"試験被験者における注意欠陥多動性障害attentiondeficithyperactivitydisorder:ADHDを発症するリスクの上昇を検出する方法であって、a前記被験者から核酸試料を取得する工程および前記試料がADHD関連コピー数多型CNVの存在を示す少なくとも1つのインフォーマティブSNPを含有するか否かを判定する工程であって、前記SNPが検出された場合に前記患者がADHD発症のリスクの上昇を有し、前記SNP含有核酸が表13に提供されるものから成るSNPの群から選択されるものである、前記判定する工程を有する方法。請求項1記載の方法において、前記標的核酸は検出前に増幅されるものである方法。請求項1記載の方法において、前記SNPの存在を検出する工程が特異的ハイブリダイゼーションの検出、アレルサイズの測定、制限断片長多型解析、アレル特異的ハイブリダイゼーション解析、単一塩基プライマ伸長反応、および増幅ポリヌクレオチドの配列決定から成る群から選択される過程を使用して行われるものである方法。請求項1記載の方法において、前記標的核酸はDNAである方法。請求項1記載の方法において、前記SNPを含む核酸はヒト試験被験者の単離細胞から取得されるものである方法。神経シグナル伝達および/または神経細胞形態を改変する治療剤を同定する方法であって、a請求項1記載の少なくとも1つのCNV含有核酸を発現する細胞を提供する工程と;b工程aのCNV含有核酸に対応する同種の野生型配列を発現する細胞を提供する工程と;c工程aおよびbの細胞を試験薬剤と接触させる工程と;d前記薬剤が工程aの細胞の神経シグナル伝達および/または形態を工程bの細胞と比較して改変するかどうかを分析する工程であって、これにより神経シグナル伝達および形態を改変する薬剤を同定するものである、前記分析する工程とを有する方法。請求項6記載の方法において、前記薬剤はmGluRポジティブアロステリックモジュレータpositiveallostericmodulators:PAM、mGluRネガティブアロステリックモジュレータnegativeallostericmodulator:NAM、およびタキキニン-3/ニューロキニン-3受容体TACR3/NK3Rアンタゴニストから成る群から選択されるものである方法。請求項7記載の方法において、前記mGluRPAMはAMN082、ADX63365、ADX50938、およびADX71149から成る群から選択されるものである方法。請求項7記載の方法において、前記mGluRNAMはLY341495およびADX48621から成る群から選択されるものである方法。請求項7記載の方法において、前記TACR3/NK3RアンタゴニストはGSK1144814およびSB223412タルネタントから成る群から選択されるものである方法。請求項6記載の方法において、前記治療剤はADHDまたは他の関連神経発達障害の治療に効力を有するものである方法。ADHDの治療を必要とする患者におけるADHDを治療する方法であって、請求項6によって同定された薬剤の有効量の投与を有するものである方法。請求項12記載の方法において、前記薬剤は代謝型グルタミン酸受容体遺伝子の活性を調節するものである方法。多重SNPパネルであって、ADHD関連CNVの存在について情報を与える核酸を有し、前記パネルは表13に提供される核酸を含有するものである方法。請求項14記載のSNP含有核酸の少なくとも1つを有するベクター。請求項15記載のベクターを有する宿主細胞。請求項14記載のADHD関連SNP含有核酸を有する固体支持体。請求項1記載の方法を行うためのキットであって、単離された核酸試料中でのADHD関連CNVの存在について情報を与える核酸を有する多重SNPパネルを有し、前記パネルは表13に提供される核酸を含有するものであるキット。請求項18記載のキットにおいて、前記パネルは固体支持体に固定されているものであるキット。請求項18記載のキットにおいて、前記パネルはインシリコで提供されるものであるキット。ADHD関連コピー数多型の存在を示す少なくとも1つの一塩基多型singlenucleotidepolymorphism:SNPを有すると判定されたヒト被験者において、注意欠陥多動性障害attention-deficithyperactivitydisorder:ADHDを治療する方法であって、前記少なくとも1つのSNPは表13に示されるSNPから成る群から選択され、表1に示される薬剤の少なくとも1つの治療的有効量を前記ヒト被験者に投与する工程を有するものである方法。ADHD関連コピー数多型の存在を示す少なくとも1つの一塩基多型SNPを有すると判定されたヒト被験者において注意欠陥多動性障害attention-deficithyperactivitydisorder:ADHDを治療する方法であって、前記少なくとも1つのSNPは表13に示されるSNPから成る群から選択され、ピラセタム系向知性剤の少なくとも1つの治療的有効量を前記ヒト被験者に投与する工程を有するものである方法。請求項21または22記載の方法において、前記SNPは代謝型グルタミン酸受容体5GRM5、代謝型グルタミン酸受容体7GRM7、代謝型グルタミン酸受容体8GRM8の少なくとも1つの欠失である方法。請求項21または22記載の方法において、前記SNPは代謝型グルタミン酸受容体1の重複である方法。請求項21または22記載の方法において、前記向知性剤はピログルタミドである方法。請求項25記載の方法において、前記ピログルタミドは-5-オキソ-D-プロリンピペリジンアミド1水和物NS-105である方法。本発明により、ADHDの診断および治療のための方法が提供される。例示的な方法は、標的ポリヌクレオチド内で少なくとも1つのCNVの存在を検出することを伴い、前記CNVsが存在する場合、前記患者はADHDを発症するリスクが高い。本発明の一観点において、注意欠陥多動性障害ADHDを発症する傾向を、これを必要とする患者において検出する方法が提供される。例示的な方法は、標的ポリヌクレオチドにおいて少なくとも1つのSNPを含む核酸の存在の検出を伴い、前記SNPはADHD関連コピー数多型CNVの存在について情報を与え、前記SNPが存在する場合、前記患者はADHDを発症する高いリスクを有し、前記SNPを含有する核酸は、表13に提供される。本発明の別の実施形態において、神経シグナル伝達および/または形態を変化させる薬剤を同定する方法が提供される。このような方法は、本発明のADHD関連CNVsを含む少なくとも1つの核酸を発現する細胞を提供する工程工程aと、CNVが欠失した同種の野生型配列を発現する細胞を提供する工程工程bと、各試料由来の細胞を試験薬剤と接触させる工程と、前記薬剤が工程aの細胞の神経シグナル伝達および/または形態を工程bの細胞と比較して改変するかどうかを分析して、これにより神経シグナル伝達および形態を改変する薬剤を同定する工程とを含む。好ましい実施形態において、前記試験薬剤は代謝型グルタミン酸受容体mGluR遺伝子活性を調節する。別の実施形態において、前記試験薬剤は、mGluRポジティブアロステリックモジュレータpositiveallostericmodulators:PAMたとえばmGluR5PAM、mGluR7PAM、mGluRネガティブアロステリックモジュレータnegativeallostericmodulator:NAMたとえばmGluR2/3NAM、およびタキキニン-3/ニューロキニン-3受容体TAC3/NK3Rアンタゴニストから成る群から選択される。別の実施形態において、前記試験薬剤は、ADX63365、ADX50938、ADX71149、ADX48621、AMN082、1-ヘテロアリール-3-アミノ-ピロリジン誘導体たとえば米国特許出願2008/0300266号で提供されているもの、LY341495、GSK1144814、およびSB223412から成る群から選択される。ADHD患者を治療する方法であって、これを必要とする患者において本明細書に記載する方法を使用して同定された試験薬剤の投与によってADHD患者を治療する方法も、本発明に含まれる。本発明は、表13に挙げた群より選択される、少なくとも1つの単離されたADHD関連SNP含有核酸も提供する。一実施形態において、表13からのインフォーマティブSNPsすべてを含有する多重SNPパネルが提供される。ADHD関連CNVsの存在を示すこのようなSNP含有核酸は、神経細胞中での発現のための好適な発現ベクターに選択的に含有されることができる。または、これらは固形支持体に固定化することができる。なお別の代案において、パネルはインシリコで提供することができる。本発明のなお別の観点により、以下に記載するようなADHD関連コピー数多型の存在を示す少なくとも1つの規定された一塩基多型を有すると判定された患者において、患者にピラセタム系向知性剤の少なくとも1つのメンバの治療的有効量を投与することにより、ADHDを治療する方法が提供される。本方法は試験および治療のパラダイムを提供し、このパラダイムにより、患者の遺伝的プロフィールを使用して、ADHDを示す個人に見出される特異的な神経生理学的欠陥を標的とする治療剤による治療をパーソナライズする。このような試験および治療モデルは、非パーソナライズ治療よりも高い効力および少ない副作用で、ADHD患者の最大50に恩恵をもたらす可能性がある。このため、グルタミン酸作動性シグナル伝達の改変を示すいずれの患者も、このような遺伝的改変の存在について試験を行って、次に上に挙げた薬剤などの適切な医薬品によって治療することができる。注意欠陥多動性障害ADHDは、病因が不明である一般的な遺伝性の精神神経障害である。近年、我々は、自閉症における学習、挙動、シナプス伝達および中枢神経系の発達に関与する遺伝子の低頻度変異体の濃縮について報告して1、低頻度遺伝性構造変異体も関連精神神経障害であるADHDの病因で役割を果たす可能性があることを示唆した。この研究を追跡するために、我々は、550,000個のSNPマーカーによって遺伝子型が同定されたヨーロッパ系のADHD症例1,013名および健常小児4,105名のコホートで、全ゲノムCNV研究を実施した。総計でヨーロッパ系のADHD症例2,493名および対照9,222名となる複数の独立したコホートで陽性所見を評価し、各症例-対照コホートには対応プラットフォームで遺伝子型を同定した。我々の結果は、すべての独立コホートにわたって有意に濃縮された代謝型グルタミン酸受容体遺伝子に影響する複数のCNVsを同定したP=2.1×10-9。このうち、GRM5代謝型グルタミン酸受容体5における欠失は、3つの独立コホートにわたる症例10名および対照被験者1名のみで発生したP=1.36×10-6。加えて、GRM7における欠失は症例6名で、GRM8における欠失は症例8名で発生し、どちらも対照の頻度はゼロであった。GRM1は症例8名で重複しており、対照を超えて顕著に濃縮された頻度である。観察された変異体は、定量PCRを使用して実験的に妥当性確認を行った。続いての遺伝子ネットワーク解析によって、対照と比較して、症例ではGRM受容体と相互作用する遺伝子は、CNVsが有意に濃縮されP=4.38×10-10、本研究においてはADHD症例の約10に集団的に影響していることが示された。さらに我々は、GRMsが相互作用遺伝子の高度に連結されたモジュールを調整する重要なハブとして作用して、相互作用遺伝子の多くがCNVsを持ち、シナプスおよび神経生物機能が濃縮されていることを見出した。以下の定義は、本発明の理解を促進するために提供される。I.定義:本発明の目的のために、aまたはan要素は、その要素の1若しくはそれ以上を指す。たとえばcDNAは、1若しくはそれ以上のcDNAまたは少なくとも1つのcDNAを指す。したがって、aまたはan、1若しくはそれ以上および少なくとも1つという用語は、本明細書では互換的に使用できる。含むcomprising、含むincluding、および有するという用語が互換的に使用できることにも留意する。さらに、から成る群から選択される化合物は、2若しくはそれ以上の化合物の混合物すなわち配合物を含む、以下のリスト内の1若しくはそれ以上の化合物を指す。本発明により、単離された、または生物学的に純粋な分子は、その天然環境から除去された化合物である。したがって、単離されたおよび生物学的に純粋なは、化合物が精製された程度を必ずしも反映しているわけではない。本発明の単離された化合物はその天然源から入手することができるか、実験室合成方法を使用して産生できるか、またはこのような化学合成経路のいずれによっても産生できる。遺伝的改変という用語は、本明細書で使用する場合、1若しくはそれ以上の核酸分子の野生型または参照配列からの変化を指す。遺伝的改変は制限なく、既知配列の核酸分子からの少なくとも1つのヌクレオチドの塩基対の置換、付加および欠失を含む。一塩基多型singlenucleotidepolymorphism:SNPは、DNA中の単一の塩基がその位置の通常の塩基とは異なっている変化を指す。このような単一の塩基の変化は、SNPsまたはsnipsと呼ばれる。ヒトゲノムには数百万個のSNPsが記載されている。鎌状赤血球を引き起こすような一部のSNPsは、疾患に関与する。他のSNPは、ゲノムにおける正常な変異であるコピー数多型copynumbervariation:CNVは、個人のゲノムにおける特定の遺伝子またはそのセグメントのコピー数を指す。CNVsは、ヒトの表現型多様性の主要な遺伝的コンポーネントを表す。遺伝的障害に対する感受性は、一塩基多型SNPだけではなく、CNVsを含む構造的および他の遺伝的変異にも関連していることが公知である。CNVは、約1キロベースkb若しくはそれ以上であるDNA断片を包含するコピー数の変化を表すFeuketal.2006a。本明細書に記載するCNVsは、今後のCNV解析の複雑性を最小限に抑えるために、転移性因子たとえば約6kbKpnI反復の挿入/欠失から生じる変異体を含んでいない。ゆえにCNVという用語は、大規模コピー数変異体large-scalecopynumbervariants:LCVs;Iafrateetal.2004、コピー数多型copynumberpolymorphisms:CNPs;Sebatetal.2004、および中型変異体intermediate-sizedvariants:ISVs;Tuzunetal.2005などの以前に導入された用語を含むが、レトロポゾン挿入は含まない。重複含有CNVも、提供したCNVの定義と一致して、以下で使用される。ADHD関連SNPまたはADHD関連特異的マーカーまたはADHD関連情報配列分子は、ADHDを発症するリスクの上昇または低下に関連して、この疾患を有さない通常の患者には見出されない、SNPまたはマーカー配列である。このようなマーカーは、これに限定されるものではないが、核酸、核酸によってコードされたタンパク質、または他の小分子を含む。このため、ADHD関連SNP含有核酸という語句は、上の説明に含まれる。固体マトリックスという用語は、本明細書で使用する場合、ビーズ、微小粒子、マイクロアレイ、微量滴定ウェル若しくは試験管の表面、またはディップスティック若しくはフィルタなどのいずれの形式も指す。マトリックスの材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストラン、またはアガロースである。本質的に~から成るという表現は、特定のヌクレオチドまたはアミノ酸を指す場合、所与の配列ID番号の特性を有する配列を意味する。たとえば、アミノ酸配列に関して使用する場合、この語句は、配列の機能的および新規特徴に影響しない配列それ自体および分子修飾を含む。部分インフォーマティブCNVという語句は、染色体上に重複を含む配列にハイブリダイズする核酸を指すために本明細書で使用するが、部分インフォーマティブCNVは、重複と同一でない可能性があり、むしろCNVは、重複の一部のみに一致する可能性があるが、それでもなおそれについて情報を与える。標的核酸は、本明細書で使用する場合、複合核酸混合物中に存在する核酸の以前に定義された領域を指し、ここで定義された野生型領域は、ADHDに関連する可能性があるが、または関連する可能性がないが、ADHDのリスクについて情報を与える、少なくとも1つの既知のヌクレオチド変異を含有する。核酸分子は、cDNAクローニング若しくはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然源から単離するか、または手動で合成することができる。