"軟骨細胞の同化刺激作用を誘導する化合物の同定方法であって、化合物を、配列番号101~128及び401~594からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させることと、軟骨細胞の同化刺激作用に関係する化合物-ポリペプチドの特性を測定することを含む、前記方法。前記ポリペプチドがインビトロ無細胞調製物内にある、請求項1記載の方法。前記ポリペプチドが哺乳動物細胞に存在する、請求項2記載の方法。前記特性が、前記ポリペプチドに対する前記化合物の結合親和性である、請求項1記載の方法。前記特性が、軟骨細胞の同化刺激作用の指標となる生化学的マーカーを産生する生物学的経路の活性化である、請求項3記載の方法。前記指標が、コラーゲンII型、アルファ-1col2α1及びアグリカンからなる群から選択される、請求項5記載の方法。前記ポリペプチドが、配列番号101~128からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項6記載の方法。前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリーの化合物及び配列番号101~128及び401~594からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと結合親和性を有する化合物からなる群から選択される、請求項1記載の方法。前記化合物がファージディスプレイライブラリー又は抗体断片ライブラリーのペプチドである、請求項2記載の方法。アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉RNAsiRNAからなる群から選択される、軟骨細胞の同化刺激作用を誘導する薬剤であって、配列番号101~128及び401~594からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然ポリヌクレオチド配列と相補的であるか、又はそれから操作された核酸配列を含む、前記薬剤。ポリペプチドが、配列番号101~128からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項10記載の薬剤。哺乳動物細胞のベクターが前記薬剤を発現する、請求項11記載の薬剤。前記ベクターがアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクターである、請求項12記載の薬剤。前記アンチセンスポリヌクレオチド及び前記siRNAが、センス鎖に相補的な17~25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号101~128からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列の17~25の連続したヌクレオチドから選択された、請求項10記載の薬剤。前記siRNAが前記センス鎖をさらに含む、請求項14記載の薬剤。前記センス鎖が、配列番号1~28からなる群から選択される核酸配列の17~25の連続したヌクレオチドから選択された、請求項15記載の薬剤。前記siRNAが、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖を接続するループ領域をさらに含む、請求項16に記載の薬剤。前記ループ領域が、配列番号201で定義される核酸配列を含む、請求項17記載の薬剤。前記薬剤が、配列番号202~315からなる群から選択されるポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を含むアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム又はsiRNAである、請求項18記載の薬剤。請求項10に記載の薬剤の治療的有効量を医薬として許容し得る担体との混合物中に含む、軟骨細胞の同化刺激作用を増強する、医薬組成物。軟骨の全身的又は局所的減少を伴う疾患の、その疾患に患っているか又は感受性の対象における治療及び/又は予防方法であって、前記対象に請求項20記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。前記疾患が、骨関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、痛風関節炎、敗血性又は感染性関節炎、反応性関節炎、反復交感神経ジストロフィー、疼痛性ジストロフィー、ティーツェ症候群又は肋骨軟骨炎、繊維筋痛症、骨軟骨炎、神経性又は神経障害性関節炎、関節症、変形性骨関節炎風土病、ムセレニMseleni病、ハンディゴデュHandigodu病、骨関節炎から生じた変性症、全身性エリテマトーデス、強皮症、強直性脊椎炎、遺伝性軟骨融解、軟骨形成不全、偽軟骨異形成、小耳症、無耳症及び骨幹端軟骨異形成症からなる群から選択される、請求項21記載の方法。前記疾患が変形関節炎である、請求項22記載の方法。平均軟骨厚の減少を伴う疾患の治療及び/又は予防のための医薬品の製造における、請求項10~19記載の薬剤の使用。前記疾患が、骨関節炎、悪性の高カルシウム血症、多発骨髄腫、副甲状腺機能亢進及び甲状腺機能亢進症からなる群から選択される、請求項24記載の使用。前記疾患が骨関節炎である、請求項25に記載の使用。軟膏細胞が再分化するのに十分な時間、脱分化した軟骨細胞を、配列番号1~28からなる群から選択されるポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と接触させ、それによって軟骨基質を生成することを含む、軟骨組織のインビトロ産生方法。軟骨細胞及び脱分化軟骨細胞の混合物を基質に適用して、細胞基質を形成することと、前記細胞を、配列番号202~315からなる群から選択されるポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を含むポリヌクレオチド配列と接触させ、それによって連続的軟骨基質を生成することとを含む、請求項27記載の方法。対象において平均軟骨厚の全身的又は局所減少を伴う病的状態又はその病態に対する感受性を診断するための方法であって、前記対象から得られる生体試料中に存在する配列番号101~128及び401~594からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの第1の量を測定することと、前記第1の量を健康者集団で測定されるポリペプチド量の範囲と比較することとを含み、健康者で測定した量の範囲と比較した前記生体試料中のポリペプチドの量の増加は前記病的状態の存在を示すものである、前記方法。軟骨細胞の脱分化を伴う病理状態の診断方法であって、ゲノムDNA試料中において配列番号1~28の遺伝子のいずれか1つの核酸配列を決定する段階と、段階aの配列と健康な対象の核酸配列とを比較する段階と、病理学的状態に関連するいかなる違いも確認する段階を含む、前記方法。軟骨細胞の脱分化を伴う病理状態の診断方法であって、試料中において配列番号101~128のポリペプチドのいずれか1つの量を測定する段階と、段階aで測定した量と健康体の試料における前記ポリペプチドの量とを比較する段階とを含み、このとき前記健康体の試料と比較して増加していることが前記病理学的状態の開始又は存在を示す、前記方法。前記病理状態が骨関節炎である、請求項31記載の方法。本発明は、軟骨細胞の同化刺激作用を導く軟骨合成プロセスを誘導する化合物の同定方法に関するものであり、この方法は、化合物を、配列番号101~128及び401~594からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれらの機能的断片若しくは誘導体と、前記ポリペプチドが前記化合物に結合するのを可能にする条件下で接触させることと、軟骨細胞の同化刺激作用に関連した化合物-ポリペプチドの特性を測定することとを含む。本発明はまた、発現抑制剤、同剤を含む医薬組成物、インビトロにおける軟骨組織の産生方法及び前記抑制剤を発現する宿主細胞に関する。本発明の方法の態様は、ターゲットのポリペプチドを使用した化合物のインビトロアッセイ並びにターゲットを阻害してからコラーゲンII型、アルファ-1col2α1及びアグリカンレベルを含む効果指標を観察する細胞アッセイを含む。本発明の他の態様は、効果的に軟骨形成を促進する量のターゲット阻害剤を含む医薬組成物を投与することによって、軟骨細胞の脱分化及び/又は軟骨厚の減少に関係する病気に罹患した、又は罹患しやすい対象におけるそれらの病気を治療又は予防する方法である。本発明の他の態様は、前記阻害剤が、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉RNAsiRNAからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含み、前記阻害剤が、配列番号101~128及び401~594からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然ポリヌクレオチド配列と相補的であるか、又はそれから操作された核酸配列又はその断片を含む、前記方法で使用するための医薬組成物である。本発明のさらに他の態様は、医薬として許容し得る担体と混合した治療上効果的に軟骨形成を促進する量のターゲット阻害剤又はそれらの医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和化合物若しくはプロドラッグを含む医薬組成物である。本発明のポリヌクレオチド及びターゲット阻害剤化合物はまた、軟骨細胞の脱分化及び/又は軟骨厚の減少が関与する病気を治療するための医薬品の製造に有用である。さらに、本発明はまた、診断方法に関する。以下の用語は、本明細書において以下の定義に従って使用される:用語薬剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び小分子を含む任意の分子を意味する。用語軟骨細胞の同化刺激作用は、軟骨形成の誘導又は軟骨細胞の同化活性の誘導若しくは増強と理解すべきである。同化刺激作用は、例えば、軟骨成分合成を刺激することによって、又は軟骨合成に必要な成分の合成を誘導することによって生じる。軟骨細胞の同化刺激作用はまた、マトリックスGlaタンパク質MGPの発現が誘導されるプロセスと理解することができる。軟骨細胞の同化刺激作用はさらに、軟骨由来のレチノイン酸感受性タンパク質CD-RAPの発現誘導、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質COMPの発現誘導、アグリカン1agc1、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質1又はCSPG1とも称するの発現誘導、又はコラーゲン、II型、アルファ-1col2α1、軟骨のコラーゲン、コンドロカルシン及びコラーゲン、xi型、アルファ-3col11α3としても知られるコラーゲンIIの合成誘導として理解することができる。用語アンチセンス核酸は、遺伝子の発現を減少させるように、塩基対合によって標的の発現に関与する特定の相補的核酸配列と相互作用するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドのことである。遺伝子の発現に関与する特定の核酸配列はゲノムDNA分子又はこの遺伝子の一部をコードするmRNA分子であることが好ましい。このゲノムDNA分子は、遺伝子の調節領域又は成熟遺伝子のためのコーディング配列を含むことができる。用語アッセイは、化合物の特定の特性を測定するために用いられる任意の方法を意味する。スクリーニングアッセイは、化合物の集団からそれらの活性に基づいて化合物の特徴を明らかにするかそれらを選択するために用いられる方法を意味する。用語結合親和性は、2つ以上の化合物が互いに非共有結合でどの程度強く結合するかを記述する特性である。結合親和性は、質的に例えば強い、弱い、高い又は低い、或いは量的に例えば、KDの測定特徴付けることができる。用語担体は、医薬組成物に媒体、嵩及び/又は使用可能な形態を提供するために医薬組成物の製剤で用いる無毒性材料を意味する。担体は賦形剤、安定剤又は水性のpH緩衝溶液などのそのような材料の1つ又は複数を含むことができる。生理的に許容できる担体の例としては:リン酸、クエン酸及び他の有機酸を含む水性又は固体の緩衝成分;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子約10未満残基ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物、EDTAなどのキレート剤;マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの塩形成対イオン;並びに/或いはTWEEN商標、ポリエチレングリコールPEG及びPLURONICS商標などの非イオン性界面活性剤である。用語複合体は、2つ以上の化合物が互いと結合するときに形成される実体を意味する。用語化合物は、本明細書では本発明のアッセイと関連して記載される試験化合物又は薬剤候補化合物との関連で用いられる。そうしたものとして、これらの化合物は合成又は天然供給源由来の有機又は無機の化合物を含む。化合物には、無機又は有機の化合物、例えば比較的低分子量を特徴とするポリヌクレオチド、脂質又はホルモン類似体が含まれる。他のバイオポリマー有機試験化合物としては、約2から約40のアミノ酸を含むペプチド及び約40から約500のアミノ酸を含むより大きなポリペプチド、例えば抗体若しくは抗体複合体がある。アンチセンスオリゴヌクレオチド及び方法における、用語ヌクレオチド配列に相補的は、細胞中で、すなわち、生理学的条件下で、配列に対するハイブリダイズを可能にするようにそのような配列に十分相補的であると理解するべきである。用語病態又は疾患は、症状すなわち病気の明白な提示又は異常な臨床指標例えば生化学指標の現れを意味する。或いは、用語疾患は、そのような症状又は異常な臨床指標を起こす遺伝的若しくは環境的リスク又はその傾向を指す。用語接触又は接触させるは、インビトロ系であれインビボ系であれ、少なくとも2つの部分を一緒にすることを意味する。用語脱分化は、軟骨成分を合成するという細胞表現型から離れて軟骨細胞が分化する一般的なプロセスのことである。このような成分には、限定はしないが、コラーゲンII、アグリカン1、バーシカン、リンクタンパク質、パールカン、SZP/ルブリシンlubricin、バイグリカンDS-PGI、デコリンDS-PGII、エピフィカンDS-PGIII、フィブロモデュリン、ルミカン、CILP、C型レクチン、フィブロネクチン、PRELP、COMPトロンボスポンジン-5、トロンボスポンジン-1及び-3、CMPマトリリン-1、マトリリン-3、C型レクチン、フィブロネクチン、コンドロアドヘリン、テネイシン-C、フィブリリン、エラスチン、gp-39/YKL-40、マトリックスGlaタンパク質/MGP、プレイオトロフィン、コンドロモデュリン-I/SCGP、コンドロモデュリン-II、CD-RAP、コンドロカルシン、PARP、リゾチーム及びホスホリパーゼA2が含まれる。用語有効量又は治療的有効量は、医師又は他の臨床医によって探求されている対象の生物学的又は医学的な反応を導き出す化合物又は剤の量を意味する。特に、軟骨細胞の同化刺激作用の誘導に関して、用語有効量は、軟骨細胞同化の増加プロセスを表す軟骨細胞マーカーのレベルの生物学的に意味のある増加をもたらす化合物又は因子の効果的分化促進量を意味するものとする。用語発現可能な核酸は、タンパク性分子をコードする核酸、RNA分子又はDNA分子を意味する。用語内因性とは、哺乳類が自然に産生する物質を意味する。用語プロテアーゼ、キナーゼ又はGタンパク質結合受容体GPCRに関して内因性とは、それが哺乳類例えばそれには限定されないがヒトによって自然に産生されるものを意味する。対照的に、この関係における用語非内因性は、哺乳類例えばそれには限定されないがヒトによって自然に産生されないものを意味する。両用語は、インビボ及びインビトロ系の両方を記載するために用いることができる。例えば、それらには限定されないが、スクリーニング手法において、内因性又は非内因性のターゲットはインビトロスクリーニング系に関することでよい。それには限定されないが他の例として、哺乳類のゲノムが非内因性のターゲットを含むように操作された場合、インビボ系による候補化合物のスクリーニングが有効である。用語発現は、トランスダクションによる内因性の発現と過剰発現をどちらも含む。用語発現抑制剤は、正常に細胞内で発現する特定のポリペプチド又はタンパク質の転写、翻訳及び/又は発現に選択的に干渉するように設計されたポリヌクレオチドを意味する。より詳しくは、発現抑制剤は少なくとも、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードするポリリボヌクレオチド配列中の少なくとも約17の連続したヌクレオチドと同一であるか相補的なヌクレオチド配列を含む、DNA又はRNA分子を含む。例示的な発現抑制分子としては、リボザイム、二本鎖siRNA分子、自己相補的一本鎖siRNA分子、遺伝子のアンチセンス構築物及び修飾された安定化骨格を有する合成RNAアンチセンス分子がある。用語発現可能な核酸は、タンパク性分子をコードする核酸、RNA分子又はDNA分子を意味する。本明細書では、用語遺伝学的アンチセンスは、遺伝子配列に相補的なアンチセンス構築物の細胞ゲノムへの組み入れを指す。このような組み入れは、アンチセンス分子の継続した合成を可能にする。用語ハイブリダイゼーションは、塩基対形成を通して核酸鎖と相補鎖とを結合させる任意の方法を意味する。用語ハイブリダイゼーション複合体は、相補的塩基間での水素結合の形成によって、2つの核酸配列間で形成される複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中で形成することができ例えばC0t又はR0t分析、又は溶液中に存在する1つの核酸配列と固体支持体例えば紙、膜、フィルター、チップ、ピン又はガラススライド、又は細胞若しくはそれらの核酸が固定された他のいかなる適当な基質上で固定された他の核酸配列との間で形成することができる。用語ストリンジェントな条件は、ポリヌクレオチドと請求されたポリヌクレオチドとの間でのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。ストリンジェントな条件は塩濃度、有機溶剤、例えばホルムアミドの濃度、温度及び当技術分野で公知である他の条件によって規定することができる。詳細には、塩濃度を低くするか、ホルムアミドの濃度を高くするか、ハイブリダイゼーション温度を上昇させることにより、ストリンジェンシーを増大させることができる。用語反応との関係で用語抑制する又は抑制性は、化合物がない場合と対照的に化合物の存在下で反応が減少するか、阻止されることを意味する。用語抑制は、過程の減少、ダウンレギュレーション、又はタンパク質若しくはポリペプチドの発現の消失又は最小化をもたらす、過程への刺激の除去を指す。用語誘導は、タンパク質又はポリペプチドの発現をもたらす過程及び細胞の表現型の変化をもたらす過程の誘導、アップレギュレーション又は刺激を指す。