"配列番号22若しくは配列番号24のアミノ酸配列、または、1又は複数のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入された改変アミノ酸配列を有することを特徴とする発光タンパク質。配列番号1~21のいずれかアミノ酸配列を有する請求項1に記載の発光タンパク質。請求項1または2に記載の発光タンパク質をコードするDNAまたはその相補鎖。本発明は、新規な発光タンパク質及び該発光タンパク質をコードする遺伝子を提供することを目的とする。そこで上記課題を解決するために、発光能を有する海洋プランクトンを日本近海、具体的には、函館湾沖、親潮域で採取し、発光タンパク質ルシフェラーゼを網羅的にクローニングし、これらの配列を元にバイオインフォマティクスを駆使し、ルシフェラーゼの祖先遺伝子の予測を行い、この配列からルシフェラーゼ活性の発揮に必須な最小機能領域を特定して、発光機能を保持した分子量十数kDaのさらに小さいルシフェラーゼを開発した。本発明は、以下の新規な発光タンパク質およびそれをコードする遺伝子を提供するものである。項1.配列番号22若しくは配列番号24のアミノ酸配列、または、1又は複数のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入された改変アミノ酸配列を有することを特徴とする発光タンパク質。項2.配列番号1~21のいずれかアミノ酸配列を有する項1に記載の発光タンパク質。項3.項1または2に記載の発光タンパク質をコードするDNAまたはその相補鎖。本発明によれば、発光タンパク質の祖先遺伝子とアミノ酸配列を同定することができた。このような祖先遺伝子が明らかになったことで、より優れた性質を有する改変型発光タンパク質が開発されることが期待される。本発明の1つの特徴は、海洋プランクトン由来の発光タンパク質において、Metridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科プランクトン由来のルシフェラーゼの遺伝子配列およびアミノ酸配列を同定し、それにより祖先遺伝子とアミノ酸配列を決定したことにある。Metridinidae科プランクトン及びLucicutiidae科プランクトンの祖先発光タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号22に示され、該アミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号46に示される。また、Heterorhabdidae科プランクトンの祖先発光タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号24に示され、該アミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号48に示される。配列番号22に記載のアミノ酸配列は、配列番号23に記載のアミノ酸配列において、91位のCys→Aspに、92位のSerがCysに置換されたものである。本発明者らが見出したMetridinidae科とLucicutiidae科の海洋プランクトン由来の発光タンパク質配列番号1~15を用いて得られた配列番号23の祖先発光タンパク質は発光活性を有しなかったが、91位と92位のアミノ酸を上記のように置換した配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する改変型の祖先発光タンパク質は発光活性を有することを確認した。Heterorhabdidae科プランクトンの場合には、本発明者らが見出した配列番号16~21のアミノ酸配列を用いて得られた祖先発光タンパク質は発光活性を有することを確認した。配列番号22,24に示される祖先発光タンパク質は、本発明により初めて明らかにされたものである。本発明は、配列番号22,24の配列において、図1,図2に示される範囲内でアミノ酸置換が可能である。例えば図1において、N末端のアミノ酸は、配列番号22のaCopLuc43mutではMであるが、このアミノ酸は、図1の他の発光タンパク質で確認できるH,L,Gに置換可能である。同様に、N末端から4番目の配列番号22のアミノ酸Kは、Q、Lに置換可能である。N末端から10番目の配列番号22のアミノ酸Vは、他の発光タンパク質が全てVであるため、置換できない。同様に、11番目のアミノ酸Lも置換不可能である。図2のアミノ酸配列に関しても、配列番号24のアミノ酸配列において同様なアミノ酸置換は可能である。さらに配列番号22、24のアミノ酸配列のN末端又はC末端側には、図1、図2で示される他のアミノ酸が付加可能である。本発明における、配列番号22、24のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入された改変アミノ酸配列とは、上記のアミノ酸置換ないし付加が包含される。