"単離されたNotumモジュレーター。Notumアンタゴニストを含む、請求項1に記載の単離されたNotumモジュレーター。抗体またはその免疫反応性断片を含む、請求項1に記載の単離されたNotumモジュレーター。前記抗体またはその免疫反応性断片が、モノクローナル抗体を含む、請求項3に記載の単離されたNotumモジュレーター。前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、請求項4に記載の単離されたNotumモジュレーター。前記モノクローナル抗体が、3つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と、3つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、前記重鎖の相補性決定領域および前記軽鎖の相補性決定領域が、図7Bに示される相補性決定領域を含む、請求項4に記載の単離されたNotumモジュレーター。前記モノクローナル抗体が、ヒト化抗体である、請求項6に記載の単離されたNotumモジュレーター。前記モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18、配列番号22、配列番号26、配列番号30、配列番号34、配列番号38、配列番号42、配列番号46、配列番号50、配列番号54、配列番号58、配列番号62、配列番号66、配列番号70、配列番号74、配列番号78、配列番号82、配列番号86、配列番号90、配列番号94および配列番号98に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも60の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号16、配列番号20、配列番号24、配列番号28、配列番号32、配列番号36、配列番号40、配列番号44および配列番号48、配列番号52、配列番号56、配列番号60、配列番号64、配列番号68、配列番号72、配列番号76、配列番号80、配列番号84、配列番号88、配列番号92および配列番号96に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも60の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の単離されたNotumモジュレーター。請求項8に記載のアミノ酸重鎖可変領域またはアミノ酸軽鎖可変領域をコードする核酸。請求項9に記載の核酸を含むベクター。請求項8に記載のモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体。配列番号2に示されるアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項1に記載の単離されたNotumモジュレーター。免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をさらに含む、請求項12に記載の単離されたNotumモジュレーター。被験体に投与されると、腫瘍始原細胞の頻度を低減する、請求項1に記載の単離されたNotumモジュレーター。前記頻度の低下が、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析、または腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的検出を用いて決定される、請求項14に記載の単離されたNotumモジュレーター。前記頻度の低下が、invitroまたはinvivoにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項14に記載の単離されたNotumモジュレーター。前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞の免疫不全マウスへの移植を含むinvivoにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項16に記載の単離されたNotumモジュレーター。invivoにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項17に記載の単離されたNotumモジュレーター。前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞のinvitroにおけるコロニー支持条件への限界希釈沈着を含むinvitroにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項16に記載の単離されたNotumモジュレーター。invitroにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項19に記載の単離されたNotumモジュレーター。前記腫瘍始原細胞が、腫瘍永続細胞を含む、請求項14に記載の単離されたNotumモジュレーター。Notum関連障害を処置する方法であって、治療有効量のNotumモジュレーターを、Notum関連障害の処置を必要とする被験体に投与するステップを含む、方法。前記Notumモジュレーターが、Notumアンタゴニストを含む、請求項22に記載の方法。前記Notumモジュレーターが、抗体またはその免疫反応性断片を含む、請求項22に記載の方法。前記抗体またはその免疫反応性断片が、モノクローナル抗体を含む、請求項24に記載の方法。前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、請求項25に記載の方法。前記モノクローナル抗体が、3つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と、3つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、前記重鎖の相補性決定領域および前記軽鎖の相補性決定領域が、図7Bに示される相補性決定領域を含む、請求項25に記載の方法。前記モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18、配列番号22、配列番号26、配列番号30、配列番号34、配列番号38、配列番号42、配列番号46、配列番号50、配列番号54、配列番号58、配列番号62、配列番号66、配列番号70、配列番号74、配列番号78、配列番号82、配列番号86、配列番号90、配列番号94および配列番号98に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも60の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号16、配列番号20、配列番号24、配列番号28、配列番号32、配列番号36、配列番号40、配列番号44および配列番号48、配列番号52、配列番号56、配列番号60、配列番号64、配列番号68、配列番号72、配列番号76、配列番号80、配列番号84、配列番号88、配列番号92および配列番号96に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも60の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の方法。前記過剰増殖性障害が、新生物性障害を含む、請求項22に記載の方法。前記新生物性障害が、充実性腫瘍を含む、請求項29に記載の方法。前記充実性腫瘍由来の組織が、KRAS変異、APC変異、CTNNB1変異、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項30に記載の方法。新生物性障害が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、または乳がんを含む、請求項29に記載の方法。前記被験体における腫瘍始原細胞の頻度を低減するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。前記頻度の低下が、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析を用いて決定される、請求項33に記載の方法。前記頻度の低下が、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的検出を用いて決定される、請求項33に記載の方法。前記頻度の低下が、invitroまたはinvivoにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項33に記載の方法。前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞の免疫不全マウスへの移植を含むinvivoにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項36に記載の方法。invivoにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項37に記載の方法。前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞のinvitroにおけるコロニー支持条件への限界希釈沈着を含むinvitroにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項36に記載の方法。invitroにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項39に記載の方法。抗がん剤を投与するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。前記Notumモジュレーターが、配列番号2に示されるアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項22に記載の方法。前記Notumモジュレーターが、免疫グロブリン定常領域またはその断片をさらに含む、請求項42に記載の方法。前記Notumモジュレーターが、融合タンパク質を含む、請求項43に記載の方法。前記Notumモジュレーターと異なる第2のNotumモジュレーターを投与するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。腫瘍始原細胞の頻度の低減を必要とする被験体における腫瘍始原細胞の頻度を低減する方法であって、Notumモジュレーターを前記被験体に投与するステップを含む、方法。前記腫瘍始原細胞が、腫瘍永続細胞を含む、請求項46に記載の方法。前記腫瘍永続細胞が、1または複数のマーカーを含む、請求項47に記載の方法。前記Notumモジュレーターが、Notumアンタゴニストを含む、請求項46に記載の方法。前記Notumモジュレーターが、抗体を含む、請求項46に記載の方法。前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項50に記載の方法。前記被験体が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、および乳がんからなる群より選択される新生物性障害を患っている、請求項46に記載の方法。腫瘍始原細胞の前記頻度が、少なくとも10低減される、請求項46に記載の方法。前記頻度の低下が、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析を用いて決定される、請求項46に記載の方法。前記頻度の低下が、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的検出を用いて決定される、請求項46に記載の方法。前記頻度の低下が、invitroまたはinvivoにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項46に記載の方法。前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞の免疫不全マウスへの移植を含むinvivoにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項56に記載の方法。invivoにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項57に記載の方法。前記頻度の低下が、ヒト腫瘍生細胞のinvitroにおけるコロニー支持条件への限界希釈沈着を含む、invitroにおける限界希釈解析を用いて決定される、請求項56に記載の方法。invitroにおける限界希釈解析を用いて決定される前記頻度の低下が、ポアソン分布統計を用いる腫瘍始原細胞の頻度の定量化を含む、請求項59に記載の方法。抗がん剤による処置のために被験体における腫瘍を感作させる方法であって、Notumモジュレーターを前記被験体に投与するステップを含む、方法。前記Notumモジュレーターが、抗体である、請求項61に記載の方法。前記腫瘍が、充実性腫瘍である、請求項61に記載の方法。前記抗がん剤が、化学療法剤を含む、請求項61に記載の方法。前記抗がん剤が、生物学的薬剤を含む、請求項64に記載の方法。過剰増殖性障害の診断を必要とする被験体における過剰増殖性障害を診断する方法であって、a.組織試料を前記被験体から得るステップと、b.前記組織試料を、少なくとも1つのNotumモジュレーターと接触させるステップと、c.前記試料と会合した前記Notumモジュレーターを検出または定量化するステップとを含む、方法。前記Notumモジュレーターが、モノクローナル抗体を含む、請求項66に記載の方法。前記抗体が、レポーターと作動可能に会合している、請求項67に記載の方法。Notum関連障害を診断または処置するのに有用な製品であって、Notumモジュレーターを含む容器と、前記Notumモジュレーターを用いて前記Notum関連障害を処置または診断するための指示書とを含む、製品。前記Notumモジュレーターが、モノクローナル抗体である、請求項69に記載の製品。前記容器が、読み取り可能なプレートを含む、請求項70に記載の製品。KRAS変異、APC変異、またはCTNNB1変異を呈示する充実性腫瘍を含む新生物性障害を患っている被験体を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも1つのNotumモジュレーターを投与するステップを含む、方法。前記Notumモジュレーターが、アンタゴニストを含む、請求項72に記載の方法。前記Notumモジュレーターが、抗体を含む、請求項72に記載の方法。前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項74に記載の方法。前記新生物性障害が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、および乳がんからなる群より選択される、請求項72に記載の方法。新生物性障害を患っている被験体を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも1つのNotum中和モジュレーターを投与するステップを含む、方法。前記Notumモジュレーターが、配列番号2に示されるアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項77に記載の方法。前記Notumモジュレーターが、抗体を含む、請求項77に記載の方法。前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項79に記載の方法。前記新生物性障害が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、および乳がんからなる群より選択される、請求項80に記載の方法。腫瘍始原細胞の集団を同定するか、単離するか、区分するか、または濃縮する方法であって、前記腫瘍始原細胞を、Notumモジュレーターと接触させるステップを含む、方法。前記Notumモジュレーターが、抗体を含む、請求項82に記載の方法。前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項83に記載の方法。前記腫瘍始原細胞を、フローサイトメトリー解析に供するステップをさらに含む、請求項82に記載の方法。前記フローサイトメトリー解析が、FACSを含む、請求項85に記載の方法。過剰増殖性障害を患っている患者における腫瘍始原細胞を枯渇させる方法であって、Notumモジュレーターを投与するステップを含む、方法。前記Notumモジュレーターが、モノクローナル抗体を含む、請求項87に記載の方法。前記モノクローナル抗体が、細胞傷害性剤と会合している、請求項88に記載の方法。ヒト化抗体を含むNotumモジュレーターであって、前記抗体が、配列番号331に実質的に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、配列番号332に実質的に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列とを含む、Notumモジュレーター。hSC2.D2.2抗体と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。転移の阻害または防止を必要とする被験体における転移を阻害または防止する方法であって、薬学的有効量のNotumモジュレーターを投与するステップを含む、方法。前記被験体が、前記Notumモジュレーターを投与する前、または前記Notumモジュレーターを投与した後に腫瘍減量手順を受ける、請求項92に記載の方法。前記腫瘍減量手順が、少なくとも1つの抗がん剤の投与を含む、請求項93に記載の方法。前記被験体が、前記Notumモジュレーターを投与するときに寛解期にある、請求項94に記載の方法。維持療法を必要とする被験体に維持療法を実施する方法であって、薬学的有効量のNotumモジュレーターを投与するステップを含む、方法。前記被験体が、前記Notumモジュレーターの投与前に新生物性障害について処置された、請求項96に記載の方法。前記Notumモジュレーターを投与するとき、前記被験体が、前記新生物性障害について無症候性である、請求項97に記載の方法。前記被験体を前記新生物性障害について処置してから6カ月超経過後、前記Notumモジュレーターが投与される、請求項98に記載の方法。前記Notumモジュレーターが、モノクローナル抗体を含む、請求項99に記載の方法。Notum媒介性パラクリンシグナル伝達の阻害を必要とする被験体においてNotum媒介性パラクリンシグナル伝達を阻害する方法であって、薬学的有効量のNotumモジュレーターを投与するステップを含む、方法。広義において、Notum関連障害例えば、過剰増殖性障害または新生物性障害の処置において使用され得る方法、化合物、組成物、および製品を対象とする本発明は、これらの目的および他の目的を掲げる。この目的では、本発明が、がん幹細胞を有効に標的とし、多種多様な悪性疾患を患っている患者を処置するのに使用され得る新規のNotumモジュレーターを提供する。特定の実施形態では、開示されるNotumモジュレーターが、Notumポリペプチド、そのリガンド、またはその遺伝子を認識するか、これと競合するか、刺激するagonizeか、これと拮抗するか、これと相互作用するか、これに結合するか、またはこれと会合し、Notumタンパク質の、1または複数の生理学的経路例えば、Wnt/ベータ-カテニン経路、Hh経路、またはBMP経路に対する影響を調節するか、調整するか、変更するか、変化させるか、または修飾する任意の化合物を含みうる。本発明の選択された実施形態では、Notumモジュレーターが、単離形態にあるNotum自体またはその断片を含む場合もあり、他の部分と融合または会合しているNotum自体もしくはその断片例えば、Fc-Notum、PEG-Notum、または標的化部分と会合しているNotumを含む場合もある。他の選択された実施形態では、Notumモジュレーターが、本出願の目的では、Notumを認識するか、これと競合するか、これと相互作用するか、これに結合するか、またはこれと会合し、腫瘍始原細胞を含めた新生物性の細胞を中和するか、消失させるか、低減するか、感作させるか、再プログラム化するか、阻害するか、またはそれらの増殖を制御する任意の構築物または化合物を意味すると考えられるものとするNotumアンタゴニストを含みうる。好ましい実施形態では、本発明のNotumモジュレーターが、新生物性細胞を増殖させるpropagateか、維持するか、拡大増殖させるか、増殖させるproliferateか、またはそれらの生存、再発、再生、および/もしくは転移を他の形で促進する腫瘍始原細胞の能力を、サイレンシングするか、中和するか、低減するか、減少させるか、枯渇させるか、加減するか、減殺するか、再プログラム化するか、消失させるか、または他の形で阻害することが予測外にも見出された抗Notum抗体またはその断片もしくは誘導体を含む。一実施形態では、Notumモジュレーターが、ヒト化抗体を含むことが可能であり、前記抗体が、配列番号331に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、配列番号332に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列とを含む。他の好ましい実施形態では、本発明が、hSC2.D2.2抗体と薬学的に許容される担体とを含む組成物の形態である。特定の他の実施形態では、本発明が、被験体に投与されると腫瘍始原細胞の頻度を低減するNotumモジュレーターを含む。頻度の低下は、invitroまたはinvivoにおける限界希釈解析を用いて決定することが好ましい。特に好ましい実施形態では、このような解析は、ヒト腫瘍生細胞の免疫不全マウスへの移植を含むinvivoにおける限界希釈解析を用いて実施することができる。代替的に、限界希釈解析は、ヒト腫瘍生細胞のinvitroにおけるコロニー支持条件への限界希釈沈着limitingdilutiondepositionを含む、invitroにおける限界希釈解析を用いて実施することもできる。いずれの場合においても、頻度の低下についての解析、計算、または定量化は、正確な計算をもたらすポアソン分布統計の使用を含むことが好ましい。このような定量化法が好ましい一方で、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学など、他のそれほど労働集約的でない方法もまた、所望の値を提供するのに用いることができ、したがって、本発明の範囲内にあるものとして明示的に意図されることが理解されるであろう。このような場合、頻度の低下は、フローサイトメトリー解析を用いて決定することもでき、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的検出を用いて決定することもできる。したがって、別の好ましい実施形態では、本発明が、Notum関連障害を処置する方法であって、治療有効量のNotumモジュレーターを、それを必要とする被験体に投与し、これにより、腫瘍始原細胞の頻度を低減するステップを含む方法を含む。ここでもまた、腫瘍始原細胞の頻度の低下は、invitroまたはinvivoにおける限界希釈解析を用いて決定することが好ましい。この点で、本発明は、Notumポリペプチドが、多様な新生物の病因に関与する腫瘍永続細胞すなわち、がん幹細胞と会合するという発見に少なくとも部分的に基づくことが理解されるであろう。より具体的に述べると、本出願は、予測外にも、多様な例示的Notumモジュレーターの投与が、腫瘍始原細胞を介する腫瘍原性のシグナル伝達を低減する場合もあり、阻害する場合もあり、消失させる場合もあるすなわち、腫瘍始原細胞の頻度を低減することを示す。これは、腫瘍始原細胞の低減または消失または再プログラム化またはサイレンシングを介する場合であれ、腫瘍細胞形態の改変例えば、分化の誘導、ニッシェの破壊を介する場合であれ、シグナル伝達を低減し、今度は、腫瘍形成、腫瘍維持、拡大増殖、および/または転移、ならびに再発を阻害することを介するNotum関連障害のより有効な処置を可能とする。他の実施形態では、開示されるモジュレーターが、Notum媒介性パラクリンシグナル伝達であって、腫瘍の増殖growthを刺激しうるパラクリンシグナル伝達に干渉する場合もあり、これを抑制する場合もあり、これを他の形で遅延させる場合もある。さらに、以下でより詳細に論じられる通り、Notumポリペプチドは、Wnt/ベータ-カテニン発がん性生存経路、ヘッジホッグHh発がん性生存経路、および骨形成タンパク質BMP発がん性生存経路にも密接に関与する。本明細書で記載される新規のNotumモジュレーターを用いてこれらの発生シグナル伝達経路に介入することにより、さらに1つより多い機構すなわち、腫瘍始原細胞の低減および発生シグナル伝達の破壊を介して障害を改善して、相加作用または相乗作用をもたらすこともできる。したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、それを必要とする被験体におけるNotum媒介性障害を処置する方法であって、Notumモジュレーターを前記被験体に投与するステップを含む方法を含む。特に好ましい実施形態では、Notumモジュレーターを、抗がん剤と会合させる例えば、コンジュゲートさせる。加えて、被験体の腫瘍組織が、隣接する正常組織と比較して、Notumレベルの上昇を呈示する場合であれ、Notumレベルの低減または抑制を呈示する場合であれ、このような破壊および副次的利益を達成することができる。さらに、本発明のモジュレーターが、特定の充実性腫瘍を処置するのにとりわけ有効でありうることの証拠が存在する。したがって、他の特に好ましい実施形態では、本発明が、KRAS変異、APC変異、またはCTNNB1変異を呈示する充実性腫瘍を含む新生物性障害を患っている被験体を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも1つのNotumモジュレーターを投与するステップを含む方法を含む。さらに他の実施形態では、本発明が、それを必要とする被験体におけるNotum媒介性パラクリンシグナル伝達を阻害する方法であって、薬学的有効量のNotumモジュレーターを投与するステップを含む方法を含む。本発明の他の様相は、開示されるモジュレーターが、腫瘍始原細胞を同時にサイレンシングしながら、複数の発がん性生存経路を潜在的に破壊する能力を利用する。このような多重活性のNotumモジュレーター例えば、Notumアンタゴニストは、標準治療の抗がん剤または腫瘍減量剤と組み合わせて用いる場合に特に有効であることがわかる場合がある。加えて、2つ以上のNotumアンタゴニスト例えば、Notumにおける2つの個別のエピトープに特異的に結合する抗体を、本教示に従い組み合わせて用いることができる。さらに、以下である程度詳細に論じる通り、本発明のNotumモジュレーターは、場合によって、多様な化学的抗がん剤または生物学的抗がん剤と組み合わせた感作剤として、コンジュゲート状態で用いることもでき、非コンジュゲート状態で用いることもできる。したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、抗がん剤による処置のために被験体における腫瘍を感作させる方法であって、Notumモジュレーターを前記被験体に投与するステップを含む方法を含む。本発明の特に好ましい態様では、Notumモジュレーターが、とりわけ、invitroまたはinvivoにおける限界希釈解析を用いて決定される腫瘍始原細胞の頻度の低減を結果としてもたらす。同様に、本発明の化合物は、多様な生理学的機構を介して治療的利益をもたらしうるので、本発明はまた、とりわけ、特定の細胞過程を利用するように作製される、選択されたエフェクターまたはモジュレーターも対象とする。例えば、特定の実施形態では、好ましいモジュレーターを創出して腫瘍始原細胞の表面におけるNotumまたは腫瘍始原細胞の表面近傍におけるNotumと会合させ、被験体の免疫反応を刺激する。他の実施形態では、エフェクターが、任意のNotum酵素活性の中和を促進するエピトープを指向し、次いで、腫瘍微小環境および任意の関連するパラクリンシグナル伝達におけるNotum基質の量を低減するのに用いられる抗体を含みうる。さらに他の実施形態では、開示されるモジュレーターが、Notum関連細胞を枯渇させることを介して作用する場合もあり、これを消失させることを介して作用する場合もある。したがって、本発明が、任意の具体的な作用方式に限定されず、所望の結果を達成する任意の方法またはNotumモジュレーターを包含することを理解することが重要である。このような枠組みの中では、開示される実施形態のうちの好ましい実施形態が、新生物性障害を患っている被験体を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも1つのNotum中和モジュレーターを投与するステップを含む方法を対象とする。他の実施形態は、Notum関連障害を患っている被験体を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも1つのNotum枯渇化モジュレーターを投与するステップを含む方法を対象とする。さらに別の実施形態では、本発明が、維持療法maintenancetherapyの方法であって、腫瘍塊の少なくとも一部を除去するようにデザインされた初期手順例えば、化学療法手順、照射手順、または手術手順後のある期間にわたり開示されるエフェクターを投与する維持療法の方法を提供する。このような治療レジメンは、何週間かにわたり投与する場合もあり、何カ月間かにわたり投与する場合もあり、何年間かにもわたり投与する場合もあり、Notumモジュレーターが予防的に作用して、転移および/または腫瘍の再発を阻害しうる。さらに他の実施形態では、開示されるモジュレーターを、転移を防止するかまたは遅延させる公知の腫瘍減量レジメンと共に投与することもできる。上記で論じた治療的使用のほかに、本発明のモジュレーターを、Notum関連障害、および、特に、過剰増殖性障害を診断するのに使用され得ることも理解される。したがって、好ましい実施形態は、それを必要とする被験体における過剰増殖性障害を診断する方法であって、a.組織試料を前記被験体から得るステップと、b.組織試料を、少なくとも1つのNotumモジュレーターと接触させるステップと、c.試料と会合したNotumモジュレーターを検出または定量化するステップとを含む方法を含む。このような方法は、本出願と共に容易に識別することができ、自動式プレートリーダー、専用レポーターシステムなど、一般に市販される技法を用いて容易に実施することができる。好ましい実施形態では、検出するステップまたは定量化するステップが、腫瘍始原細胞の頻度の低下を含む。さらに、既に上記で示唆した通りに、限界希釈解析を実施することができ、頻度の低下についての正確な計算をもたらすポアソン分布統計を使用することが好ましい。同様に、本発明はまた、がんなどのNotum関連障害を診断およびモニタリングするのに有用なキットも提供する。この目的では、本発明が、Notumモジュレーターを含む容器、および前記Notumモジュレーターを用いてNotum関連障害を処置または診断するための指示書を含む、Notum関連障害を診断または処置するのに有用な製品を提供することが好ましい。本発明の他の好ましい実施形態はまた、蛍光活性化細胞分取FACSまたはレーザー媒介型区分lasermediatedsectioningなどの方法を介して、腫瘍始原細胞の集団または亜集団を同定するか、単離するか、区分するか、または濃縮するのに有用な手段としての、開示されるモジュレーターの特性も利用する。したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、腫瘍始原細胞の集団を同定するか、単離するか、区分するか、または濃縮する方法であって、前記腫瘍始原細胞をNotumモジュレーターと接触させるステップを含む方法を対象とする。前出は概要であり、したがって、必然的に、細部の単純化、一般化、および省略を含有するものであり、このため、当業者は、概要は例示的であるにとどまるものであり、いかなる形であれ、限定的であることを意図するものではないことを理解するであろう。本明細書で記載される方法、組成物、および/またはデバイスおよび/または他の対象物の他の態様、特色、および利点は、本明細書で示される教示において明らかとなるであろう。概要は、以下の発明を実施するための形態にさらに記載される概念の、単純化された形態による選択を導入する目的で示されている。この概要は、特許請求される対象物の重要な特色または本質的な特色を同定することを意図するものではなく、特許請求される対象物の範囲を決定する一助として用いることを意図するものでもない。I.序説広義において、本発明の実施形態は、新規のNotumモジュレーターおよびがんを含めた過剰増殖性障害を処置するか、管理するか、改善するか、またはその発生を防止することにおけるそれらの使用を対象とする。いかなる具体的な理論に拘束されることも望まずに述べると、開示されるモジュレーターは、腫瘍の成長を低減するかまたは遅延させ、腫瘍原性細胞を消失させるかまたは中和するほか、このような細胞の抗がん剤に対する感受性を変化させるのに有効であることが発見された。さらに、選択された腫瘍永続細胞TPCとNotumとして公知のタンパク質との間にこれまでのところ未知である表現型の関連が認められることが驚くべきことに発見された。この点で、選択されたTPCすなわち、がん幹細胞またはCSCが、正常組織と比較した場合に上昇したレベルのNotumを発現させるほか、併せて充実性腫瘍の大半を構成する腫瘍前駆細胞TProgおよび非腫瘍原性NTG細胞と比較した場合にも上昇したレベルのNotumを発現させることが見出された。したがって、選択された実施形態では、Notumが、腫瘍関連マーカーまたは抗原を含み、選択された細胞の表面と会合したタンパク質のレベルおよび腫瘍の微小環境におけるタンパク質レベルの上昇に起因するTPCおよび関連する新生物を検出、感作、および/または抑制するのに有効な薬剤をもたらすことが見出された。より具体的に述べると、かつ、なおより驚くべきことに、Notumが明らかに分泌される少なくともある程度ことを踏まえると、Fc-Notum構築物および免疫反応性アンタゴニスト例えば、タンパク質に対する抗体を含めたNotumモジュレーターが、これらの腫瘍永続細胞を枯渇させるか、感作させるか、消失させるか、低減するか、再プログラム化するか、これらの細胞の分化を促進するか、あるいはこれらの細胞が広がって患者における腫瘍の成長もしくは再発を刺激し、かつ/またはこれらの細胞が持続的に患者における腫瘍の成長もしくは再発を刺激する能力を他の形で取り除くかまたは制限するのに有用でありうることもさらに発見された。好ましい実施形態では、本発明のNotumモジュレーターが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドを含む。既に示唆し、以下でも詳細に論じる通り、本明細書で開示される選択された実施形態は、コンジュゲートされた形態またはコンジュゲートされていない形態にある、Notumに対する抗体を含む。Notumモジュレーターの他の実施形態は、Notum、または、例えば、Notum融合構築物例えば、Notum-Fc、Notum標的化部分などもしくはNotumコンジュゲート例えば、Notum-PEG、Notum-細胞傷害性剤cytotoxicagentなどを含めた、その形態、変異体、誘導体、もしくは断片を含むことが好ましい。さらに他の実施形態では、モジュレーターが遺伝子レベルで作用することが可能であり、アンチセンス構築物、siRNA、miRNAなどの化合物を含みうる。前出のNotumモジュレーターは、例えば、Notumモジュレーターの形態または投与および送達方法に依存して、選択された経路を刺激するかもしくはこれと拮抗するか、または特定の細胞非TPC支持細胞を含めたを消失させるかもしくは枯渇させる競合的機構を介して、腫瘍永続細胞および/または関連する新生物の成長、増殖または生存を減弱しうる。これらの発見を考えると、当業者は、本発明の特に好ましい実施形態が、大部分、Notumモジュレーターおよび腫瘍始原細胞の頻度の低減におけるそれらの使用を対象とすることを理解するであろう。本明細書で広範にわたり論じられる通り、本発明と適合可能なNotumモジュレーターは、Notumと会合するか、結合するか、複合体化するか、または他の形で反応するかもしくは競合し、場合によって、腫瘍永続細胞の頻度の低下をもたらす任意の化合物を広く含む。本明細書で開示される例示的なモジュレーターは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドを含む。好ましい特定の実施形態では、選択されたモジュレーターが、Notumに対する抗体またはその免疫反応性断片もしくは誘導体を含む。このような抗体は、アンタゴニスト性の場合もあり、アゴニスト性の場合もある。他の好ましい実施形態では、本発明と適合可能なエフェクターが、Notum自体またはその反応性断片を含むNotum構築物を含む。このようなNotum構築物は、融合タンパク質を含むことが可能であり、免疫グロブリン、ステープルドペプチドstapledpeptide、または生物学的応答修飾剤など、他のポリペプチドに由来する反応性ドメインを含みうることが理解されるであろう。さらに他の好ましい態様では、NotumエフェクターまたはNotumモジュレーターが、ゲノムレベルで所望の効果を及ぼす核酸アセンブリーを含む。本教示と適合可能なさらに他のモジュレーターについては、以下で詳細に論じる。関連して述べると、以下の議論は、Notumモジュレーター、Notumアンタゴニスト、および抗Notum抗体に関する。各用語のより詳細な定義を以下に示すが、この開示の目的では、これらの用語が大部分互換的であり、文脈により示されない限り、狭義に理解されるべきではないことが理解されるであろう。例えば、Notumアンタゴニストに関して言及する場合、これはまた、偶然アンタゴニスト性である本発明の抗体にも当てはまる。同様に、Notumモジュレーターという用語は、開示されるNotumアンタゴニストおよび抗Notum抗体を明示的に包含し、後者に対する言及はまた、文脈により除外されない限り、モジュレーターにも当てはまる。II.Notum本明細書で用いられるNotumという用語は、天然のNotumペクチンアセチルエステラーゼタンパク質、その断片、またはその変異体を指す。代表的なNotumオルソログには、ヒトすなわち、hNotumオルソログ、マウスオルソログ、マカクザルオルソログ、およびショウジョウバエオルソログが含まれるがこれらに限定されない。その遺伝子のヒトオルソログは、分子量を約55.7kDaとする496アミノ酸aaのポリペプチド構築物をもたらす、1488塩基対のオープンリーディングフレームを含む。ヒトNotumタンパク質をコードする例示的な核酸配列を、配列番号1に示す一方で、対応するアミノ酸配列を、配列番号2に示すそれぞれ、図1Aおよび1B。ヒトNotumタンパク質は、切り出されてこのタンパク質の成熟形態すなわち、477aaをもたらす、配列番号2のアミノ酸1~19を含む、予測されるシグナル配列またはリーダー配列を含むことが理解されるであろう。参考として、マウスNotumGenBank受託番号:NM_175263が、ヒトNotumと約91相同である一方、マカクザルNotumGenBank受託番号:XM_001112829は、ヒトNotumと約96相同である。直接の参照または文脈的な必然性により別段に示されない限り、Notumという用語は、ヒトNotumおよび免疫反応性の同等物を対象とするものとする。NotumのヒトホモログGenBank受託番号:NM_178493、GeneID:147111は、参考として本明細書に援用される、Torisuら、2008年、PMID:18429952においてより完全に記載されている。この用語はまた、抗体が特異的に結合しうるエピトープを含有する、Notumの天然形態または変異体形態の断片も指しうることがさらに理解されるであろう。ここでもまた、いかなる特定の理論に拘束されることも望まないが、本発明のNotumモジュレーター、および、特に、Notumアンタゴニストは、少なくとも部分的に、標準治療の治療レジメン例えば、イリノテカンの文脈外で発がん性の生存に干渉することを介して作用しうるほか、腫瘍始原細胞によるシグナル伝達を低減するかまたは消失させることを介しても作用し得ると考えられる。例えば、Notumと拮抗することを介するTPCの消失は、増殖する細胞を消失させる化学療法レジメンに対して細胞増殖を単に促進することを包含する場合もあり、それらの自己再生すなわち、無際限の増殖能力が失われるように、TPCの分化を促進する場合もある。既に示した通り、Notumは、特に、Wnt経路、Hh経路、およびBMP経路に関与すると考えられる。この点で、当業者は、Notumが、ヘパリン硫酸プロテオグリカンDally様DlpおよびDallyを修飾することにより、WinglessWg活性を抑制するものとして、当初Drosophila属において同定された、分泌されたヒドロラーゼであることを理解するであろう。Drosophila属において、Notum遺伝子は、α/βヒドロラーゼスーパーファミリーの植物ペクチンアセチルエステラーゼと関連する、671アミノ酸残基のタンパク質をコードすると考えられる。より近年の証拠は、ショウジョウバエのNotumdNotumが、リパーゼとしてもまた機能し、DlpのグリコシルホスファチジルイノシトールGPIアンカーを切断することにより、細胞表面からDlpを放出しうることを実証している。ゲル電気泳動により証明される通り、Notumを介するこれらの細胞表面プロテオグリカンの修飾および/または放出は、結果として、細胞表面におけるDallyタンパク質の発現レベルの急激な低下、およびDlpの修飾形態への転換をもたらす。このような観察は、dNotumが、おそらくはそれらのグリコアミノグリカン側鎖を修飾し、かつ/またはDlpを細胞表面から放出することにより、DallyおよびDlpを介して増大するWgシグナル伝達およびヘッジホッグHhシグナル伝達と拮抗することを示す。dNotumによるこれらの修飾は、局所的なWg濃度およびヘッジホッグ濃度を修飾し、したがって、これらのモルフォゲンの、それらの受容体との相互作用と拮抗するように作用する。さらに、DallyまたはDlpと会合したWgタンパク質またはヘッジホッグタンパク質の、細胞表面からの放出は、これらのモルフォゲンの長期にわたる活性を促進し、発生における組織のパターン形成に大きな影響を及ぼす。一般に、それらの各々の全体が、参考として本明細書に援用される、Ayersら、2010年、PMID:20412775;Giraldezら、2002年、PMID:12015973;およびTraisterら、2008年、PMID:17967162を参照されたい。多様な研究はまた、DallyプロテオグリカンおよびDlp関連プロテオグリカンが、脊椎動物のWntシグナル伝達において重要な役割を果たす可能性が高くTopczewskiら、2001年、PMID:11702784;およびFilmusら、2008年、PMID:18505598、Notumが、Drosophila属における類似のタンパク質と全く同様に、その受容体であるFrizzledを介してWntシグナル伝達を調節するように作用することも示している。Wgと同様に、哺乳動物のNotumは、細胞表面からグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーGPIグリピカンDlpおよびDallyと類似のグリピカンを放出することにより、Wnt経路を下方制御すると提起されているTraisterら、前出。細胞表面に結合すると、GPIアンカーグリピカンが、多様な形態のWntの、それらのFrizzled受容体との相互作用を安定化させることにより、Wntシグナル伝達を促進する一方で、細胞表面から放出されたグリピカンは、Wntの、Frizzled受容体に近位のGPIアンカー細胞表面グリピカンとの相互作用を競合的に阻害することにより、Wntシグナル伝達を抑制するFilmusら、前出。グリピカンが存在しないかまたは局所的なグリピカン濃度が減少すると、最低限でも、Fzd受容体を介してベータ-カテニン経路のシグナル伝達を刺激するために細胞表面に存在しなければならないWnt濃度の閾値が上昇する。これらのデータは、さらなる研究と共に、哺乳動物例えば、ヒトのNotumが、Wntシグナル伝達と拮抗することを示している。Notumはまた、転写の活性化についてのWnt/ベータ-カテニン標的としても同定されていることから、Notumは、Wnt/Fzd/ベータ-カテニンシグナル伝達カスケードのフィードバック阻害剤であることが示唆される。Wnt/Fzdシグナル伝達は、器官形成時および発生時の多くの組織内で細胞運命決定に大きな役割を果たし、これらの経路の攪乱は、結果としてがんをもたらすことが多い。さらに、下部消化管の幹細胞が同定および/または操作されている複数のマウス遺伝子モデルは、Wnt/ベータ-カテニン経路を介するシグナル伝達は、それら自身が、陰窩幹細胞が常在することが公知の場所であるとして公知の組織構造の基部における幹細胞の自己再生および拡大増殖を支持することが示唆されている、パネート細胞の生成をもたらす組織常在性幹細胞の分化の決定に影響を及ぼすことを示している。NotumによるWntシグナル伝達の脱制御および/またはTPC集団に近位のNotumの局所濃度の増大によるこの経路のフィードバック制御の機能障害は、腫瘍形成、腫瘍成長の持続、および腫瘍の再発に寄与しうる。Notumモジュレーターによりこの寄与を修飾すれば、腫瘍細胞の細胞表面に近位のWnt勾配の形成を変化させることを介する治療的利益がもたらされる可能性がある。Notumが細胞表面におけるグリピカン濃度を有効に低減する能力を踏まえるなら、Notumはまた、細胞表面からグリピカンを放出することにより、ヘッジホッグHhモルフォゲン勾配に対しても制御を及ぼす可能性が高い。上記で言及した通り、Drosophila属では、Dally関連グリピカンおよびDlp関連グリピカンがまたHhにも結合して、Hh受容体であるPatchedPtcと能動的に競合する。PtcとのHhへの結合についての競合は、近位HhのPtcへの結合を有効に低減して、転写因子のGliファミリーを介してHhエフェクター経路に作用する、Smoothenedを介するシグナル伝達の減少を結果としてもたらす。細胞表面からグリピカンを切断することにより、Notumは、Hhについての膜近位の競合濃度を低減し、このために、SmoothenedのリプレッサーであるPtcに結合してこれを阻害する有効なHh濃度の上昇を促進することにより、Smoothenedを介するHhシグナル伝達を増大させるTraisterら;およびFilmus、いずれも前出ことから、Ptcの遺伝子の不活化を介してHhシグナル伝達カスケードを活性化させる遺伝子モデルが潜在的に再現される。Wntファミリーのタンパク質と同様、Hhタンパク質は、脂質で修飾されており、複合体全体の溶解度を改善する会合タンパク質例えば、グリピカンの補助なしには、ごくわずかしか拡散しないEatonS.、2006年、PMID:16364628。Hhモルフォゲン勾配は、多様な固形組織の器官形成および発生に極めて重要であり、Hhモルフォゲン勾配の攪乱またはPtcを介するSmoothenedシグナル伝達を阻害する能力は、発生の異常およびがんと関連している。また、グリピカンおよびそれに会合したHhタンパク質の放散の増大を促進することにより、Notumがまた、Hhの溶解度が乏しい特徴、そのグリピカンとの会合が緊密であることのために、それまでには存在しなかったHhの新たな濃度勾配も創出することも認識すべきである。