"CD20と特異的に結合する抗体またはその断片であって、アポトーシス、抗体依存性細胞傷害ADCCおよび補体依存性細胞傷害CDCを誘導することができる、抗体またはその断片。前記抗体または断片が、ネズミ、非ヒト、ヒト化、キメラ、再表面化またはヒトである、請求項1記載の抗体または断片。抗体または断片がモノクローナルまたは単鎖である、請求項1記載の抗体または断片。ハイブリドーマATCC受託番号PTA-10486またはハイブリドーマATCC受託番号PTA-10487により産生される、抗体またはその断片。ほ乳類、酵母、昆虫、植物または細菌細胞からなる群から選択される真核性または原核性宿主細胞から得られる、請求項1記載の抗体またはその断片。前記ほ乳類細胞が、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6またはHEK-293細胞である、請求項5記載の抗体またはその断片。前記酵母細胞が、ピキアパストリスPichiapastorisまたはサッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae細胞である、請求項5記載の抗体またはその断片。前記昆虫細胞がSf-9細胞である、請求項5記載の抗体またはその断片。前記植物細胞がアオウキクサ属Lemna細胞である、請求項5記載の抗体またはその断片。前記細菌細胞が大腸菌Ecoli細胞である、請求項5記載の抗体またはその断片。抗体または断片が、CD20の第3および第4膜貫通ドメイン間に位置するアミノ酸残基を含む少なくとも1つのアミノ酸と特異的に結合する、請求項1記載の抗体または断片。細胞傷害性薬物と結合する請求項1記載の抗体または断片を含む複合体。前記細胞傷害性薬物が、メイタンシノイド、メイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン、タキソイド、CC-1065、CC-1065類似体、ズオカルマイシン、ズオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アリスタチンaristatin、トマイマイシン誘導体およびレプトマイシン誘導体からなる群から選択される、請求項12記載の複合体、または前記複合体のプロドラッグ。請求項1記載の抗体または断片および薬剤的に許容される担体を含む医薬組成物。請求項12記載の複合体および薬剤的に許容される担体を含む医薬組成物。請求項12記載の複合体を含む診断試薬であって、前記抗体または断片が標識されている、診断試薬。前記標識が放射標識、フルオロフォア、発色団、造影剤および金属イオンからなる群から選択される、請求項16記載の診断試薬。抗体または断片が、配列番号45のアミノ酸、またはGI21330989、GenBankProteinID23110989のいずれか1つに対応する配列を含む少なくとも1つのアミノ酸と特異的に結合する、請求項1記載の抗体または断片。前記抗体または断片がCD20を発現する細胞の死を誘導することができる、請求項1記載の抗体または断片。前記抗体または前記断片が、架橋剤の非存在下でアポトーシスを実質的に誘導する能力を有し、そして脂質ラフト中へのCD20の再分布を引き起こし、補体依存性細胞傷害CDCを実質的に誘導する能力を有するIII型抗体である、請求項1記載の抗体または断片。抗体またはその断片がウェスタンブロットにおいて前記CD20と特異的に結合する、請求項1記載の抗体または断片。抗体またはその断片がELISAにおいて前記CD20と特異的に結合する、請求項1記載の抗体または断片。抗体またはその断片がフローサイトメトリーアッセイにおいて前記CD20と特異的に結合する、請求項1記載の抗体またはその断片。前記抗体または断片が、Fab、Fab’、Fab’2、Fd、単鎖Fv、すなわちscFv、ジスルフィド結合Fv、V-NARドメイン、IgNar、細胞内抗体、IgGΔCH2、ミニボディminibiody、Fab’3、四重特異性抗体、三重特異性抗体、二重特異性抗体、単一ドメイン抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、scFv2、またはscFv-Fcを含む、請求項1記載の抗体または断片。免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、請求項1記載の抗体または断片。前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、IgG1定常領域、IgG2定常領域、IgG3定常領域およびIgG4定常領域からなる群から選択される、請求項25記載の抗体または断片。前記細胞がB細胞由来である、請求項19記載の抗体。前記細胞がガン細胞である、請求項19記載の抗体。前記ガン細胞が、B細胞リンパ腫、NHL、前駆体B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫および成熟B細胞新生物、B細胞慢性リンパ性白血病CLL/小リンパ球性リンパ腫SLL、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫MCL、濾胞性リンパ腫FL、低悪性度、中悪性度および高悪性度FL、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALT型辺縁帯B細胞リンパ腫、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫ALCLからなる群から選択される、請求項28記載の抗体。前記細胞が望まれない免疫応答に影響を及ぼす、請求項19記載の抗体または断片。前記細胞が炎症に影響を及ぼす、請求項19記載の抗体または断片。前記抗体または断片が、少なくとも約48のRamosリンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が、架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含む、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片が、少なくとも約48のRamosリンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含み;そして前記抗体が約0.018μg/mL以下のEC50でRamosリンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅がCDCを含む、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片が少なくとも約48のRamosリンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅は架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含み;そして前記抗体または断片がRamosリンパ腫細胞を約0.018μg/mL以下のEC50で殺滅することができ、前記殺滅がCDCを含み;そして前記抗体または断片がCD20を前記細胞の膜の脂質ラフトコンパートメント中に移動させることができる、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片が少なくとも約53のRajiリンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含む、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片が少なくとも約34のWSU-DLCL-2リンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含む、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片が少なくとも約34のWSU-DLCL-2リンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含み;前記抗体または前記断片がWSU-DLCL-2リンパ腫細胞を約0.58μg/mL以下のEC50で殺滅することができ、前記殺滅がCDCを含む、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片が少なくとも約12のJeko-1リンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含む、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片が少なくとも約40のGranta-519リンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含む、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片がCD20上のエピトープと結合し、前記エピトープが位置170および/または172でアミノ酸残基プロリンを含まないかまたは必要としない、および/または前記エピトープが位置163および/または166でアミノ酸残基アスパラギンを含むかまたは必要とする、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片がCD20のエピトープと結合し、前記エピトープが位置170および/または172でアミノ酸残基プロリンを含まないかまたは必要としない、および/または前記エピトープが位置163および/または166でアミノ酸残基アスパラギンを含むかまたは必要とし;そして前記抗体または断片が少なくとも約48のRamosリンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含む、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片がCD20のエピトープと結合し、前記エピトープが位置170および/または172でアミノ酸残基プロリンを含まないかまたは必要としない、および/または前記エピトープが位置163および/または166でアミノ酸残基アスパラギンを有するCD20エピトープを含むかまたは必要とし;そして前記抗体または断片が少なくとも約53のRajiリンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含む、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片がCD20上のエピトープと結合し、前記エピトープが位置170および/または172でアミノ酸残基プロリンを含まないかまたは必要としない、および/または前記エピトープが位置163および/または166でアミノ酸残基アスパラギンを含むかまたは必要とし;そして前記抗体または断片が少なくとも約34のWSU-DLCL-2リンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含む、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片がCD20上のエピトープと結合し、前記エピトープが位置170および/または172でアミノ酸残基プロリンを含まないかまたは必要としない、および/または前記エピトープが位置163および/または166でアミノ酸残基アスパラギンを含むかまたは必要とし;そして前記抗体または断片が、少なくとも約12のJeko-1リンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含む、請求項1記載の抗体。前記抗体または断片がCD20上のエピトープと結合し、前記エピトープが位置170および/または172でアミノ酸残基プロリンを含まないかまたは必要としない;および/または前記エピトープが位置163および/または166でアミノ酸残基アスパラギンを含むかまたは必要とし;そして前記抗体または断片が少なくとも約40のGranta-519リンパ腫細胞を殺滅することができ、前記殺滅が架橋剤の非存在下でのアポトーシスを含む、請求項1記載の抗体。配列番号25~30および17~22からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの相補性決定領域を含む抗体またはその断片。前記抗体または前記断片がCD20と結合する、請求項46記載の抗体または断片。少なくとも1つの重鎖および少なくとも1つの軽鎖を含む抗体またはその断片であって、前記重鎖が、配列番号20~22または28~30のアミノ酸配列を有する3つの連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、配列番号17~19または25~27のアミノ酸配列を有する3つの連続した相補性決定領域を含む、抗体またはその断片。前記重鎖が、配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と少なくとも90の配列同一性を有する、請求項48記載の抗体または断片。前記重鎖が配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と少なくとも95の配列同一性を有する、請求項48記載の抗体または断片。前記重鎖が配列番号47、34、35または36のアミノ酸配列を有する、請求項48記載の抗体または断片。前記軽鎖が配列番号46、32または33により表されるアミノ酸配列と少なくとも90の配列同一性を有する、請求項48記載の抗体または断片。前記軽鎖が配列番号46、32または33により表される前記アミノ酸配列と少なくとも95の配列同一性を有する、請求項48記載の抗体または断片。前記軽鎖が配列番号46、32または33のアミノ酸配列を有する、請求項48記載の抗体または断片。前記重鎖のアミノ酸配列が配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と比較して1~5の保存的置換を含む、請求項48記載の抗体または断片。前記重鎖のアミノ酸配列が配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と比較して1~3の保存的置換を含む、請求項48記載の抗体または断片。前記重鎖のアミノ酸配列が、配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と比較して、3の保存的置換を含む、請求項48記載の抗体または断片。前記重鎖のアミノ酸配列が配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と比較して2の保存的置換を含む、請求項48記載の抗体または断片。前記重鎖のアミノ酸配列が配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と比較して1の保存的置換を含む、請求項48記載の抗体または断片。前記軽鎖のアミノ酸配列が配列番号46、32または33により表されるアミノ酸配列と比較して1~5の保存的置換を含む、請求項48記載の抗体または断片。前記軽鎖のアミノ酸配列が配列番号46、32または33により表されるアミノ酸配列と比較して1~3の保存的置換を含む、請求項48記載の抗体または断片。前記軽鎖のアミノ酸配列が配列番号46、32または33により表されるアミノ酸配列と比較して3の保存的置換を含む、請求項48記載の抗体または断片。前記軽鎖のアミノ酸配列が配列番号46、32または33により表されるアミノ酸配列と比較して、2の保存的置換を含む、請求項48記載の抗体または断片。前記軽鎖のアミノ酸配列が配列番号46、32または33により表されるアミノ酸配列と比較して、1の保存的置換を含む、請求項48記載の抗体または断片。CD20と特異的に結合する改善された抗体または断片であって、以下:a配列番号32~36、46、47、17~22、25~30および1~7からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む抗体またはその断片をコード化するDNAを提供し;b少なくとも1つのヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を前記DNAに導入して、前記DNAによりコード化される前記抗体または抗体断片のアミノ酸配列を変更し;c前記抗体または抗体断片を発現し;d前記改善に関して前記発現された抗体または抗体断片をスクリーニングし、それにより前記改善された抗体または抗体断片を調製すること;によって調製された、抗体または断片。前記改善がCD20に関する増大した親和性である、請求項65記載の抗体または断片。前記少なくとも1つのヌクレオチド突然変異、欠失または挿入が、オリゴヌクレオチド介在性部位特異的突然変異誘発、カセット式突然変異誘発、エラープローンPCR、DNAシャッフリング、および大腸菌のミューテーター株の使用からなる群から選択される方法によってなされる、請求項65記載の抗体または断片。配列番号1~7および17~36からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含むポリペプチドを含む、抗体またはその断片。前記改善が増大したエフェクター機能である、請求項65記載の抗体または断片。前記改善が増大したCDC活性である、請求項65記載の抗体または断片。前記改善が増大したADCC活性である、請求項65記載の抗体または断片。前記改善が増大したADCC活性、増大したCDC活性および増大したエフェクター機能である、請求項65記載の抗体または断片。前記抗体または断片がトランスジェニック発現宿主から得られ、前記宿主が、トランスジェニックヤギ、ニワトリ、ウシ、または卵からなる、請求項1記載の抗体またはその断片。ガン細胞の成長を阻害するための方法であって、前記細胞を請求項1記載の抗体または断片と接触させることを含む、方法。ガン患者を治療する方法であって、有効量のCD20と特異的に結合する抗体またはその断片もしくは複合体を前記患者に投与することを含み、前記抗体または断片が、アポトーシス、抗体依存性細胞傷害ADCCおよび補体依存性細胞傷害CDCを誘導することができる、方法。前記患者に治療薬を投与することをさらに含む、請求項75記載の方法。前記治療薬が細胞傷害性薬物である、請求項76記載の方法。ガン患者を治療する方法であって、前記患者に有効量の請求項19記載の複合体を投与することを含む、方法。前記ガンが、B細胞リンパ腫、NHL、前駆体B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫および成熟B細胞新生物、B細胞慢性リンパ性白血病CLL/小リンパ球性リンパ腫SLL、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫MCL、濾胞性リンパ腫FL、低悪性度、中悪性度および高悪性度FL、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALT型辺縁帯B細胞リンパ腫、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫ALCLからなる群から選択されるガンである、請求項75記載の治療法。ガンの疑いのある対象者を診断する方法であって:前記対象者に請求項16記載の診断試薬を投与し;そして前記対象者内での前記試薬の分布を検出することを含む、方法。前記ガンが、B細胞リンパ腫、NHL、前駆体B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫および成熟B細胞新生物、B細胞慢性リンパ性白血病CLL/小リンパ球性リンパ腫SLL、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫MCL、濾胞性リンパ腫FL、低悪性度、中悪性度および高悪性度FL、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALT型辺縁帯B細胞リンパ腫、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫ALCLからなる群から選択されるガンである、請求項80記載の診断法。自己免疫または炎症性疾患を有する患者を治療する方法であって、前記患者に有効量のCD20と特異的に結合する抗体またはその断片もしくは複合体を投与することを含み、前記抗体または断片が、アポトーシス、抗体依存性細胞傷害ADCCおよび補体依存性細胞傷害CDCを誘導することができる、方法。前記自己免疫または炎症性疾患が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡SLE、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、突発性血小板減少性紫斑病ITP、血栓性血小板減少性紫斑病TTP、自己免疫血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性ニューロパチー、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レーノー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、橋本病、強直性脊椎炎、C型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎、慢性限局性脳炎、水疱性類天疱瘡、血友病A、膜性増殖性糸球体腎炎、成人性および若年性皮膚筋炎、成人性多発筋炎、慢性蕁麻疹、原発性胆汁性肝硬変症、視神経脊髄炎、グレーブス甲状腺疾患、水疱性類天疱瘡、膜性増殖性糸球体腎炎、チャーグストラウス症候群、喘息、乾癬性関節炎、皮膚炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、湿疹、アテローム性動脈硬化症、白血球接着不全、若年型糖尿病、ライター疾患、ベーチェット病、溶血性貧血、アトピー性皮膚炎、ウェゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性感染性単球増加症、HIVおよびヘルペス関連疾患、全身性硬化症、シェーグレン症候群および糸球体腎炎、皮膚筋炎、ANCA、無形成性貧血、自己免疫溶血性貧血AIHA、第VIII因子欠乏症、血友病A、自己免疫好中球減少症、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病GVHD、自己免疫肝炎、リンパ様間質肺炎HIV、閉塞性細気管支炎非移植、ギランバレー症候群、大血管炎、巨細胞高安動脈炎、中血管炎、川崎病、および結節性多発動脈炎からなる群から選択される自己免疫または炎症性疾患である、請求項82記載の方法。請求項1、4、18および48のいずれか1項に記載の抗体または断片をコード化するポリヌクレオチド。請求項1、4、18および48のいずれか1項に記載の抗体または断片の軽鎖または重鎖をコード化するポリヌクレオチド。請求項85記載のポリヌクレオチドを含むベクター。前記ベクターが、前記抗体または抗体断片を発現することができる発現ベクターである、請求項86記載のベクター。請求項87記載の発現ベクターを含む宿主細胞。CD20に特異的に結合するための手段であって、アポトーシス、ADCCおよびCDCを誘導することができる、手段。ガン患者を治療する方法であって、前記患者に有効量の請求項1記載の抗体または断片を投与することを含み、前記抗体または断片が放射標識された化合物と結合している、方法。前記細胞傷害性薬物に対する抗体または断片の前記結合が、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、感光性基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基からなる群から選択されるリンカーを介する、請求項12記載の複合体。リンカーが、3-2-ピリジルジチオプロピオン酸N-スクシンイミジルSPDP、4-2-ピリジルジチオブタン酸N-スクシンイミジルSPDB、4-2-ピリジルジチオ2-スルホブタン酸N-スクシンイミジルスルホ-SPDB、4-2-ピリジルジチオペンタン酸N-スクシンイミジルSPP、2-イミノチオランおよびアセチルコハク酸無水物からなる群から選択される、請求項91記載の複合体。リンカーが、4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボン酸N-スクシンイミジルSMCC、N-スクシンイミジル-4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシ-6-アミドカプロエートLC-SMCC、κ-マレイミドウンデカン酸N-スクシンイミジルエステルKMUA、β-マレイミドプロパン酸N-スクシンイミジルエステルBMPS、γ-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステルGMBS、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルEMCS、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルMBS、N-α-マレイミドアセトキシ-スクシンイミドエステルAMAS、スクシンイミジル-6-β-マレイミドプロピオンアミドヘキサノエートSMPH、4-p-マレイミドフェニル-酪酸N-スクシンイミジルSMPB、N-p-マレイミドフェニルイソシアネートPMPI、N-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミノベンゾエートSIAB、ヨード酢酸N-スクシンイミジルSIA、ブロモ酢酸N-スクシンイミジルSBA、および3-ブロモアセトアミドプロピオン酸N-スクシンイミジルSBAPからなる群から選択される、請求項91記載の複合体。以下、その例が添付の構造および式に示されている本発明のある態様を詳細に参照する。本発明を列挙された態様に関連して記載するが、それらは本発明をこれらの態様に限定することを意図しないと理解されるであろう。そうではなく、本発明は、特許請求の範囲により規定されるような本発明の範囲内に含まれ得るすべての代替物、修飾、および等価物を網羅することが意図される。当業者は、本発明の実施において使用することができる、本明細書中に記載されるものと類似または同等の多くの方法および材料を知っているであろう。1つの態様において、本発明は抗CD20抗体および/またはその断片である。1つの態様において、本発明は、抗CD20細胞溶解抗体および/またはその断片である。本発明の1つの態様において、抗CD20細胞溶解抗体および断片は、CD20を発現するB細胞がその病状の経過に影響を及ぼす病状の治療に有用である。1つの態様において、標的化B細胞は望まれない。1つの態様において、病状には、望まれないB細胞の活性が関与する。1つの態様において、病状はB細胞疾患である。本発明の別の態様は、CD20抗原と特異的に結合する抗体またはその断片であり、ここで、前記抗体または断片は、アポトーシス、抗体依存性細胞傷害ADCCおよび補体依存性細胞傷害CDCを誘導することができる。好ましい態様において、病状は非ホジキンリンパ腫である。本発明の1つの態様は、CD20と特異的に結合する抗体またはその断片であり、ここで、前記抗体または断片は、アポトーシス、抗体依存性細胞傷害ADCCおよび補体依存性細胞傷害CDCを誘導することができ、抗体または断片は、ネズミ、非ヒト、ヒト化、キメラ、再表面化またはヒトである。本発明の別の態様は、CD20と特異的に結合する抗体またはその断片であり、ここで、抗体または断片は、アポトーシス、抗体依存性細胞傷害ADCCおよび補体依存性細胞傷害CDCを誘導することができ、抗体または断片はモノクローナルまたは単鎖である。本発明の1つの態様は、CD20と特異的に結合する抗体またはその断片を含み、ここで、前記抗体または断片は、アポトーシス、抗体依存性細胞傷害ADCCおよび補体依存性細胞傷害CDCを誘導することができ、ここで、抗体はCHOまたはNS0細胞から得られる。本発明のさらに別の態様において、抗体またはその断片は、CD20の第3および第4膜貫通ドメインの間に位置するアミノ酸残基を含む少なくとも1つのアミノ酸と特異的に結合する。本発明の別の態様において、抗体またはその断片は、配列番号45のアミノ酸、またはGI21330989、GenBankProteinID23110989のいずれか1つに対応する配列などを含む少なくとも1つのアミノ酸と特異的に結合する。本発明の別の態様は、抗体または断片であって、CD20を発現する細胞の死を誘導することができる抗体または断片である。本発明のさらに別の態様において、抗体または断片は、II型抗体と同様に、架橋剤の非存在下でアポトーシスを実質的に誘発する能力を有し、そしてI型抗体と同様に、CD20の脂質ラフト中への再分布を引き起こし、補体依存性細胞傷害CDCを実質的に誘導する能力を有するIII型抗体である。本発明の1つの態様は、抗CD20抗体または断片を含み、ここで、抗体または断片は、ウェスタンブロット、ELISAまたはFACSアッセイにおいてCD20と特異的に結合する。本発明の1つの態様において、抗CD20抗体または断片は、Fab、Fab’、Fab’2、Fd、単鎖Fv、すなわちscFv、ジスルフィド結合Fv、V-NARドメイン、IgNar、細胞内抗体、IgGDCH2、ミニボディminibiody、Fab’3、四重特異性抗体、三重特異性抗体、二重特異性抗体、scFv2、単一ドメイン抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、またはscFv-Fcを含む。本発明の別の態様は、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む抗体もしくは断片および/またはその複合体である。本発明の1つの態様において、抗体または断片免疫グロブリン重鎖定常領域は、IgG1定常領域、IgG2定常領域、IgG3定常領域およびIgG4定常領域からなる群から選択される。本発明の1つの態様において、抗CD20抗体はCD20-6である。本発明の別の態様において、抗CD20抗体はCD20-7である。本発明の1つの態様において、抗体、断片またはその複合体は、リンパ腫細胞のアポトーシスを誘導する。本発明の1つの態様において、抗体、断片またはその複合体は、Ramosリンパ腫細胞および/またはRajiリンパ腫細胞および/またはWSU-DLCL-2リンパ腫細胞および/またはJeko-1リンパ腫細胞および/またはGranta-519リンパ腫細胞のアポトーシスを誘導する。本発明の別の態様において、本発明の抗体、断片および/またはその複合体は、架橋剤の非存在下でAnnexin-V染色により測定すると、Ramosリンパ腫細胞および/またはRajiリンパ腫細胞および/またはWSU-DLCL-2リンパ腫細胞および/またはJeko-1リンパ腫細胞および/またはGranta-519リンパ腫細胞のアポトーシスを誘導する。本発明の1つの態様において、抗体、断片および/またはその複合体は、架橋剤の非存在下でAnnexin-V染色により測定すると、少なくとも約48のRamosリンパ腫細胞および/または少なくとも約53のRajiリンパ腫細胞および/または少なくとも約34のWSU-DLCL-2リンパ腫細胞および/または少なくとも約12のJeko-1リンパ腫細胞および/または少なくとも約40のGranta-519リンパ腫細胞においてアポトーシスを誘導する。本発明の別の態様において、抗体、断片またはその複合体は、架橋剤の非存在下で約0.2nM以下のEC50でリンパ腫細胞のアポトーシスを誘導することができる。本発明の別の態様において、抗体、断片またはその複合体は、架橋剤の非存在下で0.2nM以下のEC50で少なくとも48のRamosリンパ腫細胞においてアポトーシスを誘導することができる。本発明の別の態様において、抗体、断片および/またはその複合体は、CD20を発現する細胞膜の脂質ラフトコンパートメント中にCD20を効率的に移動させることができる。本発明の別の態様において、本発明の抗体、断片および/またはその複合体は、CD20発現リンパ腫細胞および/またはCD20発現免疫調節細胞の膜の脂質ラフトコンパートメント中にCD20を効率的に移動させることができる。本発明の1つの態様において、抗体、断片またはその複合体は、Ramosリンパ腫細胞の膜の脂質ラフトコンパートメント中にCD20を効率的に移動させることができる。本発明の1つの態様において、抗体、断片および/またはその複合体は、約5の補体を有するヒト血清の存在下でのCDCにより、Ramosリンパ腫細胞を約0.018μg/mL以下のEC50で殺し、および/またはDaudiリンパ腫細胞を約0.25μg/mL以下のEC50で殺し、および/またはWSU-DLCL-2リンパ腫細胞を約0.58μg/mL以下のEC50で殺す。本発明の1つの態様において、抗体、断片またはその複合体は、位置170および/または172でアミノ酸残基プロリンを含まないかまたは必要としないCD20上のエピトープと結合する。本発明の1つの態様において、抗体、断片またはその複合体は、位置163および/または166でアミノ酸残基アスパラギンを含むかまたは有するCD20上のエピトープと結合する。本発明の1つの態様において、抗体、断片またはその複合体は、位置170および/または172でアミノ酸残基プロリンを含まないかまたは必要としない、および/または位置163および/または166でアミノ酸残基アスパラギンを含むかまたは有するCD20上のエピトープと結合する。本発明の1つの態様において、抗体、断片またはその複合体はCD20上のエピトープと結合し、ここで、CD20エピトープは位置170および/または172でプロリンを有さない、および/または位置163および/または166でアミノ酸残基アスパラギンを有さない。本発明の1つの態様において、抗体またはその断片は、配列番号25~30からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの相補性決定領域を含む。本発明の1つの態様において、抗体またはその断片は、配列番号17~22からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの相補性決定領域を含む。本発明の1つの態様において、抗体または断片は、配列番号25~30および17~22からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの相補性決定領域を含み、ここで、前記抗体または断片はCD20と結合する。本発明の1つの態様において、抗体または断片は少なくとも1つの重鎖および少なくとも1つの軽鎖を含み、ここで、前記重鎖は、配列番号20~22または28~30のアミノ酸配列を有する3つの連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖は、配列番号17~19または25~27のアミノ酸配列を有する3つの連続した相補性決定領域を含む。本発明の1つの態様において、Abまたは断片重鎖は、配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と少なくとも90の配列同一性を有する。本発明の1つの態様において、抗体または断片重鎖は、配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と少なくとも96を有する。本発明の1つの態様において、抗体または断片重鎖は、配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と少なくとも97を有する。本発明の1つの態様において、抗体または断片重鎖は、配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と少なくとも98を有する。