ここで置換、付加、欠失又は挿入される1又は複数のアミノ酸とは、150個以下、145個以下、140個以下、135個以下、130個以下、125個以下、120個以下、115個以下、110個以下、105個以下、100個以下、95個以下、90個以下、85個以下、80個以下、75個以下、70個以下、65個以下、60個以下、55個以下、50個以下、45個以下、40個以下、35個以下、30個以下、25個以下、20個以下例えば1、2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19又は20個のアミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入を意味する。例えば図1に示されるMoLuc1は図1に示す番号で1番~48番,57番~85番、146番、148番、226番の合計80個のアミノ酸が配列番号22の改変型祖先発光タンパク質に対して付加され、さらに87番PG、94番AE、97番IK、104番、118番KH、127番、128番、135番、137番、141番、143番、145番、149番、151番、159番、163番、165番、178番、183番、192番、195番、196番、203番、206番、207番、210番、214番、217番、218番、224番の合計30個のアミノ酸が置換されている。従って、MoLuc1の場合、配列番号22のアミノ酸配列に対し110個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されることになり、このようなアミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入は、本発明の範囲内である。また、置換、付加、欠失、挿入されるアミノ酸は、図1,図2に示される範囲内であることが好ましく、MoLuc1と配列番号22の祖先発光タンパク質aCopLuc43Mutを比較して最大110個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入可能であるが、1~109個のアミノ酸を適宜選択して置換、付加、欠失又は挿入してもよい。上記の記載は、MoLuc1を例に取り説明したが、MoLuc2、McLuc1、McLuc2、MaLuc1、MaLuc2、PsLuc1、PsLuc2、PaLuc1、PaLuc2、PxLuc17、PxLuc18、PxLuc2、LoLuc11、LoLuc13についても同様に、図1に示される範囲でアミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入が可能である。さらに、HtLuc112、HtLuc113、HtLuc122、HtLuc2、HmLuc1、HmLuc2についても同様に、図2に示される範囲でアミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入が可能である。以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。実施例1:発光プランクトン由来の新規ルシフェラーゼ1アミノ酸配列及び塩基配列海洋に棲息する動物性プランクトンより、発光プランクトンを探索した。具体的には、北海道大学大学院水産科学研究院の山口篤准教授産総研客員研究員と共同で、附属練習船おしょろ丸に乗船し、函館湾沖、親潮域で採取された海洋中に存在する、動物性プランクトンの分類を進める過程で、数多くの発光プランクトンを採取した。更に、これら発光プランクトンのうち、分類学的に節足動物門Arthropodaカイアシ亜綱Copepodaに属する動物性プランクトンであって、体外に分泌発現型の発光タンパク質を発現しているものを選別した。この動物プランクトン採集で見出された、分泌型の発光タンパク質を発現しているカイアシ亜綱Copepodaの分類を試み、Calanoida目、Augaptiloidea上科に属するMetridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科のプランクトンの同定を行った。さらにMetridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科プランクトン由来のルシフェラーゼタンパク質について、それをコードする遺伝子の塩基配列の特定と、推定アミノ酸配列の決定を試みた。先ず、Metridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科プランクトンから、全RNAを抽出し、含まれるmRNAを精製し、逆転写酵素を用い、定法に従って、対応するcDNAを合成した。これまでに報告されているMetridinidae科プランクトン由来のルシフェラーゼ遺伝子の配列を参考にPCR法によりcDNAより部分配列の増幅を行った。