"VEGFAの発現をinvivoで低減するための方法であって、siRNAを被検者に投与することを含み、前記siRNAが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、及び88からなる群から選択される配列である配列を含む、上記方法。前記被検者が哺乳動物である、請求項1に記載の方法。前記被検者がヒトである、請求項2に記載の方法。前記siRNAが、長さ17~30塩基対である二重らせん領域と、突出部領域なしか、1つの突出部領域又は2つの突出部領域とからなり、各突出部領域が、6以下の塩基を有する、請求項1に記載の方法。前記siRNAが、長さ17~30塩基対である二重らせん領域を有するshRNAである、請求項1に記載の方法。前記siRNAが、aセンス鎖とbアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の各々が、長さ19~36ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、及び88からなる群から選択される配列である配列を含む、請求項1に記載の方法。a前記センス鎖内で、1位及び2位のヌクレオチド、すべてのCヌクレオチド及びUヌクレオチドが、2’-O-メチル修飾を有し、センス鎖の他のすべてのヌクレオチドが、2’OH基を有し;b前記アンチセンス鎖内で、すべてのCヌクレオチド及びUヌクレオチドが、2’フルオロ修飾を有し、アンチセンス鎖の他のすべてのヌクレオチドが、2’OH基を有し、アンチセンス鎖の1位のヌクレオチドが、5’リン酸化されている、請求項6に記載の方法。前記アンチセンス鎖の2つの3’モスト塩基がUUである、請求項7に記載の方法。前記アンチセンス鎖が、長さ21塩基である、請求項8に記載の方法。前記センス鎖が、長さ19塩基であり、前記アンチセンス鎖と前記センス鎖が、長さ19塩基対の二重らせん領域を形成する、請求項9に記載の方法。前記siRNAが、前記センス鎖の3’末端に結合するコレステロール部分をさらに含み、前記コレステロール部分が、C5リンカーによって結合され、前記二重らせん領域が、前記センス鎖の6位、13位及び19位にミスマッチを含み、前記位置が、前記センス鎖の5’末端に対して決定され、前記センス鎖は5’突出部領域を含まない、請求項6に記載の方法。前記siRNAが、前記センス鎖の3’末端に結合するコレステロール部分をさらに含み、前記コレステロール部分が、C5リンカーによって結合され、前記二重らせん領域が、前記センス鎖の6位、13位及び19位にミスマッチを含み、前記位置が、前記センス鎖の5’末端に対して決定され、前記センス鎖は5’突出部領域を含まない、請求項7に記載の方法。前記アンチセンス鎖が、長さ21塩基である、請求項12に記載の方法。前記センス鎖が、長さ19塩基であり、前記アンチセンス鎖と前記センス鎖が、長さ19塩基対の二重らせん領域を形成する、請求項13に記載の方法。前記アンチセンス鎖が、配列番号54を含む、請求項14に記載の方法。前記センス鎖内の6位、13位及び19位の前記ミスマッチヌクレオチドが、アンチセンス鎖の相補的ヌクレオチドと同じである、請求項15に記載の方法。治療有効量のsiRNAを含む医薬組成物であって、前記siRNAが、a長さが19~36塩基であり、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、及び88からなる群から選択される配列を有する、アンチセンス鎖と、b長さが19~36塩基であるセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖とセンス鎖が、17~30塩基対の二重らせん領域を形成し、両鎖が、前記二重らせん領域内で、少なくとも75相補的である、上記医薬組成物。前記二重らせん領域内で、6位、13位又は19位の1つ以上の位置にミスマッチがあり、前記位置は、前記センス鎖の5’末端に対して決定される、請求項17に記載の医薬組成物。前記センス鎖内で、1位及び2位ならびにすべてのC及びUが、2’-OMe修飾を有し、センス鎖の他のすべての位置が、2’-OH基を有し、前記アンチセンス鎖のすべてのC及びUが、2’-F修飾を有し、アンチセンス鎖の他のすべてのヌクレオチドが、2’-OH基を有し、アンチセンス領域の1位ヌクレオチドが、リン酸化されている、請求項18に記載の医薬組成物。前記センス鎖が、長さ19塩基であり、前記アンチセンス鎖が、長さ21塩基であり、アンチセンス鎖の2つの3’モスト塩基がUU突出部である、請求項19に記載の医薬組成物。コレステロール部分が、C5リンカーによって前記センス領域の3’末端に結合されている、請求項20に記載の医薬組成物。本発明は、VEGFA発現の抑制のための組成物及び方法、ならびにVEGFAの過剰発現に関連する病態の治療に関する。従って、本発明は、VEGFAの産生を全部又は一部抑制するsiRNAを導入するためのキット、siRNA及び方法を提供する。第1の実施形態によれば、本発明は、VEGFAの発現を抑制するための方法を提供する。本方法は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、及び88からなる群から選択される配列を含むsiRNAをinvivoで例えば、ヒトに投与することを含む。第2の実施形態によれば、本発明は、VEGFAの発現を抑制するための方法を提供する。本方法は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、及び88からなる群から選択される配列を含むsiRNAをinvitroで投与することを含む。第3の実施形態によれば、本発明は、VEGFAの発現を抑制するための方法を提供する。本方法は、最初の2つの実施形態のいずれかに関わるsiRNAを投与することを含み、siRNAは、以下の修飾:センス鎖内のすべてのC及びUヌクレオチド、ならびにセンス鎖の最初の2つの5’ヌクレオチドの2’-O-アルキル例えば、2’-O-メチル修飾、アンチセンス鎖内のC及びUヌクレオチドすべての2’フルオロ修飾、ならびにアンチセンス鎖の1位ヌクレオチドの5’リン酸化の1つ以上を有する。いくつかの実施形態では、siRNAは、センス鎖内のすべてのC及びUヌクレオチドに2’-O-アルキル修飾を有し、アンチセンス鎖に少なくとも1つの2’-O-アルキル修飾を有する。いくつかの実施形態では、siRNAは、1~6ヌクレオチドからなる1つ以上の突出部を有する。いくつかの実施形態では、前述した修飾のすべてが存在し、これらの修飾しか存在せず、従って、G及びAヌクレオチドで、センス鎖の1位及び2位に位置するもの以外は、すべて2’-OH基を有する。第4の実施形態によれば、本発明は、VEGFAの発現を抑制するための方法を提供する。本方法は、初めの3つの実施形態のいずれかに関わるsiRNAを投与することを含み、siRNAは、以下の修飾:C5リンカーにより結合されたコレステロール部分、ならびにセンス鎖の6位、13位及び19位の1つ以上の位置におけるミスマッチの1つ以上を有し、ここで、センス鎖は長さが19ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖も長さ19ヌクレオチドである突出部を除く。センス鎖における位置は、センス鎖の5’末端から測定するが、ここで、センス鎖の最初の5’ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合する5’-モストmostヌクレオチドとして識別される。このように、上記の定義では、5’センス鎖の突出部ヌクレオチドは、計数計画に含まれない。これら実施形態には、5’突出部がないものもある。上記実施形態のいくつかでは、1~6塩基の1つ又は2つの3’突出部があるか、又は突出部はない。いくつかの実施形態では、6位、13位及び19位を除いて、二重らせん領域内に、100相補性が存在する。第5の実施形態によれば、本発明は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、及び88からなる群から選択される少なくとも2つのsiRNAのプールを提供する。第6の実施形態によれば、本発明は、本明細書に開示する1つ以上のsiRNAの治療有効量を含む医薬組成物を提供する。第7の実施形態によれば、本発明は、治療有効量のsiRNAを含む医薬組成物を提供し、siRNAは、a長さが19~36塩基であり、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、及び88からなる群から選択される配列を含むアンチセンス鎖;及びb長さが19~36塩基であるセンス鎖からなり、アンチセンス鎖とセンス鎖は、17~30塩基対の二重らせん領域を形成し、二重らせん領域内に少なくとも75相補性が存在する。siRNAの二重らせん領域が、長さ19塩基対より長い場合には、追加のセンス及びアンチセンス配列をアンチセンス鎖の3’末端と、センス鎖の5’末端に付加する。本明細書に記載する方法、siRNA及び医薬組成物の使用によって、VEGFAを効率的かつ有効にサイレンシングすることができる。定義別途記載のない限り、又は文面から明らかである場合を除いて、下記の用語及びフレーズは、以下に記載する意味を有するものとする。2’修飾2’修飾とは、概してリボヌクレオチド内のリボース糖の2’位に位置するヒドロキシル基の、別の部分、例えば、-O-メチル、-O-エチル、-O-n-プロピル、-O-イソプロピルなどの-O-アルキル基、又はフルオロ基のような別の基による置換を意味する。-O-アルキル修飾が存在する場合、いくつかの実施形態では、同じ-O-アルキル基がすべての-O-アルキル-修飾ヌクレオチドに存在する。その他のタイプの2’修飾として、ハロゲン基、例えば、2’フルオロ、又は2’ブロモがある。AccellsiRNAAccellという用語は、以下のものを含む好ましいsiRNA構造を意味する:センス鎖が、長さ19ヌクレオチドであり、11及び2位5’末端から数えてに2’-O-メチル修飾;2すべてのC及びUに2’-O-メチル修飾;さらには3C5リンカーを介して3’末端と結合したコレステロールを有する。アンチセンス鎖は、長さ21ヌクレオチドであり、5’リン酸修飾を有し、すべてのC及びUに2’F修飾を含み、センス鎖と対合すると、2ヌクレオチド突出部を形成し、1突出部の2つのヌクレオチド同士の間、及び2二重らせん領域の3’モストヌクレオチドと、突出部の第1ヌクレオチドとの間に、チオリン酸修飾を含む。さらに、Accell分子は、6位、13位、及び19位センス鎖の5’末端から数えてにミスマッチを含む。いずれの場合にも、これらのミスマッチは、センスヌクレオチドを別の塩基で置換することにより生成される。このようにして、アンチセンス鎖は、標的分子と完全な相補性を保持する。