プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつα12マンノシダーゼI遺伝子が導入されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有するがO結合型糖鎖の産生能が低下した変異酵母。プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子PMT1及びPMT2の少なくとも一方が機能欠損している、請求項1に記載の変異酵母。プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能欠損による増殖能の低下が抑制されている、請求項1又は2に記載の変異酵母。α12マンノシダーゼI遺伝子が再導入されており、それによりMan5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能が増強されている、請求項1~3のいずれか1項に記載の変異酵母。さらにプロテアーゼ遺伝子が機能欠損している、請求項1~4のいずれか1項に記載の変異酵母。プロテアーゼ遺伝子PEP4及びPRB1の少なくとも一方が機能欠損している、請求項5に記載の変異酵母。受託番号FERMP22041又はFERMP22042で示される、請求項1~3のいずれか1項に記載の変異酵母。受託番号FERMP22186で示される、請求項4に記載の変異酵母。受託番号FERMP22184又はFERMP22185で示される、請求項5又は6に記載の変異酵母。α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつNアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子及びα12マンノシダーゼI遺伝子が導入されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有し、かつGlcNAc1Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能をさらに有する変異酵母。受託番号FERMP22043で示される、請求項10に記載の変異酵母。α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつα12マンノシダーゼI遺伝子が導入され、さらにタンパク質分泌生産能が増強されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有する変異酵母。さらにプロテアーゼ遺伝子が機能欠損している、請求項12に記載の変異酵母。受領番号FERMAP22208で示される、請求項12又は13に記載の変異酵母。糖タンパク質の製造のための、請求項1~14のいずれか1項に記載の変異酵母の使用。本発明は、十分な増殖能を保持しつつ、O結合型糖鎖の産生が抑制され、ヒト型N結合型糖鎖Man5GlcNAc2を合成できる酵母を提供することを課題とする。本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、α12マンノシダーゼI遺伝子が導入され、かつプロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子が機能欠損し、また酵母に特異的な外糖鎖の生合成に関与する遺伝子のうち、初発の糖鎖延長付加反応を行うα16マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子OCH1、糖鎖の非還元末端にマンノースを付加するα13マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子MNN1、及びマンノース1リン酸の付加を制御する遺伝子MNN4が機能欠損した酵母に由来する、増殖能が良好な酵母株を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を包含する。1プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつα12マンノシダーゼI遺伝子が導入されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有するがO結合型糖鎖の産生能が低下した変異酵母。2プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子PMT1及びPMT2の少なくとも一方が機能欠損している、上記1の変異酵母。3プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊による増殖能の低下が抑制されている、上記2の変異酵母。4α12マンノシダーゼI遺伝子が再導入されており、それによりMan5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能が増強されている、上記1~3の変異酵母。5さらにプロテアーゼ遺伝子が機能欠損している、上記1~4の変異酵母。6プロテアーゼ遺伝子PEP4及びPRB1の少なくとも一方が機能欠損している、上記5の変異酵母。7受託番号FERMP22041又はFERMP22042で示される、上記1~3の変異酵母。8受託番号FERMP22186で示される、上記4の変異酵母。9受託番号FERMP22184又はFERMP22185で示される、上記5又は6の変異酵母。10α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつNアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子及びα12マンノシダーゼI遺伝子が導入されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有し、かつGlcNAc1Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能をさらに有する変異酵母。11受託番号FERMP22043で示される、上記10の変異酵母。12α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつα12マンノシダーゼI遺伝子が導入され、さらにタンパク質分泌生産能が増強されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有する変異酵母。13さらにプロテアーゼ遺伝子が機能欠損している、上記12の変異酵母。14受領番号FERMAP22208で示される、上記12又は13の変異酵母。15糖タンパク質の製造のための、上記1~14の変異酵母の使用。本発明を用いれば、哺乳動物型N結合型糖鎖付加タンパク質を、Oグリコシル化を抑制しつつ、効率よく生産することができる。以下、本発明を詳細に説明する。1.糖鎖構造の改変本発明は、哺乳動物細胞が生産する糖鎖と同じ糖鎖構造を有するN結合型糖鎖タンパク質のアスパラギン残基に付加された糖鎖を生産する能力を有し、かつ十分な増殖能を有する変異酵母、及びその変異酵母を糖鎖及び糖タンパク質の製造に用いる方法に関する。糖タンパク質に付加されている糖鎖には、大別して、N結合型Asn結合型、ムチン型、O結合型OGlcNAc型、GPIアンカー型、プロテオグリカン型などがあり竹内誠、グリコバイオロジーシリーズ5、グリコテクノロジー、木幡陽箱守仙一郎永井克孝編、講談社サイエンティフィック、191208、それぞれ固有の生合成経路を持ち、個別の生理機能を担っている。N結合型糖鎖の生合成においては、まず、タンパク質のアスパラギン残基Asnに結合する形で、マンノースMan8残基とNアセチルグルコサミンGlcNAc2残基からなるM8ハイマンノース型糖鎖Man8GlcNAc2が合成される。このハイマンノース型糖鎖を含有するタンパク質はゴルジ体に輸送されて種々の修飾を受けるが、このゴルジ体での修飾は酵母と哺乳類で大きく異なっているGemmillTRandTrimbleRBBiochimBiophysActa1426227。哺乳動物細胞では、多くの場合、M8ハイマンノース型糖鎖にαマンノシダーゼIが作用してマンノース数残基が切断され、Man5GlcNAc2等のハイマンノース型糖鎖が生成する。マンノースが3残基切断されたM5ハイマンノース型糖鎖Man5GlcNAc2にNアセチルグルコサミントランスフェラーゼIGnTIが作用してNアセチルグルコサミンが1残基転移され、GlcNAc1Man5GlcNAc2で表される糖鎖が生成する。このようにして生成された糖鎖は混成ハイブリッド型と呼ばれる。さらに、αマンノシダーゼII及びGnTIIが作用すると、GlcNAc2Man3GlcNAc2で表される複合コンプレックス型糖鎖構造の糖鎖が生成する。これにさらに十数種にもおよぶ糖転移酵素群が作用して、多様な哺乳類型糖鎖が生成される。一方、酵母では、M8ハイマンノース型糖鎖に、数残基から100残基以上のマンノースを含む糖鎖外糖鎖が付加される図1A。酵母における外糖鎖の生合成は、M8ハイマンノース型糖鎖に、まず、α16マンノシルトランスフェラーゼOCH1遺伝子産物;Och1の作用により、マンノース残基がα16結合で付加される延長開始反応が起こるNakayamaetalEMBOJ1125112519。さらにα16マンノシルトランスフェラーゼによりマンノース残基がα16結合で逐次延長する反応が起こり、外糖鎖の骨格が形成される。また酵母では、α13マンノシルトランスフェラーゼMNN1遺伝子産物;Mnn1の作用により、M8ハイマンノース型糖鎖の末端のマンノース残基にα13結合マンノース残基が付加されるNakanishiShindoetalJBiolChem2682633826345。また酵母ではハイマンノース型糖鎖部分及び外糖鎖部分にマンノース-1-リン酸が付加される酸性糖鎖の生成ことも知られており、この反応にはマンノースリン酸転移酵素MNN6遺伝子産物;Mnn6及びマンノースリン酸転移酵素のポジティブレギュレーターMNN4遺伝子産物;Mnn4が関与しているWangetalJBiolChem2721811718124;OdanietalGlycobiology6805810OdanietalFEBSletters420186190。多くの場合、この酵母に特有の外糖鎖は、タンパク質産物の均質性を損ない、タンパク質の精製を困難にしたり比活性を低下させたりするだけでなく、哺乳動物において強い免疫原性を有する等の問題がある。さらに酵母は、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼPMT1~7の遺伝子産物の作用により、O結合型糖鎖をタンパク質のSer/Thr残基に付加する図1B。このO結合型糖鎖も、前述の通り、哺乳動物の糖タンパク質の組換え生産の際にタンパク質に付加されると不都合が生じる。そこで本発明では、酵母を用いた哺乳動物型糖鎖結合タンパク質の生産のため、酵母のα16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子典型的にはOCH1遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子典型的にはMNN1遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子典型的にはMNN4遺伝子の機能欠損通常は遺伝子破壊又は何らかの変異導入を引き起こすことにより外糖鎖の付加を阻止し、さらにα12マンノシダーゼI遺伝子を導入することによりマンノース残基のα12結合を抑制して、Man5GlcNAc2糖鎖の産生を促進する図1D。併せて、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能欠損を引き起こすことにより、O結合型糖鎖の付加を低減させる図1E。本発明ではまた、酵母を用いた哺乳動物型糖鎖結合タンパク質の生産のための別の態様として、酵母のα16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子典型的にはOCH1遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子典型的にはMNN1遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子典型的にはMNN4遺伝子の機能欠損通常は遺伝子破壊又は何らかの変異導入を引き起こすことにより外糖鎖の付加を阻止し、さらにα12マンノシダーゼI遺伝子を導入することによりマンノース残基のα12結合を抑制し、さらにNアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子を導入することで末端マンノース残基へのNアセチルグルコサミンGlcNAcの転移を引き起こし、GlcNAc1Man5GlcNAc2で表される糖鎖の産生を促進する図1F。2.糖鎖改変酵母株の作製本発明は、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子の機能欠損遺伝子破壊又は何らかの変異導入を有しており、かつα12マンノシダーゼI遺伝子が導入されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有するがO結合型糖鎖の産生能が低下した変異酵母を提供する。本発明における酵母は、限定するものではないが、例えば、サッカロミセス科Saccharomycetaceae、又はシゾサッカロミセス科Schizosaccharomycetaceaeに属するものがあげられる。本発明における酵母は、サッカロミセス属Saccharomycesに属するものが好ましく、例えば出芽酵母Saccharomycescerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomycespombe等がより好ましい。本明細書において変異酵母とは、野生型酵母と比較して1以上の内因性遺伝子が変異若しくは欠損している、又は、1以上の外来遺伝子が導入されている酵母をいう。本発明に係る変異酵母において機能欠損させるプロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子は、宿主酵母ゲノム中に存在する内在性プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子であり、例えばPMT1遺伝子出芽酵母では、GenBankアクセッション番号NC001136の配列中、ORF配列は287059~289512位、PMT2遺伝子出芽酵母では、NC001133の配列中、ORF配列は106273~108552位、PMT3遺伝子X83797の配列中、ORF配列は37~2298位、PMT4遺伝子X83798の配列中、ORF配列は101~2389位、PMT5遺伝子X92759の配列中、ORF配列は182~2413位、PMT6遺伝子NM001181328ORF配列;コード化アミノ酸配列:NP011715、及びPMT7遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つであってよい。中でもPMT1~PMT4及びPMT6遺伝子のうち少なくとも1つが好ましい。PMT1遺伝子及びPMT2遺伝子のいずれか一方を機能欠損させることがより好ましく、PMT1遺伝子及びPMT2遺伝子の両方を機能欠損させることがさらに好ましい。本発明に係る変異酵母において機能欠損させるα16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子は、宿主酵母ゲノム中に存在する内在性α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、好ましくはOCH1遺伝子である。