ヒト由来の第IX因子FIXおよびヒト由来のトランスフェリンを含む融合タンパク質。前記FIXは、配列番号1のアミノ酸配列で表示されるポリペプチドまたはその機能的同等物であることを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質。前記機能的同等物は、FIXと実質的に同等の機能活性を有し、配列番号1で表示されるアミノ酸配列において、アミノ酸残基が欠失、挿入または置換されたことを特徴とする、請求項2に記載の融合タンパク質。前記トランスフェリンが配列番号2のアミノ酸配列で表示されるポリペプチドまたはその機能的同等物であることを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質。前記機能的同等物は、トランスフェリンと実質的に同等の機能活性を有し、配列番号2で表示されるアミノ酸配列においてアミノ酸残基が欠失、挿入または置換されたことを特徴とする、請求項4に記載の融合タンパク質。前記融合タンパク質は、FIXとトランスフェリンとの間にリンカーを含むことを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質。前記リンカーは、GGGGSNで表示され、この時、Nが1~20の整数であるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする、請求項6に記載の融合タンパク質。前記リンカーは、配列番号3または4のアミノ酸配列で表示されるペプチドであることを特徴とする、請求項7に記載の融合タンパク質。前記リンカーは、トロンビン、因子Xaおよび因子XIaからなる群より選ばれるプロテアーゼによって切断され得るプロテアーゼ切断部位をさらに含むことを特徴とする請求項7に記載の融合タンパク質。前記リンカーは、配列番号5乃至11のいずれか一つのアミノ酸配列で表示されるペプチドであることを特徴とする、請求項9に記載の融合タンパク質。請求項1乃至請求項10のいずれか一項による融合タンパク質配列をコードする遺伝子。前記遺伝子は、配列番号12乃至21の塩基配列で表示される遺伝子からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項11に記載の遺伝子。請求項12による遺伝子を含む組み換えベクター。請求項13の組み換えベクターを含む宿主細胞。前記宿主細胞は、CHO細胞、BHK21細胞、HEK293細胞およびHepG2細胞からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項14に記載の宿主細胞。したがって、本発明の目的は、天然型の第IX因子の生物学的活性を保持する融合タンパク質を提供することである。本発明の他の目的は、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を提供することである。本発明のもう一つの目的は、前記遺伝子を含む組換えベクターを提供することである。本発明のもう一つの目的は、前記組換えベクターを含む宿主細胞を提供することである。上記の目的を達成するために、本発明は、ヒト由来の第IX因子FIXとヒト由来のトランスフェリンを含む融合タンパク質を提供する。上記他の目的を達成するために本発明は、上記融合タンパク質配列をコードする遺伝子を提供する。上記また他の目的を達成するために本発明は、上記の遺伝子を含んでいる組換えベクターを提供する。上記また他の目的を達成するために本発明は、上記組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明に係るFIX活性を有する融合タンパク質は、天然型FIXに比べて高いFIXの生物学的活性を有しているため、FIXを用いた治療において有効に用いることができる。本発明は、第IX因子FIXおよびトランスフェリンを含む融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質のFIXおよびトランスフェリンは、任意の哺乳動物、好ましくは、ヒト由来のもので有り得る。より好ましくは、上記FIXおよびトランスフェリンは、ヒトの血液から発見される各々の天然型タンパク質と95以上の相同性を持つもので有り得る。最も好ましくは、上記FIXは配列番号1のアミノ酸配列を持ち、トランスフェリンは配列番号2のアミノ酸配列を持つものでよい。また、本発明の融合タンパク質には、実質的に同等の機能的活性を持つ機能的同等物または機能的誘導体が含まれる。このような機能的同等物の例として、配列番号1および2で表示されるアミノ酸配列において、アミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的に置換されるか、またはこれらの組み合わせによって変異した変異体を含むことができ、この際、当該変化は、FIXの生物学的活性を付与する活性部位または活性ドメインを実質的に変化させることはない。場合によっては、本発明の融合タンパク質は、これらの物理、化学的性質を増加または減少させる変形を持つことができ、リン酸化phosphorylation、硫酸化sulfation、アクリル化acrylation、糖化glycosylation、メチル化methylation、ファルネシル化farnesylation、アセチル化acetylation、アミド化amidationなどで修飾modificationされることができ、これらの修飾によってFIXの活性が実質的に維持される限り、このような機能的誘導体も本発明の範囲に含まれる。上記融合タンパク質において、FIXおよびトランスフェリンの結合手順は、例えば、FIXのC-末端にトランスフェリンのN-末端が結合するもので有り得る。