"ActivinAを含有する抑制性神経前駆細増殖溶液。請求項1記載の抑制性神経前駆細増殖溶液中で抑制性神経前駆細胞を培養することを特徴とする抑制性神経前駆細胞のinvitro増殖方法。抑制性神経前駆細胞が、大脳皮質から単離した細胞である請求項2のinvitro増殖方法。抑制性神経前駆細胞が、ES細胞またはiPS細胞から分化させた細胞である請求項2のinvitro増殖方法。ActivinAを含む溶液を脳の抑制性神経前駆細胞に接触させることを特徴とする抑制性神経細胞前駆細胞のinvivo増殖方法。抑制性神経前駆細胞が脳表面近傍または脳室下帯に分布する細胞である請求項5のinvivo増殖方法。培養条件下で増殖した神経細胞の集団からActivinA受容体Acvr1を発現している細胞を単離することを特徴とする抑制性神経前駆細胞および抑制性神経細胞の分離方法。神経系細胞の集団が、大脳皮質から単離培養した細胞集団である請求項7の分離方法。神経系細胞の集団が、ES細胞またはiPS細胞から分化させた細胞集団である請求項7の分離方法。請求項7から9のいずれかに記載の方法により分離された抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞を脳表面に移植する方法。抑制性神経前駆細胞に対する選択的増殖促進物質のスクリーニング方法であって、a抑制性神経前駆細胞に被験物質を接触させて細胞の増殖の程度を測定する工程、bActivinA受容体Acvr1に対する抗体、またはAcvr1の細胞内領域の活性を阻害する物質を予め接触させた抑制性神経前駆細胞に被験物質を接触させて細胞の増殖の程度を測定する工程、およびc工程aの細胞増殖が、工程bにおいて消滅または有意に低下した被験物質を目的物質として選択する工程、を含むことを特徴とする方法。人間の思考の中枢である大脳皮質は、興奮性80の神経細胞と抑制性20の神経細胞によって構成されている。人間に見られるいくつかの脳機能疾患の原因は抑制性神経細胞GABA神経細胞の脱落によるという可能性が示されている。このような脳機能疾患の治療には、治療効果を達成するのに十分な量の抑制性神経細胞を脳内の患部に移植する再生医療が有効であると考えられる。しかしながら前記のとおり、現状では十分な量の抑制性神経前駆細胞と発生中の抑制性神経細胞を準備できる状況ではない。その理由は、抑制性神経前駆細胞が増殖能を有するにも関わらず、この細胞を効果的に増殖する手段が確立されていないからである。そこでこの出願の第一の課題は、抑制性神経前駆細胞を効率よく増殖させることのできる新しい手段すなわち、抑制性神経前駆細胞の増殖促進因子とその利用を提供することにある。また、前記第一の課題が解決された場合、患者の大脳皮質から少量採取した脳組織に含まれる抑制性神経前駆細胞を培養増殖して移植用の十分な量の細胞を得ることが可能となるが、この培養物は他の様々な神経系細胞を含む細胞混合物である。あるいは、ES細胞やiPS細胞から抑制性神経前駆細胞や抑制性神経細胞を分化させ場合にも、得られた細胞集団には未分化のES細胞やiPS細胞、あるいは他の種類に分化した神経系細胞が含まれる可能性がある。従って、このような細胞集団から移植に用いる抑制性神経前駆細胞や発生中の抑制性神経細胞を確実に分離する必要がある。この出願の第二の課題は、増殖した抑制性神経前駆細胞や抑制性神経細胞を細胞集団から確実に分離する方法を提供することである。また、前記の第二の課題が解決されて、十分な量の移植用抑制性神経前駆細胞や抑制性神経細胞を分離することが出来たなら、脳を大きく侵襲することなく移植して、効率よく生着させることが必要である。この出願の第三の課題は、分離した抑制性神経前駆細胞や抑制性神経細胞を、脳に大きく侵襲することなく移植して、効率よく生着させる方法を提供することである。さらに、前記第一課題の解決手段は、新たな抑制性神経前駆細胞の増殖促進因子を探索することによって、さらにその効果を向上させ、また新たな産業上利用可能な技術分野を拓く可能性がある。この出願の第四の課題は、抑制性神経前駆細胞の新たな増殖促進因子を探索するための手段を提供することである。この出願の発明者らは、前記の課題を解決するために鋭意研究をおこなった結果、以下の新規な知見を得た。AActivinAが抑制性神経前駆細胞を選択的かつ高効率に増殖させること。BActivinAは抑制性神経前駆細胞にのみ発現するActivinA受容体Acvr1に結合して抑制性神経前駆細胞を増殖させること。