その結果、約250塩基のルシフェラーゼ遺伝子の部分配列を得た。次にその塩基配列をもとに、cDNA全長の増幅と塩基配列解析を行い、目的とするMetridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科プランクトン由来のルシフェラーゼタンパク質の配列を解明した。このMetridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科プランクトン由来のルシフェラーゼタンパク質の完全長アミノ酸配列をアライメントして、コンピュータプログラムMEGA5を用いて分子量15kDaおよび138kDaの祖先ルシフェラーゼタンパク質配列を予測し、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列を人工遺伝子合成して、大腸菌およびほ乳類培養細胞において発現させ、そのルシフェラーゼ機能を確認するに至った。本発明にかかるCalanoida目、Augaptiloidea上科、Metridinidae科、Lucicutiidae科、Heterorhabdidae科に属する動物プランクトン由来の発光タンパク質、カイアシ類Metridinidae科およびLucicutiidae科に属する動物プランクトン由来の発光タンパク質のアミノ酸配列から推測されるその祖先ルシフェラーゼタンパク質aCopLuc43とその改変体aCopLuc43mut、カイアシ類Heterorhabdidae科に属する動物プランクトン由来の発光タンパク質のアミノ酸配列から推測されるその祖先ルシフェラーゼタンパク質の名称と完全長アミノ酸配列、塩基配列の配列番号の対応関係を以下に示す。2実験方法カイアシ類Metridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科のプランクトン体内でのタンパク質の発現に伴い、残留している多種のmRNAのうち、当該ルシフェラーゼの遺伝子を選別することを試みた。具体的には、mRNAよりcDNAライブラリーを作製し、このcDNAライブラリーからPCR法によりルシフェラーゼ遺伝子の部分配列および全長配列の取得を行った。以下に、本発明のカイアシ類由来のルシフェラーゼに関して、より詳しく説明する。カイアシ類発光プランクトンの採集、同定まず、本発明のルシフェラーゼの起源である動物性発光プランクトンは、函館湾沖、水深50~1000mから採取された親潮域深層水中に見出された、Calanoida目、Augaptiloidea上科に属するプランクトンである。代表的な発光プランクトンMetridiaokhotensisの形態は、図3aに示すように、紫外線照射下において、蛍光顕微鏡により観察すると発光基質を含む分泌腺が青緑色に見える。また、白色光下で顕微鏡観察すると、図3に示すように、Metridiaokhotensisのプランクトンの体内は透明から若干白色がかって観察される。本発明でルシフェラーゼ遺伝子のクローニングを行ったプランクトンはMetridinidaeメトリディニダエ科に属するものとして、Metridiaokhotensis、Metridiacurticauda、Metridiaasymmetrica、Pleuromammaabdominalis、Pleuromammascutullata、Pleuromammaxiphias、Lucicutiidaeルチクチイダエ科に属するものとしてLucicutiaovaliformis、またHeterorhabdidaeヘテロハブディダエ科に属するものとして、Heterorhabdustanneri、Heterostylitesmajorの計5属9種である。これらの動物プランクトンの詳細な分類学上の同定では、Metazoa動物界、Arthropoda節足動物門、Crustacea甲殻亜門、Maxillopodaアゴアシ綱、Copepodaカイアシ亜綱、Neocopepodaカイアシ下網、Gymnoplea前脚類、Calanoidaカラヌス目、Metridinidaeメトリディニダエ科もしくはLucicutiidaeルチクチイダエ科もしくはHeterorhabdidae科ヘテロハブディダエ科となる。本発明者らは、これらのMetridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科に属するプランクトンが物理的刺激を与えることにより発光を示し、またその粗抽出液を発光基質セレンテラジンと混合した際に発光が観測されることを詳細に調べた結果、ルシフェラーゼを産生するバクテリアの寄生、付着に起因するものではなく、このMetridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科のプランクトン自体に由来するルシフェラーゼに因ると結論した。