"以下のことを含むことを特徴とする、単離された毛包から誘導多能性幹細胞iPS細胞を生成させる方法:a単離された毛包ケラチン生成細胞をフィーダー細胞の層の上で培養して、毛包ケラチン生成細胞のコロニーを生成させること;b毛包ケラチン生成細胞の前記コロニーを前記フィーダー細胞から分離して、分離されたケラチン生成細胞を生成させること;c少なくとも一種の脱分化因子をコードする核酸分子を含むウイルスに前記分離されたケラチン生成細胞を感染させて、感染されたケラチン生成細胞を生成させること;及びd前記感染されたケラチン生成細胞を、培養培地中でフィーダー細胞の層の上で、iPS細胞が形成されるまで培養し、それによりiPS細胞を生成させること。前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、単離された毛包の細胞を解離させることによって生成されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。前記コロニーは、20~30個の毛包ケラチン生成細胞を含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、前記ウイルスと2時間未満の間、接触させられることを特徴とする、請求項1~3のいずれかに記載の方法。前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、前記ウイルスと1時間未満の間、接触させられることを特徴とする、請求項1~4のいずれかに記載の方法。前記ウイルスはレンチウイルスであることを特徴とする、請求項1~5のいずれかに記載の方法。前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、三代より多く継代されていないことを特徴とする、請求項1~6のいずれかに記載の方法。前記単離された毛包ケラチン生成細胞は、二~三代継代されていることを特徴とする、請求項1~7のいずれかに記載の方法。前記解離させることは、トリプシンを使用して行われることを特徴とする、請求項2~8のいずれかに記載の方法。前記感染させることは、約200g~約1000gの遠心力での遠心分離中に行われることを特徴とする、請求項4~9のいずれかに記載の方法。前記感染させることは、25°C~37°Cの温度で行われることを特徴とする、請求項1~10のいずれかに記載の方法。前記フィーダー細胞は、3T3細胞又はマウスの胚性フィーダー細胞MEF細胞を含むことを特徴とする、請求項1~11のいずれかに記載の方法。前記核酸分子は、LoxP部位をさらにコードすることを特徴とする、請求項1~12のいずれかに記載の方法。前記iPS細胞をcreリコンビナーゼ酵素と接触させることによって工程dの後に前記核酸分子を除去することをさらに含むことを特徴とする、請求項13に記載の方法。前記少なくとも一種の脱分化因子は、OCT4,SOX2,KLF4,C-MYC,Nanog及びLin28からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1~14のいずれかに記載の方法。前記少なくとも一種の脱分化因子は、OCT4,SOX2,KLF4及びC-MYCからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1~15のいずれかに記載の方法。前記少なくとも一種の脱分化因子は、OCT4,SOX2及びKLF4であることを特徴とする、請求項1~16のいずれかに記載の方法。前記少なくとも一種の脱分化因子は、OCT4,SOX2及びC-MYCであることを特徴とする、請求項1~16のいずれかに記載の方法。前記少なくとも一種の脱分化因子は、OCT4及びSOX2であることを特徴とする、請求項1~16のいずれかに記載の方法。前記核酸分子は、配列番号1に規定される配列を含むことを特徴とする、請求項1~16のいずれかに記載の方法。前記感染されたケラチン生成細胞を培養する時間の少なくとも一部の間、前記培養培地は小分子を含むことを特徴とする、請求項1~20のいずれかに記載の方法。前記小分子は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3GSK-3阻害剤、リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、TGF-β阻害剤;マイトジェン活性化タンパク質キナーゼMAPK/ERKキナーゼ又はMEK阻害剤とGSK-3阻害剤の組み合わせ;及びL型カルシウムチャンネルアゴニストからなる群から選択されることを特徴とする、請求項21に記載の方法。前記GSK-3阻害剤は、CHIR99021を含むことを特徴とする、請求項22に記載の方法。前記リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤は、パルネートトラニルシプロミンであることを特徴とする、請求項22に記載の方法。前記分離させることは、EDTAを使用して行われることを特徴とする、請求項1~24のいずれかに記載の方法。請求項1~25のいずれかに記載の方法によって得られることを特徴とする誘導多能性幹細胞iPS細胞。請求項26に記載のiPS細胞の細胞系。組織再生における使用のための、請求項26に記載のiPS細胞。前記組織再生は、心臓組織の再生であることを特徴とする、請求項28に記載のiPS細胞。請求項26に記載のiPS細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。以下のことを含むことを特徴とする、系譜特異的な細胞を生成させる方法:a請求項1に記載の方法に従ってiPS細胞を生成させること;及びbエクスビボで前記iPS細胞を系譜特異的な細胞へと分化させ、それにより前記系譜特異的な細胞を生成させること。本発明は、体細胞からの、特に引き抜かれた毛包由来のケラチン生成細胞からの多能性幹の生成の分野に関する。さらに、本発明は、多能性幹細胞の治療的使用、及び医薬スクリーニング及び疾患モデリングにおけるそれらの使用にも関する。本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。引き抜かれた毛包は、遺伝子疾患の研究のための、及び診断目的のための簡便なサンプル材料として使用されている。また、毛包は、生物医学的研究のための上皮細胞の興味深いモデルシステムも提供するLimatら、1986。発表されているプロトコールに従った成体ヒト毛髪からのiPS細胞の生成効率は低いため、本発明者らは、かかる細胞を生成させるための新規な方法を工夫した。かかる方法は、引き抜かれた毛髪の外部毛根鞘からのケラチン生成細胞の単離、及び好適な培地中のフィーダー細胞上でのケラチン生成細胞の増殖を含む。さらに、本発明者らは、プロトコールの感染段階の前にフィーダー細胞を除去して、感染直後にそれらを再び与えることが必要であることを見出した。単離されたヒトケラチン生成細胞からのiPS細胞の成功した生成は、図1A-D及び図2A-Dに示されている。本発明者らは、いくつかのアッセイを使用して、生成された細胞の多能性を証明し図3A-B,4,5A-J,8及び9A-F、さらに、これらの細胞がエクスビボで心臓系譜に分化できることを示した図6A-E。従って、本発明の一つの側面によれば、以下のことを含むことを特徴とする、単離された毛包から誘導多能性幹細胞iPS細胞を生成させる方法が提供される:a単離された毛包ケラチン生成細胞をフィーダー細胞の層の上で培養して、毛包ケラチン生成細胞のコロニーを生成させること;b毛包ケラチン生成細胞の前記コロニーを前記フィーダー細胞から分離して、分離されたケラチン生成細胞を生成させること;c少なくとも一種の脱分化因子をコードする核酸分子を含むウイルスに前記分離されたケラチン生成細胞を感染させて、感染されたケラチン生成細胞を生成させること;及びd前記感染されたケラチン生成細胞を、培養培地中でフィーダー細胞の層の上で、iPS細胞が形成されるまで培養し、それによりiPS細胞を生成させること。本明細書で使用されるように、用語多能性細胞は、長期間例えば、一年以上にわたってインビトロで分割する能力を有する細胞であって、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の三層の胚葉の全てに由来する細胞に分化する特異的な能力を有する細胞を意味する。多能性細胞は、様々な特定の組織に特異的な別個の異なる形態学的、細胞学的又は機能的な表現型を有する全範囲の娘細胞に分化する能力を有する。対照的に、多能性細胞の子孫は、それらの分化能力を漸進的に制限されており、いくつかの細胞は結局一つの運命のみを有する。句単離された毛包は、付着した外部毛髪から除去された毛包を意味する。毛包は、内部毛根鞘IRSによって包囲された毛軸の内部部分を含む同心層を含む。IRSは、末端分化したケラチン生成細胞からなり、毛包の最外層である外部毛根鞘ORSによって取り囲まれている。