CActivinAで活性化した移植用抑制性神経前駆細胞を脳表面に移植すると、自走的に脳内に移動すること。DActivinA受容体Acvr1に対する特異抗体を抑制性神経前駆細胞に前処理することによって、ActivinAの抑制性神経前駆細胞増殖効果が減弱ないし消失すること。すなわちこの出願は、前記の知見Aに基づき、第一の課題を解決するものとして以下の発明1~6を提供する。1ActivinAを含有する抑制性神経前駆細増殖溶液。2前記発明1記載の抑制性神経前駆細増殖溶液中で抑制性神経前駆細胞を培養することを特徴とする抑制性神経前駆細胞のinvitro増殖方法。3抑制性神経前駆細胞が大脳皮質から単離した細胞である前記発明2のinvitro増殖方法。4抑制性神経前駆細胞がES細胞またはiPS細胞から分化させた細胞である前記発明2のinvitro増殖方法。5ActivinAを含む溶液を脳の抑制性神経前駆細胞に接触させることを特徴とする抑制性神経細胞前駆細胞のinvivo増殖方法。6抑制性神経前駆細胞が脳表面近傍または脳室下帯に分布する細胞である前記発明5のinvivo増殖方法。またこの出願は、前記知見Bに基づき、第二の課題を解決するものとして、以下の発明7~9を提供する。7培養条件下で増殖した神経細胞の集団からActivinA受容体Acvr1を発現している細胞を単離することを特徴とする抑制性神経前駆細胞および抑制性神経細胞の分離方法。8神経系細胞の集団が大脳皮質から単離培養した細胞集団である前記発明7の分離方法。9神経系細胞の集団がES細胞またはiPS細胞から分化させた細胞集団である前記発明7の分離方法。さらにこの出願は、前記知見Cに基づき第三の課題を解決するものとして、以下の発明10を提供する。10前記発明7から9のいずれかに記載の方法により分離された抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞を脳表面に移植する方法。さらにこの出願は、前記知見Dに基づき第四の課題を解決するものとして、以下の発明11を提供する。11抑制性神経前駆細胞に対する選択的増殖促進物質のスクリーニング方法であって、a抑制性神経前駆細胞に被験物質を接触させて細胞の増殖の程度を測定する工程、bActivinA受容体Acvr1に対する抗体、またはAcvr1の細胞内領域の活性を阻害する物質を予め接触させた抑制性神経前駆細胞に被験物質を接触させて細胞の増殖の程度を測定する工程、およびc工程aの細胞増殖が、工程bにおいて消滅または有意に低下した被験物質を目的物質として選択する工程、を含むことを特徴とする方法。前記の各発明において抑制性神経細胞とは、抑制性神経伝達物質を放出して他の神経細胞の興奮を抑制する神経細胞であり、大脳、間脳、中脳、脊髄ではGABA作動性神経細胞、延髄ではGABA作動性神経細胞とクリシン作動性神経細胞をさす。その前駆細胞とは、不等分裂により抑制性神経細胞を生み出す能力を有する細胞である。増殖とは、等分裂によりその細胞の基本的な性質を保持した状態で、元の細胞数の2倍、好ましくは4倍程度に増加させることを意味する。また、不等分裂により、抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞、または、抑制性神経前駆細胞と2次抑制性神経前駆細胞等を生み出すことを意味する。また、人を含む哺乳類の中枢神経系組織から単離した抑制性神経前駆細胞を含む細胞集団、またはES細胞やiPS細胞から分化させた抑制性神経前駆細胞を含む細胞集団から、抑制性神経前駆細胞のみを選択的に増やし、最終的に抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞が大多数の集団とすることを意味する。この発明におけるその他の用語や概念は、下記の実施形態の説明や実施例において説明する。発明1によれば、抑制性神経前駆細胞の新規な増殖促進因子であるActivinAを含む抑制性神経前駆細胞の増殖溶液が提供される。発明2~4によれば、前記発明1の溶液を用いることによって、大脳皮質から単離した、あるいはES細胞やiPS細胞から分化させた抑制性神経前駆細胞を大量にinvitro増殖させることが可能となる。発明5、6によれば、ActivinAを含有する溶液を、脳表面近傍または脳室下帯に分布する抑制性神経前駆細胞に接触させることによって、抑制性神経前駆細胞を脳内invivoで増殖させることが可能となる。