そこで、該プランクトンを集め、ルシフェラーゼタンパク質の単離を進めることを検討したが、入手されるプランクトン量が十分でなく、そのアミノ酸配列解析に十分なタンパク質量を回収することは困難であると判断された。従って、近縁のMetridia属のMetridialonga由来のルシフェラーゼGenBankaccessionnumberAY364164文献4とGaussia属に属する、Gaussiaprinceps由来のルシフェラーゼGenBankaccessionnumberAY015993文献3のアミノ酸配列に基づき、相同性の高いアミノ酸配列の一部をコードする、縮重プライマーを作製し、cDNAから、当該ルシフェラーゼの遺伝子をPCR法により、クローニングする手法を適用した。カイアシ類発光プランクトンRNAの精製およびcDNAの合成Metridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科プランクトンより、市販のRNA抽出試薬;RNeasyMinikitQiagen社製を用いて全RNAを抽出し、次いで、市販の精製キット;OligotexdT30mRNAPurificationkitTakaraBio社製を用いてPolyAmRNAの精製を行った。更に、精製済みのmRNAから、市販のcDNA調製キット:SMARTRACEcDNA増幅キットTakaraBio社製を利用して、それぞれ5’末端側増幅用および3’末端側増幅用cDNAの合成をおこなった。PCR反応による、カイアシ類ルシフェラーゼcDNA断片の取得Metridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科のプランクトン由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子クローニング工程においては、mRNAから調製されるcDNAを鋳型として、前記上流側混合プライマー二種と下流側混合プライマー二種とを組み合わせた、計4種のPCR用プライマー対についてPCR反応を行った。具体的には、以下に示す、上流側混合プライマー2種と下流側混合プライマー2種の塩基配列を選択した。上流側混合プライマーWhitelucUP126mer:16種の混合プライマー5’GGCTGCACYAGGGGATGYCTKATMTC3’YTC;KGT;MACWhitelucUP226mer:16種の混合プライマー5’GCTATTGTTGAYATYCCYGARAT3’YTC;RGA下流側混合プライマーWhitelucLP226mer:16種の混合プライマー5’TCAAGTTGWTCAATRAAYTGYTCCAT3’WAT;RGA;YTCWhitelucLP123mer:12種の混合プライマー5’ACATTGGCAAGACCYTTVAGRCA3’YTC;VAGC;R=GAMetridinidae科、Lucicutiidae科またはHeterorhabdidae科のプランクトン由来のmRNAを鋳型として、調製される3’ReadycDNAから、上記に示す4組のプライマー対を利用して、常法に従いPCR増幅産物を調製する。回収されたDNA溶液PCR増幅産物に、10xLoadingdye液2μLを添加した後、16TAEアガロースゲルにアプライし、各レーンDNA溶液15μLを泳動した。目的分子量のバンドをゲルから切り出し、Montageゲル抽出キットMillipore社製に含まれるマイクロチューブカラムにゲル片を入れて、7000rpmで10分間遠心する。メンブレンを通して抽出されてきたDNA溶液をさらにMinElutePCRpurificationkitQiagen社製を用いて精製を行う。DNA溶液1容量当たり、バッファーPBを5容量を加え、ボルテックスにかけた後、MinEluteカラムに移した。30秒間遠心し、DNAをカラムに吸着させる。ついでカラムを、バッファーPE07mLで洗浄し、さらに1分間、遠心15000rpmすることによりバッファーPEをカラムから完全に除く。その後、溶出バッファーEB10μLを加えて、室温で、1分間静置する。最後に、1分間、遠心15000rpmし、カラムから溶出してきたDNAを15mL用マイクロチューブ中に回収する。上記精製済みPCR反応産物を、クローニングベクターpCR21TOPOInvitrogen社製中に挿入する。PCR反応産物2μLにベクターに添付のSaltsolution05μLおよびベクター溶液05μLを加えて、室温で5~15分間インキュベートしてライゲーションを行う。この反応液に含まれるDNAをChemicalcompetentcellDH5alpha株へ導入し、形質転換株を選択する。プラスミドベクターの宿主大腸菌へ導入は、以下の手順で実施した。宿主大腸菌に利用する、DH5alpha株は、凍結保存されているCompetentcellを、氷温で解凍する。