"式A:式中、R1はH、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル又はC2~C6アルキニルであり、該アルキル、アルケニル又はアルキニルは必要に応じてSR5、NR5R5A又はOR5によって置換され、R2はH、F、Cl、Br、I、OR6又はNHR7であり、R3はH、Cl、Br、F、I、OR8又はNHR9であり、R4はH、Cl、Br、F、I、CH3、SCH2COOH、SR10、SeR11、CH2R12、C≡CR13、CH=CHR14又はSCH2nC=OR17であり、X1は-S-、-Se-、-CH2-、-CH=CH-又は-C≡C-であり、X2は単結合、C1~C4アルキレン、C2~C4アルケニレン又はC2~C4アルキニレンであり、X3は-NHC=O-、-C=ONH-、-NR15-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CH2-、-O-、-S-であり、Zはから選択されるか、又は、ZはC6~C10アリール、5員~7員のヘテロアリール、アリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキルであり、該アリール及びヘテロアリールは必要に応じて1個~3個のR0基で置換され、R0はF、Cl、Br、I、OH、NH2、NO2、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル又はC2~C6アルキニルであり、R5、R5A、R6、R7、R8、R9、R15は各々独立してH、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル又はC2~C6アルキニルから選択され、R10、R11、R12、R13及びR14は各々独立してC1~C6アルキル、C2~C6アルケニル又はC2~C6アルキニルから選択され、R16はOH、NH2、N3又はOCH2CH≡CHであり、R17はOH又はNHCH2pArであり、ここでArは必要に応じてBr、C≡CHによって置換されたアリール基であり、mは0又は1であり、nは1、2又は3であり、pは1、2又は3であるの化合物、及びその互変異性体、立体異性体、立体異性体混合物又は薬学的に許容される塩形態。式Ia:である、請求項1に記載の化合物。X3が-O-又は-NH-である、請求項2に記載の化合物。式Ib:である、請求項1に記載の化合物。X2が-CH2-である、請求項1~4のいずれか一項に記載に記載の化合物。R16がNH2又はOHである、請求項1~5のいずれか一項に記載に記載の化合物。R2がHである、請求項1~6のいずれか一項に記載に記載の化合物。R1がHである、請求項1~7のいずれか一項に記載に記載の化合物。R3がHである、請求項1~8のいずれか一項に記載に記載の化合物。R4がHである、請求項1~9のいずれか一項に記載に記載の化合物。5’-アミノ-5’-デオキシアデノシン-8-イル-チオ-N-[5’-アミノ-5’-デオキシアデノシンメチル]アセトアミド、8-[3-N-5’-デオキシアデノシルアミノプロプ-1-イニル]アデノシン、及び、8-[3-5’-デオキシアデノシルメトキシプロプ-1-イニル]アデノシン、から選択される、請求項1に記載の化合物。請求項1~11のいずれか一項に記載の式Aの化合物を1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤と混合して含む医薬組成物。細菌感染症の予防及び/又は治療において使用される請求項1~11のいずれか一項に記載の式Aの化合物。請求項2に記載の式Iaの化合物を調製する方法であって、i.式IIaの化合物と式IIIaの化合物とをカップリングする工程と、式中、R1、R2、R3、R4、X2及びX3は上記に規定したとおりであり、HalはBr、I又はClであり、Zは上記に規定したとおりであり、ヒドロキシル基は存在する場合、ヒドロキシル保護基Prによって保護されるii.得られた化合物のヒドロキシル基を脱保護する工程と、必要に応じて、iii.得られた式Iaの化合物を回収する工程と、を含む、方法。請求項4に記載の式Ibの化合物を調製する方法であって、i.式IIbの化合物と式IIIbの化合物とをカップリングする工程と、式中、R1、R2、R3、R4、X2、X3は上記に規定したとおりであり、R17はOR18又はHalであり、R18はH、C1~C6アルキルであるか、又はC=OOR18が活性化エステルを形成するようなものであり、Zは上記に規定したとおりであり、ヒドロキシル基は存在する場合、ヒドロキシル保護基によって保護されるii.得られた生成物のヒドロキシル基を脱保護する工程と、必要に応じて、iii.得られた式Ibの化合物を回収する工程と、を含む、方法。検出可能な標識とカップリングした請求項1~11のいずれか一項に記載の式Aの化合物を含む化学プローブ。NADキナーゼ阻害剤のinvitroスクリーニングのための請求項16に記載の化学プローブの使用。NADキナーゼを阻害する分子をスクリーニングする方法であって、i.NADキナーゼと、請求項16に記載の化学プローブとをスクリーニング対象の分子とともに接触させる工程と、ii.前記NADキナーゼに結合した又は結合していない化学プローブの量を決定する工程と、iii.それによりスクリーニングした分子が前記NADキナーゼの阻害剤であるかを推定する工程と、を含む、方法。