"多能性幹細胞から膵内分泌前駆細胞集団を誘導する方法であって、a.多能性幹細胞集団を培養する工程と、b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系definitiveendodermlineageに特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、c.前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、初期腸管細胞集団へと分化させる工程と、d.前記初期腸管細胞集団を、前腸後方の細胞集団へと分化させる工程と、e.前記前腸後方の細胞集団を、レチノイン酸を分解する剤を添加した培地で処理する工程と、を含む、方法。前記レチノイン酸を分解する剤がCYP26A阻害剤である、請求項1に記載の方法。前記CYP26A阻害剤が約1nM~約1000nMの濃度で使用される、請求項2に記載の方法。前記CYP26A阻害剤が約10nM~約100nMの濃度で使用される、請求項2に記載の方法。前記CYP26A阻害剤がN-{4-[2-エチル-1-1H-1,2,4-トリアゾール-1-イルブチル]フェニル}-1,3-ベンゾチアゾール-2-アミンである、請求項2に記載の方法。よりβ細胞に類似している、機能性のインスリン発現細胞を生成するためのinvitro法の開発が未だに強く求められている。本発明は、レチノイン酸を分解する剤を用い膵前駆細胞集団を生成することにより、多能性幹細胞のインスリン発現細胞への分化効率を改善するという、代替的なアプローチを取る。一実施形態では、本発明は、レチノイン酸を分解して内分泌前駆細胞集団を生成する剤を用いる方法を提供する。一実施形態では、膵内分泌前駆細胞集団の生成は、段階的な分化プロトコルにより実施され、このプロトコルでは、まず始めに、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系definitiveendodermlineageに特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる。次に、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、初期腸管細胞集団へと分化させる。次に、初期腸管細胞集団を前腸後方の細胞集団Posteriorforegutへと分化させる。次に、レチノイン酸を分解する剤を添加した培地により、前腸後方の細胞を処理することで、前腸後方の細胞集団を内分泌前駆細胞の集団へと分化させる。一実施形態では、更に、内分泌前駆細胞集団を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる。開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、発明を実施するための形態を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を説明又は例示する下記の小項目に分割する。定義幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し、分化して後代細胞を生成するという、これらの両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉層内胚葉、中胚葉及び外胚葉から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉層の組織を生じ、胚盤胞への注入後、すべてではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。幹細胞は、発生能によって、1全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、2全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、3細胞系の小集合を生じるが、すべて特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じる能力を意味する複能性例えば、造血幹細胞HSCは、HSC自己再生、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素例えば、血小板を含む後代を産生できる、4複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系統の小集合を生じる能力を意味する寡能性、並びに51つの細胞系例えば、精子形成幹細胞を生じる能力を意味する単能性に分類される。分化は、専門化されていない中立の又は比較的専門化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの専門化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化誘導した細胞は、細胞系内でより専門化された分化決定された状況を示す細胞である。分化プロセスに適用した際の用語傾倒したは、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系統内で比較的特殊化されて又は傾倒していない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系統は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞に由来するか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系とは、発生及び分化の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。本明細書で使用するとき、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞又はステージ1細胞又はステージ1とは、以下のマーカー、すなわち、SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、短尾奇形、Mix-様ホメオボックスタンパク質、FGF4、CD48、eomesoderminEOMES、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99、又はOTX2のうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。本明細書で使用するとき、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞とは、以下のマーカー、すなわち、PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9、又はPROX1のうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。膵内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。本明細書で使用するとき、胚体内胚葉は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99、及びMIXL1を発現する。