PCR産物挿入プラスミドベクター溶液3μLを、解凍された宿主大腸菌DH5alpha株懸濁液50μLに加える。そのまま氷上で10分間保持した後、42°C、30秒加温し、氷上に戻した。ついで100μLのSOC培地を加えて、37°C、10分間振盪培養する。その後、培養液に含まれる形質転換株を、クローニングベクターpCR21TOPOに由来する選択マーカーを利用して薬剤耐性株を選択する。50μgmL抗生剤カルベニシリンを含んだLBプレート上に出現するコロニーを解析して、PCR産物を保持するプラスミドベクターをもつ大腸菌を選択する。PCR産物を保持するプラスミドベクターの複製、精製選別されたクローンから、以下の手順で、導入されているプラスミドベクターの精製を行う。PCR産物が挿入されたプラスミドベクターを保持する宿主大腸菌DH5alpha株のコロニークローンを、それぞれ2mLのLB/カルベニシリン液体培地中に懸濁し、37°C、16時間培養を行った。培養液を、10分間、遠心5000xgして、細胞を分取した。分取した細胞から、市販のプラスミド精製キット:QiagenPlasmidpurificationkitQiagen社製を利用して、プラスミドを分離、精製する。分取した細胞に、同精製キットに添付のP1液025mLを添加し、ボルテックスにかけて、よく分散させる。この細胞分散液に、添付のP2液025mLを添加、混和して室温20°Cにて5分間静置する。溶菌処理後、添付のN3液035mLを添加し、混和する。次いで15分間、4°Cで遠心15000rpmし、プラスミドDNAを含む上清を分離、回収する。上清を、同精製キットのQIAprepminiカラムにかける。4°Cで遠心15000rpmし、液層を除去する。バッファーPB05mLを加えて、カラムを洗浄し、引き続き、バッファーPE075mLを加えて、再度洗浄する。最終的に、1分間、4°Cで遠心15000rpmし、洗浄液を完全に除去する。精製キットのQIAprepminiカラムに吸着されているプラスミドDNAは、バッファーEB30μLにより溶出、回収する。この精製済みプラスミドを含む液30μLのうち、1μLをとり、蒸留水99μLを加えて、100倍希釈液とし260nmの吸光度を測定してDNA濃度の定量を行った。このプラスミドベクターのDNA濃度を250ngμLとなるように、濃度調整を行った。選別クローン中のcDNA断片PCR産物の塩基配列解析プラスミドベクター中に挿入されている、cDNA断片PCR産物を、以下の手順で塩基配列解析用の核酸鎖伸長反応産物を調製する。選択クローンから回収、次いで、市販のシークエンス用DNA試料調製キット:BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKitver11により、この精製済みプラスミドベクターを鋳型として、塩基配列解析用の試料を、2種のプライマー;M13senseM4およびM13reverseをシークエンスプライマーとして利用し、プラスミドベクター中に挿入されているcDNA断片を含む領域のシーケンス反応生成物を調製する。調製された塩基配列解析用の試料の精製は、以下の手順で行う。各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の05mL容チューブに移す。試料溶液5μL当たり、3M酢酸ナトリウム水溶液05μL、95エタノール125μLの比率で混合した液を、別途、15mL容チューブに予め用意する。この15mL容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入する。均一に混合した上で、氷冷下に、10分間静置し、含まれるDNA断片をエタノール沈澱析出させる。20分間、遠心15000rpmし、析出したDNA断片を沈積させ、上清を除去する。次いで、125μLの70エタノールを加え、沈殿DNAをリンスする。再び、5分間、遠心15000rpmし上清を吸引除去する。残った沈殿DNA断片のペレットを乾燥する。精製した解析用試料DNA断片は、15μLホルムアミド中に再溶解する。ボルテックスにかけて、混合した後、遠心して液を集める。95°C、2分間加熱し、一本鎖DNAに分離し、氷冷する。その後、解析用試料DNA断片は、市販のシークエンス装置:ABIPRISM3100GeneticAnalyzerにかけ、塩基配列解析を行う。センス鎖の配列解析結果と、アンチセンス鎖の配列解析結果とを総合し、挿入されているcDNA断片PCR反応産物の塩基配列を決定する。得られたカイアシ類由来の各ルシフェラーゼの塩基配列及びアミノ酸配列を表1及び配列表に記載する。カイアシ類由来ルシフェラーゼタンパク質のヒト細胞発現用発現ベクターのHEK293細胞への導入ほ乳類培養細胞発現用ベクターpcDNA32V5HisTOPOInvitrogen社製中へ上記で得られたカイアシ類由来ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域を挿入する。