"エタノールへの暴露によって起こるGABAAR可塑性に関連するアルコール中毒およびアルコール使用障害を治療する、抑制する、低減するおよび/または逆転させる方法であって、エタノールに暴露される、暴露されているおよび/または暴露されたGABAA受容体にジヒドロミリセチンを投与するステップを含む方法。GABAA受容体の活性を増強する方法であって、前記GABAA受容体にジヒドロミリセチンを投与するステップを含む方法。GABAA受容体に対するエタノールの作用に拮抗する方法であって、前記エタノールへの暴露前、暴露中および/または暴露後に前記GABAA受容体にジヒドロミリセチンを投与するステップを含む方法。対象のエタノール中毒、アルコール離脱症候群の症候、アルコール使用障害および/またはアルコール乱用を治療する、抑制するおよび/または低減する方法であって、請求項1に記載の前記対象のGABAA受容体のGABAAR可塑性を治療する、抑制する、低減するおよび/または逆転させる方法、請求項2に記載の前記対象のGABAA受容体の活性を増強する方法、および/または請求項3に記載の前記対象のGABAA受容体に対するエタノールの作用に拮抗する方法を含む方法。請求項4に記載の方法において、前記アルコール離脱症候群の症候が、エタノールに対する耐性、基礎不安の増加、および過剰興奮性からなる群から選択されることを特徴とする方法。請求項4に記載の方法において、前記治療が、前記エタノールへの暴露によって起こる前記対象の注意力の低下を低減するまたは抑制することを特徴とする方法。請求項1~6のいずれか1項に記載の方法において、前記ジヒドロミリセチンが有効量投与されることを特徴とする方法。請求項1~7のいずれか1項に記載の方法において、前記ジヒドロミリセチンが前記エタノールへの暴露前、暴露中および/または暴露後に投与されることを特徴とする方法。請求項1~8のいずれか1項に記載の方法において、前記ジヒドロミリセチンが飲料などの食品の形態で投与され、前記食品がエタノールを含有しても含有しなくてもよいことを特徴とする方法。請求項1~9のいずれか1項に記載の方法において、前記ジヒドロミリセチンがエタノールと併用投与されることを特徴とする方法。本明細書に開示される本発明。本発明は、ジヒドロミリセチンDHMの投与を含む、アルコールエタノール、EtOH中毒、アルコール暴露からの離脱およびアルコール乱用を治療する、抑制するおよび/または低減する方法および組成物に関する。DHMは、玄圃梨JapaneseRaisinTree、ケンポナシHoveniadulcisから得ることができる。ケンポナシHoveniadulcis抽出物および精製されたDHMを含有する薬草療法薬は、アルコールおよび他の化学物質によって誘発された肝障害を緩和する、アルコール二日酔いの症候を緩和する、およびアルコール中毒を軽減するのに使用されてきた。KawaiK,etal.1977Experientia3311:1454;HaseK,etal.1997BiolPharmBull20:381-385;Yoshikawa,etal.1997YakugakuSasshi1172:108-118;JiY,etal.2001ZhongYaoCai24:126-128;JiY,etal.2002ZhongYaoCai25:190-191;ChenSH,etal.2006ZhongguoZhongYaoZaZhi31:1094-1096;LiuXL,etal.2006ZhongguoZhongYaoZaZhi31:1097-1100;FangHL,etal.2007AmJChinMed35:693-703;HussainRA,etal.1990JEthnopharmacol281:103-115;YoshikawaK,etal.1993Phytochemistry34:1431-1433;YoshikawaM,etal.1996ChemPharmBullTokyo44:1454-1464;WangY,etal.1994ChinaTradHerbalDrugs25:306-307;およびKimK,etal.2000KoreanJMedCropSci8:225-233を参照されたい。しかし、本発明以前は、DHMおよび/またはケンポナシHoveniadulcis抽出物がアルコール暴露によって起こるGABAAR可塑性を調節できるかどうかは不明であった。実際、本発明以前は、DHMおよび/またはケンポナシHoveniadulcis抽出物のGABAARに対する影響を調べた研究はなかった。さらに、従来技術の研究には、従来技術の研究がアルコール暴露によって起こるGABAAR可塑性を一部または全部治療する、抑制するおよび/または逆転させるためにDHMおよび/またはケンポナシHoveniadulcis抽出物を投与することを本質的に教示しているまたは示唆していると言えるような、慢性的アルコール暴露の状況が必ずしも含まれていない。様々な症状のための薬草療法に使用されるケンポナシHoveniadulcisおよび他の植物、例えば、クズKudzuおよびその抽出物中には、ジヒドロミリセチンの他に、ミリセチン、ケルシチンquercitin、ホベニチンhovenitin、ラリシトリン、アピゲニンなどの様々なフラボノイドが存在する。アルコール暴露に関するフラボノイドの有益な効果の多くは、それらの抗酸化特性によるものである。従って、DHM、またはケンポナシHoveniadulcisの調合物もしくは抽出物が慢性的アルコール暴露によって起こるGABAAR可塑性に対する効果を有するかどうか、またはDHMおよびケンポナシHoveniadulcisの抽出物の有益な効果が単に抗酸化作用によるものであるかどうかは不明であった。さらに、本発明者らは幾らかの量のDHMが血液脳関門を通過できると考えたが、多くのフラベノイドflavenoidsおよび抗酸化物質は影響を及ぼさないため、このような量でGABAARに何らかの影響を及ぼすかどうかは不明であった。従って、本明細書に記載のとおり様々な実験を行った。本明細書に記載のとおり、実験から以下のことが分かる。1DHM1mg/kgは、EtOH中毒を強力に打ち消す。従って、本発明は、必要とする対象にDHMを投与するステップを含む、対象のEtOH中毒を治療する、抑制する、低減する方法を提供する。幾つかの実施形態では、DHMはEtOHへの暴露前、暴露中および/または暴露後に投与される。幾つかの実施形態では、DHMはEtOHと共に投与される。例えば、EtOHを含む組成物、例えば、飲料などの食品にDMHを添加した後、その組成物を対象に投与する。幾つかの実施形態では、EtOH中毒は急性EtOH中毒である。2DHMは、aEtOHに対する耐性;b基礎不安の増加、およびcPTZ誘発性発作に対する過敏性過剰興奮性を含む、EtOH暴露/離脱によって誘発される行動変化を緩和する。従って、本発明は、必要とする対象にDHMを投与するステップを含む、EtOH暴露からの離脱によって起こる症候を治療する方法を提供する。幾つかの実施形態では、DHMはEtOHへの暴露前、暴露中および/または暴露を停止した後に投与される。幾つかの実施形態では、症候は、EtOHに対する耐性、基礎不安の増加、および過剰興奮性からなる群から選択される。3DHMは、対象のEtOH消費の増大を予防する。従って、本発明は、対象にDHMを投与するステップを含む、対象がより多くのEtOHを随意に消費することを抑制する、低減するまたは予防する方法を提供する。幾つかの実施形態では、DHMは、EtOHの消費前、消費中、および/または消費後に投与される。幾つかの実施形態では、DHMは、消費されるEtOHと共に投与される。例えば、EtOHを含む組成物、例えば、飲料などの食品にDMHを添加した後、その組成物を対象に投与する。4DHMは、中毒、鎮静作用または感覚脱出を引き起こさない。従って、本発明は、対象にDHMを投与するステップを含む、EtOHへの暴露によって起こる対象の注意力の低下を治療する、低減するまたは予防する方法を提供する。幾つかの実施形態では、DHMは、EtOHへの暴露前、暴露中および/または暴露後に投与される。幾つかの実施形態では、DHMはEtOHと共に投与される。例えば、EtOHを含む組成物、例えば、飲料などの食品にDMHを添加した後、組成物を対象に投与する。