"試料中の核酸を定量しおよび/または解析するための方法であって、a試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を電極上に固定し、b固定化した核酸をプライマーとして利用した増幅反応を行うことにより、電極上で検出対象とする核酸の一部、もしくは全部を増幅させ、二本鎖核酸として電極上に配置し、c電気化学応答の測定を行う、工程を含んでなる方法。請求項1の工程bで電極上に配置した二本鎖核酸に、酸化還元活性を有する物質を結合させる工程を含む請求項1に記載の方法。酸化還元活性を有する物質がフェロセン化ナフタレンジイミドFNDであることを特徴とする請求項2に記載の方法。酸化還元活性を有する物質がルテニウム錯体であることを特徴とする請求項2に記載の方法。試料中の検出対象する核酸がRNAであることを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の方法。増幅反応に逆転写酵素を用いることを特徴とする請求項5に記載の方法。試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でにハイブリダイズする核酸を固定した電極と、請求項1に記載の工程bにおける増幅反応に必要な試薬を含む請求項1から6のいずれかに記載の方法による核酸検出用キット。本発明の課題は、蛍光物質を利用することなく、増幅された核酸を電気化学的に定量検出する方法を提供することにある。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、検出対象となる標的核酸の相補鎖の部分配列を電極上に固定し、電極上で増幅反応を行わせ、酸化還元活性を有する物質の存在のもと増副核酸を電気化学的に検出できることを見出し、本願発明を完成させるに至った。すなわち、本願は以下の1から7に記載の態様を包含する:1試料中の核酸を定量しおよび/または解析するための方法であって、a試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を電極上に固定し、b固定化した核酸をプライマーとして利用した増幅反応を行うことにより、電極上で検出対象とする核酸の一部、もしくは全部を増幅させ、二本鎖核酸として電極上に配置し、c電気化学応答の測定を行う、工程を含んでなる方法。21の工程bで電極上に配置した二本鎖核酸に、酸化還元活性を有する物質を結合させる工程を含む1に記載の方法。3酸化還元活性を有する物質がフェロセン化ナフタレンジイミドFNDであることを特徴とする2に記載の方法。4酸化還元活性を有する物質がルテニウム錯体であることを特徴とする2に記載の方法。5試料中の検出対象とする核酸がRNAであることを特徴とする1から4のいずれかに記載の方法。6増幅反応に逆転写酵素を用いることを特徴とする5に記載の方法。7試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でにハイブリダイズする核酸を固定した電極と、1に記載の工程bにおける増幅反応に必要な試薬を含む1から6のいずれかに記載の方法による核酸検出用キット。標的核酸にハイブリダイズする電極上に固定化した一本鎖プライマーを利用して増幅反応を行うことにより、標的となる核酸の増幅とその増幅産物を電気化学的に検出することができ、遺伝子検査への利用性を高めることができる。本発明は、試料中の核酸を定量しおよび/または解析するための方法であって、a試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を電極上に固定し、b固定化した核酸をプライマーとして利用した増幅反応を行うことにより、電極上で検出対象とする核酸の一部、もしくは全部を増幅させ、二本鎖核酸として電極上に配置し、c電気化学応答の測定を行う、工程を含んでなる方法を提供する。本発明における検出すべき試料中の核酸は、DNAもしくはRNA、あるいはそのハイブリッドであっても良く、増幅可能な人工核酸を含んでいても良い。また、その形状は一本鎖もしくは二本鎖以上であっても良い。検出対象とする核酸標的核酸の塩基配列の長さは、プライマーが標的核酸にハイブリダイズして増幅できる長さであれば良く、好ましくは10から1,000mer、より好ましくは20から100merである。核酸を含む試料としては、ヒト組織、ヒト臓器、血清、血漿等を例示することができ、検査診断の方法に応じて適宜選択され利用される。試料からの核酸抽出は、必要な量の標的核酸が得られる方法であれば良く、好ましくは試料中に存在する夾雑物質を排して選択的に従って、高純度で核酸を抽出できる方法である。