ペプチド成分および疎水性成分を含み、該ペプチド成分はファージディスプレイ法の増殖因子認識産物を含み、該認識産物は該ペプチド成分のほぼN末端に結合しており、該疎水性成分は該ペプチド成分のほぼC-末端に結合している、両親媒性ペプチド化合物。認識産物が、増殖因子BMP2、TGFβ1、VEGF、FGF2、NT3およびラミニン5との結合相互作用をもたらすエピトープ配列から選択される、請求項1記載の化合物。結合するエピトープ配列が、YPVHPSTを含む、請求項2記載の化合物。配列が、増殖因子BMP2との非共有結合相互作用にある、請求項3記載の化合物。結合するエピトープ配列が、LPLGNSHを含む、請求項2記載の化合物。配列が、増殖因子TGFβ1との非共有結合相互作用にある、請求項5記載の化合物。ペプチド成分が、生理的pHにおいて正味荷電を有する、請求項1記載の化合物。アラニン、グリシン、ロイシン、システイン、バリンおよびセリンから選択される残基を含む、請求項7記載の化合物。疎水性成分が、約C6~約C22の範囲のアルキル部分を含む、請求項2記載の化合物。ペプチド成分が、実質的に直鎖状である、請求項1記載の化合物。複数の第1の両親媒性ペプチド化合物を含み、該化合物各々が該化合物のペプチド成分に結合しているファージディスプレイ法の増殖因子認識産物を含み、該ペプチド成分が生理的pHにおいて正味荷電を有し、疎水性成分のほぼC末端に結合しているペプチド組成物。複数の第2の両親媒性ペプチド化合物をさらに含み、該化合物各々は増殖因子認識産物が欠けており、生理的pHにおいて、第1の化合物の正味荷電に相補的な正味荷電を有する、請求項11記載の組成物。第2の化合物のペプチド成分のアミノ酸配列が、第1の化合物のペプチドアミノ酸配列の長さより短い長さを有する、請求項12記載の組成物。水性媒体にミセル集合物を含む、請求項13記載の組成物。非共有結合的に相互作用する少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項14記載の組成物。増殖因子が、BMP2、TGFβ1、VEGF、FGF2、NT3、ラミニン5およびそれらの組み合わせから選択される、請求項15記載の組成物。幹細胞に接触する、請求項16記載の組成物。複数の第2の両親媒性ペプチド化合物をさらに含み、該化合物が第1の化合物のペプチドアミノ酸配列の長さより短い長さを有し、該第2の化合物が増殖因子認識産物が欠けており、生理的pHにおいて該第1の化合物の正味荷電に相補的な正味荷電を有する、請求項11記載の組成物。水性媒体にミセル集合物を含む、請求項18記載の組成物。幹細胞に接触し、組成物と非共有結合的に相互作用する増殖因子を含む、請求項19記載の組成物。以下の段階を含む、両親媒性ペプチド化合物を使用して増殖因子のバイオアベイラビリティーに影響を与える方法:複数の第1の両親媒性ペプチド化合物および複数の第2の両親媒性ペプチド化合物を含むミセル集合物を提供する段階であって、複数の第1の両親媒性ペプチド化合物の各々が第1の化合物のペプチド成分に結合しているファージディスプレイ法の増殖因子認識産物を含み、該ペプチド成分が生理的pHにおいて正味荷電を有し、疎水性成分のほぼC-末端に結合しており、複数の第2の両親媒性化合物が第1の化合物のペプチド配列の長さより短い長さを有するペプチドアミノ酸配列を含み、増殖因子認識産物が欠けており、生理的pHにおいて該第1の化合物の正味荷電に相補的な正味荷電を有する段階;ならびに幹細胞に該集合物を接触させる段階。増殖因子が、幹細胞によって産生される、請求項21記載の方法。増殖因子が、BMP2、TGFβ1、VEGF、FGF2、NT3、ラミニン5およびそれらの組み合わせから選択される、請求項21記載の方法。認識産物が、増殖因子BMP2およびTGFβ1の1つと非共有結合相互作用をもたらすエピトープ配列から選択される、請求項23記載の方法。エピトープ配列が、増殖因子BMP2と非共有結合的に相互作用するYPVHPSTを含む、請求項24記載の方法。エピトープ配列が、増殖因子TGFβ1と非共有結合的に相互作用するLPLGNSHを含む、請求項24記載の方法。接触が、幹細胞分化に十分である、請求項21記載の方法。集合物が、増殖因子BMP2を含み、認識産物が、該増殖因子と非共有結合的に相互作用するエピトープ配列を含む、請求項27記載の方法。幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項28記載の方法。幹細胞が、骨細胞に分化する、請求項29記載の方法。ある種の態様の詳細な説明本発明は、特異的な非共有結合相互作用によって増殖因子に結合することができる自己集合ペプチド両親媒性物質に基づいたシステムを記載する。増殖因子は細胞の信号伝達において重要な役割を果たしており、従って、幹細胞の分化を制御するための有望な因子であり、移植した組織の組み込みをサポートするおよび/または非機能組織の再生を生ずる可能性のある休止中の生物学的過程をインビボにおいて分子的または生理的に再活性化する。増殖因子はインビボにおいて迅速に分解し、損傷部位から迅速に拡散消失する。従って、増殖因子を損傷部位に保持し、増殖因子を周囲の細胞に徐放的に放出する骨格が必要とされる。自己集合ペプチド両親媒性物質を使用しているヒドロゲルは、細胞外マトリックスのいくつかの機能を満たす、すなわち、細胞接着を促進し、分化を制御することができることが示されている。本発明は、骨形成タンパク質2、トランスフォーミング増殖因子β1、VEGFおよびIL6が挙げられるが、それに限定されるわけではない増殖因子に特異的に結合することができるペプチド配列でこれらのECM置換基を修飾することに関する。これらの増殖因子ペプチド配列はファージディスプレイ技法によって入手することができ、ペプチド両親媒性物質に結合して結合ペプチド両親媒性物質を形成することができる。結合ペプチド両親媒性物質およびフィラーペプチド両親媒性物質は自己集合して、特定の形状に成形され、組織修復の骨格として使用することができるヒドロゲルを形成することができる。または、結合ペプチド両親媒性物質およびフィラーペプチド両親媒性物質はインビボまたはインビトロにおいて細胞試料または組織試料に導入して、試料中でヒドロゲルに自己集合することができる。