さらに詳細については、米国特許出願公開第20090209626A1号明細書を参照されたい。尚、この文献の開示内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。相補的相補的という用語は、相互に塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を意味する。塩基対は、概して、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位同士の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン-クリック型例えば、A~T、A~U、C~G、又は、二重らせんの形成を可能にする別のいずれかの方式で塩基対合することができる。当業者であれば、DNAに対してRNAを用いるとき、チミンではなくウラシルが、アデノシンと相補的であると考えられる塩基であることは認識している。しかし、本発明に関して、Uを示すとき、別途記載のない限り、Tに置き換えられる可能性も含まれる。完全な相補性、すなわち100相補性とは、1つのポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド単位が、第2のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合することができる状況を指す。完全ではない相補性とは、2つの鎖の全部ではないが、いくつかのヌクレオチド単位が互いに水素結合することができる状況を指す。例えば、2つの20量体の場合、各鎖の2つの塩基対だけが互いに水素結合することができれば、このポリヌクレオチド鎖は、10相補性を呈示する。同じ例で、各鎖の18塩基対が互いに水素結合することができれば、このポリヌクレオチド鎖は、90相補性を呈示する。いくつかの実施形態において、二重らせん領域内で、少なくとも75相補性、少なくとも80相補性、少なくとも90相補性、少なくとも95相補性又は100相補性が存在する。コンジュゲート部分本発明のコンジュゲート部分単にコンジュゲートとも呼ぶは、ヌクレオチドと直接又は間接的に連結され、様々な手段によって細胞内への進入をターゲティングすることができる部分である。例えば、コンジュゲート部分は、天然状態の脂質であってもよい。従って、脂質に基づくコンジュゲート部分は、カチオン性脂質、中性脂質、スフィンゴ脂質、ならびに脂肪酸、例えば、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノールエライジン酸、リノレン酸、及びミリスチン酸などがある。この他に、コンジュゲート部分は、天然状態のタンパク質性であってよく、膜転移例:TAT、ペネトラチン、MAP又はカチオン性例:ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリリシン/アルギニン/ヒスチジン、若しくはプロタミンのペプチドがある。これ以外にも、コンジュゲート部分は、例えば、特定の受容体をターゲティングするか、又はそれ自体を膜に挿入することができ、しかも、エンドサイトーシス経路によって吸収されうる小分子であってもよい。従って、アダマンタン、多環芳香族炭化水素例えば、ナフタレン、フェナンスレン、又はピレン、大環状分子、ステロイド、又はその他の化学スカフォールドに基づく小分子はすべて、本発明に関して考えられるコンジュゲートである。さらに別の実施形態では、コンジュゲート部分は、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン、デンドリマー、ポリアルキルピリジニウム塩、又はカチオン性アルブミンに基づいていてもよい。場合によっては、コンジュゲート部分は、受容体のためのリガンドであるか、又は、後に受容体と結合する分子と会合することもできる。このクラスには、胆汁酸、小分子薬物リガンド、ビタミン、アプタマー、炭水化物、ペプチド限定するものではないが、ホルモン、タンパク質、タンパク質断片、抗体又は抗体フラグメントなど、ウイルスタンパク質例えば、キャプシド、毒素例えば、細菌毒素などが含まれる。また、天然状態でステロイドであるコンジュゲート、例えば、コレステロール、コレスタノール、コラン酸、スチグマステロール、プレグネロン、プロゲステロン、コルチコステロン、アルドステロン、テストステロン、エスラジオール、エルゴステロールなども含まれる。本発明の好ましいコンジュゲート部分は、コレステロールCHOL、コレスタノールCHLN、コラン酸CHLA、スチグマステロールSTIG、及びエルゴステロールERGOである。別の実施形態では、特定の受容体をターゲティングする分子は、他の供給源に結合したsiRNAの起こりうる減少を排除するように修飾する。例えば、コレステロールに結合したsiRNAが正常な血清の存在下に置かれると、この材料の有意な画分が、血清中のアルブミン及び/又は他のタンパク質と会合することから、siRNAは、例えば、LDLとの相互作用に利用できなくなる。このために、本発明のコンジュゲート部分は、それらの意図する標的例えば、LDLと結合、又は会合し続けるが、意図しない結合パートナー例えば、血清アルブミンに対しては、より低い親和性を有するように修飾することができる。二重らせん領域二重らせん領域というフレーズは、ワトソン-クリック型塩基対合、又は相補的又は実質的に相補的なポリヌクレオチド鎖間の安定化二重らせんを可能にする他の方式のいずれかによって、互いに塩基対を形成する2つの相補的又は実質的に相補的ポリヌクレオチドの領域を指す。二重らせん領域のサイズの例として、限定するものではないが、17~30塩基対、17~25塩基対、17~23塩基対、18~30塩基対、18~25塩基対、18~23塩基対、19~30塩基対、19~25塩基対、19~23塩基対が含まれる。二重らせん領域は、塩基対の長さ、及びその範囲にわたる相補性の程度によって定義される。従って、二重らせん領域が、ヌクレオチドの2つの個別の鎖、すなわち、アンチセンス鎖とセンス鎖から形成される場合、各鎖が、二重らせんの一部であるヌクレオチドと、5’末端又は3’末端のどちらかで二重らせんの一部ではないヌクレオチドを含みうることは留意することが重要である。アンチセンス鎖において標的と相補的なすべてのヌクレオチドが、二重らせん領域の一部であり、従って、センス鎖に、相補的ヌクレオチドを有するように、siRNAを設計することができる。しかし、アンチセンス鎖が、3’末端及び/又は5’末端のどちらかにも、センス鎖に相補的ヌクレオチドは有していないが、標的に相補的ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖内のヌクレオチドの連続的区間の一部であるヌクレオチドを含むように、siRNAを設計することも可能である。例として、センス鎖は、19個のヌクレオチドを含み、また、アンチセンス鎖は、21個のヌクレオチドを含んでよい。アンチセンス鎖の2つの3’モストヌクレオチドを除くすべてのヌクレオチドが、センス鎖の19ヌクレオチドと相補的であってよく、また、アンチセンス鎖の21ヌクレオチドの全区間は、標的の21ヌクレオチドの区間と相補的であってよい。あるいは、アンチセンス鎖の2つの3’モストヌクレオチドが、標的の一部と相補的ではないように選択してもよいし、これらをランダムに、又はプロセッシングを促進するように選択して、一方又は両方が、標的の2つのヌクレオチドと相補的であるか、又は相補的ではないようにしてもよく、ここで、上記2つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の他の19ヌクレオチドが相補的であるヌクレオチドと隣接している。さらに、様々な実施形態では、二重らせん領域内で、ミスマッチなし、1つのミスマッチ、2つのミスマッチ、3つのミスマッチ、4つのミスマッチ、又は5つのミスマッチがあってもよい。ミスマッチミスマッチという用語は、ワトソン-クリック型塩基対合が、センス鎖のヌクレオチドとアンチセンス鎖のヌクレオチドとの間に起こらない状況を意味する。ミスマッチの例として、限定するものではないが、Gに対しA、Aに対しC、Cに対しU、Gに対しU、Aに対しA、Gに対しG、Cに対しC、Uに対しUなどがある。リンカーリンカーは、2つ以上の他の部分に結合する部分である。定義又は慣例に制限される意図はないが、本願では、リンカーの長さは、コンジュゲート部分をリンカーと連結させる原子と、オリゴヌクレオチドと結合している末端リン酸部分の酸素原子これを介してリンカーはオリゴヌクレオチドに連結しているとの間の最短距離を示す原子の数を数えることにより表される。例えば、コンジュゲート部分が、カルバミン酸結合を介してリンカーと連結している実施形態では、リンカーの長さは、カルバミン酸結合の窒素原子とリン酸結合の酸素原子との間の最短距離を示す原子の数として表す。環構造が存在する場合、最短の経路を示す環の周囲の原子を数えるのが好ましい。本発明の組成物及び方法で用いることが可能なコンジュゲートリンカーの構造の非制限的例として、限定するものではないが、β-アミノ-1,3-ジオール、β-アミノ-1,2-ジオール、ヒドロキシプロリノール、ω-アミノ-アルカノール、ジエタノールアミン、β-ヒドロキシ-1,3-ジオール、β-ヒドロキシ-1,2-ジオール、β-チオ-1,3-ジオール、β-チオ-1,2-ジオール、β-カルボキシ-1,3-ジオール、β-カルボキシ-1,2-ジオール、ω-ヒドロキシ-アルカノール、ω-チオ-アルカノール、ω-カルボキシ-アルカノール、機能性オリゴエチレングリコール、アリルアミン、アクリル酸、アリルアルコール、プロパルギルアミン、及びプロパルギルアルコールに基づくリンカー/リンカー化学が含まれる。いくつかの実施形態では、リンカーは、コンジュゲート部分との結合部位を提供するだけでなく、支持体との結合及びオリゴヌクレオチド合成の開始のための機能性部位も提供する。好ましくは、これらの部位は、コンジュゲート修飾固体支持体の合成中にこれらを化学的に識別できるようにするため、ヒドロキル基であり、最も好ましくは、第1ヒドロキシル基及び第2ヒドロキシル基である。一方のヒドロキシル基、好ましくは第1ヒドロキシル基は、当業者に十分に理解される方法によって、保護基で保護するが、この保護基は、オリゴヌクレオチドの合成の第1ステップとして除去することができる。好ましくは、上記保護基は、発色団であり、固体支持体に結合したコンジュゲート部分の量の推定に使用することができ、最も好ましくは、保護基は、トリフェニルメチルTr、モノメトキシトリフェニルメチルMMTr、ジメトキシトリフェニルメチルDMTr及びトリメトキシトリフェニルメチルTMTrから選択される。