"組み換え免疫刺激サイトカインを発現する1つ又はそれ以上の増殖不全遺伝子組み換え新生細胞を含み、そして少なくとも1つのトール様受容体TLRアゴニストを含んでなる、免疫原性組成物。サイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSFである、請求項1に記載の免疫原性組成物。細胞が同等量の少なくとも1つのTLRアゴニスト及びGM-CSFを含んでいる、請求項1に記載の免疫原性組成物。TLRアゴニストが、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7又はTLR8、TLR9アゴニストである、請求項1に記載の免疫原性組成物。組成物がTLR4アゴニスト及びTLR7/8アゴニストを含んでいる、請求項1に記載の免疫原性組成物。TLR4アゴニストがLPS、LPS断片、又は合成グルコピラノシルリピドA類縁体であり、そしてTLR7/8アナログがR848である、請求項5に記載の免疫原性組成物。細胞が放射線照射によって増殖不全にされる、請求項1に記載の免疫原性組成物。新生細胞が、白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、扁桃腺癌、下咽頭癌、上咽頭癌、乳癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌、膠芽細胞腫及び脳腫瘍よりなる群から選ばれる、請求項1に記載の免疫原性組成物。組成物が、少なくとも1×105細胞当り約1ngのTLR4アゴニスト~1×105細胞当り10ngのTLR4アゴニストを含んでいる、請求項1に記載の免疫原性組成物。組成物が、少なくとも5×105細胞当り約3~5ngを含んでいる、請求項1に記載の免疫原性組成物。細胞が、リポフェクタミン又はその他のリポソームベクターと結合しているTLRアゴニストを含んでいる、請求項1に記載の免疫原性組成物。細胞が、LPS/リポソームミセルを含んでいる、請求項1に記載の免疫原性組成物。1つ又はそれ以上の腫瘍抗原を発現する細胞をさらに含んでなる、請求項1に記載の免疫原性組成物。細胞が、自家又は同種異系である、請求項1~13の何れか一項に記載の免疫原性組成物。ワクチンが、薬学的に許容される賦形剤中に組み換え免疫刺激サイトカインを発現する有効量の増殖不全性腫瘍細胞を含み、そして有効量の外因性トール様受容体TLRアゴニストを含んでなる、対象の腫瘍形成を改善するワクチン。細胞が、CN-CSFを発現するように遺伝子組み換えされている、請求項15に記載のワクチン。組成物がTLR4アゴニスト及びTLR7/8アゴニストを含む、請求項15に記載のワクチン。TLR4アゴニストがLPS、LPS断片、又は合成グルコピラノシルリピドA類縁体であり、そしてTLR7/8アナログがR848である、請求項17に記載のワクチン。細胞が、LPS/リポソームミセルを含んでいる、請求項15に記載のワクチン。1つ又はそれ以上の腫瘍抗原を発現する細胞をさらに含んでいる、請求項12に記載のワクチン。細胞が、自家又は同種異系である、請求項12~20の何れか一項に記載のワクチン。方法が、組み換え免疫刺激サイトカインを発現する1つ又はそれ以上の増殖不全性腫瘍細胞を含み、そして外因性トール様受容体TLRアゴニストを含む、有効量の免疫原性組成物を対象に、当該対象において腫瘍細胞抗原に特異的な免疫応答を誘発するのに十分な量を投与することを含んでなる、腫瘍を有しているか又は腫瘍を発症する傾向にある対象において腫瘍細胞抗原に特異的な免疫応答を誘発する方法。方法が、対象に請求項1~21の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を当該対象において腫瘍細胞抗原に特異的な免疫応答を誘発するのに十分な量で投与して、それによって対象を治療することを含んでなる、腫瘍を有しているか又は腫瘍を発症する傾向にある対象の腫瘍形成を治療又は予防する方法。方法が、対象に請求項1~21の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を投与して、それによって対象における腫瘍の進展又は転移を治療又は予防することを含んでなる、腫瘍を有している対象における腫瘍の進展又は転移を治療又は予防する方法。方法が、対象に請求項1~21の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を投与して、それによって対象における確立された腫瘍を治療するか又は腫瘍形成を予防する、対象における確立された腫瘍を治療するか又は腫瘍形成を予防する方法。方法が、対象に請求項1~21の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を投与して、それによって対象における微小転移巣又は残存疾患を治療することを含んでなる、微小転移巣又は残存疾患を有する対象における微小転移巣又は残存疾患を治療する方法。方法が、対象に請求項1~21の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンを投与することを含んでなる、対象に免疫を与える方法。腫瘍細胞が癌細胞株由来であるか又は腫瘍由来である、請求項14~27の何れか一項に記載の方法。癌細胞株又は腫瘍が、白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、扁桃腺癌、下咽頭癌、上咽頭癌、乳癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌、膠芽細胞腫及び脳腫瘍よりなる群から選ばれる、請求項17に記載の方法。免疫原性組成物を全身的又は局所的に投与する、請求項14~16の何れか一項に記載の方法。免疫原性組成物を筋肉内注射、静脈内注射、腫瘍内注射、又は腹腔内注射で投与する、請求項19に記載の方法。1つ又はそれ以上の化学療法剤の有効量を対象に投与することをさらに含んでなる、請求項8又は9に記載の方法。1つ又はそれ以上の化学療法剤が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、オーリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、BMS184476、2,3,4,5,6-ペンタフルオロ-N-3-フルオロ-4-メトキシフェニルベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、N,N-ジメチル-L-バリル-L-バリル-N-メチル-L-バリル-L-プロリ-1-L-プロリン-t-ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロランブシル、シクロホスファミド、3’-4’-ジデヒドロ-4’-デオキシ-8’-ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチンBCNU、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジンDTIC、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、ドキソルビシンアドリアマイシン、エトポシド、5-フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシウレア及びヒドロキシウレアタキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチンCCNU、MDV3100、メクロレタミンナイトロジェンマスタード、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、タキサン類、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、RPR109881、リン酸エストラムスチン、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、及びビンフルニンよりなる群から選ばれる、請求項12に記載の方法。方法が、GVAXの単独使用に比べて、樹状細胞の活性化増強し、そして/或いはAH1特異的細胞傷害性T細胞又はp15E特異的細胞傷害性T細胞の数を減少する、請求項12~31の何れか一項に記載の方法。