上記のように、本発明のペプチド両親媒性物質は、アルキルテイル、βシート形成ペプチド配列および生物活性ペプチド配列を含むことができる。最初の2つのブロックは、ナノファイバーなどであるが、これに限定されないミセルファイバーを形成し、適切な条件下において、ヒドロゲルまたは溶媒が細孔を満たしている他の湿潤ゲルを形成する。好ましくは、生物活性なエピトープは溶解のために部分的に荷電しているが、この荷電は、インテグリン結合配列、向神経活性配列等のような多種多様の配列において異なってもよい。さらに、相補的な荷電のペプチド両親媒性物質は自己集合して混合ファイバーを形成する。この原理を使用して通常のPAおよびファイバー表面から延在している増殖因子結合エピトープ配列を有する長いPAからなるナノファイバーを作製することができる。望ましい増殖因子結合配列は、無作為ペプチドライブラリーを使用するファージディスプレイによって得られ、コンビナトリアル選択過程を使用して強力な結合配列を生ずる。増殖因子の放出は、マトリックスの分解、細胞外受容体への結合またはこれらの組み合わせによって誘導される。既存の技術は、増殖因子をヒドロゲルに捕獲し、それらをポリマーテザーに共有結合するまたはそれらを陰イオンポリマーまたはヘパリンに静電気的に結合する。テザーシステムの欠点は、製造の複雑さおよび増殖因子が細胞外受容体に到達しない可能性である。捕獲されている増殖因子および陰イオンポリマーと複合体形成している増殖因子は比較的迅速に放出され、徐放的な制御は少ない。例えば、陰イオンポリマーに結合している増殖因子は8時間以内に放出される。ヘパリン結合システムは非特異的であり、増殖因子のサブセットに限定される。有利なことに、本発明は、望ましい増殖因子だけが、結合状態で増殖因子を保持するのに十分に大きい結合強度で複合体形成されるが、細胞外受容体との結合と競合しない程度に弱いように設計される。本明細書に記載する本発明の一局面は、ファージディスプレイ技法を使用して増殖因子を結合するペプチド配列を誘導体化し、その後これらの結合配列を有するペプチド両親媒性物質を製造するために使用することができるということである。ファージ技法によって作製される増殖因子には、骨形成タンパク質、トランスフォーミング増殖因子β1、ニューロトロフィンおよび分裂促進因子FGF2、ソニックヘッジホッグおよびWnt3aおよびを挙げることができる。これらの増殖因子タンパク質は、短いペプチド両親媒性物質と結合して、増殖因子ペプチドを有する長いペプチド両親媒性物質を形成する。これらの増殖因子エピトープを有するPAまたは結合ペプチド両親媒性物質は短いフィラーまたは相補的なフィラーPAと同時集合して、結合エピトープが表面から延在するナノファイバーを作製し、その後多価イオンの添加またはpHの変化の結果ヒドロゲルを形成することができる。次いで、得られたヒドロゲルを、ヒドロゲル内部に封入されている幹細胞などであるが、これに限定されない細胞と共に使用してもまたはインビボにおける組織再生のために送達ビヒクルとして単独使用してもよい。細胞以外に、他の治療化合物をヒドロゲルに封入してもまたは結合してもよい。これらの化合物には、抗炎症剤、化学療法剤またはこれらの併用を挙げることができるが、これに限定されない。ファージディスプレイは、特定の標的に対する分子プローブを作製するためならびにタンパク質リガンド相互作用を分析および操作するために使用することができる。ファージディスプレイは、アミノ酸、ペプチド、増殖因子、酵素および種々の核酸などであるが、これに限定されない標的分子に結合するアミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質を決定するために使用される。ファージディスプレイは、市販のライブラリーを使用して、マイクロタイターウェルプレートに物理吸着する増殖因子のような標的分子に実施することができる。好ましくは、ライブラリーは、G3コートタンパク質のN末端が、アミノ酸の全ての可能な組み合わせが存在する方法で、1~約13以上のランダムアミノ酸が延在しているファージからなる。ライブラリーは増殖因子などの標的分子に接触され、その後非特異的に結合したファージは界面活性剤溶液と共に溶出される。結合ファージの回収後、この集団を例えば、大腸菌において増幅し、溶出条件の緊縮度を増してこの過程を2回以上反復する。最終的な集団を結合ファージに関して濃縮し、クローンのいくつかのDNAを配列決定して、これらのファージ上に提示されているアミノ酸配列の同定を可能にすることができる。その後、ELISAアッセイを実施して、単離されたクローンの相対的な結合強度を推定することができる。固体状態の合成を使用して、同定されたアミノ酸配列を使用して結合ペプチド両親媒性物質を作製するためのペプチドを作製する。本発明のフィラーPAおよび結合エピトープペプチド両親媒性物質のペプチド成分は天然型アミノ酸および人工アミノ酸を含んでもよい。対応する成分がこれに関してペプチド様であり、ナノファイバーなどのミセルを形成する自己集合であるという効果で、βまたはγアミノ酸などの人工アミノ酸および非天然側鎖を含有する人工アミノ酸および/またはヒドロキシ酸などの他の同様のモノマーの組み込みも考慮されている。本発明の種々のペプチド両親媒性物質は、上記の組み込まれている公報である国際公開公報第03054146号および全体として参照により本明細書に組み入れられる、Hartgerinketalによって最初に記載されているものの変法を含む、当業者に周知の製造技法を使用して合成することができる。本発明の合成方法およびエピトープを使用することができる分岐鎖状ペプチド両親媒性物質も本発明において考慮されている。分岐鎖状ペプチド両親媒性物質は、内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる、2004年12月6日に本願と同時提出された上記の同時係属出願に開示されている方法および組成物を使用することによって作製することができる。結合エピトープを有するこのような分岐鎖状ペプチド両親媒性物質もナノファイバーに自己集合すると思われる。分岐鎖状ペプチド両親媒性物質は、βシート形成ペプチド部分の第1の末端に結合しているアルキルテイル部分およびエピトープの第2の末端において1つ以上のペプチド分岐鎖を含むペプチド部分を有すると思われる。