"a1つ以上の疾病一次組織サンプルおよび1つ以上の健常一次組織好ましくは疾病組織に相当するものを提供し、b前記サンプルからMHCリガンドペプチドを単離し、c前記リガンドペプチドのHPLCMS分析を実施し、dステップcから派生し、前駆体イオンシグナル強度面積を各シグナルに対し抽出し、e異なる測定操作とサンプルの間の面積をグループ化するために、フラグメントスペクトルのクラスタリングおよびデータベース検索により前記MHCリガンドペプチドの配列を同定し、さらに反復測定内の面積を正規化し、反復測定間の技術的性能/感度の差を補正し、誤差推定値を含む1サンプル当たりの各ペプチドの平均量を得て、f異なるサンプル間の比較で、対立遺伝子特異的配列サブグループを生成するために前記配列をMHC対立遺伝子に割り当て、さらに該対立遺伝子特異的サブグループを使って異なるサンプル間を正規化し、異なるサンプルサイズまたはMHC発現レベルを説明すると、結果がサンプル間で比較可能な相対量となり、gサンプルすべてのペプチド再現性に基づきデータの品質管理を実施し、同定した配列総数および面積分散が小さい配列数ができるだけ高いことを検証し、hMHCリガンドペプチドの過剰発現の可能性を測定するために、提示プロフィールと提示スコアを計算し、i同定と区間推定値の質をコントロールするが、例えば、ペプチド同定結果と区間再現性の外観検査によるか、または統計的解析によって行い、j前記の1つ以上の疾病一次組織サンプルで検出された値を、前記の1つ以上の一次健常組織から得た値と比較し、k前記MHCリガンドペプチドを定量するステップを有する、一次組織サンプル中のMHCリガンドペプチドの同定/無標識定量の方法。前記MHCリガンドペプチドは、腫瘍関連ペプチドTAAまたは疾病関連ペプチドDAAから選択される、請求項1に記載の方法。さらに、過剰提示されるおよび/または腫瘍特異的MHCリガンドペプチドの選択を含む、請求項1または2に記載の方法。前記疾病サンプルは腫瘍サンプルまたは感染組織サンプルである、請求項1~3のいずれか一に記載の方法。品質管理は自動化および/または手動点検によって実施される、請求項1~4のいずれか一に記載の方法。保持時間を調製し、配列についての知識なしに反復測定内で対応するシグナルを割り当てる、および/または配列の知識無しに保持時間を調整することにより異なるサンプル間に対応するシグナルを割り当てるステップd、遺伝子1つ当たり2以上のペプチドから相対的提示データを実行し、遺伝子中心の過剰提示スコアを計算するステップh、および注入したペプチドに基づき品質管理を実行するステップiのグループから選択された1つ以上のステップをさらに含む、請求項1~5のいずれか一に記載の方法。前記方法はinvitroで実施される、請求項1~6のいずれか一に記載の方法。前記方法のステップは指示される順序で実施される、請求項1~7のいずれか一に記載の方法。前記方法は指示されるステップから構成される、請求項1~8のいずれか一に記載の方法。。前記方法によって合成機または手動で同定および/または定量されるように、1つ以上の前記MHCリガンドペプチドを合成するステップをさらに含む、請求項1~9のいずれか一に記載の方法。前記MHCリガンドペプチドを、免疫原性について合成ペプチドとしてテストするステップをさらに含む、請求項10に記載の方法。前記サンプルは1個人に由来する、請求項1~11のいずれか一に記載の方法。同定および/または定量時の前記MHCリガンドペプチドに基づいた、個別のMHCリガンドプロフィール、好ましくは個別の疾病特異的MHCリガンドプロフィールを生成することをさらに含んだ、請求項12に記載の方法。同定配列の前記総数および面積分散の小さい配列数は5を、好ましくは25を、さらに好ましくは50を、最もこのましくは100を超える、請求項1~13のいずれか一に記載の方法。以下の例は、TAA/がんの状況における本発明の方法を説明している。これらの例は、本発明の好ましい1実施形態にすぎず、本発明はこれらに限定されない。