用語リガンドは、内因性の天然の受容体に特異的な内因性の天然分子を意味する。用語医薬として許容し得る塩類は、本発明の化合物の、非毒性の無機及び有機の酸付加塩、並びに塩基付加塩を指す。これらの塩類は、本発明で役立つ化合物の最終的な単離及び精製の間に、insituで調製することができる。用語ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖の、センス又はアンチセンスの配向性のポリ核酸、ストリンジェントな条件で特定のポリ核酸にハイブリダイズする相補的なポリ核酸、及びその塩基対の少なくとも約60パーセントで相同的なポリヌクレオチドを意味し、より好ましくはその塩基対の70パーセント、最も好ましくは90パーセント、特別な実施形態ではその塩基対の100パーセントが共通するポリヌクレオチドが好ましい。ポリヌクレオチドには、ポリリボ核酸、ポリデオキシリボ核酸及びそれらの合成類似体が含まれる。ポリヌクレオチドは、長さの範囲が約10から約5000の塩基、好ましくは約100から約4000の塩基、より好ましくは約250から約2500の塩基の配列によって記述される。好ましいポリヌクレオチドの実施形態は、長さが約10から約30の塩基を含む。ポリヌクレオチドの特別な実施形態は、約10から約22のヌクレオチドのポリヌクレオチドより一般的には低分子干渉RNAsiRNAと記載されるポリリボヌクレオチドである。他の特別な実施形態は、ペプチド核酸PNA、ポリシロキサン、及び2’-O-2-メトキシエチルホスホロチオエートなどの修飾された軟骨格を有する核酸であり、又は非天然の核酸残基、又は1つ若しくは複数の核酸置換基、例えばメチル-、チオ-、サルフェート、ベンゾイル-、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-及びメタノカルバヌクレオシド、又はその検出を容易にするリポーター分子を含む。用語ポリペプチドは、タンパク質例えばターゲット、タンパク性分子、タンパク質分画、ペプチド及びオリゴペプチドに関するものである。本明細書では、用語リボザイムは、その他のRNA分子を配列に特異的な方法でホスホジエステル結合箇所で切断できる触媒性RNA分子に対応する。用語溶媒和物は、本発明に役立つ化合物と1つ以上の溶媒分子との物理的結合を意味する。この物理的結合には、水素結合が含まれる。ある例では、溶媒和物は、例えば1つ以上の溶媒分子が結晶質固体の結晶格子内に組み込まれた場合などに、単離が可能である。溶媒和物は、溶相及び単離可能な溶媒和物の両方を含む。代表的な溶媒和物としては、水和物、エタノレート及びメタノレートがある。用語対象は、ヒト及び他の哺乳動物を含む。用語治療するは、それらの障害若しくは病態の1つ又は複数の症状を含めて障害、疾患若しくは病態の発生を予防するかその病理を変更し、それによって軽減することを目的に実施する診療行為を意味する。したがって、治療するは治癒的な治療及び予防的若しくは防止的な処置の両方を指す。治療を要する者としては、すでにその障害を有する者、並びにその障害を予防すべき者が含まれる。用語治療するが上で定義されているように、本明細書で使用する関連語治療は、障害、症状、疾患又は病態を治療する行為を指す。用語ベクターはまた、プラスミド並びに組換えウイルスなどのウイルスベクター、又は組換えウイルスをコードする核酸に対応する。用語脊椎動物細胞は、魚、鳥、爬虫類、両生類、有袋類及び哺乳類を含む脊椎構造を有する動物から得られた細胞のことである。好ましい細胞は、哺乳類から得られ、最も好ましい細胞はヒト細胞である。哺乳類細胞には、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス及びラットなどのネズミ並びにウサギが含まれる。軟骨細胞の同化刺激作用に対するターゲットの関係に基づいた、本出願者の発明前述のように、本発明は、ターゲットは軟骨細胞の同化プロセスの上方制御及び/又は誘導における要素であるという本発明者等の発見に基づいている。用語ターゲット又はターゲット複数は、以下に記載されているアッセイによって軟骨細胞の同化刺激作用の誘導に関与することが確認されたタンパク質を意味する。好ましいターゲットは、表1Aにおいて配列番号101~128及び401~594と特定されている。表1Aに本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド及びノックダウン標的配列を挙げる。表1Bに膜貫通タンパク質ターゲットの断片例を挙げる。表1Cに本発現抑制剤の発明の実施に有用なKD標的配列例を挙げる。本発明は、化合物と配列番号101~128ターゲットのポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれらの機能的断片を、化合物に対する前記ポリペプチドの結合を可能にする条件下で接触させることと、前記ポリペプチドと前記化合物との複合体の形成を検出することとを含む、軟骨細胞の同化刺激作用を誘導する化合物の測定方法に関する。複合体形成を測定する好ましい1手段は、前記ポリペプチドに対する前記化合物の結合親和性を測定することである。より具体的には、本発明は、軟骨細胞の同化刺激作用を誘導する因子の同定方法に関し、この方法はさらに、a軟骨細胞の集団を前記ターゲットに結合親和性を示す前記化合物の1種又は複数と接触させることと、b軟骨細胞の同化刺激作用に関与する化合物-ポリペプチドの特性を測定することとを含む。前記で述べた化合物-ポリペプチドの特性は、軟骨細胞の同化刺激作用に関し、当業者によって選択される測定可能な現象である。この測定可能な特性は、例えば、ポリペプチドターゲットのペプチドドメインに対する結合親和性、又は軟骨細胞同化作用の増加のいくつかの生化学的マーカーレベルのいずれか1つのレベルであってよい。軟骨細胞の同化刺激作用は、例えば、タンパク質及び正常な軟骨の重要な成分などの分化プロセス中に誘導されるその他の分子のレベルを測定することによって測定することができる。特に、軟骨の主要なタンパク質成分、コラーゲンIIの誘導を測定する。さらに、軟骨細胞の同化刺激に関与する化合物-ポリペプチド特性は、C20/A4、T/C-28a2、T/C-28a4、C-28/12、Ch-4,8,N、Ch-8-OA、TC6、MCT、MC615、IRC、RCS2、Hig82及びD1ORLUVAD1細胞で測定される。しかし、このような特性はまた、非軟骨細胞系でも測定される。例えば、本発明のポリペプチドに結合する化合物の親和性を測定するinsitu結合アッセイは、ポリペプチドを発現する任意の細胞種を使用して実施される。このポリペプチドの発現は外因性又は内因性である。さらに、化合物-ポリペプチド特性が生物学的経路の活性化であるとき、化合物-ポリペプチドの特性を測定するために、その経路の細胞性成分を含有する任意の細胞を使用する。例えば、軟骨細胞におけるcol2α1又はアグリカンの誘導は、軟骨細胞の同化刺激作用の指標である。特に、col2α1又はアグリカンプロモーターによって活性化されたレポーター分子を含有するように非軟骨細胞を操作することができる。このような方法で、軟骨細胞の同化刺激作用を示す特性を測定するために非軟骨細胞を使用することができる。本発明は、軟骨細胞の同化刺激作用を誘導及び/又は増加させる化合物の同定方法に関し、前記方法は、表1Aに挙げたもののいずれか1つのポリペプチド又はそれらの機能的断片若しくは誘導体を発現する細胞集団を培養する段階と、前記細胞集団において軟骨細胞分化の第1レベルを測定する段階と、前記細胞集団を化合物又は化合物の混合物に曝露する段階と、前記細胞集団を化合物又は化合物の混合物に曝露している間若しくは曝露後に前記細胞集団における軟骨細胞分化のレベルを測定する段階と、軟骨形成分化を誘導及び/又は増加させる化合物を同定する段階とを含む。本発明はまた、表1Aに挙げたポリペプチドのいずれか1つの発現及び/又は活性を減少させる化合物の同定方法に関し、前記方法は、前記ポリペプチド又はそれらの断片又は誘導体を発現する細胞集団を培養する段階と、前記ポリペプチドの発現及び/又は活性の第1レベルを測定する段階と、前記細胞集団を化合物又は化合物の混合物に曝露する段階と、前記細胞集団を化合物又は化合物の混合物に曝露している間若しくは曝露後に前記ポリペプチドの発現及び/又は活性のレベルを測定する段階と、前記ポリペプチドの発現及び/又は活性を減少させる化合物を同定する段階とを含む。もし、このポリペプチド活性が容易に測定できないならば、化合物の同定は、前記ポリペプチドのアゴニストに対して前記細胞集団を曝露することを含む追加段階によって利益を得ることができる。さらに、本発明の方法は、表1Aに挙げたポリペプチドのいずれか1つをコードする遺伝子を前記細胞集団に導入する段階を含んでよい。ハイスループットのためには、前記細胞のゲノムに安定して組み込まれる遺伝子を有することが有益であり得る。好ましい実施形態では、軟骨細胞再分化のレベルは、マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって測定され、好ましいマーカー遺伝子は、コラーゲンII型、アルファ-1col2α1又はアグリカンをコードする。適切な同化刺激作用のために、col2α1又はアグリカンの発現及び/又は活性を増加させることが好ましい。本発明は、特定の1実施形態では、ポリペプチドがGPCRである新規化合物の同定方法を提供する。そのような場合、前記GPCRの発現及び/又は活性は、第2メッセンジャーのレベルを測定することによって測定することが好ましい。好ましい第2メッセンジャーは、環状AMP、Ca2又はその両方である。一般的に、第2メッセンジャーのレベルは、第2メッセンジャーに応答するプロモーターを制御してレポーター遺伝子で測定し、このプロモーターは環状AMP応答性プロモーター、NF-KB応答性プロモーター、又はNF-AT応答性プロモーターであることが好ましく、このときレポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、GFP、eGFP、dGFP、ルシフェラーゼ及びβ-ガラクトシダーゼからなる群から選択される。他の特定の実施形態では、本発明は、ポリペプチドがキナーゼ又はホスファターゼである新規化合物の同定方法を提供する。前記キナーゼ又はホスファターゼの活性は、前記キナーゼ又はホスファターゼの基質のリン酸化レベルを測定することによって測定することが好ましい。さらに他の特定の実施形態では、本発明は、ポリペプチドがタンパク質分解酵素である新規化合物の同定方法を提供する。前記タンパク質分解酵素の活性は、前記タンパク質分解酵素の基質の切断レベルを測定することによって測定することが好ましい。第2メッセンジャーレベルの測定方法、レポーター遺伝子及び第2メッセンジャー応答性プロモーターの使用並びにホスファターゼアッセイ及びタンパク質分解酵素アッセイは当業界では周知で、ここではさらに詳述はしない。好ましい実施形態では、ポリペプチドを阻害する化合物はせいぜい10マイクロモルのポリペプチドに結合親和性を示す。本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチドターゲットは、配列番号101~128及び401~594表1A及び1Bからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の特に好ましい実施形態では、ポリペプチドターゲットは、配列番号101~128表1Aからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。当業者の選択に従い、本アッセイ方法は一連の測定として機能するように設計することができ、そのそれぞれは薬剤候補化合物が実際にポリペプチドに作用して軟骨細胞の同化刺激作用を誘導するかどうかを決定するように設計される。例えば、化合物のポリペプチド又はその断片に対する結合親和性を測定するように設計されたアッセイは、試験化合物が対象に投与されたときに平均軟骨厚を増大させるのに役立つかどうかを確認するために必要かもしれないが十分ではない。それにもかかわらず、そのような結合情報は、生化学経路のさらに上の異なる特性、例えばコラーゲンIIの量を測定することによって評価される軟骨成分合成を測定するアッセイで使用するための一組の試験化合物を同定する際に役立つはずである。そのような第2のアッセイは、ポリペプチドに結合親和性を有する試験化合物が実際に軟骨細胞の同化刺激作用を誘導することを確認するように設計することができる。偽陽性の読取値でないことを保証するために、適当な対照を常に設置しなければならない。これらの測定の順序は本発明の実行に重要であるとは考えられておらず、任意の順序で実行することができる。例えば、情報が知られていない一組の化合物のスクリーニングアッセイを、ポリペプチドに対するそれらの化合物の結合親和性を考慮しながら最初に実施することができる。或いは、ポリペプチドドメインに対して結合親和性を有すると同定された一組の化合物、又はそのポリペプチドの阻害剤であると同定された化合物のクラスをスクリーニングすることができる。しかし、本アッセイが薬剤候補化合物の究極の用途に意味があるようにするために、コラーゲンIIレベル又はアグリカンの測定が必要である。対照及び本発明のポリペプチドへの結合親和性の測定を含むバリデーション試験は、それにもかかわらず任意の治癒的又は診断的用途で有用な化合物を同定する際に役立つ。ポリペプチドターゲットを有する化合物の結合親和性は、当技術分野で公知の方法、例えば表面プラズモン共鳴バイオセンサーBiacore、標識化合物による飽和結合分析例えばScatchard及びLindmo分析、示差UV分光光度計、蛍光偏光アッセイ、蛍光定量的イメージングプレートリーダーFLIPR商標系、蛍光共鳴エネルギー転移及びバイオルミネセンス共鳴エネルギー転移によって測定することができる。化合物の結合親和性は、解離定数Kd、又はIC50若しくはEC50として表すこともできる。IC50は、他のリガンドのポリペプチドとの結合の50抑制に必要な、化合物濃度を意味する。EC50は、ターゲット機能を測定する任意のアッセイで最大効果の50を得るために必要な濃度を意味する。解離定数Kdは、リガンドがどの程度ポリペプチドに結合するかを見るための測定手段であり、ポリペプチド上の結合部位の正確に半分を飽和させるために必要なリガンド濃度と等価である。高親和性結合を有する化合物は、低いKd、IC50及びEC50値を有し、すなわち100nMから1pMの範囲である。中等度から低い親和性の結合は、高いKd、IC50及びEC50値と関連し、すなわちマイクロモル濃度の範囲である。本アッセイ方法は細胞アッセイで実行することもできる。ターゲットを発現する宿主細胞としては、内因性発現を有する細胞、又は例えばトランスダクションによってターゲットを過剰発現する細胞が可能である。ポリペプチドの内因性発現が、容易に測定することができるベースラインを測定するのに十分でないときは、ターゲットを過剰発現する宿主細胞を用いることができる。過剰発現は、ターゲット基質最終産物のレベルが内因性の発現による活性レベルより高い利点を有する。したがって、現在利用できる手法を用いてそのようなレベルを測定することは、より簡単である。このような細胞アッセイでは、ターゲットの生物学的活性は、以下の軟骨成分合成の産生によって測定することができる。本発明は、さらに、軟骨細胞の同化刺激作用を誘導する化合物の方法同定に関し:a化合物を、配列番号101~128及び401~594からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させることと;bポリペプチドへの化合物の結合親和性を測定することと;c前記ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞の集団を少なくとも10マイクロモルの結合親和性を示す化合物と接触させることと;d正常な軟骨の構成要素であり、及び/又は軟骨の形成に必要とされているタンパク質の合成を誘導する化合物を同定することを含む。ハイスループット目的のためには、抗体断片ライブラリー、ペプチドファージディスプレイライブラリー、ペプチドライブラリー例えばLOPAP商標、SigmaAldrich、脂質ライブラリーBioMol、合成化合物ライブラリー例えばLOPAC商標、SigmaAldrich、又は天然化合物ライブラリーSpecs、TimTecなどの化合物ライブラリーを用いることができる。好ましい薬剤候補化合物は、低分子量化合物である。低分子量化合物、すなわち500ダルトン以下の分子量のものは、生物系で優れた吸収性及び浸透性を有し、したがって500ダルトンを超える分子量を有する化合物よりも候補薬として成功する可能性が高いLipinskiら。ペプチドには、他の好ましいクラスの薬剤候補化合物が含まれる。ペプチドは優れた候補薬であることができ、生殖ホルモン及び血小板凝集阻害薬など、商業的に価値あるペプチドの複数の例がある。天然化合物は、他の好ましいクラスの薬剤候補化合物である。そのような化合物は天然供給源で見られまたそれらから抽出され、それらはその後合成することができる。脂質は、他の好ましいクラスの薬剤候補化合物である。他の好ましいクラスの薬剤候補化合物は抗体である。本発明は、ターゲットを対象とした抗体も提供する。これらの抗体は細胞中で内因的に産生されてターゲットと結合することができるか、組織に加えて細胞外に存在するターゲットポリペプチドと結合することができる。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体でよい。本発明は、キメラ、単鎖及びヒト化の抗体、さらにはまた、FAbフラグメント、FAb発現ライブラリーの生成物、並びにFvフラグメント及びFv発現ライブラリーの生成物を含む。ある実施形態では、本発明の実行においてポリクローナル抗体を用いることができる。当業者は、ポリクローナル抗体を調製する方法を知っている。ポリクローナル抗体は哺乳動物で、例えば免疫化剤、及び所望によりアジュバントの1つ又は複数の注射によって作製することができる。一般的に、免疫化剤及び/又はアジュバントは、哺乳類では皮下又は腹腔内の複数の注射によって注入される。抗体は、無傷のターゲットタンパク質若しくはポリペプチドに対して、又はターゲットタンパク質若しくはポリペプチドの断片、コンジュゲート体を含む誘導体、若しくは他のエピトープに対して、例えば細胞膜中に包埋されたターゲット、又はファージディスプレイライブラリーなどの抗体可変部のライブラリーに対して作製することもできる。免疫化する哺乳動物で免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫化剤をコンジュゲートすることは、役立つ可能性がある。そのような免疫原性タンパク質の例としては、それらには限定されないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターがある。使用することができるアジュバントの例としては、フロインド完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント一リン酸化リピドA、合成トレハロースジコリノミコレートがある。当業者は、過度の実験をしなくても免疫化プロトコルを選択することができる。