"ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法であって、aタンパク質生成物を含むロード流体を、第1の樹脂を含むカラムに、前記生成物が前記樹脂に結合する条件下で曝すステップと、b第1の樹脂から前記生成物を含む流体を回収して第1の溶出液を生成するステップと、c第1の溶出液が第2の樹脂に移動する際に、第1の溶出液を滴定液で滴定するステップであって、滴定液が、溶出液と滴定液の容積比が最大40変化する場合に、第2の樹脂に対する前記生成物の分配係数の変化が10未満であるように、第1の溶出液の1つまたは複数の条件を変更するステップと、d滴定された溶出液を、第2の樹脂を含むカラムに、前記生成物が第2の樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第1の樹脂を含むカラムが、第2の樹脂を含むカラムとタンデムで配置されているステップと、e第2の樹脂から前記生成物を含む流体を回収して第2の溶出液を生成し、それによって、ロード流体から精製タンパク質生成物を回収するステップとを含む方法。第1の溶出液が、約95:5~80:20の間の容積比の滴定液で滴定される、請求項1に記載の方法。第1のポンプがロード流体を第1の樹脂に送り、第2のポンプが滴定液を第1の溶出液に送り、ポンプが30未満変化する流量の比で稼動される、請求項1に記載の方法。滴定液および第1の溶出液が、第2の樹脂に曝される前にミキサーを通過する、請求項1に記載の方法。第2の樹脂に曝される前に、滴定される溶出液のpHを検出するステップを含む、請求項1に記載の方法。滴定される溶出液が、第2の樹脂に曝される前にフィルターを通過する、請求項1に記載の方法。固体が、沈殿によってロード流体から除去される、請求項1に記載の方法。固体を、ポリマー凝集剤を使用してロード流体から沈殿させる、請求項7に記載の方法。固体を、低溶解度を有する塩を形成する陽イオンおよび陰イオンを使用してロード流体から沈殿させる、請求項7に記載の方法。固体を、カルシウムおよびホスフェートを使用して沈殿させる、請求項9に記載の方法。ロード流体が細胞培養培地を含む、請求項1に記載の方法。細胞が細胞培養培地から除去される、請求項1に記載の方法。細胞が、遠心分離によって細胞培養培地から除去される、請求項12に記載の方法。タンパク質が抗体の抗原結合部分を含む、請求項1に記載の方法。タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項14に記載の方法。タンパク質が小モジュラー免疫薬である、請求項14に記載の方法。第1の樹脂が免疫グロブリンに選択的に結合する、請求項1に記載の方法。第1の樹脂がプロテインAを含む、請求項17に記載の方法。第2の樹脂がイオン交換樹脂を含む、請求項1に記載の方法。滴定液が、滴定される溶出液中の生成物が弱い分配モードで第2の樹脂に結合するように、第1の溶出液の1つまたは複数の条件を変更する、請求項19に記載の方法。滴定される溶出液および樹脂の条件が、樹脂に対する生成物の分配係数が0.1~20であるようなものである、請求項20に記載の方法。滴定される溶出液および樹脂の条件が、樹脂に対する生成物の分配係数が0.5~5であるようなものである、請求項21に記載の方法。滴定液が、第2の樹脂が、樹脂1mL当たり少なくとも1mgの生成物に結合するように、第1の溶出液の1つまたは複数の条件を変更する、請求項1に記載の方法。第2の樹脂に曝される、滴定される溶出液のpHが可変である、請求項19に記載の方法。イオン交換樹脂が陰イオン交換樹脂である、請求項19に記載の方法。滴定液が、陰イオン交換樹脂が弱い分配モードで滴定される溶出液中の生成物に結合するpHの0.5pH単位高いpHを有する、請求項25に記載の方法。滴定液が塩を含む、請求項19に記載の方法。滴定液が、生成物が様々な滴定液量の添加にわたって第2の樹脂への結合を維持するように、第1の樹脂の溶出液のイオン強度を増大させる、請求項27に記載の方法。滴定液が少なくとも50mMの塩濃度を有する、請求項28に記載の方法。イオン交換樹脂が陽イオン交換樹脂である、請求項19に記載の方法。ロード流体、第1の溶出液、または第2の溶出液を、1つまたは複数のウイルス低減処理で処理するステップを含む、請求項1に記載の方法。1つまたは複数のウイルス低減処理が、酸不活性化、界面活性剤不活性化、ウイルス低減フィルターの通過、またはこれらの組合せを含む、請求項31に記載の方法。1つまたは複数のウイルス低減処理が酸不活性化を含まない、請求項31に記載の方法。ロード流体を第1の樹脂に曝す前に、界面活性剤を用いたロード流体の処理を含む、請求項32に記載の方法。第2の樹脂の溶出液をウイルス低減フィルターに通過させるステップを含む、請求項32に記載の方法。ポンプが、第2の樹脂の溶出液をウイルス低減フィルターに送る、請求項35に記載の方法。ウイルス低減フィルターに通過させた後に、酸を用いた第2の溶出液の処理を含む、請求項32に記載の方法。ロード流体を第1の樹脂に曝す前に、酸を用いたロード流体の処理を含む、請求項37に記載の方法。ロード流体、第1の溶出液、または第2の溶出液を、1つまたは複数の粘度降下処理で処理するステップを含む、請求項1に記載の方法。1つまたは複数の粘度降下処理が、加熱、塩の添加、pHの変化、またはこれらの組合せを含む、請求項39に記載の方法。第1の溶出液を加熱するステップを含む、請求項40に記載の方法。第2の樹脂が陰イオン交換樹脂であり、生成物が、生成物が樹脂から溶出する条件付近であるpKaを有する緩衝液、および生成物が弱い分配モードで第2の樹脂に結合する条件付近のpKaを有する緩衝液を含む流体中で、第1の樹脂から回収される、請求項18に記載の方法。生成物が、5.5超のpKaを有する緩衝液を含む流体中で、第1の樹脂から回収される、請求項42に記載の方法。緩衝液がトリスを含む、請求項43に記載の方法。イオン交換樹脂に曝すためのロード流体を調製する方法であって、aイオン交換樹脂に結合するタンパク質生成物を含むロード流体を提供するステップと、bロード流体に滴定液を添加するステップであって、滴定液が、前記生成物が様々な滴定液量の添加にわたってイオン交換樹脂への結合を維持するように、ロード流体のイオン強度を増大させるステップとを含む方法。イオン交換樹脂に曝すためのロード流体を調製する方法であって、aイオン交換樹脂に結合するタンパク質生成物を含むロード流体を提供するステップと、bロード流体に滴定液を添加するステップであって、滴定液が、少なくとも50mMの塩濃度を有するステップとを含む方法。ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法であって、aタンパク質生成物を含むロード流体を、第1の樹脂を含むカラムに、前記生成物が樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第1の樹脂がプロテインA樹脂であるステップと、b第1の樹脂から前記生成物を含む流体を溶出することによって第1の溶出液を生成するステップであって、前記生成物が、前記生成物が樹脂から溶出する条件付近であるpKaを有する緩衝液、および前記生成物が弱い分配モードで第2の樹脂に結合する条件付近のpKaを有する緩衝液を含む溶出流体中で、第1の樹脂から溶出されるステップと、c第1の溶出液が第2の樹脂に移動する際に、第1の溶出液を滴定液で滴定するステップと、d滴定される溶出液を、第2の樹脂を含むカラムに、前記生成物が第2の樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第1の樹脂を含むカラムが、第2の樹脂を含むカラムとタンデムで配置されているステップと、e第2の樹脂から前記生成物を含む流体を回収することによって第2の溶出液を生成し、それによって、精製タンパク質生成物をロード流体から回収するステップとを含む方法。ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法であって、aタンパク質生成物を含むロード流体を、第1の樹脂を含むカラムに、前記生成物が樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第1の樹脂がプロテインA樹脂であるステップと、b第1の樹脂から前記生成物を含む流体を溶出することによって第1の溶出液を生成するステップであって、前記生成物が、5.5超のpKaを有する緩衝液を含む溶出流体中で、第1の樹脂から溶出されるステップと、c第1の溶出液が第2の樹脂に移動する際に、第1の溶出液を滴定液で滴定するステップと、d滴定される溶出液を、第2の樹脂を含むカラムに、前記生成物が第2の樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第1の樹脂を含むカラムが、第2の樹脂を含むカラムとタンデムで配置されているステップと、e第2の樹脂から前記生成物を含む流体を回収することによって第2の溶出液を生成し、それによって、精製タンパク質生成物をロード流体から回収するステップとを含む方法。ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法であって、aタンパク質生成物を含むロード流体をプロテインAカラムに、前記生成物がプロテインAに結合する条件下で曝すステップと、bプロテインAカラムから前記生成物を含む流体を溶出することによって第1の溶出液を生成するステップであって、前記生成物が、前記生成物が樹脂から溶出する条件付近であるpKaを有する緩衝液、および前記生成物が弱い分配モードで第2の樹脂に結合する条件付近のpKaを有する緩衝液を含む溶出流体中で、第1の樹脂から溶出されるステップと、c第1の溶出液がプロテインAカラムから溶出する際に、第1の溶出液を滴定液で滴定するステップであって、滴定液が、滴定される溶出液中の前記生成物が弱い分配モードで陰イオン交換樹脂に結合するように第1の溶出液の1つまたは複数の条件を変更し、溶出液と滴定液の容積比が最大40変化する場合に、第2の樹脂に対する前記生成物の分配係数の変化が10未満であるように、第1の溶出液の1つまたは複数の条件を変更し、前記生成物が様々な滴定液量の添加にわたって第2の樹脂への結合を維持するように、第1の樹脂の溶出液のイオン強度を増大させるステップと、d滴定される溶出液を、陰イオン交換樹脂を含むカラムに、前記生成物が陰イオン交換樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、プロテインAカラムが、陰イオン交換樹脂を含むカラムとタンデムで配置されているステップと、e陰イオン交換樹脂から前記生成物を含む流体を回収することによって第2の溶出液を生成し、それによって、精製タンパク質生成物をロード流体から回収するステップとを含む方法。治療用タンパク質および診断用タンパク質を商業的に使用するのに適切な程度の純度を達成するために、精製プロトコールは、2つ以上の精製ステップの使用を必要とすることが多い。より複雑な精製スキームによって、課題が提示されている。例えば、1つの精製モードによって処理された生成物プールは、第2の精製モードにおける処理に対して適合性にしなければならない。また、部分的に処理された生成物プールは、下流の精製システムが使用するのに直ちに利用可能でない場合、適切に貯蔵されなければならない。複数のシステムは、一貫した適切な作業を保証するために、複数のサンプリングステップおよびバリデーションステップを必要とする。複数の精製モードを一体化するシステムは、現在の精製スキームの複雑性を潜在的に低減し、それによって、効率を高め、製造されるタンパク質の取り扱いの費用を低減するはずである。本開示は、とりわけ、精製ユニットがタンデムで連結され、精製ユニットのロバストな稼動を可能にするシステムを使用してタンパク質を精製する方法を提供する。