"Cys-Gly-Pro-Cys、Cys-Pro-Tyr-Cys、Cys-Pro-His-Cys又はCys-Pro-Pro-Cys配列を有し、チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる1種又は2種以上を有効成分とする、網膜神経細胞の機能回復剤。前記ポリペプチド類がヒトチオレドキシンである請求項1に記載の網膜神経細胞の機能回復剤。本発明の目的は、神経系ないし神経細胞の再生を促進する技術に関する。本発明者は、TRXが神経系ないし神経細胞の再生を促進し、視神経網膜の再生による眼科領域での疾患の治療や、大脳皮質などの神経系ないし神経細胞の再生を促進し、神経細胞死に起因する各種疾患の治療に有用であることを見出した。本発明は、以下の機能回復剤に関する項1.Cys-Gly-Pro-Cys、Cys-Pro-Tyr-Cys、Cys-Pro-His-Cys又はCys-Pro-Pro-Cys配列を有し、チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる1種又は2種以上を有効成分とする、網膜神経細胞の機能回復剤。項2.前記ポリペプチド類がヒトチオレドキシンである請求項1に記載の網膜神経細胞の機能回復剤。本明細書においては、チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類には、チオレドキシン活性を有するものであれば、オリゴペプチドからポリペプチドタンパク質まで広く含まれる。チオレドキシン活性を有するファミリーは、活性中心に配列-Cys-X-Y-Cys-X及びYは同一又は異なって20種類の天然アミノ酸のいずれかを示す。を有しており、チオレドキシンスーパーファミリー以下、TRXファミリーというと呼ばれている。TRXファミリーに属するポリペプチドとしては、活性中心に配列-Cys-Gly-Pro-Cys-、-Cys-Pro-Tyr-Cys-、-Cys-Pro-His-Cys-、-Cys-Pro-Pro-Cys-を有するポリペプチド類を例示することができ、これらの中でも、活性中心に配列-Cys-Gly-Pro-Cys-を有するポリペプチド類が好ましい。また、TRXファミリーに属するポリペプチドには、具体的には、ヒトを含む動物のチオレドキシンヒトを含む動物のADF、大腸菌などの細菌のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン等のチオレドキシン;ヒトADF活性を有するポリペプチドヒトADFP;ヒト,大腸菌等のグルタレドキシン等が含まれる。TRXファミリーに属するポリペプチドとしては、チオレドキシンが好ましく、特にヒトチオレドキシン及び酵母チオレドキシンが好ましい。酵母チオレドキシンは、酵母から単離したものでもよいが、チオレドキシンを多く含む酵母の形態で使用することもできる。これらTRXファミリーに属するポリペプチド類は、本発明に係る網膜神経細胞の機能回復剤に、単独で、又は2種以上組み合わせて含有させることができる。TRXファミリーに属するポリペプチドは、細菌大腸菌、酵母、植物及び動物、特にヒトを含む哺乳動物ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、モルモット、ラット、マウス、ウサギなど由来のいずれであってもよい。また、TRXファミリーに属するポリペプチドは、天然物を精製する方法、遺伝子組換え法により、酵母,大腸菌等から得られるものであってもよく、TRX活性を有する限り、その1又は複数のアミノ酸を置換、付加、欠失等した誘導体であってもよい。チオレドキシンを含む該ポリペプチド類は、酸化型であっても還元型であってもよいが、好ましくは還元型である。再生される神経としては、大脳皮質、髄質、小脳、脳幹、視神経、内耳神経、運動神経、知覚神経、脊髄、交感神経、副交感神経などが挙げられ、これらの神経に分化し得る各種幹細胞にTRXファミリーに属するポリペプチドを作用させることで、神経を再生し、神経の変性ないし神経細胞死に起因する各種神経系疾患を治療することができる。神経に分化し得る各種幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞などが例示できる。本発明者らは、神経幹細胞にTRXが多く発現していることを見出しており、下記の実施例からも、TRXが幹細胞の増殖及び神経細胞への分化を促進することは明らかである。神経の再生により治療可能な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、失明疾患などが例示される。本発明に係る網膜神経細胞の機能回復剤は、例えば神経を再生可能な各種幹細胞に適用することにより、これら幹細胞の神経細胞への分化、結果として神経の再生を促進することができる。神経系幹細胞の増殖及び神経細胞への分化を促進するためのTRXファミリーに属するポリペプチドの有効量としては、成人1日あたり50~500mg程度であり、これを1日あたり1~3回に分けて投与することができる。投与経路としては、経口錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤など及び非経口注射剤、吸入剤、点鼻剤、坐剤などのいずれでも投与することができる。以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明する。実施例11細胞株及び培養NGF,ポリエチレンイミンPEI,PD98059及びNACはSigmaから購入した。ラット褐色細胞腫腫瘍細胞株PC12は、5CO2を含む湿気のある雰囲気中37°Cで、10熱不活性化ウマ血清及び5熱不活性化胎仔ウシ血清FCSを有し、抗生物質100IU/mlのペニシリン及び100mg/mlのストレプトマイシンを補足したRPMI1640LifeTechnologies,GrandIsland,NY中で維持した。プラスミド:pTrxCATプラスミドは公知の方法に従い構築したTaniguchietal.,1996。thepTrxCATベクターからのHindIII-BamHIインサートは、pBluescriptIIKSpTRXblueベクターにサブクローニングした。pTRX-1148-Luc、pTRX-1062-Luc、pTRX-352-Luc及びpTRX-263-LucベクターはpTRXblueベクターのKpnI/BamHIフラグメントをpGL3ベイシックベクターPromega,WIのKpnI/BglII部位にライゲートすることにより構築した。pTRX-263-LucベクターのApaI/PvuIIインサートは、切り出され、埋められ、自己ライゲートされてpTRX-217-Lucベクターを得た。pGL3-c-fos-40,42及びpGL3-c-fos-99,42lucベクターは、Fos-40lucのMluI/HindIIIフラグメントMasutanietal.,1997及びthepFDE-lucベクターをpGL3ベイシックベクターPromegaのMluI/HindIII部位にサブクローニングすることにより構築した。pFDE-lucは、FDE-CATTroucheetal.,1993のBamHI/HindIIIフラグメントをpGL2ベイシックベクターPromegaのBglII-HindIIIにサブクローニングすることにより構築した。