本発明の目的のため、本明細書で引用されている全ての参考文献が、その全体の参照として組み込まれている。方法:組織サンプル患者の腫瘍組織および正常組織は、分析された腫瘍実体によって異なる数箇所の病院から提供された。手術前にすべての患者から書面でインフォームドコンセントを得た。組織は、術後直ちに液体窒素で衝撃冷凍し、TUMAPを単離するまで-80°Cで保存した。組織サンプルからのHLAペプチドの単離衝撃冷凍した組織サンプルのHLAペプチドプールは、わずかに修飾したプロトコールに従い、HLA-A、-B、-C特異的抗体W632、HLAA02特異的抗体BB72、CNBr-活性化セファロース、酸処理、および限外ろ過により、固体組織から免疫沈降によって得た。異なるHLA対立遺伝子に対し、当分野で既知の他の特異的抗体が使用でき、例としてA03用のGAPA3、B対立遺伝子用のB1232がある。質量分析得られたHLAペプチドプールをその疎水性に従い逆相クロマトグラフィーnanoAcquityUPLCsystem、Watersにより分離し、溶出したペプチドは、ESI源付きLTQオービトラップ型ハイブリッド質量分析計ThermoElectronで分析した。ペプチドプールを17μmC18逆相充填剤Watersが詰まった分析用溶融シリカミクロキャピラリーカラム75μm内径x250mmに、流速400nL/minで直接装填した。その後ペプチドを,流速300iL分で10から33まで,2段階の180分バイナリ勾配をかけて分離した。勾配は、溶媒A01蟻酸水溶液と溶媒B01蟻酸アセトニトリル溶液から成る。金被覆ガラスキャピラリーPicoTipNewObjectiveをnanoESI源の導入に使った。LTQオービトラップ型質量分析計はTOP5法とTOP3法を使ってデータ依存モードで操作した。手短に言えば、オービトラップでTOP3ではR=30000、TOP5ではR=60000、高い質量確度の全スキャンからスキャンサイクルを開始し、続いて、以前に選択したイオンTOP5を動的排除した5つの最も多量に存在する前駆イオンについてはオービトラップでR=7500、または以前に選択したイオンTOP3を動的排除した3つの最も多量に存在する前駆イオンについてはLTQで、MSMSスキャンを実施した。データ解析各サンプルについて、TOP5モードで2回、TOP3モードで3回の5回の無標識LCMS反復測定を得た。LCMSデータは、LCMS調査とタンデムMSMSMSデータを分析する自家パイプラインにより処理された。我々の漸増する反復取得の設定、および標準的プロテミクスソフトウェアによって満足に取り扱われないペプチドミクスデータについては、専用のデータ解析で最適化され、採用されている。新しい各データセットは、ImmaticsDiscoveryデータベースMySQLに統合される。全データは、入手可能なプロテオームデータ、ゲノムデータ、および文献データと相互参照される。配列の同定タンデムMSスペクトルはmsnextractThermoScientificを使って抽出し、IPIデータベースに対してSequestで検索した。タンパク質データベースのヒットはその後、HLAペプチドミクスデータ用に最適化した閾値を使い、自動品質フィルタリングにより検証される。増大するペプチドワクチン候補はさらに手動点検によって確認される。同定したペプチド配列は、発生した天然ペプチドの断片化パターンを、合成配列の同一参照ペプチドの断片化パターンと比較して確認した。図1は、ペプチドCDC2001関連MHCクラスIの腫瘍、およびUPLC系のその溶出プロフィールから得られた典型的なスペクトルを示す。同定感度の増大に対して、社内で開発したスペクトルクラスタリングアルゴリズムを使用して、スペクトルを、IFLImmaticsFragmentspectraLibraryに収集されている既知ペプチドMSMSに割り当てた。新たなLCMS測定のMSMSスキャンを、IFLのスキャン毎に徐々に増大させながら追加する。クラスタリングは、スペクトルデータに採用された、成長しているk平均法クラスタリングアルゴリズムを使用している。