また、本明細書に開示される実験から次のことも分かる、すなわち、aDHMの打ち消し効果は、invivoおよびinvitroでフルマゼニルにより拮抗され、DHMは、GABAARのベンゾジアゼピン部位への[3H]フルニトラゼパムの結合を競合的に抑制する;bDHMは、急性EtOHによって誘発されるGABAARの増強に拮抗する;cDHMは、EtOHによって誘発される、急性EtOHに対するGABAARの反応性の変化Itonic調節の消失およびmIPSC感受性の増加を含むに拮抗する;dDHMは、海馬薄片および培養ニューロンのGABAARを増強し、EtOHに対する耐性を誘発するEtOH暴露/離脱後でもGABAARを増強する効力を維持する;およびeDHMは、EtOH暴露/離脱によって誘発されるラット海馬のGABAARα4サブユニットの量の増加を阻害する。換言すれば、DHMは、EtOH暴露に伴うGABAARの活性を増強し、各GABAARに対するEtOHの作用に拮抗し、GABAARのベンゾジアゼピン部位に結合する。本明細書で使用する場合、増強するとは、GABAARの活性および/または有効性の増加を引き起こすことを意味する。驚くべきことに、本明細書の実験から、DHMが、EtOHへの暴露によって起こるGABAARの可塑性を抑制する、低減する、およびさらには逆転させることも分かる。本明細書で使用する場合、受容体の可塑性とは、受容体のサブユニット構成の変化を意味する。本発明に関して、本明細書で使用する場合、GABAAR可塑性とは、GABAARのサブユニット構成の変化を指す。EtOHへの暴露により、α4βδサブユニットを含有するGABAARが内在化される。α4サブユニットがシナプス後膜に戻るとき、δサブユニットがもはやα4サブユニットと結合しないように、δサブユニットの位置が変化し、それにより、GABAAR可塑性が生じる、即ち、EtOH暴露前と比較してシナプス後膜でα4サブユニットが増加する。本明細書に示すとおり、DHMは、EtOHへの暴露によって起こるGABAAR可塑性を抑制する、低減する、逆転させるおよび/または予防する。本発明以前は、EtOH暴露によって起こるGABAAR可塑性を抑制する、低減する、逆転させるおよび/または予防する化合物または組成物は知られていないため、これらの結果は驚くべきものである。DHMと類似の他のフラボノイド、例えば、ダイジンおよびケルセチンは、DHMと同じまたはDHMと類似の活性を示さない、即ち、GABAARを増強しない、EtOH作用に拮抗しない、およびGABAARのベンゾジアゼピン部位に結合しにないということに鑑みて、本明細書の実験の結果はとりわけ驚くべきことである。従って、本発明は、脳組織にGABAARに作用するDHMを投与するステップを含む、EtOHへの暴露によって起こるGABAAR可塑性を治療する、抑制する、低減する、逆転させるおよび/または予防する方法を提供する。本明細書で使用する場合、EtOH暴露によって起こるGABAAR可塑性とは、LiangJ,etal.2007JNeurosci.2745:12367-77;ZuccaSandValenzuelaCF2010JNeurosci.3019:6776-81;およびShenetal.2011MolPharmacol.793:432-42によって記載されているようなGABAAR可塑性を指す。本発明の実施形態の幾つかでは、投与されるDHMの量は有効量である。本明細書で使用する場合、DHMの有効量とは、対照と比較して所望の効果が得られる量、即ち、エタノールへの暴露によって起こるGABAAR可塑性を治療する、抑制する、低減するおよび/または逆転させる、またはGABAA受容体の活性を増強する、またはGABAA受容体に対するエタノールの作用に拮抗する量である。例えば、EtOHへの暴露慢性的間欠的暴露および単一用量暴露を含むによって起こるGABAAR可塑性を一部または全部逆転させるDHMの有効量とは、対応する未処置GABAARと実質的に類似のまたは同じ構成および/または活性を有するGABAARの量を増加させる量である。DHMの治療有効量とは、対象に投与したとき、対象の症状が、処置前の対象の症状と比較してまたは対照の対象と比較して、目に見えるほど改善するように、EtOHへの暴露によって起こるGABAAR可塑性を治療する、抑制する、低減するおよび/または逆転させるのに、またはGABAARの活性を増強するのに、または対象のGABAARに対するエタノールの作用に拮抗するのに十分な量である。また、本明細書で使用する場合、DHMの治療有効量とは、対象に投与したとき、対照と比較して、対象の所与の臨床症状、例えば、エタノール中毒、アルコール離脱症候群の少なくとも1つの症候、アルコール使用障害、またはアルコール乱用を治療する量である。通常、DHMの治療有効量を、毎日、約0.002~約200mg/kg体重、好ましくは約0.1~約100mg/kg体重、例えば、約1mg/kg体重の投与量で経口または静脈内投与することができる。通常、0.01~10mg/kgの用量を1日1~4回に分割して、または徐放性製剤として投与すると、所望の薬理学的効果を得るのに有効である。しかし、特定の対象に対する具体的な用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、年齢、体重、全身的健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、および排泄速度、併用する薬物drugcombinationおよび特定の疾患および/または症状の重症度を含む様々な要因に依存することを理解されたい。また、投与頻度も治療される特定の疾患および/または症状に応じて変わり得る。また、治療に有効な投与量は、特定の治療を行う過程で増減し得ることも分かるであろう。当該技術分野で公知の臨床的方法での標準的な診断アッセイの結果、投与量の変更が行われ、明らかになり得る。場合によっては、慢性的投与が必要なこともある。DHMの有効量および治療有効量は、当該技術分野で公知の通常の方法で当業者が容易に決定できる。幾つかの実施形態では、有効量のDHMを飲料などの食品の形態で投与することができる。幾つかの実施形態では、飲料は、発酵した穀類例えば、ウィスキー、バーボン、ライウィスキー、ウォッカ、ジンおよび/またはビール、発酵した果物例えば、ワイン、ブランデー、シェリーおよびコニャック、サトウキビおよび/またはテンサイ例えば、ラム、および/または発酵したリュウゼツランの頭部テキーラから製造できるアルコールを含有する。幾つかの実施形態では、有効量のDHMをチューインガム組成物の形態で投与することができる。本発明の医薬製剤は、分割された用量または単一用量のDHMを含み、単位剤形および/または所望の投与形態に適切な包装で調製することができる。本発明の医薬製剤は、経口、経直腸、経鼻、局所経口腔粘膜および舌下を含む、経皮、経粘膜、経膣および非経口皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含むを含む任意の好適な経路で治療のために投与することができる。好ましい経路は、レシピエントの症状および年齢、治療される症状の性質によって変わることが分かるであろう。例えば、幾つかの実施形態では、治療有効量のDHMを対象に経皮パッチまたは沸騰錠例えば、水などの液体に溶解させると泡立ちを生じる、有効量のDHM、炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩、およびクエン酸などの酸性材料を含む錠剤の形態で投与することができる。幾つかの実施形態では、ヒト対象用のDHMの単位用量は約50~70mgである。従って、幾つかの実施形態では、本発明の食品、経皮パッチ、チューインガムおよび/または沸騰錠は、単位当たり約50~70mgを含む。実験動物および材料動物実験は全て動物実験委員会InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeにより認可された。雄性および雌性Sprague-DawleySDラット250~300gは飼育室内にて12時間の明暗サイクルで飼育し、飼料と水に自由にアクセスさせた。ジヒドロミリセチンDHM、2R,3R-3,5,7-トリヒドロキシ-2-3,4,5-トリヒドロキシフェニル-2,3-ジヒドロクロメン-4-オンは、ZRChemicalShanghai,Chinaから購入したCASNo.27200-12-0、HPLCで98精製。フルマゼニル、ピクロトキシンおよびビククリンはSigmaから購入した。統計解析データは、前述のニューロン培養および/またはラットの少なくとも3つの独立した標本から得た。SigmaplotWindowsversion10.1およびSigmaStatWindowsversion3.5をデータ表示および統計解析に使用した。データは、平均±SEMとして表した。一元配置または二元配置反復測定RM分散分析と、DunnettまたはNewman-Keulsに基づく事後比較分析およびスチューデントt検定を使用して、処置群と溶媒群との有意差を判定した。