本発明は、上記融合タンパク質が、FIXとトランスフェリンとの間にリンカーlinkerをさらに含む融合タンパク質を提供する。上記リンカーは、FIXのC-末端とトランスフェリンのN-末端との間に存在し得る。上記リンカーは、両融合パートナーの潜在的干渉を最小化して融合タンパク質のFIX活性を増加させることができる。リンカーは、1個~100個のアミノ酸を有することが好ましいが、これに制限されることはなく、FIXとトランスフェリンとを分離させることのできるいずれのペプチドでも可能である。上記リンカーを構成するアミノ酸配列に特別な制限はないが、グリシンGおよびセリンSを繰り返しまたはランダムなパターンで含むことが望ましい。そのような例として、上記リンカーはGGGGSNNは1以上の整数、好ましくは1~20の整数であるのアミノ酸配列を含むことができ、より好ましくは、配列番号3または4のアミノ酸配列を有するものであり得る表2参照。また、上記リンカーは、損傷した組織において豊富に存在するプロテアーゼによって認識できる、プロテアーゼ切断部位を含むことができる。上記切断部位は、トロンビン、因子Xaおよび因子Xiaからなる群より選択されるプロテアーゼによって切断され得る。このようなプロテアーゼ切断部位を含む融合タンパク質は、作用部位workingsiteにおいてFIXおよびトランスフェリンそれぞれのタンパク質に分離されて、個々のタンパク質として機能することになる。好ましくは、上記リンカーは、配列番号5~11のアミノ酸配列を有してもよい表2参照。本発明によるFIX-トランスフェリン融合タンパク質は、非融合の天然型FIXに比べ1.5倍以上のFIX比活性specificactivityを示す。本発明の一実施態様によると、非融合の天然型FIXの比活性に比べて、本発明による特定の融合タンパク質は、約0.5倍~2倍向上されたFIX比活性を有する表3、4および図8b、8dを参照。本発明はまた、上記融合タンパク質をコードする遺伝子を提供する。上記融合タンパク質をコードする遺伝子は、コドンの縮退degeneracyにより、または上記融合タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、上記融合タンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に対して様々な変形が可能で、コーディング領域を除いた部分においても、タンパク質の発現に影響を及ぼさない範囲内で様々な変形または修飾ができ、そのような変形遺伝子もまた本発明の範囲に含まれる。好ましくは、上記遺伝子は、第IX因子の発現を増加させるための、FIXのイントロンの一部を含むことができる。より好ましくは、FIXのエキソン1の88bpに対応する部分に、FIXのイントロン1の5’末端の981bpおよび3’末端の443bpを含むことができる。また、本発明による上記遺伝子は、リンカー部位をコードする遺伝子を含むことができる。本発明において、融合タンパク質をコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号12~21の塩基配列で表される遺伝子である。本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子は、これを発現するベクターによって提供することができる。本発明は、上記融合タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを提供する。本発明において、ベクターとは、宿主細胞に融合タンパク質をコードするDNAを導入して、融合タンパク質を発現させるための手段を指し、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクター、およびウイルスベクター等を含む通常の全てのベクターを含み、好ましくはプラスミドベクターである。適切な発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーのような発現調節エレメントの外、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含んでおり、目的に応じて多様に製造され得る。開始コドンおよび終止コドンは、遺伝子組換え作物が投与されたとき、個体において必ず作用を表す必要があり、コード配列とインフレームinframeにあらなければならない。また、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含む。ベクターは、自己複製したり、宿主細胞のDNAに組み込まれたりすることができる。具体的には、本発明による組換え発現ベクターは、pcDNA3.1-hygroベクターに上記融合タンパク質配列をコードする遺伝子を挿入して製造することができる。また、本発明は、上記組換え発現ベクターで形質転換されて融合タンパク質を生産する宿主細胞を提供する。宿主細胞に応じてタンパク質の発現量と修飾などが異なって現れるので、目的に最も適した宿主細胞を選択して用いる。宿主細胞としては、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣細胞CHO、ヒト胚性腎細胞HEK293、ハムスター腎臓細胞BHK21、ヒト肝臓癌細胞HepG2などが挙げられるが、これに制限されるものではない。本発明に係る組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換させるために、当分野に公知の方法を用いることができ、このような方法には、電気ショック遺伝子伝達法electroporation、原形質融合法、リン酸カルシウムCaPO4沈殿法および塩化カルシウムCaCl2沈殿法などが含まれるが、これに制限されない。