ストリンジェントな条件とは、任意の核酸が、他の核酸を含む混合物中で、その標的核酸にはハイブリダイズするが、他の核酸にはハイブリダイズしない条件を意味する。ハイブリダイズする核酸の配列がより長い場合には、より特異的に、より高温でハイブリダイズすることができる。一般に、高ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度およびpHで特異的配列の融解温度より約5から10°C低くなるように選択される。これに対して低ストリンジェントな条件は、一般的には融解温度より約15~30°C低くなるように選択される。融解温度とは、既定のイオン強度、pH、核酸配列で標的核酸に対して相補的な核酸において50が平衡状態で占める温度である。電極に固定する核酸は、DNAもしくはRNA、あるいはそのハイブリッドであっても良く、増幅可能な人工核酸を含んでいても良い。また、その塩基配列の長さは特異的なハイブリダイズに適した長さであれば任意の長さで良く、好ましくは5から1,000mer、より好ましくは10から100merである。電極に核酸を固定する際には、核酸溶液を調製し電極に添加することで、核酸と非特異な電極表面の反応により固定することもできるが、核酸の固定化量を制御できる点や所定の強度のもとに核酸を電極に固定化できる点で、核酸に化学修飾を施すことが好ましい。核酸の化学修飾は、核酸の5‘末端あるいは3’末端でも良く、核酸配列の物理的特性に応じて適宜選択すれば良い。核酸に導入する官能基としては、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、リン酸基、-SH基チオール基、ビオチン等が挙げられるが、この中でも、アミノ基、チオール基が特に好ましく用いることができる。官能基の導入法は、当業者では周知であり、導入する官能基は適宜選択して、既知の化学合成法により核酸に導入することができる。核酸溶液を調製する際には、pHを制御できる緩衝液を用いることが好ましく、緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液等の無機塩からなる緩衝液、あるいはTris-HCl緩衝液等を例示することができる。標的核酸の塩基配列は、学術情報や公的データベースhttpwwwncbi.nlm.nih.gov/genbank/などの塩基配列情報を参考にして配列の解析を行うことにより決定することができる。電極として、好ましく用いられるのは、金、銀、白金に代表される金属や、カーボン、ITOなどが挙げられ、より好ましくは核酸に導入する一例として挙げたチオール基との配位結合に優れた金である。本発明においてプライマーとは、ポリメラーゼが核酸を伸長合成する際に3’水酸基を供給する役割をもつ短い核酸断片であり、一本鎖のDNAもしくはRNA、あるいはそのハイブリッドであり、その塩基配列の長さは5から100mer、より好ましくは15から30merである。本発明においては、プライマーは試料中の核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする性能を有しており、試料中の核酸もしくはその相補鎖と部分的な二本鎖を形成することで核酸の伸長合成の出発点として機能する。プライマーとしては、例えば、TRC法IshiguroTetalAnalBiochem.314:77-86,2003におけるフォワードプライマーFowardPrimerあるいはリバースプライマーReversePrimerを例示することができる。増幅反応とは、電極上に固定化した核酸プライマーがハイブリダイズする試料中の検出対象とする核酸鋳型核酸からその複製を合成する反応である。増幅反応としては、試料中の検出対象とする核酸がRNAである場合、例えば、TRC法、NASBA法、TMA法、RT-PCR法などが例示でき、試料中の検出対象とする核酸がDNAである場合、例えば、PCR法などが例示できる。また、これら方法に限らず、その他、鋳型依存性DNAポリメラーゼを用いた方法、逆転写酵素を含む鋳型依存型RNAポリメラーゼを用いた方法、もしくはその組み合わせを用いた方法を例示することができる。用いる増幅反応がTRC反応の場合、反応液中では通常のTRC反応と同様に、陽性標準液中の鋳型RNAがシザープローブによりトリミングされた後、リバースプライマーとハイブリダイズし、酵素によりリバースプライマーが伸長し、さらにRNA鎖が加水分解される。