pCDSRaalpha-TRX及びpCDSRa-TRXC32S/C35Sベクターは、既述の方法により構築したHirotaetal.,1997。ThepcDNA3TRX32S/35Sベクターは、既述の方法により構築したNishiyamaetal.,1999。pCDSRa-TRX及びpCDSRa-TRXmTagayaetal.,1989;Hirotaetal.,1997からのBamHIインサートは、各々pBluescriptIIKSpBS-wtTRX,pBS-dmTRXのBamHI部位にサブクローニングした。pBI-EGFP-wtTRX及びpBI-EGFP-dmTRX32S/35Sは、各々pBS-wtTRX及びpBS-dmTRXベクターのEcoRV/XbaIフラグメントをpBI-EGFPベクターClontechのPvuII/NheI部位にライゲートすることにより構築した。すべての構築物は、ThermoSequenaseIIダイターミネーターサイクルシークエンシングキットdyeterminatorcyclesequencingkitAmershamPharmaciaを用いた直接ヌクレオチドシークエンシングによりコントロールした。pRL-TKベクターは、Promegaから購入した。pcDNA3はInvitrogenから購入した。ウェスタンブロット分析細胞を集めて氷冷リン酸緩衝生理食塩水PBSで2回洗浄し、次いで可溶化溶液10mM.Tris-HCIpH7.4,150mMNaCI,1NP-40,1mMEDTA,0.1mMPMSF,8mg/mlアプロチニン及び2mg/mlロイペプチンで氷上30分間溶解させた。抽出物を遠心分離により清澄にした。細胞可溶化液を95°Cで5分間維持し、次いで15SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。分離したタンパク質をポリビニリデンジフルオライド膜MilliporeCo.,Bedford,MAに移した。該膜をT-PBS0.05Tween20を含むPBS中10w/vスキムミルクで終夜処理し、抗マウスTRXウサギポリクローナル抗体Takagietal.,1998cと1時間インキュベートし、次いでペルオキシダーゼ複合化抗ウサギIgGAmershanPharmaciaBiotechと1時間インキュベートした。エピトープをECLウェスタンブロット検出キットAmershanPharmaciaBiotechで可視化した。本発明者は、以前にこの抗マウス抗体がラットTRXと交差反応することを報告したTakagietal.,1998b。ノーザンブロット分析全RNAを製造元の仕様書に従いTRIzol試薬を用いて抽出したMaruyamaetal.,1997。全RNA20mgを電気泳動にかけMaximumstrengthNytrannylonSchleicherandSchrul,Knee,NHにTurbo-BlotterシステムSchleicherandSchrulを用いて移した。フィルターを、既述のようにTakagietal.,1998bラットTRXmRNAと交差反応するマウスTRXプローブとハイブリダイズさせた。トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイPC12細胞をトランスフェクション前に35-mmディッシュに70コンフルエンスで播種した。血清を含まない培地中の細胞をBoussifらBoussifetal.,1995に記載されたようにPEI試薬を用いてトランスフェクトした。24時間後、トランスフェクトした細胞を50ng/mlのNGFSigmaで処理した。Renillaルシフェラーゼ活性により規格化したルシフェラーゼ遺伝子発現をアッセイキットPromega,Madison,WIを用い、ルミノメーターで24時間後に分析した。ルシフェラーゼの相対的フォールド活性化を計算した。同じ実験を3回行った。PC12細胞を、TRXの活性部位が不活性化された二方向性発現ベクターpBI-EGFP,pBI-EGFP-wtTRX又はpBI-EGFP-dmTRXでトランスフェクトしたUenoetal.,1999。トランスフェクション後、NGFを培地に加えた。24時間後、細胞発現EGFPをレーザー共焦点顕微鏡により調べた。免疫蛍光細胞染色PC12細胞をポリ-L-リシンでコートした培養スライド中70コンフルエンスで染色する前に播種した。次いで、細胞を10FCSを含むPBS中3.7パラホルムアルデヒドで20分間室温で固定した。これを次にPBS中0.2W/VTritonX-100を用いて10分間膜透過性化し、5ウシ血清アルブミン及び10FCSを含むPBSで20分間ブロッキングした。スライドを2mg/mlのマウスTRX抗体富士レビオより提供で60分間インキュベートし、次いでPBSで洗浄した。次いでスライドを1mg/mlのフルオレセインイソチオシアネート標識二次抗体と60分間インキュベートし、再度PBSで洗浄した。染色細胞をレーザー共焦点顕微鏡Bio-Radで調べた。結果PC12細胞中でのNGF誘発TRX発現本発明者は、NGFのPC12細胞中でのTRX発現についての効果を調べた。該タンパク質発現は、NGFによりPC12細胞中で増加した図1A。TRXmRNAもまたNGF処理の2時間後に増加した図1B。NGF処理による誘導メカニズムをさらに分析するために、本発明者は、TRXプロモータールシフェラーゼレポーターコンストラクトTRX-LucでPC12細胞をトランスフェクトした。NGFによる処理は、TRXプロモーター活性を有意に増強した図1C。TRXプロモーター中のNGF-応答領域の同定NGFによるTRX遺伝子の活性化のメカニズムを理解するために、TRXプロモーター領域の各種欠失ミュータントを含むルシフェラーゼレポーターコンストラクトを使用した。翻訳開始部位に対し-263位~-217位の遺伝子領域はNGF応答に必要であった。この領域はコンセンサスCREに似ている配列を含み、活性化におけるCREの関与を示す図2。TRX発現はPD98059又はNACにより抑制された。ERK阻害剤であるPD98059及びNACKamataetal.,1996はNGFによるERK-CRE介在活性化を抑制することが知られている。NGFで2日間処理すると神経突起伸長の出現を伴うPC12細胞のニューロン分化を誘発した。既報告のように、PD9805950mM又はNAC20mMは、PC12cellsにおけるNGF-誘発形態変化を抑制した図3A。次いで、本発明者はPD98059またはNACのNGF-介在TRX遺伝子活性化についての効果を試験した。PD98059またはNACは、TRX遺伝子のNGF-誘発活性化をブロックした図3B。PD98059又はNACはまた、TRXタンパク質発現の減少を生じた図3C。TRXのNGF-誘発核輸送は、PD98059またはNACによりブロックされる。ERKは、NGF処理中に細胞質から核に輸送されるChenetal.,1992.TRXはまた、H2O2又はUV照射にさらされたときにも細胞質から核に輸送されるHirotaetal.,1997。NGF-誘発シグナリングにおけるTRXの関与を分析するために、本発明者はNGF処理の際のTRXの細胞下局在を研究した。NGFで16時間処理した後、TRXは核に移動した。該移動はPD98059又はNACによりブロックされた図4。