逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合の純度が少なくとも95面積であるヒストリチクス菌コラゲナーゼIであって、前記コラゲナーゼIは、色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーから浸出する物質を含まないものである、ヒストリチクス菌コラゲナーゼI。13000~23000fSRC単位mgのSRCアッセイ活性を有する、請求項1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI。逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合、2面積未満の凝集タンパク質を含有する、請求項1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI。逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合、1面積未満のクロストリパインを含有する、請求項1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI。アニオン交換クロマトグラフィーで測定した場合、1面積未満のゼラチナーゼを含有する、請求項1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI。1ugmg未満のロイペプチンを含有する、請求項1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI。1cfuml未満の生物汚染度を有し、滅菌されている、請求項1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI。10EUml未満の内毒素を含有する、請求項1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI。5EUmg未満の内毒素を含有する、請求項1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI。逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合に少なくとも97面積の純度を有する、請求項1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI。逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合に少なくとも98面積の純度を有する、請求項1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI。逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合の純度が少なくとも95面積であるヒストリチクス菌コラゲナーゼIIであって、前記コラゲナーゼIIは、色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーから浸出する物質を含まないものである、ヒストリチクス菌コラゲナーゼII。200000~380000fGPA単位mgのGPAアッセイ活性を有する、請求項12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII。逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合、2面積未満の凝集タンパク質を含有する、請求項12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII。逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合、1面積未満のクロストリパインを含有する、請求項12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII。アニオン交換クロマトグラフィーで測定した場合、1面積未満のゼラチナーゼを含有する、請求項12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII。1ugmg未満のロイペプチンを含有する、請求項12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII。1cfuml未満の生物汚染度を有し、滅菌されている、請求項12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII。10EUml未満の内毒素を含有する、請求項12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII。5EUmg未満の内毒素を含有する、請求項12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII。逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合に少なくとも97面積の純度を有する、請求項12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII。逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合に少なくとも98面積の純度を有する、請求項12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII。請求項1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼIおよび請求項12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼIIからなり、コラゲナーゼIとコラゲナーゼIIが約1:1の質量比を有する、大量生産物。本発明の課題は、コラーゲン媒介疾患を処置するための組成物および方法を提供することである。即ち、本発明の要旨は、1逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合の純度が少なくとも95面積であるヒストリチクス菌コラゲナーゼIであって、前記コラゲナーゼIは、色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーから浸出する物質を含まないものである、ヒストリチクス菌コラゲナーゼI、213000~23000fSRC単位mgのSRCアッセイ活性を有する、1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI、3逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合、2面積未満の凝集タンパク質を含有する、1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI、4逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合、1面積未満のクロストリパインを含有する、1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI、5アニオン交換クロマトグラフィーで測定した場合、1面積未満のゼラチナーゼを含有する、1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI、61ugmg未満のロイペプチンを含有する、1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI、71cfuml未満の生物汚染度を有し、滅菌されている、1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI、810EUml未満の内毒素を含有する、1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI、95EUmg未満の内毒素を含有する、1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI、10逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合に少なくとも97面積の純度を有する、1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI、11逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合に少なくとも98面積の純度を有する、1記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼI、12逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合の純度が少なくとも95面積であるヒストリチクス菌コラゲナーゼIIであって、前記コラゲナーゼIIは、色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーから浸出する物質を含まないものである、ヒストリチクス菌コラゲナーゼII、13200000~380000fGPA単位mgのGPAアッセイ活性を有する、12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII、14逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合、2面積未満の凝集タンパク質を含有する、12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII、15逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合、1面積未満のクロストリパインを含有する、12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII、16アニオン交換クロマトグラフィーで測定した場合、1面積未満のゼラチナーゼを含有する、12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII、171ugmg未満のロイペプチンを含有する、12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII、181cfuml未満の生物汚染度を有し、滅菌されている、12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII、1910EUml未満の内毒素を含有する、12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII、205EUmg未満の内毒素を含有する、12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII、21逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合に少なくとも97面積の純度を有する、12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII、22逆相高性能液体クロマトグラフィーで測定した場合に少なくとも98面積の純度を有する、12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼII、231記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼIおよび12記載のヒストリチクス菌コラゲナーゼIIからなり、コラゲナーゼIとコラゲナーゼIIが約1:1の質量比を有する、大量生産物に関する。本発明により、コラーゲン媒介疾患を処置するための組成物および方法が提供される。発明の要約本発明は、高精製されたコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの組み合わせを含むコラゲナーゼ組成物を提供する。好ましくは、コラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIは約1対1の質量比で存在する。コラーゲン媒介疾患を処置するための医薬組成物として使用される場合、本発明の組成物は改善され、かつ一貫した治療効果を提供し、同時に副作用の潜在性を低減する。本発明は、本発明のコラゲナーゼ組成物を調製する方法、本発明の組成物を含む医薬製剤、および本発明のコラゲナーゼ組成物を用いたコラーゲン媒介疾患に苦しむ患者を処置する方法をさらに提供する。本発明の前記および他の対象、特徴および利点は、同様の参照特徴が異なる観点を通して同じ部分のことを指す付随の図面に例示されるように、本発明の好ましい態様の以下のより具体的な記載から明白である。図面は、必ずしも拡大、強調する必要はないが、本発明の原理の例示に置かれる。発明の詳細な説明本発明は、質量比約1:1の高精製されたコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの混合物を含む新規コラゲナーゼ製剤原料を提供する。人工的質量比1:1のコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの混合物を含む組成物は、非常に再現可能で、かつ最適酵素活性を提供し、優れた治療効果を付与し、同時に副作用の潜在性を低減することを発見した。用語製剤原料、製剤またはコラゲナーゼ組成物は互換可能に使用され得ることが理解される。1つの態様において、本発明は、それぞれヒストリチクス菌コラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの配列を有し、約1:1の質量比を有し、少なくとも95面積の純度、好ましくは少なくとも98面積の純度を有するコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIからなる製剤原料を提供する。別の態様において、本発明は、以下の表Aから選択される少なくとも1つの特性を有する製剤原料を提供する。1つの局面において、本発明は、aヒストリチクス菌を発酵する工程bコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを含む粗産物を回収する工程c濾過およびカラムクロマトグラフィーを介して粗回収物からコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを精製する工程ならびにd約1:1の比で工程cから精製されたコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを合わせる工程を含み、それぞれヒストリチクス菌コラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの配列を有し、約1:1の質量比を有し、少なくとも95面積の純度を有するコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIからなる製剤原料を製造する方法を提供する。1つの好ましい態様において、発酵工程は、豚由来の、フィトンペプトンまたは植物性ペプトン培地の存在下で行われる。より好ましくは、豚由来培地はプロテオースペプトン3である。1つの態様において、本発明は、a第一段階の培地をヒストリチクス菌で接種し、混合物を攪拌する工程b工程からの混合物をインキュベートしてアリコートを得る工程c第二段階の培地を工程から得られたアリコートで接種し、混合物を攪拌する工程d工程からの混合物をインキュベートする工程e第三段階の培地を工程から得られたアリコートで接種し、攪拌する工程f工程からの混合物をインキュベートする工程g第四段階の培地を工程から得られたアリコートで接種し、攪拌する工程h工程からの混合物をインキュベートする工程ならびにi濾過によって工程から得られた培養物を回収する工程を含む、発酵手順を提供する。好ましい態様において、発酵手順は、a37°Cの温度設定点で3×250μLのWCBを3×25mLPP3培地に接種し嫌気性ガスジャー内に含まれる3×125mL振とうフラスコの25mL培養、125rpmで混合物を攪拌する工程b工程からの混合物を12時間インキュベートする工程c37°Cの温度設定点で上記25mL培養の1つからの4×5mLアリコートを接種4×200mLPP3培地に接種し、125rpmで混合物を攪拌する工程d工程からの混合物を12時間インキュベートする工程e37°Cの温度設定点および700のpH設定点で3×200mL培養物を144LのPP3培地に接種し、125rpmで混合物を攪拌する工程f工程からの混合物を12時間インキュベートする工程g37°Cの温度設定点および700のpH設定点で15L培養物の8Lを192LのPP3培地に接種し、125rpmで混合物を攪拌する工程h工程からの混合物を14時間インキュベートする工程ならびにiMilliporeMillistak4m2および02μmフィルターを介して200Lhの流速での濾過によって200L培養物を回収する工程を含む。1つの態様において、本発明は、a粗回収物をMustangQ陰イオン交換カプセルフィルターに通して濾過する工程b硫酸アンモニウムを、好ましくは1Mの最終濃度まで添加する工程c粗回収物を、好ましくは045μmフィルターに通して濾過する工程d濾過物をHICカラム、好ましくはフェニルセファロース6FFに通す工程e濾過物にロイペプチンを、好ましくはHIC後溶出産物に対して02mMの最終濃度まで添加する工程f硫酸アンモニウムを除去し、コラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの正しい結合のためのロイペプチンを、TFFによるバッファ交換、好ましくはTFFによるバッファ交換で維持する工程g工程の混合物を、好ましくは045μmフィルターに通して濾過する工程hQセファロースHPを用いてコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを分離する工程iコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIについてTFF濃度および調合物を別々に調製する工程ここでTFFは10およびまたは3OKMWCOPESまたはRCポリエーテルスルホンまたは再生セルロースフィルター膜を用いてタンジェンシャルフロー濾過tangentialflowfiltrationである。選択タンパク質を保持および濃縮し、かつ1つのバッファ溶液から別のものにタンパク質を交換する手段を提供するならびにj02μm濾過システムに通して濾過する工程を含む、精製手順を提供する。本発明の製剤原料は、コラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの両方を含む。粗コラゲナーゼの好ましい供給源は細菌発酵プロセス、具体的にはヒストリチクス菌の発酵からである。本発明の1つの態様において、発酵プロセスを記載する。Chisから得られた粗コラゲナーゼは、色素リガンドアフィニティークロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および金属キレート化クロマトグラフィーを含む、当業者に公知の様々な方法によって精製され得る。粗コラゲナーゼおよび部分的精製コラゲナーゼは、AdvanceBiofacturesCorpLynbrookNewYorkを含む多くの供給源から市販されている。コラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの両方はメタロプロテアーゼであり、活性のために密着結合する亜鉛および緩く結合するカルシウムを必要とする。両方のコラゲナーゼはあらゆる種類のコラーゲンに対する広い特異性を有するJBC260p27712776。コラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIは、生理学的条件下でコラーゲンの3重らせん領域を加水分解することでコラーゲンを消化するJBC260p27712776。各コラゲナーゼは異なる特異性を示すけども、一緒に、これらはコラーゲンに対する相乗活性を有するMandlIBiochemistry3p17371741VosScheperkeuterGHCellTransplantation6p403412。コラゲナーゼIIは、文献でクラスIIおよびクラスIコラゲナーゼについて報告されるように、コラゲナーゼIよりもあらゆる種類の合成ペプチド基質に対してより高い活性を有する。BondMDBiochemistry23p30853091HesseFTransplantationProceedings27p32873289。本発明の組成物および方法によって処置され得るコラーゲン媒介性疾患の例としては、限定されないがデュピュイトラン病ペーロニー病有痛性肩拘縮症、ケロイド過形成性瘢痕炎症性ざ蒼から生じるもの等の陥凹性瘢痕;手術後癒着尋常性ざ瘡脂肪腫、ならびにしわ、セルライト形成および新生物形成線維症等の外見を損なう状態が挙げられる。参照によって本明細書に援用される米国特許第6086872号および第5589171号はデュピュイトラン病の処置におけるコラゲナーゼ調製物の使用を開示する。参照によって本明細書に援用される米国特許第6022539号は、ペーロニー病の処置におけるコラゲナーゼ調製物の使用を開示する。コラーゲン媒介疾患の処置のその使用に加えて、本発明の組成物はまた、広範囲の実験室、診断および治療適用に有用であるような、組織の個々の細胞および細胞クラスターへの解離に有用である。これらの適用には、小直径合成血管移植播種のための微細血管内皮細胞、遺伝子治療、薬物細胞毒性スクリーニングおよび体外肝臓補助デバイスのための肝細胞、軟骨再生のための軟骨細胞、ならびにインスリン依存性真性糖尿病の処置のためのランゲルハンス島を含む、様々な使用のための多くの種類の細胞の単離を含む。酵素処置は細胞間接触を維持する細胞外マトリックスタンパク質およびタンパク質を断片化するように働く。コラーゲンは組織超構造の主要タンパク質成分であるために、酵素コラゲナーゼは望ましい組織崩壊を達成するために頻度高く使用されている。一般に、本発明の組成物は細胞の除去または細胞外マトリックスの修飾が望ましい任意の適用に有用である。