N末端からC末端の方向に第一及び第二のドメインを含み、第一及び第二のドメインがICreIモノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来し、前記第一のドメイン及び第二のドメインの各々が、ドデカペプチドモチーフ及びDNA結合部分を含むポリペプチドフラグメントからなり、前記第一及び第二のドメインがリンカーにより結合されている、DNA切断を起こし得る単鎖メガヌクレアーゼ。リンカーがIDmoIループに由来する、請求項1に記載の単鎖メガヌクレアーゼ。リンカーが配列番号8~11の配列からなる群より選択される配列を含む、請求項1又は2に記載の単鎖メガヌクレアーゼ。単鎖メガヌクレアーゼが配列番号6の配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の単鎖メガヌクレアーゼ。請求項1~4のいずれか1つに記載のメガヌクレアーゼをエンコードする精製又は組換えポリヌクレオチド。請求項5に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。請求項5に記載のポリヌクレオチド、請求項6に記載のベクター又は請求項1~4のいずれか1つに記載のメガヌクレアーゼを含む宿主細胞。分子生物学的道具としての、請求項5に記載のポリヌクレオチド、請求項6に記載のベクター又は請求項1~4のいずれか1つに記載のメガヌクレアーゼの使用。遺伝子工学のための、請求項5に記載のポリヌクレオチド、請求項6に記載のベクター又は請求項1~4のいずれか1つに記載のメガヌクレアーゼの使用。遺伝子治療のための医薬品の製造のための、請求項5に記載のポリヌクレオチド、請求項6に記載のベクター又は請求項1~4のいずれか1つに記載のメガヌクレアーゼの使用。1請求項1~4のいずれか1つに記載の対応するメガヌクレアーゼを用いて、ハイブリッド標的部位を含む標的遺伝子座に二本鎖切断を導入する工程;及び2標的遺伝子座に相同な配列が隣接した導入配列を含む標的構築物を提供する工程を含む遺伝子工学の方法。標的遺伝子座がゲノム遺伝子座である、請求項11に記載の方法。メガヌクレアーゼが、請求項5に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターによるか又は該メガヌクレアーゼ自身のいずれかにより提供される、請求項11又は12に記載の方法。ウイルスゲノムの二本鎖切断が請求項1~4のいずれか1つに記載のメガヌクレアーゼにより誘導され、かつウイルスゲノム又はその一部の欠失を導く組換え事象を導く、ウイルスゲノム又はその一部を欠失する方法。これらの努力にもかかわらず、認識および切断についての新規な配列特異性を有する新規なレアカットエンドヌクレアーゼへの強い必要性がまだ存在する。要約本発明は、第一のドメインおよび第二のドメインを含むハイブリッドメガヌクレアーゼに関し、ここで第一および第二のドメインは2つの異なる当初のLAGLIDADGメガヌクレアーゼに由来し、該当初のメガヌクレアーゼはモノまたはジLAGLIDADGメガヌクレアーゼのいずれかである。本発明は、2つのドメインを含むハイブリッドメガヌクレアーゼも意図し、ここで各ドメインは同じメガヌクレアーゼに由来し、かつ該2つのドメインは当初のメガヌクレアーゼからは異なる配置を有する。本発明は、第一のドメインおよび第二のドメインを含む単鎖メガヌクレアーゼにも関し、ここで該第一および第二のドメインは当初のモノLAGLIDADGメガヌクレアーゼに由来する。さらに、本発明は、本発明によるハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするいずれのポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター、細胞または非ヒト動物に関する。本発明は、本発明によるハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼ、またはそれをエンコードするポリヌクレオチドの、分子生物学、遺伝子工学および遺伝子治療のためのいずれの使用に関する。図面の簡単な説明図1は、IDmoIのリボン図である。不連続の線は、2つのドメイン間の2回回転擬対称軸を示す。IDmoIのN末端ドメインは軸の左側であり、C末端ドメインは右側にある。DNAは、2つのβシートより下で、対称軸に垂直に結合する。αDおよびαDはドデカペプチドモチーフを含むヘリックスのことをいい、DBMはDNA結合部分、そしてVは可変配列のことをいう。図2は、棒状の図の結合したDNAを有するダイマーICreIのリボン図である。不連続の線は、2つのドメインまたはモノマーの間の2回回転対称軸を示す。結合したDNAは、2つのβシートより下で、対称軸に垂直である。αDはドデカペプチドモチーフを含むヘリックスのことをいい、DBMはDNA結合部分、そしてVは可変配列のことをいう。図3Aおよび3Bは、それぞれ、ドデカペプチドモチーフ領域でのIDmoIおよびICreIのリボン図である。両方のタンパク質について、ドデカペプチドモチーフに対応する残基の主鎖の原子を、その他のタンパク質からの重ね合わせた原子と共に棒状の図で示す。不連続の線は、2つのタンパク質ドメインの間の2回回転対称軸を示す。図3Aでは、星印はIDmoIドメインの間のリンカーの限界を示し、そして図3B中ではリンカーが工作されるICreI中の対応する位置を示す。タンパク質の方向は図1および2と同じである。図4は、IDmoIICreIハイブリッドタンパク質のリボン図である。IDmoI部分の末端である、両方のドメインを連結するリンカーは、2つの星印の間である。不連続の線は、2つのタンパク質ドメインの間の2回回転対称軸を示す。IDmoIのN末端ドメインは軸の左であり、ICreIドメインは右である。αDおよびαDはドデカペプチドモチーフを含むヘリックスのことをいい、DBMはDNA結合部分、そしてVは可変配列のことをいう。図5Aおよび5Bは、それぞれ、ICreIダイマーおよび単鎖ICreIのリボン図である。星印は、リンカーが導入されるところを示し;第一のモノマー中の3つのαヘリックスは、第二のモノマーのN末端残基と共に、単鎖中では除去される。2つの星印の間に含まれ、両方のドメインを連結するループは、IDmoIから得られる。灰色の円盤は、対称軸を表す。図6Aおよび6Bは、ハイブリッドメガヌクレアーゼIDmoIICreIの2つの代案のアミノ酸配列および各代案をエンコードするポリヌクレオチド配列を開示する。下線を引いた残基はLAGLIDADGモチーフである。太字で、変異されたIDmoI中の残基を示す。Hは、IDmoIおよびICreIドメインの間の交換点を示す。全てのタンパク質の配列において、2つの当初のN末端残基がメチオニンおよびアラニンであり、かつ3つのC末端残基がアラニン、アラニンおよびアスパラギン酸である。これらの配列は、NcoIおよびEagI制限部位を含むDNAコーディング配列を有することを許容し、これらは種々のベクターへのクローニングのために用いられる。代案Aは、交換点を示すのみであるが、代案Bは、起こり得る障害を避ける3つの付加変異を有する。図7は、単鎖ICreIの代案のアミノ酸配列および該単鎖メガヌクレアーゼをエンコードする1つのポリヌクレオチドを開示する。タンパク質の配列において、2つの当初のN末端残基はメチオニンおよびアラニンであり、そして3つのC末端残基はアラニン、アラニンおよびアスパラギン酸である。これらの配列は、NcoIおよびEagI制限部位を含むDNAコーディング配列を有することを許容し、これらは種々のベクターへのクローニングのために用いられる。図8は、ハイブリッドメガヌクレアーゼIDmoIICreIのインビトロ切断アッセイ、およびそのようなハイブリッドを用いたSDSPAGEゲルを示す。図8A:ラインA:分子量マーカー;ラインB:ハイブリッドメガヌクレアーゼIDmoIICreI;ラインC:野生型メガヌクレアーゼIDmoI。図8B:ハイブリッドIDmoIICreのアガロースゲル活性;ラインA、B、C、D:標的IDmoIICreI;ラインE、F、G、H:標的ICreIIDmoI;ラインD、G:サイズマーカー;ラインC、H:直鎖プラスミド;ラインB、F:37°Cでのアッセイ;ラインA、E;65°Cでのアッセイ。図9は、単鎖メガヌクレアーゼICreIのインビトロ切断アッセイおよびこのような単鎖メガヌクレアーゼを用いたゲルろ過のSDSPAGEゲルを示す。図9A:ラインA:分子量マーカー;ラインBおよびC:ゲルろ過のデッドカラム。ラインD:単鎖メガヌクレアーゼICreI。図9B:単鎖メガヌクレアーゼのアガロースゲル活性;ラインA:マーカー;ラインB:野生型ICreIメガヌクレアーゼの標的部位;ラインC:野生型ICreI野生型ICreIメガヌクレアーゼの標的部位;ラインD:野生型ISceI単鎖ICreIメガヌクレアーゼの標的部位;ラインEおよびF:それぞれラインEおよびFについて、37°Cおよび65°Cで1時間の野生型ICreI単鎖ICreIメガヌクレアーゼの標的部位。図10Aは、LACURAZレポーター構築物の概略図である。LACZは、LacZ遺伝子の要素を示す。介在配列のそれぞれの側面の区画Aは、LacZ遺伝子の内部の重複を含む。pADH1は、酵母の構成プロモーターである。tADH1は、酵母のターミネーターである。Ura3はUra3遺伝子を示す。矢印は転写の始まりを示す。切断部位のタグは、アッセイされるメガヌクレアーゼの認識および切断部位のことをいう。Trp1は、Trp1選択マーカー、《cen》は複製のARSCEN起点のことをいう。図10Bは、メガヌクレアーゼ誘導可能発現ベクターの概略図である。pGAL10はガラクトースの存在下で誘導可能な酵母プロモーターである。tADH1は酵母のターミネーターである。Leu2および2μは、それぞれLeu2選択マーカーおよび2μ複製起点のことをいう。矢印は転写の始まりを示す。図11は、同時形質転換およびそれに続くレポーター遺伝子の修飾の組み合わせを示す。《X》は、表Aに開示される組み合わせのことをいう。淡灰色の箱はUra3遺伝子のことをいう。濃灰色の箱はLacZ遺伝子のことをいう。白色の箱はメガヌクレアーゼをエンコードする遺伝子のことをいう、白色のタグはアッセイされるメガヌクレアーゼの認識および切断部位のことをいう。詳細な説明定義本出願においてメガヌクレアーゼにより、一般的に約12~40bpの長さ、より好ましくは14~40bpのポリヌクレオチド認識部位を有するレアカットエンドヌクレアーゼを意図する。一般的なメガヌクレアーゼは、それらの認識部位の内部で切断を起こし、3OH突出を有する4ntのジグザグのカットを残す。メガヌクレアーゼは、一般にホーミングエンドヌクレアーゼとも呼ばれる。好ましくは、本発明によるメガヌクレアーゼは、ドデカペプチドファミリーに属する。メガヌクレアーゼについてのさらなる情報についてはDalgaardら、ならびにChevalierおよびStoddardを参照。LAGLIDADGメガヌクレアーゼの具体例を表1に列挙する。本発明においてヘリックスにより、αヘリックスを意図する。本発明におけるαDおよびαLAGLIDADGは、LAGLIDADG、DODまたはドデカペプチドモチーフを含むヘリックスのことをいう。由来するにより、ドメインが、ドメインが由来するメガヌクレアーゼのドメインの配列を含むことを意図する。ドメインの該配列はいくつかの修飾または置換を含み得る。本明細書において用いられる標的部位または認識および/または切断部位は、メガヌクレアーゼにより結合され、かつ切断されるポリヌクレオチド配列のことをいう。組換えポリペプチドの語は、本明細書において、人工的に設計され、かつそれらの当初の天然の環境において近接するポリペプチド配列として見出されない少なくとも2つのポリペプチド配列を含むポリペプチド、または組換えポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドのことをいう。本明細書において用いられるような個体の語は哺乳動物、およびその他の動物を含む。本明細書において用いられるような哺乳動物および哺乳類の語は、それらの子に授乳し、かつ生きている子を産むか、または産卵するのいずれかの単孔類、有袋類および胎盤哺乳類を含むいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳動物種の例は、ヒトおよびその他の霊長類、げっ歯類および反芻動物を含む。本明細書において用いられるレポーター遺伝子の語は、その産物が、ガラクトシダーゼをエンコードするlacZ遺伝子のような、例えば酵素反応産物として呈色的に容易にアッセイできる核酸配列のことをいう。広く用いられるレポーター分子の例は、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、βグルコシダーゼのような酵素;グリーン蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼのような蛍光分子;ならびにHis3pおよびUra3pのような栄養要求性マーカーの9章参照を含む。本明細書において交換可能に用いられるような核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの語は、一本鎖または二重の形態のいずれかにある1以上のヌクレオチドのRNA、DNAまたはRNADNAハイブリッド配列を含む。ポリヌクレオチドの語は、プリンまたはピリミジン、リボースまたはデオキシリボース糖部分、およびリン酸基またはホスホジエステル結合を含む単位のポリマーのことをいう。ポリヌクレオチドは、次の修飾代替の連結基、プリンの類似の形態、ピリミジンの類似の形態、または類似の糖の少なくとも1つを含む修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのこともいう。エンドヌクレアーゼ:エンドヌクレアーゼにより、高度に特異的な位置でのDNA分子における二本鎖切断を起こし得る酵素を意図する。細胞または宿主細胞は、本明細書中において交換可能に用いられる語である。このような語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫、または潜在的な子孫のこともいうことが理解される。ある修飾は、続いて起こる世代において変異または環境的影響のいずれかにより起こり得るので、このような子孫は親細胞と同一ではないが、それでも本明細書において用いられるような語の範囲内に含まれる。同一性は、2つの核酸分子またはポリペプチド間の配列の同一性をいう。同一性は、比較の目的で整列させ得る各配列における位置を比較することにより決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基で占められるとき、その分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列により共有される位置における同一または適合するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージの部分として入手可能であり、例えばデフォルト設定で用い得るFASTAまたはBLASTを含む種々の整列アルゴリズムおよび/またはプログラムを、2つの配列の間の同一性を計算するのに用いることができる。本発明の非ヒト動物は、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などのような哺乳動物を含む。好ましい非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含むげっ歯類のファミリーから選択され、最も好ましくはマウスであるが、ツメガエル属の構成要素ようなトランスジェニック両生類、およびトランスジェニックニワトリ、ウシ、ヒツジも重要な道具を提供し得る。ベクターの語は、それが連結されているその他の核酸を移すことができる核酸分子のことをいう。好ましいベクターのあるタイプは、エピソーム、すなわち染色体外の複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、自律複製および/またはそれらが連結されている核酸の発現が可能なものである。それらが実施可能に連結されている遺伝子の発現に向けることができるベクターは、本明細書において発現ベクターという。本発明によるベクターは、限定されないが、YAC、BAC、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成DNAからなる直鎖もしくは環状DNAもしくはRNA分子を含む。一般に、組換えDNA技術において実用性のある発現ベクターは、しばしば、一般に環状二本鎖DNAループをいうプラスミドの形態にあり、そのベクターの形態においてそれらは染色体に結合しない。適切なベクターの多数は、次の細菌ベクター:pQE70、pQE60、pQE9、pbs、pDlO、phagescript、psi174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A;ptrc99a、pKK2233、pKK2333、pDR540、pRIT5;pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG;pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL;pQE30のように当業者に知られており市場で入手可能である。ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルスのようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびαウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスを含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えばノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLVBLVグループ、レンチウイルス、スプマウイルスを含む。その他の例は、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、メイソンファイザーサルウイルス、サル免疫不全性ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルスおよびレンチウイルスを含む。ベクターのその他の例は、例えばMcVeyら、米国特許第5801030号に記載され、この教示は本明細書に参照として組み込まれる。ベクターは、選択マーカーを含み得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を提供し、かつ本発明に続いて知られることとなる発現ベクターのその他の形態を含むことを意図する。