本発明に係る変異酵母は、酵母特有の糖鎖構造の生合成に関与する、糖鎖の非還元末端にマンノースを付加する酵素をコードするα13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子好ましくは、MNN1遺伝子、及びマンノース1リン酸基の付加を制御促進する酵素をコードするマンノース1リン酸付加制御遺伝子好ましくは、MNN4遺伝子の機能欠損をさらに有する。このような本発明に係る変異酵母は、α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能欠損により外糖鎖を生成せず、また導入したα12マンノシダーゼI遺伝子の機能によりマンノース残基のα12結合が切断され、Man5GlcNAc2で表される糖鎖を生成できる図1D。また本発明に係る変異酵母では、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子好ましくは、MNN1遺伝子及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子好ましくは、MNN4遺伝子の機能欠損により、糖鎖末端へのα13結合マンノース残基の付加や酸性糖鎖の生成が抑制される。さらに本発明に係る変異酵母においては、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能欠損により、O結合型糖鎖の生成が低減され、すなわちO結合型糖鎖の産生能が低下している。このような改変された糖鎖構造の確認は、例えば、培養菌体から抽出したマンノプロテインから切断して得られる糖鎖サンプルをPA化した後、HPLC解析に供することによって行うことができる。本発明に係る変異酵母は、さらに、酵母特有の糖鎖構造の生合成に関与する他の遺伝子の機能欠損を有することも好ましい。そのような遺伝子としては、例えば、ハイマンノース型糖鎖及び外糖鎖のα13結合マンノース残基に対するマンノース1リン酸基転移酵素遺伝子MNN6など、外糖鎖の生合成に関与する酵素をコードする他の遺伝子MNN7、MNN8、MNN9、及びMNN10など、またO結合型糖鎖の延長反応を担うマンノース転移酵素遺伝子KRE2など等が挙げられる。本発明に係る変異酵母はまた、糖鎖生合成に関与しない他の内在性遺伝子の機能欠損を有していてもよい。本発明において、遺伝子の機能欠損とは、活性タンパク質をコードする当該遺伝子が存在しないことを意味する。遺伝子の機能欠損が生じている酵母は、遺伝子破壊株遺伝子欠失株だけでなく、例えばORFへのヌクレオチド挿入又は欠失変異によるフレームシフトや活性中心等でのアミノ酸置換等が起きた結果、当該遺伝子が活性を喪失したタンパク質不活性タンパク質又はポリペプチドをコードするように変異した突然変異株も包含する。なおゲノム中の当該遺伝子が破壊されている場合、当該遺伝子の一部例えば膜貫通領域コード配列が宿主酵母のゲノム等に存在していても、その一部が活性例えば酵素活性を保持した部分タンパク質をコードしていない限り、遺伝子の機能欠損に包含される。ゲノム中の遺伝子の機能欠損は、常法により引き起こすことができる。一例として、遺伝子の破壊は、典型的には、相同組換えを利用した方法により引き起こすことができる。例えば、破壊対象の遺伝子の5側配列と3側配列の間に、マーカー遺伝子が挿入されたプラスミドを構築し、これを宿主酵母細胞に導入し培養することにより、宿主ゲノム中の破壊対象の遺伝子と導入したプラスミドとの間で相同組換えが引き起こされ、当該遺伝子内にマーカー遺伝子が挿入される。その結果、当該遺伝子は破壊される。相同組換えに基づく遺伝子破壊法についても、任意の様々な方法を用いることができるが、例えば、Alaniらの方法AlanietalGenetics116541545では、hisGURA3hisG発現カセットマーカー遺伝子と、その両側に挿入した破壊対象の遺伝子の5側配列及び3側配列を有するプラスミドを宿主細胞に導入し、当該遺伝子との間で相同組換えによりhisGURA3hisG発現カセットをゲノム中に挿入し、これにより当該遺伝子が破壊された遺伝子破壊株を得ることができ、そのスクリーニングの際にURA3マーカーを利用できる。なお各種プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子及びα16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子OCH1、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子MNN1、マンノース1リン酸付加制御遺伝子MNN4の配列は、様々な生物で公知になっている。また機能欠損を引き起こすための遺伝子への突然変異の導入は、例えば部位特異的突然変異誘発法等の変異導入法を用いて改変することにより実施することができる。具体的には、部位特異的突然変異誘発法として、Kunkel法、Gappedduplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。これらの変異導入は、例えば市販の部位特異的突然変異誘発キット例えばQuikChangeSiteDirectedMutagenesisKItStratagene社、MutanKTAKARABIOINC社製、MutanSuperExpressKmTAKARABIOINC社製、PrimeSTARMutagenesisBasalKitTAKARABIOINC社製などを用いて当業者であれば容易に行うことができる。本発明に係る変異酵母に導入するα12マンノシダーゼI遺伝子は、任意の生物由来であってよく、限定するものではないが、真菌のα12マンノシダーゼI遺伝子であることが好ましい。α12マンノシダーゼI遺伝子の配列は、様々な生物で公知になっている。真菌のα12マンノシダーゼI遺伝子としては、例えば、アスペルギルス属Aspergillus、サッカロミセス属Saccharomyces、カンジダ属Candida、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces等のα12マンノシダーゼI遺伝子が挙げられる。とりわけAspergillussaitoiのα12マンノシダーゼI遺伝子msdSは好適に使用され得る。α12マンノシダーゼI遺伝子は宿主ゲノム中に組み込まれることが好ましいが、これに限定されるものではない。α12マンノシダーゼI遺伝子は、宿主酵母のタンパク質の膜貫通領域コード配列の下流に融合させた融合遺伝子として導入することも好ましい。この場合、α12マンノシダーゼI遺伝子は、その天然のN末端例えば、膜貫通領域を欠失したものであることが好ましい。これにより、α12マンノシダーゼIを酵母ゴルジ体上にアンカリングさせることができる。融合させる膜貫通領域の由来タンパク質は、好ましくは、宿主酵母が生来有する膜貫通型糖タンパク質である。例えば、OCH1遺伝子、MNN1、MNN4、MNN6、MNN7、MNN8、MNN9、及びMNN10遺伝子、KRE2遺伝子等が挙げられる。融合させる膜貫通領域の由来タンパク質は、宿主酵母において機能欠損させた遺伝子によってコードされるものであってもよい。α12マンノシダーゼI遺伝子はまた、HAタグ等の任意のタグ配列とさらに融合させた形態で宿主酵母に導入してもよい。遺伝子の導入は、限定するものではないが、通常は、当該遺伝子を組み込んだ酵母発現ベクターを宿主酵母に導入して宿主酵母の形質転換体を取得することによって行うことができる。酵母発現ベクターとしては、例えば、YEpと略される酵母エピソーム型プラスミドyeastepisomeplasmid、YRpと略される酵母自己複製型プラスミドyeastreplicatingplasmidなどが挙げられる。酵母エピソーム型プラスミドベクターは、酵母が本来有する2μプラスミドの配列を含んでおり、その複製起点を利用して宿主酵母細胞内で複製できるようにしたベクターである。酵母エピソーム型発現ベクターは、酵母の2μプラスミド配列の少なくともARS配列を含んでおり、かつ宿主酵母菌体内において染色体外で増殖することができるものが好ましい。具体的なプラスミドとして、YEp51、pYES2、YEp351、YEp352及びpREPなどが挙げられる。また染色体組み込み型ベクターYIp、並びに自立複製領域ARS及び動原体領域CENを併せ持つYCp型ベクターも利用できる。上記の酵母発現ベクターは、組換え大腸菌でのサブクローニングを行えるように、大腸菌体内部で増殖できるシャトルベクターである方が好ましく、またアンピシリン耐性遺伝子等選択マーカー遺伝子を含むものがさらに好ましい。また、該発現ベクターは、組換え酵母を作成した際に、栄養要求性や薬剤耐性によって酵母クローンを選抜できる、マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子としては、例えば、HIS3、TRP1、LEU2、URA3、ADE2、CAN1、SUC2、LYS2、CUP1などがあげられる大島泰治編著、生物化学実験法39、酵母分子遺伝学実験法、119144。これらはあくまで例示であり、遺伝子導入の宿主とする酵母菌株の遺伝子型に応じて適宜選択すればよい。上述した融合遺伝子発現プラスミドの構築に関する一連の手法は、後記実施例の記載を参照して、あるいは慣用の技術により当業者が適宜実施することができる。発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン、タグをコードするDNAなどを付加してもよい。また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。市販されている融合タンパク質発現ベクターとして、pGEXシリーズアマシャムファルマシアバイオテク社、pETCBDFusionSystem34b38bNovagen社、pETDsbFusionSystems39b及び40bNovagen社、pETGSTFusionSystem41及び42Novagen社などが挙げられる。宿主酵母の形質転換は、一般的に行われている遺伝子導入法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコールPEG法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。形質転換体の選択は、常法に従って行うことができるが、通常は使用したベクターに組み込まれた選択マーカー等を利用して行うことができる。本発明に係る変異酵母においては、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能欠損による増殖能の低下が、抑制されていることが特に好ましい。本発明に係る変異酵母は、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能欠損以外は同じ遺伝子型を有する酵母株と比較して、70以上増殖能の低下レベル:30以下、好ましくは75以上増殖能の低下レベル:25以下、より好ましくは80以上増殖能の低下レベル:20以下、さらに好ましくは85以上増殖能の低下レベル:15以下、特に好ましくは88以上増殖能の低下レベル:12以下の増殖能を有する。そのような増殖能の低下レベルは、30°Cでの培養で経時的に測定した最高到達菌体濃度を基準として評価することができる。本発明に係る変異酵母は、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能欠損によって引き起こされるストレス耐性の低下が、抑制されていることも好ましい。具体的には、例えば、本発明に係る変異酵母は、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能欠損による高温ストレス耐性例えば、30°C以上、より好ましくは35°C以上、例えば37°C以上での培養に対する耐性の低下が抑制されていることも好ましい。本発明に係る変異酵母はさらに、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能欠損による薬剤ストレス耐性例えば、ハイグロマイシン等の抗生物質や、酵母生育阻害活性が知られるCalcofluorwhiteCFWの存在下での培養に対する耐性の低下が抑制されていることも好ましい。このような増殖能低下やストレス耐性低下が抑制されている本発明に係る変異酵母は、上記のように糖鎖生合成に関与する遺伝子の機能欠損又は導入等により改変した酵母糖鎖改変酵母株から作製することができる。このような酵母株の作製は、そのゲノムにさらに変異を導入することによって行うことができる。変異導入法としては、限定するものではないが、例えば、不均衡変異導入法AbeHetalGlycobiologyvol19no4pp428436、特許文献3、国際公開WO2009150848号が好適である。不均衡変異導入法とは、DNAポリメラーゼの校正機能を制御することで突然変異を導入する方法である。染色体DNA複製時に機能するDNAポリメラーゼの複製エラーを校正する機能を欠損させた変異酵素例えば、変異ポリメラーゼδをコードする遺伝子を含むプラスミドを宿主酵母細胞内に導入して、校正機能を持たないポリメラーゼを発現させることにより、複製エラーによって酵母ゲノム中に入る変異が変異酵素により校正を受けずに維持されることで効率的に変異を蓄積させる方法である。変異ポリメラーゼコード遺伝子は、限定するものではないが、宿主ゲノムに組み込むことなくプラスミドから発現させることが好ましい。変異ポリメラーゼコード遺伝子としては、限定するものではないが、配列番号25のアミノ酸配列からなる変異pol3タンパク質変異ポリメラーゼδの触媒サブユニットをコードする遺伝子、例えば、配列番号24で示される塩基配列からなるORF配列を有する遺伝子DNAを、好適に用いることができる。この不均衡変異導入法には、出芽酵母をミューテーター化するために、例えば変異pol3遺伝子発現ベクターYCplac33NMLmutII国際公開WO2009150848号を好適に使用できる。このようにして得られる本発明に係る変異酵母のとりわけ好適な具体例としては、出芽酵母SaccharomycescerevisiaeYFY22株及びYFY24株が挙げられる。YFY22株及びYFY24株は、2010年11月30日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1つくばセンター中央第6に、それぞれ受託番号FERMP22041及び受託番号FERMP22042として寄託されている。これらの変異酵母では、上記の通り、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能欠損による増殖能の低下が顕著に抑制されている。また高温ストレス耐性及び薬剤ストレス耐性の低下も抑制されている。したがってこれらの変異酵母を、例えば組換えタンパク質生産用の宿主として用いる場合、効率的なタンパク質生産が可能になる。本発明のさらなる実施形態では、酵母におけるプロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子の機能欠損遺伝子破壊又は何らかの変異導入、及びα12マンノシダーゼI遺伝子の導入に加えて、α12マンノシダーゼI遺伝子の再導入2コピー目又はそれ以上のコピー数の遺伝子導入を行ってもよい。この再導入は、不均衡変異導入法等の変異導入により変異酵母のM5糖鎖Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の生産量が低下し、M8糖鎖Man8GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の生産量が増加した場合に、特に好適である。α12マンノシダーゼI遺伝子を再導入した上記変異酵母は、少なくとも2コピーのα12マンノシダーゼI遺伝子を有する。本発明では、α12マンノシダーゼI遺伝子の再導入により、M5糖鎖Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を増強することができる。