"本明細書中に記載される発明。発明の要旨本発明は、摩擦補充tribosupplementationによる変形性関節症および他の変性関節疾患に対する新規な処置を特徴とする。摩擦補充は、損傷した関節または関節炎の関節に潤滑ポリペプチドを直接投与することによって実行される。粘度補充とは異なり、摩擦補充は、それが添加される溶液例えば、滑液の粘度を実質的に増加させない。トリボネクチンtribonectinが添加される溶液の粘度は、わずか10、好ましくはわずか5、より好ましくは、わずか2、より好ましくは、わずか1しか増加しない。最も好ましくは、トリボネクチンが添加される溶液の粘度は、不変であるか、または減少する。従って、本発明は、トリボネクチンを提供する。トリボネクチンは、KEPAPTT配列番号3と少なくとも50同一であるアミノ酸配列の少なくとも1つの反復を含む人工の境界潤滑剤である。トリボネクチンは、少なくとも1つのO結合型潤滑部分を含む。好ましくは、その潤滑部分は、β1-3Gal-GalNAc部分である。天然に存在するトリボネクチンのタンパク質骨格のアミノ酸配列は、ヒト巨核球刺激因子MSF遺伝子のエキソンの選択的スプライシングに依存して、異なり得る。例えば、トリボネクチンは、配列番号1のアミノ酸1~24および200~1404を含むが、配列番号1のアミノ酸25~199を欠損する。トリボネクチンは、配列番号1のアミノ酸1~156および200~1404を含むが、配列番号1のアミノ酸157~199を欠損する。トリボネクチンは、配列番号1のアミノ酸1~106および200~1404を含むが、配列番号1のアミノ酸107~199を欠損する。トリボネクチンは、配列番号1のアミノ酸1~25、配列番号1の67~106および配列番号1の200~1404を含むが、配列番号1のアミノ酸26~66を欠損する。トリボネクチンは、精製された天然に存在するポリペプチドもしくは合成的に作製されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドである。合成もしくは組換えトリボネクチンの骨格のアミノ酸配列は、天然に存在するトリボネクチンのアミノ酸配列と少なくとも50同一であり、そして、天然に存在するトリボネクチンの潤滑活性の少なくとも50を所有する。トリボネクチンは、潤滑が所望される、哺乳動物関節または他の組織例えば、心臓組織への投与のために処方される。好ましくは、トリボネクチンは、組換えまたは化学的に合成された潤滑ポリペプチドである。例えば、トリボネクチンは、実質的に純粋なポリペプチドを含み、そのアミノ酸配列は、少なくとも1つの反復を含むが、76未満の反復を含む。各サブユニットは、少なくとも7個のアミノ酸そして代表的には、10個以下のアミノ酸を含む。各サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号3と少なくとも50同一であり、そして参照配列における非同一アミノ酸は、保存的アミノ酸置換である。例えば、1つもしくは両方のスレオニン残基は、セリン残基に置換される。好ましくは、そのサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号3と同一である。トリボネクチンまた、アミノ酸配列XXTTTX配列番号4の1つ以上の反復を含む。本明細書中に記載されるポリペプチドまたは他の化合物が、それらが目的の化合物が少なくとも重量で60乾燥重量である調製物内にある場合、実質的に純粋であるといわれる。好ましくは、その調製物は、目的の化合物重量で、少なくとも75、より好ましくは、少なくとも90、および最も好ましくは、少なくとも99である。純度は、任意の適切な標準的方法例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC分析によって測定され得る。特定のポリペプチドまたは核酸分子が、限定された長さの参照ポリペプチドまたは核酸分子と特定の同一性パーセントを有することが言われている場合、その同一性パーセントは、参照ポリペプチドまたは核酸分子に関連している。従って、100アミノ酸長である参照ポリペプチドと50同一であるペプチドは、参照ポリペプチドの50アミノ酸長部分と完全に同一である50アミノ酸ポリペプチドであり得る。それはまた、その全長にわたって参照ポリペプチドと50同一である100アミノ酸長ポリペプチドであり得る。所定の参照ポリペプチドまたは核酸分子と実質的に同一であるポリペプチドまたは核酸分子は、所定の参照ポリペプチド配列または核酸分子の配列に対して少なくとも85、好ましくは90およびより好ましくは95、98、99以上の同一性を有する配列を有するポリペプチドまたは核酸分子である。同一性は、当該分野で認められた意味を有し、そして公開された周知技術例えば、ComputationalMolecularBiology,1988,LeskA.M.,編、OxfordUniversityPress,NewYork;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,1993,Smith,D.W.編、AcademicPress,NewYork;ComputerAnaylusisofSequenceData,PartI,1994,Griffin,A.M.およびGrifin,E.G.,編、EumanaPress,NewJersey;SequenceAnalysisinMolecularBiology,1987,Heinje,G.,AcademicPress,New20York;およびSequenceAnalysisPrimer,1991,Gribskov,M.およびDervereux,J.,編、StocktonPress,NewYorkを使用して算出される。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定するための方法は、多数存在するが、用語同一性は、当業者に周知であり、そして所定の特定の方法に関する限定された意味を有する。本明細書中に記載される配列同一性は、LasergenesoftwarepackageDNASTAR,Inc.Madison,WIを使用して測定される。使用されるMegAlignモジュールは、ClustalV方法Higginsら、1989、CABIOS52:151-3である。使用されるパラメータは、gappenalty10、gaplengthpenalty10である。あるいは、所定の参照配列と異なる核酸は、参照配列を有するDNA鎖またはその相補鎖と、高いストリンジェンシーにてハイブリダイズする。高いストリンジェンシー条件は、42°Cにおいて50ホルムアミド中でハイブリダイゼーションさせ、65°Cにて2×SSCで第1の洗浄を行い、そして65°Cにて0.2×SSCで第2の洗浄を行うことである。トリボネクチンは、支持表面間の摩擦計数μを減少させるものとして特徴付けられる。例えば、摩擦の減少は、インビトロでラテックス:ガラスベアリングを使用して、摩擦装置における摩擦の減少を検出ことによって測定される。摩擦の減少はまた、インビボで、例えば患者の痛みの減少を測定することによって、測定される。本発明のトリボネクチンは、潤滑組成物である。参照配列と少なくとも50しかし、100未満のアミノ酸配列同一を有するポリペプチドが、支持表面間のμの減少を測定することによって潤滑摩擦について試験される。トリボネクチンは、O結合型オリゴサッカリド例えば、β型1-3Gal-GalNACにおけるN-アセチルガラクトサミンおよびガラクトースを含む。例えば、KEPAPTT配列番号3およびXXTTTX配列番号4反復ドメインは、β型1-3Gal-GalNACこれは、時折、1-3Gal-GalNAC-NeuAcの形態においてNeuAcでキャップされ得るによってグリコシル化される。ポリペプチドに関する用語グリコシル化は、炭水化物部分がポリペプチド分子の1つ以上の部位に存在することを意味する。例えば、トリボネクチンの少なくとも10、好ましくは少なくとも20、より好ましくは少なくとも30、そして最も好ましくは少なくとも40がグリコシル化される。50以上までのトリボネクチンが、グリコシル化され得る。グリコシル化パーセントは、重量によって決定される。トリボネクチンポリペプチドは、MSFの実質に純粋なフラグメントを含む。例えば、天然に存在するトリボネクチンのアミノ酸配列を有する実質的に純粋なトリボネクチンの分子量は、220~280kDaの範囲内にである。好ましくは、トリボネクチンの見かけの分子量は、230kDa未満、より好ましくは250kDa未満、そして最も好ましくは280kDa未満である。タンパク質またはポリペプチドフラグメントは、天然に存在するタンパク質またはそれから誘導されるポリペプチド例えば、MSFのアミノ酸配列の一部全てではないと同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして定義される。トリボネクチンは、ポリペプチドを含み得、そのアミノ酸配列は、配列番号1の残基200~1140包括的の配列と少なくとも50同一であり、例えば、それは配列番号1の残基200~1140包括的のアミノ酸配列を含む。別の例において、このポリペプチドは、配列番号1の残基200~1167包括的の配列と少なくとも50同一であるアミノ酸配列を含み、例えば、配列番号1の残基200~1167包括的と同一であるアミノ酸配列を有する。このポリペプチドは、配列番号1の残基200~1212包括的の配列と少なくとも50同一であるアミノ酸配列例えば、配列番号1の残基200~1212包括的と同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこのポリペプチドは、配列番号1の残基200~1263包括的の配列と少なくとも50同一であるアミノ酸配列例えば、配列番号1の残基200~1263包括的と同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、ポリペプチドの配列は、配列番号1の残基1~24包括的のアミノ酸配列および/または配列番号1の残基67~104包括的のアミノ酸配列を欠損する。本発明はまた、トリボネクチンをコードする単離された核酸分子を特徴とする。例えば、その核酸は、配列番号2のヌクレオチド631~3453包括的と少なくとも50同一である配列を含む。好ましくは、その核酸は、配列番号1の残基200~1140のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。例えば、その核酸は、配列番号2のヌクレオチド631~3453包括的の配列と同一であるヌクレオチド配列またはその縮重改変体を有する。単離された核酸分子は、5’および3’コード配列または生物体の天然に存在するゲノムにおいてすぐ隣に隣接するコード配列を伴う非コード配列から分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に存在しない核酸分子例えば、組換えDNA技術によって作製された核酸分子を含む。例えば、本発明の核酸は、配列番号2のヌクレオチド631~3453包括的を含むが、天然に存在するゲノム配列において、それらの配列のすぐ隣に隣接するヌクレオチドまたは天然に存在するcDNAを含まない。また、関節を、精製されたMSFまたはトリボネクチンと接触させることによって、哺乳動物関節を潤滑させるlubricating方法は、本発明の範囲内である。その哺乳動物は、好ましくは、ヒト、ウマ、イヌ、ウシ、ロバ、マウス、ラット、モルモット、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、サル、またはネコであり、そして関節は、アーティキュレイティングarticulating関節例えば、膝、肘、肩関節、股関節部または任意の他の体重負荷関節である。トリボネクチンは、関節内に投与される。治療的関節潤滑はまた、遺伝子治療例えば、関節または滑液をトリボネクチンをコードする核酸と接触させることによって実施され得る。例えば、核酸は、関節内intra-articular注射によって滑液腔に投与される。哺乳動物関節における境界潤滑剤として機能することに加えて、トリボネクチンは、哺乳動物軟部組織間例えば、皮膚もしくは内臓または哺乳動物組織と医療デバイス例えば、人工器官移植片との間に、境界潤滑剤として使用される。従って、本発明は、組織癒着形成を阻害するために適切な形態で、トリボネクチンを含む生物学的適合性組成物を包含する。例えば、トリボネクチンは、フィルム、膜、泡沫、ゲルまたは繊維の形態である。本明細書中で使用される場合、用語フィルムは、薄い膜に泡沫またはゲルを押しつけることによって、例えば、鋳型に注ぎ込み、そして薄い膜に風乾することによってか、またはゲルもしくは繊維を押しつけることによってか、あるいはゲルまたは繊維を脱水させるか、もしくは脱水を引き起こすことによって形成される物質を意味する。