もう1つのヒドロキシル基、好ましくは第2ヒドロキシル基は、当業者には十分に理解される方法によって、固体合成支持体上の官能基と共役結合反応することができる機能性テザーと誘導体化する。好ましいテザーは、例として、ジカルボン酸、例えば、コハク酸、グルタル酸、テレフタル酸、シュウ酸、ジグリコール酸、及びヒドロキノン-0,0’-二酢酸がある。上記テザーのカルボン酸官能性の1つは、ヒドロキシルと反応して、エステル結合を提供し、この結合は塩基性試薬水酸化物、炭酸塩又はアミンを用いて切断が可能であるが、他方のカルボン酸官能性は、通常、支持体上のアミン官能性とのアミド結合の形成により、合成支持体と反応する。リンカーはまた、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに他の望ましい特性、すなわち、改善された水溶性、コンジュゲート部分とオリゴヌクレオチドとの間の最適な距離、可変性又はその欠失、特異的配向、枝分れなども付与しうる。好ましくは、リンカーとコンジュゲート部分の間の化学結合は、カルバミン酸結合であるが、それ以外の化学作用chemistriesも本発明の範囲に含まれる。コンジュゲート部分との化学結合を形成するリンカー上の官能基の例として、限定するものではないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、カルボニル、クロロカルボニル、イミダゾリルカルボニル、チオール、マレイミド、ハロアルキル、スルホニル、アリル及びプロパルギルがある。リンカーとコンジュゲートとの間に形成される化学結合の例として、限定するものではないが、カルバミン酸、エーテル、エステル、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、ホスホジエステル、チオリン酸エステル、ホルホロジチオエートphorphorodithioateジチオリン酸phosphorodithioate、スルホンアミド、スルホン酸、スルホン、スルホキシド、尿素、ヒドラジド、オキシム、感光性結合、C-C結合形成基、例えば、DielsAlder環状付加対又は閉環メタセシス対、及びMichael反応対に基づくものがある。一般に、コンジュゲート部分は、天然又は化学的に組み込んだ適切な官能基を有することになる。従って、リンカーは、コンジュゲート部分の官能基と効率的かつ安定的に反応するように選択された官能基と合成することができる。同じ長さを有するが、2つ以上のコンジュゲートと結合することができるリンカーもまた具体的に考慮される。別の実施形態では、リンカーは、ヌクレオシド誘導体であってよい。ヌクレオシドは、例えば、リボヌクレオシド、2’-デオキシリボヌクレオシド、又は2’-修飾-2’-デオキシリボヌクレオシド、例えば、2’-O-メチル若しくは2’-フルオロであってよい。ヌクレオシドは、例えば、アラビノヌクレオシド又は2’-修飾アラビノヌクレオシドであってよい。当業者には公知の方法を用いて、プリン及びピリジミンヌクレオシドを塩基の特定の部位で修飾することにより、コンジュゲート部分の結合のためのリンカー及び官能基を用意してもよい。例えば、ウリジン及びシチジンのようなピリミジンヌクレオシドは、ウラシル又はシトシン塩基の5位で、酢酸第二水銀、パラジウム触媒、及びアリル試薬、例えば、アリルアミン、アリルアルコール、又はアクリル酸を用いて修飾することができる。あるいは、5-ヨードピリミジンを、5位で、パラジウム触媒、及びプロパルギル試薬、例えば、プロパルギルアミン、プロパルギルアルコール又はプロパルギル酸を用いて修飾することができる。これ以外にも、ウリジンを4位で、トリアゾール又は塩化スルホニルによる活性化、続いて、ジアミン、アミノアルコール又はアミノ酸との反応によって修飾してもよい。同様に、シチジンを4位で、重亜硫酸塩での処理、続いて、ジアミン、アミノアルコール又はアミノ酸との反応により修飾してもよい。同様に、プリンを7、8又は9位で、類似タイプの反応配列を用いて修飾してもよい。好ましい実施形態では、リンカーは、長さが約3~約9原子である。従って、リンカーは、長さが3、4、5、6、7、8、又は9原子であってよい。好ましくは、リンカーは、長さが5、6、7又は8原子である。より好ましくは、リンカーは、長さが5又は8原子である。最も好ましくは、リンカーは、直鎖C5リンカーである。すなわち、コンジュゲート部分をリンカーと連結する原子と、オリゴヌクレオチドと結合している末端リン酸部分の酸素原子これにより、リンカーはオリゴヌクレオチドと結合しているとの間に5個の炭素原子がある。従って、コンジュゲート部分が、カルバミン酸結合を介してC5リンカーと連結している場合、カルバミン酸結合の窒素原子とリン酸結合の酸素原子との間に5つの炭素原子が存在する。1つの好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカーは、カルバメート基を介してコレステロールに結合したC5リンカー5炭素リンカーであり、このようにして、Chol-C5コンジュゲート-リンカーを形成する。ホスホジエステル結合を介して、二重らせんのセンス及び/又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの5’及び/又は3’末端に結合する場合、得られるコンジュゲート-リンカー-オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有しうる:別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカーは、カルバメート基を介してコレステロールに結合したC3リンカーであり、このようにして、Chol-C3コンジュゲート-リンカーを形成する。ホスホジエステル結合を介してセンス及び/又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの5’及び/又は3’末端に結合する場合、得られるコンジュゲート-リンカー-オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有しうる:別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカーは、カルバメート基を介してコレステロールに結合したC8リンカー8炭素リンカーであり、このようにして、Chol-C8コンジュゲート-リンカーを形成する。ホスホジエステル結合を介してセンス及び/又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの5’及び/又は3’末端に結合する場合、得られるコンジュゲート-リンカー-オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有しうる:別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカーは、カルバメート基を介してコレステロールに結合したPROリンカー4炭素リンカーであり、このようにして、Chol-PROコンジュゲート-リンカーを形成する。別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカーは、カルバメート基を介してコレステロールに結合したPIPリンカー6炭素リンカーであり、このようにして、Chol-PIPコンジュゲート-リンカーを形成する。ホスホジエステル結合を介してセンス及び/又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの5’及び/又は3’末端に結合する場合には、得られるコンジュゲート-リンカー-オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有しうる:別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールであり、リンカーは、カルバメート基を介してコレステロールに結合したC6-HPHP6とも呼ばれるリンカー9炭素リンカーであり、このようにして、Chol-C6-HPコンジュゲート-リンカーを形成する。ホスホジエステル結合を介してセンス及び/又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの5’及び/又は3’末端に結合する場合には、得られるコンジュゲート-リンカー-オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有しうる:ヌクレオチド別途記載のない限り、ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はその修飾された形態、及びその類似体を指す。ヌクレオチドには、プリン、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、及びその誘導体及び類似体、ならびにピリミジン、例えば、シトシン、ウラシル、チミン、及びその誘導体及び類似体を有する種が含まれる。いくつかの実施形態では、すべてのヌクレオチドは、修飾又は非修飾A、C、G又はUからなる群から選択される。ヌクレオチド類似体としては、塩基、糖及び/又はリン酸塩の化学構造に修飾を有するヌクレオチド、限定するものではないが、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、及び5-ブロモ-ウラシルの置換;ならびに2’-位糖修飾、限定するものではないが、2’-OHが、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、又はCNここで、Rはアルキル部分であるなどの基で置換される糖修飾リボヌクレオチドなどが含まれる。ヌクレオチド類似体はまた、塩基例えば、イノシン、キューオシン、キサンチン、糖例えば、2’-メチルリボース、非天然のリン酸ジエステル結合例えば、メチルホスホネート、チオリン酸エステル及びペプチドを有するヌクレオチドも含むものとする。修飾塩基とは、1つ以上の原子又は基の置換又は付加によって修飾されているヌクレオチド塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、キサンチン、イノシン、及びキューオシンを指す。塩基部分に関して修飾されたヌクレオチドを含むことができるタイプの修飾のいくつかの例として、限定するものではないが、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化、又はアセチル化塩基があり、これらは単独でも、組み合わせてもよい。