"5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された以下のA~Cの核酸領域:A2~5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、Bgna又はgnnaここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかであるの塩基配列からなる第2核酸領域、及びC第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、かつ第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成されるヘアピン型DNAを、以下の1又は2で示される核酸断片の少なくとも一の末端に連結してなる核酸。1完全に又は部分的に塩基対合する二本鎖核酸断片、又は2一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有する一本鎖核酸断片前記第1核酸領域がg又はcの塩基配列からなる、請求項1に記載の核酸。前記核酸断片がDNA、RNA及び/又はそれらの誘導体からなる、請求項1又は2に記載の核酸。前記核酸断片が請求項11に記載の二本鎖核酸断片の場合において、該二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む、請求項3に記載の核酸。以下の1~4のいずれかにおいて、核酸断片及びヘアピン型DNAが5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された、請求項4に記載の核酸。1siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、請求項1で規定されたヘアピン型DNA、siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片及び請求項1で規定されたヘアピン型DNA、2請求項1で規定されたヘアピン型DNA、siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、請求項1で規定されたヘアピン型DNA及びsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、3siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、請求項1で規定されたヘアピン型DNA、siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片及び請求項1で規定されたヘアピン型DNA、又は4請求項1で規定されたヘアピン型DNA、siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、請求項1で規定されたヘアピン型DNA及びsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片以下の1~4のいずれかに記載の末端において、請求項1で規定されたヘアピン型DNAを連結してなる、請求項4に記載の核酸。1siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の5’末端及び3’末端、2siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の5’末端及び3’末端、3siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片及びアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片のそれぞれの3’末端、又は4siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片及びアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片のそれぞれの5’末端以下の1~4のいずれかに記載の末端において、請求項1で規定されたヘアピン型DNAを連結してなる、請求項4に記載の核酸。1siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の5’末端、2siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の5’末端、3siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の3’末端、4siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の3’末端前記二本鎖核酸断片のそれぞれの鎖が19~30塩基からなる、請求項4~7のいずれか一項に記載の核酸。前記二本鎖核酸断片が一以上のミスマッチ部位及び/又はバルジ構造を有する、請求項4~8のいずれか一項に記載の核酸。前記核酸断片が請求項11に記載の二本鎖核酸断片の場合において、該二本鎖核酸断片が標的分子の結合領域を含む、請求項3に記載の核酸。以下の1又は2において、核酸断片及びヘアピン型DNAが5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された、請求項10に記載の核酸。1前記二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、請求項1で規定されたヘアピン型DNA、二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片及び請求項1で規定されたヘアピン型DNA、又は2請求項1で規定されたヘアピン型DNA、前記二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、請求項1で規定されたヘアピン型DNA及び二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片以下の核酸断片及びヘアピン型DNAが5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結され、かつ該両末端が互いに連結された、請求項10に記載の核酸。前記二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、請求項1で規定されたヘアピン型DNA、二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片及び請求項1で規定されたヘアピン型DNA二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片領域内に一箇所のニックを有する、請求項12に記載の核酸。二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片領域内に一箇所のニックを有し、両ニックが対向しない、請求項12に記載の核酸。前記二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の5’末端及び3’末端、又は前記二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片の5’末端若しくは3末端のいずれかに請求項1で規定されたヘアピン型DNAを連結してなる、請求項10に記載の核酸。標的分子が転写調節因子である、請求項10~15のいずれか一項に記載の核酸。前記核酸断片が請求項12に記載の一本鎖核酸断片の場合において、該一本鎖核酸断片が機能性核酸の塩基配列を含む、請求項3に記載の核酸。該一本鎖核酸断片の分子内アニールによって形成される一以上のステム構造間にミスマッチ部位又はバルジ構造を有する、請求項17に記載の核酸。前記機能性核酸が、一本鎖miRNA前駆体、shRNA、核酸アプタマー、リボザイムデオキシリボザイムを含む、モレキュラービーコン又はリボスイッチ及びU1アダプターからなる群より選択される、請求項17に記載の核酸。前記一本鎖核酸断片の5’末端又は3’末端のいずれかに請求項1で規定されたヘアピン型DNAを連結した、請求項17~19のいずれか一項に記載の核酸。請求項1~20のいずれか一項に記載の核酸を有効成分として含む医薬組成物。製薬上許容可能な担体を含む、請求項21に記載の医薬組成物。5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された以下のA~Cの核酸領域:A2~5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、Bgna又はgnnaここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかであるの塩基配列からなる第2核酸領域、及びC第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、かつ第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成されるヘアピン型DNAを、以下の1又は2で示される核酸断片の少なくとも一の末端に連結し、核酸断片の核酸分解酵素に対する分解耐性能を向上させる方法。1完全に又は部分的に塩基対合する二本鎖核酸断片、又は2一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有する一本鎖核酸断片前記第1核酸領域がg又はcの塩基配列からなる、請求項23に記載の方法。前記核酸断片がDNA、RNA及び/又はそれらの誘導体からなる、請求項23又は24に記載の方法。前記核酸断片が請求項231に記載の二本鎖核酸断片の場合において、該二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む、請求項25に記載の方法。前記核酸断片が請求項231に記載の二本鎖核酸断片の場合において、該二本鎖核酸断片が標的分子の結合領域を包含する、請求項25に記載の方法。前記核酸断片が請求項232に記載の一本鎖核酸断片の場合において、該一本鎖核酸断片が機能性核酸を含む、請求項25に記載の方法。前記機能性核酸が、shRNA、primiRNA、premiRNA、核酸アプタマー、リボザイムデオキシリボザイムを含む、モレキュラービーコン又はリボスイッチ及びU1アダプターからなる群より選択される、請求項28に記載の方法。本発明は、二本鎖核酸断片又は分子内アニールにより高次構造を形成する一本鎖核酸断片の、核酸分解酵素に対する分解耐性能を簡便な調製でかつ低コストで向上させる方法及びその方法により得られる核酸を提供することを課題とする。本発明は、機能性核酸の生体内での安定性を高め、継続的にその薬理効果を発揮し得る核酸を提供する。前記課題を解決するために、本願発明者らが鋭意研究を重ねた結果、一本鎖又は二本鎖の機能性核酸を含む核酸断片の5’末端及び/又は3’末端に特定の配列からなるヘアピン型DNAを連結することによって、必ずしも閉環構造でなくとも、その核酸断片の核酸分解酵素に対する分解耐性が向上できることが明らかとなった。前記特定の配列からなるヘアピン型DNAは、本願発明者らが以前に発見した7~14塩基からなり、分子内アニールによってヘアピン構造を形成する、ミニヘアピンと呼ばれる核酸であるHiraoIetalNucleicAcidSympSer227576HiraoIetalFEBSLett321169172KhanIMCoulsonJMNucleicAcidsRes2129672958YoshizawaSetalNucleicAcidsRes2222172221HiraoIetalNucleicAcidsRes22576582MestreBetalBioconjugChem6466472YoshizawaSetalBiochemistry3647614767JollesBetalNucleicAcidsRes2546084613。ミニヘアピンは、これまでmRNAやプライマーDNAのような分子内アニールによって高次構造を形成しない一本鎖核酸断片に連結することで、その一本鎖核酸断片に対して核酸分解酵素に対する分解耐性を付与できることが知られていた。しかし、機能性核酸を含む、二本鎖核酸断片や分子内アニールによって高次構造を形成する一本鎖核酸断片に付与した場合に、同様の効果を奏し得ることや、機能性核酸の機能を保持し得ることについては全く知られていなかった。さらに、核酸安定化のためのダンベル型構造は、前述のように閉環状構造であり、非連結部位を有するダンベル型様構造すなわち、ダンベル型構造に一箇所又は二箇所のニックが入ったような構造が、核酸分解酵素に対して分解耐性能を有することについては、当該分野においても予想だにされていなかった。本願発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、すなわち、以下の1~29を提供する。15’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された以下のA~Cの核酸領域:A2~5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、Bgna又はgnnaここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかであるの塩基配列からなる第2核酸領域、及びC第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、かつ第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成されるヘアピン型DNAを、完全に又は部分的に塩基対合する二本鎖核酸断片、又は一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有する一本鎖核酸断片で示される核酸断片の少なくとも一の末端に連結してなる核酸。2前記第1核酸領域がg又はcの塩基配列からなる、1に記載の核酸。3前記核酸断片がDNA、RNA及び/又はそれらの誘導体からなる、1又は2に記載の核酸。4前記核酸断片が前記1に記載の二本鎖核酸断片の場合において、該二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む、3に記載の核酸。5以下のI~IVのいずれかにおいて、核酸断片及びヘアピン型DNAが5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された、4に記載の核酸。IsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、前記1で規定されたヘアピン型DNA、siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片及び前記1で規定されたヘアピン型DNA、II前記1で規定されたヘアピン型DNA、siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、前記1で規定されたヘアピン型DNA及びsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、IIIsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、前記1で規定されたヘアピン型DNA、siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片及び前記1で規定されたヘアピン型DNA、又はIV前記1で規定されたヘアピン型DNA、siRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、前記1で規定されたヘアピン型DNA及びsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片6以下のI~IVのいずれかに記載の末端において、前記1で規定されたヘアピン型DNAを連結してなる、4に記載の核酸。IsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の5’末端及び3’末端、IIsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の5’末端及び3’末端、IIIsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片及びアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片のそれぞれの3’末端、又はIVsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片及びアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片のそれぞれの5’末端7以下のI~IVのいずれかに記載の末端において、前記1で規定されたヘアピン型DNAを連結してなる、4に記載の核酸。IsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の5’末端、IIsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の5’末端、IIIsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の3’末端、IVsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の3’末端8前記二本鎖核酸断片のそれぞれの鎖が19~30塩基からなる、4~7のいずれかに記載の核酸。9前記二本鎖核酸断片が一以上のミスマッチ部位及び/又はバルジ構造を有する、4~8のいずれかに記載の核酸。10前記核酸断片が前記1に記載の二本鎖核酸断片の場合において、該二本鎖核酸断片が標的分子の結合領域を含む、3に記載の核酸。11以下のI又はIIにおいて、核酸断片及びヘアピン型DNAが5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された、10に記載の核酸。I前記二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、前記1で規定されたヘアピン型DNA、二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片及び前記1で規定されたヘアピン型DNA、又はII前記1で規定されたヘアピン型DNA、前記二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、前記1で規定されたヘアピン型DNA及び二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片12以下の核酸断片及びヘアピン型DNAが5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結され、かつ該両末端が互いに連結された、10に記載の核酸。前記二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、前記1で規定されたヘアピン型DNA、二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片及び前記1で規定されたヘアピン型DNA13二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片領域内に一箇所のニックを有する、12に記載の核酸。14二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片領域内に一箇所のニックを有し、両ニックが対向しない、12に記載の核酸。15前記二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の5’末端及び3’末端、又は前記二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片の5’末端若しくは3末端のいずれかに前記1で規定されたヘアピン型DNAを連結してなる、10に記載の核酸。16標的分子が転写調節因子である、10~15のいずれかに記載の核酸。17前記核酸断片が前記1に記載の一本鎖核酸断片の場合において、該一本鎖核酸断片が機能性核酸の塩基配列を含む、3に記載の核酸。18該一本鎖核酸断片の分子内アニールによって形成される一以上のステム構造内にミスマッチ部位又はバルジ構造を有する、17に記載の核酸。19前記機能性核酸が、miRNA、shRNA、核酸アプタマー、リボザイムデオキシリボザイムを含む、モレキュラービーコン又はリボスイッチ及びU1アダプターからなる群より選択される、17に記載の核酸。20前記一本鎖核酸断片の5’末端又は3’末端のいずれかに前記1で規定されたヘアピン型DNAを連結した、17~19のいずれかに記載の核酸。21前記1~20のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む医薬組成物。22製薬上許容可能な担体を含む、21に記載の医薬組成物。235’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された以下のA~Cの核酸領域:A2~5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、Bgna又はgnnaここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかであるの塩基配列からなる第2核酸領域、及びC第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、かつ第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成されるヘアピン型DNAを、以下のI又はIIで示される核酸断片の少なくとも一の末端に連結し、核酸断片の核酸分解酵素に対する分解耐性能を向上させる方法。I完全に又は部分的に塩基対合する二本鎖核酸断片、又はII一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有する一本鎖核酸断片24前記第1核酸領域がg又はcの塩基配列からなる、23に記載の方法。25前記核酸断片がDNA、RNA及び/又はそれらの誘導体からなる、23又は24に記載の方法。26前記核酸断片が前記23Iに記載の二本鎖核酸断片の場合において、該二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む、25に記載の方法。27前記核酸断片が前記23Iに記載の二本鎖核酸断片の場合において、該二本鎖核酸断片が標的分子の結合領域を包含する、25に記載の方法。28前記核酸断片が前記23IIに記載の一本鎖核酸断片の場合において、該一本鎖核酸断片が機能性核酸を含む、25に記載の方法。29前記機能性核酸が、shRNA、primiRNA、premiRNA、核酸アプタマー、リボザイムデオキシリボザイムを含む、モレキュラービーコン又はリボスイッチ及びU1アダプターからなる群より選択される、28に記載の方法。本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010096520号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。本発明の核酸によれば、低コストで、かつ簡便な調製方法により、二本鎖核酸断片又は分子内アニールにより高次構造を形成する一本鎖核酸断片に核酸分解酵素に対する分解耐性能を付与し、生体内での高い安定性を確保させことができる。それによって、前記二本鎖核酸断片又は一本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の生体内での安定性を高め、長期間にわたり継続的にその薬理効果を作用させることができる。I.核酸第1の実施形態において、本発明は、核酸分解酵素に対する分解耐性能を有する核酸に関する。図1に本発明に関連する核酸の構造例を模式図で示す。この図のA~Cで示すように、本発明の核酸は、ヘアピン型DNA101及び核酸断片102、103、108からなり、核酸断片の少なくとも一の末端にヘアピン型DNAを連結した構造を有する。本明細書において、核酸とは、原則として、ヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した生体高分子をいう。したがって、通常は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが連結したDNA及び/又はアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが連結したRNAのような、自然界に存在する天然型ヌクレオチドが連結してなる天然型核酸が該当する。その他にも、本発明の核酸は、非天然型ヌクレオチド又は非天然型核酸も含むことができる。本明細書において、非天然型ヌクレオチドとは、人工的に構築された又は人工的に化学修飾されたヌクレオチドであって、前記天然型ヌクレオチドに類似の性質及び/又は構造を有する、又は天然型ヌクレオチドを構成するヌクレオシド若しくは塩基に類似の性質及び/又は構造を有するヌクレオシド若しくは塩基を含む、自然界に存在しないヌクレオチドをいう。例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2′デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、βLデオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシドが挙げられる。さらに、前記糖修飾を有するヌクレオシドには、置換五単糖2′Oメチルリボース、2′デオキシ2′フルオロリボース、3′Oメチルリボース、1′,2′デオキシリボース、アラビノース、置換アラビノース糖;置換六単糖及びアルファ-アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。また、本発明の非天然型ヌクレオチドは、人工的に構築された塩基類似体又は人工的に化学修飾された塩基修飾塩基であってもよい。塩基類似体には、例えば、2オキソ1Hピリジン3イル基、5位置換2オキソ1Hピリジン3イル基、2アミノ62チアゾリルプリン9イル基、2アミノ62チアゾリルプリン9イル基、2アミノ62オキサゾリルプリン9イル基等が挙げられる。修飾塩基には、例えば、修飾化ピリミジン例えば、5ヒドロキシシトシン、5フルオロウラシル、4チオウラシル、修飾化プリン例えば、6メチルアデニン、6チオグアノシン及び他の複素環塩基等が挙げられる。本明細書において、非天然型核酸とは、天然型核酸に類似の構造及び/又は性質を有する人工的に構築された核酸類似体をいう。例えば、ペプチド核酸PNA:PeptideNucleicAcid、ホスフェート基を有するペプチド核酸PHONA、架橋化核酸BNALNA:BridgedNucleicAcidLockedNucleicAcid、モルホリノ核酸等が挙げられる。メチルホスホネート型DNARNA、ホスホロチオエート型DNARNA、ホスホルアミデート型DNARNA、2Oメチル型DNARNA等の化学修飾核酸や核酸類似体を含むこともできる。また、本発明の核酸は、必要に応じて、リン酸基、糖及び/又は塩基が標識されていてもよい。標識は、当該分野で公知のあらゆる核酸用標識物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素例えば、32P、3H、14C、DIG、ビオチン、蛍光色素例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA、又は発光物質例えば、アクリジニウムエスターが挙げられる。なお、本明細書においては、以下、便宜的に、上記非天然型ヌクレオチド、非天然型核酸又は標識化核酸をまとめて修飾核酸と呼ぶ。1.本発明の核酸の構成前述のように、本発明の核酸は、ヘアピン型DNA101及び核酸断片二本鎖核酸断片:102又は103;一本鎖核酸断片:108から構成される。以下、それぞれについて具体的に説明をする。1-1.ヘアピン型DNA本発明の核酸を構成するヘアピン型DNAの模式図を図2に示す。この図で示すように、ヘアピン型DNAは、第1核酸領域201、第2核酸領域202及び第3核酸領域203の3つのDNA核酸領域がそれぞれ5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された構造を有する。第1核酸領域とは、2~5個の任意ヌクレオチドからなる核酸領域である。前記ヌクレオチドは、グアニンg、アデニンa、シトシンc又はチミンtの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドをいう。本核酸領域の塩基は、好ましくはグアニン又はシトシンである。