本明細書で使用するときマーカーとは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出限界は、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。本明細書で使用するとき、膵内分泌前駆体細胞は、次のマーカー:NGN3、NEUROD、又はNKX2.2のうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。本明細書で使用するとき、前腸後方細胞Posteriorforegutcellは、次のマーカー:PDX1又はHNF6のうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。本明細書で使用するとき、未成熟な膵臓ホルモン発現細胞は、次のマーカー:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、MAFB、PDX1、ARX、NKX6.1、NKX2.2、又はNEURODのうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。本明細書で使用するとき、初期腸管細胞は、次のマーカー:HNF1β又はHNF4αのうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。本明細書で使用するとき、膵内分泌細胞又は膵臓ホルモン発現細胞又は膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することが可能な細胞を指す。多能性幹細胞の単離、増殖及び培養多能性幹細胞の特徴付け多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原SSEA3及び4、並びにTra-1-60及びTra-1-81と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの1つ以上を発現するThomsonら、Science282:1145,1998。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、SSEA-4、Tra-1-60、及びTra-1-81の発現が減少し存在する場合、SSEA-1の発現が上昇する。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を4パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者VectorLaboratoriesBurlingameCalif.によって記載されるようにVectorRedを基質として現像することによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有しする。未分化の多能性幹細胞はまた、RT-PCRにより検出されるように、一般にOCT4及びTERTも発現する。増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、3つの胚葉のすべて、すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば細胞を重症複合型免疫不全症SCIDマウスに注入し、4パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、それらを3つの胚葉由来の細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を3つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なGバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は正常な核型を有することが望ましく、正常な核型とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がすべて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性幹細胞の供給源使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期必ずしもではないが、通常は妊娠約10~12週よりも前に採取した前胚性組織例えば胚盤胞など、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例としては、例えばヒト胚性幹細胞株H1、H7及びH9WiCellなどのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株が挙げられる。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される1次多能性細胞である。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、BG01vBresaGen,Athens,GAなどの変異型ヒト胚幹細胞株も好適である。一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Thomsonらに開示される方法の通りに調製される米国特許第5,843,780号;Science282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff.,1998;Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:7844,1995。多能性幹細胞の培養一実施形態において、多能性幹細胞は、フィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。代替的に、多能性幹細胞は、基本的にフィーダー細胞が存在しないにも関わらず、ほぼ分化を受けないで多能性幹細胞の増殖を支持する培養液システム中で培養される。多能性幹細胞を分化させずに無フィーダー培養液中で増殖させる際には、以前に他の細胞種を予め培養しておいて馴化させた培地を使用することでこの操作が支持される。代替的に、多能性幹細胞を無フィーダー培養液中で分化させずに増殖させる際は、合成培地を使用することでこの操作が支持される。一実施形態において、多能性幹細胞は、ReubinoffらNatureBiotechnology18:399~4042000に開示されている方法に従って、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Thompsonらに開示されている方法に従ってマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよいScience6November1998:Vol.282.no.5391,pp.1145~1147。あるいは、多能性幹細胞は、RichardsらStemCells21:546~556,2003に開示されているフィーダー細胞層の任意の1つの上で培養されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞は、WangらStemCells23:1221~1227,2005に開示されている方法に従って、ヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。