"R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンである化合物、又はその薬学的に許容し得る塩。R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンである請求項1に記載の化合物。R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンメタンスルホン酸塩である請求項1に記載の化合物。R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン酢酸塩である請求項1に記載の化合物。R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンヘミシュウ酸塩である請求項1に記載の化合物。R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンヘミコハク酸塩である請求項1に記載の化合物。請求項1~6のいずれか一項に記載の化合物又は塩と、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物。癌を治療する方法であって、有効量の請求項1~6のいずれか一項に記載の化合物又は塩をそれを必要としている患者に投与することを含む方法。癌を治療する方法であって、有効量の請求項1~6のいずれか一項に記載の化合物又は塩と電離放射線とをそれを必要としている患者に投与することを含む方法。癌を治療する方法であって、有効量の請求項1~6のいずれか一項に記載の化合物又は塩と1以上の化学療法剤とをそれを必要としている患者に投与することを含む方法。1以上の化学療法剤が、5-フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びタキソールからなる群より選択される請求項10に記載の方法。癌が、膀胱癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、腎臓癌及び子宮癌からなる群より選択される請求項8~11のいずれか一項に記載の方法。治療において使用するための請求項1~6のいずれか一項に記載の化合物又は塩。癌の治療において使用するための請求項1~6のいずれか一項に記載の化合物又は塩。癌の治療において電離放射線と同時に、別々に、又は連続して併用して使用するための請求項1~6のいずれか一項に記載の化合物又は塩。癌の治療において1以上の化学療法剤と同時に、別々に、又は連続して併用して使用するための請求項1~6のいずれか一項に記載の化合物又は塩。1以上の化学療法剤が、5-フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びタキソールからなる群より選択される請求項16に記載の使用のための化合物又は塩。癌が、膀胱癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、腎臓癌及び子宮癌からなる群より選択される請求項14~17のいずれか一項に記載の使用のための化合物又は塩。薬学的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤と、任意で他の治療成分と共に、請求項1~6のいずれか一項に記載の化合物又は塩を含む医薬組成物。本発明は、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンである化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。好ましい実施形態は、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンメタンスルホン酸塩、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン酢酸塩、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンヘミシュウ酸塩、及びR-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンヘミコハク酸塩である。具体的な実施形態として、本発明は、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンである化合物を提供する。本発明は、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンのメタンスルホン酸塩、酢酸塩、ヘミシュウ酸塩、及びヘミコハク酸塩を提供する。別の実施形態は、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンの水和物である。本発明は、結晶形のR-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン水和物を提供する。また、本発明は、15.73、17.71及び20.12からなる群より選択されるピークのうちの1以上と合わせて、5.17で2θ±0.2のピークを有するX線粉末回折パターンを特徴とする結晶形のR-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン水和物を提供する。本発明は、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩と、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明は、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤と、任意で他の治療成分と共に、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩を含む医薬組成物を提供する。本発明は、癌を治療する方法であって、有効な量のR-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩を、それを必要としている患者に投与することを含む方法を提供する。更に、本発明は、癌を治療する方法であって、有効な量のR-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩と電離放射線とを、それを必要としている患者に投与することを含む方法を提供する。更に、本発明は、癌を治療する方法であって、有効な量のR-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩と1以上の化学療法剤とを、それを必要としている患者に投与することを含む方法を提供する。本発明は、癌を治療する医薬を製造するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩の使用を提供する。更に、本発明は、癌を治療する医薬を製造するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩の使用であって、前記治療が、電離放射線との併用療法を含む使用を提供する。更に、本発明は、併用療法によって癌を治療する医薬を製造するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩の使用であって、前記併用療法による治療が、同一の患者に対する前記医薬の投与及び1以上の化学療法剤の投与を含む使用を提供する。