CHO細胞におけるポリペプチドの組換え産生のための細胞培養培地であって、60~2500mg/Lの塩化コリンまたは等量の別のコリン塩を含み、20~57mmol/Lのアミノ酸の全濃度を有する、細胞培養培地。80~1000mg/Lの塩化コリンまたは等量の別のコリン塩を含む、請求項1に記載の細胞培養培地。35~54mmol/Lのアミノ酸の全濃度を有する、請求項1または2に記載の細胞培養培地。500~1400mg/Lの濃度でグルタミンを含有する、請求項1から3のいずれかに記載の細胞培養培地。細胞培養培地中のグルタミンの含有量が900~1200mg/Lの量である、請求項4に記載の細胞培養培地。mmol/Lで表す以下の濃度で以下のアミノ酸:アルギニン4.0~6.0アスパラギン3.0~6.0アスパラギン酸2.5~4.0グリシン0.3~0.8ヒスチジン0.6~1.0イソロイシン2.0~5.0ロイシン3.0~7.0リシン2.0~4.0メチオニン1.0~1.5フェニルアラニン1.0~2.0プロリン2.5~6.0セリン3.0~8.0スレオニン2.0~3.5トリプトファン0.4~1.0バリン2.5~5.0チロシン1.0~2.0シスチン0.5~1.0を含む、請求項4または5のいずれかに記載の細胞培養培地。無血清および無タンパク質培地である、請求項1から6のいずれかに記載の細胞培養培地。生産期を含む、組換えポリペプチドを産生するための方法であって、請求項1から7のいずれかに記載の細胞培養培地中で組換えCHO細胞を培養し、組換えポリペプチドを発現させる方法。組換えポリペプチドが組換え抗体である、請求項8に記載の方法。フェドバッチプロセスで細胞を培養する、請求項8または9のいずれかに記載の方法。前述の技術的課題に対処するため、本発明は、特にバイオテクノロジーによる生産プロセスの後期段階で細胞特異的生産性および細胞生存率の予期せぬ改善をもたらす、塩化コリンの含有量が高い細胞培養培地を提供する。さらに、この細胞培養培地の使用により、組換え産物の質も驚くほど改善することができる。本発明による細胞培養培地は、生産期中に使用するのに特に適している。したがって本発明は、CHO細胞からの組換えポリペプチドの産生を可能にする。細胞培養培地は特に生産培地として使用して、生産期中に高い細胞増殖、高い生存細胞密度および高いポリペプチド力価を得ることができる。本発明による細胞培養培地を使用することにより、凝集の低下および/または組換え産物の改善グリコシル化パターンなどのより良い翻訳後修飾の点で、品質を改善することができることも見出される。本発明中では、塩化コリンを使用することが好ましい。しかしながら、異なる対イオンの使用に基づくと、他のコリン源、例えば水酸化コリン、酒石酸コリン/重酒石酸コリン、コリン硫酸、コリンリン酸、または任意の他のコリン化合物も、本発明による細胞培養培地中で使用するのに適している。このような他のコリン化合物を使用する場合、それらの量は、前に与えた濃度範囲および値で塩化コリンを使用して得るのと、同じモルコリン濃度を得るように選択することが好ましい。すなわち、他のコリン塩は、前述の塩化コリンの濃度と等しい濃度で存在するのが好ましい。これは、以下に言及する具体的な態様および実施形態にも当てはまる。本発明の第一の態様によれば、60mg/L~2500mg/Lの範囲内の塩化コリン含有量である細胞培養培地を提供する。細胞培養培地中の塩化コリン含有量は、80mg/L以上、あるいは160mg/L以上、200mg/L以上または220mg/L以上であってよい。細胞培養培地中の塩化コリンの含有量は、2500mg/L、あるいは1000mg/L、840mg/L、500mg/Lまたは300mg/Lに限られる。塩化コリンは約240mg/Lの濃度で存在してよい。本発明の第一の態様による細胞培養培地は、20~57mmol/Lのアミノ酸の全濃度により表される、ごく限られた含有量のアミノ酸をさらに含む。あるいは、全アミノ酸濃度は25mmol/L超、30mmol/L超、35mmol/L超またはさらに40mmol/L超である。さらに、全アミノ酸濃度は54mmol/L未満であってよい。全アミノ酸濃度は、例えば約51mmol/Lであってよい。さらに細胞培養培地は、低含有量のグルタミンを場合によっては含む。特に、グルタミンは500~1400mg/L、あるいは800~1400mg/L、またはさらに900~1200mg/Lの濃度で存在する。