異種ウイルスの抗原及びロタウイルスの抗原が連結されたロタウイルス複合抗原。前記異種ウイルスは、A型肝炎ウイルスである、請求項1に記載のロタウイルス複合抗原。前記ロタウイルスの抗原はVP7タンパク質であり、前記A型肝炎ウイルスの抗原はドメイン2またはドメイン3である、請求項2に記載のロタウイルス複合抗原。前記VP7タンパク質は配列表における第1配列のアミノ酸配列を含み、前記D2は配列表における第2配列のアミノ酸配列を含み、前記D3は配列表における第3配列のアミノ酸配列を含む、請求項3に記載のロタウイルス複合抗原。前記ロタウイルスの抗原と前記A型肝炎ウイルスの抗原とは、LeuGluProGlyまたはLysAspGluLeuのペプチドリンカーによって連結されている、請求項4に記載のロタウイルス複合抗原。請求項1ないし5のいずれか一項に記載の組み換え型のロタウイルス複合抗原を含むワクチン組成物。i異種ウイルスの抗原及びロタウイルスの抗原が連結された複合抗原をコードするヌクレオチド配列と、ii前記複合抗原をコードする配列に動作可能に連結されたプロモーターとを含む請求項1に記載のロタウイルス複合抗原発現用コンストラクト。請求項7に記載のロタウイルス複合抗原発現用コンストラクトで形質転換された宿主細胞。a請求項8に記載の宿主細胞を培養する工程と、b前記工程aで培養された細胞から組み換えロタウイルス複合抗原タンパク質を分離及び精製する工程とを含むロタウイルス複合抗原の生産方法。iロタウイルスのVP2、VP4及びVP6のポリペプチド、及びii請求項1ないし5のいずれか一項に記載のロタウイルス複合抗原とを含むロタウイルスのウイルス類似粒子。請求項10のロタウイルスのウイルス類似粒子を含むワクチン組成物。iプロモーターに動作可能に連結されたVP2コーディングヌクレオチド配列を含む第1の組み換えバキュロウイルス;プロモーターに動作可能に連結されたVP4コーディングヌクレオチド配列を含む第2の組み換えバキュロウイルス;プロモーターに動作可能に連結されたVP6コーディングヌクレオチド配列を含む第3の組み換えバキュロウイルス;及びプロモーターに動作可能に連結されたロタウイルス複合抗原コーディングヌクレオチド配列を含む第4の組み換えバキュロウイルスを含み、前記ロタウイルス複合抗原は、異種ウイルスの抗原及びロタウイルスの抗原が連結されたものである、請求項10に記載のロタウイルスのウイルス類似粒子の発現用コンストラクト。a請求項12に記載のコンストラクトで形質転換された宿主細胞を培養する工程と、b前記工程aで培養された細胞からロタウイルスのウイルス類似粒子を分離及び精製する工程とを含む請求項10に記載のロタウイルスのウイルス類似粒子を生産方法。本発明者らは、異種ウイルス抗原エピトープが搭載された組み換えロタウイルス複合抗原を一つの発現ベクターシステムを用いて発現させることができるベクターシステム及び、これを用いて上記組み換えロタウイルス複合抗原を含有するロタウイルスのウイルス類似粒子を生産する方法を開発するために鋭意研究した。その結果、A型肝炎ウイルス抗原エピトープ及びロタウイルス抗原を同時に発現させることができるバキュロウイルス発現ベクターシステムを構築し、これを宿主細胞に形質転換してウイルス複合抗原を成功的に発現させて免疫原性を確認した。また、上記複合抗原と追加的なウイルス構造タンパク質とを共同発現させることにより、上記複合抗原を持つロタウイルスのウイルス類似粒子を成功的に生産し、この類似粒子の免疫原性も確認し、本発明を完成した。したがって、本発明の目的は、異種ウイルス抗原が含まれたロタウイルス複合抗原発現用コンストラクトを提供することにある。本発明の他の目的は、上記ロタウイルス複合抗原発現用コンストラクトで形質転換された宿主細胞を提供することにある。本発明のまた他の目的は、上記ロタウイルス複合抗原を含むワクチン組成物を提供することにある。本発明のまた他の目的は、上記ロタウイルス複合抗原の生産方法を提供することにある。本発明のまた他の目的は、A型肝炎ウイルス抗原及びロタウイルス抗原の複合抗原タンパク質を持つロタウイルスのウイルス類似粒子を提供することにある。本発明のまた他の目的は、上記ロタウイルスのウイルス類似粒子を含むワクチン組成物を提供することにある。本発明のまた他の目的は、上記ロタウイルスのウイルス類似粒子を含むワクチン組成物を生産する方法を提供することにある。本発明の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってさらに明確になる。本発明の一様態によると、本発明は、異種ウイルスの抗原及びロタウイルスの抗原が連結された複合抗原をコーディングするヌクレオチド配列;及び上記複合抗原をコーディングする配列に作動的に連結されたプロモーターを含むロタウイルス複合抗原発現用コンストラクトを提供する。