神経幹細胞の自己複製を促進するための促進剤であって、ECF-LまたはECF-Lを発現する発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、促進剤。前記ECF-Lがヒトacidicchitinase、ヒトchitotriosidase、ヒトoviductalglycoprotein1precursor、ヒトchitinase3like2またはヒトchitinase3like1であることを特徴とする、請求項1に記載の促進剤。神経幹細胞を培養する方法であって、ECF-L存在下で神経幹細胞を培養することを特徴とする、方法。前記ECF-Lがヒトacidicchitinase、ヒトchitotriosidase、ヒトoviductalglycoprotein1precursor、ヒトchitinase3like2またはヒトchitinase3like1であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。神経幹細胞の自己複製を促進するための医薬組成物であって、ECF-LまたはECF-Lを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする医薬組成物。前記ECF-Lがヒトacidicchitinase、ヒトchitotriosidase、ヒトoviductalglycoprotein1precursor、ヒトchitinase3like2またはヒトchitinase3like1であることを特徴とする、請求項5に記載の医薬組成物。神経の機能不全をもたらす疾患の治療用医薬組成物であることを特徴とする、請求項5または6に記載の医薬組成物。前記疾患が、脳梗塞、脊髄損傷、筋委縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、脳出血、または、くも膜下出血であることを特徴とする、請求項7に記載の医薬組成物。前記神経の機能不全が、加齢に起因することを特徴とする、請求項7に記載の医薬組成物。請求項5~9のいずれかに記載の医薬組成物を含有することを特徴とする、医薬剤。そこで、本発明は、神経幹細胞の自己複製促進剤およびその使用方法を提供することを目的とする。本発明者らは、以下の実施例に示すように、骨髄由来血管内皮前駆細胞の培養上清に含まれるECF-Lによって神経幹細胞の自己複製が促進されることを見出し、本発明の完成に至った。すなわち、本発明に係る促進剤は、神経幹細胞の自己複製を促進するための促進剤であって、ECF-LまたはECF-Lを発現する発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする。ここで、本発明に係る促進剤に含まれる前記ECF-Lは、ヒトacidicchitinase、ヒトchitotriosidase、ヒトoviductalglycoprotein1precursor、ヒトchitinase3like2またはヒトchitinase3like1であることが好ましい。また、本発明に係る神経幹細胞を培養する方法は、ECFL存在下で神経幹細胞を培養することを特徴とする。ここで、本発明に係る神経幹細胞を培養する方法において、前記ECF-Lはヒトacidicchitinase、ヒトchitotriosidase、ヒトoviductalglycoprotein1precursor、ヒトchitinase3like2またはヒトchitinase3like1であることが好ましい。本発明に係る医薬組成物は、神経幹細胞の自己複製を促進するための医薬組成物であって、ECF-LまたはECF-Lを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする。ここで、本医薬組成物は、神経の機能不全をもたらす疾患の治療用医薬組成物であることが好ましい。このような疾患は、脳梗塞、脊髄損傷、筋委縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、脳出血、または、くも膜下出血であってもよい。また、神経の機能不全は加齢に起因してもよい。ここで、本発明に係る医薬組成物において、前記ECF-Lはヒトacidicchitinase、ヒトchitotriosidase、ヒトoviductalglycoprotein1precursor、ヒトchitinase3like2またはヒトchitinase3like1であることが好ましい。本発明に係る医薬剤は、上記いずれかの医薬組成物を含有することを特徴とする。==クロスリファレンス==本出願は、2010年4月26日付で出願した日本国特許出願2010-101415に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、JSambrookEFFritschTManiatisMolecularcloningalaboratorymanualColdSpringHarborPressColdSpringHarborNewYorkFMAusubelRBrentREKingstonDDMooreJGSeidmanJASmithKStruhlCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsLtd等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。==ECF-L==本明細書においてECF-Lとは、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログ、または配列番号1に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子のオーソログがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで、ホモログは、配列番号1に示すアミノ酸配列と、60以上相同であることが好ましく、70以上相同であることがより好ましく、80以上相同であることがさらに好ましく、90以上相同であることがさらに好ましく、95以上相同であることがさらに好ましい、というように、相同性が高いほど好ましい。ECF-Lのアミノ酸配列は、いずれの動物種のECF-Lに由来するものであってもよく、神経幹細胞の自己複製促進機能を有する範囲で制限されないが、自己複製を促進させる対象となる神経幹細胞が由来する動物種と同じであることが好ましく、例えば、ヒト由来の神経幹細胞の自己複製を促進する場合には、ヒト由来のアミノ酸配列を有するECF-Lを用いることが好ましい。ここで、ヒト由来のアミノ酸配列を有するECF-L、すなわち、ECF-Lのヒトホモログとして、例えば、acidicchitinaseisoforma及びisoformc、chitotriosidase、oviductalglycoprotein1precursor、chitinase3like2isoforma、isoformb、及びisoformcchitinase3like1が挙げられる。このECF-Lは、その神経幹細胞自己複製促進機能を失わない範囲で変異を有していていてもよく、例えばそのアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、挿入、または置換されているものも含む。また、その神経幹細胞自己複製促進機能を失わない範囲で、糖鎖修飾等の翻訳後修飾がなされていてもよい。==神経幹細胞の自己複製促進剤とその製造方法==ECF-L存在下で神経幹細胞を培養すると、神経幹細胞の自己複製を促進することができる。従って、ECF―Lを有効成分として含有する薬剤は、神経幹細胞の自己複製促進剤として有効である。ECF-Lは、所望の自己複製促進機能を有する範囲でその取得、調製法によって特に制限されず、天然由来ECF-Lであっても、あるいは、人工ECF-Lであってもよい。天然由来のECF-Lは、例えば、周知のタンパク質の単離、精製法を適宜組み合わせることにより、ECF-Lを発現している動物組織から取得することができる。人工ECF-Lは、例えば、周知の遺伝子組換え技術や化学合成法を用いて製造することができる。遺伝子組換え技術の場合、例えば、ECF-LをコードするDNAの塩基配列を好適な発現ベクターに導入した後、培養細胞等の宿主に対してその発現ベクターをトランスフェクトし、ペプチドを発現させ、培地からECF-Lを単離するか、培地をそのまま用いることもできる。一方、化学合成法としては、例えば、Fmoc法フルオレニルメチルオキシカルボニル法やtBoc法tブチルオキシカルボニル法等が挙げられる。また、各種市販のペプチド合成機を利用してECF-Lを製造することもできる。あるいは、神経幹細胞の自己複製促進剤は、ECF―Lを発現する発現ベクターを含有しても良い。この発現ベクターは、神経幹細胞内でECF-Lを発現させるための適切なプロモーター、および、その下流にECF-LをコードするDNAを有しており、この発現ベクターが細胞内に導入されることにより、ECF―Lが発現する。このため、この発現ベクターを含有する薬剤は、神経幹細胞に対し、ECF-Lを含有する薬剤と同じ自己複製促進効果をもたらす。この促進剤は、ECF-L以外の物質であって、神経幹細胞に作用して自己複製を促進する物質、神経幹細胞を維持するために有効な物質、または、神経幹細胞の増殖を促進する物質を一種類、または複数種含有してもよい。