プラスミドpcDNA32V5HisTOPOのクローニングサイト中に各遺伝子が挿入されていることをシーケンスにより確認する。作製したほ乳類培養細胞発現ベクターのうち、MoLuc1MoLuc2MaLuc1PsLuc1PaLuc1PaLuc2PxLuc17PxLuc18LoLuc11LoLuc13を代表として培養細胞で遺伝子発現させた。精製済みのヒト細胞発現ベクターを、HEK293細胞中に、Lipofectamine2000を用いて遺伝子導入した。宿主のHEK293細胞は、10mL血清添加培地MEM10FBSPenicillinstreptomycinを用いて、100mmdish上で、95コンフルエントな状態まで培養されたものを利用する。まずプラスミド溶液DNA濃度:1μgμL24μLを15mLの無血清OptiMEM培地に懸濁したものと、Lipofectamine200060μLを同様に15mLの無血清OptiMEM培地に懸濁したものを用意する。この2液を混合して室温にて20分間インキュベートする。この混合液全量を100mmdish上の細胞培地中に添加して、均一になるように軽く撹拌する。トランスフェクション処理後、HEK293細胞は、5CO2下、37°Cにて48時間以上インキュベーションし、導入遺伝子の発現を行う。培養上清10mLをすべて新しい15mLの遠心管に移し、1000rpmで2分間遠心して、遠心上清を培地画分とした。一方、dish上に残った細胞に新しい培地10mLを加えて、セルスクレーパーを使って細胞をはがした後すべて15mLの遠心管に回収した。この懸濁液を氷上で10秒間超音波破砕を行い、15000rpmで5分間遠心した。上清を細胞内画分として回収し、培地画分と同時に発光活性を測定した。そのタンパク質は、細胞外に分泌され、培地中に蓄積されることが観測された図4。またその時の分泌効率について表2に記した。ルシフェラーゼ活性の測定法は、後述するカイアシ類由来ルシフェラーゼ活性の測定に記載した。以上より、ヒト由来のHEK293細胞内においても、カイアシ類由来ルシフェラーゼタンパク質のコード遺伝子に基づき、完全長のアミノ酸配列を有するプレタンパク質型組換え体へと翻訳がなされる。その後、そのN末端に存在するシグナルペプチド部を利用して、細胞外へ成熟型活性タンパク質として、分泌されることを明確に示している。実施例2:祖先遺伝子の推測と大腸菌による発現、活性の確認カイアシ類由来ルシフェラーゼの祖先遺伝子の推測Metridinidae科、Lucicutiidae科およびHeterorhabdidae科プランクトン由来ルシフェラーゼのアミノ酸配列を、それぞれの科ごとにタンパク質配列データの分子進化系統学的解析を行うためのソフトウェアMEGA5にて解析を行った。まずアミノ酸配列をもとに多重配列アライメントをClustalWを用いて行った。この多重配列アライメントデータをもとにMaximumlikelihood法により系統樹を再構成し、MEGA5の祖先配列推測機能を用いて、祖先遺伝子の配列推定を行った。具体的にはMetridinidae科およびLucicutiidae科のプランクトンに由来する15種のルシフェラーゼのアミノ酸配列から推定したその祖先遺伝子のアミノ酸配列として137アミノ酸からなるaCopLuc43と、Heterorhabdidae科プランクトンに由来する6種のルシフェラーゼのアミノ酸配列から推定したその祖先遺伝子のアミノ酸配列として132アミノ酸からなるaCopLuc48を決定した。Metridinidae科およびLucicutiidae科の共通祖先遺伝子を推測したのは、この2つの科から見いだされたルシフェラーゼのアミノ酸配列が、Heterorhabdidae科由来のものと比較して相同性が高かったからである。このaCopLuc43のアミノ酸配列を、クローニングしたMetridinidae科およびLucicutiidae科のプランクトンに由来する15種のルシフェラーゼとアライメントしたところ図1、15種のルシフェラーゼのアミノ酸配列中に強く保存されているアミノ酸残基CysXCysLeuXLeuXCysXProXArgCysの並び方に合致しない領域を発見したため、aCopLuc43のアミノ酸配列をコードする塩基配列を人工合成した後、当該部位に変異を導入して、この法則に合致したクローン、aCopLuc43mutを作成した。カイアシ類由来ルシフェラーゼの祖先遺伝子の大腸菌による発現Metridinidae科、Lucicutiidae科およびHeterorhabdidae科プランクトン由来ルシフェラーゼのアミノ酸配列の解析により得られたカイアシ類ルシフェラーゼの祖先遺伝子aCopLuc43aCopLuc43mutおよびaCopLuc48のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、大腸菌で使用されるコドン頻度に最適化して、オペロンバイオテクノロジー社の人工遺伝子合成サービスを利用して合成した。