本明細書中で使用される場合、用語泡沫は、例えば、トリボネクチン溶液、懸濁物、ゲルまたは繊維内に空気のように導入することによって形成される多孔性構造を有する物質を意味する。本明細書中で使用される場合、用語生物学的適合性とは、移植後の身体において、身体から除去されるか、または代謝される非毒性産物に分解する組織適合性材料の能力をいう。本明細書中で用語として使用される場合、生物学的適合性物質は、生物学的機能に対して医学的に受容不可能である毒性か、または傷害性の効果をもたない物質である。癒着を予防するためのトリボネクチン組成物がまた、例えば、組織が癒着を伴わずに増殖し得る型わくを形成するように、押出しextrusionのために適切な組成物として処方される。哺乳動物における第一表面と第二表面との間の接着形成を阻害する方法は、哺乳動物における表面の接着を防ぐのに十分な量で第一表面と第二表面との間にトリボネクチンを配置することによって実行される。例えば、表面の一方または両方が哺乳動物組織であり、そしてそれらの間に配置されたトリボネクチンが、治癒プロセスの間の接着の形成を妨げる。あるいは、第一表面または第二表面あるは、その両方は、整形外科移植物のような人工的なデバイスである。処置されるべき組織は、外科手術切開または外傷により損傷された組織を含む。生物学的サンプルを哺乳動物から得て、生物学的サンプル中のMSFフラグメントの量を測定することによって、変形性関節症またはそれに対する素因を診断するための方法もまた本発明の範囲内である。コントロール例えば、変形性関節症を有しないことが既知の哺乳動物由来の生物学的サンプルまたはネイティブの診断に関連する所定の値と比較した量の増加は、哺乳動物が変形性関節症を罹患するかまたは変形性関節症の発症にかかりやすくあることを示す。任意の生物学的サンプルが、この診断方法で試験するのに適する;典型的には、生物学的サンプルは、滑液、血液、血清または尿である。好ましくは、MSFフラグメントは、配列番号3のアミノ酸配列を含む。あるいは、MSFフラグメントは、EPAPTTのアミノ酸配列配列番号5;トリボネクチンのトリプシン切断の産物またはPTTKEPのアミノ酸配列配列番号6;トリボネクチンのエラスターゼ切断の産物を含む。本発明の特徴および利点は、本発明の好ましい実施形態の以下の記載および特許請求の範囲から明らかである。例えば、本発明は以下を提供する:項目1少なくとも1つのO結合型潤滑部分を含むトリボネクチン。項目2前記部分がβ1-3Gal-GalNAc部分である、項目1に記載のトリボネクチン。項目3項目1に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチンは、配列番号1のアミノ酸1~24および200~1404を含み、配列番号1のアミノ酸25~199を欠失する、トリボネクチン。項目4項目1に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチンは、配列番号1のアミノ酸1~156および200~1404を含み、配列番号1のアミノ酸157~199を欠失する、トリボネクチン。項目5項目1に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチンは、配列番号1のアミノ酸1~106および200~1404を含み、配列番号1のアミノ酸107~199を欠失する、トリボネクチン。項目6項目1に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチンが、配列番号1のアミノ酸1~25、67~106および200~1404を含み、配列番号1のアミノ酸26~66を欠失する、トリボネクチン。項目7ポリペプチドを含むトリボネクチンであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも1つのサブユニットを含むが76個より少なく、ここで、a各サブユニットが少なくとも7個のアミノ酸を含み;そしてb該サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号3に対して少なくとも50同一であり、ここで非同一アミノ酸が保存的アミノ酸置換である、トリボネクチン。項目8前記サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号3である、項目7に記載のトリボネクチン。項目9配列番号4のアミノ酸配列の1つ以上の繰り返しをさらに含む、項目7に記載のトリボネクチン。項目10支持表面との間の摩擦係数を低減するとして特徴付けられる、項目1に記載のトリボネクチン。項目11インビトロで支持表面との間の摩擦係数を低減するとして特徴付けられる、項目1に記載のトリボネクチン。項目12インビボで支持表面との間の摩擦係数を低減するとして特徴付けられる、項目1に記載のトリボネクチン。項目13前記トリボネクチンが添加される溶液の粘度を実質的に増大しない、項目1に記載のトリボネクチン。項目14O結合型オリゴ糖を含む、項目7に記載のトリボネクチン。項目15前記オリゴ糖が、N-アセチルガラクトサミン-ガラクトースである、項目14に記載のトリボネクチン。項目16前記トリボネクチンの少なくとも10がグリコシル化される、項目1に記載のトリボネクチン。項目17前記トリボネクチンの少なくとも40がグリコシル化される、項目1に記載のトリボネクチン。項目18前記トリボネクチンの分子量が、200~280kDaの範囲である、項目1に記載のトリボネクチン。項目19前記ポリペプチドが、巨核球刺激因子のフラグメントを含む、項目1に記載のトリボネクチン。項目20前記ポリペプチドが、配列番号1に含まれる残基200~1140の配列と少なくとも50同一であるアミノ酸配列を含む、項目1に記載のトリボネクチン。項目21前記ポリペプチドが、配列番号1に含まれる残基200~1140のアミノ酸配列を含む、項目1に記載のトリボネクチン。項目22前記ポリペプチドが、配列番号1に含まれる残基200~1167の配列と少なくとも50同一であるアミノ酸配列を含む、項目1に記載のトリボネクチン。項目23前記ポリペプチドが、配列番号1に含まれる残基200~1167のアミノ酸配列を含む、項目1に記載のトリボネクチン。項目24前記ポリペプチドが、配列番号1に含まれる残基200~1212の配列と少なくとも50同一であるアミノ酸配列を含む、項目1に記載のトリボネクチン。項目25前記ポリペプチドが、配列番号1に含まれる残基200~1212のアミノ酸配列を含む、項目1に記載のトリボネクチン。項目26前記ポリペプチドが、配列番号1に含まれる残基200~1263の配列と少なくとも50同一であるアミノ酸配列を含む、項目1に記載のトリボネクチン。項目27前記ポリペプチドが、配列番号1に含まれる残基200~1263のアミノ酸配列を含む、項目1に記載のトリボネクチン。項目28前記ポリペプチドが、配列番号1に含まれる残基1~24のアミノ酸配列を欠失する、項目1に記載のトリボネクチン。項目29前記ポリペプチドが、配列番号1に含まれる残基67~104のアミノ酸配列を欠失する、項目1に記載のトリボネクチン。項目30トリボネクチンをコードする、単離された核酸分子。項目31前記核酸が、配列番号2に含まれるヌクレオチド631~3453の配列を含む、項目30に記載の核酸。項目32哺乳動物の関節を潤滑させる方法であって、該方法は、該関節を、単離されたMSF遺伝子産物と接触させる工程を包含する、方法。項目33哺乳動物の関節を潤滑させる方法であって、該方法は、該関節を、項目1に記載のトリボネクチンと接触させる工程を包含する、方法。項目34ヒトのアーティキュレイティング関節である、項目33に記載の方法。項目35イヌのアーティキュレイティング関節である、項目33に記載の方法。項目36ウマのアーティキュレイティング関節である、項目33に記載の方法。項目37前記トリボネクチンが、関節内に投与される、項目33に記載の方法。項目38哺乳動物の関節を潤滑させる方法であって、該方法は、該関節を項目30に記載の核酸と接触させる工程を包含する、方法。項目39哺乳動物における、屈指-関節症-心膜炎症候群を予防するかまたは処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物にトリボネクチンを投与する工程を包含する、方法。項目40トリボネクチンを含む生物学的適合性組成物であって、該組成物は、組織接着形成の阻害に適切な形態である、組成物。項目41前記トリボネクチンが、膜、泡沫、ゲル、または繊維である、項目40に記載の組成物。項目42哺乳動物において第1表面と第2表面との間の接着形成を阻害する方法であって、該方法は、該哺乳動物における該表面の接着を阻害するのに十分な量で該第1表面および該第2表面との間にトリボネクチンを配置する工程を包含する、方法。項目43前記第1表面および前記第2表面が、共に前記哺乳動物の損傷した組織である、項目42に記載の方法。項目44前記第1表面または前記第2表面が、人工デバイスである、項目42に記載の方法。項目45前記人工デバイスが整形外科用移植片である、項目44に記載の方法。項目46前記トリボネクチンが、膜、泡沫、ゲル、または繊維の形態である、項目42に記載の方法。項目47前記損傷が外科的切開に起因する、項目42に記載の方法。項目48前記損傷が外傷に起因する、項目42に記載の方法。項目49前記第1表面または前記第2表面が心膜組織である、項目42に記載の方法。項目50哺乳動物において、変形性関節症またはそれに対する素因を診断する方法であって、該方法は、該哺乳動物に由来する生物学的サンプルにおいて、巨核球刺激因子MSFまたはそのフラグメント量を測定する工程を包含し、ここでコントロールと比較された該量における増大は、該哺乳動物が変形性関節症を罹患するか、または変形性関節症を発症しやすいかを示す、方法。項目51前記生物学的サンプルが滑液、血液、血清、尿である、項目50に記載の方法。項目52前記MSFフラグメントが、配列番号3のアミノ酸配列を含む、項目50に記載の方法。項目53前記MSFフラグメントが、配列番号5のアミノ酸配列を含む、項目50に記載の方法。項目54前記MSFフラグメントが、配列番号6のアミノ酸配列を含む、項目50に記載の方法。詳細な説明多くの天然トリボネクチンアイソフォームが同定され、単離された。例えば、ヒト潤滑ポリペプチドは、滑液から精製され、MSF遺伝子のエキソン2および4~12エキソン1または3でないによってコードされるアミノ酸を含むことが見出された。天然の全長MSFをコードする遺伝子は、12エキソンを含み、そして天然のMSF遺伝子産物は、ヘモペキシン様領域およびソマトメジン様領域を含むビトロネクチンに対して複数のポリペプチド配列相同性を有する1404アミノ酸を含む。中心に位置するエキソン6は、940残基を含む。エキソン6は、O-グリコシル化ムチンドメインをコードする。配列番号2のヌクレオチド631~3453によってコードされるポリペプチドは、関節軟骨細胞の境界潤滑を提供する。滑液から単離される境界潤滑物は、オルタナティブスプライシングされたMSFの改変体である。このオルタナティブスプライシングされた改変体は、関節に潤滑能力を与える滑液に存在する組成物において見出された。ヒト滑液から単離される境界潤滑物は、MSF遺伝子のエキソン2、および4~12によってコードされるアミノ酸を含むすなわち、オルタナティブスプライシング改変体がMSF遺伝子のエキソン1および3によってコードされるアミノ酸を欠く。MSFの少なくともエキソン6を含む組換え的にまたは化学的に産生されたポリペプチドエキソン1も3もないは、変形性関節症疾患を妨げる、そして/または処置するのに有用である。同一または保存的置換を有するのいずれかでアミノ酸配列KEPAPTT配列番号3の少なくとも1つの反復を含む組換え的または化学的に産生された潤滑ポリペプチドはまた、哺乳動物の関節を潤滑させるために投与される。組換え潤滑ポリペプチドの産生および精製組換えポリペプチドを産生するために、適切な発現ベクター中のMSFのエキソン6配列番号2のヌクレオチド631~3453を含むDNAが細胞にトランスフェクトされる。DNAはまた、MSF遺伝子のエキソン7配列番号2のヌクレオチド354~3534、エキソン8配列番号2のヌクレオチド3535~3670、またはエキソン9配列番号2のヌクレオチド3671~3822のいくつかまたはすべてを含み得る。MSFの種々のエキソンにわたるDNAを生成するためのポリメラーゼ連鎖反応PCR方法のためのプライマーが、以下に示される。他のアイソフォームは、発現されることが求められるアミノ酸配列をコードするMSFのエキソンに対応する核酸をクローニングすることによって発現される。