本発明の1つの態様において、抗体または断片重鎖は、配列番号47、34、35または36により表されるアミノ酸配列と少なくとも99を有する。本発明の1つの態様において、抗体または断片重鎖は、配列番号47、34、35または36のアミノ酸配列を有する。分泌シグナル配列を形成する配列は、成熟ポリペプチド中に存在しない。本発明は、ヒトCD20、またはその抗原結合断片および/またはその複合体と結合し、インビボでB細胞を枯渇させる、再表面化抗体を提供する。さらに別の態様において、B細胞はヒトまたはカニクイザル由来である。他の態様において、CDR領域は、残基がドナー由来でも、レシピエント抗体由来でもない、アミノ酸置換を含む。好ましい態様において、本発明の抗体は、VH領域がヒトIgG重鎖定常領域と結合した完全長抗体である。いくつかの好ましい態様において、IgGはヒトIgG1またはIgG3である。本発明の1つの態様において、抗体またはその断片軽鎖は、配列番号46、32または33により表されるアミノ酸配列と少なくも90の配列同一性を有する。本発明の1つの態様において、抗体またはその断片軽鎖は、配列番号46、32または33により表される前記アミノ酸配列と少なくとも95の配列同一性を有する。本発明の1つの態様において、抗体またはその断片軽鎖は、配列番号46、32または33により表される前記アミノ酸配列と少なくとも96の配列同一性を有する。本発明の1つの態様において、抗体またはその断片軽鎖は、配列番号46、32または33により表される前記アミノ酸配列と少なくとも97の配列同一性を有する。本発明の1つの態様において、抗体またはその断片軽鎖は、配列番号46、32または33により表される前記アミノ酸配列と少なくとも98の配列同一性を有する。本発明の1つの態様において、抗体またはその断片軽鎖は、配列番号46、32または33により表される前記アミノ酸配列と少なくとも99の配列同一性を有する。本発明の1つの態様において、抗体または断片軽鎖は、配列番号46、32または33のアミノ酸配列を有する。1つの態様において、再表面化抗CD20抗体および/またはその複合体は、CD20-7、またはその断片である。本発明の1つの態様において、抗体または断片は:a配列番号32~36、46、47、17~22、25~30および1~7からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む抗体またはその断片をコード化するDNAを提供し;b前記DNAに少なくとも1つのヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を導入して、前記DNAによりコード化される前記抗体または抗体断片のアミノ酸配列を変更し;c前記抗体または抗体断片を発現し;d前記発現された抗体または抗体断片を前記改善に関してスクリーニングし、それにより前記改善された抗体または抗体断片を調製することによって調製された、CD20と特異的に結合する改善された抗体または断片である。本発明の1つの態様において、改善は、CD20に対する増大した親和性である。本発明のさらに別の態様において、増大した親和性は、オリゴヌクレオチド介在性部位特異的突然変異誘発、カセット式突然変異誘発、エラープローンPCR、DNAシャッフリング、および大腸菌のミューテーター株の使用などの公知方法によりなされた少なくとも1つのヌクレオチド突然変異、欠失または挿入に起因する。本発明の別の態様において、改善は、CD20に対する増大した結合力である。本発明の別の態様において、改善は、CD20を発現する細胞に対する増大した細胞毒性活性である。本発明の別の態様において、改善は増大した発現レベルである。本発明の別の態様において、改善は増大したイディオタイプ活性である。本発明の別の態様において、本発明の抗体またはその断片は、本発明の別の抗体またはその断片と比較した場合、アミノ酸残基の1以上の保存的置換を含む。いくつかの実施形態において、そのような置換は、抗体またはその断片の重および/または軽鎖のフレームワークおよび/またはCDRおよび/または超可変セクションで起こる。いくつかの実施形態において、そのような置換は、CDR配列でのみ起こる。いくつかの実施形態において、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50またはそれ以上のそのような置換がある。他の実施形態において、1~20、1~15、1~10、1~5、1~3、20、19、18、17、16、15、14,13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1のそのような置換が本発明の抗体またはその断片の重および/または軽鎖中にある。したがって、本発明は、CD20結合抗体またはその機能的断片および/またはその複合体、ならびに疾患に関連するCD20発現細胞での治療におけるそれらの使用を提供する。具体的な態様において、CD20と結合する抗体は、さらに好ましくは、再表面化、ヒト化またはキメラである。ヒト化抗体は、フレームワーク領域FR中にアミノ酸置換を有するものおよびCDR中に変更を有する親和性成熟抗体を含む。CDRまたはFR中の置換アミノ酸は、ドナーまたはレシピエント抗体に存在するものに限定されない。他の態様において、本発明のCD20抗体またはその機能的断片および/またはその複合体は、Fc領域中のアミノ酸において変更をさらに含み、これは増強されたCDCおよび/またはADCC機能ならびにB細胞殺滅をはじめとする改善されたエフェクター機能に至る。本発明の他の抗CD20抗体またはその機能的断片および/またはその複合体は、安定性を改善する特定の変化を有するものを含む。具体的な態様において、ヒト化CD20抗体またはその機能的断片は安定性を増大させる。改善されたインビボADCC機能を有するグリコシル化変異を有する抗体も提供される。本発明の1つの態様において、抗体またはその断片は、CD20と特異的に結合するための手段であり、前記手段は、アポトーシス、ADCCおよびCDCを誘導することができる。本発明の1つの態様において、抗体または断片は、配列番号1~7および17~36からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含む少なくとも1つのポリペプチドを含む。別の態様において、本発明は、ATCC受託番号PTA-10486に対応するハイブリドーマまたはATCC受託番号PTA-10487に対応するハイブリドーマにより産生される抗体またはその断片である。診断適用に関して、本発明の抗体またはその断片は、典型的には、検出可能な部分で標識される。検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを産生することができる任意のものであり得る。例えば、検出可能な部分は、3H、14C、32P、35S、もしくは131Iなどの放射性同位体;フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンなどの蛍光もしくは化学発光化合物;またはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼもしくはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素であり得る。1つの態様において、本発明は、抗CD20細胞溶解抗体および/または断片複合体である。本発明の1つの態様において、CD20特異的細胞溶解抗体複合体は、CD20を発現するB細胞が病状の経過に影響を及ぼす病状の治療において有用である。1つの態様において、標的化B細胞は望まれない。1つの態様において、病状はB細胞疾患である。1つの態様において、病状には望まれないB細胞の活性が関与する。本発明の別の態様はCD20と特異的に結合する抗体複合体であり、ここで、前記抗体または断片は、CD20を発現する細胞において、アポトーシス、抗体依存性細胞傷害ADCCおよび補体依存性細胞傷害CDCを誘導することができる。1つの態様において、病状は非ホジキンリンパ腫である。本発明の1つの態様は、細胞傷害性薬物に結合した抗体または断片を含む抗CD20抗体または断片複合体である。複合体で用いられる細胞傷害性薬物は、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン、タキサン、CC-1065およびCC-1065類似体、ズオカルマイシンおよびズオカルマイシン類似体、エンジイン、例えばカリケアマイシン、ドラスタチンならびにアウリスタチン、トマイマイシン誘導体およびレプトマイシン誘導体をはじめとするドラスタチン類似体であり得る。さらに好ましい細胞傷害性薬物は、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン、タキサン、CC-1065およびCC-1065類似体である。メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体は好ましい細胞傷害性薬物に含まれる。好適なメイタンシノイドの例は当業者には公知であり、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体のエステルが挙げられる。好適なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第4,424,219号;同第4,256,746号;同第4,294,757号;同第4,307,016号;同第4,313,946号;同第4,315,929号;同第4,331,598号;同第4,361,650号;同第4,362,663号;同第4,364,866号;同第4,450,254号;同第4,322,348号;同第4,371,533号;同第6,333,410号;同第5,475,092号;同第5,585,499号;同第5,846,545号;同第6,444,163号;同第6,716,821号;同第7,276,497号、同第7,473,796号および米国公開第20050169933号で開示されている。タキサンも好ましい細胞傷害性薬物である。本発明における使用に適したタキサンは、例えば、米国特許第6,372,738号;同第6,340,701号;同第6,436,931号;同第6,596,757号;同第7,441,063号;同第7,495,114号および同第7,598290号で開示されている。細胞毒性複合体の調製物の1つの候補は、CC-1065の類似体であり、これはストレプトマイセスゼレンシスStreptomyceszelensisの培養ブロスから単離される強力な抗腫瘍抗生物質である。CC-1065は、通常用いられる抗ガン剤、例えばドキソルビシン、メトトレキサートおよびビンクリスチンよりもインビトロで約1000倍強力であるBKBhuyanetalCancerRes4235323537。CC-1065類似体も本発明での使用に好ましい細胞傷害性薬物である。CC-1065およびその類似体は、米国特許第6,756,397号;同第7,049,316号;同第7,388,026号;同第6,372,738号;同第6,340,701号;同第5,846,545号および同第5,585,499号で開示されている。ベンゾジアゼピン誘導体もまた、本発明での使用に好適な細胞傷害性薬物である。ピロロベンゾジアゼピン、例えば米国特許公開第20090036431号および欧州特許出願第2019104号で記載されているものは好適な細胞傷害性薬物である。ベンゾジアゼピン誘導体、例えば米国仮出願第61/150,201号で記載されているものも好適である。細胞傷害性薬物、例えばメトトレキサート、シスプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシルおよびモルホリノドキソルビシンも、本発明の複合体の調製に好適である。細胞傷害性薬物を抗体と結合させるために、結合基を使用する。好適な切断性および非切断性結合基は本明細書中に記載され、当該技術分野で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、感光性基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基を含む。好ましい結合基はジスルフィド基およびチオエーテル基、特に、米国特許第6,913,748号、米国特許公開第20050169933号、同第20090274713号および国際公開第2009/0134976号に記載されているものである。例えば、複合体は、ジスルフィド交換反応を使用するか、または抗体と細胞傷害性薬物との間にチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。抗体を修飾してジスルフィド結合複合体を得るための好ましいリンカーは、4-2-ピリジルジチオペンタン酸N-スクシンイミジルSPP、4-2-ピリジルジチオブタン酸N-スクシンイミジルSPDBまたは4-2-ピリジルジチオ-2-スルホブタン酸N-スクシンイミジルスルホ-SPDBである。本発明は、非切断性リンカーによるメイタンシノイドの抗体に対する結合が、抗CD20抗体またはその断片の固有の機能的活性が維持されるようにインビボで高用量を達成しつつ、その効力を増強する態様を包含する。抗体または抗体断片を修飾してメイタンシノイドとチオエーテル結合を形成するための好ましい非切断性リンカーは、4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボン酸N-スクシンイミジルSMCC、4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボン酸N-スクシンイミジルスルホSMCC、N-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミドベンゾエートSIABである。本発明はさらに、本明細書中で記載されるリンカーが親水性であり例えば、PEGを組み入れる、薬物の活性の増大に寄与する態様も包含する。したがって、本発明の別の態様は、薬物が抗CD20抗体に結合して、リンカーデザインが広範囲の腫瘍わたって、特に低抗原発現または薬物耐性腫瘍において活性な複合体を提供する、改善された方法を包含する。加えて、これらの親水性リンカーを組み入れることにより、抗体1分子あたり15分子までの薬物が高収率で、凝集または沈殿なく結合される。抗体1分子あたり15分子までの薬物が結合した親水性リンカーを含むこれらの複合体は、高親和性で標的CD20抗原と結合する非修飾抗体と同様。抗体の修飾に好ましい親水性リンカーは、N-スクシンイミジル-[N-マレイミドプロピオンアミド-テトラエチレングリコール]エステルNHS-PEG4-マレイミドである。本発明はさらに、本明細書中で記載されるリンカーが硫黄原子を含まない態様、例えばジカルボン酸ベースの部分由来のリンカーも包含する米国公開第2005016993号を参照のこと。本発明はさらに、本明細書中で記載されるリンカーが荷電し、電荷が抗CD20抗体またはその断片の修飾後と、結果として得られる薬物複合体中との両方で保持される態様も包含する。本発明はさらに、約2~8個の薬物分子が抗CD20抗体またはその断片に結合した態様も包含する。好ましい態様は、約2~8個の薬物分子が抗CD20抗体またはその断片に結合した複合体であり、この複合体の細胞殺滅は、同じ抗CD20抗体にさらに少数またはさらに多数の薬物が結合した薬物負荷と比較すると、より有効である。本発明のさらに別の態様は、前記方法での治療に対して感受性のガンを治療する方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に対して、式CB-[Xl--CH2-CH2-O-n-Yp-D]m式IIまたはD-Yp--CH2-CH2-O-n-Xl]m-CB式II’式中、CBは抗CD20抗体を表し;Dは薬物を表し;Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カーバメート結合、またはエーテル結合により細胞結合剤に結合した脂肪族、芳香族または複素環単位を表し;Yは、チオエーテル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素-炭素結合およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合により薬物と結合した脂肪族、芳香族、または複素環単位を表し;lは0または1であり;pは0または1であり;mは2~15の整数であり;そしてnは1~2000の整数であるの複合体を含む有効量の組成物を非経口投与することを含む。重要なことに、本発明で記載される複合体は、細胞傷害性薬物での治療に対する感受性が低い、多剤耐性mdrであるCD20発現細胞に対して非常に強力であるかまたは有効である。例えば、ガン療法は、異なる化学治療薬での複数ラウンドの治療後に多くの場合生じる薬物耐性の機序を克服するという課題を課す。ガン細胞で観察されるそのような機序の1つは、多剤耐性と呼ばれ、ATP結合カセットABCトランスポーターによる薬物の排出の増大により引き起こされるCDrumondBISikicJClinOncology19991710611070GSzokacsetalNatureReviews52192342006。薬物耐性のこれらの機序を克服する療法、例えばガン細胞による薬物のこのような流出を干渉するかまたは克服することは重要な価値がある。本発明の1つの態様は、抗体または断片および/またはその複合体を含む組成物である。本発明のさらに別の態様は、抗体または断片および/またはその複合体ならびに薬剤的に許容される担体を含む医薬組成物である。本発明の1つの態様において、抗体または断片医薬組成物は、複合体および薬剤的に許容される担体を含む。本発明は、抗CD20抗体または断片複合体および担体例えば、薬剤的に許容される担体を含む組成物例えば、医薬組成物を包含する。本発明はさらに、抗CD20抗体またはその断片、複合体および担体薬剤的に許容される担体を含み、第2の治療薬をさらに含む組成物例えば、医薬組成物も包含する。本発明の組成物は、異常な細胞成長を阻害するかまたはほ乳類例えば、ヒトにおける増殖性障害を治療するために有用である。本発明の組成物はさらに、ほ乳類例えば、ヒトにおける鬱病、不安、ストレス、恐怖症、パニック、不快、精神障害、痛み、および炎症性疾患を治療するためにも有用である。本発明の1つの態様において、診断試薬は、抗体またはその断片および/またはその複合体を有する組成物であって、本明細書中に記載するように、抗体または断片が標識されている組成物を含む。本発明の1つの態様において、抗体または断片および/またはその複合体標識は、放射標識、フルオロフォア、発色団、造影剤および金属イオンからなる群から選択される。本発明の1つの態様において、CD20発現細胞と特異的に結合するための方法がある。本発明の1つの態様において、CD20はB細胞により発現される。本発明の1つの態様において、CD20発現細胞はガン細胞である。本発明の1つの態様において、抗体または断片は、B細胞リンパ腫、例えばNHL、前駆体B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫および成熟B細胞新生物、例えばB細胞慢性リンパ性白血病CLL/小リンパ球性リンパ腫SLL、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫MCL、低悪性度、中悪性度および高悪性度FLを包含する濾胞性リンパ腫FL、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫MALT型、節性および脾臓型、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫ALCLからなる群から選択されるガン細胞と結合する。本発明の別の態様において、CD20発現細胞は望まれない免疫応答に影響を及ぼす。本発明の別の態様において、CD20発現細胞は炎症に影響を及ぼす。抗CD20抗体またはその複合体、およびそれらを含む組成物は、例えば、細胞の異常な成長を特徴とする障害例えば、ガンならびに免疫疾患および障害を治療するかまたは重篤度を減少させるために有用である。本発明の他の適用としては、これらに限定されるものではないが、骨粗鬆症、鬱病、不安、ストレス、恐怖症、パニック、不快、精神障害、および痛みの同時治療cotreatingまたは抗てんかん薬、抗菌薬、利尿剤ならびに降圧薬、脂質低下薬、および抗鬱薬として、が挙げられる。本発明の1つの態様において、細胞を抗体または抗体断片および/またはその複合体と接触させることを含む、ガン細胞の成長を阻害するための方法がある。本発明の1つの態様において、本明細書中に記載される有効量の抗体または断片および/またはその複合体を患者に投与することを含む、ガン患者を治療する方法がある。本発明の1つの態様において、治療は、前記患者に治療薬を投与することをさらに含む。本発明の1つの態様において、治療薬は細胞傷害性薬物である。さらに別の態様において、本発明は、例えば関節リウマチなどの炎症性疾患の治療に有用なCD20特異的細胞溶解抗体または断片および/またはその複合体である。さらなる態様において、本発明は、メトトレキサートとの組み合わせで関節リウマチの治療に有用な、CD20を標的とした細胞溶解抗体および/またはその複合体である。1つの態様において、本発明は、1以上のTNF拮抗物質療法に対して不適切な反応をする軽度から重度の関節リウマチの患者においてメトトレキサートとの組み合わせで関節リウマチの治療に有用なCD20特異的細胞溶解抗体および/またはその複合体である。本発明の1つの態様において、抗体またはその断片および/またはその複合体は、ガン患者を治療する方法であって、前記患者に有効量の本明細書中に記載される複合体を投与することを含む方法である。本発明の1つの態様において、治療可能なガンは、B細胞リンパ腫、例えばNHL、前駆体B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫および成熟B細胞新生物、例えばB細胞慢性リンパ性白血病CLL/小リンパ球性リンパ腫SLL、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫MCL、低悪性度、中悪性度および高悪性度FLを包含する濾胞性リンパ腫FL、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫MALT型、節性および脾臓型、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫ALCLからなる群から選択されるガンである。本発明の1つの態様では、ガンの疑いのある対象者を診断する方法があり、前記方法は、対象者に診断試薬を投与し;そして対象者内の試薬の分布を検出することを含む。本発明の1つの態様において、診断方法は、B細胞リンパ腫、例えばNHL、前駆体B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫および成熟B細胞新生物、例えばB細胞慢性リンパ性白血病CLL/小リンパ球性リンパ腫SLL、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫MCL、低悪性度、中悪性度および高悪性度FLをはじめとする濾胞性リンパ腫FL、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫MALT型、節性および脾臓型、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫ALCLからなる群から選択されるガンを診断することを含む。本発明の別の態様では、免疫障害に罹っていることが疑われる対象者を診断するための方法があり、前記方法は、対象者に診断試薬を投与し;そして対象者内の試薬の分布を検出することを含む。本発明の1つの態様において、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡SLE、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、突発性血小板減少性紫斑病ITP、血栓性血小板減少性紫斑病TTP、自己免疫血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性ニューロパチー、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レーノー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、橋本病、強直性脊椎炎、C型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎からなる群から選択される免疫障害を診断することを含む診断方法。本発明の好ましい態様は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡SLE、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、突発性血小板減少性紫斑病ITP、血栓性血小板減少性紫斑病TTP、自己免疫血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性ニューロパチー、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レーノー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、橋本病、強直性脊椎炎、C型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎、慢性限局性脳炎、水疱性類天疱瘡、血友病A、膜性増殖性糸球体腎炎、成人性および若年性皮膚筋炎、成人性多発筋炎、慢性蕁麻疹、原発性胆汁性肝硬変症、視神経脊髄炎、グレーブス甲状腺疾患、水疱性類天疱瘡、膜性増殖性糸球体腎炎、チャーグストラウス症候群、喘息、乾癬性関節炎、皮膚炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、湿疹、アテローム性動脈硬化症、白血球接着不全、若年型糖尿病、ライター疾患、ベーチェット病、溶血性貧血、アトピー性皮膚炎,尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性感染性単球増加症、HIVおよびヘルペス関連疾患、全身性硬化症、シェーグレン症候群および糸球体腎炎からなる群から選択される自己免疫または炎症性疾患に罹っていることが疑われる対象者を診断するための方法である。自己免疫疾患が関節リウマチである場合、抗体を場合によっては第2の治療薬と組み合わせて投与することができ、この第2の治療薬は、好ましくはメトトレキサートである。本発明のさらなる態様は、B細胞を本発明の抗体および/またはその複合体と接触させて、それによりB細胞を殺滅することを含む、インビボでB細胞のアポトーシスを誘導する方法である。本発明はさらに、CD20結合抗体またはその断片および/またはその複合体を、疾患を患っているヒト患者などのほ乳類に投与することにより、疾患を治療する方法も提供する。自己免疫疾患またはCD20発現ガンを治療するための方法のいずれかにおいて、1つの態様では、抗体はCD20-7またはCD20-6である。したがって、1つの態様は、CD20陽性ガンを治療する方法であって、ガンを患っている患者に、治療有効量の本発明のCD20結合抗体および/またはその複合体を投与することを含む方法である。好ましい態様において、CD20発現ガンは、非ホジキンリンパ腫NHLまたはリンパ球優位型ホジキン病LPHD、慢性リンパ性白血病CLLまたはSLLをはじめとする、CD20を発現するB細胞リンパ腫または白血病である。B細胞リンパ腫または白血病を治療する方法の1つの態様において、抗体および/またはその複合体を約20~2000mg/m2の投与量範囲で投与する。さらなる態様において、治療方法は、患者に少なくとも1つの化学治療薬を投与することをさらに含み、ここで、非ホジキンリンパ腫NHLに関して、化学治療薬は、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンからなる群から選択される。さらに提供されるのは、自己免疫または炎症性疾患を治療する方法であって、自己免疫または炎症性疾患を患っている患者に、治療有効量の本明細書中で検討されているCD20結合抗体または断片および/またはその複合体を投与することを含む方法である。自己免疫または炎症性疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡SLE、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、突発性血小板減少性紫斑病ITP、血栓性血小板減少性紫斑病TTP、自己免疫血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性ニューロパチー、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レーノー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、橋本病、強直性脊椎炎、C型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎、慢性限局性脳炎、水疱性類天疱瘡、血友病A、膜性増殖性糸球体腎炎、成人性および若年性皮膚筋炎、成人性多発筋炎、慢性蕁麻疹、原発性胆汁性肝硬変症、視神経脊髄炎、グレーブス甲状腺疾患、水疱性類天疱瘡、膜性増殖性糸球体腎炎、チャーグストラウス症候群、喘息、乾癬性関節炎、皮膚炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、湿疹、アテローム性動脈硬化症、白血球接着不全、若年型糖尿病、ライター疾患、ベーチェット病、溶血性貧血、アトピー性皮膚炎,尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性感染性単球増加症、HIVおよびヘルペス関連疾患、全身性硬化症、シェーグレン症候群および糸球体腎炎からなる群から選択される。自己免疫疾患が関節リウマチである場合、抗体は、場合によって、第2の治療薬とあわせて投与することができ、この第2の治療薬は、好ましくはメトトレキサートである。1つの態様において、本発明は、皮膚筋炎、ヴェゲナー肉芽腫、ANCA、無形成性貧血、自己免疫溶血性貧血AIHA、第VIII因子欠乏症、血友病A、自己免疫好中球減少症、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病GVHD、IgM依存性、血栓性血小板減少性紫斑病TTP、橋本病、自己免疫肝炎、リンパ様間質肺炎HIV、閉塞性細気管支炎非移植対NSIP、ギランバレー症候群、大血管炎、巨細胞高安動脈炎、中血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎からなる群から選択される自己免疫または炎症性疾患を治療する方法であって、この疾患を患っている患者に、治療有効量のCD20結合抗体および/または複合体を投与することを含む方法を提供する。この方法の1つの態様において、CD20結合抗体はCD20-7またはCD20-6である。本出願者らの治療方法において、CD20結合抗体および/またはその複合体を単独あるいは第2の治療薬、例えば第2の抗体、または化学治療薬もしくは免疫抑制剤と組み合わせて投与することができる。第2の抗体または断片および/またはその複合体は、CD20もしくは異なるB細胞抗原、またはNKもしくはT細胞抗原と結合するものであり得る。1つの態様において、第2の抗体または断片および/またはその複合体は放射標識された抗CD20抗体である。他の態様において、CD20結合抗体を、毒素または放射性同位体をはじめとする細胞傷害性薬物に結合させる。本発明は、望まれないB細胞および/もしくは異常な細胞成長を阻害するか、またはほ乳類例えば、ヒトにおける増殖性障害を治療する方法であって、前記ほ乳類に治療有効量の抗CD20抗体および/または複合体および/またはその溶媒和物および塩またはその組成物を単独または第2の治療薬と組み合わせて投与することを含む方法を包含する。本発明の1つの態様は、CD20抗体および/またはその複合体を約20mg/mLの抗体、約10mMの硫酸ヒスチジンpH5.8、約60mg/mlのスクロース6および約0.2mg/mlのポリソルベート200.02で含む液体処方である。本発明はさらに、抗体および/または抗体断片を発現するための発現ベクターをはじめとする、本明細書中で開示される抗体のいずれかをコード化する種々の単離された核酸を提供する。本発明の1つの態様は、本明細書中で記載される抗体または断片をコード化するポリヌクレオチド複数可を包含する。本発明の1つの態様において、ポリヌクレオチドは抗体または断片および/またはその複合体の軽鎖または重鎖をコード化し、そしてポリヌクレオチドはDNAまたはRNAである。本発明の1つの態様において、ポリヌクレオチドはベクター中にある。本発明の別の態様において、ベクターは、前記抗体または断片を発現することができる発現ベクターである。本発明は、配列番号8~16のヌクレオチド配列を含む単離された核酸、またはこれらの配列の縮重変異体などを提供する。1つの態様は、配列番号1~7および17~36からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する配列を含み、場合によって保存的アミノ酸置換を有する、単離された核酸である。別の態様は、宿主細胞における発現のための発現ベクターをはじめとする、本明細書中に記載される核酸を含むベクターである。ベクターを含む宿主細胞も同様に含まれる。本発明の別の態様は、核酸を含む宿主細胞、および抗体または断片を産生する宿主細胞を包含する。後者の好ましい態様において、宿主細胞はCHO細胞またはNS0細胞である。抗体および/またはその複合体を産生する方法が提供され、この方法は、抗体を産生する宿主細胞を培養し、細胞培養から抗体を回収することを含む。本発明は、ほ乳類細胞、生物、または関連する病状のインビトロ、インサイチュ、およびインビボ診断または治療のために抗CD20抗体および/または複合体を合成し、使用する方法を含む。本発明の態様は、製品またはキットで提供することができる。対象者の診断または治療で使用するために、製品は、その組成物を使用して、適切な疾患または障害を診断または治療することを表示する添付文書をさらに含む。本発明の抗体、抗体断片、複合体、組成物および使用法のすべての好ましい態様において、再表面化CD20結合抗体は、CD20-7であり、前述のような軽および重鎖アミノ酸配列を有する。本発明は、CD20発現例えば、陽性細胞に対する以下の3つの細胞傷害性活性、アポト-シス、ADCC、およびCDCの誘導、に高い力価を有する新規の抗CD20抗体すなわち、III型を提供する。さらに、invivo腫瘍モデルを用いて示されるように、抗CD20抗体とSMCC-DM1の複合体は、CD20発現細胞を予想外に死滅させる。定義あらゆる態様において、脂肪族基とは、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基と定義される。アルキル基は、直鎖または分岐状であり得る脂肪族炭化水素基で、好ましくは鎖または環の中に1~20個の炭素原子を有し、好ましくは3~10個の炭素原子を有する。鎖中に1~12個の炭素原子を有するアルキル基がさらに好ましい。分岐状とは、メチル、エチルまたはプロピル等の1つまたは複数の低級アルキル基が直鎖アルキル鎖に結合していることを意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、3-ペンチル、オクチル、ノニル、デシル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。