"CLEC-2に結合する核酸リガンドであって、少なくとも1つのステム構造および少なくとも1つのループ構造を形成する核酸配列を含む核酸リガンド、または薬学的に許容されるこの塩。5’から3’方向に、5-10塩基対長である第1のステム、配列5’-GNC-3’を含む第1のトリヌクレオチドループ、4塩基対長である第2のステムであり、第2のステムの塩基にゆらぎ対を含む、前記第2のステム、およびヌクレオチド配列5’-YUYNNRYU-3’を含む第2のループを含む、請求項1に記載のリガンド。核酸配列が、配列番号7または配列番号8または配列番号9に対して少なくとも80同一の配列を含む、請求項1に記載のリガンド。核酸配列が配列番号24に対して少なくとも80同一の配列を含む、請求項1に記載のリガンド。約0.1nMから10nMまでの範囲に及ぶ解離定数でCLEC-2に結合する、請求項1から4のいずれか一項に記載のリガンド。請求項1から5のいずれか一項に記載のリガンドまたは薬学的に許容されるこの塩を含む医薬組成物。CLEC-2リガンドに特異的に結合するモジュレーターであって、前記モジュレーターが第2の核酸配列を含み、前記CLEC-2リガンドが第1の核酸配列を含む、モジュレーター。CLEC-2媒介障害を処置するための方法であって、治療的有効量の請求項1から6のいずれか一項に記載のリガンドまたは薬学的に許容されるこの塩を、治療を必要とする宿主に投与することを含む方法。CLEC-2媒介障害が血小板媒介障害である、請求項8に記載の方法。血小板媒介障害が、血管障害、心血管障害、末梢血管障害、脳血管障害、血小板媒介炎症性障害、糖尿病関連障害、癌およびHIV感染症からなる群から選択される、請求項8または9に記載の方法。血管障害が、急性冠動脈症候群、血栓症、血栓塞栓症、血小板減少症、末梢血管疾患および一過性脳虚血発作からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。脳血管障害が、一過性脳虚血発作、虚血性発作および塞栓症からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。血小板媒介炎症性障害が、関節炎、関節炎リューマチ、乾癬性関節炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患、強直性脊椎炎および強皮症からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。癌が、肺癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膵癌、脳癌、骨癌および肝癌からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。糖尿病関連障害が、糖尿病性網膜症、糖尿病性脈管障害、アテローム動脈硬化症、虚血性発作、末梢血管疾患、急性腎損傷および慢性腎不全からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。CLEC-2リガンドがCLEC-2依存性血小板凝集体形成を活性化するのか阻害するのかを決定するための方法であって、aCLEC-2リガンドを血液試料と混合して、処理された血液試料を調製するステップ、b処理された血液試料を、固体支持体に固定化されている促進性分子と接触させるステップ、c接触後、血小板凝集体形成を測定するステップ、dステップcにおいて検出された血小板凝集体形成の程度を、CLEC-2リガンドのない対照血液試料を用いて前記促進性分子を接触させる場合に得られる血小板凝集の程度と比較するステップを含む方法。促進性分子がCLEC-2の活性化剤である、請求項16に記載の方法。促進性分子が可溶性I型、II型またはIII型コラーゲンであり、ロドサイチンを血液試料に添加することをさらに含む、請求項16または17に記載の方法。ステップbに先立って、処理された血液試料をモジュレーター分子と混合することをさらに含み、前記モジュレーター分子は調節リガンド分子に結合することができる、請求項16、17または18に記載の方法。CLEC-2リガンドおよび医薬賦形剤を含むキット。CLEC-2リガンドに特異的に結合するモジュレーターをさらに含む、請求項20に記載のキット。CLEC-2リガンドに特異的に結合するモジュレーターを含むキット。したがって、CLEC-2媒介障害を処置するための治療薬および方法に対する必要性が存在する。要旨本明細書では、CLEC-2を特異的に阻害する核酸リガンド、これらのリガンドを同定するおよび/または特徴付けるための方法、ならびにこれらのリガンドの使用のための処置が記載されている。一態様では、単離された核酸配列を含むCLEC-2リガンドまたは薬学的に許容されるこの塩が提供される。一実施形態では、少なくとも1つのヌクレオチドはリボヌクレオチドである。別の実施形態では、少なくとも1つのヌクレオチドは2’-フルオロ-2’デオキシピリミジンヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、CLEC-2リガンドの単離された核酸配列は、リボヌクレオチドと2’-フルオロ-2’デオキシピリミジンヌクレオチドの混合物を含む。一実施形態では、CLEC-2リガンドは、少なくとも1つのステムおよび少なくとも1つのループを含む二次構造を含む。一実施形態では、CLEC-2リガンドは、5’から3’方向に、5-10塩基対bp長である第1のステム、配列5’-GNC-3’を含む第1のトリヌクレオチドループ、4bp長である第2のステムであり、第2のステムの塩基にゆらぎ対を含む前記第2のステム、およびヌクレオチド配列5’-YUYNNRYU-3’を含む第2のループを含む。一実施形態では、CLEC-2核酸リガンドは約20から約100ヌクレオチドnt長である。別の実施形態では、このリガンドは約30から約90、約30から約40または約30から約35nt長である。別の実施形態では、CLEC-2核酸リガンドは、約30nt、31nt、32nt、33nt、34ntまたは35nt長である。一実施形態では、CLEC-2リガンドは、配列番号4-93からなる群から選択される配列に対して少なくとも80、85、90、95、98、99もしくは100同一である核酸配列または薬学的に許容されるこの塩を含む。一実施形態では、リガンドはタンパク質CLEC-2またはこの断片に結合する。別の実施形態では、リガンドはCLEC-2の可溶性ドメインに結合する。さらに別の実施形態では、リガンドはCLEC-2細胞外ドメインに結合する。さらに別の実施形態では、リガンドはCLEC-2Gln58-Pro230ドメインに結合する。一実施形態では、リガンドはCLEC-2タンパク質配列番号1に特異的に結合する。別の実施形態では、リガンドはCLEC-2の細胞外ドメイン配列番号2に特異的に結合する。一実施形態では、リガンドは、その1つまたは複数が改変されているヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ヌクレオチド改変は安定化に寄与する改変である。さらに別の実施形態では、改変はインビトロおよび/またはインビボでリガンドの安定性を増加する。さらに別の実施形態では、改変はインビボでリガンドの生物学的利用能を増加する。一実施形態では、リガンドはこの3’末端に逆位チミンを含む。一実施形態では、リガンドは、CLEC-2に対して約20ナノモルnMまたはそれ未満の解離定数Kdを有する。一実施形態では、リガンドは、0より大きいが約100マイクロモルμM未満、約1μM未満、約500ナノモルnM未満、約100nM未満、約50nM未満、約1nM未満、約500ピコモルpM未満、約300pM未満、約250pM未満または約200pM未満であるCLEC-2に対する解離定数を有する。一実施形態では、リガンドは約0.1から10nMまたは約0.5から約5nMの範囲に及ぶCLEC-2に対する解離定数を有する。一実施形態では、CLEC-2リガンドは、CLEC-2のバリアントに結合してこの機能を減少または阻害し、CLEC-2バリアントはCLEC-2アミノ酸配列配列番号1または配列番号2に対して少なくとも80、85、90、91、93、94、95、96、97、98または99同一である。一実施形態では、CLEC-2リガンドがCLEC-2に結合することにより、CLEC-2の活性立体構造が安定化する。別の実施形態では、CLEC-2リガンドがCLEC-2に結合することにより、CLEC-2の不活性立体構造が安定化する。一実施形態では、リガンドの1つまたは複数のヌクレオチドは改変された糖および/または改変された塩基を含む。別の実施形態では、改変は2’-安定化に寄与する改変である。さらに別の実施形態では、2’-安定化に寄与する改変は、ヌクレオチド糖環上の2’-フルオロ改変である。一実施形態では、CLEC-2に対する核酸リガンドは可逆的であり、CLEC-2に結合しているCLEC-2リガンドは解離されることができる。別の実施形態では、CLEC-2に結合しているCLEC-2リガンドは、CLEC-2リガンドモジュレーターの存在下でCLEC-2から解離される。一態様では、CLEC-2リガンドに結合するモジュレーターであって、CLEC-2リガンドの活性を部分的にまたは完全に逆転させるモジュレーターが提供される。一実施形態では、モジュレーターは単離された核酸配列を含む。別の実施形態では、モジュレーターは、DNA配列、RNA配列、ポリペプチド配列またはこれらの任意の組合せを含む。一実施形態では、モジュレーターは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、2’-O-メチル-2’デオキシヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドと2’-O-メチル-2’デオキシヌクレオチドの混合物を含む核酸モジュレーターである。別の実施形態では、核酸モジュレーターは、少なくとも1つの改変されたデオキシリボヌクレオチドおよび/または少なくとも1つの改変されたリボヌクレオチドを含む。一実施形態では、モジュレーターは、CLEC-2核酸リガンドの少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、モジュレーターは、CLEC-2核酸リガンドの少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチドからなる。別の実施形態では、モジュレーターは、CLEC-2リガンドにおけるループの少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、モジュレーターは、CLEC-2リガンドにおけるステムの少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、モジュレーターは、CLEC-2リガンドにおけるステムの少なくとも一部におよびCLEC-2リガンドにおけるループの少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、モジュレーターは、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64および配列番号65からなる群から選択される配列に対して80、85、90、91、93、94、95、96、97、98または99を超えて同一である配列を含む。別の実施形態では、モジュレーターは、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64および配列番号65からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、CLEC-2核酸リガンドのモジュレーターは、リボザイム、DNAザイム、ペプチド核酸PNA、モルフォリノ核酸MNAおよびロックド核酸LNAからなる群から選択される。一実施形態では、CLEC-2核酸リガンドのモジュレーターは、CLEC-2核酸リガンドの少なくとも一部に相補的である核酸を含む。別の実施形態では、モジュレーターは、リボザイム、DNAザイム、ペプチド核酸PNA、モルフォリノ核酸MNAおよびロックド核酸LNAからなる群から選択され、このモジュレーターはCLEC-2核酸リガンドの少なくとも一部に特異的に結合または相互作用する。一実施形態では、モジュレーターは、核酸結合タンパク質またはペプチド、小分子、オリゴ糖、核酸結合脂質、ポリマー、ナノ粒子およびマイクロスフェアからなる群から選択され、このモジュレーターはCLEC-2核酸リガンドの少なくとも一部に結合または相互作用する。一実施形態では、モジュレーターは、配列が約10ntから約30nt、約10ntから約25nt、約10ntから約20nt、約10ntから約15ntまたは約15ntから約20nt長である、単離された核酸配列を含む。別の実施形態では、モジュレーターは、配列が約10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19ntまたは20nt長である、単離された核酸配列を含む。一実施形態では、CLEC-2核酸リガンドおよび/または核酸モジュレーター配列のヌクレオチドのうちの1つまたは複数が改変される。別の実施形態では、1つまたは複数のヌクレオチドは、2’ヒドロキシル位に改変を含む。別の実施形態では、CLEC-2リガンドに存在する改変は2’-フルオロからなる群から選択される。別の実施形態では、CLEC-2リガンドの1つまたは複数のヌクレオチドは、2’-フルオロ-2’デオキシシチジンまたは2’-フルオロ-2’デオキシウリジンである。さらに別の実施形態では、モジュレーターの1つまたは複数のヌクレオチドは、2’-O-メチルシトシン、2’-O-メチルウリジン、2’-O-メチルアデノシン、2’-O-メチルグアノシンまたは2’-O-メチルチミジンである。さらに別の実施形態では、1つまたは複数のヌクレオチドは、2’フルオロシチジン、2’フルオロウリジン、2’フルオロアデノシンまたは2’-フルオログアノシンである。一実施形態では、CLEC-2核酸モジュレーターの1つまたは複数のヌクレオチドの改変は、5-フルオロウラシル、5-フルオロシトシン、5-ブロモウラシル、5-ブロモシトシン、5-クロロウラシル、5-クロロシトシン、5-ヨードウラシル、5-ヨードシトシン、5-メチルシトシン、5-メチルウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-カルボキシヒドロキシルメチルウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、6-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキューオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、5-メトキシシトシン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシルオキシ酢酸v、ブトキソシンbutoxosine、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチルチオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシルオキシ酢酸v、5-メチルチオウラシル、3-3-アミノ-3-Nカルボキシプロピルウリジンacp3Uおよび2,6-ジアミノプリンからなる群から選択される改変を含む。一実施形態では、モジュレーターは、少なくとも1つの改変された糖部分を含む。一実施形態では、モジュレーターがCLEC-2リガンドに結合すると、CLEC-2リガンド内の自殺位が曝露され、それによってCLEC-2リガンドの二次構造が破壊され、ヌクレアーゼによる核酸CLEC-2リガンドの破壊が増強される。一実施形態では、CLEC-2リガンド-CLEC-2複合体にモジュレーターが結合すると、CLEC-2リガンドのCLEC-2への結合が減少または排除される。別の態様では、CLEC-2リガンドの活性をモジュレートする方法が提供される。一実施形態では、核酸リガンドはCLEC-2に特異的に結合し、CLEC-2媒介障害を抑制する。一実施形態では、リガンドは、血小板凝集を媒介するCLEC-2の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、血小板活性化および分泌を媒介するCLEC-2の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、血栓形成を伝播するCLEC-2の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、内在性タンパク質ポドプラニンと相互作用するCLEC-2の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、腫瘍細胞と相互作用するCLEC-2の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、ポドプラニンを介して腫瘍細胞に結合し血小板を腫瘍部位に引き付けるCLEC-2の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、CLEC-2の能力を腫瘍細胞と相互作用することから抑制し、それによって転移を抑制する。一実施形態では、リガンドは、CLEC-2の能力を腫瘍細胞と相互作用することから抑制し、それによって増殖因子を放出する腫瘍細胞の能力を減少させる。一実施形態では、リガンドは、CLEC-2の能力をヒト免疫不全ウイルスHIVと相互作用することから抑制する。一実施形態では、リガンドは、CLEC-2の能力をHIV播種を促進することから抑制する。一実施形態では、リガンドは、CLEC-2シグナル伝達媒介炎症応答、サイトカイン産生、血小板-単球相互作用および血小板粘着の能力を抑制する。一実施形態では、核酸CLEC-2リガンドを投与されている宿主にCLEC-2リガンドのモジュレーターを投与することによりCLEC-2核酸リガンドの活性をモジュレートする方法が提供される。一実施形態では、モジュレーターはオリゴヌクレオチドモジュレーターまたはこの誘導体であることが可能であり、ある種の実施形態では、核酸CLEC-2リガンドの一部に相補的である。追加の態様では、CLEC-2リガンドを使用してCLEC-2機能を調節する方法が提供される。一実施形態では、CLEC-2機能を調節するための方法は、宿主に治療的有効量のCLEC-2リガンドを投与することを含む。別の実施形態では、この方法は、すでにCLEC-2リガンドを投与されている宿主にCLEC-2リガンドモジュレーターを投与することをさらに含む。別の態様では、CLEC-2媒介疾患または障害を処置するまたは寛解させる方法が提供される。一実施形態では、この方法は、CLEC-2に結合するCLEC-2リガンドの治療的有効量をそれを必要とする宿主に投与することを含む。一実施形態では、宿主は血小板媒介障害に罹っていると診断されている。一実施形態では、血小板媒介疾患または障害は、心血管障害、脳血管障害、末梢血管障害、急性冠動脈症候群、糖尿病関連障害および癌からなる群から選択される。一実施形態では、脳血管障害は、血栓症、血栓塞栓症または一過性脳虚血発作TIAである。別の実施形態では、急性冠動脈症候群は、冠動脈血栓症、不安定狭心症または心筋梗塞に起因する。さらに別の実施形態では、糖尿病関連障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性脈管障害、アテローム動脈硬化症、虚血性発作、末梢血管疾患、急性腎損傷または慢性腎不全である。一実施形態では、癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膵癌、脳癌、骨癌および肝癌から選択される。一実施形態では、CLEC-2リガンドは、非経口投与、静脈内注射、内皮送達、関節内送達、滑液嚢内送達、くも膜下腔内、動脈内送達、心臓内送達、筋肉内送達、皮下送達、眼窩内送達、嚢内送達、脊髄内送達、胸骨内送達、局所送達、経皮パッチ送達、直腸送達、頬側送達、膣または尿道坐剤を介した送達、腹膜送達、経皮送達、点鼻薬を介した送達、手術移植を介した送達、内部手術用ペンキInternalsurgicalpaintを介した送達、注入ポンプを介した送達またはカテーテルを介した送達により投与される。別の態様では、血小板機能を調節するCLEC-2リガンドを投与することによりそれを必要とする患者を処置するための方法が提供される。一実施形態では、治療的有効量のCLEC-2が投与される。一実施形態では、治療的有効量は血小板粘着および/もしくは凝集および/もしくは分泌を減少または抑制する。一態様では、CLEC-2に結合する核酸リガンドの治療的有効量を含む医薬組成物が提供される。一態様では、CLEC-2に結合する核酸CLEC-2リガンドの活性を逆転させるモジュレーターの治療的有効量を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、医薬組成物は、CLEC-2リガンドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、静脈内注射に適した液体である。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、皮下注射に適した液体またはディスパーションである。一態様では、CLEC-2核酸リガンドおよび/またはCLEC-2核酸リガンドの活性を調節するモジュレーターの治療的有効量を含むキットが提供される。一実施形態では、キットはCLEC-2リガンドを含む。別の実施形態では、キットはCLEC-2リガンドのモジュレーターを含む。さらに別の実施形態では、キットは、CLEC-2リガンドとCLEC-2リガンドのモジュレーターの両方を含む。本明細書に記載される核酸リガンドの方法、医薬組成物および使用も、抗血小板または抗血栓療法を必要とする障害または処置計画において使用するためのモジュレート可能な治療法として提供される。ある種の実施形態では、処置は、経皮的介入を含む外科的介入である。この方法は、CLEC-2に対する核酸リガンドをそれを必要とする、閉塞性血栓疾患または冠動脈、大脳もしくは末梢血管系の障害に罹っているまたは罹るリスクがある宿主に投与することを含むことが可能である。さらに、核酸リガンドまたはこのモジュレーターが薬学的に許容される担体と組み合わされている医薬組成物が提供される。モジュレーターを含有する組成物は、核酸リガンドを与えられている宿主に投与して、リガンドの活性のモジュレーションを可能にし、したがって、出血の危険のある宿主の凝固状態を調節するように設計することが可能である。一態様では、CLEC-2リガンドがCLEC-2機能を活性化するのか阻害するのかを決定するための方法が提供される。一実施形態では、CLEC-2機能はCLEC-2依存性またはCLEC-2媒介血小板凝集である。別の実施形態では、CLEC-2リガンドがCLEC-2依存性血小板凝集を活性化するかどうかを決定するための方法が提供される。さらに別の実施形態では、この方法はインビトロで実施される。一実施形態では、この方法は、aCLEC-2リガンドを血液試料と混合して、処理された血液試料を調製するステップ、b処理された血液試料を促進性分子と接触させるステップ、c接触後、血小板凝集体形成を測定するステップ、およびdステップcにおいて検出された血小板凝集体形成の程度を、CLEC-2に結合して促進性分子とのこの相互作用を阻害するのに使用されるCLEC-2リガンドのない対照血液試料を用いて得られる血小板凝集体形成の程度と比較するステップを含む。一実施形態では、促進性分子は固体支持体に固定化されている。一実施形態では、促進性分子はCLEC-2活性化物質である。別の実施形態では、促進性分子はロドサイチンである。