"哺乳類におけるウイルス感染を阻害する方法であって、有効量の式I:式中:Ar1およびAr2は独立して1価のアリールまたはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、またはハロ、アミノ、アミジノ、グアニジノ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、スルホンアミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、アルキルスルホニル、およびアミノスルホニルからなる群から選択される5個までの置換基により置換されていてよく;R1は1価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、または加えて以下の:シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、スルホンアミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、アルキルスルホニル、およびアミノスルホニルからなる群から選択される置換基のいずれかにより置換されていてよく;R2およびR3は独立して水素、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、およびアシルアミノ部分からなる群から選択され;R4は水素、1価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル部分からなる群から選択され;そして式中:R2およびR3はつながって炭素環式または複素環式環を形成していてよく;R2およびR3が異なる場合、その鏡像異性体はR-もしくはS-立体配置のどちらか、またはラセミ化合物であってよい;を含む構造を有する少なくとも1種類の化合物および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を投与することを含む、前記方法。前記の化合物がウイルスの宿主細胞中への侵入を阻害するのに有効である、請求項1に記載の方法。前記の医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤が結合剤、増量剤、潤滑剤、崩壊剤、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル、および保存剤から選択される、請求項1に記載の方法。前記の化合物がインフルエンザ感染を阻害するのに有効である、請求項1に記載の方法。前記のインフルエンザがトリインフルエンザである、請求項4に記載の方法。前記のトリインフルエンザがH5N1亜型である、請求項5に記載の方法。前記の化合物がエボラ感染を阻害するのに有効である、請求項1に記載の方法。前記の化合物が水疱性口内炎ウイルス感染を阻害するのに有効である、請求項1に記載の方法。前記の哺乳類がヒトである、請求項1に記載の方法。前記の組成物が皮内、経皮、筋内、腹腔内、静脈内、または経口から選択される経路により投与される、請求項1に記載の方法。前記の組成物が経口投与される、請求項10に記載の方法。前記の経口投与が錠剤、ゼラチンカプセル、マイクロカプセル、および液体配合物からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。式Iの化合物:式中:Ar1およびAr2は独立して1価のアリールまたはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、またはハロ、アミノ、アミジノ、グアニジノ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、スルホンアミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、アルキルスルホニル、およびアミノスルホニルからなる群から選択される5個までの置換基により置換されていてよく;R1は1価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、または加えて以下の:シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、スルホンアミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、アルキルスルホニル、およびアミノスルホニルからなる群から選択される置換基のいずれかにより置換されていてよく;R2およびR3は独立して水素、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、およびアシルアミノ部分からなる群から選択され;R4は水素、1価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル部分からなる群から選択され;そして式中:R2およびR3はつながって炭素環式または複素環式環を形成していてよく;R2およびR3が異なる場合、その鏡像異性体はR-もしくはS-立体配置のどちらか、またはラセミ化合物であってよい;および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含む組成物であって、哺乳類におけるウイルス感染を阻害するのに有効である、前記組成物。前記の化合物がウイルスの宿主細胞中への侵入を阻害するのに有効である、請求項13に記載の組成物。前記の医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤が結合剤、増量剤、潤滑剤、崩壊剤、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル、および保存剤から選択される、請求項13に記載の組成物。前記の化合物がインフルエンザ感染を阻害するのに有効である、請求項13に記載の組成物。前記のインフルエンザがトリインフルエンザである、請求項16に記載の組成物。前記のトリインフルエンザがH5N1亜型である、請求項17に記載の組成物。前記の化合物がエボラ感染を阻害するのに有効である、請求項13に記載の組成物。前記の化合物が水疱性口内炎ウイルス感染を阻害するのに有効である、請求項13に記載の組成物。前記の医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤が結合剤、増量剤、潤滑剤、崩壊剤、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル、および保存剤から選択される、請求項13に記載の組成物。前記の化合物がインフルエンザ感染を阻害するのに有効である、請求項13に記載の組成物。前記のインフルエンザがトリインフルエンザである、請求項22に記載の組成物。前記のトリインフルエンザがH5N1亜型である、請求項23に記載の組成物。前記の化合物がエボラ感染を阻害するのに有効である、請求項13に記載の組成物。インフルエンザ感染を阻害するための、請求項13に記載の組成物の使用。インフルエンザ感染を処置または予防するための医薬品の製造における、請求項13に記載の組成物の使用。エボラ感染を阻害するための、請求項13に記載の組成物の使用。エボラ感染を処置または予防するための医薬品の製造における、請求項13に記載の組成物の使用。本発明は、新規のウイルス感染の非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。より詳細には、本発明は、ウイルスの宿主細胞中への侵入、すなわち感染を予防するための新規の非ペプチド性小分子阻害剤の発見および方法に関する。1態様において、本発明は、インフルエンザウイルスの哺乳類宿主細胞中への侵入を予防する新規の非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。特に好ましい態様において、その非ペプチド性小分子は、ヒトにおけるトリH5N1インフルエンザウイルス亜型の侵入、すなわち感染を阻害する。本明細書で記述される阻害剤は、本明細書で記述される小分子阻害剤の投与による、哺乳類、特にヒトにおけるトリH5N1インフルエンザウイルスの処置および/または予防のための方法に適している。別の態様において、本発明は、エボラウイルスの哺乳類宿主細胞、好ましくはヒト宿主細胞中への侵入を予防する新規の非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。本明細書で記述される阻害剤は、本明細書で開示される阻害剤の投与による、哺乳類、特にヒトにおけるエボラウイルスの処置および/または予防のための方法において適切である。別の態様において、本発明は、水疱性口内炎ウイルスの哺乳類宿主細胞、好ましくはヒト宿主細胞中への侵入を予防する新規の非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。