実施例以下、下記の実施例によって本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。―実施例1:FIX発現ベクターの製造―FIX発現ベクターを製造するために、図1aに示すようにFIXタンパク質をコードするポリヌクレオチド断片Eを作製した。上記断片EはFIXの発現効率を高めるために、FIXのエキソンにFIXイントロンの一部を挿入して作製した。つまり、FIXイントロン1の5’末端981bpおよび3’末端443bpの部分をFIXエキソン1の88bpに対応する部分に添加したJBC、vol.270、p.5276-5281。具体的な製造過程は、下記の通りである。<1-1>断片Aの製造pcDNA3.1/Hygro/lacZベクターInvitrogenに配列番号1のFIXkozakORFを挿入し、pcDNA3.1FIXpDNAを得た。具体的には、コザーク配列Kozaksequence;gccaccatggagを含むことができる順方向プライマーF1、配列番号22と逆方向プライマーR1、配列番号23とを作製し、HepG2においてPCRを行い、FIXkozakORFを得た。PCRは、pfuturboDNAポリメラーゼInvitrogen、2.5unit/ul600252を用いて56°Cでアニールして、68°Cで3分間延長する過程を30サイクル反応させて行った。上記PCR産物をプロメガPromega社のpGEMT-easyベクターMadison、Wl、Cat.No.A1360にクローニングした後、塩基配列を確認した。確認されたベクターを鋳型にして、順方向プライマーF2、配列番号24と逆方向プライマーR2、配列番号25とを用いてPCRを行い、FIXkozakORF挿入体を得た。PCRは、pfuturboDNAポリメラーゼInvitrogen、2.5unit/ul600252を用いて58°Cでアニールし、68°Cで3分間延長する過程を1サイクルとして30サイクル反応させ行った。このようにして得た挿入体をBamH1/Spe1で処理した後、BamH1/Xba1酵素で処理したpcDNA3.1/Hygro/lacZに、T4DNAライゲースTakara、2011Aを用いてライゲーションを行い、pcDNA3.1-hygro-FIXKOI発現ベクターを製造した。上記pcDNA3.1FIXpDNAを鋳型とし、センスプライマーF3、配列番号26とアンチセンスプライマーR2、配列番号25およびpfuturboDNAポリメラーゼInvitrogen、2.5unit/ul600252を用いてPCRを行い、図1aの断片Aを得た。PCRは、pfuturboDNAポリメラーゼInvitrogen、2.5unit/ul600252を用いて58°Cでアニールして、68°Cで2分間延長する過程を30サイクル反応させて行った。<1-2>断片Bの製造図1bに示す方法に基づいてFIXのイントロン1イントロンF1XイントロンF2で構成から、図1aの断片BイントロンF1の一部イントロンF2で構成を製造した。具体的には、HEK293のゲノムDNAを鋳型とし、センスプライマーF4、配列番号27およびアンチセンスプライマーR3、配列番号28を用いてPCRを行い、イントロンF2PCR産物を得た。PCRは、pfuturboDNAポリメラーゼInvitrogen、2.5unit/ul600252を用いて58°Cでアニールして、68°Cで2分間延長する過程を30サイクル反応させて行った。上記イントロンF2PCR産物に、センスプライマーF5、配列番号29とアンチセンスプライマーR3、配列番号28およびpfuturboDNAポリメラーゼInvitrogen、2.5unit/ul600252を用いてPCRを行い、イントロンF1の一部とイントロンF2とで構成された断片Bを得た。PCRは、pfuturboDNAポリメラーゼInvitrogen、2.5unit/ul600252を用いて58°Cでアニールして、68°Cで2分間延長する過程を30サイクル反応させ行った。<1-3>断片Cの製造実施例<1-1>および<1-2>で製造された断片AおよびBに、センスプライマーF5、配列番号29とアンチセンスプライマーR2、配列番号25およびpfuturboDNAポリメラーゼInvitrogen、2.5unit/ul600252を用いてPCRを行い、イントロンF1の一部とイントロンF2およびエキソンF2から構成された断片Cを得た。PCRは、pfuturboDNAポリメラーゼInvitrogen、2.5unit/ul600252を用いて58°Cでアニールさせ、68°Cで3分間延長する過程を30サイクル反応させ行った。<1-4>断片Dの製造エキソンF1とイントロンF1とに設定された断片Dを製作するために、HEK293のゲノムDNAを鋳型とし、センスプライマーF6、配列番号30とアンチセンスプライマーR4、配列番号31とを用いてPCRを行った。PCRは、pfuturboDNAポリメラーゼInvitrogen、2.5unit/ul600252を用いて58°Cでアニールして、68°Cで2分間延長する過程を30サイクル反応させ行った。<1-5>短編Eの製造実施例<1-3>および<1-4>で製造された断片CおよびDに、センスプライマーF6;配列番号30とアンチセンスプライマーR2;配列番号25およびpfuturboDNAポリメラーゼInvitrogen、2.5unit/ul600252を用いてPCRを行った。PCRは、58°Cでアニールして、68°Cで3分間延長する過程を30サイクル反応させ行った。