式:式中、R3は低級アルキルを表すで表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩の製造方法であって、以下の工程~、さらに必要により工程を含む製造方法:式:式中、R1はアミノ、又は保護基で保護されたアミノを表し、2つのR3は、前記と同義の同一の低級アルキルを表すで表されるアミノマロナート誘導体と式:式中、R2は低級アルキルを表し、Yはハロゲンを表すで表されるハロゲン化酢酸エステル誘導体を塩基の存在下で反応させて式:式中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義であるで表されるエステル誘導体又はその塩に変換する工程、B式で表されるエステル誘導体又はその塩に非動物由来の酵素、該酵素を生産する細胞、該細胞の培養物、又は該細胞若しくは該細胞の培養物の処理物を作用させ、式:式中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義であるで表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩に変換する工程、C式で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩を縮合剤の存在下、アンモニア源と反応させるか、又は活性化試薬と反応させた後に、さらにアンモニア源と反応させて、式:式中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義であるで表される光学活性アミド誘導体又はその塩に変換する工程、D式で表される光学活性アミド誘導体又はその塩に塩基を作用させて、式又は式:[式中、R1Aは保護基で保護されたアミノを表し、R3は前記と同義である]で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程、E式で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩のR1A上の保護基を脱保護して、上記式で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程。式で表されるエステル誘導体又はその塩に非動物由来の酵素、該酵素を生産する細胞、該細胞の培養物、又は該細胞若しくは該細胞の培養物の処理物を作用させる工程を含む、式で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩の製造方法。酵素が微生物由来エステラーゼである請求項1又は2に記載の製造方法。酵素がバチルス属に属する微生物由来エステラーゼである請求項1又は2に記載の製造方法。酵素がバチルスチューリンゲンシス由来エステラーゼである請求項1又は2に記載の製造方法。酵素が以下のa~dより選ばれる蛋白質である請求項1又は2に記載の製造方法。a配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質b配列番号2に記載のアミノ酸配列において1つ又は複数のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質c配列番号2に記載のアミノ酸配列と95以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質d配列番号2に記載のアミノ酸配列において、N末端から1~40個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質R1及びR1Aがベンジルオキシカルボニルアミノであり、R2がエチルであり、R3がエチルである請求項1ないし6のいずれか1項に記載の製造方法。請求項1に記載の製造方法により、式で表される光学活性スクシンイミド誘導体{以下、化合物と称する}を製造する工程、及び該工程で得られた化合物を2スピロピロリジン34ピロロ12aピラジン1235テトラオン以下、化合物Aと称するに変換する工程を含む化合物Aの製造方法。化合物Aの製造方法であって、下記a~eの工程を含む製造方法:a化合物を1に記載の製造方法で製造する工程;b前記工程aで得られた化合物を酸例えば、酢酸などの存在下に25ジメトキシテトラヒドロフランと反応させる工程;c前記工程bで得られた生成物をトリクロロアセチル化試薬例えば、トリクロロアセチルクロリド、トリクロロアセチルブロミド、無水トリクロロ酢酸などと反応させる工程;d前記工程cで得られた生成物を4ブロモ2フルオロベンジルアミンと反応させる工程;及びe前記工程dで得られた化合物Aを単離する工程。R3がエチルである請求項8又は9に記載の製造方法。以下のa~dより選ばれる蛋白質。a配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質b配列番号2に記載のアミノ酸配列において1つ又は複数のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質c配列番号2に記載のアミノ酸配列と95以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質d配列番号2に記載のアミノ酸配列において、N末端から1~40個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質以下のa~dより選ばれるDNA。a配列番号1に記載の塩基配列により特定されるDNAb請求項11に記載の蛋白質をコードするDNAc配列番号1に記載の塩基配列において1つ又は複数の塩基が置換及び/又は欠失及び/又は付加された塩基配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAd配列番号1に記載の塩基配列と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA本発明の課題は、化合物Aの鍵中間体である光学活性スクシンイミド誘導体を効率的に製造する方法を提供することにある。より具体的には、本発明の課題は、化合物Aの鍵中間体である光学活性スクシンイミド誘導体を効率的に製造する方法、及び化合物Aの有用中間体であるエステル誘導体から光学活性カルボン酸誘導体を効率的に製造する方法を提供することにある。本発明は、以下の1~12に関する。1式:式中、R3は低級アルキルを表すで表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩の製造方法であって、以下の工程~、さらに必要により工程を含む製造方法:式:式中、R1はアミノ、又は保護基で保護されたアミノを表し、2つのR3は、前記と同義の同一の低級アルキルを表すで表されるアミノマロナート誘導体と式:式中、R2は低級アルキルを表し、Yはハロゲンを表すで表されるハロゲン化酢酸エステル誘導体を塩基の存在下で反応させて式:式中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義であるで表されるエステル誘導体又はその塩に変換する工程、B式で表されるエステル誘導体又はその塩に非動物由来の酵素、該酵素を生産する細胞、該細胞の培養物、又は該細胞若しくは該細胞の培養物の処理物を作用させ、式:式中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義であるで表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩に変換する工程、C式で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩を縮合剤の存在下、アンモニア源と反応させるか、又は活性化試薬と反応させた後に、さらにアンモニア源と反応させて、式:式中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義であるで表される光学活性アミド誘導体又はその塩に変換する工程、D式で表される光学活性アミド誘導体又はその塩に塩基を作用させて、式又は式:[式中、R1Aは保護基で保護されたアミノを表し、R3は前記と同義である]で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程、E式で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩のR1A上の保護基を脱保護して、上記式で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程。