本明細書において使用される用語複合抗原は、二つ以上の異なる抗原またはエピトープを同時に含むキメラ抗原を意味する。本発明の最大の技術的特徴の一つは、ロタウイルス抗原に異種ウイルスの抗原エピトープが連結され、異種ウイルス抗原エピトープが搭載されたロタウイルス複合抗原を発現させることができる発現コンストラクトシステムを確立した点にある。本明細書において使用される用語発現コンストラクトは、発現目的のヌクレオチド配列及びこの配列の発現を誘導する配列を含む、発現のための最小限のエレメントを意味する。当該発現コンストラクトは、好ましくは、転写調節配列発現目的のヌクレオチド配列ポリアデニル化配列を含む。本明細書において使用される用語プロモーターは、真核細胞において目的遺伝子の転写を誘導することができる転写調節配列を意味する。上記真核細胞において作動可能なプロモーター配列は、サイトメガロウイルスの即時初期型プロモーター、SV40のプロモーター、HSVのtkプロモーター、アデノウイルス2主要後期型プロモーター、アデノウイルス2初期型プロモーター、AAVのp19プロモーター、エプスタインバールウイルスプローモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ワクシニアウイルス75Kプロモーター、マウスのメタロチオネインプロモーター、MMTVLTRプロモーター、HIVのLTRプロモーター、βアクチンプロモーター、EF1アルファプロモーター、ヒトIL2遺伝子のプロモーター、ヒトIFN遺伝子のプロモーター、ヒトIL4遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター及びヒトGMCSF遺伝子のプロモーター、また、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンまたはヒトメタロチオネイン由来のプロモーターがあるが、これに限定されるものではない。本明細書において用語作動的に連結されたは、核酸発現調節配列と核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって上記調節配列は上記他の配列の転写及びまたはトランスレーションを調節するようになる。本発明の発現コンストラクトには転写終結配列として、ポリアデニル化配列が含まれても良く、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター、SV40由来のポリアデニル化配列、HIV1polyA、βグロビンpolyA、HSVTKpolyAまたはポリオーマウイルスpolyAを含むが、これに限定されるものではない。また、本発明の発現コンストラクトには選択標識として、当業界で通常用いられる抗生物質耐性遺伝子を含んでも良く、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシンまたはテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含む。本発明の組み換え複合抗原発現コンストラクトは多様な形態に作製されても良く、代表的にプラスミドまたはウイルスベクターシステムに作製されることができる。好ましくは、本発明の発現コンストラクトはウイルスベクターシステムであり、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルスなどのベクターシステムに適用されることができるが、これに限定されない。本発明の最も好ましい実現例によれば、上記発現コンストラクトはバキュロウイルス転移ベクターに作製されることができる。本発明の好ましい実現例によれば、上記ロタウイルス複合抗原の発現コンストラクトにおいて上記異種ウイルスはA型肝炎ウイルスである。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記A型肝炎ウイルスの抗原はドメイン2またはドメイン3である。より好ましくは、上記A型肝炎ウイルス抗原のドメイン2とドメイン3は、それぞれ配列表における第2配列と第3配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記ロタウイルス抗原はVP7タンパク質部位である。より好ましくは、上記ロタウイルス抗原VP7タンパク質部位は、配列表における第1配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記ロタウイルス抗原と上記A型肝炎ウイルス抗原とはペプチドリンカーによって連結される。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記ペプチドリンカーはLeuGluProGlyまたはLysAspGluLeuである。