このような物質として、例えば、EGF、FGF、VEGF、BDNF、PEDF、HGF、IGF、PDGF、TGF等が挙げられるが、これらに限定されない。この促進剤は、必要に応じて、上記有効成分以外の、当業者に周知の担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物等を用いて剤形化することができる。その形態は促進剤として適切な剤形であれば特に制限されず、錠剤、カプセル、乳剤、液剤、顆粒、粒剤散剤、ペースト剤等に剤形化することができる。==神経幹細胞の培養方法==神経幹細胞とは、自己複製能及び神経細胞とグリア細胞への多分化能を有する細胞である。神経幹細胞を、ECF-L存在下で培養することにより、神経幹細胞の非対称分裂およびそれに伴うグリア前駆体への分化を抑制し、神経幹細胞のみを効率よく自己複製させることができる。増殖させるべき神経幹細胞は、その取得方法によって制限されない。例えば、神経幹細胞を単離する材料となる組織は、神経幹細胞を含有している組織であれば制限されず、動物の中枢神経組織、中でも海馬や側脳室やその周辺が好ましい。この動物の発生、発達段階は、所望の神経幹細胞が得られる範囲内で制限されず、胎仔胎児、未成熟個体、成体等のいずれであってもよい。神経幹細胞が由来する動物種は特に制限されないが、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物であることが好ましい。神経幹細胞を組織から調製する際、組織材料に対し、適切な前処理を行ってもよい。例えば、神経幹細胞を巻き込んだ細胞塊になっている場合には、含まれている細胞を解離するために、材料に対してピペッティング等による物理的処理や、酵素等による化学的処理を行えばよい。酵素としては、トリプシン、コラゲナーゼ等、常法で用いられている酵素が挙げられる。あるいは、神経幹細胞を胚性幹細胞ES細胞や人工多能性幹細胞iPS細胞から分化させても良い。例えば、まず、ES細胞やiPS細胞を、低濃度レベル10-9M~10-6Mのレチノイン酸存在下で培養し、embryoidbodyEBを形成させる。あるいは、分化細胞由来多能性幹細胞の培地にノギンNogginタンパク質を添加することによりEBを形成させることもできる。具体的には、アフリカツメガエルノギンを哺乳類培養細胞に導入し、一過性にノギン蛋白質を発現させた培養上清をそのまま1~50vv使用してもよく、リコンビナントノギン蛋白質1μg/ml程度を用いてもよい。こうして得られたEBを解離して、bFGF10~100ng/mlを添加した無血清培地で培養することによってニューロスフェアとして神経幹細胞を分化させることができる。このようにして得られた神経幹細胞を遠心分離500~2000rpm、3~10分し、沈殿させた細胞に培地を入れて細胞浮遊液を調製した後、細胞を10000~20000/cm2でプレートに播種し、37°C、5CO2インキュベーターで培養する。ここで用いる培地は、神経幹細胞を培養することができる培地であれば特に制限されず、例えば、α-MEMα-minimumessentialmedium、DMEMDulbecco’smodifiedEagle’smedium、IMDMIsocove’smodifiedDulbecco’smedium等が挙げられる。神経幹細胞の自己複製を促進するために、培地には有効量のECF-Lを含有する神経幹細胞の自己複製促進剤を添加しておく。ここで、ECF-Lの有効量は特に制限されず、培養する神経幹細胞に合わせて当業者が適宜決定することができる。また、培地は、ECF-Lまたは神経幹細胞の自己複製促進剤以外に、通常細胞培養に用いられる、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質や神経幹細胞の維持や増殖促進に有効な成長因子例えば、EGF、bFGF、TGF-α、LIF等を含んでいてもよい。==自己複製された神経幹細胞の使用==本発明に係る培養方法によって自己複製した神経幹細胞は、再生医療分野において高い利用価値を有する。例えば、自己複製した神経幹細胞を、神経の機能不全が生じた神経組織に必要量移植することにより、移植部位において新たな神経細胞が分化し、組織再生することができる。この場合、移植細胞である神経幹細胞の由来動物種ドナーと、移植を受ける動物種レシピエントは同一であることが好ましく、同一個体であることがさらに好ましいが、これに制限されない。また、自己複製された神経幹細胞の移植前調製法は特に制限されず、当業者が適宜決定できるが、例えば、培地やバッファーに懸濁して調製しても、あるいは、細胞塊や細胞シートに調製してもよい。ここで、上記レシピエントの疾患は、神経幹細胞の移植によって病状の改善が期待される疾患であれば特に制限されないが、神経の機能不全をもたらす疾患であることが好ましく、例えば、脊髄損傷などの外傷性疾患、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症等の神経変性疾患、脳出血、くも膜下出血、脳梗塞等による神経細胞の壊死等が挙げられる。また、神経の機能不全が加齢に起因する場合も、自己複製された神経幹細胞の移植によって治療することができる。==ECF-Lを含有する医薬組成物==本発明に係る、神経幹細胞を増殖するための医薬組成物は、ECF-LまたはECF-Lを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする。ECF-L存在下で神経幹細胞を培養すると、神経幹細胞の自己複製を促進することができる。従って、ECF―Lを有効成分として含有する医薬組成物を、神経の機能不全をもたらす疾患に罹患する患者に投与すると、患者自身の神経幹細胞の自己複製を促進することにより、神経幹細胞を増殖させることができる。そして、この神経幹細胞が新たな神経細胞を生み出し、組織再生につながる。神経の機能不全をもたらす疾患として、例えば、脊髄損傷などの外傷性疾患、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症等の神経変性疾患、脳出血、くも膜下出血、脳梗塞等による神経細胞の壊死等が挙げられる。また、神経幹細胞の機能不全は、加齢に起因してもよい。本発明に係る医薬組成物は、ECF-Lを有効成分として含む。この医薬組成物に含有されるECF-Lの濃度は、神経幹細胞を増殖させるために必要な最終濃度を考慮し、当業者が適宜決定できる。また、この医薬組成物は、ECF-L以外の物質であって、神経幹細胞に作用して自己複製を促進する物質、神経幹細胞を維持するために有効な物質、または、神経幹細胞の増殖を促進する物質を一種類、または複数種含有してもよい。このような物質として、例えば、EGF、FGF、VEGF、BDNF、PEDF、HGF、IGF、PDGF、TGF等が挙げられるが、これらに限定されない。ECF-Lを有効成分として含む医薬組成物を剤形化して製造された医薬剤は、神経細胞の機能不全をもたらす疾患の治療に用いることができる。この医薬剤は、必要に応じて薬学的に許容される担体を含有し、製剤化される。ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される医薬組成物の形態に応じて、慣用されている担体の中から適宜選択して用いることができる。医薬剤の形態は、治療に適切な剤形であれば特に特定されず、例えば、経口剤として、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等に剤形化してもよい。また、注射剤に剤形化してもよく、例えば、溶液性注射剤、乳濁性注射剤、または固形注射剤等が挙げられる。本医薬剤には、上記製剤用添加物の他、異なる医薬組成物を配合することもできる。なお、本医薬剤は、有効成分として本発明に係る上記医薬組成物の一種類を含有していても、あるいは複数種を含有していても制限はなく、当業者が適宜選択することができる。本医薬剤に含有される医薬組成物は、ECF-Lが投与対象と同じ動物種に由来することが好ましい。たとえば、医薬剤をヒトに投与する場合には、ヒト由来のECF-Lを含有する医薬組成物を選択することが好ましい。本発明の医薬剤の投与法は、安全とされている投与量の範囲内において、投与対象の動物に対し、必要量を、適した方法で投与することができる。本発明の治療用医薬剤の投与量は、剤形の種類、投与方法、投与対象の年齢や体重、投与対象の病状の等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。本発明に係る医薬剤を投与する対象となる動物は、上記のような神経幹細胞の増殖により病状の改善が期待される疾患に罹患した動物であれば制限されないが、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。実験方法==生細胞計数法==10μlのトリパンブルーと10μlの骨髄由来血管内皮前駆細胞懸濁液を混合し、これを血球計算盤に滴下し、16エリア1エリアは250×250μmにおける非染色細胞を計数した。なお、トリパンブルーは死細胞を染色するため、非染色細胞は生細胞である。==マウスの組織固定法==マウスをジエチルエーテルで麻酔し、その左心室に50mlPBSで満たした灌流ポンプに接続した23Gニードルを用いてPBSを緩やかに注入し、灌流を行った。肝臓の色が赤から灰色に変色した後、PBSに代えて50~75mlの4パラホルムアルヒドpH7.4を還流し、組織を固定した。