変異酵母における糖鎖の産生能は、例えば下記実施例の糖鎖構造解析手順に示されるようにして、一定条件下で各糖鎖の産生量を測定又は比較することにより評価することができる。α12マンノシダーゼI遺伝子の再導入ではM8糖鎖Man8GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生量は増加しない。このため、本発明に係る変異酵母の好適な実施形態では、α12マンノシダーゼI遺伝子の再導入により、M8糖鎖の産生量に対する、M5糖鎖の産生量の比率が有意に増加する。特に、α12マンノシダーゼI遺伝子の再導入の結果、M5糖鎖の産生量がM8糖鎖の産生量よりも有意に多くなるまで増強されたM5糖鎖産生能を有するように変異酵母が改変されることが好ましい。このような変異酵母は、M8糖鎖の産生量の好ましくは11倍以上、より好ましくは15倍以上、さらに好ましくは2倍以上、なお好ましくは3倍以上高いM5糖鎖産生量を示すことができる、M5N結合型糖鎖高効率生産株である。ここで、再導入するα12マンノシダーゼI遺伝子は上記と同様であり、最初に導入したα12マンノシダーゼI遺伝子と同じ塩基配列を有するものであってもよい。α12マンノシダーゼI遺伝子の再導入も、上記のα12マンノシダーゼI遺伝子の最初の導入と同様の方法で行うことができる。これらの変異酵母はまた、α12マンノシダーゼI遺伝子の再導入を実施前の上記変異酵母と比較して、O結合型糖鎖の結合量が有意に低下していることが好ましい。この変異酵母においては、タンパク質に付加されるO結合型糖鎖長が短縮化されていることが好ましい。本発明に係るこのような変異酵母の好ましい具体例として、出芽酵母SaccharomycescerevisiaeYKT4株が挙げられる。YKT4株は、2011年11月8日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号FERMP22186として寄託されている。本発明の一実施形態では、上記変異酵母について、さらに、プロテアーゼ遺伝子を機能欠損させることも好ましい。上記変異酵母、例えば、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつα12マンノシダーゼI遺伝子が導入されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有するがO結合型糖鎖の産生能が低下した変異酵母であって好ましくはα12マンノシダーゼI遺伝子が再導入された変異酵母について、さらにプロテアーゼ遺伝子を機能欠損させた変異酵母も、本発明の範囲に含まれる。本発明に係る変異酵母において機能欠損させるプロテアーゼ遺伝子は、宿主酵母の内在性の任意の1つ又は2つ以上のプロテアーゼ遺伝子であってよく、例えば、PEP4遺伝子出芽酵母では、GenBankアクセッション番号M13358の配列中、ORFCDS配列は728~1945位、PRB1遺伝子出芽酵母では、GenBankアクセッション番号M18097の配列中、ORFCDS配列は1944~3851位、YPS1遺伝子GenBankアクセッション番号BK006945の配列中、ORFCDS配列は386511~388220位相補鎖、KEX2遺伝子GenBankアクセッション番号Z71514の配列中、ORFCDS配列は495~2939位等が挙げられる。PEP4遺伝子及びPRB1遺伝子の両方を機能欠損させることが特に好ましい。このようにしてさらにプロテアーゼ遺伝子を機能欠損させた本発明に係る変異酵母は、好ましくはタンパク質高分泌生産能を有する。この変異酵母においては、導入した外来遺伝子からの組換えタンパク質の分泌生産能が、プロテアーゼ遺伝子を機能欠損させる前の変異酵母に同じ外来遺伝子を導入した場合と比較して、好ましくは11倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは4倍以上、なお好ましくは10倍以上増加している。変異酵母の組換えタンパク質の分泌生産能は、その変異酵母の培養上清中に分泌された組換えタンパク質の量を測定することにより評価することができる。酵母における組換えタンパク質の分泌生産能の評価は、例えば、ガレクチン9遺伝子発現ベクターを当該酵母に導入し好ましくはそのゲノム中に導入し、その培養上清例えば30°Cで72時間培養後の培養上清中のガレクチン9量を測定することによって行うことができ、例えば実施例10に記載の方法に従って行うことができる。このようにして得られる変異酵母は、糖タンパク質の組換え生産を行う際に、タンパク質生産効率を顕著に増加させることができて有利である。これらの変異酵母はまた、親株と同様に、M8糖鎖の産生量の好ましくは11倍以上、より好ましくは15倍以上、さらに好ましくは2倍以上、なお好ましくは3倍以上高いM5糖鎖産生量を示すことができる、M5N結合型糖鎖高効率生産株であることが好ましい。本発明に係るこのような変異酵母の好ましい具体例として、出芽酵母SaccharomycescerevisiaeYIT3株及びYIT4株が挙げられる。YIT3株は受託番号FERMP22184として、YIT4株は受託番号FERMP22185として、2011年11月8日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。一方、本発明の別の実施形態では、α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつNアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子及びα12マンノシダーゼI遺伝子が導入されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有し、かつGlcNAc1Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能をさらに有する変異酵母も提供される。α12マンノシダーゼI遺伝子は宿主ゲノム中に組み込まれていることが好ましい。α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子の機能欠損、及びα12マンノシダーゼI遺伝子の導入は、上記のプロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、並びにα16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損し、α12マンノシダーゼI遺伝子が導入された改変酵母と同様である。本実施形態では、宿主酵母に導入するNアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子典型的には、GnTI遺伝子は、任意の生物由来であってよく、例えば植物のNアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子であってもよい。NアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子の配列は、様々な生物で公知になっている。宿主酵母に導入するNアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子は、好ましくはイネ科植物のNアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子であり、より好ましくはイネのNアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子である。この改変酵母は、NアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子の導入により、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の末端マンノース残基にNアセチルグルコサミン残基を付加し、哺乳動物において見られる複合型糖鎖中間体GlcNAc1Man5GlcNAc2を生成することができる。この改変酵母はまた、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能も保持している。本発明に係るこのような変異酵母のとりわけ好適な具体例としては、出芽酵母SaccharomycescerevisiaeYKT1株が挙げられる。YKT1株は、2010年11月30日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1つくばセンター中央第6に、受託番号FERMP22043として寄託されている。本発明に係るさらに別の実施形態では、α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつα12マンノシダーゼI遺伝子が1コピー又は2コピー以上導入され、さらにタンパク質分泌生産能が増強されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖M5糖鎖の産生能を有し、かつMan8GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖M8糖鎖の産生能をさらに有する変異酵母も提供される。この変異酵母においては、導入した外来遺伝子からの組換えタンパク質の分泌生産能が、タンパク質分泌生産能の増強前の酵母に同じ外来遺伝子を導入した場合と比較して、好ましくは11倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは4倍以上、なお好ましくは10倍以上増加している。変異酵母の組換えタンパク質の分泌生産能は、上記と同様に、その変異酵母の培養上清中に分泌された組換えタンパク質の量を測定することにより評価することができる。この変異酵母においては、組換えタンパク質だけでなく内在性タンパク質の分泌生成能も顕著に増強されることが好ましい。この変異酵母の作製は、α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつα12マンノシダーゼI遺伝子が導入されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖M5糖鎖の産生能を有し、かつMan8GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖M8糖鎖の産生能をさらに有する変異酵母から作製することができる。このような酵母株の作製は、そのゲノムにさらに、タンパク質分泌生産能を増強させる変異を導入することによって行うことができる。変異導入法としては、限定するものではないが、例えば、不均衡変異導入法AbeHetalGlycobiologyvol19no4pp428436、特許文献3、国際公開WO2009150848号が好適である。このようにして得られる変異酵母は、タンパク質の高い分泌生産能を有する。本発明に係るこの変異酵母の好ましい具体例としては、出芽酵母SaccharomycescerevisiaeYFY25株が挙げられる。本発明の一実施形態では、このような変異酵母について、さらに、プロテアーゼ遺伝子を機能欠損させることも好ましい。上記変異酵母、例えばYFY25株について、さらにプロテアーゼ遺伝子を機能欠損させた変異酵母も、本発明の範囲に含まれる。本発明に係る変異酵母において機能欠損させるプロテアーゼ遺伝子は、宿主酵母の内在性の任意の1つ又は2つ以上のプロテアーゼ遺伝子であってよく、例えば、PEP4遺伝子出芽酵母では、GenBankアクセッション番号M13358の配列中、ORFCDS配列は728~1945位、PRB1遺伝子出芽酵母では、GenBankアクセッション番号M18097の配列中、ORFCDS配列は1944~3851位、YPS1遺伝子GenBankアクセッション番号BK006945の配列中、ORFCDS配列は386511~388220位相補鎖、及びKEX2遺伝子GenBankアクセッション番号Z71514の配列中、ORFCDS配列は495~2939位等が挙げられる。このようにしてさらにプロテアーゼ遺伝子を機能欠損させた本発明に係る変異酵母は、好ましくは特に高いタンパク質分泌生産能を有する。本発明に係るこの変異酵母では、導入した外来遺伝子から発現される組換えタンパク質の分泌生産能が増強されるだけでなく、内在性タンパク質の分泌生産能も増強される。この変異酵母においては、例えば導入した外来遺伝子からの組換えタンパク質の分泌生産能が、プロテアーゼ遺伝子を機能欠損させる前の変異酵母に同じ外来遺伝子を導入した場合と比較して、好ましくは11倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは4倍以上、なお好ましくは10倍以上増加している。変異酵母の組換えタンパク質の分泌生産能は、その変異酵母の培養上清中に分泌された組換えタンパク質の量を測定することにより評価することができる。酵母における組換えタンパク質の分泌生産能の評価は、例えば、ガレクチン9遺伝子発現ベクターを当該酵母に導入し好ましくはそのゲノム中に導入し、その培養上清例えば30°Cで72時間培養後の培養上清中のガレクチン9量を測定することによって行うことができ、例えば実施例10に記載の方法に従って行うことができる。このようにして得られる変異酵母は、糖タンパク質の組換え生産を行う際に、タンパク質生産効率を顕著に増加させることができて有利である。本発明に係るこのような変異酵母の好ましい具体例として、出芽酵母SaccharomycescerevisiaeYFY26株が挙げられる。YFY26株は、2011年12月5日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号FERMP22208受領番号FERMAP22208として寄託されている。本発明に係るこのような変異酵母は、糖タンパク質の組換え生産を行う際に、高いタンパク質生産効率を増加させることができて有利である。本発明は、上記のように、α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつα12マンノシダーゼI遺伝子が導入され、さらに不均衡変異導入法によって変異が導入されることによってタンパク質分泌生産能が増強されているか、またはプロテアーゼ遺伝子が機能欠損しているか、あるいは変異導入及びプロテーゼ遺伝子の機能欠損によりタンパク質分泌生産能が増強されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有する変異酵母を提供する。このような変異酵母の具体例には、上記のYIT3株、YIT4株、YFY26株が含まれる。以上のような本発明における糖鎖改変酵母の作製の概要を、図13にまとめた。3.糖タンパク質の製造のための使用本発明では、上記のような糖鎖改変酵母を用いて糖タンパク質の製造を行うことができる。この糖タンパク質の製造方法では、哺乳動物型糖鎖を付加したタンパク質を製造することができる。したがって本発明は、哺乳動物型糖鎖を有する糖タンパク質又はそのような糖鎖の製造のための上記変異酵母の使用、及び上記変異酵母を用いた糖タンパク質又は糖鎖の製造方法を提供する。プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子及びα16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能欠損を有し、α12マンノシダーゼI遺伝子が導入されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有するがO結合型糖鎖の産生能が低下した変異酵母を用いた本発明に係る糖タンパク質の製造方法による産生に適した糖タンパク質は、限定するものではないが、例えば、エリスロポエチン、インターフェロンγ、インターフェロンβ、ラクトフェリン、トランスフェリン、αガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、αLイズロニダーゼ、アリールスルファターゼ、Nアセチルガラクトサミン6スルファターゼ、βガラクトシダーゼ、βグルコシダーゼ、イズロネート2スルファターゼ、セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ヘパランNスルファターゼ、Nアセチルαグルコサミニダーゼ、アセチルCoAαグルコサミニドNアセチルトランスフェラーゼ、Nアセチルグルコサミン6スルファターゼ、ガラクトース6スルファターゼ、アリールスルファターゼA、B及びC、アリールスルファターゼAセレブロシド、ガングリオシド、酸性βガラクトシダーゼGM1ガルグリオシド、酸性βガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、ヘキソサミニダーゼB、αフコシダーゼ、αNアセチルガラクトサミニダーゼ、糖タンパク質ノイラミニダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、並びにリソソームスフィンゴミエリナーゼ等が挙げられる。α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子の機能欠損を有し、NアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子及びα12マンノシダーゼI遺伝子が導入されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有し、かつGlcNAc1Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能をさらに有する変異酵母を用いた本発明に係る糖タンパク質の製造方法による産生に適した糖タンパク質は、限定するものではないが、例えば、エリスロポエチン、インターフェロンγ、インターフェロンβ、ラクトフェリン、トランスフェリン、αガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、αLイズロニダーゼ、アリールスルファターゼ、Nアセチルガラクトサミン6スルファターゼ、βガラクトシダーゼ、βグルコシダーゼ、イズロネート2スルファターゼ、セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ヘパランNスルファターゼ、Nアセチルαグルコサミニダーゼ、アセチルCoAαグルコサミニドNアセチルトランスフェラーゼ、Nアセチルグルコサミン6スルファターゼ、ガラクトース6スルファターゼ、アリールスルファターゼA、B及びC、アリールスルファターゼAセレブロシド、ガングリオシド、酸性βガラクトシダーゼGM1ガルグリオシド、酸性βガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、ヘキソサミニダーゼB、αフコシダーゼ、αNアセチルガラクトサミニダーゼ、糖タンパク質ノイラミニダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミダーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、並びにリソソームスフィンゴミエリナーゼ等が挙げられる。本発明に係る他の糖鎖改変酵母を用いた本発明に係る糖タンパク質の製造方法による産生に適した糖タンパク質の例も、上記と同様である。上記糖鎖改変酵母を用いた糖タンパク質の製造は、目的の糖タンパク質をコードするDNAを組み込んだ発現ベクターを宿主細胞である当該糖鎖改変酵母に導入して形質転換し、得られた形質転換酵母を培養し、組換えタンパク質の発現を誘導することによって行うことができる。形質転換酵母の培養方法は、酵母の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。培地としては、酵母が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地を用いればよく、具体的には、YPD培地、YPG培地、YPDG培地、YPAD培地、グルコース合成最小培地SD、ヨウ素添加最小培地SMM、Hartwellの完全培地HC、GAL発酵試験培地、胞子形成培地などを適宜用いることができる。培地には、KClやソルビトール等を添加してもよい。培地は、pH6~8に調整して用いることが好ましい。培養は、28~37°C、好ましくは29°C~35°C、より好ましくは30°Cで、適切な期間例えば一晩~1ヶ月、好ましくは1日24時間~14日間、より好ましくは2日48時間~7日間にわたり、常法に従い通気や攪拌を適宜行いながら実施すればよい。このようにして得られる糖タンパク質は、哺乳動物型糖鎖、例えば、外糖鎖を有さず、Man5GlcNAc2で示されるN結合型糖鎖を有している。プロテインOマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を機能欠損させた変異酵母を用いた場合は、本発明の方法により、O結合型糖鎖の結合量が顕著に低下した糖タンパク質を製造できる。NアセチルグルコサミントランスフェラーゼI遺伝子を導入した変異酵母を用いた場合には、GlcNAc1Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖が結合した糖タンパク質も併せて製造できる。あるいは、宿主酵母が生来的に有する糖タンパク質を、哺乳動物型糖鎖を付加して産生させることもできる。この場合、上記糖鎖改変酵母を目的の糖タンパク質発現誘導条件下で培養することにより、哺乳動物型糖鎖が付加された酵母タンパク質を産生させることができる。また、本発明に係る糖鎖改変酵母を用いた糖タンパク質の製造の一実施形態において、α16マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、α13マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びマンノース1リン酸付加制御遺伝子が機能欠損しており、かつα12マンノシダーゼI遺伝子が導入され、さらに、プロテアーゼ遺伝子が機能欠損していることによりタンパク質分泌生産能が増強されている、Man5GlcNAc2で表されるN結合型糖鎖の産生能を有する変異酵母を使用すれば、糖タンパク質好ましくは外来遺伝子由来の組換え糖タンパク質を高効率、高収量で培養上清中に分泌させることができて有利である。このようにして製造される哺乳動物型糖鎖を有する糖タンパク質又はそのタンパク質に付加された糖鎖は、変異酵母細胞又はその培養上清から通常の糖タンパク質の抽出法や単離精製法を用いて、取得することができる。例えば、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁し、その後、オートクレーブ、超音波破砕機、フレンチプレス、ホモジナイザー、ダイノミルなどを適宜用いて細胞を破砕し、得られる細胞抽出液を遠心分離して上清を得て、その上清から溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル-セファロースなどのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法などを適宜組み合せることにより、糖タンパク質を回収することができる。培養上清中に分泌生産したタンパク質の場合は、その培養上清から硫安などによる塩析法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル-セファロースなどのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法などを適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。糖タンパク質から糖鎖を単離するためには、回収した糖タンパク質をヒドラジンやグリコペプチダーゼ例えば、グリコペプチダーゼF等などで処理し、有機溶媒を用いて抽出し、水層を採取する方法を用いることができる。以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。[参考例1]増殖能を回復した糖鎖改変酵母株の作製特開2008220172に記載された増殖能を回復した糖鎖改変酵母株の作製方法に従い、Man8GluNAc2糖鎖の産生能を有し、ヒト型糖タンパク質を効率よく生産し、かつ増殖能力及びタンパク質生産能力に優れた糖鎖改変酵母株YAB100を作製した。簡単に述べると、国際公開WO01014522号パンフレットに開示される糖鎖改変酵母株TIY19OCH1遺伝子破壊Δoch1、MNN1遺伝子破壊Δmnn1、及びMNN4遺伝子破壊Δmnn4を有すると同じクローンから四分子分析によって得た、TIY19と同じ構造の改変糖鎖を産生する出芽酵母糖鎖改変株TIY20株matαoch1hisGmnn1hisGmnn4hisGに、pol3遺伝子変異体配列番号1を導入して形質転換体を得て、それを出芽酵母用合成培地SDU67gYeastnitrogenbasewithoutaminoacidsDifcolaboratories、20gグルコース、077gCMSURASunriseScienceProducts液体中で培養し、さらに高温耐性株を得るためSDU固形培地に播いて37°Cで3日間培養し、生えてきたコロニーを採取し、完全培地YPAD10g酵母エキスDifcolaboratories、20gペプトンDifco、02g硫酸アデニンSigma、20gグルコース1Lにストリークして培養し、単一コロニーを回収し、そのうちSDU培地で生えることができないコロニーを取得した。得られたコロニーの酵母株については、親株であるTIY20と同じ糖鎖長のN結合型糖鎖を生成することを確認した。この酵母株の成長回復効率をYPAD中で調べたところ野生株と比べてTIY20株で低下した増殖能が回復したことが確認された。また糖鎖構造解析により、得られたこの酵母株がいわゆる哺乳動物型糖鎖に当たるMan8GluNAc2の糖鎖を産生することが確認された。またキチナーゼ解析により、得られた酵母株からのタンパク質分泌効率が、TIY20株で低下したタンパク質分泌効率が野生型と同等レベルに回復したことも示された。このようにして得られた増殖能及びタンパク質分泌効率を回復した哺乳動物型糖鎖Man8GluNAc2を産生する糖鎖改変酵母株YAB100株を、以下の実施例で用いた。YAB100株は、2006年7月11日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている受託番号FERMBP11122。[実施例1]YFY20株の取得1Asaitoiのα12マンノシダーゼI遺伝子msdSのゲノムインテグレーション用ベクターpRS304OCH1msdSの構築出芽酵母Saccharomycescerevisiaeから抽出したゲノムDNAを鋳型として、出芽酵母OCH1遺伝子OCH1遺伝子配列:GenBankアクセッション番号NM001180903;Och1全長アミノ酸配列:NCBIデータベースアクセッション番号NP011477の膜貫通領域開始メチオニンMetより61アミノ酸;配列番号2をコードするDNA断片を、PCR法により取得した。PCRに使用したプライマーは、公知のOCH1遺伝子配列に基づいて設計し、常法により合成した。また、AspergillussaitoiAsaitoiから抽出したゲノムDNAを鋳型として、Asaitoiのα12マンノシダーゼI遺伝子msdSmsdS遺伝子配列:GenBankアクセッション番号D49827;msdS全長アミノ酸配列:NCBIデータベースアクセッション番号BAA08634由来の、N末端から37アミノ酸を除去したN末端切断msdSタンパク質配列番号3をコードするDNA断片を、PCR法により取得した。PCRに使用したプライマーは、公知のmsdS遺伝子配列に基づいて設計し、常法により合成した。得られた両DNA断片を連結して融合遺伝子を構築し、それを出芽酵母用発現ベクターYEp352GAPIINakayamaKetalGlycobiologyvol13pp673680のEcoRISalI部位にクローニングし、pAB103を構築した。このpAB103を鋳型とし、PCR反応にて、ベクター中のGAPDHプロモーター及びターミネーターKainumaetalGlycobiologyvol9pp133141を融合遺伝子インサートと共に含むOCH1msdSDNA断片を増幅した。このPCR反応にはフォワードプライマーGAPFNot15CCCCCGCGGCCGCGGAACAACAAGAAGTTTAATGACGCGGAGGCC3配列番号4、及びリバースプライマーGAPRKpn15GGGGGGGTACCGAATCGAAAATGTCATTAAAATAGTATATAAATTG3配列番号5を用いた。PCR反応液は以下の組成で調製した。PCR反応液組成10X反応バッファー50μl鋳型DNA20ng100μMフォワードプライマー02μl100μMリバースプライマー02μlDNAポリメラーゼExpandHighFidelityロシュ1μl滅菌ミリQ水全量50μlとなるように添加合計50μlPCR反応条件は鋳型変性の1サイクル94°Cで2分の後、PCR合成の30サイクル94°Cで15秒、55°Cで30秒、72°Cで2分30秒72°Cの反応時間を11サイクル以降は1サイクルにつき5秒延長、そして1サイクル72°Cで7分とした。得られた増幅断片をTAクローニング用ベクターpCR21TOPOInvitrogenのTAクローニングサイトにクローニングした。このベクターを制限酵素NotI及びKpnIにより消化し、得られたDNA断片GAPDHOCH1msdSを、ゲノム組み込み型ベクターpRS304のNotIKpnI部位にクローニングし、得られた組換えベクターをpRS304OCH1msdSとした。2YFY20株OCH1msdS発現株の作製pRS304OCH1msdSを制限酵素EcoRVにて切断し、直鎖状にした。この直鎖状ベクターを上記の参考例1で作製した糖鎖改変酵母株YAB100に導入して形質転換した。酵母細胞の形質転換は以下のようにして行った。まず、糖鎖改変酵母株YAB100を、液体培地YPADKCl10g酵母エキスDifco、20gペプトンDifco、20gグルコース、02g硫酸アデニン和光純薬、2237gKCl1L5ml中で15時間振とう培養し、培養後の酵母細胞を全て回収し、滅菌ミリQ水1mlで洗菌した。得られた菌体ペレットをDTTバッファー10mMジチオトレイトール、06Mソルビトール、10mMTrisClpH751mlに懸濁し、室温で30分静置した後、氷冷した1Mソルビトール1mlで3回洗菌した。菌体ペレットを100μlの1Mソルビトールに懸濁して前述の直鎖状ベクターを3μg加え、おだやかに攪拌し氷上で5分静置した。この懸濁液をエレクトロポレーション用キュベット2mmギャップに移し、エレクトロポレーターBIORAD製MicroPulserを用いて通電15kV、1pulseした後、回収し、SDWプレート67gYeastnitrogenbasewoaminoacidDifco、20gグルコース、02g硫酸アデニン和光純薬、074gTrpDOSupplementClontech、2237gKCl、20g寒天1Lにプレーティングして30°Cで培養し、トリプトファン陽性コロニーを得た。このようにして得られた複数の形質転換体より、コロニーPCR法にて、OCH1msdSDNA断片がゲノム中に組み込まれている株を選抜し取得した。コロニーPCR反応には、msdS遺伝子を特異的に増幅するフォワードプライマーMan13F5CGAAGAACCTCGCCG3配列番号6及びリバースプライマーMan1Sal15’GGGCCCGTCGACTTATGTACTACTCACCCGCACTGGATGTGCCTCGG3配列番号7を用いた。PCR反応液は以下の組成で調製した。