"肝臓への分化を誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法:i人工多能性幹iPS細胞の集団を提供するステップ;ii前記集団を内胚葉誘導培地中で培養し、前方胚体anteriordefinitive内胚葉ADE細胞の集団を生成するステップここで、前記内胚葉誘導培地は、以下の性質を持つ所定の化学培地である:線維芽細胞成長因子活性を有し、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路、並びにSMAD1、SMAD5及びSMAD9を介したシグナリング経路を刺激し、並びにホスファチジルイノシトール3-キナーゼPI3K及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βを阻害する;並びにiiiADE細胞の前記集団を肝臓性誘導培地中で培養し、肝臓性前駆細胞の集団を生成するステップここで、前記肝臓性誘導培地は、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する所定の化学培地である。請求項1に記載の方法であって、前記内胚葉誘導培地が線維芽細胞成長因子を含む該方法。請求項1又は請求項2に記載の方法であって、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する第一のTGFβリガンドを前記内胚葉誘導培地が含む該方法。請求項3に記載の方法であって、前記第一のTGFβリガンドがアクチビンである該方法。請求項1~4の何れか1項に記載の方法であって、SMAD1、SMAD5及びSMAD9を介したシグナリング経路を刺激する第二のTGFβリガンドを前記内胚葉誘導培地が含む該方法。請求項5に記載の方法であって、前記第二のTGFβリガンドが骨形成蛋白質である該方法。請求項1~6の何れか1項に記載の方法であって、前記内胚葉誘導培地が、PI3K阻害剤及びGSK3β阻害剤を含む該方法。請求項7に記載の方法であって、前記PI3K阻害剤がLY294002である該方法。請求項7又は請求項8に記載の方法であって、前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である該方法。請求項1~9の何れか1項に記載の方法であって、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する第一のTGFβリガンドを前記肝臓性誘導培地が含む該方法。請求項10に記載の方法であって、前記第一のTGFβリガンドがアクチビンである該方法。請求項1~11の何れか1項に記載の方法であって、前記ステップiiが、以下をサブステップ含む該方法:aiPSCの前記集団を前記内胚葉誘導培地中で培養すること;bGSK3β阻害剤が欠如した前記内胚葉誘導培地中で前記集団を更に培養すること;並びにc前方胚体内胚葉ADE誘導培地中で前記集団を更に培養して、ADE細胞の前記集団を生成することここで、該培地はSMAD2及びSMAD3シグナリング経路を刺激し、並びに線維芽細胞成長因子活性を有する。請求項12に記載の方法であって、前記ADE誘導培地が線維芽細胞成長因子を含む該方法。請求項12又は請求項13に記載の方法であって、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する第一のTGFβリガンドを前記AE誘導培地が含む該方法。請求項14に記載の方法であって、前記第一のTGFβリガンドがアクチビンである該方法。請求項12~15の何れか1項に記載の方法であって、前記集団を、前記サブステップa~cのそれぞれにおいて24時間培養する該方法。請求項1~16の何れか1項に記載の方法であって、更に以下のステップを含む方法:iv前記肝臓性前駆細胞の集団を肝臓性成熟培地中で培養し、肝細胞の集団を生成するステップ。請求項17に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞の集団を10~20日間培養し、前記肝細胞の集団を生成するステップ。請求項17又は請求項18に記載の方法であって、前記肝細胞の集団によるアルブミンの産生及び/又はα1アンチトリプシンの産生を測定するステップを含む該方法。請求項17~19の何れか1項に記載の方法であって、少なくとも80の前記肝細胞の集団がアルブミン及び/又はα1アンチトリプシンを発現する該方法。請求項17~20の何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞の集団又は肝細胞を増殖させるステップを含む該方法。請求項17~21の何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を培養又は維持するステップを含む該方法。請求項17~22の何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を保存するステップを含む該方法。請求項1~23何れか1項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を、医薬的に許容可能な賦形剤と混合するステップを含む該方法。請求項1~24何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞がヒトiPS細胞である該方法。請求項1~25何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が継代された回数が30回以下である該方法。請求項1~26何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が1の個体から得た線維芽細胞に由来する該方法。請求項1~27何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞は、損傷した又は機能不全の肝臓組織を有する1の個体から得た細胞に由来し、そして、前記集団中の前記肝細胞が正常な表現型を示す該方法。請求項28に記載の方法であって、肝臓病に関連した遺伝的変異又は遺伝的欠陥が、前記iPS細胞において修復され、その結果、前記肝細胞が正常な表現型を示す該方法。請求項29に記載の方法であって、前記肝臓病が遺伝的代謝異常IMDである該方法。請求項30に記載の方法であって、前記IMDが以下の群から選ばれる該方法:α1アンチトリプシン欠損、糖原病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラーナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、第IX因子欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin-Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。請求項29に記載の方法であって、前記遺伝的変異又は遺伝的欠陥が、A1ATにおけるGlu342Lys変異であり、前記肝臓病がα1アンチトリプシン欠損である該方法。請求項1~27の何れか1項に記載の方法であって、前記iPS細胞が、肝臓病を有する個体から得た細胞に由来し、前記集団中の前記肝細胞が病気の表現型を示す該方法。請求項33に記載の方法であって、前記肝臓病が遺伝的代謝異常である該方法。請求項34に記載の方法であって、前記IMDが以下の群から選ばれる該方法:α1アンチトリプシン欠損、糖原病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラーナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、第IX因子欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin-Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。請求項33~35の何れか1項に記載の方法であって、前記肝細胞の集団における1種以上の病理を検出又は測定するステップを含む該方法。請求項36に記載の方法であって、前記肝細胞の集団において以下の1種以上の事象を測定又は検出することによって前記病理を検出する該方法:蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。請求項33~37の何れか1項に記載の方法であって、前記集団中の前記肝細胞における遺伝的変異又は遺伝的欠陥を修復して、前記肝細胞が正常な表現型を示すステップを含む該方法。請求項1~35又は38の何れか1項に記載の方法によって製造され、単離された肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団であって、前記前駆細胞又は肝細胞が正常な表現型を示す該集団。ヒト又は動物の身体を治療する方法において使用するための請求項39に記載の集団。損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者を治療する方法において使用するための請求項40に記載の集団。請求項36~37の何れか1項に記載の方法によって製造された肝細胞の集団であって、前記肝細胞が病気の表現型を示す該集団。損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者を治療する方法であって、以下のステップを含む方法:肝細胞の請求項39に記載の肝細胞の集団を、該集団を必要とする個体に投与するステップ。損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者の治療で使用するための医薬の製造における請求項39に記載の集団の使用。化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップを含む方法:請求項1~38の何れか1項に記載の方法で製造され、単離された肝細胞を試験化合物に接触させるステップ;及び前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果、及び/又は前記試験化合物に対する前記肝細胞の効果を測定するステップ。請求項45に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べた試験化合物が有るときの前記肝細胞の成長若しくは生存率、又は1種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力を測定するステップを含む該方法ここで、成長が低下すること、生存率が低下すること、又は1種以上の肝細胞の機能を実践する能力が低下することは、前記化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す。請求項46に記載の方法であって、前記肝細胞による前記試験化合物の代謝を測定する該方法。請求項47に記載の方法であって、以下の事象を決定又は測定するステップを含む方法:前記試験化合物の量若しくは濃度の減少、及び/又は前記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加。肝臓病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、以下のステップを含む該方法:請求項1~38の何れか1項に記載の方法で製造された肝細胞の集団を試験化合物と接触させるステップ;、及び前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果を測定するステップ。請求項49に記載の方法であって、前記肝細胞が病気の表現型を示し、前記肝細胞における1種以上の病理に対する前記試験化合物の効果を測定する該方法。請求項50に記載の方法であって、以下の1種以上の事象に対する前記試験化合物の効果を決定する該方法:蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。請求項50~51の何れか1項に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べた試験化合物が有るときの、前記肝細胞における1種以上の病理が減少又は改善することにより、前記肝臓病の治療において前記試験化合物が有用となり得ることを示す該方法。請求項49に記載の方法であって、前記肝細胞が正常な表現型を示す方法であり、1種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力に対する前記試験化合物の効果を測定する該方法。請求項53に記載の方法であって、前記1種以上の肝細胞の機能が以下から選択される該方法:解毒、グリコーゲン貯蓄、AAT又はアルブミンの分泌、胆汁の生成、トロンボポイエチンの生成、アンギオテンシノゲンの生成、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。請求項53~54の何れか1項に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べた試験化合物が有るときの、1種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力が増加することにより、前記肝臓病の治療において前記試験化合物が有用となり得ることを示す該方法。こうした課題は、特に肝臓病特に肝臓の遺伝的代謝異常IMDに関連している。こうした群の病気は、肝細胞の鍵キーとなる蛋白質に影響を与える遺伝的変異から生じる。こうした群の病気は、肝臓を全器官移植することによって治療することができるが、こうした手順は、相当のリスクを生じる。従って、病気のメカニズムに対する理解を深め、代替治療法を開発する必要がある[10][11]。しかし、そのための研究においては幾つかの困難が立ちふさがっており、該困難としては:肝細胞を初代培養することが困難であることや;病気の原因となる蛋白質の機能不全、ひいては細胞の欠陥を忠実に再現し、関連のあるヒト肝細胞様細胞株を提供することができない点が挙げられる[12]本発明は、ヒトiPS細胞を肝臓性前駆細胞及び肝細胞へインビトロで高効率誘導するための方法に関する。本発明は、例えば、細胞ベースの治療法又は病気のモデリングのための肝細胞を生成する際に有用となる可能性がある。一態様において、本発明は以下の方法を提供する。肝臓への分化を誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法:i人工多能性幹iPS細胞の集団を提供するステップ;ii前記集団を内胚葉誘導培地中で培養し、前方胚体anteriordefinitive内胚葉ADE細胞の集団を生成するステップここで、前記内胚葉誘導培地は、以下の性質を持つ所定の化学培地である:線維芽細胞成長因子活性を有し、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路、並びにSMAD1、SMAD5及びSMAD9を介したシグナリング経路を刺激し、並びにホスファチジルイノシトール3-キナーゼPI3K及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βを阻害するiiiADE細胞の前記集団を肝臓性誘導培地中で培養し、肝臓性前駆細胞の集団を生成するステップここで、前記肝臓性誘導培地は、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激する所定の化学培地である。