RNAトリホスファターゼの少なくとも1つの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの少なくとも1つの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの少なくとも1つの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの少なくとも1つの触媒ドメインを含む、キメラ酵素。細胞質キメラ酵素であることを特徴とする、請求項1に記載のキメラ酵素。RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインが単量体に含まれる、請求項1または2に記載のキメラ酵素。DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインが単量体に含まれる、請求項1から3のいずれか一項に記載のキメラ酵素。DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインならびにRNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインからなる群の中で選択される触媒ドメインの少なくとも1つが単量体に含まれる、請求項1から4のいずれか一項に記載のキメラ酵素。DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインがバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインである、請求項1から5のいずれか一項に記載のキメラ酵素。RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインからなる群の中で選択される前記触媒ドメインの少なくとも1つがウイルスキャッピング酵素の触媒ドメインである、請求項1から6のいずれか一項に記載のキメラ酵素。単量体酵素であることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載のキメラ酵素。RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインからなる群の中で選択される前記触媒ドメインの少なくとも2つが連結性ペプチドによって結合される、請求項1から8のいずれか一項に記載のキメラ酵素。請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ酵素をコードする、単離核酸分子または単離核酸分子群。RNAポリメラーゼIIに対するプロモーターおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターからなる群から選択される少なくとも1つのプロモーターと作動可能に連結された、請求項10に記載の核酸分子。請求項10または11に記載の核酸分子を含むベクター。請求項10もしくは11に記載の核酸分子もしくは単離核酸分子群または請求項12に記載のベクターを含む宿主細胞。請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ酵素を発現する、遺伝子改変したヒト以外の真核生物。5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を産生するための、請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ酵素のinvitroまたはexvivoでの使用。DNA配列にコードされた、5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を宿主細胞で産生するためのinvitroまたはexvivoの方法であって、前記方法が請求項10または11に記載の核酸分子または単離核酸分子群を宿主細胞で発現させる工程を含み、前記DNA配列がDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターに作動可能に連結される方法。前記宿主細胞の内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼおよびまたは内因性のキャッピング酵素のサブユニットの少なくとも1つの発現を阻害する工程をさらに含む、請求項16に記載の方法。請求項1から9のいずれか一項に記載の少なくとも1つのキメラ酵素ならびにまたは請求項10または11に記載の単離核酸分子およびもしくは単離核酸分子群ならびにまたは請求項12に記載のベクターを備える、5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を産生するためのキット。請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ酵素ならびにまたは請求項10または11に記載の単離核酸分子およびもしくは単離核酸分子群ならびにまたは請求項12に記載のベクターを含む、医薬組成物。DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターに作動可能に連結された、少なくとも1つの対象DNA配列をさらに含み、請求項19に記載の医薬組成物。したがって、細胞毒性または誘発性細胞毒性を伴わない遺伝子治療および大規模なタンパク質産生に適切な、真核細胞における効率的な遺伝子組換えについての新規で改善された系に関するかなりの必要性が当技術分野に依然として存在する。本発明者は、本明細書に開示される本発明を用いて著しい前進を遂げた。本発明の目的は、上記の問題の全てまたは一部を解決することを可能にする新規なキメラ酵素を提供することによって、この必要を満たすことである。期せずして本発明者は、RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインを含むキメラ酵素は、細胞毒性がなくアポトーシスを誘導せずに、真核性の翻訳機構によって高度に翻訳可能な5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成することができることを実証した。ワクシニアウイルスバクテリオファージRNAPハイブリッド発現系では、T7転写産物のキャッピングは最適化されていないままであり、融合酵素のCTDT7RNAポリメラーゼでは達成することができないので、これらの結果は驚くべきものである。したがって、一態様では、本発明は、RNAトリホスファターゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインを含むキメラ酵素に関する。特に、本発明によるキメラ酵素は、5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成することができる。本発明によるキメラ酵素は、特に以下の利点を有する。内因性遺伝子の転写と導入遺伝子の転写との間に競合がない。高価でなく、実施するのに迅速容易であるので、大規模なアッセイおよびタンパク質産生に適切である。ワクシニアウイルスバクテリオファージRNAPハイブリッド発現系と対照的に、明らかな細胞毒性またはアポトーシス促進活性がない。任意の真核生物種においてRNA転写産物の産生を可能にする。別段定義されない限りは、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者に通常理解されるのと同じ意味を持つ。便宜上、本明細書、実施例および特許請求の範囲で特定の用語およびフレーズの意味が用いられる。本明細書で使用する場合、キメラ酵素という用語は、自然界に見られる天然の酵素ではない酵素を指す。したがって、キメラ酵素は、異なる供給源に由来する触媒ドメインまたは同じ供給源に由来するが自然界に見つかるものと異なる様式で配置されている触媒ドメインを含むことができる。キメラ酵素という用語は、単量体酵素を含み、さらにはオリゴマー酵素、特にヘテロオリゴマー酵素も含む。本明細書で使用する場合、単量体酵素という用語は、ポリペプチド鎖のみで構成される単一ユニット酵素に関する。本明細書で使用する場合、オリゴマー酵素という用語は、共有結合または非共有結合によって互いに連結された、少なくとも2つのポリペプチド鎖から構成される多ユニット酵素を指す。オリゴマー酵素という用語は多ユニット酵素を含み、前記酵素の少なくとも2つのユニットは、共有結合または非共有結合によって互いに連結される。オリゴマー酵素という用語は、1種の単量体のみから構成される多ユニット酵素であるホモオリゴマー酵素および異なる種類の単量体から構成されるヘテロオリゴマー酵素を含む。特に、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、共有結合およびまたは非共有結合によって互いに連結される。特に、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成するように作動可能に互いに連結される。特に、本発明によるキメラ酵素は、RNAトリホスファターゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインを含み、前記触媒ドメインの少なくとも2つは、好ましくはそれらの末端で共有結合または非共有結合によって互いに連結され、より特定すると、RNAトリホスファターゼの前記少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインからなる群の中で選択される触媒ドメインの少なくとも1つが、好ましくはその末端で共有結合または非共有結合によって、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインと好ましくはその末端で連結される。特に、本発明は、RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインならびに核の真核性DNA依存性RNAポリメラーゼI、IIおよびまたはIIIの触媒ドメインのみ、より詳細には、DNA依存性RNAポリメラーゼIIの触媒ドメインのみを含むキメラ酵素を除外して、RNAトリホスファターゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインを含む、本発明によるキメラ酵素に関する。特に、本発明は、RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよび核の真核性DNA依存性RNAポリメラーゼI、IIおよびまたはIIIの触媒ドメイン、より特定すると、少なくともDNA依存性RNAポリメラーゼIIの触媒ドメインを含むキメラ酵素を除外して、RNAトリホスファターゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの少なくとも1つの、特に1つの触媒ドメインを含む、本発明によるキメラ酵素に関する。特に、真核性宿主細胞における発現に関して、本発明による前記キメラ酵素は、好ましくは真核性の翻訳機構によって翻訳可能である5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成することができる。特に、真核性宿主細胞における発現に関して、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインによって合成されるRNA分子の5末端にm7GpppNキャップを付加することができ、好ましくは5末端にm7GpppNキャップを有する前記RNA分子は、真核性の翻訳機構によって翻訳可能である。特に、真核性宿主細胞における発現に関して、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインがバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインの際には、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、グアノシンリボヌクレオチドを5末端に有するRNA分子の5末端にm7GpppNキャップを付加することができる。