句単離された毛包ケラチン生成細胞は、毛包から得られたケラチン生成細胞の集団であって、立毛筋、皮脂腺、及びアポリン汗腺において見出されるような他の毛包細胞の少なくとも一部分を欠く集団を意味する。一つの実施形態によれば、毛包ケラチン生成細胞の集団は、毛包ケラチン生成細胞の純粋な少なくとも90純粋な集団である。毛包ケラチン生成細胞は、いかなる哺乳動物、例えばヒトに由来されることができる。一つの実施形態によれば、ケラチン生成細胞は、トリプシンを含むがこれに限定されない分散剤を使用して他の毛包細胞から分離される。機械的な分散も想定される。機械的な分散とトリプシン処理の組み合わせは、単一細胞の懸濁物の生成をもたらしうる。トリプシン処理は、いかなる公知のプロトコールに従って行われることもでき、例えば、約0.1のトリプシン及び約0.02のEDTAでのインキュベーションによって行われることができるが、これに限定されない。上述の通り、単離された毛包ケラチン生成細胞は、毛包ケラチン生成細胞のコロニーの生成を可能にする条件下でフィーダー細胞上で培養される。従って、例えば、ケラチン生成細胞は、得られるケラチン生成細胞の量に依存して、6ウェルプレートの一つ、二つ、又は三つのウェル中にフィーダー細胞の層上に播種されることができる。6ウェルプレートは、当該技術分野で一般的に使用されており、標準的なマイクロプレートの外部寸法を有する。6ウェルプレート中の一つのウェルは、約9.6cm2の増殖面積、及び約2ml~約5mlの作業容積を有する。ケラチン生成細胞を培養するための想定される増殖培地は、DMEM及び/またはDMEMF12を含むが、これらに限定されない。培地は、動物血清を含んでもよいし、含まなくてもよい。一つの実施形態によれば、培地は、上皮増殖因子を含む。特定の実施形態によれば、培地は、Green培地60のDMEM,30のDMEMF-12、10のウシ胎児血清、1mMのピルビン酸ナトリウム、2mMのL-グルタミン、5μgのインスリン、0.5μg/mlのヒドロコルチゾン、0.2nMのアデニン、2nMのトリヨードチロニンT3、10ng/mlの上皮増殖因子、及び100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンである。ケラチン生成細胞の増殖を支持するために使用されるフィーダー細胞の特定の例は、増殖条件に依存し、以下のものから選択されることができるが、これらに限定されない:NIH-3T3細胞ATTCCRL-1658、J2又はJmax-3T3細胞Pellegriniら、2001参照、Pa-6細胞理研生物質源センター細胞バンク、Koyadai、日本、カタログ番号RCB1127、又はHFFATTCSCRC-1041もしくはHDFのような繊維芽細胞。所望により、細胞は、ゼラチンやコラーゲンなどの細胞非含有マトリックス上で培養されることができる。特定の実施形態によれば、単離されたケラチン生成細胞は、3T3フィーダー細胞上で培養される。使用前にフィーダー細胞を不活性化することは、一般的な慣習である。即ち、例えばフィーダー細胞を、マイトマイシンCのようなDNA合成を阻害する化学薬剤にさらして、結果として細胞分裂を防止することによってフィーダー細胞の複製を防止する。特定の実施形態では、単離されたケラチン生成細胞の培養に使用されるフィーダー細胞は、後述の材料及び方法の欄に規定されるような不活性化されたMEFフィーダー細胞を含む。別の実施形態によれば、ケラチン生成細胞は、凍結されていない即ち、新たに単離される。特定の実施形態では、レンチウイルスの感染のために最適なケラチン生成細胞の密度は、6ウェルプレートのウェル当たり約10000~60000個及び20000~40000個、好ましくは30000個の範囲から選択される細胞密度で即ち、1cm2当たり約1000~6000個及び2000~4000個、好ましくは3000個の範囲から選択される細胞密度でケラチン生成細胞を播種することによって得られる。好ましくは、ケラチン生成細胞は、感染の前に四代より多く継代されていない。より好ましくは、ケラチン生成細胞は、感染の前に三代より多く継代されていない。特定の実施形態によれば、ケラチン生成細胞は、感染の前に二~三代継代されている。約20~30個のケラチン生成細胞のコロニーが形成されると、フィーダー細胞から分離される。これは、当該技術分野で公知のいかなる方法によっても行われることができ、例えば、フィーダー細胞が可視的に分離され、ケラチン生成細胞がなおもプレートに接着しているまで、37°Cで8時間まで、約0.01~約0.02の濃度のEDTA中で細胞をインキュベートすることを含むが、これに限定されない。ケラチン生成細胞からiPS細胞を生成させるために、後述するように脱分化因子がケラチン生成細胞中で発現される。脱分化因子の例は、OCT4,SOX2,KLF4,C-MYC,Nanog及びLin28を含むが、これらに限定されない。典型的には、四つの脱分化因子が細胞中で発現される。しかし、もし毛包ケラチン生成細胞中への導入後に、形質導入された細胞が、後述するように形質導入経路及び/又はクロマチンを変化させる分子を含む培地中でインキュベートされるなら、脱分化因子の数は、減少されることができる。一つの実施形態によれば、方法は、Octファミリー又はSoxファミリーに属する少なくとも一つのポリペプチドを細胞中で発現させることによって行われる。別の実施形態によれば、方法は、一つがOctファミリーに属し、もう一つがSoxファミリーに属する少なくとも二つのポリペプチドを細胞中で発現させることによって行われる。Octファミリーに属するポリペプチドの例は、Oct3/4NM_013633、マウス及びNM_002701、ヒト、Oct1ANM_198934、マウス及びNM_002697、ヒト、Oct6NM_011141、マウス及びNM_002699、ヒトを含む。Oct3/4は、POUファミリーに属する転写因子であり、未分化細胞のマーカーとして報告されているOkamotoら、Cell60:461-72,1990。また、Oct3/4は、多能性の維持に関与することも報告されているNicholsら、Cell95:379-91,1998。SoxSRY-ボックス含有ファミリーに属するポリペプチドの例は、Sox1NM_009233、マウス及びNM_005986、ヒト、Sox3NM_009237、マウス及びNM_005634、ヒト、Sox7NM_011446、マウス及びNM_031439、ヒト、Sox15NM_009235、マウス及びNM_006942、ヒト、Sox17NM_011441、マウス及びNM_022454、ヒト及びSox18NM_009236、マウス及びNM_018419、ヒトを含み、好ましい例は、Sox2NM_011443、マウス及びNM_003106、ヒトを含む。なお別の実施形態によれば、方法は、Octファミリーに属する一つのポリペプチド、Soxファミリーに属する一つのポリペプチド、Nanog、及びlin28の四つのポリペプチドを細胞中で発現させることによって行われる。代替的に、方法は、Octファミリーに属する一つのポリペプチド、Soxファミリーに属する一つのポリペプチド、Klf-4、及びc-Mycの四つのポリペプチドを細胞中で発現させることによって行われる。本明細書中で上述した脱分化因子をケラチン生成細胞中で発現させることは、遺伝子操作によって行われることができ、例えば、発現コンストラクトを使用して行われることができる。本発明の発現ベクターを毛包ケラチン生成細胞中に導入するために、様々な方法を使用することができる。かかる方法は、例えば以下の文献に一般的に記載されている:Sambrook,J.及びRussell,D.W.1989,1992,2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,NewYork;Ausubel,R.M.ら、編1994,1989.CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley及びSons,Baltimore,Md.1989;Chang,P.L.,編1995.SomaticGeneTherapy,CRCPress,BocaRaton,Fla.;Vega,M.A.1995.GeneTargeting,CRCPress,BocaRaton,Fla.;Rodriguez,R.L.及びDenhardt,D.H.1987.Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,Butterworth-Heinemann,oston,Mass;及びGilboa,E.ら1986.Transferandexpressionofclonedgenesusingretro-viralvectors.Biotechniques46,504-512。かかる方法は、例えば、安定な又は一過的なトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、及び組換えウイルスベクターでの感染を含む。