本発明は、治療において使用するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。更に、本発明は、療法において使用するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩、及び電離放射線を提供する。更に、本発明は、療法において使用するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩、及び1以上の化学療法剤を提供する。本発明は、癌の治療において使用するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。更に、本発明は、癌の治療において使用するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩、及び電離放射線も提供する。更に、本発明は、癌の治療において使用するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩、及び1以上の化学療法剤を提供する。本発明は、癌を治療する医薬を製造するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩の使用であって、前記医薬が、電離放射線と同時に、別々に、又は連続して投与される使用を提供する。本発明は、癌を治療する医薬を製造するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩の使用であって、前記医薬が、1以上の化学療法剤も含むか、又は1以上の化学療法剤と同時に、別々に、若しくは連続して投与される使用を提供する。本発明は、癌の治療において電離放射線と同時に、別々に、又は連続して併用するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。本発明は、癌の治療において1以上の化学療法剤と同時に、別々に、又は連続して併用するための、R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。更に、本発明は、1以上の化学療法剤が5-フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びタキソールからなる群より選択される、本明細書に記載する方法及び使用の好ましい実施形態を提供する。更に、本発明は、2つの化学療法剤が5-フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びタキソールからなる群より選択される、本明細書に記載する方法及び使用のより好ましい実施形態を提供する。また、本発明は、化学療法剤が5-フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びタキソールからなる群より選択される、本明細書に記載する方法及び使用の更により好ましい実施形態を提供する。本明細書に記載する方法及び使用の好ましい実施形態は、膀胱癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、腎臓癌及び子宮癌からなる群より選択される癌である。上記で使用されたとき且つ本発明の明細書全体にわたって、特に指示されない限り、以下の用語は、以下の意味を有すると理解するものとする:薬学的に許容し得る塩は、本発明の化合物の比較的無毒な無機塩及び有機塩を指す。本発明の化合物は、例えば、多くの無機酸及び有機酸と反応して、薬学的に許容し得る塩を形成することができる。このような薬学的に許容し得る塩及びそれを調製する慣用的な方法は、当該技術分野において周知である。例えば、P.Stahlら,HandbookofPharmaceuticalSalts:Properties,Selection,andUse,VCHA/Wiley-VCH,2002年;S.M.Bergeら,PharmaceuticalSalts,JournalofPharmaceuticalSciences,Vol.66,No.1,1977年1月を参照されたい。本発明の化合物は、好ましくは、1以上の薬学的に許容し得る担体、希釈剤又は賦形剤を用いて医薬組成物として製剤化され、様々な経路によって投与される。好ましくは、このような組成物は、経口、皮下、又は静脈内投与用である。このような医薬組成物及びそれを調製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Remington:TheScienceandPracticeofPharmacyA.Gennaroら編,第21版,MackPublishingCo.,2005年を参照されたい。用語治療、治療する、治療している等は、障害の進行の遅延又は逆行を含むことを意味する。また、これら用語は、たとえ実際に障害又は状態を消失させなくても、たとえ障害又は状態の進行がそれ自体遅延又は逆行しなくても、障害又は状態のうちの1以上の症状を緩和、寛解、減弱、消失、又は低減することを含む。治療上有効な量又は有効な量は、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床家によって求められている組織、系、動物、哺乳類、又はヒトに対する生物学的若しくは医学的応答、又は望ましい治療効果を誘発する本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩、あるいは本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有する医薬組成物の量を意味する。実際に投与される本発明の化合物の量は、治療される状態、選択される投与経路、投与される実際の本発明の化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答、並びに患者の症状の重篤度を含む関連状況に基づいて医師が決定するであろう。1日当たりの投与量は、通常、約0.1~約10mg/kg体重の範囲内である。場合によっては、前述の範囲の下限を下回る投与量レベルでも適切な量を超えている場合もあり、更に多い投与量が使用される場合もある。本発明の化合物は、当該技術分野において公知である様々な手順、並びに以下の製造例及び実施例に記載される手順により調製され得る。記載される各経路の特定の合成工程を様々な方法で組み合わせて本発明の化合物を調製してもよい。試薬及び出発物質は、概して、当業者が容易に入手可能なものである。他の試薬及び出発物質は、有機化学及び複素環化学の標準的な技術、既知の構造的に類似する化合物の合成に類似する技術、並びに任意の新規手順を含む以下の製造例及び実施例に記載される手順によって作製され得る。以下の製造例及び実施例は、本発明を更に詳細に例証し、化合物の典型的な合成を示すために提供される。本発明の化合物の名称は、Autonomアドインを備えるISISDraw2.5SP2によって一般に提供される。