稼動パラメータ例えば、ポンプ速度、滴定液の容量添加などの変動に対してロバスト性を維持する方法は、フィードバック制御がより少なく済み、より費用効果的であり、それによって、実際面で、精製タンパク質の商品の費用を低減する。精製ユニットを一体化すると、運転間で、部分的に処理された生成物プールを貯蔵する必要性が排除される。生成物を1回のシフトで処理することができ、精製時間を低減する。一体化は、サンプリング、バリデーション、およびドキュメンテーション要求例えば、汚染微生物数サンプリング、バッチ記録のドキュメンテーションなども低減する。パラメータ、例えば、流量、背圧、およびカラム同士間の滴定液と溶出液の混合などが変動すると、生成物結合が変化し、生成物の回収率および品質を損なう場合がある。本方法の特徴は、このような変動に対する高い許容性をもたらす。したがって、一態様では、本開示は、流体から精製生成物例えば、タンパク質生成物;例えば、抗体を回収する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、aタンパク質生成物を含むロード流体loadfluidを、第1の樹脂を含むカラムに、生成物が樹脂に結合する条件下で曝すステップと、b第1の樹脂から生成物を含む流体を回収して第1の溶出液を生成するステップと、c第1の溶出液が第2の樹脂に移動する際に、第1の溶出液を滴定液で滴定するステップと、d滴定された溶出液を、第2の樹脂を含むカラムに、生成物が第2の樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第1の樹脂を含むカラムが、第2の樹脂を含むカラムとタンデムで配置されているステップと、e第2の樹脂から生成物を含む流体を回収して第2の溶出液を生成し、それによって、ロード流体から精製タンパク質生成物を回収するステップとを含む。いくつかの実施形態では、滴定液は、溶出液と滴定液の容積比が最大40変化する場合に、第2の樹脂に対する生成物の分配係数Kpの変化が10未満であるように、第1の溶出液の1つまたは複数の条件を変更する。第1の溶出液は、様々な容積比の滴定液で滴定することができる。いくつかの実施形態では、第1の溶出液は、約95:5~80:20の間の容積比の滴定液で滴定される。いくつかの実施形態では、溶出液は、固定された容積比の滴定液で滴定される。いくつかの実施形態では、精製ユニットのタンデムシステムを通じた流体の流れは、1つまたは複数のポンプによって促進される。例えば、いくつかの実施形態では、第1のポンプは、ロード流体を第1の樹脂に送り、第2のポンプは、滴定液を第1の溶出液に送る。ポンプは、30未満、20未満、または10未満変化する流量の比で稼動させることができる。いくつかの実施形態では、溶出液および滴定液は、後続の精製ユニットに曝される前にミキサーを通過する。タンデム稼動は、精製の所与の段階例えば、稼動がpHによって影響される精製ユニットの前でpHを検出するためのpHモニターを任意選択により含むことができる。いくつかの実施形態では、精製方法は、流体に1つまたは複数のフィルター例えば、0.2μmのフィルターを通過させることを含む。タンデム精製方法のいくつかの実施形態では、フィルターは、2つのカラムの間に配置される。フィルターに加えて、またはフィルターに代えて、沈殿によって固体を流体から除去することができる。いくつかの実施形態では、ポリマー凝集剤を使用して固体を流体から沈殿させることができる。いくつかの実施形態では、固体を、低溶解度を有する塩を形成する陽イオンおよび陰イオンを使用して例えば、陽イオンおよび陰イオンを有する塩の溶解度積定数が、約10-4M2未満である;例えば、カルシウムおよびホスフェートを使用して流体から沈殿させる。いくつかの実施形態では、一連の精製ユニットに曝されるロード流体は、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、細胞が除去された例えば、遠心分離によってものである場合がある。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、無血清例えば、添加されるタンパク質および/または添加される動物生成物を欠いているとすることができる。本明細書で提供される方法は、様々なタイプの対象とする生成物を回収するのに使用することができる。多くの実施形態では、生成物は、タンパク質、例えば、抗体例えば、モノクローナル抗体、抗体断片、単鎖抗体など、Fc融合タンパク質、または小モジュラー免疫薬SMIP商標などである。抗体、Fc融合タンパク質、および/または小モジュラー免疫薬の精製は、プロテインAproAなどの免疫グロブリンに選択的に結合する樹脂の使用を含むことができる。本明細書で提供される方法の様々な実施形態では、滴定液は、滴定される溶出液中の生成物が弱い分配モードで第2の樹脂に結合するように、第1の溶出液の1つまたは複数の条件を変更する。例えば、滴定される溶出液および樹脂の条件は、樹脂に対する生成物の分配係数Kpが0.1~20例えば、0.2~10、または0.5~5であるようなものとすることができる。いくつかの実施形態では、滴定液は、第2の樹脂が、樹脂1mL当たり少なくとも1mgの生成物例えば、1mL当たり少なくとも5mg、10mg、20mg、40mg、50mg、または60mgの生成物に結合するように、第1の溶出液の1つまたは複数の条件を変更する。本明細書で提供される方法では、第2の樹脂に曝される、滴定される溶出液のpHは、可変となり得る。本明細書で提供される方法は、イオン交換樹脂の使用を含むことができる。いくつかの実施形態では、イオン交換樹脂は、陰イオン交換樹脂である。いくつかの実施形態では、滴定液は、陰イオン交換樹脂が弱い分配モードで滴定される溶出液中の生成物に結合するpHの0.5pH単位高いpHを有する。いくつかの実施形態では、滴定液は塩を含む。生成物が様々な滴定液量の添加にわたって第2の樹脂例えば、イオン交換樹脂への結合を維持するように、第1の樹脂の溶出液のイオン強度を増大させる滴定液を使用することができる。いくつかの実施形態では、滴定液は、少なくとも50mM例えば、少なくとも100mM、150mM、200mM、250mM、500mM、750mM、1M、またはそれ以上の塩濃度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法において使用されるイオン交換樹脂は、陽イオン交換樹脂である。提供される方法によって処理される流体は、1つまたは複数のウイルス低減処理、例えば、酸不活性化、界面活性剤不活性化、ウイルス低減フィルターの通過、またはこれらの組合せなどで処理することができる。いくつかの実施形態では、一方法において使用されるウイルス不活性化処理は、酸不活性化を含まない。いくつかの実施形態では、一方法は、ロード流体をタンデムシステム内の第1の樹脂に曝す前に、界面活性剤でロード流体を処理するステップを含む。ウイルス低減フィルターが使用されるいくつかの実施形態では、ポンプが流体をフィルターに送る。方法は、粘度降下処理を含むことができ、これは、例えば、加熱、塩の添加、pHの変化、またはこれらの組合せを使用することができる。ある特定の実施形態では、第1の樹脂はプロテインA樹脂であり、第2の樹脂はイオン交換樹脂であり、生成物は、生成物が第1の樹脂から溶出する条件付近であるpKaを有する緩衝液、および生成物が弱い分配モードで第2の樹脂に結合する条件付近のpKaを有する緩衝液を含む流体中で、第1の樹脂から回収される。いくつかの実施形態では、生成物は、5.5超のpKaを有する緩衝液例えば、トリスを含む流体中で、第1の樹脂から回収される。別の態様では、本開示は、イオン交換樹脂に曝すためのロード流体を調製する方法を提供する。一方法は、例えば、aイオン交換樹脂に結合するタンパク質生成物を含むロード流体を提供するステップと、bロード流体に滴定液を添加するステップであって、滴定液は、生成物が様々な滴定液量の添加にわたってイオン交換樹脂への結合を維持するように、ロード流体のイオン強度を増大させるステップとを含む。いくつかの実施形態では、ロード流体は、プロテインA樹脂の溶出液である。いくつかの実施形態では、一方法は、生成物が樹脂に結合する条件下で、滴定される溶出液をイオン交換樹脂に曝すステップを含む。いくつかの実施形態では、イオン交換樹脂は陰イオン交換樹脂である。方法は、ロード流体例えば、第2の溶出液を1つまたは複数の追加の樹脂に曝すステップと、樹脂複数から生成物を含む流体を回収するステップとをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ロード流体は、ヒドロキシアパタイト樹脂例えば、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、疎水性相互作用樹脂、金属親和性樹脂、イオン交換樹脂、またはこれらの組合せに曝される。別の態様では、本開示は、イオン交換樹脂に曝すためのロード流体を調製する方法を提供する。方法は、例えば、aイオン交換樹脂に結合するタンパク質生成物を含むロード流体を提供するステップと、bロード流体に滴定液を添加するステップであって、滴定液は、少なくとも50mM例えば、少なくとも100mM、150mM、200mM、250mM、500mM、750mM、1M、またはそれ以上の塩濃度を有するステップとを含む。いくつかの実施形態では、ロード流体は、プロテインA樹脂の溶出液である。いくつかの実施形態では、一方法は、生成物が樹脂に結合する条件下で、滴定される溶出液をイオン交換樹脂に曝すステップを含む。いくつかの実施形態では、イオン交換樹脂は陰イオン交換樹脂である。方法は、1つまたは複数の追加の樹脂にロード流体例えば、陰イオン交換樹脂の溶出液を曝すステップと、樹脂複数可から生成物を含む流体を回収するステップとをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ロード流体は、ヒドロキシアパタイト樹脂例えば、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、疎水性相互作用樹脂、金属親和性樹脂、イオン交換樹脂、またはこれらの組合せに曝される。さらに別の態様では、本開示は、ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法を提供する。一方法は、例えば、aタンパク質生成物を含むロード流体を、第1の樹脂を含むカラムに、生成物が樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第1の樹脂がプロテインA樹脂であるステップと、b第1の樹脂から生成物を含む流体を溶出することによって第1の溶出液を生成するステップであって、生成物は、生成物が樹脂から溶出する条件付近であるpKaを有する緩衝液、および生成物が弱い分配モードで第2の樹脂に結合する条件付近のpKaを有する緩衝液を含む溶出流体中で、第1の樹脂から溶出されるステップと、c第1の溶出液が第2の樹脂に移動する際に、第1の溶出液を滴定液で滴定するステップと、d滴定される溶出液を、第2の樹脂を含むカラムに、生成物が第2の樹脂に結合する条件下で曝すステップと、e第2の樹脂から生成物を含む流体を回収することによって第2の溶出液を生成し、それによって、精製タンパク質生成物をロード流体から回収するステップとを含む。いくつかの実施形態では、第1の樹脂を含むカラムは、第2の樹脂を含むカラムとタンデムで配置される。いくつかの実施形態では、第2の樹脂は、イオン交換樹脂例えば、陰イオン交換樹脂、または陽イオン交換樹脂である。方法は、ロード流体例えば、第2の溶出液を1つまたは複数の追加の樹脂に曝すステップと、樹脂複数可から生成物を含む流体を回収するステップとをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ロード流体は、ヒドロキシアパタイト樹脂例えば、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、疎水性相互作用樹脂、金属親和性樹脂、イオン交換樹脂、またはこれらの組合せに曝される。