実施例I.化学合成A.概要合成のための試薬及び溶媒は商業供給業者から入手し、更に精製することなく使用した。標準のヌクレオシド及びヌクレオチドは商業供給業者から入手した。5’-メチルチオ-5’-デオキシアデノシンMTA、1は市販のものであった。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲル60Merck及び指定の溶媒混合物を用いて行った。分取HPLC及び分析HPLCは、Agilentのシステム1100シリーズで4.0ml/分又は1ml/分の流量、及び20mMトリエチルアンモニウムアセテートバッファーTEAApH7.0中のCH3CNの線形勾配で、C18逆相カラムKromasil、5μ100Åを用いて20分かけて行った。1HNMRスペクトル及び13CNMRスペクトルは、BrukerのAvance400分光計で、それぞれ400.13MHz及び100.62MHzで作動させて記録した。化学シフトはppmδで示し、カップリング定数Jはヘルツで報告し、通常の略語を使用する。高分解能質量スペクトルは、WatersのQ-TOFマイクロMS装置で0.1ギ酸を含むアセトニトリル/水の移動相を用いて記録した。B.モノマーブロックの合成5’-ブロモ-5’-デオキシアデノシン2をアデノシンの直接ハロゲン化[12]によって合成した。5’-フルオロ-5’-デオキシアデノシン3[13]及び5’-アジド-5’-デオキシアデノシン6を、2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシンから出発して調製した。5’-アミノ-5’-デオキシアデノシン7を、5’-アジド-5’-デオキシアデノシン6の接触水素化によって得た。8-ブロモヌクレオシド8及び9を、6及び7を無水DMF中でNBSと反応させることによって得た。5’-O-プロパルギル誘導体4を、報告されている手順[14]に従って、臭化プロパルギルをNaHの存在下でN6-ベンゾイル-2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシンと反応させることによって得て、続いて保護基を除去した。5’-N-プロパルギルアミノ-5’-デオキシアデノシン5スキーム1:1NH2NH2H2O、無水EtOH、80°C、90分;2臭化プロパルギル、DIEA、DMF、0°C、18時間;380ギ酸、30°C、一晩。化合物5の合成の概略をスキーム1に示す。アミノ12を、Kolb及び共同研究者らの方法[15]に従って2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシンからフタルイミドアデニレート11を介して二段階で合成した。無水DMF8mL中の120.31g、0.8mmolの溶液に、臭化プロパルギルトルエン中801.1当量及びDIEA4当量を0°Cで添加した。4°Cで一晩撹拌した後、反応混合物を蒸発乾固し、フラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2/MeOH、9/1によって精製して、130.18g、65を得た。1390mg、0.26mmolを30°Cで一晩、水3mL中の80ギ酸で処理して、フラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2/MeOH/NH4OH、90/10/1による精製後に568mg、85を得た。1HNMRMeODδ2.73t,1H,CH、3.10d,2H,H5’及びH5’、3.53t,2H,NCH2、4.24m,1H,H4’、4.34t,1H,H3’、4.87t,1H,H2’、5.98d,1H,H1’,J=4.4Hz、8.25s,1H,H2、8.29s,1H,H8;13CNMRMeODδ37.17NCH2、49.85C5’、71.95C3’、72.60CH、73.20C2’、79.90Cq、83.48C4’、89.51C1’、119.48C5、140.63C8、149.06C4、152.44C2、155.96C6;HRMSESI-TOFm/zC13H16N6O3MHの計算値305.1362;実測値305.1348。8-カルボキシメチルチオ-5’-アジド-5’-デオキシアデノシン10無水DMF2mL中のチオグリコール酸0.2mmol及びNaH0.4mmol、油中60の溶液を10分間撹拌した後、DMF1mL中の8-ブロモ-5’-アジド-5’-デオキシアデノシン850mg、0.13mmolを0°Cで添加した。室温で8時間後、更にDMF中のチオグリコレート0.2mmolを添加した。一晩撹拌した後、反応混合物を濃縮乾固し、残留物を逆相HPLC20分かけてTEAA中10→30のACNによって精製して、1028mg、56を得た。UVλmax279nm;HRMSESI-TOFm/zC12H14N8O5SMHの計算値383.0886;実測値383.0890。C.リガンド17、リガンド19及びリガンド21の合成5’-アミノ-5’-デオキシアデノシン-8-イル-チオ-N-[5’-アミノ-5’-デオキシアデノシンメチル]アセトアミド17スキーム2:1NBS、DMF、室温、2日;2チオグリコール酸、NaH、DMF、室温、18時間;312、PyBOP、DIEA、DMF、室温、18時間;4NH2NH2H2O、80°C、90分;次いで80ギ酸、30°C、5時間。