本発明の第一の態様による細胞培養培地中のアミノ酸の含有物は、mmol/lで表す以下の濃度で以下のアミノ酸:アルギニン4.0~6.0、好ましくは4.5~5.5アスパラギン3.0~6.0、好ましくは4.0~5.5アスパラギン酸2.5~4.0、好ましくは3.0~3.6グリシン0.3~0.8、好ましくは0.5~0.7ヒスチジン0.6~1.0、好ましくは0.7~0.9イソロイシン2.0~5.0、好ましくは3.0~4.0ロイシン3.0~7.0、好ましくは3.5~6.0リシン2.0~4.0、好ましくは2.5~3.5メチオニン1.0~1.5、好ましくは1.2~1.4フェニルアラニン1.0~2.0、好ましくは1.3~1.8プロリン2.5~6.0、好ましくは3.0~5.5セリン3.0~8.0、好ましくは4.0~7.0スレオニン2.0~3.5、好ましくは2.5~3.1トリプトファン0.4~1.0、好ましくは0.5~0.8バリン2.5~5.0、好ましくは3.0~4.5チロシン1.0~2.0、好ましくは1.2~1.8シスチン0.5~1.0、好ましくは0.6~0.8を場合によっては含むことができる。細胞培養培地は、無血清および無タンパク質であることが好ましい。さらにそれらは、タンパク質加水分解物を含まないことが好ましい。本発明の第二の態様によれば、生産期を含む組換えポリペプチドを産生するための方法であって、本発明の第一の態様による細胞培養培地中で組換えCHO細胞を培養する方法を提供する。調製される組換えポリペプチドは特に組換え抗体である。本発明の方法中、細胞はフェドバッチプロセスで培養することが好ましい。図1~図8中、3種の培地は、低コリン増殖培地菱形;対照1、生産培地三角形;対照2および高コリン増殖培地、すなわち追加量の200mg/lの塩化コリンを補充した低コリン増殖培地四角形である。細胞の培養、およびこれらの細胞培養物からのその後のポリペプチド産生に使用される従来の細胞培養培地は、少量の塩化コリンのみを含有する。従来技術中に記載された非常に少数の細胞培養培地のみが、適量またはさらに多量の塩化コリンを含有する。しかしながら、これらの培地は、特に生産期中に使用したときの、多量の塩化コリンが細胞特異的生産性、細胞増殖および品質に対して有する役割の点で、系統的に調べられていない。本発明によれば、少量の塩化コリンを含む培地と比較して、多量の塩化コリンを含む生産培地として細胞培養培地を使用してCHO細胞を培養したとき、細胞特異的生産性またはポリペプチド発現の予期せぬ改善が観察される。多量の塩化コリンを補充したときの増殖培地も、生産期中のCHO細胞の培養に有効な生産培地として驚くことに使用することができ、それによって多量のポリペプチド、好ましくは細胞培養中の組換えポリペプチド発現によって得られるポリペプチドを得ることができることが、本明細書で実証される。塩化コリンは本発明に従い使用することが好ましいが、異なる対イオンの使用に基づくと、他のコリン源、例えば水酸化コリン、酒石酸コリン/重酒石酸コリン、コリン硫酸、コリンリン酸、または他の各コリン化合物も、本発明による細胞培養培地中で使用するのに同様に適している。本発明によるポリペプチドの産生用の細胞培養培地の使用は、ポリペプチドの組換え発現用のCHO細胞の培養を一般に含む。細胞培養培地は、ポリペプチドの大規模生産に使用することが好ましい。ポリペプチドの大規模生産は、治療活性がある生物製剤の調製に使用される組換えポリペプチドの、工業生産に典型的に必要とされる量と関係がある。少なくとも500Lの体積、少なくとも1000L、少なくとも5000Lまたはさらに高体積の細胞培養は、典型的には大規模生産用途となる。ポリペプチド産生に使用する本発明による細胞培養培地中の塩化コリンの量は、大規模なポリペプチド産生に使用された使用済み細胞培養培地から知られる塩化コリン含有量より有意に多い。したがって、本発明は、60mg/L以上、80mg/L以上、160mg/L以上、200mg/L以上またはさらに220mg/L以上などの高含有量の塩化コリンを含むCHO細胞を使用する、組換えポリペプチドの産生に適している。細胞培養培地中の塩化コリンの含有量は、2500mg/L、1000mg/L、840mg/L、500mg/Lまたはさらに300mg/Lに限られる。塩化コリンは約240mg/Lの濃度で存在してよい。塩化コリン濃度が高くなるほど、培地に関するコストは高くなる。したがって、高すぎる塩化コリン濃度はコストの観点から不利である。さらに、塩化コリン含有量は培地のモル浸透圧濃度に貢献する。高すぎる塩化コリン濃度は、それらが他の培地成分と共に、望むより高い全体モル浸透圧濃度をもたらし得るので、不利である可能性がある。特にフェドバッチプロセスでは、高すぎる開始モル浸透圧濃度を使用することは望ましくない。これが、供給戦略に制約を課す可能性があるからである。前述の理由で、本発明者らは、最適塩化コリン濃度は本明細書で述べる範囲内にあると考える。塩化コリン以外のコリン化合物を使用する場合、それらは等しい濃度で利用する。等しい濃度は、前述の範囲内の濃度で塩化コリンを使用するときに得るのと同じ範囲内にある、コリンのモル濃度を得ることを意味する。