優性型TRXの過剰発現は、PC12のNGF-誘発分化をブロックした。本発明者は、次いでTRXがPC12細胞のNGF-依存性分化に要求されるのかを調べた。本発明者は、PC12細胞をpBI-EGFP,pBI-EGFP-wtTRX又はpBI-EGFP-dmTRX32S/35Sを用いて一時的にトランスフェクトし、そこでは、TRXのレドックス活性部位は不活性化された。ミュータントTRXは転写因子のTRX依存性活性化を阻害したUenoetal.,1999。トランスフェクション後、NGFが培地に添加された。NGF処理の24時間後、細胞をレーザー共焦点顕微鏡で調べた。ミュータントTRXベクターでトランスフェクトされた細胞は分化の抑制を示し、一方野生型TRXベクターまたはコントロールベクターでトランスフェクトされた細胞はNGF-誘発分化を示した図5。優性なネガティブミュータント型TRXの過剰発現は、NGFによるCRE介在c-fos誘発をブロックした。TRXは、DNA結合Hirotaetal.,1997Uenoetal.,1999又はコ-アクチベータ相互作用Emaetal.,1999を促進することにより各種の転写因子を制御することが報告された。それゆえ、本発明者はTRXがCREを介したNGF-介在活性化の調節に関与するかについて分析した。4時間の処理後、NGFはpGL3-c-fos-99,42中でルシフェラーゼ活性の40倍の増大を生じさせたが、pGL3-c-fos-40,42は増大しなかった図6A。レポーター遺伝子であるpGL3-c-fos-99,42のNGFに対する応答は,TRXの優性なネガティブミュータントのトランスフェクションにより著しく抑制された。トランス活性化はミュータントTRXにより75抑制された図6B考察本研究において、本発明者はNGFがPC12細胞において、タンパク質及びmRNAレベルでTRX発現を誘導することを見出した。本発明者は、ルシフェラーゼアッセイによりTRX遺伝子の-263~-217bpに位置するNGF応答領域を同定した。この領域は、CREをコンセンサスする類似物を保有するCGTCA配列を含んでいたMontminyetal.,1986。さらに、本発明者はERK阻害剤であるPD98059がNGF-誘発TRX発現を抑制することを示した。NGF-誘発CRE活性化は細胞外シグナリング調節蛋白質キナーゼERKImpeyetal.,1998により介在される。これらの結果は、TRX遺伝子がERK及びCREカスケードを通してNGFにより誘導されることを示す。さらなる研究が、NGFによるTRX遺伝子誘発メカニズムの分析について進行中である。本発明者はまた、NGFがPMAHirotaetal.,1997,UVUenoetal.,1999及びへミンKimetal.,2001と同様にTRXの核移動を誘発することを実証した。本発明者は、ERK阻害剤であるPD98059がNGFのこの効果をブロックすることを示し、この結果はERKがTRXのNGF-誘発核移動の調節に関与することを示唆する。該核移動のメカニズム及び生理学的重要性はさらに詳細に研究されるべきである。TRXのNGF-誘発発現及び核移動はPC12細胞のNGF-誘発分化に関連するようであり、なぜならPD98059及びNACは各々NGF-誘発分化及びTRX発現だけでなく核移動を抑制するからである図3及び4。より重要なことには、優勢なネガティブミュータントTRXの過剰発現は、分化をほぼ完全に阻害した図5。これらの結果は、TRXがNGFにより誘発されるPC12の分化に必要であることを示す。c-fosのような遺伝子はNGFの作用に要求されると考えられた。c-fos遺伝子の上流制御領域において、CREは神経分化を誘発する各種の細胞外刺激に応答するc-fos転写の調節に決定的に重要であるAhnetal.,1998Shengetal.,1988。本発明者は、TRXの優勢なネガティブミュータント型の過剰発現がCREを含むpGL3-c-fos-99,42レポーター遺伝子のNGF-誘発活性化ブロックするが、pGL3-c-fos-40,42はブロックしないことを示した。これらの結果は、TRXがc-fos発現をもたらすCREを介したNGFシグナリングに必要であることを実証する。TRXはJun/FosAP-1を含むDNA-結合タンパク質の活性を調節し、核内還元分子であるレドックスファクター1Ref-1と相互作用するHirotaetal.,1997。AP-1及びRef-1は分化に関与することが報告されたShengandGreenberg,1990Chiarinietal.,2000。最近、本発明者は、TRX及びRef-1が転写因子とコアクチベータ間の相互作用を調節することEmaetal.,1999、及びCREBの活性化がTRXにより調節されることを報告したHirotaetal.,2000。従って、TRXはCREBのDNA又はコアクチベータとの相互作用を増大させ、NGFシグナリングを促進するかもしれない。さらなる研究は、NGFシグナリング経路におけるTRXの関連メカニズムに必要である。NGFは、軸索再生を促進することが示されたHollowelletal.,1990。Endohらはコリン作動性ニューロンについてのTRXの神経栄養活性を報告したEndohetal.,1993。本結果は、この知見を確認及び発展させ、TRXがニューロンの分化及び再生についてのNGFの効果を増強する神経栄養性コファクターであることを示唆するNGFはまた、ニューロン生存因子としても働く。NGFは軸索切断した中隔ニューロンの死を予防することが示されたPallageetal.,1986。NGFがなくなるとPC12細胞のアポトーシスを生じ、これはp38MAPK及びアポトーシスシグナリングキナーゼ1ASK1により媒介されるXiaetal.,1995;Kummeretal.,1997;Kanamotoetal.,2000。TRXはASK1及びp38MAPKの内因性阻害剤として働くことが報告されSaitohetal.,1998;Hashimotoetal.,1999、NGFの消失はまたPC12細胞におけるTRX発現のダウンレギュレーションを生じるBai,etal.unpublishedobservations。これらの結果は、NGFによるTRXレベルの維持はニューロン死を予防する役割を果たすことを実証する。TRXの神経損傷に対する保護的役割が示された。TRXは虚血後の星状膠細胞で誘導されるTomimotoetal.,1993。トランスジェニックマウスにおけるTRXの過剰発現は、病巣の脳虚血障害Takagietal.,1999及び興奮毒性海馬損傷Takagietal.,2000を軽減する。アルツハイマー病患者の脳におけるTRXの減少した発現が報告されているLovelletal.,2000。NGF投与は、アルツハイマー病患者のコリン作動性ニューロンを維持するために提案されたSerranoSanchezetal.,2001。これらの結果及び本発明の結果を総合すると、TRXの投与が神経変性疾患のような神経疾患におけるNGFの効果を増強し得ることを示す。神経変性疾患に対するTRXの治療的可能性を明らかにするためのさらなる研究が進行中である。実施例2網膜視細胞についてのデータ動物4週齢の雄BALB/cmicealbinoを日本SLC静岡,日本,から入手し、実験前の2~5日間本発明者のコロニールームで飼育した。