"遊離システインアミノ酸、及び配列番号50-98から選択される重鎖における配列又は配列番号99-147から選択される軽鎖における配列を含んでなる単離されたシステイン操作抗体であって、配列におけるシステインが遊離システインアミノ酸であるシステイン操作抗体。請求項1に記載の単離されたシステイン操作抗体であって、システイン操作抗体をコードするために、一又は複数のアミノ酸残基をシステインで置換することによって、親抗体の核酸配列を変異誘発させる工程、システイン操作抗体を発現させる工程、及びシステイン操作抗体を単離する工程を含んでなる方法によって調製されるシステイン操作抗体。変異誘発が部位特異的変異誘発を含む請求項2に記載のシステイン操作抗体。システイン操作抗体が、ファージ又はファージミド粒子から選択されるウィルス粒子上で発現される請求項2に記載のシステイン操作抗体。請求項2に記載のシステイン操作抗体であって、親和性標識されたシステイン操作抗体を生成するための、チオール反応性親和性試薬とのシステイン操作抗体の反応、及び捕獲媒体への、親和性標識されたシステイン操作抗体の結合の測定を更に含んでなるシステイン操作抗体チオール反応性親和性試薬がビオチン部分を含む請求項5に記載のシステイン操作抗体。チオール反応性試薬がマレイミド部分を含む請求項5に記載のシステイン操作抗体。捕獲媒体がストレプトアビジンを含む請求項5に記載のシステイン操作抗体。システイン操作抗体が、アルブミン結合ペプチドを含んでなる融合タンパク質である請求項1に記載のシステイン操作抗体。ABPが、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、及び配列番号:5から選択される配列を含む請求項9に記載のシステイン操作抗体。システイン操作抗体がモノクローナル抗体、抗体断片、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体から選択される請求項1に記載のシステイン操作抗体。抗体断片がFab断片である請求項11に記載のシステイン操作抗体。システイン操作抗体が抗HER2抗体である請求項11に記載のシステイン操作抗体。システイン操作抗体が、一又は複数のレセプター-:BMPR1BE16;STEAP1;0772P;MPF;Napi3b、メンバー2、タイプIIナトリウム-リン酸共輸送体3b;Sema5b、膜貫通型ドメイン及びショート細胞質ドメイン、5B;Sema5b、膜貫通型ドメイン及びショート細胞質ドメイン、5B;PSCAhlg;ETBR;MSG783;STEAP2;TrpM4;CRIPTO;CD21又はC3DR又はHs73792;CD79b、B29;FcRH2、SPAP1B、SPAP1C;HER2;NCA;MDP;IL20Rα;ブレビカン;EphB2R;ASLG659;PSCA;GEDA;BAFF-RCD22;CD79a;CXCR5;HLA-DOB;P2X5;CD72;LY64、ロイシンリッチ反復配列ファミリーのI型膜タンパク質;FcRH1;IRTA2;及びTENB2に結合する請求項1に記載のシステイン操作抗体。システイン操作抗体が、一又は複数のレセプター-:抗体が捕獲標識、検出標識、薬剤部分、又は固相担体に共有結合されている請求項1に記載のシステイン操作抗体。抗体がビオチン捕獲標識に共有結合されている請求項15に記載のシステイン操作抗体。抗体が蛍光色素検出標識に共有結合されている請求項15に記載のシステイン操作抗体。蛍光色素がフルオレセイン型、ローダミン型、ダンシル、リサミン、シアニン、フィコエリトリン、テキサスレット ゙、及びその類似体から選択される請求項17に記載のシステイン操作抗体。抗体が3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、89Zr、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At、及び213Biから選択される放射性核種検出標識に共有結合されている請求項15に記載のシステイン操作抗体。抗体がキレートリガンドによって検出標識に共有結合されている請求項15に記載のシステイン操作抗体。キレートリガンドがDOTA、DOTP、DOTMA、DTPA及びTETAから選択される請求項20に記載のシステイン操作抗体。抗体が、マイタンシノイド、アウリタチン、ドラスタチン、トリコテシン、CC1065、カリチアマイシン、エンジイン抗生物質、タキサン、及びアントラサイクリンから選択される薬剤部分に共有結合され、式Iを有する抗体薬剤コンジュゲートを形成しここで、Abは抗体であり、Lはリンカーであり、Dは薬剤部分であり、そしてpは1、2、3、又は4である請求項15に記載のシステイン操作抗体。抗体薬剤コンジュゲートが、構造:を有する請求項22に記載のシステイン操作抗体。Dが、構造:を有するマイタンシノイドであり、ここで、波線はリンカーへのDのイオウ原子の共有結合を示し、RはH、メチル、エチル、1プロピル、2プロピル、1ブチル、2メチル1プロピル、2ブチル、2メチル2プロピル、1ペンチル、2ペンチル、3ペンチル、2メチル2ブチル、3メチル2ブチル、3メチル1ブチル、2メチル1ブチル、1ヘキシル、2ヘキシル、3ヘキシル、2メチル2ペンチル、3メチル2ペンチル、4メチル2ペンチル、3メチル3ペンチル、2メチル3ペンチル、23ジメチル2ブチル、及び33ジメチル2ブチルから独立して選択され、mは1、2、又は3である請求項22に記載のシステイン操作抗体。Dが、構造:及びから選択される請求項24に記載のシステイン操作抗体。請求項25に記載のシステイン操作抗体であって、の構造を有し、nは0、1、又は2であるシステイン操作抗体。Dが、構造:を有するモノメチルアウリスタチン薬剤部分MMAE又はMMAFである請求項22に記載のシステイン操作抗体。抗体薬剤コンジュゲートが、構造:から選択され、ここで、Valはバリンであり、Citはシトルリンであり、そしてpは1、2、3、又は4である請求項27に記載のシステイン操作抗体。本発明のある実施態様を詳細に参照するが、その例を添付の構造及び式で例証する。本発明を列挙する実施態様に関連して説明するが、それらは本発明をその実施態様に限定することを意図するものではないことは理解されよう。それどころか、本発明は特許請求の範囲によって定まる本発明の範囲に含まれうるあらゆる代替例、変形例、及び均等物を包含することが意図される。当業者であれば、本発明の実施において使用されうるここに記載のものと同様な又は均等な多くの方法及び材料が分かるであろう。本発明は記載された方法及び材料に決して限定されるものではない。特に別に定義しない限り、ここで使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有し、例えば、Singleton等DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology2ndEdJWileySonsNewYorkNYandJanewayCTraversPWalportMShlomchikImmunobiology5thEdGarlandPublishingNewYorkに従っている。定義別の定義をしない限り、ここで使用される次の用語と語句は次の意味を有しているものである:商品名がここで使用される場合、本出願人は商品名の製品製剤、ジェネリック薬剤、商品名の製品の活性な薬学的成分を独立に含むものである。ここでの抗体なる用語は最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を包含するJourofImmunology17048544861。抗体はマウス、ヒト、ヒト化、キメラ、又は他の種由来であり得る。抗体は特定の抗原を認識し結合することができる免疫系によって産生されるタンパク質である。ImmunoBiology5版GarlandPublishingNewYork。標的抗原は、一般に、複数の抗体のCDRによって認識されるエピトープとも呼ばれる多くの結合部位を有している。異なったエピトープに特異的に結合する各抗体は異なった構造を有している。よって、一つの抗原は一を越える対応の抗体を有しうる。抗体は、完全長免疫グロブリン分子又は完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、つまり、対象の標的の抗原又はその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を含み、かかる標的は、限定しないが、癌細胞又は自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を含む。ここに開示されている免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意のタイプ、クラス又はサブラスでありうる。免疫グロブリンは、任意の種から誘導されうる。しかしながら、一態様では、免疫グロブリンはヒト、マウス、又はウサギ起源である。抗体断片は、完全長抗体の一部、一般には、その抗原結合ドメイン又は可変ドメインを含む。抗体断片の例は、Fab、Fab’、F2、及びFv断片;ダイアボディ、線状抗体、ミニボディProteinEngDesignSel17315323、Fab発現ライブラリーによって生産される断片、抗イディオタイプ抗体、CDR、及び癌細胞抗原、ウイルス抗原又は微生物抗原、単鎖抗体分子に免疫特異的に結合する上記の何れかのエピトープ結合断片;及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。ここで使用されるモノクローナル抗体という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、少量で存在しうる可能な天然に生じる変異を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体によって汚染されないで合成されうる点で有利である。モノクローナルとの修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等Nature256495に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは組換えDNA法によって作製することができる。またモノクローナル抗体は、例えば、Clackson等Nature352:624628;Marks等JMolbiol222581597に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。ここでモノクローナル抗体は、特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び/又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものであるキメラ抗体を特に含むProcNatlAcadSciUSA8168516855。ここでの興味のキメラ抗体は、非ヒト霊長類由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含むプリマタイズ抗体を含む。インタクトな抗体は、VL及びVHドメイン、並びに軽鎖定常ドメイン及び重鎖定常ドメイン、CH1、CH2及びCH3を含んでなるものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン又はそのアミノ酸配列変異体でありうる。インタクトな抗体は、抗体のFc定常領域に起因する生物学的活性を意味する一又は複数のエフェクター機能を有しうる。抗体エフェクター機能の例は、C1q結合;補体依存性細胞傷害性;Fcレセプター結合;抗体依存性細胞媒介細胞傷害性;ファゴサイトーシス;B細胞レセプター及びBCRのような細胞表面レセプターのダウンレギュレーションを含む。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクトな抗体には異なったクラスがあてがわれうる。インタクトな免疫グロブリン抗体の5つの主要なクラス;IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMがあり、これらの幾つかは更にサブクラス、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及びIgA2に更に分割されうる。抗体の異なったクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なったクラスのサブユニット構造及び三次元立体構造はよく知られている。Ig形態は、ヒンジ修飾されたもの又はヒンジレス形態を含むJImmunol16140834090Lund等EurJBiochem26772467256US20050048572US20040229310。ErbBレセプターは、メンバーが細胞増殖、分化及び生存の重要なメディエーターであるErbBレセプターファミリーに属するレセプタープロテインキナーゼである。ErbBレセプターファミリーは、上皮増殖因子レセプター、HER2、HER3及びHER4を含む4つの区別されるメンバーを含む。抗ErbB2抗体のパネルは、ヒト乳房腫瘍細胞株SKBR3を使用して特徴づけられたMolCellBiol911651172。最大の阻害は4D5と呼ばれる抗体で得られ、細胞増殖を56阻害した。パネルの他の抗体は、このアッセイではより少ない程度に細胞増殖を低減させた。抗体4D5は、TNFαの細胞傷害効果に対し、ErbB2過剰発現乳房腫瘍細胞株を感作させることが更に分かった。Hudziak等に検討されている抗ErbB2抗体は、Fendly等CancerResearch5015501558Kotts等InVitro2659ASarup等GrowthRegulation17282Shepard等JClinImmunol11117127Kumar等MolCellBiol11979986Lewis等CancerImmunolImmunother37255263Pietras等Oncogene918291838Vitetta等CancerResearch5453015309Sliwkowski等JBiolChem2691466114665Scott等JBiolChem266143005Dsouza等ProcNatlAcadSci9172027206Lewis等CancerResearch5614571465andSchaefer等Oncogene1513851394に更に特徴づけられている。ErbBレセプターは一般的に、ErbBリガンド;脂溶性膜貫通ドメイン;保存細胞内チロシンキナーゼドメイン;及びリン酸化されうる幾つかのチロシン残基を持つカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを結合しうる細胞外ドメインを含むだろう。ErbBレセプターは天然配列ErbBレセプター又はそのアミノ酸配列変異体でありうる。好ましくはErbBレセプターは天然配列ヒトErbBレセプターである。従って、ErbBレセプターファミリーのメンバーは、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4を含む。アミノ酸配列変異体は、天然配列ポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。通常は、アミノ酸配列変異体は、天然ErbBリガンドの少なくとも一つの受容体結合ドメインと、又は天然ErbB受容体の少なくとも一つのリガンド結合ドメインと少なくとも約70の配列同一性を有し、好ましくはそれらは、このような受容体又はリガンド結合ドメインと、少なくとも約80、より好ましくは少なくとも約90の配列相同性であろう。アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び/又は挿入を有する。アミノ酸は、1文字及び3文字コードの慣習的名称によって命名される。配列同一性は、最大の配列同一性が達成されるように、配列を整列させ、必要ならば間隙を導入した後に、同一であるアミノ酸配列変異体における残基の割合と定義される。アラインメントの方法及びコンピュータプログラムは、当該分野でよく知られている。このようなコンピュータプログラムの一つは、Genentech社が著作し、1991年12月10日にアメリカ合衆国著作権庁にユーザー文書と共に出願されたAlign2である。天然抗体は、通常は、2つの同一の軽鎖及び2つの同一の重鎖からなる約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメインを一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメインを、他端に定常ドメインを有し;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。可変という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する3つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主に採る4つのFRをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、FRによって近接して保持され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接には関連していないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害活性における抗体の関与を示す。ここで使用されるときの高頻度可変領域なる用語は、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般的に、相補性決定領域又はCDRからのアミノ酸残基、50-56及び89-97、及び重鎖可変ドメインの31-35、50-65及び95-102;Kabat等supra、及び/又は高頻度可変ループ由来の残基、50-52及び91-96及び重鎖可変ドメインの残基26-32、53-55及び96-101;ChothiaandLeskJMolBiol196901917を含む。フレームワーク領域又はFR残基はここで定義される高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。抗体のパパイン消化は、Fab断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映してFc断片と命名される。ペプシン処理は2つの抗原結合部位を持つF2断片を生じ、尚、抗原と交差結合することができる。Fvは、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの3つの高頻度可変領域が相互に作用してVHVL二量体表面に抗原結合部位を定めるのはこの配置においてである。集合的に、6つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメインでさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。Fab断片はまた軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域を有する。Fab断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でFab断片とは異なる。FabSHは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を有しているFabに対するここでの命名である。F2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab断片の対として産生された。抗体断片の他の化学結合もまた知られている。任意の脊椎動物種からの抗体の軽鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる2つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。一本鎖Fv又はscFv抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりscFvが抗原結合に対して望ましい構造を形成するのが可能になる。scFvの概説については、ThePharmacologyofMonoclonalAntibodiesvol113Rosenburg及びMoore編SpringerVerlagNewYorkpp269315のPluckthunを参照のこと。抗ErbB2抗体scFv断片は、WO93/16185;米国特許第5571894号;及び5587458に記載されている。非ヒト抗体のヒト化型とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化は、マウス抗原結合情報を非免疫原性ヒト抗体受容体に移すための方法であり、多くの治療的に有用な薬剤をもたらす。ヒト化の方法は一般的に、全ての6つのマウス相補性決定領域をヒト抗体フレームワークに移すことにより始まるNature321522525。