"重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、をそれぞれ別々に固定化した抗体固定化領域を独立して1以上備え、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であることを特徴とする抗体固定化担体。上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は、それぞれ別々に担体表面の材料と結合する担体結合性ペプチドを介して担体に固定化されており、上記担体結合性ペプチドは、重鎖低分子抗体において重鎖の可変領域のC末端側に、また軽鎖低分子抗体において軽鎖の可変領域のC末端側にそれぞれ配置されているものであることを特徴とする請求項1に記載の抗体固定化担体。上記担体表面の材料は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサンまたはポリメタクリル酸メチルのプラスチック樹脂を変質させて親水化処理したものであることを特徴とする請求項2に記載の抗体固体化担体。上記担体結合性ペプチドは、親水性のポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサンまたはポリメタクリル酸メチルに結合するペプチドであることを特徴とする請求項2または3に記載の抗体固体化担体。上記重鎖低分子抗体は、重鎖の可変領域からなる重鎖低分子抗体、または重鎖の可変領域と重鎖第1定常領域とからなる重鎖低分子抗体であることを特徴とする請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体固体化担体。上記軽鎖低分子抗体は、軽鎖の可変領域からなる軽鎖低分子抗体、または軽鎖の可変領域と軽鎖定常領域とからなる軽鎖低分子抗体であることを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載の抗体固体化担体。重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体とを、それぞれ別々に担体に固定化して抗体固定化領域を作製する固定化工程を有し、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であることを特徴とする抗体固定化担体の製造方法。上記固定化工程は、上記抗体固定化領域を独立して2以上備えるように複数回行われるものであることを特徴とする請求項7に記載の抗体固定化担体の製造方法。上記固定化工程は、a上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体の不溶性凝集体をそれぞれ変性剤にて変性させた状態で担体表面に接触させ、担体に固定化する第1の工程と、b上記固定化された変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体から変性剤を除去することにより、変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体をリフォールディングさせる第2の工程と、を有することを特徴とする請求項7または8に記載の抗体固定化担体の製造方法。上記固定化工程における第1の工程および第2の工程は、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とについて別々に行われることを特徴とする請求項9に記載の抗体固定化担体の製造方法。上記固定化工程は、軽鎖低分子抗体について第1の工程および第2の工程が行われた後、重鎖低分子抗体について第1の工程および第2の工程が行われることを特徴とする請求項10に記載の抗体固定化担体の製造方法。上記第1の工程は、変性剤として0.5M~4Mの尿素を用いることを特徴とする請求項9~11のいずれか1項に記載の抗体固定化担体の製造方法。請求項8~12のいずれか1項に記載の方法によって得られたことを特徴とする抗体固定化担体。請求項1~6,13のいずれか1項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識する重鎖低分子抗体および/または軽鎖低分子抗体をスクリーニングする工程を有することを特徴とする抗体のスクリーニング方法。請求項1~6,13のいずれか1項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程iと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程iiと、上記工程iiにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程iiiと、を有することを特徴とするスクリーニング方法。さらに、上記工程iiiで候補として決定した軽鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程ivと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程vと、上記工程vにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖の可変領域の候補として決定する工程viと、を有することを特徴とする請求項15に記載のスクリーニング方法。請求項1~6,13のいずれか1項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程iと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程iiと、上記工程iiにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖領域の候補として決定する工程iiiと、を有することを特徴とするスクリーニング方法。さらに、上記工程iiiで決定した重鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程ivと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程vと、上記工程vにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程viと、を有することを特徴とする請求項17に記載のスクリーニング方法。請求項15~18のいずれか1項に記載のスクリーニング方法により、決定されたヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補と重鎖の可変領域の候補とを組み合わせて、ヒト抗体を製造する工程を有することを特徴とするヒト抗体の製造方法。しかしながら、上述したファージディスプレイ法を利用した抗体スクリーニング方法では、操作が煩雑で、陽性クローンの単離が困難という問題点があり、さらに擬陽性クローンを選択してしまう可能性もあり十分とはいえない。このため、ファージディスプレイ法以外に、抗体スクリーニングに利用できる新たな技術の開発が強く求められていた。本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、抗体スクリーニングにも利用可能な抗体固定化担体、抗体固定化担体の製造方法および抗体固定化担体の利用を提供することにある。本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、異なる抗体由来の重鎖と軽鎖とを低分子化した後、多数組み合わせて担体上に固定化することで、特定の抗原を認識する抗体を効果的にスクリーニングできる画期的な技術を開発し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下の構成からなるものである。1重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、をそれぞれ別々に固定化した抗体固定化領域を独立して1以上備え、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来である抗体固定化担体。2上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は、それぞれ別々に担体表面の材料と結合する担体結合性ペプチドを介して担体に固定化されており、上記担体結合性ペプチドは、重鎖低分子抗体において重鎖の可変領域のC末端側に、また軽鎖低分子抗体において軽鎖の可変領域のC末端側にそれぞれ配置されているものである1に記載の抗体固定化担体。3上記担体表面の材料は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサンPDMSまたはポリメタクリル酸メチルPMMAのプラスチック樹脂を変質させて親水化処理したものである2に記載の抗体固体化担体。4上記担体結合性ペプチドは、親水性のポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサンPDMSまたはポリメタクリル酸メチルPMMAに結合するペプチドである2または3に記載の抗体固体化担体。5上記重鎖低分子抗体は、重鎖の可変領域からなる重鎖低分子抗体、または重鎖の可変領域と重鎖第1定常領域CH1とからなる重鎖低分子抗体FabHである1~4のいずれかに記載の抗体固体化担体。6上記軽鎖低分子抗体は、軽鎖の可変領域からなる軽鎖低分子抗体、または軽鎖の可変領域と軽鎖定常領域Ckとからなる軽鎖低分子抗体FabLである1~5のいずれかに記載の抗体固体化担体。7重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体とを、それぞれ別々に担体に固定化して抗体固定化領域を作製する固定化工程を有し、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来である抗体固定化担体の製造方法。8上記固定化工程は、上記抗体固定化領域を独立して2以上備えるように複数回行われる7に記載の抗体固定化担体の製造方法。9上記固定化工程は、a上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体の不溶性凝集体をそれぞれ変性剤にて変性させた状態で担体表面に接触させ、担体に固定化する第1の工程と、b上記固定化された変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体から変性剤を除去することにより、変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体をリフォールディングさせる第2の工程と、を有する7に記載の抗体固定化担体の製造方法。10上記固定化工程における第1の工程および第2の工程は、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とについて別々に行われる9に記載の抗体固定化担体の製造方法。11上記固定化工程は、軽鎖低分子抗体について第1の工程および第2の工程が行われた後、重鎖低分子抗体について第1の工程および第2の工程が行われる10に記載の抗体固定化担体の製造方法。12上記第1の工程は、変性剤として0.5M~4Mの尿素を用いる9~11のいずれかに記載の抗体固定化担体の製造方法。13上記7~12のいずれかに記載の方法によって得られた抗体固定化担体。14上記1~6,13のいずれかに記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識する重鎖低分子抗体および/または軽鎖低分子抗体をスクリーニングする工程を有する抗体のスクリーニング方法。15上記1~6,13のいずれか1項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程iと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程iiと、上記工程iiにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程iiiと、を有するスクリーニング方法。