2式で表されるエステル誘導体又はその塩に非動物由来の酵素、該酵素を生産する細胞、該細胞の培養物、又は該細胞若しくは該細胞の培養物の処理物を作用させる工程を含む、式で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩の製造方法。3酵素が微生物由来エステラーゼである1又は2に記載の製造方法。4酵素がバチルス属に属する微生物由来エステラーゼである1又は2に記載の製造方法。5酵素がバチルスチューリンゲンシス由来のエステラーゼである1又は2に記載の製造方法。6酵素が以下のa~dより選ばれる蛋白質である1又は2に記載の製造方法。a配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質b配列番号2に記載のアミノ酸配列において1つ又は複数のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質c配列番号2に記載のアミノ酸配列と95以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質d配列番号2に記載のアミノ酸配列において、N末端から1~40個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質7R1及びR1Aがベンジルオキシカルボニルアミノであり、R2がエチルであり、R3がエチルである1ないし6のいずれかに記載の製造方法。81に記載の製造方法により、式で表される光学活性スクシンイミド誘導体{以下、化合物と称する}を製造する工程、及び該工程で得られた化合物を化合物Aに変換する工程を含む化合物Aの製造方法。9化合物Aの製造方法であって、下記a~eの工程を含む製造方法:a化合物を1に記載の製造方法で製造する工程;b前記工程aで得られた化合物を酸例えば、酢酸などの存在下に25ジメトキシテトラヒドロフランと反応させる工程;c前記工程bで得られた生成物をトリクロロアセチル化試薬例えば、トリクロロアセチルクロリド、トリクロロアセチルブロミド、無水トリクロロ酢酸などと反応させる工程;d前記工程cで得られた生成物を4ブロモ2フルオロベンジルアミンと反応させる工程;及びe前記工程dで得られた化合物Aを単離する工程。10R3がエチルである8又は9に記載の製造方法。11以下のa~dより選ばれる蛋白質。a配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質b配列番号2に記載のアミノ酸配列において1つ又は複数のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質c配列番号2に記載のアミノ酸配列と95以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質d配列番号2に記載のアミノ酸配列において、N末端から1~40個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質12以下のa~dより選ばれるDNA。a配列番号1に記載の塩基配列により特定されるDNAb請求項11に記載の蛋白質をコードするDNAc配列番号1に記載の塩基配列において1つ又は複数の塩基が置換及び/又は欠失及び/又は付加された塩基配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAd配列番号1に記載の塩基配列と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ配列番号2に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA本発明の製造方法によれば、化合物Aの有用中間体であるエステル誘導体から光学活性カルボン酸誘導体を効率的に製造することができる。特に、本発明の方法によれば、高い光学純度の化合物及び化合物Aを高収率で製造することができるので、工業的な観点などから有利である。式で表される化合物を化合物と前記で定義したが、他の式番号の化合物についても以下同様である。式~の各基の定義において、低級アルキルとしては、例えば直鎖又は分岐状の炭素数1~6のアルキルが挙げられ、より具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、secブチル、tertブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等が挙げられる。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。保護基で保護されたアミノにおける保護基とは、例えば、有機合成化学で常用されるアミノの保護基[例えば、プロテクティブグループスインオーガニックシンセシス第3版、グリーン著、JohnWileySonsInc等に記載されているもの]等が挙げられ、より好ましくは、チオール若しくは酸の作用、又は加水素分解等により脱保護される保護基が挙げられる。チオールの作用により脱保護される保護基としては、例えば、2ニトロベンゼンスルホニル、4ニトロベンゼンスルホニル、24ジニトロベンゼンスルホニル等が挙げられる。酸の作用により脱保護される保護基としては、例えば、アセチル、トリチル、tertブトキシカルボニル等が挙げられ、より好ましくはtertブトキシカルボニルが挙げられる。加水素分解により脱保護される保護基としては、例えば、ベンゼン環上にハロゲン原子、低級アルキル、低級アルコキシ及びニトロからなる群から選ばれる1~3個の置換基を有していてもよいベンジルオキシカルボニル、ベンジル等が挙げられる。より好ましくは、ベンジルオキシカルボニル、4ニトロベンジルオキシカルボニル、4クロロベンジルオキシカルボニル、4メチルベンジルオキシカルボニル、2メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンジル、4ニトロベンジル、4クロロベンジル、4メチルベンジル、2メトキシベンジル、4メトキシベンジル等が挙げられる。本発明において、保護基で保護されたアミノは、反応中にアミノに変換されてもよい。式中のR1及びR1Aとしては、例えば、チオール若しくは酸の作用、又は加水素分解等により脱離しうる保護基で保護されたアミノ等が挙げられ、好ましくは、ベンジルオキシカルボニルアミノ、又はtertブトキシカルボニルアミノが挙げられる。式中のR2及びR3としては、例えば、エチル等が挙げられる。R1、R2、及びR3の好ましい組み合わせとしては、例えば、R1がベンジルオキシカルボニルアミノであり、かつR2及びR3がエチルである場合が挙げられる。R1AとR3との好ましい組み合わせとしては、R1Aがベンジルオキシカルボニルアミノであり、かつR3がエチルである場合が挙げられる。Yとしては、ハロゲンが挙げられ、好ましくはヨウ素、臭素、塩素等が挙げられる。より好ましくは、臭素、又は塩素が挙げられる。アンモニア源としては、アンモニア若しくはアンモニア等価体が挙げられ、好ましくは、アンモニアが挙げられる。アンモニアの形態としては気体又は水溶液が挙げられ、好ましくは水溶液が挙げられる。アンモニア等価体としては、例えば、アンモニアと酸との塩が挙げられ、好ましくは、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム等が挙げられ、さらに好ましくは酢酸アンモニウムが挙げられる。縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、1エチル3カルボジイミド塩酸塩、NNカルボニルジイミダゾール、Nヒドロキシベンゾトリアゾール、ジフェニルリン酸アジド、Nヒドロキシスクシンイミド、Nヒドロキシフタルイミド、ベンゾトリアゾール1イルオキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、44メチルモルホリニウムクロリド、ONNNNテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、2クロロ1メチルピリジニウムヨージド等が挙げられる。活性化試薬としては、例えば、クロロギ酸メチル、クロロギ酸エチル、クロロギ酸イソプロピル、クロロギ酸イソブチル、塩化ピバロイル、ホスゲン、トリホスゲン、オキシ塩化リン、五塩化リン、塩化チオニル等が挙げられ、好ましくは、クロロギ酸イソブチルが挙げられる。化合物、、、、又はの塩としては、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩などの有機酸塩などが挙げられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。