これは、後述する第3核酸領域との間でステム構造を形成するにあたり、gc含量が多いほどTm値も増加し、前記ステム構造を安定的に保持することができるからである。したがって、第1核酸領域の全塩基配列がg及び/又はcで構成されていることがもっとも好ましい。第2核酸領域とは、5‐gna‐3’又は5‐gnna‐3’の塩基配列からなる核酸領域である。配列中の各nは、独立に、天然型塩基g、a、t、若しくはc、前記塩基類似体又は修飾塩基のいずれかからなる。第3核酸領域とは、第1核酸領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸領域である。したがって、第3核酸領域の塩基配列は、第1核酸領域の塩基配列によって定まり、また第1核酸領域と第3核酸領域は、分子内で塩基対を形成する。その結果、第1核酸領域と第3核酸領域は、互いに完全に塩基対合したステム部分を、また第1核酸領域と第3核酸領域の間に存在する第2核酸領域は、ループ部分をそれぞれ構成し、全体として、例えば、配列番号1又は2の塩基配列を有する7~14個のヌクレオチドからなるヘアピン型DNAが形成される。上記ヘアピン型DNAを、次で説明する核酸断片の一以上の末端にホスホジエステル結合によって連結することによって、その核酸断片の核酸分解酵素に対する分解耐性を向上させて生体内での安定性を高めることが可能となる。1-2.核酸断片本発明の核酸を構成する核酸断片は、二本鎖核酸断片又は分子内アニールによって高次構造を形成する一本鎖核酸断片からなる。これらの核酸断片は、機能性核酸の塩基配列を包むことができる。ここで機能性核酸とは、生体内又は細胞内において、特定の生物学的機能、例えば、酵素機能、触媒機能又は生物学的阻害若しくは亢進機能例えば、転写、翻訳の阻害又は亢進を有する核酸をいう。具体的には、例えば、siRNA、shRNA、miRNAprimiRNA、premiRNAを含む、核酸アプタマーRNAアプタマー、DNAアプタマーを含む、リボザイムデオキシリボザイムを含む、リボスイッチ、U1アダプター、モレキュラービーコン又は転写因子結合領域等が挙げられる。以下、二本鎖核酸断片及び一本鎖核酸断片のそれぞれについて、具体的に説明をする。1-2-1.二本鎖核酸断片二本鎖核酸断片を構成する各核酸断片の塩基は、本発明の核酸において互いに完全に又は部分的に塩基対合をしている。完全にとは、本明細書において、少なくとも一方の核酸断片の全ての塩基が他方の核酸断片の対応する塩基と塩基対合することをいう。したがって、各核酸断片の塩基長が等しい場合、両核酸断片の全ての塩基が互いに塩基対を形成することとなる。また、部分的にとは、各核酸断片の対応する塩基配列間において、一部の塩基、好ましくは連続する2以上の塩基が塩基対合を形成している状態を意味する。したがって、この場合、二本鎖核酸断片は、図1Bで示すようにその内部に一以上の塩基のミスマッチ部位104、又は一以上のバルジ構造105を有していてもよい。本発明の二本鎖核酸断片は、全体でその内部に3個以上、好ましくは5個以上、より好ましくは7個以上、さらに好ましくは10個以上の塩基対を含む。また、本発明の二本鎖核酸断片の塩基長は、特に限定はしない。それぞれの機能性核酸領域がその機能を発揮し得る範囲で適宜定めればよい。また、二本鎖核酸断片を構成する各核酸断片の塩基長は、同一であっても又は異なっていてもよい。好ましくは、同一塩基長である。各核酸断片の塩基長が異なる場合、図1Bで示すように、長鎖側が分子内アニールによって一以上のループ構造及び一以上のステム構造107を形成してもよい。このとき、ステム構造は、その内部に一以上のミスマッチ部位104又は一以上のバルジ構造105を含むこともできる。二本鎖核酸断片は、DNA、RNA及び/又は修飾核酸からなる。前述のように二本鎖核酸断片は、機能性核酸の塩基配列を含むことができる。二本鎖核酸断片に含まれ得る機能性核酸としては、例えば、siRNA、成熟型二本鎖miRNA又は標的分子の結合領域を有する機能性核酸断片が挙げられる。以下、それぞれについて説明をする。<siRNA>siRNA短分子干渉RNAsmallinterferenceRNAとは、標的遺伝子の一部に相当する塩基配列を有するセンス鎖、及びそのアンチセンス鎖からなる小分子二本鎖RNAである。siRNAは、細胞真核細胞へ導入することによって配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングいわゆる、RNA干渉を誘導することができるFireAetal.,1998,Nature,391806811。以下、本発明の核酸を構成する二本鎖核酸断片中にsiRNAの塩基配列が含まれる場合について説明をする。二本鎖核酸断片に含まれるsiRNAは、標的遺伝子のセンス鎖塩基配列の連続する一部領域と完全に一致する塩基配列をいずれか一方の核酸断片に包含する。完全一致する塩基配列の長さは、17~32塩基、好ましくは18~30塩基、より好ましくは19~25塩基である。二本鎖核酸断片において、siRNAに相当する核酸領域は、原則としてRNAからなるが、1又は数個の修飾核酸を含むこともできる。本明細書において数個とは、2~30の整数、例えば、2~30、2~29、2~28、2~27、2~26、2~25、2~24、2~23、2~22、2~21、2~20、2~19、2~18、2~17、2~16、2~15、2~14、2~13、2~12、2~11、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3の整数をいう。二本鎖核酸断片の塩基配列において、siRNAの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチドDNA及び/又はRNA又は核酸類似体が存在していてもよい。siRNAの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、その末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1~20個の範囲内であることが好ましい。具体的には、例えば、siRNAのセンス鎖側及びRNAアンチセンス鎖側の3’末端側にTTチミン‐チミン又はUUウラシル‐ウラシル等を付加することができる。siRNAの標的遺伝子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的遺伝子に対するsiRNAの塩基配列も包含することができる。siRNAは、標的遺伝子の塩基配列に基づいて公知の方法により設計すればよい。例えば、UiTeiらの方法NucleicAcidsRes329369482004、Reynoldsらの方法NatBiotechnol223263302004、Amarzguiouiらの方法BiochemBiophysResCommun316105010582004らの方法にに基づいて、その配列を設計することができる。また、種々の研究機関や企業によって、siRNA設計が可能なウェブサイトが公開されており、有効なsiRNAをウェブ上で設計することが可能である。代表的なsiRNA設計ウェブサイトとしては、siDirecthttpdesignRNAijp、siSearchhttpwwwepigeneticstationcomepigeneticlinksdetaillink203html、siDESIGNCenterhttpwwwdharmaconcomdesigncenterdesigncenterpageaspx、siRNASelectionServerhttpjurawimitedubiocsiRNAext、GeneSpecificsiRNASelectorhttpbioinfowistarupennedusiRNAsiRNAhtmなどが挙げられる。上記のようなsiRNAの塩基配列を包含する二本鎖核酸断片を構成要素として含む本発明の核酸は、従来のsiRNAよりも安定的に生体内又は細胞内で標的遺伝子の発現をサイレンシングすることが可能となる。また、二本鎖核酸断片は、siRNAに加えて、他の機能性核酸を含むこともできる。例えば、二本鎖核酸断片の一方の核酸断片が他方の核酸断片と塩基対合しない長い領域を含む結果、その領域で分子内アニールにより一以上のループ構造及び一以上のステム構造を形成する場合、具体的には、例えば、図1B107で示すような場合、各核酸断片が塩基対を形成する領域106にsiRNAを含み、さらに前記分子内アニールによって二次構造を形成する領域107には、例えば、RNAアプタマーや一本鎖miRNA前駆体等の他の機能性核酸をさらに含んでいてもよい。<成熟型二本鎖miRNA>miRNAmicroRNAとは、生体内に存在し、特定の遺伝子の発現を調節する長さ21~23塩基長の一本鎖ノンコーディングRNAである。このRNAは、標的遺伝子のmRNA及びタンパク質因子と結合して複合体を形成し、標的遺伝子の翻訳を阻害することが知られている。miRNAは、primiRNAと呼ばれる一本鎖の前駆体状態でゲノムから転写された後、核内でDroshaと呼ばれるエンドヌクレアーゼによりpremiRNAと呼ばれるさらなる一本鎖前駆体状態にプロセシングされ、核外でDicerと呼ばれるエンドヌクレアーゼの働きによって成熟型二本鎖miRNAとなり、そのうち一方の鎖がRISCRNAinducedsilencingcomplex複合体に取り込まれて、成熟型一本鎖miRNAとして標的遺伝子発現を調製する。本発明の核酸において、二本鎖核酸断片は、この成熟型二本鎖miRNAの塩基配列を包含することができる。二本鎖核酸断片において、成熟型二本鎖miRNAは、野生型の成熟型二本鎖miRNAと同じ塩基配列を有することが好ましい。この場合、ゲノム上にコードされたmiRNAの塩基配列に基づいて、設計すればよい。二本鎖核酸断片において、成熟型二本鎖miRNAの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチドDNA及び/又はRNA又は核酸類似体が存在していてもよい。成熟型二本鎖miRNAの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1~20個の範囲内であることが好ましい。成熟型二本鎖miRNAが標的とする遺伝子の種類については、特に制限はしない。したがって、本発明の核酸によれば、所望する遺伝子のmiRNAがゲノム上に存在する場合には、そのmiRNAを用いることができる。<標的分子の結合領域を有する機能性核酸断片>標的分子の結合領域とは、標的とする特定の分子と特異的及び/又は高親和性で結合することのできる核酸上の領域である。この標的分子の結合領域を有する機能性核酸断片以下、本項において、機能性核酸断片とするは、生体内又は細胞内において標的分子と結合することによって、その標的分子の生物学的機能を阻害又は抑制することができる。標的分子としては、例えば、DNA又はRNAに特異的に結合するタンパク質因子、核酸又は低分子化合物が挙げられる。機能性核酸断片としては、例えば、特定の転写調節因子のDNA結合領域を有し、その転写因子の機能を阻害又は抑制するデコイDNAおとりDNAが挙げられる。二本鎖核酸断片の塩基配列において、機能性核酸断片は、その一末端又は両末端に一以上のヌクレオチドDNA及び/又はRNA又は修飾核酸を有してもよい。一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端が前記ヘアピン型DNAと連結されるのであれば、1~20個の範囲内であることが好ましい。機能性核酸断片の標的分子については、特に制限はない。所望の標的分子の結合領域が公知であれば、それに基づいて設計、構築すればよい。上記のような機能性核酸断片の塩基配列を包含する二本鎖核酸断片を構成要素として含む本発明の核酸は、従来の機能性核酸断片よりも安定的に生体内又は細胞内で標的分子の生物学的機能を阻害又は抑制することが可能となる。1-2-2.一本鎖核酸断片本発明の核酸を構成する一本鎖核酸断片の塩基は、図1cで示すように、分子内アニールによって一以上のステム構造109及び一以上のループ構造110を有する。さらに、ステム構造は、一以上のミスマッチ部位111及び/又は一以上のバルジ構造112を含んでいてもよい。一本鎖核酸断片に含まれ得る機能性核酸は、分子内アニールによって高次構造を形成し、その機能を発揮し得るものが該当する。例えば、一本鎖miRNA前駆体、shRNA、核酸アプタマー、リボザイムデオキシリボザイムを含む、モレキュラービーコン、リボスイッチ、U1アダプター又は標的分子の結合領域を有する機能性核酸断片が挙げられる。一方、プライマー、プローブ、成熟型一本鎖miRNA又はアンチセンスDNAのように、一般に分子内アニールによって高次構造を形成しない機能性核酸は、当該一本鎖核酸断片には含まれない。以下、一本鎖核酸断片に含まれ得る機能性核酸について説明をする。<一本鎖miRNA前駆体>一本鎖miRNA前駆体は、前述の成熟型二本鎖miRNAの項で説明したように、ゲノムから転写された後、核内でプロセシングを受け、成熟型一本鎖miRNAになるまでの間の一本鎖状態の前駆体状態のmiRNAをいう。具体的には、例えば、primiRNAやpremiRNAが該当する。一本鎖核酸断片において、一本鎖miRNA前駆体の配列は、ゲノム上にコードされた野生型のmiRNAと同じ塩基配列を有することができる。一本鎖核酸断片において、一本鎖miRNA前駆体の一末端又は両末端には一以上のヌクレオチドDNA及び/又はRNA又は修飾核酸が存在していてもよい。一本鎖miRNA前駆体の一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は特に限定はしないが、その末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1~20個の範囲内とすることが好ましい。一本鎖miRNA前駆体が標的とする遺伝子の種類については、特に制限はしない。したがって、本発明の核酸によれば、発現調節を所望する遺伝子に対するmiRNAがゲノム上に存在する場合には、そのmiRNAを用いることができる。上記のような一本鎖miRNA前駆体を包含する一本鎖核酸断片を含む本発明の核酸を適当な方法で用いることにより、特異的に、かつ従来のmiRNAよりも安定的に標的遺伝子の発現をサイレンシングすることが可能となる。<shRNA>shRNAshorthairpinRNAとは、siRNA又は成熟型二本鎖miRNAが適当な短いスペーサ配列で連結された一本鎖RNAをいう。したがって、shRNAは、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、同時に前記スペーサ配列がループ構造をとることによって、分子全体としてヘアピン型のステム-ループ構造を有する。