さらに別の実施形態では、促進性分子はポドプラニンである。一実施形態では、CLEC-2活性化物質と組み合わせて使用される場合、促進性分子は可溶性コラーゲンである。別の実施形態では、可溶性コラーゲンはI、IIまたはIII型コラーゲンである。さらに別の実施形態では、この方法は、CLEC-2活性化物質を血液試料に添加することをさらに含む。さらに別の実施形態では、CLEC-2活性化物質はロドサイチンである。一実施形態では、血液試料は全血である。別の実施形態では、血液試料は多血小板血漿PRPである。さらに別の実施形態では、血液試料は洗浄血小板である。一実施形態では、CLEC-2リガンドは核酸CLEC-2リガンドである。別の実施形態では、核酸CLEC-2リガンドは、配列番号8または配列番号9または配列番号8もしくは配列番号9由来の配列を含む。核酸リガンドは、アプタマーとも呼ばれるが、目的の標的分子への結合を可能にする特定の三次元形状をとる天然に存在しない一本鎖核酸である。ペプチドおよびタンパク質に結合するリガンドでは、モノクローナル抗体がこの標的タンパク質に結合するとタンパク質の機能が阻害されることがあるのと同じように、リガンドがこの標的タンパク質に会合するとタンパク質の機能を阻害することがある。核酸リガンドの独特の特長は、ワトソン-クリック型塩基対合によりリガンドにハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチドの形態で、それ自体に対する活性制御剤を生成する能力である。これらの活性制御剤は、リガンドの活性構造を根本的に変化させ、それによってこの薬理活性を中和する。本発明は、CLEC-2の生体機能および相互作用を媒介するCLEC-2に対する核酸リガンドを含む化合物、組成物および方法を提供する。さらに、CLEC-2核酸リガンドの活性を調節することができるモジュレーターが提供される。定義本明細書で使用される場合、他の方法で指示されてなければ、以下の定義が適用するものとする。重さ、時間、用量、等の量などの測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される用語約は、特定された量から±20または±10、±5、±1もしくは±0.1の変動を包含することが意図されており、したがって、変動は開示された方法を実施するのに適切である。核酸リガンドは、本明細書ではリガンドまたはアプタマーと呼ばれることもあるが、三次構造を形成することができ、標的分子と相互作用する核酸である。CLEC-2核酸リガンドまたはCLEC-2リガンドまたは抗CLEC-2リガンドまたは核酸CLEC-2リガンドとは、CLEC-2またはこの断片に特異的に結合するリガンドまたはアプタマーのことである。CLEC-2断片は、細胞外ドメインECDまたはこの断片などの可溶性断片であってもよい。代わりに、CLEC-2リガンドは、細胞の表面で発現されるまたは血小板と会合しているのが見出されるCLEC-2分子に結合する。CLEC-2タンパク質は、細胞上で内因的に発現されるまたは組換え手段により発現されることもある。この用語は、生理的環境において対象の標的分子と複合体を形成することができる特定の結合領域を有するオリゴヌクレオチドのことである。標的分子へのリガンドの結合の親和性は、リガンドと標的分子間の相互作用の解離定数Kdの点から定義される。典型的には、その標的に対するリガンドのKdは約0.1nMから約100nMの間である。結合の特異性は、環境におけるリガンドおよび他の物質または無関係な分子一般に関する解離定数と比べた場合の標的に対するリガンドの比較解離定数の点から定義される。典型的には、標的に関するリガンドのKdは、環境における無関係物質または付随的物質に関するKdの10分の1、50分の1、100分の1または200分の1になる。本明細書で使用される場合、相同領域という文脈においては、実質的に相同な配列は、特定の分子内でワトソン-クリック塩基対合により同じ二次構造を形成する配列である。ある種の実施形態では、特定のリガンドに対する少なくとも80、85または約90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99配列同一性などのそれよりも多い配列同一性を共有するならば、配列は実質的に相同である。明確にするために、そのような実質的に相同な配列は、特定の配列に対して少なくとも80、85、90もしくは95配列同一性を有する配列と、または配列は特定のリガンド配列に対して約90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99同一であり得ると言ってもよい。50またはそれ未満のヌクレオチドなどの特定された長さの核酸リガンドという状況では、相同配列は、ワトソン-クリック結合に、特定領域内の配列同一性とは無関係に、同じ二次構造を形成させる任意の領域において見出すことができる。本出願と一緒に提出される配列表は、一次配列のみを提供する特定の改変なしのヌクレオチドの配列を提供する。本特許明細書においておよび提出される配列表において提供される配列それぞれが、本明細書に記載される改変のいかなる組合せでも有し得ることは理解されている。表1-4に記載される改変を有する配列は、それぞれが特定のクローン名または名称と関連しており、これらの名称はその具体的に定義された改変を有する核酸配列の定義された説明を与える。リガンドモジュレーターペアは、標的分子に対する特定のリガンドと、リガンドとその標的の相互作用がモジュレートされるようにリガンドの二次および/または三次構造を変化させるリガンドモジュレーターを含むことが意図されている。モジュレーターはリガンドの一部に相補的なオリゴヌクレオチドであることが可能である。モジュレーターは、インビトロ、エクスビボまたはインビボでの生理条件下でリガンドの立体構造を変化させてリガンドの標的結合能を10から100、20から100、25、40、50、60、70、80、90もしくは100または10から100までの範囲の任意の割合で減少させることができる。モジュレーター、解毒剤antidote、レギュレーターまたは制御剤とは、本明細書に記載されるリガンドまたはアプタマーに結合してそのリガンドとこの標的分子間の相互作用を目的の形態で変更するたとえば、リガンドの構造を改変することによりことができる任意の薬学的に許容される作用剤のことである。本明細書で使用されるモジュレートするmodulateは、活性における減弱、増加または何か他の測定可能な変化を意味する。宿主とは哺乳動物のことであり、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む。宿主の例には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ブタ、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウシおよびヒトが含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用される薬学的に許容されるは、連邦もしくは州政府の規制当局により承認されている、または米国薬局方もしくはヒトに使用するために一般的に承認されている他の薬局方に収載されていることを意味する。薬学的有効量は、疾患状態の発生を予防する、抑制するまたは疾患状態を処置する症状をある程度軽減するのに必要な用量である。薬学的有効量は、疾患の種類、使用される組成物、投与経路、処置される哺乳動物の種類、検討中の特定の哺乳動物の身体特性、併用薬物および医者が認識する他の要因に依拠する。一般に、活性成分の0.1mg/kgから100mg/kg体重/日の量が、核酸リガンドとモジュレーターの効力に応じて投与される。安定化された核酸分子とは、安定化されていない核酸分子と比べてインビボでたとえば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼにより容易に分解されにくい核酸分子のことである。安定化は、長さおよび/または二次構造および/またはオリゴヌクレオチド骨格の糖またはリン酸部分内における化学的置換の包含の機能でありえる。安定化は、たとえば、分子を安定化することができる二次構造を制御することにより得ることが可能である。たとえば、核酸分子の3’末端が上流領域に相補的である場合、その部分は折り畳まれて分子を安定化するステムループ構造を形成することができる。用語結合親和性および結合活性は、標的に結合するまたは結合しないリガンド分子の傾向を指すことが意図されている。前記相互作用のエネルギー機構は結合活性および結合親和性において重要である。なぜならば、エネルギー機構が、相互作用する相手の必要な濃度、これらの相手が会合することができる速度ならびに溶液中の結合しているおよび遊離の分子の相対濃度を規定するからである。エネルギー機構は、とりわけ、解離定数Kdの決定を通じて特徴付け得る。本明細書で使用される処置または処置するは、a疾患から保護する、すなわち、臨床症状を発生させない、b疾患を抑制する、すなわち、臨床症状の発生を停止、寛解、減少または抑制する、および/またはc疾患を軽減する、すなわち、臨床症状の後退を引き起こす、を含む哺乳動物における疾患の任意の処置を意味する。人間医学においては、最終的な誘導事象単数または複数が未知で、潜在性であることがあり、または患者は前記事象単数または複数の発生のずっと後まで確認されないために、予防すると抑制するを区別するのは必ずしも可能ではないことは当業者であれば理解する。したがって、本明細書で使用される場合、用語予防は、本明細書で定義される予防すると抑制するの両方を包含する処置の要素であることが意図されている。本明細書で使用される用語保護は、予防を含むことが意図されている。用語有効量は、処置される障害または疾患状態を処置するのに十分な投与量を意味する。これは、患者、疾患および行われる処置に応じて変化することになる。本明細書で使用されるCLEC-2核酸リガンドバリアントは、CLEC-2核酸リガンドと基本的に同じ機能を果たすバリアントを包含し、実質的に同じ構造を含む。CLEC-2CLEC-2は、肝細胞ならびに単球、樹状細胞、NK細胞および顆粒球を含むいくつかの造血細胞の表面で発現される膜貫通型タンパク質である。造血細胞および肝臓類洞内脾細胞のうち、CLEC-2タンパク質は血小板および巨核球細胞において特異的に発現されるChaipanら、2006年;JVirol、80:8951-8960頁。CLEC-2は、SrcおよびSykキナーゼを通じて血小板活性化を媒介することが明らかにされている。最初、CLEC-2に対する外来性リガンドのみが同定されていた。これらのリガンドには、ヘビ毒であるロドサイチンアグレチンaggretinおよびHIV-1が含まれており、この両方が血小板を活性化しそれによって血小板凝集を活性化することが明らかにされている。CLEC-2欠損は、出血時間の増加および閉塞性動脈血栓形成からの保護を伴うMayら、2009年、Blood、114:3464-3472頁。Mayらは、マウスの抗CLEC-2抗体処置により、循環する血小板においてCLEC-2が数日間、完全におよび高度に特異的に消失し、これに伴って血小板凝集に重篤な欠陥が生じることも明らかにした。内在性CLEC-2リガンドは、最近、Ozakiら2010年;J.ThromHaemos.、7:191-194頁により同定されたが、ポドプラニンである。ポドプラニンは、腫瘍誘導血小板凝集および腫瘍転移に関与しているシアロ糖タンパク質である。ポドプラニンはリンパ内皮においておよび腎臓ポドサイトにおいて高度に発現される。ポドプラニンの発現は血管内皮では検出されない。ポドプラニンとCLEC-2の相互作用は、発生中の血液とリンパ管の分離にとって重要である。研究によれば、ポドプラニン欠損マウスもCLEC-2欠損マウスも出血表現型および不定型の血管接続を示すことが明らかにされたSchacht,V.ら、2003年、EMBO、J.22:3546-3556頁;Suzuki-InoueK.ら、2010年、J.Biol.Chem.285:24494-24507頁。研究によれば、CLEC-2は、受容体が腫瘍細胞伝播を著しく促進することで知られているプロセスである腫瘍細胞誘導血小板活性化を媒介するために、血行性腫瘍転移に関与し得ることが示唆されているHonnら、1992年、CancerMetastasisRev、11:325-351頁;Nieswandtら、CancerRes、1999年、59:1295-1300頁。完全長CLEC-2タンパク質のアミノ酸配列ジェンバンク受託番号AAF36777は以下に提示されている。CLEC-2配列番号1CLEC-2の細胞外ドメインECDは、およそアミノ酸58-229を包含しており、以下に提示されている。CLEC-2Gln58-Pro229配列番号2N-末端His10タグ配列番号3に融合したCLEC-2の細胞外ドメインECDは、本明細書に記載される核酸リガンドを選択するために使用されたが、アミノ酸58-229を包含しており、以下に提示されている。CLEC-2核酸リガンドの開発CLEC-2タンパク質に特異的に結合する核酸リガンドは、SELEX法を使用して同定された。SELEXにより最初に得られたリガンドは、次に、CLEC-2リガンドの特性を理解するために完全に特徴付けられた。そのような特徴付けには、配列決定、保存された配列、二次構造予測およびトランケーションを決定するための配列整列化ならびにCLEC-2に特異的に結合し阻害するという目的の機能にもっとも重要であるリガンド領域を同定するための変異解析が含まれた。SELEXとは、指数関数的濃縮EXponentialEnrichmentによるリガンドの組織的進化SystematicEvolutionofLigandsのことである。この方法は、標的分子へ高度に特異的な結合をする核酸分子のインビトロ進化を可能にする。SELEX法は、たとえば、米国特許第5475096号および米国特許第5270163号に記載されているWO91/19813も参照。そのもっとも基本的な形態では、SELEXプロセスは、以下の一連のステップにより定義し得る。1異なる配列の核酸の候補混合物が調製される。候補混合物には一般に、固定された配列の領域すなわち、候補混合物のメンバーのそれぞれが同じ位置に同じ配列を含有するおよびランダム化された配列の領域が含まれる。固定された配列領域は、a以下に記載される増幅ステップを支援する、b標的に結合することが分かっている配列を模倣する、またはc候補混合物において所与の構造配列の核酸の濃度を増強するように選択される。ランダム化された配列は、全体的にランダム化することもすなわち、任意の位置に塩基を見出す確率は4つに1つであるまたは部分的にのみランダム化することもたとえば、任意の位置に塩基を見出す確率は、0から100の間の任意のレベルで選択することができる可能である。2候補混合物は、標的と候補混合物のメンバー間の結合に都合の良い条件下で選択された標的と接触させる。このような状況下で、標的と候補混合物の核酸間の相互作用は、標的と標的に対してもっとも強力な親和性を有する核酸間で核酸-標的複合体を形成すると見なすことが可能である。3標的に対してもっとも高度な親和性を有する核酸は、標的に対する親和性の少ない核酸から区分される。もっとも高度な親和性核酸に一致する配列は候補混合物にはごくわずかな数しかおそらく、1分子の核酸のみ存在しないので、区分化中、候補混合物中における相当量の核酸およそ5から50が保持されるように、区分化基準を設定するのが一般的に望ましい。4次に、区分化中に標的に対して比較的高度な親和性を有するとして選択された核酸は増幅されて、新しい候補混合物を作り、標的に対して比較的高度な親和性を有する核酸に濃縮される。5上記の区分化と増幅ステップを繰り返すことにより、新たに形成された候補混合物が含有する弱く結合する配列は徐々に少なくなり、標的に対する核酸の親和性の平均度合は一般的に増加することになる。SELEXプロセスは、標的分子ともっとも高度な親和性相互作用を可能にする特定の二次および三次構造に折り畳まれる最初の候補混合物由来の核酸配列を表す1つまたは少数の独特の核酸を含有する候補混合物を生じる。CLEC-2に特異的な核酸リガンドは、たとえば、米国特許第7087735号に記載されるSELEX法を使用して、分子の細胞外ドメインを表す短いペプチドに対してSELEXを実施することにより生成することができる。代わりに、たとえば、米国特許第6730482号に記載されるSELEX法を使用して、無傷の血小板、タンパク質について濃縮された血小板膜画分で、精製されたCLEC-2で、またはCLEC-2受容体を特異的に過剰発現している細胞系統でSELEXを実施することにより、CLEC-2に特異的な核酸リガンドを単離することが可能である。さらに、SELEXプロセスは、米国特許第5780228号に記載されるスキームなどの、競合親和性溶出スキームを使用して特異的CLEC-2核酸リガンドを単離することに向けることが可能である。ある種の実施形態では、CLEC-2核酸リガンドは、生理条件下でCLEC-2受容体に結合する。生理条件は典型的には、溶液の塩およびpHのレベルに関係している。インビトロでは、生理条件は典型的には、150mMNaCl、2mMCaCl2、20mMHEPESを約7.4のpHで含むバッファーにおいて再現される。ある種の実施形態では、天然の、典型的には活性化されていない血小板が上記の通りに使用されて、核酸リガンドの集団をスクリーニングし濃縮された集団を与え、この中には血小板上に見出されるタンパク質に向けられるリガンドが含有される。次に、濃縮された集団は、目的のCLEC-2受容体を過剰発現している安定な細胞系統またはタンパク質で一過性にトランスフェクトされている細胞系統に対して使用される。リガンド競合実験を通じてまたは細胞内シグナル伝達経路へのその効果を同定することにより、これらの細胞から単離された受容体にまたはホール細胞に修正されたSELEX手法を使用することにより、二次スクリーニングは実現することが可能である。多血小板血漿もしくは洗浄血小板調製物において実施される光線透過率凝集測定、または全血において実施されるインピーダンス凝集測定、または多血小板血漿もしくは全血もしくは洗浄血小板において、ロドサイチンにより血小板を活性化し続いて抗CD62PP-セレクチン、抗PAC1活性化されたGPIIbIIIaもしくは抗フィブリノーゲンを含む血小板活性化および凝集のマーカーで染色して実施されるFACSなどの血小板機能アッセイにおいて血小板凝集の抑制についてリガンドをスクリーニングすることも可能である。CLEC-2に対する所与の核酸リガンドの特異性は、所与の受容体の既知のアゴニストにより誘発される細胞内シグナル伝達事象を遮断するリガンドの能力によりさらに区別することが可能である。CLEC-2に対する所与の核酸リガンドの特異性は、凝集がCLEC-2以外の受容体を活性化するアゴニストにより誘発される場合の血小板凝集に対する効果の非存在によりさらに区別することも可能である。本明細書に記載されるリガンドは単離された核酸配列を含み、この配列はDNAでもRNAでも可能であり、改変されたリボ核酸またはデオキシリボ核酸を使用して合成することが可能である。本明細書に記載されるある種の実施形態では、核酸の配列はRNA配列として書かれる。同様に、核酸リガンドが最初はDNA分子として同定される本明細書に記載されるある種の実施形態では、核酸の配列はDNA配列として書かれる。DNA配列としてテキスト形式で提示されるヌクレオチド配列は、DNA配列内のチミンTがウリジンUで置き換えられてヌクレオチドの対応するRNA配列が得られる対応するRNA配列の記述を本質的に与えることは理解されている。同様に、RNA配列としてテキスト形式で提示されるヌクレオチド配列は、RNA配列内のウリジンUがチミンTで置き換えられて対応するDNA配列が得られる対応するDNA配列の記述を本質的に与えることは理解されている。標的に関するリガンドの結合親和性は、Kdの点から定義することができる。この解離定数の値は、実施例1に記載される放射性リガンド結合法によりなどの、周知の方法により直接決定することが可能である。一部の実施形態では、CLEC-2へのリガントの結合のKdは、約1nMから約100nMまで、約10nMから約50nMまでまたは約0.1nMから約20nMまでの範囲に及ぶことができる。他の実施形態では、CLEC-2へのリガントの結合のKdは、環境内の無関係なタンパク質または他の付随する物質へのリガントの結合のKdの少なくとも2分の1、3分の1、4分の1、5分の1または10分の1である。無関係なタンパク質は、別の血小板活性化または粘着受容体などのCLEC-2に存在するモチーフに関係するモチーフを有するタンパク質であることもある。以下でより詳細に考察されるように、SELEX法により得られ同定されるリガンドの結合活性は、多種多様の技術手法を使用してさらに改変または増強することが可能である。一部の実施形態では、リガンドはCLEC-2の細胞外ドメインと相互作用する。リガンドは、内在性リガンドのCLEC-2受容体への結合を妨害することができる。ある種の実施形態では、リガンドはCLEC-2受容体を介する細胞内シグナル伝達を阻害することができる。リガンドは、ポドプラニンなどの内在性リガンドと相互作用するこの受容体の能力が減少するように、二量体立体構造などの受容体の立体構造を安定化することも破壊することもできる。ある種の実施形態では、リガンドは、血小板凝集および/もしくは活性化ならびに/または血小板粘着ならびに/または血小板分泌に影響を与えることができる。本明細書に記載される核酸リガンドは、能動的な可逆的作用剤として機能することができる。これらは、患者への投与後、第2の作用剤の投与により直接制御することが可能な作用剤または薬学的な活性分子である。下にもっと詳細に記載されるように、第2の作用剤は、本明細書ではモジュレーターと呼ばれるが、リガンドの薬理活性を遮断または微調整することができる。その結果、リガンドの薬理活性は、たとえば、薬物クリアランス以外の手段により逆転させることができる。本明細書に開示されるCLEC-2リガンドは、好ましくは、CLEC-2細胞外ドメインECDアミノ酸残基Gln58-Pro230;配列番号2に特異的に結合する核酸リガンドである。CLEC-2リガンドは、下におよび実施例1にもっと詳細に記載されるSELEX法を使用して選択され、次に、安定性、CLEC-2に対する親和性および/またはCLEC-2活性を調節する能力を増加させるよう改変された。本明細書に記載される方法に従って単離されたリガンドは、本明細書の実施例2に提示される、下の表1-2に提示されている。本明細書に記載されるように、CLEC-2に結合するアプタマーは実施例1-2に記載される通りに単離され塩基配列決定され、20の独特な配列が同定された。1つのクローン、S2-20は、CLEC-2依存性血小板凝集の高親和性阻害因子として同定された。このクローンは、さらに実施例3-5に記載されるSELEX選択された配列の切断型および/または変異されたバージョンを生成することにより特徴付けられた。クローンS2-20配列番号8または配列番号9の二次構造解析は、mfoldサーバーmfold.bioinfo.rpi.eduで利用可能なソフトウェアを使用して、CLEC-2リガンドアプタマーが約6bp長の第1のステムを有する共通構造を予想したが、データによれば、この第一ステムの長さは5から10bpの範囲に及び、CLEC-2に対する高親和性を維持することができることが明らかにされている。したがって、アプタマーの第1のステムは、約3bpから約15bpまで、または約4bpから約12bpまで、または約5bpから約10bpまでの範囲に及び得る。第1のステムは、約3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、11bp、12bp、13bp、14bpまたは15bpの長さを有し得ることが想定されている。