本明細書で使用するとき、以下の用語は、指定の意味を有する:BCAは、ビシンコニン酸を指し;BSAは、ウシ血清アルブミンを指し;DMSOは、ジメチルスルホキシドを指し;DPBSは、二塩基性リン酸緩衝生理食塩水を指し;DTTは、ジチオトレイトールを指し;EtOAcは、酢酸エチルを指し;FBSは、ウシ胎児血清を指し;HEPESは、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸を指し;MEMは、最少必須培地を指し;MeOHは、メタノールを指し;PBSは、リン酸緩衝生理食塩水を指し;PIは、ヨウ化プロピジウムを指し;RNAaseは、リボヌクレアーゼAを指し;RPMIは、ロズウェルパーク記念研究所を指し;TBSTは、トリス緩衝生理食塩水Tween-20を指し;THFは、テトラヒドロフランを指し;TR-FRETは、時間分解蛍光エネルギー転移を指し;トリスは、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを指し;トリトン-Xは、4-1,1,3,3-テトラメチルブチルフェニル-ポリエチレングリコールt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルを指し;Tween-20は、ポリソルベート20を指す。製造例1tert-ブチルR-3-6-クロロピラジン-2-イルオキシピペリジン-1-カルボキシレート水素化ナトリウム225.6g、5.64molをTHF3Lに分散させ、温度を0~5°Cに低下させる。R―3-ヒドロキシ-1-bocピペリジン891.6g、4.43molのTHF3L溶液を、0~5°Cの温度を維持しながら1時間かけて添加する。反応物を1時間撹拌する。同じ温度を維持しながら、THF3L溶液として2,6-ジクロロピラジン600g、4.03molを1.5時間かけて滴下する。反応物を25~30°Cで2時間撹拌し、次いで、氷上に注ぐ。混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出する。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過し、濃縮する。残油をヘキサン中5のジクロロメタンと共に粉砕して、白色の固体として生成物を得る。固体を濾過によって回収し、乾燥させて、1538gの粗物質を得る。粗生成物をヘキサン中5のジクロロメタンと共に粉砕して、定量的収率で白色の固体を得る。ES/MSm/z314.1[MH]。製造例22-メトキシ-6-メチル-ニコチン酸メチルエステル窒素下で2-クロロ-6-メチル-ニコチン酸メチルエステル10.4g、56.52mmolのMeOH撹拌溶液に、室温のナトリウム2.58g、113.04mmolのメタノール80.0mL溶液ナトリウム金属が、窒素雰囲気下でメタノールに溶解しているを添加する。反応混合物を一晩還流させる。反応物を室温に冷却し、酢酸を用いてpHを7に調整する。反応混合物を酢酸エチル100mL及び水30mLで希釈する。有機層を分離し、酢酸エチル2×75mLで水層を抽出する。合わせた有機抽出物をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して粗生成物を得る。収量:7.25g71。1HNMR400MHz,CDCl3,δ8.066-8.047d,J=7.6Hz,1H,6.782-6.764d,J=7.2Hz,1H,4.029s,3H,3.879s,3H,2.483s,3H;ES/MSm/z182.2[MH]。製造例35-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イルアミンn-BuLi1.2M、96.0mL、115.6mmolを-78°Cのアセトニトリル6.08mL、115.4mmolのTHF300mL溶液に添加し、-78°Cで30分間撹拌する。THF200mL中の2-メトキシ-6-メチル-ニコチン酸メチルエステル20g、105.1mmolを添加し、更に30分間-78°Cで撹拌する。反応混合物を、水500mLを用いて-78°Cで冷却し、EtOAc2×250mLで洗浄する。水層を分離し、蒸発させる。これをトルエンと共に2回共蒸留させて、3-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-3-オキソ-プロピオニトリルを得る。収量=21.4g粗製物。ES/MSm/z191.1[MH]。3-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-3-オキソ-プロピオニトリル21g、110.4mmolのエタノール200mL溶液を、密閉したチューブに入れる。ヒドラジン水和物32.1mL、662.4mmol及び酢酸21.0mLを添加し、反応物を2時間100°Cで加熱する。溶媒を蒸発させて除去し、反応混合物をEtOAc500mL及び飽和重炭酸ナトリウム溶液100mLで希釈する。有機層を分離し、水層をEtOAc2×250mLで抽出する。合わせた有機抽出物をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗生成物を得、これを更に精製することなく次の工程で用いる。収量=16.5g73。1HNMR400MHz,DMSO-d6δ11.50bs,1H,7.90d,J=7.6Hz,1H,6.86d,J=7.6Hz,1H,5.88s,1H,4.64s,2H,3.91s,3H,2.38s,3H。製造例45-アミノ-3-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-ピラゾール-1-カルボン酸tertブチルエステル5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イルアミン16.0g、78.3mmolのTHF200mL溶液を、0°CのNaH鉱油中60、3.4g、85.0mmolのTHF200mL撹拌懸濁液にゆっくり添加する。0°Cで15分間後、ジ-tert-ブチルジカーボネート19.8mL、86mmolを反応混合物にゆっくり添加し、0°Cで30分間撹拌する。反応混合物を氷水およそ250mLで冷却し、生成物を酢酸エチル2×500mLに抽出する。合わせた有機部分を水及び飽和NaCl溶液200mLで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、粗物質を得る。この物質をヘキサンと共に2回粉砕して、18.5g78の表題化合物を得る。1HNMR400MHz,DMSO-d6δ8.05d,J=7.6Hz,1H,6.90d,J=7.2Hz,1H,6.28s,2H,5.85s,1H,3.90s,3H,2.40s,3H,1.56s,9H。製造例5R-3-{6-[2-tert-ブトキシカルボニル-5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イルアミノ]-ピラジン-2-イルオキシ}-ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル1,4-ジオキサン1.4L中5-アミノ-3-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-ピラゾール-1-カルボン酸tert-ブチルエステル50.0g、164.5mmol、tert-ブチルR-3-6-クロロピラジン-2-イルオキシピペリジン-1-カルボキシレート56.6g、180.9mmol、4,5-ビス-ジフェニルホスファニル-9,9-ジメチル-9H-キサンテン14.2g、24.6mmol及びCs2CO385.5g、263mmolの混合物を2個の並んだ丸底フラスコに均等に分け、両方を2時間アルゴンでパージする。