別の態様では、本開示は、ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法を提供する。一方法は、例えば、aタンパク質生成物を含むロード流体を、第1の樹脂を含むカラムに、生成物が樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第1の樹脂がプロテインA樹脂であるステップと、b第1の樹脂から生成物を含む流体を溶出することによって第1の溶出液を生成するステップであって、生成物は、5.5超のpKaを有する緩衝液を含む溶出流体中で、第1の樹脂から溶出されるステップと、c第1の溶出液が第2の樹脂に移動する際に、第1の溶出液を滴定液で滴定するステップと、d滴定される溶出液を、第2の樹脂を含むカラムに、生成物が第2の樹脂に結合する条件下で曝すステップと、e第2の樹脂から生成物を含む流体を回収することによって第2の溶出液を生成し、それによって、精製タンパク質生成物をロード流体から回収するステップとを含む。いくつかの実施形態では、第1の樹脂を含むカラムは、第2の樹脂を含むカラムとタンデムで配置される。いくつかの実施形態では、第2の樹脂は、イオン交換樹脂例えば、陰イオン交換樹脂、または陽イオン交換樹脂である。方法は、ロード流体例えば、第2の溶出液を1つまたは複数の追加の樹脂に曝すステップと、樹脂複数可から生成物を含む流体を回収するステップとをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ロード流体は、ヒドロキシアパタイト樹脂例えば、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、疎水性相互作用樹脂、金属親和性樹脂、イオン交換樹脂、またはこれらの組合せに曝される。さらに別の態様では、本開示は、ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法を提供する。方法は、例えば、aタンパク質生成物を含むロード流体をプロテインAカラムに、生成物がプロテインAに結合する条件下で曝すステップと、bプロテインAカラムから生成物を含む流体を溶出することによって第1の溶出液を生成するステップであって、生成物は、生成物が樹脂から溶出する条件付近であるpKaを有する緩衝液、および生成物が弱い分配モードで第2の樹脂に結合する条件付近のpKaを有する緩衝液を含む溶出流体中で、第1の樹脂から溶出されるステップと、c第1の溶出液がプロテインAカラムから溶出する際に、第1の溶出液を滴定液で滴定するステップであって、滴定液は、滴定される溶出液中の生成物が弱い分配モードで陰イオン交換樹脂に結合するように第1の溶出液の1つまたは複数の条件を変更し、溶出液と滴定液の容積比が最大40変化する場合に、第2の樹脂に対する生成物の分配係数の変化が10未満であるように、第1の溶出液の1つまたは複数の条件を変更し、生成物が様々な滴定液量の添加にわたって第2の樹脂への結合を維持するように、第1の樹脂の溶出液のイオン強度を増大させるステップと、d滴定される溶出液を、陰イオン交換樹脂を含むカラムに、生成物が陰イオン交換樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、プロテインAカラムは、陰イオン交換樹脂を含むカラムとタンデムで配置されているステップと、e陰イオン交換樹脂から生成物を含む流体を回収することによって第2の溶出液を生成し、それによって、精製タンパク質生成物をロード流体から回収するステップとを含む。いくつかの実施形態では、第1の溶出液は、約95:5~80:20の間の容積比の滴定液を用いて滴定される。いくつかの実施形態では、精製ユニットのタンデムシステムを通じた流体の流れは、1つまたは複数のポンプによって促進される。ポンプは、30未満、20未満、または10未満変化する流量の比で稼動させることができる。いくつかの実施形態では、曝されるロード流体は、細胞培養培地、例えば、細胞が除去された例えば、遠心分離によって細胞培養培地を含む。いくつかの実施形態では、生成物は、タンパク質、例えば、抗体例えば、モノクローナル抗体、抗体断片、単鎖抗体など、Fc融合タンパク質、または小モジュラー免疫薬SMIP商標などである。いくつかの実施形態では、滴定される溶出液および樹脂の条件は、樹脂に対する生成物の分配係数Kpが0.1~20例えば、0.2~10、または0.5~5であるようなものとすることができる。いくつかの実施形態では、滴定液は、第2の樹脂が、樹脂1mL当たり少なくとも1mgの生成物例えば、1mL当たり少なくとも5mg、10mg、20mg、40mg、50mg、または60mgの生成物に結合するように、第1の溶出液の1つまたは複数の条件を変更する。いくつかの実施形態では、滴定液は、陰イオン交換樹脂が弱い分配モードで滴定される溶出液中の生成物に結合するpHの0.5pH単位高いpHを有する。いくつかの実施形態では、滴定液は塩を含む。いくつかの実施形態では、滴定液は、少なくとも50mM例えば、少なくとも100mM、150mM、200mM、250mM、500mM、750mM、1M、またはそれ以上の塩濃度を有する。方法は、ロード流体例えば、第2の溶出液を1つまたは複数の追加の樹脂に曝すステップと、樹脂複数可から生成物を含む流体を回収するステップとをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ロード流体は、ヒドロキシアパタイト樹脂例えば、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、疎水性相互作用樹脂、金属親和性樹脂、イオン交換樹脂、またはこれらの組合せに曝される。提供される方法を実行するためのシステムも提供される。本開示のある特定の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示されている。本開示の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。すべての引用された特許、および特許出願、および参考文献は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている。定義用語抗体は、本明細書において、任意の免疫グロブリンまたはその断片を指し、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。この用語は、それだけに限らないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、移植抗体、およびインビトロで生成された抗体を含む。用語抗体は、抗体断片、例えば、Fab、Fab’2、Fv、scFv、Fd、dAbなど、ナノボディnanobody、免疫グロブリン新抗原受容体immunoglobulinnewantigenreceptorsIgNARS、マキシボディmaxibody、ミニボディminibody、細胞内発現抗体intrabody、二重特異性抗体diabody、三重特異性抗体triabody、四重特異性抗体tetrabody、抗原結合機能を保持する他の分子も含む。一般的に、このような断片は、抗原結合ドメインを含むはずである。ある特定の実施形態では、抗体は、CH2/CH3領域を含み、したがって、プロテインAクロマトグラフィーによる精製に適用できるものである。用語CH2/CH3領域は、プロテインAと相互作用する免疫グロブリン分子のFc領域中のアミノ酸残基を指す。いくつかの実施形態では、CH2/CH3領域は、インタクトなCH2領域と、後続のインタクトなCH3領域を含み、他の実施形態では、免疫グロブリンのFc領域を含む。CH2/CH3領域含有タンパク質の例には、抗体、免疫接着物immunoadhesion、およびCH2/CH3領域に融合またはコンジュゲートした対象とするタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。結合生成物boundproductOは、本明細書において、フィードストリームと平衡状態にあるとき、樹脂に結合する生成物の量を指す。溶出液は、本明細書において、樹脂に曝された流体を指す。溶出液は、樹脂に曝されたロード流体例えば、フロースルー流体を含む流体、樹脂に曝された洗浄流体例えば、洗浄緩衝液、樹脂に曝されたアイソクラチック洗浄流体、樹脂に曝された溶出流体、およびこれらの組合せとすることができる。溶出液は、フロースルー、弱い分配性の結合溶出クロマトグラフィーモードで稼動された樹脂から回収される流体を含む。不純物は、本明細書において、精製されている対象とするタンパク質の試料中にやはり存在する、精製されている対象とするタンパク質以外の任意の分子を指す。不純物として、生体高分子、例えば、DNA、RNA、タンパク質、タンパク質変異体、例えば、凝集タンパク質、高分子量種、低分子量種、および断片など、ならびに脱アミド化種など;精製されているタンパク質を分泌する宿主細胞からの他のタンパク質宿主細胞タンパク質;プロテインAなどの、前の精製ステップの間に試料中に浸出する場合のある、クロマトグラフィーに使用される吸着剤の一部である分子;エンドトキシン;細胞残屑;ならびにウイルスが挙げられる。アイソクラチッククロマトグラフィーは、本明細書において、対象とする期間の間に強度を変化させない溶媒を用いたクロマトグラフィーカラムの稼動を指す。本質的にアイソクラチックな洗浄液は、本明細書において、組成および/またはpHがロード流体からわずかしか変化しない溶液を指す。ロードは、本明細書において、対象とする生成物を含有する任意の材料を指す。ロード流体は、ロードを含有する任意の液体を指す。いくつかの実施形態では、ロード流体は、精製樹脂に曝される。いくつかの実施形態では、ロード流体は、細胞培養培地である。細胞培養培地は、澄ませることができる例えば、細胞または細胞残屑を除去するために。分配係数Kpは、本明細書において、pHおよび溶液組成の指定された条件下での、樹脂に吸収される生成物の濃度Oと、溶液中の生成物の濃度Cとの平衡状態の比を指す。分配係数Kpは、生成物吸着等温線にも関係する。分配係数Kpは、非常に低い溶液濃度で、生成物吸着等温線の傾きに対応する。これは、以下のような最大能力に関係する:Kp=Q/C=Qmax/kd、式中、Qmaxは、生成物についての樹脂の最大能力であり、kdは、樹脂--生成物相互作用についての解離定数である。いくつかの実施形態では、分配係数は、バッチ結合技法で測定される。アイソクラチッククロマトグラフィーなどの他の技法も使用することができる。タンパク質またはポリペプチドは、本明細書において、ペプチド結合を介して一緒に連結されたアミノ酸の連続鎖を含む任意の分子を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すのに使用されるが、当業者は、この用語は、非常に長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して一緒に連結された2つのアミノ酸を含む最小鎖を指すことができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、タンパク質は、5、10、20、50、100、または200超のアミノ酸を含む鎖を有する。タンパク質は、1つまたは複数の別個のアミノ酸鎖を含むことができる。タンパク質には、天然に産生されるタンパク質、または原核細胞もしくは真核細胞例えば、初代細胞、もしくは細胞系内で産生される組換えタンパク質が含まれる。精製ユニットは、本明細書において、例えば、タンデム精製システムにおいて、精製の1つのモードを実施するのに使用することができる物理的なユニットを指す。いくつかの実施形態では、精製ユニットは、樹脂を含む容器例えば、カラムである。いくつかの実施形態では、精製ユニットはフィルターである。