本明細書で記述される阻害剤は、本明細書で開示される阻害剤の投与による、哺乳類、特にヒトにおける水疱性口内炎ウイルスの処置および/または予防のための方法において適切である。可能性のあるトリインフルエンザH5N1の世界的流行は、世界的な公衆衛生の懸念である。H5N1ウイルスに関して利用可能な認可されたヒトのワクチンはまだなく、今までに不活化H5N1ワクチンを用いて実施された研究は、これらの試験ワクチンは低い免疫原性を有することを示唆している。従って、ヒトの患者における薬剤耐性H5N1株の出現は、新規の抗H5N1および他のインフルエンザ療法の開発に関するモーニングコールwake-upcallである。新規の抗インフルエンザ療法を開発するための本明細書で記述される戦略は表面タンパク質ヘマグルチニンHAを標的とすることであり、それはインフルエンザウイルスの受容体結合およびそのウイルスの宿主細胞との融合による侵入を媒介している。本発明は、ウイルスの宿主細胞中への侵入を阻害するように機能する非ペプチド性小分子の単離および同定を記述する。このアプローチに関する概念的支持は、以前のRSVおよびMVの侵入を妨害するいくつかの小分子の同定から来ている。HAはクラスI融合タンパク質であり、それはHIVのGp120およびパラミクソウイルスRSVおよびMVのFタンパク質が含まれるクラスである。クラスI融合タンパク質は一連の立体構造の再編成を経て、結果として安定な6本のらせんの束の融合構造がもたらされ、それはタンパク質間相互作用により維持される。その最終的な融合ヘアピン構造の形成または硬化を妨害する、RSVおよびMVの小分子侵入阻害剤が同定されているCiancietal2004上記。インフルエンザのHAを含む他のクラスI融合タンパク質において類似の構造が存在するため、これらの阻害剤の発見は創薬のための戦略としてHAを標的とする仮説を支持する。本発明は、ウイルスの宿主細胞中への侵入を阻害する特定の有機化合物を提供する。本明細書で概説する手順に従うことにより、ウイルスの侵入、すなわち宿主細胞の感染を予防する、スルホンアミド骨格を有する一連の化合物が発見された。本発明の化合物は式Iの構造およびその医薬的に許容できる塩類を含む:式中:Ar1およびAr2は独立して1価のアリールまたはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、または以下:ハロ、アミノ、アミジノ、グアニジノ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、スルホンアミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、アルキルスルホニル、およびアミノスルホニルから選択される5個までの置換基により置換されていてよく、そしてR1は1価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、または加えて以下の:シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、スルホンアミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、アルキルスルホニル、およびアミノスルホニルから選択される置換基の1個以上により置換されていてよく、そしてR2およびR3は独立して水素またはアルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、およびアシルアミノ部分から選択され、そしてR4は水素または1価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル部分から選択され;そして式中:置換基R2およびR3はつながって炭素環式または複素環式環を形成していてよく、そして置換基R2およびR3が異なる場合、その鏡像異性体はR-もしくはS-立体配置のどちらか、またはラセミ化合物であってよい。経口で有効な療法剤錠剤または液体を開発するのが好ましく、これはそれが世界的流行の場合に大きな曝露された集団に薬物を投与するための最も好都合かつ迅速な方法であるためである。しかし、本明細書で記述される阻害剤は、自然な大流行の場合には感染した患者がIV投与を必要とする可能性があることが予想されるため、IV投与にも適しているであろう。従って、本明細書で記述される阻害剤は、あらゆる新しく出現した世界的流行株単数または複数に関して有効、安全、かつ容易な療法的選択肢を提供するであろう。経口投与に関して、その医薬組成物は、例えば一般に用いられる手段により医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤、例えば結合剤例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース;増量剤例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸カルシウム;潤滑剤例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ、崩壊剤disintegrants例えばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウムsodiumstarchglycolate;または湿潤剤例えばラウリル硫酸ナトリウムを用いて調製される錠剤またはカプセルの形をとってよい。その錠剤は、当技術で周知の方法によりコートすることができる。経口投与のための液体製剤は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形をとってよく、またはそれらは使用の前に水もしくは他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として与えられてよい。そのような液体製剤は、一般に用いられる手段により、医薬的に許容できる添加剤、例えば懸濁化剤例えばソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは硬化食用脂肪;乳化剤例えばレシチンまたはアカシア;非水性ビヒクル例えばアーモンド油、油性エステル類またはエチルアルコールおよび保存剤例えばp-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸を用いて調製することができる。本明細書で1個以上の名前を挙げられた要素または工程を含んでいると記述された組成物または方法は開放型open-endedであり、それはその名前を挙げられた要素または工程は本質的であるが他の要素または工程をその組成物または方法の範囲内に加えてよいことを意味する。冗長さを避けるため、1個以上の名前を挙げられた要素または工程を含んでいるまたは含むと記述されたあらゆる組成物または方法は、その同じ名前を挙げられた要素または工程から本質的になっているconsistingessentiallyofまたはから本質的になるconsistsessentiallyof対応するより限定された組成物または方法も記述し、それはその組成物または方法にはその名前を挙げられた本質的な要素または工程が含まれ、その組成物または方法の基本的および新規の特徴単数または複数に実質的に影響を及ぼさない追加の要素または工程も含まれていてよいことを意味することも理解されている。本明細書で1個以上の名前を挙げられた要素または工程を含んでいる、または1個以上の名前を挙げられた要素または工程から本質的になっていると記述されたあらゆる組成物または方法は、あらゆる他の名前を挙げられていない要素または工程を除外するように、名前を挙げられた要素または工程からなっているまたはからなる対応する、より限定された、および閉鎖型のclosed-ended組成物または方法も記述することも理解されている。本明細書で開示されるあらゆる組成物または方法において、あらゆる名前を挙げられた本質的な要素または工程の既知の、または開示された均等物は、その要素または工程の代わりに用いられてよい。からなる群から選択される要素または工程は、その列挙された要素または工程のあらゆる2個以上の組み合わせを含む、後に続くリスト中の要素または工程の1個以上を指す。他の用語の意味は、有機化学、薬理学、および微生物学の分野が含まれる技術分野の当業者により理解されている通りに、文脈により理解されるであろう。本発明は、ウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。式Iのクラスのスルホンアミド化合物は、RNAエンベロープウイルスが含まれるがそれに限定されないある範囲のウイルスの感染性、すなわち宿主細胞への侵入を阻害するのに有効であろう。