本発明の方法は更に以下のステップを含むことができる;iv前記肝臓性前駆細胞の集団を肝臓性成熟培地肝臓性細胞へと成熟させる培地中で培養し、肝細胞の集団を生成するステップ。好ましくは、前記iPS細胞はヒトiPS細胞である。iPS細胞は、非多能性且つ完全に分化した先祖細胞に由来する多能性細胞である。適切な先祖細胞には、成人の線維芽細胞や、末しょう血球が含まれる。通常、先祖細胞は、多能性の遺伝子又は蛋白質例えば、Oct4、Sox2及びSox1を細胞に導入することにより再プログラムされる。前記遺伝子又は蛋白質は、分化した細胞へ、任意の適切な技術によって導入することができる。該技術としては、プラスミド性、若しくはより好ましくは、ウィルス性のトランスフェクション、又は直接的な蛋白質の送達が含まれる。また、他の遺伝子を細胞に導入して、誘導効率を増加させても良い:例えば、Kif遺伝子例えば、Kif-1、-2、-4及び-5;Myc遺伝子例えば、c-Myc、L-Myc及びN-Myc;nanog;及びLin28。多能性の遺伝子又は蛋白質を導入した後、先祖細胞を培養することができる。多能性のマーカーを発現する細胞は、単離及び/又は精製を行い、iPS細胞の集団を生成することができる。iPS細胞を製造するための技術は周知であるYamanakaetalNature2007;448:313-7;Yamanaka62007Jun7;11:39-49.KimetalNature.2008Jul31;4547204:646-50;TakahashiCell.2007Nov30;1315:861-72.ParketalNature.2008Jan10;4517175:141-6;KimetalCellStemCell.2009Jun5;46:472-6;Vallier,L.,etal.StemCells,2009.9999999A:p.N/A.。iPS細胞は、以下の多能性に関連したマーカーを1種以上発現することができる:Oct4、Sox2、アルカリホスファターゼ、SSEA-3、nanog、SSEA-4、Tra-1-60、KLF-4及びc-Myc。幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるiPS細胞は、1つの個体から得られた健常な細胞例えば線維芽細胞即ち、病気に関連した表現型又は遺伝子型を持たない細胞に由来する。健常細胞に由来するiPS細胞は、本明細書に記載の通り使用して、正常な即ち、病気に関連しない表現型を示す肝細胞を生成することができる。健常細胞は、正常な肝臓機能をもつ個体から得ることができる。或いは、健常細胞は、損傷した又は機能不全の肝臓細胞を有する患者から得ることができる例えば、肝臓の損傷又は病気を有する患者例えば、肝炎例えば、A型、B型、C型、D型、E型、G型又はK型の肝炎、肝硬変、肝臓細胞の癌、非アルコール性脂肪性肝炎、薬剤誘発肝臓損傷、アルコール性肝疾患又は自己免疫性の肝疾患。幾つかの実施形態において、iPS細胞は、固有の遺伝的背景を有する個体から得られた健常細胞に由来してもよい。例えば、iPS細胞は、肝臓病を患った個体、肝臓病を患うリスクの高い個体、及び/又は肝臓病を患うリスクの低い個体からの健常細胞から生成することができる。本明細書に記載に従って固有の遺伝的背景を有する個体から生成された肝細胞は、肝臓病のメカニズムの研究、及び治療用ターゲットの同定に有用となる可能性がある。正常な即ち、病気に関連しない表現型を示す肝細胞は、後述するように、肝臓の損傷又は病気を有する患者を治療する際に有用となる可能性がある。例えば、iPS細胞の由来元となる健常細胞の供給元となった患者の治療の際に有用となる可能性がある。他の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるiPS細胞は、1つの個体から得た細胞であって病気に関連した細胞に由来する。即ち、細胞は、肝臓病又は肝臓の機能不全に関連した表現型又は遺伝子型を示す。そして、該表現型又は遺伝子型としては、例えば、肝臓の遺伝的代謝疾患IMDがあり、該疾患の例としては以下の物が挙げられる:α1アンチトリプシン欠損、糖原病例えば、糖原病1a型、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラーナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、又は第IX因子欠損若しくは他の血友病、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin-Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、又はレフサム病。前記遺伝子型例えば遺伝的変異又は遺伝的欠陥を有する任意の細胞は、IMD又は他の肝臓病と関連し、また、線維芽細胞のサンプル例えば、皮膚の線維芽細胞から適宜得ることができるが、こうした任意の細胞を使用することができる。ある個体から得た細胞であって、病気に関連した細胞に由来するiPS細胞即ち、病気特有のiPS細胞:ds-iPS又はdhiPSは、本明細書に記載の通り使用して、肝臓病に関連した表現型例えばIMD表現型を示す肝細胞を生成することができる。通常は、前記肝細胞は、肝臓病に関連した遺伝的変異又は遺伝的欠陥を有するであろう。こうした細胞は、上述したように、肝臓の損傷又は病気を有する患者の治療、又は肝臓病のモデリング及びスクリーニングにおいて有用となる可能性がある。他の実施形態では、肝臓病を有する個体から得た、病気に関連した細胞に由来するiPS細胞即ち、病気特有のiPS細胞:ds-iPS又はdhiPSは、肝臓病に関連した遺伝的変異又は遺伝的欠陥を有する例えば、α1-アンチトリプシンにおけるGlu342Lysの変異であって、A1AT欠損の原因となる変異。前記変異及び欠損は、分化する前に、iPS細胞内で、修復することができる。例えば、病気に関連した遺伝的な変異又は損傷を含むds-iPS細胞内のヌクレオチド配列は、野生型ヌクレオチド配列に置換することができる。遺伝的変異及び欠損を修復するための適切な方法は周知であり、本明細書以外の所でも記載されている。こうした修復されたcorrectediPS細胞c-iPSCは、上述したように、肝臓の損傷又は病気を有する患者の治療において有用となる可能性がある。肝臓の病気については上述した通りであり、遺伝的代謝異常IMDを含めることができる。IMDは、ER内での蛋白質のミスフォールディングに関連したIMDであってもよい。例えば、以下の病気が挙げられる:α1-アンチトリプシン欠損;肝臓に関連した受容体疾患receptoropathy例えば、家族性高コレステロール血症FH;代謝異常例えば、糖原病、例えば、GSD1a。肝臓病は、後期に発症する異常、又は成熟成人肝臓細胞に関連した異常であってもよい。製造後、iPS細胞の集団は、従来の技術を用いて培養又は維持をすることができるVallier,L.etalDev.Biol.275,403-4212004,Cowan,C.A.etal.N.Engl.J.Med.350,1353-13562004,Joannides,A.etal.StemCells24,230-2352006Klimanskaya,I.etal.Lancet365,1636-16412005,Ludwig,T.E.etal.Nat.Biotechnol.24,185-1872006。例えば、本発明の方法での使用に適したiPS細胞特にヒトiPS細胞は、適宜以下の条件で培養することができる:培養ディッシュ内での支持細胞例えば、放射状マウス胚線維芽細胞MEFの層の上で、培地としては、例えば、KnockoutKS培地添加物として、4ng/mlのFGF2で、そして、適切な密度例えば、105~106細胞/60mmディッシュで培養することができる。或いは、条件付の供給物を有する若しくは所定の培地とともに適切な基質の上で培養することができる。好ましくは、継代数が少ないiPS細胞が本明細書に記載の方法において用いられる。継代数が少ないiPS細胞は、培養した細胞の継代数が40以下、好ましくは35以下、又は30以下である。本発明の方法において使用するためのiPS細胞は、酵素的手段又は機械的手段で継代することができる。iPS細胞に適した培養培地には、以下の物が挙げられる:4ng/mlのFGF2を添加したKnockoutKS培地;Knockoutダルベッコ改変イーグル培地KO-DMEM添加物として、20の血清置換物、1の非必須アミノ酸、1mMのL-グルタミン、0.1mMのβ-メルカプトエタノール、及び4ng/ml~10ng/mlのヒトFGF2;並びにDMEM/F12添加物として、20のKnockout血清置換物KSR、6ng/mlのFGF2PeproTech、1mMのL-Gln、100μMの非必須アミノ酸、100μMの2-メルカプトエタノール、50U/mlのペニシリン及び50mg/mlのストレプトマイシン。培養中、細胞は、コラゲナーゼを含まない試薬例えば、Accutase商標BioWestを用いて回収することが好ましい。本明細書に記載の方法に従って、iPS細胞を肝細胞に分化させるには、3つの段階を経る。第1の段階では、iPS細胞の集団は、前方胚体内胚葉ADE細胞の集団へと分化する。第2の段階では、前記ADE細胞は、肝臓性前駆細胞に分化する。そして、随意的な第3の段階では、前記肝臓性前駆細胞は、肝細胞に分化する。これらの方法で使用される全ての培地は、所定の化学培地であり、好ましくはヒトに適応化した培地である。ADE細胞への分化を誘導するために、前記iPS細胞の集団は、内胚葉誘導培地中で培養される。前記内胚葉誘導培地は、所定の化学培地CDMであり、以下の性質を持つ:iSMAD1、SMAD2、SMAD3、及びSMAD5が介するシグナリング経路を刺激する;iiホスファチジルイノシトール3-キナーゼPI3K及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βを阻害する;及びiii線維芽細胞成長因子FGF活性を有する。所定の化学培地は、特定の成分のみ、好ましくは既知の化学構造の成分のみを含有する、細胞培養用のための、栄養溶液である。好ましくは、前記所定の化学培地は、ヒトに適応化した培地である。ヒトに適応化した所定の化学培地は、ヒト以外の動物に由来する成分又は添加物例えば、ウシ胎児血清FBS、ウシ血清アルブミンBSA、マウス支持細胞を含まない。前記内胚葉誘導培地には、所定の化学的基礎培地が含まれる。適切な所定の化学的基礎培地では、IMDM及び/又はF12を含み、添加物としては、インシュリンを、例えば0.5μg/ml~70μg/ml、トランスフェリンを、例えば、濃度1.5μg/ml~150μg/ml、抗酸化剤例えば、1-チオールグリセロールを、例えば、濃度45μM~4.5mM、及び脂質が挙げられる。適切な所定の化学的基礎培地としては、JohanssonandWilesCDMJohanssonandWiles1995MolCellBiol15,141-151が挙げられ、添加物としては、ポリビニルアルコール、インシュリン、トランスフェリン及び所定の脂質を添加できる。JohanssonandWilesCDMは、以下の物から構成される:50のIMDMGibco、これに加えて、50のF12NUT-MIXGibco;7μg/mlのインシュリン;15μg/mlのトランスフェリン;1mg/mlのポリビニルアルコールPVA;1の所定の化学的脂質濃縮物Invitrogen;、及び450μMの1-チオールグリセロール。他の適切な所定の化学的基礎培地については公知である。ウシ又はヒトの血清アルブミンの使用を避けるために、所定の化学的基礎培地は、内胚葉誘導培地の中に、ポリビニルアルコールPVAを0.5mg/ml~50mg/mlの濃度で添加することができる。ポリビニルアルコールを添加した所定の化学的基礎培地は、慣用的にCDM-PVAと呼ばれる。内胚葉誘導培地の中で、CDM-PVAは、追加因子、好ましくは組み換え型ヒト因子を添加することができ、該培地は、iPS細胞を誘導し、前方胚体内胚葉ADE細胞へ分化させる。例えば、CDM-PVAは、線維芽細胞成長因子を添加する。線維芽細胞成長因子は、蛋白質の因子であり、線維芽細胞成長因子の受容体FGFRへ結合することによって、細胞の成長、増殖、及び細胞の分化を刺激する。適切な線維芽細胞成長因子は、FGFファミリーの任意のメンバーが含まれる。例えば、FGF1~FGF14及びFGF15~FGF23のうちの任意の1つが含まれる。前記線維芽細胞成長因子は、以下の物であることが好ましい:FGF2NCBIGeneID:2247,核酸配列NM_002006.3GI:41352694,アミノ酸配列NP_001997.4GI:41352695;FGF7ケラチノサイト成長因子又はKGFとしても知られている,NCBIGeneID:2247,核酸配列NM_002006.3GI:41352694,アミノ酸配列NP_001997.4GI:41352695;、又はFGF10NCBIGeneID:2247,核酸配列NM_002006.3GI:41352694,アミノ酸配列NP_001997.4GI:41352695。最も好ましくは、線維芽細胞成長因子は、FGF2であるAmit,M.,etal.DevelopmentalBiology227:271-2782000。線維芽細胞成長因子例えば、FGF2、FGF7及びFGF10は、ルーチンの組み換え型技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手できる例えば、RDSystems,ミネアポリス,MN;StemgentInc,USA。便宜上、内胚葉誘導培地中のFGF濃度は、1~500ng/mlであってもよく、好ましくは約40ng/mlであってもよい。CDM-PVAは、更に第一のTGFβリガンドを添加してもよく、該リガンドは、iPS細胞中において、SMAD2及びSMAD3を介した細胞内シグナリング経路を刺激する。TGFβリガンドはTGFβスーパーファミリーのペプチドである。TGFβスーパーファミリーのメンバーは、特徴的な構造を有しており、周知である。第一のTGFβリガンドは、アクチビンActivin又はTGFβであってもよい。アクチビンアクチビンA:NCBIGeneID:3624核酸参照配列NM_002192.2GI:62953137,アミノ酸参照配列NP_002183.1GI:4504699は、二量体性ポリペプチドであり、アクチビン/Nodal経路の刺激を介して、細胞へのある範囲の効果を及ぼすVallieretal.,CellScience118:4495-45092005。アクチビンは販売元から容易に入手できる例えば、StemgentInc.MAUSA。便宜上、培地中のアクチビン濃度は、10~1000ng/mlの範囲であってもよく、好ましくは約100ng/mlであってもよい。TGFβNCBIGeneID:7040核酸参照配列NM_000660.4GI:260655621,アミノ酸参照配列NP_000651.3GI:63025222は、ホモダイマーのポリペプチドであり、増殖及び分化を制御するWatabe,T.etal2009.CellRes.19:103-115。組み換え型ヒトTGFβは販売元から容易にから入手できる例えば、StemgentInc.MAUSA。便宜上、培地中のTGFβ濃度は、10~1000ng/mlであっても良く、好ましくは約100ng/mlであっても良い。CDM-PVAは、更に第二のTGFβリガンドを添加することができ、iPS細胞中において、SMAD1、SMAD5及びSMAD9を介した細胞内シグナリング経路を刺激する。第二のTGFβリガンドは、骨形成蛋白質BMPであってもよい。骨形成蛋白質は、骨形成蛋白質受容体BMPRに結合して、SMAD1、SMAD5及びSMAD9を介した経路を通して、細胞内シグナリングを刺激する。