CLEC-2リガンド構造は、配列5’-GAC-3’を有する第1のループを有するとも予想されたが、変異解析により第1のループ構造の第二位における変異の許容性が明らかにされた。したがって、CLEC-2リガンドの第1のループは5’-GNC-3’共通配列を含み、NはA、T、C、GまたはUであることが可能であることが想定されている。第一ループの3’側に第2のステムがあり、ステムの塩基にゆらぎ塩基対のある約4bpの長さを有するが、この長さは約3bpから7bpまでまたは4bpから約6bpまで変わり得る。第2のステムの3’側に、配列5’-CUCAUAUU-3’の第2のループ構造がある。変異解析により、好ましいループ2共通配列は5’-YUYNNRYU-3’であり得、Yはピリミジン、RはプリンおよびNはA、G、C、TまたはUであることが明らかにされた。S2-20に由来する切断型CLEC-2リガンドのうち、S2-20T10配列番号22およびRB587配列番号24がそのようなリガンドの例である。共通構造を決定すれば、リガンド構造および機能を増強または減少させ得る1つまたは複数のヌクレオチドを同定するためのリガンドの操作が促進される。共通構造を決定すれば、特定のステムおよびループ構造へのヌクレオチド付加、欠失および置換をさらに効率よく同定し試験することが可能になる。共通二次構造が分かれば、リガンド構造および機能にとって有害になり得る改変を回避することも可能になる。たとえば、ステムまたはループ領域内の2’-フルオロなどのある種の改変は共通二次構造内に保存されていることもある。これらの場合、リガンドのステムまたはループから2’-フルオロを取り去ると活性が失われることがある。一実施形態では、リガンドはSELEX法を使用して選択される核酸分子であり、切断型およびこれに実質的に相同な配列を含む。本明細書で使用されるように、相同領域という状況では、実質的に相同な配列は、特定の分子内でワトソン-クリック塩基対合により同じ二次構造を形成する配列である。別の実施形態では、SELEX法を使用して選択されるリガンドは、配列番号5-59にまたは配列番号9-14、16-22、24、33、37、38、42、44-48および55-57からなる群から選択される配列に少なくとも80、85、90、95、96、97、98もしくは99同一であるまたは同一である核酸配列を含む核酸配列からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、リガンドは、生理条件下、インビトロで測定された場合、約10nM未満または約5nM未満の解離定数を有するリガンドである。本明細書に記載されるCLEC-2リガンドは、配列番号7、配列番号8または配列番号9内の1つまたは複数のヌクレオチド位に欠失を有することによりS2-20配列とは異なる配列を含む核酸分子でもよい。CLEC-2リガンドは、配列番号7、配列番号8または配列番号9内に1つまたは複数の欠失の任意の組合せ導入することにより作製してもよい。本明細書で言及されるCLEC-2リガンドは、配列番号7、配列番号8または配列番号9の5’および/または3’末端から1つまたは複数のヌクレオチドを切断する欠失することにより生成される配列を含んでいてもよい。たとえば、CLEC-2リガンドは、配列番号7、配列番号8または配列番号9の最初5’の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16ヌクレオチドを欠失することにより生成される配列であってもよい。別の実施形態では、配列番号7、配列番号8または配列番号9から最後3’の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16ヌクレオチドが欠失される。さらに別の実施形態では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79もしくは80位のヌクレオチドまたはこれらの任意の組合せが配列番号7、配列番号8または配列番号9の配列から欠失される。別の実施形態では、欠失配列の組合せは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチドからなる。好ましい実施形態では、CLEC-2リガンドは、配列番号24に少なくとも80、85、90または95同一である配列を含む。この実施形態では、CLEC-2リガンドは、約20bpから40bp、25bpから30bまたは約27bpから33bpまでの範囲に及ぶ長さを有する。このCLEC-2リガンドは、第1のステム、5’-GNC-3’NはG、A、T、CまたはUを含む第1のループ、第2のステムおよび5’-CUCAUAUU-3’または5’-YUYNNRYU-3’Yはピリミジン、Rはプリン、NはA、G、C、TまたはUを含む第2のループを含む二次構造を有する。核酸リガンド配列番号24という状況では、特定の領域内の配列同一性とは無関係に、ワトソン-クリック結合に同じ二次構造を形成させるいかなる領域においても相同配列を見出すことができる。本明細書に記載されるCLEC-2リガンドは、インビトロでおよび/またはインビボでCLEC-2分子の活性を阻害するように機能する。言い換えると、CLEC-2活性を測定するように設計された特定のアッセイにおいては、CLEC-2リガンドを添加するとCLEC-2活性を減少させ得る。たとえば、CLEC-2リガンドはCLEC-2機能を阻害する。CLEC-2リガンドは、インビトロでおよび/またはインビボでCLEC-2依存性血小板機能を阻害することにより機能し得る。CLEC-2核酸リガンドのモジュレーター一部の実施形態では、CLEC-2に対する核酸リガンドは可逆的である。一態様では、CLEC-2リガンドのモジュレーターを前記核酸リガンドを投与された宿主に投与することによりCLEC-2に対するリガンドの活性をモジュレートするための方法が提供される。モジュレーターは、核酸リガンドに結合し、そのリガンドとこの標的分子間の相互作用をたとえば、核酸リガンドの構造を改変することにより目的の方法で改変することができる、または核酸リガンドを分解する、代謝する、切断するもしくは他の方法で化学的に変化させてその生物学的効果を改変するいかなる薬学的に許容される作用剤でも含むことが可能である。本明細書に記載されるCLEC-2リガンドの核酸モジュレーターは標準相補的ワトソン-クリック塩基対合則に基づいて設計される実施例6参照。変化する長さのモジュレーターオリゴヌクレオチドは、CLEC-2機能を阻害することが明らかにされているCLEC-2リガンドに相補的な配列を有するように合成される。次に、合成されたモジュレーターオリゴヌクレオチドのそれぞれは、たとえば、ゲル移動度シフトアッセイにより、CLEC-2リガンドの結合するその能力について試験される。次に、CLEC-2リガンドに結合するモジュレーターがCLEC-2リガンドの活性を逆転させることもできるかどうかを試験することが重要である。下でおよび実施例のセクションでさらに詳細に記載されるように、所与のモジュレーターの逆転活性は、CLEC-2リガンドの抗血小板活性を評価するアッセイを使用して試験することが可能である。CLEC-2媒介血小板凝集を阻害するCLEC-2リガンドを同定するために実施されるアッセイは、CLEC-2リガンドに結合することが明らかにされているモジュレーターの存在下でも実施される。モジュレーターは、CLEC-2リガンドの添加の前に、同時にまたは後でアッセイ混合物に添加してもよい。モジュレーターの逆転活性は、たとえば、洗浄血小板凝集研究、全血、多血小板血漿におけるまたは洗浄血小板調製物におけるロドサイチンまたはポドプラニン誘導血小板凝集アッセイ、CLEC-2リガンドの存在下でP-セレクチン発現を評価するためのロドサイチンまたはポドプラニンを用いて実施されるフローサイトメトリーアッセイおよびインビトロフローベースの血小板粘着アッセイを使用して実証することが可能である。好ましい実施形態では、CLEC-2核酸リガンドのモジュレーターは、CLEC-2核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図8に示されるようにおよび表4参照、CLEC-2リガンドRB587のモジュレーターは、RB587の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。RB581は、RB587の一次配列の3’16塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるCLEC-2リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、CLEC-2へのRB587の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、CLEC-2リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ループ2、ステム2およびステム1またはこれらの部分を包含するCLEC-2核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。1つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、CLEC-2リガンドRB587配列番号24のおよそ14-31または14-26または16-31または18-31または21-31または16-26または16-29位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとCLEC-2リガンドとの特定の相互作用により、CLEC-2ポリペプチドへのCLEC-2リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、CLEC-2リガンドによるCLEC-2標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。好ましい実施形態では、CLEC-2核酸リガンドのモジュレーターは、CLEC-2核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図8に示されるようにおよび表4参照、CLEC-2リガンドRB587のモジュレーターは、RB587の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。RB582は、RB587の一次配列の内部16塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるCLEC-2リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、CLEC-2へのRB587の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、CLEC-2リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ループ2、ステム2およびステム1の一部またはこれらの部分を包含するCLEC-2核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。1つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、CLEC-2リガンドRB587配列番号24のおよそ14-31または14-29または14-27または16-29または16-27または19-29または21-31または21-29位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとCLEC-2リガンドとの特定の相互作用により、CLEC-2ポリペプチドへのCLEC-2リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、CLEC-2リガンドによるCLEC-2標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。好ましい実施形態では、CLEC-2核酸リガンドのモジュレーターは、CLEC-2核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図8に示されるようにおよび表4参照、CLEC-2リガンドRB587のモジュレーターは、RB587の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。RB583は、RB587の一次配列の内部15塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるCLEC-2リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、CLEC-2へのRB587の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、CLEC-2リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ループ1、ステム2およびループ2またはこれらの部分を包含するCLEC-2核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。1つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、CLEC-2リガンドRB587配列番号24のおよそ7-21または9-21または9-17または7-19または7-17または7-14位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとCLEC-2リガンドとの特定の相互作用により、CLEC-2ポリペプチドへのCLEC-2リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、CLEC-2リガンドによるCLEC-2標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。好ましい実施形態では、CLEC-2核酸リガンドのモジュレーターは、CLEC-2核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図8に示されるようにおよび表4参照、CLEC-2リガンドRB587のモジュレーターは、RB587の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。RB584は、RB587の一次配列の内部16塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるCLEC-2リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、CLEC-2へのRB587の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、CLEC-2リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ステム1の一部、ループ1、ステム2およびループ2の一部またはこれらの部分を包含するCLEC-2核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。1つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、CLEC-2リガンドRB587配列番号24のおよそ1-21または1-19または1-14または4-14または4-19または4-21または6-21または6-14位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとCLEC-2リガンドとの特定の相互作用により、CLEC-2ポリペプチドへのCLEC-2リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、CLEC-2リガンドによるCLEC-2標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。好ましい実施形態では、CLEC-2核酸リガンドのモジュレーターは、CLEC-2核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図8に示されるようにおよび表4参照、CLEC-2リガンドRB587のモジュレーターは、RB587の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。RB585は、RB587の一次配列の5’18塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるCLEC-2リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、CLEC-2へのRB587の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、CLEC-2リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ステム1、ループ1、ステム2およびループ2の一部またはこれらの部分を包含するCLEC-2核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。1つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、CLEC-2リガンドRB587配列番号24のおよそ1-21または1-18または1-16または1-14または4-21または4-18または4-14または6-14または6-18または6-21位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとCLEC-2リガンドとの特定の相互作用により、CLEC-2ポリペプチドへのCLEC-2リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、CLEC-2リガンドによるCLEC-2標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。好ましい実施形態では、CLEC-2核酸リガンドのモジュレーターは、CLEC-2核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図8に示されるようにおよび表4参照、CLEC-2リガンドRB587のモジュレーターは、RB587の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。RB586は、RB587の一次配列の5’13塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるCLEC-2リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、CLEC-2へのRB587の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、CLEC-2リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ステム1、ループ1およびステム2またはこれらの部分を包含するCLEC-2核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。1つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、CLEC-2リガンドRB587配列番号24のおよそ1-13または1-10または6-13位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとCLEC-2リガンドとの特定の相互作用により、CLEC-2ポリペプチドへのCLEC-2リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、CLEC-2リガンドによるCLEC-2標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。モジュレーターの別の例には、核酸リガンド配列の少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチドまたはこれの類似体リボザイムまたはDNAザイムを含むが含まれる。他の例には、ペプチド核酸PNA、モルフォリノ核酸MNAもしくはロックド核酸LNA;核酸結合タンパク質もしくはペプチド;オリゴ糖;小分子;または核酸結合ポリマー、脂質、ナノ粒子もしくはマイクロスフィアベースのモジュレーターが含まれる。モジュレーターは、特定の核酸リガンドに高度な特異性および目的の程度の親和性で結合するように設計することが可能である。モジュレーターは、結合すると、リガンドの構造がより活性なまたはより活性ではない形態に改変されるように設計することも可能である。たとえば、標的になった核酸リガンドに結合すると、そのリガンドの二次構造および/または三次構造が変更され、それにより前記リガンドはもはやその標的分子に結合できなくなるまたはその標的分子により低い親和性で結合するように、モジュレーターを設計することが可能である。代わりに、モジュレーターは、結合すると、リガンドの三次元構造が、その標的分子に対するリガンドの親和性が増強されるように変更されるように設計することが可能である。すなわち、モジュレーターは、結合すると、構造モチーフがリガンドの親和性が増加されるように改変されるように設計することが可能である。別の実施形態では、リガンド/モジュレーター対は、対象の標的に結合することができない核酸リガンド分子にモジュレーターが結合すると、リガンド内に構造モチーフが生成され、それによってリガンドはその標的分子に結合することができるようになるように設計される。モジュレーターは、特定の核酸リガンドまたは核酸リガンドのセットに、複合体を形成するのに十分な親和性で非特異的に結合するように設計することも可能である。そのようなモジュレーターは一般に、電荷-電荷相互作用を介して核酸と会合することができる。そのようなモジュレーターは、1よりも多い核酸リガンドに同時に結合することもできる。モジュレーターは、1つまたは複数の核酸リガンドに結合すると、核酸リガンドの構造がその活性型から著しく変化することはなく、むしろモジュレーターは、核酸リガンドとその標的分子との会合を遮蔽するまたは立体的に妨げるように設計することが可能である。ヌクレオチドモジュレーターは、リガンド分子への効果的な結合を可能にするいかなる長さでも可能である。たとえば、オリゴヌクレオチドモジュレーターは、約10ヌクレオチドntから約30nt、約10ntから約20ntまたは約15ntからの長さの範囲に及ぶことができる。ヌクレオチドモジュレーターは、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29ntまたは30nt長でもよい。当業者であれば、30ntよりも大きな長さを有するヌクレオチドモジュレーターを想定することも可能である。本明細書に記載される核酸リガンドは、活性な三次構造を有し、これは適切で安定した二次構造の形成により影響を受けることが可能である。したがって、相補的オリゴヌクレオチドモジュレーターと核酸リガンド間の二重鎖の形成の機構は2本の短い線状オリゴリボヌクレオチド間の二重鎖の形成に類似しているが、そのような相互作用を設計するための規則とそのような産物の形成の速度論の両方は分子内リガンド構造に影響を受けることが可能である。核酸リガンドとオリゴヌクレオチドモジュレーター間での最初の塩基対形成の核形成速度は、最終的な安定した二重鎖の形成において重要な役割を果たしており、このステップの速度は、オリゴヌクレオチドモジュレーターを、核酸リガンドに存在する一本鎖ループおよび/または一本鎖3’もしくは5’テールに標的することにより大いに増強される。