RNAエンベロープウイルスは、全てが1型膜タンパク質を有し、宿主細胞への侵入に関して類似の機構、すなわち受容体に媒介されるエンドサイトーシスおよびそれに続く細胞質中への放出のための酸溶解による機構を利用する点で類似している。インフルエンザウイルス、エボラウイルス、および水疱性口内炎ウイルスは、この侵入機構を利用するRNAエンベロープウイルスの代表的な例である。特定の理論には一切限定されないが、本明細書で記述されるスルホンアミド化合物はウイルスの感染性のこの機構を有効に遮断すると信じられている。従って、本明細書で記述される式Iのスルホンアミド化合物は、宿主細胞のこのクラスのウイルス、すなわち例えばSARSウイルスが含まれるRNAエンベロープウイルスによる感染性の阻害において有効であろうことは、当業者には理解されるであろう。別の態様において、本発明は、インフルエンザウイルスの感染を処置または予防するための非ペプチド性小分子阻害剤の発見および方法に関する。本明細書で記述される阻害剤は、インフルエンザウイルスの処置および/または予防に適している。より詳細には、本明細書で記述される阻害剤はヒトにおけるインフルエンザウイルスの処置および/または予防に適している。具体的には、本発明は、そのウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する非ペプチド性小分子阻害剤の同定および特性付けに関する。さらにもっと詳細には、本発明は、トリインフルエンザH5N1亜型の宿主細胞中への侵入を予防するための非ペプチド性小分子阻害剤の同定に関する。好ましい態様において、本発明の阻害剤は、ウイルスの細胞中への侵入を媒介するヘマグルチニンHAエンベロープ糖タンパク質を標的とする、すなわちそれに特異的であろう。しかし、本明細書で記述される手順に従うことにより、あらゆるインフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス亜型だけでなく、例えばエボラウイルスおよび水疱性口内炎ウイルスそれらに限定されないのような他のウイルスに関しても非ペプチド性小分子阻害剤を同定することができることは理解されるであろう。別の態様において、本発明は、エボラウイルスの感染を処置または予防するための非ペプチド性小分子阻害剤の発見および方法に関する。本明細書で記述される阻害剤は、哺乳類におけるエボラウイルス感染の処置および/または予防に適している。より詳細には、本明細書で記述される阻害剤はヒトにおけるエボラウイルス感染の処置および/または予防に適している。具体的には、本発明は、エボラウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する非ペプチド性小分子阻害剤の同定および特性付けに関する。しかし、本明細書で記述される手順に従って、あらゆるウイルスまたはウイルス亜型による宿主感染を予防するための非ペプチド性小分子阻害剤を同定することができることは、当業者には理解されるであろう。別の態様において、本発明は、水疱性口内炎ウイルスVSVの感染を処置または予防するための非ペプチド性小分子阻害剤の発見および方法に関する。本明細書で記述される阻害剤は、哺乳類におけるVSV感染の処置および/または予防に適している。より詳細には、本明細書で記述される阻害剤はヒトにおけるVSV感染の処置および/または予防に適している。具体的には、本発明は、VSVの宿主細胞中への侵入を予防する非ペプチド性小分子阻害剤の同定および特性付けに関する。しかし、本明細書で記述される手順に従うことにより、あらゆるウイルスまたはウイルス亜型による宿主感染を予防するための非ペプチド性小分子阻害剤を同定することができることは、当業者には理解されるであろう。以下は、トリインフルエンザウイルスH5N1の宿主細胞中への侵入を予防するための阻害剤化合物を同定するための偽型ウイルスの構築を記述する。しかし、下記で記述する手順は、エボラウイルスおよび水疱性口内炎ウイルスが含まれるがそれらに限定されない多くのウイルスのいずれの宿主細胞中への侵入を予防する阻害剤化合物を同定するのにも適していることは、当業者には理解されるであろう。トリインフルエンザウイルスH5N1に対する阻害剤の同定。H5N1ウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する阻害剤を同定するために、HAH5亜型を発現する偽型ウイルスを、生ウイルスの細胞中へのHAに媒介される侵入を模倣するためのモデルとして開発した。その偽型ウイルスは、ウイルス侵入機構を安全に複製する、およびその阻害剤を同定するための手段を提供し、次いでその阻害剤をその偽型ウイルスを用いる最初のスクリーニングには必要でない厳しい制御条件下で生ウイルス感染に対して試験することができる。その偽型ウイルスを構築するため、渡り鳥における高病原性H5N1インフルエンザウイルスのHA遺伝子をコードするcDNAを、pcDNA3哺乳類発現ベクター中に、CMVプロモーターの制御下にクローニングした。HAを発現するHIV由来のインフルエンザ偽型HIV/HAを生成するため、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するHIV-1プロウイルスゲノムpNL4.3.Luc.R-E-をH5のHApcDNA3-HAと共に293T細胞中に同時形質移入した。そのHIV/HAはレポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子を含有する。標的細胞中への侵入の際、ウイルスRNAが逆転写され、能動的に核の中に運び入れられ、安定にゲノム中に組み込まれる。形質導入された細胞におけるルシフェラーゼの活性は、ウイルスの感染性の尺度を提供するManicassamyetalJVirol7947934805。ルシフェラーゼアッセイは非常に高感度であり、96ウェルプレート形式の高スループットスクリーニングHTSに適している。加えて、複製しないHIVに由来するインフルエンザ偽型の使用は、病原性トリインフルエンザ株を取り扱うために必要な厳重なバイオハザード条件を必要とせずにHTSを実行可能にする。これは、ウイルスの付着および侵入を測定するためのHTSアッセイを開発するためのHIV/HAの重要な利点である。本出願は、以下のことを含む本発明に従う小分子阻害剤の発見に関するいくつかの重要なパラメーターの最適化にも取り組む:aHIV/HAの生成、b用いるべき標的細胞、cHIV/HAの力価測定、ならびにd感染性およびシグナル対バックグラウンドS/B比を最大化する>100/1ための制御。HIV/HAの構築の後、その偽型ウイルスを集め、標準的なプロトコルに従って感染性に関して評価した。その偽型ウイルスの特定の利点は、それが生ウイルスの宿主細胞中への侵入を安全に、かつ信頼できるものとして模倣する一方で直接その生ウイルスを扱う危険性を排除する手段を提供することである。最終的にこの初期のスクリーニングプロセスで同定された可能性のある阻害剤はその生ウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する能力に関して試験されるであろうが、これらの後期の試験はその偽型ウイルスを扱うためには必要でない厳しい制御条件下で実施されるであろう。従って、その偽型ウイルスアッセイからの阻害剤の一次ヒットは、次いで感染性低病原性トリH5N2分離株に対して、および組み換えH5N1株に対して、強化enhancedBSL3実験室において評価されるであろう。この二次スクリーニングは、感染性ウイルスに対して有効であるそれらの化合物のみを迅速に同定するであろう。初期のスクリーニングを生感染性ウイルスに対するものとして偽型ウイルスを用いて実施することの別の利点は、生ウイルスを扱うことはウイルスの侵入だけでなくウイルスの複製および放出egressも阻害するであろう化合物の同定をもたらすと考えられることである。その初期のスクリーニングは侵入阻害に関して100,000種類より多くの化合物の化合物ライブラリーを用いて実施され、従って複製および組み立ての阻害剤の存在による一次ヒットの数の少しの増大さえも、結果として数千種類の化合物の追加の二次試験の必要性をもたらし得る。それに対し、本明細書で記述されるような偽型ウイルスを用いた初期スクリーニングは、それは推定されるH5インフルエンザウイルスの侵入阻害剤のみを同定すると考えられるため、一次ヒットの数を低減する。従って、偽型ウイルスを用いた初期スクリーニングの方法は、取り扱う化合物の数および必要なスクリーニングの両方を低減した。別の観点において、本発明は、可能性のあるインフルエンザウイルスの小分子阻害剤を本明細書で記述される偽型ウイルスを用いて迅速にスクリーニングするための高スループットHTSアッセイに向けられている。