Hhシグナル伝達が、他のモルフォゲンによるシグナル伝達経路と共に正常に作用して、正常な細胞運命の決定を制御するのに対し、Smoothenedの構成的活性化は、基底細胞がん、髄芽腫、および膵臓腫瘍を結果としてもたらすことが示されている。また、Hhシグナル伝達の上昇が、APCおよび/またはKRASの損傷と連動して、例えば、がんの発症および重症度を増幅しうることについての多くの証拠も存在する。NotumがHhの局所的な濃度の増大、およびグリピカンと会合するHhの、遠位における新たな濃度勾配を促進すると予測される能力のために、TPCと近位のNotumレベルの上昇は、発がんおよび腫瘍の進行において重要ではあるがいまだに認知されていない因子である可能性がある。最後に、グリピカンは、多様な組織におけるBMP/TGF-ベータファミリーメンバーの局所的な濃度勾配を制御することが示されておりPaine-Saundersら、2000年、PMID:10964473、したがって、グリピカンが、細胞表面からのNotumの切断および放出に対して感受性であれば、BMP受容体によるシグナル伝達が減少し、かつ/または機能的に不活化される腫瘍およびマウスのがんモデルにおいて観察される通り、がんの進行を実際に促進しうるであろうKodachら、2008年、PMID:18008360;およびHardwickら、2008年、PMID:18756288。例を目的として述べると、BMP受容体の変異は、ヒトにおける若年性ポリポーシス症候群およびがんの偶発的要因である。上記で論じた通り、グリピカンは、異なる種類の増殖因子およびモルフォゲンを、組織特異的な形で制御する。グリピカンの遺伝子発現の変化もまた、Notumの発現とは独立して発がんを媒介することを示している。例えば、グリピカン3は、増殖を阻害し、特定の腫瘍型における細胞死を誘導する。したがって、グリピカン3は、腫瘍の抑制因子として作用し、由来の異なる多数の腫瘍において下方制御されるFilmusJ、2001年、PMID:11320054。本発明の枠組みでは、TPCが高レベルのNotumを発現させつつある腫瘍では、グリピカンの濃度が有効に低減され、これらの低減が発がんおよび腫瘍の進行に寄与すると考えられる。本明細書で開示される通り、提供されるNotumモジュレーターは、これらのレベルを減弱し、所望の抗新生物応答を付与しうる可能性が高い。前述のグリピカンを介する制御に加えて、Notumのリパーゼ活性以下の実施例24で例示されるは、NotumがWnt活性を調節するさらなる機構、例えば、Wntタンパク質を脱脂することにより、長期にわたるWntの輸送に影響を及ぼすほか、Wnt受容体および共受容体との相互作用を攪乱して、それらのシャペロンとの相互作用を調節する機構も示唆する。広範にわたるリパーゼ活性はまた、脂質で修飾されたタンパク質を介する他のシグナル伝達経路例えば、BMP、Wnt、およびHhも攪乱しうる。したがって、本明細書で開示されるNotumモジュレーターは、この酵素活性に干渉して、腫瘍始原細胞の頻度をさらに低減し、新生物性の成長および/または転移を阻害しうる。これらの経路は過去数年間に広範にわたり研究されてきたが、本発明による解明の前にNotumの役割が完全に認知または利用されたことはなかった。この点では、肝細胞がん、胃がん、結腸直腸がん、および膵臓がんを含めた多様な充実性腫瘍についての遺伝子発現プロファイリングは、Notumがこれらの新生物を伴う患者において過剰発現することを示している。例えば、それらの各々がその全体において参考として本明細書に援用される、U.S.S.N.10/568,471、U.S.S.N.10/301,822、U.S.P.N.7,371,840;およびTorisuら、前出を参照されたい。U.S.S.N.10/568,471では、ヒトNotumに対する単一抗体の生成が実証されたが、このような抗体が任意の種類の治療環境において有効であるという証拠は見られなかった。さらに、本発明の新規のNotumモジュレーターとは異なり、開示される抗体が、分泌されたNotumと拮抗して、本明細書で開示される抗新生物性の効果を生成させることは全く示されなかった。参考文献のうちのいずれにおいても、Notumが腫瘍始原細胞と関連しているか、またはこの関連により、これらの腫瘍誘発物を感作させるか、消失させるか、もしくは他の形で中和し、これにより、異質な腫瘤の有効な処置を可能とする有効な機構がもたらされることは示されていない。III.腫瘍始原細胞先行技術の任意の教示とは対照的に、本発明は、腫瘍始原細胞、および、とりわけ、腫瘍永続細胞を標的とし、これにより、新生物性障害の処置、管理、または防止を容易にするのに特に有用であるNotumモジュレーターを提供する。より具体的に述べると、既に示した通り、驚くべきことに特異的な腫瘍細胞の亜集団が、Notumを発現させ、がん幹細胞の自己再生および細胞生存に重要なモルフォゲンによるシグナル伝達の局所的調整を修飾する可能性が高いことが見出されている。したがって、好ましい実施形態では、本教示に従い、Notumのモジュレーターを用いて腫瘍始原細胞の頻度を低減し、これにより、過剰増殖性疾患の処置または管理を容易にすることができる。本明細書で用いられる、腫瘍始原細胞TICという用語は、腫瘍永続細胞TPC:すなわち、がん幹細胞またはCSCおよび増殖性の高い腫瘍前駆細胞TProgと称するの両方を包含し、併せて一般に、腫瘤または腫瘍塊の固有の亜集団すなわち、0.1~40を構成する。本開示の目的では、腫瘍永続細胞という用語とがん幹細胞という用語とは等価なものであり、本明細書では、これらを互換的に用いることができる。逆に、TPCは、単離された少数の細胞の連続移植マウスを介する2代以上の継代により実証される通り、それらが、腫瘍内に存在する腫瘍細胞の組成を完全に反復し、無際限の自己再生能力を有するという点において、TProgと異なる。以下でより詳細に論じられる通り、適切な細胞表面マーカーを用いる蛍光活性化細胞分取FACSは、少なくとも部分的に、それが単一の細胞と細胞塊すなわち、ダブレットなどとを識別する能力のために、高濃度に濃縮された細胞亜集団純度>99.5とするを単離するのに信頼できる方法である。このような技法を用いて、高度に精製された少細胞数のTProg細胞を、免疫不全マウスへと移植すると、それらは、初代移植において、腫瘍の成長を刺激しうることが示されている。しかし、精製されたTPC亜集団とは異なり、TProgにより生成した腫瘍が、表現型の細胞異質性において親腫瘍を完全に反映するわけではなく、その後の移植における連続的な腫瘍形成を再開するには、実証可能な程度に非効率的である。これに対し、TPC亜集団は、連続的に単離および移植されると、親腫瘍の細胞異質性を完全に再構成し、腫瘍を効率的に惹起しうる。したがって、当業者は、TPCとTProgとは、初代移植では両方が腫瘍を生成させうるが、それらの間の決定的な差違は、少細胞数で連続移植されると、異質な腫瘍成長を永続的に刺激する、TPCの固有の能力であることを認識するであろう。TPCを特徴付ける他の一般的な手法は、細胞表面マーカーの形態および検討、転写プロファイル、および薬物応答を伴うが、マーカーの発現は、培養条件およびinvitroにおける細胞系の継代と共に変化しうる。したがって、本発明の目的では、腫瘍永続細胞が、正常組織における細胞の階層構造を支持する正常幹細胞と同様、多系統分化能を維持する一方で無際限に自己再生するそれらの能力により規定されることが好ましい。したがって、腫瘍永続細胞は、腫瘍原性の後代すなわち、腫瘍始原細胞:TPCおよびTProgおよび非腫瘍原性NTGの後代の両方を生成させることが可能である。本明細書で用いられる非腫瘍原性細胞NTGとは、腫瘍始原細胞から生じるが、それ自体は自己再生したり、腫瘍を構成する異質な腫瘍細胞の系統を生成させたりする能力を有さない腫瘍細胞を指す。実験に基づき述べると、NTG細胞は、過剰な細胞数で移植されても、マウスにおいて腫瘍を再現的に形成することができない。示される通り、TProgもまた、それらがマウスにおいて腫瘍を生成させる限定的な能力のために、腫瘍始原細胞またはTICとして類別されている。TProgは、TPCの後代であり、典型的には有限回数の非自己再生的細胞分裂が可能である。さらに、TProg細胞は、初期腫瘍前駆細胞ETPおよび後期腫瘍前駆細胞LTPへとさらに分けることができ、これらの各々は、表現型例えば、細胞表面マーカーおよび腫瘍細胞構造を反復する能力が異なることにより識別することができる。このような技術的な差違にも拘らず、ETPおよびLTPのいずれもが一般に、少細胞数で移植されると腫瘍を連続的に再構成することがそれほど可能ではなく、典型的には親腫瘍の異質性を反映しないという点において、TPCとは機能的に異なる。前出の差違にも拘らずまた、多様なTProg集団が、まれな機会には、通常は幹細胞に帰せられる自己再生能を獲得し、それら自身がTPCまたはCSCとなりうることも示されている。いずれにせよ、いずれの種類の腫瘍始原細胞も、単一の患者の典型的な腫瘍塊中で表出される可能性が高く、本明細書で開示されるモジュレーターによる処置にかけられる。すなわち、開示される組成物は一般に、特定の実施形態または腫瘍中で表出される混合物に関わらず、このようなNotum陽性腫瘍始原細胞の頻度を低減するかまたは化学療法感受性を変化させるのに有効である。本発明の文脈では、TPCが、腫瘤を構成するTProg細胞ETP細胞およびLTP細胞の両方、NTG細胞、およびTPCに由来しない腫瘍浸潤細胞例えば、線維芽細胞/間質細胞、内皮細胞、および造血細胞より腫瘍原性であり、比較的より休眠性であり、より化学療法耐性であることが多い。従来の療法およびレジメンが、大部分において、腫瘍を減量し、かつ、迅速に増殖する細胞を攻撃するようにデザインされていることを踏まえると、TPCは、より迅速に増殖するTProgおよび他の腫瘤細胞集団より、従来の療法およびレジメンに対して耐性である可能性が高い。さらに、TPCは、多剤耐性輸送体の発現の増大、DNA修復機構の増強、および抗アポトーシス性タンパク質など、それらを従来の療法に対して比較的化学療法耐性とする他の特徴を発現させることが多い。それらの各々がTPCによる薬物耐性に寄与するこれらの特性は、病期の進んだ新生物を伴う大半の患者に長期的な利益を確実にする標準的な腫瘍処置レジメンが奏効しないこと、すなわち、持続的な腫瘍成長および再発を刺激するこれらの細胞すなわち、TPCまたはCSCを的確に標的として根絶するのに奏効しないことの重要な理由を構成する。前述の先行技術による処置の多くとは異なり、本発明の新規の組成物は、被験体に投与されると、選択されたモジュレーターの形態または特異的な標的例えば、遺伝物質、Notum、またはNotumのリガンドに関わらず、腫瘍始原細胞の頻度を低減することが好ましい。上記で言及した通り、腫瘍始原細胞の頻度の低下は、a腫瘍始原細胞の消失、枯渇、感作、サイレンシング、もしくは阻害;b腫瘍始原細胞の成長、拡大増殖もしくは再発の制御;c腫瘍始原細胞の開始、増殖propagation、維持、もしくは増殖proliferationの中断;またはd腫瘍原性細胞の生存、再生、および/もしくは転移の他の形での妨害の結果として生じうる。一部の実施形態では、腫瘍始原細胞の頻度の低下は、1または複数の生理学的経路が変化する結果として生じる。経路の変化は、腫瘍始原細胞の低減または消失を介する場合であれ、それらの潜在能力の改変を介する例えば、分化の誘導、ニッシェの破壊場合であれ、それらが腫瘍環境または他の細胞に影響を及ぼす能力に他の形で干渉する場合であれ、腫瘍形成、腫瘍の維持、ならびに/または転移および再発を阻害することにより、Notum関連障害のより有効な処置を可能とする。腫瘍始原細胞の頻度のこのような低下を評価するのに使用され得る方法には、ポアソン分布統計を用いる計数、またはinvivoにおいて腫瘍を発生させるかどうかの能力など、あらかじめ規定された決定的なイベントの頻度の評価を後続させることが好ましい、invitroまたはinvivoにおける限界希釈解析がある。このような限界希釈解析が、腫瘍始原細胞の頻度の低下を計算する好ましい方法であるのに対し、他の要求の少ない方法もまた、精度は若干低下するが、所望の値を有効に決定するのに用いることができ、本明細書の教示と完全に適合可能である。したがって、当業者により理解される通り、また、周知のフローサイトメトリー手段または免疫組織化学的手段を介しても、頻度の値の低下を決定することができる。前述の方法全てについては、例えば、それらの各々がそれらの全体において参考として本明細書に援用される、Dyllaら、2008年、PMCID:PMC2413402;およびHoeyら、2009年、PMID:19664991を参照されたい。限界希釈解析に関しては、invitroにおける腫瘍始原細胞の頻度の計数は、画分化されたヒト腫瘍細胞または画分化されていないヒト腫瘍細胞例えば、それぞれ、処置された腫瘍および処置されていない腫瘍由来のヒト腫瘍細胞を、invitroにおけるコロニー形成を助長する成長条件へと置くことにより達成することができる。このようにすれば、コロニーの単純なカウンティングおよび特徴付けを介してコロニー形成細胞を計数することもでき、例えば、系列希釈下におけるヒト腫瘍細胞のプレートへの配置、および各ウェルを播種の少なくとも10日後におけるコロニー形成について陽性または陰性とスコア化することからなる解析を介してコロニー形成細胞を計数することもできる。それらが腫瘍始原細胞の頻度を決定する能力において一般により正確である、invivoにおける限界希釈実験または限界希釈解析は、系列希釈下で、ヒト腫瘍細胞を、処置されていない対照条件または処置された条件から、例えば、免疫不全マウスへと移植し、その後、各マウスを移植の少なくとも60日後における腫瘍形成について陽性または陰性とスコア化することを包含する。invitroまたはinvivoにおける限界希釈解析による細胞の頻度値の導出は、ポアソン分布統計を公知の陽性イベントおよび陰性イベントの頻度へと適用し、これにより、陽性イベントの定義を満たすイベント、この場合は、それぞれ、コロニーまたは腫瘍形成の頻度をもたらすことにより行うことが好ましい。腫瘍始原細胞の頻度を計算するのに使用され得る本発明と適合可能な他の方法について述べると、最も一般的な方法は、定量化可能なフローサイトメトリー法および免疫組織化学的な染色手順を含む。すぐ上で記載した限界希釈解析法ほど正確ではないが、これらの手順は、労働集約性がはるかに低く、比較的短い時間枠で妥当な値をもたらす。したがって、当業者は、腫瘍始原細胞を濃縮することが公知である、当技術分野で認知された細胞表面タンパク質例えば、以下の実施例1には、潜在的に適合可能なマーカーが示されるに結合する、1または複数の抗体または試薬を用いる、フローサイトメトリーによる細胞表面マーカープロファイルの決定を用い、これにより、多様な試料からTICレベルを測定しうることが理解されるであろう。さらに別の適合可能な方法では、当業者であれば、これらの細胞の境界を定めると考えられる細胞表面タンパク質に結合することが可能である1または複数の抗体または試薬を用いる免疫組織化学を介して、insituすなわち、組織切片でTICの頻度を計数しうるであろう。次いで、上記で言及した方法のうちのいずれかを用いると、本明細書の教示に従う、開示されるNotumモジュレーターによりもたらされるTICまたは上記ではTPC頻度の低下を定量化することが可能である。場合によっては、本発明の化合物が、TIC頻度を、10、15、20、25、30、なおまたは35低減しうる消失、分化の誘導、ニッシェの破壊、サイレンシングなどを含めた、上記で言及した多様な機構を介する。他の実施形態では、TIC頻度の低下が、40、45、50、55、60、または65のオーダーでありうる。特定の実施形態では、開示される化合物が、TIC頻度を、70、75、80、85、90、なおまたは95低減しうる。当然ながら、TIC頻度の任意の低下は、新生物の腫瘍原性、持続、再発、および侵襲性aggressivenessの対応する低下の結果としてもたらされる可能性が高いことが理解されるであろう。IV.Notumモジュレーターいずれにせよ、本発明は、Notumと関連する多数の悪性疾患のうちのいずれか1つを診断、処置、および/または予防するための、Notumアンタゴニストを含めたNotumモジュレーターの使用を対象とする。開示されるモジュレーターは、単独で用いることもでき、化学療法剤もしくは免疫療法剤または生物学的応答修飾剤など、多種多様な抗がん化合物と共に用いることもできる。他の選択された実施形態では、2つ以上の異なるNotumモジュレーターを組み合わせて用いて抗新生物効果の増強をもたらすこともでき、これらを用いて多重特異性構築物を作製することもできる。特定の実施形態では、本発明のNotumモジュレーターが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドを含む。モジュレーターは、例えば、Notum融合構築物例えば、Notum-Fc、Notum標的化部分などまたはNotumコンジュゲート例えば、Notum-PEG、Notum-細胞傷害性剤、Notum-brmなどを含めた、可溶性NotumsNotum、または、その形態、変異体、誘導体もしくは断片を含むことがなおより好ましい。他の実施形態では、また、Notumモジュレーターが、抗体例えば、抗NotummAbまたはその免疫反応性断片もしくは誘導体を含むことも理解される。特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターが、中和抗体またはその誘導体もしくは断片を含む。他の実施形態では、Notumモジュレーターが、内部移行抗体を含みうる。さらに他の実施形態では、Notumモジュレーターが、枯渇化抗体を含みうる。さらに、前述の融合構築物と同様に、これらの抗体によるモジュレーターは、多様なおよび、場合によって、複数の作用機構を伴う方向付けられた免疫療法をもたらすために、選択された細胞傷害性剤、ポリマー、生物学的応答修飾剤BRMなどとコンジュゲートすることもでき、連結することもでき、他の形で会合させることもできる。さらに他の実施形態では、モジュレーターが、遺伝子レベルでも機能することが可能であり、アンチセンス構築物、siRNA、マイクロRNAなどの化合物を含みうる。開示されるNotumモジュレーターは、例えば、Notumモジュレーターの形態、会合させる任意のペイロード、または投与および送達方法に依存して、選択された経路を刺激するかもしくはこれと拮抗するか、または特定の細胞を消失させることを含めた多様な機構を介して、腫瘍細胞、特にTPCおよび/または関連する新生物の増殖growth、propagationまたは生存を枯渇させることもでき、消失させることもでき、阻害することもできることがさらに理解されるであろう。したがって、本明細書で開示される好ましい実施形態は、腫瘍永続細胞など、特定の腫瘍細胞亜集団の枯渇、阻害、またはサイレンシングを対象とするが、このような実施形態は、例示的なものであるに過ぎず、いかなる意味でも制限的なものではないことを強調しなければならない。むしろ、添付の特許請求の範囲に示される通り、本発明は、いかなる特定の機構または標的腫瘍細胞集団であるかを問わず、Notumモジュレーターおよび多様なNotum媒介性過剰増殖性障害の処置、管理、または予防におけるそれらの使用を広く対象とする。同じ意味で、本発明の開示される実施形態は、1または複数のNotumアンタゴニストを含む。この目的で、本発明のNotumアンタゴニストは、Notumタンパク質またはその断片を認識するか、これに反応するか、これと結合するか、これと混合されるか、これと競合するか、これと会合するか、または他の形でこれと相互作用し、腫瘍始原細胞または腫瘤もしくはNTG細胞を含めた他の新生物性の細胞を消失させるか、サイレンシングするか、低減するか、阻害するか、妨害するか、制限するか、またはこれらの成長を制御する、任意のリガンド、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体またはこれらの免疫学的に活性な断片もしくは誘導体を含みうることが理解されるであろう。選択された実施形態では、Notumモジュレーターが、Notumアンタゴニストを含む。本明細書で用いられるアンタゴニストとは、受容体のリガンドへの結合または酵素の基質との相互作用を含めた、特定のタンパク質または指定されたタンパク質の活性を中和するか、遮断するか、阻害するか、解消するか、低減するか、またはこれらに干渉することが可能な分子を指す。より一般的に述べると、本発明のアンタゴニストは、抗体およびこれらの抗原結合断片または誘導体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、アンチセンス構築物、siRNA、miRNA、生体有機分子、ペプチド模倣体、医薬およびそれらの代謝物、転写制御配列および翻訳制御配列などを含みうる。アンタゴニストにはまた、低分子阻害剤、融合タンパク質、タンパク質に特異的に結合し、これにより、その標的基質への結合を封鎖する受容体分子および誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異体、タンパク質を指向するアンチセンス分子、RNAアプタマー、ならびにタンパク質に対するリボザイムも含まれうる。本明細書で用いられて2つ以上の分子または化合物に適用される、認識するまたは特異的に認識するという用語は、それにより、1つの分子が他の分子に対して影響を及ぼす、共有結合または非共有結合による分子の反応、結合、特異的結合、組合せ、会合、相互作用、結合、連結、一体化、癒合、融合、または接合joiningを意味すると考えられるものとする。さらに、本明細書の実施例で実証される通り、ある場合には、一部のヒトNotumモジュレーターが、ヒト以外の種例えば、マウスに由来するNotumと交差反応しうる。他の場合には、例示的なモジュレーターが、ヒトNotumの1または複数のアイソフォームに特異的であることが可能であり、他の種に由来するNotumのオルソログとの交差反応性を呈示しない。いずれにせよ、当業者は、開示されるモジュレーターを、コンジュゲートした形態で用いる場合もあり、コンジュゲートされていない形態で用いる場合もあることを理解するであろう。すなわち、モジュレーターは、薬学的に活性な化合物、生物学的応答修飾剤、細胞傷害性剤もしくは細胞増殖抑制剤、診断用部分、または生体適合性の修飾剤と会合させることもでき、これらとコンジュゲートすることもできる例えば、共有結合により、または非共有結合により。この点では、このようなコンジュゲートが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、低分子、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子、および放射性同位元素を含みうることが理解される。さらに、上記で示した通り、選択されたコンジュゲートは、少なくとも部分的にはコンジュゲーションを実施するのに用いられる方法に応じて、多様なモル比でNotumモジュレーターに、共有結合により連結することもでき、非共有結合により連結することもできる。V.抗体a.概観既に示唆した通り、本発明の特に好ましい実施形態は、抗体の形態にあるNotumモジュレーターを含む。本明細書における抗体という用語は、その最も広義において用いられ、それらが、所望の生物学的活性すなわち、Notumとの会合または結合を呈示する限りにおいて、とりわけ、合成抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナルまたはポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、組換え生成抗体、イントラボディー、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、霊長動物化抗体、Fab断片、Fab’断片、単鎖FvFcscFvFc、単鎖FvscFv、抗イディオタイプ抗Id抗体、および他の任意の免疫学的に活性な抗体断片を網羅する。より広義において、本発明の抗体は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、これらの断片を、Fc領域またはその断片が含まれるがこれらに限定されない、別の免疫グロブリンドメインに融合させる場合もあり、これに融合させない場合もある、抗原結合部位を含有する分子を包含する。さらに、本明細書でより詳細に概括される通り、1つの抗体および複数の抗体という用語は、とりわけ、場合によって、少なくとも1つのアミノ酸残基の修飾を含み、免疫グロブリンの免疫学的に活性な断片に融合させた、全長抗体およびFc領域を含む変異体のFc融合体、またはその断片を含めた、以下で記載されるFc変異体を包含する。以下でより詳細に論じられる通り、一般的な用語である抗体または免疫グロブリンは、生化学的に識別することができ、かつ、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて適切なクラスに容易に割り当てることができる、5つの異なる抗体のクラスを含む。歴史的な理由で、無傷抗体の主要なクラスを、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMと称する。ヒトでは、構造および特定の生化学的特性に応じて、IgGクラスおよびIgAクラスを、さらに認知されたサブクラスアイソタイプ、すなわち、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2へと分けることができる。ヒトにおけるIgGアイソタイプは、IgG1を最も豊富とする血清中のそれらの存在量の順位により名付けられていることが理解されるであろう。抗体の5つのクラス全てすなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMおよび全てのアイソタイプすなわち、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2のほか、これらの変異体が本発明の範囲内にあるが、例示だけを目的として、免疫グロブリンのIgGクラスを含む好ましい実施形態について、ある程度詳細に論じる。しかし、このような開示は、例示的な組成物および本発明を実施する方法を実証するだけのものであり、いかなる形であれ、本発明の範囲またはこれに付属する特許請求の範囲を制限するものではないことが理解される。この点で、ヒトIgG免疫グロブリンは、分子量を約23,000ドルトンとする2つの同一な軽鎖ポリペプチドと、そのアイソタイプに応じて分子量を53,000~70,000とする2つの同一な重鎖とを含む。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、対応する小文字のギリシア文字であるα、δ、ε、γ、およびμで表される。任意の脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づきカッパκおよびラムダλと呼ばれる、明確に異なる2つの種類のうちの1つに割り当てることができる。当業者は、免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元的立体構成が周知であることを理解するであろう。4つの鎖は、ジスルフィド結合を介してY字型の立体構成に接合され、ここで、軽鎖は、Y字型の開口部に発して重鎖から分岐しbracket、可変領域を経てY字型の双対する末端へと続く。各軽鎖は、1つの共有結合的なジスルフィド結合を介して重鎖に連結されるが、重鎖は、ヒンジ領域における2つのジスルフィド結合により接合される。重鎖および軽鎖の各々はまた、規則的な間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋も有し、それらの数は、IgGのアイソタイプに基づき変化しうる。各重鎖は、一方の末端において、可変ドメインVHを有し、これに多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の末端において、可変ドメインVLを有し、その他方の末端において、定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1の定常ドメインと整列され、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。この点で、軽鎖VL部分および重鎖VH部分の両方の可変ドメインが、抗原の認識および特異性を決定することが理解されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメインCLおよび重鎖の定常ドメインCH1、CH2、またはCH3は、分泌、経胎盤移動、循環半減期、補体結合など、重要な生物学的特性を付与し、これらを制御する。慣例により、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位となるのに応じて、定常領域ドメインの番号付けを大きくする。したがって、抗体のアミノ末端またはN末端は、可変領域を含み、カルボキシ末端またはC末端は、定常領域を含む。したがって、CH3ドメインおよびCLドメインは、それぞれ、実際に、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。可変という用語は、可変ドメインの特定の部分の配列が、免疫グロブリン間で広範にわたり異なり、これらのホットスポットが、特定の抗体の結合および特異性についての特徴の大部分を規定する事実を指す。これらの超可変部位は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方において、それぞれの相補性決定領域CDRとして公知である3つのセグメントに現れる。CDRに隣接する、可変ドメインの高度に保存的な部分を、フレームワーク領域FRと称する。より具体的に述べると、天然の単量体のIgG抗体では、抗体の各アームに存在する6つのCDRは、抗体が水性環境においてその三次元立体構成をとるときに抗原結合部位を形成するように特異的に配置された、短く非連続のアミノ酸配列である。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの残余を含むフレームワーク領域は、分子間におけるアミノ酸配列のばらつきが小さい。むしろ、フレームワーク領域は、大部分がβシート構成をとり、CDRは、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成する、ループを形成する。したがって、これらのフレームワーク領域は、鎖間における非共有結合的な相互作用により、6つのCDRを適正な配向性で配置する足場を形成するように作用する。配置されたCDRにより形成される抗原結合部位は、免疫反応性の抗原すなわち、Notumにおけるエピトープと相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、抗体の免疫反応性の抗原エピトープへの非共有結合的な結合を促進する。CDRの位置は、当業者により容易に同定されうることが理解されるであろう。以下でより詳細に論じられる通り、標準的な組換え法および発現法を用いて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の全部または一部を組み換えるかまたは操作して、有効な抗体をもたらすことができる。すなわち、第1の抗体に由来する重鎖可変領域または軽鎖可変領域またはこれらの任意の部分は、第2の抗体に由来する重鎖可変領域または軽鎖可変領域の任意の選択された部分と混合しマッチさせることができる。例えば、一実施形態では、第1の抗体の3つの軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域の全体を、作動的な抗体をもたらす第2の抗体の3つの重鎖CDRを含む重鎖可変領域の全体と対合させることができる。さらに、他の実施形態では、多様な抗体に由来する個別の重鎖CDRと軽鎖CDRとを混合しマッチさせて、特徴を最適化した所望の抗体をもたらすことができる。したがって、例示的な抗体は、第1の抗体に由来する3つの軽鎖CDR、第2の抗体に由来する2つの重鎖CDR、および第3の抗体に由来する第3の重鎖CDRを含みうる。より具体的に述べると、本発明との関係では、図7Bに開示される重鎖CDRおよび軽鎖CDRのうちのいずれかをこのようにして再配列して、本教示に従い最適化した抗Notum例えば、抗Notum抗体をもたらしうることが理解されるであろう。いずれにせよ、相補性決定領域の残基数は、Kabatら1991年、NIHPublication、91~3242頁、NationalTechnicalInformationService、Springfield、Va.による残基数、とりわけ、軽鎖可変ドメインにおける残基24~34CDR1、50~56CDR2、および89~97CDR3、ならびに重鎖可変ドメインにおける残基31~35CDR1、50~65CDR2、および95~102CDR3として規定することができる。CDRは、抗体ごとに大幅に変化するかつ、定義により、Kabatによるコンセンサス配列との相同性を呈示しないことに注意されたい。フレームワーク残基の最大のアライメントは、Fv領域に用いられる番号付けシステムでのスペーサー残基の挿入を要求することが多い。加えて、種間の相違または対立遺伝子間の相違のために、所与の任意のKabat部位番号における特定の個別の残基の同一性も、抗体鎖ごとに変化しうる。また、定義が、互いと比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットを包含する、Chothiaら、J.Mol.Biol.、196巻:901~917頁1987年;およびMacCallumら、J.Mol.Biol.、262巻:732~745頁1996年も参照されたい。前述の参考文献の各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれ、上記に引用された参考文献の各々により規定されるCDRを包含するアミノ酸残基は、比較のために示される。簡便さを目的として述べると、図7Bに示されるCDRならびに図31Aおよび31Bで下線を付されるCDRは、Chothiaらの用語法を用いて規定されるが、本出願の内容を踏まえるなら、当業者であれば、それぞれの各重鎖配列および各軽鎖配列について、Kabatらにより規定されるCDRを容易に同定および計数することもできるであろうし、MacCallumらにより規定されるCDRを容易に同定および計数することもできるであろう。したがって、このような用語法により規定されるCDRを含む抗体は、本発明の範囲内に明示的に含まれる。より広く述べると、可変領域CDRのアミノ酸残基という用語は、上記で示した方法に基づく任意の配列または構造を用いて同定されるCDRにおけるアミノ酸を包含する。本明細書で用いられる可変領域フレームワークFRのアミノ酸残基という用語は、Ig鎖のフレームワーク領域におけるこれらのアミノ酸を指す。本明細書で用いられるフレームワーク領域またはFR領域という用語は、可変領域の一部であるが、CDRの一部ではない例えば、KabatによるCDRの定義を用いるアミノ酸残基を包含する。したがって、可変領域のフレームワークは、約100~120アミノ酸の長さの非連続配列であるが、CDRの外側にあるアミノ酸だけを包含する。Kabatらにより規定される重鎖可変領域およびCDRの具体例では、フレームワーク領域1が、アミノ酸1~30を包含する可変領域ドメインに対応し、フレームワーク領域2が、アミノ酸36~49を包含する可変領域ドメインに対応し、フレームワーク領域3が、アミノ酸66~94を包含する可変領域ドメインに対応し、フレームワーク領域4が、アミノ酸103~可変領域末端にわたる可変領域ドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域は、軽鎖可変領域CDRの各々により同様に分離される。同様に、ChothiaらまたはMcCallumらによるCDRの定義を用いて、上記の通り、フレームワーク領域の境界を、それぞれのCDR末端により分離する。前述の構造についての検討事項を念頭に置くと、当業者は、本発明の抗体が、多数の機能的実施形態のうちのいずれか1つを含みうることを理解するであろう。この点では、適合可能な抗体が、被験体において所望の生理学的応答をもたらす任意の免疫反応性抗体この用語が本明細書で規定される通りの免疫反応性抗体を含みうる。開示される抗体のうちのいずれかは、本教示と共に使用され得る一方、本発明の特定の実施形態は、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、もしくはヒトモノクローナル抗体、またはこれらの免疫反応性断片を含む。しかし、他の実施形態は、例えば、均一であるかまたは異質な、多量体の構築物、Fc変異体、およびコンジュゲート、またはグリコシル化について変化させた抗体を含みうる。さらに、このような立体構成は相互に除外的ではなく、適合可能な個別の抗体が、本明細書で開示される機能的態様のうちの1または複数を含みうることが理解される。例えば、適合可能な抗体は、ヒト化可変領域を伴う単鎖ダイアボディーまたは血清半減期を調節するようにグリコシル化パターンを変化させるFc修飾を伴う完全ヒト全長IgG3抗体を含みうる。当業者には他の例示的な実施形態が、容易に明らかであり、本発明の範囲内にあるものとして容易に識別可能でありうる。b.抗体の生成周知の通り、本明細書の教示に従い、ウサギ、マウス、ラットなどを含めた多様な宿主動物に接種し、これらを用いて抗体をもたらすことができる。接種される種に応じて免疫応答を増大させるのに使用され得る、当技術分野において公知のアジュバントには、フロイントアジュバントフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油のエマルジョン、キーホールリンペットkeyholelimpetヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの界面活性物質、ならびにBCGカルメット-ゲラン桿菌およびCorynebacteriumparvumなど、潜在的に有用なヒト用アジュバントが含まれるがこれらに限定されない。このようなアジュバントは、抗原を局所的な沈着物中に封鎖することにより急速な分散から保護する場合もあり、それらが、宿主を刺激して、マクロファージおよび免疫系の他の構成要素に走化性である因子を分泌させる物質を含有する場合もある。ポリペプチドを投与する場合は、免疫化のスケジュールが、ポリペプチドの、数週間にわたる2回以上の投与を伴うことが好ましい。Notumの免疫原で動物を免疫化した後、当技術分野で認知された技法を用いて、この動物から抗体および/または抗体生成細胞を得ることができる。一部の実施形態では、動物から採血するかまたはこれを屠殺することにより、抗Notumポリクローナル抗体を含有する血清を得る。血清は、研究を目的として、動物から得られた形態で用いることもでき、代替法では、抗Notum抗体を免疫グロブリン画分化または均一な抗体調製物をもたらすように部分的または完全に精製することもできる。c.モノクローナル抗体本発明の特定の態様と共にポリクローナル抗体を使用し得る一方で、好ましい実施形態は、Notum反応性のモノクローナル抗体の使用も含む。本明細書で用いられるモノクローナル抗体またはmAbという用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、変異、例えば、少量で存在しうる天然の変異の可能性を除き同一である。したがって、修飾語句であるモノクローナルは、異なる抗体の混合物としてではない抗体の特徴を示し、任意の種類の抗体と共に用いることができる。特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体が、Notumと結合するかまたはこれと会合するポリペプチド配列を含む抗体であって、Notumに結合するポリペプチド配列が、単一の標的結合ポリペプチド配列の複数のポリペプチド配列からの選択を包含する工程を介して得られる抗体を包含する。好ましい実施形態では、抗体生成細胞系を、免疫化した動物から単離された細胞から調製する。免疫化の後、動物を屠殺し、リンパ節および/または脾臓のB細胞を、当技術分野において周知の手段により不死化させる。細胞を不死化させる方法には、それらをがん遺伝子でトランスフェクトする方法、それらに発がん性のウイルスを感染させ、それらを不死化細胞について選択する条件下で培養する方法、それらを発がん性の化合物下または変異を引き起こす化合物下に置く方法、それらを不死化細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合させる方法、および腫瘍抑制遺伝子を不活化させる方法が含まれるがこれらに限定されない。骨髄腫細胞との融合を用いる場合は、骨髄腫細胞が、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない非分泌性細胞系であることが好ましい。不死化細胞は、Notumまたはその免疫反応性部分を用いてスクリーニングする。好ましい実施形態では、酵素免疫測定アッセイELISAまたはラジオイムノアッセイを用いて初期スクリーニングを実施する。より一般的に述べると、本発明と矛盾しない個別のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え法、ファージディスプレイ技術、酵母ライブラリー、トランスジェニック動物例えば、XenoMouse登録商標またはHuMAbMouse登録商標、またはこれらの一部の組合せを含めた、当技術分野で公知の多種多様な技法を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、上記で広く記載され、それらの各々が本明細書に援用される、Harlowら、Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress、2版、1988年;Hammerlingら、MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas、563~681頁Elsevier、N.Y.、1981年においてより詳細に教示されるハイブリドーマ法などを用いて生成させることができる。抗体は、開示されるプロトコールを用いて、哺乳動物において、関連する抗原およびアジュバントを複数回にわたり皮下注射または腹腔内注射することにより惹起されることが好ましい。既に論じた通り、この免疫化は一般に、抗原反応性抗体免疫化する動物をトランスジェニックとする場合は、完全ヒト抗体でありうるの、活性化させた脾臓細胞またはリンパ球からの生成を含む免疫反応を誘発する。結果として得られる抗体を動物の血清から採取して、ポリクローナル調製物をもたらしうるのに対し、個別のリンパ球を脾臓、リンパ節、または末梢血から単離して、均一のモノクローナル抗体の調製物をもたらすことが一般により望ましい。リンパ球は、脾臓から得、不死化してハイブリドーマをもたらすことが最も典型的である。例えば、上記の通り、選択工程は、固有のクローンの、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えDNAクローンのプールなど、複数のクローンからの選択でありうる。選択されたNotum結合配列をさらに変化させて、例えば、標的に対する親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養物におけるその生成を改善し、invivoにおけるその免疫原性を低減し、多重特異性抗体などを創出することができ、標的結合配列の変化を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。異なる決定基エピトープを指向する個別の抗体を包含することが典型的なポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原における単一の決定基を指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらに交差反応性でありうる他の免疫グロブリンが夾雑していないことが典型的であるという点において有利である。d.キメラ抗体別の実施形態では、本発明の抗体が、少なくとも2つの異なる種または種類の抗体に由来する、共有結合させたタンパク質セグメントに由来するキメラ抗体を含みうる。本明細書で用いられるキメラ抗体という用語は、それらが所望の生物学的活性を呈示する限りにおいて、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくは特定の抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたはこれと相同である一方、鎖複数可の残りは、他の種に由来する抗体または他の抗体クラスもしくは他の抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたはこれと相同である構築物ならびにそのような抗体の断片を対象とする米国特許第4,816,567号;Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81巻:6851~6855頁1984年ことが理解されるであろう。例示的な一実施形態では、本明細書の教示に従うキメラ抗体が、マウスVHアミノ酸配列およびマウスVLアミノ酸配列と、ヒト供給源に由来する定常領域とを含みうる。他の適合可能な実施形態では、本発明のキメラ抗体が、以下で記載されるCDR移植抗体またはヒト化抗体を含みうる。一般に、キメラ抗体を作製する目標は、意図される対象種に由来するアミノ酸の数を最大化するキメラを創出することである。1つの例は、抗体が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくは特定の抗体サブクラスに属する1または複数の相補性決定領域CDRを含む一方、抗体鎖複数可の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくは別の抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたはこれと相同である、CDR移植抗体である。ヒトにおいて用いる場合は、齧歯動物抗体に由来する可変領域または選択されたCDRを、ヒト抗体へと移植して、ヒト抗体の天然の可変領域またはCDRを置換することが多い。これらの構築物は一般に、完全強度のモジュレーター機能例えば、CDC、ADCCなどをもたらす一方で、被験体による抗体に対する有害な免疫反応を低減する利点を有する。e.ヒト化抗体ヒト化抗体とは、CDR移植抗体に類似している。一般に、ヒト化抗体は、当初ヒト以外の動物において発生させたモノクローナル抗体から生成させる。本明細書で用いられる非ヒト例えば、マウス抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体が、レシピエントのCDRに由来する残基を、所望の特異性、親和性、および/または能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長動物など、非ヒト種のCDRドナー抗体に由来する残基で置換したヒト免疫グロブリンレシピエント抗体である。選択された実施形態では、アクセプター抗体が、コンセンサス配列を含みうる。ヒトコンセンサスフレームワークを創出するには、いくつかのヒト重鎖アミノ酸配列またはヒト軽鎖アミノ酸配列に由来するフレームワークを整列させて、コンセンサスのアミノ酸配列を同定することができる。