分子間二重鎖の最適な形成が起こるためには、自由エネルギーは、標的にされた核酸リガンド内の既存の分子内二重鎖の形成に関して分子間二重鎖の形成にとって理想的に有利である。本明細書に記載されるモジュレーターは一般には、標的にされた核酸リガンド配列の少なくとも一部に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドである。たとえば、モジュレーターオリゴヌクレオチドは、標的にされたリガンドの約6ntヌクレオチドから25nt、8ntから20ntまたは10ntから15ntに相補的な配列を含むことができる。モジュレーターオリゴヌクレオチドの長さは、標的にされたリガンドと求める効果を考慮し、本明細書に記載され当業者には公知の技法を使用して容易に最適化することが可能である。オリゴヌクレオチドは、DもしくはL立体化学またはこれらの混合物を有するヌクレオチドを用いて作製することが可能である。天然に存在するヌクレオシドはD立体配置である。オリゴヌクレオチドモジュレーターは、核酸リガンドの少なくとも一部に相補的な配列を含むが、絶対的相補性は必要ではない。核酸リガンドの少なくとも一部に相補的な配列とは、本明細書では、核酸リガンドとハイブリダイズすることができるのに十分な相補性を有する配列のことである。ハイブリダイズする能力は、核酸の相補性の程度と長さの両方に依存することができる。一般に、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが大きくなるにしたがって、このオリゴヌクレオチドが含有しそれでも安定な二重鎖または場合によっては三重鎖を形成することができる標的リガンドとの塩基ミスマッチの数は多くなる。当業者であれば、ハイブリダイズされた複合体の融点を決定する標準法を使用することによりミスマッチの許容できる程度を確かめることができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖DNAもしくはRNAまたはこれらのキメラ混合物または誘導体または改変されたバージョンであることが可能である。モジュレーターは、核酸骨格にも個々の核酸の構造にも改変を含むことが可能である。ある種の実施形態では、モジュレーターは、リガンド中の少なくとも1つのループ領域に相補的な核酸である。他の実施形態では、モジュレーターは、リガンド中の少なくとも1つのステム領域に相補的な核酸である。さらに他の実施形態では、モジュレーターは、少なくとも1つのループ領域および1つの連続するステム領域に相補的な核酸である。一部の実施形態では、モジュレーターは、リガンドの一部に生理条件でハイブリダイズする配列を少なくとも有するオリゴヌクレオチドである。モジュレーターの目的の機能に応じて、モジュレーターは、核酸リガンドの二次および/または三次構造を破壊または安定化するように設計することが可能である。一部の実施形態では、モジュレーターは、リガンド上の自殺位に結合しそれによってリガンドの配列を破壊するように設計される。自殺位は、酵素的切断を受けやすいリガンドの一本鎖部分である。一つの例示的な実施形態では、自殺位は、モジュレーターがリガンドに結合すると一本鎖で不安定になり、血液または肝臓エンドヌクレアーゼなどの循環中の酵素によるリガンドの切断を増強することができる。ある種の実施形態では、モジュレーターはリガンドに結合し、その後前記リガンドはもはやその標的とは相互作用できなくなる。一部の実施形態では、モジュレーター配列は少なくとも1つの改変されたヌクレオチドを含む。たとえば、2’-O-メチルまたは2’-フルオロ改変であり、これは2’-O-メチルシトシン、2’-O-メチルウリジン、2’-O-メチルアデノシン、2’-O-メチルグアノシン、2’フルオロシチジンまたは2’フルオロウリジンを含むことができる。様々な戦略を使用して、オリゴヌクレオチドモジュレーターによる結合のための核酸リガンド内の最適部位を決定することが可能である。相補的オリゴヌクレオチドが核酸リガンドの周辺で歩行されるwalked経験的戦略を使用することができる。このアプローチに従えば、リガンド上の約5ヌクレオチドたとえば、リガンドの1-15、6-20、11-25、等に相補的なオリゴヌクレオチドにより捩じれる約15ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドたとえば、2’-O-メチルまたは2’-フルオロオリゴヌクレオチドを使用することが可能である。経験的戦略は、ハイブリダイゼーションの効率性に対する核酸リガンドの三次構造の影響を予測するのは困難になることがあるために、特に効果的になることが可能である。実施例6および8に記載されるアッセイなどのアッセイを使用し、核酸リガンドの完全な結合を達成するのに必要なモル過剰なオリゴヌクレオチドを特に重視して、特定の核酸リガンドにハイブリダイズする異なるオリゴヌクレオチドの能力を評価することができる。その標的分子からの核酸リガンドの解離速度または前記分子とのリガンドの会合速度を増加する異なるオリゴヌクレオチドモジュレーターの能力は、たとえば、BIACOREアッセイを使用する標準速度論研究を行うことにより決定することも可能である。オリゴヌクレオチドモジュレーターは、リガンドとその標的分子間の相互作用を目的の形態で改変するのに5-50倍のモル過剰なオリゴヌクレオチドまたはそれ未満が必要であるように、選択することが可能である。代わりに、標的にされた核酸リガンドは、オリゴヌクレオチドモジュレーターとの会合を促進するために、一本鎖テール3’または5’を含むように改変することが可能である。適切なテールは、1から20ヌクレオチド、1から10ヌクレオチド、1から5ヌクレオチドまたは3から5ヌクレオチドを含むことができる。テールは改変もし得るたとえば、2’-O-メチルおよび2’-フルオロ改変であり、これは2’-O-メチルシトシン、2’-O-メチルウリジン、2’-O-メチルアデノシン、2’-O-メチルグアノシン、2’フルオロシチジンまたは2’フルオロウリジンを含むことができる。テールドtailedリガンドは、結合およびバイオアッセイたとえば、以下の実施例に記載されているにおいて試験し、一本鎖テールの付加が核酸リガンドの活性な構造を破壊しないことを検証することが可能である。テール配列と、たとえば、1、2、3、4または5塩基対を形成することができる一連のオリゴヌクレオチドたとえば、2’-O-メチルオリゴヌクレオチドを設計して、テールドリガンド単独と会合するその能力、ならびにその標的分子からのリガンドの解離速度または前記分子とのリガンドの会合速度を増加するその能力について試験することが可能である。スクランブルされた配列制御を用いて、この効果は二重鎖形成に起因するものであり非特異的効果ではないことを検証することができる。別の実施形態では、モジュレーターはリボザイムまたはDNAザイムである。酵素的核酸は、先ず標的RNAまたはDNAに結合することにより作用する。そのような結合は、標的RNAを切断するように作用する分子の酵素的部分に密に近接して保持されている酵素的核酸の標的結合部分を通じて起こる。したがって、酵素的核酸は先ず、相補的塩基対合を通じて標的RNAまたはDNAを認識し次に結合し、正確な部位に結合すると、酵素的に作用して標的RNAを切断し、それによってRNAリガンドの不活化を可能にする。それぞれが異なる種類の特異性を示すリボザイムが少なくとも5種類存在する。たとえば、グループIイントロンはサイズが約300から>1000ヌクレオチドであり、切断部位のすぐ5’の標的配列にUを必要とし、切断部位の5’側の4-6ヌクレオチドに結合する。別の種類はリボヌクレアーゼPRNAM1RNAであり、これはサイズが約290から400ヌクレオチドである。第3の種類はハンマーヘッド型リボザイムであり、これはサイズが約30から40ヌクレオチドである。ハンマーヘッド型リボザイムは、切断部位のすぐ5’の標的配列にUHHはGではないを必要とし、切断部位の両側で可変数のヌクレオチドに結合する。第4の種類はヘアピンリボザイムであり、サイズが約50ヌクレオチドである。ヘアピンリボザイムは、切断部位のすぐ3’の標的配列にGUCを必要とし、切断部位の5’側の4ヌクレオチドおよび切断部位の3’側のほうの可変数に結合する。第5のグループはデルタ型肝炎ウイルスHDVリボザイムであり、これはサイズが約60ヌクレオチドである。DNAザイムは一本鎖であり、RNAもDNAも切断する。DNAザイムの一般モデルが提唱されており、10-23モデルとして知られている。10-23モデルに従うDNAザイムは、それぞれ7から9デオキシリボヌクレオチドの2つの基質認識ドメインが隣接する、15デオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。別の実施形態では、モジュレーターそれ自体は核酸リガンドである。この実施形態では、目的の治療標的に結合する第1のリガンドが生成される。第2のステップでは、第1のリガンドに結合する第2のリガンドが本明細書に記載されるSELEXプロセスまたは別のプロセスを使用して生成され、治療リガンドと標的間の相互作用をモジュレートする。一実施形態では、第2のリガンドは第1のリガンドの効果を非活性化する。別の例示的な実施形態では、モジュレーターはPNA、MNA、LNAまたはPCOベースのモジュレーターである。オリゴヌクレオチドモジュレーターの核酸塩基は、核酸塩基間連鎖、たとえば、ペプチジル連鎖ペプチド核酸PNAの場合:Nielsenら1991Science254、1497頁および米国特許第5539082号およびモルフォリノ連鎖Qinら、AntisenseNucleicAcidDrugDev.10、11頁2000;Summerton、AntisenseNucleicAcidDrugDev.7、187頁1997;Summertonら、AntisenseNucleicAcidDrugDev.7、63頁1997;Taylorら、JBiolChem.271、17445頁1996;PartridgeらAntisenseNucleicAcidDrugDev.6、169頁1996を介して、または他の任意の天然または改変された連鎖により連結することが可能である。オリゴ核酸塩基はロックド核酸LNAでも可能であるNielsenら、JBiomolStructDyn17、175頁1999;PetersenらJMolRecognit13、44頁2000;Nielsenら、BioconjugChem11、228頁2000。PNAは、オリゴヌクレオチドに類似しているが組成は異なる化合物である。PNAでは、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース骨格はペプチド骨格で置き換えられている。ペプチド骨格のそれぞれのサブユニットは天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基に付着している。PNAは、N-2-アミノエチルグリシン単位からなるアキラルポリアミド骨格を有することが多い。プリンまたはピリミジン塩基は、メチレンカルボニルリンカー1-3を介してそれぞれの単位に連結されて、相補的核酸を標的にする。PNAは、ワトソン-クリック塩基対合則に従って平行または逆平行方向に相補的RNAまたはDNAに結合する。PNAオリゴマーの無電荷の性質は、天然のホモ二重鎖と比べて、ハイブリッドPNA/DNARNA二重鎖の安定性を増強する。モルフォリノ核酸は、それぞれが6員モルフォリン環に連結されている4種の遺伝子塩基アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンのうちの1つを含有するモルフォリノサブユニットから構築されるので、そう称される。これらの4種のサブユニット種のサブユニットは、非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間連鎖により特定の順に結合されて、モルフォリノオリゴを与える。LNAは、これがモジュレーターの第一候補になるいくつかの特長を有するDNA類似物の1種である。LNAモノマーは、RNAモノマーに構造的に類似する二環式化合物である。LNAはDNAとRNAの化学特性の大半を共有し、水溶性であり、ゲル電気泳動により分離することができ、エタノール沈殿する、等であるTetrahedron、54、3607-3630頁1998。しかし、LNAモノマーをDNAまたはRNA内に導入すると、相補的DNAまたはRNAとの二重鎖の高温安定性を生じるが、同時にワトソン-クリック塩基対合則に従う。プソイド環状オリゴ核酸塩基PCOもモジュレーターとして使用することが可能である米国特許第6383752号参照。PCOは3’-3’または5’-5’末端を通じて結合された2つのオリゴヌクレオチドセグメントを含有する。PCOのセグメント機能的セグメントの1つは、ある機能性たとえば、標的RNAへの相補性を有する。別のセグメント保護セグメントは、機能的セグメントのこのセグメントが機能的セグメントに結合している末端に応じて3’-または5’-末端に相補的である。機能的と保護的セグメントセグメント間の相補性に結果として、PCOは、標的核酸たとえば、RNAの非存在下で分子内プソイド環状構造を形成する。PCOは、3’-3’または5’-5’連鎖の存在および分子内プソイド環状構造の形成のせいで従来のオリゴヌクレオチドよりも安定である。マウスにおける薬物動態、組織分布および安定性研究により、PCOは、PS-オリゴヌクレオチド一般よりも高いインビボ安定性ならびにPS-オリゴヌクレオチド一般に類似する薬物動態および組織分布プロファイル、しかし選択された組織からの急速な排出を有することが示唆される。フルオロフォアおよびクエンチャー分子が本開示のPCOに適切に連結されると、前記分子は直線的配置の時は蛍光を発するが、環状構造の時は蛍光は消光される。この特長を使用してPCOを潜在的モジュレーターとしてスクリーニングすることが可能である。別の例示的な実施形態では、モジュレーターはペプチドベースのモジュレーターである。核酸リガンドのペプチドベースのモジュレーターは、オリゴヌクレオチドまたはその類似物に対する代替分子クラスのモジュレーターである。このクラスのモジュレーターは、標的核酸リガンドの十分に活性なオリゴヌクレオチドモジュレーターが、標的とオリゴヌクレオチドモジュレーター間の核形成を促進するのに十分な一本鎖領域に欠けるせいで単離することができない場合は、特に有用である。さらに、ペプチドモジュレーターは、オリゴヌクレオチドモジュレーターとは異なる生物学的利用能および薬物動態を与える。一つの例示的な実施形態では、モジュレーターはプロタミンであるOneyら、2009年、Nat.Med.15:1224-1228頁。プロタミンは水に可溶性で、熱により凝固することはなく、アルギニン、アラニンおよびセリンを含む大部分がプロリンおよびバリンも含有し、多くがグリシンおよびイソロイシンを含有する。モジュレーターには、プロタミンバリアントたとえば、Wakefieldら、J.Surg.Res.63:280頁1996参照および米国特許出願公開第2004/0121443号に記載される改変型を含む改変型のプロタミンも含まれる。他のモジュレーターには、米国特許第6624141号および米国特許出願公開第2005/0101532号に記載される断片などのプロタミン断片が含まれる。モジュレーターには、一般に、ヘパリン、他のグリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンの活性をモジュレートするペプチドも含まれるたとえば、米国特許第5919761号参照。一つの例示的な実施形態では、モジュレーターは、ポリ-L-リジンおよびポリ-L-オルニチンなどの、電荷-電荷相互作用を安定化させる陽イオン性NH基を含有するペプチドである。標的核酸リガンドに結合しそれによってこの活性をモジュレートすることができるペプチドを単離するためのいくつかの戦略が利用可能である。たとえば、ビーズに固定化されたコードされたペプチドコンビナトリアルライブラリーが記載されており、ウイルスRNA配列に結合し、ウイルスRNAと前記RNAに特異的に結合するウイルス調節タンパク質間の相互作用を破壊することができるペプチドを含有することが実証されているHwangらProc.Natl.Acad.SciUSA、1999年、96:12997頁。そのようなライブラリーを使用して、標識を標的核酸リガンドに付加し、ライブラリーの一部のメンバーと核酸間の結合が好まれる条件下で、標識された標的とビーズに固定化されたペプチドライブラリーを一緒にインキュベートすることにより、核酸リガンドのモジュレーターを単離することが可能である。所与のビーズ上の特定のペプチドへの核酸リガンドの結合により、ビーズは核酸リガンド上の標識により色付けされ、したがって、ビーズの簡単な単離により標的に結合することができるペプチドを同定することが可能になる。そのようなスクリーニング法により単離されるペプチドと標的核酸リガンド間の直接的相互作用は、核酸リガンドのモジュレーターを同定するために記載されている任意の数の結合アッセイを使用して確認し定量化することが可能である。標的核酸リガンドの活性をモジュレートする前記ペプチドの能力は、適切なバイオアッセイにより確かめることが可能である。一部の実施形態では、モジュレーターはタンパク質である。たとえば、ある種の実施形態では、核酸リガンドはビオチン分子に連結される。その例では、ストレプトアビジンまたはアビジンが投与されて、リガンドに結合し、この効果を逆転させるSaviらJThrombosisandHaemostasis、6:1697-1706頁参照。アビジンは、鳥類、爬虫類および両生類の輸卵管において産生され、その卵の白い部分に沈着している四量体タンパク質である。ストレプトアビジンは、細菌ストレプトマイセスアビジニイStreptomycesavidiniiから精製される四量体タンパク質である。四量体タンパク質は、それぞれが高度な親和性と特異性でビオチンビタミンB7、ビタミンHに結合することができる4つの同一サブユニットホモ四量体を含有する。CLEC-2核酸リガンドのタンパク質モジュレーターは、CLEC-2核酸リガンドが結合するCLEC-2ドメインの可溶性部分であってもよい。たとえば、CLEC-2ポリペプチドのECDまたはこの断片は、細胞結合のまたは天然のCLEC-2への結合をめぐってCLEC-2核酸リガンドと競合し、CLEC-2核酸リガンドの天然のCLEC-2分子への結合を逆転させ得る。追加の実施形態では、モジュレーターはオリゴ糖ベースのモジュレーターである。オリゴ糖は核酸と相互作用することができる。たとえば、抗生物質アミノグリコシドは、ストレプトマイセス種の産物であり、様々なリボザイム、リボソームのRNA成分ならびにHIV-1のTARおよびRRE配列などのRNA分子の多様なアレイと特異的に相互作用する。したがって、オリゴ糖は核酸に結合することができ、これを使用して核酸リガンドの活性をモジュレートすることが可能である。別の実施形態では、モジュレーターは小分子ベースのモジュレーターである。リガンドと標的の間に介入するまたは他の方法でリガンドと標的間の結合を破壊するもしくは改変する小分子も、治療調節物質として使用することが可能である。そのような小分子は、小分子ありおよびなしでのリガンドと標的間の結合変化を測定するアッセイにおいて候補をスクリーニングすることにより、または小分子ありおよびなしでの標的に対するリガンドの生物学的効果の差異を測定するインビボまたはインビトロアッセイを使用することにより同定することが可能である。目的の効果を示す小分子が同定されると、コンビナトリアルアプローチなどの技法を使用して目的の調節効果のために化学構造を最適化することが可能である。追加の例示的な実施形態では、モジュレーターは核酸結合ポリマー、脂質、ナノ粒子またはマイクロスフィアである。追加の非限定的例では、モジュレーターは、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリンEDOPC;ジラウロイルエチルホスファチジルコリンEDLPC;EDLPC/EDOPC;ピリジニウム界面活性剤;ジオレオイルホスファチジル-エタノールアミンDOPE;±-N-3-アミノプロピル-N,N-ジメチル-2,3-ビスドデシルオキシ-1-プロパンアミニウムブロマイドGAP-DLRIEプラス中性コリピッドco-lipidジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPEGAP-DLRIE/DOPE;±-N,N-ジメチル-N-[2-スペルミンカルボキシアミドエチル]-2,3-ビスジオエイルオキシdioeyloxy-1-プロパンアミニウムペタ塩酸塩DOSPA;ジラウロイルエチルホスファチジルコリンEDLPC;エチルジミリストイルホスファチジルコリンEDMPC;±-N,N,N-トリメチル-2,3-ビスz-オクタデク-9-エン-オイルオキシ-1-プロパンアミニウム塩化物DOTAP;±-N-2-2-ヒドロキシエチル-N,N-ジメチル-2,3-ビステトラデシルオキシ-1-プロパンアミニウムブロマイドDMRIE;±-N,N,N-トリメチル-2,3-ビスz-オクタデク-9-エニルオキシ-1-プロパンアミニウム塩化物DOTMA;5-カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシル-アミドDOGS;ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン5-カルボキシスペルミルアミドDPPES;1,3ジオレオイルオキシ-2-6-カルボキシスペルミル-プロピルーアミドDOSPER;テトラメチルテトラパルミトイルスペルミンTMTPS;テトラメチルテトラオレイルスペルミンTMTOS;テトラメチルテトララウリルスペルミンTMTLS;テトラメチルテトラミリスチルスペルミンTMTMS;テトラメチルジオレイルスペルミンTMDOS;ジフィタノイルホスファチジル-エタノールアミンDPhPE;および±-N-3-アミノプロピル-N,N-ジメチル-2,3-ビスドデシルオキシ-1-プロパンアミニウムブロマイドGAP-DLRIEからなる群から選択することが可能である。アルコール;アクリルまたはメタクリルポリマー;Newkomeデンドリマー;ポリフェニレン;ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドDAB;セチルトリメチルアンモニウムブロマイドCTAB;アルブミン;酸処理ゼラチン;ポリリジン;ポリオルニチン;ポリアルギニン;DEAE-セルロース;DEAE-デキストラン;およびポリN,N-ジメチルアミノエチルメタクリル酸;およびポリプロピルアミンPOPAM。一実施形態では、モジュレーターはキトサンおよびキトサン誘導体から選択される。キトサン誘導体には、水溶性キトサンナノ粒子が含まれるたとえば、米国特許第6475995号;米国特許出願公開第2006/0013885号;Limpeanchobら、2006EfficacyandToxicityofAmphotericinB-ChitosanNanoparticles;NareusanUniversityJournal142:27-34頁。キトサンポリマー基本的に、反復グルコサミンモノマーで構成された極めて大きなポリアミンポリマーのポリカチオン性を考慮すると、キトサンを使用して、宿主への注入に続いて、リガンドを凝集および/またはインビボで多価電解質複合体中に被包し得る。これは、キトサン上に見出される一次アミンとリガンドのリン酸ジエステル骨格の相互作用に一部基づいている。