本発明のコラゲナーゼ組成物はまた、特定数の活性単位または特定質量の好ましい精製酵素のいずれかを混合することで調製され得る。コラゲナーゼ活性は合成ペプチドまたはコラーゲン基質のいずれかを加水分解する酵素の能力によって測定され得る。当業者は、本明細書に開示される以外の酵素アッセイがまた、機能的に等価な酵素組成物を定義および調製するために使用され得ることを認める。本発明の別の局面は、本発明の組成物中のコラゲナーゼIIに対するコラゲナーゼIが1対1の質量比である再現可能な最適化である。コラゲナーゼIIに対するコラゲナーゼIの比の再現可能性は、いくつかの因子のために以前に試みがあった。第一に、Clostridiumの市販発酵物は一般に、1対2の比であるコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIをもたらす。第二に、精製手順が、この比を変更することが公知であり、精製産物の一貫しない比を有意にもたらす。本発明の組成物の最適固定質量比によって、優れた治療益をもたらす2つの異なるコラゲナーゼによって提供される相乗活性が最大化される。本発明はまた、本発明の組成物の医薬製剤を提供する。本発明の医薬製剤は、1つ以上の薬学的に許容され得る担体または賦形剤と共に配合される本発明の治療有効量のコラゲナーゼ組成物を含む。本明細書で使用される場合、用語薬学的に許容され得る担体または賦形剤は、非毒性、不活性固体、半固体または液体フィラー、希釈剤、封入物質、または任意の種類の処方補助剤を意味する。薬学的に許容され得る担体として役立ち得る物質のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロース等の糖コーンスターチおよびジャガイモ澱粉等の澱粉セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース等のその誘導体粉末トラガカント麦芽ゼラチンタルクプロピレーングリコール等のグリコールオレーン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル寒天水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤アルギン酸発熱物質なしの水等張食塩水リンガー溶液エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液であり、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム等の他の非毒性適合潤滑剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、香料剤、保存剤および抗酸化剤はまた、製剤者の判断に従って、組成物に存在し得る。本発明の医薬組成物は、非経口、局所、または移植貯蔵器を介して投与され得る。本明細書で使用される用語非経口は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、硬腔内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む。好ましい態様において、組成物は外観を損なう組織に注射される。ペーロニー病またはデュピュイトラン病または癒着性関節包炎の場合において、組成物が髄またはプラークに注射される。用語局所投与は、かかる直接注射を包含するために本明細書に定義される。さらに、具体的に良好な結果が投与後の注射部位を固定することによって得られ得る。例えば、投与部位は4時間以上固定され得る。注射可能な調製物、例えば、滅菌注射可能な水性懸濁液または油性懸濁液が、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて公知の技術分野に従って製剤化され得る。滅菌注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能な溶液、懸濁液またはエマルジョン、例えば13ブタンジオール中の溶液であり得る。なかでも、使用され得る許容可能なビヒクルおよび溶媒は水、リンガー溶液、USPおよび等張塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌固定オイルは従来、溶媒または懸濁媒体として使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の混合固定オイルが使用され得る。また、オレーン酸等の脂肪酸が注射可能物の調製に使用される。注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルターによるフィルトレーションによって、または使用前に滅菌水または他の滅菌注射可能な媒体に溶解または分散され得る滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を取り込むことによって滅菌され得る。滅菌溶液はまた、後の使用のために凍結乾燥され得る。本発明の化合物の局所投与または経皮投与の投与形態としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入またはパッチが挙げられる。活性成分は、滅菌条件下で薬学的に許容され得る担体および必要に応じて任意に必要される保存剤またはバッファと混合される。本発明の活性化合物に加えて、軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、動物および植物性脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレーングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび亜鉛酸化物、またはその混合物等の賦形剤を含み得る。粉末およびスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、カルシウムシリケート、およびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含み得る。スプレーはさらに、クロロフルオロ炭化水素等の通常の高圧ガスを含み得る。経皮パッチは、体への化合物の調節された送達を提供するという付加された利点を有する。かかる投与形態は適切な媒体に化合物を溶解または分散することによって作製され得る。吸収増強剤はまた、皮膚を横切る化合物の流入を増大するために使用され得る。速度は、速度調節膜の提供またはポリマーマトリックスまたはゲル中の化合物の分散のいずれかによって調節され得る。1つの好ましい態様において、本発明の製剤原料はラクトースを配合した凍結乾燥された注射可能な組成物である。1つの態様において、注射可能なコラゲナーゼの1ミリグラムずつが19mgのラクトースと配合される。別の態様において、注射コラゲナーゼの1ミリグラムずつは、好ましくはおよそ2800SRC単位、および合成基質pzGPGGPAを用いた潜在アッセイで測定される51000単位を有する。別の好ましい態様において、本発明のコラゲナーゼ組成物は、約80のpHレベルのスクロース、Trisを配合し、凍結乾燥された注射可能な組成物である。最も好ましくは、本発明の10mgの製剤原料が、約80のpHの60mMスクロース、10mMTris中に配合される。製剤のいくつかの例としては、限定されないが058mgの製剤原料用量について、185mgのスクロースおよび11mgのTrisが各バイアルに添加され、この場合標的バイアル充填容積は09mlであるおよび058mgの製剤原料用量について、120mgスクロースおよび07mgのTrisが挙げられる。本発明に従って、処置の必要がある患者に、本発明の組成物の治療有効量、または本発明の医薬製剤の治療有効量を投与する工程を含む、コラーゲン媒介疾患を処置する方法が、提供される。本発明の化合物の治療有効量は、任意の医学処置に適用可能な合理的な利益/リスク比で、処置された被験体に対して治療効果を付与する化合物の量を意味する。治療効果は、客観的または主観的であり得る。効果的な用量はまた、投与経路ならびに他の薬剤との同時使用の可能性に依存して変化する。しかし、本発明の組成物の毎日総使用が良さそうな医学判断の範囲内で付き添い医師によって決定され得ることが理解される。任意の特定患者のための特定の治療効果用量レベルは、処置される障害および障害の重篤度を含む様々な因子使用される特定化合物の活性使用される特定組成物患者の年齢、体重、一般健康、性別および食事投与の時間、投与の経路、および使用される特定化合物の排出速度処置の期間使用される特定化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物ならびに医学技術分野で周知の類似因子に依存する。注射可能なコラゲナーゼの製剤原料は、コラゲナーゼAUXIおよびコラゲナーゼABCIならびにコラゲナーゼAUXIIおよびコラゲナーゼABCIIと呼ばれる2つの微生物コラゲナーゼからなる。用語コラゲナーゼI、ABCI、AUXI、コラゲナーゼAUXIおよびコラゲナーゼABCIは、同じであることを意味し、交換可能に使用され得ることが理解される。同様に、用語コラゲナーゼII、ABCII、AUXII、コラゲナーゼAUXII、およびコラゲナーゼABCIIは、同じ酵素のことをいい、また、交換可能に使用され得る。これらのコラゲナーゼは、細菌細胞によって分泌される。これらは、クロマトグラフィー法によりヒストリチクス菌培養上清から単離および精製される。両方のコラゲナーゼは、特別なプロテアーゼであり、同じEC番号を共有する。コラゲナーゼAUXIは、115kDaの分子量を有し、約1000アミノ酸からなる単一ポリペプチド鎖を有する。コラゲナーゼAUXIIはまた、110kDaの分子量を有し、約1000アミノ酸からなる単一ポリペプチド鎖を有する。コラゲナーゼAUXIおよびAUXIIの領域に配列ホモロジーがあることが文献に示されているけども、2つのポリペプチドはウエスタンブロット分析で示されるように免疫学的に交差反応性であるように見えない。製剤原料は、コラゲナーゼAUXIおよびAUXIIについて約1対1の質量比を有する。コラゲナーゼ濃縮物は1528の吸光係数を有する。印刷、電子的媒体、コンピューター読み取り可能保存媒体または他の形式であろうとなかろうと、限定されないが、要約、記事、雑誌、公開物、教科書、論文、インターネットウェブサイト、データベース、特許、および特許公開公報を含む、本明細書に引用される全ての参照は、その全体を参照によって表現上援用される。本発明の組成物およびプロセスは、例示としてのみ意図され、本発明の範囲を限定しない以下の実施例と共によりよく理解される。開示される態様への様々な変化および改変が当業者に明白であり、限定されないが本発明のプロセス、製剤および/または方法に関連するものを含むかかる変化および改変が、本発明の精神および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく行われ得る。プロセス2発酵プロセス本研究は、動物フリー成分成長培地の5L発酵規模プロセスからの250mgLの全コラゲナーゼABCIIIの目標収量を送達することを目的とした発酵プロセスを開発するために設定された。様々な潜在的で代替的な窒素供給源がスクリーニングされ、これらが成長培地に現在使用されるフィトン成分に対しておよびこれを超えてコラゲナーゼ発現に何らかの影響を与えるかどうかを判断した。2つの株であるヒストリチクス菌004および013の生産性を比較する実験によって、増殖動力学、コラゲナーゼ生産性および動物由来培地で増殖した夾雑プロテアーゼの生成に関して2つの株間での任意の違いが決定された。この比較によって、動物フリー成長培地に対する動物由来培地におけるヒストリチクス菌株の成長の間での有意な違いが強調された。以前の結果によって、フィトンおよび酵母抽出物の増大した濃度がより高いバイオマス濃度およびより高いレベルの全コラゲナーゼ発現を支持することが示されたことが記載された。最適化バッチ発酵培地のバイオマス濃度および全コラゲナーゼ生産性をさらに増大する試みにおいて、流加発酵戦略が設計された。1つは高濃度培地のバッチ相、続いて低濃度飼養相を有し、第二は低濃度培地のバッチ相続いて高濃度飼養相を有する2つの5L発酵を実施した。両方の発酵物は高いバイオマス濃度を生成するが、高濃度バッチ相は比較的低レベルのコラゲナーゼ発現を示した。低濃度バッチ発酵は、非常に高いレベルのコラゲナーゼ発現を示したが、この培養はまた、夾雑プロテアーゼのクロストリパインの有意な量を生じた。低濃度バッチ発酵はコラゲナーゼの発現に関して非常に良好な結果を与えたが、非常に濃縮されたフィトンおよび酵母抽出物供給溶液は、調製することが非常に困難であった。2つのさらなる発酵が実施され、第一は以前の成功した流加発酵の繰り返しであり、第二はより低濃度供給溶液を用いてわずかに高い濃度のバッチ相培地組成を有した。両方の発酵は、同様のバイオマス濃度を達成し、コラゲナーゼおよびクロストリパインの同じ発現プロフィールを示した。生成したコラゲナーゼの量は、両方の発酵において約280mgLと再度見積もられた。しかし、これらの発酵は夾雑プロテアーゼクロストリパインの有意な量を生成した。代替窒素供給源の選択を、流加発酵戦略で使用されるフィトンペプトンを置き換える能力について評価した。ヒストリチクス菌は、4~5単位の光学密度に達する植物性ペプトンで極端に十分増殖した。しかし、これらの発酵物のSDSPAGE分析は、コラゲナーゼまたはクロストリパインのいずれかの発現も示さなかった。これらのペプトンで観察される豊かな細胞増殖のために、複合窒素供給源の濃度が非常に高く、プロテアーゼ発現の阻害をもたらすことが考えられた。従って、第二セット発酵は、バッチ戦略において50gLの代替ペプトンを用いて行われた。発酵物はSDSPAGEで分析された場合、コラゲナーゼまたはクロストリパインの発現は再度見られなかった。フィトンペプトンを用いた流加発酵に、3つのアミノ酸、グルタミン、トリプトファンおよびアスパラギンを添加した。これらのアミノ酸は非動物培地中に低量で存在していると同定された。発酵の増殖プロフィールはアミノ酸添加なしの流加発酵のものと非常に類似した。SDSPAGE分析によって、同様の収量のコラゲナーゼであるが、少し低レベルのクロストリパインが示された。クロストリパインアッセイは、対照流加発酵と比較する場合にアミノ酸添加で活性の減少を示した。なお有意であるクロストリパイン活性の減少は、動物培地と非動物培地との間での違いほど大きくはなかった。硫酸アンモニウム沈殿を用いるコラゲナーゼの一次回収工程の評価が粗発酵上清の02μm濾過で行われた。プロセスを介して行われるここでの目的は、コラゲナーゼ収量を増大し、クロストリパインの量を理想的に減少することを助けることであった。最初に100~400gLの硫酸アンモニウム濃度をアッセイした。400gLの硫酸アンモニウムは、コラゲナーゼの有意な回収をもたらした。さらなる研究がより高い範囲の硫酸アンモニウムで実施された。また、pHを60に減少する効果および沈殿前に培地を酸素化する効果がまた、調査された。これらの条件のいずれかでの上清から回収したコラゲナーゼまたはクロストリパインの量のいずれかにおいて違いは観察されなかった。400gL硫酸アンモニウムから生じたペレットは懸濁することが最も容易であった。2つの株のヒストリチクス菌を比較する研究は、動物由来培地のコラゲナーゼの生産性は最適非動物由来培地のものより低かったことを示した。クロストリパイン活性の酵素アッセイによって支持されるSDSPAGE分析によって、非動物培地よりも動物由来培地から生成される物質中に有意に低い量のクロストリパインがあることが強調された。このことは、非動物由来培地発酵から生成した供給ストックが、夾雑プロテアーゼの生成に関して動物由来培地を用いた発酵とは有意に異なる供給ストック物質であるという事実を強調した。第一セット流加発酵DCFT24プロセス開発研究の結果によって、オリジナル培地と比べて、豊富培地の使用がコラゲナーゼのより高い量の発現をもたらすことが示された。また、これが生成されるクロストリパインの量を減少することが最初に見られた。2つの5L発酵を次に実施した。最初に、戦略は長バッチ相短流加相からなり、二番目は短バッチ相長流加相からなった。両方の戦略において、発酵の終わりに、フィトンペプトンおよび酵母抽出物の濃度は、バッチ発酵の場合のように、それぞれ100gLおよび50gLであった。表1および2は、培地配合および使用される戦略を詳細に記す。図1は2つの発酵物からの増殖曲線を示し、一方、図2は正味の増殖曲線を示す。第一発酵からの細胞は非常に速く増殖し、約10時間後に最大ODに達したことが観察された。これは、バッチ相の培地が非常に豊富であるという事実のためであった。流加相中に、細胞は増殖するように見えなかった。OD値は少し減少し、これは細胞が死んでいるという事実および発酵器への供給物の希釈効果に部分的に寄与し得る。第二発酵について、流加相は、6時間後に開始された。その時点で、OD値は、図1の増殖曲線によって示唆されるように、低い。細胞は、約18時間までゆっくり増殖し続けた。図2の正味の増殖曲線は、DCFT24b発酵の細胞密度がDCFT24a発酵より高いことを示唆することが注目された。接種前に培地のOD600nmは約17であり、一方でDCFT24bにおいて、約04であった。これらの違いは、発酵物がオートクレーブされる場合に沈殿が形成されるという事実のためである。DCFT24aについて、より高い量がDCFT24bと比較して形成された。SDSPAGEゲル上清試料のSDSPAGE分析が、2つの発酵についてそれぞれ実施された。ゲルを図3および4に示す。半定量的SDSPAGEゲルはまた、第二発酵の回収点試料について生じた。図4のSDSPAGEゲル分析は、非常に低い量のコラゲナーゼが発現されることを示した。これは、細胞がバッチ相中で非常に速く増殖し、結果として最大細胞濃度が約10時間後に達したという事実のためであり得た。対照的に、おそらくは細胞が短バッチ相中でよりゆっくり増殖し、流加相中で増殖し続けるために、非常に高いレベルのコラゲナーゼ発現が第二発酵で観察された。従って、本発明は、細胞増殖が短バッチ相中にゆっくり調節され、流加相中で増殖し続ける、Chisのための改善された発酵方法に関する。ゆっくりした増殖は、発酵プロセスの開始の約10時間以内のような、流加相の前に短バッチ相中の増殖速度が最大細胞濃度をもたらさないということを意味するために定義される。好ましい態様において、増殖速度はだいたい本明細書に記載される第二発酵サイクルから生じる。第二発酵サイクルの回収点での半定量的SDSPAGEゲルの推定コラゲナーゼ生産性は、コラゲナーゼABCIについて132mgLおよびコラゲナーゼABCIIについて158mgLであった。以前に得られたものとこれらの値を比較して、流加戦略を用いて約3倍の発現レベル増大がある。次の工程は、少し改変した流加戦略および培地を用いてさらなる流加発酵セットを行うことであった。目的は発酵プロセスの規模可能性および丈夫さを改善することであった。この発酵の培地配合は、バッチ相のフィトンペプトンおよび酵母抽出物がオートクレーブされる代わりに濾過滅菌されたことを除いて、上記と同じであった。培地中のタンパク質の加熱変性によって組成物に潜在的に影響を与え得る、酵母抽出物およびフィトンのオートクレーブを回避するためにこれを行った。発酵DCFT26bについて、酵母抽出物およびフィトンペプトンの量を増大した。これを行うと、供給物中の酵母抽出物およびペプトンの濃度がDCFT26aより低く、作製および濾過滅菌することが容易であった。両方の発酵について、後に続く戦略は同じであり、6時間バッチ相続いて14時間流加相であった。表3および4は培地配合を表し、図6は両方の発酵に使用される戦略を表す。図7は2つの発酵からの増殖曲線を示し、一方で図8は、正味の増殖曲線を示す。DCFT26aおよびDCFT26bの増殖曲線は、図2に示されるDCFT24bのものと非常に類似した。細胞は流加相中でゆっくり増殖し、約35の最終の正味OD600nmに達した。発酵試料のSDSPAGEゲル上清試料のSDSPAGE分析を、2つの発酵のそれぞれについて実施した。また、コラゲナーゼの量の良好な推定をするために、半定量的SDSPAGEゲルを、DCFT26aおよびDCFT26bの回収点試料について行った。両方の発酵において、コラゲナーゼのレベルはDCFT24bのものと類似した。半定量的SDSPAGEゲルによって、DCFT24bに非常に類似するレベルがDCFT26aおよびDCFT26bの両方について得られたことが示される。DCFT26a発酵サイクルの回収点は、コラゲナーゼIについて約142mgLおよびコラゲナーゼIIについて約132mgLであった。DCFT26b発酵サイクルの回収点は、コラゲナーゼIについて約147mgLおよびコラゲナーゼIIについて約158mgLであった。クロストリパインのレベルは、DCFT24bの場合のように、なお高かった。硫酸アンモニウム沈殿工程の研究これらの発酵の結果によって、コラゲナーゼのレベルは流加戦略を用いて高いが、クロストリパインのレベルはまた、なお有意に高かったことが示された。従って、小規模実験研究が、濾過された発酵上清からの沈殿ペレット中の、クロストリパインおよびコラゲナーゼの回収量に対する硫酸アンモニウム濃度の効果を調査するために設定された。硫酸アンモニウム沈殿工程の効果を評価するために、6×100mL上清試料を、発酵DCFT26aから回収した。これらの試料を、以下の表に詳細に記載されるように、6つの異なる硫酸アンモニウム濃度を用いて沈殿した。ペレットを33mLのWFI中に懸濁し、10OmMのK2HPO4に対して透析した。次に、透析後試料をSDSPAGE分析によって分析した。図1315および225で沈殿される透析後回収点試料図1430および375で沈殿される透析後回収点試料図1545および60で沈殿される透析後回収点試料ゲルは、使用される硫酸アンモニウムが15~45飽和である場合に透析後試料中のコラゲナーゼのレベルが非常に低いことを示す。これらの場合に回収は5未満であるように思われた。60飽和の硫酸アンモニウムが使用される場合、透析後試料中のコラゲナーゼのレベルは、非常に高かった。バンドの強度を比較することで、コラゲナーゼのそれぞれについて約70mgLが透析後試料中に存在したことが推定され得る。このことは、DCFT26aの半定量ゲルによれば、回収点試料中に約130mgLの各コラゲナーゼが存在したために、約50~60の回収を示唆する。