上記PCR産物をプロメガ社のpGEMT-easyベクターMadison、WI、Cat.No.A1360にクローニングし、断片Eの配列を確認した。上記断片は、コザックkozak配列とORFおよびイントロン1の一部から構成されており、これをFIXKOIと命名した。<1-6>発現ベクターの製造前記実施例<1-5>で得られたFIXKOIに、センスプライマーF2、配列番号24とアンチセンスプライマーR5、配列番号32とを用いてPCRを行った。PCRは、PhusionHigh-FidelityDNAポリメラーゼFinnzyme、2units/μL、F-530Sを98°Cで30秒間反応させ、98°Cで10秒、58°Cで45秒、72°Cで2分間反応させることを1サイクルとして30サイクル反応させた後、72°Cで7分間反応させて終了した。上記PCR産物をBamH1およびXho1で処理して、pcDNA3.1/hygroベクターを同じ酵素で処理した後、T4DNAライゲースTakara、2011Aを用いてライゲーションligationを行いpcDNA3.1-hygro-FIXKOI発現ベクターを製造した。上記FIXKOI発現ベクターを製造するために、PCRに使用したプライマーを下記表1に示した。-実施例2:FIXKOI-Tf発現ベクターpcDNA3.1-hygro-FIXKOI-Tfの製造-FIXKOIにヒトトランスフェリンTfを連結させた融合タンパク質を発現するベクターを製造した。上記発現ベクターの製造過程を図2に示した。具体的には、実施例1で製造したpcDNA3.1-hygro-FIXKOI発現ベクターを鋳型としてPCRを行い、FIXKOI断片を増幅させた。この時、FIXKOIの終止コドンを除去し、様々なサイズのリンカーをFIXKOIとTfとの間に挿入させるためにAge1部位ACCGGTおよびXho1部位GAGTCTを含むプライマーとして、トレオニンThrおよびグリシンGlyに翻訳されるBgl2部位を内包するセンスプライマーF7;配列番号33、およびAge1とXho1部位を内包し、終止コドンを除去するアンチセンスプライマーR6;配列番号34を用いた。また、PCRのポリメラーゼとしてPhusionHigh-FidelityDNAポリメラーゼFinnzyme、2units/μL、F-530Sを用いた。50μLの反応液1μLベクター鋳型、2μLのプライマーF7およびR6各10pmol/ul、10μLの5xPhusionHF緩衝液、1μLのdNTP、0.5μLのPhusionDNAポリメラーゼおよび35.5μLの水を98°Cで30秒間反応させ、98°Cで10秒、58°Cで45秒、72°Cで2分間反応させることを1サイクルとして30サイクル反応させた後、72°Cで7分間反応させて終了した。増幅されたPCR産物FIXKOI-Age1-Xho1をBgl2およびXho1で37°Cにて処理して切断し、BamH1およびXho1で処理したpcDNA3.1/Hygroベクターにクローニングした。一方、ヒトトランスフェリンTfを得るために、ヒトトランスフェリンがクローニングされたpCMV6-NEOベクターを用意した。具体的には、ヒトC-タイプトランスフェリンGenBankaccessionNo.NM_001063.2のcDNAをOrigene社Origene、Cat:SC322130から購入した後、シークエンシングして塩基配列を確認し、そこからGAT→AATAsp197AsnおよびCCA→CAAPro332Glnの突然変異があることを発見した。突然変異した配列を、PCRベースの突然変異法PCR-basedmutagenesisを用いて変異誘発プライマーF8、R7、F9、R8配列番号35~38を使用して復元させた。上記PCRは、20μLの反応液1μLヒトcDNAクローンを含むプラスミドDNAOrigene、Cat:SC322130、1μLのF8またはR7プライマー10μM、1μLのF9またはR8プライマー10μM、0.4μLdNTP10mM、2μL10XPfuturboPCR緩衝液Stratagene、14.2μLの蒸留水および0.4μLのPfuturboDNAポリメラーゼStratagene、600252、2.5units/μLを94°Cで5分間反応させ、94°Cで30秒、58°Cで1分、72°Cで10.5分反応させることを1サイクルとして17サイクル反応させた後、72°Cで7分間反応させることによって終了させた。突然変異していないプラスミド鋳型を除去するために、PCR生成物を制限酵素DpnINEB、R0176Sで、37°Cで1時間処理した。合成したベクターをE.coliHITcompetentcell、DH5α、RH617において増幅させ、DNAの準備minipreparationおよび制限酵素処理により選別した。選別された陽性クローンをF10、R9、F11、R10、F12、R11、F13、R12、F14およびPrimerXL39Origene配列番号39~48を用いてDNAシーケンシングで確認した。確認の結果、コード部位において存在していた突然変異は復元されており、配列はヒトトランスフェリンcDNAGenBankaccession:NM_001063.2と完全に一致した。上記ヒトトランスフェリンcDNAを鋳型にして、センスプライマーF15、配列番号49、アンチセンスプライマーR13、配列番号50およびPhusionHigh-FidelityDNAポリメラーゼFinnzyme、2units/μL、F-530Sを用いてPCRを行った。PCR条件は、プライマー20pmolのF15および20pmolのR13を用いたことを除いては、上記FIXKOIPCRの反応条件と同様に行った。