16さらに、上記工程iiiで候補として決定した軽鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程ivと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程vと、上記工程vにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖の可変領域の候補として決定する工程viと、を有する15に記載のスクリーニング方法。17上記1~6,13のいずれか1項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程iと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程iiと、上記工程iiにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖領域の候補として決定する工程iiiと、を有するスクリーニング方法。18さらに、上記工程iiiで決定した重鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程ivと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程vと、上記工程vにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程viと、を有する17に記載のスクリーニング方法。19上記15~18のいずれか1項に記載のスクリーニング方法により、決定されたヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補と重鎖の可変領域の候補とを組み合わせて、ヒト抗体を製造する工程を有するヒト抗体の製造方法。本発明の抗体固定化担体は、異なる抗体由来の重鎖と軽鎖とが多数組み合わされて固定化された担体であるため、特定の抗原を認識する抗体を効率的にスクリーニングすることができる。また抗体スクリーニング以外にも診断用抗体のスクリーニングにも利用できる他、抗原抗体反応を利用した種々の免疫測定法にも利用できる。本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。本明細書において特記しない限り、数値範囲を表すA~Bは、A以上Aを含みかつAより大きくB以下Bを含みかつBより小さいを意味する。また、文言抗原を認識する、抗原と親和性を有するおよび抗原と結合するとは、いずれも抗体成分が抗原と免疫反応することを意味し、全て同義であって互いに置き換え可能である。<1.抗体固定化担体>本発明にかかる抗体固定化担体は、少なくとも重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、少なくとも軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、をそれぞれ別々に固定化した抗体固定化領域を独立して1以上備え、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であればよく、その他の具体的な構造、材料、形態等の構成は特に限定されるものではない。本発明における低分子抗体とは、全長抗体wholeantibody、例えばwholeIgG等の一部分が欠損している抗体断片であって、少なくとも重鎖の可変領域VHまたは軽鎖の可変領域VLを含んでおり、抗原への結合能を有していればよい。好ましい低分子抗体の具体例としては、例えば、VH,VL,重鎖または軽鎖におけるFab、Fab’、Fab’2などを挙げることができるが、特に、重鎖低分子抗体としては、重鎖の可変領域からなるもの、または重鎖の可変領域と重鎖第1定常領域CH1とからなるものFabHであることが好ましい。また、軽鎖低分子抗体としては、軽鎖の可変領域からなるもの、または軽鎖の可変領域と軽鎖定常領域CkとからなるものFabLであることが好ましい。これらの低分子抗体であれば担体に効率的に固定化することができるためである。このような低分子抗体を得るには、公知のクローン化技術や化学合成法によって製造することが可能である。例えば、クローン化技術を利用すれば、上記の抗体断片低分子抗体をコードするDNAを調製し、これを自律複製可能なベクターに挿入して組換えDNAとし、これを大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などの適宜宿主に導入して形質転換体とし、その培養物から本アミノ酸配列を含むペプチドを採取することができる例えば、CoMSetalJImmunol15229682976BetterMandHorwitzAHMethodsEnzymol178476496PluckthunAandSkerraAMethodsEnzymol178497515LamoyiEMethodsEnzymol121652663RousseauxJetalMethodsEnzymol121663669BirdREandWalkerBWTrendsBiotechnol9132137参照。また、上記の低分子抗体をコードするDNAを調製し、小麦胚芽や大腸菌細胞抽出液などを用いて無細胞タンパク質合成系により合成することもできる。また、固相法または液相法等の慣用のペプチド化学合成法を利用して、アミノ酸を逐次、脱水縮合させて伸長させても上記低分子抗体を得ることができる。特に、遺伝子組換えによる抗体の生産技術により、抗体を大量かつ安価に生産できる。このため、通常の抗体産生細胞株から、抗体産生遺伝子を分離し、該遺伝子から低分子抗体に対応する塩基配列を調整し、これを大腸菌等に組み込んで、抗原に結合する可変領域を基本骨格とした低分子抗体を製造することが好ましい。以下に、低分子抗体を製造する方法について例示する。まず抗体を産生するハイブリドーマから、可変領域をコードするmRNAまたはtotalRNAを単離する。mRNAまたはtotalRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法ChirgwinJMetalBiochemistry19791852945299、グアニジンンチオシアネートホットフェノール法、グアニジンチオシアネート-グアニジン塩酸法、グアニジンチオシアネート塩化セシウム法、アルカリショ糖密度勾配遠心分離法、AGPC法ChomczynskiPetalAnalBiochem1987162156159等により行ってtotalRNAを調製し、mRNAPurificationKitPharmacia製等を使用して目的のmRNAを調製する。また、QuickPrepmRNAPurificationKitPharmacia製を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体可変領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMVReverseTranscriptaseFirststrandcDNASynthesisKit生化学工業社製等を用いて行う。また、cDNAの合成および増幅を行うには、5aposAmpliFINDERRACEKitClontech製およびPCRを用いた5aposRACE法FrohmanMAetalProcNatlAcadSciUSA19888589989002、BelyavskyAetalNucleicAcidsRes19891729192932等を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。前記のようにして得られた本発明の抗体をコードする遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーターの下流に、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばlaczプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。laczプロモーターを使用する場合はWardらの方法Nature1098341544546FASEBJ1992624222427により、あるいはaraBプロモーターを使用する場合はBetterらの方法Science198824010411043により発現することができる。産生された抗体は、サイトプラズム内に凝集しインクルージョンボディとなるが、抗体タンパク質凝集体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直してrefold使用すればよい。なお、プロモーターと抗体遺伝子の間に、抗体分泌のためのシグナル配列を挿入し、抗体をペリプラズムに分泌させることもできる。かかる手法は当業者にとって周知である。抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列LeiSPetalJBacteriol19871694379を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直してrefold使用する。複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピロ8ーマウィルスBPV等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼAPH遺伝子、チミジンキナーゼTK遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼEcogpt遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素dhfr遺伝子等を含むことができる。本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。次に、形質転換された宿主細胞をinvitroまたはinvivoで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清FCS等の血清補液を併用することもできる。また、上記のように発現、産生された抗体は、均一にまで精製することができる。低分子抗体の精製についても、公知の手法を利用でき特に限定されない。例えば、本発明で使用される低分子抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインAカラムを用いたカラムとして、HyperD、POROS、SepharoseFFPharmacia製等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができるAntibodiesALaboratoryManualEdHarlowDavidLaneColdSpringHarborLaboratory1988。また、後述するように、本発明では低分子抗体には担体結合性ペプチドをタグとして有しているため、形質転換体からの生成物を含む溶液を担体表面に接触させることにより、担体表面に直接吸着させて、分離精製することができる。生成物を含む溶液とは、目的となる低分子抗体を含み、かつ宿主に起因する不要な夾雑物が存在する溶液全般を指す。例えば、菌体破砕液、菌体破砕液を遠心分離して得られた可溶性画分、菌体破砕液を遠心分離して得られた不溶性画分を可溶化したもの、細胞膜画分、細胞壁画分、細胞から分泌生産された分泌物、体液、またはこれらの不完全な精製物等を含む。さらに、組換えDNAを導入することによって異種遺伝子を宿主内で大量に発現させた場合、生成されたタンパク質による宿主への悪影響を避けるため、不溶性凝集体封入体inclusionbodyとして生成されることがある。