スキャン間の対類似性はMuQestThermoScientificによって測定する。各クラスターはコンセンサススペクトルによって示される。これらのコンセンサススペクトルは、余分なスペクトルを除くことにより、下流解析をスピードアップするために使用できる。コンセンサススペクトルは実験MSMSスペクトルの平均化の結果であるので、前駆体の質量は、より正確であり、そのスペクトルのノイズはより少ない。TUMAPの相対的定量LCMS調査データは、高質量確度を使用するタンデムMSとは独立して解析された。LCMSシグナルとそのシグナル領域イオン計数を抽出するために、プログラムSuperHirnETHZurichが使用された。そのため、各同定ペプチドは定量的データと関連づけることができ、サンプルと組織間の相対的定量を可能にする。技術的および生物学的反復測定間のバラツキを説明するために、中心傾向による正規化に基づき2段階の正規化スキームが使用された。この正規化は、ほとんどの測定シグナルがハウスキーピングペプチドの結果であり、過剰提示されるペプチドの少量画分はデータの中心傾向に有意に影響しないことを前提としている。最初の正規化ステップにおいて、同一サンプルの反復測定は、各ペプチドの各々の反復測定セット中の各ペプチドの平均提示を計算することにより、正規化される。この平均値は、各ペプチドおよびLCMS測定に対する正規化係数を計算するのに使用される。全ペプチドを平均化すると、結果として、特定のLCMS測定の全ペプチドに適用される、測定正規化係数が得られる。このアプローチでは、例として反復測定間で注入量が異なることによる、系統的な内部サンプルのバラツキが除かれることを保証する。反復測定領域間で25未満の変動係数を有するペプチドのみが、次の正規化ステップで考慮される。ここでも、各ペプチドの平均提示が、この時点では定義した提示抗体例BB72の全サンプルについて計算される。この平均値は、各ペプチドおよびサンプルに対する正規化係数を計算するのに使用される。全ペプチドを平均化すると、結果として、特定のサンプルの全ペプチドに適用される、サンプル正規化係数が得られる。その故、異なる組織重量またはMHC発現レベルによる系統的バイアスが除かれる。過剰提示されたペプチドを抽出するために、各ペプチドに対し提示プロフィールが計算され、サンプル提示の平均値と反復測定のバラツキを示す。プロフィールは、関心のある腫瘍実体サンプルを正常組織サンプルのベースラインと対比させるために並べて置く。これらの各プロフィールは、誤発見率FalseDiscoveryRateFDRによる多変量検定を補正する線形混合効果モデルGNURのp値を計算することにより、過剰提示スコア内に整理統合された。それらのp値により全ペプチドをランク付けすると、提示の観点から、最も期待できるワクチン候補が出てくる。β2mミクログロプリンの定量β2mミクログロプリンb2mは、基準タンパク質としてβアクチンを使用してウェスタンブロッティングによって定量し、ゲル上に負荷したタンパク質量に対して正規化した。結果細胞株によるTUMAP定量法の開発定量パイプラインを確立するために、異なる方法が適用された。第1にサンプルのバラツキをシミュレーションするために、2と20に希釈したJY細胞株を使って希釈実験を実施した各希釈サンプルについて、反復測定を3回行った。測定間およびサンプル間のバラツキを正規化後、2つのサンプル間の正規化係数は995であった。第2の実験では別のJYサンプルを、トリプシン消化されたMassPREPTMWatersタンパク質混合物ホスホリラーゼb、BSA、ウシヘモグロビン、エノラーゼ、ADHを100、10および1fmolに希釈して注入した。再び、各濃度を3回反復測定した。データ解析後、既知の注入ペプチド間の平均比は、1対100fmol、100対10fmol、および10対1fmolのサンプルを比較した場合、各々90、8、11であった。さらに、異なる取得方法を比較し、ペプチド同定数と確度、さらに本実験の設定における定量精度を最大にした。