二重リガンド17の合成の概略をスキーム2に示す。フタルイミドアデニレート114とNBS2当量とを無水DMF中、室温で2日間反応させて、フラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2/MeOH、95/5による精製後に14を収率40で得た。無水DMF10mL中のチオグリコール酸2mmol及びNaH油中60、4mmolの撹拌溶液に、DMF1mL中の化合物140.51g、1mmolを添加した。室温で一晩撹拌した後、反応混合物を濃縮乾固した。残留物を水に取り、AcOEtで抽出した3回。有機層を乾燥させ、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2/MeOHによって精製して、150.27g、51を得た。無水DMF2mL中の化合物1529mg及び5’-アミノ-2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシン1222mg、1.3当量に、PyPOB29mg、1当量及びDIEA3当量を添加した。室温で一晩撹拌した後、反応混合物を濃縮乾固した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2/MeOH、95/5によって精製して、1638mg、85を得た。化合物1634mgを無水エタノール2mL中のヒドラジン水和物0.02mL、16当量で処理した。80°Cで90分後、反応を終了させ、溶媒を蒸発除去した。残留物を水に取り、酢酸をpHが4となるまで添加した後、反応混合物を凍結乾燥した。粗生成物30mgを30°Cで5時間、80ギ酸水溶液1.5mLで処理した。反応混合物をアンモニア水の添加によって中和した後、凍結乾燥した。逆相HPLC20分かけてTEAA中5→40のACNによる精製によって、化合物1710mg、二段階で38を得た。Rt20分かけてTEAA中5→40のACN5.1分;1HNMRDMSO-d6δ:2.82m,2H,H5’a及びH5’’a、3.47m,2H,H5’b及びH5’’b、3.88m,1H,H4’a、4.01m,1H,H4’b、4.12m,3H,H3’b及びCH2、4.21dd,2H,H3’a、4.71t,1H,H2’b、5.04t,1H,H2’a、5.77d,1H,H1’a,J=6.2Hz、5.87d,1H,H1’b,J=6.0Hz、7.07bs,2H,NH2、7.28bs,2H,NH2、8.08s,1H,H2、8.28s,1H,H2、8.33s,1H,H8、8.63bs,1H,NH;13CNMRDMSO-d6δ:36.61CH2、41.97C5’a、44.11C5’b、70.75CH2、71.26C3’b、71.47C2’b、71.70C3’a、73.15C2’a、83.77C4’a、86.48C4’b、88.64C1’a、89.05C1’b、119.71及び119.99C5、140.87CH8、148.81、149.65及び151.69C8,C4、152.17及び153.15C2、154.73及び156.63C6、167.47CO;UVλmax287nm;HRMSESI-TOFm/zC22H29N12O7SMHの計算値604.2030;実測値604.2012。スキーム3:1NH2NH2H2O、無水EtOH、80°C、90分;2臭化プロパルギル、DIEA、DMF、4°C、18時間;38-ブロモ-2’,3’,5’-トリ-O-アセチル-アデノシン、CuI、PdPPh34、THF、60°C;436NH4OH水溶液、MeOH、50°C、3時間;580ギ酸、30°C、7時間。8-[3-N-5’-デオキシアデノシン-5’-イルアミノプロプ-1-イン-1-イル]アデノシン19市販の8-ブロモ-アデノシンをピリジン中、無水酢酸4当量で処理することによって、フラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2/MeOHによる精製後に8-ブロモ-2’,3’,5’-トリ-O-アセチル-アデノシンを収率62で得た。THF10mL中のブロモ誘導体0.21g、0.45mmol、アルキン130.20g、0.58mmol及びトリエチルアミン3当量の脱気した3回溶液に、CuI10mol及びPdPPh345molを添加した。Ar下、60°Cで一晩撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2/MeOHによって精製し、カップリング生成物180.17g、52を得た。MeOH4mL及び36アンモニア水2mL中の180.13g、0.18mmolの溶液を50°Cで加熱した。3時間後、反応を終了させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2/MeOHによる精製によって、脱アセチル化生成物58mg、収率51を得た。この化合物48mgを80ギ酸水溶液1mLを用いて30°Cで処理した。7時間後、反応を終了させ、反応混合物をアンモニア水の添加によって中和した後、凍結乾燥した。粗生成物を逆相HPLCによって精製して、196mg、16を白色の粉末として得た。