本発明の第一の態様によれば、細胞培養培地は、アミノ酸の全濃度により表されるごく限られた含有量のアミノ酸を含む。より詳細には、本発明の第一の態様による細胞培養培地は、20~57mmol/Lのアミノ酸の全濃度によって特徴付けられる。全アミノ酸濃度は25mmol/L超、30mmol/L超、35mmol/L超またはさらに40mmol/L超であってよい。さらに、全アミノ酸濃度は54mmol/L未満であってよい。全アミノ酸濃度は、例えば約51mmol/Lであってよい。同時に、塩化コリン濃度は前述の通り、すなわち60mg/L~2500mg/Lの範囲内であり、好ましい範囲および値も前述の通りである。本発明の第一の態様による細胞培養培地は、特に生産培地として使用して、生産期中に高い細胞増殖、高い生存細胞密度および高いポリペプチド力価を得ることができる。さらに、特に凝集の低下および/または改善グリコシル化パターンなどのより良い翻訳後修飾の点で、高い品質の組換え産物が得られる。細胞培養物の増殖および結果としてのポリペプチド生産性に対するアミノ酸グルタミンの役割は、近年広範囲の研究の主題となっている。グルタミンはポリペプチド合成に重要な基本構造要素であるだけでなく、哺乳動物細胞の主要エネルギー源にもなることが見出されている。したがって、高濃度のグルタミンが、ポリペプチド産生に使用される細胞培養培地中に通常含まれている。細胞培養培地中の多量のグルタミンは、特に産業規模で、細胞増殖およびポリペプチド発現に重要である。それにもかかわらず、グルタミン代謝はグルタミンの分解およびアンモニウムイオンの蓄積をもたらし、これは細胞増殖およびポリペプチド産生に対して毒性がある副産物として知られる。したがって、細胞培養中はグルタミンの量を制限することが望ましい。いくつかのグルタミン代替物質、例えばグルタミン酸が従来技術中で示唆されている。しかしながら、フェドバッチプロセスにおけるグルタミン酸とグルタミンの置換は少ない副産物形成だけでなく、低い生産性にもつながることが記載されているDoverskogetalJBiotechnol199759103115。したがって、高い細胞増殖およびポリペプチド生産性を依然可能にしながら、少量のグルタミンを含有する細胞培養培地が望ましい。多量の塩化コリンの添加によって、細胞の生産性に大きく影響を与えない状態で、特に生産期中、いくつかの知られている培地と比較して少量のグルタミンを含む培地の使用が可能になることが分かっている。したがって、本発明の第一の態様によれば、従来技術からの培地と比較して有意に少ない、任意選択量のグルタミンをさらに含む細胞培養培地を提供する。細胞培養培地は、グルタミン酸などのようなグルタミン代替物質は含まなくてもよい。細胞培養培地は、500~1400mg/L、800~1400mg/L、または900~1200mg/Lの濃度でグルタミンを場合によっては含む。同時に、塩化コリン濃度は前述の通り、すなわち60mg/L~2500mg/Lの範囲内であり、好ましい範囲および値も前述の通りである。さらに、細胞培養培地中のアミノ酸の全濃度は同時に20~57mmol/Lであり、好ましい範囲および値も前述の通りである。本発明の第一の態様の、別の任意選択の修飾によれば、個々のアミノ酸のそれぞれの量は以下に定義する通りである。アミノ酸のこのような適量は、DMEMまたはRPMIのような従来型細胞培養培地中に含有されるアミノ酸の量より一層高いが、同時に、大規模生産に使用される典型的な生産培地中に含有されるアミノ酸の量より有意に低い。生産培地中の多量のアミノ酸は、特に大規模またはさらに産業規模でポリペプチド生産を実施するとき、高い生産性および高い品質に重要であると考えられる。特に生産期中に使用される細胞培養培地において、多量の塩化コリンの存在によって、個々のアミノ酸の量が制限されることが現在分かっている。本発明の第一の態様の、この任意選択の修飾による細胞培養培地中の個々のアミノ酸の含有物は、mmol/lで表す以下の量で以下のアミノ酸:アルギニン4.0~6.0、好ましくは4.5~5.5アスパラギン3.0~6.0、好ましくは4.0~5.5アスパラギン酸2.5~4.0、好ましくは3.0~3.6グリシン0.3~0.8、好ましくは0.5~0.7ヒスチジン0.6~1.0、好ましくは0.7~0.9イソロイシン2.0~5.0、好ましくは3.0~4.0ロイシン3.0~7.0、好ましくは3.5~6.0リシン2.0~4.0、好ましくは2.5~3.5メチオニン1.0~1.5、好ましくは1.2~1.4フェニルアラニン1.0~2.0、好ましくは1.3~1.8プロリン2.5~6.0、好ましくは3.0~5.5セリン3.0~8.0、好ましくは4.0~7.0スレオニン2.0~3.5、好ましくは2.5~3.1トリプトファン0.4~1.0、好ましくは0.5~0.8バリン2.5~5.0、好ましくは3.0~4.5グルタミン6.0~10.0、好ましくは7.5~9.0チロシン1.0~2.0、好ましくは1.2~1.8シスチン0.5~1.0、好ましくは0.6~0.8を含む。