオチニル化ビタミンD化合物はビオチニル化25-ヒドロキシビタミンD2である。前記に述べたように、本発明に開示する検出方法に使用するのに好ましい特異的結合剤は、抗体およびビタミンD結合タンパク質である。ビタミンD結合タンパク質を競合アッセイ方式に用いると、それは結合について1種類以上のビオチニル化ビタミンD化合物誘導体と競合するすべてのビタミンD化合物を統合的に測定するであろう。1態様において、ビタミンD結合タンパク質は検出可能に標識化、たとえばルテニウム化されるであろう。使用:1態様において本発明は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるために、試薬組成物をアルカリ化剤と一緒に使用することに関する。他の態様において本発明は、被験試料中に存在すると予想されるビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるために、試薬組成物をアルカリ化剤と一緒に使用することに関する。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物を検出する方法においてビタミンD化合物を解離させるために、試薬組成物をアルカリ化剤と一緒に使用することに関する。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物を検出する方法において被験試料中に存在すると予想されるビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるために、0.1M~2.0Mの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質および2mM~30mMの還元剤を含有する試薬組成物を、1M~1.5Mのアルカリ化剤溶液と一緒に使用することに関する。試薬組成物の使用は、ある態様において、本発明の試薬組成物について記載した炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質の、好ましい物質を同様に含む。キット:1態様において本発明は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるためのキットであって、0.1M~2.0Mの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質および還元剤を含む試薬組成物を含むキットに関する。1態様において本発明は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から検出するためのキットであって、0.1M~2.0Mの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質および還元剤を含む試薬組成物、ならびにアルカリ化剤を含むことを特徴とするキットに関する。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から検出するためのキットであって、0.1M~2.0Mの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質および2mM~30mMの還元剤を含む試薬組成物、ならびにアルカリ化剤を含むことを特徴とするキットに関する。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から検出するためのキットであって、検出成分のほかに、0.1M~2.0Mの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質および2mM~30mMの還元剤を含む試薬組成物、ならびにアルカリ化剤の1M~1.5M溶液を含むことを特徴とするキットに関する。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物を検出するためのキットであって、特異的結合剤を含む溶液のほかに、炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質および還元剤を含む試薬組成物、ならびにアルカリ化剤を含むキットに関する。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物を検出するためのキットであって、特異的結合剤を含む溶液のほかに、0.1M~2.0Mの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質および2mM~30mMの還元剤を含む試薬組成物、ならびにアルカリ化剤の1M~1.5M溶液を含むことを特徴とするキットに関する。