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体でよい。モノクローナル抗体は、当業界周知の方法によって調製することができる。本発明のモノクローナル抗体は、宿主が抗体に対して免疫応答を起こすことを予防するためにヒト化されたものでよい。ヒト化抗体は、軽鎖及び/又は重鎖可変ドメインフレームワークの相補性決定部CDR及び/又は他の部分はヒト以外の免疫グロブリンに由来するが、分子の残りの部分は1つ又は複数のヒト免疫グロブリンに由来するものである。ヒト化抗体には、供与体又は受容体の非修飾軽鎖又はキメラ軽鎖と結合したヒト化重鎖、又はその逆を特徴とする抗体も含まれる。抗体のヒト化は、当技術分野で公知の方法によって達成することができる例えば、Mark及びPadlan、第4章。モノクローナル抗体のヒト化、TheHandbookofExperimentalPharmacologyVol113SpringerVerlagNewYork、を参照。ヒト化抗体を発現するために、トランスジェニック動物を用いることができる。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含めて当技術分野で公知の様々な手法を用いて産生することもできるHoogenboom及びWinter、JMolBiol2273818;Marksら、JMolBiol22258197。Coleら及びBoernerらの手法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できるColeら、モノクローナル抗体及び癌療法AlanRLissp77;Boernerら、JImmunol1478695。単鎖抗体の産生のための当技術分野で公知の手法は、本発明のターゲットポリペプチド及びタンパク質に対する単鎖抗体を産生するために応用することができる。抗体は、一価抗体でよい。一価抗体の調製法は当技術分野で公知である。例えば、1つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、重鎖架橋性を阻止するために、一般にFc部の任意の点でトランケーションされる。或いは、架橋性を阻止するために関連するシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換されるか削除される。二重特異性抗体は少なくとも2つの異なる抗原に対して、好ましくは細胞表面タンパク質又は受容体又は受容体サブユニットに対して結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくはヒトの又はヒト化の抗体である。この場合は、結合特異性の1つはターゲットの1ドメインに対するものであり、他の1つは、同じか異なるターゲットの他のドメインに対するものである。二重特異性抗体の作製法は当技術分野で公知である。従来法では、二重特異性抗体の組換え産生は2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の共発現に基づき、2つの重鎖は異なる特異性を有するMilstein及びCuello、Nature3055379。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組合せのために、これらのハイブリドーマクアドローマは10の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生するが、僅か1つだけが正しい二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィ段階は、通常、正しい分子の精製を達成する。類似した手法は、Trauneekerら、EMBOJ1036559、で開示される。他の好ましい実施形態によると、ターゲットへの結合親和性を有すると同定され、且つ/又は1つ又は複数のターゲットに対するアンタゴニスト活性などのダウンレギュレーション活性を有するとすでに同定された薬剤候補化合物を、アッセイ方法は用いる。さらに本発明は、軟骨細胞の同化刺激作用を誘導するための、前記細胞を、配列番号1~28からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むポリリボヌクレオチドの少なくとも約17の連続したヌクレオチドと相補するポリヌクレオチド配列を含む発現抑制剤と接触させることを含む方法に関する。好ましい実施形態では、発現抑制剤は、配列番号202~315からなる群から選択されるヌクレオチド配列を補うポリヌクレオチド配列を含む。本発明の他の態様は、前記細胞を、ターゲットポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドの細胞内での翻訳を抑制する発現抑制剤と接触させることを含む、軟骨細胞の同化刺激作用の誘導方法に関するものである。特定の実施形態は、剤をターゲットターゲットmRNAと対合してそれによってターゲットポリペプチドの発現をダウンレギュレート又は阻止する働きをする少なくとも1つのアンチセンス鎖を含むポリヌクレオチドを含む組成物に関するものである。抑制剤は好ましくはアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉RNAsiRNAを含み、前記薬剤は配列番号101~128からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドの一部をコードする天然ポリヌクレオチド配列と相補的であるかそれから操作される核酸配列を含む。好ましい実施形態では、発現抑制剤は、配列番号1~28からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に相補的である。特に好ましい実施形態では、発現抑制剤は、配列番号202~315からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に相補的である。本発明の一実施形態は、発現抑制剤がアンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドODN、配列番号101~128をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号101~128をコードするポリリボヌクレオチドの一部に十分に相補的であり、その結果そのsiRNA、好ましくはshRNAがターゲットポリペプチドへのターゲットポリリボヌクレオチドの翻訳に干渉する低分子干渉RNAsiRNA、好ましくはshRNAからなる群から選択される方法に関するものである。好ましくは、発現抑制剤は、配列番号1~28からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相補的な、アンチセンスRNA、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド又はsiRNA、好ましくはshRNAである。特に好ましい実施形態では、発現抑制剤は、配列番号202~315からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に相補的である。本発明の特別な実施形態は、発現抑制剤がアンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドODN、配列番号101~128をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号101~128をコードするポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同的であり、その結果そのsiRNA、好ましくはshRNAがターゲットポリペプチドへのターゲットポリリボヌクレオチドの翻訳に干渉する低分子干渉RNAsiRNA、好ましくはshRNAを発現する核酸である方法に関するものである。好ましくは、このヌクレオチド配列は、配列番号1~28からなる群から選択されるポリヌクレオチドに相補的である。特に好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号202~315からなる群から選択されるポリヌクレオチドに相補的である。アンチセンス核酸を用いる遺伝子発現のダウンレギュレーションは、翻訳又は転写のレベルで達成することができる。本発明のアンチセンス核酸は、好ましくはターゲットポリペプチド又は対応するメッセンジャーRNAをコードする核酸の全部又は一部と特異的にハイブリダイズすることができる核酸断片である。さらに、その転写一次産物のスプライシングを抑制することによってターゲットポリペプチドをコードすることができる核酸配列の発現を減少させる、アンチセンス核酸を設計することができる。それがターゲットをコードする核酸の発現をダウンレギュレートするか阻止することができる限り、任意の長さのアンチセンス配列が本発明の実行のために適当である。好ましくは、アンチセンス配列は長さが少なくとも約17ヌクレオチドである。アンチセンス核酸、アンチセンスRNAをコードするDNAの調製及び使用、並びにオリゴ及び遺伝子アンチセンスの使用は当技術分野で公知である。発現抑制剤の一実施形態は、配列番号1~28を含む核酸にアンチセンスである核酸である。例えば、アンチセンス核酸例えばDNAは、配列番号1~28を含む核酸の細胞内発現を抑制するための遺伝子治療として、インビトロで細胞に導入することができるか、又は対象にインビボ投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、約17から約100のヌクレオチドを含む配列を含み、より好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約18から約30のヌクレオチドを含む。アンチセンス核酸は、配列番号1~28の配列から選択される核酸配列に相補的な約10から約30の連続したヌクレオチドから調製することができる。アンチセンス核酸は好ましくはオリゴヌクレオチドであり、デオキシリボヌクレオチドのみ、修飾されたデオキシリボヌクレオチドのみ、又は両者の組合せからなり得る。アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドでよい。安定性及び/又は選択性を改善するために、オリゴヌクレオチドは所望により化学的に修飾することができる。オリゴヌクレオチドは細胞内ヌクレアーゼによる分解に感受性であるので、修飾としては、例えば、ホスホジエステル結合の遊離酸素を置換する硫黄基の使用があり得る。この修飾は、ホスホロチオエート結合と呼ばれる。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、水溶性で、ポリ陰イオン性で、内因性のヌクレアーゼに抵抗性である。さらに、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがそのターゲット部位にハイブリダイズするとき、RN202-315NA二重鎖は、ハイブリッド分子のmRNA成分を切断する内因性の酵素リボヌクレアーゼリボヌクレアーゼHを活性化する。さらに、ホスホラミダイト及びポリアミドペプチドとのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、合成することができる。これらの分子は、ヌクレアーゼ分解に非常に抵抗性でなければならない。さらに、安定性を強化してターゲット部位へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合を促進するために、化学基を糖部分の2’炭素及びピリミジンの5炭素C-5に加えることができる。修飾としては、2’-デオキシ、O-ペントキシ、O-プロポキシ、O-メトキシ、フルオロ、メトキシエトキシホスホロチオエート、修飾塩基、並びに当業者に公知の他の修飾があり得る。ターゲットのレベルを低減する他の種類の発現抑制剤は、リボザイムである。リボザイムは、別々の触媒及び基質の結合ドメインを有する触媒性RNA分子RNA酵素である。基質結合配列はヌクレオチド相補性により、また恐らく非水素結合相互作用により、そのターゲット配列と結合する。触媒部分は、特定の部位でターゲットRNAを切断する。リボザイムの基質ドメインは、それを指定されたmRNA配列に向けるように設計することができる。リボザイムは、相補的な塩基対形成を通してターゲットmRNAを認識して、次に結合する。一旦それが正しいターゲット部位に結合するならば、リボザイムは酵素的にターゲットmRNAを切断する働きをする。リボザイムによるmRNAの切断は、対応するポリペプチドの合成を指示するその能力を無効にする。一旦リボザイムがそのターゲット配列を切断したならば、それは放出されて、他のmRNAで繰り返し結合及び切断することができる。リボザイム形態には、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、デルタ型肝炎ウイルス、I群イントロン若しくはリボヌクレアーゼPRNARNAガイド配列と結合モチーフ又はNeurosporaVSRNAモチーフがある。これらの触媒RNA分子は細胞中で真核生物のプロモーターから発現させることができるので、ハンマーヘッド又はヘアピン構造を有するリボザイムは容易に調製されるChenら、NucleicAcidsRes2045819。本発明のリボザイムは、真核細胞で適当なDNAベクターから発現させることができる。所望により、リボザイムの活性は、第2のリボザイムによる転写一次産物からのその放出によって高めることができるVenturaらNucleicAcidsRes21324955。リボザイムは、オリゴデオキシリボ核酸を、転写後にターゲットmRNAにハイブリダイズする配列に連なるリボザイム触媒ドメイン20ヌクレオチドと結合することによって、化学的に合成することができる。オリゴデオキシリボ核酸は、基質結合配列をプライマーとして用いることにより増幅される。増幅生成物は、真核生物の発現ベクターにクローン化される。リボザイムは、DNA、RNA又はウイルスのベクターに挿入された転写単位から発現される。リボザイム配列の転写は、真核生物のRNAポリメラーゼIポルI、RNAポリメラーゼIIポルII又はRNAポリメラーゼIIIポルIIIのプロモーターから始動される。ポルII又はポルIIIプロモーターからの転写産物は、全ての細胞で高レベルで発現される。与えられた細胞型内の与えられたポルIIプロモーターのレベルは、近くの遺伝子調節配列によって決まる。原核生物のRNAポリメラーゼ酵素が適当な細胞で発現されるならば、原核生物のRNAポリメラーゼプロモーターも用いられるGao及びHuang、NucleicAcidsRes21286772。これらのプロモーターから発現されるリボザイムは、哺乳動物細胞で機能することが証明されたKashaniSabetらAntisenseResDev2315。特に好ましい抑制剤は、低分子干渉RNAsiRNA、好ましくはshRNAである。siRNA、好ましくはshRNAは、抑制されたRNAに配列が相同的である二重鎖RNAdsRNAによって、遺伝子抑制の転写後過程を媒介する。本発明によるsiRNAは、配列番号1~28で記載される配列の群、好ましくは配列番号202~315で記載される配列の群から選択される連続した17~23のヌクレオチド配列と相補的又は相同な17~25のヌクレオチドのセンス鎖、並びにこのセンス鎖に相補的な17~25のヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。配列例は、配列番号202~315に相補的な配列として記載されている。最も好ましいsiRNAは、互いに100パーセント相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖、及びターゲットポリヌクレオチド配列を含む。好ましくは、siRNAはセンス鎖及びアンチセンス鎖を結合するループ領域をさらに含む。本発明による自己相補一本鎖shRNA分子ポリヌクレオチドは、ループ領域リンカーによって接続されたセンス部分及びアンチセンス部分を含む。好ましくは、ループ領域配列は、長さが4~30ヌクレオチド、より好ましくは長さが5~15ヌクレオチド、最も好ましくは長さが8ヌクレオチドである。最も好ましい実施形態では、リンカー配列はUUGCUAUA配列番号201である。自己相補的一本鎖siRNAはヘアピンループを形成して、普通のdsRNAよりも安定である。さらに、それらはベクターからより容易に産生されるアンチセンスRNAに類似して、siRNAは核酸溶解性分解に対する抵抗性を保証するために、又は活性を強化するために、又は細胞分布を強化するために、又は細胞取り込みを強化するために修飾することができ、そのような修飾は修飾されたヌクレオシド間結合、修飾された核酸塩基、修飾された糖及び/又は1つ又は複数の部分若しくはコンジュゲート体へのsiRNA化学結合からなる。siRNA設計規則に適合しないヌクレオチド配列と比較してターゲット配列の減少が改善されたヌクレオチド配列が、これらのsiRNA設計規則に従って選択されるこれらの規則及びsiRNA調製例の議論については、国際公開2004094636、2004年11月4日公表、及びUA20030198627が本明細書で参照により組み込まれている。本発明は、軟骨細胞の同化刺激作用を誘導することができるポリヌクレオチドを発現することができるDNA発現ベクターを含み、本明細書で先に発現抑制剤として記載されている組成物及び前記組成物を用いる方法にも関する。これらの組成物及び方法の具体的な態様は、ターゲットポリペプチドと選択的に相互作用することができる細胞内結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの誘導された発現による、ターゲットポリペプチドの発現のダウンレギュレーション又は阻止に関する。細胞内結合タンパク質には、それが発現される細胞内のポリペプチドと選択的に相互作用又は結合して、ポリペプチドの機能を中和することができる任意のタンパク質が含まれる。好ましくは、細胞内結合タンパク質は、配列番号101~128及び401~594のターゲットポリペプチドのエピトープに結合親和性を有する中和抗体又は中和抗体の断片である。より好ましくは、細胞内結合タンパク質は単鎖抗体である。この組成物の具体的な実施形態は、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドODN、配列番号101~128をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号101~128をコードするポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同的であり、その結果そのsiRNAがターゲットポリペプチドへのターゲットポリリボヌクレオチドの翻訳に干渉する低分子干渉RNAsiRNAからなる群から選択される発現抑制剤を含む。発現抑制剤を発現するポリヌクレオチドは、好ましくはベクター内に含まれる。ポリ核酸は核酸配列の発現を可能にするシグナルに作動可能的に結合されて、好ましくは組換えベクター構築物を利用して細胞内に導入され、この構築物は一旦ベクターが細胞に導入されるとアンチセンス核酸を発現する。