スペーサ配列は、通常3~24塩基、好ましくは、4~15塩基あればよい。スペーサ配列については、siRNA又は成熟型二本鎖miRNAが塩基対合することができる配列であれば、特に制限はない。一本鎖核酸断片の塩基配列において、shRNAの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチドDNA及び/又はRNA又は核酸類似体が存在していてもよい。shRNAの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1~20個の範囲内であることが好ましい。shRNAの標的遺伝子については、それがsiRNAを含む場合には特に制限はない。したがって、この場合、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的遺伝子に対するshRNAも包含することができる。また、shRNAが成熟型二本鎖miRNAを含む場合には、標的遺伝子に対するmiRNAがゲノム上に存在する限りにおいて、特に制限はなく、所望の標的遺伝子のshRNAを包含することができる。<核酸アプタマー>核酸アプタマーとは、それ自身の立体構造によって標的分子に結合し、その機能を阻害又は抑制することのできる核酸をいう。RNAで構成されるRNAアプタマーと、DNAで構成されるDNAアプタマーが知られるが、本発明の核酸に含まれる核酸アプタマーは、DNA、RNA又はそれらの組合せのいずれで構成されていてもよい。好ましくはRNAで構成されるRNAアプタマーである。一般に、RNAはDNAと比較して、より多くの立体構造を形成できる柔軟性を有するからである。核酸アプタマーは、標的分子に対する特異性及び親和性が、抗体よりも通常高く、それ故、標的分子と特異的に直接かつ強固に結合できる。また、結合に必要な標的のアミノ酸残基数が抗体のそれと比較して少なくてもよいことから、例えば、互いに相同性の高いタンパク質群の中で特定のタンパク質の機能のみを抑制させたい場合には抗体よりも優れている。アプタマーに関しては、例えば、JaynasenaSDClinChem4516281650を参照されたい。一本鎖核酸断片の塩基配列において、核酸アプタマーの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチドDNA及び/又はRNA又は核酸類似体が存在していてもよい。核酸アプタマーの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1~20個の範囲内であることが好ましい。核酸アプタマーの標的分子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的分子に対する核酸アプタマーも包含することができる。核酸アプタマーの配列は、当該分野で公知の方法により得られた核酸アプタマーの塩基配列又は公知の核酸アプタマーの配列に基づけばよい。核酸アプタマーを作製する場合、RNAアプタマーであれば、例えば、SELEX法を用いて試験管内選別により作製される。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両末端にプライマー結合領域を有するRNA分子で構成されるRNAプールから標的分子に結合したRNA分子を選択し、回収後にRTPCR反応によって増幅した後、得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、次のラウンドのRNAプールにするという一連のサイクルを数~数十ラウンド繰り返して、標的分子に対してより結合力の強いRNAを選択する方法である。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。通常、ランダム配列領域は20~80塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15~40塩基の範囲である。標的分子への特異性を高めるためには、標的分子に類似する分子とRNAプールとを混合し、その分子と結合しなかったRNA分子からなるプールを用いればよい。このような方法によって最終的に得られたRNA分子をRNAアプタマーとして利用する。SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、PanらProcNatlAcadSciUSA921150911513に準じて行えばよい。上記のような核酸アプタマーを包含する一本鎖核酸断片を含む本発明の核酸を適当な方法で用いることにより、特異的に、かつ従来の核酸アプタマーよりも安定的に標的分子の機能を阻害又は抑制することが可能となる。<リボザイム>リボザイムとは、RNAの特定の部位を特異的に切断する触媒機能をもつRNAをいう。本発明のリボザイムは、RNAで構成されるリボザイムのほかに、DNAで構成されるデオキシリボザイムを包含する。したがって、本発明のリボザイムは、広く一本鎖RNA及び/又はDNAとして構成されるものをさす。一本鎖核酸断片の塩基配列において、リボザイムの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチドDNA及び/又はRNA又は核酸類似体が存在していてもよい。リボザイムの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1~20個の範囲内であることが好ましい。リボザイムの標的分子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的分子に対するリボザイムも包含することができる。<モレキュラービーコン>モレキュラービーコンとは、ステム構造とループ構造とを持つヘアピン構造の一本鎖核酸であり、ループ部分と相補性のある配列の存在確認のためのプローブとして利用される遺伝子解析ツールである。通常は、蛍光剤と消光剤の距離が近いため消光されている。しかしループ部分に相補な配列があると、ループ部分が相補配列とハイブリダイズするため、ヘアピン構造が開き、蛍光剤と消光剤が引き離されるため、蛍光が検出される。一本鎖核酸断片の塩基配列において、モレキュラービーコンの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチドDNA及び/又はRNA又は核酸類似体が存在していてもよい。モレキュラービーコンの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1~20個の範囲内であることが好ましい。モレキュラービーコンの標的分子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的分子に対するモレキュラービーコンも包含することができる。<リボスイッチ>リボスイッチとは、mRNAの5’末端の非翻訳領域に存在するシスエレメントであり、代謝産物感受性遺伝子スイッチとして機能する。リボスイッチは、低分子有機化合物等と直接結合することによりmRNAの立体構造を変化させ、その遺伝子発現を調整することができる。一本鎖核酸断片の塩基配列において、リボスイッチの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチドDNA及び/又はRNA又は核酸類似体が存在していてもよい。リボスイッチの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1~20個の範囲内であることが好ましい。リボスイッチの標的分子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的分子に対するリボスイッチも包含することができる。<U1アダプター>U1アダプターとは、標的遺伝子のmRNA前駆体における3末エクソンに相補的な5側の標的ドメインと、U1snRNAの5’領域に相補的な配列を有する3側のU1ドメインを含む二機能性の約25塩基からなる一本鎖核酸であるGoraczniakRetal2009NatBiotechnolVol27p257263。生体内にU1アダプターを導入すると、U1snRNAを含むU1核内低分子リボ核蛋白質が標的遺伝子のmRNA前駆体におけるポリAシグナル周辺に結合し、該mRNAのポリアデニル化を特異的に阻害する。その結果、標的遺伝子のmRNA前駆体が不安定化し、その後、核内で分解されることによって、遺伝子のサイレンシングが生じる。一本鎖核酸断片の塩基配列において、U1アダプターの一末端又は両末端には一以上のヌクレオチドDNA及び/又はRNA又は核酸類似体が存在していてもよい。U1アダプターの一末端又は両末端に存在するヌクレオチド等の数は、特に限定はしないが、末端を前記ヘアピン型DNAと連結させるのであれば、1~20個の範囲内であることが好ましい。U1アダプターの標的遺伝子については、特に制限はない。したがって、本発明の核酸は、原則として、如何なる標的遺伝子に対するU1アダプターも包含することができる。上記のようなU1アダプターを包含する一本鎖核酸断片を含む本発明の核酸を適当な方法で用いることにより、特異的に、かつ従来の核酸アプタマーよりも安定的に標的分子の機能を阻害又は抑制することが可能となる。<標的分子の結合領域を有する機能性核酸断片>標的分子の結合領域は、前述の1-2-1.二本鎖核酸断片の標的分子の結合領域を有する機能性核酸断片の項で説明したとおりである。ここでの機能性核酸断片としては、例えば、特定の選択的スプライシング調節因子のRNA結合領域例えば、ドナー部位又はアクセプター部位や特定のmiRNAのRNA結合領域すなわち、標的遺伝子のmiRNA結合領域等を有し、特定の選択的スプライシング調節因子やmiRNAの機能を阻害又は抑制するデコイRNAが挙げられる。2.本発明の核酸の構造本発明の核酸は、一以上のヘアピン型DNAが核酸断片に連結されてなる。以下、本発明の核酸の構造及びその核酸におけるヘアピン型DNAと核酸断片の連結態様について具体的に説明をする。2-1.二本鎖核酸断片にヘアピン型DNAが連結された核酸二本鎖核酸断片にヘアピン型DNAが連結された核酸は、最大で4つ、すなわち二本鎖核酸断片の5’末端及び3末端のそれぞれに、本発明の前記ヘアピン型DNAを連結することができる。通常は、1つ又は2つのヘアピン型DNAが二本鎖核酸断片に連結されていれば、本発明の核酸の効果を奏し得る。二本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの連結態様は、連結されるヘアピン型DNA数、及び二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類によって決定される。1ヘアピン型DNAを1つ有する場合二本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの連結には、図3で示す3つ態様がある。本発明の核酸は、いずれの連結態様であってもよい。また、この場合、二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は問わない。すなわち、RNAで構成されるsiRNAや成熟型二本鎖miRNAの塩基配列を含んでいてもよいし、DNAで構成されるデコイDNAのような標的分子の結合領域の塩基配列を含んでいてもよい。I二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の3’末端にヘアピン型DNAの5’末端が連結された核酸図3A本連結態様では、ヘアピン型DNAの3’末端と二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片の5’末端が連結されていない。この連結態様における本発明の核酸は、二本の核酸断片、すなわち、二本鎖核酸断片の一方の核酸断片とヘアピン型DNAとを連結してなる核酸断片と、二本鎖核酸断片の他方の核酸断片とから構成される。本連結態様において、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片又はアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片のいずれの3’末端にヘアピン型DNAの5’末端を連結するかは、特に制限はしない。ヘアピン型DNAをsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の3’末端に連結した図4Aで示す核酸、又はヘアピン型DNAをsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の3’末端に連結された図4Dで示す核酸のいずれであってもよい。II二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の3’末端にヘアピン型DNAの5’末端が連結された核酸図3B本連結態様では、ヘアピン型DNAの3’末端と二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片の5’末端が連結されていない。本連結態様における本発明の核酸は、前記Aの場合と同様に、二本の核酸断片、すなわち、二本鎖核酸断片の一方の核酸断片とヘアピン型DNAとを連結してなる核酸断片と、二本鎖核酸断片の他方の核酸断片とから構成される。本連結態様において、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片又はアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片のいずれの5’末端にヘアピン型DNAの3’末端を連結するかは、特に制限はしない。ヘアピン型DNAをsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の5’末端に連結した図4Bで示す核酸、又はヘアピン型DNAをsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片の5’末端に連結された図4Cで示す核酸のいずれであってもよい。III二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の5’末端にヘアピン型DNAの3’末端が連結され、他方の核酸断片の3’末端にヘアピン型DNAの5’末端一の末端が連結された核酸図3C本連結態様では、ヘアピン型DNAの5’末端及び3’末端が二本鎖核酸断片のそれぞれの核酸断片と連結されている。