従って、本発明は、DCFT26bにおいて上に示される培地配合の使用、および約400gリットルの硫酸アンモニウムがコラゲナーゼ含有培地に添加される、コラゲナーゼを沈殿するための硫酸アンモニウムの使用に関する。第三セットの流加発酵ここでの主な目的は、開発された流加戦略の再現性を評価することであった。DCFT26bの複製発酵である流加発酵を実施した。また、硫酸アンモニウム沈殿工程を、以前の小規模研究と比較してより詳細に調査した。より具体的に、目的は、沈殿透析後試料中のコラゲナーゼおよびクロストリパインの回収に対する、60から80までの、様々な硫酸アンモニウム濃度の効果を調べることであった。また、回収上清試料を処理する2つの方法がまた、評価され、すなわち、pHをシフトし、培地を酸素化した。増殖曲線使用される培地および流加戦略は、DCFT26bと全く同じであった。図16は、発酵からの増殖曲線および正味の増殖曲線を示す。増殖曲線はDCFT26bのものと非常に類似し、プロセスの良好な再現性を示した。発酵を通して得られる上清試料のSDSPAGE分析は、コラゲナーゼおよびクロストリパインのレベルがDCFT26bのものと非常に類似することを示した。半定量的SDSPAGEゲルを、回収点試料について実施した。ゲルは、DCFT26bに観察されるレベルと類似して、120mgLよりも高い各コラゲナーゼが存在することを示唆する。発酵回収試料の硫酸アンモニウム沈殿硫酸アンモニウム沈殿工程の有効性を評価するために、7×500mL上清試料を回収した。これらを、以下の6つの方法を用いて沈殿した。全ての場合において、ペレットを165mLの10OmMのK2HPO4に懸濁し、同じバッファに対して透析する方法4を例外として、ペレットを165mLのWFIに懸濁し、10OmMのK2HPO4に対して透析した。SDSPAGEゲルを、次に、透析後試料中のコラゲナーゼの量を推定し、沈殿透析工程の回収を評価するために実施した。続く沈殿透析方法は以下のものである。1400gLの硫酸アンモニウムを、上清試料に一度に添加する沈殿。10OmMのK2HPO4pH67に対する透析。2400gLの硫酸アンモニウムを、上清試料にゆっくり約30分添加する沈殿。10OmMのK2HPO4pH67に対する透析。3400gLの硫酸アンモニウムを、予備酸素化した上清試料にゆっくり約30分添加する沈殿。発酵器から回収された500mL細胞培養物を約10分間酸素化することでこれを行った。培養物を次に、濾過滅菌した。硫酸アンモニウム沈殿後に形成されたペレットを、10OmMのK2HPO4pH67に対して透析した。4400gLの硫酸アンモニウムを、5NHClを添加してpHをpH6に変化した上清試料にゆっくり約30分添加する沈殿。後に形成されたペレットを、10OmMのK2HPO4pH6に対して透析した。5440gLの硫酸アンモニウムを、上清試料にゆっくり約30分添加する沈殿。10OmMのK2HPO4pH67に対する透析。6480gLの硫酸アンモニウムを、上清試料にゆっくり約30分添加する沈殿。10OmMのK2HPO4pH67に対する透析。7520gLの硫酸アンモニウムを、上清試料にゆっくり約30分添加する沈殿。10OmMのK2HPO4pH67に対する透析。硫酸アンモニウムは、上清試料中に480gLおよび520gLで添加した場合に完全に溶解しなかったが、400gLおよび440gLで添加した場合に完全に溶解した。SDSPAGEの結果は、沈殿工程に使用される硫酸アンモニウムの異なるレベルまたは使用される他の方法は、透析後試料に存在するコラゲナーゼの量に対する明らかな効果を有するように見えなかったことを示した。全ての場合において、透析後試料中の各コラゲナーゼ濃度は50mgL~60mgLの範囲であった。図18aは、400gL硫酸アンモニウムで沈殿された透析後試料のもののような、代表的なSDSPAGEゲルを示す。全てのゲルは非常に類似していたので、他のSDSPAGEゲルはこの報告に提示されない。回収点試料および透析後試料中のコラゲナーゼの推定濃度を考慮すると、沈殿透析工程後のコラゲナーゼの回収は、約50であった。SDSゲルによるコラゲナーゼ濃度の推定におけるエラーが一般的に高いので、50回収の値が正確であるかを調査するために、以下のSDSPAGEゲルを行った。硫酸アンモニウム沈殿試料の遠心分離後の全ての上清のSDSPAGEゲル。目的は、任意の量のコラゲナーゼが上清で損失されるかどうかを評価することであった。回収点上清試料および透析後硫酸アンモニウム沈殿試料が等量のコラゲナーゼを含むように適切に希釈され、同じゲルに負荷されたSDSPAGEゲル。回収点上清試料および透析後硫酸アンモニウム試料が等量のコラゲナーゼを含むように適切に希釈され、同じゲルに負荷されたSDSPAGEゲル。図18bから、硫酸アンモニウム沈殿試料の遠心分離後の上清中に存在するコラゲナーゼの量は非常に低かったことがわかる。図19および図20で、沈澱透析工程後のコラゲナーゼの量は上清回収試料のものと非常に類似するように見えた。従って、上清および透析後試料の半定量的SDSPAGEゲルを比較することに由来する回収値が実際により高いことがありえた。動物由来TSBプロテオースを用いたベンチマーク発酵実験動物由来成分含有培地中のヒストリチクス菌013株および004株の発酵を実施した。目的は013株を004株と比較し、細胞増殖、コラゲナーゼ発現および夾雑物のレベルに対する動物成分の効果を評価することであった。ヒストリチクス菌013凍結乾燥された株はPBS中に懸濁され、TSBプロテオース寒天プレートおよびPBFT58dを行った。表6は、使用されるTSBプロテオース培地の配合を提示する。図21は、得られた増殖曲線を示す。図21より、013株は004株より高いODまで増殖したことがわかった。しかし、両方の場合に最終OD600nmは25より高く、動物由来培地は両方の株の良好な増殖を支持することを示した。013株は回収点までゆっくり増殖し続けるが、004株は約27の正味のOD600nmまで増殖し、次に増殖が止まることが注目された。非動物由来培地を用いて、以前に提示された流加発酵と比較して、動物由来TSBプロテオース培地を用いて得られた最終ODは低かった。SDSPAGE分析発酵を通して得られた上清試料のSDSPAGEゲルを、図22および図23に示す。発酵上清、特に013株の場合に任意のクロストリパインが存在するように見えなかった。これは、コラゲナーゼの精製中のオリジネーターが問題を有し得なかったか、あるいは問題を減少したという事実を説明し得るので、非常に重要な発見であった。対照的に、精製プロセス中に、コラゲナーゼの分解が有する有意な問題は以前に経験した。これは発酵物中のクロストリパインの存在に部分的に寄与し得る。発酵物中に存在するコラゲナーゼの量の良好な推定値を得るために、半定量的SDSPAGEゲルを、回収点試料について行った。ゲルはより低量のコラゲナーゼが植物性培地を用いた流加発酵と比べて、TSBプロテオース培地を用いたバッチ発酵に生成されることを示唆する。これは、より高い細胞密度が後者の場合に得られたという事実に寄与し得る。表7は半定量的ゲルの結果をまとめる。発酵回収試料の硫酸アンモニウム沈殿各発酵について、2×500mL回収点試料を、400gLおよび520gL硫酸アンモニウムを用いて沈殿した。ペレットを、165mLのWFIに懸濁し、10OmMのK2HPO4に対して透析した。透析後試料のSDSPAGE分析を、次に行った。これらのゲルの結果は、非常に濃縮された透析後試料においても、クロストリパインのレベルは極端に低いかったことを示した。これは004株と比較して013株の場合により明白である。従って、本発明は本明細書に記載される発酵プロセスによって製造されるもののようなクロストリパインを含まないコラゲナーゼ組成物に関する。クロストリパイン活性の測定クロストリパインの役割をさらに調査するために、酵素アッセイを、透析後試料のクロストリパイン活性を測定するために設定した。以下の方法を使用したクロストリパインの酵素アッセイ:BAEENaベンゾイルLアルギニンエチルエステル条件:T25°C、pH76、A253nm、光路1cm方法:連続分光測光法速度測定単位定義:1ユニットは、25mMDTTの存在下、pH76、25°Cで1分当り10μmolのBAEEを加水分解する。透析後の試料のクロストリパイン活性についての分析:クロストリパイン活性アッセイを使用して、TSBプロテオースPBFT58を添加した発酵液由来の透析後試料および植物ベース流加発酵液PBFT57を分析した。表8に結果をまとめる。結果は、TSBプロテオース発酵液の場合には極めて低いクロストリパイン活性が存在したことを示す。対照的に、流加PBFT58の場合にはクロストリパイン活性は非常に高かった。代替ペプトンの調査振盪フラスコ中のスクリーニング試験:この試験において、種々の植物ペプトンをフィトンphytoneペプトンに代わるものとして使用した。目的は、コラゲナーゼおよびクロストリパインの発現のレベルにおける種々のペプトンの効果を評価することであった。試験した全てのペプトンは植物供給源に由来し、Sigmaにより販売されている。使用した実験の手順を図28に説明する。メディウムの配合は表9に詳述し、使用したペプトンのリストは表10に示す。また、フィトンペプトンを含有するものを対照振盪フラスコとした。全ての場合で、発酵させた流加発酵液の採取の時点でこれらの成分の濃度を模倣するために、50gLの酵母抽出物および100gLのそれぞれのペプトンを使用した表4参照。振盪フラスコを18時間インキュベートした。OD600nmおよび生存細胞計測について培養物を分析した。培養物を濾過してSDSPAGEにより上清を分析した。OD600nm測定の結果および生存細胞計測の結果を表10にまとめる。フィトンペプトンと比較して、ほとんどの植物性ペプトンはより高い正味のOD値を生じた。しかしながら、OD値は生存細胞計測数とは相関しなかった。これは部分的に、生存細胞計測法の変動、または予備的な選択的採取の時点18時間以前に細胞が既に溶解し始めていたことに起因し得た。興味深いことに、SDSPAGEゲルは、対照のフラスコフィトンペプトンを含む全てのフラスコで、コラゲナーゼの発現は見られなかったゲルは示さずことを示した。このことについて考えられる理由は、使用したフィトンペプトンおよび酵母抽出物の濃度が非常に高く、そのためにコラゲナーゼの発現が抑制されたということであり得た。代替ペプトンを使用した流加発酵DCFT27ab:コラゲナーゼの発現が観察されなかったという先の振盪フラスコ実験の情報に基づいて、発酵した流加戦略を使用して代替ペプトンを評価することを決定した。2種類の流加発酵、DCFT27a植物性抽出物2およびDCFT27b植物性加水分解物2を行なった。両発酵液において、フィトンペプトンを含むメディウムについて開発された流加戦略を使用した。表11にはメディウムの配合を示し、図29には使用した戦略を示す。増殖曲線:DCFT27aおよびDCFT27bについての増殖曲線正味のOD600nm対時間を図30に示す。両発酵液において、フィトンペプトンを含むメディウム発酵液PBFT57、図16と比較して、細胞はわずかに高いOD600nmまで増殖した。これは生存細胞計測数と一致したPBFT57について15x109CFUmLと比較して、DCFT27abについておよそ2x109CFUmL。SDSPAGEゲル:振盪フラスコ実験について、SDSPAGE分析はDCFT27aおよびDCFT27bの両方でコラゲナーゼの発現がないことを示したゲルは示さず。これは、フィトンペプトンを使用する場合は、多量のペプトンからなるメディウムがコラゲナーゼの発現を補助するが、代替ペプトンを使用する場合には多すぎて、コラゲナーゼおよびクロストリパインを含む何らかの代謝産物の発現を抑制するということに起因し得る。該細胞は代替ペプトンを含むメディウム中で豊かな増殖条件を経験し何らかのプロテアーゼを産生する必要がないものと思われる。代替ペプトンを使用したバッチ発酵PBFT59abc:DCFT27aおよびDCFT27b流加発酵の結果から、3種類のさらなる変形ペプトンを調べるさらなる研究が導かれたが、以前に使用したよりも低い濃度が使用された。3種類の5Lバッチ発酵、PBFT59a植物性トリプトン、PBFT59b植物性抽出物およびPBFT59c植物性抽出物番号1を実行した。18時間後に発酵液を採取した。動物性メディウム中のプロテオースペプトンプロテオース/ペプトンの濃度および以前に使用したフィトンペプトンの濃度を模倣するために、50gLの濃度で全てのペプトンを使用した。メディウムの配合を表12に示す。増殖曲線:PBFT59abc発酵液から得られた増殖曲線を図31に示す。全ての場合において、細胞は、DCFT27流加発酵液と比較して、より低いOD600nm18~28まで増殖した。これはまた、生存細胞計測数に一致したDCFT27abについて2x109CFUmLであったのと比較して、PBFT59abcについて07x109CFUmL~12x109CFUmL。トリプトンを含むメディウムにおいて、細胞は最も遅い増殖速度を示し、18時間後に最も低い細胞密度に達した。SDSPAGEゲル:振盪フラスコ実験およびDCFT27ab流加発酵液に関して、SDSPAGEゲルではコラゲナーゼの発現は見られなかったゲルは示さず。これらの結果は、代替ペプトンは細胞増殖を補助するが、コラゲナーゼの発現を可能にはしないことを示す。先に示唆したように、これは、これらのペプトンが栄養素、例えば遊離アミノ酸、小分子ペプチドに非常に富むためであり得る。4組目の流加発酵DCFT27d代替植物性ペプトンを使用した実験の結果が良好ではなかったので、この研究の次の目的はフィトンペプトンメディウムを使用した開発した流加発酵液におけるクロストリパインのレベルを減少する可能性を調べることであった。前述のように、クロストリパインはおそらく精製プロセスの間のコラゲナーゼの分解を引き起こしていると思われた。3種類のアミノ酸、即ちグルタミン、トリプトファンおよびアスパラギンを補充した標準的フィトンペプトンメディウムを使用して流加発酵を行なった。この発酵は、製造業者により提供されたこれらの成分のアミノ酸組成に基づく動物性TSBプロテオースメディウムと比較して、これらの特定のアミノ酸濃度をフィトンペプトン中でより低くして実行した。ここでの目的は、これらのアミノ酸の添加によりクロストリパインの発現に寄与する要因となり得る何らかの栄養素制限を低減することができるかどうかを調べることであった。メディウム配合を図13に示す。使用した発酵戦略はDCFT26およびPBFT57発酵図6参照に使用した標準的流加戦略であった。増殖曲線:DCFT27d発酵液から得られた増殖曲線を図32に示す。得られた増殖プロフィールは、以前に示したアミノ酸無しの標準的流加発酵DCFT26bおよびPBFT57について得られたものと非常に類似していた。SDSPAGEゲル:図33aは、発酵を通じて得られた上清試料のSDSPAGEゲルを示す。コラゲナーゼのレベルは標準的流加発酵について見られたものDCFT26bのSDSPAGEゲルについて図10参照と同様である。クロストリパインは依然として発酵液中に存在しているが、そのレベルはDCFT26bの場合よりも低いように思われた。このことをさらに調べるために、クロストリパイン活性アッセイを使用して、透析後採取点の試料のクロストリパイン活性を推定した。また、20L凍結乾燥バッチから得た透析後採取点の試料のクロストリパイン活性も推定した。この特定のバッチは有意なコラゲナーゼ分解を示すことなく精製されたので、このバッチのクロストリパイン活性の認識は有益であった。表14に透析後試料の酵素活性をまとめる。これは、比較目的で、表8に示される標準的フィードバッチ発酵液PBFT57および動物性TSBプロテオースペプトンについての酵素活性も含む。DCFT27dの結果は、アミノ酸の添加により該株により産生されるクロストリパインの活性が低減することを示す。クロストリパイン対コラゲナーゼの割合は、対照流加発酵液と比較して、アミノ酸補充発酵液ではおよそ4倍低い。動物由来発酵液のクロストリパイン対コラゲナーゼの割合は、アミノ酸補充流加発酵液よりも10倍低かった。クロストリパイン活性の減少は、精製の間のコラゲナーゼの分解の有意な減少を生じ得る可能性がある。一連の5L発酵を実施して、いくつかの流加発酵戦略を評価した。そのコラゲナーゼの収量、夾雑物の量およびスケーラビリティーに基づいて戦略を評価した。これらの結果に基づいて、最適な流加戦略を、およそ280mgLのコラゲナーゼ総量の生産力を生じるものとして同定した。バッチメディウム濃度をわずかに増加させ、流加メディウム濃度を減少させて発酵戦略を改変し、そのスケーラビリティーを向上させた。発酵戦略についてのこの変更は夾雑物の生産量またはレベルに何ら影響を与えなかった。第2の目的は、コラゲナーゼの一次回収工程を最適化することであった。この工程の最適化は、プロセス工程の収量の向上、または回収される夾雑物の量の減少、またはスケーラビリティーの増加に関係した。100~520gLの硫酸アンモニウム濃度の範囲を評価した。pHを60に下げることの効果およびメディウムに酸素添加することの効果も評価した。400gL未満の全ての硫酸アンモニウム濃度はコラゲナーゼの非常に低い回収を示した。400~520gLの硫酸アンモニウム濃度のいずれにおいてもコラゲナーゼまたはクロストリパインの回収に差は見られなかった。400gL沈殿物由来のペレットは最も容易に再懸濁されたため、この濃度を最適レベルと規定した。ヒストリチクス菌菌株013および004を添加した動物由来メディウムにおけるコラゲナーゼおよびクロストリパインの増殖および産生を測定および比較するために、ベンチマーキング実験を行なった。動物由来培地の配合は、TSBおよびプロテアーゼペプトンを利用したプロセス1発酵メディウムから得た。この実験はまた、動物性メディウムおよび非動物性メディウム中で増殖した系統004の比較を可能にした。SDSPAGE分析の結果は、動物由来培地中で増殖したヒストリチクス菌のクロストリパインの量はかなり少ないことを示した。クロストリパイン活性についての酵素アッセイを使用してこれらの結果を確認した。アッセイは、動物由来メディウムを使用した発酵液中のクロストリパインの活性の有意な減少を示した。2種類の系統を比較した場合、004は013よりも高いクロストリパイン活性を示した。代替窒素供給源の選択を、流加発酵戦略におけるフィトンペプトンと置き換えるその能力について評価した。これらのペプトンは植物性抽出物2Sigma、49869および植物性加水分解物2Sigma、07436であった。ヒストリチクス菌は、4~5単位の最適密度600nmに達し、植物性ペプトンにおいて非常に良好に増殖した。これらの発酵液のSDSPAGE分析は、コラゲナーゼやクロストリパインいずれの発現も示さなかった。これらのペプトンにおいて観察された豊富な細胞増殖のために、複合窒素供給源の濃度が高すぎ、プロテアーゼ発現の阻害を生じたということが考えられた。そのため、第2の組の発酵は、バッチ戦略において50gLで代替ペプトンを使用して行なった。これらの実験について、植物性トリプトンSigma、16922植物性抽出物Sigma、05138および植物性抽出物1Sigma、04316を代替ペプトンとして使用した。SDSPAGEで発酵液を分析した際に、コラゲナーゼやクロストリパインの発現は見られなかった。フィトンペプトンを使用した流加発酵液に3種類のアミノ酸、グルタミン、トリプトファンおよびアスパラギンを補充した。これらのアミノ酸は非動物性メディウム中に少量で存在するものとして同定された。発酵液の増殖プロフィールはアミノ酸の補充を行なわなかった流加発酵のものと非常に類似していた。SDSPAGE分析は、クロストリパインはわずかに低いレベルではあるが、同様のコラゲナーゼの収量を示した。クロストリパインアッセイは、対照流加発酵液と比較した場合、アミノ酸の補充で活性の減少を示した。クロストリパイン活性の減少は、依然として大きかったが、動物性メディウムと非動物性メディウムの差ほど大きくはなかった。材料および方法:植物性メディウムを使用した発酵用接種メディウムこの開発研究を通して接種メディウム用に以下の配合を使用した。接種メディウム植物性メディウムは濾過滅菌した接種手順内部のセルバンク由来のバイアルを溶解して、0025mLを30mLユニバーサルの接種メディウム中の5mLの接種に使用した。5mLの培養物を、嫌気性ジャー中で嫌気性ガスジェネレーターの存在下で、37°Cでインキュベートした。およそ13~15時間のインキュベーション後、4mLの培養物を使用して、500mLのフラスコ中で200mLの接種メディウムに接種した。前述のようにフラスコを、嫌気性ガスジェネレーターの存在下で嫌気性ジャー中に置いた。37°C、75rpmでおよそ13~15時間のインキュベーション後、フラスコの全内容物を使用して発酵液に接種した。発酵液のpHおよび温度は、それぞれ70および37°Cで制御した。窒素流速を1L分約02vvmに、および撹拌機の速度を100rpmに設定した。OD600nm測定および生存細胞計測のために発酵液を決まった時間でサンプリングした。試料を022μmのフィルターで濾過した。SDSPAGE分析のために濾過物を20°Cで保管して20°Cで凍結乾燥した。図33bに模式的な接種の手順を示す。流加発酵液の好ましい配合を以下に示す。コラゲナーゼ産物の質や収量を損なうことなく発酵プロセスをさらにスケールアップすることも望ましい。従って、本発明はさらに、図33cのフローチャートに記載するようなおよそ200リットルの流加プロセスに関する。生存細胞計測法振盪フラスコから得た試料を104~107倍希釈してTBアガープレート上に塗布した。プレートを37°Cでおよそ48時間、Genboxジャー中でインキュベーションした。ジャー中に嫌気性条件を作るために嫌気性ガスジェネレーターパックを使用した。その後コロニー数を計測した。硫酸アンモニウム沈殿:材料:SorvallEvolution遠心分離化学物質:硫酸アンモニウム、GPR等級BDH022μmのフィルターを通して上清試料100mL~500mLを濾過した。実験ごとに種々の量の硫酸アンモニウムを添加した15~80飽和。溶液をおよそ15分かけて、硫酸アンモニウムが溶解するまで磁性撹拌機中でゆっくりと混合した。その後混合せずに約35時間、2~8°Cで溶液を維持した。維持工程後に、多くの沈殿が形成した。次いで溶液を7200×gで、4°Cで20分間遠心分離した。上清を廃棄してペレットを20°Cで保管した。透析材料:10kDaMWCOSnakeSkin透析チューブ68100、Pierce磁性撹拌機化学物質:オルトリン酸2水素カリウムAnalaRBDH注射用の水WFI100mLの硫酸アンモニウム試料から得られたペレットを33mLのWFIに再懸濁した。