核酸分子は、トリエステル合成方法によって手動で、またはDNA自動合成装置によって合成することができる。本発明で使用する核酸に関して、単離核酸という語が時折用いられる。この用語は、DNAに適用する場合、DNA分子であって、このDNA分子が由来する生物の自然発生ゲノム内で5’方向および3’方向に直接隣接する配列から分離されるDNA分子を指す。たとえば単離された核酸は、プラスミド若しくはウイルスベクターなどのベクター中に挿入された、または原核生物若しくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれたDNA分子を含む可能性がある。単離された核酸分子は、cDNA分子も含む可能性がある。ベクター中に挿入された、単離された核酸分子は本明細書で場合により、組み換え核酸分子とも呼ばれる。RNA分子に関して、単離された核酸という用語は、上で定義したような単離されたDNA分子によってコードされたRNA分子を主に指す。またこの用語は、RNA分子が実質的に純粋な形で存在するように、RNA分子の自然の状態ですなわち細胞または組織内で結合されているRNA分子から、十分に分離されたRNA分子を指す可能性がある。核酸に関して濃縮という語の使用により、特異的DNAまたはRNA配列が、正常な細胞中または配列が採取された細胞中と比べて、興味のある細胞または溶液中に存在するすべてのDNAまたはRNAを著しく高い割合2~5倍で構成することを意味する。濃縮は、存在する他のDNAまたはRNA量の優先的減少によって、または特定のDNAまたはRNA量の優先的増加によって、または2つの組み合せによって、人為的に引き起こすことができる。しかし、濃縮は、他のDNAまたはRNA配列が存在しないことを意味するのではなく、興味のある配列の相対的な量が著しく増加したことを単に示唆していることに留意すべきである。目的によっては、ヌクレオチド配列は精製形であることも好都合である。核酸に関して精製されたという用語は、均質調製のような完全な純度を要求するのではない。代わりに、この用語は、その配列が自然環境中と比べて比較的純粋である自然レベルと比べて、たとえば、mg/mlで少なくとも2~5倍であるべきであるという指摘を表す。cDNAライブラリから単離された個々のクローンは、電気泳動によって均質になるまで精製することができる。これらのクローンから得られる請求項に係るDNA分子は、全DNAまたは全RNAから直接得ることができる。cDNAクローンは、自然発生はしないが、むしろ部分精製された自然発生物質メッセンジャーRNAの操作によって好ましくは得られる。mRNAからのcDNAライブラリの構築は、合成物質cDNAの生成を包含していて、純粋な個々のcDNAクローンは、cDNAライブラリを運搬する細胞のクローン選択によって合成ライブラリから単離できる。このため、mRNAからのcDNAライブラリの構築および別個のcDNAクローンの単離を含むこの工程によって、未変性メッセージのおよそ10-6倍の精製を生じる。このため、少なくとも1桁分の、好ましくは2桁または3桁分の、およびさらに好ましくは4桁または5桁分の精製が明示的に考えられる。このため、実質的に純粋なという用語は、少なくとも50~60重量の興味のある化合物たとえば核酸、オリゴヌクレオチドなどを含む調製物を指す。さらに好ましくは、調製物は、少なくとも75重量の、および最も好ましくは90~99重量の興味のある化合物を含む。純度は、興味のある化合物に適した方法によって測定する。相補的という用語は、互いに複数の好適な相互作用を形成できる2つのヌクレオチドを示す。たとえば、アデニンおよびチミンは2個の水素結合を形成できるので、アデニンはチミンに対して相補的である。同様に、グアニンおよびシトシンは3個の水素結合を形成できるため、グアニンおよびシトシンは相補的である。このため、核酸配列が以下のチミン、アデニン、グアニンおよびシトシンの塩基配列を含有する場合、この核酸分子の補体は、チミンの代わりにアデニン、アデニンの代わりにチミン、グアニンの代わりにシトシン、およびシトシンの代わりにグアニンを含有する分子である。この補体は、親核酸分子との最適な相互作用を形成する核酸配列を含有できるため、このような補体は、その親分子と高い親和性で結合できる。1本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、特異的にハイブリダイズするという用語は、当分野において一般に使用される所定の条件下で、このようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な場合により実質的に相補的と呼ばれる配列の2個の1本鎖ヌクレオチド分子間の結合を指す。特にこの用語は、オリゴヌクレオチドと本発明の1本鎖DNAまたはRNA分子内に含有されている実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドと非相補的配列の1本鎖核酸とのハイブリダイゼーションの実質的な排除を指す。たとえば、特異的ハイブリダイゼーションは、いずれのADHD特異的マーカー遺伝子または核酸にもハイブリダイズするが、他のヌクレオチドにはハイブリダイズしない配列を指すことができる。また特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本明細書に含まれる表に示すADHD特異的マーカーなどの神経特異的な特異的マーカーのみにハイブリダイズすることができる。様々な相補性の1本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする適切な条件は、当分野で周知である。例として、特定の配列相同性の核酸分子間でハイブリダイゼーションを達成するために必要な厳密性条件を計算するための一般的な式を以下に示すSambrooketal.,MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory1989:Tm=81.5°C16.6Log[Na]0.41GC-0.63ホルムアミド-600/2本鎖中の塩基対の数上の式の例として、[Na]=[0.368]および50ホルムアミドを、42のGC含有率および200塩基の平均プローブサイズと共に使用すると、Tmは57°Cである。DNA2本鎖のTmは、相同性が1低下するごとに、1~1.5°C低下する。このため、配列同一性が約75を超える標的は、42°Cのハイブリダイゼーション温度を使用して観察される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の厳密性は、主に溶液の塩濃度および温度に依存している。一般に、プローブの、その標的によるアニーリングの速度を最大限にするために、ハイブリダイゼーションは通常、計算されたハイブリッドの温度Tmより20~25°C低い塩および温度条件下で行われる。洗浄条件は、標的に対するプローブの同一性度のために可能な限り厳密であるべきである。一般に、洗浄条件は、ハイブリッドのTmよりおよそ12~20°C低くなるように選択される。本発明の核酸に関して、中程度の厳密性ハイブリダイゼーションは、6×SSC、5×デンハルト液、0.5SDSおよび100μg/ml変性サケ精子DNA中、42°Cでのハイブリダイゼーションと定義され、2×SSCおよび0.5SDS中で55°Cにて15分洗浄される。高厳密性ハイブリダイゼーションは、6×SSC、5×デンハルト液、0.5SDSおよび100μg/ml変性サケ精子DNA中、42°Cでのハイブリダイゼーションと定義され、1×SSCおよび0.5SDS中で65°Cにて15分洗浄される。超高厳密性ハイブリダイゼーションは、6×SSC、5×デンハルト液、0.5SDSおよび100μg/ml変性サケ精子DNA中、42°Cでのハイブリダイゼーションと定義され、0.1×SSCおよび0.5SDS中で65°Cにて15分洗浄される。オリゴヌクレオチドという用語は、本明細書で使用する場合、2若しくはそれ以上、好ましくは3を超えるリボまたはデオキシリボヌクレオチドから成る核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、多様な因子およびオリゴヌクレオチドの特定の用途および使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、プローブおよびプライマを含むが、3ヌクレオチドから核酸分子の全長までの任意の長さであることが可能であり、3ヌクレオチドからポリヌクレオチドの全長までの隣接する核酸の考えられるいずれの数も明示的に含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも約10ヌクレオチド、さらに好ましくは長さが少なくとも15ヌクレオチド、さらに好ましくは長さが少なくとも約20ヌクレオチドである。プローブという用語は、本明細書で使用する場合、精製された制限酵素による消化においてのように天然に発生するか、または合成により産生されるかにかかわらずに、プローブに相補的配列を持つ核酸とアニーリングすることができる、またはこの核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはRNA若しくはDNAのどちらかの核酸を指す。プローブは、1本鎖または2本鎖のどちらかである。プローブの正確な長さは、温度、プローブ源、および方法の使用を含む、多くの因子に依存する。たとえば診断用途では、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは通例、15~25若しくはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、このプローブはより少ないヌクレオチドを含有することができる。本明細書のプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に相補的であるように選択される。このことは、プローブが、一連の所定の条件の下でプローブの各標的鎖に特異的にハイブリダイズできるように、またはその標的鎖とアニーリングできるように、十分に相補的でなければならないことを意味する。ゆえに、プローブ配列は、標的の正確な相補的配列を反映する必要はない。たとえば、非相補的ヌクレオチド断片は、プローブの5’または3’末端に結合され、プローブ配列の残りの部分は標的鎖に相補的である。また、プローブ配列が標的核酸と特異的にアニーリングするために標的核酸の配列との十分な相補性を有しているならば、非相補的塩基またはより長い配列をプローブ中に分散させることができる。プライマという用語は、本明細書で使用する場合、生物系に由来する、制限酵素消化によって生成された、または合成的に産生された、RNAまたはDNAのどちらかの、1本鎖または2本鎖のどちらかのオリゴヌクレオチドであって、適正な環境に置かれると、テンプレート依存性核酸合成のイニシエータとして機能的に作用することができるオリゴヌクレオチドである。適切な核酸テンプレート、核酸の好適なヌクレオシド3リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、好適な補因子および好適な温度およびpHなどの条件と共に与えられると、プライマは、ポリメラーゼの作用または同様の活性によるヌクレオチドの添加によって3’末端にて伸長して、プライマ伸長生成物を生じることができる。プライマは、用途の特定の条件および要求事項に応じて長さが変わる可能性がある。たとえば診断用途では、オリゴヌクレオチドプライマの長さは、通例15~25ヌクレオチド若しくはそれ以上である。プライマは、所望の伸長生成物の合成をプライミングするために、すなわちポリメラーゼまたは同様の酵素による合成の開始に使用するためにプライマの3’ヒドロキシル部分を適切な近位に提供するのに十分な様式で、所望のテンプレート鎖によってアニーリングできるようにするために、所望のテンプレートに十分に相補性でなければならない。プライマ配列が所望のテンプレートの正確な補体になることは要求されない。たとえば非相補的ヌクレオチド配列は、それ以外では相補的なプライマの5’末端に結合することができる。また、プライマ配列が所望のテンプレート鎖の配列と十分な相補性を有して伸長生成物の合成のためのテンプレート-プライマ複合体を機能的に提供するならば、非相補的塩基をオリゴヌクレオチドプライマ配列中に分散させることができる。ポリメラーゼ連鎖反応polymerasechainreaction:PCRは、米国特許第4,683,195号明細書、第4,800,195号明細書および第4,965,188号明細書に記載され、その全体の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ベクターという用語は、細胞中に感染、トランスフェクト若しくは形質転換させて、独立して、または宿主細胞ゲノム内で複製することができる、1本鎖または2本鎖環状核酸分子に関する。環状2本鎖核酸分子は、制限酵素による処理時に、切断されることによって線形化することができる。各種のベクター、制限酵素、および制限酵素によって標的とされるヌクレオチド配列の情報は、当業者には容易に利用可能であり、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ若しくはウイルスなどのレプリコンを含み、これに別の遺伝子配列または要素DNA若しくはRNAのどちらかを結合させて、結合配列若しくは要素の複製を引き起こすことができる。ベクターを制限酵素で切断し、2片を共にライゲートすることによって、本発明の核酸分子をベクター中に挿入することができる。当業者は、原核生物若しくは真核生物中への発現構築物の形質転換、トランスフェクション、または形質導入を促進するための多くの技法を利用できる。形質転換、トランスフェクション、および形質導入という用語は、核酸および/または発現構築物を細胞または宿主生物中に挿入する方法を指す。これらの方法は、細胞を高濃度の塩、電場、または界面活性剤で処理して宿主細胞外膜または壁を興味のある核酸分子に対して透過性にすること、微量注入法、PEG融合法などの様々な技術を包含する。プロモータ要素という用語は、適切な細胞内部に入ると、転写因子および/またはポリメラーゼの結合ならびにその後のベクターDNAの一部のmRNA中への転写を促進できる、ベクター中に組み入れられるヌクレオチド配列を表す。一実施形態において、本発明のプロモータ要素はADHD特異的マーカー核酸分子の5’末端の前にあるので、ADHD特異的マーカー核酸分子はmRNA中に転写される。宿主細胞機構は次に、mRNAをポリペプチドに翻訳する。当業者は、核酸ベクターが、プロモータ要素およびADHD特異的マーカー核酸分子以外の核酸要素を含有可能であることを認識するであろう。これらの他の核酸要素は、これに限定されるものではないが、複製起点、リボソーム結合部位、薬剤耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、および分泌シグナル、局在化シグナル、若しくはポリペプチド精製に有用なシグナルをコードする核酸配列を含む。レプリコンは、任意の遺伝要素、たとえばプラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド、ファージまたはウイルスであり、主にそれ自体の制御下で複製可能である。レプリコンは、RNA若しくはDNAのどちらかであり、1本鎖または2本鎖である。発現オペロンは、転写および翻訳制御配列、たとえばプロモータ、エンハンサ、翻訳開始シグナルたとえばATGまたはAUGコドン、ポリアデニル化シグナル、ターミネータなどを所有することができ、宿主細胞または生物中のポリペプチドコード配列の発現を促進する核酸セグメントを指す。本明細書で使用する場合、レポーター、レポーター系、レポーター遺伝子、またはレポーター遺伝子産物という用語は、核酸が、発現された場合に、たとえば生物学的検定法、免疫測定、放射免疫測定、若しくは比色法、蛍光法、化学発光法または他の方法によって容易に測定可能であるレポーターシグナルを産生する産物をコードする遺伝子を含む、操作可能な遺伝子系を意味するものとする。核酸は、RNAまたはDNA、線状または環状、1本鎖若しくは2本鎖、アンチセンスまたはセンス極性のどちらかであり、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御要素に操作可能に連結することができる。