PdOAc25.4g、24.6mmolを添加し各容器に半分ずつ、1時間パージし続ける。次いで、反応物を1時間90~95°Cで加熱する。反応混合物を室温に冷却し、合わせ、酢酸エチル1Lで希釈する。次いで、混合物を珪藻土を通して濾過し、酢酸エチルで洗浄し、濾液を濃縮する。粗生成物を、溶離剤として15EtOAc/ヘキサンを用いてシリカゲルで精製して、55g収量57の白色粉末を得る。55gの精製生成物を、15gの同様に調製及び精製した物質20gの5-アミノ-3-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-ピラゾール-1-カルボン酸tert-ブチルエステルから得たと合わせる。合わせた70gの物質をTHF及びメタノール1.4Lの4:1混合物に溶解させ、QuadraSil商標AP140gで2時間処理する。反応混合物を珪藻土を通して濾過し、酢酸エチル4×100mLで洗浄する。濾液を、再度QuadraSil商標AP140gと共に2時間撹拌し、上記の通り濾過する。溶媒を蒸発させて、白色の固体として表題化合物を得る。収量=70g47。ES/MSm/z582.5[MH]。実施例1R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンR-3-{6-[2-tert-ブトキシカルボニル-5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イルアミノ]-ピラジン-2-イルオキシ}-ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル13.0g、22.3mmolのジクロロメタン150mL撹拌溶液に、0°Cで5分間にわたってトリフルオロ酢酸12.4mL、167mmolのジクロロメタン20mL溶液を添加する。反応物を室温に加温し、3時間撹拌する。反応物をジクロロメタン1000mLで希釈し、次いで、飽和重炭酸ナトリウム溶液250mLを添加し、次いで、4時間撹拌する。有機部分を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させる。得られる物質をイソプロパノールから結晶化させて、望ましい生成物を得る。収量=7.2g85。1HNMR400MHz,DMSO-d6δ12.40s,1H,9.71s,1H,8.02d,J=7.6Hz,1H,7.97s,1H,7.46s,1H,6.93d,J=7.6Hz,1H,6.91s,1H,4.94-4.86m,1H,3.97s,3H,3.20-3.13m,1H,2.83-2.75m,1H,2.57dd,J=12.0,8.4Hz,1H,2.53-2.45mobscured,1H,2.42s,3H,2.15-2.05m,1H,1.71-1.63m,1H,1.60-1.49m,1H,1.49-1.40m,1H;ES/MSm/z382.5[MH]。実施例2R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンメタンスルホン酸塩メタンスルホン酸0.247g、2.57mmolを、0°CのR-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン0.982g、2.57mmolのジクロロメタン25mL撹拌溶液に添加する。反応物を室温に加温し、45分間撹拌する。溶媒を蒸発させ、得られる塩をエーテル10mL及びペンタン10mLで連続して洗浄して、望ましい生成物を得る。収量=1.139g92.6。1HNMR400MHz,DMSO-d6,δ12.5bs,1H,9.81s,1H,8.73bs,1H,8.54bs,1H,8.07s,1H,7.96d,J=7.6Hz,1H,7.56s,1H,6.95d,J=7.6Hz,1H,6.81s,1H,5.31-5.24m,1H,3.97s,3H,3.48-3.39m,1H,3.39-3.30m,1H,3.18-3.10m,1H,3.10-3.01m1H,2.43s,3H,2.32s,3H,2.03-1.85m,3H,1.73-1.65m,1H;ES/MSm/z382.4[MH]。実施例3R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン酢酸塩R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン0.100g、0.26mmolのジクロロメタン10mL溶液に、0°Cのジクロロメタン1mLに溶解している酢酸0.015mL、0.26mmolを添加する。反応混合物を室温で60分間撹拌し、次いで、溶媒を蒸発させて、残渣を得る。残渣を、ジエチルエーテル20mL、次いでn-ペンタン20mLと共に粉砕する。物質を高真空下で4時間乾燥させて、望ましい生成物を得る。収量=0.060g51.8。1HNMR400MHz,DMSO-d6δ12.40bs,1H,9.70s,1H,8.02d,J=7.6Hz,1H,7.98s,1H,7.46s,1H,6.94d,J=7.6Hz,1H,6.90s,1H,4.97-4.38m,1H,3.98s,3H,3.20-3.13m,1H,2.83-2.74m,1H,2.66-2.56m,1H,2.42s,3H,2.14-2.03m,1H,1.89s,3H,1.74-1.62m,1H,1.61-1.51m,1H,1.50-1.40m,1H,1.30-1.20m,1H;ES/MSm/z382.5[MH]。実施例4R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンヘミシュウ酸塩R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン0.100g、0.26mmolのジクロロメタン10mL溶液に、0°CのMeOH0.1mLに溶解しているシュウ酸0.012mg、0.13mmolを添加する。反応混合物を室温で60分間撹拌し、次いで、溶媒を蒸発させて、残渣を得る。残渣を、ジエチルエーテル20mL、次いでn-ペンタン20mLと共に粉砕する。物質を高真空下で4時間乾燥させて、表題化合物を得る。収量=0.095g77。1HNMR400MHz,DMSO-d6δ9.77s,1H,8.07s,1H,7.95d,J=7.6Hz,1H,7.55s,1H,6.95d,J=7.6Hz,1H,6.79s,1H,5.33-5.24m,1H,3.97s,3H,3.45-3.30m,2H,3.18-3.09m,1H,3.08-2.98m,1H,2.42s,3H,2.05-1.85m,2H,1.74-1.63m,1H,1.18-1.10m,1H;ES/MSm/z382.4[MH]。実施例5R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミンヘミコハク酸塩R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン0.1g、0.26mmolのジクロロメタン10mL溶液に、室温のエタノール1mL、50°Cで溶解に溶解しているコハク酸0.015g、0.13mmolを添加する。反応混合物を室温で2時間撹拌する。溶媒を蒸発させ、得られた残渣をジエチルエーテル20mL、次いでn-ペンタン20mLと共に粉砕する。