上記LysAspGluLeuは、ERに組み換えタンパク質の残留を促進することによりMHCクラスIによる抗原提示効果を向上する。本発明の具体的な一実施例によれば、上記本発明のロタウイルス複合抗原発現用コンストラクトは、図1に示されるDNA構成要素を含む。本発明の他の一様態によれば、本発明は、上記ロタウイルス複合抗原発現用コンストラクトで形質転換された宿主細胞を提供する。本発明のロタウイルス複合抗原の発現コンストラクトで形質転換されることができる宿主細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞であり、最も好ましくは昆虫細胞株である。昆虫細胞としては、例えば、Sf21、Sf9、Tn5などを用いることができるが、これに限定されない。本発明において上記発現コンストラクトを動物細胞に形質転換する方法は、当業界に公知された多様な方法を用いることができ、例えば、微小注入法、リン酸カルシウム沈澱法、電気穿孔法、リポソーム媒介形質感染法、DEAEデキストラン処理法、遺伝子衝撃、酢酸リチウムDMSO法などが挙げられるが、これに限定されない。本発明の他の一様態によれば、本発明は、A型肝炎ウイルス抗原とロタウイルス抗原とが相互連結された組み換えロタウイルス複合抗原を提供する。本発明のまた他の一様態によれば、上記組み換えロタウイルス複合抗原を有効成分として含むワクチン組成物を提供する。本発明の好ましい実現例によれば、上記ロタウイルス抗原はVP7タンパク質部位であり、上記A型肝炎ウイルス抗原エピトープはドメイン2またはドメイン3である。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記ロタウイルス抗原VP7タンパク質部位は、配列表における第1配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記A型肝炎ウイルスの抗原エピトープのD2とD3はそれぞれ、配列表における第2配列と第3配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記ロタウイルス抗原と上記A型肝炎ウイルス抗原エピトープとはペプチドリンカーによって連結され、より好ましくは、上記ペプチドリンカーはLeuGluProGlyまたはLysAspGluLeuである。本発明の組み換えロタウイルス複合抗原タンパク質は、下記実施例において立証されるように、ロタウイルスに対する抗体誘導能のみならず、A型肝炎ウイルスに対する抗体誘導能を保有する。本発明のワクチン組成物は、A型肝炎ウイルス抗原を含む組み換えロタウイルス複合抗原タンパク質の薬剤学的有効量;及び薬剤学的に許容される担体を含む。本発明のワクチン組成物は、A型肝炎ウイルス及びロタウイルス感染によって誘発される多様な疾患の予防に用いられることができる。本明細書において用語薬剤学的有効量は、上記疾患に対する予防効果を達成するのに十分な量を意味する。本発明のワクチン組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油などを含むが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は、上記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでも良い。本発明のワクチン組成物は、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、または局所投与を用いて投与することができる。本発明のワクチン組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、普通に熟練された医者は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明のワクチン組成物は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及びまたは賦形剤を用いて製剤化されることで、単位用量形態で製造されかまたは多用量容器内に入れて製造されることができる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であっても良く、分散剤または安定化剤をさらに含んでも良い。本発明の他の一様態によれば、本発明は、次のステップを含むA型肝炎ウイルス抗原を含むロタウイルス複合抗原の生産方法を提供する:A型肝炎ウイルスの抗原及びロタウイルスの抗原が連結された複合抗原をコーディングするヌクレオチド配列;及び上記複合抗原をコーディングする配列に作動的に連結されたプロモーターを含むロタウイルス複合抗原発現用組み換えバキュロウイルスで形質転換された宿主細胞を培養するステップ:及び上記ステップで培養された培養物から組み換えロタウイルス複合抗原タンパク質を分離及び精製するステップ。