様々なウイルスベースの系が利用でき、それらにはアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクター系が含まれ、全てはターゲット細胞内に発現抑制剤のポリヌクレオチド配列を導入して発現するために用いることができる。好ましくは、本発明の方法で用いられるウイルスベクターは、複製に欠陥がある。そのような複製不完全なベクターは、感染細胞内でのウイルスの複製のために必要な少なくとも1つの領域を通常含む。これらの領域は、当業者に公知の任意の手法によって除去する全体若しくは一部か、又は機能不全にすることができる。これらの手法には、全除去、置換、部分欠失又は必須の複製のために領域への1つ又は複数の塩基の付加が含まれる。そのような手法はインビトロ単離されたDNA上で又はinsituで遺伝子操作手法を用いて、又は突然変異誘発物質での処理により実施することができる。好ましくは、複製欠陥ウイルスはそのゲノムのウイルス粒子の封入に必要な配列を保持する。好ましい一実施形態では、ウイルス要素はアデノウイルスに由来する。好ましくは、媒体はアデノウイルスカプシドに封入されたアデノウイルスベクター、その機能性部分、誘導体及び/又は類似体を含む。アデノウイルスの生物学的特徴は、分子レベルで比較的よく知られている。アデノウイルスベクターのための多くのツールがすでに開発され、これからも開発が継続されるので、アデノウイルスカプシドは本発明のライブラリーに組み込むための好ましい媒体となる。アデノウイルスは、多種多様な細胞に感染することができる。しかし、アデノウイルス血清型が異なると、細胞に対する好みも異なる。好ましい一実施形態で本発明のアデノウイルスカプシドが入ることができるターゲット細胞集団を組み合わせて拡張するために、媒体は少なくとも2つのアデノウイルスからのアデノウイルス繊維タンパク質を含む。好ましいアデノウイルス繊維タンパク質配列は、血清型17、45及び51である。これらのキメラベクターの手法又は構築及び発現は米国公表特許出願20030180258及び20040071660で開示され、これらは本明細書で参照によって組み込まれる。好ましい一実施形態では、アデノウイルスに由来する核酸としては、アデノウイルス後期タンパク質、その機能部分、誘導体及び/又は類似体をコードする核酸がある。アデノウイルス後期タンパク質、例えばアデノウイルス繊維タンパク質は、好ましくはある細胞を媒体の標的にするために、又は媒体の細胞への送達増を誘導するために用いることができる。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸は基本的に全てのアデノウイルス後期タンパク質をコードし、アデノウイルスカプシド全体又はその機能部分、類似体及び/又は誘導体の形成を可能にする。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸としては、アデノウイルスE2A、又はその機能部分、誘導体及び/又は類似体をコードする核酸がある。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸としては、少なくとも1つのE4領域タンパク質又はその機能部分、誘導体及び/又は類似体をコードする核酸があり、それらは少なくとも部分的に、細胞内でのアデノウイルス由来核酸の複製を促進する。この用途の実施例で用いられるアデノウイルスベクターは、本発明の治療方法に役立つベクターの例である。本発明のある実施形態では、レトロウイルス系を用いる。レトロウイルスは分裂細胞に感染する組み込み型ウイルスであり、それらの構築は当技術分野で公知である。レトロウイルスベクターは異なる種類のレトロウイルスから、例えばMoMuLVマウスモロニー白血病ウイルス、MSVマウスモロニー肉腫ウイルス、HaSVハーベイ肉腫ウイルス;SNV脾臓壊死ウイルス;RSVラウス肉腫ウイルス及びフレンドウイルスから構築することができる。レンチウイルス系も本発明の実行において用いることができる。本発明の他の実施形態では、アデノ随伴ウイルスAAVが利用される。AAVウイルスは、安定して部位特異的に感染細胞のゲノムに組み込む、比較的小さな大きさのDNAウイルスである。それらは、細胞成長、形態及び分化に対するどんな影響をも誘導することなく広範囲の細胞に感染することができ、しかも、それらはヒトに病原性ではないようである。ベクターの構築において、本発明のポリヌクレオチド剤は、1つ又は複数の調節領域に結合することができる。1つ又は複数の適当な調節領域の選択は、当業者の技術レベルの範囲で解決できる日常の問題である。調節領域はプロモーターを含み、エンハンサー、サプレッサー、その他を含むことができる。本発明の発現ベクターで用いることができるプロモーターは、構成プロモーター及び調節された誘導可能なプロモーターの両方を含む。プロモーターは、宿主によっては原核生物性又は真核生物性でよい。本発明の実施に役立つ原核生物のバクテリオファージを含むプロモーターには、lac、lacZ、T3、T7、ラムダPr、Pl及びtrpプロモーターがある。本発明の実施に役立つ真核生物ウイルスのものを含むプロモーターとしては以下のものがある。遍在性のプロモーター例えば、HPRT、ビメンチン、アクチン、チューブリン、中間フィラメントプロモーター例えばデスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAP、治療的遺伝子プロモーター例えばMDR型、CFTR、第VIII因子、組織特異プロモーター例えば平滑筋細胞のアクチンプロモーター、又は内皮細胞で活性なFlt及びFlkプロモーター、例えば動物転写調節領域であり、これらは組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている:膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼI遺伝子調節領域SwiftらCell3863946;OrnitzらColdSpringHarborSympQuantBiol50399409;MacDonaldHepatology7425515;膵臓β細胞で活性なインシュリン遺伝子調節領域HanahanNature31511522、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域GrosschedlらCell3864758;AdamesらNature3185338;AlexanderらMolCellBiol7143644、精巣、乳腺、リンパ細胞及び肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス調節領域LederらCell4548595、肝臓で活性なアルブミン遺伝子調節領域PinkertらGenesandDevel126876、肝臓で活性なアルファフェトプロテイン遺伝子調節領域KrumlaufらMolCellBiol5163948;HammerらScience235538、肝臓で活性なα1抗トリプシン遺伝子調節領域KelseyらGenesandDevel116171、骨髄性細胞で活性なβ-グロビン遺伝子調節領域MogramらNature31533840;KolliasらCell468994、脳の乏突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域ReadheadらCell4870312、骨格筋で活性なミオシン軽鎖2遺伝子調節領域SaniNature3142836、並びに視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出因子遺伝子調節領域MasonらScience23413728。本発明の実行において用いることができる他のプロモーターとしては、分裂細胞で優先して活性化されるプロモーター、刺激に応答するプロモーター例えばステロイドホルモン受容体、レチン酸受容体、テトラサイクリン調節転写モジュレータ、前初期のサイトメガロウイルス、レトロウイルスLTR、メタロチオネイン、SV40、Ela及びMLPプロモーターがある。更なるベクター系としては、患者へのポリヌクレオチド剤の導入を促進する非ウイルス性の系がある。例えば、所望の配列をコードするDNAベクターは、インビボでリポフェクションによって導入することができる。リポソーム媒介トランスフェクションで遭遇する問題点を制限するように設計された合成陽イオン脂質は、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために用いることができるFelgnerらProcNatlAcadSciUSA8474137;MackeyらProcNatlAcadSciUSA85802731;UlmerらScience25917458を参照。陽イオン脂質の使用は、負に荷電した核酸の被包性を促進し、そのうえ負に荷電した細胞膜との融合を促進することができるFelgner及びRingold、Nature3373878。核酸移動に特に役立つ脂質化合物及び組成物は、国際特許公開9518863、国際公開9617823、及び米国特許第5459127号で記載されている。インビボで外来性の遺伝子を特定の臓器に導入するためのリポフェクションの使用は、一定の実用上の利点を有し、特定の細胞型にトランスフェクションを向けることは、細胞異質性の組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳で特に有利である。脂質は、ターゲティング目的のために他の分子と化学的に結合することができる。ホルモン類若しくは神経伝達物質などの標的のペプチド、及び抗体などタンパク質、又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合することができる。他の分子も、インビボでの核酸のトランスフェクションを促進するために有用であり、例としては陽イオンオリゴペプチド例えば国際特許公開9521931、DNA結合タンパク質に由来するペプチド例えば国際特許公開9625508、又は陽イオンポリマー例えば国際特許公開9521931がある。裸のDNAプラスミドとしてインビボでDNAベクターを導入することも可能である米国特許第5693622号、第5589466号及び第5580859号を参照。治療目的のための裸のDNAベクターは、当技術分野で公知の方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はDNAベクタートランスポータの使用などで、所望の宿主細胞に導入することができる例えば、WilsonらJBiolChem2679637;Wu及びWu、JBiolChem263146214;Hartmutら、1990年3月15日に出願のカナダ特許出願2012311;WilliamsらProcNatlAcadSciUSA88272630参照。受容体媒介DNA送達手法を用いることができるCurielらHumGeneTher314754;Wu及びWu、JBiolChem262442932。本発明は、本明細書で先に記載したようにターゲット阻害剤及び/又は発現抑制剤として同定された1つ又は複数の化合物の有効量を含む、生体適合性の軟骨形成促進組成物も提供する。生体適合性組成物は、本発明の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター及び抗体が活性型で、例えば生物的活性を発揮することが可能な形態で維持されている、固体、液体、ゲル、又は他の形態である組成物である。例えば、本発明の化合物はターゲットに対する逆作動薬、すなわちアンタゴニスト活性を有し、核酸は複製すること、メッセージを解釈すること、又はターゲットの相補的なmRNAにハイブリダイズすることができ、ベクターは、本明細書で先に記載されているように、ターゲット細胞をトランスフェクションすること、及びアンチセンス、抗体、リボザイム又はsiRNAを発現することができ、抗体は、ターゲットポリペプチドドメインと結合する。好ましい生体適合性組成物は、例えば、トリス、リン酸又はHEPES緩衝液を用いて緩衝される、塩イオンを含む水溶液である。通常、塩イオンの濃度は生理的レベルと類似する。生体適合性溶液は、安定化剤及び保存料を含むことができる。より好ましい実施形態において、生体適合性組成物は医薬として許容し得る組成物である。そのような組成物は、局所、経口、腸管外、鼻腔内、皮下及び眼内の各経路による投与のために製剤化することができる。非経口的投与は、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射又は注入手法を含むものとする。組成物は、所望により標準で公知の非毒性の生理的に許容される担体、アジュバント及び媒体を含む投薬単位製剤で、非経口的に投与することができる。本組成物発明の特に好ましい実施形態は、本明細書で先に記載されている発現抑制剤の治療的有効量を医薬として許容し得る担体と混合して含む、軟骨形成促進医薬組成物である。他の好ましい実施形態は、平均軟骨厚の全身的若しくは局所的減少に関係する病態又はその病態に対する感受性の治療又は予防のための医薬組成物であり、ターゲットアンタゴニスト又は逆作動薬、その医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物又はそのプロドラッグの軟骨形成促進有効量を、医薬として許容し得る担体との混合物として含む。経口投与のための医薬組成物は、当技術分野で公知の医薬として許容し得る担体を経口投与に適当な投薬量で用いて製剤化することができる。そのような担体は、医薬組成物が患者による摂取のために錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液、などとして製剤化されるのを可能にする。経口用の医薬組成物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、生じる混合物を任意選択に粉砕し、錠剤又は糖衣丸コアを得るために所望により適当な補助剤を加えた後に顆粒剤の混合物を加工することによって調製することができる。適当な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質の充填剤、例えばラクトース、ショ糖、マンニトール又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ又は他の植物からの澱粉、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカンタゴムを含むゴム、及びゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質である。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤又は可溶化剤を加えることができる。糖衣丸コアは適当なコーティングとともに用いることができ、例としてはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポルゲル、ポリエチレングリコール及び/又は二酸化チタンを含むこともできる濃縮糖液、ラッカー溶液並びに適当な有機溶媒又は溶媒混合物がある。色素又は顔料を製品識別のために、又は活性化合物の量、すなわち投薬量を明らかにするために、錠剤又は糖衣丸コーティングに加えることができる。経口的に用いることができる医薬用製剤としては、ゼラチンで作られた押込嵌めカプセル、並びにゼラチン及び、グリセリン又はソルビトールなどのコーティングで作られた柔らかく、密封されたカプセルがある。押込嵌めカプセルは、ラクトース若しくは澱粉などの充填剤又は結合剤、タルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、及び任意選択に安定剤と混合した有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、活性化合物を、安定剤の有無にかかわらず、適当な液体、例えば脂肪油、液体、液体ポリエチレングリコールの中に溶かすか懸濁することができる。好ましい無菌の注射製剤は、無毒性の非経口的に許容できる溶媒又は希釈液の溶液又は懸濁液でよい。医薬として許容し得る担体の例は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、等張性生理食塩水例えばリン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウム、又はそのような塩類の混合物、リンガー液、ブドウ糖、水、滅菌水、グリセリン、エタノール、及びそれらの組合せである。1,3-ブタンジオール及び無菌の不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒体として便利に使用される。いかなる低刺激性の不揮発性油も使用することができ、例としては合成のモノグリセリド又はジグリセリドがある。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の調製で使用することができる。組成物媒体はヒドロゲルでもよく、それは任意の生体適合性又は非細胞傷害性のホモポリマー又はヘテロポリマー、例えば薬剤吸収スポンジの働きをする親水ポリアクリル酸ポリマーから調製される。それらのあるものは、例えば特にエチレン及び/又はプロピレンオキシドから得られるものは市販されている。ヒドロゲルは、例えば外科的診療の間に、治療する組織の表面へ直接置くことができる。本発明の医薬組成物の実施形態は、本発明のポリヌクレオチド抑制剤をコードする複製欠陥組換えウイルスベクター、及びポロキサマーpoloxamerなどのトランスフェクションエンハンサーを含む。ポロキサマーの例はPoloxamer407であり、それは市販BASF、Parsippany、NJされている無毒性、生体適合性のポリオールである。組換えウイルスを含浸させたポロキサマーは、例えば外科的診療の間に、治療する組織の表面へ直接置くことができる。ポロキサマーは基本的にヒドロゲルと同じ利点を有するが、粘度は低い。活性発現抑制剤は、コロイド薬剤送達系例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル又はマクロエマルジョンにおいて、例えば界面重合により調製したマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-メチルメタシレートマイクロカプセルに封入することもできる。そのような手法は、RemingtonsPharmaceuticalSciences、第16版、OsolA編、で開示されている。徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスがあり、そのマトリックスは造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル例えばポリ2-ヒドロキシエチル-メタクリレート、若しくはポリビニルアルコール、ポリ乳酸米国特許第3773919号、L-グルタミン酸及びγ-エチル-L-グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRONDEPOT商標乳酸グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェアなどの分解可能な乳酸グリコール酸コポリマー、並びにポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸がある。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸グリコール酸のなどのポリマーは100日以上の分子の放出を可能にするが、あるヒドロゲルはより短い期間、タンパク質を放出する。カプセル化抗体が長い間体内に残るときは、それらは37°Cの湿気に曝露する結果変性又は凝集を起こし、結果として生物的活性の消失及び免疫原性の変化の可能性をもたらす。関係するメカニズムに応じて、安定化のために合理的な手法を考案することができる。例えば、凝集メカニズムがチオジスルフィド相互変換を通しての分子間S-S結合形成であることが判明した場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、適当な添加剤を用いて含水量を制御し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより安定化を達成することができる。上で定義されたように、治療有効量はタンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド又はその抗体、アゴニスト若しくはアンタゴニストの、症状又は病態を改善する量を意味する。そのような化合物の治療効力及び毒性は、細胞培養又は実験動物で標準的な薬学手法、例えばED50集団の50で治療効果の見られる用量及びLD50集団の50に致死的な用量で測定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比を治療指数といい、LD50/ED50で表される。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトで使用される用量の範囲を処方するために使用される。そのような化合物の投薬量は、好ましくはほとんど毒性がなく、ED50を含む循環濃度範囲内にある。投薬量は、使用される剤形、患者の感受性及び投与経路に従ってこの範囲内で変動する。任意の化合物について、最初に、細胞培養アッセイで、又は動物モデルで、通常はマウス、ウサギ、イヌ若しくはブタで、治療有効量を推定することができる。動物モデルは、望ましい濃度域及び投与経路に到達するためにも用いられる。そのような情報は、次にヒトで役立つ用量及び投与経路を決定するために用いることができる。正確な投薬量は、治療される患者を考慮して個々の医師によって選択される。用量及び用法は、活性部分の十分なレベルを提供するために、又は所望の効果を維持するために調節される。考慮することができる更なる要素としては、患者の疾病状態の重症度、年齢、体重及び性別、食事、所望の治療期間、投与方法、投与の時間及び頻度、併用薬、反応感度並びに治療に対する寛容性/反応がある。長時間作用の医薬組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度次第で3~4日ごとに、毎週、又は2週間に1回投与してもよい。本発明による医薬組成物は、様々な方法によって対象に投与することができる。それらはターゲット組織に直接加えることができ、陽イオン脂質との複合体を形成することができ、リポソーム中に封入することができ、又は当技術分野で公知の他の方法によってターゲット細胞に送達することができる。所望の組織への局所投与は、直接注入、経皮吸収、カテーテル、注入ポンプ又はステントによって実施することができる。DNA、DNA/媒体複合体、又は組換えウイルス粒子は、治療部位に局所的に投与される。代替の送達経路としては、それらには限定されないが、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアゾール吸入、経口用錠剤若しくは丸剤、局所、全身、目、腹腔内及び/又はクモ膜下の送達がある。リボザイム送達及び投与の例は、Sullivanら国際公開9402595で提供されている。本発明による抗体は、ボーラスとしてだけ送達すること、経時的に注入すること、又はボーラスとしての投与及び経時的注入の両方が可能である。当業者は、タンパク質のものとは異なる製剤をポリヌクレオチドのために使用することができる。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、病態、部位、その他に特異的である。本明細書で先に議論されたように、本発明に役立つポリヌクレオチド剤をコードするDNAを導入するために、組換えウイルスを用いることができる。本発明による組換えウイルスは、通常、約104から約1014のpfuの用量の形で製剤化及び投与される。AAV及びアデノウイルスの場合、約106から約1011のpfuの用量を用いるのが好ましい。用語pfuプラーク形成単位は、ビリオン懸濁液の感染力に対応して、適当な細胞培養を感染させて形成されるプラーク数を測定することで決定される。ウイルス溶液のpfu力価を測定するための手法は、先行技術で十分記載されている。本発明はまた、本発明の発現抑制剤の治療有効量を前記対象に投与することを含む軟骨形成の増強方法を提供する。本発明の他の態様は、本明細書で説明したような軟骨形成増強医薬組成物を前記対象に投与することを含む、軟骨細胞同化刺激作用に関与した疾患を治療又は予防する方法に関する。本発明の手段及び方法を使用して治療できる軟骨細胞の同化刺激作用に関与した疾患の例には、限定はしないが、骨関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、痛風関節炎、敗血性又は感染性関節炎、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、疼痛性ジストロフィー、ティーツェ症候群又は肋骨軟骨炎、繊維筋痛症、骨軟骨炎、神経性又は神経障害性関節炎、関節症、変形性骨関節炎風土病のような風土病型関節炎、ムセレニMseleni病及びハンディゴデュHandigodu病、繊維筋痛症から生じた変性症、全身性エリテマトーデス、強皮症及び強直性脊椎炎が含まれる。さらに、遺伝性軟骨融解、軟骨形成不全及び偽軟骨異形成を含む先天性軟骨奇形に罹患した人々は、軟骨細胞の同化刺激作用を引き起こす治療計画から利益を得るようであり、したがって、これらの疾患も、本発明の方法及び手段を使用することによって治療できる。先天性軟骨奇形関連疾患の非限定的な例は、小耳症、無耳症及び骨幹端骨軟骨形成症である。本発明の方法で使用されるポリペプチド又はポリヌクレオチドは、溶液中で遊離状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面で運ばれても、細胞内に置かれてもよい。本方法を実施するために、本発明のポリペプチド又は化合物を固定してそのポリペプチドの非複合形態から複合体の分離を促進し、且つアッセイをオートメーション化することが可能である。化合物との本発明のポリペプチドの相互作用例えば、結合は、反応体を収納するのに適当な任意の容器内で達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管及び微量遠心管がある。一実施形態では、ポリペプチドのマトリックスへの結合を可能にするドメインを加える、融合タンパク質を提供することができる。例えば、本発明のポリペプチドはHisタグを付け、次にNi-NTAマイクロタイタープレート上へ吸着させることができ、又は、本発明のポリペプチドとのProtA融合をIgGに吸着させ、それを次に細胞溶解物例えば、35S標識及び候補化合物と組み合わせ、混合物は複合体形成に好都合な条件下例えば、生理的条件の塩及びpHでインキュベートする。インキュベーションに続いて、プレートを洗浄して未結合の標識があれば除去し、マトリックスを固定化する。放射能の量は直接、又は複合体の解離後に上清で測定することができる。或いは、複合体をマトリックスから解離してSDS-PAGEで分離し、本発明のタンパク質へのタンパク質結合のレベルを標準の電気泳動手法を用いてゲルから定量化することができる。マトリックス上のタンパク質の固定化のための他の手法も、化合物の同定方法で用いることができる。例えば、本発明のポリペプチド又は化合物は、ビオチン及びストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化することができる。本発明のビオチン化タンパク質分子は、当技術分野で公知の技術例えばビオチン化キット、PierceChemicals、Rockford、Illを用いてビオチン-NHSN-ヒドロキシスクシンイミドから調製して、ストレプトアビジンでコーティングされた96穴プレートPierceChemicalのウェル内に固定化することができる。或いは、本発明のポリペプチドと反応性であるがポリペプチドと化合物との結合を干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導することができ、本発明のポリペプチドは抗体コンジュゲーションによってウェルに捕捉することができる。先に述べたように、標識候補化合物の調製物は本発明のポリペプチドを提示するプレートのウェル内でインキュベートされ、ウェルに捕捉された複合体の量は定量することができる。本発明の他の実施形態は、軟骨細胞を再分化するのに十分な時間、軟骨細胞を、配列番号1~28に相補的な配列からなる群から選択される、好ましくは配列番号202~315に相補的な配列からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド配列と接触させ、それによって軟骨基質を生成する段階を含む、軟骨組織のインビトロ生成方法に関する。好ましい実施形態では、この方法は、a細胞基質を形成するために軟骨細胞を基質に適用する段階と、b軟骨細胞を再分化するのに十分な時間、配列番号1~28に相補的な配列からなる群から選択される、好ましくは配列番号202~315に相補的な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを導入し、それによって軟骨基質を生成する段階とを含む。したがって、本発明は、人工膝関節及び指関節などの人工関節並びに顎顔面移植片を含む耐荷重性移植片を供給するために使用できるマトリックスを増殖させる基質の製造方法を提供する。これはまた、スペーサーなどの特殊な手術装置又は軟骨充填剤に使用することができ、軟骨の欠陥、及び損傷を受けた、若しくは欠落した軟骨の強化、除去又は再構成において使用することができる。本発明はまた、耐荷重性移植片好ましくは、前述のマトリックスでコーティングされていると前述のマトリックスを含む軟骨充填剤との組合せに関する。本発明の方法はまた、修正手術に関連して、すなわち、以前の手術装置の交換が必要なときに、非常に適している。適切な細胞は、幹細胞細胞であり、間葉幹細胞細胞、特に軟骨細胞前駆細胞が含まれる。間葉幹細胞、特に軟骨細胞前駆細胞は、本来の環境から採取すると軟骨生成プロセスに非常に効果的であることが発見された。さらに、対象の軟骨生検から得られた細胞は、培養して本発明で利用することができる。間葉幹細胞は、直接基質に適用することができるか、又は基質に適用する前に基質無しで都合良く増殖させることができる。後者の方法の場合、この細胞は増殖した後でもまだ非常に多能性があり、本発明の目的では、未分化であるとまだ言われる。その後、この細胞を分化させることができる。分化は、適切な誘導因子、例えば、骨形態形成タンパク質BMP2、BM4、BMP7、トランスフォーミング成長因子ベータTGFベータ、CDMP1及びCDMP2の存在によって誘導されるか、高められることができる。分化に特に適した誘導因子は、本発明の発現抑制剤である。間葉幹細胞の使用は、いくつかの利点をもたらす。最初に、分化が低ければ低いほど増殖速度が速いことを意味し、結果として生じる機能性をより特異化し、より制御することができる。さらに、これらの細胞を培養することは、有機成分及び無機成分を含有する必要な軟骨基質を生じるだけでなく、培地及びマトリックス中に、組織の増殖及び既存の生組織に適合するために必須のいくつかの因子の存在をもたらす。また、培地は、移植過程に関連して使用される、成長因子などの活性因子の原料であることができる。さらに、このような未分化の細胞は大量に、且つ、例えば成熟軟骨細胞よりも便利に入手できることが多く、回収中の死滅率が低いことが示されている。さらに、この未分化細胞は、移植を企図する患者から得ることができる。これらの細胞から生じた軟骨細胞は、患者由来で、したがって免疫応答が誘導されない。未分化細胞を使用した結果、厚さ100μmのマトリックスを生成することができる。この未分化細胞を適用し、培養することができる基質は、チタン、コバルト/クロム合金又はステンレス鋼などの金属、リン酸カルシウムなどの生物活性表面、ポリエチレンなどのポリマー表面などであることができる。あまり好ましくはないが、ガラスセラミックなどのケイ酸含有物質もまた基質として使用することができる。リン酸カルシウムは基質に必須の成分ではないが、最も好ましいのは、チタン及びリン酸カルシウムなどの金属である。基質は多孔性若しくは非多孔性であってよい。細胞は、例えば、cm2当たり細胞103~106個、特にcm2当たり細胞104~2×105個の割合で適用することができる。本発明による方法で使用する培地は、MEM最小必須培地などの通常公知の培地であってよい。培地は、調整培地であると有利である。この場合、調整培地とは、同様の細胞がすでにインキュベートされており、この細胞の分泌によって培地が細胞増殖及び細胞分化に重要なポリペプチドなどの要素を含有するようになった培地であると理解される。この細胞を、マトリックス層、例えば、厚さが少なくとも0.5μm、特に1から100μmまで、さらに特に10~50μmまでのマトリックス層を生成するために十分な時間培養する。この細胞を、例えば、2~15週間、特に、4~10週間培地と接触させることができる。基質に適用するとき、マトリックスの生成は、基質の表面領域の少なくとも50。特に少なくとも80を覆う連続的な、又は準連続的なコーティングをもたらす。本発明の他の態様では、本発明は軟骨細胞の脱分化に関与した病理状態の診断方法を提供し、前記方法は、ゲノムDNA試料中に表1Aに挙げたポリペプチドをコードする遺伝子のいずれか1つの核酸配列を決定する段階と、段階aの配列と健康な対象の核酸配列とを比較する段階と、病理学的状態に関していかなる差も確認する段階とを含む。このような差は、本明細書で開示した同様のマーカー遺伝子を適用するインビトロアッセイでさらに確認することができる。このようなアッセイは、軟骨細胞の同化刺激プロセスにおける遺伝子又はそれがコードするポリペプチドの役割を明らかにするだろう。このような変異が同定されたならば、この知識は同様の疾患の診断のための試験キットでさらに利用することができる。本発明の他の態様は、対象で軟骨細胞の同化刺激作用に関係する病的状態又はその病態への感受性を診断するための方法であって、生体試料中の配列番号101~128及び401~594からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量を測定することと、その量を健康対象におけるそのポリペプチドの量と比較することとを含む方法に関し、健康対象と比較してのポリペプチド量の増加はその病的状態の存在の指標となる。明らかに、本明細書で開示した標的遺伝子の活性及び/又は発現レベルは、軟骨細胞の同化刺激作用に効果を有することが可能である。疾患を診断するために活性は何レベル上昇すべきかを決定することが残されている。しかし、患者、無症状の個体及び明らかに健康な個体で見いだされたレベルを比較することによって、当業者は容易にこれらの相対レベルを決定することができる。当業者はすでにどのポリペプチドをモニターすべきか知っているので、本発明は、このような診断の試験測定法のための新規手段を提供する。本発明によってもたらされる知識を使用することによって、制御、確認及び診断が可能な疾患で最初に挙げられるのは骨関節炎である。軟骨細胞同化刺激作用の速度は一般的に、軟骨、又は軟骨成分、又は軟骨細胞によって培地中に産生される軟骨含有細胞外マトリックスの蓄積量を測定することによって測定することができる。WalshGの著書タンパク質:バイオテクノロジー及び生化学JohnWileyandSonsに記載されたもののような、細胞をベースにしたELISA、酵素アッセイ又は当業界で公知のその他の一般的な技術は、軟骨成分を測定するために使用することができる。本発明を以下の図面及び実施例でさらに例示する。実施例1:内因性II型コラーゲン、アルファ-1col2α1検出のハイスループットスクリーニング法の開発測定の原理2次元培養で増殖させた正常ヒト関節軟骨細胞NHACは、脱分化し、徐々に軟骨を合成しなくなる。これらは適切な因子例えば、BMP2の存在下で同化活性軟骨細胞に再分化させることができる。このような因子をスクリーニングするアッセイは、コラーゲンII型、アルファ-1col2α1、正常軟骨の主要な構成成分のレベルをモニターすることによって開発された。NHACを384ウェルプレートに接種し、播種して1日後にSilenceSelectコレクションWO03020931参照の個々のsiRNAアデノウイルスAd-siRNAを感染させる。Col2α1の沈着量は、感染開始後14日目に測定する14dpi。対照ウイルスAd-BMP2:WO03018799に記載。BMP4:完全長骨形態形成タンパク質4前駆タンパク質の発現を媒介するAd5dE1/E2AアデノウイルスNP_570912参照Ad-LacZ:WO02070744ではpIPspAdApt6-lacZと呼ばれている。Ad-eGFP:WO02070744ではpIPspAdApt6-eGFPと呼ばれている。Ad-空:WO02070744に記載されている。アッセイの開発NHACは、死因に関連性のない提供者から単離され、インフォームドコンセント後に入手したCambrex、Verviers、ベルギー。384ウェルプレートで実施した一連の実験において、いくつかの変数、すなわち細胞接種密度、対照ウイルスAd-BMP2又はAd-eGFPの感染多重度MOI、感染期間、毒性、感染率Ad-eGFPを使用及び計測日を最適化した。アッセイ開発用の陽性対照としてAd-BMP2BMP2過剰発現を使用すると、以下のプロトコルはアッセイ用ダイナミックレンジが最も高く、バックグラウンドシグナルにおける標準偏差が最も小さくなった。NHACを0日目に10熱不活性化牛胎児血清FBS-HI及びPen/Strepを含有するDMEM/F12Invitrogen60μlに、384ウェルプレートで1500細胞/ウェルとなるように接種し、翌日2.5μlのAd-対照ウイルスAd-BMP2又はAd-eGFP、これは推定MOI2000に対応するを感染させる。7日後、2-ホスホ-L-アスコルビン酸50μg/mlを入れた測定用培地10μlを各ウェルに添加する。col2α1の上方制御は10dpiで読み取る。培地はVacuSafeで除去する。氷冷MeOH50μlをマルチドロップで添加し、VacuSafeですぐに除去する。