物質を高真空下で8時間乾燥させて、表題化合物を得る。収量=0.102g78。1HNMR400MHz,DMSO-d6δ12.4bs,1H,9.72s,1H,8.05-7.96m,2H,7.48s,1H,6.93d,J=7.6Hz,1H,6.86s,1H,5.06-4.97m,1H,3.97s,3H,2.90-2.81m,1H,2.74-2.62m,1H,2.42s,3H,2.30s,2H,2.09-2.01m,1H,1.80-1.60m,2H,1.57-1.46m,1H,1.14-1.10m,1H,1.10-1.00m,1H;ES/MSm/z382.4[MH]。実施例6R-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン水和物48時間周囲温度で、5:95水-エタノール混合物10mLにR-[5-2-メトキシ-6-メチル-ピリジン-3-イル-2H-ピラゾール-3-イル]-[6-ピペリジン-3-イルオキシ-ピラジン-2-イル]-アミン52.1mg;ES/MSm/z382.2[MH]を懸濁させ、スラリー状にする。白色の結晶質固体を吸引濾過によって回収する。35kV及び50mAで稼働する、CuKa源λ=1.54060Å及びVantec検出器を備えるBrukerD4EndeavorX線粉末回折計で結晶質固体のX線粉末回折XRDパターンを得る。2θにおいて0.009°の刻み幅で、2θにおいて4~40°でサンプルをスキャンする。乾燥粉末を石英サンプルホルダに充填し、スライドガラスを用いて平滑表面を得る。この場合、2θにおける±0.2のピーク位置変動は、指定の結晶形の絶対的同定を妨げることのない電位変化を考慮に入れる。結晶形の確認は、ピーク単位:°2θ、典型的にはより顕著なピークを識別する任意の独自の組合せに基づいて行ってよい。周囲温度及び相対湿度で回収した結晶形回折パターンを、8.85及び26.77°2-シータのNIST675基準ピークに基づいて調整した。したがって、化合物のサンプル結晶形は、以下の表1に記載する通り、CuKa放射を使用するXRDパターンにより、回折ピーク2-シータ値を有すると特徴付けられる。具体的には、パターンは、回折角0.2°の許容差で、15.73、17.71及び20.12からなる群より選択されるピークの1以上と合わせて5.17にピークを含む。Chk1生化学アッセイChk1の生化学的活性に対する化合物の影響は、CHK1/基質ペプチドフィルタ結合アッセイを使用して測定することができる。このアッセイでは、Cdc25のアミノ酸配列残基206~225に基いた合成ペプチドを、組換え型Chk1タンパク質キナーゼのホスホ-アクセプター基質として使用する。ホスホ-ドナー基質としてγ-33P-ATPを用いて、Chk1は、放射性γ-33リン酸基を前記合成ペプチドに転移させる。反応は、陽イオン交換濾紙プレートにペプチド基質を捕捉し、放射されるβ粒子をシンチレーション計数することによって測定される。96ウェルV底ポリスチレンプレートでキナーゼ反応反応容積40μLを実施する。Chk1酵素の添加によって反応を開始させる。最終反応条件は、67mMのHEPESナトリウム塩pH7.4、0.007v/vのTRITON商標X-100、2.7mMのDTT、2.7mMのMgCl2、12μMのペプチド基質、60μMのATP二ナトリウム塩、0.75μCiのγ-33P-ATP、0.75nMの活性Chk1酵素、4v/vのDMSO、及び化合物の段階希釈物1:3段階希釈、20μMで開始、10点である。Chk1酵素の添加に続いて、反応物を90分間室温でインキュベートし、次いで、140μLのリン酸を添加して反応を終了させる。反応混合物をホスホセルロース陽イオン交換紙不透明濾板の対応するウェルに移して、30分間静置する。濾板を、真空マニホールド中にて、0.5のリン酸v/v200μLで5回洗浄する。濾板を一晩乾燥させた後、40μLのMicroscint商標-20を板の各ウェルに添加する。室温で4時間撹拌した後、MicroBetaTriluxマイクロプレートシンチレーションカウンターPerkinElmerを用いて板の放射活性を測定する。IC50の測定については、各板において実行した対照から得られるシンチレーション計数比を用いて各濃度の阻害率を計算する。次いで、ActivityBase4.0を使用して、10点化合物濃度データを4-パラメータロジスティック方程式に適合させる。得られる曲線から絶対的なIC50値を計算する。本発明の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例1の化合物を試験すると、<0.001μMn=6のIC50を有することが見出される。更に、実施例2の化合物を試験すると、<0.001μMn=3のIC50を有することが見出される。これら結果は、本発明の範囲内の化合物がChk1の強力な阻害剤であることを示す。Chk2生化学アッセイChk2の生化学的活性に対する化合物の影響は、CHK2/基質ペプチドフィルタ結合アッセイを使用して測定することができる。このアッセイでは、Cdc25Cのアミノ酸配列残基206~225に基いた合成ペプチドを、組換え型Chk2タンパク質キナーゼのホスホ-アクセプター基質として使用する。ホスホ-ドナー基質としてγ-33P-ATPを用いて、Chk2は、放射性γ-33リン酸基を前記合成ペプチドに転移させる。反応は、陽イオン交換濾紙プレートにペプチド基質を捕捉し、放射されるβ粒子をシンチレーション計数することによって測定される。96ウェルV底ポリスチレンプレートでキナーゼ反応反応容積40μLを実施する。Chk2酵素の添加によって反応を開始させる。最終反応条件は、67mMのHEPESナトリウム塩pH7.4、0.007v/vのTRITON商標X-100、2.7mMのDTT、2.7mMのMgCl2、12μMのペプチド基質、60μMのATP二ナトリウム塩、0.75μCiのγ-33P-ATP、1.4nMの活性Chk2酵素、4v/vのDMSO、及び化合物の段階希釈物1:3段階希釈、20μMで開始、10点である。Chk2酵素の添加に続いて、反応物を90分間室温でインキュベートし、次いで、140μLのリン酸を添加して反応を終了させる。反応混合物をホスホセルロース陽イオン交換紙不透明濾板の対応するウェルに移して、30分間静置する。濾板を、真空マニホールド中にて、0.5のリン酸v/v200μLで5回洗浄する。濾板を一晩乾燥させた後、40μLのMicroscint登録商標-20を板の各ウェルに添加する。室温で4時間撹拌した後、MicroBetaTriluxマイクロプレートシンチレーションカウンターPerkinElmerを用いて板の放射活性を測定する。IC50の測定については、各板において実行した対照から得られるTR-FRET比を用いて各濃度の阻害率を計算する。次いで、ActivityBase4.0を使用して、10点化合物濃度データを4-パラメータロジスティック方程式に適合させる。得られる曲線から絶対的なIC50値を計算する。本発明の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例1の化合物を試験すると、0.011μMSE=0.002、n=6のIC50を有することが見出される。更に、実施例2の化合物を試験すると、0.012μMSE=0.008、n=3のIC50を有することが見出される。