"特定のMHC-ペプチド複合体に特異的に結合する少なくとも4つのドメインを含むポリペプチドであって、前記ドメインはリンカーアミノ酸配列により分離されており、それにより、各ドメインには別個のMHC-ペプチド複合体に結合する能力が付与される、ポリペプチド。エフェクター機能を有するアミノ酸配列をさらに含む、請求項1に記載のポリペプチド。6つのMHC-ペプチド複合体結合ドメインを有する、請求項1又は2に記載のポリペプチド。前記特異的結合ドメインのうちの少なくとも1つは免疫グロブリン断片を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチド。前記少なくとも1つの免疫グロブリン断片は、天然の、突然変異した及び/又は合成のVHである、請求項4に記載のポリペプチド。前記特異的結合ドメインのうちの少なくとも1つは一本鎖T細胞受容体ドメインを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載のポリペプチド。前記特異的結合ドメインはMHC-I-ペプチド複合体に結合できる、請求項1~6のいずれか一項に記載のポリペプチド。前記特異的結合ドメインは、腫瘍関連抗原由来のペプチドを含むMHC-I-ペプチド複合体、特に種々のMAGEペプチドを含むMHC-I-ペプチド複合体に結合できる、請求項6に記載のポリペプチド。前記特異的結合ドメインのうちの少なくとも1つは、QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS又はEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSに本質的に一致するアミノ酸配列を有する、請求項5に記載のポリペプチド。前記リンカーのうちの少なくとも1つは、Gly4SerN、GSTSGSn、GSTSGSGKPGSGEGSTKG、EFAKTTAPSVYPLAPVLESSGSG、若しくはタンパク質フォールディングに対する柔軟性を付与する他の任意のリンカー、又はEPKSCDKTHTIgG1、ELKTPLGDTTHTIgG3若しくはESKYGPPIgG4に本質的に一致するアミノ酸配列を有する、請求項5に記載のポリペプチド。Hexa-AH5:QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS;又はHexa-11HCH1:EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC;又はHexa-11HAH5:EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGSQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKSPGSGEGTKGEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEFAKTTAPSVYPLAPVLESSGSGQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSGSTSGSGKSPGSGEGTKGQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSに本質的に一致するアミノ酸配列を有する、請求項5に記載のポリペプチド。前記特異的結合ドメインは、本質的にもっぱら前記MHC-ペプチド複合体に結合する能力を有し、前記ペプチド自体、別のMHC-ペプチド複合体又は空のMHCには結合しない、請求項5に記載のポリペプチド。請求項1~12のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。請求項13に記載の核酸を含むベクター。請求項13に記載の核酸を宿主細胞のゲノムに組み込むための手段をさらに含む、請求項14に記載のベクター。請求項13に記載の核酸に作動可能に連結された分泌シグナルをさらに含む、請求項14又は15に記載のベクター。請求項1~12のいずれか一項に記載のポリペプチドの発現のための宿主細胞であって、請求項11、12又は13に記載の核酸が組み込まれた宿主細胞。請求項1~12のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造するための方法であって、請求項18に記載の宿主細胞を培養するステップと、請求項13に記載の核酸を発現させるステップと、請求項1~12のいずれか一項に記載のポリペプチドを採取するステップと、を含む方法。請求項1~12のいずれか一項に記載のポリペプチドと、適切な希釈剤及び/又は賦形剤と、を含む医薬組成物。従来の細胞増殖抑制及び/又は殺腫瘍剤をさらに含む、請求項19に記載の医薬組成物。癌の治療において使用するための、請求項1~12のいずれか一項に記載のポリペプチド。癌のアジュバンド治療において使用するための、請求項1~12のいずれか一項に記載のポリペプチド。癌の組合せ化学療法において使用するための、請求項1~12のいずれか一項に記載のポリペプチド。異なるHLA対立遺伝子を対象とする本発明の少なくとも2種の異なるポリペプチドを含むキットオブパーツ。異なるMHC-ペプチド複合体を対象とする本発明の少なくとも2種の異なるポリペプチドを含むキットオブパーツ。