これらに加えて、陽性-陰性選択方法について、米国特許第5464764号及び第5487992号が参照される。典型的には、核酸分子は、核酸配列の発現を駆動することができるプロモーターをさらに含む。かかるプロモーターは、延長因子1Ef1αプロモーターやサイトメガロウイルスCMVプロモーターなどの構成的に活性なプロモーター、又はポリシストロン的に編成されているので、全ての転写因子遺伝子の発現を制御する誘導性プロモーターである。ウイルス感染によるケラチン生成細胞中への本発明の発現コンストラクトの導入は、リポフェクションやエレクトロポレーションなどの他の方法と比較して、形質転換及び増殖の効率の高さの点でいくつかの利点を提供する。特定の実施形態によれば、上述の脱分化因子をケラチン生成細胞中で発現させることは、例えば、レンチウイルスを使用したレトロウイルス形質導入によって行われる。ケラチン生成細胞を感染させるための想定されるカセットは、配列番号1に規定されている。他の想定されるウイルスは、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスを含む。特定の実施形態によれば、ケラチン生成細胞を感染させるためのカセットは、LOXP部位を含み、これにより、iPS細胞の生成後の導入遺伝子の除去が、後述のようにcreリコンビナーゼ酵素と共にインキュベートすることによって行われることができる。除去可能な核酸分子は、当該技術分野で公知のいかなる他の除去可能なベクターであることもできる。ウイルス組込みなしにiPS細胞を導入する他の方法も想定される。例えば、Stadtfeldら、2008、[Science322,945-949]及びOkitaら、2008、[Science322,949-953]を参照のこと。特定の実施形態によれば、ケラチン生成細胞は、再プログラミングに必要な脱分化因子をコードする遺伝子を含むポリシストロン性核酸分子を含むレンチウイルスで感染される。好ましくは、ケラチン生成細胞の再プログラミングのために必要な全ての転写因子をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む単一のポリシストロン性レンチウイルスベクターが使用される。好ましくは、感染工程は、ケラチン生成細胞及びウイルスを含む培養皿の例えば、約200~1000gの遠心力での遠心分離中に行われる。一つの実施形態によれば、遠心分離工程即ち、ケラチン生成細胞がウイルスと接触させられる時間は、2時間以下であり、好ましくは1時間以下である。この実施形態による感染の想定される温度は、約25°C~37°Cである。特定の実施形態によれば、ケラチン生成細胞は、約32°Cの温度で、約500gの遠心力で、約50分間の遠心分離を含む条件下での遠心分離中にレンチウイルスと接触させられる。感染段階の直後に、培地は、ウイルスを含まない新鮮な培地及び新鮮なフィーダー細胞に交換される。典型的には、感染前に繊維芽細胞を培養するために使用された培地と同じ培地及びフィーダー細胞がこの段階で使用されるが、他の培地も想定される。従って、例えば、感染された毛包ケラチン生成細胞は、Green培地及び3T3フィーダー細胞中で約4~7日間培養されることができる。本発明は、一回以上例えば、二回又は三回の感染を想定し、各回において感染の前にフィーダー細胞を除去して、感染後に交換する。最後の感染後、培養条件は、多能性幹細胞の培養に適合されることができる。これは、有利である。なぜなら、繊維芽細胞とは異なり、ヒトの毛包細胞は、hES細胞条件では増殖することができないからである。従って、出現するiPS細胞は全て、極めて容易に観察され、単離され、さらに拡大されることができる真の安定なiPS細胞である。従って、例えば、培地は、胚性幹細胞培地Thompsonら、1998に交換されることができ、3T3フィーダー細胞は、マウスの胚性繊維芽MEFフィーダー細胞に交換されることができる。好ましくは、ケラチン生成細胞は、感染の3~6日後に、多能性幹細胞条件に移されるべきである。多能性幹細胞培地中での培養は、iPS細胞のコロニーが観察されるまでの時間例えば、14~21日間、行われることができる。上述の通り、再プログラミングの効率、及び/又は効率的な再プログラミングのためにケラチン生成細胞中で発現されることが必要である脱分化因子の数は、例えばクロマチン修飾又はシグナル伝達経路を調節することによって減少されることができるFengら、2009。従って、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3GSK-3阻害剤、リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、TGF-β阻害剤;マイトジェン活性化タンパク質キナーゼMAPK/ERKキナーゼ又はMEK阻害剤とGSK-3阻害剤の組み合わせ;及びL型カルシウムチャンネルアゴニストが、例えば、最終感染の二日後に胚性幹細胞培地に添加されることができる。一つの実施形態によれば、これらの薬剤は、多能性幹細胞培地中に、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、少なくとも20日間添加される。特に、ヒストンメチルトランスフェラーゼは、BIX-01294,RG108及びAZAからなる群から選択される。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、VPA,TSA及びSAHAからなる群から選択される。MEK阻害剤は、PD0325901であることができる。TGF-β阻害剤は、A-83-01であることができる。L型カルシウムチャンネルアゴニストは、BayK8644であることができる。本発明によれば、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3GSK-3阻害剤及び/又はリジン特異的なデメチラーゼ阻害剤は、三つの転写因子のみの導入でケラチン生成細胞を再プログラミングすることを可能にすることが見出されている。上述のことに鑑み、特定の実施形態では、ヌクレオチド配列によってコードされる転写因子の数は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3GSK-3阻害剤及び/又はリジン特異的なデメチラーゼ阻害剤などの小分子の存在下で感染されたケラチン生成細胞を培養することによって、4個未満、即ち1,2又は3個まで減少される。特定の実施形態では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3GSK-3阻害剤は、CHIR99021であり、リジン特異的なデメチラーゼ阻害剤は、パルネートトラニルシプロミンである。特定の実施形態では、核酸配列は、OCT4,SOX2及びKLF4から選択される三つの転写因子をコードし、特に、核酸配列は、配列番号2に規定される核酸配列を有するカセットから転写される。他の実施形態では、核酸配列は、OCT4及びSOXから選択される二つの転写因子をコードする。増殖因子は、胚性幹細胞培地bFGFに添加されることができる例えば、Invitrogen,N.Y,米国;8ng/ml。上述の通り、ケラチン生成細胞を感染させるためのカセットは、LOXP部位を含み、これにより、iPS細胞の生成後の導入遺伝子の除去が、creリコンビナーゼ酵素と共にインキュベートすることによって行われることができる。かかるカセットを除去する方法は、Soldnerら、2009;Brambrinkら、2008によって与えられる。別の実施形態では、本発明は、上述の本発明の方法によって得られる誘導多能性幹細胞を提供する。本明細書で使用される用語誘導多能性幹細胞は、Oct4,Sox2,Nanog,Rex1亜鉛フィンガータンパク質42ZFP42としても知られる、TRA1-60腫瘍拒絶抗原1-60、TRA1-81腫瘍拒絶抗原1-81、及びSSEA4段階特異的な胚抗原4を含むがこれらに限定されないhES細胞の表現型に関連した多能性マーカーを発現し、インビトロ及びインピボで三つの胚葉の全てに分化することができ、多くの継代にわたって培養中で増殖することができ、正常な核型を維持することができる細胞を意味する。以下の実施例4に示されるように、四つの選択されたHFKT-iPS細胞クローンは、源のHFKT及び多能性hES細胞と比較して、ケラチン生成細胞マーカー及び多能性マーカーの発現について十分に特徴付けられていた。本発明者らは、hES細胞と比較してHFKT-iPS細胞中では、K14やP63などのケラチン生成細胞マーカーがなお高度に発現されていることを見出した。このことは、以前に記載されたように後成記憶の保持を示唆するHochedlingerら、2009;Marchettoら、2009。しかし、分析された全ての多能性マーカーは、hES細胞及びHFKT-iPS細胞において陽性であり、同様に発現されており、このことは、真の多能性iPS細胞クローンが生成されたことを示す。