合成された一本鎖DNAはフォワードプライマーとハイブリダイズし、酵素によりフォワードプライマーが伸長し二本鎖DNAが合成される。二本鎖DNAを鋳型として、トリミングされた鋳型RNAの複製が合成される。一方、電極上でも同様の反応が進行し、電極上に固定化されたリバースプライマーにトリミングされた鋳型RNAがハイブリダイズし、酵素によりリバースプライマーが伸長し、さらにRNA鎖が加水分解される。合成された一本鎖DNAは電極上に固定されており、さらにフォワードプライマーとハイブリダイズし、酵素によりフォワードプライマーが伸長し、電極上に固定された二本鎖DNAが合成されるIshiguroTetalAnalBiochem.314:77-86,2003。電気化学応答の測定とは、物質の濃度や種類を電気的に計測する方法であり、電位差滴定法、クロノクーロメトリー法、交流インピーダンス法、ボルタンメトリーvoltammetry法などを例示できる。特に測定装置が小型にでき、電位を変化させ、それに応答して変化する電流を計測するボルタンメトリー法が好ましい。ボルタンメトリー法の中でも、特に、高感度と迅速性に優れた矩形波ボルタンメトリー法が好ましい。電気化学的応答をより精度高く測定するためには、反応液中に酸化還元活性を有する物質を添加することが好ましい。酸化還元活性を有する物質には、ヘキスト33258、メチレンブルー、FNDフェロセン化ナフタレンジイミド、ルテニウム錯体などを例示することができる。電気化学的に反応しやすく、小さい電位の変化により酸化還元反応が進行する点で、FNDがより好ましい。酸化還元活性を有する物質を結合させる工程とは、当該物質を電極上で増幅し配置させた二本鎖核酸に特異的に結合させる工程である。この工程は、例えば、ヘキスト33258、メチレンブルー、FNDなどが有する二本鎖核酸への特異的結合性を利用し、両者を接触させる工程、もしくは増幅反応に用いるプライマーあるいは基質にこれら物質を予め結合させておくことで、増幅反応によりこれら物質が二本鎖核酸に特異的に取り込まれる工程である。前者の工程では、例えば、増幅した二本鎖核酸に対して過剰量好ましくは1から1,000μM、より好ましくは10から50μMのFNDを含む溶液に電極を浸せば良い。後者の工程では、例えば、フォワードプライマーの5’末端に既知の化学合成方法を利用しルテニウム錯体を結合させ、増幅反応に用いれば良い。また、本発明は、試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でにハイブリダイズする核酸を固定した電極と、上記本発明の方法における工程bにおける増幅反応に必要な試薬を含む、上記本発明の方法による核酸検出用キットを提供する。増幅反応に必要な試薬としては、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素、基質などが挙げられる。核酸を固定した電極は、例えば、電極マットや導電板とともに基板上に配置し、測定ウェルとして組み立てることができる。基板においては、当該電極に上記増幅反応に必要な試薬を添加した場合でも、液体が拡散しないように、当該電極を配置する領域の周囲には区画が設けられていることが好ましい。こうして組み立てた測定ウェルは、電気化学アナライザーなどの装置に適用して、試料中の核酸を定量しおよび/または解析することができる。さらに、本発明のキットには、洗浄液、対照陰性対照、陽性対照となる溶液、当該キットの説明書が含まれていてもよい。以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例1電極への核酸の固定化電極ホルダーに金電極、電極マット、導電板をセットし測定ウェルを組み立てた羽野製作所製。CUTE1MPRフェムトサイエンス社製を用いて0.5Torr、30sccmAir、出力70で30秒のプラズマ照射を行った。5、50、100、200nMに調製した配列番号1に記載した合成DNAGenet社製を100mMNaCl、1mM6-メルカプトヘキサノールになるように調整した溶液300μLをそれぞれ測定ウェルに加えて密閉し、37°Cで2時間インキュベートし上述のDNAを固定化しプローブとした。なお、プローブ配列番号1の5’端の-SS-は、プローブを電極に固定するために付加したチオール結合を示すものであり、またプローブ配列番号1の5’端側に存在する8個のtは、プローブ中に含まれ、後述するTRC法に基づく増幅においてリバースプライマーとして機能する3’端の18塩基部分を電極から一定程度離間させるためのものである。