この目的に対し、異なるMSMSモードにおいて、JYサンプルを約50回反復測定した。原発性腫瘍および正常組織相対的に定量されたTUMAPの例を以下に示す。例1:神経膠芽細胞腫ワクチンカクテルの一部である、PTPRZ1チロシンホスファターセ、受容体タイプ、Zポリペプチド1HLAクラスIペプチドの提示プロフィール。赤は、異なる臓器の正常組織サンプルと比較した腫瘍サンプルを示している。各バーは、前記ペプチドに対し正規化したサンプル領域の中央値を表し、一方、エラーバーは、測定のバラツキのインジケータとして最小と最大の反復測定領域を示す。例2:CDC2001CDK1でコード化された胃癌関連TUMAPの提示プロフィールについては、図5を参照。例3:ASPM002ASPMでコード化された胃癌関連TUMAPの提示プロフィールについては、図6を参照。異なる組織実体中のMHCタンパク質の発現本発明者らは、3重MHCα鎖/β2ミクログロブリン/ペプチド複合体図7参照の代表的化合物として、β2ミクログロブリンを使ってMHC発現レベルの範囲を知るために、異なる組織実体中のMHC分子発現を解析した。MHCの相対的発現b2mβアクチンは、中央値b2mβアクチン=052付近でわずか5の係数で変動するので、異なる組織実体間では比較的一定である。この範囲は、質量分析データに基づく正規化に対し十分に狭くなっている。ウェスタンブロッティングWBに比較した質量分析に基づくMHC量の正規化表2:MHCのWBに基づく正規化とMSに基づく正規化の比較要約すると、MSおよびWBに基づく正規化は非常に類似しており、これらの正規化方法間のバラツキはわずか係数2程度である。MS正規化係数は、計算においてより多くの同定数を使用すれば、正確度が向上する。そのため、MSに基づく正規化は、一次組織免疫沈降から得たMHC分子量の変動を補正する信頼性のある方法である。品質保証定量的性能を継続的にチェックするために、我々は保持時間とシグナル領域の精度管理用に7つの非ヒト由来合成ペプチドを確立し導入した。各サンプルは5回の反復測定により分析されるので、ペプチドの定量にはバラツキの推定が付随し、測定問題が検出される。付随して、品質管理の手動手順を確立し、ペプチドデータの一貫性と正確さを検証しながら確認した。ペプチドの免疫原性および発現プロフィールの測定例本発明のペプチドをコード化する遺伝子の発現プロフィールMHC分子による腫瘍細胞表面に提示されることが同定されたペプチドすべてが、免疫療法に適しているとはいえないが、その理由は、これらの多くのペプチドが多数の細胞タイプにより発現された正常の細胞タンパク質に由来しているからである。これらのペプチドのほんの僅かだけが、腫瘍に関連しており、由来する腫瘍を認識するのに高い特異性を有するT細胞を誘発できる傾向を有している。このようなペプチドを同定し、ワクチン接種により誘発される自己免疫のリスクを最小限にするため、本発明者は多数の正常組織と比較して、腫瘍細胞で過剰発現されるタンパク質に由来するこれらのペプチドに焦点を当てた。理想的なペプチドは、腫瘍に特異的で他の組織には提示されないタンパク質に由来する。理想的なペプチドに近い発現プロフィールを有する遺伝子に由来するペプチドを同定するために、同定したペプチドを、それらが由来するタンパク質と遺伝子にそれぞれ割り当て、これらの発現プロフィールを生成した。RNA源と予備調製書面によるインフォームドコンセントを各患者から得たのちに、外科的に切除した組織標本が異なる2ヶ所の臨床施設例1を参照から提供された。腫瘍組織標本は、術後直ちに液体窒素でスナップ凍結し、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒を使い均質化した。総RNAをTRI試薬Ambion、ドイツ、ダルムシュタット、続いてRNeasyQIAGEN、ドイツ、ヒルデンによるクリーンアップによりこれらのサンプルから調製し、両方法とも製造者のプロトコールに従って実施した。