日本SLCと本発明者の実験室における光強度は300luxであり、実験室のケージ内の光強度は20-40luxであった。すべてのマウスを12時間8:00A.M.から8:00P.M.の明/暗サイクルにおいて、日本SLC及び本発明者のコロニールームで維持した。光照射4週齢のマウスを実験前24時間暗所に置いた。瞳孔を1塩酸シクロペントレート点眼剤参天製薬で拡張した。麻酔していないマウスを8,000luxの発散する冷白色蛍光松下電器産業に2時間反射インテリアreflectiveinteriorを備えたケージ中でさらした。すべての光照射は午前10時に開始した。光照射中の温度は25±1.5°Cに維持した。照射中、両目が.同程度に照射を受けるように特別の配慮をした。網膜組織切片の調製ペントバルビタールによる腹腔内注射により深い麻酔を誘導後、マウスをリン酸緩衝生理食塩水PBSpH,7.4を用いて左心室を灌流して固定前に血液を洗い流した。次いで、PBS中0.25グルタルアルデヒドを含む新たに調製した4パラホルムアルデヒドで灌流した。次いで、目を取り除いた。すべての組織を既述のものと同じ固定剤で12時間4°Cでパラフィン中に埋入して固定し、視神経円板を含む全網膜を有する1μmの矢状切片に切断した。7-0絹縫合糸を目の側頭側のランドマークとしておいた。組織切片をスライドガラス上に集め、30分間キシレン及び分量を変えた一連のアルコールで処理し、切片のパラフィンを除去した。形態計測視神経円板を含む網膜パラフィン切片1μmをヘマトキシリン-エオジンH-Eで染色し、各切片の4つの位置のデジタル化カラー画像をPDMCleデジタル画像システムオリンパスを用いて得た。2つの画像を視神経円板上部100~800μmの上部網膜から、及び2つを視神経円板下部100~800μmの下部網膜から得た。各画像のヘマトキシリン陽性の光受容体細胞核の数をカウントし、ワン-ウェイone-wayANOVA、次いでBonfferoni/Dunnposthocテストにより比較した。TdT-介在dUTPニック末端標識TUNELTUNELを、insituアポトーシス検出キット宝酒造を用い、1-μmパラフィン切片上で行った。3’,3’-ジアミノベンゼンDako,Carpinteria,CAを発色剤として使用した。TUNEL-陽性核の数を上記のヘマトキシリン陽性細胞カウントについて使用されたのと同様な方法によりカウントした。抗体ウサギ抗マウスTRX抗体ポリクローナルを既報のように調製した19。マウス及びヒトTRXの免疫組織化学マウスTRXの免疫組織化学分析のために、本発明者はイムノペルオキシダーゼ法19を使用した。簡潔に述べると、内因性ペルオキシダーゼ活性を0.6H2O2で不活性化した。一次抗体又はコントロール正常ウサギ血清を加え、4°Cで終夜インキュベートした。ビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンBiomeda,FosterCity,CAを二次抗体として使用した。アビジン-ビオチン増幅Biomedaを行い、次いで基質である0.13’,3’-diaminobenzidineDakoでインキュベートした。マウスTRXのウェスタンブロット網膜サンプル調製法及びウェスタンブロット法は、既報のように行った15。簡潔に述べると、ペントバルビタールの腹腔内注射により深い麻酔に誘導後、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水PBSpH,7.4を用いてマウスの左心室を灌流して固定前に血液を洗い流し、次いで目を除去した。角膜及びレンズを目から取り除き、網膜の内層網膜神経neuralretinaを顕微鏡下にアイカップから分離した。氷冷PBSでの灌流後の目において、光受容体細胞層と網膜色素上皮細胞層の間の接着は弱くなり、それらは容易に分離された。網膜神経neuralretina除去後のアイカップは、網膜色素上皮細胞フラクションとして分析した。従って、このフラクションは脈絡膜及び強膜を含んでいた。等量の網膜タンパク質5μgprotein/laneを12ドデシル硫酸ナトリウムSDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、次いで電気泳動的にポリビニリデンジフルオライドPVDF膜Millipore,Bedford,MAに移した。ブロッキング後、膜を最初の抗体とインキュベートし、次いでペルオキシダーゼ連結第二抗体とインキュベートした。化学ルミネセンスをECLウェスタンブロット検出キットAmershamPharmaciaBiotech,Buckinghamshire,UKで検出した。組換えチオレドキシンrTRXの硝子体内注入5μgのrTRXまたはミュータントrTRXTRXC32S/C35S20又は3μlの0.9NaClを光照射の2時間前に硝子体内注入した。rTRXを10-μlマイクロインジェクションシリンジを備えた30-G微細使い捨て針Hamilton,Reno,NVを用いて右目の側頭縁から硝子体内注入した。チロシンリン酸化タンパク質の検出チロシンリン酸化タンパク質はECLチロシンリン酸化検出システムRPN2220/1,AmershamPharmaciaBiotechを用いて検出した。製造業者の推奨に従い、網膜神経neuralretinaのタンパク質サンプルを調製し、12SDS-ポリアクリルアミドゲル10μgタンパク質/レーン上で電気泳動し、次いで電気泳動的にPVDF膜に移した。ブロッキング後、膜をペルオキシダーゼ連結抗ホスホチロシン抗体PY-20,AmershamPharmaciaBiotechとインキュベートし、次いで化学ルミネセンスをECLウェスタンブロット検出キットで検出した。酸化タンパク質の検出酸化タンパク質は、酸化タンパク質検出キットOxyBlot,Intergen,Purchase,NYを用いて既報のように検出した17。OxyBlotはカルボニル基の感受性免疫検出試薬を提供する。製造業者のプロトコールに従い、網膜神経の2,4-ジニトロフェニルDNP-ヒドラゾン誘導体化タンパク質サンプルを調製し、12SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動5μgタンパク質/レーンで分離し、次いでPVDF膜に移した。ブロッキング後、膜をタンパク質のDNP部分に特異的な一次抗体とインキュベートした。タンパク質バンドをマウスTRXに関するウェスタンブロットと同じ方法で検出した。DNAラダーヌクレオソーム間DNA切断をQuickApoptoticDNAladderDetectionKitMBL,名古屋,日本を用いて検出した。製造業者のプロトコールに従い、網膜DNAを抽出し、1アガロースゲルにロードして電気泳動した。ゲルをエチジウムブロミドで染色し、DNAバンドを紫外線トランスルミネーターで可視化した。統計的分析全ての統計的分析は、StatViewソフトウェア、バージョン5.0SAS,Cary,NC.を用いるマッキントッシュのパーソナルコンピュータ上で行った。結果網膜における内因性TRXの発現網膜損傷の重篤度を決定するために、網膜切片中のトータル及びTUNEL-陽性光受容体核図7を光照射の前、直後、光照射後12,24,48及び96時間でカウントした。