染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を確立する方法であって、前記染色体および別の染色体をカバーする複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を2つ以上のサンプルから得ること、前記断片を前記配列情報に基づいて染色体に割り当てること、各サンプルについて、前記配列情報に基づいて前記染色体のカバー深度とGC含量とを計算すること、ならびに、前記染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を決定することを含む方法。前記ポリヌクレオチド断片が約10bp~約1000bpの範囲の長さである、請求項1に記載の方法。前記ポリヌクレオチド断片が約15bp~約500bpの範囲の長さである、請求項2に記載の方法。前記ポリヌクレオチド断片が約20bp~約200bpの範囲の長さである、請求項3に記載の方法。前記ポリヌクレオチド断片が約25bp~約100bpの範囲の長さである、請求項4に記載の方法。前記ポリヌクレオチド断片が約35bpの長さである、請求項5に記載の方法。前記割り当てが、前記断片の配列を参照ヒトゲノム配列と比較することによるものである、請求項1~6のいずれかに記載の方法。前記参照ヒトゲノム配列がhg18またはhg19である、請求項7に記載の方法。2つ以上の染色体に割り当てられる断片は無視するものとする、請求項7に記載の方法。いずれの染色体にも割り当てられない断片は無視するものとする、請求項7に記載の方法。染色体のカバー深度は、前記染色体に割り当てられる断片の数と、前記染色体の参照固有リードの数との間の比である、請求項1~10のいずれかに記載の方法。前記カバー深度が正規化される、請求項11に記載の方法。前記正規化が、別の染色体のカバー度に対して計算される、請求項12に記載の方法。前記正規化が、他のすべての常染色体のカバー度に対して計算される、請求項12に記載の方法。前記正規化が、他のすべての染色体のカバー度に対して計算される、請求項12に記載の方法。染色体のGC含量は、前記染色体に割り当てられるすべての断片の平均GC含量である、請求項1~15のいずれかに記載の方法。少なくとも2個、5個、10個、20個、50個、100個、200個、500個、または1000個のサンプルが使用される、請求項1~16のいずれかに記載の方法。前記染色体が1番染色体、2番染色体、...、22番染色体、X染色体、またはY染色体である、請求項1~17のいずれかに記載の方法。以下の式の関係が成立し、式中、はサンプルi、染色体jのカバー深度と対応するGC含量との間の関係についての関数を表し、εijはサンプルi、染色体jの残差を表す、請求項12に記載の方法。カバー深度とGC含量との間の関係が局所多項回帰により計算される、請求項1~19のいずれかに記載の方法。前記関係は強くない線形関係である、請求項20に記載の方法。前記関係がloessアルゴリズムによって決定される、請求項21に記載の方法。以下の式に従って、あてはめられたカバー深度を計算することをさらに含む、請求項19~22のいずれかに記載の方法。以下の式に従って標準変動を計算することをさらに含み、ここでnsは参照サンプルの数を表す、請求項23に記載の方法。以下の式に従ってスチューデントのt統計量を計算することをさらに含む、請求項24に記載の方法。前記サンプルが妊娠女性被検者由来のものである、請求項1~25のいずれかに記載の方法。前記サンプルが男性被検者由来のものである、請求項1~25のいずれかに記載の方法。前記サンプルが末梢血液サンプルである、請求項1~27のいずれかに記載の方法。前記配列情報が並列ゲノム配列決定法により得られる、請求項1~28のいずれかに記載の方法。胎児の遺伝的異常を決定する方法であって、aサンプルから複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得る工程、b前記断片を、前記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、c前記配列情報に基づいて、染色体のカバー深度およびGC含量を計算する工程、d前記染色体の前記GC含量、および、前記染色体のカバー深度とGC含量との間の確立された関係を使用して、前記染色体のあてはめられたカバー深度を計算する工程、ならびに、e前記あてはめられたカバー深度を、前記染色体の前記カバー深度と比較する工程であって、それらの間の差異は胎児の遺伝的異常を示す工程を含む方法。カバー深度とGC含量との間の前記確立された関係が、請求項1~29のいずれかに記載の方法により得られる、請求項30に記載の方法。前記遺伝的異常が染色体異常である、請求項30または31のいずれかに記載の方法。前記遺伝的異常が異数性である、請求項32に記載の方法。f胎児の性別を決定することをさらに含む、請求項30~33のいずれかに記載の方法。胎児の性別が以下の式に従って決定され、式中、およびは、それぞれX染色体およびY染色体の正規化された相対カバー度である、請求項34に記載の方法。g胎児分割合を推定することをさらに含む、請求項34または35のいずれかに記載の方法。胎児分割合が以下の式に従って計算され、ここで、は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、は、男性被検者のY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表す、請求項36に記載の方法。胎児分割合が以下の式に従って計算され、ここで、は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、は、男性被検者からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表す、請求項36に記載の方法。胎児分割合が以下の式に従って計算され、ここで、は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、は、男性被検者からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、は、男性被検者のY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表す、請求項36に記載の方法。前記あてはめられたカバー深度と前記染色体のカバー深度との比較は、統計学的仮説検定により実行される、請求項30~39のいずれかに記載の方法。1つの仮説は胎児が正倍数体であることH0であり、もう1つの仮説は胎児が異数体であることH1である、請求項40に記載の方法。両方の仮説についてスチューデントのt統計量が計算される、請求項41に記載の方法。H0およびH1についてのスチューデントのt統計量が、それぞれ以下の式およびに従って計算され、ここでは胎児分割合である、請求項42に記載の方法。t1およびt2の対数尤度比は以下の式に従って計算され、ここで、Lijは対数尤度比であり、degreeはt分布の自由度を表し、Dは二倍性を表し、Tはトリソミーを表し、は、t分布自由度が与えられた場合の条件付き確率密度を表す、請求項43に記載の方法。前記胎児異数性が、13トリソミー、18トリソミー、および21トリソミーからなる群から選択される常染色体障害である、請求項33に記載の方法。前記胎児異数性が、XO、XXX、XXY、およびXYYからなる群から選択される性染色体障害である、請求項33に記載の方法。胎児の性別が女性であり、スチューデントのt統計量が以下の式に従って計算され、ここで、は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度である、請求項46に記載の方法。は胎児がXXXまたはXOであることを示す、請求項47に記載の方法。は胎児がXXXまたはXOであることを示す、請求項47に記載の方法。