しかし、本明細書で記述される高スループットアッセイは、ウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する阻害剤化合物、例えばエボラウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する阻害剤化合物それらに限定されないを同定するのに適合している可能性があることは、当業者には理解されるであろう。従って、本明細書で記述されるアッセイは、哺乳類、特にヒトにおける多種多様なウイルスに関連する疾患を処置または予防する可能性を有するウイルス阻害化合物を同定するための価値のある手段を提供する。受容体結合および宿主細胞との融合によるインフルエンザウイルスの侵入を媒介するエンベロープ糖タンパク質であるヘマグルチニンHAを標的とすることは、本発明の目的である。この出願の焦点は、抗H5N1侵入阻害剤を発見すること、ならびにH5N1および他の世界的流行の可能性のあるインフルエンザウイルスに関する入り口となる療法entrytherapeuticsを開発することである。HAは亜型間で著しい30より大きい変動を示すが、受容体結合および融合に関する重要なドメインは保存されている。従って、これらの保存された領域を標的とすることは、耐性の発生の可能性を小さくするであろう。別の態様において、本発明は、詳細に明らかにされた作用機序を有しない可能性のある広いスペクトルの抗インフルエンザ阻害剤の同定に向けられている。このタイプの阻害剤は、可能性のあるインフルエンザウイルス阻害剤としてさらに試験する一方でその作用機序をさらに解明するのに適しているであろう。下記で概説する手順に従って、おおよそ40,000種類の別個の化合物をスクリーニングし、141個の一次ヒットを同定した。HTSに関するZ’因子Z’factorは0.5±0.2であった。一次ヒットを、無関係な糖タンパク質VSV-Gを発現する偽型ウイルスおよび感染性H1N1ウイルスを用いて、それらの特異性に関してカウンタースクリーニングした。それらをそれらの効力および細胞毒性に関して、再合成した化合物を用いて評価した。その一次ヒットの内の36種類のみがHAに媒介される侵入プロセスを特異的に阻害した。そのHTSからの最終的なヒット率は0.09であった。36種類のヒット化合物は全て25μM以下のIC90値を示した。構造的に、そのHA阻害剤は、それぞれ2員以上の群および単集合として表すことができる。従って、本明細書で記述される手順に従うことにより、HAH5阻害剤に関してスクリーニングするためにHIV/HAH5を用いるHTSアッセイが開発された。25μM未満のIC90および25μMより大きいCC50を有する36種類のHAH5特異的阻害剤が同定され、36種類の化合物は全て細胞培養で増殖させたインフルエンザウイルスH1N1PR8を阻害した。この発明の好ましいウイルス侵入阻害剤は、図12において示す構造を有する。実施例1.H5N1トリインフルエンザの侵入に関するHIV/HA偽型系の確立。この研究において用いられたインフルエンザウイルスのHA。高病原性H5N1インフルエンザウイルスのHAH5遺伝子をコードするcDNAは、Dr.GeorgeGao中国科学院微生物研究所、中国により親切に提供して頂いた。このHA遺伝子は元々中国青海省において死んだ渡り鳥ガン中に存在するインフルエンザAH5N1から単離された。本明細書で記述されるHIV/HA偽型ウイルスは、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子を含有する。標的細胞中に侵入すると、そのウイルスRNAが逆転写され、能動的に核の中に運び入れられ、安定にゲノム中に組み込まれる。形質導入された細胞におけるルシフェラーゼの活性は、ウイルスの感染性の尺度を提供するManicassamyetal2005上記。ルシフェラーゼアッセイは非常に高感度であり、96ウェルプレート形式に適している。加えて、複製しないHIVに由来するインフルエンザ偽型の使用は、病原性トリインフルエンザ株を取り扱うために必要な厳重なバイオハザード条件を必要とせずにHTSを実行可能にする。両方とも、ウイルスの付着および侵入を測定するためのHTSアッセイを開発するためのHIV/HAの重要な利点である。本明細書で記述される小分子を単離するために、以下のものを含むいくつかの重要なパラメーターを最適化した:aHIV/HAの生成、b用いるべき標的細胞、cHIV/HAの力価測定、ならびにd感染性およびシグナル対バックグラウンドS/B比を最大化する>100/1ための制御。pNLluc3R-E-およびpNLluc3RE-は、HIV-1プロウイルスクローンpNL4-3に基づくプラスミドである。これらのプラスミドは、両方のプラスミドが哺乳類および植物細胞中での発現に最適化された第3世代のホタルルシフェラーゼ遺伝子であるPromegaのluc遺伝子を含有している点で、前の版と異なる。それらはpNLlucプラスミドの前の版と、それらのそれぞれの名前におけるlucの後の3の存在により区別することができる。本明細書で記述される偽型ウイルスを構築するため、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するエンベロープ欠損プロウイルスゲノムpNL4.3.LucR-E-を、HIV-1発現ベクターとして用いた。そのpNL4.3.Luc.R-E-ベクターにおいて、そのホタルルシフェラーゼ遺伝子をpNL4-3nef遺伝子中に挿入する。2個のフレームシフト5’EnvおよびVpraa26がこのクローンをEnv-およびVpr-にして、それを単一ラウンドの複製の能力しかないようにする。そのベクターは、ソーク研究所のDr.NedLandeauから許可を与えられた。本明細書で記述される偽型ウイルスを構築するため、HA遺伝子をコードするcDNAを哺乳類発現ベクターpcDNA3Invitrogen中に、CMVプロモーターの制御下にクローニングした。HAを発現するHIV由来のインフルエンザ偽型[HIV/HA]を生成するため、以前に記述されたように、pNL4.3.Luc.R-E-をH5のHApcDNA3-HAと共に293T細胞中に同時形質移入したManicassamyetal2005上記CormieretalProcNatlAcadSciUSA1011406714072。その偽型ウイルスを含有する上清を形質移入の48時間後に集め、合わせて、0.45μm孔径のフィルターを通して濾過し、標準的なプロトコルに従って感染性に関して評価したHsuetalProcNatlAcadSciUSA10072717276ProductionandUseofHIV1LuciferaseReporterVirusesEnnaWilliamsMCurrentProtocolsinPharmacology125112512JohnWileySonsConnoretalVirology206935944。対照偽型ウイルスを生成するために、VSV-GHIV/VSV-Gをコードするプラスミドおよび空ベクターもpNL4.3.Luc.R-E-と共に同時形質移入した。それらのそれぞれの感染性の直接的な比較のため、偽型ウイルスのp24含有量を商業的に入手できるキットBeckmanCoulter,カリフォルニア州を用いて測定した。293Tヒト、HeLaヒト、QT6ウズラ、およびDF-1ニワトリ細胞を、p24で正規化したHIV/HAまたは対照のウイルス粒子を用いて感染させ、その細胞のルシフェラーゼ活性を負荷の48時間後に決定した図3。予想されたように、そのVSV-G偽型HIVウイルス粒子を用いて感染させた4種類の細胞株は全て高レベルのルシフェラーゼ活性を示し6.6~7.2RLUのlog、一方で空ベクターを感染させた細胞はより低いレベルのルシフェラーゼ活性を示した2.8~3.1RLUのlog。そのHIV/HAウイルス粒子により感染された細胞は、バックグラウンドよりもおおよそ100倍高いルシフェラーゼ活性を発現し、これはヒト由来およびトリ由来の両方のこれらの細胞の全てがそのHIV/HAウイルスにより感染され得ることを示唆している。これらの結果は、H5N1の感染に関する侵入機構を研究するための機能アッセイを実証している。この機能アッセイは侵入機構の研究のために、および侵入阻害剤のスクリーニングのために生H5N1ウイルスを用いることの安全性の懸念を大きく軽減するであろうことを強調するのは重要である。この機能アッセイを用いて、インフルエンザウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する可能性のある小分子阻害剤を同定した。下記で記述するように、このアッセイを用いることによりヒト肺細胞株A549およびNCIH661はHIV/HAの形質導入に非常に感受性であることが実証されており、これらの細胞はHIV/HAのこれらの宿主細胞中への侵入を予防する小分子阻害剤を同定するためのHTSアッセイにおける標的細胞として用いられるであろう。