さらに、多くの場合、ヒト免疫グロブリンの可変ドメインにおける1または複数のフレームワーク残基を、ドナー抗体に由来する、対応する非ヒト残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法を介して、例えば、CDRとフレームワーク残基との相互作用をモデル化して、抗原への結合に重要なフレームワーク残基を同定することを介して、かつ、特定の位置におけるまれなフレームワーク残基を同定する配列比較を介して同定する。このような置換は、移植されたCDR複数可の適切な三次元的立体構成を維持する一助となり、フレームワーク置換を伴わない類似の構築物に対して親和性を改善することが多い。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基も含みうる。これらの修飾を行い、周知の技法を用いて抗体の性能をさらに洗練させることができる。CDRの移植およびヒト化抗体については、例えば、U.S.P.N.6,180,370、同5,693,762、同5,693,761、同5,585,089、および同5,530,101において記載されている。一般に、ヒト化抗体は、CDRのうちの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのCDRに対応し、フレームワーク領域のうちの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である、少なくとも1つの、および典型的には2つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によってまた、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部Fc、典型的に、ヒト免疫グロブリンのFcも含む。さらなる詳細については、例えば、Jonesら、Nature、321巻:522~525頁1986年;Riechmannら、Nature、332巻:323~329頁1988年;およびPresta、Curr.Op.Struct.Biol.、2巻:593~596頁1992年を参照されたい。また、例えば、VaswaniおよびHamilton、Ann.Allergy,AsthmaImmunol.、1巻:105~115頁1998年;Harris、Biochem.Soc.Transactions、23巻:1035~1038頁1995年;HurleおよびGross、Curr.Op.Biotech.、5巻:428~433頁1994年;ならびにU.S.P.N.6,982,321および同7,087,409も参照されたい。さらに別の方法は、ヒューマニア化humaneeringと称し、例えば、U.S.2005/0008625に記載されている。本出願の目的では、ヒト化抗体という用語が、フレームワーク置換を伴わないか、または最小限のフレームワーク置換を伴うCDR移植抗体すなわち、1または複数の移植された非ヒトCDRを含むヒト抗体を明示的に包含すると考えられる。加えて、非ヒト抗Notum抗体はまた、WO98/52976およびWO00/34317において開示される方法を介して、ヒトT細胞エピトープを特異的に欠失させるかまたは脱免疫化することにより改変することもできる。略述すると、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、MHCクラスIIに結合するペプチドについて解析することができ、これらのペプチドは、潜在的なT細胞エピトープWO98/52976およびWO00/34317で規定されるを表す。潜在的なT細胞エピトープを検出するには、ペプチドスレディングpeptidethreadingと称する、コンピュータによるモデル化法を適用することができ、加えて、ヒトMHCクラスII結合ペプチドのデータベースを、WO98/52976およびWO00/34317において記載されているVH配列およびVL配列に存在するモチーフについて検索することもできる。これらのモチーフは、18の主要なMHCクラスIIDRアロタイプのうちのいずれかに結合し、これにより、潜在的なT細胞エピトープを構成する。検出される潜在的なT細胞エピトープは、可変領域における少数のアミノ酸残基を置換することにより消失させることもでき、単一のアミノ酸置換により消失させることもできる。可能な限り、保存的置換を行う。ヒト生殖細胞系列の抗体配列における位置と共通のアミノ酸を使用し得ることが多いが、必ずしもそうではない。脱免疫化する変化を同定した後は、VHおよびVLをコードする核酸を、変異誘発または他の合成方法例えば、新規の合成、カセット置換などにより構築することができる。変異誘発された可変配列は、場合によって、ヒト定常領域に融合させることもできる。選択された実施形態では、ヒト化抗体の可変領域残基のうちの少なくとも60、65、70、75、または80が、親フレームワーク領域FRおよびCDR配列の可変領域残基に対応する。他の実施形態では、ヒト化抗体残基のうちの少なくとも85または90が、親フレームワーク領域FRおよびCDR配列の残基に対応する。さらに好ましい実施形態では、ヒト化抗体残基のうちの95超が、親フレームワーク領域FRおよびCDR配列の残基に対応する。ヒト化抗体は、本明細書で記載される一般的な分子生物学法および生体分子操作法を用いて作製することができる。これらの方法は、重鎖または軽鎖のうちの少なくとも1つに由来する免疫グロブリンのFv可変領域の全部または一部をコードする核酸配列を単離するステップと、操作するステップと、発現させるステップとを包含する。当業者には、このような核酸の供給源が周知であり、例えば、上記の通り、所定の標的に対する抗体または免疫反応性断片を生成させる、ハイブリドーマ、真核細胞、またはファージから得ることもでき、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子から得ることもでき、合成構築物から得ることもできる。次いで、ヒト化抗体をコードする組換えDNAは、適切な発現ベクターへとクローニングすることができる。ヒト生殖細胞系列の配列は、例えば、Tomlinson,I.A.ら1992年、J.Mol.Biol.、227巻:776~798頁;Cook,G.P.ら1995年、Immunol.Today、16巻:237~242頁;Chothia,D.ら1992年、J.Mol.Bio.、227巻:799~817頁;およびTomlinsonら1995年、EMBOJ、14巻:4628~4638頁において開示されている。VBASEの要覧は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な要覧をもたらすRetterら、2005年、NucAcidRes、33巻:671~674頁を参照されたい。これらの配列は、ヒト配列の供給源、例えば、フレームワーク領域およびCDRに用いることができる。例えば、U.S.P.N.6,300,064において記載されている通り、本明細書で示されるヒトコンセンサスフレームワーク領域もまた用いることができる。f.ヒト抗体前述の抗体に加えて、当業者は、本発明の抗体が、完全ヒト抗体を含みうることを理解するであろう。本出願の目的では、ヒト抗体という用語が、ヒトに生成させた抗体および/または本明細書で開示されるヒト抗体を作製する技法のうちのいずれかを用いて作製した抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体を含む。ヒト抗体についてのこの定義は、とりわけ、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、当技術分野で公知の多様な技法を用いて生成させることができる。上記で示唆した通り、本教示に従い、ファージディスプレイ法を用いて、免疫活性の結合領域をもたらすことができる。したがって、本発明の特定の実施形態は、抗Notum抗体またはその抗原結合部分を生成させる方法であって、ファージにおいて抗体ライブラリー好ましくはヒト抗体ライブラリーを合成するステップと、このライブラリーをNotumまたはその抗体結合部分でスクリーニングするステップと、Notumに結合するファージを単離するステップと、免疫反応性断片をファージから得るステップとを含む方法をもたらす。例を目的として述べると、ファージディスプレイ法において用いられる抗体ライブラリーを調製する一方法は、ヒトまたはヒト以外の免疫グロブリン遺伝子座を含むヒト以外の動物を、Notumまたはその抗原性部分で免疫化して免疫応答を創出するステップと、抗体生成細胞を免疫化された動物から抽出するステップと、本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするRNAを抽出された細胞から単離するステップと、RNAを逆転写させてcDNAを生成させるステップと、プライマーを用いてcDNAを増幅するステップと、ファージにおいて抗体を発現させるように、cDNAを、ファージディスプレイベクターへと挿入するステップとを含む。より具体的に述べると、VHドメインおよびVLドメインをコードするDNAを、PCRを介してscFvリンカーと併せて組み換え、ファージミドベクター例えば、pCANTAB6またはpComb3HSSへとクローニングする。次いで、ベクターを、E.coliへと電気穿孔することができ、次いで、このE.coliにヘルパーファージを感染させる。これらの方法で用いられるファージは、典型的に、fdファージおよびM13ファージを含めた糸状ファージであり、VHドメインおよびVLドメインは通常、ファージ遺伝子IIIまたはファージ遺伝子VIIIに組換えにより融合させる。上記の通りに調製した、組換えによるコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明の組換えヒト抗Notum抗体を単離することができる。好ましい実施形態では、ライブラリーが、B細胞から単離されたmRNAから調製したヒトVLおよびVHのcDNAを用いて生成したscFvファージディスプレイライブラリーである。当技術分野では、このようなライブラリーを調製およびスクリーニングする方法が周知であり、ファージディスプレイライブラリーを生成させるためのキット例えば、PharmaciaRecombinantPhageAntibodySystem、型番:27-9400-01;およびStratageneSurfZAP商標ファージディスプレイキット、型番:240612が市販されている。また、抗体ディスプレイライブラリーを生成させ、スクリーニングするのに使用され得る他の方法および試薬も存在する例えば、U.S.P.N.5,223,409;PCT公開第WO92/18619号、同第WO91/17271号、同第WO92/20791号、同第WO92/15679号、同第WO93/01288号、同第WO92/01047号、同第WO92/09690号;Fuchsら、Bio/Technology、9巻:1370~1372頁1991年;Hayら、Hum.Antibod.Hybridomas、3巻:81~85頁1992年;Huseら、Science、246巻:1275~1281頁1989年;McCaffertyら、Nature、348巻:552~554頁1990年;Griffithsら、EMBOJ.、12巻:725~734頁1993年;Hawkinsら、J.Mol.Biol.、226巻:889~896頁1992年;Clacksonら、Nature、352巻:624~628頁1991年;Gramら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89巻:3576~3580頁1992年;Garradら、Bio/Technology、9巻:1373~1377頁1991年;Hoogenboomら、Nuc.AcidRes.、19巻:4133~4137頁1991年;およびBarbasら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88巻:7978~7982頁1991年を参照されたい。ナイーブのライブラリー天然または合成のいずれかによって生成された抗体は、中程度の親和性Kaを約106~107M-1とするであるが、また、当技術分野において記載されている通り、二次的なライブラリーを構築し、これらから再選択することにより、invitroにおいて、親和性成熟を模倣することもできる。例えば、変異は、Hawkinsら、J.Mol.Biol.、226巻:889~896頁1992年の方法において、またはGramら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89巻:3576~3580頁1992年の方法において、変異性error-proneポリメラーゼを用いることによりLeungら、Technique、1巻:11~15頁1989年において報告されている、invitroにおいてランダムに導入することができる。加えて、親和性成熟は、選択された個別のFvクローンにおいて、例えば、対象のCDRにわたり、ランダム配列を保有するプライマーによるPCRを用いて、1または複数のCDRをランダムに変異させ、高親和性のクローンをスクリーニングすることにより実施することもできる。WO9607754は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域において変異誘発を誘導し、軽鎖遺伝子のライブラリーを創出する方法について記載している。別の有効な手法は、Marksら、Biotechnol.、10巻:779~783頁1992年において記載されている通り、免疫化されていないドナーから得られる天然のVドメイン変異体のレパートリーを伴うファージディスプレイを介して選択されるVHドメインまたはVLドメインを組み換え、数回のラウンドにわたり鎖をリシャフリングすることにより高親和性についてスクリーニングすることである。この技法は、解離定数Kdkoff/konを約10-9M以下とする抗体および抗体断片の生成を可能とする。それらの表面において結合対を発現させる真核細胞例えば、酵母を含むライブラリーを用いる類似の手順を使用し得ることがさらに理解されるであろう。ファージディスプレイ技術と同様に、真核生物によるライブラリーを対象の抗原すなわち、Notumに対してスクリーニングし、候補結合対を発現させる細胞を単離し、クローニングする。ライブラリー内容物を最適化し、反応性結合対を親和性成熟させるステップを採用することができる。例えば、U.S.P.N.7,700,302およびU.S.S.N.12/404,059を参照されたい。一実施形態では、ヒト抗体を、ヒト抗体を発現させるファージライブラリーから選択するVaughanら、NatureBiotechnology、14巻:309~314頁1996年;Sheetsら、Proc.Natl.Acad.Sci.、95巻:6157~6162頁1998年;HoogenboomおよびWinter、J.Mol.Biol、227巻:381頁1991年;Marksら、J.Mol.Biol、222巻:581頁1991年。他の実施形態では、ヒト結合対を、酵母などの真核細胞において生成させたコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離することができる。例えば、U.S.P.N.7,700,302を参照されたい。このような技法は、多数の候補モジュレーターをスクリーニングし、候補配列の比較的容易な操作例えば、親和性成熟または組換えシャフリングを介するをもたらすことを可能として有利である。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性の免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活化させたトランスジェニック動物、例えば、マウスへと導入することにより作製することもできる。チャレンジすると、遺伝子の再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含めた全ての点でヒトにおいて見られるヒト抗体の生成と酷似するヒト抗体の生成が観察される。この手法は、例えば、以下:Marksら、Bio/Technology、10巻:779~783頁1992年;Lonbergら、Nature、368巻:856~859頁1994年;Morrison、Nature、368巻:812~13頁1994年;Fishwildら、NatureBiotechnology、14巻:845~51頁1996年;Neuberger、NatureBiotechnology、14巻:826頁1996年;LonbergおよびHuszar、Intern.Rev.Immunol.、13巻:65~93頁1995年の科学刊行物と共に、Xenomouse登録商標法に関する、U.S.P.N.5,545,807;同5,545,806;同5,569,825;同5,625,126;同5,633,425;同5,661,016、ならびにU.S.P.N6,075,181、および同6,150,584に記載されている。代替的に、ヒト抗体は、標的抗原を指向する抗体を生成させるヒトBリンパ球を不死化させることにより調製することもできるこのようなBリンパ球は、新生物性障害を患っている個体から回収することもでき、invitroにおいて免疫化することもできる。例えば、Coleら、MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy、AlanR.Liss、77頁1985年;Boernerら、J.Immunol、147巻1号:86~95頁1991年;およびU.S.P.N.5,750,373を参照されたい。VI.抗体の特徴どのようにして得られようとも、または抗体モジュレーターが前述の形態のうちのいずれの形態例えば、ヒト化形態、ヒト形態などをとろうとも、開示されるモジュレーターの好ましい実施形態は、多様な特徴を呈示しうる。この点で、抗Notum抗体の生成細胞例えば、ハイブリドーマまたは酵母コロニーを、例えば、頑健な成長、高度な抗体生成、および以下でより詳細に論じられる所望の抗体特徴を含めた所望の特徴について選択し、クローニングし、さらにスクリーニングすることができる。ハイブリドーマは、同系動物においてinvivoで拡大増殖させることもでき、免疫系を欠く動物、例えば、ヌードマウスにおいて拡大増殖させることもでき、細胞培養物中でinvitroで拡大増殖させることもできる。それらの各々が異なる抗体種を生成させるハイブリドーマおよび/またはコロニーを選択し、クローニングし、拡大増殖させる方法は、当業者に周知である。a.中和抗体特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターが、中和抗体またはその誘導体もしくは断片を含む。中和抗体または中和アンタゴニストという用語は、リガンドまたは酵素に結合するかまたはこれと相互作用し、リガンドまたは酵素のその結合パートナーまたは基質への結合を防止し、中断されなければ2つの分子の相互作用から生じる生物学的応答を中断する抗体またはアンタゴニストを指す。抗体またはその免疫学的に機能的な断片もしくは誘導体の結合および特異性の評価では、過剰な抗体により、標的分子に結合した結合パートナーの量が、少なくとも約20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、97、99以上本明細書の実施例に示されるTCFアッセイなどの、invitroにおける競合的結合アッセイにより測定される低減される場合、抗体または断片は、リガンドまたは酵素のその結合パートナーまたは基質への結合を実質的に阻害する。Notumに対する抗体の場合、中和抗体またはアンタゴニストは、NotumがGPIを切断する能力を、少なくとも約20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、97、99以上減殺し、これにより、遊離グリピカンの濃度を低減する。このグリピカン濃度の減殺は、当技術分野で認知された技法を用いて直接測定する場合もあり、このような低下がWnt、Hh、またはBMPなど、Notum関連経路に対して及ぼす影響を介して測定する場合もあることが理解されるであろう。b.内部移行抗体証拠は、Notumが細胞により分泌されうることを示すが、少なくとも一部のNotumは、細胞表面との会合を維持する可能性が高く、これにより、開示されるモジュレーターの内部移行を可能とする。したがって、抗Notum抗体は、Notumを発現させる細胞により、少なくともある程度は内部移行されうる。例えば、腫瘍始原細胞の表面においてNotumに結合する抗Notum抗体は、腫瘍始原細胞により内部移行されうる。特に好ましい実施形態では、このような抗Notum抗体を、内部移行させると細胞を死滅させる細胞傷害性部分と会合させることもでき、これとコンジュゲートすることもできる。本明細書で用いられる、内部移行する抗Notum抗体とは、哺乳動物細胞と関連するNotumに結合すると、この細胞により取り込まれる抗Notum抗体である。内部移行抗体には、抗体断片、ヒト抗体またはヒト化抗体、および抗体コンジュゲートが含まれる。内部移行は、invitroにおいて発生する場合もあり、invivoにおいて発生する場合もある。治療的適用では、内部移行をinvivoにおいて発生させることができる。内部移行させる抗体分子の数は、Notum発現細胞、とりわけ、Notum発現腫瘍始原細胞を死滅させるのに十分であるかまたは適度でありうる。場合によっては、抗体または抗体コンジュゲートの効力に応じて、単一の抗体分子の細胞への取込みが、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、特定の毒素は、抗体にコンジュゲートした1つの毒素分子の内部移行が、腫瘍細胞を死滅させるのに十分であるように、殺滅の効力が高い。抗Notum抗体が、哺乳動物細胞におけるNotumに結合すると内部移行するかどうかは、以下の実施例において記載されているアッセイを含めた多様なアッセイにより決定することができる。抗体が細胞へと内部移行するかどうかを検出する方法は、参照によりその全体において本明細書に援用される、U.S.P.N.7,619,068において記載されている。c.枯渇化抗体他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターが、枯渇化抗体またはその誘導体もしくは断片を含む。枯渇化抗体という用語は、細胞表面において、または細胞表面の近傍においてNotumに結合するかまたはこれと会合し、細胞の死滅または消失を誘導するか、促進するか、または引き起こす例えば、補体依存性細胞傷害作用または抗体依存性細胞傷害作用を介して抗体または断片を指す。以下でより完全に論じられる一部の実施形態では、選択された枯渇化抗体を、細胞傷害性剤と会合させるか、またはこれとコンジュゲートする。枯渇化抗体は、規定された細胞集団内の腫瘍永続細胞のうちの少なくとも20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、97、または99を除去するか、消失させるか、または死滅させうることが好ましい。一部の実施形態では、細胞集団が、濃縮されるか、区分されるか、精製されるか、または単離された腫瘍永続細胞を含みうる。他の実施形態では、細胞集団が、腫瘍永続細胞を含む全腫瘍試料を含む場合もあり、腫瘍永続細胞を含む異質な腫瘍抽出物を含む場合もある。当業者は、本明細書の教示に従い、以下の実施例に記載されている標準的な生化学的技法を用いて、腫瘍永続細胞の枯渇をモニタリングおよび定量化しうることを理解するであろう。d.エピトープとの結合開示される抗Notum抗体は、選択された標的複数可により提示される異なるエピトープまたは決定基と会合するかまたはこれに結合することがさらに理解される。本明細書で用いられるエピトープという用語は、特定の抗体が認識することが可能であり、特定の抗体が特異的に結合することが可能な標的抗原の部分を指す。抗原がNotumなどのポリペプチドである場合、エピトープは、タンパク質の三次フォールディングにより並置される連続アミノ酸および非連続アミノ酸の両方から形成されうる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的に、タンパク質が変性しても保持されるが、三次フォールディングにより形成されたエピトープは、典型的に、タンパク質が変性すると失われる。エピトープは、典型的に、固有の空間コンフォメーションにおける少なくとも3アミノ酸、およびより通常は少なくとも5アミノ酸、または8~10アミノ酸を包含する。より具体的に述べると、当業者は、エピトープという用語が、免疫グロブリンもしくはT細胞受容体に特異的に結合することが可能であるか、または分子と他の形で相互作用することが可能な任意のタンパク質決定基を包含することを理解するであろう。エピトープ決定基は一般に、アミノ酸または炭水化物または糖の側鎖など、分子の化学的に活性な表面群groupingからなり、一般に特異的な三次元構造上の特徴のほか、特異的な電荷特徴を有する。加えて、エピトープは、直鎖状の場合もあり、コンフォメーション性の場合もある。直鎖状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子抗体などの分子との間の全ての相互作用点が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直鎖状に発生する。コンフォメーションエピトープでは、相互作用点が、直鎖においては互いに分離する、タンパク質におけるアミノ酸残基を横断して発生する。抗原における所望のエピトープを決定したら、例えば、本明細書で記載される技法を用いて、そのエピトープに対する抗体を生成させることができる。代替的には、発見過程において、抗体の生成および特徴付けにより、所望のエピトープについての情報が明らかになりうる。次いで、この情報により、同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能となる。これを達成する手法は、互いと競合的に結合する抗体、すなわち、抗原への結合について競合する抗体を見出す競合研究を実施することである。それらの交差競合に基づく、抗体をビニングbinningするためのハイスループット工程については、WO03/48731において記載されている。本明細書で用いられる、ビニングという用語は、それらの抗原への結合特徴に基づき抗体を群分けする方法を指す。ビンの割当ては、被験抗体の、観察される結合パターンがどれほど異なるかに応じて、ある程度恣意的である。したがって、この技法は、本発明の抗体を類別するのに有用なツールであるが、ビンがエピトープと常に直接相関するわけではなく、当技術分野で認知された他の方法を介して、このような初期決定をさらに確認するべきである。この警告を踏まえて、当技術分野において公知であり、本明細書の実施例でも示される方法を用いることにより、選択された一次抗体またはその断片が、第2の抗体と同じエピトープに結合するのか、または第2の抗体との結合について交差競合するのかを決定することができる。一実施形態では、飽和条件下で、本発明の一次抗体をNotumに結合させ、次いで、二次抗体がNotumに結合する能力を測定する。被験抗体が一次抗Notum抗体と同時にNotumに結合することが可能であるならば、二次抗体は、一次抗体と異なるエピトープに結合する。しかし、二次抗体が、Notumに同時に結合することが可能でないならば、二次抗体は、同じエピトープ、重複エピトープ、または一次抗体が結合したエピトープにごく近接するエピトープに結合する。当技術分野で公知であり、以下の実施例で詳述される通り、所望のデータは、直接的もしくは間接的な固相ラジオイムノアッセイRIA、直接的もしくは間接的な固相酵素免疫アッセイEIA、サンドイッチ競合アッセイ、Biacore商標システムすなわち、表面プラズモン共鳴:GEHealthcare、ForteBio登録商標Analyzerすなわち、BioLayerInterferometry:ForteBio,Inc.、またはフローサイトメトリー法を用いて得ることができる。本明細書で用いられる表面プラズモン共鳴という用語は、バイオセンサーマトリックス中のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの生体特異的相互作用の解析を可能とする光学現象を指す。特に好ましい実施形態では、以下の実施例で実証される通り、BiacoreまたはForteBio装置を用いて解析を実施する。同じエピトープについて競合する抗体の文脈で用いられる場合の競合という用語は、抗体間の競合を、被験下の抗体または免疫学的に機能的な断片が、共通の抗原に対する基準抗体の特異的結合を防止するかまたは阻害するアッセイにより決定することを意味する。典型的に、このようなアッセイは、これらの標識されていない被験免疫グロブリンおよび標識された基準免疫グロブリンのうちのいずれかを保有する固体表面または細胞に結合させた、精製された抗原の使用を伴う。競合的阻害は、被験免疫グロブリンの存在下における固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通常は、被験免疫グロブリンが過剰に存在する。競合アッセイにより同定される抗体競合抗体は、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体、および基準抗体が結合したエピトープに対して、立体障害が発生するのに十分な程度に近位の隣接エピトープに結合する抗体を包含する。本明細書の実施例では、競合的結合を決定する方法に関するさらなる詳細が提供される。通常、競合抗体が過剰に存在すると、基準抗体の共通抗原への特異的結合が、少なくとも40、45、50、55、60、65、70、または75阻害される。場合によっては、結合が、少なくとも80、85、90、95、または97以上阻害される。エピトープ特異性以外に、開示される抗体は、例えば、結合親和性、融解温度Tm、および等電点を含めた、多数の異なる物理的特徴を用いて特徴付けることができる。e.結合親和性この点では、本発明が、Notumに対する結合親和性が高い抗体の使用をさらに包含する。その解離定数であるKdkoff/konが、≦10-8Mである場合に、本発明の抗体は、その標的抗原に特異的に結合すると言う。Kdが≦5×10-9Mである場合に、抗体は、高い親和性で抗原に特異的に結合し、Kdが≦5×10-10Mである場合に、極めて高い親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態では、抗体のKdを≦10-9Mとし、解離速度off-rateを約1×10-4/秒とする。本発明の一実施形態では、解離速度を<1×10-5/秒とする。本発明の他の実施形態では、抗体が、Kdを約10-8M~10-10MでNotumに結合し、さらに別の実施形態では、Kd≦2×10-10MでNotumに結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、解離定数またはKdkoff/konを、10-2M未満、5×10-2M未満、10-3M未満、5×10-3M未満、10-4M未満、5×10-4M未満、10-5M未満、5×10-5M未満、10-6M未満、5×10-6M未満、10-7M未満、5×10-7M未満、10-8M未満、5×10-8M未満、10-9M未満、5×10-9M未満、10-10M未満、5×10-10M未満、10-11M未満、5×10-11M未満、10-12M未満、5×10-12M未満、10-13M未満、5×10-13M未満、10-14M未満、5×10-14M未満、10-15M未満、または5×10-15M未満とする抗体を含む。特定の実施形態では、Notumに免疫特異的に結合する本発明の抗体の会合速度定数またはkon速度NotumAb抗原Agkon←Ab-Agが、少なくとも105M-l秒-l、少なくとも2×105M-l秒-l、少なくとも5×105M-l秒-l、少なくとも106M-l秒-l、少なくとも5×106M-l秒-l、少なくとも107M-l秒-l、少なくとも5×107M-l秒-l、または少なくとも108M-l秒-lである。別の実施形態では、Notumに免疫特異的に結合する本発明の抗体のkoff速度NotumAb抗原Agkoff←Ab-Agが、10-l秒-l未満、5×10-l秒-l未満、10-2秒-l未満、5×10-2秒-l未満、10-3秒-l未満、5×10-3秒-l未満、10-4秒-l未満、5×10-4秒-l未満、10-5秒-l未満、5×10-5秒-l未満、10-6秒-l未満、5×10-6秒-l未満、10-7秒-l未満、5×10-7秒-l未満、10-8秒-l未満、5×10-8秒-l未満、10-9秒-l未満、5×10-9秒-l未満、または10-10秒-l未満である。本発明の他の選択された実施形態では、抗Notum抗体の親和性定数またはKakon/koffが、少なくとも102M-1、少なくとも5×102M-1、少なくとも103M-1、少なくとも5×103M-1、少なくとも104M-1、少なくとも5×104M-1、少なくとも105M-1、少なくとも5×105M-1、少なくとも106M-1、少なくとも5×106M-1、少なくとも107M-1、少なくとも5×107M-1、少なくとも108M-1、少なくとも5×108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも5×109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも5×1010M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも5×1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも5×1012M-1、少なくとも1013M-1、少なくとも5×1013M-1、少なくとも1014M-1、少なくとも5×1014M-1、少なくとも1015M-1、または少なくとも5×1015M-1である。f.等電点前述の結合特性に加えて、抗Notum抗体およびその断片は、全てのポリペプチドと同様に、一般にポリペプチドが正味の電荷を保有しないときのpHとして規定される等電点pIを有する。当技術分野では、タンパク質の溶解度が、典型的に、溶液のpHがタンパク質の等電点pIと等しいときに最も低くなることが公知である。したがって、抗体におけるイオン化可能な残基の数および場所を変化させ、pIを調整することにより、溶解度を最適化することが可能である。例えば、ポリペプチドのpIは、適切なアミノ酸置換を行うことにより例えば、リシンなどの荷電アミノ酸を、アラニンなどの非荷電残基で置換することにより操作することができる。あらゆる特定の理論に拘束されることを望まないが、抗体のpIの変化を結果としてもたらす前記抗体のアミノ酸置換により、抗体の溶解度および/または安定性を改善することができる。当業者ならば、どのアミノ酸置換であれば、特定の抗体が所望のpIを達成するのに最も適切であるのかを理解するであろう。タンパク質のpIは、等電点電気泳動および多様なコンピュータアルゴリズムが含まれるがこれらに限定されない多様な方法例えば、Bjellqvistら、1993年、Electrophoresis、14巻:1023頁を参照されたいを介して決定することができる。一実施形態では、本発明の抗Notum抗体のpIが、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、または約9.0よりも高い。別の実施形態では、本発明の抗Notum抗体のpIが、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、または9.0よりも高い。さらに別の実施形態では、本発明の抗体のpIを結果として変化させる置換が、それらのNotumに対する結合親和性をそれほどは減殺しない。以下でより詳細に論じられる通り、とりわけ、FcγRへの結合を結果として変化させるFc領域の置換複数可がまた、pIも結果として変化させうることが意図される。好ましい実施形態では、Fc領域の置換複数可が、とりわけ、FcγR結合の所望の変化およびpIの任意の所望の変化の両方を果たすように選択される。本明細書で用いられる、pI値は、優勢な荷電形態のpIとして定義される。g.熱安定性抗体のFabドメインのTmが、抗体の熱安定性の良好な指標であることが可能であり、保管寿命をさらに示しうることがさらに理解されるであろう。Tmとは、所与のドメインまたは配列について50のアンフォールディングをもたらす温度に過ぎない。より低いTmは増大した凝集/低い安定性を示すのに対し、より高いTmは少ない凝集/高い安定性を示す。したがって、Tmが高い抗体または断片もしくは誘導体が好ましい。さらに、当技術分野で認知されている技法を用いて、抗Notum抗体またはそのドメインの組成を変化させ、分子の安定性を増大させるかまたは最適化することが可能である。例えば、U.S.P.N.7,960,142を参照されたい。したがって、一実施形態では、選択された抗体のFabドメインのTm値が、少なくとも50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、90°C、95°C、100°C、105°C、110°C、115°C、または120°Cより高い。別の実施形態では、抗体のFabドメインのTm値が、少なくとも約50°C、約55°C、約60°C、約65°C、約70°C、約75°C、約80°C、約85°C、約90°C、約95°C、約100°C、約105°C、約110°C、約115°C、または約120°Cより高い。タンパク質ドメイン例えば、Fabドメインの熱融解温度Tmは、当技術分野で公知の任意の標準的な方法を用いて、例えば、示差走査熱量測定により測定することができる例えば、それらの両方が参考として本明細書に援用される、Vermeerら、2000年、Biophys.J.、78巻:394~404頁;Vermeerら、2000年、Biophys.J.、79巻:2150~2154頁を参照されたい。VII.Notumモジュレーターの断片および誘導体本発明の薬剤が、無傷の融合構築物を含むのであれ、抗体を含むのであれ、断片または誘導体を含むのであれ、選択されたモジュレーターは、Notumと反応するか、結合するか、組み合わされるか、複合体化するか、接続するか、付着するか、接合するか、相互作用するか、または他の形でNotumと会合し、これにより、所望の抗新生物効果をもたらす。当業者は、抗Notum抗体を含むモジュレーターを、抗体において発現する1または複数の結合部位を介して、Notumと相互作用させるかまたは会合させることを理解するであろう。より具体的に述べると、本明細書で用いられる結合部位という用語は、目的の標的分子例えば、酵素、抗原、リガンド、受容体、基質、または阻害剤に選択的に結合することの一因となるポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは、少なくとも1つの結合部位例えば、無傷のIgG抗体は、2つの結合ドメインと2つの結合部位とを有するを含む。例示的な結合ドメインには、抗体の可変ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、または酵素ドメインが含まれる。本発明の目的では、Notumの酵素として活性な領域例えば、Fc-Notum融合構築物の一部としてのが、基質例えば、グリピカンに対する結合部位を含みうる。a.断片モジュレーターのどの形態例えば、キメラ形態、ヒト化形態などを選択して本発明を実施するかに関わらず、モジュレーターの免疫反応性断片を、本明細書の教示に従い使用され得ることが理解されるであろう。その最も広義において、抗体断片という用語は、無傷抗体例えば、天然の免疫グロブリンの少なくとも一部を含む。より具体的に述べると、断片という用語は、無傷または完全な抗体または抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含む、抗体または抗体鎖の一部または部分またはFc融合体の場合におけるNotum分子を指す。抗原結合断片という用語は、抗原に結合するか、または抗原への結合すなわち、特異的結合について無傷抗体と競合するすなわち、それらが由来する無傷抗体と競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片を指す。本明細書で用いられる抗体分子の断片という用語は、抗体の抗原結合断片、例えば、抗体の軽鎖VL、抗体の重鎖VH、単鎖抗体scFv、Fab’2断片、Fab断片、Fd断片、Fv断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディー、直鎖状抗体、抗体断片から形成された単鎖抗体分子および多重特異性抗体を包含する。同様に、Notumの酵素的活性断片は、その、無傷Notumと類似する形でおそらく、ある程度効率を低下させてではあるがNotum基質と相互作用し、それらを修飾する例えば、それらを切断するclip能力を保持するNotum分子の一部を含む。当業者は、断片を、無傷のモジュレーターまたは完全なモジュレーター例えば、抗体または抗体鎖の化学的処理または酵素的処理を介して得る場合もあり、組換え手段を介して得る場合もあることを理解するであろう。この点で、多様な抗体断片が、無傷抗体の消化との関係で規定される一方、当業者は、このような断片は、化学的に新規に合成する場合もあり、組換えDNA法を用いることにより新規に合成する場合もあることを理解するであろう。したがって、本明細書で用いられる抗体という用語は、全抗体の修飾を介して生成させるか、または組換えDNA法を用いて新規に合成する抗体またはその断片もしくは誘導体を明示的に包含する。より具体的に述べると、抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を伴うFab断片と呼ばれる2つの同一な抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化するその能力を反映する残余のFc断片とを生成させる。ペプシン処理は、2つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋形成することも可能なFab’2断片をもたらす。Fab断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメインCH1も含有する。Fab’断片は、抗体のヒンジ領域に由来する1または複数のシステインを含めた、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加により、Fab断片と異なる。本明細書では、Fab’-SHを、定常ドメインのシステイン残基複数可が少なくとも1つの遊離チオール基を保有するFab’の記号表示とする。Fab’2抗体断片は元来、それらの間にヒンジシステインを有するFab’断片の対として生成した。抗体断片の他の化学的連結もまた公知である。他の抗体断片のより詳細な説明については、例えば、FundamentalImmunology、W.E.Paul編、RavenPress、N.Y.1999年を参照されたい。Fv断片とは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する抗体断片であることがさらに理解されるであろう。この領域は、例えば、scFvでは共有結合的な性質でありうる緊密な会合下にある、1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインによる二量体からなる。各可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VH-VL二量体の表面における抗原結合部位を規定するのは、この構成においてである。併せて6つのCDRまたはこれらのサブセットが、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメインまたは抗原に特異的な3つのCDRだけを含むFvの半分でもなお、通常は結合部位全体より低い親和性においてではあるが、抗原を認識してこれに結合する能力を有する。他の実施形態では、抗体断片が、例えば、Fc領域を含み、FcRnへの結合、抗体半減期の調節、ADCC機能、および補体結合など、無傷抗体において存在する場合にFc領域と通常関連する生物学的機能のうちの少なくとも1つを保持する抗体断片である。一実施形態では、抗体断片が、invivoにおける半減期が無傷抗体と実質的に同様である一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、invivoにおける安定性を断片に付与することが可能なFc配列に連結された抗原結合アームを含みうる。b.誘導体別の実施形態では、本発明のモジュレーターが、一価の場合もあり、多価例えば、二価、三価などの場合もあることがさらに理解されるであろう。本明細書で用いられる価数という用語は、抗体と会合する潜在的な標的すなわち、Notumの結合部位の数を指す。各標的結合部位は、1つの標的分子または標的分子における特定の位置もしくは遺伝子座に特異的に結合する。本発明の抗体が、複数の標的結合部位多価を含む場合、各標的結合部位は、同じ分子に特異的に結合する場合もあり、異なる分子に特異的に結合する場合もある例えば、異なるリガンドまたは異なる抗原に結合する場合もあり、同じ抗原における異なるエピトープまたは異なる位置に結合する場合もある。本発明の目的では、対象の抗体が、ヒトNotumに特異的な少なくとも1つの結合部位を有することが好ましい。一実施形態では、本発明の抗体が、分子の各結合部位がNotumの単一の位置またはエピトープに特異的に結合するという点において一価である。他の実施形態では、抗体が、それらが複数の結合部位を含み、かつそれらの種々の結合部位が単一よりも多い位置またはエピトープと特異的に会合するという点において多価である。このような場合には、複数のエピトープが選択されたNotumポリペプチドに存在することもあり、単一のエピトープがNotumに存在することもある一方、第2の異なるエピトープが別の分子または別の表面に存在することもある。例えば、U.S.P.N.2009/0130105を参照されたい。上記で示唆した通り、多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合する場合もあり、標的分子ならびに異種ポリペプチドまたは固体の支持材料などの異種エピトープの両方に免疫特異的に結合する場合もある。抗Notum抗体の好ましい実施形態は、2つの抗原だけに結合するすなわち、二重特異性抗体が、本発明ではまた、三重特異性抗体など、さらなる特異性を伴う抗体も包含される。限定なしに述べると、二重特異性抗体の例には、一方のアームがNotumを指向し、他方のアームが他の任意の抗原例えば、モジュレーターの細胞マーカーを指向する二重特異性抗体が含まれる。当技術分野では、二重特異性抗体を作製する方法が公知である。全長二重特異性抗体の従来の生成は、2つの鎖が異なる特異性を有する、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の共発現に基づくMillsteinら、1983年、Nature、305巻:537~539頁。他のより洗練された適合可能な多重特異性構築物およびそれらの作製法は、U.S.P.N.2009/0155255に示されている。さらに他の実施形態では、所望の結合特異性を伴う抗体の可変ドメイン抗体-抗原結合部位を、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合させる。ヒンジ領域、CH2領域、および/またはCH3領域のうちの少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインとの融合体が好ましい。一例では、軽鎖の結合に必要な部位を含有する第1の重鎖定常領域CH1が、融合体のうちの少なくとも1つに存在する。