種々の長さのトリボネクチンポリペプチドをコードし、そして例えば、エキソン2、4~12;エキソン6~9;およびエキソン2、4~9によってコードされるポリペプチドを作製するために、MSF遺伝子の種々のエキソンを組み込むDNAを作製するために使用されるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計する方法は、分子生物学の分野で周知である。単離された核酸を用いて細胞をトランスフェクトするための標準的な方法は、分子生物学の当業者に周知である。例えば、培養物中の原核生物細胞または真核生物細胞は、細胞中で高レベル発現に適切な発現制御配列に作動可能に連結される本発明のDNAを用いてトランスフェクトされる。このような細胞は、多量の潤滑ポリペプチドを産生するのに有用であり、これは、標準的な方法を使用して精製される。潤滑ポリペプチドは、関節炎疾患の処置または予防のために治療的に使用される。ポリペプチドはまた、天然または組換え的に産生される潤滑糖タンパク質またはグリコペプチドに対する抗体を産生するために使用される。例えば、組換え遺伝子産物は、融合タンパク質として発現され、市販の発現および精製システム例えば、pFLAG発現システムIBIを使用して精製される。本発明の目的のために使用され得る発現システムには、本明細書中に記載される核酸分子を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAの発現ベクターを用いて形質転換される細菌例えば、E.coliおよびB.subtilisのような微生物が挙げられるが、これには限定されない。グリコシル化ポリペプチドの産生のために、真核生物発現系が使用さ得る。トリボネクチンポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換される酵母例えば、SaccharornycesおよびPichiaが使用される。トリボネクチンをコードする核酸分子を含む組換えウイルス発現ベクター例えば、バキュロウイルスを用いて感染される昆虫細胞系、および哺乳動物細胞のゲノム例えば、メタロチオネインプロモーターからまたは哺乳動物ウイルス例えば、アデノウイルス後期プロモーターおよびワクシニアウイルス7.5Kプロモーターから誘導されるプロモーターを含む組換え発現構築物を宿す哺乳動物細胞系例えば、COS、CEO、BEK、293、VERO、HeLa、MDCK、W138、およびNIH3T3細胞もまた有用である。臨床的用途に加えて、組換えポリペプチドは、以下に記載されるような抗体を産生するためにウサギまたはゲッ歯動物に注射される。炎症を起こしたまたは損傷した関節の滑液は、潤滑タンパク質またはポリペプチドを分解するタンパク質分解酵素を含む。例えば、好中球のような浸潤免疫細胞は、トリプシンおよび/またはエラスターゼを分泌する。関節に対する小さな損傷または炎症状態は、細胞性浸潤および外傷性滑膜炎を生じるタンパク質分解酵素分泌を生じ得る。数日または数週間の滑膜炎は、関節の細胞保護層の損失を生じ得、これは、次いで、軟骨の損失に導く。潤滑されていない軟骨の支持面bearingは、変形性関節症を開始し得る早発磨耗prematurewearを経験し得る。外傷性滲出例えば、膝関節水腫で臨床的に診察を受ける個人は、変形性関節症を発症しやすくあり;タンパク質分解酵素の生成が滑液中の天然に存在する潤滑組成物を分解し、消耗する。天然の潤滑組成物の消耗は、慢性関節リウマチのような他の炎症性関節疾患を生じる。本発明の潤滑組成物を用いたこのような損傷関節の滑液の置換または補充は、長期例えば、数年、数十年後さえの変形性関節症の発症を防ぎ、すぐに関節を潤滑し、短期の損傷を最小化する。インビボでの分解を受けにくい潤滑ペプチドのアナログ、ホモログまたは模倣物を使用して、哺乳動物の関節を潤滑させる。アナログは、アミノ酸配列、配列に影響を及ぼさない改変、またはその両方が、天然に存在するペプチドと異なり得る。改変通常は主要配列を改変しないとしては、ポリペプチドのインビボもしくはインビトロの化学的誘導体化例えば、アセチル化もしくはカルボキシル化が挙げられる。グリコシル化の改変例えば、その合成およびプロセシングの間に、またはさらなるプロセシング工程においてポリペプチドのグリコシル化パターンを改変すること、例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素例えば、哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素にポリペプチドを曝すことにより作製される改変もまた、挙げられる。被験体に注射した後のペプチドのタンパク質分解が問題である場合に、特に感受性のペプチド結合を非切断性のペプチド模倣結合と置換することは、得られるペプチドをより安定にし、従って治療剤としてより有用にする。治療ペプチドをペプチダーゼ例えば、トリプシンまたはエラスターゼelastiseにより分解されにくくするために、ペプチドのペプチド結合を、別の型の共有結合で置換し得るペプチド模倣物。トリプシン、エラスターゼ、および他の酵素は、関節炎症の間に免疫細胞が浸潤することにより合成され得る。トリプシンは、リジンおよびアルギニンのカルボキシ末端側でポリペプチド結合を切断し;エラスターゼは、アラニン、グリシンのカルボキシ末端側で切断する。トロンビン出血性関節において存在するセリンプロテアーゼであるは、アルギニンのカルボキシ末端側でペプチド結合を切断する。コラゲナーゼは、滑液代謝が変化した場合に例えば、傷害の間に線維芽細胞および軟骨細胞により生成される酵素のファミリーである。これらの酵素は、グリシンおよびプロリンのカルボキシ末端側で切断する。1つ以上のペプチダーゼ感受性ペプチド結合例えば、KEPAPTT配列番号3反復配列に現れる結合を改変して例えば、非ペプチド結合と置換して、部位を切断しにくくし、従って、治療処方物の臨床的半減期を増大させる。このような模倣物およびポリペプチドにこれらの模倣物を組み込む方法は、当該分野で周知である。同様に、L-アミノ酸残基をD-アミノ酸で置換することは、ポリペプチドをタンパク質分解されにくくする標準的方法である。アミノ末端ブロック基もまた有用である。このブロック基としては、以下が挙げられる:t-ブチルオキシカルボニル、アセチル、テニルtheyl、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリルsuberyl、アジピルadipyl、アゼライルazelayl、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼレイル、メトキシアジピル、メトキシスベリル、および2,4-ジニトロフェニル。トリボネクチンtribonectinの臨床的処方物はまた、ペプチダーゼインヒビターを含み得る。このペプチダーゼインヒビターとしては、以下が挙げられる:N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Valクロロメチルケトンエラスターゼのインヒビター。他の臨床的に受容可能なプロテアーゼインヒビター例えば、Berlingら、1998、Int.J.Pancreatology24:9-17、例えば、ロイペプチン、アプロチニン、α1-アンチトリプシン、α2-マクログロブリン、α1-プロテアーゼインヒビター、アンチキモトリプシンACHY、分泌性白血球プロテアーゼインヒビターPSTIはまた、トリボネクチンとともに同時投与されて、プロテアーゼ分解切断を減少し、かつ臨床的半減期を増大させる。2つ以上のプロテアーゼインヒビターのカクテルcocktailもまた、同時投与され得る。トリボネクチンポリペプチドまたはこのポリペプチドをコードする核酸の組成物は、当該分野で公知の標準的な生理学的に適合性の賦形剤中に処方される例えば、リン酸緩衝化生理食塩水PBS。他の処方物およびこのような処方物を作製するための方法は周知であり、かつRemington’sPharmaceuticalSciencesに見いだされ得る。トリボネクチンはまた、非架橋ヒアルロン酸調製物または粘性補充viscosupplementation組成物とともに処方される例えば、架橋ヒアルロン酸調製物。トリボネクチンを粘性補充処方物に添加する場合、トリボネクチンとヒアルロン酸との相互作用は、粘性補充物質の粘性を減少させる。糖ペプチドを作製し、そしてグリコシル化を決定する方法は、当該分野で公知である例えば、米国特許第5,767,254号に記載。N-アセチルガラクトサミンの存在は、O結合型オリゴサッカリドすなわちSer/Thr結合型オリゴサッカリドの存在を示す。O結合型オリゴサッカリドにおいて、GalNAcは、アミノ酸に対して直のO-グリコシドα結合において共通して見いだされる。O結合型オリゴサッカリドの存在はまた、Jacalin-セファロース糖タンパク質におけるSer/Thrに結合したコアのジサッカリド配列Galβ1-3GalNAcに結合する固定化植物レクチン、すなわちβ1-3Gal-GalNAcに結合するピーナッツ凝集素に結合することにより検出される。O結合型オリゴサッカリドは、標準的な方法を用いて、N結合型オリゴサッカリドとは区別される。例えば、Oグリコシド結合であって、N結合型グリコシル結合でないオリゴサッカリドは、ホウ素化水素ナトリウムの存在下50mMNaOH、1MNaBH4、45°Cで16時間で穏和な塩基を用いた処理によりペプチドから遊離しやく、β脱離反応を引き起こす。獣医学的適用イヌ変形性関節症は、本明細書中で記載される方法を使用して処置される有力な臨床的障害である。5匹の成体イヌに対して推定1匹が変形性関節症に罹っており;推定800万匹のイヌがこの変性潜在的に衰弱性疾患に苦しんでいる。しかし、多くの飼い主は、慢性的なイヌの疼痛の兆候を認識していない。どのイヌも変形性関節症を発症し得るが、危険性が最も高いイヌは、多産largebreedの老齢化したイヌ、非常に活動的なイヌ例えば、労働犬または競技用犬、および臀部または肘形成異常のような遺伝した関節異常を有するイヌである。ウマ変形性関節疾患例えば、変形性関節症は、ウマの不具および作業の減少の原因である。ヒトおよび他の動物でも同様に、ウマに罹る変性性関節疾患は、関節性軟骨変性および関節滲出により特徴づけられる滑膜性の連結の進行性障害である。急性または慢性の外傷、酷使、発達疾患、関節不安定性および老齢は滑膜炎、軟骨代謝の欠陥、および関節軟骨における亀裂の形成を導く。トリプシン、エラスターゼ、ストロメライシンおよびヒアルロニダーゼのような破壊酵素は、関節に放出され、関節では、それらは滑液および軟骨成分を分解し、結果として滑液粘性の減少、貧弱な潤滑性、軟骨代謝の衰え、ならびに疼痛および軟骨衰退を生じる摩擦の増大を生じる。現在の治療アプローチとしては、疼痛除去および抗炎症薬物のための医薬が挙げられる。本明細書中に記載される組成物および方法は、罹患した関節の潤滑能力を補充するために有用である。治療的ポリペプチドの適用ペプチドの送達について標準的な方法が使用される。このような方法は、当業者に周知である。関節内投与について、トリボネクチンは、1回の注射につき約0.1~2mlの容量で20~500μg/mlの範囲の濃度で滑膜腔synovialcavityに送達される。例えば、250μg/mlの濃度の1mlのトリボネクチンは、細い例えば、14~22ゲージ、好ましくは、18~22ゲージ針を用いて膝関節に注射される。本発明の組成物はまた、非経口投与例えば、静脈内、皮下、筋肉内、および腹膜内のために有用である。手術癒着を予防するために、本明細書中に記載のトリボネクチンを、ゲル、泡foam、繊維、または織物fabricの形態で投与する。このように処方されたトリボネクチンは、並んでいる表面の間での癒着形成を予防するために、損傷したか、または曝された組織境界の上および組織境界の間に配置される。有効であるためには、ゲルまたはフィルムは、適所に留まっていなければならず、そしてゲルが最終的に分散し、そして組織が接触する場合に、もはや癒着の傾向がないように、十分長期間にわたり、組織接触を妨げなければならない。癒着形成を阻害または予防するために処方されたトリボネクチン例えば、メンブレン、織物、泡沫、またはゲルの形態では、ラット盲腸接着モデルGoldbergら、GynecologicSurgeryandAdhesionPrevention、Willey-Liss、191~204頁、1993において手術後癒着の予防について評価される。組成物を、外科的に磨り減らしたabradedラット盲腸周辺に配置し、そして未処理コントロールと比較する盲腸を磨り減らしたが、いずれの処置も受けなかった動物。トリボネクチン処方物の存在下でのラットモデルにおける癒着形成の量の減少は、処方物非存在下での量と比較すると、この処方物が、組織癒着形成を減少するに臨床的に有効であることを示す。