これらのCDR移植された抗体は一般的に、抗原結合についてそれらの元の親和性を保持せず、事実、親和性はしばしばひどく損なわれる。CDRに加え、選択の非ヒト抗体フレームワーク残基も適切なCDRコンホメーションを維持するために組み込まれなければならないNature342877。移植CDRの構造コンホメーションを支えるためにヒトアクセプターへ主要マウスフレームワーク残基を移すことは、抗原結合及び親和性を回復することが示されているJMolBiol224487499FooteandWinterJMolBiol224487499Presta等JImmunol15126232632Werther等JImmunolMethods15749864995andPresta等ThrombHaemost85379389。大部分では、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種の高頻度可変領域由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリンである。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの変更は、抗体の性能を更に洗練させるために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFRがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細については、米国特許第6407213号Jones等Nature321522525Riechmann等Nature332323329andPrestaCurrOpStructBiol2593596を参照のこと。遊離システインアミノ酸は、親抗体中に操作され、チオール官能基を有し、分子内又は分子間ジスルフィド架橋として対合しないシステインアミノ酸残基を意味する。チオール反応性値なる用語は、遊離システインアミノ酸の反応性の定量的特徴である。チオール反応性値は、チオール反応性試薬と反応するシステイン操作抗体における遊離システインアミノ酸の割合であり、最大値1に転換される。例えば、ビオチンマレイミド試薬等、チオール反応性試薬と100収率で反応し、ビオチン標識抗体を形成するシステイン操作抗体上の遊離システインアミノ酸は、チオール反応性値1.0を有する。チオール反応性試薬と80収率で反応する同じか又は異なった親抗体中に操作された他のシステインアミノ酸は、約0.8のチオール反応性値を有する。チオール反応性試薬との反応に完全に失敗する同じ又は異なった親抗体中に操作された他のシステインアミノ酸は、チオール反応性値0を有する。特定のシステインのチオール反応性値の決定は、ELISAアッセイ、質量分析、液体クロマトグラフィー、オートラジオグラフィー、又は他の定量分析試験により実施することができる。親抗体は、一又は複数のアミノ酸残基が一又は複数のシステイン残基に置き換わっているアミノ酸配列を含む抗体である。親抗体は、天然の又は野生型の配列を含んでいてもよい。親抗体は、他の天然、野生型又は修飾した形態の抗体と比較して既存のアミノ酸配列修飾を有してもよい。親抗体は、関心ある標的抗原、すなわち生物学的に重要なポリペプチドに対して産生されうる。非ポリペプチド抗原に対して産生された抗体も考慮される。例示的な親抗体は、細胞表面及び膜貫通レセプター及び腫瘍関連抗原に親和性及び選択性を有する抗体を含む。単離された抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、ローリー法で測定して抗体の95重量を越えるまで、最も好ましくは99重量を超えるまで;スピニングカップシークエネーターを使ったN末端又は内在するアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、又はクーマシーブルー、又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元状態の下でのSDSPAGEにより均一になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の少なくとも一成分が存在しないことから、組換え細胞内のインサイツ抗体を含む。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程によって調製されるであろう。分子標的又は興味の抗原、例えばErbB2抗原に結合する抗体は、抗体が抗原発現細胞を標的にすることにおいて利用できる程、十分な親和性で抗原に結合することができるものである。抗体がErbB2に結合するものである場合、通常他のErbBレセプターに対してErbB2と特異的に結合し、EGFR、ErbB3又はErbB4のような他のタンパク質と有意には交差反応しないようなものである。このような実施態様では、これらの非ErbB2タンパク質に対する抗体の結合度合いは、蛍光活性化細胞選別分析又は放射性免疫沈降による測定では約10未満であろう。時として、抗ErbB2抗体は、例えばSchecter等Nature312513andDrebin等Nature312545548に記載されているように、ラットneuタンパク質と有意には交差反応しない。本発明によって包含される抗体の分子標的は、CDタンパク質及びそれらのリガンド、例えば、限定するものではないが:CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79α、及びCD79β;ErbBレセプターファミリーのメンバー、例えばEGFレセプター、HER2、HER3又はHER4レセプター;細胞接着分子、例えばLFA1、Mac1、p150、95、VLA4、ICAM1、VCAM及びαv/β3インテグリン、そのアルファ又はベータサブユニットを含む;増殖因子、例えばVEGF;IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満レセプター;mplレセプター;CTLA4;プロテインC、BR3、cmet、組織因子、β7等;及び細胞表面及び膜貫通腫瘍関連抗原を含む。別段の定めがある場合を除き、モノクローナル抗体4D5なる用語は、マウス4D5抗体の抗原結合残基を有するか又はマウス4D5抗体由来の抗体を示す。例えば、モノクローナル抗体4D5は、マウスモノクローナル抗体4D5又はその変異体、例えばヒト化4D5でありうる。例示的なヒト化4D5抗体は、米国特許第5821337号に記載のようなhuMAb4D51、huMAb4D52、huMAb4D53、huMAb4D54、huMAb4D55、huMAb4D56、huMAb4D57及びhuMAb4D58を含む。治療する及び治療なる用語は、治癒的処置と、目的が例えば癌の発症又は広がりのような望まれない生理学的変化又は疾患を防止し又は遅延させることである予防的又は防止的手段の双方を意味する。この発明の目的では、有益な又は所望の臨床結果は、限定するものではないが、検出可能であれ検出不可能であれ、徴候の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化状態、疾患進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解を含む。治療は、治療を受けない場合に予想される生存率と比較して生存を延長することを意味しうる。治療を必要とする者は、既に症状又は疾患を持つ者並びに症状又は疾患になりやすい者又は症状又は疾患が防止される者を含む。治療的に有効な量なる語句は、哺乳動物における疾病又は疾患を治療するのに有効な薬剤の量を意味する。癌の場合、薬剤の治療的に有効な量は、癌細胞の数を減少させ;腫瘍サイズを減少させ;周辺器官への癌細胞の浸潤を阻害し;腫瘍転移を阻害し;腫瘍増殖をある程度まで阻害し;及び/又は癌に伴う徴候の一又は複数をある程度軽減しうる。薬剤が増殖を防止し、及び/又は存在する癌細胞を死滅させうる程度まで、それは細胞分裂阻害性及び/又は細胞毒性でありうる。癌治療では、効能は、例えば無増悪期間を評価し、及び/又は奏功率を決定することにより測定することができる。癌及び癌性という用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。腫瘍は一又は複数の癌細胞を含む。癌の例には、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ系腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃又は腹部癌、例えば胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌を含む。ErbB発現癌はその細胞表面に存在するErbBタンパク質を有する細胞を含むものである。ErbB2発現癌は、その細胞表面に十分なレベルのErbB2を産生するものであり、抗ErbB2抗体がそれに結合し得、癌に対して治療効果を奏する。抗原性レセプターを過剰発現する癌は、同じ組織型の非癌細胞と比較して、その細胞表面に有意に高いレベルのErbB2のようなレセプターを有しているものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写又は翻訳を増加させることにより引き起こされうる。レセプター過剰発現は、細胞の表面のレセプタータンパク質の増加レベルを評価することにより、診断又は予後アッセイで決定されうる。あるいは、又は加えて、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション、サザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応法、例えばリアルタイム定量PCRを介して、細胞中のレセプターコード化核酸のレベルを測定してもよい。ここで用いられる細胞傷害剤なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び/又は細胞の破壊を生じせしめる物質を意味する。該用語は、放射性同位体、化学療法剤、及び毒素、例えばその合成アナログ及び誘導体を含む、小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素を含むことが意図されている。ファージディスプレイは、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージの粒子の表面でコートタンパク質と融合したタンパク質として提示する手法である。ファージディスプレイの一有用性は、ランダム化タンパク質変異体の大きなライブラリーから対象分子と高親和性で結合する配列を迅速かつ効率的に選別できることにある。ファージ上のペプチド及びタンパク質ライブラリーの提示は、何百万ものポリペプチドから特異的結合特性を持つものをスクリーニングするために利用されてきた。多価ファージディスプレイ法は、典型的には繊維状ファージのpIII又はpVIIIとの融合体を通して小さなランダムペプチド及び小タンパク質を提示するために利用されてきたCurrOpinStructBiol3355362とその中の引用文献。一価のファージディスプレイでは、タンパク質又はペプチドのライブラリーがファージコートタンパク質又はその一部に融合され、野生型タンパク質の存在下で低レベルで発現される。アビディティー効果は多価のファージと比較して低下しているので、選別は内在性のリガンド親和性に基づいており、ファージミドベクターが使われるが、このベクターはDNA操作を単純化する。LowmanandWellsMethodsAcompaniontoMethodsinEnzymology32050216。ファージディスプレイは、抗体様分子を生産する技術を含むImmunobiology5thEdGarlandPublishingNewYorkp627628Lee等。ファージミドは、細菌の複製起点、例えばCo1E1及びバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは任意の既知のバクテリオファージ、例えば繊維状バクテリオファージ及びラムドイドバクテリオファージに使用できる。プラスミドは、一般に、抗生物質耐性の選択マーカーも含む。これらのベクターにクローニングされたDNAセグメントは、プラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを備える細胞がファージ粒子の生産のために必要なすべての遺伝子を備えているとき、プラスミドの複製様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミドDNAの一つの鎖のコピーとパッケージファージ粒子を生成する。ファージミドは感染性又は非感染性ファージ粒子を形成しうる。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面で提示されるように遺伝子融合体として異種ポリペプチド遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子又はその断片を含むファージミドを含む。リンカー、リンカーユニット、又はリンクは、抗体を薬剤部分に共有的に結合させる共有結合又は原子鎖を含む化学的部分を意味する。様々な実施態様では、リンカーはLと特定されている。リンカーは、2価の基、例えばアルキルジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキロキシ及びアルキラミノの繰り返しユニットであるnOnなどの成分、及び、スクシナート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミドを含む二酸エステル及びアミドが含まれる。標識なる用語は、抗体に共有的に結合可能であり、検出可能なシグナルを提供し;第2の標識と相互作用し、第1又は第2の標識、例えばFRETにより提供される検出可能なシグナルを修飾し;相互作用を安定化させるか、又は抗原もしくはリガンドとの結合親和性を増加させ;電荷、疎水性度、形状、又は他の物理的パラメーターにより、移動度、例えば電気泳動移動度、又は細胞透過性に影響を与え、又はキャプチャー部分を提供し、リガンド親和性、抗体/抗原結合、又はイオン錯体形成を調節するように機能する任意の部分を意味する。ここで使用される立体化学の定義及び慣習は一般にSPParker編McGrawHillDictionaryofChemicalTermsMcGrawHillBookCompanyNewYork;及びElielE及びWilenSStereochemistryofOrganicCompoundsJohnWileySonsIncNewYorkに従う。多くの有機化合物は光学的に活性な形態で存在する、つまり、それらは直線偏光の面を回転させる能力を有している。光学的に活性な化合物を記述する場合、接頭辞D及びL、又はR及びSは、そのキラル中心の回りの分子の絶対配置を示すために使用される。接頭辞d及びl又は及びは化合物による直線偏光の回転の符号を示すために使用され、又はlは化合物が左旋性であることを意味する。又はdの接頭辞の化合物は右旋性である。所定の化学構造に対して、これらの立体異性体は、それらが互いに鏡像であることを除いて同一である。特定の立体異性体は、エナンチオマーとも称されることがあり、そのような異性体の混合物はしばしばエナンチオマー混合物と呼ばれる。エナンチオマーの50:50混合物はラセミ混合物又はラセミ体と呼ばれ、化学反応又はプロセスに立体選択又は立体特異性がなかった場合に生じうる。ラセミ混合物及びラセミ体なる用語は、光学活性を欠いている2つのエナンチオマー種の等モル混合物を意味する。ここで使用される薬学的に許容可能な塩なる語句は、ADCの薬学的に許容可能な有機又は無機塩を意味する。例示的な塩には、限定されるものではないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸ホスフェート、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸シトレート、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、pトルエンスルホン酸塩、パモ酸塩塩が含まれる。薬学的に許容可能な塩は、アセテートイオン、スクシネートイオン又は他の対イオンのような他の分子を含みうる。対イオンは親化合物上の電荷を安定化する任意の有機又は無機部分でありうる。更に、薬学的に許容可能な塩は、その構造中に一を越える荷電原子を有しうる。複数の荷電原子が薬学的に許容可能な塩の一部である場合は、複数の対イオンを有しうる。よって、薬学的に許容可能な塩は一又は複数の荷電原子及び/又は一又は複数の対イオンを有しうる。薬学的に許容可能な溶媒和物は一又は複数の溶媒分子とADCの結合体を意味する。薬学的に許容可能な溶媒和物を形成する溶媒の例には、限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、DMSO、酢酸エチル、酢酸、及びエタノールアミンが含まれる。システイン操作抗体発明の化合物は、野生型又は親抗体の一又は複数のアミノ酸がシステインアミノ酸で置換されているシステイン操作抗体を含む。任意の形態の抗体がそのように操作、すなわち変異されうる。例えば、親Fab抗体断片はシステイン操作Fabを形成するように操作され得、ここではThioFabと称される。単一部位の変異はThioFabにおいて単一の操作システイン残基を生じる一方、単一部位の変異はThioMabにおいてはIgG抗体の二量体の性質のため、二つの操作システイン残基を生じることに留意されなければならない。置換システイン残基を有する変異体は、新たに導入された操作システインチオール基の反応性について評価される。チオール反応性値は0~1.0の範囲の相対的な数字で表され、任意のシステイン操作抗体について測定可能である。発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は0.6~1.0;0.7~1.0;又は0.8~1.0の範囲である。本発明の設定、選別および調製方法により、求電子性の官能性と反応するシステイン改変抗体が可能である。これらの方法によりさらに、所定の設定した選択した部位に薬剤分子を有する抗体薬剤コンジュゲート化合物などの抗体複合体化合物が可能である。抗体表面上の反応性のシステイン残基により、マレイミド又はハロアセチルなどのチオール反応基を介した薬剤成分の特異的なコンジュゲートが可能である。マレイミド基に対するCys残基のチオール官能基の求核反応性は、リジン残基のアミノ基又はN末端アミノ基などのタンパク質内の任意の他のアミノ酸官能性の、およそ1000倍である。ヨードアセチルおよびマレイミド試薬のチオール特異的官能性はアミン基と反応するが、より高いpHとより長い反応時間が必要である。発明のシステイン操作抗体は、その野生型対応物の抗原結合能を好ましくは保持する。よって、システイン操作抗体は、抗原に、好ましくは特異的に結合可能である。このような抗原には、例えば、腫瘍関連抗原、細胞表面レセプタータンパク質及び他の細胞表面分子、膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達又は分化に関連する分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関与する分子、脈管形成に関与する分子及び血管形成に関連する分子が含まれる。腫瘍関連抗原はクラスター分化因子でありうる。システイン操作抗体が結合可能な抗原は、上述のカテゴリーのサブセットのメンバーであり得、上記カテゴリーの他のサブセットは、区別される特性を有する他の分子/抗原を含む。親抗体はまた、huMAb4D51、huMAb4D52、huMAb4D53、huMAb4D54、huMAb4D55、huMAb4D56、huMAb4D57及びhuMAb4D58;ヒト化520C9及びここに記載のヒト化2C4抗体から選択されるヒト化抗体でありうる。発明のシステイン改変抗体は部位特異的であり、チオール反応性の試薬と効率よくカップリングしうる。チオール反応性の試薬は、多機能性リンカー試薬、キャプチャ、すなわち親和性、標識試薬、検出標識、固相固定化試薬、又は薬剤リンカー中間生成物であってもよい。チオール反応性試薬の一例はNエチルマレイミドである。ある例示的な実施態様では、ビオチンリンカー試薬とのThioFabの反応によりビオチン化されたThioFabが生じ、これによって改変されたシステイン残基の存在および反応性が検出され、測定されうる。多機能リンカー試薬とのThioFabの反応により、薬剤成分試薬又は他の標識とさらに反応しうる官能化されたリンカーを有するThioFabが生じる。薬剤リンカー中間生成物とのThioFabの反応により、ThioFab薬剤コンジュゲートが生じる。本明細書中で記述される例示的な方法は一般に、抗体の同定および産生、さらに一般的には、本明細書中に記載の設定およびスクリーニングの工程によって他のタンパク質に応用されてもよい。