==凍結切片作製法==上記のように固定した脳組織を単離し、4°Cで一晩4パラホルムアルデヒドで後固定し、30ショ糖PBS液中で一晩インキュベートした。なお、増殖細胞の陽性対照として、胸腺組織を同様に処理した。上記脳組織から前脳を単離し、OCTcompoundTissueTek、SakuraFinetecUSA社に包埋した。鼻部に近い側の前脳から第三脳室までの1.2mmの組織において14μm厚の冠状断凍結切片を85枚作製した。この切片は、MASコーティングスライドグラス松浪硝子工業株式会社にマウントした。==免疫組織化学的染色法==切片をPBSで10分間洗浄し、0.3TritonX-100-PBSを150μl滴下して3分間インキュベートした。この切片を、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体を用いて4°Cで一晩、あるいは37°Cで3時間インキュベートした。免疫染色の対照として、対照切片は、ブロッキングバッファーのみでインキュベートした。PBSで10分間ずつ3回洗浄し、二次抗体を用いて室温で1時間インキュベートした。PBSで10分間ずつ3回洗浄した後、PBSで1000倍に希釈したHoechest33258Sigma社で10分間インキュベートすることにより核を対比染色した。この切片をPBSで10分間ずつ2回洗浄し、さらに滅菌蒸留水で5分間洗浄した。切片を封入剤を用いて封入し、蛍光顕微鏡、もしくは、共焦点レーザースキャン顕微鏡下で観察した。実施例1本実施例では、マウス骨髄由来血管内皮前駆細胞の培養上清Endotherialprogenitorcellconditionedmedium、EPC-CMが、invivoにおいて神経幹細胞の自己複製を促進する効果、およびその子孫細胞の数を増加させる効果を有することを示す。==骨髄由来細胞の単離法==成体マウスC57BL6J、オス、8~10週齢、n=10を、ジエチルエーテルを用いて麻酔した後、断頭、もしくは、頚椎脱臼することにより屠殺した。このマウスをアルコール消毒した後、腿骨および脛骨を単離し、氷上で冷却した6cmディッシュのPBS中で維持した。これらの骨から、70エタノールを含んだキムワイプ日本製紙クレシア株式会社を用いて、筋肉組織および腱を除去した後、10個体分の骨を6mlのαMEM/FBS10FBS、100ユニット/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン添加αMEMで満たした乳鉢に入れ、すりつぶした。この粉砕骨溶液を70μmフィルターcellstrainer2350、ファルコン社を用いて遠心分離によりろ過し、ろ過された細胞懸濁液を回収した。回収した細胞懸濁液を280×gで8分間遠心し、得られた細胞ペレットを、ピペッティングにより、5mlαMEM/FBSに再懸濁した。==フィコールによる単核細胞群の単離法==冷却したフィコールFicollPaqiePlus1077g/ml、GEヘルスケアバイオサイエンス社を5ml加え、ここに5mlの細胞懸濁液を重層した。これを、4°C、780×gで15分間遠心した。上層を2ml残して吸引により除去した。さらに、8mlのαMEM/FBSを満たしたピペットを、残留した上層表面の下部に挿入して、約2mlの中間層単核細胞層を回収した。この中間層を280×gで8分間遠心した後、上層を除去して細胞ペレットを2mlのEGM2BulletKit培地Lonza社にピペッティングにより再懸濁し、これを骨髄単核細胞懸濁液とした。ここで、生細胞計数法に従い、細胞計数を行った。==骨髄由来血管内皮前駆細胞の培養法==まず、6ウェルプレートの各ウェルに、3mlずつフィブロネクチン溶液1mg/mlのフィブロネクチンストック溶液50μlを25mlPBSで希釈を加えた。これを、37°Cで一晩インキュベートし、PBSで洗浄してフィブロネクチンコーティングプレートとした。次に、上記フィコールによる単離法により得られた骨髄単核細胞を1×106/mlの濃度で、EGM2BulletKit培地で6ウェルのフィブロネクチンコーティングプレートに播種し、5CO2、37°Cで培養した。播種24時間後、7日後、および14日後に3mlの新しいEGM2BulletKit培地と交換し、接着性の細胞がコンフルエントになるまで、培養を続けた。血管内皮細胞の増殖に適した本培養方法によって、培養21日後には骨髄単核細胞から血管内皮前駆細胞のみが選択的に増殖した。それらの細胞は、4パラホルムアルデヒド固定後、CD31、およびVEcadherinに対する免疫染色の陽性反応を確認することによって、ならびに、細胞固定前に培養液にDiIによりラベルしたアセチル化LDLを添加し、その取り込み能を細胞内のDiIの蛍光により確認することによって、血管内皮前駆細胞と同定した。==骨髄由来血管内皮前駆細胞培養上清の回収==播種後21日目に、骨髄由来血管内皮前駆細胞の培養液を吸引し、細胞を1mlのMHM培地DMEMF12、glucose、glutamine、sodiumbiocarbonate、HEPES、insulin、transferrin、progesterone、sodiumselenate、purescine、MurayamaetalJournalofNeuroscienceResearch698378472002で洗浄した後、1mlのMHMを加え、さらに24時間培養を続けた。その後、この培地を回収し、これを0.45μmのフィルターでろ過し、血管内皮前駆細胞培養上清EPC-CMとした。必要に応じ、使用時まで-20°Cで保存した。==骨髄由来血管内皮前駆細胞培養上清の調製==上記回収されたEPC-CMを、AmiconUltra15centrifugefilterdevices10KNMWL、UFC9010、Millipore社を用いて、2380×g、30分間遠心してろ過し、フィルター上に残留した培養上清をピペットで回収した。これによりEPC-CMは約45倍濃縮された。これを濃縮EPC-CMとし、必要に応じて使用まで-20°Cで保存した。==マウス脳への注入装置の設置==マウス脳室への濃縮EPC-CMの注入は、AlzetBrainInfusionKit30008851、Alzet社、およびAlzetosmoticpump1007D、Alzet社を用いて行った。まず、この注入装置のカテーテルチューブを2cmの長さに切り、一端を脳注入用カニューレに、もう一端をAlzetpumpflowmodulatorに接続し、これらの接続点をシアノアクチレート接着剤でそれぞれ接着した。さらに、脳注入用カニューレに、0.5mm厚の深度調節用スペーサーを取り付け、シアノアクチレート接着剤で接着した。これにより、3mmであったカニューレチューブの深度が25mmに調節された。Alzetosmoticpumpに濃縮EPC-CM、あるいは、αMEM担体、対照を満たした。適当な長さに切った残りのカテーテルチューブを用い、このニードルの先をAlzetpumpflowmodulatorの開放側に接続して、注入装置にシリンジ内の濃縮EPC-CM、あるいは同様に濃縮したαMEM対照を注入した。その後、シリンジと、シリンジに接続されたカテーテルチューブを取り外し、Alzetflowmodulatorの開放側にAlzetosmoticpumpを接続した。マウスC57BL6J、オス、8週齢を吸入麻酔4イソフルランで導入し、0.35l分N2O、0.15l分O2で麻酔を維持し、保温パッド上で固定具を設置した。眼のやや後方から切開し、頭蓋骨を露出させた。その後、スパチュラを用いて頭蓋骨に結合している骨膜性結合組織を取り除いた。次にマウスの背側の肩中心部に皮下ポケットを作成し、このポケットに浸透流ポンプを挿入した。なお、この浸透流ポンプには脳注入用カニューレチューブに繋がるカテーテルチューブに接続している。頭蓋骨計測点のブレグマおよびラムダを決定し、さらに、これらの点を参考にして脳注入用カニューレの挿入位置を決定したブレグマを起点にし、前後方向に0mm、内外方向に-1.2mm、背腹方向に-2.3mm。この位置において、電気ドリルを用いて頭蓋骨に1mm程度の穴を開けた。頭蓋骨を乾燥させ、穴の周囲にシアノアクチレート接着剤を数滴滴下した。脳注入用カニューレを穴から挿入し、このカニューレが接着剤により定位置で接着された後、カニューレを保持するために使用していたタブを切除し、頭皮を縫合した。固定具から取り外したマウスを麻酔から回復させた後ケージに戻し、濃縮EPC-CMあるいは濃縮αMEM培地を毎時0.5μlの速度でAlzetosmoticpumpで注入しながら、7日間飼育を続けた。==BrdUによる分裂細胞の標識とBrdU標識された分裂細胞の検出==これらのマウスに対し、以下に詳細に説明するように、BrdUを投与して、神経幹細胞及びその子孫細胞を検出した。神経幹細胞から産生された分裂能を持つ子孫細胞は増殖速度が速く、神経幹細胞は増殖速度が遅いことが知られている。BrdUは、投与中に新たに合成されたDNAに取り込まれるため、投与中にDNA合成が行われた細胞を標識するが、このBrdU標識細胞は、BrdUを取り込んだ細胞が分裂を繰り返すうちに希釈される。従って、増殖速度が速い子孫細胞においては、BrdU投与からより短い期間で標識細胞は希釈され、増殖速度の遅い神経幹細胞においては、より長い期間BrdU標識が保持される。