エクスビボ又はインビボ画像処理における検出のための手段をさらに含む、請求項1~12のいずれか一項に記載のポリペプチド。請求項1~12のいずれか一項に記載のポリペプチドと、細胞増殖抑制又は殺腫瘍剤と、のコンジュゲート。実施例1:HLA-A0201/マルチMAGE-Aに特異的なヒト抗体断片の選択0087HLA-A0201提示マルチMAGE-AエピトープY-L-E-Y-R-Q-V-P-Gに特異的なヒト抗体断片配列番号5を得るために、以前deHaardら2により記載された手順に従ってヒトFabファージディスプレイライブラリーが構築され、本質的にChamesら3により記載されたようにして、選択のために使用された。ヒトFabファージ1013コロニー形成単位はまず2脱脂粉乳を含有するPBSPBSM中室温で1時間プレインキュベートされた。並行して、200μlのストレプトアビジン被膜ビーズDynalはPBSM中1時間平衡化された。それに続くラウンドでは、100μlのビーズが使用された。パンMHCバインダーを枯渇させるため、それぞれの選択ラウンドでは、無関係なペプチドを含有するビオチン化MHCクラスI-ペプチドMHC-p複合体Sanquin、theNetherlands200nMがファージに添加され、回転下30分間インキュベートされた。平衡化されたビーズが添加され、その混合物は回転下15分間インキュベートされた。ビーズは磁力を用いてチューブの側面に引き付けられた。枯渇されたファージ画分に、それに続いて減少する量のビオチン化MHC-p複合体第1ラウンドでは200nM、第2及び第3ラウンドでは20nMが添加され、連続回転させながら室温で1時間インキュベートされた。同時に、パンMHCクラスI結合可溶性FabD3がファージMHC-p複合体混合物に添加されたそれぞれ1~3ラウンドで50、10及び5μg。平衡化されたストレプトアビジン被膜ビーズが添加され、その混合物は回転下15分間インキュベートされた。ファージは磁力により選択された。非結合ファージは、PBSMを用いた5回洗浄ステップ、0.1TWEEN登録商標を含有するPBSを用いた5ステップ及びPBSを用いた5ステップにより取り除かれた。ファージは、500μlの新たに調製されたトリエチルアミン100mMと一緒の10分間インキュベーションによりビーズから溶出された。溶液のpHは、500μlの1MTrispH7.5の添加により中和された。溶出されたファージは、37°Cで30分間、対数増殖するイーコリE.ColiTG1細胞0.5のOD600nmと一緒にインキュベートされた。細菌は2×TYAGプレート上で一晩増殖させた。次の日、コロニーは採取され、50mlの2×TYAGにおいて10μlの接種材料が使用された。細胞は0.5のOD600nmまで増殖させ、5mlのこの懸濁液にM13k07ヘルパーファージ5×1011コロニー形成単位を感染させた。37°Cでの30分間のインキュベーション後、細胞は遠心分離され、25mlの2×TYAKに再懸濁され、30°Cで一晩増殖させた。ファージは既に記載された通りに培養上清から回収され、次のラウンドのパニングのために使用された。3回の選択ラウンド後、261倍の濃縮が得られ、解析された282クローンのうち46がHLA-A2-マルチMAGE-A複合体に特異的であることが明らかにされた図1。HLA-A0201/マルチMAGE-A複合体及びJCウイルス由来ペプチドとのHLA-A0201複合体を使用するELISAを用いて、選択されたFabの特異性が決定された。1.2HLA-A0201/マルチMAGE-Aエピトープに特異的なヒトFabは抗原陽性細胞に結合する0088選択されたFabファージは、マルチMAGE-AペプチドY-L-E-Y-R-Q-V-P-Vが負荷されたHLA-A0201陽性EBV形質転換B-LCLに結合する能力について解析された。B-LCL株BSM0.5×106は、37°Cで30分間、マルチMAGE-Aペプチド100μlPBS中10μgを負荷され、続いてFabファージAH5、CB1、CG1、BD5及びBC7と一緒にインキュベートされ、フローサイトメトリーにより解析された。図2に示されるように、FabAH5、CB1及びCG1はペプチド負荷細胞のみに特異的に結合するが、FabBD5及びBC7は、マルチMAGE-Aペプチドが負荷されていないBSMに対して非特異的結合を示した。AH5、CB1及びCG1による非ペプチド負荷細胞への結合は観察されなかった。0089次いで、AH5、CB1及びCG1を提示しているファージ、並びにHLA-A0101/MAGE-A1特異的FabファージG84を用いて、組織学的起源の異なる腫瘍細胞株が染色された。この目的のために、前立腺癌細胞LNCaP、多発性骨髄腫細胞MDN、黒色腫細胞MZ2-MEL43及びG43及び乳癌細胞MDA-MB157は染色されフローサイトメトリーにより解析された図3。FabAH5は多発性骨髄腫細胞MDNに特異的に結合したが、HLA-A0201陰性黒色腫及び乳癌細胞には結合しなかった。CB1とCG1の両方は黒色腫細胞株G43上で非特異的結合を示した。陽性対照FabG8は試験されたすべての細胞株への結合を示した。1.3FabAH5はHLA-A0201/マルチMAGE-A複合体のみに結合する0090複数のペプチド/MHC複合体を使用するELISAによってFab-AH5の特異性が確認された。