増幅されたPCR産物Tfを、Age1およびXho1で37°Cにて処理して、上記で製造されたFIXKOIがクローニングされているpcDNA3.1/hygroベクターを同じ制限酵素で処理した後、DNAライゲースTakara、2011Aを用いてライゲーションligationしFIXKOI-Tf発現ベクターを製造した。-実施例3:FIXKOI-GS-Tf発現ベクターの製造-FIXKOIとTfとをリンカーで連結した融合タンパク質を発現するベクターを製造した。上記リンカーとして、4つのグリシンおよび1つのセリンからなるペプチドGGGGSを基本リンカー単位として使用し、これらの単位を繰り返して連結した、より長い長さのリンカーを製造した。上記リンカーをGSリンカーと命名し、繰り返し単位が1であるリンカーをGS1または1GSにして繰り返し単位の数に応じてGS2または2GS、GS3または3GS、GS4または4GSなどで表示した。本実施例では、GS1、GS7およびGS15リンカーを使用した。<3-1>FIXKOI-GS1-Tf発現ベクターpcDNA3.1-hygro-FIXKOI-GS1-Tfの製造FIXKOIとTfがGS1リンカーで接続された融合タンパク質を発現するベクターを下記のように製造した。上記の製造過程を図3に示した。具体的に、GS-1リンカーにTfを接続させることにおいては、F16配列番号51とR13配列番号50プライマーを用いてPCRを行った。PCRは、PhusionHigh-FidelityDNAポリメラーゼFinnzyme、2units/μL、F-530Sを98°Cで30秒間反応させ、98°Cで10秒、58°Cで45秒、72°Cで2分間反応させることを1サイクルとして30サイクル反応させた後、72°Cで7分間反応させて終了させた。増幅されたPCR生成物を鋳型にして、センスプライマーF17、配列番号52、アンチセンスプライマーR13、配列番号50とPhusionHigh-FidelityDNAポリメラーゼFinnzyme、2units/μL、F-530Sを使用してPCRを行い、GS1-Tf断片を増幅させた。上記のPCR条件は、実施例2のTfPCR反応条件と同様に行った。増幅されたPCR産物GS1-TfをAge1とXho1で37°Cにて処理し、FIXKOIがクローニングされているpBluescriptSKIIベクターをAge1およびSal1で処理した後、T4DNAライゲースTakara、2011Aを用いてライゲーションした。この時に使ったFIXKOIがクローニングされているpBluescriptSKIIは次の通り作製した。実施例2においてと同様、FIXの終止コドンを除去し、増幅されたPCR産物FIXKOI-Age1-Xho1を製作し、BamH1制限酵素のみを処理した後、BamH1/EcoRVで処理したpBluescriptSKIIにT4DNAライゲースTakara、2011Aを用いてライゲーションして作製した。FIXKOI-GS1-Tf断片をpcDNA3.1/hygroベクターに挿入させるために、前記製造されたベクターを鋳型としてセンスプライマーF7;配列番号33、アンチセンスプライマーR13;配列番号50およびPhusionHigh-FidelityDNAポリメラーゼFinnzyme、2units/μL、F-530Sを使用してPCRを行い、FIXKOI-GS1-Tf断片を増幅させた。上記PCR条件は、プライマーF720pmolおよびR1320pmolを使用したことを除いては、実施例2のTfPCR反応条件と同様に行った。上記増幅されたPCR産物FIXKOI-GS1-TfをBgl2およびXho1で37°Cにて2時間処理し、pcDNA3.1/HygroベクターをBamH1およびXho1で処理した後、T4DNAライゲースTakara、2011Aを用いてライゲーションし、FIXKOI-Tf発現ベクターを製造した。<3-2>FIXKOI-GS15-Tf発現ベクターpcDNA3.1-hygro-FIXKOI-GS15-Tfの製造FIXKOIおよびTfがGS15リンカーで接続された融合タンパク質を発現するベクターを、図4のプロセスに基づいて製造した。具体的には、GS15リンカーがサブクローニングされているベクターをAge1で処理してGS15リンカー断片を確保して、実施例2において製造したFIXKOI-Tf発現ベクターを同じ制限酵素で処理した後、T4DNAライゲースTakara、2011Aを用いてライゲーションし、FIXKOI-GS15-Tf発現ベクターを製造した。-実施例4:トロンビン切断部位を持つGSリンカーを含むFIXKOI-Tf発現ベクターの製造-<4-1>FIXKOI-GS1-THR-GS1-Tf発現ベクターpcDNA3.1-hygro-FIXKOI-GS1-THR-GS1-Tfの製造GS1およびトロンビン切断部位THRを持つFIXKOI-Tf発現ベクターを、図4のプロセスに従って製造した。具体的には、GS1-THR-GS1がサブクローニングされたベクターSKケミカルをAge1で37°Cにて処理してGS1-THR-GS1断片を確保して、実施例2において製造したFIXKOI-Tf発現ベクターを同じ制限酵素で処理した後、T4DNAライゲースを使用してライゲーションし、FIXKOI-GS1-THR-GS1-Tf発現ベクターを製造した。<4-2>FIXKOI-GS7-THR-GS7-Tf発現ベクターpcDNA3.1-hygro-FIXKOI-GS7-THR-GS7-Tfの製造GS7およびGS7リンカーの間にトロンビン切断部位THRを持つFIXKOI-Tf発現ベクターを、図4のプロセスに従って製造した。具体的には、GS7-THR-GS7がサブクローニングされたベクターSKケミカルをAge1で37°Cにて処理してGS7-THR-GS7断片を確保して、実施例2において製造したFIXKOI-Tf発現ベクターを、同じ制限酵素で処理した後、T4DNAライゲースを使用してライゲーションし、FIXKOI-GS7-THR-GS7-Tf発現ベクターを製造した。