本明細書での精製技法は、例えば、カラム形式、膜形式、および/または拡張吸着流動床expandedbedadsorption形式で実践することができる。樹脂は、本明細書において、不純物から生成物を分離するのに使用することができる任意の物質を指す。いくつかの実施形態では、樹脂は、免疫グロブリンに結合する樹脂例えば、プロテインA樹脂である。いくつかの実施形態では、樹脂は、イオン交換樹脂例えば、陰イオン交換樹脂、または陽イオン交換樹脂である。小モジュラー免疫薬またはSMIP商標は、抗原などの同族構造についての結合ドメイン、免疫グロブリンヒンジ領域これは、野生型配列と比べてアミノ酸置換を含んでいても、含んでいなくてもよい、ならびに免疫グロブリンCH2およびCH3ドメインを有する結合ドメイン-免疫グロブリン融合タンパク質を指す。小モジュラー免疫薬は、例えば、米国特許公開第2003/133939号、同第2003/0118592号、同第2005/0136049号、ならびにWO02/056910、WO2005/037989、およびWO2005/017148に記載されている。弱い分配モードは、本明細書において、配合物中に含有される少なくとも1つの生成物、および少なくとも1つの混入物または不純物がともに、クロマトグラフィー樹脂に結合する生成物配合物分離技法を指す。弱い分配モードでの生成物の結合は、クロマトグラフィーの樹脂または培地1mL当たり、少なくとも1mgの生成物である。一般に、弱い分配モードについての生成物分配係数は、少なくとも0.1である。弱い分配モードは、アイソクラチック操作である。弱い分配モードを使用する分離は、米国公開第2007/0060741号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれている。タンデム方法およびシステム本開示は、2つ以上の精製ユニットが、タンデムで、すなわち、ロード流体を複数の精製ユニットに連続して曝すことができるように稼動される方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態では、精製システムは、第1の樹脂および第2の樹脂を含み、第2の樹脂は、弱い分配モードで稼動することができるもの例えば、イオン交換樹脂である。例示的なタンデムシステムを図1に示す。この例示的なシステムでは、プロテインAカラム、AEXカラム、およびVRFフィルターが連結されている。タンデムシステムにおけるバルブは、精製ユニットの任意の組合せをインラインで稼動させるように配置することができる。例えば、第1の樹脂の下流に配置されるバルブは、ロード流体が第1の樹脂に施されている間閉じたままであり、第1の樹脂が洗浄された後、開いたままであることができる。精製ユニットを通過する流体は、要望通りに、後続の精製ユニットに向け例えば、洗浄、平衡化、ロードし、もしくは後続の精製ユニットから溶出するために、または廃棄することができる。精製ユニットは、専門家によって必要に応じて、かつ/または要望通りに、別個に洗浄および/または再生することができる例えば、個々のユニットを通じてのみ向けられる流体、または上流ユニットからの流体を用いて。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるシステムは、疑似移動床システムである。連続して複数の精製ユニットを稼動させると、システム内で望ましくないレベルの圧力または圧力の変化が生じる場合がある。圧力の増大は、様々な手法によって軽減することができる。ポンプは、1つまたは複数の精製ユニットの前、間、および/または後に、流れを促進するために配置することができる。粘度を低減し、かつ/または沈殿し、流れを妨げ、システム内の圧力を増大させる場合のある不純物を除去するために、流体を処理することができる。いくつかの実施形態では、システム内の流体は、粘度を低減するために加熱される。いくつかの実施形態では、第1の精製ユニットの溶出液が、粘度を低減するために加熱される。タンデムシステムが稼動する間に沈殿する場合のある不純物を除去するために、ロード流体または下流流体を処理することによって、流体から物質を分離することができる。いくつかの実施形態では、ポリマー凝集剤が使用される。ポリマー凝集剤の例には、プロタミンスルフェート、キトサン、DEAEデキストラン、アクリルアミド系ポリマー、ポリエチレンイミン、およびポリエチレンアミンが含まれる。いくつかの実施形態では、不溶性塩を形成する陽イオンと陰イオンの組合せ、例えば、1×10-4未満の溶解度積定数を有する塩例えば、CaPO4を形成する陽イオンおよび陰イオンが、流体から不純物を除去するのに使用される。不純物を除去する方法は、例えば、米国公開第2007/0066806号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれている。固体の除去は、濾過によっても実現することができる。沈殿する不純物を除去するための方法のいずれか1つ、または組合せを使用することができる。いくつかの実施形態では、ロード流体例えば、培地は、沈殿する場合のある不純物を除去するために、第1の樹脂に曝される前に処理される。タンパク質精製方法の実施の多くでは、ウイルス不活性化または除去ステップが使用される。ウイルスを不活性化するための一方法は、流体のpHを下げることである。いくつかの実施形態、例えば、低pHが隣接する精製ステップと適合しない実施形態では、ウイルスは、ウイルス低減フィルターに流体を通過させることによって、かつ/または界面活性剤不活性化によって除去される。様々な界面活性剤のいずれも、例えば、TweenまたはTritonX-100を、ウイルス不活性化に使用することができる。いくつかの実施形態では、ロード流体例えば、培地は、ウイルスを除去または不活性化するために、第1の樹脂に曝される前に処理される。弱い分配本明細書で提供される方法の様々な実施形態では、1つまたは複数の精製ステップは、弱い分配モードでクロマトグラフィーを使用する。弱い分配モードでは、生成物含有流体は、樹脂を通過させられ、生成物および不純物がともに樹脂に結合する。しかし、不純物は、生成物よりしっかりと結合する。ローディングが続くにつれて、結合していない生成物が樹脂を通過し、カラム流出物中に回収される。いくつかの実施形態では、樹脂が洗浄されて例えば、アイソクラチック洗浄液で、追加の弱く結合された生成物が回収される。弱い分配モードは、樹脂が、樹脂1mL当たり少なくとも1mgの生成物例えば、1mL当たり少なくとも5、10、20、30、40、50、または60mgに結合する条件によって定義される。弱い分配モードは、少なくとも0.1の分配係数Kpによっても定義される。いくつかの実施形態では、弱い分配モードでの稼動は、約0.2~20例えば、0.2~10、または0.5~5の範囲内のKpによって定義される条件下で稼動させることを含む。弱い分配と対照的に、結合-溶出モードは、一般的に20超のKpによって定義され、生成物を溶出させるのに、ロード後の緩衝液組成の変化を使用する。フロースルーモードは、一般的にKp<0.1によって定義され、生成物を回収するのにアイソクラチック洗浄液を使用する。Kpは、平衡状態における吸着されたタンパク質濃度と遊離タンパク質濃度の比として、バッチ結合実験から計算される。Kpは、平衡化緩衝液、ローディング緩衝液、および洗浄緩衝液中のpHおよびイオンの濃度の関数である。いくつかの実施形態では、弱い分配モードについて、AEXステップは、Kp=1とKp=3の間で稼動される米国公開第2007/0060741号、およびKelleyBD、ToblerSA、BrownP、CoffmanJL、GodavartiR、IskraT、SwitzerM、VunnumS、BiotechnolBioeng.2008年10月15日;1013:553~66を参照。弱い分配のための適切な稼動条件は、生成物を精製するために選択される樹脂の選択に依存する。条件として、pHレベル、およびイオン強度、塩濃度、および/または賦形剤レベルを挙げることができる。いくつかの実施形態では、弱い分配のための条件は、スクリーニングによって同定される。スクリーニングとして、バッチ結合試験またはカラム結合試験を挙げることができる。カラム結合試験として、勾配溶出試験またはアイソクラチック溶出試験を挙げることができる。例えば、当業者は、精製されている特定のタンパク質、および同定されている稼動条件について、どの緩衝液または塩が適切であるかを判定することができる。次いで、例えば、精製される生成物および不純物を含むロード流体が施されたカラムに、ある勾配の選択された緩衝液または塩を通すことによって、選択された緩衝液または塩の最適濃度を判定することができる。カラムの溶出物の画分を収集し、分析することによって、生成物の結合が樹脂1mL当たり少なくとも1mgの生成物である、または代わりに、生成物についての分配係数が少なくとも0.1である緩衝液または塩の濃度を判定することができる。いくつかの実施形態では、分配係数は、バッチ結合実験において、3~6の相比液体の量と樹脂の量で、1~10mg/mLのロードチャレンジの間で測定される。稼動条件が決定されると、弱い分配条件で樹脂に施される流体例えば、プロテインAなどの前の樹脂の溶出液の条件を、本明細書に記載されるように、それに応じて調整することができる。流体が樹脂を通過した後、樹脂は、ある量の本質的にアイソクラチックな洗浄液で任意選択により洗浄される。精製生成物は、いずれの本質的にアイソクラチックな洗浄液からも得ることができ、ロードサイクルの間のカラム流出物からの精製生成物とともにプールすることができる。任意選択の洗浄ステップの後に、例えば、固相表面上の不純物の蓄積を最小限にし、かつ/または樹脂を安定化させて生成物に微生物が混入するのを回避するために、樹脂を任意選択によりストリップ、または再生することができる。高いロード濃度およびロード量が、弱い分配モードで可能である。一実施形態では、ロード流体中の生成物の濃度は、ロード流体1mL当たり少なくとも1mgの生成物であり、別の実施形態では、ロード流体中の生成物の濃度は、ロード流体1mL当たり少なくとも5mgの生成物、別の実施形態では、ロード流体1mL当たり少なくとも50mgの生成物、別の実施形態では、ロード流体1mL当たり少なくとも100mgの生成物である。精製生成物は、樹脂を通過した最大50CVのロード流体から回収することができる。従来のバッチクロマトグラフィーモードにおける正確な配合を得るために、第1の樹脂例えば、proA樹脂の溶出液の滴定は、pHフィードバックによって、またはプログラムされた比の緩衝液を送るポンプによって制御されるポンプの使用を必要とする場合がある。本明細書で提供される方法は、精製手順にロバスト性を加え、より複雑な制御機構の必要性を排除することができる。本明細書で提供されるタンデム精製方法のある特定の実施形態では、生成物は、緩衝液を含む流体中で第1の樹脂から回収される。いくつかの実施形態では、第1の樹脂の溶出液のより早い画分が滴定液と混合される際に、pHの揺れが起こる。条件は、滴定される溶出液はpHの揺れを示すが、溶出液のより遅い画分中の緩衝液が、第2の樹脂の性能に対するpHの揺れという負の作用を緩和するものとすることができることが発見された。例えば、溶出の過程にわたってpHが一貫して低下する限り、proA溶出の最後のpHがタンデムプールtandempoolの生成物の品質および回収率を決定することが見出された。反対に、proA溶出の最初における最適より高いpHは、生成物の品質および回収率に最小の作用をもたらす。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、可変のpHにもかかわらず、タンデムproA-AEXプロセスを稼動することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、このような方法におけるポンプ速度を変更する必要がない。上記に言及したように、分配係数、Kpは、pHおよび溶液組成例えば、イオン強度および緩衝液組成に関係する。