特に、iPS細胞クローンは、Oct4,Sox2,Nanog,Rex1,TRA1-60及びTRA1-81のような典型的なhES細胞マーカーを発現することが見出された。どの遺伝子が細胞中で特異的に発現されているのかを決定するために、マイクロアレイ分析が本発明のこの側面のiPS細胞に対して行われることができる。この方法を使用して、ヒト毛包ケラチン生成細胞から生成されたiPS細胞は、他の多能性幹細胞、胚性幹細胞ES細胞、及び皮膚から生成されたiPS細胞と比較されることができる。2倍以上アップレギュレーション又はダウンレギュレーションされている遺伝子は、有意に変化されたとみなすことができる。結果の確認は、例えばRT-PCR分析及び免疫染色を含む当該技術分野で公知のいかなる方法を使用して行うことができる。従って、ある実施態様では、本発明の誘導多能性幹細胞は、Oct4,Sox2,Nanog,Rex1,TRA1-60及びTRA1-81のような典型的なhES細胞マーカーの発現によって特徴付けられることができる。構成的に活性なプロモーターを有するレンチウイルスベクターが再プログラミングのために使用されたので、HFKT-iPS細胞における導入遺伝子の発現レベルは、対応するhES細胞と比較して高いと予想された。興味深いことに、一つのクローンKTN7におけるKlf4の高発現を除くと、調査された全てのクローンにおける再プログラミング因子の転写レベルは、hES細胞中で見出されるレベルと同様であった。以下の実施例で示される結果は、外来導入遺伝子のサイレンシングが、ヒトSTEMCCAベクターによって生成されたHFKT-iPS細胞クローン中で実際に生じることを示す。外来導入遺伝子は、iPS細胞の継代中にさらにサイレンシングされた。これらのデータは、ヒトiPS細胞は、培養時にhES細胞の遺伝子発現プロフィールと近くなる遺伝子発現プロフィールを採用していることを示す。本発明のHFKT-iPS細胞は、インビボ及びインビトロで三つの胚葉に自発的にさらに分化することができる。HFKT-iPS細胞のクローンの分化能力は、心筋細胞CMに特異的に分化するそれらの能力によって実施例5においてさらに示され、それらの分子的及び機能的特性について特性決定された。多数の筋フィラメントタンパク質の陽性免疫染色は、肉腫様構造の予備的な組織化が、他の細胞源からのhES細胞由来のCM及びiPS細胞由来のCMGermanguzら、2009;Zhangら、2009と同様にHFKTiPS細胞-CMでも発展しうることを示唆した。HFKT-iPS細胞-CMの機能性についての証拠は、多電極アレイMEAデータ取得システムによって記録される堅固な細胞外エレクトログラムによって、及び全細胞電流クランプによって記録される活動電位によって与えられた。さらに、CMに典型的な興奮-収縮カップリング、及びβ-アドレナリン作用性刺激への応答は、細胞の[Ca2]i過渡現象及び収縮を測定することによって示された。従って、本発明者らは、機能的なCMに分化するHFKT-iPS細胞の能力、及び治療及び研究目的のための細胞の代替的な源として役立つためのHFKT-iPS細胞の能力を初めて証明した。特定の実施形態では、本発明の誘導多能性幹細胞は、三つの胚葉の全ての誘導体を含む胚様体又は奇形腫に分化することができる。胚様体は、様々な細胞タイプに分化し、制限された範囲まで胚発生を反復する幹細胞の集合体である。奇形腫は、独立した胚細胞の発生によって生じた皮膚、毛髪、及び筋肉などの様々なタイプの組織からなる腫瘍である。本明細書中で使用される句三つの胚葉の全ての誘導体は、三つの胚葉即ち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれかに由来する即ち、発生した、分化中の又は分化した細胞を意味する。本発明によれば、誘導多能性幹細胞は、機能的な心筋細胞、神経組織、内皮、上皮、脂肪細胞、又は筋肉組織、及び他の系譜特異的な細胞に分化できることが見出された。本発明は、かかる系譜特異的な細胞の生成について当該技術分野で公知のいかなるエクスビボ分化プロトコールの使用をも想定するということは理解されるだろう。特定の実施形態では、本発明の誘導多能性幹細胞から由来する胚様体は、機能的な心筋細胞、神経組織、内皮、上皮、脂肪細胞、筋肉組織骨格筋、平滑筋、及び心筋を含む、内皮先祖細胞、間葉先祖細胞、骨、軟骨、腱、及び靭帯組織、特に細胞外マトリックス生産細胞に分化できる。従って、本発明の方法は、上記のことに鑑み、組織再生、遺伝子治療、細胞治療、医薬スクリーニング、及び疾患モデリングのために使用されることができる幹細胞を提供する。例えば、細胞は、移植用の器官及び組織の生成のために使用されることができ、糖尿病、パーキンソン病のような神経変性疾患、肝臓病、心臓病、整形疾患、及び自己免疫疾患についての見込みのある代替治療を提供する。代替的に、細胞は、遺伝子置換治療を必要とする組織に機能的な遺伝子を提供するために使用されることができる。一つの側面において、本発明は、医薬的に許容可能なキャリアと、本明細書中に規定される方法によって生成される誘導多能性幹細胞とを含む医薬組成物を提供する。上述のように、本発明の誘導多能性幹細胞は、いかなる損傷した組織をも再生するために使用されることができる。特に、本発明は、本明細書中に規定される方法によって生成される誘導多能性幹細胞を機能的な心筋細胞に分化させ、それにより機能的な心筋細胞を得ることを含む、機能的な心筋細胞の生成方法;及び本発明の方法に従って得られた機能的な心筋細胞を損傷された組織と置換し、機能的な心筋細胞が機能的な心臓組織を形成し、それにより損傷された心臓組織を修復することを含む、損傷された心臓組織を修復する方法に向けられている。例えば、方法は、損傷された組織の領域中への直接注入、又は全身注入によって心筋細胞を再増大させ、細胞に心臓組織を形成させるために使用されることができる。本明細書中で使用される用語約は、±10を示す。用語含む/備えるcomprises、comprising、includes、including、有するhaving、およびそれらの同根語は、含むが、それらに限定されないincludingbutnotlimitedtoことを意味する。用語からなるconsistingofは、含み、それらに限定されるincludingandlimitedtoことを意味する。表現から本質的になるconsistingessentiallyofは、さらなる成分、工程および/または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および/または部分を含み得ることを意味する。本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、1~6などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲例えば、1~3、1~4、1~5、2~4、2~6、3~6など、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値例えば、1、2、3、4、5および6を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字分数または整数を含むことが意味される。第1の示された数字および第2の示された数字の範囲である/の間の範囲という表現、および、第1の示された数字から第2の示された数まで及ぶ/までの範囲という表現は、交換可能に使用され、第1の示された数字と、第2の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。本明細書中で使用される用語方法methodは、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語治療する/処置するには、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えDNAの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい:MolecularCloning:AlaboratoryManualSambrookら、1989;CurrentProtocolsinMolecularBiologyI~III巻、Ausubel,R.M.編1994;Ausubelら、CurrentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileyandSons、米国メリーランド州バルチモア1989;PerbalAPracticalGuidetoMolecularCloning、JohnWileySons、米国ニューヨーク1988;Watsonら、RecombinantDNAScientificAmericanBooks、米国ニューヨーク;Birrenら編GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries1~4巻、ColdSpringHarborLaboratoryPress、米国ニューヨーク1998;米国特許の第4666828号、同第4683202号、同第4801531号、同第5192659号および同第5272057号に記載される方法;CellBiology:ALaboratoryHandbookI~III巻、Cellis,J.E.