DHMは急性ETOH中毒を防止し、ETOH離脱症候を予防するラットで行った代謝試験から、DHM経口投与、1mg/kgの投与により代謝の変化飼料および水の摂取、尿量および便量は誘発されないことが分かったデータは示していない。当該技術分野で公知の標準的LORRアッセイを使用して、ラットでのEtOH誘発性LORRに対するDHMの効果を調べた。KakihanaR,etal.1966Science154756:1574-1575を参照されたい。簡潔に言えば、薬物を注射した後、ラットをV字形の支持物に仰臥位で置いた。LORR発生時間は薬物注射i.p.の終点から測定した。動物が30秒以内に3回反転できたとき、LORR持続時間は終了した。LORRアッセイは盲検的に行った。LORR持続時間は、平均分±SEMとして報告した。対照群EtOH注射の30分前に生理食塩水、20ml/kg、i.p.で前処置では、EtOH3g/kg、i.p.により、72±2分のLORRが誘発された。DHMで前処置1mg/kg、i.p.、EtOH注射の30分前すると、EtOHによって誘発されるLORRは8±4LORRに低減した対照の10.6±5.9、図1A、p<0.05。EtOH3mg/kg、i.p.投与の30分後にDHM1mg/kg、i.p.で処置すると、LORRは79±2から49±2に低減した図1B。特に、DHM注射図1Bの赤い破線以降、LORR持続時間は51±2から21±2分に低減した対照の41.2±3.8、p<0.05。EtOH3mg/kg、i.p.とDHM1mg/kg、i.p.を同時投与すると、EtOHによって誘発されるLORRの持続時間は0.7±0.4に有意に低減した対照の1.2±0.6、図1C、p<0.05。DHMは単独ではLORRを誘発しなかった図1C。これらの結果から、DHMは、EtOHの投与前、投与中および/または投与後に投与されると、急性EtOH中毒に拮抗することが示唆される。次いで、単一用量EtOH中毒および離脱に対するDHMの効果を調べた。ラットに生理食塩水20ml/kg、溶媒、EtOH3g/kg、EtOHDHMEtOHの30分後、1mg/kg、またはDHM1mg/kg単独をi.p.注射した。48時間の離脱時間後、EtOHによって誘発されるLORRのアッセイEtOH、3g/kg、i.p.を行った。LORR持続時間は、単一用量EtOH中毒/離脱により有意に低減した、即ち、9±3対58±5分溶媒となった。このことから、EtOH離脱によりEtOH耐性が誘導されることが示唆される。DHMとEtOHで後処置すると、EtOH離脱によるLORR持続時間の減少が有意に抑制、低減および/または予防された図1D、p<0.05。LORR持続時間分:それぞれ、EtOHDHM61±4およびDHM61±4。このことから、DHMがEtOH離脱によって誘発されるEtOH耐性を抑制、低減および/または予防することが示唆される。また、ラットでペンチレンテトラゾールPTZによって誘発される発作も測定した。溶媒生理食塩水、20ml/kg、i.p.、EtOH3g/kg、i.p.、DHMEtOH1mg/kg3g/kg、i.p.またはDHM1mg/kg、i.p.処置から24時間離脱した後、PTZ誘発性発作に関してラットを試験した。この試験に使用したPTZの用量42mg/kg、生理食塩水中は、75の未処置ラットで発作を誘発する用量として決定された。簡潔に言えば、PTZのi.p.注射後、強直-間代発作の発生時間と持続時間を前述のとおり測定した。動物行動実験を行った研究者らは、処置群に対して盲検化された。動物はどの測定でも1回だけ使用した。EtOH離脱により、PTZ発作の持続時間は1.7±0.8溶媒から8.1±1.2分に著しく増加した図1E、p<0.05。このことから、EtOH離脱により発作感受性か増加することが示唆される。DHMとEtOHを同時投与すると、PTZ発作の持続時間の増加が有意に無くなった、低減した、および/または抑制された0.9±0.2分に減少。DHM前処置単独では、発作の持続時間に有意なまたは目に見える変化は誘発されなかった。またDHMにより、発作の発生率の増加も有意に無くなった、低減した、および/または抑制された図1F。EtOH離脱により、発作の発生率は溶媒85と比較して増加し100になったが、DHMはこのような増加を抑制、低減、および/または予防した85。これらの結果から、DHMはEtOH離脱によって誘発される発作感受性と過剰興奮性の増加を緩和することが示唆される。これらの知見から、DHMは、急性EtOH中毒、EtOH暴露/離脱によって誘発されるEtOH耐性、およびEtOH離脱によって誘発される過剰興奮性を有効に抑制、低減および/または予防することが示唆される。DHMは単一用量ETOH中毒によって誘発されるGABAAR可塑性を予防するDHMがEtOH中毒によって誘発される急性EtOHに対するGABAARの感受性の変化を予防するかどうかを判定するために、EtOH離脱によって誘発されるGABAARの機能的変化に対するDHMの効果を、48時間の離脱でのラット海馬薄片中の歯状回顆粒細胞DGCのホールセルパッチクランプ記録で調べた。背側海馬の横断薄片400μmをVibratomeVT100,TechnicalProductsInternational,St.Louis,MOおよび当該技術分野で公知の標準的方法で得た。薄片を人工脳脊髄液ACSFで連続的に灌流した。Liang,J.,etal.2007JNeurosci27:12367-12377を参照されたい。人工脳脊髄液ACSF、125mMNaCl、2.5mMKCl、2mMCaCl2、2mMMgCl2、26mMNaHCO3、および10mMD-グルコースで灌流中に-70mVの保持電位で34±0.5°Cにて、DG層にある細胞からホールセルパッチクランプ記録を得た。確実に薄片が十分酸素化され、pHが7.4になるように、ACSFに95O2-5CO2を連続的に通気した。抵抗7.5~9MΩの薄肉のホウケイ酸ガラスピペットからパッチ電極を引き、ピペット溶液即ち、137mMCsCl、2mMMgCl2、1mMCaCl2、11mMEGTA、10mMHEPESおよび3mMATP、CsOHでpH7.30に調節を充填した。シグナルは、Axopatch700BamplifierMolecularDevices,Sunnyvale,CAで、電位固定モードで記録した。約70電気補償を行う前に、ホールセルアクセス抵抗は<25MΩの範囲であった。電位固定記録中、5mVステップコマンドstepcommandに反応した容量性過渡変化capacitativetransientの大きさを測定することによりアクセス抵抗を監視し、>20の変化が生じた場合、データは破棄した。mIPSC記録を開始する前に、少なくとも10分間、ピペット溶液を細胞内環境と平衡化させた。細胞内シグナルを3kHzでローパスフィルタリングし、Digidata1440AおよびソフトウェアCLAMPEX10MolecularDevicesを用いて、20kHzのサンプリング周波数でデータを取得した。薬理学的に分離されたGABAAR媒介mIPSCを前述Liang2007およびShen2011のとおり記録した。GABA濃度-反応曲線では、Valvelink8.02高速交換灌流システムAutoMateScientific,USAを使用し、取り外し可能なピペット先端部を通してGABA、DHM、またはジアゼパムをニューロンに急性投与する間、誘発されたGABAAR-電流を記録した。データは、ClampfitVersion9.0、MolecularDevicesおよびMiniAnalysisProgramversions6.0.7,Synaptosoft,Decatur,GAを使用して解析した。MiniAnalysisprogramSynaptosoft,Decatur,GAを使用して、mIPSCを解析した。Itonicは、所与の記録時間の平均ベースライン電流である。Itonicの振幅は、ピクロトキシン100μMまたはビククリン10μMの前後に測定した保持電流の差として算出した。Wei,W.,etal.2004JNeurosci24,8379-8382;Liang2007;およびShen2011を参照されたい。簡潔に言えば、記録は、オフラインでClampfitsoftware、2kHzでローパスフィルタリングされた。mIPSCは、振幅8pAおよび電荷移動20pAmsの閾値基準で検出したMiniAnalysisProgram,version6.0.7。所与の100秒間の記録時間中に自動検出された全ての事象からmIPSCの頻度を測定した。