アンモニウム塩としては、例えば、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられる。アミノ酸付加塩としては、例えばリジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩が挙げられる。本発明の製造方法は、下記工程中の工程2において酵素として非動物由来、好ましくは微生物由来、より好ましくはバチルス属に属する微生物由来、特に好ましくはバチルスチューリンゲンシス由来のエステラーゼを用いることを特徴としている。次に本発明の製造方法について説明するが、反応温度、試薬の種類、試薬の量、反応時間などの反応条件は例示のために言及したものであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。式中、R1はアミノ又は保護基で保護されたアミノを表し、R1Aは保護基で保護されたアミノを表し、R2及びR3は、それぞれ同一又は異なって低級アルキルを表し、Yはハロゲンを表す化合物に対し、溶媒中、50°Cと150°Cの間の温度で、1~30当量の塩基の存在下、1当量~大過剰量の化合物を、5分間~72時間反応させることにより化合物を得ることができる。また、ハロゲン化アルカリを添加して反応を行ってもよい。溶媒は、反応に関与しないものであればいずれも使用可能であるが、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tertブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等が挙げられ、好ましくはDMFが挙げられる。これらは単独若しくは混合物として用いることができる。塩基としては、有機塩基又は無機塩基が挙げられ、好ましくは無機塩基が挙げられ、より好ましくは、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸セシウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtertブトキシド等が挙げられ、さらに好ましくは、水素化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸セシウム等が挙げられ、最も好ましくは水素化ナトリウム、又は炭酸カリウムが挙げられる。ハロゲン化アルカリとしては、臭化アルカリ、ヨウ化アルカリ等が挙げられ、好ましくはヨウ化アルカリが挙げられ、さらに好ましくはヨウ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、又はヨウ化セシウムが挙げられる。最も好ましくは、ヨウ化カリウムが挙げられる。化合物としては、2クロロ酢酸エチル、2ブロモ酢酸エチル等が挙げられる。化合物及び化合物は市販品として入手することもできる。化合物に、水中又は水及び溶媒の混合溶媒中、基質濃度は01~50、好ましくは1~30で0~60°C、好ましくは10~40°Cの間の温度で、反応pHは3~10、好ましくはpH4~9で、基質に対し100000分の1から10倍量、好ましくは10000分の1から1倍量の酵素を作用させて、1~200時間、好ましくは5~150時間反応させることにより化合物を得ることができる。さらに、緩衝液、又は金属塩を加えて反応を行うこともできる。溶媒としては、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tertブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、tertブチルアルコール、DMF、DMSO、アセトニトリル等が挙げられ、好ましくは、エタノール、又はアセトニトリルが挙げられる。混合溶媒で用いる際は、水と溶媒が均一系、又は不均一系のいずれを形成してもかまわないが、均一系を形成するのが好ましい。酵素としては、非動物由来、好ましくは微生物由来のエステラーゼが挙げられる。微生物としては、例えば、バチルス属に属する微生物が好ましい。バチルス属に属する微生物としては、例えば、バチルスチューリンゲンシス、バチルスズブチリス、バチルスアントラシス、バチルスセレウス、バチルスコアギュランス、バチルスリケニホルミス、バチルスマガテリウム、バチルスステアロテルモフィルス、バチルスアミロリケファチエンス、バチルスプミルスなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。好ましくはバチルスチューリンゲンシス由来のエステラーゼが好ましいが、上記の特定のエステラーゼに限定されることはない。例えば、バチルスチューリンゲンシス由来のエステラーゼとして、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるエステラーゼを挙げることができる。本発明の方法には、上記の特定のエステラーゼのほか、該アミノ酸配列と95以上、好ましくは97以上、さらに好ましくは99以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記エステラーゼと同様のエステラーゼ作用を有する蛋白質を用いることもできる。また、配列番号1で表される塩基配列からなるDNAによりコードされる蛋白質、又は該塩基配列と95以上、好ましくは97以上、さらに好ましくは99以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAによりコードされ、配列番号2に記載されたエステラーゼと同様のエステラーゼ作用を有する蛋白質などが挙げられる。エステラーゼとして微生物由来のエステラーゼを用いる場合には、微生物の培養物から分離した微生物の菌体のほか、微生物の培養物、あるいは分離した微生物の菌体または微生物の培養物を適宜の処理に付して得られる菌体処理物または培養物の培養物の処理物を用いてもよい。このようにエステラーゼを含む菌体、培養物、または菌体若しくは培養物の処理物などを用いる態様も微生物由来のエステラーゼの使用態様に包含されることは言うまでもない。菌体または培養物の処理物としては、例えば、菌体または培養物の凍結乾燥物、トルエン、アセトンなどで処理して得られる菌体処理物のほか、さらに、菌体を公知の固定化法、例えば包括法、担体結合法、架橋法などで固定化した固定化物などを挙げることができる。包括法としては、カラギーナンやアルギン酸などの天然高分子又はモノマーやプレポリマーによる合成高分子を用いる方法、担体結合法としては、キトサンなどに吸着させる方法、架橋法としては、グルタルアルデヒドなどを用いる方法が挙げられる。また、菌体処理物として菌体の破砕物又は抽出物を用いてもよい。菌体の破砕物は、公知の菌体破砕法、例えば超音波破砕法、フレンチプレス破砕法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法などにより得ることができる。また、菌体の抽出物は、前記菌体破砕物から遠心分離などにより菌体を除いて得ることができる。菌体の抽出物は、粗酵素液として用いることができるが、粗酵素液を例えば硫安沈殿による塩析法、限外濾過膜による濃縮法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィーによる分離などの組み合わせにより精製して精製酵素として用いることもできる。本明細書において、菌体処理物の用語は、上記のような菌体の破砕物、抽出物、粗酵素液、精製酵素などを包含する。菌体処理物として菌体の破砕物又は抽出物粗酵素又は精製酵素を担体に固定化することにより、その固定化菌体又は固定化酵素を繰り返し使用することができる。固定化菌体又は固定化酵素として使用する場合、連続法によって目的物の製造を行うこともでき、例えばそれらをカラムに充填してバイオリアクターとして用いることも可能である。担体としては一般に用いられるものであればなんでもよい。例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、κ‐カラギーナン、アルギン酸、ゼラチン、酢酸セルロース等の多糖類、グルテン等の天然高分子、活性炭、ガラス、白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム等の無機物、ポリアクリルアミド、ポリビニルアセテート、ポリプロピレングリコール、ウレタン等の合成吸着剤等が挙げられる。固定化方法としては、例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法が使用できる。微生物の培養条件は特に限定されず、通常用いられる方法で行うことができる。