より具体的な例としては、例えば、5-プロピルウリジン、5-プロピルシチジン、6-メチルアデニン、6-メチルグアニン、N,N,-ジメチルアデニン、2-プロピルアデニン、2-プロピルグアニン、2-アミノアデニン、1-メチルイノシン、3-メチルウリジン、5-メチルシチジン、5-メチルウリジン、ならびに5位に修飾を有する他のヌクレオチド、5-2-アミノプロピルウリジン、5-ハロシチジン、5-ハロウリジン、4-アセチルシチジン、1-メチルアデノシン、2-メチルアデノシン、3-メチルシチジン、6-メチルウリジン、2-メチルグアノシン、7-メチルグアノシン、2,2-メチルグアノシン、5-メチルアミノエチルウリジン、5-メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば、7-デアザ-アデノシン、6-アゾウリジン、6-アゾシチジン、6-アゾチミジン、5-メチル-2-チオウリジン、その他のチオ塩基、例えば、2-チオウリジン及び4-チオウリジン及び2-チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチル及び置換されたナフチル基、あらゆるO-及びN-アルキル化プリン及びピリミジン、例えば、N6-メチルアデノシン、5-メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン5-オキシ酢酸、ピリジン-4-オン、ピリジン-2-オン、フェニル及び修飾フェニル基、例えば、アミノフェノール又は2,4,6-トリメトキシベンゼン、Gクランプヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、8-置換アデニン及びグアニン、5-置換ウラシル及びチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、及びアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドがある。修飾ヌクレオチドには、糖部分に関して修飾されたヌクレオチド、さらには、糖又はリボシルではない類似体を有するヌクレオチドも含まれる。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、4’-チオリボース、及びその他の糖、ヘテロ環、又は炭素環式化合物であってもよいし、それらに基づいていてもよい。ヌクレオチドという用語は、当分野でユニバーサル塩基として知られるものも含むものとする。例えば、ユニバーサル塩基としては、限定するものではないが、3-ニトロピロール、5-ニトロインドール、又はネブラリンがある。ヌクレオチドという用語はまた、リボシル3’酸素のアミン基による置換から得られるN3’→P5’ホスホルアミデートを含むものとする。さらに、ヌクレオチドという用語は、検出可能な標識、例えば、ヌクレオチドに結合した放射性若しくは蛍光部分、又は質量標識を有する種も含む。製薬上許容される担体製薬上許容される担体というフレーズは、本発明の組成物を動物又はヒトなどの生物に送達するための製薬上許容される塩、溶剤、懸濁剤又はビヒクルを意味する。担体は、液体、半固体又は固体でよいが、往々にして、希釈剤、賦形剤、又は塩と同義に用いられる。製薬上許容されるというフレーズは、開示されるあらゆる原材料、賦形剤、担体、希釈剤又は成分が、適度な利益/リスク比に比例する不当な有害副作用例えば、毒性、分離及びアレルギー応答なしに、ヒト及び/又は動物への使用に適したものであることを意味する。例えば、RemingtonsPharmaceuticalScience16theditionOsolAEd1980を参照されたい。リボヌクレオチド及びリボ核酸リボヌクレオチドという用語及びリボ核酸RNAというフレーズは、少なくとも1つのリボヌクレオチド単位を含む、修飾若しくは非修飾ヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す。リボヌクレオチド単位は、リボシル部分これは、リボシル部分の1’位にN-グリコシド結合で結合された窒素塩基を有するの2’位に結合したヒドロキシル基と、別のヌクレオチドとの結合を可能にするか、又は結合を排除する部分を含む。センス鎖/アンチセンス鎖センス鎖というフレーズは、全部又は一部が、標的核酸配列、例えば、メッセンジャーRNA又はDNAの配列と同じである配列を含むポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖というフレーズは、全部又は一部が、標的核酸配列、例えば、メッセンジャーRNA又はDNAの配列の補体である配列を含むポリヌクレオチドを指す。siRNAの配列が記載される場合、慣例により、別途記載のない限り、これはセンス鎖の配列であり、また、相補的アンチセンス鎖も含まれる。二重らせんsiRNA2つの個別の鎖から形成されるの場合には、一方の鎖はセンス鎖で、他方の鎖はアンチセンス鎖であってよい。突出部が存在する場合、センス領域というフレーズは、突出部領域以外のセンス鎖のヌクレオチド配列部分を指すことがある。同様に、アンチセンス領域というフレーズは、突出部領域以外のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列部分を指すことがある。siRNAがshRNAである場合、2つの個別の鎖はなく、センス領域は、全部又は一部が、標的配列と同じ配列を有する二重らせん領域の一部であり、アンチセンス領域は、全部又は一部が、標的核酸配列及びセンス領域と相補的なヌクレオチドの配列を指す。センス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、例えば、19~36塩基、19~30塩基、19~25塩基及び19~23塩基である。これらの鎖長さは、考えられる突出部領域を含む。siRNAsiRNAという用語は、RNA干渉RNAi経路を誘導する低分子阻害RNA二重らせんを指す。本明細書で用いられるように、これらの分子は、長さが異なり一般に、17~30塩基対と突出部、アンチセンス鎖における標的mRNAに対し様々な程度の相補性を含みうる。全部ではないが、一部のsiRNAは、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の5’又は3’末端に非対合の突出塩基を有する。siRNAという用語は、2つの個別の鎖からなる二重らせんと、別途明示しない限り、一本鎖も含み、これら一本鎖は、二重らせん領域を含むヘアピン構造を形成することができ、shRNAと呼ばれる。siStablesiStableという用語は、特定の二重らせんに関連する化学的修飾パターンを指す。具体的には、siStablesiRNAは、以下の構造を含む:センス鎖は、長さ19ヌクレオチドであり、11位及び2位5’末端から数えてに2’-O-メチル修飾を、2すべてのC及びUに2’-O-メチル修飾を有する。アンチセンス鎖は、長さ21ヌクレオチドであり、5’リン酸修飾を有し、すべてのC及びUに2’F修飾を含み、センス鎖と対合すると2ヌクレオチド突出部を形成すると共に、1突出部の2つのヌクレオチドの間、及び2二重らせん領域の3’モストヌクレオチドと、突出部の最初のヌクレオチドとの間に、チオリン酸修飾を含む。詳細については、米国特許出願公開第20070269889A1号明細書を参照されたい。標的標的という用語は、本文献全体を通じて様々な異なる形態で用いられ、それが用いられる状況に応じて定義される。標的mRNAとは、特定のsiRNAを向けることができるメッセンジャーRNAを指す。標的配列及び標的部位とは、siRNAのセンス鎖が、様々な程度の同一性を示し、アンチセンス鎖が、様々な程度の相補性を呈示する、mRNA内の配列を指す。siRNA標的というフレーズは、siRNAが向けられる遺伝子、mRNA、又はタンパク質を意味しうる。同様に、標的サイレンシングは、遺伝子、又は対応するmRNA若しくはタンパク質の状態を意味しうる。治療有効量VEGFA特異的siRNAをコードする配列を含む組成物の治療有効量すなわち有効用量は、VEGFA標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を少なくとも10阻害する量である。より高い阻害率、例えば、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも85、少なくとも90以上が、いくつかの実施形態において好ましいと考えられる。当業者であれば、いくつかの要因が、被検者を有効に治療するのに必要な用量及びタイミングに影響を与える可能性があり、限定するものではないが、疾患又は障害の重症度、治療歴、被検者の健康状態及び/若しくは年齢、ならびに存在する他の疾患などが包まれることを理解されよう。さらに、治療有効量を用いた被検者の治療は、単一の治療又は一連の治療を含みうる。場合によっては、siRNAの一時発現が望ましいこともある。siRNAをコードする構築物に誘導プロモーターが含まれる場合には、発現を誘導するのに用いる適切な用量の物質を被検者に送達した後、発現をアッセイする。組成物の適切な用量は、調節しようとする発現又は活性に関する分子siRNAをコードする配列の能力に応じて変動する。これら分子の1つ以上を動物例えば、以下のような哺乳動物:ヒト若しくはその他の霊長類、例えば、チンパンジー、オランウータン、類人猿、サルなど、又はイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ラット、ヒツジ、若しくはマウスに投与して、1つ以上の標的ポリペプチドの発現又は活性を調節することができる。医師は、例えば、まず比較的低い用量を処方し、その後、適切な応答が得られるまで用量を増加していくことができる。さらに、特定の被検者の具体的用量レベルが、使用する具体的化合物の活性、被検者の年齢、体重、健康状態、性別、及び治療食、投与時間、投与経路、排出の速度、何らかの薬物の組合せ、及び調節しようとする発現又は活性の程度を含む様々な要因に応じて変動することは理解されよう。VEGFA特異的siRNAの治療有効量は、VEGFAの発現増大に関連する病態、疾患、又は障害、例えば、限定するものではないが、乾癬、癌、慢性関節リウマチ、眼の血管新生、血管形成の異常、網膜血管透過性、網膜浮腫、糖尿病網膜症特に、増殖性糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、浸出型加齢黄斑変性、網膜虚血に関連する続発症、及び眼球後区血管新生を治療するのに有用である。好ましい実施形態以下に、本発明を好ましい実施形態に関して説明することにする。これらの実施形態は、本発明の理解を助けることを目的として提示するのであって、本発明をいかようにも制限することを意図するものではなく、また、制限すると解釈すべきではない。本発明の開示内容を読んで当業者に明らかになる代替物、変更及び同等物はすべて、本発明の精神及び範囲に含まれるものとする。