動態分析では、記録トレースの目視検査中に安定なベースライン、急な上昇期10~90上昇時間、および指数関数的減衰を有する単一事象mIPSCだけを選択した。二重および多重ピークmIPSCは排除した。各実験条件で少なくとも100の個々のmIPSC事象を記録した。各細胞中の半上昇時間に合致する選択された平均単一事象の解析からmIPSC動態を得た。二重指数関数を平均mIPSCの下降期に適合させることにより、減衰時定数を得た。所与の記録時間の平均ベースライン電流から、Itonicの大きさを得た。Itonicの振幅は、ピクロトキシン50μMまたはビククリン10μMの投与前後に測定された保持電流の差として算出された。LiangJetal2007;Shen2011;Hamann2002;およびManganPS,etal.2005MolPharmacol673:775-788を参照されたい。記録およびmIPSC解析を行う研究者らは、ラットが受ける処置溶媒、EtOH、ED、またはDに関して盲検化された。EtOH処置ラットのニューロンの記録から、急性EtOH60mM投与によるItonic増強の消失図13A、図3B、図13GItonicが14.0±2.1から14.3±2.8pAになったのに対し、溶媒では:28.2±4.5から62.1±3.0pAになった;図2A、p<0.05、およびmIPSCのEtOH感受性の増加58.5±20.0増加したのに対し、溶媒対照では:16.9±4.1の増加であった図13H、図2B、p<0.05が明らかになった。対照的に、EtOHDHM処置ラットのニューロンの記録から、急性EtOHに対する反応性は溶媒処置ラットのものと区別不可能であることが分かった図13CItonicは27.9±3.0から61.3±2.3pAに増加し、mIPSCは18.0±5.9増加した、図13G、図13H、図2A、図2B。EtOHがGABAARα4サブユニットの全タンパク質の変化を誘発するかどうかを判定するために、ラット海馬の並行ウエスタンブロットを行った。ラットの海馬組織を、1TritonX-100、0.1ドデシル硫酸ナトリウムSDS、50mMNa3PO4、150mMNaCl、2mMEDTA、50mMNaF、10mMピロ硫酸ナトリウム、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、1mMフェニルメチルスルホニルフルオライドPMSFおよびCompleteproteaseinhibitorcocktailRocheを含有するRIPA緩衝液に溶解した。溶解物を15分間14,000×g、4°C遠心分離し、上清を回収してウエスタンブロット分析を行った。ウサギ抗GABAARα4aa379-421およびマウス抗-β-アクチンSigmaの後、HRP結合二次抗体を使用してウエスタンブロットを行った。ECLdetectionkitAmershamを使用してバンドを検出し、ImageQuant5.2MolecularDynamicsを使用して濃度測定により分析した。62.5mMTris-HCl、100mMβ-メルカプトエタノールおよび2SDSpH6.7を含有する緩衝液でバンドをストリッピングし、数回再検査した。タンパク質濃度は、BCAProteinAsssayKitPierceで製造業者の指示に従って測定した。溶媒、EtOH、EDまたはDHMを強制経口投与したラットの、48時間離脱した後の海馬組織GABAARα4サブユニットのウエスタンブロットを図12Dに示す。EtOH暴露/離脱によりα4GABAARサブユニットの増加が誘発されたが、ED処置によりこの増加は予防された。DHM単独ではα4GABAARサブユニットに変化は生じなかった図12D。図12Eは、図12Dの実験の全α4サブユニットタンパク質の定量化を示す。これらの結果から、DHMとEtOHを併用して処置すると、EtOH離脱によって誘発されるGABAAR可塑性を全部または一部抑制、低減および/または予防できることが分かる。従って、本発明は、対象にDHMを投与するステップを含む、EtOH暴露/離脱によって誘発される対象のGABAAR可塑性を治療する、抑制する、低減するおよびまたは予防する方法を提供する。DHMは、未処置ラットのDGCのGABAAR媒介電流を増大させ、急性ETOHによるその増強に拮抗するDHMの抗アルコール効果がアルコール作用の主な標的であるGABAARとの相互作用によるものであるかどうかを判定するために、未処置ラットの海馬薄片中のDGCのGABAAR機能に対する急性DHMの効果を前述のとおり調べた。急性DHM0.3μMによりDGC中でのGABAAR媒介Itonicは17.5±4.9から29.0±6.7pAに増大し、mIPSC減衰時間は長くなり、mIPSC全電荷移動面積は濃度依存的に増大した面積が571±61から615±22fCに増加した図3、パネルa、a-1、a-2。別々に投与したとき、EtOHとDHMは両方ともGABAAR媒介電流を増強する。しかし、EtOHによって誘発されるItonicの増強は、EtOHの存在下でDHMにより濃度依存的に減少した1μMDHMにより43.8±1.8から32.0±2.0pAに減少した、図3、パネルb、b-1、p<0.05。しかし、DHMの存在下でEtOHを投与しても、Itonicのそれ以上の増強はなかった60mMEtOHにより、41.1±2.2から44.4±3.6pAになった、図3、パネルc、c-1。これらのデータから、DHMは、EtOHによって誘発されるGABAARの増強を阻害することにより、EtOH中毒によって誘発されるGABAAR可塑性に拮抗することが分かる。従って、本発明は、DHMとEtOHを同時投与することにより、EtOHによって誘発されるGABAAR可塑性に拮抗する方法を提供する。本発明はまた、EtOHに暴露する前にDHMを投与することにより、EtOHによって誘発されるGABAAR可塑性に拮抗する方法も提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、DHMを投与するステップを含む、GABAAR媒介電流を増強する方法を提供する。DHMETOHを同時投与すると、ETOH中毒によって誘発される初代培養海馬ニューロンのGABAAR可塑性が予防されるDHMがinvitroでEtOHによって誘発される培養ニューロンのGABAAR可塑性を抑制するおよび/または予防するかどうかを判定するために、次の実験を行った。パパイン解離papaindissociationWorthingtonBiochemical,Lakewood,NJにより、胎生18日目のラットの海馬ニューロンを準備し、神経細胞用基礎培地neurobasalmediumおよびB27サプリメントB27supplementInvitrogen中で培養した。培養は、前述のとおり5CO2加湿インキュベータ中で37°Cに維持した。Shen,Y.,etal.2011MolPharmacol79:432-442を参照されたい。パパイン解離WorthingtonBiochemical,Lakewood,NJにより、胎生18日目のSDラットの海馬ニューロンを準備し、前述のとおり神経細胞用基礎培地InvitrogenおよびB27サプリメント中で培養した。StowellJNandCraigAM1999Neuron223:525-536を参照されたい。簡潔に言えば、イソフルランで麻酔し、断頭することにより安楽死させた母親ラットから胚を取り出した。海馬を切除し、Ca2-およびMg2-非含有HEPES緩衝Hank緩衝塩溶液pH7.45に入れた。パパイン消化した後、Pasteurピペットでトリチュレーションし、パパイン阻害剤で処理することにより組織を解離した。細胞をペレット化し、2B27血清非含有サプリメント、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、0.5mMグルタミン全てInvitrogen製、および10μMグルタメートSigmaを含有する神経細胞用基礎培地に再懸濁した。次いで、解離したニューロンを細胞0.3×105個/cm2の密度で24ウェルプレート内の12mmの円形のカバーガラス上にパッチクランプ記録用、および/または0.5×105個/cm2の密度で、ポリ-D-リシンSigma、50μg/mlでコーティングされた6ウェルプレート内でウエスタンブロットおよびビオチン化アッセイ用平板培養した。培養は、5CO2加湿インキュベータ中で37°Cに維持した。その後、培地の3分の1~半分を、週に2回、2B27サプリメントおよび0.5mMグルタミンを含有する神経細胞用基本培養培地と交換した。