イオン交換樹脂に曝すための流体を調製するのに使用される滴定液に塩を添加すると、様々な滴定比にわたって一定の程度の結合強度が維持されることによって、精製のロバスト性が増大することが発見された。この原理は、タンデム法および非タンデム法に適用可能である。さらなる実施形態では、Kpの変化kがある特定の量未満になるタンデム精製例えば、proA-AEXを、溶出液と滴定液の様々な中和比vで設計することができる。Kpおよびvに依存しないロバストな稼動ウインドウを、以下のように関数kとして記述することができる:k=ABS[KpvΔv-Kpv-Δv]/Kpv、、これは、所与の稼動範囲v±Δv内で、Kpの絶対的な変化の程度を示す。例えば、いくつかの実施形態では、vが目標の50~150変化するとき、Kpkの相対変化が100未満になるタンデムproA-AEXは、様々な中和比vおよびパラメータの組合せで行われる。いくつかの実施形態では、タンデムproA-AEXは、目標のvの75~125の範囲内で、k<50の条件で行われる。いくつかの実施形態では、条件は、目標のvの90~110の範囲内で、k<20をもたらす。本明細書で提供される精製方法を改善するための別の態様は、タンパク質がproAから溶出される条件に関係する。高いpKa例えば、5.5以上を有する緩衝液を酸性のproA溶出緩衝液に添加すると、例えば、陰イオン交換樹脂への施用に備えて、引き続いて滴定液で中和する間のpHの変動に対する抵抗力がもたらされることが発見された。5.5以上のpKaを有する緩衝液を表Aに列挙する。これらのいずれも、プロテインA溶出緩衝液中に使用することができる。樹脂結合-溶出樹脂bind-eluteresin、陰イオン交換樹脂、サイズ排除樹脂、疎水性相互作用樹脂、固定化金属親和性樹脂、およびヒドロキシアパタイト樹脂を含めた樹脂の様々な組合せを、本明細書で提供される方法例えば、タンデム精製方法において使用することができる。使用することができる陰イオン交換樹脂には、ジエチルアミノエチルDEAE基、トリメチルアミノエチルTMAE基、4級アミノエチルQAE基、および4級アミンO基などの置換基を有する樹脂が含まれる。使用することができる陽イオン交換樹脂には、カルボキシメチルCM、スルホエチルSE、スルホプロピルSP、ホスフェートP、およびスルホネートSなどの置換基を有する樹脂が含まれる。いくつかの実施形態では、セルロースイオン交換樹脂例えば、WhatmanLtd.Maidstone、Kent、U.Kから入手可能なDE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32、またはCM-52が使用される。精製に使用されるセファデックスベースのイオン交換体ならびに架橋イオン交換体として、例えば、DEAE-セファデックス、QAE-セファデックス、CM-セファデックス、およびSP-セファデックス、ならびにDEAE-セファロース、Q-セファロース、CM-セファロース、およびS-セファロース、ならびにセファロースAmershamBiosciences、Piscataway、N.J.が挙げられる。DEAEおよびCM誘導体化エチレングリコール-メタクリレートコポリマー、例えば、TOYOPEARL商標DEAE-650SまたはTOYOPEARL商標DEAE-650M、およびTOYOPEARL商標CM-650SまたはTOYOPEARL商標CM-650Mなどは、TosoHaasCo.、Philadelphia、Paから入手可能である。市販のプロテインAクロマトグラフィーカラムとして、例えば、PRO-A商標Millipore、U.K.、ProteinASepharoseFASTFLOW商標GEHealthcare、Piscataway、N.J.、TOYOPEARL商標650MプロテインATosoHassCo.、Philadelphia、Pa.、およびMabSelect商標カラムGEHealthcare、Piscataway、N.J.が挙げられる。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーHIC樹脂が精製に使用される。HICは、疎水性に基づいて分子を分離する。一般に、高塩濃度緩衝液中の試料分子がHIC樹脂上にロードされる。緩衝液中の塩は、水分子と相互作用することによって、溶液中の分子の溶液を低減し、それによって、試料分子中の疎水性領域を露出し、したがって試料分子は、HIC媒体によって吸収される。分子がより疎水性であるほど、結合を促進するのに必要とされる塩がより少ない。したがって、生成物分子とHIC媒体の間の相互作用は、媒体のpH、イオン強度、および塩濃度などの条件に依存する。使用することができる市販のHIC樹脂には、疎水性リガンド例えば、アルキル基またはアリール基が結合されるベースマトリックス例えば、架橋アガロースまたは合成コポリマー材料を含む樹脂が含まれる。例として、PhenylHAROSE商標、6FASTFLO商標PharmaciaLKBBiotechnology、AB、スウェーデン;PhenylHAROSE商標HighPerformancePharmaciaLKBBiotechnology、AB、スウェーデン;OctylHAROSE商標HighPerformancePharmaciaLKBBiotechnology、AB、スウェーデン;Fractogel商標EMDプロピルまたはFRACTOGEL商標EMDフェニルE.Merck、ドイツ;MACRO-PREP商標メチルまたはMACRO-PREP商標t-ブチル支持体Bio-Rad、CA;WPHI-PropylC3商標J.T.Baker、N.J.;およびTOYOPEARL商標エーテル、フェニル、またはブチルTosoHaas、Pa.が挙げられる。HICは、弱い分配モードで実施することができる。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが精製に使用される。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、マトリックスおよびリガンドの両方として、式[Ca10PO46OH2]の不溶性ヒドロキシル化リン酸カルシウムを利用する。官能基は、正に帯電したカルシウムイオンC-部位と負に帯電したホスフェート基のクラスターP-部位の対からなる。生成物とヒドロキシアパタイト媒体の間の結合相互作用は、媒体のpH、イオン強度、および賦形剤濃度、例えば、ホスフェート濃度、カルシウム濃度、アルギニン濃度、グリシン濃度、およびHEPES濃度などに依存する。様々なヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂が市販されている。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、弱い分配モードで実施することができる。いくつかの実施形態では、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーIMAC樹脂が精製に使用される。IMACは、樹脂上に固定化されたキレート化遷移金属イオンと、対象とするタグ付けされた生成物上のヒスチジン残基のイミダゾール側鎖との間の相互作用に基づく。分子の分離は、IMAC樹脂上の金属群に対する、対象とするタグ付けされた生成物とカウンターリガンドとの間の競合の結果として起こる。生成物と金属が装填されたIMAC媒体との間の結合相互作用は、媒体のイミダゾール濃度などのカウンターリガンドレベル、およびイオン強度などの条件に依存する。様々なIMAC樹脂が市販されている。IMACは、弱い分配モードで実施することができる。上記樹脂のいずれかを使用する精製は、当業者に公知の条件下で、本明細書で提供される本発明の方法と組み合わせて行うことができる。例えば、proA樹脂を様々な条件下で稼動させることができる。いくつかの実施形態では、proAカラムは、ロード流体と接触させる前に、1つまたは複数の溶液でフラッシュおよび平衡化される。このような溶液は、例えば、緩衝液例えば、トリス、MES、HEPES、ヒスチジン、もしくはホスフェート、例えば、1~500mM、25~100mMの間、もしくは50mM、および/または塩例えば、NaCl、NaPO4、酢酸ナトリウム、もしくはCaCl2、例えば、0~2M、もしくは5~250mMの間を含むことができる。平衡溶液のpHは、一般に、3.5~10例えば、pH6.0~8.0の間である。proA樹脂をロード流体と接触させた後、結合された樹脂を洗浄することができる。洗浄液は、緩衝液例えば、トリス、MES、HEPES、ホスフェート、もしくはヒスチジン、例えば、1~500mMの間、および/または塩例えば、NaCl、CaCl2、NaPO4、もしくは酢酸ナトリウム、例えば、0~2Mの間、および/または添加剤例えば、グアニジン、尿素、スクロース、アルギニン、もしくはアルギニン誘導体、および/または溶媒例えば、エタノール、アセトニトリル、もしくはポリエチレングリコールを含むことができる。洗浄液は一般に、3.5~10の間のpH例えば、4.5~8.0のpHを有する。いくつかの実施形態では、樹脂は、樹脂を平衡化するのに使用されるのと同じ溶液で洗浄される。ポリペプチドは、pH、塩のタイプ、塩濃度、溶媒のタイプ、溶媒濃度、置換剤のタイプ、置換剤濃度、またはこれらの組合せの段階変化または勾配変化を使用して、proA樹脂から溶出することができる。一般に、proA樹脂から生成物を溶出するために、樹脂は、溶出緩衝液と接触させられる。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、塩例えば、NaClまたはCaCl2、例えば、1~100mMを含有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、グリシン、酢酸、またはクエン酸例えば、20mM~250mMを含有することができる。溶出緩衝液は、緩衝液例えば、HEPES、例えば、10~100mMも含有することができる。溶出緩衝液は、酢酸例えば、20mM~約50mM、添加剤例えば、グアニジン、尿素、もしくはスクロース、および/または溶媒例えば、エタノール、アセトニトリル、ポリエチレングリコール、例えば、1~10の溶媒、例えば、5の溶媒も含有することができる。溶出緩衝液のpHは、約2.0~約4.0の範囲となり得る。いくつかの実施形態では、勾配溶出例えば、pH5.0~pH3.0の勾配溶出を生じさせるのにpHを変更することができる例えば、徐々に。一実施形態では、溶出緩衝液のpHは、約3.0である。樹脂から回収した後、本明細書に記載されるように滴定液を添加することによって、例えば、pHを6.0~8.0に調整することによって溶出液を中和することができる低pHが溶出に使用される場合。精製のための生成物本明細書で提供される方法およびシステムは、天然に存在するタンパク質、融合タンパク質、Fc含有タンパク質、免疫複合体、サイトカイン、成長因子、Gタンパク質共役受容体、インターロイキン、ホルモン、および酵素を含めた、対象とする様々な生成物の精製例えば、商業スケールの精製に使用することができる。いくつかの実施形態では、精製を受けるタンパク質は、1つまたは複数の定常抗体免疫グロブリンドメイン複数可を含むことができる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、単一または複数の可変抗体免疫グロブリンドメイン複数可も含むことができる。Fc含有タンパク質は、抗体を含むことができる。タンパク質は、培養された組換え原核生物宿主細胞系または組換え真核生物宿主細胞系を含めた様々な源に由来することができる。本明細書で提供される方法によって精製するためのタンパク質例えば、抗体は、それだけに限らないが、免疫動物の血清、腹水、ハイブリドーマ上清または骨髄腫上清、タンパク質分子を発現する組換え細胞系を培養することから得られる馴化培地、およびタンパク質産生細胞の細胞抽出物から得られる馴化培地を含めた、いくつかの源からのものとすることができる。