さらに、本発明は、RNA干渉を実施するための組成物又は方法に関する入門書ではない。当業者には公知の基本的概念については詳細に記載していない。第1の実施形態によれば、本発明は、VEGFAの発現をinvivoで低減するための方法であって、siRNAを生物に投与することを含み、siRNAが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、及び88からなる群から選択される配列を含む方法を提供する。被検者は、RNAi経路を有するどんな生物であってもよく、このような生物として、限定するものではないが、哺乳動物、鳥類又は爬虫類が含まれる。哺乳動物の例として、限定するものではないが、ヒト、サル、類人猿、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス及びラットが含まれる。さらに、センス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重らせんは、少なくとも1つの突出部を含むことができ、各突出部は、少なくとも1つのヌクレオチドを含む。突出部は、例えば、以下に位置することができる。センス鎖の5’末端;センス鎖の3’末端;センス鎖の5’及び3’末端;アンチセンス鎖の5’末端;アンチセンス鎖の3’末端;アンチセンス鎖の5’及び3’末端;センス鎖の5’末端及びアンチセンス鎖の5’末端;センス鎖の3’末端及びアンチセンス鎖の3’末端。いくつかの実施形態では、突出部は、長さが6ヌクレオチド以下であり、好ましい実施形態では、突出部は、アンチセンス鎖の3’末端に存在する。すなわち、アンチセンス領域の3’モストヌクレオチドに結合している。さらに好ましくは、アンチセンス鎖の3’末端に存在する突出部は、長さが2ヌクレオチドである。突出部におけるヌクレオチドについての塩基の選択は、任意の方法で実施してよい。すなわち、突出部は、標的mRNAと塩基対合しても、しなくてもよい。便宜上かつ単純化のために、2ヌクレオチド突出部は、通常、UU突出部であるしかし、AA、GG、CC、AC、CA、AG、GA、GC、及びCGジヌクレオチド突出部及びその他も考慮される。Vermeulenetal2005RNA115674682を参照。好ましくは、突出部のヌクレオチド同士の結合、及び二重らせんの末端ヌクレオチドと突出部の最初のヌクレオチドとの結合は、チオリン酸結合である。1つの特に好ましい実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3’末端に位置するUU突出部を含み、アンチセンス鎖において、3’末端Uを第2Uヌクレオチドと結合するチオリン酸結合、及び第2Uヌクレオチドを次のヌクレオチド5’方向でと結合するチオリン酸結合を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖の5’末端及び/又はセンス鎖の3’末端及び/又はアンチセンス鎖の5’末端及び/又はアンチセンス鎖の3’末端は、末端リン酸基を含む。好ましくは、末端リン酸基は、アンチセンス鎖の5’末端に位置する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドはないすなわち、リボース糖の各々の2’位はOH部分を有する。別の実施形態では、1つ又は2つ以上の化学修飾がある。例えば、以下:1センス鎖の1位及び2位ならびにすべてのCヌクレオチド及びすべてのUヌクレオチドの2’-O-アルキル修飾例えば、O-メチル、O-エチル、O-n-プロピル、O-イソプロピルなど;2コンジュゲート部分が、リンカーとコンジュゲート部分例えば、コレステロール部分を含む、又はこれらから実質的に構成される、又はこれらから構成され、上記リンカーが、センス鎖の最後のヌクレオチドの3’位に結合している、上記コンジュゲート部分;3アンチセンス鎖のすべてのC及びUヌクレオチドの2’フルオロ修飾又はアンチセンス鎖の少なくとも1つの2’-O-アルキル修飾;4アンチセンス鎖の第一のヌクレオチドの5’位でのリン酸化、また、すべての他のヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、非修飾であってもよい;51つ以上の突出部;ならびに6どちらかの鎖の任意の突出部のヌクレオチドと結合した1つ以上のチオリン酸修飾の1つ以上又は全部があってもよい。突出部が存在するいくつかの実施形態では、2’-O修飾は、センス鎖の突出部のC及びUに出現してもよいし、2’-フルオロ修飾は、アンチセンス鎖のC及びUに出現してもよい。別の実施形態では、2’-O修飾及び2’-フルオロは、二重らせん領域のヌクレオチド内にしか出現しない。さらに、いくつかの実施形態では、それぞれの鎖で、前述した2’C及びUのすべてが修飾されている突出部領域が存在すれば、これを含む、又は除くことが望ましい場合もある。しかし、別の実施形態では、各鎖又はいずれかの鎖で、すべてではないいくつかのC及びUが前述の修飾を含むことが望ましい。すべてではないいくつかのC及びUが修飾されている場合、C及びU修飾の合計数は、例えば、ある絶対数によって選択され、例えば、1~8、又は2~7、又は3~6の数が修飾されている。あるいは、この数は、例えば、修飾されない数に関して決定することができ、例えば、1を除くすべて、2を除くすべて、3を除くすべて、4を除くすべて、5を除くすべて、6を除くすべて、7を除くすべて、8を除くすべての数のC又はUが非修飾である。別の実施形態では、1つ以上の特定の位置、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、及びもし存在すれば、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30位の1つ以上の位置で2’修飾を省くのが好ましい場合もある。当業者であれば、好ましくは各鎖が少なくとも1つのC又はUヌクレオチドを含むことは認識されよう。さらに、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖で、0~30又は0~25又は0~23又は0~19又は1~30又は1~25又は1~23又は1~19又は3~30又は3~25又は3~23又は3~19又は5~30又は5~25又は5~23又は5~19又は7~30又は7~25又は7~23又は7~19又は10~30又は10~25又は10~23又は10~19又は8~15又は10~12ヌクレオチドに2’フルオロ基を有することが好ましい場合もある。修飾ヌクレオチドは、すべてピリミジンであるか、すべてプリンであってもよいし、プリンとピリミジンの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の全ヌクレオチドが2’フルオロ基を有するが、この鎖は、少なくとも1つのピリミジン、少なくとも1つのプリンを含んでもよいし、すべてピリミジン、すべてプリンであるか、又はプリンとピリミジンの組合せを有してもよい。さらにいくつかの実施形態では、2’フルオロ基は、もし存在すれば、いずれかの突出部ヌクレオチドにあるが、別の実施形態では、突出部ヌクレオチドは、このような修飾を含まない。同様に、いくつかの実施形態では、センス鎖上で、0~30又は0~25又は0~23又は0~19又は1~30又は1~25又は1~23又は1~19又は3~30又は3~25又は3~23又は3~19又は5~30又は5~25又は5~23又は5~19又は7~30又は7~25又は7~23又は7~19又は10~30又は10~25又は10~23又は10~19又は8~15又は10~12ヌクレオチドに、2’-O-アルキル例えば、2’-O-メチル基を有するのが好ましい場合もある。修飾ヌクレオチドは、すべてピリミジンであるか、すべてプリンであってもよいし、プリンとピリミジンの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、センス鎖の全ヌクレオチドが2’-O-アルキル基を有するが、この鎖は、少なくとも1つのピリミジン、少なくとも1つのプリンを有してもよいし、すべてピリミジン、すべてプリンであるか、又はプリンとピリミジンの組合せを有してもよい。さらにいくつかの実施形態では、2’-O-アルキル基は、もし存在すれば、いずれかの突出部ヌクレオチドにあるが、別の実施形態では、突出部ヌクレオチドは、このような修飾を含まない。アンチセンス鎖に少なくとも1つの2’-O-アルキル基を有する実施形態では、例えば、1~10、1~8、1~6、1~5、1~4、1~3、又は1~2の修飾が存在してもよい。別の実施形態では、ちょうど1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のこうした修飾が存在してもよい、これらの少なくとも1つの修飾は、例えば、3’アンチセンス突出部領域及び/又は二重らせん領域内のアンチ鎖の5’末端から測定して、アンチセンス鎖の1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、又は1~2位の1つ以上の位置に位置してもよい。非制限的例として、アンチセンス鎖の1、2、3、4、5、6、7又は8位のどの位置に単一の2’-O-アルキル修飾例えば、メチルがあってもよい。あるいは、UU突出部の2つのヌクレオチドの1つ又はこれらヌクレオチドの両方に単一の2’-O-アルキル修飾があってもよい。2’-O-アルキル修飾の他の組合せとして、限定するものではないが、1位と2位、1位と3位、1位と4位、1位と5位、1位と6位、1位と7位、1位と8位、2位と3位、2位と4位、2位と5位、2位と6位、2位と7位、2位と8位、3位と4位、3位と5位、3位と6位、3位と7位、3位と8位、4位と5位、4位と6位、4位と7位、4位と8位、5位と6位、5位と7位、5位と8位、6位と7位、6位と8位、7位と8位、1位とUU突出部における2つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、2位とUU突出部における2つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、3位とUU突出部における2つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、4位とUU突出部における2つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、5位とUU突出部における2つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、6位とUU突出部における2つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、7位とUU突出部における2つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方、または8位とUU突出部における2つのヌクレオチドの一方又はこれらヌクレオチドの両方の組合せが含まれる。