胎児の性別が男性であり、スチューデントのt統計量が以下の式に従って計算され、ここで、は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度である、請求項46に記載の方法。は胎児がXXYまたはXYYであり得ることを示す、請求項50に記載の方法。は胎児がXXYまたはXYYであることを示す、請求項50に記載の方法。胎児の遺伝的異常を決定する方法であって、a1つの染色体ともう1つの染色体をカバーする複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を、2つ以上の正常サンプルから得る工程、b前記断片を、前記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、c前記正常サンプルからの前記配列情報に基づいて、前記染色体のカバー深度およびGC含量を計算する工程、d前記染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を決定する工程、e生体試料から複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得る工程、f前記断片を、前記生体試料からの前記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、g前記生体試料からの前記配列情報に基づいて、前記染色体のカバー深度とGC含量とを計算する工程、h前記染色体の前記GC含量、および、前記染色体のカバー深度とGC含量との間の前記関係を使用して、前記染色体のあてはめられたカバー深度を計算する工程、ならびに、i前記あてはめられたカバー深度を前記染色体の前記カバー深度と比較する工程であって、それらの間の差異は胎児の遺伝的異常を示す工程を含む方法。胎児の遺伝的異常の出生前診断を実行するための複数の指示を含むコンピュータ可読媒体であって、前記指示は、aサンプルからの複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を受け取る工程、b前記ポリヌクレオチド断片を、前記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、c前記配列情報に基づいて、染色体のカバー深度およびGC含量を計算する工程、d前記染色体の前記GC含量、および、前記染色体のカバー深度とGC含量との間の確立された関係を使用して、前記染色体のあてはめられたカバー深度を計算する工程、ならびに、e前記あてはめられたカバー深度を、前記染色体の前記カバー深度と比較する工程であって、それらの間の差異は遺伝的異常を示す工程を含むコンピュータ可読媒体。工程eにおける前記比較は統計学的仮説検定により実行される、請求項54に記載のコンピュータ可読媒体。1つの仮説は胎児が正常であることH0であり、もう1つの仮説は胎児が異常であることH1である、請求項55に記載のコンピュータ可読媒体。両方の仮説についてスチューデントのt統計量が計算される、請求項56に記載のコンピュータ可読媒体。カバー深度とGC含量との間の前記確立された関係が、請求項1~29のいずれかに記載の方法により得られる、請求項54~57のいずれかに記載のコンピュータ可読媒体。f胎児の性別を決定する工程をさらに含む、請求項54~58のいずれかに記載のコンピュータ可読媒体。g胎児分割合を推定する工程をさらに含む、請求項59に記載のコンピュータ可読媒体。胎児の遺伝的異常が染色体異常である、請求項54~60のいずれかに記載のコンピュータ可読媒体。胎児の遺伝的異常が異数性である、請求項61に記載のコンピュータ可読媒体。前記異数性が、13トリソミー、18トリソミー、および21トリソミーからなる群から選択される常染色体障害である、請求項62に記載のコンピュータ可読媒体。前記異数性が、XO、XXX、XXY、およびXYYからなる群から選択される性染色体障害である、請求項62に記載のコンピュータ可読媒体。胎児の遺伝的異常を決定するためのシステムであって、その方法が、aサンプルからの複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得るための手段、およびb請求項54~64のいずれかに記載のコンピュータ可読媒体を含むシステム。c妊娠女性被検者から得られた生体試料をさらに含み、ここで、前記生体試料は複数のポリヌクレオチド断片を含む、請求項65に記載のシステム。配列情報を得るための前記手段が並列ゲノム配列決定手段である、請求項65または66のいずれかに記載のシステム。本発明は、母体の生体試料由来のポリヌクレオチド断片を大規模配列決定することにより胎児の遺伝的異常を非侵襲的に検出するための方法に関する。さらに、染色体のカバー深度と対応するGC含量との間の関係に基づいて、染色体のGC含量の違いに起因するGCバイアスを配列決定結果から除去する方法も提供される。従って、各サンプルの染色体のカバー深度をそのポリヌクレオチド断片のGC含量に対してあてはめる局所重み付き多項回帰により、GC含量を用いたスチューデントのt計算において使用される参照パラメータを計算上調節する方法が、本明細書において提供される。統計学的仮説検定を使用した統計学的解析により胎児の遺伝的異常を決定する方法も、本明細書において提供される。さらに、一定の統計学的有意水準のために必要とされる臨床サンプルの量を決定する上で有用なデータ品質管理DQC基準を計算するための方法も提供される。[I定義]他に定義が示されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書で引用するすべての特許、出願、公開出願、およびその他の刊行物は、その全体が引用により組み入れられる。この節において提示される定義が、引用により本明細書に組み入れられる上記特許、出願、公開出願、およびその他の刊行物において提示される定義と相反する場合、あるいはそうでなくとも矛盾する場合は、この節において提示される定義が、引用により本明細書に組み入れられる定義よりも優先される。本明細書において使用される場合、単数形のa、an、およびtheは、別段の表示が無い限り、複数への言及を含む。例えば、ダイマーadimerは、1つ以上のダイマーを含む。染色体異常という用語は、対象となる染色体の構造と正常な相同的染色体との間の偏差を表す。正常という用語は、特定の種の健康な個体において見出される主要な核型またはバンドパターンを表す。染色体異常は数または構造についてのものであり得、異数性、倍数性、逆位、トリソミー、モノソミー、重複、欠失、染色体の一部の欠失、追加、染色体の一部の追加、挿入、染色体の断片、染色体の領域、染色体再編成、および転座を含むがこれらに限定されない。染色体異常は、病理学的状態の存在、または病理学的状態を生じる素因と相関し得る。本明細書の定義では、一塩基多型SNPは染色体異常ではない。XモノソミーXO、1つの完全なX染色体の欠如はターナー症候群の最も一般的な種類であり、女性生産児の2500~3000人に1人において起こるSybertとMcCauley、NEnglJMed35112271238。XXY症候群は、ヒトの男性が1つ余分なX染色体を有する状態であり、男性の約1000人に1人において存在するBock、UnderstandingKlinefelterSyndromeAGuideforXXYMalesandTheirFamilies、NIHPubNo933202。XYY症候群は性染色体の異数性であって、ヒトの男性が1つ余分にY染色体を受け取って、より一般的な46個ではなく全部で47個の染色体となるものであり、男児出生の1000件に1件に起こって、男性不妊につながる可能性も有するAksglaedeら、JClinEndocrinolMetab93169176。ターナー症候群はいくつの状態を包含するものであり、その中でもXモノソミーXO、1つの完全な性染色体バー小体の欠如が最も一般的である。通常の女性は2つのX染色体を有するが、ターナー症候群では、これら性染色体の内の1つが欠けている。表現型上女性である人の2000~5000人に1人に生じるこの症候群は、多くの形で顕現する。