同時に、塩化コリン濃度は前述の通り、すなわち60mg/L~2500mg/Lの範囲内であり、好ましい範囲および値も前述の通りである。さらに、細胞培養培地中のアミノ酸の全濃度は同時に20~57mmol/Lであり、好ましい範囲および値も前述の通りである。塩化コリンの高含有量のため、アミノ酸のそれぞれの量は、ポリペプチドの大規模生産用に使用する、他の細胞培養培地において使用する量より有意に低くてよい。言い換えると、多量の塩化コリンの添加によって、細胞増殖、細胞生存率およびポリペプチド力価の低下なしに、大部分のアミノ酸の量を有意に減らすことができる。これには、低濃度の大部分のアミノ酸を含む細胞培養培地を使用することができ、それによって可溶性が低い細胞培養培地の成分が沈殿する問題を回避できる技術的利点がある。さらに、細胞培養培地に関する有意なコストの低下が達成されるが、ポリペプチド産物の全体的性質および収率は影響を受けず、またはさらに改善される可能性がある。以下に記載するように、組換えポリペプチド産物の凝集は、本発明による細胞培養培地の使用によって減らすことが可能である。さらに、グリコシル化パターンの改善または組換えポリペプチドの凝集低下などの他のタンパク質品質特性のような、より良い翻訳後修飾も得られている。いくつかの場合、本発明によって開示する細胞培養培地の修飾は、細胞生存率および細胞増殖、ならびに結果としてポリペプチド力価の改善も手助けする。用語細胞培養培地は、長時間にわたり細胞を増殖するのに使用することができる栄養素の水溶液を指す。典型的には、細胞培養培地は以下の成分を含む。通常、炭水化物化合物、好ましくはグルコース、アミノ酸、好ましくは全必須アミノ酸および非必須アミノ酸を含めたアミノ酸の基底集合、ビタミン、および/または低濃度で必要とされる他の有機化合物、遊離脂肪酸、および微量元素、無機塩を含めた無機化合物、緩衝化合物およびヌクレオシドおよび塩基であるエネルギー源。用語増殖培地は、生産プロセス全体の増殖期中に通常使用される細胞培養培地を指す。増殖期は、高い細胞増殖および低いポリペプチド生産によって主に特徴付けられる、培養/生産プロセス全体の第一期である。増殖期は細胞を増殖する目的を果たし、指数関数的増殖期中に生産用バイオリアクターに接種するのに適した数の細胞を生成することを意味する。用語生産培地は、生産プロセス全体の生産期中に通常使用される細胞培養培地を指す。生産期は、多量の産物を生産する目的を果たす、培養/生産プロセス全体の第二期である。生産期中、細胞は、可能な限り生存および生産形態で維持されなければならない。例えば治療活性がある組換えポリペプチドを産生するための、製薬産業の分野における細胞培養培地の使用は、安全性および汚染の問題のため、生物起源の任意の物質の使用を一般に可能にしない。したがって、本発明による細胞培養培地は、無血清および/または無タンパク質培地であることが好ましい。用語無血清および/または無タンパク質培地は、組織加水分解物、ウシ胎児血清などのような動物源由来の添加剤を含有しない化学的に完全に定義された培地を表す。さらに、タンパク質、特にインスリン、トランスフェリンなどのような成長因子も、本発明による細胞培養に加えないことが好ましい。さらに、本発明による細胞培養培地は、大豆、小麦または米ペプトンまたは酵母加水分解物などのような、加水分解タンパク質源を補充しないことも好ましい。本発明による細胞培養培地は、様々な細胞培養プロセス中で使用することができる。細胞の培養は、接着培養、例えば単層培養、または好ましくは浮遊培養で実施することができる。例えばバイオテクノロジー産業において確立した様々な発酵プロセスによって、細胞の大規模培養を使用することができる。本発明による細胞培養培地を使用して、灌流およびケモスタットのような不連続および連続細胞培養プロセスを利用することができる。反復フェドバッチおよび反復バッチを含めた不連続プロセスは、好ましい一実施形態である。バッチ細胞培養は、フェドバッチ培養または単純バッチ培養を含む。用語フェドバッチ細胞培養は、細胞および細胞培養培地を最初に培養容器に供給し、他の培養栄養素を、培養の停止前に定期的な細胞および/または産物採取有りまたは無しで培養プロセス中に、培養物に連続的または不連続な増加で供給する、細胞培養を指す。用語単純バッチ培養は、細胞および細胞培養培地を含めた細胞培養に関する全ての成分を、培養プロセスの開始時に培養容器に供給する手順に関する。本発明による細胞培養培地中で培養する細胞は、CHO細胞である。