光照射されていないマウスの光受容体細胞数と比較して平均±SD;248.5±11.4細胞/100μm、該数は光照射の24時間後182.0±10.7,P<0.05及びその後178.3±18.3細胞/100μm,P<0.01及び50.0±9.8細胞/100μm,P<0.01、各々48時間及び96時間に有意に減少した。TUNEL-陽性核は光照射の12時間後に観察され平均±SD;8.7±2.2、そして光照射の96時間後まで維持された44.2±6.9,34.5±2.4,及び38.0±11.7各々24,48,及び96時間において。.TRXは様々な酸化ストレスに応答してアップレギュレーションされるので、本発明者は免疫組織化学図8A及びウェスタンブロット図8B、Cによる光酸化ストレスに網膜が応答する間のTRX発現を分析した。光照射の直後、TRXの核標識が網膜後極の核内層及び核外層において観察された;標識は虹彩直後の網膜周辺においては有意ではない。核内層中のTRX標識は光照射の24時間後及びそれ以降に消失した。一方、核外層の標識は96時間まで維持された。光照射の24時間後、強力なTRX標識が後極の網膜色素上皮RPEで観察され、それは光照射後96時間まで維持された。標識は分析された時間経過を通じ、周辺網膜のRPEにおいて有意ではなかった。TRXのウェスタンブロットの結果は、TRXのアップレギュレーションが網膜神経及びRPEフラクションにおいて光照射の12時間後及び24時間後で示された図8B及びC。光照射の12時間後及び24時間後で、光照射前の網膜神経及びRPEフラクションの両方においてクマッシーブルー染色されたゲル中の顕著なバンドの変化はなかったデータは示さない。rTRX注射マウスの網膜サンプルにおける酸化及びチロシンリン酸化されたタンパク質の検出本発明者は、rTRX,ビヒクル又はミュータントrTRXを硝子体内のキャビティに光照射前に注入したマウスの光照射後の酸化ストレスを評価するために、タンパク質の酸化及びチロシンリン酸化を分析した。ビヒクル又はミュータントrTRXマウスにおいて、網膜神経中の酸化されたタンパク質量は光照射直後に増大した図9A。ビヒクル又はミュータントrTRX処理マウスと比較して、酸化されたタンパク質の量は、rTRX-処理マウスで減少した。光を照射しないマウス由来の網膜標本では、チロシンリン酸化された2本の強い強度のバンド及び3本の弱いバンドが検出された図9B。光照射の直後、強い強度の2つのバンドのうちの1つが増強され、弱い強度の追加の1つのバンドがビヒクル又はミュータントrTRX処理マウスで検出された。ビヒクル又はミュータントrTRX処理マウスと比較して、これらのバンドの増強はrTRX-処理マウスでより顕著ではなかった。光酸化ストレスに対するrTRXの細胞保護効果本発明者は、次いで網膜損傷に対するrTRX投与の効果を調べた。rTRX,ビヒクルまたはミュータントrTRXのいずれかを硝子体内のキャビティに光照射前に注入し、生存する光受容体細胞核をこれらの目の間で比較図10A,B。光照射の96時間後、光受容体細胞核の数は.ビヒクルP<0.001またはミュータントrTRX-処理の目P<0.001よりもrTRX-処理の目で有意に高かった。ヌクレオソーム間のDNAラダーはrTRX-,ビヒクル-またはミュータントrTRX-処理の目由来の網膜サンプルで評価した。光照射の36時間後、DNAラダーはビヒクル-及びミュータントrTRX-処理マウス由来の網膜神経サンプルでは検出されたが、rTRX-処理マウス由来の網膜神経サンプルでは検出されなかったデータは示さない。光照射の96時間後、DNAラダーはビヒクル及びミュータントrTRX-処理マウス由来の網膜神経サンプルで検出された。これに対し、rTRX-処理マウス由来の網膜神経サンプルでは減少した図10C。考察光照射は光受容体核の有意な損失の原因となる図7。TUNEL-陽性光受容体細胞核図7及びDNAラダー形成図10Cは光照射後の網膜で観察されるので、本発明者の現在のデータはアポトーシスが光受容体細胞の細胞死の主要な経路であり、このことは以前の文献10と一致する。免疫組織化学法によると、TRXは網膜神経及びRPEの両方において、光照射後にアップレギュレートされ、虹彩のごく近傍の網膜周辺peripheralretinaではアップレギュレートされなかった図8A。ウェスタンブロッティングにおいて、TRXは網膜神経及びRPEフラクションの両方においてアップレギュレートされた図8B及び8C。これらを合わせると、本発明の結果はTRXが光誘導性の内因性分子であり、TRXが光による網膜神経の再生において重要な役割を果たしていることを示す。タンパク質酸化はフリーラジカル産生により生じ、srcファミリーキナーゼ、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ及びマイトージェン活性化蛋白質キナーゼを含むチロシンキナーゼが酸化ストレスにより活性化される12,22,23。本研究は、酸化及びチロシンリン酸化タンパク質の両方の光照射後の網膜神経における増強がrTRX-処理マウスで減少するが,ミュータントrTRX-処理マウスでは減少せず図9A,B,このことはrTRXの硝子体内投与が網膜における光酸化ストレスによる網膜神経の損傷を減少し、その保存された活性部位におけるシステイン残基が光酸化ストレスの減少に重要な役割を担うことを示唆する。ビヒクル処理されたマウスと比較すると、光受容体細胞核及びDNAラダー形成の減少は、rTRX-処理マウスにおいて有意に除外され、一方、その効果はミュータントTRX-処理マウスで消失した図10。この結果は、TRXが網膜光障害において抗アポトーシス効果を有し、その保存活性部位におけるシステイン残基がこの細胞保護に重要な役割を担うことを示唆する。以前の研究は、外因性rTRXの虚血/再灌流障害の肺16、網膜18及び血管内皮障害24に対する細胞保護効果を示唆する。外因性rTRXが網膜光受容体のダメージを改善するメカニズムは知られていない細胞外空間及び細胞膜における光酸化により誘導される活性酸素種はTRX依存性ペルオキシダーゼ25又は一重項酸素又はヒドロキシラジカルに対するTRXの直接消去作用26により減少される可能性がある。他の可能性は外因性TRXが細胞膜に結合し、細胞内空間に取り込まれることである。以前に、アスコルビン酸27、ジメチルチオウレア28,29及びWR-779138の様な抗酸化剤に対する細胞保護効果が示された。本発明の結果は、網膜光障害に対する抗酸化剤の役割をさらに強調するものである。さらに、チオレドキシンはレドックスレギュレーター、転写因子の調節機能及びストレスシグナリングキナーゼとしての作用を発揮し得12,13、これらの作用メカニズムは網膜光ストレスに対するチオレドキシンの細胞保護効果に重要であるかもしれない。過剰な光はヒトの加齢に関係する黄斑変性及びおそらく網膜色素変性のいくつかの形態1,2の進行及び重篤度を増強し得る。眼科のプラクティスにおいて使用される顕微鏡の操作に由来する広いスペクトル光のハザードは光黄斑症の原因となり得る3,4。本発明は外因性TRX投与により網膜光障害保護の可能性を実証した。さらに本発明は、内因性TRXの誘導が網膜光障害に対する増大した耐性と関連することを示唆する。本発明者は、プロスタグランジンE130,31及びゲラニルゲラニルアセトン32が細胞又は組織において効果的に内因性TRXを誘導することを示した。