さらに、アンチセンス鎖に存在する少なくとも1つの2’-O-アルキル修飾があるいくつかの実施形態では、A又はG塩基だけがこの修飾を含み、これにより、すべてのC及びU塩基がフルオロ基で修飾されるように、位置を選択する。別の実施形態では、1つ以上のC又はU塩基が、2’-O-アルキル修飾を含む。このような場合、siRNAは、2’-O-アルキル修飾を有していないC及びU塩基はすべて2’フルオロ修飾を有するように設計することができる。いくつかの実施形態では、siRNAは、長さが、17~30塩基対又は18~30塩基対又は19~30塩基対又は19~23塩基対又は19~21塩基対又は18~23塩基対の二重らせん領域を含む。二重らせん領域が長さ17塩基対で、19量体アンチセンス配列が得られる場合、アンチセンス19量体の3’末端の2つの塩基は、突出部を形成する可能性がある。二重らせん領域内に、100の相補性又は100に満たない相補性、例えば、少なくとも80の相補性、少なくとも85の相補性、少なくとも90の相補性、又は少なくとも95の相補性がありうる。一実施形態では、センス鎖の6位又は13位、又は19位、又は6位と13位又は13位と19位又は6位と19位、又は6位、13位及び19位を除いて、100の相補性がある。この例では、指定位置にミスマッチがある。ミスマッチは、センス鎖におけるヌクレオチドの同一性を変更することによって、二重らせんに導入する。このようにして、アンチセンス鎖は、標的mRNAの領域との100の相補性を保持する。さらに、本明細書で用いるように、鎖内の位置番号は、二重らせん領域の第一の、すなわち5’モストヌクレオチドに対し該当するヌクレオチドの位置を指している。従って、センス鎖の1位は、センス鎖の5’モストヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の1位は、アンチセンス鎖の5’モストヌクレオチドである。2位は、それぞれの鎖の1位のすぐ下流又は3’にある位置である。前述したように、いくつかの実施形態では、ミスマッチをセンス鎖に導入する。いくつかの実施形態では、ミスマッチの位置に導入されたヌクレオチドは、通常、その特定のセンス鎖ヌクレオチドと結合するアンチセンス鎖のヌクレオチドと同じ同一性又は化学的性質を有する。従って、例えば、センス鎖に19ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖に19ヌクレオチドを含み、いずれの鎖にも突出部のない二本鎖分子がある場合、ミスマッチをセンス鎖の6位この鎖の5’末端から数えてに導入すると、センス鎖の上記位置のヌクレオチドは、アンチセンス鎖の14位のヌクレオチドと、ワトソン-クリック型対合をしない。さらに、アンチセンス鎖の14位のヌクレオチドが、例えばCであれば、ミスマッチは、センス鎖の6位にCを導入することによって達成される。こうした変更の結果、センス鎖の6位に位置するヌクレオチドは、例えば、mRNAの標的領域において対応するヌクレオチドとの同一性をもはや有していない。しかし、例えば、14位に位置するアンチセンスヌクレオチドは、標的領域のヌクレオチドとの相補性を保持する。二重らせんオリゴヌクレオチド複合体におけるコンジュゲート-リンカーの位置は、結合される単数または複数の鎖例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方、修飾される鎖内の単数または複数の位置すなわち、鎖内のヌクレオチド位置、及び修飾されるヌクレオチド上の位置例えば、糖、塩基に関して、変動する可能性がある。コンジュゲート-リンカーは、1つ以上の鎖の5’及び/又は3’末端に配置することができる。例えば、コンジュゲート-リンカーは、センス鎖の5’末端及び/又はセンス鎖の3’末端及び/又はアンチセンス鎖の3’末端に配置することができる。コンジュゲート-リンカーは、ホスホジエステル結合を介して、鎖の5’及び/又は3’末端に結合させることができる。好ましい実施形態では、コンジュゲート-リンカーは、ホスホジエステル結合を介して、センス鎖の一端又は両端に、さらに好ましくはセンス鎖の3’末端に結合させる。コンジュゲート-リンカーはまた、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の内部位置に結合させてもよい。さらに、ヌクレオチドの複数の位置、例えば、ウリジンの5位、シチジンの5位、シチジンの4位、グアノシンの7位、アデノシンの7位、グアノシンの8位、アデノシンの8位、アデノシンの6位、リボースの2’位、リボースの5’位、及びリボースの3’位をコンジュゲートと核酸の結合に用いることができる。別の実施形態では、本発明は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、及び88から選択される配列を含む少なくとも1つのsiRNAをinvitroで細胞に導入することを含む、遺伝子サイレンシングの方法を提供する。siRNAは、siRNAの受動的取込みを可能にすることにより、又はベクターの使用によって導入することができる。本明細書に開示するどの方法及びキットも、単分子siRNA、2つの個別のポリヌクレオチド鎖からなるsiRNA、又はこれらの組合せのいずれを使用することもできる。さらには、本明細書に開示するどの方法も、様々な異なるプロトコルを用いて、遺伝子サイレンシングに使用することができる。1つの非制限的例では、同じ遺伝子をターゲティングする2つ以上のsiRNAを同時に投与することができる。個別のsiRNAの場合と同様に、2つ以上のsiRNAを単回用量若しくは単一トランスフェクションで、複数回用量で、又は状況に応じて、投与することができる。一実施形態では、本発明は、VEGFAの過剰発現に関連する疾患を治療する薬剤の製造を目的とする、VEGFA遺伝子の発現及び/又は活性を阻害する化合物の使用を提供する。薬剤は、例えば、経口、非経口皮下、筋内、又は静脈内を含む、直腸、経皮、口腔、又は鼻内に投与することができる。薬剤は、本明細書に記載する化合物のいずれか1つ以上を含んでいてよい。干渉RNAは、眼組織注射、例えば、眼周囲、結膜、眼球鞘下、眼房内、硝子体内、眼内、網膜下、結膜下、球後、又は小管内注射により;カテーテル又はその他の留置装置、例えば、網膜ペレット、眼内挿入物、座薬、又は多孔性、非多孔性、若しくはゼラチン質材料を含むインプラントを用いて、眼への直接適用により;局部点眼液又は軟膏により;又は盲嚢中の、若しくは強膜に隣接して経強膜移植した、若しくは強膜中の内強膜、若しくは眼内の徐放装置によって、眼に直接送達してよい。前房内注射は、薬剤が線維柱帯網に到達することができるように、角膜から前房中に実施してよい。小管内注射は、シュレム管に排液する静脈集合路venouscollectorchannels内か、又はシュレム管内に実施してよい。眼への送達のために、干渉RNAを、眼科学的に許容される防腐剤、補助溶剤、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、バッファー、塩化ナトリウム、又は水性の滅菌点眼懸濁液若しくは溶液を形成するための水と組み合わせてもよい。溶液製剤は、干渉RNAを生理学的に許容される等張性水性バッファーに溶解させることによって調製することができる。さらに、溶液は、干渉RNAの溶解を助けるために、許容される界面活性剤を含んでもよい。化合物の定着を改善するために、粘度上昇剤、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを本発明の組成物に添加してもよい。滅菌眼軟膏製剤を調製するためには、干渉RNAを適切なビヒクル、例えば、鉱油、液体ラノリン、又は白色ワセリン中で、防腐剤と組み合わせる。滅菌眼ゲル製剤は、当分野で公知の方法に従い、例えば、CARBOPOL登録商標-940BFGoodrich,Charlotte,NCなどの組合せから調製した親水性塩基中に干渉RNAを懸濁させることによって調製することができる。眼内注射には、例えば、VISCOAT登録商標AlconLaboratoriesIncFortWorthTXを用いてもよい。本発明の他の組成物は、干渉RNAが眼に浸透しにくい場合、クレメフォールcremephorcremophor等の浸透促進剤及びTWEEN登録商標80ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレエート、SigmaAldrichStLouis,MOを含有してもよい。本発明はまた、製剤上許容される担体中に本発明のsiRNAを含む医薬組成物も提供する。従って、別の実施形態では、本発明は、治療有効量のsiRNAを含む医薬組成物に関し、siRNAは、a二重らせん領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖であって、二重らせん領域は、長さが17~30塩基対であり、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、及び88からなる群から選択される配列を有するアンチセンス鎖を含む、上記鎖と;b上記アンチセンス領域に対し100相補的であるか、1つ以上の位置にミスマッチを有するセンス領域とから構成される。一例では、上記分子は、19塩基の二本鎖複合体と、センス領域の6位、13位又は19位に位置するミスマッチとを形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖から構成され、前記位置は、二重らせん領域の一部であるセンス鎖の5’モストヌクレオチドに対して決定される。上に記載したすべてのものについて、以下の修飾を採用することができる:センス領域1位及び2位ならびにすべてのC及びUが、2’-O-Me修飾を有し、センス領域の他のすべての2’位置が、2’-OH基を有する;アンチセンス領域のすべてのC及びUが2’-F修飾され、アンチセンス領域の他のすべてのヌクレオチドが2’-OH基を有する;また、アンチセンス領域の1位のヌクレオチドがリン酸化されて、アンチセンス領域の3’末端に結合するUU突出部がある;アンチセンス鎖の二重らせん領域の、突出部の2つのヌクレオチド同士、ならびに突出部の第一のヌクレオチドと3’モストアンチセンスヌクレオチドとのヌクレオチド間結合は、チオリン酸結合である;ならびに、コレステロール部分が、C5リンカーによってセンス領域の3’末端に結合されている。