この方法は、細胞移植手術に比べ、患者への負担を大幅に軽減することができる。発明7~9によれば、様々な種類の細胞が含まれる可能性のある細胞集団から、移植用の抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞のみを確実に分離することが可能となる。発明10によれば、前記発明7~9にて分離した移植用の抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞を脳表面に移植することにより、抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞は自走能により必要とされる脳の部位にまで移動するので、脳実質への細胞移植手術に比べ、患者への負担を大幅に軽減することができる。発明11によれば、ActivinAと同様の機能すなわち、受容体Acvr1に結合して抑制性神経前駆細胞を増殖させる機能を有する新規な物質の探索が可能となる。このような物質は、例えば脳内注入用の薬剤の安全かつ効果的な有効成分となり得る可能性がある。発明1の抑制性神経前駆細増殖溶液は、神経系細胞用培養溶液にActivinAを添加して製造することができる。神経系細胞用培養溶液中のActivinAの含有量は、1μg~100μg/ml、好ましくは10μg~40μg/ml、さらに好ましくは15μg~25μgの範囲である。ActivinAは、例えば、特許文献1-3に記載された方法等により得ることができる。神経系細胞用培養溶液は、様々な神経系細胞の培養に用いられている公知の培養培地を使用することができ、例えば、basicfibroblastgrowthfactorbFGF20μg/mlおよびepidermalgrowthfactorEGF20μg/mlを含有する塩溶液NeurobasalMediumなどである。また、本発明の目的抑制性神経前駆細胞の増殖のためには、下記のsinglecellmicroarrayのデータに基づき、Insulin、Insulin-likegrowthfactor1、Insulin-likegrowthfactor2、LeukemiainhibitoryfactorLIF、AndrogenおよびEstrogenを添加することも望ましい。発明2~4のinvitro増殖方法は、発明1の抑制性神経前駆細増殖溶液中で抑制性神経前駆細胞を培養し、細胞を増殖させることを特徴とする。培養対象である抑制性神経前駆細胞は、例えば大脳皮質脳表面近傍、脳室下帯などの脳組織に含まれる細胞、あるいはES細胞やiPS細胞から公知の方法例えば、非特許文献1、非特許文献2により分化させた細胞である。細胞培養は、公知の神経系細胞の培養と同様に行うことができる。本発明方法により、1週間程度の培養によって、抑制性神経前駆細胞を2~4倍程度に増殖させることができる。発明5、6のinvivo増殖方法は、ActivinAを含有する溶液を脳の抑制性神経前駆細胞に接触させることを特徴とする。溶液それ自体は発明1の溶液と同一とすることができ、ActivinAの濃度は発明の1の溶液と同一またはそれより何倍かに増量することが好ましい。脳表面に注入する場合は、流動性をおさえて局所に滞留するように生体に影響の少ないヒトコラーゲン等の高分子ポリマーを混合して使用する。また、溶液をそのまま大脳皮質に注入する場合は、脳に接し浸透する時間を長くするようにする。脳室に注入する場合は溶液をそのまま注入する。この方法は、具体的には、カテーテル等を介して頭蓋腔内や脳室ないにActivinA含有溶液を注入することによって、脳表面近辺または脳室下帯に分布する抑制性神経前駆細胞を増殖させる。ActivinA含有溶液の注入量は、50ml~500ml程度を、30分~5時間掛けて注入する。発明7~9は、培養条件下で増殖した神経細胞の集団からActivinA受容体Acvr1を発現している細胞を単離することによって、抑制性神経前駆細胞および抑制性神経細胞の分離する方法である。神経系細胞の集団は大脳皮質から単離培養した細胞集団、またはES細胞やiPS細胞から分化させた細胞集団である。すなわち、ActivinAの受容体として数種類の遺伝子が知られているが、大脳皮質内では、Acvr1は抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞のみが発現している受容体であるので図5-6、Acvr1を発現している細胞を選択することによって、抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞を他の細胞から分離することができる。