代替実施形態では、多能性幹細胞は、StojkovicらStemCells200523:306~314,2005に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、MiyamotoらStemCells22:433~440,2004に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、AmitらBiol.Reprod68:2150~2156,2003に開示されるヒトフィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、InzunzaらStemCells23:544~549,2005に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞は、米国特許出願公開第2002/0072117号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第6642048号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第2005014799に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、XuらStemCells22:972~980,2004に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2007/0010011号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0233446号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第6800480号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第2005065354号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞は、CheonらBioReprodDOI:10.1095/biolreprod.105.046870,October19,2005に開示される方法に従って培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、LevensteinらStemCells24:568~574,2006に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0148070号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0244962号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第2005086845号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。一実施形態において、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体-リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリクス成分である。一実施形態において、好適な培養基材はMATRIGEL登録商標BectonDickensonである。MATRIGEL登録商標は、Engelbreth-HolmSwarm腫瘍細胞由来の可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。他の細胞外マトリクス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な希釈率にて播かれてもよい。これらの特徴のすべては、播種分布に細心の注意を払うことで利益を得られるものであり、当業者は容易に決定することができる。好適な培地は、以下の成分、すなわち例えば、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、Gibco11965-092;ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地KODMEM、Gibco10829-018;ハムF12/50DMEM基本培地;200mML-グルタミン、Gibco15039-027;非必須アミノ酸溶液、Gibco11140-050;β-メルカプトエタノール、SigmaM7522;ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF、Gibco13256-029等から調製することもできる。多能性幹細胞からの膵内分泌前駆細胞の生成本発明は、多能性幹細胞集団からの、膵前駆細胞集団の生成方法を提供する。一実施形態では、本発明は、膵内分泌前駆細胞を、膵内分泌系マーカーを発現する細胞へと更に分化させる方法を提供する。一実施形態では、本発明は膵前駆細胞の生成方法を提供し、この方法は、次工程:a、b、c、d及びeを含む。a.多能性幹細胞集団を培養する工程、b.多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程、c.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、初期腸管細胞集団へと分化させる工程、d.初期腸管細胞集団を、前腸後方の細胞集団へと分化させる工程、及びe.前腸後方の細胞集団をレチノイン酸を分解する剤を添加した培地で処理することにより、前腸後方の細胞集団を、膵内分泌前駆細胞集団へと分化させる工程。この膵内分泌前駆細胞集団を更に処理して、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成することもできる。分化の効率は、処理した細胞集団を、所望の細胞型に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する作用剤例えば、抗体などに暴露することにより測定することができる。培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。この方法としては、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR、ノーザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelら、eds.2001supplementを参照されたい、並びにイムノアッセイ、例えば、免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティング、及びインタクトな細胞で利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析FACS例えば、Harlow及びLane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress1998参照が挙げられる。