特に、真核性宿主細胞における発現に関して、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインが細菌のDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインの際には、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、グアノシンリボヌクレオチドまたはアデノシンリボヌクレオチドを5末端に有するRNA分子の5末端にm7GpppNキャップを付加することができる。特に、真核性宿主細胞における発現に関して、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインがヒトまたはマウスのミトコンドリアのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインの際には、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、アデノシンリボヌクレオチドまたはチミジンリボヌクレオチドを5末端に有するRNA分子の5末端にm7GpppNキャップを付加することができる。本明細書で使用される酵素の触媒ドメインという用語は、特にその三次元構造において酵素機能を保証するのに必要十分なドメインに関する。例えば、RNAトリホスファターゼの触媒ドメインは、RNAトリホスファターゼの機能を保証するのに必要十分なドメインである。触媒ドメインという用語は、野生型または変異酵素の触媒ドメインを含む。本発明によるキメラ酵素は、少なくとも前記触媒ドメインを含むが前記触媒ドメインを含有する酵素の全部または一部をさらに含むことができる。実際、本発明によるキメラ酵素の一実施形態によれば、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、DNA依存性RNAポリメラーゼの、好ましくは単量体のDNA依存性RNAポリメラーゼの全部または一部に含まれてよい。RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインも、キャッピング酵素、好ましくは単量体のキャッピング酵素の全部または一部に含まれてよい。本発明によるキメラ酵素は、核の酵素、細胞内区画の酵素または細胞質の酵素であってもよい。したがって、本発明によるキメラ酵素は、当業者に周知の、細胞において酵素の輸送を導くシグナルペプチドまたはマーカーシグナルを含むことができる。例えば、本発明によるキメラ酵素は酵素を核に導く核移行シグナルを含むことができる。このようなNLSは、塩基性で正電荷の5つのアミノ酸からなるユニットであることが多い。NLSはペプチド鎖のどこにでも配置することができる。好ましくは、本発明によるキメラ酵素は細胞質キメラ酵素である。特に、キメラ酵素は、細胞質を除いた、酵素の輸送を導くシグナルペプチドまたはマーカーシグナルを含まない。本発明によるキメラ酵素の細胞質局在は、真核細胞の細胞質から核への巨大なDNA分子の能動的な移行および核から細胞質へのRNA分子の運び出しを回避させることによって、導入遺伝子の発現レベルを最適化するという利点を有する。したがって、本発明によるこのような細胞質キメラ酵素は、核と比較して有意に高い量のトランスフェクトされたDNAが通常見られる細胞質で機能することができる、宿主非依存的な真核性の遺伝子発現系を作出するのに有用であり得る。本発明によるこれらの細胞質キメラ酵素は、細胞毒性がなくアポトーシスを誘導せずに、真核性の細胞質内翻訳機構によって高度に翻訳可能な5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成することができる。細胞質で起こる導入遺伝子の転写と対照的に、内因性遺伝子の転写は真核細胞の核で起こるので、内因性遺伝子の転写と導入遺伝子の転写との間に競合もない。したがって、本発明による細胞質キメラ酵素は、大規模なアッセイおよびタンパク質産生に特に適する。本発明によるキメラ酵素の一実施形態では、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、単量体、すなわち1つのポリペプチドに含まれる。例えば、前記単量体は、本発明による単量体のキャッピング酵素または単量体のキメラ酵素であってもよい。特に、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、単量体のキャッピング酵素に含まれる。この場合、本発明によるキメラ酵素は、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインを含む単量体のキャッピング酵素を含む。前記単量体のキャッピング酵素は、単量体のウイルスのキャッピング酵素でよく、特に、RNA分子の5末端にm7GpppNキャップを付加することができる野生型のブルータングウイルスキャッピング酵素、野生型のタケモザイクウイルスキャッピング酵素、野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素、野生型の多食アメーバミミウイルスキャッピング酵素ならびにそれらの変異体および誘導体からなる群の中で選択される単量体のウイルスキャッピング酵素でよく、より詳細には、RNA分子の5末端にm7GpppNキャップを付加することができる野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素ならびにその変異体および誘導体からなる群の中で選択される単量体のウイルスキャッピング酵素でよく、さらにより詳細には、野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素であってもよい。特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは単量体、すなわち1つのポリペプチドに含めることができる。例えば、前記単量体は、単量体のDNA依存性RNAポリメラーゼまたは本発明による単量体のキメラ酵素であってもよい。特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは単量体のDNA依存性RNAポリメラーゼに含まれる。この場合、本発明によるキメラ酵素はDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインを含む単量体のDNA依存性RNAポリメラーゼを含む。前記単量体のDNA依存性RNAポリメラーゼは、単量体のファージのDNA依存性RNAポリメラーゼでよく、特に、二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5→3の向きで合成することができるT7RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼおよびSP6RNAポリメラーゼならびにそれらの変異体または誘導体からなる群の中で選択される単量体のファージのDNA依存性RNAポリメラーゼでよく、より詳細には、二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5→3の向きで合成することができるT7RNAポリメラーゼおよびその変異体または誘導体からなる群の中で選択される単量体のファージのDNA依存性RNAポリメラーゼであってもよい。DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインならびに、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインからなる群の中で選択される少なくとも1つの、好ましくは少なくとも2つ以上の、より好ましくは全ての触媒ドメインは、単量体に含むことができる。本発明によるキメラ酵素は、単量体またはオリゴマーであってもよい。実際、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、1つまたはいくつかのポリペプチドに含むことができる。好ましくは、本発明によるキメラ酵素は単量体である。実際、本発明者は、RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインを含む単量体のキメラ酵素が、細胞毒性がなくアポトーシスを誘導せずに、真核性の翻訳機構によって高度に翻訳可能な5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を合成することができることを実証した。その天然の高次構造を保たなければならない立体障害および構成要素および酵素が原因で、転写産物のキャッピングが単量体酵素を用いて十分に起こるか明らかでなかった。実際、新生RNA分子の5末端のm7GppNキャッピングを引き起こすと思われるが、T7転写産物のキャッピングは、融合酵素CTDT7RNAポリメラーゼでは達成できなかった。本発明による単量体のキメラ酵素は、特に、高価でなく、実施するのに迅速容易であるので、大規模なアッセイおよびタンパク質産生に特に適切であるという利点を有する。実際、単量体酵素の産生は、オリゴマー酵素の産生よりも容易である。単一ユニットしかないので、ユニット構築の問題もない。単量体酵素はまた、多量体酵素よりも扱いが簡単である。本明細書で使用する場合、DNA依存性RNAポリメラーゼという用語は、二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5→3の向きで合成するヌクレオチジルトランスフェラーゼに関する。好ましくは、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、比較的簡単な構造を有する酵素の触媒ドメインであり、より好ましくは、特徴付されたゲノムの酵素制御エレメントを有する酵素の触媒ドメインである。したがって、特にDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメイン、細菌のDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインまたは様々な真核性オルガネラのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインであってもよい。一実施形態では、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインはバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインである。バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼは、特に真核性RNAポリメラーゼよりも高い処理能力を有することで導入遺伝子の発現レベルを最適化するという利点を特に有する。バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼはまた、複数のサブユニットを持つ複合体構造を有する多くの核の真核性ポリメラーゼよりもより単純な構造を有する。今までに特徴付けられたバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの大部分は単一サブユニット酵素であり、それらは転写の開始、伸長または終結に関して補助蛋白質を必要としない。クローニングの由来となったバクテリオファージにちなんで名付けられたこれらの酵素のいくつかは、よく特徴付けられた、遺伝子組換えにとって重要なゲノム制御エレメントも有する。内因性遺伝子の転写と導入遺伝子の転写との間に競合もない。バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼ部分を含む本発明によるキメラ酵素は、任意の真核生物種においてRNA転写産物の産生を可能にする。それらは、高価でなく、実施するのに迅速容易であるので、大規模なアッセイおよびタンパク質産生に適切であり、RNAポリメラーゼIIなどの真核性RNAポリメラーゼと対照的にバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの大部分は転写の開始、伸長または終結に関して補助因子を必要としないので、任意の生物系においてRNA転写産物の産生を可能にする。バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメイン、特に、野生型のT7RNAポリメラーゼ、野生型のT3RNAポリメラーゼ、野生型のK11RNAポリメラーゼ、野生型のφA1122RNAポリメラーゼ、野生型のφYeo312RNAポリメラーゼおよび野生型のgh1RNAポリメラーゼ、野生型のK15RNAPRNAポリメラーゼおよび野生型のSP6RNAポリメラーゼの触媒ドメインならびに二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5→3の向きで合成することができるそれらの変異体または誘導体からなる群の中で選択される触媒ドメイン、より詳細には、野生型のT7RNAポリメラーゼの触媒ドメインであってもよい。本明細書で使用する場合、T7RNAポリメラーゼという用語はバクテリオファージのT7DNA依存性RNAポリメラーゼに関する。好ましくは、T7RNAポリメラーゼは、SEQIDN°1のアミノ酸配列を有し、分子量が988kDaである883アミノ酸のタンパク質である。T7RNAポリメラーゼは、invitroで極めて伸長性があり、37°Cで5→3の向きに240~250ヌクレオチド秒伸長するという利点を特に有する。そのうえ、真核細胞で発現させた際に、T7RNAポリメラーゼは細胞質に大部分が留まり、そのことによって真核細胞の細胞質から核への巨大なDNA分子の能動的な移行および核から細胞質へのRNA分子の運び出しが回避されることによって、導入遺伝子の発現レベルが最適化される。DNA依存性RNAポリメラーゼ触媒ドメインは、T7RNAポリメラーゼの野生型の触媒ドメインであってもよいが、処理能力が低下しても、二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5→3の向きに合成することができるT7RNAポリメラーゼの変異体の触媒ドメインでもよい。例えば、前記変異体は、R551S、F644A、Q649S、G645A、R627S、I810SおよびD812EならびにK631Mを含む群の中で選択することができる。本発明によるキメラ酵素の一実施形態では、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインに対してC末端に位置する。実際、DNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインがバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメイン、特にT7、T3およびSP6RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインの際は、前記触媒ドメインはその天然のカルボキシル末端を好ましくは保存する。特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのC末端、特にバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼC末端は、前記キメラ酵素のC末端と一致する。特に、キメラ酵素がバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの全体、特にT7、T3およびSP6RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの全体を含む際は、前記ポリメラーゼは、その天然のカルボキシル末端を好ましくは保存する。特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのC末端、特にバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼのC末端は、前記キメラ酵素のC末端に一致する。特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメイン、特に、T7、T3およびSP6RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの全部または一部に含まれ、ここでは、前記バクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼのC末端は、前記キメラ酵素のC末端に一致する。本発明によるキメラ酵素の一実施形態では、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメイン、特にバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメイン、特にT7、T3およびSP6RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインに対してC末端に位置する。別の実施形態では、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは細菌のDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインである。好ましくは、前記細菌のDNA依存性RNAポリメラーゼは、構造の複雑さが中程度である。例えば、前記細菌のDNA依存性RNAポリメラーゼは大腸菌のDNA依存性RNAポリメラーゼでよく、このポリメラーゼは4つの異なるサブユニットで構成され、これらのサブユニットは5つのααββσサブユニット複合体に会合する。大腸菌のRNAポリメラーゼのプロモーター、rho依存的および非依存的ターミネーターを含めた終結シグナルならびに転写中断配列を含めて、この酵素の活性制御に関わるゲノムエレメントはよく特徴付けられている。別の実施形態では、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、ミトコンドリア、葉緑体および原色素体のような真核性オルガネラのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインである。実際、これらのポリメラーゼも比較的簡単な構造を有し得る。特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、ミトコンドリアのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインである。特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、哺乳動物のマウスのミトコンドリアのRNAポリメラーゼの触媒ドメインでよく、このポリメラーゼは、単一ユニットの120kDaのタンパク質であり、バクテリオファージのRNAポリメラーゼと相同性を持つ。いくつかの転写因子、すなわちTFB1MまたはTFB2M、TFAMおよび転写終結に関するmTERFが転写の開始、伸長または終結に必要とされる。ミトコンドリアゲノムの軽鎖および重鎖にある2つのプロモーターならびに転写終結シグナルを含めて、ミトコンドリアRNAポリメラーゼの酵素活性制御に関わるゲノムエレメントはよく特徴付けられている。本明細書で使用する場合、RNAトリホスファターゼという用語は、新生mRNA前駆体の5三リン酸末端γリン酸残基を除去し二リン酸にする酵素に関する。本明細書で使用する場合、RNAグアニリルトランスフェラーゼという用語は、GTPから二リン酸新生RNA末端にGMPを移す酵素を指す。本明細書で使用する場合、N7グアニンメチルトランスフェラーゼという用語は、グアニンの7位の窒素にメチル残基を加えてGpppNキャップとする酵素に関する。RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、同じまたは異なったキャッピング酵素の触媒ドメインであってもよい。前記触媒ドメインが同じ酵素の触媒ドメインである場合、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは異なる酵素の触媒ドメインである。好ましくは、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、1つまたはいくつかの細胞質の酵素由来であり、それらは比較的簡単な構造およびよく特徴付けられた酵素活性を好都合なことに有する。したがって、特にRNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、1つまたはいくつかのウイルスキャッピング酵素の触媒ドメインまたは細胞質エピゾームのキャッピング酵素の触媒ドメインであってもよい。一実施形態では、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、1つまたはいくつかのウイルスキャッピング酵素に由来し、特に、新生mRNA前駆体5三リン酸末端のγリン酸残基を除去して二リン酸にすること、またはGTPからGMPを二リン酸新生RNA末端に移すこと、またはグアニンの7位の窒素にメチル残基を加えてGpppNキャップとすることがそれぞれできる、野生型のブルータングウイルスキャッピング酵素、野生型のタケモザイクウイルスキャッピング酵素、野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素、野生型の多食アメーバミミウイルスキャッピング酵素およびそれらの変異体または誘導体からなる群の中で選択されるキャッピング酵素に由来し、より詳細には、野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素に由来する。本明細書で使用する場合、ブルータングウイルスキャッピング酵素という用語は、ブルータングウイルスの単一ユニットのVP4キャッピング酵素に関する。この酵素は、76kDaタンパク質である。このキャッピング酵素は、そのカルボキシル末端近傍に位置するロイシンジッパーを介してホモ二量体化する可能性が高い。VP4は、mRNAのm7GpppNキャッピング合成に必要とされる3つ全ての酵素、すなわちRTPase、GTaseおよびN7MTaseの段階を触媒する。本明細書で使用する場合、タケモザイクウイルスキャッピング酵素という用語は、ORF1、すなわちタケモザイクウイルスのmRNAキャッピング酵素に関する。この酵素は単一ユニットの155kDaタンパク質である。ORF1タンパク質は、m7GpppNのmRNAキャッピングを生じるのに必要な全ての酵素活性、すなわちRTPase、GTaseおよびN7MTaseを有する。加えて、ORF1はRNA依存性RNAポリメラーゼ活性を有し、この活性は本発明によるキメラ酵素活性には必須ではなく、このmRNAキャッピング酵素のAsp1229Asp1230残基を欠損させることにより無効にすることができる。本明細書で使用する場合、アフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素という用語はNP868Rキャッピング酵素、に関する。この酵素は、単一ユニットの100kDaタンパク質である。本明細書で使用する場合、多食アメーバミミウイルスキャッピング酵素という用語はR382、に関する。これは、別の単一のユニット1365kDaタンパク質である。一実施形態では、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、pGKL2のような、細胞質のエピゾームの1つまたはいくつかのキャッピング酵素に由来する。特に、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインは、酵母の染色体外直線状エピゾームpGKL2のキャッピング酵素全部または一部に含まれる。細胞質の直線状エピゾームは二本鎖DNA構造であり、様々な酵母系統の細胞質で安定して複製する。酵母の染色体外直線状エピゾームの一プロトタイプ、pGKL2は、クルイベロミセスラクチスCB2359および出芽酵母F1022を含めた様々な酵母系統で全配列が決定されている。クルイベロミセスラクチスpGKL2のORF3遺伝子にコードされているキャッピング酵素は、594アミノ酸のタンパク質である。本発明によるキメラ酵素の一実施形態では、少なくとも2つの、特に少なくとも3つの、より特定すると全ての触媒ドメインを直接的に、または連結性ペプチドによって間接的に会合、融合または結合することができる。特に、RNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインからなる群の中で選択される、少なくとも2つ、特に少なくとも3つ、より特定すると全ての触媒ドメインが直接的に、または連結性ペプチドによって結合する。連結性ペプチドは、立体障害を最小限にし、融合タンパク質の構成要素に十分なスペースを提供してその天然の高次構造を保つ融合タンパク質を産生するという利点を有する。