さらに別の実施形態では、siRNAは、前述したものと同じ特徴を有するが、アンチセンス鎖は、2’-F修飾ではなく、少なくとも1つの2’-O-Me修飾を有する。製剤上許容される担体は、1つ以上の賦形剤、例えば、ビヒクル補助剤、pH調節剤及び緩衝剤、等張化剤、安定剤及び湿潤剤を含んでもよい。さらには、いくつかの実施形態において、例えば、コアセルベーション技術により、又はコロイド状薬物送達系例えば、リポソーム、ミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル又はマイクロエマルション中での界面重合例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリメチルメタシレートマイクロカプセルにより、siRNAをマイクロカプセル中で送達する。現在知られている方法、又は今後知られるようになる方法、及び本発明の開示内容から、当業者が、siRNAによる細胞膜の貫通を可能にする上で本発明に関して有用であろうと判断する方法のいずれかによって、細胞又は生物にsiRNAを導入することができる。このような方法として、限定するものではないが、任意のトランスフェクション方法、例えば、DEAEDextran、リン酸カルシウム、カチオン性脂質/リポソーム、ミセル、圧力操作、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、イムノポレーション、ベクター例えば、ウイルス、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、細胞融合物などの使用、ポリヌクレオチドと特異的コンジュゲート又はリガンド例えば、抗体、抗原、又は受容体などとの結合、受動的導入、siRNAの取込みを促進する部分のsiRNAへの添加などを用いたトランスフェクションが含まれる。別の実施形態では、本発明は、以下の病態:乾癬、癌、慢性関節リウマチ、眼の血管新生、血管形成の異常、網膜血管透過性、網膜浮腫、糖尿病網膜症特に、増殖性糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、浸出型加齢黄斑変性、網膜虚血に関連する続発症、及び眼球後区血管新生の1つ以上を治療、阻害又は改善するための薬剤の製造において、VEGFAをターゲティングするsiRNAの使用を特徴とする。本発明のsiRNAのレシピエントは、例えば、前述した疾患の1つ以上に罹患している人でよい。siRNAの用量は、好ましくは治療有効量である。治療有効量は、少なくとも部分的に、治療しようとする生物の年齢、体重及び罹患の状態又は重症度によって、決定される。本発明のsiRNAの例には、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、及び88から選択されるアンチセンス配列と、表1の対応するセンス鎖が含まれ得る。表1は、実施例のセクションに記載するようにinvitroで試験した42の非修飾siRNAのサイレンシング活性を示す。表2は、非修飾及びsiStable修飾フォーマットにおけるsiRNAのサイレンシング活性を示す。具体的には、D及びE列のデータは、24時間時点の非修飾分子から得られたものである。F、G、H及びI列のデータは、72時間後のsiStable修飾分子から得られたものである。F及びG列のデータは、siRNAを100nM濃度の細胞にトランスフェクトして得られたものである。上に挙げた二重らせんはミスマッチを含まないことに留意されたい。本発明は、具体的に挙げるsiRNAと、これらを含む医薬組成物及びそれらを使用するための方法を含む。本発明はまた、前述したものと類似しているが、センス鎖の6位若しくは13位若しくは19位、又はセンス鎖の6位と13位の両方若しくは13位と19位の両方若しくは6位と19位の両方又はセンス鎖の6位、13位及び19位の全部に異なる塩基を有するsiRNAも含む。従って、これら位置のいずれかに、表1又は2において、Uに相補的なAがある場合、U、C又はGを挿入してもよく、表1又は2において、Aに相補的なUがある場合、A、C又はGを挿入してもよく、表1又は2において、Gに相補的なCがある場合、U、A又はGを挿入してもよく、表1又は2において、Cに相補的なGがある場合、U、C又はAを挿入してもよい。さらにまた、これらsiRNAのいずれかが突出領域、例えば、UU3’アンチセンス突出部及び/又はUU3’センス突出部を含んでもよい。さらに別の例として、一実施形態では、本発明は、表2に記載のsiRNA、又はセンス鎖が、6位、13位及び19位に位置する3つのミスマッチヌクレオチドを有し、アンチセンスには相補的ヌクレオチドを有する点で、表2のものとは異なるsiRNA、例えば、センス鎖が、6位、13位及び19位に位置する3つのミスマッチヌクレオチドを有する以外は、vegfa3.7と同じセンス及びアンチセンス配列を含むsiRNAに関する。いくつかの実施形態では、ミスマッチは、1つ以上、例えば、2つ又は3つのミスマッチ塩基が逆鎖の塩基と同じであり、それ以外のミスマッチ塩基は二重らせんに存在しないように選択される。非制限的例として、vegfa3.7の場合、二重らせんは、以下の通りでよい:SS-5’AGAGAUAAGAGAUAGUGUA3’配列番号91AS-3’UCUCUUUUCUCUUUCACAA5’配列番号54この二重らせんは、本明細書に開示する他の任意の二重らせんと同様に、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに3’突出部を含んでもよい。非制限的例として、ジヌクレオチド突出部、例えば、UUがあってもよい。この突出部は、センス鎖に存在するが、アンチセンス鎖には存在しない;アンチセンス鎖には存在するが、センス鎖には存在しない;両鎖に存在するか、又はどちらの鎖にも存在しなくてもよい。各突出部は、突出部のヌクレオチド同士の標準的ヌクレオチド間結合と、二重らせんの適切な鎖の3’末端との標準的結合を有するように構築してもよいし、又は突出部において、突出部の2つのヌクレオチド同士、ならびに突出部の最初のヌクレオチドと、この鎖の二重らせん領域の3’モストアンチセンスヌクレオチドとの結合はチオリン酸結合であってもよい。従って、例えば、前段落のvegfa3.7二重らせんにおいて、配列番号54は、UU3’アンチセンス突出部を含んでもよく、これは、突出部のヌクレオチド同士の間、若しくは突出部と配列番号54の3’との間にチオリン酸結合を含まないか、又はこれらの位置の一方若しくは両方にチオリン酸結合があってもよい。別途記載のない限り、前述した実施形態の各々の特徴はいずれも、他の実施形態のいずれに用いてもよい。ただし、こうした使用が実施形態と不適合であるか、調和しない場合を除く。ある程度詳細に本発明を説明してきたが、以下に実施例を記載する。これらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限する意図はなく、また、制限すると解釈すべきではない。実施例1:invitro試験のための一般技法試験のためのsiRNA選択VEGFAのすべての変異体をターゲティングすることができるsiRNAの収集物を同定したNM001025366、NM003376、NM001025367、NM001025368、NM001033756、NM001025369、NM001025370。表1は、センス及びアンチセンス鎖配列5’→3’に沿ったsiRNAの一覧を示す。各siRNAの相対官能性を評価するために、2’ACE化学米国特許第6008400号明細書;米国特許第6111086号明細書;米国特許第6590093号明細書;ScaringeMethodsinFnzymology317318ScaringeMethods23206217を用いて配列を合成し、次に、製造者のプロトコル96ウェルフォーマットにおいてウェル当たり10000細胞、100nMsiRNA02μlDharmalFECT1/ウェルを用いて、脂質媒介トランスフェクションによりHeLa細胞ATCC、CCL2にトランスフェクトした。トランスフェクションから72時間後、全細胞生存性及びmRNAでの標的ノックダウン及びタンパク質レベルを決定した。すべてのアッセイは3回反復して、siRNAの選択群について実施し、siRNA/標的mRNA対のIC50を確認するため、用量曲線0001、001、01、10、100及び100nMを実施した。正及び負の対照がすべての実験に含まれ、これらは、非ターゲティング対照NTC5センス鎖配列:5UGGUUUACAUGUCGACUAAUU3配列番号89及びPPIBをターゲティングする正の対照センス鎖配列:5ACAGCAAAUUCCAUCGUGU3配列番号90からなる。注記:これらの試験に用いられる正の対照の分子は、以下の修飾を含む:センス鎖は、鎖の5’末端から数えて最初の2つのヌクレオチドに2’-O-メチル修飾を含み;アンチセンス鎖は、5’リン酸基を含み;センス及びアンチセンスの両鎖は、3’末端に2ヌクレオチドUU突出部を含む。標的mRNA及びタンパク質ノックダウン分析トランスフェクションから72時間後、分枝DNAアッセイQuantiGeneScreenKitPanomicsを用いて、標的mRNAノックダウンを決定した。PPIBの発現を基準mRNAとして用いて、標的mRNAノックダウンを、対応する非ターゲティング対照NTCに対しさらに基準化した。トランスフェクションから72時間後、トランスフェクトした細胞からの上澄みに対してVEFGAELISAアッセイを実施することにより、タンパク質発現を評価した。ELISAは、50μLの上澄みを用いて、製造者の指示に従い実施したHumanVEGFAELISAkitThermoScientific。吸光度を分光光度計で450nMにて読み取った。データを、対応するNTC対照に対し基準化した。細胞生存性アッセイトランスフェクションから72時間後、細胞生存性をレサズリンアッセイにより評価した。レサズリンを培地に直接添加し、プレートを1~1.5時間インキュベートした後、WallacVICTOR2PerkinElmerLifeSciencesプレートリーダーで蛍光を測定した励起530nm、放射590nm及び1秒暴露。データを、対応するNTC対照に対し基準化した。試験のためのsiRNA設計invitro試験で試験するsiRNA構成は、1標準的非修飾設計19塩基対二重らせん、センス及びアンチセンス両鎖の3’末端にUU突出部と、2安定化設計19塩基対二重らせん;センス鎖修飾:ヌクレオチド1及び2鎖の5’末端から数えてに2’-O-メチル修飾、さらに、すべてのC及びUに2’-O-メチル修飾;アンチセンス鎖修飾:5’末端ヌクレオチドにリン酸エステル、すべてのC及びUに2’F修飾、3’末端に2ヌクレオチドUU突出部、ならびに突出部の2つのヌクレオチド同士の間、及び二重らせんの最初の3’モストヌクレオチドと突出部の最初のヌクレオチドとの間のチオリン酸ヌクレオチド間修飾とを含む。