具体的には、例えば、Acvr1に対する抗体を介して目的細胞に磁気ビーズを結合し、磁石を用いて磁気ビーズを回収すれば、Acvr1を特異的に発現する抑制性神経前駆細胞および抑制性神経細胞を分離することができる。あるいは、抗Acvr1抗体を蛍光色素等で標識すれば、蛍光発色セルソーターFACSによりAcvr1を特異的に発現する抑制性神経前駆細胞および抑制性神経細胞を分離することができる。発明10は、発明7~9の方法により分離した抑制性神経前駆細胞および抑制性神経細胞を、脳表面に移植する方法である。分離した抑制性神経前駆細胞および軸索や樹状突起を形成する前の抑制性神経細胞は移動能力がある。生体に影響の少ないヒトコラーゲン等の高分子ポリマー液と抑制性神経前駆細胞および抑制性神経細胞を混ぜ、流動性をおさえて局所に滞留するようにした細胞混合液を脳表面または大脳皮質溝に注入する。細胞混合液が脳表面に接している間に、移動能のある抑制性神経前駆細胞および抑制性神経細胞は、軟膜を貫いて大脳皮質実質に進入して、抑制性神経細胞が欠落した領域に移動し生着して神経回路に組み込まれる。発明11の方法は、以下の工程:a抑制性神経前駆細胞に被験物質を接触させて細胞の増殖の程度を測定する工程、bActivinA受容体Acvr1の細胞外被験物質と結合する領域に対する抗体、またはAcvr1の細胞内領域の活性を阻害する物質を予め接触させた抑制性神経前駆細胞に被験物質を接触させて細胞の増殖の程度を測定する工程、およびc工程aの細胞増殖が、工程bにおいて消滅または有意に低下した被験物質を目的物質として選択する工程、を含むことによって、抑制性神経前駆細胞に対する選択的増殖促進物質すなわち、ActivinA-受容体Acvr1結合を介した増殖促進因子をスクリーニングする方法である。すなわち、神経系前駆細胞の増殖促進物質は幾つかのものが知られており、これらの物質は抑制性神経前駆細胞を含め、数種類もの前駆細胞を増殖させる。しかしながら、例えば細胞集団の中の抑制性神経前駆細胞のみを選択的に増殖させるためには、ActivinAのように受容体Acvr1と結合して増殖活性を発揮する物質が必要となる。前記工程aで抑制性神経前駆細胞を増殖させる物質が得られたとしても、この物質がActivinA-受容体Acvr1結合を介した増殖促進物質であることを確認する必要がある。そこで、工程bにおいて被験物質がAcvr1に結合することを阻害して被験物質の増殖促進の程度を測定することによって、最終的に工程cで被験物質がActivinA-Acvr1結合を介した増殖促進物質であることを確認することが可能となる。aの工程では、抑制性神経前駆細胞の増殖の程度は、例えば下記の実施例に示したように、thymidinetriphosphateのアナログBrdUまたはEdUの取り込みを指標として確認することができる。また被験物質としては、例えば、有機または無機の化合物特に低分子量の化合物、タンパク質、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が公知のものであっても、未知のものであってもよい。あるいはコンビナトリアルケミカルライブラリーは、目的物質を効率的に特定するための候補物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、化学合成または生物学的合成により、試薬などの多くの化学的ビルディンクブロックを結びつけることにより生成される種々の化学組成物のコレクションである。例えば、ペプチドライブラリーなどの直線的なコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ビルディンクブロックアミノ酸のセットを、所与の化合物の長さすなわちペプチドのサイズについて可能なすべての方法で結びつけることにより形成される。化学的なビルディングブロックについてのこのようなコンビナトリアルミキシングを通して、多数の化学組成物を合成することが可能である。例えば、100の可換的な化学的ビルディングブロックについての系統的なコンビナトリアルミキシングは、結果として1億個の4量体化合物または100億個の5量体化合物を生じる例えば、Gallopetal.,1994379:1233-1250参照。