このような手法は、反応基が例えばマレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、又は他のチオール反応性の結合パートナーである他のチオール反応性試薬のコンジュゲーションに応用されてもよいBioconjugateChem12;HermansonGinBioconjugateTechniquesAcademicPressSanDiegopp4055643671。パートナーは、細胞傷害座位、フルオロホア、例としてフルオレセインまたはローダミンのような蛍光染料、イメージングまたは放射性治療用金属のためのキレート剤、ペプチジルまたは非ペプチジル標識ないしは検出用タグ、又はポリエチレングリコールの各種アイソフォームなどのクリアランス改変剤、第三成分に結合するペプチド、または他の炭水化物または親油性剤であってもよい。ここでの例示的抗体断片、hu4D5Fabv8において同定される部位は主に、全種の抗体にわたって良く保存されている抗体の定常ドメインにある。これらの部位は、特定の抗体構造の構造設計又は知識を更に必要とせず、抗体の可変ドメインに備わる抗原結合特性を干渉することなく、他の抗体に広く応用可能であるべきである。癌の治療に有用であり得るシステイン操作抗体は、限定しないが、細胞表面レセプター及び腫瘍関連抗原に対する抗体を含む。そのような抗体は、ネイキッド抗体として又は式Iの抗体薬物コンジュゲートとして使用されうる。腫瘍関連抗原は当該分野で知られており、当該分野で良く知られている方法及び情報を使用して抗体生産に使用するために調製することができる。癌診断及び治療法のための効果的な細胞標的を発見する試みにおいて、研究者は、一又は複数の正常な非癌性細胞上と比較して一又は複数の特定のタイプの癌細胞の表面に特異的に発現される膜貫通型又は他の腫瘍関連ポリペプチドを同定しようとした。しばしば、そのような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌性細胞の表面上と比較して癌細胞の表面上により豊富に発現される。そのような腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定は、抗体ベースの療法を介した破壊のために癌細胞に特異的に標的とする能力を生じせしめた。TAAの例は、限定しないが、以下に列挙するTAA-を含む。簡単のために、その全てが当該分野で知られているこれらの抗原に関する情報を以下に列挙するが、これは、名前、別名、Genbank受託番号及び主要な文献、その後に国立バイオテクノロジー情報センターの核酸及びタンパク質配列同定コンベンションを含む。TAA-に対応する核酸及びタンパク質配列は公的データベース、例えばGenBankから入手できる。抗体によって標的とされる腫瘍関連抗原は、引用された文献で同定された配列に対して少なくとも約70、80、85、90、又は95の配列同一性を有する全てのアミノ酸配列変異体及びアイソフォームを含み、又は引用された文献に見出される配列を有するTAAと実質的に同じ生物学的性質又は特性を示す。例えば、変異配列を有するTAAは、一般に、列挙された対応の配列を持つTAAに特異的に結合する抗体に特異的に結合することができる。ここに特に記載された文献中の配列及び開示は出典明示により明示的に援用される。腫瘍関連抗原-:BMPR1BtenDijke、P等Science264101104Oncogene1413771382国際公開2004063362国際公開2003042661米国特許出願公開2003134790A1国際公開2002102235国際公開2003055443国際公開200299122国際公開2003029421国際公開2003024392国際公開200298358国際公開200254940国際公開200259377国際公開200230268国際公開200148204NP001194骨形成タンパク質レセプター、タイプIBpidNP0011941クロスリファレンスMIM603248NP0011941AY065994E16;BiochemBiophysResCommun255、283288、Nature395288291、Gaugitsch、HW、等JBiolChem2671126711273国際公開2004048938国際公開2004032842国際公開2003042661国際公開2003016475国際公開200278524国際公開200299074国際公開200286443国際公開2003003906国際公開200264798国際公開200014228米国特許出願公開2003224454国際公開2003025138NP003477ソリュートキャリアファミリー7、メンバー5pidNP0034773ホモサピエンスクロスリファレンスMIM600182NP0034773NM015923NM0034861STEAP1;CancerRes61、58575860、Hubert、RS、等ProcNatlAcadSciUSA961452314528国際公開2004065577国際公開2004027049EP1394274国際公開2004016225国際公開2003042661米国特許出願公開2003157089米国特許出願公開2003185830米国特許出願公開2003064397国際公開200289747国際公開2003022995NP036581六回膜貫通型上皮抗原クロスリファレンスMIM604415NP0365811NM01244910772P;JBiolChem2762737127375国際公開2004045553国際公開200292836国際公開200283866米国特許出願公開2003124140クロスリファレンスGI34501467AAK741203AF3614861MPFYamaguchi、N、等BiolChem269、805808、ProcNatlAcadSciUSA961153111536、ProcNatlAcadSciUSA93136140、JBiolChem2702198421990国際公開2003101283国際公開2002101075国際公開200271928WO9410312クロスリファレンスMIM601051NP0058142NM0058231Napi3b、メンバー2、タイプIIナトリウム-リン酸共輸送体3b、Genbank受託番号NM_006424;JBiolChem2771966519672、Genomics62281284、Feild、JA、等BiochemBiophysResCommun258578582国際公開2004022778欧州特許出願公開1394274国際公開2002102235欧州特許出願公開875569国際公開200157188国際公開2004032842国際公開200175177クロスリファレンスMIM604217NP0064151NM0064241Sema5b、膜貫通型ドメイン及びショート細胞質ドメイン、5B、Genbank受託番号AB040878;NagaseT、等DNARes7143150国際公開2004000997国際公開2003003984国際公開200206339国際公開200188133国際公開2003054152国際公開2003101400受託Q9P283EMBLAB040878BAA959691GenewHGNC10737PSCAhlg;Ross等CancerRes6225462553米国特許出願公開2003129192米国特許出願公開2004044180米国特許出願公開2004044179米国特許出願公開2003096961米国特許出願公開2003232056国際公開2003105758米国特許出願公開2003206918欧州特許出願公開1347046国際公開2003025148クロスリファレンスGI37182378AAQ889911AY3586281ETBR;NakamutaM、等BiochemBiophysResCommun177、3439、1991OgawaY、等BiochemBiophysResCommun178、248255、1991AraiH、等JpnCircJ5613031307、1992AraiH、等JBiolChem268、34633470、1993SakamotoA、YanagisawaM、等BiochemBiophysResCommun178、6566631991ElshourbagyNA、等JBiolChem268、38733879、1993HaendlerB、等JC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5国際公開9851824国際公開9840403AccessionO43653EMBLAF043498AAC396071GEDA;AAP14954脂肪腫HMGIC融合対様タンパク質pidAAP149541ホモサピエンス国際公開2003054152国際公開2003000842国際公開2003023013米国特許出願公開2003194704クロスリファレンスGI30102449AAP149541AY2607631BAFF-R;BAFFレセプターpidNP4431771ホモサピエンスThompson、JS、等Science293、21082111国際公開2004058309国際公開2004011611国際公開2003045422国際公開2003014294国際公開2003035846国際公開200294852国際公開200238766国際公開200224909クロスリファレンスMIM606269NP4431771NM0529451AF132600CD22;Wilson等JExpMed173137146国際公開2003072036クロスリファレンスMIM107266NP0017621NM0017711CD79aと共有的に相互作用し、IgM分子と表面上に複合体を形成し、B細胞分化に関与するシグナルを伝達するB細胞-特異タンパク質、pI484MW25028TM2PGeneChromosome19q132GenbankaccessionNoNP00177410国際公開2003088808、米国特許出願公開20030228319国際公開2003062401米国特許出願公開2002150573国際公開9958658国際公開9207574米国特許5644033Ha等JImmunol14815261531Mueller等EurJBiochem2216211625Hashimoto等Immunogenetics40287295Preud’homme等ClinExpImmunol90141146Yu等JImmunol148633637Sakaguchi等EMBOJ734573464CXCR5;372aa、pI854MW41959TM7PGeneChromosome11q233GenbankaccessionNoNP0017071国際公開2004040000国際公開2004015426米国特許出願公開2003105292米国特許6555339国際公開200261087国際公開200157188国際公開200172830国際公開200022129国際公開9928468米国特許5440021国際公開9428931国際公開9217497Dobner等EurJImmunol2227952799Barella等BiochemJ309773779HLA-DOB;273aa、pI656MW30820TM1PGeneChromosome6p213GenbankaccessionNoNP0021111Tonnelle等EMBOJ428392847Jonsson等Immunogenetics29411413Beck等JMolBiol228433441Strausberg等ProcNatlAcadSciUSA991689916903Servenius等JBiolChem26287598766Beck等JMolBiol255113Naruse等TissueAntigens59512519国際公開9958658米国特許6153408米国特許5976551米国特許6011146Kasahara等Immunogenetics306668Larhammar等JBiolChem2601411114119P2X5;422aa、pI763MW47206TM1PGeneChromosome17p133Genbank受託番号NP0025522Le等FEBSLett418195199国際公開2004047749国際公開2003072035Touchman等GenomeRes10165173国際公開200222660国際公開2003093444国際公開2003087768国際公開2003029277CD72;359aa、pI:8.66,MW:40225TM:1[P]遺伝子染色体:9p13.3,Genbank受託番号NP_001773.1;国際公開2004042346国際公開2003026493国際公開200075655VonHoegen等JImmunol14448704877Strausberg等ProcNatlAcadSciUSA991689916903LY64、ロイシンリッチ反復配列ファミリーのI型膜タンパク質、B細胞活性化及びアポトーシスを調節し、機能喪失が全身性エリテマトーデスの患者における疾患活性の増加に関連;661aa、pI620、MW74147TM1PGeneChromosome5q12Genbank受託番号NP0055731米国特許出願公開2002193567国際公開9707198Miura等Genomics38299304Miura等Blood9228152822国際公開2003083047国際公開9744452国際公開200012130FcRH1;429aa、pI528、MW46925TM1PGeneChromosome1q211q22Genbank受託番号NP4431701国際公開2003077836国際公開200138490Davis等ProcNatlAcadSciUSA9897729777国際公開2003089624欧州特許出願公開1347046国際公開2003089624IRTA2;977aa、pI688MW106468TM1PGeneChromosome1q21Genbank受託番号ヒトAF343662、AF343663、AF343664、AF343665、AF369794、AF397453、AK090423、AK090475、AL834187、AY358085マウスAK089756、AY158090、AY506558NP1125711国際公開2003024392Nakayama等BiochemBiophysResCommun277124127国際公開2003077836国際公開200138490TENB2;374aa、NCBI受託AAD55776、AAF91397、AAG49451、NCBIRefSeqNP057276NCBIGene23671OMIM605734SwissProtQ9UIK5Genbank受託番号AF179274AY358907、CAF85723CQ782436国際公開2004074320JP2004113151国際公開2003042661国際公開2003009814欧州特許出願公開1295944国際公開200230268国際公開200190304米国特許出願公開2004249130米国特許出願公開2004022727国際公開2004063355米国特許出願公開2004197325米国特許出願公開2003232350米国特許出願公開2004005563米国特許出願公開2003124579Horie等Genomics67146152Uchida等BiochemBiophysResCommun266593602Liang等CancerRes60490712GlynneJones等IntJCancerOct159417884親抗体はまた、アルブミン結合ペプチド配列を含んでなる融合タンパク質でありうるAlbuminBindingAsAGeneralStrategyForImprovingThePharmacokineticsOfProteinsJBiolChem2773503535043WO0145746。発明の抗体は、Dennis等JBiolChem2773503535043の表III及びIV頁35038US20040001827の0076及びWO0145746の頁1213に教示され、その全体を出典明記によりここに援用するABP配列を有する融合タンパク質を含む。変異誘発出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体をコードするDNAは、公知の様々な方法により調製される。これらの方法には、これに限定されるものではないが、部位指向性突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及びポリペプチドをコードする前もって調製されたDNAのカセット突然変異による調製が含まれる。組換え抗体の変異体はまた、制限断片操作によって、又は合成オリゴヌクレオチドを用いるオーバーラップエクステンションPCRによって構築されうる。変異誘発プライマーは、システインコドン置換をコードする。標準的な変異誘発技術を使用して、このような変異体システイン操作抗体をコードするDNAを生成できる。一般的なガイダンスは、Sambrook等MolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY1989andAusubel等CurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenePublishingandWileyInterscienceNewYorkNY1993に見られる。部位特異的突然変異誘発は、置換変異体、つまり変異体タンパク質を調製するための一方法である。この方法はよく知られている等NucleicAcidsRes1344314443Ho等Gene775159andKunkel等ProcNatlAcadSciUSA82488を参照されたい。簡潔に言えば、DNAの部位特異的突然変異誘発を実施するには、出発DNAがそのような出発DNAの一本鎖に所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを先ずハイブリダイズすることにより改変される。ハイブリダイゼーション後にDNAポリメラーゼが、プライマーとしてハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを使用し、テンプレートとして出発DNAの一本鎖を使用して、完全な第2ストランドを合成するために使用される。よって、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドが得られた二本鎖DNAに導入される。部位特異的突然変異誘発は、発現プラスミドにおいて、変異誘発されるタンパク質を発現する遺伝子内で実施され得、得られたプラスミドは、所望のシステイン置換突然変異の導入を確認するために配列決定されうるJBiolChem2732025220260。QuikChangeMultiSiteDirectedMutagenesisKitなど、商業的に入手可能なものを含む部位特異的のプロトコル及び形式。PCR突然変異誘発もまた出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を製造するために好適である。HiguchiinPCRProtocolspp177183AcademicPressIto等Gene1026770Bernhard等BioconjugateChem5126132andVallette等NucAcidsRes17723733を参照されたい。簡潔に述べれば、少量のテンプレートDNAがPCRの出発材料として使用される場合、テンプレートDNAにおける対応する領域とは配列が僅かに異なるプライマーを使用して、プライマーがテンプレートと異なる位置でのみテンプレート配列と異なる比較的多量の特異的NA断片を産生することができる。変異体を調製する他の方法であるカセット突然変異誘発は、Wells等Gene34315323により記載された方法に基づく。出発材料は変異される出発ポリペプチドDNAを含んでなるプラスミドである。変異される出発DNAのコドンが同定される。同定される変異部位の各側に独特な制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。そのような制限部位が存在しない場合は、出発ポリペプチドDNAの適切な位置にそれを導入するために上述したオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を使用してこれを産生しうる。プラスミドDNAはこれらの部位で切断されてそれを線形化する。制限部位間のDNA配列をコードするが所望の変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドは常套的な手順を使用して合成され、そこでは、オリゴヌクレオチドの二本のストランドが別個に合成され、ついで標準的な方法を使用して共にハイブリダイズされる。オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト合成方法によって調製されるAdvancesinthesynthesisofoligonucleotidesbythephosphoramiditeapproachTetrahedron4822232311。