<4-3>FIXKOI-GS1-THR-GS1-del-Tf発現ベクターpcDNA3.1-hygro-FIXKOI-GS1-THR-GS1-del-Tfの製造実施例4-1で製造したGS1およびトロンビン切断部位THRを持つ発現ベクターから、リンカーとTfとの間を接続するAge1制限酵素配列を除去した。具体的には、実施例4-1で製造したFIXKOI-GS1-THR-GS1-Tf発現ベクターを、実施例2において記述されたPCRベースの突然変異法PCR-basedmutagenesisを利用してAge1制限酵素を除去した。変異誘発プライマーF18およびR14配列番号53および54を使用して合成したベクターをE.coliHITcompetentcell、DH5α、RH617で増幅させてDNAの準備minipreparationおよび制限酵素処理により選別した。選別された陽性クローンを、プライマーF19配列番号55を使用してDNAシーケンシングでAge1制限酵素の除去を確認した。-実施例5:FXa切断部位を持つGSリンカーを含むFIXKOI-Tf発現ベクターの製造-<5-1>FIXKOI-GS1-FXa-Tf発現ベクターpcDNA3.1-hygro-FIXKOI-GS1-FXa-Tfの製造GS1リンカーおよびFXa切断部位FXaを持つFIXKOI-Tf発現ベクターを、図5のプロセスに従って製造した。具体的には、FXa切断部位を成す二つの相補的配列であるOa配列番号56およびOb配列番号57をそれぞれ100pmolおよび5ulをとり、72°Cで10分間反応させ、アニーリングannealingした後、Bgl2およびBamH1で37°Cにて30分間処理した。一方、実施例<3-1>で製造したFIXKOI-GS1-Tf発現ベクターをBamH1で処理してGS1と接続されたTf断片Tf-1とするを除去して、上記で製造したFXa切断部位とT4DNAライゲースTakara、2011Aを用いてライゲーションした。FXa切断部位が順方向にきちんとクローニングされたことを確認した後、BamH1の制限酵素で処理し除去していた短編Tf-1をBamH1部位にT4DNAライゲースTakara、2011Aを使用して再度ライゲーションした。<5-2>FIXKOI-GS7-FXa-GS7-Tf発現ベクターpcDNA3.1-hygro-FIXKOI-GS7-FXa-GS7-Tfの製造二つのGS7リンカーの間にFXa切断部位を有するFIXKOI-Tf発現ベクターを、図4のプロセスに従って製造した。具体的には、GS7-FXa-GS7がサブクローニングされたベクターをAge1で37°Cにて処理しGS7-FXa-GS7断片を確保して、実施例2において製造したFIXKOI-Tf発現ベクターを同じ制限酵素で処理した後、T4DNAライゲースを使用してライゲーションし、FIXKOI-GS7-FXa-GS7-Tf発現ベクターを製造した。上記で使用されたGS7-FXa-GS7がサブクローニングされたベクターは以下のように作製した。FXaによって切断されるアミノ酸配列であるIEGRを含むプライマーOa配列番号56とOb配列番号57を合成した。製作したそれぞれのプライマー5ul100pmole/uLを72°Cで10分間加熱し、冷却させアニーリングした。このようにして得られたリンカーを7GSがpcDNA3.1/HygroにクローニングされているベクターSKケミカルをBamH1とHpa1との制限酵素で順次処理したベクターにT4DNAライゲースを使用してライゲーションした。前記製造されたベクターをBamH1とHpa1とで処理して、7GSとTFとを含む挿入体をBgl2とHpa1の制限酵素で処理した後、これをT4DNAライゲースを用いて前記ベクターにライゲーションした。ここで使用された挿入体は、7GSがpcDNA3.1/Hygroにクローニングされているベクターを鋳型にしてF16配列番号51とR13配列番号50を用いてPCRを行った。PCRは、PhusionHigh-FidelityDNAポリメラーゼFinnzyme、2units/μL、F-530Sを用いて58°Cでアニーリングし、68°Cで2分間延長する過程を30サイクル反応させて行った。PCR生成物をBgl2とHpa1とで処理した後、ゲル抽出して使用した。-実施例6:FXIa切断部位を持つGSリンカーを含むFIXKOI-Tf発現ベクターの製造-<6-1>FIXKOI-GS1-FXIa-Tf発現ベクターpcDNA3.1-hygro-FIXKOI-GS1-FXIa-Tfの製造GS1リンカーおよびFXIa切断部位FXIaを持つFIXKOI-Tf発現ベクターを、図5のプロセスに従って製造した。具体的には、FXIa切断部位を成す二つの相補的な配列であるOc配列番号58およびOd配列番号59をそれぞれ100pmolおよび5ulを、72°Cで10分間反応させアニーリングannealingした後、BamH1で37°Cにて30分間処理した。一方、実施例<3-1>で製造したFIXKOI-GS1-Tf発現ベクターをBamH1で処理してGS1と接続されたTf断片Tf-1とするを除去して、上記で製造したFXIa切断部位とT4DNAライゲースTakara、2011Aとを用いてライゲーションした。FXIa切断部位が順方向にきちんとクローニングされたことを確認した後、BamH1の制限酵素で処理して除去していた短編Tf-1をBamH1siteでT4DNAライゲースTakara、2011Aを使用して再度ライゲーションした。