側面にあって:線状化されるかまたは切り出されるポリヌクレオチドの側面には、切断部位があるが、これはこのような部位が該ポリヌクレオチドのいずれかもしくは両方の端にあるか、またはその近くにある場合である。線状化されるかまたは切り出されるポリヌクレオチドの1つの端もしくはその近くに1つの切断部位が存在することができるか、または線状化されるかまたは切り出されるポリヌクレオチドのそれぞれの端もしくはその近くに1つがある、2つの切断部位が存在することができる。本発明において、近くにより、好ましくは切断部位が、組み込まれるポリヌクレオチドの端の1kb未満、好ましくは500bp未満、より好ましくは200または100bp未満に位置することを意図する。本発明は、新規な、設計されたレアカットエンドヌクレアーゼおよびその使用に関する。これらの新規な、設計されたレアカットエンドヌクレアーゼは、好ましくはドデカペプチドLAGLIDADGのメガヌクレアーゼファミリーに由来する。ハイブリッドメガヌクレアーゼメガヌクレアーゼは、200を越えるレアカット二本鎖DNAエンドヌクレアーゼのクラスを形成する。これらは14~40塩基対の間の長さの非対称なDNA配列を認識し、それらの標的配列のほぼ中央で二本鎖切断をつくる。本明細書において該標的部位は、2つの異なる半分の部位の合計として定義される。複合DNAでは、16ヌクレオチドの長さのDNA配列は、ヒトゲノムのサイズのゲノムにおいてさえも、非反復であることを予想することができる。よって、メガヌクレアーゼは、標的遺伝子座において細胞のゲノムをただ1度だけ切断する。LAGLIDADGタンパク質ファミリーは、ドデカペプチド、またはP1およびP2、LAGLIおよびDADGまたはLAGLIDADGと呼ばれる、よく保存された配列モチーフの1または2コピーの存在を特徴とする。これらのモチーフの外側では、関連する相同な配列はない。より小さい例、すなわちICreIは、ただ1つのドデカペプチドモチーフを有し、2つの15~20kDaサブユニットまたはドメインのホモダイマーとして機能する。ただ1つのドデカペプチドモチーフを有するこれらのタンパク質は、本明細書においてモノドデカペプチドタンパク質と呼ばれる。一方、より大きいタンパク質、すなわちIDmoI、ISceIおよびPISceIは、2つのドデカペプチドモチーフを有する単鎖タンパク質である2つのドデカペプチドモチーフを有するこれらのタンパク質は、本明細書においてジドデカペプチドタンパク質と呼ばれる。詳細な3次元構造は、4つのLAGLIDADGタンパク質:ICreI、IDmoI、PISceIおよびPIPfuIについて説明されている。これらの構造は、ドデカペプチドモチーフが2ヘリックスの束の部分であることを説明する。2つのαヘリックスは中心の界面のほとんどを形成し、ここで2回回転対称軸が2つの構成ドメインを分けている。ドデカペプチドモチーフの他にも、各ドメインが標的DNA配列の2つの半分の部位の1つと相互作用するようにタンパク質を駆り立てるDNA結合界面を示す。非反復の活性な触媒部位は、その特異的性質および空間的配置がDNA切断に必要とされる両方の構造ドメインからのアミノ酸残基を含む。LAGLIDADGタンパク質ファミリーにおいて、活性部位の残基は互いに異なっている。持続性の保存を示す独特の残基は、両方のLAGLIDADGモチーフからの最後の酸性アミノ酸である。したがって、これらの酸性アミノ酸を除いて、活性部位の残基に機能的役割を割り当てるのは困難である。これらの残基の変異は触媒作用を完全に破壊するが、DNA結合は破壊しない。その他に、酸性および塩基性残基のアミノ酸側鎖により構造的に構成されているいくつかの水分子からなる水和殻は、二価のカチオンと共に、おそらくDNAホスホジエステル結合の切断を行うのに必須の役割を有している。DNA配列に対するそれらの特異性を変更するための既知のメガヌクレアーゼの工作は、新規なDNA配列を標的とし、選択された遺伝子の二本鎖切断を創ることを許容することができた。しかしながら、ドメイン間パッキング界面および触媒部位に関連する残基は、非常に圧迫されている。酵素の触媒ドメインは、しばしば複雑で修飾に対して高度に反応性であることが知られている。メガヌクレアーゼの場合、触媒部位が2つのドメインの界面により構成されているので、この修飾に対する感受性が増大されている。したがって、明確な触媒部位残基を有するメガヌクレアーゼのドメイン交換が、機能的な活性タンパク質を回復させるかは知られていない。さらに、既知のメガヌクレアーゼのドメイン構造、特にLAGLIDADGタンパク質ファミリーのものにもかかわらず、このようなドメイン構造の単位としての行動については何も知られていない。本発明は、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼがモジュールのものであり、そして天然のホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼのドメイン交換が可能、そして有利の両方であることを最初に示している:異なるLAGLIDADGメガヌクレアーゼから得られる2つのドメインの新規で人工的な組み合わせは、対応する2つの半分の部位でつくられるDNA配列を認識し、結合し、かつ切断する。このような人工的な組み合わせの工作は、新規な特異性を有するメガヌクレアーゼを生み出すために主として有用である。LAGLIDADGタンパク質ファミリーは、本質的に、ドデカペプチドモチーフ内に配列の保存を示す。3D構造は類似である:これらは、独特のトポロジーで構成されている二次構造の要素の同じ組を有する。ドデカペプチドモチーフおよびタンパク質サイズの保存は、二次構造が保存されていることを提案するのに充分であると考えられる。本発明は、好ましくは少なくとも2つの異なるLAGLIDADGメガヌクレアーゼに由来する、新規なエンドヌクレアーゼ、より具体的にはハイブリッドメガヌクレアーゼに関する。当初のメガヌクレアーゼは、ICreIメガヌクレアーゼのようなモノドデカペプチドもしくはモノLAGLIDADG、またはIDmoIのようなジドデカペプチドもしくはジLAGLIDADGメガヌクレアーゼであり得る。これらの新規な、設計されたエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、LAGLIDADGメガヌクレアーゼのハイブリッドである。本発明は、各ドメインが異なるLAGLIDADGメガヌクレアーゼに由来する2つのドメインを含むハイブリッドメガヌクレアーゼに関する。表1参照。本発明は、各ドメインが同じメガヌクレアーゼに由来するが、当初のメガヌクレアーゼに比べて異なる配置、構成、位置などにある2つのドメインを含むハイブリッドメガヌクレアーゼも意図する。本発明において、LAGLIDADGメガヌクレアーゼのドメインにより、ドデカペプチドモチーフおよびDNA結合部分を含むか、またはそれらからなるポリペプチドフラグメントを意図する。任意に、該ドメインはDNA結合またはドメイン界面に関与しない付加的なポリペプチド配列も含み得る。しかしながら、これらの付加的な配列は、多様なサイズを有し、DNAの認識および結合、またはエンドヌクレアーゼ活性には一般的に重要ではない。ドデカペプチドモチーフはαヘリックスに含まれ、本明細書中では概略的にαLAGLIDADGまたはαDという。より詳細には、最後のD残基は一般的にαヘリックスをキャッピングし、そして続くGly残基が主鎖をαヘリックスに垂直なβストランドへ再び向けさせる。DNA結合部分は、一般的にαヘリックスおよびβストランドを含む。メガヌクレアーゼの最小限のDNA結合部分は、βヘアピンである。天然のメガヌクレアーゼは、各DNA結合部分中に2つのこのようなβヘアピンを含み、4ストランドのβシートに連結する。2つのβヘアピンの間の連結は1つのαヘリックスを含む。一般に、DNA結合部分は4ストランドのβシートの下流にさらに1つのαヘリックスを含む。付加的なポリペプチド配列は、ドデカペプチドモチーフおよびDNA結合部分からなるグループの各側面に見出すことができる。したがって、本発明によるメガヌクレアーゼドメインは、ドデカペプチドモチーフ含むヘリックス、αDおよびDNA結合部分であるDBMをを含む。任意に、付加的な配列は、さらに該ドメインに含まれることができる。該付加的な配列は、ハイブリッドメガヌクレアーゼの第一のドメインのN末端側、またはハイブリッドメガヌクレアーゼの第二のドメインのC末端側にあることができる。2つのドデカペプチドモチーフを含むLAGLIDADGメガヌクレアーゼは、2つのドメインを含み、1つのドメインはN末端ドメイン、もう1つはC末端ドメインと呼ばれる。N末端ドメインは、連続的に、付加的な任意の配列、ドデカペプチドモチーフおよびDNA結合部分を含む。C末端ドメインは、連続的に、ドデカペプチドモチーフ、DNA結合部分および付加的な任意の配列を含む。各ドメインの2つのドデカペプチドαヘリックスは、密にパッキングされたドメイン界面を形成する。2つのドメインを連結するループはN末端ドメインのDNA結合部分と、C末端ドメインの第二のドデカペプチドモチーフを含むヘリックスとの間である。ジドデカペプチドメガヌクレアーゼは、概略的に、N末端の端からC末端の端に、次の構造で表すことができる:VαDDBMαDDBMV。ヘリックスαDおよびαDは、ドデカペプチドモチーフを含むヘリックスに相当する。2つのドデカペプチドモチーフを含むメガヌクレアーゼのドメインは非対称である。ジドデカペプチドメガヌクレアーゼの数は既知である。表1のddまたはDDを参照。。1つのドデカペプチドモチーフを含むダイマーのLAGLIDADGメガヌクレアーゼは、連続的に、付加的な任意のポリペプチド配列、ドデカペプチドモチーフ、DNA結合部分および付加的な任意ポリペプチド配列を含む。2つのドデカペプチドヘリックスは、密にパッキングされたダイマー界面を形成する。モノドデカペプチドメガヌクレアーゼは、概略的に、N末端の端からC末端の端を含む次の構造により表すことができる:VαDDBMV。モノドデカペプチドメガヌクレアーゼの数は既知である。表1のモチーフDを参照。したがって、本発明は、N末端からC末端の方向に第一のドメインおよび第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼに関し、該第一および第二のドメインは2つの異なる当初のLAGLIDADGメガヌクレアーゼに由来し、該当初のメガヌクレアーゼはモノまたはジドデカペプチドのいずれかであり、そして該第一および第二のドメインは適切なリンカーにより結合され、ここで該ハイブリッドメガヌクレアーゼはDNA切断を起こし得る。本発明は、2つのドメインを含むかまたはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼも意図し、各ドメインは同じメガヌクレアーゼに由来し、該2つのドメインは当初のメガヌクレアーゼとは異なる配置を有し、そして該第1および第2のドメインは、適切なリンカーにより結合されている。ハイブリッドメガヌクレアーゼの生成のための本発明による当初のモノおよびジドデカペプチドメガヌクレアーゼは、表1に記載のメガヌクレアーゼからなる群から好ましくは選択され、特にISceI、IChuI、IDmoI、ICreI、ICsmI、PISceI、PITliI、PIMtuI、ICeuI、ISceII、ISceIII、HO、PICivI、PICtrI、PIAaeI、PIBsuI、PIDhaI、PIDraI、PIMavI、PIMchI、PIMfuI、PIMflI、PIMgaI、PIMgoI、PIMinI、PIMkaI、PIMleI、PIMmaI、PIMshI、PIMsmI、PIMthI、PIMtuI、PIMxeI、PINpuI、PIPfuI、PIRmaI、PISpbI、PISspI、PIFacI、PIMjaI、PIPhoI、PITagI、PIThyI、PITkoIおよびPITspI;好ましくは、ISceI、IChuI、IDmoI、ICreI、ICsmI、PIPfuI、PISceI、PITliI、PIMtuI、ICeuI、ISceII、ISceIIIおよびHO;より好ましくは、ISceI、IChuI、IDmoI、ICreI、ICsmI、PISceI、PIPfuI、PITliI、PIMtuIおよびICeuI;さらにより好ましくは、IDmoI、ICreI、ISceIおよびIChuI;さらにより好ましくはIDmoIおよびICreIである。ハイブリッドメガヌクレアーゼの生成のための本発明による当初のジドデカペプチドメガヌクレアーゼは、表1に記載のDDまたはddモチーフを含むメガヌクレアーゼからなる群から好ましくは選択され、特に:ISceI、IChuI、IDmoI、ICsmI、PISceI、PITliI、PIMtuI、ISceII、ISceIII、HO、PICivI、PICtrI、PIAaeI、PIBsuI、PIDhaI、PIDraI、PIMavI、PIMchI、PIMfuI、PIMflI、PIMgaI、PIMgoI、PIMinI、PIMkaI、PIMleI、PIMmaI、PIMshI、PIMsmI、PIMthI、PIMtuI、PIMxeI、PINpuI、PIPfuI、PIRmaI、PISpbI、PISspI、PIFacI、PIMjaI、PIPhoI、PITagI、PIThyI、PITkoIおよびPITspI;好ましくは、ISceI、IChuI、IDmoI、ICsmI、PIPfuI、PISceI、PITliI、PIMtuI、ISceII、ISceIIIおよびHO;より好ましくは、ISceI、IChuI、IDmoI、ICsmI、PISceI、PITliIおよびPIMtuI;さらにより好ましくは、IDmoI、ISceIおよびIChuI;さらにより好ましくはIDmoIである。ハイブリッドメガヌクレアーゼの生成のための本発明による当初のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼは、表1に記載のDモチーフを含むメガヌクレアーゼからなる群から好ましくは選択され、特に:ICreI、ICeuI;好ましくはICreIである。より好ましくは、本発明は、モノもしくはジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第一のドメインおよび別のモノもしくはジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼに関し、該第一および第二のドメインは、適切なリンカーにより結合されている。好ましい実施形態において、本発明は次のハイブリッドメガヌクレアーゼからなる群より選択されるハイブリッドメガヌクレアーゼに関する:ISceIIChuI、ISceIPIPfuI、IChuIISceI、IChuIPIPfuI、ISceIIDmoI、IDmoIISceI、IDmoIPIPfuI、IDmoIICreI、ICreIIDmoI、ICreIPIPfuI、ISceIICsmI、ISceIICreI、ISceIPISceI、ISceIPITliI、ISceIPIMtuI、ISceIICeuI、ICreIICeuI、IChuIICreI、IChuIIDmoI、IChuIICsmI、IChuIPISceI、IChuIPITliI、IChuIPIMtuI、ICreIIChuI、ICreIICsmI、ICreIPISceI、ICreIPITliI、ICreIPIMtuI、ICreIISceI、IDmoIIChuI、IDmoIICsmI、IDmoIPISceI、IDmoIPITliI、IDmoIPIMtuI、ICsmIIChuI、ICsmIPIPfuI、ICsmIICreI、ICsmIIDmoI、ICsmIPISceI、ICsmIPITliI、ICsmIPIMtuI、ICsmIISceI、PISceIIChuI、PISceIIPfuI、PISceIICreI、PISceIIDmoI、PISceIICsmI、PISceIPITliI、PISceIPIMtuI、PISceIISceI、PITliIIChuI、PITliIPIPfuI、PITliIICreI、PITliIIDmoI、PITliIICsmI、PITliIPISceI、PITliIPIMtuI、PITliIISceI、PIMtuIIChuI、PIMtuIPIPfuI、PIMtuIICreI、PIMtuIIDmoI、PIMtuIICsmI、PIMtuIPISceI、PIMtuIPITliI、およびPIMtuIISceI;好ましくは、ISceIIChuI、ISceIPIPfuI、IChuIISceI、IChuIPIPfuI、ISceIIDmoI、IDmoIISceI、IDmoIPIPfuI、IDmoIICreI、ICreIIDmoI、ICreIPIPfuI、ISceIICsmI、ISceIICreI、ISceIPISceI、ISceIPITliI、ISceIPIMtuI、ISceIICeuI、IChuIICreI、IChuIIDmoI、IChuIICsmI、IChuIPISceI、IChuIPITliI、IChuIPIMtuI、ICreIIChuI、ICreIICsmI、ICreIPISceI、ICreIPITliI、ICreIPIMtuI、ICreIISceI、IDmoIIChuI、IDmoIICsmI、IDmoIPISceI、IDmoIPITliI、IDmoIPIMtuI、ICsmIIChuI、ICsmIPIPfuI、ICsmIICreI、ICsmIIDmoI、ICsmIPISceI、ICsmIPITliI、ICsmIPIMtuI、ICsmIISceI、PISceIIChuI、PISceIIPfuI、PISceIICreI、PISceIIDmoI、PISceIICsmI、PISceIPITliI、PISceIPIMtuI、PISceIISceI、PITliIIChuI、PITliIPIPfuI、PITliIICreI、PITliIIDmoI、PITliIICsmI、PITliIPISceI、PITliIPIMtuI、PITliIISceI、PIMtuIIChuI、PIMtuIPIPfuI、PIMtuIICreI、PIMtuIIDmoI、PIMtuIICsmI、PIMtuIPISceI、PIMtuIPITliIおよびPIMtuIISceI;より好ましくは、ISceIIChuI、IChuIISceI、ISceIIDmoI、IDmoIISceI、IDmoIICreIおよびICreIIDmoI;さらにより好ましくは、IDmoIICreIおよびICreIIDmoI;またはさらにより好ましくはIDmoIICreI;より具体的には配列番号2または4のハイブリッドメガヌクレアーゼである。例えば、ISceIICeuIについて、最初に示されるメガヌクレアーゼは、ハイブリッドメガヌクレアーゼの第一のドメインの起源に相当し、二番目に示されるメガヌクレアーゼは、ハイブリッドメガヌクレアーゼの第二のドメインの起源に相当する。