培地としては通常使用されるものであればよく、微生物が生育することができ、かつ資化可能な炭素源、窒素源、無機物、及び必要な生育促進物質を適当に含有する培地であれば任意の培地を用いることができる。培地としては合成培地又は天然培地のいずれも使用可能である。炭素源としては、菌体が資化し生育できる炭素化合物であればいずれでも使用可能である。例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、デキストリン、可溶性デンプン、糊化デンプン、ソルビトールなどの糖類、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びその塩類、パラフィンなどの炭化水素類、糖蜜、菜種油などを単独で又は混合して使用することができる。窒素源としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸、クエン酸などの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆加工品、尿素などの有機窒素源を単独で又は混合して用いることができる。無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、鉄などの硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、硝酸塩、リン酸塩などをそれぞれ単独で又は混合して用いることができる。さらに、ビタミン類などの通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。培養は微生物の種類に応じて、振とう培養やジャーファーメンターなどを用いた通気条件下又は嫌気的条件下のいずれかで行うことができる。培地のpHは3~10の範囲が好ましく、温度は10~50°Cの範囲が好ましく、培養時間は10~500時間が好ましいが、このようは培養条件は微生物の種類に応じて適宜選択することができ、上記の特定の条件に限定されることはない。別の態様では、例えば、配列番号1で特定される塩基配列を含むDNA、又は該塩基配列と95以上、好ましくは97以上、さらに好ましくは99以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、配列番号2に記載されたエステラーゼと同様のエステラーゼ作用を有する蛋白質をコードするDNAを含む組み換えベクターを作成し、このベクターを適宜の宿主細胞に導入して形質転換体を調製して、該DNAによりコードされる蛋白質を取得してエステラーゼとして使用することもできる。配列番号1に記載された塩基配列により特定されるDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAや、配列番号1に記載された塩基配列において1または複数個、好ましくは1から120個、より好ましくは1から数十個、さらに好ましくは1から数個の塩基の欠失、置換、及び/又は付加を有する塩基配列を含むDNAを用いてもよい。上記の形質転換体が微生物である場合には、すでに説明したように、菌体のほか、微生物の培養物、又は分離した微生物の菌体を適宜の処理に付して得られる菌体処理物などとして用いてもよい。ここでいうハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのDNAであってもよい。プローブとして用いるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAをあげることができるが、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAであってもよい。DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラークローニング第2版、第3版2001年、MethodsforGeneralandMolecularBacteriologyASMPress1994、ImmunologymethodsmanualAcademicpressに記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。上記のストリンジェントな条件とは、例えばDNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50ホルムアミド、5×SSC750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム、50mMのリン酸ナトリウムpH76、5×デンハルト溶液、10の硫酸デキストラン、および20μglの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42°Cで一晩、インキュベートした後、例えば約65°Cの02×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE20×SSCEは、3mollの塩化ナトリウム、02mollのリン酸二水素ナトリウム、002mollのEDTA、pH74、05のSDS、30のホルムアミド、100μglの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で、37°Cで一晩インキュベートした後、50°Cの1×SSC、01SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度例えば5×SSCの溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えばBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて計算したときに、配列番号1で表される塩基配列と95以上、好ましくは97以上、より好ましくは99以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。上記したDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが、配列番号2に記載されたエステラーゼと同様のエステラーゼ作用を有する蛋白質をコードするDNAであることは、該DNAを発現する組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAを主細胞に導入して得られる微生物を培養し、得られる培養物から粗酵素抽出液等を調製して化合物IVと反応させ、化合物Vの生成の有無により確認できる。配列番号2に記載のアミノ酸配列において1または複数個、好ましくは1から40個、より好ましくは1から30個、より好ましくは1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2において特定されるアミノ酸配列を有するエステラーゼと同様の作用を有する蛋白質をコードするDNAは、配列番号2に記載のアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法、又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。例えば、配列表の配列番号2に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA、例えば配列番号1に記載された塩基配列を有するDNAを用いて、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、又は遺伝子工学的手法などにより所望のDNAを調製することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であり、例えば、モレキュラークローニング第2版、カレントプロトコールズインモレキュラーバイオロジーJohnWileySonsに記載の方法に準じて行うことができる。また、配列番号2に記載のアミノ酸配列と95以上、好ましくは97以上、さらに好ましくは99以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2において特定されるアミノ酸配列を有するエステラーゼと同様の作用を有する蛋白質は、配列番号2に記載のアミノ酸配列をクエリーに用い、各種蛋白質のデータベースを検索することで該アミノ酸配列と95以上の同一性を有するアミノ酸配列を取得し、取得されたアミノ酸配列を有する酵素を上記したように組換えDNAを用いて該酵素を発現させ、その活性を確認することにより調製することができる。また、配列表の配列番号2に記載されたアミノ酸配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて微生物の染色体をスクリーニングすることにより上記DNAを取得することもできる。