適切な骨形成蛋白質は、BMPファミリーの任意のメンバー例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6又はBMP7が挙げられる。好ましくは、第二のTGFβリガンドは以下の通りである:BMP2NCBIGeneID:650,核酸配列NM_001200.2GI:80861484;アミノ酸配列NP_001191.1GI:4557369;、又は、BMP4NCBIGeneID:652,核酸配列NM_001202.3GI:157276592;アミノ酸配列NP_001193.2GI:157276593。骨形成蛋白質は、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる例えば、RD,ミネアポリス,USA,StemgentInc,USA。便宜上、骨形成蛋白質の培地中の濃度例えば、BMP2又はBMP4は、1~500ng/mlであってもよく、好ましくは約10ng/mlであってもよい。したがって、内胚葉誘導培地には、所定の化学的基礎培地を含むことができ、該培地には、ポリビニルアルコール、FGF、第一の及び第二のTGFβリガンド、PI3K阻害剤、並びにGSK3β阻害剤を添加することができる。PI3K阻害剤は、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ例えば、ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェート3-キナーゼEC2.7.1.153の活性を阻害する。適切なPI3K阻害剤は、以下の物が含まれる:ウォルトマンニン;LY30149717-b-ヒドロキシウォルトマンニン;LY2940022-モルホリン-4-イル-8-フェニルクロメン-4-オン:Macleanetal2007StemCells2529-38;CLB1309KN309:±-2-{1-[7-メチル-2-モルホリン-4-イル-4-オキソ-ピリド[1,2-a]ピリミジン-9-イル]エチル}アミノ安息香酸;PX-8661E,4S,4aR,5R,6aS,9aR-5-アセチルオキシ-1-[ジ-2-プロペン-1-イルアミノメチレン]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-オクタヒドロ-11-ヒドロキシ-4-メトキシメチル-4a,6a-ジメチルシクロペンタ[5,6]ナフト[1,2-c]ピラン-2,7,101H-トリオン;IC87114キノロンピロロピリミジン;6図17;GDC-09413図17;2-1H-インダゾール-4-イル-6-[[4-メチルスルホニル-1-ピペラジニル]メチル]-4-4-モルホリニル-チエノ[3,2-d]ピリミジン;TGX-2217-メチル-2-4-モルホリニル-9-[1-フェニルアミノエチル]-4H-ピリド[1,2-a]ピリミジン-4-オン,ケルセチン;BEZ2354図17;XL1471図17;Xl7652図17;PX-8665図17;ZSTK4742-2-ジフルオロメチルベンジミダゾール-1-イル4,6-ジモルホリノ-1,3,5-トリアジン;及びSF11262-[2-メトキシエチルアミノ]-8-フェニル-4H-1-ベンゾピラン-4-オン。他のPI3K阻害剤は、当分野で入手可能である。適切なPI3K阻害剤は、販売元から入手可能である例えば、CalbiochemCAUSA。例えば、内胚葉誘導培地は、1~100μMのPI3K阻害剤例えば、LY294002を含むことができ、好ましくは約10μM含むことができる。GSK3β阻害剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGeneID2932:EC2.7.11.26の活性を阻害する。適切な阻害剤には、以下の物が含まれる:CHIR990216-2-4-2,4-ジクロロフェニル-5-4-メチル-1H-イミダゾール-2-イルピリミジン-2-イルアミノエチルアミノニコチノニトリル;RingD.B.etal.,Diabetes,52:588-5952003、alsterpaullone、kenpaullone、SB2167633-2,4-ジクロロフェニル-4-1-メチル-1H-インドール-3-イル-1H-ピロール-2,5-ジオン、及びSB4152863-[3-クロロ-4-ヒドロキシフェニルアミノ]-4-2-ニトロフェニル-1H-ピロール-2,5-ジオン。適切なグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤は、販売元から入手可能である例えば、StemgentInc.MAUSA;CaymanChemicalCo.MIUSA。例えば、内胚葉誘導培地は、0.3~30μMのGSK3β阻害剤例えば、CHIR99021を含むことができ、好ましくは約3μM含むことができる。幾つかの実施形態において、内胚葉誘導培地は、CDM-PVA基礎培地から構成されてもよく、該培地は、アクチビン、FGF2、BMP-4、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ阻害剤好ましくはLY294002、及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤好ましくはCHIR99021を添加してもよい。好ましくは、内胚葉誘導培地中のアクチビン、FGF2及びBMP-4は、全て組み換え型ヒト蛋白質である。ほ乳動物の細胞培養については周知である例えば、以下の文献を参照されたい:BasicCellCultureProtocols,C.Helgason,HumanaPressInc.U.S.15Oct2004ISBN:1588295451;HumanCellCultureProtocolsMethodsinMolecularMedicineS.HumanaPressInc.,U.S.9Dec2004ISBN:1588292223;CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,R.Freshney,JohnWileySonsInc2Aug2005ISBN:0471453293,HoWYetalJImmunolMethods.2006310:40-52,HandbookofStemCellsed.R.LanzaISBN:0124366430。これらの培地及び成分は、販売元から入手可能である例えば、Gibco、Roche、Sigma、Europabioproducts、RDsystems。標準的なほ乳動物の細胞培養条件を用いることができる。例えば、37°C、21酸素、5二酸化炭素といった条件を用いることができる。培地は、2日ごとに交換することが好ましく、細胞は、重力によって設置されることが好ましい。細胞は以下の条件で培養することが好ましい:単層で、支持細胞が存在せず、血清好ましくはヒト血清又は細胞外マトリックス蛋白質例えば、フィブロネクチン、ラミニン、又はコラーゲンで被覆コーティングされた基質上で培養。適切な培養技術は周知である。好ましい実施形態において、iPS細胞を前方胚体内胚葉ADE細胞へと分化させる工程は、3つの別々のステップで行うことができる。例えば、iPS細胞の集団をADE細胞へ分化させる工程は以下のステップを含むことができる:aiPSCの集団を内胚葉誘導培地中で培養するステップであって、例えば12~36時間、好ましくは約24時間培養するステップ;b更に、前記集団を、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤が存在しない内胚葉誘導培地中で培養するステップであって、例えば12~36時間、好ましくは約24時間培養するステップ;並びにc更に、前記集団を、ADE誘導培地中で培養するステップであって、該培地は、SMAD2及びSMAD3シグナリング経路を刺激し、線維芽細胞成長因子活性を有し、例えば12~36時間、好ましくは約24時間培養し、前方胚体内胚葉ADE細胞の集団を生成するステップ。前記ADE誘導培地は、所定の化学培地であって、所定の化学的基礎培地が含まれる。適切な所定の化学的基礎培地には、RPMI-1640が含まれる。RPMI-1640Moore,G.E.andWoodsL.K.,1976TissueCultureAssociationManual.3,503-508は、無機塩、アミノ酸、ビタミン、抗酸化剤及び緩衝剤バッファを含有する無血清基礎培地である。RPMI-1640は周知であり、販売元から容易に入手できる例えば、Sigma-AldrichMIUSA。RPMI-1640培地の成分を表2に示す。所定の化学的基礎培地は、無血清培地添加物を添加することができる。適切な無血清培地添加物には、B27BreweretalJ.NeurosciRes35567-5761993及びNS21ChenetalJ.NeurosciMeths2008171239-247が含まれる。無血清培地添加物例えば、B27及びN21は周知であり、幅広く市場で入手可能である例えば、Invitrogen;SigmaAldrichInc。また、ADE誘導培地においては、所定の化学的基礎培地に、追加的因子、好ましくは組み換え型ヒト因子を添加して、前方胚体内胚葉ADE細胞の集団を生成する。例えば、所定の化学的基礎培地には、線維芽細胞成長因子FGF及び第一のTGFβリガンドを添加することができ、該リガンドは、SMAD2及びSMAD3を介する細胞内シグナリング経路を刺激する。FGF及び第一のTGFβリガンドについては、これまでの記載の所で更に詳しく述べたとおりである。幾つかの実施形態において、ADE誘導培地は、所定の化学的基礎培地を含むことができ、該培地には以下の添加物を添加することができる:1~1000ng/mlの第一のTGFβリガンド例えば、アクチビン、好ましくは100ng/ml、及び4~400ng/mlのFGF例えば、FGF2、好ましくは40ng/mlのFGF。所定の化学的基礎培地は、RPMI-1640であってもよく、該培地には、B27又はNS21培地添加物を添加してもよい。好ましくは、iPS細胞の集団は、2~4日間、最も好ましくは3日間培養して、ADE細胞の集団を生成する。前方胚体内胚葉ADE細胞は、内胚葉マーカーを発現することができ、例えば、Sox17、foxA2、GSC、Mixl1、Lhx1、CXCR4、GATA6、Eomes及びHexを発現することができる。前方胚体内胚葉ADE細胞は、多能性のマーカー、又は内胚葉の若しくは中胚葉の系統と関連するマーカーの発現が欠損してもよい。例えば、ADE細胞は、以下のマーカを、検出可能なレベルで、1種以上、好ましくは全て発現しなくてもよい:Oct4、Sox2、アルカリホスファターゼ、SSEA-3、nanog、SSEA-4、Tra-1-60及びKLF-4。1種以上のADE細胞マーカー、及び/又は1種以上の多能性細胞マーカーの発現は、分化している細胞集団中でモニター及び/又は検出することができる。これにより前記細胞集団に対してどの程度分化又は内胚葉誘導が成されているかを決定することができる。分化した後、ADE細胞の集団は、実質的に他の細胞種を含まなくても良い。例えば、培地で培養した後、前記集団は、ADE細胞を85以上、90以上、95以上又は98以上含むことができる。好ましくは、ADE細胞の集団は、他の細胞種の存在が十分排除されており、精製を必要としない。要すれば、ADE細胞の集団は、任意の便宜的な技術例えば、FACSによって精製することができる。幾つかの実施形態において、ADE細胞の集団は、肝臓性の系統へ更に分化させる前に増殖させることができる。ADE細胞は、任意の便宜的な技術によって増殖させることができ、例えば、上述したように、FGFを添加した培地例えば、ADE誘導培地内で増殖させることができる。肝臓性前駆細胞への分化を誘導するために、ADE細胞の集団は、肝臓性誘導培地中で培養する。前記肝臓性誘導培地は、所定の化学培地CDMであり、該培地は、SMAD2及びSMAD3を介するシグナリング経路を刺激し、肝臓性の系統への分化を誘導する。肝臓性誘導培地は、所定の化学的基礎培地が含まれ、該培地には、1種以上の追加的因子、好ましくは組み換え型ヒト因子が添加され、ADE細胞が肝臓性前駆細胞に分化することを誘導する。適切な所定の化学的基礎培地CDMには、上述したRPMI-1640が含まれる。前記CDMは、第一のTGFβリガンド例えば、上述したように、TGFβ又はアクチビンを添加することができ、該リガンドは、SMAD2及びSMAD3を介したシグナリング経路を刺激することができる。前記培地には、5~500ng/mlの第一のTGFβリガンド例えば、アクチビン、好ましくは約50ng/mlを添加することが好ましい。ADE細胞の集団は、4~6日間、好ましくは約5日間培養することができ、肝臓性前駆細胞の集団を生成することができる。分化している細胞の集団において、1種以上の肝臓性前駆細胞マーカー及び/又は1種以上のADE細胞マーカーの発現を、モニター及び/又は検出を行うことができる。これにより、培養時の分化の度合い程度を測定することが可能となる。肝臓性前駆細胞は、肝細胞、又は胆管細胞cholangiocytesのいずれかへ分化する能力があり、両方の系統のマーカーを発現する。肝臓性前駆細胞は、以下の1種以上を発現することができる:α-フェトプロテインAFP、サイトケラチン18CK18、サイトケラチン19CK19、肝細胞核因子4HNF4、及び肝細胞核因子6HNF6。1種以上のこれらのマーカーが検出されれば、それは、肝臓性の系統へ分化したことを示す。肝臓性前駆細胞の集団は、実質的に他の細胞種を含まなくても良い。例えば、前記集団は、培地中で培養した後、80以上、85以上、90以上又は95以上の肝臓性前駆細胞を含むことができる。好ましくは、肝臓性前駆細胞の集団は、他の細胞種の存在が十分排除されており、精製を必要としない。要すれば、前記肝臓性前駆細胞の集団は、任意の便宜的な技術によって精製することができる。上述したように倍地中で培養した後、肝臓性前駆細胞の集団は、培地から単離及び/又は除去することができる。そのための適切な技術については、周知である。肝臓性前駆細胞は、従来の技術を用いて、増殖させたり、培養中で維持したり、保存したり例えば凍結保存することができる。あるいは、肝臓性前駆細胞は、本明細書に記載したように、治療又は他の応用において使用することができる。例えば、肝臓性前駆細胞は、後述するように細胞ベースの治療法において使用することができる。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、肝臓性前駆細胞を肝細胞に分化するように誘導するステップを含むことができる。分化を誘導するために、肝臓性前駆細胞の集団は、肝臓性成熟培地中で培養する。該培地は、所定の化学的基礎培地CDMから構成され、追加的因子好ましくは組み換え型ヒト因子が添加されている。培養の結果、肝臓性前駆細胞は、誘導されて、肝細胞hepaticprogenitorcellsへと成熟する。適切な所定の化学的基礎培地CDMには、CMRL及びHepatozymeSFMが含まれるGibco商標;InvitrogenInc。CMRL基礎培地は、無血清基礎培地であり、該培地は周知であり、販売元から容易に入手できる例えば、CatNo:11530037Invitrogen;ProductC0422Sigma。CMRL培地の組成は、表3に示す。HepatozymeSFMは、無血清基礎培地であり、該培地は販売元から入手できる例えば、CatNo17705;Invitrogen。所定の化学培地CDM培地は、1種以上の因子を添加してもよく、該因子とは、肝芽細胞又は肝臓性前駆細胞から肝細胞への分化又は成熟を誘導する因子である。例えば、基礎培地には、肝細胞成長因子HGF又は上皮成長因子EGFを添加することができる。