ペプチドは分岐鎖状アミノ酸および荷電ペプチド部分を含む。分岐鎖状エピトープペプチド部分は、ペプチド両親媒性物質のβシート形成ペプチド部分の第2の末端に結合してもよい。分岐鎖状ペプチドの結合エピトープ配列はファージディスプレイ法から誘導されてもよい。これらの参照文献に記載する合成スキームを本発明に適用することができる。ペプチド両親媒性物質は、完全にプロトン化された形態であっても、部分的にプロトン化された形態であってもまたは酸もしくは塩基付加塩として存在してもよい。一般に、このようなペプチド両親媒性物質は、上記の組み入れられている参照文献に記載されているまたは本明細書に提供する標準的な固相ペプチド化学によって作製することができる。当業者に公知であると思われ、望ましい両親媒性組成物またはペプチド配列に応じて公知の手法および合成技法または直接的な改良を使用して承知しているこれらの合成方法の改良を実施することができる。図1に示す種類のフィラーペプチドは、好ましくは、結合エピトープを有するペプチド両親媒性物質より長さが短く、これらのペプチド両親媒性物質の組み合わせから自己集合するナノファイバーは、増殖因子結合エピトープがナノファイバーの表面から突出する。相補的なフィラーペプチド両親媒性物質は、酸塩基または他の種類の結合によりフィラーペプチドのアミノ酸と相互作用するアミノ酸の側基を有する。ファージディスプレイ法から誘導されるペプチド配列は、増殖因子、酵素、核酸およびアミノ酸を含むが、これらに限定されないペプチドおよび分子に非共有結合するためのペプチド両親媒性物質の結合部位またはエピトープとして使用することができる。ファージディスプレイはエピトープ配列を誘導するために好ましいが、酵母ハイブリッドシステムなどであるが、これに限定されない結合エピトープの配列を同定し、決定する他の相補的な方法を使用することができる。これらの結合ペプチドまたはエピトープをβシート形成ペプチドの遊離端、荷電ペプチドの遊離端またはスペーサーペプチドの遊離端に結合することができる。ペプチド両親媒性物質デザインは、ペプチド両親媒性物質の自己集合のために分子の円錐形状の細長い部分を形成するために働く単純な疎水性テイルを含むことができる。好ましくは、疎水性テイルは、種々のサイズであってもよいが、好ましくは、炭素原子の長さが6を超えるアルキル鎖である。アルキルテイルは、ペプチド両親媒性物質のβシート形成構造セグメントに共有結合されている。βシートペプチド構造セグメントは、テイル基をファージペプチド;または荷電ペプチド、スペーサーペプチドおよびファージペプチド;または荷電ペプチドおよびファージペプチドに共有結合するために使用することができる。βシートペプチド構造セグメントは、一方の末端がテイルに、他方の末端が、種々のペプチドのアミノ酸配列に共有結合する。架橋が望ましい場合には、システインアミノ酸をセグメントのいずれかに使用してもよいが、好ましくは、構造βシートセグメントに使用する。架橋が望ましくない場合には、アラニン、セリンまたはロイシンなどであるが、これに限定されない他の疎水性アミノ酸をこの領域に使用することができる。このシステインフリーシステムは、ナノファイバーマトリックスの分解速度を制御するために、インビボにおける生物適用にさらに適当となりうる。システムのSLSL改良により、骨格のインビボにおける集合を制御するために使用することができるナノファイバーの自己集合を遅くすることを予想することができる。理論に結びつけたいわけではないが、かさばるロイシン側鎖は、ファイバーへの充填に長い時間を必要とすると考えられる。遅い自己集合は、ナノファイバーの形成が遅いことが有利となることがある、手術室などの機能的なインサイチュー環境における適用性が大きい場合もある。構造的なβシート形成セグメントはグリシンまたは他のアミノ酸を含むフレキシブルなリンカーを含む場合もある。構造セグメントが疎水性アミノ酸を含む場合には、疎水性アミノ酸およびアルキルテイルが疎水性セグメントと考えることができる。構造セグメントが親水性アミノ酸を含む場合には、親水性アミノ酸および親水性ヘッド基が親水性セグメントと考えることができる。βシート形成単位は、好ましくは、βシートを形成するように相互作用することができ、ペプチド両親媒性物質の全体的な円錐形状を形成する助けをするような疎水性アミノ酸を含む。突出しているペプチド両親媒性物質については、この単位のアミノ酸の数は、ナノファイバーを形成するために使用されるフィラーペプチド両親媒性物質より長く、結合しているペプチド両親媒性物質のペプチドへの接近しやすさを提供するペプチド両親媒性物質を提供するように選択することができる。このセグメントには約4~約10のアミノ酸が存在してもよく、最も好ましくは、約6のアミノ酸が存在してもよい。βシート形成セグメントについては、好適なアミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンならびに同様の化学的および構造的な方法でペプチド両親媒性物質において使用することができる他の非天然型アミノ酸には、を挙げることができるが、これに限定されない。水性環境において、好ましくは、患者の部位においてペプチド両親媒性物質の溶解性を提供する荷電セグメントが結合ペプチド両親媒性物質に存在する。荷電ペプチドセグメントには、この溶解性を提供し、自己集合を可能にするようなアミノ酸およびそれらの組み合わせを挙げることができ、ペプチド両親媒性物質の溶解性を改良するためにEまたはKなどの極性アミノ酸およびそれらの組み合わせに限定されない。このセグメントには約2~約7のアミノ酸が存在してもよく、好ましくは、約3~4のアミノ酸が存在する。このセグメントは、第1の末端が構造ペプチドに結合し、第2の末端が、ファージディスプレイ法から誘導されるペプチドに結合するために使用される。スペーサー基ペプチドがペプチド両親媒性物質に含まれてもよい。スペーサーは、SおよびGなどであるが、これに限定されないアミノ酸を含んでもよく、スペーサーは1~約6のアミノ酸を含んでもよい。ファージ上に提示されているペプチドが遊離N末端を有する場合には、ペプチド両親媒性物質の典型的な合成スキームを遊離N末端を提供するように修正することができる。