本発明において形質転換された宿主細胞の培養は、当業界で公知された通常の動物細胞の培養方法を用いることができる。細胞培養時に使用される培地は、形質転換された宿主細胞が有効に用いられる炭素原、窒素原、無機塩などを含めば、天然培地または合成培地を使用することができる。使用できる炭素原は、グルコース、フルクトース、スクロースのような炭水化物;澱粉、澱粉の加水分解物;酢酸及びプロピオン酸のような有機酸;メタノール、エタノール、プロパンのようなアルコールなどを含む。窒素原は、アンモニア;塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウムのような無機酸または有機酸のアムモニウム塩;ペプトン、肉エキス、酵母エキス、とうもろこし浸漬液、カゼイン加水分解物、大豆エキス、大豆加水分解物;多様な醗酵した細胞及びこれらの分解物などを含む。無機塩は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを含む。本発明において用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられるいずれの培地でも良く、例えば、EaglessMEM、αMEM、IscovesMEM、199培地、CMRL1066、RPMI1640、F12、F10、DMEM、DMEMとF12の混合物、WaymouthsMB7521、McCoys5A及びMCDBシリーズなどが用いられる。培地に関する説明は、RIanFreshneyCultureofAnimalCellsAManualofBasicTechniqueAlanRLissIncNewYorkに詳細に記載されており、この文献は本明細書に参照として組み込まれる。培養は、通常、振とう培養または回転機の回転といった好気的条件下で行う。培養温度は、好ましくは15ないし40°Cで行い、培養時間は一般的に5時間ないし7日間行う。培地のpHは、培養中に好ましくは30ないし90の範囲を維持する。培地のpHは無機または有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどで調節することができる。培養中には必要な場合、アンピシリン及びテトラサイクリンのような抗生物質を添加することができる。上記培養された形質転換細胞から発現された複合抗原タンパク質を分離する方法は、当業界で通常用いられる分離及び精製方法を採用して実施することができる。例えば、硫酸アンモニウムまたはPEGなどを用いた溶解度による分離、分子量による限外ろ過分離、様々なクロマトグラフィーによる分離など、多様な方法が用いられ、通常は、上記方法の組合わせを用いて分離及び精製する。本発明の一様態によれば、本発明は、ロタウイルスのVP2、VP4及びVP6のポリペプチド、及び異種ウイルス抗原エピトープ及びロタウイルス抗原VP7の融合タンパク質を含むロタウイルスのウイルス類似粒子を提供する。本発明の好ましい実現例によれば、上記異種ウイルスはA型肝炎ウイルスである。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記融合タンパク質はA型肝炎ウイルス抗原D2及びロタウイルス抗原VP7の融合タンパク質D2VP7である。本発明の好ましい実現例によれば、上記VP2ポリペプチドは配列表における第4配列を含み、上記VP4ポリペプチドは配列表における第5配列のアミノ酸配列を含み、上記VP6ポリペプチドは配列表における第6配列のアミノ酸配列を含み、上記D2ポリペプチドは配列表における第2配列のアミノ酸配列を含み、上記VP7ポリペプチドは配列表における第1配列のアミノ酸配列を含む。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記融合タンパク質D2VP7はD2ポリペプチドとVP7ポリペプチドとがペプチドリンカーLeuGluProGlyまたはLysAspGluLeuによって連結される。本発明のまた他の一様態によれば、本発明は、ロタウイルスのVP2、VP4及びVP6のポリペプチド、及びA型肝炎ウイルス抗原エピトープD2及びロタウイルス抗原VP7の融合タンパク質であるD2VP7を含むロタウイルスのウイルス類似粒子を有効成分として含むワクチン組成物を提供する。本発明においてロタウイルスのウイルス類似粒子を含むワクチン組成物に関する説明は、上記ロタウイルス複合抗原において説明したものと同様であるため、重複記載はしない。