肝細胞成長因子HGFNCBIGeneID:3082,核酸配列NM_000601.4GI:58533168,アミノ酸配列NP_000592.3GI:33859835は、S1ペプチダーゼのプラスミノーゲンサブファミリーのメンバーである間充織由来の分裂促進因子である。HGFは、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる例えば、PeproTechIncNJUSA。便宜上、培地中のHGFの濃度は、2~200μg/mlであってもよく、好ましくは約20μg/mlであってもよい。上皮成長因子EGFNCBIGeneID:1950,核酸配列NM_001178130.1GI:296011012アミノ酸配列NP_001171601.1GI:296011013;Reynolds,B.A.etal.J.Neurosci.12:4565-45741992は、成長因子であり、該因子の受容体EGFRへの結合を通して増殖及び分化を制御することができる。EGFは、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる例えば、PeproTechIncNJUSA,StemgentIncUSA。便宜上、培地中のEGFの濃度は、2~200μg/mlであってもよく、好ましくは約20μg/mlであってもよい。また、所定の化学培地CDM培地は、1種以上の因子を添加してもよく、該因子は、肝細胞の分化及び成熟を誘導し、例えば、オンコスタチン-M等が挙げられる。オンコスタチン-MNCBIGeneID:5008,核酸配列NM_020530.3GI:28178862,アミノ酸配列NP_065391.1GI:10092621は、IL-6ファミリーのサイトカインである。オンコスタチン-Mは、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる例えば、RDsystems,MNUSA;AbcamLtd,UK。便宜上、培地中のオンコスタチン-Mの濃度は、1~100μg/mlであってもよく、好ましくは約10μg/mlであってもよい。肝臓性前駆細胞の集団は、10~40日間、好ましくは約25日間培養することができ、肝細胞の集団を生成することができる。肝細胞は、以下の1種以上を発現することができる:アルブミンAlbumin、α1-アンチトリプシンAAT、シトクロームP450CYP例えば、Cyp3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9及びCYP2D6、第IX因子、アポリポプロテインA2apopoliprotein、CEBPα及びトランスチレチン。幾つかの実施形態において、肝細胞は、1種以上の前駆細胞マーカー例えば、AFP、CK18及びSox17を発現しなくともよい。前記細胞集団内で、1種以上の肝臓性前駆細胞マーカー及び/又は1種以上の肝細胞マーカーの発現は、モニター及び/又は検出を行うことができる。例えば、肝細胞の集団による、アルブミン及び/又はα1-アンチトリプシンの発現又は製造を測定することができる。これにより、培養集団中での分化の度合いを測定又は及び/又はモニターすることが可能となる。細胞マーカーの発現は、任意の適切な技術によって、測定することができ、該技術としては、免疫細胞化学、免疫蛍光、RT-PCR、蛍光活性化セルソーティングFACS、及び酵素的分析が含まれる。集団において、1種以上の肝細胞の機能を実践する細胞の能力を、モニター及び/又は測定することができる。例えば、以下の1種以上を行う細胞の能力をモニター及び/又は測定することができる:解毒、グリコーゲン貯蓄、AAT又はアルブミンの分泌、胆汁の製造、トロンボポイエチンの製造、アンギオテンシノゲンの製造、アンモニアから尿素への変換尿素サイクル、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。肝細胞の集団は実質的に他の細胞種を含まなくても良い。例えば、前記集団は、培地中で培養した後、肝細胞を、80以上、85以上、90以上、又は95以上含むことができる。集団中の肝細胞の存在又は割合は、上述したように、アルブミン及び/又はα1-アンチトリプシンの発現を通して測定することができる。好ましくは、肝細胞の集団は、他の細胞種の存在が十分排除されており、精製を必要としない。要すれば、肝細胞の集団は、FACSを含む任意の便宜的な技術によって精製することができる。本明細書に記載の方法において任意の段階で生成されたADE細胞、肝臓性前駆細胞、及び/又は肝細胞は、単離及び/又は精製することができる。細胞は、当業者に知られた任意の技術を用いて、集団中の他の細胞種から分離することができる。該技術としては、後述するが以下に基づいたものが含まれる:抗体による細胞外エピトープの認識、及び磁気ビーズ又は蛍光活性化セルソーティングFACS、細胞外領域の特徴的マーカーに対する抗体を使用することを含む。本明細書に記載の方法で生成された肝細胞の集団は、標準的なほ乳動物の細胞培養技術を用いて、増殖、培養、又は維持することができる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法で生成された肝細胞の集団は、保存することができ、例えば、凍結乾燥及び/又は凍結保存などがある。肝細胞の集団は、他の試薬と混合してもよく、例えば、緩衝剤、キャリア、希釈剤、保存薬防腐剤又は医薬的に適用可能な賦形剤が挙げられる。適切な試薬については、後で更に詳述する。上述したように、病気特有のiPS細胞を用いて肝細胞を生成することができ、生成された細胞は、肝臓病に関連した表現型例えば、IMDを示す。病気に関連した表現型を有する肝細胞は、病気に関連した1種以上の病理を示すことができる。本明細書に記載の方法は、肝細胞の集団において、1種以上の病理を検出又は測定するステップを含むことができる。病理には以下の1種以上の事象を含めることができる:異常な成長、アポトーシスの上昇、異常な遺伝子発現;グルカゴン刺激に対する異常な応答;蛋白質の凝集又は重合化ポリマー化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;乳酸の生成;、及び前記肝細胞の集団における上述した1種以上の肝細胞の機能の欠陥。病理を有する肝細胞を生成する方法は以下のステップを含むことができる:上述したように、ds-iPS細胞の集団をインビトロで肝臓へ分化することを誘導するステップ。これにより、病理を有する肝細胞の集団を生成するステップ。ds-iPS細胞からの分化を開始した後、ds-iPS細胞由来の肝細胞は、10日、20日、40日、又は複数日以内に病理を示すことができる。一旦生成されると、病気の表現型例えば、IMD表現型を有する肝細胞は、例えば、スクリーニングにおいて使用するために、培養、増殖、及び維持することができる。上述したように、病気の表現型を有する肝細胞を維持する方法は、次のステップを含むことができる:病気の表現型有し、且つds-iPS細胞に由来する肝細胞の集団を培養するステップ。本発明の別態様は、上述した方法によって生成され、そして単離された肝細胞又は肝臓性前駆細胞の集団を提供することである。前記集団は、肝細胞又は肝臓性前駆細胞を80以上、85以上、90以上、又は95以上含むことができる。本明細書に記載の方法で生成された肝細胞は、成熟肝細胞に特有の1種以上の機能、又は機能的特徴を示すことができる。例えば、肝細胞は、グリコーゲン及びLDL、分泌AAT及び/又はアルブミンを蓄えることができ、CytP450経路を介して薬剤を代謝することができ、並びに、肝細胞特有のApoAIIプロモーターを制御してGFP蛋白質を発現することができる。肝細胞は、胆汁、トロンボポイエチン、アンギオテンシノゲン、尿素及びコレステロールを1種以上生成することができ;、並びに、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成及び脂質生成のうち1種以上を行うことができる。幾つかの実施形態において、肝細胞は、成熟した成人肝細胞に完全に分化しなくともよい。そして、肝細胞は、1種以上の前駆細胞マーカー例えば、AFPを発現し続けてもよく、減少したレベルでALBを発現してもよく、及び/又は成熟成人肝細胞と比べると低いCyp3A4活性を示してもよい。肝細胞は、以下の特徴を1種以上随時示すことができる:二核性;グリコーゲン貯蔵;頂部の微小突起apicalmicroprotrusions;粗面小胞体及び滑面小胞体ER、並びに顕著なprominentゴルジ体。本明細書に記載の方法で生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、iPS細胞を生成するために使用した外因性の再プログラミング因子を発現しないレトロウイルス性の転移遺伝子として、細胞内に依然として存在している可能性があるが。肝細胞又は肝臓性前駆細胞の集団は、ヒト又は動物の身体の治療例えば、損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者の治療の方法において使用することができる。また、前記集団は、損傷した又は機能不全の肝臓性組織の治療において使用するための医薬の製造において使用することができる。損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する個体は、以下の症状を有してもよい:肝炎例えば、A型、B型、C型、D型、E型、G型又はK型の肝炎、肝硬変、肝臓細胞の癌、非アルコール性脂肪性肝炎、薬剤誘発肝臓損傷、アルコール性肝疾患、自己免疫性の肝疾患若しくは遺伝的代謝異常例えば、α1アンチトリプシン欠損、糖原病例えば糖原病1a型、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラーナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、又は第IX因子欠損若しくは他の血友病、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Dubin-Johnson症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。治療への応用を目的として、肝細胞は、臨床のグレードの肝細胞であることが好ましい。損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者を治療する方法は以下のステップを含むことができる:上述したように生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞の集団を、該集団を必要とする個体に投与するステップ。前記肝細胞の集団は、移植することもでき、注入することもでき、或いは、個体の臓器に投与することもできる。これらのための適切な技術は周知である。肝細胞の集団は、前記個体から得た細胞に由来するiPS細胞から生成することができる。幾つかの実施形態において、iPS細胞における病気に関連した変異又は遺伝的欠損は、上述したように、肝細胞又は肝臓性前駆細胞へ分化する前に、修復することができる。また、本発明の態様は、医薬組成物、医薬、薬剤、又は他の組成物にも拡張され、これらは、本明細書に記載の方法で生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞を含む。また、本発明の方法では、上述したように、例えば、損傷した又は機能不全の肝臓性組織を治療予防的な治療も含めることができるを目的として、こうした肝細胞又は肝臓性前駆細胞を患者に投与するステップを含む。そして、医薬組成物を製造するための本発明の方法は、医薬的に適用可能な賦形剤、ビヒクル又はキャリア、そして、随意的に1種以上の他の成分を、こうした肝細胞又は肝臓性前駆細胞と混合するステップを含む。個体に投与される肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、遺伝的に操作して、治療用分子例えば、薬剤又は成長因子を生成することができるBehrstockSetal,GeneTher2006Mar;135:379-88,KleinSMetal,HumGeneTher2005Apr;164:509-21。本発明は、本発明に従い生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞と、1種以上の追加的成分とを含有する組成物を提供する。本発明に従った医薬組成物、及び本発明に従った使用を目的とする医薬組成物は、前記肝細胞のほかに以下の物を含むことができる:医薬的に適用可能な賦形剤、キャリア、緩衝剤、保存薬防腐剤、安定化剤、抗酸化剤、又は当業者に周知の他の物質。こうした物質は、毒性を持たない物にすべきであり、前記肝細胞の活性と干渉しない物にすべきである。キャリア、又は他の物質の正確な特性は、投与経路に依存するであろう。液体医薬組成物は、一般的に、水、石油、動物性油若しくは植物性油、鉱物油、又は合成油などの液体キャリアが含まれる。また、以下の物も含めることができる:生理食塩水溶液、組織培地若しくは細胞培養培地、デキストロース又は他の糖類溶液、グリコール例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコール。組成物は、非経口的に許容可能な水性溶液の形態であってもよく、感染源を含まず、適切なpH、等張性及び安定性を有する。当分野の関係者であれば、例えば、等張性のビヒクル例えば、塩化ナトリウム、リンゲル液、乳酸リンゲル液を用いて適切な溶液を調製することは十分可能である。組成物は、人工的な脳脊髄液を用いて調製することができる。肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、任意の公知技術によって、患者に移植することができる例えば、Lindvall,O.1998Mov.Disord.13,Suppl.1:83-7;Freed,C.R.,etal.,1997CellTransplant,6,201-202;Kordower,etal.,1995NewEnglandJournalofMedicine,332,1118-1124;Freed,C.R.,1992NewEnglandJournalofMedicine,327,1549-1555,LeBlancetal,Lancet2004May1;3639419:1439-41。特に、細胞懸濁液は、患者の門脈に注入することができる。本発明に従った組成物の投与は、予防としての有効量又は治療としての有効量であることが好ましい場合によっては、予防を治療とみなすこともできるかもしれないが。そして、該量とは、個体に対して利点を示すのに十分な量である。実際の投与する量、割合、及び時間変化は、治療対象の性質や深刻度によるだろう。治療の処方箋例えば、投与量等の決定については、一般的に実践する者、又は他の医療ドクターの責任の範囲内である。組成物は、治療する症状に応じて、単独で投与することもでき、又は他の治療と組み合わせて同時に若しくは連続のいずれかで投与することができる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法で生成された集団中における肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、正常な表現型を示すことができる。例えば、細胞は、肝臓の損傷又は機能不全を有する個体から得ることができ、iPS細胞を生成するために使用することができる。幾つかの実施形態において、iPS細胞は、変異や遺伝的な欠陥を含んでいてもよい。また、該変異又は欠陥は、従来の組み換え技術を用いて修復し、正常な表現型を有するiPS細胞を生成することができる。