本発明による細胞培養および細胞培養培地から産生することができるポリペプチドは制限されない。ポリペプチドは組換え型または非組換え型であってよい。本明細書で使用する用語ポリペプチドは、ペプチド結合により接合した3つ以上のアミノ酸の鎖で構成される分子、2本以上のこのような鎖を含有する分子、例えばグリコシル化によってさらに修飾された1本または複数本のこのような鎖を含む分子を包含する。用語ポリペプチドはタンパク質を包含するものとする。本発明による細胞培養および細胞培養培地によって産生される好ましいクラスのポリペプチドは、組換え抗体である。用語抗体は広義に使用し、完全長モノクローナル抗体を含めたモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体例えば、二重特異性抗体、ナノボディ、修飾抗体、抗体のサブユニット、抗体誘導体、人工抗体、抗体とタンパク質の組合せ、および望ましい生物活性を示すほど十分長い抗体断片を具体的には含む。本明細書で使用するモノクローナル抗体はヒト抗体であってよい。しかしながら、抗体以外のポリペプチド、例えば、膜貫通タンパク質、受容体、ホルモン、増殖因子、プロテアーゼ、凝固および抗凝固タンパク質、阻害剤タンパク質、インターロイキン、輸送因子、融合タンパク質などのようなポリペプチドを、本発明による細胞培養および細胞培養培地を使用して産生することもできる。細胞培養培地はウイルスの生成に使用することもできる。このような細胞培養プロセスから得られる産物は、医薬調製物の調製に使用することができる。用語医薬調製物は、哺乳動物、特にヒトへの投与に適した、またはそれに適合する組成物を指す。さらに、本発明による1つまたは複数のタンパク質は、薬学的に許容される界面活性剤、レシピエント、担体、希釈剤および賦形剤などの、生物学的活性剤の他の成分と一緒に投与することができる。本発明による細胞培養培地中の多量の塩化コリンの存在によって、高密度での細胞増殖をサポートする培地の能力に悪影響を与えずに、細胞培養培地中のアミノ酸含有量を低下させることが可能であり、同時に高いポリペプチド力価を可能にする。この影響は、生産プロセス全体の生産期に特に重要である。多くの実験は、ごく少量の塩化コリンと組合せて高濃度の選択アミノ酸を含む従来の生産培地と比較したとき、本発明による細胞培養培地によって、さらに良い性能パラメーターが得られることをさらに明らかにしている。特定の理論に拘束されることなく、リン脂質前駆体コリンの濃度は、他のリン脂質以外の細胞膜の完全性および機能を保つのに必要な、必須細胞膜成分ホスファチジルコリンの量と関係があると考えられる。低コリン含有量の培地中で増殖する細胞は、コリンが非必須培地成分であり細胞がそれを独立して合成することができるに違いないとしても、培養プロセス中この基質中で、したがってホスファチジルコリン中で限られると考えることができる。しかしながら、不活性または限定的経路は、限られた量のコリンが十分な量のホスファチジルコリンを生成するのに利用可能である理由であり得る。これが、膜、特に小胞体およびゴルジ複合体の膜の異常な組成をもたらす可能性がある。これは、これらの膜の機能に悪影響を与え、細胞内のポリペプチド発現率またはポリペプチド輸送を低減する可能性がある。ホスファチジルコリン欠損CHO細胞におけるゴルジ複合体から原形質膜へのポリペプチド輸送の阻害は、Testerinketalによって示された。この欠陥は外因性ホスファチジルコリンの添加によって救済することが可能である。いくつかの重要な利点は、本発明による細胞培養培地の特異的組成に起因する。第一に、本発明による細胞培養培地中のアミノ酸の全含有量を減らすことによって、細胞増殖、生存細胞密度およびポリペプチド生産性の点で、類似またはさらに改善された技術性能パラメーターで細胞培養プロセスを実施することができ、一方で同時に、細胞培養中のアミノ酸またはいくつかの選択アミノ酸の全含有量を減らすことによって、細胞培養培地に関する限り、コスト低減により生産プロセスのより良い全体的経済収支をもたらす。第二に、本発明による細胞培養培地は、細胞培養培地中に含有される成分、特に比較的高濃度で培地中に含有される疎水性アミノ酸の沈殿のリスクを回避する。これは培地の保存中に特に有利である。これらの成分に関して、低濃度は、細胞増殖およびポリペプチド生産中の、必須基質の供給の悪化の回避に役立つ。これは生産プロセス全体の生産期中に特に有益である。第三に、本発明による細胞培養培地は、高品質を有する組換えポリペプチドの生成を可能にする。形成されるポリペプチドの凝集は低下し、細胞は、より良い翻訳後修飾でグリコシル化パターンも改善されたポリペプチドを生成することができる。組換え発現中に形成されるポリペプチドの凝集は、低い産物収率をもたらす技術上の問題点である。