これは、側鎖をドデシルアミンで官能基化することができるアスパラギン酸誘導体を合成することによって実施することができる。このアミノ酸をWang樹脂に結合することにより、N末端を官能基化する必要なしに、典型的な固相状態のFmoc化学によってPA合成を完了することができた。遊離PAは、95TFA25水25トリイソプロピルシランで処理することにより得ることができる。残存TFAはPAを3mMのHClに溶解することによって除去することができ、室温において1時間平衡させ、次いで凍結乾燥することができる。これらの分子の合成の成功は、エレクトロスプレー質量分析法を使用して確認することができる。増殖因子エピトープを有するペプチド両親媒性物質は、体液に存在するイオンおよび自己集合を促進するために添加されるイオン試薬を使用して、インビボにおいて患者の部位において自己集合することができる。または、増殖因子結合エピトープを有する好適なペプチド両親媒性物質の組成物を型に注ぎ、自己集合を使用して、置換または再生される組織または骨の形状の骨格を形成する。成形された骨格を、修復または再生治療を必要としている患者の部位に挿入することができる。組織移植の場合には、増殖因子結合エピトープを有するペプチド両親媒性物質は型で支持構造物またはマトリックスに形成され、組織移植のための患者の支持として使用することができる。ペプチド両親媒性物質ナノファイバーまたは骨格は、幹細胞などであるが、これに限定されない細胞を含んでもよい。他の治療化合物がヒドロゲルに封入されてもまたは結合されてもよい。これらの化合物には、抗炎症剤、化学療法剤またはこれらの組み合わせを挙げることができるが、これに限定されない。増殖因子結合エピトープを有するペプチド両親媒性物質と短いβシート構造ペプチド荷電ペプチド酸末端フィラーペプチド両親媒性物質の同時集合を使用して、本発明のナノファイバーおよび骨格を製造することができる。本発明の骨格およびナノファイバーを製造するために、異なる増殖因子結合エピトープを有する1つ以上のペプチド両親媒性物質を使用することができ、種々のフィラーペプチド両親媒性物質を使用することができるが、限定するものではない。フィラーペプチド両親媒性物質と比較した増殖因子結合エピトープを有するペプチド両親媒性物質の量は、本発明の骨格およびナノファイバーを製造する際に異なってもよいが、限定されない。自己集合ミセルおよびナノファイバーは、NOEおよびFTIR分光分析、円二色性によって特徴づけることができる;ナノファイバーのファイバーネットワークは透過型電子顕微鏡を使用して可視化することができる。結合エピトープを有するペプチド両親媒性物質は、増殖因子またはアミノ酸もしくは核酸などであるが、これに限定されない他のペプチドと非共有結合相互作用によって相互作用することができるエピトープのペプチド配列を選択することによって製造することができる。増殖因子または他のペプチドと結合エピトープを有するペプチド両親媒性物質の非共有結合相互作用の程度は、エピトープが、競合しないまたは細胞外受容体比較して、増殖因子または他のペプチドに対する結合親和性が低いように選択される。受動的な放出実験を使用して、特徴づけ、その後増殖因子結合エピトープを有する種々のナノファイバーの親和性を改良することができる。この特徴づけは、事前ブロックしたマイクロタイタープレート中で増殖因子を含有する自己集合ナノファイバーゲルについて実施することができる。これらのゲルは、適当な比でPAの2溶液を混合し、次にTBSで11希釈することによって作製することができる。次いで、増殖因子を添加し、次に2当量の多価イオンを添加してゲル化および自己集合を誘導することができる。増殖因子含量について上清をアッセイして、このようなゲルの増殖因子結合能を評価することができる。結合エピトープは、近隣の細胞または組織の細胞外受容体より種々のペプチドに対する親和性が弱いことが組織増殖および他の治療に好ましいが、それは、望ましくは、ペプチド、増殖因子、酵素または核酸または体液もしくは細胞試料の他の分子に強力に化学的に結合するペプチド両親媒性物質の結合エピトープであることが考慮されている。この場合には、好適なエピトープを有する結合ペプチド両親媒性を表面で自己集合させて固定して、センサーコーティングまたは除去媒体を形成する。これらの強力に結合しているペプチド両親媒性物質の自己集合から形成されるヒドロゲルは、患者の部位に挿入するためまたはろ過システムに使用するために成形してもよい。ヒドロゲルは、患者の関節もしくは腫瘍などの部位または患者の体液からHGFまたはVEGFのような標的ペプチドを除去するために使用してもよい。発明の実施例以下の限定するものではない実施例およびデータは、増殖因子と非共有結合相互作用をすることができるエピトープ配列を有するまたは有しない特定の範囲の両親媒性ペプチド化合物の合成、このような化合物または組成物の自己集合ならびに増殖因子のバイオアベイラビリティーおよび幹細胞分化に影響を与えるそれらの用途を含む、本発明の化合物、組成物および/または方法に関する種々の局面および特徴を例示している。従来技術と比較すると、本発明の化合物、組成物および/または方法は驚くべきであり、予測されず、従来技術と異なる。本発明の利用性はいくつかの化合物組成物および集合物を使用することにより例示されているが、同様の結果は、本発明の範囲に相応の種々の他の化合物、組成物および/または集合物で得ることができることが当業者によって理解される。樹脂およびFmoc1アミノ酸は全てNovabiochemから入手した。固相合成のための試薬は全て合成用であり、AppliedBiosystemsから入手した。他の試薬は全てAldrichChemicalCoから入手し、入手したままで使用した。固相ペプチド合成のための溶媒はAppliedBiosystemsから入手し、ペプチド合成用であった。他の溶媒はFisherScientificから入手し、特に記載しない限り、入手したままで使用した。PAは、AppliedBiosystems433A自動ペプチド合成装置を使用して合成した。NMRスペクトルは、VarianInova500MHz分光計で室温において得た。