正常な表現型を有する肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、本明細書に記載のように、これらのiPS細胞から生成することができる。そして、患者に移植して、肝臓の損傷又は機能不全を修復又は改善することができる。他の実施形態では、本明細書に記載の方法で生成された集団中の肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、病気の表現型を示しても良い。例えば、細胞は、肝臓の損傷又は機能不全を有する個体から得ることができ、病気特有のiPSds-iPS細胞を生成するために使用することができる。病気の表現型を有する肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、本明細書に記載のように、これらのiPS細胞から生成することができる。そして、これらの細胞は、正常な表現型を取り戻すために処理することができる。例えば、病気の表現型の原因となる遺伝的変異又は遺伝的欠陥は、インビトロで修復することができる。単離したほ乳動物の細胞内で、遺伝的変異又は欠陥を修復するための様々な技術が利用可能である。一旦、欠陥又は変異が修復され、正常な表現型を取り戻すと、肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、患者に移植することができ、肝臓の損傷又は機能不全を修復又は改善することができる。上述した方法で生成された肝細胞の集団は、試験化合物と肝臓細胞との相互作用をモデリングする際に有用となる可能性ある例えば、毒性スクリーニングにおける、肝臓病のモデリング、及び潜在的な治療用効果を有する化合物のためのスクリーニング。化合物をスクリーニングする方法は、以下のステップを含むことができる:上述の方法によって生成される肝細胞の集団を、試験化合物に接触させるステップ;及び前記肝細胞に対する試験化合物の効果、及び/又は、試験化合物に対する前記肝細胞の効果を測定するステップ。肝細胞は、正常の又は病気の表現型を示すことができる。試験化合物が無い場合と比べた試験化合物が有るときの肝細胞の成長又は生存率を測定することができる。成長又は生存率が低下することは、化合物が肝臓毒性の効果があることを示す。試験化合物が無い場合と比べた試験化合物が有るときの遺伝子発現を測定できる。例えば、以下の遺伝子の発現を測定することができる:アルブミン、α1-アンチトリプシンAAT、シトクロームP450酵素例えば、Cyp3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9及びCYP2D6、第IX因子、アポリポプロテインA2、CEBPα及び/又はトランスチレチン。発現が低下することは、化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す。遺伝子発現は、核酸レベルについて、例えばRT-PCRによって、測定することができる。蛋白質レベルについてであれば、免疫学的な技術例えば、ELISA又は、活性アッセイによって、測定することができる。シトクロームP450アッセイ例えば、ルミネッセンスのアッセイ、蛍光性のアッセイ、発色性のアッセイは周知であり、販売元から入手できる。肝細胞による試験化合物の代謝、変性、又は分解を測定することができる。幾つかの実施形態において、前記試験化合物の量若しくは濃度、及び/又は前記試験化合物の代謝産物における変化は、ある時間の範囲にわたって、連続的又は1以上の時間ポイントのいずれかで、決定又は測定することができる。例えば、前記試験化合物の量又は濃度の減少、及び/又は前記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加を、決定又は測定することができる。幾つかの実施形態において、前記試験化合物の量若しくは濃度、及び/又は代謝産物における変化速度を決定測定することができる。試験化合物又は代謝産物の量を測定するための適切な技術として、質量分析法が挙げられる。該方法は、試験化合物についての、インビボ半減期、毒性、効能、又は他のインビボ特性を測定する際に、有用となる可能性がある。試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときとで、肝細胞の1種以上の機能を決定及び/又は測定することができる。例えば、以下の1種以上の事を行うための肝細胞の機能を決定及び/又は測定することができる:有機化合物の解毒、グリコーゲン貯蓄、AAT又はアルブミンの分泌、胆汁の製造、トロンボポイエチンの製造、アンギオテンシノゲンの製造、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときで、1種以上のこれらの機能を実行するための肝細胞の能力が低下した場合、それは、化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す。肝臓病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法は、以下のステップを含むことができる:上述した方法で生成された病気の表現型を示す肝細胞の集団を、試験化合物と接触させるステップ;及び前記肝細胞に対する試験化合物の効果を決定するステップ。前記肝細胞は、病気の表現型を示すことができる。肝細胞において、1種以上の病理に対する試験化合物の効果を決定することができる。例えば、以下の1種以上の事象に対する試験化合物の効果を決定することができる:細胞の成長、遺伝子発現、蛋白質の凝集又は重合化;ER内での蛋白質封じ込め;コレステロール取り込み;脂質及び/又はグリコーゲン蓄積;並びに乳酸の生成。そのための適切な技術は周知であり、免疫染色、質量分析法、ウェスタンブロット法、及び酵素的アッセイが挙げられる。試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときで、肝細胞中の1種以上の病理が減少又は改善された場合、それは、肝臓病の治療例えば遺伝的代謝異常において、試験化合物が有用となる可能性があることを示すことができる。遺伝的代謝異常の具体例については、既に述べた通りである。本明細書に記載の方法は、肝細胞における1種以上の病理例えばIMD病理を減少又は改善させる試験化合物を特定するステップを含むことができる。病理を減少させる化合物は、肝臓病の治療のための治療薬の開発において有用となる可能性がある。他の実施形態では、肝細胞は、正常な表現型を示すことができる。また、該肝細胞は、一般的な集団と比べて、例えば、肝臓病に対するリスクが高い、又は肝臓病の影響を非常に受けやすい個体に由来する物であっても良い。以下の1種以上の事象に対する試験化合物の効果を測定することができる:細胞の成長、又は遺伝子発現例えば、シトクロームP450CYPの発現例えば、Cyp3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9、及びCYP2D6。肝細胞の1種以上の機能に対する試験化合物の効果を測定することができる。例えば、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときとで、以下の1種以上を行う肝細胞の機能について、決定及び/又は測定することができる:有機化合物の解毒、グリコーゲン貯蓄、AAT又はアルブミンの分泌、胆汁の製造、トロンボポイエチンの製造、アンギオテンシノゲンの製造、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときに、遺伝子発現、成長及び/又は1種以上の機能が増加した場合には、前記化合物が肝臓病例えば、肝炎例えば、A型、B型、C型、D型、E型、G型又はK型の肝炎、肝硬変、肝臓細胞の癌、非アルコール性脂肪性肝炎、薬剤誘発肝臓損傷、アルコール性肝疾患、又は自己免疫性の肝疾患の治療において有用である可能性を示す。肝細胞において1種以上の病理を減少又は改善する化合物を同定した後、前記化合物は、該化合物の医薬的特性を最適化するために改変することができる。こうした改変は、周知のモデリング技術を用いて行うことができる。肝細胞において1種以上の病理例えば、IMD病理を減少又は改善する能力を有する物として、1種以上の初期スクリーニングを用いて同定された試験化合物は、1種以上の2次スクリーニングを用いて更に評価することができる。2次スクリーニングでは、インビトロ及び/又はインビボ例えば、動物モデルにてでの生物学的機能又は活性を試験することを含むことができる。例えば、病気の動物モデルにおいて、肝臓病に関連する1種以上の症状又は病理を減少又は改善するための試験化合物の能力を測定することができる。肝細胞において、1種以上の病理を減少又は改善する試験化合物を同定した後、前記化合物を単離及び/又は精製することができる。或いは、組み換え発現又は化学合成等の従来の技術を用いて、合成することができる。更に、化合物は、組成物例えば、医薬、医薬組成物又は薬剤の調製即ち、製造又は配合において製造又は使用することができる。これらの組成物は肝臓病の治療を目的として個体に投与することができる。本明細書に開示した内容を参照すれば、本発明に係る更なる様々な態様及び実施形態があることが当業者にとって明らかであろう。本明細書で記述した全ての文献は、参照により、その内容全体を本明細書に組み込む。本明細書で使用する及び/又はという表現該表現において、及びを並びにに置き換えた場合や、又はを若しくはに置き換えた場合も同様は、特定の二つの特性又は成分のうちのそれぞれであって、他方の要素を伴うもの、又は伴わないものである旨を特定して開示するものとして解釈すべきものである。例えば、A及び/又はBという表現は、iA、iiB、及びiiiAとB、のそれぞれが、ちょうど本明細書において個別に列挙されたかのように、特定して開示するものとして解釈すべきものである。特記しない限り、上述した特徴に関する記載や定義は、本発明のあらゆる特定の態様や実施形態に限定されない。そして、記載した全ての態様及び実施形態に等しくあてはまるものである。本発明の特定の態様及び実施形態については、後述する図面及び表を参照しながら、例示的な意味合いで以下述べることとする。方法hiPSC派生物及び培養物倫理的な承認と患者の同意を適切に得た後、8mmの皮膚パンチの生体検査材料を、Addenbrooke病院のボランティア患者から得たEthicsrefnumber08/H0311/201;RDNo:A091485。標準化された屋内inhouseプロトコルを用いて、GMP条件で、提供された組織から線維芽細胞を生成した。そして、標準的な線維芽細胞培養培地中で増殖させた。更なる線維芽細胞サンプルをINSERMフランス及びCoriellBiorepositoryから得た。全部で5つの異なる病気サンプルを、7人の異なる患者から得た。詳細を表1に示す。モロニーマウス白血病ウイルス由来のベクター該ベクターは、4種類のヒト遺伝子Oct-4、Sox2、c-Myc及びKlf4のうち1つのコーディング配列をそれぞれ含有すると、対応するウィルス性粒子とをVectalys社Toulouse,フランスが生成した。そして、感染効率multipleofinfectivityを10にして、線維芽細胞に感染させるために使用した。これらの技術については、山中氏及び共同研究者が当初記載した通りであり、また、本発明者が近年記載したとおりである[29]。一旦誘導されると、hiPSCは、放射状マウス供給物feedersを含有するプレート上で、そして、標準的なhESC培養条件Knockout[KSR],GibcoFGF24ng/ml;RDsystemsInc.,ミネアポリスで培養される。RNA抽出及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応RNeasyMiniKitQiagen,Hilden,Germanyを用いて、hiPSC又は分化した前駆細胞から、トータルRNAを抽出した。各サンプルは、DNAの混入をさけるため、RNase-FreeDNaseQiagenで処理した。SuperscriptII逆転写酵素Invitrogenを用いて、トータルRNAの各サンプル0.6μgを逆転写した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応PCRの反応混合物を、文献の記載に従って調製したSensiMiXProtcol;Quantace,London。そして、94°Cで5分間変性させた。その後、94°Cで30秒、60°Cで30秒、そして、72°Cで30秒というサイクルで反応させた。40サイクルが完了した後、続いて、72°Cで10分間、最後の伸長反応を行った。プライマー配列については別途記載の通りである[16]。リアルタイムPCR反応は、Stratagene社のMx3005PLaJolla,CAを用いてトリプリケートで行った。そして、同一の反応実験内thesamerunで、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼPBGDに対して標準化を行った。QPCRデータは、3件の独立した実験の平均として表され、エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。リアルタイムPCR分析用に用いるプライマーは、最後のところに表として記載した。免疫蛍光hiPSC、又はこれらから分化した前駆細胞は、4パラホルムアルデヒド中で、20分間、4°Cで固定した。その後、PBSで3回洗浄した。10のロバ血清SerotecLtd.を含有するPBS中で、20分間室温で細胞をインキュベートした。続いて、1のロバ血清を含有するPBS中で希釈した一次抗体を用いて一晩4°Cでインキュベートした。用いた抗体及び希釈率は下記の通り:Oct-41:100;Abcamab18976[ケンブリッジ,U.K.]Sox21:100;Abcamab15830,Brachyury1:100;Abcamab20680orRDsystemsInc.,Sox17RDsystemsInc.,foxA21:50;Abcamab5074,GATA41:250;SantaCruzBiotechnologyInc.,GATA61:200;Abcamab22600orSantaCruzBiotechnologyInc.,CXCR41:100;RDsystemsInc.又はBDPharmingen,CK181:50,DakoCK191:50,Dako,アルブミン1:100;RD1455,α-フェトプロテイン1:300,DakoA008,α1-アンチトリプシン1:100,SigmaA0608。その後細胞はPBSで三回洗浄した。そして、以下の物と結合したTexasRed又はフルオレセインイソチオシアネート結合抗体を用いて2時間室温でインキュベートした:マウスIgGSigma-Aldrich;1のロバ血清を含有したPBSで1:200で希釈、又はウサギIgGJacksonLaboratory,BarHarbor,ME;ロバ血清を含有したPBSで1:400で希釈又はヤギIgGJacksonLaboratory;ロバ血清を含有したPBSで1:400で希釈。結合しなかった二次抗体は、PBSで三回洗浄して除去した。Hoechst33258を最初の洗浄液に添加したSigma-Aldrich;1:10,000。脂質を視覚化するために、脂質特異的な染色であるBODIPYボロン-ジピロメテン;BODIPY登録商標493/503Invitrogen.D-3922を用いた。奇形腫hiPSCは、移植する直前に回収した。約106個の細胞を、8週齢のC.B.