例えば、PCR法により各種微生物由来の染色体DNAライブラリー又はcDNAライブラリーを鋳型として所望のDNAを単離することができるが、上記のプローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、目的DNAのクローニングなどの手法は当業者に周知かつ慣用であり、例えば、上掲のカレントプロトコールズインモレキュラーバイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。配列番号1で特定される塩基配列を含むDNA、又は該塩基配列と95以上、好ましくは97以上、さらに好ましくは99以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、配列番号2に記載されたエステラーゼと同様のエステラーゼ作用を有する蛋白質をコードするDNAは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するプラスミドなどのベクター、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれて染色体と共に複製されるベクターなどを利用することができる。上記DNAから所望の蛋白質を発現させるために発現ベクターを用いることが好ましいが、発現ベクターでは上記DNAが転写に必要なプロモーター等と機能的に連結されていることが望ましい。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルスステアロテルモフィルスマルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バチルスリケニホルミスαアミラーゼ遺伝子、バチルスアミロリケファチエンスBANアミラーゼ遺伝子、バチルスズブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、若しくはバチルスプミルスキシロシダーゼ遺伝子のプロモータ、又はファージラムダのPR若しくはPLプロモータ、大腸菌のlac、trp、若しくはtacプロモータなどが挙げられる。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、P10プロモータ、オートグラファカリホルニカポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子1プロモータ、又はバキュウロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、TPI1プロモータ、ADH24cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ADH3プロモータまたはtpiAプロモータなどがある。組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。上記DNA、プロモータ、所望によりターミネータ、及び/又は分泌シグナル配列などを適宜の順番でそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。組み換えベクターを導入するための宿主細胞の種類は上記のDNAを発現できる限り特に限定されない。例えば、細菌、酵母、真菌、高等真核細胞等が挙げられるが、細菌や酵母などが好ましい。細菌としては、バチルス属、ストレプトマイセス属などに属するグラム陽性菌、あるいは大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられるが、大腸菌などが好ましい。これらの細菌の形質転換は細胞の種類に応じて適宜の手段で行うことができる。形質転換体を適宜の条件下で培養することにより、導入されたDNAからエステラーゼを発現させることができ、その後、エステラーゼを適宜の手段で単離精製して本発明の方法に用いることができる。先に説明したように、形質転換体として微生物を用いる場合には、菌体自体や菌体処理物などを用いることも可能である。例えば、上記DNAをプラスミドに導入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターを大腸菌に導入して形質転換した後、大腸菌を培養することにより所望のエステラーゼを取得することができるが、形質転換体の利用態様はこの特定の態様に限定されることはない。工程2における反応に用いる緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられ、好ましくはリン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は01mmolL~1molL、好ましくは1mmolL~100mmolLである。金属塩としては、NaCl、FeCl3、KCl、CaCl2、MgSO4、MnSO4、ZnCl2、CoCl2等が挙げられる。金属塩の濃度は001~10が好ましい。上記反応によって得られた式の光学活性カルボン酸誘導体は、反応終了後、反応液を濾過して不溶物を除去し、酸を加えてpH1~3、好ましくはpH2程度に調整した後、適当な溶媒により反応物を抽出することにより分離することができる。化合物に対し、A溶媒中、50°C~150°C、好ましくは30°C~80°Cの温度で、1当量~大過剰量の縮合剤を5分間~72時間反応させた後、50°C~150°C、好ましくは30°C~80°Cの温度で、1当量~大過剰量のアンモニア源を添加して、5分間~72時間反応させるか、B溶媒中、50°C~150°C、好ましくは30°C~80°Cの温度で、1当量~大過剰量の活性化試薬を5分間~72時間反応させた後、50°C~150°C、好ましくは30°C~80°Cの温度で、1当量~大過剰量のアンモニア源を添加して、5分間~72時間反応させるか、又は、C溶媒中、50°C~150°C、好ましくは20°C~80°Cの温度で、1当量~大過剰量の縮合剤の存在下、1当量~大過剰量のアンモニア源を添加して、5分間~72時間反応させることにより、化合物を得ることができる。A~Cいずれの場合も、溶媒は反応に関与しないものであればいずれも使用可能であるが、例えば、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tertブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、アセトン、ピリジン、DMF、DMSO、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル等が挙げられ、好ましくはTHFが挙げられる。これらの溶媒は単独又は任意の混合物として用いることができる。また、A~Cいずれの場合も、アンモニア源との反応の際は、上記溶媒に加えて水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等の溶媒が使用可能であり、これらは単独又は任意の混合物として用いることができる。さらに、A~Cいずれの場合も、10分の1~30当量の塩基を加えて反応を行うこともできる。塩基としては、有機塩基又は無機塩基が挙げられ、好ましくは、有機塩基が挙げられる。有機塩基としては、例えば18ジアザビシクロ5407ウンデセン、トリエチルアミン、4ジメチルアミノピリジン、NNジメチルアニリン、ピリジン、Nメチルモルホリン、エチルジイソプロピルアミン等が挙げられ、好ましくは、トリエチルアミンが挙げられる。無機塩基としては、例えば、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸セシウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtertブトキシド等が挙げられる。縮合剤としては前記と同様の縮合剤を用いることができる。活性化試薬及びアンモニア源も前記と同様のものを用いることができる。化合物に対し、溶媒中、50°C~150°C、好ましくは20°C~60°Cの温度で、1当量~大過剰量の塩基を5分間~72時間作用させることにより化合物又は化合物を得ることができる。溶媒としては、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ピリジン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tertブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、水、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、DMF、DMSO等が挙げられ、好ましくはエタノールが挙げられる。