この事実を利用し、図1に示す様にBrdU短期群、BrdU-短期1d群、BrdU長期群の各スケジュールでBrdU投与を行うことにより、神経幹細胞及びその子孫細胞を個別に検出したFDoetschICailleDALimJMGarciaVerdugoAAlvarezBuyllaSubventricularzoneastrocytesareneuralstemcellsintheadultmammalianbrainCell97703716CMMorsheadCGCraigDvanderKooyInvivoclonalanalysesrevealthepropertiesofendogenousneuralstemcellproliferationintheadultmammalianforebrainDevelopment12522512261参照。すなわち、BrdU短期群、およびBrdU-短期1d群では、BrdUを一度投与し、増殖速度の速い子孫細胞のみを標識して検出した。一方、BrdU長期群では、BrdUを長期投与し、その間にDNA合成した子孫細胞および神経幹細胞を共に標識したが、その後、BrdU非投与期間を設けることにより、標識された子孫細胞が希釈され、標識された神経幹細胞のみを検出した例えば、KawaguchietalMolecularCellNeuroscience172592732001参照。以下に、実験方法を具体的に説明する。まず、0.007NのNaOHを含む0.9NaCl1mlあたり25mgのBrdUB5002、Sigma社を溶解してBrdUストック溶液を調製した。脳に注入装置を設置してから計14日間、マウスに水200mlあたり8mlのBrdUストック溶液を加えて調製した飲料水を与え、その後1週間、BrdUを含まない通常の飲料水を与えた図1、BrdU長期群、濃縮EPC-CM投与と濃縮αMEM投与のそれぞれn=7。または、注入装置設置7日後、体重1gあたりの投与量が50μgになるように、上記BrdUストック溶液を腹腔内注射した後、3時間飼育を続けた図1、BrdU短期群、濃縮EPC-CM投与と濃縮αMEM投与のそれぞれn=3。あるいは、注入装置設置7日後、吸入麻酔4イソフルランで導入し、0.35l分N2O、0.15l分O2、1.5イソフルランで麻酔を維持によりマウスを麻酔し、注入装置設置の際の縫合部位を切開した。ここで、注入装置のチューブを切断した後、注入カニューレチューブに接続した切断面をシアノアクリレート接着剤を用いて閉鎖し、切開部位を再び縫合した。その次の日、体重1gあたりの投与量が50μgになるように、上記BrdUストック溶液を腹腔内注射した後、3時間飼育を続けた図1、BrdU-短期1d群、濃縮EPC-CM投与n=4、濃縮αMEM投与n=5。ここで、BrdU投与の3時間後に屠殺したBrdU短期群、およびBrdU-短期1d群では、BrdU投与の時点でDNA合成した細胞、すなわち増殖速度の速い子孫細胞のみが標識される。BrdU長期群では、14日間のBrdU投与期間にDNA合成した子孫細胞および神経幹細胞が共に標識されるが、この標識細胞のうち、増殖速度が速い子孫細胞においては、BrdU投与終了後1週間で細胞分裂により分配され、標識細胞は希釈される。一方、標識細胞のうち、増殖速度の遅い神経幹細胞においては、BrdU投与終了後1週間経過してもBrdU標識は保持される。このようにしてBrdUを投与されたマウスにおいて、マウスの組織固定法に従って組織固定を行い、以下のようにしてBrdU標識された分裂細胞を検出した。まず、カニューレチューブを頭蓋骨から取り外し、続いて、脳組織を頭蓋骨から単離し、凍結組織切片を作製した。この切片を1NHClで30分間、37°Cでインキュベートした後、免疫組織化学的染色法に従い、標識を行った。この際、ブロッキングバッファーとして10正常ロバ血清含有PBSを用い、一次抗体として抗BrdUヒツジ抗体20BS17、Fitzgerald社、500倍希釈、二次抗体として、AlexaFluor568標識抗ヒツジIgGロバ抗体A21099、MolecularProbes社、1000倍希釈を用いて、BrdUを検出した。また、封入剤は、PermaFluorMountingMediumLabvisioncorp社を用いた。作成された冠状断凍結切片85枚のうち、10枚毎に8枚を選択した。Hoechest33258にて染色される細胞の核を指標に、側脳室周囲の細胞が密集する側脳室下帯を計数の対象領域として、濃縮EPC-CMまたはαMEM注入側のBrdU標識細胞を、蛍光顕微鏡を用いて計数した。各群の、濃縮EPC-CM投与とαMEM投与におけるBrdU標識細胞数についてt検定により統計処理した。図2に示すように、BrdU長期群では、濃縮EPC-CMを注入した群において、側脳室周囲で、濃縮αMEM注入群に比較してBrdU標識細胞数が有意に多かった。これは、濃縮EPC-CMを注入した群で神経幹細胞が増加したことを示す。一方、BrdU短期群では、濃縮αMEM注入群に比較して濃縮EPC-CMを注入した群で、BrdU標識細胞数が有意に少なかった。これは、濃縮EPC-CMを注入した群で子孫細胞が少ないことを示す。また、BrdU短期-1d群では、濃縮αMEM注入群に比較して濃縮EPC-CMを注入した群において、BrdU標識細胞数が有意に多かった。これは、濃縮EPC-CMの注入を終了してから1日経った群において、子孫細胞が多いことを示す。以上の結果は、濃縮EPC-CMの注入によって、側脳室周囲の神経幹細胞の自己複製が促進されること、および、子孫細胞を産生する非対称分裂が抑制されることを示している。加えて、濃縮EPC-CM注入を終了してから1日後には、自己複製により増加した神経幹細胞が分裂し、子孫細胞数が増加することも示している。このように、EPC-CMには、神経幹細胞の自己複製を促進する効果を有する物質が含有されている。そして、神経幹細胞の自己複製による増加の結果、神経幹細胞の子孫細胞数も増加する。実施例2本実施例では実施例1で回収されたEPC-CMが、invitroで神経幹細胞の自己複製を促進することを示す。==骨髄間質細胞培養上清の調製==骨髄由来血管内皮前駆細胞の培養上清EPC-CMの比較対照として、骨髄由来血内皮前駆細胞と同様に骨髄由来で増殖因子を分泌する骨髄間質細胞の上清MSC-CMを調製した。まず、以下のように、骨髄間質細胞を培養した。実施例1と同様に、成体マウスC57BL6J、オス、8~10週齢、n=2の粉砕骨溶液を遠心分離して得られた細胞ペレットをαMEM/FBSに再懸濁した。さらに、生細胞計数法に従い、16エリアにおける生細胞を計数した。なお、計数に際し、10μlのトリパンブルーに対して、40μlの細胞懸濁液を混合した。次に、この細胞懸濁液の細胞密度を5×106細胞/mlの濃度で、実施例1に記載のフィブロネクチンコーティング6ウェルプレートにおいてαMEM/FBS培地に播種し、5CO2、37°Cで培養した。播種後24時間後、7日後、および14日後に3mlの新しいαMEM/FBS培地と交換し、細胞がコンフルエントに達するまで、培養を続けた。初代培養細胞がコンフルエントに達した後、細胞をPBSで洗浄し、1mlのトリプシン/EDTA0.25を加えて約15分間37°Cで処理した。その後、10mlのαMEM/FBSで細胞を洗浄し、酵素反応を停止させた。セルスクレーパー541070、Greiner社で細胞を掻き取り、ピペットを用いて50ml遠心管に移した。280×gで8分間遠心し、上清を除去した後、細胞ペレットを2mlαMEM/FBSに再懸濁した。ここで得られた細胞懸濁に含まれる生細胞数を、生細胞計数法に従って計数し、新しい培養皿に約8000細胞/cm2の密度で播種し、継代培養を行った。上記継代培養後に細胞がコンフルエントに達した後、実施例1と同様にして骨髄間質細胞培養上清Bonemarrowstromalcellconditionedmedium、MSC-CMを回収した。==マウス胎仔由来ニューロスフェアアッセイ==大脳半球の線条体から単離した細胞をinvitroで浮遊培養することにより、神経幹細胞および神経前駆細胞からなる浮遊細胞塊ニューロスフェアを形成させることができる。以下に、EPC-CMで培養することにより継代培養後のニューロスフェアの形成率を増加させることができることから、神経幹細胞の自己複製を促進させる物質がEPC-CMに含まれていることを示す。まず、妊娠成体マウスICRE14、メスから、子宮を摘出し、氷冷したPBSG0.6v/vグルコース含有PBSの入った10cmディッシュに入れた。クリーンベンチ内で、子宮から摘出した同腹8胎仔の頭部を単離し、これを氷冷したPBSGの入った新しい10cmディッシュに入れた。実体顕微鏡下で、各頭部において頭蓋骨と眼球部の間で左右対称に皮膚と頭蓋骨を切開し、さらに脳組織を開いて側脳室を露出させた。この側脳室内腔に認められる灰色の線条体を眼科用ハサミおよびピンセットを用いて単離し、氷冷したPBSGの入った新しい10cmディッシュに入れた。このように単離された脳組織を800μlのMHMの入った遠心管に移し、ピペッティングによって粉砕した。ここで、生細胞計数法を用いて細胞を計数した。このようにして得られた細胞を、20ng/mlbFGFPeprotech社と20ng/mlEGF共に最終濃度を添加したMHMを含む75cm2フラスコに2×105細胞/mlの密度で播種し、5CO2、37°Cで培養した。播種後3日目ごろにニューロスフェアの形成が認められ、播種後7日目にはニューロスフェアのほとんどは直径100μm以上の大きさに達した。