これら結果は、本発明の範囲内の化合物がChk2の強力な阻害剤であることを示す。Chk1の自己リン酸化細胞に基づくアッセイChk1の阻害剤は、タンパク質のキナーゼ活性によって、DNA損傷応答が活性化されている細胞において基質がリン酸化されるのを防ぐ。Chk1の容易に検出できる基質は、Chk1自体の自己リン酸化部位であるセリン296である。以下の免疫ブロットアッセイを用いて、Chk1のセリン296のリン酸化の量、及び間接的にChk1タンパク質キナーゼの活性レベルを測定することができる。10v/vの熱不活化ウシ胎児血清、1×MEM非必須アミノ酸、1×ピルビン酸ナトリウムを添加した、L-グルタミンと共にアール平衡塩類溶液を含有するMEM中でHeLa細胞を培養し、24ウェル細胞培養プレートの1ウェル当たり600μLのMEM培養培地中に1×105個の細胞をプレーティングした。37°C、5CO2及び湿度95~100で24時間細胞をインキュベートする。培養培地中4μMのドキソルビシン原液のうちの16μLを各適切なウェルに添加して、ドキソルビシンの最終濃度を100nMにする。プレートをインキュベータに戻して、更に24時間インキュベートした後、Chk1阻害剤化合物を添加する。化合物を100のDMSOで10mMになるように溶解させ、次いで、40v/vのDMSOで2mMに希釈し、次いで、培養培地及び4v/vのDMSOで100μMに希釈する。次いで、100μM~0.005μMの範囲の前記化合物の段階希釈物1:3を調製する。66μLの化合物原液をプレートの適切なウェルに添加して、最終DMSO濃度を0.4v/vに、最終化合物濃度範囲を1μM~0.0005μMにする。プレートをインキュベータに戻して、更に2時間インキュベートし、次いで、細胞溶解及び処理のために取り出す。次いで、プレートから培地を除去し、各ウェルを氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水DPBS0.5mLで一回洗浄し、全ての液体を除去し、残りの手順のためにプレートを氷上に置く。各ウェルに、ホスファターゼ阻害剤カクテルSigma、カタログ番号P0044P5725及びプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤RocheDiagnostics、カタログ番号11836153001を含有する細胞抽出バッファからなる75μLの氷冷溶解バッファを添加する。10分間後、各ウェルからこすり取り、氷上の1.5mLポリプロピレン微小遠心管に溶解物を移す。各溶解物を、水/氷浴に懸濁させながら、プレートカップホーンソニケーターMisonixで45秒間超音波処理する。各サンプル50μLを、4×Laemmliサンプルバッファを25μL含有する0.5mLのポリプロピレン微小遠心管に移し、5分間95°Cで加熱し、-80°Cで凍結保存する。残りの溶解物は、タンパク質濃度の測定BCAタンパク質アッセイキット、ThermoScientificに使用する。サンプルバッファ中各細胞溶解物5μgをE-Page96ウェルゲルに適用し、電気泳動に供する。当技術分野において十分に理解されている手順に従って、ゲルからImmobilon-PメンブレンPVDF0.45μmにタンパク質を電気転写するTowbinら,PNAS1979年769,4350-4。メンブレンを10mMのトリス/HClpH8.0、150mMのNaCl及び0.05v/vのTween20TBSTで短時間すすぎ、TBST/5v/vで再構成したCarnation登録商標インスタントミルク中に25°Cで1時間浸漬する。メンブレンを5分間TBSTで4回洗浄し、次いで、ウサギ抗-ホスホ-Chk1セリン296を適切に希釈したTBST/5w/vウシ血清アルブミン中に24時間4°Cで浸漬する。メンブレンを25°Cにて5分間TBSTで4回洗浄し、次いで、ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしているロバ抗ウサギIgGGEHealthcare、カタログ番号NA9340の適切な希釈物を含有するTBST/5ミルク中に2時間25°Cで浸漬して、自己リン酸化されたChk1タンパク質を検出する。メンブレンを、再度25°Cにて5分間TBSTで4回洗浄する。メンブレンに固定された抗原-抗体-レポーターコンジュゲートを、FUJILAS-4000イメージングシステムを使用してSuperSignalWesternFemtoHRP-検出試薬で検出する。ホスホ-Chk1ser296のバンド強度をTotalLabソフトウェアNonlinearDynamicsを用いて計算する。ドキソルビシン誘導性Chk1自己リン酸化の阻害率を、以下の式を用いることによって計算する:阻害率=サンプルのホスホChk1バンド強度-ドキソルビシン無しのネガティブコントロールのホスホChk1バンド強度/ドキソルビシンポジティブコントロールのホスホChk1バンド強度-ドキソルビシン無しのネガティブコントロールのホスホChk1バンド強度×100。本発明の化合物を、実質的に上記の通り実行したこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例1の化合物をこのアッセイで試験すると、<0.001μMn=1のEC50を有することが見出される。例えば、実施例3の化合物をこのアッセイで試験すると、<0.001μMn=1のEC50を有することが見出される。これら結果は、本発明の範囲内の化合物がChk1の強力な阻害剤であることを示す。ドキソルビシン誘導性G2Mチェックポイント廃止のHeLa細胞に基づくAcumenアッセイChk1の阻害剤は、トポイソメラーゼII阻害剤であるドキソルビシンで処理されたp53-マイナス腫瘍細胞におけるG2MDNA損傷チェックポイントを無効にする。G2Mチェックポイント廃止の指標は、細胞がG2Mチェックポイントを通過し、有糸分裂に入った後に生じるセリン10におけるヒストンH3のリン酸化である。以下のハイコンテンツイメージングアッセイを用いて、細胞におけるヒストンH3のリン酸化を測定することができる。HeLa細胞を、10v/vのFBSを添加したMEM培地で培養し、1ウェル当たり100μLの体積のポリD-リシンでコーティングされた透明底黒色プレートに1ウェル当たり2000個の細胞をプレーティングする。次いで、18~24時間37°C、5CO2及び相対湿度95、細胞培養インキュベータにおいてプレートをインキュベートする。最初のインキュベーション後、20μLのMEM培地と625nMのドキソルビシンを含有している10のFBSとをプレートの適切なウェルに添加して、最終濃度を125nMにする。プレートを、インキュベータに戻し、G2Mチェックポイントで細胞を停止させるのに十分な24時間インキュベートする。次の日、細胞を化合物で処理する。化合物を10mMになるように100のDMSOに溶解させ、次いで、50μMで始めて、MEMと4v/vDMSOとで10倍原液に希釈する。次いで、50μM~0.39μMの範囲の化合物の段階希釈物1:2を調製する。13μLの化合物原液をプレートの適切なウェルに添加して、最終DMSO濃度を0.4v/vに、最終化合物濃度範囲を5μM~0.039μMにする。プレートをインキュベータに戻して更に7時間インキュベートし、次いで、固定するために取り出す。液体を各ウェルから慎重に除去し、100μLのPREFER商標固定剤を添加する。