免疫グロブリン重鎖の融合体をコードするDNAと、所望の場合は、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAとを、別個の発現ベクターへと挿入し、適切な宿主生物へと共トランスフェクトする。これは、構築で用いられる3つのポリペプチド鎖の比率が同等でないことにより最適の収量がもたらされる実施形態において、3つのポリペプチド断片の相互の割合を調整するのに多大な柔軟性をもたらす。しかし、比率が同等な少なくとも2つのポリペプチド鎖が発現する結果として高収量がもたらされる場合、または比率が特別の重要性を有さない場合は、2つまたは3つのポリペプチド鎖全てのコード配列を1つの発現ベクターに挿入することも可能である。この手法の一実施形態では、二重特異性抗体が、一方のアームにおいて第1の結合特異性を伴うハイブリッドの免疫グロブリン重鎖例えば、Notumと、他方のアームにおけるハイブリッドの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対第2の結合特異性をもたらすとからなる。二重特異性分子の半分だけにおいて免疫グロブリン軽鎖が存在することにより分離の容易な方法がもたらされるので、この非対称性の構造は、所望の二重特異性化合物の、不要な免疫グロブリン鎖の組合せからの分離を促進することが見出された。この手法は、WO94/04690に開示されている。二重特異性抗体の生成についてのさらなる詳細については、例えば、Sureshら、1986年、MethodsinEnzymology、121巻:210頁を参照されたい。WO96/27011において記載されている別の手法によれば、抗体分子の対を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大化するように操作することができる。好ましいインターフェースは、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1の抗体分子のインターフェースに由来する1または複数の小型のアミノ酸側鎖を、より大型の側鎖例えば、チロシンまたはトリプトファンで置換する。大型の側鎖複数可と同一であるかまたは類似のサイズである代償性の空洞Compensatorycavityは、大きなアミノ酸側鎖を小型のアミノ酸側鎖例えば、アラニンまたはトレオニンで置換することにより、第2の抗体分子のインターフェースを創出する。これは、ホモ二量体など、他の不要な最終生成物を上回るヘテロ二量体の収量を増大させるための機構をもたらす。二重特異性抗体にはまた、架橋抗体またはヘテロコンジュゲート抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート内の一方の抗体をアビジンに連結し、他方の抗体をビオチンに連結することができる。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞を免疫系細胞の標的とすることU.S.P.N.4,676,980、およびHIV感染の処置WO91/00360、WO92/200373、およびEP03089について提起されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋形成法を用いて作製することができる。当技術分野では適切な架橋形成剤が周知であり、多数の架橋形成法と共に、U.S.P.N.4,676,980において開示されている。VIII.Notumモジュレーター:定常領域の修飾a.Fc領域およびFc受容体上記で示した、開示されるモジュレーター例えば、Fc-Notumまたは抗Notum抗体の可変領域または結合領域に対する多様な修飾、置換、付加、または欠失に加えて、当業者は、本発明の選択された実施形態がまた、定常領域すなわち、Fc領域の置換または修飾も含みうることを理解するであろう。より具体的に述べると、本発明のNotumモジュレーターが、とりわけ、薬物動態の変化、血清半減期の延長、結合親和性の増大、免疫原性の低減、生成の増大、Fcリガンド結合の変化、ADCC活性またはCDC活性の増強または低減、グリコシル化および/またはジスルフィド結合の変化、ならびに結合特異性の改変が含まれるがこれらに限定されない好ましい特徴を伴う化合物を結果としてもたらす、1または複数のさらなるアミノ酸残基の置換、変異、および/または修飾を含有しうることが意図される。この点で、これらのFc変異体は、開示されるモジュレーターの有効な抗新生物特性を増強するのに用いると有利でありうることが理解されるであろう。本明細書におけるFc領域という用語は、天然配列のFc領域および変異体のFc領域を含めた、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するのに用いられる。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変化しうるが、ヒトIgG重鎖のFc領域は通常、Cys226位のアミノ酸残基から、またはPro230から、そのカルボキシル末端へと延びると定義される。Fc領域のC末端リシンEU番号付けシステムによる残基447は、例えば、抗体の生成または精製時において除去することもでき、抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することにより除去することもできる。したがって、無傷抗体の組成物は、全てのK447残基を除去した抗体集団、K447残基を除去していない抗体集団、ならびにK447残基を伴う抗体とK447残基を伴わない抗体との混合物を有する抗体集団を含みうる。機能的Fc領域は、天然配列のFc領域のエフェクター機能を保有する。例示的なエフェクター機能には、C1qへの結合、CDC、Fc受容体への結合、ADCC、食作用、細胞表面受容体の下方制御例えば、B細胞受容体:BCRなどが含まれる。このようなエフェクター機能は一般的に、Fc領域が結合ドメイン例えば、抗体の可変ドメインと組み合わさることを要求し、例えば、本明細書の定義で開示される多様なアッセイを用いて評価することができる。Fc受容体またはFcRは、抗体のFc領域に結合する受容体について記載する。一部の実施形態では、FcRが、天然ヒトFcRである。一部の実施形態では、FcRが、IgG抗体ガンマ受容体に結合するFcRであり、これには、これらの受容体の対立遺伝子変異体、および選択的にスプライシングされた形態を含めた、FcγRIサブクラス、FcγRIIサブクラス、およびFcγRIIIサブクラスの受容体が含まれる。FcγII受容体は、主にこれらの細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する、FcγRIIA活性化受容体およびFcγRIIB阻害受容体を包含する。活性化受容体であるFcγRIIAは、その細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフITAMを含有する。阻害受容体であるFγRIIBは、その細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフITIMを含有する例えば、Daeron、Annu.Rev.Immunol.、15巻:203~234頁1997年を参照されたい。FcRは、例えば、RavetchおよびKinet、Annu.Rev.Immunol、9巻:457~92頁1991年;Capelら、Immunomethods、4巻:25~34頁1994年;ならびにdeHaasら、J.Lab.Clin.Med.、126巻:330~41頁1995年において総説されている。本明細書におけるFcRという用語には、将来同定されるFcRを含めた他のFcRも包含される。Fc受容体またはFcRという用語にはまた、特定の場合には、母体IgGの胎児への移動Guyerら、J.Immunol.、117巻:587頁1976年;およびKimら、J.Immunol.、24巻:249頁1994年、および免疫グロブリンのホメオスタシスの制御の一因となる、新生児受容体であるFcRnも含まれる。FcRnへの結合を測定する方法は公知である例えば、GhetieおよびWard.、Immunol.Today、18巻12号:592~598頁1997年;Ghetieら、NatureBiotechnology、15巻7号:637~640頁1997年;Hintonら、J.Biol.Chem.、279巻8号:6213~6216頁2004年;WO2004/92219Hintonらを参照されたい。b.Fc機能本明細書で用いられる補体依存性細胞傷害作用およびCDCとは、補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。補体の活性化経路は、補体系の第1成分C1qの分子、例えば、同種cognate抗原と複合体化した抗体への結合により惹起される。補体の活性化を評価するには、例えば、Gazzano-Santoroら、1996年、J.Immunol.Methods、202巻:163頁において記載されているCDCアッセイを実施することができる。さらに、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用またはADCCとは、特定の細胞傷害性細胞例えば、ナチュラルキラーNK細胞、好中球、およびマクロファージに存在するFc受容体FcRに結合した、分泌されたIgが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を保有する標的細胞に特異的に結合し、その後、細胞毒素により標的細胞を死滅させることを可能とする細胞傷害の形態を指す。標的を指向する特異的な高親和性のIgG抗体は、細胞傷害性細胞を携え、このような殺滅に絶対的に必要とされる。標的細胞の溶解は、細胞外における溶解であり、細胞間における直接の接触を必要とし、補体は伴わない。FcRとの結合親和性またはADCC活性を変化させたNotumモジュレーター変異体とは、FcRとの結合活性および/またはADCC活性を、親抗体もしくは改変されていない抗体と比較して、または天然配列のFc領域を含むモジュレーターと比較して増強または減殺したNotumモジュレーター変異体である。FcRへの結合の増大を示すモジュレーター変異体は、親抗体もしくは改変されていない抗体または天然配列のFc領域を含むモジュレーターよりも良好な親和性で少なくとも1つのFcRに結合する。FcRへの結合の減少を示す変異体は、親抗体もしくは改変されていない抗体または天然配列のFc領域を含むモジュレーターよりも良好ではない親和性で少なくとも1つのFcRに結合する。FcRへの結合の減少を示すこのような変異体は、FcRへの感知可能な結合をほとんど保有しないかまたは全く保有しない場合があり、例えば、当技術分野において周知の技法により決定される通り、例えば、天然配列のIgGのFc領域と比較して、FcRへの結合が0~20となる。FcRnについて述べると、本発明の抗体はまた、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて5日より長いか、10日より長いか、15日より長いか、好ましくは20日より長いか、25日より長いか、30日より長いか、35日より長いか、40日より長いか、45日より長いか、2カ月より長いか、3カ月より長いか、4カ月より長いか、または5カ月より長い半減期例えば、血清半減期をもたらす、定常領域に対する修飾を伴うFc変異体も含むかまたは包含する。哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明の抗体またはFc含有分子の半減期の延長は、結果として、哺乳動物における前記抗体または抗体断片の高血清力価をもたらし、したがって、前記抗体もしくは抗体断片の投与頻度を低減し、かつ/または投与される前記抗体もしくは抗体断片の濃度を低減する。invivoにおける半減期を延長した抗体は、当業者に公知の技法を介して生成させることができる。例えば、invivoにおける半減期を延長した抗体は、FcドメインとFcRn受容体との間の相互作用に関与するものとして同定されるアミノ酸残基を修飾する例えば、置換するか、欠失させるか、または付加することにより生成させることができる例えば、国際公開第WO97/34631号、同第WO04/029207号、U.S.P.N.6,737,056、およびU.S.P.N.2003/0190311を参照されたい。invivoにおけるヒトFcRnへの結合、およびヒトFcRnと高親和性で結合するポリペプチドの血清半減期は、例えば、トランスジェニックマウスにおいてアッセイすることもでき、ヒトFcRnを発現させる、トランスフェクトされたヒト細胞系においてアッセイすることもでき、変異体のFc領域を伴うポリペプチドを投与する霊長動物においてアッセイすることもできる。WO2000/42072はFcRnへの結合を改善するかまたは減殺した抗体の変異体について記載する。また、例えば、Shieldsら、J.Biol.Chem.、9巻2号:6591~6604頁2001年も参照されたい。c.グリコシル化による修飾さらに他の実施形態では、本発明の抗体のグリコシル化パターンまたは組成を修飾する。より具体的に述べると、本発明の好ましい実施形態は、1または複数の操作されたグリコフォームglycoform、すなわち、グリコシル化パターンの変化またはFc領域を含む分子に共有結合する炭水化物組成物の変化を含みうる。操作されたグリコフォームは、エフェクター機能の増強もしくは低減、抗体の標的抗原に対する親和性の増大、または抗体生成の促進が含まれるがこれらに限定されない多様な目的に有用でありうる。エフェクター機能の低減が所望される場合には、分子を操作して非グリコシル化形態で発現させうることが理解されるであろう。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の1または複数のグリコシル化部位を変化させることにより達成することができる。すなわち、1または複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす1または複数のアミノ酸置換を行い、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる例えば、U.S.P.N.5,714,350および同6,350,861を参照されたい。逆に、1または複数のさらなるグリコシル化部位における操作を介して、Fc含有分子に、エフェクター機能の増強または結合の改善を付与することもできる。加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体hypofucosylatedantibodyまたは二分岐性GlcNAc構造を増大させた抗体など、グリコシル化の組成を変化させたFc変異体も作製することができる。これらおよび類似のグリコシル化パターンの変化は、抗体のADCC能力を増大させることが実証されている。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法を介して、例えば、操作されたかまたは変異体の発現株を用いることにより、1または複数の酵素例えば、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIGnTI11を伴う共発現を介して、多様な生物もしくは多様な生物に由来する細胞系においてFc領域を含む分子を発現させることにより、またはFc領域を含む分子を発現させた後で炭水化物複数可を修飾することにより、生成することができる。例えば、Shields,R.L.ら2002年、J.Biol.Chem.、277巻:26733~26740頁;Umanaら1999年、Nat.Biotech.、17巻:176~1頁のほか、欧州特許第EP1,176,195号;PCT公開第WO03/035835号;同第WO99/54342号、Umanaら、1999年、Nat.Biotechnol、17巻:176~180頁;Daviesら、20017年、BiotechnolBioeng、74巻:288~294頁;Shieldsら、2002年、JBiolChem、277巻:26733~26740頁;Shinkawaら、2003年、JBiolChem、278巻:3466~3473頁;U.S.P.N.6,602,684;U.S.S.N.10/277,370;同10/113,929;PCTWO00/61739A1;PCTWO01/292246A1;PCTWO02/311140A1;PCTWO02/30954A1;Potillegent商標法、Biowa,Inc.;GlycoMAb商標グリコシル化操作法GLYCARTbiotechnology,AG;WO00061739;EA01229125;U.S.P.N.2003/0115614;Okazakiら、2004年、JMB、336巻:1239~49頁を参照されたい。IX.モジュレーターの発現a.概観所望のNotumモジュレーターをコードするDNAは、従来の手順例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることを介するを用いて容易に単離し、配列決定することができる。モジュレーターが抗体である場合は、単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞またはファージもしくは酵母に由来するコロニーを、このようなDNAの好ましい供給源として用いることができる。所望の場合は、核酸を本明細書で記載される通りにさらに操作して、融合タンパク質、またはキメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは完全ヒト抗体を含めた薬剤を創出することもできる。より具体的に述べると、単離されたDNAこれは改変することができるを用いて、U.S.P.N.7,709,611において記載されている抗体を製造するための定常領域配列および可変領域配列をクローニングすることができる。この例示的な方法は、選択された細胞からのRNAの抽出、cDNAへの転換、および抗体に特異的なプライマーを用いるPCRを介する増幅を伴う。本明細書で例示される通り、当技術分野では適切なプライマーが周知であり、多数の商業的供給源から容易に入手可能である。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離される組換えヒト抗体または組換え非ヒト抗体を発現させるためには、抗体をコードするDNAを、組換え発現ベクターへとクローニングし、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含めた宿主細胞へと導入することが理解されるであろう。さらに他の実施形態では、モジュレーターを、サルCOS細胞、NS0細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、または他に所望の構築物を生成させない骨髄腫細胞に導入し、それらによって発現させる。以下でより詳細に論じられる通り、所望のモジュレーターを発現する形質転換細胞は、比較的大量に成長させて、融合構築物または免疫グロブリンの臨床的および商業的な供給をもたらすことができる。Notumモジュレーターの所望の部分をコードする核酸が、ファージディスプレイ法、酵母ライブラリー、ハイブリドーマベースの技法、合成により、または商業的供給源のいずれから得られるかまたはこれらのいずれに由来するのであれ、本発明が、融合タンパク質および抗Notum抗体またはこれらの抗原結合断片もしくは誘導体を含めたNotumモジュレーターをコードする核酸分子および核酸配列を明示的に包含することを理解されたい。本発明は、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下、または代替的に、中程度または低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下例えば、以下で規定されるで、本発明のモジュレーターまたはこれらの断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸と相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸または核酸分子例えば、ポリヌクレオチドもさらに包含する。本明細書で用いられる核酸分子または単離された核酸分子という用語は、少なくともDNA分子およびRNA分子を包含することを意図する。核酸分子は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあるが、二本鎖DNAであることが好ましい。さらに、本発明は、限定なしに述べると、ベクター、プラスミド、宿主細胞、コスミド、またはウイルス構築物を含めた、このようなモジュレーターをコードするポリヌクレオチドを組み込む任意のビヒクルまたは構築物を含む。単離された核酸という用語は、この核酸がiinvitroにおいて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCRにより増幅されたか、iiクローニングを介する組換えによりに生成させたか、iii例えば、切断およびゲル電気泳動による画分化を介して精製されたか、またはiv例えば、化学合成を介して合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えDNA技法を介する操作に利用可能な核酸である。より具体的に述べると、本発明の抗体、またはこれらの断片、誘導体、ムテイン、もしくは変異体の一方または両方の鎖を含めたモジュレーターをコードする核酸、ハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分なポリヌクレオチド、PCRプライマー、あるいはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するか、解析するか、変異させるか、または増幅するための配列決定用プライマー、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前出の相補的な配列も提供される。核酸は、任意の長さでありうる。核酸は、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000ヌクレオチド以上の長さの場合もあり、かつ/または1もしくは複数のさらなる配列、例えば、制御配列を含む場合もあり、かつ/または大型の核酸、例えば、ベクターの一部の場合もある。これらの核酸は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、RNAヌクレオチドおよび/またはDNAヌクレオチド、ならびにこれらの人工の変異体例えば、ペプチド核酸を含みうる。抗体またはその免疫反応性断片もしくは誘導体を含めた本発明のモジュレーターをコードする核酸は、上記の通りに単離されていることが好ましい。b.ハイブリダイゼーションおよび同一性示される通り、本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件下において他の核酸とハイブリダイズする核酸をさらに提供する。当技術分野では、核酸をハイブリダイズさせる方法が周知である。例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileySons、N.Y.1989年、6.3.1~6.3.6を参照されたい。本出願の目的では、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件において、5×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSC、0.5のSDS、1.0mMのEDTApH8.0を含有する前洗浄溶液、約50のホルムアミド、6×SSCのハイブリダイゼーション緩衝液、および55°Cのハイブリダイゼーション温度またはハイブリダイゼーション温度を42°Cとする、約50のホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション溶液など、他の類似のハイブリダイゼーション溶液、ならびに0.5×SSC、0.1のSDS中で60°Cの洗浄条件を用いる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、45°C、6×SSC中でハイブリダイズさせた後、68°C、0.1×SSC、0.2のSDS中で1または複数回にわたり洗浄する。さらに、当業者は、互いと少なくとも65、70、75、80、85、90、95、98、または99同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的に、互いとハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーション条件および/または洗浄条件を操作して、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大または減少させることもできる。より一般的に述べると、本開示の目的では、核酸配列について実質的に同一であるという用語は、基準核酸配列と少なくとも約85、または90、または95、または97の配列同一性を呈示するヌクレオチド配列とみなされ得る。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータおよび適切な条件を案出するための指針は、例えば、Sambrook、Fritsch、およびManiatis1989年、MolecularCloning:ALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、N.Y.、9および11章;ならびにCurrentProtocolsinMolecularBiology、1995年、Ausubelら編、JohnWileySons,Inc.、2.10および6.3~6.4節により示されており、例えば、核酸の長さおよび/または塩基組成に基づき、当業者が容易に決定しうる。本発明による核酸は、単独で存在する場合もあり、同種または異種である他の核酸と組み合わせて存在する場合もあることがさらに理解されるであろう。好ましい実施形態では、核酸を、前記核酸と同種または異種であり得る発現制御配列に機能的に連結する。この文脈において、同種という用語は、核酸がまた発現制御配列に天然でも機能的に連結されることを意味し、異種という用語は、核酸が発現制御配列に天然で機能的に連結されるわけではないことを意味する。c.発現RNAおよび/またはタンパク質もしくはペプチドを発現する核酸などの核酸と、発現制御配列とは、前記核酸の発現または転写が前記発現制御配列の制御下または影響下にあるような形で互いと共有結合により連結される場合、互いと機能的に連結される。核酸が機能的タンパク質へと翻訳され、発現制御配列がコード配列と機能的に連結される場合は、前記発現制御配列の誘導の結果として、コード配列においてフレームシフトを引き起こしたり、前記コード配列が所望のタンパク質またはペプチドへと翻訳されることができなくなったりすることなしに前記核酸の転写がもたらされる。本発明による発現制御配列という用語は、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子の転写またはmRNAの翻訳を制御する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列を制御することができる。発現制御配列の正確な構造は、種または細胞型の関数として変化しうるが、一般には、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列など、それぞれ、転写および翻訳の開始に関与する、5’側の非転写配列ならびに5’側の非翻訳配列および3’側の非翻訳配列を含む。より具体的に述べると、5’側の非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写を制御するためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列も含みうる。本発明によれば、プロモーターまたはプロモーター領域という用語は、発現する核酸配列に対して上流5’側に位置し、RNAポリメラーゼの認識部位および結合部位をもたらすことによりこの配列の発現を制御する核酸配列に関する。プロモーター領域は、遺伝子の転写の制御に関与するさらなる因子のさらなる認識部位および結合部位も包含しうる。プロモーターは、原核生物遺伝子の転写を制御する場合もあり、真核生物遺伝子の転写を制御する場合もある。さらに、プロモーターが、誘導的であり、誘導因子inducingagentに応答して転写を惹起する場合もあり、転写が誘導因子により制御されない場合は、構成的である場合もある。誘導的プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導因子が存在しない場合、発現しないかまたはわずかな程度だけ発現する。誘導因子の存在下では、遺伝子がオンに切り替わるか、または転写レベルが増大する。これは一般に、特異的な転写因子が結合することを介する。本発明による好ましいプロモーターには、SP6ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、およびT7ポリメラーゼのプロモーター、ヒトU6RNAプロモーター、CMVプロモーター、ならびにこれらの人工のハイブリッドプロモーター例えば、CMVが含まれ、この場合、これらの1または複数の部分を、例えば、さらなるイントロン複数可を含めて、またはさらなるイントロン複数可を含めずに、ヒトGAPDHグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼなどの他の細胞タンパク質の遺伝子のプロモーターの1または複数の部分に融合させる。本発明によれば、発現という用語は、その最も一般的な意味で用いられ、RNAの生成またはRNAおよびタンパク質/ペプチドの生成を含む。発現という用語はまた、核酸の部分的な発現も含む。さらに、発現は、一過性で実施することもでき、安定的に実施することもできる。好ましい実施形態では、本発明によれば、核酸分子が、ベクター内に、適切な場合はこの核酸の発現を制御するプロモーターと共に存在する。本明細書では、ベクターという用語が、その最も一般的な意味で用いられ、核酸を、例えば、原核生物細胞および/または真核生物細胞へと導入し、適切な場合はゲノムへと組み込むことを可能とする、前記核酸用の任意の中間的なビヒクルを含む。この種のベクターは、細胞内で複製および/または発現させることが好ましい。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、またはウイルスゲノムを含みうる。本明細書で用いられるプラスミドという用語は一般に、染色体DNAとは独立に複製しうる、通常は環状のDNA二重鎖である、染色体外の遺伝物質の構築物に関する。本発明を実施することにおいて、場合によって、分子生物学、微生物学、および組換えDNA法における多くの従来の技法を用いることが理解されるであろう。このような従来の技法は、本明細書で定義されるベクター、宿主細胞、および組換え法に関する。これらの技法は、周知であり、例えば、BergerおよびKimmel、GuidetoMolecularCloningTechniques、MethodsinEnzymology、152巻、AcademicPress,Inc.、SanDiego、Calif.;Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual3版、1~3巻、ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor、N.Y.、2000年;ならびにCurrentProtocolsinMolecularBiology、F.M.Ausubelら編、前出において説明されている。例えば、細胞の単離および培養例えば、その後における核酸またはタンパク質の単離のためのについての他の有用な参考文献には、Freshney1994年、CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique、3版、Wiley-Liss、NewYork、およびこの文献で引用されている参考文献;Payneら1992年、PlantCellandTissueCultureinLiquidSystems、JohnWileySons,Inc.、NewYork、N.Y.;GamborgおよびPhillips編1995年、PlantCell,TissueandOrganCulture:FundamentalMethods、SpringerLabManual、Springer-VerlagBerlin、Heidelberg、NewYork;ならびにAtlasおよびParks編、TheHandbookofMicrobiologicalMedia1993年、CRCPress、BocaRaton、Fla.が含まれる。核酸を作製する方法例えば、invitroにおける増幅、細胞からの精製、または化学合成を介する、核酸を操作する方法例えば、部位指向変異誘発、制限酵素消化、ライゲーションなどを介する、および核酸を操作し作製するのに有用な多様なベクター、細胞系などは、上記の参考文献に記載されている。加えて、本質的に、任意のポリヌクレオチド例えば、標識化またはビオチン化されたポリヌクレオチドを含めたは、多様な商業的供給源のうちのいずれかから、特注品を注文することもでき、標準品を注文することもできる。したがって、一態様では、本発明が、本発明の抗体またはこれらの部分の組換え発現を可能とする組換え宿主細胞を提供する。本明細書では、このような組換え宿主細胞における発現を介して生成させた抗体を組換え抗体と称する。本発明はまた、このような宿主細胞の後代細胞、およびこのような宿主細胞に生成させた抗体も提供する。本明細書で用いられる組換え宿主細胞または単に、宿主細胞という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を意味する。組換え宿主細胞および宿主細胞とは、特定の対象細胞だけを意味するわけではなく、また、このような細胞の後代も意味することを理解されたい。後続の世代では、変異または環境的影響のために特定の修飾が発生しうるため、このような後代は、実のところ、親細胞と同一ではないが、本明細書で用いられる宿主細胞という用語の範囲内になおも包含される。このような細胞は、上記の通り、本発明によるベクターを含みうる。別の態様では、本発明が、本明細書で記載される抗体またはこれらの部分を作製する方法を提供する。一実施形態によれば、前記方法は、上記のベクターでトランスフェクトまたは形質転換した細胞を培養するステップと、抗体またはこれらの部分を回収するステップとを含む。上記で示した通り、本発明の抗体またはこれらの断片もしくは変異体の発現は、所望の抗Notum抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター複数可を含むことが好ましい。当業者に周知の方法を用いて、抗体のコード配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、invitroにおける組換えDNA法、合成法、およびinvivoにおける遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明の実施形態は、プロモーターに作動可能に連結した本発明の抗Notum抗体例えば、全抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメイン、またはこれらの部分、あるいは重鎖CDRもしくは軽鎖CDR、単鎖Fv、またはこれらの断片もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。好ましい実施形態では、このようなベクターが、抗体分子の重鎖またはその断片をコードするヌクレオチド配列、抗体の軽鎖またはその断片をコードするヌクレオチド配列、または重鎖および軽鎖の両方をコードするヌクレオチド配列を包含しうる。本明細書の教示により本発明のヌクレオチドを単離および改変したら、それらを、抗Notum抗体またはこれらの断片を含めた、選択されたモジュレーターを生成させるのに用いることができる。X.モジュレーターの生成および精製当技術分野で認知された分子生物学法および最新のタンパク質発現法を用いて、実質的な量の所望のモジュレーターを生成させることができる。より具体的に述べると、上記の通りに得られ、かつ、操作される抗体などのモジュレーターをコードする核酸分子を、多様な種類の宿主細胞を含む、周知の市販されるタンパク質生成系に組み込んで、前臨床的な量、臨床的な量、または商業的な量の所望の医薬品をもたらすことができる。好ましい実施形態では、モジュレーターをコードする核酸分子を、選択された宿主細胞への効率的な組込み、およびその後における所望のNotumモジュレーターの高度な発現レベルをもたらすベクターまたは発現ベクターへと操作することが理解されるであろう。モジュレーターの生成には原核生物系を使用し得ることが理解されるが、Notumモジュレーターをコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターを、適切な哺乳動物宿主細胞、植物宿主細胞、細菌宿主細胞、または酵母宿主細胞のトランスフェクションに使用され得ることが好ましい。トランスフェクションは、ポリヌクレオチドを宿主細胞へと導入する任意の公知の方法を介しうる。当技術分野では、異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞へと導入する方法が周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ポリヌクレオチド複数可のリポソームへの封入、およびDNAの核内への直接的なマイクロインジェクションが含まれる。加えて、核酸分子は、ウイルスベクターを介して哺乳動物細胞へ導入することもできる。当技術分野では、哺乳動物細胞を形質転換する方法が周知である。例えば、U.S.P.N4,399,216、同4,912,040、同4,740,461、および同4,959,455を参照されたい。当技術分野ではさらに、例えば、Agrobacterium属を介する形質転換、遺伝子銃による形質転換、直接的な注射、電気穿孔、およびウイルスによる形質転換を含めた、植物細胞を形質転換する方法も周知である。当技術分野ではまた、細菌細胞および酵母細胞を形質転換する方法も周知である。さらに、宿主細胞を、本発明の2つの発現ベクター、例えば、重鎖に由来するポリペプチドをコードする第1のベクター、および軽鎖に由来するポリペプチドをコードする第2のベクターで共トランスフェクトすることができる。2つのベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの実質的に同等な発現を可能とする同一の選択マーカーを含有しうる。代替的に、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、これらを発現させることが可能な単一のベクターを用いることもできる。このような状況では、軽鎖を重鎖の前に配置して、毒性の過剰な遊離重鎖を回避することが好ましい。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAを含む場合もあり、ゲノムDNAを含む場合もある。a.宿主発現系多くは市販されている多様な宿主発現ベクター系が、本明細書の教示に適合可能であり、本発明のモジュレーターを発現させるのに用いることができる。このような宿主発現系は、それを介して目的のコード配列が発現され得、その後精製され得るビヒクルを表すが、また、適切なヌクレオチドのコード配列で形質転換するかまたはトランスフェクトすると、insituで本発明の分子を発現させうる細胞も表す。このような系には、モジュレーターのコード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA発現ベクター、プラスミドDNA発現ベクター、もしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌例えば、E.coli、B.subtilis、Streptomyces属などの微生物、モジュレーターのコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトした酵母例えば、Saccharomyces属、Pichia属、モジュレーターのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター例えば、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞系、モジュレーターのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター例えば、カリフラワーモザイクウイルスであるCaMV、タバコモザイクウイルスであるTMVを感染させるか、もしくはモジュレーターのコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター例えば、Tiプラスミドでトランスフェクトした植物細胞系例えば、Nicotiana属、Arabidopsis属、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、バレイショなど、または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター例えば、メタロチオネインプロモーター、もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター例えば、アデノウイルスの後期プロモーター、ワクシニアウイルスの7.5Kプロモーターを含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系例えば、COS細胞、CHO細胞、BHK細胞、293細胞、3T3細胞が含まれるがこれらに限定されない。細菌系では、多数の発現ベクターを、発現させる分子に意図される使用に応じて有利に選択し得る。例えば、モジュレーターの医薬組成物を作製するために、このようなタンパク質を大量に生成させる場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を誘導するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターには、E.coliによる発現ベクターであるpUR278ベクターRutherら、EMBO1巻、2号:1791頁1983年この場合、コード配列は、融合タンパク質を生成させるように、lacZコード領域とインフレームで、ベクターへと個別にライゲーションすることができる;pINベクターInouyeおよびInouye、NucleicAcidsRes.、13巻:3101~3109頁1985年;VanHeekeおよびSchuster、J.Biol.Chem.、24巻:5503~5509頁1989年などが含まれるがこれらに限定されない。pGEXベクターもまた、外来のポリペプチドを、グルタチオン5-トランスフェラーゼGSTとの融合タンパク質として発現させるのに用いることができる。一般に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへと吸着および結合させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることにより、溶解させた細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から放出されうるように、トロンビンまたは因子Xaのプロテアーゼ切断部位を包含するようにデザインされる。昆虫系では、Autographacalifornicaの核多角体病ウイルスAcNPVを、外来遺伝子を発現させるベクターとして用いることができる。このウイルスは、Spodopterafrugiperda細胞において成長する。コード配列は、このウイルスの非必須領域例えば、ポリヘドリンpolyhedrin遺伝子へと個別にクローニングし、AcNPVプロモーター例えば、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。哺乳動物の宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を用いて、所望のヌクレオチド配列を導入することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、対象のコード配列を、アデノウイルスの転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび3部分tripartiteリーダー配列にライゲーションすることができる。次いで、このキメラ遺伝子を、invitroまたはinvivoにおける組換えを介して、アデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域例えば、E1領域またはE3領域への挿入により、感染させた宿主において生存可能でかつ分子を発現させることが可能な組換えウイルスを結果としてもたらす例えば、LoganおよびShenk、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81巻:355~359頁1984年を参照されたい。特異的な開始シグナルはまた、挿入されたコード配列の効率的な翻訳にも必要とされる場合がある。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。さらに、挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームとインフェーズでなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、由来が多様であることが可能であり、天然および合成のいずれでもありうる。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強することができる例えば、Bittnerら、MethodsinEnzymol.、153巻:51~544頁1987年を参照されたい。こうして、当技術分野では、発現のための宿主として利用可能な適合可能な哺乳動物の細胞系が周知であり、これらには、AmericanTypeCultureCollectionATCCから入手可能な多くの不死化細胞系が含まれる。これらの細胞系には、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、293Freestyle細胞LifeTechnologies、SanDiego、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞COS、ヒト肝細胞がん細胞例えば、HepG2細胞、A549細胞、および他の多数の細胞系が含まれる。組換えタンパク質を長期にわたり高収量で生成するために、安定的発現が好ましい。したがって、当技術分野で認知された標準的な技法を用いて、選択されたモジュレーターを安定的に発現させる細胞系を操作することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などにより制御されるDNAおよび選択マーカーで形質転換することができる。外来DNAを導入した後、操作された細胞を、濃縮した培地中で1~2日間にわたり成長させることができ、次いで、選択培地へと切り替える。組換えプラスミド内の選択マーカーにより、選択に対する耐性が付与され、細胞がプラスミドをそれらの染色体へと安定的に組み込み、成長させて細胞巣fociを形成することが可能となり、今度は、これらをクローニングして、細胞系へと拡大増殖させることができる。