アルケニル基は、炭素炭素二重結合を含み、直鎖または分岐状であり得、好ましくは2~15個の炭素原子を鎖中に有する脂肪族炭化水素基である。アルケニル基は鎖中に2~12個の炭素原子を有することがより好ましく;鎖中に約2~4個の炭素原子を有することがより好ましい。アルケニル基の例としては、エテニル、プロペニル、n-ブテニル、i-ブテニル、3-メチルブタ-2-エニル、n-ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、およびデセニルが挙げられる。アルキニル基は、炭素炭素三重結合を含み、直鎖でも分岐状でもよく、好ましくは鎖中に2~15個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基である。アルキニル基は鎖中に2~12個の炭素原子を有することがより好ましく;鎖中に2~4個の炭素原子を有することがより好ましい。アルキニル基の例としては、エチニル、プロピニル、n-ブチニル、2-ブチニル、3-メチルブチニル、n-ペンチニル、ヘプチニル、オクチニルおよびデシニルが挙げられる。本明細書で使用される場合、芳香族基という用語は、6~14個の炭素原子、好ましくは6~10個の炭素原子を有する芳香族の単環式または複環式炭化水素環構造から成る置換または非置換のアリール基を意味する。アリール基の例としては、フェニルおよびナフチルが挙げられる。置換基には、限定されないが、アルキル基、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシルおよびメトキシ、エトキシおよびプロポキシ等のC1~C3アルコキシ基が挙げられる。複素環、ヘテロシクリルおよび複素環式基という用語は、少なくとも1つの環員がヘテロ原子である、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、非芳香族の安定な3~14員、好ましくは5~10員の単環式、二環式または複環式の環、または、少なくとも1つのヘテロ原子を有する芳香族の、好ましくは5~10員の単環式、二環式もしくは複環式の環を意味する。典型的に、ヘテロ原子には、限定されないが、酸素、窒素、硫黄、セレン、およびリン原子が含まれる。好ましいヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄である。複素環は、PaquetteLeoAPrinciplesofModernHeterocyclicChemistryparticularlyChapters13467and9TheChemistryofHeterocyclicCompoundsAseriesofMonographsinparticularVolumes13141619and28andJAmChemSoc825566に記載されている。また、ヘテロシクリルには、飽和、部分不飽和環、または芳香族の炭素環式もしくは複素環の環と縮合する、複素環の遊離基も含まれる。脂肪族、芳香族、且つ複素環である単位はまた、荷電した置換基も有し得る。荷電した置換基は、限定されないが、カルボン酸塩、スルホン酸およびリン酸から選択される負に帯電した基、または三級もしくは四級アミノ基から選択される正に帯電した基であり得る。ヘテロアリールという用語は、5または6員環の一価の芳香族遊離基を意味し、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される1つまたは複数のヘテロ原子を含む、5~18個の原子からなる縮合環構造少なくともその1つは芳香族であるが含まれる。ヘテロアリール基の例は、ピリジニル例えば、2-ヒドロキシピリジニルを含む、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、ピリミジニル例えば、4-ヒドロキシピリミジニルを含む、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノニリル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、およびフロピリジニルである。複素環またはヘテロアリール基は、可能な場合、炭素炭素結合型または窒素窒素結合型が結合され得る。例として、限定するものではないが、炭素結合型の複素環およびヘテロアリールは、ピリジンの2、3、4、5、もしくは6位、ピリドアジンの3、4、5、もしくは6位、ピリミジンの2、4、5、もしくは6位、ピラジンの2、3、5、もしくは6位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロールもしくはテトラヒドロピロールの2、3、4、もしくは5位、オキサゾール、イミダゾールもしくはチアゾールの2、4、もしくは5位、イソキサゾール、ピラゾール、もしくはイソチアゾールの3、4、もしくは5位、アジリジンの2もしくは3位、アゼチジンの2、3、もしくは4位、キノリンの2、3、4、5、6、7、もしくは8位、またはイソキノリンの1、3、4、5、6、7、もしくは8位に結合される。例として、限定するものではないが、窒素結合型複素環およびヘテロアリールは、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、2-ピロリン、3-ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、2-イミダゾリン、3-イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、2-ピラゾリン、3-ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、1H-インダゾールの1位、イソインドール、またはイソインドリンの2位、モルホリンの4位、およびカルバゾール、またはO-カルボリンの9位に結合される。ヘテロアリールおよびヘテロシクリル基中に存在するヘテロ原子には、NO、SO、およびSO2等の酸化型が含まれる。ヘテロアリールまたはヘテロシクリルの置換基には、限定されないが、アルキル基、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシルおよびメトキシ、エトキシおよびプロポキシ等のC1~C3アルコキシ基が含まれる。ハロゲンには、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子が含まれる。フッ素および塩素原子が好ましい。複合体という用語は、本明細書で使用される場合、細胞結合物質すなわち、抗CD20抗体またはその断片に結合している化合物またはその誘導体を意味し、一般式C-L-CBAにより定義され、式中、C=化合物、L=リンカー、およびCBA=細胞結合物質すなわち抗CD20抗体または断片である。いくつかの実施形態において、一般式D-L-CBA式中、D=薬剤、L=リンカーおよびCBA=細胞結合物質すなわち抗CD20抗体または断片も、同様に用いられ得るリンカーとは、化合物、通常はメイタンシノイド等の薬剤を、抗CD20抗体またはその断片等の細胞結合物質に、安定な共有結合様式で連結できるあらゆる化学部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性を維持する条件下で、酸による切断、光による切断、ペプチダーゼによる切断、エステラーゼによる切断、およびジスルフィド結合開裂を起こし易くてもよく、またはそれらに対して実質的に抵抗性であってもよい。好適なリンカーは該技術分野において周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基およびエステラーゼに不安定な基が挙げられる。また、リンカーには、本明細書に記載される、当該技術分野で知られている、荷電したリンカー、およびその親水性形態も含まれる。異常な細胞増殖とは、本明細書で使用される場合、特に明記しない限りは、正常な制御機構に非依存的例えば、接触阻止の喪失である細胞増殖を意味する。これには、例えば、1変異型チロシンキナ-ゼの発現または受容体型チロシンキナ-ゼの過剰発現により増殖する腫瘍細胞腫瘍;2異常なチロシンキナ-ゼ活性化が起こる他の増殖性疾患の良性細胞および悪性細胞;3受容体型チロシンキナ-ゼにより増殖するあらゆる腫瘍;4異常なセリン/トレオニンキナ-ゼ活性化により増殖するあらゆる腫瘍;並びに5異常なセリン/トレオニンキナ-ゼ活性化が起こる他の増殖性疾患の良性細胞および悪性細胞の異常増殖が含まれる。本発明は、腫瘍形成性疾患を含むCD20を発現する細胞が関与する種々の疾患、および免疫疾患、例えば、自己免疫性疾患または炎症性疾患を治療および/または予防するのに用いられ得る。がんおよびがん性のという用語は、典型的には制御されない細胞増殖により特徴付けられる、哺乳類における生理的条件を意味する、または説明している。腫瘍は1つまたは複数のがん性細胞から成る。がんの例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病またはリンパ系腫瘍が含まれる。治療および/または予防され得る腫瘍形成性の疾患の例としては、B細胞リンパ腫NHLを含む、前駆Bリンパ芽球性白血病リンパ腫および成熟B細胞腫瘍、例えば、B細胞慢性リンパ球性白血病CLL/小リンパ球性リンパ種SLL等の、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫MCL、濾胞性リンパ腫FL低悪性度の、中悪性度のおよび高悪性度のFLを含む、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫MALT型、結節性および脾臓型、毛様細胞性白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ球増加症、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、並びに未分化大細胞リンパ腫ALCLが含まれる。CD20発現B細胞が関与し、治療および/または予防され得る免疫不全および免疫疾患の例としては、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎、全身性強皮症および全身性硬化症、炎症性腸疾患IBD、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、糸球体腎炎、湿疹、喘息、アテローム性動脈硬化、白血球接着不全、多発性硬化症、レイノー症候群Reynaud’ssyndrome、シェーグレン症候群、若年発症糖尿病、ライター病、ベーチェット病、免疫複合体性腎炎、IgA腎症、IgM多発ニューロパシー、急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病等の免疫性の血小板減少、溶血性貧血、重症筋無力症ールプス腎炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチRA、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、ウェゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性伝染性単核症、HN、およびヘルペスウイルス関連疾患が挙げられる。さらに、重症急性呼吸窮迫症候群および脈絡網膜炎choreoretinitisが例として挙げられる。さらなる例としては、B細胞がエプスタイン-バーウイルスEBV等のウィルスに感染することにより引き起こされる疾患および障害が挙げられる。治療薬には、抗体、ペプチド、タンパク質、酵素等の生物学的作用物質または化学療法剤の両方が包含される。化学療法剤とは、がん治療に有用な化学物質である。化学療法剤の例としては、エルロチニブTARCEVA商標登録、ジェネンテック社/OSIファーマスーティカルズ社、ボルテゾミブVELCADE商標登録、ミレニアムファーマスーティカルズ社、フルベストラントFASLODEX商標登録、アストラゼネカ社、スーテントSU11248、ファイザー社、レトロゾールFEMARA商標登録、ノバルティス社、メシル酸イマチニブGLEEVEC商標登録、ノバルティス社、PTK787/ZK222584ノバルティス社、オキサリプラチンEloxatin商標登録、サノフィ社、5-FU5-フルオロウラシル、ロイコボリン、ラパマイシンシロリムス、RAPAMUNE商標登録、ワイス社、ラパチニブTYKERB商標登録、GSK572016、グラクソスミスクライン社、ロナファーニブSCH66336、ソラフェニブBAY43-9006、バイエルラボ社、およびゲフィチニブIRESSA商標登録、アストラゼネカ社、AG1478、AG1571SU5271;スーゲン、チオテパおよびCYTOXAN商標登録シクロホスファミドcyclosphosphamide等のアルキル化剤;ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン等のスルホン酸アルキル;ベンゾドーパbenzodopa、カルボコン、メツレドーパmeturedopa、およびウレドーパuredopa等のアジリジン;エチレンイミンおよびメチラメラミンmethylamelamine、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロメラミン;アセトゲニン特にブラタシンおよびブラタシノン;カンプトテシン合成類似化合物トポテカンを含む;ブリオスタチン;カリスタチン;CC-1065そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビセレシン合成類似化合物を含む;クリプトフィシン特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8;ドラスタチン;デュオカルマイシン合成類似化合物、KW-2189およびCB1-TM1を含む;エリュテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチン;スポンジスタチン;クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロルエタミン酸化物塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード;カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン等のニトロソ尿素nitrosurea;エンジイン抗菌剤等の抗菌剤例えば、カリチアマイシン、特にカリチアマイシンγIIおよびカリチアマイシンωIIAngewChemIntlEdEngl33183186;ジネミシン、例えばジネミシンA;クロドロネート等のビスホスホネート;エスペラミシン;並びに、ネオカルチノスタチン発色団および関連色素蛋白エンジイン抗菌剤発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシンauthramycin、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシンcarabicin、カルミノマイシンcaminomycin、カルジノフィリン、クロモマイシンchromomycinis、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN商標登録ドキソルビシン、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンC等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシンquelamycin、ロドルビシンrodorubicin、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル5-FU等の代謝拮抗剤;デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート等の葉酸類似体;フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアムニプリンthiamniprine、チオグアニン等のプリン類似体;アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン等のピリミジン類似体;カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン;アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗副腎剤antiadrenal;フォリン酸frolinicacid等の葉酸補充液;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシドaldophosphamideglycoside;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキサート;デフォファミンdefofamine;デメコルチン;ジアジクオン;エフロルニチンelformithine;エリプチニウムアセタート;エポシロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン;メイタンシンおよびアンサマイトシン等のメイタンシノイド;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモールmopidanmol;ニトラエリンnitraerine;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK商標登録多糖類複合体JHSナチュラルプロダクツ社JHSNaturalProducts、オレゴン州ユージーン;ラゾキサン;リゾキシン;シゾフィランsizofuran;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2’,2’’-トリクロロトリエチルアミン;トリコテシン特にT-2毒素、ベルカリンAverracurinA、ロリジンAおよびアングイジン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシンgacytosine;アラビノシドシトシンアラビノシドAraC;シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、TAXOL商標登録パクリタキセル;ブリストルマイヤーズスクイブ社BristolMyersSquibbOncology、ニュージャージー州プリンストン、ABRAXANE商標登録無クレモフォール、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤アメリカンファーマシューティカルパートナーズ社AmericanPharmaceuticalPartners、イリノイ州シャンバーグSchaumberg、およびTAXOTERE商標登録ドセタキセルdoxetaxel;ローヌプーランローラー社RhonePoulencRorer、フランス、アントニー;クロランブシルchloranmbucil;GEMZAR商標登録ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサ-ト;シスプラチンおよびカルボプラチン等の白金類似体;ビンブラスチン;エトポシドVP-16;イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;NAVELBINE商標登録ビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキサ-ト;ダウノマイシン;アミノプテリン;カペシタビンXELODA商標登録;イバンドロン酸;CPT-11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチンDMFO;レチノイン酸等のレチノイド;および上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、酸および誘導体が含まれる。また、化学療法剤の定義には、i抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体調節物質SERM等の、例えば、タモキシフェンNOLVADEX商標登録;クエン酸タモキシフェンを含む、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびFARESTON商標登録クエン酸トレミフェンを含む、腫瘍に対するホルモン作用を制御または阻害するよう作用する抗ホルモン剤;ii例えば、45-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE商標登録酢酸メゲストロール、AROMASIN商標登録エキセメスタン;ファイザー社、ホルメスタンformestanie、ファドロゾール、RIVISOR商標登録ボロゾール、FEMARA商標登録レトロゾール;ノバルティス社、およびARIMIDEX商標登録アナストロゾール;アストラゼネカ社等の、副腎におけるエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤;iiiフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン等の抗アンドロゲン;並びにトロキサシタビン1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体;ivタンパク質キナ-ゼ阻害剤;v脂質キナ-ゼ阻害剤;vi例えば、PKC-α、RalfおよびH-Ras等のアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関わるシグナル経路における遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド;viiVEGF発現阻害剤例えば、ANGIOZYME商標登録およびHER2発現阻害剤等のリボザイム;viii遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えば、ALLOVECTIN商標登録、LEUVECTIN商標登録、およびVAXID商標登録;PROLEUKIN商標登録rIL-2;LURTOTECAN商標登録等のトポイソメラーゼ1阻害剤;ABARELIX商標登録rmRH;ixベバシズマブAVASTIN商標登録、ジェネンテック社等の血管新生阻害剤;並びにx上記のいずれかの薬剤的に許容できる塩、酸および誘導体も含まれる。他の血管新生阻害剤には、MMP-2マトリックスメタロプロテアーゼ2阻害剤、MMP-9マトリックスメタロプロテアーゼ9阻害剤、COX-IIシクロオキシゲナーゼII阻害剤、およびVEGF受容体型チロシンキナ-ゼ阻害剤が含まれる。本化合物/組成物との併用で使用され得る有用なマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の例としては、国際公開第9633172号、国際公開第9627583号、欧州特許第818442号、欧州特許第1004578号、国際公開第9807697号、国際公開第9803516号、国際公開第9834918号、国際公開第9834915号、国際公開第9833768号、国際公開第9830566号、欧州特許第606号046、欧州特許第931号788、国際公開第9005719号、国際公開第9952910号、国際公開第9952889号、国際公開第9929667号、国際公開第9907675号、欧州特許第945864号、米国特許第5,863,949号、米国特許第5,861,510号、および欧州特許第780号386に記載され、これら全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる。VEGF受容体型チロシンキナ-ゼ阻害剤の例としては、4-4-ブロモ-2-フルオロアニリノ-6-メトキシ-7-1-メチルピペリジン-4-イルメトキシキナゾリンZD6474;国際公開第01/32651号中の実施例2、4-4-フルオロ-2-メチルインドール-5-イルオキシ-6-メトキシ-7-3-ピロリジン-1-イルプロポキシ-キナゾリンAZD2171;国際公開第00/47212号中の実施例240、バタラニブPTK787;国際公開第98/35985号およびSU11248スニチニブ;国際公開第01/60814号、並びにPCT国際公開第97/22596号、PCT国際公開第97/30035号、PCT国際公開第97/32856号、およびPCT国際公開第98/13354号に開示される化合物が挙げられる。化学療法剤の他の例としては、PI3Kホスホイノシチド3キナーゼの阻害剤、例えば、YaguchietalJouroftheNatCancerInst98545556;米国特許第7,173,029号;米国特許第7,037,915号;米国特許第6,608,056号;米国特許第6,608,053号;米国特許第6,838,457号;米国特許第6,770,641号;米国特許第6,653,320号;米国特許第6,403,588号;国際公開第2006/046031号;国際公開第2006/046035号;国際公開第2006/046040号;国際公開第2007/042806号;国際公開第2007/042810号;国際公開第2004/017950号;米国特許出願公開第2004/092561号;国際公開第2004/007491号;国際公開第2004/006916号;国際公開第2003/037886号;米国特許出願公開第2003/149074号;国際公開第2003/035618号;国際公開第2003/034997号;米国特許出願公開第2003/158212号;欧州特許第1417976号;米国特許出願公開第2004/053946号;日本特許第2001247477号;日本特許第08175990号;日本特許第08176070号;米国特許第6,703,414号;および国際公開第97/15658号等で報告されているものが挙げられ、これら文献全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのようなPI3K阻害剤の具体例としては、SF-1126PI3K阻害剤、セマフォーファーマスーティカルズ社SemaforePharmaceuticals、BEZ-235PI3K阻害剤、ノバルティス社、XL-147PI3K阻害剤、エクセリクシス社Exelixis、Incが挙げられる。本明細書で使用される場合、CD20またはCD20抗原という用語は、天然に発現される、またはCD20遺伝子を形質移入した細胞等で発現される、CD20のポリペプチド並びにあらゆる変異体、アイソフォームおよび種相同体specieshomologを意味する。ヒトCD20は、MS4A1膜貫通4領域、サブファミリーA、メンバー1としても知られている。当該技術分野で認知される、CD20のさらなる同義語には、CD20抗原、CD20受容体、B-リンパ球表面抗原B1、B1、Bp35、LEU-16、MGC3969、MS4A2およびS7が含まれる。2つの転写変異体が、ヒトCD20について説明されている。変異体1はより長い転写変異体を表わし、GenBankIDGI68348720に一致する。変異体3は、変異体1と比較すると5’UTRの一部が欠如しており、GenBankIDGI68348721に一致している。変異体1および3は同じタンパク質をコードしている。ヒトCD20の主要な形態は、GenBankタンパク質ID23110989に記載されるタンパク質の297個のアミノ酸を含んでいる。エピトープという用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。通常、エピトープは、アミノ酸または糖側鎖等の、化学的に活性な表面分子集団から成り、通常は特異的な三次元的構造特性および特異的な電荷特性を有している。ラフトという用語は、細胞の原形質膜の外側に位置する、スフィンゴ脂質およびコレステロールに富む細胞膜マイクロドメインを意味する。該ドメインへのあるタンパク質の結合能は、そのタンパク質の機能に影響を与え得る。例えば、本発明の抗体および/またはその断片が結合した後に、CD20分子が脂質ラフトへ移行することにより、原形質膜に高密度のCD20抗原-抗体複合体がつくり出される。そのような高密度のCD20抗原-抗体複合体により、CDC中に補体系を効率的に活性化することが可能となり得る。本明細書で使用される場合、抗体または断片等には、限定されないが、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも1つの相補性決定領域CDRまたはそのリガンド結合部位、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、重鎖もしくは軽鎖の定常領域、フレームワーク領域、またはそのあらゆる部分、あるいは抗原または抗原受容体または結合タンパク質の少なくとも一部分等の、本発明のCD20に対する抗体に組み込まれ得る免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含むいずれのタンパク質またはペプチドも包含される。そのような抗体は、特異的リガンドにさらに作用する場合があり、例えば、限定されないが、そのような抗体はinvitro、insitu、invivoおよびexvivoにおいて、少なくとも1つの抗原活性もしくは抗原結合、または抗原受容体活性もしくは抗原受容体結合を、調節、減少、増加、拮抗、アゴナイズ、緩和mitigate、軽減aleviate、遮断、阻害、抑制および/または妨害する。非制限的な例として、特定部位または変異体が、少なくとも1つの抗原分子、またはその特定部位、変異体もしくは領域に結合し得る、種々のCD20特異的抗体が開示される。また、好適な抗原特異的抗体、特定部位、または変異体は、少なくとも1つの活性または機能、例えば、限定されないが、RNA、DNAまたはタンパク質合成、放出、受容体シグナリング、膜結合、結合活性、タンパク質産生および/または合成にも、場合によっては影響し得る。抗体はヘテロ四量体の糖タンパク質であり、2つの同一な軽鎖LCおよび2つの同一な重鎖HCから成る。典型的には、各軽鎖は1つの共有結合性のジスルフィド結合により重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。また、それぞれの重鎖および軽鎖は、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変領域VHを有し、それにいくつかの定常領域が続いている。各軽鎖は、可変領域VLを一端に、定常領域をもう一端に有し;軽鎖の定常領域は重鎖の第一の定常領域と一緒に並んでおり、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と一緒に並んでいる。いかなる脊椎動物種の抗体の軽鎖も、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、2つの明らかに異なる型、すなわちκおよびλのうち1つに分類され得る。免疫グロブリンは、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、5つの主要なクラス、つまりIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに分類され得る。IgAおよびIgGはさらに、アイソタイプIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に亜分類される。抗体断片には、限定されないが、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも1つの相補性決定領域CDRまたはリガンド結合部位、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、重鎖もしくは軽鎖の定常領域、フレームワーク領域、またはそのいかなる部分、あるいは抗原または抗原受容体または結合タンパク質の少なくとも一部分等の、本発明のCD20に対する抗体に組み込まれ得る免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含むいずれのタンパク質またはペプチドも包含される。可変という用語は、可変領域のある部分が、抗体間の配列において広範に異なっている事実を意味し、それぞれの特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において用いられる。しかし、可変性は抗体の可変領域全体に均等に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖および重鎖の可変領域の両方に存在する、相補性決定領域CDRまたは超可変領域と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変領域でより高度に保存される領域は、フレームワークFRと呼ばれる。未変性の重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、4つのFR領域を含み、該FR領域は主としてβシート立体配置を採り、βシート構造に連結するループを形成し、場合によってはβシート構造の部分を形成する3つのCDRが連結している。各鎖のCDRはFR領域のすぐ傍にまとまっており、他の鎖のCDRと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与するKabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterestFifthEditionNationalInstituteofHealthBethesdaMdを参照。定常領域は抗体の抗原への結合に直接的には関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与等、種々のエフェクター機能を示す。また、抗体という用語には、その消化断片、特定の部分および変異体が包含され、抗体模倣体、つまり、抗体またはその特定の断片もしくは部分の構造および/または機能を模倣する抗体の一部分も含まれ、一本鎖抗体およびその断片も含まれる。機能的断片には、CD20等の哺乳類の抗原に対し、単独でまたは他の抗原、例えば、ヒト上皮増殖因子受容体HER1、IgE、血管内皮増殖因子、HER二量化阻害剤、Bcl-2ファミリータンパク質、MET、IL-13、IFNα、EGFL7、CD40、DR4およびDR5、PI3キナ-ゼ、リンホトキシンα、β7インテグリン、アミロイドβ、CRIg、TNF、補体C5、CBL、CD147、IL-8、gp120、VLA-4、CD11a、CD18、VEGF、CD40L、Id、ICAM-1、CD2、EGFR、TGF-β、TNF-α、E-セレクチン、第VII因子FactVII、TNF、Her2/neu、Fgp、CD11/18、CD14、ICAM-3、CD80、CD40L、CD4、CD23、β2-インテグリン、α4β7、CD52、HLADR、CD22、CD64FcR、TCRαβ、CD2、CD3、HepB、CA125、EpCAM、gp120、CMV、gpIIbIIIa、IgE、IL5、IL-4、CD25、CD3、CD33、CD19、CD22、CD28、CD36、CD37、CD44、CD55、CD59、CD70、CD79、CD80、CD103、CD134、CD137、CD138、CD152、CD30、HLA、VNRインテグリン、CD25、IL-23並びにIL-12等との組み合わせで、結合する抗原結合部位断片が含まれる。