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは線形化されたプラスミドの末端と適合性である5及び3末端を有するように設計され、プラスミドに直接に結合できる。しかして、このプラスミドは変異DNA配列を含んでいる。コード化システイン置換を有する変異体DNAは、DNA配列決定によって確認できる。単一突然変異はまた、PCRベース変異誘発により鋳型として二本鎖プラスミドDNAを使用してオリゴヌクレオチド指定突然変異により生成されるMolecularCloningALaboratoryManual3rdeditionZoller等MethodsEnzymol100468500ZollerMJandSmithMNuclAcidsRes1064876500。本発明では、M13ファージにディスプレイされるhu4D5Fabv8SequencePlasticityInTheAntigenBindingSiteOfATherapeuticAntiHER2AntibodyJMolBiol32185162をモデルシステムとして実験のために使用した。システイン変異を、hu4D5Fabv8ファージ、hu4D5Fabv8、及びABPhu4D5Fabv8コンストラクトに導入した。hu4D5ThioFabファージ調製を、前述のように、ポリエチレングリコール沈降法を使用して実施したMethodsinMolecularBiology87249264。PHESELECTORアッセイPHESELECTORアッセイにより、ELISAファージ様式での抗体の反応性システイン基の検出が可能である。ウェル表面に興味のタンパク質をコートし、その後にファージ粒子、次いでHRP標識した二次抗体を用いインキュベーションし吸光度を検出するプロセスが、実施例2に詳細に記載されている。ファージにディスプレイされる変異タンパク質は、迅速で、強力な、ハイスループット方法でスクリーニングされうる。システイン改変抗体のライブラリを生成して同じ手法を用いて結合選別を行い、抗体又は他のタンパク質のランダムなタンパク質ファージライブラリから遊離Cys取込みの反応性の部位を適切に同定することができる。この技術は、ファージにディスプレイされるシステイン変異タンパク質を、チオール反応性でもあるレポーターグループ又は親和性試薬と反応させることを含む。図8は、HER2へのFab又はThioFab及びストレプトアビジンへのビオチン化ThioFabの結合を描く、模式図によるPHESELECTORアッセイを示す。タンパク質の発現及び精製システイン操作抗体をコードしているDNAは、常法を用いて直ぐに分離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの供給源となる。ひとたび分離されたならば、DNAを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、又は他の哺乳類宿主細胞、例えばミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。hu4D5Fabv8システイン操作抗体の収率は、野生型hu4D5Fabv8と類似であった。抗体をコードするDNAの細菌中での組換え発現に関する概説文献は、Skerra等CurrOpinioninImmunol5256262andPluckthunImmunolRevs130151188を含む。設定および選別の後、改変された、反応性のある対になっていないCys残基を有するシステイン改変抗体、例えばThioFabが、細菌、例えば大腸菌システム又は哺乳類の細胞培養システム、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞における発現、および一般的なタンパク質精製技術を用いた精製JBiolChem2661098210988によって産生されてもよい。ThioFabは、非サプレッサー大腸菌株である34B8JournalBiologicalChemistry2721067884における誘発により発現させた。実施例3aを参照のこと。収集した細胞ペレットをPBSに再懸濁させ、完全細胞溶解をマイクロフルダイザーを通過させることによって実施し、ThioFabをプロテインGHAROSETMを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ThioFabを上記のようにビオチンPEOマレイミドとコンジュゲートさせ、ビオチン化ThioFabをSuperdex200TMゲル濾過クロマトグラフィーによって更に精製し、これは遊離ビオチンPEOマレイミド及びThioFabのオリゴマー画分を除去した。質量分析法液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析を、ビオチンコンジュゲートFabの正確な分子量決定のために使用したWileyNewYork。ビオチン化hu4D5Fabv8ペプチドのアミノ酸配列を、トリプシン消化と、その後のLCESITandemMS分析によって決定した。抗体Fab断片hu4D5Fabv8は約445のアミノ酸残基を有し、10のCys残基を含む。ヒト化4D5可変断片の高分解能構造が確立されているJMolBiol229969995を参照。全てのCys残基はジスルフィド結合の形態で存在し、従ってこれらの残基は、薬剤マレイミドとコンジュゲートする何れかの反応性チオール基を持たない。よって、新しく設計されたCys残基は不対のままであり得、求電子リンカー試薬又は薬剤リンカー中間体、例えば薬剤マレイミドと反応、つまりコンジュゲートできる。図1AはX線結晶配位によるhu4D5Fabv8抗体断片の三次元表示を示す。重及び軽鎖の操作されたCys残基の構造位置は、連続的番号付けシステムにより番号付けされている。この連続的番号付けシステムは、N末端で開始され、a、b、cで記される挿入によってKabat番号付けスキームと異なる、連続的番号付けスキームを示す図1Bに従い、トラスツズマブの4d5v7fabH変異体について、Kabat番号付けシステムSequencesofProteinsofImmunologicalInterest5thEdPublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthBethesdaMDに相関する。カバット番号付けシステムを用いると、実際の直鎖のアミノ酸配列は、可変ドメインのFRないしCDRが短くなっているアミノ酸か、又はFRないしCDRに挿入を含むアミノ酸を含みうる。システイン操作重鎖変異体部位は、次の表の連続的番号付けおよびカバット番号付けスキームによって同定される。M13ファージミドCys変異体Fabは、Fabタンパク質と比較して迅速にスクリーニングできる。抗原及びストレプトアビジンに結合するファージミドThioFabは、実施例2に記載し図8に示すように、ELISAプレートにそれぞれHER2及びストレプトアビジンをコートし、抗FabHRPで探索することによって試験できる。この方法は、操作Cys残基/コンジュゲートされたビオチン分子による、抗原結合及びチオール基の反応性に対する効果の同時モニタリングを可能にした。また、方法は、M13ファージにディスプレイされている任意のタンパク質について反応性チオール基をスクリーニングするのに使用できる。コンジュゲート又は非コンジュゲートファージミドThioFabは、単純なPEG沈殿によって精製される。ヒト化4D5の抗原結合断片は大腸菌において良く発現され、バクテリオファージにディスプレイされるGene128103109。抗体Fab断片hu4D5Fabv8を、チオール反応性を探索するために、ELISAベースアッセイにおいてモデルシステムとして、M13ファージ上にディスプレイした。図8はPHESELECTORアッセイのグラフィック表示であり、HER2及びストレプトアビジンへのビオチン化ThioFabファージ及び抗ファージHRP抗体の結合を示す。5のアミノ酸残基を、抗原結合表面からの遠位として結晶構造情報から最初に選択したJMolBiol229969995。タンパク質データベースX線結晶構造を1FVCとして設計した。Cys残基を部位特異的変異誘発によりこれらの位置に設計した。ThioFabファージ調製物を単離し、ビオチン化試薬と反応させた。ビオチンコンジュゲート及び非コンジュゲート変異体を、HRPコンジュゲートされた抗ファージ抗体を用いて、ELISAベースPHESELECTORアッセイを使用してHER2及びストレプトアビジン結合について試験した。BSA、HER2又はストレプトアビジンとの非ビオチン化ファージhu4D5Fabv8及びビオチン化ファージhu4D5Fabv8との相互作用を、抗M13西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体を介し、標準的なHRP反応を展開し、450nmで吸光度を測定することによりモニタした。発色基質のターンオーバーにより生成される吸光度を450nmで測定した。HER2とのThioFabの反応性は、抗原結合を測定する。ストレプトアビジンとのThioFabの反応性は、ビオチン化の程度を測定する。BSAとのThioFabの反応性は、非特異的相互作用のネガティブコントロールである。図2Aに見られるように、全てのThioFabファージ変異体は、野生型hu4D5Fabv8ファージのと比較して、HER2への類似な結合を有する。更に、ビオチンとのコンジュゲーションは、HER2へのThioFabの結合を干渉しなかった。驚くべきこのに、また予想外に、ThioFabファージサンプルは、様々なレベルのストレプトアビジン結合活性を示した。全ての試験したファージThioFabから、A121Cシステイン操作抗体が最大のチオール反応性を呈した。野生型hu4D5Fabv8ファージを同じ量のビオチンマレイミドとインキュベートしたが、これらのファージはほとんどストレプトアビジン結合を持たず、hu4D5Fabv8及びM13ファージコートタンパク質からの既存のシステイン残基は、ビオチンマレイミドの部位特異的コンジュゲーションを干渉しなかったことを示す。これらの結果は、ファージELISAアッセイが、Fab表面上の反応性チオール基をスクリーニングするのに成功裏に使用できることを示す。PHESELECTORアッセイにより、抗体の反応性のチオール基のスクリーニングが可能である。この方法によるA121C変異の同定は一例である。完全なFab分子は、反応性チオール基を有するThioFab変異体をより多く同定するために、効果的に検索されうる。パラメーターである断片的な表面のアクセス容易性を用いて、ポリペプチド内のアミノ酸残基に対する溶媒のアクセスしやすさを同定して、定量化した。表面のアクセス容易性は、溶媒分子、例えば水が接触することができる表面積として表されうる。水が占める面積は1.4Å半径球として概算される。アルゴリズムを用いて公知のX線結晶学由来の座標によりタンパク質の各アミノ酸の表面アクセス容易性を算出する結晶学プログラムのCCP4SuiteとしてActaCrystD50760763、ソフトウェアは入手自由であるか許可されている1925603825orbyinternetwwwccp4acukdisthtmlINDEXhtml。BLeeandFMRichardsJMolBiol55379400のアルゴリズムに基づいて、表面アクセス容易性の算出を実行する2つの例示的なソフトウェアモジュールは、AREAIMOLおよびSURFACEである。AREAIMOLは、タンパク質のヴァンデルワールス表面を転がるので、プローブ球の中心の座標としてタンパク質の溶媒にアクセスする表面を定義する。AREAIMOLは、各原子の周りの拡がった球上に表面ポイントを生成して、周囲の原子と関連する同等の球内にあるものを除くことによって溶媒にアクセス容易な表面を算出する。AREAIMOLは、PDB座標ファイルに原子の溶媒にアクセス容易な領域を見つけ、残基、鎖、及び全分子がアクセス容易な領域をまとめる。個々の原子がアクセス容易な領域は、偽PDB出力ファイルに書き込まれる。AREAIMOLは各エレメントについて単一の半径を仮定し、限られた数の異なるエレメントを認識するのみである。未知の原子タイプにはデフォルト半径の1.8Aが割り当てられるだろう。認識された原子のリストは:AREAIMOLおよびSURFACEは、絶対的なアクセス容易性、すなわち正方形のオングストロームの数を示す。部分的な表面アクセス容易性は、ポリペプチド内のアミノ酸に関する標準の状態を参照することで算出される。基準状態はトリペプチドGlyXGlyであり、ここで、Xは対象のアミノ酸であり、基準状態は伸展した高次構造、すなわちβ鎖内の高次構造様でなければならない。伸展した高次構造はXのアクセス容易性を最大にする。算出したアクセス容易な領域をGlyXGlyトリペプチド基準状態のアクセス容易な領域で割って、比率を比率を示す。これが部分的なアクセス容易性となる。アクセス容易性の割合は、100を乗じた部分的アクセス容易性である。表面アクセス容易性を算出するための他の例示的なアルゴリズムは、ポリペプチドのX線座標に基づいて水球体に対するアミノ酸残基の部分的アクセス容易性を算出するプログラムxsaeのSOLVモジュールに基づく。hu4D5Fabv7のすべてのアミノ酸の部分的表面アクセス容易性を、結晶構造情報を使用して算出したJMolBiol229969995US7521541。Cys残基と置換されるよう操作できるhu4D5Fabv8の残基を同定するために、次の2つの基準を使用した:1完全に埋没しているアミノ酸残基は除外される。10より大のアクセス可能であるhu4D5Fabv8の134及び151残基がある。上位10の最もアクセス可能なSer、Ala及びVal残基を、他のアミノ酸と比較したCysへのそれらの近い構造類似性により選択し、新規に設計されたCysにより、抗体に最小の構造制約のみを導入した。他のシステイン置換部位もまたスクリーニングでき、コンジュゲーションに有用でありうる。2残基は、Fabの機能的及び構造的相互作用におけるそれらの役割に基づいて分別される。抗原相互作用に関与せず、存在するジスルフィド結合と離れた残基を更に選択した。新規に設計されたCys残基は、抗原結合と異なり、抗原結合を干渉せず、ジスルフィド結合形成に関与するシステインと誤対合しないべきである。L10からL20、L38からL48、L105からL115、L139からL149、L163からL173から選択される軽鎖の範囲内、及びH35からH45、H83からH93、H114からH127、及びH170からH184から選択される重鎖の範囲内、及びH268からH291、H319からH344、H370からH380、及びH395からH405から選択される範囲内のFc領域において、反応性のシステインアミノ酸によるアミノ酸の置換を持つ抗体に対してチオール反応が生じうる。また、チオール反応は、抗体の特定のドメイン、例えば軽鎖定常ドメインおよび重鎖定常ドメイン、CH1、CH2およびCH3に対して生じうる。0.8以上のチオール反応値となるシステイン置換は、インタクト抗体、つまりIgGサブクラスIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2を含むIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMの重鎖定常ドメインα、δ、ε、γおよびμにあってもよい。選択した10のCys変異体が抗原結合部位、例えばこの場合HER2とのインターフェースから離れていることが、結晶構造データから明らかである。これらの変異体は、機能的相互作用への間接的効果について実験的に試験できる。全てのCysFab変異体のチオール反応性を、実施例1及び2に説明し、表1に提示するように、測定し算出した。残基LV15C、LV110C、HA88C及びHA121Cは、反応性であり安定なチオール基を有する。変異体V15C、V110C、A144C、S168Cは、軽鎖Cys変異体である。変異体A88C、A121C、A175C、S179Cは重鎖Cys変異体である。PHESELECTORアッセイによって算出されるように、高い部分的表面アクセス容易性を有する部位が最も高いチオール反応性を持たなかったことは驚くべきことであり予期されなかった。言い換えると、部分的表面アクセス容易性は、チオール反応性と相関しなかった。事実、20~80の中程度の表面アクセス容易性を有する部位、又は部分的に露出された部位、例えばAla又はVal残基に設計されたCys残基が、Ser残基に導入されたCysより、より良いチオール反応性、すなわち>0.6、を呈し、よって、結晶構造情報単独がこれらの部位を選択するのに十分でないことから、チオール反応部位のスクリーニングにおいてPHESELECTORアッセイの使用の必要性を示す。チオール反応性データを、図3A及び3Bに、4D5ThioFabCys変異体:非ビオチン化及びビオチン化ファージThioFabのアミノ酸残基について示す。抗体/Fab表面上の反応性チオール基を、BSA、HER2又はストレプトアビジンとの非ビオチン化ファージhu4D5Fabv8及びビオチン化ファージhu4D5Fabv8の相互作用について、PHESELECTORアッセイ分析により同定した。アッセイは実施例2に記載のように実施した。軽鎖変異体は左側であり、重鎖変異体は右側である。非ビオチン化4D5ThioFabCys変異体の結合は予想した通り低いが、HER2への強い結合は保持されている。ビオチン化4D5ThioFabCys変異体のストレプトアビジン及びHER2への結合の割合は、表1のチオール反応性値をもたらす。450nmでのバックグラウンド吸光度、又はBSAへのビオチン化4D5ThioFabCys変異体の少量の非特異的タンパク質結合もまた、図3Bにおいて明らかである。Cys残基で置換された選択アミノ酸残基の部分的表面アクセス容易性値を図4Aに示す。部分的表面アクセス容易性は、利用可能なhu4D5Fabv7構造から算出したJMolBiol229969995。hu4D5Fabv7及びhu4D5Fabv8構造のコンホメーションパラメーターは、高度に一定であり、hu4D5Fabv7の部分的表面アクセス容易性算出と、hu4D5Fabv8システイン変異体のチオール反応性との間の任意の相関の決定を可能にする。部分的に露出された残基に導入されたファージThioFabCys残基の測定されたチオール反応性は、Ser残基に導入されたものと比較して、良いチオール反応性を有した。チオール反応性値と部分的表面アクセス容易性との間にほとんどあるいは全く相関がないことが、表1のThioFabCys変異体から分かる。抗体の位置L15、L43、L110、L144、L168、H40、H88、H119、H121、H122、H175、及びH179のアミノ酸が一般的に遊離システインアミノ酸で変異されうる。発明のシステイン操作抗体を産生するために、これらの位置の両側の約5アミノ酸残基内の範囲、すなわちL10~L20;L38~L48;L105~L115;L139~L149;L163~L173;H35~H45;H83~H93;H114~H127;及びH170~H184、並びにH268~H291;H319~H344から選択されるFc領域の範囲;H370~H380;及びH395~H405がまた遊離システイン酸で置換され得る。L=軽鎖、H=重鎖、A=アラニン、S=セリン、V=バリン、C=システインチオール反応性は、HER2結合のOD450nmに対するストレプトアビジン結合のOD450nmの割合として測定される。1のチオール反応性値は、システインチオールの完全ビオチン化を示す。軽鎖からの2つのCys変異体及び重鎖からの2つを、これらの変異体が最も高いチオール反応性を示したことから、更なる分析のために選択した。ファージ精製と異なり、Fab調製は2-3日を必要とし得、生産の規模に依存する。この間、チオール基は酸化によって反応性を失いうる。hu4D5Fabv8ファージ上のチオール基の安定性を調べるために、ファージthioFabのチオール反応性の安定性を測定した。ThioFabファージ精製の後、1日目、2日目及び4日目に、全てのサンプルをビオチンPEOマレイミドでコンジュゲートし、ファージELISAアッセイで調査し、HER2及びストレプトアビジン結合を試験した。LV15C、LV110C、HA88C及びHA121Cは、他のThioFab変異体と比較して有意な量のチオール反応性を保持する。標識されたシステイン操作抗体発明のシステイン操作抗体は、反応性システインチオール基を通して抗体に共有結合できる任意の標識部分とコンジュゲートされうるAnalBiochem30414715HarlowEandLaneDUsingAntibodiesALaboratoryManualColdSpringsHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYLundbladRLChemicalReagentsforProteinModification2ndedCRCPressBocaRatonFL。付着された標識は、検出可能なシグナルを提供する、第二標識と反応して、例えばFRETが生じるように第一又は第二標識によって生じる検出可能なシグナルを改変する、抗原又はリガンドとの相互作用を安定させるかまたは結合の親和性を増加する、電荷、疎水性、形状又は他の物理学的なパラメータによって可動性、例えば電気泳動易動度又は細胞透過性に作用する、又はキャプチャー成分を与えて、リガンド親和性、抗体/抗原結合又はイオン錯体形成を調節する、ように機能しうる。