加えて、感染した細胞が優れたルシフェラーゼのシグナル対ノイズバックグラウンド比>100/1を与えるであろうように、十分な数の標的細胞/ウェルを有することが重要である。実施例2.産生細胞のノイラミニダーゼNA処理はその偽ウイルス粒子の感染性を増進する。そのHIV/HA偽型系を最適化するため、293T産生細胞のノイラミニダーゼNA処理を用いてそのHIVに基づく偽型ウイルスの感染を増進した。293T細胞にpNL4.3.LucR-E-およびHAプラスミドを同時形質移入した。形質移入後26時間、その形質移入された293T細胞を、0、5、10、20、40単位/mlの濃度のNANewEnglandBiolabsで処理した。そのウイルス上清を5倍希釈し、それを用いてその標的細胞に負荷をかけたchallenge。感染した細胞のルシフェラーゼ活性を注入の48時間後に決定し、その結果を図4において示す。結果は、5単位/mlのNAにおいて、NA処理した細胞から集めたHIV/HAは処理しなかった細胞よりも少なくとも10倍高いルシフェラーゼ活性を示したことを示している。産生細胞のより高い濃度のNA10~40単位/mlによる処理は、標的細胞におけるルシフェラーゼシグナルを、大きくではないがさらに増大させた5.62~5.73log。HIV/VSVGおよび空ベクターを形質移入した偽型ウイルスを対照として用いた。これらの結果は、NA処理が産生細胞からのウイルスの放出を促進することと一致している。加えて、その高いシグナル/バックグラウンド比は、さらなるHTSの最適化後に提案された実験のために広く用いられるであろう効率的なHIV/HA偽型ウイルスの確立の成功を示している。従って、HIV/HA偽型を、293T細胞100mmディッシュ中3×106細胞、約70コンフルエントのpcDNA3-HA12μgおよびpNL4.3.Luc.R-E-12μgによる、標準的なプロトコルに従ってlipofectamine2000を用いる同時形質移入により生成した図10参照。対照のため、HIV由来VSV-G偽型HIV/VSV-Gを、293T細胞におけるVSV-Gを有するプラスミドpcDNA3-VSV-GおよびpNL4.3.Luc.R-E-の同時形質移入により生成し、その化合物のHA標的特異性を確立した。そのHIV/HAまたはHIV/VSV-G偽型は複製欠損であり、その偽型はその感染プロセスの1ラウンドのみに関して評価されるであろう。ウイルスの感染性は、その形質導入された細胞のルシフェラーゼ活性から測定される。バックグラウンドの活性は、空のpcDNA3ベクターおよびpNL4.3.Luc.R-E-を形質移入された細胞の上清を用いて感染させた細胞のルシフェラーゼ活性から決定される。実施例3.HIV/HA偽型ウイルスはトリプシン処理を必要としない。前に述べたように、HAの切断は感染性に必要であり、これはそれがウイルスエンベロープおよび細胞膜の間の融合を媒介するHA2の疎水性N末端を生成するためであるLuscherMattliMArchVirol14522332248。トリプシン処理のH5N1に由来するHIV/HAの感染性への作用を調べた。比較のため、低病原性トリH5N2分離株CK/ミチョアカン/28159-530/95のHAを発現する別のHIV/HA偽型ウイルスを生成した。この株のHAはあらゆる遍在性プロテアーゼにより切断され得る切断部位を有しておらず、TPCK処理されたトリプシンによる処理をその切断のために必要とする。それはDr.DavidL.Suarez,USDAにより親切に提供して頂いた。この低病原性トリ分離株のHIV/HAは、それを実験のHIV/HAと区別するためにHIV/HAUSDAと呼ばれる。HIV/HAまたはHIV/HAUSDA偽型ウイルスをトリプシン50μg/mlで37°Cで30分間処理するかトリプシン処理しないかのどちらかの後、標的293T細胞に負荷をかけた。トリプシン処理はHIV/HAに媒介されるウイルス侵入を増進または阻害しなかった図5。それに対し、トリプシン処理されたHIV/HAUSDAの感染はトリプシン処理なしでの感染と比較して大きく増進された。実施例4.低病原性実験室インフルエンザAウイルス[A/WS/33]は感染性にトリプシン処理を必要とする。インフルエンザAウイルス実験室株A/WS/33H1N1[ATCCVR-1520]を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から得た。ウイルスのストックを増殖させ、MDCK細胞において力価測定し、80コンフルエントのMDCK細胞にそのウイルスを感染させ、37°Cで3時間吸着させておき、ウェルが覆われた状態を保つために15分ごとに振盪した。保温の後、その細胞を洗浄し、0.125BSA、10mMHEPESpH7.4を補った、1μg/mlTPCK処理トリプシンを含む、または含まないEMEMと共に保温した。トリプシン処理のインフルエンザAウイルス[A/WS/33]の感染性への作用を決定するため、MDCK細胞にトリプシン処理した、または未処理のインフルエンザAウイルス株A/WS/33を1のMOIで感染させた。表1において示すように、未処理のインフルエンザAウイルスにおいて、TPCK-トリプシンで処理されたウイルスと比較した場合に、感染性の著しい阻害があった。その結果は、HIV/HAUSDA偽型ウイルスの結果と一致している。これはさらに、HIV/HAUSDA偽型ウイルスにおいて、および低病原性実験室株において発現したHAの両方が類似して挙動することを示唆しており、本明細書で記述される偽型ウイルスモデルを有効にする。実施例5.HIV/HA偽型ウイルスは侵入の間リソソーム向性lysosomotropic化合物に感受性である。HAに媒介されるウイルス侵入のpH依存性を試験するため、予め決定された力価のHIV/HAを用いてバフィロマイシンAおよび塩化アンモニウムNH4Clの存在下で293T細胞を感染させた。バフィロマイシンAはエンドソームのHATPアーゼの非常に選択的な阻害剤であり、エンドソームの酸性化を妨げ、エンドソームのpHを上昇させるBowmanetalProcNatlAcadSciUSA8579727976YoshimorietalJBiolChem2661770717712DroeseetalBiochemistry3239023906。同様に、NH4Clは弱塩基であり、エンドソームのpHを上昇させる。図6のパネルAにおいて示したように、293T細胞のバフィロマイシンAによる処理は50~150nMでHIV/HA偽型ウイルスの感染性を効率的に阻害した。同様に、最初の3時間のウイルス吸着の間の細胞のNH4Cl[5~25mM]への曝露は、未処理の対照と比較してウイルス感染を有意に低減した図6、パネルB。従って、その結果は、HIV/HAの侵入はHAにおける低pHに誘導される変化に依存することを示唆している。実施例6.バフィロマイシンAはインフルエンザAウイルス[A/WS/33]の感染を阻害する。バフィロマイシンAのインフルエンザAウイルスの感染性への作用を調べた。MDCK細胞6ウェルプレート中で約80コンフルエントを、系列希釈した用量のバフィロマイシンA25~200nMで15分間処理した。インフルエンザAウイルス約100pfu/ウェルを細胞に添加し、37°Cで3時間吸着させた。バフィロマイシンAもその3時間の吸着期間の間に存在していた。保温後、未吸着のウイルスを洗浄により除去し、細胞を4ウシ血清アルブミンおよび1μg/mlのTPCK処理されたトリプシンを補ったEMEMを含有する0.8アガロースで覆い、37°Cで3日間培養した。3回の独立した実験を行ってウイルスの力価を決定した。図7において示すように、バフィロマイシンAは試験した濃度25~200nMでインフルエンザウイルス感染の感染性を効率的に阻害した。従って、その結果は、インフルエンザAウイルスA/WS/33の侵入もHAにおける低pHに誘導される変化に依存することを示唆しており、本明細書で記述されるHIV/HA偽型ウイルスモデルを有効にする。実施例7.ヒト肺細胞はHIV/HA偽型ウイルスに対して最大の感染性を示す。宿主指向性hosttropismを特性付けおよび比較するため、HIV/HAの感染性を一群のapanelof標的細胞株に対して、前に記述した方法に従うプラークアッセイにより評価した。ヒト肺細胞株A549、NCI-H661およびHAPEC、およびラット肺細胞株L2を感染のための標的細胞として用いた。インフルエンザウイルス感染に耐性であるLec1チャイニーズハムスター卵巣細胞株も用いた。前に記述したプロトコルに従って、細胞にHIV/HAおよびHIV/HAUSDA偽型ウイルスを感染させた。HIV/VSVGおよび空ベクターを形質移入した偽型ウイルスを、それぞれ陽性および陰性対照として用いた。ヒト肺細胞株A549およびNCI-H661は、HIV/HA偽型ウイルスによる感染に、ヒト肺細胞株HAPECと比較して非常に感受性であった図8。