Rt20mMTEAAバッファ中5→25のACN12.3分;1HNMRDMSO-d6δ:2.88m,1H,H5’a、3.01m,1H,H5’a、3.53m,1H,H5’b、3.70m,1H,H5’b、3.76d,2H,NCH2、3.98m,1H,H4’b、4.06m,1H,H4’a、4.17m,1H,H3’a、4.21m,1H,H3’b、4.72m,1H,H2’a、4.99m,1H,H2’b、5.18bs,2H,OH、5.40bs,2H,OH、5.50bs,1H,OH、5.86d,1H,H1’a,J=6.1Hz、5.96d,1H,H1’b,J=6.7Hz、7.24bs,2H,NH2、7.57bs,2H,NH2、8.15s,1H,H2、8.17s,1H,H2、8.35s,1H,H8;UVλmax262nm、279nm;1HRMSESI-TOFm/zC23H28N11O7MHの計算値570.2173;実測値570.2174。スキーム4:1臭化プロパルギル、NaH、THF、4°C、18時間;28-ブロモ-2’,3’,5’-トリ-O-アセチル-アデノシン、CuI、PdPPh34、THF、60°C;336NH4OH水溶液、MeOH、室温、18時間;480ギ酸、30°C、2時間。8-[3-アデノシン-5’-イルメトキシプロプ-1-イン-1-イル]アデノシン22THF10mL中の8-ブロモ-2’,3’,5’-トリ-O-アセチル-アデノシン0.14g、0.30mmol、アルキン20[3]0.20g、0.44mmol及びトリエチルアミン3当量の脱気した3回溶液に、CuI10mol及びPdPPh345molを添加した。Ar下、60°Cで一晩撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2/MeOHによって精製して、210.15g、61及び副生成物としてジアルキン化合物25を得た。化合物2154mgを、メタノール2mL中の36アンモニア水2mLと室温で一晩反応させた。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を80ギ酸水溶液1.5mlを用いて30°Cで処理した。2時間後、反応を終了させ、反応混合物を希酢酸の添加によって中和した後、凍結乾燥した。逆相HPLC13アイソクラチックによる粗生成物の精製によって、二重リガンド22を46で得た。Rt20分でTEAA中5→40のA13.0分。1HNMRDMSO-d6δ:3.54m,1H,H5’a、3.67m,1H,H5’’a、3.77m,1H,H5’b、3.85m,1H,H5’’b、4.00m,1H,H4’a、4.10m,1H,H4’b、4.21m,2H,H3’a及びH3’b、4.60m,2H,CCH2、4.62m,1H,H2’a、5.00m,1H,H2’b、5.50bs,5H,OH、5.92d,1H,H1’a,J=5.3Hz、5.95d,1H,H1’b,J=6.7Hz、7.23bs,4H,NH2、7.63bs,2H,NH2、8.17及び8.16それぞれs,2H,2H2、8.32s,1H,H8;13CNMRDMSO-d6δ:58.75C5’a、62.65C5’b、70.75CH2、71.03及び71.44C4’a,C4’b、72.15C2’a、73.71C2’b、83.30C4’a、87.18C4’b、87.94C1’b、89.94C1’a、119.50及び119.84C5、133.43C8、139.83CH8、148.90及び149.96C4、153.19及び153.90C2、154.73及び156.64C6;UVλmax265nm、279nm;HRMSESI-TOFm/zC23H27N10O8MHの計算値571.2013;実測値571.1993。8-ブロモ-N9-ベンジルアデニン23DMF10mL中のN9-ベンジルアデニン0.22g、1.0mmolの撹拌溶液に、NHS0.53g、3.0mmolを室温で添加した。一晩撹拌した後、溶媒を蒸発させ、残留物をフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2中1→3のMeOHで溶出させるによって精製して、230.15g、50を得た。1HNMRDMSO-d6δ:5.36s,2H,CH2、7.24m,2H,H芳香族、7.30m,1H,H芳香族、7.35m,2H,H芳香族、7.41bs,2H,NH2、8.17s,1H,H2;13CNMRDMSO-d6δ:47.07CH2、119.47C5、126.91C8、127.58、128.26及び129.21CH、136.43Cq、151.44C4、153.56C2、155.29C6;HRMSESI-TOFm/z[C12H10N5BrH]の計算値304.0198及び306.0178;実測値304.0184及び306.0167。8-カルボキシメチルチオ-N9-ベンジルアデニン24無水DMF3mL中のチオグリコール酸0.05mL、0.68mmol及びNaH0.05g、1.35mmol、油中60の溶液をアルゴン下、0°Cで30分間撹拌した後、DMF3mL中の230.13g、0.45mmolを添加した。室温で一晩撹拌した後、反応混合物を濃縮乾固し、粗生成物を逆相HPLC20分かけてTEAA中5→50のACNによって精製して、240.07g、50を得た。