標識したシステイン改変抗体は、例えば、特定の細胞、組織又は血清における対象の抗原の発現を検出するための診断的検査法に有用となりうる。診断用適用のために、抗体は一般的に検出可能な成分ににより標識されるであろう。多くの標識が利用可能であり、通常、以下のカテゴリに分類することができる:ラジオアイソトープ、例えば3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At、又は213Bi。放射性同位体標識抗体は、レセプター標的撮像実験において有用である。抗体は、ImmunologyVolumes1and2ColigenetalEdWileyInterscienceNewYorkNYPubsのCurrentProtocolsに記載される技術を用いて、リガンド試薬が抗体の改変システインチオールと反応性がある場合に、キレートを結合するか、あるいはラジオアイソトープ金属と複合化する該リガンド試薬により標識することができる。金属イオンを複合化しうるキレートリガンドには、DOTA、DOTP、DOTMA、DTPAおよびTETAが含まれる。放射性核種は、本発明の抗体薬剤コンジュゲートとの複合体化によりターゲティングされうるNatureBiotechnology2311371146。DOTAマレイミド試薬は、システイン改変抗体の遊離したシステインアミノ酸と反応して、抗体上の金属錯体形成リガンドを提供するBioconjChem97286。DOTANHSなどのキレート化リンカー標識試薬は市販されている。放射性核種標識抗体によるレセプター標的造影は、腫瘍組織の抗体の進行性蓄積の検出および定量化によって経路活性化のマーカーとなりうるBioorgMedChemLett812071210。造影実験のための抗体標識として好適な金属キレート複合体JImmunolMethods65147157;Meares等AnalBiochem1426878;Mirzadeh等BioconjugateChem15965;Meares等JCancer1990Suppl102126;Izard等BioconjugateChem3346350;Nikula等NuclMedBiol2238790;Camera等NuclMedBiol2095562;Kukis等JNuclMed3921052110;Verel等JNuclMed4416631670;Camera等JNuclMed21640646;Ruegg等CancerRes5042214226;Verel等JNuclMed4416631670;Lee等CancerRes6144744482;Mitchell等JNuclMed4411051112;Kobayashi等BioconjugateChem10103111;Miederer等JNuclMed45129137;DeNardo等ClinicalCancerResearch4248390;Blend等CancerBiotherapyRadiopharmaceuticals18355363;Nikula等JNuclMed4016676;Kobayashi等JNuclMed3982936;Mardirossian等NuclMedBiol206574;Roselli等CancerBiotherapyRadiopharmaceuticals1420920。蛍光標識、例えば希有土類キレート、FITC、5カルボキシフルオレセイン、6カルボキシフルオレセインを含むフルオレセイン種;TAMRAを含むローダミン種;ダンシル;リサミン;シアニン;フィコエリトリン;テキサスレッド;及びこれらの類似体。蛍光標識は、例えば、上記のImmunologyのCurrentProtocolsに開示される技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光色素および蛍光標識試薬には、InvitrogenMolecularProbesおよびPierceBiotechnologyIncから市販されているものが含まれる。蛍光色素および化学発光色素などの検出標識SynthesisofFunctionalisedFluorescentDyesandTheirCouplingtoAminesandAminoAcidsJChemSocPerkinTrans110511058は検出可能なシグナルを提供し、通常、好ましくは以下のような特性により標識化抗体に応用することができる。標識抗体は、少量の抗体が無細胞アッセイおよび細胞に基づくアッセイにおいて敏感に検出されるように低いバックグランドで非常に高いシグナルを産生するものである、さらに、標識抗体は、有意に写真を退色させることなく蛍光シグナルが観察され、モニターされ、記録されるように、光安定性を有するものである。膜又は細胞表面、特に生きている細胞への標識抗体の細胞表面結合を伴う用途では、標識は、有効なコンジュゲート濃度と検出感度が達成されるように良好な水溶性であり、細胞の正常な代謝過程が破壊されないか、又は早期に細胞死を引き起こさないように生きている細胞に対して毒性がないことが好ましい。様々な酵素基質標識は利用可能であり、開示されてもいる。一般に、酵素は、様々な技術を用いて測定することができる色素生産性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光測光法で測定することができる基質の変色を触媒するかもしれない。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変えうる。蛍光の変化を定量化する技術は上記の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、測定することができるか、またはエネルギーを蛍光受容基に与える光を発しうる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、23ジヒドロフタルアジネジオン、リンゴ酸酵素、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ、複素環のオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートする技術は、OSullivan等MethodsforthePreparationofEnzymeAntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassayinMethodsinEnzymAcademicpressNewYork73147166に記載されている。酵素基質の組合せの例には、例えば以下のものが含まれる:基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ、ここで水素ペルオキシダーゼが染料前駆ジアミン又は3355テトラメチルのベンジジン塩酸塩を酸化する;色素生産性基質としてリン酸パラグラフニトロフェニルを有するアルカリホスファターゼ;及び色素生産性基質又は蛍光発生基質4メチルウンベリフェリルβDガラクトシダーゼを有するβDガラクトシダーゼ。標識は、システイン改変抗体と間接的にコンジュゲートされてもよい。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した大きな3つの分類のうちの何れかはアビジン又はストレプトアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にストレプトアビジンと結合し、したがって、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。あるいは、ポリペプチド変異体と標識とを間接的にコンジュゲートさせるために、ポリペプチド変異体は小ハプテンとコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの1つは抗ハプテンポリペプチド変異体とコンジュゲートさせる。したがって、ポリペプチド変異体と標識は間接的にコンジュゲートすることができるinBioconjugateTechniquesAcademicPressSanDiego。本発明のポリペプチド変異体は、任意の公知のアッセイ方法、例えばELISA、競合結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイに用いられてもよいMonoclonalAntibodiesAManualofTechniquespp147158CRCPressInc。検出標識は、結合又は認識事象を局所化し、視覚化して、数量化するために有用となりうる。本発明の標識抗体は細胞表面レセプターを検出しうる。検出可能に標識した抗体についての他の使用は、蛍光標識抗体とビーズをコンジュゲートさせ、リガンド結合時の蛍光シグナルを検出することを含む、ビーズに基づく免疫キャプチャの方法である。同様の結合検出方法論は、表面プラスモン共鳴効果を利用して抗体抗原相互作用を測定して検出するものである。本発明の標識システイン操作抗体は、様々な方法及び以下のような生医学的かつ分子的撮像法の技術によってバイオマーカーやプローブを造影する際に有用である。MRI、MicroCT、SPECT、PETTinianowJ等NuclearMedicineandBiology37289297Chen等BioconjugateChem154149US20100111856、バイオルミネセンス、蛍光、及び超音波。イムノシンチグラフィは、放射性物質にによって標識された抗体が動物又はヒト患者に投与される造影手順であり、画像は抗体が局在する身体の部位のものである。造影バイオマーカーは、客観的に測定され、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、又は治療的介入に対する薬理学的応答の指標として評価されてもよい。バイオマーカーはいくつかの種類がある。タイプ0は、疾患の自然な成長マーカーであって、公知の臨床指標、例えば関節リウマチの滑液炎症のMRI評価と縦方向に相関する。タイプIマーカーは、例えばメカニズムが臨床転帰と関係していなくても、作用のメカニズムの関係として介入の効果を捕らえる。タイプIIマーカーは代理のエンドポイントとして機能するものであり、該バイオマーカーの変化又は該バイオマーカーのシグナルから、関節リウマチの骨浸食をCTで測定するなどの目的の応答を有効と認めるために臨床的な利点を予測する。したがって、造影バイオマーカーは、標的タンパク質の発現、標的タンパク質に対する治療用の結合、すなわち選択性、およびクリアランスおよび半減期の薬物動態学的データについての薬物動態学的治療的情報を提供しうる。研究室ベースのバイオマーカーと比較したときのインビボ造影バイオマーカーの利点には、非侵襲性処置、定量化できる、全身評価、反復性投与及び評価、すなわち複数の時点の投与と評価、及び臨床前の結果を臨床の結果に潜在的に置き換えることができる結果が含まれる。用途によっては、バイオイメージングは、前臨床研究の多くの動物実験の代替となるかまたは最小化する。ペプチド標識方法は周知である。Haugland2003MolecularProbesHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicalsMolecularProbesIncBrinkley1992BioconjugateChem32;GarmanNonRadioactiveLabellingAPracticalApproachAcademicPressLondonMeansBioconjugateChem12;Glazer等ChemicalModificationofProteinsLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiologyAmericanElsevierPublishingCoNewYork;LundbladRLandNoyesCMChemicalReagentsforProteinModificationVolsIandIICRCPressNewYork;PfleidererGChemicalModificationofProteinsModernMethodsinProteinChemistryHTschescheEdWalterDeGryterBerlinandNewYork;及びWongChemistryofProteinConjugationandCrosslinkingCRCPressBocaRatonFla;DeLeonRodriguez等ChemEurJ1011491155;Lewis等BioconjugateChem12320324;Li等BioconjugateChem13110115;Mier等BioconjugateChem16240237を参照。十分近接した蛍光レポーターとクエンチャーの2つの成分にて標識されたペプチドとタンパク質は、蛍光共鳴エネルギー転移を受ける。レポーター基は、一般的に、特定の波長で光に励起され、エネルギーをアクセプター又はクエンチャーに転移して、その結果、最大の明るさで発光するための適切なストークスシフトが生じる蛍光色素である。蛍光色素には、広範な芳香族性を有する分子、例としてフルオレセインおよびローダミン、ないしこれらの誘導体が含まれる。蛍光レポーターは、完全なペプチドのクエンチャー成分によって部分的あるいは有意に失活されうる。ペプチダーゼ又はプロテアーゼによるペプチドの切断時に、蛍光の検出可能な増加が測定されうるFluorimetricAssaysofProteolyticEnzymesMethodsinEnzymologyAcademicPress2481834。また、本発明の標識抗体は親和性精製剤として用いられてもよい。この方法では、標識抗体は、当分野で公知の方法を用いて、セファデックス樹脂又は濾紙などの固相に固定される。固定された抗体は、精製される抗原を含む試料と接触させ、その後、支持体を、精製される抗原以外の試料中の実質的にすべての物質を取り除く適切な溶媒にて洗浄し、固定されたポリペプチド変異体に結合させる。最後に、抗原をポリペプチド変異体から放すように、支持体を他の適切な溶媒、例えばグリシンバッファ、pH5.0にて洗浄する。標識化試薬は、一般的に、標識抗体を形成するためにシステイン改変抗体のシステインチオールと直接、リンカー標識中間生成物を形成するためにリンカー試薬と、又は標識抗体を形成するためにリンカー抗体と、反応しうる反応官能基を保持する。標識試薬の反応性官能基には、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、26ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、およびホスホラミダイトが含まれるが、他の官能基も用いられてよい。THIOFABへのビオチンマレイミドのコンジュゲーションファージコートタンパク質へのFabの融合はCysチオールアクセス容易性又は反応性を潜在的に変えうるため、上記ThioFab特性はファージの存在下において得た。従って、ThioFabコンストラクトはアルカリホスファターゼプロモーター下で発現ベクターにクローン化しGene55189196、ThioFab発現は無ホスフェート培地において大腸菌細胞を増殖させることにより誘発させた。ThioFabをプロテインGHAROSETMカラムにおいて精製し、還元及び非還元SDSPAGEゲルにおいて分析した。これらの分析は、ThioFabがそれらの反応性チオール基を保持したか、又は分子内又は分子間ジスルフィド結合の形成により不活性化されたかの評価を可能にする。ThioFabLV15C、LV110C、HA88C、及びHA121Cを発現させ、プロテインGHAROSETMカラムクロマトグラフィーによって精製した。精製したタンパク質を還元及び非還元条件においてSDSPAGEゲルにおいて分析した。他の還元剤、例えばBMEが、鎖間ジスルフィド基を切断するためにゲルにおいて使用されうる。SDSPAGEゲル分析から、ThioFabの主要画分が単量体型であり、野生型hu4D5Fabv8は基本的に単量体型であることが明らかである。ThioFab及び野生型hu4D5Fabv8を100倍過剰のビオチンマレイミドで室温で3時間インキュベートし、ビオチン化FabをSuperdex200TMゲル濾過カラムにロードした。この精製工程は、オリゴマーFab及び過剰の遊離ビオチンマレイミドから単量体Fabを分離するのに有用である。図5はファージ環境不在でのThioFab変異体の特性の検証を示す。ファージ融合無しのタンパク質、hu4D5Fabv8及びhu4D5Fabv8A121Cを発現させ、プロテインGアガロースビーズを使用して精製し、100倍モル過剰のビオチンマレイミドでインキュベートした。ビオチン化cys操作ThioFab及び非ビオチン化野生型Fabのストレプトアビジン及びHER2結合を比較した。ビオチンコンジュゲーションの程度及びそれらのHER2に対する結合能を、ELISA分析によりモニターした。各Fabを2ng及び20ngで試験した。ビオチン化A121CThioFabは、野生型hu4D5Fabv8のものと同等なHER2結合を保持した。野生型Fab及びA121CThioFabをゲル濾過カラムクロマトグラフィーによって精製した。2つのサンプルを、ヤギ抗FabHRPを二次抗体として使用してELISAによって、HER2及びストレプトアビジン結合について試験した。野生型及びThioFab双方ともHER2への類似な結合を有したが、ThioFabのみがストレプトアビジン結合を保持した。非ビオチン化野生型hu4D5Fabv8では、バックグラウンドレベルのみのストレプトアビジンとの相互作用が観察された。ビオチン化ThioFabの質量スペクトル分析は、野生型hu4D5Fabv8と比較して、48294.5ダルトンの主要ピークとなった。2分子間の537.5ダルトンの差は、ThioFabにコンジュゲートした単一ビオチンマレイミドにちょうど相応する。質量分析タンパク質配列決定の結果は、コンジュゲートしたビオチン分子が新規の操作Cys残基にあることを更に確認した。アルブミン結合ペプチドTHIOFABへのビオチンマレイミドの部位特異的コンジュゲーション血漿タンパク質結合は、生存が短い分子の薬物動態学的性質を向上させる有効な手段となりうる。アルブミンは血漿中で最も多いタンパク質である。血清アルブミン結合ペプチド類は、組織取り込み、浸透および拡散の変更を含む、融合した活性なドメインタンパク質の薬物動態を変えうる。これらの薬物動態学的パラメータは、適切な血清アルブミン結合ペプチド配列を特異的に選別することによって調製されうる。一連のアルブミン結合ペプチドは、ファージディスプレイスクリーニングによって同定されたAlbuminBindingAsAGeneralStrategyForImprovingThePharmacokineticsOfProteinsJBiolChem2773503535043;国際公開第01/45746号。本発明の化合物には、Dennis等JBiolChem2773503535043atTablesIIIandIVpage35038、米国特許公開20040001827の0076、及び国際公開第0145746号の12~13頁に示されるABP配列が含まれ、これらの文献はすべて出典明記によって本明細書中に援用される。アルブミン結合Fabは、1:1の化学量比で、Fab重鎖のC末端にアルブミン結合ペプチドを融合させることによって作製した。アルブミンとのこれらABPFabの会合により、それらの半減期がウサギおよびマウスの25倍以上に増加したことが示された。したがって、上記の反応性のCys残基をこれらABPFabに導入し、細胞障害性剤と部位特異的にコンジュゲートさせた後にインビボ動物実験に用いることができる。例示的なアルブミン結合ペプチド配列は、限定するものではないが、配列番号:1-5に挙げるアミノ酸配列を含む:アルブミン結合ペプチド配列は、複数の種からのアルブミンにKd=0.3μMで結合する。アルブミン結合ペプチドは、アルブミンに結合すると知られているリガンドと競合せず、ウサギでは2.3時間の半減期を有する。ABPThioFabタンパク質を、先のセクションに記載するようにBSAHAROSETMにおいて精製し、ビオチンマレイミドコンジュゲーションし、SuperdexS200カラムクロマトグラフィーで精製した。精製したビオチン化タンパク質は均一であり、何れのオリゴマー形成も持たなかった。図6は、アルブミン結合ペプチドThioFab変異体の特性を示す。ELISA分析を、ウサギアルブミン、ストレプトアビジン及びHER2とのABPhu4D5Fabv8wt、ABPhu4D5Fabv8V110C及びABPhu4D5Fabv8A121Cの結合能力を試験するために実施した。ビオチン化ABPThioFabは、ELISA及びBIAcore結合キネティクス分析から確認されるように、野生型ABPhu4D5Fabv8のと類似な親和性で、アルブミン及びHER2に結合することができる。ELISAプレートを記載のようにアルブミン、HER2及びSAでコートした。アルブミン、HER2及びSAへのビオチン化ABPThioFabの結合を、抗FabHRPで探索した。