PCR反応液組成10X反応バッファー10μl01BSA17μl酵母菌体適宜100μMフォワードプライマー01μl100μMリバースプライマー01μlDNAポリメラーゼExTaq025μl滅菌ミリQ水全量10μlとなるように添加合計10μl反応条件は菌体破壊の1サイクル94°Cで5分の後、PCR合成の40サイクル92°Cで30秒、49°Cで30秒、72°Cで1分、そして1サイクル72°Cで7分とした。得られた増幅産物の4μlを、10アガロースゲルにアプライし、100Vで20分で電気泳動電気泳動バッファー:Tris塩基242g、酢酸571ml、EDTA2Na186g500mlを行い、msdS遺伝子に特異的なバンドが検出された株msdSを発現している株を選抜した。さらに、選抜した株でOCH1msdS融合遺伝子が発現していることを、RTPCR法により確認した。このようにして得られたOCH1msdS発現株、及び参考例1で得たYAB100株を、それぞれ、10mlYPAD液体培地にて30°Cで15時間振とう培養した。これらの菌体をそれぞれ回収し、滅菌水にて菌体を洗浄後、200μlのセパゾールナカライテスク株式会社とガラスビーズを加え、激しくボルテックスすることにより菌体を破砕した。菌体破砕液を新しいチューブに移した後、800μlのセパゾールを加え、撹拌後、室温にて5分静置した。200μlのクロロホルムを加えて転倒混和し、室温で3分間静置後、4°C、12000gで15分間遠心分離した。水相を別のチューブへ移し、500μlのイソプロパノールを加え、混和し10分室温にて静地した。4°C、12000gで5分間遠心し、上清を除去した。得られたペレットに75エタノールを加え、洗浄後、エタノールを捨て、十分乾燥させた後、200μlのDEPEC処理水に溶かした。さらに、同量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール50482を加え、混和後、12000gで5分間、室温にて遠心分離した。水相を新しいチューブに移し、25倍量の100エタノールと110量の3MLiClを加え、80°Cにて30分静置した後、4°C、12000gで15分間遠心した。上清を捨て、ペレットを70エタノールにて洗浄し、よく乾燥させた後、100μlの滅菌ミリQ水に溶かしてRNAサンプルとした。ゲノムDNAの混入を防ぐために、上記で得たRNAサンプルの30μlに、5μlのDNaseI反応バッファーインビトロジェンデオキシリボヌクレアーゼIAmplificationGrade及び2μlのDNAaseIAmpgrade;インビトロジェン、13μlのミリQ水を加えて23°Cにて15分間静置し、DNAを分解した。これに、4μlの25mMEDTAを加え、65°Cにて10分加熱後、同量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール50482を加え、混和後、12000gで5分間、室温にて遠心分離した。水相を新しいチューブに移し、25倍量の100エタノールと110量の3MLiClを加え、80°Cにて30分静地した後、4°C、12000gで15分間遠心した。上清を捨て、ペレットを70エタノールにて洗浄し、よく乾燥させた後、30μlの滅菌ミリQ水に溶かした。このようにして得られた全RNAを鋳型として、RTPCR逆転写PCRを行った。RTPCR反応にはフォワードプライマーMan13F5CGAAGAACCTCGCCG3配列番号8及びリバースプライマーMan1RX5GTCAAGTGTTGCGAGCTC3配列番号9を用いた。RTPCR反応の反応液は以下の組成で調製した。RTPCR反応液組成2X反応バッファー625μl鋳型RNA1μg10μMフォワードプライマー025μl10μMリバースプライマー025μl逆転写酵素RTPlatinumTaqMix025μl滅菌ミリQ水全量125μlとなるように添加合計125μl反応条件はcDNA合成の1サイクル50°Cで30分、94°Cで2分の後、PCR合成の25サイクル94°Cで15秒、55°Cで30秒、72°Cで1分、そして1サイクル72°Cで10分とした。得られた増幅産物の6μlを20アガロースゲルにアプライして上述と同じ方法で電気泳動し、msdS特異的なバンドが検出されることを確認した。このようにして得られたOCH1msdS発現株をYFY20株と命名した。3YFY20株の糖鎖構造解析aマンノプロテインの抽出作製したYFY20株、及び糖鎖改変酵母株YAB100株特開2008220172参照をそれぞれ、25mlのYPAD培地300mMKCl含有で30°C、180rpmで72時間培養した。培養開始より24、36、48、60時間目に、最終濃度2のグルコースを添加した。培養終了後、1200g、2分間の遠心分離にかけ、菌体を回収した。これをPBSで洗浄し、10mlの100mMクエン酸バッファーpH7に再懸濁した。その後、マンノプロテイン抽出のため、121°Cで2時間オートクレーブにかけて加熱した。加熱終了後、10000gで10分間遠心分離して上清9mlを回収し、27mlの100エタノールを加えて30°Cで1時間放置した。その後10000g、10分間遠心分離して沈殿を回収し、80エタノール、100エタノールで順次洗浄した後、エタノールを揮発させて除去してタンパク質を回収した。bグリコペプチダーゼF処理によるN結合型糖鎖の切り出し及び粗精製回収したタンパク質を03mlの可溶化バッファー500mMTrisHCl05SDS0752メルカプトエタノールpH86中に懸濁し、100°Cで3分間処理した。その後20000gで10分間遠心して上清を回収した。これを20μl採取して新しいチューブに移し、さらに20μlの5NonidetP40、56μlのDDWdoubledistilledwater、4μlの05mUμlのグリコペプチダーゼFタカラバイオを加えて、37°Cで20時間反応させた。反応終了後、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール25241を加えてよく撹拌し、遠心分離して水層を回収した。この水層にクロロホルムイソアミルアルコール241加えてよく撹拌し、遠心分離して再度水層を回収した。最後に、水層を遠心濃縮機で完全に乾燥させた。このようにして得られる粗精製乾燥サンプルには糖鎖が含まれる。c糖鎖のPA化及びHPLCによる分析上記bで得た糖鎖のピリジルアミノ化PA化と精製は、ピリジルアミノ化マニュアルキットPyridylaminationManualKit;タカラバイオを用いてキット添付の使用説明書に従って行った。簡単に説明すると、乾燥糖鎖試料にカップリング試薬を添加して80°Cで15時間反応させ、さらにその反応液に還元試薬を添加して80°Cで1時間反応させることにより、糖鎖還元末端残基に2アミノピリジンを還元アミノ化反応で結合させて糖鎖を安定な蛍光誘導体に誘導化PA化し、続いて、この試料溶液をセルロースカートリッジシリンダーに注入し、溶媒1ブタノール/エタノール/水/酢酸41097003容量比で洗浄した後、溶媒2エタノール/75mM重炭酸アンモニウム12容量比を注入して糖鎖を溶出させることによりカラムクロマトグラフィー精製を行った。このようにして精製及び乾燥させたPA化糖鎖を100μlのDDWに溶解し、UltrafreeMCミリポアを用いて不溶物の除去を行った後、HPLCで分析した。HPLC分析の詳細は以下の通りである。HPLC:超高速液体クロマトグラフProminenceUFLC島津製作所カラム:TSKgelAmide803μm東ソー溶媒:アセトニトリル200mM酢酸トリエチルアミン73溶媒Aアセトニトリル200mM酢酸トリエチルアミン37溶媒B分析時間:60分グラジエント:分離開始から50分間で溶媒A100溶媒B0から溶媒A50溶媒B50へのリニアグラジエント。50分以後は溶媒A50溶媒B50を維持。流速:1mlmin励起波長:310nm蛍光波長:380nmこのHPLC分析の結果、図2に示すように、YFY20株では、YAB100株で見られるマンノース8個を含む糖鎖M8図1C、図2Aが消失し、マンノース5個を含む糖鎖M5に置き換わっていた図1D、図2B。このことから、YFY20株が産生する糖鎖においては、マンノース8個からなる糖鎖部分が、導入したα12マンノシダーゼによってマンノース5個からなるM5型糖鎖にトリミングされていることが示された。[実施例2]YFY22株及びYFY24株の取得1PMT1遺伝子及びPMT2遺伝子破壊用のプラスミドの構築糖鎖改変酵母株におけるO結合型糖鎖の産生を抑制するため、実施例1で得たYFY20株を用いて、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼPMT1及びPMT2遺伝子がさらに破壊された酵母株の作製を行った。このPMT1及びPMT2遺伝子の破壊には、ネズミチフス菌SalmonellaTyphimurium由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするhisG遺伝子を利用した、URA3栄養要求性マーカーを繰り返し利用できるシステムAlaniEetalGenetics116541545;国際公開WO0114522号を用いた。このシステムでは、ゲノム中の標的遺伝子を、相同組換えにより、hisG遺伝子で挟み込んだURA3遺伝子ウラシル非要求性をもたらす含有断片で置換することで破壊し、その破壊株の選抜の際にウラシル栄養要求性マーカーを利用し、選抜後にはウラシルによって毒性を示す5フルオロオロオロチン酸5FOAの添加によって両端のhisGの間で相同組換えを引き起こしてURA3を欠損させ、URA3マーカーを繰り返し利用することができる。PMT1遺伝子破壊用のプラスミドとしては、プラスミドpSP73promegaから購入のBamHI部位にhisGURA3hisGHUH断片AlaniEetalGenetics1165415451987を挿入したプラスミドpSP73HUHのSph1PvuII部位にPMT12454~2756断片、PvuIIXhoI部位には2~290断片を挿入し、pSP73pmt1HUHを構築した。PMT2遺伝子破壊用のプラスミドとしては、pSP73のBamHI部位にhisGURA3hisG断片、Sph1PvuII部位にPMT12260~2583断片を、PvuIIXhoI部位には3~319断片を挿入し、pSP73pmt2HUHを構築した。なお上記挿入断片における領域位置指定は、出芽酵母S288c株の染色体IVの全長配列GenBankアクセッション番号NC001136上のPMT1遺伝子配列PMT1のORFNC001136配列の287059~289512位、及び同染色体Iの全長配列GenBankアクセッション番号NC001133のPMT2遺伝子配列PMT2のORFNC001133配列の106273~108552位に基づく。得られたそれぞれの遺伝子破壊用プラスミドは制限酵素PvuIIで切断し、直鎖状にした。2YFY21株の取得1で得た直鎖状プラスミドを、実施例1で作製したYFY20株に導入して形質転換した。得られた形質転換体の中から、コロニーPCR法により、pmt1HUH株ゲノム中のPMT1遺伝子が、相同組換えによりPMT1の5端含有断片HUHPMT1の3端含有断片で置換されているを選抜し取得した。このコロニーPCR反応にはフォワードプライマーURACF5GGTAGAGGGTGAACGTTAC3配列番号10及びリバースプライマーPMT1R35TGATCTTACACACCTGC3配列番号11を用いた。反応液の組成は上述のYFY20株選抜時のコロニーPCRで用いた組成と同じであった。PCR反応条件は、菌体破壊の1サイクル94°Cで5分後、PCR合成の40サイクル92°Cで30秒、50°Cで30秒、72°Cで2分、そして1サイクル72°Cで7分とした。得られた増幅産物の4μlを、10アガロースゲルを用いて上述の通り電気泳動し、バンドを検出した。pmt1HUH株に特異的なバンドが検出された株を選抜した。このpmt1HUH株のゲノムより、導入したマーカー遺伝子URA3を除去するため、その株を5フルオロオロチン酸以下5FOA培地67gYeastnitrogenbasewoaminoacidDifco、20gグルコース、02g硫酸アデニン和光純薬、50mgウラシルナカライテスク、077gUraDOSupplementClontech、1g5FOA和光純薬1L上に塗布した。5FOAは、URA3がコードするタンパク質によって有毒性の物質に変換されるため、URA3欠損株又はURA3変異株のみが、5FOAを取り込んでも生存可能である。そこで5FOA培地上でコロニー形成した複数の株を、URA3削除株として採取した。この採取した株について、PCR法によりURA3の削除を確認した。PCR反応は対象酵母株より抽出されたゲノムDNAを鋳型とし、フォワードプライマーPMT1F5GACACGTGTCGAAGAAGAG3配列番号12;PMT1の5端配列に結合及びリバースプライマーPMT1R35TGATCTTACACACCTGC3配列番号13;PMT1の3端配列に結合を用いて行ったゲノムPCR。ゲノムPCR反応の反応液は以下の組成で調製した。ゲノムPCR反応液組成10X反応バッファー:1μl鋳型ゲノムDNA:1μg50μMフォワードプライマー:02μl50μMリバースプライマー:02μlDNAポリメラーゼExTaq:004μl滅菌ミリQ水:全量10μlとなるように添加合計10μl反応条件は鋳型変性の1サイクル94°Cで2分の後、PCR合成の30サイクル94°Cで15秒、50°Cで30秒、72°Cで3分、そして1サイクル72°Cで7分とした。検出されたバンド長から、ゲノムからのURA3遺伝子の削除を確認した。こうして得た、PMT1が破壊されたpmt1HUH株のうちでURA3遺伝子の削除が確認された株を、YFY21株と命名した。3YFY22株の取得上記のようにして得られたYFY21株に、不均衡変異導入法を適用し、増殖能等を回復させた株を得るために、配列番号25のORFオープンリーディングフレーム配列を有する変異pol3遺伝子を含みその組換え発現をもたらす出芽酵母用ミューテーター化ベクターYCplac33NMLmutII国際公開WO2009150848号を上記と同様の方法で導入し形質転換し、その形質転換体について以下の方法にて培養を行った。得られた形質転換体をSDUKCl液体培地67gYeastnitrogenbasewoaminoacidDifco、20gグルコース、02g硫酸アデニン和光純薬、077gUraDOSupplementClontech、2237gKCl1Lにて培養し、変異を蓄積させるために10回継代を繰り返した。この継代後の菌をSDUKCl固体培地にスプレッドし、30°Cで3日間培養し、最も大きなコロニーを形成した株を釣菌した。得られた株よりYCplac33NMLmutIIを脱落させるため、完全培地YPADKCl10g酵母エキスDifco、20gペプトンDifco、20gグルコース、02g硫酸アデニン和光純薬、2237gKCl1Lにストリークして培養し、単一コロニーを複数個回収した。これらのうち、プラスミドの脱落によりウラシル要求性を取り戻した株、すなわちSDUKCl培地で生えてくることができない株を選抜した。こうして選抜された株を、YFY22株と命名した。YFY22株では、YFY21株で低下した増殖能生育能が回復した。出芽酵母SaccharomycescerevisiaeYFY22は、2010年11月30日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した受託番号FERMP22041。4YFY23株の取得上記3のようにして得られたYFY22株に、上記1で作製した制限酵素PvuIIで直鎖状にしたプラスミドpSP73pmt2HUHを、上述の方法で導入し形質転換した。得られた形質転換体の中から、コロニーPCR法によりpmt2HUH株ゲノム中のPMT2遺伝子が、相同組換えによりPMT2の5端含有断片HUHPMT2の3端含有断片で置換されているを選抜し取得した。