方法が、GVAXの単独使用に比べて、腫瘍細胞増殖、腫瘍生育、又は対象の生存を減少又は安定化する、請求項12~31の何れか一項に記載の方法。GM-CSFをコードする発現ベクター及び少なくとも1つのTLRアゴニストを含んでなる、増殖不全性腫瘍細胞。細胞が、白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、扁桃腺癌、下咽頭癌、上咽頭癌、乳癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌、膠芽細胞腫及び脳腫瘍又はこれらの細胞株に由来している、請求項34に記載の腫瘍細胞。細胞が、TLR4及びTLR7/8アゴニストを含んでいる、請求項34に記載の腫瘍細胞。TLRアゴニストがリポソームベクターと結合している、請求項34に記載の腫瘍細胞。請求項1~21の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量及び薬学的に許容される賦形剤を含んでなる、腫瘍を治療するための医薬組成物。キットが、請求項1~21の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量、及びキットを請求項22~33の何れか一項に記載の方法で用いるための説明書を含んでなる、腫瘍を治療するためのキット。方法が、対象に請求項1~21の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を投与して、それによって対象の子宮頸癌を治療又は予防することを含んでなる、対象の子宮頸癌を治療又は予防する方法。方法が、対象に請求項1~21の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を投与して、それによって対象の多型性TLR欠損症を治療することを含んでなる、対象の多型性TLR欠損症を治療する方法。本発明は少なくとも1つのTLRアゴニストと製剤化したサイトカインGM-CSFを発現する腫瘍細胞含んでいる組成物及び免疫応答を誘発又は増強するためにこの組成物を用いる方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、腫瘍細胞に基づいたワクチンにTLRアゴニストを添加すると、腫瘍組織に存在している宿主免疫応答回避メカニズムを打破することによりワクチンの有効性が増強したという発見に基づいている。特に、以下に更に詳細に報告するように、同系のGM-CSFを分泌する全細胞腫瘍ワクチンGVAXとTLR4アゴニストを用いてTEGVAXTLRで増強したGVAXを作成した。このワクチンの有効性を、免疫原性が弱いB16マウスメラノーマモデルを含む、3つの異なる治療マウスモデルで試験した。免疫組織化学、フローサイトメトリー分析、ELISPOT、及びインビボGTL分析を、腫瘍組織に対する先天性及び適合性免疫応答の両方を評価するために用いた。TEGVAXの腫瘍内及び全身投与は、GVAX単独に比べて増大したインビボでの抗腫瘍応答をもたらした。TEGVAXの改善された抗腫瘍効果は、TLRシグナル伝達低下MyD88-/-マウスには存在していなかった。Balb/cマウスのCT26マウスモデルにおいて、40~60のマウスが移植された腫瘍の退行を示した。CT26腫瘍細胞を再投与すると、これらのマウスは腫瘍に対して免役されていることが証明された。TEGVAXで処置した腫瘍は、腫瘍組織に増大した湿潤しているCD4及びCD8T細胞を、更に増大した数のCD86細胞も示した。TEGVAXで処置したマウス由来流入領域リンパ節は、GVAX処置群及び偽処置群と比べて増大した数の活性化CD86MHCII及びCD80MHCII樹状細胞を有していた。ELISPOTアッセイ更にはインビボCTLアッセイはTEGVAXで処置したマウスにおいて、AH1腫瘍抗原に特異的な増大した数のCTLを示した。細胞に基づいたワクチンはTLRアゴニストを用いてインビボでの改善された抗腫瘍応答を有するように製剤化できる。TLRアゴニストは抗腫瘍免疫応答を増強する不偏腫瘍抗原の供給源としての腫瘍細胞ワクチンの使用は多数の臨床試験で安全性が示されてきた。しかしながら、この手法の臨床効果には、抗腫瘍細胞毒性応答に向かうT細胞応答を歪め得る活性化抗原提示細胞の弱い上方制御による、限度がある。感染との関連において、TLRアゴニストは樹状細胞を活性化して免疫原性にすることが示されているが、TLR4シグナル伝達の欠乏が耐性を導き得る14。BlanderandMedzhitovは貪食された微生物抗原がLPSの存在下でより効果的に提示されることを示した17。抗原含有ファゴリソソームにおいて、TLR4シグナル伝達なしで、ペプチド-MHCクラスII複合体がDCの細胞表面に非効率的に存在している。これらの研究から推測されることは、局在性TLR4刺激が併用ワクチンの一部として投与されたときに抗腫瘍応答を増強するということである。何れかのTLRアゴニストの使用に対する一つの懸念はその毒性である。なぜなら、TLR4に対する生理的なリガンドは、敗血症に応答可能な巨大分子である、LPSである。LPSのTLR4アゴニスト活性はLPSのリピドA成分を分離していて、非毒性リピドA形態の多くの形態が癌患者に導入されている18。他のものは、癌患者に敗血症及びアナフィラキシーの徴候なしで、LPSを発熱性用量以上で皮内に用いている19。その他の懸念は、腫瘍細胞上で発現されるTLR4受容体が発癌を促進するかもしれないということである20。免疫調節サイトカインGM-CSFを発現する遺伝子組み換え腫瘍細胞を含んでいる、GVAXワクチンは最近、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、及び大腸癌についての臨床試験の段階にある。本明細書で報告されたように、TLR刺激作用をGVAXと局所的に組合わせることはGVAXワクチンの免疫原性を有意に増強することができる。前発がん性のTLR4刺激を最小化し、全身性TLR4刺激を最小化するために、LPS及びその他のTLRアゴニストがGVAX細胞中で製剤化されて、この新規な併用ワクチンが幾つかのマウスモデルで抗腫瘍効果を示した。従って、本発明は腫瘍細胞に基づいたワクチンを含有しているTLRアゴニストを含む治療用組成物、及び腫瘍細胞例えば、乳癌及びメラノーマ細胞の侵襲を阻害し、減少し、或いは取り除くために或いは腫瘍又はその症状を治療するためにこのような細胞に基づいたワクチンを用いる方法を提供する。ある特定の実施態様では、本発明は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSFを分泌するように遺伝子組み換えされた患者特異的癌細胞を含み、更にトール様受容体アゴニストを含むように製剤化された自己癌細胞ワクチンを提供する。GM-CSFは白血球生成の刺激に対する幾つかの特異性を有している、多種の造血前駆細胞の増殖及び分化を調節して、治療誘発性好中球減少症を回復できる。この物質は抗原提示を促進し、抗体依存性細胞毒性ADCCを上方調節し、そしてインターロイキン-2介在リンホカイン活性キラー細胞の機能を増大して宿主の抗腫瘍免疫を増大することもできる。TLRアゴニストはアジュバントとして作用してワクチンの効果を増大する。TLRアゴニストと共に製剤化した腫瘍細胞に基づいたワクチンは、活性化局所領域樹状細胞の数を増大し、更に腫瘍特異的CTL応答も増大する。安全性については、ワクチン化の前に細胞を放射線照射する。免疫原性組成物癌ワクチンを含む、本発明の免疫原性組成物は特定のタイプの癌治療のための治療法及び予防法として有用である。有利には、これらのワクチンを、標的特異的腫瘍抗原を対象の腫瘍上に発現するようにワクチンを作成して、特定個人の癌を治療するように調整することができる。本発明のワクチンは通常、不活性化腫瘍細胞又はGM-CSFを発現するように遺伝子操作されている癌抗原を発現する細胞を含有し、この細胞は更にTLR4アゴニスト又はその断片を含んでいる。本発明の細胞は、リポフェクタミン又はその他のリポソーム媒体、例えば、油/水エマルション親油性分子、非細胞毒性の、受動的吸収でこれらの親油性分子を可溶化するもの、と組合わせたTLR4アゴニストを細胞と接触させることによってTLR4アゴニストを取り込むように誘導される。理論と結びつけるつもりはないが、TLRアゴニスト又はその生物活性断片を、TLRアゴニスト含有ミセルを形成するのに十分な条件下でリポソームと接触させる。