再構成されたペレットを前もって湿らせた10kDaMWCOSnakeSkin透析チューブに移し100mMのK2HPO4pH67に対して約12~16時間、2~8°Cで透析した。次いで、WFIを換えて透析を2~4時間続けた。透析した材料を回収して、体積を測定した。透析後試料を20°Cで保管した。SDSPAGE分析8Trisグリシンゲル材料:XcellSureLockMiniCell化学物質:高分子量SDSPAGE標準1610303、BioRadNovex8Trisグリシンゲル、15mm、10ウェルEC6018BOX、InvitrogenNovex8Trisグリシンゲル、15mm、15ウェルEC60185BOX、InvitrogenNovexTrisグリシンSDSランニングバッファ10xLC2675、InvitrogenNovexTrisグリシンSDSサンプルバッファ2xLC2676、InvitrogenNuPAGE試料還元剤10xNP0009、InvitrogenCollodialBlue染色キットLC6025、Invitrogenエチレーンジアミン酢酸二ナトリウム塩AnalarRBDH10μlの試料を10μlの試料バッファ2x、25μl還元剤10xおよび2μlの01MEDTAに添加して10mMの終濃度とした還元SDSPAGE用試料を調製した。10μlの濃縮ストックを80μlの還元剤10x、310μlWFIおよび400μl試料バッファ2xに添加して、高分子量HMWマーカーを調製した。次いで、等分する前に希釈HMW標準を95°Cで5分間加熱して、その後のゲルでの使用のために20°Cで保管した。コラゲナーゼ含有試料15μlを直接即ち事前に加熱処理せずにTrisグリシンランニングバッファを使用して、130Vで約1時間50分間、8Trisグリシンゲルに流した。電気泳動後、製造業者の指示書の通りにゲルをコロイドブルー染色試薬で染色した。精製プロセス精製の5Lプロセスについての方法の要約:工程1培養メディウム上清分泌タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿。再構成および01Mリン酸カリウム、01MアルギニンpH67に透析。工程2ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー200μMロイペプチンの存在下4CVで、0264Mリン酸カリウムpH67の0~100勾配により溶出。A280>A260での2つの後期溶出ピークのプール、TMAE上に直接負荷工程3フラクトゲルTMAEイオン交換200μMロイペプチンの存在下核酸除去PallMustangQフィルターも使用できる未結合フロースルーの回収およびプール。工程410mMTrispH80に透析工程5QセファロースHPイオン交換200μMロイペプチンの存在下AUXIとAUXIIを分離20CVで、10mMTris、3mMCaCl2、360mMNaClpH80の0~40勾配により溶出2つのピークを回収:ピーク1AUXIIピーク2AUXIAUXIおよびAUXIIを含む画分に01Mまでアルギニンを添加した工程6AUXIおよびAUXIIプールを加圧式撹拌セルで濃縮した工程7Superdex75ゲルろ過クロストリパインおよびゼラチナーゼをAUXIおよびAUXIIから除去AUXIおよびAUXIIを別々のカラムに個々に流す。試料を5CVで負荷バッファ:10mMTris、3mMCaCl2、150mMNaCl、01MアルギニンpH8工程8AUXIおよびAUXIIをプールして個々に濃縮し水に透析濾過して、その後プールして最終薬物生成物とする。カラム詳細:カラム充填可能な限り製造業者の指示書の通りにカラムに充填した。TMAEカラム問題は生じなかった。QセファロースおよびSuperdex75カラムのサイズのために充填して正確に圧縮することに困難は生じなかった。しかし、カラムは推奨の圧力で流した。HA50スラリーで充填して10mL分で流した。5Lプロセスの収率回収ABCIおよびABCIIそれぞれについて5Lプロセスの収量はおよそ60~75mgであるスケールアップでは、発酵液に応じて、20Lについて250~300mgおよび200Lについて2500~3000mgの収量が予想され得た。5Lスケールプロセスの個々のクロマトグラフィー工程:ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムサイズ:XK5030中2x300mLそれぞれ15cm床高さバッファA:01Mリン酸カリウム、200μMロイペプチン、pH67バッファB:0264Mリン酸カリウム、200μMロイペプチン、pH67試料:約350mL01Mリン酸カリウム、01MアルギニンpH67中は、<10mgメディウムで負荷された流速:98mL分溶出:4CVで0~100B図34は、10mgメディウム1Lの負荷によるハイドロキシアパタイト後のクロマトグラムを示し、分離および標的分解のかなりの量の低下が生じている。フラクトゲルTMAEアニオン交換カラムサイズ:XK2620中58mL10cm床高さバッファA:10mMリン酸カリウム、02MNaCl、200μMロイペプチン、pH67バッファB:10mMリン酸カリウム、2MNaCl、pH67試料:05mgmLで約650mLリン酸カリウムpH67中、HAカラムから直接は約55mgメディウム1mLで負荷された流速:88mL分溶出:核酸を溶出するために100B図35は、フラクトゲルTMAEアニオン交換後のクロマトグラムを示す。未結合画分をプールして05mgmLで約650mLを得た。pH8で10mMTrisに透析した。図36は、5LスケールプロセスのHA前、HA後およびTMAE後材料のSDSPAGEゲルを示す。コロイドブルーでゲルを染色する。オリジナル溶出勾配によるQセファロースHPアニオン交換カラムサイズ:XK5020中100mL50cm床高さバッファA:10mMTris、3mMCaCl2、200μMロイペプチン、pH80バッファB:10mMTris、3mMCaCl2、360mMNaCl、200μMロイペプチン、pH80試料:05mgmLで約650mL10mMTris、pH80200μMロイペプチン中は約30mgメディウム1mLで負荷された流速:180mL分溶出:20CVで0~40B図37は、オリジナル溶出勾配によるQセファロースHPアニオン交換後のクロマトグラムを示す。01Mまで、画分含有ABCIおよびABCIIにアルギニンを添加する。ピーク1画分ABCIIをプールして、28mgmLで約45mLを得るための撹拌セルにより濃縮された055mgmLで約220mLを得た。ピーク2画分ABCI、ゼラチナーゼショルダーを除くをプールして、2mgmLで約42mLを得るための撹拌セルにより濃縮された045mgmLで約190mLを得た。図38は、ピーク1ABCIIについてのロイペプチンの存在下で泳動したTMAE後物質のQセファロースIEXクロマトグラフィーのSDSPAGEゲルを示す。ゲルをコロイドブルーで染色する。図39は、ピーク2ABCIについてのロイペプチンの存在下で泳動したTMAE後物質のQセファロースIEXクロマトグラフィーのSDSPAGEゲルを示す。ゲルをコロイドブルーで染色する。修飾勾配によるQセファロースHPアニオン交換バッファAへのNaCl添加の小規模試験およびスティーパーファスター勾配を使用した小規模試験。試料は135Lプロセス、TMAE後、前凍結20°Cに由来した。カラムサイズ:1mLバッファA:10mMTris、30mMNaCl、3mMCaCl2、200μMロイペプチン、pH80バッファB:10mMTris、3mMCaCl2、360mMNaCl、200μMロイペプチン、pH80試料:3mgTMAE後、10mMTris、30mMNaCl、200μMロイペプチン、pH80に透析後。3mgメディウム1mLで負荷した勾配:2CVで0~25B、2CVについて25B、75CVで25~40B図40は、修飾溶出勾配によるQセファロースHPアニオン交換後のクロマトグラムを示す。ABCIとABCIIの良好な分離が観察される。勾配の第2部分はスティーパーによりABCIピークを鋭利にし得る。ピークの改善は、3および10mgメディウム1mLで負荷された5mLCVを使用してもなされ得る。ABCIIIEXのピーク1のSuperdex75ゲル浸透クロマトグラフィーカラムサイズ:XK5060中880mL54cm床高さバッファ:10mMTris、3mMCaCl2、150mMNaCl、01Mアルギニン、pH80試料:25mgmL10mMTris、3mMCaCl2、約60mMNaCl、01Mアルギニン、pH80中で約44mL5CV流速:88mL分図41は、ABCIIIEXのピーク1のsuperdex75ゲル浸透クロマトグラフィー後のクロマトグラムを示す。ピークをプールして12mgmLで約60mLのABCIIを得る。図42は、アルギニン存在下で泳動した濃縮ABCIIのsuperdex75ゲル浸透クロマトグラフィーのSDSPAGEゲルを示す。ゲルをコロイドブルーで染色する。ABCIIEXのピーク2のSuperdex75ゲル浸透クロマトグラフィー:カラムサイズ:XK5060中880mL54cm床高さバッファ:10mMTris、3mMCaCl2、150mMNaCl、01Mアルギニン、pH80試料:20mgmL10mMTris、3mMCaCl2、約60mMNaCl、01Mアルギニン、pH80中で約42mL5CV流速:88mL分図43は、ABCIIEXのピーク2のsuperdex75ゲル浸透クロマトグラフィー後のクロマトグラムを示す。ピークをプールして11mgmLで約60mLのABCIを得た。図44は、アルギニン存在下で泳動した濃縮ABCIのsuperdex75ゲル浸透クロマトグラフィーのSDSPAGEゲルを示す。ゲルをコロイドブルーで染色する。カラムサイズのスケールアップさらに最適化されるカラムの種類および得られる床高さ。メディウムの容積は5Lスケールから直線的にスケールアップされる。図44bは、5L精製プロセスのフロースキームを示す。本発明のさらに他の態様において、上述の精製プロセスの透析工程は、透析を使用した限外濾過透析濾過UFDF操作で置き換えることができ、撹拌セルはTFF、タンジェンシャルフロー濾過で置き換えられる。上述のTMAE工程は任意である。本発明は、上述の精製プロセスによりもたらされるまたは産生され得るコラゲナーゼ生成物を含む。かかるコラゲナーゼ産物は、非常に高い純度および保持酵素活性を有する。例えば、該組成物はクロストリパインを含まない例えば、無視できるかまたは検出されないレベルのクロストリパインを有する。製造方法の最適化:臨床研究を補助するためおよび市販スケールのプロセスを提供するために、より早期に開発された製造方法の最適化がなされた。プロセスの変化は以下に簡潔に説明され、表19に概略が述べられる。発酵最適化オリジナルのセルバンクからのウシ由来原料の除去および発酵プロセスを実行した。スケールアップに必要な継代生存能力に基づいたマスターセルバンクとして使用するために、ヒストリチクス菌Clostridiumhistolyticumの系統004を増殖した。マスターセルバンクについての特異性および解析結果を表20に記録する。バイオマスおよびコラゲナーゼの産生を増加させるために、20リットルの発酵スケールで増殖メディウム中の動物を含まない原料を利用して、流加発酵戦略を開発した。200リットルまでのさらなる発酵のスケールアップには、一定の細胞増殖、コラゲナーゼ発現、および改善された夾雑物プロフィールを確実にするブタ由来のメディウム成分即ち、プロテオースペプトン3、上述が必要であることが観察された。下流のプロセスを通じてコラゲナーゼの収量および純度を高めるために、以降の変更がなされた。これらの変更としては、新規の分離および濾過戦略の追加、ならびに200リットルバッチ発酵スケールを補助する生産設備のスケールアップが挙げられる。図45は、プロセス3についての発酵のフローチャートを示す。一次回収および精製の最適化一次回収および下流の精製プロセスを最適化するためのさらなる開発に着手している。硫酸アンモニウム沈殿をフェニルセファロース高速フロー低サブカラムfastflowlowsubcolumnクロマトグラフィーに換えてコラゲナーゼを捕捉することは、収量の向上、多量の硫酸アンモニウムの使用の排除、および無菌的な処理の改善のために行なった。精製に関して、PallMustangQフィルターは、さらなる収量の向上ならびに生成プロセス試験および評価要件の簡略化のために、DNAの残存および不純物の除去のために行なった。パラメーターを操作する4アミンセファロース高性能QHPは、ゲル浸透クロマトグラフィーGPC工程を排除するために最適化した。上述のプロセスの変更に加えて、10mMTris、60mMスクロース、pH80を含むように製剤原料を改変し、産物溶解性ならびに製剤原料および製剤の安定性を向上した。最適プロセスを2段階で行なった。最初のプロセスプロセス2は、20リットルスケールで実施される流加発酵による全ての細胞保管および発酵段階のための動物性非含有メディウムを利用する。下流のプロセスは、プロセス1が残りのDNAの除去のためのMustangQ濾過およびさらなる宿主細胞夾雑物の除去のためのSuperdex75GPCを含むように改変した。クロマトグラフィーバッファー系にロイペプチンを添加してタンパク質分解を防いだ。プロセス2材料は、プロセス1材料表21Aと解析において橋渡しbridgeされ、本明細書に概略が記載される前臨床試験と並行して試験した。プロセス2材料は、フェーズ3臨床プログラムの初期段階で使用するよう提唱された。プロセス2の中間体、および製剤原料はそれぞれ表22および23に詳細に記載される。さらなるプロセス、製剤化および凍結乾燥の開発により最適化された製造プロセスプロセス3が提供された。これらの変更は新規の分離および濾過戦略の追加、ならびに表19に概略が記載される200リットルバッチ発酵スケールを補助する製造設備のスケールアップを含む。図46はプロセス3についての精製のフローチャートを示す。用量の説明declaration:最初のインビトロ有効性アッセイはウシコラゲナーゼアッセイであり、コラゲナーゼI型およびII型を区別しなかった。このアッセイは、典型的に10000単位の能力を生じる058mgの用量でオープンラベルDUPY101およびDUPY202臨床試験のみに使用される材料に利用された。I型コラゲナーゼおよびII型コラゲナーゼについて現在の別々のインビトロ潜在性アッセイを利用するプロセス1材料の解析は、典型的にI型コラゲナーゼについて1700~3500単位用量058mg用量およびII型コラゲナーゼについて43000~69000単位用量058mg用量を生じる。現在のインビトロ潜在性アッセイを利用するプロセス2材料の解析により、典型的に、プロセス1材料と比較して同様の相対的な能力値を達成することが確認され。プロセス1とプロセス2の間の解析的比較の説明:プロセス1とプロセス2の変化を裏付けるために、放出試験および解析特徴づけの形態で比較データを出した。これらのデータは表21に示す。以前のプロセスプロセス1;参照と本発明のプロセスプロセス2のAUXIおよびAUXIIと記載される中間体ならびに製剤原料の比較。この解析比較はプロセス2で製造された材料がプロセス1で製造されたものと同等であることを示す表21。特に、これらの材料間の同一性、有効性および純度は同等である。プロセス2中間体の純度レベルを図47の還元型SDSPAGEクーマシー染色ゲルに示す。ゲルは、それぞれの中間体について一本のバンドを示し、他の明白なマイナーバンドはなかった。AUXIは115kDaの明らかなMWを有して参照ABCIに匹敵し、AUXIIは110kDaの明らかなMWを有して参照ABCIIに匹敵する。図48は、製剤原料を表す還元型SDSPAGEクーマシー染色ゲルを示す。中間体に関して、プロセス2で製造された製剤原料は参照プロセス1に匹敵する。銀染色したSDSPAGEゲルを図49にし表し、さらにプロセス2製剤原料が高純度レベルであることを実証する。要約すると、プロセス2を使用して製造された中間体AUXIおよびAUXIIおよび製剤原料の放出試験ならびに解析特徴づけは、プロセス1参照材料と明らかに同等性を示す。さらに、さらなる放出試験をプロセス2の物質で実施して、表21Bに列挙する。結論付けると、プロセス1の物質とプロセス2の物質の直接の解析的比較表21、およびさらに中間体および放出試験表22は、プロセス2材料がヒトの試験における使用に適していることを示す。表23および24はさらにプロセス2製造方法から得られた解析の詳細を列挙する。プロセス3についての詳細な実験:プロセス3発酵:プロセス2で使用したフィトンペプトンを用いた発酵プロセスは、DSP開発およびGMP製造両方の提供の間にかなりの変動性を示した。以前の研究の間に、動物由来プロテオースペプトンがヒストリチクス菌の非常に良好な増殖を補助することが示された。動物由来プロテオースペプトン培養物は、プロセス2で観察されたよりも有意に低いクロストリパインを生じ、AUXIおよびAUXIIを11の割合で発現した。結果として、調節上な許容され得る動物由来ペプトン、BectonDickinsonのプロテオースペプトン3PP3、は5L発酵で評価された。既存のフィトンベースプロセスプロセス2の最初の比較により、50gLでPP3を使用することで迅速な指数関数的増殖の高バイオマス濃度を生じることが示された。発酵液は、半定量的SDSPAGE分析によりプロセス2の約230mgLに対して350mgLより多くの総コラゲナーゼ収量を生じた。PP3を使用したさらなる発酵は、動物由来発酵メディウムを使用して有意に低いクロストリパインが産生されたことを示した。第1の3種類の発酵液PP3の1バッチを使用したは、極めて一致した増殖プロフィールを示した。産物をSDSPAGEで解析した場合、コラゲナーゼの収量および純度は3種類の発酵間で極めて再現可能であることが見出された。DSPにプロセス開発用の材料を供給するために、PP3を使用していくつかの発酵を実施した。この供給材料のため、PP3の3種類の異なるバッチを使用した。これらのバッチの2つを使用した場合、培養の増殖プロフィールは以前のPP3発酵とは一致しないことが示され、発酵間の増殖プロフィールの変動性が示された。小スケールでの調査は、PP3におけるバッチ対バッチの変動性によりこの変化が生じたことを示した。小スケール試験はまた、100gLまでのPP3濃度の増加がこの変化を妨げることを示した。小スケール実験で示したように1つが典型的な増殖プロフィールを生じ、1つが生じない2つのバッチのペプトンを使用して、100gLPP3で2つの5L発酵を行なった。この実験は、濃度の増加により、PP3の異なるバッチによる2つの発酵が再現可能であることが確実になることを示した。増殖プロフィールは非常に類似しており、産物は同様の収率および純度で発現した。100gLPP3を利用する最適化された発酵プロセスは、最終的には200Lにスケールアップされた。200L増殖プロフィールは5Lスケールで見られたものと非常に類似していた。発酵液濾過物のSDSPAGE分析は、200L発酵液から、定量的比重計測により約320mgL総コラゲナーゼの高い収量を示した。コラゲナーゼ産物の純度発酵後は5Lおよび200Lスケールの両方で同様であった。200L発酵液濾過物のうちの20LはDSP群により処理されて、以降のプロセスについての部分的なスケールアップを示した下記。プロテオースペプトン3発酵プロセスプロセス3は既存のフィトンプロセスよりも高い収量かつ低いクロストリパインでコラゲナーゼを生成した。100gLではPP3は、種々のPP3のバッチを使用したにもかかわらず、再現可能な増殖曲線でヒストリチクス菌培養物を生じることが示された。コラゲナーゼの収量および純度の両方はまた、種々のPP3のロットを使用した場合にも再現可能であることが示された。ヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼの産生のための原料としてのプロテオースペプトン3の評価。複合窒素供給源としてフィトンペプトンを利用した発酵で変動性が観察されたために、5L発酵においてプロテオースペプトン3BectonDickinson、212230PP3を評価した。50gLPP3の単純バッチ戦略を使用した。正確なメディウム組成は材料および方法のセクションに見ることができる。図51は、50gLPP3プロセス2のフィトン濃度よりも低い濃度発酵の増殖曲線とフィトン流加発酵液を比較する。PP3培養は、接種後およそ8時間で定常段階に入る前の指数関数的増殖の間に非常に早い特異的増殖速度を示す。PP3発酵は47単位の最大光学密度600nmに達した。産物の生成分解をモニターするために、培養物を定常状態でさらに12時間静置した。図52は、PP3培養の20時間の時点のコラゲナーゼ産物の濃度のSDSPAGE半定量的分析を示す。図53は、フィトン流加プロセスについての同様の解析を示す。PP3発酵によりフィトンベースプロセスよりも多くの産物が生じることが観察され得る図52および53の半定量的解析に基づく230mgLから360mgLまでの総コラゲナーゼの増加。PP3培養はまた、AUXIおよびAUXIIを1:1の割合で発現したが、プロセス2は2つのタンパク質を1:16の割合で産生した。プロテオースペプトン3バッチ発酵の再現性。PP3バッチプロセスの再現性は、ロット番号5354796のプロテオースペプトン3を使用してさらに試験された。図54に示される3つ全ての実験runは、8時間後に得られるおよそ45の最大光学密度600nmを有する一定の増殖プロフィールを示す。発酵液の採取時点の半定量的SDSPAGE分析は、総コラゲナーゼの収量が約350~400mgLであることを示した。発酵液の採取時点も本試験の間に評価された。8、11および20時間で発酵液を採取した。図55および56は、PP3発酵GCFT05d11時間で採取されるの経時的SDSPAGE分析を示す。図55に示されるゲルをコロイドブルーで染色して、図56のゲルを銀染色した。図55および56のゲル上のコラゲナーゼの2本のバンドの上に、三番目に高い分子量のバンドを観察することができる。このバンドは、文献で報告されたAUXI前駆体タンパク質に対応すると考えられる。前駆体のバンドは指数関数的増殖段階中に存在する。指数関数的増殖の終わりの時点で、前駆体バンドは密度が減少し、11時間後には存在しない。GCFT05dにおいて主要な低分子量夾雑物は銀染色のゲルのおよそ90、60、55、45、および40kDaに見ることができる。これらの夾雑物は低レベルで存在し、銀染色でのみ明確に検出されることに留意すべきである。発酵液の最適な採取時点は発酵のこの段階でおよそ11時間であることが決定された。図57は、標準的フィトン流加発酵の時間経過の試料のSDSPAGE分析を示す。