好ましくは、少なくともDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインからなる群の中で選択される触媒ドメインの少なくとも1つと連結性ペプチドによって結合する。特に、連結性ペプチドは、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメイン、特にT7、T3およびSP6RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対してN末端に、ならびにRNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインに対してC末端に位置することできる。特に、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのN末端、特にT7、T3およびSP6RNAポリメラーゼからなる群の中で選択されるバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのN末端は、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインからなる群の中で選択される触媒ドメイン1つのC末端に、共有結合、特に連結性ペプチドによって連結する。前記連結性ペプチドは、式nのペプチド配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択することができる。式nのフレキシブルなリンカーペプチドは、グリシン残基がペプチドに柔軟性を与え、一方セリンが多少の溶解性をもたらすという利点を有する。さらに、nリンカー配列にキモトリプシンI、第Xa因子、パパイン、プラスミン、トロンビンおよびトリプシンに対する感受性部位がないことによって、得られる融合タンパク質の全体的な安定性が増すはずである。可変長のnリンカーが単鎖Fv断片抗体を作成するのに一般に使用される。加えて、nリンカーが、融合タンパク質の各構成要素の生物活性を高頻度で保持する様々な融合タンパク質を作出するのに使用されている。GGGGIAPSMVGGGGS、SPNGASNSGSAPDTSSAPGSQ、EGKSSGSGSESKSTE、EGKSSGSGSESKEF、GGGSGGGSGGGTGGGSGGG、GSTSGSGKSSEGKG、YPRSIYIRRRHPSPSLTT、GSTSGSGKPGSGEGSTKG、GSTSGSGKPGSGEGS、SSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDA、GSADDAXXDAAXKDDAKKDDAKKDGS、LSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDL、AEAAAKEAAAKEAAAKA、GSHSGSGKP、GSTSGSGKPGSGEGSTGAGGAGSTSGSGKPSGEG、LSLEVAEEIARLEAEVおよびGTPTPTPTPTGEFなど、他のタイプのペプチドリンカーも本発明によるキメラ酵素を作出するのに検討可能である。他のタイプの共有結合には、これらに限定されないが、ジスルフィド結合、トランスグルタミネーションならびに化学薬品およびまたは物理的要因、例えばトリスルテニウムジクロリドおよび紫外線照射による架橋結合によるタンパク質のトランス結合が含まれる。RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒はドメイン、ロイシンジッパー、触媒ドメインの一方に対するビオチニル化ドメインまたはPFBtagおよび他方の触媒ドメインの1つに対するビオチン結合ドメインまたはNanotagのような、本発明によるキメラ酵素中の特定のタンパク質エレメントによっても会合可能である。本発明によるキメラ酵素の一実施形態では、前記触媒ドメインの少なくとも2つは非共有結合、特にロイシンジッパーによって会合することができる。好ましくは、少なくともDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびN7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインからなる群の中で選択される触媒ドメインの少なくとも1つに、非共有結合、特にロイシンジッパーによって会合する。互いに相互作用する両親媒性の2つのαヘリックスからなる、二量体のコイルドコイルタンパク質構造であるロイシンジッパーは、ホモまたはヘテロ二量体化タンパク質に一般に使用される。各へリックスは7アミノ酸リピートから構成され、この7アミノ酸の最初のアミノ酸は疎水性であり、4番目は通常ロイシンであるが、他の残基は極性である。平行なヘテロ二量体の2本鎖コイルドコイル構造を形成するロイシンジッパーのVELCROのACIDp1およびBASEp1は、平行なタンパク質ヘテロ二量体を形成する傾向が高い。これらは、膜タンパク質ならびにいくつかの可溶性タンパク質をヘテロ二量体化するのに使用されている。他のタイプのオリゴマー形成ペプチドドメイン、特にACIDa1BASEa1、ACIDKgBASEEg、NZCZ、ACIDpLLBASEpLLならびにEE1234LおよびRR1234Lロイシンジッパーなどの逆平行のヘテロマー構造を形成するロイシンジッパーも、本発明によるキメラ酵素を作出するのに、本発明によるキメラ酵素の前記触媒ドメインの少なくとも2つを会合するのに検討可能である。ジスルフィド結合バージョンのロイシンジッパーも本発明によるジスルフィドコイルドコイル結合ヘテロ二量体のキメラ酵素ならびに酸化条件下でのシステイン残基間の鎖間ジスルフィド架橋を作出するのに使用することができる。したがって、RNAトリホスファターゼの前記触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの前記触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの前記触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインの少なくとも2つは、ロイシンジッパー、特にACIDa1BASEa1、ACIDKgBASEEg、NZCZおよびACIDpLLBASEpLLロイシンジッパーのような逆平行のヘテロマー構造を形成するロイシンジッパー、ジスルフィドコイルドコイル結合ならびにシステイン残基間のジスルフィド架橋によって会合することができる。一実施形態では、本発明によるキメラ酵素は、特にリンカーを介して、より詳細には4リンカーを介して、RNA分子の5末端にm7GpppNキャップを付加することができるアフリカブタコレラウイルスの野生型のmRNAキャッピング酵素またはその変異体もしくは誘導体、特に野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素と、それと融合された二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5→3向きで合成することができる野生型のT7RNAポリメラーゼまたはその変異体もしくは誘導体のアミノ末端、特に野生型のT7RNAポリメラーゼのアミノ末端を含む。別の実施形態では、本発明によるキメラ酵素は、特にリンカーを介して、より詳細には、4リンカーを介して、RNA分子の5末端にm7GpppNキャップを付加することができるアフリカブタコレラウイルスの野生型のmRNAキャッピング酵素またはその変異体もしくは誘導体、特に野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素と、それと融合された二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5→3の向きで合成することができる野生型のT3RNAポリメラーゼまたはその変異体もしくは誘導体のアミノ末端、特に野生型のT3RNAポリメラーゼアミノ末端を含む。別の実施形態では、本発明によるキメラ酵素は、特にリンカーを介して、より詳細には4リンカーを介して、RNA分子の5末端にm7GpppNキャップを付加することができるアフリカブタコレラウイルスの野生型のmRNAキャッピング酵素またはその変異体もしくは誘導体、特に野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素と、それと融合された二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5→3の向きに合成することができる野生型のSP6RNAポリメラーゼまたはその変異体または誘導体のアミノ末端、特に野生型のSP6RNAポリメラーゼのアミノ末端を含む。別の実施形態では、本発明によるキメラ酵素は、ロイシンジッパーによって会合するRNA分子の5末端にm7GpppNキャップを付加することができるアフリカブタコレラウイルスの野生型のmRNAキャッピング酵素またはその変異体もしくは誘導体、特に野生型のアフリカブタコレラウイルスキャッピング酵素および二本鎖鋳型DNAに対して配列が相補的な一本鎖RNAを5→3の向きで合成することができる野生型のT7RNAポリメラーゼまたはその変異体ならびに誘導体のアミノ末端、特に野生型のT7RNAポリメラーゼのアミノ末端を含む。本発明によるキメラ酵素は、本発明のキメラ酵素の少なくとも1つの触媒ドメインの活性、特にRNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、グアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン、N7グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインからなる群の中で選択される少なくとも1つの触媒ドメインの活性を増強するドメインをさらに含むこともできる。例えば、本発明のキメラ酵素の少なくとも1つの触媒ドメインの活性を増強する前記ドメインは、ワクシニアウイルスD12L遺伝子にコードされる31kDaサブユニットでよく、このサブユニットは固有の酵素活性は持たないが、ワクシニアのmRNAキャッピング酵素のD1RサブユニットのRNAN7グアニンメチルトランスフェラーゼ活性を強烈に増強する。一実施形態では、本発明のキメラ酵素は、ワクシニアmRNAキャッピング酵素の少なくとも1つの触媒ドメイン、特に、RNAトリホスファターゼ、RNAグアニリルトランスフェラーゼおよびRNAN7グアニンメチルトランスフェラーゼの酵素活性を有し、ワクシニアウイルスD1R遺伝子にコードされる95kDaサブユニット少なくとも1つのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメイン、特にT7、T3およびSP6RNAポリメラーゼからなる群の中で選択される触媒ドメイン、より詳細にはT7RNAポリメラーゼの触媒ドメインおよびワクシニアウイルスのD12L遺伝子によってコードされる31kDaサブユニットを含み、特にリンカーを介して、より詳細には4リンカーを介して、およびまたはロイシンジッパーによって全部または一部が会合する。本発明は、単離核酸分子または単離核酸分子群にも関する。前記核酸分子は、本発明によるキメラ酵素をコードする。本発明によるキメラ酵素をコードする前記単離核酸分子群は、その発現によって本発明によるキメラ酵素を得るのに必要かつ十分な全ての核酸分子を含むまたはそのような核酸分子から構成される。一実施形態では、本発明によるキメラ酵素をコードする前記単離核酸分子群は、少なくとも1つのRNAトリホスファターゼの触媒ドメイン、少なくとも1つのグアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよび少なくとも1つのN7グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインをコードする核酸分子ならびに少なくとも1つのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインをコードする核酸分子を含むまたはそれらから構成される。