ビオチン化ABPThioFabは、非ビオチン化コントロールABPhu4D5Fabv8wtと比較してストレプトアビジンに結合でき、同じCys変異体を双方の変異体に使用したことから、ABPThioFabがThioFabのように部位特異的にビオチンマレイミドにコンジュゲートされたことを示す。あるいは、アルブミン結合ペプチドはリンカー部分を介して共有結合によって抗体に結合されてもよい。FABあたり2つの遊離チオール基を有するABPTHIOFABの設計上記の結果は、全4つのthioFab変異体が、標識試薬、リンカー試薬、又は薬剤リンカー中間体との部位特異的コンジュゲーションに使用できる反応性チオール基を有することを示す。LV15Cは比較的低い収率で発現及び精製が可能である。しかしながら、LV110C、HA88C及びHA121C変異体の発現及び精製収率はhu4D5Fabv8のと類似であった。よってこれらの変異体は更なる分析に使用され、Fabあたり1つ以上のチオール基を得るために組換えできる。この目的のために、Fab分子あたり2つのチオール基を得るために、軽鎖に1つ及び重鎖に1つのチオール基を構築した。これらの2つの二重Cys変異体を大腸菌発現系において発現させ、精製した。精製したビオチン化ABPThioFabの均一性は、単一Cys変異体のと類似であることが分かった。Fabあたり2つの反応性Cys残基を設計することの効果を調査した。第二のビオチンの存在を、ストレプトアビジンHRPを使用して、SAへのビオチン化ABPThioFabの結合を探索することによって試験した。HER2/Fab分析では、ELISAプレートをHER2でコートし、抗FabHRPで探索した。SA/Fab分析では、ELISAプレートをSAでコートし、抗FabHRPで探索した。SA/SA分析では、ELISAプレートをSAでコートし、SAHRPで探索した。図7。HER2、ストレプトアビジンとのビオチン化ABPhu4D5Fabv8cys変異体の相互作用のELISA分析。HER2/Fab、SA/Fab及びSA/SAは、それらの相互作用が抗FabHRP、SAHRPによってそれぞれモニタされたことを示す。SA/FabはFabあたり単一のビオチンの存在をモニタし、Fabあたり一以上のビオチンはSA/SA分析によってモニタされる。二重cys変異体とのHER2の結合は、単一Cys変異体のと類似である。しかしながら、二重Cys変異体におけるビオチン化の程度は、Fab分子あたり一以上の遊離チオール基により、単一Cys変異体と比較して高かった。トラスツズマブのTHIOIgG変異体の設計システインを完全長モノクローナル抗体、トラスツズマブGenentechIncの特定残基に導入した。トラスツズマブの単一cys変異体HA88C、HA121C及びLV110C、及びトラスツズマブの二重cys変異体V110CA121C及びV110CA121Cを、CHO細胞において、1mMのシステインを含有する培地において一過性発酵によって発現させた。A88C変異体重鎖配列は配列番号:6である。A121C変異体重鎖配列は配列番号:7である。V110C変異体軽鎖配列は配列番号:8である。一実施態様では、システイン操作thioトラスツズマブ抗体は、遊離システインアミノ酸と共に一又は複数の次の可変領域重鎖配列を含む。他の実施態様では、システイン操作thioトラスツズマブ抗体は、遊離システインアミノ酸と共に一又は複数の次の可変領域軽鎖配列を含む。得られた完全長のthioトラスツズマブIgG変異体を、チオール反応性及びHER2結合活性についてアッセイした。図10Aは固定化HER2へのビオチン化抗体の結合及び吸光度検出のためのHRP標識二次抗体の図説を示す。図10Bは:非ビオチン化野生型トラスツズマブ、ビオチンマレイミドコンジュゲートthioトラスツズマブ変異体V110C、A121C、及びV110CA121Cの450nmでの吸光度の検出による、固定化HER2への結合測定を示す。各thioIgG変異体及びトラスツズマブを、1、10、及び100ngで試験した。測定は、ビオチン化抗HER2ThioMabがHER2結合活性を保持することを示す。図11Aは、吸光度検出のための抗IgGHRPへのビオチンの結合と共に、固定化HER2に結合するビオチン化抗体の図説を示す。図14Bは、ストレプトアビジンへの結合における、ビオチンマレイミドコンジュゲートのthioトラスツズマブ変異体及び非ビオチン化野生型トラスツズマブの450nmでの吸光度の検出による結合測定を示す。左から右:V110C、A121C、V110C/A121C、及びトラスツズマブ。各thioIgGトラスツズマブ変異体及び親トラスツズマブを1、10、及び100ngで試験した。測定はHER2ThioMabが高チオール反応性を有することを示す。システインを、完全長2H9抗EphB2R抗体の特定残基に導入した。2H9の単一cys変異体HA121CをCHO細胞において、1mMのシステインを含有する培地において一過性発酵によって発現させた。A121C2H9変異体重鎖配列は配列番号:28である。システイン操作thio2H9抗体は、遊離システインアミノ酸と共に次のFc定常領域重鎖配列を含む。システインを、完全長3A5抗MUC16抗体の特定残基に導入した。3A5の単一cys変異体HA121CをCHO細胞において、1mMのシステインを含有する培地において一過性発酵によって発現させた。A121C3A5変異体重鎖配列は配列番号:39を含む。システイン操作thio3A5抗MUC16抗体は、遊離システインアミノ酸と共に次の可変領域重鎖配列を含む。システイン操作thio3A5抗MUC16抗体は、遊離システインアミノ酸と共に次の可変領域軽鎖配列を含む。4D5抗HER2THIOFABの設計及びチオール反応性システインを抗HER2hu4D5Fabv8Fab断片抗体の重鎖及び軽鎖の各位置に導入した。全440の重鎖変異体及び軽鎖変異体を、ここに記載の方法に従って調製した。チオール反応性をPHESELECTORアッセイによって測定した。重鎖配列は連続的番号付けシステムによって番号付けされる。軽鎖配列はKabat番号付けシステムに従う。軽鎖配列では、Kabat及び連続的番号付け双方は同じ番号を示す。重鎖hu4D5Fabv8変異体を、HER2レセプタータンパク質への効果的結合及びビオチン化試薬、ビオチンPEOマレイミドとのチオール反応性について選択した。特定の重鎖変異体はHER2ECDへの限られた又は低減された結合を有し、なぜなら、これが抗体Fabの可変領域におけるCDRに位置する、抗原結合に重要な残基だからである。Fabの定常ドメインに位置する幾つかの残基も乏しいHER2結合を示し、なぜなら、これらの残基はFabの構造及びフォールディングに貢献し得、M13ファージにおける乏しい4D5FabディスプレイをもたらすからであるJImmunolMethods3324152。乏しいHER2ECD結合を有する重鎖hu4D5Fabv8変異体は、位置1、21、31、33-36、38、48-50、59、87、95、101、104、129、131、132、136、153、155、159、166、169、170、172、197、198、202、215、219でのシステイン変異を含んだ。野生型システイン変異体22、96、147、203、223を測定した。他の重鎖変異体は、ビオチン化試薬との限られたチオール反応性を有した。遊離システインアミノ酸残基は、表3の中央欄の配列においてフランキング残基と共に中央にある。置換アミノ酸及び重鎖における位置を左欄に示す。表3の重鎖hu4D5Fabv8変異体配列番号:50-98は、野生型システイン変異体を除き、HER2結合及び約0.8以上のチオール反応性値を保持した。配列番号:50-98の抗体はチオール反応性を示し、捕獲標識、検出標識、薬剤部分、又は固相担体との供給結合形成に有用でありうる。表3の重鎖変異体は、ThioFab又はThioMabとして、例えば抗体薬剤コンジュゲートとしてコンジュゲートされうる。軽鎖hu4D5Fabv8変異体を、HER2レセプタータンパク質への効果的結合及びビオチン化試薬、ビオチンPEOマレイミドとのチオール反応性について選択した。特定の軽鎖変異体はHER2への限られた又は低減された結合を有し、なぜなら、これが抗体Fabの可変領域におけるCDRに位置する、抗原結合に重要な残基だからである。Fabの定常ドメインに位置する幾つかの残基も乏しいHER2結合を示し、なぜなら、これらの残基はFabの構造及びフォールディングに貢献し得、M13ファージにおける乏しい4D5FabディスプレイをもたらすからであるJImmunolMethods3324152。HER2への乏しい結合を有する軽鎖hu4D5Fabv8変異体は、位置4、29-32、35、36、50、82、86、89-91、113、115、117、120、126、128、139、141、146、148、179、186、192、202でのシステイン変異を含んだ。他の軽鎖変異体は、ビオチン化試薬との限られたチオール反応性を有した。遊離システインアミノ酸残基は、表4の中央欄の配列においてフランキング残基と共に中央にある。置換アミノ酸及び軽鎖における位置を左欄に示す。表4の軽鎖hu4D5Fabv8変異体配列番号:99-147は、野生型システイン変異体を除き、HER2結合及び約0.8以上のチオール反応性値を保持した。配列番号:99-147の抗体はチオール反応性を示し、捕獲標識、検出標識、薬剤部分、又は固相担体との供給結合形成に有用でありうる。表4の軽鎖変異体は、ThioFab又はThioMabとして、例えば抗体薬剤コンジュゲートとしてコンジュゲートされうる。THIOMABのチオール反応性完全長のIgGシステイン操作抗体のチオール反応性を、ビオチン化及びストレプトアビジン結合によって測定した。ビオチンマレイミドと特異的にコンジュゲートするThioMabをスクリーニングするために、ウエスタンブロットアッセイを設定した。このアッセイでは、抗体は還元SDSPAGEにおいて分析され、ビオチンの存在はストレプトアビジンHRPでインキュベートすることによって特異的にプローブされる。図18から分かるように、ストレプトアビジンHRP相互作用は、どの操作cys変異体が使用されているかに依存して重鎖又は軽鎖どちらかに観察され、野生型とは相互作用が見られず、ThioMab変異体が操作Cys残基でビオチンと特異的にコンジュゲートしたことを示す。図18は、固定化抗IgGHRP及びストレプトアビジンHRPでの捕獲後の、還元されたビオチン化ThioIgG変異体の変性ゲル分析を示す。レーン1:3A5HA121C。レーン2:3A5LV110C。レーン3:2H9HA121C。レーン4:2H9LV110C。レーン5:抗EphB2R2H9親、野生型。各変異体はHRP検出を有する抗IgGによって捕獲され、選択性及び親和性が保持されていることを示す。HRP検出を有する固定化ストレプトアビジンによる捕獲は、重及び軽鎖上のビオチンの位置を確認した。レーン1及び3におけるシステイン操作抗体上のシステイン変異の位置は重鎖である。レーン2及び4におけるシステイン操作抗体上のシステイン変異の位置は軽鎖である。システイン変異部位は、ビオチンマレイミド試薬でのコンジュゲーションを受ける。LC/MSによる図18のThioMabシステイン操作抗体及び2H9V15C変異体の分析は、チオール反応性の定量的指標を与える。システイン操作を定常ドメイン、すなわちIgG抗体のFc領域に実施した。様々なアミノ酸部位をシステイン部位に変換し、発現変異体、すなわちシステイン操作抗体をそれらのチオール反応性について評価した。ビオチン化2H9ThioMabFc変異体を、ELISAアッセイにおいて固定化ストレプトアビジンにおける捕獲によって、HRP定量化によってチオール反応性について評価した。ELISAアッセイを、反応性チオール基を有するCys残基を迅速にスクリーニングするために行った。図19の概要図に示すように、ストレプトアビジンビオチン相互作用は、抗IgGHRPでプローブし、450nmで吸光度を測定することによってモニタされる。これらの結果は、2H9ThioFc変異体V282C、A287C、A339C、S375C及び400Cが中程度から最も高いチオール反応性を有したことを確認する。2H9ThioMabFc変異体のビオチンコンジュゲーションの程度を、表6に報告するようにLS/MS分析によって定量化した。LS/MS分析は、A282C、S375C及びS400C変異体が100のビオチンコンジュゲーションを有し、V284C及びA339Cが50のコンジュゲーションを有したことを確認し、反応性システインチオール基の存在を示す。他のThioFc変異体、及び親、野生型2H9は、非常に少ないビオチン化、又は無しであった。THIO4D5FAB軽鎖変異体のチオール反応性抗ErbB2抗体4D5の様々なシステイン操作軽鎖変異体Fabのスクリーニングは、図8のPHESELECTORアッセイに測定されるように、0.6以上のチオール反応性値を有する多くの変異体をもたらした。表7のチオール反応性値は、100に設定される重鎖4D5ThioFab変異体に正規化され、HCA121C変異体の完全なビオチン化を仮定し、パーセント値として表している。抗体薬剤コンジュゲート発明のシステイン操作抗体は、任意の治療剤、すなわち薬剤部分にコンジュゲートされ得、それは反応性システインチオール基により抗体に共有結合できる。抗体薬剤コンジュゲート化合物の例示的な実施態様は、システイン操作抗体、及び薬剤部分を含み、抗体は一又は複数の遊離システインアミノ酸を有し、抗体はリンカー部分によって一又は複数の遊離システインアミノ酸を介してDに結合され;組成物は式Iを有しここで、pは1、2、3、又は4である。チオール反応性リンカー部分によって抗体分子にコンジュゲートされうる薬剤部分の数は、ここに記載の方法によって導入されるシステイン残基の数に限定される。式Iの例示的なADCは、従って、1、2、3、又は4の操作システインアミノ酸を有する抗体を含む。抗体薬剤コンジュゲート化合物の他の例示的な実施態様は、システイン操作抗体、アルブミン結合ペプチド及び薬剤部分を含み、抗体はリンカー部分によって薬剤部分に結合され、抗体はアミド結合又は第二のリンカーによってアルブミン結合ペプチドに結合され、組成物は式Iaを有しここでpは1、2、3、又は4である。本発明のADC化合物は、抗癌活性の有用性を持つものを含む。特に、化合物は、薬剤部分、すなわち毒素にコンジュゲートされた、つまりリンカーによって共有的に結合されたシステイン操作抗体を含む。薬剤が抗体にコンジュゲートしていないとき、薬剤は細胞傷害性又は細胞分裂抑制効果を有している。よって、薬剤部分の生物学的活性は抗体へのコンジュゲーションによって調節される。本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、有効用量の細胞傷害剤を腫瘍組織に選択的に送達し、それによって、より大きな選択性、つまりより低い有効投薬量が達成されうる。薬剤部分抗体薬剤コンジュゲートの薬剤部分は、細胞傷害又は細胞分裂停止効果を有する任意の化合物、部分又は基を含む。薬剤部分は微小管インヒビター、有糸分裂インヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、又はDNAインターカレーターとして機能しうる化学療法剤;酵素的に機能しうるタンパク質毒素;及び放射性同位体を含む。例示的な薬剤部分は、限定するものではないが、マイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン、トリコテシン、CC1065、カリチアマイシン及び他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、及び立体異性体、アイソスター、その類似体又は誘導体を含む。メイタンシノイド薬剤部分としての使用に適切なメイタンシン化合物は当分野で周知であり、公知の方法に従って天然の供給源から単離してもよいし、又は遺伝子工学技術を用いて産生してもよいPROCNATACADSCI9979687973を参照。また、マイタンシノール及びマイタンシノール類似体は、公知の方法に従って合成して調製されてもよい。メイタンシノイド薬剤部分としての使用に適切なメイタンシン化合物は当分野で周知であり、公知の方法に従って天然の供給源から単離してもよいし、又は遺伝子工学技術を用いて産生してもよいPNAS9979687973を参照。また、マイタンシノール及びマイタンシノール類似体は、公知の方法に従って合成して調製されてもよい。例示的なメイタンシノイド薬剤部分には、修飾した芳香族環を有するもの、例えば、C19デクロロ;C20ヒドロキシ/-C19デクロロ;及びC20デメトキシ、C20アシロキシ、/-デクロロ、及び他の位置に修飾を有するものが含まれる。また、例示的なメイタンシノイド薬剤部分には、修飾を有するもの、例えば、C9SH;C14アルコキシメチル;C14ヒドロキシメチル又はアシロキシメチル;C15ヒドロキシ/アシロキシ;C15メトキシより単離;C18Nデメチル;及び、45デオキシが含まれる。メイタンシン化合物上の多くの位置が、結合位置として有用であることが知られており、結合のタイプに依存する。例えば、エステル結合の形成には、ヒドロキシル基を有するC3位置、ヒドロキシメチルで修飾されたC14位置、ヒドロキシル基で修飾されたC15位置、及びヒドロキシル基を有するC-20位置が全て好適である。式Iの抗体薬剤コンジュゲートの薬剤部分は次の構造を有するマイタンシノイドを含み:ここで波選は抗体薬剤コンジュゲートのリンカーへのDのイオウ原子の共有結合を示す。Rは独立して、メチル、エチル、1プロピル、2プロピル、1ブチル、2メチル1プロピル、2ブチル、2メチル2プロピル、1ペンチル、2ペンチル、3ペンチル、2メチル2ブチル、3メチル2ブチル、3メチル1ブチル、2メチル1ブチル、1ヘキシル、2ヘキシル、3ヘキシル、2メチル2ペンチル、3メチル2ペンチル、4メチル2ペンチル、3メチル3ペンチル、2メチル3ペンチル、23ジメチル2ブチル、及び33ジメチル2ブチルから選択されるC1C6アルキル又はHでありうる。イオウ原子へアミド基を結合するアルキレン鎖は、メタニル、エタニル又はプロピルであり得、すなわちmは1、2、又は3である。メイタンシン化合物は、マイクロチューブリンタンパク質であるチューブリンの重合阻害により有糸分裂中の微小管の形成を阻害することによって細胞増殖を阻害するScience18910021005。メイタンシン及びマイタンシノイドは高い細胞傷害性を有するが、主に腫瘍に対するそれらの乏しい選択性に起因するそれらの重篤な全身性副作用により、癌治療におけるそれらの臨床使用は非常に限られてきた。メイタンシンによる臨床治験は、中枢神経系及び胃腸管系への重篤な副作用により中断されているCanTreatmentRev5199207。メイタンシノイド薬剤部分は、それらが、発酵又は化学的修飾、発酵産物の誘導体化による調製に比較的到達可能であり、抗体への非ジスルフィドリンカーを介してのコンジュゲーションに適した官能基での誘導体化が受け入れられ、血漿中で安定しており、多様な腫瘍細胞株に対して効果的であるので、抗体薬剤コンジュゲートにおける魅力的な薬剤部分である。他の薬剤部分と同様に、メイタンシノイド薬剤部分のすべての立体異性体、Dのキラル炭素でのR及びS配位の組合せは、本発明の化合物のために考慮される。一実施態様では、メイタンシノイド薬剤部分は次の立体化学を有する:マイタンシノイド薬剤部分の例示的な実施態様は、DM1、m=CH2CH2;DM3、m=CH2CH2CH;及びDM4、m=CH2CH2C2を含み、次の構造を有するリンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC14位、ヒドロキシル基で修飾されたC15位、及びヒドロキシル基を有するC20位で生じる。好適な実施態様では、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC3位で形成される。また、式Iの抗体薬剤コンジュゲートの薬剤部分は、ドラスタチン及びそれらのペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチンを含む。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解及び核と細胞の分割を妨げAntimicrobAgentsandChemother4535803584、抗癌活性及び抗真菌性活性AntimicrobAgentsChemother4229612965を有することが示されている。様々な形態のドラスタチン又はアウリスタチン薬剤部分が、ペプチド薬剤部分のN末端又はC末端を通して抗体に共有結合されうるNatureBiotechnology21778784Francisco等Blood10214581465。薬剤部分は、ドラスタチン、アウリスタチン、及びその類似体及び誘導体を含む。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解、及び核及び細胞分裂を干渉しAntimicrobAgentsandChemother4535803584、抗癌及び抗真菌活性AntimicrobAgentsChemother4229612965を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のN末端又はC末端により抗体に接着しうる。