40kDaの夾雑物は、図57のゲル上に観察することができる。フィトン流加プロセス由来のこの40kDaの夾雑物のバンドはプロテアーゼクロストリパインであると同定された。図55と57のゲルを比較することで、PP3発酵プロセスを使用して産生されたクロストリパインの量はフィトンベース発酵よりも有意に少ないと決定することができる。下流プロセス開発のための供給材料の生成下流プロセスDSP開発を補助するために、50gLPP3を使用していくつかの発酵を実施した。これらの発酵の間に、2つの異なるロットのPP3を使用した5332398および5325635。図58は、ロット5354796GCFT05dを使用した発酵正方形で示すと比較して、これらの発酵の増殖曲線ひし形で示すを示す。PP3の新しいバッチによる発酵は、大きく異なる増殖プロフィールを表す。培養物の最初の増殖速度は非常に似ているが、定常状態に入る時点では、最大バイオマス濃度はかなり異なる。接種培養物の光学密度600nmは、非常にわずかな変化5mL段階のOD600;29~36単位、200mL段階のOD600;45~59単位を示し、PP3ロット5354796を使用した以前の接種から減少していなかった。変化および減少した光学密度600nmは、培養の最終発酵段階においてのみ示された。このことは、変化の理由がPP3の栄養素の制限ならびにPP3バッチ間で異なる栄養素制限の量のためであったことを示唆する。これらの発酵はDSP開発に首尾よく使用され、SDSPAGE分析は産生されるコラゲナーゼの量に大きな変化は見られない半定量的SDSPAGE分析に基づいて350~400mgL総コラゲナーゼ、データは示さずことを示すが、この変化の原因を調べることは依然として重要であると決定された。増殖プロフィールの変化は発酵液の採取時点を予測することを非常に困難にした。また、栄養素の制限がフィトン流加プロセスで見られる他のプロテアーゼ、特にプロテアーゼクロストリパインの発現を誘導し得るという関係がある。プロテオースペプトン3のバッチ間の変化の調査。PP3での最初の研究により、高い産物収量および低いプロテアーゼクロストリパインを有する、高度にエラー強さのあるプロセスが示された。新しいPP3のバッチを使用した場合、プロセスエラー強さは高度に可変的な増殖プロフィールで大きく減少したことが観察された。これまでに使用した3つのPP3のバッチロット5354796、5325635および5332398を直接比較するために振盪フラスコ実験を行なった。この実験は、5Lプロセスから2段階接種プロセスを繰り返したが、最終的な発酵段階をもう1つの200mLの培養で置き換えた。これまでの実験におけるプロセスの最終発酵段階においてのみ変化が観察されたので、この3つ目の段階を有することが重要であった。それぞれの変移段階において培養物の光学密度600nmが測定され、この培養物を使用して次の段階に接種した。3種類のバッチのPP3を50gLで使用してメディウムを調製した。5L実験においてヒストリチクス菌の低いバイオマス濃度を生じた2つのバッチのうちの1つロット5332398はまた、100gLでも調製した。図59は、小スケール実験の結果を示す。ロット5325635および5332398はおよそ25単位の第3の段階において低い光学密度600nmを示すことが観察され得るので、PP3のうちでこれらが不良バッチであったと考えられた。ロット5354796は、培養の第3の段階において5単位の光学密度600nmを維持するので、これはPP3のうちで良好なバッチであると考えられた。興味深いことに、PP3の不良バッチ5332398の濃度を100gLまで増加した場合、培養の第2および第3の段階において同一の光学密度600nmが達成された。このデータは、増殖プロフィールにおける逸脱はPP3のバッチ間の栄養素の制限の量を変化することによって生じるという説を裏付ける。PP3のバッチの解析試験によりこの栄養素を特定することはできなかった。5L発酵中の100gLでのプロテオースペプトン3の評価小スケール試験の結果により、50から100gLへのPP3の濃度の増加がバッチ対バッチの変動性の問題を解消することが示された。このプロセスの変化は、PP3変動性の小スケール調査の間に測定されたので、PP3の良好なバッチおよび不良バッチロット5354796および5325635、それぞれを使用して5Lのスケールで試験された。図60は2つの発酵液の増殖プロフィールを示す。2つの培養液は、指数関数期には同じ特異的増殖速度を示す。発酵液が定常期に入り、およそ65単位の非常に類似した最大光学密度600nmに達する。このデータにより、PP3の濃度の増加はPP3のバッチ対バッチの変動性の問題を解消することが示される。達成された高いバイオマス濃度および発酵中の長い指数関数期のために、採取点が12時間まで延長された。図61および62は、100gLのPP3を利用した2つの発酵液のSDSPAGE分析を示す。ゲルは両方の発酵液においてコラゲナーゼの一定の発現を示す。PBFT70dはわずかに多い40kDaのバンドクロストリパインを含むようではあるが、両方の発酵液由来の試料は、図56に示される同様のレベルの夾雑物を含むように思われる。これらの小さな差は染色または負荷の差のためであり得る。この場合も、PP3プロセスを使用して生じたクロストリパインの量はフィトンプロセスよりも有意に低い。前駆体のバンドは、発酵の時間経過においてより長く持続するようである。100gLでの将来の発酵は14時間の採取に延長するべきであることが推奨された。前駆体バンドの存在は、プロセス検証の間の採取点の規定およびその条件づけの重要性を強調する。図63は、図61のゲルのデンシトメトリー解析のデータを表示する。この図は産物形成および前駆体形成デンシトメトリーピーク面積と細胞増殖OD600を比較する。産物形成は、細胞増殖と一致するようであり、培養物が定常期に入る場合に産生の速度は減少する。指数関数的増殖が終了すると前駆体バンドの密度は減少するが、発酵液の採取時点では依然として存在している。100gLのプロテオースペプトン3発酵液の200Lへのスケールアップ。PP3濃度の100gLへの増加後、プロセスを200Lにスケールアップした。200L容器についての接種の必要量を生成するために、15L作業体積発酵液を使用して、第3の接種段階を導入した。3x200mL培養物を使用して、15L発酵液を接種し、その後、12時間の増殖を続け、15L中の8Lを200L容器に接種した。図64は200L発酵液の増殖曲線と100gLPP3を使用した2つの5L発酵液の増殖曲線を比較する。推奨されるように増殖プロフィールを14時間に伸ばして、プロセスを開始する前に前駆体バンドが完全に消失することを確実にした。200L発酵液の増殖プロフィールは5Lスケールでの発酵と非常に類似しており、培養のスケールアップの成功を示した。図65は、200L発酵液の時間経過のSDSPAGE分析を示す。ゲルは発酵経過中の産物形成を示す。14時間採取点の物質は検出可能な前駆体を含んでおらず、非常に低レベルの夾雑物を含む。200L発酵液で生成された産物は5Lプロセスで生成されたものと非常に類似しているようであり、200Lプロセスの高い生成数は有害な効果を有さなかったことを示す。図66は、図64のゲルのデンシトメトリー解析のデータを表示する。この図は産物形成および前駆体形成デンシトメトリーピーク面積と細胞増殖OD600を比較する。産物形成は細胞増殖に一致するようであり、培養物が定常期に入ると産生の速度は減少する。指数関数的増殖が終了すると前駆体バンドの密度は減少する。200L発酵液では5L培養PBFT70c図63よりも迅速に前駆体バンドの密度が減少する。図67は、200L発酵の時間経過についての4~12BisTrisゲルを使用したSDSPAGE分析を示す。検出された夾雑物のおよその分子量はゲル上にしるす。プロセス2について開発された採取プロセス濾過による浄化は200Lスケールアップ発酵の間に評価された。濾過試験の阻害を伴わない既存のプロセスを使用して細胞培養物は良好に浄化された。採取プロセスを材料および方法のセクションに記載する。200L発酵液の20Lの濾過物をDSPにより処理して下流のプロセス3後述の部分的スケールアップを示した。デンシトメトリー解析による産物収量の定量上流プロセス工程の間の産物濃度を測定するために、半定量的SDSPAGE分析図62および63よりも正確で定量的な方法が必要であった。発酵濾過物は、UVおよびBradfordアッセイなどの標準タンパク質定量技術を不要にする増殖メディウム由来の多量の色素およびペプチドを有する。以前に行った半定量的分析を、クーマシー染色ゲルのデンシトメトリー解析を行なうことによって改変し、更新した。該方法は、Trisグリシンゲル上で定量される試料の混合されたAUXIおよびAUXII参照材料ならびに希釈物の量の範囲02~12μgレーンを負荷する工程を含んだ。次いで、スキャンされた画像を解析して標準および試料についてのピーク面積を推定した。次いで標準曲線を構築して総コラゲナーゼ、試料希釈物中の総コラゲナーゼ量を定量するために使用した。図68は、コラゲナーゼ標準曲線の一例を示し、試料の推定される範囲内の定量方法の直線性を強調する。TrisグリシンゲルではAUXIおよびAUXIIが完全には分離されなかったので、2つのタンパク質を別々に定量するよりもむしろ総コラゲナーゼを定量した。コラゲナーゼの量はPBFT70c、PBFT70dおよび200Lスケールアップ発酵液について解析した。3つ全ての発酵液について量は約280~350mgL総コラゲナーゼであることが見出された。材料および方法メディウム調製:1Lメディウム調製接種調製物用のリン酸塩表25を、1L容器で、121°C、20分間オートクレーブした。バルクメディウム表26を、1L、121°C、20分間のオートクレーブにかける前にまず電子レーンジで60°Cに加熱して内容物を完全に溶解した。PSA1表27を02μmSartopore2150cm2フィルターで濾過して250mL滅菌容器に入れた。300mLのオートクレーブにかけたリン酸塩、600mLのオートクレーブにかけたバルクメディウムおよび100mLの濾過滅菌したPSA1を、30mLのγ線照射ユニバーサル8x5mLおよび500mL三角フラスコ4x200mLに等分する前にプールした。5Lメディウム調製5Lスケール用のリン酸塩溶液表29を、1L容器で121°C、20分間オートクレーブした。バルクメディウム表30を5L容器に直接添加して121°C、20分間オートクレーブにかけた。PSA1表31を02μmSartopore2150cm2フィルターで濾過して500mLの滅菌ボトルに入れた。250mLのリン酸塩溶液および200mLのPSA1を別々に、オートクレーブが完了した5L容器にポンプで入れ容器を冷ました。15Lメディウム調製リン酸塩溶液表33を02μmSartopore2300cm2フィルターで濾過して滅菌2Lボトルに入れた。バルクメディウム表34を、容器のスチームインプレイスSIP滅菌の前に20Lの容器に直接添加した。PSA1表35を02μmSartopore2300cm2フィルターで濾過して1L滅菌ボトルに入れた。750mLのリン酸および600mLのPSA1を、SIPが完了した20Lの容器に別々に入れ容器を冷ました。200Lメディウム調製リン酸塩溶液表37を02μmSartopore2300cm2フィルターで濾過して、GammasartBiosystemSA1010Lバックに入れた。容器のSIP滅菌の前にバルクメディウム表38を200Lの容器に直接添加した。PSA1溶液表39を02μm300cm2フィルターで濾過してGammasartBiosystemSA1010Lバックに入れた。10Lのリン酸塩および8LのPSA1を、SIPが完了した200Lの容器に別々に入れ、容器を冷ました。発酵図69は5Lおよび200LスケールのフィトンおよびPP3発酵プロセスについてのプロセスの流れの概要を示す。5Lスケール発酵WCB20051019Dのバイアルを解凍し、50μLのアリコートを使用して30mLγ線照射ユニバーサル中の8x5mLの接種メディウムに接種したbinoculate。3嫌気性気体パックの存在下で5mLの培養物を嫌気性ジャー中で、37°Cでインキュベートした。インキュベーションのおよそ12時間後OD60030~40、2x5mLの培養物を選択して使用し、500mLの三角フラスコ中で2x200mLの接種メディウムに接種した。3つの気体パックと共に2つのフラスコを共に嫌気性ジャー中に設置し、振盪インキュベーター70rpm中で、37°Cで12時間インキュベーションした。インキュベーションの12時間後OD60060~70、それぞれ200mLの接種物を用いて5L容器に接種した。5L7L容器FTApplikon容器の作業用容積は5Lとし、その4vvが200mL段階由来の接種物であった。撹拌速度を100rpmに設定した。pH、dO2および温度を、700単位、飽和の0および37°Cそれぞれに制御した。pHはHCl5MまたはNaOH5Mのいずれかの添加で制御した。dO2濃度は、1L分の流速の窒素の連続散布により0に維持した。発酵の間に試料を取り出し、解析のために20°Cで保存する前に02μmフィルターで濾過した。OD60060~70のOD600で発酵液は定常期に入り始めた。12時間後、採取を始める前に発酵液を10~20°Cに冷却した。200Lスケール発酵WCB20051019Dのバイアルを解凍して50μLのアリコートを使用し、30mLγ線照射ユニバーサルの8x5mLの接種メディウムに接種した。5mLの培養液を、3つの嫌気性気体パックの存在下で、嫌気性ジャー中37°Cでインキュベーションした。インキュベーションのおよそ12時間後OD60030~40、4x5mLの培養液を選択して、500mLの三角フラスコ内の4x200mLの接種メディウムの接種に使用した。2つのフラスコを3つの気体パックと共に嫌気性気体ジャー中に一緒に設置し、振盪インキュベーター70rpm中、37°Cで12時間インキュベートした。インキュベーションの12時間後OD60060~70、4本のフラスコのうち3本を一緒にプールして20Lの容器の接種に使用した。20L容器の作業用容積は15Lとし、その4vvが200mL段階由来の接種物であった。撹拌速度を100rpmに設定した。pH、dO2および温度をそれぞれ700単位、0および37°Cに設定した。pHはHCl5MまたはNaOH5Mいずれかの添加により制御した。dO2濃度を、流速20L分で窒素の連続的ヘッドスペース散布により0で維持した。20L容器中の増殖の12時間後OD60060~70、8Lの培養液を使用して200Lの容器に接種した。行った条件は20Lスケールと同じであった。採取の時点での最終的な光学密度600nmは60~70であった。14時間後、採取を開始する前に発酵液を10~20°Cに冷却した。採取5L採取5L培養液を、5L時間の流速で、Millistak10Opticap深度フィルターdepthfilterMillipore、KC0HC10FF1および02μmSartopore2300cm2フィルターに通して、滅菌250mLバイオコンテナに入れた。処理した物質を20°Cまたは4°Cのいずれかで、DSPによる処理の前に保存した。200L採取一連の濾過、採取を使用して200L採取を行なった。培養液を、200L時間の流速で、4x1m2の濾過面積で、MilistakMC0HC10FS1使い捨て深度フィルターを通して、その後02μm02μmExpressOpticapXL10フィルター、2x049m2Millipore、KHGES10TT1を使用して汲み上げた。最初の浄化の処理時間は1時間であった。採取の終了時点でさらに10分静置して、フィルターに付着した残りの産物を回収した。濾過物の重量を記録しながら浄化した上清を200LStedimPalletankに回収した。20Lの濾過物を、約6L分の流速でMustangQhighアフィニティーDNAカラムに通して、4°Cで一晩保存する前に2本の滅菌の20Lstedimバッグに回収した。解析光学密度測定分光光度計は波長600nmで、PBSを使用してブランクを取った。PBSを使用して、発酵試料を10、20または100細胞密度に応じて倍に希釈した。1mLのそれぞれの希釈試料を1mLキュベットに移し;600nmの波長で3回の光学密度読出しの記録の前に上部を密封し5回反転された。TrisグリシンゲルSDSPAGE分析について発酵試料を調製する前に02μmフィルターで濾過した。10μlの濾過試料を10μlの試料バッファ2x、25μl還元剤10xおよび2μlの01MEDTA10mMの最終濃度としたに添加した。10μlの濃縮ストックを80μlの還元剤10x、310μlWFIおよび400μl試料バッファ2xに添加して、高分子量HMWマーカーを調製した。次いで、その後のゲルでの使用のための等分および20°Cでの保管の前に、希釈HMW標準を95°Cに5分間加熱した。事前に冷却した4°CTrisグリシンランニングバッファを使用して、130V、400mAおよび100Wで約1時間50分間かけて、15μLの発酵試料および10μLのHMWマーカーを8Trisグリシンゲルに泳動した。電気泳動後、ゲルを100mLのコロイドブルー染色試薬55mLWFI、20mLメタノール、5mL着色剤A、20mL着色剤Bに浸漬して、回転式シェーカー、60rpmで5時間染色した。200mLWFIでゲルを脱色した。余分な染色が除去されるまでゲルをWFIに15~20時間静置して、その後製造業者の指示に従いゲルをスキャンして乾燥させた。BisTrisゲル10μlの02μm濾過試料を4μl試料バッファ4x、15μl還元剤10xおよび17μlの01MEDTA10mMの最終濃度としたに添加して、SDSPAGE分析用の発酵試料を調製した。MESランニングバッファを使用して、200V、400mAおよび100Wで約40分間かけて、15μLの発酵試料および10μLのMark12マーカーを4~12BisTrisゲルに流した。電気泳動後、ゲルを100mL固定化溶液40mLdH2O、50mLメタノール、10mL酢酸に10分間浸漬した後、95mLの染色溶液55mLdH2O、20mLメタノール、20mL着色剤Aで10分間置換した。5mLの着色剤Bを染色溶液に添加して、60rpmの回転式振盪シェーカーで、ゲルを5時間静置して染色し、その後200mLのWFIで脱色した。余分な染色が抜けるまで15~20時間、ゲルをWFIに静置し、その後製造業者の指示に従いゲルをスキャンして乾燥させた。プロセス3精製:プロセス2を改変した、ヒストリチクス菌からコラゲナーゼを精製するための新しく開発されたプロセスプロセス3の最初の20Lスケールのランスルーrunthroughを20LスケールでGMPについて実施した。精製をより規模の大きなものにし、スケールアップおよびその後のプロセス検証について修正の余地あるものにするために、プロセスの大きな変更をプロセスの3の開発に導入した。このプロセスの変更を容易にする1つの大きな要因は、発酵の成分の選択にあった。プロセス2は発酵メディウムに基づくフィトンを維持するための要件に基づき、一方でプロセス3について、プロテオースペプトンNo3を使用した。プロセスランスルーは下流の精製ならびにコラゲナーゼAUXIおよびAUXIIの重要な工程に分かれる。これらは、MustangQカプセル、疎水性相互作用クロマトグラフィー、タンジェンシャルフロー濾過工程1TFF1と示す、アニオン交換クロマトグラフィーおよびタンジェンシャルフロー濾過工程2TFF2と示すを使用する発酵液濾過の処理を含む。AUXIおよびAUXIIは精製の最初の工程で共に精製され、アニオン交換クロマトグラフィー工程の間に分離されるのみであるQセファロースHPメディウムを使用して実行される。AUXIおよびAUXIIは、次いで別々に処理されて製剤化される。次いで、中間体は1:1の割合で混合されUVにより測定されたタンパク質含有量に対して、濾過されて薬物を形成する。プロセス3の開発において、プロセス2と関連した重要な工程が除去された。注目すべきこととして、硫酸アンモニウム沈殿工程、2つのクロマトグラフィー工程ハイドロキシアパタイトおよびゲル浸透クロマトグラフィーおよび全ての20°Cの維持工程を排除した。撹拌セルおよび透析などのスケールアップできない工程の使用も除去し、タンジェンシャルフロー濾過TTFに置き換えた。プロセス2において明らかであったそしてTFFの使用により排除された産物の不安定性の問題は、プロセス3の20Lスケールの稼動においては見られなかった。しかしながら、プロセス3に関連する夾雑物プロフィールはクロストリパインおよびゼラチナーゼが主要な成分であったプロセス2とは異なっていた。最も注目すべきこととしては、SDSPAGEにより、40kDa、55kDaおよび2つの90kDaの夾雑物1つはAUXIと共に精製され、もう1つはAUXIIと共に精製されるが検出された。これらの新しい夾雑物の結果として、QCアッセイはプロセス3の全ての不純物を溶解しなかったため、いくつかのQCアッセイRPHPLCおよびSECHPLCなどの使用が制限された。確立されたQCアッセイをプロセス純度の測定に使用できないことにより、Qセファロースカラム由来の物質がさらなる精製に適切であることを確立するための方法を規定する必要性が生じた。Qセファロースカラム上のAUXIおよびAUXIIの産物から夾雑物が明白に分離されないためにこのことが必要であり、そのために、遡及的に解析され得る別々の画分中に溶出された物質を回収することが必要であった。SDSPAGEにより分析が行なわれ、20Lランスルーについての規定をプールすることが、標準的な1μgの負荷を使用した産物に対する不純物の相対的な染色強度の実験に基づいた。SDSPAGEの遡及的なデンシトメトリー解析により、生成物純度の相対的なパーセントに基づいて記載される基準をプールすることが可能になった。200Lのデモンストレーション稼動由来の物質を使用したさらなるデンシトメトリー解析により、確立される標準化された方法およびアッセイの変数の近似法が可能になった。これにより、第1のGMPの一連の動作において実行される、処理中の画分をプールするための同意された手法が可能になった。プロセスの記載に加えて、バッファの安定性および処理中の試料の安定性試験を記載する予備的な作業が、プロセス3に関連するいくつかの不純物の最初の特徴づけの他に提示される。プロセス3は3つの主要な分野においてプロセス2と異なった。第1に、硫酸アンモニウム沈殿工程およびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程が除かれ;第2に、ゲル浸透クロマトグラフィーGPC工程が排除され、第3に、全てのバッファ交換工程がタンジェンシャルフロー濾過により実行された。