上記低分子抗体が不溶性凝集体として生成されていても、変性剤で不溶性凝集体を可溶化後そのまま担体表面に固定化することができ、しかも固定化させた状態で変性剤を除去することによって上記低分子抗体がリフォールディングされる場合もある。また、不溶性凝集体に対してだけではなく、何らかの原因によって、立体構造が変性されていても、本発明の低分子抗体であれば、そのまま担体表面に固定化することができる。しかも固定化させた状態で適当なリフォールディングバッファを加えることによってリフォールディングできる場合もある。変性の原因としては、加熱、凍結、高圧、超音波、紫外線、X線、かくはん、吸着、希釈などの物理的な原因と、極端な酸性またはアルカリ性、有機溶媒、重金属塩、変性剤、界面活性剤などの化学的な原因がある。以上の低分子抗体を取得するための方法は、低分子抗体のみならず、後述する抗体、例えば完全ヒト抗体を取得する際にも利用可能であり、適宜説明を援用できることを付言しておく。また、抗体固定化領域は、少なくとも1つ以上設けられていればよく、その数は特に限定されない。より好適には、抗体固定化領域は、独立して2以上備えられるものであることが好ましい。独立して2以上備えるとは、1つの抗体固定化領域には、1組の重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とが固定化されており、このような抗体固定化領域が担体上に独立して2以上存在することを意図している。また重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来である。これは重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とが、それぞれ異なる抗原と結合性を有する抗体から作製されたものであることを意図している。例えば、重鎖は抗インターフェロンγIFNG抗体由来であり、軽鎖は抗インターロイキン6受容体IL-6R抗体由来である場合等を例示できる。また抗体の元々の由来生物については、ヒトが好ましいが、ヒト限られず、ニワトリ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、サル等の種々の脊椎動物由来の抗体を利用できる。本発明において、担体とは、抗体を固定化できるものであればよく、通常水に不溶のものが用いられる。担体は、樹脂、ナイロン、ニトロセルロース、多糖、ガラスまたは金属から選択される材料の膜、ビーズ、ゲルまたは基板であり、該担体は必要に応じてガラス、セラミックス、金属、プラスチック等の支持体上にある。図1a,bに本発明にかかる抗体固定化担体の構造の一例を模式的に示す。図1aは担体上に固定化された重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体との1組が、抗原と反応している様子を模式的に示した図であり、bは担体上に多数の重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体との組み合わせが固定化された様子を模式的に示す図である。本発明における抗体固定化担体では、図1a,bに示すように、重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は、それぞれ別々に担体結合性ペプチドを介して担体に固定化されている。つまり、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、1つの抗体固定化領域に1組のペアとして、別々の分子として単独で固定化されているものである。なお、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、抗体固定化領域に固定化する際にそれぞれ別々に固定化されていればよく、抗体固定化領域に固定化された後であれば、相互作用していてもよく、またS-S結合等が形成されていてもよい。重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は担体結合性ペプチドを介して担体に固定化されている。抗体を固定化する際に、重鎖および軽鎖の可変領域がそれぞれ抗原抗体反応に寄与できるように、C末端側が担体表面に対して垂直に結合し、抗原結合部位が外側を向き、立体的に正常な配置を取る形態で固定化されていることが好ましい。それゆえ、担体結合性ペプチドは、重鎖低分子抗体においては、重鎖の可変領域のC末端側に配置されており、また軽鎖低分子抗体においては、軽鎖の可変領域のC末端側にそれぞれ配置されていることが好ましい。ここで担体結合性ペプチドとは、担体表面の材料と結合する機能を有するペプチドであればよく、その他の具体的なアミノ酸配列や長さ等については特に限定されない。なお、本発明において結合にはペプチドと担体表面とが、本発明の意図する用途に利用できる程度の強度で相互作用する意であり、担体表面と親和性を有し吸着する場合を含む。例えば、担体表面の材料は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサンPDMSまたはポリメタクリル酸メチルPMMA等のプラスチック樹脂を変質させて親水化処理したものであることが好ましい。このような材料を担体表面の材料とする場合、担体結合性ペプチドとしては、上記親水化処理したプラスチック樹脂のそれぞれに対して結合する機能を有するペプチドが挙げられる。例えば、親水性のポリスチレンを担体表面の材料とした場合は、親水性のポリスチレンに結合するペプチドを選択するといった具合である。担体結合性ペプチドとして、親水化処理したプラスチック樹脂のそれぞれに対して結合する機能を有するペプチドは既にいくつか報告されている公知のものを適宜利用することができる。例えば、親水性のポリスチレンに結合するペプチド以下、PS-tagと称する場合もある。としては、後述する実施例に使用しているもの以外にも、例えば国際公開公報WO2009/101807A1号公報等に記載のペプチドを利用することができる。具体的には、N末端側からC末端側に向けて順にRXXXRRXRRR:アルギニン、X:イソロイシンI、ロイシンL、バリンV、アラニンA、グリシンG、メチオニンM、セリンSまたはトレオニンTの一つまたは複数の組み合わせ。本願配列表の配列番号11に示すという配列である。より具体的には、WO2009/101807A1号公報の配列番号1~20に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを利用できる。なお、後述する実施例では、Xを全てイソロイシンとしたPS-tagを用いている。また、親水性のポリカーボネートPCに結合する機能を有するペプチドとしては、例えば、特表2004-518442特願2003-571248号公報に記載されているペプチドを利用することができる。また、本発明者らが独自に見出したPCに結合する機能を有するペプチドである本願配列表の配列番号12~17にアミノ酸配列を有するペプチドも利用可能である。なお、本願配列表の配列番号12~17のペプチドは本出願時点において未公知である。また、ポリメタクリル酸メチルPMMAに結合する機能を有するペプチドとしては、例えば、を同定することが可能となる。それゆえ、抗体医薬候補のスクリーニングや診断用抗体のスクリーニングに非常に有用である。特に、抗体固定化担体に複数の抗体固定化領域を設ける場合、重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体の担体上の位置情報座標情報について、PC等の公知の演算装置で情報管理しておくことが好ましい。この構成により、例えば、抗体固定化担体に対して、ある疾病の原因物質抗原、ターゲット分子を接触させた場合に、シグナルが得られた座標から抗原特異性の高い重鎖と軽鎖とを特定することができる。また、固定化した重鎖および軽鎖の遺伝子情報もリンクさせておくことにより、抗原特異性の高い抗体遺伝子を得ることもできる。以上のように、本発明によれば、例えば、抗体医薬開発における時間、コスト、労力を大幅に削減でき、有用な抗体および抗体遺伝子を網羅的に取得可能である。さらに、患者の個人差にも対応した抗体医薬開発が可能となるテーラーメード抗体医薬。<2.抗体固定化担体の製造方法>本発明にかかる抗体固定化担体の製造方法は、重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体とを、それぞれ別々に担体に固定化して抗体固定化領域を作製する固定化工程を有し、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であればよく、その他の工程、条件、材料等については、従来公知のものを利用でき、特に限定されるものではない。また、より好適には、上記固定化工程は、上記抗体固定化領域を独立して2以上備えるように複数回行われるものであることが好ましい。本製造方法は、上記<1>欄で述べた抗体固定化担体を製造する方法と換言できるため、上記<1>欄の説明と重複する部分は上記説明を適宜援用できる。それゆえ、重複する説明は省略し、製造方法に特化した部分について説明する。例えば、重鎖低分子抗体軽鎖低分子抗体を遺伝子組換え技術により調製する場合、上述したように不溶性凝集体として得られることが一般的である。この不溶性凝集体を用いる場合は、まず不溶性凝集体を回収するために、変性剤を用いて可溶化させる。その後、多段階の透析を行って変性剤を除去して再活性化リフォールディングさせ、精製し定量した後、上記固定化工程を行って、担体に固定化する方法を利用できるいわゆる液相リフォールディング法。一方、不溶性凝集体を回収するために、変性剤を用いて可溶化させた状態で担体と接触させ、その後変性剤を除去して、リフォールディングさせることもできるいわゆる固相リフォールディング法。本発明では、いずれの方法でも利用できるが、収率、効率性工程とコストから、固相リフォールディング法を行うことが好ましい。すなわち、上記固定化工程には、a上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体の不溶性凝集体をそれぞれ変性剤にて変性させた状態で担体表面に接触させ、担体に固定化する第1の工程と、b上記固定化された変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体から変性剤を除去することにより、変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体をリフォールディングさせる第2の工程と、を有することが好ましい。上記a第1の工程において使用する溶液に含まれる低分子抗体の濃度についても特に限定されず適宜設定できるが、0.1μg/ml~500μg/mlが好ましく、0.5μg/ml~200μg/mlがより好ましく、1μg/ml~100μg/mlがさらに好ましい。ここで変性剤としては、一般的なタンパク質変性剤や界面活性剤等を用いることができ、特に限定されるものではないが、例えば尿素、塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤、SDS、CHAPS等の界面活性剤を挙げることができる。変性剤の濃度も使用する低分子抗体の量や種類に応じて適宜設定でき限定されない。例えば、後述する実施例に示すように、低分子抗体が5~100μg/mlである場合、変性剤としては0.5M~8Mの尿素を用いることが好ましく、0.5M~4Mの尿素を用いることがより好ましく、さらに0.5M~2Mの尿素を用いることがより好ましい。なお、このとき凝集抑制剤としてTween20等の界面活性剤を併用してもよい。変性剤は、例えば、まず不溶性凝集体を高濃度の変性剤存在下例えば、8Mで可溶化し、その後希釈して好ましい変性剤濃度0.5M~2Mにしてから担体に接触させて固定化する方法でもよい。変性の時間や固定化の時間についても、低分子抗体の量や種類に応じて適宜設定でき限定されない。固定化工程の場合は、低分子抗体の溶液と担体とを接触させる時間を例えば、10分~10時間、より好ましくは30分~5時間、さらに好ましくは1時間~3時間行うことが好ましい。