このミセルはGM-CSF発現腫瘍細胞によって非特異的に吸収されてこのTLRアゴニスト製剤化細胞ワクチンを対象の免疫系を刺激するために用いることができる。別の実施態様では、TLRアゴニストは賦形剤の存在下で細胞上に吸着する。適切な賦形剤の限定されない1つの例は、ホスファチジルコリンを含む安定なスクアレン水中油型エマルション例えば、水中に10重量の水中油型エマルションである。免疫系は腫瘍を標的とする免疫応答性細胞を産生してこの刺激に応答する。特定の実施態様では、本発明の癌ワクチンは望ましく、微小転移巣又は残存疾患のような、検出不可能な腫瘍細胞を標的にしており、それによって腫瘍の再発を阻止する。病気の発症を阻止する他の病気用のワクチンとは違って、癌ワクチンは通常、対象が腫瘍を有していると確認された後に投与される。腫瘍細胞ワクチンは、本明細書に記載されているようにして作成される、本発明の細胞組成物を用いて産生される。細胞は増殖不全にされ、対象に注入されて、そこで腫瘍は細胞抗原の免疫応答刺激を起動する。望ましくは、免疫系は致死的な放射線照射された細胞上に表示された1つ又はそれ以上の抗原を運搬する癌細胞の小集団を標的にする。組み換えポリペプチド発現本発明は組み換えGM-CSFポリペプチドを発現するように遺伝子を組み換えた細胞を提供する。本発明のGM-CSFポリペプチドは、実質的に科学界で公知の何れかの方法を用いて産生される。一般に、組み換えポリペプチドは、適切な発現媒体内にGM-CSFポリペプチドをコードする核酸分子又はその断片の全て又は一部を有している適切な宿主細胞例えば、癌又は腫瘍細胞株由来の細胞の形質転換によって産生される。このような核酸分子は、腫瘍を有する対象由来の細胞へ又は腫瘍細胞株へインビトロで送達することができる。核酸分子は、GM-CSFタンパク質又はその断片の治療有効レベルを産生できるように細胞が受け取れる形態で対象の細胞に送達されなくてはならない。形質導入ウィルス例えば、レトロウィルス、アデノウィルス、及びアデノ随伴ウィルスベクターは、とりわけそれらの効率的な感染性及び安定な融合及び発現によって、遺伝子送達のために用いることができる例えば、CayouetteetalHumanGeneTherapy84234301997KidoetalCurrentEyeResearch158338441996BloomeretalJournalofVirology71664166491997NaldinietalScience2722632671996andMiyoshietalProcNatlAcadSciUSA94103191997を参照されたい。例えば、GM-CSFタンパク質、変異体、又はそれらの断片をコードするポリヌクレオチドをレトロウィルスベクターにクローン化して、その内因性プロモーターから、レトロウィルスの長い末端反復から、又は目的の標的細胞型に特異的なプロモーターから発現を生じさせることができる。使用できるその他のウィルスベクターは、例えば、ワクシニアウィルス、ウシパピローマウィルス、又はエプシュタインバールウィルスのような、ヘルペスウィルスを包含する例えば、MillerHumanGeneTherapy15141990FriedmanScience244127512811989EglitisetalBioTechniques66086141988TolstoshevetalCurrentOpinioninBiotechnology155611990SharpTheLancet337127712781991CornettaetalNucleicAcidResearchandMolecularBiology363113221987AndersonScience2264014091984MoenBloodCells174074161991MilleretalBiotechnology79809901989LeGalLaSalleetalScience2599889901993及びJohnsonChest10777S83S1995のベクターも参照されたい。レトロウィルスベクターは特に十分に開発されていて、臨床の場で用いられているRosenbergetalNEnglJMed3233701990AndersonetalUSPatNo5399346。最も好ましくは、ウィルスベクターは、TLR4アゴニストの細胞への送達の前、それと同時に、又はそれに続いて、GM-CSFポリヌクレオチドを本発明の細胞へ投与するために用いられる。ウィルスによらない手法も、GM-CSFをコードするベクターを腫瘍を有する患者由来又は腫瘍細胞株由来細胞へ導入するために用いることができる。例えば、GM-CSFをコードする核酸分子は、リポフェクチンFeigneretalProcNatlAcadSciUSA8474131987OnoetalNeuroscienceLetters172591990BrighametalAmJMedSci2982781989StaubingeretalMethodsinEnzymology1015121983、アシアロオロソムコイド-ポリリジン共役WuetalJournalofBiologicalChemistry263146211988WuetalJournalofBiologicalChemistry264169851989の存在下に核酸分子を投与して、又は手術条件下で微量注入してWolffetalScience24714651990細胞内へ導入することができる。核酸をリポソーム及びプロタミンと組合せて投与することが好ましい。GM-CSFコードベクターによるトランスフェクションと同時に、その前に、又はそれに続いて、細胞をTLRアゴニストと組合わせてリポフェクタミンで処理することができる。インビトロでトランスフェクションを実施する方法は、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、電気穿孔法、及び原形質融合の使用を包含する。リポソームもDNAを細胞内へ送達するために潜在的に有益である。本発明の方法で用いるためのcDNA発現は、何れかの適切なプロモーター例えば、ヒトサイトメガロウィルスCMV、シミアンウィルス40SV40、又はメタロチオネインプロモーターから指令され、何れかの適切な哺乳類調節エレメントによって調節されてもよい。例えば、必要により、特定の細胞型において優先的に遺伝子発現を指令することが知られているエンハンサーを核酸の発現を指令するために用いることができる。用いられるエンハンサーは、これに限定されないが、組織-又は細胞-特異的エンハンサーとして特徴付けられているものを包含できる。あるいは、遺伝子ゲノムを治療構築物として用いる場合は、調節を同種の調節配列又は、必要により、上記のプロモーター又は調節エレメントの何れかを包含する、異種起源由来の調節配列を介して行うことができる。本発明に含まれるその他の治療手段は、組み換えGM-CSFタンパク質、変異体、又はそれらの断片を分泌している細胞のような、組み換え治療薬を、可能性のある又は実際の疾患発症組織の部位に直接例えば、腫瘍内、腫瘍周辺又は全身的に例えば、従来の組み換えタンパク質投与技術によって、投与することを包含する。GM-CSFタンパク質を発現している投与される細胞の用量は、個々の患者の大きさ及び健康状態を包含する多数の要因によって決まる。何れかの特定の対象については、特定の投薬計画は時間をかけて、個人のニーズ及びこの組成物を投与している人間又は投与を監督している人間の専門的な判断に従って調節されなければならない。自己細胞サイトカイン、例えばGM-CSFを発現してTLR4抗原を含んでいる、自己遺伝子組み換え細胞の使用は、それぞれの患者の腫瘍が、他の患者から見出される形態学的に類似した、MHC適合腫瘍細胞とは異なる独特な一連の腫瘍抗原を発現するので、利益をもたらす。例えば、KawakamietalJImmunol148638643DarrowetalJImmunol14233293335及びHometalJImmunother10153164を参照されたい。対照的に、MHC適合腫瘍細胞は、患者が遺伝子組み換えされた腫瘍細胞産生のために腫瘍サンプルを得る手術を受ける必要がないという利益をもたらす。一実施態様では、腫瘍を有する患者を治療する方法は、対象から腫瘍細胞を得ること;細胞をGM-CSFをコードする発現ベクターと接触させること;細胞に食菌することをもたらすか又はTLRアゴニストを吸収する条件下で細胞をTLRアゴニストと接触させること;細胞を増殖不全にすること例えば、細胞に放射線を照射することにより;及び細胞を細胞を得た対象に投与することを含んでいる。