多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81の1つ以上の発現が挙げられる。多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばCXCR4等のタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤例えば、抗体等に暴露することにより、分化した細胞を精製することができる。本発明で用いるのに好適な多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞株H9NIHコード:WA09、ヒト胚性幹細胞株H1NIHコード:WA01、ヒト胚性幹細胞株H7NIHコード:WA07、及びヒト胚性幹細胞株SA002Cellartis,Swedenが挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すなわち、ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、及びTra1-81のうちの少なくとも1つを発現する細胞も本発明で用いるのに好適である。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、短尾奇形、Mix様ホメオボックスタンパク質、FGF4、CD48、エオメソダーミンEOMES、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99、及びOTX2からなる群から選択される。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞は本発明での使用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。膵内胚葉系初期腸管細胞及び前腸後方の細胞を包含するに特徴的なマーカーは、PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9及びPROX1からなる群から選択される。膵内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。膵内分泌系に特徴的なマーカーは、NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、NGN3、及びPTF-1αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することができる。本発明で使用するに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも1つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、PDX1と、以下の転写因子、すなわち、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4、及びPAX6のうちの少なくとも1つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。多能性幹細胞からの胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、当該技術分野で公知の任意の方法により、多能性幹細胞集団から生成することができる。例えば、D’Amourら,NatureBiotechnology23,1534~15412005に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、Shinozakiら,Development131,1651~16622004に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、McLeanら,StemCells25,29~382007に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、D’Amourら,NatureBiotechnology24,1392~14012006に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、米国特許出願公開第11/736,908号に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、米国特許出願公開第11/779,311号に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、米国特許出願公開第12/493,741号に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。例えば、米国特許出願公開第12/494,789号に開示の方法に従って、多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。膵内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成膵内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。一実施形態では、本発明の方法により生成された胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、当該技術分野の任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化する。例えば、本発明の方法に従って得られた胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、D’Amourら、NatureBiotechnology24,1392~14012006に開示される方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、本発明の方法に従って得られた胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第11/736,908号に開示される方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。膵内分泌前駆細胞集団の生成一実施形態では、本発明は膵前駆細胞の生成方法を提供し、この方法は、次工程:a、b、c、d及びeを含む。a.多能性幹細胞集団を培養する工程、b.多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程、c.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、初期腸管細胞集団へと分化させる工程、d.初期腸管細胞集団を、前腸後方の細胞集団へと分化させる工程、及びe.前腸後方の細胞集団をレチノイン酸を分解する剤を添加した培地で処理することにより、前腸後方の細胞集団を、膵内分泌前駆細胞集団へと分化させる工程。一実施形態では、レチノイン酸を分解する剤はCYP26A阻害剤である。CYP26A阻害剤は、約1nM~約1000nMの濃度で使用することができる。あるいは、CYP26A阻害剤は、約10nM~約100nMの濃度で使用することができる。任意のCYP26A阻害剤が本発明に使用するのに好適である。