細胞を固定するために氷冷MeOH80μlをマルチドロップで添加し、プレートを-20°Cで20分間インキュベートする。MeOHはVacuSafeで除去する。プレートを20分間空気乾燥して、次にリン酸緩衝生理食塩水PBS80μlで2回洗浄する。ブロッキング緩衝液カゼイン0.1のPBS溶液75μlを添加し、プレートを少なくとも2時間室温RTでインキュベートする。ブロッキング緩衝液を除去する。細胞を、EC緩衝液リン酸ナトリウム20mM、EDTA2mM、NaCl400mM、BSA0.2、CHAPS0.05、カゼイン0.4、NaN30.05、pH725μlで洗浄し、緩衝液Cリン酸ナトリウム20mM、EDTA2mM、NaCl400mM、BSA1、pH7で1/450、1/225に希釈した第1抗体コラーゲンII型Ab-2ネオマーカー、カタログ番号MS-235-P35μlをマルチチャンネルピペットで添加する。プレートを4°Cで一晩インキュベートする。第1抗体を除去する。細胞をPBSTTween200.5のPBS溶液80μlで2回、PBS80μlで1回洗浄する。第2抗体ヤギ抗マウスイムノグロブリン/HRP.DAKO.カタログ番号P0477、緩衝液Cで1/2000に希釈35μlをマルチチャンネルピペットで添加する。プレートをRTで1時間インキュベートして、第2抗体を除去し、細胞をPBST80μlで2回、PBS80μlで1回洗浄する。ルミノール基質50μlを添加し、5分後に照度計で計測値を測定する。アッセイを最適化した後図1参照、陽性対照ウイルスBMP2及びBMP4及び変化を与えないneutralウイルスeGFP、lacZ及び空、図1参照を含有する384ウェル対照プレートを準備する。対照プレートの一定量を準備し、-20°Cで凍結した。対照プレートを解凍し、各スクリーニングバッチに用いる。実施例2:軟骨形成アッセイにおけるアデノウイルスsiRNAベクター9216個のスクリーニングSilenceSelectライブラリーのスクリーニングに最適なプロトコルを以下のように実施する。0日目に、増殖させたヒト由来の初代培養軟骨細胞を培地60μlに、底が透明なGreinerwhite、平底TC処理384ウェルプレートカタログ番号781080でウェル当たり1500細胞の密度になるように接種する。1日後、384ウェルプレートに保存したSilenceSelect商標収集物WO03020931の各ウェルのAd-siRNAウイルス推定力価、1ml当たりウイルス粒子1×109個2.5μlを96/384チャンネル分配器TeMO96、TeMO384及びRoMaを備えたTecanFreedom200、TecanAG、スイスで軟骨細胞を含有する384ウェルプレートの個々のウェルに移す。対照プレートをSilenceSelect収集物の分取プレートと同様の条件下で実施する。Ad-siRNAウイルス全てを独立した測定プレートで2連でスクリーニングする。感染後、プレートを37°Cでインキュベートする。感染7日後、アデノウイルスを含有する培地を新鮮培地と交換する。感染13日後、ウェル当たりのcol2α1沈着の量をcELISA法で測定する。384ウェルスクリーニングプレートの一般的な結果を図2に示す。2連のスクリーニングをもう1回繰り返す。試験した4回のうち2連で2回スクリーニング少なくとも2回のデータ点が閾値を上回るならば、Ad-siRNAウイルスはヒットとして登録する。閾値はプレート当たり全データ点の平均プラス標準偏差の2.5倍に設定する。スコアが閾値を上回ったヒット総数282個を単離したところ、独立した遺伝子274個が示された。2連のデータ点の標準偏差の倍数をX軸及びY軸に示した代表例を図2に示す。閾値標準偏差の2.5倍は点線で表す。負の値は、スコアが平均を下回るデータ点を示す。遺伝子のいくつかの結果を図3に示す。コラーゲンIIレベルの明らかな誘導が、表示の遺伝子を標的とするAd-siRNAの感染後に認められる。このデータは、コラーゲンIIレベルに相関する相対光単位rluとして表わされる。実施例3:ヒットの増殖軟骨細胞同化刺激作用を誘導する治療能力を確立するためにAd-siRNAヒット282個の分析をさらに行う。最初の段階は、さらに分析するためにこの実施例選択されたAd-siRNAの品質管理を必要とする。次の段階は、コラーゲンIIに加えて軟骨のもう1つの主要構成成分であるアグリカンの誘導などの軟骨細胞同化刺激作用における標的の役割を確認するその他のアッセイにおける標的のスクリーニング実施例4、その他の提供者の軟骨細胞における軟骨細胞同化刺激作用の誘導能力実施例5、3次元軟骨細胞培養における妥当なマーカー特性の誘導実施例11、3次元軟骨細胞培養におけるアグリカン実施例9及びコラーゲンII実施例10の翻訳後修飾の存在、同定された転写物を標的とする他のAd-siRNAの開発実施例7、及び既存の軟骨細胞で対応する遺伝子が本当に発現することの確認実施例12である。軟骨形成アッセイの282個のヒットを増殖させるため、PerC6.E2A細胞2.25×104個を96ウェルプレートの各ウェルの非加熱不活性化FCS10を含有するDMEM200μlに接種して、CO210の湿潤インキュベーター内で39°Cで一晩インキュベートする。その後、マトリックス管内のsiRNAアデノウイルス保存物の粗溶解物1μlを添加し、インキュベーションをCO210の湿潤インキュベーター内で34°Cで7日間実施する。全ヒットを2枚の独立したプレートで2連で増殖させる。2つの溶解物を収集し、一部を-20°Cで凍結する。増殖したAd-siRNAを軟骨形成アッセイにおいて3種類のMOIで2連で再スクリーニングする実施例1参照。Ad-siRNAは、この品質管理段階を通過するためにはスコアが少なくとも1回は閾値平均標準偏差2.5倍を上回らなければならない。実施例4:アグリカン誘導軟骨細胞同化因子をスクリーニングする第2のアッセイは、軟骨のもう1つの主要構成要素、アグリカンのレベルをモニターすることによって開発されている。このアッセイでは、アグリカン上のグリコサミノグリカンをアルシアンブルーによって染色する。NHACを384ウェルプレートに接種し、接種して1日後にSilenceSelect商標コレクションの個々のAd-siRNAに感染させる。アグリカン沈着は感染して14日後に測定する。陽性対照としてAd-BMP2を使用し、一連の実験において、ColIIcELISAアッセイに最適化されたいくつかの変数はまた、アグリカンのアルシアンブルー染色アッセイにも適用できることを確認している。これらの変数には、細胞接種密度、対照ウイルスのMOI、感染期間及び計測日が含まれる。NHACを、0日目に、10FBS-HI及びPen/Strepを含有するDMEM/F1260μlに、底が透明な384ウェル黒色プレートで1500細胞/ウェルとなるように接種し、翌日にMOI2000でAd-BMP2又はAd-eGFP2.5μlに感染させる。7日後、アッセイ培地に溶かした2-ホスホ-L-アスコルビン酸溶液50μg/ml、10μlを各ウェルに添加する。アグリカンの上方制御はアルシアンブルー染色で10dpiで計測される。培地をVacuSafeで除去し、氷冷MeOH50μlをマルチドロップで添加し、すぐにVacuSafeで除去し、細胞を固定するために氷冷MeOH80μlを添加し、プレートを-20°Cで20分間インキュベートし、MeOHをVacuSafeで除去し、プレートを20分間空気乾燥する。PBS80μlで1回洗浄した後、0.05アルシアンブルー染色緩衝液アルシアンブルー、Sigma、カタログ番号S-2889;MgCl20.4M/酢酸ナトリウム25mM、pH5.580μlを添加し、プレートをRTで一晩インキュベートする。翌日、細胞を80μlの3酢酸、25エタノール/3酢酸及び50エタノール/3酢酸で順次洗浄する。溶液をマルチドロップで添加し、VacuSafeで除去する。50エタノール/3酢酸を70エタノール/3酢酸で置換した後、個々のウェルをSONYCCDカメラで撮影し、ノイズ除去フィルター後に色閾値法による青シグナル分離に基づいたガラパゴスアルシアンブルー定量アルゴリズムを使用して画像を分析する。アグリカン含量に比例する青染色の量はピクセル単位で表す図4参照。実施例3の増殖したヒットは、軟骨形成アッセイにおいてNHAc細胞を3種類のMOIで2連で形質導入するために使用する実施例1参照。Ad-siRNAがこの2次アッセイを合格するためには、2連で閾値平均2.5×標準偏差を少なくとも1MOI上回るスコアでなければならない。全体で、ヒット282個のうち101個がアグリカンのアルシアンブルーアッセイを合格した表1参照。遺伝子のいくつかの結果を図5に示す。値は説明したアルゴリズムの出力数を示し、アルシアンブルー染色レベルと相関する。アグリカンレベルの明らかな誘導が、表示の遺伝子を標的とするAd-siRNAの感染後に認められる。FZD1を標的とするAd-siRNAは、アルシアンブルー染色を誘導しないようである。実施例5:提供者依存性所与のヒットによるColII産生の誘導が単一の提供者に限定されないことを示すために、ColIIcELISA試験によって確認されたヒット282個に提供者依存性試験をさらに行う。以前に使用した11歳の提供者提供者Iに加えて、年齢24提供者II、41提供者III及び50提供者IVの複数の提供者から、インフォームドコンセントの後NHACを採取するCambrex、Verviers、ベルギー。実施例1及び3で説明したように細胞を接種する。軟骨形成アッセイにおいてこれらの様々な提供者のNHAc細胞を3種類のMOIで2連で形質導入するために、増殖したAd-siRNAを使用する実施例1及び3参照。Ad-siRNAは、この提供者依存性試験を合格するためには少なくとも1回スコアが閾値平均標準偏差の2.5倍を上回らなければならない。アグリカンのアルシアンブルーアッセイを合格した101個のヒットのうち、97個が提供者IVにおいて陽性を記録した。残りの4個のうち1個は、提供者IIにおいて陽性を記録した。その他の3個は試験したその他の提供者では記録されなかった。さらに、101個のヒットのうち40個は他の3人の提供者全てにおいて陽性を記録した。これらの結果は、これら101個のヒットのうち98個は提供者非依存性の形態で機能することを示している。例外は、H33~145、H33~182及びH33~263である表1参照。この表1で示したのは、標的遺伝子記号、遺伝子バンクアクセッション番号及び標的配列に対応する遺伝子の治療薬の種類である。これらの遺伝子のいくつかの結果を表2に示す。これらのデータは、表示の遺伝子のRNAレベルをノックダウンすると少なくとも2人の提供者においてコラーゲンIIレベルが誘導されることを示している。値は、バックグラウンドの標準偏差の倍率を示す。実施例6:標的Ad-siRNAの品質管理PER.C6登録商標細胞Crucell、Leiden、オランダの誘導体を96ウェルプレートレベルで使用することによって標的Ad-siRNAを増殖させ、その後1次アッセイ実施例1参照でいくつかのMOIでこれらのウイルスを再スクリーニングし、標的Ad-siRNAウイルスによってコードされたsiRNAを配列決定する。PER.E2A細胞を、PER.E2A培地180μlに、96ウェルプレートでウェル当たり40000細胞の密度となるように接種する。次に、細胞を10CO2湿潤インキュベーター内において39°Cで一晩インキュベートする。翌日、細胞に標的Ad-siRNAを含有するSilenceSelect保存物の粗細胞溶解物1μlを感染させる。細胞変性効果が現れるまで細胞が膨潤し、丸くなることによって明示される、通常感染後7日目、細胞をさらに34°C、CO210でインキュベートする。上清を収集し、ウイルス粗溶解物をタンパク質分解酵素Kで処理し、粗溶解物12μlを、タンパク質分解酵素KRocheMolecularBioChemicals、カタログ番号7457231mg/ml及びTween-20RocheMolecularBioChemicals、カタログ番号13354650.45を補給した溶解緩衝液MgCl2RocheMolecularBioChemicals、カタログ番号1332465を含む1×ExpandHighFidelity緩衝液4μlに滅菌PCRチューブ内で添加する。これらを55°Cで2時間インキュベートし、その後95°Cの不活性化段階で15分間インキュベートする。PCR反応では、溶解物1μlを、MgCl2含有10×ExpandHighFidelity緩衝液5μl、dNTPミックス各dNTPについて10mM0.5μl、フォワードプライマー10mM保存物、配列:5’CCGTTTACGTGGAGACTCGCC、配列番号291μl、リバースプライマー10mM保存物、配列:5’CCCCCACCTTATATATATTCTTCCC、配列番号301μl、ExpandHighFidelityDNAポリメラーゼ3.5U/μl、RocheMolecularBiochemicals0.2μl及びH2O41.3μlから構成されるPCRマスターミックスに添加する。PCRは、PEBiosystemsGeneAmpPCRシステム9700で、以下のように、PCR混合物全部で50μlを95°Cで5分インキュベートし、各サイクルは95°Cで15秒、55°Cで30秒、68°Cで4分処理し、35サイクル繰り返す。最後のインキュベーションは68°Cで7分間行う。PCR混合物5μlを、増幅産物を分離するために臭化エチジウム0.5μg/μlを含有する0.8アガロースゲル上に添加された6×ゲル添加緩衝液2μlと混合する。増幅断片の大きさは、同ゲルに添加した標準DNAラダーから推定する。予測される大きさは500までbpである。配列分析のため、標的アデノウイルスによって発現したsiRNA構築物をpIPspAdapt6-U6プラスミドのSapI部位に隣接するベクター配列に相補的なプライマーを使用してPCRによって増幅する。PCR断片の配列を測定し、予測した配列と比較する。配列は全て、予測した配列と同一であることが分かる。実施例7:同定したsiRNA配列の標的効果の評価同定したsiRNA配列が標的mRNAのノックダウンによって本当にコラーゲンII及びアグリカンのレベルを増加させるかどうかを評価するために、同様の効果を発揮する第2のsiRNA配列を同定する。HIT配列を標的とするいくつかの他のsiRNA配列を設計し、WO03020931に従ってアデノウイルスに組み込む。これらのアデノウイルスを生成したのち、Ad-siRNAを軟骨細胞に様々な量1.5μl、5μl及び15μlで感染させ、コラーゲンIIに対するこれらの効果を実施例1で説明したように評価する。各量について閾値平均標準偏差の2.5倍を計算する。異なる感染量の1つ又は複数についてウイルスのスコアが閾値を上回るならば、陽性であると見なす。標的の結果を図6に示す。これらの結果は、HIT配列を標的とする少なくとも1つの他のsiRNAが同定され得ることを示す。これは、SilenceSelectライブラリーのスクリーニング中に同定されたsiRNA配列の標的効果を明白に示す。実施例8:安定な軟骨の定量マーカー分析及びグリコサミノグリカンGAG及びヒドロキシプロリンHyp合成の評価のための3次元アルギン酸培養系の開発測定の原理3次元培養で増殖した正常ヒト関節軟骨細胞NHACは、コラーゲンII型及びアグリカンの発現によって測定された通り分化状態を維持することができる。継代数を限定するために2次元系で培養された脱分化軟骨細胞は、3次元培養系に移されると分化状態に戻ることができる。この系は、1同化活性軟骨細胞と相関するmRNA発現パターンを誘導し、2軟骨の安定性に関与するコラーゲンII型ヒドロキシプロリン及びアグリカングリコサミノグリカンのタンパク質改変を誘導する、siRNAアデノウイルスAd-siRNAの能力を試験するために確立された。正常な軟骨NHACは、細胞増殖目的のために2回又は3回継代する2次元培養系で培養する。細胞は、2次元培養系で個々のsiRNAアデノウイルスAd-siRNAで形質導入し、3日後、3次元アルギン酸培養系に移す。アルギン酸培養を10日行った後、様々な変数を評価することができる例えば、mRNAマーカー分析及びタンパク質改変。アッセイ方法mRNAマーカー分析及びタンパク質改変評価両方のために陽性対照としてAd-BMP2BMP2:強コラーゲンII誘導因子及びAd-BMP7BMP7:弱コラーゲンII誘導因子並びに陰性対照としてAd-ALPLを使用して、以下の方法を設定する。単層培養条件で2回又は3回継代した後、NHACを軟骨細胞増殖培地Cambrex30mlに2.10E06細胞/T175フラスコとなるように接種し、MOI2000を使用して対照ウイルスAd-BMP2、Ad-BMP4、Ad-BMP7、Ad-ALPLで翌日形質導入する。3日後、細胞を軟骨細胞試薬パックCambrexを使用してトリプシン処理して、塩化ナトリウム155mM/Hepes20mMph7.4Cambrexで1回洗浄する。細胞をアルギン酸ナトリウム1.2に2×106細胞/mlの密度で再懸濁する。細胞懸濁液を21~22ゲージ針を装着したシリンジに移し、塩化カルシウム102mM/Hepes5mMpH7.4に滴下によって放出する24ウェルプレートに1ml及び6mlウェルプレートに5ml。ビーズを24ウェルプレートではウェル当たり5個、6ウェルプレートでは50個作製する。アルギン酸ビーズを含有するプレートを2分間隔でゆっくり振盪して10分間インキュベートする。塩化カルシウム溶液をVacusafeシステムで吸引して、ビーズを、Vacusafeを使用して塩化ナトリウム溶液で3回、加熱不活性化牛胎児血清FBS-HI10及びペニシリン/ストレプトマイシン1を補給したDMEMF/12で1回洗浄する。アルギン酸ビーズは、加熱不活性化牛胎児血清FBS-HI10、ペニシリン/ストレプトマイシン1及びアスコルビン酸Fluka、Sigm101~128及び401~594ldrich25μg/mlを補給したDMEMF/120.5ml及び3mlそれぞれ、24ウェルプレート及び6ウェルプレートに再懸濁する。アルギン酸培養は、湿潤インキュベーター内で37°C及びCO25で10日間、48/72時間ごとに培地を取り替えてインキュベートする。各アデノウイルス形質導入について、アルギン酸ビーズ60個を作製する。GAG/Hyp評価用に2×5ビーズを24ウェルプレートで培養し、mRNA発現パターン測定用に50ビーズを6ウェルプレートの1個のウェルで培養する。対照ウイルスAd-BMP2:WO03018799に記載されているAd-BMP7:完全長骨形態形成タンパク質7前駆タンパク質の発現を媒介するAd5dE1/E2AアデノウイルスNP_001710Ad-BMP4:完全長骨形態形成タンパク質4前駆タンパク質の発現を媒介するAd5dE1/E2AアデノウイルスNP_570912Ad-ALPL:完全長肝臓/骨/腎臓アルカリホスファターゼの発現を媒介するAd5dE1/E2AアデノウイルスNP_000469実施例9:アルギン酸ビーズに包埋した軟骨細胞における、グリコサミノグリカンGAGレベルでの標的遺伝子ノックダウンの効果軟骨細胞を感染させ、実施例8に従ってアルギン酸ビーズに包埋する。10日間培養後、定量前にグリコサミノグリカンを可溶化するためにアルギン酸ビーズをパパインで処理する。24ウェルプレートで培養したビーズを50mMリン酸緩衝液pH6.5で1回洗浄し、EDTA2mM、L-システイン2mM及びパパインSigma126μg/mlを含有する同緩衝液250μl/ウェルで65°Cで3時間から4時間インキュベートする。