クラインフェルター症候群は、ヒトの男性が1つ余分なX染色体を有する状態である。ヒトにおいてはクラインフェルター症候群は最も一般的な性染色体障害であり、余分な染色体の存在により引き起こされるものとしては2番目に一般的な状態である。この状態は男性約1000人に1人に存在する。XYY症候群は性染色体の異数性であり、ヒトの男性が1つ余分にY染色体を受け取って、より一般的な46個ではなくて合計47個の染色体となっているものである。これは47、XYYという核型を生じる。この状態は通常は無症候性であり男児出生の1000件に1件に起こる一方で、男性不妊を引き起こし得る。13トリソミーパトー症候群、18トリソミーエドワーズ症候群、および21トリソミーダウン症候群は、臨床的に最も重要な常染色体トリソミーであり、これらをいかにして検出するかということは常に大きな関心事であった。上記胎児染色体異常の検出は出生前診断において大きな重要性を有するOstler、Diseasesoftheeyeandskinacoloratlas、LippincottWilliamsWilkinspp72ISBN9780781749992;DriscollとGross、NEnglJMed36025562562;Kaganら、HumanReproduction2319681975。参照固有リードという用語は、固有の配列を有する染色体断片を表す。従って、そのような断片は単一の染色体上位置に明確に割り当てることができる。染色体の参照固有リードは、例えばhg18またはhg19のような、公表された参照ゲノム配列に基づいて構築することができる。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、および核酸分子という用語は、本明細書では互換的に使用されて、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体形態を表し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含み得る。この用語は分子の一次構造のみを表す。従ってこの用語は、三本鎖、二本鎖、および一本鎖デオキシリボ核酸DNAを含み、三本鎖、二本鎖、および一本鎖リボ核酸RNAも同様に含む。この用語はまた、例えばアルキル化および/またはキャッピングにより修飾された形態、ならびに非修飾形態のポリヌクレオチドも含む。より具体的には、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、および核酸分子という用語は、tRNA、rRNA、hRNA、およびmRNAスプライシングされているか否かを問わないを含む、ポリデオキシリボヌクレオチド2デオキシDリボースを含有する、ポリリボヌクレオチドDリボースを含有する、プリンもしくはピリミジン塩基のNもしくはCグリコシドである他の種類のポリヌクレオチドのいずれか、ならびに非ヌクレオチド骨格を含有するその他のポリマー、例えば、ポリアミド例えばペプチド核酸PNAおよびポリモルフォリノオレゴン州CorvallisのAntiVirals社からNeuGene登録商標として市販されているポリマー、ならびにその他の合成配列特異的核酸ポリマーDNAおよびRNAで見られるような塩基対形成および塩基スタッキングを許容する立体配置で核酸塩基を含有するポリマーであることを条件とするを含む。従ってこれらの用語は、例えば、3’デオキシ2’5’DNA、オリゴデオキシリボヌクレオチドN3’-P5’ホスホロアミダート、2’Oアルキル置換RNA、DNAとRNAとの間のハイブリッドまたはPNAとDNAもしくはRNAとの間のハイブリッドを含み、既知の種類の修飾、例えば、標識、アルキル化、キャップ、1つ以上のヌクレオチドを類似体で置換したもの、ヌクレオチド間修飾例えば、無電荷の連結部例えばメチルリン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、カルバメート等を有するもの、負に荷電した連結部例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等を有するもの、および正に荷電した連結部例えばアミノアルキルホスホロアミダート、アミノアルキルホスホトリエステルを有するもの、例えばタンパク質酵素例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリLリシン等のペンダント部分を含有するもの、インターカレーター例えばアクリジン、ソラレン等を有するもの、キレート例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結部を有するもの例えばアルファアノマー核酸等、ならびにポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの非修飾形態を含む。大量並列配列決定とは、数百万個の核酸断片の配列決定を行う技術を意味し、例えば、無作為に断片化したゲノムDNAを平面状で光学的に透明な表面に結合させること、および、数百万個のクラスター各々、平方センチメートル当たり約1000コピーの鋳型を含むを有する高密度配列決定フローセルを創出する固相増幅を用いる。これらの鋳型は、四色DNA合成による配列決定テクノロジーを使用して配列決定される。カリフォルニア州SanDiegoのIllumina社により提供される製品を参照のこと。本発明で使用される配列決定技術は、事前増幅またはクローニング工程を伴わずに実施されることが好ましいが、PCRと顕微鏡的な鋳型ベース配列決定の両方のための反応小室を有するマイクロ流体チップにおける増幅ベースの方法と組み合わせてもよい。ある配列を特定のヒト染色体に属する配列として同定するためには、約30bpの無作為な配列情報が必要とされるだけである。より長い配列はより詳細な標的を特異的に同定できる。本事例では多数の35bpリードが得られた。大量並列配列決定法のさらなる説明は、RogersとVentner、Nature437326327に見出される。本明細書で使用される場合、生体試料とは、生きた採取源もしくはウイルス性採取源、または巨大分子および生体分子のその他の採取源から得られたあらゆるサンプルを表し、核酸もしくはタンパク質またはその他の巨大分子を得ることができる対象のあらゆる細胞種または組織を含む。生体試料は、生物学的供給源から直接得られたサンプルであっても処理されたサンプルであってもよい。例えば、増幅された単離核酸は生体試料を構成する。生体試料は、体液例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、および汗、動物および植物からの組織および臓器サンプル、ならびにこれらに由来する処理済みサンプルを含むが、これらに限定されない。本明細書で記述される発明の側面および実施態様は、からなるconsistingおよび/またはから実質的になるconsistingessentiallyofの側面および実施態様を含むものと理解される。本発明の他の目的、利点、および特徴は、以下の明細書を添付の図面を参照しながら読むことによって明らかとなるであろう。[IIカバー深度とGC含量との間の関係の確立]本明細書では、染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を確立するための方法が提供され、この方法は、上記染色体および別の染色体をカバーする複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を2つ以上のサンプルから得ること、上記断片を上記配列情報に基づいて染色体に割り当てること、各々のサンプルについて、上記配列情報に基づいて上記染色体のカバー深度とGC含量とを計算すること、ならびに、上記染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を決定することを含む。作業の工程が実施される順番は特に特定されない。