エレクトロスプレー質量スペクトルは、MicromassQuattroIITripleQuadrupoleHPLCMSMS質量分析計で収集した。CDスペクトルは、JascoPTC348WIペルチェ効果温度コントローラー付きJascoJ715分光偏光計で記録した。FTIRスペクトルは、BioRadFTS40FTIRマシーンで、2cm1の分解能で400から4000nmまで操作した。円二色性分光法路程01cmの石英セルを全ての実験に使用した。スキャン速度100nmmin、反応時間2秒およびバンド幅1nmで300nmから190nmまで各スペクトルを記録し、5回スキャンを平均した。試料は、特に記載しない限り、水で01mgmLの濃度に調製した。酸塩基滴定pKa滴定は、100mMKClにおいて35mgmLの濃度において、FisherAccumetpHメーターを用いてpH2~10の範囲のPA1~4に実施した。酸性PA2および4については、低いpHから開始して、01NKOHを1~5μLずつ添加したが、塩基性PA1および3については、高いpHから開始して、01NHClを1~5μLずつ添加した。NMRNOE分光分析PA1~6をd6DMSOに5mgmLの濃度で溶解した。NOESYスペクトルは、各PAの10または15mgmL濃度、モル比11において、ミキシングタイム01s、128スキャンでD2O中で測定した。FTIR検討については、2重量の試料を水から凍結乾燥し、次いでKBRペレットに圧縮した。スキーム1ペプチド両親媒性物質の化学構造実施例1トリプルリジン配列を有する2つおよびトリプルグルタミン酸配列を有する2つの4つのPAを製造した。PA1および2は、プレロードしておいたWang樹脂を使用し、次にカップリング試薬として21133テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを用いてパルミチン酸でアルキル化して、標準的なFmoc固相ペプチド技法によって製造した。95トリフルオロ酢酸、25水および25トリイソプロピルシランの混合物を用いて両親媒性を樹脂から切断した。ペプチド両親媒性物質3および4の合成は、スキーム2によりアミノ酸7を合成した。NカルボベンジルオキシLアスパラギン酸無水物をドデシルアミンと反応させて、脂肪酸アミノ酸5を得た。次いで、接触水素化によってCBz基を脱離して、6を得、次いでアミンのFmoc保護を実施した。この合成は、5グラムスケールで容易に進行する。次いで、カップリング試薬としてHBTUを使用して生成物7をリンク樹脂にカップリングした。その後、標準的なFmoc固相技法を使用して、残りのアミノ酸を8に添加した。以前に記載したように、標準的な切断条件により、逆構造を有するPAを得た。1HNMRおよびエレクトロスプレーイオン化質量分析は予想される構造に一致している。スキーム2脂肪酸アミノ酸の合成実施例1aNドデシル2カルボベンジルオキシアミノスクシンアミド酸NカルボベンジルオキシLアスパラギン酸無水物を50mL塩化メチレンに溶解し、次に105eqのドデシルアミンおよび11eqのトリエチルアミンを添加した。蒸散を防ぐために反応に蓋をし、12時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーによって出発材料がわずかでも検出されなかったら、20mLの1N塩酸で反応を停止し、次にクロロホルムで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、7を白色の固体として得た。実施例1b2アミノNドデシルスクシンアミド酸100mlのエタノールに、100mmolの7を溶解し、PdおよびCを含有する反応容器に移した。次いで、容器を水素雰囲気下に3時間おいた。反応混合物をセライトでろ過し、減圧下蒸発乾固して、生成物を白色の固体として得た。収率95。実施例1cNドデシル2Fmocアミノスクシンアミド酸水ジオキサン混合物の200mLに、66mmolの6を13mLのトリエチルアミンと共に溶解し、次に1eqのFmocOスクシンアミドを溶解した。反応をTLCでモニターし、2~3時間後、全てのFmocOSuが消費された。反応を酸で停止して、白色の沈殿物を得、ろ過して回収した。収率85。実施例1dPA合成および精製参照文献3に記載されているように、PA1~2を製造した。PA3~6は、標準的なリンク樹脂を反応容器に入れ、30ピペリジンのNMP溶液で3回脱保護し、次いで2eqの7に終夜カップリングした。ニンヒドリン試験が陰性の結果を示すまで、カップリングを反復した。次いで、この修飾樹脂8を自動合成装置にロードし、PA1~2についてと同様にペプチド合成を進行した。自動合成が完了したら、参照文献3に記載されているように、PAを樹脂から切断した。実施例1eC15H31CONHValValValAlaAlaAlaLysLysLysCOOH実施例1fC15H31CONHValValValAlaAlaAlaGluGluGluCOOH実施例1gAspValValValValValValLysLysLysNH2実施例1hAspValValValAlaAlaAlaGluGluGluNH2実施例2PAは、好適な刺激の存在下で水性媒体に分散すると、典型的には、自己集合して高アスペクト比の円筒形ナノファイバーを形成する。以前の研究に基づいて、1つのPA分子または2つのPA分子の混合物からなるファイバーは、βシート様水素結合を有する二次構造を示すことが予想されると思われる。負に荷電している2または4とそれぞれ反対に荷電している1または3を混合すると平行なβシート様水素結合配列を生ずると思われるが、1または2とそれぞれ末端アミンが反対に荷電している4または3を混合すると逆平行配列を生ずると思われることが予想された。実施例301mMの濃度では、2~4のCDスペクトルは、主にランダムコイル特性を有するペプチドセグメントを明らかにした。これは、荷電が大きい分子間の静電反発力によって生じる可能性が最も大きい。荷電を中和するようにpHを変化するまたはカルシウムイオンを添加すると、全てのPAはβシート構造を示した。一方、1は任意のpHにおいてβシートシグニチャーを示す。1は、酸性末端がリジン残基の1つの荷電を中和して、みかけの正味荷電2を式に与える可能性があるので、他より荷電が小さい可能性がある。