コロニーPCRにはフォワードプライマーURACF5GGTAGAGGGTGAACGTTAC3配列番号14及びリバースプライマーPMT2R5CGAATAACACGAGTACGG3配列番号15を用いた。コロニーPCR反応液の組成は上述のYFY20株選抜時のコロニーPCRで用いた組成と同じであった。PCR反応条件は菌体破壊の1サイクル94°Cで5分の後、PCR合成の40サイクル92°Cで30秒、53°Cで30秒、72°Cで2分、そして1サイクル72°Cで7分とした。得られた増幅産物の4μlを、10アガロースゲルを用いて上述の通り電気泳動し、バンドを検出した。pmt2HUHに特異的なバンドが検出された株を選抜した。このpmt2HUH株より、導入したマーカー遺伝子URA3を除去するため、上記と同様にして5FOA培地を用いたポジティブセレクションを行い、5FOA培地上でコロニー形成した株を複数個取得した。これらの株について、PCR法にてゲノムDNAからのURA3の削除を確認した。PCR反応は、対象酵母株より抽出されたゲノムDNAを鋳型とし、フォワードプライマーPMT2F5GATCCGTTTCGTGTACTG3配列番号16;PMT2の5端配列に結合、リバースプライマーPMT2R5CGAATAACACGAGTACGG3配列番号17;PMT2の3端配列に結合を用いて行った。反応液の組成は上述のゲノムPCR反応で用いたものと同様である。。反応条件は鋳型変性の1サイクル94°Cで2分の後、PCR合成の30サイクル94°Cで15秒、53°Cで30秒、72°Cで3分、そして1サイクル72°Cで7分とした。検出されたバンド長から、ゲノムからのURA3遺伝子の削除を確認した。こうして得たURA3遺伝子の削除が確認された株を、YFY23株と命名した。YFY23株では、PMT1遺伝子とPMT2遺伝子の両方が破壊されている。5YFY24株の取得上記のようにして得られたYFY23株に、上記ベクターYCplac33NMLmutIIを上記と同様の方法で導入し形質転換した。得られた形質転換体をSDUKCl液体培地にて培養し、変異を蓄積させるために10回継代を繰り返した。この継代後の菌をSDUKCL固体培地にスプレッドし、30°Cで5日間培養し、最も大きなコロニーを形成した株を釣菌した。得られた株よりYCplac33NMLmutIIを脱落させるため、完全培地YPAD個体培地にストリークして培養し、単一コロニーを複数個回収した。これらのうち、プラスミドの脱落によりウラシル要求性を取り戻した株を上記と同様にして選抜した。こうして選抜された株を、YFY24株と命名した。YFY24株では、YFY23株で低下した増殖能生育能が回復した。出芽酵母SaccharomycescerevisiaeYFY24は、2010年11月30日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した受託番号FERMP22042。[実施例3]糖鎖改変酵母株の表現型解析1増殖能の評価実施例1及び2で作製した糖鎖改変酵母株YFY20、YFY21、YFY22、YFY23、及びYFY24株、並びにTIY20株、YAB100株特開2008220172及び野生型株W3031Bmataleu23112trp11can1100ura31ade21his31115;ThomasBJandRothsteinRCell56619630の8株の増殖能を以下のようにして比較検討した。これらの酵母株を、YPADKCl液体培地5mlで前培養した30°C。20mlのYPAD液体培地に、菌体濃度がそれぞれOD600=01となるように前培養液を植菌した。これらの菌体を30°Cにて振とう培養し、培養開始72時間目までOD600での濁度を経時的に測定した。測定結果を図3に示す。α12マンノシダーゼI遺伝子を導入したYFY20株図中、白抜き三角は、親株と同等の糖鎖改変株YAB100図中、黒三角と比較すると、増殖速度が若干遅くなるものの、最高到達菌体濃度はほぼ同等であった。YFY20株のPMT1遺伝子を破壊して作製されたYFY21株図中、黒四角では増殖速度は著しく低下し、また最高到達菌体濃度も親株であるYFY20株の約60にまで抑制された。一方、YFY21株由来の増殖能回復株YFY22図中、白抜き四角では、増殖速度が回復し、最高到達菌体濃度もYFY20株の約82まで回復していた。YFY22株のPMT2遺伝子をさらに破壊して作製されたYFY23図中、黒ひし形では再び増殖速度が低下し、最高到達菌体濃度もYFY21株と同程度にまで低下した。さらにYFY23株由来の増殖能回復株YFY24図中、白ひし形では増殖速度が回復し、最高到達濃度もYFY20株の約89まで回復した図3。2ストレス耐性の評価YFY20株、YFY21株、YFY22株、YFY23株、YFY24株、TIY20株、YAB100株及びW3031B株の計8株を、YPADKCl液体培地5mlで前培養した30°C。これらの前培養液を、濁度がOD600=10、01、001、0001、00001となるように滅菌水で段階希釈し、YPAD固体培地にそれぞれ5mlずつ滴下した。これらを30°C、35°C、又は37°Cで静置培養し、高温耐性を評価した。一方、3mgmlハイグロマイシンBSigma又は4mgmlCalcofluorwhiteSigmaを含むYPAD固体培地に、上記菌体を同様に滴下し、30°Cで静置培養して薬剤耐性を評価した。図4に示すように、YFY20株では、親株と同等のYAB100株よりも高温ストレスや薬剤ストレスに対する耐性が低下していた。YFY21株では通常温度下での増殖がYFY20株よりもさらに抑制され、高温ストレス耐性及びCalcofluorwhiteに対する薬剤ストレス耐性も低下していることが示された。一方、YFY22株では、高温及び薬剤ストレスに対する耐性は著しく増大し、特に高温とハイグロマイシンBに対する耐性はYFY20株よりも強化されていた。YFY23株では高温及び薬剤ストレスへの耐性は再び低下し、著しいストレス感受性を示した。しかしYFY24株では、高温及び薬剤ストレス耐性が回復する傾向が認められた図4。3O結合型糖鎖長の解析糖鎖改変酵母株のO結合型糖鎖生成を解析するため、酵母の分泌タンパク質であるキチナーゼにおけるO結合型糖鎖結合量を指標として以下のようにして測定した。YFY20株、YFY22株、YFY24株、TIY20株、YAB100株及びW3031B株を、それぞれ25mlのYPAD培地300mMKCl含有で30°C、180rpmで72時間培養した後、1500×gで2分間の遠心分離にかけ、培養上清を回収した。この培養上清に40mgの湿潤キチンwetchitin;カニ甲羅由来粗精製キチンシグマアルドリッチを1SDS12メルカプトエタノールで100°Cで10分間処理した後、DDWで10回洗浄したものを加えて、4°Cで24時間ゆっくりと撹拌した。撹拌終了後、しばらく静置して培養上清を除去し、キチンを回収した。これをPBSで3回洗浄した後、80μlの2×SDSPAGEサンプルバッファーを加えて懸濁し、100°Cで10分間処理した。その後上清を回収し、このうち5μlをSDSPAGE520で分離した。検出はマンノース結合性レクチンであるコンカナバリンAConAによるレクチン染色にて行った。図5に示すように、YFY22株及びYFY24株ではキチナーゼの分子量がW3031B株、TIY20株、YAB100株及びYFY20株よりも低分子側にシフトしており、キチナーゼにおけるO結合型糖鎖の結合量が大幅に減少していた。このことは、プロテインOマンノシルトランスフェラーゼPMT1、PMT2遺伝子の破壊により、YFY22株及びYFY24株におけるタンパク質へのO結合型糖鎖の付加が大幅に減少したことを示している。[実施例4]YKT1株の取得1pAUR101HAMNN9TMDOsGnTIプラスミドの作製イネ由来のGnTI遺伝子OsGnTI;NアセチルグルコサミントランスフェラーゼIGenBankアクセッション番号NM001055166の膜貫通領域除去断片NCBIデータベースアクセッション番号NP001048631の、アミノ酸35442位の配列配列番号18コード配列に、出芽酵母の糖転移酵素MNN9MNN9遺伝子配列:GenBankアクセッション番号NM001183864、MNN9全長アミノ酸配列:NCBIデータベースアクセッション番号NP015275の膜貫通領域MNN9TMD;アミノ酸140位;配列番号19コード配列を融合させた融合遺伝子を構築した。ここでOsGnTIを酵母タンパク質の膜貫通領域と融合させたのは、酵母細胞内で発現したOsGnTIが酵母ゴルジ体上にアンカリングされるようにするためである。またOsGnTIの発現を容易に確認できるようにするためにHAタグも付加した。次いで、フォワードプライマーSacIfMHAMNN9TDFprimer:5AAAAGAGCTCATGCCATACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGTCACTTTCTCTTGTATCGTACCGCCTAAGA3配列番号20、及びリバースプライマーXbaIOsGnTIRprimer:5AAAATCTAGACTATACCCTAAGCTGACTGAGGGAATCCGGA3配列番号21を用いてベクターから融合遺伝子HAMNN9TMDOsGnTIを増幅し、それを酵母発現ベクターYEp352GAPIIのXbaISacI部位にクローニングして、発現ベクターYEp352GAPIIHAMNN9TMDOsGnTIを構築した。さらにその融合遺伝子をGAPDH発現ユニットとしてクローニングするため、フォワードプライマーSphIGAPDHPFprimer:5AAAGCATGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGA3配列番号22及びリバースプライマーGAPDHTRprimer:5TGTTGGGAAGGGCGATCGGT3配列番号23を用いて、PCR法により増幅した。得られた増幅断片GAPHAMNN9TMDOsGnTIをpAUR101タカラバイオのSmaISphIHF部位にクローニングし、発現ベクターpAUR101HAMNN9TMDOsGnTIを構築した。2HAMNN9TMDOsGnTI断片のYFY20株ゲノムDNAへの挿入によるYKT1株の構築上記で構築したpAUR101HAMNN9TMDOsGnTIをBstEIINewEnglandBiolabsで切断して直鎖化し、それをYFY20株へ導入して形質転換した。形質転換処理した酵母を、025μgmlオーレオバシジンAタカラバイオ及び300mMKClを含むYPADプレートにスプレッドして30°Cで培養した。pAUR101は抗真菌剤オーレオバシジンAに対する耐性遺伝子AUR1Cを保持している。本ベクターをAUR1C内に存在する制限酵素部位で切断して直鎖状とし、酵母に導入することで組換え体はオーレオバシジンA耐性となるため、オーレオバシジンA含有培地で培養することにより組換え体が選択される。生じたコロニーを同様のYPADプレートに移植し、再度30°Cで培養した。増殖した酵母を少量掻き取ってDNA抽出キットGenとるくんTM酵母用タカラバイオでゲノムDNAを抽出し、100μlのDDWに溶解した。このゲノムDNAを鋳型として、フォワードプライマーScChXIFprimer:5GTCCAAAGTACCAAACTCGACGT3配列番号26、リバースプライマーHARprimer:5CGTAATCTGGAACATCGTATGGGT3配列番号27を用いてPCRを行い、目的の増幅断片に相当する約5kbpのバンドが確認された株をYKT1株とした。なおScChXIFprimerは、ベクター挿入部位近傍の酵母11番染色体上の配列、HARprimerはHAタグに対する配列に対して設計した。3YKT1株のマンナン糖鎖の構造解析OsGnTIを導入したYKT1株では、マンナン糖鎖マンノースを主体とする糖鎖のマンノース残基にGlcNAcNアセチルグルコサミンが付加されると考えられる。そこでYKT1が生産するマンナン糖鎖にGlcNAcが結合されているかどうか調べるために、YKT1の糖鎖構造解析を行った。YKT1株及びYFY20株をYPAD培地20mlで30°Cにて72時間培養し、菌体を回収した。培養においては、培養24時間目に最終濃度2となるようにグルコースを添加し、以後12時間ごとに同様にグルコースを添加した。回収した菌体については、実施例1-3と同様の方法でマンノプロテイン抽出、グリコペプチダーゼF処理及び糖鎖のPA化を行い、HPLCに供した。図6に示すように、YFY20株が示したマンノース5個の糖鎖のピークに加え、YKT1株ではマンノース5個の糖鎖M5にGlcNAcが付加された糖鎖のピークが観察された。この結果から、YKT1株がGlcNAc1Man5GlcNAc2の糖鎖を生産することができる株であることが実証された。出芽酵母SaccharomycescerevisiaeYKT1株は、2010年11月30日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した受託番号FERMP22043。[実施例5]YKT4株の取得上述の実施例で作製したYFY24株の産生糖鎖を解析したところ、N結合型糖鎖の糖鎖種はM5ではなくM8が多かった。すなわちN結合型糖鎖のうちM5糖鎖の生産性が低下し、M8糖鎖の生産性が増加していた。これは不均衡変異導入法の適用によって増殖性がより高いM8糖鎖の生産能を増加させる変異がYFY24株に導入されたものと考えられる。そこで、pmt1及びpmt2遺伝子の二重破壊株であってかつM5糖鎖の生産性の高い株を作製するため、YFY24株に、実施例1で使用したAsaitoi由来α12マンノシダーゼI遺伝子msdSを以下のようにして再導入2コピー目の当該遺伝子を導入した。1Asaitoi由来α12マンノシダーゼI遺伝子msdSの再ゲノムインテグレーション用ベクターpRS305OCH1msdSの構築実施例1で作製したpRS304OCH1msdSを鋳型として、PCR反応にてGAPDHプロモーター及びターミネーターが付加されたOCH1msdS断片を増幅した。PCR反応にはフォワードプライマーXbaIGAPDHPF5AAATCTAGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGA3;配列番号28、リバースプライマーPstIGAPDHTR5AAAACTGCAGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGT3;配列番号29を用いた。PCRの反応溶液の組成は以下の通り。反応液組成05ngμl鋳型DNA溶液1μl10pmolμlフォワードプライマー15μl10pmolμlリバースプライマー15μl10mMdNTPs1μl10X反応バッファー5μl5UμlPfx50DNAポリメラーゼinvitrogen05μlDDW395μl合計50μl反応条件は初期変性1サイクル94°Cで2分、PCRを35サイクル94°Cで15秒、60°Cで20秒、68°Cで2分30秒、最終伸長1サイクル68°Cで3分とした。得られた増幅産物を出芽酵母用ゲノムインテグレーションベクターpRS305GenBankアクセッション番号U034371のXbaIPstI部位にクローニングし、得られた組換えベクターをpRS305OCH1msdSとした。2YKT4株の作製上記で得たpRS305OCH1msdSを制限酵素BstEIIで切断して直鎖状にし、YFY24株に導入し形質転換した。酵母の形質転換は以下のように行った。まずYFY24株を、SDLプレート67gYeastnitrogenbasewoaminoacidDifco、20gグルコース、02g硫酸アデニン和光純薬、074gLeuDOSupplementClontech、2237gKCl、20g寒天1Lにスプレッドして30°C、3日間培養し、ロイシン要求性に基づくスクリーニングを行った。生じたコロニーを再度SDLプレートにストリークして30°C、1日間培養した。