沈殿工程を、クライアントの推奨により疎水性相互作用クロマトグラフィーHICの使用に置き換えた。この工程の開発により、産物捕捉それにより濃縮工程として機能するおよびいくつかのタンパク質および色素夾雑物の除去についてのHICの実行の成功がもたらされた。その後、HIC工程はまた、dsDNAのレベルを減少するように示された。プロセス開発プログラムの結果として、HICの導入およびMustangQ工程の包含により、硫酸アンモニウム沈殿工程およびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程の両方の必要性が取り除かれた。全体の効果は、最前面の産物の捕捉を簡潔化すること、およびプロセス2に関連する潜在的な保持工程を除去することであった。この後者の点は、沈殿工程により生じたペレットが処理の前に20°Cで保持され得るために、下流の精製よりも前に以前の発酵が評価され得るという重要性を有した。HIC工程後、タンジェンシャルフロー濾過TFFを使用して、産物はバッファ交換された。これは、30kDa分子量カットオフMWCO膜を使用し実施され、プロセス2に使用された透析手順に置き換えた。存在する場合にAUXII由来として検出された凝集夾雑物は、アニオン交換クロマトグラフィー工程IEXの間に除去されるようであった。結果として、AUXIおよびAUXII中間体の両方がIEXに続く凝集物の特定の間に存在したので、GPC工程が排除された。最終的に、AUXIおよびAUXII中間体の最終濃度および形成は、撹拌セルを使用した以前の方法に変わってTFFを使用して実施された。全体的に、プロセス3は、プロセス2よりもスケールアップおよび検証し簡単なプロセスを示した。また、消費コストの減少は、ハイドロキシアパタイトおよびゲル浸透メディウムの必要性の排除によって、ならびにロイペプチンを必要とする工程の数の減少によって明らかなものとなった。プロセス3についての精製スキームの概要が図46に示される。20Lスケールでの非GMPデモンストレーション稼動適当な質の物質がこの改変された20Lスケールのプロセスを使用して生成され得るかどうか実証するために、プロセス開発の実験室において、プロセス3を20Lスケールで実施した。処理のための重要な要件は、可能な場所でならどこででも冷却される工程を実施すること、および該手順の重要な段階でシステインプロテアーゼインヒビターであるロイペプチンを包含することによって、潜在的なプロテアーゼ活性を制限できる能力であった。フィードストックが200L発酵液PP3から生成されたため、全量20Lの発酵液濾過物を処理した。発酵ならびにその後の採取および濾過の詳細を別の報告に記載する。発酵液濾過物のMustangQ処理02μm濾過後、およそ22Lの発酵液上清を、上述のようにMustangQクロマトグラフィーカプセルに負荷した。最初の10LStedimバッグの内容物が2番目のものよりも色素が少なく見えたので、ある程度の可視色素夾雑物緑色茶色が第1の10Lの濾過の間にMustangQカプセルにより除去されたようであった。MustangQカプセルのdsDNAを除去する能力は、MustangQ試料の前後のピコグリーン解析によりこの工程を通じてモニターされた表41。プロセスにおいて、解析は、小スケールで生成された以前のデータとは異なり、MustangQ工程でバルク核酸除去は明白ではなかったことを示した。そのため、この工程のエラー強さおよび適用にはさらなる調査が必要である。疎水性相互作用クロマトグラフィーHICHICの使用は、精製において3つの機能を果たした。第1に、条件が、コラゲナーゼが樹脂に結合するように特定されたため産物の体積は減少した。第2に、いくつかの色素およびタンパク質夾雑物がこの段階で除去され、第3に、この稼動のピコグリーン解析がdsDNAの減少を示した。HIC工程は、MustangQ処理後に発酵液から直接処理された上清を使用して実施され、結果として維持工程は硫酸アンモニウム沈殿としてプロセス2に明白であるプロセス3には存在しなかった。コラゲナーゼがHICカラムに結合する条件を提供するために、MustangQ工程由来の産物20Lを3M硫酸アンモニウム溶液で希釈して終濃度1Mとした。濾過後、産物をカラムに負荷し、2工程アイソクラチック溶出を使用して溶出した。HIC負荷物質のタンパク質濃度は正確に測定することが困難であり、2つの方法で推定された。第1に、硫酸アンモニウムの添加前に該物質についてBradfordアッセイを行なった。これは、アッセイを妨害することが知られている発酵メディウム中の色素の寄与を標準化するために、希釈していない物質を使用して行なった。第2に、推定は1mL当りのカラム樹脂の負荷した発酵メディウムの体積に基づいた。カラム負荷量を、Bradfordアッセイにより全タンパク質mL樹脂中59mgと推定するか、あるいは樹脂1mL当りの発酵メディウムの約13mLであると推定した。カラムから溶出された標的タンパク質の全量の推定値は、UVを使用して34gであると測定された表42参照。HIC負荷中に存在した全タンパク質量が9gであると仮定すればBradfordアッセイ、これは38回収と同等であると考えられた。しかしながら、発酵メディウム成分を含有する試料についてのアッセイの不正確さのために、この値は相対的測定値と見なされるだけであった。HIC負荷濃度を推定するための代替的な方法を、デンシトメトリーを用いて決定したが、この推定により、全タンパク質の推定値ではなく、コラゲナーゼ含量が得られ得ることが認識された。このアプローチを使用すると、全コラゲナーゼは360mgLと推定され、AUXIIに対するAUXIのおよその比は4060と推定された。このデータを用いて、HIC負荷において予測される全コラゲナーゼは72gであり得、47の工程収率がもたらされる。HIC工程から得られたクロマトグラムを図70に示す。可視的色素は、フロースルーにおいて明白であるとともに、カラムに結合させた。カラムを平衡化バッファーで洗浄してフロースルー夾雑物を除去後、ピーク1を、中間濃度の硫酸アンモニウム溶液を用いて溶出した。このピークは、タンパク質夾雑物を含有することが示されたが、この段階で少量のAUXIIもまた溶出された。生成物のこの損失は予測され、以前に見られた。純度を損なうことなく生成物の損失量を最小限にするため、ピーク1除去のための溶出容量を5カラム容量に設定した。次いで、大部分の生成物を含有するピーク2を、硫酸アンモニウムを含まないバッファーを用いて溶出した。ピーク2は、溶出バッファーのカラム容量の3/4がカラムに適用された後に回収が開始するようにプログラムされたクロマトグラフィー方法により単一のプールとして回収された。次いで、合計4カラム容量が回収された後、回収を終了させた。該方法のこの段階での生成物の潜在的なタンパク質分解を最小限にするため、ロイペプチンをHIC後の溶出液に添加し、物質を2~8°Cに保持した。HIC後の溶出液の保持時間は、2日間の持続期間であった。タンジェンシャルフロー濾過1生成物の容量を低減させるため、およびバッファーを陰イオン交換カラムへの結合に適した条件に交換するため、HIC後に30kDa膜を用いたTFFを導入した。特に重要なことは、IEX負荷試料の導電率が18mSとなるような硫酸アンモニウムの充分な低減であった。ダイアフィルトレーションバッファーを冷却し、タンパク質分解の可能性を低減するためにロイペプチンを使用前に添加した。この工程の過程においてタンパク質の損失は推定されなかったが、これは、TFF1前物質内の色素の存在による該方法のこの段階でのタンパク質濃度の不正確を反映し得る。およそ975の全タンパク質が保持物質中に回収され、最初の膜の濯ぎでさらに2048mgが回収された。合わせた保持物質からの全タンパク質の濾過および濯ぎを、物質を一晩2~8°Cで保持する前にTFF工程の最後に行なった。SDSPAGE分析により、TFF工程前後で有意差は検出されなかったことが示された。QセファロースクロマトグラフィーQセファロースカラムに樹脂1mLあたり最大容量の5mg全タンパク質を負荷した。その結果、TFF工程の利用可能な物質すべてが、この工程が利用されたわけではなかった。Qセファロースカラムにより、予測どおり、AUXIおよびAUXIIコラゲナーゼが分離された。AUXII溶出の開始は、およそ136Bに始まり、57mSのカラム後導電率に等しくなった。吸光度値がピーク高さの25に低下するまで、AUXIIの溶出により画分を回収した。小さなピークがAUXII溶出後、およそ8mSで溶出された。小規模実験の以前のこのピークの方法中の分析において、これは、AUXII由来凝集物質であることが示された。AUXI溶出の開始は、およそ27Bであった。以前のように、吸光度が必要とされる25値に低下するまで、100mL画分を回収した。回収された各AUXIおよびAUXII画分を、SDSPAGEによって分析し、デンシトメトリーに供した。デンシトメトリーは遡及的に行なったため、画分のプールに関する決定は、Colloidalblue染色による可視的夾雑物レベルの経験に基づいた。Auxiliumと合わせると、画分6~12はAUXII生成物についてプールされ、画分19~26はAUXIについてプールされた。Qセファロース実施からプールされた物質中に存在するタンパク質の工程収率および濃度が、表42に含まれる。20Lデモンストレーション実施のIEX後AUXIおよびAUXII生成物のSDSPAGE分析により、SDSPAGEによる可視的夾雑物はほとんど示されなかった。また、検出された夾雑物は、以前の小規模実験に従って検出されたが、夾雑物の分離に顕著な差が見られ、これは、小規模モデルではより明確なものであるようであった。これらの夾雑物はまた、クロストリパインおよびゼラチナーゼが主要成分であったプロセス2で同定されたものと異なった。その結果、プロセス2に対して開発されたQCプロトコルは、プロセス3に伴う新たな夾雑物の検出に対して最適化されなかった。プールされた物質の遡及的デンシトメトリーにより、AUXIは951およびAUXIIは994の純度が推定された。しかしながら、現在、≧97の純度規格がRPHPLCによって示されているが、デンシトメトリーを用いた最終生成物規格は確立されていない。AUXIおよびAUXIIの濃度およびバッファー交換Qセファロースカラムから分離されたAUXIおよびAUXII生成物を、30kDa膜を用いたTFFによって別々に処理した。この工程は、最終生成物中のロイペプチンを除去低減するため、補正バッファー中に中間体を配合するため、必要とされる標的タンパク質濃度09~11mgmLを達成するために必要とされた。合計799mgのAUXIIおよび860mgのAUXIを、175mgmLの標的濃度に濃縮した。この理論的濃度は、濃縮工程中に生成物の損失はないと仮定するのに必要とされる計算された容量減少に基づいた。次いで、必要とされる配合バッファー中にダイアフィルトレーションを行ない、最小容量のTFF系で膜を洗浄し、全量を濃縮物と合わせ、必要とされる標的濃度09~11mgmLを達成した。濾過後、合計8195mgのAUXIIおよび7970mgのAUXIが利用可能であった。両方の場合において、大部分の生成物が保持物質中に回収され、AUXIIは954およびAUXIは831と推定された。膜の濯ぎによってもたらされたさらなる物質は、AUXIIおよびAUXIで、それぞれ、153mgおよび896mgと推定された。製剤原料への中間体の混合およそ200mgの各中間体を合わせ、400mgの製剤原料を得た。次いで、これを濾過し、およそ26mgを試験のためにQCに提供した。AUXI、AUXII中間体および製剤原料のQCの結果を表43に示す。製剤原料およびAUXII中間体に関するすべての試験は、必要とされる規格に合格した。しかしながら、中間体AUXIの効力の試験は、指定された範囲内ではなかったが、他のすべての試験は合格した。AUXI効力の結果を除き、これらのデータは、プロセス3により、20L規模で精製された場合、必要とされる規格の物質が作製され得ることを示した。QC試験に加えて、20Lデモンストレーション実施からの物質を、KBIBioPharmaIncでの方法の検証に利用した。クライアントの要望時、200mgの製剤原料をドライアイスを入れて、製剤原料および製剤の方法の検証のためにKBIに輸送した。後者の試験は、KBIでの製剤原料の凍結乾燥後に行なった。また、25mgの各中間体を、分析方法の検証のためにKBIに供給した。20Lデモンストレーション実施の個々の工程収率を表42に示す。利用可能な物質すべてをQセファロースカラムに負荷したデータの外挿は、この方法のランスルーrunthroughからの利用可能な製剤原料の最大総量が16gであることを示した。これは、HICカラムへの負荷に利用可能な全タンパク質の量の最初の推定値9gに基づく、およそ178の全方法収率に等しい。Qセファロースカラムへの負荷に対する制限により、利用可能な中間体がすべて混合されて製剤原料が形成された場合、最大14gの製剤原料が現在のランスルーから利用可能であった。試料安定性試験20Lデモンストレーション実施中、試料を重要なプロセス点で得た。デモンストレーション実施は連続的な方法として行なったため、GMPバッチで予測される保持時間中の方法内物質の安定性を評価する試みを行なった。GMPで予測された実施持続期間の延長は、方法工程間の装置クリアランスデータを得るための要件により認識された。方法過程の物質を2~8°Cで、GMP製造で予測されたおよその持続期間保持した。また、GMP製造で予測されたものの2倍である長時間、試料を保持した。得られた試料の説明を、それぞれの保持時間とともに表44に示す。20Lデモンストレーション実施での処理時間を表45に示す。すべての試料をSDSPAGE、RPHPLC、SECHPLCおよびUV分析のためにQCに供した。全体的に、結果により、純度、分解および凝集に関して、最初の保持時点において、生成物における検出可能な劣化はないことが示された。しかしながら、アッセイのいくつかは、低分子量成分が8SDSPAGEによって検出され得ず、プロセス3に伴う40kDa、55kDaおよび90kDa夾雑物を検出するためのRPHPLCアッセイが開発されていなかったため、制限されることが認識された。また、発酵試料中におけるUVおよびSECHPLCの使用などのいくつかのアッセイは、粗試料にあまり関連しなかった。これらの制限にもかかわらず、生成物プロフィールにおいて唯一検出された変化は、第2の保持時点で、Qセファロースカラムから得られたAUXII方法内試料について同定された。これにより、第5日目と第12日目の間での凝集物レベルの増加が示されたが、この増加はわずか0~062であった。第2の安定性研究は、20Lデモンストレーション実施中の製造時点で得られ、20°Cで保存された方法内保持物において行なった。この研究では、試料を解凍し、室温および37°Cでインキュベートし、4~12SDSPAGE分析によってモニターし、夾雑物の全分子量範囲が評価されるようにした。これらのデータは、Qセファロース陰イオン交換前の試料が分解されやすいことを示した。コラゲナーゼAUXIおよびAUXIIの分離後、試料は、比較的安定なようであり、SDSPAGEによると時間ゼロの試料に匹敵するようであった。総合すると、両方の研究は、温度が2~8°Cに維持されることを条件として、方法内物質は、調査された保持時間中での処理中に分解することが予測されないことを示す。これにより、ロイペプチンおよび温度制御の使用がGMPにおいて予測される持続期間での処理中の生成物分解のレベルを制限するのに充分な信頼レベルがもたらされる。バッファー安定性研究表46に示すバッファー試料を20Lデモンストレーションから確保し、2~8°Cで保存後に再試験した。バッファーのpH、導電率、温度および外観を、終了時点および保存12~13日後に記録した。この研究の結果を表47に示す。pHおよび導電率の値に小さな差が観察されたが、これは、元のバッファーと試験された保持物間の温度の差によるものであり得る。特に、HICバッファーは、導電率および温度において最大の変動を示した。その結果、バッファー安定性に関するさらなる研究は、すべてのパラメータを記録するための許容された温度範囲の規格を含むべきである。すべての場合において、バッファー保持物は、時間ゼロおよび必要とされる保持時間後、外観が透明であった。N末端配列決定による夾雑物同定SDSPAGE分析により、3種類の主な不純物がプロセス3で検出された。これらは、AUXIおよびAUXIIコラゲナーゼと共溶出されるようであり、Qセファロースカラムから溶出されたピークの分別によってのみ分離された。夾雑物は、SDSPAGEにおけるその見かけ分子量によって、40kDa、55kDaおよび90kDa夾雑物に割り当てられた。SDSPAGEからのバンドの切除後、特定の夾雑物の上昇したレベルを有する画分をN末端配列決定に供した。配列分析は、20Lデモンストレーション実施から単離された55kDaおよび40kDa夾雑物の両方について良好であった。AUXIに伴う55kDa夾雑物バンドのN末端は、コラゲナーゼAUXIのColG配列の領域に適合するが、AUXIIの40kDa夾雑物バンドは、コラゲナーゼAUXIIのColH配列の領域と同一であることが示された。以前の試みは、AUXIおよびAUXII生成物の両方に伴う90kDaバンドを配列決定するためになされた。AUXI生成物に伴う90kDa夾雑物の配列決定は、同定物がAUXI配列のN末端と相関したという点で良好であった。対照的に、AUXIIに伴う90kDa夾雑物の完全な配列を得ることは可能ではなく、これは、2つの90kDa夾雑物が異なる生成物であることを示唆した。プロセス3に伴う主な夾雑物は、関連生成物のようであり、AUXIのN末端切断生成物およびAUXIIのN末端切断生成物またはAUXIのC末端切断生成物のいずれかと同定された。これらの夾雑物は、プロセス2で同定されたものと異なるため、中間体および製剤原料の規格に用いたQCアッセイは、該アッセイ開発がプロセス2あたりで始まったため、新たな夾雑物は分離されなかった。特に、標準純度アッセイは、40kDaおよび55kDa夾雑物のレベルを検出するのに使用することができなかった。デンシトメトリー分析20Lデモンストレーション実施プロセス3に伴う40kDa、55kDaおよび90kDa夾雑物を同定し、SDSPAGEによって分離した。これらの夾雑物は、Qセファロースカラムから溶出された画分中に明白に検出され、ピークプロフィールの立ち上がりおよび立ち下がりで溶出するようであった。さらなる精製のためにどの画分を含めるか、または排除するかの決定は、Colloidalblue染色ゲル上の夾雑物および生成物の染色の相対強度の経験に基づいた。これを主観性の低い推定とするため、デンシトメトリーを用い、Qセファロース工程後の画分に対する特定のプール基準を決定した。デンシトメトリーは、このアッセイにより、プロセス3に伴う新たな夾雑物が分離され得ないため、現行の純度のためのQCアッセイよりも好ましく使用された。20Lデモンストレーション実施からのQ後画分のデンシトメトリーデータIEX後画分の2つの独立した分析のデンシトメトリー値を平均し、表48に示す。画分1~12およびピーク1の最後の25は、AUXIIならびに40、75および90kDaの随伴する夾雑タンパク質を含有する。画分13~27およびピーク2の最後の25は、AUXIならびに55および90kDaの随伴する夾雑物を含有する。デンシトメトリー分析なしでSDSPAGEに基づいて選択された画分のプールをハイライトで示す。200Lデモンストレーション実施のQ後画分のデンシトメトリーの概要の記録デンシトメトリー分析の概要GMP実施のためのIEXBMRにおいて記録され得るプール基準を確立するため、200L操作実施からのIEX後画分を多数回分析した。このプール基準は、操作実施で作製される物質の質はGMP物質に適切である、およびデンシトメトリー方法の近似値は許容範囲であるというに仮定に基づく。目的が、GMP実施においてより高品質の物質を作製することである場合、プール基準の規格は、改定される必要がある。IEXからのプールの規格全部で、200L操作実施からの試料は6回分析され、平均データを表49に示す。操作実施でプールされた画分を赤でハイライトで示す。この分析から、以下のプール基準:885以上の純度の任意の画分がプールされ得る、単一の不純物を10以上有する任意の画分はプールされ得ない、プールされる画分は連続画分由来でなければならない、プールの計算理論純度は、AUXIでは理論純度93以上AUXIIでは理論純度96以上でなければならないが確立され得る。この最後の点は、利用可能な画分中の全タンパク質が推定された200L操作実施からの推定値に基づいた。この分析のデータを表50に示す。注:これらの基準から、AUXIIピークの画分7が排除され得る。アッセイ変動200L操作実施からのIEX後画分のデータから、以下のレベルの精度が推定された。生成物では、CVは、21および23と計算された。したがって、プールのための886の純度規格は、863~909の範囲であり得る。不純物では、CVはずっと大きく、範囲は不純物に応じて185~337と推定された。その結果、単一の不純物を10以下有する画分を排除する純度規格は、実際には663~1337の不純物範囲を有する画分であり得る。したがって、生成物の純度の値は、プール規格に最も信頼性のある値である。デンシトメトリーによる最終物質の推定純度また、200L操作実施での最終物質のデンシトメトリー分析は、デンシトメトリーによって測定され、以下のとおりであった。AUXI=960AUXII=987DS=976方法の標準化反復分析の過程において、作業者間の誤差およびゲル間の変動を最小限にするため、デンシトメトリー方法を標準化し、SOPに記録される。最も注目すべきは、ゲルの各レーンの全タンパク質の標準的な負荷は1μgである。各生成物ピークから最大16の画分が分析用に選択される。これにより、デンシトメトリー分析用のゲルの数が4に制限される。選択された16の画分は、各ピークについて最後の画分で回収が開始され、前方で連続的に作業される。これにより、平均純度の計算値の精度が確保されることになる。Qセファロース後画分に対するGMPプール基準イオン交換BMRにおいて指定されるべき詳細A以下のプール基準が、デンシトメトリーによって分析されたAUXIおよびAUXIIピーク両方からの画分に対して指定されるべきである。各生成物ピークから最大16の画分が分析に選択される。これにより、デンシトメトリー分析用のゲルの数が4に制限される。9000以上の純度の任意の画分がプールされ得る。単一の不純物を900以上有する任意の画分はプールされ得ない。プールされる画分は連続画分由来でなければならない。B以下のプール基準が、SECHPLCによって分析されたAUXIIピークからの画分に対して指定されるべきである。