組成物を哺乳類対象に皮内に、皮下に又は腫瘍内に投与することが好ましい。ある場合は、単一自己腫瘍細胞がGM-CSFだけを、或いは1つ又はそれ以上の腫瘍関連抗原と共にGM-CSFを発現するかもしれない。別の場合は、GM-CSF及び1つ又はそれ以上の腫瘍関連抗原が異なった自己腫瘍細胞によって発現されるかもしれない。本発明の一態様では、自己腫瘍細胞は、それらの発現に必要なプロモータ及び発現/制御配列に動作可能なように結合している、GM-CSFをコードする核酸配列を含んでいるベクターを導入することによって遺伝子的に組み換えられる。別の態様では、同一の自己腫瘍細胞又は第二自己腫瘍細胞は、それらの発現に必要なプロモータ及び発現/制御配列に動作可能なように結合している、1つ又はそれ以上の腫瘍関連抗原をコードする核酸配列を含んでいるベクターを導入することによって遺伝子的に組み換えられる。1つ又はそれ以上の腫瘍関連抗原をコードする核酸配列を、同一又は異なったベクターを用いて同一又は異なった自己腫瘍細胞内に導入することができる。1つ又はそれ以上の腫瘍関連抗原をコードする核酸配列は、プロモーターに動作可能なように結合している選択可能マーカー配列を更に含んでいても含んでいなくてもよい。望ましくは、自己腫瘍細胞は高レベルのGM-CSF及び/又は1つ又はそれ以上の前立腺腫瘍関連抗原を発現する。同種異系細胞一実施態様では、TLR4アゴニストを含んでいる例えば、TLRアゴニストをリポソーム賦形剤と共に含んでいる遺伝子組み換え同種異系細胞は腫瘍免疫原性を増強できる。本明細書で用いられている腫瘍細胞株は最初は腫瘍又はその他の腫瘍細胞に由来していた細胞を含んでいる。このような細胞は一般に、培養で無限の生育を示す。一態様では、対象の免疫応答を増強する方法は:a腫瘍細胞株を得ること;b細胞が増大したレベルのサイトカイン、例えば、GM-CSFを産生できるように細胞株を遺伝子組み換えすること;c細胞を、細胞がアゴニストを吸収するような条件下で、TLRアゴニストと接触させること;d組み換え腫瘍細胞株が増殖不全になるようにすること;及びd腫瘍細胞株を腫瘍細胞株を得たのと同じ型の腫瘍細胞を有するかそれを発症する可能性がある対象に投与することを包含している。ある実施態様では、投与された細胞は同種異系であって、対象に対してMHC適合性であるか又は適合性ではない。このような同種異系の株は、前もって製造できる、特性化される、公知の量のTLR4アゴニストを含有していて及び同等量のサイトカインを生産するバイアルに等分できて、そして対象に投与するためによく特性化された細胞が得られるように、保存即ち、凍結されるという利点をもたらす。遺伝子組み換え細胞を産生する方法は、例えば、参照により本明細書に明確に取り込まれている、国際公開第WO00/7286号公報に記載されている。同種異系細胞株組成物を患者に導入するために何れの投与経路も用いることができ、組成物を皮内、皮下又は腫瘍内投与することが好ましい。TLRアゴニストR848、GLA、細菌性リポペプチド、細菌性リポタンパク質、細菌性リポタイコ酸、ミコバクテリアリポグリカン、酵母ザイモサン、ポリン、ウィルス性二重螺旋RNA、リポ多糖類、リピドA、モノホスフォリルリピドAMPL登録商標、AGPs、フラゲリン、ウィルス性一重螺旋RNA、イミダゾキノリン類、細菌性DNA、CpGDNA、ヘモゾイン、尿路疾患性細菌、及び原生動物プロフィリンを包含する:適切なTLRアゴニスト、又はアゴニストの組合わせの何れも、本明細書に提供される免疫原性組成物の製造に用いることができる。これらのTLRアゴニストは当該技術分野で公知であり、例えば、ReedetalTrendsinImmunol3023322008に記載されていて、これはさらにアジュバント及び賦形剤の総括を提供している。上記Reedの文献はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。投与サイトカイン例えば、GM-CSFを発現するように遺伝子組み換えされてTLRアゴニストを含む腫瘍細胞は投与前に低温保存できる。このような細胞は増殖が不可能増殖不全になるように処理されことが好ましい。このような細胞は、増殖不全にされるが、最終的な細胞死以前にGM-CSFの産生を未だ可能にするような放射線照射によって増殖不全にされることが最も好ましい。一実施態様では、本発明の細胞は、患者に投与する前に、約50~約200ラド/分、又は約120~約140ラド/分の用量で照射される。細胞がさらに増殖するのを実質的に100阻害するのに十分な総用量で細胞を放射線照射することが好ましい。約10,000~20,000ラド、適切には、約15,000ラドの総用量で細胞を放射線照射することが望ましい。一般に治療過程において、TLRアゴニストを含んでいるサイトカイン例えば、GM-CSF発現細胞の1回以上の投与を対象に送達する。特定の治療過程に依存して、多様な時間間隔で反復される治療での一時点で複数回注入を行うことができる。例えば、初期又はプライミング治療に1回又はそれ以上のブースター治療を続けることができる。このようなプライミング及びブースター治療は通常、同じ投与経路で及び/又はほぼ同じ部位に送達される。複数回用量を投与する場合は、最初の免疫化用量はその後の免疫化用量より高くてよい。例えば、GM-CSF及び腫瘍抗原生産細胞の5×107~8個の最初の用量に107~8個~3×107~9個の数回のブースター用量を続けることができる。TLRアゴニストを含んでいる遺伝子組み換え細胞の単回注入は一般に、少なくとも約105~109細胞の間、例えば、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、5×107、×108、×109細胞である。サイトカイン及び腫瘍抗原産生細胞の数は、所定の細胞性免疫治療組成物によって産生されるサイトカイン及び/又は腫瘍抗原のレベルに従い、調節できる。好ましい実施態様では、組み換え細胞は筋肉内又は静脈内の何れかで注入される。ある実施態様では、細胞性免疫治療のサイトカイン産生細胞は、100万細胞当り、24時間で少なくとも1、5、10、20、75、100、200、300、400、500ngのGM-CSFを産生できる用量で投与される。ある実施態様では、本発明の免疫原性組成物は100万細胞当り、24時間で少なくとも500ngの特定腫瘍抗原を産生できる用量で投与される。最適な細胞用量及び比率の決定は、本明細書に提示されている開示を考慮すると、日常的確認事項であって、通常の技術を有する実施医の技術範囲内である。本発明の細胞は、細胞を作成するために用いた追加成分の大部分を除去するために処理される。特に、ウシ胎仔血清、ウシ血清成分、又は培地中のその他の生物補填物質を除去する。一実施態様では、細胞を、例えば反復弱遠心分離によって、適切な薬理学的に適合する賦形剤中で洗浄する。適合性賦形剤は、多種の細胞培養培地、等張食塩水、生理的適合性緩衝液、例えば、リン酸又はヘペス、と共に又は無しで、及びブドウ糖のような栄養素、生理学的に適合するイオン又はアミノ酸、特にその他の免疫原性成分が欠けているものを包含する。インビボで投与するための組成物は、更に薬学的に許容される、適切な担体又は希釈剤を含むことができる。例えばアルブミン及び血漿分画のような担体、及び不活性な増量剤を用いることができる。このような組成物を製造する方法は当該技術分野で記載されている。例えば、RemingtonsPharmaceuticalSciences19theditionGenarroAEdを参照されたい。医薬剤形において、本明細書に記載されている免疫原性組成物は単独で、又は当該技術分野で公知であるような他の薬学的に活性な化合物と適切に関連させて、更には併用しても用いることができる。医薬治療本発明は、腫瘍の治療に有用な腫瘍細胞に基づいたワクチン例えば、GM-CSFを発現してTLR4アゴニスト又はその断片を含んでいる増殖不全腫瘍細胞を包含する。ある特定の実施態様では、本発明の免疫原性組成物は新生物又は腫瘍に特異的な抗原に対する免疫応答を誘発又は増強するために有用である。本明細書で用いられるような表現増強された免疫応答は、特異的な免疫活性化の検出可能な増大が検出可能である例えば、B細胞及び/又はT細胞応答の増大ことを意味する。増強した免疫応答の例は、本発明のサイトカイン発現細胞性ワクチンの投与前には低レベルで検出された抗原に結合する抗体の量の増大である。