トリプシンで処理されたHIV/HAUSDA偽型ウイルスも、これらの細胞に対して非常に感染性であった。しかし、未処理のHIV/HAUSDA偽型ウイルスは感染性ではなかったデータは示していない。ラット肺細胞L2はHIV/HAおよびHIV/HAUSDA両方による感染にそれほど感受性ではなく、一方でLec1細胞は両方の偽型に対して高度に耐性であった図8。これらの結果は、HIV/HAおよびHIV/HAUSDAはヒト肺細胞への好ましい侵入指向性を示すことを示している。そのヒト肺細胞株A549およびNCI-H661は、さらなる最適化の後に、インフルエンザ侵入阻害剤に関して化合物ライブラリーをスクリーニングするために用いられるであろう。これらの結果は、HIV/HA偽型ウイルス中のHAは感染性インフルエンザウイルス中に存在するHAの機能的特性を保持していることを示唆している。実施例8.感受性細胞に対するHA結合アッセイの開発。HA/阻害剤相互作用の方式を解明するため、HA結合アッセイを開発した。H5N1HA1の4つの異なる領域図9Aにおいて1~4と表示するをヒトIgGのFcと融合させて融合タンパク質を生成した。そのコンストラクトの全部をDNA配列決定により確認した。これらの融合タンパク質を、KuhnetalJBiolChem2811595115958のプロトコルを修正したものに従って発現させ、精製した。簡潔には、それぞれのプラスミドを293T細胞中に形質移入した。細胞を、4mMのL-グルタミンを補ったVP-SFM培地で、形質移入後16時間の間、再び満たしたreplenished。上清を48および72時間の時点で2回集め、0.45μMフィルターを通して濾過した。それぞれの上清を、カラム中に組み立てられたプロテインAアガロースSantaCruzBiotechPierceに適用した。そのプロテインAアガロースをPBSで2回洗浄し、タンパク質を1mlの0.1MグリシンpH2.8で遠心分離により3回溶離した。そのタンパク質を、溶離後すぐに60μlのトリスHClpH8.0を添加することにより中和した。次いでそのタンパク質を、Slide-A-Lyzer透析カセットPierceによりPBS中で透析し、Centricon遠心濾過ユニットMilliporeにより濃縮した。1ミリグラムのそれぞれの精製されたタンパク質をSDS-PAGE上で泳動し、続いてクーマシーブリリアントブルー染色を行った図9B。そのコンストラクトに応じて、その上清を100mmプレートからプールすることにより0.1~1mgの融合タンパク質を精製することができ、それは下記で記述する結合アッセイに適していた。これらのタンパク質の細胞への結合を、Kuhnetal2006により記述されたようにフローサイトメトリーを用いて測定した。簡潔には、293T細胞をPBS/5mMEDTAにより脱離し、PBS/1BSA中で再懸濁し、30分間氷上においた。異なる量のHA-hIgGタンパク質1~20μgを0.5×106個の細胞と共に氷上で1時間保温し、続いてPBS/1BSAで2回洗浄した。FITCとコンジュゲートした抗ヒトIgG抗体を1:100の希釈度で細胞と共に氷上で45分間保温した。細胞をPBS/1BSAで3回、およびPBSで2回洗浄し、それに対してフローサイトメトリーを行った。陰性対照HA-hIgGタンパク質を添加しなかったの平均蛍光強度MFIをHA1~HA4のMFIから引いた図9C。コンストラクト2および3はこれらの条件下では293T細胞に多くの結合を示さなかったことは明らかである。それに対し、コンストラクト1および4はその標的細胞に用量依存的な結合を示した。コンストラクト4はHA1のN末端が欠失している残基17~88が、それはその標的細胞に完全長HA1融合タンパク質1よりも優れた結合を与えたことは興味深い。これらの融合タンパク質の細胞結合特性をさらに特性付けするため、2種類の感受性細胞株および1種類の耐性細胞株をそのアッセイにおいて用いた。293Tおよびヒト肺細胞株であるA549は両方とも非常に感受性であることが示されており、一方でヒトT細胞株であるJurkatはHIV/HA感染に耐性である。2μgのそれぞれの融合タンパク質を用いた。これらの条件下で、コンストラクト4のみがその感受性細胞に著しい結合を示し、一方で残りの3種類の融合タンパク質はあまり多くの結合を示さなかった。重要なことだが、その融合タンパク質はいずれもJurkat細胞にあまり多くの結合を示さず図9D、これは上記で示した形質導入のデータと一致する。これらの実験は、その融合タンパク質の1種類コンストラクト4は2μgにおいてさえも特異的に感受性細胞に結合することができることを実証している。これは高感度なHA結合アッセイの開発を実証し、それは次の実験において用いられるであろう。上記の実験に基づいて、構造的に多様な化合物ライブラリーをスクリーニングしてインフルエンザウイルスの宿主細胞中への侵入を予防するための小分子阻害剤を同定し、二次アッセイを用いることによりその化合物のヒットに優先順位をつけることが可能であった。上記で記述したように、ウイルス侵入の間にインフルエンザのHAを標的とする阻害剤を同定するためにHTSアッセイが開発された。このアッセイを用いることにより、中程度のスループットから高スループットまでのアッセイ条件1000より多くの化合物/日、ならびに容易な読み取りルシフェラーゼ/GFPレポーター、および高いシグナル/バックグラウンド比10/1より大きいでスクリーニングすることが可能であった。1.低病原性H5インフルエンザウイルスを用いたHA阻害剤の評価。生感染性インフルエンザH5N1ウイルスを用いる実験に必要とされる厳しい生物汚染biocontainment基準は、生H5N1ウイルスに対して評価することができるヒットの数を制限するであろう。従って、ヒットはH5亜型のHAを発現する低病原性トリインフルエンザAウイルス株CK/ミチョアカン/28159-530/95USDA株に対する盲検様式で上記のものからスクリーニングされ、それらの効力は細胞培養において生感染性ウイルスに対して評価されるであろう。この株はDr.DavidL.SuarezUSDAから得て、野生型H5N1ウイルスのような厳しい生物汚染を必要としない。USDA株および野生型H5N1のH5のHAの間の唯一の違いは、あらゆる遍在性プロテアーゼにより切断され得る正規のcanonicalフューリン切断部位RRRKKRが存在しないことである。多くの報告がH5のHAタンパク質のこのポリ塩基性切断ペプチドはH5ウイルスの高病原性に必要であることを示してきたHorimotoT1997上記StienekeGroberetalEMBOJ1124072414Horimotoetal1994上記。既に切断されたHAを有する偽型ウイルスに頼るスクリーニング戦略のため我々のヒットがHAの切断に影響を及ぼすであろうとは予想されないため、高病原性H5N1ウイルスを阻害するヒットはUSDA株も阻害するであろうと予測される。この低病原性USDA株に対する最高の阻害活性を有するヒットは、野生型H5N1を用いてさらに評価されるであろう。野生型H5N1ウイルスは低病原性インフルエンザウイルスよりも攻撃的であるため、最終的な評価が必要である。インフルエンザAウイルス株CK/ミチョアカン/28159-530/95は、10日齢の有精鶏卵の尿膜腔中で増殖させられるであろう。簡潔には、ウイルスを尿膜腔に注入し、37°Cで28~42時間保温するであろう。その上清を小さな分割量aliquotsに分け、瞬間冷凍し、将来の使用のために-80°Cで保存するであろう。それぞれの分割量は使用前に1回解凍されるであろう。ウイルス力価を決定するため、系列希釈したウイルス懸濁液を6ウェルプレート中のコンフルエントなMDCK単層細胞培養物中に接種し、37°Cで2時間培養するであろう。その細胞を洗浄し、0.6アガロースおよび2μg/mlアセチル化トリプシンを含有するDMEMで覆い、37°Cで2日間培養するであろう。プラークをギムザ染色により可視化するであろう。インフルエンザウイルスの感染性の阻害。ウイルスを系列希釈したヒットと共に前保温し1時間、96ウェルマイクロタイタープレート中のMDCK細胞2×105細胞/mlに0.1のMOIで、0.1mlの総量で添加するであろう。未処理のウイルスが陽性対照として用いられるであろう。37°Cにおいて2時間の保温の後、吸着していないウイルスを洗浄により除去し、2μg/mlのトリプシンを含有する新しい培地をその細胞に添加し、37°Cで2日間培養するであろう。バックグラウンドは、それぞれのプレートにおいて、細胞を未感染の卵からの尿膜腔液を用いて感染させることにより決定されるであろう。比較対象comparatorsとして、既知のインフルエンザ阻害剤バフィロマイシンA1、アマンタジンおよびスタキフリンstachyflinが用いられるであろう。培養後、その培養上清を集め、その培養上清の乳酸デヒドロゲナーゼLDH活性を測定するであろう。