invivo試験のために、siRNAは以下の設計を含む:19bp二重らせんセンス鎖修飾ヌクレオチド1及び2鎖の5’末端から数えてに2’-O-メチル修飾すべてのC及びUに2’-O-メチル修飾C5リンカーを用いて3’末端に結合させたコレステロール2009年8月20日に公開された米国特許出願公開第20090209626号明細書を参照のこと。尚、その開示内容は、全文が本明細書に記載されているのと同様に、参照として本明細書に組み込むものとするアンチセンス鎖修飾5’リン酸すべてのC及びUに2’F3’末端に2つのヌクレオチドUU突出部突出部の2つのヌクレオチド同士の間、及び二重らせんの最初の3’モストヌクレオチドと突出部の最初のヌクレオチドとの間のチオリン酸ヌクレオチド間修飾。さらに、6位、13位及び19位のミスマッチは、invivo試験で用いる分子に組み込んだ。すべてのケースで、siRNAの両鎖間のミスマッチは、センス鎖のヌクレオチドが、その位置で一般的に対合する塩基アンチセンス鎖のと同一性を有するようにヌクレオチドを変更することにより達成した。従って、例えば、センス鎖6位でセンス-アンチセンス対が、通常、U-Aであれば、この対をA-Aに転換することによってミスマッチを導入する。同様に、センス鎖6位でセンス-アンチセンス対が、G-Cである場合には、ミスマッチはC-Cとなる。このようにして、ミスマッチを二重らせんに組み込むが、アンチセンス鎖は、意図する標的の逆相補配列を保持する。実施例2:invitro及びinvivo試験の結果invitroで試験したすべての配列の性能を表1に示す。多くの配列が、RNA及びタンパク質レベルの両方で70を超える遺伝子ノックダウンをもたらすことが観察され、そのような配列として、例えば、Vegfa2.2、2.3、2.4、2.12、3.1、3.2、3.3、3.5及び3.7がある。さらに、収集物のサブセットを安定化設計について試験したところ、全体性能が、非修飾状態で観察されたものと同等が、又はそれより優れていることがわかった例えば、Vegfa21、32、33を参照。表2が示すように、非修飾及び修飾状態の両方で、RNAノックダウンのIC50は、約0.11→23nMの範囲であり、また、タンパク質ノックダウンのIC50は、約0.17→3.17nMの範囲であった。これらの結果に基づき、2つの配列、Vegfa3.2及び3.7は、以前記載されているinvivo設計Accellと呼ぶを用いて再合成した。これらの実験の結果については、添付の図面を参照にして、さらに詳しく説明することにする。図1A及びBは、それぞれ、ラット網膜において、注射から72時間後の、VEGFAmRNA及びタンパク質の発現に対するAccellVEGFAsiRNAの硝子体内IVT注射の作用を示す。Lewisラットは、1XsiRNAバッファーDharmaconに再懸濁させたAccellVEGFA3.2、ZVEGFA3.7又はAccell非標識対照1NTC1siRNAの10μgIVT注射ODを受けた。AccellNTC1siRNAセンス鎖配列は、5’-UGGUUAACAUGUCGACUAA-3’配列番号92であり、AccellNTC1siRNAアンチセンス鎖配列は、5’-UUAGUCGACAUGUAAACCAUU-3’配列番号93である。対側の眼OSは処理しなかった。注射から72時間後、眼を採取し、網膜を解剖により分離した。図1TrizolInvitrogenを用いて、全RNAを抽出し、VEGFA及びβ-アクチンACTBmRNAレベルをTaqmanqRT-PCRアッセイAppliedBiosystemsにより決定した。VEGFAmRNA発現をβ-アクチン発現に対し基準化した。図1RIPAバッファーPierceを用いて、タンパク質を抽出してから、ラットVEGFAタンパク質レベルをELISARDSystemsにより決定した。VEGFAタンパク質発現を、BCAアッセイPierceにより決定した全タンパク質に対し基準化した。データは、平均値n6±標準偏差エラーバーとして表す。:NTC1に対してP<0.001。いずれのVEGFAsiRNAも有意にVEGFAmRNA発現を低減し、VEGFA3.7はまた、VEGFA及びタンパク質も有意に低減した。NTC1対照siRNAは,VEGFA発現に対する作用は、あったとしても極めてわずかであった。図2は、ラット網膜におけるAccellVEGFA3.2siRNAと対照siRNAについての用量応答曲線の比較を示す。Lewisラットは、1XsiRNAバッファーDharmaconに再懸濁させたAccellVEGFA3.2又はAccellNTC1対照siRNAの1~25μgIVT注射ODを受けた。対側の眼OSは処理しなかった。注射から72時間後、眼を採取し、網膜を解剖により分離した。TrizolPlusInvitrogenを用いて、全RNAを抽出し、VEGFA及びβ-アクチンmRNAレベルをTaqmanqRT-PCRアッセイAppliedBiosystemsにより決定した。VEGFAmRNA発現をβ-アクチンmRNAに対し基準化した。データは、基準化VEGFAmRNA発現についての平均OD:OS比処理した眼と非処理の眼におけるVEGFAレベルの比n6±標準偏差エラーバーとして表す。、:AccellNTC1に対して、それぞれP<0.05、P<0.01。AccellVEGFAsiRNA3.2の量を増加して硝子体内注射すると、25μgでVEGFAmRNA発現のほぼ完全なサイレンシングを達成する用量応答が得られた。図3A及びBは、ラット網膜におけるAccellVEGFA3.7siRNAと対照siRNAについての用量応答曲線の比較を示す。Lewisラットは、1XsiRNAバッファーDharmaconに再懸濁させたAccellVEGFA3.7又はAccellVEGFA3.7切断部位ミスマッチCSMM対照siRNAの1~50μgIVT注射ODを受けた。AccellVEGFA3.7CSMM対照siRNAは、VEGFAmRNA標的配列に対する3ヌクレオチドミスマッチを除いて、AccellVEGFA3.7siRNAと同じ配列を有する。AccellVEGFA3.7CSMMsiRNAセンス鎖配列は、5’-AGAGAUAACUCAUAGUGUA-3’配列番号94;AccellVEGFA3.7CSMM対照siRNAアンチセンス鎖配列は、5’-AACACUUUGAGUUUUCUCUUU-3’配列番号95である。対側の眼OSは処理しなかった。注射から72時間後、眼を採取し、網膜を解剖により分離した。図3TrizolInvitrogenを用いて、全RNAを抽出し、VEGFA及びβ-アクチンmRNAレベルをTaqmanqRT-PCRアッセイAppliedBiosystemsにより決定した。VEGFAmRNA発現をβ-アクチンmRNA発現に対し基準化した。図3RIPAバッファーPierceを用いて、タンパク質を抽出してから、ラットVEGF-AレベルをELISARDSystemsにより決定した。VEGFAタンパク質発現を、BCAアッセイPierceにより決定した全タンパク質レベルに対し基準化した。データは、基準化VEGFAmRNA又はタンパク質発現の平均OD:OS比n6±標準偏差エラーバーとして表す。:P<0.03、:P<0.0002、:P<0.005。硝子体内注射AccellVEGFA3.7siRNAは、5μgという低い用量で、mRNA及びタンパク質レベルの両方でVEGFA発現に有意な低減を引き起こした。AccellVEGFA3.7siRNAは、25μgsiRNAで、VEGFAmRNA発現が>70阻害、VEGFAタンパク質発現が約80阻害に達する用量応答を呈示した。対照siRNAによる、VEGFA発現の非RNAi媒介阻害も観察された。この効果については、VEGFAタンパク質は、VEGFAmRNAほど顕著ではなかった。図4A及びBは、AccellVEGFA3.7siRNAの作用の持続時間を示す。Lewisラットは、1XsiRNAバッファーDharmaconに再懸濁させたAccellVEGFA3.7siRNA又はAccellNTC1対照siRNAの25μgIVT注射ODを受けた。対側の眼OSは処理しなかった。注射から1、3、7、14、28、42、及び56時間後、眼を採取し、網膜を解剖により分離した。VEGFAmRNA図4とVEGFAタンパク質図4の発現を前掲の実施例に記載したように評価した。データは、基準化VEGFAmRNA又はタンパク質発現の平均OD:OS比n6±標準偏差エラーバーとして表す。、:NTC1に対してP<0.001、P<0.002。AccellVEGFA3.7siRNAを硝子体内注射すると、24時間以内に、VEGFAmRNA及びタンパク質発現の有意な阻害を引き起こした。阻害は、数週間持続した。図5A及びBは、ラット酸素誘導網膜症OIRモデルPennetalPediatrRes367247311994から改変における、VEGFAタンパク質発現及び網膜前血管新生の阻害をそれぞれ示す。14日の50~10O2の循環後、新生SpragueDawleyラットを室内空気21O2に7日間暴露した生後15~21日、すなわちP15~P21。P15及びP18日に、ラットは、1XsiRNAバッファーDharmaconに再懸濁させたAccellVEGFAsiRNA3.7又はAccellVEGFA3.7CSMM対照siRNAの25μgIVT注射OSを受けた。対側の眼ODは、ビヒクル1XsiRNAバッファーで処理した。注射量は1μlであった。P21日に、眼を採取し、網膜を解剖により分離した。図5RIPAバッファーPierceを用いて、タンパク質を抽出し、VEGFAタンパク質レベルをELISARDSystemsにより決定した。VEGFAタンパク質発現をBCAアッセイPierceにより決定した全タンパク質レベルに対し基準化した。データは、平均基準化VEGFAタンパク質発現n7±標準偏差エラーバーとして表す。:P<0.03。図5網膜を10中性緩衝ホルマリン中に24時間固定し、ADPase染色に付した後、全取付け物としてスライドに固定した。NikonCoolscope登録商標を用いて、画像を取得し、網膜当たり12セクターの各々を血管新生の存在又は非存在について評価することにより、時間スコアclockhourscoreを取得したn6~8。:P<0.05。AccellVEGFA3.7siRNAは、VEGFAタンパク質発現に有意な低減約40を引き起こし、網膜前血管新生の約88阻害を達成した。AccellVEGFA3.7CSMM対照siRNAは、VEGFA発現又は血管新生のいずれにも有意な作用をもたらさなかった。当業者であれば認識されるように、ラットで得られた観測値をヒトに外挿することは公知である。"