本発明のまた他の一様態によれば、本発明は、次のステップを含むA型肝炎ウイルス抗原を含むロタウイルスのウイルス類似粒子の生産方法を提供する:プロモーターに作動的に連結されたVP2コーディングヌクレオチド配列を含む第1の組み換えバキュロウイルス;プロモーターに作動的に連結されたVP4コーディングヌクレオチド配列を含む第2の組み換えバキュロウイルス;プロモーターに作動的に連結されたVP6コーディングヌクレオチド配列を含む第3の組み換えバキュロウイルス;及びプロモーターに作動的に連結された融合タンパク質D2VP7コーディングヌクレオチド配列を含む第4の組み換えバキュロウイルスで形質転換された宿主細胞を培養するステップ;上記宿主細胞の培養物からロタウイルスのウイルス類似粒子を分離及び精製するステップ。本発明の好ましい実現例によれば、上記VP2ポリペプチドは配列表における第4配列のアミノ酸配列を含み、上記VP4ポリペプチドは配列表における第5配列のアミノ酸配列を含み、上記VP6ポリペプチドは配列表における第6配列のアミノ酸配列を含み、上記D2ポリペプチドは配列表における第2配列のアミノ酸配列を含み、上記VP7ポリペブチドは配列表における第1配列のアミノ酸配列を含む。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記融合タンパク質D2VP7はD2とVP7とがペプチドリンカーLeuGluProGlyまたはLysAspGluLeuによって連結される。本発明においてロタウイルスのウイルス類似粒子を生産する方法は、上記ロタウイルス複合抗原タンパク質を生産する方法において説明したものと同様であるため、重複記載はしない。本発明は、異種ウイルス抗原エピトープが搭載されたロタウイルス複合抗原発現用コンストラクト、上記ロタウイルス複合抗原を含むワクチン組成物、ロタウイルス複合抗原を含むロタウイルスのウイルス類似粒子、及びロタウイルスのウイルス類似粒子を含むワクチン組成物に関する。本発明によれば、ロタウイルスの抗原とともにロタウイルスと異なる異種ウイルスのエピトープを同時に含む複合抗原と、該複合抗原を含むロタウイルスのウイルス類似粒子を安価で大量生産することができ、ロタウイルス及び異種ウイルスに対する新規複合ワクチンの研究及び開発に応用することができる。以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。実験方法1.実験材料昆虫細胞株であるSf9細胞株を韓国細胞主銀行から確保し、バキュロウイルス生成のために使用した。Sf9細胞は250mLスピナーフラスコを用いて90rpm、27°C条件下で10FBSが含有されたTNMFH培地において成長及び保持し、トリパンブルー色素排除実験を基盤に血球計算器を用いて細胞数及び細胞生存率を測定した。血清型G1P8Waロタウイルス株とHM175A型肝炎ウイルス株ゲノムから抗原エピトープ遺伝子を確保し、組み換えバキュロウイルス製造のためにBacNBlueバキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた。2.試薬及び実験動物制限酵素XhoI及びT4DNAligaseはNewEnglandBiolabsから購入した。バキュロウイルスの転移ベクターpBlueBac45V5Hisとバキュロウイルス発現システムBacNBlueTMはInvitrogenから購入した。プラスミドミニプレップキットはBioneerから購買して使用した。A型肝炎ウイルスの人体感染患者からの抗血清及びWaロタウイルス株に対するウサギ血清を免疫原性分析のために使用した。6~8週齢のSPFニュージーランドWhitefemaleウサギを動物実験のために使用し、実験前の2週間、順応させた。3.ロタウイルス及びA型肝炎ウイルスのエピトープ含有組み換えバキュロウイルスの同時発現システムの構築ロタウイルスのカプシド構成成分であるVP7遺伝子は、WaロタウイルスズRNAからRTPCRによって合成したcDNAに基づいて合成した。A型肝炎ウイルスのドメイン2及びドメイン3遺伝子は、HM175A型肝炎ウイルス株RNAからRTPCRによって合成したcDNAに基づいて合成した。プライマーに人為的に導入させたXhoI制限酵素部位を用いてA型肝炎ウイルスとロタウイルスエピトープとを同時に含有する2種類の組み換え複合抗原をエンコードするDNA画分を得た:HAVD2及びHRVVP7、HAVD3及びHRVVP7。これら組み換え遺伝子をPCRによって増幅した後、バキュロウイルス転移ベクターpBlueBac45内にクローニングして組み換えバキュロウイルス転移ベクターを作った。製造した組み換え転移ベクターは塩基配列分析をして正確なクローニング可否を確認した。製造した組み換えバキュロウイルス転移ベクターは、BacNBlueTMlinearizedバキュロウイルスDNAと血清のない培地を使用して準備したCellfectin登録商標II試薬と混合し、常温で15分反応させた後、ここに昆虫細胞Sf9細胞株を添加した。