例えば、CYP26A阻害剤は、米国特許第7,468,391号に開示の化合物から選択することができる。あるいは、CYP26A阻害剤は、米国特許出願公開第2005/0187298A1号に開示の化合物から選択することができる。あるいは、CYP26A阻害剤は、米国特許出願公開第2004/0106216A1号に開示の化合物から選択することができる。あるいは、CYP26A阻害剤は、国際公開第2005058301A1号に開示の化合物から選択することができる。あるいは、CYP26A阻害剤は、PNASMay12,2009vol.106no.197864~7869に開示の化合物から選択することができる。一実施形態では、CYP26A阻害剤はN-{4-[2-エチル-1-1H-1,2,4-トリアゾール-1-イルブチル]フェニル}-1,3-ベンゾチアゾール-2-アミンである。式1を参照されたい。一実施形態では、レチノイン酸を分解する剤を添加した培地には、更に、BMP阻害能をもつ因子、TGFβ受容体シグナル伝達阻害剤、ビタミンA及びPKC活性化剤からなる群から選択される少なくとも1つの因子が添加される。一実施形態では、BMP阻害能をもつ因子はノギンである。ノギンは、約50ng/mL~約500μg/mLの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは、100ng/mLの濃度で使用することができる。一実施形態では、TGFβ受容体シグナル伝達阻害剤はALK5の阻害剤である。一実施形態では、ALK5の阻害剤はALK5阻害剤IIである。ALK5阻害剤IIは、約0.1μM~約10μMの濃度で使用することができる。一実施形態では、ALK5阻害剤IIは1μMの濃度で使用することができる。一実施形態では、PKC活性化剤は、2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニル-2,4-ペンタジエモイルアミノベンゾラクタム、インドラクタムVILV、ホルボール-12-ミリステート-13-アセテートPMA、及びホルボール-12,13-ジブチレートPDBuからなる群から選択される。一実施形態では、プロテインキナーゼC活性化剤は、2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニル-2,4-ペンタジエモイルアミノベンゾラクタムである。2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニル-2,4-ペンタジエモイルアミノベンゾラクタムは、約20nM~約500nMの濃度で使用することができる。本明細書では、2S,5S-E,E-8-5-4-トリフルオロメチルフェニル-2,4-ペンタジエモイルアミノベンゾラクタムはTPBと呼ぶ。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成一実施形態では、本発明の方法により生成された膵内分泌前駆細胞集団を、当該技術分野で公知の任意の方法により、更に、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、D’Amourら、NatureBiotechnology,2006に開示されている方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、D’Amourら、NatureBiotechnology,2006に開示されている方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第11/736,908号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、米国特許出願公開第11/779,311号に開示の方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと更に分化させることもできる。例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第60/953,178号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第60/990,529号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。実施例1FBS不含でかつCYP26A阻害剤を含有している細胞培養培地でのヒト胚性幹細胞株H1の細胞の膵内分泌前駆細胞への分化MEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地を用い、MATRIGEL登録商標コーティングディッシュ1:30希釈BDBiosciences;カタログ番号356231で、ヒト胚性幹細胞株H1の細胞p40~p50をコロニーとして培養し、次の通りに膵内分泌前駆細胞へと分化させた。a.ステージI胚体内胚葉:ヒト胚性幹細胞を、2脂肪酸不含BSAカタログ番号68700Proliant、IAと100ng/mLアクチビンARDSystems、MNに加え、20ng/mLのWNT-3aカタログ番号1324-WN-002RDSystems、MNと8ng/mLのbFGFカタログ番号100-18BPeproTech、NJを添加したRPMI培地で1日培養し、続いて、2BSAと100ng/mLアクチビンAに加え8ng/mLのbFGFを添加したRPMI培地で更に2日処理し、次にb.ステージII初期腸管:細胞を2の脂肪酸不含BSA及び50ng/mLのFGF7を加えたRPMIで2日処理し、次にc.ステージIII前腸後方:細胞を、1:200希釈したITS-XInvitrogen、CAと0.1BSALipidRichInvitrogen、カタログ番号11021-045と50ng/mLFGF7と0.25μMのSANT-1と2μMレチノイン酸RASigma、MOと100ng/mLノギンRDSystems、MNと2.5μM4-[4-4-フルオロフェニル-1-3-フェニルプロピル-5-ピリジン-4-イル-1H-イミダゾール-2-イル]ブタ-3-イン-1-オール米国特許第6,521,655号に開示のP38阻害剤と20ng/mLアクチビンAと、を添加したDMEM/高グルコースで5日処理し、次にd.ステージIV膵内分泌前駆体:細胞を、1:200希釈したITS-XInvitrogen、CAと0.1BSAInvitrogen、Caと100ng/mLノギンと1μMALK5阻害剤SD-208、MolecularPharmacology200772:152~161に開示と500nMのTPBα-アミロイド前駆体タンパク質修飾物質カタログ番号565740、EMD、CAと10~100nMのCYP26A阻害剤N-{4-[2-エチル-1-1H-1,2,4-トリアゾール-1-イルブチル]フェニル}-1,3-ベンゾチアゾール-2-アミンと10~100nMのビタミンAカタログ番号R7632Sigma,MOを添加したDMEM/高グルコースで4日処理し、あるいは一部の培養物では、ステージIVは6日間に延長した。ステージIII及びIVで、膵臓関連遺伝子についてリアルタイムPCRで解析するために、mRNAを単離した。図1に示す通り、ステージIVでCYP26A阻害剤を添加することで、投与量に応じた様式で、内分泌腺前駆体マーカーNGN3、Pax4、NeuroDと膵内胚葉マーカーNKX6.1の発現が著しく増加した。