他の態様において本発明は、ビタミンD化合物を検出するためのキットであって、特異的結合剤を含む溶液のほかに、0.1M~2.0Mの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質ならびに2mM~30mMの2-メルカプトエタノール、2-メルカプトエチルアミン-HCl、TCEP、システイン-HClおよびジチオトレイトールDTTからなる群から選択される還元剤を含む試薬組成物、ならびにNaOH、KOH、CaOH2およびLiOHからなる群から選択されるアルカリ化剤の1M~1.5M溶液を含むことを特徴とするキットに関する。キットは、ある態様において、本発明の試薬組成物について記載した炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオンHCO3-を放出できる物質の、好ましい物質を同様に含む。本発明による試薬組成物は、ビタミンD化合物の自動検査に使用するのに適切であることが証明された。本発明は好ましくは、特にビタミンD化合物の測定のための検査において、ビタミンD化合物をビタミンD結合タンパク質から解離させるための本発明による試薬組成物の使用に関する。ビタミンD化合物の検査は、好ましくは完全自動化される。この場合の完全自動化は、実験者は被験試料とビタミンD化合物の測定のための全成分を含有する試薬パックとを自動分析計に乗せるだけでよく、以後のすべての工程が分析計によって自動的に実施されることを意味する。完全自動検査は、RocheDiagnosticsからのElecsys登録商標で実施するのが特に好ましい。本発明による試薬組成物は、他の態様において、25-ヒドロキシビタミンD2、25-ヒドロキシビタミンD3、24,25-ジヒドロキシビタミンD2、24,25-ジヒドロキシビタミンD3、およびC3-エピ25-ヒドロキシビタミンDからなる群から選択されるビタミンD化合物を検出するためのインビトロ方法に使用される。既に前記に述べたように、25-ヒドロキシビタミンD2および25-ヒドロキシビタミンD3が診断に特に関連する形態のビタミンDである。本発明によるインビトロ方法において、25-ヒドロキシビタミンD2もしくは25-ヒドロキシビタミンD3または両方を25-ヒドロキシビタミンD2または25-ヒドロキシビタミンD3に対する特異的抗体で特異的に検出することも好ましい態様である。本発明を以下の実施例および図面によってさらに説明する。実際の保護範囲は本発明の特許請求の範囲から生じる。実施例125-ヒドロキシビタミンDの検出のためのアッセイ法市販のアッセイ法を製造業者の指示に従って使用する。25-ヒドロキシビタミンDの測定を、文献の記載に従って、HPLC25OHビタミンD3の検査、ImmundiagnostikCompany,ベンスハイム,注文No.KC3400により、またはLC-MS/MS14151417により実施する。新規検査法のための成分および全般的検査法を以下に記載する:1.1ヒドロキシビタミンD2-3-2’-シアノエチルエーテルの合成20.6mg50μmolの25-ヒドロキシビタミンD2FlukaNo.17937を、内部温度計付き25ml三口丸底フラスコ内で10mlの乾燥アセトニトリルにアルゴン雰囲気下で溶解する。1.5mlのtert.-ブタノール/アセトニトリル9:1を溶液に添加し、氷浴内で6°Cに冷却する。次いで820μlのアクリロニトリル溶液1.0mlアセトニトリル中の86μlアクリロニトリルを添加し、6°Cで15分間撹拌する。次いで205μlの水素化カリウム溶液25mgのKH,0.5mlのtert.-ブタノール/アセトニトリル9:1中を添加する。短時間の凝集が起きた後に透明な溶液が得られる。反応溶液を6°Cでさらに45分間、続いて4°Cで60分間、撹拌する。続いて、反応溶液を10mlのメチル-tert.-ブチルエーテルで希釈し、それぞれ10mlのH2Oで2回洗浄する。有機相を約1gの無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、G3ガラスフリットでろ過し、ロータリーエバポレーターで蒸発させる。それを高真空下で乾燥させると、約55mgの質量をもつ粘稠な透明残留物が生成する。1.2ヒドロキシビタミンD2-3-3-アミノプロピルエーテルの合成上記で得たニトリル全体を15mlのジエチルエーテルに溶解し、水素化リチウム7.5mgのジエチルエーテル7.5ml中における懸濁液と、撹拌しながら混合する。