他の実施形態では、モジュレーターは、1,5-ジメチル-1,5-ジアザウンデカメチレンポリメソブロマイド;ポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレンブロックコポリマー;ポリ-L-リジン;ポリアミドアミンPAMAM;β-シクロデキストリン含有ポリカチオンCDP;β-シクロデキストリン含有ポリカチオンイミダゾール含有バリアントCDP-Im;ポリホスホロアミド酸ポリマー8kDa、30kDaPPA-DPA8k、PPA-DPA30k;ポリブレン;スペルミン;PEG-ブロック-PLL-デンドリマー;ポリエチレンイミンPEI;マンノース-PEI;トランスフェリン-PEI;線状PEIlPEI;ゼラチン;メタクリル酸/メタクリルアミド;ポリベータアミノエステル;多価電解質複合体PEC;ポリビニルアミンPVA;コラーゲン;ポリプロピレンイミンPPI;ポリアリルアミン;ポリビニルピリジン;アミノアセタール化ポリビニルからなる群から選択される。ある種の実施形態では、キトサンポリマー上の一級アミンを実質的に改変して、水溶性および電荷状態を変更することができる。キトサン誘導体には、トリメチルキトサンクロライドTMCが含まれ、これは異なる程度の四級化で合成することが可能である;ポリ両性電解質ポリマーであるモノ-カルボキシメチル化キトサンMCC;グルタルアルデヒド架橋誘導体CSGA;チオラート化キトサンLeeら2007Pharm.Res.24:157-67頁;グリコールキトサンGC、エチレングリコールにコンジュゲートされたキトサン誘導体Leeら2007IntJPharm.;[N-2-カルボキシベンジルキトサンCBCSLinら2007CarbohydrRes.3421:87-95頁;ベータ-シクロデキストリン-キトサンポリマーVenterら2006IntJPharm.3131-2:36-42頁;O-カルボキシメチルキトサン;N,O-カルボキシメチルキトサン;またはキサンテート基をその骨格上に導入することにより化学的に改変されたキトサンが含まれる。一実施形態では、空のキトサンナノ粒子が生成され、モジュレーターとして使用される。10,000Daから>1,000,000Daの分子量範囲のキトサンまたはキトサン誘導体を使用し得る。ある種の実施形態では、キトサンは500,000Daまたはそれより少ない。ある種の実施形態では、キトサンは100,000Daまたはそれより少ない。一部の実施形態では、前記化合物は10,000から100,000Da、10,000から90,000、10,000から80,000、20,000から70,000、30,000から70,000、約30,000、約40,000、約50,000または約60,000Daである。一部の実施形態では、異なる程度の脱アセチル化された一級アミンを含有するキトサンポリマーが使用される。これらの実施形態では、異なる程度の脱アセチル化によりポリマーの電荷状態が変更され、それによってポリマーの結合特性が変更される。宿主においてキトサンナノ粒子がリガンドと接触すると、リガンドはナノ粒子表面に結合し捕捉されるまたはナノ粒子に進入してイオン性相互作用により被包され得る。別の実施形態では、モジュレーターはポリリン酸ポリマーマイクロスフィアである。ある種の実施形態では、モジュレーターは、米国特許第6548302号に記載される、ポリL-ラクチド-コ-エチル-亜リン酸塩またはPLAEG-EOP、等などのそのようなマイクロスフィアの誘導体である。そのようなポリマーは、ポリマー骨格の一部として種々の官能基を含有するように作製することが可能である。一例では、ポリマーは、接触すると1つまたは複数の核酸を複合体化または被包することができるように、生理的pHで陽電荷を有する第四級アミンを含有し得る。ある種の実施形態では、ポリマーは陽電荷を含有しない。ある種の実施形態では、モジュレーターは陽イオン分子である。ある種の実施形態では、リガンドは、グアニン四重鎖G-四重鎖またはG-四本鎖構造を形成する。これらの構造は陽イオン分子により結合される。ある種の実施形態では、前記分子は金属キレート分子である。一部の実施形態では、モジュレーターはポルフィリンである。一部の実施形態では、前記化合物はTMPyP4である。JoachimiらJACS2007年、129、3036-3037頁およびToroらAnalyticalBiochemistry2008年、Aug1、37918-15頁を参照されたい。モジュレーターは、一般に、結合アッセイ、分子モデリングまたは生物学的機能の改変を測定するインビボもしくはインビトロアッセイを通じて同定することが可能である。一実施形態では、核酸へのモジュレーターの結合は、ゲルシフトアッセイにより決定される。別の実施形態では、核酸リガンドへのモジュレーターの結合はBIACOREアッセイにより決定される。標準結合アッセイを使用して、モジュレーターを同定し選択することが可能である。非限定的例は、ゲルシフトアッセイおよびBIACOREアッセイである。すなわち、試験モジュレーターは、試験条件または典型的な生理条件下で標的にされる核酸リガンドと接触させ、試験モジュレーターが実際にリガンドに結合するのかどうかに関して判定することが可能である。次に、核酸リガンドに結合することが分かっている試験モジュレーターは適切なバイオアッセイリガンドとその標的分子に応じて異なり、たとえば、凝固試験において解析され、試験モジュレーターがその標的分子上のリガンドにより引き起こされる生物学的効果に影響を与えることができるかどうかを判定することが可能である。ゲルシフトアッセイは、結合能を評価するのに使用される周知の技法である。たとえば、CLEC-2に対する核酸リガンドは先ずCLEC-2タンパク質もしくはこの断片またはCLEC-2タンパク質もしくは断片を含有する混合物と一緒にインキュベートされ、次に電気泳動によりゲル上で分離される。リガンドがタンパク質に結合すると、この複合体はサイズが大きくなり、したがってその移動は、CLEC-2タンパク質の非存在下でゲルの対照レーンに適用することができる遊離リガンドの移動と比べて遅れることになる。リガンドは、たとえば、放射性または非放射性成分により標識され、ゲル内のリガンドCLEC-2複合体の検出が可能になる。ゲルシフトアッセイを使用してCLEC-2結合活性を有するリガンドについてスクリーニングする場合、複合体は次にゲルから抽出され、単離されたリガンドは解析されて目的のCLEC-2結合活性を有するリガンドを同定することができる。ゲルシフトアッセイを使用して、CLEC-2に対する核酸リガンドへの結合についてモジュレーターをスクリーニングすることも可能である。なぜならば、核酸リガントとのモジュレーターの会合により遊離リガンドの移動と比べて核酸リガンドの移動度は遅れるからであるたとえば、Rusconiら、2002年、Nature、419:90-94頁参照。さらに、モジュレーターをそのようなアッセイフォーマットに添加して、CLEC-2核酸リガンドとCLEC-2の会合を遮断するその能力についてスクリーニングすることが可能である。たとえば、CLEC-2-リガンド混合物を、増加する量の潜在的モジュレーターの存在下でインキュベートすることができる。目的の活性のあるモジュレーターは、ゲルシフトアッセイにより検出した場合、CLEC-2-リガンド複合体の形成を特異的に減少させることになる。BIACORE技術は、ポリペプチド-核酸相互作用を含む巨大分子相互作用を同定し解析するための信頼できる貴重なツールとして当業者には公知である。したがって、この技術を使用すれば、CLEC-2タンパク質またはこの断片に特異的に結合する核酸アプタマーまたはリガンドについてスクリーニングまたは同定することができる。BIACORE技術は、表面に粘着する相互作用体が解析の特異性を決定するように、センサーチップ表面上で結合事象を測定する。言い換えると、CLEC-2タンパク質または断片を、たとえば、ヒスチジンタグを介してセンサーチップ表面に粘着させることができる。次に、結合したCLEC-2タンパク質は、潜在的リガンド分子を含有する溶液に曝露される。核酸リガンドがCLEC-2タンパク質に結合すれば、表面プラズモン共鳴SPRシグナルが直ちに変化する。前記シグナルは、表面に結合する分子の質量に正比例する。ゲルシフトアッセイについて記載されているように、BIACOREを使用すればCLEC-2リガンドのモジュレーターを同定または解析することができる。さらに、チップ結合CLEC-2タンパク質を曝露させる反応混合物は、増加する量のモジュレーターと一緒に既知のCLEC-2リガンドの両方を含有することができ、その効果は、CLEC-2とそのリガンド間の結果としての相互作用の標準BIACORE解析により判定することができる。オリゴヌクレオチドもしくはこの類似物、ペプチド、ポリペプチド、オリゴ糖または小分子が、標的とのその相互作用が改変されるような形態でリガンドに結合することができるかどうかを判定することが可能なアッセイが他にいくつか存在する。たとえば、電気泳動移動度シフトアッセイEMSA、滴定熱量測定、シンチレーション近接アッセイ、分析用超遠心を使用する沈降平衡アッセイたとえば、www.cores.utah.edu/interaction参照、蛍光偏光アッセイ、蛍光異方性アッセイ、蛍光強度アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移FRETアッセイ、ニトロセルロース繊維結合アッセイ、ELISA、ELONAたとえば、米国特許第5789163号参照、RIAまたは平衡透析アッセイを使用して、核酸リガンドに結合する作用剤の能力を評価することが可能である。作用剤と核酸リガンド間の相互作用が直接決定される直接アッセイを実施することが可能である、またはリガンドをその標的から置き換える作用剤の能力を評価する競合もしくは置換アッセイを実施することが可能であるたとえば、Green、BellandJanjic、Biotechniques305、2001年、1094頁および米国特許第6306598号参照。候補モジュレーション作用剤が同定されると、その標的に対する核酸リガンドの活性をモジュレートするその能力はバイオアッセイにおいて確認することができる。代わりに、リガンドとこの標的との相互作用をモジュレートすることができる作用剤が同定される場合、そのような結合アッセイを使用して、作用剤がリガンドと直接相互作用していることを検証することができ、相互作用の親和性を測定することが可能である。別の実施形態では、質量分析を、核酸リガンドに結合するモジュレーター、モジュレーターと核酸リガンド間の相互作用の部位複数可およびリガンドに対する作用剤の相対的結合親和性の同定のために使用することが可能であるたとえば、米国特許第6329146号参照。そのような質量分析法は、選択された標的リガンドに結合しこのリガンドのモジュレーターとして使用することができる個々の化合物を求めて化学混合物またはライブラリー、特にコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするためにも使用することが可能である。さらに、質量分析法を使用すれば、たとえば、化合物のコンビナトリアルライブラリーに対して複数の標的核酸リガンドを同時にスクリーニングすることができる。さらに、質量分析法を使用すれば、複数の分子種、特に小分子間の相互作用および標的リガンド上の分子相互作用部位を同定することができる。別の実施形態では、核酸リガンドと、処置される障害に特異的である標的と間の相互作用を改変する際のモジュレーターの有効性を評価するインビボまたはインビトロアッセイは、核酸リガンドに結合するモジュレーターの同定のために使用することが可能である。周知であり使用することが可能な生物学的特性についての標準アッセイが豊富に存在する。生物学的アッセイの例は、本出願に引用され特定の適用のためにある種の核酸リガンドを記載している特許に提供されている。一実施形態では、モジュレーターは、1010.0マイクロモルμM未満、11.0マイクロモルμM、好ましくは0.1μM未満、さらに好ましくは0.01μM未満のモジュレーター濃度で溶液中の核酸リガンドに実質的に結合する能力を有する。実質的には、標的の生物学的活性の少なくとも50パーセントの減少が標的の存在下でのモジュレーションにより観察されることを意味し、50の減少で本明細書ではIC50値と呼ばれる。リガンドとモジュレーターの最適化リガンドが治療薬として使用するのに適切であるために、リガンドは好ましくは合成が廉価であり、宿主における使用が安全であり、インビボで安定している。野生型RNAおよびDNAオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼによる分解に対するその感受性のせいでインビボでは安定していない。ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性は、2’位での修飾基の取り込みにより大幅に増加させることが可能である。2’-フルオロまたはアミノ基はオリゴヌクレオチドプールに取り込まれ、その後にリガンドがそこから選択される。本開示では、2’-フルオロピリミジンがインビトロ転写反応において使用されて、リガンド選択のための最初のオリゴヌクレオチドプールが生成される実施例1参照。リガンドたとえば、SELEXによりおよびモジュレーターたとえば、配列相補性に基づく設計の最初の同定後、リガンドとモジュレーターは改変または操作されて、種々の手段によりその目的の構造、機能および/または安定性が改善されることが可能である。これらの手段には、特定の糖残基を置換する、リガンドにおける特定の領域および/または構造の組成およびサイズを変化させる、ならびにモジュレーターによりさらに効果的に調節され得るリガンドを設計することが含まれるが、これらに限定されない。核酸リガンドの設計および最適化は、リガンドの二次構造ならびに二次構造とモジュレーター制御間の関係への認識を含む。核酸を改変する従来の方法とは違って、CLEC-2タンパク質に対するリガンドの設計は、潜在的モジュレーターの設計に対するリガンドの変化の影響を検討することを含み得る。たとえば、リガンドがトランケーションにより改変される場合、対応するモジュレーターは切断型リガンドを制御するように設計されるほうがよい。SELEXプロセスを通じて同定されたリガンドの二次構造は、当業者には公知の種々の方法により予想することが可能である。たとえば、それぞれの配列は、Mfoldなどのソフトウェアプログラムを使用して解析し得るmfold.bioinfo.rpi.edu;Zuker、2003年、NucleicAcidsRes.31:3406-3415頁およびMathewsら、1999年、J.Mol.Biol.288:911-940頁も参照。その後、種々の選択された配列の比較配列解析を使用して、保存された共通二次構造エレメントに基づいて配列を整列化し、CLEC-2リガンドの予想される二次共通構造を得ることができる。本明細書に開示されるCLEC-2核酸リガンドは、変化する全体のリガンド長ならびにステムおよびループ構造の長さにより改変することが可能である。たとえば、リガンドの5’および/または3’末端の一部がSELEXプロセスにおいて選択されるリガンドから欠失されているリガンドトランケーションを生成し得る。リガンドにより許容されるトランケーションの程度を決定するために、使用される1つの方法は、リガンドの5’または3’末端領域に相補的なオリゴヌクレオチドたとえば、DNAオリゴヌクレオチドを熱アニールし、次にアニールされたオリゴヌクレオチドのあるリガンドの結合とこれのないリガンドの結合を比較することであり得る。アニールされたオリゴヌクレオチドのあるリガンドとこれのないリガンド間で著しい結合差異が観察されない場合、これは、リガンドのアニールされた部分がリガンドの標的タンパク質への結合にとって必要ではないことを示唆している。この方法は、種々の長さのリガンドの5’または3’末端にアニールするオリゴヌクレオチドを使用して実施され、完全に機能的なリガンドを与える5’および3’境界を決定することができる。別の実施形態では、設計はリガンドのサイズを減らすことを含む。別の実施形態では、モジュレーターのサイズはリガンドのサイズとの関係で変えられる。さらに別の実施形態では、グアニンひもは4グアニン未満、または3グアニン未満、または2グアニン未満またはグアニンなしに減らされる。しかし、これらの変化の連合効果は、適切な活性を与えるがモジュレーターにより簡単に中和されるリガンドを作製するという難問に応えなければならない。モジュレーターのターゲティングでは、改良されたリガンドは、オリゴヌクレオチドモジュレーターとの会合を促進するために一本鎖テール3’または5’を含むように改変することも可能である。適切なテールは、1ntから20nt、好ましくは1ntから10nt、1ntから5ntまたは3ntから5ntを含むことができ、テール内のそれぞれの位のヌクレオチドはA、C、G、TまたはUでもよい。そのようなテールは、下にさらに詳細に記載されている改変されたヌクレオチドを含み得ることは容易に理解される。テール付のリガンドは、結合およびバイオアッセイたとえば、下に記載されているにおいて試験し、一本鎖テールを付加してもリガンドの活性な構造が破壊されないことを検証することが可能である。たとえば、テール配列と1、3または5塩基対を形成することができる一連のオリゴヌクレオチドたとえば、2’-O-メチルオリゴヌクレオチドを設計して、テール付きのリガンドとのみ会合するその能力ならびにその標的分子からのリガンドの解離速度またはその標的分子とのリガンドの会合速度を増加するその能力について試験することが可能である。スクランブルされた配列制御を用いて、その効果が二重鎖形成に起因し非特異的効果ではないことを検証することが可能である。CLEC-2リガンドは、対になったモジュレーターによるさらに効果的な調節を可能にする自殺位を有するようにも設計し得る。モジュレーターがリガンドに結合すると、自殺位は一本鎖で不安定になり、それによって血液または肝臓エンドヌクレアーゼなどの血液中に天然に存在する酵素によるリガンドの切断を促進する。これは、循環からの活性なリガンドの効果的でほぼ即時の除去のための手段を提供する。化学修飾核酸の治療的使用において遭遇する一つの問題は、そのリン酸ジエステル型のオリゴヌクレオチドは、全体効果が明らかになる前にエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどの細胞内および細胞外酵素により体液中で分解されることがあることである。核酸リガンドのある種の化学修飾は、核酸リガンドのインビボ安定性を増加するまたは核酸リガンドの送達を増強するもしくは媒介することができる。さらに、ある種の化学修飾は、核酸リガンド内の必要な構造エレメントの形成を安定化するもしくは促進するまたは標的分子との追加の分子相互作用を与えることにより、その標的に対する核酸リガンドの親和性を増加させることができる。リガンドの修飾は、追加の電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電的相互作用および官能性を核酸リガンド塩基にまたは全体としてのリガンドに取り込む化学基を与える修飾を含むことができるがこれらに限定されない。修飾は、たとえば、分子の安定性および意図された標的に対する親和性などの特性を改善するために、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格にあってもよい。そのような修飾には、2’-位糖修飾、5-位ピリミジン修飾、8-位プリン修飾、環外アミンでの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモまたは5-ヨードウラシルの置換、骨格修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルリン酸修飾、メチル化、イソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどの異常な塩基対合組合せおよび同種のものが含まれるが、これらに限定されない。修飾は、キャッピングなどの3’および5’修飾も含むことができる。SELEX法は、改良されたインビボ安定性または改良された送達特徴などの改良された特徴をリガンドに与える修飾されたヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような修飾の例には、リボースおよび/またはリン酸および/または塩基位置での化学置換が含まれる。修飾されたヌクレオチドを含有するSELEX同定された核酸リガンドは、米国特許第5660985号に記載されており、これにはピリミジンの5-および2’-位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。米国特許第5580737号には、2’-アミノ2’-NH2、2’-フルオロ2’-Fおよび/または2’-O-メチル2’-OMeを用いて修飾された1つまたは複数のヌクレオチドを含有する特定の核酸リガンドが記載されている。SELEX法は、米国特許第5637459号および米国特許第5683867号に記載されている、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能的ユニットと組み合わせることを包含する。米国特許第5637459号には、2’-アミノ2’-NH2、2’-フルオロ2’-Fおよび/または2’-O-メチル2’-OMeで修飾された1つまたは複数のヌクレオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドが記載されている。SELEX法は、米国特許第6011020号に記載されている、選択された核酸リガンドを親油性または非免疫原性、高分子量化合物と診断または治療複合体に組み合わせることをさらに包含する。核酸リガンドがSELEX法により導かれる場合、修飾は前または後SELEX修飾であることが可能である。前SELEX修飾は、その標的に対する特異性も改良されたインビボ安定性も備えたリガンドをもたらすことができる。2’-ヒドロキシル2’-OH核酸リガンドに加えられた後SELEX修飾は、核酸リガンドの結合能に有害な影響を与えることなくインビボ安定性を改良することができる。一実施形態では、リガンドの修飾には、分子の3’末端での3’-3’逆位リン酸ジエステル連鎖ならびにヌクレオチドの一部またはすべての2’フルオロ2’-F、2’アミノ2’-NH2、2’デオキシおよび/または2’Oメチル2’-OMe修飾が含まれる。本明細書に記載されるリガンドは、CおよびU残基が2’-フルオロ置換されておりAおよびG残基が2’-OHの転写物のライブラリーを使用してSELEXにより最初に生成された。ある種の実施形態では、リガンドを構成している核酸は、修飾された糖および/または修飾された塩基を含む。ある種の実施形態では、修飾は2’-安定化修飾などの安定化修飾を含む。一実施形態では、2’-安定化修飾は、糖環上に2’-フルオロ修飾を含むことが可能である。一実施形態では、設計はリガンドもしくはモジュレーターまたはその両方の2’-ヒドロキシル含有量を減少させることを含む。別の実施形態では、設計はリガンドもしくはモジュレーターまたはその両方の2’-フルオロ含有量を減少させることを含む。別の実施形態では、設計はリガンドもしくはモジュレーターまたはその両方の2’-O-メチル含有量を増加させることを含む。医薬組成物では、リガンドは、可溶性または生物学的利用能を改良する塩の形態などの形態で提供することが可能である。適切な塩にはナトリウムおよびカリウムなどの無機陽イオンが含まれる。開示のオリゴヌクレオチドのいずれも、当技術分野で公知の標準法により、たとえば、自動DNA合成機たとえば、Biosearch、AppliedBiosystemsから市販されているなどのの使用により合成することが可能である。リガンドおよびモジュレーターは、当業者なら容易に理解し以下の通りに注記される略記法を使用して本明細書では記載される。