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である例えば、米国特許第6,004,617号;5,985,365号を参照。また各種の市販ライブラリーを使用することもできる。bの工程では、目的は、特異的にAcvr1が被験物質と結合することを阻害することであり、特異的にAcvr1が被験物質と結合したことにより生じたAcvr1の細胞内領域の変化を特異的に阻害することにある。前者の阻害は、実施例5にあるように、ヒトAcvr1SwissProtIDQ04771のN末から20~50アミノ酸のペプタイドに対してウサギで作った抗体を加えて、Acvr1が被験物質と結合するのを阻害することができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体を使用する。また、後者の阻害は、Acvr1の細胞内領域の蛋白構造の隙間に入り込み、その変化を妨害する物質例えば6-[4-2-piperidin-1-ylethoxyphenyl]-3-pyridin-4-ylpyrazolo[1,5-a]pyrimidineなどで予め抑制性神経前駆細胞を処理しておくと、被験物質とAcvr1が結合しても、シグナル伝達を阻害することができ非特許文献12、被験物質がActivinA-Acvr1結合を介した特異的な増殖促進物であるか否かを確認することができる。cの工程では、aとbの工程で、増殖した抑制性神経前駆細胞に取り込まれたthymidinetriphosphateのアナログBrdUまたはEdUの量の計測により、その差が大きいほど有望な特異的な抑制性神経前駆細胞の増殖促進物質であると判定できる。以下、抑制性神経前駆細胞GABA作動性神経前駆細胞とActivinAおよびその受容体との関係を調べるために行った実験、および実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下に限定されるものではない。[実験1]抑制性神経前駆細胞の性質を調べるために、GAD67GABA合成酵素の遺伝子の座にGFPを挿入したマウス、GAD67-GFPknockinmouse非特許文献8の生直後の大脳皮質のGFP陽性細胞を調べた図1a。その結果、GFP陽性で、複数の神経細胞マーカー例えば、GAD67doublecortinを発現している細胞が、細胞周期マーカーPCNA,Ki-67,cyclinD1/2,cyclinE1/2,phospholirated-HistonH3陽性でDNA合成期に伴いBrdUを取り込むことが明らかになった図1b。神経細胞マーカーと細胞周期マーカーを発現しているGFP陽性の細胞を抑制性神経前駆細胞と判定して、その分布を調べた。その結果、P0マウス大脳皮質の脳室下帯sub-ventricularzone、中間帯intermediatezone非特許文献6、加えて今回の実験により、皮質板corticalplate、辺縁層marginalzone、軟膜piamater図15,16に多くの抑制性神経前駆細胞が存在することが分かった。[実験2]次にGAD67-GFPP0マウスの大脳皮質SVZの一部を取り出し、蛋白分解酵素トリプシンで細胞を分散し、10個の細胞をピックアップし、single-cellmicroarrayanalysisを行った[非特許文献7]。その結果、1-5番の細胞は細胞分裂を伴う状態にあり、特に2番はcyclinE1/E2、PCNA、多くのDNA合成関連遺伝子の発現状況から判断して細胞分裂のS期に、4番はcyclinD1/D2の発現からG1期にあると考えられた[非特許文献7]。そこで、これら10個の細胞が発現している、細胞増殖因子受容体というキーワードで候補遺伝子を650上げて、集めて図示した図2。その結果、それぞれの細胞の細胞周期の中のフェーズの違いにより、細胞増殖因子受容体の発現量が異なることが明らかになった。細胞1-5はNotch3が陰性で対称分裂を準備している可能性があり、6-10はNotch3が陽性で非対称分裂を準備しているか、非対称分裂を行った後の状態にある可能性がある。それ故、6-10の細胞は抑制性神経細胞である可能性がある。神経細胞に細胞増殖因子受容体が発現していても、細胞分裂に関わるものではなく、突起を伸ばしたり、細胞の成熟に関係するものと考えられる。それに対し、G1期はその後細胞分裂をやめて分化するか、再度分裂期に入るかを決める重要なチェックポイントの時期にある。