さらに凝集は、機能活性があるポリペプチド産物を精製するのを一層困難にする。したがって、実際の生産プロセス中に可能な限り、形成されるポリペプチド産物の凝集を減らすことが望ましい。本発明による細胞培養培地は、典型的な生産培地と比較すると、組換えポリペプチド産物の凝集の低下をもたらすことが分かっている。多くのポリペプチドは、翻訳後修飾、特にポリペプチドグリコシル化に曝される。結果として生じるポリペプチドは、共有結合したオリゴ糖鎖を含む。グリコシル化は、ポリペプチド機能の重要なメディエーターとして知られている。したがって、内因性グリコシル化構造を正確に模倣する組換えポリペプチド生産に使用する宿主細胞系の能力は、品質の重要な態様である。組換えポリペプチドの治療有効性は、免疫原性が原因の不適切なポリペプチドグリコシル化、および不適切にグリコシル化したポリペプチドの投与後に低減するinvivo半減期によって強く影響を受ける可能性がある。一般にマンノシル化は、特に組換え抗体の分野で、組換えポリペプチド生産における重要な態様と考えられる。ポリペプチドの高マンノシル化を回避することは、組換えポリペプチド生産における一般的な目的である。したがって、組換えポリペプチドの生産中に可能な限り高マンノシル化を低減することは、重要な目的である。本発明による細胞培養培地は、非常に低度の高マンノシル化がある組換えポリペプチドの生産を可能にする。この技術効果は、典型的な生産培地に関して特に有意である。例えば、本発明による細胞培養培地を使用した発現から得た組換えポリペプチドの全体量の、高マンノシル化がある高マンノシル化組換えポリペプチドの相対量は、生産培地と比較して約50低いことが望ましい。さらに、本発明による細胞培養培地の使用によって得た組換えポリペプチドには、従来の増殖培地または生産培地の使用によって得た対応するポリペプチドと比較して、高い割合のβ-ガラクトシル化があることが、驚くことに分かっている。高いコリン濃度を有する培地のさらなる利点は、それが生産期および増殖期用に一培地のみを有することを可能にし、時間および資源を節約することである。以下の実験は、本出願において定義する本発明をさらに例示するものとする。細胞培養培地の記載3種の以下の培地を試験する:低コリン増殖培地、すなわち40mg/Lの塩化コリン含有量を有する培地対照1;生産培地対照2;高コリン増殖培地、すなわち、追加量の200mg/Lの塩化コリンを補充して240mg/Lの塩化コリン全含有量にした、低コリン増殖培地。最初の2種の培地低コリン増殖培地および生産培地は比較目的のみで使用し、一方で塩化コリンの含有量が高い第三の培地は本発明による培地を表す。低コリン増殖培地は、細胞培養物の成長および増殖用に設計した典型的な培地である。この培地は高密度の細胞に到達するまで細胞の培養を可能にし、これは大規模ポリペプチド生産に関する重要な要件である。しかしながら、低コリン増殖培地は細胞培養からのポリペプチド生産用には設計されていない。51.1mmol/Lの培地中のアミノ酸全濃度を考慮すると多くのアミノ酸の含有量は低度~適度であるからである。低コリン増殖培地のアミノ酸組成は以下の通りである:低コリン増殖培地とは対照的に、第二の培地生産培地は、細胞培養を使用する大規模ポリペプチド生産に有用な培地である。この生産培地は、低コリン増殖培地と比較したとき、より多量の大部分のアミノ酸を含有するが培地中のアミノ酸全濃度は90.50mmol/Lである、他の成分の量は基本的に同一である。使用した生産培地のアミノ酸組成は以下の通りである:この比較生産培地中の塩化コリンの含有量も、低コリン増殖培地中より有意に高い。従来技術から知られている生産培地が、さらに少量の塩化コリンを通常含有することを記すことは重要である。したがって、比較生産培地中の塩化コリンの高含有量は、それらの塩化コリン含有量が知られている増殖培地と通常違わない従来技術から知られている生産培地との重要な違いとして考えなければならない。第三の培地は、高コリン増殖培地、すなわち、240mg/lの塩化コリン全含有量をもたらす200mg/lの塩化コリンを補充した低コリン増殖培地によって表される、本発明による培地である。塩化コリンの高含有量以外、本発明による第三の培地は、依然典型的な増殖培地として考えることができる。これらの実施例は、生産期中に使用したとき、低コリン増殖培地のような増殖培地中の、多量の塩化コリンによって得られる顕著な改善を実証し、塩化コリンの含有量が高いこのような増殖培地は、細胞増殖、細胞生存率およびポリペプチド力価の点で少量の塩化コリン補充培地よりはるかに優れているだけでなく、同じ態様で等しく多量の塩化コリンを含む生産培地よりさらに優れていることを実証する。多量の塩化コリンの添加は、正常増殖培地において、より良い細胞増殖および生存率、および改善されたポリペプチド力価を得るのに役立つ。