別の例は、増大した細胞免疫応答である。細胞免疫応答は、T細胞を包含して、インビトロで例えば、クロム放出アッセイで測定することにより又はインビボで観察できる。増強した免疫応答は、一般に、免疫細胞の特異的集団の増大とともに起こる。別の実施態様では、本発明の免疫原性組成物は腫瘍細胞の生育を阻害するために有用である。語句腫瘍の生育を阻害することは、腫瘍量、腫瘍体積、腫瘍細胞の量又は腫瘍の生育速度の測定可能な減少を示す。腫瘍量の測定可能な減少は当業者に公知の多くの方法で検出できる。アクセス可能な腫瘍の直接測定、腫瘍細胞例えば、血中に存在するの算出、腫瘍抗原例えば、前立腺特異抗原PSA、アルファーフェトプロフェンAFPの測定及び多くの可視化技術例えば、MRI、CATスキャン及びX線を包含する。腫瘍生育速度の減少は一般に、癌を有する対象のより長い生存期間と相関している。更に別の態様では、本発明の細胞に基づいたワクチンは、腫瘍の生育及び/又は腫瘍細胞の周辺組織へ侵入するか或いはまた転移する傾向を予防又は減少するために有用である。治療用途に関しては、例えば、本明細書に開示されているワクチンは、生理食塩水のような薬学的に許容される緩衝液中で製剤化して、全身的に又は局所的に投与することができる。好ましい投与経路は、例えば、腫瘍内、腫瘍周辺、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮内注射を包含し、これらは免疫応答を誘発又は増強するのに十分なものである。ヒト患者又はその他の動物の治療は、生理的に許容される担体中の、本明細書で確認した治療薬の治療有効量を用いて実施できる。適切な担体及びそれらの製剤化は、例えば、RemingtonsPharmaceuticalSciencesbyEWMartinに記載されている。投与する治療薬剤の量は、投与の方法、患者の年齢及び体重によって、並びに腫瘍の臨床的症状によって変化する。場合によっては化合物の特異性が増大するためにより低い量を必要とするが、一般に、量は腫瘍に関連している他の疾患の治療に用いられている他の薬剤に用いられている量の範囲内であるだろう。医薬組成物の製剤化腫瘍治療のための細胞に基づくワクチンの投与は、他の成分と組合わせて、腫瘍を改善し、減少し、又は安定化するのに有効なワクチンの濃度をもたらす適切な方法の何れかによることができる。ワクチンは何れかの適切な量で、何れかの適切な担体物質中に含まれてよく、一般に組成物の総重量の1~95重量の量で存在する。細胞に基づくワクチンは非経口例えば、皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内投与経路に適している剤形で提供されてもよい。好ましい投与方法は筋肉内、腫瘍内、又は静脈内注入である。医薬組成物は従来の医薬実務に従って製剤化できる例えば、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacyedARGennaroLippincottWilliamsWilkins2000及びEncyclopediaofPharmaceuticalTechnologyedsJSwarbrickandJCBoylan19881999MarcelDekkerNewYorkを参照されたい。非経口用組成物細胞に基づくワクチンを含んでいる医薬組成物は、従来の、非毒性の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有している、剤形、製剤中で、又は適切な送達デバイス或いは移植を介して、注射、輸液又は移植皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内等によって非経口投与できる。このような組成物の製剤及び調製物は医薬製剤分野の当業者に周知である。製剤は、前記のRemingtonTheScienceandPracticeofPharmacyに見ることができる。非経口で使用する組成物は、単位剤形例えば、単回用量アンプルで、又は数回用量を含有しているアンプルで提供することができ、及びその中に適切な防腐剤を添加してもよい以下を参照されたい。組成物は溶液、懸濁液、乳濁液、輸液用具、又は移植用の送達デバイスの形態であってよく、或いは使用前に水又はその他の適切な賦形剤で再構築する乾燥粉末として存在していてもよい。腫瘍を減少又は改善する活性薬剤と離して、組成物は非経口投与で許容される担体及び/又は賦形剤を含有することができる。活性な治療薬を放出制御のために、微小球、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム等に取り込むことができる。更に組成物は、懸濁、溶解、安定化、pH調節剤、張力調節剤、及び/又は懸濁化剤を含有することができる。上で示したように、本発明の医薬組成物は、無菌注射に適している形態であってよい。このような組成物を調製するために、適切な治療薬複数を含むを非経口投与で許容される液体賦形剤に溶解又は懸濁する。とりわけ、使用できる許容可能な賦形剤及び溶媒は、水、適量の塩酸、水酸化ナトリウム又は適切なバッファーを添加して適切なpHに調節した水、1,3-ブタンジオール、リンゲル溶液、及び等張の食塩溶液並びにブドウ糖溶液である。水性製剤は1つ又はそれ以上の防腐剤例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、エチル又はn-プロピルも含有することができる。1つの化合物が水に難溶か殆ど溶けない場合は、溶解増強剤又は溶解剤を添加してもよい、或いは溶媒が10~60w/wのプロピレングリコール等を含んでもよい。併用治療任意に、本発明の癌ワクチンに基づく治療剤を他の何れかの化学療法剤と併用して投与することができる:このような方法は当業者にとって公知であってRemingtonsPharmaceuticalSciencesbyEWMartinに記載されている。特に、本発明の免疫原性組成物を、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、オーリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、BMS184476、2,3,4,5,6-ペンタフルオロ-N-3-フルオロ-4-メトキシフェニルベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、N,N-ジメチル-L-バリル-L-バリル-N-メチル-L-バリル-L-プロリ-1-L-プロリン-t-ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、3’,4’-ジデヒドロ-4’-デオキシ-8’-ノルビン-カロイコブラスチン34didehydro4deoxy8norvincaleukoblastine、ドセタキソールdocetaxol、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチンBCNU、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジンDTIC、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、ドキソルビシンアドリアマイシン、エトポシド、5-フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン類、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチンCCNU、MDV3100、メクロレタミンナイトロジェンマスタード、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、タキサン、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、RPR109881リン酸エストラムスチン、タモキシフェン、タソネムリン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、及びビンフルニンの1つ又はそれ以上の何れかと併用して投与することができる。本発明の併用療法では、治療成分を同時に、又は互いに1、3、5、7、14、21又は28日以内に、腫瘍の生育を阻害するのに十分な量を投与する。