トリボネクチンはまた、哺乳動物への移植の前に、人工四肢および関節をコーティングするために使用される。例えば、このようなデバイスは、トリボネクチンの溶液に浸漬、すなわち槽に入れられる例えば、米国特許第5,709,020号および同第5,702,456号に記載。潤滑性ポリペプチドは、少なくとも約10アミノ酸少なくとも1つのKEPAPTT配列番号3または少なくとも1つのXXTTTX配列番号4反復を含むであり、通常、長さが約20の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも40の連続するアミノ酸、より好ましくは、少なくとも50の連続するアミノ酸、および最も好ましくは、少なくとも約60~80の連続するアミノ酸である。例えば、このポリペプチドは、長さが約500アミノ酸であり、そして76反復のKEPAPTT配列番号3を含む。このポリペプチドは、長さが1404残基未満であり、例えば、天然に存在するMSF配列番号1のアミノ酸配列を有するが、少なくとも5、10、15、20、または24アミノ酸の天然に存在するMSFを欠如する。このようなペプチドは当業者に公知の方法により作製され、このような方法としては、以下が挙げられる:組換えMSFタンパク質のタンパク質分解、デノボ合成、または遺伝子操作例えば、MSF遺伝子のクローニングおよび少なくともエキソン6、7、8、および/または9の発現。トリボネクチンポリペプチドはまた、生化学的に精製される。酵素、キモトリプシンは、MSF遺伝子のエキソン6によりコードされるアミノ酸をひとまとめにした部位で切断する。従って、MSF遺伝子のエキソンしかし、他のどのMSFエキソンでもないによりコードされるアミノ酸を含むポリペプチドは、キモトリプシンでの酵素消化により、天然に存在するか、または組換え生成されたMSF遺伝子産物から調製される。次いで、このポリペプチドを標準的な生化学的精製方法に供して、治療的投与、潤滑性活性の評価または抗体生成に適した実質的に純粋なポリペプチドを得る。治療組成物は、薬学的に受容可能なキャリア例えば、生理食塩水中で投与される。キャリアは、投与様式および経路ならびに標準的薬学的実施に基づいて選択される。治療組成物例えば、潤滑性ポリペプチドの治療的に有効な量は、処置した動物において医学的に所望される結果例えば、哺乳動物関節の境界の潤滑を生じ得る量である。医学的に所望される結果は、疼痛の減少例えば、Peyronら、1993、J.Rheumatol.補遺.39:10-15に記載の可視的類似疼痛スケールvisualanalogpainscaleを用いて測定されるまたは関節を動かす能力の増大例えば、Belcherら、1997、J.Orthop.Trauma11:106-109に記載のようにペドメトリpedometryを用いて測定されるである。処置後に滑液の潤滑性を測定する別の方法は、罹患した関節から少量の滑液を再吸引し、そして本明細書中に記載の摩擦装置を用いてインビトロで潤滑特性を試験することである。医学分野で周知のように、任意の1匹の動物についての投薬量は、多くの因子に依存する。これらの因子としては、以下が挙げられる:動物のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全般的健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物。一般に、損傷した関節または炎症を起こした関節に局所的に投与が行われる。あるいは、このポリペプチドは、損傷した関節または炎症を起こした関節の部位でゆっくりと放出させるために、関節のすぐ近くに配置された時限放出time-releasedインプラントを介して投与される。遺伝子治療遺伝子治療は、治療的潤滑性ペプチドをコードする哺乳動物核酸例えば、アミノ酸配列KEPAPTT配列番号3の1回以上の反復をコードするDNAまたはMSFの潤滑性フラグメントをコードするDNAを、標準的ベクターおよび/または遺伝子送達系により投与することで行われる。適切な遺伝子送達系としては、以下が挙げられる:リポソーム、レセプター媒介送達系、裸のDNA、およびウイルスベクター例えば、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス。上記のように遺伝子送達系に加えて、治療組成物は、動物への投与に適切な薬学的に受容可能なキャリア例えば、生理食塩水のような生物学的に適合性のビヒクルを含み得る。治療的に有効な量の核酸またはポリペプチド組成物は、処置される動物において医学的に所望される結果例えば、関節の動きと関連した疼痛の減少、滑液の潤滑機能の増大を生じ得る量である。非経口投与例えば、静脈内、皮下、筋内、および腹腔内送達経路は、化合物を送達するために使用され得る。好ましくは、治療組成物例えば、核酸またはポリペプチドは、関節内に送達される。任意の1患者のための用量は、多くの因子患者のサイズ、体表面面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路に依存し、一般的な健康、および同時に投与される他の薬剤例えば、抗炎症薬剤、粘性治療薬剤viscotherapeuticdrugsに依存する。核酸の投与の好ましい用量は、約106~1022コピーの核酸分子である。DNAは、標準ベクター例えば、プロモーター配列に作動可能に連結されたトリボネクチンをコードするDNAを含むベクターによって患者の標的細胞に導入される。適切な遺伝子送達系としては、リポソーム、レセプター媒介送達系、裸のDNA、およびウイルスベクター特にヘルペスウイルス、レトロウイルス、およびアデノウイルスが挙げられる。DNAは、標準方法を使用するアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス送達系を使用して局所的に投与され得る。例えば、DNAを関節内の滑液に送達する方法およびDNAを滑液由来の細胞例えば、滑液の線維芽細胞または軟骨細胞に送達する方法は、米国特許第5,858,355号に記載される。組換えアデノ随伴ウイルスAAVベクターの複製およびパッケージングに必要とされるシス作用配列のみが、AAV末端反復である。4kbまでのDNAが、ウイルス複製にもパッケージングにも影響しないで末端反復の間に挿入される。組換えAAVベクターをパッケージングするために、末端反復を含むプラスミドおよび治療的ポリペプチドをコードするDNAは、AAVrepおよびカプシドタンパク質を発現するプラスミドと共に、細胞に同時トランスフェクトされる。次いで、トランスフェクトされた細胞は、アデノ随伴ウイルスで感染され、そして所望の配列を含む組換えAAVウイルスは、トランスフェクション後、約48~72時間の細胞から単離される。次いで組換えウイルスは、公知の方法を使用して遺伝子治療適用のために投与される。エレクトロポレーションは、標的細胞例えば、滑液の線維芽細胞または軟骨細胞に、エキソビボでDNAを導入する別の方法である。エレクトロポレーションされる細胞は、Hepes緩衝液生理食塩水EBSに、約107細胞/mlの濃度で置かれる。エレクトロポレーションされるDNAは、約5~20μg/mlのHBSの濃度で添加される。混合物はエレクトロポレーションデバイスに配置され、そして電場が標準プロトコール例えば、約250と300ボルトの間の範囲でに従って適用される。エキソビボでの滑膜細胞へのDNAの導入後、遺伝的に改変された自己滑膜細胞が、関節内注射によってドナーに移植される。約107細胞が、約1mlの量で関節に関節内で注射される。DNAが導入された滑膜細胞は、従来の方法例えば、関節鏡を通じてを使用して得ら得る。関節鏡は、滑膜細胞を関節鏡検査で回収するために外科的な機器への接近をアクセスを可能にする小さな刺創を介して膝に挿入された小さく、窪んだ杆体である。いくつかの場合において、関節鏡的に切除された組織における滑膜細胞は、結合組織マトリックスの酵素学的消化によって無菌的に回収される。例えば、滑膜は、約1mmの直径の小片にカットされ、そして順次、トリプシンGey’sBalancedSaltSolution中0.2w/vで、37°Cで30分間、そしてコラゲナーゼGey’sBalancedSaltSolution中0.2w/vで、37°Cで2時間、消化される。遺伝的に改変された細胞の懸濁液は、レシピエント哺乳動物関節に注射される。この型の関節内注射は慣習的であり、かつ、さらなる外科的処置を用いないで医務室で行われる。必要な場合、繰り返しの注射が行われる。あるいは、DNA裸またはウイルス内にパッケージングされたは、適切な薬学的キャリア内に処方され、そして関節内に注射される。遺伝子治療はまた、変形性関節症を高度に発達させ易いと決定された個人例えば、急性関節障害に罹患した個人において変形性関節症の発達を防ぐために予防的な手段として投与され得る。治療的ポリペプチドをコードするDNAの、関節への直接の関節内注射は、DNAの発現を可能にするためのレシピエントの滑膜細胞のトランスフェクションを生じる。内因性トリボネクチンプロモーターを刺激する薬剤例えば、TGF-βはまた、滑液の発現のレベルを増加するために上記のように投与され得る。滑液潤滑ポリペプチドに特異的な抗体の産生潤滑ポリペプチドに特異的な抗体は、当該分野で周知の技術によって得られる。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。例えば、ポリクローナル抗体は、Ghoseら、MethodsinEnzymology,第93巻,326-327,1983に記載される方法によって得られ得る。例えば、配列番号2のヌクレオチド632-3453によってコードされる潤滑ポリペプチドは、ウサギの抗血清においてポリクローナル抗体の産生を刺激するための免疫源として使用される。類似の方法が、動物例えば、ヤギ、ヒツジおよびげっ歯類において抗血清を惹起するために使用され得る。モノクローナル抗体は、MilsteinおよびKohler、Nature、256:495-497,1975に記載されるか、またはGerhard,MonoclonalAntibodies,PlenumPress,1980,第370-371頁によって変更された周知のプロセスによって得られる。ハイブリドーマは、抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。この抗体は、滑液潤滑ポリペプチドに高度に特異的である。好ましくは、抗体は、少なくとも約108リットル/モルの親和性、そしてより好ましくは、少なくとも約109リットル/モルの親和性を有する。ポリクローナル抗体のモノクローナルは、大量の組換え潤滑ポリペプチドを急速に精製する手段を提供する。トリボネクチンのペプチドコアを配向する抗体に加えて、トリボネクチンの糖部分または糖ペプチド複合体を配向する抗体が好ましい。ペプチドコアに対する抗体を産生するために、配列番号1のアミノ酸200~350に渡るペプチドが使用される。配列番号1のアミノ酸200~350の8~15アミノ酸部分に同一である、より短いペプチド例えば、8~15アミノ酸長はまた、このような抗体を産生するために使用され得る。トリボネクチンのペプチドコアに特異的な抗体についての免疫源として使用される他のペプチドとしては、配列番号1のアミノ酸24~66、配列番号1のアミノ酸105~155、配列番号1のアミノ酸156~199の領域におけるペプチドが挙げられる。グリコシル化されたトリボネクチンポリペプチドに結合する抗体を産生するためにしかしグリコシル化形態でも非グリコシル化形態でもない、免疫源は好ましくは、糖ペプチド、トリボネクチンの高度にグリコシル化された部分に渡るアミノ酸配列例えば、配列番号1の残基200~1140のアミノ酸配列を有するペプチドである。その同じ高度にグリコシル化された領域内の、より短い糖ペプチド例えば、8~15のアミノ酸長はまた、免疫源として使用される。高度にグリコシル化された生体分子に対する抗体を産生する方法は、当該分野で公知である例えば、Schneersonら、1980、J.Exp.Med.152:361-376に記載される。診断の方法変形性関節症は、ゆっくりと発達し、かつ関節痛がしばしば個人に医学処置を求めさせる、その後期段階まで診断が困難な疾患である。変形性関節症の初期診断、またはこの疾患を発達する素因の診断は、初期の介入が、進行した変形性関節症の発達を防ぐか、または減少すること可能にする。本発明は、この疾患またはそれを発達させる素因の初期の検出方法を提供する。この方法は、体液例えば、血清または尿を天然に生じるトリボネクチンのフラグメントの存在またはMSFのフラグメントの存在について試験することによる。生物学的液体中のこのようなペプチドの検出および定量化は、当該分野で周知である。例えば、標準サンドイッチELISAアッセイは、天然に生じるトリボネクチンに対する2つの異なる抗体例えば、糖ペプチドのオリゴサッカリド部分に結合する第1抗体および糖ペプチドのペプチドコアに結合する第2抗体を使用して行われる。