別の実施形態では、本発明によるキメラ酵素をコードする前記単離核酸分子群は、少なくとも1つのRNAトリホスファターゼの触媒ドメインをコードする核酸分子、少なくとも1つのグアニリルトランスフェラーゼの触媒ドメインをコードする核酸分子、少なくとも1つのN7グアニンメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインをコードする核酸分子および少なくとも1つのDNA依存性RNAポリメラーゼの触媒ドメインをコードする核酸分子を含むまたはそれらから構成される。特に、本発明による核酸分子は、真核性DNA依存性RNAポリメラーゼ、好ましくはRNAポリメラーゼIIに対するプロモーターおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターからなる群から選択される少なくとも1つの、好ましくは全てのプロモーターに作動可能に連結することができる。真核性DNA依存性RNAポリメラーゼ、好ましくはRNAポリメラーゼIIに対するプロモーターと核酸の連結は、真核性宿主細胞で本発明のキメラ酵素を発現させる際に、キメラ酵素の発現が真核性RNAポリメラーゼ、好ましくはRNAポリメラーゼIIによって駆動するという利点を特に有する。次に、これらのキメラ酵素は導入遺伝子の転写を開始することができる。組織特異的RNAポリメラーゼIIプロモーターを使用する場合、本発明のキメラ酵素を標的組織細胞で選択的に発現させることができる。前記プロモーターは、当業者に周知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってもよい。このプロモーターは、発達的制御性、誘導性または組織特異的であってもよい。本発明は、本発明による核酸分子を含むベクターにも関する。前記ベクターは、半安定的または安定的発現に供してよい。本発明は、本発明による前記単離核酸分子群を含むベクター群にも関する。特に、本発明による前記ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターである。ベクターは、バクテリオファージなどのウイルスベクターまたはプラスミドベクターなどの非ウイルスベクターであってもよい。一実施形態では、本発明による前記ベクターはバイシストロニックなベクターであり、特に、本発明による核酸分子およびDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインおよびまたは少なくとも1つの目的DNA配列に対するプロモーターを含み、ここでは、前記DNA配列は、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのプロモーターに作動可能に連結される。本発明による前記ベクターは、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターを含んでもよい。本発明は、本発明による単離核酸分子もしくは本発明による単離核酸分子群または本発明によるベクターもしくは本発明によるベクター群を含む宿主細胞にも関する。本発明による宿主細胞は、大規模なタンパク質産生に有用であり得る。好ましくは、本発明によるDNAポリメラーゼRNAポリメラーゼキメラ酵素の前記触媒ドメインは、内因性遺伝子の転写と導入遺伝子の転写との競合を防ぐために、宿主細胞のものとは異なる酵素由来である。本発明は、発明によるキメラ酵素を発現させた遺伝子改変したヒト以外の真核生物にも関する。前記ヒト以外の真核生物は、ヒト以外の任意の動物、植物であってもよい。本発明は、5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子を産生するための、本発明によるキメラ酵素または本発明による単離核酸分子もしくは本発明による単離核酸分子群の、特にinvitroまたはexvivoでの使用にも関する。本発明は、タンパク質、特に抗体のような治療上有益なタンパク質を、特にinvitro合成タンパク質アッセイまたは培養細胞などの真核生物系で産生するための、本発明によるキメラ酵素または本発明による単離核酸分子もしくは本発明による単離核酸分子群のinvitroまたはexvivoでの使用にも関する。本発明は、特にinvitroまたはexvivoにおいて、5末端にm7GpppNキャップを有する、DNA配列にコードされたRNA分子を宿主細胞で産生する方法にも関し、前記方法は、本発明による核酸分子または核酸分子群を宿主細胞で発現させる工程を含み、前記DNA配列はDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーター、特に前記宿主細胞で有効な前記プロモーターに作動可能に連結される。好ましくは、本発明によるキメラ酵素のDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインは、内因性遺伝子の転写と前記DNA配列の転写との競合を防ぐために、宿主細胞のものと異なる酵素に由来する。特に、本発明による前記方法は、リン酸カルシウムを用いるトランスフェクション、エレクトロポレーションまたは陽イオン脂質とDNAを混合してリポソームを産生することによるような当業者に周知の方法で、前記DNA配列およびまたは本発明による核酸を宿主細胞へ導入する工程をさらに含むことができる。一実施形態では、本発明による前記方法は、前記宿主細胞の細胞内転写および転写後機構を抑制する工程、特にサイレンシングをさらに含む。一実施形態では、本発明による前記方法は、前記宿主細胞の内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼのサブユニットおよびまたは内因性のキャッピング酵素のサブユニットの少なくとも1つの発現を抑制する工程をさらに含む。前記追加工程サイレンシングすること、ならびにあるいは前記宿主細胞の内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼの1つもしくはいくつかのサブユニットおよびまたは内因性のキャッピング酵素の1つまたはいくつかのサブユニットの発現を抑制することによって、5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子合成の最適化が可能になる。本明細書で使用する場合、内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼという用語は、前記宿主細胞の内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼに関する。宿主細胞が真核細胞の際は、前記内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼはRNAポリメラーゼIIである。本明細書で使用する場合、内因性のキャッピング酵素という用語は、前記宿主細胞の内因性のキャッピング酵素を指す。本明細書で使用する場合、タンパク質の発現抑制という用語は、前記タンパク質の発現が少なくとも20、特に少なくとも35、少なくとも50、より特定すると少なくとも65、少なくとも80、少なくとも90減少することに関する。タンパク質の発現抑制は、これらに限定されないが、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、RTPCRを含めた当業者に周知の技術によって決定することができる。前記宿主細胞の内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼおよびまたは内因性のキャッピング酵素の発現抑制の工程は、これらに限定されないが、前記内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼおよびまたは内因性のキャッピング酵素を標的にするsiRNA技術、前記内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼおよびまたは内因性のキャッピング酵素を標的にするアンチセンスRNA技術、前記内因性のDNA依存性RNAポリメラーゼおよびまたは内因性のキャッピング酵素を標的にするshRNA技術を含めた、任意の当業者に周知の技術によって実施することができる。同じ目的で、siRNAに加えて、DNAまたはRNAアンチセンス、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイムまたはキメラsnRNAU1アンチセンス標的配列を含めた他の抑制配列も検討可能であろう。加えて、細胞の転写、転写後プロセシングおよびmRNAの核外移行経路に含まれる他の遺伝子を含めた、他の細胞の標的遺伝子が抑制に関して検討可能であろう。一実施形態では、本発明による方法は、前記RNA分子が治療上有益なポリペプチドをコードすることができる。別の実施形態では、前記RNA分子は、siRNA、リボザイム、shRNAおよびアンチセンスRNAを含む群から選択されるノンコーディングRNA分子であってもよい。特に、前記DNA配列は、mRNA、ノンコーディングRNA、特にsiRNA、リボザイム、shRNAおよびアンチセンスRNAからなる群の中で選択されるRNA分子をコードすることができる。本発明は、キャッピング酵素およびDNA依存性RNAポリメラーゼとしての本発明によるキメラ酵素の使用にも関する。本発明は、5末端にm7GpppNキャップを有するRNA分子の産生のためのキットにも関する。このキットは、少なくとも1つの本発明によるキメラ酵素、ならびにまたは本発明による単離核酸分子およびもしくは核酸分子群、ならびにまたは本発明によるベクターおよびもしくは本発明によるベクター群を備える。一実施形態では、本発明のキットは、本発明によるベクターおよびまたは本発明によるベクター群を備え、前記ベクターは、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターおよびまたはDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターに作動可能に連結された、少なくとも1つの対象DNA配列を備える。本発明によるキットは、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターを含むベクターおよびまたはDNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインに対するプロモーターに作動可能に連結された、少なくとも1つの対象DNA配列をさらに備えることができる。本発明は、特に、好ましくは遺伝子治療による、ヒトまたは動物の病状の予防およびまたは治療のための医薬として使用するための、本発明によるキメラ酵素、本発明による単離核酸分子、本発明による核酸分子群または本発明によるベクターにも関する。本発明は、本発明によるキメラ酵素、ならびにまたは本発明による単離核酸分子およびもしくは本発明による核酸分子群、ならびにまたは本発明によるベクターを含む医薬組成物にも関する。好ましくは、本発明による前記医薬組成物は薬学的に許容可能な担体で製剤化される。薬学的に許容可能な担体は当業者に周知である。本発明による医薬組成物は、DNA依存性RNAポリメラーゼの前記触媒ドメインのプロモーターに対して作動可能に連結された、少なくとも1つの対象DNA配列をさらに含むことができる。そのような構成要素は、本発明による医薬組成物または医薬に治療量で存在してよい。そのような治療量は、本発明による前記医薬組成物または医薬の投与によって予防およびまたは治療されることが検討される病状およびまたは障害に対して前記構成要素の投与が与える影響の評価を含めたルーチン試験により当業者によって決定することができる。例えば、そのような試験は、異なる量の前記構成要素の投与が前記病状およびまたは前記障害に特有のマーカー一式に対して与える量的および質的の両影響を、被験者の生物学的試料から分析することによって実施することができる。本発明は、本発明によるキメラ酵素、ならびにまたは本発明による単離核酸分子およびもしくは本発明による核酸分子群、ならびにまたは本発明によるベクターおよびもしくは本発明によるベクター群を、それを必要とする患者に治療量で投与することを含む治療方法にも関する。本発明による治療方法は、少なくとも1つの目的DNA配列を治療量でそれを必要とする被験者に投与することをさらに含むことができる。前記キメラ酵素、核酸分子およびまたは本発明による前記ベクターは、前記目的DNA配列と同時に、別々にまたは連続して、特に前記目的DNA配列の前に投与することができる。