この方法は、分子を発現させる細胞系を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞系は、分子と直接的または間接的に相互作用する組成物をスクリーニングし、評価するのに特に有用でありうる。当技術分野では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子Wiglerら、Cell、11巻:223頁1977年、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子SzybalskaおよびSzybalski、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、48巻:202頁1992年、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子Lowyら、Cell、22巻:8~17頁1980年が含まれるがこれらに限定されない、多数の選択系が周知であり、これらを用いることが可能であり、それぞれ、tk-細胞、hgprt-細胞、またはaprt-細胞において用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性も、以下の遺伝子:メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子Wiglerら、Natl.Acad.Sci.USA、77巻:357頁1980年:O’Hareら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78巻:1527頁1981年;ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt遺伝子MulliganおよびBerg、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78巻:2072頁1981年;アミノグリコシドであるG-418に対する耐性を付与するneo遺伝子ClinicalPharmacy、12巻:488~505頁;WuおよびWu、Biotherapy、3巻:87~95頁1991年;Tolstoshev、Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.、32巻:573~596頁1993年;Mulligan、Science、260巻:926~932頁1993年;ならびにMorganおよびAnderson、Ann.Rev.Biochem.、62巻:191~217頁1993年;TIBTECH、11巻5号:155~215頁1993年5月;およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro遺伝子Santerreら、Gene、30巻:147頁1984年についての選択の基盤として用いることができる。組換えDNA法の当技術分野で一般に公知の方法を日常的に適用して所望の組換えクローンを選択することができ、このような方法は、例えば、Ausubelら編、CurrentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileySons、NY1993年;Kriegler、GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual、StocktonPress、NY1990年;ならびにDracopoliら編、CurrentProtocolsinHumanGenetics、JohnWileySons、NY1994年、12および13章;Colberre-Garapinら、J.Mol.Biol.、150巻:1頁1981年において記載されている。安定で高収量の細胞系を確立するのに特に好ましい1つの方法は、特定の条件下における発現を増強するための効率的な手法をもたらすグルタミンシンターゼ遺伝子発現系GS系を含むことが理解されるであろう。GS系は、それらの各々が参考として本明細書に援用される、EP特許第0216846号、同第0256055号、同第0323997号、および同第0338841号との関連で、全体的または部分的に論じられる。加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特異的な形で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株も、選択することができる。タンパク質生成物のこのような修飾例えば、グリコシル化およびプロセシング例えば、切断は、タンパク質の機能および/または精製に重要でありうる。異なる宿主細胞は、翻訳後におけるタンパク質および遺伝子産物をプロセシングおよび修飾するための特徴的で特異的な機構を有する。発現させたポリペプチドの所望の修飾およびプロセシングを確実にするように、当技術分野で公知の適切な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的のためには、一次転写物の適正なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を保有する真核生物の宿主細胞が、本発明で用いるのに特に有効である。したがって、特に好ましい哺乳動物宿主細胞には、CHO細胞、VERY細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞、NS0細胞、MDCK細胞、293細胞、3T3細胞、W138細胞のほか、例えば、BT483細胞、Hs578T細胞、HTB2細胞、BT2O細胞、およびT47D細胞などの乳がん細胞系、ならびに、例えば、CRL7O3O細胞およびHsS78Bst細胞などの正常乳腺細胞系が含まれるがこれらに限定されない。モジュレーターおよび選択された生成系に応じて、当業者は、モジュレーターの効率的な発現に適切な宿主細胞を容易に選択および最適化することができる。b.化学合成前述の宿主細胞系に加え、当技術分野で公知の技法例えば、Creighton、1983年、Proteins:StructuresandMolecularPrinciples、W.H.FreemanCo.、N.Y.;およびHunkapiller,M.ら、1984年、Nature、310巻:105~111頁を参照されたいを用いて、本発明のモジュレーターを化学合成しうることが理解されるであろう。例えば、本発明のポリペプチド断片に対応するペプチドは、ペプチド合成器を用いることにより合成することができる。さらに、所望の場合は、非古典的アミノ酸または化学的なアミノ酸類似体を、ポリペプチド配列への置換または付加として導入することもできる。非古典的アミノ酸には、一般的なアミノ酸のD異性体、2,4-ジアミノ酪酸、a-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、g-Abu、e-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、b-アラニン、フルオロアミノ酸、b-メチルアミノ酸、Ca-メチルアミノ酸、Na-メチルアミノ酸、およびアミノ酸類似体などのデザイナーアミノ酸designeraminoacidが一般に含まれるがこれらに限定されない。さらに、アミノ酸は、D右旋性アミノ酸の場合もあり、L左旋性アミノ酸の場合もある。c.トランスジェニック系本発明のNotumモジュレーターはまた、目的の免疫グロブリン重鎖配列および免疫グロブリン軽鎖配列またはそれらの断片もしくは誘導体もしくは変異体についてトランスジェニックである哺乳動物または植物の生成、ならびに回収可能な形態にある所望の化合物の生成を介してトランスジェニック的に生成させることもできる。哺乳動物におけるトランスジェニック的な生成と関連して、抗Notum抗体を、例えば、ヤギ、ウシ、または他の哺乳動物の乳汁中に生成させ、この乳汁から回収することができる。例えば、U.S.P.N.5,827,690、同5,756,687、同5,750,172、および同5,741,957を参照されたい。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を、上記の通りに、Notumまたはその免疫原性部分で免疫化する。植物において抗体を作製する方法は、例えば、U.S.P.N.6,046,037および同5,959,177において記載されている。本明細書の教示に従い、標準的なトランスジェニック技術を介して、本発明のNotumモジュレーターをコードする1または複数の核酸分子を動物または植物へと導入することにより、非ヒトトランスジェニック動物または非ヒトトランスジェニック植物を作製することができる。Hoganおよび米国特許第6,417,429号を参照されたい。トランスジェニック動物を作製するのに用いられるトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞の場合もあり、体細胞の場合もあり、受精卵の場合もある。非ヒトトランスジェニック生物は、キメラヘテロ接合体、非キメラヘテロ接合体、および非キメラホモ接合体でありうる。例えば、Hoganら、ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual、2版、ColdSpringHarborPress1999年;Jacksonら、MouseGeneticsandTransgenics:APracticalApproach、OxfordUniversityPress2000年;およびPinkert、TransgenicAnimalTechnology:ALaboratoryHandbook、AcademicPress1999年を参照されたい。、一部の実施形態では、例えば、目的の重鎖および/または軽鎖をコードする標的化構築物により非ヒトトランスジェニック動物に、標的化された破壊および置換を施す。一実施形態では、トランスジェニック動物が、Notumに特異的に結合する重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含み、発現させる。抗Notum抗体は、任意のトランスジェニック動物において作製され得るが、特に好ましい実施形態では、ヒト以外の動物が、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマである。さらなる実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物が、血液、乳汁、尿、唾液、涙液、粘液、および他の体液中に所望の医薬品を発現し、この医薬品は、当技術分野で認知された精製技術を用いて容易に得ることができる。異なる細胞系を介して、またはトランスジェニック動物において発現させた抗体を含めたモジュレーターは、互いと異なるグリコシル化パターンを有する可能性が高い。しかし、本明細書で示される核酸分子によりコードされるか、または本明細書で示されるアミノ酸配列を含む全てのモジュレーターは、分子のグリコシル化状態に関わらず、かつ、より一般的に述べると、翻訳後修飾複数可の存在または非存在に関わらず、本発明の一部である。加えて、本発明は、翻訳時または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解による切断、抗体分子または他の細胞のリガンドなどへの結合により異なって修飾されたモジュレーターも包含する。臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4、アセチル化、ホルミル化、酸化、低減、ツニカマイシンなどの存在下における代謝合成を介する特異的な化学的切断が含まれるがこれらに限定されない公知の技法により、多数の化学的修飾のうちのいずれかを実施することができる。本発明にはまた、例えば、N結合炭水化物鎖またはO結合炭水化物鎖、N末端またはC末端のプロセシング、化学的部分のアミノ酸骨格への結合、N結合炭水化物鎖またはO結合炭水化物鎖の化学的修飾、および原核宿主細胞の発現の結果としてのN末端メチオニン残基の付加または欠失が含まれる、多様な翻訳後修飾も包含される。さらに、本文および以下の実施例に示される通り、ポリペプチドはまた、酵素的標識、蛍光標識、放射性同位元素標識、または親和性標識など、モジュレーターの検出および単離を可能とする検出用標識により修飾することもできる。d.精製本発明のモジュレーターを、組換え発現または本明細書で開示される他の技法のうちのいずれか1つを介して生成させたら、これを、免疫グロブリンを精製するための、当技術分野において公知である任意の方法により精製することもでき、より一般的に述べると、タンパク質を精製するための他の任意の標準的な技法により精製することもできる。この点では、モジュレーターを単離することができる。本明細書で用いられる、単離されたNotumモジュレーターとは、その天然環境の成分から同定および分離され、かつ/またはその天然環境の成分から回収されたNotumモジュレーターである。その天然環境の夾雑成分とは、ポリペプチドの診断的使用または治療的使用に干渉する物質であり、これらには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が含まれうる。単離されたモジュレーターには、ポリペプチドの天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内でinsituのモジュレーターが含まれる。組換え技術を用いる場合は、Notumモジュレーター例えば、抗Notum抗体またはその誘導体もしくは断片を細胞内で生成させることもでき、細胞膜周辺腔内で生成させることもでき、培地へと直接分泌させることもできる。所望の分子を、第1のステップとして細胞内で生成させる場合、粒子状残渣である宿主細胞または溶解させた断片のいずれかを、例えば、遠心分離または限外濾過を介して除去することができる。例えば、Carterら、Bio/Technology、10巻:163頁1992年は、E.coliの細胞膜周辺腔へと分泌される抗体を単離する手順について記載している。略述すると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウムpH3.5、EDTA、およびフェニルメチルスルホニルフルオリドPMSFの存在下において約30分間にわたり解凍する。細胞残渣は、遠心分離を介して除去することができる。抗体を培地中に分泌させる場合は一般にまず、このような発現系に由来する上清を、市販されるタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMilliporePelliconによる限外濾過ユニットを用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を前出のステップのうちのいずれかに含ませてタンパク質分解を阻害し、抗生剤を含めて外来性の夾雑物の成長を防止することができる。細胞から調製したモジュレーター例えば、Fc-Notumまたは抗Notum抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができるが、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製法である。親和性リガンドとしてのプロテインAの適性は、選択された構築物内に存在する任意の免疫グロブリンFcドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインAを用いて、ヒトIgG1重鎖、ヒトIgG2重鎖、またはヒトIgG4重鎖に基づく抗体を精製することができるLindmarkら、JImmunolMeth、62巻:1頁1983年。全てのマウスアイソタイプおよびヒトIgG3Gussら、EMBOJ、5巻:1567頁1986年には、プロテインGが推奨される。親和性リガンドを結合させるマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。細孔制御ガラスまたはポリスチレンジビニルベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースにより達成されるより迅速な流量および短い処理時間を可能とする。抗体がCH3ドメインを含む場合は、BakerbondABX商標樹脂J.T.Baker、Phillipsburg、N.J.が、精製に有用である。イオン交換カラムによる画分化、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンによるクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂またはカチオン交換樹脂によるセファロースクロマトグラフィーポリアスパラギン酸カラムなど、等電点電気泳動chromatofocusing、SDS-PAGEおよび硫酸アンモニウム沈殿など、タンパク質を精製するための他の技法もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターを、少なくとも部分的に、プロテインAまたはプロテインGによる親和性クロマトグラフィーを用いて精製する。XI.コンジュゲートしたNotumモジュレーター本発明のモジュレーターを、本明細書の教示により精製したら、それらを、薬学的に活性な部分もしくは診断用部分または生体適合性の修飾剤と連結することもでき、これに融合させることもでき、これにコンジュゲートする例えば、共有結合による場合もあり、非共有結合による場合もあることもでき、これと他の形で会合させることもできる。本明細書で用いられるコンジュゲートという用語は、広く用いられ、会合の方法に関わらず、開示されるモジュレーターと会合している任意の分子を意味すると考えられる。この点では、このようなコンジュゲートが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、核酸分子、低分子、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子、および放射性同位元素を含みうることが理解される。さらに、上記で示した通り、選択されたコンジュゲートは、共有結合によりモジュレーターに連結することもでき、非共有結合によりモジュレーターに連結することもでき、コンジュゲーションを実施するのに用いられる方法に少なくとも部分的に依存して多様なモル比を呈示する。好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターを、選択された特徴例えば、生体毒素、バイオマーカー、精製用タグなどを付与するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとコンジュゲートするかまたは会合させうることが明らかであろう。より一般的に述べると、選択された実施形態では、本発明が、異種タンパク質または異種ポリペプチドへと組換えにより融合させるかまたは化学的にコンジュゲートした共有結合的なコンジュゲーションおよび非共有結合的なコンジュゲーションの両方を含めたモジュレーターまたはその断片の使用であって、ポリペプチドが、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または少なくとも100アミノ酸を含む使用を包含する。構築物は、必ずしも直接連結する必要はないが、リンカー配列を介して発生させることができる。例えば、本発明のモジュレーターを、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合させるかまたはコンジュゲートすることにより、抗体を用いて、invitroまたはinvivoにおいて、Notumを発現させる特定の細胞型を、異種ポリペプチドの標的とすることができる。さらに、異種ポリペプチドに融合させるかまたはコンジュゲートしたモジュレーターはまた、invitroにおけるイムノアッセイでも用いることができ、当技術分野で公知の精製方法と適合可能でありうる。例えば、国際公開第WO93/21232号;欧州特許第EP439,095号;Naramuraら、1994年、Immunol.Lett.、39巻:91~99頁;米国特許第5,474,981号;Gilliesら、1992年、PNAS、89巻:1428~1432頁;およびFellら、1991年、J.Immunol.、146巻:2446~2452頁を参照されたい。a.生体適合性の修飾剤好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターを、モジュレーターの特徴を所望の通りに調整するか、変化させるか、改善するか、または調節するのに使用され得る生体適合性の修飾剤とコンジュゲートすることもでき、これと他の形で会合させることもできる。例えば、invivoにおける半減期を延長した抗体または融合構築物は、市販されるポリエチレングリコールPEGまたは類似の生体適合性ポリマーなど、比較的分子量の大きなポリマー分子を結合させることにより生成させることができる。当業者は、PEGが、抗体に特定の特性を付与する例えば、半減期を調整しうるように選択しうる、多くの異なる分子量および分子構成で取得し得ることを理解するであろう。PEGは、多官能性リンカーを伴うかまたは伴わずに、PEGの、前記抗体または抗体断片のN末端またはC末端への部位特異的コンジュゲーションを介してモジュレーターまたは抗体断片もしくは抗体誘導体に結合させることもでき、リシン残基に存在するイプシロン-アミノ基を介してモジュレーターまたは抗体断片もしくは抗体誘導体に結合させることもできる。結果として生物学的活性の喪失を最小限とする、直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化を用いることができる。コンジュゲーションの程度を、SDS-PAGEおよび質量分析により緊密にモニタリングして、PEG分子の抗体分子への最適のコンジュゲーションを確実にすることができる。反応しなかったPEGは、例えば、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを介して、抗体-PEGコンジュゲートから分離することができる。同様に、抗体または抗体断片をinvivoにおいてより安定とするか、またはそのinvivoにおける半減期を延長するために、開示されるモジュレーターを、アルブミンにコンジュゲートすることもできる。その技法は当技術分野において周知であり、例えば、国際公開第WO93/15199号、同第WO93/15200号、および同第WO01/77137号、ならびに欧州特許第0413,622号を参照されたい。他の生体適合性コンジュゲートは、当業者に明らかであり、本明細書の教示に従い容易に同定することができる。b.診断剤または検出剤他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレーター、またはその断片もしくは誘導体を、生物学的分子例えば、ペプチドまたはヌクレオチドの場合もあり、低分子の場合もあり、放射性同位元素の場合もある診断剤または検出用薬剤にコンジュゲートする。このようなモジュレーターは、過剰増殖性障害の発症もしくは進行をモニタリングするのに有用な場合もあり、開示されるモジュレーターを含めた特定の療法の有効性を決定する臨床試験手順の一部として有用な場合もある。このようなマーカーはまた、選択されたモジュレーターを精製するのに有用な場合もあり、TICを分離または単離するのに有用な場合もあり、前臨床手順または毒性研究において有用な場合もある。このような診断および検出は、モジュレーターを、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンステラーゼを含む多様な酵素;ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子群;ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ロダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光物質;ルミノールなどであるがこれらに限定されない発光物質;ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクォリンなどであるがこれらに限定されない生物発光物質;ヨウ素131I、125I、123I、121I、炭素14C、硫黄35S、トリチウム3H、インジウム115In、113In、112In、111In、およびテクネチウム99Tc、タリウム201Ti、ガリウム68Ga、67Ga、パラジウム103Pd、モリブデン99Mo、キセノン133Xe、フッ素18F、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、および117Tinなどであるがこれらに限定されない放射性物質;多様な陽電子放出断層撮影において用いられる陽電子放出金属、非放射性の常磁性金属イオン、および放射性標識されたか、または特異的な放射性同位元素にコンジュゲートされた分子が含まれるがこれらに限定されない検出可能な物質に連結することにより達成することができる。このような実施形態では、適切な検出方法が、当技術分野において周知であり、多数の商業的供給源から容易に入手可能である。上記で示した通り、他の実施形態では、モジュレーターまたはその断片を、ペプチドまたはフルオロフォアなどのマーカー配列に融合させて、免疫組織化学またはFACなどの精製手順または診断手順を容易にする。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列が、それらのうちの多くが市販されている、とりわけ、pQEベクターQiagenにおいてもたらされるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。例えば、Gentzら、1989年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻:821~824頁において記載されている通り、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニンHAタグWilsonら、1984年、Cell、37巻:767頁およびflagタグU.S.P.N.4,703,004が含まれるがこれらに限定されない。c.治療用部分既に示唆した通り、モジュレーターまたはそれらの断片もしくは誘導体はまた、細胞毒素もしくは細胞傷害性剤、例えば、細胞増殖抑制剤もしくは殺細胞剤、治療剤、または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体もしくはベータ放射体などの治療用部分とコンジュゲートすることもでき、これと連結することもでき、これに融合させることもでき、これと他の形で会合させることもできる。本明細書で用いられる細胞毒素または細胞傷害性剤には、細胞に有害であり、細胞の成長または生存を阻害しうる、任意の薬剤または治療用部分が含まれる。例には、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、DM-1およびDM-4Immunogen,Inc.などのメイタンシノイド、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、ならびにシクロホスファミドおよびその類似体または同族化合物が含まれる。さらなる細胞毒素は、モノメチルアウリスタチンEMMAEおよびモノメチルアウリスタチンFMMAFSeattleGenetics,Inc.を含めたアウリスタチン、アルファ-アマニチン、ベータ-アマニチン、ガンマ-アマニチン、またはイプシロン-アマニチンHeidelbergPharmaAGなどのアマニチン、デュオカルマイシン誘導体Syntarga,B.V.などのDNA副溝結合剤、ならびに改変ピロロベンゾジアゼピン二量体PBD:Spirogen,Ltdを含む。さらに、一実施形態では、本発明のNotumモジュレーターを、抗CD3結合分子と会合させて、細胞傷害性T細胞を動員し、それらに腫瘍始原細胞を標的とさせることができるBiTE法;例えば、参考として本明細書に援用される、Fuhrmann,S.ら、AnnualMeetingofAACR、抄録5625号2010年を参照されたい。さらなる適合可能な治療的部分には、代謝拮抗物質例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、ダカルバジンdecarbazine、アルキル化剤例えば、メクロレタミン、チオテパthioepa、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチンBCNU、およびロムスチンCCNU、シクロホスファミドcyclothosphamide、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金IIDDPであるシスプラチン、アントラサイクリン例えば、ダウノルビシン旧称:ダウノマイシンおよびドキソルビシン、抗生剤例えば、ダクチノマイシン旧称:アクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシンAMC、および抗有糸分裂剤例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチンが含まれるがこれらに限定されない細胞傷害性剤が含まれる。治療用部分についてのより広範なリストは、それらの各々が参考として本明細書に援用される、PCT公開第WO03/075957号およびU.S.P.N.2009/0155255において見出すことができる。選択されたモジュレーターはまた、放射性金属イオン上記を参照されたい:例えば、放射性物質の放射性金属イオンをコンジュゲートするのに有用な放射性物質または大環状キレート化剤macrocyclicchelatorなどの治療用部分にコンジュゲートすることもできる。特定の実施形態では、大環状キレート化剤が、リンカー分子を介して抗体に結合させうる、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N’,N’’,N’’-テトラ酢酸DOTAである。このようなリンカー分子は一般に、当技術分野で公知であり、Denardoら、1998年、ClinCancerRes.、4巻:2483頁;Petersonら、1999年、Bioconjug.Chem.、10巻:553頁;およびZimmermanら、1999年、Nucl.Med.Biol.、26巻:943頁において記載されている。本発明のこの態様と適合可能であり得る例示的な放射性同位元素には、ヨウ素131I、125I、123I、121I、炭素14C、銅62Cu、64Cu、67Cu、硫黄35S、トリチウム3H、インジウム115In、113In、112In、111In、ビスマス212Bi、213Bi、テクネチウム99Tc、タリウム201Ti、ガリウム68Ga、67Ga、パラジウム103Pd、モリブデン99Mo、キセノン133Xe、フッ素18F、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Tin、225Ac、76Br、および211Atが含まれるがこれらに限定されない。また、他の放射性核種、とりわけ、エネルギー範囲を60~4,000keVとする放射性核種も、診断剤および治療剤として利用可能である。処置される状態および所望の治療プロファイルに応じて、当業者は、開示されるモジュレーターと共に用いるのに適する放射性同位元素を容易に選択することができる。本発明のNotumモジュレーターはまた、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物へとコンジュゲートすることもできる。すなわち、本発明と適合可能な治療剤または治療用部分は、古典的な化学的治療剤に限定されるとはみなされない。例えば、特に好ましい実施形態では、薬物部分が、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドもしくはその断片でありうる。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンA、Onconaseまたは別の細胞傷害性RNase、シュードモナス属の外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素;腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス性因子apoptoticagent、例えば、TNF-α、TNF-β、AIMI国際公開第WO97/33899号を参照されたい、AIMII国際公開第WO97/34911号を参照されたい、FasリガンドTakahashiら、1994年、J.Immunol.、6巻:1567頁、およびVEGI国際公開第WO99/23105号を参照されたいなどのタンパク質、血栓剤thromboticagentもしくは抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン;または、例えば、リンホカイン例えば、インターロイキン1IL-1、インターロイキン2IL-2、インターロイキン6IL-6、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、および顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、もしくは増殖因子例えば、成長ホルモンGHなどの生物学的応答修飾剤が含まれうる。上記で示した通り、モジュレーターをポリペプチド部分へと融合させるかまたはコンジュゲートする方法は、当技術分野において公知である。既に開示した対象の参考文献に加えて、例えば、それらの各々が参考として本明細書に援用される、U.S.P.N.5,336,603、同5,622,929、同5,359,046、同5,349,053、同5,447,851、および同5,112,946;EP307,434;EP367,166;PCT公開第WO96/04388号および同第WO91/06570号;Ashkenaziら、1991年、PNASUSA、88巻:10535頁;Zhengら、1995年、JImmunol、154巻:5590頁;ならびにVilら、1992年、PNASUSA、89巻:11337頁を参照されたい。モジュレーターの部分との会合は、必ずしも直接的な会合である必要はなく、リンカー配列を介して発生させることができる。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、それらの各々が本明細書に援用される、Denardoら、1998年、ClinCancerRes、4巻:2483頁;Petersonら、1999年、BioconjugChem、10巻:553頁;Zimmermanら、1999年、NuclMedBiol、26巻:943頁;Garnett、2002年、AdvDrugDelivRev、53巻:171頁において記載されている。より一般的に述べると、治療用部分または細胞傷害性剤をモジュレーターへとコンジュゲートする技法は周知である。アルデヒド/シッフ結合、スルフヒドリル結合、酸に不安定な結合、cis-アコニチル結合、ヒドラゾン結合、酵素分解性結合が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で認知された任意の方法を介して、部分を、モジュレーターへとコンジュゲートすることができる一般に、Garnett、2002年、AdvDrugDelivRev、53巻:171頁を参照されたい。また、例えば、Amonら、MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy、MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy、Reisfeldら編、243~56頁AlanR.Liss,Inc.、1985年;Hellstromら、AntibodiesForDrugDelivery、ControlledDrugDelivery2版、Robinsonら編、623~53頁MarcelDekker,Inc.、1987年;Thorpe、AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview、MonoclonalAntibodies’84:BiologicalAndClinicalApplication、Pincheraら編、475~506頁1985年;Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy、MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy、Baldwinら編、303~16頁AcademicPress、1985年、およびThorpeら、1982年、Immunol.Rev.、62巻:119頁も参照されたい。好ましい実施形態では、治療用部分または細胞傷害性剤にコンジュゲートさせたNotumモジュレーターは、細胞表面と会合したNotum分子への結合時に細胞によって内部移行され得、これにより、治療用ペイロードを送達することができる。XII.診断およびスクリーニング示される通り、本発明は、過剰増殖性障害を検出または診断する方法、および患者に由来する細胞をスクリーニングして腫瘍始原細胞を同定する方法を提供する。このような方法は、処置のためにがんを有する個体を同定するステップ、またはがんの進行をモニタリングするステップを包含し、患者から得られる試料を、本明細書で記載されるNotumモジュレーターと接触させること、およびモジュレーターの、試料中の結合したNotumもしくは遊離Notumとの会合の存在もしくは非存在、またはモジュレーターの、試料中の結合したNotumもしくは遊離Notumとの会合のレベルを検出することを含む。モジュレーターが、抗体またはその免疫学的に活性な断片を含む場合は、試料中のNotumとの会合が、この試料が、腫瘍永続細胞例えば、がん幹細胞を含有しうることを示すことから、がんを有する個体を、本明細書で記載されるNotumモジュレーターで有効に処置しうることが示される。方法は、結合レベルを対照と比較するステップをさらに含みうる。逆に、選択されたモジュレーターが、Fc-Notumである場合は、所望の情報をもたらす試料と接触させて、本明細書で記載される分子の酵素的特性をモニタリングすることができる直接的な場合もあり、間接的な場合もある。本明細書の教示と適合可能な他の診断法は、当技術分野において周知であり、専用のレポーティング系など、市販の物質を用いて実施することができる。例示的な適合可能なアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、競合的結合アッセイ、蛍光免疫アッセイ、免疫ブロットアッセイ、ウェスタンブロット解析、フローサイトメトリーアッセイ、およびELISAアッセイが含まれる。より一般的に述べると、生物学的試料におけるNotumの検出またはNotumの酵素活性またはその阻害の測定は、当技術分野で公知の任意のアッセイを用いて達成することができる。別の態様では、そして、以下でより詳細に論じられる通り、本発明は、過剰増殖性障害を検出するか、モニタリングするか、もしくは診断するか、このような障害を有する個体を処置の可能性について同定するか、または患者における障害の進行または後退をモニタリングするためのキットであって、本明細書で記載されるモジュレーターおよびモジュレーターの試料に対する影響を検出するための試薬を含むキットを提供する。Notumモジュレーター、ならびにそれらの後代を含めた、Notumモジュレーターを含む細胞、培養物、集団、および組成物はまた、Notum例えば、Notumポリペプチドまたはその遺伝的構成要素と相互作用することにより腫瘍始原細胞またはそれらの後代の機能または活性に影響を及ぼす化合物または薬剤例えば、薬物についてスクリーニングするかまたはこれらを同定するのにも用いることができる。したがって、本発明は、Notumまたはその基質と会合することを介して、腫瘍始原細胞またはそれらの後代の機能または活性に影響を及ぼしうる化合物または薬剤を評価または同定するためのシステムおよび方法をさらに提供する。このような化合物および薬剤は、例えば、過剰増殖性障害の処置についてスクリーニングされる候補薬物でありうる。一実施形態では、システムまたは方法が、Notumを呈示する腫瘍始原細胞および化合物または薬剤例えば、薬物を包含し、細胞および化合物または薬剤例えば、薬物を互いと接触させる。本発明は、腫瘍始原細胞または後代細胞の活性または機能を変化させるためのNotumモジュレーターまたは薬剤および化合物をスクリーニングおよび同定する方法をさらに提供する。一実施形態では、方法が、腫瘍始原細胞またはそれらの後代を、被験薬剤または被験化合物と接触させるステップと、被験薬剤または被験化合物により、Notum腫瘍始原細胞の活性または機能が調節されるかどうかを決定するステップとを包含する。集団内のこのような腫瘍始原細胞またはそれらの後代のNotumと関連する活性または機能を調節する被験薬剤または被験化合物により、被験薬剤または被験化合物が活性薬剤であるものとして同定される。調節されうる例示的な活性または機能には、細胞形態の変化、マーカーの発現、分化または脱分化、成熟、増殖、生存能力、ニューロン前駆細胞またはそれらの後代のアポトーシスまたは細胞死が含まれる。細胞もしくは細胞培養物、または方法ステップ、または処置に言及して用いられる接触させるステップとは、組成物例えば、Notum細胞またはNotum細胞培養物と言及される別の実体との間の直接的または間接的な相互作用を意味する。直接的相互作用の具体例は、物理的相互作用である。間接的相互作用の具体例は、組成物が中間的な分子に作用し、これが言及される実体例えば、細胞または細胞培養物に作用する場合である。本発明のこの態様では、調節するということが、本発明の腫瘍始原細胞または後代細胞の特定の態様例えば、転移または増殖に関連していることが決定されている細胞活性または機能に対する効果の検出と適合可能な形で腫瘍始原細胞または後代細胞の活性または機能に影響を及ぼすことを示す。例示的な活性および機能には、形態の測定、発生マーカー、分化、増殖、生存能力、細胞の呼吸、ミトコンドリア活性、膜の完全性、または特定の条件と関連するマーカーの発現が含まれるがこれらに限定されない。したがって、腫瘍始原細胞または後代細胞を、化合物または薬剤と接触させ、腫瘍始原細胞または後代細胞の活性または機能に対する、本明細書で開示されているか、または当業者に公知である任意の調節を測定することにより、化合物または薬剤例えば、候補薬物を、このような細胞または後代細胞に対するその効果について評価することができる。薬剤および化合物をスクリーニングして同定する方法には、場合によって、所定の位置またはアドレスに位置付けまたは配置された細胞アレイ例えば、マイクロアレイを含む、ハイスループットスクリーニングに適する方法が含まれる。ハイスループットのロボット式または手作業の方法により、化学的相互作用をプローブし、短時間で多くの遺伝子の発現レベルを決定することができる。分子シグナル例えば、フルオロフォアおよび超高速で情報を処理する自動式解析を用いる技法が開発されている例えば、Pinhasovら、Comb.Chem.HighThroughputScreen.、7巻:133頁2004年を参照されたい。例えば、マイクロアレイ法は、特異的な遺伝子についての情報をもたらす一方で、数千にわたる遺伝子の相互作用を一度にプローブするのに広範にわたり用いられている例えば、MocellinおよびRossi、Adv.Exp.Med.Biol.、593巻:19頁2007年を参照されたい。このようなスクリーニング法例えば、ハイスループットにより、活性薬剤および活性化合物を迅速かつ効率的に同定することができる。例えば、細胞は、培養ディッシュ、培養チューブ、培養フラスコ、培養ローラーボトル、または培養プレート例えば、8、16、32、64、96、384、および1536ウェルのマルチウェルプレートまたはマルチウェルディッシュなど、単一のマルチウェルプレートまたはマルチウェルディッシュの、場合によって、潜在的な治療用分子を同定するための規定された位置に位置づけるまたは配置あらかじめ播種することができる。スクリーニングされうるライブラリーには、例えば、小分子ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、完全ヒト抗体用酵母ディスプレイライブラリーAdimab,LLC、siRNAライブラリー、およびアデノウイルスによるトランスフェクションベクターが含まれる。XIII.医薬調製物および治療的使用a.処方物および投与経路任意選択の任意のコンジュゲートを伴うモジュレーターの形態、意図される送達方式、処置またはモニタリングされる疾患、および他の多数の変数に応じ、当技術分野で認知された技法を用いて、本発明の組成物を、所望の通りに処方することができる。すなわち、本発明の多様な実施形態では、Notumモジュレーターを含む組成物を、多種多様な薬学的に許容される担体とともに処方する例えば、Gennaro、Remington:TheScienceandPracticeofPharmacywithFactsandComparisons:DrugfactsPlus、20版2003年;Anselら、PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems、7版、LippincottWilliamsandWilkins2004年;Kibbeら、HandbookofPharmaceuticalExcipients、3版、PharmaceuticalPress2000年を参照されたい。ビヒクル、アジュバント、および希釈剤が含まれる、多様な薬学的に許容される担体は、多数の商業的供給源から容易に入手可能である。さらにまた、pH調整剤および緩衝剤、張度調整剤、安定化剤、湿潤剤など、薬学的に許容される補助物質一式も入手可能である。特定の非限定的な例示的担体には、生理食塩液、緩衝生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せが含まれる。より具体的に述べると、一部の実施形態では、本発明の治療用組成物を、他の成分を伴わずに投与することもでき、最小限のさらなる成分と共に投与することもできることが理解されるであろう。逆に、場合によって、本発明のNotumモジュレーターを、当技術分野において周知であり、モジュレーターの投与を容易にする比較的不活性な物質であるか、または活性化合物を、作用部位へと送達するのに薬学的に最適化された調製物へと加工する一助となる賦形剤および補助剤を含む、薬学的に許容される適切な担体を含有するように処方することもできる。例えば、賦形剤は、形態またはコンシステンシーをもたらす場合もあり、モジュレーターの薬物動態を改善する希釈剤として作用する場合もある。適切な賦形剤には、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧モル濃度を変化させる塩、封入剤、緩衝剤、ならびに皮膚浸透増強剤が含まれるがこれらに限定されない。全身投与用に開示されるモジュレーターは、経腸投与用に処方することもでき、非経口投与用に処方することもでき、局所投与用に処方することもできる。実際、3種類の処方物全てを同時に用いて、有効成分の全身投与を達成することができる。非経口薬物送達用および経口薬物送達用の賦形剤ならびに処方物は、Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy、20版、MackPublishing2000年に示されている。