必要な制御要素は、レポーター系の性質、およびレポーター遺伝子がDNAまたはRNAの形であるかどうかによって変化するが、これに限定されるものではないが、プロモータ、エンハンサ、翻訳制御配列、ポリA付加シグナル、転写終結シグナルなどの要素を含む。導入された核酸は、受容細胞若しくは生物の核酸中に組み込まれる共有結合される可能性もあるか、または組み込まれない可能性もある。細菌、酵母、植物および哺乳動物細胞において、たとえば導入された核酸をエピソーム要素または独立レプリコン、たとえばプラスミドとして維持することができる。また、導入された核酸は、受容細胞若しくは生物の核酸中に組み入れられ、この細胞若しくは生物中で安定して維持されて、受容細胞若しくは生物の子孫細胞若しくは生物にさらに伝えられるかまたは遺伝する可能性がある。最後に、導入された核酸は、一時的にのみ受容細胞または宿主生物に存在できる。選択可能なマーカー遺伝子という用語は、発現された場合に、形質転換細胞に選択可能な表現型、たとえば抗生物質耐性を付与する遺伝子を指す。操作可能に連結されたという用語は、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現を行うためにコーティング配列に対して適切な位置のDNA分子に位置していることを意味する。この同じ定義は、発現ベクターにおける転写単位および他の転写制御要素たとえばエンハンサの配置にも場合により適用される。組み換え生物またはトランスジェニック生物という用語は、遺伝子若しくは核酸分子の新規組み合せを有する生物を指す。遺伝子若しくは核酸分子の新規組み合せを、当業者に利用可能な多様な核酸操作手法を用いて生物中に導入することができる。生物という用語は、少なくとも1つの細胞から成るいずれかの生き物に関する。生物は、1つの真核細胞のように単純であることも、または哺乳動物のように複雑であることも可能である。ゆえに組み換え生物という語句は、組み換え細胞、ならびに真核生物および原核生物を含む。単離されたタンパク質若しくは単離および精製されたタンパク質という用語が、本明細書で場合により使用される。この用語は主に、本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を指す。またこの用語は、実質的に純粋な形で存在するように、これが自然に結合されるであろう他のタンパク質から十分に分離されているタンパク質を指す可能性がある。単離されたは、他の化合物若しくは物質との人工若しくは合成混合物、または基本的な活性を妨害せず、たとえば、不完全な精製、安定剤の添加、またはたとえば免疫原性調製物若しくは医薬的に許容される調製物中への配合によって存在する可能性がある不純物の存在を排除することを意味しない。特異的結合対は、相互に特定の特異性を有し、通常条件下では他の分子に優先して相互に結合する、特異的結合メンバsbmおよび結合パートナーbpを含む。特異的結合対の例は、抗原および抗体、リガンドおよび受容体ならびに相補的ヌクレオチド配列である。当業者は、多くの他の例を認識している。さらに特異的結合対という用語は、特異的結合メンバおよび結合パートナーのいずれかまたは両方が大分子の一部を含む場合にも適用できる。特異的結合対が核酸配列を含む実施形態において、これらは、アッセイ条件下で相互にハイブリダイズする長さ、好ましくは10ヌクレオチドを超える長さ、さらに好ましくは15または20ヌクレオチドを超える長さである。試料または患者試料または生体試料とは一般に、特定の分子、好ましくはADHD特異的マーカー分子、たとえば以下で説明するマーカーについて試験することができる試料を指す。試料は、これに限定されるものではないが、細胞、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、涙液、胸膜液などを含む体液を含む。薬剤および試験化合物という用語は、本明細書で互換的に使用され、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または細菌、植物、真菌、若しくは動物特に哺乳動物細胞若しくは組織などの生体材料から作製される抽出物を示す。生体高分子としては、siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド/DNA複合体、および本明細書に記載するCNVまたはSNP含有核酸またはそのコードされたタンパク質の活性を調節する能力を呈するいずれの核酸ベース分子も挙げられる。薬剤および化合物は、以下に記載するスクリーニングアッセイへの組み入れによって、潜在的な生物活性について評価される試験薬剤または試験化合物と呼ぶこともできる。調節するという用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載するCNV含有分子またはそれによりコードされるタンパク質の正常な活性に関連する特定の細胞、生物またはシグナル伝達機能の上昇/促進または低下/阻害を指す。たとえば調節するという用語は、試験化合物または試験薬剤が本発明の遺伝子またはタンパク質のシグナル伝達または活性を妨害する能力を指す。II.ADHD発症の傾向を診断するためにADHD関連CNVsおよび/またはSNPsを使用する方法本発明は、患者のADHDを診断する方法またはADHDを発症するリスクが上昇した患者を同定する方法を提供する。診断としては、本明細書で使用する場合、患者における本明細書に記載する遺伝的改変に関連するADHDの初期同定だけでなく、ADHDを有しているまたは有しやすいと以前に同定された患者における確認試験またはスクリーニングも挙げられる。前記方法は、患者からの生体試料を提供する工程と、生体試料、好ましくは組織および/または血液血漿試料中に存在する、特定のセットのまたはありとあらゆるADHD関連マーカー表13の量を測定する工程と、既知の結果の患者コホートで同定されたADHDマーカー発現レベルと比較して判定されたADHDマーカー発現レベルの量および/またはタイプに基づいて、患者が有するADHDの可能性がより高いか否かを判定する工程とを含む。試料が以前にADHDと診断された患者に関連するCNVマーカー発現プロファイルを有する場合に、患者はADHDを有する可能性がより高い。本発明の組成物および方法は、ADHDの予後および診断および管理に有用である。別の態様において、患者試料は以前に遺伝子型が同定されている可能性があり、このため医師が試料の遺伝子発現プロファイルを利用できる。したがって本方法は、参照ADHD関連マーカー配列情報、すなわち本明細書の表に記載されるようなより好ましいまたはより好ましくない予後に統計的に関連するようなCNV、およびコンピュータでの比較遺伝解析の性能をデータベースに格納する工程と、これによりADHDのリスクが上昇した患者を同定する工程とを含む。これに限定されるものではないが、以下に挙げるものを含むADHD関連CNVまたはSNP含有核酸は、本発明による様々な目的のために使用することができる。ADHD関連CNVまたはSNP含有DNA、RNA、またはその断片は、ADHD特異的マーカーの存在および/または発現を検出するプローブとして使用することができる。ADHD特異的マーカー核酸をこのようなアッセイのためのプローブとして利用できる方法は、これに限定されるものではないが、1インサイチュハイブリダイゼーション、2サザンハイブリダイゼーション3ノーザンハイブリダイゼーション、および4ポリメラーゼ連鎖反応PCRなどの各種の増幅反応を含む。さらに、ADHD関連CNVsまたはSNPsを検出するためのアッセイを、これに限定されるものではないが、体液血液、尿、血清、胃洗浄液、脳脊髄液を含む、任意の種類の細胞脳細胞、白血球、単核細胞、母体循環系中の胎児細胞などまたは体組織を含む、いずれの種類の生体試料にも行うことができる。明らかに、本発明のADHD関連CNVまたはSNP含有核酸、これを発現するベクター、ADHDCNVまたはSNP含有マーカータンパク質および抗ADHD特異的マーカー抗体を使用して体組織、細胞、または体液中のADHD関連CNVsまたはSNPsを検出して、ADHDの発症に関与する遺伝子およびタンパク質相互作用を評価する目的で、ADHDCNVまたはSNP含有マーカータンパク質発現を改変することができる。ADHD関連CNVsまたはSNPsをスクリーニングするための大半の実施形態において、試料中のADHD関連CNVまたはSNP含有核酸は、試料中に存在する他の配列と比べてテンプレートの量を増加させるために、たとえばPCRを使用して最初に増幅される。これにより標的配列は、試料中に存在する場合に、高度の感受性で検出されるようになる。この初期工程は、当分野で重要な高感受性アレイ技法を使用することによって回避できる。また、新規検出技術によって、この制限が克服され、わずか1μgの全RNAという少量の試料の分析も可能になる。共鳴光散乱ResonanceLightScattering:RLS技術を使用すると、これまでの蛍光技法とは対照的に、複数回の読取りにより、ビオチン標識ハイブリダイズ標的および抗ビオチン抗体を使用して、少量のmRNAsを検出することができる。PCR増幅のもう1つの別法には、信号対雑音比を上昇させ、バックグラウンド干渉を低減する、平面導波路planarwaveguide:PWG技術が含まれる。どちらの技法もQiagenInc.米国より市販されている。上記の技法のいずれを使用しても、ADHD関連CNVまたはSNPマーカー発現を検出または定量することができ、したがってADHDを診断することができる。III.キットおよび製造品上記の生成物のいずれも、ADHD関連CNV若しくはSNP特異的マーカーポリヌクレオチドまたはGeneChipに固定された1若しくはそれ以上のこのようなマーカー、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、標識、マーカー、リポーター、医薬的に許容される担体、生理学的に許容される担体、使用説明書、容器、投与用管、アッセイ基質、または任意の組み合せを含有することができるキットに組み入れることができる。IV.治療剤開発のためにADHD関連CNVsおよび/またはSNPsを使用する方法本明細書で同定したCNVsおよびSNPsはADHDの病因に関連付けられているため、このようなCNVsおよび/またはSNPsを含有する遺伝子およびそのコード生成物の活性を調節する薬剤を同定する方法によって、この障害の治療に有効な治療剤が生成されるはずである。ヒトゲノムのいくつかの領域によって、治療剤を合理的に設計するために好適な標的が提供される。これらの領域に対応する小核酸分子またはペプチド分子を使用すると、コードされたタンパク質の活性を効果的に調節する治療剤を設計するのに役立つ。分子モデリングによって、機能に必要な立体構造または重要なアミノ酸残基に基づいてCNVまたはSNP含有核酸によってコードされたタンパク質の活性部位に結合する能力を持つ、特異的有機分子の同定が促進されるはずである。コンビナトリアルケミストリー手法の使用により、最大活性を持つ分子が同定され、次にさらなるスクリーニングサイクルのために、このような分子が繰り返して開発されるであろう。このスクリーニングアッセイで利用できるいくつかの分子は、この方法に限定されるものではないが、代謝型グルタミン酸受容体mGluRポジティブアロステリックモジュレータPAM、ネガティブアロステリックモジュレータNAM、およびタキキニン-3/ニューロキニン-3受容体tachykinin-3/neurokinin-3receptor:TACR-3/NK3Rアンタゴニストを含む。詳細なリストは、ADX63365、ADX50938、ADX71149、ADX48621、AMN082,1-ヘテロアリール-3-アミノ-ピロリジン誘導体たとえば米国特許出願2008/0300266号で提供されているもの、LY341495、GSK1144814、およびSB223412表1を含む。表1.コンビナトリアルケミストリー手法で利用できる分子および治療剤薬剤スクリーニングアッセイに用いられるポリペプチドまたは断片は、溶解状態で遊離されていること、固体支持体にまたは細胞内に固定されていることのどちらかが可能である。薬剤スクリーニングの1つの方法は、ポリペプチドまたは断片を発現する組み換えポリヌクレオチドにより安定的に形質転換された真核生物または原核生物宿主細胞を、好ましくは競合結合アッセイで利用する。このような細胞は、生存形または固定形のどちらでも、標準結合アッセイに使用できる。たとえばリペプチドまたは断片と被検薬剤との間での複合体の形成を判定すること、またはポリペプチドまたは断片と既知の基質との間での複合体の形成が被検薬剤により妨害される程度を検査することができる。薬剤スクリーニングの別の技法により、コードされたポリペプチドに好適な結合親和性を有する化合物についての高スループットスクリーニングが提供され、この技法は1984年9月13日に公開されたGeysen、PCT公開出願WO84/03564号パンフレットに詳細に記載されている。簡潔に述べると、上記のものなどの多数の各種の小ペプチド試験化合物を、プラスチックピンまたはその他のある表面などの固体基質上で合成する。ペプチド試験化合物を標的ポリペプチドと反応させて、洗浄する。次に、結合したポリペプチドを当分野で周知の方法によって検出する。薬剤スクリーニングのさらなる技法は、非機能性または改変ADHD関連遺伝子を有する宿主真核細胞株または細胞上記のものなどを使用することを包含する。宿主細胞株または細胞は、ポリペプチドレベルで欠損がある。宿主細胞株または細胞を薬物化合物の存在下で培養する。宿主細胞の改変されたグルタミン酸作動性機能を測定して、化合物が欠損細胞においてこの機能を調節できるか否かを判定する。本発明での使用が考えられる宿主細胞は、これに限定されるものではないが、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および植物細胞を含む。しかし、哺乳動物細胞、特に神経細胞が好ましい。ADHD関連CNVまたはSNPコードDNA分子をこのような宿主細胞中に単独でまたは組み合せて導入すると、このような発現によって与えられる細胞の表現型を評価することができる。DNA分子を導入する方法も当業者に周知である。このような方法はAusubeletal.eds.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,NY,N.Y.1995に示され、その開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。本発明の新規DNA配列を発現するように修飾できる多種多様の発現ベクターが利用できる。本明細書に例示する特異的ベクターは、単に説明のためであって、本発明の範囲を限定することを意図していない。発現方法は、Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManualまたはCurrentProtocolsinMolecularBiology16.3-17.441989によって記載されている。サッカロミセス属における発現方法も、CurrentProtocolsinMolecularBiology1989に記載されている。本発明の実施に使用するための好適なベクターは、原核生物ベクター、たとえばpNHベクターStratageneInc.,11099N.TorreyPinesRd.,カリフォルニア州LaJolla、92037、pETベクターNovogenInc.,565ScienceDr.,ウィスコンシン州Madison、53711、およびpGEXベクターPharmaciaLKBBiotechnologyInc.,ニュージャージー州Piscataway、08854を含む。本発明の実施に有用な真核生物ベクターの例は、ベクターpRc/CMV、pRc/RSV、およびpREPInvitrogen,11588SorrentoValleyRd.,カリフォルニア州SanDiego、92121;pcDNA3.1/V5HisInvitrogen;バキュロウイルスベクター、たとえばpVL1392、pVL1393、またはpAC360Invitrogen;ならびに酵母ベクター、たとえばYRP17、YIP5、およびYEP24NewEnglandBiolabs,マサチューセッツ州Beverly、ならびにpRS403およびpRS413StratageneInc.;ピキア属ベクター、たとえばpHIL-D1PhillipsPetroleumCo.,オクラホマ州Bartlesville、74004;レトロウイルスベクター、たとえばPLNCXおよびpLPCXClontech;ならびにアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターを含む。