例えば、抗原またはその一部に結合できる抗体断片には、限定されないが、Fab例えば、パパイン分解による、Fab’例えば、ペプシン消化および部分的還元によるおよびFab’2例えば、ペプシン消化による、facb例えば、プラスミン消化による、pFc’例えば、ペプシンまたはプラスミン消化による、Fd例えば、ペプシン消化、部分的還元および再凝集による、FvまたはscFv例えば、分子生物学的技術による断片が含まれ、本発明に包含される例えば、Colligan、Immunologyを参照。そのような断片は、該技術分野において周知のおよび/または本明細書に記載の酵素的切断、合成技術または組換え技術によって生成され得る。また、抗体は、1つまたは複数の終止コドンが天然の終結部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いて、種々の切断型で生成され得る。例えば、Fab’2の重鎖部分をコードする組み合わせ遺伝子は、重鎖のCH1領域および/またはヒンジ領域をコードするDNA配列を含むように設計され得る。抗体の様々な部分は、従来技術により化学的に結合され得、または、遺伝子工学技術を用いて隣接するタンパク質として調製され得る。遮断抗体またはアンタゴニスト抗体とは、その抗体が結合するCD20等の抗原の生物活性を阻害するまたは減少させる抗体である。好ましい遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。望ましくは、生物活性は、10、20、30、50、70、80、90、95、または100までも、減少される。アゴニスト抗体とは、本明細書で使用される場合、目的の参照ポリペプチドの機能活性の少なくとも1つを模倣する抗体である。抗イディオタイプ抗Id抗体とは、抗体の抗原結合部位と通常は結合する特有の決定基を認識する抗体である。Id抗体は、抗Idが調製されるmAbのソースと同じ種および遺伝子型の動物例えば、マウス株を、免疫することにより調製され得る。免疫化動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体抗イディオタイプ抗体を産生することにより、免疫化する抗体のイディオタイプ決定基を認識し、応答するだろう。例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第4,699,880号を参照されたい。抗Id抗体は、免疫原としても使用され、さらに別の動物において免疫応答を誘導し、いわゆる抗-抗Id抗体をさせることができる。抗-抗Idは、抗Idを誘導した元のmAbと抗原決定基が同一であり得る。従って、あるmAbのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることにより、同一の特異性を有する抗体を発現する他のクローンを特定することが可能となる。単離された抗体とは、その天然の環境から分離および/または回収された抗体である。その天然の環境の不純物成分は、その抗体の診断または治療での使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を誘導し得る。好ましい態様では、抗体は、1例えば、ローリー法により測定された場合には、抗体の95重量超まで、最も好ましくは99重量超まで、2スピニングカップシーケネーターspinningcupsequenatorの使用によってN末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な程度まで、あるいは3クマシーブルー、または、好ましくは銀染色を用いる、還元または非還元条件下での、SDS-PAGEドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により均一性を示すまで、精製されるであろう。抗体の天然の環境の少なくとも1つの成分は存在しないと予期されるため、単離抗体には組換え体細胞内にあるinsituCD20抗体が含まれる。しかし通常は、単離抗体は、少なくとも1つの精製工程により調製されるだろう。リツキシマブまたはRITUXAN商標登録という用語は、米国特許第5,736,137号AndersonetalではC2B8と記載される、市販の抗CD20キメラ抗体を意味する。2F2またはオファツムマブという用語は、国際公開第2004/035607号Teelingetalにおいて記載される、完全ヒト抗CD20抗体を意味する。GA101またはアフツズマブという用語は、国際公開第2005/0448959号Umana、米国特許第5,639,641号2005に記載される、重鎖B-HH6および軽鎖B-KV1から成る、ヒト化および糖改変された抗CD20抗体を意味する。B1という用語は、マウス抗CD20抗体、トシツモマブを意味し、Bexxar商標登録の未標識抗体成分に相当する。本明細書で使用される場合、III型抗体という用語には、CD20、そのエピトープおよび/またはそのアイソフォームに結合し、II型抗体と同様に、架橋剤なしでアポトーシスを実質的に誘導することができ、I型抗体と同様に、CD20を脂質ラフトに再分布し、補体依存性細胞傷害CDCを実質的に誘導することができるインタクトな抗体またはその断片が含まれる。本明細書で使用される場合、設計された抗体engineeredantibodyまたは改変抗体という用語には、重要なヒトフレームワークおよび定常領域CL、CH領域例えば、CH1、CH2、CH3、およびヒンジ、並びに抗CD20抗体またはその断片等の抗原結合抗体由来のCDRを有する抗体が含まれる。完全ヒトフレームワークは、ヒト生殖細胞の配列および体細胞突然変異を有する配列に相当するフレームワークを含む。CDRは、あらゆる抗体フレームワークのコンテキストcontextの内側または外側において、抗原と会合または結合する1つまたは複数のCDRに由来し得る。例えば、CD20を対象とする本発明のヒト型に設計された抗体humanengineeredantibodyのCDRは、マウス抗体フレームワークのコンテクスト内の抗原に結合するCDRに由来する場合があり、その後ヒトフレームワークのコンテキスト内の抗原に結合するように改変される。ヒト型に設計された抗体humanengineeredantibodyはしばしば、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。同様に、霊長類サル、ヒヒ、チンパンジー等、げっ歯類マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター等および他の哺乳類を指定した抗体は、このような種、亜属、属、亜科、および科に特異的な抗体を指定する。さらに、キメラ抗体は上記のいかなる組み合わせをも含み得る。このような変化または変異は、所望により且つ好ましくは、非改変抗体に比べて、ヒトまたは他の種における免疫原性を保持または低下させる。ヒト型に設計された抗体humanengineeredantibodyは、キメラ抗体またはヒト化抗体と異なる。設計された抗体engineeredantibodyは、機能的に再編成されたヒトまたはヒト改変免疫グロブリン例えば、重鎖および/または軽鎖遺伝子を発現できる非ヒトの動物または原核もしくは真核細胞により産生され得る。さらに、設計された抗体engineeredantibodyが一本鎖抗体である場合、該抗体は未変性のヒトまたは非ヒト抗体で見出されるリンカーペプチドを含み得る。例えば、Fvは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域を連結する、2~約8のグリシンまたは他のアミノ酸残基等のリンカーペプチドを含み得る。そのようなリンカーペプチドは、ヒト由来であると考えられている。CD20および非CD20抗原等の少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナル抗体、好ましくは、ヒト抗体、ヒト型に設計された抗体humanengineeredantibody、再表面化された抗体またはヒト化抗体である、二重特異性抗体、異種特異的抗体、ヘテロ複合体抗体または類似抗体も使用され得る。この場合、一方の結合特異性は、少なくとも1つの抗原タンパク質に対するものであり、もう一方は別の抗原タンパク質に対するものである。二重特異性抗体を作成する方法は、該技術分野において周知である。従来、二重特異性抗体の組換え体生成は、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づくものであり、ここで、2つの重鎖は異なる特異性を有するMilsteinandCuelloNature305537。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の任意組み合わせにより、これらのハイブリドーマクアドローマは、約10の異なる抗体分子からなる可能な混合物を生成し、このうち1つだけが正しい二重特異性構造を有する。構造が正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィーによる工程または本明細書に記載の別の方法により通常は行われる。同様の手法が、例えば、国際公開第93/08829号、米国特許第6,210,668号、同第6,193,967号、同第6,132,992号、同第6,106,833号、同第6,060,285号、同第6,037,453号、同第6,010,902号、同第5,989,530号、同第5,959,084号、同第5,959,083号、同第5,932,448号、同第5,833,985号、同第5,821,333号、同第5,807,706号、同第5,643,759号、同第5,601,819号、同第5,582,996号、同第5,496,549号、同第4,676,980号、国際公開第91/00360号、国際公開第92/00373号、欧州特許第03089号、TrauneckeretalEMBOJ103655、SureshetalMethodsinEnzymology121210、米国特許第20090258026号、米国特許第20060140946号および米国特許第20070298040号に開示されており、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。抗体エフェクター機能とは、抗体のFc領域未変性配列Fc領域またはアミノ酸配列変異体Fc領域に起因する生物活性を意味し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例としては、C1q結合および補体依存性細胞傷害CDC;Fc受容体結合;抗体依存性細胞傷害ADCC;ファゴサイトーシス;細胞表面受容体例えばB細胞受容体の下流制御;並びにB細胞活性化が挙げられる。ヒト効果細胞とは、1つまたは複数のFcRを発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。ある態様では、該細胞は少なくともFcyRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を果たす。ADCCを仲介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球PBMC、ナチュラルキラーNK細胞、単球、細胞傷害性T細胞および好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、未変性のソース、例えば血液から単離され得る。抗CD20抗体出願者の発見に基づき、特に、本発明の抗CD20抗体およびその断片、複合体、組成物および方法は、突然変異体抗体等であり得る。抗CD20抗体は、抗CD20抗体のアミノ酸残基の1つまたはそれ以上が変化している、抗CD20抗体のアミノ酸配列変異体等の設計された抗体engineeredantibodyまたは改変抗体であり得る。抗CD20抗体のアミノ酸配列に対する改変には、その抗原に対する抗体もしくは断片の親和性もしくは結合活性を向上させるための、ポリペプチドおよび/もしくはポリヌクレオチド配列に対する改変、並びに/または、本明細書で特に明記しない限り既知のエフェクター機能を向上させるための抗体のFc部分に対する改変が含まれる。改変は、いずれかの既知の抗CD20抗体または本明細書に記載のものと同一の抗CD20抗体に対してなされ得る。そのような改変抗体は、参照抗CD20抗体と100未満の配列同一性または類似性を有する必要がある。好ましい態様では、改変抗体は、抗CD20抗体の重鎖または軽鎖の可変領域のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも20、25、35、45、55、65、または75の、より好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、最も好ましくは少なくとも95のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するだろう。好ましい態様では、改変抗体は、抗CD20抗体の重鎖CDR1、CDR2、またはCDR3のアミノ酸配列と少なくとも25、35、45、55、65、または75の、より好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、最も好ましくは少なくとも95のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するだろう。好ましい態様では、改変抗体はヒトCD20結合能を維持するだろう。ある態様では、本発明の抗CD20抗体は、配列番号47、34、35および36のアミノ酸配列に対し、約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99またはそれ以上同一である重鎖を含む。ある態様では、本発明の抗CD20抗体は、配列番号46、32または33のアミノ酸配列に対し、約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99またはそれ以上同一である軽鎖を含む。好ましい態様では、改変抗体は、抗CD20抗体の軽鎖CDR1、CDR2、またはCDR3のアミノ酸配列と少なくとも25、35、45、55、65、または75の、より好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、最も好ましくは少なくとも95、96、97、98、99のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するだろう。本発明のいくつかの実施形態では、抗CD20抗体は、抗CD20抗体のアミノ酸残基の1つまたはそれ以上が改変されている、抗CD20抗体のアミノ酸配列変異体等の、設計された抗体engineeredantibodyまたは改変抗体であり得る。抗CD20抗体のアミノ酸配列に対する改変には、抗体もしくは断片のその抗原に対する親和性もしくは結合活性を向上させるためのポリペプチドおよび/もしくはポリヌクレオチド配列に対する改変、並びに/または、本明細書に特に明記しない限り既知のエフェクター機能を向上させるための、抗体のFc部分への改変が含まれる。改変は、いずれかの既知の抗CD20抗体または本明細書に記載のものと同一の抗CD20抗体に対してなされ得る。そのような改変抗体は、参照抗CD20抗体と100未満の配列同一性または類似性を有する必要がある。好ましい態様では、改変抗体は、抗CD20抗体の重鎖または軽鎖の可変領域のいずれかのアミノ酸配列と比較した場合に、少なくとも1~5、1~3、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45または50この保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するだろう。好ましい態様では、改変抗体は、抗CD20抗体の重鎖CDR1、CDR2、またはCDR3のアミノ酸配列と比較した場合に、少なくとも1~20、1~15、1~10、1~5、1~3、20、19、18、17、16、15、14,13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1個の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するだろう。好ましい態様では、改変抗体はヒトCD20結合能を維持するだろう。ある態様では、本発明の抗CD20抗体は、配列番号47、34、35および36のアミノ酸配列のアミノ酸配列と比較した場合に、約1~20、1~15、1~10、1~5、1~3、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45または50個の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む。ある態様では、本発明の抗CD20抗体は、配列番号46、32または33のアミノ酸配列のアミノ酸配列と比較した場合に、約1~20、1~15、1~10、1~5、1~3、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45または50個の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む。好ましい態様では、改変抗体は、抗CD20抗体の軽鎖CDR1、CDR2、またはCDR3のアミノ酸配列と比較した場合に、少なくとも1~20、1~15、1~10、1~5、1~3、20、19、18、17、16、15、14,13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1個の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するだろう。抗CD20抗体、CD20-7およびCD20-6を産生するハイブリドーマは、ATCC受託番号PTA-10487およびPTA-10486で寄託されている。同一性とは、該技術分野で知られているように、2つのポリヌクレオチド間または2つのポリペプチド間の関連性の尺度であり、それらの配列を比較することにより測定される。配列に関する同一性または類似性は、本明細書では、必要ならば、最大の配列一致率を達成するために、配列を整列させ、ギャップを導入した後、抗CD20抗体の残基に対して同一すなわち、同一の残基であるまたは類似すなわち、共通の側鎖性質に基づいた同一の群からのアミノ酸残基、下記参照している、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。可変領域の外側の抗体配列への、いかなるN末端の、C末端の、または内部の伸張、欠失、または挿入も、配列同一性または類似性に影響しないと解釈されるべきである。一般的に、比較される2つの配列は、配列間で最大相関が得られるように整列される。整列した2つの配列が分析され、2つの配列間でアミノ酸またはヌクレオチドが正確に一致している位置の数が決定され、アライメントの全長で除算され、100を乗算されて、同一性の数字が得られる。この同一性の数字は、比較される配列の全長に渡り測定され得、これは特に長さが同一または非常に類似しており非常に相同的な配列に対して特に好適であり、あるいは、より短い既定の長さに渡り測定され得、これは長さが異なるまたは低いレベルの相同性を有する配列に対してより好適である。例えば、配列はUnix下でソフトウェアclustalWで整列され得、.aln拡張子を有するファイルが得られ、続いてこのファイルは.alnファイルを開くBioeditプログラムHallTA1999BioEdit:ウインドウズ95/98/NTのためのユーザーフレンドリーな生物学的配列アライメント編集および分析プログラムNuclAcidsSympSer419598にインポートされ得る。Bioeditのウインドウにおいて、個々の配列1度に2つを選択し、それらを整列させることができる。この方法により、配列全体の比較が可能となる。2つ以上の配列の同一性を比較するための方法は当技術分野で周知である。従って、例えば、WisconsinSequenceAnalysisPackage,バージョン9.1DevereuxJetalNucleicAcidsRes123873951984、ジェネティクスコンピュータグループ社GeneticsComputerGroup、米国ウィスコンシン州マディソンから入手可能におけるプログラムが利用可能である。2つの配列間の同一性の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。例えば、BESTFITおよびGAPプログラムは、2つのポリヌクレオチド間の同一性および2つのポリペプチド配列間の同一性を決定するために使用され得る。BESTFITは、SmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズムAdvancesinAppliedMathematics24824891981を用いており、2つの配列間で類似性が最も高い単一領域を発見する。BESTFITは、長さが似ていない2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチド配列を比較するのにより適しており、該プログラムは、短い配列はより長い配列の一部を表すと仮定している。比較において、GAPは2つの配列を整列させ、NeddlemanおよびWunschのアルゴリズムJMolBiol484433541970に従って、最大類似性を発見する。GAPは、おおよそ同じ長さの配列を比較するのにより適しており、全長に渡る配列比較が期待される。各プログラムで用いられるパラメータのギャップ加重GapWeightおよび長さ加重LengthWeightは、ポリヌクレオチドに対しては、それぞれ50および3で、ポリペプチドに対しては、それぞれ12および4であることが好ましい。同一性および類似性は、比較対象の2つの配列が最適に整列した場合に決定されるのが好ましい。配列間の同一性および/または類似性を決定するための他のプログラム、例えばBLASTプログラム群KarlinAltschul1990ProcNatlAcadSciUSA8722642268modifiedasinKarlinAltschul1993ProcNatlAcadSciUSA9058735877、国立バイオテクノロジー情報センターNCB、米国メリーランド州ベテスダから入手可能であり、wwwncbinlmnihgovのNCBIのホームページを通じてアクセス可能であるもまた、該技術分野において周知である。これらのプログラムは、2つの配列を比較するために利用される数学アルゴリズムの好ましい、非制限的な例を例示している。このようなアルゴリズムは、Altschuletal1990JMolBiol215403410に記載のNBLASTおよびXBLASTプログラムの中に組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラムスコア=100、ワード長=12を用いて実行でき、本発明の任意の抗CD20抗体の全てまたは一部をコードする核酸分子に相同的なヌクレオチド配列が得られる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラムスコア=50、ワード長=3で実行することができ、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列が得られる。比較する目的でギャップを挿入したアライメントを得るために、Altschuletal1997、NucleicAcidsRes2533893402に記載されているような、GappedBLASTを利用することができる。あるいは、PSI-Blastを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行することができる同著。BLAST、GappedBLAST、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合、各プログラム例えば、XBLASTおよびNBLASTのデフォルトのパラメータを使用することができる。httpwwwncbinlmnihgovを参照されたい。配列を比較するために利用される数学アルゴリズムの別の好ましい、非制限的な例は、MyersandMiller1988CABIOS41117に記載のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラムバージョン2.0に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120加重残基表weightresiduetable、ギャップ長ペナルティ=12、ギャップペネルティ=4を用いることができる。配列間の同一性および/または類似性を決定するためのプログラムの、該技術分野において周知な、別の非制限的な例としては、FASTAPearsonWRandLipmanDJProcNatAcadSciUSA85244424481988WisconsinSequenceAnalysisPackageの一部として利用可能が挙げられる。BLOSUM62アミノ酸置換マトリクスHenikoffSandHenikoffJGProcNatAcadSciUSA、8910915109191992を、ヌクレオチド配列が比較前にまずアミノ酸配列に翻訳される場合を含む、ポリペプチド配列比較に用いることが好ましい。アミノ酸配列間の同一性および/または類似性を決定するためのプログラムの、該技術分野において周知な、さらに別の非制限的な例としては、SeqWebSoftwareGCGWisconsinPackageに対するウェブベースのインターフェース:Gapプログラムが挙げられ、該プログラムは、プログラムのデフォルトのアルゴリズムおよびパラメータ設定:blosum62、ギャップ加重GapWeight8、長さ加重LengthWeight2で利用される。2つの配列間の同一性は、上記と同様の技術を用いて決定することができ、ギャップは考慮してもしなくてもよい。同一性を計算する際、典型的には、完全な一致のみが数えられる。BESTFITプログラムは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対するクエリーポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の同一性を決定するために使用でき、クエリーおよび参照配列は最適に整列され、プログラムのパラメータは初期値に設定される。改変抗体を作成するために、1つまたは複数のアミノ酸変化例えば、置換が、抗体の1つまたは複数の超可変領域に導入される。あるいは、または、さらに、フレームワーク領域残基の1つまたは複数の変化例えば、置換が、抗CD20抗体に導入され得、これにより、抗体突然変異体の抗原に対する結合親和性が向上される。改変するフレームワーク領域残基の例としては、非共有結合的に抗原に直接結合しAmitetalScience233747753;CDRの高次構造に相互作用/影響しChothiaetalJMolBiol196901917;および/またはVLとVHの境界に関与するフレームワーク領域残基が挙げられる。ある態様では、そのようなフレームワーク領域残基の1つまたは複数の改変により、抗体の抗原に対する結合親和性が増強される。例えば、約1~約5個のフレームワーク残基例えば、1、2、3、4または5が、本発明の本態様において変化し得る。場合によっては、この変化で、いずれの超可変領域残基も変化していない場合でさえ、結合親和性が増強された抗体を産むのに十分であり得る。しかし通常は、改変抗体は、超可変領域にさらなる変化を含むだろう。変化される超可変領域残基は、特に、抗CD20抗体の抗原に対する出発結合親和性が、そのような無作為に生成された改変抗体が容易にスクリーニングできるようなものである場合、無作為に変化され得る。そのような改変抗体を作成するための1つの有用な手法は、アラニンスキャニング突然変異誘発と呼ばれているCunninghamandWellsScience24410811085。1つまたは複数の超可変領域残基は、アラニンまたはポリアラニン残基によって置換され、アミノ酸と抗原の相互作用に影響する。置換に対して機能感受性を示すこれらの超可変領域残基は、その後、さらなるまたは他の突然変異を、置換の部位で、または置換の部位に対して、導入することにより、精製される。従って、アミノ酸配列変化を導入するための場所は予め決められているが、突然変異の性質それ自体は必ずしも予め決められていない。この方法で生成されるアラニン突然変異体は、本明細書に記載の生物活性および/または該技術分野において周知の生物活性についてスクリーニングされる。そのような改変抗体を作成するための別の手法には、ファージディスプレイを用いた親和性成熟が関わるHawkinsetalJMolBiol254889896andLowmanetalBiochemistry301083210837。簡潔に説明すると、いくつかの超可変領域部位例えば、6~7部位が変異され、各部位で全ての可能なアミノ酸置換が生成される。そのように作成された抗体突然変異体は、各繊維状ファージ粒子内にパッケージされたM13の遺伝子III産物への融合体として該繊維状ファージ粒子から一価の形で提示される。ファージにより提示された突然変異体は、続いて本明細書で開示される、および/または該技術分野において周知の生物活性例えば、結合親和性についてスクリーニングされる。抗体配列における突然変異には、置換、欠失内部欠失を含む、付加融合タンパク質を生成する付加を含む、またはアミノ酸配列の内および/または近傍におけるアミノ酸残基の保存的置換が含まれ得るが、それらの突然変異の結果はサイレント変化であり、該変化により機能的に同等な抗CD20抗体または断片が生成される。保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および/または両親媒性における類似性に基づいてなされ得る。例えば、無極性疎水性のアミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ;極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ;正に帯電した塩基性アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ;負に帯電した酸性アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。さらに、グリシンおよびプロリンは、鎖配向に影響し得る残基である。非保存的置換には、これらのクラスのうちの1つのメンバーが別のクラスのメンバーに交換されることが伴うだろう。さらに、必要に応じて、非古典的アミノ酸または化学的なアミノ酸類似体が抗体配列中に置換または付加として導入され得る。非古典的アミノ酸には、限定されないが、一般的なアミノ酸のD-異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、β-メチルアミノ酸等のデザイナーアミノ酸designeraminoacid、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、およびアミノ酸類似体が、一般に含まれる。別の態様では、改変のために選択される部位は、ファージディスプレイを用いて親和性成熟される上記参照。該技術分野において周知の、突然変異誘発のためのあらゆる技術が、抗体配列にアミノ酸置換を生成する目的で、つまり制限酵素認識部位を作成/削除し、さらなる操作を容易にするために、DNA配列における個々のヌクレオチドを改変するために使用され得る。そのような技術には、限定されないが、化学的突然変異誘発、invitro部位特異的突然変異誘発KunkelProcNatlAcadSciUSA、82488HutchinsonCetalJBiolChem2536551、オリゴヌクレオチド-定方向突然変異誘発SmithAnnRevGenet19423463HilletalMethodsEnzymol155558568、PCRをベースにした重複伸張HoetalGene775159、PCRをベースにしたメガプライマー突然変異誘発SarkaretalBiotechniques8404407等が含まれる。改変は、二重鎖ジデオキシDNA配列決定により確かめることができる。本発明の単離された核酸を、少なくとも1つのCD20特異的抗体またはその断片もしくは特定の変異体を生成するために使用することができ、これを用いて細胞、組織、器官または動物哺乳類およびヒトを含むで測定し、または効果を及ぼして、限定されないが、免疫性の障害もしくは疾患、心血管系の障害もしくは疾患、感染性で悪性、且つ/または神経性の障害もしくは疾患、あるいは他の既知のまたは特定の抗原関連疾患の少なくとも1つから選択される少なくとも1つの状態を、診断、管理、調節、治療、緩和させ、その発生の予防を助け、またはその症状を低減することができる。重要な事に、CD20等のヒトタンパク質またはその断片に特異的なヒト型に設計された抗体humanengineeredantibodyは、他の免疫原性抗原またはアイソフォーム、例えば、CD20タンパク質および/またはその一部合成ペプチド等の合成分子を含む、あるいは、CD56、ヒト上皮成長因子受容体HER1、IgE、血管内皮増殖因子、HER二量化阻害剤、Bcl-2ファミリータンパク質、MET、IL-13、IFNα、EGFL7、CD40、DR4およびDR5、PI3キナ-ゼ、リンホトキシンα、β7インテグリン、アミロイドβ、CRIg、TNF、補体C5、CBL、CD147、IL-8、gp120、VLA-4、CD11a、CD18、VEGF、CD40L、Id、ICAM-1、CD2、EGFR、TGF-β、TNF-α、E-セレクチン、FactVII、TNF、Her2/neu、Fgp、CD11/18、CD14、ICAM-3、CD80、CD40L、CD4、CD23、β2-インテグリン、α4β7、CD52、HLADR、CD22、CD64FcR、TCRαβ、CD2、CD3、HepB、CA125、EpCAM、gp120、CMV、gpIIbIIIa、IgE、IL-5、IL-4、CD25、CD3、CD33、CD30、CD19、CD22、CD28、CD36、CD37、CD44、CD55、CD59、CD70、CD79、CD80、CD103、CD134、CD137、CD138、CD152、HLA、VNRインテグリン、CD25、IL-23およびIL-12等の抗原のいずれか1つまたは組み合わせに対して設計され得る。抗体産生抗CD20抗体等の、本発明の少なくとも1つの抗原特異的抗体は、該技術分野において周知のように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞または不死化細胞のクローン集団によって、所望により産生され得る。例えば、AusubeletaledCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsIncNYNYSambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual2ndEditionColdSpringHarborNYHarlowandLaneAntibodiesaLaboratoryManualColdSpringHarborNYColliganetaledsCurrentProtocolsinImmunologyJohnWileySonsIncNYColliganetalCurrentProtocolsinProteinScienceJohnWileySonsNYNYを参照されたい。