その結果、この連結態様における本発明の核酸は、二本鎖核酸断片の一方の核酸断片、ヘアピン型DNA、及び二本鎖核酸断片の他方の核酸断片を5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結した一本の核酸断片で構成される。本連結態様において、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、以下の2つの核酸のいずれであってもよい。isiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、ヘアピン型DNA、及びsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、を5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結した図4Eで示す核酸iisiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、ヘアピン型DNA、及びsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片、を5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結した図4Fで示す核酸2ヘアピン型DNAを2つ有する場合二本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの非連結部位の数に基づいて、以下の3つ態様に大別できる。本発明の核酸は、いずれの連結態様であってもよい。また、この場合、二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は問わない。すなわち、RNAを主な構成要素とするsiRNAや成熟型二本鎖miRNAの塩基配列を含んでいてもよいし、DNAを主な構成要素とするデコイDNAのような標的分子の結合領域の塩基配列を含んでいてもよい。I非連結部位が1つの場合本連結態様では、二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の一末端と一のヘアピン型DNAの一末端との間に非連結部位を有する。したがって、本連結態様の核酸は、二本鎖核酸断片のそれぞれの核酸断片と2つのヘアピン型DNAが連結した一本の核酸断片として構成される。本連結態様の核酸は、図5で示すように、二本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの非連結部位の位置に基づいて、さらに以下の2つの連結態様に分類できる。i核酸断片及びヘアピン型DNAが5’末端側から3’末端側に向かって以下の順番で連結された核酸図5A二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、ヘアピン型DNA、二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片及びヘアピン型DNA本連結態様では、二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の5’末端と一のヘアピン型DNAの3’末端とが連結されていない。本連結態様において、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片又はアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片のいずれが、前記一方の核酸断片に相当するかは、特に限定はしない。すなわち、図6Aで示すように、前記一方の核酸断片がsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であって、他方の核酸断片がsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であってもよいし、図6Cで示すように、前記一方の核酸断片がsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であって、他方の核酸断片がsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であってもよい。ii核酸断片及びヘアピン型DNAが5’末端側から3’末端側に向かって以下の順番で連結された核酸図5Bヘアピン型DNA、二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、ヘアピン型DNA及び二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片本連結態様では、二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の3’末端と一のヘアピン型DNAの5’末端とが連結されていない。したがって、本連結態様においても、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、前記iと同様に、siRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片又はアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片のいずれが、前記一方の核酸断片に相当するかは、特に限定はしない。すなわち、図6Dで示すように、前記一方の核酸断片がsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であって、他方の核酸断片がsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であってもよいし、図6Bで示すように、前記一方の核酸断片がsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であって、他方の核酸断片がsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であってもよい。II非連結部位が2つの場合本連結態様では、二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片の一末端と各ヘアピン型DNAの一末端との間に非連結部位を有する。本連結態様の核酸は、図7で示すように、二本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの非連結部位の位置に基づいて、さらに以下のi及びiiの連結態様に分類できる。i二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片の5’末端及び3’末端のそれぞれにヘアピン型DNAが連結された核酸図7A本連結態様の核酸は、二本鎖核酸断片の一方の核酸断片に2つのヘアピン型DNAが連結された核酸断片と二本鎖核酸断片の他方の核酸断片の二本の核酸断片から構成される。すなわち、本連結態様の核酸において、他方の核酸断片は、その両末端5’末端及び3’末端にヘアピン型DNAを連結していない。それ故、前記他方の核酸断片の両末端と2つのヘアピン型DNAのそれぞれの一方の末端との間に2つの非連結部位が存在する。本連結態様において、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、前記一方の核酸断片はsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片又はアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片のいずれであってもよい。すなわち、図8Aで示すように、前記一方の核酸断片がsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であって、他方の核酸断片がsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であってもよいし、図8Bで示すように、前記一方の核酸断片がsiRNAのアンチセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であって、他方の核酸断片がsiRNAのセンス鎖の塩基配列を含む核酸断片であってもよい。ii二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片にヘアピン型DNAが1つ連結された核酸図7B、C本連結態様の核酸は、二本鎖核酸断片の各核酸断片にヘアピン型DNAが1つ連結された二本の核酸断片から構成される。本連結態様の核酸は、図7Bに示すような二本鎖核酸断片のそれぞれの核酸断片の5’末端側にヘアピン型DNAを連結した場合と、図7Cに示すような二本鎖核酸断片のそれぞれの核酸断片の3’末端側にヘアピン型DNAを連結した場合の2つの連結態様にさらに分類できるが、いずれの連結態様であってもよい。本連結態様において、二本鎖核酸断片がsiRNAの塩基配列を含む場合、図8Cで示すようにsiRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれの塩基配列を含む核酸断片の3’末端側にヘアピン型DNAを連結する核酸であってもよいし、図8Dで示すようにsiRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれの塩基配列を含む核酸断片の5’末端側にヘアピン型DNAを連結する核酸であってもよい。III非連結部位がない場合図9本連結態様における核酸は、二本鎖核酸断片の末端と2つのヘアピン型DNAの末端とが全て連結されている。すなわち、本連結態様における核酸は、以下の核酸断片及びヘアピン型DNAが5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結され、かつ前記5’末端側と3’末端側とが互いに連結された構成を有する。二本鎖核酸断片を構成する一方の核酸断片、ヘアピン型DNA、二本鎖核酸断片を構成する他方の核酸断片及びヘアピン型DNA本連結態様では、二本鎖核酸断片領域内のニックの位置及び数によって、以下のさらなる3つの態様がある。i二本鎖核酸断片領域内にニックがない場合図9A本態様において、本発明の核酸は、閉環状であり、いわゆるダンベル型構造を呈する。本態様において、二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は問わない。特に、DNAを主な構成要素とするデコイDNAのような標的分子の結合領域の塩基配列を含む場合、この態様は好ましい。ii二本鎖核酸断片を構成するいずれか一方の核酸断片領域内に一箇所のニックを有する場合図9B本態様において、本発明の核酸は、前記2ヘアピン型DNAを2つ有する場合I非連結部位が1つの場合に記載の核酸と類似の構造を有する。ただし、前記2Iに記載の核酸とは、ニック非連結部位の位置が二本鎖核酸断片を構成する核酸断片とヘアピン型DNA間ではなく、二本核酸断片内である点において異なる。本態様では、二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は、DNAを主な構成要素とするデコイDNAのような標的分子の結合領域が挙げられる。前記ニックの位置が当該結合領域内に存在していてもよい。iii二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片領域内に一箇所計二箇所のニックを有し、両ニックが対向しない場合図9C本態様において、本発明の核酸は、前記2IIiiに記載の核酸と類似の構造を有する。前記2ヘアピン型DNAを2つ有する場合II非連結部位が2つの場合iiに記載の核酸とは、ニック非連結部位の位置が二本鎖核酸断片を構成する核酸断片とヘアピン型DNA間ではなく、二本核酸断片内である点において異なる。両ニックが対向しないとは、二本鎖核酸断片を構成するそれぞれの核酸断片領域の対応する同じ位置にニックが存在しないことをいう。したがって、本態様の核酸において、二箇所のニック間には少なくとも1の、好ましくは2以上の塩基対が存在する。本態様では、二本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は、DNAを主な構成要素とするデコイDNAのような標的分子の結合領域が挙げられる。前記ニックの位置がこの結合領域内に存在していてもよい。2-2.一本鎖核酸断片にヘアピン型DNAが連結された核酸一本鎖核酸断片にヘアピン型DNAが連結された核酸は、一本鎖核酸断片の5’末端及び3末端のいずれかに一つ、又は5’末端及び3末端の各末端にヘアピン型DNAを連結することができる。一本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの連結態様は、連結されるヘアピン型DNA数によって決定される。1ヘアピン型DNAを1つ有する場合一本鎖核酸断片とヘアピン型DNAの連結には、図10で示すような以下の3つ態様がある。本発明の核酸は、いずれの連結態様であってもよい。また、一本鎖核酸断片に含まれる機能性核酸の種類は問わない。例えば、前述の一本鎖miRNA前駆体、shRNA、核酸アプタマー、リボザイムデオキシリボザイムを含む、モレキュラービーコン又はリボスイッチU1アダプター、又は標的分子の結合領域のいずれの塩基配列も含むことができる。I一本鎖核酸断片の3’末端にヘアピン型DNAの5’末端が連結された核酸図10A本連結態様の核酸は、一本鎖核酸断片とヘアピン型DNAが連結した一本の核酸断片として構成される。本核酸は、5’末端が一本鎖核酸断片に、また3’末端がヘアピン型DNAに由来する。II一本鎖核酸断片の5’末端にヘアピン型DNAの3’末端が連結された核酸図10B本連結態様の核酸は、一本鎖核酸断片とヘアピン型DNAが連結した一本の核酸断片として構成される。本核酸は、5’末端がヘアピン型DNAに、また3’末端が一本鎖核酸断片に由来する点で前記Iとは構造的に異なる。III一本鎖核酸断片の3’末端と5’末端にヘアピン型DNAの5’末端と3’末端がそれぞれ連結された核酸図10C本連結態様の核酸は、一本鎖核酸断片とヘアピン型DNAが連結した閉環状核酸として構成される。2ヘアピン型DNAを2つ有する場合一本鎖核酸断片の5’末端及び3’末端のそれぞれに異なるヘアピン型DNAの連結された態様である図11本連結態様の核酸は、一本鎖核酸断片が2つのヘアピン型DNAに挟み込まれるように、それぞれが連結した一本の核酸断片として構成される。本連結態様の核酸において、一本鎖核酸断片領域に含まれる機能性核酸の種類は問わない。