bの第2の工程において、変性剤を除去する方法も公知の手法を利用でき限定されないが、例えば後述する実施例に示すように、一般的なbufferにて洗浄することにより、変性剤を除去できる。なお、上記a、bの工程において使用する低分子抗体を可溶化させるための緩衝液や、変性剤を除去するための洗浄液の組成についても従来公知のものを使用でき特に限定されない。例えば、後述する実施例に記載したものを好適に使用することができる。また、上記固定化工程における第1の工程および第2の工程は、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とで別々に行われることが好ましい。すなわち、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とについて別々に多段階例えば二段階で固定化することが好ましい。例えば、軽鎖低分子抗体について上記aの第1の工程を行って担体上に変性した軽鎖低分子抗体を固定化させる。その後、bの第2の工程を行って変性した軽鎖低分子抗体をリフォールディングさせる。次いで重鎖低分子抗体について同様にa第1の工程、b第2の工程を行うことが好ましい。後述する実施例に示すように、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とを別々に固定化した場合は、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とを混合した状態で担体と接触させ固定化工程を行った場合に比べて、顕著に抗原結合活性が優れたためである。このように、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とを別々に多段階で固定化する場合、いずれの低分子抗体を先に担体に固定化するかの順序についても特に限定されないが、軽鎖低分子抗体について第1の工程および第2の工程を行って固定化した後、重鎖低分子抗体について第1の工程および第2の工程を行って固定化することが好ましい。この順で固定化した場合、後述する実施例に示すように、担体上の抗体の抗原結合能をより一層高めることができるためである。上述した抗体固定化担体の製造方法によれば、低分子化した、異なる抗体由来の重鎖と軽鎖とが多数組み合わされて固定化された担体を効率よく製造することができる。なお、本発明には、上述した製造方法にて得られた抗体固定化担体も包含されることを念のため付言しておく。<3.抗体のスクリーニング方法>本発明にかかる抗体のスクリーニング方法は、上述した抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識する重鎖低分子抗体および/または軽鎖低分子抗体をスクリーニングする工程を有していればよく、その他の工程、条件、材料等については、従来公知のものを利用でき、特に限定されるものではない。本発明のスクリーニング方法によって選択された重鎖低分子抗体および/または軽鎖低分子抗体を再クローニングすることで完全長抗体を取得することができる。ここで特定の抗原として、例えば抗体医薬や診断用抗体の標的物質を用いた場合、抗体医薬や診断用抗体を取得することができる。例えば、抗体医薬の候補抗体を選別する場合であれば、上述した抗体固定化担体に対して、抗体医薬の標的物質抗原を接触させ、当該抗原を特異的に認識する抗体を選別すればよい。なお、抗原結合活性を評価する手法についても公知の手法を利用でき限定されないが、例えば後述する実施例に示すように、ビオチン化抗原を用いたELISA法等によって評価できる。また、スクリーニング方法に用いる特定の抗原には、検出の便宜のため、標識されていることが好ましい。標識に用いる標識物質としては、特に制限はなく、例えば、蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン、呈色標識物質等を挙げることができる。蛍光色素としては、一般に抗原であるポリペプチドやポリヌクレオチド等の物質を標識して、検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、特に限定されるものではない。例えば、フルオレシンイソチオシアネートFITC、HEX472’4’5’7’hexachloro6carboxylfluorescein、緑色蛍光色素、フルオレセインfluorescein、NED商品名、AppliedBiosystems社製、黄色蛍光色素、あるいは、6-FAM商品名、AppliedBiosystems社製、黄緑色蛍光色素、ローダミンrhodaminまたはその誘導体例えば、テトラメチルローダミンTMR、AlexaFluorInvitrogen、CyDyeGEHealthcare、QuantumDotInvitrogen等を挙げることができる。また、呈色標識物質としては、コロイド金属および着色ラテックスなどが挙げられる。コロイド金属の代表例としては、白金コロイド、金コロイドなどが挙げられる。コロイド金属の粒子の大きさは、通常は、直径3nm~100nm程度とされる。着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスが挙げられる。ラテックスとして天然ゴムラテックスのような天然ラテックスも使用できる。着色ラテックスの大きさは、直径数十nm~数百nm程度から選択することができる。これらの呈色標識物質は、市販品をそのまま使用できるが、場合によりさらに加工し、または、それ自体公知の方法で製造することもできる。本発明のスクリーニング方法によって選択された重鎖低分子抗体および/または軽鎖低分子抗体、またこれら低分子抗体をクローニングして得られた完全長抗体は、invivoでの治療および予防用途への利用、invitroおよびinvivoでの診断用途への利用、invitroでのアッセイおよび試薬用途への利用等の抗原抗体反応を含む種々の免疫測定法に用いることができる。なお、ヒトへのinvivoでの治療、予防および診断用途へ利用する場合は、実質的に純粋な完全ヒト抗体または少なくとも90~95、より好ましくは98~99以上のヒト由来の抗体部分を有するヒト化抗体が好ましい。本発明のスクリーニング方法で選別された抗体のアミノ酸配列を解析して、完全ヒト抗体等を作製する技術については公知の手法を利用すればよい。また、本発明には、上述した抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体完全ヒト抗体をスクリーニングする方法も包含される。ヒトに対して、任意の抗原を免疫して抗体を製造することは生命倫理上、許されない。このため、現在の抗体医薬は、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体や、マウス抗体の抗原結合部位CDR;complementarydeterminingregion、相補性決定領域のみをヒト抗体へ移植したヒト化抗体としてもっぱら開発されている。しかし、より抗原性が少なく安全性が高い完全ヒト抗体の開発が強く求められている。本発明に係るスクリーニング方法は、上記要望に応えて開発されたものであり、上述した抗体固定化担体を用いたInVitroDomainShuffling技術を用いて、キメラ抗体やヒト化抗体と実質的に同等かそれ以上の抗原特異性を有する完全ヒト抗体を取得するものである。具体的には以下の工程を備える。すなわち、上記スクリーニング方法の第一の態様は、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体完全ヒト抗体をスクリーニングする方法であって、上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程iと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程iiと、上記工程iiにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程iiiと、を有するものである。さらに、上記工程iiiで候補として決定した軽鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程ivと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程vと、上記工程vにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖の可変領域の候補として決定する工程viと、を有することが好ましい。本スクリーニング方法の第一の態様を概念的に説明すると以下の通りである。上記抗体固定化担体は、好ましい態様として、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とがそれぞれ別々に固定化された抗体固定化領域を複数備えるものである。ここで、当該抗体固定化領域における重鎖低分子抗体として、既に特定の抗原に対する抗原特異性が確認されているキメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体を固定化する。一方、軽鎖低分子抗体の部位には、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体を固定化する。つまり、既知の重鎖低分子抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖の可変領域を含むもの好ましくは1種類のみに対して、ヒト抗体由来の軽鎖のライブラリから任意に選択された軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体が組み合わされた、複数種類の抗体固定化領域を備える抗体固定化担体を調製することになる。このとき、ヒト抗体の軽鎖の多様性は約103個といわれているため、抗体固体化領域は約103個で調製することが好ましい。最後に、上記構成を有する抗体固定化担体に対して、抗原を接触させ、抗原結合活性の高い抗体固定化領域を特定し、当該領域に固定化された軽鎖低分子抗体を選出する。この軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定することになる。次いで、別途準備した抗体固定化担体の抗体固定化領域に、上記選出したヒト抗体の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体を固定化する。そして、重鎖低分子抗体として、複数の任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体を固定化する。つまり、候補として選出されたヒト抗体の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体に対して、ヒト抗体由来の重鎖のライブラリから任意に選択された重鎖の可変領域を含む低分子抗体が組み合わされた、複数種類の抗体固定化領域を備える抗体固定化担体を調製することになる。このとき、ヒト抗体の重鎖の多様性は約104個といわれているため、抗体固体化領域は約104個で調製することが好ましい。最後に、上記構成を有する抗体固定化担体に対して、抗原を接触させ、抗原結合活性の高い抗体固定化領域を特定し、当該領域に固定化された重鎖低分子抗体を選出する。この重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖の可変領域の候補として決定することになる。なお、抗体固定化領域は約104個で調製することが好ましいが、作業時間や手間を低減するために、抗体固定化領域を数個~102個、あるいは102個~103個とすることもできる。かかる場合であっても、本願発明を利用すれば、十分に優れた効果を有する完全ヒト抗体を取得できる。かかる方法により、ヒト抗体ライブラリから、特定の抗原に対して高い結合活性を有する軽鎖と重鎖の組み合わせを選出することができる。上記選出した軽鎖と重鎖を組み合わせることにより、キメラ抗体またはヒト化抗体と同等かそれ以上の抗原結合活性を有する完全ヒト抗体を得ることができる。