一つのアプローチにおいて、ハイブリドーマは、好適な不死化細胞株例えば、骨髄腫細胞株、例えば、限定されないが、Sp2/0、Sp2/0-AG14、NS0、NS1、NS2、AE-1、L.5、L243、P3X63Ag8.653、Sp2SA3、Sp2MAI、Sp2SS1、Sp2SA5、U937、MLA144、ACTIV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH3T3、HL-60、MLA144、NAMALWA、NEURO2A等、またはヘテロ骨髄腫heteromyloma、それらの融合産物、またはそれらに由来するあらゆる細胞もしくは融合細胞、または該技術分野において周知の他の好適なあらゆる細胞株例えば、wwwatccorg、wwwlifetechcom等を参照されたいを、抗体産生細胞、例えば、限定されないが、単離またはクローン化された脾臓、末梢血、リンパ液、扁桃腺、または他の免疫もしくはB細胞含有細胞、またはあらゆる他の細胞と、融合することにより作成され、ここで該抗体産生細胞は、重鎖または軽鎖の定常もしくは可変またはフレームワークもしくはCDR配列を、内因性核酸または異種核酸のいずれかとして、組換え体または内因性の、ウイルスの、細菌の、藻類の、原核生物の、両生類の、昆虫の、爬虫類の、魚類の、哺乳類の、げっ歯類の、ウマの、ヒツジのovine、ヤギの、ヒツジのsheep、霊長類の、真核生物の、ゲノムDNA、cDNA、rDNA、ミトコンドリアDNAもしくはRNA、葉緑体DNAもしくはRNA、hnRNA、mRNA、tRNAの、一本鎖、二本鎖もしくは三重鎖、ハイブリダイズされたもの等またはこれらのあらゆる組み合わせとして、発現する、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、AusubelsupraandColliganImmunologysuprachapter2を参照されたい。抗体産生細胞は、目的の抗原の免疫があるヒトまたは他の好適な動物の、末梢血から、または、好ましくは脾臓もしくはリンパ節から得ることもできる。他のいかなる好適な宿主細胞も、本発明の抗体、その特定の断片または変異体をコードする異種または内因性の核酸を発現するために使用することができる。融合細胞ハイブリドーマまたは組換え細胞は、選択的培養条件または他の好適な既知の方法を用いて単離され、限界希釈または細胞選別、または他の既知の方法によってクローン化することができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、好適なアッセイ例えば、ELISA、より具体的にはCD20ELISAにより選択することができる。ヒト抗原特異的抗体は、本明細書に記載のおよび/または該技術分野において周知のヒト抗体のレパートリーを産生できる遺伝子導入動物例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類等の免疫化によりさらに生成され得る。抗原特異的抗体を産生する細胞は、該動物から単離し、本明細書に記載される方法等の適切な方法を用いて不死化することができる。CD20等のヒト抗原に結合するヒト抗体のレパートリーを産生できる遺伝子導入マウスは、既知の方法により作成できる例えば、限定されないが、Lonbergらに対し公布された米国特許第5,770,428号、同第5,569,825号、同第5,545,806号、同第5,625,126号、同第5,625,825号、同第5,633,425号、同第5,661,016号および同第5,789,650号;Jakobovitsらによる国際公開第98/50433号、Jakobovitsらによる国際公開第98/24893号、Lonbergらによる国際公開第98/24884号、Lonbergらによる国際公開第97/13852号、Lonbergらによる国際公開第94/25585号、Kucherlapateらによる国際公開第96/34096号、Kucherlapateらによる欧州特許第0463151B1号、Kucherlapateらによる欧州特許第0710719A1号、Suraniらによる米国特許第5,545,807号、Bruggemannらによる国際公開第90/04036号、Bruggemannらによる欧州特許第0438474B1号、Lonbergらによる欧州特許第0814259A2号、Lonbergらによる英国特許第2272440A号、Lonbergら、Nature368856859、Taylorら、IntImmunol6579591、Greenら、NatureGenetics71321、Mendezら、NatureGenetics15146156、Taylorら、NucleicAcidsResearch2062876295、Tuaillonら、ProcNatlAcadSciUSA9037203724、Lonbergら、IntRevImmunol136593およびFishwaldら、NatBiotechnol14845851、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。一般的に、これらのマウスは、官能基が転移した、または官能基転移することができる少なくとも1つのヒト免疫グロブリン遺伝子座からのDNAを含む少なくとも1つの導入遺伝子を含む。そのようなマウスにおける内因性の免疫グロブリン遺伝子座を、破壊または欠失することで、該動物が内在性遺伝子によりコードされる抗体を産生する能力を失わせることができる。類似タンパク質または断片に対して特異的に結合する抗体をスクリーニングすることは、ペプチドディスプレイライブラリー、ファージディスプレイおよび他の既知の方法を用いて好都合に達成され得る。ペプチドディスプレイ法には、所望の機能または構造を有する個々のメンバーを得るために膨大なペプチドをスクリーニングすることが含まれる。ペプチドディスプレイライブラリーの抗体スクリーニングは該技術分野において周知である。提示されるペプチド配列は、3~5000またはそれ以上のアミノ酸長であり、しばしば5~100のアミノ酸長、たびたび約8~25アミノ酸長であり得る。ペプチドライブラリーを作成するための直接的な化学合成法に加えて、いくつかの組換えDNA方法が記載されている。ある種類は、バクテリオファージまたは細胞の表面にペプチド配列を提示することを含む。各バクテリオファージまたは細胞は、特定の提示されたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような方法は、PCT国際公開第91/17271号、同第91/18980号、同第91/19818号、および同第93/08278号に記載される。ペプチドのライブラリを作成するための他の系は、invitroにおける化学合成および組換え方法recombinantmethodの両方の態様を有する。これらの系の例は、例えば、PCT国際公開第92/05258号、同第92/14843号、および同第96/19256号に記載される。また、米国特許第5,658,754号;および同第5,643,768号も参照されたい。ペプチドディスプレイライブラリー、ベクター、およびスクリーニングのキットは、インビトロジェン社カリフォルニア州カールズバッド、およびケンブリッジアンチボディテクノロジー社CambridgeAntibodyTechnologies英国、ケンブリッジシャーのような供給業者から市販されている。これらの系の例は、例えば、Enzonに譲渡された米国特許第4,704,692号;同第4,939,666号;同第4,946,778号;同第5,260,203号;同第5,455,030号;同第5,518,889号;同第5,534,621号;同第5,656,730号;同第5,763,733号;同第5,767,260号;同第5,856,456号;Dyaxに譲渡された米国特許第5,223,409号;同第5,403,484号;同第5,571,698号;同第5,837,500号;Affymaxに譲渡された米国特許第5,427,908号;同第5,580,717号;ケンブリッジアンチボディテクノロジー社CambridgeAntibodyTechnologiesに譲渡された米国特許第5,885,793号;ジェネンテック社に譲渡された米国特許第5,750,373号;Xomaらに譲渡された米国特許第5,618,920号;同第5,595,898号;同第5,576,195号;同第5,698,435号;同第5,693,493号;同第5,698,417号;およびSambrook、上記、に記載されている。また、本発明のCD20抗体は、少なくとも1つの抗原特異的抗体をコードする核酸を用いて調製することができ、乳汁中に該抗体を生産するヤギ、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ等の遺伝子導入動物または哺乳類を提供する。そのような動物は既知の方法を用いて供給され得る。このような方法の例は、例えば、限定されないが、米国特許第5,827,690号;同第5,849,992号;同第4,873,316号;同第5,849,992号;同第5,994,616号;同第5,565,362号;同第5,304,489号等に記載される。本明細書で参照される各引用は、その全体が参照により組み込まれる。さらに、本発明の抗CD20抗体は、少なくとも1つの抗原特異的抗体をコードする核酸を用いて調製することができ、植物の一部または該植物から培養された細胞において該抗体、特定部分または変異体を産生する遺伝子導入植物および培養植物細胞例えば、限定されないが、タバコおよびトウモロコシを提供する。非制限的な例として、組換えタンパク質を発現する遺伝子導入したタバコの葉は、例えば、誘導プロモーターを用いて、大量の組換えタンパク質を生産するのに首尾よく使用される。例えば、CrameretalCurrTopMicrobolImmunol24095118およびその引用文献を参照されたい。また、遺伝子導入トウモロコシは、他の組換え系で産生されるタンパク質または天然源から精製されるタンパク質と同等の生物活性を有する哺乳類のタンパク質を、商業生産レベルで発現するのに用いられる。例えば、HoodetalAdvExpMedBiol464127147およびその引用文献を参照されたい。抗体一本鎖抗体ScFv等の抗体断片を含むは、タバコの種およびジャガイモの塊茎を含む遺伝子導入植物の種から大量に生産される。例えば、ConradetalPlantMolBiol38101109およびその引用文献を参照されたい。従って、本発明のCD20抗体は、遺伝子導入植物を用いて、既知の方法に従って生成される。また、例えば、FischeretalBiotechnolApplBiochem3099108MaetalTrendsBiotechnol135227MaetalPlantPhysiol1093416WhitelametalBiochemSocTrans22940944;およびその引用文献を参照されたい。抗体の設計、ヒト化および再表面化非ヒトまたはヒト抗体を設計する、ヒト化するまたは再表面化するための方法も用いることができ、該技術分野において周知である。ヒト化された、再表面化されたまたは同じように設計された抗体engineeredantibodyは、非ヒト、例えば、制限されないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類または他の哺乳動物であるソース由来の1つまたは複数のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば移入残基と称される残基によって置換され、該残基は、典型的には既知のヒト配列の移入可変領域、定常領域または他の領域から得られる。既知のヒトIg配列は、例えば、wwwncbinlmnihgoventrezqueryfcgiwwwncbinihgovigblastwwwatccorgphagehdbhtmlwwwmrccpecamacukALIGNMENTSphpwwwkabatdatabasecomtophtmlftpncbinihgovrepositorykabatwwwsciquestcomwwwabcamcomwwwantibodyresourcecomonlinecomphtmlwwwpubliciastateeduaboutpedroresearchtoolshtmlwwwwhfreemancomimmunologyCH05kuby05htmwwwhhmiorggrantslectures1996vlabwwwpathcamacukaboutmrc7mikeimageshtmlmcbharvardeduBioLinksImmunologyhtmlwwwimmunologylinkcompathboxwustleduabouthcenterindexhtmlwwwappliedbiosystemscomwwwnalusdagovawicpubsantibodywwwmehimeuacjpaboutyasuhitoElisahtmlwwwbiodesigncomwwwcancerresearchukorgwwwbiotechufleduwwwisacnetorgbaservucikunnlaboutjraatslinks1htmlwwwrecabunihddeimmunobmenwueduwwwmrccpecamacukwwwibtunammxvirVmicehtmlhttpwwwbioinforgukabsantibodybathacukwwwunizhchwwwcrystbbkacukaboutubcg07swwwnimrmrcacukCCccaewgccaewghtmlwwwpathcamacukaboutmrc7humanisationTAHHPhtmlwwwibtunammxvirstructurestataimhtmlwwwbioscimissouriedusmithgpindexhtmlwwwjerinideKabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterestUSDeptHealthに開示されており、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような移入された配列は、免疫原性を減少させるのにまたは結合、親和性、オン率、オフ率、結合活性、特異性、半減期、もしくは該技術分野において周知の他のあらゆる適切な特性を減少、増強もしくは改変するのに用いられ得る。一般的に、CDR残基は、直接的に且つほとんど実質的に、CD20結合への影響に関与している。従って、可変領域および定常領域の非ヒト配列はヒトまたは他のアミノ酸で置換され得るが、一部または全ての非ヒトまたはヒトCDR配列が保持される。また、抗原CD20に対する高い親和性および他の有益な生物学的性質を保持したまま、抗体は、所望によりヒト化、再表面化、設計され、つまりヒト抗体が設計され得る。この目的を達成するために、ヒト化されたまたはヒトまたは設計された抗CD20抗体および再表面化された抗体は、親配列、設計された配列、およびヒト化された配列の3次元モデルを用いた、親配列および種々の概念的なヒト化された産物および設計された産物の分析方法によって、所望により調製され得る。3次元的な免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された対象免疫グロブリン配列の推定3次元的立体配座構造を説明および提示するコンピュータープログラムが利用可能である。このような提示物を調べることにより、対象免疫グロブリン配列の機能における残基の推定機能の分析、すなわち、対象免疫グロブリンがCD20等の抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このような方法で、標的抗原に対する向上した親和性等の所望の抗体特性が達成されるように、コンセンサス配列およびインポート配列から、フレームワークFR残基を選択し組み合わせることができる。本発明の抗体のヒト化、再表面化または設計は、あらゆる既知の方法を用いて実効することができ、例えば、限定されないが、WinterRiechmannetalNature332323VerhoeyenetalScience2391534SimsetalJImmunol1512296ChothiaandLeskJMolBiol196901CarteretalProcNatlAcadSciUSA894285PrestaetalJImmunol1512623、米国特許第5639641号、同第5723323号;同第5976862号;同第5824514号;同第5817483号;同第5814476号;同第5763192号;同第5723323号;同第5766886号;同第5714352号;同第6204023号;同第6180370号;同第5693762号;同第5530101号;同第5585089号;同第5225539号;同第4816567号;国際出願PCT/:US98/16280号;同第US96/18978号;同第US91/09630号;同第US91/05939号;同第US94/01234号;同第GB89/01334号;同第GB91/01134号;同第GB92/01755号;国際公開第90/14443号;国際公開第90/14424号;国際公開第90/14430号;欧州特許第229246号;同第7557189号;同第7538195号;および同第7342110号に記載され、そのそれぞれの全体が、その引用文献を含めて、参照により本明細書に組み込まれる。Fc領域ある態様では、抗体は変化した例えば、変異したFc領域を含む。例えば、いくつかの態様では、Fc領域は抗体のエフェクター機能を減少または増強するために変化されている。いくつかの態様では、Fc領域はIgM、IgA、IgG、IgE、または他のアイソタイプから選択されるアイソタイプである。あるいは、または、さらに、アミノ酸改変と、抗原結合分子のFc領域のC1q結合および/または補体依存性細胞傷害CDC機能を変化させる1つまたは複数のさらなるアミノ酸改変とを組み合わせることは有用であり得る。とくに重要な出発ポリペプチドは、C1qに結合し、補体依存性細胞傷害を示すものであり得る。既存のC1q結合活性を有し、所望によりCDC仲介能をさらに有するポリペプチドは、それらの活性うちの一方または両方が増強されるように改変され得る。C1qを変化させるおよび/または補体依存性細胞傷害機能を改変するアミノ酸改変は、例えば、国際公開第0042072号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。変化したエフェクター機能をもつ本発明の抗体のFc領域は、例えば、C1q結合および/またはFcγR結合を改変することなどにより設計することができ、それによって、CDC活性および/またはADCC活性を変化させることができる。エフェクター機能は、生物活性例えば、対象においてを活性化または減少させる原因である。エフェクター機能の例としては、C1q結合;補体依存性細胞傷害CDC;Fc受容体結合;抗体依存性細胞傷害ADCC;食作用;細胞表面受容体の下方制御例えば、B細胞受容体;BCR等が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなエフェクター機能は、Fc領域が結合ドメイン例えば、抗体可変領域と結合していることを要することがあり、多彩なアッセイ例えば、Fc結合アッセイ、ADCCアッセイ、CDCアッセイ、等を使用して評価することができる。例えば、改善されたC1q結合および改善されたFcγRIII結合例えば、改善されたADCC活性および改善されたCDC活性の両方を有するをもつ、操作された抗CD20抗体の変異型Fc領域を産生することができる。あるいは、もしエフェクター機能の減少または除去が望まれるならば、減少したCDC活性および/または減少したADCC活性を持つよう変異型Fc領域を操作することができる。他の態様において、これらの活性のうち1つだけを増加させることができ、また所望により、他の活性を減少させることもできる例えば、改善されたADCC活性をもつが減少したCDC活性を持つFc領域変異体を生成するために、また逆の場合も同様に。例示的なFc突然変異体は、ADCCが強化され、CDC活性が減少している、S239D、A330L、およびI332DEU番号システム3残基の変化である。そのような突然変異体を設計するための非限定的な方法が、例えば、Lazaretal40054010andOkazakietal123949に記載されている。また、国際公開第03/074679号、同第2004/029207号、同第2004/099249号、同第2006/047350号、同第2006/019447号、同第2006/105338号、同第2007/041635号も参照のこと。Fc突然変異を、操作された抗体に導入することにより、新生児期のFc受容体FcRnとの相互作用を変化させ、薬物速度論的特性を改善することもできる。FcRnに対する改善された結合をもつヒトFc変異体に関する一連の記載には、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Shieldsetal2001HighresolutionmappingofthebindingsiteonhumanIgG1forFcγRIFcγRIIFcγRIIIandFcRnanddesignofIgG1variantswithimprovedbindingtotheFcγRJBiolChem27665916604が含まれる。アミノ酸置換のもう1つ型は、抗体のFc領域のグリコシル化パターンを変化させる役割を果たす。Fc領域のグリコシル化は、典型的には、N-結合型またはO-結合型のどちらかである。N-結合型は一般的には、炭水化物部分とアスパラギン残基の側鎖の結合を表す。炭水化物部分のアスパラギン側鎖ペプチド配列との酵素結合のための認識配列は、Xがプロリン以外のいずれかのアミノ酸である、アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-トレオニンである。このように、ポリペプチド中のこれらのペプチド配列のどちらかの存在が、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。O-結合型グリコシル化は、一般的には、糖類N-アセイルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの1つと、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンの結合を表すが、5-ヒドロキプロリンまたは5-ヒドロキシリジンも使用することができる。抗体又はその断片のグリコシル化パターンは、例えば、ポリペプチド中にある1つまたは複数のグリコシル化部位を除去することにより、および/または、ポリペプチド中には存在しない1つまたは複数のグリコシル化部位を付加することにより、変化させることができる。抗体または抗体断片のFc領域中のグリコシル化部位の除去は、1つまたは複数の上述のトリペプチド配列N-結合型グリコシル化部位を取り除くように、アミノ酸配列を変化させることにより、都合よく達成することができる。例示的なグリコシル化変異体は、重鎖の残基N297~A297EU番号システムのアミノ酸置換を有する。O-結合型グリコシル化部位の除去は、1つまたは複数のグリコシル化されたセリンまたはトレオニン残基の、セリンまたはトレオニン以外のいかなるアミノ酸による置換によっても、達成することができる。抗体がFc領域を含む場合、そこに結合した炭水化物を変化させることができる。例えば、抗体のFc領域に結合したフコースを欠く、成熟炭水化物構造をもつ抗体が、例えば、米国特許出願第2003/0157108号Presta、Lおよび同第2004/0093621号に記載されている。抗体のFc領域に結合した炭水化物中の、2分N-アセチルグロコサミンGlcNAcをもつ抗体が、例えば、国際公開第2003/011878号、JeanMairetetalおよび米国特許第6602684号、Umanaetalに参照されている。抗体のFc領域に結合したオリゴ糖中の少なくとも1つのガラクトース残基を持つ抗体が、例えば、国際公開第1997/30087号、Pateletalに報告されている。また、Fc領域に結合した、変化した炭水化物を持つ抗体に関する、国際公開第1998/58964号および国際公開第1999/22764号Raju、Sも参照のこと。また、例えば、変化したグリコシル化をもつ抗原結合部位分子に関する、米国特許出願第2005/0123546号Umanaetalも参照のこと。ある態様において、グリコシル化変異体は、Fc領域に結合した炭水化物構造がフコースを欠く、Fc領域を含む。このような変異体は、改善されたADCC機能を有する。脱フコシル化されたまたはフコース欠損抗体に関する文献の例としては、米国特許出願第2003/0157108号;国際公開第2000/61739号;同第2001/29246号;米国特許出願第2003/0115614号;同第US2002/0164328号;同第2004/0093621号;同第2004/0132140号;同第2004/0110704号;同第2004/0110282号;同第2004/0109865号;国際公開第2003/085119号;同第2003/084570号;同第2005/035586号;同第2005/035778号;同第2005/053742号;OkazakietalJMolBiol33612391249YamaneOhnukietalBiotechBioeng87614が挙げられる。脱フコシル化された抗体を産生する細胞株の非限定的な例としては、タンパク質フコシル化が欠損しているLec13CHO細胞;米国特許出願第2003/0157108号AI、Presta、Lおよび国際公開第2004/056312号AI、Adamsetal、特に実施例11において、アルファ-1,6-フコシル基転移酵素遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞などのノックアウト細胞株YamaneOhnukietalBiotechBioeng87614、および、細胞培地中での、例えばカスタノスペルミンなどのフコシル化経路阻害剤の使用によるもの米国特許出願第2009/0041765号などが挙げられる。ある態様において、本発明の抗体は、GnTIIIが、ヒト型に設計されたhumanengineered抗原特異的抗体にGlcNAcを付加するように、ベータ1,4-N-アセチルグルコサミン転移酵素IIIGnTIIIを発現する細胞に発現する。そのような様式で抗体を産生する方法が、国際公開第/9954342号、同第/03011878号、特許出願公開第20030003097A1号、およびUmanaetalNatureBiotechnology17176180February1999に記載されている。抗体親和性本発明の抗体は、ヒトCD20と広範囲の親和性KDで結合する。好ましい態様において、本発明の少なくとも1つのモノクローナル抗体は、所望により、ヒト抗原と高い親和性で結合することができる。例えば、ヒトの、または操作されたヒトの、またはヒト化された、または再表面化したモノクローナル抗体は、当業者によって実施される、酵素免疫測定法ELISA、表面プラズモン共鳴法SPRまたはKinExA登録商標法によって決定されるとおり、ヒト抗原を約10-7M以下のKD、限定されないが、例えば、0.1~9.9またはその中のあらゆる範囲または値x10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15またはその中のあらゆる範囲または値によって結合することができる。抗CD20抗体は、約10-9Mまたは未満、より具体的には約10-9~10-10MのKdで結合する。抗原に対する抗体の親和性または結合活性は、例えば酵素免疫測定法ELISA、または放射免疫測定法RIA、または速度法kinetics例えば、BIACORE商標分析などの、該技術分野において周知のあらゆる適切な方法を使用することによって、実験的に決定される。直接結合アッセイ並びに競合結合アッセイ型式は、容易に使用することができる。例えば、BerzofskyetalAntibodyAntigenInteractionsInFundamentalImmunologyPaulWEEdRavenPressNewYorkNYKubyJanisImmunologyWHFreemanandCompanyNewYorkNY;および本明細書に記載の方法を参照のこと。もし異なる条件下で測定される場合は、特定の抗体-抗原相互作用の親和性測定値は変動し得る例えば、塩分濃度、pH、温度など。従って、親和性測定値および他の抗原結合部位パラメータ例えば、KDまたはKd、Kon、Koffは、本明細書に記載の緩衝液のように、該技術分野において周知の、標準化された抗体および抗原の溶液、および標準化された緩衝液を使用して得ることが好ましい。1つの態様において、結合アッセイは、酵素免疫測定法例えば、ELISAとCD20抗原を使用することにより実施できる。例えば、CD20を発現しているB細胞株または組み換え型タンパク質から調製された未精製の細胞可溶化物は、本明細書に記載のCD20抗原の原料として使用することができる。そのようなCD20抗原標本を、50mM炭酸ナトリウムpH9.6中のImmulon2HBプレート上に、100μL/ウェルで、4°Cで約18~24時間コーティングする。プレートを洗浄緩衝液TBS中の0.1トウィーン-20、pH7.4で洗う。次いで、プレートをTBSpH7.4中の1カゼインを用いて、1時間室温でブロックする。プレートに抗体の段階希釈を加え、約3時間室温でインキュベートし、次いで前述と同様に洗浄する。検出のために、HRP結合ヤギ-抗ヒトまたはヤギ-抗マウス抗体を二次抗体として添加し、1時間室温でインキュベートさせておく。プレートを前述と同様に洗浄し、100μL/ウェルのTMB1基質BioFXを添加して発色させる。約20分間後、100μL/ウェルの450nm反応停止試薬BioFXで、反応を停止させる。450nmでの吸光度を読み取り、それぞれの抗体の抗体濃度に対してプロットする。S字形の用量反応曲線を結合曲線に当てはめ、GraphPadPrismv4などのプログラムで初期状態のパラメータを用いて、EC50値を算出するグラフパッドソフトウェア社GraphPadsoftwareカリフォルニア州、サンディエゴ。EC50値は、それぞれの抗体に対する明白な解離定数KdまたはKDの尺度として使用することができる。ペプチドまたはポリペプチド配列に関するアミノ酸配列同一性は、配列のアライメント、および必要に応じて最大配列同一性を達成するためのギャップ導入の後の、また配列相同性の一部としての保存的置換を全く考慮しない、特定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとしても定義される。アミノ酸配列同一性を決定するためのアライメントは、該技術分野の範囲内の多彩な方法、例えば、本明細書に記載される、BLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalignDNAスター社DNASTARソフトウェアなどの一般に入手できるコンピューターソフトウェアを使用したものなどによって達成することができる。当業者は、比較する配列の完全長にわたる最大のアライメントを達成するのに必要なアルゴリズムを含む、アライメント測定のための適切なパラメーターを決定することができる。ALIGN-2が入手可能でアミノ酸配列比較のために使用できる場合、特定のアミノ酸配列Aの、特定のアミノ酸配列Bとの、またはBに対するアミノ酸配列同一性あるいは、特定のアミノ酸配列Bとの、または、Bに対するあるアミノ酸配列同一性を有する、または含む、特定のアミノ酸配列A、とも表現し得るは、分数X/Yを100倍することにより算出する。ここで、Xは、配列アライメントプログラムALIGN-2によって、そのプログラムのAおよびBのアライメントにおいて同一の一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、およびYはBにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと同じでない場合、AのBに対するアミノ酸配列同一性は、BのAに対するアミノ酸配列同一性と等しくはならないことが理解されよう。望ましくは、2つ以上のアミノ酸配列は、少なくとも50、60、70、80、または90同一である。より望ましくは、2つ以上のアミノ酸配列は、少なくとも95、96、97、98、99、または100同一である。特に断りがない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性の値は、直前の段落で記載した通り、例えば、ALIGN-2またはBLASTコンピューターを使用して得た。抗体の使用一般的に、本発明の方法および組成物における有用な抗原特異的抗体のいくつかの形態は、所望により抗原に対する高い親和性結合を特徴とし得、また所望によりかつ好ましくは、レシピエントにおいて低い毒性および悪影響を有することを特徴とし得る。特に、可変領域、定常領域、およびフレームワークなどの個々の成分が、個々におよび/または集合的に、所望によりおよび好ましくは低い免疫原性を持つ、本発明の抗体、指定の断片または変異体は、本発明において有用である。本発明において使用し得る抗体は、所望により、長期間にわたって患者を治療し測定可能な症状軽減をもたらす能力、および、低いおよび/または許容できる毒性を特徴とする。低いまたは許容できる免疫原性および/または高い親和性、並びに他の適切な特性は、達成される治療結果に貢献し得る。低免疫原性は、本明細書において、治療された患者の25未満において、好ましくは、治療期間の間推奨される容量と推奨される治療経過によって治療された患者の10未満において発生する、抗体治療を受けている患者における抗原に対する抗体の少なくとも滴定可能なレベルの発生率として定義される。本発明の単離された核酸は、その少なくとも1つのCD20特異的抗体断片または指定されたその変異体を産生するために使用することができ、これらを用いて細胞、組織、器官または動物哺乳類とヒトを含むにおいて測定しまたは影響を及ぼし、限定されないが、少なくとも1つの免疫不全または免疫疾患、心血管障害または心血管疾患、感染性の、悪性の、および/または神経性の障害または疾患、または他の既知のまたは指定の抗原関連疾患から選択される少なくとも一つの症状の、診断、モニタリング、調節、治療、緩和、発生予防を助ける、または症状の軽減をすることができる。そのような方法は、抗CD20抗体または断片などの少なくとも1つの抗原特異的抗体を含む有効量の組成物または医薬組成物を、そのような調節、治療、緩和、予防、または症状、影響、または機構の軽減を必要としている、細胞、組織、器官、動物または患者に投与することを含み得る。有効量は、また本明細書に記載されるまたは関連技術において公知である、既知の方法を使用して実施および決定される通り、単一例えば、大量瞬時投与、複数、または継続投与あたり、または単一、複数、または継続投与あたり約0.01~5000μg/mlの血清濃度を達成するために、約0.001~500mg/kgの量、またはその中のあらゆる有効な範囲または値を含み得る。例示的な抗体本発明の好ましい抗原特異的CD20抗体は、示される配列を有する。例えば、本発明の抗原特異的抗体は、表1すなわち、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3に示される軽鎖CDR配列の1つ、および/または表1すなわち、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3に示される重鎖CDR配列の1つを含む。より具体的には、抗CD20-6抗体は、配列番号25のCDRL1、配列番号26のCDRL2、配列番号27のCDRL3、配列番号28のCDRH1、配列番号29のCDRH2、配列番号30のCDRH3を有する。また、抗CD20-7抗体は、配列番号17のCDRL1、配列番号18のCDRL2、配列番号19のCDRL3、配列番号20のCDRH1、配列番号21のCDRH2、配列番号22のCDRH3を有する。本発明例示的な態様には以下が含まれる。