"マイクロニードル部分に医薬的に有効量のDNAワクチンを含有させた、基板上に皮膚内で溶解消失する複数のマイクロニードルを有するDNAワクチンマイクロニードルアレイ。DNAワクチンがニワトリ卵白アルブミンOVA発現プラスミドであることを特徴とする請求項1に記載のDNAワクチンマイクロニードルアレイ。Th1免疫応答へと偏向した免疫誘導特性を有することを特徴とする請求項2に記載のDNAワクチンマイクロニードルアレイ。マイクロニードルの素材がヒアルロン酸、デキストラン及びポリビニルピロリドンであることを特徴とする請求項1から請求項3のいずれか1項に記載のDNAワクチンマイクロニードルアレイ。前記DNAワクチンは溶着法によりマイクロニードルに溶着させていることを特徴とする請求項1ないし4のいずれか1項記載のDNAワクチンマイクロニードルアレイ。本発明が解決しようとする課題は、ワクチン抗原としてプラスミドDNAを経皮的に投与可能な免疫製剤、すなわち貼るDNAワクチン製剤を提供することにある。皮膚内溶解型マイクロニードルを用いてプラスミドDNAを経皮的に生体内に送達し、表皮層に存在するランゲルハンス細胞にプラスミドDNAがコードする抗原蛋白質を捕捉させ認識させることにより、抗原特異的免疫反応応答を効率よく惹起することができる。プラスミドDNAを角質下の皮膚組織内に確実に送達できる方法論を構築し、それによって抗原特異的な免疫応答誘導を達成するDNAワクチン内臓マイクロニードルが提供できると考えられる。本発明のDNAワクチンマイクロニードルアレイは、マイクロニードル部分に医薬的に有効量のDNA抗原を含有させた、基板上に皮膚内で溶解消失する複数のマイクロニードルを有することを特徴とする。本発明のDNAワクチンマイクロニードルアレイに含有されるDNAワクチンとしては、例えばインフルエンザHA抗原や腫瘍関連抗原等のDNAを用いることができる。本発明におけるニワトリ卵白アルブミンOVA発現プラスミドは抗体発現の例示DNAである。さらにこのニワトリ卵白アルブミンOVA発現プラスミドは、Th1免疫応答細胞性免疫応答へと偏向した免疫誘導特性を有することを特徴とする。ランゲルハンス細胞は免疫系の司令塔として機能する抗原提示細胞であり、皮膚から生体に進入してきた病原体を捕捉して近傍のリンパ節へと移動し、抗原情報を免疫エフェクター細胞に伝達する。このランゲルハンス細胞の本来的な免疫学的機能を標的として経皮DNAワクチンを開発するには、プラスミドDNAが皮膚最外層の物理的バリアーである角質層を突破する必要があり、皮膚内溶解型マイクロニードルの適用はプラスミドDNAを安定に角質層下の皮膚組織へと到達することを可能とする。現在公表されているDNAワクチンの多くは、プラスミドDNAを皮下注射法や筋肉注射法により投与している。注射は痛みを伴うばかりでなく、注射針による感染症罹患の危険性や投与局所の腫脹や発熱といった副作用問題を孕んでいる。マイクロニードル技術を活用すれば、このような副作用を生じない、簡便で普及性に優れたDNAワクチンを実用化できる。本発明に基づき有効な経皮DNAワクチン製剤を開発上市できれば、衛生環境的医療技術的経済的な問題を抱える開発途上国にワクチンが十分に行き渡っていない現状を打開し、新興再興感染症に対する予防医療に大いに貢献できるものと確信する。本発明の応用例は感染症予防に留まらず、がん、自己免疫疾患、アレルギー、アルツハイマー病などに対する新たな予防治療法の開発にも期待が持たれる。DNAワクチンとしてニワトリ卵白アルブミンOVA発現プラスミドを含有するマイクロニードルを使用すると、これを注射法で投与する場合や蛋白質ワクチンを利用する場合に比較して、Th2免疫応答体液性免疫応答:主に抗体の産生よりもむしろTh1免疫応答細胞性免疫応答:主に細胞傷害性T細胞の活性化へと偏向した免疫誘導特性を有する特徴が認められた。がん、ウイルス感染症などに効果を発揮するワクチンは、Th2免疫応答のみならず、Th1免疫応答の誘導が必要である。また、自己免疫疾患やアレルギーはTh1/Th2免疫応答バランスの破綻が病因であるので、ワクチンによってどちらかに偏ったバランスを正常に戻せれば有効な治療法となる。このようにいずれかへ偏向した免疫誘導特性を有することは、このワクチンの新しい応用に繋がる。次に、本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。ニワトリ卵白アルブミンOVA発現プラスミド生成法OVA発現プラスミドは、以前に構築した図1に示されているpHMCMV5/OVAを使用した。この手順の詳細は次の文献に記載されている。1水口裕之、マークA.