この低い全体荷電は反発力を低下し、ファイバー内にβシート水素結合を生じさせる可能性がある。逆に、4は、アミン末端がグルタミン酸残基の1つの荷電を中和すると思われるので、2のみかけの正味荷電を有し、βシート相互作用を生じさせると思われる。しかし、4は依然として乱雑なCDシグニチャーを示した。このみかけの矛盾を解決するために、pH7における集合物の実際の荷電状態およびみかけのpKaを求めて、これらの種々のシステムの自己集合の駆動力をよりよく理解した。実施例43mMの濃度で分子1~4の集合物のpKa滴定を実施した。自己集合による動態的な影響を回避するために、全ての滴定は、分子がすでに集合した状態にあるpHから開始した。3のpKa滴定だけが、2つのみかけのpKaに関連するシャープな遷移を示し、一方は溶媒接近性の大きいアミン末端の脱プロトン化に起因し、他方はεリジンアミンの1つ以上によって生じた。PA1、2および4の集合物は複雑な曲線を示し、遷移は広い範囲にわたって生じ、これらの超分子物体のプロトン化脱プロトン化はゆっくり生じ、酸性度はナノファイバー内の局所的な微小環境により変化することを意味している。文献の最近の報告と矛盾することなく、集合物は酸およびアミン基のみかけのpKaを変化させることがこれらの結果から明らかである。実施例5荷電相補的PA分子の自己集合により、βシート水素結合配列を有する2つの成分の混合物を含有するファイバーを生ずるはずである。2をトリプルリジン両親媒性物質3または1と混合すると、得られるCDスペクトルは純粋なβシートに対応する。観察されるβシートシグニチャーは、単に2つの成分の個々のCDスペクトルの重ね合わせではないという事実は、2つの分子が1つの集合物構造を形成している混合ナノファイバーの形成を強く示唆している。トリプルグルタミン酸PA4または2と混合したPA1も同様の挙動を示す。同様の荷電の2つのPAを混合すると、13リジン混合物はβシートを示すが、24グルタミン酸混合物は、おそらくグルタミン酸残基間の大きい荷電反発性のために、乱雑な立体配座を示す。実施例6ファイバー内での分子の自己集合をさらに証明するために、荷電相補的PAから製造した15重量ゲルに核オーバーハウザー分光法を実施した。2および3の代表的なNOESYは、それぞれ、2のGluHβプロトンと3のLysHεおよびValHδプロトンの間で観察される密接な接触を示す。考えられるいくつかの他の分子間接触が検出されたが、23接触にはっきりと起因させられなかった。これらの結果は、2つのPA分子が同一のナノファイバー内に同時集合されている追加の証拠を提供している。実施例7両親媒性の自己集合の成功が確立されたら、シングルおよびマルチプルPA由来のシステムのゲル化挙動を検討した。1~4の1重量パーセント溶液はわずかに不透明で、それぞれ、酸または塩基の添加によりゲル化することができた。透過型電子顕微鏡は、他のPAにおいて以前に観察されたものと同様の、平均径65nm、平均長さ数百ナノメーターのナノファイバーの形成を明らかにしている。実施例8ファージディスプレイは、典型的には、受容体ブロッキングペプチド、すなわち高ブロッキング定数を有する配列を見つけるために使用される。PA結合部位から細胞受容体に増殖因子を移動させるためには、極端に強い結合定数は必要とされず、望ましくない場合もある可能性がある。従って、13merライブラリーより7merの市販のファージライブラリーを選択し、中間的な結合強度を得た。増殖因子を96ウェルプレートに物理吸着させ、その後ファージライブラリーに接触させた。室温において60分インキュベーション後、界面活性剤溶液ですすいで未結合のファージを除去した。その後、増殖因子溶液と共に60分インキュベーションすることによって結合ファージを溶出した。回収したファージを37°Cにおいて大腸菌内で4時間増殖し、パニングを2回以上反復した。その後のパニングラウンドにおいて、界面活性剤濃度を上昇し、ライブラリーへの接触時間を短縮することによって緊縮度を増した。最終的なファージ集団を平板培養し、1つのファージタイプだけを含有するコロニーの10クローンのDNAを配列決定した。次に、ELISAスクリーニングを使用して偽陽性を試験し、選択したクローンの相対的な結合強度を求めた。このプロトコールを使用すると、rhBMP2の最良の結合エピトープはYPVHPSTであり、rhTGFβ1はLPLGNSHであることが見出された。実施例8aファージディスプレイは、PhD7キットを用いて実施した。50マイクロリッターの希釈したM13ファージライブラリーを96ウェルマイクロタイタープレートに添加し、0°Cにおいて18時間10μgmlの増殖因子溶液50μlに接触させた。プレートを1時間ブロックし、次いでゆっくり撹拌しながら室温において60分インキュベーションした。TBSTween20ですすいで未結合のファージを除去した。その後、50μlの増殖因子溶液と共に60分インキュベーションすることによって結合ファージを溶出した。ファージを連続希釈し、その後寒天プレートで大腸菌と共に平板培養することによって結合ファージの存在を判定した。形成されたプラークの数を元の混合物中のファージの数に関連させることができる。その後、ファージを37°Cにおいて大腸菌中で4時間増幅した。その後のパニングラウンドにおいて、Tween20の濃度を05に上昇し、結合時間および溶出時間をそれぞれ短縮および延長して、選択過程の緊縮度を増した。3ラウンドのパニング後、回収したファージ混合物を希釈し、寒天で細菌と共に平板培養した。その後、1つのDNA配列を含有するプラークを単離する。精製後、10クローンを配列決定した。次に、ELISAスクリーニングを使用して偽陽性を排除し、選択したクローンの相対的な結合強度を求めた。増殖因子をコーティングしたマイクロタイタープレートで各クローンを1時間インキュベーションし、プレートをTBSTween20ですすぎ、その後HRP結合抗M13抗体を1時間インキュベーションした。ABTSの添加後、30分後に450nmにおける吸光度を測定し、単離したクローンの相対的な結合強度を求めた。その後、最も強い結合物を選択した。表1ファージディスプレイを使用して誘導されるBMP2およびTGFβ1の結合配列数値コーディングは、結合強度を最高から最低まで低下する際の選択したクローンの相対的な結合強度を例示している。