マウスアミノ酸配列muCD20-7LCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLELMRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC[配列番号1];muCD20-7LC可変領域DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEADDIATYFCQQSYEDPFTFGAGTKLELMR[配列番号32]muCD20-7HCQLQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK[配列番号2];muCD20-7HC可変領域QLQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS[配列番号34]muCD20-6LCDIVLTQSPASLAVSLGQRAIISCRASESVDNFGNSFMHWYQQKPGQPPTLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTVNPVEADDIATYYCQQSYEDPFTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC[配列番号3];muCD20-6LC可変領域DIVLTQSPASLAVSLGQRAIISCRASESVDNFGNSFMHWYQQKPGQPPTLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTVNPVEADDIATYYCQQSYEDPFTFGAGTKLELKR[配列番号46]muCD20-6HCQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEPAYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK[配列番号4];muCD20-6HC可変領域QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYKFTNVGMNWVKQVPGKGLKWMGWINTYTGEPAYADDFKGRFVFSLETSASAAFLQINNLKNEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS[配列番号47]ヒト化アミノ酸配列huCD20-7LCv1.0DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEANDIATYFCQQSYEDPFTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[配列番号5];huCD20-7LCv1.0可変領域DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASGSVDSFGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGGGSRTDFTLTINPVEANDIATYFCQQSYEDPFTFGQGTKLELKR[配列番号33]huCD20-7HCv1.0ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[配列番号6];huCD20-7HCv1.0可変領域ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS[配列番号35]huCD20-7HCv1.1ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[配列番号7];huCD20-7HCv1.1可変領域ELQLVQSGGELKKPGETVRISCAASGYSFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYAAPFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKTEDTATYFCARGAYYRYDLGMDYWGQGTSVTVSS[配列番号36]マウス可変領域DNA配列muCD20-7LCgatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatatcctgcagagccagtggaagtgttgatagttttggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcggtgggtctaggacagacttcaccctcaccattaatcctgtggaagctgatgatattgcaacctatttctgtcagcaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgatgcgg[配列番号8];muCD20-7HCcagctccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtatagtttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccatcttatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcagcaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtacgacttaggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca[配列番号9];muCD20-6LCgatattgtgctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctttagggcagagggccattatatcctgcagagccagtgaaagtgttgataattttggcaatagctttatgcactggtaccagcagaagccaggacagccacccacactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgccaggttcagtggcagtgggtctaggacagacttcaccctcaccgttaatcctgtggaggctgatgatattgcaacttattactgtcaacaaagttatgaggatccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgg[配列番号10];muCD20-6HCcagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataaattcacaaacgttggaatgaactgggtgaagcaggttccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccagcatatgctgatgacttcaagggacggtttgtcttttctttggaaacctctgccagcgctgcctttttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcaaggggggcctactataggtatgacttaggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca[配列番号11];ヒト化およびキメラの可変領域DNA配列huCD20-7LCv1.0gaattcgccaccatgggctggagctgtattattctgttcctggtagcaaccgctacaggtgtacactccgatattgttcttacccaaagcccagcctccctcgctgtcagtccaggccagcgagccactatctcctgccgtgcaagtggatctgtcgacagctttggaaatagcttcatgcactggtaccagcagaagcctggtcagcccccaaaactcctgatttatcgggcttccaatctggagtcaggagtgcccgcaaggttctctggcgggggcagccggacagatttcacattgactataaatcccgtggaggctaacgatatcgcaacatacttctgtcagcagtcttatgaggaccccttcacattcggccagggcacaaagctggagctcaaacgtacg[配列番号12];huCD20-7HCv1.0aagcttgccaccatgggatggagttgcatcatcctgttcctcgtcgcaaccgcaacaggggtgcattccgaactgcagctggtccagtctggtggtgagttgaagaaaccaggggaaacagttcgcattagctgtgctgcaagcggctatacattcacaaattatggaatgaattgggtgaaacaggcccccggcaagggcctgaagtggatgggctggataaatacctatactggagagcctagttacgccgctcccttcaaggggcggtttgccttctctcttgagacaagtgccagcaccgcctatttgcagatttctagtttgaaaaccgaagacacagctacatacttctgcgcccgcggcgcatattacagatatgatctggggatggactattggggccagggtacctccgtgaccgtatcatccgcctccacaaagggccc[配列番号13];huCD20-7HCv1.1aagcttgccaccatgggttggtcttgcatcattctgtttctggtagcaactgcaactggagtgcacagcgagctgcaactcgtccagagcggaggtgagcttaagaagccaggagagaccgtgcgaatctcttgcgccgcatccggctactctttcacaaattacggaatgaattgggtcaagcaggcaccaggtaagggactcaaatggatgggctggatcaatacctacaccggcgagcctagttatgccgcacccttcaagggtcgatttgcattcagcctggagaccagtgcttctacagcttatttgcagatcagctctctgaagaccgaggacacagctacatacttctgcgcccgtggtgcctactaccgatacgatctgggcatggactattggggccaaggcacctcagtgactgtgtcttcagcatcaaccaagggccc[配列番号14];chCD20-7LCgaattcgccaccatggggtggtcatgtatcatcctcttccttgtggcaaccgcaacaggcgtacactccgacattgtactgacccagtcacctgcctccctcgccgtatcccttgggcagagagccactattagttgcagggctagtggcagtgtcgattctttcggcaattcatttatgcactggtatcagcagaaaccagggcagccacccaagttgctcatataccgcgcctcaaaccttgagtccggggtcccagcccggttttccggaggcgggtcccgcaccgacttcaccctgacaatcaacccagtagaagcagatgatatcgctacttatttctgtcagcagagctatgaagacccttttacatttggggccggaaccaagttggagctcaagcgtacg[配列番号15];chCD20-7HCaagcttgccaccatgggatggagctgcatcattttgtttcttgtcgctaccgcaactggcgtccactcacagctgcagctggtgcagagtgggcctgagcttaagaaacccggtgagactgtgaagatctcatgtaaggctagcggctattcctttacaaattatggcatgaattgggtgaagcaggcccctgggaagggtctcaagtggatgggatggattaacacctatactggagagccttcatacgccgatgatttcaaagggaggttcgccttctccttggaaacctctgcttctactgcctaccttcagatttctaacctcaagaacgaggacactgcaacctatttttgcgctcgtggcgcatactatcgatatgatctgggcatggattattggggtcaaggcacatccgtaaccgtgtcctcagctagcactaagggccc[配列番号16];マウスおよびヒトのCD20-7再表面化CDR軽鎖CD20-7_LC_CDR1RASGSVDSFGNSFMH[配列番号:17];CD20-7_LC_CDR2RASNLES[配列番号18];CD20-7_LC_CDR3QQSYEDPFT[配列番号19];重鎖CD20-7_HC_CDR1NYGMN[配列番号20];CD20-7_HC_CDR2WINTYTGEPS[配列番号21];CD20-7_HC_CDR3GAYYRYDLGMDY[配列番号22];Kabatにより定義されたマウスおよびヒト化CD20-7HCCDR2マウスmuCD20-7_HC_KabCDR2WINTYTGEPSYADDFKG[配列番号23];ヒト化huCD20-7_HC_KabCDR2WINTYTGEPSYAAPFKG[配列番号24];マウスCD20-6CDR配列軽鎖CD20-6_LC_CDR1RASESVDNFGNSFMH[配列番号25];CD20-6_LC_CDR2RASNLES[配列番号26];CD20-6_LC_CDR3QQSYEDPFT[配列番号27];重鎖CD20-6_HC_CDR1NVGMN[配列番号28];CD20-6_HC_CDR2WINTYTGEPA[配列番号29];CD20-6_HC_CDR3GAYYRYDLGMDY[配列番号30];およびKabatにより定義されたHCCDR2CD20-6_HC_KabCDR2WINTYTGEPAYADDFKG[配列番号31]。当業者は、本応用における配列が、非限定的な例であることを理解する。機能的等価物、抗体変異体、および誘導体機能的等価物はさらに、全抗体またはインタクトな抗体のものと同じまたは匹敵する結合特性を持つ抗体の断片を含む。そのような断片は、Fab断片またはFab’2断片の1つまたは両方を含んでもよい。好ましくは、抗体断片は、完全抗体のすべての6つの相補性決定領域を含むことが望ましいが、完全抗体の6つの相補性決定領域のすべてよりもより少ない数、例えば1つ、2つ、3つ、4つ、5つのCDRを含む断片も、また機能的である。さらに、機能的等価物は、以下の免疫グロブリンクラス:IgG、IgM、IgA、IgD、またはIgE、およびそのサブクラスのいずれか1つのメンバー、またはそれらの組み合わせであってもよい。本発明のある態様において、抗CD20抗体を改変することにより融合タンパク質、すなわち、抗体、異種タンパク質に融合した断片、ポリペプチド、またはペプチドを産生することができる。ある態様において、抗CD20抗体の一部に融合したタンパク質は、ADEPTの酵素成分である。抗CD20抗体との融合タンパク質として操作され得る、他のタンパク質またはポリペプチドの例としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼI、ブドウ球菌腸毒素A、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、および緑膿菌内毒素などの毒素類が挙げられるが、これに限定されない。例えばPastanetalCell47641andGoldenbergetalCancerJournalforClinicians4443を参照のこと。使用し得る、酵素的に活性な毒素類およびその断片としては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖緑膿菌Pseudomonasaeruginosaから採取、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギAleuritesfordiiタンパク質、ジアンチンdianthinタンパク質、アメリカヤマゴボウPhytolacaamericanaタンパク質PAPI、PAPII、およびPAP-S、ニガウリmomordicacharantia阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウsapaonariaofficinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリンmitogellin、レストリクトシン、フェノマイシンphenomycin、エノマイシンenomycinおよびトリコセセンスtricothecenesが挙げられる。非限定的な例が、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられている、1993年10月28日に公開された国際公開第93/21232号に記載されている。さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および/またはコドンシャフリングまとめてDNAシャフリングと呼ぶ技術によって生成することができる。DNAシャフリングは、抗体またはその断片例えば、より高い親和性とより低い解離速度をもつ抗体、またはその断片の活性を変化させるために使用することができる。一般的には、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、米国特許第5,605,793号;同第5,811,238号;同第5,830,721号;同第5,834,252号;および同第5,837,458号、およびPattenetal1997CurrOpinionBiotechnol872433Harayama1998TrendsBiotechnol167682Hanssonetal1999JMolBiol28726576およびLorenzoおよびBlasco1998Biotechniques24308313を参照のこと。抗体はさらに、米国特許出願公開第20030118592号、同第200330133939号、およびPCT国際公開第02/056910号に記載される通り、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質であり得る。これら特許出願公開は、すべてLedbetterらにより、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。ドメイン抗体。本発明の組成物および方法の抗CD20抗体は、ドメイン抗体、例えば、ヒト抗体の重鎖VHまたは軽鎖VLの可変領域に対応する、抗体の小さな機能的結合単位を含む抗体であり得る。ドメイン抗体の例としては、治療標的に特異的な、ドマンティスリミテッド社DomantisLimited英国、ケンブリッジおよびドマンティスインク社DomantisInc.米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジより入手可能なものが挙げられるが、これらに限定されない例えば国際公開第04/058821号;同第04/003019号;米国特許第6,291,158号;同第6,582,915号;同第6,696,245号;および同第6,593,081号を参照のこと。市販されているドメイン抗体のライブラリを使用して、抗CD20ドメイン抗体を同定することができる。ある態様において、本発明の抗CD20抗体は、CD20機能的結合単位およびFcガンマ受容体機能的結合単位を含む。二重特異性抗体。二重特異性抗体という用語は、2つの抗原結合部位を持つ小さな抗体断片を表し、その断片は、同じポリペプチド鎖VH-VLの軽鎖可変領域VLに結合している重鎖可変領域VHを含む。同一鎖上で2つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、もう1つの鎖の相補的ドメインと強制的に対になり、2つの抗原結合部位を作る。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第404,097号;国際公開第93/11161号;および、HollingeretalProcNatlAcadSciUSA9064446448に、より詳細に記載されている。ワクチボディVaccibodies。本発明のある態様において、抗CD20抗体はワクチボディvaccibodiesである。ワクチボディVaccibodiesは、二量体ポリペプチドである。ワクチボディvaccibodyのそれぞれの単量体は、ヒンジ領域とCg3ドメインを介して第2scFvに結合しているAPC上の表面分子に特異性を持つscFvから成る。本発明の他の態様において、scFvの1つとして抗CD20抗体断片を含むワクチボディVaccibodiesを使用して、破壊しようとするB細胞と、ADCCを媒介するエフェクター細胞を並置することができる。例えば、Bogenらによる、米国特許出願公開第20040253238号を参照のこと。線状抗体。本発明のある態様において、抗CD20抗体は、線状抗体である。線状抗体は、一対の抗原結合部位領域を形成する、一対のタンデムFdセグメントVH-CH1-VH-CH1を含む。線状抗体は、二重特異性でも、単一特異性でもあってもよい。線状抗体の非限定的な例は、例えば、ZapataetalProteinEng810571062に開示されている。親抗体。本発明のある態様において、抗CD20抗体は親抗体である。親抗体は、本明細書に開示される変化した抗体/突然変異体抗体と比較して、1つまたは複数のその超可変領域中または隣接した領域において、1つまたは複数のアミノ酸残基が欠如または欠失しているアミノ酸配列を含む抗体である。従って、親抗体は、本明細書に開示される抗体突然変異体の対応する超可変領域より短い超可変領域を持つ。親ポリペプチドは未変性配列すなわち、天然の抗体天然の対立遺伝子変異型を含む、または天然配列に、既存のアミノ酸配列の改変他の挿入、欠失および/または置換などを持つ抗体を含んでもよい。好ましくは、親抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。抗体断片。抗体断片は、全長抗体の一部、一般的には、抗原結合性領域、またはその可変領域を含む。抗体断片の例としては、とりわけ、Fab、Fab’、Fab’2、およびFv断片;二重特異性抗体;線状抗体;単鎖抗体分子;および、抗体断片から形成された多選択性抗体などが挙げられる。従来は、インタクトな抗体をタンパク分解することにより断片を得ていた例えば、MorimotoetalJournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24107117およびBrennanetalScience22981を参照のこと。しかし現在は、組み換え型宿主細胞によって断片を直接産生することができる。例えば、本明細書で論じられているように、抗体断片を抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Fab’-SH断片を、大腸菌Ecoliから直接回収し、Fab’2断片を形成するように化学的に結合させることができる。。もう1つのアプローチによれば、Fab’2断片を、組み換え型宿主細胞を培養することにより、直接単離することもできる。本明細書の詳細な教示があれば、抗体断片を生成するための他の技術も、当業者には明らかである。他の態様において、好ましい抗体は単鎖Fv断片scFvである。例えば、国際公開第93/16185号を参照のこと。ある態様においては、抗体はFab断片ではない。二重特異性抗体。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、CD20の2つの異なるエピトープと結合し得る。他のそのような抗体は、CD20と結合し、さらに第二抗原とも結合し得る。あるいは、CD20結合アームは、標的への細胞防御機構に集中するために、T細胞受容体分子例えばCD2またはCD3などの白血球上のトリガー分子、またはIgGFcγRのためのFc受容体に結合するアームと結合し得る。二重特異性抗体は、細胞傷害性薬物を標的に局在化するためにも使用し得る。これらの抗体は、細胞マーカー結合アームおよび細胞傷害性薬物例えば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトラエキセートmetholaexate、または放射性同位元素ハプテンを結合するアームを持つ。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片例えば、Fab’:二重特異性抗体として調製し得る。二重特異性抗体を作製するための方法は、当分野において公知である。例えば、MillsteinetalNature305537539TrauneckeretalEMBOJ1036553659SureshetalMethodsinEnzymology121210KostelnyetalJImmunol14815471553HollingeretalProcNatlAcadSciUSA9064446448GruberetalJImmunol1525368米国特許第4474893号;同第4714681号;同第4925648号;同第5573920号;同第560181号;同第95731168号;同第4676980号;および同第4676980号、国際公開第94/04690号;同第91/00360号;同第92/200373号;同第93/17715号;同第92/08802号;欧州特許第03089号、および米国特許出願公開第2009/0048122号を参照のこと。本発明のある態様において、組成物および方法は、DanieletalBlood9247504757に記載されている二重特異性抗体などの、T細胞受容体のヒトCD20およびCD3イプシロン鎖に特異性を持つ二重特異性マウス抗体またはその断片、および/またはその複合体をふくむ。本発明の組成物および方法の抗CD20抗体またはその断片および/またはその複合体が二重特異的である好ましい態様において、抗CD20抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であり、ヒトCD20およびT細胞のエピトープに対する特異性を有し、または、例えば、単球/マクロファージ、および/またはNK細胞などのヒトエフェクター細胞に結合して細胞死をもたらすことができる。抗体結合親和性本発明のある態様において、抗CD20抗体を改変して、CD20およびその抗原性断片に対する結合親和性を変化させることができる。結合特性は、例えば酵素免疫測定法ELISA、または放射免疫測定法RIA、または速度法例えばBIACORE商標による分析などの、当分野で公知の多彩なinvitroアッセイによって決定し得る。一般的に、低KDを有する結合分子が好ましいことが理解されている。本発明の1つの態様において、抗体および抗体断片は、CD20とその抗原性断片と、10-5M未満、または10-6M未満、または10-7M未満、または10-8M未満、または10-9M未満、または10-10M未満、または10-11M未満、または10-12M未満、または10-13Mの解離定数またはKDまたはKdkoff/konで特異的に結合する。1つの態様において、本発明の抗体または断片は、CD20および/またはその抗原性断片と、1x10-3s-1未満、または3x10-3s-1未満のKoffで結合する。他の態様においては、抗体は、CD20およびその抗原性断片と、10-3s-1未満、5x10-3s-1未満、10-4s-1未満、5x10-4s-1未満、10-5s-1未満、5x10-5s-1未満、10-6s-1未満、5x10-6s-1未満、10-7s-1未満、5x10-7s-1未満、10-8s-1未満、5x10-8s-1未満、10-9s-1未満、5x10-9s-1未満、または10-10s-1未満のKoffで結合する。もう1つの態様において、本発明の抗体または断片は、CD20および/またはその抗原性断片と、少なくとも105M-1s-1、少なくとも5x105M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5x106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5x107M-1s-1、または少なくとも108M-1s-1、または少なくとも109M-1s-1の会合速度定数またはkon比で結合する。当業者は、本発明の複合体が、本明細書に記載されるものと同じ特性を持つことを理解する。抗体pIおよびTm本発明のある態様において、抗CD20抗体を改変して、それらの等電点pIを変化させることができる。抗体は、すべてのポリペプチドと同様に、一般的にポリペプチドが実効電荷をもたないpHとして定義される、pIを有する。タンパク質の溶解度は、典型的には、溶液のpHがタンパク質の等電点pIと同じである時最も低いことが、当分野において公知である。本明細書で使用されるとおり、pI値は、主な荷電形状のpIとして定義されている。タンパク質のpIは、等電点電気泳動、および多彩なコンピュータアルゴリズムを含む多様な方法によって決定し得るが、これらに限定されない例えば、Bjellqvistetal1993Electrophoresis141023を参照のこと。さらに、抗体のFabドメインの融解温度Tmは、抗体の熱安定性の良好な指標と成り得、有効期間の指標も提供し得る。より低いTmは、より高い凝集性/より低い安定性を示し、一方より高いTmはより低い凝集性/より高い安定性を示す。従って、ある態様において、より高いTmを有する抗体が好ましい。タンパク質のドメイン例えば、FabドメインのTmは、例えば、示差走査熱量測定などの、当分野で公知のいかなる標準的方法を使用することによっても測定し得る。例えば、Vermeeretal2000BiophysJ78394404Vermeeretal2000BiophysJ7921502154を参照のこと。従って、本発明のさらなる非排他的態様は、特定の等電点pIまたは融解温度Tmなどの、ある好ましい生化学特性を有する改変された抗体も包含する。より具体的には、1つの態様において、本発明の改変された抗体は、5.5~9.5の範囲のpIを有する。さらにもう1つの具体的な態様においては、本発明の改変された抗体は、約5.5~約6.0、または約6.0~約6.5、または約6.5~約7.0、または約7.0~約7.5、または約7.5~約8.0、または約8.0~約8.5、または約8.5~約9.0、または約9.0~約9.5の範囲のpIを有する。他の具体的な態様においては、本発明の改変された抗体は、5.5~6.0、または6.0~6.5、または6.5~7.0、または7.0~7.5、または7.5~8.0、または8.0~8.5、または8.5~9.0、または9.0~9.5の範囲のpIを有する。さらにより具体的には、本発明の改変された抗体は、少なくとも5.5、または少なくとも6.0、または少なくとも6.3、または少なくとも6.5、または少なくとも6.7、または少なくとも6.9、または少なくとも7.1、または少なくとも7.3、または少なくとも7.5、または少なくとも7.7、または少なくとも7.9、または少なくとも8.1、または少なくとも8.3、または少なくとも8.5、または少なくとも8.7、または少なくとも8.9、または少なくとも9.1、または少なくとも9.3、または少なくとも9.5のpIを有する。他の具体的な態様においては、本発明の改変された抗体は、少なくとも約5.5、または少なくとも約6.0、または少なくとも約6.3、または少なくとも約6.5、または少なくとも約6.7、または少なくとも約6.9、または少なくとも約7.1、または少なくとも約7.3、または少なくとも約7.5、または少なくとも約7.7、または少なくとも約7.9、または少なくとも約8.1、または少なくとも約8.3、または少なくとも約8.5、または少なくとも約8.7、または少なくとも約8.9、または少なくとも約9.1、または少なくとも約9.3、または少なくとも約9.5のpIを有する。抗体中のイオン化可能な残基の数と位置を変化させることにより溶解度を最適化し、plを調製することが可能である。例えば、ポリペプチドのpIは、適切なアミノ酸の置換を起こすことによって、例えば、リジンなどの荷電したアミノ酸で、アラニンなどの非荷電の残基を置換することにより操作することができる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、前記抗体のpIの変化をもたらす抗体のアミノ酸置換は、抗体の溶解度および/または安定性を改善し得る。当業者は、特定の抗体が所望のpIを達成するために、どのアミノ酸置換が最も適切であるかを理解するだろう。1つの態様において、pIを変化させるために、本発明の抗体において置換を起こす。FcγRへの変化した結合をもたらすFc領域の置換スプラと記載が、pIの変化をももたらすことは、具体的に考慮される。もう1つの態様において、Fc領域の置換は、FcγR結合における所望の変化、およびいかなる所望のpIの変化の双方に影響を与えるように、具体的に選ばれる。1つの態様において、本発明の改変された抗体は、65°C~120°Cの範囲のTmを有する。具体的な態様において、本発明の改変された抗体は、約75°C~約120°C、または約75°C~約85°C、または約85°C~約95°C、または約95°C~約105°C、または約105°C~約115°C、または約115°C~約120°Cの範囲のTmを有する。他の具体的な態様において、本発明の改変された抗体は、75°C~120°C、または75°C~85°C、または85°C~95°C、または95°C~105°C、または105°C~115°C、または115°C~120°CのTmを有する。さらに他の具体的な態様において、本発明の改変された抗体は、少なくとも約65°C、または少なくとも約70°C、または少なくとも約75°C、または少なくとも約80°C、または少なくとも約85°C、または少なくとも約90°C、または少なくとも約95°C、または少なくとも約100°C、または少なくとも約105°C、または少なくとも約110°C、または少なくとも約115°C、または少なくとも約120°CのTmを有する。さらに他の具体的な態様において、本発明の改変された抗体少なくとも65°C、または少なくとも70°C、または少なくとも75°C、または少なくとも80°C、または少なくとも85°C、または少なくとも90°C、または少なくとも95°C、または少なくとも100°C、または少なくとも105°C、または少なくとも110°C、または少なくとも115°C、または少なくとも120°CのTmを有する。操作されたエフェクター機能本発明の抗CD20抗体を、エフェクター機能に関して、例えば、がん、GVHDまたは拒絶反応などのB細胞関連疾患の治療において抗体の有効性を高めるように改変する事は望ましくあり得る。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にすることができる。このようにして産生されたホモ二量体の抗体は、改善された内部移行能力、および/または増加した補体媒介性細胞殺害、および/または抗体依存性細胞傷害ADCCを有し得る。CaronetalJExpMed17611911195andShopesBJImmunol14829182922を参照のこと。強化された活性をもつホモ二量体抗体は、WolffetalCancerResearch5325602565に記載される通り、ヘテロ二機能性のクロスリンカーを使用して調製することもできる。あるいは、二重のFc領域を有し、それによって強化された補体溶解およびADCC能力を有する抗体を設計することもできる。StevensonetalAntiCancerDrugDesign3219230を参照のこと。