Rt20分かけてB中0→10のA10.36分;1HNMRDMSO-d6δ:417s,2H,SCH2、5.31s,2H,CH2、7.10bs,2H,NH2、7.29m,3H,H芳香族、7.35m,2H,H芳香族、8.12s,1H,H2;13CNMRDMSO-d6δ:34.91SCH2、45.97CH2、119.17C5、127.77、128.22及び129.15CH、136.63Cq、147.77C8、152.02C4、152.51C2、154.62C6;169.85CO;HRMSESI-TOFm/z[C14H13N5O2SH]の計算値316.0868;実測値316.0855。化合物26無水DMF2mL中の2432mg、0.10mmol及びアミノ誘導体1240mg、0.13mmolの混合物に、PyPOB52mg、0.10mmol及びDIEA51μL、0.30mmolを添加した。室温で4時間撹拌した後、反応を終了させ、溶媒を蒸発除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2中0→7のMeOHによって精製して、化合物2560mgを得た。次いで、2530mgをトリフルオロ酢酸1mL、水中75で処理することによってイソプロピリデン基を除去した。0°Cで3時間後、反応を終了させ、溶媒を蒸発乾固した。粗物質を水に取り、数滴のNH4OHでpHを調整した後、凍結乾燥した。逆相HPLC20分かけてTEAA中10→50のACNによる精製によって、化合物2619mg、68を得た。1HNMRDMSO-d6δ:3.46m,2H,H5’及びH5’’、3.99m,1H,H4’、4.09m,3H,CH2及びH3’、4.64m,1H,H2’、5.35s,2H,CH2、5.89d,1H,H1’、7.25m,2H,H芳香族、7.34m,3H,H芳香族、8.33s,1H,H2、8.40bs,4H,NH2、8.49m,1H,NH、8.53s,1H,H8;HRMSESI-TOFm/z[C24H25N11O4SH]の計算値564.1890;実測値564.1891。化合物27無水DMF3mL中の2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシン-5’-カルボン酸MeyerScottCetalJournaloftheAmericanChemicalSociety2007129p138121381396mg、0.30mmol及びプロパルギルアミン26μL、0.39mmolの混合物に、PyPOB156mg、0.30mmol及びDIEA150μL、0.90mmolを添加した。室温で3時間撹拌した後、反応を終了させ、溶媒を蒸発除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2中0→7のMeOHによって精製した。トリフルオロ酢酸4mL、水中75で処理することによってイソプロピリデン基を除去した。0°Cで3時間後、反応を終了させ、溶媒を蒸発乾固した。逆相HPLC20分かけてTEAA中0→50のACNによる精製によって、化合物2762mg、二段階で66を得た。Rt20分かけてB中0→15のA5.9分;1HNMRDMSO-d6δ:3.17t,1H,CH、4.04m,2H,CH2、4.14m,1H,H3’、4.37s,1H,H4’、4.57m,1H,H2’、5.58bs,1H,OH、5.80m,1H,OH、5.97d,1H,H1’、7.43bs,2H,NH2、8.26s,1H,H2、8.36s,1H,H8、9.62t,1H,NH;13CNMRDMSO-d6δ:28.35CH2、72.39C2’、73.71及び73.63C3’及びCH、81.22Cq、85.13C4’、88.47C1’、120.15C5、141.18C8、149.06C4、152.94C2、156.84C6、169.86CO;HRMSESI-TOFm/z[C13H14N6O4H]の計算値319.1155;実測値319.1147。化合物28無水DMF1mL中の2735mg、0.11mmol、8-ブロモアデノシン35mg、0.10mmol及びEt3N31μL、0.22mmolの脱気した溶液に、CuI2mg、10及びPdPPh32Cl24mg、5を添加した。60°Cで2時間撹拌した後、溶媒を蒸発除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー、続いてHPLC20分かけてB中0→50のAによって精製して、化合物2813mg、23を得た。Rt20分かけてB中0→50のA10.7分;1HNMRDMSO-d6δ:3.67m,1H,H5’、3.68m,1H,H5’’、3.99m,1H,H4’、4.21m,2H,2H3’、4.44m,3H,H4’及びCH2、4.61m,1H,H2’、4.99m,1H,H2’、5.17d,1H,OH3’、5.37d,1H,OH2’、5.50t,1H,OH5’、5.57d,1H,OH2’、5.80d,1H,OH3’、5.94d,1H,H1’、6.00d,1H,H1’、7.42bs,2H,NH2、7.58bs,2H,NH2、8.15s,1H,H2、8.29s,1H,H2、8.38s,1H,H8、9.81t,1H,NH;13CNMRDMSO-d6δ:29.10CH2、62.66CH2、71.42C3’、71.47Cq、72.09及び72.54C2’、73.62C3’、85.04及び87.10C4’、88.39及び89.83C1’、93.51Cq、119.75及び120.15C5、133.72C8、141.06CH8、148.84及び149.13C4、153.06及び153.78C2、156.55及び156.82C6、170.26CO;HRMSESI-TOFm/z[C23H25N11O8H]の計算値584.1966;実測値584.1957。