あるいは、以下に記載される液体クロマトグラフィーおよび質量分析による標準タンパク質配列決定は、生物学的サンプル内のMSFフラグメントを検出するために使用される。コントロール値は、ネガティブな診断に関連して予め決定された値である;あるいは、コントロールサンプルは、変形性関節症がないことが既知の哺乳動物由来の生物学的サンプルである。30のコントロール値またはサンプルに比較された量の増加は、その哺乳動物が変形性関節症に罹患することを示すか、または、進行中の変形性関節症の素因であることを示す。ヒト滑液由来のトリボネクチンの特徴付け診断的関節鏡検査および膝全体の交換を受けている患者由来の滑液のアリコートを収集し、そして摩擦装置でアッセイした。両方の場合において、滑液は、任意の外科的な手順の開始前に吸引され、そして直ぐに10,000×gで、4°Cで2時間遠心分離し、細胞性細片は除去された。血液で汚染されたサンプルは廃棄した。正常な潤滑能力を有するアリコートをプールし、そして-20°Cで保存した。トリボネクチンの精製および単離ヒト滑液200mlを0.22マイクロ滅菌フィルターユニットNalgeneを通じて、4°Cで2日間フィルター濾過した。保持されたものretentateをフィルター膜から廃棄し、そして50mMNaAc緩衝液、pH5.5で、タンパク質分解インヒビター:1mMフェニルメチルスルホニルフルオライドPMSF、1mMパラクロロ水銀安息香酸PCMB、および10mMエチレンジアミンテトラアセテートEDTAを含んで元々の滑液量まで再懸濁した。ヒアルロン酸の消化を、37°Cでストレプトミセスヒアルロニダーゼで、1U/mlの再懸濁された滑液で行った。消化物を300mlの容量で設置かれたDEAEカラムWhatmanInternational,Maidstone,UKにロードし、NaAc緩衝液、50mMで平衡化し、そして1.5Lの同じ緩衝で洗浄した。潤滑作用を有する物質を1MNaClを用いてDEAE膜から溶出した。1Lの洗浄液を収集し、そしてXM-100膜分子量カットオフ100kDaを備えた500mlのAmiconフローセルを介して濃縮した。濃縮されたサンプルを0.15MNaClおよび0.5mMCaCl2を含む25mMリン酸緩衝液、pH7.4に対して透析した。DEAE結合濃縮物を、室温で25mMリン酸塩および0.15NaCl緩衝液、pH7.4で平衡化された、25mlの総容積で設置されたピーナッツ凝集素PNAアガロース親和性カラムにロードした。230nmおよび280nmの吸収がバックグラウンドまで減少するまで、非結合タンパク質を同じ緩衝液で溶出した。潤滑活性を有する物質を、25mMTrisおよび0.15MNaCl、pH7.4中の0.07Mの濃度の段階的なstep-wise勾配で最大限に溶出した。この物質を、汚染物質としてフィブロネクチンを除去するためにアミン基を介して、ヒトフィブロネクチンに対するZymedLaboratoriesInc.,SanFrancisco,CAマウスモノクローナル抗体に結合されたActigelALDアガロースSterogeneBioseparations,Arcadia,CAにロードした。溶出された物質を、Coomassieblueで染色されたSDS-PAGE5~15アクリルアミド上で、およびHPLCによって純度についてアッセイした。タンパク質電気泳動標準は、GibcoBRLGrandIsland,NYから、そしてDNAラダー標準は、FMCBioproductsRockland,MEからである。高圧液体クロマトグラフィーBondpakC183.9×150mmカラムWaters,Milford,MAを、45v/vメタノールSigmaおよび5v/vアセトニトリルAldrickHPLCグレードを用いて、1ml/分で、35°Cで逆相で溶出した。溶出物を、フォトダイオードアレイ検出機PDA996Watersによってアッセイし、そしてピーク画分内の物質を、Millenium32ソフトウエアWatersを使用して計算される純度プロットによって分析した。摩擦装置標準摩擦装置例えば、Jayら、1992、Conn.Tiss.Res.28:71-88、またはJayら、1998、J.Biomed.Master.Res.40:414-418に記載される装置を使用して、潤滑活性を測定した。天然のラテックスを、1.59cm2の定常接触面積を有する研磨されたガラスのリングに対して振動した。支持システムを、2つの垂直水平軸の周りを自由に回転するためにジンバルシステム内の軸の方向にロードした。支持物質としてのラテックスおよびガラスが選択された。なぜなら、それらは、0.05mmのオーダーの小さな隆起の高さを有する平らな表面を提供するからである。軟骨のようなラテックスが準拠している。ジンバルシステム内のこれらの表面は、ほとんど完全なco-planarityを有する。従って、液体ウェッジは、産生されず、そして境界液体の薄い層のみが存在した。同調する速度すなわち、スライディングスピードは、0.35×106N/rm2の定常接触圧力で0.37mm/secであった。この摩擦装置は、直線変位電圧変換器を通じて垂直の負荷軸の周りのジンバルシステムの変位を記録した。この変換器の出力電圧は、その摩擦トルクの程度に正比例した。この信号のピークごとの増幅は、公知の摩擦トルクを有する以前の較正と関連した。試験表面を、使用前に徹底的に洗浄した。ステンレス鋼スタッドに係合された3.8×3.8cmのラテックス片を流れる蒸留脱イオン水DDWで2分間洗浄した。次いで、これを0.9のNaCl生理食塩水PSの浅いバスに入れた。このガラススライドを、DDW中1v/vの7×界面活性剤FlowLaboratories,McLean,VA溶液で10分間擦り、次いで、その同じ溶液中100°Cに浸させた。5分間の擦りもまた、熱い7×溶液で行い、続いて、2~4分間流れるDDWにもとで洗浄した。μを35°Cで測定し、そしてPSを用いてそのμの基底腺測定をその前にした。潤滑を、PSのμに対するμの減少によって示した。負のδ値は、潤滑を示し、他方で正の値は、摩擦を示す。200μlのPSおよび後の200μlの試験潤滑剤の添加に続き、ベアリング表面をその溶液が両方の面を湿潤させるに充分密接させる。5分間の平衡化の後、ラテックスコーティングしたベアリングをそれが振動するときにガラス上に静止させた。ピークごとの電圧を1、3および5分後に自動記録させた。この時点で、その表面を2分間分離し、次いでさらに5分間のセッションにわたって元に戻して一緒にした。最後の2回の5分間のセッションの3および5分のμ値は、代表的に安定しており、そしてこれを記録した。ヒト血清フィブロネクチンをSigmaChemicalF0895,St.Louis,MOから購入し、そして摩擦装置における使用前にPSに対して透析した。境界潤滑剤は、表面の物理化学的特性を変更することによってその効果を奏する。ベアリング表面は、境界モードにおいて潤滑となるように共同の反発力を生成しなければならない。境界潤滑剤の代表的な室温例は、グラファイト、テフロン登録商標、および亜硫酸モリブデンである。そのような組成物は、ベアリング表面の間の摩擦を減少させ、そして従ってトリボネクチンの潤滑特性を測定するためのアッセイにおいて正のコントロールとして使用される。トリボネクチンは、ラテックスのような日生物学的疎水性表面をコーティングすることによって両親媒性の特性を有し得る境界潤滑剤である。トリボネクチンのオリゴサッカリド成分は、周囲の水性環境とネットワーク形成する。最後および最後から二番目の糖は、滑液から精製された天然に存在するトリボネクチンから除去され、潤滑能力が除去される。ラテックス:ガラスアースロトリプソメーターarthrotripsometerは、再現性良く反復して、精製された生物学的潤滑因子を試験するための迅速な方法を提供する。天然ラテックスおよび研磨ガラスは、試験ごとの物理化学的特性の変化はないかまたはあっても殆どないベアリング表面を有する。対照的に、研磨ガラスまたは軟骨自身のいずれかに対して並置された切断された軟骨は、正確に制御され得ない変位を生じる。滑液によって潤滑される軟骨-軟骨ベアリングにおいて観察されるμは、0.005と0.024との間であった。ラテックス:ガラス系におけるμの値は、認知可能により高く、そして代表的には0.04以下であった。ベアリング材料間のμの変動は、軟骨の80w/w水含量に起因する。液体クロマトグラフィーおよび質量分析LCMSによるタンパク質配列決定標準的なLCMSを、上記精製された潤滑材料のトリプシン消化で行った。潤滑材料を含む2mm厚の5~20勾配SDS-PAGEゲルBio-radLaboratories,Hercules,CAから切り出されたバンドを分析した。この材料は、NaNaseIIIおよびO-グリコシダーゼDSGlyko,Novato;CAによって脱グリコシル化した。脱グリコシル化は、それぞれ0.18U/mlおよび0.10U/mlの活性の上記酵素を用いて18時間、0.5mg/mlの滑液から精製されたトリボネクチンの存在下で行った。すべての場合において、ゲルスライスを、バンドの中央を通じて切断し、そして16mm3のサイズであった。すべての接触表面は、慎重に50v/vのアセトニトリルで洗浄した。配列データを、BLASTGENBANK登録商標検索アルゴリズムに入力し、そしてマッチを同定した。ヒト滑膜線維芽細胞の単離および培養正常な外観を有するヒト滑膜を、関節鏡検査を受けた30歳の白人男性から得た。術後1時間以内に、滑膜組織移植片を3回Dulbeccoのカルシウムおよびマグネシウムなしのリン酸緩衝化生理食塩水GIBCOで洗浄した。2mm3のサイズの片を、1mlあたり100Uのペニシリンおよび100μgのストレプトマイシンを補充し、4mg/mlのClostriopeptidaseAWorthingtonBiochemicalCLS,125-200U/mgを含み、0.22mmフィルターNalgeを通して滅菌されたDulbecco改変Eagle培地GIBCO中に入れた、この組織断片を、さらに、100mmのプラスチックペトリ皿Falconで分割し、そして5二酸化炭素および95空気の湿潤雰囲気下で37°Cで20mlの培地中で4時間インキュベートした。消化物を、パスツールピペットへの吸引Sおよびそこからの排除によって多数回充分に混合した。改変されたPuckSalineAGIBCO中の等容量の0.05トリプシンおよび0.02のEDTAを添加し、そしてインキュベーションを、さらに1時間、同じ条件下で続けた。懸濁物を、400×gで23°Cで10分間遠心分離し、そして3回40mlのカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水で各々洗浄した。このペレットを、10仔ウシ血清FlowLaboratories、100Uのペニシリンおよび100mgのストレプトマイシン1mlあたりを補充した改変Eagle培地20ml中に懸濁した。2mlのこの最終混合物を、60mmプラスチックペトリ皿Falcon1つあたりにプレートした。滑膜線維芽細胞を、コンフルエンスにまで増殖させ、そして細胞を採集した。ヒト皮膚線維芽細胞AmericanTypeCultureCollectionATCCDesignationCCD-10995K;ATCC,Mannassas,VAをコントロールとして使用し、これもまた、上記手順を用いて増殖および採取した。RNA抽出およびRT-PCR分析滑膜線維芽細胞および皮膚線維芽細胞からのRNAを、RNeasyミニカラムおよび試薬Qiagen,Crawley,Ltd.,UKによって精製した。夾雑するゲノムDNAを、DNAシュレッダーおよびDNaseRNaseなしQiagenにより除去した。第一の鎖のcDNAを、逆転写および以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR増幅により合成した。MSF-エキソン6順向きプライマー5’-CCAAACCACCAGTTGTAGATGAAGC-3’配列番号15andMSF-エキソン6逆向きプライマー5’-GCGGAAGTAGTCTTCTCTTTTCCATCAG-3’配列番号16。これらのプライマーは、ヒトMSF遺伝子配列番号2;GenBank登録番号U70136のヌクレオチド番号674-698および953-926にそれぞれ対応する。サーマルサイクル条件を、12分間42°C、95°Cで10分、続いて43サイクルの94°C×20秒および55~65°C×30~90秒であった。7分間の最終の伸長は72°CであったPerkinElmerBiosystems。トリボネクチンの代替のMSFのスプライス改変体潤滑ポリペプチドをヒト滑液から標準的な生化学的方法に続いてピーナツ凝集素を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。