例えば、前述の一本鎖miRNA前駆体、shRNA、核酸アプタマー、リボザイムデオキシリボザイムを含む、モレキュラービーコン又はリボスイッチ及びU1アダプターのいずれの塩基配列も含むことができる。3.本発明の核酸の製造本発明の核酸において、ヘアピン型DNAは主としてDNAから、また核酸断片はDNA、RNA、ヌクレオチド類似体又はそれらの混合体からなる。したがって、本発明の核酸は、原則として、予め設計した本発明の核酸の配列に基づいて公知の固相合成法に従って化学合成することができる。核酸の化学合成法については、例えば、CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistryVolume1Section3を参照されたい。また、このような化学合成については、多くのライフサイエンス系メーカー例えば、タカラバイオ株式会社、LifeTechnologiesCorporation、SigmaAldrichCorporation等が受託製造サービスを行っており、それらを利用することもできる。化学合成後の本発明の核酸は、使用前に当該分野で公知の方法によって精製することが好ましい。精製方法としては、例えば、ゲル精製法、アフィニティーカラム精製法、HPLC法等が挙げられる。本発明の核酸が、二本の核酸断片から構成される場合、例えば、図3A~、図7A~C、及び図9Cで示す構造を有する場合、本発明の核酸は、それぞれの核酸断片を独立に化学合成し、必要に応じて精製した後、2つの核酸断片を、好ましくは等量混合して、互いにアニーリングさせることで製造することができる。本発明の核酸が、一本の核酸断片から構成される場合、例えば、図3C、図5A~C、図9B、図10A~B及び図11で示す構造を有する場合、本発明の核酸は、核酸断片を化学合成し、必要に応じて精製した後、分子内アニールが可能な条件下に置くことで製造することができる。本発明の核酸が、例えば、図9A、図10Cのような閉環状の構造を有する場合、一例として、その核酸内の適当な部位に一箇所のニックが入ったものに相当する一本の核酸断片を、前記化学合成によって調製し、必要に応じて精製した後、当該分野で公知の方法を用いて、その一本の核酸断片の両末端を連結すればよい。例えば、リガーゼ等の酵素を用いて生化学的に連結することができる。4.効果本発明の核酸は、二本鎖核酸断片又は分子内アニールにより高次構造を形成する一本鎖核酸断片の核酸分解酵素に対する分解耐性能を、それらの核酸断片単独の場合又はそれらに公知のリンカー核酸若しくはヘアピン型核酸等の分解耐性を付与する核酸を連結した場合と比較して、より向上させることができる。それにより、二本鎖核酸断片等に含まれる機能性核酸の生体内での安定性を高めることが可能となり、その機能性核酸の薬理効果を継続及び/又は強化することができる。また、本発明の核酸は、公知のダンベル型構造の核酸のように閉環状構造でなくても、すなわち、非連結部位を一箇所又は二箇所含む構造であっても核酸分解酵素に対する分解耐性能を付与できることが本発明において明らかとなった。このような非連結部位を有することは、本発明の核酸を調製する上で、従来のダンベル型核酸において行われていた核酸の環状化工程を省くことができる点、及び一本の長い直鎖状核酸として化学合成されていたそのダンベル型核酸を二本の直鎖状核酸に分断化して化学合成できる点等において、機能性核酸の調製の簡便化やその製造コストの削減上、極めて有用である。さらに、本発明の核酸の調製は、基本的に化学合成のみで、その後の処理は、精製とアニーリング処理程度であることから、目的の核酸を大量かつ安価に製造できる点でも優れている。II.医薬組成物第2の実施形態において、本発明は、医薬組成物に関する。1.医薬組成物の構成本発明の医薬組成物は、前記第1の実施形態の核酸を有効成分として含むことを特徴とする。本発明の医薬組成物における本発明の核酸の含有量は、製薬上有効な量であればよい。本明細書において製薬上有効な量とは、医薬組成物の有効成分である本発明の核酸中の機能性核酸がその機能を発揮する上で必要な用量で、かつ投与する生体に対して有害な副作用がほとんどないか又は全くない用量を言う。具体的な用量は、使用する機能性核酸の種類、標的分子、使用する剤形、被検体の情報及び投与経路によって異なる。ヒトに投与する場合、製薬上有効な量の範囲及び好適な投与経路は、通常、細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被検者に応じて医師の判断により決定され、調整される。その際に、勘案される被検者の情報には、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性及び治療に対する耐性等が含まれる。一投与単位あたりにおける本発明の核酸含有量の具体例として、他の医薬の併用を必要としないヒト成人男子体重60kgに対して、siRNAを含む本発明の核酸を注射液によって投与する場合、注射液一投与単位あたり約0.01~約20、好ましくは約01~約10で本発明の核酸を含んでいればよい。本発明の医薬組成物の薬理効果を得る上で、本発明の核酸の大量投与が必要な場合、被検体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体を含むことができる。製薬上許容可能な担体とは、製剤技術分野において通常使用する溶媒及び/又は添加剤をいう。前記溶媒には、例えば、水例えば、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液、医薬的に許容される有機溶剤例えば、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類が挙げられる。これらは、殺菌されていることが望ましい。また、生理的食塩水のように必要に応じて血液等と等張に調整されていることが好ましい。前記添加剤には、例えば、賦形剤、吸着防止剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。賦形剤としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む、金属塩例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコールPEG、プルロニック、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。吸着防止剤としては、例えば、Tween80、Tween20、ゼラチン及び/又はヒト血清アルブミン等が挙げられる。結合剤としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び/又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。充填剤としては、例えば、前記糖及び/又はリン酸カルシウム例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウムが挙げられる。乳化剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。流動添加調節剤及び滑沢剤としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。このような担体は、医薬組成物の形成を容易にし、またその剤形及び薬剤効果を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。上記の添加剤の他、必要であれば安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、可溶化剤、吸収促進剤、保湿剤、増量剤、付湿剤、防腐剤、抗酸化剤、緩衝剤等を添加することもできる。さらに、本発明の医薬組成物は、本発明の核酸が有する薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、抗生物質を所定量含有していてもよい。本発明の医薬組成物の剤形は、本発明の核酸中に含まれる機能性核酸を不活化させない形態であって、投与後、生体内でその薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、湿布剤及び座剤等の非経口剤形又は液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形が挙げられる。本発明の場合、その有効成分が核酸形態であることから剤形は、注射剤であることが好ましい。2.医薬組成物の製造本発明の医薬組成物の製造方法については、当業者に公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、RemingtonsPharmaceuticalSciencesに記載された方法を参照することができる。3.医薬組成物の投与方法医薬組成物の投与方法は、投与単位形態で投与することが好ましい。経口投与、組織内投与例えば、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、組織外投与例えば、経皮投与、点眼、経鼻投与又は経直腸的投与で投与することができる。本発明の医薬組成物の投与に際しては、その投与方法に適する形態であることが好ましい。例えば、組織内投与の場合、血流を介した注射が好ましく、それ故、剤形は液体注射液となる。注射による投与の場合、注入部位は、標的分子に対して本発明の核酸がその機能を発揮し、医薬組成物を投与する目的を達し得れば、特に限定しない。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は動脈内注射等の血管内への注射である。血流を介して本発明の医薬組成物を直ちに全身に行き渡らせることが可能であり、侵襲性が比較的低いからである。あるいは、本発明の医薬組成物の薬理効果を必要とする部位に直接注射してもよい。これは、対象部位に直接的に多量に作用させることができるからである。III.核酸断片の分解耐性能向上方法第3の実施形態において、本発明は、二本鎖核酸断片又は分子内アニールにより高次構造を形成する一本鎖核酸断片の核酸分解酵素に対する分解耐性能を向上させる方法、及びそれによって生体内で安定性を保持し得る核酸を調製する方法に関する。1.核酸分解酵素耐性の向上方法本発明の方法は、前述のように、核酸断片の末端に前記実施例1に記載のヘアピン型DNAを連結することにより、その核酸断片の核酸分解酵素に対する分解耐性能が核酸断片単独の場合や他の公知のリンカー核酸を核酸断片に連結した場合と比較して向上するという知見に基づく。したがって、本発明の方法は、二本鎖核酸断片又は分子内アニールにより高次構造を形成する一本鎖核酸断片の少なくとも一の末端に前記実施形態1に記載のヘアピン型DNAを連結すればよい。2.核酸分解酵素耐性を向上させた核酸の調製方法核酸断片の末端への実施形態1に記載のヘアピン型DNAの連結させた本発明の核酸の調製は、前述のI3本発明の核酸の製造で述べたように化学合成によって行なわれる。したがって、本発明の方法では、核酸分解酵素に対する分解耐性能の向上を目的とする所望の核酸断片の所定の位置にヘアピン型DNAが連結した本発明の核酸を予め設計しておき、その設計に基づいて、化学合成を行なう結果、所定の位置にヘアピン型DNAが連結されることとなる。本発明の核酸の設計については、前記実施例1で列挙したいずれかの適当な連結態様に基づいて行なえばよい。3.効果本発明の向上方法によれば、従来生体内で核酸分解酵素による分解を受け易く、不安定であった核酸断片に、核酸分解酵素に対する分解耐性能を付与する。それによって、核酸断片単独又は分解耐性能を付与することが知られている他の公知のリンカー核酸又はヘアピン核酸よりも所定の核酸断片を安定化することができる。したがって、核酸断片が機能性核酸を含む場合、その効果をより長時間維持及び/又は強化することが可能となる。その結果、その機能性核酸の効果を増強することも可能となる。<実施例1>siRNAの塩基配列を含む核酸の調製本実施例では、実施例1~5に使用するためのsiRNAの塩基配列を含む二本鎖核酸断片の少なくとも一の末端にヘアピン型DNAを連結した本発明の核酸を調製した。実験に用いたsiRNAの標的は、ホタルルシフェラーゼmRNAとし、様々な核酸断片を設計した。各種核酸の構造とその塩基配列を図12及び13に示す。塩基配列中、大文字アルファベット領域はRNAで、また小文字アルファベット領域はDNAで構成されることを表わす。図12において、ContI~IIIは、ホタルルシフェラーゼmRNAのsiRNAを含む二本鎖核酸断片のみからなるコントロール用核酸である。ContIとContIIは、2塩基のオーバーハングをセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれの3’末端側に含み、従来型のsiRNAの構造を有する。また、ContIIIは、siRNAを含む25merの平滑末端二本鎖核酸断片のみからなるコントロール用核酸である。また、図12のa~d以下、それぞれ核酸a~核酸dとするは、本発明に記載のヘアピン型DNAを2個、前記ContIIIの核酸を構成する各核酸断片の3’末端側に連結させた本発明の核酸を示す。核酸a~核酸dは、ヘアピン型DNAの配列がそれぞれ異なる。核酸eは、核酸bのヘアピン型DNA領域をRNAに置き換えた核酸であり、ヘアピン型DNAのコントロールとして調製した。核酸f及び核酸gは、本発明に記載のヘアピン型DNAを前記ContIIIの一方の末端のみの連結させた本発明の核酸を示す。さらに、図13において、h~l以下、それぞれ核酸h~核酸lとするは、いずれも核酸bの構造を基本として、ヘアピン型DNAは変えずに二本鎖核酸断片領域に含まれるsiRNAの末端塩基数のみを変えたものである。設計した各種核酸の核酸断片を公知の固相合成法に従い北海道システムサイエンス社北海道、日本に委託して合成した。。続いて、合成した核酸断片をゲル精製し、塩基対合するそれぞれの核酸断片が同一濃度となるようにリン酸緩衝液pH74にて混合し、90°Cで加熱後25°Cまで徐冷してアニーリングさせて、本発明の核酸を調製した。<実施例2>invitroでの本発明の核酸によるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制本実施例では、実施例1で調製したsiRNAを含む種々の核酸ContI~III、核酸a~gによるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果を検証した。