混合液は10FBSが含有されたTNMFH培地に置換し、その後、標準プラーク分析によって組み換えバキュロウイルスを確認した。4.SDSPAGE及びウエスタンブロットによる発現タンパク質の確認組み換え複合抗原タンパク質発現サンプルは10SDSPAGE上で分離し、CoomassieBrilliantBlueR250染色法を用いて確認した。発現されたタンパク質の存在を確認するために、すべてのタンパク質成分はImmunoBlotTMPVDFmembraneに移した後、このメンブレインを5脱脂乳を用いてブロッキングした。1次抗体としてウサギから製造したロタウイルスWa抗血清とA型肝炎患者血清をTBST溶液内で準備し、準備された1次抗体を使用して1時間反応させ、peroxidaseconjugatedgoatantirabbitIgGを2次抗体として使用して反応させた。発現タンパク質はECL技法を用いてX線フィルムに露出した後、確認した。5.ウサギの免疫接種50μgの組み換え複合抗原タンパク質D2VP7を2匹のニュージーランドホワイトウサギに完全フロイントアジュバントとともに筋肉注射した後、28日にさらに不完全フロイントアジュバントとともにブースティングした。40日後、耳静脈から血液を採取し、血清を分離した後、抗体形成有無をELISA技法を用いて確認した。6.ELISAによる特異抗体の検出分離精製したロタウイルスWa抗原とA型肝炎ウイルスHM175抗原をウェル当たり01μgの濃度でコーティング溶液内に準備した後、96ウェル免疫プレートに4°Cで一晩中コーティングした。コーティングされたプレートをPBST200μlで3回洗浄した後、5脱脂乳を使用してブロッキングした。ウサギから収集した兔疫血清を段階別に希釈した後、37°Cで1時間反応させた。洗浄後、peroxidaseconjugatedgoatantirabbitIgGをウェル当たり100μlずつ添加した後、37°Cで1時間反応させた。基質溶液としてOPDを添加した後、5分間反応させ、1MH2SO450μlを各ウェルに添加して反応を中止させた。次いで、ELISAreaderを用いて492nmで吸光度を測定することにより、抗体濃度を定量した。7.ウイルス抗体反応による抗体特異性の確認7-1.ロタウイルスに対する抗体特異性96ウェルガラスプレートに培養された細胞株に10倍希釈したWaロタウイルス溶液100μlを添加し、ウイルス培地を100μl添加して細胞変性効果が出現する時点まで反応させた。培養した培地を除去し、80アセトンを入れて10分間反応させて細胞を固定した後、PBSで3回洗浄し、1次抗体としてウサギから得た組み換え複合抗原タンパク質D2VP7兔疫血清をPBSで50倍希釈して100μl入れて37°Cで1時間反応させた。PBSで3回洗浄し、2次抗体として50倍希釈したFITCconjugatedGoatAntiRabbitIgG50μlを入れて37°Cで1時間反応させた後、さらにPBSで3回洗浄し、80グリセロールを添加して反応を終了した。次いで、共焦点顕微鏡下で観察し、ウサギから得た抗体がロタウイルスに対して特異性を示すのかを確認した。7-2.A型肝炎ウイルスに対する抗体特異性96ウェルガラスプレートに培養された細胞株に10倍希釈したHM175A型肝炎ウイルス溶液100μlを入れてウイルス培地を100μl添加して、細胞変性効果が出現する時点まで反応させた。培養した培地を除去し、80アセトンを添加して10分間反応させて細胞を固定した。PBSで3回洗浄し、1次抗体としてウサギから得た組み換え複合抗原タンパク質D2VP7兔疫血清をPBSで50倍希釈し100μl入れて、37°Cで1時間反応させた。PBSで3回洗浄し、2次抗体として50倍希釈したFITCconjugatedGoatAntiRabbitIgG50μlを添加して37°Cで1時間反応させた後、さらにPBSで3回洗浄し、80グリセロールを入れて反応を終了した。次いで、共焦点顕微鏡下で観察して、ウサギから得た抗体がA型肝炎ウイルスに対して特異性を示すのかを確認した。8.中和抗体の形成ウサギから得た組み換え複合抗原タンパク質D2VP7兔疫血清を56°Cで30分間反応させて補体を不活性化させた後、TCID50でWaロタウイルスとHM175A型肝炎ウイルス溶液の力価を測定した。96ウェルプレートに100dosesTCID5025μlを含有した各ウイルス溶液50μlを混ぜた後、ウサギから収集した血清を10倍希釈した後に段階別に2倍ずつ希釈して、各ウェル当たり50μlを入れて、均一に混ぜた後、37°Cで1時間反応させた。細胞が培養されたプレートに各ウイルス兔疫血清混合液を50μlずつ入れて、保持培地を50μl加えた後、5日間培養した。次いで、倒立顕微鏡を用いて細胞変性程度を確認し、ACTGLaboratoryTechnologistCommitteeマニュアルによって兔疫血清の中和抗体の形成有無と抗体価を測定した。