非経口投与に適する処方物には、水溶性形態にある活性化合物の水溶液、例えば、水溶性の塩が含まれる。加えて、油性の注射用懸濁液に適するものとしての活性化合物の懸濁液も投与することができる。適切な親油性溶媒または親油性媒体には、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドが含まれる。水性の注射用懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質を含有することが可能であり、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランが含まれる。場合によって、懸濁液はまた、安定化剤も含有する。リポソームはまた、細胞内への送達のための薬剤を封入するのにも用いることができる。経腸投与に適する処方物には、硬質ゼラチンカプセルもしくは軟質ゼラチンカプセル、丸薬、コーティングされた錠剤を含めた錠剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、または吸入剤、およびこれらの制御放出形態が含まれる。一般に、Notumモジュレーターを含む本発明の化合物および組成物は、経口経路、静脈内経路、動脈内経路、皮下経路、非経口経路、鼻腔内経路、筋肉内経路、心内経路、脳室内経路、気管内経路、口腔内経路、直腸内経路、腹腔内経路、皮内経路、局所経路、経皮経路、および髄腔内経路、またはこれら以外では、植込みもしくは吸入を介する経路が含まれるがこれらに限定されない多様な経路を介して、invivoにおいてそれを必要とする被験体に投与することができる。対象の組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、浣腸、注射、吸入剤、およびエアゾールが含まれるがこれらに限定されない、固体形態、半固体形態、液体形態、または気体形態の調製物へと調合することができる。適切な処方物および投与経路は、意図される適用および治療レジメンにより選択することができる。b.投与量同様に、特定の投与レジメン、すなわち、投与量、タイミング、および反復は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。半減期などの経験的な検討事項は一般に、投与量の決定に寄与する。投与頻度は、療法期間にわたり決定および調整することができ、腫瘍始原細胞を含めた過剰増殖性細胞もしくは新生物性細胞の数の低減、このような新生物性細胞の低減の維持、新生物性細胞の増殖の低減、または転移の発生の遅延に基づく。代替的に、対象の治療用組成物の連続的な持続放出処方物も適切でありうる。上記で示唆した通り、当技術分野では、持続放出を達成するための多様な処方物およびデバイスが公知である。治療的観点から述べると、医薬組成物は、特定の適応を処置または予防するのに有効な量で投与する。治療有効量は、典型的に、処置される被験体の体重、被験体の身体状態もしくは健康状態、処置される状態の広がり、または処置される被験体の年齢に依存する。一般に、本発明のNotumモジュレーターを、1用量当たり体重1kg当たり約10μg~体重1kg当たり約100mgの範囲の量で投与することができる。特定の実施形態では、本発明のNotumモジュレーターを、1用量当たり体重1kg当たり約50μg~体重1kg当たり約5mgの範囲の量で投与することができる。特定の他の実施形態では、本発明のNotumモジュレーターを、1用量当たり体重1kg当たり約100μg~体重1kg当たり約10mgの範囲の量で投与することができる。場合によって、本発明のNotumモジュレーターを、1用量当たり体重1kg当たり約100μg~体重1kg当たり約20mgの範囲の量で投与することができる。さらに場合によって、本発明のNotumモジュレーターを、1用量当たり体重1kg当たり約0.5mg~体重1kg当たり約20mgの範囲の量で投与することができる。本発明の化合物が提供される特定の実施形態では、少なくとも体重1kg当たり約100μg、少なくとも体重1kg当たり約250μg、少なくとも体重1kg当たり約750μg、少なくとも体重1kg当たり約3mg、少なくとも体重1kg当たり約5mg、少なくとも体重1kg当たり約10mgの用量を投与する。他の投与レジメンは、参照によりその全体において本明細書に援用される、U.S.P.N.7,744,877において開示されている通り、体表面積BSAの計算に基づき予測することができる。当技術分野において周知の通り、BSAは、患者の身長および体重を用いて計算され、患者の身体の表面積により表される被験体のサイズの尺度をもたらす。本発明の選択された実施形態では、BSAを用いて、モジュレーターを、10mg/m2~800mg/m2の投与量で投与することができる。他の好ましい実施形態では、モジュレーターを、50mg/m2~500mg/m2の投与量で投与し、なおより好ましくは、100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2、または450mg/m2の投与量で投与する。当然ながら、どのようにして投与量を計算するのかに関わらず、複数の投与量を選択された期間にわたり投与して、個別の投与より実質的に高量の絶対投与量をもたらしうることが理解されるであろう。いずれにせよ、Notumモジュレーターは、それを必要とする被験体に、必要に応じて投与することが好ましい。主治医などの当業者は、処置される状態、処置される被験体の年齢、処置される状態の重症度、処置される被験体の一般的な健康状態などについての検討に基づき、投与頻度の決定を行うことができる。一般に、有効用量のNotumモジュレーターを、1回または複数回にわたり被験体に投与する。より具体的に述べると、有効用量のモジュレーターは、毎月1回、毎月1回より多く、または毎月1回より少なく被験体に投与する。特定の実施形態では、有効用量のNotumモジュレーターを、少なくとも1カ月間にわたる期間、少なくとも6カ月間にわたる期間、または少なくとも1年間にわたる期間を含めた複数回にわたり投与することができる。投与量およびレジメンはまた、1回または複数回の投与を施された個体における開示された治療用組成物について経験的に決定することもできる。例えば、個体には、本明細書で記載される通りに生成させた治療用組成物を、投与量を漸増させて施すことができる。選択された組成物の有効性を評価するには、特定の疾患、障害、または状態のマーカーを追跡することができる。個体ががんを有する実施形態では、これらに、触診もしくは目視観察を介する腫瘍サイズの直接的な測定、X線もしくは他の造影法を介する腫瘍サイズの間接的な測定;直接的な腫瘍の生検および腫瘍試料の顕微鏡検査により評価される改善;間接的な腫瘍マーカー例えば、前立腺がんについてのPSAもしくは本明細書で記載される方法により同定される抗原の測定;疼痛もしくは麻痺の軽減;腫瘍と関連する発話、視覚、呼吸、もしくは他の能力障害disabilityの改善;食欲の増進;または容認された検査により測定される生活の質の向上もしくは生存の延長が含まれる。当業者には、投与量が、個体、新生物性状態の種類、新生物性状態の病期、新生物性状態が個体における他の場所へと転移し始めたかどうか、ならびに過去に用いられた処置および現在用いられている処置に応じて変化することが明らかであろう。c.組合せ療法本発明が目論む組合せ療法は、望ましくない新生物性の細胞増殖例えば、内皮細胞の細胞増殖を減少させるかもしくは阻害するか、がんの発生を減少させるか、がんの再発を減少させるかもしくは防止するか、またはがんの拡大もしくは転移を減少させるかもしくは防止するのに特に有用でありうる。このような場合、本発明の化合物は、腫瘍塊を下支えして永続化させるTPC例えば、NTG細胞を除去することにより感作剤または化学感作剤として機能し、最新の標準治療である腫瘍減量剤または抗がん剤のより有効な使用を可能とする。すなわち、Notumモジュレーターおよび1または複数の抗がん剤を含む組合せ療法を用いて、確立したがんを減殺する、例えば、存在するがん細胞の数を減少させ、かつ/または腫瘍負荷を減少させることもでき、少なくとも1つのがんの症状もしくは副作用を改善することもできる。したがって、組合せ療法は、Notumモジュレーター、ならびに細胞傷害性剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、免疫療法剤、がんワクチン、抗血管新生剤、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法、および抗転移剤が含まれるがこれらに限定されない、1または複数の抗がん剤の投与を指す。本発明の方法によれば、組合せによる結果が、各処置例えば、抗Notum抗体および抗がん剤を個別に実施する場合に観察される効果の和となることは要請されない。少なくとも相加的である効果が一般的に望ましいが、単剤療法の抗腫瘍効果を上回る抗腫瘍効果の任意の増大が有益である。さらに、本発明は、組み合わされた処置が相乗効果を呈示することも要請しない。しかし、当業者は、好ましい実施形態を含む特定の選択された組合せにより、相乗作用が観察されうることを理解するであろう。本発明による組合せ療法を実施するには、1または複数の抗がん剤と組み合わせたNotumモジュレーター例えば、抗Notum抗体を、それを必要とする被験体に、被験体内に抗がん活性を結果としてもたらすのに有効な形で投与することができる。Notumモジュレーターおよび抗がん剤は、腫瘍環境においてそれらの組み合わされた存在およびそれらの組み合わされた作用を所望の通りに結果としてもたらすのに有効な量で、かつ、有効な時間にわたり提供される。この目標を達成するためには、Notumモジュレーターと抗がん剤とを、単一の組成物により、または同じ投与経路もしくは異なる投与経路を用いる2つ以上の異なる組成物として、同時に被験体に投与することができる。代替的に、モジュレーターは、例えば、数分間~数週間の範囲の間隔だけ、抗がん剤による処置に先行する場合もあり、後続する場合もある。抗がん剤と抗体とを被験体に個別に適用する特定の実施形態では、各送達時の間の時間を、抗がん剤とモジュレーターとが、腫瘍に対して組合せ効果を及ぼしうるような時間とする。特定の実施形態では、抗がん剤およびNotumモジュレーターの両方を、互いから約5分間~約2週間以内に投与することが意図される。さらに他の実施形態では、モジュレーターおよび抗がん剤の投与の間に数日2、3、4、5、6、または7日が経過する場合もあり、数週間1、2、3、4、5、6、7、または8週間が経過する場合もあり、数カ月1、2、3、4、5、6、7、または8カ月が経過する場合もある。Notumモジュレーターおよび1または複数の抗がん剤組合せ療法は、1回、2回、または少なくとも状態が処置されるか、緩和されるか、または治癒するまでの期間にわたり投与することができる。組合せ療法は、複数回にわたり投与することが好ましい。組合せ療法は、毎日3回~6カ月ごとに1回投与することができる。投与は、毎日3回、毎日2回、毎日1回、隔日1回、3日ごとに1回、毎週1回、隔週1回、毎月1回、隔月1回、3カ月ごとに1回、6カ月ごとに1回などのスケジュールで行うこともでき、ミニポンプを介して持続的に行うこともできる。既に示した通り、組合せ療法は、経口経路、経粘膜経路、口腔内経路、鼻腔内経路、吸入経路、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、非経口経路、腫瘍内経路、または局所経路を介して投与することができる。組合せ療法は、腫瘍部位から遠隔の部位に投与することができる。組合せ療法は一般に、組合せ療法が、腫瘍またはがんに成長を停止させるか、または重量もしくは容量を減少させるという条件で、腫瘍が存在する限り投与する。一実施形態では、短い処置サイクルにわたり、Notumモジュレーターを、1または複数の抗がん剤と組み合わせてがん患者に投与して、がんを処置する。抗体による処置の持続期間は、用いられる特定の抗がん剤により変化しうる。本発明はまた、非持続的な投与または毎日の用量を複数回の部分的な投与へ分割することも目論む。当業者は特定の抗がん剤に適する処置回数を理解するであろうし、本発明は、各抗がん剤に最適な処置スケジュールの持続的な評価を目論む。本発明は、その間に組合せ療法を投与する、少なくとも1つのサイクル、好ましくは複数のサイクルを目論む。当業者は、総サイクル数およびサイクル間の間隔と同様、1つのサイクルに適する期間を理解するであろう。本発明は、各モジュレーターおよび抗がん剤に最適な処置スケジュールの持続的な評価を目論む。さらに本発明はまた、複数回にわたる抗Notum抗体または抗がん剤の投与ももたらす。モジュレーターと抗がん剤とは、隔日または隔週で互換的に投与することもでき、一連の抗体による処置を施した後で、1または複数にわたる抗がん剤療法による処置を施すこともできる。いずれにせよ、当業者により理解される通り、化学療法剤の適切な用量は一般に、ほぼ臨床療法において既に用いられている用量であり、化学療法は、単独でまたは他の化学療法と組み合わせて投与する。別の好ましい実施形態では、本発明のNotumモジュレーターを、疾患の初期発生後における腫瘍再発の可能性を低減するかまたは消失させる維持療法において用いることができる。障害は処置され、初期腫瘍塊は消失するか、軽減されるか、または他の形で改善され、患者は無症状であるかまたは寛解していることが好ましい。このようなときは、標準的な診断手順を用いて疾患がほとんど示されないまたは全く示されなくても、薬学的有効量の開示されるエフェクターを、1回または複数回にわたり被験体に投与することができる。一部の実施形態では、エフェクターを、ある期間にわたり定期的なスケジュールで投与する。例えば、Notumモジュレーターは、毎週、隔週、毎月、6週間ごと、2カ月ごと、3カ月ごと、6カ月ごと、または毎年投与しうるであろう。本明細書の教示を踏まえるなら、当業者は、疾患再発の潜在的可能性を低減する好ましい用量および投与レジメンを容易に決定しうるであろう。さらに、患者の応答ならびに臨床パラメータおよび診断パラメータに応じて、数週間、数カ月間、数年間の期間にわたり、なおまたは無際限に、このような処置を継続しうるであろう。さらに別の好ましい実施形態では、腫瘍減量手順後において、本発明のエフェクターを用いて、腫瘍転移の可能性を予防的に防止または低減することができる。本開示で用いられる腫瘍減量手順は、広く定義され、腫瘍または腫瘍の増殖を消失させるか、低減するか、処置するか、または改善する任意の手順、技法、または方法を意味するものとする。例示的な腫瘍減量手順には、手術、放射線処置すなわち、ビーム照射、化学療法、または切除が含まれるがこれらに限定されない。腫瘍の転移を低減する臨床手順および診断手順により示唆される通り、本開示の観点に照らして当業者により容易に決定される適切な時点において、Notumモジュレーターを投与する。エフェクターは、標準的な技法を用いて決定される薬学的有効用量で1回または複数回にわたり投与することができる。好ましい投与レジメンは、必要に応じて改変することを可能とする、適切な診断法またはモニタリング法を随伴する。d.抗がん剤本明細書で用いられる抗がん剤という用語は、細胞傷害性剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、抗体、ならびに免疫療法剤を含めた、がんなどの細胞増殖性障害を処置するのに使用され得る任意の薬剤を意味する。上記で論じた、選択された実施形態では、抗がん剤が、コンジュゲートを含むことが可能であり、投与前にモジュレーターと会合させうることが理解されるであろう。細胞傷害性剤という用語は、細胞の機能を減少させるかもしくは阻害する物質および/または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する、すなわち、この物質は、細胞に対して毒性である。この物質は、生存する生物に由来する天然分子であることが典型的である。細胞傷害性剤の例には、細菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素例えば、ジフテリアDiptheria毒素、Pseudomonas属の内毒素および外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンA、真菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素例えば、α-サルシン、レストリクトシン、植物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素例えば、アブリン、リシン、モデクシン、ビスクミン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、オオムギ毒素、Aleuritesfordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaccaamericanaタンパク質PAPI、PAPII、およびPAP-S、Momordicacharantiaによる阻害剤、クルシン、クロチン、Saponariaofficinalisによる阻害剤、ゲロニン、ミトゲリンmitegellin、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン、または動物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素、例えば、それらの断片および/または変異体を含めた、膵臓細胞外RNaseなどの細胞傷害性RNase;DNaseIが含まれるがこれらに限定されない。化学療法剤とは、がん細胞の増殖grwoth、proliferationおよび/または生存を非特異的に減少させるかまたは阻害する化合物例えば、細胞傷害性剤または細胞増殖抑制剤を意味する。このような化学的薬剤は、細胞成長または分裂に必要な細胞内過程を指向することが多く、したがって、一般に成長および分裂が急速であるがん性細胞に特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合化し、したがって、細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。一般に、化学療法剤には、がん性細胞またはがん性となる可能性が高い細胞もしくは腫瘍原性の後代を生成させる可能性が高い細胞例えば、TICを阻害するかまたは阻害するようにデザインされた任意の化学的薬剤が含まれうる。このような薬剤は、組合せで、例えば、CHOP処方物で投与することが多く、最も有効であることが多い。本発明のモジュレーターと組み合わせてまたはこれとコンジュゲートして使用され得る抗がん剤の例には、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアミラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、CC-1065、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、窒素マスタード、抗生剤、エンジイン抗生剤、ジネマイシン、ビスホスホネート、エスペラマイシン、色素タンパク質、エンジイン抗生剤enediyneantiobiotic、発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシンauthramycin、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシンcactinomycin、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN登録商標であるドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗物質、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎抗体、フロリン酸などの葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクォン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、2-エチルヒドラジド、プロカルバジン、PSK登録商標である多糖複合体JHSNaturalProducts、Eugene、OR、ラゾキサン;リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクォン;2,2’,2’’-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセンとりわけ、T-2トキシン、ベラクリンA、ロリジンA、およびアングイジン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシドAra-C;シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、クロラムブシル;GEMZAR登録商標であるゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;白金類似体、ビンブラスチン;白金;エトポシドVP-16;イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;NAVELBINE登録商標であるビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキサート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;イリノテカンCamptosar、CPT-11、トポイソメラーゼ阻害剤であるRFS2000;ジフルオロメチルオルニチンdifluorometlhylornithineDMFO;レチノイド;カペシタビン;コンブレタスタチン;ロイコボリンLV;オキサリプラチン;細胞増殖を低減するPKC-アルファ阻害剤、Raf阻害剤、H-Ras阻害剤、EGFR阻害剤、およびVEGF-A阻害剤、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるがこれらに限定されない。この定義にはまた、抗エストロゲン剤および選択エストロゲン受容体モジュレーターSERM、副腎におけるエストロゲンの生成を制御する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、ならびに抗アンドロゲン剤のほか;トロキサシタビン1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体;アンチセンスオリゴヌクレオチド;VEGF発現阻害剤およびHER2発現阻害剤などのリボザイム;ワクチン、PROLEUKIN登録商標であるrIL-2;LURTOTECAN登録商標であるトポイソメラーゼ1阻害剤;ABARELIX登録商標であるrmRH;ビノレルビン、およびエスペラミシン、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体など、腫瘍に対するホルモンの作用を制御するかまたは阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。他の実施形態は、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パチツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ、およびブレンツキシマブベドチンが含まれるがこれらに限定されない、がん治療について承認された抗体の使用を含む。当業者は、本明細書の教示と適合可能なさらなる抗がん剤を容易に同定することが可能であろう。e.放射線療法本発明はまた、Notumモジュレーターの放射線療法すなわち、ガンマ線照射、X線、UV照射、マイクロ波、電子放出など、腫瘍細胞内で局所的にDNAの損傷を誘導する任意の機構との組合せももたらす。放射性同位元素の腫瘍細胞への方向付け送達を用いる組合せ療法もまた目論まれ、標的化抗がん剤または他の標的化手段と連携させて用いることができる。放射線療法は、約1~約2週間にわたりパルスで投与されることが典型的である。頭頸部がんを有する被験体には、放射線療法を、約6~7週間にわたり投与することができる。場合によって、放射線療法は、単回投与として投与することもでき、複数回にわたる逐次投与として投与することもできる。f.新生物性状態単独で投与されるのであれ、抗がん剤または放射線療法と組み合わせて投与されるのであれ、本発明のNotumモジュレーターは、良性腫瘍または悪性疾患例えば、腎臓renalがん、肝臓liverがん、腎臓kidneyがん、膀胱がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、甲状腺がん、肝臓hepaticがん;肉腫;神経膠芽腫;および多様な頭頸部腫瘍;白血病およびリンパ系悪性疾患;神経障害、神経膠障害、星状細胞障害、視床下部障害、ならびに他の腺障害、マクロファージ障害、上皮障害、間質障害、および胞胚腔障害;ならびに炎症性障害、血管新生性障害、免疫障害、および病原体により引き起こされる障害などの他の障害が含まれうる、患者または被験体における新生物性状態を一般に処置するのに特に有用である。本発明の治療用組成物および方法による処置に特に好ましい標的は、充実性腫瘍を含む新生物性状態である。他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターを、血液系悪性疾患を診断、防止、または処置するのに用いることができる。本明細書で用いられる被験体または患者という用語は、任意の哺乳動物種を含むと明示的に考えられるが、処置される被験体または患者は、ヒトであることが好ましい。より具体的に述べると、本発明に従う処置にかけられる新生物性状態は、副腎腫瘍、AIDS関連がん、胞巣状軟部肉腫、星状細胞腫瘍、膀胱がん扁平細胞がんおよび移行細胞がん、骨がんアダマンチノーマ、脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫、脳脊髄腫瘍、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頸がんcervicalcancer、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞がん、明細胞がん、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症、線維性骨異形成症、胆嚢胆管がん、妊娠性絨毛疾患、生殖細胞腫瘍、頭頸部がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞がん、白血病、脂肪腫/良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫/悪性脂肪腫性腫瘍、肝臓がん肝芽腫、肝細胞がん、リンパ腫、肺がん小細胞がん、腺がん、扁平細胞がん、大細胞がんなど、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、副甲状腺腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後posteriousブドウ膜黒色腫、まれな血液障害、腎転移がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫rhabdomysarcoma、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平細胞がん、胃がん、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺転移がん、および子宮がん子宮頸がん、子宮内膜がん、および平滑筋腫が含まれるがこれらに限定されない群より選択することができる。好ましい特定の実施形態では、がん性細胞が、乳がん、非小細胞肺がんNSCLC、小細胞肺がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、肉腫、腎転移がん、甲状腺転移がん、および明細胞がんが含まれるがこれらに限定されない充実性腫瘍の群より選択される。血液系悪性疾患については、本発明の化合物および方法が、低悪性度NHL、濾胞細胞リンパ腫FCC、マントル細胞リンパ腫MCL、びまん性大細胞リンパ腫DLCL、小リンパ球性SLNHL、中等悪性度/濾胞性NHL、中等悪性度びまん性NHL、高悪性度免疫芽球性NHL、高悪性度リンパ芽球性NHL、高悪性度小型非切れ込み核細胞性NHL、巨大腫瘤病変性NHL、原発性マクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫LPL、マントル細胞リンパ腫MCL、濾胞性リンパ腫FL、びまん性大細胞リンパ腫DLCL、バーキットリンパ腫BL、AIDS関連リンパ腫、単球性B細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ腺症、小リンパ球性リンパ芽球腫、濾胞性リンパ芽球腫、びまん性大細胞リンパ芽球腫、びまん性小型切れ込み核細胞性リンパ芽球腫、大細胞免疫芽球性リンパ芽球腫、小型切れ込み核細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫および非バーキットリンパ腫、大細胞を主とする濾胞性リンパ腫;小型切れ込み核細胞を主とする濾胞性リンパ腫;ならびに小型切れ込み核細胞および大細胞混合型濾胞性リンパ腫を含めた多様なB細胞リンパ腫を処置するのに特に有効でありうることがさらに理解されるであろう。Gaidonoら、Lymphomas、CANCER:PRINCIPLESPRACTICEOFONCOLOGY、2巻:2131~2145頁DeVitaら編、増補5版、1997年を参照されたい。当業者には、これらのリンパ腫は、分類システムの変化のために異なる名称を有することが多く、リンパ腫が異なる名称の下に分類されている患者もまた、本発明の組合せ治療レジメンから利益を得うることが明らかなはずである。さらに他の好ましい実施形態では、Notumモジュレーターを用いて、慢性リンパ性白血病CLLまたはB-CLLなどの白血病を含めた特定の骨髄系悪性疾患および血液系悪性疾患を有効に処置することができる。CLLは主として、50歳以降に発症率の増大が始まり、60歳代後半までにピークに達する老齢者の疾患である。CLLは一般に、新生物性の末梢血リンパ球の増殖を伴う。CLLの臨床所見は、リンパ球増多症、リンパ腺症lymphadenopatliy、脾腫、貧血、および血小板減少症を伴う。CLLの特徴的な特色は、モノクローナルB細胞の増殖および分化の中間段階で停止したBリンパ球の蓄積であり、このようなB細胞は、表面IgMsIgMまたはsIgMおよびsIgDの両方を発現させ、正常B細胞における密度より低い密度で単一の軽鎖を発現させる。しかし、上記で論じ、本明細書に付属の実施例でも示す通り、B-CLL細胞では、選択されたNotum例えば、Notumの発現が上方制御され、これにより、開示されるモジュレーターを誘引する標的がもたらされる。本発明はまた、良性腫瘍または前がん性腫瘍を伴う被験体の防止的処置または予防的処置も提供する。いかなる特定の種類の腫瘍または新生物性障害も、本発明を用いる処置から除外すべきではないと考えられる。しかし、腫瘍細胞の種類は、第2の治療剤、特に、化学療法剤および標的化抗がん剤と組み合わせた本発明の使用に関与性でありうる。本明細書で論じられる通り、本発明の好ましい実施形態は、充実性腫瘍を患っている被験体を処置するためのNotumモジュレーターの使用を含む。このような被験体では、これらの充実性腫瘍のうちの多くが、開示されるエフェクターによる処置に対してそれらを特に感受性としうる、多様な遺伝子の変異を呈示する組織を含む。例えば、KRAS変異、APC変異、およびCTNNB1変異は、結腸直腸がんを伴う患者において比較的一般的である。さらに、これらの変異を伴う腫瘍を患っている患者、とりわけKRAS変異を伴う患者は通常、現在の療法に対して最も不応性である。典型的には単一のアミノ酸置換を結果としてもたらすKRASの活性化変異はまた、肺腺がん、粘液腺腫、および膵管がんを含めた、処置が困難な他の悪性疾患にも関与している。現在のところ、結腸直腸がん患者がEGFR阻害薬またはVEGF阻害薬に応答するかどうかについての最も信頼できる予測は、例えば、特定のKRAS活性化変異について調べることである。KRASは、結腸直腸がんのうちの35~45が変異し、その腫瘍が変異したKRASを発現させる患者は、これらの薬物への応答が良好でない。例えば、KRAS変異は、結腸直腸がんにおけるパニツムマブ療法およびセツキシマブ療法に対する応答の欠如の前兆となるLievreら、CancerRes、66巻:3992~5頁;Karapetisら、NEJM、359巻:1757~1765頁。結腸直腸がんを伴う患者のうちの約85は、APC遺伝子に変異を有しMarkowitzおよびBertagnolli.NEJM、361巻:2449~60頁、800を超えるAPC変異が、家族性腺腫性ポリープ症および結腸直腸がんを伴う患者において特徴付けられている。これらの変異の大部分は、ベータ-カテニンの破壊を媒介する機能的能力を低減させた切断型APCタンパク質を結果としてもたらす。ベータ-カテニン遺伝子であるCTNNB1における変異はまた、このタンパク質の安定化を結果として増大させることから、また、変異したAPCが正常な細胞増殖プログラムおよび細胞分化プログラムを維持するのに要請されるベータ-カテニンの破壊を適切に媒介するのに奏効しないことの結果として生じる発がん機構でもある、いくつかの発がん性の転写プログラムの核内移入およびその後における活性化も結果としてもたらす。本明細書の実施例により示される通り、このような変異を含む腫瘍は、本発明のNotumモジュレーターによる処置に対して特に感受性であることがわかる場合がある。XIV.製品1回または複数回の投与分のNotumモジュレーターを含む、1または複数の容器を含む医薬パックおよび医薬キットもまた提供される。特定の実施形態では、単位用量が提供され、この単位用量が、1または複数のさらなる薬剤を伴うかまたは伴わずに、例えば、抗Notum抗体を含む所定量の組成物を含有する。他の実施形態では、このような単位用量が、単回使用用にあらかじめ充填された注射用シリンジにより供給される。さらに他の実施形態では、単位用量中に含有される組成物が、生理食塩液、スクロースなど、リン酸緩衝液などの緩衝液を含む場合もあり、かつ/または安定で有効なpH範囲内で処方される場合もある。代替的に、特定の実施形態では、組成物を、適切な液体、例えば、滅菌水を添加して復元しうる凍結乾燥粉末として提供することもできる。好ましい特定の実施形態では、組成物が、スクロースおよびアルギニンが含まれるがこれらに限定されない、タンパク質の凝集を阻害する1または複数の物質を含む。容器複数可上の任意のラベル、または容器複数可と関連する任意のラベルは、封入された組成物が、最適の疾患状態を診断または処置するのに用いられることを示す。本発明はまた、単回投与用または複数回投与用の投与単位のNotumモジュレーター、および場合によって、1または複数の抗がん剤を生成させるキットももたらす。キットは、容器および容器上にあるかまたは容器と関連するラベルまたはパッケージの添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成することができる。容器は、状態を処置するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有しうる例えば、容器は、静脈内注射用溶液バッグの場合もあり、皮下用注射針で穿刺可能な密栓を有するバイアルの場合もある。このようなキットは一般に、適切な容器内に、Notumモジュレーターの薬学的に許容される処方物と、場合によって、同じ容器内または異なる容器内の1または複数の抗がん剤とを含有する。キットはまた、診断用または組合せ療法用の他の薬学的に許容される処方物も含有しうる。例えば、本発明のNotumモジュレーターに加えて、このようなキットは、化学療法薬または放射線療法薬など、ある範囲の抗がん剤のうちの任意の1または複数;抗血管新生剤;抗転移薬;標的化抗がん剤;細胞傷害性剤;および/または他の抗がん剤も含有しうる。このようなキットはまた、Notumモジュレーターを抗がん剤または診断剤とコンジュゲートするのに適する試薬例えば、参照によりその全体において本明細書に援用される、U.S.P.N.7,422,739を参照されたいも提供しうる。より具体的に述べると、キットは、さらなる成分を伴うかまたは伴わずに、Notumモジュレーターを含有する単一の容器を有する場合もあり、各所望の薬剤用の異なる容器を有する場合もある。コンジュゲーション用に組み合わされた治療剤を提供する場合、単一の溶液を、モル等量の組合せであらかじめ混合することもでき、1つの成分を他の成分に対して過剰としてあらかじめ混合することもできる。代替的に、キットのNotumモジュレーターおよび任意選択の抗がん剤は、患者に投与する前に異なる容器内で個別に維持することもできる。キットはまた、注射用静菌水BWFI、リン酸緩衝生理食塩液PBS、リンゲル液、およびデキストロース溶液など、滅菌の薬学的に許容される緩衝液または他の希釈剤を含有する第2/第3の格納手段も含む。キットの構成要素を1または複数の溶液により提供する場合、溶液は水溶液であることが好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。しかし、キットの構成要素は、乾燥粉末複数可として提供することもできる。試薬または構成要素を乾燥粉末として提供する場合は、適切な溶媒を添加することにより粉末を復元することができる。溶媒はまた、別の容器でも提供されうることが想定される。上記で簡略に示した通り、キットはまた、抗体および任意選択の構成要素を動物または患者に投与するための手段、例えば、1または複数の注射針もしくはシリンジ、なおまたは点眼器、ピペット、あるいはそれにより処方物を動物へと注入または導入するかまたは身体の疾患領域へと適用する他のこのような装置も含有する。本発明のキットはまた、バイアルなどおよび他の構成要素を市販用の密閉容器、例えば、所望のバイアルおよび他の装置が配置および保持される、吹き出し成形または射出成形されたプラスチック容器などに格納するための手段も包含することが典型的である。任意のラベルまたはパッケージの添付文書により、Notumモジュレーター組成物が、がん、例えば、結腸直腸がんを処置するのに用いられることを表示する。XV.研究用試薬本発明の他の好ましい実施形態はまた、蛍光活性化細胞分取FACS、磁気活性化細胞分取MACS、またはレーザー媒介型区分などの方法により、腫瘍始原細胞の集団または亜集団を同定するか、単離するか、区分するか、または濃縮するのに有用な手段としての開示されるモジュレーターの特性も利用する。当業者は、モジュレーターを、がん幹細胞を含むTICを特徴付けそして操作するためのいくつかの適合可能な技法において使用され得ることを理解するであろう例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に援用される、U.S.S.N.12/686,359、同12/669,136、および同12/757,649を参照されたい。XVI.その他本明細書で別段に規定されない限り、本発明との関連で用いられる科学技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別段に要請されない限り、単数形の用語は、複数形を包含するものとし、複数形の用語は、単数形を包含するものとする。より具体的に述べると、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる通り、文脈により別段に明確に定められない限り、単数形のあるa、あるan、およびそのは、複数形の指示対象を包含する。したがって、例えば、タンパク質への言及は、複数のタンパク質を包含し、細胞への言及は、細胞の混合物などを包含する。加えて、明細書および添付の特許請求の範囲において示される範囲は、端点および端点の間の全ての点の両方を包含する。したがって、2.0~3.0の範囲は、2.0、3.0、および2.0と3.0との間の全ての点を包含する。一般的に、本明細書で記載される、細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションとの関連で用いられる用語法ならびにこれらの技法は、周知のものであり、一般に当技術分野で用いられている。別段に示されない限り、本発明の方法および技法は一般に、当技術分野において周知であり、本明細書の全体で引用されて論じられている多様な一般的参考文献および多様でより具体的な参考文献において記載されている従来の方法により実施される。例えば、SambrookJ.およびRussellD.、MolecularCloning:ALaboratoryManual、3版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、N.Y.2000年;Ausubelら、ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology、Wiley,JohnSons,Inc.2002年;HarlowおよびLane、UsingAntibodies:ALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、N.Y.1998年;ならびにColiganら、ShortProtocolsinProteinScience、Wiley,JohnSons,Inc.2003年を参照されたい。酵素反応および精製法は、当技術分野において一般に達成される通り、または本明細書で記載される通り、製造元の仕様に従い実施する。本明細書で記載される分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および製薬化学の実験手順および実験法との関連で用いられる用語法は、周知であり、かつ、当技術分野で一般に用いられる用語法である。本明細書中で開示されるかまたは引用される全ての参考文献または文書は、限定なしに述べると、参照によりそれらの全体において本明細書に援用される。さらに、本明細書で用いられる任意の節見出しは、構成だけを目的とするものであり、記載される対象を制限するものとしてはみなされないものとする。本発明はこのように概説されたが、例示として提供され、本発明を制限するものではない以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解される。実施例は、下の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すものではない。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度で示され、圧は大気圧またはその近くである。実施例1腫瘍始原細胞集団の特徴付けがん患者に存在するときの充実性腫瘍の細胞異質性を特徴付け、特定の表現型マーカーを用いて腫瘍永続細胞TPC;すなわちがん幹細胞:CSCの正体を解明し、臨床的に適切な治療標的を同定するために、当技術分野で認識されている技術を用いて大きな非伝統的異種移植NTX腫瘍バンクを開発し、維持した。多数の別個の腫瘍細胞系を含むNTX腫瘍バンクを、様々なの充実性腫瘍悪性疾患に罹患する多数のがん患者から最初に得られた異種腫瘍細胞の複数の継代を通して、免疫不全マウスで増殖させた。十分に規定された系統を有する多数の別個の初期継代NTX腫瘍細胞系の連続した入手可能性は、それらがそれらの細胞系から精製される細胞の再現性および反復性の特徴付けを可能にするのでTPCの同定および単離を大きく促進する。より詳しくは、単離または精製されるTPCは、その細胞が由来する患者の腫瘍試料を再現するマウスで表現型的および形態学的に異種の腫瘍を生成するそれらの能力によって遡及的にretrospectively、最も正確に定義される。したがって、単離細胞の小集団を用いてマウスで完全に異種の腫瘍を生成する能力は、その単離細胞がTPCを含むという事実の強い指標となる。そのような研究では、最小限に継代されたNTX細胞系の使用は、invivo実験を大きく単純化し、容易に証明できる結果を提供する。さらに、初期継代NTX腫瘍はイリノテカンすなわちCamptosar登録商標などの治療剤にも応答し、それは、腫瘍増殖、現在の療法への抵抗性および腫瘍再発を駆動する根本機構に対する臨床的に重要な識見を提供する。NTX腫瘍細胞系が樹立されたので、腫瘍始原細胞TICを特徴付けし、単離し、精製または濃縮するために用いることができる別個のマーカーを同定し、そのような集団の中でTPCおよびTProg細胞を分離または解析するために、フローサイトメトリーを用いて構成要素の腫瘍細胞表現型を解析した。この点に関して、本発明者らは、タンパク質発現および潜在的に有益なマーカーの同時同定に基づく細胞の迅速な特徴付けを可能にした、商標登録されたプロテオームベースのプラットホームすなわちPhenoPrint商標アレイを使用した。PhenoPrintアレイは数百の別個の結合分子を含む商標登録されたプロテオームプラットホームであり、その多くは96ウェルプレートに並べられて商業的な供給源から得られ、各ウェルはフィコエリトリン蛍光性チャンネルに異なる抗体を含有し、異なる蛍光色素の複数の追加の抗体がプレート全域のあらゆるウェルに並べられる。これは、関連する細胞の迅速な包含または非フィコエリトリンチャンネルを経た非関連細胞の消去を通して、選択された腫瘍細胞の亜集団における目的の抗原の発現レベルの決定を可能にする。PhenoPrintアレイを当技術分野で周知である組織解離、移植および幹細胞技術と組み合わせて用いた場合Al-Hajjら、2004年、Dalerbaら、2007年、およびDyllaら、2008年、全て上記、各々の全体が、参考として本明細書に援用される、関連するマーカーを有効に同定し、その後特定のヒト腫瘍細胞亜集団を非常に効率よく単離、移植することが可能であった。したがって、重度に免疫不全を起こしたマウスでヒト腫瘍のために通常なされているように、様々なNTX腫瘍細胞系を確立した後に、800~2,000mm3に到達した際に腫瘍をマウスから切除し、当技術分野で認識された酵素消化技術を用いて細胞を単一細胞懸濁液に解離した例えば、本明細書に援用されるU.S.P.N.2007/0292414を参照。PhenoPrintアレイを用いてこれらの懸濁液から得られたデータは、細胞ごとの絶対的細胞につきおよび相対的集団内の他の細胞に対するの両方の表面タンパク質発現を提供し、細胞集団のより複雑な特徴付けおよび層別化をもたらした。より具体的には、PhenoPrintアレイの使用は、TICまたはTPCをNTG腫瘤細胞および腫瘍間質から先を見越してprospectively区別したタンパク質またはマーカーの迅速な同定を可能にし、NTX腫瘍モデルから単離された場合には、特定の細胞表面タンパク質の異なるレベルを発現する腫瘍細胞亜集団の比較的迅速な特徴付けを可能にした。詳細には、腫瘍細胞集団にわたり異種発現を有するタンパク質は、高レベルおよび低レベルの特定のタンパク質またはマーカーのいずれかを発現する、異なり、かつ高度に精製された腫瘍細胞亜集団の単離、および免疫不全マウスへの移植を可能にし、それによって、TPCが1つの亜集団か別の亜集団で濃縮されたかについての評価を促進する。濃縮するという用語は細胞を単離することと同義的に用いられ、出発細胞集団または初期細胞集団と比較して、1つの型の細胞の収量画分が他の型の細胞の画分より増加していることを意味する。好ましくは、濃縮することは、出発細胞集団と比較して細胞集団中の1つの型の細胞の百分率を約10、約20、約30、約40、約50または50を超えて増大させることを指す。