ビーズの完全消化は、顕微鏡観察によって評価する。パパイン消化物は、グリコサミノグリカン定量を実施するまで-20°Cで凍結させる。アルギン酸培養系中で初代軟骨細胞によって産生したGAGをBlyscan商標アッセイBiocolorLtd、Newtownabbey、北アイルランドを使用して測定する。Blyscanアッセイの原理Blyscanアッセイは、硫酸化GAG分析用の定量的色素結合法である。このアッセイで使用した色素標識は、プロテオグリカンの硫酸化多糖成分及び/又はタンパク質を含まない硫酸化グリコサミノグリカン鎖に特異的標識をもたらす条件下で使用する1,9-ジメチルメチレンブルーである。アグリカンは、関節軟骨で優勢なプロテオグリカンで、軟骨プロテオグリカンの±90を占める。アグリカンの生物学的機能及び安定性に必要なGAGとして公知の±50ケラタン硫酸及び±100コンドロイチン硫酸鎖が結合した中心核タンパク質から構成される。アッセイの説明アルギン酸ビーズ中で10日間軟骨細胞を培養した後実施例7生じたパパイン消化物を水で1:100に希釈し、細胞を最初に陽性対照で形質導入した場合は1:200及び1:50、陰性対照で形質導入した場合は1/50、1:100に希釈する。この希釈段階で、アッセイの標準範囲内での値の計測が可能になる。製造者によって提供されたGAG標準物は、ウシ気管から精製されたコンドロイチン4-硫酸100μg/mlを含有する。この標準物を、GAG1、2、3及び5μgに対応する4段階の濃度で2連で測定する。標準物及び対照は、独立してエッペンドルフ管内で最終量100μlに希釈する。BlyscanDye試薬1ミリリットルを各チューブに添加し、連続的に振盪しながら室温で30分間インキュベートする。GAG-色素複合体は形成時に不溶性になり、その後遠心分離1000×g、10分間によって残存する過剰な可溶性未結合色素から分離される。反転によって上清を廃棄し、管の内容物を注意深く排出する。BlyscanDissociation試薬1ミリリットルを各チューブに添加し、連続的に振盪しながら1時間から1時間半インキュベートする。この試薬は、GAG結合色素を溶液に戻す。測定した試料のGAG含量は、試験試料中のGAGから回収された色素の量によって分光光度計によって測定される。脱離した色素溶液200マイクロリットルを96ウェルプレートのウェルに添加し、2波長656及び450nmで自動プレートリーダーで読み取りを実施する。Blyscanアッセイで測定したGAG濃度は、同パパイン消化物で蛍光Hoechstアッセイを実施することによってDNA含量に正規化させる。Hoechst33342色素試薬MolecuarProbesは、DNAのアデニン/チミンが豊富な領域に結合するビスベンズイミダソール色素である。パパイン消化物はTE緩衝液で1:1.7及び1:3.3に希釈し、この希釈段階で、アッセイの標準範囲内での値の計測が可能になる。精製されたウシ胸腺DNASigm101~108及び401~594ldrichを標準DNAとして使用する。初期保存溶液2μg/mlは、以下の濃度範囲:1.5、1.0、0.75、0.50、0.2μg/mlを得るためにTE緩衝液で順次希釈する。標準試料及び試験試料は、TEで最終量100μlまで希釈し、96ウェルプレートに添加する。Hoechst33342色素試薬100マイクロリットルをこのウェルに添加し、読み取りは励起波長を360nmに設定し、放射波長を440nmに設定した多機能マイクロプレートリーダーFluostarGalaxy、BMGLabtechnologiesGmbHで実施する。GAG濃度をDNA含量に正規化するとき、GAG濃度μg/ml/DNA濃度μg/ml比で表した結果の値は、アッセイウインドウを計算するために使用する。このウインドウは、正規化GAGAd-BMP2又はAd-BMP4/正規化GAGAd-ALPL比として計算される。14個の標的遺伝子のノックダウンのGAGレベルに対する効果は、説明したように評価する。得られた結果を図7に示す。結果は、2つの陰性対照ノックダウンアデノウイルスAd-PTGER4及びAd-GRM7で得られた正規化GAG値の平均と比較したGAGレベルの誘導倍率として表す。それぞれの遺伝子のmRNAのノックダウンは、GAGレベルの増加をもたらす。対照ウイルスAd-BMP2:WO03018799に記載されている。Ad-BMP4:完全長骨形態形成タンパク質4前駆タンパク質の発現を媒介するAd5dE1/E2AアデノウイルスNP_570912Ad-ALPL:完全長肝臓/骨/腎臓アルカリホスファターゼの発現を媒介するAd5dE1/E2AアデノウイルスNP_000469Ad-PTGER4:プロスタグランジンE受容体4mRNAをノックダウンするsiRNA配列CCATGCCTATTTCTACAGC配列番号31を含むAd5dE1/E2Aアデノウイルス。Ad-GRM7:向代謝性グルタミン酸受容体7mRNAをノックダウンするsiRNA配列TCAGTAACAGCTCCCAGAC配列番号32を含むAd5dE1/E2Aアデノウイルス。実施例10:ヒドロキシプロリンHypの定量分析関節軟骨では、コラーゲンの約95がII型コラーゲンである。その重合体は、組織の基本的な結合構造を形成する原線維である。コラーゲンの生合成には、プロリン及びリジン残基の水酸化を含むいくつかの特有の翻訳後修飾が関与する。これらの修飾は、コラーゲンの安定性及びタンパク質分解酵素に対する耐性に重要である。軟骨細胞を感染させ、実施例8に従ってアルギン酸ビーズに包埋する。10日間培養後、アルギン酸ビーズをパパインで処理する。24ウェルプレートで培養したビーズを50mMリン酸緩衝液pH6.5で1回洗浄し、EDTA2mM、L-システイン2mM及びパパインSigma126μg/mlを含有する同緩衝液250μl/ウェルで65°Cで3時間から4時間インキュベートする。ビーズの完全消化は、顕微鏡観察によって評価する。パパイン消化物は、ヒドロキシプロリン定量を実施するまで-20°Cで凍結させる。パパイン消化物でのヒドロキシプロリン評価は、試料を酸加水分解して、FMOCクロロギ酸9-フルオレニルメチルで誘導体化した後、HPLCによって実施する。この方法は、BankRAJansenEJBeekmanB及びTeKoppeleJM等の論文逆相高速液体クロマトグラフィーによるアミノ酸分析:クロロギ酸9-フルオレニルメチルによる誘導体化改良及び検出条件167176に記載されている。14個の標的遺伝子のノックダウンのヒドロキシプロリンレベルに対する効果は、説明したように評価する。結果を図8に示す。結果は、2個のKD対照Ad-PTGER4及びAd-GRM7で測定されたHyp濃度の平均と比較した誘導倍率として表す。それぞれの遺伝子のmRNAのノックダウンは、ヒドロキシプロリンレベルの増加をもたらす。対照ウイルスAd-BMP2:WO03018799に記載されている。Ad-BMP4:全長骨形態形成タンパク質4前駆タンパク質の発現を媒介するAd5dE1/E2AアデノウイルスNP_570912参照Ad-ALPL:完全長肝臓/骨/腎臓アルカリホスファターゼの発現を媒介するAd5dE1/E2AアデノウイルスNP_000469Ad-PTGER4:プロスタグランジンE受容体4mRNAをノックダウンするsiRNA配列CCATGCCTATTTCTACAGC配列番号33を含むAd5dE1/E2Aアデノウイルス。Ad-GRM7:向代謝性グルタミン酸受容体7mRNAをノックダウンするsiRNA配列TCAGTAACAGCTCCCAGAC配列番号34を含むAd5dE1/E2Aアデノウイルス。実施例11:安定軟骨のマーカーの定量分析測定の一般的原理軟骨表現型は、遺伝子発現の特徴的パターンによって分類することができる。定量的RT-PCR技術は、表現型が軟骨細胞上で誘導されることが特徴である一連の重要なマーカー分子の発現パターンをモニターするために使用される。陽性マーカーは、一般的に軟骨の軟骨細胞によって発現されるコラーゲンII型及びFGFR3を含んだ。陰性マーカーは、1脱分化した、又は繊維芽細胞様の軟骨細胞のための、レチノイン酸又はインターロイキン-1によっても誘導され得る表現型、コラーゲンI型及びIII型、2成人軟骨の石灰領域及び胎児成長板軟骨の底部肥厚領域に見いだされた肥厚軟骨細胞のためのコラーゲンX、PTHLH及びALK-1、及び3軟骨分解に関与するタンパク質分解酵素としてのMMP13を含んだ。機能的な軟骨の軟骨細胞は、高レベルの陽性マーカーを発現するが、陰性マーカーのレベルは低いか、又は検出不可能のようである。アッセイの説明軟骨細胞を感染させ、実施例8に従ってアルギン酸ビーズに包埋する。10日間培養後、アルギン酸ビーズ及び収集したRNAから軟骨細胞を回収するために、アルギン酸ビーズをクエン酸ナトリウムCambrex55mMで処理する。インキュベーション媒体はVacuSafeで6ウェルプレートから除去し、クエン酸ナトリウム55mM、5mlを各ウェルに添加し、室温で15分間インキュベートする。部分的に可溶化したビーズをゆっくり混合し、FALCOMチューブに移し、残存するビーズ及び脱離した細胞を収集するためにクエン酸ナトリウム溶液2mlで1回濯ぐ。チューブを横向きに倒し、ビーズが完全に可溶化するまで/-15分2~3分間隔でゆっくり混合する。チューブを1000rpmで10分間遠心する。上清を廃棄し、細胞ペレットをクエン酸ナトリウム溶液2mlに再懸濁し、5分間放置する。210gで5分間遠心する前に、塩化ナトリウム155mM/Hepes20mM、ph7.4Cambrex6ミリリットルを各チューブに添加する。細胞ペレットをSV40溶解緩衝液PromegaSV40全RNA抽出キット180μlで溶解し、RNA単離を製造者の指示に従ってPromegaSV40全RNA抽出キットで実施するまで-20°Cで凍結する。精製RNAをリボグリーン試薬MolecularProbes及び標準RNAとしての酵母RNAAmbionを使用して定量する。対照アデノウイルスで形質導入し、アルギン酸3次元培養系内で10日間培養した軟骨細胞の精製RNAを逆転写RT反応で使用する。RNAは最初に、試料の初期濃度に応じて水LifeTechnologies-Invitrogen、Breda、オランダで希釈し、RNA濃度が25ng/ml未満であれば試料を希釈せずに使用し、RNA濃度が25と50ng/mlの間であれば、試料を1:2.5に希釈し、RNA濃度が50と100ng/mlの間であれば試料を1:5に希釈し、RNA濃度が100と160ng/mlの間であれば、試料を1:10に希釈する。希釈した/希釈していないRNA2マイクロリットルを、1×TaqmanRT緩衝液、MgCl25mM、dNTP500μMそれぞれ2.5mM、ランダムヘキサマー2.5μM、リボヌクレアーゼ阻害剤0.4U/μl及びMultiScribe逆転写酵素1.25U/μl試薬は全てAppliedBiosystemsから購入からなる反応混合物5μlに添加する。PCR反応は、PeltierThermalCycler-200BIOzym、Landgraaf、オランダで、PCR全混合物60μlを25°Cで10分間インキュベートし、次に48°Cで30分間、次いで95°Cで5分間インキュベートして実施する。各反応は、いかなるRNAアーゼ阻害剤又は逆転写酵素をも含有しない対照と並行して実施する。逆転写の後、選択した陽性及び陰性マーカー遺伝子の特異的増幅のための定量PCRを行い、GAPDHを内在性対照として含める。RT反応から得られたcDNA5マイクロリットルを、1×Brilliant登録商標SYBR登録商標GreenQPCRMasterMixSratageneEurope、Amsterdam、オランダ、各フォワードプライマー及びリバースプライマー表3100μMで使用したGAPDH及びALK-1以外LifeTechnologies-Invitrogen、Breda、オランダ300μM及び参照色素StratageneH2Oで1:100に希釈300nMからなるPCR反応混合物20μlに添加する。ABIPRISM登録商標7000SequenceDetectionSystemAppliedBiosystems、NieuwerkerkA/DIjssel、オランダで、PCR混合物25μlを95°Cで10分間、続いて95°Cで15秒間及び60°Cで1分間のサイクルを40サイクルインキュベートする。結果は、対照ノックダウン対照アデノウイルスに対する試料試験したアデノウイルスによる形質導入の相対的発現相対的発現=2ddCt、式中、ddCt=dCtKD試料-dCtKD対照及びdCt=Ct試料-CtGAPDHとして各試験マーカー遺伝子について表す。遺伝子14個の結果を図9に示す。それぞれの遺伝子のmRNAをノックダウンすると、陽性マーカーの発現がもたらされるが、一方、陰性マーカーのレベルは低いか、又は検出不可能である。対照ウイルスAd-BMP2:WO03018799に記載されている。Ad-ALPL:完全長肝臓/骨/腎臓アルカリホスファターゼの発現を媒介するAd5dE1/E2AアデノウイルスNP_000469。実施例12:ヒト軟骨におけるcDNAの発現軟骨合成の調節因子の同定において、この調節因子が関心のある組織及び細胞で発現するかどうかを評価することが最も重要である。これは、RNA及び/又はタンパク質レベルを測定することによって実施することができる。近年、RNAレベルはリアルタイムPCR技術によって定量されており、RNAはまずcDNAに転写され、次に関心のあるcDNAの増幅は定量PCR反応中にモニターされる。増幅プロット及び得られたCt値は、試料中に存在する特定のRNA転写物の量の指標である。Ct値は、逆転写酵素段階の有無でRT対-RT測定される。-RT条件における増幅シグナルは、ゲノムDNAから生じる非特異的PCR産物の発生を示す。RTCt値が-RTCt値よりも3Ct値高ければ、調べたRNAはその試料中に存在する。前記のアッセイで同定した遺伝子のポリペプチドがヒト軟骨で発現するかどうかを評価するために、ポリヌクレオチド用特異的プライマーによるリアルタイムPCR要求に応じたアッセイAppliedBiosystemsをヒト軟骨全RNAに実施するClinomicsBiosciences。骨関節炎ではない患者の試料2個及び骨関節炎患者の試料2個を分析する。要するに、RNA40ngを、MultiScribe逆転写酵素50U/μlAppliedBioSystemsを使用してDNAに転写する。得られたcDNAをABIPRISM登録商標7000SequenceDetectionSystemを使用してAmpliTaqGoldDNAポリメラーゼAppliedBioSystemsで40サイクルで増幅する。転写物の増幅を、2本鎖DNA中に挿入されて蛍光シグナルを生じるSybrGreenによって検出する。ヒト軟骨から単離された全RNAを、定量リアルタイムPCRによって表4に挙げた転写物の存在について分析する。表5に挙げた遺伝子では、得られたCt値は、全RNA試料において検出されることを示す。ELA1RNAは、リアルタイムPCR分析では検出されず、他の患者分析に必要であることを明白に示している。実施例13:ターゲットキナーゼ活性を阻害する小分子の同定キナーゼポリペプチドであるターゲットの活性の阻害について化合物をスクリーニングする。ポリペプチドに対する化合物の親和性は、リン酸化の後で変化した反応状態を検出する実験で測定される。ターゲットキナーゼポリペプチドを適切な緩衝液中で基質及びATPと共にインキュベートする。これらの成分の組合せによって、基質のインビトロリン酸化がもたらされる。化合物の供給源には、市販のスクリーニングライブラリー、ファージディスプレイライブラリー又は抗体断片ライブラリーのペプチド及びターゲットキナーゼに結合親和性を有することが示された化合物が含まれる。ターゲットキナーゼポリペプチドは、このアッセイが細胞、細胞画分又は生化学的に精製されたタンパク質を使用して実施されるかどうかに応じていくつかの方法で調製することができる。このポリペプチドを完全なポリペプチド又は依然としてターゲットキナーゼ触媒活性を含むポリペプチド画分として適用することができる。ターゲットキナーゼポリペプチドの活性を阻害する小分子の同定は、リン酸化基質又はATPのレベルの変化を測定することによって実施される。ATPは基質リン酸化の間に消費されるので、そのレベルはキナーゼ活性に相関する。したがって、化学ルミネセンス反応によるATPレベルの測定は、インビトロにおいてキナーゼ活性を測定する方法を表すPerkinElmer。第2の種類のアッセイでは、リン酸化基質レベルの変化をリン特異的試薬で検出し、キナーゼ活性に相関させる。これらのレベルは、溶液中で、又はマイクロタイタープレート又はその他の担体上に基質を固定した後に検出される。溶液中で、リン酸化基質は、Eu標識基質とAPC標識リン特異的抗体PerkinElmerとの間の蛍光共鳴エネルギー移動FRETによって、リン特異的抗体が蛍光標識リン酸化基質Panveraに結合した後の蛍光偏光FPによって、いずれもALPHAビーズPerkinElmerに結合させた、リン酸化基質及びリン特異的抗体を使用した増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイALPHAによって、又はリン酸基を特異的に検出し、したがってリン特異的抗体の使用を軽減するIMAP結合試薬MolecularDevicesを使用して検出される。或いは、この基質を直接、又はビオチン-ストレプトアビジンを使用してマイクロタイタープレートに固定する。固定後、リン酸化基質のレベルは、リン特異的抗体に直接結合させるか、若しくは第2抗体に結合させた西洋ワサビペルオキシダーゼHRP又はアルカリホスファターゼAPなどの酵素によってリン特異的抗体の結合をモニターする古典的ELISAを使用して検出される。酵素活性は、リン酸化された基質のレベルに相関する。或いは、固定されたリン酸化基質へのEu標識リン特異的抗体の結合は、時間分割蛍光エネルギーTRFPerkinElmerによって測定される。さらに、基質をFLASHプレートPerkinElmerにコーティングすることができ、基質のリン酸化は33P標識ATP又は125I標識リン特異的抗体を使用して検出する。小分子を、無作為にスクリーニングするか、又は薬剤の種類すなわち、公知のキナーゼ阻害剤若しくはバーチャルリガンドスクリーニングVLSの結果に基づいて予備選択する。VLSは、本発明のポリペプチドに対する結合について、コンピュータで大量の小分子を試験するための仮想連結技術を使用する。小分子をキナーゼ反応に添加し、リン酸化基質のレベルに対する影響を1種又は複数の前述の技術で測定する。キナーゼ活性を阻害する小分子を同定し、その後様々な濃度で試験する。IC50値をこれらの用量応答曲線から計算する。強力な結合剤のIC50は、ナノモルの範囲であり、ピコモルの範囲のこともある。IC50が少なくとも10マイクロモルか、又はそれ以下nmolからpmolの化合物を、軟骨細胞同化刺激作用の誘導に対するそれらの効果を調べるためのコラーゲンIIアッセイに適用する。実施例14:ターゲットGPCRのリガンドスクリーニング実施例14A:レポーター遺伝子スクリーニングHek293又はCHO-K1細胞などの哺乳類細胞は、cAMP依存プロモーターCRE因子の制御下でルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドで安定して形質移入されるか、又はcAMP依存プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を有するアデノウイルスで形質導入される。