編1994;CurrentProtocolsinImmunologyI~III巻、Coligan,J.E.編1994;Stitesら編BasicandClinicalImmunology第8版、AppletonLange、米国コネティカット州ノーウォーク1994;MishellとShiigi編SelectedMethodsinCellularImmunology、W.H.FreemanandCo.、米国ニューヨーク1980;利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば:米国特許の第3791932号、同第3839153号、同第3850752号、同第3850578号、同第3853987号、同第3867517号、同第3879262号、同第3901654号、同第3935074号、同第3984533号、同第3996345号、同第4034074号、同第4098876号、同第4879219号、同第5011771号および同第5281521号;OligonucleotideSynthesisGait,M.J.編1984;NucleicAcidHybridizationHames,B.D.およびHigginsS.J.編1985;TranscriptionandTranslationHames,B.D.およびHigginsS.J.編1984;AnimalCellCultureFreshney,R.I.編1986;ImmobilizedCellsandEnzymesIRLPress1986;APracticalGuidetoMolecularCloningPerbal,B.1984およびMethodsinEnzymology1~317巻、AcademicPress;PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications、AcademicPress、米国カリフォルニア州サンディエゴ1990;Marshakら、StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManualCSHLPress1996;これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。材料及び方法引き抜かれた毛包からのケラチン生成細胞の誘導ヒトの引き抜かれた毛髪は、RambamHealthCareCampus,Haifa,イスラエルでのヒト対象に対する実験についてのヘルシンキ委員会による許可3611に従って、同意書にサインした健康な志願者から得られた。毛包ケラチン生成細胞HFKTは、以前に記載されたLimatら、1986ようにして、ただし微細な改変を加えて、誘導された。目に見える外部毛根鞘を有する10本の毛髪が、頭皮から引き抜かれた。毛髪の束は、切断され、毛包は、25mMのHEPES、1mMのL-グルタミン酸、及び400U/mlのペニシリン、400μg/mlのストレプトマイシンPSを含むDMEM培地で10cmペトリ皿中で37°Cで4~18時間浸漬された。毛包は、PBSで洗浄され、0.1のトリプシン及び0.02のEDTAPBSで希釈されたで被覆され、37°Cで30分間インキュベートされた。単一細胞懸濁培養物は、10FBSを補充されたDMEMと共に毛包を激しくピペットで攪拌することによって得られた。解離されたケラチン生成細胞は、200gで10分間遠心分離され、Green培地60のDMEM、30のDMEMF-12、10のウシ胎児血清、1mMのピルビン酸ナトリウム、2mMのL-グルタミン、5μgのインスリン、0.5μm/mlのヒドロコルチゾン、0.2nMのアデニン、2nMのトリヨードチロニンT3、10ng/mlの上皮増殖因子、及び100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンと共に、不活性化された3T3フィーダー層2×104個の3T3細胞/cm2上の6ウェルプレートの三つのウェルに播種された。分割のため、3T3細胞は、0.02のEDTAと共に37°Cで5分間インキュベートした後に除去された。培養物は、PBSで洗浄され、次に、分離されたケラチン生成細胞は、PBS中の0.1のトリプシン及び0.02のEDTAと共に37°Cで10~15分間インキュベートすることによって単一細胞に解離された。細胞:ヒトの包皮繊維芽細胞HFFは、ATCCPCS-201-010から得られた。293T細胞CRL-11268、H9.2hES細胞が使用されたAmitら、2000;Amitら、2002。繊維芽細胞HDF及びHFKTは、二人の健康な個人から、皮膚打ち抜き生検及び引き抜かれた毛髪からそれぞれ得られた。ベクター:HFF感染用ベクター:ゼオマイシン抵抗性-PBabe-ecoAddGeneID:10687及びPMXOCT4/Sox2/KLF4/c-MycAddgeneID17217,17218,17219,17220。HFKT及びHDF感染用ベクター:1PMXOCT4/Sox2/KLF4/c-MycとpUMVC及びpCMV-VSVGAddGeneID8449及び8454;2pMSCV/Oct4/Sox2/Klf4/c-Mycげっ歯類の幹細胞ウイルス、AddgeneID:20072,20073,20074,20076;3STEMCCAカセット配列番号1を有するヒト単一ポリシストロニックレンチウイルスベクター。レンチウイルスは、以前に記述されたMostoslavskyら、2006ようにして、293Tパッケージング細胞中の五つのプラスミドトランスフェクション系を使用して生産された。ヒト包皮繊維芽細胞HFFからのiPS細胞の生成:HFF細胞は、pBabe-Ecoプラスミドで感染され、7日後に、400ng/mlのゾエシンInvitrogenで選択された。iPS細胞の生成のため、フェニックスEco細胞は、以下の四種類のレトロウイルスベクターのうちの一つでトランスフェクトされた:pMX-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc。トランスフェクションの2日後、100000個のHFF-eco細胞は、以前に記述されたTakahashiら、2007ようにして感染された。感染の2日後、HFF-eco細胞は、様々な希釈度で分割され、MEFフィーダー層又はフィブロネクチンで被覆されたプレート上で培養された。感染の5日後、培地は、hES細胞培地又はMEFならし培地で置換された。感染の約14日後、小さなES細胞に似たコロニーが出現した。これらのコロニーは、後で機械的に単離され、さらなる分析のためにhES細胞条件でMEF上で培養された。再プログラミング効率アッセイは、他のところで記述されたLowryら、2008ようにしてTra1-60の生体染色を使用して行われた。ヒトの皮膚繊維芽HDF細胞からのiPS細胞の生成:HDF細胞は、以前に記述されたParkら、2008ようにして由来された。細胞は、以下の4種類の因子Oct4,Sox2,Klf4及びc-Mycを含むSTEMCCAカセットを有するレンチウイルスベクターで、又は山中の再プログラミング遺伝子セットOct4,Sox2,Klf4,c-Mycを発現する四つの別個のレトロウイルスpMXベクターで感染された。iPS細胞の生成のため、STEMCCAベクターは、HFKT由来のiPS細胞について上述されたようにして293T細胞中にトランスフェクトされた。pMXベクターは、Phoenix-Ampho細胞中にトランスフェクトされ、70000個のHDF細胞が、HFF細胞について上述したようにして感染された。HFKTからのiPS細胞の生成:1日目に、30000個のHFKTは、6ウェルプレートの一つのウェル中にGreen培地を補充された不活性化3T3フィーダー層20000個の細胞/cm2上に播種されたLimat及びNoser、1986。2日目に、ウイルスは以下のようにして生産された:ヒト化されたタイプの単一レンチウイルスベクターSTEMCCAカセット配列番号1は、五つのプラスミド:STEM-CCA,Gag-Pol,REV,TAT,VSVGを、20:1:1:1:2の割合で使用して293T細胞をトランスフェクションすることによって生成されたMostoslavskyら、2006。プラスミドの全量は15μgDNAであった。トランスフェクションは、jetPEI商標試薬Polyplusトランスフェクション商標、フランスによって行われた。pMSCVレトロウイルスは、jetPEI商標試薬を使用してベクターでトランスフェクトされたPheonix-Ampho細胞において生成された。四つの導入遺伝子の全てからのウイルスを含む培地上澄みが回収され、1:1:1:1pMSCV/Oct4/Sox2/Klf4/c-Mycの比で混合された。