この目的のために、ペプチドマルチMAGE-A、gp100、JCV及びMAGE-C2を提示するHLA-A0201複合体、並びにHLA-A1/MAGE-A1複合体は96ウェルプレート上に固定され、FabAH5及び対照FabG8を表示するファージと一緒にインキュベートされた。図4に示されるように、AH5はHLA-A0201/マルチMAGE-Aのみに結合し、無関係な複合体HLA-A0201/gp100、HLA-A0201/MAGE-C2、HLA-A0201/JCV及びHLA-A0101/MAGE-A1には結合しない。陽性対照FabG8はその関連標的HLA-A0101/MAGE-A1のみに結合する。実施例2:ラクダ化単一ドメインAH5VHドメインを含む六量体タンパク質の産生2.1六量体AH5VHタンパク質の産生のための遺伝子の設計0091ヒト抗体生殖系列遺伝子VH3はラマ単一ドメインVHHに高い相同性を示す。ヒトVH3遺伝子におけるアミノ酸44、45及び47をラマVHHに存在するこれらの位置のアミノ酸で交換すると、ヒトVH3遺伝子の安定性及び発現が増強されることが明らかにされている5。AH5VHは生殖系列遺伝子VH3-3301に対して低い相同性IMGT相同性サーチにより決定された場合71を示すが、その発現及び安定性は、ラクダ化と呼ばれるプロセスである、アミノ酸44、45及び47をラマVHHアミノ酸で交換することから利益を得る可能性がある。さらに、発現すると6つのAH5VHドメインを含むことになる遺伝子が収集された。この目的のために、6つのコドン最適化ラクダ化AH5VHドメインこれは、各AH5VHドメイン間にGSTSGSリンカーを有する。に作動可能に連結されたpelB分泌シグナルを含む遺伝子Hexa-AH5と呼ぶ。が設計されたDNA配列は配列番号1、アミノ酸配列は配列番号4参照。この遺伝子はGeneartRegensburg、Germanyにより合成され、イーコリにおける発現のためにpStaby1.2ベクターDelphigenetics、Belgiumにクローニングされた。2.2六量体AH5VHタンパク質の産生及び精製0092六量体AH5VHタンパク質Hexa-AH5DNA配列は配列番号1、アミノ酸配列は配列番号4参照の発現のために、pStaby-Hexa-AH5ベクターはエレクトロポレーションを介してSE1細菌に導入された。陽性クローンは、OD600=0.8まで30°C、2グルコースの存在下で増殖させた。次いで、細菌TYAG培地は、発現を誘導するために、1mMのIPTGを含有するTY培地に置き換えられた。30°Cで一晩の培養後、細菌及び培地は採取された。ペリプラズム画分は、氷上での30分間のPBS/EDTA/NaClと一緒の細菌のインキュベーション後に収集された。次いで、タンパク質発現がSDS-PAGEにより解析された。図5に示されるように、Hexa-AH5タンパク質は培地に分泌され、細菌ペリプラズムに存在していた。0093六量体AH5VHタンパク質は、Ni親和性精製を用いて培地及び細菌から単離された。この目的のために、培地はNi結合セファロースビーズと一緒にインキュベートされ、穏やかに撹拌しながら一晩インキュベートされた。細胞内タンパク質を得るために、細菌は溶解され細胞残渣は遠心分離により取り除かれた。PBSを用いた一晩の透析後、六量体AH5VHタンパク質はNi-セファロースを用いて精製された。六量体AH5VHタンパク質の純度はSDS-PAGEにより確認され、タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイPierceにより決定された。実施例3:六量体AH5VHタンパク質は多様な腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する0094パンMHCクラスI及びβ2M特異的抗体によるMHCクラスI分子の架橋結合によりアポトーシスの誘導が生じる6。このプロセスはカスパーゼ9依存性であることが明らかにされており、インビトロ及びインビボでMHCクラスI陽性腫瘍細胞の根絶をもたらす。パンMHCクラスI抗体及び抗β2M特異的抗体によるアポトーシスの誘導は、腫瘍特異的抗原を発現している腫瘍に特異的ではない。これとは対照的に、特異的ペプチド/MHC複合体に結合するT細胞受容体に似ている分子の相互作用を通じてペプチド/MHC分子が架橋結合すると、腫瘍特異的アポトーシス誘導が生じることになる。効率的架橋結合は、同時に治療分子が結合するペプチド/MHC複合体の数に依拠することになる。3.1六量体AH5タンパク質は多様な腫瘍細胞を死滅させる0095六量体AH5-VHタンパク質は、HLA-A0201とMAGE-A遺伝子の両方を発現することが知られている多様な腫瘍細胞と一緒にインキュベートすることによりアポトーシスを誘導する能力について解析された。細胞株、Daju、Mel624黒色腫、PC346C前立腺癌及びMAGE-A陰性細胞911及びHEK293Tは、10μg/mlのHexa-AH5タンパク質と一緒にインキュベートされたDMEM培地中、pen/strep、グルタミン及び非必須アミノ酸が補充されている。4時間後、細胞は、組織培養プレートからの細胞の剥離及び膜小疱形成などのアポトーシスの古典的徴候について目視で検査された。