-17/GbmsTac-scidbgDFN7雄マウスTaconicMB,ejby,Denmarkの精嚢testicularcapsuleの下に接種した。該マウスは、ケージに入れ、温度を20°C-24°C、50の室内湿度、14時間と10時間との明暗サイクル、適宜飼料と水を与えて、維持した。60日後にマウスを犠牲にし、接種をした精巣をレーザーブレードで均等な切片にカットした。材料を4中性緩衝性のホルムアルデヒドで一晩固定し、アルコールからキシレンへの一連の段階処理を通して脱水化した。前記組織をパラフィン中に包埋し、5μmの連続切片とした。その後、HE染色を行い、特徴について分析した。ヒト由来のエリアを選択するに当たっては、蛍光性のinsituハイブリダイゼーションによって確認したヒト-特異的なプローブ,CEPXY;VysisInc.,DownersGrove,IL。実験は、動物実験に関する地域委員会RegionalCommitteeforAnimalExperimentationStockholm,スウェーデン;DnrN107/06からの許可の下行った。核型分析hiPSCは、10cmディッシュ上でコンフルエントになるまで増殖させた。その後、ディッシュを回収し、中期スプレッドmetaphasespreadを、ケンブリッジ大学病院細胞遺伝学診断用研究室によって得た。hiPSCから肝細胞への分化hiPSCは、5mg/mlのコラゲナーゼIV/ディスパーゼ0.1,Gibco比率1:1v/vの混合液を用いて継代した。その後、過去の文献に記載の通り[16]、CDM-PVA中でウシ胎児血清FBSで予め被覆したプレート上に、又はヒトフィブロネクチンで予め被覆したプレート内に移した。その翌日の間Forthefirstfollowingday、細胞は、CDM-PVA中で以下の物を添加して増殖させた:CHIR990213μM,Stemgent,LY29400210μM,Calbiochem,アクチビン100ng/ml,RDsystems,FGF240ng/ml,RDsystems、及びBMP410ng/ml,RDsystems。そして、hiPSCから原始線条様の細胞への分化を誘導した。翌日、得られた細胞は、CDM-PVA中で以下の物を添加して増殖させた:LY29400210μM,Calbiochem,アクチビン100ng/ml,FGF240ng/ml,RDsystems、及びBMP410ng/ml,RDsystems。そして、決定的な内胚葉への分化を誘導した。3日目には、基礎培地をRPMIGibco1640に変更し、アクチビン100ng/ml,RDsystems,FGF240ng/ml,RDsystems及びB27を添加した。そして、前方胚体内胚葉細胞ADEを得た。その後、肝臓性内胚葉を誘導するために、RPMIGibco1640添加物として、アクチビン50ng/ml,RDsystemsの存在下でADE細胞を5日間培養した。最後に、得られた肝臓性前駆細胞を成熟させるために、細胞を、CMRL/HepatozymeInvitrogen基礎培地添加物として、HGF20μg/ml,PeproTech及びオンコスタチン-M10μg/ml,RD中で増殖させた。フローサイトメトリーアルブミン陽性細胞を検出するため、肝細胞分化プロトコルの最後で、接着細胞をPBSで二回洗浄した。細胞分離バッファInvitrogen,Carlsbad,CA中37°Cで20分間インキュベートした。細胞は、穏やかにピペッティングすることによって分離した。そして、約0.1~1×105細胞/mLの密度で、PBS3正常ヤギ血清NGS含有物として、0.1アジドSerotecLtd.,Oxford,U.K.及び0.1Triton-X中で再懸濁した。その後、一次マウス抗ヒトアルブミン抗体RD1455;100分の1に希釈、又はマウスIgGアイソタイプコントロールBDPharmingenで、細胞を40分間4°Cでインキュベートした。そして、細胞を、FACSCaliburmachineBDBiosciences,SanJose,California,USAで分析した。アルブミン陽性細胞の数は、3つの独立した実験からの平均値として記録した。イオジキサノールOptiPrepAxisShield2010ステップ勾配を用いた細胞内画分、及びEndoH消化dhiPSC由来の肝細胞を6ウェルプレート中で増殖させ、セルスクレイパーで回収した。そして、ボールベアリングホモジェナイザーを繰り返し通すことによって機械的に破壊した。細胞懸濁液を5分間4°Cかつ3000Gで遠心した。上澄みを、希釈して、最終濃度35のOptiPrep液とし、新たな遠心管に移した。前記上澄みの上に、2mlの30OptiPrepと、1mlの0OptiPrepを慎重に連続して層を重ね、遠心管を2時間4°C70,000Gで回転させた。2つの下層の間に形成された液体中間層を、注意深く吸引して、再度、45分間4°C100,000Gで回転させた。形成された連続ペレットを50μlの緩衝剤で再懸濁した。そして、ミクロソーム画分としてラベルした。エンドグリコシダーゼH[EC3.2.1.96,グリコペプチド-D-マンノシル-N4-N-アセチル-D-グルコサミニル2-アスパラギン1,4-N-アセチル-b-グルコサミノヒドロラーゼ]で消化するため、ミクロソーム細胞画分は、500ユニットのEndoH酵素BoehringherMannheim,Mannheim,Germanyで、3時間37°Cで消化した。そして、後述の通り分析を行った。SDSPAGE及びウェスタンブロット法分析サンプル30μlを、10μlの4xローディングバッファ含有物として、10v/vβ-メルカプトエタノール及び4w/vSDSと混合し、8w/vのアクリルアミドSDS-PAGEで分析した。ウェスタンブロット分析を行うため、200mAで2時間、前記蛋白質を、前記ゲルから、イモビロンPメンブレンMilliporeCorp.,Bedford,MAへとブロットトランスファーした。ブロット用のバッファーには、20v/vメタノールを加えた。ブロット後、メンブレンをPBTPBSに0.1v/vのTween20をプラスした物で洗浄した。更に、PBTに5w/vの乾燥スキムミルク粉末を添加した物を用いて、一晩ブロッキングを行った。翌日、前記メンブレンを、PBTミルク中で1:10,000で希釈した抗-α1-アンチトリプシン抗体で1時間インキュベートした。PBTで5分間の洗浄を6回行った。次に、PBTミルク中1:100,000で希釈した抗マウスIgG-ホースラディッシュペルオキシダーゼ抗体で1時間インキュベートした。メンブレンについては、PBTでの5分間の洗浄と、PBSでの15分間の洗浄とを更に6回行った。その後、ECLSuperSignalWestFemtomaximumsensitivitysubstratePierceを使用し、メンブレンをフィルムに曝して現像作業を行った。α1-アンチトリプシン用の酵素結合免疫吸着法ELISAα1-アンチトリプシンに対するアフィニティ精製ウサギポリクローナル抗体Abcam31657,ケンブリッジ,UKを、炭酸重炭酸バッファNa2CO3/NaHCO3、pH9.5中2μg/mlの濃度で用いて、高結合表面COSTAR96ウェルプレートCorning,NY,USAを一晩コーティングした。洗浄0.9w/vNaCl,0.05v/vTween20後、ブロッキングバッファPBS,0.25w/vBSA,0.05v/vTween20で、前記プレートを2時間ブロッキングした。サンプルとしては:培養培地;又は、50μlのNonidet溶解バッファ150mMNaCl,50mMトリス-Cl,pH7.5,1v/vNonidetP-40で溶解させた細胞;、及び標準液血漿精製したM型又はZ型のα1-アンチトリプシンを用いた。そして、これらをブロッキングバッファで希釈し、各ウェルに50μl加えて、2時間インキュベートした。洗浄後、ウェルを、9C5又は2C1モノクローナル抗体1μg/ml、ブロッキングバッファで希釈のいずれかで2時間インキュベートした。結合したモノクローナル抗体は、ウサギ抗-マウスIgGHRPラベル抗体SigmaAldrich,Haverhill,UK,1:20,000を1時間用いて検出した。TMB液体基質SigmaAldrich,Haverhill,UKを用いて10分間暗所で反応を進め、該反応を1MのH2SO4で停止させた。Thermo-maxmicroplatereaderMolecularDevices,Sunnyvale,CA,U.S.A.を用いて、450nmの波長で吸光度を測定した。プロテオソームブロッキングアッセイを行うため、細胞は、回収する前に16時間一晩、6ウェルプレート中で増殖させ、10,000分の1に希釈したMG132AGScientific,USAを培養培地に添加した。コントロールサンプルには、等しい体積量のPBSを加えた。アルブミン用の酵素結合免疫吸着法ELISA細胞培養培地は24時間にわたって収集し、ケンブリッジ大学病院生物化学診断用研究室ラボにて、屋内用ヒトアルブミン特異的ELISAキットBioSupplyUKを用いて、トリプリケートで分析を行った。値は、培養培地1mlの100万個の細胞あたりのngとして表した。シトクロームP450活性Cyp3A4活性アッセイについては、P450-GloアッセイキットPromegaを製造業者の指示に従って使用して、トリプリケートで行った。そして、シトクローム活性は、P450-GloMax96マイクロプレートルミノメーターを使用して分析した。過ヨウ素酸シッフ染色PAS製造業者の指示のガイダンスの下、キットSigma395B-1KTを使用して、トリプリケートで細胞に対してPAS染色を行った。続いてジアスターゼ消化を行い、陽性染色の原因がグリコーゲンの存在であることを確かめた。透過型電子顕微鏡TEM細胞を0.9NaCl溶液で短時間リンスし、温度4°Cで4グルタルアルデヒドで2時間固定した。そして、固定したプレートから、細胞をかきとり、0.1MのPIPESでリンスすることによって再懸濁した。分析はTEMで行った。LDLの取り込みDil-LDL染色キットを提供元からStoughton,MAから購入した。アッセイは、提供元の指示に従って行った。FACS分析は、FH病特有のhiPSC肝細胞中のDil取込と、コントロールHepG2細胞中のDil取込とを比べて行った。GFPレポーター細胞は、過去の文献に記載されているように[16]、APOA-II-GFPレンチウイルスベクターを用いて形質転換し、顕微鏡で検証を行った。グルカゴン刺激に応答する代謝酵素dhiPSC由来の肝細胞は、無血清の高グルコースDMEM培地で6時間培養した培地への添加物として、2mMのL-グルタミン、100U/lのペニシリン、100ug/mlのストレプトマイシン、及び0.5のウシ血清アルブミン全て、Sigma-Aldrichより入手を添加した。細胞を、100nMのグルカゴン23塩酸NovoNordisk,Bagsvaerd,Denmark又はPBSSigma-Aldrichネガティブコントロールとしてで刺激した。刺激して0、1、2、3時間後に、RNeasyKitQiagen,Hilden,Germanyを使用してトータルRNAを回収した。そして、製造業者のガイドラインに従って精製した。逆転写については、製造業者のガイドラインに従って、1ugのRNAに対して、25μlの反応混合物中で行った。反応混合物は、200Uのモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、500ngのランダムプライマー、及び0.5mMのデオキシヌクレオチド三燐酸全て、PromegaWisconsin,MAから入手を含有する。cDNAについては、以下の物を用いてリアルタイム定量PCRを行った:ABI7900detectionシステムAppliedBiosystems,FosterCity,CA;TaqmanPCRMastermixAppliedBiosystems、及び遺伝子特異的なフォワード及びリバースプライマー、並びに蛍光発生プローブ。全ての結果については、ヒト36B4を参照遺伝子として標準化させた。PEPCKHs00159918_m1、G6PHs00609178_m1、及びIGFBP1Hs00426285_m1に関するプライマー及びプローブは、AppliedBiosystemsから、予め製造済みのストックとして購入した。36B4に関するオリゴヌクレオチドは、本発明者側で設計し、Sigma-Aldrich社が合成したフォワード5’-GCAGATCCGCATGTCCCTT-3’;リバース,5’-TGTTTTCCAGGTGCCCTCG-3’;プローブ,5’-[JOEE]AGGCTGTGGTGCTGATG[TAMRA]-3’。A1ATD-hiPSCにおけるZ型変異の修復A1ATD-hiPSCについては、上記説明の通りである。2×106のhiPSCをZFN発現ベクター及びドナーテンプレートでコトランスフェクトした。そして、トランスフェクションから4日後、ピューロマイシン選択1μgml1を開始した。トランスポゾンを除去するため、標的細胞にpCMV-yPBaseYusa,K.,etalPNASUSA108,1531-15362011をトランスフェクトし、4日間培養した。そして、別の培養環境に移し、250nMの1-2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル-5-インドウラシルFIAUで、セレクションをかけた。コロニー形成能力を増加させるために、分離する4時間前、且つプレートにまいて24時間後に、細胞をROCK阻害剤26、Y-2763210μMで、処理を行った。得られたコロニーを2週間後に拾い、PCRで分析し、更にサザンブロット分析で確認を行った。免疫不全のuPAトランスジェニックマウスにおけるhiPSC由来肝細胞様細胞移植全てのマウスは、感染源のない屋内に収容した。動物を使った研究については、パスツール研究所の動物実験に関する委員会、及びフランス農務省の承認を得た。分化した細胞50μlのDMEM中5×105細胞/動物を、3~4週齢のALB-uPA/;Rag2-/-;Il2rg-/-マウスn=7の脾臓に注射した。組織学的分析を行うために移植から2週間後にレシピエントマウスを犠牲にした。血液サンプルを収集し、血漿中のヒトアルブミンの定量をELISABethyLaboratoriesで行った。ヒトアルブミンDako又はヒトA1ATDako特異的な抗体を用いて免疫蛍光を行うことにより凍結肝臓切片を分析した。移植を行っていないマウスをコントロールとして用いた。結果罹患した患者からのhiPSC由来肝細胞の5例については、関連する病気で見られる細胞病理の鍵となる特徴例えば、ミスフォールドされた突然変異体α1-アンチトリプシンが小胞体に蓄積すること;LDL受容体を介したコレステロール取り込みの欠損;、並びに細胞脂質及びグリコーゲン蓄積の上昇を再現することに成功した。hiPSCが、成人細胞における種々の範囲の遺伝性疾患のモデルとして使用できることを示したのは、これらのデータが初めてである。肝臓の遺伝性代謝病IMDを患う患者からのhiPSCライブラリーの生成ある範囲のIMDを有する7人の個体及び3人の健常なコントロールからの皮膚生検試料から皮膚の線維芽細胞を得た20個のhiPSC株、7人の患者、5種類の病気、表1参照。Yamanakaらによって開発された4種類の因子を用いたアプローチ[13]を用いて、これらの体細胞を多能性幹細胞へと再プログラムした。hiPSC誘導の成功率は、個体ごとに0.01~0.1の範囲で極端に変動した。このことは、異なる年齢及び性別の患者から得た皮膚の線維芽細胞において再プログラムする能力が変動することがあること裏付ける。可能である場合には、同一の個体から生じた株の間で存在する分化能力の保存された多様性を決定するために、更なる分析を目的として、1個体につき3つのhiPSC株を連続して用いた。