プレートを室温で20分間保持し、固定剤を除去し、次いで、10分間かけてDPBS中0.1v/vのTriton登録商標X100を100μL/ウェル添加することにより細胞を透過処理する。溶液を除去し、プレートを1ウェル当たり100μLのDPBSで2回洗浄し、次いで、室温で1時間かけて50μg/mLのリボヌクレアーゼARNAase、ウシの膵臓由来を含有しているDPBS100μLを添加する。RNAase溶液を除去し、ウサギ抗pHH3ser10及び1w/vのBSAの1:500希釈物を含有しているRNAase溶液50μLを各ウェルに添加することによって、セリン10pHH3においてリン酸化されたヒストンH3の存在について細胞を染色する。プレートを密閉し、一晩4°Cで維持する。各プレートを1ウェル当たり100μLのDPBSで2回洗浄することにより一次抗体を除去し、DPBS及び1w/vBSA中AlexaFluor登録商標488ヤギ抗ウサギIgGHL2mg/mLの1:750希釈物50μLで置換する。プレートを室温で1時間、光から保護するためにアルミニウム箔で被覆した状態で維持する。プレートを、再度1ウェル当たり100μLのDPBSで2回洗浄し、15nMのヨウ化プロピジウム原液からPBSで1:100希釈100μLで置換する。光からプレートを保護するためにプレートを黒いシールで密閉する。プレートを30分間でインキュベートして、核を染色する。488nmの励起TTPLABTECHLTCを用いてACUMENEXPLORER商標レーザー走査型蛍光マイクロプレートサイトメーターを用いてプレートをスキャンして、pHH3、並びに2N及び4Nを含むDNA含量を測定する。pHH3陽性細胞は、Alexa488からの519nmにおける平均強度によって同定される。ヨウ化プロピジウム/DNAからの655~705nmにおける合計強度を用いて、細胞周期2N細胞、4N細胞における個別細胞及び亜集団を同定する。各集団の最終読出し値は、合計細胞を正規化し、pHH3、2N及び4Nの最終アッセイ出力を作成することによって決定される。次いで、100nMで阻害剤対照化合物の最大濃度で細胞を処理して、各化合物の最終の活性を決定することによって、100の活性を決定する。0の活性は、化合物未処理に基づく。相対EC50は、ACTIVITYBASE商標、エクセルフィット、4パラメータロジスティック適合を用いる曲線適合、equation205を用いて、100の対照最大に対するpHH3を測定することによって決定される。本発明の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。実施例1の化合物を試験すると、0.029μMn=1のEC50を有することが見出される。実施例2及び実施例3の化合物を試験すると、それぞれ0.033μMn=1及び0.019μMn=1のEC50結果を有することが見出される。これら結果は、本発明の範囲内の化合物が、G2MDNA損傷チェックポイントを無効にすることを示す。ECtfs二倍感作アッセイChk1の阻害剤は、S期内のチェックポイントを廃止することを通してゲムシタビン又は他の細胞毒の抗増殖性活性を増強して、DNA損傷を維持及び増加させることができる。DNA損傷後に腫瘍細胞が継続して増殖する能力は、そのDNAを複製する細胞の能力を測定することにより分析することができる。このアッセイは、細胞がDNA損傷を修復する機会を有した後、細胞がそのDNAを複製する能力を評価する。このアッセイでは、ゲムシタビンの希釈系列で細胞を処理し、次いで、22時間後、実施例3の化合物で処理する。更に44時間後、MTS3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-5-3-カルボキシメトキシフェニル-2-4-スルホフェニル-2H-テトラゾリウム色素還元アッセイによって相対的な細胞数を評価する。ECtfsパラメータは、Chk1阻害が存在しない状態でこのアッセイにおいて測定される、ゲムシタビンのGI90濃度を半分に減少させるのに必要なChk1阻害剤の濃度の尺度である。HT-29細胞ATCCから入手したを、RPMI1640及び10v/vの熱不活化FBS中で増殖させる。96ウェル組織培養プレートに100μLの体積で1ウェル当たり2.5×103個の細胞をプレーティングし、24時間インキュベートする。マッコイの5A培地改変1×を用いて6倍濃度のゲムシタビン希釈物を調製し、1ウェル当たり20μLをウェルに添加する。ゲムシタビン希釈物を、ゲムシタビンの最高最終濃度が1.0μMになるように設定し、3倍刻みで0.5nMまで希釈する。Chk1阻害剤は、4000×最終濃度になるまでDMSOで希釈し、次いで、マッコイ培地で666倍希釈して、6倍原液を作製することによって調製する。Chk1阻害剤の希釈は、25nMから始めて0.3nMまで2.5倍刻みで進める。ゲムシタビン添加の22時間後に、120μLの培地及びゲムシタビンを含有するウェルに24μLの体積のChk1阻害剤を添加する。各ゲムシタビン希釈物に、単一のChk1阻害剤希釈物を添加する。対照ウェルにはDMSO、ゲムシタビン又はChk1阻害剤のみを添加する。Chk1阻害剤の添加の44時間後、CellTiter96登録商標AQueousアッセイ試薬30μLを各ウェルに添加し、1時間45分間室温で保持する。490nmでSpectraMax250MolecularDevices分光光度計を用いて吸光度を読み取る。SpectraMax分光光度計から得られたデータをGraphPadPrism4.0で分析する。まず、各プレートから得られたデータのマトリクスにおいて全ての他の値から平均した細胞無しの対照の吸光度を減じる。次に、デュープリケートのデータ点を平均する。各Chk1阻害剤濃度についてデータを正規化し、0細胞数を補正されたA490=0として設定し、100細胞数を0nMのゲムシタビン平均値として設定する。次いで、これら結果を変換する。ゲムシタビン濃度をlog濃度に変換し、正規化した細胞数値を阻害率に変換する阻害率=100-正規化した値。変換したデータをプロットし、非線形回帰を実施して、各Chk1阻害剤濃度におけるゲムシタビンのIC50値を推定する。非線形回帰を計算して、傾斜を変化させ、用量応答曲線の頂部又は底部については制約されない。ECtfs値を以下の通り計算する:各Chk1阻害剤濃度におけるゲムシタビンのGI50値を決定し、プロットし、ゲムシタビン単独のGI50を2分の1に減少させるのに必要なChk1阻害剤の濃度を内挿によって決定する。本発明の範囲内の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例3の化合物を試験すると、1.0nMSE=0.1、n=3のECtfs値を有することが見出される。更に、25nMの化合物が、HT-29結腸癌細胞においてゲムシタビンのEC50を22nMから3nMへ7分の1に減少させる。単独では、25nMの実施例3の化合物は、HT-29細胞の増殖に対する効果をほとんど有しない。これら結果は、本発明の範囲内の化合物が、低濃度でゲムシタビンの抗増殖性活性を有効に増強することを示す。Chk1インビボ標的阻害アッセイCalu-6細胞を、増殖培地10v/vの熱不活化FBS、1×MEM非必須アミノ酸、1×ピルビン酸ナトリウムを添加した、L-グルタミンと共にアール平衡塩類溶液を含有するMEM中で培養し、拡大する。