エフェクター機能を変化させるように、抗体のFc領域を操作する他の方法は、当分野において公知である例えば、Fc領域を改変することにより、FCγRIIAに対する結合親和性と比較した、FcγRIIBに対する結合親和性を強化すること記載しており、ともにKoenigらによる、米国特許出願公開第20040185045号およびPCT国際公開第2004/016750号;また、ArmourらによるPCT国際公開第99/58572号;Idusogieらによる同99/51642号;およびDeoらによる米国特許第6395272号も参照のこと。これらの開示は本明細書にその全体が組み入れられている。Fc領域を改変して、FcγRIIBに対する結合親和性を減少させる方法もまた、当分野において公知である例えば、ともにRavetchらによる、米国特許出願公開第20010036459号、およびPCT国際公開第01/79299号。その開示は本明細書にその全体が組み入れられる。野生型Fc領域と比較して、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する強化された結合親和性をもつ、変異型Fc領域を有する改変された抗体は、公知である例えば、ともにRavetchらによる、米国特許出願公開第20010036459号、およびPCT国際公開第01/79299号;その開示は本明細書にその全体が組み入れられている。当分野で公知のInvitroアッセイを使用して、本発明の抗CD20抗体、組成物、複合体および方法が、例えば、本明細書に記載されるもののように、ADCCを媒介可能かどうかを決定することができる。変異型Fc領域。本発明は、変異型Fc領域を含むタンパク質の製剤を提供する。すなわち、非天然のFc領域、例えば、1つまたは複数の非天然のアミノ酸残基を含むFc領域である。さらに、本発明の変異型Fc領域に包含されるのは、アミノ酸の欠失、付加、および/または改変を含むFc領域である。本明細書で使用されるFc領域は、最初の定域免疫グロブリンドメインを除いた抗体の定常領域を含む、ポリペプチドを含むということが理解されるだろう。従って、Fcは、IgA、IgD、およびIgGの最後の2つの定域免疫グロブリンドメイン、IgEおよびIgMの最後の3つの定域免疫グロブリンドメイン、およびこれらドメインに対する柔軟なヒンジN-末端を表す。IgAおよびIgMにおいては、FcはJ鎖を含んでもよい。IgGにおいては、Fcは免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3Cγ2およびCγ3、およびCγ1Cγ1とCγ2Cγ2間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変化するが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、残基C226またはP230を、そのカルボキシル末端に含むと定義され、その番号付けは、Kabatetalに記載される通り、EUインデックスに基づく。Kabat記載のEUインデックスとは、Kabatetal、supraに記載される、ヒトIgG1EU抗体の残基の番号付けを表す。Fcとは、隔離されたこの領域、または抗体、抗体断片との関係におけるこの領域、またはFc融合タンパク質を表し得る。Fc変異タンパク質は、抗体、Fc融合物、またはFc領域を含むいかなるタンパク質またはタンパク質ドメインであってもよい。Fcの非天然型変異体である変異型Fc領域を含むタンパク質が、特に好ましい。多型はKabat270、272、312、315、356、および358を含むいくつかのFc位置において観察されているが、これらに限定されず、従って、本配列と先行技術における配列には、わずかな差異が存在し得、当業者には、当教示に基づき理解されるだろう。本発明は、比較可能な分子例えば、野生型Fc領域を有することを除いて同一なアミノ酸配列を有するタンパク質と比べて、Fcリガンド例えば、Fc受容体、C1qに対する改変された結合特性を有するFc変異タンパク質を包含する。結合特性の例としては、結合特異性、平衡解離定数KD、解離および会合速度KoffおよびKon、結合親和性および/または結合活性が挙げられるが、これらに限定されない。低KDを持つ結合分子例えば、抗体などのFc変異タンパク質が、高KDをもつ結合分子よりも好ましいことは、一般的に理解されている。しかし、いくつかの例においては、KonまたはKoffの値が、KDの値よりも、より関連性があることがある。当業者は、所定の抗体応用において、どの反応速度パラメータが最も重要であるかを決定し得る。リガンドに対するFc領域の親和性および結合特性は、Fc-FcγR相互作用、すなわち、Fc領域のFcγRとの特異的結合を決定するための、当分野で公知の多彩なinvitroアッセイの方法生化学または免疫学に基づくアッセイにより決定することができ、例としては平衡時法例えば、酵素免疫測定法ELISA、または放射免疫測定法RIA、または速度法例えば、BIACORE商標分析、および間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移FRET、ゲル電気泳動、およびクロマトグラフィー例えば、ゲルろ過などの他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。これらおよび他の方法は、1つまたは複数の検査されている成分上の標識を利用することができ、および/または、発色法、蛍光法、発光法、または同位体標識法を含む多彩な検知方法も使用し得るが、これらに限定されない。結合親和性および速度法に関する詳細は、例えば、PaulWEedFundamentalImmunology4thEdLippincottRavenPhiladelphiaに記載されている。例えば、1つまたは複数の正の制御因子例えば、FcγRIIIAとのFc結合を強化しつつ、負の制御因子FcγRIIBとのFc結合を未変化に保つか、または減少すらさせる改変が、ADCC活性を強化するためにはより好ましいだろう。あるいは、1つまたは複数の正の制御因子との結合を減少させ、および/またはFcγRIIBとの結合を強化した改変が、ADCC活性を減少するためには好ましいだろう。従って、結合親和性例えば、平衡解離定数KDの比率は、Fc変異体のADCC活性が強化されたか、または減少したかを示すことができる。例えば、FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解離定数KDの比率の減少は、改善されたADCC活性に相関し、一方比率の増加は、ADCC活性の減少に相関する。さらに、C1qとの結合を強化した改変は、CDC活性を強化するために好ましく、一方C1qとの結合を減少させた改変は、CDC活性を減少させ、または除去するために好ましい。1つの態様において、本発明のFc変異体は、比較可能な分子と比べて増加した親和性でFcγRIIIAと結合する。もう1つの態様において、本発明のFc変異体は、比較可能な分子と比べて、増加した親和性でFcγRIIIAと結合し、未変化の結合親和性でFcγRIIBと結合する。さらなるもう1つの態様において、本発明のFc変異体は、比較可能な分子と比べて、増加した親和性でFcγRIIIAと結合し、減少した親和性でFcγRIIBと結合する。さらにもう1つの態様において、本発明のFc変異体は、比較可能な分子と比べて、減少したFcγRIIIA/FcγRIIB平衡解離定数KDの比率を有する。1つの態様において、Fc変異タンパク質は、比較可能な分子と比べて、1つまたは複数のFcリガンドに対する強化された結合をもつ。もう1つの態様において、変異タンパク質は、比較可能な分子のものより、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍大きな、Fcリガンドに対する親和性を持つ。具体的な態様において、Fc変異タンパク質は、Fc受容体に対する強化された結合を有する。もう1つの具体的な態様において、Fc変異タンパク質は、Fc受容体FcγRIIIAに対する強化された結合を有する。さらにもう1つの具体的な態様において、Fc変異タンパク質は、Fc受容体FcRnに対する強化された結合を有する。さらにもう1つの具体的な態様において、Fc変異タンパク質は、比較可能な分子と比べて、C1qに対する強化された結合を有する。もう1つの態様において、本発明のFc変異体は、比較可能な分子と比べて、約2倍~約10倍の間、または約5倍~約50倍の間、または約25倍~約250倍の間、または約100倍~約500倍の間、または約250倍~約1000倍の間の減少した平衡解離定数KDを有する。もう1つの態様において、本発明のFc変異体は、比較可能な分子と比べて、2倍~10倍の間、または5倍~50倍の間、または25倍~250倍の間、または100倍~500倍の間、または250倍~1000倍の間の減少した平衡解離定数KDを有する。具体的な態様において、F変異体は、比較可能な分子と比べて、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍、または少なくとも400倍、または少なくとも600倍減少した、FcγRIIIAに対する平衡解離定数KDを有する。Fc領域を含むタンパク質の血清半減期は、FcRnに対するFc領域の結合親和性を増加させることにより、増加させることができる。1つの態様において、Fc変異タンパク質は、比較可能な分子と比べてより長い血清半減期を有する。抗体依存性細胞傷害またはADCCは、ある細胞傷害性細胞例えば、ナチュラルキラーNK細胞、好中球、およびマクロファージ上に存在するFc受容体FcRs上に結合した分泌されたIgが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を、抗原を有する標的細胞に特異的に結合させ、続いて細胞毒素により標的細胞を死滅させることを可能にする、細胞傷害性の1つの形態を表す。例えば、標的細胞の表面に向けられた高親和性IgG抗体は、細胞傷害性細胞を武装し、そのような死滅をもたらす。標的細胞の溶解は細胞外のものであり、細胞と細胞との間の直接接触を必要とし、補体は関与しない。抗体に加えて、Fc領域を含む他のタンパク質、具体的には、抗原をもつ標的細胞に特異的に結合する能力を有するFc融合タンパク質は、細胞媒介性細胞傷害に影響を与え得ることが考慮される。簡便性のために、融合タンパク質の活性の結果生じる細胞媒介性細胞傷害も、本明細書において、ADCC活性と呼ぶ。ADCCによる標的細胞の溶解を媒介する、いかなる特定のFc変異タンパク質の能力も検査することができる。ADCC活性を評価するために、抗原抗体複合体によって活性化され標的細胞の細胞溶解をもたらす免疫エフェクター細胞とともに、目的のFc変異タンパク質を、標的細胞に添加する。細胞溶解は、一般的に、溶解した細胞からの標識の放出によって検知される例えば、放射性基質、蛍光色素、または天然細胞内タンパク質。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞の例としては、末梢血単核球PBMCおよびナチュラルキラーNK細胞が挙げられる。invitroADCCアッセイの具体例は、Wisecarveretal198579277282Bruggemannetal1987JExpMed16613511361Wilkinsonetal2001JImmunolMethods258183191andPateletal1995JImmunolMethods1842938に記載されている。あるいは、または追加的に、目的のFc変異タンパク質のADCC活性は、例えば、Clynesetal1998PNASUSA95652656に記載されているもののような動物モデルにおいて、invivoで評価し得る。1つの態様において、Fc変異タンパク質は、比較可能な分子と比べて、強化されたADCC活性を有する。具体的な態様において、Fc変異タンパク質は、比較可能な分子のものよりも、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍大きいADCC活性を有する。もう1つの具体的な態様において、Fc変異タンパク質は、Fc受容体FcγRIIIAに対する強化された結合を有し、また、比較可能な分子と比べて、強化されたADCC活性を有する。他の態様において、Fc変異タンパク質は、比較可能な分子と比べて、強化されたADCC活性およびより長い血清半減期の両方を有する。補体依存性細胞傷害およびCDCは、補体の存在下での標的細胞の溶解を表す。補体活性化経路は、補体系C1qの第一成分と、例えば抗体などの、同族の抗原と複合された分子との結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzanoSantoroetal1996JImmunolMethods202163に記載されているようなCDCアッセイを実施することができる。1つの態様において、Fc変異タンパク質は、比較可能な分子と比べて、強化されたCDC活性を有する。具体的な態様においては、Fc変異タンパク質は、比較可能な分子のものより、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍大きいCDC活性を有する。他の態様において、Fc変異タンパク質は、比較可能な分子と比べて、強化されたCDC活性とより長い血清半減期の両方を有する。1つの態様において、本発明は、Kabat記載のEUインデックス番号234、235、236、239、240、241、243、244、245、247、252、254、256、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333、および334番から成る群より選択される1つまたは複数の位置において、Fc領域が非天然のアミノ酸残基を含む、製剤を提供する。所望により、Fc領域は、当業者に公知の例えば、米国特許第5,624,821号;同第6,277,375号;同第6,737,056号;PCT国際公開第01/58957号;同第02/06919号;同第04/016750号;同第04/029207号;同第04/035752号、および同第05/040217号を参照のこと、または本明細書に記載される通りの、付加的および/または選択的な位置に、非天然のアミノ酸残基を含み得る。特定の態様において、本発明は、Fc変異タンパク質の製剤であって、Fc領域がKabat記載のEUインデックス番号234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R.243W、243L243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、252Y、254T、256E、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、および332Aから成る群より選択される少なくとも1つの非天然のアミノ酸残基を含む、製剤を提供する。所望により、Fc領域は、付加的および/または選択的な、当業者に公知の非天然のアミノ酸残基を含み得る。例えば、米国特許第5,624,821号;同6,277,375;6,737,056号;PCT国際公開第01/58957号;同第02/06919号;同第04/016750号;同第04/029207号;同第04/035752号、および同第05/040217号を参照のこと。もう一つの態様において、本発明は、Fc変異タンパク質の製剤であって、Fc領域が、Kabat記載のEUインデックス番号239、330および332から成る群より選択される1つまたは複数の位置に、少なくとも1つの非天然のアミノ酸を含む製剤を提供する。具体的な態様において、本発明は、Fc変異タンパク質の製剤であって、Fc領域が、Kabatに記載のEUインデックス番号239D、330L、および332Eから成る群より選択される、少なくとも一つの非天然のアミノ酸を含む製剤を提供する。所望により、Fc領域は、Kabat記載のEUインデックス番号252、254、および256から成る群より選択される1つまたは複数の位置に、付加的な非天然のアミノ酸をさらに含み得る。具体的な態様において、本発明は、Fc変異タンパク質の製剤であって、Fc領域が、Kabatに記載のEUインデックス番号239D、330L、および332Eから成る群より選択される、少なくともひとつの非天然のアミノ酸を含み、1つまたは複数の位置の少なくともひとつの非天然のアミノ酸が、Kabat記載のEUインデックス番号252Y、254T、および256Eから成る群より選択される、製剤を提供する。1つの態様において、本発明のFc変異体は、例えば、例示的なFc変異体を開示している、Ghetieetal1997NatBiotech1563740Duncanetal1988Nature332563564Lundetal1991JImmunol14726572662Lundetal1992MolImmunol295359Alegreetal1994Transplantation5715371543Hutchinsetal1995ProcNatlAcadSciUSA921198011984Jefferisetal1995ImmunolLett44111117Lundetal1995FasebJ9115119Jefferisetal1996ImmunolLett54101104Lundetal1996JImmunol15749634969Armouretal1999EurJImmunol2926132624Idusogieetal2000JImmunol16441784184Reddyetal2000JImmunol16419251933Xuetal2000CellImmunol2001626Idusogieetal2001JImmunol16625712575Shieldsetal2001JBiolChem27665916604Jefferisetal2002ImmunolLett825765Prestaetal2002BiochemSocTrans30487490米国特許第5,624,821号;同第5,885,573号;同第5,677,425号;同第6,165,745号;同第6,277,375号;同第5,869,046号;同第6,121,022号;同第5,624,821号;同第5,648,260号;同第6,528,624号;同第6,194,551号;同第6,737,056号;同第6,821,505号;同第6,277,375号;米国特許出願公開第2004/0002587号、およびPCT国際公開第94/29351号;同第99/58572号;同第00/42072号;同第02/060919号;同第04/029207号;同第04/099249号;および同第04/063351号に開示されるものなどの、他の公知のFc変異体と組み合わせることもできる。また、本発明は、欠失、付加、および/または改変を含むFc領域を包含する。さらにFc領域の他の改変/置換/付加/欠失が、当業者には容易に明白となるだろう。非天然のFc領域を生成する方法は、当分野において公知である。例えば、アミノ酸置換および/または欠失は、部位特異的突然変異誘発法例えば、KunkelProcNatlAcadSciUSA82488492、PCR突然変異誘発法例えば、HiguchiinPCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplicationsAcademicPressSanDiegopp177183、およびカセット変異導入法例えば、WellsetalGene34315323を含む突然変異誘発法によって生成することができるが、これらに限定されない。好ましくは、部位特異的な突然変異誘発は、重複伸長PCR法例えば、HiguchiinPCRTechnologyPrinciplesandApplicationsforDNAAmplificationStocktonPressNewYorkpp6170によって実施される。あるいは、重複伸長PCR法例えば、Higuchisupraの技術は、いかなる所望の突然変異を標的配列出発DNAに導入するためも使用することができる。例えば、重複伸長PCR法のPCR一巡目は、標的配列を外側のプライマープライマー1と内側の突然変異誘発プライマープライマー3で増幅し、別々に第二の外側のプライマープライマー4と内側のプライマープライマー2で増幅することを含み、二つのPCRセグメントセグメントAおよびBを産生する。内側の突然変異誘発プライマープライマー3は、所望の突然変異を特定する標的配列に対する不適正塩基対を含むよう設計される。二巡目においては、PCR一巡目の生成物セグメントAおよびBを、二つの外側のプライマープライマー1および4を使用して、PCRにより増幅する。得られた全長PCRセグメント、セグメントCを、制限酵素で消化し、得られた制限酵素断片を適切なベクターにクローニングする。突然変異誘発の第一の工程として、出発DNA例えば、融合タンパク質、抗体または単にFc領域をコードするを、突然変異誘発ベクターに機能的にクローニングする。プライマーは、所望のアミノ酸置換を反映するように設計される。変異型Fc領域の生成に有用な他の例示的な方法は、当分野において公知である例えば、米国特許第5624821号;同第5885573号;同第5677425号;同第6165745号;同第6277375号;同第5869046号;号6121022号;同第5624821号;同第5648260号;同第6528624号;同第6194551号;同第6737056号号;同第6821505号;同第6277375号;米国特許出願公開第2004/0002587号、およびPCT国際公開第94/29351号;同第99/58572号;同第00/42072号;同第02/060919号;同第04/029207号;同第04/099249号;同第04/063351号を参照のこと。これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。いくつかの態様において、Fc変異タンパク質は、1つまたは複数の操作されたグリコフォーム、すなわち、Fc領域を含む分子に、共有結合的に結合した炭水化物組成物を含む。操作されたグリコフォームは、エフェクター機能を強化または減少させることを含む、多彩な目的に有用であるが、これらに限定されない。操作されたグリコフォームは、本明細書に開示された方法および当業者に公知のいずれかの方法、例えば、操作されたまたは変異型の発現株を使用することによって、グリコシル化に影響をを与える成長条件または培地を使用することによって、1つまたは複数の酵素、例えばDIN-アセチルグルコサミン転移酵素IIIGnTI11などとの同時発現によって、多彩な生物または多彩な生物由来の細胞株中にFc領域を含む分子を発現させることによって、または、Fc領域を含む分子が発現した後に、炭水化物を改変することによって生成することができる。操作されたグリコフォームを生成するための方法は、当分野において公知であり、Umanaetal1999NatBiotechnol17176180Daviesetal20017BiotechnolBioeng74288294Shieldsetal2002JBiolChem2772673326740Shinkawaetal2003JBiolChem27834663473;米国特許第6,602,684号;米国特許出願番号第10/277,370号;同第10/113,929号;PCT国際公開第00/61739A1号;同第01/292246A1号;同第02/311140A1号;同第02/30954A1号;Potillegent商標technologyGlycoMAb商標glycosylationengineeringtechnologyに記載されるものを含むが、これらに限定されない。また、例えば、国際公開第00061739号;EA01229125号;米国特許出願第20030115614;Okazakietal2004JMB336123949も参照のこと。ポリヌクレオチド、ベクター、宿主セル、および組み換え方法本発明はさらに、本発明の抗体またはそのエピトープ結合性断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、CD20と結合することができ、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、6xSSC、0.5SDS、5xDenhardt’s溶液、および100μg/mlの熱変性させたサケ精子DNA中、60°Cで2時間のプレハイブリダイゼーション;60°Cで18時間のハイブリダイゼーション;4xSSC、0.5SDS、0.1ピロリン酸ナトリウム中、60°Cで30分間、2回洗浄し、2xSSC、0.1SDS中、60°Cで30分間、2回洗浄することを含む、ポリヌクレオチドも包含する。当分野で公知の方法によって、ポリヌクレオチドを得、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。例えば、もし抗体のヌクレオチド配列が既知であれば、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド例えば、Kutmeieretal1994BioTechniques17242に記載される通りから構築することができ、その方法は簡単に言えば、抗体をコードする配列の一部を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成、アニーリング、およびそれらオリゴヌクレオチドのライゲーション、次いでPCRによる連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。抗体をコードする配列と適切な転写および翻訳制御信号を含む組み換え型ベクターを構築するための方法は、当分野において公知である。これらの方法としては、例えば、invitro組み換え型DNA技術、合成技術、およびinvivo遺伝子組み換えなどが挙げられる。本発明は、従って、本発明の抗体分子、またはその重鎖または軽鎖、または重鎖または軽鎖可変領域、または、これらいずれかのエピトープ結合性断片をコードする、プロモーターに機能的に結合したヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。組み換え型ベクターを、通常の技術によって宿主細胞に移植し、次いで、トランスフェクトした細胞を通常の技術により培養して、本発明の抗体を得る。従って、本発明は、本発明の抗体またはそのエピトープ結合性断片をコードする、異種のプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチドを含む、宿主細胞を包含する。好ましい態様において、重鎖および軽鎖両方をコードするベクターは、全免疫グロブリン分子を発現させるために、宿主細胞中で同時発現し得る。種々の宿主発現ベクター系を利用して、本発明の抗体分子を発現させることができる。そのような宿主発現系は、目的のコード配列を生成しその後精製し得るビヒクルを表すが、また適切なヌクレオチドコード配列で形質転換または形質移入した際、本発明の抗体分子をinsituで発現し得る細胞も表す。これらは、抗体をコードする配列を含む組み換え型バクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換されたバクテリア例えば、大腸菌および枯草菌Bsubtilisなどの微生物;抗体をコードする配列を含む組み換え型酵母発現ベクターで形質転換された酵母例えば、サッカロマイセス属およびピキア属;抗体をコードする配列を含む組み換え型ウィルス発現ベクター例えば、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞系;組み換え型ウィルス発現ベクター例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMV;タバコモザイクウイルスTMVを感染させた、または抗体をコードする配列を含む組み換え型プラスミド発現ベクター例えば、Tiプラスミドで形質転換した植物細胞系;または、哺乳類の細胞のゲノム由来のプロモーター例えば、メタロチオネインプロモーター、または、哺乳類のウイルス例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター由来のプロモーターを含む組み換え型発現構築体を有する哺乳類細胞系例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3細胞、を含むがこれらに限定されない。好ましくは、大腸菌などのバクテリア細胞、そしてより望ましくは、特に全組み換え型抗体分子を発現させるためには、真核細胞を、組み換え型抗体分子の発現のために使用する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳類細胞と、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターを合わせたものは、抗体の効果的な発現系である例えば、Foeckingetal1986Gene45101Cockettetal1990BioTechnology82に開示されるとおり。組み換え型タンパク質の長期、高収率の生成のためには、安定した発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株を設計することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、適切な発現制御要素例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位などおよび選択可能なマーカーで制御されたDNAで、宿主細胞を形質転換することができる。外来性DNAの導入に続いて、操作された細胞を、豊富化した培地で1~2日成長させておいてもよく、次いで選択培地に切り替える。組み換え型プラスミド中の選択可能なマーカーは選択への抵抗性を与え、細胞が染色体中にプラスミドを安定して統合し、成長して病巣を形成することを可能にし、その病巣を、次々に細胞株中にクローニングし、増殖させることができる。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を設計するために、有利に使用することができる。このような操作された細胞株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。ひとたび本発明の抗体分子が組み換えにより発現したら、免疫グロブリン分子を精製するための当分野で公知のいかなる方法、例えば、クロマトグラフィー例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特にプロテインA後の特異抗原に対してはアフィニティークロマトグラフィーによって、およびサイジングカラムクロマトグラフィー、遠心分離、吸収率較差溶解度測定、またはタンパク質精製のためのいかなる他の標準的技術によっても、抗体分子を精製することができる。この点については、本開示において米国特許第7,538,195号が参照されており、その教示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。もう一つの態様において、多様な抗体および抗体断片、ならびに擬態抗体を、CDRの特定の一組に隣接する可変領域および定常領域配列内で、突然変異、欠失および/または挿入により、容易に産生することができる。従って、例えば、異なる重鎖の置換によって、CDRの特定の一組に対し、異なるクラスの抗体が可能であり、それによって、例えば、IgG1~4、IgM、IgA1~2、IgD、IgE抗体型およびアイソタイプを産生し得る。同様に、本発明の範囲に含まれる人工抗体を、CDRの特定の一組を完全に合成のフレームワーク内に埋め込むことにより、産生することができる。可変という用語は、本明細書において、抗体間で配列が異なる可変領域のある部分を記述するために使用され、それぞれの特定の抗体の抗原に対する結合と特異性において使用される。しかし、可変性は、通常、抗体の可変領域を通して均一には分布していない。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域において、相補性決定領域CDRまたは超可変領域とよばれる3つのセグメントに集中している。より高度に保存された可変領域の部分は、フレームワークFRと呼ばれる。重鎖および軽鎖の可変領域それぞれは、が主としてβシート構造をとる4つのフレームワーク領域を含み、これらは、環状に連結し、いくつかの場合においてはβシート構造の一部を形成する3つのCDRによって連結される。各鎖中のCDRはFR領域によってごく近傍にまとめられ、他の鎖からのCDRとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する例えば、EAKabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterestfifthedition1991NIHを参照のこと。定常領域は、抗体の抗原との結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害における抗体の関与などの、多彩なエフェクター機能を示す。ヒト化抗体、または他の哺乳類による非拒絶に適合させた抗体は、再表面化およびCDR移植などのいくつかの技術を使用して産生することができる。再表面化技術において、分子モデリング、統計的分析、および突然変異誘発を組み合わせることにより、可変領域の非CDR表面を、標的宿主の既知抗体の表面に類似するように調整する。抗体の再表面化のための指針および方法、および異なる宿主内の抗体の免疫原性を減少させるための他の方法が、例えば、米国特許第5,639,641号に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。CDR移植技術においては、マウスの重鎖および軽鎖CDRを、完全にヒト型のフレームワーク配列中に移植する。本発明は、また、本明細書に記載される抗体の機能的等価物も包含する。機能的等価物は、抗体の結合特性に匹敵する結合特性を持ち、例えば、キメラ化抗体、ヒト化抗体、および単鎖抗体ならびにその断片などを含む。そのような機能的等価物を産生する例示的な方法が、PCT国際出願第93/21319号、欧州特許出願第239,400号;PCT国際出願第89/09622号;欧州特許出願第338,745号;および同第332,424号に開示されており、それぞれの全体が参照により組み入れられている。機能的等価物は、本発明の抗体の可変領域または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じであるアミノ酸配列をもつポリペプチドを含む。アミノ酸配列に用いた実質的に同じであるは、本明細書において、PearsonandLipmanProcNatlAcadSciUSA8524442448に従ってFASTA調査法により決定される通り、もう1つのアミノ酸配列に対して、少なくとも約90、そしてより好ましくは少なくとも約95、96、97、98、および99の配列同一性をもつ配列として定義される。キメラ化抗体は、好ましくは、ヒト抗体定常領域に実質的または独占的に由来する定常領域を有し、ヒト以外の哺乳類由来の可変領域の配列に実質的または独占的に由来する可変領域を有する。抗体のヒト化形態は、例えばマウス抗体の相補性決定領域を、ヒトフレームワークドメイン中に置換することによって作成される。例えば、PCT国際公開第92/22653号。ヒト化抗体は好ましくは、対応するヒト抗体領域に実質的または独占的に由来する相補性決定領域CDR、およびヒト以外の哺乳類に実質的または独占的に由来するCDR以外に、定常領域および可変領域を有する。機能的等価物はまた、単鎖抗体scFvsとしても知られる単鎖抗体断片をも含む。これらの断片は、1つまたは複数の相互接続リンカーを伴いまたは伴わずに、抗体可変軽鎖配列VLの少なくとも1つの断片に係留されたtethered、抗体可変重鎖アミノ酸配列VHの少なくとも1つの断片を含む。