いくつかの実施態様では、この方法は以下の順番で実施され得る:a上記染色体および別の染色体をカバーする複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を2つ以上のサンプルから得ること、b上記断片を上記配列情報に基づいて染色体に割り当てること、c各々のサンプルについて、上記配列情報に基づいて上記染色体のカバー深度とGC含量とを計算すること、ならびに、d上記染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を決定すること。1つの染色体位置のカバー深度およびGC含量を計算するためには、サンプルから得られた鋳型DNAの配列決定をすることにより、ポリヌクレオチド断片の配列情報を得る。一実施態様では、鋳型DNAは母体DNAと胎児DNAの両方を含む。別の実施態様では、鋳型DNAは妊娠女性の血液から得られる。血液は、採血のためのいずれかの標準的な技術静脈穿刺を含むがこれに限定されないを使用して採集することができる。例えば、血液は肘の内側または手の裏の静脈から採取することができる。血液サンプルは、胎児妊娠のいずれの時期において妊娠女性から採取してもよい。例えば、血液サンプルは、胎児妊娠の第1~4週、4~8週、8~12週、12~16週、16~20週、20~24週、24~28週、28~32週、32~36週、36~40週、または40~44週におけるヒト女性から採取することができ、胎児妊娠の第8~28週の間に採取することが好ましい。ポリヌクレオチド断片は、配列情報に基づいて染色体位置に割り当てられる。参照ゲノム配列を使用して参照固有リードを得る。本明細書において使用される場合、参照固有リードという用語は、参照ゲノム配列に基づいて特定のゲノム位置に割り当てられた、すべての固有ポリヌクレオチド断片を表す。いくつかの実施態様では、参照固有リードは同じ長さ例えば約10、12、15、20、25、30、35、40、50、100、200、300、500、または1000bpを有する。いくつかの実施態様では、ヒトゲノム構築物hg18またはhg19を参照ゲノム配列として使用し得る。染色体位置は、染色体上の互いに隣接したウィンドウであり得、このウィンドウは約10KB、20KB、30KB、40KB、50KB、60KB、70KB、80KB、90KB、100KB、200KB、300KB、400KB、500KB、600KB、700KB、800KB、900KB、1000KB、2000KB、300KB、400KB、5000KB、6000KB、7000KB、8000KB、9000KB、10000KBまたはそれ以上の長さを有し得る。染色体位置は1つの染色体でもあり得る。本明細書で使用される場合、カバー深度という用語は、1つの染色体位置に割り当てられる断片の数と、その染色体位置の参照固有リードの数との間の比を表し、次の式を使用し、ここで、はサンプルiにおいて染色体jに位置付けられた固有配列リードの数であり、はサンプルiにおける染色体jのカバー深度であり、はサンプルiにおいて染色体jに位置付けられた固有配列リードの数であり、は染色体jにおけるサンプルiカバー深度であり、は染色体jにおける参照固有リードの数である。いくつかの実施態様では、いずれの染色体位置にも割り当てられないポリヌクレオチド断片や、複数の染色体位置に割り当てられるポリヌクレオチド断片は廃棄される。いくつかの実施態様では、カバー深度は、別の染色体位置、別の染色体、他のすべての常染色体の平均、他のすべての染色体の平均、またはすべての染色体の平均のカバー深度に基づいて正規化される。いくつかの実施態様では、22個の常染色体の平均カバー深度を正規化定数として使用して、異なるサンプルについて得られる配列リードの総数の違いについて調整し、ここで、crijはサンプルiにおける染色体jの相対カバー深度を表す。ここから以降は、各染色体についての相対カバー深度は正規化された値を表し、異なるサンプルを比較するために使用され、後の解析のために使用される。染色体位置のGC含量は、その染色体位置における固有参照リードに基づいて、またはその染色体位置に割り当てられる配列決定済みポリヌクレオチド断片に基づいて、染色体位置の平均GCパーセンテージにより計算することができる。染色体のGC含量は、次の式を使用して計算することができ、ここで、iはサンプルiを表し、jは染色体jを表し、NGCijはGおよびCのDNA塩基の数を表し、BASEijはサンプルiにおける染色体jのDNA塩基の数を表す。カバー深度およびGC含量は、単一のサンプル、または複数のサンプルから得られたポリヌクレオチド断片の配列情報に基づいたものであり得る。1つの染色体位置のカバー深度とGC含量との間の関係を確立するためには、少なくとも1個、2個、5個、10個、20個、50個、100個、200個、500個または1000個のサンプルから得られたポリヌクレオチド断片の配列情報に基づいた計算であり得る。いくつかの実施態様では、カバー深度とGC含量との間の関係は、強くない線形関係である。Loessアルゴリズムあるいは局所重み付き多項回帰を使用して、数値対の間例えばカバー深度とGC含量との間の非線形関係相関を評価することができる。[III胎児の遺伝的異常の決定]本明細書では、胎児の遺伝的異常を決定する方法も提供され、この方法は、aサンプルから複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得ること、b上記断片を、上記配列情報に基づいて染色体に割り当てること、c上記配列情報に基づいて、染色体のカバー深度およびGC含量を計算すること、d上記染色体の上記GC含量、および、上記染色体のカバー深度とGC含量との間の確立された関係を使用して、上記染色体のあてはめられたカバー深度を計算すること、ならびに、e上記あてはめられたカバー深度を、上記染色体の上記カバー深度と比較することを含み、ここで、それらの間の差異は胎児の遺伝的異常を示す。この方法は、胎児の染色体異常を検出するために使用することができ、異数性、倍数性、モノソミー、トリソミー、21トリソミー、13トリソミー、14トリソミー、15トリソミー、16トリソミー、18トリソミー、22トリソミー、三倍性、四倍性、ならびに、XO、XXY、XYY、およびXXXを含む性染色体異常の検出に特に有用である。本方法に従ってヒトゲノム中の特定の領域に焦点を合わせ、部分的モノソミーや部分的トリソミーを同定することもできる。例えば、本方法は、染色体上をスライドする規定のウィンドウ例えば、染色体を覆って分布する、互いに隣接する非重複50Kb領域における配列データを解析することを含み得る。13q、8p、7q、遠位6p、5p、3q、2q、1qの部分的トリソミー、部分的Xp、および4q351モノソミーが報告されているが、他にも報告例がある。例えば、18番染色体の長腕の部分的重複は、18q211qterが重複される場合にはエドワーズ症候群を引き起こし得るMewarら、AmJHumGenet53126978。いくつかの実施態様では、胎児分の割合が、サンプルからのポリヌクレオチド断片について得られた配列情報に基づいて推定される。XおよびY染色体のカバー深度およびGC含量を、胎児分の割合を推定するために使用し得る。いくつかの実施態様では、サンプルからのポリヌクレオチド断片について得られた配列情報に基づいて胎児の性別が決定される。XおよびY染色体のカバー深度およびGC含量を、胎児の性別を決定するために使用し得る。いくつかの実施態様では、上記あてはめられたカバー深度と上記染色体のカバー深度との比較は、統計学的仮説検定により実行され、ここで、1つの仮説は胎児が正倍数体であることH0であり、もう1つの仮説は胎児が異数体であることH1である。いくつかの実施態様では、双方の仮説についてスチューデントのt統計量をそれぞれt1およびt2として計算する。いくつかの実施態様では、t1およびt2の対数尤度比が計算される。いくつかの実施態様では、1の対数尤度比が胎児のトリソミーを示す。