任意に、該ハイブリッドメガヌクレアーゼは:1第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第二のドメイン;2第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第二のドメイン;3第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第一のドメインおよび別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第二のドメイン;または4第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第一のドメインおよび同じかもしくは別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼから、好ましくは別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第二のドメインを含むか、またはそれらからなる。好ましくは、該ハイブリッドメガヌクレアーゼは:1第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第二のドメイン;または2第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第一のドメインおよび別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第二のドメインを含むか、またはそれらからなる。より好ましくは、該ハイブリッドメガヌクレアーゼは、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第二のドメインを含むか、またはそれらからなる。任意に、該ハイブリッドメガヌクレアーゼは:1第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第二のドメイン;2第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび同じもしくは別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第二のドメイン;3第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来する第二のドメイン;4第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第一のドメインおよび同じもしくは別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第二のドメイン;5第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来する第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第二のドメイン;6第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第一のドメインおよび同じもしくは別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第二のドメイン;7第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来する第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第二のドメイン;8第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来する第二のドメイン;または9第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来する第一のドメインおよび同じもしくは別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来する第二のドメインを含むか、またはそれらからなる。好ましくは、該ハイブリッドメガヌクレアーゼは:1第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第二のドメイン;2第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび同じもしくは別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第二のドメイン;3ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来する第二のドメイン;4第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第一のドメインおよび同じもしくは別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第二のドメイン;または5第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来する第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第二のドメインを含むか、あるいはそれらからなる。より好ましくは、該ハイブリッドメガヌクレアーゼは:1第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第二のドメイン;2第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび同じもしくは別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第二のドメイン;または3第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来する第二のドメインを含むか、またはそれらからなる。本発明においては、ドメインの順序が当初のメガヌクレアーゼと同じでなければ、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、同じジドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第一のドメインおよび第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼも意図する。より具体的には、本発明においては、N末端からC末端への方向で第一および第二のドメインを含むハイブリッドメガヌクレアーゼを意図し、ここで各ドメインは同じジドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来し、かつ該第一のドメインはC末端ドメインに由来し、該第二のドメインはN末端ドメインに由来する。ハイブリッドメガヌクレアーゼの2つのドメインの間に連結を導入する方法は、当業者によく知られている。本発明においては、好ましい方法は、フレキシブルポリペプチドリンカーの使用、またはジドデカペプチドメガヌクレアーゼからのループの使用のいずれかである。本発明においては、ループがリンカーの実施形態である。フレキシブルポリペプチドリンカーは、本質的に、グリシン、セリンおよびスレオニン残基を含む。ループは、ハイブリッドメガヌクレアーゼの設計のために用いられる2つの当初のジドデカペプチドメガヌクレアーゼの1つに存在するループ、または2つのドメインの間に導入されるいずれのその他のジドデカペプチドメガヌクレアーゼからのループ、好ましくはIDmoIループのいずれかであり得る。ハイブリッドメガヌクレアーゼの生成のための我々の好ましいアプローチは、種々のLAGLIDADGメガヌクレアーゼと矛盾しないドメイン交換である。ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメイン/ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメイン第一の好ましい実施形態は、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼに関する。交換点はいずれの適切な場所に位置する。交換点は、第一のメガヌクレアーゼの配列が第二のメガヌクレアーゼの配列により実質的に置き換えられる点である。この交換点は、DNA結合部分DBMの最後のヘリックスから第二のドデカペプチドモチーフαDを含むヘリックスの端までに位置することが可能である。第二のドデカペプチドモチーフに先行するループの内部、またはドデカペプチドモチーフを含むヘリックスの中に位置するのが好ましい。一般に、ドデカペプチドモチーフの上流にはほとんどアミノ酸がなく、ヘリックスの形成にもほとんどのアミノ酸が参加しない。ある好ましい実施形態において、交換点はヘリックスの内部に位置する。特に好ましい実施形態において、交換点はドデカペプチドモチーフ自身の前のヘリックス中に位置する。得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼAのN末端ドメインおよびメガヌクレアーゼBのC末端ドメインを含む。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。AおよびBは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。ABは、交換点がセグメントの内部にあり、要素の第一の部分の起源がAであり、第二の部分のそれがBであることを示す。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。代替の実施形態において、交換点は交換ドメインにより置き換えられる。実際に、配列を急に変更する代わりに、ハイブリッドメガヌクレアーゼのヘリックスαDおよびαDは、2つの当初のメガヌクレアーゼの混合物であり得る。ヘリックス界面のほうに向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、両方のヘリックスαDおよびαDについて1つのメガヌクレアーゼのものである。任意に、界面における残基は、モノまたはジドデカペプチドメガヌクレアーゼXからのドデカペプチドヘリックスの別の対に由来することが可能である。各ドメインの内部において、ドメインの内側の方に向けられているαDおよびαDを含むヘリックスからのアミノ酸残基は、それが由来するメガヌクレアーゼのそのドメイン中のその点で見出される残基に対応するものである。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、BおよびXは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。ABは、交換点がセグメントの内部にあり、要素の第一の部分の起源がAであり、第二の部分のそれがBであることを示す。インターは、ドメイン間の界面に向いているαDおよびαDの残基のことをいい、イントラは、各ドメインの内部に向いているαDおよびαDの残基のことをいう。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。任意に、アミノ酸側鎖の間の立体障害を避け、そして/または安定性を増大させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、生産性および/または溶解性を増大させ、かつ毒性を減少させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、ループを適切なリンカーにより完全にまたは部分的に置き換えることができる。適切なリンカーは、好ましくはフレキシブルである。該フレキシブルリンカーは、好ましくはグリシン、セリンおよびスレオニン残基を含む。ループとドメインとの間に、短いフレキシブルリンカーを導入することもできる。任意に、該ループを、いずれの他のジドデカペプチドメガヌクレアーゼからのループ、好ましくはIDmoIループにより置き換えることもできる。任意に、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインからの第二のドメインを含むか、またはそれらからなるこのようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、そのNおよび/またはC末端の端にループまたはリンカー、およびいずれの付加的なドメインをさらに含むことができる。好ましくは、該付加的なドメインは、DNA結合ドメイン、転写促進剤またはリプレッサードメイン、核局在化シグナルまたはDNA切断ドメインである。任意に、このようなハイブリッドのエンドヌクレアーゼ活性を撤廃することができる。よって、ハイブリッドの主要な機能は特異的DNA結合である。ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメイン/ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメイン第二の実施形態は、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼに関する。交換点はいずれの適切な場所に位置する。第二のドデカペプチドモチーフに先行するループの端、またはヘリックスの中に位置するのが好ましい。ある好ましい実施形態において、交換点はヘリックスの内部に位置する。特に好ましい実施形態において、交換点はドデカペプチドモチーフ自身の前のヘリックス中に位置する。得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、N末端の端からC末端の端に、メガヌクレアーゼAのN末端ドメインおよびメガヌクレアーゼBのN末端ドメインを含む。好ましくは、得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼBのC末端ドメインのDBMを含まず、より好ましくはそのC末端ドメインを含まない。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。AおよびBは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。ABは、交換点がセグメントの内部にあり、要素の第一の部分の起源がAであり、第二の部分のそれがBであることを示す。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。代替の実施形態において、交換点は交換ドメインにより置き換えられる。実際に、配列を急に変更する代わりに、ハイブリッドメガヌクレアーゼのヘリックスαDおよびαDは、2つの当初のメガヌクレアーゼの混合物であり得る。ヘリックス界面のほうに向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、両方のヘリックスαDおよびαDについて1つのメガヌクレアーゼのものである。任意に、界面における残基は、モノまたはジドデカペプチドメガヌクレアーゼXからのドデカペプチドヘリックスの別の対に由来することが可能である。各ドメインの内部において、ドメインの内部の方に向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、それが由来するメガヌクレアーゼのそのドメイン中のその位置で見出される残基に対応するものである。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、BおよびXは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。インターは、ドメイン間の界面に向いているαDおよびαDの残基のことをいい、イントラは、各ドメインの内部に向いているαDおよびαDの残基のことをいう。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。任意に、アミノ酸側鎖の間の立体障害を避け、そして/または安定性を増大させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、生産性および/または溶解性を増大させ、かつ毒性を減少させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、ループを適切なリンカーにより完全にまたは部分的に置き換えることができる。適切なリンカーは、好ましくはフレキシブルである。該フレキシブルリンカーは、本質的にグリシン、セリンおよびスレオニン残基を含む。ループとドメインとの間に、短いフレキシブルリンカーを導入することもできる。任意に、該ループを、いずれの他のジドデカペプチドメガヌクレアーゼからのループ、好ましくはIDmoIループにより置き換えることもできる。任意に、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインからの第二のドメインを含むこのようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、そのNおよび/またはC末端の端にループまたはリンカー、およびいずれの付加的なドメインをさらに含むことができる。好ましくは、該付加的なドメインは、DNA結合ドメイン、転写促進剤またはリプレッサードメイン、核局在化シグナルまたはDNA切断ドメインである。任意に、このようなハイブリッドのエンドヌクレアーゼ活性を撤廃することができる。第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび同じジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼも、本発明の意図するところである。この種類のメガヌクレアーゼにも、同じ設計の規則が適用される。ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメイン/モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメイン第三の実施形態は、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインからの第一のドメインおよび別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼに関する。交換点はいずれの適切な場所に位置する。メガヌクレアーゼの第二のドデカペプチドモチーフに先行するループの端、またはヘリックスαDの中に位置するのが好ましい。ある好ましい実施形態において、交換点はヘリックスαDの内部に位置する。