最終の画分であって、唯一潤滑能を有したものは、見かけ上の分子量が280kDaの産物を含んでいた。280kDaを超える分子量の成分は、観察されなかった。280kDaの切断バンドからのトリプシンフラグメントにおいて行われたLCMSは、2つの異なるタンパク質の存在を示した。このタンパク質は、BLAST検索アルゴリズムでフィブロネクチン前駆体およびMSFGenBankTM登録番号U70136と適合した。MSFの配列は、ネイティブおよび脱グルコシル化の潤滑ポリペプチドの両方から同定された。従って、精製スキームを、抗フィブロネクチンカラムで終結させ、これは、不純物としてフィブロネクチンの除去を生じたC18分析HPLCおよび純度プロット分析によってアッセイされるところ。さらに、SDS-PAGE上70kDaおよび160kDaにおけるより低分子量のバンドは、抗フィブロネクチンカラムから溶出する精製したトリボネクチン調製物からなくなっていた。摩擦装置においてアッセイされた精製したトリボネクチンは、全体の滑液のものに類似する境界潤滑活性をしめすことが分かった表5。対照的に、精製した血清フィブロネクチンは、摩擦を上昇させ、このことは、滑液潤滑能が精製されたトリボネクチンによって媒介されたことを示す。PSに中250μg/mlの濃度で試験した。生理学的生理食塩水。†死後のヒト滑液さらに、トリプシン処理フラグメントのLCMSにより、エキソン6~9両端服務の部分が同定された。精製されたトリボネクチンは、ピーナツ凝集素と反応した。このことは、その精製によるβ1-3Gal-GalNAcオリゴサッカリドの存在を示す。電気泳動の移動度における増加が、NaNaseIIIおよびO-グリコシダーゼDSでの消化後に観察された。このことは、この精製されたトリボネクチンが高度にO結合型オリゴサッカリドを介してグリコシル化されていることを示す。滑液から精製された脱グリコシル化したトリボネクチンの見かけ上の分子量は120kDaであった。RT-PCR分析を、MSFのN末端およびエキソン6をコードするヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いて完了させた。ヒト滑膜線維芽細胞RNAを用いたRT-PCRは、280bp産物を生じ、これは設計されたプライマーの間の距離であった。逆転写酵素なしの類似の実験では、この産物は生じなかった。このことは、そのRNAがゲノムDNAを含まないことを示す。皮膚線維芽細胞からの精製されたRNAは、この同じプライマーを用いても何ら産物を生じなかった。MSFは、ヒト単球からまず単離された;MSFの25kDaフラグメントは、巨核球の発生を刺激することが見出された。MSF前駆体タンパク質は、1404残基のサイズであり、そして12のエキソンから構成される。エキソン6は、940残基の長さである中心に位置するムチンをコードするようである。エキソン6は、ビトロネクチンに対して相補性を有し、エキソン2および3は、ソマトスタチンB様領域に対して相補的であるようであり、そしてエキソン8、9は、ビトロネクチンにおけるヘモペキシン様領域に類似する。ヘモペキシンは、ヒアルロネートと相互作用する血清ヘムスカベンジタンパク質である。滑液から精製されたトリボネクチンおよび関節軟骨から精製された関節軟骨の表面帯タンパク質SZPは、MSFとの配列同一性を共有するが、それらの見かけ上の分子量およびアミノ酸配列において異なる。実施例1:ヒト滑膜線維芽細胞によるMSF遺伝子発現天然に存在するトリボネクチンは、MSFをコードする遺伝子からのヒト滑膜線維芽細胞によって発現されることを見出した。すべてではないがいくつかのMSF遺伝子のエキソンは、トリボネクチン遺伝子産物において表現される。例えば、トリボネクチンは、MSF遺伝子のエキソン6-9によってコードされる配列を含むが、天然に存在するMSF遺伝子の少なくとも1つのエキソンによってコードされる配列を欠如する。MSF遺伝子発現を以下のように評価した。正常の潤滑能力を有する、プールされたヒト滑液精製されたトリボネクチンの240kDaの見かけ上の分子量バンドからのゲルスライスをトリプシンで消化した。トリプシン処理したフラグメントのN末端配列決定を、液体クロマトグラフィー質量分析によって行い、そして結果を、GenBankTMにおける公知配列と比較した。O-グリコシダーゼDSおよびNaNaseIIIを有する精製されたトリボネクチンの消化を用いて、コアタンパク質の分子量を示した。潤滑能力を、研磨ガラスのリングに対して、天然のラテックスを振動させる標準的な摩擦装置を用いてアッセイした。2つの以前に同定されたタンパク質種は、ヒト滑液の最後の潤滑画分に存在した。フィブロネクチン前駆体FNおよび巨核球刺激因子MSFのトリプシン処理フラグメントを、両方とも同定した。100マッチE値は0.31~0.047の範囲であるが、エキソン6~9について特異的なMSF配列を用いて観察された。MSFは、ビトロネクチンに類似する多重機能ドメインを有するサイズが1104アミノ酸である。このトリボネクチンは、摩擦係数nを、0.142から0.036へと減少させたが、他方、精製された血清フィブロネクチンは、nを0.136から0.181へと上昇させた。配列番号1のアミノ酸位214-222および300-309に対応する順向きおよび逆向きのRT-PCRプライマーを用いて、インビトロで増殖させたヒトの滑膜線維芽細胞から精製されたmRNAを検査した。280bp遺伝子産物が予測されたアミノ酸配列と一致していることが観察された。本明細書において記載されるデータは、天然に存在するトリボネクチンが、MSF遺伝子の発現を介して、滑膜繊維が細胞から分泌されることを示す。以下に記載される方法を使用して、滑液における潤滑成分を特徴付けた。ヒト滑液収集物診断関節鏡検査を受ける患者からの滑液および綜合膝置換物のアリコートを集め、そしてその摩擦装置においてアッセイした。両方の場合において、滑液を、任意の手術手順の開始の前に吸引し、そして直ぐに2時間4°Cで10,000×gで遠心分離して、細胞砕片を除去した。血液を肉眼で見て夾雑するサンプルを捨てた。正常な潤滑能力を有するアリコートをプールし、そして-20°Cで格納した。ヒトトリボネクチンの精製および単離ヒト滑液200mlを、0.22nmの滅菌フィルターユニットNalgeneを通して4°Cで2日にわたって濾過した。保持物をフィルターメンブレンから掻き取り、そして50mMNaAc緩衝液、pH5.5を用いて再懸濁してもとの滑液容量とした。その再懸濁緩衝液は、タンパク質加水分解インヒビター:1mMPMSF、1mMPCMBおよび10mMEDTAを含んだ。ヒアルロン酸の消化を、1U/mlの再懸濁した滑液のストレプトマイセスヒアルロニダーゼによって37°Cで行った。消化物を、300mlの設置した容量のDEAEカラムWhatmanInternational、Maidstone、UK上にのせ、NaAc緩衝液、50mMに平衡化し、そして1.5Lの同じ緩衝液で洗浄した。所望の材料をDEAEマトリクスから、1MNaClを用いて溶出した。1Lの洗浄物を収集し、そしてXM-100メンブレンmwカットオフ=100kDaを有する500mlのAmiconフローセルを介して濃縮した。濃縮したサンプルを25mMリン酸緩衝液、pH7.40.15MNaClおよび0.5mMCaCl2を含むに対して透析した。このDEAE結合濃縮物を、25mlの設置ベッド容量を有するピーナツ凝集素PNAアガロースアフィニティーカラムにのせ、室温で25mMホスフェートおよび0.15NaCl緩衝液、pH7.4と平衡化した。結合していないタンパク質を、同じ緩衝液で、230nmおよび280nmでの吸光度がバックグラウンドにまで下がるまで溶出した。所望の材料をa-ラクトースの段階勾配の存在下で25mMTrisおよび0.15MNaCl濃度でpH7.4にて最大に溶出された。予備精製されたトリボネクチンを、アミン結合を介してヒトフィブロネクチンに対するマウスモノクローナル抗体ZymedLaboratoriesInc.,SanFrancisco,CA.に結合されたActigelALDアガロースSterogeneBioseparations,Arcadia,CAにのせた。溶出された材料をクーマシーブルーで染色したSDS-PAGE5-15およびHPLCによってアッセイした。高圧液体クロマトグラフィーμBondapakC183.9×150mmカラムWaters,Milord,MAを、45v/vメタノールSigmaおよび5v/vアセトニトリルAldrichHPLC等級を用いた逆相中で1分間/分で35°Cで溶出した。溶離物を、光ダイオードアレイ検出器PDA996Watersによりアッセイし、そしてMillenium32ソフトウェアWatersを用いて算出した精製プロットによってピークを分析した。摩擦装置標準的な摩擦装置を用いて、上記のように潤滑活性を測定した。μを、35°Cで測定した。その前に、μの基底線測定をPSを用いて行った。潤滑を、PSのμに対する減少によって表した。負のΔμの値は、潤滑を示すが、他方、正の値は摩擦を表す。200μlのPSの添加および後の200μlの試験潤滑剤の添加に続いて、その溶液が両方の表面を湿らせるように十分ベアリング表面を近接させた。平衡化のための5分の後、ラテックスコーティングされたベアリングを、それが振動しているときにガラス上にとどまらせた。ピークごとの電圧を、1、3および5分後に自動的に記録させた。この時点で、その表面を2分間分離し、次いで別の5分間のセッションのために戻して一緒にした。最後の5分間のセッションの3分および5分のμ値は代表的に安定化し、そしてこれを記録した。LCMSトリプシン処理消化物のLCMSを、上記のように行った。バンドを、2mm厚の5-20勾配SDS-PAGEゲルBio-radLaboratories,Hercules,CAからさらなる分析のために切り出した。脱グルコシル化をNaNaseIIIおよびO-グルコシダーゼDSGlyko,Novato,CAそれぞれ0.17U/mlおよび0.10U/mlの濃度で、0.5mg/mlタンパク質の存在下で6時間を用いて行った。全ての場合において、ゲルスライスを、バンドの中心を通り、16mm3のサイズとなるように切り出した。すべての接触表面を、注意深く50v/vアセトニトリルで洗った。配列データをBLASTGenBankTM検索アルゴリズムに入力し、そしてマッチを同定した。RNA抽出およびRT-PCR分析滑膜線維芽細胞および皮膚線維芽細胞からのRNAは、RNeasyミニカラムおよび試薬Qiagen,Crawley,Ltd.,UKによって精製した。夾雑するゲノムDNAは、DNAシュレッダーおよびDNaseRNaseなしQiagen.によって除去される。第一の鎖cDNAを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーMSF特異的プライマーの相対位置は図1に示されるを用いて逆転写およびPCR増幅によって合成した:MSF-エキソン6順向きプライマー5’-CCAAACCACCAGTTGTAGATGAAGC-3’配列番号15およびMSF-エキソン6逆向きプライマー5’-GCGGAAGTAGTCTTCTCTTTTCCATCAG-3’配列番号16。これらのプライマーは、GENBANKTM登録番号U70136ヒトMSFにおいてそれぞれ塩基対番号位置674-698および953-926に対応する。サーマルサイクリング条件は、12分で42°C、95°Cで10分に続いて43サイクルの94°C×20秒および55~65°C×30~90秒であった。7分間の最終の伸長を、72°CであったPerkinElmerBiosystems。種々の試薬ヒト血清フィブロネクチンを、SigmaChemicalF0895,St.Louis,MOから購入し、そしてPSに対して透析し、その後、摩擦装置において使用した。タンパク質電気泳動の標準物を、GibcoBRLGrandIsland,NYから購入し、そしてDNAラダー標準物を、FMCBioproductsRockland,MEから購入した。ヒト滑液からのトリボネクチンを精製した。唯一潤滑能力を有した最終画分は、主に、280kDaの見かけ上の分子量を有する産物を含んだ。この画分はまた、マイナーな分子量成分を含んでおり、これは、最終の抗体ベースの精製工程で除去された。280kDaを超える分子量を有する成分は、観察されなかった。280kDaから切り出されたバンドからのトリプシン処理フラグメントにおいて実施されたLCMSは、2つの異なるタンパク質の存在を示し、これは、フィブロネクチン前駆体およびMSFに対するBLAST検索アルゴリズムに適合したGENBANKTM登録番号U70136。MSFの配列は、ネイティブおよび脱グルコシル化トリボネクチンの両方から同定された。