"中間精製およびポリッシングの工程を少なくとも含む、バイオリアクターにおいて生成された細胞ブロスからの抗体の精製方法であって、前記新規精製工程は、合わせた連続的インラインのAEXおよびCEXクロマトグラフィーを含む、方法。分離混合物をフロースルー画分として生成する前記アニオン交換AEXクロマトグラフィー工程が最初に行われ、続いて連続的インラインで、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成するカチオン交換CEXクロマトグラフィー工程が行われ、前記精製抗体調製物は、少なくとも1つのさらなる精製工程に供される、請求項1に記載の方法。分離混合物をフロースルー画分として生成する前記カチオン交換CEXクロマトグラフィー工程が最初に行われ、続いて連続的インラインで、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成するアニオン交換AEXクロマトグラフィー工程が行われ、前記精製抗体調製物は、少なくとも1つのさらなる精製工程に供される、請求項1に記載の方法。前記連続的インラインのAEXおよびCEXクロマトグラフィー工程が、単一ユニット操作として行われる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。第2のイオン交換工程前の前記分離混合物に、前記第2のイオン交換クロマトグラフィー工程において最適な性能が得られるようにpHおよび導電率を調整するために適量の溶液が補充される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。CEXクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、適量の酸性溶液が補充される、請求項2に記載の方法。CEXクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、クエン酸またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩、リン酸またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩、酢酸、塩酸または硫酸を含有する適量の溶液が補充される、請求項6に記載の方法。AEXクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、適量のアルカリ性溶液が補充される、請求項3に記載の方法。AEXクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、水酸化ナトリウムもしくはカリウム、またはその一もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩またはトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含有する適量の溶液が補充される、請求項8に記載の方法。アニオン交換クロマトグラフィー部分およびカチオン交換クロマトグラフィー部分の両方を連続的に連結して含む請求項2に記載の方法において使用され得る単一操作ユニットであって、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の出口は、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の入口に連結されており、前記ユニットは、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含みかつ前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、前記ユニットはまた、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分と前記カチオン交換クロマトグラフィー部分との間にも入口を含む、単一操作ユニット。カチオン交換クロマトグラフィー部分およびアニオン交換クロマトグラフィー部分の両方を連続的に連結して含む請求項3に記載の方法において使用され得る単一操作ユニットであって、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の出口は、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の入口に連結されており、前記ユニットは、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含みかつ前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、前記ユニットはまた、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分と前記アニオン交換クロマトグラフィー部分との間にも入口を含む、単一操作ユニット。[材料および方法]全ての実験を、哺乳動物細胞株によって産生されたIgG1を用いて実施した。培養を、化学的に規定された培地を用い、XD登録商標培養GeneticEngineeringBiotechnologyNews,Apr12010Vol.30,No.7参照を適用して実施し、その後、採取物を希釈し、ZetaPlus10M02P、ZetaPlus60ZA05およびSterAssurePSA020全てCuno3Mからの三段デプス濾過フィルター列によって細胞を除去した。この清澄化した採取物は、およそ4.0g/LのIgGを含有するものであり、-20°Cにてアリコートで貯蔵した。これを、プロテインA精製に先立って解凍し、室温に平衡させた。まず、標準的なプロテインAクロマトグラフィーによる初期精製を、MabSelectGEを使用し、標準的な手順清澄化採取物を負荷し、まず20mMTris150mMNaClで洗浄し、次にpH5.5の100mM酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、100mMアセテート緩衝液pH3.0を用いて溶出させるを用いて実施した。MabSelect溶出後、溶出ピークを回収し、1時間にわたりpH3.5で維持した。その後、試料を、2MTrispH9.0を用いてpH7.4に中和し、0.22μmで濾過した。こうして得られた材料を用いて、次の3つの一連の実験を実施した。1.フロースルー様式でのAEXクロマトグラフィーについてのHCP除去性能を確立する実験1。2.フロースルー様式でCEXクロマトグラフィーを使用して最適条件を確立する実験2。3.最適化されたAEX条件およびCEX条件の両方を1つの単一ユニット操作実験において組み合わせる実施例1。HCPは、多クローン性抗PerC6HCPを用いてELIZAによって測定した。単量体IgGおよび凝集体の濃度は、標準的な手順に従って、サイズ排除クロマトグラフィーHP-SECによって測定した。