DIV13-14ニューロンinvitroで13~14日間培養の後、培養ニューロンの培地の半分を120mMEtOH最終EtOH濃度は60mMであった、0.2μMDHMプラス120mMEtOH、または0.2μMDHMのみDHM対照、即ち、EtOHを含まないを含有する神経細胞用基本培養培地と30分間交換した後、培地を全て、新鮮な神経細胞用基本培養培地半分プラス元の培地半分とそれぞれ交換した。対照ニューロンは、対応する溶媒でEtOH処置ニューロンと同じ手順で処置した。以前の実験に鑑みて、EtOH濃度60mMを選択した。LiangJetal2007を参照されたい。特に、培養ニューロンの処置に使用するEtOH濃度は60mMを選択したが、これは、5g/kgの強制経口投与による中毒後に成体ラットで測定される血中レベルに合致し、それにより約60mMの血液最高血漿中[EtOH]が約2~3時間持続し、GABAARに顕著な可塑性および耐性が誘発された。DIV14ニューロンinvitroで14日間培養を溶媒、EtOH、EtOHDHMまたはDHM単独で処置した後、24時間離脱させた。次いで、電気生理学的記録の直前に、カバーガラス上で増殖した細胞を灌流室WarnerInstrumentsに移し、倒立顕微鏡TE200、ニコンNikonで可視化した。電位固定モードで、室温22~25°Cにて-70mVの保持電位で培養ニューロンからホールセルパッチクランプ記録を得た。細胞を細胞外溶液137mMNaCl、5mMKCl、2mMCaCl2、1mMMgCl2、20mMグルコースおよび10mMHEPES310~320Osm、NaOHでpH7.40に調節で灌流した。ガラスピペットに薄片記録のものと同じ内部溶液を充填し、その入力抵抗は4~7MΩであった。前述と同じ薬理学的方法を使用して、GABAAR媒介mIPSCを記録した。GABA濃度-反応曲線では、Valvelink8.02高速交換灌流システムAutoMateScientific,USAでニューロンの神経細胞体の近くに配置された取り外し可能な先端部を通してGABAおよび/またはDHMを培養ニューロンに急性投与することにより、誘発されたGABAAR媒介電流を記録した。Multiclamp200BamplifierMolecularDevices,USAを使用して、電気シグナルを増幅した。ホールセル状態を形成した後、膜パッチが安定化し、記録電極とサイトゾルとの間にイオン交換が起こるように、薬物を投与する前に少なくとも10分間経過させた。pClampsoftwareVersion10.0,MolecularDevices,USAでデータを取得し、20kHzでデジタル化しDigidata1440A,MolecularDevices、ClampfitsoftwareVersion10.0,MolecularDevicesおよびMiniAnalysisProgramversions6.0.7,Synaptosoft,Decatur,GAを使用し、当該技術分野で公知の方法を使用して解析した。HamannM,etal.2002Neuron334:625-633;StellBMandModyI2002JNeurosci2210:RC223;およびLiang2007を参照されたい。EtOH暴露/離脱-ニューロンは、Itonicの大きさ溶媒-ニューロンの13.8±1.4pAからEtOH-ニューロンの5.6±1.0pAになった、および急性EtOHに対するその反応性EtOH増強は溶媒-ニューロンの109.6±15.7からEtOH-ニューロンの14.3±18.9に減少した、図4A、p<0.05の劇的な減少を示したが;EtOH暴露/離脱-ニューロンでは、前述のとおり、急性EtOHに対するmIPSC反応性の増加が現れたEtOHによる増強は溶媒-ニューロンの3.0±10.0からEtOH-ニューロンの33.7±14.9に増加した、図4B、p<0.05。Shen2010を参照されたい。DHMとEtOHの同時投与は、GABAARにおけるこれらの効果に拮抗した平均したItonicの大きさは11.2±0.6pAであったが、EtOHにより25.2±1.2pAに増加し、EtOHによるmIPSCの増強は8.3±9.4であった;DHM単独暴露/離脱ではGABAAR機能は変化しなかった図4Aおよび4B。本明細書に記載のとおり培養ニューロンのウエスタンブロットを行い、検査した。培養ニューロンのGABAARに関するビオチン化アッセイは前述のとおり行った。ChungWO,etal.2000InfectImmun6812:6758-6762を参照されたい。簡潔に言えば、培養皿内のニューロンを氷上に載せ、氷冷PBSで2回洗浄した。次いで、1mg/mlスルホ-NHS-LC-ビオチンProteoChemを含有するPBSと共に氷上でニューロンを30分間インキュベートした。Tris緩衝生理食塩水TBSとのビオチン反応を急冷した後、ニューロンを変更されたRIPA緩衝液20mMTris-HClpH7.5、150mMNaCl、1mMNa2EDTA、1mMEGTA、1NP-40、1デオキシコール酸ナトリウム、2.5mMピロ硫酸ナトリウム、1mMb-グリセロホスフェート、1mMNa3VO4、および1μg/mlロイペプチン150μlに溶解した。ホモジネートを15分間遠心分離した14,000×g、4°C。上清の一部10を取り出し、β-アクチンを測定した。残りの上清を50ニュートラアビジンアガロースPierceChemicalCompany60μlと共に4時間4°Cでインキュベートし、溶解緩衝液で4回洗浄した。アガロース結合タンパク質をSDSサンプル緩衝液20μl中に溶解させ、沸騰させた。前述のとおり、ウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロットのデータおよびビオチン化データから、DHMは、EtOH暴露/離脱によって誘発される培養ニューロンの細胞表面GABAARα4サブユニットの変化をなくすまたは逆転させることが分かった図14C。これらの知見から、invitroでDHMとEtOHを同時投与すると、EtOHによって誘発されるGABAAR可塑性を抑制、低減および/または予防できることが実証され、それにより本明細書に開示されるラットでのinvivoにおける知見が裏付けられる。DHMは対照ニューロンとETOH暴露/離脱ニューロンの両方でGABAAR機能を増強する培養海馬ニューロンに対するDHMの効果も調べた。培養ニューロンにおける、DHMのGABAAR媒介Itonic図5A、白丸、EC50=約0.2μMおよびmIPSC図5B、白丸、EC50=約0.3μMに対する濃度-反応曲線を作成した。EtOH暴露によりDHMに対するGABAARの反応性が変化するかどうかを判定するために、EtOH暴露/離脱したニューロンにおけるDHM濃度-反応曲線も作成した。EtOH暴露は、DHMとItonic図5A、黒丸、EC50=約0.3μMまたはmIPSC図5B、黒丸、EC50=約0.5μMとの濃度-反応関係に影響を及ぼさなかった。これらの結果から、DHMはEtOH暴露/離脱条件でもシナプスGABAARおよびシナプス外GABAARを増強することが分かり、DHMがEtOHに対する交叉耐性を生じさせないことが分かる。DHMのGABAARに対する直接的な効果を明らかにするために、GABA1~300μMを培養海馬ニューロンにパフ投与し、濃度-反応曲線を作成した。DHM0.3および1μMとGABAを同時投与すると、同じGABA濃度におけるGABA活性化電流の振幅が増加し、GABA濃度-反応曲線が左側にシフトした図5Cおよび5D。これらの結果から、DHMはGABAARを直接増強することが分かる。DHMはETOH中毒を打ち消し、このDHMの効果はフルマゼニルにより拮抗される以下のように、さらにLORRアッセイを行った。ラットを4群に分け、生理食塩水、EtOH3g/kg、E、EtOHとDHMとの組み合わせ1mg/kg、ED1、またはDHMD1を腹腔内i.p.注射した。EtOHは、69±18のLORRを誘発した。ED1は、LORRを2.7±1.4に低減した図6A。DHMは、生理食塩水と同様に、LORRを誘発しなかった。これらの結果から、DHMは急性EtOH中毒を打ち消すことが示唆される。追加の前処置および後処置実験も行った。EtOH注射D1Eの30分前に投与すると、DHMはLORRを8.2±4.1に低減した図6B。LORRを誘発したEtOH注射の30分後、生理食塩水を注射したラットではLORRがさらに42±9.1継続したが;DHMを注射すると、残りのLORRが19±1.0に低減したE生理食塩水の42、図6B。これらの結果から、DHMはEtOH中毒を打ち消すことが示唆される。従って、EtOH暴露の30分前または30分後に投与した場合でも、DHMは中~高用量のEtOH中毒を効果的に緩和する。