全ての配列は強く結合している。実施例9ファージ上で提示されるペプチド配列は遊離N末端を有するので、PAの典型的な合成経路を使用することができなかった。従って、側鎖をドデシルアミンで修飾したアスパラギン酸をRinkアミド樹脂と反応させた。。その後、ペプチドの残りを通常のFmocペプチド合成技法を使用して合成し、逆の極性を有するPAを生じた。選択したペプチド配列は、それぞれ、BMP2はV6K3SG3YPVHPSTであり、TGFβ1はV3A3K3SG3LPLGNSHであった。K3セグメントは、フィラー2の荷電E3ヘッド基と同時集合するように選択した。SG3配列はスペーサー単位であり、ファージに存在したものと同じスペーサーである。BMP2のそれぞれYPVHPSTおよびKQALTOTとの結合定数は、蛍光偏光解消によって測定するとき、Ka19±09106M1および21±085105M1であり、結合強度の同調性を例示している。実施例9aAspValValValValValValLysLysLysSerGlyGlyGlyTyrProValHisProSerThr実施例9bAspValValValAlaAlaAlaLysLysLysSerGlyGlyGlyLeuProLeuGlyGlnSerHisNH2スキーム3:実施例10PA9とフィラーPA2の同時集合は、円二色性分光法を使用して証明できると思われる。013mMの濃度において、この濃度における個々のPAナノファイバーのCDスペーサーは主にランダムコイル特性を有する。しかし、一体として混合すると、CDスペクトルは純粋なβシートを反映し、PAは、1つだけのPA分子からなる個々のホモファイバーを形成するのではなく、1つのファイバーに同時集合することを例示している。同時集合は、KKKおよびEEE部分が複合体を形成する場合には、静電反発力が低下するので、エネルギー的に好ましい。15重量溶液の核オーバーハウザー効果分光法を使用して同時集合の追加の証拠が得られた。EβとKεプロトンの間およびEβとVδプロトンの間に密接な接触が観察され、この距離はホモファイバー間より有意に大きいと思われる。考えられる他の分子間接触は明白に起因させられなかった。最後に、凍結乾燥試料および1重量溶液のフーリエ変換赤外分光法は、βシートに典型的な1630cm1ピークの存在を示した。同様の結果は102混合物で得られた。試料を37°Cにおいて24時間アニーリングすることにより、CD効果の強度が有意に増加した。この増加は、完全に結合している発色団のドメインのサイズの増加に起因する。おそらく、最初の混合によって完全でない混合システムの動態的な捕獲を生じ、アニーリングによって、その後両親媒性物質が熱力学的に最も安定な状態に再組織化することが可能になる。水素結合ネットワークおよび脂肪族テイルの予想される融点を十分に上回る80°Cにおける長時間の加熱も超分子キラリティーの任意の顕著な損失を生じず、ナノファイバーの高い安定性を例示している。実施例11この方法の生理学的重要性を試験するために、異なるレベルの増殖因子を含有するゲルにおいて間葉系幹細胞を培養した。これらの細胞実験では、タンパク質による認識を確実にするために、結合エピトープを501比に希釈した。望ましい量の増殖因子を含有する50μlのプレミックスPAおよび50μlの間葉系幹細胞懸濁液をガラスカバースリップ上で混合し、次に30mgmlのCaCl2溶液10μlを添加することによってゲルを調製した。ゲルを15時間固化させ、その後1mlの間葉系幹細胞培地を添加した。この方法では、92または2単独からなるおよび0、1または50ngmlのBMP2を含有するゲルが調製された。別の対照として、10000の幹細胞をガラスカバースリップで平板培養し、同じ濃度のBMP2を培地に添加した。培地を4日めごとに交換し、培養7日目および21日目にトリプリケート試料を単離した。その後、系統特異的なマーカーオステオカルシン、アジポネクチン、コラーゲンIIおよびアグリカンならびにα平滑筋アクチンおよびデスミンのタンパク質発現をウェスタンブロットによって評価した。実施例11a細胞実験のプロトコール:ヒト間葉系幹細胞を5000細胞cm2の密度で4つのT75培養フラスコの15mlの間葉系幹細胞培地に入れ、37°C、5CO2、湿度90においてインキュベーションした。集密度90において、細胞を025トリプシンEDTA25mlで5分間トリプシン処理した。その後、8mlの培地を添加して、プロテアーゼ活性を失活させた。細胞懸濁液を合わせて、850rpmで8分遠心分離した。細胞ペレットを1mlの培地に再懸濁させ、10μlを細胞計測に使用した。細胞懸濁液を培地で2000000細胞mlの濃度に希釈した。PA1および3を2重量の濃度で溶解した。その後、1の50μlを3の1250μlと混合した。混合物を410μlの3部に分割し、さらに3の410μlの3部を調製した。次いで、2μgmlBMP2の20μlを13および1の1部に100ngmlBMP2濃度まで添加した。同様に、20ngmlBMP2の41μlを最終濃度2ngmlのBMP2まで添加した。50μlのPA溶液と50μlの細胞懸濁液を電子顕微鏡用ガラスカバースリップ上で混合することによってゲルをトリプリケートで調製した。次いで、30mgmlCaCl2の10μlを添加し、ゲルを37°C、5CO2、湿度90において90分固化させた。得られた濃度は1重量PAであり、BMP2では0、1または50ngmlである。次に、1mlの培地を添加した。5μlの細胞懸濁液をガラスカバースリップに置き、1mlの培地を添加することによって増殖因子の対照溶液を調製した。次いで、2μgmlBMP2の25μlおよび2μgmlのBMP2の05μlを添加して、それぞれ50ngmlおよび1ngml濃度のBMP2溶液を得た。培地の半分を4日目ごとに交換した。実施例12細胞の生存度は、3週間の培養後に全てのゲルにおいて95であることを細胞生存度アッセイは示した。エンドグリンの発現はどの時点においてもウェスタンブロットによって検出することができず、全ての細胞は分化を開始していたことを示している。アジポネクチンおよびアグリカンの発現も任意の時点において検出できなかった。