スキーム7:aNBS、DMF、2日;bPPh3、ピリジン、2時間;NH4OH、12時間;cチオグリコール酸、NaH、DMF、18時間;d9a又は7a、PyBOP、DIEA、DMF、2時間~3時間;e80TFA水溶液、2時間。5’-アジド-5’-デオキシ-2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシン6aピリジン100mL中の2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシン10.0g、32.5mmolの溶液に、ピリジン15mL中のp-トルエンスルホニルクロリド7.44g、7.8mmolの溶液を-20°Cで滴下した。暗所で48時間後、水10mLを反応混合物に-20°Cで添加した。15分後、水500mLを更に室温で添加し、反応混合物を酢酸エチル2×200mLで抽出した。有機層を乾燥させ、蒸発乾固した13.53gの粗化合物。無水DMF110mL中の粗5’-O-トシル化アデノシン5.15g及びアジ化ナトリウム2.90g、44.6mmolの混合物をアルゴン下、80°Cで加熱した。2時間後、反応を終了させ、溶媒を除去した。残留物を酢酸エチルに取り、水で洗浄した2回。有機層を乾燥させ、蒸発させ、粗物質をフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2中0→4のMeOHで溶出させるによって精製して、6a1.50g、二段階で41を得た。NMRスペクトルは既報のデータComstockLRRajskiSRTetrahedron5860196026に一致する。5’-アジド-8-ブロモ-5’-デオキシ-2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシン8aDMFmL中の6a1.00g、3.0mmolの撹拌溶液に、NHS1.60g、9.0mmolを室温で添加した。一晩撹拌した後、2回目のNHS0.53g、3.0mmolの添加を行った。室温で更に18時間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、油性残留物をCH2Cl2に取った。有機層を水で洗浄し×3、Na2SO4で乾燥させた後、蒸発乾固した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2中1→3のMeOHで溶出させるによって精製して、8a0.50g、41を得た。5’-アミノ-8-ブロモ-5’-デオキシ-2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシン9a8a0.26g、0.63mmolをPPh30.25g、0.94mmolとピリジン中で反応させ、続いて33NH4OH水溶液7mLで処理することによって、フラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2中5→20のMeOHで溶出させるによる精製後に9a0.20g、81を得た。5’-アジド-8-カルボキシメチルチオ-5’-デオキシ-2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシン29無水DMF10mL中のチオグリコール酸0.12mL、1.8mmol及びNaH0.15g、3.6mmol、油中60の溶液をアルゴン下、0°Cで10分間撹拌した後、DMF2mL中の5’-アジド-8-ブロモ-5’-デオキシ-2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシン8a0.48g、1.2mmolを添加した。室温で一晩撹拌した後、反応混合物を濃縮乾固し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl21NH4OH中1→20のMeOHで溶出させるによって精製して、290.37g、75を淡黄色の粉末として得た。1HNMRMeODδ1.40s,3H,CH3、1.60s,3H,CH3、3.46dd,1H,H5’、3.59dd,1H,H5’’、4.06s,2H,CH2、4.29m,1H,H4’、5.10dd,1H,H3’、5.73dd,1H,H2’、6.20d,1H,H1’,J=2.3Hz、8.13s,1H,H2;13CNMRMeODδ24.09CH3、26.01CH3、37.13SCH2、51.70C5’、82.04C3’、83.12C2’、85.78C4’、89.61C1’、114.28C5、150.38C8、150.57C4、151.19C2、154.25C6、173.17CO。5’-アジド-5’-デオキシアデノシン-8-イル-チオ-N-[5’-アミノ-8-ブロモ-5’-デオキシアデノシンメチル]アセトアミド32無水DMF2mL中の5’-アミノ-8-ブロモ-5’-デオキシ-2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシン9a58mg、0.15mmol及び5’-アジド-8-カルボキシメチルチオ-5’-デオキシ-2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシン2970mg、0.16mmolの混合物に、PyPOB86mg、0.16mmol及びDIEA58μL、0.45mmolを添加した。