DHMの抗EtOH効果の標的を調べるため、GABAARを調節する選択的ベンゾジアゼピンアンタゴニストであるフルマゼニルを試験した。Hunkeler,W.,etal.1981Nature290:514-516を参照されたい。EtOHは69±11.3LORRを誘発した;DHM3mg/kgとEtOHを同時注射するとLORRが2.7±1.7に低減した図6C。フルマゼニル10mg/kgはDHMによるLORRの低減を逆転させた56.1±4.6。DHM用量を10mg/kgに増加すると、フルマゼニルの効果が低下した29.3±4.8が、フルマゼニルの用量を30mg/kgに増加すると、DHM効果に対するその拮抗作用が増大した58.2±3.9。フルマゼニルとEtOHの同時注射では、EtOH群と比較してLORRは変化しなかった71.1±4.8、図6C。これらの結果から、GABAARは、invivoでEtOH誘発性LORRという行動効果に重要な役割を果たすことが示唆される。フルマゼニルは、EtOHによって誘発されるLORRに対するDHMの効果に競合的に拮抗する。さらに、その結果から、DHMとEtOHの相互作用は、GABAARベンゾジアゼピン部位におけるDHMの作用を含み、これがEtOH中毒に対するDHMの治療効果の根底にあり得ることが示唆される。高用量のDHMEtOH中毒に対するそのアンタゴニスト効果のための用量より数百倍高い用量について調べた。DHM100および300mg/kgは、それぞれ、0.9±0.8および4.0±2.8のLORRしか誘発しなかった図7。このことから、DHMは典型的なベンゾジアゼピンであるだけではないことが示唆される。高用量のフルマゼニル200mg/kgではLORRは誘発されなかった図7。EtOH群およびEtOHDHM群の血漿中EtOH濃度血漿中[EtOH]を測定するために、LORRアッセイ中、5~180分の様々な時点で静脈血サンプルを採取した。血漿中[EtOH]アッセイを行うために、EtOHまたはEDi.p.注射後の様々な時点0、5、30、60、90、180分におけるラットの尾静脈から、または随意アルコール2瓶選択手順後のラットEtOH群およびEtOHDHM群から血液サンプルを採集した。Liang2007を参照されたい。ラットを拘束管に入れ、その尾は約40°Cで温暖であった。レールの先端部の尾静脈を鋭利な刃で穿刺した。約0.2mlの静脈血を、ヘパリンリチウムRamScientificInc.Yonkers,NYを含有する毛細管採血チューブに滴下した。血液サンプルを2500rpmで15分間遠心分離した。上清を回収し、アッセイを行うまで-80度で貯蔵した。各血液サンプルのEtOH含有量をEtOH標準液を用い、アルコールオキシダーゼ反応手順GM7Micro-Stat;AnaloxInstruments,Lunenberg,MAを使用してデュープリケートで測定した。EtOHにより、5分以内にLORRの発生が誘発された。血漿中[EtOH]は5分間急速に増加した後、約60分まで比較的ゆっくりと増加し、その後[EtOH]は徐々に低下した。ED1群とED10群DHM1、10mg/kgでは、血漿中[EtOH]の上昇時間が早い時点で遅くなった図8。しかし、30分~60分まで、EtOH群とED1群の間には血漿中[EtOH]に統計学的有意差は見られなかった30分:EtOH対ED1=334.9±37.8対287.7±21.5mg/dl、および60分:EtOH対ED1=353.7±35.4対326.27±17.8mg/dlが、その時間中、ED10は[EtOH]を有意に減少させた30分:250.6±12.2および60分:306.0±7.6mg/dl、図8。30分~60分の間、EtOH群は眠っていたが、ED1群とED10群は覚醒していた。これらの結果から、DHMはEtOHの薬物動態に影響を及ぼすことが示唆されるが、この効果は、EtOHによって誘発されるLORRをDHMが防止することを説明するのに十分ではない。DHMはETOHによって誘発されるGABAARの増強に拮抗し、その効果はフルマゼニルにより阻害される前に行ったとおり、invitroにおける海馬薄片の歯状回顆粒細胞DGCでホールセルパッチクランプ記録を行った。EtOH60mMの灌流液中投与により、Itonicは22.0±0.7から46.9±1.4pAに増加し、mIPSCは0.53±0.02から0.64±0.02nCに増大した図9、パネルA~C。EtOHの効果は、DHMにより濃度依存的に拮抗された0.3および1.0μM。次いで、DHMの抗EtOH作用に対するフルマゼニルの効果を本明細書に記載のとおり試験した。DHM3μMは、EtOHによって増強されるItonicを44.8±2.3から21.0±0.9pAに、mIPSCを0.78±0.01から0.70±0.02nCに減少させたが、フルマゼニル10μMによりDHMの作用は逆転したItonicを37.3±1.6pAに、mIPSCを0.78±0.01nCに逆転させた、図9、パネルD~F。これらのデータから、DHMは、EtOHによって誘発されるシナプス外GABAARとシナプスGABAARの両方の増強に拮抗し、その効果はフルマゼニルによって阻害されることが示唆される。これらのデータは行動実験観察図6Cと一致し、GABAARベンゾジアゼピン部位に対するDHMとEtOHの相互作用が、EtOH中毒に対するDHMの治療効果の根底にある細胞機構であることが分かる。DHMはベンゾジアゼピン部位におけるGABAARの正の調節物質である海馬薄片中のDGCのGABAAR媒介ItonicおよびmIPSCに対するDHM0.1~30μMの効果。DHM1μMによりItonicが増大し22.5±2.5から44.0±4.1pA、mIPSC面積が増加した0.59±0.01から0.72±0.03nC、図10、パネルA~Cが、この効果は濃度依存的であった0.1~30μM。これらの結果から、DHMはCNSニューロンのGABAAR機能を増強することが分かる。GABAARに対するDHMの作用部位をさらに調べるため、DIV13~14DIV:invitroでの日数における培養海馬ニューロンのGABAAR機能を亢進させるDHMに対するフルマゼニルの効果を分析した。DHM1μMは、Itonic対照の194.9±13.6およびmIPSC面積対照の181.8±9.2、図10、パネルD~Fを増強した。フルマゼニルは、DHMによって増大するGABAAR電流を濃度依存的に抑制した10μMフルマゼニルによりItonic:143.0±3.2に、mIPSC:125.7±3.9に減少、図10、パネルD~F。これらの観察から、DHMはGABAAの同じ部位に作用し、ベンゾジアゼピンと同様にGABAAR機能を増強することが示唆される。未処置成体ラットから得られる皮質膜ホモジネート中の[3H]フルニトラゼパム結合を使用するベンゾジアゼピン部位に対するDHM0.03~100μMの作用を調べた。放射性リガンド結合アッセイのためのラット皮質膜の標準的な準備手順は、前述のとおり行ったが、遠心分離および洗浄の速度と回数、ならびに緩衝液の組成は変更した。LiGD.,etal.2010JBiolChem285:8615-8620を参照されたい。未処置ラット皮質を脳から切除し、0.32Mショ糖、10mMHEPES緩衝液pH7.4中でホモジナイズし、650×g、4°Cで遠心分離した。その後の上清を150,000×gで遠心分離し、所望の膜含有ペレットを回収した。ペレットを洗浄し、1回目に氷冷水を使用し、2回目に50mMKH2PO4、1mMEDTA、2mMベンザミジンHCl、0.5mMDTT、0.1mMベンゼトニウムHCl、0.01バシトラシン、0.2PMSFを含有する膜緩衝液pH7.4を使用してさらに2回遠心分離し、得られるペレットを凍結した。結合アッセイの当日、50mMKH2PO4、1mMEDTA、200mMKClを含有するアッセイ緩衝液pH7.4中でペレットをホモジナイズし、遠心分離し、新鮮なアッセイ緩衝液中に再懸濁させ、最終タンパク質濃度1mg/mlにした。[3H]フルニトラゼパム85.2Ci/mmol、PerkinElmer,Boston,MA、脳ホモジネート、およびDHMを混合して最終アッセイ容量0.5mlにし、氷上でインキュベートし、BrandelcellharvesterM-24RBrandelCo,GaithersburgMDで濾過した。サンプルの計数はBeckmanLS-3801液体シンチレーションカウンターで行った。特異的結合は、全結合量ゼロ非標識リガンドから最終濃度10μMのフルラゼパムSigmaの存在下での結合を減じたものとして定義された。