これらの溶媒は単独又は任意の混合物として用いることができる。塩基としては、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸セシウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtertブトキシド等が挙げられ、好ましくはナトリウムエトキシドが挙げられる。化合物のR1Aが加水素分解により脱保護される保護基で保護されたアミノであるときは、溶媒中、50°C~150°C、好ましくは20°C~100°Cの温度で、1~10気圧、より好ましくは1~5気圧の圧力下で、基質に対して10分の1~50重量、好ましくは1~10重量の金属触媒を添加して、水素又は水素供与体共存下、5分間~72時間反応させることにより化合物を得ることができる。溶媒としては、酢酸、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tertブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、DMF等が挙げられ、好ましくはエタノールが挙げられる。これの溶媒は単独又は任意の混合物として用いることができる。金属触媒としては、酸化プラチナ、プラチナ炭素、水酸化パラジウム、水酸化パラジウム炭素、パラジウム炭素、パラジウムアルミナ、ルテニウム炭素、ロジウム炭素、ロジウムアルミナ、ウィルキンソン触媒、ラネーニッケル等が挙げられ、好ましくはパラジウム炭素が挙げられる。パラジウム炭素におけるパラジウム含量は、特に限定されないが、好ましくは5~10が挙げられる。水素供与体としては、ギ酸アンモニウム、シクロヘキセン、シクロヘキサ13ジエン、シクロヘキサ14ジエン等が挙げられる。化合物のR1Aが酸の作用により脱保護しうる保護基で保護されたアミノであるときは、無溶媒下又は溶媒中、50°C~150°C、好ましくは20°C~100°Cの温度で、酸を作用させることにより化合物を得ることができる。溶媒としては、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tertブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、水、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、DMF、ジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられ、これの溶媒を単独又は任意の混合物として用いることができる。酸としては、無機酸、有機酸等が挙げられ、無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等が挙げられ、有機酸としては、酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、pトルエンスルホン酸等が挙げられる。好ましくは、トリフルオロ酢酸が挙げられる。化合物のR1Aがチオールの作用により脱保護される保護基で保護されたアミノであるときは、溶媒中、50°C~150°C、好ましくは20°C~100°Cの温度で、1当量~大過剰量のチオールを1当量~大過剰量の塩基存在下で5分間~72時間作用させることにより化合物を得ることができる。溶媒としては、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ピリジン、ジエチルエーテル、THF、ジオキサン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、水、アセトン、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、DMF、ジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられ、これの溶媒を単独又は任意の混合物として用いることができる。チオールとしては、スルフヒドリル基を有する化合物であれば、いずれも用いることができるが、好ましくは、置換基を有していてもよいチオフェノール、置換基を有していてもよい低級アルキルチオールが挙げられ、さらに好ましくは、チオフェノール、メタンチオール、エタンチオール、1ドデカンチオール等が挙げられる。塩基としては、有機塩基又は無機塩基が挙げられる。有機塩基としては、例えばDBU、トリエチルアミン、4ジメチルアミノピリジン、NNジメチルアニリン、ピリジン、Nメチルモルホリン、エチルジイソプロピルアミン等が挙げられ、無機塩基としては、例えば、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtertブトキシド等が挙げられ、好ましくは炭酸カリウム、又はトリエチルアミンが挙げられる。化合物及び化合物B:を化合物Aの中間体として利用できることが非特許文献3に示されているので、化合物及び化合物Bを化合物Aの製造原料として利用できることは当業者に自明である。この文献の記載に従えば、例えば、前記9のb~eの各工程は以下のように実施される。工程bでは、例えば、化合物B、約15当量の25ジメトキシテトラヒドロフラン及び過剰量の酢酸の混合物を約70°Cで約15時間撹拌する。通常では、常法に従って粗製の反応生成物を単離し、これを次工程に用いることができる。工程cでは、例えば、前記工程bで得られた生成物、約3当量のトリクロロアセチルクロリド、及び適量のクロロホルムの混合物を約16時間加熱還流させる。クロロホルムに代えて他の不活性溶媒例えば、ジクロロメタン、THF等を用いることもできる。通常では、常法に従って粗製の反応生成物を単離し、これを次工程に用いることができる。工程dでは、例えば、前記工程cで得られた生成物、約12当量の4ブロモ2フルオロベンジルアミン塩酸塩、及び約25当量のトリエチルアミンを適量の乾燥DMF溶媒中、室温で約16時間撹拌する。通常では、常法に従って粗製の反応生成物化合物Aを単離し、これを次工程に用いることができる。工程eでは、例えば、工程dで得られた化合物Aを適量の酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒から再結晶する。他の再結晶溶媒として、エタノールなどのアルコール類を用いることもできる。以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例及び参考例で用いられるプロトン核磁気共鳴スペクトルは、300MHzで測定されたものであり、化合物及び測定条件によって交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いるが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。さらに、質量スペクトルにより化合物の分子量の確認を行った。ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノ2エトキシカルボニルスクシナートから1エチル水素3ベンジルオキシカルボニルアミノ3エトキシカルボニルスクシナートへの転換反応については、含量分析を行ない、液量×含量により生成量を求め収率を算出した。含量分析は、HPLCを用いて次の条件で行った。カラムはジーエルサイエンス社製InertsilODS3、展開溶媒はアセトニトリル005molLリン酸緩衝液5050、流速10mLmin、オーブン温度は40°C、検出波長は254nmで行った。含量は既知濃度の標準液による検量線から算出した。また、光学純度分析についてはHPLCを用いて次の条件で行った。カラムはダイセル化学工業社製CHIRALCELOJRHを用いた。1エチル水素3ベンジルオキシカルボニルアミノ3エトキシカルボニルスクシナートの光学純度分析は、展開溶媒はアセトニトリル過塩素酸水溶液3070、流速10mLmin、オーブン温度は20°C、検出波長は254nmで行った。ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノ2カルバモイルスクシナートの光学純度分析は、展開溶媒はアセトニトリル水3070、流速05mLmin、オーブン温度は20°C、検出波長は254nmで行った。2ベンジルオキシカルボニルアミノ2エトキシカルボニルスクシンイミドの光学純度分析は、展開溶媒はアセトニトリル過塩素酸水溶液3070、流速05mLmin、オーブン温度は20°C、検出波長は254nmで行った。