本発明は、特に遺伝子治療による、ヒトまたは動物の病状の予防およびまたは治療に使用するための本発明による医薬組成物にも関する。前記病状は、前記の少なくとも1つの目的DNA配列の投与によって改善され得る病状からなる群から選択することができる。本発明は、特に遺伝子治療によるヒトまたは動物の病状の予防およびまたは治療のために、本発明によるキメラ酵素、ならびにまたは本発明による単離核酸分子およびもしくは本発明による核酸分子群、ならびにまたは本発明によるベクターおよびもしくは本発明によるベクター群を医薬製造へ使用することにも関する。本発明は、少なくとも1つの本発明による酵素、ならびにまたは少なくとも1つの本発明による核酸分子およびもしくは本発明による核酸分子群、ならびにまたは本発明による核酸分子およびもしくは本発明による核酸分子群を含むかつまたは発現させる少なくとも1つの本発明によるベクターおよび少なくとも1つの目的DNA配列を含む、同時、分離または連続投与のための併用製品にも関する。前記目的DNA配列は、抗癌遺伝子であってもよい。前記目的DNA配列は、治療上有益なポリペプチドまたはsiRNA、リボザイム、shRNAおよびアンチセンスRNAを含む群の中で選択されるノンコーディングRNAをコードすることができる。前記治療上有益なポリペプチドは、サイトカイン、細胞のまたは核の受容体、リガンド、凝固因子、CFTRタンパク質、インスリン、ジストロフィン、成長ホルモン、酵素、酵素阻害剤、抗悪性腫瘍効果を有するポリペプチド、細菌性、寄生虫性またはウイルス性感染、特にHIV感染を抑制することができるポリペプチド、抗体、毒素、免疫毒素、RNAポリメラーゼIIのサブユニットおよびマーカーから選択することができる。好ましくは、本発明による併用製品は、薬学的に許容可能な担体で製剤化することができる。本発明による併用製品の一実施形態では、前記ベクターは前記目的DNA配列の前に投与される。本発明は、特に遺伝子治療によるヒトまたは動物の病状の予防およびまたは治療に使用するための本発明による併用製品にも関する。前記病状は、上で述べたような、少なくとも1つの目的DNA配列の投与によって改善され得る病状からなる群から選択することができる。例えば、前記病状ならびにその臨床的、生物学的または遺伝的サブタイプは、癌およびその素因、悪性血液障害、血液凝固障害および1次止血障害、異常血色素症、自己免疫障害、心血管系症状、代謝異常、感染性疾患、筋障害、呼吸器疾患、腎臟疾患、肝疾患、結腸直腸障害、眼障害特に網膜疾患、中枢神経系障害ならびに皮膚障害および結合組織障害を含む群から選択することができる。一実施形態では、本発明の併用製品は、本発明による核酸分子およびまたは本発明による核酸分子群を含むかつ発現させる少なくとも1つのベクターおよび少なくとも1つの目的DNA配列を含む。本発明は、ヒトまたは動物のαアマニチンによる肝毒性の、遺伝子治療による予防およびまたは治療に使用するための、この併用製品にも関する。本発明は、本発明のキメラ酵素をコードする前記核酸分子または前記核酸分子群を、少なくとも1つの宿主細胞で、前記核酸分子の発現を前記宿主細胞で可能にする条件で発現させる工程を含む、本発明によるキメラ酵素の製造方法にも関する。本発明は、本発明のキメラ酵素をコードする前記核酸分子群の一部を第一の宿主細胞で前記核酸分子の発現を前記宿主細胞で可能にする条件で発現させ、本発明のキメラ酵素の第一部分を得る工程と、本発明のキメラ酵素をコードする前記核酸分子群の他の部分を第二の宿主細胞で前記核酸分子の発現を前記宿主細胞で可能にする条件で発現させ、本発明のキメラ酵素の第二部分を得る工程と、前記第一部分および前記第二部分を会合させて、本発明のキメラ酵素を得る工程とを含む、本発明によるキメラ酵素を製造する方法にも関する。本発明について以下の実施例を用いて詳細に説明することにするが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。活性な単量体キメラ酵素NP868RT7RNAPの実施例IプラスミドNP868R、すなわちアフリカブタコレラウイルスのmRNAキャッピング酵素とバクテリオファージT7の野生型のファージDNA依存性RNAポリメラーゼとの融合物をコードする1つのプラスミドを合成した。このキャッピング酵素は、4リンカーを介してT7RNAポリメラーゼのアミノ末端に融合した。このpNP868RT7RNAPプラスミドを使用して、ホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現アッセイでコードされる酵素の活性を評価した。手短に言えば、pNP868RT7RNAPおよびpT7pルシフェラーゼプラスミドをヒトHEK293培養細胞へ同時にトランスフェクションした。NP868RT7RNAP酵素の発現は、対応するプラスミドのRNAポリメラーゼII依存性CMVプロモーターで駆動する。次に、NP868RT7RNAP酵素は、T7プロモーターからpT7pルシフェラーゼプラスミドの転写を開始することが期待される。NP868RT7RNAP酵素のmRNAキャッピングおよびDNA依存性RNAPの両酵素活性が保持されている際は、m7GpppGmキャップ構造を有するルシフェラーゼmRNAが合成されることになり、次にホタルルシフェラーゼタンパク質に翻訳され得、細胞発光アッセイで検出することができる。加えて、pNP868RT7RNAPプラスミドを使用して、HEK293細胞における酵素の細胞分布ならびに酵素の発現に関連する細胞生存率、細胞毒性およびアポトーシスを調べた。NP868RT7RNAPおよびT7RNAP酵素をコードするプラスミドを、GeneArtAGによって四工程で合成した。pT7RNAプラスミドによってコードされるタンパク質配列は、配列番号19に対応する。pNP868RT7RNAPプラスミドによってコードされるタンパク質配列は、配列番号20に対応する。第一に、T7RNAポリメラーゼプロモーターおよびマルチプルクローニングサイトを含むDNA断片をpCMVScriptプラスミドから除去した。第二に、カセットをpCMVScriptのプラスミドのCMVプロモーターとSV40ポリアデニリル化シグナルとの間に導入した。このカセットは、Lacオペレーターのステムループ、MCS、ポリA領域およびΤΦクラスIヘアピンターミネーターシグナルから構成されていた。第三に、翻訳開始のコザックコンセンサス配列、それに続くNP868RT7RNAPまたはT7RNAP酵素の全翻訳領域をPCRに基づく方法を使用して合成オリゴヌクレオチドから構築し、クローニングし、全配列を確認した。NP868RT7RNAPのORFおよびT7RNAPのORFを、好ましいコドン使用頻度への変更、潜在的なスプライス部位およびポリシグナルなどのシスエレメントの除去ならびに直列反復配列および二次構造要素の除去によるmRNA安定性の改善によって最適化した。第四に、NP868RT7RNAPまたはT7RNAPのそれぞれの全ORFをカセット中のMCSにサブクローニングして、pNP868RT7RNAPプラスミドおよびpT7RNAPプラスミドを得た。構築方法の結果として、2つの余分なアミノ酸がコザック配列のATGの直ぐ下流に付加され、他の2つが4リンカーの直ぐ上流に付加され、2つがNP868RT7RNAP酵素のこのリンカーの直ぐ下流に付加された。最後に、pNP868RT7RNAPおよびpT7RNAPプラスミドは、以下の設計、すなわちCMVプロモーター、コザック配列に続いてNP868RT7RNAPまたはT7RNAPのORF、ポリA領域、ファージRNAポリメラーゼの転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有していた。ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする2種のプラスミドをEurofinsMWGOperonによって合成した。pET22bRNAPpルシフェラーゼプラスミドを本発明によるキメラ酵素の活性のアッセイ用に設計した。試験用の配列を、一連のRNAポリメラーゼプロモーター、Lacオペレーターステムループ配列、ホタルルシフェラーゼの全ORF、ポリA領域、RNA自己切断配列をコードするD型肝炎リボザイムおよびファージRNAポリメラーゼの転写用のΤΦターミネーターから構成されるpET22b骨格に導入した。ルシフェラーゼORFとT7プロモーターとの間の物理的接続を切断したBamHI消化バージョンのpT7pルシフェラーゼプラスミドも陰性対照として使用した。さらに、活性対照として使用したpCMVルシフェラーゼプラスミドは、pCMVScriptプラスミドのRNAポリメラーゼII依存性CMVプロモーター下流にホタルルシフェラーゼを含む。II細胞培養およびトランスフェクションヒト胚性腎臓293細胞を5C02、37°Cで生育させた。細胞は、397mMのLアラニルLグルタミン、10のウシ胎仔血清、1の非必須アミノ酸、1のペニシリンおよびストレプトマイシンならびに02のファンギゾンを追加したダルベッコ変法イーグル培地中で維持した。トランスフェクションの前日に、ウェルあたり約8×104細胞密度で24ウェルプレート中にHEK293細胞を蒔いた。トランスフェクションの一時間前に、抗生物質なしの新鮮な完全培地に培地を交換した。トランスフェクションは、リポフェクタミン2000を使用して製造者の推奨に従って実施した。手短に言えば、OptiMEMI血清使用量低減培地に希釈しリポフェクタミン2000と混合したプラスミドDNAを細胞培地に添加した。トランスフェクションに引き続き、細胞を120時間までインキュベートし、その後ルシフェラーゼおよびSEAP遺伝子のレポーター発現を試験した。pT7pルシフェラーゼレポータープラスミドと共にpT7RNAPまたはpNP868RT7RNAPで細胞を同時にトランスフェクションした。一連の他のトランスフェクション条件を陰性対照として使用し、これらには、ルシフェラーゼORFとT7プロモーターとの間の物理的接続を切断するBamHI制限酵素でpT7pルシフェラーゼが消化されていることを除いて、上記と同じ同時トランスフェクション、pNP868RT7RNAPまたはpT7RNAPプラスミド単独、消化または未消化pT7pルシフェラーゼレポータープラスミド単独、トランスフェクション試薬単独が含まれる。pORFeSEAPプラスミドおよびpCMVT7RNAPプラスミドでも細胞をトランスフェクションした。IIIホタルルシフェラーゼ発光アッセイおよびSEAP比色アッセイホタルルシフェラーゼ発光は、ルシフェラーゼアッセイシステムを使用して製造者の推奨に従ってアッセイした。手短に言えば、細胞培養溶解試薬溶解バッファー中でHEK293細胞を溶解し、12000×gで2分間4°Cで遠心分離し、ルシフェラーゼアッセイ発光試薬を上清に添加した。発光をルミノメーターリーダーで製造者の説明に従って読み取った。pORFeSEAPプラスミドの発現を使用して、トランスフェクション効率を標準化した。このプラスミドは、胎盤分泌アルカリホスファターゼをコードし、SEAPは、QuantiBlue比色酵素アッセイキットを使用して、選択した時点で細胞培養培地中で酵素活性をアッセイする。レポーター遺伝子の発現をトランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光として表し、次にSEAPの吸光度で割ってトランスフェクション効率比を標準化した。IV統計解析全ての統計解析は、必要に応じて多重検定に関してホルムボンフェローニの補正によって調整した、スチューデントの両側t検定で実施した。005未満のP値を有意であるとみなした。Vレポーター遺伝子発現アッセイホタルルシフェラーゼレポーター発光アッセイを使用して、本発明によるキメラ酵素またはT7RNAP酵素によって作り出されたmRNAの翻訳能力を評価した。pT7RNAPとpT7pルシフェラーゼプラスミドとの同時トランスフェクションによって、pT7RNAPpT7pルシフェラーゼプラスミドのBamHI消化バージョンを同時にトランスフェクションした細胞と比較して、低いけれども検出可能なルシフェラーゼ発現シグナルが引き起こされた。これは、真核細胞で発現させたT7RNAPは、5キャッピングの欠如のために翻訳されにくいRNA分子を合成することができることを示した以前の公表報告と一致する。pT7RNAPプラスミドなしまたはpT7pルシフェラーゼプラスミドなしまたは両方なしでトランスフェクションを実施した際も、ホタルルシフェラーゼ遺伝子発現シグナルの強烈な減少が観察された。