本発明の発現ベクターで使用するためのプロモータは、原核生物細胞または真核生物細胞中で操作可能であるプロモータを含む。原核生物細胞において操作可能であるプロモータは、ラクトースlac制御要素、バクテリオファージラムダpL制御要素、アラビノース制御要素、トリプトファンtrp制御要素、バクテリオファージT7制御要素、およびそのハイブリッドを含む。真核生物細胞において操作可能であるプロモータは、エプスタインバーウイルスプロモータ、アデノウイルスプロモータ、SV40プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、サイトメガロウイルスcytomegalovirus:CMVプロモータ、AcMNPVポリヘドリンプロモータなどのバキュロウイルスプロモータ、アルコールオキシダーゼプロモータなどのピキア属プロモータ、ならびにgal4誘導プロモータなどのサッカロミセス属プロモータ、およびPGK構成的プロモータならびに神経細胞特異的血小板由来成長因子プロモータplatelet-derivedgrowthfactor:PDGF、Thy-1プロモータ、ハムスターおよびマウスプリオンプロモータmousePrionpromoter:MoPrP、およびグリア細胞における導入遺伝子の発現のためのグリア線維性酸性タンパク質Glialfibrillaracidicprotein:GFAPを含む。加えて、本発明のベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を容易にするいくつかの多様なマーカーのいずれか1つを含有することができる。このようなマーカーは、温度感受性、薬剤耐性に関連する遺伝子、または宿主生物の表現型の特徴に関連する酵素を含む。本発明のADHD関連CNVsおよび/若しくはSNPsまたはその機能性断片を発現する宿主細胞は、ADHDの発症を調節する能力を持つ可能性がある化合物または薬剤をスクリーニングする系を提供する。このため一実施形態において、本発明の核酸分子を使用して、ADHDおよび異常なグルタミン酸作動性機能に関連する細胞代謝の態様を調節する薬剤を同定するアッセイで使用するための組み換え細胞株を作製することができる。CNVおよびSNP含有核酸によってコードされたタンパク質の機能を調節することができる化合物をスクリーニングする方法も提供される。別の手法は、CNVまたはSNP含有核酸によってコードされたポリペプチドの断片をファージ表面に発現するよう設計されたファージディスプレイライブラリの使用を含む。次に、このようなライブラリをコンビナトリアルケミカルライブラリと、発現されたペプチドとケミカルライブラリの構成要素と間の結合親和性が検出できる条件の下で接触させる。米国特許第6,057,098号明細書および第5,965,456号明細書は、このようなアッセイを行うための方法および装置を提供する。合理的な薬剤設計の目標は、たとえばポリペプチドのより高い活性形若しくは安定形である、またはたとえばポリペプチドの機能を生体内で向上させる若しくは妨害する薬剤を構築するために、興味のある生物活性ポリペプチドの、またはそれらが相互作用する小分子たとえばアゴニスト、アンタゴニスト、阻害物質の構造的類似体を産生することである。たとえばHodgson,1991Bio/Technology9:19-21を参照。上で議論した1つの手法において、興味のあるタンパク質の、またはたとえばタンパク質-基質複合体の3次元構造は、x線結晶解析によって、核磁気共鳴によって、コンピュータモデル化によって、または最も典型的には、手法の組み合せによって解析される。頻度は低いが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同性タンパク質の構造に基づくモデリングによって得ることができる。合理的な薬剤デザインの例は、HIVプロテアーゼ阻害剤の開発であるEricksonetal.,1990Science249:527-533。加えて、ペプチドをアラニンスキャンによって解析することができるWells,1991Meth.Enzym.202:390-411。この技法では、アミノ酸残基をAlaで置換して、ペプチドの活性に対するその効果を決定する。この方式でペプチドの各アミノ酸残基を解析して、そのペプチドの重要な領域を決定する。機能アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離して、次にその結晶構造を解析することも可能である。原則として、この手法によってファーマコフォアを得て、続いて薬剤設計はこれに基づいて行うことができる。機能性薬理活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体anti-idiotypicantibodies:anti-idsを生成することによって、タンパク質の結晶解析をすべて回避することができる。anti-idsの結合部位は、鏡像の鏡像として、元の分子の類似体であることが予測される。次にこのanti-idを使用して、化学的または生物学的に産生されたペプチドのバンクからペプチドを同定および単離することができる。選択されたペプチドは次に、ファーマコフォアとして作用する。このため、たとえばポリペプチドの活性若しくは安定性が改善されている、またはポリペプチド活性の阻害物質、アゴニスト、アンタゴニストなどとして作用する薬剤を設計することができる。本明細書に記載するCNVまたはSNP含有核酸配列が利用できることによって、X線結晶解析などの解析的研究を行うために十分な量のコードされたポリペプチドを利用できるようになる。加えて、本明細書で提供するタンパク質配列の情報は、X線結晶解析の代わりに、またはそれに加えて、コンピュータモデルリング技法を用いる人々の指針となるであろう。別の実施形態において、ADHD関連CNVまたはSNP含有核酸が利用できることによって、本発明のADHD関連SNPsまたはCNVsを有する実験用マウス系統を産生できるようになる。本発明のADHD関連CNVまたはSNPを発現するトランスジェニックマウスは、ADHDの発症および進行におけるCNVまたはSNP含有核酸によってコードされたタンパク質の役割を調べるためのモデルシステムを提供する。実験用マウスに導入遺伝子を導入する方法は、当業者に公知である。3つの一般的な方法として、1.興味のある外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターの初期胚への組み込み、2.新たな受精卵の前核へのDNAの注入、および3.遺伝子操作された胚性幹細胞の、初期胚への取り込みが含まれる。上記のトランスジェニックマウスを作製することにより、異常なグルタミン酸作動性機能、改変された向神経活性リガンド受容体シグナル伝達および異常な神経伝達、または改変された神経形態および神経突起伸長を含む多様な細胞代謝過程において標的タンパク質が果たす役割の分子的解明が容易になる。このようなマウスは、全動物モデルで推定治療薬を研究するための生体内スクリーニングツールを提供し、本発明に含まれる。動物という用語は、本明細書では、ヒトを除くすべての脊椎動物を含むように使用する。動物は、胚期および胎仔期を含む、発達におけるすべての期の個々の動物も含む。トランスジェニック動物は、標的組み換えまたはマイクロインジェクションまたは組み換えウイルスによる感染などによる細胞下レベルでの意図的な遺伝子操作によって、直接または間接的に改変または受容された遺伝情報を持つ1若しくはそれ以上の細胞を含有する任意の動物である。トランスジェニック動物という用語は、古典的な異種交配または体外受精を含むことを意図しないが、むしろ1若しくはそれ以上の細胞が組み換えDNA分子によって改変されるまたは組み換えDNAを受容する動物を含むことを意図する。この分子は、定義された遺伝子座を特異的に標的とすること、染色体内に無作為に組み込まれること、または染色体外で複製することができる。生殖細胞系列トランスジェニック動物という用語は、遺伝的改変または遺伝情報が生殖系列細胞に導入されたことにより、この遺伝情報を子孫に伝達する能力が与えられるトランスジェニック動物を指す。このような子孫が実際にその改変または遺伝情報の一部またはすべてを所有する場合、子孫もトランスジェニック動物である。遺伝情報の改変は、レシピエントが属する種にとって外来性であるか、特定のレシピエント個体のみに外来性であるか、またはレシピエントがすでに所有する遺伝情報である可能性がある。遺伝情報の改変がレシピエントがすでに所有する遺伝情報である場合には、改変または導入された遺伝子が未変性遺伝子とは異なって発現される可能性がある。このような改変または外来性遺伝情報は、ADHD関連CNVまたはSNP含有ヌクレオチド配列の導入も含む。標的遺伝子の改変に使用されるDNAは、これに限定されるものではないが、ゲノム源からの単離、単離されたmRNAテンプレートからのcDNAの調製、直接合成、またはその組み合せを含む多種多様の技法によって得ることができる。導入遺伝子の導入に好ましい種類の標的細胞は、胚性幹embryonalstem:ES細胞である。ES細胞は、体外培養された着床前胚から得ることができるEvansetal.,1981Nature292:154-156;Bradleyetal.,1984Nature309:255-258;Gossleretal.,1986Proc.Natl.Acad.Sci.83:9065-9069。導入遺伝子は、DNAトランスフェクションなどの標準的な技術によって、またはレトロウイルス媒介形質導入によって、ES細胞中に効率的に導入できる。得られた形質転換ES細胞はその後、ヒト以外の動物の胚盤胞と組み合せることができる。導入されたES細胞はその後、胚にコロニーを形成して、得られたキメラ動物の生殖系列に寄与する。個々の遺伝子およびその発現産物の寄与を決定する問題に対する手法の1つは、単離したADHD関連CNVまたはSNP遺伝子を挿入カセットとして使用して、全能性ES細胞上記のものなど中の野生型遺伝子を選択的に不活性化し、次にトランスジェニックマウスを作製することである。遺伝子標的トランスジェニックマウスの作製における遺伝子標的ES細胞の使用は、別の箇所にて記載および総説されているFrohmanetal.,1989Cell56:145-147;Bradleyetal.,1992Bio/Technology10:534-539。標的相同組み換えを使用して染色体対立遺伝子に特異的変化を挿入することによって、任意の遺伝子領域を不活性化または改変して所望の突然変異を生じさせる技法を利用することができる。しかし、100に近い頻度で起こる染色体外相同組み換えと比べて、プラスミド-染色体相同組み換えは、当初はわずか10-6~10-3の頻度で検出されることが報告された。プラスミド-染色体非相同相互作用は、比較可能な相同挿入よりも105倍~102倍高いレベルで、より頻繁に起こる。マウスES細胞におけるこのように低い標的組み換え率を克服するために、低頻度の相同組み換えを検出または選択する多様な戦略が開発されてきた。相同改変事象を検出する1つの手法では、ポリメラーゼ連鎖反応PCRを使って、相同挿入について形質転換細胞のプールをスクリーニングして、続いて個々のクローンをスクリーニングする。また、ポジティブ遺伝子選択手法が開発されており、この手法では、相同挿入が起こった場合にのみ活性となり、これらの組み換えが直接選択されるようにするマーカー遺伝子が構築される。相同組み換えを選択するために開発された最も強力な手法の1つとして、改変の直接選択が存在しない遺伝子のために開発されたポジティブ-ネガティブ選択positive-negativeselection:PNS法がある。PNS法は、マーカー遺伝子が独自のプロモータを有するため、高レベルで発現されない遺伝子を標的とする場合に、より効率的である。非相同組み換え体は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼHerpesSimplexvirusthymidinekinase:HSV-TK遺伝子を使用することと、ガンシクロビルgancyclovir:GANCまたは1-2-デオキシ-2-フルオロ-B-Dアラビノフラノシル-5-ヨードウラシルFIAUなどの効果的なヘルペス治療薬によって非相同挿入を不利に選択することによって、不利に選択される。この対抗選択によって、生存する形質転換体中の相同組み換え体の数を増加させることができる。ADHD関連CNVまたはSNP-含有核酸を標的挿入カセットとして利用することにより、たとえばADHD関連CNVまたはSNP核酸によってコードされたポリペプチドに免疫特異的な抗体に対する免疫反応性の獲得によって可視化されるように、挿入が成功したことを検出して、ゆえに所望の遺伝子型を持つES細胞のスクリーニング/選択を容易にする手段が提供される。ノックイン動物とは、本明細書で使用する場合、マウス内在性遺伝子が、たとえば本発明のヒトのADHD関連CNVまたはそのインフォーマティブ断片またはSNP含有核酸で置換された動物である。このようなノックイン動物は、ADHDの発症を研究するための理想的なモデルシステムを提供する。本明細書で使用する場合、ADHD関連CNV若しくはSNP含有核酸、その部分インフォーマティブCNV断片、またはCNVまたはSNPがコードされているADHD関連融合タンパク質の発現は、ADHD関連CNVまたはSNPのすべてまたは一部をコードする核酸配列が、特定の組織または細胞型においてコードされたタンパク質の発現を指示する調節配列たとえばプロモータおよび/またはエンハンサに操作可能に連結されているベクターを使用して、組織特異的方式または細胞型特異的方式で標的にすることができる。このような調節要素は、生体外および生体内用途の両方に役立てるために使用できる。組織特異的タンパク質を指示するためのプロモータは、当分野で公知であり、本明細書に記載されている。本発明のADHD関連CNVまたはSNPをコードする核酸配列は、トランスジェニック動物における発現のために、多様な各種のプロモータ配列に操作可能に連結させることができる。このようなプロモータは、これに限定されるものではないが、米国特許第5,877,399号明細書およびBorcheltetal.,Genet.Anal.1361996159-163ページに記載されている、ハムスターおよびマウスプリオンプロモータMoPrPなどのプリオン遺伝子プロモータ;米国特許第5,612,486号および第5,387,742号明細書に記載されている、ラット神経細胞特異的エノラーゼプロモータ;米国特許第5,811,633号明細書に記載されている、血小板由来成長因子B遺伝子プロモータ;米国特許第5,849,999号に記載されている、脳特異的ジストロフィンプロモータ;Thy-1プロモータ;PGKプロモータ;CMVプロモータ;神経細胞特異的血小板由来成長因子B遺伝子プロモータ;NEGR1プロモータ、GRM5プロモータ、下の表に挙げた任意の遺伝子のプロモータ、ならびにグリア細胞における導入遺伝子の発現のためのグリア線維性酸性タンパク質GFAPプロモータを含む。本発明のトランスジェニックマウスのための使用方法も、本明細書で提供されている。ADHD関連CNV若しくはSNPを含有する核酸またはそのコードされたタンパク質が導入されたトランスジェニックマウスは、たとえば治療剤をスクリーニングしてADHDの発症を調節できる治療物質を同定するためのスクリーニング法を開発するのに有用である。V.医薬品およびペプチド療法本明細書に記載するADHD関連CNVsおよびSNPsが向神経活性リガンド受容体シグナル伝達において果たす役割を解明することによって、ADHDの治療および診断に有用な医薬組成物の開発が容易になる。これらの組成物は、上記の物質の1つに加え、医薬的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知の他の物質を含むことができる。このような物質は、非毒性であるべきで、有効成分の効力を妨害すべきでない。