2アミノ2エトキシカルボニルスクシンイミドの光学純度分析は、展開溶媒は過塩素酸水溶液、流速045mLmin、オーブン温度は5°C、検出波長は196nmで行った。上記各製造方法における中間体及び目的化合物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等に付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次の反応に供することも可能である。化合物、、、、又はの塩を取得したいとき、化合物、、、、又はが塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、化合物、、、、又はを適当な溶媒に溶解又は懸濁し、酸又は塩基を加えて単離、精製すればよい。また、化合物、、、、又は並びにそれらの塩は、水あるいは各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明に包含される。例1:ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノ2エトキシカルボニルスクシナートの製造クロロ酢酸エチル法ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノマロナート50g、炭酸カリウム27g、ヨウ化カリウム027g及び2クロロ酢酸エチル26gのDMF50mL懸濁液を50°Cで1時間撹拌した。冷後、反応液を希塩酸中に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルnヘキサンから結晶化して表記の化合物55gを無色結晶として得た。1HNMRδ734639510424410349121MSmz396HRMScalcdforC19H26NO83961658found3961653例2:ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノ2エトキシカルボニルスクシナートの製造ブロモ酢酸エチル法ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノマロナート50gの無水DMF溶液300mLに、氷冷撹拌下、水素化ナトリウム647gを徐々に加えた後、室温で30分間撹拌し、次いで2ブロモ酢酸エチル226gを加え一夜撹拌した。反応液を希塩酸中に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、nヘキサン酢酸エチルで溶出、精製した後、酢酸エチルnヘキサンから結晶化して表記の化合物467gを無色結晶として得た。例3:1エチル水素3ベンジルオキシカルボニルアミノ3エトキシカルボニルスクシナートの製造エステルの加水分解反応酵素精製独立法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門より分譲を受けたBacillusthuringiensisNBRC13866をGPY培地1グルコース、05ペプトン、03酵母エキスからなる培地にて30°C、16時間、好気的に培養した。得られた培養液から、遠心分離12000×g、10分により、湿菌体を回収し、001Mトリス塩酸緩衝液pH80に懸濁した。懸濁液を氷冷下、超音波ホモジナイザー日本精機US300Tにより破砕した後、遠心分離12000×g、10分間により、上清と残渣に分離した。上清に氷冷下、硫酸アンモニウムを20飽和濃度になるように加え、攪拌後、遠心分離12000×g、10分間を行い、上清を除いた。沈殿を1mMDithiothreitolを含む001Mトリス塩酸緩衝液pH80に懸濁し、同緩衝液により透析した。この溶液にDEAESepharoseFastFlowGEHealthcare社製を加え、混合後、ろ過し、活性溶液を回収した。この溶液に3ジメチルアンモニオプロパンスルホネートCHAPSを最終濃度1となるように加え混合し、氷冷下、30分間超音波ホモジナイザーで処理した後、1mMDTT、1CHAPSを含む001Mトリス塩酸緩衝液pH80以下緩衝液Aとするで平衡化したDEAESepharoseに付し、緩衝液Aにて洗浄後、塩化ナトリウムの0から03Mのグラジエントによりタンパク質を溶出した。活性画分を透析し、CHAPSを除いた後、ポリオキシエチレンラウリルエーテルBrij35を最終濃度005となるように加え、005Brij35、1mMDTT、03M塩化ナトリウムを含む001Mトリス塩酸緩衝液pH80以下緩衝液Bにて平衡化したPhenylSepharoseHighPerformanceに付し、緩衝液Bにて洗浄後、塩化ナトリウムの03から0Mのグラジエントによりタンパク質を溶出した。活性画分を緩衝液Aにて透析、限外濾過濃縮後、緩衝液Aにて平衡化したMonoQに付し、緩衝液Aにて洗浄後、塩化ナトリウムの0から05Mのグラジエントによりタンパク質を溶出した。活性画分を緩衝液Aにて平衡化したBenzamidineSepharose4FastFlowに付し、緩衝液Aにて洗浄後、塩化ナトリウムの0から05Mのグラジエントによりタンパク質を溶出した。その活性画分を、SDSPAGEに供したところ、約50kDaのタンパク質のみを確認し目的酵素を精製したことを確認した。活性測定は以下のように行った。酵素を含む溶液01mLに精製水を03mL、1Mリン酸緩衝液pH7を005mL、1ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノ2エトキシカルボニルスクシナートを含むアセトニトリル005mLを加え、混合した後、30°Cで4時間振盪した。反応液中の生成物1エチル水素3ベンジルオキシカルボニルアミノ3エトキシカルボニルスクシナートをHPLCにより分析した。1分間に1μmolの基質を変換する活性を1Uとした。部分精製酵素による反応上記のDEAESepharoseカラム精製の活性画分を限外ろ過膜により濃縮した。濃縮液008mL約8mU、35のジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノ2エトキシカルボニルスクシナートを含むアセトニトリル001mL、1Mリン酸緩衝液pH7を001mLを加え混合し、30°Cで振盪した。反応液のpHは1N水酸化ナトリウムを用いpH75に調整した。HPLC分析により、30時間後には反応収率70で1エチル水素3ベンジルオキシカルボニルアミノ3エトキシカルボニルスクシナートが得られたことを確認した。生成物の光学純度をHPLCで確認したところ、R体であり、光学純度は100eeであった。1HNMRδ735651509424408348119MSmz368HRMScalcdforC17H22NO83681345found3681314精製した酵素のN末端アミノ酸配列分析上記で精製した酵素のN末端アミノ酸配列分析を行なった。分析は株式会社アプロサイエンス〒7710360徳島県鳴門市瀬戸町字板屋島124番4に依頼した。分析の結果、GluLysLysProValSerLeuThrGluArgThrSerLeuPhePheの配列が得られた。この配列をDNADataBankofJapanDDBJで相同性検索を行なったところ、BacillusthuringiensisIBL200の、遺伝子配列から推定されるHydrolaseaccessionnoC3IAP1と相同性があった。遺伝子取得このHydrolaseの遺伝子情報を基にBacillusthuringiensisNBRC13866から酵素遺伝子の取得を行なった。BacillusthuringiensisNBRC13866を5mLGPY培地で、30°C、200rpmで24時間、振盪培養した培養液から、GenomicDNABufferset株式会社キアゲン及びQIAGENGenomictip500G株式会社キアゲンを用いて単離したゲノムDNAを鋳型とし、5TAAATCCATTGCTTAACGCCTCTACTCTT及び5TCACGCAATGATGATTGCATGATGGCTTTをプライマーとして、KODplusを使用して添付説明書に従いPCRを行った。PCR産物をpUC18タカラバイオ株式会社に挿入しプラスミドを構築したpBTEST7。pBTEST7を鋳型とし、プライマーウォーキング法により、インサートDNAの塩基配列を解読した。塩基配列解読にはABIPRISM310NTGeneticAnalyzerアプライドバイオシステムズジャパン株式会社及びBigDyeTerminatorv31CycleSequencingKitアプライドバイオシステムズジャパン株式会社を使用し、各々の添付説明書に従い解読した。配列を解読した結果、遺伝子は1380bpから成っていた配列番号1。配列番号1に示した遺伝子は460アミノ酸残基から成る酵素をコードしていた配列番号2。