それ故、G1期にある細胞4で発現していると判定されたPresentCall細胞増殖因子受容体に結合する因子は、細胞分裂を調節する重要な役割を持つことが考えられる。それ故、細胞4で発現していると判定された細胞増殖因子受容体遺伝子リストに、S期にありDNAを複製している時期の細胞2で発現していると判定された細胞増殖因子受容体遺伝子リストを足して、図を作成した図3。この図3を精査したところ、細胞4が特徴的な分子としてActivinAreceptortype1Acvr1:ALK2を発現していたことが明らかになった。さらに、ActivinA受容体Acvr1以外に、basicfibroblastgrowthfactorbFGF,epidermalgrowthfactorEGF,Insulin,Insulin-likegrowthfactor1AF440694,Insulin-likegrowthfactor2AK011784,LeukemiainhibitoryfactorLIF;AF065917,Androgenreceptor,Estrogenreceptorの受容体が検出され、これらの受容体活性が細胞増殖を維持するために必要であると考えられる。なお、特徴的な分子として着目した分子、ActivinA受容体は、図4にリストアップした。[実験3]ActivinAの受容体Acvr1が実際に抑制性神経前駆細胞で発現しているかどうかを確認した。ヒトAcvr1SwissProtIDQ04771のN-末から20~50アミノ酸のペプチドを抗原としてウサギを免疫して作成した抗体を使用した。この抗体を用いてマウス大脳皮質を免疫染色した。その結果、幼若な抑制性神経細胞と抑制性神経前駆細胞が多く分布する大脳皮質脳室下帯にAcvr1免疫組織染色が集中していた図5。さらに、高倍で3次元的に提示すると、GFP陽性細胞の表面一部に染色が局在していることが分かった図6。次にAcvr1をGAD67陽性細胞でのみを欠落させる実験を実施した。全身でAcvr1を欠落したknock-outmouseは胎児の段階に致死で、適切な実験が出来ない。それ故、本実験では、Acvr1の遺伝子の第7エクソンの両側に、loxPと呼ばれるP1phage由来のDNAを挿入したマウスconditionalknock-outmouse非特許文献9を米国MichiganUniversityから入手し、GAD67-Creknock-inmouse非特許文献6を新潟大学から入手し、両マウスを掛け合わせて、GAD67陽性細胞でのみでAcvr1の発現を欠落させた。その結果、原因はまだ不明であるが、出産後致死であった。それ故、出産前日、胎生18日目E18にGAD67陽性細胞でのみでAcvr1の発現を欠落させた胎児を取り出し、灌流固定を行って、大脳皮質のGABAに対する免疫組織を行ったところ、図7に示したようにGABAの免疫組織染色度が大きく下落した。[実験4]脳内で、抑制性神経前駆細胞が脳室周囲の脳室下帯に存在することは図1で示した。脳表面近傍での抑制性神経前駆細胞の分布を調べるために、幼弱P7GAD67-GFPknock-inmouseの軟膜を観察した。軟膜内にはGFP陽性の細胞が多く分布し、pia-progenitorと呼び習わしている。図8では軟膜はLaminin陽性図14-Cで赤く示されている。GAD67-GFPP0マウスの大脳皮質を取り出し、蛋白分解酵素トリプシンで細胞を分散し、セルソーターによってGFP陽性細胞を取り出した。神経幹細胞用培養液Neurobasalmedium5B27supplement,20ng/mlbFGF,20ng/mlEGFにE18のマウス胎児脳組織を加えて一晩培養することによりコンディションをととのえ、その後細胞を除いて5g/mlのBrdUを加え、セルソーターで取り出したGFP陽性細胞を2-7日間培養し、固定した。その結果、GFP陽性のGABA作動性神経前駆細胞の一部は、コンディションを整えた神経幹細胞溶培養液中でBrdUを取り込んで、細胞分裂することを確認した図9。胎児脳組織によりコンディションを整えていない神経幹細胞溶培養液でGFP陽性細胞を培養しても図9のような像は得られなかった。以上の結果から、GABA神経前駆細胞は神経幹細胞用培養液では増殖できないが、必須増殖因子を神経幹細胞用の培養液中に加えると増える可能性が示されたので、必須増殖因子の検出系が確立できた。ActivinAを20ng/ml、神経幹細胞用培養液に加えた場合と加えなかった場合に、BrdUのDNAへの取り込みを調べたところ、有意な差が観察された図10。