さらに、レポーター構築物を、Ca2依存プロモーターNF-AT因子又は活性化NF-κBによって制御されるプロモーターの制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子と共に使用することができる。レポーター構築物を発現するこれらの細胞を、次にターゲットGPCRのcDNAを有するアデノウイルスで形質導入する。形質導入後40時間して、細胞を以下のもので処理する:a受容体のアゴニストで、ペプチドLOPAP、SigmaAldrich、脂質Biomol、TimTech、炭水化物Specs、天然化合物Specs、TimTech、小化合物Tocris、市販のスクリーニングライブラリー及びターゲットGPCRの配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性を有することが示された化合物を含む参照化合物の大きな収集物に対してスクリーニングされたアゴニスト;又はbペプチドLOPAP、SigmaAldrich、脂質Biomol、TimTech、炭水化物Specs、天然化合物Specs、TimTech、小化合物Tocris、市販のスクリーニングライブラリー及びターゲットGPCRの配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性を有することが示された化合物を含む参照化合物の大きな収集物。アゴニストが誘導するルシフェラーゼ活性又は構成的活性の増加を減少させる化合物は、ターゲットGPCRのアンタゴニスト又は逆アゴニストと考えられる。これらの化合物は、検証のために再度スクリーニングされ、軟骨細胞の同化刺激作用に対する効果についてスクリーニングされる。これらの化合物はまた、GPCRに対する結合を確認するためにスクリーニングされる。結合及びレポーター活性の測定は、化合物をスクリーニングするために、本質的に任意の順番で実施することができる。さらに、NF-ATレポーター遺伝子を発現する細胞は、G15のα-サブユニット又はキメラGαサブユニットをコードするcDNAを有するアデノウイルスで形質導入することができる。G15は、多くの様々なGPCRに結合し、そうしたものとしてそれ自体のシグナル伝達を細胞内Ca2貯蔵の放出に向け直すGq型の無差別なGタンパク質である。キメラのGアルファサブユニットは、5C末端残基をGαqの残基によって置換させるGs及びGi/oファミリーの構成要素であり、これらのキメラGタンパク質はまた、cAMPシグナル伝達をCa2シグナル伝達に向け直す。実施例14B:FLIPRスクリーニングHek293又はCHO-K1細胞などの哺乳類細胞は、ターゲットGPCRのcDNAを有する発現プラスミド構築物で安定して形質移入される。細胞を接種し、増殖させ、十分安定な細胞を得ることができるまで選択する。細胞をFura3又はFura4などのCa2依存性フルオロフォアに添加する。過剰なフルオロフォアを洗浄した後、アゴニスト或いは、受容体の構成的活性を使用するならばアゴニストを添加する必要はない及び化合物を同時に細胞に添加することによって、細胞をペプチドLOPAP、SigmaAldrich、脂質Biomol、TimTech、炭水化物Specs、天然化合物Specs、TimTech、小化合物Tocris、市販のスクリーニングライブラリー及びターゲットGPCRの配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性があることが示された化合物を含む参照化合物の大きな収集物に対してスクリーニングする。受容体の活性化は、フルオロフォアと放出されるCa2との相互作用による蛍光のほとんど即時的な増加として測定される。アゴニストが誘導する蛍光又は構成的蛍光の増加を減少させるか、又は阻害する化合物は、スクリーニングした受容体のアンタゴニスト又は逆アゴニストと考えられる。これらの化合物は、軟骨細胞の同化刺激作用の量及びターゲットGPCRに対する結合を測定するために再度スクリーニングされる。実施例14C:AequoScreenアポイクオリンを安定的に発現するCHO細胞は、ターゲットGPCRのcDNAを有するプラスミド構築物で安定して形質移入される。細胞を接種し、増殖させ、十分安定な細胞を得ることができるまで選択する。この細胞にアポイクオリンのための補因子であるセレンテラジンを添加する。受容体が活性化されると、細胞内Ca2貯蔵が空になり、イクオリンが発光過程においてセレンテラジンと反応する。放出された光は、受容体活性化の基準である。イクオリン及び受容体の両方を安定的に発現するCHOを、アゴニスト或いは、受容体の構成的活性を使用するならばアゴニストを添加する必要はない及び化合物を同時に細胞に添加することによって、ペプチドLOPAP、SigmaAldrich、脂質Biomol、TimTech、炭水化物Specs、天然化合物Specs、TimTech、小化合物Tocris、市販のスクリーニングライブラリー及びターゲットGPCRの配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性があることが示された化合物を含む参照化合物の大きな収集物に対してスクリーニングする。受容体の活性化は、アポイクオリン、セレンテラジン及び放出されるCa2の相互作用によるほとんど即時的な閃光として測定される。アゴニストが誘導する光又は構成的活性の増加を減少させるか、又は阻害する化合物は、スクリーニングした受容体のアンタゴニスト又は逆アゴニストと考えられる。これらの化合物を、軟骨細胞の同化刺激作用の量及びターゲットGPCRに対する結合を測定するために再度スクリーニングする。さらに、アポイクオリン遺伝子を安定して発現するCHO細胞は、G15のα-サブユニット又はキメラGαサブユニットをコードするcDNAを有するプラスミド構築物で安定して形質移入される。G15は、多くの様々なGPCRに結合し、そうしたものとしてそれ自体のシグナル伝達を細胞内Ca2貯蔵の放出に向け直すGq型の無差別なGタンパク質である。キメラのGアルファサブユニットは、5C末端残基をGαqの残基によって置換するGs及びGi/oファミリーの構成要素であり、これらのキメラGタンパク質はまた、cAMPシグナル伝達をCa2シグナル伝達に向け直す。実施例14D:GPCRポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング置換実験化合物のターゲットGPCRポリペプチドに対する結合をスクリーニングする。ポリペプチドに対する化合物の親和性は、置換実験で測定される。要するに、GPCRポリペプチドを、ポリペプチドに結合することが知られている標識放射標識、蛍光標識リガンド及び非標識化合物と共にインキュベートする。ポリペプチドと標識リガンドとの置換は、ポリペプチドに依然として結合している標識リガンドの量を測定することによって測定される。IC50値を計算するために、ポリペプチドに結合した量を化合物の濃度に対してプロットする。この値は、ターゲットに対する化合物の結合親和性、すなわちターゲットGPCRポリペプチドを反映している。強力な結合剤のIC50は、ナノモルの範囲であり、ピコモルの範囲のこともある。IC50が少なくとも10マイクロモルか、又はそれ以下nmolからpmolの化合物を、骨形成に対する効果を調べる軟骨細胞の同化刺激作用アッセイに適用する。ターゲットGPCRポリペプチドは、このアッセイが細胞、細胞画分を使用して、又は生化学的に精製されたタンパク質に実施されるかどうかに応じて、いくつかの方法で調製することができる。実施例14E:ターゲットGPCRに結合する化合物のスクリーニング一般的GPCRスクリーニングアッセイGタンパク質受容体が構成的に活性になると、Gタンパク質Gq、Gs、Gi、Goに結合し、GTPのGタンパク質に対する結合を刺激する。次に、Gタンパク質はGTP加水分解酵素として作用し、GTPをGDPにゆっくり加水分解し、それによって、正常な条件下で、受容体は不活性化する。しかし、構成的に活性化された受容体は、GDPをGTPに変換し続ける。GTPの非加水分解類似体である[35S]GTPγSは、構成的に活性化された受容体を発現する膜に対する結合の増大をモニターするために使用することができる。[35S]GTPγSは、リガンド存在下及び非存在下において、膜に対するGタンパク質の結合をモニターするために使用できることが報告されている。さらに、好ましい取り組みは、GPCR-Gタンパク質融合タンパク質の使用である。ターゲットGPCR-Gタンパク質融合タンパク質を生成する方法は、当業界では周知である。ターゲットGPCR-Gタンパク質融合タンパク質を発現する膜は、逆アゴニストなどの候補化合物の直接同定で使用するために調製される。ターゲットGPCR-Gタンパク質融合タンパク質で均質化した膜を96ウェルプレートに移す。ピン状の道具を使用して候補化合物を[35S]GTPγSを添加した各ウェルに移し、次いで室温で60分間振盪機でインキュベートする。プレートを22°Cで4000RPMで15分間回転させることによってアッセイを停止する。次に、プレートを吸引し、その後放射活性を読み取る。実施例14F:細胞表面上での受容体リガンド結合試験アデノウイルスによって細胞を形質導入することによって受容体を哺乳類細胞Hek293、CHO、COS7で発現させる米国特許第6340595号参照。この細胞を、10pMから10μMの範囲の様々な濃度の標識リガンドヨウ素化、トリチウム化又は蛍光性及び非標識化合物と共にインキュベートする4°Cで3時間、HEPES25mM、NaCl140mM、CaCl21mM、MgCl25mM及びBSA0.2、pH7.4に調節。細胞収集器Packardを使用して、反応混合物をPEI-処理GF/Bガラスフィルター上に吸引する。フィルターを氷冷洗浄緩衝液HEPES25mM、NaCl500mM、CaCl21mM及びMgCl25mM、pH7.4に調節で2回洗浄する。シンチレーション物質MicroScint-10、35μlを乾燥したフィルターに添加し、このフィルターをシンチレーションカウンターPackardTopcountで計数する。データを分析して、PrismソフトウェアGraphPadSoftware、サンディエゴ、カリフォルニア州を使用してプロットした。競合曲線を分析して、IC50値を計算した。1種又は複数のデータ点がこの競合曲線のS字曲線範囲内にないか、又はS字曲線範囲に近ければ、測定を繰り返し、標識リガンド及び非標識化合物の濃度を、より多くのデータ点が曲線のS字範囲内に接近するように、又は入るように適合させる。実施例14G:膜調製物上における受容体リガンド結合試験膜調製物を哺乳類細胞Hek293、CHO、COS7から単離し、受容体を過剰発現する細胞を以下のようにする。培地を形質導入細胞から吸引し、ゆっくりかき取ることによって細胞を1×PBS中に収集する。細胞をペレットにして2500rpm、5分、50mMTrispH7.4に再懸濁する10×106細胞/ml。細胞ペレットを3×5秒超音波処理UP50H、超音波発振器MS1、最大振幅:140μm、最大超音波出力密度:125W/cm2することによって均質化する。膜画分を、最大速度13000rpm、約15000から20000g若しくはrcfで20分間遠心分離することによって調製する。得られたペレットを50mMTrispH7.4、500μlに再懸濁して、再度3×5秒超音波処理する。この膜画分を遠心分離によって単離して、最終的にPBSに再懸濁する。前述のように結合競合とIC50値の誘導を測定する。実施例14H:内在化スクリーニング1GPCR関連シグナル伝達経路の活性化は通常、細胞質から形質膜又は細胞質から核への特異的シグナル伝達分子の移行を導く。Norakは、受容体脱感作中に生じる、受容体-β-アレスチン-GFP複合体の細胞基質から形質膜へのアゴニスト誘導性の移行、及びその後のこの複合体の内在化に基づいたトランスフローアッセイを開発した。同様のアッセイは、β-アレスチンの代わりにGFPタグ受容体を使用する。Hek293細胞を、ターゲットGPCR-eGFP融合タンパク質について翻訳するターゲットGPCRベクターで形質導入する。形質導入して48時間後、細胞を、血清を含まない新鮮培地に60分間入れ、37°C、5CO2で、15、30、60又は120分リガンドによって処理する。表示の曝露時間の後、細胞をPBSで洗浄して、パラホルムアルデヒド5でRTで20分間固定する。GFP蛍光は、デジタルカメラを装着したZeiss顕微鏡で視覚化する。この方法は、融合タンパク質の細胞内区分へのリガンド媒介性構成的活性媒介性移行を阻害する化合物を同定することがねらいである。実施例14I:内在化スクリーニング2移行アッセイにおける様々な変更は、β-アレスチン及びβ-ガラクトシダーゼ酵素の補完並びにエネルギードナーとしての受容体及びエネルギーアクセプターとしてのβ-アレスチンを用いたBRETアッセイを使用して存在する。pH感受性色素で標識した特異的受容体抗体の使用もまた、アゴニストが誘導する受容体の酸性リソソームへの移行を検出するために使用される。移行アッセイは全て、アゴニスト作用リガンド及びアンタゴニスト作用リガンドの両方をスクリーニングするために使用される。実施例14J:メラニン保有細胞アッセイArenaPharmaceuticalメラニン保有細胞アッセイは、アフリカツメガエルメラニン保有細胞においてメラニン含有メラノソームの分布を変更するGPCRの能力に基づいている。メラノソームの分布は、Gi/o又はGs/qのいずれかと共役する外在性受容体に依存している。メラノソームの分布散在又は密集は、光吸収を測定することによって容易に検出される。この種のアッセイは、アゴニスト並びにアンタゴニスト化合物両方のスクリーニングに使用される。実施例15:タンパク質分解酵素活性を阻害する小分子の同定本発明のポリペプチドの活性の阻害について化合物をスクリーニングする。ポリペプチドに対する化合物の親和性は、切断された基質のレベルの変化を検出する実験で測定される。簡単に説明すると、本発明のポリペプチドを適切な緩衝液中でその基質と一緒にインキュベートする。これらの成分の組合せによって、基質の切断が生じる。ポリペプチドは、完全なポリペプチド、又は依然として本発明のポリペプチドの触媒活性を含むポリペプチド画分として適用することができる。基質の切断は、いくつかの方法で行うことができる。最初の方法では、基質タンパク質はフルオレセインのような蛍光色素で多量に標識されて、蛍光シグナルの完全な消失を生じる。しかし、基質の切断によって、蛍光標識をあまり含有しない個々の断片が放出される。それによって、切断された基質のレベルと相関する蛍光シグナルの消失及び発生の損失が生じる。より小さなペプチド断片をもたらすタンパク質の切断はまた、蛍光偏光FPを使用して測定することができる。或いは、基質の切断はまた、蛍光共鳴エネルギー移動FRETを使用して検出することができ、ペプチド基質は、DABCYL及びEDANSのような発光抑制剤及び蛍光分子のいずれかで両側が標識される。基質が切断されるとき、両分子は分離され、切断された基質のレベルに相関する蛍光シグナルを生じる。さらに、ペプチド基質の切断はまた、他の酵素反応のための新たな基質を生じることができ、これは次に蛍光、化学ルミネセンス又は比色法によって検出される。小分子は、無作為にスクリーニングされるか、又は薬剤の種類、すなわち、タンパク質分解酵素若しくはバーチャルリガンドスクリーニングVLSの結果に基づいて予備選択される。VLSは、本発明のポリペプチドに対する結合について、コンピュータで大量の小分子を試験するための仮想連結技術を使用する。小分子をタンパク質分解反応に添加し、切断された基質のレベルに対する影響を前述の技術で測定する。タンパク質分解酵素活性を阻害する小分子は同定され、その後様々な濃度で試験される。IC50値をこれらの用量応答曲線から計算する。強力な結合剤のIC50は、ナノモルの範囲であり、ピコモルの範囲のこともある。IC50が少なくとも10マイクロモルか、又はそれ以下nmolからpmolの化合物を、ベータアミロイド分泌及びプロセシングに対する効果を調べるアミロイドベータ分泌アッセイに適用する。実施例16:ホスホジエステラーゼ活性を阻害する小分子の同定本発明のポリペプチドの活性の阻害について化合物をスクリーニングする。ポリペプチドに対する化合物の親和性は、基質又は生成物のレベルの変化を検出する実験で測定される。簡単に説明すると、本発明のポリペプチドを適切な緩衝液中でその基質と一緒にインキュベートする。これらの成分の組合せによって、基質の生成物への変換が生じる。ポリペプチドを完全なポリペプチド又は依然として本発明のポリペプチドの触媒活性を含むポリペプチド画分として適用することができる。cAMP又はcGMPのAMP又はGMPへの変換の後、1例えば、ELISA、アルファスクリーニング技術、時間分割蛍光技術、IMAPを使用してcAMP又はcGMPレベルを測定すること、2比色測定法を使用して生成物AMP及びGMPのレベルを測定することができる。後者の測定法の基本は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼによるcAMP又はcGMPの開裂である。脱離した5’-ヌクレオチドは、酵素5’-ヌクレオチダーゼによってヌクレオシド及びリン酸にさらに切断される。酵素的切断によって脱離したリン酸は、BIOMOLGREEN商標試薬を使用して、改変マラカイトグリーンアッセイで定量される。小分子は、無作為にスクリーニングされるか、又は薬剤の種類、すなわち、PDEに基づいて、又はバーチャルリガンドスクリーニングVLSの結果に基づいて予備選択される。VLSは、本発明のポリペプチドに対する結合について、コンピュータで大量の小分子を試験するための仮想連結技術を使用する。小分子をPDE反応に添加し、環状ヌクレオチドレベルに対する影響を前述の技術で測定する。PDE活性を阻害する小分子は同定され、その後様々な濃度で試験される。IC50値をこれらの用量応答曲線から計算する。強力な結合剤のIC50は、ナノモルの範囲であり、ピコモルの範囲のこともある。IC50が少なくとも10マイクロモルか、又はそれ以下nmolからpmolの化合物を、軟骨細胞の同化活性を評価するアッセイに適用する。これは、軟骨細胞によって産生されるcol2α1及びアグリカンのレベルを測定することによって実施することができる。参考文献ArtsetalGenomeRes10232532ChubinskayaandKuettnerIntJBiochemCellBiol35132340CortezRetamozoetalCancerRes6428537DorsettYTuschlTNatureReviewsDrugDiscovery3318329HarborthJetalAntisenseNucleicAcidDrugDev1383105KhvorovaAetalCell11520916LipinskyCAetalAdvDrugDelivRev46326ReynoldsAetalNatBiotechnol2232630TuschlNatureBiotechnol204468UiTeiKetalNucleicAcidsRes3293648WangLandMuFYBioinformatics"