反応混合物を室温で1時間撹拌する。その後、水素化アルミニウムリチウム38.4のジエチルエーテル6.6ml中における懸濁液を添加する。その結果、混合物が強く混濁する。反応混合物を室温でさらに1時間撹拌し、次いで反応混合物を氷浴内で0~5°Cに冷却し、35mlの水を慎重に添加する。6.6mlの10M水酸化カリウム溶液の添加によりpHを強塩基性にする。それをそれぞれ65mlのメチル-tert.-ブチルエーテルで3回抽出する。有機相を合わせて、約5gの無水硫酸ナトリウムにより乾燥させ、濾過し、室温でロータリーエバポレーターにより蒸発させる。残留物をオイルポンプで一定質量になるまで乾燥させる。粗生成物を5mlのDMSOおよび3.0mlのアセトニトリルに溶解し、分取HPLCにより精製する溶離剤A=Millipore-H2O0.1トリフルオロ酢酸;溶離剤B=95アセトニトリル5Millipore-H2O0.1TFA;勾配:50Bから100Bまで100分間で流速:30ml/分温度:室温カラム寸法:直径=5.0cm;長さ=25cmカラム材料:VydacC18/300Å/15~20μm検出波長:226nm分析用HPLCVydacC18/300Å/5μm;4.6×250mmによってその生成物含量が85より多い画分を丸底フラスコにプールし、凍結乾燥させる。13.7mg収率:58が無色の凍結乾燥物として得られる。1.3ヒドロキシビタミンD2-3-3’-N-ヘミスベリルアミノプロピル-エーテル-ビオチン-ベータ-Ala-Glu-Glu-Lysイプシロンコンジュゲート=Ag-Biの合成13.7mg25μmolのヒドロキシビタミンD2-3-3’-アミノプロピルエーテルを3.5mlのDMSOに溶解し、28.7mg30μmolのビオチン-ベータ-Ala-Glu-Glu-Lysepison-ヘミ-スベレート-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルRocheAppliedScience、No.11866656および12.5μlのトリエチルアミンを添加し、それを室温で一夜撹拌する。反応溶液を4.5mlのDMSOで希釈し、0.45μmのマイクロフィルターにより濾過し、続いて分取HPLC条件は実施例2.3bを参照により精製する。分析用HPLCによって85より多量の生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥させる。9.8収率:30の精製ビオチンコンジュゲートが得られる。1.4ビタミンD結合タンパク質のルテニウム化およびゲル濾過クロマトグラフィーによる精製ビタミンD結合タンパク質を100mMリン酸カリウム/150mM塩化ナトリウム緩衝液pH8.5へ移し、タンパク質濃度を5~10mg/mlに調整する。ルテニウム化試薬ルテニウムIIトリスビピリジル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルをDMSOに溶解し、抗体溶液に3対1のモル比で添加する。45分間の反応時間後、1-リジンの添加により反応を停止し、ルテニウム化ビタミンD結合タンパク質=DBP-RuをSuperdex200カラムでのゲル濾過によって精製する。1.5アッセイに際しての検査法被験試料をRocheDiagnosticscompanyからのElecsys登録商標システムにより測定する。被験試料を試薬組成物Aおよびアルカリ化剤Bと混合することにより、試薬混合物を調製する。この例では、15μlの試料を15μlの試薬組成物Aおよび10μlのアルカリ化剤Bと混合した試薬混合物を調製する。この試薬混合物を9分間インキュベートする。次の工程で70μlの検出試薬溶液Cを試薬混合物に添加し、さらに9分間インキュベートする。最終工程で、ビオチニル化wall抗原溶液D60μl、および30μlのストレプトアビジンSA30μlコートした磁性ポリスチレン粒子懸濁液Eを添加する。さらに9分間のインキュベーション後、結合したルテニウム化ビタミンD結合タンパク質の量を常法により測定する参照:図1、2、3、4a、4b。試薬組成物Aは下記のものを含有する:10mMNaOH4mMEDTA6.7mMジチオトレイトールDTT0.5M炭酸エチレンECpH5.5アルカリ化剤Bは下記のものを含有する:1.375MNaOHルテニウム化ビタミンD結合タンパク質DBP-Ruを含む溶液Cは下記のものを含有する:0.2Mビス-トリス-プロパンpH7.52.5ヒト血清アルブミンHSA50mMNaCl1マンニット0.1オキシピリオン0.12μg/mLDBP-Ruビオチニル化wall抗原を含む溶液Dは下記のものを含有する:0.2Mビス-トリス-プロパンpH8.60.5tween-20溶液0.1オキシピリオン30ng/mlビオチン0.0108μg/mLAg-Bi実施例1.1からSA-コートしたラテックス粒子を含む懸濁液Eは下記のものを含有する:0.72mg/mlSA-コートした磁性ポリスチレン粒子;470ng/mlの結合容量をもつ。