増殖した出芽酵母の一部を掻き取って、GenとるくんTMタカラバイオを用いてゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを鋳型としたPCR反応にて、pRS305OCH1msdSがゲノムDNAに組み込まれたクローンを確認した。PCR反応には、フォワードプライマーScChIIIF5CAGAGGTCGCCTGACGCATATACCT3;配列番号30、及びリバースプライマーSacIOCH1TDF5AAGAGCTCATGTCTAGGAAGTTGTCCCACCT3;配列番号31を用いた。PCRの反応溶液は以下の通り。反応液組成10ngμl鋳型DNA溶液1μl10pmolμlフォワードプライマー03μl10pmolμlリバースプライマー03μlEmeraldAmp登録商標PCRMasterMixタカラバイオ5μlDDW34μl合計10μl反応条件は初期変性1サイクル94°Cで5分、PCRを35サイクル94°Cで20秒、55°Cで20秒、72°Cで6分、最終伸長1サイクル72°Cで3分とした。増幅産物をアガロース電気泳動で分離後、エチジウムブロマイド染色を行い、ゲノムDNAから増幅が見られたクローンをYKT4株とした。3YKT4株の糖鎖構造解析YFY24株のN結合型糖鎖はM5が16、M8が約60とその糖鎖種はM8がメインであった。α12マンノシダーゼI遺伝子が再導入されたYKT4株について、M5とM8の割合を調べるため、N結合型糖鎖の構造を解析した。まず、YKT4株及びYFY24株をYPAD培地20mlで30°Cにて72時間培養し、菌体を回収した。培養においては、培養24時間目に最終濃度2となるようにグルコースを添加し、以後12時間ごとに同様にグルコースを添加した。回収した菌体については、実施例1-3と同様の方法でマンノプロテイン抽出、グリコペプチダーゼF処理及び糖鎖のPA化を行い、HPLCに供した。その結果を図7に示す。図7に示すように、YFY24株ではM8がメインピークを示したのに対し図7A、YKT4ではマンノース5個の糖鎖M5のピークがメインピークとして観察された図7B。この結果から、YKT4株がM5糖鎖構造を効率的に生産できることが実証された。出芽酵母SaccharomycescerevisiaeYKT4株は、2011年11月8日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した受託番号FERMP22186。4O結合型糖鎖長の解析YKT4株のO結合型糖鎖の付加を解析するため、酵母の分泌タンパク質であるキチナーゼにおけるO結合型糖鎖結合量を指標として以下のようにして測定した。YKT4株、YFY24株をそれぞれ25mlのYPAD培地300mMKCl含有で30°C、180rpmで72時間培養した後、1500×gで2分間の遠心分離にかけ、培養上清を回収した。さらに実施例3-3と同様の方法でキチナーゼサンプルを調製し、SDSPAGE後、キチナーゼ特異的なバンドの検出を行った。図8に示すように、YKT4株からのキチナーゼの分子量がYFY24株のものよりも低分子側にシフトしており、キチナーゼにおけるO結合型糖鎖の結合量が減少していた。野生型株ではO結合型糖鎖の末端はMnn1タンパク質を含むα13マンノース転移酵素群によりマンノースがα13結合しているが、YKT4ではα13マンノース転移酵素をコードするMNN1遺伝子が破壊されているため、多くのO結合型糖鎖の末端はα12結合でマンノースが転移されている。この結果は、α12マンノシダーゼI遺伝子の再導入によりYKT4株のO結合型糖鎖の末端に結合しているα12マンノースが分解されO結合型糖鎖長が短くなったことを示している。[実施例6]YIT3株の取得糖鎖改変酵母にて組換えタンパク質を高効率に生産させるために、酵母自身のプロテアーゼ活性を低下させることが考えられる。そこで、上記実施例で得られたYKT4株について、出芽酵母自身のプロテアーゼをコードするPEP4遺伝子の破壊を行った。1PEP4遺伝子破壊用DNA断片の作製実施例21に記載のpSP73HUHから制限酵素EcoRI、PvuIIを用いてHUH断片を切り出し、pBSIISKストラタジーンのEcoRI、SmaI部位に導入して作製したプラスミドpBSIISKHUHを鋳型とし、フォワードプライマーPEP4DF5CAAAACTAACATGTTCAGCTTGAAAGCATCGACGGTATCGATAAGCTTG3配列番号32及びリバースプライマーPEP4DR5GCCAAACCAACCGCATTGTTGCCCAAATCGCTCTAGAACTAGTGGATCC3配列番号33を用いたPCR法にて、hisGURA3hisGHUH断片の5末端側にPEP4遺伝子GenBankアクセッション番号M13358の10~19領域配列番号58を、また3末端側にPEP4遺伝子の1177~1205領域配列番号59を付加した一次増幅断片を作製した。この状態では含まれるPEP4領域が短く相同組換えには不十分なため、PEP4領域を伸長するために一次増幅断片を鋳型とし、フォワードプライマーPEP4ELF5ATTTAATCCAAATAAAATTCAAACAAAAACCAAAACTAACATGTTCAGC3配列番号34及びリバースプライマーPEP4ELR5AGTAAGAAAAGTTTAGCTCAAATTGCTTTGGCCAAACCAACCGCATTGT3配列番号35を用いた二次PCR反応を行った。この反応によりHUH断片の5末端側にPEP4遺伝子の40~19領域配列番号60を、また3末端側にPEP4遺伝子の1177~1235領域配列番号61を付加した増幅断片を得た。得られたDNA断片をPEP4遺伝子破壊用断片とした。反応液は一次PCR及び二次PCRのいずれも以下の組成で調製した。PCR反応液組成10X反応バッファー5μl25mMdNTPs4μl鋳型DNA20ng相当量100μMフォワードプライマー10μl100μMリバースプライマー10μlDNAポリメラーゼExTaq02μl滅菌ミリQ水全量50μlとなるように添加合計50μl反応条件は一次PCR及び二次PCRのいずれも、DNA変性の1サイクル98°Cで2分の後、PCR合成の30サイクル98°Cで10秒、60°Cで30秒、72°Cで4分、そして1サイクル72°Cで7分とした。2YKT4株への形質転換及びPEP4遺伝子破壊の確認このようにして得られた破壊用断片を用いて、上述の方法に従って上記で得たYKT4株の形質転換を行った。得られた形質転換体の中から、コロニーPCR法により、pep4HUH株ゲノム中のPEP4遺伝子が、相同組換えによりPEP4の5端含有断片HUHPEP4の3端含有断片で置換されているを選抜し取得した。このコロニーPCR反応にはフォワードプライマーPEP4F5GAGAAGCCTACCACGTAAGGGAAGAATAAC3配列番号36及びリバースプライマーPEP4R5CCCGCATATAATGACATTATGGGCAGCAGC3配列番号37を用いた。PCR反応液は以下の組成で調製した。PCR反応液組成2XEmeraldampPCRmastermix50μl01BSA17μl酵母菌体適宜100μMフォワードプライマー01μl100μMリバースプライマー01μl滅菌ミリQ水全量10μlとなるように添加合計10μlPCR反応条件は、菌体破壊の1サイクル94°Cで5分後、PCR合成の40サイクル92°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで4分、そして1サイクル72°Cで7分とした。得られた増幅産物の4μlを、10アガロースゲルを用いて上述の通り電気泳動し、バンドを検出した。pep4HUH株に特異的なバンドが検出された株を選抜した。このpep4HUH株より、導入したマーカー遺伝子URA3を除去するため、その株を上記5FOA含有培地上に塗布し5FOA培地上でコロニー形成した複数の株を、URA3削除株とした。これらの株について、PCR法によりURA3の削除を確認した。PCR反応は酵母株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、上記のフォワードプライマーPEP4F及びリバースプライマーPEP4Rを用いて行った。PCR反応液は以下の組成で調製した。PCR反応の反応液は以下の組成で調製した。ゲノムPCR反応液組成10X反応バッファー:1μl鋳型ゲノムDNA:1μg20μMフォワードプライマー:02μl20μMリバースプライマー:02μlDNAポリメラーゼExTaq:004μl滅菌ミリQ水:全量10μlとなるように添加合計10μl反応条件はDNA鋳型変性の1サイクル98°Cで2分の後、PCR合成の30サイクル98°Cで10秒、60°Cで30秒、72°Cで4分、そして1サイクル72°Cで7分とした。検出されたバンド長から、ゲノムからのURA3遺伝子の削除を確認した。こうして得た、PEP4が破壊されているpep4HUH株のうちでURA3遺伝子の削除が確認された株を、YIT3株と命名した。YIT3株は、2011年11月8日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した受託番号FERMP22184。[実施例7]YIT4株の取得さらに、プロテアーゼをコードするPRB1遺伝子の破壊を以下のようにして上記YIT3株に加えた。1PRB1遺伝子破壊用DNA断片の作製PRB1遺伝子破壊用DNA断片を以下のように作製した。pBSIISKHUHを鋳型とし、フォワードプライマーPRB1DF5CTAATTCTAACAAGCAAAGATGAAGTTAGCGACGGTATCGATAAGCTTG3配列番号38及びリバースプライマーPRB1DR5CTCTCACTTGATCAAAGATTAAATCGGTCGCTCTAGAACTAGTGGATCC3配列番号39を用いたPCR法にて、hisGURA3hisGHUH断片の5’末端側にPRB1遺伝子GenBankアクセッション番号M18097の19~10領域配列番号62を、また3’末端側にPRB1遺伝子の1851~1879領域配列番号63を付加した一次増幅断片を作製した。この状態では含まれるPRB1領域が短く相同組換えには不十分なため、PRB1領域を伸長するために一次増幅断片を鋳型とし、フォワードプライマーPRB1ELF5CTTCATCGCCAATAAAAAAACAAACTAAACCTAATTCTAACAAGCAAAG3配列番号40及びリバースプライマーPRB1ELR5ATTAAATAATATTCAATTTATCAAGAATATCTCTCACTTGATCAAAGAT3配列番号41を用いた二次PCR反応を行った。この反応によりHUH断片の5末端側にPRB1遺伝子の49~10領域配列番号64を、また3末端側に1851~1909領域配列番号65を付加した増幅断片を得た。得られたDNA断片をPRB1遺伝子破壊用断片とした。PCR反応の反応液及び反応条件は、プライマー配列以外は、一次PCR及び二次PCRのいずれも実施例6-1と同じとした。2YIT3株への形質転換及びPRB1遺伝子破壊の確認上記で得られた破壊用断片を用いて、実施例6-2と同様の手法を用いてYIT3株の形質転換を行った。得られた株はコロニーPCRを用いてPRB1遺伝子が破壊されているかどうか確認した。コロニーPCRにはフォワードプライマーPRB1F5GTTACGTCCCGTTATATTGGAGTTCTTCCC3配列番号42及びリバースプライマーPRB1R5AGGGACTCCGACTTGTAACCTCGAGACGCC3配列番号43を用いた。prb1HUH株ゲノム中のPRB1遺伝子が、相同組換えによりPRB1の5端含有断片HUHPRB1の3端含有断片で置換されているに特異的なバンドが検出された株を選抜した。このprb1HUH株より、実施例6-2と同様の手法を用いて、URA3を除去した。このようにして取得したURA3削除株については、実施例6-2と同様にしてゲノムDNAを用いたPCR法にてURA3の削除を確認した。PCR反応には上記フォワードプライマーPRB1F、リバースプライマーPRB1Rを用いた。こうして得た、PRB1が破壊されているprb1HUH株のうちでURA3遺伝子の削除が確認された株を、YIT4株と命名した。YIT4株は、2011年11月8日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した受託番号FERMP22185。[実施例8]YFY25株の作製実施例1で作製したYFY20株からタンパク質高分泌生産株誘導株を作製するため、以下に示すスクリーニング方法及び不均衡変異導入法を用いた。1分泌型βラクタマーゼ発現プラスミドの構築上記YEp352GAPIIを鋳型とし、PCR反応にて、アンピシリン耐性を大腸菌に与えるβラクタマーゼ遺伝子bla;GenBankアクセッション番号NP052129を含まないYEp352GAPIIを増幅した。PCR反応には、フォワードプライマーSpeIYEp352F5GGGACTAGTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTC3配列番号44、リバースプライマーAatIIYEp352R5CCACCTGACGTCTAAGAAACCA3配列番号45を用いた。PCRの反応溶液の組成は以下の通り。反応液組成05ngμl鋳型DNA溶液1μl10pmolμlフォワードプライマー15μl10pmolμlリバースプライマー15μl10mMdNTPs1μl10×バッファー5μl5UμlPfx50DNAポリメラーゼ05μlDDW395μl合計50μl反応条件は初期変性1サイクル94°Cで2分、PCRを35サイクル94°Cで15秒、55°Cで20秒、68°Cで5分、最終伸長1サイクル68°Cで3分とした。またpCR21TOPOinvitrogenを鋳型とし、PCR反応にて、カナマイシン耐性を大腸菌に与えるアミノグリコシド3Oホスホトランスフェラーゼ遺伝子aph;GenBankアクセッション番号YP788126を増幅した。PCR反応にはフォワードプライマーAatIIaphF5AGAAAGACGTCAAAATTCAGGGCGCAAGGGCT3配列番号46、リバースプライマーSpeIaphR5AGGACTAGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGA3配列番号47を用いた。PCRの反応溶液の組成は以下の通り。反応液組成05ngμl鋳型DNA溶液1μl10pmolμlフォワードプライマー15μl10pmolμlリバースプライマー15μl10mMdNTPs1μl10×バッファー5μl5UμlPfx50DNAポリメラーゼ05μlDDW395μl合計50μl反応条件は初期変性1サイクル94°Cで2分、PCRを35サイクル94°Cで15秒、55°Cで20秒、68°Cで1分、最終伸長1サイクル68°Cで3分とした。以上のようにして得られた両方の増幅産物を混合し、AatII及びSpeIで切断し、ライゲーションした。これを大腸菌に導入し、プラスミドを抽出することにより、カナマイシンをマーカーとして宿主を選択することが可能なベクターYEp352GAPIIを構築した。また、出芽酵母MF1遺伝子GenBankアクセッション番号NM001184001;タンパク質のアミノ酸配列はGenPeptNCBI参照番号のNP0151371のN末端側89アミノ酸コード配列と上記βラクタマーゼ遺伝子blaを連結した融合遺伝子を構築し、YEp352GAPIIベクターのEcoRIKpnI部位にクローニングして、ベクターpAB109を作製した。pAB109をEcoRIKpnIで切断してαfactorBlaコード断片を切り出し、同様に切断したYEp352GAPIIとライゲーションした。これを大腸菌に導入し、抽出したプラスミドを、βラクタマーゼ多コピー発現用ベクターYEp352GAPIIとした。このベクターは、出芽酵母において、融合タンパク質αfactorbla配列番号48を、GAPDHプロモーター及びターミネーター制御下、発現及び分泌させることができる。本ベクターYEp352GAPIIを、さらに、複製起点領域2μmoriをCEN4ARS1に置換することによって、単コピー発現用ベクターに改変した。