こうして得られたニューロスフェア初代ニューロスフェアを用いて、EPC-CMとMSC-CMが神経幹細胞の自己複製に与える効果を調べた。具体的なニューロスフェアアッセイの手順を図3に示す。本アッセイでは、初代ニューロスフェアの1回目の継代後に様々な条件下で培養を行い、2回目の継代後に至適条件で培養を行った。継代1回目フラスコ内の初代ニューロスフェアを遠心管に移し、400rpmで5分間遠心した。上清を除去し、細胞ペレットに2mlMHMを加えてニューロスフェアを再懸濁した。ピペッティングにより、ニューロスフェアを粉砕し、細胞懸濁液を調製した。数分間、この懸濁液を静置することにより、残った細胞塊を沈下させ、単細胞のみを含む上澄み部分1.5mlを新しい遠心管に移した。さらに、細胞塊を含む下層に1.5mlのMHMを加え、再びピペッティングにより細胞塊を粉砕した。これを2分間静置し、この上澄み1.5mlを1回目に回収した上澄みに混合した。ここに2mlMHMを加え、800rpmで5分間遠心した。上清を吸引除去し、細胞ペレットに1mlMHMを加えて細胞を再懸濁した。ここで、生細胞計数法に従って細胞数を計数し、EPC-CMあるいはMSC-CMを用いて細胞密度を15×104細胞/3mlに調製し、6ウェルプレート3471UltraLowCluster、Coster社に播種した。ニューロスフェア形成率の解析用には、細胞密度を2000細胞/200μlに調製し、96ウェルプレート3474UltraLowCluster、Coster社にEPC-CM、MSC-CMを用い、それぞれ36ウェル播種した。ここで、増殖因子添加群のウェルEPC-CM、MSC-CM、それぞれ18ウェルには、20ng/mlbFGFと20ng/mlEGF共に最終濃度を添加し、5CO2、37°Cで培養した。播種後3日目ごろから二次ニューロスフェアの形成が認められた。継代2回目さらに、6ウェルプレートに播種した二次ニューロスフェアを、継代1回目と同様に継代した。細胞数を計数した後に得られた細胞ペレットを、20ng/mlbFGFと20ng/mlEGF共に最終濃度を添加したMHM/初代培養ニューロスフェアの培養上清1:1に再懸濁し2000細胞/200μlの細胞密度に調製した。これを96ウェルプレートに播種し、5CO2、37°Cで10日間培養した。ニューロスフェア形成率の解析上記1回目あるいは2回目の継代後の培養で得られた、各ウェルにおける直径が50μmより大きなニューロスフェアを計数した。計数した三次ニューロスフェア数の、播種した細胞数に対する百分率をニューロスフェア形成率とした。ニューロスフェアは、それぞれ一個の神経幹細胞に由来する、自己複製した神経幹細胞と神経前駆細胞からなる細胞塊であり、ニューロスフェアの培養の至適条件下では、播種した細胞中に含まれていた神経幹細胞がそれぞれニューロスフェアを形成する。本実施例における2回目継代後の培養条件は、ニューロスフェア培養の至適条件であるので、そのニューロスフェア形成率は、1回目継代後の培養条件で得られた二次ニューロスフェアに含まれていた神経幹細胞の割合を表す。すなわち、1回目継代後の培養条件で神経幹細胞の自己複製が促進された場合は、2回目継代後の三次ニューロスフェアの形成率が上昇する。図4に示すように、1回目の継代後増殖因子GFを含むEPC-CMで培養した群EPC-CMGF群とEPC-CMで培養した群EPC-CM群では増殖因子GFを含むMSC-CMで培養した群MSC-CMGF群とMSC-CMで培養した群MSC-CM群に比較してそれぞれニューロスフェア形成率が有意に高かったt検定。また、図5に示すように、1回目の継代後にMSC-CMで培養した群と比較し、1回目の継代後にEPC-CMで培養した群では、三次ニューロスフェアの形成率が有意に高かったt検定。これらの結果は、EPC-CMで培養することにより神経幹細胞の自己複製が促進されることを示している。この自己複製は、添加した増殖因子以外の有効物質によって促進され、MSC-CMには含まれず、EPC-CMにのみ含有されている有効物質が存在していることがわかる。実施例3本実施例では、EPC-CMに含まれる神経幹細胞の自己複製促進物質が、既知の増殖因子以外の物質であることを示す。上記実施例1および2で得られたEPC-CMとMSC-CMに含まれる増殖因子bFGF、EGF、VEGF、BDNFの含有量をELISA法により調べた。測定にはQuantikineFGFbasicDFB50、QuantikineEGFMEG00、QuantikineVEGFMMV00、QuantikineBDNFDBD00RD社のELISAキットを使用し、製造者の使用説明書に記載の方法に従った。図6に示すように、EPC-CMとMSC-CMにはBDNF以外の各増殖因子が含まれている。実施例1、2において神経幹細胞の自己複製促進効果が示されたEPC-CMでより多く含まれるのはbFGFおよびEGFであった。そこで、これらの増殖因子に対する抗体AntibasicFGF、AntiEGFをそれぞれ最終濃度10μg/mlと20μg/mlをEPC-CMに加えることによって各因子を中和し、実施例2に記載のニューロスフェアアッセイを行った。なお、対照群には、20ng/mlbFGFと20ng/mlEGF共に最終濃度を添加したMHMを用いた。図7に示すように、抗体添加EPC-CM群EPC-CM抗GFにおける2回継代後の三次ニューロスフェア形成率は、抗体無添加のEPC-CMより低かったものの、増殖因子添加MHM群MHMGFより有意に高かったt検定。この結果は、EPC-CMには既知の増殖因子以外にも神経幹細胞の自己複製促進物質が含まれていることを示す。実施例4本実施例では、EPC-CMに含まれる神経幹細胞自己複製促進タンパク質であるECF-Lを単離する。==蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動==蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動財団法人化学物質評価研究機構安全性評価技術研究所に委託、試験番号937-07-P-1022によって、EPC-CMには含まれるが、MSC-CMには含まれない物質を検索した。以下に具体的な実験法を説明する。本実施例で用いた試薬および入手先尿素、ジチオスレイトールDTT、ファーマライト、グリセロール、ラウリル硫酸ナトリウムSDS、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩Tris、Cy-DyeはGEヘルスケアバイオサイエンス社、3dimethylammonio1propanesulfonateCHAPS、ヨードアセトアミドは同仁化学、リジンはシグマ社、酢酸、蟻酸精密分析用は和光純薬、メタノールHPLCグレードは和光純薬工業、トリプシンはプロメガ社、マルチプルアフィニティーリムーバルスピンカートリッジ、Ms-3はアジレントテクノロジー社、SyproRubyはMolecularProbes社より、それぞれ購入した。サンプルの前処理および標識反応マルチプルアフィニティーリムーバルスピンカートリッジを用いて、サンプルEPC-CM、および、MSC-CM中のアルブミン、IgG、トランスフェリンをアジレント社の提供しているプロトコールに従って除去した。除去処理後のタンパク質溶液に対して2倍量の冷アセトンを添加した後にディープフリーザー-80°Cで1時間保持し、析出したタンパク質を20000×gで20分間遠心した。沈降物をプロテアーゼインヒビターを添加したLysisBufferLBで溶解したものを解析用サンプルとした。タンパク質濃度については、濃縮処理後LBに再溶解したサンプルのタンパク質濃度をブラッドフォード法に従って定量した。処理後のEPC-CMとMSC-CMの両サンプルをタンパク質量として等量ずつ混合したものをプールサンプルとした。タンパク質100μg当り200pmolのCy-DyeDMF溶液、1μlを添加後氷上にて30分間静置した。反応終了後に過剰量のリジン溶液10mM溶液、1μlを添加して10分間保持し反応を終了し、最後に等量の2×サンプルバッファー8Mウレア、4wvCHAPS、20mg/mlDTT、2vvファーマライトを添加してさらに10分間氷上に保持した。プールサンプルをCy2で、EPC-CMをCy3、MSC-CMをCy5でラベルした。ラベリング効率は、SDS-ポリアクリルアミドゲルにて泳動したゲルイメージの各レーンの平均蛍光強度で確認した。二次元電気泳動二次元電気泳動を、以下の条件に従って、3枚のゲルにおいて行ったトリプリケート。各200μgのサンプルを展開した。一次元目電気泳動は、MultiphoreIIGEヘルスケアバイオサイエンス社、およびIPGImmobilizedpHGradientStrips24cm、pI3-10、GEヘルスケアバイオサイエンス社を用い、サンプルはカップローディングホルダーから添加した。フォーカシングは、トータルで40kVh行った。泳動後、平衡化溶液50mMTris、pH8.8、6Mウレア、30グリセロール、2SDSに0.25wvDTTを添加したA液及び同様に4.5wvヨードアセトアミドを添加したB液に対して各々10分間ずつ平衡化を行った。二次元目電気泳動は、平衡化終了後、EttanDALTIIシステムGEへルスケアバイオサイエンス社および12均一ゲルを用いて二次元目のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。泳動は、3W15°C一定で泳動先端が完全に溶出するまで約15時間行った。