特に好ましい実施形態において、交換点はドデカペプチドモチーフ自身の前のヘリックスαD中に位置する。得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、N末端の端からC末端の端に、メガヌクレアーゼAのN末端ドメインおよびメガヌクレアーゼBのドメインを含む。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。AおよびBは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。ABは、交換点がセグメントの内部にあり、要素の第一の部分の起源がAであり、第二の部分のそれがBであることを示す。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。本発明は、より具体的には、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、IDmoIメガヌクレアーゼのN末端ドメインからの第一のドメインおよびICreIメガヌクレアーゼからの第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼIDmoIICreIに関する。好ましくは、該適切なリンカーはIDmoIメガヌクレアーゼループである。好ましくは、交換点はドデカペプチドモチーフ自身の前のヘリックスαD中に位置する。ある実施形態において、本発明は実施例1および図6に開示されるハイブリッドメガヌクレアーゼIDmoIICreIまたはそれらの変形に関する。代替の実施形態において、交換点は交換ドメインにより置き換えられる。実際に、配列を急に変更する代わりに、ハイブリッドメガヌクレアーゼのヘリックスαDおよびαDは、2つの当初のメガヌクレアーゼの混合物であり得る。ヘリックス界面のほうに向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、両方のヘリックスについて1つのメガヌクレアーゼのものである。任意に、界面における残基は、モノまたはジドデカペプチドメガヌクレアーゼXからのドデカペプチドヘリックスの別の対に由来することが可能である。各ドメインの内部において、ドメインの内部の方に向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、それが由来するメガヌクレアーゼのそのドメイン中のその位置で見出される残基に対応するものである。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、BおよびXは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。ABは、交換点がセグメントの内部にあり、要素の第一の部分の起源がAであり、第二の部分のそれがBであることを示す。インターは、ドメイン間の界面に向いているαDおよびαDの残基のことをいい、イントラは、各ドメインの内部に向いているαDおよびαDの残基のことをいう。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。任意に、アミノ酸側鎖の間の立体障害を避け、そして/または安定性を増大させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、生産性および/または溶解性を増大させ、かつ毒性を減少させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、ループを適切なリンカーにより完全にまたは部分的に置き換えることができる。適切なリンカーは、好ましくはフレキシブルである。該フレキシブルリンカーは、好ましくはグリシン、セリンおよびスレオニン残基を含む。ループとドメインとの間に、短いフレキシブルリンカーを導入することもできる。任意に、該ループを、いずれの他のジドデカペプチドメガヌクレアーゼからのループ、好ましくはIDmoIループにより置き換えることもできる。任意に、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインからの第一のドメインおよび別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインからの第二のドメインを含むこのようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、そのN末端および/またはC末端の端にループまたはリンカー、およびいずれの付加的なドメインをさらに含むことができる。好ましくは、該付加的なドメインは、DNA結合ドメイン、転写促進剤またはリプレッサードメイン、核局在化シグナルまたはDNA切断ドメインである。任意に、このようなハイブリッドのエンドヌクレアーゼ活性を撤廃することができる。ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメイン/ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメイン第四の好ましい実施形態は、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼに関する。交換点はいずれの適切な場所に位置する。この交換点は、DNA結合部分DBMの最後のヘリックスから、ヘリックスαDに先行するループの開始までに位置する。ヘリックスαDに先行するループの開始に位置するのが好ましい。得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼAおよびBのC末端ドメインを含む。好ましくは、得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼAのN末端ドメインのDBMを含まず、より好ましくはそのN末端ドメインを含まない。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。AおよびBは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。ABは、交換点がセグメントの内部にあり、要素の第一の部分の起源がAであり、第二の部分のそれがBであることを示す。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。代替の実施形態において、交換点は交換ドメインにより置き換えられる。実際に、配列を急に変更する代わりに、ハイブリッドメガヌクレアーゼのヘリックスαDおよびαDは、2つの当初のメガヌクレアーゼの混合物であり得る。ヘリックス界面のほうに向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、両方のヘリックスαDおよびαDについて1つのメガヌクレアーゼのものである。任意に、界面における残基は、モノまたはジドデカペプチドメガヌクレアーゼXからのドデカペプチドヘリックスの別の対に由来することが可能である。各ドメインの内部において、ドメインの内部の方に向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、それが由来するメガヌクレアーゼのそのドメイン中のその位置で見出される残基に対応するものである。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、BおよびXは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。ABは、交換点がセグメントの内部にあり、要素の第一の部分の起源がAであり、第二の部分のそれがBであることを示す。インターは、ドメイン間の界面に向いているαDおよびαDの残基のことをいい、イントラは、各ドメインの内部に向いているαDおよびαDの残基のことをいう。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。任意に、アミノ酸側鎖の間の立体障害を避け、そして/または安定性を増大させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、生産性および/または溶解性を増大させ、かつ毒性を減少させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、ループを適切なリンカーにより完全にまたは部分的に置き換えることができる。適切なリンカーは、好ましくはフレキシブルである。該フレキシブルリンカーは、好ましくはグリシン、セリンおよびスレオニン残基を含む。ループとドメインとの間に、短いフレキシブルリンカーを導入することもできる。任意に、該ループを、いずれの他のジドデカペプチドメガヌクレアーゼからのループ、好ましくはIDmoIループにより置き換えることもできる。任意に、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインからの第二のドメインを含むこのようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、そのN末端および/またはC末端の端にループまたはリンカー、およびいずれの付加的なドメインをさらに含むことができる。好ましくは、該付加的なドメインは、DNA結合ドメイン、転写促進剤またはリプレッサードメイン、核局在化シグナルまたはDNA切断ドメインである。任意に、このようなハイブリッドのエンドヌクレアーゼ活性を撤廃することができる。第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第一のドメインおよび同じジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼも、本発明の意図するところである。この種類のメガヌクレアーゼにも、同じ設計の規則が適用される。モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメイン/ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメイン第五の実施形態は、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインからの第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼに関する。交換点は、DNA結合部分DBMの最後のヘリックスから、ヘリックスαDに先行するループの開始までに位置することができる。ヘリックスに先行するループの開始に位置するのが好ましい。得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、N末端の端からC末端の端に、メガヌクレアーゼAのドメインおよびメガヌクレアーゼBのC末端ドメインを含む。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。AおよびBは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。ABは、交換点がセグメントの内部にあり、要素の第一の部分の起源がAであり、第二の部分のそれがBであることを示す。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。代替の実施形態において、交換点は交換ドメインにより置き換えることができる。実際に、配列を急に変更する代わりに、ハイブリッドメガヌクレアーゼのヘリックスαDおよびαDは、2つの当初のメガヌクレアーゼの混合物であり得る。ヘリックス界面のほうに向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、両方のヘリックスαDおよびαDについて1つのメガヌクレアーゼのものである。任意に、界面における残基は、モノまたはジドデカペプチドメガヌクレアーゼXからのドデカペプチドヘリックスの別の対に由来することが可能である。各ドメインの内部において、ドメインの内部の方に向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、それが由来するメガヌクレアーゼのそのドメイン中のその位置で見出される残基に対応するものである。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、BおよびXは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。ABは、交換点がセグメントの内部にあり、要素の第一の部分の起源がAであり、第二の部分のそれがBであることを示す。インターは、ドメイン間の界面に向いているαDおよびαDの残基のことをいい、イントラは、各ドメインの内部に向いているαDおよびαDの残基のことをいう。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。任意に、アミノ酸側鎖の間の立体障害を避け、そして/または安定性を増大させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、生産性および/または溶解性を増大させ、かつ毒性を減少させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、ループを適切なリンカーにより完全にまたは部分的に置き換えることができる。適切なリンカーは、好ましくはフレキシブルである。該フレキシブルリンカーは、本質的にグリシン、セリンおよびスレオニン残基を含む。ループとドメインとの間に、短いフレキシブルリンカーを導入することもできる。任意に、該ループを、いずれの他のジドデカペプチドメガヌクレアーゼからのループ、好ましくはIDmoIループにより置き換えることもできる。任意に、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインからの第二のドメインを含むこのようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、そのN末端および/またはC末端の端にループまたはリンカー、およびいずれの付加的なドメインをさらに含むことができる。好ましくは、該付加的なドメインは、DNA結合ドメイン、転写促進剤またはリプレッサードメイン、核局在化シグナルまたはDNA切断ドメインである。任意に、このようなハイブリッドのエンドヌクレアーゼ活性を撤廃することができる。ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメイン/ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメイン第六の好ましい実施形態は、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼに関する。第一および第二のドメインは、いずれのジドデカペプチドメガヌクレアーゼYからの適切なリンカーまたは連結ループのいずれか、例えばIDmoIメガヌクレアーゼのループにより連結されている。適切なリンカーは、好ましくはフレキシブルである。該フレキシブルリンカーは、本質的にグリシン、セリンおよびスレオニン残基を含む。ループとドメインとの間に、短いフレキシブルリンカーを導入することもできる。リンカーは、メガヌクレアーゼAのC末端ドメインのDBMの4ストランドのβシートに続くヘリックスの一端、およびメガヌクレアーゼBのN末端ドメインのヘリックスαDにおける他の端に付着しているのが好ましい。得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、N末端の端からC末端の端にメガヌクレアーゼAのC末端ドメイン、リンカーまたは連結ループ、およびメガヌクレアーゼBのN末端ドメインを含む。好ましくは、得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼAのN末端ドメインのDBMを含まず、より好ましくはそのN末端ドメインを含まない。好ましくは、得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼBのC末端ドメインのDBMを含まず、より好ましくはそのC末端ドメインを含まない。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、BおよびYは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。代替の実施形態において、ハイブリッドメガヌクレアーゼのヘリックスαDおよびαDは、2つの当初のメガヌクレアーゼの混合物であり得る。ヘリックス界面のほうに向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、両方のヘリックスαDおよびαDについて1つのメガヌクレアーゼのものである。任意に、界面における残基は、モノまたはジドデカペプチドメガヌクレアーゼXからのドデカペプチドヘリックスの別の対に由来することが可能である。各ドメインの内部において、ドメインの内部の方に向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、それが由来するメガヌクレアーゼのそのドメイン中のその位置で見出される残基に対応するものである。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、B、XおよびYは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。インターは、ドメイン間の界面に向いているαDおよびαDの残基のことをいい、イントラは、各ドメインの内部に向いているαDおよびαDの残基のことをいう。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。任意に、アミノ酸側鎖の間の立体障害を避け、そして/または安定性を増大させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、生産性および/または溶解性を増大させ、かつ毒性を減少させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインからの第二のドメインを含むこのようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、そのN末端および/またはC末端の端にループまたはリンカー、およびいずれの付加的なドメインをさらに含むことができる。好ましくは、該付加的なドメインは、DNA結合ドメイン、転写促進剤またはリプレッサードメイン、核局在化シグナルまたはDNA切断ドメインである。