ビタミンAとCYP26A阻害剤を添加しても、膵内胚葉又は内分泌腺前駆体マーカーの発現量に有意な変更は見られなかった。更に、ステージIVでCYP26A阻害剤を添加した場合、CDX2腸マーカー及びアルブミン肝臓マーカーの発現が減少した。ステージIVで、NGN3カタログ番号AF3444,RDSystems、MNに対して免疫染色したところ、100nMのCYP26A阻害剤で処理した培養物で、NGN3発現量の有意な増加が明瞭に示された。実施例2FBS不含でかつCYP26A阻害剤を含有している細胞培養培地でのヒト胚性幹細胞株H1の細胞の膵内分泌前駆細胞への分化の代替法MATRIGEL登録商標1:30希釈コーティングしたディッシュBDBiosciences;カタログ番号356231で、ヒト胚性幹細胞株H1の細胞p40~p52を、16ng/mLのFGF2カタログ番号100-18BPeproTech、NJ及び10μMのY-27632Rock阻害剤、カタログ番号Y0503Sigma、MOを添加したMEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地に、個別の細胞として密度100000個/cm2で播種した。播種の72時間後、培養物を次の通りに胚体内胚葉DEへと分化させた:a.ステージI胚体内胚葉:ヒト胚性幹細胞を、2脂肪酸不含BSAカタログ番号68700Proliant、IAと0.0025g/mL重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187Sigma、MOと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079Invitrogen、Caと100ng/mLアクチビンARDSystems、MNに加え20ng/mLWNT-3aカタログ番号1324-WN-002RDSystems、MNを添加したMCDB-131カタログ番号10372-019Invitrogen、CA培地により1日処理し、続いて、2BSAと重炭酸ナトリウムとGlutamaxと100ng/mLアクチビンAを添加したMCDB-131培地により更に3日処理し、次にb.ステージII初期腸管:細胞を、2脂肪酸不含BSAと50ng/mLFGF7を添加したMCDB-131で3日処理し、次にc.ステージIII前腸後方:細胞を、1:200希釈したITS-XInvitrogen、CAと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079Invitrogen、Caと0.0025g/mL重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187Sigma、MOと0.1BSALipidRichInvitrogen、カタログ番号11021-045と50ng/mLFGF7と0.25μMのSANT-1と、2μMレチノイン酸RASigma,MOと2.5μMの4-[4-4-フルオロフェニル-1-3-フェニルプロピル-5-ピリジン-4-イル-1H-イミダゾール-2-イル]ブタ-3-イン-1-オール米国特許第6,521,655号に開示のp38阻害剤と100nMのLDN-193189BMP受容体阻害剤、カタログ番号04-0019Stemgent、CAと500nMのCYP26A阻害剤N-{4-[2-エチル-1-1H-1,2,4-トリアゾール-1-イルブチル]フェニル}-1,3-ベンゾチアゾール-2-アミンと20ng/mLアクチビンAを添加したMCDB-131/高グルコース25mMグルコースで4日処理し、次にd.ステージIV膵内分泌前駆体:細胞を、1:200希釈したITS-XInvitrogen、CAと0.1BSAInvitrogen、Caと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079Invitrogen、Caと0.0025g/mL重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187Sigma、MOと1μMのALK5阻害剤SD-208、MolecularPharmacology200772:152~161に開示と500nMのPDBuPKC活性化剤カタログ番号P1269Sigma、MOと100nMのLDN-193189BMP受容体阻害剤、カタログ番号04-0019Stemgent、CAと0.25μMのSANT-1S4572Sigma、MOと500nMのCYP26A阻害剤N-{4-[2-エチル-1-1H-1,2,4-トリアゾール-1-イルブチル]フェニル}-1,3-ベンゾチアゾール-2-アミンを添加したMCDB-131/高グルコース25mMグルコースで7日処理し、e.ステージIV膵内分泌前駆体:細胞を、1:200希釈したITS-XInvitrogen、CAと0.1BSAInvitrogen、Caと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079Invitrogen、Caと0.0025g/mL重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187Sigma、MOと1μMのALK5阻害剤SD-208、MolecularPharmacology200772:152~161に開示と500nMのPDBuPKC活性化剤カタログ番号P1269Sigma、MOと100nMのLDN-193189BMP受容体阻害剤、カタログ番号04-0019Stemgent、CAと0.25μMSANT-1S4572Sigma、MOを添加したMCDB-131/高グルコース25mMグルコースで7日処理した。ステージIII及びIVで、膵臓関連遺伝子についてリアルタイムPCRで解析するために、mRNAを単離した。上記実施例1と同様、ステージIVでCYP26A阻害剤を加えた場合に、NGN3及びNeuroDなどの膵内分泌前駆体マーカーの発現が上昇したという結果が観察された。図2を参照されたい。ステージIII及びIVの両方で阻害剤を添加すると、NGN3及びNeuroDの発現は更に上昇した。驚くべきことに、CYP26A阻害剤をステージIIIレチノイン酸の存在下でに添加した場合、PDX-1及びNKX6.1の発現は有意に減少したのに対してCDX2の発現は増加した。これらの結果は、CYP26A阻害剤を添加するのに適切なステージはステージIVであることを示す。実施例3FBS不含でかつCYP26A阻害剤を含有している細胞培養培地でのヒト胚性幹細胞株H1の細胞の膵内分泌細胞への分化の代替法MATRIGEL登録商標1:30希釈コーティングしたディッシュBDBiosciences;カタログ番号356231で、ヒト胚性幹細胞株H1の細胞p40~p52を、16ng/mLのFGF2カタログ番号100-18BPeproTech、NJ及び10μMのY-27632Rock阻害剤、カタログ番号Y0503Sigma、MOを添加したMEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地に、個別の細胞として密度100000個/cm2で播種した。播種の72時間後、培養物を次の通りに胚体内胚葉DEへと分化させた:a.