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路、たとえば経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路に依存する。ポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子、または本発明による他の医薬的に有用な化合物のいずれが個人に投与されようと、投与は、好ましくは予防的有効量または治療的有効量場合によっては、予防を療法と見なすことができるであり、これは個人に恩恵を示すのに十分な量である。後述する物質および方法は、以下の実施例の実施を容易にするために提供されている。CNV発見のためのIlluminaInfiniumアッセイ我々は、InfiniumIIHumanHap550BeadChiptechnologyIllumina、カリフォルニア州SanDiegoを使用して、CHOPのCenterforAppliedGenomicsにて高スループットゲノムワイドSNP遺伝子型同定を行った。遺伝子型データ内容は遺伝子型同定アレイによって提供される強度データと共に、CNVコールについて高い信頼性を提供する。重要なのは、同じ実験環境での強度データおよび遺伝子型データの同時分析によって、正常2倍体状態およびその任意の逸脱が高い精度で定義される。CNVsをコールするために、我々は、各SNPマーカーにおけるLogR比LRRおよびBアレル頻度BAlleleFrequency:BAFを含む複数の情報源を組み合せるPennCNVアルゴリズムを、CNVコールを作製するためのSNPスペーシングおよびBアレルの集団頻度と共に用いた。複製患者および対照コホートは、Perlegen600K、Illumina1M、およびAffymetrix5.0アレイを用いて、ゲノムワイドSNP遺伝子型同定を利用した。未加工のXおよびY値をlog10によって正規化し、クラスタ化して、PennCNV-Affyプロトコルを用いてBAFおよびLRRを確立した表2。低頻度反復性CNVsは、我々の研究の焦点であった。表2.AffymetrixPowerTools出力形式に適合させるためのPerlegenデータ再フォーマットファイル試料A遺伝子型コールファイル0=AA、1=AB、2=BB、-1=コールなしB遺伝子型コール信頼性スコアすべて1に設定C強度サマリ-A=log10X、-B=log10YdbGaP単一試料最終レポートファイルからのXおよびY値CNVコールおよび重要な遺伝子座の検討追加のCNV負荷は症例対対照では観察されず、むしろ作製されたコールの分布が高度に比較可能であった図1。我々は、メンデル遺伝パターンを観察することによって、IlluminaおよびPerlegenデータでCNVコール信頼性を確立した。3人組を最初に遺伝子型遺伝によって検証および解析し、観察された遺伝に基づいてIlluminaおよびPerlegenプラットフォームの両方からのCNVコールの品質を確立した。IlluminaCHOPデータから3人組においてコールされたすべてのCNVコールに基づき、子孫において観察された8,647のCNVsが親から遺伝したが、437のCNVsは、デノボ率が4.811である、推定的デノボであった。PerlegenIMAGEデータから3人組においてコールされたすべてのCNVコールに基づき、子孫において観察された1,862のCNVsが親から遺伝したが、505のCNVsは、デノボ率が21.335である、推定的デノボであった。51のIMAGE症例、22の欠失遺伝子座、および5の複製遺伝子座が低いデータ品質のために複数のデノボ事象を有し、域外値として除外された。ひとたび除外されると、785のCNVsが遺伝して、63がデノボであり、これにより観察されたデノボ率は許容可能なレベルの7.429まで低下した。IlluminaCHOPデータからの親において観察されたCNVsに基づき、9,305のCNVsが小児に遺伝したが、7,432のCNVsは遺伝せず、55.595の遺伝率を生じた。PerlegenIMAGEデータからの親において観察されたすべてのCNVsに基づき、2,114のCNVsが小児に遺伝したが、3,789のCNVsは遺伝せず、35.812の遺伝率を生じた。我々は、子孫に遺伝していない20若しくはそれを超えるCNVsを持つ域外値である65の親試料を除外し、これらの試料を除去した結果、1,204のCNVsが小児に遺伝したが、1,221は遺伝せず、49.650の遺伝率が生じ、これによりこのCNVコールセットの信頼性が確立された。すべてのPennCNVコールを検討することは困難であり、サイズ閾値より小さいCNVsを除外することは無駄が多い。代わりに、我々は検出されたすべてのCNVsに基づいて遺伝子座を統計的にスコア化して、これらの名目上関連するCNVR遺伝子座を適切なオーバーラップ、シグナル品質、およびメンデル遺伝について検討した。表3に示すように、報告されたすべての遺伝子座は、親から遺伝したCNVを持つ少なくとも1の症例を示し、このような症例では、両親とも有効であった。表3.ADHD親において過剰発現された新規CNVRsAADHDと有意に関連する遺伝子座B名目上の有意性を持つADHD遺伝子座13に示された症例;‡3症例は同一ファミリ内に存在する;†2症例は同一ファミリ内に存在する;遺伝Inh列は、親からの各CNVの症例への遺伝パターンを形式::で示す。遺伝パーセンテージを以下に示す。親はすべての症例について必ずしも有効ではなかったことに留意する。対照の頻度と比べてADHD症例において反復性であり、濃縮することが観察され、複数の独立コホートで検出された低頻度の変異体について報告する。すべてのGRM遺伝子は、CNVRによって直接影響される。示した領域は、方法に記載するように、症例の最適オーバーラップおよび対照に対する有意性を表す。各CNVR遺伝子座に対して最も近接した遺伝子が示されているのは、この遺伝子が最も影響されると考えられるためである。寄与する各プロジェクトからの詳細な数については、表16を参照。直接影響される遺伝子はないため、最も近い近接遺伝子を示した。個々のCNV境界を表17に与える。OR:オッズ比CI:信頼区間。複製は、組み合せされたIMAGE、PUWMa、IMAGEII、NIMH、およびUtahを表す。合計で症例3,506名および対照13,327名であり、3倍を超える大量の対照試料となり、CNVsが存在しない、または症例試料よりも頻度が低いことが確実に定義される。1試料につき検出されたCNVsの数は70という多さであったが、正常2倍体CN=2コールが実際に推測されるため、各試料が等価となっている。このCNVsはきわめて低頻度であるため、観察されたCNVコールの数はサンプルによって変動する。定量PCRQPCRによるCNV妥当性確認ProbeFinderv2.41ソフトウェアRoche、インディアナ州Indianapolisを使用して、UniversalProbeLibraryUPL;Roche、インディアナ州Indianapolisプローブを選択した。定量PCRは、ABI7500RealTimePCRInstrumentまたはABIPrism商標7900HTSequenceDetectionSystemAppliedBiosystems、カリフォルニア州FosterCityで行った。各試料は、反応混合物25μl250nMプローブ、900nM各プライマ、RocheによるFastStartTaqManProbeMaster、および10ngゲノムDNAまたは反応混合物10μl100nMプローブ、200nM各プライマ、InvitrogenからのROXを含む1×白金定量PCRSuperMix-ウラシル-DNA-グリコシラーゼUracil-DNA-Glycosylase:UDG、および25ngゲノムDNA中で4回ずつ分析した。SequenceDetectionソフトウェアv2.2.1AppliedBiosystems、カリフォルニア州を使用して、値を評価した。ΔΔCT法を使用して、データ分析をさらに行った。COBL、GUSB、およびSNCAから選んだ参照遺伝子を最小変動係数に基づいて含め、次にデータを正常対照を値1に設定することによって正規化した。PerlegenプラットフォームでのCNVコーリングは、Illuminaアレイで使用されたアルゴリズムに良く似たアルゴリズムを使用したが、シグナル前処理は異なる。正規化されたシグナル強度LogR比およびBアレル頻度をBeadStudioソフトウェアから直接エクスポートできるIlluminaプラットフォームとは異なり、Perlegen600Kプラットフォームのこれらのシグナル強度基準は、未加工のXおよびY値に基づいて遺伝子型が同定された試料の収集から計算する必要がある。遺伝子型同定実験で生成された未加工最終レポートファイルからのデータ正規化およびシグナル抽出を行うために、我々は最初に、dbGaPからのデータをAffymetrixPowerTools:birdseed.calls.txt、birdseed.confidences.txt、およびquant-norm.pm-only.med-polish.expr.summary.txtによって産生されたフォーマットに再フォーマットした表2を参照。dbGaPからレポートファイルに基づいて試料中に提供されたXおよびY値を、対数底10を取ることによって、より限定された範囲に縮小した。我々は、次に各SNPマーカーについて、遺伝子型同定したすべての試料でAA、ABおよびBB遺伝子型のアレル特異的シグナル強度に依拠して、Illuminaクラスタリング生成手法に似た極座標シータおよびRに、3つの基準遺伝子型クラスタを構築した。-conf2オプションがgenerate_affy_geno_cluster.plの実行に含まれていたのは、1が最良スコアとしてコードされたためである。基準遺伝子型クラスタが構築されたら、次に我々はnormalize_affy_geno_cluster.plを使用して、各SNPのシグナル強度値をLogR比LRRおよびBアレル頻度BAF値に変換した。さらなる技術詳細事項については、www.openbioinformatics.org/penncnv/penncnv_tutorial_affy_gw6.htmlを参照。隠れマルコフモデルHiddenMarkovModel:HMMを最適化するために、我々は30の3連続バッチにおいて、ベースライン基準ファイルhh550.hmmを使用して、PennCNVの-trainを実行した。最初の訓練ではLRRの標準偏差が最低の試料を使用したが、他の2回の実行には、新たな基準として作成したファイルを使用して、より無作為な典型的試料を含めた。我々は、観察されたPerlegenデータに特異的に適合したCNVコーリングをさらに通知するために、SNP間距離および集団b-アレル頻度を提供する定義ファイルも作成した。これによって、CNVコールが2,789のPerlegen600K試料のうち1,887症例642名および親1,245名で利用できるようになった。LRRの全体の標準偏差は試料の大半84で0.2より低かったが、強度データは、コールされたCNVの領域で著しくノイズが多く、おそらく実験室での処理中のPCR飽和のために、欠失シグナルを識別できないSNPの亜集団を示すことが多かった。それにもかかわらず、欠失および重複特徴は、同じSNPsについてそれぞれ示したホモ接合体およびAAB/ABB遺伝子型の確認によって、なお検出された図2および図3を参照。最後に、PerlegenCNVコールを、CHOPIlluminaデータに基づいて関連する11の遺伝子座とのオーバーラップについてスクリーニングした。シグナル品質をクリアにするために、各CNVコールの基礎を成すSNPレベルデータを検討した。検出された各CNVが真のDNAの特徴であり、決して使用したPerlegen600Kアレイまたは我々によるデータのバイオインフォマティクス操作のアーチファクトでないことを裏付けるために、我々はqPCRを用いて独立研究機関にて各CNVに妥当性確認を行った図4を参照。CNV品質管理我々は、低品質のDNA試料および偽陽性CNVsを除外するために、統計的分布に基づいて我々のHumanHap550GWASデータの品質管理QC基準を計算した。第1の閾値は、正常に遺伝子型が同定された、試行SNPsのパーセンテージである。コールレートが98を超える試料のみを含めた。ゲノムワイド強度シグナルのノイズは、可能な限り少なくなければならない。正規化強度の標準偏差standarddeviation:SDLRRが0.35より小さい試料のみを含めた。すべての試料は主成分分析に基づいてコーカサス民族性を有する必要があり図5、他の試料はすべて除外した。さらに、群間のゲノムインフレーション因子genomicinflationfactor:GIF=1.024を計算することによって、症例および対照マッチングを確保した。低い全長DNA量のハイブリダイゼーションバイアスから生じるGC含有率にほぼ相関する波状アーチファクトは、コピー数多型の正確な推定を妨害することが公知である43。波モデルに対するLRRの波因子が-0.52000g;妊娠中に主要医療事象なし;妊娠中に母親の薬物乱用なしADHDと関連することが公知である単一遺伝子疾患たとえば脆弱X、フェニルケトン尿症、高カルシウム血症、甲状腺ホルモン不応症がないこと。神経疾患および障害たとえば片麻痺および他の脳性麻痺、てんかん、水頭症、脳炎後症候群、運動ニューロン障害などがないこと。自閉症またはアスペルガー症候群、統合失調症、双極性障害、原発性大うつ病エピソード、および不安障害、トゥーレット症候群の基準を満たしていないこと。IMAGEIIの対照使用した対照被験者は、NIMHジェネティクスリポジトリからのAffymetrix6.0遺伝子型同定被験者から抜き取った。被験者は、米国国内代表調査パネルUSNationallyrepresentativesurveypanel1回に成人約60,000名、常時入れ替えありで無作為番号ダイアルを通じて収集した。参加者は、精神病および双極性障害のスクリーニングを行った。対照参加者は、ADHDのスクリーニングを行わなかった。血液試料は、USnationalphlebotomyserviceを通じて収集した。対照参加者は、生体物質がNIMHの判断で医学研究のために使用されることについて、書面による同意を提出した。対照は、Affymetrix6.0アレイを使用して、BroadInstituteNationalCenterforGenotypingandAnalysisにて遺伝子型同定された。遺伝子型コールは、BIRDSUITEパッケージのモジュールである、BIRDSEEDプログラムを用いて作成した。ネットワーク解析我々は、Cytoscapeソフトウェア47を使用して、併合ヒトインタラクトームに基づいて、2親等以内の228の遺伝子を8つのGRM遺伝子まで同定した。我々は、FAG-ECアルゴリズムをデフォルトパラメータで使用するソフトウェアのClusterVizプラグインを使用するネットワークトポロジーのみに基づいて、この遺伝子ネットワークを17の別個のモジュラークラスタにクラスタ化した。17モジュールそれぞれのコンポーネント遺伝子をDAVID44に提出して、ホモサピエンスGOアノテーションを使用して機能的濃縮の有意性を評価した。以下の実施例は、本発明のある実施形態を例証するために提供されている。実施例は、本発明を決して限定するものではない。ADHDに関連する代謝型グルタミン酸受容体遺伝子の改変発達脳および正常脳機能の重要な媒介物である、グルタミン酸作動性神経伝達に関与する遺伝子に影響する、複数の独立したADHDコホートにおいて過剰提示されるいくつかの低頻度反復性CNVsが同定されている。これらの結果は、ADHDの遺伝的感受性への寄与因子としての脳のグルタミン酸作動性遺伝子ネットワークに関わる変異を示唆している。研究の参加者発見コホートには、フィラデルフィア小児病院Children’sHospitalofPhiladelphia:CHOPにて遺伝子型が同定された、北欧家系のADHD症例計1,013名が含まれていた。この症例は、CHOPにて募集した、親のない症例664名および3人揃った組からの症例349名から構成された表8および表9を参照。表8.