従って、精製スキームを、抗フィブロネクチンカラムによって終結させ、そしてC18分析HPLCおよび精製プロット分析において不純物としてフィブロネクチンのおおよその除去を達成した。さらに、SDS-PAGEにおける70kDaおよび160kDaにおけるマイナーな低分子量バンドは、抗フィブロネクチンカラムから溶出された精製調製物から除かれていた。摩擦装置においてアッセイされた精製されたトリボネクチンは、滑液の全体のものに類似する境界潤滑活性を示すことが見出された表6。生理食塩水†PSにおいて250μg/mlの濃度で試験した。対照的に、精製された血清フィブロネクチンは、摩擦を上昇させた。このこことは、滑液潤滑能力がトリボネクチンによって媒介されることを示した。トリプシン処理フラグメントのLCMSは、MSFのエキソン6~9両端含むの部分を正確に同定した。エキソン6の初めおよび終わりで核酸配列によってコードされたフラグメントが見出された。トリボネクチンは、PNAと反応した。このことは、その精製による、1-3Gal-GalNAcオリゴサッカリドの存在を示すさらに、NaNaseIIIおよびO-グルコシダーゼDSでの消化後に電気泳動移動度における非常に有意な増加が存在した。このことは、トリボネクチンがO結合型オリゴサッカリドを介してグリコシル化されることを示す。脱グルコシル化トリボネクチンの見かけ上の分子量は120kDaであった。RT-PCR分析は、MSFのエキソン6のN末端をコードするヌクレオチド配列について特異的なプライマーを用いて完了させた。ヒト滑膜線維芽細胞RNAを用いたRT-PCRは、280bpの産物を生成した。これは、設計されたプライマーの間の推定距離である。逆転写酵素のない類似の実験は、この産物を生成しなかった。このことは、このRNAは、ゲノムDNAを含まないことを示した。皮膚線維芽細胞から精製されたRNAは、同じプライマーを用いて何も産物を生成しなかった。本明細書において記載されたデータは、MSF遺伝子のエキソンが選択スプライシングされて、滑膜関節において潤滑ポリペプチドを発現することを示す。滑膜線維芽細胞は、関節におけるそのようなトリボネクチンの供給源のひとつである。本明細書においてきさいされた単離された天然に存在するトリボネクチンMr-280kDaおよびSZPMr-345kDaは異なる分子である。なぜなら、65kDaだけ見かけ上の分子量が異なるからである。MSFは、滑膜腔に集中する2つの独立した細胞株によってMSFエキソンの異なる発現によって両方の分子についての前駆体であることが可能である。トリプシン処理された消化物の反復LCMS配列決定は、MSFにおけるエキソン6から9に囲まれたエキソンのいずれも同定しなかった。仔ウシから精製された天然に存在するトリボネクチンは、ヒト供給源から精製されたトリボネクチンと同じ分子量を有することが見出された。境界潤滑剤は、表面の物理化学的特性を変更することによってこれらの効果を奏する。ベアリング表面は、境界モードで潤滑されるために、相互反発を生成しなければならない。通常の室温環境の例は、グラファイト、テフロン登録商標および硫化モリブデンである。トリボネクチンは、ラテックスのような非生物学的疎水性表面をコーティングすることによって両親媒性特性を有するようである。広汎なグリコシル化は、周囲の水性環境でネットワークにとって重要である。最後および最後から二番目の糖が除去されるとき、潤滑能力が消失した。エキソン9によって発現されるタンパク質を介すSZPまたはトリボネクチンに対するヒアルロネートの結合は、滑液における役割をヒアルロネートが果たす機構を支持する。ヒアルロネートポリマーは、多くのSZPまたはトリボネクチンの分子を、タンデムで側方に結合するように機能し得る。従って、せん断ストレスを分配し、そして潤滑分子を安定化させる。MSF前駆体トリボネクチンのような選択スプライシング遺伝子産物の主な構造は、MG2、スタテリンstatherineおよびプロリンリッチ糖タンパク質のものこれは、唾液および潤滑歯科ベアリングにおいて見出されるとは異なる。MG2のみがこのラテックス:ガラスベアリングにおいて試験され、そしてトリボネクチンと同程度に有効に潤滑させることが見出された。糖タンパク質の両方は、同じO結合型1-3Gal-GalNAz部分を共有する。これらのデータは、O結合型1-3Gal-GalNAc部分は境界潤滑活性にとって重要であることを示す。酵素消化実験は、滑液によって提供される境界潤滑は、トリプシンにとって非常に感受性であることを示す。これらの実験は、ホスホリパーゼによる潤滑能力の除去極少量のトリプシン様プロテアーゼが夾雑するがプロテアーゼインヒビターのロイペプチンおよびアプロチニンとともに同時インキュベーションすることによって除去され得る。リジンおよびアルギニンは、徹底的にグリコシル化され、そして従ってタンパク質分解を妨害し得るトリボネクチンの同じ領域であるとはいえトリプシン感受性の観察を支持するエキソン6産物のそれぞれ13.5および1.3を含む。トリプシンまたはエラスターゼを詳述するさらにマイナーな炎症状態は、天然に存在するトリボネクチンの潤滑能力に対して有害効果を有するようである。非潤滑性軟骨ベアリングは、変形性関節症を開始し得る未熟な摩損量を経験し得る。そのような条件は、本明細書に記載される潤滑ポリペプチド、すなわちトリボネクチンを用いて処理される。実施例2:染色体1q25に局在されるヒト滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞によるトリボネクチンおよびSZP:MSF産物の遺伝子発現の相同性トリボネクチンの発現を初代ヒト滑膜線維芽細胞および初代関節軟骨において評価した。RNAを、変性関節疾患のない被検体から得られた組織移植片からインビトロで増殖したヒト滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞から精製した。RT-PCRをMSF遺伝子のエキソン6ならびにエキソン6のN末端およびC末端の両方における個々のエキソンを発現する中心のムチンにわたる多重相補的プライマー対とともに用いた。エキソン2、4および5は、滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞によって変動して発現されるようである。MSF遺伝子の種々のエキソンから発現される、潤滑ポリペプチドであるトリボネクチンは、軟骨細胞および滑膜線維芽細胞の両方をインビトロで発現する。トリボネクチンおよび関連プロテオグリカンである表面帯タンパク質SZPの両方は、類似のではあるが同一ではない一時構造を共有する。トリボネクチンおよびSZPはまた、O結合型オリゴサッカリドと翻訳後改変において異なり:トリボネクチンは、O結合型オリゴサッカリドを含むが、他方、そのような翻訳後改変は、SZPには検出されなかった。オリゴサッカリドは、トリボネクチンにおいて優勢である;制限された量のコンドロイチンおよびケラチン硫酸がSZPにおいて見出された。ほとんどのMSFエキソンがトリボネクチンの発現に関与していることから、ビトロネクチンに対する強力な相同性が持続する。ヒトゲノムBACライブラリーのエキソン6について相補的なcDNAプライマー対を使用したスクリーニングは、2つのクローンを同定した。両方のクローンは、染色体1q25について、インサイチュハイブリダイゼーションによって相補的であった。この位置は、屈指camptodactyl-関節症-心膜炎症候群CAPに、遺伝子マッピングによって相関付けられた。大きな関節の関節症であるCAPは、滑膜によって提供される無効な境界潤滑と関連している。従って、本明細書において記載されるトリボネクチンは、CAPを予防および/または処置するに有用である。以下に記載されるデータは、以下の課題を検討する:112のMSFのエキソンのうちどれが、滑膜線維芽細胞によって発現され、そしておそらく、滑膜の腔へのトリボネクチン分泌を生じるか。2どのようにこれが、軟骨の表面にSZP分泌を生じる関節軟骨細胞によるMSFの発現とは異なるか、3トリボネクチンおよびSZPが同じ一次構造を共有するかどうか、4トリボネクチンは、SZPの特徴であるコンドロイチン硫酸で翻訳後かいへんされるかどうか、ならびに5単離されたエキソン6産物が境界潤滑能力をゆうするかどうか。ヒト滑液を上記のように処理した。収集し、そしてトリボネクチンを上記の方法を用いてヒト組織から精製および単離した。潤滑活性を標準的な摩擦装置を用いて測定した。コンドロイチン-6-硫酸の免疫検出モノクローナル抗体M621CICN,Aurora,OHを用いてコンドロイチン-6-硫酸の存在を検出した。標準的なドットブロット技術およびウェスタンブロット技術を用いた。キモトリプシンでのトリボネクチンの消化ヒト滑液のTLCK処理したキモトリプシン0.1BTEEU/mlを、37°Cで1時間インキュエートした。消化後すぐに潤滑活性を、摩擦装置においてアッセイした。さらなる消化を、市販のTLCK処置がトリプシンを夾雑して不完全に不活化した場合において、同じ方法で、ただし10μgのロイペプチンおよび5μg/mlのアプロチニンの存在下で行なった。ヒト関節軟骨細胞の単離および培養ヒト滑膜線維芽細胞を上記のように単離することに加えて、ヒト軟骨細胞を単離した。ヒトの膝関節の大腿部の関節丘および頚骨平坦部plateauから軟骨を解剖によりドナー関節疾患の既知の履歴のないまたは組織銀行からの健常器官ドナーから入手した。軟骨スライスを、2-3mm3の片に切断し、DMEMWhittakerMABBioproducts,Walkerville,MDで洗浄し、そしてトリプシン10v/vで37°Cで水浴中で15分間処理した。この組織をDMEM、5FBS,ペニシリン-ストレプトマイシン-フンジゾンfungizoneおよび2mg/mlC.perfringensコラゲナーゼIV型Sigmaへと移し、そしてこれを旋回シェーカー上で一晩消化した。この細胞を3回DMEMで洗浄し、そして5FBSを含むDMEM中で培養した。ヒト単球の培養懸濁物中のヒト単球CRL-9855をAmericanTypeCultureCollectionMannassas,VAから購入した。細胞を、遠心分離により濃縮し、そして次いでT75フラスコに再懸濁して、熱非働化していない10仔ウシ血清FlowLaboratories、0.03mMチミジン、0.1mMヒポキサンチンおよび0.05mM2-メルイカプトエタノールを補充したIscove改変Dulbecco培地を用いて0.2×106/mlと1.0×106/mlとの間に濃縮した。単球が増幅するにつれ、その培養物は、上記の濃度範囲を維持するように拡張した。RNA抽出およびRT-PCR分析ヒト滑膜および関節の軟骨細胞および単球からのRNAを、RNeasyミニカラムおよび試薬Qiagen,Valencia,CAによって精製した。夾雑するゲノムDNAを、DNAシュレッダーおよびDNaseRnaseなしQiagenにより除去した。相補的なDNA合成を、逆転写酵素によるヘキサマープライマーの伸長のために25°Cで10分間、および42°Cで12分間のcDNAの合成および95°Cで10分間のRNA-cDNA複合体のAmpliTaq/変性の活性化のためインキュベートすることによって行なった。サーマルサイクリング条件は、43サイクルの94°C、20秒変性のためおよび62°C、60秒および72°Cで7分間の最終の伸長であったPerkinElmerBiosystems,FosterCity,CA。RT-PCR産物を、臭化エチジウムにより染色した、3NuSieveGTGアガロースFMC,Rockland,MEゲル電気泳動により分析した。推定されるRT-PCR産物サイズに対応しないバンドを、切り出し、そしてアガロースから抽出したQiagen。BACクローンライブラリースクリーニングヒトゲノムを含むE.coliBACライブラリーを、MSFエキソン6に対して相補的なcDNAプライマー対を用いてPCRによりスクリーニングしたResearchGeneticsInc.,Huntsville,AL:配列番号2の674-698および953-926の塩基対位置番号に対して相補的な順向き5’-CCAAACCACCAGTTGTAGATGAAGC-3’配列番号15および逆向きプライマー5’-GCGGAAGTAGTCTTCTCTTTTCCATCAG-3’配列番号16。候補となるE.coliクローンを、12.5mg/mlクロラムフェニコールを含むLB寒天中で37°Cで16時間増殖した。ゲノムDNAのない大きな構築物DNAを、アニオン交換およびエキソヌクレアーゼ消化によって精製したQiagenLarge-constructkit,Valencia,CA。BACクローンDNAおよび染色体のインサイチュハイブリダイゼーション中期染色体を、樹立されたプロトコルに従って正常な個体からの短期リンパ球培養物から調製した。