任意に、このようなハイブリッドのエンドヌクレアーゼ活性を撤廃することができる。第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第一のドメインおよび同じジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼも、本発明の意図するところである。この種類のメガヌクレアーゼにも、同じ設計の規則が適用される。モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメイン/ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメイン第七の実施形態は、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインからの第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼに関する。第一および第二のドメインは、いずれのジドデカペプチドメガヌクレアーゼYからの適切なリンカーまたは連結ループのいずれか、例えばIDmoIメガヌクレアーゼのループにより連結されている。適切なリンカーは、好ましくはフレキシブルである。該フレキシブルリンカーは、本質的にグリシン、セリンおよびスレオニン残基を含む。ループとドメインとの間に、短いフレキシブルリンカーを導入することもできる。リンカーは、メガヌクレアーゼAのドメインのDBMの4ストランドのβシートに続くヘリックスの一端、およびメガヌクレアーゼBのN末端ドメインのヘリックスαDにおける他の端に付着しているのが好ましい。得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、N末端の端からC末端の端にメガヌクレアーゼAのドメイン、リンカーまたは連結ループ、およびメガヌクレアーゼBのN末端ドメインを含む。好ましくは、得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼBのC末端ドメインのDBMを含まず、より好ましくはそのC末端ドメインを含まない。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、BおよびYは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。代替の実施形態において、ハイブリッドメガヌクレアーゼのヘリックスαDおよびαDは、2つの当初のメガヌクレアーゼの混合物であり得る。ヘリックス界面のほうに向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、両方のヘリックスについて1つのメガヌクレアーゼのものである。任意に、界面における残基は、モノまたはジドデカペプチドメガヌクレアーゼXからのドデカペプチドヘリックスのその他の対に由来することが可能である。各ドメインの内部において、ドメインの内部の方に向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、それが由来するメガヌクレアーゼのそのドメイン中のその位置で見出される残基に対応するものである。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、B、XおよびYは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。インターは、ドメイン間の界面に向いているαDおよびαDの残基のことをいい、イントラは、各ドメインの内部に向いているαDおよびαDの残基のことをいう。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。任意に、アミノ酸側鎖の間の立体障害を避け、そして/または安定性を増大させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、生産性および/または溶解性を増大させ、かつ毒性を減少させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインからの第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインからの第二のドメインを含むこのようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、そのN末端および/またはC末端の端にループまたはリンカー、およびいずれの付加的なドメインをさらに含むことができる。好ましくは、該付加的なドメインは、DNA結合ドメイン、転写促進剤またはリプレッサードメイン、核局在化シグナルまたはDNA切断ドメインである。任意に、このようなハイブリッドのエンドヌクレアーゼ活性を撤廃することができる。ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメイン/モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメイン第八の実施形態は、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインからの第一のドメインおよび別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼからの第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼに関する。第一および第二のドメインは、いずれのジドデカペプチドメガヌクレアーゼYからの適切なリンカーまたは連結ループのいずれか、例えばIDmoIメガヌクレアーゼのループにより連結されている。適切なリンカーは、好ましくはフレキシブルである。該フレキシブルリンカーは、本質的にグリシン、セリンおよびスレオニン残基を含む。ループとドメインとの間に、短いフレキシブルリンカーを導入することもできる。リンカーは、メガヌクレアーゼAのC末端ドメインのDBMの4ストランドのβシートに続くヘリックスの一端、およびメガヌクレアーゼBのドメインのヘリックスαDにおける他の端に付着しているのが好ましい。得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、N末端の端からC末端の端にメガヌクレアーゼAのC末端ドメイン、リンカーまたは連結ループ、およびメガヌクレアーゼBのドメインを含む。好ましくは、得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼAのN末端ドメインのDBMを含まず、より好ましくはそのN末端ドメインを含まない。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、BおよびYは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。代替の実施形態において、ハイブリッドメガヌクレアーゼのヘリックスαDおよびαDは、2つの当初のメガヌクレアーゼの混合物であり得る。ヘリックス界面のほうに向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、両方のヘリックスについて1つのメガヌクレアーゼのものである。任意に、界面における残基は、モノまたはジドデカペプチドメガヌクレアーゼXからのドデカペプチドヘリックスのその他の対に由来することが可能である。各ドメインの内部において、ドメインの内部の方に向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、それが由来するメガヌクレアーゼのそのドメイン中のその位置で見出される残基に対応するものである。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、B、XおよびYは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。インターは、ドメイン間の界面に向いているαDおよびαDの残基のことをいい、イントラは、各ドメインの内部に向いているαDおよびαDの残基のことをいう。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。任意に、アミノ酸側鎖の間の立体障害を避け、そして/または安定性を増大させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、生産性および/または溶解性を増大させ、かつ毒性を減少させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインからの第一のドメインおよび別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインからの第二のドメインを含むこのようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、そのN末端および/またはC末端の端にループまたはリンカー、およびいずれの付加的なドメインをさらに含むことができる。好ましくは、該付加的なドメインは、DNA結合ドメイン、転写促進剤またはリプレッサードメイン、核局在化シグナルまたはDNA切断ドメインである。任意に、このようなハイブリッドのエンドヌクレアーゼ活性を撤廃することができる。モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメイン/モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメイン第九の実施形態は、第一および第二のドメインが適切なリンカーにより結合されている、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインに由来する第一のドメインおよび同じもしくは別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインに由来する第二のドメインを含むか、またはそれらからなるハイブリッドメガヌクレアーゼに関する。第一および第二のドメインは、いずれのジドデカペプチドメガヌクレアーゼYからの適切なリンカーまたは連結ループのいずれか、例えばIDmoIメガヌクレアーゼのループにより連結されている。適切なリンカーは、好ましくはフレキシブルである。該フレキシブルリンカーは、本質的にグリシン、セリンおよびスレオニン残基を含む。ループとドメインとの間に、短いフレキシブルリンカーを導入することもできる。リンカーは、メガヌクレアーゼAのドメインのDBMの4ストランドのβシートに続くヘリックスの一端、およびメガヌクレアーゼBのドメインのヘリックスαDにおける他の端に付着しているのが好ましい。得られるハイブリッドメガヌクレアーゼは、N末端の端からC末端の端にBのDBMの下流に位置する可変配列VAを欠失したメガヌクレアーゼAのドメイン、リンカーまたは連結ループ、およびBのドメインを含む。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、BおよびYは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。代替の実施形態において、ハイブリッドメガヌクレアーゼのヘリックスαDおよびαDは、2つの当初のメガヌクレアーゼの混合物であり得る。ヘリックス界面のほうに向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、両方のヘリックスについて1つのメガヌクレアーゼのものである。任意に、界面における残基は、モノまたはジドデカペプチドメガヌクレアーゼXからのドデカペプチドヘリックスの別の対に由来することが可能である。各ドメインの内部において、ドメインの内部の方に向けられているヘリックスαDおよびαDからのアミノ酸残基は、それが由来するメガヌクレアーゼのそのドメイン中のその位置で見出される残基に対応するものである。このようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、概略的に:を含む。A、B、YおよびXは、セグメントV、αD、DBM、L、αD、DBM、Vの起源でのメガヌクレアーゼを示す。インターは、ドメイン間の界面に向いているαDおよびαDの残基のことをいい、イントラは、各ドメインの内部に向いているαDおよびαDの残基のことをいう。αAおよびαBは、N末端ドメインのαDのことをいい、αAおよびαBは、C末端ドメインのαDのことをいう。DBM欄について、文字およびは、それぞれ、N末端ドメインおよびC末端ドメインからの起源を示す。任意に、アミノ酸側鎖の間の立体障害を避け、そして/または安定性を増大させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、生産性および/または溶解性を増大させ、かつ毒性を減少させるために、いくらかのアミノ酸修飾をさらに導入することができる。任意に、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインからの第一のドメインおよび別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインからの第二のドメインを含むこのようなハイブリッドメガヌクレアーゼは、そのN末端および/またはC末端の端にループまたはリンカー、およびいずれの付加的なドメインをさらに含むことができる。好ましくは、該付加的なドメインは、DNA結合ドメイン、転写促進剤またはリプレッサードメイン、核局在化シグナルまたはDNA切断ドメインである。任意に、このようなハイブリッドのエンドヌクレアーゼ活性を撤廃することができる。ハイブリッドメガヌクレアーゼ、より具体的にはジドデカペプチドメガヌクレアーゼのN末端ドメインに由来する第一のドメインおよび別のジドデカペプチドメガヌクレアーゼのC末端ドメインに由来する第二のドメインを含むハイブリッドメガヌクレアーゼは、IDmoIICreIハイブリッドメガヌクレアーゼについて実施例1に開示されている。2つのドメイン間に該リンカーを導入するある方法の例は、単鎖ICreIメガヌクレアーゼについて、実施例2に開示されている。代替の工作の計略が可能である。例えば、フレキシブルリンカーは、グリシン、セリンおよびスレオニンアミノ酸のいくつかを含む配列であり得る。我々の発明には存在しない不都合は、この場合、タンパク質ドメインへの連結と共に、各ドメインの組み合わせについて正確なリンカー配列および長さを決定する必要があることだろう。我々の好ましい計略は、ドメイン交換された親のタンパク質の構造解析および比較に基づく。別のアプローチは、保存構造のモチーフに最も確実に一致する領域における2つのタンパク質の配列を整列させることを必要とする。例えば、ドデカペプチドモチーフの配列保存は、ドメイン内の2ヘリックスの束の持続的な存在に関連する。ドメイン交換されたエンドヌクレアーゼは、第二のドデカペプチドモチーフ内のどこか、またはリンカー領域が存在しなければならないモチーフの直前においてタンパク質配列を交換することにより、工作することができる。本発明は、本質的に認識ドメインとしてのこのようなハイブリッドメガヌクレアーゼの使用も意図する。この場合、ハイブリッドメガヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ触媒活性は、ある変異、例えば触媒活性に必要な酸性残基DEにより撤廃することができる。ある具体的な実施形態において、本発明はドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来するあるドメイン、リンカーおよびドデカペプチドモチーフを含むヘリックスを含むキメラタンパク質に関する。任意に、該リンカーはジドデカペプチドメガヌクレアーゼからのループである。任意に、該キメラタンパク質は、付加的なドメインをさらに含む。該付加的なドメインは、好ましくはDNA結合ドメイン、転写促進剤またはリプレッサードメイン、核局在化シグナルまたはDNA切断ドメインである。単鎖メガヌクレアーゼ本発明において、我々は、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼを開示している。モノドデカペプチドメガヌクレアーゼは、ホモダイマーとして活性である。各モノマーは、主に、それらのドデカペプチドモチーフを介してダイマー化する。この単鎖メガヌクレアーゼは、この酵素の2つのサブユニットの間に共有結合を導入するように修飾されたモノドデカペプチドメガヌクレアーゼの2つのモノマーを共有的に結合する。好ましくは、該共有結合は、2つのモノマーの間にペプチド結合を創ることにより導入される。しかしながら、その他の適切な共有結合も本発明により意図される。本発明は、N末端からC末端の方向に該第一および第二のドメインを含み、第一および第二のドメインが同じモノドデカペプチドメガヌクレアーゼに由来し、そして単鎖メガヌクレアーゼがDNA切断を起こし得る、単鎖メガヌクレアーゼに関する。単鎖メガヌクレアーゼは、単鎖ICreおよび単鎖ICeuIのような同じメガヌクレアーゼからの2つのサブユニットを含むことができる。単鎖ICeuIIも、本発明により意図する。単鎖ICreIについての実施例2を参照。本発明は、配列番号6の配列を含むICreの単鎖メガヌクレアーゼに関する。単鎖メガヌクレアーゼは、多数の利点を有する。例えば、単鎖メガヌクレアーゼは、操作するのがより容易である。単鎖メガヌクレアーゼは、例えば標的配列の認識について、ダイマーの形成に比べて熱力学的に好ましい。単鎖メガヌクレアーゼは、オリゴマー化の調節を許容する。ハイブリッドメガヌクレアーゼの同じ原理が単鎖メガヌクレアーゼに適用される。より具体的には、モノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインに由来する第一のドメインおよび同じまたは別のモノドデカペプチドメガヌクレアーゼのドメインに由来する第二のドメインを含むハイブリッドメガヌクレアーゼを参照。本発明は、本発明によるハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼの変形にも関する。好ましくは、ハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼの変形は、当初のハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼと少なくとも70の相同性、より好ましくは少なくとも80、90、95または99の相同性を有する、2つのドメインおよびリンカーからなるメガヌクレアーゼの核を含む。