<6-2>FIXKOI-GS7-FXIa-GS7-Tf発現ベクターpcDNA3.1-hygro-FIXKOI-GS7-FXIa-GS7-Tfの製造GS7およびGS7リンカーとの間にFXIa切断部位を持つFIXKOI-Tf発現ベクターを、図4のプロセスに従って製造した。具体的には、GS7-FXIa-GS7がサブクローニングされたベクターを、Age1で37°Cにて処理してGS7-FXIa-GS7断片を確保して、実施例2で製造したFIXKOI-Tf発現ベクターを同じ制限酵素で処理した後、T4DNAライゲースを使用してライゲーションし、FIXKOI-GS7-FXIa-GS7-Tf発現ベクターを製造した。一方、上記で使用されたGS7-FXIa-GS7がクローニングされているベクターは、実施例5の5-2に記述したFIXKOI-GS7-FXa-GS7-Tf発現ベクターを作製する方法において、FXIaによって切断されるアミノ酸配列であるSKLTRAETVFを示すプライマーOc配列番号58とOd配列番号59とを用いたことを除いて同じように実験して製造した。-比較例1:FIXKOI-G6V-アルブミン発現ベクターpcDNA3.1-hygro-FIXKOI-G6V-Albuminの製造-米国特許20090042787A1号に開示されたFIXKOI-G6V-アルブミン融合タンパク質を、図6のプロセスに従って製造した。まず、ヒト肝臓mRNAClontechを鋳型にして遺伝子特異プライマーF20およびR15配列番号60および61を用いてRT-PCRによりヒトアルブミンcDNAを得た。上記のRT-PCRは、10μL逆転写反応液1μL10X逆転写酵素緩衝液、0.6μLオリゴ-dTプライマー、1μLdNTP、0.4μL水、および5μLヒト肝臓mRNA10ng/μLを65°Cで5分、室温で5分間反応させた後、100mMDTT1μLおよび逆転写酵素緩衝液1μLを入れ、42°Cで1時間反応させた。合成されたcDNAを鋳型としてプライマーF20およびR15を使用して、ヒトアルブミン配列を確保した。PCRは、50μL反応液1μLcDNA、10μL5xPhusionHFBuffer、プライマーF20とR15を各1μL、1μLの10mMdNTP、0.5μLPhusionDNApolymeraseFINNZYMES、F-530S2units/μL、35.5μLの水を98°Cで1分間反応させ、98°Cで10秒、62°Cで30秒、72°Cで60秒反応させることを1サイクルとして30サイクル反応させた後、72°Cで7分反応させることにより終了させた。一方、米国特許20090042787A1号に開示のGSリンカーG6VGGGGGGVを示すアミノ酸配列を作るためにF21配列番号62およびアルブミンの配列全体をPCRできるプライマーR16配列番号63を用いて、上記で得られたアルブミンを鋳型にしてPCRを行った。PCRは、PhusionHigh-FidelityDNAポリメラーゼFinnzyme、2units/μL、F-530Sを用いて58°Cでアニールして、68°Cで2分間延長する過程を30サイクル反応させて行った。PCR生成物をAge1とXho1とで処理して、挿入体を準備し、実施例2のFIXKOI-Age1-TFをAge1とXho1との制限酵素で処理してベクターとして用意し、上記挿入体とベクターをT4DNAライゲスTakara、2011Aを用いてライゲーションした。上記実施例および比較例で製造した発現ベクターの特徴を下記表2に示した。-実験例1:融合タンパク質の形質感染および発現-<1-1>融合タンパク質の形質感染実施例2~実施例6のFIXKOI-Tf発現ベクターおよび比較例1のFIXKOI-G6V-Albumin発現ベクターをVKORC1ビタミンKエポキシド還元複合体サブユニット1を安定的に発現するCHO細胞株であるCHO-DG44VK2細胞に形質感染させ、FIXKOI融合タンパク質を発現させた。CHO-DG44VK2は、インビトロゲン社のCHO-DG44cellにVKORC1発現ベクターを挿入して、独自に製作した。具体的には、実施例2~実施例5及び比較例1の発現ベクターを合成したベクターをE.coliHITcompetentcell、DH5α、RH617で増幅させてエンドトキシンendotoxin排除エンドトキシンフリーマキシプレップキットendotoxinfreemaxiprepkit、QIAGEN、cat12362を用いて、各々の発現ベクターを抽出した。発現対照群としてpcDNA3.1/hygroベクターおよび実施例1で製造したpcDNA3.1-hygro-FIXKOIベクターを使用した。上記ベクターを動物細胞に形質感染させるため下記のように動物細胞を用意した。CHO-DG44VK2細胞を10FBSLonza、14-501F、1XHTInvitrogen、11067-030、4mML-グルタミンLonza、17-605Eおよび200μg/mlのハイグロマイシンInvitrogen、10687-010を追加したα-MEMLonza、12-169F培地で48時間培養した後、培地を遠心分離して浮遊細胞を除去した。上記細胞を6-ウェルプレートに1.5×106細胞/ウェルの濃度で播種seedingした。上記細胞を培地で24時間培養した後、リポフェクタミン2000Invitrogen、Catno.11668-019を利用して、メーカーの手引きに従って形質感染させた。ウェル当り形質感染DNAの量および比率は、FIXKOI誘導体DNA3μg:β-ガラクトシダーゼDNA1μgで使用した。形質感染4時間後、前記培養液を無血清培養液OptiMEMに置き換えて、5μg/mlのビタミンKを追加しました。培養48時間後、培養液をサンプリングし、-70°Cで保存した。