xkdoseofthehighestdilutionrsumofthenumberofresponsesdspacingbetweendilutionsnwellsperdilutionSpearmanKarberformulaMxkd059.ロタウイルスのウイルス類似粒子の合成実験9-1.細胞感染10FBSと01PluronicF68を含有したTNMFH培地250mlで約3×106cellsml程度に培養したSf9細胞を遠心濃縮し、VP2、VP4、VP6及びD2VP7をコーディングするポリヌクレオチドを含む計4種の組み換えバキュロウイルスを、5pfucellのMOIをもって混合して同時に感染させた。3~4時間くらい遠心チューブでウイルスを吸着させた後、細胞感染液を遠心分離して、上澄み液培地を新鮮な培地に取り替えた。このとき、培地は10FBSと01PluronicF68を含有した220mlGrace’sinsect培地を使用した。その後、27°Cで5~7日間培養した。9-2.ロタウイルスのウイルス類似粒子の純粋分離及び精製感染された細胞培養液を12000rpmで30分間超高速遠心分離して細胞培養上澄み液を得た。VLPを含んでいる培養上澄み液に35スクロースクッション15mlを添加し、SW28ロータを用いて25000rpmで90分間遠心分離することにより、VLP沈殿物を得た。収得したVLP沈殿物は4mlのTNC緩衝液に浮遊させ、042gCsClmlを添加してSW501ロータを用いて35000rpmで18時間遠心分離を行った。遠心分離した後、確認された2つのバンド、すなわち下位バンドと上位バンドとを使い捨て注射器を用いて回収し、各6mlのTNC緩衝液に浮遊させた後、SW41ロータを用いて35000rpmで120分間遠心分離を行った。VLPペレットをTNC緩衝液に浮遊させた後、電子顕微鏡分析を通じてVLPの存在を確認した。9-3.免疫接種精製した下位バンドと上位バンド各50μgを各2匹のマウスに完全フロイントアジュバントとともにマウスの背中の皮の皮下2~3箇所に分けて注射した後、14、35、56日後にさらに不完全フロイントアジュバントとともにブースティングした。60日後、静脈から血液を採取して血清を分離した後、抗体形成有無をELISA技法を用いて確認した。実験結果1.ロタウイルスとA型肝炎ウイルスとの組み換え複合抗原タンパク質の同時発現のためのベキュロウイルスベクターシステムの構築図1は、本発明で作製したA型肝炎ウイルスとロタウイルスとの組み換え複合抗原タンパク質同時発現システムの模式図である。図1に示されるように、D2VP7とD3VP7と名づけられた計2種のロタウイルスとA型肝炎ウイルスエピトープとを同時に含有する組み換え複合抗原タンパク質の発現システムを構築した。組み換え抗原タンパク質はOverlapextensionPCRを用いてそれぞれ1215bpと1149bpに該当する増幅産物を確保し、これらをそれぞれバキュロウイルス転移ベクターであるpBlueBac45に挿入した。製造した2種の組み換えバキュロウイルスの転移ベクターに対してDNA塩基配列分析を実施し、クローニングした塩基配列がインフレーム融合されたことを確認した。2.Sf9昆虫細胞株における組み換え複合抗原タンパク質の同時発現構築された2種の組み換えバキュロウイルス発現ベクターを昆虫細胞株Sf9に取り入れ、発現有無を総細胞タンパク質分析を通じて確認した。その結果、予想された大きさの2種の組み換え複合抗原タンパク質産物がそれぞれの昆虫細胞株において発現されることを確認した。特に、これらタンパク質の存在を確認するためにV5抗体を用いて確認したところ、該当産物の大きさに該当する特異的なタンパク質産物を確認することができた。この結果は、本発明において構築されたロタウイルス抗原とA型肝炎ウイルス抗原とを同時に含有する組み換え複合抗原タンパク質発現システムによって組み換え複合抗原タンパク質が安定的に発現されたことを示す。昆虫細胞株Sf9において組み換え複合抗原タンパク質の経時的な発現様相を調べるために、D2VP7を発現する組み換えバキュロウイルスを細胞当たり5pfuで初期感染させて10日間観察したところ、感染後2日目に最高発現量を示し、その後漸進的に減少して10日目に最小量を示した。これは組み換えバキュロウイルスの感染後、10日を周期に正常な細胞溶解が誘導されたことを示す。3.組み換え複合抗原タンパク質の免疫原性発現された2種のロタウイルス及びA型肝炎ウイルスの抗原を含有する組み換え複合抗原タンパク質が免疫原性を持つかを調べた。まず、人体感染患者のA型肝炎ウイルス抗血清及びウサギから生産されたロタウイルス特異抗体を使用して2種の組み換え複合抗原タンパク質に対してウエスタンブロットを行った。