電気泳動後のゲルは、直ちにTyphoonアマシャムバイオサイエンス社にて画像の取り込みを行ったCy2:励起480nm、蛍光530nm;Cy3:励起540nm、蛍光590nm;Cy5:励起625nm、蛍光680nm。取り込んだゲル画像をTIFFファイルに変換後、DecyderDIAソフトアマシャムバイオサイエンス社を用いて、取り込んだ画像のスポット認識、ノイズデータのフィルタリングおよび同一ゲル内の各スポットにおけるCy色素間でのスポットボリュームの比較により定量解析を行った。また、DecyderBVAソフトアマシャムバイオサイエンス社を用いてゲル間のスポットマッチングおよび統計解析を行った。図8に二次元電気泳動ゲルのイメージを示す。この図中に示されるスポットは、上記のように取り込まれたMSC-CMを示す蛍光の強度と、EPC-CMを示す蛍光の強度とを標準化対数度数standardizedlogabundanceで表した値の比MSC-CM/EPC-CM比が1/4より小さいp<0.01スポットである。ここに示される各スポットについて、3枚のゲルから得られたMSC-CM/EPC-CM値平均、検定結果のp値を表1に示す。表中、MSC-CM/EPC-CM値に関しては、DecyderBVAソフトに従い、x分の一を-xと表示している。==質量分析によるスポット中のタンパク質の同定==上記二次元ディファレンスゲルの方法に従い、同条件下で600μgのタンパク質を含むサンプルを泳動した。泳動後、固定化液メタノール10、酢酸7に室温で30分浸漬してタンパク質を固定化した。固定化後、200mlのSyproRuby液モレキュラープローブ社中に室温で3時間浸漬した。染色が終了したら、脱色液メタノール10、酢酸7で余分な染色液を洗った。MasterImagerアマシャムバイオサイエンス社を用いてSyproRubyの励起波長480nmおよび蛍光波長620nmで画像を取得した。染色後に解析用のゲルに対してDecyderBVAソフトアマシャムバイオサイエンス社を用いてマッチングし、上記図8および表1の1302番のスポットをスポットピッカーEttanSpotPicker、アマシャムバイオサイエンス社でピッキングした。得られたゲルプラグは、各ゲルあたり0.1μgのトリプシンプロメガ社で酵素消化30°C、一晩した後にnanoLC-ESI-MScap-LCウォーターズ社、Q-Tofmicroマイクロマス社を用いて解析した。LCおよびMSの分析条件を以下に示した。LC条件:カラム:PepMap10075μmID×15cm、3μm、100Å、SN31817カラム温度:室温移動相:A液95/5水/アセトニトリル0.1蟻酸B液5/95水/アセトニトリル0.1蟻酸流速:2.5μL/分グラジェント条件:表2MSの条件:MS測定はMasslynxソフトウェアマイクロマス社のサーベイモードで行った。キャピラリー電圧:3300Vコーン電圧:45VCollisioninduceddissociationCIDガス:アルゴンコリジョンエネルギー:2535eVデータベース検索MSMS解析により得られたデータは、MassLynxマイクロマス社によりデコンボリューション処理を行った。得られたピークリストファイルpklファイルをMascotマトリックスサイエンス社を用いてNCBInrおよびSwiss-Protのデータベースに対して検索を行った。修飾に関する検索条件は、カルバミドメチル化とメチオニンの酸化を標準とした。Swiss-Prot検索結果およびNCBInr検索結果をそれぞれ表3および4に示す。どちらの検索においても、7種のペプチドが検出結果として示され、これらのアミノ酸配列から相当するタンパク質が同定された。なお、下記表3および4におけるトータルスコアは統計的な確率に基づいて計算され、異なるタンパク質がランダムヒットにより同定される確率Pの場合のスコアは-10 ́log10Pで表示される。スコアがより高いほど信頼性が高い。以上の結果は、EPC-CM特異的に含まれるタンパク質が分子量約45kDaのECF-Lであることを示している。実施例5本実施例では、実施例4で同定されたECF-Lが、神経幹細胞自己複製促進物質であることを示す。==ECF-L組換えタンパク質の調製==マウスChitanase3like3ECF-LをコードするcDNAが挿入されたpDNR-LIBベクターを有する大腸菌DH10BTonA30298306、imaGenes社をクロラムフェニコール30mg/mlで100エタノールに希釈選択LB培地に播種し、37°Cで培養した。翌日、コロニーをピックアップし、さらにクロラムフェニコール選択LB液体培地で一晩振盪培養した後、QIAprepSpinMiniprepKitを用いてプラスミドを回収した。ここで得られたプラスミドを、pLPCMVMycAcceptorVectorカタログ番号631603、Clontech社に導入するため、反応液蒸留水、7.5μl;10×CreReactionBufferClontech社、2μl;10×BSA、2μl;200ngDonorVector、7.0μl200ngAcceptorVector、0.5μlCreRecominaseClontech社、1μlを調製した。これを、室温で15分インキュベートした後、5分間70°Cに加熱して反応を停止させた。この反応液1μlを用い、DH5αコンピテント細胞に混合し、15分間氷上でインキュベートした後、42°Cで30秒ヒートショックを与え、さらに2分間氷上でインキュベートすることにより形質転換を行った。このDHαコンピテント細胞を、クロラムフェニコール選択LB培地に播種して一晩培養した。培養後、得られたコロニーのうち大きなコロニーをピックアップし、下記プライマーを用いたコロニーPCRによってプラスミドの組換えを確認した。CMV-F:GCTCACCGTCTTTCATTGCC配列番号2CMV-R:TGTATCTTATCATGTCTGGATC配列番号3このようにして組換えが確認されたコロニーについて、QIAprepSpinMiniprepKitQiagen社を用いてプラスミドを回収し、インサートDNAのシークエンスを確認した。タンパク質発現用細胞のトランスフェクションに先立ち、この所望のプラスミドをQIAprepSpinMaciprepkitQiagen社を用いてスケールアップした。トランスフェクション前日、10cmのPoly-o-コーティングディッシュあたり15~25×105個のHEK293T細胞を播種した後、5CO2、37°Cで一晩培養し、50~80コンフエルエントに達した。800μlの培地Opti-MEMを滅菌チューブに入れ、ここに18μlのGeneJuiceTransfectionRegentNovagen社を加えた。これをボルテックスで懸濁し、5分間インキュベートした。ここに、6μgのプラスミドDNAを加え、ピペッティングにより混合した。その後、5~15分室温でインキュベートし、上記HEK293T細胞に滴下した。5CO2、37°Cで24時間インキュベートした。その後、トランスフェクションミクスチャーを除去し、MHMトランスフェリン無添加で3回洗浄したのち、新たなMHMトランスフェリン添加/無添加を1ウェルにつき1mlを加えた。==ウエスタンブロット法によるECF-L組換えタンパク質の検出==得られたECF-L遺伝子導入HEK293T細胞の培養上清にECF-Lが分泌されていることを確認するため、ウエスタンブロット法によりECF-L遺伝子導入HEK293T細胞の培養上清に含まれるECF-Lを検出した。まず、ECF-L遺伝子導入HEK293T細胞の培養上清1mlを回収し、AmiconUltra4CentrifugalFilterDevicesを用いてろ過することにより濃縮した。この濃縮培養上清をサンプルとして、1レーン当たり700ngのタンパク質をSDS-ポリアクリスアミドゲルにおいて電気泳動を行い、分離されたタンパク質をPVDF膜にブロットした。ブロッティング後、膜を5スキムミルクTBSTTween20添加Tris緩衝生理食塩水に希釈を用いて室温で1時間ブロッティングし、抗マウスECFLラットモノクローナル抗体MAB2446、RDsystems社、250倍希釈を用いて室温で1時間、あるいは、4°Cで一晩インキュベートした。その後、膜を5~10分TBSTで洗浄し、ホースラディシュペルオキシダーゼ標識抗ラットIgGヤギ抗体JacksonImmunoResearch社、5000倍希釈で室温で1時間インキュベートした。膜を再びTBSTで洗浄した後、ECLPlusWesternBlottingDetectionSystemを用いてシグナルを検出した。図9に示すように、45kDa付近において、抗ECF-L抗体で検出される特異的バンドが検出された。一方、同様の工程により蛍光蛋白質のvenusを発現させた対照遺伝子導入群、および、pDNR-LIBベクターによるpLPCMVMycAcceptorVectorの組換えを行わず、その他の工程を同様に行った非遺伝子導入群においては、このバンドが検出されなかった。この結果は、トランスフェクトされたHEK293T細胞が組換えECF-Lを発現し、このECF-Lが培養上清に分泌されていることを示している。==マウス胎仔由来神経幹細胞自己複製におけるECF-Lの効果==以下、組換えECF-Lが、神経幹細胞の自己複製に対する促進効果があることを検証した。まず、実施例2に記載のマウス胎仔由来ニューロスフェアアッセイを行った図3参照。