変形は、11以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基により置換されており、かつこのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりエンコードされることができるか、またはされることができないもの、または21以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または3ハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物のような別の化合物と融合されているもの、または4リーダー配列もしくは分泌配列、またはハイブリッドメガヌクレアーゼの精製に用いられる配列のような、付加的なアミノ酸がハイブリッドメガヌクレアーゼに結合されたものであり得る。このような変形は、当業者の視野の範囲内であると考えられる。本発明によるハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換の場合、1またはいくつかのアミノ酸を等価アミノ酸により置換することができる。本明細書において用いられる等価アミノ酸の表現は、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造およびヒドロパシーの性質が実質的に変更されないことを予期できるように、類似の特性を有するアミノ酸の1つについて置換することができるいずれのアミノ酸を表す。一般に、次のアミノ酸の群が等価な変更を表す:Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr;Cys、Ser、Tyr、Thr;Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;Lys、Arg、His;Phe、Tyr、Trp、His。修飾されたハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼは、タンパク質溶解に耐性があるペプチド分子であり、CONHペプチド結合が、還元結合、レトロ逆結合、メチレンオキシ結合、チオメチレン結合、カルバ結合、セトメチレン結合、ヒドロキシエチレン結合、結合、Eアルセン結合またはCHCH結合により修飾され、かつ置換されているペプチドである。本発明は、少なくとも1つのペプチド結合が上記のようにして修飾されているハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼも包含する。本発明は、本発明によるハイブリッドもしくは単鎖メガヌクレアーゼを含むいずれの細胞、または非ヒト動物に関する。本発明は、本発明によるハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼを含むいずれの医薬組成物も含む。ハイブリッドおよび単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド、ベクター、細胞および動物本発明は、本発明によるハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼをエンコードする組換えポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドのうち、本発明は、配列番号1、3および5からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチドに関する。本発明は:a本発明によるハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列を含むいずれのベクター;b本発明によるハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列もしくは該ポリヌクレオチド配列を含むベクターのいずれかを含む原核細胞または真核細胞;c本発明によるハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチドを含むベクター、または該ポリヌクレオチドもしくは該ポリヌクレオチドを含むベクターのいずれかを含む細胞を含む非ヒト動物に関する。ハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、1以上の発現調節配列に実施可能に連結された該ハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼのコーディング配列の全部または部分を含み、それによりコーディング配列が転写シグナルの調節下にあって該ハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼの産生または合成を許容する。よって、ハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼをエンコードする該ポリヌクレオチドは、発現カセットの中に含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、該エンコードするポリヌクレオチドに実施可能に連結されるプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写終結部位を含む。また、エンハンサーを含むこともできる。プロモーターの選択は、ハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼの発現のために要求される経路に依存する。本発明は、発現ベクターの要素に影響を及ぼさない細胞に発現ベクターを導入することを含む、ハイブリッドまたはメガヌクレアーゼの製造方法に関する。ハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列は、いずれの既知の方法により製造できる。例えば、ハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列は、通常の分子生物学の技術を用いることにより、当初のメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列から製造できる。好ましくは、ハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列は、よく知られた逆翻訳法によりつくられるのが好ましい。例えばGCG配列解析パッケージ;EMBOSSのDNAストライダーなどにおいて、いくつかの逆翻訳ソフトが入手可能である。得られるポリヌクレオチド配列は、当業者によく知られたいずれの方法を用いて合成することができる。ハイブリッド認識および切断部位本発明によるハイブリッドメガヌクレアーゼは、ハイブリッドメガヌクレアーゼに含まれる各ドメインにより認識される半分の部位を含む、ハイブリッド部位または標的を認識し、かつ切断する。メガヌクレアーゼの認識部位は、パリンドロームではない。ジドデカペプチドメガヌクレアーゼAについて、N末端およびC末端は、2つの異なる半分の認識部位を認識する。当初の半分の部位について示される配列は、通常、ゲノムのプラス鎖の配列に対応する。Lは、部位の左の部分、Rは、右の部分をいう。よって、メガヌクレアーゼAの部位は、部位LA部位RAと記載することができる。本発明において、RC部位により、ゲノムの標的部位のプラス鎖上の半分の部位の逆相補配列を意図する。それらのそれぞれの認識および切断部位上での親の分子の配向は、常によく定義され、知られているわけではない。よって、好ましくは、いくつかの半分の部位の組み合わせを合成し、切断に付さなければならない。例えば、ジドデカペプチドメガヌクレアーゼAのドメインに由来する第一のドメインおよびジドデカペプチドメガヌクレアーゼBのドメインに由来する第二のドメインを含むハイブリッドメガヌクレアーゼについて、次の標的部位が好ましく用いられる;部位LA部位RBRC部位RA部位RB部位LARC部位LBRC部位RARC部位LB配向がわかっている場合、ハイブリッド部位は、いずれの組み合わせなしに容易に定義することができる。配向の決定は、ハイブリッドメガヌクレアーゼの発生、および上記の組み合わせのいくつかの標的へのそれらの特異性の研究により決定することができる。メガヌクレアーゼの各配向、および認識部位の決定の方法については、実施例3を参照。エンドヌクレアーゼ活性および特異性を試験するために、親の半分の部位の融合またはそれらの組み合わせに対応する合成標的部位を合成し、そしてベクターにクローニングするか、またはそのまま用いる。本発明は、本発明によるハイブリッド標的部位を含む単離または組換えポリヌクレオチドに関する。このハイブリッド標的部位は、当初のメガヌクレアーゼからの2つの半分の部位を含む。本発明は、本発明によるハイブリッド標的部位を含むベクターにも関する。本発明は、さらに、本発明による組換えポリヌクレオチドまたはハイブリッド標的部位を含むベクターを含む細胞に関する。本発明は、さらに、本発明による組換えポリヌクレオチドまたはハイブリッド標的部位を含むベクターを含む非ヒト動物に関する。本発明は、さらに、本発明による組換えポリヌクレオチドまたはハイブリッド標的部位を含むベクターを含む植物に関する。認識および切断部位に関して何も知られていない場合、この部位を決定するために次の方法を用いることができる。ドデカペプチドファミリーの、イントロンにエンコードされたホーミングメガヌクレアーゼは、通常、イントロンを有さない遺伝子中に存在する配列を認識し、切断するが、ここで該イントロンはメガヌクレアーゼをエンコードする配列を含む。実際に、メガヌクレアーゼについての標的配列は、イントロンを有さない遺伝子中に天然に存在する上流および下流のエキソンの接合点により表される。メガヌクレアーゼのこのクラスについての二本鎖切断は、認識部位の内部で起こる。認識部位の伸張についてのデータがない場合、認識部位の長さは、左の部分に30ヌクレオチド、および右の部分に30ヌクレオチドであるべきであり、つまりタンパク質の結合および/または切断を試験するのに60ヌクレオチドという意味である。認識配列は、イントロンを有さない遺伝子中のイントロン挿入点の場所の付近の中心におくべきである。インテインの特定の場合、規範的な標的は、DNAレベルにおいて、2つのエクステインをエンコードする配列の接合点により表されるべきであり、かつ前出の部位に等価なサイズのものであるべきである。認識部位についてのデータがない場合、イントロンにエンコードされた部位の決定との1つの相違点は、認識部位の真ん中でのシステインコドンの存在であろう。ハイブリッドメガヌクレアーゼの場合、規範的な標的配列は、各原型のメガヌクレアーゼの2つの半分の部位の間の接合点により表されるべきである。インビトロ切断アッセイ本発明によるハイブリッドおよび/または単鎖メガヌクレアーゼによる特定のDNA配列の認識および切断は、当業者に知られているいずれの方法により分析され得る。ハイブリッドおよび/または単鎖メガヌクレアーゼの活性を試験するある方法は、アッセイするメガヌクレアーゼに対応する認識および切断部位を含むポリヌクレオチド基質のインビトロ切断アッセイを用いることである。該ポリヌクレオチド基質は、合成され、ベクターにクローニングされる親の半分の部位の融合に対応する合成標的部位である。制限酵素により一旦線状化されたこのベクターを、次いでハイブリッドとインキュベーションする。該ポリヌクレオチド基質は、線状または環状であることができ、好ましくは切断部位を1つだけ含む。アッセイされるメガヌクレアーゼは、適切な条件でポリヌクレオチド基質とインキュベートされる。得られるポリヌクレオチドは、いずれの既知の方法、例えばアガロース上での電気泳動またはクロマトグラフィーにより分析される。メガヌクレアーゼ活性は、2つのバンドの出現、および当初の全長の基質のバンドの消滅により検出される。好ましくは、該アッセイされるメガヌクレアーゼは、例えば得られるポリヌクレオチドの分析の前に、プロテイナーゼKにより消化される。ある実施形態において、標的産物は、TAまたは制限酵素クローニングによる、プラスミドへの認識および切断配列を含むポリヌクレオチドの導入、および任意にそれに続くプラスミドの線状化を用いて調製される。好ましくは、このような線状化は、標的部位の周囲では行われない。Wangら、1997、NucleicAcidResearch、25、3767~3776;InmaterialsMethodsICreIendonucleaseactivityassaysセクション、および考慮するメガヌクレアーゼの特性を決定している文献を参照。それらのそれぞれの認識および切断部位上での当初のメガヌクレアーゼの配向は、いつも知られているわけではない。よって、いくつかの半分の部位の組み合わせが合成され、切断に付されなければならない。インビボ切断アッセイ本発明によるハイブリッドおよび/または単鎖メガヌクレアーゼによる特定のDNA配列の認識および切断は、当業者に知られているいずれの方法により分析され得る。ハイブリッドおよび/または単鎖メガヌクレアーゼの活性を試験するある方法は、インビボ一本鎖アニーリング組換え試験の使用である。この種の試験は、当業者に知られており、例えばその開示が本明細書に参照として組み込まれるRudinら;FishmanLobellおよびHaber;Linら、ならびにRouetらに開示される。この試験は、いずれのエンドヌクレアーゼ、好ましくはレアカットエンドヌクレアーゼの分析のために用い得る。本発明によるハイブリッドおよび/または単鎖メガヌクレアーゼを試験するために、我々は、真核細胞、すなわち酵母細胞または哺乳動物細胞のような高等真核細胞中でSSAに基づくインビボアッセイを開発した。インビボアッセイのある好ましい実施形態において、該方法は酵母細胞を用いる。この生物は、高頻度で相同組換えを介してそのDNAを自然に組み換える利点を有する。このインビボ試験は、アッセイされるメガヌクレアーゼによりその認識および切断部位においてつくられる部位特異的二本鎖切断により誘導されるレポーターマーカーのSSAによる修復に基づく。標的は、アッセイされるメガヌクレアーゼの認識および切断部位を含む介在配列により分離される内部重複を持つ修飾されたレポーター遺伝子からなる。内部重複は、少なくとも50bp、好ましくは少なくとも200bp、より好ましくは少なくとも300または400bpを含むべきである。SSA試験の効率は、内部重複のサイズにより増加される。介在配列は、2kbにあり、好ましくは2kb未満である。好ましくは、少なくとも認識および切断部位を含む介在配列のサイズは、数bp~1kbの間、好ましくは500bpの中である。介在配列は、任意に、選択マーカーを含み得る。レポーター遺伝子により、容易にアッセイされる産物、例えばβガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グリーン蛍光タンパク質、チロシナーゼ、DsRedタンパク質をエンコードするいずれの核酸を意図する。レポーター遺伝子は、好ましくは、アッセイにおいて用いられる細胞に関連する構成プロモーターに実施可能に連結される。本アッセイ方法によると、レポーターはSSAイベントが、アッセイされるメガヌクレアーゼにより導入される二本鎖切断に続いて起こる場合にのみ検出される。アッセイされるメガヌクレアーゼは、発現カセット中に導入される。好ましくは、この発現カセットは独立した構築物上にある。メガヌクレアーゼをエンコードする配列は、誘導可能なプロモーターまたは構成プロモーターに実施可能に連結されることができる。もちろん、該プロモーターは、アッセイで用いられる細胞に影響を及ぼさないものである必要がある。好ましい実施形態において、該構築物はプラスミドに含まれている。任意に、各構築物は、細胞中のプラスミドの存在を確実にするのに選択可能なマーカーを含むことができる。この選択可能なマーカーの存在は、酵母細胞中で進められるアッセイに必要である。例えば、酵母について、標的遺伝子を含む第一の構築物は、形質転換された酵母がいずれのロイシンも含まない合成培地で増殖するのを許容するLeu2選択マーカーを含むことができ、そして第二の構築物は、形質転換された酵母がいずれのトリプトファンも含まない合成培地で増殖するのを許容するTrp1選択マーカーを含むことができる。2つの構築物を用いて、適切な細胞を同時に形質転換する。メガヌクレアーゼが発現し、そしてレポーター構築物上でその切断部位を認識する場合、一本鎖アニーリングとして知られる機構により、それは二本鎖切断および標的配列の間の部位特異的組換えを促進することができる。得られるレポーター遺伝子は、次いで完全に活性なレポータータンパク質を発現するはずである。コントロール実験を、いずれのメガヌクレアーゼ遺伝子を発現しない構築物、ならびに認識および切断部位を有さないレポーター構築物を用いて行うことができる。実施例4は、Ura3選択マーカーにより分離された900pbの内部重複を有する修飾されたβガラクトシダーゼ遺伝子、およびアッセイされるメガヌクレアーゼへの切断部位からなる標的の使用を開示した。本発明によるハイブリッドおよび/または単鎖メガヌクレアーゼによる認識および切断は、遺伝子変換アッセイによっても行うことができる。例えば、レポーター構築物は、欠失および欠失の位置での介在配列の挿入をもつ第一の修飾されたレポーター遺伝子を含む。この介在配列は、アッセイされるメガヌクレアーゼの認識および切断部位を含む。レポーター構築物は、さらに、欠失に接するレポーター遺伝子配列がそれぞれの側にある、欠失されたレポーター遺伝子のフラグメントを含む。この接する配列は、それぞれの側で、レポーター遺伝子と少なくとも100bp、好ましくは少なくとも300pbの相同性を有する。その認識および切断部位における、アッセイされるメガヌクレアーゼによりつくられる部位特異的二本鎖切断の誘導は、遺伝子変換事象の引き金となり、機能的なレポーター遺伝子となる。この種のアッセイは、次の文献に記載されている:Rudinら、FishmanLobellおよびHaber、PaquesおよびHaber、これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる。他には、本発明によるハイブリッドおよび/または単鎖メガヌクレアーゼによる認識および切断は、染色体の標的上の組換えアッセイを介して行うことができる。組換えは、SSAまたは遺伝子変換機構に基づくことができる。例えば、アッセイされるメガヌクレアーゼについての認識および切断部位を含む変異非機能性レポーター遺伝子は、細胞の染色体に導入される。該切断部位は、変異の近傍でなければならず、好ましくは変異から1kb未満、より好ましくは変異の周囲で500bp、200bpまたは100pb未満である。変異に対応する機能性レポーター遺伝子のフラグメントおよび細胞内で、アッセイされるメガヌクレアーゼの産生を許容する発現構築物で細胞をトランスフェクションすることにより、アッセイされるメガヌクレアーゼによりつくられる二本鎖切断の相同性組換えによる修復は、機能性レポーター遺伝子に導き、このレポーター遺伝子の発現が検出される。