例示的なアウリスタチンの実施態様には、N末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤部分DE及びDFを含み、US7498298及びUS7659241に開示され、各開示は出典明記によってその全体が特別に援用される。式Iの抗体薬剤コンジュゲートの薬剤部分は、N末端を介して抗体に結合されるモノメチルアウリスタチン薬剤部分MMAE及びMMAFを含み、次の構造を有する:一般的に、ペプチドベースの薬剤成分は、2以上のアミノ酸及び/又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる。薬剤部分はカリケアマイシン、及びその類似体及び誘導体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、US5712374US5714586US5739116US5767285US5770701US5770710US5773001US5877296を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1I、α2I、α3I、Nアセチルγ1I、PSAG及びθI1Lode等CancerResearch5829252928が含まれる。タンパク質毒素は:ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖、リシンA鎖Science2381098、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファサルシン、アレウライツフォルディイプロテイン、ジアンシンプロテイン、フィトラッカアメリカーナプロテイン、モモルディカキャランティアインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリスインヒビター、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンスが含まれる。治療用放射性同位体は、32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212Bi、212Pb及びLuの放射性同位体を含む。放射性同位体又は他の標識は、既知の方法によりコンジュゲートに組み込まれうるBiochemBiophysResCommun804957MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphyChatalCRCPress1989。炭素14標識された1イソチオシアナートベンジル3メチルジエチレントリアミン5酢酸は、抗体への放射性同位体のコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。リンカーリンカーは、一又は複数の薬剤成分と抗体ユニットを連結させて、式Iの抗体薬剤コンジュゲートを形成させるために用いられうる、二官能性成分又は多機能性成分である。抗体薬剤コンジュゲートは、薬剤及び抗体への結合について反応性機能を有するリンカーを用いて都合良く調製されうる。システイン改変抗体のシステインチオールは、リンカー試薬、薬剤成分又は薬剤リンカー中間生成物の官能基と結合することができる。一態様では、リンカーは、抗体に存在する求核性システインに反応することができる求電子性基を有する反応部位を有する。抗体のシステインチオールは、リンカー上の求電子性基と反応することができ、リンカーに共有結合する。有用な求電子性の基には、マレイミドおよびハロアセトアミド基を含むが、これらに限定されるものではない。システイン改変抗体は、Klussman等BioconjugateChemistry15765773の766ページのコンジュゲート法及び、実施例4のプロトコールに従って、マレイミド又はαハロカルボニルなどの求電子性の官能基を有するリンカー試薬又は薬剤リンカー中間生成物と反応する。さらに他の実施態様では、リンカー試薬又は薬剤リンカー中間体の反応基は、抗体の遊離したシステインチオールと結合することができるチオール反応性の官能基を含む。チオール反応性の官能基の例には、限定するものではないが、マレイミド、αハロアセチル、活性エステル、例として、スクシンイミドエステル、4ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸クロリド、塩化スルホニル、イソシアネートおよびイソチオシアネートが含まれる。他の実施態様では、リンカーは、分岐した多機能性リンカー成分を介して一より多い薬剤成分を抗体へ共有結合的に付着させるために樹枝状型であるBioorganicMedicinalChemistryLetters1222132215;Sun等BioorganicMedicinalChemistry111761176;KingTetrahedronLetters4319871990。樹枝状のリンカーは抗体に対する薬剤のモル比を増やす、すなわち負荷することができ、これはADCの力価に関連がある。したがって、システイン改変抗体は1つの反応性のシステインチオール基のみを有する場合、多くの薬剤成分が樹枝状のリンカーを介して付着されうる。リンカーは、抗体を本発明のシステイン改変抗体薬剤コンジュゲートの薬剤成分に連結するアミノ酸残基を含んでいてもよい。アミノ酸残基は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチドのユニットを形成しうる。アミノ酸残基には、天然に生じるもの、並びにシトルリンなどの微量アミノ酸及び天然に生じないアミノ酸類似体が含まれる有用なアミノ酸残基ユニットは、特定の酵素、例えば活性薬剤部分を遊離させるための腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断について、それらの選択性を設計及び最適化できる。一実施態様では、アミノ酸残基ユニット、例えばバリンシトルリンは、その切断がカテプシンB、C及びD、又はプラスミンプロテアーゼによって触媒される。リンカーユニットはpアミノベンジルカルバモイルユニット等の自己犠牲タイプであり得、ADCは次の例示的な構造を有し:このとき、Qは、C1C8アルキル、O、ハロゲン、ニトロ、又はシアノであり、mは0~4の範囲の整数であり、そして、pは1から4の範囲である。自己犠牲的なスペーサーの他の例には、PABグループに電子的に類似している芳香族化合物、例として、2アミノイミダゾール5メタノール誘導体BioorgMedChemLett92237、およびオルトないしはパラアミノベンジルアセタールが含まれるが、これらに限定されるものではない。アミド結合加水分解の際に環化されるスペーサー、例として、置換した、及び、置換していない4アミノ酪酸アミドChemistryBiology2223、適切に置換されたビシクロ221、及び、ビシクロ222環システムJAmerChemSoc945815、及び2アミノフェニルプロピオン酸アミドJOrgChem555867などが使われてもよい。また、グリシンで置換されるアミン含有薬剤の除去JMedChem271447は、ADCに有用な自己犠牲的スペーサーの例である。他の実施態様では、リンカーLは、分岐状の、多機能リンカー成分により一又は複数の薬剤成分が抗体に共有結合するために樹枝型のリンカーであってもよいBioorganicMedicinalChemistryLetters1222132215;Sun等BioorganicMedicinalChemistry1117611768。樹枝状のリンカーは抗体に対する薬剤のモル比を増す、すなわち負荷することができ、これはADCの力価に関連がある。したがって、システイン改変抗体は1つの反応性のシステインチオール基のみを有する場合、多くの薬剤成分が樹枝状のリンカーを介して付着されうるJAmerChemSoc1251568815689;Shamis等JAmerChemSoc12617261731;Amir等AngewChemIntEd4244944499。式Iaの抗体薬剤コンジュゲート化合物の実施態様は、、、及びを含む:式Iaの抗体薬剤コンジュゲート化合物の他の例示的な実施態様は次の構造を含み:ここでXは:Yは:そして、RはそれぞれH又はC1C6アルキルであり、そして、nは1~12である。他の実施態様では、リンカーは、抗体に存在する求電子性の基に反応することができる求核基を有する反応性の官能基を有する。抗体上の有用な求電子性の基は、アルデヒドおよびケトンカルボニル基が含まれるが、これらに限定されるものではない。リンカーの求核基のヘテロ原子は抗体上の求電子性の基と反応して、抗体ユニットに共有結合することができる。リンカーの有用な求核基には、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジドが含まれるが、これらに限定するものではない。抗体の求電子性の基は、リンカーへの付着に都合の良い部位を提供する。一般的に、ペプチドタイプのリンカーは、2以上のアミノ酸および/またはペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野では周知である液相合成方法ThePeptidesvolume1pp76136AcademicPressに従って調製されうる。他の実施態様では、リンカーは、溶解性又は反応性を変更した基に置換されてもよい。例えば、ADCを調製するために用いる合成手段に応じて、スルホン酸又はアンモニウムなどの荷電性の置換基は、試薬の水溶性を増し、抗体又は薬剤成分とリンカー試薬とのカップリング反応を容易にしうるか、またはDとAbLとのカップリング反応、又はAbとDLとのカップリング反応を容易にしうる。発明の化合物は、限定するものではないが、リンカー試薬:BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LCSMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホEMCS、スルホGMBS、スルホKMUS、スルホMBS、スルホSIAB、スルホSMCC、およびスルホSMPB、及びSVSBベンゾアート、及びビスマレイミド試薬、例えばDTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM3、及びBM4にて調製されるADCが明示的に考えられ、これらはPierceBiotechnologyIncCustomerServiceDepartmentPOBox117RockfordIL61105USAUSA18008743723International8159680747から市販されている。pages46749820032004ApplicationsHandbookandCatalogを参照のこと。ビスマレイミド試薬により、連続した様式又は同時の様式で、チオール含有薬剤成分、標識又はリンカー中間生成物にシステイン改変抗体のチオール基が付着することができる。システイン改変抗体、薬剤成分、標識又はリンカー中間生成物のチオール基と反応することができるマレイミド以外の他の官能基には、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネートおよびイソチオシアネートが含まれる。また、有用なリンカー試薬は、MolecularBiosciencesIncなどの他の商業的供給源により得ることができるし、Toki等JOrgChem6718661872;WalkerMAJOrgChem6053525355;Frisch等BioconjugateChem7180186;米国特許第6214345号;国際公開02/088172;米国特許公開2003130189;米国特許公開2003096743;国際公開03/026577;国際公開03/043583;及び国際公開04/032828に記載の手段に従って合成してもよい。マレイミドストレッチャーとパラアミノベンジルカルバモイル自己犠牲的スペーサーとを有する例示的なバリンシトルリンジペプチドリンカー試薬は、以下の構造を有する:ここで、QはC1C8アルキル、O、ハロゲン、ニトロ又はシアノであり;mは0~4の範囲の整数である。マレイミドストレッチャーユニットとpアミノベンジル自己犠牲的スペーサーユニットとを有する例示的なphelysジペプチドリンカー試薬は、Dubowchik等TetrahedronLetters38525760に従って調製されてもよく、以下の構造を有する:ここで、Mtrはモノ4メトキシトリチルであり、QはC1C8アルキル、O、ハロゲン、ニトロ又はシアノであり;mは0~4の範囲の整数である。例示的な発明の抗体薬剤コンジュゲート化合物は以下を含む:ここで、Valはバリンであり;Citはシトルリンであり;pは1、2、3、又は4であり;Abはシステイン操作抗体である。マイタンシノイド薬剤部分DM1がBMPEOリンカーを介してトラスツズマブのチオール基に結合されている他の例示的な抗体薬剤コンジュゲートは次の構造を持ちここで、Abはシステイン操作抗体であり;nは0、1、又は2であり;pは1、2、3、又は4である。抗体薬剤コンジュゲートの調製式IのADCは、共有結合を介して抗体リンカー中間体AbLを形成するためのリンカー試薬とのシステイン操作抗体のシステイン基の反応と、続く活性化された薬剤部分Dとの反応;及び共有結合を介して薬剤リンカー中間体DLを形成するためのリンカー試薬との薬剤部分の求核基の反応と、続くシステイン操作抗体のシステイン基との反応を含む、当業者に知られた有機化学反応、条件、及び試薬を用いて、幾つかの経路によって調製されうる。コンジュゲーション方法及びを様々なシステイン操作抗体、薬剤部分、及びリンカーと共に用いて、式Iの抗体薬剤コンジュゲートを調製することができる。抗体システインチオール基は、求核であり、反応して、活性エステル、例えばNHSエステル、HOBtエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物;アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド;アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基;及びスルフィド交換を介するピリジルジスルフィドを含むジスルフィドを含む、リンカー試薬及び薬剤リンカー中間体上の求電子性の基と共有結合を形成することができる。薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、リンカー部分上の求電子基及びリンカー試薬と反応して共有結合を形成可能なアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基を含む。マイタンシンは、例えば、MaySSCH3に変換され得、これは遊離チオールMaySHへ還元され、修飾抗体CancerResearch52127131と反応して、ジスルフィドリンカーを有するマイタンシノイド抗体イムノコンジュゲートを生成できる。ジスルフィドリンカーを有する抗体マイタンシノイドコンジュゲートが報告されている。ジスルフィドリンカーSPPは、リンカー試薬Nサクシニミジル4ペンタノエートを用いて構築される。特定の条件下で、システイン改変抗体は、DTT又はTCEPホスフィンヒドロクロライド;Getz等AnalBiochemVol2737380;SoltecVenturesBeverlyMAなどの還元剤にて処理することによって、リンカー試薬とのコンジュゲートに対して反応性にしてもよい。CHO細胞に発現される完全長のシステイン改変モノクローナル抗体を、新たに導入したシステイン残基と培養培地中に存在するシステインとの間で形成しうるジスルフィド結合を還元するために、およそ50倍の過剰なTCEPにて37°Cで3時間かけて還元した。還元されたThioMabを希釈して、10mM酢酸ナトリウム、pH5にてHiTrapSカラムに流し、0.3M塩化ナトリウムを含むPBSにて溶出する。希釈硫酸銅水、室温に終夜置くことにより親Mabに存在するシステイン残基間にジスルフィド結合が再構築された。当分野で公知の他の酸化体、すなわち酸化剤および酸化条件が用いられてもよい。外気酸化も有効である。この低刺激性の部分的な再酸化工程により、高品位の鎖内ジスルフィドが効率よく形成される。およそ10倍過剰な薬剤リンカー中間生成物、例えばBM4DM1を添加し、混合して、室温におよそ1時間置いて、コンジュゲートに作用させ、ThioMab抗体薬剤コンジュゲートを形成させた。コンジュゲート混合物をゲル濾過し、HiTrapSカラムに流して溶出させ、過剰な薬剤リンカー中間生成物と他の不純物を除去した。図11は、コンジュゲートのために細胞培養物から発現されるシステイン改変抗体を調製するための一般的な方法を示す。おそらく様々な鎖間ジスルフィド結合を有する、システイン付加物は、還元的に切断され、抗体の還元形態をもたらす。対のシステイン残基間の鎖間ジスルフィド結合は、部分的参加条件下、例えば周囲酸素への曝露下で、再形成される。システイン付加物は、おそらく様々な鎖間ジスルフィド結合とともに、抗体の還元型を生じさせるために、還元により切断される。対形成したシステイン残基間の鎖間ジスルフィド結合は、周囲酸素への曝露等の不完全酸化条件下で再形成される。新たに導入され、改変され、対形成しないシステイン残基は、リンカー試薬や薬剤リンカー中間生成物と反応して本発明の抗体コンジュゲートを形成するために利用されうる状態にある。哺乳類の細胞株において発現されるThioMabは、SS結合形成によって外部からコンジュゲートされた改変CysへのCys付加物となる。したがって、精製されたThioMabは、反応性のThioMabsを生産するために、実施例11に記載の還元及び再酸化の手順にて処理されなければならない。これらのThioMabを用いて、細胞障害性剤、蛍光体および他の標識を含むマレイミドとコンジュゲートさせる。様々なThioFab及びThioMab抗体薬剤コンジュゲートが調製された。システイン変異体hu4D5Fabv8を、ビスマレイミドリンカー試薬BMPEOを用いてマイタンシノイド薬剤部分DM1にコンジュゲートさせ、hu4D5Fabv8BMPEODM1を形成した。インビトロ細胞増殖アッセイ一般に、抗体薬剤コンジュゲートの細胞傷害性又は細胞分裂抑制活性は、細胞培養培地中のADCの抗体にレセプタータンパク質、例えばHER2を有する哺乳動物細胞を暴露し;約6時間から約5日の期間、細胞を培養し;細胞生存率を測定することにより、測定される。細胞ベースのインビトロアッセイを使用して、発明のADCの生存率、細胞傷害性、及びアポトーシスの誘導を測定した。抗体薬剤コンジュゲートのインビトロ力価を、細胞増殖アッセイによって測定した。CellTiterGlo発光細胞生存アッセイは商業的に入手可能であり、Coleopteraルシフェラーゼの組換え発現に基づく均一アッセイ方法である。この細胞増殖アッセイは、代謝的に活性な細胞の指標であるJImmunolMeth1608188米国特許6602677存在しているATPの定量に基づき培養中の生存細胞の数を決定する。CellTiterGloアッセイを96ウェル形式で実施し、それを自動化高スループットスクリーニングに受け入れられるものにしたAntiCancerDrugs6398404。該均一アッセイ手順は、血清補填培地で培養された細胞に直接単一の試薬試薬を加えることを含む。細胞洗浄、培地の除去及び複数のピペット操作工程は必要とされない。該システムは、試薬を添加し混合した後、10分で384ウェル形式で15細胞/ウェルと少ない検出を行う。細胞は、ADCで連続的に処理されてもよく、あるいはそれらは処理され、ADCから離されてもよい。一般に、短く、すなわち3時間処理された細胞は、連続的に処理された細胞と同じ効力効果を示した。均一アドミックス手段形式は存在するATPの量に比例した細胞溶解及び発光シグナルの生成を生じる。ATPの量は培養物中に存在する細胞の数に正比例する。CellTiterGloアッセイは、ルシフェラーゼ反応により生成されるグロータイプ発光シグナルを生じ、これは一般的に5時間を超える半減期を有し、細胞タイプ及び使用する培地に依存する。生細胞は相対発光単位に反映される。基質のカブトムシルシフェリンは、組換えホタルルシフェラーゼによって酸化的に脱カルボキシル化され、ATPからAMPへの同時の転換と光子の発生を伴う。インビボ効力発明の2つのアルブミン結合ペプチドDM1抗体薬剤コンジュゲートのインビボ効力は、高度にHER2を発現するトランスジェニック外植マウスモデルによって測定される。同種移植片は、ハーセプチン治療法に応答しないか僅かにしか応答しないFo5mmtvトランスジェニックマウスから増殖される。被験者を、ABPrhuFab4D5cysDM1;ABPrhuFab4D5cysDM1;及びプラセボPBSバッファーコントロールで一回処置し、3週にわたってモニターし、腫瘍が倍になる時間、対数細胞死滅、及び腫瘍収縮を測定した。抗体薬剤コンジュゲートの投与発明の抗体薬剤コンジュゲートは治療される症状に適した任意の経路によって投与されうる。