室温で2時間撹拌した後、反応を終了させ、溶媒を蒸発除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2中0→5のMeOHによって精製して、O-保護30を得た。次いで、トリフルオロ酢酸2mL、水中75で処理することによってイソプロピリデン基を除去した。0°Cで2時間後、反応を終了させ、溶媒を蒸発乾固した。粗物質を水に取り、数滴のNH4OHでpHを調整した後、凍結乾燥した。逆相HPLC20分かけてTEAA中0→50のACNによる精製によって、化合物3223mg、二段階で28を白色の泡状物として得た。Rt20分かけてTEAA中0→50のACN11.5分;1HNMRDMSO-d6δ3.48m,2H,H5’a及びH5’’a、3.53dd,1H,H5’b、3.69dd,1H,H5’’b、4.02m,2H,H4’、4.14s,2H,CH2、4.21dd,1H,H3’a、4.31dd,1H,H3’a、5.16m,2H,H2’、5.80d,1H,H1’a,J=5.3Hz、5.85d,1H,H1’b,J=6.1Hz、7.10bs,2H,NH2、7.51bs,2H,NH2、8.12s,1H,H2、8.31s,1H,H2、8.56bs,1H,NH;13CNMRDMSO-d6δ36.66SCH2、46.12C5’a、51.92C5’b、71.28、71.36、71.56C2’及びC3’、83.69C4’a、84.20C4’b、89.64C1’a、90.05C1’b、119.70及び120.13C5、127.69CH8、148.91、150.65及び151.46C8,C4、152.24及び153.38C2、154.69及び155.52C6、167.27CO;HRMSESI-TOFm/z[C22H25N14O7SBrH]の計算値709.1013及び709.0995;実測値709.1018及び709.1016。5’-アジド-5’-デオキシアデノシン-8-イル-チオ-N-[5’-アミノ-5’-デオキシアデノシンメチル]アセトアミド33無水DMF2mL中の2943mg、0.10mmol及び5’-アミノ-8-ブロモ-5’-デオキシ-2’,3’-O-イソプロピリデン-アデノシン17444mg、1.3当量の混合物に、PyPOB57mg、1当量及びDIEA56μL、3当量を添加した。室温で2時間撹拌した後、反応を終了させ、溶媒を蒸発除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2中10→20のMeOHによって精製して、O-保護2265mgを得た。30と同様のイソプロピリデン基の除去の後、粗物質を逆相HPLC20分かけてTEAA中0→80のACNによって精製して、純粋な3329mg、46を得た。Rt20分でTEAA中0→50のACN8.5分;1HNMRDMSO-d6δ3.46m,2H,H5’a及びH5’’a、3.53m,1H,H5’b、3.69m,1H,H5’’b、4.02m,2H,H4’、4.13m,3H,H3’b及びCH2、4.31dd,2H,H3’a、4.72t,1H,H2’b、5.15t,1H,H2’a、5.80d,1H,H1’a,J=5.4Hz、5.88d,1H,H1’b,J=6.0Hz、7.10bs,2H,NH2、7.30bs,2H,NH2、8.11s,1H,H2、8.29s,1H,H2、8.34s,1H,H8、8.63bs,1H,NH;13CNMRDMSO-d6δ36.62SCH2、41.99C5’a、51.93C5’b、71.29、71.36、71.71C2’及びC3’、73.10C2’、83.69C4’a、83.76C4’b、88.59C1’a、89.64C1’b、119.70及び120.01C5、140.90CH8、148.92、149.64及び151.45C8,C4、152.24及び153.16C2、154.72及び156.63C6、167.38CO;HRMSESI-TOFm/z[C22H26N14O7SH]の計算値631.1908;実測値631.1929。5’-アミノ-5’-デオキシアデノシン-8-イル-チオ-N-[5’-アミノ-8-ブロモ-5’-デオキシアデノシンメチル]アセトアミド34ピリジン2mL中の3260mg、0.08mmolの溶液に、トリフェニルホスフィン33mg、0.13mmolを添加した。室温で2時間撹拌した後、反応を終了させ、次いで33アンモニア水2mLを添加した。一晩撹拌した後、反応混合物を蒸発乾固し、粗物質をCH2Cl2中でトリチュレートしたtriturated。残留物を逆相HPLC20分かけてTEAA中5→15のACNによって精製して、3422mg、40を得た。