癌のタイプ及びその進展段階に応じて、併用療法は、癌を治療する、癌の拡散を遅らせる、癌の生育を遅らせる、原発腫瘍から身体の他の部分へ拡散しうる癌細胞を殺すか止める、癌に起因する症状を軽減する、又は最初の場所で癌を阻止するために用いることができる。併用療法は、痛み及び不快感を引き起こす癌細胞を除去して、人々がより快適に暮らすことの手助けもする。本発明の併用投与は、それぞれの化合物を単独で投与することに比べて同様な効果及びより低い毒性をもたらしつつ、それぞれの化合物のより低い用量の投与を可能にする。あるいは、このような併用は腫瘍の治療において同様なあるいは減少した毒性を持って改善された効果をもたらす。キット本発明は、腫瘍を治療又は予防するためのキットを提供する。一実施態様では、キットは単位剤形内に腫瘍細胞に基づくワクチンの有効量を含有している治療又は予防組成物を包含している。ある実施態様では、キットは治療又は予防細胞組成物を含有する滅菌容器を含んでいて;このような容器は箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で公知のその他の適切な容器形態であってよい。このような容器はプラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属泊、又は医薬品を保持するのに適している材料で作ることができる。必要に応じて、本発明の腫瘍細胞に基づくワクチンは、癌例えば、メラノーマ、乳癌を有しているか、又は癌が進展する危険性のある対象にワクチンを投与するための説明書と共に提供される。説明書は通常、腫瘍を治療又は予防するための組成物の使用についての情報を含んでいる。別の実施態様では、説明書は以下のものの少なくとも1つを含んでいる:治療薬の説明;虚血又はその症状を治療又は予防するための投与計画及び投与;事前注意;警告;適応症;禁忌;過量投与情報;副作用;動物薬理;臨床研究;及び/又は参考文献。説明書は容器存在するときに直接、又は容器に貼付したラベルとして、或いは容器内に又は容器と共に供給される別個のシート、パンフレット、カード、又はホルダーとして印刷できる。本発明の実施には、別段の指示がないかぎり、分子生物学組み換え技術を含む、微生物学、細胞生物学、生物化学及び免疫学の従来技術を使用するが、これらは十分に当業者の理解の範囲内である。このような技術は、MolecularCloningALaboratoryManualsecondeditionOligonucleotideSynthesisAnimalCellCultureMethodsinEnzymologyHandbookofExperimentalImmunologyGeneTransferVectorsforMammalianCellsPCRThePolymeraseChainReactionCurrentProtocolsinImmunologyのような文献に十分に説明されている。これらの技術は本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの製造に適用でき、このようにして本発明を作成し実施する際に考慮できる。特定の実施態様のために特に有用な技術は以下のセクションで検討される。以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、及び治療方法をどのように作成して用いるかについての完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが彼らの発明と見なしているものの範囲を限定することを意図していない。実施例1:TLRアゴニストで増強したEnhancedGVAXTEGVAXの製剤化。局所領域に固有の免疫細胞活性化を増強し、更にトール様受容体4TLR4刺激の全身毒性を最小化して腫瘍細胞に対するTLR4刺激を最小化するために、リポ多糖類LPSをGVAXTEGVAX-TLR4強化GVAX内に製剤化した。致死的放射線照射の前に、GVAX細胞内へのLPSの吸収を最適化するために市販のリポソームベクター-リポフェクタミン-を用いた。吸収の程度を定量するために、LPS-ジピロメテンボロンジフルオライドBODIPYフルオロフォアを用いてLPS-BODIPYで製剤化する細胞の98を有するように最適化する各種条件を試験した図1。細胞当り吸収されたLPSの総量を定量するために、リムルスアメボサイトライゼートLimulusAmebocyteLysate:LALアッセイCambrexを用いて、LPS製剤を最適化したリポフェクタミン方法によって、5×105細胞内に4.73±0.2ngのLPSが吸収されたことを明らかにした。それぞれのインビボマウス腫瘍実験に対して、TEGVAX製剤中のLPSとGM-CSFの同等量を保証するために、TEGVAXのアリコートをLALアッセイ更にはGM-CSFELISAアッセイを用いて試験した。典型的な分泌されたGM-CSFは50~200ng/ml/106細胞/日の範囲であった。実施例2:TEGVAXはインビボで複数のマウス癌モデルにおいて抗腫瘍応答を誘発する。TEGVAXの効果を最初にB16メラノーママウスモデルで試験し、そこでは治療モデルに腫瘍を移植した3~5日後にTEGVAXを腫瘍内に送達した。腫瘍内注射の理論的根拠の一部は、腫瘍と流入領域リンパ節の間を循環している局所領域の抗原提示細胞APCsを標的としていたことを保証することであった。アネルギー性で耐性の腫瘍特異的T細胞は早ければB16注入の3日後に現れるのでこれらの時点を選択した。図2に示したように、TEGVAXはGVAX処置と比べるとB16腫瘍の生育速度を減少させた。これらの生育速度の統計的に有意な差を生存曲線の差に置き換えた図2。しかしながら、TEGVAXで処置した全てのC57B1/6マウスは最終的に注射部位に大きい腫瘍を発症した。5×105細胞当り4.73ngのLPSが測定されたことを考量して、コントロール実験を実施して、TEGVAX処置群と等モル量のLPSを腫瘍周辺に注入した。ここで、これらのマウスは、GVAX又はPBSで処置した腫瘍担持マウスと生育速度又は生存率に差を有していなかった図7。リポソーム製剤なしでGVAXを注射した等モルのLPSは、PBSコントロール群と比べて抗腫瘍応答を明らかにせず、LPSの細胞内製剤がその抗腫瘍応答に対して重要であることを示唆した図7。TEGVAXも全身性抗腫瘍応答を誘発した図8。B16メラノーマモデルを用い、マウスは腫瘍周辺又は腫瘍接種部位の対側肢の何れかをTEGVAXで処置して、両処置群が同様なインビボ腫瘍生育速度を示した図8。TEGVAXが別のマウス腫瘍モデルにおいても抗腫瘍応答を明らかにできるか否かを試験するために、野生型TLR4Rを有する同系C3H/HeOUJマウスの横腹にSCCFVII/SF細胞を皮下注射した図2。腫瘍が触診可能になった時点で、腫瘍をマウスSCCFVII/SF扁平上皮癌細胞から調製したTEGVAX又はGVAXの何れかで処置した。B16モデルを用いるTEGVAX実験と同様に、TEGVAXは有意な抗腫瘍応答を示した。今度も、TEGVAXで処置した全てのマウスが最終的に安楽死を必要とした巨大な腫瘍を発症した。SCCFVII/SFマウスモデルにおける口腔腫瘍の舌及び口腔底部の測定が本来不正確であるので、同所注射は実施しなかった。最後に、CT26大腸癌モデルでTEGVAXも試験して、これも抗腫瘍応答を示し、ここでは移植した腫瘍の生育速度がGVAX単独で処置したCT26腫瘍より統計的に遅かった図2。CT26に対して、TEGVAXで処置したマウスの40~60が実際に腫瘍の退行を有していた。CT26細胞を生存したマウスから採取して腫瘍を再移植すると、どの腫瘍も生育せず、完全な免疫治療の治癒を明らかにした。CT26モデルに対して、TEGVAXと等モル量の致死的に放射線照射したHEK293細胞で製剤化したLPSも試験した。同一の腫瘍抗原及びGMCSFのセットがない細胞に基づくワクチン内に製剤化したLPSはCT26モデルにおいて抗腫瘍応答を引き起こさなかった。実施例3:TEGVAXへの抗腫瘍応答はMyD88依存性である。上記のインビボ抗腫瘍効果が実際にTLR4シグナル伝達の導入に起因していたことを確認するために、B16腫瘍をMyD88-/-遺伝子型を有するC57B1/6マウスに接種した。次いで、腫瘍をTEGVAX又はGVAXで処置した。図3は、GVAX細胞内に構築されたTLR4アゴニストの添加による増強された抗腫瘍応答が、実際に、TLR4刺激に続発することを示している。