ADCは、典型的には非経口的、つまり、注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下腔内及び硬膜外投与される。薬学的製剤発明の治療用抗体薬剤コンジュゲートの薬学的製剤は、典型的には薬学的に許容可能な非経口ビヒクルでの非経口投与用、つまりボーラス、静脈内、腫瘍内注射として、また単位投薬形態の注射可能形態で調製される。所望の度合いの純度を有する抗体薬剤コンジュゲートは、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、場合によっては薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤又は安定剤と混合される16版、Osol、A編。抗体薬剤コンジュゲート治療本発明の抗体薬剤コンジュゲートを用いて、例えば腫瘍抗原の過剰発現に特徴がある様々な疾患ないしは疾病を治療することが考慮される。例示的な症状又は過剰増殖性疾患には、良性ないし悪性の腫瘍;白血病およびリンパ系の悪性腫瘍が含まれる。他には、神経系、神経膠、星状性、視床下部、腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、胚盤胞性、炎症性、血管形成性、及び、自己免疫性を含む免疫性の疾患が含まれる。一般に、治療される疾患又は障害は、癌などの過剰増殖性疾患である。ここで治療される癌の例は、限定しないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉芽腫、及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍を含む。このような癌のより特定の例は、扁平細胞癌、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺癌の腺癌及び肺癌の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌、例えば胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌を含む。ADC化合物が治療において使用されうる自己免疫疾患は、リウマチ学疾患、自己免疫性胃腸及び肝臓疾患、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆管萎縮症、原発性硬化性胆管炎、及び小児脂肪便病など、血管炎、自己免疫性神経学的疾患、腎臓疾患、自己免疫性皮膚科疾患、血液系疾患、アテローム性動脈硬化、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植及び自己免疫性内分泌系疾患などの糖尿病関連の自己免疫性疾患、アジソン病及び自己免疫性甲状腺疾患などが含まれる。より好ましい前記疾患には、例えば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、ANCA関連血管炎、狼瘡、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、IDDM、悪性貧血、甲状腺炎及び糸球体腎炎が含まれる。疾患の予防又は治療のために、ADCの適切な用量は、上述のような治療されるべき疾患のタイプ、疾患の重篤度及び過程、分子が予防目的か治療目的で投与されるかどうか、患者の臨床歴、及び抗体への応答、及び担当医師の裁量に依存する。分子は、好適には一回で又は一連の治療で患者に投与される。疾患のタイプ及び重篤度に応じて、分子の約1μg/kgから15mg/kgが、例えば一又は複数回の別個の投与か又は連続注入にかかわらず、患者への投与に対する最初の候補用量である。典型的な1日の用量は、上述の要因に応じて、約1mg/kgから100mg/kg又はそれ以上の範囲となるかも知れない。患者に投与されるADCの例示的な用量は、約0.1から約10mg/kg患者体重の範囲である。症状に応じて、数日以上にわたる繰り返し投与に対して、疾患兆候の所望の抑制が生じるまで、治療が維持される。例示的な投薬レジメンは、約4mg/kgの初期負荷用量と、これに続く約2mg/kgの抗ErbB2抗体の毎週の維持用量の投与を含む。他の投薬レジメンが有用でありうる。この治療法の進行は、一般的な技術及びアッセイによって容易にモニターされる。標識抗体造影方法:本発明の他の実施態様では、システイン改変抗体は、放射性核種、蛍光色素、バイオルミネセンスを誘発する基質成分、化学発光を誘発する基質成分、酵素、および診断用、薬物動態用、治療用の適用の造影実験のための他の検出標識を有するシステインチオールによって標識されてもよい。一般に、標識されたシステイン改変抗体、すなわちバイオマーカー又はプローブは、注入、灌流又は経口摂取によって生きている生物体、例えばヒト、げっ歯動物、又は他の小動物、灌流される臓器、又は組織試料に投与される。プローブの分布は経時的に検出され、画像に表される。製造品発明の他の実施態様では、上述の疾患の治療に有用な物質を含む製造品又はキットが提供される。製造品は容器と該容器上の又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ブリスターパック等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状を治療するのに有効な抗体薬剤コンジュゲート組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る。組成物中の少なくとも一の活性剤はADCである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療のために使用されることを示している。あるいは、又は加えて、製造品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の容器を更に含みうる。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含んでもよい。実施例実施例1-ビオチン化ThioFabファージの調製ThioFabファージを、150倍過剰のビオチンPEOマレイミドビオチニル3マレイミドプロピオンアミジル36ジオキサオクタンジアミンOda等NatureBiotechnology19379382PierceBiotechnologyIncと、室温で3時間反応させた。過剰ビオチンPEOマレイミドを、反復PEG沈殿によりビオチンコンジュゲートファージから除去した。他の商業的に利用可能な、システインチオール基と反応性である求電子基を有するビオチン化標識を使用してもよく、BiotinBMCC、PEOIodoacetylBiotin、IodoacetylLCBiotin、及びBiotinHPDP、及びNαbiocytinを含む。ビオチン化、二機能性及び多機能性リンカー試薬の他の商業的供給源は、MolecularProbes、Eugene、OR、及びSigmaStLouisMOを含む。実施例2-PHESELECTORアッセイウシ血清アルブミン、erbB2細胞外ドメイン及びストレプトアビジンを、Maxisorp96ウェルプレート上に別個にコートした。0.5Tween20でブロッキングした後、ビオチン化及び非ビオチン化hu4D5Fabv8ThioFabファージを1時間室温でインキュベートし、その後西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された二次抗体でインキュベートした。図8は、HER2へのFab又はThioFab、ストレプトアビジンへのビオチン化ThioFabの結合を描く略図によりPHESELECTORアッセイを示す。標準的なHRP反応を実施し、吸光度を450nmで測定した。チオール反応性を、ストレプトアビジンのOD450/HER2のOD450間の比を算出することによって測定した。1のチオール反応性値は、システインチオールの完全なビオチン化を示す。Fabタンパク質結合測定の場合、hu4D5Fabv8を使用し、その後HRP標識されたヤギポリクローナル抗Fab抗体でインキュベートした。実施例3a-ThioFabの発現及び精製ThioFabsを、非サプレッサー大腸菌株である34B8における誘発により発現させたJournalBiologicalChemistry2721067884。収集した細胞ペレットをPBSに再懸濁させ、完全細胞溶解をマイクロフルダイザーを通過させて実施し、ThioFabをプロテインGHAROSETMを用いアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ThioFabLV15C、LV110C、HA88C、及びHA121Cを発現させ、プロテインGHAROSETMカラムクロマトグラフィーによって精製した。オリゴマーFabは画分26~30に存在し、ほとんどの単量体型は画分31-34に存在した。単量体型から成る画分をプールし、野生型hu4D5Fabv8と共にSDSPAGEによって分析し、還元及び非還元条件においてSDSPAGEゲルにおいて分析した。A121CThioFabのゲル濾過画分を非還元SDSPAGEにおいて分析した。ThioFabsを上記のようにビオチンPEOマレイミドでコンジュゲートし、ビオチン化ThioFabをSuperdex200TMゲル濾過クロマトグラフィーによって更に精製して遊離ビオチンPEOマレイミド及びThioFabのオリゴマー画分を除去した。野生型hu4D5Fabv8及びhu4D5Fabv8A121CThioFabを各々別個に、100倍モル過剰のビオチンPEOマレイミドで3時間室温でインキュベートし、Superdex200ゲル濾過カラムにロードし、遊離ビオチン並びに単量体型からのオリゴマーFabを分離させた。実施例3b-ThioFabの分析ビオチン化hu4D5Fabv8ThioFab及び野生型hu4D5Fabv8の酵素消化断片を、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析によって分析した。ビオチン化hu4D5Fabv8の48294.5一次質量及び野生型hu4D5Fabv8の47737.0一次質量間の差は、557.5質量単位だった。この断片は単一ビオチンPEOマレイミド部分の存在を示す。表8は、配列を確認する断片化値の割当てを示す。Superdex200ゲル濾過の前後に、ビオチン化ABPhu4D5Fabv8A121C、ビオチン化ABPhu4D5Fabv8V110C、ビオチン化二重CysABPhu4D5Fabv8、及びビオチン化二重CysABPhu4D5Fabv8の、DTT又はBMEでの還元の有無によるSDSPAGEゲル分析を実施した。hu4D5Fabv8BMPEODM1の質量分析:Fab151607.5、Fab50515.5。このデータは91.2のコンジュゲーションを示す。hu4D5Fabv8BMPEODM1のMS/MS分析:LC23447.2、LC124537.3、HC27072.5。このデータは、全てのDM1コンジュゲーションがFabの軽鎖上であることを示す。実施例4-ABPhu4D5Fabv8及びMCMMAEのコンジュゲーションによるABPhu4D5Fabv8MCMMAEの調製DMSOに溶存する薬剤リンカー試薬、マレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンE、すなわちMCMMAEを、既知濃度でアセトニトリル及び水に希釈し、そしてリン酸緩衝生理食塩水中における冷却ABPhu4D5Fabv8ThioFabに加え、これらはUS7521541、US7659241、及びUS7498298に従った。約1時間後、過剰のマレイミドを加え、反応をクエンチし、何れかの未反応抗体チオール基をキャップした。反応混合物を遠心限外濾過によって濃縮し、ABPhu4D5Fabv8MCMMAEを、PBS中におけるG25樹脂を通す溶出により精製及び脱塩し、無菌条件下で0.2μmフィルターを通して濾過し、保管のために凍結させた。実施例5-ABPhu4D5Fabv8及びMCMMAFのコンジュゲーションによるABPhu4D5Fabv8MCMMAFの精製ABPhu4D5Fabv8MCMMAFは、実施例4の手順に従い、ABPhu4D5Fabv8ThioFab及びMCMMAFのコンジュゲーションにより調製される。実施例6-ABPHCA121CThioFab及びMCvalcitPABMMAEのコンジュゲーションによるABPHCA121CThioFabMCvalcitPABMMAEの調製ABPhu4D5Fabv8MCvalcitPABMMAEは、実施例4の手順に従い、ABPhu4D5Fabv8及びMCvalcitPABMMAEのコンジュゲーションにより調製される。実施例7-ABPHCA121CThioFab及びMCvalcitPABMMAFのコンジュゲーションによるABPHCA121CThioFabMCvalcitPABMMAFの調製ABPhu4D5Fabv8MCvalcitPABMMAFは、実施例4の手順に従い、ABPhu4D5Fabv8及びMCvalcitPABMMAFのコンジュゲーションにより調製される。実施例8-hu4D5Fabv8ThioFabBMPEODM1の調製抗体の表面上の反応していないマレイミド基を残すビスマレイミド試薬であるBM3によってhu4D5Fabv8ThioFabの遊離システインを改変した。これは、50エタノール/水混合物にBM4を10mMの濃度にまで溶解して、10倍モル過剰のBM3をおよそ1.6mg/mlの濃度のhu4D5Fabv8ThioFabを含むリン酸緩衝生理食塩水溶液に加えて、1時間反応させることによって行った。過剰なBM3は、150mMNaClバッファを有する30mMクエン酸塩、pH6のゲル濾過によって除去した。ジメチルアセトアミドに溶解したおよそ10倍モル過剰のDM1を、hu4D5Fabv8ThioFabBMPEO中間生成物に加えた。また、ジメチルホルムアミドが薬剤成分試薬を溶解するために使用されてもよい。反応混合物を終夜反応させて、PBSにてゲル濾過又は透析を行って、反応しなかった薬剤を除去した。PBSのS200カラムのゲル濾過を用いて、高分子量集合体を取り除き、精製されたhu4D5Fabv8ThioFabBMPEODM1に与えた。同じプロトコルによって、hu4D5Fabv8ThioFabBMPEODM1を調製した。実施例9-インビトロ細胞増殖アッセイADCの効果を次のプロトコルCancerRes6254855488を使用して細胞増殖アッセイによって測定した:1.培地中に約104の細胞を有する100μlの細胞培養物のアリコートを、96ウェル、不透明ウェルプレートの各ウェルに入れた。2.コントロールウェルを培地を含み、細胞無しで調製した。3.ADCを実験ウェルに加え、3-5日間インキュベートした。4.プレートをおよそ30分間、室温に平衡化させた。5.各ウェルに存在する細胞培養培地の体積と等しい体積のCellTiterGlo試薬を加えた。6.内容物を、細胞溶解を誘導するためにオービタルシェーカーにおいて2分間混合させた。7.プレートを、発光シグナルを安定化させるために、室温で10分間インキュベートした。8.発光を記録し、RLU=相対発行単位としてグラフに報告した。特定の細胞が、96ウェルプレート、50uL/ウェルにおいて、1000-2000/ウェル又は2000-3000/ウェルで播種される。1又は2日後、ADCが、9000、3000、1000、333、111、37、12.4、4.1、又は1.4ng/mLの最終濃度まで50μL体積において加えられ、培地単独を有する無ADCコントロールウェルもある。条件は2つ組み又は3つ組みである。3又は4-5日後、100μL/ウェルのCellTiterGloIIが加えられ、細胞数はルミノメーターを使用して決定される。データは、標準偏差エラーバーと共に、各反復のセットについて発行の平均としてプロットされる。プロトコルはCellTiterGloLuminiscentCellViabilityAssayの改変である:1.1000細胞/ウェルのPC3/Muc16、PC3/neoのプレーティング。Ovcar3細胞は、2000細胞/ウェルでプレーティングされなければならない。細胞を一晩接着させる。2.ADCを、作業濃度18μg/mlで開始し、培地中に1:3に段階的に希釈したこれは9μg/mlの最終濃度になる。50μLの希釈ADCが50μLの細胞に加えられ、培地はウェルに既に存在する。3.72-96時間インキュベートする標準は72時間だが、細胞が85-95のコンフルエントになった時にアッセイを停止するために0ug/mL濃度を見る。4.100μL/ウェルのPromegaCellTiterGlo試薬を加え、3分間振とうさせ、ルミノメーターを読む培地:PC3/neo及びPC3/MUC16は50/50/10FBS/グルタミン/250μg/mLにおいて増殖、G418OVCAR3はRPMI/20FBS/グルタミンにおいて増殖実施例10-HER2を高度に発現するトランスジェニック外植片マウスにおける腫瘍増殖阻害のインビボ効率トランスジェニック実験に好適な動物は、Taconic等の標準的な商業的供給源から得ることができる。多くの株が好適であるが、FVB雌マウスが、腫瘍形成への高い感受性により好ましい。雄FVBを交配に使用し、精管切除されたCD.1種動物を偽妊娠を刺激するために使用した。精管切除マウスは任意の商業的供給者から入手可能である。ファウンダーをFVBマウス又は129/BL6×FVBp53ヘテロ接合体マウスと繁殖させた。p53対立遺伝子にヘテロ接合性を有するマウスを、腫瘍形成を潜在的に増加させるために使用した。しかしながら、これは不必要であると判明した。よって、幾つかのF1腫瘍は混合株である。ファウンダー腫瘍はFVBのみである。6のファウンダーを幾つかの発生した腫瘍と共に得、同腹仔はなかった。腫瘍を有する動物をADCの静脈内注射によって単回又は複数回投与処置した。腫瘍体積を、注射後、様々な時間点で評価した。腫瘍は、HER2のラット相同体であるneuの変異的活性化形態を発現するトランスジェニックマウスにおいて直ぐに生じたが、ヒト乳癌で過剰発現されるHER2は変異されておらず、非変異HER2を過剰発現するトランスジェニックマウスでは腫瘍形成はそれほど強固ではないSeminCancerBiol56976。非変異HER2で腫瘍形成を改善するために、トランスジェニックマウスをHER2cDNAプラスミドを使用して生産し、そこでは、上流ATGがかかる上流ATGコドンでの翻訳の開始を防止するために欠失され、そうでなければHER2の下流の真の開始コドンからの翻訳の開始の頻度が低減させるJBiolChem2742433524341を参照。更に、キメライントロンを5’末端に加え、これはまた先に報告されるように発現のレベルを増強するNucleicAcidsRes166713BuchmanandBergMolCellBiol84395Brinster等ProcNatlAcadSciUSA85836。キメライントロンは、Promegaベクター、Pcineo哺乳類発現ベクターから得られる。cDNA3’末端は、ヒト成長ホルモンエクソン4及び5、及びポリアデニル化配列を両側に持つ。更に、FVBマウスを、この株が腫瘍形成により感受性であることから使用した。MMTVLTRからのプロモーターを、乳腺における組織特異的HER2発現を確実にするために使用した。腫瘍形成への感受性を増加させるために、動物にAIN76Aの食事を与えたBreastCancerResandTreatment45149158。実施例11-コンジュゲーションのためのThioMabの還元/酸化CHO細胞において発現された完全長のシステイン操作モノクローナル抗体を、約50倍過剰のTCEPホスフィンハイドロクロライドGetz等AnalBiochemVol2737380SoltecVenturesBeverlyMAで3時間37°Cで還元した。還元されたThioMabを希釈し、10mMの酢酸ナトリウムにおいてHiTrapSカラムにロードし、0.3Mの塩化ナトリウムを含有するPBSで溶出した。溶出された還元ThioMabを、室温で一晩、200nMの水性硫酸銅で処理した。デヒドロアスコルビン酸及び周囲空気酸化も効果的なオキシダントである。実施例12-ThioMabのコンジュゲーションthioトラスツズマブ、thio2H9、及びthio3A5を含む、実施例11からの再酸化ThioMabを、10倍過剰の薬剤リンカー中間体、BM3DM1と組合せ、混合し、室温で約1時間静置してコンジュゲーションを生じさせ、thioトラスツズマブBMPEODM1、thio2H9BMPEODM1、及びthio3A5BMPEODM1を含むThioMab抗体薬剤コンジュゲートを形成した。コンジュゲーション混合物をゲル濾過るすか、又はHiTrapSカラムにロードし溶出して、過剰の薬剤リンカー中間体及び他の不純物を除去した。本発明は、発明の幾つかの態様の説明として意図される実施例に開示されている特定の実施態様によって範囲が限定されるものではなく、機能的に均等なあらゆる実施態様がこの発明の範囲内である。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入ることを意図する。全ての特許、特許出願、及び明細書中の引用文献は、全ての目的に対し、その全体が、出典明示によりここに明示的に援用される。"