[実験1][フロースルー様式でのアニオン交換クロマトグラフィーの良好な性能のための条件の確立]フロースルー様式でのAEXクロマトグラフィーを、上述のアセテートTris緩衝液中の予備精製したIgGを使用して実施した。以下のAEX媒体を試験した:MustangQコイン0.35mLPall、SartobindQカプセル1mLおよびChromaSorbカプセル0.08mLMillipore全て膜吸着体。全てのAEX媒体を、40床容積/時間でAKTAエクスプローラーを使用して、フロースルーで実施した。試料を、最終導電率が5mSとなるまで脱塩水で希釈した。コンディショニングおよび洗浄用緩衝液は、100mMアセテートTrispH7.4であった。各AEX媒体上に負荷した生成物の量は、1.5gIgG/mL膜床容積であった。HCPを、クロマトグラフィー工程の前後で測定した。出発物質は、3305ng/mgIgGを含有していた。溶出した物質は、上述したMustangQ、SartobindQおよびChromasorb膜について、それぞれ39、57および71ng/mgIgGを含有していた。これらの結果は、試験した全てのAEXクロマトグラフィー媒体が、適用した条件下でHCPを十分に除去することを明確に示していた。[実験2][フロースルー様式でCEXクロマトグラフィーを使用しての凝集体除去のための条件の確立]これらの実験のために、予備精製したIgGをpH8.0に調整し、導電率が2mSとなるように希釈した。16cmの床長さのPoros50HSAppliedBiosystemsを充填したVL11Milliporeカラムを、AKTAエクスプローラーで使用した。洗浄および平衡用緩衝液は、5.35ml/分の流量での50mMTrisHClpH7.4であった。この洗浄後、生成物を、同様の流量で負荷した。負荷の間中、カラムに入る前にpHおよび導電率を調整するために、そのカラムの前において、50mMNaH2PO4の溶液緩衝液Bを、第2のポンプを用いてインライン混合した。生成物流れおよび緩衝液Bの種々の固定比を、カラムを通る全流量を一定に維持して試験した。フロースルー物の試料をそれぞれの比において採取し、その後、UVシグナルを安定させた。これらの試料の分析結果表1に示すは、pHを十分に低下させた場合、フロースルー物はIgGを依然として含有しつつもそれは凝集体をもはや含有しないということを明確に示している。[1つの単一ユニット操作における最適化されたAEXおよびCEX条件でのIgGの精製]AKTAエクスプローラーを使用して、AEXユニットおよびCEXユニットを、図1の図に示されるように、連続的にインライン連結した。AEXには、SartobindQカプセル1mLを使用し、CEXには、16cmの床長さのPoros50HSAppliedBiosystemsを充填したVL11Milliporeカラムを使用した。生成物負荷前のコンディショニングには、50mMTrisHCl緩衝液pH7.4、導電率4.0mSを使用した緩衝液A。同時に、緩衝液Bを、AEX膜後かつCEX樹脂前に、27.5の体積比でインライン混合した。緩衝液Bは、50mMNaH2PO4を含有するものであった。CEXユニットを通る全流量は、5.35mL/分であった。この実験のために、予備精製したIgGを、導電率が2.98mSとなるように脱塩水で希釈した。予備精製したIgGの負荷は、緩衝液Aのポンプ輸送を停止している間に、IgGを緩衝液Aと同様の流量でポンプ輸送することによって開始した。緩衝液Bは、27.5の体積比の流量で維持した。1.96gのIgGを含有する602.5mLの量を負荷した。負荷の完了後、このシステムから全ての生成物を回収するために、流れを緩衝液Aに切り替えて戻した洗浄。洗浄後、2MNaClをポンプAにより添加することによってAEX-CEXユニットをストリッピングし、ポンプBを停止した。ストリッピング物stripは別個に回収した。全試験の間中、CEXを通る流量は、5.35mL/分であった。合計時間コンディショニング、洗浄およびストリッピングを含むは、3時間未満であった。負荷物およびフロースルー物の両方を、IgG凝集体比、ならびにHCP含有量およびタンパク質生成物含有量A280について分析した。HCP濃度は、出発物質中は2697ng/mgIgGであり、フロースルー物と洗液との画分中は47ng/mgIgGであった。凝集体の量は、付加物出発物質においては3.66であり、フロースルー物と洗液とにおいては、完全な凝集体除去を示す0.00であった。ストリッピング物は、30.4の凝集体を含有していた。フロースルー物と洗液とにおける全生成物回収率は評価しなかったが、以前に実施した同様の試験において、全生成物回収率は、フロースルー物と洗液とではおよそ86であり、フロースルー物と洗液とストリッピング物とでは92であった。[1つの単一ユニット操作における最適化されたCEXおよびAEX条件でのIgGの精製]AKTAエクスプローラーを使用して、CEXユニットおよびAEXユニットを、図2の図に示されるように、連続的にインライン連結する。CEXには、16cmの床長さのPoros50HSAppliedBiosystemsを充填したVL11Milliporeカラムを使用し、AEXユニットには、SartobindQカプセル1mLを使用する。生成物負荷前のコンディショニングには、50mMTris-アセテート緩衝液pH6.6、導電率4.0mSを使用する緩衝液A。同時に、緩衝液Bを、AEX膜後かつCEX樹脂前に、20の体積比でインライン混合した。緩衝液Bは、200mMTrispH9.0を含有するものである。AEXユニットを通る全流量は、5.4mL/時間である。この実験のためには、予備精製したIgGのpHを、7.4ではなく6.6に調整し、次いで、導電率が4mSとなるように脱塩水で希釈する。このpH6.6に調整した予備精製したIgGの負荷は、緩衝液Aの流れを停止している間に、IgGを緩衝液Aと同様の流量でポンプ輸送することによって開始する。緩衝液Bは、20の体積比の流量で維持する。1.5gのIgGを含有する600mLの量を負荷する。負荷の完了後、このシステムから全ての生成物を回収するために、流れを緩衝液Aに切り替えて戻す洗浄。洗浄後、2MNaClをポンプAにより添加することによってCEX-AEXユニットをストリッピングし、ポンプBを停止する。ストリッピング物は別個に回収する。全試験の間中、AEXを通る流量は、5.4mL/時間である。合計時間コンディショニング、洗浄およびストリッピングを含むは、3時間未満である。負荷物およびフロースルー物の両方を、IgG凝集体比、ならびにHCP含有量およびタンパク質生成物含有量A280について分析する。[使用した略語]A280280nmでの光吸収AEXアニオン交換CEXカチオン交換CHO細胞チャイニーズハムスター卵巣細胞EBA膨張床吸着HCP宿主細胞タンパク質HPLC高圧液体クロマトグラフィーIgG免疫グロブリンGLoD検出限界TFF接線流濾過Trisトリスヒドロキシメチルメチルアミン"