細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、増殖培地血清を含まない中1×106個の細胞を等体積のBDMatrigel商標マトリクスと混合し、次いで、前照射した4.5Gyヌードマウス無胸腺ヌードマウスの側腹部に皮下注射する。移植腫瘍サイズ=150~200mm3後15日目に、毎日生理食塩水で新たに製剤化したゲムシタビンを、150mg/kgの用量で腹腔内経路によって動物に投与する。6時間後、希NaOHの添加によってpHを6.8に調整した0.2Tween-80/0.5メチルセルロースで製剤化したChk1化合物を経口投与する。Chk1阻害剤投与の2時間後に動物を屠殺し、腫瘍を摘出し、ホスファターゼ阻害剤カクテルSigma、カタログ番号P0044P5725及びプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤RocheDiagnostics、カタログ番号11836153001を含有する氷冷細胞抽出バッファ中で直ちに処理する。15秒間highに設定した電動組織ホモジナイザーを使用して、氷冷した15mLのポリプロピレンコニカルチューブ中にて、1.5~2.0mLの溶解バッファで腫瘍を処理する。氷上でサンプルを維持したまま、25ゲージの針を備える1mLのシリンジを通して溶解物を4回吸い出す。0.35mLの腫瘍溶解物を、4×Laemmliサンプルバッファ0.15mLを含有している1.5mLのポリプロピレン微小遠心管に移す。次いで、サンプルを混合し、95°Cで5分間加熱し、Misonix3000プレートホーンソニケーターで高出力を用いて1分間超音波処理する。次いで、ウエスタンブロットによる標的阻害評価のためにサンプルを氷上で保存するか又は-80°Cで保存する。サンプルバッファ中各腫瘍溶解物5μgをE-Page96ウェルゲルに適用し、電気泳動に供する。当技術分野において十分に理解されている手順に従って、ニトロセルロースBA83ProtranメンブレンWhatman、カタログ番号10402405にタンパク質を転写するTowbinら,PNAS1979年769,4350-4。次いで、メンブレンを処理して、セリン296が自己リン酸化されているChk1タンパク質を測定する。メンブレンを水、次いで10mMのトリス/HClpH8.0、150mMのNaCl及び0.05v/vのTween20TBSTで短時間すすぎ、TBST/5w/vで再構成したCarnationインスタントミルク中に25°Cで1時間浸漬する。次いで、メンブレンを5分間TBSTで4回洗浄する。メンブレンをウサギ―ホスホChk1抗-ホスホ-Chk1セリン296の適切な希釈物中TBST/5w/vBSAに16時間4°Cで浸漬する。次いで、メンブレンを25°Cにて5分間TBSTで4回洗浄し、次いで、ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしているロバ抗ウサギIgGの適切な希釈物を含有するTBST/5ミルク中に2時間25°Cで浸漬して、ホスホ-Chk1ser296を検出する。メンブレンを25°Cにて5分間TBSTで4回再度洗浄する。メンブレン上に固定された抗原-抗体-リポーターコンジュゲートを、SuperSignalWesternFemtoHRP-検出試薬で検出する。シグナルをFUJILAS-4000イメージングシステムを使用して検出及び捕捉する。TotalLabソフトウェアNonlinearDynamicsを用いてホスホ-Chk1ser296バンドの強度を計算する。ゲムシタビン誘導性Chk1自己リン酸化の阻害率を、以下の式を用いることによって計算する:阻害率=サンプルのホスホChk1バンド強度-平均ゲムシタビンMaxポジティブコントロールのホスホChk1バンド強度/平均ネガティブコントロールMinのホスホChk1バンド強度-平均ゲムシタビンMaxポジティブコントロールのホスホChk1バンド強度×100。本発明の範囲内の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例3の化合物を試験すると、1.3mg/kgn=1のChk1自己リン酸化の標的調節50有効量TMED50を有することが見出される。この結果は、本発明の範囲内の化合物が、インビボにおいてChk1タンパク質キナーゼの活性化を強力に阻害することを示す。ヒト腫瘍異種移植片モデルDNA損傷剤による殺腫瘍を強化するChk1阻害剤の能力は、Calu-6肺及びHT-29結腸腫瘍異種移植片有効性モデルを使用してインビボで測定することができる。Calu-6肺癌細胞は、増殖培地10v/vの熱不活化FBS、1×MEM非必須アミノ酸、1×ピルビン酸ナトリウムを添加したL-グルタミンと共にアール平衡塩類溶液を含有するMEM中で培養し、HT-29結腸癌細胞ATCCは、増殖培地10のFBSを添加したマッコイの5A培地中で培養し、拡大する。細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、増殖培地血清を含まない中で5×106個の細胞HT-29又は1×106個の細胞Calu-6を、等体積のBDMatrigel商標マトリクスと混合し、次いで、ヌードマウスCD-1nu/nuの側腹部へ皮下注射する。Chk1阻害剤の皮下投与移植150~200mm3後約16日目に、ゲムシタビンを毎日生理食塩水で新たに製剤化し、60mg/kgの用量で腹腔内経路によって動物に投与する。24時間後、動物に、0.2Tween-80/0.5メチルセルロース中の実施例3の化合物を1日2回皮下投与する。2日間の休息後、投与を更に3周期繰り返す実施例3の化合物を4日間毎に合計4回Q4Dx4オフセット24時間。ビヒクル処理対照群の平均腫瘍サイズからの化合物処理群の平均腫瘍サイズの減少率として腫瘍増殖阻害TGIを計算する。本発明の範囲内の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、ゲムシタビンと組み合わせて投与された実施例3の化合物は、HT-29及びCalu-6腫瘍異種移植片モデルの両方において優れた用量依存的な抗腫瘍活性を示すことが見出され、ゲムシタビンのみに対して腫瘍成長阻害が最高6倍増加する。この結果は、皮下に投与された本発明の範囲内の化合物が、ヒト腫瘍異種移植片モデルにおけるゲムシタビンの抗腫瘍活性を著しく増加させることを示す。Chk1阻害剤の経口投与移植150~200mm3後約16日目に、ゲムシタビンを毎日生理食塩水で新たに製剤化し、40mg/kgの用量で腹腔内経路によって動物に投与する。24時間後、動物に、0.2Tween-80/0.5メチルセルロース中のChk1化合物を1日2回経口経路により投与する。3日間の休息後、投与を更に3周期繰り返した実施例3の化合物を5日間毎に合計4回Q5Dx4オフセット24時間。前段落に記載の通り、腫瘍増殖阻害TGIを計算する。本発明の範囲内の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例3の化合物をゲムシタビンと組み合わせて投与すると、HT-29及びCalu-6腫瘍異種移植片モデルの両方において優れた用量依存的な抗腫瘍活性を示すことが見出され、ゲムシタビンのみに対して腫瘍増殖阻害が最高2.9倍増加する。この結果は、経口投与された本発明の範囲内の化合物が、ヒト腫瘍異種移植片モデルにおけるゲムシタビンの抗腫瘍活性を著しく増加させることを示す。"