オステオカルシンの発現はゲルと対照間で顕著な差を示した。オステオカルシンは対照では検出できなかったが、全てのゲルは、通常の2~3週間ではなくすでに7日目に有意なレベルのオステオカルシンを発現したが、3週間経過時点において有意に増加しなかった。1および3週における同様の発現レベルは、オステオカルシンの発現レベルは培養期間中一定であることを意味している。驚くべきことに、発現はBMP2濃度に依存しないと思われ、比は、結合PAを含有するゲルと結合PAを含有しないゲルで12である。さらに、BMP2を添加しないゲルも同様のレベルを示す。おそらく、細胞自体によって産生される内因性BMP2レベルは、骨芽細胞分化を刺激するのに十分であるが、結合ゲルがBMP2の一部に結合する能力は発現されるオステオカルシン量をわずかに低下する。オステオカルシンの発現はまた免疫細胞化学でも可視化することができた。一方、α平滑筋アクチンは、9を含有するゲルにおいて検出されなかったが、結合物を含有しないゲルにおいて発現された。しかし、それは3週間後にどちらの場合でも発現されたが、92のゲルにおける発現は2のゲルよりわずかに低く、対照より有意に低い。さらに、最終分化平滑筋細胞のマーカーであるデスミンの発現を検出することができなかった。実施例12aウェスタンブロットプロトコール:培地を除去した後、ゲルを1mlのリン酸緩衝生理食塩液ですすぎ、その後、200μlの2ドデシル硫酸ナトリウム、008MTris、10グリセロールで細胞を溶解した。3つの溶菌液を合わせ、10μlの溶菌液と200μlのBCAタンパク質アッセイ試薬を混合し、37°Cにおける30分のインキュベーション後BSA標準シリーズに対する562nmの吸光度を読むことによってタンパク質濃度を測定した。その後、10μgのタンパク質、3μlのβメルカプトエタノール、3μlのブロモフェノールブルーを混合し、水を総容量36μlまで添加した。混合物を5分間煮沸し、4または10~20Novexトリスゲルにロードした。ゲルは、130Vの定電圧でトリス泳動緩衝液で90分泳動した。次いで、タンパク質を、ニトロセルロース膜に移し、190mAの定電流で90~120分泳動した。膜を5脱脂乳中で1時間ブロックし、オステオカルシン、エンドグリン、アジポネクチン、α平滑筋アクチンおよびポリクローナルアグリカンに対するモノクローナル抗体を使用して、1ミルクで1500希釈のそれぞれのマーカーを2時間探索した。膜を、トリス緩衝生理食塩液01Tween20で15分間3回すすいだ。次いで、二次抗体を1ミルク中で13000希釈で1時間平衡させ、次にTTBSによるすすぎ段階を3回実施した。ECLウェスタンブロット分析溶液で1分平衡させることによって膜を形成し、ECLハイパーフィルムに接触させた。実施例12b細胞を2パラホルムアルデヒド02グルタルアルデヒド02Mカルコジレートナトリウムで4°Cにおいて20分固定した。PBSですすいだ後、試料を01TritonXと共にPBS溶液中で5分間インキュベーションした。その後、試料をPBSですすいだ。次に、ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体の1BSAPBS溶液を添加し、試料を4°Cにおいて終夜インキュベーションした。PBSで3回すすいだ後、FITC結合二次抗体の1BSAPBSを添加し、2時間インキュベーションした。PBSで3回すすいだ後、NikonEclipseTE2000電子顕微鏡で倍率10×で試料を可視化した。実施例13一連の実験は、TGFβ1の最高濃度が、50ngmlでなく20ngmlであることを除いて、PA10、結合TGFβ1、BMP2実験についてと同様に実施した。試料は10日後に単離した。TGFβ1の存在下における培養により、平滑筋および軟骨系統が分化する。コラーゲンIIの発現は結合ゲルでは高く、TGFβ1の増加により増加すると思われる。驚くべきことに、オステオカルシンおよびコラーゲンXが発現され、この早期時点では予想されない肥大軟骨細胞段階への成熟が生じていることを示している。同様に、α平滑筋アクチン発現はTGFβ1濃度と共に増加するが、非結合ゲルより結合ゲルにおいて高い。それは対照においてはるかに高いが、デスミンの発現レベルは、これらは主に未熟筋細胞であることを示している。実施例147および12merファージディスプレイキットを用いて、血管内皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ニューロトロフィン3およびラミニン5の数多くの結合配列を決定した;は最も強い結合物を示す:先の実施例によって例示するように、本発明は、標準的な固相方法に適合する遊離N末端を有するペプチド両親媒性分子の合成方法を提供する。遊離C末端PAと混合すると、これらの分子は自己集合して、同じ極性のPAの同時集合物より安定性が高いと思われる熱安定性が高いβシート構造を含有するナノファイバーを形成する。表面に遊離N末端を有する集合物を作製する新規機会により、ペプチド配列のC末端を露出しているナノ構造物では以前には入手不可能であった生物活性ナノファイバーの設計が可能になる。本発明は、ある好ましい態様を参照してかなり詳細に記載されているが、他の形態も可能である。例えばファージディスプレイ法によって誘導されるペプチドまたはタンパク質配列を使用して、増殖因子以外のタンパク質に結合して保持する結合ペプチド両親媒性化合物を製造することができる。自己集合して、ナノファイバーヒドロゲルの表面に固定することができる結合ペプチド両親媒性物質を製造するように酵素を結合することができると思われる。このようなヒドロゲルをセンサー適用のコーティングとして使用することができる。または、ペプチド両親媒性物質に結合したファージディスプレイ由来のペプチドの結合相互作用は、HGFまたはVEGFなどのペプチドに強力に結合し、それらを除去することによって種々の疾病および状態を治療するように選択してもよい。これらの結合ペプチド両親媒性化合物の自己集合によって形成されるヒドロゲルは患者の部位に挿入するためまたはろ過システムに使用するために成形してもよい。ヒドロゲルは、患者の関節もしくは腫瘍などの部位または患者の体液からHGFまたはVEGFのような標的ペプチドを除去するために使用してもよい。