実施例2炭酸エステルと金属塩、リン酸緩衝液および炭酸塩との比較被験試料をRocheDiagnosticscompanyからのElecsys登録商標システムにより測定する。全アッセイ操作は実施例1.5に示されている。実施例1.5と異なり、試薬組成物Aはそれぞれ0.5M炭酸エチレンEC、0.5MNa2CO3、0.5MNaClまたは0.5MNaH2PO4を含有する。試薬組成物A:10mMNaOH4mMEDTA6.7mMDTT0.5MEC、Na2CO3、NaClまたはNaH2PO4のいずれか。対照として、10mMNaOH、4mMEDTA、6.7mMDTTを含有する試薬組成物Aを用いた。結果を図5に示す。アルカリ前処理試薬混合物に際して存在する炭酸エステル0.5MEC◆は、競合アッセイにおいて信号増強効果をもたらす。特に、ECを含まない検査□と比較して信号動態が改善される。塩0、5MNaCl、◇は効果を示さない。0.5MNa2CO3の添加○または0.5MNaH2PO4の添加▲は信号に対するわずかな効果を示す。実施例3炭酸エステルを含む/含まないアルカリ前処理被験試料をRocheDiagnosticscompanyからのElecsys登録商標システムにより測定する。アッセイ操作は実施例1.5に示されている。実施例1.5と異なり、下記のいずれかを含有する3種類の異なる試薬組成物を調製した:◆:10mMNaOH、4mMEDTA、6.7mMDTT、0.5MEC実施例1.5を参照または▲:10mMNaOH、4mMEDTA、6.7mMDTTまたは□:10mMNaOH、4mMEDTA。試料それぞれ◆試薬組成物Aアルカリ化剤B;実施例1.5に記載、▲、または□のいずれか=試薬混合物の4分間の前処理インキュベーションの後で溶液Cの添加前に、トリス-プロパンpH6.3の添加により試薬混合物のpHをpH9に調整した図6。アルカリ前処理試薬混合物に際して存在する炭酸エステルECは、競合アッセイにおいて信号増強効果をもたらす。特に、ECを含まない検査と比較して信号動態が改善される。実施例4炭酸エチレン-対-炭酸ジメチル被験試料をRocheDiagnosticscompanyからのElecsys登録商標システムにより測定する。アッセイ操作は実施例1.5に示されている。実施例1.5と異なり、下記のいずれかを含有する2種類の異なる試薬組成物Aを調製した:○:10mMNaOH、4mMEDTA、6.7mMDTT、0.5MEC1.5を参照または◆:10mMNaOH、4mMEDTA、6.7mMDTT、0.5M炭酸ジメチル炭酸エチレンまたは炭酸ジメチルの両方の炭酸エステルが、それぞれ同じアッセイ性能を示す図7。実施例5炭酸エチレンの加水分解生成物の効果被験試料をRocheDiagnosticscompanyからのElecsys登録商標システムにより測定する。アッセイ操作は実施例1.5に示されている。実施例1.5と異なり、下記のいずれかを含有する5種類の異なる試薬組成物Aを調製した:◆:10mMNaOH、4mMEDTA、6.7mMDTT、0.5MEC1.5を参照または○:10mMNaOH、4mMEDTA、6.7mMDTT、0.5MNaHCO3または▲:10mMNaOH、4mMEDTA、6.7mMDTT、0.5MNaHCO30.5Mエチレングリコール□:10mMNaOH、4mMEDTA、6.7mMDTTECのアルカリ加水分解生成物はエチレングリコールであり、これはアッセイに対して影響をもたない▲。炭酸水素塩NaHCO3も信号増強効果を示すが、炭酸エステルほど大きくはない図8。実施例6炭酸エチレン-対-1,2炭酸グリセロール被験試料をRocheDiagnosticscompanyからのElecsys登録商標システムにより測定する。アッセイ操作は実施例1.5に示されている。実施例1.5と異なり、下記のいずれかを含有する2種類の異なる試薬組成物Aを調製した:◆:10mMNaOH、4mMEDTA、6.7mMDTT、0.5MEC1.5を参照または○:10mMNaOH、4mMEDTA、6.7mMDTT、0.5M1,2炭酸グリセロール炭酸エチレンまたは1,2炭酸グリセロールの両方の炭酸エステルが、それぞれ同じアッセイ性能を示す図9。"