本明細書で用いられるマーカーとは、細胞または組織の文脈において、疾患または障害に侵された組織または細胞集団の中かその上で同定されるものを含む、特定の細胞、細胞集団または組織と同定可能に関連するか、その中かその上で特異的に見出される化学的実体または生物学的実体の形の任意の特徴を意味する。明らかにされるように、マーカーは、性質が形態学的、機能的、または生化学的であってよい。好ましい実施形態では、マーカーは、特定の細胞型例えば、TPCによって、または一定の条件下の細胞例えば、細胞のライフサイクルの特定の時点または特定のニッシェにおける細胞によって差次的または優先的に発現される細胞表面抗原である。好ましくは、そのようなマーカーはタンパク質であり、より好ましくは抗体、アプタマーまたは当技術分野で公知である他の結合分子のためのエピトープを有する。しかし、マーカーは、それらに限定されないがタンパク質ペプチドおよびポリペプチド、脂質、多糖、核酸およびステロイドを含む、表面または細胞の中に見出される任意の分子からなることができる。形態学的マーカーの特徴または形質traitの例には、形状、サイズおよび核と細胞質との比が含まれるが、これらに限定されない。機能的マーカーの特徴または形質の例には、特定の基質に接着する能力、特定の色素を組み込むか排除する能力例えば、それに限定されないが親油性色素の排除、特定の条件下で移動する能力、および特定の系統に沿って分化する能力が含まれるが、これらに限定されない。マーカーは、レポーター遺伝子、例えばそのレポーター遺伝子をコードする核酸配列のその細胞への導入、およびマーカーとして用いることができるレポータータンパク質の生成をもたらすその転写の結果として細胞によって発現されるレポーター遺伝子から発現されるタンパク質であってもよい。マーカーとして用いることができるそのようなレポーター遺伝子は、例えば蛍光性タンパク質酵素、染色小粒タンパク質chromomericprotein、耐性遺伝子などであるが、これらに限定されない。関連した意味で、組織、細胞または細胞集団例えば、安定したTPC表現型の文脈において、マーカー表現型という用語は、特定の細胞または細胞集団を特徴付けるか、同定、分離、単離または濃縮するために用いることができる任意のマーカーまたはマーカーの組合せを意味する。具体的な実施形態では、マーカー表現型は、細胞表面マーカーの組合せの発現を検出または同定することによって決定することができる細胞表面表現型である。当業者は、多数のマーカーまたはそれらの不在ががん幹細胞の様々な集団と関連付けられ、腫瘍細胞亜集団を単離して特徴付けるために用いられていることを認識するであろう。これに関して、例示的ながん幹細胞マーカーは、以下:を含む。例えば、各々が参考として本明細書に援用される、Schulenburgら、2010年、PMID:20185329、U.S.P.N.7,632,678ならびにU.S.P.N.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416および2011/0020221を参照。いくつかのこれらのマーカーが上記のPhenoPrintアレイに含まれたことは理解されるであろう。同様に、特定の腫瘍型のがん幹細胞と関連する細胞表面表現型の非限定例には、以下:ならびに当技術分野で公知である他のがん幹細胞表面表現型が含まれる。例えば、各々の全体が、参考として本明細書に援用される、Schulenburgら、2010年、前掲、Visvaderら、2008年、PMID:18784658およびU.S.P.N.2008/0138313を参照。当業者は、直前に例示されるものなどのマーカー表現型が、さらなる解析のためにTICおよび/またはTPCの細胞または細胞集団を特徴付けるか、単離、精製または濃縮するために、標準のフローサイトメトリー解析および細胞選別技術と一緒に用いることができることを理解するであろう。本発明に関して興味のあるのは、解析される腫瘍標本が初代患者腫瘍標本であるか患者由来のNTX腫瘍であったか否かを問わず、CD46、CD324、および任意選択でCD66cは、多くのヒトの結腸直腸CR、乳房BR、非小細胞肺NSCLC、小細胞肺SCLC、膵臓PA、黒色腫Mel、卵巣OVおよび頭頸部がんHN腫瘍細胞の表面で高度にまたは不均一に発現される。実施例2濃縮腫瘍始原細胞集団からのRNA試料の単離および解析免疫不全マウスで腫瘍を開始するために、樹立された結腸直腸NTX細胞系SCRx-CR4を用いた。平均腫瘍負荷tumorburdenが約300mm3に到達したならば、マウスを無作為化して、15mg/kgイリノテカンまたはビヒクル対照PBSのいずれかで週2回、20日間処置し、その時点でマウスを安楽死させ、実施例1に示すマーカー表現型を一般に用いて、新鮮に切除したNTX腫瘍からTPC、TProgおよびNTG細胞をそれぞれ単離した。より詳しくは、CD46、CD324およびCD66cマーカーを用いる蛍光活性化細胞分取FACSによって細胞集団を単離し、直ちにペレットにし、QiagenRLTPlusRNA溶解緩衝液Qiagen,Inc.に溶解した。その後、用いるまで、溶解物を-80°Cで保存した。RNA細胞溶解物を解凍した後、販売者の指示に従ってQiagenRNEasy単離キットQiagen,Inc.を用いて全RNAを抽出し、再度販売者のプロトコールおよび推奨される機器設定を用いてNanodropThermoScientificおよびBioanalyzer2100Agilentで定量化した。生じた全RNA調製物は、遺伝子の配列決定および解析に適していた。ビヒクルまたはイリノテカンで処置されたマウスから前記のように単離されたTPC、TProgおよびNTG細胞集団から得られたRNA試料は、1試料につき5ngの全RNAから出発して、AppliedBiosystemsSOLiD3.0オリゴライゲーション/検出による配列決定次世代配列決定プラットホームLifeTechnologiesを用いる全トランスクリプトームの配列決定のために調製された。ヒトゲノムからの34,609個の遺伝子へマッピングされた、SOLiDプラットホームによって生成されたデータは、Notumを検出することができ、全ての試料においてNotumレベルの検証可能な測定値を提供した。一般に、SOLiD3次世代配列決定プラットホームは、ビーズに連結するクローン増幅RNA/DNA断片の平行した配列決定を可能にする。次に、試料中に存在する各断片の50塩基の読取りを生成するために、色素標識オリゴヌクレオチドとのライゲーションによる配列決定が用いられ、合計で50,000,000を超える読取りがゲノムでのタンパク質のmRNA転写産物レベルの発現のずっと正確な表示を生成する。SOLiD3プラットホームは、読取り範囲ゲノム位置へ固有にマッピングされた読取りだけに基づいて、発現だけでなく、SNP、既知および未知の選択的スプライシング事象ならびに潜在的に新しいエクソンの発見を捕捉することができる。したがって、この次世代プラットホームの使用は、転写産物レベルの発現の差、ならびにそれらの発現されるmRNA転写産物の特定のスプライス変異体の差または優先度の決定を可能にした。さらに、AppliedBiosystemsからの改変完全トランスクリプトームプロトコールを用いるSOLiD3プラットホームによる解析は、およそ5ngの出発材料の前増幅を必要としただけであった。このことは、細胞のTPCサブセットが、例えばNTGまたは腫瘤よりも数が非常に少なく、したがって使える出発材料が非常に少ない量になる場合に、選別された細胞集団からの全RNAの抽出として重要である。標準的な工業上の実施の通り、二連で実行したSOLiD3プラットホームからの配列決定データを正規化し、変換し、倍率を計算した。図2で見られるように、データの解析は、転写産物レベルにおいてNotumがTPCでTProgおよびNTG集団の2倍から5倍高く上方制御され、週2回の15mg/kgイリノテカンで処置されたNTX腫瘍保持マウスではさらに上昇したことを示した。極めて感度が高いSOLiD3解析プラットホームを用いて観察されたNTX腫瘍試料のTPC亜集団でのNotumの過剰発現は、Notumが結腸直腸の腫瘍形成および維持で重要な役割を果たし得ることを示唆する。実施例3濃縮腫瘍始原細胞集団でのNotumのリアルタイムPCR解析TPC集団対TProgおよびNTG細胞でNotumの発現の増強を確認するために、TaqMan定量的リアルタイムPCRを使用して、前述の様々なNTX系から単離されたそれぞれの細胞集団で遺伝子発現レベルを測定した。そのようなリアルタイムPCR解析が、目的の特定の遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブのセットを用いて、別個の標的の遺伝子発現レベルのより直接的で迅速な測定を可能にすることは理解されるであろう。TaqManリアルタイム定量的PCRは、複数の患者由来のNTX系細胞集団および対応する対照でNotum遺伝子の発現を測定するために用いられた、AppliedBiosystems5900HT機器LifeTechnologiesで実施された。以降の解析は、TaqManシステムと一緒に供給された説明書に指定された通りに、および市販されているNotumプライマー/プローブセットLifeTechnologiesを用いて行われた。図3に見られるように、3つの異なる結腸直腸NTX腫瘍系例えば、CR2、CR4およびCR5から単離されたNTG、TProgおよびTPC集団での遺伝子発現を調べた定量的リアルタイムPCRは、Notum遺伝子発現がTPC細胞でおよそ2倍上昇すること、およびこの発現は、イリノテカンによる処置を受けたマウスではおよそ4倍にさらに上昇することを示す。リアルタイム定量的PCRのより広く容認された方法を用いた、TProgおよびNTG細胞対照と比較したNTXTPC細胞調製物での上昇したNotum発現の観察は、前の実施例のSOLiD3完全トランスクリプトーム配列決定データを確認し、結腸直腸新生物での駆動因子としてのNotumをさらに示唆する。さらに、抗がん剤で処置された腫瘍で増加したNotumの発現は、Notumモジュレーターまたはアンタゴニストが補助療法として価値があることを証明し得ることを示す。実施例4未分画結腸直腸腫瘍試料でのNotumの発現TProgおよびNTG細胞と比較したときに、結腸直腸腫瘍からのTPC集団でNotum遺伝子発現が上昇することが見出されたという事実を考慮して、正常な隣接組織NATおよび他の正常な組織試料に対して未分画結腸直腸腫瘍試料でもNotum発現レベルが上昇したかどうか決定するための実験を行った。提供されたプロトコールに従って、110個の結腸直腸患者腫瘍標本、正常な隣接組織および48個の正常組織を含有するカスタム仕様のTumorScanqPCROrigeneTechnologies384ウェルアレイを設計し、注文作製をした。実施例3で詳述される手法および同じNotum特異的プライマー/プローブセットを用いて、カスタム仕様プレートのウェルでTaqManリアルタイム定量的PCRを次に実施した。図4Aおよび4Bは、正常な結腸および直腸の組織での平均的発現に対して正規化した発現データの結果を、グラフ形式で示す。より具体的には、図4Aは、110人の結腸直腸がん患者から得られた168個の組織標本そのうち35個の組織標本は結腸直腸がん患者からの正常な隣接組織であるおよび48個の正常組織を使って生成されたデータを要約する。グラフでは、データはボックスおよびひげグラフで表され、メジアンの値はボックスの中の線で表される。同様に、図4Bは、腫瘍組織または正常な隣接組織から得られた24個のマッチさせた結腸直腸患者標本からのデータを含有する。ここでは、プロットされたデータは、試料別にそれぞれの腫瘍とNATの間を関連させて提示される。図4Aおよび4Bの両方は、提示される4つの病期の全てにおいて、Notum遺伝子の発現レベルが、結腸直腸腫瘍、および正常な隣接組織に対してマッチさせた腫瘍標本で上昇することを示す。さらに詳しくは、これらの初代患者腫瘍試料NTX腫瘍とは対照的にでのリアルタイムPCRの結果は、がんの病期すなわち第I期~第IV期疾患にかかわりなく、Notum遺伝子発現が正常な隣接組織NATに対して患者腫瘍でおよそ1,000倍高いことを示した。同様に、Notum遺伝子発現は、NATに対してマッチさせた腫瘍でおよそ10~100倍上昇した。さらに、Notum発現はほとんどの正常組織で比較的低く、正常な胎盤および肝臓組織だけが、病期によってクラスター化させた結腸直腸がん患者腫瘍で観察されたメジアンレベル以上の遺伝子発現レベルを有していた。未分画結腸直腸腫瘍試料でのNotumの発現の上昇および正常な対照組織での比較的低い発現レベルは、悪性疾患の発達および支持におけるNotum遺伝子産物の役割に関して再び示唆的である。実施例5例示的な腫瘍試料でのNotumの差次的発現17個の他の異なる充実性腫瘍型のうちの1つと診断された患者からの追加の結腸直腸がん患者腫瘍試料および腫瘍標本でNotum遺伝子発現をさらに評価するために、実施例4でのように提供されたプロトコールに従って注文により組み立てたTissueScanqPCROrigeneTechnologies384ウェルアレイを用いてTaqManqRT-PCRを実施した。測定の結果は図5Aおよび5Bに提示され、Notumの遺伝子発現がいくつかの腫瘍試料で有意に上昇することを示す。これに関して、図5Aおよび5Bは、18個の異なる充実性腫瘍型のうちの1つを有する患者からの腫瘍標本全体灰色ボックスまたはマッチさせたNAT白色ボックスでのヒトNotumの、相対的または絶対的な遺伝子発現レベルをそれぞれ示す。図5Aでは、データは、解析した腫瘍型ごとに平均のNAT遺伝子発現に対して正規化される。図5Bでは、Notumの絶対的発現は様々な組織/腫瘍で評価され、データは、定量的リアルタイムPCRによって指数関数的増幅に到達するために必要なサイクル数Ctとしてプロットされている。増幅されていない標本は45のCt値を割り当てられ、それは実験プロトコールでの増幅の最後のサイクルを表す。データはボックスおよびひげグラフで表され、メジアンの値はボックスの中の線で表される。結腸直腸がんと診断された患者に加えて、子宮内膜、食道および子宮がんと診断された患者もNATに対して腫瘍で有意に多いNotum遺伝子発現を有し、これらの腫瘍でTPCの自己再生および増殖に影響を与えることによってNotumが病理学的役割も果たすかもしれないことを示唆した。より有意でないが、卵巣、前立腺および甲状腺の腫瘍も上昇したNotum発現を有していた。これらの試験からさらに明瞭であったことは、ほとんどのNAT試料でNotum遺伝子発現が概して低い~検出不能までの間であって、最も高い発現が肝臓、精巣および肺で観察されたことである。再び、これらのデータは、いくつかの過剰増殖性障害での腫瘍形成または永続に関して、Notum発現が指標となること、および潜在的に手がかりを与えるものであることを示唆する。実施例6様々なプールされた組織溶解物でのNotumタンパク質の差次的発現前の実施例によって証明されたようにいくつかの腫瘍形成試料でのNotum遺伝子発現の増強を立証した後、類似した腫瘍試料でのNotumタンパク質の対応する増加のための証拠を追求した。これに関して、11個の異なる腫瘍型またはそれらのそれぞれの正常な隣接組織からの溶解物のプールされた2つの反復物を含む逆相タンパク質アレイを、外因性プロモーターOriGeneTechnologiesによって駆動されたTP53過剰発現の有り無しで、293個の細胞の対照と一緒に提供した。溶解物でのNotumタンパク質発現は、ヒトNotumに対して生成されたマウスポリクローナル抗体、および比色検出試薬、および製造業者によって提供されたプロトコールを用いて検出された。製作されたアレイ上のスポットはフラットベッドスキャナを用いてデジタル画像に変換し、次に、AlphaEaseFcソフトウェアAlphaInnotech,Inc内のSpotDenso機能を使って定量化した。これらのアッセイの結果は図6に示され、Notumタンパク質の発現が数種類の異なる腫瘍で上方制御されることを示す。より具体的には、図6は、11個の異なる腫瘍型すなわち、初代腫瘍試料のうちの1つを有する患者から得られた標本からの、正常な隣接組織および293TP53陰性対照白または293TP53陽性対照および腫瘍組織黒でのヒトNotumの発現レベルを示す。データを前記のように生成し、1スポットあたりの平均ピクセル強度として表した。プロットされたデータは、平均±SEMを表す。結腸直腸がんに加えて、Notumタンパク質の発現は、黒色腫、前立腺がんおよび膵臓がんを有する患者からの腫瘍標本で有意に上昇するようである。これらのデータは、Notum過剰発現がこれらの腫瘍でTPCの増殖および/または生存に関与する可能性を示唆する。さらに、Notumタンパク質の検出は、これらの疾患の予後徴候となることがある。TPC濃縮細胞集団および様々な腫瘍でNotumが過剰発現される遺伝子レベルおよびプロテオームレベルの両方でことを示す上の実施例、ならびにそのような上昇した発現レベルが腫瘍形成および腫瘍増殖と関連する可能性を考慮して、Notumモジュレーターの生成で用いることができるNotum免疫原を構築することが決定された。実施例7タグ付きNotumモジュレーターの構築および発現Notumモジュレーターの生成で用いるために、下記のように構築物を製作し、発現させた。出発点として、全読み取り枠ORF配列番号1をコードするヒトNotumのcDNAを、商業的な供給源OpenBiosystems;受託番号BC060882から得た。DNA配列決定によって、cDNAクローンORF配列は、参照配列GenBankNM_178493と比較して変異がないことを確認した。組換え産物の精製および検出の容易さのために、完全長NotumのORFをコードするcDNAを、8×-HisandStrep-タグIIエピトープIBAGmBHをコードする配列を含むようにPCRによって改変した。改変されたNotumのORFをコードするDNAは、QiaQuickPCRクリーンアップカラムQiagen、pCMV-ScriptStratagene,Inc.のNotI部位とXhoI部位の間にサブクローニングされたDNAを用いてPCRから精製し、DNA配列決定によって変異がないことを確認した。この場合、野生型Notumシグナルペプチド配列が、組換えタンパク質の分泌を指示する。本発明に従って、所望の組換え産物の産生で用いるためのpSEC発現ベクターを構築した。pSEC-CAG発現ベクターはCAGプロモーターを含み、それは、ヒトサイトメガロウイルスCMVの主要最初期遺伝子エンハンサー/プロモーター領域、エンハンサー/プロモーター領域の下流に位置するβ-グロビン/IgGキメライントロンで構成される。pSEC-CAGベクターは、クローニングされたcDNA挿入断片の強力な構成的発現を多くの細胞型で促進する。pSEC-CAGは、プラスミドでトランスフェクトされた細胞から発現される組換えタンパク質の分泌の増強を促進するための、IgKシグナルペプチド/リーダー配列も含む。pSEC-CAG-NOTUM-StrepHisを作製するために、pCMV-Scriptからのエピトープタグ付きNotumORFを、pSEC-CAGベクターへ、SfiI部位とXhoI部位の間にPCRによってサブクローニングした。懸濁液293細胞の1リットルのトランスフェクションのためにpSEC-CAG-NOTUM-StrepHisDNAを用い、組換えタンパク質はニッケル-NTAカラムを用いてトランスフェクトされた細胞の上清から精製した。より具体的には、製造業者の指示に従ってリポフェクトアミン2000LifeTechnologiesを用いてプラスミドpSEC-CAG-NOTUM-StrepHisをトランスフェクトすることによって、組換えNotumタンパク質を付着性のHEK293T細胞で生成した。付着細胞からの上清を48時間で収集し、組換えHisタグ付きタンパク質は、AKTAプライム機器を用いてNi-NTAHisTrapカラムGEAmershamで精製した。組換えタンパク質すなわち、hNotum-Hisは、イミダゾールの線形勾配最終濃度500mMを用いてカラムから溶出させ、Notumタンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、AKTAFPLCを用いてSuperdex200サイズ排除カラムでさらに精製してモノマータンパク質を収集した。精製されたNotumタンパク質は、ELISAによって、およびタンパク質ブロット解析によって確認された。収集した物質は、以降の実施例で免疫化のために用いた。同様に、直前に示すのと実質的に同じ技術および下記の実施例8に記載されるマウスNotum遺伝子を用いて、Hisタグ付きマウスNotumすなわち、Notum-Hisをその後製作し、発現させた。この構築物は、続く実施例に記載される本発明のモジュレーターを特徴付けるためにも用いられた。実施例8Fc-Notum融合モジュレーターの構築および発現モジュレーター、免疫原、アッセイ試薬として用いるため、およびinvivo試験のために、追加の比較的より可溶性のNotumタンパク質を生成した。より詳しくは、ヒトNotumならびにマウスおよびアカゲザルMacacamulattaまたはマカクのオルソログをそれぞれ用いてFc構築物を作製した。本出願のために、特に明記しない限り、そのような構築物のFc部分は起源がヒトである。実施例7に示すように、成熟したヒトNotumタンパク質をコードするDNAを、インフレームで隣接EcoRIおよびNcoI制限部位を含むようにPCRによって増幅し、pFUSE-mIgG2bベクターInvivogenのEcoRI部位とNcoI部位の間にサブクローニングして、マウスIgG2b遺伝子に由来するFcドメインをコードする配列とインフレームで融合された、成熟したヒトNotumタンパク質をコードする配列にインフレームで融合された、IL-2シグナルペプチド配列を含むpFUSE-NOTUM-mIgGを生成した。マウスIgG2bのFcドメインを、プラスミドpFUSE-hIgG2InvivogenからPCRによって増幅した、ヒトIgG2のFcをコードするDNA配列と置換した。ヒトIgG2FcのPCR産物をBglIIおよびNheIで消化し、ベクターpFUSE-NOTUM-mIgGの同じ部位にサブクローニングして、ヒトIgG2遺伝子に由来するFcドメインをコードする配列とインフレームで融合された、成熟したヒトNotumタンパク質をコードする配列にインフレームで融合された、IL-2シグナルペプチド配列を含むpNOTUM-hIgG2hFcを生成した。例示的なヒトFc-Notum融合構築物のアミノ酸配列配列番号333および核酸配列配列番号334が図1Dに示され、そこで、分子のNotum部分は下線を引かれている。線状のポリエチレンイミンおよび標準方法を用いてpNOTUM-hIgG2hFcプラスミドでトランスフェクトさせたCHO-S細胞LifeTechnologiesで、組換えヒトNotum-Fcタンパク質すなわち、hNotum-Fcを生成した例えば、参考として本明細書に援用されるDurocher,Y.らNucleicAcidsRes.2002年30巻:e9頁を参照。トランスフェクションの5日後に、プロテインAカラムおよび製造業者の指示GEAmershamを用いて、組換えタンパク質を上清から精製した。カラムから溶出した物質を濃縮しおよそ1mg/mLへ、緩衝液をPBSに交換した。類似した分子生物学的技術およびDNAクローニング技術を用いて、マウスNotumおよびマカクNotumおよびヒトFc領域を含む融合構築物を、アッセイ開発作業およびinvivo製品開発で使用するために製作した。MusmusculusNotumGenBankNM_175263およびMacacamulattaNotumGenBankXM_001112829のORFに対応する配列を、GENEArtRegensburg、Germanyによってオリゴヌクレオチドから合成した。成熟したマウスNotumタンパク質をコードするDNAは、GENEArtによって供給されるベクターからPCRによって増幅し、マウスIgG2bFcドメインをコードする配列がヒトIgG2Fcドメインをコードする配列と置換されたpFUSE-mIgG2bに由来するプラスミドである、pSCRXv003のEcoRI部位およびNcoI部位にサブクローニングした。これは、ヒトのNotumがマウスのNotumに置換されているpNOTUM-hIgG2hFcに大部分類似しているプラスミドpSCRXv3-mus-Notumを与えた。Durocher,Y.ら、上記。同様に、成熟したM.mulattaのNotumタンパク質をコードするDNAは、GENEArtによって供給されるベクターからPCRによって増幅し、pSCRXv003のEcoRI部位およびBglII部位にサブクローニングして、pSCRXv003-mac-Notum同じく、ヒトのNotumがマカクNotumに置換されているpNOTUM-IgG2hFcに類似するを与えた。上でヒトFcタグ付きヒトNotumについて記載されるように、必要に応じて組換えマウスおよびマカクNotum-ヒトFcタグ付きタンパク質をCHO-S細胞で生成した。実施例9Notum構築物を用いる抗Notum抗体の生成本明細書の教示に従って、マウス抗体の形のNotumモジュレーターを、hNotum-HisまたはhNotum-Fcによる接種を通して生成した。この点に関して、新生物障害の処置のためにNotumの作用を阻害するために治療的に用いることができる、高親和性マウスモノクローナル抗体を生成するために、3系統のマウスを用いた。具体的には、以下の通りにBalb/c、CD-1およびFVBのマウス系統をヒト組換えNotumで免疫化して、ハイブリドーマの生成のために用いた。6匹の雌マウス各2匹:Balb/c、CD-1、FVBをNotum抗原の様々な調製物で免疫化することによってマウス抗体を生成した。免疫原にはHisタグ付きヒトNotum、または293細胞で発現されるNotum-Fcが含まれた。全ての注射について、足蹠経路を通してマウスを免疫化した。等容量のTITERMAXまたはミョウバンアジュバントで乳化させた10μgのNotum免疫原を免疫化のために用いた。ヒトNotumに特異的なマウスIgG抗体についてマウス血清をスクリーニングするために、固相ELISAアッセイを用いた。簡潔には、PBS中の0.01~1μg/mLの異なる濃度のNotum-His実施例7からでプレートを一晩コーティングした。0.02v/vTween20を含有するPBSによる洗浄の後、PBS中の3w/vBSAにより、200μL/ウェルでウェルをRTで1時間ブロックした。Notum-Hisでコーティングされたプレートの上で、50μL/ウェルで、マウス血清希釈物をRTで1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に3BSA-PBSで1:10,000に希釈した50μL/ウェルのHRP標識ヤギ抗マウスIgGと一緒にRTで1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、100μL/ウェルのTMB基質溶液をRTで15分間にわたり加えた。洗浄の後、プレートをTMB基質ThermoScientific34028で発色させ、OD450において分光計で解析した。血清陽性の免疫化マウスを屠殺し、流入領域リンパ節肥大している場合、膝窩および鼠径部を切除して、抗体産生細胞の供給源として用いた。電気融合によってB細胞の単一細胞懸濁液6.35×107細胞を非分泌性P3x63Ag8.653骨髄腫細胞ATCCCRL-1580と1:1の比で融合させた。電気細胞融合は、融合発生器モデルECM2001Genetronic,Inc.を用いて実施した。細胞は、HATSigmaA9666を補充したハイブリドーマ選択培地DMEMCellgrocat15-017-CM培地、15胎児クローンI血清Hyclone、1mMピルビン酸ナトリウム、4mML-グルタミン、10μg/mLゲンタマイシン、50μM2-メルカプトエタノール、100μMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリンおよび16μMチミジンを含有するに再懸濁させ、次に、最終的に96ウェルプレートにつき2×106個のB細胞を平板培養することを基準にして、20個の96ウェル平底組織培養プレートに200μL/ウェルで平板培養した。次に、5のCO2および95の空気を含有する37°Cの加湿インキュベーターに、プレートを7~10日間置いた。上記のものに類似したELISAアッセイを用いて、マウス免疫グロブリンを分泌する増殖陽性ハイブリドーマのウェルを、Notum特異性についてスクリーニングした。簡潔には、96ウェルプレートVWR、610744に、炭酸ナトリウム緩衝液中の0.4μg/mLのヒトNotum-Hisを4°Cで一晩コーティングした。プレートを洗浄し、1BSA-PBSを用いて37°Cで1時間ブロックし、その後直ちに用いるか4°Cで保存した。未希釈のハイブリドーマ上清を、RTで1時間プレートの上でインキュベートした。プレートを洗浄し、1BSA-PBSで1:10,000に希釈したHRP標識ヤギ抗マウスIgGによってRTで1時間プロービングした。プレートは、次に前記の基質溶液と一緒にインキュベートし、OD450で読み取る。あるいは、ELISAプレートにhNotum-Fcを捕捉するために、ELISAプレートをヤギ抗ヒトIgGFcでコーティングした。プレートを洗浄し、3BSA-PBSを用いてRTで1時間ブロックし、未希釈のハイブリドーマ上清をスクリーニングするために用いた。その後、プレートを洗浄し、3BSA-PBSで1:10,000に希釈したHRP標識ヤギ抗マウスIgGによってRTで1時間プロービングした。プレートは、次に前記の基質溶液と一緒にインキュベートし、OD450で読み取った。Notum特異的ハイブリドーマを細胞培養で拡大増殖させ、再平板培養し、再スクリーニングし、限界希釈または単一細胞FACS選別によって逐次的にサブクローニングした。生じたクローン集団を拡大増殖させ、凍結用培地90FBS、10DMSOで冷凍保存し、液体窒素に保管した。ELISA解析から、これらのハイブリドーマのほとんどまたは全てからの精製抗体が、濃度依存的にNotumに結合することが確認された。ELISAプレートへNotumが直接結合することがタンパク質の変性を引き起こすことができ、見かけの結合親和性は未変性タンパク質への結合を反映することができない点に注意すべきである。2つの融合を実施し、各融合は20枚のプレートに播種された1920ウェル/融合。これは、ヒトNotumに特異的な数ダースのマウス抗体を与えた。実施例10Notumモジュレーターの特徴付け前の実施例で生成されたNotumモジュレーターは、以下のように特徴付けられた:抗体捕捉Biacore技術を用いて、抗体の結合特性を評価した。解離定数値Kdkoff/konを、選択された抗体について決定した。表面プラズモン共鳴SPR動態測定のために、Biacore3000GEHealthcareバイオセンサーを用いた。精製抗体を用いて、センサー表面での抗体の捕捉を通して定量的koff定数を導いた。標準のアミンカップリング化学を用いて、センサーチップのCM5表面に抗マウスIgGを固定化した。抗原を固定化抗体の上に注入して抗体抗原相互作用の解析を可能にする前に、各mAbを抗IgG表面に捕捉した。抗Notum抗体のBiacore解析を用いて得られた定量的Kd値は、モノクローナル抗体のいくつかが非常に高親和性であり、Kd測定値は1×10-7Mから7×10-10Mの範囲にあることを明らかにする。実施例11Notumモジュレーターのエピトープ決定多重化競合的抗体ビニングは、参考として本明細書に援用される、Jiaら、2004年、PMID:15183088に概略されている。参照mAbを捕捉するために、多重Luminexビーズを抗マウスIgGに結合した。各mAbが固有のスペクトルアドレスと関連するように、各ビーズは固有のスペクトルコーディングを有していた。mAbビーズ複合体の全てをマスターミックスにプールし、96ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに等分して入れた。各ウェルでの参照抗体-ビーズ複合体のマスターミックスをまず抗原と、次にプローブmAbと一緒にインキュベートしたが、各ウェルにつき1つの異なるプローブmAbであった。競合的抗体ビニングアッセイでの抗原は、組換えNotum-Hisであった。プローブmAbは、異なるエピトープを認識する参照mAbによって捕捉されていた抗原だけに結合した。シグナルは、Luminex100でRFUとして読み取られた。この実験は、スクリーニングされた抗体が、Notumタンパク質の上の少なくとも4つの異なるエピトープに結合することを示した。実施例12Notumモジュレーターの配列決定上記に基づいて、見かけ上高い親和性で固定化ヒトNotumに結合するいくつかの例示的な異なるモノクローナル抗体を選択した。図7Aおよび7Bで表形式により示すように、実施例9からのmAbをコードするDNAの配列解析は、多くが固有のVDJ再配列を有し、新規相補性決定領域を提示することを確認した。図7Bに示す相補性決定領域が、上記のChothiaらに従って定義されることに注意されたい。配列決定の開始のために、TRIZOL試薬をInvitrogenLifeTechnologiesから購入した。1工程RTPCRキットおよびQIAquickPCR精製キットをQiagen,Inc.から購入し、RNasinはPromegaからであった。カスタム仕様のオリゴヌクレオチドは、IntegratedDNATechnologiesから購入した。ハイブリドーマ細胞を、RNA調製のためにTRIZOL試薬で溶解した。104μLから105の間の細胞を、1mlのTRIZOLに再懸濁させた。200μlのクロロホルムを添加した後、管を激しく振盪させた。試料を、4°Cで10分間遠心分離した。水相を新鮮なミクロチューブへ移し、等容量のイソプロパノールを加えた。管を激しく振盪させ、室温で10分間インキュベートした。その後、試料を4°Cで10分の間遠心分離した。ペレットを1mlの70エタノールで一度洗浄し、室温で短時間乾燥させた。RNAペレットを、40μlのDEPC処理水で再懸濁させた。RNA調製物の品質は、1アガロースゲルで3μLを分画することによって決定した。使用するまで、RNAを-80°Cのフリーザーに保管した。マウス免疫グロブリンの重鎖およびカッパ軽鎖に特異的なコンセンサスプライマーセットで増幅されたハイブリドーマの可変DNA配列は、可変ドメインプライマーの混合物を用いて得られた。各RNA試料からVHおよびVK遺伝子セグメントを増幅するために、1工程RT-PCRキットを用いた。Qiagen1工程RT-PCRキットは、SensiscriptおよびOmniscript逆転写酵素、HotStarTaqDNAポリメラーゼ、Qiagen1工程RT-PCR緩衝液、dNTPミックスおよびQ溶液、困難な例えば、GCに富む鋳型の効率的な増幅を可能にする新規添加剤のブレンドを提供する。3μLのRNA、100μMの重鎖またはカッパ軽鎖プライマーの0.5、5μLの5×RT-PCR緩衝液、1μLのdNTP、逆転写酵素およびDNAポリメラーゼを含有する1μLの酵素混合物、ならびに0.4μLのリボヌクレアーゼ阻害剤RNasin1ユニットを含む反応混合物を調製した。反応混合物は、逆転写およびPCRの両方に必要とされた試薬の全てを含有する。サーマルサイクラープログラムは、RT工程の50°Cで30分間、95°Cで15分間、続いて30サイクルの95°Cで30秒間、48°Cで30秒間、72°Cで1.0分間であった。次に、72°Cで10分間の最終インキュベーションがあった。直接DNA配列決定のためにPCR産物を調製するために、製造業者のプロトコールに従ってQIAquick商標PCR精製キットを用いてそれらを精製した。50μLの滅菌水を用いてスピンカラムからDNAを溶出させ、次に両方の鎖から直接に配列決定をした。PCR断片を直接に配列決定し、DNA配列はVBASE2を用いて解析したRetterら、NucleicAcidRes.33巻;671~674頁、2005年。上記のように、24個24の例示的な抗体重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列および核酸配列を図8A~8Xにそれぞれ示し配列番号3~98、これらおよび追加の抗hNotum抗体の遺伝子上の配置および派生CDR上記、Chothiaらによって定義されるを、図7Aおよび7Bに表の形式でそれぞれ示す配列番号103~330。実施例13点変異を含むNotumモジュレーターの構築前記のように、Notumは酵素のα/βヒドロラーゼスーパーファミリーのメンバーである。Notumの配列解析は、Gly230から始まるGXSXGのシグネチャー触媒エルボー配列signaturecatalyticelbowsequenceを特定し、そのSer232は、このスーパーファミリーに特徴的な求核体、酸性残基およびヒスチジンの触媒三つ組の推定上の求核性残基であろう。ショウジョウバエ型S237A、Kreuger、2004年、PMID:15469839およびマウス型S239A、Traister、2008年、上記のオルソログ残基の部位特異的変異誘発は、不活性のタンパク質をもたらす。したがって、そのタンパク質のHisタグ付きバージョンでS232A変異を生成するためにすなわち、hNotum-S232A-His、野生型ヒトNotumタンパク質の上で部位特異的変異誘発を実施するために、標準の分子生物学的技術QuickChangeMutagenesisキット、Stratagene/Agilent,Inc.を用いた。同様に、配列アラインメントは、ヒトD340が触媒性の酸性残基であることを示唆する。したがって、分子のD340A変異バージョンを生成するために同じキットを用いてこの残基を変更した。実施例7および8に示すように、ヒトNotum-hFc発現ベクターすなわち、hNotum-S232A-hFcにこの変異を含むNotumドメインをクローニングするために、PCRクローニングを用いた。前述のように次に構築物を発現させ、精製した。実施例14NotumモジュレーターはWnt3Aの正準のシグナル伝達を変更するショウジョウバエのNotumはWinglessシグナル伝達の機能的アンタゴニストであることが示されたが、マウスのNotumは一過性トランスフェクションアッセイでベータカテニンルシフェラーゼレポーターの誘導に拮抗することが示されている。正準のWntシグナル伝達の活性化のためのレポーターを含む細胞の安定した集団を生成するために、HEK293T細胞をレンチウイルスベクター、すなわちTCFの転写応答エレメントの4つのタンデムリピートに連結された最小限のCMVレポーターの制御下の二官能基のGFPおよびルシフェラーゼレポーターカセットをコードするpGreenFire1-TCFSystemBiosciencesで形質導入した。293.TCF細胞と呼ばれる形質導入された細胞集団は、以下の通りにWnt3Aの正準のシグナル伝達アッセイでその後用いられた:96ウェル組織培養プレートの各ウェルに、50μLの無血清DME培地に2.5×104の293.TCF細胞を平板培養した。24時間の血清飢餓の後、L/Wnt3A細胞ATCCCRL-2647;Willert、2003年からの馴化培地CMの様々な希釈物、または親のL細胞ATCCCRL-2648からの未希釈CMの25μLを、DMEM0.2FBSの25μLと一緒に各ウェルに加えた。CMの添加の18時間後に、100μLのOne-Glo溶液ProMegaCorp.を各ウェルに加えた。細胞を溶解するために次に各ウェルの内容物を完全に混合し、溶解物の100μLを黒い96ウェルプレートに移し、5分後にWallacVictor3Multilabel計数器Perkin-ElmerCorpを用いて各ウェルの発光を読み取った。図9Aに見られるように、Wnt3Aを含有するCMの異なる濃度へ曝露させた細胞は、L細胞対照CMへ曝露させた細胞と比較してルシフェラーゼシグナルの2倍から4倍の間の誘導を一般的に示した。より詳しくは、Wnt3ACM培地が25からおよそ3に希釈されるに従って、Wnt経路の活性化は発光の対応する減少と一緒に減少した。ルシフェラーゼレポーター系が確立されたならば、様々なNotumモジュレーターの生物活性を決定するためのアッセイを以下の通りに実施した。96ウェル組織培養プレートの各ウェルに、50μLの無血清培地に2.5×104の293.TCF細胞を平板培養した。23時間の血清飢餓の後、様々な濃度の様々なNotumモジュレーター例えば、上の実施例7、8および13に従って得られたhNotum-His、hNotum-hFc、hNotum-S232A-His、マウスNotum-His、マウスNotum-hFc、マカクNotum-hFc、対照タンパク質-Hisまたは対照タンパク質-hFcを含有するDMEM0.2FBSの25μLを細胞に加えた。1時間後に、25μLのWnt3Aまたは対照L細胞のCMを各ウェルに加えた。CMを加えてから18時間後に、100μLのOne-Glo溶液ProMegaCorp.を各ウェルに加え、各ウェルの内容物を完全に混合して細胞を溶解し、溶解物の100μLを黒い96ウェルプレートに移し、5分後に発光を読み取った。図9B、9Cおよび9Dに見られるように、ヒトNotum-His、ヒトNotum-hFc、マウスNotum-His、マウスNotum-hFcおよびマカクNotum-hFcの全ては、293.TCF細胞でWnt3Aによって媒介されるルシフェラーゼの誘導に機能的に拮抗するが、実施例13からのヒト-NOTUMS232A変異体HisおよびhFcならびに対照-Hisおよび対照-hFcタンパク質は、293.TCF細胞でWnt3Aによって媒介されるルシフェラーゼの誘導に拮抗しなかった。本発明の化合物を特徴付けるのに有用な機能アッセイの開発を実証する他に、図9B~9Dは、可溶性Hisタグ付きNotum構築物およびFc-Notum融合タンパク質の両方が本明細書の教示に従ってNotumモジュレーターとして効果的に作用することを示す。より具体的には、図9Bは、ルシフェラーゼ活性の減少で示される、Wnt経路に及ぼすhNotum-FcおよびhNotum-Hisモジュレーターの濃度依存的効果を例示し、IC50計算値はそれぞれ0.4702および0.5031である。これらの結果は、Notum-hFcおよびNotum-HisモジュレーターがWnt3A経路に濃度依存的に拮抗するが、実施例13の変異体Notumモジュレーターは拮抗しないことをグラフで例示する図9Cで確認される。同様に、図9Dは、マウスNotumモジュレーターHisおよびFcおよびマカクNotum-hFcもWnt3A正準経路に濃度依存的に拮抗することを示す。上記データはNotum/Wntバイオアッセイを確証し、Notum細胞外ドメインの少なくとも一部を含む様々な可溶性Notum構築物がWnt経路に拮抗することができることを示す。実施例15NotumモジュレーターはinvitroでNotum活性を中和する上記の293.TCF細胞を用いて、ELISAアッセイによってNotumに結合することが示された実施例9ハイブリドーマからの上清および/または精製抗体を、以下の通りにhNotum-HisまたはhNotum-Fc活性を中和するそれらの能力についてスクリーニングした。96ウェル組織培養プレートの各ウェルに、50μLの無血清培地に2.5×104の293.TCF細胞を平板培養した。23時間の血清飢餓の後、様々な濃度の様々なNotumタンパク質を含有するDMEM0.2FBSの10μLを、ハイブリドーマからの上清の15μLまたは様々な濃度の精製抗体の15μLのいずれかと混合し、室温で5分間インキュベートした。25μLの抗体:Notum混合物を、次に293.TCF細胞に加えた。1時間後に、25μLのWnt3Aまたは対照L細胞のCMを各ウェルに加えた。CMの添加の18時間後に、100μLのOne-Glo溶液ProMegaCorp.を各ウェルに加えた。細胞を溶解するために次に各ウェルの内容物を完全に混合し、溶解物の100μLを黒い96ウェルプレートに移し、5分後に発光を読み取った。抗体活性の解析のために、RAWルシフェラーゼRLUをプロットしたか、データを正規化してWnt3ACM活性を1に、およびL細胞対照培地をゼロに設定したか正規化されたWnt3誘導ルシフェラーゼ活性としてグラフに示す、または正規化してWnt3ACM活性を1に、および最大Notumアンタゴニスト活性時のルシフェラーゼシグナルをゼロに設定した中和活性としてグラフに示す。図10に見られ得るように、10μg/mLの濃度で加えたとき、抗体のいくつかはNotum活性を阻害することができた。さらに、選択されたNotumモジュレーター例えば、SC2.A106[別名10B3]およびSC2.D2.2は特に有効であることが判明し、同じ濃度で80を超えるNotum阻害を示した。293.TCFルシフェラーゼ誘導アッセイでヒトNotumの活性を阻害して、陰性対照とほぼ同じレベルまでルシフェラーゼシグナルを回復するその能力を実証するために、抗体SC2.D2.2をさらに特徴付けした図11A。より詳しくは、図11Aは、SC2.D2.2上清および精製抗体が濃度依存的に作用して、加えられたhNotum-Hisの効果に拮抗することを示す。この効果は、SC2.D2.2精製抗体がそれぞれNotum-His図11BおよびNotum-hFc図11Cの様々な濃度に対して滴定される、図11Bおよび11Cでさらに例示される。各図の生じた曲線での変曲点は、抗体のモジュレーション活性が濃度依存的に作用して、可溶性Notumの絶対量と比較してNotum活性に拮抗することを確認する。さらに、図11Dに見られるように、見かけ上はSC2.D2.2と同程度でないが、第2のNotumモジュレーターSC2.A106もヒトNotum-Hisの活性を阻害することができた。まとめると、これらの結果は、本明細書で開示されるNotumモジュレーターが有効な中和候補を提供し、腫瘍始原細胞の頻度を低減するためのそのような化合物の使用を強く指し示すことを示す。実施例16NotumモジュレーターのELISAによる特徴付け抗体によって提示される高度の特異性はしばしば抗原オルソログに対する異なる効力をもたらし、それは疾患の異なる動物モデルでのこれらの分子の効能に影響を及ぼすことができる。Notumの構造-機能関連性を調査するために、ヒト、マカクおよびマウスのNotumタンパク質実施例7および8をコードするcDNA配列をクローニングした。これらの動物からのNotumタンパク質の推測されたアミノ酸配列は高度の相同性を示し、それは、いくつかの種で観察されている生物学的および免疫学的交差反応性を説明する。前に論じたように、ヒトNotumはサルNotumと97同一であり、マウスと91同一である。1ジスルフィド結合成熟したヒトNotum配列中の16個のCys残基はマウスNotum配列で保存されている2N-グリコシル化部位;および3共通の酵素活性に基づいて予測された活性ドメインの完全な保存がある。アミノ酸置換のほとんどは、保存的である。ヒトおよびマウスの配列のN末端部分が最も多くのバリエーションを示し、いくつかのアミノ酸置換、欠失および/または挿入があった図1C。実施例9に従って、マウスを免疫化してモジュレーターを生成するために、ヒトNotumの抗原構築物を用いた。ヒトとマウスのNotumタンパク質の間に91の配列相同性があり、これらの抗体の大部分はマウスNotumタンパク質と交差反応すると予想された。ヒトおよびマウスNotumcDNAの一過性トランスフェクションから生成された精製Notum抗原への選択されたハイブリドーマ由来のマウスmAbの結合は、ELISAアッセイを用いて試験された。当技術分野で認識される技術を用いてELISAプレートを直接にコーティングするために、ヒトおよびマウスのNotumを用いた。マウスmAbの結合は、HRPコンジュゲートヤギ抗マウス抗体と、続く比色西洋ワサビペルオキシダーゼproxidase基質TMB基質、ThermoScientifcとで検出した。