SECHPLCに供される試料の最大数は10であり、このピークで回収された最後の画分および前方の連続画分由来でなければならない。200以上の凝集を有する任意の画分は、プールされ得ない。情報のみのために記録されるべき詳細A推定されたプールの理論純度は、情報のみのために計算されるべきであり、AUXIでは、理論純度9300以上AUXIIでは、理論純度9700以上であることが予測される。B05g未満の画分を排除する基準が将来使用され得る場合、確立するためには各プール中の最少量のタンパク質が使用され得る。CAUXIピークの画分は、RPHPLCに供されるが、遡及的に情報のみのために分析される。これらのデータは、プール基準の一部とみなされない。プールに対して予測される影響以下は、表51に示す平均データセットから計算され、新たなプール基準に従う収率および画分選択に対する効果を反映する。2データセットの比較は、平均データセットについて、以下の遡及的プール基準が記録されることを可能にしたが、20L実施において実際にプールされたものから、さらなる1つの画分が含まれ得る。AUXI≧87の純度を有するが単一の不純物を≧10有さないすべての画分をプールする。AUXII≧94の純度を有するが単一の不純物を≧4有さないすべての画分をプールする。20Lデモンストレーション実施からの最終物質の分析からのQCデータにより、RPHPLCによって、AUXII中間体は994純粋であり、AUXI中間体は991純粋であり、製剤原料は999コラゲナーゼであることが示された。したがって、プール方法について指定された基準は、最終物質に対する放出規格に合格する物質をもたらすことが予測され得る。200Lデモンストレーション実施前記の20Lデモンストレーション実施で確立された基準は、200L操作実施で行なわれたものと異なった。この場合、プールは、≧865の純度を有するが、単一の不純物夾雑物を≧10有さない画分としてのAUXIおよびAUXII生成物の両方について指定された。SECHPLCによって検出された≧2の不純物レベルを有するAUXII試料もまた排除した。得られたAUXIAUXII中間体および製剤原料もまた、標準化された方法を用いてデンシトメトリーによって分析し、単一のゲルで3回の分析に基づいて、以下の推定純度:AUXI=960;AUXII=987;DS=976を有することが示された。また、中間体および製剤原料のQCで測定された純度は、RPHPLCアッセイによる規格に合格することが示された。その結果、200L操作実施に従うプール基準は、現在利用可能な分析方法に基づいて適当な純度の生成物の送達において良好であった。材料および方法MustangQクロマトグラフィー装置:MustangQクロマトグラフィーカプセル、60mLConductivityandpHMeter4330化学物質塩化ナトリウム水酸化ナトリウム溶液Trisメチルアミン硫酸アンモニウムHyclone注射用水高品質水60mL床容量のMustangQクロマトグラフィーカプセルを、30mL分の流速で30分間1MNaOHで消毒した。次いで、1MNaClを用いてカプセルを同じ時間および流速で予め調整した。カプセルを2LのMustangQ平衡バッファーにより60mL分の流速で平衡化した。pHが≦8であることが確実であるように、出口流れを確認した。200L発酵液PP3の上清を、540mL分の流速でカプセルに負荷した。カプセルの最大推奨操作流速は600mL分であった。濾過した物質を、2~8°Cで一晩、2×10LStedimバッグ中に保存した。疎水性相互作用クロマトグラフィー装置UnicornV501ソフトウェアがインストールされたAKTAPilotVantageS130カラムConductivityandpHMeter4330Sartopore208045μmフィルターカプセルMedicalRefrigerationUnitMP150化学物質:フェニルセファロース6FFlowsub水酸化ナトリウム溶液塩化ナトリウムトリスメチルアミン硫酸アンモニウムロイペプチンHyclone注射用水高品質水HICカラム充填2400mLのフェニルセファロース6FFLowSubスラリーを3時間置き、エタノールを除去し、1800mLのWFIと交換した。媒体を再度スラリー化し、置き、WFIで1回および1800mL200mMNaClで2回洗浄し、洗浄と洗浄の間は一晩置いた。媒体を1800mL200mMNaClで再度スラリー化し、カラムに注入し、1時間置いた。アダプターを樹脂床の約1cm上まで下げ、媒体を200mMNaCl中に400mL分の流速で10分間充填した。この充填流速を、GMPに利用可能なKprimeシステムの最大操作流速と同等であるとして利用した。アダプターを床の上面まで下げ、カラムを192cm時で10分間充填した後、アダプターを樹脂の上面にねじ込み、192cm時でさらに10分間充填し、この間、樹脂の圧縮は観察されなかった。充填試験は、AKTAPilot方法:HIC1500mLPackTestを用いて行なった。このため、カラムを1カラム容量の200mMNaCl含有WFIで平衡化し、15mLの1MNaCl含有WFIを用いて313mL分の流速で充填試験した。カラムに2CVのWFIを流し、2CVの10mMNaOHで保存した。充填カラムは、12の非対称度、2659プレートメートルのプレートカウント、1525mLのCVおよび122cmの床高さを有した。カラム消毒および平衡化フェニルセファロース6FFカラムを05MNaOHで60分間消毒し、2カラム容量のWFIで洗浄し、5CVの10mMTris、pH8の後、5CVの10mMTris、10M硫酸アンモニウム、pH8で平衡化した。HIC負荷の調製1348kgの30M硫酸アンモニウム、10mMTris、pH8を、MustangQ処理後の221kg発酵濾液に添加した。005m2フィルターカプセルによる濾過工程の前に濾液を5分間混合した。濾過した物質を、使用まで氷上に保存した。HICカラム実施HIC実施は、2~8°Cに維持した冷却バッファーを使用し、150cm時の一定の線形流速で行なった。30Lの原液を、2CVの10mMTris、10M硫酸アンモニウム、pH8で予め平衡化した1525mLのフェニルセファロース6FFカラムに負荷した。10CVのHICバッファーAで未結合物質をカラムから洗い流した。次いで、カラムを5CVの10mMTris、03M硫酸アンモニウム、pH8で洗浄し、結合タンパク質を10CVの10mMTris、pH8で溶出した。溶出バッファーの最初の067CVを廃棄し、4CVのHIC後プールを回収した。ロイペプチンをHIC後プールに10mMロイペプチン、10mMTris、pH8のストック溶液から200μMの最終濃度まで添加した。タンジェンシャルフロー濾過によってさらに処理する前に、混合溶液を2~8°Cで2日間保存した。タンジェンシャルフロー濾過工程1装置ProFluxM12TFFシステムConductivityandpHmeter4330Sartopore208045μmフィルターカプセルPellicon2MiniFilter01m230kDaMWCOPES膜MedicalRefrigerationUnitMP150材料化学物質水酸化ナトリウム溶液トリスメチルアミンロイペプチンHyclone注射用水高品質水システム設定ProFluxM12TFFシステムを製造業者の使用説明書に従って設定し、2つのPellicon2MiniFilter30kDaMWCOPES膜を使用し、05MNaOHで60分間消毒し、使用まで01MNaOH中に保存した。システムを排水し、14LのWFIを流し、正常水透過率は、25°Cで、15psigの膜間圧で、23Lm2時psiと測定された。システムに05L10mMTris、pH8を流し、1Lの同じバッファーで10分間で平衡化した。透過液の導電率およびpHを測定し、ダイアフィルトレーションバッファーのものに対して使用前に膜が平衡化していることが確実であることを確認した。濃縮およびダイアフィルトレーション200μMロイペプチンを含有する冷却ダイアフィルトレーションバッファーを使用し、濃度およびダイアフィルトレーション工程を行なった。使用直前にTFFシステムに1Lの冷却バッファーを流した。2LのHIC後物質をTFFシステム貯蔵槽にポンピングし、膜を条件設定するために背圧なしで10分間再循環させた。貯蔵槽上のレベルセンサーを12Lに設定し、すべての物質がシステムに入るまで、HIC後物質を15psigのTMPで濃縮した。透過液を回収し、分析のために2~8°Cで保存した。入口チューブをダイアフィルトレーションバッファーに接続し、物質のダイアフィルトレーションを15psigのTMPでおよそ85ターンオーバー容量で行ない、貯蔵槽内の物質の容量を12Lに維持した。5、7および85TOV後に透過液の導電率およびpHを測定し、ダイアフィルトレーションバッファーのものに対して確認した。保持物質をシステムから排水し、2~8°Cで保存した。250mLのダイアフィルトレーションバッファーを貯蔵槽にポンピングし、背圧なしでシステムに10分間再循環させてシステムを濯ぎ、排水し、濯ぎを繰り返し、両方の濯ぎ液を別々に2~8°Cで保存した。保持物質および濯ぎ液のタンパク質濃度を測定し、最初の濯ぎ液を保持物質に添加した。次いで、このTFF1後物質をSartopore208045μmフィルターカプセルにより濾過し、Qセファロースイオン交換クロマトグラフィーによるさらなる処理まで、2~8°Cで一晩保存した。イオン交換クロマトグラフィー装置:Unicorn501ソフトウェアがインストールされたAKTAPilotConductivityandpHMeter4330VantageS90カラムMedicalRefrigerationUnitMP150化学物質水酸化ナトリウム溶液塩化ナトリウムトリスメチルアミン塩化カルシウム2水和物ロイペプチンQセファロースHPHyclone注射用水高品質水カラム充填および調製AKTAPilotクロマトグラフィーシステムを用い、VantageS90カラムをQセファロースHP媒体含有WFIで充填し、10cm床高さを有し、したがって、620mLのカラム容量を有する充填カラムを得た。充填は、製造業者の指示に従ったが、210cm時の充填流速および028MPaの圧力限界に等しい課されたVantageカラムの圧力限界で行なった。充填後、カラムを2CVの02MNaClで平衡化し、100cm時の流速で1CVの1MNaClを用いて充填試験した。充填カラムは、16の非対称度の12605プレートメートルのプレートカウントを有し、これは、媒体の規格内であった。必要なときまで、カラムを10mMNaOH中に保存した。使用前、Qセファロースカラムを15カラム容量のWFIで洗浄して保存バッファーを除去し、15CVのWFIを再度流す前に05MNaOHにより60分間40cm時で消毒した。次いで、製造業者の使用説明書に従って、2CVの10mMTris、3mM塩化カルシウム、pH8、続いて、2CVの10mMTris、3mMCaCl2、360mMNaCl、pH8、最後に5CVの10mMTris、3mMCaCl2、pH8をカラムに充填し、平衡化した。カラム実施試料をカラムに負荷する直前、冷却した10mMTris、3mMCaCl2、200μMロイペプチンpH8でカラムを再度平衡化した。255mgmLの濃度の1216mLの冷却したTFF1後物質を、100cm時の流速でカラムに負荷した。これは、5mg全タンパク質mL媒体のカラム負荷に等しい。生成物の負荷後、3カラム容量のIEXバッファーAでカラムを洗浄し、10mMTris、3mMCaCl2、360mMNaCl、200μMロイペプチン、pH8により、20CVで0~40溶出バッファーの勾配で、702ml分の流速でタンパク質を溶出した。280nmおよび260nmで溶出をモニターし、AUXIIおよびAUXIを含有する2つの生成物ピークで100mL画分が回収された。画分回収は、ピークの急増部から開始し、立ち下り端上のピーク高さの25まで継続した。AUXIIピークで合計12の画分が回収され、AUXIピークで15の画分が回収された。QセファロースHPクロマトグラフィーは、18~23°Cの標準的な研究温度で行なったが、使用したバッファーは予め冷却した。SDSPAGE分析から結果が得られるまで画分を2~8°Cで保存した。画分6~12はAUXIIコラゲナーゼとしてプールされ、容量は、683gと測定され、UV分析による濃度は、117mgmLと測定された。画分19~26は、AUXIコラゲナーゼとしてプールされ、容量は796gと測定され、UVによる濃度は108mgmLと測定された。タンジェンシャルフロー濾過工程2装置:ProFluxM12TFFシステムConductivityandpHmeter4330Pellicon2MiniFilter01m230kDaMWCOPES膜90mmFilterUnit02μmPES膜MedicalRefrigerationUnitMP150材料化学物質水酸化ナトリウム溶液トリスメチルアミンスクロースロイペプチンHyclone注射用水高品質水FrensiusKabi注射用水システム設定ProFluxM12TFFシステムを製造業者の使用説明書に従って設定し、1つのPellicon2MiniFilter30kDaMWCOPES膜を用い、05MNaOHで60分間消毒し、使用まで01MNaOH中に保存した。システムを排水し、14LのWFIを流し、正常水透過率は、AUXIに使用された膜では195Lm2時psi、および25°CでAUXIIに使用された膜では、15psigの膜間圧で25°Cで145Lm2時psiと測定された。システムに05Lの10mMTris、60mMスクロース、pH8を流し、1Lの同じバッファーで10分間平衡化した。透過液の導電率およびpHを測定し、配合バッファーのものに対して確認した。濃縮および配合濃縮およびダイアフィルトレーション工程を、AUXIおよびAUXIIの各IEX後プールにおいて別々に行なった。すべての工程は、2~8°Cに維持した冷却配合バッファーを用いて行なった。使用直前に、TFFシステムに1Lの冷却バッファーを流した。IEX後プールをTFFシステム貯蔵槽にポンピングし、10ポンプ速度で、膜を条件設定するために背圧なしで10分間再循環させた。貯蔵槽のレベルセンサーをおよそ400mLに設定し、貯蔵槽内の容量がおよそ360~390mLに減少するまで、AUXIまたはAUXIIプールを15psigのTMPで濃縮した。標的容量の減少は、濃度操作中のタンパク質の損失がないと仮定される生成物の理論的濃度175mgmLの達成に基づいた。透過液を回収し、分析のために2~8°Cで保存した。ダイアフィルトレーション操作のため、入口チューブを配合バッファーに接続し、15psigのTMPでダイアフィルトレーションを行なった。AUXIIでは、およそ12ターンオーバー容量、およびAUXIでは85TOVを行ない、貯蔵槽内の物質の容量を約400mLに維持した。AUXIIでは12TOV後、AUXIでは6、7および85TOV後、透過液の導電率およびpHを測定し、配合バッファーのものに対して確認した。保持物質をシステムから排水し、2~8°Cで保存した。250mL配合バッファーを使用し、システムに10分間再循環させることにより、膜から残留生成物を洗浄した。濯ぎ溶液を排出後、第2の洗浄を行ない、濯ぎ液1および濯ぎ液2の両方を2~8°Cで保存した。保持物質および濯ぎ液のUVタンパク質含量の測定後、第1の濯ぎ液を保持物質に添加し、混合し、混合物のUVタンパク質濃度を測定した。AUXIIでは、122gの第2の濯ぎ液もまた保持物質濯ぎ液1に添加し、11mgmLの理論的AUXII濃度を得た。AUXIでは、94gの第2の濯ぎ液を物質に添加し、11mgmLの理論的AUXI濃度を得た。AUXIおよびAUXII物質の両方をClassIIフード内で1LNalgene02μmフィルターユニットによって濾過し、濾過後のタンパク質濃度を測定した。AUXIおよびAUXII中間体を2~8°Cで保存した。タンパク質濃度測定吸光度装置DU800SpectrophotometerUVspectrophotometryによって、220と330nmの間で試料のUVスキャンを行なうことにより方法内試料を分析した。適切なバッファーをブランクとして使用し、試料のスキャンの前にバッファーブランクのスキャンを行なった。必要であれば、A280<10AUが確保されるように試料を同じバッファーで希釈した。BeerLambert則、c=Abε式中、Aは吸光度であり、bはパス長であり、εはタンパク質の吸光係数であるに従ってタンパク質濃度を測定した。AUXIでは148mg1cm1mL、AUXIIでは1576mg1cm1mLおよびAUXIAUXII混合物では1428mg1cm1mLの吸光係数を使用した。Bradfordアッセイ材料:凍結乾燥BSA化学物質タンパク質アッセイ染色試薬濃縮物BSA標準曲線は、BSAを水で既知濃度に希釈することにより作製した。BioRadタンパク質アッセイ色素試薬は、1部の濃縮物を4部の水で希釈することにより調製した。試験試料は水で希釈することにより調製した。50μLの試験試料を、そのまま、または希釈してのいずれかでキュベットに添加し、25mLの希釈試薬を添加した。試料は、同じものを2つ調製した。ODを読む前に試料を10分間インキュベートした。既知濃度のBSA溶液のOD595nmを測定することによりOD595nm対タンパク質濃度の標準曲線を得た。次いで、試験試料をアッセイし、タンパク質濃度を標準タンパク質アッセイ曲線から決定した。色素からの寄与を標準化するため、MustangQ工程後の試料は、常に希釈なしで分析した。この場合、50μLの未希釈のMustangQ後物質をアッセイに利用した。SDSPAGE分析装置:XcellSureLockMiniCellElectrophoresisSystemElectrophoresisPowerSupplyEPS601Rocky振とう台化学物質SDSPAGEStandardsHighMolecularWeightMark12非染色標準Novex8Trisグリシンゲル、15mm、10ウェルNuPAGENovex4~12BisTrisゲル、10mm、12ウェルNovexTrisグリシンSDSランバッファーNuPAGEMESSDSランバッファーNovexTrisグリシンSDS試料バッファーNuPAGELDS試料バッファーNuPAGE試料還元剤ColloidalBlue染色キットエチレーンジアミン四酢酸二ナトリウム塩AnalaRRTrisグリシンゲル12μlの試料を、20μlの試料バッファー、4μlの還元剤および4μlの01MEDTAに添加することにより、還元性SDSPAGEのための試料を調製した。10μlの濃縮原液を、80μlの還元剤、310μlのWFIおよび400μlの試料バッファーに添加することにより、高分子量マーカーを調製した。次いで、希釈HMW標準を、アリコートに分ける前に95°Cで5分間加熱し、次のゲルでの使用のために20°Cで保存した。Trisグリシンランバッファーを使用し、130Vで約2時間、コラゲナーゼを含有する試料を直接、8Trisグリシンゲル上でランさせた。電気泳動後、製造業者の使用説明書のとおりにcolloidalblue染色試薬でゲルを染色した。BisTrisゲル165μlの試料を、75μlの試料バッファー、3μlの還元剤および3μlの01MEDTAに添加することにより、還元性SDSPAGEのための試料を調製した。MARK12マーカーをそのままで負荷した。MESランバッファーのいずれかを使用し、200Vで約40分間、コラゲナーゼを含有する試料を直接、4~12BisTrisゲル上でランさせた。電気泳動後、ゲルを、colloidalblue染色試薬で製造業者の使用説明書のとおりに染色するか、または標準的な手順を用いて銀染色するかのいずれかとした。IEX後画分のデンシトメトリー分析装置:XcellSureLockMiniCellElectrophoresisSystemElectrophoresisPowerSupplyEPS601、Rocky振とう台平坦床スキャナー材料化学物質:NuPAGENovex4~12BisTrisゲル、10mm、12ウェルNuPAGEMESSDSランバッファーNuPAGELDS試料バッファーNuPAGE試料還元剤Mark12非染色標準ColloidalBlue染色キットエチレーンジアミン四酢酸二ナトリウム塩精製水還元性SDSPAGElμgレーン負荷でMESランバッファーを使用し、IEX後試料を4~12BisTrisゲル上でランさせた。20μLの希釈IEX後物質を、8μLの試料バッファー、3μLの還元剤および34μLの01MEDTAに添加することにより、試料を調製した。15μLの各試料を、混合後直接ウェルに負荷し、200Vで40分間ランさせた。電気泳動後、ゲルを製造業者の使用説明書に従ってColloidalBlue染色試薬で染色したが、染色変動を低減するために固定染色持続期間を伴ったゲル走査およびデンシトメトリーゲルを2つのアセテートシート間に配置し、すべての気泡の除去を確実にし、平坦床スキャナー上で600dpi解像度で走査し、画像をトリミングし、HPImagezoneソフトウェアでサイズ変更およびカラー補正した。AlphaEaseFCソフトウェアにより画像を8ビットグレースケールTIFF画像に変換し、QuantityOneゲル記録ソフトウェアを用いてタンパク質バンドを分析した。バックグラウンドの差し引き後、選択されたバンドの強度ピーク面積を、各レーンの生成物および不純物の相対パーセント値に変換した。バッファー安定性装置蠕動ポンプ125mlPETGバイオ容器蠕動ポンプ用WatsonMarlowTubingConductivityandpHMeter4330Sartopore2300フィルターカプセル20Lデモンストレーション実施用のバッファーを、調製後、04502μmフィルターカプセルに通して10μ20LStedimバッグ内に濾過し、使用前に2~8°Cで保存した。大部分のバッファーが濾過されたら、およそ75mlの残留バッファーを、予備標識された125mlのPETGバイオ容器内に回収し、2~8°Cで保存した。バッファーのpH、導電率、温度および調製日を記録した。20Lデモンストレーション実施の終了時、バッファー試料を冷却保存から回復させ、pH、導電率、および外観について再試験した。また、試験時のバッファーの温度も記録した。