pNP868RT7RNAPプラスミドをpT7pルシフェラーゼプラスミドと同時にトランスフェクションし、上記と同じ条件下で試験した。最高時において、pT7RNAPpT7pルシフェラーゼプラスミドの使用よりも約23倍高いルシフェラーゼ発現シグナルが、pNP868RT7RNAPpT7pルシフェラーゼの使用で観察された。上記の発見の特異性は、ルシフェラーゼ発現シグナルの強烈な減少をもたらしたpT7pルシフェラーゼプラスミドのBamHI消化バージョンの同時トランスフェクション、ならびに消化されたpNP868RT7RNAPもしくはpT7pルシフェラーゼプラスミドまたは両方によるトランスフェクションによって確証された。最高時において、pNP868RT7RNAPpT7pルシフェラーゼプラスミドの同時トランスフェクションは、pCMVT7RNAPプラスミドのシグナルに対して72のルシフェラーゼ発現シグナルをもたらした。要約すると、pNP868RT7RNAPプラスミドによってコードされる本発明によるキメラNP868RT7RNAP酵素の活性をホタルルシフェラーゼレポーター発光アッセイを使用し実証した。本発見の特異性は一連のコントロールによって支持され、このことは、HEK293細胞で発現させた際に、NP868RT7RNAP酵素のmRNAキャッピングおよびDNA依存性RNAポリメラーゼの両酵素活性が保持されることを示唆するものである。VIαアマニチン処理細胞における遺伝子レポーター発現アッセイpNP868RT7RNAPによる転写がファージのDNA依存性T7RNAポリメラーゼ部分に依存していることをさらに実証するために、αアマニチン処理細胞での遺伝子トランスフェクションアッセイも実施した。αアマニチンは核のRNAポリメラーゼIIの特異的阻害剤であり、核のRNAポリメラーゼIIのRpb1サブユニットに結合する。対照的に、αアマニチンは、本発明によるキメラ酵素NP868RT7RNAPを設計するのに使用したファージT7RNAポリメラーゼによる転写には作用しない。RNAポリメラーゼII依存性CMVプロモーターで駆動するNP868RT7RNAP酵素の発現を惹起するために、αアマニチンの細胞培地への添加およびpT7pルシフェラーゼプラスミドを用いた第二のトランスフェクションの24時間前に、pNP868RT7RNAPを細胞へトランスフェクションした。pCMVルシフェラーゼプラスミドについては、細胞を同時にトランスフェクションし、αアマニチンで処理した。レポーター遺伝子の発現をトランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験細胞のルシフェラーゼ発光として表し、次にSEAPの吸光度で割ってトランスフェクション効率比を標準化した。期待通りに、αアマニチンは、pCMVルシフェラーゼでトランスフェクションした細胞のホタルルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現をほぼ完全に無効にした。対照的に、pNP868RT7RNAPpT7pルシフェラーゼをトランスフェクションした細胞では、全ての濃度のαアマニチンは、ルシフェラーゼ発現を軽く減少させたのみであった。したがって、本発見は、NP868RT7RNAP酵素による転写は、そのファージDNA依存性T7RNAポリメラーゼ部分の酵素活性に依存していることを確証するものである。VII免疫蛍光法間接免疫蛍光法によって、NP868RT7RNAP酵素の細胞内分布を調べた。ポリLリジンでコーティングしたカバーガラス上の24ウェルプレートに8×104細胞ウェルでHEK293細胞を蒔き、次に上記のようにトランスフェクションした。トランスフェクション後6時間および24時間目に、リン酸緩衝食塩水中で細胞を洗浄し、次に4パラホルムアルデヒドで15分間固定した。固定後PBSで細胞を洗浄し、次に5ヤギ血清、01トリトンX100および002アジ化ナトリウムを含むPBS中で30分間透過処理した。T7RNAポリメラーゼに対するマウスモノクローナル抗体と共に細胞を4°Cで一晩インキュベートした。PBSで十分に洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスIgGと共に室温で3時間細胞をインキュベートした。46ジアミジノ2フェニルインドールで5分間細胞核を染色した。次に細胞を洗浄し、蛍光退色防止培地Mowiol488にマウントした。適切なフィルターを使用した落射蛍光顕微鏡で細胞を解析した。期待通りに、弱いけれども検出可能なFITCシグナルがpNP868RT7RNAPプラスミドでトランスフェクションした細胞の細胞質で6時間および24時間目の両方で観察され、一方その細胞の核はDAPIで染色された。VIII細胞生存率、細胞毒性およびアポトーシスアッセイApoToxGloTriplexAssayを使用して、NP868RT7RNAP酵素の発現が生存率を害するか、またはトランスフェクションした細胞の毒性もしくはアポトーシスを誘導するかを調べた。2種のプロテアーゼ活性、すなわち1つは細胞生存率マーカーであり、もう1つは細胞毒性マーカーを蛍光によってアッセイした。アポトーシスは、テトラペプチド配列DEVDを含む発光性カスパーゼ37基質で、カスパーゼ活性に最適化した試薬中でアッセイした。ウェルあたり12×104細胞の密度範囲で96ウェルプレートにHEK293細胞を蒔いたことを除いて、細胞培養およびトランスフェクションを上記のように実施した。pNP868RT7RNAPプラスミド、pT7RNAPプラスミドまたはトランスフェクション試薬のみで細胞にトランスフェクションした。製造者の推奨に従ってApoToxGloTriplexAssayを実施した。手短に言えば、GFAFC基質およびビスAAFR110基質の両方を含む生存率細胞毒性試薬を選択した時点でウェルに添加し、37°Cで30分間インキュベートした後、生存率および細胞毒性用の2つの異なる波長セットで蛍光評価を行った。その後、カスパーゼ試薬を全てのウェルに添加して、室温で30分インキュベートした後に発光を測定した。上記のように統計解析を実施した。細胞生存率、細胞毒性およびアポトーシスレベルは、無処理の細胞の発光蛍光を差し引いた、試験細胞の発光蛍光シグナルとして表した。以前に報告されているように、細胞生存率、細胞毒性およびアポトーシスは、無処理の細胞と比較して、トランスフェクション試薬で処理した細胞において有意に害された。また期待通りに、プラスミドDNAをトランスフェクション混合物に添加した際に、細胞生存率、細胞毒性およびアポトーシスは、概してさらに害された。しかし、pNP868RT7RNAPプラスミドでトランスフェクションした細胞の細胞生存率、細胞毒性またはアポトーシスのマーカーは、細胞生存率のトランスフェクション後24時間目のみを除いて、試験した全ての時点で、pT7RNAPプラスミドの各マーカーと統計的に違いはなかった。結論として、キャッピング酵素活性が認められないT7RNAPと比較して、NP868RT7RNAP酵素の細胞毒性、細胞生存率およびアポトーシスに明らかな違いがないことを実証することができる。活性な単量体キメラ酵素NP868RT3RNAPおよびNP868RSP6RNAPの実施例野生型の単量体T3またはSP6バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼのアミノ末端にフレキシブルなリンカー4を介して融合したNP868R、すなわち単量体のアフリカブタコレラウイルスmRNAキャッピング酵素から構成される、本発明による単量体のキメラ酵素の2つの他のタイプを作出した。I方法前記単量体のキメラ酵素を作出するのに使用する配列は、PCRに基づく方法を使用して合成オリゴヌクレオチドから構築し、クローニングし、全配列を確認した。これらの配列を先に述べたサブクローニングカセットを含むpCMVScriptプラスミドにサブクローニングした。最後に、発現に使用する全てのプラスミドは、類似の設計、すなわちCMVIE1プロモーターエンハンサープロモーター、コザック配列に続いてORF、ポリA領域、ファージRNAポリメラーゼの転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有していた。サブクローニング方法の結果として、プラスミドでコードされるコザック配列のATGの直ぐ下流にアミノ酸が付加された。加えて、2つのアミノ酸が4リンカーの直ぐ上流または下流に付加された。上記のようにHEK293細胞を24ウェルプレートで生育させ、リポフェクタミン2000試薬および適切なプラスミドでトランスフェクションした。pT7pルシフェラーゼおよびルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、上記のようにホタルルシフェラーゼ発光をアッセイした。上記のように、pORFeSEAPプラスミドの発現を使用してトランスフェクション効率を標準化した。必要に応じて多重検定に関してホルムボンフェローニの補正によって調整した、スチューデントの両側t検定を使用して統計解析を実施した。005未満のP値を統計的に有意であるとみなした。II結果図8に示すように、レポーターpT7pルシフェラーゼプラスミドと共にトランスフェクションした際は、pNP868RT3RNAPおよびNP868RSP6RNAPの両方が強いルシフェラーゼ遺伝子のレポーターシグナルを示し、そのシグナルは、それぞれpT3RNAPまたはpSP6RNAPよりも14倍および56倍高かった。NP868RT3RNAP酵素は、pCMVT7RNAPプラスミドの活性に対して36の活性であるが、一方NP868RSP6RNAPヘテロ二量体酵素は、pCMVT7RNAPプラスミドの発現に対して11倍のルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を示す。これらの結果は、本発明による異なるタイプの単量体のキメラ酵素の活性を実証するものである。活性な二量体および三量体キメラ酵素の実施例本発明による異なるタイプの活性なオリゴマーキメラ酵素を図9に示すように作出した。EE1234LおよびRR1234Lロイシンジッパーを介する、単量体のアフリカブタコレラウイルスmRNAキャッピング酵素NP868Rと単量体のT7RNAポリメラーゼとの非共有結合の結果得られる、1つのヘテロ二量体キメラ酵素。これは、ヘテロ二量体のRR1234LpNP868REE1234LT7RNAPキメラ酵素を形成する。ワクシニアウイルスのmRNAキャッピング酵素の2つの各サブユニットと単量体のT7RNAポリメラーゼとのフレキシブルな4リンカーを介する融合によって得られる、2つのヘテロ二量体のキメラ酵素。各融合タンパク質をワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素の他のサブユニットと共発現させ、ヘテロ二量体のD12LD1T7RNAPおよびD1RD12LT7RNAPキメラ酵素を形成する。EE1234LおよびRR1234LロイシンジッパーがそれぞれワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素のサブユニットの1つおよびT7RNAポリメラーゼのアミノ末端へ融合することによって作出された、2つのヘテロ三量体キメラ酵素。RR1234LD1RまたはpRR1234LD12LとワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素他のサブユニットとEE1234LT7RNAPとを共発現して、ヘテロ三量体のD1RRR1234LD12LEE1234LT7RNAPおよびD12LRR1234LD1REE1234LT7RNAPキメラ酵素を形成する。I方法キメラ酵素を作出するのに使用する配列は、PCRに基づく方法を使用して合成オリゴヌクレオチドから構築し、クローニングし、全配列を確認した。これらの配列は、上記のサブクローニングカセットを有するpCMVScriptプラスミドにサブクローニングした。最後に、発現に使用する全てのプラスミドは類似の設計、すなわちCMVIE1プロモーターエンハンサープロモーター、コザック配列に続いて翻訳領域、ポリA領域、ファージRNAポリメラーゼの転写用のΤΦターミネーターおよびSV40ポリアデニリル化シグナルを有していた。サブクローニング方法の結果として、2つのアミノ酸がいくつかのプラスミドのコザック配列のATGの直ぐ下流に、ロイシンジッパー配列の直ぐ下流に、いくつかのコードタンパク質のカルボキシル末端に付加された。加えて、2つのアミノ酸が4リンカーの直ぐ上流または下流に付加された。