これらのTRX誘導剤を用いたTRX増強は、ヒトの光酸化ストレス関連網膜疾患の保護のための有用な治療的戦略になり得る実施例2に関するReferences1.CruickshanksKJ,KleinR,KleinBE.Sunlightandage-relatedmaculardegeneration.TheBeaverDamEyeStudy.ArchOphthalmol.1993;1114:514-518.2.CideciyanAV,HoodDC,HuangY,etal.Diseasesequencefrommutantrhodopsinalleletorodandconephotoreceptordegenerationinman.ProcNatlAcadSciUSA.1998;9512:7103-7108.3.ByrnesGA,ChangB,LooseI,MillerSA,BensonWE.Prospectiveincidenceofphoticmaculopathyaftercataractsurgery.AmJOphthalmol.1995;1192:231-232.4.MincklerD.Retinallightdamageandeyesurgery.Ophthalmology.1995;10212:1741-2.5.WiegandRD,GiustoNM,RappLM,AndersonRE.Evidenceforrodoutersegmentlipidperoxidationfollowingconstantilluminationoftheratretina.InvestOphthalmolVisSci.1983;2410:1433-1435.6.PennJS,NaashMI,AndersonRE.Effectoflighthistoryonretinalantioxidantsandlightdamagesusceptibilityintherat.ExpEyeRes.1987;446:779-788.7.OrganisciakDT,WangHM,XieA,ReevesDS,DonosoLA.Intense-lightmediatedchangesinratrodoutersegmentlipidsandproteins.ProgClinBiolRes.1989;314:493-512.8.RemeCE,BraschlerUF,RobertsJ,DillonJ.Lightdamageintheratretina:effectofaradioprotectiveagentWR-77913onacuterodoutersegmentdiskdisruptions.PhotochemPhotobiol.1991;541:137-142.9.DeLaPazMA,ZhangJ,FridovichI.Antioxidantenzymesofthehumanretina:effectofageonenzymeactivityofmaculaandperiphery.CurrEyeRes.1996;153:273-278.10.HafeziF,SteinbachJP,MartiA,etal.Theabsenceofc-fospreventslight-inducedapoptoticcelldeathofphotoreceptorsinretinaldegenerationinvivo.NatMed.1997;33:346-349.11.HolmgrenA.Thioredoxin.AnnuRevBiochem.1985;54:237-271.12.SaitohM,NishitohH,FujiiM,etal.Mammalianthioredoxinisadirectinhibitorofapoptosissignal-regulatingkinaseASK1.EmboJ.1998;179:2596-2606.13.HirotaK,MurataM,SachiY,etal.Distinctrolesofthioredoxininthecytoplasmandinthenucleus.Atwo-stepmechanismofredoxregulationoftranscriptionfactorNF-kappaB.JBiolChem.1999;27439:27891-27897.14.NakamuraH,NakamuraK,YodoiJ.Redoxregulationofcellularactivation.AnnuRevImmunol.1997;15:351-369.15.OhiraA,HondaO,GaunttCD,etal.OxidativestressinducesadultTcellleukemiaderivedfactor/thioredoxinintheratretina.LabInvest.1994;702:279-285.16.OkuboK,KosakaS,IsowaN,etal.Ameliorationofischemia-reperfusioninjurybyhumanthioredoxininrabbitlung.JThoracCardiovascSurg.1997;1131:1-9.17.TakagiY,MitsuiA,NishiyamaA,etal.Overexpressionofthioredoxinintransgenicmiceattenuatesfocalischemicbraindamage.ProcNatlAcadSciUSA.1999;967:4131-4136.18.ShibukiH,KataiN,KuroiwaS,KurokawaT,YodoiJ,YoshimuraN.ProtectiveeffectofadultT-cellleukemia-derivedfactoronretinalischemia-reperfusioninjuryintherat.InvestOphthalmolVisSci.1998;398:1470-1477.19.TakagiY,GonY,TodakaT,etal.Expressionofthioredoxinisenhancedinatheroscleroticplaquesandduringneointimaformationinratarteries.LabInvest.1998;788:957-966.20.HirotaK,MatsuiM,IwataS,NishiyamaA,MoriK,YodoiJ.AP-1transcriptionalactivityisregulatedbyadirectassociationbetweenthioredoxinandRef-1.ProcNatlAcadSciUSA.1997;948:3633-3638.21.OliverCN,Starke-ReedPE,StadtmanER,LiuGJ,CarneyJM,FloydRA.Oxidativedamagetobrainproteins,lossofglutaminesynthetaseactivity,andproductionoffreeradicalsduringischemia/reperfusion-inducedinjurytogerbilbrain.ProcNatlAcadSciUSA.1990;8713:5144-5147.22.NakamuraK,HoriT,SatoN,SugieK,KawakamiT,YodoiJ.Redoxregulationofasrcfamilyproteintyrosinekinasep56lckinTcells.Oncogene.1993;811:3133-3139.23.NakamuraK,HoriT,YodoiJ.Alternativebindingofp56lckandphosphatidylinositol3-kinaseinTcellsbysulfhydryloxidation:implicationofaberrantsignalingduetooxidativestressinTlymphocytes.MolImmunol.1996;3310:855-865.24.NakamuraH,MatsudaM,FurukeK,etal.AdultTcellleukemia-derivedfactor/humanthioredoxinprotectsendothelialF-2cellinjurycausedbyactivatedneutrophilsorhydrogenperoxide[publishederratumappearsinImmunolLett1994Oct;423:213].ImmunolLett.1994;421-2:75-80.25.ChaeHZ,ChungSJ,RheeSG.Thioredoxin-dependentperoxidereductasefromyeast.JBiolChem.1994;26944:27670-27678.26.DasKC,DasCK.Thioredoxin,asingletoxygenquencherandhydroxylredicalscavenger:redoxindependentfunctions.BiochemBiophysResCommun.2000;2772:443-447.27.OrganisciakDT,WangHM,LiZY,etal.Theprotectiveeffectofascorbateinretinallightdamageofrats.InvestOphthalmolVisSci1985;2611:1580-1588.28.LamS,TsoMO,GurneDH.Ameliorationofretinalphoticinjuryinalbinoratsbydimethylthiourea.ArchOphthalmol1990;10812:1751-1757.29.OrganisciakDT,DarrowRM,JiangYI,etal.Protectionbydimethylthioureaagainstretinallightdamageinrats.InvestOphthalmolVisSci1992;335:1599-1609.30.YamamotoM,OhiraA,HondaO,etal.AnalysisoflocalizationofadultT-cellleukemia-derivedfactorinthetransientischemicratretinaaftertreatmentwithOP-1206alpha-CD,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01図16B、12h及び24h。野生型マウスにおいて、強い染色が光曝露24時間後で維持された図16A、左パネル。一方、trx-tgマウスの外顆粒層の染色は光曝露24時間後に減少した図16A、右パネル。主要なDNA塩基改変産物である8OhdGはヒドロキシラジカル、一重項酸素、または光動力作用のいずれかにより誘導され、酸化的ストレス誘発DNA損傷の確立したマーカーであるToyokuniS.etal.,Lab.Invest.,761997365-374。従って、この結果は、過剰発現したTRXが光酸化ストレスにより生じる視細胞のDNA損傷を防止することを示す。網膜電図記録法ERGは、視細胞により生じる作用電位a-波及びMullerグリア細胞と相互作用する内顆粒層の二次ニューロンにより生じる作用電位b-波の記録である。従って、a-およびb-波の振幅はこれらの最初の2つの網膜ニューロンの機能的状態を反映する。網膜機能に関する過剰発現したTRXでの効果をテストするために、本発明者は、両方のマウス系統間でa-波及びb-波を比較した。フラッシュERGはPE-3000Tomey,Nagoyaを用いて記録した。金のコンタクトレンズ電極直径3mm、1.5-mmベースカーブ、京都コンタクトレンズを左目上に置き、同一の参照電極を口内に、外側電極を左脚パッド上に置いた。光曝露前、a-波およびb-波の振幅はこれらの系統間で異ならなかった図17,-2h。光曝露後、a-波およびb-波の振幅は、6時間各々、P<0.01及びP<0.05及び12時間各々、P<0.01及びP<0.05で、野生型マウスと比較してtrx-tgマウスで有意に高かった図17,6h及び12h。従って、この結果は、過剰発現したTRXが光損傷を受けた網膜神経を再生することを示す。参考文献AhnS,OliveM,AggarwalS,KrylovD,GintyDD,VinsonC1998Adominant-negativeinhibitorofCREBrevealsthatitisageneralmediatorofstimulus-dependenttranscriptionofc-fos.MolCellBiol18:967-977.BoussifO,Lezoualc’hF,ZantaMA,MergnyMD,SchermanD,DemeneixB,BehrJP1995Aversatilevectorforgeneandoligonucleotidetransferintocellsincultureandinvivo:polyethylenimine.ProcNatlAcadSciUSA92:7297-7301.ChenRH,SarneckiC,BlenisJ1992Nuclearlocalizationandregulationoferk-andrsk-encodedproteinkinases.MolCellBiol12:915-927.ChiariniLB,FreitasFG,Petrs-SilvaH,LindenR2000Evidencethatthebifunctionalredoxfactor/APendonucleaseRef-1isananti-apoptoticproteinassociatedwithdifferentiationinthedevelopingretina.CellDeathDiffer7:272-281.ConnorB,DragunowM1998Theroleofneuronalgrowthfactorsinneurodegenerativedisordersofthehumanbrain.BrainResRev27:1-39.EmaM,HirotaK,MimuraJ,AbeH,YodoiJ,SogawaK,PoellingerL,Fujii-KuriyamaY1999MolecularmechanismsoftranscriptionactivationbyHLFandHIF1alphainresponsetohypoxia:theirstabilizationandredoxsignal-inducedinteractionwithCBP/p300.EMBOJ18:1905-1914.EndohM,KunishitaT,TabiraT1993Thioredoxinfromactivatedmacrophagesasatrophicfactorforcentralcholinergicneuronsinvitro.BiochemBiophysResCommun192:760-765.GintyDD,BonniA,GreenbergME1994NervegrowthfactoractivatesaRas-dependentproteinkinasethatstimulatesc-fostranscriptionviaphosphorylationofCREB.Cell77:713-725.GreeneLA,TischlerAS1976Establishmentofanoradrenergicclonallineofratadrenalpheochromocytomacellswhichrespondtonervegrowthfactor.ProcNatlAcadSciUSA73:2424-2428.HashimotoS,MatsumotoK,GonY,FuruichiS,MaruokaS,TakeshitaI,HirotaK,YodoiJ,HorieT1999Thioredoxinnegativelyregulatesp38MAPkinaseactivationandIL-6productionbytumornecrosisfactor-alpha.BiochemBiophysResCommun258:443-447.HirotaK,MatsuiM,IwataS,NishiyamaA,MoriK,YodoiJ1997AP-1transcriptionalactivityisregulatedbyadirectassociationbetweenthioredoxinandRef-1.ProcNatlAcadSciUSA94:3633-3638.HirotaK,MatsuiM,MurataM,TakashimaY,ChengFS,ItohT,FukudaK,YodoiJ2000Nucleoredoxin,glutaredoxin,andthioredoxindifferentiallyregulateNF-kappaB,AP-1,andCREBactivationinHEK293cells.BiochemBiophysResCommun274:177-182.HollowellJP,VilladiegoA,RichKM1990Sciaticnerveregenerationacrossgapswithinsiliconechambers:long-termeffectsofNGFandconsiderationofaxonalbranching.ExpNeurol110:45-51.HolmgrenA1985Thioredoxin.AnnuRevBiochem54:237-271.HoriK,KatayamaM,SatoN,IshiiK,WagaS,YodoiJ1994NeuroprotectionbyglialcellsthroughadultTcellleukemia-derivedfactor/humanthioredoxinADF/TRX.BrainRes652:304-310.ImpeyS,ObrietanK,WongST,PoserS,YanoS,WaymanG,DeloulmeJC,ChanG,StormDR1998CrosstalkbetweenERKandPKAisrequiredforCa2stimulationofCREB-dependenttranscriptionandERKnucleartranslocation.Neuron21:869-883.KamataH,TanakaC,YagisawaH,MatsudaS,GotohY,NishidaE,HirataH1996Suppressionofnervegrowthfactor-inducedneuronaldifferentiationofPC12cells.N-acetylcysteineuncouplesthesignaltransductionfromrastothemitogen-activatedproteinkinasecascade.JBiolChem271:33018-33025.KanamotoT,MotaM,TakedaK,RubinLL,MiyazonoK,IchijoH,BazenetCE2000Roleofapoptosissignal-regulatingkinaseinregulationofthec-JunN-terminalkinasepathwayandapoptosisinsympatheticneurons.MolCellBiol20:196-204.KaneDJ,SarafianTA,AntonR,HahnH,GrallaEB,ValentineJS,OrdT,BredesenDE1993Bcl-2inhibitionofneuraldeath:decreasedgenerationofreactiveoxygenspecies.Science262:1274-1277..KaplanDR,Martin-ZancaD,ParadaLF1991Tyrosinephosphorylationandtyrosinekinaseactivityofthetrkproto-oncogeneproductinducedbyNGF.Nature350:158-160.KimYC,MasutaniH,YamaguchiY,ItohK,YamamotoM,YodoiJ2001Hemin-inducedactivationofthethioredoxingenebyNrf2.Adifferentialregulationoftheantioxidantresponsiveelementbyaswitchofitsbindingfactors.JBiolChem276:18399-18406.KummerJL,RaoPK,HeidenreichKA1997Apoptosisinducedbywithdrawaloftrophicfactorsismediatedbyp38mitogen-activatedproteinkinase.JBiolChem272:20490-20494.LoDC1992Signaltransductionandregulationofneurotrophins.CurrOpinNeurobiol2:336-340.LovellMA,XieC,GabbitaSP,MarkesberyWR2000DecreasedthioredoxinandincreasedthioredoxinreductaselevelsinAlzheimer’sdiseasebrain.FreeRadicBiolMed28:418-427.MansurK,IwahashiY,Kiryu-SeoS,SuQ,NamikawaK,YodoiJ,KiyamaH1998Up-regulationofthioredoxinexpressioninmotorneuronsafternerveinjury.BrainResMolBrainRes62:86-91.MaruyamaT,KitaokaY,SachiY,NakanoinK,HirotaK,ShiozawaT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