図6に示されるように、Daju細胞は実際、Hexa-AH5タンパク質と一緒のインキュベーション後にのみ組織培養プレートから剥離する。これは、Mel624及びPC346C細胞でも見られた。インキュベーションが一晩まで延長されると、Daju、Mel624及びPC346C細胞は分解され、処理された培養物に特に不在であった。Hexa-AH5タンパク質で処理されなかった細胞、並びにHLA-A0201HEK293T及びMAGE-A遺伝子911及びHEK293Tを発現しない細胞は影響を受けなかった。3.2六量体AH5タンパク質は活性カスパーゼ-3を誘導する0096アポトーシスに対する古典的な細胞内の顕著な特徴は活性カスパーゼ-3の存在である。六量体AH5タンパク質が活性カスパーゼ-3を誘導するかどうかを判定するために、Daju細胞は10μg/mlのHexa-AH5タンパク質と一緒にインキュベートされた。4時間後、カスパーゼ-3/7に対する蛍光的に標識された阻害剤であるFAM-DEVD-FMKが組織培養培地に添加された。この物質は細胞膜を通過することができる。そして、活性カスパーゼ-3が存在する場合のみ、明るい蛍光シグナルが例えば蛍光顕微鏡法により検出されることになる。0097図7に示されるように、Hexa-AH5タンパク質で処理されたDaju細胞は、活性カスパーゼ-3の存在を示す蛍光シグナルを放射している。処理されなかった細胞は蛍光を示さず、カスパーゼ-3阻害剤の特異性を実証している。実施例4:六量体AH5タンパク質は移植可能なヒト腫瘍モデルにおいてアポトーシスを誘導する0098三次元ヒト腫瘍におけるHexa-AH5タンパク質のアポトーシス活性を実証するために、同所性前立腺癌モデルが使用された。この目的のために、ヒトPC346C前立腺癌細胞がオスNOD-SCIDマウスの前立腺に注射され、超音波誘導検査により腫瘍が検出可能になるまで増殖させた。4.1Hexa-AH5の腫瘍内注射はアポトーシスを誘導する0099NOD-SCIDマウスのヒトPC346C前立腺腫瘍に10μgのHexa-AH5タンパク質20μl総容量中が1回直接注射された。次の日、腫瘍は取り除かれ、固定化されパラフィン包埋された。パラフィン包埋腫瘍からスライドが調製され、アポトーシスの古典的マーカーである断片化DNAを検出するアッセイのTunnelUniversalアポトーシス検出キットGenescriptを用いて染色された。手短に言えば、スライドは60°Cで30分間加熱され、PBSで3回洗浄され、プロテイナーゼK溶液と一緒に1時間インキュベートされた。次いで、スライドはブロッキング溶液メタノール中3H2O2と一緒に10分間インキュベートされ、PBSで洗浄され、タネル反応混合液平衡バッファー、ビオチン-11-dUTP及びTdTと一緒に37°Cで1時間インキュベートされた。3回洗浄後、スライドは、37°Cで30分間、ストレプトアビジン-HRP溶液と一緒にインキュベートされ、最後にDAB基質DABバッファー、PBS中H2O2と一緒にインキュベートされた。00100Hexa-AH5で処理された腫瘍材料の顕微鏡解析により、広範囲のアポトーシス細胞が示されている図8参照。非処理の腫瘍はDNA損傷のいかなる徴候も示していない。4.2Hexa-AH5の静脈内注射は同所性前立腺癌細胞においてアポトーシスを誘導する4.2.1前立腺腫瘍細胞はHexa-AH5の静脈内注射後ニックの入ったDNAを示す00101次の実験では、同所性ヒトPC346C前立腺腫瘍を有するNOD-scidマウスは、25μgのHexa-AH5150μl総容量中を尾部静脈を介して1回注射された。次の日、腫瘍は取り除かれ、パラフィン包埋され、腫瘍スライドはタネルアッセイを用いてニック入りのDNAについて染色された。00102図9に示されるように、Hexa-AH5処置マウスには広範囲のアポトーシス細胞が存在するが、非処置マウスはアポトーシスのいかなる徴候も示さなかった。4.2.2前立腺腫瘍細胞は、Hexa-AH5の静脈内注射後活性カスパーゼを示す00103同所性PC346C腫瘍を有するNOD-scidマウスは、25μgのHexa-AH5150μl総容量中を尾部静脈から1回注射された。次の日、これらのマウスは、蛍光的に標識されたカスパーゼ阻害剤であるFLIVOImmunohistochemistryLtdの注射を受けた。この阻害剤は1時間循環し細胞膜を通過するままにされた。次いで、腫瘍は取り除かれ、固定され、パラフィン包埋された。00104蛍光顕微鏡法によるHexa-AH5処理腫瘍の解析により、カスパーゼ基質に陽性染色する数多くの細胞の存在が示された図10参照。未処置マウスでは蛍光的に標識された細胞は検出されなかった。実施例5:循環及び腫瘍浸潤を改善するためのHexa-AH5遺伝子の構築00105治療タンパク質の薬物動態特性例えば、分布、代謝、排出は、形状、電荷及びサイズなどの要因に依存する。大半の小血漿分子MW<50~60kDaの有する半減期は非常に短いが、ヒト血清アルブミンHSA及び免疫グロブリンIgなどのもっと大きな血漿タンパク質は半減期が非常に長いHSAで19日間、Igで1~4週間。実際、IgG-Fc又はヒト血清アルブミンを添加すると、治療タンパク質に連結した場合、循環時間、腫瘍浸潤及び抗腫瘍効果を伸ばすことが示されている。