また、上記の態様では、まずキメラ抗体またはヒト化抗体の重鎖と組み合わせて、抗原特異性の高いヒト抗体の軽鎖の候補を選出したが、本発明はこの態様に限られない。例えば、まずキメラ抗体またはヒト化抗体の軽鎖と組み合わせて、ヒト抗体の重鎖ライブラリから任意に選択した重鎖低分子抗体の候補を選出した後、かかる重鎖の候補と組み合わせて、抗原特異性の高いヒト抗体の軽鎖の候補を選出する方法であってもよい。すなわち、本発明のスクリーニング方法の第二の態様として、上記抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程iと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程iiと、上記工程iiにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖領域の候補として決定する工程iiiと、を有するものであってもよい。さらに、上記工程iiiで決定した重鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程ivと、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程vと、上記工程vにおいて、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程viと、を有することが好ましい。また、上記のスクリーニング方法では、いったんヒト抗体の軽鎖あるいは重鎖を候補として選出した後、当該候補である軽鎖あるいは重鎖と組み合わせて、抗原結合活性が高いヒト抗体由来の重鎖あるいは軽鎖の候補を選出するという二段階の方法であったが、本発明は、かかる態様に限られない。例えば、aキメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖あるいは軽鎖と組み合わせて、抗原結合活性の高いヒト抗体の軽鎖あるいは重鎖を候補として選出する工程、bキメラ抗体またはヒト化抗体由来の軽鎖あるいは重鎖と組み合わせて、抗原結合活性の高いヒト抗体の重鎖あるいは軽鎖を候補として選出する工程、を別々に行い、上記a,bの工程のそれぞれから選出されたヒト抗体の軽鎖および重鎖の候補を組み合わせて、より抗原結合活性に優れる完全ヒト抗体を得てもよい三段階。かかる態様であれば、選出されたヒト抗体の軽鎖候補と重鎖候補とについて、それぞれ複数の組み合わせで、抗原結合活性を調べることができる点で好ましい。加えて、本発明には、上記スクリーニング方法により、決定されたヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補と重鎖の可変領域の候補とを組み合わせて、ヒト抗体を製造する工程を有するヒト抗体の製造方法も包含される。つまり、本発明のヒト抗体の製造方法は、スクリーニング方法を一工程として含むものと換言できる。ヒト抗体の軽鎖ライブラリまたは重鎖ライブラリから選出された軽鎖と重鎖の候補から、完全ヒト抗体を製造する方法については、従来公知の手法を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、上述した低分子抗体を得る場合に利用するクローン化技術や化学合成法によって製造することが可能であり、その説明を援用する。例えば、クローン化技術を利用すれば、上記の抗体をコードするDNAを調製し、これを自律複製可能なベクターに挿入して組換えDNAとし、これを大腸菌、動物細胞などの適宜宿主に導入して形質転換体とし、その培養物から本アミノ酸配列を含むペプチドを採取することができる。その他、無細胞タンパク質合成系や慣用のペプチド化学合成法を利用してもよい。また抗体の精製についても、公知の手法を利用でき特に限定されない。本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、明細書に記載した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。<1.材料>1インクルージョンボディ可溶化用solubilizationbufferpH7.56M塩酸グアニジン、10mM2-メルカプトエタノール、2×PBS2Fab精製用BindingbufferpH7.5...A液8M尿素、20mMイミダゾール、2×PBS3Fab精製用ElutionBufferpH7.5...B液8M尿素、400mMイミダゾール、2×PBS4固相リフォールディング用親水性ポリスチレン担体PSプレート組織培養用96ウェルマイクロプレートAGCTechnoglass3861-096。5ELISA用発色液ABTSInvitrogen:00-2001100μlを0.1Mクエン酸bufferpH4.0、0.03H2Oで100倍希釈して使用した。6Fab発現用ベクター:pET22Novagen7発現用宿主:大腸菌RosettaDE3Novagen<2.使用した抗体遺伝子の文献>1抗RNase抗体KatakuraYKobayashiEKurokawaYOmasaTFujiyamaKSugaKCloningofcDNAandCharacterizationofAntiRNaseAMonoclonalAntibody3A21JournalofFermentationandBioengineering823123142抗CRP抗体DongHwanChoiKatakuraYNinomiyaKShioyaSRationalScreeningofAntibodiesandDesignofSandwichEnzymeLinkedImmunosorbentAssayontheBasisofaKineticModelJournalofBioscienceandBioengineering1052612723抗ED-B抗体および抗IFNG抗体AlessandroPiniFrancescaVitiAnnalisaSantucciBarbaraCarnemollaiLucianoZardiiPaoloNeriandDarioNeriDesignandUseofaPhageDisplayLibraryTheJournalofBiologicalChemistry27321769-21776<3.低分子抗体FabおよびPS-tag融合Fabの調製>上記文献はいずれもscFv遺伝子に関する文献である。このため、本実施例ではFab遺伝子についてはscFv遺伝子からVH,VLドメイン部分に相当する遺伝子をPCRで単離し、CH1ドメインおよびCkドメインの遺伝子と融合して調製した。実施例で使用したFabおよびPS-tag融合Fabのアミノ酸配列は以下の通りである。なお、使用したFabおよびPS-tag融合FabのN末端部は開始コドンであるメチオニンMとした。また、PS-tagなしの場合はC末端部にpET22由来の配列の末尾にヒスチジンタグH×6を、またPS-tag有りの場合はpET22由来の配列の間にPS-tag配列を加え、C末端部分にヒスチジンタグH×6を付加した。マウス抗RNase抗体由来のFab-HFabH...配列番号1PS-tag融合マウス抗RNase抗体由来のFab-HFabH-PS...配列番号2マウス抗RNase抗体由来のFab-LFabL...配列番号3PS-tag融合マウス抗RNase由来のFab-LFabL-PS...配列番号4PS-tag融合マウス抗CRP抗体由来のFab-HFabH-PS...配列番号5PS-tag融合マウス抗CRP抗体由来のFab-LFabL-PS...配列番号6PS-tag融合ヒト抗ED-B抗体由来のFab-HFabH-PS...配列番号7PS-tag融合ヒト抗ED-B抗体由来のFab-LFabL-PS...配列番号8PS-tag融合ヒト抗IFNG抗体由来のFab-HFabH-PS...配列番号9PS-tag融合ヒト抗IFNG抗体由来のFab-LFabL-PS...配列番号10具体的な低分子抗体FabおよびPS-tag融合Fabの調製方法は以下の通りである。A大腸菌の培養まず、2×YT培地Amp、Cm含有10mlに組換え大腸菌を植菌し、37°Cで一晩、前培養した。次いで、OvernightExpress培地NovagenAmp、Cm含有50mlに前培養液をOD600=0.1になるように加え、37°C、200rpmで24時間培養した。最後に、培養後、遠沈管に培養液を移して20分間遠心分離し、上清を取り除いた。なお、抗生物質Amp及びCmの濃度についてAmpは50μg/ml、Cmは34μg/mlになるよう培地に添加した。Bインクルージョンボディの回収まず、ペレット状の菌体にBugBusterNovagen2.5ml、リゾチーム1mg/ml、BenzonaseNucleaseNovagen2.0μl加えてvortexした。次いで、エッペンチューブに分注し、遠心分離した4°C、20000×g、20分間。次に、上清を除去し、蒸留水を800μl添加後、vortexして再び遠心分離した4°C、20000×g、20分。続いて、上清を除去後、インクルージョンボディを回収した。最後に、solubilizationbufferを5ml加え、インクルージョンボディを溶解した。Cアフィニティクロマトグラフィーによる精製以下の手順で可溶化した低分子抗体を変性状態で精製した。まず、A液、B液を調製した。次に、クロマトグラフィーシステムAKTAを起動し、LineA、BにA液、B液をセットした。LineA、BをそれぞれA液、B液で置換し、HisTrapTMHPカラムGEHealthCareを取り付けた。次いで、A液を流速1ml/minでカラムに供給し、カラム内を平衡化した。可溶化した低分子抗体を流速1ml/minで供給し、カラムに吸着させた。A液を流速1ml/minでカラムに供給し、洗浄した。続いて、B液を流速1ml/minでカラムに供給し、FabおよびPS-tag融合Fabを回収した。回収後、低分子抗体を8M尿素-1×PBSに対して一晩透析した。<4.ビオチン化抗原の調製>まず、抗原1mg/mlを1×PBS1Lに対して透析した。次に、ビオチンアミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを1mg量り取り、N,N-ジメチルホルムアミド10μl加え、溶解させたC溶液。透析後の抗原をサンプル瓶に移し、C溶液を10μl加えて室温で1時間、ゆるやかに撹拌した。その後、1×PBS1Lに対して一晩透析した。<5.マウス抗RNase抗体由来の低分子抗体を用いた抗体固定化担体>マウス抗RNase抗体由来の低分子抗体を、親水性PSプレート上に固相リフォールディング法により固定化した。具体的には、まず低分子抗体FabH、FabH-PSの終濃度が100μg/ml、尿素の終濃度が4M、Tween20の終濃度が1となるように希釈し、室温で10分間インキュベートした。次いで、親水性PSプレートに100μl添加し、25°Cで1時間インキュベートした。その後、0.1PBSTで5回洗浄し、FabHを親水性PSプレート上でリフォールディングさせた。FabL、FabL-PSおよびFabH-PSに対しても上記と同様の操作を行い、それぞれ親水性PSプレート上に固定化させた。作製した抗体固定化担体は以下の6通り。FabHを固定化した担体HFabLを固定化した担体LFabH-PSを固定化した担体H-PSFabL-PSを固定化した担体L-PSFabH-PSを担体に固定化した後、FabL-PSを固定化した担体H-PS/L-PSFabL-PSを担体に固定化した後、FabH-PSを固定化した担体L-PS/H-PSこれらの抗体固定化担体を用いて、それぞれの抗原結合活性をELISA法により調べた。具体的には、まず低分子抗体を固定化したPSプレートに2BSA-PBSTを300μl添加し、25°Cで1時間インキュベートした。次にPBSTで5回洗浄後、0.2BSA-PBSTで0~5μg/mlに希釈したビオチン化抗原マウスRNaseを100μl添加し、25°Cで1時間インキュベートした。