いくつかの実施形態では、様々なタンパク質産生組換え細胞系の馴化細胞培地からのタンパク質が精製される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、市販の配合物からのものである。いくつかの実施形態では、抗体が精製される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって精製するためのタンパク質は、組換え細胞内の発現によって産生される。多種多様な細胞を、組換えタンパク質を生成するのに使用することができる。対象とするタンパク質例えば、モノクローナル抗体を発現するように組換えDNAで形質転換することができる任意の細胞を、本開示の方法において使用することができる。細胞は、様々な種、例えば、植物、酵母、線虫、蠕虫、昆虫、両生類を含めた真核生物種、または哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、もしくはげっ歯類源由来とすることができる。特定の実施形態では、細胞は、ヒトまたはげっ歯類由来である。特定の実施形態では、細胞は、ハムスター由来例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。使用することができる哺乳動物細胞の例として、BALB/cマウス骨髄腫系NSO/I、ECACC番号:85110503;SP2/0;Balb/c3T3;ヒト網膜芽細胞PER.C6CruCell、Leiden、オランダ;SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1系COS-7、ATCCCRL1651;ヒト胚腎臓系293細胞、または懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングされた293細胞、Grahamら、J.GenVirol.、36:591977;仔ハムスター腎細胞BHK、ATCCCCL10;チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFRCHO、UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:42161980;GS-CHO、CHO-K1、CHO-K1SV、CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-DUXB11、CHO-S;マウスセルトリ細胞TM4、Mather、Biol.Reprod.、23:243~2511980;ラットハイブリドーマYB2/0Shinkawaら、J.Biol.Chem.278:3466~3473、2003;サル腎細胞CV1ATCCCCL70;アフリカミドリザル腎細胞VERO-76、ATCCCRL-1587;ヒト子宮頸癌細胞HeLa、ATCCCCL2;イヌ腎細胞MDCK、ATCCCCL34;バッファローラット肝細胞BRL3A、ATCCCRL1442;ヒト肺細胞W138、ATCCCCL75;ヒト肝細胞HepG2、HB8065;マウス乳腺腫瘍MMT060562、ATCCCCL51;TRI細胞Matherら、AnnalsN.Y.Acad.Sci.、383:44~681982;MRC5細胞;FS4細胞;ならびにヒト肝細胞癌系HepG2が挙げられる。いくつかの適当な細胞系は、アメリカタイプカルチャーコレクションATCC、Manassas、Vaなどの受託機関から得ることができる。使用することができる植物細胞の例には、コウキクサLemmnaminorウキクサ、シロイヌナズナArabidopsisthalania、およびヒメツリガネゴケPhyscomitrellapatensコケの細胞が含まれる。使用することができる昆虫細胞の例には、スポドプテラフルギペルダSpodopterafrugiperdaSf9およびSf21、イラクサギンウワバTrichoplusianiTniおよびBTI-Tn5B1-4、ならびにヨトウガMamestrabrassicaeMbの細胞が含まれる。有用な真菌細胞には、ピキアパストリスPichiapastoris細胞、およびサッカロミセスセレビシアエSaccharomycescerevisiae細胞が含まれる。実施例1プロテインAステップ、陰イオン交換AEXクロマトグラフィーステップ、およびウイルス低減フィルターVRFのタンデム稼動プロテインAカラム、AEXカラム弱い分配モードで実行、およびウイルス低減フィルターVRFのタンデム稼動図1を、MAbおよび小モジュラー免疫薬を精製するために実験室スケールで実施した。ポンプAおよびBは、一定の比の流量で稼動する。ミキサーは、ポンプAによって送られるProA流出物の、ポンプBによって送られる5~20v/vの滴定液との完全な混合を保証する。バルブ1~3は、プロセスの間、単位操作の任意の組合せをインラインとすることを可能にする。例えば、proAロードステップおよび洗浄ステップの間、proAカラムのみがインラインであり、ポンプBはアイドル状態である。1proAカラム体積CVの最終的な高pH/低濃度塩proA洗浄の後、バルブ2および3が開き、ポンプBは、中和緩衝液滴定液をproA流出物に添加し始め、これは、AEXおよびVRFを平衡化するのに使用される。proA流出物は、中和されている最中であり、TMAE洗浄液として使用されるので、低pH溶出および溶出後のproA洗浄の一部の間、3つすべての単位操作はインラインのままである。あるいは、proAカラムの溶出後洗浄液を廃棄に向けることができ、TMAEを専用の緩衝液で洗浄することができる。proAカラムおよびAEXカラムは、別個に再生される。しかし、エタノール含有保存緩衝液を、タンデムで両カラムに適用することができる。溶出の間のUV、pH、および圧力のトレースを表している、タンデムproA-AEX-VRFクロマトグラムの例を図2に示す。圧力の急激な変化は、システムコンポーネントのオンオフのスイッチングによるものであった。図3に示すように、溶出の間の圧力の段階的な上昇は、VRF膜を通過するピーク頂点と相関した。溶出後、VRFにわたる圧力は、ほとんど溶出前のレベルに戻り、圧力上昇は、生成物ピークの粘度によるものであり、膜の詰まりによるものでなかったことを示した。3つの単位操作を含むタンデムプロセスを、いくつかのモノクローナル抗体MAbおよび小モジュラー免疫薬SMIP商標について実行して成功し、インライン中和の実現可能性を実証した。意外にも、システムは、proAのピーク沈殿によって、容認しがたい高い背圧を経験しなかった。再使用で圧力の上昇はまったく観察されず、ファウリングが存在しないことを示した。実施例2凝集させたproAロードを用いたタンデムproA-AEXプロセス生成物、HMW、および他の不純物の沈殿は、proAのピーク溶出および中和の間に起こることが多い。このプロセスは制御することが困難である。固体は、その存在がAEX樹脂のファウリングを引き起こすので、プロセスのストリームから除去されるべきである。いくつかの実施形態では、除去は、0.2μmのフィルターを通じた濾過によって達成される。固体粒子の核形成および成長は、進行して完了するのに場合により時間のかかる、動態学的に制御されるプロセスである。proAピークのプール中和poolneutralizationとAEXローディングの間に大きなタイムラグが存在するので、核形成の継続時間は、通常のバッチクロマトグラフィーに影響しない。しかし、タンデム稼動において例えば、図1に示すような、沈殿が0.2μmのフィルターの下流で発生する場合があり、これは、AEXカラムおよび/またはVRFに有害となる。さらに、これがミキサーを通じて移動する際のproAのピーク頂点の中和により、沈殿物質の濃縮されたバンドが生じることが予期され、これは、フィルターまたは他の下流のコンポーネントを塞ぐ場合がある。したがって、中和されたproAピークの沈殿を最小限にする、ある特定のステップを、proAカラムの上流に導入することができる。馴化培地の凝集は、別個に、またはセントレートcentrateのパッド濾過と組み合わせて、中和後のproAピーク頂点における濁度を著しく低減することが発見された。濁度自体は、詰まりの正確な予測因子ではないが、これは、固体の濃度の好都合な代用測定として役割を果たす。過剰な背圧を伴うことなく、凝集された物質を処理することが可能であったので、濁度を低減することによって、凝集およびパッド濾過は、インライン中和を可能にした可能性がある。以下に説明する実験では、先にパッド濾過された調整培地を、30mMのCaCl2、20mMのK2HPO4、40mMのHEPESpH7.5と1時間混合することによって凝集させ、その後、遠心分離することによって形成された固体を除去した。対照と比較した場合、凝集された物質は、はるかにきれいなproAピーク画分を生じた図4Aおよび図4B。本実施例において説明するすべてのタンデム実験では、このようにして凝集されたCMを使用した。ポリエチレンイミンPEIまたは他の凝集剤を使用することなどの凝集の他の方法も使用することができる。凝集およびパッド濾過はともに、高濃度で、かつpH変化の間に凝集する傾向がある脂質などの疎水性調整培地成分の除去の直交法であると推測することができる。実施例3エンベロープウイルスを不活性化するために、proAロードが溶媒-界面活性剤混合物と処理されるタンデム稼動本明細書で提供されるタンデム精製方法のいくつかの実施形態では、ウイルス不活性化のために保持される低pHは使用されず、その理由は、いくつかの実施形態では、proA流出物は、これがミキサーを通じて移動する際に連続的に中和されるためである。したがって、エンベロープウイルスを不活性化するための代替ステップが必要となり得る。本開示は、溶媒-界面活性剤ウイルス不活性化ステップを、遠心分離による細胞除去の後であるが、proAカラムを通過する前に組み込むことができることを示す。このステップのこのような配置は、proAが、フロースルーおよび洗浄において界面活性剤を除去することができる結合溶出ステップであるので有益である。弱い分配性のAEXステップは、選択吸着を通じて界面活性剤を除去することが予期されない。大きいミセルTritonX-100について70kDa超は、膜によって保持されるので、UF/DFステップによる界面活性剤の除去も非効率的である。同時に、界面活性剤は、細胞溶解、ならびに粘性DNAおよび他の不純物の放出を引き起こすので、細胞除去の前に添加されるべきでない。本実施例において説明されるすべての実験において、0.5w/vまたは0.25w/vのTritonX-100を凝集された調整培地に添加した。界面活性剤の存在は、クロマトグラフィーステップの性能にインパクトを与えなかった。タンデムピーク画分中のTritonX-100の濃度は、RPHPLCによって測定した。界面活性剤は、ロード中の0.5w/vからピーク頂点中の0.0135w/vまで、1.5logの低減で、タンデム稼動にわたって大部分除去された。実施例4proAピークからの生成物ストリームの滴定を伴う、proAおよびAEXクロマトグラフィーのタンデム稼動本実施例は、proAピークからの生成物ストリームの、これが固定された容積比の高pH溶液とともにカラムから溶出する際の滴定を説明する。これは、得られるプロセスストリームを、AEXでの弱い分配性のクロマトグラフィーを促進する特定の範囲のpHレベルおよび塩濃度レベルに移す。弱い分配性のAEXクロマトグラフィーは、より弱い結合性の生成物を犠牲にして、高分子量HMW種および宿主細胞タンパク質HCPなどのより強い結合性の不純物の保持力を達成するために、正確に配合された移動相を必要とする。結合強度は、熱力学的な分配係数、Kpによって決定され、これは、平衡状態における吸着されたタンパク質濃度と遊離タンパク質濃度の比として、バッチ結合実験から計算される。Kpは、AEX平衡緩衝液、ローディング緩衝液、および洗浄緩衝液中のpHおよび陰イオン一般的に[Cl-]の濃度の関数である。Kp=fpH、[Cl-]の関数は、バッチ結合実験から経験的に導出される。