5.1IgG1-Fc及びヒト血清アルブミンを用いた六量体AH5の構築00106六量体AH5構築物はIgG1-Fc領域に又はヒト血清アルブミンに連結され、真核細胞での発現のためにコドン最適化され、pcDNA-3.1ベクターGeneart、Regensburg、GermanyにクローニングされたHexa-AH5Fcについては配列番号2のDNA配列及び配列番号5のアミノ酸配列、Hexa-AH5HSAについては配列番号3のDNA配列及び配列番号6のアミノ酸配列参照。5.2六量体AH5-Fc及びAH5-HSAは活性カスパーゼ-3を誘導する00107六量体AH5-Fc及びAH5-HSA構築物は、pcDNA-3.1にクローニングされて、293T細胞において発現された。トランスフェクションの4日後に得られた上清を用いて、HLA-A0201及びMAGE-A遺伝子を発現することが知られている黒色腫624細胞においてアポトーシスを誘導した。この目的のために、黒色腫624細胞は24ウェルプレートに播種され0.25×106細胞/ウェル、一晩付着させておいた。次の日、培地は、トランスフェクトされた293T細胞から得られた培地に置き換えられた。結果は、Hexa-AH5-FcとHexa-AH5-HSAの両方で処理された624黒色腫細胞について陽性カスパーゼ-3染色を示した。単純な培地と一緒にインキュベートされた624細胞又はHLA-A0201陽性、MAGE-A陰性911細胞では染色は観察されなかった図11。5.3六量体AH5で処置されたマウスの延長された生存及びマウスの遅延された腫瘍増殖00108黒色腫細胞株DajuHLA-A0201/MAGE-A陽性を接種されたマウスは、六量体AH5タンパク質の静脈内注射で処置された2.5μg/2回/週。1腫瘍なしマウス、及び2腫瘍増殖が示されている図12。5.4二量体六量体AH5CH1及び11HCH1によるアポトーシスの増強された誘導00109真核細胞における発現のために、AH5CH1及び11HCH1配列は、pMSecSUMOSTARベクターに導入された六量体AH5CH1及び11HCH1はCaPO4を用いたトランスフェクション後293T細胞の上清中で産生された。293T上清DMEM中に1対1で希釈された、5FCSと一緒のDaju及びMEL624黒色腫細胞のインキュベーション1時間後、膜小疱形成及び細胞の剥離が観察された。5.525°Cでの六量体AH5の改良された発現振盪フラスコにおける30°C又は37°CでのSE1における六量体AH5の発現は、多くの望ましくない比較的小さな産物を生じることが示された。増殖及び産生中に25°Cまで温度を下げると、産生の著しい改善が生じた。タンパク質の収率が上がっただけでなく、得られた副産物は少なくなるか、全くなくなった図14A及び14B。参考文献:1StephanieGraff-Dubois,OlivierFaure,David-AlexandreGross,PedroAlves,AntonioScardino,SalemChouaib,FrancoisA.LemonnierandKostasKosmatopoulos.GenerationofCTLRecognizinganHLA-A0201-RestrictedEpitopeSharedbyMAGE-A1,-A2,-A3,-A4,-A6,-A10,and-A12TumorAntigens:ImplicationinaBroad-SpectrumTumorImmunotherapy.TheJournalofImmunology,2002,169:575-580.2HansJ.deHaard,NicolevanNeer,AnnekeReurs,SimonE.Hufton,RobC.Roovers,PaulaHenderikx,AdriaanP.deBruine,Jan-WillemArends,andHennieR.Hoogenboom.ALargeNon-immunizedHumanFabFragmentPhageLibraryThatPermitsRapidIsolationandKineticAnalysisofHighAffinityAntibodies.TheJournalofBiologicalChemistry,1999,274:18218-18230.3P.Chames,H.R.Hoogenboom,andP.Henderikx.Selectionofantigensagainstbiotinylatedantigens.InAntibodyphagedisplay,methodsandprotocols,EditedbyP.M.O’BrienandR.Aitken.MethodsinMolecularBiology,2002,178:147-159.4PatrickChames,SimonE.Hufton,PierreG.Coulie,BarbaraUchanska-Ziegler,HennieR.Hoogenboom.DirectselectionofahumanantibodyfragmentdirectedagainstthetumorT-cellepitopeHLA-A1-MAGE-A1fromanonimmunizedphage-Fablibrary.PNAS,2000,97:7969-7974.5LutzRiechmann,SergeMuyldermans.Singledomainantibodies:comparisonofcamelVHandcamelizedhumanVHdomains.JournalofImmunologicalMethods,1999,231:25-38.6JingYang,PhDandQingYi.KillingTumorCellsThroughTheirSurfaceb2-MicroglobulinorMajorHistocompatibilityComplexClassIMolecules.Cancer,2010,116:1638-1645.