この際、1回目の継代の後、6ウェルプレート9.6cm2の各ウェルにおいて、ECF-L組換えタンパク質を含有するMHMRcECF-L、EPCCM、ECF-L枯渇EPC-CM、あるいは、MHM3mlに10~15×104細胞を含むように調製して播種した。なお、ECF-L組換えタンパク質を含有するMHMには、本実施例のECF-L組換えタンパク質の調製に従って得られたECF-L発現HEK293T細胞の培養上清を用いた。ECF-L枯渇EPC-CMは、実施例1で14日間培養された骨髄由来血管内皮前駆細胞EPCにxtremeGENEsiRNATransfetionReagent04476093001、Roche社を用いて下記のsiRNAを導入し、その後1週間培養した後に回収した培養上清である。なお、siRNAはSigmaGenosyssiRNAserviceで作製した。Sensestrand5’GAUCAAGUUCAACGGUUUUUC配列番号4Antisensestrand5’AAAACCGUUGAACUUGAUCUU配列番号5図10に示すように、RcECF-L群、EPC-CM群でのみ1回目の継代後の二次ニューロスフェアの形成が認められた。一方で、ECF-L枯渇EPC-CM群、および、MHM群ではニューロスフェアが形成されなかった。n=12。EPC-CM群ではニューロスフェア形成が認められ、ECF-L枯渇EPC-CM群ではニューロスフェア形成が認められなかったこと、および、RcECF-L群においてニューロスフェア形成が認められたことは、ECF-Lがニューロスフェア形成に作用することを示す。さらに、図11に示すように、三次ニューロスフェアの形成率は、RcECF-L群およびEPC-CM群で同程度に高く、増殖因子添加MHM群MHMGFに比較して有意に高かったt検定。==成体マウス由来神経幹細胞自己複製におけるECF-Lの効果==ここでは、組換えECF-Lが、成体の線条体から得られた神経幹細胞の自己複製促進効果を有することを検証する。まず、成体マウスC57BL6J、オス、8~10週齢を、ジエチルエーテルを用いて麻酔した後、断頭、もしくは、頚椎脱臼することにより屠殺した。このマウスをアルコール消毒した後、頭皮を、首から眼窩まで切開し、さらに頭蓋骨を切開した。頭蓋骨をはがし取り、露出した脳組織を氷冷したPBSGに維持した。線条体を眼科用ハサミおよびピンセットで単離し、これを新しい氷冷PBSGに維持した。この線条体を遠心管に移し、PBSGをトリプシン溶液トリプシンT1005、Sigma社40mg、ヒアルロニダーゼH6254、Sigma社20mg、kynucreicacid6mgを30mlMHMに溶解し、フィルター滅菌に交換し、ピペッティングによって組織を粉砕した。37°Cで15分間消化した後、再びピペッティングによって組織を粉砕した。ここにトリプシン阻害剤溶液TrypsininhibitorT2011Sigma社8.4mgを12mlMHMに溶解し、フィルター滅菌を加え、600rpmで5分間遠心した。上清を除去した後、ペレットに5mlのトリプシン阻害剤溶液を加え、ピペッティングにより再懸濁した。600rpmで5分間遠心し、上清を除去し、ペレットを1mlのMHMに再懸濁した。ここで、生細胞計数法に従い、細胞を計数した。このようにして得られた細胞を、20ng/mlbFGFPeprotech社と20ng/mlEGF共に最終濃度を添加したMHMを含む75cm2フラスコに3000~5000細胞/mlの密度で播種し、5CO2、37°Cで培養した。約1週間で、ほとんどの初代ニューロスフェアは直径100μm以上の大きさに達した。この初代ニューロスフェアを、実施例2と同様に継代し、6ウェルプレート9.6cm2の各ウェルにおいて、ECF-L組換えタンパク質を加えたMHMRcECF-L、あるいは、増殖因子添加MHM3mlに10~15×104細胞を含むように調製して播種し、5CO2、37°Cで7日間培養した。ここで得られた二次ニューロスフェアを400rpmで5分間遠心した後、ペレットを回収し、上清を0.45μmフィルターでろ過した。ペレットにろ過した上清ろ過培地2mlを加え、ピペッティングによって二次ニューロスフェアを粉砕し、細胞懸濁液を調製した。数分間、この懸濁液を静置することにより、残った細胞塊を沈下させ、単細胞のみを含む上清部分1.5mlを新しい遠心管に移した。さらに、細胞塊を含む下層に1.5mlのろ過培地を加え、再びピペッティングにより細胞塊を粉砕した。これを2分間静置し、この上澄み1.5mlを1回目に回収した上澄みに混合した。ここに2mlのろ過培地を加え、800rpmで5分間遠心した。上澄みを吸引除去し、細胞ペレットに1mlの20ng/mlbFGFと20ng/mlEGF共に最終濃度を添加したMHM/初代培養ニューロスフェアの培養上清1:1を加えて細胞を再懸濁した。生細胞計数法に従い細胞数を計数した後、二次ニューロスフェアを構成する細胞をMHM-CM培地を用いて2~8×106細胞/mlの密度に調製した。この細胞懸濁液に、2μg/mlPropidiumIodideSigma社を加え、死細胞を標識した。この懸濁液において、FACSで生細胞を分離し、以下のシングル細胞培養に用いた。このようにして得られた生細胞を、96ウェルプレートの各ウェルに1細胞ずつ播種し、1ペニシリンG、硫酸ストレプトマイシン、および20ng/mlbFGFと20ng/mlEGF共に最終濃度を添加したMHM/初代培養ニューロスフェアの培養上清1:1において、5CO2、37°Cで10日間培養した。細胞を播種したウェルの数に対して、直径が50μmより大きなニューロスフェアが形成されたウェルの数の百分率を、ニューロスフェア形成ウェル率とした。図12に示すように、1回目の継代後にECF-L組換えタンパク質を含有するMHMで培養した群RcECF-Lでは、増殖因子添加MHM群MHMGFと比較してニューロスフェア形成ウェル率が高かった。なお、シングル細胞の上記条件下の培養では一定の割合の神経幹細胞がニューロスフェアを形成することが知られるため、上記ニューロスフェア形成ウェル率は、上記生細胞における神経幹細胞率を相対的に示している。本実施例における以上の結果は、ECF-Lが、マウス胎仔および成体マウスから得られた神経幹細胞の自己複製促進効果を有することを示す。従って、このECF-Lは神経幹細胞の自己複製促進のための促進剤、医薬組成物などに用いることができ、さらに、この医薬組成物は神経細胞の機能不全に起因する疾患の治療のために用いることができる。実施例6本実施例では、神経幹細胞が存在する海馬および脳室下帯においてECF-Lが局在しており、ECF-Lが生理的に神経幹細胞に作用している可能性があることを示す。==GFP標識細胞移植マウスの作製==CAG-EGFPマウスから、前述の骨髄由来細胞の単離法に基づいて骨髄細胞を取得した。この骨髄細胞を、レシピエント個体C57BL/6J、オス、8~10週齢あたり2×106細胞ずつ移植した後、レシピエント個体を10.5Gyの放射線に曝露した。その後、4週間以上飼育した。未処理の成体マウスC57BL/6J、オス、8~10週齢、あるいは、前記のようにGFP標識骨髄由来細胞を移植されたマウスについて、前述のマウスの組織固定法、および、凍結切片作成法に従ってマウス脳の冠状断凍結切片を作成した。次に、前述の免疫組織化学的染色法に従い、各タンパク質の標識を行った。この際、ブロッキングバッファーとして10正常ヤギもしくはロバ血清含有PBSを用いた。ECF-Lの検出のため、一次抗体として抗マウスECF-Lラットモノクローナル抗体MAB2446、RDsystems社、50倍希釈または抗マウスECF-Lヤギ抗体AF2446、RD社、1000倍希釈を用いた。CD31の検出のため、一次抗体として抗マウスCD31ラット抗体550274、BDBiosciences社、10倍希釈を用いた。なお、CD31は血管内皮細胞に局在することが知られる。また、GFAPGlialfibrillaryacidicproteinの検出のため、一次抗体として抗GFAPマウスモノクローナル抗体G3893、SigmaAldrich社、100倍希釈を用いた。なお、このGFAPマウスモノクローナル抗体により、側脳室の脳室下帯では、神経幹細胞を検出することができる。また、アクアポリン4AQP4の検出のため、一次抗体として抗アクアポリン4ウサギ抗体AB3594、Millipore社、200倍希釈を用いた。AQP4は脳において、血管周囲のアストロサイトの突起終末に特に局在し、局在部位における脳血液関門の存在を示すことが知られる。なお、二次抗体として、AlexaFluor488標識抗ラットIgGヤギ抗体A11006、MolecularProbes社、500倍希釈、AlexaFluor488標識抗ヤギIgGロバ抗体A11055、MolecularProbes社、500倍希釈、AlexaFluor350標識抗マウスIgGヤギ抗体A11045、MolecularProbes社、500倍希釈、AlexaFluor350標識抗ウサギIgGヤギ抗体A11046、MolecularProbes社、500倍希釈、AlexaFluor633標識抗ヤギIgGロバ抗体A21100、MolecularProbes社、500倍希釈を適宜使用し、CD31についてはTyramideSignalAmplificationによるシグナル増強を行った。また、必要に応じ、Hoechst33258により核の対比染色を行った。図13に示すように、海馬において、CD31の局在する血管内皮細胞でECF-Lの局在が認められたA~J、矢印。