[IV胎児遺伝的異常の診断のためのコンピュータ可読媒体およびシステム]別の側面において、本明細書では、胎児の遺伝的異常の出生前診断を実行するための複数の指示を含むコンピュータ可読媒体が提供され、この複数の指示は、a上記配列情報を受け取る工程、b上記ポリヌクレオチド断片を、上記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、c上記配列情報に基づいて、上記染色体のカバー深度およびGC含量を計算する工程、d上記染色体の上記GC含量、および、上記染色体のカバー深度とGC含量との間の確立された関係を使用して、上記染色体のあてはめられたカバー深度を計算する工程、ならびに、e上記あてはめられたカバー深度を、上記染色体の上記カバー深度と比較する工程であって、それらの間の差異は遺伝的異常を示す工程、を含む。さらに別の側面において、本明細書では、胎児の異数性を決定するためのシステムが提供され、この方法は、a上記ポリヌクレオチド断片から配列情報を得るための手段、およびb胎児の遺伝的異常の出生前診断を実行するための複数の指示を含むコンピュータ可読媒体を含む。いくつかの実施態様では、このシステムは、妊娠女性被検者から得られた生体試料をさらに含み、ここで、この生体試料は複数のポリヌクレオチド断片を含む。多数の異なる配列決定法および変形を使用し得ることは当業者には明らかであろう。一実施態様では、配列決定は大量並列配列決定法を使用して行われる。例えば454プラットフォームRoche社Marguliesら、Nature437376380、IlluminaゲノムアナライザーもしくはSolexa登録商標プラットフォームまたはSOLiD登録商標システムAppliedBiosystems社またはHelicos社のTrueSingleMoleculeDNA配列決定テクノロジーHarrisら、Science320106109、PacificBiosciences社の一分子リアルタイムSMRT登録商標テクノロジー、およびナノポア配列決定法SoniとMeller、ClinChem5319962001において達成されるような大量並列配列決定は、並列的な方式による高度な多重化の下、試料から単離された多数の核酸分子の配列決定を可能とするDear、BriefFunctGenomicProteomic1397416。これらのプラットフォームの各々は、クローンとして増大されたか、あるいは増幅されてすらいない、核酸断片の単一分子群の配列決定をする。ポリヌクレオチド断片の配列情報を得るにあたっては市販の配列決定装置を使用することができる。[V実施例]以下の実施例は本発明を説明するために提供されるのであって、本発明を限定するために提供されるのではない。[実施例1検出の感度に影響する因子の解析:GCバイアスおよび性別]カバー深度およびGC含量を計算するための図式化された手順の枠組みを図1に示す。本発明者らは、ソフトウェアを使用してhg18参照配列をlマーに切り離すことにより参照固有リードを作成しここでいうlマーとは、サンプルの配列リードと同じlの長さを有するようにヒト配列参照から人工的に分解されたリードである、これらの固有のlマーを参照固有リードとして回収した。第2に、配列決定したサンプルのリードを、各染色体の参照固有リードにマッピングした。第3に、五分位数外れ値カットオフ法を適用することによって外れ値を削除し、明瞭なデータセットを得た。最後に、すべてのサンプルについて、各染色体のカバー深度をカウントし、すべてのサンプルについて、各染色体にマッピングされた配列決定済み固有リードのGC含量をカウントした。GC含量がいかにデータに影響するかを調べるために、本発明者らは核型の検査結果を有する300個の正倍数体事例を選び、それらのカバー深度および関連する配列決定リードのGC含量をグラフ上に散布したところ、両者の間に強い相関が示され、そしてこの現象は過去に報告されていないものであった図2。図2において、カバー深度はGC含量と強く相関し、4番、13番等のようないくつかの染色体では明白に下向きな傾向を示した一方で、19番、22番等のような他の染色体では上向きの傾向を示した。図3に示すように、すべての染色体をそれらの固有GC含量に基づいて昇順に並べると、より低いGC含量の群の染色体においては下向き傾向が存在する一方で、より高いGC含量の群の染色体においては上向き傾向が存在する。あるサンプルについて配列決定されたポリヌクレオチド断片が他のサンプルより高いGC含量を有しているならば、より低いGC含量の群の染色体においては、このサンプルのカバー深度は上記他のサンプルのものと比較して低下することになり、より高いGC含量の群の染色体においては上昇することになる、と解釈することができる。異なるGC含量の染色体間のこのような異なる変化傾向について考え得る説明としては、図4に示す異なる染色体におけるGC含量組成の違いと、配列決定過程において導入されるGCバイアスとの組合せがある。各染色体について、すべての35マー参照固有リードのGC含量を使用して、GC含量を36個のレベルに分類する。各染色体の組成GCとしての各レベルのパーセンテージを計算し、Heatmap2ソフトウェアを用いてヒートマップを描くために使用した。13番染色体を例にすると、その大部分はより低いGC含量の配列セグメントから構成されているが、その小部分はより高いGC含量の配列セグメントから構成されている。もし配列決定またはPCR処理の際の条件が、より高いGC含量のセグメントの配列を好むものであるならば、低GC含量である13番染色体の比較的大部分は配列決定されにくくなり、このサンプルの13番染色体におけるカバー深度が低下するという結果がもたらされたであろう。それと比較して、19番染色体のようなより高いGC含量の群では、このサンプルの19番染色体におけるカバー深度はより高くなっている。なぜなら19番染色体の大部分はシークエンサーが好む高GC含量であったからである。どの染色体であろうとGCに乏しいセグメントおよびGCに富んだセグメントは配列決定しにくいが、しかしGCバイアスによってもたらされる影響は、異なるGC含量組成を有する異なる染色体に応じて異なっていた。すべての参照染色体を1KBの区分に分割し、その区分における各々の固有参照リードのGC含量を計算した。適切な区間形式0306内にある各区分のGC含量を0001のステップサイズで分割し、すべての区間における相対カバー度を計算する。図5は、各染色体についての相対カバー度とGC含量とのプロットを示す。独立2標本t検定を使用して、胎児の性別がデータに与える影響を解析した。ほぼ同じGC含量において、性染色体を除き常染色体間には有意差は見出されなかったが、女性と男性との間ではURの明白な差が存在しChiuら、ProcNatlAcadSciUSA1052045820463、常染色体の異数性を検出するときには胎児の性別を見分ける必要はないが、XO、XYY等のような性染色体の異数性を検出するときにはまず胎児の性別を見分ける必要があることが示唆される。[実施例2統計モデル]上記で論じたこの現象を使用し、本発明者らは局所多項を用いてカバー深度と対応するGC含量との間の関係をあてはめることを試みた。カバー深度は、以下の式のように、GCの関数と正規分布の残差とからなり、ここで、はサンプルi、染色体jのカバー深度と対応するGC含量との間の関係についての関数を表し、εijはサンプルi、染色体jの残差を表す。カバー深度と対応するGC含量との間には、強くない線形関係が存在することから、本発明者らは、loessアルゴリズムを適用してカバー深度を対応するGC含量とともにあてはめ、そこから、本発明者らのモデルにとって重要な値、すなわちあてはめられたカバー深度を計算した。このあてはめられたカバー深度を用いて、標準分散およびスチューデントのtを以下の式6および式7に従って計算した。[実施例3胎児分割合の推定]胎児分割合は本発明者らが行う検出にとって非常に重要であるという理由から、本発明者らは、試験手順に先立って胎児分の割合を推定した。先述したように、本発明者らは19人の成人男性の配列決定を行い、そのカバー深度を女性胎児を身ごもった事例のものと比較したところ、男性のX染色体のカバー深度は女性のX染色体のカバー深度のほぼ12倍であり、男性のY染色体のカバー深度は女性のY染色体のカバー深度よりほぼ05も大きいことを見出した。