ケイHiroyukiMizuguchiandMarkA.Kay,改良された生体外連結法による組換えアデノウイルスベクターの効率的な構築EfficientConstructionofaRecombinantAdenovirusVectorbyanImprovedInVitroLigationMethod,ヒト遺伝子治療HumanGeneTherapy,米国、マリーアンライバート社MaryAnnLiebert,Inc,1998年,9巻,17号,2577-2583頁2水口裕之、マークA.ケイHiroyukiMizuguchiandMarkA.Kay,E1およびE1/E4を欠損した組換えアデノウイルスベクターを構築するための簡便法ASimpleMethodforConstructingE1-andE1/E4-DeletedRecombinantAdenoviralVectors,ヒト遺伝子治療HumanGeneTherapy,米国、マリーアンライバート社MaryAnnLiebert,Inc,1999年,10巻,12号,2013-2017頁3岡田直貴、斎藤友美、舛永安繁、塚田有希子、中川晋作、水口裕之、森宏平、岡田裕香、藤田卓也、早川堯夫、眞弓忠範、山本昌NaokiOkada,TomomiSaito,YasushigeMasunaga,YukikoTsukada,ShinsakuNakagawa,HiroyukiMizuguchi,KoheiMori,YukaOkada,TakuyaFujita,TakaoHayakawa,TadanoriMayumi,andAkiraYamamoto,アルギニン-グリシン-アスパラギン酸配列を含むファイバー変異型アデノウイルスベクターを用いた効率的な抗原遺伝子形質導入は、ネズミ樹状細胞の抗腫瘍ワクチン効果と機能成熟を増強できるEfficientAntigenGeneTransductionUsingArg-Gly-AspFiber-MutantAdenovirusVectorsCanPotentiateAntitumorVaccineEfficacyandMaturationofMurineDendriticCells,癌研究CancerResearch,米国、米国癌学会AmeicanAssociationforCancerResearch,2001年,61巻,21号,7913-7919頁pHMCMV5/OVAはE.coli株DH5α東洋紡績株式会社にトランスフォーメーションして増幅した後、QIAGENPlasmidGigaKitQIAGEN株式会社を用いて精製した。皮膚内溶解型マイクロニードルの作製方法図1に本実施例のマイクロニードルの断面図を示す。本実施例で用いたマイクロニードルの材質とマイクロニードルに含めた薬物をまとめて表1に示す。マイクロニードルの材質は、マイクロニードルを構成する3成分の質量比で示す。抗原の濃度は、マイクロニードル質量に対する質量で示す。本実施例で用いられているヒアルロン酸は株紀文フードケミファ製でその分子量は80万商品名:FCH-80LE、デキストランは日本バルク薬品株製商品名:デキストラン70、ポリビニルピロリドンはBASFジャパン製商品名:コリドン12PFである。また、本発明において分子量とは重量平均分子量であり、ゲルパーミェーションクロマトグラフィーGPCにより測定された量をいう。マイクロニードルは、根元直径0.2mm、先端直径0.04mm、長さ0.8mmの円錐台状であり、0.8mm間隔に格子状に配列されており、1cm2の円形パッチ型アレイでありマイクロニードルは144個形成されている。各素材組成の混合物を水に溶解させて10固形分水溶液とした。この水溶液にOVA発現プラスミドを添加し、室温下マイクロニードル形成用凹部に充填し水分を蒸発して乾燥した後剥離してマイクロニードルアレイを製造した。また、別の製造法として、マイクロニードルパッチを成形し、その針先をDNAを溶解したヒアルロン酸水溶液に浸漬した後乾燥させて針先にDNAを含有するマイクロニードルを製造することもできる溶着法。針部に3μgのpHMCMV5/OVAを装填した針長800μmのマイクロニードルMH800-pHMCMV5/OVA、ならびに針部に10μgのOVA蛋白質Sigma-Aldrich株式会社を装填した針長800μmのマイクロニードルMH800-OVAを上に述べた方法に従って作製した。なお、pHMCMV5/OVAおよびOVA蛋白質の含量は、それぞれPicoGreenassaykitMolecularProbes株式会社およびELISA法にて定量した。ワクチン接種方法C57BL/6マウスの除毛した背部皮膚にMH800-pHMCMV5/OVAあるいはMH800-OVAを6時間貼付した。この免疫操作を2週間隔で3回繰り返し、経日的に血清を回収した。