健常ヒト組織の総RNAは市販品から得たAmbion、英国ハンティンドン;Clontech、ドイツ、ハイデルベルク;Stratagene、オランダ、アムステルダム;BioChain、米国カリフォルニア州ヘーワード。数人2名から123名の間のRNAを混合し、各個人のRNAを等重量にした。白血球は4名の健常ボランティアの血液サンプルから単離した。総RNAサンプルの質と量は、RNA6000PicoLabChipKitAgilentを用いてAgilent2100BioanalyzerAgilent、ドイツ、ヴァルトブロンで測定した。マイクロアレイ実験すべての腫瘍と正常組織のRNAサンプルの遺伝子発現解析は、AffymetrixHumanGenomeHGU133AまたはHGU133Plus20オリゴヌクレオチドマイクロアレイAffymetrix、米国カリフォルニア州サンタクララを使って実施した。すべてのステップはAffymetrixマニュアルに従って実施された。簡単にいうと、二本鎖cDNAを総RNA5~8μgからSuperScriptRTIIInvitrogenとオリゴdTT7プライマーMWGBiotech、ドイツ、エーバースベルクを使って取扱説明書の説明通りに合成した。Invitro転写は、U133AアレイにはBioArray高収率RNA転写ラベルキットENZODiagnosticsInc、米国ニューヨーク州ファーミンデールで、U133Plus20アレイにはGeneChipIVTラベルキットAffymetrixで実施した後、cRNAフラグメンテーション、ハイブリダイゼーション、およびストレプトアビジン-フィコエリトリンとビオチン化抗ストレプトアビジン抗体MolecularProbes、オランダ、ライデンによる染色を行った。画像はAgilent2500A遺伝子アレイスキャナーU133AまたはAffymetrix遺伝子チップスキャナー3000U133Plus20でスキャンし、データは全パラメータの初期設定値を用いてGCOSソフトウェアAffymetrixで解析した。正規化は、Affymetrixにより提供された100個のハウスキーピング遺伝子を使った。相対的発現値は、ソフトウェアで得たシングルログ比から計算し、正常腎サンプルは適宜10に設定した。胃癌で高く過剰発現する本発明の遺伝子源の発現プロフィールを図2に示す。例3:IMA941MHCクラスI提示ペプチドのinvitro免疫原性本発明のTUMAPの免疫原性について情報を得るため、すでにWalterSHerrgenLSchoorOJungGWernetDBuhringHJRammenseeHGandStevanovicS2003CuttingedgepredeterminedavidityofhumanCD8TcellsexpandedoncalibratedMHCantiCD28coatedmicrospheresJImmunol17149744978により報告され、十分確立されたinvitro刺激プラットフォームを用いて検討を行った。我々が32HLAA2402の免疫原性を示すことができた前記方法は、本発明のTUMAPを限定し、これらのペプチドがT細胞エピトープであり、このエピトープに対してCD8前駆体T細胞がヒトに存在することを立証した表3。CD8T細胞のinvitroプライミングペプチドMHC複合体pMHCおよび抗CD28抗体を載せた人工抗原提示細胞aAPCによるinvitro刺激を実行するために、発明者はまず、血液バンクTuebingenから得た健常ドナーの新鮮HLAA24白血球分離生成物からCD8T細胞を単離した。CD8T細胞は、白血球分離生成物から直接栄養強化されたか、または標準的な密度勾配分離用溶媒を使ってPBMC末梢血単核細胞が最初に単離されたPAA、ドイツ、ケルベ。単離されたPBMCを、10熱不活性化ヒトAB血清PANBiotech、ドイツ、アイデンバッハが補充されたRPMI-グルタマックスInvitrogen、ドイツ、カルルスルーエ、100Umlペニシリン/100μgmlストレプトマイシンCambrex、ドイツ、コローニュ、1mMピルビン酸ナトリウムCCPro、ドイツ、オーベルドルラ、および20μgml/ゲンタマイシンCambrexで構成される、ヒトinvitroプライミング用T細胞培地TCMで一晩インキュベートした。