研究参加者の臨床的人口統計値PACS:ペアレントアカウントオブチャイルドシンプトムParentalAccountofChildSymptoms;Conners:行動評定尺度Behavioralratingscales;SDQ:強さと困難さアンケートStrengthandDifficultiesQuestionnaire;WISC:ウェクスラー児童用知能検査WechslerIntelligenceScaleforChildren:WISC-IV;KSADS-IVR:学童IVRのための感情障害および統合失調症用面接基準ScheduleforAffectiveDisordersandSchizophreniaforSchool-AgeChildren-IVR;DICA:小児および青年のための診断面接DiagnosticInterviewforChildrenandAdolescents;Kinder-DIPS:小児の精神障害のための診断面接DiagnosticInterviewforPsychiatricDisordersinChildren、K-ABC:Kaufman-ABC知能スケール。WRAADDS=Wender-Reimherr成人期注意欠陥障害スケールAdultAttentionDeficitDisorderScale;WURS=WenderUtah評価スケール;PRS=親評価スケールParentRatingScale。表9.不注意、衝動性、および過活動ドメインにおけるCHOP研究参加者のK-SADSADHD重要度集中力記録1件を紛失†衝動的発言記録3件を紛失。スコア1および2は、症状が正常範囲内であることを意味するが、スコア3および4は過剰である。複製に対処するため、我々は遺伝関連情報ネットワークGeneticAssociationInformationNetwork:GAINの一部であるIMAGEコホートにアクセスした。この研究の品質管理基準を満足するIMAGE試料が624個あった。IMAGE用のこれらの遺伝子型および強度データへのアクセスは、遺伝子型および表現型のデータベースdatabaseofGenotypesandPhenotypes:dbGaPを通じて提供された。LosAngelesのカリフォルニア大学UniversityofCalifornia、マサチューセッツ総合病院MassachusettsGeneralHospital、およびワシントン大学WashingtonUniversitySt.LouisからのPUWMaコンソーシアムは、ADHD症例864名および親1,258名を提供した。IMAGEIIコンソーシアムは、ADHD症例787名および非血縁対照898名を提供した。さらに、NIMHにて募集した症例128名およびユタ大学TheUniversityofUtahにて募集した症例90名も複製のために供給された。CHOP、NIMH、およびUtahコホートからのDNA試料は、CHOPにてIlluminaInfiniumHumanHap550KBeadChipを使用して遺伝子型を同定した。IMAGEコホートは、Perlegen600Kプラットフォームを使用して遺伝子型を同定した。PUWMaコホートは、Illumina1MBeadChipで遺伝子型を同定した。IMAGEIIコホートは、Affymetrix5.0アレイで遺伝子型を同定した。アレイ間のCNV検出の相違を処理するために、我々は、CHOPからのIllumina550k4,105名、GAIN乾癬およびうつ病プロジェクトからのPerlegen600k3,297名、PUWMa親およびSAGEからのIllumina1M3,469名、ならびにNIMHジェネティクスリポジトリおよびAGRE親からのAffymetrix5.0および6.0対照2,456名を含む、症例プラットフォームに対応するプラットフォームで遺伝子型が同定された対照を使用した。症例および対照におけるCNVのサイズおよび数新規CNVsを検索するために、我々は、すべて欧州系統である対照小児4,105名と比較して、CHOP症例1,013名を発見コホートとして解析した。IMAGE、PUWMa、IMAGEII、NIMH、およびUtahコホートからのデータを、同じプラットフォームで遺伝子型が同定された9,222名の独立した対照コホートと共に複製に使用した。このため、対照CNV頻度は、Illumina、Perlegen、およびAffymetrixプラットフォームに基づいて複数の大型独立コホートにおいて確実にキャラクタリゼーションされる。我々は、dbGaPで利用可能な2,713個症例934名のIMAGE試料のうち、1,886個症例624名が厳密に確立されたCNVsのデータ品質閾値を満足したことに着目した。PennCNVソフトウェアを使用して、前述されているような10症例および対照のCNVコールを産生した。コホートの大部分の分布から指数関数的に逸脱したカウントCNVコール品質測定での実質的な域外値を除外することを含む品質標準を満たした、被験者のCNV頻度によって、8~45のCNVコールを有する被験者が93となった図1。我々は、3,172のホモ接合欠失コピー数、すなわちCN=0、27,810の半接合欠失CN=1、14,806の1コピー重複CN=3、および581の2コピー重複CN=4を含む、4つの異なるコピー数状態をコールした。図8は、BeadStudioソフトウェアで参照した未加工Illuminaデータおよび生じたCNVコールの例を示す。CNVコールは3~598SNPsに及び、CNVコールに付き平均14SNPsであり、最大CNVは2.2Mb、および平均CNVサイズは62kbであった。可変プローブカバー範囲によって、少なくとも3つのSNPsが存在するという条件で、物理サイズの小さいCNVsまで検出することが可能となり、CNVsはqPCRを使用して実験的に妥当性確認された。調査した対照個人も、8~45のCNVコールを持つ被験者が93であった図1。CNVコールのうち、我々は、4,471のホモ接合欠失CN=0、49,726の半接合欠失CN=1、27,032の1コピー重複CN=3、および1,480の2コピー重複CN=4を同定した。CNVコールは3~708のSNPsに及び、CNVコールに付き平均12.8のSNPsであり、最大CNVは2.9Mb、および平均CNVサイズは53.6kbであった。SNP関連試験我々は発見コホートにGWA解析を行ったが、我々はゲノムワイド有意性の統計的基準を満足するいずれの単一SNP遺伝子型関連シグナルも検出しなかったp98およびlogr比の標準偏差0.3。PennCNVは、欠失を示す0以下となる傾向がある、または重複を示す0を超える傾向がある強度logR比を持つ隣接するSNPsの領域を検出する。このような傾向が観察されない場合、正常な2倍体状態を示すCNVコールは生成されない。同時に、遺伝子型データは、欠失を示すホモ接合遺伝子型または対照マイナーアレル頻度への正の相関に重み付けされた重複を示すAABおよびABB遺伝子型の連続した物理的位置において評価される。ADHDに関与する遺伝子の同定および患者の結果によって、存在する変異体が示され、ADHD発症のリスクの改変を所有するものが同定される。本明細書で提供する情報によって、以前に起こる可能性があった疾患進行への早期の治療的介入が可能となる。本明細書で上述したように、GRM受容体ファミリは、ADHDの治療に有効な新しい治療剤の開発のための新規標的を提供する。特に、この疾患を発症する傾向がより高い患者におけるこのような遺伝子の発現を調節することが望ましい。表13A.多重SNPパネル表13B.診断アレイにおける実行に利用できるSNPのリスト追加の研究において、我々は、我々の以前のCNVsのGRMネットワーク解析を、ADHDの有意性を示す335の遺伝子のより包括的なネットワークにまで拡張した。元のmGluRネットワークは、ヒトインタラクトームによって定義された1および2親等相互作用遺伝子を含む、271の遺伝子から生成された。解析の更新により、遺伝子のGRMsとの機能相互作用をより良好に取り込むための、mGluRネットワーク定義のより包括的な更新が提供される。これらの追加の標的を生成するために、以下のデータデータベースを用いた:1.生物学的相互作用および機能アノテーションのIngenuityKnowledgeBase。各Ingenuityの相互作用は、専門の科学者たちが特定の相互作用分子を裏付ける刊行物を用いて手作業で作成している。2.遺伝子関連性およびヒトゲノム疫学の統合された検索可能な知識ベースである、HumanGenomeEpidemiologyHuGENavigatorで報告されている公開GWASの結果。3.mGluR遺伝子との相互作用に関する我々のPubMedの文献総説。4.パブリックドメインでは見出されないADHD患者の配列決定からの低頻度変異体。これらの更新されたネットワークを使用して、神経学的に正常な対照7449名と比較して、ADHD症例1292名を解析した。負の対照を使用して、発生経路HOXgenexes、癌肺癌経路、およびADHDに関係していない神経シグナル伝達GABAなどの生物関連予測におけるCNV解析アルゴリズムを妥当性確認した。ネットワークは非常に有意であり、CNVsは症例全体の17および対照の9で同定され、OR2.1およびP=6.5×10-17である。表13Cは、Ingenuityソフトウェアを使用して同定した、提示されている271の遺伝子に加えて、64の追加の遺伝子の名称を示す合計335。解析の更新によって、生物学的相互作用および機能アノテーションのIngenuityKnowledgeBaseに基づく、遺伝子のGRMsとの機能的相互作用が提供される。各Ingenuityの相互作用は、専門の科学者たちが特定の相互作用分子を裏付ける刊行物を用いて手作業で作成している。拡張CNV解析による結果は以下の通りである:表13C.335の標的を以下に挙げる表13Aからの271の標的を含む本発明により、ADHD患者の10が代謝型グルタミン酸受容体遺伝子metabotropicglutamatereceptors:mGluRsをコードする遺伝子の突然変異の特異的な種類を保有することが見出されている。これらの突然変異は、mGluR経路の欠陥によるADHDを選択および治療するための感受性および特異的なバイオマーカーである。さらに本発明者らは、mGluRsを特異的に活性化して、mGluR遺伝子のGRMファミリに突然変異を持つADHD患者において正常な神経生理を回復する可能性がある薬剤候補を同定した。表1を参照。たとえば、本明細書に記載する試験および治療パラダイムを実施する際に投与される可能性のある化合物は、F.Gualtierietal.,Curr.Pharm.Des.,8:125-382002に記載されているようなピラセタム系向知性剤を含む。さらに好ましくは、治療剤はピログルタミドである。本発明の実施に使用することができるピログルタミドの調製および製剤に関する詳細事項は、Kimuraetal.への米国特許第5,102,882号で提供されている。ADHD関連コピー数多型の存在を示す1若しくはそれ以上のSNPsを有することが判定された患者でのADHDの治療に特に好ましい薬剤は、表13に示されているように、-5-オキソ-D-プロリンピペリジンアミド1水和物NS-105である。ADHDの病因に関与する、上で同定したCNV含有mGluR遺伝子は、ADHDの治療に有効な新たな治療剤の開発のための新規標的も提供する。このために、mGluRタンパク質相互作用および関連する病態を調節する候補薬剤薬剤または化合物のスクリーニング方法を、本明細書で提供する情報に基づいて行うことができる。代表的な候補薬剤は、核酸、ポリペプチド、小分子化合物およびペプチド模倣薬を含む。いくつかの症例において、遺伝因子は、酵母細胞に遺伝子をコードする核酸構築物と接触させることによってスクリーニングすることができる。たとえば、多種多様の遺伝子を発現するcDNAライブラリをスクリーニングして、このような相互作用を調節する他の遺伝子を同定することができる。たとえば、同定された薬剤は、グルタミン酸関連神経シグナル伝達、細胞下タンパク質局在および/または神経細胞形態または生存能を調節することができる。したがって、正確な作用機序とは無関係に、本明細書に記載するスクリーニング法によって同定された薬剤は、ADHDに苦しむ患者に治療的利益を提供することが予想される。好適なスクリーニング法は、ATCCから入手可能な多種多様の神経細胞型を用いることができる。候補薬剤は、合成または天然化合物の大規模なライブラリからスクリーニングすることができる。1つの実施例は、FDA承認のヒトが使用できる化合物のライブラリである。加えて、化合物ライブラリは、これに限定されるものではないが、MaybridgeChemicalCo.英国コーンウォール州Trevillet、Comgenexニュージャージー州Princeton、Microsourceコネチカット州、NewMilford、アルドリッチAldrichウィスコンシン州Milwaukee、AKosConsultingandSolutionsGmbHスイスBasel、AmbinterフランスParis、AsinexロシアMoscow、AuroraオーストリアGraz、BioFocusDPI、Switzerland、Bionet英国Camelford、ChemBridgeカリフォルニア州SanDiego、ChemDivカリフォルニア州SanDiego、ChemicalBlockLtロシアMoscow、ChemStarロシアMoscow、ExclusiveChemistry,LtdロシアObninsk、EnamineウクライナKiev、EvotecドイツHamburg、Indofmeニュージャージー州Hillsborough、InterbioscreenロシアMoscow、InterchimフランスMontlucon、LifeChemicals,Inc.コネチカット州Orange、MicrochemistryLtd.ロシアMoscow、Otavaオンタリオ州Toronto、PharmExLtd.ロシアMoscow、PrincetonBiomolecularニュージャージー州MonmouthJunction、ScientificExchangeニューハンプシャー州CenterOssipee、SpecsオランダDelft、TimTecデラウェア州Newark、TorontoResearchCorp.オンタリオ州NorthYork、UkrOrgSynthesisウクライナKiev、Vitas-MロシアMoscow、ZelinskyInstituteロシアMoscow、およびBicoll中国Shanghaiを含むいくつかの企業より市販されている。コンビナトリアルライブラリは、入手可能であり、調製することができる。細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形の天然化合物のライブラリは市販されているか、または当分野で周知の方法によってただちに調製できる。動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含む植物源などの天然源から単離された化合物、ならびに海洋試料は、潜在的に有用な医薬品の存在について候補としてアッセイすることが提案されている。スクリーニングされる医薬品は、化学組成物または人工化合物からの誘導または合成も可能であることが理解される。たとえば、神経細胞を試験化合物、たとえばピログルタミドたとえば米国特許第5,102,882号明細書およびピラセタム系向知性剤の他のメンバの存在下または非存在下でインキュベートして、その後、グルタミン酸シグナル伝達に対する化合物の効果を評価することができる。このように同定された薬剤は次に、ADHDの全動物モデルでの試験を行って、生体内有効性を評価することができる。本明細書に記載するスクリーニングアッセイを使用して同定された薬剤も、本発明に含まれる。考察現在、ADHDにおけるゲノムワイド関連性研究はきわめて不十分であり、ADHDに有意に関連しているCNVsについて報告した研究はない。したがって、我々の研究は、ADHDにおけるCNVsの最初の大規模な偏りのない2段階ゲノムワイドスキャニングに相当する。小児3名が罹患した1つのADHDのファミリおよびGRM7が欠失した1つのファミリでのGRM5欠失を、57の他の非GRM受容体遺伝子と共に以前報告したが、その大半は単一事象であり13、代謝型グルタミン酸受容体ファミリの遺伝子GRM5、GRM7、GRM8およびGRM1は、ADHDに有意に関連するCNVsに影響されることが示され、複数の独立した症例対照データセットでの複製が観察されたのが初めてである。