ステージI胚体内胚葉:MATRIGEL登録商標コーティングしたディッシュで、ヒト胚性幹細胞を、2脂肪酸不含BSAカタログ番号68700Proliant、IAと0.0025g/mL重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187Sigma、MOと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079Invitrogen、Caと100ng/mLのGDF-8RDSystems、MNに加え2.5μMのGSK3B阻害剤14-プロパ-2-エン-1-イル-3,5,7,14,17,23,27-ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]ヘプタコサ-125,227,3,5,826,9,11,21,23-ノナエン-16-オンを添加したMCDB-131カタログ番号10372-019Invitrogen、CA培地で個別の細胞として1日培養し、続いて、2BSAと重炭酸ナトリウムとGlutamaxと100ng/mLのGDF-8を添加したMCDB-131培地で更に3日処理し、次にb.ステージII初期腸管:細胞を、2脂肪酸不含BSA及び50ng/mLのFGF7を添加したMCDB-131培地で2日処理し、次にc.ステージIII前腸後方:細胞を、1:200希釈したITS-XInvitrogen、CAと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079Invitrogen、Caと0.0025g/mL重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187Sigma、MOと0.1BSA高脂質Invitrogen、カタログ番号11021-045と50ng/mLのFGF7と0.25μMのSANT-1と2μMのレチノイン酸RASigma、MOと2.5μMの4-[4-4-フルオロフェニル-1-3-フェニルプロピル-5-ピリジン-4-イル-1H-イミダゾール-2-イル]ブタ-3-イン-1-オールと100nMのLDN-193189BMP受容体阻害剤、カタログ番号04-0019Stemgent、CAと20ng/mLのアクチビンAを添加したMCDB131/高グルコース25mMのグルコースで4日処理し、次にd.ステージIV膵前駆体:細胞を、1:200希釈したITS-XInvitrogen、Caと0.1BSAInvitrogen、Caと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079Invitrogen、Caと0.0025g/mL重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187Sigma、MOと100nMLDN-193189BMP受容体阻害剤、カタログ番号04-0019Stemgent、CAと50nMのPDBuPKC活性化剤カタログ番号P1269Sigma、MOと0.25μMのSANT-1S4572Sigma、MOと100nMのCYP26A阻害剤N-{4-[2-エチル-1-1H-1,2,4-トリアゾール-1-イルブチル]フェニル}-1,3-ベンゾチアゾール-2-アミンを添加したMCDB131/高グルコース25mMグルコースで3日処理し、次にe.ステージV膵内分泌前駆体:細胞を、1:200希釈したITS-XInvitrogen、CAと0.1BSAInvitrogen、Caと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079Invitrogen、Caと0.0025g/mL重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187Sigma、MOと100nMのLDN-193189BMP受容体阻害剤、カタログ番号04-0019Stemgent、CAと0.25μMのSANT-1S4572Sigma、MOと2μMのALK5阻害剤SD-208、MolecularPharmacology200772:152~161に開示と100nMのCYP26A阻害剤N-{4-[2-エチル-1-1H-1,2,4-トリアゾール-1-イルブチル]フェニル}-1,3-ベンゾチアゾール-2-アミンを添加したMCDB131/高グルコース25mMグルコースで3日処理し、次にf.ステージVI未成熟な膵ホルモン発現細胞:細胞を、1:200希釈したITS-XInvitrogen、CAと0.1BSAInvitrogen、Caと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079Invitrogen、Caと0.0025g/mL重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187Sigma、MOと100nMのLDN-193189BMP受容体阻害剤、カタログ番号04-0019Stemgent、CAと2μMのALK5阻害剤SD-208、MolecularPharmacology200772:152~161に開示を添加したMCDB131/高グルコース25mMグルコースで3日処理し、次にg.ステージVII膵ホルモン発現細胞:細胞を、1:200希釈したITS-XInvitrogen、CAと0.1BSAInvitrogen、Caと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079Invitrogen、Caと0.0025g/mL重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187Sigma、MOと100nMのLDN-193189BMP受容体阻害剤、カタログ番号04-0019Stemgent、CAと2μMのALK5阻害剤SD-208、MolecularPharmacology200772:152~161に開示と100nMビタミンAカタログ番号R7632Sigma、MOを添加したMCDB131/高グルコース25mMのグルコースで3日処理し。一部の培養物では、ステージVIIを18日に延長した。リアルタイムPCR解析、免疫蛍光染色IF、及びFACS解析のため、ステージV及びVIで試料を回収した。FACS及び免疫蛍光染色IFの両方に際し、NKX6.1抗体をアイオワ大学のハイブリドーマバンクカタログ番号F55A12から得、CDX2抗体をAbcamカタログ番号ab76541Cambridge、MAから得、PDX-1抗体をAbcamカタログ番号ab47267から購入した。図3は、各種分化ステージでの培養物の形態を強調して示す。ステージII以降、培養物はステージIII~VIを通して均質の形態を示した。図4は、各種分化ステージに関し、FACSにより測定されたものとしてNKX6.1の発現を示す。この図は、実施例3に開示のプロトコルにより、分化の後期のステージを通してNKX6.1の発現が高く維持され得ることを強調している。図5は、プロトコルのステージV及びステージVIIに関しPDX1、NKX6.1、及びCDX2発現のIF染色を示す。NKX6.1陽性細胞の90超がPDX1も陽性であったのに対し、CDX2に陽性の染色細胞は10未満であった。本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。"