この種のアッセイは、次の文献に記載されている:Rouetら;Choulikaら;Donohoら;これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる。標的遺伝子またはウイルスに対するハイブリッドメガヌクレアーゼの検索本発明は、ウイルスゲノムまたは興味のあるその他のゲノム中、より具体的にはそれらの遺伝子内の標的遺伝子座における、メガヌクレアーゼの天然もしくはハイブリッドについての新規な標的を見出す新規な方法を開示する。実際に、多数のLAGLIDADGメガヌクレアーゼから、ハイブリッドメガヌクレアーゼが、標的部位の高い多様性を生み出すのを許容している。これらの新規な標的部位は、興味のあるゲノム中に希であり、好ましくはほぼ唯一であり、そしてさらに以下で詳細に説明されるいくつかの使用に有用である。全ての既知のメガヌクレアーゼ標的部位を含むデータベースを作成する。好ましくは、このようなデータベースは、メガヌクレアーゼにより切断されると実験的に示されている標的部位を含む。第二のデータベースは、ハイブリッドメガヌクレアーゼについての全ての可能な標的を含んで設計される。ハイブリッドメガヌクレアーゼについてのこのような標的は、上で開示されるようにして設計することができる。これらのデータベースから、整列を行ってギャップのない相同配列を見出すが、該相同配列は少なくとも70、好ましくは80、より好ましくは90、さらにより好ましくは95の同一性を有する。2つの配列の間の同一性を計算するのに、GCG配列分析パッケージの部分として入手可能であって、例えばデフォルトの設定で用い得るFASTAまたはBLASTを含む種々の整列アルゴリズムおよび/またはプログラムを用い得る。メガヌクレアーゼの使用本発明によるハイブリッドメガヌクレアーゼは、分子生物学ならびに遺伝子工学および遺伝子治療のために、より具体的にはWO9614408、米国特許第5830729号、WO0046385、WO0046386ならびに証明番号第366520号の下で2001年10月26日にファイルされた仮出願および証明番号366517の下で2001年9月14日にファイルされた仮出願に記載の方法に従って、用いることができる。ハイブリッドメガヌクレアーゼの非常に興味深い使用は、興味のある特定のゲノム遺伝子座を標的とするためのものである。実際、細胞の染色体DNAの興味のある部位での二本鎖切断の誘導は、高い効率での、切断部位を取り囲む領域に相同な標的DNAの導入により達成される。ハイブリッドメガヌクレアーゼは、ハイブリッド標的部位を含む特定のゲノム遺伝子座を標的とするために用いることができる。本発明によるハイブリッドメガヌクレアーゼは、染色体DNAの特定部位での二本鎖DNA切断の細胞内における誘導を含む方法において用い得る。より詳細には、WO9614408、米国特許第5830729号、WO0046386を参照。ハイブリッドメガヌクレアーゼは、次の工程を含む遺伝子工学の方法において用い得る:1対応するハイブリッドメガヌクレアーゼを用いて、ハイブリッド標的部位を含むゲノム遺伝子座にて二本鎖切断を導入し;2標的遺伝子座に、相同配列が側面にある導入する配列を含む標的DNA構築物を提供する。実際に、相同DNAは、標的DNA構築物の左および右のアームにあり、興味のある配列を修飾するDNAは、2つのアームの間に位置する。該ハイブリッドメガヌクレアーゼは、該ハイブリッドメガヌクレアーゼをエンコードし、かつ用いられる細胞におけるその発現に適したポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、またはハイブリッドメガヌクレアーゼ自体のいずれかを介して細胞に提供される。本発明によるハイブリッドまたは単鎖メガヌクレアーゼは、ウイルスゲノムまたはその部分の欠失のために用い得る。実際に、ウイルスゲノムにおけるカットは、ウイルスゲノム全体または部分の欠失に導き得る組換えを誘導する。この方法は、通常、ウイルスポップアウトと呼ばれる。よって、ハイブリッドメガヌクレアーゼは、ウイルスゲノムを標的とすることを許容する。WO9614408の実施例5を参照。したがって、本発明は、本発明によるメガヌクレアーゼによりウイルスゲノム中に二本鎖切断を導入し、そして該二本鎖切断が組換え事象を誘導してウイルスゲノムまたはその部分の欠失に導く、ウイルスゲノムまたはその部分を欠失する方法に関する。標的遺伝子座または標的ウイルスゲノムに二本鎖切断を導入するための適切なハイブリッドメガヌクレアーゼの決定のためには、すぐ前のセクションを参照。その他の使用において、ハイブリッドおよび単鎖メガヌクレアーゼは、少なくとも1つ、好ましくは2つのハイブリッド標的部位が側面にあるポリヌクレオチドフラグメントのインビボでの切り出しのためであり得る。本発明によるハイブリッドメガヌクレアーゼは、ベクターを取り込んだ細胞内のベクターからの標的DNAまたはポリヌクレオチドフラグメントの切り出しを含む方法において用い得る。このような方法は、少なくとも1つ、好ましくは2つのハイブリッド標的部位が側面にある該ポリヌクレオチドフラグメントを含むベクター、および用いられる細胞中での発現に適したハイブリッド標的部位に対応するハイブリッドおよび単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該ハイブリッドおよび単鎖メガヌクレアーゼのいずれかの使用を含む。該切り出されたポリヌクレオチドフラグメントは、USSN60330639の下で2001年10月26日にファイルされた仮出願およびUSSN60318818の下で2001年9月14日にファイルされた仮出願中に記載されているような、トランスジェネシスのために用い得る。該切り出された標的DNAは、標的DNAの左および右のアームに相同DNAを含み、興味のある配列を修飾するDNAが2つのアームの間に位置する。より詳細には、WO0046385を参照。細胞内のベクターからの標的DNAの切り出しのこの方法は、染色体DNA中の興味のある特定の配列の修復のため、染色体DNA中の特定の配列もしくは遺伝子の修飾のため、興味のある内在遺伝子の弱毒化のため、標的部位への変異の導入のため、または個体における遺伝子疾患の治療もしくは予防のために用い得る。本発明は、得られる細胞、およびタンパク質もしくはその他の遺伝子産物の産生のため、あるいは遺伝子的な欠損の結果として起こる個体における症状もしくは障害の治療または予防のためのそれらの使用にも関する。例えば、細胞を本明細書に記載される方法により産生し、次いで既知の方法を用いて個体に導入することができる。代わりに、個体内で細胞を修飾することができる。本発明は、最適なデリバリー技術の評価のための、ハイブリッドメガヌクレアーゼ部位が疾患遺伝子の部位において導入されている、疾患の動物モデルの産生にも関する。実施例実施例1:IDmoIICreIハイブリッドメガヌクレアーゼIDmoIICreIハイブリッドメガヌクレアーゼ設計IDmoIは、超高熱始原菌であるデスルフロコッカスモビリスの23SrRNA遺伝子のイントロンによりエンコードされている熱安定性エンドヌクレアーゼである。IDmoIは、メガヌクレアーゼのLAGLIDADGファミリーに属する。X線結晶学により解明されたその構造は、擬2回回転対称により関連づけられる2つの類似のα/βドメインからなる。ドデカペプチドモチーフは、各ドメインの第一のαヘリックスのC末端の端に位置する。これらのヘリックスは、ドメイン間の界面において2ヘリックスの束を形成し、2つの4ストランド逆平行βシートにより形成される鞍形DNA結合表面に垂直である。ICreIは、クラミドモナスレインハルディティの葉緑体23SrRNA遺伝子中の自己スプライシングイントロン内に含まれるオープンリーディングフレームによりエンコードされる、別のLAGLIDADGメガヌクレアーゼである。しかしながら、このタンパク質ファミリーの多くの構成要素とは異なり、ICreIはドデカペプチドモチーフの単一コピーを含み、かつダイマーの形態で機能する。ICreIダイマーは、単鎖LAGLIDADGタンパク質の全体の構造を示す。各モノマーは単一のドメインに対応し、DNA結合のための2つの4ストランド逆平行βシートのうちの1つを提供し、そしてドデカペプチドモチーフは、ドメイン間の界面におけるαヘリックス内にある。これらは類似の全体のトポロジーを示すので、IDmoIおよびICreIの構造は、重ね合わせると低い二乗平均偏差であり、ICreIからの各モノマーは、IDmoIからの2つのドメインの1つによく適合している。最適な構造的適合は、次の原子を重ね合わせて得られた:低いRMSDは、2つのドデカペプチドドメイン間パッキング界面の類似性を強く示唆している。ドデカペプチドモチーフおよび対応するαヘリックスの整合した配列は:である。重ね合わせの視覚的な検査は、対応するICreIモノマーで第二のIDmoIドメインを置き換えることにより、両方のタンパク質のハイブリッドが形成されているであろうことを示した。両方のDNA結合ドメインをつなぐループ内、またはそれに続く第二のドデカペプチドαヘリックス内の同じ点から開始するIDmoI配列は、対応する点から開始するICreIのそれにより置換されるべきである。我々は、第二のドデカペプチドモチーフの始まりでドメインを交換することを選択した。得られたハイブリッドタンパク質配列は、Phe109までIDmoIのタンパク質配列で、そしてLeu213からICreIのタンパク質配列であった。したがって、Leu213に先行するICreIからの残基は除いた。このようなハイブリッドのアミノ酸、およびポリヌクレオチド配列については図6を参照。モデル配列においては、新規なドメイン間パッキング界面はほとんど欠陥を示さず、例えば、おそらくPhe294とのオーバーラップを有するIle107を除いて、容易に弛緩しない空間的衝突を有するアミノ酸側鎖は存在しなかった。潜在的に好ましくない斥力が得られることを抑制するために、イソロイシン残基をロイシンアミノ酸により置換する。結局、ドメイン間のリンカー配列は次のようである:さらに、Leu47、His51およびLeu55は、Lys296に非常に近い。しかしながら、タンパク質の主鎖構造が、構造が充分に確かなものではないことを示し得るので、これは不確定である。にもかかわらず、3つの付加的な変異:L47A、H51AおよびL55Dを含むハイブリッドタンパク質の第二のバージョンが設計されている。アラニンアミノ酸は、対応する残基のαヘリックス構造を安定化させるのに選択された。第三の変異は、Lys296へのドメイン間塩橋の形成に導き、それにより更なる安定化を与えるはずである。このようなハイブリッドのアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、図6Bを参照。ハイブリッドIDmoIICreIメガヌクレアーゼ産生溶液超音波破砕溶液:25mMHEPES、5グリセロール、01抗プロテアーゼ溶液;溶液A:25mMHEPES、5グリセロール、保存溶液:25mMHEPES、20グリセロール標準反応溶液:125mMHEPES、25グリセロール、5~10mMMgCl2;標準停止溶液:01MTrisHClpH75、025MEDTA、5SDS、05mgmlプロテイナーゼK。プラスミド発現プラスミドNovagenを工作して、ヒスチジンタグを有するかまたは有さないIDmoIICreIハイブリッドメガヌクレアーゼを産生した。簡単に、ORF配列を有し、かつNcoIおよびEagIまたはXhoI制限部位が側面にあるフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応および特異的オリゴヌクレオチドを用いて作製した。まず、半分のIDmoIおよびICreI配列をPCRにより作製し、次いでIDmoIICreIハイブリッド配列を別のPCRにより完成した。IDmoIICreIハイブリッドメガヌクレアーゼの発現および精製エシェリヒアコリBL21株RILを、IDmoIICreIの精製に用いた。IDmoIICreIプラスミドNovagenで形質転換したクローンを、30mgmlカナマイシンを含む250mlのルリア培地で、37°Cにおいて振とうしながら増殖させた。培養物が08~12のA600に到達したときに、1mMの最終濃度までのIPTGの添加により発現を誘導し、25°Cで5時間~15時間後に細胞を遠心分離により回収した。特に記載しない限りは、次の手順を4°Cで行った。回収した細胞を氷冷超音波破砕溶液25mlに再懸濁し、次いで5分間超音波破砕した。溶菌液を105000gで30分間遠心分離した。上清を回収し、次いで105000gで30分間の第二の超遠心分離に付した。タンパク質90を含んでいたこの上清を、可溶性フラクションと称した。該可溶性フラクションを、コバルトをのせたHiTrapキレーティングカラム5mlに、流速25ml分でアプライした。溶液A25mlでカラムを洗浄後、結合したタンパク質を、溶液A中で作製した0~025Mのイミダゾールの直線勾配、その後の05Mイミダゾール05MNaClの溶出段階で溶出した。フラクションを回収し、タンパク質の量およびIDmoIICreI活性を測定した。カラムフラクションをSDSPAGEによっても分析した。ほとんどのIDmoIICreI活性を含むフラクションをプールし、10kDaカットオフのセントリプレップアミコンシステムを用いて濃縮した。この濃縮されたフラクションを、溶液Aの流速1ml分でのSuperdex75PGHiLoad2660カラムにアプライして精製した。フラクションを回収し、タンパク質の量およびIDmoIICreI活性を測定した。カラムフラクションをSDSPAGEによっても分析した。ほとんどのIDmoIICreI活性を含むフラクションをプールし、10kDaカットオフのセントリプレップアミコンシステムを用いて濃縮した。次いで、保存溶液に対して一晩透析し、そしてアリコートで液体窒素中に保存した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を、Laemmliにより記載されたようにして、15のアクリルアミドゲルを用いて行った。ゲルをクマシーブリリアントブルーを用いて染色した。図8Aは、ハイブリッドメガヌクレアーゼIDmoIICreIがよく発現されており、このハイブリッドが上清中に得られており、つまり可溶性であることを示している。IDmoIICreIハイブリッドメガヌクレアーゼのサイズ溶液中のIDmoIICreIの分子量を、精製タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーにより判断した。カラムフラクションをSDSPAGEにより分析し、そして主として312kDaのバンドが溶出したが、これは30kDaの分子量に相当した。つまり、この分析は、IDmoIICreIが主にモノマーであることを示した。実施例2:単鎖ICreIメガヌクレアーゼ単鎖ICreIメガヌクレアーゼ設計ICreIは、ダイマー化する単独LAGLIDADGタンパク質ドメインである。ドメイン交換ストラテジーのために、我々はICreIドメインをいずれの他のLAGLIDADGドメインにつなぐことを計画した。2つのモノマー間に連結を置くことによる単鎖ICreIタンパク質の工作は、実施例Iに相補的であった。これは、新規なDNA結合特異性を有するタンパク質を与えなかった。代わりに、得られた人工タンパク質は、天然の単独LAGLIDADGタンパク質が、より大きい二倍のLAGLIDADGタンパク質の半分が2つとして効果的に判断することができることを明らかにした。2つのドメインの融合が機能的であったなら、異なる単独LAGLIDADGからのドメインの、このようなタンパク質の間での、または二倍のLAGLIDADGタンパク質からのドメインとの交換は、簡単であるはずである。各ICreIドメインは、二倍のLAGLIDADGタンパク質のC末端ドメインに存在するが、N末端ドメインの部分ではあり得ない3つのαヘリックスからつくられたC末端サブドメインを含む。これらのタンパク質のN末端ドメインは、2つのドメインをつなぐループまたはリンカーが3つのαヘリックスの位置にあるので、実際により短い。3つのヘリックスはダイマー構造の反対側の部位、ドデカペプチドモチーフのN末端ヘリックスから遠くで終結する。1つのドメインのC末端残基を他のドメインのN末端残基につなげるフレキシブルリンカーの長さは、かなりである。そのほかにも、このようなリンカーの工作は、タンパク質表面の多くの部分を横切る必要があるために困難であろう。したがって、正しいドメインのパッキングが得られるかは確かでない。前の実施例において論じたIDmoIおよびICreIの構造的重ね合わせは、単純なリンカーの解決を設計するのを許容した。IDmoI自体からのループ領域である残基96~103は、1つのICreIドメインのC末端フラグメントを置き換え、そして第二のドメインのN末端領域に導くことができる。ループの両側において、IDmoIおよびICreIからの残基はよく整合し、そして重ね合わせることができる。これらの残基は:である。よって、ICreIドメインの間の連結は、第一のドメインのC末端残基、および第二のもののN末端残基、それぞれPro93、Phe94またはLeu95からLys207、Glu208またはPhe209までのいずれかを置き換えるように選択されるべきである。実際、2つの重ね合わされた位置のアミノ酸は同一であり、第三の位置ではこれらは等価であるのに充分に類似である。よく保存された残基であり、そして活性部位に近いICreIのリシン98は機能的役割を有しているであろうと言うJuricaらの開示にもかかわらず、第一のドメインICreIのリシン98を除去する。プロリン93は、その残基の位置での主鎖のαヘリックス構造について最適な残基ではない。IDmoI中の対応するアスパラギンは、わずかにより良いだけである;アミノ酸の独特な水素結合の特性は、αヘリックス中のN末端切断を促進する明白な傾向を確立する。この位置においては、結局、アラニン残基が好ましい。よって、ICreIの単鎖バージョンを、天然のICreIドメインの短くしたバージョンとそのドメインのほぼ完全なコピーとの間に、Met94から開始してGlu105まで、IDmoIブリッジを導入するように工作したおよびポリヌクレオチド配列について、図5および図7。Met94は、ICreIタンパク質ダイマー内に埋まっている、よりかさばるフェニルアラニンアミノ酸を置換した。両方のアミノ酸は、同等によく適合しているようであり、そしてその配列の位置で代わりとして試すことができる。別の非極性アミノ酸、位置98でのイソロイシンは、いずれの原子の重なりを創ることなく、原型のダイマー構造にパッキングされる。