また対照群のマウスには、同様のスケジュールで3μgのpHMCMV5/OVAを大腿外側に筋肉内注射した。なお、MH800-pHMCMV5/OVAとMH800-OVAとではマイクロニードル当たりの薬物量が異なるが、両薬物は作用機構が異なるため、免疫操作の有効性を薬物投与量基準で判断することは困難である。血清中OVA特異的抗体価の測定方法血清中のOVA特異的抗体価はELISA法により測定した。50mMbicarbonatebufferpH9.6に溶解したOVAを0.5μg/50μl/wellで96ウェルELISAプレートに分注し、4°Cで一晩インキュベーションすることでOVAの固相化を行った。ブロッキング処理は、4ブロックエースDSファーマバイオメディカル株式会社溶液を200μl/well添加し、37°Cで2時間インキュベーションすることにより行った。血清検体を0.4ブロックエース/TBS-TTris-bufferedsalinecontaining0.05Tween20を用いて連続2倍希釈し、ブロッキング液を除去したプレートに各希釈血清検体を50μl/well添加した。室温で2時間インキュベーションし、各ウェルをTBS-Tで3回洗浄した後、HorseradishperoxidaseHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体SouthernBiotech株式会社、HRP標識ヤギ抗マウスIgG1抗体SouthernBiotech株式会社、あるいはHRP標識ヤギ抗マウスIgG2c抗体SouthernBiotech株式会社を50μl/wellで添加した。なお、各HRP標識抗体は0.4ブロックエース/TBS-Tでメーカー推奨濃度に希釈して使用した。プレートを室温で2時間インキュベーションし、各ウェルをTBS-Tで3回洗浄後、HRP基質溶液TMB,ultrasensitive;Moss株式会社を100μl/weIl添加した。適当な発色が認められるまでプレートを室温でインキュベーションした後、反応停止液として2NH2SO4を50μl/well添加し、主波長450nm、副波長655nmにて吸光度を測定した。各血清検体のOVA特異的抗体価は、無免疫マウスの同倍希釈血清検体よりも吸光度が0.1以上高い値を示す最大希釈倍率2-xについて、その逆数2Xの2を底とする対数log22x=Xを算出し、その値をReciprocallog2titerとして表わした。本実験において測定した血清中OVA特異的抗体価の推移を図2にまとめた。MH800-pHMCMV5/OVAを用いて経皮ワクチンしたマウスにおいては、1回のワクチン接種で血清中にOVA特異的IgG抗体の産生が検出され、そのレベルは従来のDNAワクチンpHMCMV5/OVAの筋肉内注射を受けたマウスと同等であった。しかしながら、これらDNAワクチンを施した両群のOVA特異的IgG抗体価は、OVA蛋白質を経皮ワクチンした群MH800-OVA群の抗体価と比較すると明らかに低値であった。またMH800-OVA群では複数回のワクチン接種によってOVA特異的IgG抗体価の明らかな上昇ブースト効果が認められたのに対して、DNAワクチンの二群では2回目ワクチン接種以降の抗体価は初回ワクチン接種後と比較して大きな変化はなかった。したがって、プラスミドDNAの投与経路の差異に拘わらず、DNAワクチンは蛋白質抗原を用いたワクチン手法と比較して抗体産生体液性免疫応答が誘導されにくいのではないかと推察された。そこで、DNAワクチンと蛋白質ワクチンの免疫誘導特性を比較する足掛かりとして、血清中OVA特異的IgG抗体のサブクラス解析を行った。MH800-pHMCMV5/OVA群ならびにpHMCMV5/OVA筋肉内注射群においては、Th1型サブクラスとされるIgG2cの抗体価上昇は認められたものの、Th2型サブクラスであるIgG1の抗体価については検出限界以下であった。一方、MH800-OVA群においてはIgG1およびIgG2cともに抗体価の上昇が認められ、それらのレベルはTh2型であるIgG1が優位な傾向にあった。したがって、DNAワクチンは蛋白質ワクチンと比較するとTh2免疫応答体液性免疫応答よりもむしろTh1免疫応答細胞性免疫応答へと偏向した免疫誘導特性を有する可能性が示唆された。以上を総合すると、マイクロニードルを応用したDNA経皮ワクチンは、免疫誘導機序ならびに免疫応答特性に関する詳細な解析が必要とされるものの、従来の注射によるDNAワクチンと同等の抗原特異的免疫応答を誘導できることが実証された。またDNA経皮ワクチンが細胞性免疫応答を優位に活性化できる可能性が示されたことは、ウイルス感染症や癌などのように予防や治療に細胞性免疫の働きが必要となる疾患への本アプローチの応用も期待される。"