従来のバッチクロマトグラフィーモードでは、proAピークは、緩衝剤としてのグリシン、および下流のAEXへの結合強度を制御する塩化物イオンの主要源である塩NaClを含有する低pH緩衝液で溶出される。プールされたピークは、所望のpHに到達するまで、濃縮された中和剤高pHトリス緩衝液で滴定される。したがって、AEXロードのKpは、proA溶出緩衝液の正確な配合および滴定によって制御される。図1に示したようなタンデム配置では、ポンプAおよびBは、予めプログラムされた多様な比の緩衝液を送るように同調させることができる。あるいは、ポンプBは、ミキサーの後のpHメーターからのフィードバックによって制御することができる。これらの実施形態では、AEXロード全体わたって一定のpHを生じさせることができるが、製造施設内で実施およびバリデートするのに高価となり得る。本開示によって提供されるタンデムプロセスの一例では、ポンプは、一定またはほぼ一定の比の流量で稼動する。高pHの最終的なproA洗浄緩衝液は、proAカラムから出てくる際に低pH溶出緩衝液で置換されているので、溶出ストリームのpHは可変である。さらに、proAリガンドおよび吸着された生成物はともに、溶出緩衝液中で酸を吸収する滴定可能残基を有する。これにより、proA溶出のpHが、生成物ピークより遅れる。したがって、proA溶出ストリームの組成は、proAWash2緩衝液から、ピークの前縁部において緩衝能をまったく有さない溶出緩衝液まで、ピークの末端において改変されていない溶出緩衝液まで変化する。結果として、proA流出物が一定の比の高pH中和緩衝液で混合されるとき、pHトレースは、pHの揺れを示す。図5は、このpHの揺れを示す、分画されたproAピークの濃度およびpHのオフライン分析である。ポンプが一定の流量を搬送する場合、得られるpHは、proA溶出の過程にわたって変化する。図5に示したように、オフライン緩衝液滴定実験により、滴定される溶出緩衝液の最終的なpHは、約pH7.9で安定化することが正確に予測された。溶出緩衝液の早い画分は、酸をほぼ欠いており、結果として、中和緩衝液で過剰滴定された状態になった。pH8.3への結果として生じるpH偏位がピーク頂点の間に起こった。このpH偏位は、弱い分配モードで稼動する下流のAEXカラムへの、影響されたproAピーク画分のより堅い結合を引き起こし、生成物回収に悪影響を与える。意外にも、溶出緩衝液のより遅い画分は、十分な緩衝能を含んでおり、したがって、予期されたpHレベルに中和され、より早くに結合された追加の生成物の脱離を引き起こし、許容される収率をもたらした。AEXカラムは、pHが著しく変化したにもかかわらず、HCPの除去において順調に稼動し、許容されるレベルまでのプロテインAを浸出した。したがって、タンデムproA/TMAEは、TMAEを稼動させる間にpHが広く揺れたにもかかわらず、弱い分配性クロマトグラフィーの使用を可能にした。溶出の過程にわたってpHが一貫して減少する限り、proA溶出の最後のpHのみがタンデムプールの生成物の品質および回収率を決定することが見出された。反対に、proA溶出の最初における最適より高いpHは、生成物の品質および回収率に最小の作用をもたらす。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、可変のpHにもかかわらず、タンデムproA-AEXプロセスを稼動することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、このような方法におけるポンプ速度は一定である。実施例5ProAおよびAEXクロマトグラフィーのタンデム稼動のための、塩基性であり、塩を含有する滴定液の使用ともに塩基性でありAEXステップの稼動より約0.5pH単位上のpHレベル、および100mM~2Mの間の緩衝液濃度レベル、塩を含有する、プロテインAおよびAEXのタンデム稼動のための滴定液の使用を試験した。条件は、滴定液を添加すると、広範囲の滴定液量添加の関数として、一定のまたはほぼ一定の結合Kp、分配係数のような測定基準によって測定した場合を維持するような様式で、プロセス中間体のpHおよびプロセス中間体のイオン強度がともに上昇するように設計した。中和比vとさらに呼ばれる、ポンプAおよびB例えば、図1に示したからの流量の目標容積比を設定するために、pHおよび塩化物濃度、[Cl-]、ならびにしたがってKpに対するvの効果が、最初に求められなければならない。pHは、vの関数、すなわち、pH=fvであり、これは、Henderson-Hasselbach方程式から計算し、溶出緩衝液を滴定することによって検証することができる。vの関数としての塩化物イオンの濃度、すなわち[Cl-]=fvも、任意の比の緩衝液で計算することができる。得られるvのpHおよび[Cl-]についての関数は、経験的に導出される関数、Kp=fpH、[Cl-]中に置換し、図6Aに示すようにプロットすることができる。稼動の目標vは、所望のKpに基づいて選ばれる。Kp=fvのこの形状は、現在の最新技術を反映する。したがって、関数のこの形状を生じさせるパラメータの組合せは、稼動の対照モードと呼ばれる。図6Aに示した例では、低pHproA溶出緩衝液は、NaClを含有し、一方、中和緩衝液は、塩をまったく含有しない。したがって、vの増大とともに[Cl-]が降下する間、pHは上昇し、Kpが着実に増大する。稼動のこのモードは、所望のAEX性能を保証するために、正確で一定の中和比を維持するのに極めて重要となるので、課題を提示する。ポンプ性能が変わりやすい場合があるので、この精度は、製造スケールで達成することが困難となり得る。中和緩衝液中に塩を組み込むことによって、図6Bに示すように、Kp関数の形状を著しく変化させることができることが見出された。Kp関数のこの挙動は、添加される滴定液の量とともに、pHおよび[Cl-]が同時に上昇することによるものである。より高いpHは、AEXへの結合をより強くし、一方、より高い[Cl-]は、反対の効果を有する。これらの2つの効果の和により、広範囲の滴定液添加において一定の結合強度の領域が生じる。Kp=fv関数のこの形状を生じさせるパラメータの本発明の組合せは、本開示によって提供され、稼動のロバストモードと呼ばれる。図6Aおよび図6Bに示した例は、滴定液に塩を添加すると、proAカラム後のインラインでの緩衝液混合の精度に関して、タンデムプロセスがよりロバストになることを実証する。ロバストなタンデム稼動を視覚化する別の方法を、図7に表す。ハイスループットバッチ結合実験から得られる経験的なモデルKp=fpH,[Cl-]は、一定の結合強度を生じさせるpHと[Cl-]の関係を示す等Kp線を描くことを可能にする。上記に論じた滴定モデル図6Aおよび図6Bから、中和されるproA流出物のpHを、[Cl-]の関数としてプロットすることができる。現在の最新技術によれば、図7Aに示したように、[Cl-]が上昇していると、pHは降下していることになる。しかし、酸性proA溶出緩衝液がNaClも含有する塩基性中和緩衝液で滴定される場合、混合物中の塩化物イオン濃度は、vとともに直線的に上昇する。したがって、図7B中で総[Cl-]の関数としてプロットされる、滴定される溶出緩衝液のpHは、図6B中のpH関数と同じ形状を有することになる。pH=f[Cl-]関数の一部は、等Kp曲線と重なることになる。重なりのこの領域において、滴定液量の小さい変動は、等Kp線に沿ったシフトを引き起こし、それによって、AEX樹脂への結合強度に影響しない。中和緩衝液中に塩を含まない稼動モード図6Aおよび図7A、対照モードと、塩を含む稼動モード図6Bおよび図7B、ロバストモードとの間の明らかな差異を、治療剤MAbを用いて実証した。バッチクロマトグラフィーによるこの分子の精製は、proAのプール中に高レベルのHMWをもたらす。このHMWは、弱い分配性TMAE陰イオン交換クロマトグラフィーステップによって有効に除去される。したがって、HMWの除去を、タンデム稼動における純度のマーカーとして使用した。シミュレーションおよび実験で使用した緩衝液の組合せを表1に要約する。緩衝液組成は、v=11.5での稼動の両モードについて、同じKp=1.25を生じるように選んだ。対照溶出緩衝液組成は、表3に示した、臨床的製造キャンペーンにおいて使用したものと非常に類似する。図6に示した稼動の2つのモードのシミュレーションを、中心点v=11.5、過少滴定点v=6.5、および過剰滴定点v=16.5で、合計6回の実行でタンデムを実施することによって実験的に検証した。対照モードおよびロバストモードについてシミュレートしたKp関数の重ね合わせを図8に示す。定義により、両モードは、中心点において、生成物純度および回収率に関して同様に機能することが予期される。しかし、これらのKp関数は、vの自由裁量で選んだ偏差の2つの両極端で劇的に相違する。例えば、v=6.5ポンプBの流量の46.5の減少と等価で、得られるKpは、対照モードにおける91の減少と比較して、ロバストモードでは、28しか減少しない。同様に、v=16.5ポンプBの流量の52の増加と等価で、Kpは、ロバストモードでは15しか降下しないが、対照モードでは197上昇する。したがって、このモデルは、ロバストモードにおける、中和比の±5の絶対変化の後の、生成物の品質および回収率の相対的に小さい変化を予測する。しかし、対照モードでは、5の過少滴定は、HMWおよびHCPのブレークスルーをおそらく引き起こす一方で、5の過剰滴定は、生成物の回収率の損失をもたらす可能性がある。実施例6様々な中和比v、およびvが目標の50~150変化するときに、100未満のKpkの相対変化をもたらすパラメータでのproA-AEXタンデムステップの稼動この実施例では、タンデムproA-AEXステップを、様々な中和比v、およびvが目標の50~150変化するときに、100未満のKpkの相対変化をもたらすパラメータの組合せで行った。より正確には、条件は、目標vの90~110の範囲内で、k<20をもたらした。稼動パラメータは、溶出緩衝液および中和緩衝液のpH、塩濃度、およびpKaである。本明細書に記載される方法の様々な実施形態は、ロバストプロセスは、ロバスト性ウインドウ内の目標vで稼動するべきであることを示す。いくつかの実施形態では、プロセスは、ロバスト性ウインドウの中心で稼動する。Kpおよびvの値に依存しないロバストな稼動ウインドウを定義するために、関数、k=ABS[KpvΔv-Kpv-Δv]/Kpv、、を使用することができ、これは、所与の稼動範囲v±Δv内のKpの絶対的な変化の程度を示す。例えば、実施例5で論じた条件について、Δvが10に設定される場合、k関数は、k20=ABS[Kp0.9v-Kp1.1v]/Kpv、、となり、これは、図9にプロットされている。このグラフに示したロバストな稼動ウインドウは、k20が<20である場合のvの範囲に及ぶ。v=11.5での稼動のロバストモードの中心点は、k=0に対応し、これを稼動するのに最も好ましいスポットにしている。対照的に、対照モードの中心点は、k=61を生じる。これは、過少滴定10条件から過剰滴定10条件までシフトすることによって、TMAEロードのKpは、対照モードでは61シフトすることになる一方で、ロバストモードでは一定のままであることを意味する。ロバストな稼動ウインドウの外側でタンデムプロセスを稼動させると、中和比の許容される偏差が著しく制限されることになり、プロセスをより失敗する傾向にすることが予測される。タンデム稼動の任意の所与のレシピについて、Kp関数が未知であっても、実施例5に論じたロバストモードの実行範囲は、実験的に求めることができる。例えば、Kpおよびkはともに、vが目標の90、100、および110に設定される、一連の3つのバッチ結合実験で測定することができる。実験セットアップは、図1による、抗IL-13抗体を精製するための2つのカラムのタンデムシステムを基にした。これは、1.1cm×23cmのproAMabSelectカラム、その後の10cm2、0.2μmのSterivexフィルターユニット、その後の1.6cm×14cmのAEXTMAEカラムからなった。