次いでPBSTで5回洗浄後、0.2BSA-PBSTで5000倍希釈したHRP標識ストレプトアビジンを100μl添加し、25°Cで1時間インキュベートした。最後にPBSTで5回洗浄後、発色液を100μl加えて25°Cで30分間インキュベートし吸光度を測定した。結果を図2に示す。同図に示すように、L-PS/H-PSのみ抗原結合活性が得られた。<6.固相リフォールディング条件の検討>マウス抗RNase抗体由来の低分子抗体を親水性PSプレートに固定化する際の固相リフォールディング条件を検討した。具体的な方法は、低分子抗体FabH,FabH-PS,FabLまたはFabL-PSの終濃度を5μg/mlとし、尿素の終濃度を4M、2M、1M、0.5Mとした以外は、上記<5>と同じ方法で親水性PSプレート上に固定化した。低分子抗体の組み合わせを変えて、操作を繰り返し、以下の5種類の抗体固定化担体を作製した。FabHを固定化した後、FabL-PSを固定化した担体HL-PSFabL-PSを担体に固定化した後、FabHを固定化した担体L-PSHFabLを担体に固定化した後、FabH-PSを固定化した担体LH-PSFabH-PSを担体に固定化した後、FabL-PSを固定化した担体H-PSL-PSFabL-PSを担体に固定化した後、FabH-PSを固定化した担体L-PSH-PSこれらの抗体固定化担体を用いて、それぞれの抗原結合活性をELISA法により調べた。ELISA法は、用いたビオチン化抗原マウスRNaseの濃度を1μg/mlとした以外は、上記<5>と同じ方法で行った。結果を図3に示す。同図に示すように、尿素の濃度が0.5M~2Mの場合、L-PSH-PS、H-PSL-PS、LH-PS、HL-PS、L-PSHの順で活性が高かった。なお、尿素の濃度が4Mでは、L-PSH-PSのみに活性が確認された。<7.マウス抗CRP抗体、マウス抗RNase抗体、ヒト抗IFNG抗体およびヒト抗ED-B抗体由来の低分子抗体を用いた抗体固定化担体>マウス抗CRP抗体、マウス抗RNase抗体、ヒト抗IFNG抗体およびヒト抗ED-B抗体由来の、FabH-PS、FabL-PSをそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製した。まず各種FabL-PSを親水性PSプレートに固定化した後、各種FabH-PSを固定化した。固定化の方法は、各種FabL-PS,FabH-PSの終濃度を5μg/mlとし、尿素の終濃度を2Mとした以外は、上記<5>,<6>と同様の操作で行った。各種FabL-PS,FabH-PSの組み合わせを変えて操作を繰り返し、最終的に各種FabL-PS,FabH-PSの全ての組み合わせた16種類の抗体固定化担体と、各種FabL-PSまたはFabH-PSのみを固定化した抗体固定化担体8種類を作製した。抗原としてマウスRNase、マウスCRP、ヒトED-BまたはヒトIFNGを用いて、それぞれの抗原結合活性をELISA法により調べた。ELISA法は、上記<6>と同じ方法で行った。それぞれの検出結果を図4~図7に示す。図中、w/oHはFabH-PSを固定化せず、FabL-PSのみ固定化したことを示す。同様にw/oLはFabL-PSを固定化せず、FabH-PSのみ固定化したことを示す。また例えば、グラフの縦軸がHED-Bである場合のLED-Bのバーは、ヒト抗ED-B抗体由来のFabL-PSとFabH-PSとが固定化されたPSプレートの抗原結合活性の結果を示す。図4に示すように、抗原としてマウスRNaseを用いた場合、マウス抗RNase抗体由来のFabL-PSとFabH-PSとが固定化されたPSプレートのみが抗原結合活性を有していた。図5に示すように、抗原としてマウスCRPを用いた場合、軽鎖ではマウス抗CRP抗体由来のFabL-PSの抗原結合活性が高かった。しかし、重鎖ではヒト抗ED-B抗体由来のFabH-PSの抗原結合活性が高く、これら両者の組み合わせが最も抗原結合活性が高かった。図6に示すように、抗原としてヒトED-Bを用いた場合、重鎖がヒト抗ED-B抗体由来以外のFabH-PSである場合、マウス抗CRP抗体由来のFabL-PSの抗原結合活性が高かった。一方、重鎖軽鎖の組み合わせとしてみた場合は、ヒト抗ED-B抗体由来のFabL-PSとFabH-PSの組み合わせが最も抗原結合活性が高かった。一方、図7に示すように、抗原としてヒトIFNGを用いた場合、FabH-PS、FabL-PSともに特異性が認められず、FabH依存的に抗原に結合するものと考えられる。<8.固定化方法の違いによる低分子抗体の抗原結合活性の検討>マウス抗RNase抗体由来の、FabH、FabL、FabH-PS、FabL-PSをそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製するに際して、固定化方法の違いによる抗原結合活性の違いを検討した。具体的には、重鎖低分子抗体または軽鎖低分子抗体をそれぞれ単独で固定化した場合、重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体を混合した状態で同時に固定化した場合、重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体について逐次的に多段階で固定化した場合で比較した。具体的な方法は以下の通り。単独で固定化する場合まずFabH、FabH-PS、FabLまたはFabL-PSのいずれかについて、終濃度が200μg/ml、尿素の終濃度が4M、Tween20の終濃度が1となるように希釈し、室温で10分間インキュベートした。次いで、親水性PSプレートに100μl添加し、25°Cで1時間インキュベートした。その後、PBSTで5回洗浄し、FabH、FabH-PS、FabLまたはFabL-PSのいずれかを親水性PSプレート上でリフォールディングさせた。抗原結合活性の結果を図8aに示す。混合して固定化する場合まずFabHまたはFabH-PSと、FabLまたはFabL-PSとの組み合わせについて、それぞれの低分子抗体の終濃度が200μg/mlとし組み合わせの合計で400μg/ml、尿素の終濃度が4M、Tween20の終濃度が1となるように希釈し、室温で10分間インキュベートした。次いで、親水性PSプレートに100μl添加し、25°Cで1時間インキュベートした。その後、PBSTで5回洗浄し、低分子抗体の組み合わせを親水性PSプレート上でリフォールディングさせた。抗原結合活性の結果を図8bに示す。逐次多段階にて固定化する場合低分子化抗体の終濃度を200μg/mlとした以外は、上記<5>と同様の操作にて固定化した。抗原結合活性の結果を図8cに示す。図8a~cに示すように、上記単独で固定化する場合および混合して固定化する場合のいずれも抗原結合活性はほとんど認められず、逐次多段階にて固定化する場合のみ抗原結合活性が認められた。特に、FabLまたはFabL-PSを担体に固定化した後、FabHまたはFabH-PSを固定化した場合に優れた抗原結合活性が認められた。<9.マウス抗体ライブラリからの抗AFP抗体のスクリーニング実験>まず、1次スクリーニングとして、抗原に親和性の重鎖H鎖および軽鎖L鎖のスクリーニングを行った。具体的な手順は、以下の通りである。1AFP免疫マウスからの抗体遺伝子の増福;抗原として、肝がんの診断マーカーであるαフェトプロテインAFPを用いた。AFP50μgをマウスに1週間おきに4回免疫し、5週目に脾臓を摘出した。脾臓中のTotalRNAを回収し、RT-PCRで抗体のFabHおよびFabL遺伝子群を増幅させた。FabHおよびFabL遺伝子群をPS-tag融合タンパク質発現ベクターpET-PS19-6のNdeI/NotIサイトにライゲーションした。ライゲーション後のベクターで大腸菌BL21DE3Rosettaを形質転換し、LB-アンピシリンプレート上でシングルコロニー化させた。FabH遺伝子群を導入した大腸菌をFabH-PS大腸菌ライブラリ1×105コロニー、FabL遺伝子群を導入した大腸菌をFabL-PS大腸菌ライブラリ1×105コロニーとした。2マイクロプレートを用いるPS-tag融合FabHFabH-PSおよびPS-tag融合FabLFabL-PSのハイスループット生産;まず、96ウェルディープウェルプレートグライナー社製、780271の各ウェルに50μg/mlアンピシリンおよび34μg/mlクロラムフェニコールを含むOvernightExpressTB培地メルクを1ml加えた。これらを20プレート分用意した。次に、LB-アンピシリンプレート上でシングルコロニー化したFabH-PS大腸菌ライブラリからシングルコロニーを採取し、上述のディープウェルプレートの各ウェルに植菌した。次いで、FabL-PS大腸菌ライブラリからも同様にシングルコロニーを植菌した。具体的には、FabH-PS大腸菌ライブラリ、FabL-PS大腸菌ライブラリそれぞれ10プレート960コロニーずつ植菌した。その後、ディープウェルプレートを37°C、1,400rpmで24時間培養した。3菌体破砕ならびにインクルージョンボディの可溶化;ディープウェルプレートを5000rpm、20min遠心分離を行い、上清を除去した。次に、菌体破砕液Bugbuster20ml,Lysozyme20mg,benzonaze6μlを各ウェルに200μlずつ添加し、1800rpm、37°Cで1時間振盪させた。次いで、5000rpm、20min遠心分離後、上清を除去し、イオン交換水を各ウェルに200μlずつ添加し、懸濁させた。この操作を2回繰り返した。その後、5000rpm、20min遠心分離した後、可溶化液8MUreaPBS50ml,メルカプトエタノール35μlを各ウェルに500μlずつ加え、25°C、14000rpmで1時間振盪させた。続いて、5000rpm、20min遠心分離を行い、上清に含まれるFabH-PSおよびFabL-PSを以下のとおり精製した。4フィルタープレートによるFabH-PSおよびFabL-PSの精製;96ウェルフィルタープレートワットマンに50NiSepharose4BGEHealthCareレジンを200μl/wellずつ添加した。400μl次いで、200μlのBindingBuffer18M尿素-2×PBS、20μMイミダゾールで平衡化した。各wellにディープウェルプレートから500μlのサンプルをフィルタープレートに添加した。ピペッティングで穏やかにレジンとサンプルを混和し、20分間インキュベートした。サンプル溶液をアスピレーターで吸引して除去し、400μlのBindingBuffer1で1回、さらに200μlのBindingBuffer1で2回洗浄した。さらに、200μlのBindingBuffer28M尿素-1×PBS、20μMイミダゾールで洗浄し、アスピレーターで溶液を除去した。その後、250μlのElutionBuffer8M尿素-400mMイミダゾール-1×PBSを添加し、20分間インキュベートすることでレジンに吸着したFabH-PSおよびFabL-PSを溶出した。次いで、フィルタープレートと800μl用96ウェルディープウェルプレートグライナーを重ね、遠心分離500g,5minにより溶出液を回収ディープウェルプレート内に回収した。この操作を2回行った。その後、再度、上記およびの操作を行った。5FabH-PSライブラリおよびFabL-PSライブラリからのAFP高親和性クローンの単離;スクリーニング用96ウェルPSplateとして蛍光測定用BlackplateBDFalcon353241を用いた。PSplateに30Wで1分間酸素プラズマを照射し、PSplateの表面を親水化した。1.33TweenPBSを75μlずつ添加後、FabH-PSライブラリまたはマウスH鎖ライブラリを25μlずつ各ウェルに添加した。これを4°Cで一晩インキュベートした。次いで、0.1TweenPBSにて洗浄後、2BSA-0.1TweenPBSを各ウェルに270μl添加し、1時間ブロッキングした。次に、0.1TweenPBSにて洗浄後、0.2BSA-0.1TweenPBSを用いて1μg/mlのAlexaFluor647標識AFPを作製し、各ウェルに100μlずつ添加後、遮光して1時間インキュベートした。