代謝型グルタミン酸受容体metabotropicglutamatereceptors:GRMsまたはmGluRsは、神経系における興奮性シナプス伝達の調節に関与する7回膜貫通領域を所有するGタンパク質共役受容体のクラスである14。配列相同性、推定シグナル伝達機構、および薬理学的特性に基づいて、3つの受容体群がある15。GRM5およびGRM1は、ADHDに関連する脳領域である基底核および小脳で特に発現されるグループIのメンバである16。これらの受容体はホスホリパーゼCを活性化することが示されて、嗜癖、不安および行動障害において役割を果たす可能性があることが仮定されている17。GRM7およびGRM8は、サイクリックAMPカスケードの阻害に関連する、グループIIIのメンバである。GRM7は、不安に関連していて18、各種の哺乳動物種ですべてのmGluRサブタイプの中で最も高度に保存されている19。ADHDにグルタミン酸作動性が関与する証拠は、多様な分野から生じている。グルタミン酸作動性受容体およびトランスポータ中の変異体を調べる関連研究によって、相容れない結果が報告されているが20-23、ADHD小児におけるメチルフェニデートに対する応答を調べるゲノムワイド関連研究によって、GRM7rs3792452内のSNPsを含む複数のSNPsの関連についての名目上の証拠が検出された24。GRIN2Aは遺伝的連鎖研究でADHDと関連することが報告され20、GRIN2BはTDTによって関連付けられていた25。磁気共鳴分光研究によって、ADHD被験者の前頭および線条体脳領域におけるグルタミン酸作動性緊張の上昇が示され26-28、この上昇は刺激薬およびアトモキセチンによって正常化する29。ADHD動物モデルであるSLC6A3-KODAT-KOマウスは、ドーパミントランスポータの欠乏にもかかわらずメチルフェニデートになお反応性であり30、これらのマウスの多動性は、NMDA受容体遮断薬によって上昇させることができ、グルタミン酸作動性伝達を向上させる薬物によって抑制することができる31。中脳SLC6A3およびDRD4発現の増加は、線条体におけるグルタミン酸トランスポータの増加が見出されたラットで報告され32、ドーパミンの減少がグルタミン酸シグナル伝達を改変する可能性があることが示唆される。また、グルタミン酸受容体サブユニット遺伝子GRIN2Aの破壊によって、マウスの前頭皮質および線条体におけるDAおよびセロトニン代謝が増加して、ドーパミンまたはセロトニン受容体アンタゴニストによって低減された自発運動活性が上昇した33。その上、グルタミン作動性glutametergic経路における遺伝子の調節不全発現は、SHR34-37において、およびADHDのPCB曝露ラットモデルにおいて36観察されている。グルタミン酸レベルの上昇は、ADHD脳の神経代謝で報告され、ADHDではグルタミン酸伝達の改変が重要であることを示唆している28。我々の研究におけるADHDに関連したグルタミン酸受容体は、3つの例では欠失していて、1つの例では重複していたが、欠失症例におけるグルタミン酸シグナル伝達で生じた摂動は、送達および受容された神経伝達シグナルの不一致を補償しようとして、追加のグルタミン酸を放出するフィードバックループを通じてADHDを促進する可能性がある。遺伝子のGRMファミリとは別に、我々は8つの他の遺伝子座とADHDとの関連を検出し、その4つは遺伝子に影響を及ぼす表3B。これらの中には、ADHDに関して興味深い生態を持つ遺伝子がある。DPP6は以前、ゲノムワイド関連研究において筋萎縮性側索硬化症AmyotrophicLateralSclerosis:ALSと関連していて38,39、DPP6に影響を及ぼすCNVsが自閉症と関連付けて報告されている40。我々の関連はCTNNA2に直接影響を及ぼさないがDPP6およびCTNNA2は、以前のADHDSNP遺伝子型GWASによって関係付けられている9。NLNは、神経ペプチド、たとえば以前にADHDに関係していたニューロペプチドYNeuropeptideY:NPYなどの神経ペプチドの代謝不活性化に関与する興味深い候補である45,46。SLC7A10は、グルタミン酸作動性シナプスにてD-セリンの動員を通じて、グルタミン酸作動性伝達の調節で役割を果たすことが示されている。LARP7は、転写後スプライシングに関与するタンパク質複合体である、snRNPの完全性にとって重要である。NEGR1は、哺乳動物脳での再生軸索出芽および神経細胞成長において神経細胞接着分子および経神経成長促進因子をコードする。興味深いことに、この神経細胞遺伝子は近年、肥満と関連していた41。CHOP発見コホートにおいて、ファミリ230は、そのファミリのADHD症例3名すべてが母親から遺伝したGRM5欠失および父親から遺伝したNEGR1重複の両方に影響を受けている。優れたIQレベルにもかかわらず、これらの小児3名は重篤な機能障害を有していた。これは、3名すべてのファミリ性症例で観察され、対照では観察されない唯一のCNV領域であった。成人ADHDセルフレポートスケールSelf-ReportScale42を使用した母親の評価によって、ADHDの可能性が指摘された。これらの領域で各遺伝子を直接破壊する8つのCNVRsが示されているがGRM5、GRM7、GRM8、GRM1、NEGR1、DPP6、SGTB/NLNおよびLARP7を含む、残りは最も近いものによってアノテーションされている表3Aおよび3B。さらに、GRM8、GRM1、SGTB/NLN、およびLARP7CNVsはエキソン性である。ADHD表現型に関係する関連遺伝子の機能を十分にキャラクタリゼーションするためのさらなる機能研究が行われる。このため、複数の独立コホートにおけるゲノム全体を評価する我々の偏りのない手法によって、ADHDにおける脳に対するいずれの潜在的な生物学的および生理学的影響についても以前に研究されていない新規遺伝子中のCNVsが明らかとなり、さらなるキャラクタリゼーションが待たれている。ADHDの病因で報告された4つのGRM受容体遺伝子の有意性および各遺伝子座におけるCNVsの低頻度を考慮すると、我々は、GRM受容体相互作用遺伝子を、症例および対照におけるCNV観察の頻度について評価することにした。GRM受容体遺伝子ファミリの強い関連が以前に知られていることを考慮すると、このことにより有意傾向の遺伝子座を含めることができる。CNVsは所与の遺伝子座において非常に低頻度であることが多いが1、その印象的な効果量によって証明されるように、その関連性によって、疾患状態に対して共通変異体よりも強い直接相関が提供される表3のORsを参照。個々の有意な遺伝子座のみに基づいて、3.66のADHD症例は、発見されたCNVsと強く相関している。信頼できるGRMファミリによる結果をGRM受容体相互作用/シグナル伝達遺伝子の遺伝子ネットワークに拡張することにより、対照の頻度について調整した後に、9.94のADHD症例にその疾患の遺伝的キャラクタリゼーションが提供されるすなわち、症例における正味の影響。このネットワークを裏付ける主要な拠点は、以前に統合失調症およびてんかんと関連付けられた、TNIK48、GNAQ49、およびCALM150図11を含む。興味深いことに、GRM受容体ネットワーク遺伝子のGRIK1は、ADHDの過活動/衝動的症状とも関連付けられている8。まとめると、我々のCNVの解析およびGRM受容体遺伝子相互作用ネットワークの機能的濃縮によって、GRMsは多数の相互作用を形成しないが、他のセットの遺伝子の機能モジュールを調整する役割を果たすことが示唆される。励みになることには、これらのモジュールのいくつかは、シナプス伝達の過程、神経発生、およびADHDにて欠陥があると考えられる他の神経学的過程において重要である。このため、ADHDに影響を及ぼすCNVsのネットワーク解析を通じて、我々は、脳特異的シナプス活動に影響することが示されている、RNA結合、プロセシング、および選択的スプライシングなどの過程で重要であるモジュールを同定している51,52。また我々は、我々が以前自閉症と結び付けた過程であるユビキチン化に関与する機能モジュールを同定し1、自閉症はADHDとある表現型特徴を共有している。さらに、異常機能脳接続性は、ADHDを含む認知障害と関連する発育性脳障害における候補因子である53,54。このため、受容体のGRMファミリのうち影響するCNVRs、特にGRM5およびGRM7は、ADHDの根底にある分子的病因にとって重要である。結論として、我々は、高分解能CNV検出のための2段階ゲノムワイド関連手法を使用して、対照と比較してADHD症例においてCNVsの濃縮を示す12の遺伝子座を同定し、症例および対照に適合した3つの異なるプラットフォームで遺伝子型が同定されたADHD症例および健常対照の独立したデータセットを使用して、遺伝子座のうち4つの複製に成功した。影響された遺伝子のうち4つは、代謝型グルタミン酸受容体ファミリに属している。グルタミン酸受容体と相互作用する200を超える遺伝子のネットワークは、CNVsによって集合的に影響を及ぼされ、すべてのADHD症例のおよそ10の遺伝的多様性を取り込む。さらに、代謝型グルタミン酸受容体と相互作用する遺伝子のこのネットワークは、重要な神経細胞機能を持つ機能モジュールのセットを定義し、その神経細胞機能の欠陥は、ADHDおよび他の神経発達障害の根底にあると考えられている。したがって、ADHDに関連するCNVsについてのこの分子系内での遺伝子の濃縮によって、疾患に対する新規感受性機構が示唆され、これらの分子ネットワーク内の候補遺伝子における構造的変異および単一塩基変化を含む、追加の変異の評価が促進されるであろう。我々の結果により、これらの候補遺伝子中のCNVsの生物学的効果を評価するための発現および他の機能アッセイが必要とされる。表14.ADHDCNVファミリベースの伝達不平衡およびデノボ統計試験。A遺伝で濃縮されたIlluminaCHOP欠失B遺伝で濃縮されたIlluminaCHOP重複Cデノボで濃縮されたIlluminaCHOP欠失Dデノボで濃縮されたIlluminaCHOP重複E遺伝で濃縮されたPerlegenIMAGE欠失F遺伝で濃縮されたPerlegenIMAGE重複Gデノボで濃縮されたPerlegenIMAGE欠失Hデノボで濃縮されたPerlegenIMAGE重複表15.ADHDCNVファミリベースの伝達不平衡およびデノボ統計試験表16.影響するCNV遺伝子座に対する試料源の寄与表17.表1Aおよび1Bにおける個々のCNVsの境界エキソン距離0は、エキソンがCNVの影響を受けていることを示す。^qPCR妥当性確認に利用できない試料BeadStudioにて目視で妥当性確認された試料。表18.ADHD症例および対照のGRM受容体相互作用遺伝子中のCNVsの頻度表19.相互作用遺伝子のネットワークに基づく遺伝子クラスタGRM5遺伝子の1コピー中に大規模な欠失を持つADHD患者のファミリにおいて同定されたGRM5CNV欠失の生物学的効果を、エプスタインバーウイルスEpstein-Barrvirus、EBVによって形質転換されたPBMC由来細胞株中で調べた。文献ではPBMC細胞がmGluR1およびmGluR5の両方を発現して、mGluRsがT細胞活性化で役割を果たす可能性があることが報告されている。我々は最初に、健常被験者に由来するEBV形質転換細胞株中のmGluR5の発現をqRT-PCRおよびフローサイトメトリーによって調べた。結果によりmGluR5の発現が確認された。我々は次に、フローサイトメトリーでの蛍光シグナルの定量分析によって、ADHDファミリに由来する4つの細胞株を4つの対照細胞株と比較した。mGluR5Ab染色と対照Ab染色との間の蛍光値の比を計算した。ADHD群の平均比は4.6±0.4であったのに対して、対照の平均は7.3±1.7であった。差は統計的に有意でありt検定、p=0.024、欠失症例でmGluR5発現が約36低下したことを示している。この結果により、GRM5遺伝子中のこのCNVがmGluR5発現の低下を引き起こすという最初の証拠が提供される。以下の物質および方法は、実施例4の実施を容易にするために提供されている。qRT-PCR。TaqManプローブおよびプライマは、AppliedBiosystemsカタログ番号Hs00168275-m1より購入した。7900HTreal-timePCRシステムAppliedBiosystemsを使用して、348のウェルプレートでリアルタイムPCRを行った。テンプレートは、RTcDNA合成キットAppliedBiosystems、カタログ番号4374867を使用して、全RNAおよび無作為のプライマからcDNA合成した。RNAを10FBSを含有するRPMI1640培地で培養した細胞から単離した。フローサイトメトリー。細胞をパラホルムアルデヒドで固定して、特異的mGluR5モノクローナル抗体RD、カタログ番号MAB4514またはアイソタイプマッチ対照抗体RD、カタログ番号MAB002、続いてフィコエリトリンコンジュゲート抗マウス抗体によって染色した。染色した細胞を、BDFACSCaliburフローサイトメータを使用して分析した。結果各被験者の細胞を3つの試料に分けた。そのうち1つを染色を用いてバックグラウンド対照として使用し、そのうち2つをmGluR5Abおよび対照Abによってそれぞれ染色した。各被験者のmGluR5Abおよび対照Abで染色した細胞の平均蛍光を表Aに示す。mGluRAb染色および対照Ab染色の比を計算して、再び表1に示す。ADHD群の平均比は4.6±0.4であったのに対して、対照の平均は7.3±1.7であった。差は統計的に有意でありt検定、p=0.024、mGluR5発現が約36低下したことを示している。これらのデータによって、本明細書で提供する多様な遺伝子標的におけるCNVsの生物学的な重要性が、生物系において実験的に決定および検証され、このことによりこれらの欠失の結果として失われた生物活性をたとえば回復することができる有益な治療剤の同定およびキャラクタリゼーションが容易になることが示されている。表A.PBMC由来細胞株のフローサイトメトリー分析の結果参考文献1GlessnerJTWangKCaiGetalAutismgenomewidecopynumbervariationrevealsubiquitinandneuronalgenesNature20094595695732DerksEMHudziakJJDolanCVvanBeijsterveldtTCVerhulstFCBoomsmaDIGeneticandenvironmentalinfluencesontherelationbetweenattentionproblemsandattentiondeficithyperactivitydisorderBehavGenet3811233WoodACRijsdijkFSaudinoKJAshersonPKuntsiJHighheritabilityforacompositeindexofchildrensactivitylevelmeasuresBehavGenet382662764HaberstickBCTimberlakeDHopferCJLessemJMEhringerMAHewittJKGeneticandenvironmentalcontributionstoretrospectivelyreportedDSMIVchildhoodattentiondeficithyperactivitydisorderPsycholMed38105710665WangKZhangHMaDetalCommongeneticvariantson5p141associatewithautismspectrumdisordersNature4595285336FrankeBNealeBMFaraoneSVGenomewideassociationstudiesinADHDHumGenetdoi101007s00439009066347NealeBMLaskySuJAnneyRetalGenomewideassociationscanofattentiondeficithyperactivitydisorderAmJMedGenetBNeuropsychiatrGenet147B133713448LaskySuJNealeBMFrankeBetalGenomewideassociationscanofquantitativetraitsforattentiondeficithyperactivitydisorderidentifiesnovelassociationsandconfirmscandidategeneassociationsAmericanJournalofMedicalGeneticsPartBNeuropsychiatricGenetics147B134513549LeschKPTimmesfeldNRennerTJetalMoleculargeneticsofadultADHDconvergingevidencefromgenomewideassociationandextendedpedigreelinkagestudiesJNeuralTransm1151573158510WangKLiMHadleyDetalPennCNVanintegratedhiddenMarkovmodeldesignedforhighresolutioncopynumbervariationdetectioninwholegenomeSNPgenotypingdataGenomeRes171665167411ZhouKDempfleAArcosBurgosMetalMetaanalysisofgenomewidelinkagescansofattentiondeficithyperactivitydisorderAmJMedGenetBNeuropsychiatrGenet147B1392812KentWJSugnetCWFureyTSetalThehumangenomebrowseratUCSCGenomeRes12996100613EliaJGaiXetalRareStructuralVariantsfoundinAttentionDeficitHyperactivityDisorderarePreferentiallyAssociatedwithNeurodevelopmentalGenesMolecularPsychiatryJune232009Epub14TaniuraHSanadaNKuramotoNYonedaYMetabotropicGlutamateReceptorFamilyGeneinDictyosteliumdiscoideumJBiolChem281123361234315ConnPJPinJPhamacologyandFunctionsofMetabotropicGlutamateReceptorsAnnuRevPharmacolToxicol372053716BertheleAPlatzerSLaurieDJetalExpressionofmetabotropicglutamatereceptorsubtypemRNAinhumancerebellumNeuroReport103861386717KoobGFSannaPPBloomFENeuroscienceofAddictionNeuron2146747618CryanJFKellyPHNeijtHCSansigGFlorPJvanDerPuttenHAntidepressantandanxiolyticlikeeffectsinmicelackingthegroupIIImetabotropicglutamatereceptormGluR7EuropeanJournalofNeuroscience172409241719MakoffAPillingaCHarringtonKEmsonPHumanmetabotropicglutamatereceptortype7MolecularcloningandmRNAdistributionintheCNSMolecularBrainResearch4016517020TuricDLangleyKMillsSetalFollowupofgeneticlinkagefindingsonchromosome16p13evidenceofassociationofNmethylDaspartateglutamatereceptor2AgenepolymorphismwithADHDMolPsychiatry916917321MickEandFaraoneSVGeneticsofattentiondeficithyperactivitydisorderChildAdolescPsychiatrClinNAm17261284viiviii22TuricDLangleyKWilliamsHetalAfamilybasedstudyimplicatessolutecarrierfamily1member3geneinattentiondeficithyperactivitydisorderBiolPsychiatry2005Jun1571461623EliaJCapassoMZaheerZetalCandidategeneanalysisinanongoinggenomewideassociationstudyofattentiondeficithyperactivitydisordersuggestiveassociationsignalsinADRA1APsychiatrGenetPMID1935221824MickENealeBMiddletonFAMcGoughJJFaraoneSVGenomewideassociationstudyofresponsetomethylphenidatein187childrenwithattentiondeficithyperactivitydisorderAmJMedGenetBNeuropsychiatrGenet147B1412141825DorvalKMWiggKGCrosbieJetalAssociationoftheglutamatereceptorsubunitgeneGRIN2BwithattentiondeficithyperactivitydisorderGenesBrainBehav626JinZZangYFZengYWZhangLWangYFStriatalneuronallossordysfunctionandcholineriseinchildrenwithattentiondeficithyperactivitydisordera1HmagneticresonancespectroscopystudyNeurosciLett315454827MacMasterFPCarreyNSparkesSKusumakarVProtonspectroscopyinmedicationfreepediatricattentiondeficithyperactivitydisorderBiolPsychiatry5318418728CourvoisieHHooperSRFineCKwockLCastilloMNeurometabolicfunctioningandneuropsychologicalcorrelatesinchildrenwithADHDHpreliminaryfindingsJNeuropsychiatryClinNeurosci16636929CarreyNMacMasterFPFogelJetalMetabolitechangesresultingfromtreatmentinchildrenwithADHDa1HMRSstudyClinNeuropharmacol2621822130GainetdinovRRWetselWCJonesSRLevinEDJaberMCaronMGRoleofserotoninintheparadoxicalcalmingeffectofpsychostimulantsonhyperactivityScience28339740131GainetdinovRRMohnARBohnLMCaronMGGlutamatergicmodulationofhyperactivityinmicelackingthedopaminetransporterProcNatlAcadSciUSA98110471105432MasuoYIshidoMMoritaMOkaSEffectsofneonatal6hydroxydopaminelesiononthegeneexpressionprofileinyoungadultratsNeurosciLett33512412833MiyamotoKNakanishiHMoriguchiSetalInvolvementofenhancedsensitivityofNmethylDaspartatereceptorsinvulnerabilityofdevelopingcorticalneuronstomethylmercuryneurotoxicityBrainRes90125225834RussellVAllieSWigginsTIncreasednoradrenergicactivityinprefrontalcortexslicesofananimalmodelforattentiondeficithyperactivitydisorderthespontaneouslyhypertensiveratBehavBrainRes117697435RussellVADopaminehypofunctionpossiblyresultsfromadefectinglutamatestimulatedreleaseofdopamineinthenucleusaccumbensshellofaratmodelforattentiondeficithyperactivitydisorderthespontaneouslyhypertensiveratNeurosciBiobehavRev2767168236DasBanerjeeTMiddletonFABergerDFLombardoJPSagvoldenTFaraoneSVAcomparisonofmolecularalterationsinenvironmentalandgeneticratmodelsofADHDapilotstudyAmJMedGenetBNeuropsychiatrGenet147B15546337SagvoldenTJohansenEBWoienGetalThespontaneouslyhypertensiveratmodelofADHDtheimportanceofselectingtheappropriatereferencestrainNeuropharmacology576192638DelBoRGhezziSCortiSetalDPP6genevariabilityconfersincreasedriskofdevelopingsporadicamyotrophiclateralsclerosisinItalianpatientsJournalofNeurologyNeurosurgeryPsychiatry79108539CroninSTomikBBradleyDGSlowikAHardimanOScreeningforreplicationofgenomewideSNPassociationsinsporadicALSEuropeanJournalofHumanGenetics1721321840MarshallCRNoorAVincentJBetalStructuralvariationofchromosomesinautismspectrumdisorderAmJHumGenet824778841RenstromFPayneFNordstromAetalReplicationandextensionofgenomewideassociationstudyresultsforobesityin4923adultsfromnorthernSwedenHumanMolecularGenetics181489149642KesslerRCAdlerLABarkleyRetalPatternsandpredictorsofattentiondeficithyperactivitydisorderpersistenceintoadulthoodresultsfromthenationalcomorbiditysurveyreplicationBiologicalPsychiatry571442145143DiskinSLiMHouCetalAdjustmentofgenomicwavesinsignalintensitiesfromwholegenomeSNPgenotypingplatformsNucleicAcidsResearch3644DennisGJrShermanBTHosackDAetalDAVIDDatabaseforAnnotationVisualizationandIntegratedDiscoveryGenomeBiology445LeschKPSelchSRennerTJetalGenomewidecopynumbervariationanalysisinADHDassociationwithneuropeptideYgenedosageinanextendedpedigreeMolPsychiatryEpubaheadofprint46OadesRDDanielsRRascherWPlasmaneuropeptideYlevelsmonoaminemetabolismelectrolyteexcretionanddrinkingbehaviorinchildrenwithattentiondeficithyperactivitydisorderPsychiatRes807718647ShannonPMarkielAOzierOBaligaNSWangJTRamageDAminNSchwikowskiBIdekerTCytoscapeasoftwareenvironmentforintegratedmodelsofbiomolecularinteractionnetworksGenomeRes2003Nov13249850448PotkinSGTurnerJAGuffantiGLakatosAFallonJHNguyenDDMathalonDFordJLaurielloJMacciardiFFBIRNAgenomewideassociationstudyofschizophreniausingbrainactivationasaquantitativephenotypeSchizophrBull2009Jan3596108Epub2008Nov2049WangXBaoXPalRAgbasAMichaelisEKTranscriptomicresponsesinmousebrainexposedtochronicexcessoftheneurotransmitterglutamateBMCGenomics2010Jun71136050CdeLanerolleNihalEidToreLeeTihShihGenomicExpressionintheEpileptogenicHippocampusandPsychiatricCoMorbiditiesCurrentPsychiatryReviewsVolume6Number2May2010pp13514451UleJStefaniGMeleARuggiuMWangXTaneriBetalAnRNAmappredictingNovadependentsplicingregulationNature4445806doi101038nature0530452UleJUleASpencerJWilliamsAHuJClineMetalNovaregulatesbrainspecificsplicingtoshapethesynapseNaturegenetics3784452doi101038ng161053MuriasMSwansonJMSrinivasanRFunctionalconnectivityoffrontalcortexinhealthyandADHDchildrenreflectedinEEGcoherenceCerebralcortex17178899doi101093cercorbhl08954WangLZhuCHeYZangYCaoQZhangHetalAlteredsmallworldbrainfunctionalnetworksinchildrenwithattentiondeficithyperactivitydisorderHumanbrainmapping3063849doi101002hbm20530本発明のいくつかの好ましい実施形態が上で記載され、特に例示されたが、本発明がこのような実施形態に限定されることは意図されていない。以下の請求項に記載されているように、本発明の範囲から逸脱することなく、多様な変更および修正が行えることが当業者に明らかになるであろう。"