<1-2>ウェスタンブロット法による発現の解析ブラッドフォード分析を介して前記実験例<1-1>で製造した試料のタンパク質を定量した後、4xLDS試料緩衝液InvitrogenNP0008と7xプロテアーゼ阻害剤カクテルRoche、CompleteMini、EDTAfree、1836170とを使用して、総タンパク質の濃度が1μg/μLになるように調整した。上記の試料10μLを4~12のゲルInvitrogen、NuPAGENovex4~12Bis-TrisGelにロードし、電気泳動した。電気泳動が終わったゲルをニトロセルロース膜Whatman、PROTRANBA83に移転させた後、上記移転された幕をオムニトレイomnitrayに移し、ブロッキング溶液3BSAinTBSwith0.1Tween20を添加して、ロッカーrockerで1時間ブロッキングした。その後、一次抗体CedarlaneCL20040APを4°Cで12時間反応させてタンパク質に結合させ、二次抗体antigoat、SantacruzSC-2350を室温で1時間反応させ結合させた後、アマシャムAmershamのECL溶液ミックスGEHealthcare、RPN1232を利用して、フィルムに現像した。ウエスタンブロッティングの結果を図7に示した。図7に示すように、本発明に係るFIXKOI融合タンパク質は、発現され断片化されず、予想した大きさを持つことが分かった。-実験例2:FIXKOI融合タンパク質の比活性specificactivityの測定-<2-1>FIXKOI融合タンパク質誘導体群FIXKOI-Tf、FIXKOI-GS1-Tf、FIXKOI-GS1-THR-GS1-Tf、FIXKOI-GS15-Tf、FIXKOI-GS7-THR-GS7-Tf、FIXKOI-GS7-FXa-GS7-Tf、FIXKOI-GS7-FXIa-GS7-Tf、FIXKOI-GS1-FXa-Tf、FIXKOI-GS1-FXIa-Tf、FIXKOI-G6V-Albと天然型FIXKOIの比活性の測定実験例1のFIXKOI融合タンパク質試料および円FIXKOIを対象に、比活性を測定した。具体的には、試料をFIXELISAキットCedarlane、PairedAntibodiesforElisa-FactorIX、CL20041K、LotEIA9-0025R1を利用して、FIXタンパク質抗原の量を測定し、BIOPHENFactorIX分析キットHYPENBioMed、Ref.221802を利用して、FIXの色素形成能chromogenicactivityの分析を行い、凝固活性clottingactivityを測定した。標準ヒト血漿DadeBehring、REFORKL13、Lot503214Eの量の分析において対照群として使用し、これを1/100100から1/32003.13まで1/2ずつ連続希釈して、上記標準のOD値を基準に試料の抗原値を計算した。FIXKOI融合タンパク質の培地試料は、1/4に希釈して使用した。上記ELISA法で生成されたタンパク質抗原の量を確認したが、二重FIXの活性を持たないタンパク質もあり得るので、色素形成能分析によって、得られた値を、ELISA法によって得た値で割り、単位活性度activitytoantigenratioの値を求めた。実施例により得られた試料のELISAおよび色素形成能の分析結果を表3及び図8aに示し、上記の値に基づいて得られた単位活性度、すなわち、比活性の測定結果を表3及び図8bに示す。表3及び図8bに示すように、FIXKOI-トランスフェリン融合タンパク質の比活性は5.86で、天然型FIXKOIの2.98に比べてかなり活性度が増加したことが分かった。また、リンカーを含むFIXKOI-トランスフェリン融合タンパク質は、1.53から5.58の高い比活性を示し、FIXKOI-G6V-Albumin融合タンパク質の比活性よりも高く測定された。<2-2>FIXKOI融合タンパク質誘導体FIXKOI-GS1-THR-GS1-TfおよびFIXKOI-GS1-THR-GS1-del-Tf並びに天然型FIXKOIの比活性測定実験例1のFIXKOI-GS1-THR-GS1-Tf、FIXKOI-GS1-THR-GS1-del-Tfおよび天然型FIXKOIのFIXKOI融合タンパク質試料を対象に、比活性を測定した。実施例4-1とほぼ同様のリンカー配列を含む、実施例4-3によって得られた試料をFIXELISAキットCedarlane、PairedAntibodiesforElisa-FactorIX、CL20041K、LotEIA9-0028R1を用いて、FIXタンパク質抗原の量を測定し、BIOPHENFactorIX分析キットHYPENBioMed、Ref.221802、Lot01602を用いて、FIXの色素形成能chromogenicactivityの分析を行い、凝固活性clottingactivityを測定した。標準ヒト血漿DadeBehring、REFORKL13、Lot503216Fを量分析において対照群として用いて、<2-1>と同じ方法で希釈し使用した。実施例4-1と4-3のELISAおよび色素形成能の分析結果を表4及び図8cに示し、上記の値に基づいて得られた単位活性、すなわち、比活性の測定結果を表4及び図8dに示す。表4および図8dに示すように、FIXKOI-トランスフェリンリンカーを含む融合タンパク質の比活性は、1.6から1.8で、天然型FIXKOIの0.9に比べて活性度が増加したことが分かった。また、リンカーを接続するAge1制限酵素配列を含むFIXKOI-GS1-THR-GS1-TFと、これを除去したFIXKOI-GS1-THR-GS1-del-Tfとの比活性はほぼ類似して現れた。本実験例において、リンカーの長さとFIXKOI融合タンパク質の比活性とは一定の関係を示さず、リンカーの切断部位の種類および比活性にも一定の関係を示さなかった。