Rt20分でTEAA中5→15のACN9.7分;1HNMRDMSO-d6δ2.95m,2H,H5’a及びH5’’a、3.47m,2H,H5’’b,H5’b、3.97m,2H,H4’a、4.02m,2H,H4’b、4.12m,2H,CH2、4.20m,1H,H3’b、4.24m,1H,H3’a、5.00t,1H,H2’a、5.15t,1H,H2’b、5.78d,1H,H1’a,J=6.1Hz、5.85d,1H,H1’b,J=6.1Hz、7.13bs,2H,NH2、7.51bs,2H,NH2、8.09s,1H,H2、8.29s,1H,H2、8.58bs,1H,NH;13CNMRDMSO-d6δ36.66SCH2、41.67C5’a、46.02C5’b、71.29、71.36、71.55及び71.62C2’及びC3’、84.22C4’、89.26C1’b、90.88C1’a、119.73及び120.13C5、127.68C8、148.70、150.63及び151.48C8,C4、152.17及び153.34C2、154.76及び155.51C6、167.33CO;HRMSESI-TOFm/z[C22H27N12O7SBrH]の計算値683.1108及び685.1090;実測値683.1118及び685.1093。II.生化学的評価A.材料及び方法発現、精製及び活性アッセイHisタグ付きLmNADK1野生型及びHisタグ付きSaNADKを発現させ、既に公表されているようにコバルトベースのIMAC樹脂Clontechで精製した13。340nmでの吸光度を測定することによってNADキナーゼ活性を決定し、カップリング酵素酵母に由来するグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼによって生成する還元型NADPの形成を追跡した。カップリング酵素及びその基質は、SigmaAldrichから購入した。アッセイは、EppendorfECOM6122分光光度計を用いて30°Cで、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ及びNADKを含有する0.5mLのサンプル50mMTris-HClpH7.4、10mMMgCl2、1mMグルコース-6-リン酸、2mMクエン酸ナトリウムにおいて行った。NADKリガンドの阻害能力阻害剤アッセイのために、1mMNAD及び4mMATPLmNADK1に対する又は2mMATPSaNADKに対するの存在下でIC50を決定した。ディクソンプロットを使用して、4mMATPLmNADK1に対する又は2mMATPSaNADKに対する及び3つのNAD濃度0.2mM、0.5mM及び1mMの存在下でKIを決定した。阻害剤がカップリング酵素の活性に対して影響を有しないことも確認した。殺菌活性アッセイヒト臨床分離株であるスタフィロコッカスアウレウスS25株を、ブレインハートインフュージョンBHIブロス中、200rpm及び37°Cで一晩成長させた。一晩培養物をOD600nm=0.05となるまでBHI-リン酸緩衝生理食塩水25v/vで希釈した。細菌を200rpm及び37°Cで、培養物がOD600nm=0.5に達するまで成長させた。細菌懸濁液を2×105細菌/mLの濃度に調整した。マイクロタイタープレート内で、2×103個の細菌を1ウェル当たり0.1mLのBHI-リン酸緩衝生理食塩水25v/v中の漸増濃度のNADK阻害剤とともに、200rpm及び37°Cで一晩インキュベートした。殺菌活性を定量化するために、各々の細菌懸濁液をBHIで段階希釈し、BHI寒天プレート上に二連でプレーティングした。プレートを37°Cで24時間~48時間インキュベートし、コロニー形成単位の数を決定した。ヒト細胞の細胞毒性ヒト子宮頸がんHeLa細胞を、75cm2のプラスチックフラスコ内の10ウシ胎仔血清FBS、APP、100U/mLのペニシリン及び10μg/mLのストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地DMEM、Gibco中、37°C、5CO2、加湿雰囲気下で維持した。化学化合物の細胞毒性を評価するために、HeLa細胞を、10FBSを添加したDMEMの存在下で96ウェルプレート内に低密度で播種し、10μMの種々の化合物で96時間処理した。培養培地中のDMSOの最終濃度は、溶媒の毒性を回避するために0.1v/vとした。細胞の形状及び接着性をモニタリングし、全てのアッセイを二連で行った。DMSOを陰性対照として使用した。B.結果LmNADK1の阻害アデノシン誘導体1~10を、既に記載されているように精製酵素に対して試験した[11]。化合物9のみが非常に弱い阻害を示した0.3mMのIC50値。対照的に、マイクロモル範囲での阻害が二重リガンド17、二重リガンド19及び二重リガンド22で検出された表1を参照されたい。このため、これらの化合物は、これまでに記載の細菌NADキナーゼの最良の阻害剤であると考えられる。表1:リステリアモノサイトゲネスLm及びスタフィロコッカスアウレウスSaに由来するNADK阻害剤22、NADK阻害剤17及びNADK阻害剤19のKiスタフィロコッカスアウレウスに対するNADK阻害剤の抗菌活性NADK阻害剤17、NADK阻害剤19及びNADK阻害剤22を、スタフィロコッカスアウレウスのヒト病原株に対する殺菌活性についてアッセイした。図1~図3から、これらのNADK阻害剤が、阻害剤17及び阻害剤22については1μg/mL、阻害剤19については10μg/mLで顕著な殺菌活性を示すことが分かる。その上、阻害剤の濃度の更なる増大は殺菌活性を増大させなかった。これらの効率は、バンコマイシン等の参照化合物の効率8μg/mLに引けを取らない。細胞毒性並行して、培養物中で96時間、Hela細胞に対する細胞毒性をアッセイした。10マイクロモルで試験した場合に細胞の形状及び増殖速度の変化は観察されなかった。"