また、配列番号2に示した配列をDDBJで相同性検索を行なったところ、上記BacillusthuringiensisIBL200の、遺伝子配列から推定されるHydrolaseと最も相同性が高かったが、完全には一致せず、相同性は96であった。また、活性本体である酵素の全長アミノ酸配列が明らかになったことから、上記bにおいてエステラーゼ活性が確認された蛋白質は、配列番号2に記載のアミノ酸配列において、そのN末端側の40アミノ酸が欠失している蛋白質であることがわかった。組換え大腸菌の作製pBTEST7を鋳型とし、5AAACAGCATGCAAAAAAAGAAATTACAAAAATCAGCAC北海道システムサイエンス株式会社および5CTTTTGTTGTAGATCTTTTCTTTGTCGCATTGACCCA北海道システムサイエンス株式会社をプライマーとし、KODplusを使用してPCRを行った。PCR産物をSphI東洋紡績株式会社、及びBglII東洋紡績株式会社で消化し、pQE70株式会社キアゲンのSphI及びBglIIサイトに挿入したプラスミドを構築したpBTEST12。pBTEST12をCompetenthighJM109東洋紡績株式会社を用いて添付説明書に従い大腸菌JM109に遺伝子導入し、大腸菌JM109pBTEST12を作製した。組換え大腸菌を用いた反応上記で作製した大腸菌JM109pBTEST12を100mgLのアンピシリンナトリウム和光純薬工業株式会社を含む5mLのLB液体培地10ポリペプトン、05酵母エキス、10塩化ナトリウム、pH70に植菌し、25°C、200rpmで12時間振盪培養を行った。この培養液を01mMイソプロピルβチオガラクトピラノシドナカライテスク株式会社を含む200mLのLB液体培地に植え継ぎ、25°C、200rpmで24時間振盪培養を行った。この培養液を16L調製し、12000×g、4°Cで10分間遠心分離し、菌体を得た。この菌体を精製水に懸濁し、35ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノ2エトキシカルボニルスクシナートを含むアセトニトリル溶液を10mL、10Mリン酸緩衝液pH70を10mL加え、さらに総量100mLとなるよう精製水を加えた。この溶液を攪拌しながら、24時間、25°Cに維持した。反応液のpHが70に維持されるように、適時28水酸化ナトリウム溶液を加えた。この反応液を12000×g、4°Cで10分間遠心分離し、菌体を除去した後、上清をHPLCで分析し、反応収率90で1エチル水素3ベンジルオキシカルボニルアミノ3エトキシカルボニルスクシナートが得られたことを確認できた。生成物の光学純度をHPLCで確認したところ、R体であり、光学純度は100eeであった。組換え大腸菌からの酵素精製及び酵素反応大腸菌JM109pBTEST12を100mgLのアンピシリンナトリウムを含む5mLのLB液体培地に植菌し、25°C、200rpmで12時間振盪培養を行った。この培養液を01mMイソプロピルβチオガラクトピラノシドを含む200mLのLB液体培地に植え継ぎ、25°C、200rpmで24時間振盪培養を行った。この培養液からQIAexpressTypeATGKit株式会社キアゲンを使用し、添付説明書に従い酵素精製を行った。精製した酵素溶液をSDSPAGEで電気泳動を行った結果、単一のバンドであり酵素精製できたことを確認した。この精製酵素を用いて、3ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノ2エトキシカルボニルスクシナート、01Mリン酸緩衝液pH70、055mgmL精製酵素の組成となるように溶液を調製し、30°Cで3時間放置した。この反応液をHPLCで分析したところ、反応収率20で1エチル水素3ベンジルオキシカルボニルアミノ3エトキシカルボニルスクシナートが得られたことを確認できた。また、生成物の光学純度をHPLCで確認したところ、R体であり、光学純度は100eeであった。N末端欠損酵素遺伝子の発現組換え大腸菌の作製上記において、エステラーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号2に記載のアミノ酸配列のN末端側のアミノ酸配列が、40アミノ酸を欠損している蛋白質であることが分かった。このことから、N末端が欠損している蛋白質を発現する組換え大腸菌を作製した。pBTEST12を鋳型とし、5GTACAAAGCATGCAAAAGAAACCAGTCTCTTTAACGGAGCG北海道システムサイエンス及び5CTTTTGTTGTAGATCTTTTCTTTGTCGCATTGACCCA北海道システムサイエンスをプライマーとし、KODplusを使用してPCRを行なった。PCR産物をSphI及びBglIIで消化し、pQE70のSphI及びBglIIサイトに挿入したプラスミドを構築した。pBTEST38をCompetenthighJM109を用いて添付説明書に従い大腸菌JM109に遺伝子導入し、大腸菌JM109pBTEST38を作製した。大腸菌JM109pBTEST38を100mgLのアンピシリンナトリウムを含む5mLのLB液体培地に植菌し、30°C、200rpmで19時間振盪培養を行った。この培養液を01mMイソプロピルβチオガラクトピラノシドを含む100mLのLB液体培地に植え継ぎ、25°C、200rpmで16時間振盪培養を行った。この培養液を3L調製し、12000×g、4°Cで10分間遠心分離し、菌体を得た。この菌体を少量の01Mリン酸緩衝液pH70に懸濁し、35ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノ2エトキシカルボニルスクシナートを含むアセトニトリル溶液を15mL加え、さらに総量150mLとなるよう精製水を加えた。この溶液を攪拌しながら、18時間、25°Cに維持した。反応液のpHが70に維持されるように、適時28水酸化ナトリウム溶液を加えた。この反応液を12000×g、4°Cで10分間遠心分離し、菌体を除去した後、上清をHPLCで分析し、反応収率90で1エチル水素3ベンジルオキシカルボニルアミノ3エトキシカルボニルスクシナートが得られたことを確認した。生成物の光学純度をHPLCで確認したところ、R体であり、光学純度は100eeであった。例4:ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノ2カルバモイルスクシナートの製造1エチル水素3ベンジルオキシカルボニルアミノ3エトキシカルボニルスクシナート18gのTHF20mL溶液に15°C撹拌下、トリエチルアミン096mL、クロロギ酸イソブチル084mLの順で加え、5分間撹拌した。同温度にて25アンモニア水047mLを反応液に滴下した。同温度にて1時間撹拌後、反応液を希塩酸中に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、nヘキサン酢酸エチルで溶出、精製した後、酢酸エチルnヘキサンから結晶化して表記の化合物151gを無色結晶として得た。旋光度はαD2557°、光学純度は961eeであった。1HNMRδ734651635563512426410348123MS367HRMScalcdforC17H23N2O73671505found3671509例5:2ベンジルオキシカルボニルアミノ2エトキシカルボニルスクシンイミドの製造氷冷撹拌下、ジエチル2ベンジルオキシカルボニルアミノ2カルバモイルスクシナート200mgの無水エタノール10mL溶液に、ナトリウムエトキシド41mgを加え、同温度で2時間撹拌した後、冷1molL塩酸を注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し残渣を酢酸エチルnヘキサンから再結晶して表記の化合物149mgを無色結晶として得た。旋光度はαD28318°、光学純度は992eeであった。1HNMRδ839736627512432318129MS321HRMScalcdforC15H17N2O63211087found3211074例6:2アミノ2エトキシカルボニルスクシンイミドの製造2ベンジルオキシカルボニルアミノ2エトキシカルボニルスクシンイミド80mgをエタノール10mLに溶解し、5パラジウム炭素4mgを加え、水素雰囲気下、室温で接触水素化した。触媒を濾去した後、濾液を減圧濃縮した。残渣をエタノールから再結晶して、表記の化合物43mgを無色結晶として得た。旋光度はαD24359°であった。光学純度は999ee以上であった。1HNMRδ428319274130MS187HRMScalcdforC7H11N2O41870719found1870700