0.1TweenPBSにて洗浄後、蛍光プレートリーダーTECANinfiniteM200を用いて蛍光強度を測定した励起波長:645nm、蛍光波長:678nm。蛍光強度の高い順からFabH-PSクローンを40種類、FabL-PSクローンを30種類選択し、次の工程に用いた。その結果を図9,図10に示す。なお、図中、棒グラフは吸着量左側目盛を示し、点は蛍光強度右側目盛を示す。なお、H鎖の960クローンの平均シグナル強度蛍光強度は、1086であった。また、L鎖の960クローンの平均シグナル強度蛍光強度は、1028であった。6InVitroDomainShufflingを用いるFabライブラリプレートの作成とAFP高親和性Fabのスクリーニング;上記で選択したFabH-PSクローンを40種類、FabL-PSクローンを30種類用いて、基板上に1200種類H鎖:40種×L鎖:30種の抗体ライブラリを作製し、抗原結合性を評価した2次スクリーニング。具体的な手順は以下の通りである。スクリーニング用384ウェルPSplateとして蛍光測定用BlackplateBDFalcon353285を用いた。PSplateに30Wで1分間酸素プラズマを照射し、PSplateの表面を親水化した。1.33TweenPBSを30μlずつ添加後、FabL-PSライブラリ上位30クローンを10μlずつ各ウェルに添加した。これを25°Cで2時間インキュベートした。次いで、1.33TweenPBSを30μlずつ添加後、FabH-PSライブラリ上位40クローンを10μlずつ各ウェルに添加した。これを25°Cで2時間インキュベートした。0.1TweenPBSにて洗浄後、2BSA-0.1TweenPBSを各ウェルに80μl添加し、1時間ブロッキングした。0.1TweenPBSにて洗浄後、0.2BSA-0.1TweenPBSを用いて1μg/mlのAlexaFluor647標識AFPを作製し、各ウェルに100μlずつ添加後、遮光を施し1時間インキュベートした。0.1TweenPBSにて洗浄後、蛍光プレートリーダーTECANinfiniteM200を用いて蛍光強度を測定した励起波長:645nm、蛍光波長:678nm。蛍光強度のシグナルが5000以上となった重鎖と軽鎖との組み合わせを抗AFP抗体として判定した。その結果、H3,L4、H3,L6、H3,L12、H6,L6、H8,L6、H8,L15、H19,L9、H20,L9、H35,L6の9種類が、肝がん診断用の抗AFP特異的抗体として判定した。なお、括弧の中のHは重鎖を意味し、数字は図9に示すH鎖の順位である。同様に、括弧の中のLは軽鎖を意味し、数字図10に示すL鎖の順位である。つまり、これらの重鎖と軽鎖の組み合わせが抗AFP抗体として利用可能であることがわかった。<10.ヒト抗体ライブラリを用いたキメラ抗体からヒト抗体への変換>InVitroDomainShuffling技術を用いて、キメラ抗体と同等かそれ以上の抗原特異性を有する完全ヒト抗体を取得することを目的として、以下の実験を行った。1ヒト抗体遺伝子の増福;ヒト脾臓TotalRNAクロンテック636525から、RTPCRでヒト抗体のFabHおよびFabL遺伝子群を増幅した。FabHおよびFabL遺伝子群をPS-tag融合タンパク質発現ベクターpET-PS19-6のNdeI/NotIサイトにライゲーションした。ライゲーション後のベクターで大腸菌BL21DE3Rosettaを形質転換し、LB-アンピシリンプレート上でシングルコロニー化させた。FabH遺伝子群を導入した大腸菌をFabH-PS大腸菌ライブラリ1×106コロニー、FabL遺伝子群を導入した大腸菌をFabL-PS大腸菌ライブラリ1×106コロニーとした。2マイクロプレートを用いるPS-tag融合FabHFabH-PSおよびPS-tag融合FabLFabL-PSのハイスループット生産;96ウェルディープウェルプレートグライナー社製、780271の各ウェルに50μg/mlアンピシリンおよび34μg/mlクロラムフェニコールを含むOvernightExpressTB培地メルクを1ml加えた。これらを20プレート分用意した。LB-アンピシリンプレート上でシングルコロニー化したFabH-PS大腸菌ライブラリからシングルコロニーを採取し、上述のディープウェルプレートの各ウェルに植菌した。FabL-PS大腸菌ライブラリからも同様にシングルコロニーを植菌した。FabH-PS大腸菌ライブラリ、FabL-PS大腸菌ライブラリそれぞれ10プレート960コロニーずつ。ディープウェルプレートを37°C、1,400rpmで24時間培養した。3菌体破砕ならびにインクルージョンボディの可溶化;ディープウェルプレートを5000rpm、20min遠心分離を行い、上清を除去した。次いで、菌体破砕液Bugbuster20ml、Lysozyme20mg、benzonaze6μlを各ウェルに200μlずつ添加し、1800rpm、37°Cで1時間振盪させた。5000rpm、20min遠心分離後、上清を除去し、イオン交換水を各ウェルに200μlずつ添加し、懸濁させた。この操作を2回繰り返した。続いて、5000rpm、20min遠心分離後、可溶化液8MUreaPBS50ml、メルカプトエタノール35μlを各ウェルに500μlずつ加え、25°C、14000rpmで1時間振盪させた。次に、5000rpm、20min遠心分離を行い、上清に含まれるFabH-PSおよびFabL-PSを以下のとおり精製した。4フィルタープレートによるFabH-PSおよびFabL-PSの精製;96ウェルフィルタープレートワットマンに50NiSepharose4BGEHealthCareレジンを200μl/wellずつ添加した。400μl次いで200μlのBindingBuffer18M尿素-2xPBS、20μMイミダゾールで平衡化した。各wellにディープウェルプレートから500μlのサンプルをフィルタープレートに添加した。ピペッティングで穏やかにレジンとサンプルを混和し、20分間インキュベートした。その後、サンプル溶液をアスピレーターで吸引して除去し、400μlのBindingBuffer1で1回、さらに200μlのBindingBufferで2回洗浄した。次に、200μlのBindingBuffer28M尿素-1×PBS、20μMイミダゾールで洗浄し、アスピレーターで溶液を除去した。続いて、250μlのElutionBuffer8M尿素-400mMイミダゾール-1×PBSを添加し、20分間インキュベートすることでレジンに吸着したFabH-PSおよびFabL-PSを溶出した。次に、フィルタープレートと800μl用96ウェルディープウェルプレートグライナーを重ね、遠心分離500g、5minにより溶出液を回収ディープウェルプレート内に回収した。この操作を2回行った。再度、およびの操作を行った。5InVitroDomainShufflingを用いたリツキサン登録商標キメラFabH-PS/ヒトFabL-PSライブラリの評価960クローン中95クローンの選抜;既に上市されているリツキサン登録商標をモデル抗体として、キメラ抗体と同等かそれ以上の抗原特異性を有する完全ヒト抗体の取得を試みた。なお、リツキサン登録商標は、CD20を標的とし、細胞性リンパ腫に適用される抗体医薬である。なお、抗原であるCD20抗原は、エピトープ部分が既に公開されている。このため、当該エピトープペプチドのみを固相合成法にて合成し、N末端部分にFITCを付加した蛍光標識エピトープペプチドを作製し、抗原として用いた。具体的な手順は以下の通りである。スクリーニング用384ウェルPSplateとして蛍光測定用BlackplateBDFalcon353285を用いた。PSplateに30Wで1分間酸素プラズマを照射し、PSplateの表面を親水化した。次に、1.33TweenPBSを27μlずつ添加後、ヒトFabL-PSライブラリを9μl各ウェルに添加した。リツキサン登録商標キメラFabH-PSを2MUrea1TweenPBS,250μg/mlに調製したものを4μl添加後、2時間インキュベートした。続いて、0.1TweenPBSにて洗浄後、2BSA-0.1TweenPBSを各ウェルに80μl添加し、1時間ブロッキングした。次いで、0.1TweenPBSにて洗浄後、0.1Tween20および5ヒト血清を含む1μg/mlのFITC標識抗原溶液を作製し、各ウェルに40μlずつ添加後、遮光を施し1時間インキュベートした。0.1TweenPBSにて洗浄後、蛍光プレートリーダーTECANinfiniteM200を用いて蛍光強度を測定した励起波長:486nm、蛍光波長:520nm。キメラH鎖とヒトL鎖ライブラリ960種の掛けあわせた結果の結果を図11に示す。図中、縦軸は蛍光強度、横軸はヒトL鎖の種類を示す。掛けあわせのうち、最も高い蛍光強度は6435であり、平均蛍光強度は2466であった。キメラH鎖との掛けあわせ960クローン中、蛍光強度が4000以上のL鎖について、検出された蛍光強度の高い順に95クローンを選択した。6InVitroDomainShufflingを用いたリツキサン登録商標キメラFabH-PS/ヒトFabL-PSライブラリTop95クローンの評価;上記選択したL鎖95クローンについて、キメラ抗体のH鎖との組み合わせ並びに単独の比活性を評価した。スクリーニング用96ウェルPSplateとして蛍光測定用BlackplateGreiner655076を用いた。PSplateに30Wで1分間酸素プラズマを照射し、PSplateの表面を親水化した。ヒトFabL-PSTop95クローンとリツキサン登録商標FabH-PSキメラを混合し、終濃度として尿素2M、Tween201、キメラFabH-PS25μg/mlとした。コントロールとして、終濃度0.1Tween20および2M尿素のヒトFabL-PSライブラリ溶液すなわち、キメラFabH-PSを含まないも調製した。これらを各ウェル100μlずつ添加し、2時間インキュベートした。0.1TweenPBSにて洗浄後、2BSA-0.1TweenPBSを各ウェルに270μl添加し、1時間ブロッキングした。0.1TweenPBSにて洗浄後、0.1Tween20および5ヒト血清を含む1μg/mlのFITC標識抗原溶液を作製し、各ウェルに100μlずつ添加後、遮光を施し1時間インキュベートした。0.1TweenPBSにて洗浄後、蛍光プレートリーダーTECANinfiniteM200を用いて蛍光強度を測定した励起波長:486nm、蛍光波長:520nm。結果を図12に示す。図中、上部パネルがヒトL鎖の上位95クローンとキメラ抗体のH鎖との組み合わせの蛍光強度を示し、下部パネルがヒトL鎖の95クローン単独の蛍光強度を示す。上部パネルに示すように、ヒトL鎖の上位95クローンとキメラ抗体のH鎖との組み合わせのうち、蛍光強度が6000以上増加したものは61クローン63.8、4000以上増加したものは77クローン81.9、2000以上増加したものは93クローン98.9であり、最大で14131増加したクローンもあった。スクリーニングしたヒトL鎖の多くがキメラ抗体由来のH鎖と組み合わせた際に、抗原結合力が大幅に上昇することが明らかとなった。7InVitroDomainShufflingを用いたヒトFabH-PSライブラリ/リツキサン登録商標キメラFabL-PSの評価960クローン中94クローンの選抜;次に、キメラ抗体のL鎖とヒトのH鎖ライブラリ960種類とを掛けあわせて、好適なヒトH鎖をスクリーニングした。スクリーニング用384ウェルPSplateとして蛍光測定用BlackplateBDFalcon353285を用いた。PSplateに30Wで1分間酸素プラズマを照射し、PSplateの表面を親水化した。1.33TweenPBSを27μlずつ添加後、ヒトFabH-PSライブラリを9μl各ウェルに添加した。リツキサン登録商標キメラFabL-PSを2MUrea1TweenPBS,250μg/mlに調製したものを4μl添加後、2時間インキュベートした。次いで、0.1TweenPBSにて洗浄後、2BSA-0.1TweenPBSを各ウェルに80μl添加し、1時間ブロッキングした。