抑制効果の測定は、実施例1の各種核酸を、標的分子であるホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドと共にリポフェクション法によりHeLa細胞に導入し、ルシフェラーゼの発光強度を測定することで前記各種核酸の発現抑制効果を検証した。1細胞培養HeLa細胞の培養は、二酸化炭素濃度5、培養温度37°Cの条件下で、10仔ウシ血清FBS、JRHBIOSCIENCES社を含むMEM培地MinimumEssentialMediumEagle、シグマ社に抗生物質ペニシリン最終濃度100UmL、ストレプトマイシン100μgmLを添加したものを用いた。2実施例1で調製した各種核酸とプラスミドの培養細胞への導入96穴プレートの1穴あたりに15×104個100μLのHeLa細胞をに播種し、抗生物質を含まない10仔ウシ血清含有MEM培地で24時間培養した。トランスフェクションは、リポフェクタミン2000インビトロジェン社を1穴あたり05μL用いて、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドpGL3control、プロメガ社を1穴あたり200ng、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドpGL474hRlucTK、プロメガ社を1穴あたり200ng、及び前記実施例1で調製した各種核酸を最終濃度が01nMとなるようにOPTIMEM培地インビトロジェン社中で混合した溶液50μLを添加することで行った。3遺伝子の発現抑制効果の解析トランスフェクション後22時間培養し、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムプロメガ社を用いて、ホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼの発光をそれぞれ定量し、siRNAの標的となるホタルルシフェラーゼのタンパク質発現の抑制効果を調べた。具体的には、トランスフェクション後の細胞を1穴あたり100μLのPBSで2回洗浄したのち、20μLの細胞溶解用緩衝液を加えて、25°Cで30分間静かに攪拌しながら細胞を溶解した。この溶液に、LARII試薬を100μL加えて混合し、LAS4000富士フィルム社を用いてホタルルシフェラーゼの発光を検出露光時間:120秒した。続いて、StopGlo試薬を100μL加えて、ウミシイタケルシフェラーゼの発光を検出露光時間:200秒し、それぞれの発光の強さをScienceLab2005MultiGauge富士フィルム社を用いて数値化した。各発光検出において、バックグラウンドとしてトランスフェクションを行わなかった場合の発光量をそれぞれのルシフェラーゼの発光量から差し引いた後、標的分子であるホタルルシフェラーゼの発光量を共発現させたコントロールであるウミシイタケルシフェラーゼの発光量で除することによって規格化した。そして、siRNAを含む核酸の非存在下における値を100として、種々のsiRNA存在下での標的分子とするルシフェラーゼの相対活性を算出した。また、異なる種々の濃度のsiRNA存在下でも標的分子とするルシフェラーゼの相対活性を算出し、濃度に対して相対活性をプロットしたグラフからIC50値を求めた。具体的には、カレイダグラフAlbeckSoftwareを用いて、計算式YM4M3M4110LOGM0LOGM1M2初期値:M1M2M31、M4100に当てはめて、最小二乗法によるデータフィッティングにより算出した。YはsiRNA存在下での標的分子とするルシフェラーゼの相対活性、M0nMはsiRNA濃度、IC50値はM1nMに相当する。4結果相対発現量を図14に、IC50値を表1にそれぞれ示す。従来型のsiRNAであるContI~IIIと比較して、ヘアピン型DNAをsiRNAに結合することにより、siRNA活性が向上することが判明した。コントロールとなるsiRNAのIC50値が、0057±0007nMContI、0081±0011nMContII、0062±0007nMContIIIであるのに対して、ヘアピン型DNAを含むsiRNAのIC50値は0035±0006nM核酸a、0029±0004nM核酸b、0047±0006nM核酸c、0024±0003nM核酸dとそれぞれ活性が向上することが分かった。また、核酸の一方の末端にのみヘアピン型DNAを結合すると、0037±0003nM核酸f、0069±0010nM核酸gであり、特にセンス側にヘアピン型DNAを結合すると効果があった。さらに、ヘアピン型DNAを相同配列のRNAに置換した核酸eでは、IC50値が0210±0030nMとその活性が著しく低下し、DNA型のヘアピン構造に効果があることも明らかになった。ヘアピン型DNAのステム領域が3塩基対からなる核酸bと核酸dは、特にRNA干渉効果が高いことがわかった。<実施例3>本発明の核酸の二本鎖核酸断片領域におけるsiRNAの長さの検証本発明の核酸の二本鎖核酸断片領域中に含まれるsiRNAの塩基長を短縮する実験を行った。25塩基対の核酸bを基準にして、それぞれ23核酸h、l、21核酸i、k及び19ヌクレオチド核酸jに短縮した。それぞれの核酸の発現抑制効果の測定は、実施例2に準じて行なった。結果を図15に示す。本発明の核酸における二本鎖核酸断片領域がsiRNAの塩基配列を含む場合、その塩基長は19ヌクレオチド程度に短くしても、高い活性を保持していることが明らかになった。<実施例4>本発明の核酸によるインターフェロン誘導の有無哺乳動物細胞等では、長鎖二本鎖RNAによってインターフェロン応答が誘導され、非特異的な転写の抑制が起こることが知られているNatureCellBiol5834839NatureGenet34263264。siRNAは、短い二本鎖RNAを使用することによりインターフェロン応答を回避し、特異的な遺伝子発現抑制を可能にしているが、本発明の核酸の導入による前記実施例2、3の遺伝子抑制効果がインターフェロン応答によるものでないことを確認するため、本発明の核酸の導入によって、インターフェロン応答が起きているか否かを、リアルタイムRTPCRにより検出することで検証した。インターフェロン応答の有無は、インターフェロン応答により発現が誘導されるhumanoas1遺伝子とhumanstat1遺伝子の発現をRTPCRにより検出することで確認した。また、インターフェロン応答を誘導するポジティブコントロールには、polyI:Cを用いた。ネガティブコントロールには、scrambledsiRNATaKaRaを用いた。1各種siRNAとプラスミドの培養細胞への導入24穴プレートに1穴あたり9×104個700μLのHeLa細胞を播種し、抗生物質を含まない10仔ウシ血清含有MEM培地で24時間培養した。トランスフェクションは、リポフェクタミン20001穴あたり35μLを用いて、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドとウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド1穴あたり各1400ng、PBS中でアニーリング処理した各種核酸最終濃度25nM:ヌクレオチド換算で、scrambledsiRNAは105nMに相当、ContIIIは125nMに相当、核酸b及び核酸dは170nMに相当、及びpolyI:CTaKaRa、最終濃度0019ngμL、ヌクレオチド換算で58nMをOPTIMEM培地中で混合した溶液350μLを添加して行った。また、ヌクレオチド換算で濃度を合わせた場合170nM相当も同様にして、インターフェロンの誘導を調べた。2RNA抽出とリアルタイムRTPCRによるoas1及びstat1遺伝子発現解析トランスフェクション後、22時間培養した細胞を、セパゾールRNAIsuperG1穴あたり400μL、ナカライテスク社を用いてプレートから回収し、総RNAを抽出した。さらに、DNaseIで処理してDNAを除去した後、フェノールクロロホルム抽出でRNA回収し、UV吸収からRNA量を求めた。得られたRNAを鋳型としてOneStepSYBRPrimeSciptRTPCRキットPerfectRealtime、TaKaRa社を用いて、リアルタイムRTPCRABI7000を行い、oas1とstat1の発現を定量した。プライマーは、IFNResponseWatcherTaKaRa社に添付のoas1、stat1及びβ-actinプライマーセットを用いた。3結果oas1及びstat1遺伝子のmRNA量を、βactinのmRNA量で補正した値をグラフ化して図16に示した。PolyI:Cの導入では、インターフェロン応答が誘導され、oas1とstat1の発現が上昇しているが、ContIII、核酸b及びdでは、oas1及びstat1遺伝子の有意な発現上昇は認められず、mRNA量がほぼ同等であったことから、siRNAの塩基配列を含む二本鎖核酸断片にヘアピン型DNAを付加してもインターフェロン応答は誘導されないことが確認された。<実施例5>核酸分解酵素に対する分解耐性の検証ヘアピン型DNAを構成要素とする本発明の核酸が核酸分解酵素による分解に対しても耐性が高いことを検証するため、siRNAを含む本発明の核酸のヘビ毒ホスホジエステラーゼ中での安定性を調べた。1SVPD存在下でのsiRNAの安定性解析本発明の核酸b最終濃度2μMと核酸bからへアピン型DNAを除いた構造に相当するContIII最終濃度2μMをSVPD最終濃度が00016UμLと混合し、この溶液を37°Cでインキュベートした。溶液の組成は、20mMTrisHClpH78、15mMMgCl2である。10、20、30、40分後にそれぞれ混合溶液から6μLを分取し、106μLの500mMEDTApH80溶液と4μLの40Glycerolを混合して、分解反応を停止させた。反応後のサンプルを非変性15ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、ゲルをSYBRGREENIで染めることで二本鎖RNAを検出した。SVPDによる分解産物のバンドパターンをバイオイメージャーFLA7000富士フィルムで解析した。2結果結果を図17に示す。ヘアピン型DNAのない二本鎖核酸断片二本鎖RNAのみのContIIIでは、SVPD処理10分後には、全長に相当するバンドは確認できず、40分後には完全にバンドが消失し、二本鎖RNAは分解されてしまった。一方、核酸bでは、SVPD処理40分後でも、まだ全量の約20程度が二本鎖RNAの状態で保持されていることがバンドパターンから確認できた。この結果から、siRNAを含む二本鎖核酸断片にヘアピン型DNAを連結した本発明の核酸では、ヘアピン型DNAにより二本鎖核酸断片に核酸分解酵素に対する分解耐性能が付与され、安定化することが立証された。<実施例6>デコイDNAの塩基配列を二本鎖核酸断片領域に含む本発明の核酸の設計と調製図18に、実施例7~9に用いた各種核酸の二次構造とその配列を示す。Cont1は、NFκBへ結合するコンセンサス配列を含む二本鎖核酸断片のみからなる核酸で、Cont2は、NFκBへ結合するコンセンサス配列を含む二本鎖核酸断片の両末端をリンカーDNAで連結した従来型のダンベル型デコイDNAであって、いずれも本発明の核酸に対するコントロールとして用いた。A~E以下、核酸A~核酸Eとするは、本発明の核酸であって、NF-κBを標的分子とするデコイDNAの塩基配列を二本鎖核酸断片領域に含み、その末端を2つのヘアピン型DNAを連結した構造を有する。核酸Aは、閉環状ダンベル型の核酸、核酸Bは、核酸Aに一箇所ニックが入った一本鎖核酸、核酸C及びDは二本鎖核酸断片領域を短縮化し、またニックの位置を変えた核酸である。Cont1、及び核酸B~Dは、それぞれ図中に記載の配列番号で示される塩基配列を有する核酸を化学合成によって調製し、その後、12変性アクリルアミドゲルにて精製した。核酸Aは、核酸Bを96°Cから16°Cへと温度を下げながら分子内でアニーリングさせた後、T4DNAリガーゼを添加して、16°Cで一晩インキュベートし、環状型ODN分子を調製した。核酸Eは、それぞれの核酸断片配列番号X、Xを化学合成して精製した後、等量を混合して96°Cから16°Cへと温度を下げながらアニーリングさせて調製した。Cont2も、48merからなるDNA断片配列番号40を用いて、核酸Aと同様にして調製した。<実施例7>デコイDNAの標的分子への結合活性実施例6で調製した各種核酸のNFκBp50への結合を調べるために、従来型デコイDNAであるCont1用いた競合実験を行った。具体的には、[γ32P]ATPにより標識したCont1と種々の濃度の非標識核酸Cont1、Cont2、核酸A~Eの存在下でNFkBp50を添加して、インキュベートした。20μLの反応液10mMトリス-塩酸緩衝液pH76、100mMNaCl、25mMDTT、01mMEDTA、005NP-40及び10グリセロール中に、標識化Cont1、各々の濃度の競合ODN5~500nM、非特異的配列を持つ二本鎖核酸断片配列番号41、42;最終濃度5μM及びNFκBp5002gsu、プロメガ社が含まれるように調製し、25°Cで30分間インキュベートした。その後、10非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてNFkBp50に結合した標識化Cont1と遊離状態の標識化Cont1とを分離し、ゲルを乾燥させ、バイオイメージアナライザーによって可視化して、放射活性を測定した。また、競合効率は、ソフトウエアのカレイダグラフAlbelbeckSoftwareを用いて、計算式y=M0×M1/M0M2に当てはめ、最小二乗法によるデータフィッティングを行い、IC50値として求めた。yは、タンパク質との結合効率M0は競合物質の非標識ODNの濃度であり、IC50値は、M1とし、M2は競合物質非存在下でのタンパク質との結合効率として算出した。ゲル電気泳動の結果のいくつかを図19Aに、また競合効率の結果を図19Bに示す。各種核酸とも、ほとんど同様の結合活性を有しており、ヘアピン型DNAを二本鎖核酸断片に3 ́末端に導入しても、結合活性には影響がないことが明らかとなった。<実施例8>核酸分解酵素に対する分解耐性の検証前期実施例5と同様に、デコイDNAを含む本発明の核酸が核酸分解酵素による分解に対しても耐性が高いことを検証するため、[γ-32P]ATPにより標識化した実施例6の各種核酸をエキソヌクアーゼIII、S1ヌクレアーゼ及びヒト血清と共にそれぞれインキュベートした。エキソヌクレアーゼIIIはDNAの3 ́末端から消化する核酸分解酵素である。エキソヌクレアーゼは、生体や細胞への投与等の核酸の生物学的応用において問題となるDNA分解の主な原因の一つとなっている。また、S1ヌクレアーゼは、一本鎖核酸領域を認識し、分解するエンドヌクレアーゼである。