rAは2’OHAまたはアデノシン;Aは2’-デオキシAまたは2’-デオキシアデノシン;mAは2’-O-メチルAまたは2’-メトキシ-2’-デオキシアデニン;rGは2’-OHGまたはグアノシン;Gは2’-デオキシGまたは2’-デオキシグアノシン;mGは2’-O-メチルGまたは2’-メトキシ-2’デオキシグアノシン;fCは2’-フルオロCまたは2’-フルオロ-2’デオキシシチジン;mCは2’-O-メチルCまたはメトキシ-2’-デオキシシチジン;fUは2’-フルオロUまたは2’-フルオロ-ウリジン;mUは2’-O-メチルUまたは2’-メトキシ-ウリジン;およびiTは逆位2’HTである。担体へのカップリング本明細書に記載されるリガンドは生物学的利用能または安定性を改良する修飾も含むことができる。そのような修飾は、親水性または疎水性部分を含み得るがこれらに限定されない担体分子へのコンジュゲーションを含むことができる。CLEC-2媒介障害を処置するための方法一実施形態では、CLEC-2媒介障害を処置するための方法であって、本明細書に記載されるリガンドまたは薬学的に許容されるこの塩の治療的有効量をそれを必要とする宿主に投与することを含む方法が提供される。CLEC-2は最初、血小板凝集の媒介物として同定された概説については、Suzuki-Inoueら、2011年、J.ThrombHaemostasis、9S1:44-55頁参照。その後、CLEC-2は、血栓形成および安定化に関与していることが明らかにされた。したがって、CLEC-2の機能または活性を抑制することができるCLEC-2リガンドは多種多様な血小板媒介障害の治療的介入のために使用することが可能である。一実施形態では、CLEC-2媒介障害は血管障害を含む。別の実施形態では、血管障害は、急性冠動脈症候群、血栓症、血栓塞栓症、血小板減少症、末梢血管疾患および一過性脳虚血発作からなる群から選択される。本明細書に記載される組成物は、一過性脳虚血発作、虚血性発作および塞栓症を含むがこれらに限定されない脳血管障害の処置にも有用である。一実施形態では、CLEC-2媒介障害は糖尿病関連障害である。一実施形態では、糖尿病関連障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性脈管障害、アテローム動脈硬化症、虚血性発作、末梢血管疾患、急性腎損傷および慢性腎不全からなる群から選択される。一実施形態では、CLEC-2媒介障害は血小板媒介炎症障害を含む。別の実施形態では、血小板媒介炎症障害は、関節炎、関節炎リューマチ、乾癬性関節炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患、強直性脊椎炎および強皮症からなる群から選択される。一実施形態では、CLEC-2媒介障害は癌である。血小板は癌転移および/または進行に関与していると長い間示唆されてきたNashら、202、LancetOncol、3:425-430頁。腫瘍細胞を取り囲む血小板凝集は、血液中で剪断応力およびNK細胞から腫瘍細胞を保護し、それによって腫瘍細胞巣の形成を促進していることがある。さらに、内在性CLEC-2リガンドとしてのポドプラニンの発見以来、実験データによれば、CLEC-2/ポドプラニンは、抗転移薬の実行可能な標的であり得ることが示唆されてきた。たとえば、抗ポドプラニンブロッキング抗体は、ポドプラニンを発現している腫瘍細胞からなる転移性肺小結節の数を著しく抑制するKatoら、2008年、CancerSci.、99:54-61頁。本明細書に記載されるCLEC-2リガンドは、CLEC-2媒介血小板凝集を抑制することが明らかにされているが、腫瘍転移の処置および抑制に治療的使用を有する。一実施形態では、癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膵癌、脳癌、骨癌および肝癌からなる群から選択される。しかし、本明細書に記載されるCLEC-2リガンドは、転移してしまったまたは転移する可能性が高いと当業者により考えられているいかなる癌も処置または抑制するのに有用であり得ると理解されている。一実施形態では、CLEC-2リガンドは血小板活性化の開始を抑制する。他の実施形態では、CLEC-2リガンドは血小板活性化およびその結果起こる血小板炎症促進性応答を抑制する。他の実施形態では、CLEC-2リガンドは血小板粘着を抑制する。他の実施形態では、CLEC-2リガンドは血小板凝集を抑制する。さらに追加の実施形態では、CLEC-2リガンドは血栓生成を抑制する。ある種の実施形態では、血管事象、特に血栓または血栓塞栓症の形成を処置または予防する方法であって、本明細書に記載されるCLEC-2核酸リガンドをそれを必要とする宿主に投与することを含む方法が提供される。一実施形態では、CLEC-2核酸リガンドは長期間提供される。この例では、CLEC-2リガンドモジュレーターは、緊急事態、たとえば、処置により、頭蓋内または胃腸出血を含む出血が生じる場合にのみ使用してもよい。別の実施形態では、CLEC-2核酸リガンド処置を受けた患者に救急手術が必要な場合にモジュレーターが投与される。別の実施形態では、CLEC-2核酸リガンドの濃度ならびにそれによって処置の持続時間および強度を制御するためにモジュレーターが投与される。別の実施形態では、CLEC-2核酸リガンドは、心肺バイパス処置中に血小板麻酔薬として与えられる。別の実施形態では、CLEC-2核酸リガンドは、経口抗血小板薬物にトランジションオフまたはオンの時期を与えるために投与され、モジュレーターは、経口抗血小板薬の治療レベルが確立されると、CLEC-2核酸リガンドを逆転させるために使用される。本明細書に記載される方法は、別の治療と組み合わせて使用してもよい。一実施形態では、宿主は、外科的介入を受ける準備をしているもしくは受けている、または宿主を閉塞性血栓症の危険にさらす外科的介入を受けたことがある。他の実施形態では、宿主は血液透析を可能にする血管移植片を受けており、これは血管と血小板間の相互作用のせいで閉塞するリスクがある。一実施形態では、治療は、治療的有効量の抗癌薬または抗血栓薬を用いて宿主を処置することを含む。一実施形態では、治療は、HIV抗ウイルス薬、免疫モジュレーターおよび抗感染症薬からなる群から選択される抗HIV薬の治療的有効量を用いて宿主を処置することを含む。投与および医薬組成物本明細書で教唆されるCLEC-2核酸リガンドまたはCLEC-2リガンドモジュレーターは、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことができるが、これらに限定されない医薬組成物に処方することが可能である。組成物の正確な性質は、任意の安定化修飾を含むリガンドおよび/またはモジュレーターの性質ならびに投与経路に少なくとも一部は依存することになる。モジュレーターを含有する組成物は、リガンドの活性のモジュレーションを可能にし、したがって投与されたCLEC-2核酸リガンドの抗血小板活性を調節するように、CLEC-2核酸リガンドを与えられている宿主に投与するために設計することが可能である。医薬または薬理学組成物の設計および調製は、本開示に照らして当業者には公知である。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液としての注射液として;注射に先立つ液体中の溶液または懸濁液に適した固形形態;経口投与のための錠剤または他の固体として;徐放性カプセルとして;経口投与のための液体として;点眼液、クリーム、ローション、軟膏、吸入薬および同種のものを含むエリキシル、シロップ、坐薬、ゲルとしてまたは当技術分野で使用されている他の任意の形態で調製することが可能である。手術野における特定領域を扱う外科医、内科医または医療従事者による生理食塩水ベースの洗浄剤などの減菌製剤の使用も特に有用であり得る。組成物は、微小デバイス、微小粒子またはスポンジを介する送達のために処方することも可能である。組成物は、局所送達のためにステントなどの埋め込み型医療デバイス上に被膜することも可能である。CLEC-2核酸リガンドまたはCLEC-2リガンドモジュレーターを含む薬剤的に有用な組成物は、少なくとも一部は薬学的に許容される担体の混合により処方することが可能である。そのような担体および処方の方法の例は、Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy、第20版LippincottWilliamsWilkins、2000年およびAnselら、PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems、6thEd.Media、Pa.:WilliamsWilkins、1995年に見出せる。適切な医薬賦形剤には、安定化剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、バッファーおよびリン酸緩衝食塩水を含むがこれに限定されないpH調整剤が含まれる。適切な添加剤には、生理的に生物学的適合性バッファーたとえば、トロメタミン塩酸塩、キレート剤の添加たとえば、EDTA、DTPAまたはDTPA-ビスアミドなどまたはカルシウムキレート複合体たとえば、カルシウムDTPA、CaNaDTPA-ビスアミド、または場合によってカルシウムもしくはナトリウム塩たとえば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウムの添加が含まれる。医薬組成物は、液体の形態で使用するためにパッケージすることが可能であり、または凍結乾燥することが可能である。効果的投与に適切な薬学的に許容される組成物を形成するために、そのような組成物は有効量の核酸リガンドまたはモジュレーターを含有することになる。そのような組成物は、1つよりも多い化合物の混合物を含有することができる。組成物は、典型的には約0.1重量パーセントwtから約50wt、約1wtから約25wtまたは約5wtから約20wtの活性作用剤リガンドまたはモジュレーターを含有する。皮下、筋肉内または静脈内注射および点滴液を含む、非経口投与のための医薬組成物が本明細書では提供される。非経口投与では、無菌懸濁液および溶液が望まれる。静脈内投与が望まれる場合、一般に適切な保存剤を含有する等張調製物が用いられる。医薬組成物は、無菌化されるならびに/または、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤などのアジュバント、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩および/もしくはバッファーを含有してもよい。液体、特に注射可能な組成物は、たとえば、溶解する、分散する、等により調製することが可能である。活性化合物は、たとえば、水、緩衝水、生理食塩水、0.4生理食塩水、0.3グリシン、ヒアルロン酸、水性デキストロース、グリセロール、エタノールおよび同種のものなどの薬学的に純粋な溶剤に溶解する、またはと混合して、それによって注射可能な溶液または懸濁液を形成する。さらに、注射に先立って液体に溶解するのに適した固体形態を処方することが可能である。作用剤の水環境への溶解を補助するために、界面活性剤を湿潤剤として添加してもよい。界面活性剤は、ラウリル酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびジオクチルナトリウムスルホン酸などの陰イオン界面活性剤を含み得る。陽イオン界面活性剤を使用してもよく、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含むことができる。界面活性剤として製剤に含むことができる非イオン性界面活性剤には、ラウロマクロゴール400、ポリオキシル40ステアリン酸、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油10、50および60、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート20、40、60、65および80、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースならびにプルロニックF68および/またはプルロニックF127などのプルロニック界面活性剤のいずれかが含まれるが、これらに限定されないたとえば、StrappeらEur.J.ofPharm.Biopharm.、2005年、61:126-133頁参照。界面活性剤は、単独でまたは異なる比の混合物としてタンパク質または誘導体の製剤中に存在していてもよい。錠剤またはカプセルの形態での経口投与では、活性薬物成分は、エタノール、グリセロール、水および同種のものなどの経口非毒性薬学的に許容される不活性担体と組み合わせることが可能である。さらに、望まれるまたは必要な場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤も前記混合物に取り込むことが可能である。適切な結合剤には、制限なしで、デンプン、ゼラチン、グルコースまたはベータラクトースなどの天然糖、コーン甘味料、アカシア、トラガントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスおよび同種のものが含まれる。これらの剤形で使用される潤滑剤には、制限なしで、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび同種のものが含まれる。崩壊剤には、制限なしで、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムおよび同種のものが含まれる。経口投与で使用される液体形態では、活性薬物成分は、合成および天然ガム、たとえば、トラガント、アカシア、メチルセルロースおよび同種のものなどの適切な香りの懸濁化剤または分散剤と組み合わせることが可能である。用いることができる他の分散剤には、グリセリンおよび同種のものが含まれる。活性薬物成分を含有する局所調製物は、たとえば、アルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンAおよびEオイル、鉱油、PPG2ミリスチルエーテルプロピオン酸および同種のものなどの当技術分野で周知の種々の担体物質と混合させて、たとえば、アルコール溶液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローションおよびクリームまたはゲル製剤中のシャンプーを形成することができる。リガンドは、小単層小胞、大単層小胞および多層状小胞などのリポソーム送達システムの形態で投与することも可能である。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどの種々のリン脂質から形成することができる。直接たとえば、単独でまたはリポソーム製剤で投与される活性作用剤は、たとえば、米国特許第6147204号に記載されている。リガンドは、標的設定可能な薬物担体として可溶性ポリマーと連結することも可能である。そのようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル-アミド-フェノール、ポリヒドロキシ-エチルアスパルトアミドフェノールまたはパルミトイル残基で置換されたポリエチル-エネオキシドポリリジンを含むことが可能である。さらに、リガンドは、薬物の徐放を達成するのに有用な生分解性ポリマーの一種、たとえば、ポリエチレングリコールPEG、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリオキサゾリン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびハイドロゲルの架橋されたまたは両親媒性ブロックコポリマーに連結することが可能である好ましくは、共有結合を介して。コレステロールおよび類似の分子を核酸リガンドに連結させて、生物学的利用能を増加し延長することができる。開示のモジュレーターを使用のために一緒に処方することができる親油性化合物および非免疫原性高分子量化合物は、当技術分野で現在知られているまたはその後開発された様々な技法のうちのいずれによっても調製することが可能である。典型的には、前記化合物は、リン脂質、たとえば、ジステアロイルホスファチジルコリンから調製され、中性脂質、たとえば、コレステロールなどの他の材料および正電荷を帯びたたとえば、コレステロールのステリルアミンまたはアミノマンノースまたはアミノマンニトール誘導体または負電荷を帯びたたとえば、リン酸ジアセチル、ホスファチジルグリセロール化合物などの表面改質剤も含み得る。多層状リポソームは、従来の技法により、すなわち、脂質を適切な溶剤に溶解し次に前記溶剤を蒸発させて器の内側に薄膜を残すことによりまたは噴霧乾燥により、適切な容器または器の内壁に脂質を沈着させることによって形成することができる。次に水相を旋回またはボルテックス運動とともに器に添加すると、多層状リポソーム小胞MLVが形成される。次に、単層リポソーム小胞UVは、MLVの均質化、超音波処理または押し出し成型フィルターを通してにより形成することができる。さらに、UVは、洗剤除去法により形成することができる。本開示のある種の実施形態では、複合体は、リポソームの表面に会合したターゲティング核酸リガンド複数可および被包された治療薬または診断薬と一緒にリポソームを含む。前もって形成されたリポソームは改質して、核酸リガンドに会合させることが可能である。たとえば、陽イオン性リポソームは静電気相互作用を通じて核酸リガンドに会合する。代わりに、コレステロールなどの親油性化合物に粘着した核酸を前もって形成されたリポソームに付加することができ、それによりコレステロールはリポソーム膜に会合する。代わりに、核酸はリポソームの形成中にリポソームに会合させることができる。別の実施形態では、ステントまたは医療デバイスは、当業者に公知の方法に従って、CLEC-2リガンドまたはCLEC-2リガンドモジュレーターを含む製剤で被膜し得る。治療キットも想定されている。キットは、上記方法を実行するのに必要になり得る試薬、活性作用剤および材料を含む。キットは、一般に、適切な容器手段で、CLEC-2リガンドおよび/またはCLEC-2リガンドモジュレーターの薬学的に許容される製剤を含有することになる。キットがCLEC-2リガンドとCLEC-2モジュレーターの両方を含む場合、CLEC-2モジュレーターは、一部の実施形態では、キット内のCLEC-2リガンドに結合するモジュレーターである。キットは、単一容器手段を有してもよくおよび/またはキットは化合物ごとに別個の容器手段を有してもよい。投与のための方法本開示のCLEC-2リガンドおよび/またはCLEC-2リガンドモジュレーターの宿主への投与様式には、非経口注射または時間をかけた少しずつの注入により、静脈内、皮内、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、動脈内、心臓内、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、脊髄内、胸骨内、局所、経皮パッチ、直腸経由で、頬側、膣もしくは尿道坐剤、腹膜、経皮的、点鼻、手術移植、内部外科ペンキ、注入ポンプまたはカテーテルを経由してが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、作用剤および担体は、移植片、ボーラス、マイクロ粒子、マイクロスフィア、ナノ粒子またはナノスフィアなどの緩効性製剤で投与される。一実施形態では、CLEC-2核酸リガンドは、皮下注入浸透ポンプによるなどのを含む、皮下注射または沈着を経由して送達される。一実施形態では、CLEC-2核酸リガンドは皮下投与を経由して送達され、モジュレーターは皮下または静脈内投与により送達される。本開示のリガンドおよびモジュレーターを含む治療組成物は、単位用量の注射によるなどの静脈内に投与し得る。用語単位用量は治療組成物に言及して使用される場合、宿主に対する単位投与量として適切な物理的に別個の単位のことであり、それぞれの単位は、必要な希釈剤、すなわち、担体または媒体と合併して目的の治療効果を生じるように計算された予め定められた量の活性物質を含有する。さらに、非経口投与のための1つのアプローチは、一定レベルの投与量が維持されることを保証する、緩効性または徐放性システムの埋め込みを用いる。たとえば、罹患した関節の間質への局所投与も提供される。局所投与は、注射器または針などの注射デバイスを含有する他の製品からなどの、注射により達成される。注射器からの投与速度は、注射器の内容物を分配する目的の期間をかけて制御された圧力により制御することが可能である。別の例では、局所投与は、ポンプまたは他の類似のデバイスの使用により促進することができる注入により達成することが可能である。血管組織への局所投与のための代表的非限定的アプローチも提供され、1たとえば、取り除かれるまたはバイパスされる損傷を受けたまたは疾患に罹った血管組織セグメントの代わりに被膜されたまたは含浸された血管を埋め込むことにより、インビボでの送達のために核酸リガンドを含むゲルで血管組織を被膜するまたは含浸させる;2送達が望まれる血管へのカテーテルによる送達;3患者に埋め込まれることになる血管に組成物をポンプで送ることを含む。代わりに、化合物は、マイクロインジェクションにより、またはリポソーム被包により細胞に導入することが可能である。ステントなどの医療デバイスを前記リガンドを含有する医薬組成物で被膜することによる対象へのCLEC-2リガンドの投与も提供される。リガンドの適切な放出および投与を可能にする被膜のための方法は当業者には公知である。本明細書に記載される組成物に対する最適投与計画は当業者により容易に確立することが可能であり、モジュレーター、患者および求められる効果によって変わることがある。有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢および投与される核酸リガンドの量などの種々の要因に従って変わることがある。他の要因には投与様式が含まれる。薬学的有効量は、疾患の種類、使用される組成物、投与経路、処置される哺乳動物の種類、検討中の特定の哺乳動物の身体的特徴、併用薬物および当業者が認識することになる他の要因に依存する。一般に、組成物は、体重に対して調整される投与量、たとえば、約1μg/kg体重から約100mg/kg体重までの範囲に及ぶ投与量で投与されることになる。さらに典型的には、投与量は約0.1mg/kgから約20mg/kg、さらに典型的には、約0.5mg/kgから約10mg/kgまたは約1.0mg/kgから約5.0mg/kgまたは約1.0mg/kg、約2.0mg/kg、約3.0mg/kg、約4.0mg/kg、約5.0mg/kg、約6.0mg/kg、約7.0mg/kg、約8.0mg/kg、約9.0mg/kgまたは約10.0mg/kgの範囲に及ぶことになる。典型的には、用量は最初は約0.002μg/mlから約2000μg/mlの薬物、さらに典型的には、約2.0μg/mlから約400μg/ml、さらに典型的には、約10μg/mlから200μg/ml、約20μg/mlから約100μg/ml薬物、約20μg/ml、約40μg/ml、約60μg/ml、約80μg/ml、約100μg/ml、約120μg/ml、約140μg/ml、約160μg/ml、約180μg/mlまたは約200μg/mlの薬物の血漿濃度を提供する。既にリガンドを投与されている宿主にモジュレーターを投与する場合、モジュレーター対リガンドの比は、目的レベルのリガンドの抑制に基づいて調整することができる。モジュレーター用量は、リガンドの用量との相関関係に基づいて計算することが可能である。一実施形態では、モジュレーター対リガンドの重量対重量用量比は1:1である。別の実施形態では、モジュレーター対リガンドの比は、2:1または約2:1、3:1または約3:1、4:1または約4:1、5:1または約5:1、6:1または約6:1、7:1または約7:1、8:1または約8:1、9:1または約9:1、10:1または約10:1またはそれよりも多いなどの1:1よりも大きい。