同結果により、G1期に発現しているActivinA受容体Acvr11448460-ALK2は抑制性神経前駆細胞の細胞増殖を促進すると証明できた。1416787-ALK2は、10細胞のうちの多くでシグナルが高く、細胞5、細胞6でもPresentCallがでているが、プローブが異なるので、Acvr1の異なるsplicingvariantsと考えられる。ActivinAの効果をinvivoでも確認するために、生後3日目P3の幼若マウスの脳にActivinA溶液を直接注入した。加えて30分後に、EdUを腹腔内注射した。その後、1週間飼育して、麻酔下に固定して組織観察した結果、ActivinA注入側の半球ではA-C、GFP/EdUの二重染色された抑制性神経細胞矢印が反対半球D-Fに比べ有意に多く観察された。また、注入側の軟膜の中には、多くのpiaprogenitorと考えられる細胞元はGFP/EdU陽性であったと考えられるがEdU陽性細胞として観察される図11。このことによりActivinAを含む溶液を脳の抑制性神経前駆細胞に接触させることができれば、invivoの抑制性神経前駆細胞を増殖させることが可能であることが示された。次に問題となるのが、脳の内部の抑制性神経前駆細胞にActivinAを届ける方法である。その方法は、注射針で貫いて脳を損傷するようなことがない方法であることが好ましい。抑制性神経前駆細胞は脳表面近傍または脳室下帯に多くが分布するとこは既に記載した。脳表面近傍または脳室下帯にActivinAを届ける手法を確立するために、ActivinAそれ自身ではなく、検出が容易な蛋白でモニター実験を実施した。使用した蛋白は、チトクロームCを酵素分解したペプチドで、ヘムを含む部分を精製して作られたマイクロパーオキシダーゼmicroperoxidaseを使用した。マウスの小脳の尾側には大槽と呼ばれる、大きなくも膜下腔がありそこに、マイクロパーオキシダーゼを注入して30分後にホルマリンにて固定し、酵素の分布をDAB反応peroxidaseの反応を介して、発色させて示した。マイクロパーオキシターゼが通過できない場合は、脳血液関門BloodBrainBarrierに相当する障壁があると定義されている。図12にある実験結果では、マイクロパーオキシターゼの一部が、大槽から第四脳室に侵入し、第四脳室から第三脳室、そして側脳室LVに至り、側脳室表面から脳実質に浸透していることが示された。また、大槽から脳底部に回り込んだマイクロパーオキダーゼは、脳表面の軟膜から脳実質にも浸透していることが示された。つまりBBBに相当する障壁は、くも膜下腔と脳実質の間境は軟膜、脳室と脳実質の間境は脳室帯には無いことを意味している。また、マイクロパーオキシダーゼmicroperoxidaseに代えて、分子量の大きいホースラディッシュパーオキシダーゼHorseradishperoxidaseを使用しても同じ結果が得られた。つまり、ActivinAや他の細胞増殖因子を含む液を、脳表面くも膜下腔または脳室に注入する方法により、脳表面近傍、脳室下帯に分布する抑制性神経前駆細胞に、ActivinAや他の細胞増殖因子を接触させて作用させることが可能であることが示された。Acvr1は膜蛋白で、細胞膜を貫き細胞外にActivinAを結合する領域を持ち、細胞内に他の分子をリン酸化する機能を持った分子である。それゆえ、実験3で使用した抗Acvr1抗体は細胞が生きた状態でAcvr1に結合できる。Acvr1は抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞のみに発現しているので図5、6、図13に模式図を示した方法により抑制性前駆細胞と抑制性神経細胞を分離した。結果は図14に示したとおりであり、GAD67-GFP陽性細胞抑制性神経前駆細胞と抑制性神経前駆細胞を主要な細胞として分離することが出来た。抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞を脳の表面に触れさせる形で移植した。なお、移植の全ての工程を記載するのではなく、実証されている事柄に付いてはその根拠となる文献名を記載し、実証されていない工程に絞って記載する。GAD67-Creマウス胎児E14の大脳基底核原基にCAG-ImRFPIGFP-polyAのプラスミドDNAを電気穿孔法で導入し、大脳基底核原基から大脳皮質に移動してくるGAD67陽性細胞系譜にある細胞をGFPで標識した。