図4aに示されるように、発現された2種の組み換え複合抗原タンパク質は、いずれもロタウイルス特異抗体に陽性反応を示した。一方、3人の人体感染患者から得たA型肝炎ウイルス抗血清を使用してウエスタンブロットした場合、D2VP7においてのみ陽性反応を確認することができた。図4bに示される結果のように、組み換え複合抗原D2VP7が3人の人体感染患者から得たA型肝炎ウイルス抗血清によって認知されることを確認した。上記結果は、構築された2種の組み換え複合抗原タンパク質のうちD2VP7が、ロタウイルスとA型肝炎ウイルスに対していずれも免疫原性を保有していることを示す。D2VP7組み換え複合抗原タンパク質の免疫原性を再度確認するために、該当抗原をウサギに免疫接種して抗原特異的な抗体が形成されるのかを調べた。図5a及び図5bの結果から分かるように、D2VP7組み換え複合抗原タンパク質は、ロタウイルスWa株及びA型肝炎ウイルス抗原に対する特異的な抗体形成を誘導した。さらに、D2VP7組み換え複合抗原に特異的な抗体がロタウイルスとA型肝炎ウイルスに特異的に反応するかを確認するために、各ウイルスで感染させた培養された細胞とD2VP7組み換え複合抗原の接種によって誘導された兔疫血清とを反応させた。図6a及び図6bに示される結果のように、D2VP7組み換え複合抗原の接種によって得たウサギ兔疫血清が各ウイルスに特異的に反応することを確認した。かかる結果は、D2VP7組み換え複合抗原が、A型肝炎ウイルスとロタウイルスに特異的な抗体の生成を誘導するということを証明するものである。4.組み換え複合抗原タンパク質の中和抗体形成能D2VP7組み換え複合抗原に特異的な抗体がロタウイルスとA型肝炎ウイルスに対して中和力を持つかを確認するために、各ウイルスを細胞に感染させて培養した後、これをD2VP7組み換え複合抗原に対する抗血清と反応させた。その結果、陽性対照群と比べて細胞変性効果の出現が、ロタウイルスの場合、希釈倍数320倍、A型肝炎ウイルスの場合、希釈倍数160倍まで減少して、抗血清が各ウイルスを抑制する中和力があることを確認することができた。下記表2は、ウサギに接種して得た組み換え複合抗原タンパク質D2VP7の抗血清のTCID50を測定した結果を示す。5.ロタウイルスのウイルス類似粒子の電子顕微鏡写真上記実施例に記載の方法によって合成したロタウイルスのウイルス類似粒子を電子顕微鏡で観察した。その結果、D2VP7組み換え複合抗原を含有するロタウイルスのウイルス類似粒子が正常に形成されていることが確認できた。6.ロタウイルスのウイルス類似粒子の免疫原性製造したロタウイルスのウイルス類似粒子に対する免疫原性有無を調べるために、10SDSPAGE上で分離し、ウサギから生産されたロタウイルス特異抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果、該当産物の大きさに該当する特異的なタンパク質産物を確認した。ロタウイルスのウイルス類似粒子の免疫原性を再確認するために、上記製造したウイルス類似粒子をマウスに免疫接種して抗原特異的な抗体形成の有無を調べた。その結果、陰性対照群と比べてウイルス特異的な抗体が誘導されることを確認した。7.実験の結論及び期待効果本発明においては、A型肝炎ウイルスエピトープとロタウイルスエピトープとを組み合わせた計2種の組み換え複合抗原タンパク質D2VP7及びD3VP7を発現することができるバキュロウイルス発現ベクターシステムを構築し、これら複合抗原タンパク質を昆虫細胞であるSf9細胞株において発現した。これら発現された組み換え複合抗原タンパク質に対する免疫原性を、ウサギ及び人体感染患者の血清を用いたウエスタンブロット分析法を通じて確認した。また、免疫原性が確認された候補の組み換え複合抗原タンパク質をウサギに直接投与して血清を得て、この血清に対してELISA分析を行ってウイルス特異抗体が形成されたことを証明することで免疫原性を再確認した。さらに、ウサギ免疫接種で形成された抗血清が、A型肝炎ウイルスとロタウイルスの活性をいずれも抑制する中和抗体能力を持っていることを確認した。また、作製したロタウイルスA型肝炎ウイルスの組み換え複合抗原を含有するロタウイルスのウイルス類似粒子をマウスに免疫接種した結果、A型肝炎ウイルスとロタウイルスの両方に対して特異的な抗体が形成された。本発明の複合抗原タンパク質発現システムは、A型肝炎ウイルス及びロタウイルス由来の抗原タンパク質の同時及び大量発現、キメラウイルス類似粒子の合成、A型肝炎ウイルス及びロタウイルスに対する複合免疫ワクチンの開発と多様なウイルス抗原を含有する複合ウイルス類似粒子ワクチンの開発に適用することができる。以上のように本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれの等価物によって定義されると言える。