LDHは解糖の間にラクテートをピルベートに変化させる酸化酵素である。LDHは細胞膜および細胞質に広く存在し、細胞損傷の直後に細胞から培養上清中に放出される。従って、細胞外のLDHの定量化はウイルスの感染性の尺度を提供するであろう。上清のLDH活性は、CytoTox96登録商標非放射性細胞毒性アッセイキットPromegaCorporation,米国により、製造業者の説明書に従って測定されるであろう。インフルエンザウイルス感染のパーセント阻害は、阻害=100-[{ODTV-ODCM}/{ODCV-ODCM}]×100として計算されるであろう。ODTVは阻害剤の存在下でウイルスに感染させた培養物の上清の吸光度LDH活性であり、ODCVは阻害剤の非存在下でウイルスを感染させた培養物の上清の吸光度陽性対照であり、ODCMは未感染の卵からの尿膜腔液を用いて感染させた細胞の上清の吸光度陰性対照/バックグラウンドである。10μM未満のIC50を示す阻害剤をストックプレートから選び取り、プラークアッセイによりさらに確証するであろう。パーセント阻害は100×[化合物の存在下でのプラーク数/あらゆる阻害剤を含まない陽性対照のプラーク数]として計算されるであろう。陽性の結果10μM未満のIC50を示す化合物[二次ヒット]は、下記で記述するような組み換えH5N1株に対してさらに試験されるであろう。組織培養における生H5N1ウイルスの阻害。その二次ヒットの抗H5N1インフルエンザ活性は、強化BSL3汚染施設において組み換え世界的流行H5N1インフルエンザウイルスに対して実証されるであろう。高病原性H5N1ベトナム株A/ベトナム/1203/2004からのHAを有する組み換えウイルスは、FodoretalJVirol7396799682の逆遺伝学系を用いて、BasleretalProcNatlAcadSciUSA9827462751の方法に従って生成されるであろう。その現在循環している病原性H5N1ベトナム株A/ベトナム/1203/2004は、それが新しい世界的流行株を示唆する特徴を有するために選択された。ヒットのそのH5N1株に対する阻害活性は、MDCK細胞を用いるプラークアッセイにより確証されるであろう。パーセント阻害は、=100×[化合物の存在下でのプラーク数/あらゆる阻害剤を含まない陽性対照のプラーク数]として計算されるであろう。図11は、HIV/HAを用いた最初のスクリーニング段階からの小さい化合物のヒットをヒトおよび他の哺乳類におけるワクチンとしての使用に適したHA特異的インフルエンザ阻害剤へと進めるための設計の作業の流れの図を示す。実施例9.インフルエンザウイルスの小分子阻害剤を同定するための化合物ライブラリーの初期スクリーニング上記で概説したように、12μgの適切なウイルスエンベロープ糖タンパク質を含有するコンストラクトを12μgのpNL4-3-Luc-R--E-HIVベクターと共に、10cmプレート中の293T細胞90コンフルエント中に、Lipofectamine2000Invitrogenを用いて、供給業者のプロトコルに従って同時形質移入することにより、偽型ウイルスを生成した。細胞培養で増殖させたインフルエンザH1N1PR8ウイルスを、標準的なプロトコル疾病管理予防センター,2004,上記に従って、MDCK細胞において1μg/mlのトシルスルホニルフェニルアラニル-クロロメチルケトンTPCK処理されたトリプシンSigma-Aldrichの存在下で37°Cで3日間にわたって増殖させ、力価測定した。スクリーニングした化合物ライブラリーは、152,500種類を超える化合物の、広い、よくバランスのとれたコレクションである。それらはChembridgeカリフォルニア州サンディエゴおよびTimtecデラウェア州ニューアークから購入され、96ウェルマスタープレートにおいてジメチルスルホキシドDMSO中で2.5mMで希釈され、-20°Cで保管された。化合物は、200~500Daの分子量範囲で選択された。それらは好都合なcLogP値n-オクタノール/水分配係数の対数として計算されるを有し、200を超える化学型を含む。組み合わせ化合物ライブラリーの偽型ウイルスを用いた高スループットスクリーニングを96ウェルプレートで実施した。低継代A549細胞の単層に、25μM終濃度の試験化合物の存在下で、8μg/mlのポリブレンを含有する100μlの偽型ウイルスを感染させた。5時間後、その接種物を除去し、新しい培地を添加し、そのプレートを37°Cおよび5CO2において72時間培養した。感染を、BritelitePlus商標アッセイシステムPerkinElmerを用いてWallacEnVision2102マルチラベルリーダーPerkinElmer,マサチューセッツ州において定量化した。パーセント阻害を以下のように計算した:100×[化合物の存在下での相対ルシフェラーゼ単位RLU-陰性対照のRLU/阻害剤を一切含まない陽性対照のRLU-陰性対照のRLU]。AlphaScreenSureFireGAPDHアッセイキットPerkinElmerを用いて、製造業者のプロトコルに従って細胞溶解物中の内在性の細胞性GAPDHを測定することにより、細胞の生存度を試験した。結果おおよそ40,000種類の別個の化合物をスクリーニングし、141個の一次ヒットを同定した。HTSに関するZ’因子は0.5±0.2であった。一次ヒットを、無関係な糖タンパク質VSV-Gを発現する偽型ウイルスおよび感染性H1N1ウイルスを用いて、それらの特異性に関してカウンタースクリーニングした。再合成した化合物を用いて、それらをそれらの効力および細胞毒性に関して評価した。その一次ヒットの内の36種類のみがHAに媒介される侵入プロセスを特異的に阻害した。そのHTSからの最終的なヒット率は0.09であった。36種類のヒット化合物は全て25μM以下のIC90値を示した。構造的に、そのHA阻害剤は、それぞれ2員以上の群および単集合として表すことができる。本明細書で同定されたHA阻害剤には、多数の化学的に関連する構造の群ならびに単集合が含まれていた。5種類の観察されたヒット表2参照の内で、特にスルホンアミド骨格を有する1種類の化合物化合物2は3.9μMのIC90を示し、この結果に基づいて、一群のスルホンアミドアナログを用いてさらなる構造活性相関SAR研究を実施した表3参照。表3に示した骨格に関して調べられた追加の置換基には、R1におけるエトキシ置換基2-エトキシ、4-エトキシ、R2におけるハロ置換基F、Cl、Br、およびR3-置換されたフェニル基およびアミン窒素の間の直接結合の代わりとなる柔軟なリンカー、例えば-CH2CH2O-すなわち、次の式の部分:が次の部分:の代わりとなるが含まれていた。上記で同定された化合物は、インフルエンザ感染の予防および処置のための抗ウイルス剤としての開発のための候補である。その化合物は、インフルエンザウイルスの宿主細胞中への侵入の研究のための分子プローブとしても有用である可能性がある。実施例10.合成スキームスキーム1アミノアセトアミドスルホンアミドウイルス阻害剤化合物の合成アミノアセトアミドスルホンアミド類は、2種類の置換されたアラニンそれは同じまたは異なっていることができる、スルホニルクロリド、およびブロモアセチルブロミドから始まる収束する3工程のプロセスで合成される。一方のアラニンは水性塩基の存在下でブロモアセチルクロリドによりアセチル化されてブロモアセトアニリドbromoacetanlildeを形成し、一方で他方のアラニンはスルホニルクロリドによりスルホニル化されてスルホンアミドを形成する。そのスルホンアミドは穏やかな塩基により脱プロトン化され、結果として生じた陰イオンを用いてブロモアセトアニリドのブロモ置換基を置換して標的化合物を形成する。標的化合物中の変動は、一般に出発するアニリン類のレベルで成し遂げられる。置換基RおよびR’は出発するアニリン類中にあり、合成を通して持ち越される。置換基R’’は出発するスルホニルクロリド中にあり、それもその合成を通して持ち越される。スキーム2アミノアセトアミドスルホンアミド類の合成に関する代表的な手順2アミノビフェニルのジエチルエーテル中における10°Cの溶液に、10M水性NaOHを添加した。ブロモアセチルブロミドのジエチルエーテル中における溶液を15分間かけて添加した。冷却浴を取り外し、その反応混合物をさらに15分間撹拌した。その混合物を分離し、水層をジエチルエーテルで洗浄した。有機性抽出物を合わせて水およびブラインで洗浄し、次いでMgSO4で乾燥させ、濾過し、最初の量の4分の1まで蒸発させた。結果として得られた固体を濾過により集め、高真空下で乾燥させると、65gの望まれる生成物が白色の結晶質固体として得られた:1HNMRδ832753736727722。I.N4メトキシベンゼンスルホンアミド4メトキシベンゼンスルホニルクロリドおよび4クロロアニリンのジクロロメタン中における0°Cの溶液に、トリエチルアミンを10分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を16時間撹拌した。