得られたhiPSC株のライブラリ10人の個体からの20種類の株は、以下の事柄で特徴づけた:これらの株の形態、多能性マーカーの発現、三胚葉への誘導物をインビボ及びインビトロで形成する能力、正常の核型、並びに内因性及び外因性の多能性遺伝子の発現プロファイル。全てのhiPSCが内因性の多能性のマーカーを発現し、神経外胚葉、内胚葉及び中胚葉の細胞へと分化することができた。このことは、本発明者らが、体細胞から多能性幹細胞を生成することができたことを裏付ける。興味深いことに、1つの特定の胚葉へ分化する能力が欠如したhiPSC株は存在しなかった。このことは、本研究の為に生成したhiPSC株の分化能力において、大きな違いがなかったことを示している。更に、異常な核型は、所定の化学的条件の下で長期間継代40回増殖させたhiPSCでのみ観察された。このことは、ヒト胚性幹細胞hESC[14]についての文献に記載のごとく、hiPSCを増殖させるために使用される培養システムが、遺伝的安定性に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。そこで、継代数が少ないhiPSC継代数30未満、<p30のみを本研究に用いた。ウイルス組み込みの数は、株や患者間で変化が見られた。このことは、完全な再プログラミングは、ウイルス組み込みの特有のパターンとは関係しない[15]という過去の研究を補強するものである。最後に、外因性導入遺伝子の異所発現は、本発明者らのhiPSC株においては、ほとんど検出されなかった。このことは、多能性幹細胞において、本発明者らのウィルス性ベクターの効率がサイレンシングを起こしたことを示している。まとめると、これらの結果は、本研究のために生成したhiPSC株は、完全に再プログラムされ、従って、IMDを有する患者に由来するhiPSC株のユニークなライブラリを代表する物であること示している。患者特有のhiPSC由来の肝細胞を生成するための確実で簡潔な方法の開発近年、本発明者らは、ヒトES及び正常hiPSCを肝細胞に分化させるための確実性の高いプロトコルを開発した[16]。本発明の培養システムは、患者特有のhiPSC用いて使用するのに最も適した、新規な分化方法の基礎を提供する。本発明者らの主要な目的は、幅広い数のhiPSC株を肝細胞へ効果的に分化させることができる簡潔な方法を開発することであった。健常な個体に由来するhiPSC株n=6;2つの異なる被験体、及びα1-アンチトリプシン欠損を有する個体に由来するhiPSC株n=6;3つの異なる患者を使用して、広い範囲の培養条件で経験則的にスクリーニングを行った。得られたプロトコルを図1に記載した。肝細胞の発生の通常の経路での鍵となるステージの後で、3段階のプロトコルが続く。1番目のステップは、hiPSCを内胚葉細胞へと誘導することからなる。ここで、内胚葉細胞は、Sox17、CXCR4、foxA2及びHexを発現し、これらは、前方胚体内胚葉の特異的マーカーである。そして、前方胚体内胚葉は、肝臓細胞の生成元となるものであり図1b及び1c、CDM-PVA培地添加物として、アクチビン、FGF2、BMP-4及びPI3キナーゼ阻害剤を用いて生成される。得られた内胚葉細胞は、アクチビン及びB27添加物を用いて、肝臓性前駆細胞へと分化させる。肝臓性前駆細胞は、AFP、CK18、CK19、HNF4、及びHNF6図2、3を発現する。最後に、CMRL/肝細胞培養培地混合物添加物として肝細胞成長因子HGF及びオンコスタチン-M中で成熟させる。このことにより、アルブミン及びα1-アンチトリプシンの両方を発現する肝細胞様細胞が25日目までに生じる図2、3及び4。FACS分析によれば、これらの培養条件で生成した80の細胞がアルブミンを発現した図4。このことは、上記アプローチで生成された細胞集団が均一であることを裏付ける。25日目までに、前記細胞は、ヒト肝細胞に非常に酷似した形態を示した。そして、以下の事象をしめした:時折見られる二核性図1;グリコーゲン貯蔵及び頂部の微小突起図5;粗面小胞体及び滑面小胞体ER、並びに顕著なゴルジ体。更に、hiPSC由来の肝細胞は、生来のヒト肝細胞に類似した機能的特徴をインビトロで共有する。即ち、これらの細胞は、グリコーゲンLDLを蓄えることができ、アルブミンを分泌することができ、CytP450経路を介して薬剤を代謝することができ図6、肝細胞特有のApoAIIプロモーターの制御下でGFP蛋白質を発現することができる。更に、外因性再プログラミング因子の発現は、これらの細胞で抑制されたままであり、このことは、分化した後のレトロウイルス性の導入遺伝子はサイレンシングされたままであることを裏付けている。これらのデータは、本発明者らによる培養システムで生成した肝臓細胞の関連する機能的特徴を示す相当量の証拠を提供してはいる。しかしながら、これらの細胞が最終的に分化しているわけではないことも本発明者らは認識している。このことは、AFPの発現が持続していることによって証拠付けされる図2及び3。その代わり、これらの肝細胞は、胎児の胚発生の最初の三ヶ月間の終わりと、及び完全な成人細胞α1-アンチトリプシン遺伝子発現のレベル、及びFACSで確認されるアルブミン発現細胞のパーセンテージで示されるという発生学的な両者位置の間のどこかしらに位置している可能性が高い図1d。本発明者らの培養システムで生成した肝臓細胞は、肝細胞マーカーを発現する例えば、アルブミンALB、α-1-アンチトリプシンAAT、αAPOF、TAT、TDO2、TTR、HNF4α及びHHEX図4A。また、胎児のマーカー例えば、α-フェトプロテインAFP及びCYP3A7の発現も、分化の過程を通じて維持された。その一方で、成人シトクロームCyp3A4の発現は、比較的低いままだった図4A。このことは、これらの細胞が、胎児様肝細胞であることを表し、また、成人細胞を生成するために更なる成熟が必要であることを示唆している。これらの知見は、免疫染色分析及びFACS分析によって裏付けることができる。これらの分析では、ALB、サイトケラチン18、AAT及びAFPが、均質なhomogenous共発現を示している図4B及び4C。しかし、これらの細胞では、肝細胞の機能的特徴も示した例えば:iALB及びAATの分泌図4D、iiデキサメタゾンにより誘導可能なCyp3A4活性図4E、iiiコレステロール取り込み、及びivグリコーゲン貯蓄図4F。最後に、本発明者が観察したところでは、本発明の培養システムは、数多くの株に適用された10人の個体から得た20種類のhiPSC株。肝臓細胞に分化できなかったhiPSC株は2種類のみであった。総合すると、これらの結果は、成熟肝細胞に特有の幾つかの機能的特徴を示す集団であり、均一に近い集団であり、そして、胎児の肝臓性細胞である集団へとhiPSCが分化することを誘導するための、本発明者らによる所定の培養条件が効率的であること示す。患者特有のhiPSCを用いた肝臓病のインビトロモデリング:α1-アンチトリプシン欠損肝臓病をインビトロでモデリングするための、本発明者らのアプローチの有効性については、病気特有のhiPSCdhiPSC由来の肝細胞が、該肝細胞の由来元となった病気の鍵となる特徴を再現できるかどうかを調べることで評価した。本発明者らは、まずα1-アンチトリプシン欠損dhiPSCに着目した。これまでの研究によれば、Z型の対立遺伝子Glu342Lysの結果として、ER内に保持されるα1-アンチトリプシンが秩序だったポリマー形態で形成されることが示されている[17]。これらのポリマーは、肝細胞内に蓄積し、ヘテロ接合体を、新生児の肝炎、肝硬変及び肝臓細胞の癌へとかかりやすくさせる[18]。こうしたα1-アンチトリプシンポリマー化の経路は、臨床上の表現型の中心的なものとなる[17]。そこで、本発明者らは、2C1ポリマー特異的モノクローナル抗体[30]を使用し、α1-アンチトリプシン欠損型のdhiPSC由来の肝細胞内でのポリマーを検出した。ポリマーは、免疫染色図8及びELISA図10分析で検出した。これらのデータが示すところによれば、α1-アンチトリプシンポリマーの蓄積は、α1-アンチトリプシン欠損を有する個体から得たdhiPSC由来の肝細胞でのみ発生した。コントロール被験体から得たhiPSC由来の肝細胞内では、ポリマーは存在しなかった。前記ポリマーの細胞内の局在については、以下の手順で確認した、即ち、細胞の細胞内画分を得て、その後、エンドグリコシダーゼH図9で消化した。該酵素は、高マンノースER形態であるN-結合型グリカンを除去し、且つゴルジ体内でシアル酸付加した後の多糖類鎖に影響しない酵素である。エンドグリコシダーゼH処理により、患者特有のhiPSC由来の肝細胞における全ての細胞内α1-アンチトリプシンが、単一の50-kDaのバンドに減少分解した。しかし、コントロールのhiPSC由来の肝細胞では減少しなかった。このことは、こうした全ての細胞内α1-アンチトリプシンがER内に保持されたことを示している。重要なこととして、同一の患者から採取した3種類の異なるhiPSC株間では、一貫してポリマーの増加が観察された。しかし、患者が異なる場合のhiPSC株間では違いが見られた。こうした表現型の多様性は、患者の病状と相関しうるものであり、従って、該病気の臨床上の特徴を反映している可能性がある。しかし、A1ATD患者2に由来するhiPSC株について観察したところ、ポリマーの発現レベルは低かった。また、該細胞では特に内胚葉分化に対して抵抗性であった。従って、本研究において観察された病気の表現型の多様性は、肝臓への効率的な分化を達成するhiPSCの能力を主に反映している。最後に、将来的なインビトロでの薬剤スクリーニングを目的とした、本発明の細胞株の潜在的な応用について調査するため本発明者らは、プロテアソーム阻害剤MG132を培地に一晩添加したことによる効果を評価した。この重要な蛋白質分解経路をブロックすることにより、α1-アンチトリプシンポリマーが病気特有の細胞内増加を示すことが明らかとなった図10。総合すると、これらの結果により、dhiPSC由来肝細胞は、インビトロにおいて、α1-アンチトリプシン欠損の病理学上の鍵となる特徴をモデリングする能力があり、また、将来的な薬剤スクリーニングアッセイにおいて有用なものとなる可能性があることが示された。患者特有のhiPSCを用いた肝臓病のインビトロモデリング:家族性高コレステロール血症本発明者らの培養システムが臨床上の病気をモデリングする能力を確認すること、他の細胞内の局在に特有の病気プロセスを検証できる可能性について調査することを目的として、家族性高コレステロール血症FHを有する1人の個体から得たdhiPSC由来の肝細胞の特徴を分析した。FHにおける原始的な欠陥は、LDL受容体の機能が損なわれることにある。この結果として、血漿でのLDLが過剰となり、未成熟なアテローマとなる[19]。FHを有する個体から生成したdhiPSC株は、肝細胞へと分化して、典型的な機能的特徴を示す図11。分化した細胞をウェスタンブロット法で分析したところ、LDL受容体が欠損していることを確認した。こうした受容体の欠陥によるインビボでの機能は、免疫染色及びFACS分析で示すように、本発明者らのモデルにおいても、保存されて表現されている。このことは、FH-dhiPSC由来の肝細胞は、LDLを取り込む能力が欠損していることを示す図12。これらの結果は、FHをモデリングためにdhiPSCを使用することに成功する可能性を示しており、従って、膜を通る蛋白質輸送や受容体機能不全に関わる他の病気のモデリングにも適している可能性があることを示している。患者特有のhiPSCを用いた肝臓病のインビトロモデリング:糖原病1a型GSD-1a最後に、本発明者らは、サイトゾルでの代謝の欠損を表す病状のモデリングを行うためのアプローチを用いた。GSD-1aは、グルコース-6-ホスファターゼの欠陥によって引き起こされる。該酵素は、グルコース-6-リン酸をグルコースとリン酸とに加水分解する反応を触媒する主な酵素であり、該反応は、糖新生及びグリコーゲン分解の最終ステップである。GSD-1aを有する個体は、グルコースのホメオスタシスを維持することができず、以下のような症状を経験することとなる:高脂質血症、乳酸アシドーシス、高尿酸血症、低血糖、肝腫脹、腎腫大、及び成長遅延[20]。1つの被験体に由来する3種類のGSD-1a株を分化させ、得られた細胞については、これらの肝細胞に類似の性質についての特徴分析を行った図13。過ヨウ素酸シッフ染色を行ったあとで、細胞内の病気の表現型を確認した。GSD1aの病状のdhiPSC由来の肝細胞では、コントロールと比べると、細胞内グリコーゲンの蓄積量が有意に大きいことが明らかになった図14。更に、同細胞は、過剰な脂質蓄積図15、及び過剰な乳酸の製造図17といった、前記病気に関する他の特徴も再現した。重要なこととして、前記細胞においては、グルカゴンで刺激した後、3つの標準的なグルカゴン応答性遺伝子の発現が誘導された図16[21][22]。これらの結果が示すところによれば、GSD1aの鍵となる細胞の態様をインビトロでモデリングできるだけでなく、本発明者らの培養システムで生成した肝細胞は、中間代謝の鍵となるホルモンに対する少なくとも幾つかの応答を示すことができる。従って、本発明者らのアプローチは、他のより一般的な代謝異常のモデリングに応用できることを示唆している。数多くのhiPSC株を成熟した肝臓の状態の細胞へと効率的に分化させることを可能にするシンプルな所定の化学的培養システムを開発することにより、非神経由来の病気群該病気は表現型が成人細胞内での複雑な蛋白質調節不全の結果となる病気であるをモデリングを本発明者らは示した。本発明者がモデリングした3種類の病気は、多様な範囲の病理学上の機構を包含しているER内での蛋白質のミスフォールディングから、細胞表面受容体機能不全まで、そして、最後は、サイトゾルの代謝の阻害。それにより、本発明の新規のプラットフォームを他の研究領域へと開拓するための幅広い応用できる可能性が潜在することを示す。本発明者らのモデリングシステムの可能性については、その最たる例として、一群の病気の中から最もありふれており、非常に特徴の分析が行われている病気である、α1-アンチトリプシン欠損を最初に検討する。これまでの研究では、ミスフォールディングが起こること、及びZ型ポリマーがER内にトラップされることが、臨床上の表現型のメカニズムとして存在していることが示されている[17]。しかし、同じ遺伝子型を有する個体間で示す表現型が変化することについては未だ説明がついていない。こうした変化は、ミスフォールドされた蛋白質を取り扱う能力が患者で異なることが原因となっている可能性がある[23][24][8][9,18][7]。こうした蛋白質の処理を担う、肝細胞に特異的な質的コントロールのメカニズムは、今日こんにち明らかになりつつある[25,26]。こうした経路の1つであるプロテオソームは、幾つかの肝臓性細胞株[27]及び肝臓外のほ乳動物の細胞株[28]において、Z型α1-アンチトリプシンを代謝する際に重要な役割を果たしている。しかし、これらのプロテオソームは、ヒト肝細胞のプロテオソームにおいて、蛋白質の取り扱いを近似できるに過ぎない。更に言えば、蛋白質分解経路に関する我々の理解が深まってきているものの、Z型のα1アンチトリプシンの蓄積がどのようにして細胞死や肝臓不全を引き起こすのかについては依然として不明である。こうした不明点に対する我々の理解や、及び類似の蛋白質のミスフォールディング異常の原因として重要となる他の関連機構とに対する我々の理解を深めることを目的として、ヒト肝細胞に特有の蛋白質分解経路を解明することは、次の段階の研究として重要である。患者特有のhiPSC由来の肝細胞であって、病気特有の蛋白質のポリマー化及びER内トラップの中核となる要素を保存することができる肝細胞を生成することによって、そして、この新規なインビトロの細胞システムを用いることによって、こうした精巧な細胞内プロセスを潜在的に研究できることを本発明者は本明細書に示している。