従って、式8、式9および式10のように、GC相関も考慮しながら、X染色体およびY染色体のカバー深度に依存して胎児分の割合を推定でき、ここで、は、女性胎児を有する事例のX染色体カバー深度と対応するGC含量との回帰相関によるあてはめられたカバー深度であり、は、女性胎児を有する事例のY染色体カバー深度と対応するGC含量との回帰相関によるあてはめられたカバー深度を表し、は、成人男性のX染色体カバー深度と対応するGC含量との回帰相関によるあてはめられたカバー深度を表し、は、成人男性のY染色体カバー深度と対応するGC含量との回帰相関によるあてはめられたカバー深度を表す。単純に計算するために、所与のとは同等であり、とは同等である。[実施例4すべての染色体の残差の計算]図6は、一定の固有リード総数のもとにおけるすべての染色体についての標準変動式3を参照のことは、関与する参照事例数により影響されることを示す。各事例について170万の総固有リード数が配列決定されたという条件下で、選ばれた事例数が150より大きい場合は、標準変動はほとんど増加しなかった。しかしながら、標準変動は異なる染色体では異なっていた。GCバイアスを考慮に入れた後では、本発明者らの方法は、13番染色体00063、18番染色体00066、および21番染色体00072について中程度の標準変動を有していた。X染色体の標準変動は上述の染色体よりも高く、これは正確な異常検出を行うためにさらなる戦略を必要とするものである。図7はQQプロットを示しており、ここで残差は正規分布にコンパイルされ、スチューデントtの計算が合理的であることを示唆している。[実施例5胎児性別の識別]性染色体の障害を発見するためには、胎児の性別を見分けることが最善である。本発明者らが300個の事例におけるY染色体のカバー深度の頻度分布を調べたところ、2つの明白なピークが存在しており、Y染色体のカバー深度によって性別を見分けるというヒントを発明者らは得た。図8のように、カバー深度が004未満である事例は女性胎児を身ごもっているとみなすことができ、0051を超える事例は男性胎児を身ごもっているとみなすことができ、004と0051の間ならば性別不明とみなされる。これらの性別不明瞭事例および異数性事例については、式11のようにしてロジスティック回帰を使用して性別を予測しFanら、ProcNatlAcadSciUSA421626616271、ここで、およびはそれぞれXおよびYの正規化された相対カバー度である。核型の結果と比較すると、胎児性別を見分けるための本発明者らの方法は300個の参照事例において100の精度で非常にうまく機能し、その一方で901個の事例セットにおいて実行した場合には1つの事例を誤認したが、誤認されたこの事例のY染色体カバー深度は004と0051の間である。[実施例6GC相関t検定アプローチの診断的性能]サンプル募集事前に深セン市人民病院および深セン市母子ケアサービスセンターから903人の参加者を、その核型の検査結果とともに集めた。それぞれの募集場所の施設内審査委員会から承認を受け、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。血液採取時における母体の年齢および妊娠週数を記録した。この903個の事例は、2個の13トリソミー事例、15個の18トリソミー事例、16個の21トリソミー事例、3個のXO事例、2個のXXY事例、および1個のXYY事例を含んでいた。参加者らの核型の結果の分布を図9に示す。母体血漿DNAの配列決定参加した各妊娠女性から末梢静脈血5ミリリットルを採取してEDTAチューブに入れ、4時間以内に、1600gで10分間遠心分離した。血漿を微量遠心機用チューブに移し、16000gで10分間、再び遠心分離して、残っていた細胞を除去した。細胞非含有血漿を、DNA抽出をする時まで80°Cで保存した。各血漿試料は一度だけ凍結解凍した。大量並列ゲノム配列決定のために、母体血漿600μlからのすべての抽出DNAを使用して、Illumina社の修正プロトコールに従ってDNAライブラリー作製を行った。手短に述べると、T4DNAポリメラーゼ、Klenow登録商標ポリメラーゼ、およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、母体血漿DNA断片の末端修復を行った。末端A残基を付加した後、DNA断片に市販のアダプターIllumina社を連結した。それから、標準的なマルチプレックスプライマーを用いた17サイクルのPCRを使用して、アダプター連結DNAを追加的に増幅した。AgencourtAMPure登録商標60mlキットBeckman社を使用してPCR産物を精製した。配列決定用ライブラリーのサイズ分布を、2100Bioanalyzer登録商標Agilent社上でDNA1000キットを用いて解析し、リアルタイムPCRで定量化した。IlluminaGAII登録商標単一末端配列決定法上のクラスターステーションの前に、異なるインデックスを有する配列決定用ライブラリーを等量ずつプールして1つとした。胎児DNAの割合を推定する後続の解析のために、19個の男性正倍数体サンプルを配列決定した。13トリソミー、18トリソミー、21トリソミー、および性染色体異常の診断のための1つの新しいGC相関t検定アプローチを本発明者らは開発した。本発明者らは、この新しい方法を、後述する他の3つの方法と、診断性能という点に関して比較した。[実施例713、18、および21トリソミーのような胎児異数性の検出]患者事例において染色体のコピー数が正常状態から逸脱しているか否かを決定するために、染色体のカバー深度を他のすべての参照事例のものと比較した。過去のすべての研究は1つの帰無仮説を有するのみであった。本発明者らは、2つの帰無仮説を使用することにより、2値仮説を初めて導入した。1つの帰無仮説H0:胎児は正倍数性であるは、患者事例分布の平均カバー深度と、すべての正常参照分布の平均カバー深度とが同等であるという仮定であり、これは、もしこの帰無仮説が採択されるならばその患者事例は正倍数体であったことを意味する。スチューデントのt検定を使用して、式12のようにt1を計算することができる。別の帰無仮説H1:胎児は異数性であるは、概算の胎児分割合を有する患者事例分布の平均カバー深度が、同じ胎児分割合を有する異数性事例の分布の平均カバー深度と同等であるというものであり、これは、もしこの帰無仮説が採択されるならばその患者事例は異数体であったことを意味する。スチューデントのt統計量t2を、式13のように計算した。およびは、ほとんどの場合特に、正倍数体事例と異数体事例との間の分布が完全に区別される場合には異数体の事例を示す一方で、明確さが不十分であるとか胎児分割合が不十分である等のようなその他の条件では、t1が3より小さくても胎児は異常であり得る。t1とt2との組合せは、より正確な決定をする助けとなり得、そこで本発明者らは、式14のようにt1およびt2の対数尤度比を利用したここでLijは対数尤度比である。もしこの比が1より大きいならば、胎児がトリソミーであり得ると推量できる。しかし、女性胎児の事例では、胎児分割合を推定することが難しく、従って計算することが不可能である。しかしながら、胎児分割合の経験的分布に従って、割合7の参照値RVを与えることができる。903個の事例を調べ、それらのうち866事例は正倍数体胎児を身ごもっており、その中で300事例を無作為に選択して、GC相関スチューデントtアプローチを開発した。さらに、2個の13トリソミー事例、12個の18トリソミー事例、16個の21トリソミー事例、4個のXO事例3つのXO事例、および1つの45xo46xx2723キメラ事例からなる、2個のXXY事例、および1個のXYY事例が発明者ら調査に参加していた。アラインメントの後、本発明者らは、事例あたり平均170万のデータSD306185固有アラインメント済みリードミスマッチを含まないを得た。