実験設定実験用に、無血清、無タンパク質培地条件に適合させることによって、dhfrCHO-K1細胞系ATCCCCL-61に由来する親CHO細胞系を使用するKaoetalGenetics196755513524KaoetalPNAS19686012751281PucketalJExpMed1958108945959。この親細胞系の3アリコートをトランスフェクトして、それぞれ3つの異なるモノクローナル抗体mAb1、mAb2、mAb3を発現させる。振とうフラスコの実験実験1~3全9本の振とうフラスコ各実験用に3個を、培地以外同じ条件下で操作する。条件は、1日当たり2および0.4の初期培養体積の供給率で第3日および第5日において開始する1日2回の大量供給でのフェドバッチ培養、第5日における36.5°Cから33°Cへの温度変動、インキュベーター中に10のCO2、150rpmの振とう速度ストローク半径=25mmを含む。細胞の細胞増殖/生存率および結果として生じる発現組換え抗体の力価を決定する。a実験1図1および2は、細胞増殖および生存率の点で、実験1中で培養したmAb1発現細胞に関して得た結果を示す。図1および2中に示すように、塩化コリンの含有量が高い本発明の培地高コリン増殖培地は、塩化コリンの含有量が低い低コリン増殖培地と比較したとき、最大生存細胞密度の53の増大、および生存率の緩慢な低下を示す。図3は、ポリペプチド力価の点で、実験1中で培養した細胞に関して得た結果を示す。図3中に示すように、塩化コリンの含有量が高い本発明の培地高コリン増殖培地において得た組換え抗体のポリペプチド力価は、ごく少量の塩化コリンを有し単に典型的な増殖培地を表す低コリン増殖培地と比較して、第13日で330のポリペプチド力価の増大を示す。図3は、塩化コリンの含有量が高い本発明の培地は、生産培地から得られる力価より若干高いポリペプチド力価の獲得をさらに可能にすることも明らかにする。b実験2図4および5は、細胞増殖および生存率の点で、実験2中で培養したmAb2発現細胞に関して得た結果を示す。図4および5により示すように、塩化コリンの含有量が高い本発明の培地高コリン増殖培地は、ごく少量の塩化コリンを有する低コリン増殖培地と比較したとき、細胞増殖に対してごくわずかな影響を有するが、プロセスの最後に有意に高い生存率を与える。図6は、ポリペプチド力価の点で、実験2中で培養した細胞に関して得た結果を示す。図6は、低コリン増殖培地と比較したときの、本発明による細胞培養培地に関する、第11日におけるポリペプチド力価の85の増大を明らかにする。さらに、本発明による細胞培養培地において得たポリペプチド力価は、等しく高含有量の塩化コリンを有する生産培地において得たポリペプチド力価と比較したときさらに高い。c実験3図7および8は、細胞増殖および生存率の点で、実験3中で培養したmAb3発現細胞に関して得た結果を示す。図7および8により示すように、ごく少量の塩化コリンを含む比較用細胞培養培地低コリン増殖培地と比較したとき、本発明による細胞培養培地を用いた培養プロセスの最後に高い細胞生存率を得る。図9は、ポリペプチド力価の点で、実験3中で培養した細胞に関して得た結果を示す。図9は、本発明による細胞培養培地において得たポリペプチド力価は、比較用培地、低コリン増殖培地と比較したとき、第11日において145増大することを明らかにする。さらに本発明による細胞培養培地に関するポリペプチド力価は、塩化コリンの含有量が高い生産培地を使用することにより得る力価より若干高い。生産培地における高濃度の塩化コリンの使用は、240mg/Lの標準塩化コリン量を有する生産培地の使用と比較したとき、改善された細胞増殖またはポリペプチド力価をもたらさなかったことが、実験によってさらに確認されている。以下の追加実験を実施して、ポリペプチド品質に対する細胞培養培地の影響を決定する。特に、産物を分析して、凝集およびグリコシル化に対する培地の影響を決定する。図10は、全量の組換え抗体と比較した組換え抗体産物の凝集率を示す。本発明による細胞培養培地における凝集率は、生産培地と比較して30超低減する。異なる細胞培養培地におけるmAb3の発現、次に組換え抗体のグリコシル化パターンの分析は、塩化コリンの含有量が高い本発明による増殖培地は、望ましくないグリコシル化パターンを表す高マンノシル化を含む、組換え抗体および少量の全組換え産物をもたらすことを示す。本発明による培地の使用は、生産培地の使用と比較して、高マンノシル化の点で55を超える低減をもたらす。バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作実験4以下の実験は、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作である。