CEN4ARS1断片は、酵母用単コピー発現ベクターYCpLac111GenBankアクセッション番号X75457を鋳型としたPCRにて増幅した。このPCRにはフォワードプライマーCEN4ARS1FHpa5GTTTGTTAACCGCTGGGCCATTCTCATGAA3配列番号49、リバースプライマーCEN4ARS1RAat5GTTTGACGTCCAACTGCATGGAGATGAGTC3配列番号50を用いた。CEN4ARS1断片増幅用のPCR反応液は以下の組成で調製した。PCR反応液組成10X反応バッファー5μl鋳型DNA25ng相当量25mMdNTPs4μl100μMフォワードプライマー1μl100μMリバースプライマー1μlExpandhighfidelityenzymeロシュ1μl滅菌ミリQ水全量50μlとなるように添加合計50μlPCR反応条件は、DNA変性の1サイクル94°Cで2分後、PCR合成の30サイクル94°Cで30秒、56°Cで30秒、72°Cで2分11サイクル以降は1サイクルごとに5秒延長、そして1サイクル72°Cで7分とした。YEp352GAPIIからの2μmoriの削除は、制限酵素HpaI及びAatIIで当該ベクターを消化することによって行い、この削除部位に上記で得たCEN4ARS1断片を挿入した。このようにして得られたβラクタマーゼシングルコピー発現用ベクターをpYF039と命名した。2出芽酵母用ミューテーター化ベクターYCplac111mutIIの構築出芽酵母用ミューテーター化ベクターYCplac33NMLmutII国際公開WO2009150848号をEcoRI及びSalIで消化し、変異型DNAポリメラーゼNMLmutII断片を切り出して抽出した。このNMLmutII断片を出芽酵母用ベクターYCplac111のEcoRISalI部位に挿入することによって、ロイシン要求性を用いて選抜可能な出芽酵母用ミューテーター化ベクターを構築しYCplac111mutIIと命名した。3YFY201株の取得実施例1で作製したYFY20株に、ベクターpYF039及びYCplac111mutIIを上述の方法で同時に形質転換した。形質転換体の選抜用培地にはSDULKCl67gYeastnitrogenbasewoaminoacidDifco、20gグルコース、02g硫酸アデニン和光純薬、067gCSMLEUURAMPバイオメディカル、2237g塩化カリウム/1Lプレートを用いた。得られた形質転換体10株をまとめてSDULKCl液体培地5mlに植菌し、30°Cで一晩振とう培養した。培養した菌体を滅菌水で500倍希釈し、SDULKClプレートに50μlずつスプレッドし30°Cで3日間静置培養した。生育してきたコロニーを170株ピックアップし、各株が分泌するβラクタマーゼの活性をヨードメドリック染色法にて検討した。この染色法では、まず、ピックアップした170株の菌体を、SDSULKCl67gYeastnitrogenbasewoaminoacidDifco、1gグルコース、2g可溶化デンプン和光純薬02g硫酸アデニン和光純薬、067gCSMLEUURAMPバイオメディカル、2237g塩化カリウム/1Lプレートに均一な点状に約1cm間隔で塗布し、30°Cで2日間静置培養した。このプレートに、液状のヨードアンピシリンアガーを重層し、ハローHalo領域が形成されるまで室温に放置した。ヨードアンピシリンアガーは、SDSULKCl液体培地に10g/1LBactoagarベクトンディッキンソンを加えて電子レンジを用いて熱溶解させ、50°C程度まで冷ました寒天培地4容量に対し15容量のヨード液15gヨウ化カリウム和光純薬、3gヨウ素和光純薬、03gアンピシリンナトリウムナカライテスク/1L、1xリン酸緩衝液Sigmaを加えて静かに攪拌することによって調製した。本染色法により形成されるハロー領域の面積は、各株の分泌するβラクタマーゼの活性に比例する。そこで、最も大きなハロー領域を形成する株15株を選抜した図9。これらの株をまとめてSDULKCl液体培地にて培養し、変異を蓄積させるために継代を5回繰り返した。変異を蓄積させた菌体を、上述の方法にて単離し、再びヨードメトリック染色によってβラクタマーゼ高分泌株を選抜した。このような変異蓄積と高分泌株の選抜を合計3回繰り返し、最後に選抜された10株を得た。これらの株をまとめ、さらに、pYF039を脱落させるためSDLKCl液体培地にて培養し、3回継代を繰り返した後SDLKClプレートにストリークして培養し、単一コロニーを複数個回収した。これらのうち、pYF039の脱落によりウラシル要求性を取り戻した株、すなわちSDUKCl培地で生えてくることができない株を選抜した。こうして選抜された株をYFY201株と命名した。4αアミラーゼ発現用ベクターpYF048の構築出芽酵母のベクターpRS304のEcoRISalI部位にSaccharomycopsisfibuligera由来のαアミラーゼ遺伝子Genbankアクセッション番号E01174の1040~1687領域を挿入し、ベクターpYF020を構築した。続いてpYF020をSacI及びSalIで消化してαアミラーゼ断片を切り出して抽出し、抽出断片を出芽酵母ベクターpRS316のSacISalI部位に挿入した。このようにして構築されたベクターをpYF048と命名した。5グルコアミラーゼ発現用ベクターpYF053の構築出芽酵母用多コピー発現用ベクターYEP352GAPIIのSacISmaI部位に、PIR2FLAG断片を挿入したプラスミドpYF005を構築した。PIR2FLAG断片はpAB51AbeetalFEMSYESCTResearch4p4174252004を鋳型としフォワードプライマーPIR2FSac5GTTTGAGCTCATGCAATACAAAAAGAC3配列番号51とFLAGRSma5GTTTCCCGGGCTTGTCATCGTCATCCTTG3配列番号52を用いたPCR反応にて増幅した。PCR反応液の組成は上述のpYF039構築時のPCRで用いた組成と同じとした。PCR反応条件は、DNA変性の1サイクル94°Cで2分後、PCR合成の30サイクル94°Cで30秒、46°Cで30秒、72°Cで1分20秒11サイクル以降は1サイクルごとに5秒延長、そして1サイクル72°Cで7分とした。続いてpYF005のSmaIXbaI部位に、Aspergillusawamorivarkawachi由来のグルコアミラーゼ遺伝子断片GenBankアクセッション番号D00427を挿入し、pYF025を構築した。グルコアミラーゼ遺伝子断片は、YEUpGAIGotoetalAppliedandEnvilonmentalMicrobilogy61p392639301994を鋳型とし、フォワードプライマーAkGAFSma5GTTTCCCGGGGCGACCTTGGATTCGTGG3配列番号53とリバースプライマーAkGARXba5GTTTTCTAGACTACCGCCAGGTGTCGGT3配列番号54を用いたPCR反応にて増幅した。PCR反応液の組成は上述のpYF039構築時のPCRで用いた組成と同じであった。PCR反応条件は、DNA変性の1サイクル94°Cで2分後、PCR合成の30サイクル94°Cで30秒、58°Cで30秒、72°Cで2分11サイクル以降は1サイクルごとに5秒延長、そして1サイクル72°Cで7分とした。さらにpYF025をPvuIで消化し、栄養選択マーカーURA3と複製起点2μmoriを含む領域を削除した。この削除後の領域に、出芽酵母用単コピー発現用ベクターpRS313GenBankアクセッション番号U03439中の栄養選択マーカーHIS3及び複製起点CEN6ARSH4領域を含む断片pRS313をPvuI消化して生じる断片を挿入した。このようにして構築されたベクターをpYF053と命名した。6YFY25株の取得YFY201株に、pYF048及びpYF053を、上述の方法にて同時に形質転換した。形質転換体の選抜用培地にはSDULHKCl67gYeastnitrogenbasewoaminoacidDifco、20gグルコース、02g硫酸アデニン和光純薬、065gHisLeuUraDOsupplementClontech、2237g塩化カリウム/1Lプレートを用いた。得られた形質転換体30株をまとめてSDULKCl液体培地にて培養し、滅菌水で500倍希釈しSDSGULHKCl67gYeastnitrogenbasewoaminoacidDifco、20g可溶化デンプン和光純薬02g硫酸アデニン和光純薬、065gHisLeuUraDOsupplementClontech、2237g塩化カリウム/1Lプレートにスプレッドし6日間培養した。培養6日目のプレートを図10に示す。本来、出芽酵母はデンプンのみを炭素源とするSDSGULHKCl培地ではほとんど生育できない図10Aが、外来のαアミラーゼとグルコアミラーゼを発現及び分泌させたところ、生育可能になった図10B。SDSGULHKCl培地上での生育速度はαアミラーゼとグルコアミラーゼの分泌量に依存すると考えられる。そこで、SDSGULHKClプレート上で最も大きなコロニーを形成した10株を選抜し、まとめてSDSGULHKCl液体培地にて培養し、変異を蓄積させるために継代を10回繰り返した。変異を蓄積させた菌体をSDSGULHKClプレートにスプレッドして培養し、最も大きなコロニーを形成する10株を選抜した。このような変異蓄積と高分泌株の選抜を合計3回繰り返し、最後に選抜された10株を得た。これらの株をまとめ、pYF048とpYF053を脱落させるためSDLKCl液体培地にて培養し、3回継代を繰り返した後SDLKClプレートにストリークして培養し、単一コロニーを複数個回収した。これらのうち、pYF048とpYF053の脱落によりウラシル及びヒスチジン要求性を取り戻した株、すなわちSDUKCl培地及びSDHKCl培地67gYeastnitrogenbasewoaminoacidDifco、20gグルコース、02g硫酸アデニン和光純薬、077gHisDOsupplementベクトンディッキンソン、2237g塩化カリウム/1Lのいずれにおいても生えてくることができない株を選抜した。こうして選抜した株をYFY25株とした。[実施例9]YFY26株の取得YFY25株からさらにタンパク質の高分泌生産株を取得するために、YFY25株のPEP4遺伝子を実施例6と同様の手法にて破壊し、YFY26株を構築した。YFY26株は2011年12月5日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した受領番号FERMAP22208。YFY26株はYFY20株をベースとして作製された株であり、M5又はM8糖鎖生産能を有する。[実施例10]組換えタンパク質生産能の評価構築した酵母株の組換えタンパク質発現能を調べるためには、適当な外来タンパク質をコードする遺伝子を各酵母細胞に1コピーで導入する必要がある。そこで、以下のようにしてヒトの安定型ガレクチン9を発現するゲノム組み込み型ベクターを構築した。このベクターを用いて、各酵母のゲノムDNAにヒト安定型ガレクチン9遺伝子をインテグレーションし、ガレクチン9の分泌生産量にて得られた酵母株の組換えタンパク質生産能力を以下の通り評価した。1ガレクチン9G9null発現ベクターの作製出芽酵母MF1遺伝子GenBankアクセッション番号NM001184001;タンパク質のアミノ酸配列はGenPeptNCBI参照番号のNP0151371のN末端側89アミノ酸コード配列と改変型ヒトガレクチン9G9nullコード配列とを連結した融合遺伝子を発現するプラスミドPAB108AbeetalGlycobioloby194p428436を鋳型とし、PCR反応にてGAPDHプロモーター及びターミネーターが付加されたαfactorG9nullコード断片を増幅した。PCR反応にはフォワードプライマーNotIGAPDHPF5AAAGCGGCCGCAGCGAGTCAGTGAGCGA3配列番号55、リバースプライマーSpeIGAPDHTR5TTTACTAGTATGATGTGGTCTCTACAGGATCTGA3配列番号56を用いた。PCRの反応溶液の組成は以下の通り。反応液組成05ngμl鋳型DNA溶液1μl10pmolμlフォワードプライマー15μl10pmolμlリバースプライマー15μl10mMdNTPs1μl10×バッファー5μl5UμlPfx50DNAポリメラーゼ05μlDDW395μl反応条件は初期変性1サイクル94°Cで2分、PCRを35サイクル94°Cで15秒、60°Cで20秒、68°Cで2分、最終伸長1サイクル68°C3分とした。得られた増幅産物を出芽酵母用ゲノムインテグレーションベクターpRS303GenBankアクセッション番号U034351のNotISpeI部位にクローニングした。このようにして得られた、pRS303αfactorG9nullと命名された本ベクターは、出芽酵母において、融合タンパク質αfactorG9null配列番号57をGAPDHプロモーター及びターミネーター制御下で、発現及び分泌することができる。2ヒト由来ガレクチン9G9null発現株の取得ベクターpRS303αfactorG9nullをNheIで切断して直鎖状にし、YKT4、YIT3、YIT4、YFY26、YFY20株に実施例5-2と同様の方法で、YKT4及びYIT3、YIT4、YFY26、YFY20株のヒスチジン遺伝子座にインテグレーションされるように形質転換を行った。形質転換体はSDHプレート67gYeastnitrogenbasewoaminoacidDifco、20gグルコース、02g硫酸アデニン和光純薬、074gHisDOSupplementClontech、2237gKCl、20g寒天1Lにスプレッドして30°C、3日間培養し、ヒスチジン要求性に基づくスクリーニングを行った。生じたコロニーを再度SDHプレートにストリークして30°C、1日間培養した。3αfactorG9nullの生産分泌量の比較SDHプレート上で増殖が見られた各菌株を5mlのYPADCKCl10g酵母エキス、20gペプトン、50gグルコース、02g硫酸アデニン、20gカザミノ酸Difco、2237gKCl1L中で30°C、72時間、160rpmの条件で振とう培養し、培養後の酵母を2300×g、1分間遠心分離した。2mlの培養上清を回収し、15μlのStrataCleanresinStratageneを加えて室温、15分間、10rpmで回転させた。その後2300×g、1分間遠心分離して樹脂を回収し、15μlのSDSPAGEバッファー50mMTrisHCl、1SDS、50mMDTT、001BPB、10グリセロール、pH68で懸濁して100°C、3分間加熱した。これをアクリルアミドゲルSuperSepTMAce520和光純薬で1×TrisグリシンSDSBIORADを用いて30mA定電流で電気泳動した。その後ゲル中のタンパク質をPVDF膜FluoroTrans登録商標W02μmPALLにBSNバッファー48mMTrisHCl、39mMグリシン、20メタノールを用いて10V定電圧で1時間転写した。ヒトガレクチン9生産量生産分泌量の検出はヒトガレクチン9に対するウサギ由来ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングで行った。図11A及びBから分かるように、YKT4株のG9null生産量に比べてYIT3は約12倍、YIT4株は約20倍の生産量を示し、これら株ではG9null生産量が飛躍的に高くなっていることが示された。4YFY26株におけるヒトガレクチン9の発現比較上記の通り構築されたαfactorG9nullを導入したヒトガレクチン9発現YFY20株、YFY25株、YFY26株のガレクチン9生産量を、上記3と同様の方法にて解析した。その結果を図12に示す。YFY20株のG9null生産量と比べてYFY25株からのG9null生産量は大幅に増加した。さらに、YFY25株のG9null生産量と比較してもYFY26株の生産量は顕著に高く、YFY20株のG9null生産量に比べるとYFY26株からの生産量が約10倍も高くなっていることが示された。