0.1TweenPBSにて洗浄後、0.1Tween20および5ヒト血清を含む1μg/mlのFITC標識抗原溶液を作製し、各ウェルに40μlずつ添加後、遮光を施し1時間インキュベートした。0.1TweenPBSにて洗浄後、蛍光プレートリーダーTECANinfiniteM200を用いて蛍光強度を測定した励起波長:486nm、蛍光波長:520nm。キメラ抗体由来のL鎖とヒトH鎖ライブラリ960種の掛けあわせた結果を図13に示す。図中、縦軸が蛍光強度、横軸はヒトH鎖の種類を示す。掛けあわせのうち、最も高い蛍光強度は12074であり、平均蛍光強度は2716であった。キメラ抗体由来のL鎖との掛けあわせたヒトH鎖960クローン中、蛍光強度が4000以上のH鎖について、検出された蛍光強度の高い順に94クローンを選択した。8InVitroDomainShufflingを用いたヒトFabH-PSライブラリTop94クローン/リツキサン登録商標キメラFabL-PSの評価;上記選択したH鎖94クローンについて、キメラ抗体のL鎖との組み合わせ並びに単独の比活性を評価した。スクリーニング用96ウェルPSplateとして蛍光測定用BlackplateGreiner655076を用いた。PSplateに30Wで1分間酸素プラズマを照射し、PSplateの表面を親水化した。8M尿素-PBSに溶解したヒトFabH-PSライブラリTop94クローンとリツキサン登録商標FabL-PSキメラを混合し、終濃度として尿素2M、Tween201、キメラFabL-PS25μg/mlとした。コントロールとして、終濃度0.1Tween20および2M尿素のヒトFabH-PSライブラリ溶液すなわち、キメラFabL-PSを含まないも調製した。これらを各ウェル100μlずつ添加し、2時間インキュベートした。0.1TweenPBSにて洗浄後、2BSA-0.1TweenPBSを各ウェルに270μl添加し、1時間ブロッキングした。0.1TweenPBSにて洗浄後、0.1Tween20および5ヒト血清を含む1μg/mlのFITC標識抗原溶液を作製し、各ウェルに100μlずつ添加後、遮光を施し1時間インキュベートした。0.1TweenPBSにて洗浄後、蛍光プレートリーダーTECANinfiniteM200を用いて蛍光強度を測定した励起波長:486nm、蛍光波長:520nm。結果を図14に示す。図中、上部パネルがヒトH鎖の上位94クローンとキメラ抗体のL鎖との組み合わせの蛍光強度を示し、下部パネルがヒトH鎖の94クローン単独の蛍光強度を示す。上部パネルに示すように、ヒトH鎖の上位94クローンとキメラ抗体のL鎖との組み合わせのうち、蛍光強度が2000以上増加したものは17クローン18.1、1000以上増加したものは83クローン67.0であり、最大で5272増加したクローンもあった。スクリーニングしたヒトH鎖の多くがキメラ抗体由来のL鎖と組み合わせた際に、抗原結合力が大幅に上昇することが明らかとなった。9InVitroDomainShufflingを用いたヒトFabH-PSライブラリ/ヒトFabL-PSの評価;次に、上記5~8において選別したヒトFabL-PSおよびヒトFabH-PSの中から抗原への結合能が高いクローンを、ヒトFabL-PS5種類クローンNo.1,2,3,11,12、ヒトFabH-PS8種類クローンNo.1,2,3,4,11,32,48,85,91を選択し、組み合わせた場合の抗原結合力を評価した。コントロールとして、リツキサン登録商標キメラFabL-PSおよびキメラFabH-PSも用いた。なお、ここで示すヒトFabL-PSのクローンNo.は、図11,図12に示すものと同一であり、またヒトFabH-PSのクローンNo.は図13,図14に示すものと同一である。具体的な手順は以下の通りである。まず、スクリーニング用96ウェルPSplateとして蛍光測定用BlackplateGreiner655076を用いた。PSplateに30Wで1分間酸素プラズマを照射し、PSplateの表面を親水化した。次に、8M尿素-PBS-1Tween20中にてヒトFabH-PSの各クローン,ヒトFabL-PSの各クローン、リツキサン登録商標キメラFabL-PSおよびキメラFabH-PSがそれぞれ1mg/mlとなるように調製した。PVC製プレートの各ウェルに1Tween20を含むPBSを72μl、8M尿素および1Tween20含むPBSを24μl加え、それぞれウェルにFabL-PSおよびFabH-PSを12μlずつ添加した総液量120μl、FabL-PSおよびFabH-PSの終濃度100μg/ml、尿素の終濃度2M、Tween20の終濃度1。なお、比較としてFabH-PS、FabL-PSどちらか一方を含まないサンプルも調製した。これらをBlackplateの各ウェルに100μlずつ添加し、25°Cで2時間インキュベートした。次に、0.1TweenPBSにて洗浄後、2BSA-0.1TweenPBSを各ウェルに270μl添加し、1時間ブロッキングした。0.1TweenPBSにて洗浄後、0.1Tween20および5ヒト血清を含む1μg/mlのFITC標識抗原溶液を作製し、各ウェルに100μlずつ添加後、遮光を施し1時間インキュベートした。最後に、0.1TweenPBSにて洗浄後、蛍光プレートリーダーTECANinfiniteM200を用いて蛍光強度を測定した励起波長:486nm、蛍光波長:520nm。ヒトFabH-PSクローン8種類、ヒトFabL-PSクローン5種類を用いて合計40種類のヒトFabをPSプレート上に作製し、FITC標識抗原との親和性を評価した結果を図15に示す。同図に示すとおり、コントロールであるキメラFabH-PS/キメラFabL-PSの組み合わせよりも高いシグナルを示すヒトFabH-PS/ヒトFabL-PSの組み合わせが多数存在した。得られたシグナル強度をFabH-PS/FabL-PSの固定化量で除し、比活性すなわち、単位Fabあたりのシグナル強度を算出した結果を図16に示す。同図に示すとおり、ヒトFabH-PS/ヒトFabL-PSの組み合わせは、キメラFabH-PS/キメラFabL-PSと同等もしくはそれ以上の比活性を示すものが多く得られた。したがって、本発明を利用することによって、キメラ抗体から完全ヒト抗体を製造できることが明らかとなった。10InVitroDomainShufflingを用いたヒトFabH-PS/ヒトFabL-PSライブラリの評価;本実験では、上記5~8において選別したヒトFabH-PSの中から抗原への結合能が高いクローンとして、ヒトFabH-PS5種類クローンNo.1,2,3,4,11を選び、これらに対し、InVitroDomainShufflingを用いてヒトFabL-PSライブラリ960クローンを掛けあわせ、抗原に対する親和力を評価した。具体的な手順は以下の通りである。まず、スクリーニング用384ウェルPSplateとして蛍光測定用BlackplateBDFalcon353285を用いた。PSplateに30Wで1分間酸素プラズマを照射し、PSplateの表面を親水化した。1.33TweenPBSを27μlずつ添加後、ヒトFabL-PSライブラリを9μl各ウェルに添加した。次いで、ヒトFabH-PS各クローンを2MUrea1TweenPBS,250μg/mlに調製したものを4μl添加後、2時間インキュベートした。0.1TweenPBSにて洗浄後、2BSA-0.1TweenPBSを各ウェルに80μl添加し、1時間ブロッキングした。0.1TweenPBSにて洗浄後、0.1Tween20および5ヒト血清を含む1μg/mlのFITC標識抗原溶液を作製し、各ウェルに40μlずつ添加後、遮光を施し1時間インキュベートした。最後に、0.1TweenPBSにて洗浄後、蛍光プレートリーダーTECANinfiniteM200を用いて蛍光強度を測定した励起波長:486nm、蛍光波長:520nm。11InVitroDomainShufflingを用いたヒトFabH-PSライブラリ/ヒトFabL-PSの評価;同様に、上記5~8において、高いシグナル強度が検出された上位5クローンヒトFabL-PS5種類クローンNo.1,2,3,11,12に対し、InVitroDomainShufflingを用いてヒトFabH-PSライブラリ960クローンを掛けあわせ、抗原に対する親和力を評価した。具体的な手順は以下の通りである。まず、スクリーニング用384ウェルPSplateとして蛍光測定用BlackplateBDFalcon353285を用いた。PSplateに30Wで1分間酸素プラズマを照射し、PSplateの表面を親水化した。1.33TweenPBSを27μlずつ添加後、ヒトFabH-PSライブラリを9μl各ウェルに添加した。ヒトFabL-PS各クローンを2MUrea1TweenPBS,250μg/mlに調製したものを4μl添加後、2時間インキュベートした。0.1TweenPBSにて洗浄後、2BSA-0.1TweenPBSを各ウェルに80μl添加し、1時間ブロッキングした。その後、0.1TweenPBSにて洗浄後、0.1Tween20および5ヒト血清を含む1μg/mlのFITC標識抗原溶液を作製し、各ウェルに40μlずつ添加後、遮光を施し1時間インキュベートした。最後に、0.1TweenPBSにて洗浄後、蛍光プレートリーダーTECANinfiniteM200を用いて蛍光強度を測定した励起波長:486nm、蛍光波長:520nm。上述のように、キメラFabH-PSおよびキメラFabL-PSと混合した際に高い検出シグナルが得られるヒトFabH-PSクローン5種及びヒトFabL-PS5種クローンを選別し、これらに対してそれぞれヒトFabL-PSライブラリ960クローン又はヒトFabH-PSライブラリ960クローンを網羅的に会合させ、PSplate上にヒトFabH-PS/ヒトFabL-PSからなるFab抗体9600種類を作製した。これらヒトFabH-PS/ヒトFabL-PSに対する蛍光標識抗原の親和力を評価した結果を図17~図22に示す。より詳細には、図17の上パネルは、ヒトFabH-PSのクローンNo.1に、ヒトFabL-PSライブラリ960種を組み合わせたFab抗体の結果を示し、図17の下パネルはヒトFabH-PSのクローンNo.2に、ヒトFabL-PSライブラリ960種を組み合わせたFab抗体の結果を示す。同様に、図18の上パネルは、ヒトFabH-PSのクローンNo.3に、ヒトFabL-PSライブラリ960種を組み合わせたFab抗体の結果を示し、図18の下パネルは、ヒトFabH-PSのクローンNo.4に、ヒトFabL-PSライブラリ960種を組み合わせたFab抗体の結果を示す。図19は、ヒトFabH-PSのクローンNo.11に、ヒトFabL-PSライブラリ960種を組み合わせたFab抗体の結果を示す。また、図20の上パネルは、ヒトFabL-PSのクローンNo.1に、ヒトFabH-PSライブラリ960種を組み合わせたFab抗体の結果を示し、図20の下パネルはヒトFabL-PSのクローンNo.2に、ヒトFabH-PSライブラリ960種を組み合わせたFab抗体の結果を示す。図21の上パネルは、ヒトFabL-PSのクローンNo.3に、ヒトFabH-PSライブラリ960種を組み合わせたFab抗体の結果を示し、図21の下パネルはヒトFabL-PSのクローンNo.11に、ヒトFabH-PSライブラリ960種を組み合わせたFab抗体の結果を示す。図22は、ヒトFabL-PSのクローンNo.12に、ヒトFabH-PSライブラリ960種を組み合わせたFab抗体の結果を示す。これらの図に示すように、キメラFabH-PS/ヒトFabL-PS又はヒトFabH-PS/キメラFabL-PSからなるFab抗体に比べて、同等もしくはそれ以上に高いシグナルが得られるヒトFabH-PS/ヒトFabL-PSの組み合わせが多数検出された。特に、10000以上のシグナル強度が得られたヒトFabH-PS/ヒトFabL-PSの組み合わせは抗原に対して極めて高い親和力を有している可能性が高い。このため、これらの詳細な親和力評価を実施すれば、キメラFabH-PS/キメラFabL-PSからなるキメラ抗体よりも親和力の高く、副作用に少ない完全ヒト抗体クローンが獲得可能である。"