GVAX群で先に言及された僅かな差は、最終的にPBS処置群の生育曲線と重なった図7。MyD88はTLR4シグナル伝達の必須細胞内メディエーターであって、MyD88欠損マウスにおいてTLR4シグナル伝達の非存在が、野生型C57B1/6マウスで一貫して認められた増強したインビボ抗腫瘍応答をもはや明らかにしなかった。実施例4:TEGVAXは腫瘍微小環境においてT細胞浸潤及びAPCの増強を誘発する。TEGVAX処置によるインビボ抗腫瘍応答の潜在的なメカニズムを検討するために、処置後に腫瘍組織を摘出してリンパ球浸潤を分析した。図4に示したように、TEGVAXで処置した腫瘍は、コントロール処置及びGVAX処置腫瘍と比べて、CD4及びCD8浸潤を定量的に増大していた。さらに、TLR4アゴニストが局所に常在しているAPCを成熟するように刺激すると仮定して、CD86に対する抗体で免疫染色を行って、TEGVAXで処置した腫瘍微小環境において定量的に増強したCD86細胞が観察された。マクロファージが腫瘍組織内で増大しているか否かも試験したが、処置群の間でF4マクロファージの湿潤に有意な差は見出されなかった。実施例5:局所的流入領域リンパ節における樹状細胞活性化の増強。図4の免疫染色データはTLR4アゴニストを製剤化した細胞ワクチンは活性化した局所領域の樹状細胞の数を増大できるという仮説と一致していた。DCはエフェクター細胞が免疫寛容性になるか或いは細胞毒性の何れになるかを決定できる重要な一次抗原処理細胞である。理論に縛られるつもりはないが、GVAXに吸収されたLPSは、細胞残屑及び腫瘍抗原とのミセルのように浸潤DC内に取り込まれると思われる。従って、TEGVAX処置によって増大した数の活性化した局所領域のDC集団が存在すると思われる。この仮説を試験するために、PBS、GVAX、又はTEGVAXの何れかで処置した腫瘍担持マウス由来の流入領域リンパ節から樹状細胞を精製して、B220及びCD11cを用いて従来型のDC集団をゲートした。これらのゲートした細胞由来DC活性化マーカーCD86、CD80及びMHCIIの多様性染色が、GVAX処置群又はコントロール処置群と比べてTEGVAX処置群由来の樹状細胞がより多くの活性化DCの集団を有していることを示す図5。実施例6:腫瘍特異的細胞傷害性T細胞はTEGVAXで処置したマウス中で増大する。SCCFVII/SF及びB16モデルと組合せてCT26モデルを検討する1つの理論的根拠は、AH1特異的細胞傷害性T細胞の定量のための試薬の利用可能性であった。局所領域樹状細胞を活性化するTEGVAXのインビボ抗腫瘍応答が腫瘍特異的細胞傷害性エフェクター細胞の下流集団を増大するかを試験するために、ELISPOTアッセイを実施した。免疫原性MHCクラスILd制限AH1ペプチドを用いて、流入領域リンパ節及び脾臓由来のT細胞を採取して、AH1ペプチドAPCでパルスしたCT26に対する免疫優性ペプチドの存在下で、ELISPOTアッセイによってIFN産生細胞傷害性T細胞をスクリーニングした。図6Aに示したように、TEGVAXによる処置の5日後に最小量のAH1特異的T細胞が検出されたに対して、8日目までに、TEGVAX群の、流入領域リンパ節及び脾臓の両方に統計的に有意なAH1特異的T細胞が存在した。インビボ細胞傷害性Tリンパ球CTLアッセイも、未置群と比べてTEGVAX処置群においてAH1ペプチドに対する増強された細胞傷害性T細胞プライミングも明らかにした図6B。B16モデル由来のp15E特異的T細胞を用いるインビボCTLアッセイもTEGVAX群に増強されたp15E特異的T細胞を明らかにした。実施例7:GVAXと組合わせたTLR4アゴニストは、腫瘍細胞の生育を減少してAH1特異的細胞傷害性T細胞の数を増大した。上で報告したように、TEGVAXは3つの異なったマウスモデルにおいてインビボ腫瘍応答を改善した。B16メラノーマモデル、CT26大腸癌モデル、そしてSCCVII舌扁平上皮癌モデルにおいて、確立された腫瘍に腫瘍内注入したTEGVAXがGVAX単独と比べて腫瘍の生育を減少した。腫瘍接種後のTEGVAXを用いる全身処置もインビボでB16の生育速度を減少させた。抗腫瘍応答を誘発する免疫学的メカニズムを試験するために、CT26マウスモデルを抗腫瘍細胞傷害性T細胞CTL応答を検討するために用いた。十分に特性化されているELISPOTアッセイ及びインビボCTLアッセイを用いると、TEGVAXで処置したマウスは処置の8日後までに増大した数のAH1特異的細胞傷害性T細胞CTLを示した。これらの実験で、前臨床モデルにおいてTLR4アゴニストをGVAXと併用することにより、腫瘍生育の速度が減少した。実施例8:GVAX並びにTLR7及びTLR8アゴニストR848と組合わせた合成TLR4アゴニスト-グリコピラノシルリピドA類縁体GLA-はメラノーマ細胞の生育を有意に減少した。腫瘍微小環境内のTLRシグナル伝達の1つ以上のタイプが抗腫瘍応答を改善できるか否かを確認するために、TLR4アゴニストの別の形態である、GLA合成グリコピラノシルリピドA類縁体をGVAXと共に用いた。GVAXに構築したGLAをR848、TLR7及びTLR8とも組合わせた。B16メラノーママウスを用いてインビボ腫瘍処置実験を実施した。B16メラノーマモデルを用いると、GVAX、GLA、及びR848の組み合わせは野生型マウスにおける悪性B16腫瘍の生育を阻止した図9。ワクチン製剤を腫瘍接種の2~4日後に注入した。一般的に、このような免疫原性腫瘍細胞が少ない場合は、GVAXそれ自身はインビボのB16の生育を阻止しない。これらのマウスにB16メラノーマ細胞株を再注入すると、投与された腫瘍細胞は生育しなかった。p15E特異的CD8T細胞を定量するためにELISPOT及びインビボCTLアッセイの両方を実施して、GVAX、GLA、R848で処置したマウスがGVAX単独で処置したマウスより有意によりp15Eに特異的なCD8T細胞を有していた。実施例9:GVAX/GLA/R848の組み合わせは樹状細胞の活性化を増強する。器質性の腫瘍組織を治療するために、GVAX/GLA/R848製剤を用いて触診可能なB16腫瘍を処置した。腫瘍接種の7~10日後にワクチン製剤を触診可能な腫瘍組織から離れた部位に注入した。再び、TLRアゴニストで増強されたGVAXは腫瘍生育速度を減少した図10。ELISPOT及びインビボCTLアッセイを実施してそれぞれの群でp15E特異的CTLのレベルを定量し、そしてその結果はGVAX/GLA/R848で処置したマウスがインビボ腫瘍生育速度に相関するp15E特異的T細胞の最も多い数を有していたことを明らかにした図11。GVAX/GLA/R848製剤によるこれらの抗腫瘍応答を考慮して、TLRアゴニストで増強したワクチンが樹状細胞を刺激したと推測した。従って、各処置群由来の流入領域リンパ節及び脾臓を採取して、樹状細胞の活性化状態を試験した。CD11c及びB220細胞上でCD80及びCD86活性化マーカーを用いると、GVAX/GLA/R848処置群は有意に増強された活性化樹状細胞を示した図12。各処置群由来の腫瘍組織を、免疫組織化学を用いて分析した。GVAX/GLA/R848で処置した腫瘍により多い数のCD4、CD8、及びCD86細胞が見出された。最後に、各処置群でサイトカイン環境を試験してTLRアゴニストで処置したマウスにおいてIl-12が上昇したか否かを確認した。CD11c陽性細胞を流入領域リンパ節及び脾臓の両方から採取して、T細胞レパートリーを抗腫瘍Th1応答に向けさせる能力に関するIl-12サイトカインのレベルを試験した図13。GVAX/GLA/R848で処置したマウスが、T細胞環境をTh1応答に向けさせる主要なサイトカインである、Il-12を発現するCD11c細胞の統計的に有意な数を有していた。これは流入領域リンパ節及び脾臓の両方で著名であった。要約すると、これらの結果はGVAX基盤を複数のTLRアゴニストと共に用いる方法が固形腫瘍の治療における効果を増大したことを示した。GVAXとTLR4及びTLR7/8アゴニストとの組合わせはインビボでの抗腫瘍応答を改善する。改善された抗腫瘍応答は活性化樹状細胞の増大した数、腫瘍特異的CTLの増大した数、流入領域リンパ節及び脾臓内にIl-12を分泌できるCD11cの増大した数と相関している。実施例10:GVAX細胞ワクチンとのTLRアゴニストの特定の製剤化時間は、抗腫瘍活性のインビボの有効性を改善する。TEGVAX製剤の形成中のTLRアゴニストのGVAXとの培養時間の抗腫瘍活性に対する効果を評価した。