他の実施形態では、モジュレーター対リガンドの重量対重量用量比は、0.9:1もしくは約0.9:1、0.8:1もしくは約0.8:1、0.7:1もしくは約0.7:1、0.6:1もしくは約0.6:1、0.5:1もしくは約0.5:1、0.45:1もしくは約0.45:1、0.4:1もしくは約0.4:1、0.35:1もしくは約0.35:1、0.3:1もしくは約0.3:1、0.25:1もしくは約0.25:1、0.2:1もしくは約0.2:1、0.15:1もしくは約0.15:1、0.1:1もしくは約0.1:1などの約1:1未満または約0.005:1もしくはそれ未満などの0.1:1未満である。一部の実施形態では、重量対重量用量比は、0.5:1から0.1:1までまたは0.5:1から0.2:1までまたは0.5:1から0.3:1までである。他の実施形態では、重量対重量用量比は、1:1から5:1までまたは1:1から10:1までまたは1:1から20:1までである。リガンドは単回日用量、隔日用量で静脈内に投与することが可能である、または日全投与量は数回に分けた用量で投与することが可能である。リガンドおよび/またはモジュレーター投与は、1日につき1回q.d.、1日につき2回b.i.d.、1日につき3回t.i.dまたは必要に応じてそれよりも多い回数提供してもよい。したがって、モジュレーターは、モジュレーターの投与により核酸リガンドの効果を変更するいかなる適切な手段でも提供される。核酸リガンドは、週2回、毎週、2週間ごとにまたは毎月皮下に投与することが可能である。一部の実施形態では、リガンドまたはモジュレーターは、1日につき1回よりも少ない回数で投与される。たとえば、リガンド投与は、1日おきに、3日おきに、4日おきに、毎週または毎月実施してもよい。一実施形態では、他の作用剤の同時投与または連続投与が望ましいことがある。活性作用剤が別々の投与製剤である1よりも多い活性作用剤を用いた併用処置では、活性作用剤は同時に投与することが可能である、またはそれぞれを別々の時間差を設けて投与することが可能である。組成物は、投与製剤と適合する形態でおよび治療的有効量で投与される。投与される量は、処置される宿主、活性成分を利用する宿主体系の能力および望まれる治療効果の程度に依存する。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、実施者の判断に依存し、それぞれの個体に特有である。しかし、全身適用に適した投与量範囲は本明細書に開示されており投与経路に依存する。投与に適した計画も可変であるが、初回投与とそれに続くその後の注射または他の投与による1時間またはそれよりも長い時間の間隔を開けての再投与により典型的に表される。代わりに、インビボ治療のために指定された範囲で血中濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が提供される。ある種の実施形態では、本開示の組成物は別の治療薬をさらに含み得る。第2の作用剤が使用される場合、第2の作用剤は別々の剤形としてまたは化合物もしくは組成物と一緒の単一剤形の一部として投与し得る。発明化合物のうちの1つまたは複数を単剤療法の適用において使用して、障害、疾患または症状を処置することができるが、前記化合物は、発明化合物または組成物治療薬の使用が同じならびに/または他の種類の障害、症状および疾患を処置するための1つまたは複数の他の治療薬の使用と組み合わされる併用療法においても使用し得る。併用療法は、2つまたはそれよりも多い治療薬の同時または連続した投与を含む。作用剤はいかなる順序で投与してもよい。代わりに、複数の治療薬を組み合わせて患者に投与することができる単一の組成物にすることができる。CLEC-2リガンドおよびCLEC-2リガンドのモジュレーターを特徴付けるための方法一態様では、本開示は、CLEC-2の活性化因子または阻害因子として機能し得るCLEC-2リガンドを特徴付けるための方法を提供する。そのような方法は、CLEC-2媒介血小板凝集の点でCLEC-2活性を評価する。一実施形態では、アッセイは、全血フローベースの血小板粘着アッセイを使用してインビトロまたはエクスビボで行われる。様々な研究により、CLEC-2はコラーゲン被膜表面への最初の血小板粘着には必要ではない場合があるが、CLEC-2は血小板凝集体の安定化および血栓成長には必要とされる場合があることが示唆されている。血栓症におけるCLEC-2の役割は、たとえば、マウスにおいてCLEC-2キメラを使用して研究されてきた。これらの研究によれば、CLEC-2は、インビトロでもインビボでも血栓安定化に関与していることが示唆されているSuzuki-Inoue,Kら、2010年、J.Biol.Chem.285、24494-24507頁。インビトロでの血小板凝集体安定化におけるCLEC-2受容体の役割も、全血潅流アッセイを使用して最近実証され、CLEC-2枯渇血小板はコラーゲン被膜表面に正常に粘着することはできるがその後の安定な血小板凝集体形成は中程度から高剪断速度下で強く損なわれたMay,Fら、2009年、Blood、114:3464-3472頁。そのような研究を通じて、CLEC-2は、コラーゲンとは接触しない成長中の血栓に動員される血小板におけるGPVIの役割を引き継ぐことにより血栓成長に寄与し得ると仮定されてきたNeswandt,Bら、2011年、J.Throm.Haemost、9.suppl1:92-104頁。言い換えると、血小板のコラーゲン被膜表面への粘着および最初の血栓形成はGPVIに依存しているが、血小板のさらなる凝集、すなわち、血栓を形成するにはCLEC-2が必要である。コラーゲン被膜表面への流動条件下での血小板の粘着は、インビトロおよびインビボ血栓成長および安定性の研究のために決まって使用されてきた。これらの流動実験は、たとえば、BioFlux商標FluxionBiosciences、SouthSanFrancisco、CAなどの機器を使用して行われ、この機器はインビトロモデルにおいて生理的剪断フローを模倣する能力があり、ハイスループットウェルプレートフォーマットも提供する。全血を使用するインビトロフローベースの血小板粘着アッセイを使用して、CLEC-2媒介血小板凝集体形成の活性化因子または阻害因子を同定することができることがほどなく発見された。一実施形態では、全血の剪断フローに供される表面は、CLEC-2依存性血小板凝集体形成を効果的に刺激することが知られているロドサイチンで被膜される。実施例10図12Aに詳述されているように、ロドサイチン被膜表面の使用は、全血における流動条件下での血栓中の活性化された血小板の蓄積を支持している。次に、前記アッセイ法は、CLEC-2依存性血小板凝集体形成の推定阻害因子または活性化因子の存在下で実施される。たとえば、全血試料はCLEC-2に結合することが知られている化合物たとえば、本明細書に記載されるCLEC-2リガンドのいずれか1つと一緒にインキュベートされる。次に、CLEC-2リガンドの存在下でおよび非存在下で血小板凝集体形成の比較を行うことが可能である。CLEC-2依存性血小板凝集体形成の阻害因子は、CLEC-2リガンドの非存在下での血小板凝集体形成のレベルと比べた場合、血小板凝集体形成のレベルを少なくとも50、75、80、85、90または95減少させるCLEC-2リガンドである。このアッセイを使用して、CLEC-2リガンドのモジュレーターも同定し得る。さらに、実施例10に記載されているように、全血試料は、CLEC-2リガンドのモジュレーターの追加の存在下または非存在下、CLEC-2リガンドの存在下で、インキュベートしてもよい。CLEC-2リガンドの機能的モジュレーターである化合物は、CLEC-2リガンドの活性を逆転させることになる。たとえば、CLEC-2リガンドが血小板凝集体形成のレベルを減少させている場合、CLEC-2リガンドの機能的モジュレーターの添加により、CLEC-2リガンドのみの存在下で見られるレベルと比べて血小板凝集体形成が増加することになる。CLEC-2リガンドの機能を特徴付けるのに有用な第2のプロトコールでは、全血が可溶性I型コラーゲンコラーゲンIで被膜されている表面に曝露される、全血を使用するインビトロフローベースの血小板粘着アッセイが実施される。たとえば、実施例10図12Bは、ウェルが可溶性ラット尾コラーゲンIで被膜されている、BIOFLUXを使用して実施されたアッセイを示している。このプロトコールでは、全血試料は、可溶性コラーゲンI被膜表面を通るフローに先立って、ロドサイチンと一緒にインキュベートされる。試料中にロドサイチンが存在すると、ロドサイチンを欠く血液流に形成される血小板凝集体と比べてより大きな血小板凝集体が可溶性コラーゲンI被膜表面に形成される。CLEC-2媒介血小板凝集体形成を活性化または阻害するCLEC-2リガンドの能力を試験するために、全血試料は、血流スッテプに先立ってCLEC-2リガンドと一緒にインキュベートされる。CLEC-2リガンドとのインキュベーションは、ロドサイチンとのインキュベーションに先立ってまたはその後で行うことが可能である。代わりに、CLEC-2リガンドとロドサイチンは血液試料に同時に添加される。次に、上記のように、CLEC-2リガンドの存在下および非存在下での血小板凝集体形成についての比較を行うことが可能である。CLEC-2依存性血小板凝集体形成の阻害因子は、CLEC-2リガンドの非存在下での血小板凝集体形成のレベルと比べた場合、血小板凝集体形成のレベルを少なくとも50、75、80、85、90または95減少させるCLEC-2リガンドである。さらに、CLEC-2リガンドのモジュレーターは、上記のように、CLEC-2媒介血小板凝集体形成に対するCLEC-2リガンドの効果を逆転させるその能力で特徴付けることが可能である。CLEC-2リガンドの機能的モジュレーターである化合物は、CLEC-2リガンドの活性を逆転させることになる。たとえば、CLEC-2リガンドが血小板凝集のレベルを減少させている場合、CLEC-2リガンドの機能的モジュレーターの添加により、CLEC-2リガンドのみの存在下で見られるレベルと比べて血小板凝集体形成が増加することになる。CLEC-2リガンドおよびCLEC-2リガンドのモジュレーターの機能的活性を特徴付けるためのこれらのアッセイ法は、全血試料を用いた使用に限定されないことは理解される。血液試料は、ある種の実施形態では、1つまたは複数の天然血液成分を含み得る。血液試料は、ある種の実施形態では、1つまたは複数の人工血液成分を含み得る。代わりに、フローアッセイにおいて使用される血液試料は、全血または多血小板血漿または洗浄血小板を含む試料である。CLEC-2リガンドおよびモジュレーターの機能的活性は、様々な細胞系統、たとえば、内皮細胞、樹状細胞、白血球、単球、好中球、マクロファージ、リンパ系細胞、免疫細胞、すなわち、ナチュラルキラーT細胞、B細胞を使用して試験することができる。様々な機能アッセイには、血小板-血小板相互作用、血小板-単球相互作用、血小板白血球相互作用、カルシウムシグナル伝達、細胞粘着アッセイ、分泌アッセイ、LSP誘導炎症アッセイ、細胞遊走アッセイ、SykおよびSrkリン酸化アッセイ、リガンド結合についてのELISAアッセイ、フローサイトメトリーベースの受容体占有アッセイまたは診断マーカーアッセイが含まれる。アプタマーリガンドを用いて試験することができる試薬およびCLEC-2受容体モジュレーターの合成等価物は、架橋抗体、CLEC-2受容体の同種親和性相互作用研究、小分子阻害因子および活性化因子、ペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体、リポタンパク質、脂質付加されたペプチド、等である。以下の実施例は本開示のある種の態様を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示の範囲を限定すると決して考えられるべきではない。実施例1:CLEC-2に対する核酸リガンドの同定SELEX法を使用して、図1に記載され例示されるCLEC-2に結合するリガンドを得た。候補DNAライブラリーは、1nモルの鋳型DNAオリゴおよび1.5nモルの5’DNAプライマーオリゴを熱アニールしスナップ冷却することにより生成された。候補混合物を設計するためのSel2DNA鋳型オリゴの配列は、5’-TCTCGGATCCTCAGCGAGTCGTCTGN40CCGCATCGTCCTCCCTA-3’配列番号4N40は、等モル量のA、T、GおよびCを用いて合成された40近接ヌクレオチドを表すであり、5’プライマーオリゴおよび3’プライマーオリゴは、それぞれ、および5’-TCTCGGATCCTCAGCGAGTCGTCTG-3’である。反応生成物はExo-Klenowで充填され、EDTAを添加して停止されて最終濃度2mMとし、PCI[フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール25:24:1]、次にクロロホルム:イソアミルアルコール24:1で抽出された。抽出物は脱塩され、濃縮され、組み込まれなかったヌクレオチドはAmicon10スピンカラムを用いて取り除かれた。DNA鋳型は転写反応において利用されて、2’-フルオロピリミジン開始ライブラリーを生成した。インビトロ転写条件は、40mMTris-HClpH8.0、4PEG-800、12mMMgCl2、1mMスペルミジン、0.002Triton、5mMDTT、1mMrGTP、1mMrATP、3mM2’F-CTP、3mM2’F-UTP、8μg/mL無機ピロホスファターゼ、0.5μMDNAライブラリーおよびY639F変異体T7ポリメラーゼであった。転写は37°Cで一晩インキュベートされ、デオキシリボヌクレアーゼ処理され、クロロホルム:イソアミルアルコール24:1で2度抽出され、Amicon10スピンカラムを用いて濃縮され、12変性PAGEゲル上でゲル精製された。RNAはゲルから溶出され、バッファー交換して、Amicon10スピンカラムにおいてTE10mMTrispH7.5、0.1mMEDTA洗浄剤を用いて濃縮された。CLEC-2選択は、約1014の異なる2’-フルオロピリミジンRNA配列の複合ライブラリーから開始した。複合RNAプールはビオチン-PEG6-His6ペプチドに対してプレクリアーpreclearされ、磁気ストレプトアビジンビーズ上に固定化された。プレクリアーされたRNAは、精製組換えN-termHis10タグ付きCLEC-2タンパク質配列番号3に結合された。精製ヒスチジンタグ付きCLEC-2タンパク質は、RDSystemsMinneapolis、MN、カタログ番号1718-CL-050から入手され、残基Gln58-Pro229を包含していた。CLEC-2リガンド選択は、結合バッファーFにおいて実施された。結合バッファーFは、20mMHEPESpH7.4、150mMNaCl、2mMCaCl2および0.01BSAからなる。ラウンド3で開始し、0.0024酵母tRNAは、ラウンド結合反応においてインキュベートされた。タンパク質-RNA複合体は、25mmニトロセルロースディスク上で洗浄しながら分配された。結合RNAは、PCI25:24:1中のインキュベーションと共にニトロセルロースディスクから抽出された。水が添加され、水相が抽出され、続いてクロロホルム:イソアミルアルコール24:1で抽出された。得られた結合RNAはエタノール沈殿された。沈殿したRNAの4分の1は3’プライマーに熱アニールされ、AMVRTを使用して逆転写された。全RT反応は、5’および3’プライマーを用いたPCRならびに標準PCR条件で使用されて、RNA生成の次のラウンドのためのDNA鋳型を生成した。選択ラウンドごとの具体的条件は図2に示されている。CLEC-2に対するリガンドライブラリーの濃縮は、SELEXおよび可溶性CLEC-2のそれぞれのラウンド由来の放射性標識されたリガンドRNAプールを利用する直接結合研究においてモニターされた。結合研究は、トレースP32末端標識されたRNAを結合バッファーF中の段階希釈のCLEC-2に添加して実施された。結合研究のための放射性標識されたRNAを調製するために、100ピコモルのRNAは50°Cで1時間細菌性アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化された。反応は、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール25:24:1で抽出され、クロロホルム:イソアミルアルコール24:1で抽出され、エタノール沈殿された。3pモルの脱リン酸化されたRNAは、バッファーが供給されているT4ポリヌクレオチドキナーゼおよび20μCiのγ-P32-ATPを用いて末端標識され、その後BioradMicroBioSpinP-30スピンカラムを用いて洗浄された。末端標識されたRNAは、最終濃度2000cpm/μLまで希釈され、65°Cで5分間熱変性された。RNAおよびCLEC-2希釈液は使用に先立って37°Cで平衡化された。RNA5μLは、37°Cで、変化する濃度のCLEC-215μLに添加され、5から15分間一緒にインキュベートされた。次に、複合体化したRNA/CLEC-2タンパク質混合物は、ProtranBA85ニトロセルロース膜上に充填され、96ウェル真空マニフォールドシステムにおいてGenescreenPlusNylon膜上に洗浄と共にかけられた。膜はホスフォイメージャースクリーンに曝露され、スキャンされ、MolecularDynamicsStorm840ホスフォイメージャーを用いて定量化された。結合した割合は、ニトロセルロース上のカウント数を全カウント数で割って計算され、バックグランドについて調整された。CLEC-2選択の結合の濃縮は図3に示されている。実施例2:CLEC-2核酸リガンドの塩基配列決定および同定実施例1に記載されるSELEX実験のラウンド10由来の抗CLEC-2濃縮されたリガンドライブラリーを表す最終PCR産物は、EcoRIおよびBamHIで消化され、精製キットを使用して洗浄され、線形化されたpUC19ベクターに方向性にクローニングされた。細菌コロニーは単一クローンについて画線され、5mLの一晩培養物は単一コロニーから播種された。プラスミドDNAは、InvitrogenPurelinkQuickPlasmidMiniprepキットを使用して単一コロニーから調製され、ベクタープライマーを利用して塩基配列決定された。全部で42クローンが塩基配列決定され、20が独特な配列を示した。これらの独自の配列それぞれが、CLEC-2親和性実施例1における方法に従っておよびロドサイチン誘導CLEC-2依存性血小板凝集を阻害する能力実施例8における方法に従ってに関して評価された。20クローンについて得られたデータの解析後、リガンドS2-20はCLEC-2依存性凝集の高親和性阻害因子として同定され、下に詳述されるようにさらに完全に特徴付けられた。DNAランダム領域、対応するRNAランダム領域、完全長DNA、完全長RNAおよびアプタマーS2-20のための改変を有する完全長RNAの配列は、表1に示されている。完全長とはSELEXプロセスから生じ、SELEXプロセスにおいて使用されるリガンドライブラリーの両ランダム部分由来の配列ならびにランダム領域に隣接する固定された配列部分由来の配列を含む配列のことである。CLEC-2に対する抗CLEC-2リガンドの親和性は、上の実施例1に記載されている放射性標識されたトレースリガンドRNAおよび可溶性CLEC-2を使用する直接結合研究により決定された。CLEC-2に対する抗CLEC-2リガンド、S2-20の親和性は高く、Kdは約1.4nMであった。実施例3:抗CLEC-2リガンド配列のトランケーションプロービング潜在的二次構造についてのS2-20のスクリーニングは、mfoldサーバーmfold.bioinfo.rpi.eduを利用して行われた。これらの方法の説明は、前記サーバーサイトはもちろん、M.Zuker2003MfoldwebserverfornucleicfoldingandhybridizationpredictionNucleicAcidsRes.3113、3406-15頁およびD.H.Mathewsら1999ExpandedSequenceDependenceofThermodynamicParametersImprovesPredictionofRNASecondaryStructureJ.Mol.Biol.288、911-940頁に見られる。抗CLEC-2リガンドS2-20に対する一連の切断型化合物が生成され表2、CLEC-2に対するその親和性が決定された表2。RB587の例外はあるが、すべての切断型はインビトロでDNA鋳型から転写された。RB587は、idTプレロードされたCPGを用いてMermade12DNA/RNA合成装置で合成された。S2-20完全長アプタマー、S2-20T10トランケートおよびRB587についての結合データは図4に示されている。トランケートS2-20T10およびRB587の二次構造は図5に提示されている。5’および3’末端の予想される境界は、ステム1および機能的抗CLEC-2リガンドを形成するのに十分である。ステム1の3’部分が取り除かれると、S2-20T5の場合と同じように、CLEC-2への結合は消失する。S2-20T7およびS2-20T8についての結合データによれば、ステム1は5塩基対長であるがそれでも匹敵する結合親和性を保持することができる。ステム1を6塩基対から8-10塩基対に延長しても、S2-20T6ext8およびS2-20T6ext10に関して実証されているように、高親和性でCLEC-2に結合した。したがって、ステム1は5-10塩基対長で匹敵する結合親和性を有することができる。ステム2は4塩基対ステムで、下側でのゆらぎ塩基対が好まれる。S2-20T11は、ステム2の下側塩基対をU-GからC-Gに変化させる単一置換を有する。この置換は、Kdの著しいおよそ30倍増加により示されるように、十分には許容されていない。実施例4:抗CLEC-2リガンド配列の変異プロービングループ領域内にヌクレオチド変異を含有するS2-20トランケートの一連の変異体化合物が生成され、CLEC-2に対するその結合親和性が決定された表3。RB588の例外はあるが、すべての変異体トランケートはインビトロでDNA鋳型から転写された。RB588は、idTプレロードされたCPGを用いてMermade12DNA/RNA合成装置で合成された。切断型S2-20配列の二次構造図5は、2つのループ構造が存在し、ループ1は5’-GAC-3’でありループ2は5’-CUCAUAUU-3’であることを示している。変異解析を行うことにより、ループ構造のより厳密な定義を決定することができた。ループ1塩基1では、Amut25、Cmut7またはUmut33への置換は十分に許容されなかった。Mut7は基本的にCLEC-2タンパク質への特異的結合はなく、化学的に合成されたバージョンRB588は、さらなる研究において負の対照として使用された。ループ1の第2の塩基は、Gmut31またはUmut8への置換を容易に受け入れ、この位置はプリンでもピリミジンでも許容できることが示唆される。二重変異体mut1結合データは、単一点変異体データと一致している。ループ1の第3の塩基はCである方が好ましい。その他のピリミジンUmut26へのCの置換は十分に許容されず、Gmut6への置換も許容されなかった。このデータを検討すると、ループ1は共通配列5’-GNC-3’Nは4つの塩基A、G、C、TまたはUのいずれかを表すを有すると説明することができる。ループ2は8塩基ループであり、配列5’-CUCAUAUU-3を有する。変異体解析によれば、塩基1にはピリミジンが好ましいことが示唆される。Umut17への置換は十分許容されたが、親和性のわずかな消失が観察された。Gmut9への塩基1の置換は十分に許容されなかった。