それは前述の実験3に相当する。mAb3を発現する細胞を使用した。条件は以下の通りである。2Lの開始体積、1日当たり2および0.4の初期培養体積の供給率で第3日および第5日において開始する2つの異なる供給液の連続供給、第5日における36.5°Cから33°Cへの温度変動、pO2=30、pH=6.9不動帯0.1、CO2および0.5MのNaOHで制御、振とう速度=300rpm。図11および12は、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作として実施した実験4中の、細胞の生存細胞密度および生存率に関して得た結果を示す。細胞の細胞増殖および生存率に関して、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作からの結果は、振とうフラスコ実験において得た結果と一致する。すなわち、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作は基本的に、振とうフラスコ実験において得た結果を確認する。振とうフラスコ実験中と同様に、生産培地において得たピーク生存細胞密度は、塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地高コリン増殖培地と比較して若干高かった。しかしながら、本発明の細胞培養培地、すなわち高含有量の塩化コリンを補充した培地を使用して、ごく少量の塩化コリンを有する非補充増殖培地と比較したとき、生存率は有意に高いレベルに留まった。図13は、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作として実施した実験4中の、ポリペプチド力価に関して得た結果を示す。塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地に関して第11日において測定したポリペプチド力価は、ごく少量の塩化コリンを有する比較増殖培地と比較したとき170増大した。塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地に関して得たポリペプチド力価は、振とうフラスコ実験において比較目的で生産培地の使用により得たポリペプチド力価よりも優れてさえいるが、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作での実験は、生産培地と比較して、塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地における若干低いポリペプチド力価を明らかにする。それにもかかわらず、塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地の使用により、バイオリアクターにおいて得たポリペプチド力価は非常に高く、比較目的で生産培地の使用により得たポリペプチド力価と依然匹敵するレベルである。バイオリアクターにおける実験4は、塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地は、各細胞培養培地中のアミノ酸の全量または選択アミノ酸の量を有意に低減することができる一方で、匹敵するポリペプチド力価の獲得を可能にすることによって、従来の生産培地の適切な代替となることをさらに確認する。バイオリアクターにおける実験4は、ポリペプチド生産用の増殖培地を使用するとき、典型的な増殖培地中の塩化コリン含有量の増大は、ポリペプチド力価の多大な増大を得るのに役立つことも再度証明する。増殖培地への異なる濃度の塩化コリンの添加さらなる実験組では、塩化コリンを様々な濃度40;80;120;160;200;240;500;840;1000;3000および5000mg/l、合計で粉末状増殖培地に加える。このようにして得た培地は、概略的に前述したように、それぞれmAb3およびmAb4の生成に使用する。培養の全期間にわたるそれぞれ13、17日、mAb3に関する標準抗体濃度、標準生存細胞密度、および生存率、およびさらにmAb4に関する標準細胞特異的生産性を、図14~図24中にさらに示す。これらのデータから見ることができるように、培養13または17日後に生存率および抗体濃度に関する最小値を、合計40mg/lの塩化コリンを有する増殖培地において得る。3000mg/l以上の濃度が細胞の生存率に悪影響を与えることはないが、細胞はこれらの培地中では増殖しないので、抗体濃度は1未満に留まる。40mg/lを超える全てのコリン濃度に関して生存率は高い。生存率に対する塩化コリンの濃度依存的影響があるようである。培地中の高い塩化コリン濃度は、培養の末期に高い生存率をもたらした。