更に、本発明者らのデータは、高ストレス即ち、エキソビボでの再プログラミング及び分化プロトコルは細胞に対して影響を及ぼす可能性がある[8,24]であることにも関わらず、同細胞内プロセスを正確に保存できることも示している。続いて、本発明者らのモデリングシステムを用いて、他の2つの病気について評価したが、該評価により、肝細胞における蛋白質の機能不全の下流への影響が、dhiPSCを用いた患者特異的な態様内でも保存されていることが強く示された。まず、本発明者らは、LDL脂質を肝細胞内へ取り込むことを仲介するLDL受容体の欠損を再現することにより、家族性高コレステロール血症に関する新たな細胞モデルを確立することに成功した。前記FHモデルは、受容体機能不全核合成から、ERを介した輸送まで、果ては細胞膜のリサイクルまでを支配する肝細胞に特有で生来のプロセスの全体像holisticimpressionを提供するために、いかにして本発明のプラットフォームがユニークに構築されるかを示している。本発明のプラットフォームは、広範囲の肝臓に関連する受容体の病気receptoropathiesの研究へと更にフォローアップするのに非常に適している可能性がある。hiPSC由来の肝細胞における遺伝的欠陥の修復本発明者らは、次に、α1-アンチトリプシン欠損A1ATDを有する個体に由来するhiPSCにおいて、piggybacktransposonsを用いて、変異の修復を行ったYusaetal2011PNASUSA1081531-1536;Wangetal20081059290-9295。A1ATDは、北欧系において2000人に1人の割合で見られる染色体劣勢異常であり、最もありふれたものとして肝臓の遺伝的代謝疾患を代表するものであるPerlmutter,D.H.CellDeathDiffer16,39-452009;Gooptu,B.Lomas,D.A.AnnuRevBiochem78,147-1762009。該病気は、A1AT遺伝子の単一の点突然変異Z型対立遺伝子;Glu342Lysから生じる。そして、該変異により肝細胞の小胞体内で、前記蛋白質の秩序だったポリマー形成を引き起こす。結果として肝硬変を引き起こし、現在唯一の治療法は、肝臓移植のみである。主に、ドナー不足の深刻化や、免疫抑制治療による有害な効果によって、臓器移植が大きく制限されている。従って、hiPSCに基づく治療法の可能性は、大いに魅力的なものとなる。本発明者らはZFN技術を用いた。該技術は、hESC並びにhiPSCにおいて遺伝子ターゲティングを刺激するUrnov,F.D.etal.NatRevGenet11,636-6462010、Hockemeyer,D.etal.NatBiotechnol27,851-8572009;Zou,J.etal.CellStemCell5,97-1102009。Z型変異のサイトを特異的に切断するようにZFNペアを設計した。ターゲティングベクターを、PGK-puroΔtkカセットに隣接するpiggyBacリピートとともに同質遺伝子型のDNAから構築した。突然変異部位と、piggyBacトランスポゾンの間の隔たり違いを最小限にするため、変異部位の10bp上流にあるCTGロイシンコドンを、TTAロイシンコドンに変更した。この結果、TTAA配列が生じた。なお、この配列は、piggyBac除去の後もゲノムの中に残る。ZFN発現ベクター及びターゲティングベクターをエレクトロポレーション法で共に導入し、その後、ピューロマイシン耐性hiPSCコロニーを得た。そして、PCRを用いて、ターゲットクローンのスクリーニングを行った。3人の異なる患者に由来するA1ATD-hiPSC株を用いてテーゲットクローンを生成した表4。特筆すべきこととして、54のピューロマイシン耐性コロニーでは、対立遺伝子を片方だけターゲッティングしていた。一方で、対立遺伝子両方を同時にターゲティングしたのは4であった。piggyBac隣接選択カセットを、これら改変クローンから除去するため、本発明者らは、高活性形態のpiggyBacトランスポザーゼYusaetal2011supraを2つのホモ接合体のターゲットクローンB-16及びC-G4に一時的にトランスフェクトした。そして、これらのクローンをFIAU選択にかけた。得られたFIAU耐性コロニーの遺伝子型を、PCRで分析し、サザンブロットで確認した。11のFIAU耐性コロニーで、2対の対立遺伝子の除去が観察された表5。配列を分析したところ、Z型変異は、両方の対立遺伝子上で修復されており、当初の計画通り、トランスポゾン除去により、TTAA配列が生じていた。得られた修復済みのA1ATD-hiPSCc-hiPSC株は、20回を超える継代の間、多能性のマーカーの発現を維持した。そして、三胚葉のマーカーを発現する細胞へと分化する能力を維持していた。このことは、ゲノム改変によって、c-hiPSCの多能性が変化しなかったことを示している。本発明者らは、比較ゲノムハイブリダイゼーションCGHを用いて、hiPSC株のゲノムの一貫性を分析した。A1ATD-hiPSC初期株3種のうち2種が、親の線維芽細胞とは異なっており、20kb~1.3Mbの範囲で、増幅や欠損を示していたhESCで頻繁に増幅が起こる領域である20q11.21でのゲインを含むLefort,N.etal.NatBiotechnol26,1364-13662008;Spits,C.etal.NatBiotechnol26,1361-13632008。株Aは、該株の親の線維芽細胞と比べると、通常のゲノム量を保持していた。ZFNがターゲティングを刺激した後、6種類のホモ接合体クローンのうち、4種類では、これらの種の親のhiPSC株と比べるとゲノムに変化がないことを本発明者は確認して安心を得た。二対立遺伝子のpiggyBac除去が行われた16種類の細胞株を、これらと対応する初期のhiPSCを比較した。そして、12種類でゲノムに変化が無かった。また、本発明者はhiPSC株をSNPアレイにより分析し、異型接合性が失われたかどうかについてチェックした。そして、分析した全ての株の全ゲノムで、異型接合性を維持していたことを見出した。こうした知見が示すこととして、二対立遺伝子の遺伝子修復は、同時に相同組換えが起こり、続いて、両方の対立遺伝子が同時に削除された結果起こったものであり、これらのプロセスにおいては有糸分裂組換は関与していなかった。本発明者らは、修復されたB-16-C2株、及び該株の親の線維芽細胞のエクソーム解析を行った。これらのエクソームの比較により、29種類の変異を特定した。これらの変異の発生については、初期のhiPSC株と、ホモ接合体のターゲット中間体を分析して決定した。24箇所の点突然変異と、1つの1bpの欠損を、初期のhiPSC株で検出した。そして、遺伝子修復の間、4つの変異が発生した:1つは、ターゲティングの間に発生し、後の3つは、piggyBac除去の間に発生した。これらの遺伝的署名GenomicSignatureは、ZFNのオフ-ターゲットサイト、又はpiggyBac組み込みサイトとも一致しないため、これらの変異は、明らかに培養中に発生したものである。総合すると、本発明者らは、ZFNをpiggyBacと組み合せることにより、hiPSCの基本的な特徴に影響を与えることなく、該hiPSCにおいて迅速且つクリーンに点突然変異を修復することが可能になると結論付けた。hiPSCの遺伝的修復により、予想通りの表現型修復が得られることを確認するべく、hiPSCこれらの主な細胞種は、病気A1ATDの影響を受けているを、インビトロで肝細胞様細胞へと分化させた。修復した株を分化させたところ、予想通り、ほぼ同質の肝細胞様集団が生じた。特筆すべきこととして、分化細胞をCGH分析したところ、肝臓への分化によって、遺伝的な異常の数を増加させることもなく、また、異常な核型を有する細胞へと選択されることもなかった。得られた細胞は、これらのインビボでの対応物と共通する形で、鍵となる機能的属性を有していた該属性として、グリコーゲン貯蓄、LDL-コレステロール取り込み、アルブミン分泌、及びシトクロームP450活性が挙げられる。重要なこととして、c-hiPSC由来肝細胞様細胞において、突然変異ポリマー性A1ATが存在せず、代わりに、エンドグリコシダーゼ-H非感受性である通常のモノマーA1ATを効率的に分泌することが、免疫蛍光及びELISAの両方で示された図19A-D。更に言うと、分泌されたA1ATは、正常な成人肝細胞から得られた物に匹敵する酵素的阻害活性を示した図19E。かくして、酵素阻害活性の生理学的回復が達成できたことが示された。最後に、ALB-uPA/;Rag2-/-;Il2rg-/-マウスの肝臓へ脾内注射により移植した後、c-hiPSC由来肝細胞様細胞B-C16-2株のインビボでの機能を評価した。注射して14日後に肝臓を回収した。そして、ヒト細胞がコロニー化しているのが見出された。これについては、ヒトアルブミン及びA1ATに特異的な抗体で特定した図19F、G。これらヒト肝細胞様細胞は、肝臓の各葉全体に分散していた。そして、既存のマウス柔組織に組み込まれているのが観察された図19F、G。更に言うと、ヒトアルブミンが、少なくとも5週間の間、移植した動物の血清中で検出された図18H。一方で、どのマウスでも腫瘍の形成は検出されなかった。従って、c-hiPSC由来肝細胞様細胞は、インビボ肝臓で、コロニーを形成することができ、ヒトESC由来の該当物に特徴的な機能的活性を示したTouboul,T.etal.Hepatology51,1754-17652010。纏めると、これらの分析から、Z型変異を遺伝的に修復することにより、患者由来の細胞におけるA1ATの機能を回復させることができることが示された。上述した実験証拠により、A1ATDの細胞ベースの治療を目的とした、患者特有のiPSCにおける遺伝的修復へ応用できる可能性が示された。遺伝的修復は、より臨床面から関係の深い細胞において、線維芽細胞から再プログラムされた患者特有のiPSCを用いて、センダイウイルスベクター組み込みを行わない方法で繰り返し行われてきたFusaki,N.,etal.ProcJpnAcadSerBPhysBiolSci85,348-3622009。CGH分析により、未修復のゲノムを有することが分かっている初期のhiPSC株は、上述した方法で修復した。最終生成物であるiPSC-3-G5-A7は、修復されたA1ATを有し、親の線維芽細胞を比べると無傷のゲノムを有しており、肝細胞様細胞へと分化した際には、通常のA1AT蛋白質を発現した。変異修復済みの患者特有のiPSCを生成できることを示したのは今回が初めてである。修復されたiPSCは、効率的に肝細胞様細胞へと分化し、また、腫瘍を形成することなく、肝臓損傷の動物モデルへと移植された。更に言えば、異なる患者に由来するhiPSCが効果的に修復することができ、このことは、本発明の方法が多数のA1ATD-hiPSC株に適用可能であることを示している。2対の対立遺伝子の修復が4ヶ月未満で行うことができたことから、本発明者らのアプローチは、A1ATDのみならず、他の単一遺伝子性の異常についても修復された患者特有のhiPSCを大規模に生成することに適合できる可能性がある。結論として、本研究は、幾つかの意味で、hiPSCの分野を発展させるものとなった。第一に、成人細胞に影響を及ぼす異なる病気を、単一のプラットフォームを用いて、モデリングできる可能性があることを示した。このことは、hiPSC病気のモデリングの分野において、最も差し迫った問いに対する答えの一つとなった。従って、これらの実現化により、多様な研究分野への潜在的な応用のための、確実で、容易で、再現性の高い技術的資源を提供することが可能となった。第二に、種々の遺伝的及び病理的背景を有する多数の患者から、hiPSC由来の肝細胞を生成することができることを示した。このことにより、本発明者らのシステムは、肝臓を標的とし、且つ医薬産業に潜在的に関連する化合物について、早期段階での安全性や治療用スクリーニングを行うための効率的且つ新規の方法となることが示された。最後に、そして、おそらく最も重要なこととして、細胞ベースの治療法に理想的な肝細胞であり、ある群の病気を有する多数の患者特異的な肝細胞を均一に生成する能力があることを示した。このことは、患者特有のhiPSC技術を提供するための別途重要なステップを本発明者らが再度踏み出したことを示している。参考文献1.Saha,K.andR.JaenischCellStemCell,2009.56:p.584-595.2.Park,I.H.Cell,2008.134:p.877-886.3.Maehr,R.,etal.PNAS2009.10637:p.15768-15773.4.Dimos,J.T.Science,2008.321:p.1218-1221.5.Lee,G.,etal.Nature,2009.4617262:p.402-406.6.Ebert,A.DNature,2009.457:p.277-280.7.Balch,W.E.,etal.Science,2008.3195865:p.916-919.8.Pan,S.,etal.Hepatology,2009.501:p.275-281.9.Perlmutter,D.H..CellDeathDiffer,2008.161:p.39-45.10.Enns,G.M.etalMolecularGeneticsMetabolism.951-2:3-10.11.Fisher,R.A.etalTransplantation,2006.824:p.441-9.12.Guillouzo,A.etalExpertOpiniononDrugMetabolismToxicology,2008.410:1279-1294.13.Takahashi,K.andS.YamanakaCell,2006.126:p.663-676.14.Brons,I.G.,etalNature,2007.4487150:p.191-5.15.Chin,M.H.,etal.CellStemCell,2009.51:p.111-123.16.Touboul,T.,etal.Hepatology,2009.9999999A:p.NA.17.Gooptu,B.etalAnn.Rev.Biochem.2009.781:p.147-176.18.Perlmutter,D.H.PediatrRes,2006.60:p.233-238.19.Rader,D.J.etalJ.Clin.Invest.2003.11112:p.1795-1803.20.Shieh,J.-J.,etal.J.Biol.Chem.2002.2777:p.5047-5053.21.Salavert,A.etal.J.Biol.Chem.1982.25722:p.13404-13412.22.Dentin,R.,etal.Nature,2007.4497160:p.366-369.23.Piitulainen,E.,etalChest,2005.128:p.2076-2081.24.Wu,Y.,etal.ProcNatlAcadSciUSA,1994.91:p.9014-9018.25.Cabral,C.M.,etalJ.Biol.Chem2000.27532:p.25015-25022.26.Cabral,C.M.,etal.Mol.Biol.Cell,2002.138:p.2639-2650.27.Teckman,J.H.,etal.J.Biol.Chem2001.27648:p.44865-44872.28.Qu,D.,etal.J.Biol.Chem.,1996.27137:p.22791-22795.29.Vallier,L.,etal.StemCells,2009.9999999A:p.N/A.30.Miranda,E.,etal.,inpress-Hepatology"