Amut10またはCmut18への置換は十分に許容されなかったので、Uはループ2の第2の塩基で好ましい。ピリミジンはループ3の第3の塩基mut19で好ましく、プリンmut11への置換は十分に許容されなかった。ループ2の塩基4はプリンmut20またはピリミジンmut12置換を許容することができた。この位置はプリンでもピリミジンでも許容することができるが、塩基の欠失は許容されなかったmut28。塩基5はAmut13またはCmut21への置換を許容することができ、匹敵する結合親和性であった。さらに、Gmut32への置換も許容された。この位置は置換を容易に許容することができるが、この位置の欠失は許容されないmut37。ループ2の塩基6ではプリンが好ましい。プリン置換mut22は許容されたが、ピリミジン置換mut14およびmut27はどちらも許容されなかった。ピリミジンはループ2の塩基7で好ましいmut23。塩基7でのAmut15への置換ではKdが増加する。変異体15Kd約30nMの結合は生成されたその他の変異体構築物の多くよりも有意に優れているが、この位置のプリンはピリミジンほど望まれない。Uはループ2の塩基8で好まれる。Cmut24またはAmut16へのこのUの置換は十分に許容されなかった。このデータに基づいて、好まれるループ2共通配列は、以下の5’-YUYNNRYU-3’として書くことが可能であり、Yはピリミジンを表し、Rはプリンを表し、Nは4つの塩基のいずれでも表す。実施例5:縮重SELEXS2-20CLEC-2リガンド配列内の重要なヌクレオチドを同定するために、縮重SELEXが実施された。縮重SELEXのための開始鋳型オリゴは、縮重がN40領域に故意に導入されているS2-20配列であった。S2-20縮重鋳型オリゴの合成は、S2-20ランダム領域配列全体を通して60の最初の塩基および13.3の残りの3種の塩基のそれぞれであった。SELEXの選択圧にS2-20配列の縮重バージョンを導入することにより、どのヌクレオチド置換がCLEC-2への結合にとり好まれるかを決定することが可能である。S2-20縮重RNA開始プールはCLEC-2に対するナイーブScl2プールに匹敵する結合を有していた。4ラウンドの選択後、縮重選択由来のラウンド4RNAプールの結合親和性は最初の選択由来のラウンド10RNAに匹敵していた。縮重S2-20選択のための特定の条件は図6に示されている。ラウンド3由来の43のアプタマーおよびラウンド4由来の46のアプタマーは、実施例2に記載される通りにクローニングされ塩基配列決定された。開始縮重プールは、開始配列の60を保存して設計された。個々の位置での置換度数率を分析することにより、どの塩基が置換を容易に許容するかを決定することが可能である。ランダム領域についてのラウンド3とラウンド4配列の両方の個々の位置でのそれぞれのヌクレオチドの頻度は図7に例示されている。前記配列のランダム領域における最初の24ヌクレオチドは高度に保存されている。塩基位置25-40は、設計された60のベースラインと比べて含有される保存は有意に少ない。これらのデータは、トランケーションデータと一致しており、CLEC-2への結合に必要な最小必須領域が示されている。縮重選択解析により、ステム1がゆらぎ塩基対ならびにステム構造は無傷のままであると仮定していくつかの最小不対塩基を許容することができたことも明らかになっている。トランケーションデータと一致して、ステム2は縮重選択において高度に保存されており、ステムの底のU-G塩基対は100の頻度で好まれていた。ループ1では、ループ中の第1の塩基Gは5’固定領域に由来しておりその結果その位置では変異は見られなかった。ループ1の塩基2Aでは、実際にAに対する好みが存在するように思われたが、他の置換が観察され、この位置でのAの表示は、SELEXがラウンド3からラウンド4に進むに従って減少しているように思われた。変異データと一致して、ループ1における第3の塩基のCはラウンド3とラウンド4の両方由来の配列の100で保存されていた。ループ2では、縮重選択結果と実施例3における変異データを比較すると、類似する知見が見られた。全体としては、CLEC-2への結合に関与しているランダム領域の部分ランダム領域の塩基1-24は最初のS2-20配列に高度に収束していた。最小構造において必要ではないランダム領域の残りの塩基塩基25-40は、はるかに多岐にわたっていた。実施例6:抗CLEC-2リガンド配列に対する制御剤リガンドは、相補的ワトソン-クリック塩基対合則に基づくリガンドでは、核酸モジュレーターまたは制御剤を設計するのに必要な情報をコードしている。所与の制御剤の有効性は、制御剤との核形成のためのリガンドの標的にされた領域の到達性、ならびにリガンドとの完全二重鎖形成に先立って変性を必要とすると考えられる制御剤内の限られた内部二次構造の非存在を含む、いくつかの要因に依存している。核酸モジュレーターとの会合のために好まれる領域であると考えられる抗CLEC-2リガンドの領域を定義するために、一連の制御剤表4および図8参照がRB587について設計された。6つの制御剤RB581-586すべての有効性を試験するために、ゲルシフトアッセイが用いられた。このアッセイでは、RB587はγ-P32-ATPで末端標識され、痕跡量で非標識RB587に加えられ、次にバッファーまたは様々なモル比の前記6つの制御剤のうちの1つと一緒にインキュベートされた。さらに具体的には、非標識RB587のモル濃度は1μMと一定に保たれ、一定範囲の制御剤8μMから0.25μMが反応に加えられ、モル比範囲1:8から1:0.25のRB587対制御剤が得られた。反応は37°Cで15分間インキュベートされ、16天然ポリアクリルアミド/0.5×TBE/2mMCaCl2ゲル上に充填され。10Wで3時間移動させた。次に、ゲルは取り外され、ラップに包まれ、遮光カセット内で1時間ホスフォイメージャースクリーンに曝露され、Storm840によりスキャンされた。生じたスキャンは、RB587の天然位置のみを示し、RB587プラス様々なモル量の制御剤は、リガンドと制御剤のハイブリダイゼーションのせいで上方に移動していた。RB587の天然のフォールディングを破壊するのに必要な制御剤の最小モル比の結果は表4に示されている。抗CLEC-2リガンド、RB587の二次構造は、制御剤の使用により効率的にモジュレートされることができる。実施例7:抗CLEC-2リガンドの抗血小板活性を評価するための方法洗浄血小板調製WPおよび凝集研究:ヒト洗浄血小板は、基本的にMustardら1972年;Br.J.Haematol22、193-204頁に記載されている通りに調製された。手短に言えば、ヒト血液は6分の1容量の酸/クエン酸塩/ブドウ糖ACDバッファー85mMクエン酸ナトリウム、65mMクエン酸および110mMグルコースに収集され、37°Cで30分間水浴に置かれ、次に室温で16分間、250×gで遠心分離された。多血小板血漿は取り除かれ、室温で13分間、2200×gで遠心分離され、次に、10U/mLヘパリンおよび5μM最終濃度プロスタグランジンI2PGI2を含有するHEPES緩衝タイロード溶液136.5mMNaCl、2.68mMKCl、1mMMgCl2、2mMCaCl2、12mMNaHCO3、0.43mMNaH2PO4、5.5mMグルコース、5mMHEPESpH7.4、0.35ウシ血清アルブミンの40mLに再懸濁された。血小板懸濁液は37°C水浴において10分間インキュベートされ、5μM最終濃度PGI2を添加され、混合液は1900×gで8分間遠心分離された。生じたペレットは5μM最終濃度PGI2を含有するHEPES緩衝タイロード溶液の40mLに再懸濁され、次に37°C水浴において10分間インキュベートされ、1900×gで8分間遠心分離された。ペレットは、0.1U/mLジャガイモアピラーゼを含有するHEPES緩衝タイロード溶液に3×108血小板/mLの密度で再懸濁され、凝集測定研究での使用に先立って37°C水浴において2時間インキュベートされた。ロドサイチンアグレチン;FrankfurtUniversityHospitalから購入誘導WP血小板凝集は、37°CでルミアグリゴメーターChrono-LogCorp.Havertown、PAにおいて撹拌された1200rpm洗浄血小板の0.5ml懸濁液425μl洗浄血小板、25μlフィブリノーゲン、25μlの阻害因子または対照および25μlのロドサイチンを通る光の透過を測定することにより決定された。器具のベースラインは、0.5mlのHepes緩衝タイロード溶液を使用して設定された。凝集測定に先立って、血小板懸濁液は1mg/mlフィブリノーゲン最終濃度を補充された。血小板凝集は、指示された濃度のロドサイチン70-90間の凝集パーセントを生じるの添加により開始され、光透過は少なくとも6分間連続して記録された。ロドサイチン誘導血小板凝集を遮断する能力についての抗CLEC-2リガンドまたは対照のスクリーニングでは、抗CLEC-2リガンドは目的の最終濃度を生じる希釈度で血小板懸濁液に添加され、ロドサイチンの添加前3分間インキュベートされ、応答はロドサイチン添加後4-6分間記録された。ロドサイチンの効力は、適切な誘発濃度を決定するために、20mMTrispH8.0、50mMNaClバッファー中およそ3-60nM範囲からの段階希釈を使用して用量反応曲線から得られた最大程度の凝集パーセントからドナーごとに決定された。ロドサイチン誘導血小板凝集を阻害する抗CLEC-2リガンドの能力は、広範囲の抗CLEC-2リガンド濃度を使用して、上記のWP調製物において試験された。図9Aおよび9Bは、CLEC-2リガンドS2-20トレース2およびトレース6;1μMおよび0.5μM;RB587トレース1およびトレース5;1μMおよび0.5μM;RB588トレース3およびトレース7;1μMおよび0.5μM;および対照トレース4およびトレース8;20nMロドサイチンのロドサイチン誘導WP血小板凝集のグラフを示している。ロドサイチン添加6分後の位置は、太い下向き矢印によりトレース上に印が付けられている。図9Aおよび9Bで示されるように、S2-20およびRB587アプタマーは、およそ20-30nMロドサイチンアゴニストの存在下でロドサイチン誘導WP凝集を阻害するのに十分に効果的であった。実施例8:ロドサイチン誘導血小板凝集アッセイにおける抗CLEC-2リガンドS2-20完全長クローンおよびRB587トランケートの抗血小板活性を評価するための方法ヒト洗浄血小板は、基本的に上記の通りに調製された。ロドサイチンの効力は、実施例7に記載の通りに、適切な誘発濃度を決定するために、およそ3-60nMからのロドサイチンの段階希釈を使用して用量反応曲線から得られた最大程度の凝集パーセントからドナーごとに決定された。ロドサイチン誘導血小板凝集を阻害する抗CLEC-2リガンドの能力は、上記の通りにWP調製物において試験された。S2-20およびRB587の用量反応解析からのデータは図10Aおよび10Bに提示されている。図10Aは、ヒト洗浄血小板における変化する濃度のCLEC-2核酸リガンドS2-20クローンに対する対照のパーセントとして表されているロドサイチン誘導血小板凝集のグラフである。図10Bは、ヒト洗浄血小板における変化する濃度のCLEC-2核酸リガンドRB587および不活性変異体RB588に対する対照のパーセントとして表されているロドサイチン誘導血小板凝集のグラフである。ロドサイチン添加後6分間の0.5μMのS2-20またはRB587の存在下での凝集の基本的に完全な阻害が観察される。WPにおけるCLEC-2核酸リガンドの核酸モジュレーター試験のためのロドサイチン誘導血小板凝集アッセイ:ヒト洗浄血小板は、上記の通りに調製された。広範囲の濃度のCLEC-2核酸リガンド阻害因子が試験された場合、IC95-100値が得られる。IC95-100値は、所与の濃度の検証されるアゴニストにより誘発される凝集を約95-100阻害するのに必要な阻害因子の濃度を表す。モジュレーターを抗血小板活性のその可逆性について試験する場合、血小板は2-4μMCLEC-2アプタマーIC95-100またはバッファーFと一緒に3分間インキュベートされ、続いてロドサイチンの添加前10分間異なるモル濃度のモジュレーター4:1、2:1、1:1のモジュレーター:アプタマーが添加され、反応は6分間記録される。図10Cは、ヒト洗浄血小板における単独でのまたはCLEC-2リガンドモジュレーターRB581、RB582、RB583、RB584、RB585およびRB586と組み合わせた変化する濃度のCLEC-2核酸リガンドRB587に対する対照のパーセントとして表されているロドサイチン誘導血小板凝集のグラフを示す。実施例9:ロドサイチンアグレチンを用いたフローサイトメトリーP-セレクチン:CD62-P発現を使用する血小板活性化機能解析フローサイトメトリー研究:ロドサイチン誘導ヒトP-セレクチン発現を阻害するCLEC-2アプタマーの能力を評価するために、フローサイトメトリーがP-セレクチン特異的抗体を使用して実施された。血小板表面でのP-セレクチン発現は血小板活性化のマーカーである。ヒト洗浄血小板懸濁液密度3×108細胞/mLはタイロードバッファー中1/10まで希釈され、37°Cに保たれた。バッファーF中のそれぞれの試験化合物SEL2プール、S2-20、S2-20T4、S2-20T5、S2-20T6;RB587およびRB58820μMストックの5μLが5mLのアッセイ管に添加された。直ちに、50μLの希釈された血小板が添加され穏やかに混合された。管は室温で3分間インキュベートされた。2.5μLのロドサイチン20mMTris、50mMNaClバッファー、pH8.0中で3.331μMストックが作製されたがそれぞれの管に添加され、混合されさらに5分間インキュベートされた。管は氷上に移され、1分間冷却された。20μLのCD62P-PE抗体BectonDickinson;カタログ番号550561がそれぞれの管に添加され、氷上で20分間インキュベートされた。それぞれの管の血小板懸濁液は、0.6mLの氷冷PBSでさらに希釈され、FACS-Caliburにおいて解析された。FACS-Caliburを使用するCD62発現の検出:2つの別個のドットプロット1つはログSSC対FSCおよびログFSC対FL2-Hおよびヒストグラムがフロー表示領域上で作成された。血小板はSSC対FSCのドットプロットを使用して同定された機器は適切な表示に調整された。血小板周辺の対象の領域1R1が作製されたこれは細片が血小板として計数されるのを回避するためである。領域1R1の血小板はドットプロットFSC対FL2-H上で観察された対照を使用して調整されたFL2。血小板はヒストグラムプロットされたカウント対FL2-H上でも見られた。象限統計マーカーは、対照管を使用してFSC対FL2-Hドットブロット上にセットされ、統計的パラメータが定義された対照;未染色血小板。静止対照プラス抗体で開始する試料すべてが収集された。データは、GraphPadPrismを使用して、対照の割合としてプロットされる150nMロドサイチン活性化;下右象限は100活性化トータルとして処理された。上記のFACS解析を使用して、WPにおけるロドサイチン誘導P-セレクチン発現を阻害する、アプタマーS2-20、RB587およびS2-20の3つのトランケートの能力を試験した。得られたデータは図11Aおよび11Bに例示されており、これらの図にはP-セレクチン-PE抗体を用いるフローサイトメトリーを使用してロドサイチン誘導ヒトP-セレクチン発現のグラフが与えられている。活性は、ヒト洗浄血小板における2μMのCLEC-2核酸リガンドS2-20クローンおよびトランケート図11Aまたはヒト洗浄血小板における2μMのCLEC-2核酸リガンドRB587および不活性変異体RB588図11Bに対する対照のパーセントとして表される。CLEC-2リガンドS2-20、RB587、S2-20-T4およびS2-20-T6は、それぞれがヒトWPの表面上でのロドサイチン誘導ヒトP-セレクチン発現を著しく減少させることができたが、トランケートS2-20-T5およびRB588はCLEC-2に結合せず、阻害活性を示すことはなく、CLEC-2に対するリガンド親和性とCLEC-2活性の阻害間の相関関係を実証している。実施例10:Bioflux商標200FluxionBiosciences,Inc.を使用するCLEC-2アプタマー活性についての全血におけるインビトロフローベースの血小板粘着アッセイCLEC-2リガンドは、全血存在下でのインビトロフローベースの血小板粘着アッセイを使用して、CLEC-2媒介血小板凝集を阻害するその能力について特徴付けられた。潅流およびフロー実験のための全血調製:血液は、19G×3/4針を使用して健康な志願者からPPACK0.3mM抗凝固剤入りの60mL注射器に吸引された。血液は直ちに、37°Cで1時間4μMのカルセインAMInvitrogenP/NC3100MPで蛍光的に標識されたカルセインAMは、管を数回反転させて混合することにより極めてゆっくりと血液に添加された、血液は吸引から3.5時間内に使用された。実験が線維性コラーゲンまたはロドサイチン被膜ウェルを用いて実施された場合、実験は200μLの標識された血液を入口ウェルに添加することにより開始され、潅流は、Bioflux商標ソフトウェアを使用して5dyn/cm2全血フロー設定を37°Cで使用して直ちに開始された。実験がラット尾コラーゲン被膜表面を用いて実施された場合、全血は2分間165nMのロドサイチンを用いて活性化され、次に実験は200μLの標識され活性化された血液を入口ウェルに添加することにより開始され、潅流は、Bioflux商標ソフトウェアを使用して5dyn/cm2全血フロー設定を37°Cで使用して直ちに開始された。データ血小板凝集体の蛍光画像は、6-10分の全持続時間6秒ごとにタイムラプス蛍光倒立顕微鏡AxiocamCharged-CoupledDevicecameraおよびAxiovisionソフトウェアに接続されているZeiss200MAxiovertMicroscopeを使用して収集された。試験物CLEC-2アプタマーRB587および不活性リガンド対照RB588を試験するために、200μLの標識された血液は、入口ウェルへの添加前に室温で3-5分間指示された濃度のアプタマーまたはバッファーF;10μL容量でと一緒にインキュベートされた。タグ付き画像ファイルtiffフォーマットされた画像を使用して、BiofluxMontage商標ソフトウェアを使用して蛍光強度を計算し、次にデータ表はMicrosoftエクセルにエクスポートされ、GraphpadPrismを使用してプロットされた図12Aおよび12B。ロドサイチン被膜表面を用いた実験:ロドサイチンは、CLEC-2依存性血小板凝集を効果的に刺激する実施例7;図9および10。流動条件下でのCLEC-2アプタマー活性を研究するためにロドサイチン被膜表面での血小板凝集体形成を解析した。フロー実験では、Bioflux48ウェルプレートP/N900-0017が常用された。ロドサイチンを用いた被膜のために、プレートは5dyn/cm2で5分間、20mMTrispH8.0、50mMNaClバッファーを用いてプライムされ、次に50μg/mlの希釈されたロドサイチンは5dyn/cm2で10分間、出口ウェルから潅流された。線維性コラーゲン被膜プレートは対照として使用された。コラーゲン被膜のために、プレートは5dyn/cm2で5分間、0.02Mの酢酸を用いてプライムされ、次に0.02Mの酢酸中の25μg/mlの希釈された線維性コラーゲンChrono-LogP/N385は5dyn/cm2で10分間、出口ウェルから潅流された。フローは停止され、プレートは室温で1時間インキュベートされた。被膜タンパク質は5dyn/cm2で10分間、PBSで洗浄された。プレートは、入口ウェル1mlを5w/vBSA/PBSで完全に充填することにより遮断され、5dyn/cm2で15分間、チャネルに還流された。フローは停止され、プレートは室温でさらに10分間インキュベートされた。過剰なPBSBSAはすべてのウェルから取り除かれ、プレートは同日に使用するために室温に保たれるまたは2日間までの間、4°CでPBSBSA中に保存された。図12Aは、流動する全血に曝露されたロドサイチン被膜表面での血小板蓄積に対するCLEC-2リガンドの効果のビデオスチール蛍光エンドポイント画像を示しているA=50μg/mLロドサイチン被膜;B=25μg/mL線維性コラーゲン被膜対照:50μg/mLロドサイチン被膜で被膜されたFを通るC、C=3μMRB587;D=3μMRB588;E=4μMRB588;およびF=4μMRB587。グラフGは、FluxionMontage商標ソフトウェアにより計算された粘着血小板表面被覆データの測定を示している。データは、ロドサイチン被膜表面上の不活性変異体RB588の最大応答パーセントとして表される。図12Aに示されるように、ロドサイチンは、全血における流動条件下での血小板凝集体中の活性化された血小板の蓄積を支持した。RB587はこの活性を特異的に遮断したが、不活性変異体対照のRB588は遮断しなかった図12A、パネルCをDと、FをEと比較されたい。可溶性ラット尾コラーゲンI被膜表面を用いた実験:流動下の非活性化血小板と比べた、ラット尾コラーゲン被膜表面により大きな血小板凝集体を形成するロドサイチンCLEC-2特異的アゴニスト活性化された血小板の能力も解析した。次に、RB587を使用するこのプロセスにおけるCLEC-2の考えられる機能を解析した。このアッセイでは、プレートは上記の通りに、100μg/mLの可溶性ラット尾コラーゲンIInvitrogen;カタログ番号A10483-01で被膜された。プレートは5dyn/cm2で5分間、0.02M酢酸を用いてプライムされ、次に25μg/mlの希釈された線維性コラーゲンChrpno-LogP/N385または0.02M酢酸中可溶性ラット尾コラーゲンの100μg/mLは5dyn/cm2で10分間、出口ウェルから潅流された。フローは停止され、プレートは室温で1時間インキュベートされた。被膜タンパク質は5dyn/cm2で10分間、PBSで洗浄された。プレートは、入口ウェル1mlを5w/vBSA/PBSで完全に充填することにより遮断され、5dyn/cm2で15分間、チャネルに還流された。フローは停止され、プレートは室温でさらに10分間インキュベートされた。過剰なPBSBSAはすべてのウェルから取り除かれ、プレートは同日に使用するために室温に保たれるまたは2日間までの間、4°CでPBSBSA中に保存された。図12Bは、ロドサイチンアゴニスト処置の存在および非存在下で、流動する全血に曝露されたラット尾可溶性コラーゲン被膜表面での血小板蓄積に対するCLEC-2リガンドの効果のビデオスチール蛍光エンドポイント画像を示しているA=25μg/mL線維性コラーゲン被膜;B=100μg/mLラット尾コラーゲン;C=100μg/mLラット尾コラーゲンプラス165nMロドサイチン処置;D=100μg/mLラット尾コラーゲンプラスバッファーF;E=100μg/mLラット尾コラーゲンプラス3μMRB587プラス165nMロドサイチン処置;F=100μg/mLラット尾コラーゲンプラス3μMRB588プラス165nMロドサイチン処置。グラフGは、FluxionMontage商標ソフトウェアにより計算された粘着血小板表面被覆データの測定を示している。データは、ロドサイチンの存在下、ラット尾コラーゲン被膜表面での不活性変異体RB588の最大応答パーセントとして表されている。図12Bに示されるように、ロドサイチンアゴニストの存在は、未処置全血と比べて、ラット尾コラーゲン被膜表面に付着している血小板凝集体サイズを著しく増加させた。全血が、RB587と一緒にプレインキュベートされ、続いてロドサイチン活性化された場合、血小板凝集体サイズはロドサイチン非存在下、可溶性ラット尾コラーゲンを用いて見られるベースライン凝集体まで減少して戻っていた図12B-画像B、D、EおよびグラフG。不活性変異体対照、RB588は、血小板凝集体サイズには効果はなかった図12BパネルF。"