ELISAプレートの各ウェルの吸光度は、450nmにおいてマイクロプレートリーダーで測定した。直下の表1に見られるように、試験した46個の抗体のうちの22個はヒトNotumに特異的であった:実施例17SC2.D2.2NotumモジュレーターのエピトープマッピングSC2.D2.2とヒトNotumとの相互作用の構造的基礎をより良く理解するために、キメラNotumタンパク質を製作した。このアプローチは、オルソログが構造的に関係しているという事実を利用する。その目的のために、マウスNotumマウス残基150~484に融合させたヒト成熟Notumタンパク質残基19~144両遺伝子は実施例7と一致するのN末端で構成されるキメラNotum分子を生成し、前の実施例に示すのと同様の方法で発現させた。インフレームで融合体Notumキメラタンパク質の構築のために、ヒトNotum遺伝子のBamHI制限切断部位を用いた。次に、Hisタグ付きキメラNotum配列を含む発現ベクターを構築した。キメラNotum分子を試験し、上記のWntバイオアッセイで機能的に活性であることがわかった下の実施例27を参照。ヒトおよびマウスのNotumのcDNAの一過性トランスフェクションから生成された精製Notum分子へのSC2.D2.2および他のマウスmAbの結合は、ELISAプレートに直接にコーティングされたヒトNotum、マウスNotumおよびキメラヒト/マウスNotumによるELISAアッセイを用いて試験した。抗NotummAbの結合は、HRPコンジュゲートヤギ抗マウス抗体と、続く比色西洋ワサビペルオキシダーゼ基質TMB基質、ThermoScientifcとで検出した。ELISAプレートの各ウェルの吸光度は、450nmにおいてマイクロプレートオートリーダーで測定した。前記のELISAアッセイは、ヒトNotumおよびNotumキメラタンパク質へのSC2.D2.2抗体の結合を確認し、SC2.D2.2エピトープがヒトNotumタンパク質のN末端の最初の135残基の中にあることを確認した。実施例18Notumモジュレーターは差次的種活性を示す293.TCF細胞を用いて、マウスNotum-HisまたはマカクNotum-Fc活性を中和するそれらの能力について、精製されたSC2.D2.2およびSC2.A106抗体を以下の通りに試験した。96ウェル組織培養プレートの各ウェルに、50μLの無血清培地に2.5×104の293.TCF細胞を平板培養した。23時間の血清飢餓の後、様々な濃度のNotumタンパク質を含有するDMEM0.2FBSの10μLを、様々な濃度の精製抗体の15μLと混合し、室温で5分間インキュベートした。25μLの抗体/Notum混合物を、次に293.TCF細胞に加えた。1時間後に、25μLのWnt3Aまたは対照L細胞のCMを各ウェルに加えた。CMの添加の18時間後に、100μLのOne-Glo溶液ProMegaCorp.を各ウェルに加えた。細胞を溶解するために各ウェルの内容物を完全に混合し、溶解物の100μLを黒い96ウェルプレートに移し、5分後に発光を読み取った。実施例16に見られるようにマウスNotumと交差反応性でないことに加えて、SC2.D2.2はマウスNotumまたはマカクNotumのいずれの活性も阻害しなかった図12A。同様に、実施例16でマウスNotumと交差反応性を示すにもかかわらず、抗体SC2.A106はマウスまたはマカクのNotumの活性を阻害しなかった図12B。エピトープは成熟Notumタンパク質のN末端の最初の135アミノ酸残基にあること、およびSC2.D2.2がマカクNotumの機能を阻害すること、またはマウスNotumに結合するかその機能を阻害することができないことを示唆する実施例17のELISAデータに従って、SC2.D2.2の結合は、Asn129成熟Notumタンパク質の最初から番号をつける活性に干渉する可能性がある。図1Cの配列アラインメントを参照。すなわち、マカクおよびヒトのNotumの関連する部分で唯一のアミノ酸差がAsn129にあるので、直接的な吸蔵occlusionすなわち、エピトープがエピトープを含む、またはコンフォメーション変化、または立体障害のいずれかによるこの部位への干渉が強く示唆される。実施例19Notumモジュレーターは、共培養アッセイでWnt経路のNotum拮抗作用を低減するNotum産生細胞のinvivoでの挙動をより細かくモデル化するために、親の293T細胞293.nullまたは可溶性Notumを発現する293T細胞すなわち、293.Notum細胞のいずれかのエフェクター細胞がレポーター293.TCF細胞と様々な比で混合された共培養実験を実施した。次に、Wnt3ACMによる処理の後に、抗体の存在下でのNotumの活性または阻害をこれらの細胞混合物から決定した。簡潔には、平板培養の前に1ウェルにつき50μLの無血清培地に細胞を混合することにより、エフェクター細胞とレポーター細胞との3つの異なる比、すなわち96ウェルプレートの各ウェルにつき5×104:2.5×104、2.5×104:2.5×104細胞、または2.5×104:1.0×104細胞に対応する、2:1、1:1および1:2.5を試験した。直接的な共培養実験のために、23時間の血清飢餓の後、25μLのWnt3Aまたは対照L細胞のCMを、100μLの最終容量まで、各ウェルにつき25μLのDMEM0.2FBSと一緒に各ウェルに加えた。CMの添加の18時間後に、100μLのOne-Glo溶液ProMegaCorp.を各ウェルに加えた。細胞を溶解するために次に各ウェルの内容物を完全に混合し、溶解物の100μLを黒い96ウェルプレートに移し、5分後に発光を読み取った。図13Aに見られるように、全ての場合で、Notumを分泌するエフェクター細胞との共培養は、親の293Tエフェクター細胞との共培養に対して全ての比においてWnt3A誘導ルシフェラーゼ活性のより低いレベルに導く。興味深いことに、ルシフェラーゼ活性の全体的な誘導は、1ウェルあたりの細胞総数の減少に伴い増加し、培地消耗作用またはおそらく親の293細胞自体からの分泌Notumの低いレベルによる作用のいずれかを示唆する。抗体拮抗作用実験のために、25μLのDMEM0.2FBSおよび10μg/mLの最終濃度の抗体を含有するウェルに細胞混合物を平板培養した。平板培養から23時間後に、25μLのWnt3Aまたは対照L細胞のCMを各ウェルに加えた。CMの添加の18時間後に、100μLのOne-Glo溶液ProMegaCorp.を各ウェルに加えた。細胞を溶解するために次に各ウェルの内容物を完全に混合し、溶解物の100μLを黒い96ウェルプレートに移し、5分後に発光を読み取った。図13Bに見られるように、293.nullおよび293.TCF細胞の共培養へのSC2.D2.2の添加は、Wnt3ACMによるルシフェラーゼ活性の誘導に対してほとんど影響を及ぼさない。293.Notumと293.TCF細胞の共培養の場合、SC2.D2.2抗体の添加はWnt3Aによって誘導されるルシフェラーゼの量を増加させ、抗体が293-Notum細胞から分泌されるNotumを阻害し、293.TCF細胞へのそのパラクリン作用を妨害することと一致する。invivo条件例えばNotumのオートクリンまたはパラクリン作用をより精密に模倣する実験系でのそのような結果は、本明細書で開示されるNotumモジュレーターが、動物でNotumによって媒介される事象に効果的に影響することができることを示唆する。実施例20細胞溶解物中のNotumタンパク質の検出ウェスタンブロットおよび、潜在的には免疫組織化学によってタンパク質発現を検出するマウスモノクローナル抗体を同定する試みにおいて、当技術分野の標準技術を用いて、変性条件下で4つの異なる細胞系HepG2、SW480、K562およびCHOからのタンパク質細胞溶解物をNuPAGE4-12Bis-トリスゲルLifeTechnologiesで泳動したrun。製造業者のプロトコールに従ってiBlot登録商標乾燥ブロッティング系LifeTechnologiesを用いて、タンパク質を次にPVDF膜へ移し、膜はPBST中の3BSAで2時間ブロックした。1μg/mLのマウスポリクローナル、または2つのマウスモノクローナル抗体SC2.A101またはSC2.A109の1つのいずれかで膜をプロービングし、ブロッキング、一次抗体と二次抗体によるインキュベーションの間にそれぞれ10分の間PBSTで3回洗浄した後に、ブロック緩衝液で1:5000に希釈したAP-AffiniPureヤギ抗マウスIgG、FcγFrag特異的JacksonImmunoResearchでNotumを検出した。次に、NBT/BCIP基質:アルカリ性ホスファターゼのためのすぐ使用できる沈降基質系を用いてNotumを検出した。この基質系は、色が青色から紫色で視覚的に観察することができる、不溶性NBTジホルマザン最終産物を産生する。細胞溶解物のプロービングのために用いられた抗体の各々は、SW480溶解物でヒトNotumを検出し、それは、サイズが単量体として約50kDa、多量体としては約125kDaのようであった図14A~14B。3つ全ての抗体でプロービングしたときには、おそらく非二量体化グリコフォームに相当する60kDa以下の範囲のわずかにより大きなバンドも観察された。実施例21プールされた様々な組織溶解物でのNotumタンパク質の差次的発現マウスポリクローナル抗体を用いてNotumタンパク質発現が検出された、11個の異なる腫瘍型またはそれらのそれぞれの正常な隣接組織からプールされた溶解物の2つの反復物を含む逆相タンパク質検証アレイを含む実施例6、OriGeneTechnologies前の実施例によって証明されたように、いくつかの腫瘍形成試料でのNotum遺伝子発現の増強を実証した後。ウェスタンブロットによってヒトNotumを認識するSCRx2.A109マウスモノクローナル抗体実施例20を用いて、11個の腫瘍型またはそれらのそれぞれの正常な隣接組織からの432個の組織溶解物の4つの希釈物を含むより包括的な逆相がんタンパク質溶解物アレイを、外因性プロモーターOriGeneTechnologiesによって駆動されたTP53過剰発現の有り無しで293細胞の対照と一緒に得た。比色検出試薬およびプロトコールはProteoScanアレイの製造業者OriGeneTechnologiesによって提供され、製作されたアレイ上のスポットは、スポット強度を定量化するためにBZScan2javaソフトウェアhttp://tagc.univ-mrs.fr/ComputationalBiology/bzscan/を用いるフラットベッドスキャナを用いてデジタル画像に変換した。データを前記のように生成し、1スポットあたりの平均ピクセル強度として表した。プロットされたデータは各組織標本の個々のスポット密度を表し、線は幾何平均を表す。これらのアレイからの結果は図15A~15Gに示され、Notumタンパク質の発現が、がん患者の特定の亜集団を含むいくつかの異なる腫瘍型で上方制御されることを示す。より具体的には、図15A~15Gは、ヒトNotumタンパク質の発現レベルが、黒色腫に加えて乳がん、結腸直腸がんおよび卵巣がんを有する患者のサブセットで上昇することを示す。さらに、Notumタンパク質発現は、膵臓がんの神経内分泌サブタイプを有するほとんどの患者で上昇するようである図15B。がん患者、特に後期の結腸直腸がんおよび疾患の膵臓神経内分泌サブタイプランゲルハンス島細胞腫瘍を有する患者の様々なサブセットにおいて上昇したNotumタンパク質発現は、これらの腫瘍型で進行疾患および/または転移を促進することにおけるNotumの役割を示唆する。腎臓および肝臓の腫瘍でのNotumタンパク質発現の見かけの低減も、図15Fおよび15Gの結果で示される。この低減は、第IV期肝臓がんを除いて疾患の後期の病期で一般により大きく、低減された局所のNotumレベルが腫瘍形成および腫瘍進行で役割を果たす可能性を示唆する。胆管がん腫瘍はNotumをほとんど有していない図15Gが、胆管がんは胆管のがんであり、比較のためのProteoScanアレイの上に正常な胆管組織はなかった。実施例22NotumモジュレーターはNotumによって誘導された細胞生存/増殖に拮抗する実施例2および3に示すように、結腸直腸腫瘍からの腫瘍永続細胞ではNotum発現が上昇することが実証された。Notumタンパク質がヒト結腸直腸がん細胞、HCT-116細胞またはマウス系統枯渇lineage-depletedNTX腫瘍細胞すなわちヒト腫瘍細胞の細胞増殖および/またはアポトーシスに影響を与えるかどうかを決定するために、下記のように平板培養して組換えhNotum例えばhNotum-HisまたはhNotum-hFcおよび抗Notum抗体へ曝露させた。次に、12~14日後に細胞数を評価した。より具体的には、invitroで腫瘍形成細胞を維持することが前に実証されていた無血清培地に、SCRx-CR4またはSCRx-CR42腫瘍からのマウス系統枯渇NTX腫瘍細胞を20,000細胞/ウェルで平板培養し、続いて24時間後に、NotumモジュレーターSC2.D2.2もしくはSC2.10B3、またはアイソタイプ対照抗体すなわちMOPCの存在下または不在下で、組換えヒトNotumHisまたはhFcを添加した。次に、細胞を37°C、5CO2および5O2で14日間インキュベートし、製造業者の指示通りにPromegaのCellTiterGloアッセイキットを用いて生存可能な細胞数を評価した。HCT-116細胞系市販されている結腸直腸腫瘍細胞系については、DMEM1FBSに1ウェルにつき2,000細胞で細胞を平板培養し、続いて24時間後に、モノクローナル抗体SC2.D2.2またはSC2.10B3の存在下または不在下で組換えヒトNotumを含有する無血清DMEMを添加した。次に、HCT-116細胞を37°C、5CO2で12日間インキュベートし、細胞生存度をPromegaのCellTiterGloアッセイキットで評価した。より高い読取値は、より高い生存細胞数の指標である。患者SCRx-CR42からのマウス系統枯渇NTX腫瘍細胞のhNotum-His10μg/mL曝露図16AまたはSCRx-CR4のhNotum-Fc1または10μg/mL曝露図16Bは、他の未処理の対照またはMOPCアイソタイプ対照抗体へ曝露させた細胞と比較して細胞数の20~45の増加をもたらした。反対に、ヒトNotum中和抗体SC2.D2.210μg/mLへのSCRx-CR4細胞高いレベルのNotum遺伝子を発現するの曝露は、適当なMOPCアイソタイプ対照抗体で処理された細胞と比較して有意により少ない増殖を示した図16B。同様に、抗Notum抗体SC2.10B310μg/mLも、SC2.D2.2ほど効果的でなかったが細胞数に負の影響を及ぼすことができた図16B。直前でなされた観察の確認として、10μg/mLのhNotumへのHCT-116細胞の曝露は、細胞数の2倍を超える増加をもたらした。重要なことに、hNotum曝露の結果としての細胞数の増加は用量依存的であるようであったが、抗Notumモノクローナル抗体SC2.D2.2の存在によって妨害された図16C。これらの観察は、ヒトNotumタンパク質例えばHisまたはhFc形態が細胞増殖を増大させ得、かつ/またはアポトーシスを弱め、上記のアッセイでより高い細胞数をもたらすことができることを実証する。さらに、本明細書の教示に従って、hNotum中和モノクローナル抗体SC2.D2.2はこの活性を妨害することができ、Notum媒介性増殖を弱める。実施例23Notumモジュレーターは、Notum誘導性エステラーゼ活性に拮抗する動物種にわたって見出されるそのオルソログを除いて、ヒトNotumは、植物のペクチンアセチルエステラーゼに最も緊密に関係している。それは、α/βヒドロラーゼスーパーファミリーのメンバーでもある。これらの関係は、酵素の可能な生化学機能を示唆する。Notumがカルボキシエステラーゼ活性を有するか否かを試験するために、標準のアッセイ条件Westら、PMID:19225166を用いて精製組換えhNotum-Hisを発色性エステラーゼ基質p-ニトロフェニルアセテートPNPAおよびp-ニトロフェニルブチレートPNPBと一緒にインキュベートした。簡潔には、PNPAまたはPNPBを10mMの最終濃度までイソプロパノールに溶解/希釈した。これらの基質溶液をアッセイ緩衝液0.1アラビアゴム、2.3mg/mLデオキシコール酸ナトリウムsodiumdexoycholate、1×PBSに1:10に希釈して、規定量のhNotum酵素とインキュベートし、発色団p-ニトロフェノールの酵素的放出を405nmでの吸光度測定によってモニタリングした。図17Aに見られるように、hNotumの増加する量は、37°Cで1時間のインキュベーションの後にPNBAからますます多くの量のp-ニトロフェノールを放出させ、Notumがカルボキシエステラーゼ活性を有することを実証する。推定上の触媒求核試薬が部位特異的変異誘発によって変更されている変異体NotumS232Aは、大幅に低減されたエステラーゼ活性を示した。図17Bに示すように、マウスおよびマカクのNotumタンパク質も、エステラーゼ活性を提示する。Bacillusstearothermophilusからの組換えエステラーゼSigma-Aldrichも、陽性対照としてアッセイに含まれた図17C。具体的には、図17Cは、任意の特定の時点で、PNPB基質白抜きの四角および破線に対してPNPA黒べたの四角および実線から放出されるp-ニトロフェノールのより強力なシグナルをhNotumが与えるが、Bacillusエステラーゼは、PNPA黒丸および実線に対してPNPB基質白丸および破線を優先的に加水分解するようであることを示す。このデータは、hNotumが定量可能な様式でエステラーゼ活性を誘導することができることを実証する。直前で提示された結果は、測定されたエステラーゼ活性が、開示されたNotumモジュレーターのさらなる特徴付けを可能にするアッセイを提供するために用いることができることを示す。これに関して、図18Aおよび18Bは、PNPAおよびPNBA基質の添加前の、NotumモジュレーターSC2.D2.2と一緒のhNotumタンパク質のプレインキュベーションが、大幅に低減されたエステラーゼ活性をもたらすことを実証する。これは前の実施例で提示されるデータと全体的に一致し、再度hNotumの酵素機能を中和するSC2.D2.2抗体の能力を実証する。より具体的には、図18Aは、SC2.D2.2の量が固定されなし、または10μg/mL、Notumの濃度が変動する用量反応曲線を示す。図18Aに見られ得るように、SC2.D2.2抗体が存在する場合には、hNotumレベルの増加は測定された酵素活性をある程度均一に増大させる。反対に、図18Bは、hNotumの量が1μg/mLに固定され、SC2.D2.2の濃度が変動する、測定された酵素活性の用量反応曲線を提供する。生じた曲線は、Notumモジュレーターの存在がhNotumの酵素活性の量を濃度依存的に急激に低減することを明らかに示す。対照的に、対照抗体MOPCは、Notumのエステラーゼ活性に影響を及ぼさないデータは示さず。当業者は、本実施例が、Notumの酵素活性に対するそれらの影響を測定することによって開示されているNotumモジュレーターを特徴付けるために用いることができる別のアッセイを実証することを理解するであろう。実施例24NotumモジュレーターはNotum誘導性リパーゼ活性に拮抗するα/βヒドロラーゼスーパーファミリーのメンバーとしてのNotumの特徴付けおよびその実証されたエステラーゼ活性に基づき、このタンパク質がリパーゼとして作用することもできると仮定された。当業者は、タンパク質のリパーゼ活性がTween20の脂肪分解を測定する比濁アッセイを用いて測定することができることを理解するであろうPrattら、2000年、PMID:10706660。このように、hNotumのリパーゼ活性を測定し、本発明のNotumモジュレーターを特徴付けるために用いることができるさらに別のアッセイを提供するために、Tween20の脂肪分解を含む実験を行った。簡潔には、50mMトリス、pH7.4、33.3mMのCaCl2および0.33Tween20を含有するアッセイ緩衝液に組換えhNotum1μg/ウェルを加えた。Tween20のモノラウリル基がリパーゼ例えばhNotumによって切断されるとき、遊離脂肪酸はCa2カチオンと不溶性複合体を形成して、濁った溶液をもたらし、そのODを405nmで測定してリパーゼ活性の尺度を提供することができる。陽性対照として、ブタ膵臓リパーゼSigmaAldrichの活性を同じアッセイで測定した。図19は、精製組換えNotumがTween20を用量依存的な様式で切断することが可能であることを示し、そのような測定が本発明の化合物を特徴付けるさらに別の方法を提供することを実証する。この酵素的特性を利用し、本発明の特性をさらに例示するために、Notumの脂肪分解活性に及ぼすNotumモジュレーターの影響を決定するためにアッセイを実行した。その目的のために、様々な濃度のSC2.D2.2をhNotumと一緒に設定された期間プレインキュベートし、その後その混合物をアッセイ緩衝液に加え、生じた酵素活性を前記のように測定した。アッセイの結果は、図20にグラフで表す。生じた曲線は、NotumモジュレーターSC2.D2.2のほとんど全ての濃度がNotumのリパーゼ活性を実質的に除去するが、ブタ酵素陽性対照のリパーゼ活性には重大な影響を及ぼさないことを明らかに示す。さらに、図20は、陰性対照抗体MOPCが、Notumまたはブタ膵臓リパーゼのいずれのリパーゼ活性も阻害しないことを示す。そのような結果は、開示されるNotumモジュレーターが、Notumタンパク質の酵素的特性を妨害または破壊し、そしておそらく生理的状況でその固有の腫瘍形成能力に影響を及ぼす能力を明らかに例示する。実施例25Notumヒドロラーゼ活性および点変異を含むNotumモジュレーターにおける活性減少の蛍光アッセイ標準のアッセイ条件を用いてヒドロラーゼの活性を測定するために、実施例23および24に記載されるアッセイに加えて、蛍光性エステラーゼ基質、4-メチルウンベリフェリルヘプタノエートSigmaを用いることができるRichardsonおよびSmith、2007年、PMID:17620441;JacksおよびKircher、1967年、PMID:5582971。簡潔には、4-MUHを1.2mMの最終濃度までDMSOに溶解した。この基質をアッセイ緩衝液0.1Mトリス、pH7.5、50mMのNaCl、0.05Brijに1:10に希釈し、規定量のNotum酵素または点変異Notum酵素と一緒にインキュベートし、WallacVictor3MultilabelカウンターPerkinElmerを用いて、蛍光分子4-メチルウンベリフェロンの酵素放出をモニタリングした355nm励起、460nm発光。図21Aは、増加する量の野生型ヒトNotum酵素が、Wnt3Aへの293.TCF細胞の応答を用量依存的な様式で阻害することができることを示すアッセイの詳細は実施例14に記載される。しかし、点変異体S232AおよびD340Aは、293.TCF細胞でWnt3Aの活性に拮抗する能力を示さない。同様に、時間をわたっての相対的蛍光シグナルの線形増加によって実証されるように、野生型ヒトNotum1反応につき62.5ngは4-MUH基質を加水分解することが可能であるが、S232AおよびD340A点変異体は4-MUH基質を加水分解する能力を示さない図21B。実施例26Notumは正準のWnt経路においてGsk3の上流の工程で作用する正準の例えばLEF/TCFシグナル伝達経路の簡略図を図22に表す。通常、ベータカテニンCTNNB1は、それが細胞のアキシン/APC/GSK3破壊複合体の一部である場合に1GSK3および図22に示されていない他のキナーゼによるそのリン酸化、および2その後のユビキチン化に続いて、細胞の細胞質でプロテオゾームへ速やかに渡される。それらの受容体FzdへのWnt分子の結合はDshのリン酸化を促進し、それは複合体からアキシンを動員して破壊複合体からのベータカテニンの放出を引き起こす。これは細胞の核へのベータカテニンのトランスロケーションを可能にし、そこで、それはLEF/TCF転写因子と複合体を形成してWnt応答性遺伝子を活性化する。LiClは、GSK3の小分子阻害剤でありKleinおよびMelton、1996年、PMID:8710892、それは、正準のWntシグナル伝達経路の文脈において、ベータカテニンの安定化および放出の促進によって下流でのWnt応答性遺伝子の活性化をもたらす。図23に見られ得るように、Wnt3AのCMおよびLiCl40mMの両方は、293.TCF細胞でルシフェラーゼ転写を活性化する。ヒトNotumはWnt3ACMに拮抗するが、SC2.D2.2単独ではWnt3ACMによるルシフェラーゼの誘導を阻害しない。しかし、SC2.D2.2はヒトNotumの活性を用量依存的な様式で阻害することができ、Wnt3A誘導性のルシフェラーゼ発現の回復をもたらす。最も重要なことに、LiClはヒトNOTUMおよび/またはSC2.D2.2の存在とは無関係にルシフェラーゼレポーターを活性化することができ、Notumおよびモジュレーター抗体がGSK3の上流でそれらの作用を発揮することを示す。実施例27その生物活性に関係があるSC2.D2.2エピトープの重要な残基の描写実施例17に記載されたキメラヒト/マウスNotumタンパク質を、293.TCFアッセイに入れた。図24Aは、キメラ分子がWnt3ACMによって媒介されるルシフェラーゼの誘導を阻害することができるが、その効力は野生型タンパク質より低いことを示す。図24Bは、この活性をSC2.D2.2で中和することができることを示し、実施例17で提示されるELISAデータと一致して、SC2.D2.2のエピトープがNotumの最初の144残基に含有されることを示す。まとめると、キメラ分子の生物活性を中和するSC2.D2.2の能力、実施例18に示すようなNotumの様々な種形態に対するSC2.D2.2の活性データ、および図1Cに示す配列アラインメントは、SC2.D2.2のエピトープではヒトNotumのD141残基が重要な残基である可能性を示唆する。図1Cは、成熟したNotumタンパク質の最初からの番号付けに基づいて、その残基にD129と注をつけるが、D141の注は野生型ヒトタンパク質前駆体を考慮している点に注意されたい。エピトープでのその残基の重要性を正式に実証するために、ヒトNotumのこの残基をマカクD141NまたはマウスD141Sの残基のいずれかへ点変異させるために、標準の分子生物学的技術を使用した。同様に、この位置のマカク残基をヒト残基N141Dへ点変異させた。図25は、これらの点変異の各々が、293.TCFアッセイ図25Aおよび4-MUH加水分解アッセイ図25Bで生物活性を保持したタンパク質を与えたことを示す。しかし、これらの点変異体は、SC2.D2.2によって中和されるそれらの能力で異なった図26。マカク残基またはマウス残基のいずれかへのヒト残基の変異は、変異体Notumタンパク質を中和するSC2.D2.2の能力を除去したが図26A、マカクタンパク質残基をヒト残基N141Dへ変更することは、野生型マカクタンパク質を中和することができない図12Aにもかかわらず、今度はSC2.D2.2が変異体タンパク質を中和するのを可能にした図26A。SC2.D2.2による中和挙動のこのパターンは、4-MUHアッセイでの変異体タンパク質でも観察された図26B:ヒトD141残基の変更は、生じたタンパク質D141N、D141Sを中和するSC2.D2.2の能力を除去したが、マカク残基N141の変更は抗体が変異体タンパク質マカクN141Dを中和するのを可能にした。これらのデータは、Notumタンパク質の生物活性を中和するSC2.D2.2の能力のためのD141残基の重要性を明らかに実証する。実施例28NotumとrhWnt3AとのインキュベーションはWnt活性の不活性化をもたらすWnt3Aシグナル伝達のNotum媒介性拮抗作用の動態を決定するために、293.TCF細胞への複合体の添加の前に、組換えNotumを、単独で、またはSC2.D2.2の存在下で、組換えヒトWnt3ArhWnt3Aと一緒に37°Cで2時間プレインキュベートした。rhWnt3Aによるルシフェラーゼのこの生じた誘導を、NotumだけがまたはNotumSC2.D2.2がrhWnt3Aの添加前の2時間細胞に加えられた、293.TCFアッセイのための標準プロトコールを用いて観察されたものと比較した。図27Aに見られ得るように、標準のアッセイ条件は、SC2.D2.2の不在下でNotumが250ng/mLのrhWnt3Aへ曝露させた293.TCF細胞でルシフェラーゼの誘導を阻害することができること黒丸、および、rhWnt3Aの添加前に10μg/mLのSC2.D2.2とともにNotumをインキュベートすることはrhWnt3Aに拮抗するNotumの能力を妨害すること白丸を示す。しかし、293.TCF細胞への添加前のNotumおよびrhWnt3Aのプレインキュベーションが興味深い。この場合には、rhWnt3Aへの細胞の応答は大幅に低減される黒丸、図27B。対照的に、rhWnt3Aとのプレインキュベーション前のNotumとSC2.D2.2との複合体化は、rhWnt3Aへの細胞の感受性を回復させる白四角、図27B。合わせると、これらのデータは、細胞表面に存在する分子と相互作用するのとは対照的に、NotumがrhWnt3Aを直接に不活性化する可能性を示唆する。実施例29Notum活性の小分子阻害実施例23、24および25に示す試験はNotumがエステルおよび脂質を加水分解する能力を有することを示し、実施例28に提示するデータはそれが直接にrhWnt3Aに作用することができることを示唆する。Notumの推定上のヒドロラーゼ活性と一致して、この不活性化がWnt3Aを脱脂するNotumの能力に関係すると仮定することができた。2つの脂質がWnt3Aに連結することが公知であり、Cys77の飽和パルミテート鎖およびS209の不飽和パルミトレオイル鎖がそれであるLorenowiczおよびKorswagen、2009年、PMID:19559695。両方の脂質鎖は、Wnt3Aの分泌ならびにシグナル伝達にとって重要であることが示唆されているFranch-Marroら、2008年、PMID:18430784。パルミテートはCys77でのチオエステル結合を通してWnt3Aに連結するので、このことはNotumがチオエステラーゼ酵素の公知の阻害剤によって不活性化されるかもしれないことを示唆する。そのような1つの小分子はオルリスタットXenical登録商標であり、それは多サブユニット酵素の脂肪酸シンターゼのチオエステラーゼサブユニットを阻害することが示されているKridelら、2004年、PMID:15026345。したがって、実施例25に記載される4-MUHアッセイを、様々な量の4-MUH基質240μMまたは90μMおよびオルリスタット0~170μMの存在下で実施した。図28に見られるように、オルリスタットは4MUHへのNotumの加水分解活性を用量依存的な様式で阻害し、Notumを阻害する小分子および公知のリパーゼ阻害薬物の両方の能力を実証する。実施例30Notumとのインキュベーションに応じてのWnt3Aの物理的挙動の変化NotumがWnt3Aに直接に作用してタンパク質を脱脂するならば、この切断はタンパク質の疎水性の変化をもたらすはずであり、それはTritonX114分配アッセイで水相と界面活性剤相の間でのその分配挙動の変化によって測定することができるBordier、1981年、PMID:6257680:脂質付加されたWnt3Aは水相中に見出されるが、脱脂されたWnt3Aは水相で目立つはずであるWillertら、2003年:PMID:12717451。Notumの酵素的特性を実証するために、0.1BSA中の1.5μgのrhWnt3ARDSystemsを、250ngのNotumと一緒に室温で一晩インキュベートした。等容量の4.5TritonX114を混合物に加え、混合物を氷上で5分間、次に37°Cで5分間インキュベートした後、室温で5分間の2000×gによる遠心分離を用いて相を分離した。分離の後、イオン強度およびTritonX114含有量を正規化するために各試料を調整した後に、PAGE電気泳動によってアリコートを解析した。ゲルを泳動した後に、抗rhWnt3A抗体CellSignalingTechnologyを用いるイムノブロッティングのための膜へタンパク質バンドを移した。バンドは、SuperSignalWestPico化学発光基質ThermoFisherScientificを用いて可視化した。図29Aに示すブロットで見られるように、Notumの不在下では、rhWnt3AはTritonX114相レーン6だけに出現し、水相レーン5には現れない。反対に、rhWnt3AとNotumとのインキュベーションは、水相レーン8ならびにTritonX114レーンレーン9でのrhWnt3Aの出現をもたらす。これらのデータは、Wnt3Aを脱脂するNotumの能力を示唆させる。しかし、そのような脱脂は本実験条件の下では不完全であり、それによってTritonX114相で一部のrhWnt3Aの観察された保持をもたらす可能性がある。NotumがショウジョウバエでSonicHedgehogShhのモジュレーションに関連付けられていることも興味深いAyersら、2010年、PMID:20412775。Shhは別の脂質改変タンパク質であり、具体的には成熟タンパク質のN末端Cys24のアルファアミノ基を通してエステル化されるパルミチン酸鎖を含むものであるPepinskyら、2008年、PMID:9593755。したがって、Hedgehogシグナル伝達経路とのNotumの以前に記載された遺伝子相互作用は、それらのシグナル伝達特性を脱制御disregulateして、結果として生じる発がんの促進での作用を伴う、Hedgehogタンパク質のリパーゼに基づく脱脂を反映し得る。いずれの事象でも、図29Bに示すように、rhWnt3Aの生理化学的な挙動を変化させるNotumの実証された能力は、NotumモジュレーターSC2.D2.2によって遮断することができる。レーン1はrhWnt3Aの陽性分子量マーカーであり、各アリコート中の試薬の有無はそれぞれのレーンの上に記されるそこで、aは水性画分であり、tはTritonX-114画分であり、スライドバーはNotumモジュレーターの濃度を示す。再び、未処理のrhWnt3AはTritonX114相レーン3だけに出現し、水相レーン2には現れない。再び、hNotum-Fcとの一晩のインキュベーションは、水相へのrhWnt3Aの再分配をもたらすレーン4および5を比較する。hNotum-FcをSC2.D2.2とまずプレインキュベートするならば、この再分配を遮断することができるレーン4および5に対してそれぞれレーン6および7を比較する。遮断作用は、用いられるSC2.D2.2の量に依存する;より多い量のSC2.D2.2は、より多くのrhWnt3AがTritonX114相に保持される結果をもたらすレーン7および9を比較する。再分配の遮断は、Notumモジュレーターの特異性にも依存する;hNotum-Fcが対照モノクローナル抗体MOPCとまずプレインキュベートされる場合には、再分配の遮断は観察されないレーン10および11。実施例31ヒト、マウスおよびサルのNotumのモジュレーション上で実証されるように、モノクローナル抗体SC2.D2.2は、そのタンパク質のマウスまたはマカクのバージョンを阻害することなく、Notumのヒトバージョンを特異的に阻害することが示されている。ヒトNotumの第2のモノクローナル抗体モジュレーターSC2.D16は、上の実施例14に記載される293.TCFアッセイを用いて、マウスおよびマカクのNotumを阻害するその能力について特徴付けられた。図30に示すように、SC2.D16はヒトおよびサルのNotumを類似した効力で阻害し、マウスNotumに対して霊長類のNotumタンパク質のいずれよりもわずかに強力であるかもしれない。実施例32モノクローナル抗体Notumモジュレーターのヒト化hSC2.D2.2モジュレーターを提供するために、コンピューターを利用したCDRグラフト化法AbysisDatabase、UCLBusinessPlc.および標準の分子工学技術を用いて、マウス抗体SC2.D2.2をヒト化させた。マウスフレームワーク配列へのそれらの最も高い配列相同性およびその正準構造に基づいて、可変領域のヒトフレームワーク領域を選択した。解析のために、CDRドメインの各々へのアミノ酸の割当ては、Chothiaらのナンバリングに従う。最適なヒト化抗体を生成するために、いくつかのヒト化抗体変異体を作製した。評価のために、マウスの軽鎖および重鎖可変領域全体およびヒト定常領域を含むマウス抗体のキメラバージョンも製作した。当技術分野で認識された技術を用いて、分子工学手法を実施した。その目的のために、製造業者のプロトコールに従って、SC2.D2.2ハイブリドーマから全mRNAを抽出したTrizol登録商標PlusRNA精製システム、LifeTechnologies。SC2.D2.2重鎖の可変領域を増幅して、配列決定をするために、完全なマウスレパートリーを標的にするように設計された、32個のマウス特異的5’リーダー配列プライマーを含むプライマー混合物を、3’マウスCγ1プライマーと組み合わせて使用した。同様に、カッパ軽鎖を増幅して配列決定をするために、マウスカッパ定常領域に特異的な単一のリバースプライマーと組み合わせて、Vkマウスファミリーの各々を増幅するように設計された32個の5’Vkリーダー配列プライマー混合物を用いた。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRを用いて、100ngの全RNAからVHおよびVL転写産物を増幅した。SC2.D2.2ハイブリドーマのために合計8つのRT-PCR反応を実行した:Vカッパ軽鎖のために4つ、およびVガンマ重鎖γ1のために4つ。QIAGENOneStepRT-PCRキットを増幅のために用いたQiagen,Inc.。抽出されたPCR産物は、特異的なV領域プライマーを用いて直接に配列決定をした。最も高い配列相同性を有する生殖細胞系V、DおよびJ遺伝子メンバーを同定するために、IMGTを用いてヌクレオチド配列を解析した。導かれた配列は、V-BASE2を用い、およびマウス生殖細胞系データベースへのVHおよびVL遺伝子のアラインメントによって、IgV-およびJ-領域の既知の生殖細胞系DNA配列と比較した。配列解析:ヌクレオチド配列情報から、SC2.D2.2の重鎖および軽鎖のV、DおよびJ遺伝子セグメントに関するデータが得られた。組換えマウスD2モノクローナル抗体のクローニングのために、配列データに基づいて、SC2.D2.2のIgVHおよびVK鎖のリーダー配列に特異的な新しいプライマーセットを設計した。その後、V-D-J配列をマウスIg生殖細胞系配列と整列させた。SC2.D2.2の重鎖遺伝子は、IGHV5-17、DQ52a.1およびJH1と同定された。軽鎖遺伝子は、VカッパIGKV3-12およびJカッパ5、生殖細胞系遺伝子ファミリーからであった。得られた重鎖および軽鎖配列は、機能的ヒト可変領域配列と整列させた。配列相同性は、ヒトVH3-48およびVKA19の生殖細胞系配列に対してそれぞれ81および62の同一性であることがわかった。これらの生殖細胞系は、ヒト化SC2.D2.2mAbのためのヒトフレームワークとして選び出した。ヌクレオチド配列は、ヒトおよびマウスの配列で見られるコドンを一般に用いて、ヒト化VLおよびVHのタンパク質配列をコードするように設計された。各V遺伝子の合成DNA断片は、IntegratedDNATechnologies,Inc.によって合成された。図31AおよびBで、ヒト化SC2.D2.2の重鎖図31Aおよび軽鎖図31BVドメインの配列上の配列-配列番号331および332は、それぞれのマウスSC2.D2.2のVドメイン下の配列-配列番号56および58と整列した。縦のマークは、マウスおよびヒト化バージョンのアミノ酸が同一であることを示す。Chothiaらによって定義されるCDRは、下線を引かれている。可変領域が生成されたならば、ヒト化抗体およびキメラ抗体がさらなる特徴付けのために生成された。抗体産生のために、ヒト免疫グロブリン発現ベクターへのマウスおよびヒト化可変遺伝子PCR産物の方向性クローニングdirectionalcloningを採用した。Ig遺伝子特異的PCRで用いられた全てのプライマーは、制限部位を含んだIgHのためにはAgeIおよびXhoI、IgKのためにはXmaIおよびDraIII、それらはヒトIgG1およびIGK定常領域をそれぞれ含有する発現ベクターへの直接的なクローニングを可能にした。簡単には、PCR産物をQiaquickPCR精製キットQiagen,Inc.で精製し、続いてそれぞれAgeIおよびXhoIIgH、XmaIおよびDraIIIIgKで消化した。消化されたPCR産物は、発現ベクターへのライゲーションの前に精製された。ライゲーション反応は、200UのT4-DNAリガーゼNewEnglandBiolabs、消化および精製された遺伝子特異的PCR産物の7.5μLおよび25ngの線状化ベクターDNAを有する10μLの総容量で実施された。コンピテントE.coliDH10B細菌LifeTechnologiesは、42°Cの熱ショックを通して3μLのライゲーション産物で形質転換し、アンピシリンプレート100μg/mLに平板培養した。次にVH領域のAgeI-EcoRI断片をpEE6.4HuIgG1発現ベクターの同じ部位に挿入し、合成XmaI-DraIIIVK挿入断片はそれぞれのpEE12.4Hu-カッパ発現ベクターのXmaI-DraIII部位にクローニングした。ヒト化すなわちhSC2.D2.2抗体およびキメラSC2.D2.2抗体を産生する細胞は、293fectinを用いて適当なプラスミドによるHEK293細胞のトランスフェクションによって生成された。これに関して、プラスミドDNAはQIAprepスピンカラムQiagenで精製された。10熱不活性化FCS、100μg/mLストレプトマイシン、100U/mLペニシリンG全てLifeTechnologiesからを補充したダルベッコの改変イーグル培地DMEMで、ヒト胚性腎臓HEK293TATCC番号CRL-11268細胞を標準条件下で150mmプレートFalcon、BectonDickinsonで培養した。一過性トランスフェクションのために、細胞を80のコンフルエンシーまで増殖させた。1.5mLのopti-MEMに50μLのHEK293トランスフェクション試薬と混合した1.5mLのOpti-MEMに、等量のIgHおよび対応するIgL鎖ベクターDNA各ベクターDNAの12.5μgを加えた。混合物を室温で30分間インキュベートし、培養プレートに均一に分散させた。トランスフェクションの3日後に上清を収集し、10FBSを補充した20mLの新鮮なDMEMと置換し、トランスフェクションから6日目に再び収集した。10分間の800×gでの遠心分離によって細胞残渣から培養上清を取り出し、4°Cで保管した。組換えのキメラ抗体およびヒト化抗体をプロテインGビーズGEHealthcareで精製した。実施例33モノクローナル抗体Notumモジュレーターの特徴付けマウス可変領域を有するその類似したmAbと比較したヒト化SC2.D2.2の親和性を特徴付けるために、3つの方法を用いた。第1に、ELISAフォーマットで、抗原の連続希釈物に対してプロービングした、固定された量の抗体について、結合シグナルを測定した。測定されたシグナルレベルは、実質的に類似していたデータは示さず。第2には、表面プラズモン共鳴SPRを用いるBiacoreによってマウスSC2.D2.2の親和性を測定して、図32Aに示す結果を与えた。12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125nMの濃度系列に基づいて、および1:1のラングミュア結合モデルを用いて、抗原への抗体結合のKdは0.1nM未満であると推定された。この相互作用の長い解離速度は、動態を通しての親和性の正確な決定を困難にした。次に、250、125および62.5nMの抗原の濃度系列をもちいるForteBIOREDForteBIO,Inc.での生体層干渉法解析bio-layerinterferometryanalysisを用いて、マウス抗体をヒト化誘導体と直接比較した。図32Bマウス可変領域および図32Cヒト化可変領域で見られるように、抗体の各々は優れた親和性を示し、ほとんど同一の結合曲線を生成した。曲線の類似性は、ヒト化工程が、誘導体化された抗体の動態に有害な影響を及ぼさなかったことを示すことは理解されるであろう。実施例34Notumモジュレーターは診断剤として用いることができる本明細書の教示に従って、開示されるNotumモジュレーターは、患者からの生体試料でNotum関連バイオマーカーを検出する診断剤として用いることができる。Notumは、細胞外液中に可溶性分子として、または細胞外基質と会合してある程度分泌されることが公知であり、近隣の細胞に対してパラクリン様式で作用し得る。そのような特性を示し、Notumは特定の疾患状態で血清または血漿などの体液で検出可能であるはずであり、したがって診断目的のために有用であるか、疾患バイオマーカーとして役立ちうる。本発明のこの態様を確認するために、図33Aに示すようにサンドイッチELISAフォーマットを用いて、抗Notum抗体で標準曲線を生成した。生じた曲線は、図33Bに示すように健康な被験体および卵巣がんを患っている患者から得られた血漿試料中のNotumレベルを定量化するために次に用いた。より具体的には、pH9.6の50mM炭酸ナトリウム緩衝液に2μg/mlで、マウスSC2.D2.2を標準のELISAプレートに吸収させた。0.05v/vTween20を含有するPBSPBSTでプレートを洗浄した後に、周囲温度で2時間、2w/vウシ血清アルブミンを含有するPBSBSA緩衝液でプレートをブロックした。プレートの内容物を払い落とし、様々な濃度すなわち、標準曲線を提供するためにの精製組換えNotum-His、またはBSA緩衝液で希釈した患者試料を、周囲温度で最短2時間、プレートに加えた。プレートをPBSTで洗浄し、その後、BSA緩衝液中の0.5μg/mlでビオチンへコンジュゲートさせたNotum特異的マウスポリクローナル抗体を加えた。1時間のインキュベーションの後、プレートをPBSTで再び洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼへコンジュゲートさせたストレプトアビジンJacksonImmunoResearchの1:2000希釈物と30分間インキュベートした。PBSTで全てのプレートを2回洗浄した後に、100μlのTMB基質ThermoScientificをウェルに加え、暗所で30分の間インキュベートした。100μl/ウェルの2M硫酸を加えることによって、呈色反応を停止させた。標準のプレートリーダーを用いて、全てのウェルでOD450nmでの吸光度を読み取った。図33Aの標準曲線から外挿された値を用いて、ELISAサンドイッチフォーマットは、患者血漿試料中のNotum分析物濃度の感度が高い検出を可能にする。より詳しくは、図33Bは、健康な成人n=12および病期2~4の一群の卵巣がん患者n=7からの血漿試料で導かれたNotum分析物濃度を示す。データは、健康な成人の血漿試料中の平均Notum濃度はおよそ8.6±10.3ng/mlであるが、卵巣がん患者でのNotum濃度は36.5±25.2ng/mlで有意により高いようであることを示す。これらの結果は、開示された本発明のモジュレーターが新生物障害の検出および/またはモニタリングのための診断剤として有効に作用することができることを明らかに実証する。当業者は、その精神またはその中心的な特質から逸脱することなく本発明を他の具体的な形で具現化することができることをさらに理解するであろう。本発明の上の記載がその例示的な実施形態だけを開示するという点で、他の変形形態が本発明の適用範囲内であると企図されることを理解すべきである。したがって、本発明は、本明細書で詳細に記載されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、本発明の範囲および内容の指標となるように、添付の請求項を参照すべきである。"