陽性のクローンからの2μgのBACDNAを、製造者により供給されたプロトコルに従ってニック翻訳反応においてBioNick標識キットLifeTechnologies,MDを用い、ビオチン14-dATPを用いて標識した。ニック翻訳後、反応産物を、G50カラムにおいて精製した。100ngの標識されたDNAおよび20μgのcot1DNAをエタノールを用いて共沈した。そのDNAを遠心分離により回収し、そして20μlのハイブリダイゼーション溶液Hybrisolvii,Oncor中に溶解した。プローブハイブリダイゼーション、洗浄、顕微鏡およびプローブのマッピングを標準的な手順に従って行なった。キモトリプシンでのトリボネクチンの消化および潤滑活性についてのアッセイトリボネクチンを、プールされたヒト滑液から、Δμ<-0.06であると規定される正常な潤滑活性を有する精製し、そして280kDaの見かけ上の分子量を有した。抗フィブロネクチン工程を用いて精製を終結させることを行なって、夾雑バンドを除去した。この工程はまた、<6°へと純度角度を減少させた。250μg/mlの濃度でのトリボネクチンはラテックス:ガラスベアリングを変性関節疾患なしに被検体からの死後滑液と同様に有効に潤滑にさせた表7。平均±SD†PS中で250μg/mlの濃度で試験した‡生理食塩水死後ヒト滑液§ロイペプチンおよびアプロチニンの存在下でTLCK処置されたキモトリプシンで消化したHSFTLCK処理されたキモトリプシンでの酵素消化を行なって、その単離されたエキソン5タンパク質産物が潤滑活性を有するかどうかを判定した。なぜなら、このドメインは、芳香族アミノ酸を有していないからである。得られた消化物は、μを、生理食塩水コントロールの値μ=0.107から0.130へと上昇させた。ロイペプチン/アプロチニンの存在下での類似の消化は、潤滑活性を実証しないままであったΔμ=0.02。コンドロイチン-6-硫酸の免疫検出モノクローナル抗体M621Cを用いてニトロセルロースに移されたトリボネクチンを検査した。もとのSDS-PAGEにおける280kDaバンドに対応する反応は観察されなかった。これは、トリボネクチンがコンドロイチン-6-硫酸を含まないことを示す。滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞のRNAのRT-PCR分析軟骨細胞および滑膜線維芽細胞のmRNAのRT-PCRを表8において例示されるプライマーを用いて行なった。推定されるよりも少ない他のものに加えて推定されるサイズのRT-PCR産物が、両方の細胞株について観察された。エキソン6のC末端からエキソン12のN末端までにわたるプライマー対が769bpであることが観察された。これは、両方の細胞株について推定される長さである。同様に、エキソン6からエキソン11までの同じ位置にわたるプライマー対は、654bpの推定されるRT-PCR産物を生産した。エキソン5および6のプライマー対は、両方の細胞株について278bpのRT-PCR推定産物を生成した。塩基対位置番号は、GENBANKTMにおいて登録番号U70136に対応する塩基対位置番号は、GENBANKTMにおいて登録番号U70136に対応する。エキソン1からエキソン6までにわたるプライマー対は、756bpの推定産物サイズを単一に生成しなかった。3つのより小さなサイズの350、450および490bpのバンドの代わりに、両方の細胞株について観察された。エキソン2からエキソン6N末端にわたるプライマー対は、両方の細胞株についてほぼ420bpのサイズの産物を生成し、そしてこれはその推定サイズより短い272bp692bp-420bpであった。推定されたRT-PCR692bp産物は、軟骨細胞についてわずかに観察され、滑膜線維芽細胞についてはそれほどではなかった。エキソン2から6のプライマー対420bp産物を切り出し、そして配列決定し、これは、エキソン5およびエキソン4のほとんど最初の2つのN末端アミノ酸である配列番号1のAla105およびLeu106を除くがないことを明らかにした。エキソン1~6のプライマー対からの490および450のRT-PCR産物の配列決定によって、同じ欠失が同定された。エキソン1から6プライマー対からのより小さな350bpの産物の配列決定によって、N末端Q25をのぞいてエキソン2に加えてこれらと同じ欠失を明らかにした。エキソン4および6のプライマー対は、両方の細胞株について449bpの推定されたRT-PCR産物およびより小さな340bpの産物を生成した。この340bp産物の配列決定は、N末端のE156を除きエキソン5の欠失が明らかにした。選択スプライシングは、滑膜線維芽細胞および軟骨細胞の両方からの4つの異なる表現型のMSFアイソフォームを生成することを担うことが見出された図2Aおよび2B。表現型V0はすべての12のエキソンからなり、V1はエキソン5を欠失し、V2は、エキソン5およびエキソン4のほとんどを欠失し、そしてV3は、エキソン5およびエキソン4および2のほとんどを欠失する。さらに別のアイソフォームは、MSFエキソン1および6-12エキソン5を欠失するによってコードされるアミノ酸からなるポリペプチドである。これは、おそらく、最も小さな天然に存在するトリボネクチンである。各アイソフォームは、潤滑性ドメインエキソン6を含む。エキソン1によってコードされるドメインは、トリボネクチンの疎水性表面様軟骨に結合することを媒介することにおいて役割を果たす。単球RNAのRT-PCR分析MSFエキソン6に相補的なプライマー対表9を使用して、生成された単球RNAを用いたRT-PCRは、任意の産物を生成しなかった、エキソン1~3にわたるプリマー対が、250bpその予測される大きさのPCR産物を産生した。エキソン1~4にわたる別のプライマー対は、312bpの予測された大きさより小さいおよそ130bpであるPCR産物を産生した。エキソン2~5にわたるさらに別のプライマー対は、任意のPCR産物を生成せず、エキソン5は発現されないことを示した。これらのデータは、単球がエキソン1~3、1~4を不定に発現し、そしてエキソン6を発現しないことを示したようである。エキソン1における正方向プライマー配列は、単球、滑膜synovial線維芽細胞および軟骨細胞を含む上記のRT-PCR実験の全てに共通した。BACクローンDNAおよび染色体のインサイチュハイブリダイゼーション上記のMSFエキソン6cDNAプライマー対を用いたヒトゲノムBACクローンライブラリーのスクリーニングが、2つの候補クローンを生じた。BACクローン330および285が、q25領域DAPIバンドの染色体1にハイブリダイズした。染色体1に対する局在を確認するために、中期染色体を、染色体1特異的動原体プローブVYSISと共に、BACプローブにハイブリダイズした。動原体ならびにBACプローブの両方が、染色体1にハイブリダイズした。同じスライドの引き続くGバンドが、q25の局在を確認した。インビトロで増殖した滑膜線維芽細胞は、MSFエキソン2,4または5、あるいはそれらの組み合わせのいずれかを代替でスプライスしたspliceout。エキソン4の場合、発現は、そのエキソンの最初の2つのコドンAla105およびLeu106後で停止した。残基E156を除く、エキソン5のない同位体およびQ25を除くエキソン2のない同位体もまた存在する。3つのRT-PCR産物が、表現型V1~3に対応するようなエキソン1~6プライマー対と共に存在した。しかし、エキソン2~6プライマー対に対する期待されたRT-PCR692bp産物を観察し、これらのエキソンの各々を含む同位体V0もまた存在することを示した。トリボネクチンの4または5の異なる表現型同位体は、滑膜線維芽細胞により発現されるようである。軟骨細胞は、この表現型の発現を共有する。両方の細胞株に対する代替のスプライス部位の概要を、図3において例示する。軟骨細胞について、692bpエキソン2~6プライマー産物および449bpエキソン4~6プライマー産物の比較的大きい強度は、これらの細胞がより高い分子量同位体を潜在的に選択し得ることを示唆する。MSFにおけるエキソン6は、アナログヘパリン硫酸結合領域MSFエキソン4とヘモペキシン様リピートMSFエキソン8、9との間に位置する。これらのドメインの分離は、ドメインの近接に起因してこれらのドメインがグリコサミノグリカン結合と競合することが考えられるビトロネクチンとは異なるグリコサミノグリカンとのより大きい相互作用を与える。おそらく、潤滑ドメインのいずれかの末端または両方の末端におけるグリコサミノグリカンに結合する能力は薄層スプレンディンlaminasplendinに覆われた軟骨において潤滑活性を安定にするのに機能する。あるいは、相互作用は、トリボネクチンとコラーゲンII型との間に存在し、この相互作用は、軟骨に直接トリボネクチンを結合するのに機能する。トリボネクチンのような境界潤滑剤は、支持表面に結合し、そして境界モードmodeで潤滑させるために、相互反発を生成する。この二機能性の寄与は、ラテックスのような非生物学的疎水性表面により、両親媒性の挙動により現れる。広範なグリコシル化は、周囲の水性環境とネットワークを作る。最後のultimate糖および最後から二番目のpenultimate糖を除く場合、潤滑能力は、排除される。MSFエキソン6の発現を、潤滑活性のために必要とし;最適な潤滑活性は、少なくとも1つのさらなるMSFエキソン例えば、エキソン1により発現されるドメインの発現をおそらく必要とする。行われたキモトリプシン消化実験は、エキソン6産物を削除し、そして他の放出されたエキソン産物が、潤滑能力を妨げないと仮定して、潤滑のためのこの消化digestateを試験するために意図された。この消化digestateは、ロイペプチンおよびアプロチニンの存在下での複製にも関わらず、we;;を潤滑にせず、他のエキソン産物が必要とされ得ることを示唆した。例えば、エキソン3が必要とされ得、エキソン3は、ムチンポリマーの凝集に重要である、多数のシステイン残基を有する。表面をコートするトリボネクチンの量は、凝集するのに、疎水性および個々のトリボネクチンポリマーの能力におそらく依存する。免疫組織化学的研究は、コンドロイチン-6-硫酸を検出できず、存在しないか、またはコンドロイチン硫酸を結合するD220EASG224に隣接するO結合型グリコシル化により立体的に妨げられることを示唆した。SZPにおけるコンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸の存在を、35S標識ならびにケラタナーゼおよびコンドロイチンリアーゼABCを用いた消化後の放出により確認した。しかし、SZP分子量における顕著な変化を、この消化後には観察せず、少量の置換のみをおそらく観察することを示唆した。グリコサミノグリカンのいずれかを、トリボネクチンに結合体化することが可能である。トリボネクチンおよびSZPは、MSFエキソン1、3および6~12、ならびに代替のスプライスされたエキソン2~5を共有する類似の分子である。類似の初期構造に関わらず、2つのタンパク質との間の翻訳後改変における相違を検出した。O結合型潤滑部分β1-3Gal-GalNAcの存在を、本明細書中で記載されるトリボネクチンについてと同様に、SZPに対して検出しなかった。トリボネクチンとSZPとの間の分子量における相違を、SZPに対して開発された抗体表在性帯域のsuperficialzone軟骨細胞から生成したを用いたウェスタンブロッティングにより支持した。屈指-関節症-心膜炎症候群CAPインサイチュハイブリダイゼーション実験で、両方のBACクローンプローブが、同じ位置に独立して局在することから、トリボネクチンをコードするDNA配列が、染色体1q25に存在することを示した。OnlineMendelianInheritanceinManOMIMのブールサーチで、同じ座に遺伝的にマップされた1つの関節炎疾患を明らかにした。屈指-関節症-心膜炎症候群CAPは、一つ以上の指間関節inter-phalangealjoint屈指の若年性発症大関節非炎症性関節症juvenileonsetlargejointnon-inflammatoryarthropathyおよび先天的非外傷性屈曲拘縮により特徴付けられる。この常染色体上に受け継がれた疾患を有する患者由来の滑膜および腱滑膜組織の組織病理学的様子は、B型滑膜細胞過形成B-typesynoviocytehyperplasiaおよび終期end-stage線維症の組織病理学的様子である。CAP症候群は、早発性関節摩耗prematurejointwearを生じる、効果のない潤滑の直接の結果である。CAPを患う数人の患者はまた、心膜炎を発症する。単離された天然に存在するまたは合成性トリボネクチンは、CAPを処置するため、および心膜組織を潤滑させるために有用である。CAPを、MSF遺伝子における変異体を検出することにより診断する。他の実施形態は、上記の請求の範囲内にある。"