GLA/R848のGVAXとの培養の長さがそれぞれの製剤で変化するように30分、1時間、及び2時間GLA/R848とGVAXを含む3つのTEGVAX製剤のパネルを製造した。それぞれのTEGVAX製剤を確立されたB16腫瘍を担持しているマウスに投与して、24時間に渡ってB16腫瘍の相対体積を測定した図14。コントロールとしてGVAXとGLA/R848を投与した図14における別々に。追加のコントロールは賦形剤のみからなっていた。GLAとR848を賦形剤の存在下でGVAXと放射線照射の30分未満前に混合すると、製剤は抗腫瘍活性を有さなかった。GVAXとTLRアゴニストを2時間を超えて培養しても抗腫瘍効果は消失した。賦形剤の存在下にGLA及びR848をGVAXと1時間混合した時、TECVAX製剤において最大の抗腫瘍効果が見られた。上記の結果は以下の方法及び材料を用いて得られた。マウス腫瘍細胞株SCCFVII/SF頭頸部扁平上皮癌、B16-F0メラノーマ、及びGM-CSFを分泌するように形質導入されたB16-F0細胞株を、10の加熱不活化したウシ胎仔血清、ペニシリン100U/ml及びストレプトマイシン100U/mlを含有しているRPMI1640培地中で培養した。CT26結腸直腸癌細胞株を、MEM非必須アミノ酸SigmaStLouis、1mMのピルビン酸ナトリウム、及び2mMのL-グルタミンを加えて、同様に培養した。GM-CSFで形質導入したバイスタンダーB78HI細胞をCT26と同じであるが、ストレプトミセスハイグロスコピカスStreptomyceshygroscopicus由来のハイグロマイシンB1g/LRocheAppliedScienceIndianapolisINを加えた培地で培養した。全ての細胞を5の加湿CO2中、37°Cで培養した。腫瘍接種の10日前にワクチンを注射するワクチン接種モデルで試験したGVAXワクチン細胞株は3つのGCAX株全てで腫瘍の生育を示さなかった。マウス成熟日齢>50日雌性C57BL/6、Balb/C、及びC3H/HeOUJマウスをJacksonLaboratoryから購入して、theJohnsHopkinsAnimalCareandUseCommitteeに従って飼育した。C57BL/6MyD88-/-マウスをDrFranckHousseauから入手した。TEGVAX製剤リポフェクトAMINE試薬120μg/ml及びEscherichiacoli026:B6由来のLPS10~25μg/mlを組合わせてリポソーム複合体にした。細胞をリポ多糖類LPS製剤へ5×105細胞の密度で播種して24時間後にリポソーム-LPS複合体と6時間培養し、PBSで5回洗浄し、次いでマウスに注入した。細胞に組み込まれたLPSを定量するために、製造会社の指示の通りにLimulusAmebocyteLysateアッセイを実施した。0~3.0EU/mlからのLPS23EU/ngをスタンダードとして用いた。致死的放射線照射の前にTEGVAXを、生存細胞生育を保証するために培養した。アネキシン染色が製剤化後にアポトーシスの証拠がないことを立証した。GLA/R848を含有しているTEGVAX製剤について、TLRアゴニストをGVAX細胞と共に吸着させるための賦形剤は、ホスファチジルコリンを伴う安定なスクアレン水中油型エマルションであった。TLRアゴニストを賦形剤中、GLA1mg/ml及びR8480.2mg/mlの濃度で製造した。培養したGVAX細胞をトリプシン処理して洗浄した。洗浄後、細胞を10,000ラドで致死的に放射線照射した。賦形剤存在下のGLA及びR848を放射線照射したGVAX細胞と混合して、マウスに注入する前に、室温で1時間培養した。典型的には、20μlのGVAXと20μlのGLA/R848/賦形剤を注入の前に混合した。インビボワクチン処置アッセイC57BL/6マウスの右側腹内に5×104個のB16-F0細胞を皮下注射した。移植の3~5日後に106致死的放射線照射150GyしたB16GM-CSFGVAX、106致死的放射線照射150GyしたLPS製剤化GVAXTEGVAX製剤又はLPS吸収293細胞を腫瘍周辺に注入した。一部の場合には、腫瘍接種肢の対側肢にワクチンを注入した。C3H/HeOUJマウス及びBalb/cマウスを、それぞれ同様な方法で、SCFVII/SF細胞及びCT26細胞と共に用いた。免疫組織化学マウス由来の凍結CT26腫瘍を10μmの厚さにカットして1のBSAで室温で30分間ブロックした。4°Cで1時間培養した抗マウスCD45eBioscience及び抗マウスCD4-フルオレセインイソチオシアネートFITC、CD8-FITC、CD86-FITC抗体BDPharmingenを一次抗体として用いた。抗CD45-Cy3Invitrogenを、幾つかの場合に二次抗体として用いた。DAPIを10分間対比染色として用いた。倍率40倍の無作為に選択した10の視野にある細胞の数を数えた。NiconEclipseF800がこれらの実験に用いた顕微鏡で、NiconDSQilmcがカメラで、そしてNISElementAR30がソフトウェアであった。腫瘍障害のあるBL/6マウス由来の脾臓及び流入領域リンパ節をGVAX及びTEGVAX処置の5日後に摘出した。スライスした脾臓をDNAseIRoche及び市販の組織解離用の酵素混合物LIBERASEBLENDZYME220000MandlUmlRocheを含有している培地で酵素的に消化させた。DCが豊富な集団を、CD3及びCD19を除去して得て、そしてCD11c及びB220染色した。CD11cB220がゲートしたDCを、BDBiosciencesからのCD80、CD86、及びMHCII抗体を用いる多色FACS分析で評価した。ELISPOTアッセイ酵素結合免疫吸着スポットELISPOTプレートMultiScreenHTSfilterplateMilliporeをマウスインターフェロンIFNγ抗体AbMabTechで24時間コーティングして、4T1乳癌細胞を10μg/mlのAH1ペプチドで1晩パルスした。翌日、脾臓及びリンパ節をマウスから摘出した。106個のCD8a細胞を、105個のパルスしていない4T1細胞と共培養するために、105個のパルスした4T1細胞と共培養するために、又は陽性コントロールのために1μMのPMA及び10ng/mlのイオノマイシンで刺激するために、3組を固定した。第3日目に、プレートをビオチニル化した抗マウスIFN-γ-AbMabTechと培養し、次いでELISPOTBD用のストレプタビジン-HRPと培養した。プレートをELISPOTBD用のAEC基質試薬セットを用いて展開させて、ELISPOTプレートリーダーImmunospotを用いて分析した。インビボCTLアッセイインビボ追跡用の市販試薬CellTrace登録商標CFSECellProliferationKitMolecularProbesをTEGVAXで処置したか処置していないCT26腫瘍障害マウスにおけるCTLの死滅パーセントを試験するために用いた。脾細胞をβ-ガラクトシダーゼβ-gal又はAH1ペプチドの何れかで10μg/ml濃度で90分間処理してパルスした。β-gal集団をCFSEで低く標識0.5μMして、AH1集団をカルボキシフルオレセン二酢酸スクシニミジルエステルCFSE標識5μMした。10分間培養した後、両方のCSFE標識化細胞をマウスの3群に107細胞/マウス注入した。注入の24時間後に脾細胞を採取して分析した。統計解析2つの処置群間の統計的な有意差を見積もるために、対応のあるt検定を用いて両側p値を計算した。統計的に有意なp値を以下のように標識した。p<0.01及びp<0.05。データはエクセルソフトウェアを用いて分析した。その他の実施態様前述の説明から、本明細書に記載されている本発明を、様々な使用及び条件に適用するために、改変及び修正できることは明らかであろう。このような実施態様もまた以下の特許請求の範囲の範囲内にある。本明細書の可変部の定義の何れかにおける構成要素のリストの記述は、単一構成要素又はリストされている構成要素の組合わせ又は小組合わせの何れかとしてのその可変部の定義を包含している。本明細書の実施態様の記述は、単一の実施態様の何れかとしての、又はその他の何れかの実施態様又はそれらの部分との組合わせてとしてのその実施態様を包含している。本明細書に述べられている全ての特許及び刊行物は、それぞれの独立した特許及び刊行物が参照により取り込まれることを具体的にそして個々に示しているのと同じ程度に、参照により本明細書に取り込まれている。"