このように、プローブは電極から一定程度離間させた方が好ましく、そのためには適当な塩基をプローブの、リバースプライマーとして機能する部分の5’側に付加すれば良いが、当該付加部分による非特異的な結合を抑制するためには、測定対象に含まれていない塩基又は塩基配列を選択することが好ましく、またその塩基数は5から15mer程度、好ましくは8から10mer程度である。実施例2増幅反応前の矩形波ボルタンメトリー測定アスピレータで溶液を除去後、測定ウェルをRNaseFree水300μLで2回洗浄した。次いで、300μLの0.1M酢酸カリウム緩衝液pH5.5で洗浄した後、20μMのFNDを含む0.1Mの酢酸カリウム緩衝液Sato等,Molecules,14,693-7072005を添加し、室温で10分間静置し電気化学測定を行った。電気化学測定には参照電極としてAg/AgCl、対極にPt電極を用いて、InitEV0、FinalEV=0.6、IncrEV=0.01、AmplitudeV=0.05、FrequencyHZ=100、QuitTimeS=3、SensivityA/V=1e-5のパラメータでALSElectrochemicalAnalyzerCHInstrumentInc.社製を用いて矩形波ボルタンメトリー測定を行った。実施例3核酸増幅反応核酸増幅反応は、TRC法IshiguroTetalAnalBiochem.314:77-86,2003により実施した。また、核酸増幅反応には、市販の結核菌群検出試薬東ソー社製を用いた。すなわち、陽性酵素反応液として結核菌群rRNA検出試薬の基質試薬15μL、陰性標準液6μL、陽性標準液1.5μL陰性酵素反応液の場合は陰性標準液に変更に、別途調製したプライマー試薬15μL300mMKCl、39Dimethylsuloxide、3μMリバースプライマー配列番号2、3μMフォワードプライマー配列番号3、0.48μMシザープローブ配列番号4を混合し、実施例1にて調製した、プローブが固定された電極を有する測定ウェルに添加した後42°Cに加温し、さらに42°Cに加温しておいた酵素試薬7.5μLを素早く混和し以下の操作に用いた。測定ウェルの溶液をアスピレータで除去し、0.02U/μLRNaseinhibitorNovagen社製を加えたRNaseFree水300μlで2回洗浄した。アスピレータで溶液を除去した後、調製した陽性酵素反応溶液あるいは対照となる陰性酵素反応溶を10μLずつ加え、42°Cで20分間インキュベートしTRC反応を進行させた。この操作において、電極に固定されたプローブと、別途調製したプライマー試薬に含まれるリバースプライマーは同一の塩基配列部分を有する。これにより、結核菌群のrRNAが電極に固定されたプローブ及び/又はプライマー試薬に含まれるリバースプライマーと結合することによってTRC法に基づく増幅が開始され、前記RNAと同一の配列を有する増幅産物RNAを転写可能な二重鎖DNAが液中及び/又は電極上に作られる電極上につくられる二重鎖DNAの一方は、TRC法に基づく増幅によって伸張された、実施例1において電極に固定されたプローブである。そして、この二重鎖DNAから転写されたRNAに基づいて、更なる増幅が開始され、その結果、電極上には前記二重鎖DNAが蓄積される。実施例4増幅反応後の矩形波ボルタンメトリー測定反応終了後、反応液をアスピレータで除去した後、測定ウェルをPBS溶液300μLで2回洗浄した。次いで、実施例2と同様に、0.1M酢酸カリウム緩衝液pH5.5300μLで洗浄した後、20μMFND溶液を含む酢酸カリウム緩衝液pH5.5300μLを加え、室温で10分間静置し電気化学測定を行った。電気化学測定には参照電極としてAg/AgCl、対極にPt電極を用いて、InitEV0、FinalEV=0.6、IncrEV=0.01、AmplitudeV=0.05、FrequencyHZ=100、QuitTimeS=3、SensivityA/V=1e-5パラメータでALSElectrochemicalAnalyzerCHInstrumentInc.製を用いて矩形波ボルタンメトリー測定を行った。得られた電流値と実施例2の電流値を比較し、電流増加率を比較した。電極への固定化に用いるDNA濃度を5nM、50nM、100nM、200nMに設定し、それぞれ3ないし4回試験を行った。陽性酵素反応および陰性酵素反応における電流増加の結果を表1に示した。表1の通り、固定化時に用いたDNA濃度50から200nMの各試験区において、陽性反応のみ電流が増加した。以上の結果から、電極上に固定化した核酸をプライマーとして利用することで、標的となる核酸が増幅され、さらに、電気化学的に検出できることが示された。"