データはGraphPadPrism4.0SoftwareSanDiego,CAで解析し、IC50一部位競合式およびHillの式の傾きS字状用量反応式を求めた。実験はトリプリケートで行った。DHMによる[3H]フルニトラゼパム結合の有意な抑制が0.3μMから濃度依存的に認められたが、IC50は4.36μMであり、Hillの式の傾きは-0.73であった図10、パネルG。これらのデータから、DHMがGABAARへの[3H]フルニトラゼパム結合を、見かけ上競合的に、直接的に抑制することが示唆され、DHMがGABAARベンゾジアゼピン部位に作用するものと考えられることが分かる。培養海馬ニューロンのGABAAR媒介電流に対するDHMの効果も調べた。DHMは、Itonicを濃度依存的に増強し0.3μMDHMにより、9.5±1.5から21.0±2.3pAになり、EC50は約0.20μMであった、mIPSCを増加させた1μMDHMにより対照の128.2±8.3になり、EC50は約0.20μMであった;1μMより高いDHMに対する反応は僅かに減少した、図11Aおよび11B。DIV14の培養ニューロンで10および300μMGABAの局所パフ投与によって誘発されるGABAAR電流に対するDHMの効果を調べた。DHM0.3および1μMとGABAを同時投与すると、GABA電流の振幅が増大し、GABA濃度-反応曲線は左側にシフトした図11Cおよび11D。これらの結果から、DHMはGABAARに直接作用し、シナプスGABAARおよびシナプス外GABAARを強力に増強することが示唆される。DHMはETOH離脱症候を予防し、ETOH暴露/離脱によって誘発されるラット海馬のGABAAR可塑性を予防するラットのEtOH離脱症候に対するDHMの効果を調べた。ラットを4群に分け、溶媒、EtOH5g/kg、E、EtOHとDHM1mg/kg、EDの組み合わせ、またはDHMをそれぞれ強制経口投与した。注射の48時間後、ラットをさらに3群に分け、EtOH離脱の徴候を測定した。EtOH離脱に関連する不安および歩行運動/運動失調をEtOH離脱したラットで、高架十字迷路で測定したEPM、図12A。滞在時間を分単位で測定した。十字迷路を作成し、前述のとおり測定値を記録した。Liangetal.2004JPharmacolExpTher310:1234-1245を参照されたい。簡潔に言えば、迷路は床から1m上昇させ、直角に配置された長さ51cm、幅11.5cmの4本のアームを備えた。クローズドアームは、アームの長さにわたる高さ30cmの不透明な壁を有した。試験時、各動物を迷路の中心にオープンアームに面するように置き、5分間探索させた。このセッション中、動物の行動例えば、アームに進入する回数、および1回の進入当たりの各アームでの滞在時間をカムコーダーで記録した。溶媒群に属する対象のオープンアームでの滞在時間は2.71±0.71であり、クローズドアームでの滞在時間は1.80±0.67であった。EtOH群に属する対象は、溶媒群と比較して、オープンアームでの滞在時間が有意に短くなり0.88±0.32、クローズドアームでの滞在時間が長くなった3.64±0.27が;EtOHDHMED群に属する対象の滞在時間は類似していたオープン:2.68±0.77、およびクローズド:1.88±0.79。DHMは、ラットのどちらのアームでの滞在時間にも影響を及ぼさなかったオープン:2.92±0.70およびクローズド:1.52±0.56。これらのデータから、1EtOH暴露/離脱により不安が生じる、2DHMとEtOHを併用すると、EtOHによって誘発される不安が抑制、低減および/または予防される、および3DHMは不安レベルに影響を及ぼさないことが示唆される。EtOHに対する耐性を、急性EtOHによって誘発されるLORR単位:分、図12Bで測定した。EtOHにより、溶媒群の対象では63.6±7.0のLORRが誘発され、それに対しEtOH群の対象では10.8±3.8のLORRが誘発された。EtOHによりEtOHDHM群の対象では61.0±3.8のLORRが誘発され、DHM群の対象では65.6±8.4のLORRが誘発された。これらの結果から、EtOHへの単回暴露によりEtOHに対する耐性が生じ、DHMは、このEtOH暴露/離脱によって誘発されたEtOHに対する耐性を抑制、低減および/または予防することが示唆される。本明細書に記載のとおり、過剰興奮性を、PTZ誘発性発作の持続時間で分析した図12C。PTZにより、溶媒群の対象では0.9±0.2分間の発作が誘発され、EtOH群の対象では6.5±1.1分間の発作が誘発された。発作の持続時間はEtOHDHM群で最小であった1.7±0.8分間。DHM群におけるPTZ誘発性発作は、溶媒群と類似していた0.6±0.4分間。これらの結果から、EtOH暴露/離脱により発作感受性過剰興奮性が増加し、DHMはこれらのEtOHの効果を緩和することが示唆される。上記の4つの処置を行った48時間後の、海馬のGABAARα4サブユニットの全タンパク質含有量を分析した。ウエスタンブロットから、EtOH暴露により、全α4-タンパク質レベルが、溶媒群のものと比較して、184.0±26.0に増加することが分かった。EtOHDHM群では全α4-タンパク質レベルは増加しなかった対照の93.0±21.0。DHM暴露は、α4サブユニットレベルに影響を及ぼさなかった対照の88.3±10.3、図12Dおよび12E。これらのデータから、DHMは、invivoで、EtOH暴露/離脱によって誘発されるGABAAR可塑性を抑制、低減および/または予防することが分かる。DHMがEtOHによって誘発されるCNSニューロンのGABAAR可塑性を予防するかどうかを分析した。4群のラットに溶媒溶媒群、EtOHEtOH群、EtOHとDHMの組み合わせ1mg/kg、ED、EtOHDHM群、またはDHMDHM群を強制経口投与した。48時間離脱した後、海馬薄片中のDGCで、ホールセルGABAAR媒介電流を記録した。溶媒群では、EtOH60mMの灌流液中投与により、Itonicが28.8±3.1から62.1±3.3pAに増大した図13、パネルA、G。EtOHによりmIPSC面積は0.67±0.08から0.78±0.10nCに増大した図13、パネルA、H。EtOH群では、EtOHによりItonicは増加しなかった13.0±0.95から13.8±1.28pAになったが、mIPSC面積は0.95±0.01から1.4±0.02nCに大きく増大した図13、パネルB、G、H。EtOHDHM群では、EtOHによりItonicが30.0±2.8から60.0±2.2pAに増加したが、mIPSC調節は変化しなかった0.70±0.03から0.78±0.02nCになった、図13、パネルC、G、H。DHM群では、EtOHに対するItonicおよびmIPSCの反応は、溶媒群図13、パネルD、G、Hのものと類似していた。これらの結果から、EtOHとDHMの組み合わせを胃内投与すると、その後のEtOH耐性と、EtOHによって誘発されるGABAAR可塑性が両方とも抑制される、低減されるおよび/または予防されることが示唆される。ベンゾジアゼピンのアゴニストであるゾルピデムの、上記の4つの処置の後の、ラットのDGCに対する効果。ゾルピデムは、溶媒群と同様にDHM群でもGABAAR電流の増強を誘発したが、EtOH群のGABAAR電流には影響を及ぼさなかったため、EtOHはゾルピデムに対する交叉耐性を生じさせる図13、パネルF、I、Jことが示唆される。これらの結果から、EtOHとDHMを併用投与すると、EtOHによって誘発されるGABAAR可塑性が抑制、低減および/または予防され、DHMはEtOHに対しても、ゾルピデムに対しても交叉耐性も生じさせないことが分かる。EtOHに予め暴露された培養ニューロンに対するDHMの効果を調べた。DHMの灌流液中投与により、ItonicおよびmIPSCが濃度依存的に増大した0.03~30μM、図14Aおよび14B。Itonic約0.20μMおよびmEPSC約0.15μMを増大させるEC50は溶媒群のものと類似していた図11Aおよび11B。データから、DHMは、EtOHに対する耐性を生じさせるEtOH暴露/離脱の後でも、依然としてシナプスGABAARおよびシナプス外GABAARの増強に有効であることが示唆される。細胞表面ビオチン化と、その後のウエスタンブロット分析を使用して、培養ニューロンのα4サブユニットの表面発現を測定した。EtOH処置ニューロンでは、α4サブユニット表面発現の増加が認められた対照の249.7±28.1が;EtOHDHMで処置されたニューロンではこの増加が阻害された対照の123.0±8.4、図14Cおよび14D。DHMによりα4表面発現は変化しなかった対照の125.0±27.3、図14Cおよび14D。