残基101の芳香族フェニルアラニンは、同等に良好であるが、別の芳香族アミノ酸のチロシンにより置き換えることも可能であり、これは次いで残基94の主鎖カルボニル基に安定化水素結合を形成することができる。つまり、次の配列は、2つのICreIドメイン間のリンカー領域を提供する代替の解決である:単鎖ICreIメガヌクレアーゼ産生溶液超音波破砕溶液:25mMHEPES、5グリセロール、01抗プロテアーゼ溶液;溶液A:25mMHEPES、5グリセロール、保存溶液:25mMHEPES、20グリセロール標準反応溶液:125mMHEPES、25グリセロール、5~10mMMgCl2;標準停止溶液:01MTrisHClpH75、025MEDTA、5SDS、05mgmlプロテイナーゼK。プラスミド発現プラスミドNovagenを工作して、ヒスチジンタグを有するかまたは有さない単鎖ICreIを産生した。簡単に、ORF配列を有し、かつNcoIおよびEagIまたはXhoI制限部位が側面にあるフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応および特異的オリゴヌクレオチドを用いて作製した。まず、2つの半分の修飾されたICreI配列をPCRにより作製し、次いで単鎖ICreIハイブリッド配列を別のPCRにより完成した。ScICreIの発現および精製エシェリヒアコリBL21株RILを、ScICreIポリペプチドの産生および精製に用いた。ScICreIプラスミドNovagenで形質転換したクローンを、30mgmlカナマイシンを含む250mlのルリア培地で、37°Cにおいて振とうしながら増殖させた。培養物が08~12のA600に到達したときに、1mMの最終濃度までのIPTGの添加により発現を誘導し、25°Cで5時間~15時間後に細胞を遠心分離により回収した。特に記載しない限りは、次の手順を4°Cで行った。回収した細胞を氷冷超音波破砕溶液25mlに再懸濁し、次いで5分間超音波破砕した。溶菌液を105000gで30分間遠心分離した。上清を回収し、次いで105000gで30分間の第二の超遠心分離に付した。タンパク質90を含んでいたこの上清を、可溶性フラクションと称した。該可溶性フラクションを、コバルトをのせたHiTrapキレーティングカラム5mlに、流速25ml分でアプライした。溶液A25mlでカラムを洗浄後、結合したタンパク質を、溶液A中で作製した0~025Mのイミダゾールの直線勾配、その後の05Mイミダゾール05MNaClの溶出段階で溶出した。フラクションを回収し、タンパク質の量およびScICreI活性を測定した。カラムフラクションをSDSPAGEによっても分析した。ほとんどのScICreI活性を含むフラクションをプールし、10kDaカットオフのセントリプレップアミコンシステムを用いて濃縮した。この濃縮されたフラクションを、溶液Aの流速1ml分でのSuperdex75PGHiLoad2660カラムにアプライして精製した。フラクションを回収し、タンパク質の量およびScICreI活性を測定した。カラムフラクションをSDSPAGEによっても分析した。ほとんどのScICreI活性を含むフラクションをプールし、10kDaカットオフのセントリプレップアミコンシステムを用いて濃縮した。次いで、保存溶液に対して一晩透析し、そしてアリコートで液体窒素中に保存した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を、Laemmliにより記載されたようにして、15のアクリルアミドゲルを用いて行った。ゲルをクマシーブリリアントブルーを用いて染色した。ScICreIメガヌクレアーゼのサイズ溶液中のScICreIの分子量を、精製タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーにより判断した。並べたカラムの結果を図2Aにまとめる。カラムフラクションをSDSPAGEにより分析し、そして主として314kDaのバンドが溶出し、これは30kDaの分子質量に相当した。つまり、この分析は、ScICreIが主にモノマーであることを示した。実施例3:切断アッセイインビトロ切断アッセイハイブリッドIDmoIICreIメガヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性のアッセイプラスミドpGEMtargetを、PCRまたはシングルストレインハイブリダイゼーションにより得られる標的産物のTAまたは制限酵素クローニングにより構築した。標的産物は、次の認識および切断部位を含む:このプラスミドを切断アッセイに用いた。これはキアゲンマキシプレップDNA精製システムを用いて単離した。ほとんどの実験について、アッセイの前にこれをXmnIで線状化した。標準IDmoIICreIアッセイを、37°Cで標準反応溶液中に行い、01容量の10×標準停止溶液で停止し、そして産物を室温での1アガロースエチジウムブロマイドゲルでの電気泳動により分離した。トランスイルミネーターを用いて蛍光をカメラで捉えた。1単位のエンドヌクレアーゼ活性を、ICreI野生型と同じアッセイ条件において、37°Cで60分間に標的DNA200ngを切断するのに必要なIDmoIICreIの量と定義した。活性アッセイを、DNA切断のためのIDmoIの最適温度である65°Cでも行った。IDmoIICreIハイブリッドメガヌクレアーゼは、標的ICreIIDmoIを特異的に切断し、IDmoI、ICreIおよびISceIメガヌクレアーゼの野生型標的、ならびに標的IDmoIICreIを切断しない。これらの結果を図8Bに示す。よって、IDmoIICreIハイブリッドメガヌクレアーゼは、その新規な標的配列に高い特異性を示す。IDmoIICreIハイブリッドメガヌクレアーゼは、37および65°Cで標的ICreIIDmoIを切断するが、切断は65°Cでより速い。標的ICreIIDmoIに対するIDmoIICreIハイブリッドメガヌクレアーゼの新規な特異性は、野生型メガヌクレアーゼIDmoIの相対的な配向ならびにその認識および切断部位の決定を許容する。実際、IDmoIメガヌクレアーゼのN末端ドメインは、標的ICreIIDmoIの第二の半分のドメインを認識する。よって、IDmoIメガヌクレアーゼのN末端ドメインは、右側半分の部位と、左側のもののC末端ドメインを認識する。単鎖ICreIメガヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性アッセイプラスミドpGEMtargetを、PCRまたはシングルストレインハイブリダイゼーションにより得られる標的産物のTAまたは制限酵素クローニングにより構築した。標的産物は、次の認識および切断部位を含む:このプラスミドを切断アッセイに用いた。これはキアゲンマキシプレップDNA精製システムを用いて単離した。ほとんどの実験について、アッセイの前にこれをXmnIで線状化した。標準ScICreIアッセイを、37°Cで標準反応溶液で行い、01容量の10×標準停止溶液で停止し、そして産物を室温での1アガロースエチジウムブロマイドゲルでの電気泳動により分離した。トランスイルミネーターを用いて蛍光をカメラで捉えた。1単位のエンドヌクレアーゼ活性を、ICreI野生型と同じアッセイ条件において、37°Cで60分間に標的DNA200ngを切断するのに必要なScICreIの量と定義した。活性アッセイを、DNA切断に対する温度の影響について野生型ICreIと比較するのに65°Cでも行った。このメガヌクレアーゼはISceI標的部位を切断せず、かつ野生型ICreI標的部位を切断したので、単鎖メガヌクレアーゼはその特異性を保存していた。これらの結果を図9Bに示す。酵母におけるインビボ切断アッセイ単鎖ICreIメガヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性アッセイメガヌクレアーゼを試験するために、我々は酵母サッカロミセスセレビシエでのインビボアッセイを開発した。この生物は、相同組換えを介して自然にそのDNAを組み換えるという利点を有する。この試験は、興味のあるメガヌクレアーゼによる部位特異的二本鎖切断により誘導される比色マーカーの修復に基づいた。標的は、Ura3選択マーカーにより分離された900pbの内部重複をもつ、修飾されたβガラクトシダーゼ遺伝子、および研究されるメガヌクレアーゼに対する切断部位からなっていた。メガヌクレアーゼは、ガラクトース誘導可能なプロモーターの調節下において、2μ複製起点、およびLeu2選択マーカーを持ち、いずれのロイシンも含まない培地上で形質転換された酵母が増殖するのを許容する核発現プラスミドから発現された。レポーター遺伝子の発現は、構成プロモーターにより調節され、そしてARSCEN複製起点、およびTrp1選択マーカーを持ち、いずれのトリプトファンも含まない培地上で形質転換された酵母が増殖するのを許容する別のシャトルベクターにより運ばれた。2つの構築物を用いて、適切な酵母株を同時に形質転換した。メガヌクレアーゼが発現され、そしてレポーター構築物上の切断部位を認識すると、二本鎖切断、および一本鎖アニーリング機構による標的配列の間の部位特異的組換えを促進することができる。次いで、得られるレポーター遺伝子は完全に活性なβガラクトシダーゼを発現するはずである。我々は、いずれのメガヌクレアーゼ遺伝子および切断部位を有さないレポーター構築物を発現しないプラスミドを用いて、全てのコントロール実験も行った。アッセイは、次のようにして行う:酵母を、発現プラスミドおよびレポータープラスミドで同時トランスフェクションした。同時形質転換体を選択し、2つのプラスミドの存在を、ロイシンまたはトリプトファンのいずれも含まない合成培地上での選択により達成した。さらに、メガヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現を許容するかまたは許容しない培地の2つの組を用いた。コロニーが充分に大きいときに、オーバーレイアッセイはβガラクトシダーゼ活性の存在または不在を明らかにした。理論的には、βガラクトシダーゼ活性は、メガヌクレアーゼおよびそれ自体の認識部位が同じ酵母細胞内に存在するときにのみ検出されるはずである。この概要に従い、我々はICreI単鎖遺伝子を我々のガラクトースで誘導可能なプラスミドに、そしてICreI認識部位を我々のレポーター構築物中にサブクローニングし、そして両方のプラスミドを我々の酵母株に同時トランスフェクションした。表A:アッセイ当たりの形質転換数各形質転換は、グルコースおよびガラクトース培地上におく。方法:酵母細胞形質転換1.液体YPGlu2~5ml、または最少培地10mlに植菌し、振とうしながら30°Cで一晩インキュベーションする。2.培養を計測し、温YPGlu50mlに、5×106細胞mlの細胞密度の培養物を植菌する。3.培養物を、2×107細胞mlに等しくなるまで30°Cで200rpmの振とう器上でインキュベートする。これは、3~5時間要する。この培養は、10の形質転換に充分な細胞を与える。4.50mlの滅菌遠心管中に、3000gで5分間、培養物を回収する。5.培地を捨て、滅菌水25ml中に細胞を再懸濁して、再び遠心分離する。6.水を捨て、100mMLiAc1ml中に細胞を再懸濁し、懸濁物を15mlのマイクロ遠心管に移す。7.15秒間、最高速度で細胞をペレット化し、マイクロピペットでLiAcを除く。8.最終容積500μlに細胞を再懸濁する。9.サケ精子DNAのサンプル1mlを5分間沸騰させ、素早く氷水で冷却する。10.細胞懸濁液をボルテックスし、サンプル50μlをラベルしたマイクロ遠心管にピペットで移す。細胞をペレット化し、そしてマイクロピペットでLiAcを除く。11.基本的な形質転換ミックスは:240μlPEG36μl10MLiAc50μlSSDNAXμlプラスミドDNA34Xμl滅菌ddH2O360μl合計からなる。これらの成分を、記載した順番で注意深く添加する。。12.細胞のペレットが完全に混ざるまで各チューブを勢いよくボルテックスする。13.30°Cで30分間インキュベーションする。14.42°Cの温浴中で30分間ヒートショックする。15.6~8000rpmで15秒間マイクロ遠心分離し、マイクロピペットで形質転換ミックスを除く。16.滅菌YPGlu1mlをピペットで移し、細胞を30°Cで1~2時間そのままにする。これにより、グルコースおよびガラクトースプレート上で増殖する形質転換体の同じ数を得ることができる。17.6~8000rpmで15秒間マイクロ遠心分離し、上清を除く。18.滅菌YPGlu50200μlmlを各チューブにピペットで移し、静かにピペットで上下することによりペレットを再懸濁する。17.選択プレートに形質転換100μlを広げる。18.プレートを2~4日間インキュベートして、形質転換体を得る。XGalアガロースオーバーレイアッセイ2枚のプレートに、次の溶液を与える:1.水中の1アガロース5mlを電子レンジにかける。2.XGalミックスを1Mリン酸ナトリウムバッファー5mlジメチルホルムアミド600μl10SDS100μlとともに調製する。3.アガロースとミックスとを合わせ、攪拌しながら55°Cまで冷却させる。4.上記の溶液が準備できたとき、DMF中の10XGal20μlを添加する。5.プラスチックピペットを用いて、温かい溶液5mlで細胞の各プレートの表面をカバーする。6.寒天が冷却して固まった後、プレートを25°C、30°Cまたは37°Cのいずれかでインキュベートすることができる。インデューサーの強さに依存して、数時間で青色が現れる。7.5日後であっても、上部の寒天を通してコロニーを採取することができる。滅菌パスツールピペットを持ち、それを所望のコロニーまたは斑点に寒天を通して突く。次いで、パスツールピペットの先端を用いて新鮮なプレート上に画線し、透過にもかかわらず、細胞が増殖する。結果:1ICreIを用いたコントロール実験2単鎖ICreIを用いた実験これらの結果は、単鎖ICreI遺伝子が、それ自身の切断部位を認識して切断し、レポーター配列の相同組換えを誘導することにより、天然のICreI分子のようにふるまう活性メガヌクレアーゼの発現を許容することを示す。薄い青色は、細胞内で非常に安定なメガヌクレアーゼのわずかな発現のためである。この少量のタンパク質は、レポーター構築物が組換えを起こして検出可能なβガラクトシダーゼ活性の産生に導くのを許容する。全ての白色プレートにおいて、102の平均の率でいくつかの青色のコロニーが出現する。このバックグラウンドは、酵母での高い自発組み換えのためである。哺乳動物細胞におけるインビボ切断アッセイ単鎖ICreIメガヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性我々は、標的二本鎖切断により誘導される相同組み換えの検出に基づく、哺乳動物細胞内でのアッセイも開発した。上記の酵母系におけるように、我々は興味のあるメガヌクレアーゼの切断活性に起因する機能的LacZマーカーの修復をモニターする。まず我々は、酵母レポーター系を哺乳動物発現プラスミドに移した。ICreI切断部位を含むLACZ反復を介在配列と共にpcDNA3にクローニングした。よって、組換えに起因するいずれの機能的LACZ遺伝子もpcDNA3のCMVプロモーターの調節下であり、かつ機能的ターミネーター配列を示す。また、我々は、哺乳動物細胞のための自家製発現ベクターであるpCLS31に、ICreIおよび単鎖ICreIオープンリーディングフレームをクローニングした。Effecteneトランスフェクションキットを用いて、レポータープラスミド05μgを、pCLS3105μg、ICreI発現プラスミド05μg、または単鎖ICreI発現プラスミド05μgと共に、サルCOS細胞に同時トランスフェクションした。βガラクトシダーゼ活性を、以下に記載のアッセイによるトランスフェクションの72時間後にモニターした。コントロール実験では、いずれの切断部位も有さないレポータープラスミド05μgを、pCLS3105μg、ICreI発現プラスミド05μg、または単鎖ICreI発現プラスミド05μgと共に同時トランスフェクションした。このアッセイは、SSAと呼ばれるプロセスによりしばしば起こる縦列反復組み換えの検出に基づく。したがって、我々は、逆方向反復の間の組み換えの検出に基づくアッセイも設計した。逆方向反復の間での組み換えは、ほとんどが、別の種類の組み換え事象である遺伝子変換により起こる。ICreI切断部位により中断されている完全LacZORFを、pcDNA3に、CMVプロモーターとターミネーター配列の間に導入する。遺伝子の切り捨てられた非機能的なコピーを逆方向でクローニングして、遺伝子変換のための相同供与体鋳型を得る。これは、プロモーターおよびターミネーター配列が側面にない。これは、ICreI切断部位が他のコピーにおいて見出される領域が重複する、LacZORFの内部の部分の25Kbを含む。レポータープラスミド05μgを、pCLS3105μg、ICreI発現プラスミド05μg、または単鎖ICreI発現プラスミド05μgと共に、COS細胞に同時トランスフェクションした。コントロール実験において、いずれの相同供与体鋳型を有さないレポータープラスミド05μgを、pCLS3105μg、ICreI発現プラスミド05μg、または単鎖ICreI発現プラスミド05μgと共に同時トランスフェクションした。アッセイは、次のようにして行う:COS細胞を、供給業者のプロトコルに従ってEffecteneトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞をPBS1Xで2回リンスし、溶菌バッファー中でインキュベーションした。溶菌液を遠心分離し、そして上清をタンパク質濃度測定およびβガラクトシダーゼ液体アッセイに用いた。一般的には、抽出液30μlを3μlのMg100Xバッファー、33μlのONPG8mgmlおよび234μlのリン酸ナトリウム01MpH75と合わせた。37°Cでのインキュベーション後、反応を1MNa2CO3500μlで停止し、ODを415nmで測定した。相対βガラクトシダーゼ活性をこのODの関数として測定し、反応時間およびタンパク質全量により標準化する。結果1.縦列反復組換え:2.逆方向反復組換えこれらの結果は、単鎖ICreI刺激が、ICreI切断部位の充分な切断を誘導して、直列反復の間、および逆方向反復の間の相同組換えを刺激し得ることを示す。直列反復では、単鎖ICreIまたはICreIのいずれでも類似のレベルの誘導された組換えが観察された。組換えのこのレベルは、レポータープラスミドの組換えのバックグラウンドのレベルと比べて2~25倍の増加を表す。さらに、組換えレベルのこのような増加は、ICreI切断部位を欠失しているレポータープラスミドでは観察されなかった。逆方向反復では、単鎖ICreIおよびICreIメガヌクレアーゼが遺伝子変換の類似の刺激を誘導した;バックグラウンドのレベルに比較して25~4倍の増加。真正な相同組換え事象から予測されるように、相同供与体鋳型を欠失したレポータープラスミドでは、刺激が観察されなかった。