このプラスミドベクターをNdeIおよびBamHIにて制限酵素処理し、そのインサートDNA断片を16アガロースゲル上で泳動し、目的分子量の制限酵素断片を確認し、ゲル切片からMontageゲル抽出キットMillipore社製とMinElutePCRpurificationkitQiagen社製を用いた前述の方法でDNAを回収した。精製済みインサートDNAコード配列部分を、同様にNdeIおよびBamHIにて制限酵素処理した大腸菌発現用プラスミドpET16bNovagen社製中にライゲーションする。ライゲーションにはLigationHigh東洋紡社製を用いた。反応後ライゲーション液を、ChemicalcompetentcellDH5alpha株へ導入し、LBカルベニシリンプレート上で形質転換株を選択する。上記プレート上にはえてきたコロニーからcolonyPCR法を利用するスクリーングによって、祖先ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域を有する発現ベクターpET16bを保持している大腸菌クローンを選択する。選択されたコロニークローンを培養し、QiagenPlasmidpurificationkitQiagen社製を利用して、プラスミドベクターを回収精製し、BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKitver11により、pET16bに挿入された遺伝子のコード配列部分およびその連結部分の塩基配列を前述した方法でシーケンスし、遺伝子の配列および向きを確認した。シーケンスが確認されたプラスミドベクターを大腸菌発現株BL21CodonPlusRIPLへ導入する。形質転換体をLBカルベニシリンプレート上で37°Cで一晩培養し、得られたコロニーを10mLのZYM5052培地50μgmLカルベニシリン含に植菌し、16°C、180rpmで6日間培養した。ZYM5052培地の組成は以下の通りである。1NZamine05Yeastextract25mMNa2HPO425mMKH2PO450mMNH4Cl5mMNa2SO42mMMgSO405glycerol005glucose02lactose培養後7000rpm、10分間の遠心を行って大腸菌を沈殿させ、上清培地を除いた後、1mLの溶解バッファー20mMTrisHCl10mMMgCl2に再懸濁した。この懸濁液を氷上で10秒間超音波破砕を行い、15000rpmで5分間遠心した。上清を可溶性組換えタンパク質を含む画分として回収し、その活性を測定したところ発光活性が認められた図5。実施例3:祖先遺伝子のヒト細胞HEK293における発現図6カイアシ類由来ルシフェラーゼの祖先遺伝子のヒト細胞による発現Metridinidae科、Lucicutiidae科およびHeterorhabdidae科プランクトン由来ルシフェラーゼのアミノ酸配列の解析により得られたカイアシ類ルシフェラーゼの祖先遺伝子aCopLuc43mutおよびaCopLuc48のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、ほ乳類培養細胞発現用ベクターpcDNA32V5HisTOPO中へ挿入する。精製済みのヒト細胞発現ベクターを、ヒト培養細胞HEK293に遺伝子導入発現させ、祖先遺伝子の発光活性を測定した。100mmdishにてHEK293細胞を培養した。カイアシ類由来ルシフェラーゼの祖先遺伝子の発現ベクターのLipofectamine2000によるトランスフェクション処理後、細胞は5CO2下、37°Cにて72時間インキュベーションし、導入遺伝子の発現を行った。この結果、細胞内画分において発光活性が認められた図6。ルシフェラーゼ活性の測定法は、後述するカイアシ類由来ルシフェラーゼ活性の測定に記載した。カイアシ類由来ルシフェラーゼ活性の測定カイアシ類ルシフェラーゼの活性測定には以下の方法を用いた。1μgμLに調製した発光基質セレンテラジンcoelenterazineのメタノール溶液より1μLをとって、1mLの基質希釈用バッファー20mMTrisHClpH8050mMMgCl2で希釈した。希釈後の発光基質液は氷上に保持した。カイアシ類ルシフェラーゼを発現するプラスミドベクターを導入されたHEK293細胞からの培養上清または大腸菌破砕液5μLをポリスチレン製テストチューブに分取して、ルミノメーターLB9506ベルトールド社製の測定部にセットし、10μLの上記希釈発光基質を添加した後、直ちに測定を開始した。発光の測定は10秒間行った。発光が強すぎて測定限界を超えた場合は、試料希釈バッファー20mMTrisHClpH8010mMMgCl2にて10倍希釈を行って、同様に測定した。得られた発光値をルミノメーターに附属のプリンターに出力した後、次の試料の測定に移った。"