N末端配列決定分析のための試料調製装置:ElectrophoresisPowerSupplyEPS601XcellSureLockMiniCellElectrophoresisSystemRocky振とう台化学物質:Novex8Trisグリシンゲル、15mm、10ウェルHighMolecularWeightMarkerNuPAGE試料還元剤NovexTrisグリシンSDSランバッファーNovexTrisグリシンSDS試料バッファーColloidalBlueStainingKitエチレーンジアミン四酢酸二ナトリウム塩メタノール、AnalaR酢酸、AnalaR注射用水精製水先に概要を示したようにして、N末端配列決定用の試料を調製し、8Trisグリシンゲル上で分離した。40kDa夾雑物および55kDa夾雑物を多く含むと同定された試料は、各々、ゲルの5レーンに負荷され、配列決定に充分な物質が得られた。AUXIおよびAUXIIの両方に伴う90kDa夾雑物を多く含む、以前の20L発酵液由来のIEX後画分もまた、多数のレーンに負荷された。電気泳動後、ゲルを製造業者の使用説明書に従ってcolloidalblue染色試薬で染色し、夾雑物バンドを切り出し、N末端配列決定のためにAltaBioscienceに供した。20Lデモンストレーション実施からの90kDaAUXIに伴う夾雑物もまた配列決定に供したが、データは得られなかった。プロセス3の製造の概要発酵ヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼの生成のためのフィトン流加発酵方法は、フィトンペプトンにおけるバッチ間変動のため非常に変わりやすいことが示された。この理由のため、プロテオースペプトン3を5L発酵液中で評価した。評価により、PP3の1つの特定のバッチを50gLで使用した場合、発酵方法は確固としており、再現可能であることが示された。しかしながら、PP3の他のバッチを50gLで使用した場合、培養物の増殖プロフィールに大きな変動が見られた。PP3の種々のバッチによって支持される最大バイオマス濃度を小規模評価において評価した。これらのバッチを、ヒストリチクス菌の高いまたは低いバイオマス濃度を支持するその能力に基づいて、それぞれ良好または不良とみなした。2つの発酵を、100gLで用いるPP3の不良および良好バッチ5L規模で行なった場合、両方とも、非常に類似した増殖プロフィールおよび生成物収率を示した。この実験により、PP3の濃度を100gLに増大させると、ペプトンのバッチ間変動に伴う問題が軽減されることが示された。規模拡大発酵を200Lで行なった。発酵には、PP3の最適濃度を使用した。発酵は良好であり、5L規模で観察された増殖プロフィールおよび生成物収率質の両方が再度見られた。プロセス2のために開発された回収方法を、200L規模拡大発酵中に評価した。細胞培養物は、既存の方法を用いて、濾過の流れを阻止することなく、良好に清浄化された。クーマシー染色したTrisグリシンゲルのデンシトメトリー分析を使用し、粗発酵物試料中のコラゲナーゼ濃度の定量を改善した。混合されたAUXIおよびAUXIIの標準曲線を、発酵試料の希釈物を用いて負荷した。コラゲナーゼ濃度とデンシトメトリーピーク面積の間の関係は、試料希釈の範囲内で線形であることが示された。次いで、そのピーク面積および標準曲線を使用し、試料中のコラゲナーゼの濃度を外挿した。この方法により、コラゲナーゼの収率は、5および200L規模で、100gLPP3方法から280~350mgLであると推定された。最適化PP3発酵方法は、フィトン流加方法と比べて、より高いバイオマス濃度をもたらし、生成物収率を増大させた。発酵濾液は、フィトン方法より有意に少ないクロストリパインを含んだ。AUXI:AUXIIの比は、プロセス2の評価中に観察されたものと比べて1に近かった。要約すると、PP3方法は、生成物の収率、純度および発酵の再現性を増大させた。精製プロセス3は、Cobraで以前に開発された方法を改善するため、加速時間枠において開発され、GMPにおいて20L規模で実施した。方法に対する主な改善は、精製手順を単純化するため、確固さを促進するため、および方法を200Lに規模拡大しやすくするために行なわれた。これらの改善はまた、方法の検証を補助するのに重要とみなされた。プロセス3は、20Lの発酵物すべてが精製されたヒストリチクス菌の200L発酵液由来の物質を用いて行なった。物質は、発酵から直接処理し、保持工程は行なわなかった。濾過後、小規模実験によりこの手順を用いるとdsDNAの減少分析によって検出が示されたため、生成物をMustangQフィルターに通した。しかしながら、20Lデモンストレーション実施からの方法内試料の分析により、dsDNAの減少は示されず、この工程の確固さおよび適用には、さらなる調査が必要とされることが示唆された。20Lランスルーおよび以前の小規模実験で使用されたパラメータの比較により、カプセルのサイズを1000倍大きくした場合、dsDNA除去が示された。比較において、20Lランスルーに使用したカプセルのサイズをおよそ177~296倍大きくした。MustangQカプセルからの物質を2~8°Cで一晩保持した。該方法のこの段階で得られた試料物質に関するオフライン安定性研究は、SDSPAGE分析によって示されるように、RTおよび37°Cでインキュベートした試料が分解されやすいため、該方法のこの点での生成物安定性には、低温を維持することが重要であることを示した。硫酸アンモニウム溶液を添加して混合し、1Mの最終濃度を達成することにより、MustangQカプセルからの生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィー用に調製した。これは、フェニルセファロースFF媒体へのコラゲナーゼ結合に適当な条件を提供した。次いで、03M硫酸アンモニウムの工程溶出を用いてある割合のタンパク質夾雑物および色素がHICカラムから溶出された後、コラゲナーゼ生成物が硫酸アンモニウムを含有さない溶液で溶出された。生成物ピークの回収の基準は、4カラム容量の固定容量と確立された。次いで、溶出直後にロイペプチンを添加し、物質を2日間2~8°Cで保持した。原液の複雑な性質のため、この工程の収率を正確に測定することが困難であった。方法工程収率は、溶出物質の負荷およびUVのBradfordアッセイに基づいて38または溶出物質のデンシトメトリーおよびUVによって推定された負荷中のコラゲナーゼ含量に基づいて47と推定された。代替的に、適用したILの発酵濾液毎の相当物で017gの全タンパク質がHICカラムから溶出された。2×01m230kDa膜を用いたタンジェンシャルフロー濾過を使用し、濃縮およびバッファー交換により、HIC後プールをQセファロース精製用に調製した。この工程において損失は検出されず、報告された回収タンパク質の増大は、該方法のこの点でのUVの不正確さを反映し得る。不正確さは、色素夾雑に起因し得るか、またはタンパク質の複合体が存在しやすい場合に精製初期の物質にあまり正確でなかったコラゲナーゼの吸光係数の使用に起因し得る。TFF工程は、物質を2~8°Cで一晩保持する前に、生成物濾過工程によって終了した。プロセス2と同様、Qセファロースカラムはプロセス3において重要な精製工程であり、AUXIおよびAUXIIコラゲナーゼの分離をもたらした。しかしながら、プロセス3に伴う夾雑物はプロセス2のものと異なり、AUXIおよびAUXII生成物が密接に同時精製されたようであった。しかしながら、夾雑物は、両方のピークの立ち上り端または立ち下り端のいずれかで溶出するようであったため、生成物ピークの分別によって夾雑物を生成物から除去することが可能であった。夾雑物は、還元SDSPAGE上に、その相対分子量によって示された。AUXII生成物に伴うものは、40kDaおよび75kDaおよび90kDaと同定された。N末端アミノ酸配列決定により、配列がColH配列領域との同一性に適合したため、40kDaはAUXII関連物であることが示された。比較において、90kDa夾雑物では、低シグナルの問題のため同一性は確認され得なかった。AUXI生成物に伴う夾雑物は、55kDaおよび90kDaであった。N末端配列決定により、55kDaおよび90kDaの両方の夾雑物がAUXI関連物であると同定され、このとき、55kDa夾雑物は、ColG配列の中央領域と配列同一性を示し、90kDaは、AUXIと同一のN末端適合を示すことが示された。その結果、該方法のこの段階で同定された主要な不純物はすべて生成物関連物であり、AUXIおよびAUXIIの内部切断生成物またはAUXIのC末端切断生成物のいずれかと同定された。Qセファロースカラム後、重要な方法工程は、どの画分をさらなる精製に進めるかに関する決定においてであった。20Lデモンストレーション実施では、この基準は、4~12SDSPAGEによって分析し、ColloidalBlue染色で染色した場合の、生成物に対する夾雑物の相対染色強度に基づいた。決定は主観的であり、方法開発グループの集合的な経験およびクライアントからの要望に基づいた。プール手順を記載した規定された基準を確立するため、デンシトメトリーはSDSPAGEにおいて行なった。これから、プールは、AUXIでは≧87純粋な画分およびAUXIIでは≧94純粋な画分を含むものとして記載された。これにより、AUXIおよびAUXIIで、それぞれ、277および258のUV評価に基づく工程収率がもたらされた。後続のGMP実施のための修正基準の規定をもたらした200L規模デモンストレーション実施から得られたデータより、デンシトメトリー方法のさらなる改良および標準化が達成された。各コラゲナーゼに1×01m230kDa膜を使用し、QセファロースカラムからのAUXIまたはAUXII生成物を含有する画分をTFFによって別々に配合した。10mMTris、60mMスクロースpH8の配合バッファーはKBIBioPharmaIncによって確立された。TFF2工程後に生成物を濾過し、TFFおよび濾過の全工程収率は、AUXIで975およびAUXIIで922と推定された。この段階では、試料を中間体と呼び、QC分析のためおよび製剤原料の混合前に2~8°Cで保持した。遡及的安定性研究により、SDSPAGE、UV、RPHPLCおよびSECHPLC分析によって測定した場合、中間体は2~8°Cで少なくとも5日間安定であることが示された。中間体において唯一検出された分解は、凝集物レベルが0から062に増大した12日間の保持後、AUXII中間体において同定された。最終生成物濾過を行なう前に、AUXIおよびAUXII中間体を同じ比で混合し、製剤原料を作製した。わずかに400mgの製剤原料を調製し、その200mgを25mgの各中間体とともにKBIBioPharmaIncに輸送した。20Lの発酵原液のすべての利用可能な物質を処理し、すべての物質が製剤原料として混合されたと仮定された20Lデモンストレーション実施について、全方法収率を推定した。これにより、20L規模精製で16gの製剤原料の予測収率が得られた。これは、HICカラムへの負荷に利用可能な全タンパク質の量に対する9gの初期推定が正確であるという仮定に基づく178の方法回収に等しかった。代替的に、利用可能な全タンパク質がHIC負荷中のコラゲナーゼ含量に関する場合、全方法収率は22と計算された。方法ランスルーに加え、試料および安定性を評価するための方法から得られたバッファー保持物においていくつかの予備研究を行なった。これらのデータは、生成物では低温が分解の制御に重要なファクターであり、精製初期に得た試料は、よりタンパク質分解を受けやすいことを示した。しかしながら、生成物保持研究により、ロイペプチンおよび温度制御の組合せは、GMP方法で予測された経時的な生成物の質の維持に良好であることが示された。表54および55に、AUXIおよびAUXII中間体の、またプロセス3の製剤原料の分析明細を詳細に示した。本明細書で言及する特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書に引用されたすべての米国特許および公開または未公開米国特許出願は、参照により本明細書に援用される。本明細書に引用されたすべての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に援用される。本明細書に引用されたすべての他の公開された参考文献、文献、稿本および科学文献は、参照により本明細書に援用される。本発明を、その好ましい態様を参照して具体的に示し、記載したが、形態および詳細における種々の変形が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずになされ得ることは、当業者によって理解されよう。本発明の態様として、以下のものが挙げられる。[1]それぞれヒストリチクス菌コラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの配列を有するコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIからなり、約1対1の質量比を有し、純度が少なくとも95面積である製剤。[2]約8のpHの10mMTrisバッファーおよび60mMスクロース中にある場合、コラゲナーゼIについて約13000~約23000fSRC単位mgのSRCアッセイ活性、およびコラゲナーゼIIについて約200000~約380000fGPA単位mgのGPAアッセイ活性を有する、[1]記載の製剤。[3]約2面積未満の凝集タンパク質を含有する、[1]記載の製剤。[4]約1面積未満のクロストリパインを含有する、[3]記載の製剤。[5]約1面積未満のゼラチナーゼを含有する、[4]記載の製剤。[6]約1ugmg未満のロイペプチンを含有する、[5]記載の製剤。[7]1cfuml未満の生物汚染度を有し、滅菌された、[6]記載の製剤。[8]10EUml未満の内毒素を含有する、[7]記載の製剤。[9]5EUmg未満の内毒素を含有する、[7]記載の製剤。[10]コラゲナーゼIおよびIIが、少なくとも約97面積の純度を有する、[1]記載の製剤。[11]薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む、[1]記載の製剤。[12]滅菌凍結乾燥粉末であり、約5°Cの温度で保存される、[1]記載の製剤。[13]スクロース、Trisが配合され、約80のpHレベルを有する凍結乾燥注射可能組成物である、[11]記載の製剤。[14]約09mgの前記製剤、約185mgのスクロースおよび約11mgのTrisを含み、標的バイアル充填容量が約09mLである凍結乾燥注射可能組成物配合物を構成する、[13]記載の製剤。[15]約058mgの前記製剤、約120mgのスクロースおよび約07mgのTrisを含む凍結乾燥注射可能組成物配合物を構成する、[13]記載の製剤。[16][11]記載の製剤を提供するためのバイアルおよび前記デバイスで前記製剤をどのように送達するかを説明する使用説明書を備えるキット。[17]コラーゲン媒介性疾患に苦しむ被験体を処置するために使用される、[1]記載の製剤。[18]それぞれヒストリチクス菌コラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの配列を有するコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIからなり、約1対1の質量比を有し、純度が少なくとも95面積である製剤であって、製剤の調製が、aヒストリチクス菌を発酵させる工程bコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを含む粗発酵物を回収する工程c濾過およびカラムクロマトグラフィーによって粗回収物からコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを精製する工程ならびにd工程から精製されたコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを約1対1の比で合わせる工程を含む、製剤。[19]コラゲナーゼIについて約13000~約23000fSRC単位mgのSRCアッセイ活性、およびコラゲナーゼIIについて約200000~約380000fGPA単位mgのGPAアッセイ活性を有する、[18]記載の製剤。[20]純度が少なくとも97面積である、[18]記載の製剤。[21]純度が少なくとも98面積である、[18]記載の製剤。[22]細胞バンク調製がフィトンペプトンまたは植物性ペプトンの存在下で行なわれる、[18]記載の製剤。[23]発酵工程が、a第1段階の培地にヒストリチクス菌を接種し、混合物を攪拌する工程b工程の混合物をインキュベートし、アリコートを得る工程c第2段階の培地に、工程で得られたアリコートを接種し、混合物を攪拌する工程d工程の混合物をインキュベートする工程e第3段階の培地に、工程で得られたアリコートを接種し、攪拌する工程f工程の混合物をインキュベートする工程g第4段階の培地に、工程で得られたアリコートを接種し、攪拌する工程h工程の混合物をインキュベートする工程およびi工程で得られた培養物を濾過によって回収する工程を含む、[18]記載の製剤。[24]精製工程が、a粗回収物をMustangQカラムにより濾過する工程b硫酸アンモニウムを添加する工程c粗回収物を濾過する工程d濾液をHICカラムに供する工程e濾液にロイペプチンを添加する工程f硫酸アンモニウムを除去し、TFFによりバッファー交換しながらコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの正しい結合のためのロイペプチンを維持する工程g工程の混合物を濾過する工程hQセファロースHPを用いてコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを分離する工程iコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIのTFF濃縮液および配合物を別々に調製する工程ならびにj02μm濾過システムにより濾過する工程を含む、[18]記載の製剤。[25]約70°Cの温度で保存される、[18]記載の製剤。[26]薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む、[18]記載の製剤。[27]滅菌凍結乾燥粉末であり、約5°Cの温度で保存される、[18]記載の製剤。[28]スクロース、Trisが配合され、約80のpHレベルを有する凍結乾燥注射可能組成物である、[26]記載の製剤。[29]約09mgの前記製剤、約185mgのスクロースおよび約11mgのTrisを含み、標的バイアル充填容量が約09mLである凍結乾燥注射可能組成物配合物を構成する、[28]記載の製剤。[30]約058mgの前記製剤、約120mgのスクロースおよび約07mgのTrisを含む凍結乾燥注射可能組成物配合物を構成する、[28]記載の製剤。[31][26]記載の製剤を提供するためのバイアルおよび前記デバイスで前記製剤をどのように送達するかを説明する使用説明書を備えるキット。[32]コラーゲン媒介性疾患に苦しむ被験体を処置するために使用される、[18]記載の製剤。[33]aヒストリチクス菌を発酵させる工程bコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを含む粗発酵物を回収する工程c濾過およびカラムクロマトグラフィーによって粗回収物からコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを精製する工程およびd工程から精製されたコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを約1対1の比で合わせる工程を含む、[1]記載の製剤の作製方法。[34]製剤が、コラゲナーゼIについて約13000~約23000fSRC単位mgのSRCアッセイ活性、およびコラゲナーゼIIについて約200000~約380000fGPA単位mgのGPAアッセイ活性を有する、[33]記載の方法。[35]少なくとも97面積の純度を有する、[33]記載の製剤。[36]少なくとも98面積の純度を有する、[33]記載の製剤。[37]細胞バンク調製がフィトンペプトンまたは植物性ペプトンの存在下で行なわれる、[33]記載の方法。[38]発酵工程が、a第1段階の培地にヒストリチクス菌を接種し、混合物を攪拌する工程b工程の混合物をインキュベートし、アリコートを得る工程c第2段階の培地に、工程で得られたアリコートを接種し、混合物を攪拌する工程d工程の混合物をインキュベートする工程e第3段階の培地に、工程で得られたアリコートを接種し、攪拌する工程f工程の混合物をインキュベートする工程g第4段階の培地に、工程で得られたアリコートを接種し、攪拌する工程h工程の混合物をインキュベートする工程ならびにi工程で得られた培養物を濾過によって回収する工程を含む、[33]記載の方法。[39]精製工程が、a粗回収物をMustangQカラムにより濾過する工程b硫酸アンモニウムを添加する工程c粗回収物を濾過する工程d濾液をHICカラムに供する工程e濾液にロイペプチンを添加する工程f硫酸アンモニウムを除去し、TFFによりバッファー交換しながらコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIの正しい結合のためのロイペプチンを維持する工程g工程の混合物を濾過する工程hQセファロースHPを用いてコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIを分離する工程iコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIIのTFF濃縮液および配合物を別々に調製する工程ならびにj02μm濾過システムにより濾過する工程を含む、[33]記載の方法。[40]製剤が約70°Cの温度で保存される、[33]記載の方法。[41]薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む、[33]記載の製剤。[42]滅菌凍結乾燥粉末であり、約5°Cの温度で保存される[33]記載の製剤。[43]スクロース、Trisが配合され、約80のpHレベルを有する凍結乾燥注射可能組成物である、[33]記載の製剤。[44]約09mgの前記製剤、約185mgのスクロースおよび約11mgのTrisを含み、標的バイアル充填容量が約09mLである凍結乾燥注射可能組成物配合物を構成する、[43]記載の製剤。[45]約058mgの前記製剤、約120mgのスクロースおよび約07mgのTrisを含む凍結乾燥注射可能組成物配合物を構成する、[43]記載の製剤。[46][41]記載の製剤を提供するためのバイアルおよび前記デバイスで前記製剤をどのように送達するかを説明する使用説明書を備えるキット。[47]製剤がコラーゲン媒介性疾患に苦しむ被験体を処置するために使用される、[33]記載の方法。