レトルウイルスベクターpMX-Oct4/Sox2/Klf4/c-Mycは、以前に記述されたParkら、2008ようにして生成された。培地はトランスフェクションの24時間後3日目に、新鮮なものと置換された。トランスフェクションの48時間後4日目、蓄積されたウイルス粒子は、0.45μmフィルターを通して濾過され、2μg/mlのポリブレンを添加され、HFKTの感染のために使用された。感染の直後に、3T3フィーダー細胞は、0.02のEDTAを使用して除去された。感染は、500gで32°Cで50分間の遠心分離中に行われた。その後、培地は、新鮮なGreen培地と置換され、新鮮な不活性化3T3フィーダー細胞が添加された。感染は、翌日5日目も繰り返された。感染の5日後8日目、感染されたケラチン生成細胞は、PBS中の0.1のトリプシン及び0.02のEDTABiologicalIndustries,BeitHaemek,イスラエルによって37°Cで10分間分離され、200gで10分間遠心分離され、6ウェルプレートの六つのウェル中に、Green培地と共に、不活性化マウス胚性繊維芽細胞MEFフィーダー上に播種された。翌日、培地は、8mg/mlのbFGFInvitrogen,N.Y,米国を含むhES細胞培地Thomsonら、1998で置換された。培地は2日目ごとに置換された。最終的に、感染されたケラチン生成細胞の播種の21~25日後に、hES細胞様コロニーが出現し、さらに拡大されて分析されることができた。iPS細胞の分化:iPS細胞のEBへの分化は、以前に記述されたItskovitz-Eldorら、2000ようにして行われた。簡単に述べると、ヒトのiPS細胞は、0.2のIV型コラゲナーゼWorthingtonBiochemical,Lakewood,NJ,米国によって分離され、それらの凝集を可能にするために懸濁された。生じたEBは、80のDMEMGibco-BRL,GrandIsland,NY,米国、20のFBSHyclone,Cramlington,イギリス、1mmol/lのL-グルタミン、及び1の非必須アミノ酸両方ともGibco-BRL,GrandIsland,NY,米国中で増殖された。自発的な分化のため、EBは、懸濁液中で14日間培養され、次に、DNaseを補充されたPBS中の1mg/mlのコラゲナーゼBRoche,Mannheim,ドイツを使用して37°Cで10分間解離された。解離したEBは、0.1のゼラチンで被覆されたカバーガラスSigma-AldrichSt.Louis,MO,米国上でさらに7日間培養され、次に免疫染色アッセイが行われた。心臓への分化のためには、EBは、懸濁液中で7日間培養され、次に、0.1のゼラチンで被覆されたプレート上で培養され、その間に自発的に収縮するEBが観察された。心臓への分化の効率を評価するために、培養されたEBは、顕微鏡で監視され、培養の2~3週間後に、培養されたEBの総数に対する収縮しているEBの数が計数された。奇形腫の生成のためには、2x106個のiPS細胞は、レシピエントSCIDマウスの横腹中に注入された。腫瘍は、組織学的分析のために6~8週間後に単離され、4のパラホルムアルデヒド中で固定され、パラフィン中に埋入され、断片化された。パラフィン断片は、キシロール/キシレンによって脱パラフィン化され、次にプロパノールで再水和され、蒸留水で洗浄された。断片は、標準プロトコールに従ってヘマトキシリン及びエオシンで染色された。RNA分析:RNAは、Aurum商標TotalRNAMiniKitBIO-RAD,Hercules,CA,米国を使用して単離され、iScript商標cDNA合成キットBIO-RADによって、製造者の指示に従って逆転写された。PCRは、DreamTaq商標GreenMasterMixFermentas,Ontario,カナダによって行われた。定量的リアルタイムQRTPCR分析は、三連で行われ、内部内因性GAPDH遺伝子発現によって正規化された。反応は、PowerSYBR登録商標GreenMasterMixAppliedBiosystems,Warrington,イギリスを使用してABIPrism7000AppliedBiosystems中で行われた。分析は、配列検出ソフトウェアV.1.2;AppliedBiosystemsにおいて相対的定量化RQ研究を使用して行われた。RNA分析のために使用されたプライマーは、表1に示される。タンパク質分析:免疫蛍光:細胞は、4のパラホルムアルデヒドで15分間固定され、1のTritonX-100Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,米国中に浸漬され、次に、PBS中で10分間希釈された。一次抗体は、1のTritonを含むPBS中で希釈され、4°Cで一晩、又は室温で1時間インキュベートされた。使用された抗体は、表2に示される。ロバ抗ウサギCye3ChemiconInternational及びロバ抗マウス/ヤギAlexafluor488Invitrogen,Carlsbad,CA,米国コンジュゲート化抗体は、二次抗体として使用された1:100。細胞は、核染色のためにDAPIBoehringer,Mannheim,ドイツでも染色され1:1000、ZeissAxiovert200蛍光顕微鏡で、又はZeissLSM510Metaレーザー走査共焦点システムCarlZeiss,Munich,ドイツで検査された。蛍光活性化細胞ソーティングFACS分析:iPS細胞及びhES細胞は、0.2のIVコラゲナーゼを使用して分離され、0.25のトリプシン及び0.05のEDTAを使用して単一細胞に解離された。HFKTは、0.02のEDTAでの3T3フィーダー細胞の除去後にPBS中の0.1のトリプシン及び0.02のEDTAを使用して分離された。細胞は、4のパラホルムアルデヒドを使用して15分間固定された。細胞は、CellQuestソフトウェアBDBiosciences,SanJose,CA,米国を使用してFACScanシステムでフローサイトメトリーによって監視された。FACSのために使用された抗体は、表3に示される。[Ca2]i過渡現象及び収縮の測定:[Ca2]i過渡現象及び収縮は、以前に記述されたDolnikovら、2006;Sedanら、2008ようにして、それぞれfura-2蛍光Biotium,Hayward,CA,米国及びビデオエッジ検出器を使用して、EBの小さな解離した収縮領域において測定された。微小電極アレイMEA記録:単極エレクトログラムは、以前に記述されたMeiryら、2001;Reisnerら、2009ようにして、微小電極アレイMEAMultiChannelSystems,Reutlingen,ドイツ上に配置されたHFKT-iPS細胞由来の心筋細胞HFKT-iPS細胞-CMから記録された。K-14の細胞染色のために、細胞は、1のサポニンSigma-Aldrich及び0.5のBSAを含むPBS中に10分間浸漬された。細胞は、1のサポニン及び0.5のBSA両方ともSigma-Aldrichを含むPBSに希釈された抗K-14で染色された。ロバ抗マウスAlexafluor488Invitrogenコンジュゲート化抗体は、K-14染色のために0.5のBSA又は1のサポニンを含むPBS中に希釈されて1:100、二次抗体として使用された。全細胞電流クランプ記録:電流クランプ研究のためにHFKT-iPSC-CMの解離の後に生成した自発的に打ち砕かれた小細胞クラスター又は単離された細胞は、フィブロネクチンで被覆されたカバーガラスの上で培養されて研究された。パッチピペット溶液は、120mMのKCl、1mMのMgCl2、3mMのMg-ATP、10mMのHEPES、10mMのEGTAからなっていたpH7.3。浴溶液は、140mMのNaCl、5.4mMのKCl、1.8mMのCaCl2、1mMのMgCl2、10mMのHEPES、10mMのグルコースからなっていたpH7.4。全ての材料は、Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,米国から購入された。活動電位は、電流クランプモードを使用して記録された。Axopatch200B,Digidata1322、及びpClamp10Moleculardevices,Sunnyvale,CA,米国が、データの増幅、取得、及び分析のために使用された。短いタンデム繰り返しの分析及び核型分析:短いタンデム繰り返しSTRの分析は、様々な染色体から得られた配列を使用して行われ、ABIPRISM3130遺伝子分析器によって、製造者AppliedBiosystemsWarrington,イギリスの指示に従って分析された。STRプライマーは、表4に示されている。核型分析は、以前に記述されたAmitら、2003ようにして行われた。実施例1引き抜かれた毛髪のORSからのケラチン生成細胞の導出及びそれらの特性決定毛髪からiPS細胞を生成させるため、本発明者らは、引き抜かれた毛包からのiPS細胞の生成についてのAasenらのプロトコールAasenら、2008に従った。