これらのinvitroデータから、EtOHとDHMを併用投与すると、通常、EtOHへの暴露EtOHへの単回暴露および慢性的間欠的暴露を含むにより生じるGABAAR可塑性が抑制、低減および/または予防されることが分かる。DHMにより慢性的随意アルコール摂取ラットモデルでのETOH消費が低減するアルコール消費に対するDHMの効果を調べた。流体は全て100mlのガラスメスシリンダーに入れて提供し、逆転明暗サイクル室を消灯して15分後にステンレス鋼製の飲み口を挿入した。流体を提供して30分後と24時間後に瓶の重量を測定した。健康状態を監視するために各ラットの体重を毎日測定し、体重1キログラム当たりのエタノール摂取グラム数を算出した。ラットを4群に分け、それぞれ水/水、20EtOH/水、ED/水、またはDHM/水の2瓶の選択肢に間欠的にアクセスさせた。ラットは、2週間、水/水、20w/vEtOH/水、EtOHDHM0.05mg/ml、ED/水またはDHM/水の2瓶の選択肢に自由にアクセスするように訓練された。第1週は、どの瓶にも甘味料2pk/Lを添加した。第2週は、どの瓶にも甘味料1pk/Lを添加した。訓練後、毎週3回各24時間月曜日、水曜日、および金曜日、ラットに水/水、EtOH/水、ED/水、またはDHM/水全て甘味料なしの2瓶の選択肢にアクセスさせた。EtOHアクセス時間とEtOHアクセス時間との間、ラットを2瓶の水に無制限にアクセスさせた。左右の好みを調整するため、EtOH瓶の配置は、各EtOH飲酒セッション毎に交替した。ラットは、20EtOH間欠的アクセス2瓶選択パラダイムを7週間継続した21回のEtOH-アクセスセッション。EtOH群の半分には、第5週13回目のセッション以降、EtOH瓶にDHMを添加した。残りのEtOH群はEtOH-アクセスセッションを継続した。EtOH消費を体重1キログラム当たり消費されるEtOHのグラム数として表した。ラットの2瓶の水へのアクセスは対照群と見なした。実験の終了時、対照ラットとEtOH飲酒ラットの間には体重に有意差はなかった。第2週から、EtOH/水群ではEtOH消費が3.1±1.3から7.5±0.5g/kg/日に増加した。EtOHとDHMを併用投与するとED/水群、このEtOH摂取の増加が打ち消される2.6±0.4g/kg/日、図15A。4週間後、EtOH/水群をさらに2群に分け、一方はEtOH/水を継続し、他方にはED/水を提供した。E/水の部分群は高レベルのEtOH摂取を維持したが、ED/水の部分群ではEtOH消費が、ED/水で開始した群のものと同様に、第5週の終わりに1.8±1.0g/kg/日、および第6週の終わりに1.2±0.2g/kg/日に大きく低減した図15A。4群間には全流体消費に有意差はない。これらの結果から、DHMは、アルコールと共に摂取すると、過度のアルコール消費乱用を抑制、低減および/または予防することが示唆される。EtOH暴露により高い随意EtOH消費が既に定着している場合、DHMによりアルコール消費が低減するアルコール乱用が治療される。第4週の終わりに、ED/水に暴露されたラット群の血漿中[EtOH]は、E/水に暴露された群のものより有意に低かった。血漿中[EtOH]は、測定された消費EtOH量とよく相関した。各動物の血漿中[EtOH]mg/dlは、第4週の終わりのアルコール日に開始した30、45、60および100分の随意20EtOHの後に測定した。2群の血漿中[EtOH]には有意差があったp<0.05、図15B。これらのデータから、DHMは、高い随意EtOH消費EtOH乱用を抑制、低減および/または予防することが示唆される。追加の実験を行ったが、これから、雌性ラットではDHM1mg/kg、i.p.、n=ラット6匹/群で併用処置するとEtOH3g/kg、i.p.によって誘発されるLORR持続時間が減少することが分かるが、これは雄性ラットのものと類似している。同様に、雌性ラットでは、DHMEtOHを併用投与すると同様に、EtOH中毒/離脱によって誘発されるPTZ誘発性発作の持続時間および発作の発生率の増加が抑制、低減および/または予防される。本明細書の実験から、培養されたまたは薄片の海馬ニューロンで、DHMはGABAAR媒介mIPSCおよび強直性電流を濃度依存的に増強したことが分かる。培養ニューロンでは、DHMによりGABA濃度-反応関係が左側にシフトした。これらの結果から、DHMは、シナプスGABAARとシナプス外GABAARの両方を増強することが示唆される。しかし、DHM暴露/離脱により、細胞レベルでの持続的なGABAAR可塑性は誘発されなかった。DHMは、EtOH中毒を緩和するのに十分な用量範囲で、LORRなどの中毒性症候も誘発せず、発作感受性の増加などのAWSも引き起こさず、EtOHに対する交叉耐性も誘発しなかった。従って、DHMを使用して、急性および慢性的アルコール消費を治療することができる。ラットのEtOH暴露からの離脱において、invivoでの行動実験から、ヒトAWSで観察される症候と同様に、発作閾値の低下、不安、および鎮静/麻酔薬に対する耐性が認められる。本明細書に開示するとおり、DHMとEtOHの併用投与から48時間の離脱で急性EtOHに対する顕著なItonic感受性が認められることが、海馬薄片での試験から分かる。また、DHMとEtOHを併用投与すると、EtOH処置によるベースラインItonicの大きさの低減が阻害される。類似のDHM効果が培養海馬ニューロンでも認められた。これらのラット海馬の結果から、EtOHによって誘発されるα4含有GABAARの変化はDHMによって阻害されることが分かる。これらの結果から、DHMは、GABAAR機能に対するEtOHの効果に拮抗するだけでなく、シナプス外からシナプスへのα4含有GABAARの再局在化を阻害することも示唆される。従って、DHMを使用して、EtOHへの暴露により生じるGABAAR可塑性に関連するアルコール使用障害を治療することができる。本明細書の実験から、未処置GABAARおよびEtOHに暴露されたGABAARでは、DHMがシナプスGABAARおよびシナプス外GABAARを効果的に増強し続けることが分かる。さらにDHMは、急性EtOHによる、脳薄片中の未変性海馬ニューロンのシナプスGABAARの増強を阻害する。これらの結果から、DHMはGABAARの調節物質であることが分かり、それによりDHMはベンゾジアゼピンなどの他の薬剤に対して耐性を有する対象のアルコール中毒およびAWSの有効な治療となり得ることが分かる。ダイジン、ケルセチン、ゲニステイン、ミリセチン、およびプエラリンを用いた比較実験から、EtOH暴露によるGABAARに関連するアルコール中毒、アルコール使用障害およびアルコール乱用に対するDHMの効果は特有であり得ることが分かる。特に、ラット海馬薄片のニューロンのパッチクランプ記録から、ADHMはシナプス外GABAAR媒介強直性電流Itonicおよびシナプス後電流mIPSCを増強するが、ダイジンはItonicには影響を及ぼさず、mIPSCを有意に増強したことが分かる。ケルセチンは、ItonicにもmIPSCにも影響を及ぼさなかった。従って、DHMを使用してシナプス外GABAARを選択的に調節することができる。ラット海馬薄片中のニューロンのパッチクランプ記録から、60mMEtOHの存在下で、DHMは、EtOHによるGABAAR媒介ItonicおよびmIPSCの増強を用量依存的に阻害するが、ダイジンおよびケルセチンは阻害しないことが分かる。[3H]フルニトラゼパム結合アッセイから、DHM、ダイドゼインおよびダインジンdainzinはGABAARに結合するが、[3H]フルニトラゼパムにより著しく置換され;他方、ゲニステイン、ミリセチン、プエラリンおよびケルセチンはGABAARに結合しないことが分かる。これらの結果から、DHMは、アルコールによるCNSニューロンのGABAARの増強に特有に拮抗することが分かる。本発明の開示を理解するまたは完成させるのに必要な程度、本明細書に記載の全ての出版物、特許、および特許出願は、それぞれが個々に参照により本明細書に明示的に援用されるのと同程度、参照により本明細書に明示的に援用される。本明細書に開示される実施例および実験は、本発明を説明することを目的とするものであって、本発明を限定するものではない。本発明の例示的実施形態を上記のとおり記載したが、当業者は、本明細書内の開示内容は例示に過ぎず、本発明の範囲内で他の様々な代替、改変、および変更がなされ得ることに留意すべきである。従って、本発明は本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。"