さらに、図14に示すように、側脳室の脳室下帯では、CD31Bの局在する血管内皮細胞の、特にGFAPC、図中moGFAP陽性の神経幹細胞が接触している部位にECF-Lが共局在していたA~E。さらに、側脳室の脳室下帯および脈絡叢において、CD31GおよびECF-LFが共局在する血管内皮細胞で、脳血液関門のマーカーであるAQP4Hの局在は認めらなかったF~J、矢印ことから、脈絡叢におけるECF-Lは、脳血液関門の存在しない血管内皮細胞で発現していると考えられる。また、図15に示すように、CD31が局在するGFPで標識された骨髄由来血管内皮細胞において、ECF-Lの発現が認められたA~D、矢じり。GFPで標識された骨髄由来血管内皮細胞は、GFP標識骨髄細胞がレシピエントに移植された後にできた新生血管であるため、新生血管にECF-Lが発現していることが理解できる。一方、図16に示すように、大脳皮質においては、骨髄由来細胞とCD31が局在する血管内皮細胞において、移植された骨髄由来の新生血管であることを示すGFPの標識、ならびに、ECF-Lの局在は認められなかったA~C。このように、ECF-Lは、海馬および脳室下帯において、新生血管内皮細胞で特異的に発現している。海馬および脳室下帯は、主に神経幹細胞が存在する領域であり、この発現パターンは、生理的にも、ECF-Lが神経幹細胞に作用していることを裏付けるものである。実施例7本実施例では、ECF-Lをinvitroで作用させて調製したニューロスフェアが、高効率で神経細胞に分化することを示す。実施例5の成体マウス由来神経幹細胞自己複製におけるECF-Lの効果の記載に従って成体マウスから単離した線条体の細胞から初代ニューロスフェアを調製しn=8、継代を1回行った。この1回目の継代の後、6ウェルプレート9.6cm2の各ウェルにおいて、ECF-L組換えタンパク質を含有したMHMRcECF-L群、増殖因子20ng/mlbFGFと20ng/mlEGFを加えたECF-L組換えタンパク質含有MHMRcECF-LGF群、EPCCMEPC-CM群、ECF-L枯渇EPC-CMに増殖因子を加えたMHMECF-L枯渇EPC-CMGF群、あるいは、増殖因子を加えたMHMMHMGF群のいずれか3mlに10~15×104細胞を含むように調製して播種し、5CO2、37°Cで7日間培養した。なお、ECF-L枯渇EPC-CMは実施例5の記載に従い調製した。また、ECF-L組換えタンパク質含有MHMには、実施例5のECF-L組換えタンパク質の調製に従って得られたECF-L発現HEK293T細胞の培養上清を用いた。次に、得られた二次ニューロスフェアについて、実施例5の成体マウス由来神経幹細胞自己複製におけるECF-Lの効果の記載に従って、細胞塊の粉砕、細胞数の計数を行い、さらに1細胞ずつ96ウェルプレートに播種して、三次ニューロスフェアを形成させた。この三次ニューロスフェアを、polyLornithineとfibronectinでコーティングされたチャンバースライドにおいて、1FBS添加MHMに1×104細胞/mlの密度で播種し、5CO2、37°Cで培養し、分化させた図3参照。培養開始から4日後に培地を除去し、細胞を4パラホルムアルデヒドにより固定した。固定された細胞を、前述の免疫組織化学的染色法に従い標識した。この際、ブロッキングバッファーとして10正常ヤギ血清含有PBSを用いた。βIII-チューブリンの検出のため、一次抗体として、抗マウスβIII-チューブリンマウスモノクローナル抗体T8660、SigmaAldrich社、1000倍希釈、二次抗体として、AlexaFluor555標識抗マウスIgGヤギ抗体A11031、MolecularProbes社、1000倍希釈を用いて免疫組織化学的染色を行った。また、O4の検出のため、一次抗体として、抗O4マウスモノクローナル抗体MAB345、Millipore社、1000倍希釈、二次抗体として、AlexaFluor488標識抗マウスIgMヤギ抗体A21042、MolecularProbes社、500倍希釈を用いた。GFAPの検出のため、一次抗体として抗GFAPウサギ抗体Z0334、Dako社、2000倍希釈、二次抗体として、AlexaFluor350標識抗ウサギIgGヤギ抗体A21068、MolecularProbes社、500倍希釈を用いた。なお、βIII-チューブリンは、幼若神経細胞に局在し、O4はオリゴデンドロサイトに局在し、GFAPはアストロサイトに局在することが知られる。定量的解析のため、顕微鏡下で5視野についてβIII-チューブリン陽性細胞、O4陽性細胞、GFAP陽性細胞を計数した。図17に示すように、三次ニューロスフェアを培養して分化させた細胞において、1回目の継代後の培地によって、βIII-チューブリン陽性細胞、O4陽性細胞、GFAP陽性細胞の分化が異なっていた。RcECF-L群A~D、RcECF-LGF群E~H、EPC-CM群I~Lでは、MHMGF群Q~Tと比較して、βIII-チューブリン陽性細胞の割合が高く、GFAP陽性細胞の割合が低かった。一方、ECF-L枯渇EPC-CMGF群では、βIII-チューブリン陽性細胞およびGFAP陽性細胞の割合はHMHGF群と同程度であった。一方、全ての群において、O4陽性細胞の割合に相違は認められなかった。このように、1回目の継代後の培養においてECF-LあるいはEPC-CMを作用させることによって、三次ニューロスフェアから分化させた細胞の神経細胞への分化率を高めることができる。培養条件下では、時間と共に非対称分裂によってグリア前駆体が分化する傾向が強くなるが、この結果は、ECF-LあるいはEPC-CMが非対称分裂およびそれに伴うグリア前駆体への分化を抑制し、自己複製を促進する結果として、分化後の神経細胞の割合が増えることを示している。実施例8本実施例では、ECF-Lがinvivoでも、神経幹細胞の自己複製を促進する効果を有すること、並びに、脳室にECF-Lが注入されたマウスの線条体から得られた神経幹細胞は、高効率で神経細胞に分化することを示す。まず、実施例1のマウス脳への注入装置の設置に従ってマウス脳室にECF-Lを注入するための注入装置を設置し、実施例5で調製され、約45倍に濃縮されたECF-L組換えタンパク質含有MHMを毎時0.5μl注入しながら、7日間飼育したn=5。なお、対照群のマウスには、濃縮ECF-L含有MHMの代わりに、同容量の濃縮MHMを注入した。ECF-L組換えタンパク質含有MHMと培地の濃縮は、AmiconUltra15centrifugefilterdevices10KNMWL、UFC9010、Millipore社を用い、2380×g、30分間、遠心ろ過して行った。続いて、実体顕微鏡下で、各頭部において頭蓋骨と眼球部の間で左右対称に皮膚と頭蓋骨を切開し、さらに脳組織を開いて側脳室を露出させた。この側脳室内腔に認められる灰色の線条体を眼科用ハサミおよびピンセットを用いて単離し、氷冷したPBSGの入った新しい10cmディッシュに入れた。このように単離された脳組織を800μlのMHMの入った遠心管に移し、ピペッティングによって粉砕した。ここで、生細胞計数法を用いて細胞を計数した。このようにして得られた細胞を、polyLornithineおよびfibronectinでコーティングされたチャンバースライドにおいて、1FBS添加MHMに1×104細胞/mlの密度で播種し、5CO2、37°Cで培養した。この培地には、新たに増殖した細胞を標識するために1μMBrdUを加えた。培養開始から4日後に培地を除去し、細胞を4パラホルムアルデヒドにより固定した。次に、固定された細胞を1NHClで30分間、37°Cでインキュベートした後、免疫組織化学的染色法に従い、標識を行った。この際、ブロッキングバッファーとして10正常ヤギ血清含有PBSを用い、一次抗体として抗BrdUヒツジ抗体20BS17、Fitzgerald社、500倍希釈、二次抗体として、AlexaFluor568標識抗ヒツジIgGロバ抗体A21099、MolecularProbes社、1000倍希釈を用いて、BrdUを検出した。また、同じ試料におけるβIII-チューブリンの局在を調べるため、一次抗体として、抗マウスβIII-チューブリンマウスモノクローナル抗体T8660、SigmaAldrich社、1000倍希釈、二次抗体として、AlexaFluor555標識抗マウスIgGヤギ抗体A11031、MolecularProbes社、1000倍希釈を用いて免疫組織化学的染色を行った。なお、βIII-チューブリンは、幼若神経細胞のマーカーであることが知られている。定量的解析のため、顕微鏡下で5視野についてBrdU陽性細胞、および、βIII-チューブリン陽性細胞を計数した。図18に示すように、ECF-L注入群RcECF-Lでは、対照群MHMと比較して、より多くのBrdU陽性細胞が認められたB、D、E。βIII-チューブリンは幼若神経細胞を標識し、BrdUは新生細胞を標識するから、βIII-チューブリン陽性A、CかつBrdU陽性B、Dである細胞は、新生した幼若神経細胞である。このような新生幼若神経細胞の、全新生細胞に対する割合全BrdU陽性細胞に対する二重陽性細胞の割合は、ECF-L群において対照群よりも有意に高かったF。このように、invivoにおいても、ECF-Lは非対称分裂およびそれに伴うグリア前駆体への分化を抑制し、神経幹細胞の自己複製を促進することで神経幹細胞数を増加させる効果を有する。さらに、ECF-Lを作用させた神経幹細胞では、神経細胞への分化率も上昇する。