引き抜かれた毛髪は、MEF-ならし培地を補充されたMatrigel被覆皿上で少なくとも5日間、細胞が外部毛根鞘ORSの外側に増殖するまで培養されたが、生存しかつ増殖している細胞は不十分な数しか単離できなかった。本発明者らは、毛髪を引き抜き、目に見える毛球及び無傷のORS図1Aを有する少なくとも10本の単一の毛髪を選択し、次に、それらを、ペニシリン、ストレプトマイシン、HEPES及びL-グルタミンを補充されたDMEMと共に24時間インキュベートし、次に、トリプシン-EDTAを使用して酵素的にORSから細胞を除去することによって、ケラチン生成細胞の単一細胞懸濁物を得た図1B。これらの単離されたケラチン生成細胞は、不活性化3T3フィーダー細胞上に播種され図1C,D、四代の継代数までさらに培養されることができたLimat及びNoser、1986。それらの身元を証明するため、毛包由来の細胞は、ケラチン生成細胞マーカーK14及びP63について分析された。分析は、HaCat細胞ヒトのケラチン生成細胞系及びhES細胞と比較したQRT-PCRによって行われた。結果は、HaCatケラチン生成細胞におけるK14及びP63転写物の発現レベルと同様のK14及びP63転写物の高い発現レベルを示した。対照的に、両転写物は、hES細胞中では、ほとんど発現されなかった図1E。次に、再プログラミング因子の発現レベルが調査された。Klf14の発現は、hES細胞中よりHFKT及びHaCat細胞中の方が10倍高かった。一方、c-Mycは、三つの細胞タイプの全てにおいて同様に発現された。Oct4は、HFKT中では発現されず、Soxは、hES細胞と比較してわずかに高く発現された図1F。実施例2再プログラミング手順の最適化効率的なHFKT再プログラミングプロトコールを開発するため、本発明者らは、様々なウイルスベクター及び増殖条件を使用して、ヒト包皮繊維芽細胞HFF及びヒト皮膚繊維芽細胞HDFなどの一般的な標的細胞の再プログラミングを最適化した。分析されたウイルスベクターは、四つKlf4,Oct3/4,Sox2及びc-Myc又は三つKlf4,Oct3/4及びSox2の再プログラミング因子を有するpMXレトロウイルスベクターTakahashiら、2007;Nakagawaら、2008、AasenらAasenら、2008によって改変されたpMSCVレトロウイルスベクターセット、及び単一レンチウイルスSTEMCCAベクターのヒト化バージョン配列番号1であった。HFF細胞は、HFF-EcotropicレセプターHFF-Eco安定系の確立後に最も効率的に再プログラミングされた。再プログラミングのために、これらの細胞は、四つ又は三つの再プログラミング因子を有するpMXレトロウイルスベクターでさらに感染された。感染後、様々な増殖条件が調査された表5。感染後に細胞を低密度で培養することが、非iPS細胞の過剰増殖これは、真のiPS細胞のコロニーをしばしば被覆してしまうを回避するために重要であることが見出された。さらに、再プログラミング効率は、hES細胞培地を補充されたMEFフィーダー層上で培養された細胞と比較して、フィーダー非含有条件で細胞を培養することによって10~50倍も増大された。HFF再プログラミング効率は、以前に記述されたNakagawaら、2008;Soldnerら、2009ように、三つの因子のみが導入されたときに有意に減少したが、細胞がMEFフィーダー層上ではなくフィーダー非含有条件で培養されたときに10倍増大した表5-HFF。三つの異なるウイルスベクターは、以前に記述されたHuangfuら、2008bように好適なパッケージングベクターを使用してHDF及びHFKTの再プログラミングについて調査された。HDF及びHFKTの両方の細胞タイプがSTEMCCAベクターで効率的に再プログラミングされたが、pMX又はpMSCVベクターセットを使用すると、iPS細胞のコロニーは生成されなかったことが見出された表5。単離直後に感染された新鮮な細胞は、凍結されていた細胞よりずっと効率的に再プログラミングされることが見出された。フィーダー非含有条件でHDF及びHFKTをインキュベートすると、HFF細胞とは異なり、再プログラミング効率は改善されなかった。このことは、効率的な再プログラミングプロトコールは、細胞タイプごとに専用に最適化されるべきであるということを示す。感染後の細胞密度は、繊維芽細胞についてのみ重要である。なぜなら、過度に密集した培養物は、迅速に増殖する非iPS細胞の過剰増殖に導き、これらが真のiPS細胞のコロニーを被覆してしまうからである。しかし、HFKTは、極めて感受性の細胞であり、hES細胞条件では増殖しないので、非iPS細胞の増殖は再プログラミング培養では生じない。むしろ、真のiPS細胞のみが、STEMCCAベクターでの再プログラミング後に出現する。この観察は、再プログラミングのための細胞源としてのHFKTの有意な利点を示す。以下の条件がHFKTのiPS細胞への再プログラミング効率を改善することが見出された表6。1.HFKTを感染後、Green培地中で4~7日間培養し、次にそれをMEFフィーダー層及びhES細胞条件に移す。MEFhES細胞条件でのHFKTの培養は、それらの増殖を大きく阻害する。感染された細胞をそれらの最適培地Green培地中で数日間増殖させることにより、それらの感染後増殖が促進されることが見出された。4~7日後のhES細胞条件へのそれらの移動は、それらの増殖を直ちに阻害するが、これらの条件では一層多くのiPS細胞が生成される。2.8~10μMのCHIR99021StemGentグリコーゲンシンターゼキナーゼ3GSK-3の特異的阻害剤の添加。3.パルネートParnateSigma;トラニルシプロミンとも称されるリジン特異的デメチラーゼの阻害剤との組み合わせでのCHIR99021の添加。4.CHIR99021単独、又はCHIR99021とパルネートとの組み合わせの添加後、本発明者らは、c-Mycを有さないiPS細胞を生成することができ、及び極めて低効率で、myc及びKlf4iPS細胞の二つの因子を有さないiPS細胞を生成することができた。感染はそれぞれ、三つの再プログラミング因子Oct4,Klf4及びSox2のみを含み、c-Mycを含まない類似のポリシストロン性ベクターチェリーベクターによって、又は二つの再プログラミング因子Oct4及びSox2のみを含む類似のポリシストロン性ベクターによって行われた。CHIR99021は、マウス胚の再プログラミング効率を増大させること、及び二つの因子Klf4及びOct4のみによってヒト一次皮膚由来ケラチン生成細胞の再プログラミングを可能にすることが示されているLiW.ら、Stemcells200927:2992-3000。実施例3HFKTからの多能性幹細胞の誘導、及びHFKT親細胞及びhES細胞と比較したそれらの身元HFKTの再プログラミングのための手順は、図2Aに示されている。KTN及びKTRケラチン生成細胞は、36才及び41才の二人の健康な女性それぞれN及びRと称されるの引き抜かれた毛髪から由来された。STEMCCAベクターで感染された30000個のケラチン生成細胞から開始して、約5~9個のiPS細胞のコロニーが五つの独立した実験において単離された。重要なことに、インキュベーションの約30日後に出現した全てのコロニーは、hES細胞の形態学的特徴と類似の形態学的特徴を示す真のiPS細胞であった図2B。全てのiPS細胞のコロニーは、機械的に取り上げられ、さらなる拡大及び分析のためにMEFフィーダー層に移された。それらの核型は、分析され、二つのクローン以外は正常であることが見出された。二つのクローンのうち、一つはX染色体を欠失しており45,X0、もう一つは、不安定な核型を有していたデータは示さず。親KTR/KTN細胞と比較したHFKT-iPS細胞の特異的な特性決定は、K14タンパク質の分析によって行われた。K14染色は、HFKTにおける強い細胞質発現を示し、これはHFKT-iPS細胞では減少した図2C。FACS分析により、77のHFKTがK14タンパク質を発現したが、それらのiPS細胞誘導体のうち50だけがK14陽性であることが示された。hES細胞におけるK14タンパク質のレベルは30であった図2D。Klf4及びc-Mycタンパク質も、免疫染色によって分析され、HFKTドナー細胞において高度に発現されること、及びそれらの発現レベルは、再プログラミング後も及びhES細胞において大部分が維持されることが見出された図2C。次に、他のES細胞マーカーがFACS分析によって分析された。25のHFKTドナー細胞のみがCD90を発現したが、SSEA4タンパク質は、これらの細胞では発現されず、HFKT-iPS細胞はCD9091及びSSEA473を陽性発現したことが見出された。これらのマーカーは、hES細胞でも同様に発現され、CD90について83、SSEA4について68であった。CD29の発現は、多能性後に減少したが、HFKTは、このマーカーについて95陽性であり、それらから誘導されたiPS細胞及びhES細胞は、顕著に減少したCD29のシグナルを示した。