中和後の沈殿を最小限にするために、調整培地をリン酸カルシウムで凝集させ、パッドで濾過した。インラインでのproAピーク中和は、全流量の6.5~16.5の範囲内で、ある特定の比のポンプBからの流量を送るようにAKTAFPLCシステムをプログラミングすることによって達成した。この実験では、VRFユニットを迂回した。TMAE後に画分を採取して、オフラインでpHおよび濃度を測定した。画分中のHMWをSEHPLCによって評価した。HCPのELISAおよび浸出したproAのELISAを、画分のプールに対して実施した。溶出ピーク領域を示す、プロセスのクロマトグラムの一部を図10に示す。タンパク質ブレークスルーの程度は、対照中和モードおよびロバスト中和モードを代表する各群内で予期された通りであった。2つの群の間のピーク保持時間の著しいシフトは、proA溶出緩衝液の異なるpHに起因した。対照モードは、ロバストモードより低いpHの溶出緩衝液を使用し表1を参照、proAカラムからのより早い溶出、およびTMAEカラムを通じた生成物のより早いブレークスルーをもたらす。TMAE後の画分におけるオフライン測定を、図11A~11Fに示す。予測されたように、稼動のロバストモードは、vによってあまり影響されない。図11B、図11D、および図11Fは、非常に類似したpH、濃度、およびHMWのプロファイルを有するように思われる。反対に、対照モードは、vが6.5~11.5~16.5に変化する際に、HMWブレークスループロファイルおよび生成物溶出プロファイルの明確なトレンドを示した図11A、図11C、図11E。過少滴定v=6.5、図11Aは、TMAE樹脂に生成物および不純物が有効に結合するには低すぎるpHレベルをもたらした。結果として、生成物ピークは非常に鋭く、HMWは、溶出の早期にブレークスルーした。過剰滴定v=16.5、図11Eは、反対の結果、すなわち、HMWのブレークスルーはまったくないが、非常に広い溶出および低い生成物回収率をもたらした。中心点で対照を実行した際の、より早いHMWのブレークスルーはv=11.5、図11C、pH=2.8でproAカラムから溶出する非常に濃縮されたバンドのタンパク質に、TMAE樹脂が対処することができないことによって生じた孔の閉塞などの非平衡状態作用に起因する可能性がある。図11中の実行からの純度の結果を表2に要約する。予測されたように、過少滴定された対照を実行すると、最高レベルの不純物をもたらした。しかし、アッセイの感受性の限界のために、他のプールを区別することが不可能であった。実験結果により、ロバスト性モデルからの予測が確認された。タンデムの性能は、塩が中和緩衝液に添加された場合、実際によりロバストであることが示された。実施例7プロテインAからの溶出溶出条件付近のpKaを有する緩衝液通常、酸性条件で、またはこの条件付近で稼動される、およびまた、後続のAEXステップの稼動付近のpKaを有する緩衝液通常、中性または塩基性条件で、またはこの条件付近で稼動されるを含有する溶液でプロテインAから溶出させると、プロテインAから溶出する際のプロセスストリームの中和の間のpH偏位が防止されることが発見された。一定の中和比を伴ったタンデム稼動では、proA溶出の前縁部は、目標より高いpHを場合により有する。pHの上昇は、滴定可能なproAリガンドおよび結合生成物を含有するロードされたproAカラムを溶出緩衝液が通過する際に、溶出緩衝液による緩衝能が喪失することによって引き起こされる。高pH中和緩衝液が、酸が枯渇した溶出緩衝液に添加されると、pHは、ほとんど中和緩衝液のレベルまで上昇し、proAカラム上のすべての残基が滴定され、酸含有溶出緩衝液がミキサー中に現れるまで高い状態に留まる。通常、pH偏位は、タンパク質のフロントがAEXを通過する直前に起こり、タンデムプールの品質または回収率に影響しないが、場合により、pHの上昇がピーク収集の間に観察される。pHの上昇は、目標pHの中和される溶出緩衝液がカラムを通過する前に、AEXが高度に結合性の条件でロードされていることを意味する。いくつかの場合では、このpH偏位は、樹脂ビーズの表面への生成物またはHMW不純物の非可逆性結合を引き起こし、孔閉塞およびAEXの結合能力の早すぎる喪失をもたらす場合がある。pHの揺れを緩和するために、ロバストモードにおいて20mMのトリス-HClを溶出緩衝液に添加し、表1に列挙した目標のpH=3.7にpHを調整した。酸性化されたトリスは、これがproAカラムを通過する際にプロトン化された状態に留まり、中和の間の過剰の塩基性トリスに対する抵抗力をもたらした。図11に示した、タンデム画分におけるオフラインpH測定の比較は、pHの揺れの程度に対するトリス-HClの効果を実証する。ロバストな中和の実行は、対照の実行より軽度のpHトレンドを示す。例えば、中心点での実行v=11.5、図11C、Dにおいて、pHは、ロバストモードでは、ピーク溶出の間に0.1単位しか減少せず、一方、対照モードでは0.3単位減少した。すべてのロバストな実行では、pHの揺れは、タンパク質濃度がピークとなるとき、大部分は終わっているが、対照の実行では、pHは、目標より依然としてはるかに高い。実施例8バッチproAクロマトグラフィーとその後のバッチAEXクロマトグラフィーの稼動タンデムでない実施例5、6、および7に記載した条件で、バッチproAクロマトグラフィーとその後のバッチAEXクロマトグラフィーを実施した。従来のバッチクロマトグラフィーでは、中和されるproAプールのpHおよび伝導率は、AEXステップの性能、およびしたがって生成物の品質に影響する極めて重要なパラメータである。低pHウイルス不活性化ステップの後、proAピークのプールは、弱い分配性AEXステップに適したものにするために、ある特定のpHに中和される。バッチ中和は、通常、AEXの実行の作業pH付近のpKaを有する濃縮された緩衝剤を含有する1~2容量の滴定液を徐々に添加することによって実施される。滴定は、pHが所望の値に到達するまで進行する。伝導率は、モニターおよび記録されるが、pHと独立に調整することができない。pHおよび伝導率はともに、同時に目標値に到達することが理想的である。しかし、不完全な混合、およびpH測定での温度の効果のために、滴定の最後でのpHの読みが不正確となり、多すぎる、または十分でない滴定液がプールに添加される場合がある。偶発的な過剰滴定の状況では、緩衝剤は、伝導率に対して穏やかな効果しか有さないので、中和されるプールの実際のpHは、伝導率より高い程度で目標を上回ることになる。pHの上昇は、Kpの全体的な増大、およびAEXステップの間の生成物回収率の対応する減少を引き起こすことになる。同様の理由で、過少滴定は、目標より低いpHをもたらし、これは、伝導率の適切な減少によって補償されない。この場合、生成物の品質は、不純物のより弱い結合によってインパクトを与えられる。さらに、2つの極めて重要なパラメータpHおよび伝導率を独立して制御する能力を伴わないで、これらを同時に満たすためのGMP要求事項は、バッチの不合格のリスクを増大させる場合がある。したがって、一方のパラメータの偏差を、他方のパラメータに、適切な方向に自動的に影響を及ぼすことによって補償するためのビルトイン機構を伴う中和機構を有することが望ましいはずである。例えば、[Cl-]および伝導率が付随して増大して過剰滴定が起こる場合、Kpの全体的な変化はまったく生じない。緩衝液が正確に配合されているという条件で、pHは、伝導率と関連付けられるはずなので、このような機構は、2つの極めて重要なパラメータを有する必要性を排除する。代わりに、バッチ記録は、プールに添加される滴定液の容積画分vのみを指定することができる。滴定液中に濃縮された塩を組み込むと、上述した効果が達成されることが発見された。連続的な中和を記述するのに実施例5および6で論じた同じ数学モデルおよび物理モデルを、バッチクロマトグラフィープロセスのためにここで適用する。中和緩衝液中に塩をまったく含まず、積極的なproA溶出条件を伴う対照モードを、中和緩衝液が濃縮されたNaClを含有し、proA溶出が相対的に穏やかなpHで起こるロバストモードと比較した。例示的な緩衝液組成を表3に要約する。タンデムモデルと同様に、条件は、同じ中和比v=1.15で、稼動の両モードについて同じKp=1.25を生じるように設計した。対照モードの緩衝液は、やはり表3に列挙した製造キャンペーンで使用したものと非常に同様である。バッチ記録により、pH7.8へのproAプールの滴定が指定され、これは、v=1.40でKp=0.81に対応した。図13に示したバッチプロセスについてのvの関数としてのpH、[Cl-]、およびKpの例は、図6のタンデムプロセスについてのものと非常に類似しているように思われる。中和緩衝液は、タンデム稼動において使用される濃度の正確に10倍であり、一方、vは、タンデムにおけるものの正確に0.1倍であることにも注目することができる。この予期しない結果は、本明細書で提供される本発明の方法のスケーラビリティを実証し、ロバストな中和条件を求めるためのモデルは、広範囲のvにおいて適用可能であることを示す。図14は、過剰滴定および過少滴定の異なる効果が、稼動のロバストモードおよび対照モードにおいてKp=fvに乗ることを示す。例えば、滴定が目標のv=1.15の代わりにv=0.55で停止される場合、ロバストモードにおけるKpは1.09となり、一方、対照モードでは、これは0.08に低減され、TMAEステップの失敗をもたらす可能性がある。図14Bは、稼動の主張したロバストウインドウを定義し、ここで相対的なKp変化の関数、k=ABS[Kp1.1v-Kp0.9v]/Kpv、は、20未満である。ロバストモードおよび対照モードにおけるkの挙動の比較は、ロバストモードにおいて、滴定液添加の0.75~1.55の間のいずれかしかし、好ましくは1.15の滴定目標に設定することは安全であるが、対照モードは、vの±10の範囲内でkの著しい変化を生じることを実証する。実施例9様々な結合条件でのタンデム精製条件の様々な組合せで、対照バッチAEX、またはタンデムproA-AEXによって小モジュラー免疫薬を精製した。図15A~15Cは、弱い結合条件Kp=1.5をもたらすようにプログラムされたproA中和を使用したこれらの精製スキームの比較を示す。1つのタンデムプロセスでは、溶出緩衝液中にトリスを含まない積極的な溶出pH3.5を使用した。第2のタンデムプロセスでは、穏やかな溶出pH3.75を使用し、溶出緩衝液中にトリス-HClを使用した。proA溶出緩衝液にトリスを添加すると、滴定後に見られるpH上昇が解消された。より高いpHの緩衝液でproAを溶出すると、HMW1種に結合することについて、AEXの言われている動態学的限界が緩和された。生成物の品質は優れていた。第2のセットの実験では、条件の様々な組合せで、対照バッチAEX、またはタンデムproA-AEXによって小モジュラー免疫薬をやはり精製した。図16A~16Cは、第1のセット実験より強い結合条件Kp=3.0をもたらすようにプログラムされたproA中和を使用したこれらの精製スキームの比較を示す。1つのタンデムプロセスでは、溶出緩衝液中にトリスを含まない積極的な溶出を使用した。第2のタンデムプロセスでは、穏やかな溶出を使用し、溶出緩衝液中にトリス-HClを使用した。より強い結合条件では、積極的な溶出プロセスにおいてHMW1のレベルが低減した図16B。回収率は、すべての場合において90超であった。均等物当業者は、本明細に記載されている本開示の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常の実験程度の実験を使用して確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記説明に限定されることは意図されていない。代替の方法および材料、ならびに追加の用途は、当業者に明らかとなり、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。"