配列識別子:SEQIDNO:1.DNAsequenceHexa-AH5:1CAGCTGCAGCTGCAAGAAAGCGGTGGTGGTGTTGTTCAGCCTGGTCGTAGCCTGCGTCTG61AGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCAGCTATGGTATGCATTGGGTTCGTCAGGCA121CCGGGTAAGGAACGTGAAGGTGTTGCAGTTATTAGCTATGATGGCAGCAACAAATATTAT181GCCGATAGCGTTAAAGGTCGCTTTACCATTAGCCGTGATAATAGCAAAAACACCCTGTAT241CTGCAGATGAATAGCCTGCGTGCAGAAGATACCGCAGTTTATTATTGTGCCGGTGGTAGC301TATTATGTTCCGGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCAGCGGTAGCACC361AGCGGTAGCATGGCCCAGCTGCAATTACAAGAATCAGGTGGTGGCGTGGTGCAGCCAGGT421CGTTCACTGCGTCTGTCATGTGCAGCATCAGGCTTTACCTTCAGTTCATACGGCATGCAC481TGGGTGCGCCAAGCTCCAGGCAAAGAACGCGAAGGCGTGGCCGTTATTTCATACGATGGC541TCCAATAAATACTATGCGGATTCAGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGCGATAACAGT601AAAAACACCTTATACCTGCAAATGAATTCACTGCGTGCCGAGGATACAGCCGTGTATTAC661TGTGCGGGTGGTTCATATTACGTGCCTGATTATTGGGGACAAGGTACACTGGTGACAGTT721AGCAGTGGTAGTACCTCAGGTTCAATGGCCCAGTTACAACTGCAAGAATCTGGCGGTGGT781GTTGTGCAACCGGGTCGCTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCTGCATCAGGTTTTACATTTTCA841AGCTACGGAATGCACTGGGTTAGACAGGCTCCCGGTAAGGAAAGAGAAGGCGTTGCGGTT901ATCAGTTATGACGGTAGCAATAAGTATTATGCGGACTCTGTTAAGGGTCGTTTTACAATT961TCTCGGGACAATAGCAAGAATACACTGTACTTACAGATGAACTCTCTGAGAGCAGAAGAT1021ACAGCCGTATACTATTGCGCAGGCGGTAGTTATTATGTGCCTGACTACTGGGGCCAGGGA1081ACGCTGGTGACCGTGAGTAGCGGTTCAACCAGCGGTTCAATGGCGCAACTGCAACTTCAA1141GAGTCTGGTGGCGGTGTGGTACAGCCTGGCCGTTCTCTGCGTTTAAGCTGCGCAGCCTCT1201GGTTTTACGTTTTCATCTTATGGAATGCATTGGGTACGCCAAGCCCCTGGAAAAGAACGT1261GAGGGCGTAGCAGTGATCTCTTATGATGGTTCGAACAAATATTACGCGGACTCCGTGAAA1321GGACGCTTTACAATCTCTCGTGATAACTCAAAAAATACGCTGTATCTTCAAATGAACTCC1381TTACGTGCGGAAGATACTGCGGTCTATTACTGCGCTGGCGGTTCTTACTATGTACCAGAT1441TACTGGGGACAGGGGACCTTAGTTACAGTTAGCTCAGGTAGCACCAGTGGTTCTATGGCT1501CAATTACAGTTACAAGAAAGTGGCGGTGGCGTGGTCCAACCTGGCCGTAGTCTGCGCCTG1561TCTTGCGCAGCGAGCGGCTTTACATTTTCTAGTTATGGCATGCATTGGGTGAGACAAGCT1621CCGGGGAAAGAGCGCGAAGGGGTTGCGGTGATTTCTTATGACGGCAGTAATAAATACTAC1681GCAGATAGTGTGAAAGGTCGTTTCACAATTAGTCGCGATAACTCCAAAAACACATTATAT1741TTGCAGATGAACAGTTTGCGTGCGGAGGACACGGCTGTATATTATTGTGCAGGGGGTTCC1801TACTATGTGCCCGACTACTGGGGTCAAGGGACCTTAGTGACCGTTTCAAGCGGTAGTACC1861TCTGGTAGTATGGCTCAACTTCAGCTGCAAGAGTCAGGCGGAGGCGTTGTCCAGCCTGGA1921CGCTCACTGCGCTTAAGTTGTGCAGCCAGTGGCTTTACGTTTAGCTCTTACGGGATGCAT1981TGGGTCCGGCAGGCGCCTGGGAAGGAACGCGAAGGTGTAGCTGTGATTAGTTACGATGGC2041AGTAATAAGTATTACGCCGATTCAGTAAAAGGTCGCTTCACGATTTCGCGTGATAATTCT2101AAGAATACCCTTTACCTTCAGATGAATTCGTTACGCGCAGAGGATACCGCTGTATACTAC2161TGTGCTGGCGGATCATATTATGTCCCAGACTATTGGGGGCAGGGTACTCTGGTAACGGTT2221AGCTCTSEQIDNO:2.DNAsequenceHexa-AH5Fc:1CAGCTCCAGCTGCAGGAAAGCGGCGGAGGCGTCGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTG61AGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGGCATGCACTGGGTCCGACAGGCC121CCTGGCAAAGAACGGGAAGGCGTGGCCGTGATCAGCTACGACGGCAGCAACAAGTACTAC181GCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTAC241CTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGCGGAAGC301TACTACGTGCCCGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGGCAGCACC361AGCGGCTCCATGGCTCAGCTCCAGCTCCAGGAATCTGGCGGCGGAGTCGTCCAGCCCGGA421AGATCTCTGCGGCTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCTTTACCTTCTCCTCCTATGGAATGCAT481TGGGTCCGCCAGGCTCCCGGAAAGGAAAGGGAAGGGGTCGCAGTGATCTCCTACGATGGC541TCCAACAAGTATTATGCCGATTCTGTGAAGGGGCGCTTTACCATCTCCCGCGACAACTCC601AAGAACACACTCTATCTCCAGATGAATTCCCTGAGAGCCGAGGATACAGCCGTCTATTAC661TGCGCTGGCGGCTCCTACTATGTGCCTGATTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTG721TCCTCCGGCTCCACCAGCGGCAGTATGGCACAGCTGCAGCTCCAGGAATCTGGAGGCGGG781GTCGTGCAGCCAGGACGCTCCCTGAGACTGTCCTGTGCTGCCTCCGGATTCACCTTTAGC841TCTTATGGGATGCACTGGGTCAGGCAGGCACCAGGGAAAGAACGCGAGGGGGTGGCAGTG901ATTTCTTATGATGGGAGCAACAAATATTACGCTGACTCCGTCAAGGGCCGCTTCACAATC961TCCAGAGATAATTCCAAGAATACTCTGTACCTCCAGATGAATTCTCTGCGCGCTGAGGAC1021ACTGCTGTCTACTACTGCGCAGGGGGCAGCTATTACGTCCCCGATTACTGGGGGCAGGGG1081ACACTCGTCACCGTCAGCAGCGGCTCTACCTCCGGCTCTATGGCTCAGCTGCAGCTCCAG1141GAATCCGGGGGAGGTGTCGTGCAGCCTGGGAGATCCCTGCGCCTGAGTTGCGCCGCTTCC1201GGCTTCACTTTTTCCTCTTACGGCATGCATTGGGTCAGGCAGGCTCCAGGCAAGGAACGA1261GAGGGCGTCGCCGTGATTTCCTATGACGGATCTAACAAGTACTATGCAGACTCCGTGAAA1321GGGCGATTCACCATTAGCAGAGACAACTCTAAAAACACTCTGTATCTGCAGATGAATTCA1381CTCCGGGCCGAAGATACCGCAGTGTATTACTGTGCAGGCGGGTCTTATTACGTGCCAGAC1441TACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACTGTCTCAAGCGGCTCCACCTCTGGAAGTATGGCC1501CAGCTCCAGCTCCAGGAAAGTGGGGGCGGAGTCGTCCAGCCAGGCAGAAGCCTCAGGCTG1561TCTTGCGCTGCCAGCGGATTCACATTTTCCAGTTACGGAATGCACTGGGTCAGACAGGCT1621CCTGGAAAGGAACGCGAAGGTGTCGCTGTCATCAGCTATGACGGGTCCAACAAGTACTAT1681GCTGATAGTGTGAAAGGCCGGTTTACAATCTCTCGCGATAATAGCAAGAATACCCTCTAT1741CTGCAGATGAATAGTCTGAGAGCTGAGGATACCGCTGTGTACTACTGTGCTGGGGGCTCA1801TATTATGTCCCTGACTATTGGGGGCAGGGAACTCTCGTCACTGTGTCCAGCGGAAGCACA1861TCCGGATCAATGGCACAGCTCCAGCTGCAGGAAAGCGGAGGGGGGGTCGTCCAGCCTGGC1921CGATCACTGAGACTGTCATGCGCCGCCAGTGGGTTTACATTCAGCTCCTACGGGATGCAT1981TGGGTCCGCCAGGCACCTGGGAAAGAGCGAGAAGGCGTCGCAGTCATTAGCTACGATGGA2041AGTAACAAGTATTACGCAGATAGCGTCAAGGGGAGATTCACCATCTCTAGGGACAATTCC2101AAAAACACCCTCTACCTGCAGATGAATTCCCTGCGGGCAGAAGACACCGCTGTCTATTAT2161TGCGCCGGAGGATCTTACTACGTCCCAGATTATTGGGGACAGGGCACTCTGGTCACAGTC2221AGCAGCGGATCCACAAGCGGCAGCGGAGCCGCCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGC2281CCTGCCCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGAC2341ACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAG2401GACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACC2461AAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTG2521CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCT2581GCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCTCAGGTGTAC2641ACACTGCCTCCCAGCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTC2701AAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAAC2761AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAG2821CTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCAC2881GAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAGSEQIDNO:3.DNAsequenceHexa-AH5HSA:1CAGCTCCAGCTGCAGGAAAGCGGCGGAGGCGTCGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTG61AGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGGCATGCACTGGGTCCGACAGGCC121CCTGGCAAAGAACGGGAAGGCGTGGCCGTGATCAGCTACGACGGCAGCAACAAGTACTAC181GCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTAC241CTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGCGGAAGC301TACTACGTGCCCGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGGCAGCACC361AGCGGCTCCATGGCTCAGCTCCAGCTCCAGGAATCTGGCGGCGGAGTCGTCCAGCCCGGA421AGATCTCTGCGGCTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCTTTACCTTCTCCTCCTATGGAATGCAT481TGGGTCCGCCAGGCTCCCGGAAAGGAAAGGGAAGGGGTCGCAGTGATCTCCTACGATGGC541TCCAACAAGTATTATGCCGATTCTGTGAAGGGGCGCTTTACCATCTCCCGCGACAACTCC601AAGAACACACTCTATCTCCAGATGAATTCCCTGAGAGCCGAGGATACAGCCG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