25ngmlIL7PromoCell、ドイツ、ハイデルベルグおよび10UmlIL2NovartisPharma、ドイツ、ニュルンベルグもこの培養ステップのTCMに添加された。CD8リンパ球の単離は、CD8MicroBeadsMiltenyiBiotec、ドイツ、ベルギッシュグラートバハを使って陽性選択により実施した。pMHC/抗CD28被覆ビーズの作成、T細胞刺激および読み出しなどは、わずかな変更を行い、すでに報告の通りWalteretal497478に実施した。簡単に説明すると、膜貫通ドメインを欠損し、重鎖のカルボキシ末端でビオチン化された、ビオチン化ペプチド負荷組み換えHLAA2402分子が生成された。精製した共刺激マウスIgG2a抗ヒトCD28Ab93JungLedbetterandMullerEberhard461115は、製造業者が推奨するように、スルホ-N-ヒドロキシコハク酸イミドビオチンで化学的にビオチン化したPerbio、ドイツ、ボン。使用したビーズは、56μmの大きなストレプトビジン被覆ポリスチレン粒子BangsLaboratories、米国イリノイ州であった。コントロールとして使用したpMHCは、各々A0201MLA00修飾MelanAMART1由来ペプチドELAGIGILTVSEQIDNo26およびA0201DDX5001DDX5由来YLLPAIVHISEQIDNo27であった。800000ビーズ/200μlを、ビオチン抗CD28600ng関連ビオチンpMHC200ng共存下で、96ウェルプレートにおいて被覆した高密度ビーズ。5ngmlIL12PromoCellで補給された200μlTCM中で2x105洗浄済み被覆ビーズと共に1x106CD8T細胞を、37°Cで3~4日間共インキュベートして、96ウェルプレート中、刺激を開始した。続いて、培地の半分を80UmlIL2が補充された新しいTCMと交換し、インキュベーションは37°Cで3~4日間続けた。この刺激サイクルを合計3回実施した。最終的にLivedeadAqua色素Invitrogen、ドイツ、カルルスルーエ、CD8FITC抗体クローンSK1BD、ドイツ、ハイデルベルク、およびPEまたはAPCカップリングA2402MHC多量体で細胞を染色して多量体解析を実施した。解析は、適切なレーザーとフィルターを装備したBDLSRIISORPサイトメータを使用した。ペプチド特異的細胞を総CD8T細胞のパーセンテージとして計算した。多量体解析の評価は、FlowJoソフトウェアによって行ったTreeStar、米国オレゴン州。特定の多量体CD8リンパ球のinvitroプライミングは、適切なゲート開閉と陰性コントロール刺激との比較によって、検出した。一例の健常ドナーについてinvitroで刺激された評価可能な少なくとも1つのウェルに、invitro刺激後、特異的なCD8T細胞株が含まれることが発見された場合すなわち、このウェルがCD8T細胞中に少なくとも1の特異的多量体を含んでおり、特異的多量体細胞のパーセンテージが陰性コントロール刺激の中央値の少なくとも10倍であった場合、特定抗原の免疫原性が検出された。ペプチドのinvitro免疫原性検討したHLAクラスIペプチド25個について、invitro免疫原性をペプチド特異的T細胞株を生成させることにより証明できた。本発明の2つのペプチドに対する、TUMAP特異的多量体染色後の典型的なフローサイトメトリーの結果を、対応する負のコントロールと共に図3に示す。本発明25個のペプチドの結果を表3に要約する。表3:本発明のHLAクラスIペプチドのinvitro免疫原性本発明者により実施されたinvitro免疫原性の結果が、評価可能な陽性試験ドナーとウェルのパーセンテージを示している。少なくとも2つのドナーと24個のウェルが各ペプチドについて評価可能であった。"