その混合物をジクロロメタンで希釈し、その合わせた溶液を水およびブラインで洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、49gの生成物が黄褐色の油として得られた:1HNMRδ1017771761704696219。II.N24メトキシフェニルスルホンアミドアセトアミドN2ブロモアセトアミドおよびN4メトキシベンゼンスルホンアミドのDMF中における混合物に、K2CO3を添加した。結果として得られた懸濁液を、60°Cに45分間加熱した。その反応混合物を水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。その有機層を合わせてブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、175mgの生成物が白色の微結晶質の固体として得られた:融点100~104°CRf0171HNMRδ878849772767763760750742736729721718709704694691643628410387。III.N4メトキシベンゼンスルホンアミド4メトキシベンゼンスルホニルクロリドおよび4メチルアニリンのジクロロメタン中における0°Cの溶液に、トリエチルアミンを10分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を16時間撹拌した。その混合物をジクロロメタンで希釈し、その合わせた溶液を水およびブラインで洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、64gの生成物が黄褐色の油として得られた:1HNMRδ994766763704693377216。IV.N24メトキシフェニルスルホンアミドアセトアミドN2ブロモアセトアミドおよびN4メトキシベンゼンスルホンアミドのDMF中における混合物に、K2CO3を添加した。結果として得られた懸濁液を、60°Cに45分間加熱した。その反応混合物を水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。その有機層を合わせてブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、122mgの生成物が白色の微結晶質の固体として得られた:融点160~161°CRf0191HNMRδ919767750742733724707675424383227。V.N4メトキシベンゼンスルホンアミド4メトキシベンゼンスルホニルクロリドおよび2メトキシアニリンのジクロロメタン中における0°Cの溶液に、トリエチルアミンを10分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を16時間撹拌した。その混合物をジクロロメタンで希釈し、その合わせた溶液を水およびブラインで洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、53gの生成物が黄褐色の油として得られた:1HNMRδ770767753750705699691683673380365。VI.N24メトキシフェニルスルホンアミドアセトアミドN2ブロモアセトアミドおよびN4メトキシベンゼンスルホンアミドのDMF中における混合物に、K2CO3を添加した。結果として得られた懸濁液を、60°Cに45分間加熱した。その反応混合物を水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。その有機層を合わせてブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、84mgの生成物が白色の微結晶質の固体として得られた:融点130~131°CRf0101HNMRδ916768751740728707695686419384331。VII.N4メトキシベンゼンスルホンアミド4メトキシベンゼンスルホニルクロリドおよび4メトキシアニリンのジクロロメタン中における0°Cの溶液に、トリエチルアミンを10分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を16時間撹拌した。その混合物をジクロロメタンで希釈し、その合わせた溶液を水およびブラインで洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、95gの生成物が黄褐色の油として得られた:1HNMRδ929763723719711701691683379352。VIII.N24メトキシフェニルスルホンアミドアセトアミドN2ブロモアセトアミドおよびN4メトキシベンゼンスルホンアミドのDMF中における混合物に、K2CO3を添加した。結果として得られた懸濁液を、60°Cに45分間加熱した。その反応混合物を水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。その有機層を合わせてブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、112mgの生成物が白色の微結晶質の固体として得られた:融点131~133°CRf0121HNMR898835762747729719688671667621618420385322。IX.Nベンゼンスルホンアミドベンゼンスルホニルクロリドおよび4メチルアニリンのジクロロメタン中における0°Cの溶液に、トリエチルアミンを10分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を16時間撹拌した。その混合物をジクロロメタンで希釈し、その合わせた溶液を水およびブラインで洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、106gの生成物が黄褐色の油として得られた:1HNMRδ1009773770759749698217。X.N2フェニルスルホンアミドアセトアミドN2ブロモアセトアミドおよびNベンゼンスルホンアミドのDMF中における混合物に、K2CO3を添加した。結果として得られた懸濁液を、60°Cに45分間加熱した。その反応混合物を水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。その有機層を合わせてブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、71mgの生成物が灰白色の粉末として得られた:融点98~100°CRf0271HNMR88484877276776275975474674672872717690618416226。XI.N4クロロベンゼンスルホンアミド4クロロベンゼンスルホニルクロリドおよび4メチルアニリンのジクロロメタン中における0°Cの溶液に、トリエチルアミンを10分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を16時間撹拌した。その混合物をジクロロメタンで希釈し、その合わせた溶液を水およびブラインで洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、68gの生成物が黄褐色の油として得られた:1HNMRδ1017771761704696219。XII.N24クロロフェニルスルホンアミドアセトアミドN2ブロモアセトアミドおよびN4クロロベンゼンスルホンアミドのDMF中における混合物に、K2CO3を添加した。結果として得られた懸濁液を、60°Cに45分間加熱した。その反応混合物を水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。その有機層を合わせてブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、94mgの生成物が白色の微結晶質の固体として得られた:融点159~177°CRf0421HNMRδ877848771759752740738732729726719715695623413227。本明細書で引用された全ての刊行物、特許出願、特許、および他の文書をそのまま援用する。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書が統制するであろう。加えて、その材料、方法、および例は説明的なものでしかなく、限定的であることを意図していない。開示された化合物に対する明らかな変形および本発明の代わりの態様は、上記の開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。全てのそのような明らかな変形および代替案は、本明細書で記述されたような本発明の範囲内であると考えられる。"