70の細胞は陽性であったが、シグナル強度は約7倍低かった幾何平均パラメーターは、HFKTについて34.3であり、iPS細胞及びhES細胞について5であった。これらの結果は、ヒトの包皮ケラチン生成細胞及びそれらのiPS細胞誘導体について得られたデータと一致するAasenら、2008。DNAフィンガプリント分析短いタンデム繰り返し-STRにより、HFKT-iPS細胞のクローンは、二つの異なる源KTN及びKTR細胞から由来すること、及びiPS細胞のクローンの遺伝子プロフィールは、それらのドナー細胞のものと同一であることが確認された表7。STR分析は、iPS細胞のクローンKTR12,KTR13及びそれらのHFKT源細胞KTR、並びにiPS細胞のクローンKTN3,KTN7、及びそれらのHFKT源細胞KTNについて行われた。陰性コントロールとして、非関連の個体について生成された非関連DNAが使用された。実施例4HFKT-iPS細胞クローンの多能性詳細な特性決定を得るため、以下の四つのHFKT-iPS細胞のクローンが選択された:KTN細胞源から由来するKTN3及びKTN7、並びにKTR細胞源から由来するKTR12及びKTR13。これらのクローンは、40代の継代数まで維持され、形態学的特徴及び核型の安定性においてhES細胞に類似していた。iPS細胞のクローンは、免疫染色図3A及びRT-PCR分析図4によって証明されるように、Oct4,Sox2,Nanog,Rex1,TRA1-60及びTRA1-81などの典型的なhES細胞マーカーを発現することが見出された。四つのHFKT-iPS細胞クローン全ての再プログラミング因子の転写レベルは、三つの異なる継代つまり、5-7,12-17及び22-25でQRT-PCRによって分析され、それらのhES細胞対応物と比較された図3B。結果は、Oct4及びSox2の転写レベルがhES細胞のものと同様であることを示した。iPS細胞の後の継代での減少したレベルは例外として、c-Mycの転写レベルは、KTN7クローンを除いてiPS細胞及びhES細胞とほぼ同様であった。KTN7クローンは、hES細胞より2~3倍高いレベルでc-Mycを発現した。Klf4のmRNAは、二つのiPS細胞のクローン即ち、KTN7及びKTR13においてかなり高く、初期継代5-6においてそれぞれhES細胞のレベルより約27倍及び約4倍高かった。これらのレベルは、クローンKTR13の後期継代15-24では減少し、通常のhES細胞のレベルに到達した。クローンKTN7では、Klf4の転写レベルは、継代23で減少したが、なおもhES細胞より約20倍高かった図3B。総合的に、これらの結果は、外来導入遺伝子は、HFKT-iPS細胞のクローンの大部分においてサイレンシングされており、それらの発現レベルは、通常のhES細胞のレベルに到達するということを示唆する。細胞の分化能力を評価するため、四つのHFKT-iPS細胞のクローンの分化が、胚様体Ebの生成によってインビトロで誘導され図5A-F、奇形腫アッセイを使用してインビボで誘導された図5G-I。全てのクローンは、三層の胚葉の全てに分化した。EB免疫染色は、平滑筋アクチンSMAの中胚葉マーカー及び内皮マーカーCD31図5B,C、外胚葉チューブリンβ3及びネスチン図5D、及び内胚葉α-フィトタンパク質AFP及びグルカゴン図5E,Fの発現を示した。SCIDマウスにおけるiPS細胞のインビボ分化は、実質的な奇形腫の形成を誘導した。この奇形腫は、三層の胚葉の全てからの組織を含んでいた:神経組織図5F、内皮及び上皮図5H、及び脂肪細胞及び筋肉組織図5I。EBへのHFKT-iPS細胞の分化後の再プログラミング因子の発現レベルも調査された。全体的に、iPS細胞のクローンから由来するEB中での導入遺伝子のレベルの減少は、hES細胞から由来するEBの場合と同様に1~2倍であり時にはhES細胞から由来するEBより大きいことさえあった。しかし、クローンKTN7は、分化後に、H9.2-EBと比較して10倍も高いKlf4の発現を維持した図5J。実施例5HFKT-iPS細胞の心臓分化HFKT-iPS細胞の分化能力をさらに評価するため、本発明者らは、機能的な心筋細胞CMに向かうそれらの系譜特異的な分化を調査した。四つのクローン全てからの未分化のiPS細胞は、懸濁液中で自発的にEBに分化し、次にゼラチンで被覆されたプレート上に配置された。EBの自発的な収縮は、クローンKTN3,KTR12及びKTR13からの培養されたEB全ての3~10において観察された表8。特に、クローンKTN7からの収縮EBは、継代数39まで見出されなかった。微小切開収縮領域の免疫蛍光染色図6Aにより、細胞が心臓トロポニンI、α-肉腫アクチン、及びミオシン重鎖MHCを発現すること、及び最も重要なことに、それらは横紋の領域を示すことが証明された。心臓トロポニン高度に心臓特異的な筋繊維タンパク質の蛍光シグナルと、他のタンパク質のそれぞれの蛍光シグナルとの間に重複が見出された。HFKT-iPS細胞-CMの機能は、MEAデータ取得システムによって記録される堅固な細胞外エレクトログラムによって示され図6B、QRS及びT様の複合体の存在を証明する。また、これらの細胞の機能能力の初期評価を与えるために、本発明者らは、解離された自発的収縮領域からの全細胞電流クランプ記録を行った。これらの代表的な記録図6Cは、自発的に生成された活動電位の存在を証明し、これは顕著なペースメーカーとしての潜在能力である。細胞内Ca2[Ca2]i取り扱い機構及び機械的機能の基本特性を評価するため、[Ca2]i過渡現象及び収縮はそれぞれ、fura-2蛍光及びビデオエッジ検出器によってHFKT-iPS細胞-CMの小さな収縮クラスターから記録された。0.6Hzで刺激されたHFKT-iPS細胞-CMからの[Ca2]i過渡現象及び収縮の代表的なトレースそれぞれ図6D,6Eは、hES細胞-CMからのもの、及びHFKT-iPS細胞-CMからのものGermanguzら、2009と同様であり、これらのHFKT-iPS細胞-CMが興奮-収縮結合機構の心臓様特徴を示すことを示唆する。さらに、β-アドレナリン作動シグナル伝達経路の機能の支持において、イソプロテレノールは、[Ca2]i過渡現象及び収縮の振幅の増大によって証明されるように、2~3分以内に顕著な濃度依存的な陽性の変力性効果を生じた図6D-E。総合的に、これらの結果は、機能的なCMに分化するHFKT-iPS細胞の能力を証明する。実施例6lox-P含有STEMCCAレンチウイルスベクターのCreによって媒介される除去HFKT-iPS細胞は、再プログラミング導入遺伝子に隣接するlox-P部位を含む除去可能なレンチウイルスベクターによって生成されたので、本発明者らは、ヒトSTEMCCAカセットのCre-リコンビナーゼ除去を行った。除去手順は、再プログラミング因子を有するSTEMCCAカセット全体を含むレンチウイルスベクターの大部分を効率的に削除することができる。この目的のため、Puro抵抗性Creリコビナーゼプラスミドが二つのHFKT-iPS細胞クローンKTN7及びKTN13中に一過的に導入された。ピューロマイシン選択の後、小さなiPS細胞のコロニーが出現し、これらのコロニーは、採取され、レンチウイルスベクターの存在を分析するためにさらに拡大された。レンチウイルスベクターのWPRE配列に隣接するプライマーを使用したRT-PCRは、二つのHFKT-iPS細胞クローンCre-KTN73及びCre-KTR134中の陽性バンドの存在を示さなかった。このことは、STEMCCAカセットが細胞から成功裏に除去され図7A、組み込まれたレンチウイルスベクターのうちの小さな残余しか残っていないことを示唆する。除去されたiPS細胞のクローンは、除去後、30代の継代数まで培養され、正常な核型を有しており、形態学的に及びhES細胞に典型的なマーカーの発現においてhES細胞に類似していた図8。それらの多能性は、インビトロでのEBへの自発的な分化、及び三層の胚葉全ての検出によって証明された図9A-F。QRT-PCR分析により、未分化のCreによって媒介されるHFKT-iPS細胞のクローンにおける再プログラミング因子の転写レベルは、未分化のhES細胞によって発現されるものと同様であることが証明された図7B。これはクローンKTN7におけるKlf4の転写レベルによって良く証明され、このレベルは、非除去クローンにおいて20倍高く、除去後にhES細胞のレベルに減少したクローンCre-KTN73において。さらに、c-Mycの転写レベルは、元のKTN7及びKTR13クローンにおいてhES細胞のレベルと比較して2~3倍高く、除去後にhES細胞のレベル以下に減少した。これらの結果は、望ましくない導入遺伝子発現の除去を示す。重要なことに、本発明者らは、KTN7クローンは継代数39まで収縮EBを生成することができなかったが、その除去された誘導体クローンCre-KTN73は、比較的高い効率約13、図7C及び表9で収縮EBに自発的に分化することができたことを示した。これらのデータは、組み込まれた再プログラミング遺伝子の除去が、特定の系譜への好適な分化のために極めて望ましいということを証明する。"