本発明者らが新たに開発したGC相関スチューデントt検定を使用することにより、すべての13トリソミー事例2件中2件を同定することに成功する一方、901件の非13トリソミー事例のうち901件が正しく分類された図10A。このアプローチの感度および特異度は100および100であった表1。18トリソミーについては、12件の18トリソミー事例のうち12件、および891件の非18トリソミー事例のうち888件を正しく同定することができた図10A。このアプローチの感度および特異度はそれぞれ100および9966であった。21トリソミーについては、16件の21トリソミー事例のうち16件、および16件の非21トリソミー事例のうち16件をやはり正しく同定することができた図10A。このアプローチの感度および特異度はそれぞれ100および100であった。[実施例8XO、XXX、XXY、XYYの検出]上記では、常染色体のトリソミーの検出を検討したが、XO、XXX、XXY、およびXYYのような性染色体の障害もまた、本発明者らの方法により検出することができる。第1に、性別識別により性別を確認した。もし試験事例が女性胎児を身ごもっていると確認されたならば、スチューデントのt値t1を計算することがXXXまたはXOの検出のために必要であり、ここでおよびは式10と同じである。もしt1が313より大きいかまたは313より小さいならば、この事例はXXXまたはXOであり得る。しかし、X染色体についてのカバー深度の大きな偏差により精度が制限されていたことを考慮して、本発明者らは血漿を再び採取して実験を繰り返し、であってもである場合により信頼性のある決定を行った。この場合ではが異数性であることが確認された。本発明者らのすべての検出プロセスは、データが標準的な品質管理を満たしていることを前提とするものであった。もし試験サンプルが男性胎児を身ごもっていることが確認されたら、胎児DNA割合はまずYおよびXによって推定した。その一方で、Y染色体のカバー深度のみによって推定された胎児DNA割合を用いてX染色体についてのあてはめられたカバー深度を外挿することができ、t2を計算することができる。もしt2が大きすぎたり5より大きいあるいは小さすぎたり5より小さいすれば、その胎児はXXYまたはXYYであり得る。さらに、XとYによって独立に推定された胎児分割合の間の隔たりは、性染色体についての障害を検出するための情報を提供する。XOの検出においては、4件のXO事例のうち3件が検出され、同定できなかった事例はキメラ事例であった図10B。このアプローチの感度および特異度はそれぞれ75キメラ事例を無視するならば100および9955であった。XXY事例については、2つの事例の両方を同定することに成功する一方、901件の非XXY事例のうち901件が正しく分類され図10B、感度100、特異度100であった。XYY事例については正しく同定することができ図10B、感度および特異度はそれぞれ100および100であった。本発明者らの新規アプローチが、他の2つの報告されたアプローチ、すなわちzスコアおよびGC補正を伴うzスコアと比較して何らかの有利点を有するか否かを評価するために、本発明者らはこれらの3つのアプローチすべてを実施し、これらすべてのアプローチについて本発明者らの900事例および参照セットと同じ300事例を解析した。測定の精度は常に信頼値CVとして具体化した。本発明者らの調査では、臨床的な関心事項である18番および21番染色体において、標準的なzスコアアプローチのCVは他のアプローチよりも高く図11、その結果、18トリソミーおよび21トリソミーについてより低い感度となっている表1。GC補正を伴うzスコアアプローチについては、13番染色体のCV値は00066であり、100の感度および100の特異度を伴っている。本明細書で記述した新規GC相関スチューデントtアプローチについては、13番染色体のCV値は00063であり、100の感度および100の特異度を伴っている。18番染色体では、これら2つのアプローチのCVはそれぞれ00062および00066であり、どちらも感度は100であって、それらの特異度はそれぞれ9989および9996であった。21番染色体についてこれら2つのアプローチのCVを比較した場合には同様の成績であったそれぞれ00088および00072。本発明者らの小さな事例セットの調査ではどちらも同じ100の感度をもたらし、同じ100の特異度を達成した。そして、これら2つの方法はいずれも標準的なzスコアアプローチよりも成績が良かった。本発明者らが新たに開発したGC相関のアプローチは、好成績を有してGC補正アプローチと比肩するだけでなく、XO、XXYおよびXYYのような性染色体異常の検出において別の有利点を有していた。本発明者らのデータは、GC補正アプローチを処理する場合には、重み因子を乗ずることにより配列タグの数を補正することで導入される、性染色体を表すデータの偏差によって、胎児の性別を見分けることが困難になることを示しており、従って性染色体障害の検出は難しいと見られた。[実施例9データサイズ、妊娠週数、および胎児DNA割合を考慮した、GC相関t検定アプローチの理論的性能]母体DNAの高いバックグラウンドのために、異数性を測定することは依然として難しいことでありFanら、ProcNatlAcadSciUSA421626616271、今日に至るまで、大量並列ゲノム配列決定MPGSアプローチによる異数性の検出において、恣意的であってかつ小さい胎児DNA割合が最も重要な制約要因であった。しかしながら、MPGS検出の前に最小胎児DNA割合特に女性胎児についてを臨床的に決定することについて大きな進展がなく、胎児DNAの割合を示すことに関連する唯一の臨床的手掛かりは妊娠週数であった。胎児DNA割合と妊娠期間との間には統計学的に有意な相関があることが以前に報告されているLoら、AmJHumanGenet62768775。本発明者らの研究では、推定胎児DNA割合と妊娠期間との間の関係を調べるために、図12において、男性胎児を有するすべての本調査参加事例全427事例の胎児DNA割合をプロットし、推定式10を示した。各々のサンプルの推定胎児DNA割合は妊娠期間と相関しているPは00001より小さい。このデータはまた、妊娠期間20週においてでも、胎児DNA割合が5未満であるものが65事例中4事例あることを示しており、これは検出精度に悪影響を与えるであろう。胎児分割合推定法を評価するために、本発明者らは、推定胎児分割合において階層的に分布しているいくつかの事例を選び、QPCRの補助によって、別個に相対胎児分割合を計算した。そこから、それらの間の強い相関を示す相関標準曲線が得られ、本発明者らの方法による胎児分割合の推定は信頼できるものであることが示された。一方で、配列決定深度合計固有リード数は、標準変動の値に具体化される異数性検出精度に影響する、もう1つの重要な因子である。参照事例数が150に達する場合には、本発明者らのGC相関アプローチにおいて利用される各染色体についての標準変動は一定レベルの配列決定深度のもとで固定され得る図13。配列決定深度がどのように各染色体についての標準変動に影響するかを調べるために、本発明者らは、170万のレベルにおいてだけではなく、合計固有リード数が500万SD170万に達するもう1つの配列決定深度レベルにおいて、150事例の配列決定を行った。これら2つのセットによって、図6に示したように、標準分散は合計固有リード数の平方の逆数と線形関係にあることを見出した。所与の胎児DNA割合について、染色体コピー数の正常状態からの偏差をt13にて検出するために発明者らの方法において必要とされる合計固有リード数を推定することができた図14。胎児DNA割合がより小さければ、より大きな配列決定深度が必要となることが示された。170万の固有リードのセットにおいては、本発明者らのアプローチは、45を超える胎児DNA割合があれば13番染色体およびX染色体の異数性胎児を検出することができ、4を超える胎児DNA割合があれば21番染色体および18番染色体の異数性胎児を検出することができる。