上記のように、ヒト胚性腎臓293細胞を24ウェルプレート中で生育させた。上記のように、リポフェクタミン2000試薬および適切なプラスミドを使用してHEK293細胞へトランスフェクションした。ホタルルシフェラーゼ発光は、pET22bT7RNAPpルシフェラーゼレポータープラスミドおよびルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、上記のようにアッセイした。上記のように、pORFeSEAPプラスミドの発現を使用してトランスフェクション効率を標準化した。レポーター遺伝子の発現は、トランスフェクション試薬のみで処理した細胞の発光を差し引いた、試験条件のルシフェラーゼ発光として表し、次にSEAPの吸光度比で割った。必要に応じて多重検定に関してホルムボンフェローニの補正によって調整した、スチューデントの両側t検定を使用して、統計解析を行った。005未満のP値を統計的に有意であるとみなした。II結果II1ヘテロ二量体のRR1234LNP868REE1234LT7RNAPキメラ酵素ヘテロ二量体の酵素であるRR1234LNP868REE1234LT7RNAキメラ酵素の活性を実証した。このヘテロ二量体の酵素は、単量体のアフリカブタコレラウイルスのmRNAキャッピング酵素pNP868Rと単量体のT7RNAポリメラーゼとの間の、EE1234LおよびRR1234Lロイシンジッパーを介する非共有結合によって作出する。EE1234LおよびRR1234LロイシンジッパーGGGKの配向をわずかに修正した塩基性のロイシンジッパー、LEIRAAFLRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNIVSQYETRYGPLGGGK、一文字アミノ酸コードをそれぞれ、NP868RおよびT7RNAPのアミノ末端にそれぞれ付加した。RR1234LおよびEE1234Lロイシンジッパーは、好ましくは逆平行の配向のヘテロ二量体として溶解する2つの両親媒性のαへリックスからなる二量体のコイルドコイルペプチド構造である。期待通りに、ロイシンジッパー配列を有するまたは有さないアフリカブタコレラウイルスmRNAキャッピング酵素のみをコードするプラスミドのトランスフェクションは、検出可能なルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を何も誘導しない。また期待通りに、EE1234Lロイシンジッパーを有するT7RNAポリメラーゼをコードするプラスミドをトランスフェクションした細胞は、ロイシンジッパーを有さないT7RNAポリメラーゼと非常に類似した活性を示し、このことは、天然のT7RNAポリメラーゼのアミノ末端はその酵素処理能力を大きく損なうことなく修飾することができることのさらなる証拠を提供するものである。pRR1234LNP868RおよびpEE1234LT7RNAプラスミドをレポーターのpT7pルシフェラーゼプラスミドと共にトランスフェクションしたHEK293細胞は、強いルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現シグナルを示し、そのシグナルはpCMVT7RNAPプラスミドのシグナルに対して87である。さらに、レポーターのpT7pルシフェラーゼプラスミド存在下でpRR1234LNP868RおよびpEE1234LT7RNAプラスミドと共にトランスフェクションした細胞は、pNP868RおよびpT7RNAPと共にトランスフェクションした細胞よりも37倍高いルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を示す。これらの結果は、本発明によるヘテロ二量体のキメラ酵素の活性およびロイシンジッパーによるNP868RとT7RNAPとの非共有結合が、前記キメラ酵素によって駆動する遺伝子レポーターの発現を有意に増加させることを実証するものである。II2ヘテロ二量体のD1RD12LT7RNAPおよびD12LD1RT7RNAPキメラ酵素ワクシニアのmRNAキャッピング酵素を使用して、他のタイプのヘテロ二量体キメラ酵素の活性も実証した。ワクシニアmRNAキャッピング酵素はそれ自体で、RNAトリホスファターゼ、RNAグアニリルトランスフェラーゼおよびRNAN7グアニンメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有し、ワクシニアウイルスD1R遺伝子にコードされる、今後D1Rと名付ける95kDaサブユニット、および固有の酵素活性を持たないが、D1RサブユニットのRNAN7グアニンメチルトランスフェラーゼ活性を強烈に増強し、ワクシニアウイルスD12L遺伝子にコードされる、今後D12Lと名付ける31kDaサブユニットから構成されるヘテロ二量体である。4リンカーを介してD1RまたはD12LをT7RNAポリメラーゼのアミノ末端に融合させた。共発現させた際は、各融合タンパク質は、他のワクシニアのmRNAキャッピング酵素サブユニットと共に、それぞれD12LD1RT7RNAPおよびD1RD12LT7RNAPと名付けた2つの異なるヘテロ二量体のキメラ酵素を作出する。ヘテロ二量体のキメラ酵素は、HEK293細胞においてレポーターのpT7pルシフェラーゼプラスミドの存在下で、強いルシフェラーゼ遺伝子レポーターシグナルを発生する。ヘテロ二量体のD12LD1RT7RNAPキメラ酵素は、pCMVT7RNAPプラスミドの活性に対して32の活性を有するが、一方D1RD12LT7RNAPヘテロ二量体酵素は、pCMVT7RNAPプラスミドよりも15倍高いルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を有する。さらに、T7RNAポリメラーゼに結合していないワクシニアのmRNAキャッピング酵素の2つのサブユニットの共発現は、それぞれヘテロ二量体のD12LD1RT7RNAPおよびD1RD12LT7RNAPキメラ酵素の9分の1および42分の1のルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現シグナルを示す。これらの結果は、本発明による異なるタイプのヘテロ二量体のキメラ酵素の活性およびワクシニアのmRNAキャッピング酵素のサブユニットとT7RNAPとの共有結合がレポーター遺伝子の発現を有意に促進することを実証する。また期待通りに、レポーターのpT7pルシフェラーゼプラスミドの存在下で、T7RNAポリメラーゼを有さないD1RおよびまたはD12Lの発現は、検出可能なルシフェラーゼ発現を実質的に誘導しない。II3ヘテロ三量体のD12LRR1234LD1REE1234LT7RNAPおよびD1RRR1234LD12LEE1234LT7RNAPキメラ酵素ヘテロ三量体キメラ酵素の活性も実証した。塩基性RR1234LロイシンジッパーをワクシニアウイルスのmRNAキャッピング酵素のD1RまたはD12Lサブユニットのいずれかのアミノ末端に融合し、一方、相補的な酸性EE1234LロイシンジッパーをT7RNAポリメラーゼのアミノ末端に付加した。pEE1234LT7RNAPをpRR1234LD1RまたはpRR1234LD12Lのいずれかと他のワクシニアのmRNAキャッピング酵素サブユニットと共発現させると、それによって、それぞれD12LRR1234LD1REE1234LT7RNAPおよびD1RRR1234LD12LEE1234LT7RNAPと名付けた2つの異なるヘテロ三量体CCPP酵素が作り出される。T7RNAポリメラーゼは、ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素のD1RD12Lサブユニットと共発現させた際は、このD1RD12Lサブユニットがない場合よりも7倍高いルシフェラーゼ遺伝子のレポーターシグナルを示した。したがって、これらの結果は、組換えウイルスによって産生されたワクシニアmRNAキャッピング酵素の発現によってキャッピングされていないT7転写産物の翻訳能力が高まるという、ワクシニアウイルスバクテリオファージRNAPハイブリッド発現系で得られた結果と一致する。レポーターのpT7pルシフェラーゼプラスミドの存在下で、D1RRR1234LD12LEE1234LT7RNAPまたはD12LRR1234LD1REE1234LT7RNAPCCPP酵素のいずれかを発現するHEK293細胞において、強いルシフェラーゼ遺伝子レポーターシグナルが示された。ヘテロ二量体のD12LRR1234LD1REE1234LT7RNAPおよびD1RRR1234LD12LEE1234LT7RNAPキメラ酵素は、pCMVT7RNAPプラスミドの活性に対してそれぞれ57および33の活性を有する。ヘテロ二量体のD12LRR1234LD1REE1234LT7RNAPおよびD1RRR1234LD12LEE1234LT7RNAPキメラ酵素は、ロイシンジッパーを有さないD1、D12LおよびT7RNAPを発現する細胞よりも、それぞれ11倍および67倍強いルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現シグナルを示す。これらの結果は、本発明によるヘテロ三量体キメラ酵素の活性およびワクシニアのmRNAキャッピング酵素のサブユニットのいずれかとT7RNAポリメラーゼとの非共有結合は、遺伝子レポーター発現を有意に増加させることを実証するものである。III結論これらの本結果は、共有結合または非共有結合によって作出される本発明による異なるタイプのヘテロ二量体のおよびヘテロ三量体キメラ酵素の活性を示すものである。本結果はまた、キメラ酵素の異なる触媒ドメイン間、特にキャッピング酵素およびRNAポリメラーゼ間の共有結合または非共有結合は、キメラ酵素による遺伝子レポーター発現の最適化を可能にするという証拠を提供する。細胞のRNAポリメラーゼIIおよびキャッピング酵素に対するサイレンシング配列によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現促進I方法上記のように、HEK293細胞を24ウェルプレートで生育させ、リポフェクタミン2000試薬および適切な濃度のsiRNAおよびプラスミドを使用してトランスフェクションした。活性を強く示すNP868RSP6キメラ酵素を本試験で使用した。pT7pルシフェラーゼおよびルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、上記のようにホタルルシフェラーゼ発光をアッセイした。上記のように、pORFeSEAPプラスミドの発現を使用してトランスフェクション効率を標準化した。ヒトPOLR2Aを標的にする4種のsiRNASI04364381、SI04369344、SI04250162およびSI04354420を使用した。加えて、ヒトRNGTTを標的にする4種のsiRNASI00055986、SI03021508、SI00055972およびSI00055979を使用した。II結果第1次試験で、4種のPOLR2AsiRNAおよび4種のRNGTTsiRNAの効果を25nM終濃度で試験した。これらのsiRNAをpNP868RSP6RNAPキメラ酵素プラスミドおよびレポーターのpT7pルシフェラーゼプラスミドと共にトランスフェクションした。全体として、siRNAなしの同条件と比較して、POLR2AsiRNAはルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を平均で127増大させる傾向を示す。同様に、siRNAなしの同条件と比較して、RNGTTsiRNAの添加は、ルシフェラーゼ遺伝子のレポーター発現を全体として平均で147増加させた。最も高い促進率を示したPOLR2ASI04369344およびRNGTTSI00055972siRNAを第2次試験用に選択した。NP868RSP6RNAPで駆動するルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を0から100nMの濃度範囲のsiRNA存在下でアッセイした。両方のsiRNAで用量反応が観察された。38倍という最も強い発現促進がPOLR2ASI04369344の100nMで、51倍という最も強い発現促進がRNGTTSI00055972siRNAの100nMで観察された。III結論本発見は、siRNAによる細胞の転写および転写後機構のサイレンシングは、NP868RSP6RNAPキメラ酵素によって駆動するレポーター遺伝子の発現を促進することを実証するものである。