反応に用いた核酸は、それぞれ35pmolである。10μLの反応液中に2単位のエキソヌクアーゼIII又は1単位のS1ヌクレアーゼを添加し、37°Cで10分間又は30分間インキュベートした。ヒト血清は、DNase活性を保持するために熱処理をせずに使用した。10μLの反応液中にヒト血清を50になるまで添加し、37°Cで2時間120分間又は6時間360分間インキュベーションした。その後、10M尿素、40mMEDTAを含む反応停止緩衝液を等容量添加し、15変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離したのち、バイオイメージアナライザーFLA-7000富士フィルム社によって可視化した。その結果を図20に示す。核酸Aが核酸分解酵素に対して非常に安定であり、30分間インキュベートした後でも、ほとんど分解されなかったレーン17、19。一方、公知のリンカーDNAによるループ構造を有するCont2は、エキソヌクレアーゼIIIに対しては安定であったがレーン10、S1ヌクレアーゼに対しては顕著に分解されることがわかったレーン11、12。電気泳動図で、未処理デコイDNAよりも移動度が小さい位置に分解産物がみられるのは、S1ヌクレアーゼによって環状型DNAにニックが入った結果、一本鎖となるためであり、その後、顕著に分解が進行することがわかる。分解産物のパターンからヒト血清には一本鎖特異的なエンドヌクレアーゼが含まれていることが判明したレーン13、14、20、21、この場合でもヘアピン型DNAをもつ環状型DNAのほうが、ループ構造をもつ環状型DNAよりも耐性があることがわかった。またヘアピン型DNAを3 ́末端に付加するとエキソヌクレアーゼに対する安定性が顕著に上昇することもわかった。さらに、S1ヌクレアーゼ又はヒト血清処理において経時変化を解析した結果を図21A及びBにそれぞれに示す。図21は、各処理による経時変化のゲル電気泳動結果を定量化し、グラフ化したものである。Cont2と比較して、本発明の核酸A、核酸B及び核酸Eは、エンドヌクレアーゼに対する分解耐性能が向上していることが明確にわかる。S1ヌクレアーゼで1時間インキュベート後、Cont2は、閉環状であってもそのほとんど分解されてしまっているのに対して、本発明の核酸A及びBは80以上が分解されずに残っていた。特に、核酸Bは、ニックが一箇所存在する開裂状一本鎖核酸であるにもかかわらず、閉環状DNAのCont2よりも安定であった。加えて、ヒト血清中においても本発明の核酸A及びBは、Cont2よりもS1ヌクレアーゼに対して安定であることが判明した。なお、ヒト血清中で24時間処理した後でも核酸Aは、ニックが入った状態で保持されていることも確認できた。<実施例9>ヘアピン型DNAの結合位置とホタルルシフェラーゼ遺伝子のsiRNAによる発現抑制効果の関連性の検証図12に記載した従来型siRNAであるContIIIの末端にヘアピン型DNAを連結した核酸を調製し、その結合位置の違いと該核酸による標的遺伝子の発現抑制効果について検証した。本実施例で用いた核酸の構造模式図を図22に示す。核酸mは、ContIIIのセンス鎖及びアンチセンス鎖の5′末端にヘアピン型DNAを連結した核酸であり、核酸nは、ContIIIのセンス鎖の5′末端及び3′末端にヘアピン型DNAを連結した核酸であり、そして核酸oは、ContIIIのアンチセンス鎖の5′末端及び3′末端にヘアピン型DNAを連結した核酸である。図22では、いずれの核酸も、siRNAのアンチセンス鎖側を下線で示している。各種核酸の合成及び調製は、実施例1に準じて行った。各二本鎖核酸断片は、最終濃度が01nMとなるように調製した。また、対照用siRNAとして、ContIIIミニヘアピンを含まないsiRNAのみの核酸及び図12に記載の核酸bContIIIのセンス鎖及びアンチセンス鎖の3′末端にヘアピン型DNAを連結した核酸を用いた。各種核酸によるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果の測定は、実施例2に記載の方法に準じて行った。結果を図23に示す。核酸m、及び核酸oは、抑制効果が減少したのに対し、核酸nは、核酸bと同様の抑制効果を有することが示された。この結果から、siRNAのアンチセンス鎖の5′末端にヘアピン型DNAを連結した場合、標的遺伝子の発現抑制効果が弱くなることが明らかとなった。したがって、核酸nのように、センス鎖の5′末端と3′末端の両側にヘアピン型DNAを連結したsiRNAをデザインすることで、従来型siRNA中の片方の鎖のみを選択的にアンチセンス鎖として機能させる効果をさらに付与し得ることが示唆された。<実施例10>ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果の持続性についての検証本実施例では、本発明の核酸による発現抑制効果の持続性を検証した。具体的には、実施例1に記載の方法に準じて、図12に示すContIII及び核酸bを最終濃度01nMとなるように調製し、実施例2に記載の方法に準じて、標的分子であるホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドと共にHeLa細胞にリポフェクション法によって導入した。トランスフェクションから6時間後に培地を交換し、導入されなかったsiRNAを洗浄した。発現抑制効果の持続性は、トランスフェクションから1日後、2日後、3日後、4日後、5日後にルシフェラーゼの発光強度を測定して相対発現量を算出することによって検証した。なお、トランスフェクション3日後に、細胞維持のために再度、培地交換を行った。結果を図24に示す。ContIIIは、トランスフェクション後、時間経過に伴い、ルシフェラーゼの相対発現量が増加した。これは、発現抑制効果の持続性が低いことを示している。一方、核酸bでは、トランスフェクションから5日後であっても相対発現量に大きな変化がなく、発現抑制効果の持続性が高いことが明らかとなった。この結果から、本発明の核酸は、ヘアピン型DNAのない二本鎖核酸断片よりも、標的とするルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果が長期間持続することが立証された。<実施例11>本発明の核酸による内在性遺伝子に対するRNAi効果の検証1本実施例では、HeLa細胞の内在性遺伝子であるsurvivin遺伝子のmRNAに対するRNAi効果を検証した。1各種核酸の調製本実施例で用いた核酸の構造模式図を図25に示す。ContIV及び核酸pを構成する核酸断片の合成は、北海道システムサイエンス社北海道、日本に委託した。二本鎖核酸断片の調製は、脱塩処理後の合成核酸断片をゲル精製し、塩基対合する核酸断片を同一濃度となるようにリン酸緩衝液pH74中にて混合し、90°Cで加熱後25°Cまで徐冷してアニーリングさせて調製した。また、ContVを構成する核酸断片の合成は、ジーンデザイン社大阪、日本に委託した。二本鎖核酸断片の調製は、逆相カートリッジによる簡易カラムによる精製グレードを二本鎖断片の形で入手し、リン酸緩衝液pH74中にて同様にアニーリングさせて調製した。2各種核酸の培養細胞への導入6穴プレートに、1穴あたり3×105個のHeLa細胞を播種し、抗生物質を含まない10仔ウシ血清含有MEM培地2mLで24時間培養した。トランスフェクションは、リポフェクタミン20001穴あたり5μLを用いて、PBS中でアニーリング処理した各種核酸が最終濃度で002~2nMとなるように、OPTIMEM培地インビトロジェン社で調整した溶液を1穴あたり400μLで添加した。トランスフェクションの6時間後に抗生物質を含まない10仔ウシ血清含有MEM培地2mLに交換し、導入されなかったsiRNAを洗浄した。3mRNA発現量の解析細胞内に残存するsurvivinmRNAを定量するために、前記トランスフェクション処理した各細胞よりmRNAを回収し、リアルタイムRTPCRによってsurvivinmRNA発現量を測定した。具体的には、まず、トランスフェクション後24時間培養した細胞を、細胞溶解バッファー100mMTrisHClpH75、500mMLiCl、10mMEDTA、1LiDS、5mMDTTで処理し、その後、インビトロジェン社のDynabeadsOligo25を用いて、添付の説明書に従い、細胞溶解物からmRNAを抽出した。得られたmRNA200ngを、オリゴdTプライマー15merを用いて、プロメガ社のMMLVReverseTranscriptaseRNaseHにより逆転写することでcDNAを調製し、これを鋳型としてリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRには、KAPASYBRFASTqPCRkitを試薬として用い、リアルタイムPCR装置には、ストラタジーン社のMx3005Pを使用した。ヒトsurvivinmRNAの検出に用いたプライマーの塩基配列を、配列番号61forwardプライマー及び配列番号62reverseプライマーに示す。なお、mRNA量補正用のコントロールには、ヒトβactinのmRNAを用いた。検出に用いたプライマーの塩基配列は、forwardプライマーが配列番号63で、またreverseプライマーが配列番号64である。PCR条件は、95°Cにて30秒間変性後、95°C5秒→60°C40秒のサイクルを40サイクルで行った。補正用βactinmRNAの発現量によりsurvivinmRNA発現量を規格化した後、核酸非存在下PBSのみでトランスフェクションした場合の値を100として、survivinmRNAの相対発現量を算出した。また、異なる種々の濃度のsiRNA存在下でのsurvivinmRNAの相対発現量を算出し、濃度に対して相対発現量をプロットしたグラフからIC50値を求めた。具体的には、カレイダグラフを用いて、計算式YM1100初期値:M1001に当てはめて、最小二乗法によるデータフィッティングにより算出した。YはsiRNA存在下でのsurvivinmRNAの相対発現量に、M0はsiRNA濃度に、そしてIC50値はM1に相当する。4結果表2に得られたIC50値を示す。上記結果から、内在性遺伝子であるsurvivinを標的とした場合でも、従来型のsiRNAであるContIV又はContVと比較して、核酸pは、高いsiRNA活性を有することが立証された。<実施例12>血清中での各種核酸の分解耐性の検証実施例11に用いた各種核酸に関して、ヌクレアーゼを含む血清存在下での安定性を検証した。基本的な方法は、上記実施例5に記載の方法に準じた。具体的には、最終濃度125μMに調整した各種siRNAをマウスの血清最終濃度20と混合した。この混合溶液を37°Cでインキュベートし、1時間後、8時間後、及び24時間後に、それぞれから6μLの混合溶液を分取し、10μLのストップ溶液100mMEDTA、8MUreaと混合した。続いて、75°Cで3分熱処理した後に、その10μLを15ポリアクリルアミドゲル7M尿素により電気泳動で分離し、SYBRGreenII染色によってバンドパターンを検出した。結果を図26に示す。ヘアピン型DNAを有さないContIVやContVでは、時間経過と共にヌクレアーゼによる分解でバンドサイズが小さくなり、8時間後以降には全長に相当するバンドが全く確認できなくなった。一方、核酸pでは、24時間後でも全長のバンドが明確に確認でき、かつその量も大きな減少は見られなかった。この結果から、本発明の核酸は、血清中でも安定化されていることが示された。<実施例13>本発明の核酸による内在性遺伝子に対するRNAi効果の持続性の検証実施例11に用いた各種二本鎖核酸断片ContIV、ContV、核酸pにおけるsurvivin遺伝子のmRNAに対するRNAi効果の持続性について検証した。各核酸は、最終濃度が01nMとなるように調整し、リポフェクション法を用いてHeLa細胞内に導入した。トランスフェクションの6時間後に培地を交換した後、トランスフェクションから1日後、2日後、3日後におけるsurvivinmRNA発現量を測定した。具体的な方法は、実施例11に記載の方法に準じた。結果を図27に示す。核酸pは、ヘアピン型DNAを有さないContIVやContVと比較すると、3日後でもsurvivinmRNA発現量の高い抑制効果が観察された。この結果から、本発明の核酸は、ContIVやContVよりもRNAi効果の持続性が高いことが明らかとなった。<実施例14>本発明の核酸による内在性遺伝子に対するRNAi効果の検証2本実施例では、HeLa細胞におけるsurvivin遺伝子以外の内在性遺伝子として、LaminAC遺伝子のmRNAに対するRNAi効果を検証した。1各種核酸の調製本実施例で用いた核酸の構造模式図を図28に示す。核酸qは、従来型のsiRNAであるContVIにおける3’末端側のtのオーバーハング2塩基をヘアピン型DNAに置換した塩基配列を有し、核酸rは、従来型のsiRNAであるContVIIの3’末端側にヘアピン型DNAに付加した塩基配列を有する。各種核酸を構成する核酸断片の合成は、ジーンデザイン社大阪、日本に委託した。HPLC精製後の合成核酸断片を、塩基対合する核酸断片を同一濃度となるようにリン酸緩衝液pH74中にて混合し、90°Cで加熱後25°Cまで徐冷してアニーリングさせて調製した。2各種二本鎖核酸の培養細胞への導入基本的な方法は、上述の実施例11に記載の方法に準じた。各種核酸は、最終濃度01nMでリポフェクション法によりHeLa細胞に導入した。3mRNA発現量の解析細胞内に残存するLaminACmRNAを定量するために、前記トランスフェクション処理した細胞よりmRNAを回収し、リアルタイムRTPCRによってLaminACmRNA発現量を測定した。具体的な方法は、実施例11に記載の方法に準じた。ヒトLaminACmRNAの検出に用いたプライマーの塩基配列は、forwardプライマーが配列番号65で、またreverseプライマーが配列番号66で、示される。なお、mRNA量補正用コントロールには、ヒトGAPDHのmRNAを用いた。検出に用いたforwardプライマーは、配列番号67で、またreverseプライマーは、配列番号68で、示される。結果を図29に示す。LaminACを標的とした場合であっても、従来型のsiRNAであるContVI又はContVIIと比較すると、それぞれ本発明の核酸q又は核酸rの方が高いsiRNA活性を有していた。本実施例と上述の実施例11の結果から、本発明の核酸は、標的とする遺伝子の種類に拠ることなく、様々な内在性遺伝子の発現を抑制できることが明らかとなった。なお、本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。"