一方で、500万の参照セットにおいては、発明者らのアプローチは、約3の胎児DNA割合であっても18トリソミーおよび21トリソミーを検出する能力を有していた。約4の胎児分割合においてXXXまたはXOのようなX染色体異常のある胎児を同定したいのであれば、これらの事例および対応する参照事例のために必要とされる合計固有数は500万に達するはずである。もし胎児DNAが35に満たないのであれば、必要な配列決定深度は2000万を超えるであろう。DNA胎児分割合がより低いのであれば、検出は考えられないほど難しくなるので、本発明者らは別の戦略、すなわち、妊娠期間がより長くなった時にその妊娠女性の血漿を再採取し、上記実験を再実行し、データを再解析するべきことを発明者らは提案したが、これは妊娠期間の増加とともに胎児DNA割合が上昇するという可能性が高いことに基づく。この戦略は、胎児DNA割合が小さいことが疑われているサンプルにも適用できる。本発明者らのアプローチは高性能だとしても、大きなセットの異常事例を用いなければ説得力がない。本発明者らが適用するこのGC相関スチューデントtアプローチの感度を評価するために、異なる妊娠期間および異なる配列決定深度を考慮した理論的感度を公表した。発明者らは、以下の工程により異数性の理論的感度を計算した。第1に、回帰分析を適用して胎児DNA割合を妊娠期間にあてはめ、ここで、は妊娠期間第i週における胎児DNA割合のあてはめ平均値である、ガウシアンカーネル密度推定を利用することにより近似的な胎児DNA割合分布を推定したBirke、JournalofStatisticalPlanningandInference13928512862主に妊娠19週および20週に分布する推定胎児DNA割合を参照し、その後、胎児DNA割合と妊娠期間との間の関係に従って他の週数における胎児DNA割合分布を外挿した。ここで、は妊娠期間第i週における胎児DNA割合のあてはめ確率密度であり、Xは妊娠19週および20週のデータである図12。第2に、前述したように合計固有リード数に従って標準分散を推定したここで、は合計固有リード数である。最後に、各配列決定深度において推定された胎児DNA割合分布および標準分散に従って、一定の配列決定深度レベルにてすべての妊娠期間における感度を計算するために、すべての胎児DNA割合における偽陰性の確率密度を計算しここでは胎児DNA割合の変動は正規分布であることを仮定した、それらをまとめて、すべてのレベルの胎児DNA割合からなる妊娠期間における偽陰性率FNRを得たここで、jは染色体j第j番染色体である。この妊娠期間において一定の配列決定深度における理論的感度は1FNRとして容易に計算される。図15~21は、本発明者らの計算の結果のプロットを示す。3より大きいスチューデントtを女性胎児の異数性を同定するために設定する一方、男性胎児については、すべての割合の偽陰性の確率密度を計算する際に、2値仮説において言及した棄却限界値として1より大きい対数尤度を採用し、これが女性胎児と比べてより高い感度を達成する助けとなった。しかしながら、特に小規模のサンプリングで短い妊娠期間である場合には、妊娠期間に応じた胎児DNA割合の真の分布と限りなく近似した分布を得ることは難しいという理由から、本発明者らの推論は比較的控えめなものとなっている。[参考文献]1VirginiaPSybertElizabethMcCauleyTurner’sSyndromeNEnglJMed351122712382RobertBockUnderstandingKlinefelterSyndromeAGuideforXXYMalesandTheirFamiliesNIHPubNo933202August19933AksglaedeLiseSkakkebaekNielsEJuulAndersAbnormalsexchromosomeconstitutionandlongitudinalgrowthserumlevelsofinsulinlikegrowthfactorIIGFbindingprotein3luteinizinghormoneandtestosteronein109maleswith47XXY47XYYorsexdeterminingregionoftheYchromosomepositive46XXkaryotypesJClinEndocrinolMetab93169176doi101210jc20071426PMID179401174HBruceOstlerDiseasesoftheeyeandskinacoloratlasLippincottWilliamsWilkinspp72ISBN97807817499925DriscollDAGrossSClinicalpracticePrenatalscreeningforaneuploidyNEnglJMed360255625626KarlOKaganDaveWrightCatalinaValenciaetcScreeningfortrisomies2118and13bymaternalagefetalnuchaltranslucencyfetalheartratefreebhCGandpregnancyassociatedplasmaproteinAHumanReproductionVol23No9pp196819752008doi101093humrepden2247MaloneFDetalFirsttrimesterorsecondtrimesterscreeningorbothforDownssyndromeNEnglJMed353200120118FanHCQuakeSRSensitivityofNoninvasivePrenatalDetectionofFetalAneuploidyfromMaternalPlasmaUsingShotgunSequencingIsLimitedOnlybyCountingStatisticsPLoSONE5e10439doi101371journalpone00104399ChiuRWChanKCGaoYLauVYZhengWetalNoninvasiveprenataldiagnosisoffetalchromosomalaneuploidybymassivelyparallelgenomicsequencingofDNAinmaternalplasmaProcNatlAcadSciUSA105204582046310McCullaghPandNelderJAGeneralizedLinearModelsLondonUKChapmanHallCRC11FanHCBlumenfeldYJetalNoninvasivediagnosisoffetalaneuploidybyshotgunsequencingDNAfrommaternalbloodProcNatlAcadSciUSA42162661627112MelanieBirkeShapeconstrainedkerneldensityestimationJournalofStatisticalPlanningandInferenceVolume139Issue81August2009Pages2851286213LoetalLancet35048548714LoetalAmJhumGenet6276877515PertlandBianchiObstetricsandGynecology9848349016RogersandVentnerGenomicsMassivelyparallelsequencingNature43732632717MewaretalClinicalandmolecularevaluationoffourpatientswithpartialduplicationsofthelongarmofchromosome18AmJHumGenet1993December5312697818MarguliesetalNature43737638019HarrisetalScience32010610920SoniandMellerClinChem531996200121DearBriefFunctGenomicProteomic1397416