移動細胞の一部は、増殖能を持った抑制性神経前駆細胞で非特許文献6、脳表面に来た抑制性神経前駆細胞は、基底ラミナ層を貫いて軟膜内に入り図15a-b、Pia-progenitorとなって分裂を繰り返した図15c。つまり、抑制性神経前駆細胞は、基底ラミナ層を貫く能力を持つことが示された。基底ラミナ層には、極性があるという報告はなく、抑制性神経前駆細胞は脳から貫き出ることが出来、脳内に貫き入ることも出来る。さらに大脳皮質深くまで脳表面に移植した抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞を届けることが好ましいが、脳の中には、脳表付近に存在する自身の前駆細胞を増殖させて、大脳皮質の深い層に送り届ける仕組みが備わっていることが報告されている非特許文献10。本実施例では、大脳皮質脳室下帯の嗅球顆粒細胞抑制性神経細胞の産生の研究観察に用いられたNestin-CreERマウス非特許文献11を京都大学より供与を受けて実験に供した。このマウスとGFPCre-reporterマウスと掛け合わせて、両方の遺伝子を持つマウスを準備した。同マウスにタモキシフェンを投与し、一側の偏桃体に電極を挿入して脳を刺激し、kindlingを形成させて癲癇症マウスとした。電気刺激の都度、BrdUを腹腔内に注射し、Nestin陽性となって抑制性神経細胞を産生する抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞をGFPとBrdUで染色した。脳の外表面には図16にあるような神経前駆細胞がBrdU陽性となっているが、他のマウスで時間が経過した状況を観察すると、辺縁層にBrdUGFP二重陽性の細胞が現れる。その後もGFP陽性の細胞の分布は、深くなり、非特許文献10の報告内容が再確認できた。以上の結果は、非特許文献10にある公知の事実と、抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞は基底ラミナを貫くことができると言う本願発明の新しい知見に基づき、脳表面への抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞の安全な移植法が実施可能であることを保証するものである。ActivinAの受容体Acvr1にActivinAが結合することにより細胞増殖が進むが、Acvr1のActivinA結合部位に抗体を結合させてActivinAの結合を妨げると、細胞増殖は進まない図17。Aまず、セルソーターで新生児GAD67-GFPマウスの大脳皮質に含まれるGFP陽性細胞抑制性神経前駆細胞と抑制性神経細胞を分離して、神経幹細胞用の培養液Mで2日間培養したときに細胞のDNAに取り込まれたEdUをblottingmembrane上で発色させても、測定限界程度にしかEdUの取り込みは認められなかった図17-A。この状態は、完全にAcvr1にActivinAが結合することを阻害した場合の状況となる。B次に、神経幹細胞用の培養液に新生児マウス大脳皮質の組織を入れて一晩培養し、様々な増殖因子を分泌さてコンディションを整えた培養液MCを準備して抑制性神経前駆細胞を培養し、上記AにあるようにDNAに取り込まれたEdUをblottingmembrane上で発色させて可視化した図17-B。C次に、上記の条件に、anti-ActiviAblockingantibodyを加えて、2日間培養したときに細胞のDNAに取り込まれたEdUをblottingmembrane上で発色させて定量した図17-C。D最後に上記Bの条件にヒトAcvr1SwissProtIDQ04771のN末から20~50アミノ酸のペプタイドに対してウサギで作った抗体を加えて、2日間培養したときに細胞のDNAに取り込まれたEdUをblottingmembrane上で発色させて可視化した図17-D。以上の結果を比較することにより、コンディションを整えた培養液MCが、ActivinAを含み、ActivinAを抗体により除くと神経幹細胞用培養液と同じ状態となる。ヒトAcvr1SwissProtIDQ04771のN末から20~50アミノ酸のペプタイドに対してウサギで作った抗体を加えると、ActivinAが含まれていても、ActivinAがAcvr1に結合できずに、抑制性神経前駆細胞が増殖できなくなったことが分かる。ActivinAはAcvr1のリガンドであり、ActivinAに代わるリガンドも上記と同様の方法により特定することが可能である。"