そのようなリンカーは、単鎖抗体断片が由来する全抗体の標的分子結合特異性を維持するように、VLおよびVHドメインがひとたび結合されると、それらの適切な3次元フォールディングが確実に生じるように選択された、短く柔軟なペプチドであってもよい。一般的に、VLまたはVH配列のカルボキシル末端は、そのようなペプチドリンカーによって、相補的なVLおよびVH配列のアミノ酸末端に、共有結合的に連結されていてもよい。単鎖抗体断片は、分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリー、または同様の技術によって産生することができる。これらのタンパク質は、真核細胞、または、バクテリアを含む原核細胞のいずれかにおいて産生することができる。単鎖抗体断片は、本明細書に記載されるインタクトな抗体の少なくとも1つの可変領域または相補性決定領域CDRを有するが、それらの抗体の定常領域のいくらかまたはすべてを欠いている。これらの定常領域は、抗原結合には必要ではないが、インタクトな抗体の構造の主要な部分を構成する。従って、単鎖抗体断片は、定常領域の一部または全てを含む抗体の使用に付随する問題のいくつかを克服し得る。例えば、単鎖抗体断片には、生体分子と重鎖定常領域間の不必要な相互作用、または他の不必要な生物活性がないことが多い。その上、単鎖抗体断片は、インタクトな抗体または全抗体よりもかなり小さく、従ってインタクトな抗体よりもより大きな毛細血管透過性を有し得るため、単鎖抗体断片はより効率的に局在化しかつ標的抗原結合部位に結合することが可能になる。また、抗体断片は原核細胞において比較的大規模に産生することができ、そのようにしてそれらの産生を促進することができる。さらに、単鎖抗体断片は比較的サイズが小さいため、インタクトな抗体よりも、レシピエントにおける免疫応答を誘発しにくい。本明細書に記載される、抗CD20抗体、およびその再表面化したまたはヒト化変異体のためのアミノ酸および核酸配列に関する知識を使用して、ヒトCD20にも結合する多数の抗体を開発することができる。いくつかの研究が、抗体の一次配列の知識に基づき、抗体の配列中の様々な位置に、1つまたは複数のアミノ酸変化を導入する事による、結合および発現レベルなどのその特性における効果を調査している例えば、YangWPetal1995JMolBiol254392403RaderCetal1998ProcNatlAcadSciUSA9589108915VaughanTJetal1998NatureBiotechnology16535539。これらの研究において、オリゴヌクレオチドによって媒介される部位特異的突然変異誘発、カセット変異導入法、エラープローンPCR、DNAシャフリング、または大腸菌の突然変異誘発株などの方法を使用して、CDR1、CDR2、CDR3、またはフレームワーク領域中の重鎖および軽鎖遺伝子の配列を変化させることにより、一次抗体の変異体が生成されたVaughanTJetal1998NatureBiotechnology16535539AdeyNBetal1996Chapter16pp277291inPhageDisplayofPeptidesandProteinsEdsKayBKetalAcademicPress。一次抗体の配列を変化させるこれらの方法は、結果として、改善された二次抗体の親和性をもたらした例えば、GramHetal1992ProcNatlAcadSciUSA8935763580BoderETetal2000ProcNatlAcadSciUSA971070110705DaviesJandRiechmannL1996Immunotechnolgy2169179ThompsonJetal1996JMolBiol2567788ShortMKetal2002JBiolChem2771636516370FurukawaKetal2001JBiolChem2762762227628。抗体の1つまたは複数のアミノ酸残基を変化させる同様の定方向戦略directedstrategyにより、本発明に記載される抗体配列は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている特許出願公開第20090246195号に記載される方法などの、改善された機能をもつ抗CD20抗体の開発に使用することができる。免疫複合体本発明はまた、薬剤またはプロドラッグに結合または接合した、抗CD20抗体、抗体断片、機能的等価物、改善された抗体、および、本明細書に記載されるそれらの態様を含む、複合体本明細書において免疫複合体とも呼ぶに関する。適切な薬剤またはプロドラッグは当分野において公知である。好ましい薬剤またはプロドラッグは、細胞傷害性薬物である。本発明の細胞毒性複合体に使用された細胞傷害性薬物は、細胞を死滅に至らせる、または細胞死を誘発する、または若干のあきらかでない方法で細胞生存性を減少させる、いかなる化合物であってもよく、例えば、メイタンシノイド類およびメイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン類、タキソイド類、CC-1065およびCC-1065類似体、デュオカルマイシン類およびデュオカルマイシン類似体、カリチアマイシン類などのエンジイン類、アウリスタチン類を含むドラスタチンおよびドラスタチン類似体、トメイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、メトトレキサート、シスプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシルおよびモルフォリノドキソルビシンを含む。より好ましい細胞傷害性薬物はメイタンシノイド類およびメイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン類、タキサン類、CC-1065およびCC-1065類似体である。特に好ましいのは、メイタンシノイド類およびメイタンシノイド類似体であり、それらの多くが、以下に記載されている。米国特許出願公開第20070048314号、同第20060233814号、同第20080003652号、同第20060155110号、同第20060128970号、同第20090182038号、同第20090042837号、同第20080233618号、同第20080119558号、同第20060099235号、同第20050272727号、同第20050203174号、同第20050112726号、同第20060182750号、同第20090202536号、同第20090142361号、同第20080249085号、同第20080226659号、同第20080171865号、同第20080171856号、同第20080171040号、同第20080145374号、同第20080114153号、同第20070270585号、同第20070269447号、同第20070264266号、同第20070009541号、同第20070009540号、同第20070009539号、同第20060167245号、同第20060127407号、同第20060084141号、同第20050276812号、同第20050169933号、同第20050152913号、同第20050113571号、同第20050003513号、同第20040241174号、同第20040235840号、同第20040120949号、同第20040014980号、同第20030157694号、同第20020156318号、同第20020156274号、同第20020001587号。これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。薬剤またはプロドラッグを抗体または機能的等価物と結合させるために、結合基を使用して、そのような複合体を調製することができる。適切な結合基は当分野において公知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、感光性不安定基、ペプチダーゼ不安定基、およびエステラーゼ不安定基などが挙げられる。薬剤またはプロドラッグは、例えば、ジスルフィド結合により抗CD20抗体またはその断片に結合し得る。リンカー分子または架橋剤は、抗CD20抗体またはその断片と反応し得る反応性化学基を含む。細胞結合剤との反応のための好ましい反応性化学基は、N-スクシンイミジルエステル類およびN-スルホスクシンイミジルエステル類である。さらに、リンカー分子は反応性化学基、好ましくは、薬剤と反応してジスルフィド結合を形成し得るジチオピリジル基を含む。特に好ましいリンカー分子としては、例えば、N-スクシンイミジル3-2-ピリジルジチオプロピオナートSPDP例えば、CarlssonetalBiochemJ173723737を参照のこと、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオブタノアートSPDB例えば、米国特許第4,563,304号を参照のこと、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオ2-スルホブタノアートsulfo-SPDB米国特許出願公開第20090274713号を参照のこと、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオペンタノアートSPP例えば、CASRegistrynumber341498086を参照のこと、2-イミノチオラン、またはアセチルコハク酸無水物、および、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第6,913,748号に記載されるもののような、他の反応性架橋剤が挙げられる。例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第4,563,304号;CarlssonetalBiochemJ173723737BlattleretalBiochem2415171524LambertetalBiochem2239133920KlotzetalArchBiochemBiophys96605andLiuetalBiochem18690BlakeyandThorpeAntibodyImmunoconjugatesandRadiopharmaceuticals1116WorrelletalAntiCancerDrugDesign1179184を参照のこと。例えば、抗体または細胞結合剤は、架橋試薬によって改変することができ、そのようにして誘導された、抗体または細胞結合剤含有の遊離又は保護チオール基を、次いでジスルフィド含有またはチオール含有メイタンシノイドと反応させ、複合体を産生する。複合体は、HPLC、サイズ排除、吸着、イオン交換および親和性捕捉、透析またはタンジェント流ろ過を含む、クロマトグラフィーによって精製することができるが、これらに限定されない。本発明のもう1つの態様において、抗CD20抗体は、免疫複合体の力価、溶解度、または有効性を強化するために、ジスルフィド結合とポリエチレングリコールスペーサーを介して細胞傷害性薬物に結合している。そのような切断可能な親水性リンカーが、国際公開第2009/0134976号に記載されている。このリンカー設計の付加的な利点は、抗体-薬物複合体の、所望の高い単量体比率および最小の凝集である。この態様において具体的に考慮されるのは、ポリエチレングリコールスペーサーCH2CH2On=1-14を有し、薬剤負荷が2~8の狭い範囲である、ジスルフィド基-S-S-を介して細胞結合剤と結合した薬剤の複合体が記載されているが、それらは、がん細胞に対する比較的高い潜在生物活性を示し、最小のタンパク質凝集で高い複合収率と高い単量体の比率という、所望の生化学的性質を有する、ということである。この態様において具体的に考慮されるのは、式I:CB[XlCH2CH2OnYD]mIで表される抗CD20抗体薬剤複合体、または式I’:[D-Y-CH2CH2OnXl]m-CBI’で表される複合体であって、式中、CBは抗CD20抗体または断片を表し;Dは薬剤を表し;Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバマート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に結合した、脂肪族、芳香族、または複素環の単位を表し;Yは、ジスルフィド結合を介して薬剤に結合した、脂肪族、芳香族、または複素環の単位を表し;lは0または1であり;mは2~8の整数であり;およびnは1~24の整数である。より好ましくは、mは2~6の整数である。また、さらにより好ましくは、mは3~5の整数である。また、より好ましくは、nは2~8の整数である。あるいは、例えば米国特許第6,441,163号、および同7,368,565号に記載されるとおり、薬剤をまず改変することにより、細胞結合剤と反応するのに適切な反応性エステルを導入することもできる。細胞結合剤をもつ活性化したリンカー部分を含むこれらの薬剤の反応は、もう一つの細胞結合剤薬剤複合体の製造方法を提供する。例えば、米国特許第6,716,821号に記載される通り、メイタンシノイド類もまた、PEG結合基を使用して、抗CD20抗体または断片に結合させることができる。これらの切断不可能なPEG結合基は、水および非水性溶媒のどちらにも可溶であり、1つまたは複数の細胞傷害性薬物を細胞結合剤と結合させるために使用することができる。例示的なPEG結合基としては、リンカーの両端において、一端では機能性のスルフヒドリルまたはジスルフィド基、他の一端では活性エステルを介して、細胞傷害性薬物および細胞結合剤と反応するヘテロ二機能性PEGリンカーが挙げられる。PEG結合基を使用した、細胞毒性複合体合成の一般的な例としては、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、米国特許第6,716,821号を再度参照されたい。合成は、細胞結合剤ををもつ反応性PEG部分を有する、1つまたは複数の細胞傷害性薬物の反応から始まり、結果として各反応性PEG部分の末端活性エステルが、細胞結合剤のアミノ酸残基によって置換され、PEG結合基を介して共有結合的に細胞結合剤に結合した1つまたは複数の細胞傷害性薬物を含む細胞毒性複合体が産生される。あるいは、細胞結合を二機能性のPEG架橋剤で改変することにより、反応性のジスルフィド部分例えばピリジルジスルフィドなどを導入し、次いでチオール含有メイタンシノイドで処理することにより複合体を得ることができる。もう一つの方法においては、細胞結合を、二機能性のPEG架橋剤で改変することにより、チオール部分を導入し、次いで反応性ジスルフィド含有メイタンシノイド例えばピリジルジスルフィドなどで処理することにより、複合体を得ることができる。切断不可能な結合をもつ抗体-薬剤複合体もまた調製することができる。そのような架橋剤は、当技術分野において記述されており例えば、それぞれが参照により本明細書にその全体が組み入れられている、ThermoScientificPierceCrosslinkingTechnicalHandbookおよび米国特許出願公開第20050169933号を参照のこと以下を含むが、これらに限定されない。N-スクシンイミジル4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートSMCC、SMCCLC-SMCCの長鎖類似体であるN-スクシンイミジル-4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシ-6-アミドカプロン酸、κ-マレイミドウンデカン酸NスクシンイミジルエステルKMUA、β-マレイミドプロパン酸N-スクシンイミジルエステルBMPS、γ-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステルGMBS、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルEMCS、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルMBS、N-α-マレイミドアセトキシ-スクシンイミドエステルAMAS、スクシンイミジル-6-β-マレイミドプロピオンアミドヘキサノアートSMPH、N-スクシンイミジル4-p-マレイミドフェニル-ブチラートSMPB、およびN-p-マレイミドフェニルイソシアナートPMPI、N-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミノベンゾアートSIAB、N-スクシンイミジルヨードアセタートSIA、N-スクシンイミジルブロモアセタートSBA、およびN-スクシンイミジル3-ブロモアセトアミドプロピオナートSBAP。好ましくは、抗体は、文献に記載される通り、1~10の反応基をを導入するために、スクシンイミジル4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシレートSMCC、スルホ-SMCC、マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルMBS、スルホ-MBSまたはスクシンイミジル-ヨードアセタートなどの架橋試薬で改変されるYoshitakeetalEurJBiochem101395399HashidaetalJAppliedBiochem5663、andLiuetalBiochem18690697。次いで、改変された抗体を、チオール含有メイタンシノイド誘導体と反応させることにより、複合体を得る。複合体は、SephadexG25カラムによるゲルろ過、または透析またはタンジェント流ろ過によって精製することができる。改変された抗体を、チオール含有メイタンシノイド1~2モル当量/マレイミド基で処理し、抗体-メイタンシノイド複合体をSephadexG-25カラムによるゲルろ過、セラミックハイドロキシアパタイトカラム上でのクロマトグラフィー、透析、またはタンジェント流ろ過、またはそれらの方法の組み合わせにより精製する。典型的には、抗体あたり、平均1~10メイタンシノイド類が結合している。好ましい方法としては、抗体をスクシンイミジル4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシレートSMCCで改変してマレイミド基を導入し、次いで改変された抗体をチオール含有メイタンシノイドと反応させ、チオエーテル結合複合体を得る。再び、抗体分子あたり1~10薬剤分子をもつ複合体が生じる。抗体、抗体断片、タンパク質ホルモン、タンパク質成長因子、および他のタンパク質のメイタンシノイド複合体を、同様にして得る。本発明のもう1つの態様においては、CD20抗体は、PEGスペーサーの媒介を通した切断不可能な結合により薬剤と結合している。薬剤と抗CD20抗体または断片の間のリンカーを形成する親水性PEG鎖を含む、適切な架橋試薬もまた、当分野において公知であるか、または、市販されている例えば、カンタナバイオデザイン社QuantaBiodesign、オハイオ州、パウエル、より入手可能。適切なPEG含有架橋剤もまた、市販されているPEG自体から、当業者に公知の標準的な合成化学技術を使用して、合成することができる。薬剤を二機能性のPEG含有架橋剤と、米国特許出願公開第20090274713号および国際公開第2009/0134976号に詳細に記載されている方法によって反応させることにより、以下の式、ZXlCH2CH2OnYpDで表される化合物を得、次いでその化合物を細胞結合剤と反応させることにより、複合体を得ることができる。あるいは、細胞結合を二機能性のPEG架橋剤で改変することによりチオール反応基マレイミドまたはハロアセトアミドなどを導入し、次いでそれをチオール含有メイタンシノイドで処理することにより、複合体を得ることができる。もう一つの方法において、細胞結合を二機能性のPEG架橋剤で改変することによりチオール部分を導入し、次いでそれをチオール反応性メイタンシノイドマレイミドまたはハロアセトアミドを有するメイタンシノイドなどで処理することにより、複合体を得ることができる。従って、本発明のもう一つの態様は、式IIまたは式II’:CB[XlCH2CH2OnYpD]mII[D-YpCH2CH2OnXl]m-CBII’で表される抗CD20抗体薬剤複合体であって、式中、CBは抗CD20抗体または断片を表し;Dは薬剤を表し;Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバマート結合、またはエーテル結合によって細胞結合剤に結合している、脂肪族、芳香族、または複素環の単位を表し;Yは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバマート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素-炭素結合、およびヒドラゾン結合から成る群より選択される共有結合によって薬剤に結合している、脂肪族、芳香族、または複素環の単位を表し;lは0または1であり;pは0または1であり;Mは、2~15の整数であり;およびnは整数1から2000の整数である。好ましくは、mは2~8の整数であり;および好ましくは、nは1~24の整数である。より好ましくは、mは2~6の整数である。また、さらにより好ましくは、mは3~5の整数である。また、より好ましくは、nは2~8の整数である。適切なPEG含有リンカーの例としては、抗CD20抗体またはその断片との反応のためのN-スクシンイミジルエステルまたはN-スルホスクシンイミジルエステル部分、ならびに化合物との反応のためのマレイミドまたはハロアセチルをベースとする部分を有するリンカーが挙げられる。PEGスペーサーは、本明細書に記載される方法によって、当分野で公知のいずれの架橋剤にも組み込むことができる。PEGスペーサーで組み込むことができるマレイミドをベースとする部分を含む架橋試薬としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。N-スクシンイミジル4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートSMCC、SMCCLC-SMCCの長鎖類似体であるN-スクシンイミジル-4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシ-6-アミドカプロン酸、κ-マレイミドウンデカン酸N-スクシンイミジルエステルKMUA、γ-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステルGMBS、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルEMCS、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルMBS、N-α-マレイミドアセトキシ-スクシンイミドエステルAMAS、スクシンイミジル-6-β-マレイミドプロピオンアミドヘキサノアートSMPH、N-スクシンイミジル4-p-マレイミドフェニル-ブチラートSMPB、およびN-p-マレイミドフェニルイソシアナートPMPI。ハロアセチルをベースとする部分を含む架橋試薬としては、N-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミノベンゾアートSIAB、N-スクシンイミジルヨードアセタートSIA、N-スクシンイミジルブロモアセタートSBA、およびN-スクシンイミジル3-ブロモアセトアミドプロピオナートSBAPが挙げられる。硫黄原子を欠く他の架橋試薬も使用することができる。そのようなリンカーは、ジカルボン酸をベースとする部分から誘導することができる。適切なジカルボン酸をベースとする部分としては、以下に示す一般式:HOOC-A’p-E’q-CH2CH2OnG’r-COOHで表されるα,ω-ジカルボン酸が挙げられるが、これらに限定されず、式中、A’は2~20炭素原子を有する任意の直鎖又は分枝アルキル、アルケニル、またはアルキニル基であり、E’は3~10個の炭素原子を有する任意のシクロアルキルまたはシクロアルケニル基であり、G’は6~10個の炭素原子を有する任意の置換または非置換の芳香族基、または置換または非置換の複素環基であり、ここで、ヘテロ原子は窒素、酸素または硫黄から選ばれ、またp、q、およびrはそれぞれ0または1であるが、p、q、およびrがすべて同時にゼロではなく、nは1~2000の整数である。本明細書に開示されるリンカーの多くは、米国特許出願公開第20050169933号および同第20090274713号、および国際公開第2009/0134976号に詳細に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。本発明はまた、抗CD20抗体またはその断片の改変後、および得られた薬剤複合体中の両方において電荷が保持される、荷電リンカーを提供する。より具体的には、本発明は、薬剤を抗CD20抗体に結合するための荷電リンカーの使用に関する。本発明の1つの態様において、荷電リンカーは、細胞結合剤を改変し、それらを薬剤に結合するために使用される。本発明のもう1つの態様において、荷電リンカーは、薬剤を改変し、それらを抗CD20抗体または断片に結合するために使用される。本発明のさらにもう1つの態様において、荷電リンカーは、薬剤と細胞結合剤を同時に結合するために使用される。すべての場合において、好ましい最終結果は、薬剤-荷電リンカー-細胞結合剤の複合体であり、その複合体は式、CB--Lc-Dqで表され、式中CBは抗CD20抗体またはその断片である細胞結合剤であり、Lcは荷電リンカーであり、Dは薬剤分子であり、およびqは1~20の整数である。細胞結合剤-薬剤複合体中のリンカーの中の荷電基の存在は、いくつかの利点、例えば、i最終生成物のより高い水溶性、iiより高濃度の水性溶液中で機能する能力、iii細胞結合剤の分子あたり、より多くの数の薬剤分子と結合し、結果としてより高い力価をもたらす能力、iv荷電複合体の種が標的細胞中に保持され、結果としてより高い力価をもたらす可能性、および、v荷電した薬剤種を細胞から排出することができなくなる、多剤耐性細胞の改善された感受性、などを提供する。本発明はまた、薬剤および細胞結合剤に結合することにより複合体を産生することができ、その複合体を細胞中で代謝することにより1つまたは複数の荷電部分を含む薬剤代謝産物を産生することができるリンカーについても記載している。これらのリンカーを、プロ-荷電prochargedリンカーと呼ぶ。セル処理後に荷電するリンカー部分を、プロ-荷電procharged部分と呼ぶ。本発明の一つの態様において、荷電またはプロ-荷電procharged架橋剤は、以下の式III:で表され、式中Y’は細胞結合剤と反応することができ、Qは細胞傷害性薬物と反応することができ;また、Y’は、抗CD20抗体またはその断片との反応を可能にする機能基を表し;Qは、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ペプチド、ヒドラゾン、エーテル、エステル、カルバミン酸またはアミド結合を介した細胞傷害性薬物の結合を可能にする機能基を表し;R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10は、同一または異なって、水素;1~6個の炭素原子を有する直鎖アルキル;3~6個の炭素原子を有する分枝または環状アルキル;2~6個の炭素原子を有する直鎖、分枝または環状アルケニルまたはアルキニル;限定されないが、SO3-、X-SO3-、OPO32-、X-OPO32-、PO32-、X-PO32-、CO2-などの陰イオン;および、限定されないが、窒素含有複素環、NR11R12R13またはX-NR11R12R13、またはフェニルなどの陽イオンであり、ここで、R11、R12およびR13は、同一または異なって、水素、1~6個の炭素原子を有する直鎖アルキル、または3~6個の炭素原子を有する分枝または環状アルキルであり、Xは1~6個の炭素原子を有するフェニルまたは直鎖アルキル、または3~6個の炭素原子を有する分枝または環状アルキルを表し;l、mおよびnは0または1~4の整数であり;およびAはフェニルまたは置換フェニルであって、ここで置換基は、1~6個の炭素原子を有する直鎖アルキル、または3~6個の炭素原子を有する分枝または環状アルキル、または限定されないがSO3-、X-SO3-、OPO32-、X-OPO32-、PO32-、X-PO32-、CO2-などの陰イオン、および、限定されないが窒素含有複素環、NR11R12R13またはX-NR11R12R13などの陽イオンから選ばれる荷電した置換基であり、ここでXは上記定義と同じであり、gは0または1であり;Zは式OCH2CH2pで表される任意のポリエチレンオキシ単位であり、式中、pは0または2~約1000の整数、または、E1およびE2が同一または異なってC=O、O、またはNR14であるF1-E1-P-E2-F2単位であり、ここでR14は水素、1~6個の炭素原子を有する直鎖アルキル、3~6個の炭素原子を有する分枝または環状アルキル、2~6個の炭素原子を有する直鎖、分枝または環状アルケニルまたはアルキニルであり;Pは、E1またはE2が、末端窒素、末端炭素を介して、またはペプチドのアミノ酸の一つの側鎖を介してペプチドに結合することができる、長さが2~20アミノ酸のペプチド単位であり;また、F1およびF2は、同一または異なって、式OCH2CH2pで表される任意のポリエチレンオキシ単位であり、式中、pは0または2~約1000の整数であり、但し、ZがF1-E1-P-E2-F2でない場合、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10の少なくとも一つは荷電した置換基であり、またはgが1の場合、A、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10の少なくとも1つは荷電した置換基である。これは、荷電リンカーを有する複合体の1つの例示的な実施形態である。他の実施例は、第2009-0274713号Ravi、etalとして公開された、米国特許出願第12/433604号に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。適切な荷電リンカーは、当分野において公知であり、例えば、その内容が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている該第20090274713号に記載されたものを含む。本発明は、例えばメイタンシノイドなどの約2~約8個の薬剤分子薬剤負荷が抗CD20抗体またはその断片に結合しており、同一の細胞結合剤に結合した、より少ないかまたはより多い数の薬剤の薬剤負荷と比べて、複合体の抗腫瘍効果がより一層有効である態様を包含する。本明細書で使用される薬剤負荷とは、細胞結合剤例えば、抗CD20抗体または断片に結合し得る、薬剤分子例えば、メイタンシノイドの数を表す。1つの態様において、細胞結合剤に結合し得る薬剤分子の数は、平均約2~約8個例えば、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1個であり得る。好ましい態様において、細胞結合剤に結合し得る薬剤分子の数は、平均約2~約7個例えば、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1であり得る。さらにより好ましい態様において、細胞結合剤に結合し得る薬剤分子の数は、平均約2~約6個例えば、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1であり得る。もっとも好ましい実施形態において、細胞結合剤に結合し得る薬剤分子の数は、平均約2~約5個例えば、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1であり得る。本明細書で使用される平均という用語は、抗CD20抗体またはその断片およびそれと結合した薬剤の吸光度の吸光分光測定により決定される。もう1つの態様において、薬剤と抗CD20抗体またはその断片の複合体は、式Dabout2-about8-L-Anti-CD20Abで表され、式中、Dは薬剤例えば、メイタンシノイド、タキサンまたはCC1065類似体、Lは切断可能なリンカー例えば、ジスルフィド交換によって切断可能なリンカーまたは、実質的に切断に対する耐性をもつリンカー例えば、細胞結合剤との反応とのために、N-スクシンイミジルエステルまたはN-スルホスクシンイミジルエステル部分、ならびにマレイミド-またはハロアセチル-をベースとする部分を有するリンカーから選ばれるリンカーであり、およびAnti-CD20Abは、本明細書に記載される、抗CD20と結合する抗体またはその断片である。好ましい要素において、薬剤細胞結合剤複合体例えば、免疫複合体は式Mayabout2-about8-L-Anti-CD20Abで表され、式中、Mayはメイタンシノイドであり、Lはリンカーであり、ここで前記リンカーは切断可能なリンカーまたは実質的に切断に対する耐性を持つリンカーであり;およびAnti-CD20Abは、本明細書に記載されるCD20と結合する抗体またはその断片である。本発明における使用に適切な薬剤は、本明細書に記載される細胞結合剤と結合し得る細胞傷害性薬物である。本発明の1つの態様は、以下を含む、改変された芳香環をもつ好適なメイタンシノールの類似体である:1C-19-デクロロ米国特許第4,256,746号LアンサマイトシンP2のLAH還元により調製;2C-20-ヒドロキシまたはC-20-デメチル/-C-19-デクロロ米国特許第4,361,650号および同第4,307,016号ストレプトマイセスStreptomycesまたはアクチノマイセスActinomycesを使用した脱メチル化、またはLAHを使用した脱塩素反応により調製;および3C-20-デメトキシ、C-20-アシルオキシ-OCOR、/-デクロロ米国特許第4,294,757号塩化アシルを使用したアシル化により調製を含む、改変された芳香環を有するメイタンシノールの適切な類似体である。他の位置の改変を有するメイタンシノールの適切な類似体の具体例としては、1C-9-SH米国特許第4,424,219号メイタンシノールとH2SまたはP2S5の反応により調製;2C-14-アルコキシメチルデメトキシ/CH2OR米国特許第4,331,598号;3C-14-ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチルCH2OHまたはCH2OAc米国特許第4,450,254号ノカルディア属Nocardiaから調製;4C-15-ヒドロキシ/アシルオキシ米国特許第4,364,866号ストレプトマイセスStreptomycesによるメイタンシノールの変換により調製;5C-15-メトキシ米国特許第4,313,946号および同第4,315,929号トレウィアヌディフローラTrewianudifloraより単離;6C-18-N-デメチル米国特許第4,362,663号および第4,322,348号ストレプトマイセスStreptomycesによるメイタンシノールの脱メチル化により調製;および74,5-デオキシ米国特許第4,371,533号メイタンシノールの三塩化チタン/LAH還元により調製。本発明において有用であるチオール含有メイタンシノイド類の合成は、米国特許第5208020号、同第5416,064号、および同第7,276,497号に詳細に開示されている。C-3位置、C-14位置、C-15位置、またはC-20位置にチオール部分を持つメイタンシノイド類はすべて有用である。C-3位置が好ましく、メイタンシノールのC-3位置が特に好ましい。また等しく好ましいのは、N-メチル-アラニン-含有C-3チオール部分メイタンシノイド、およびN-メチル-システイン-含有C-3チオール部分メイタンシノイド、およびそれぞれの類似体である。好ましいメイタンシノイド類は、米国特許第5,208,020号;同第5,416,064号;同第6,333410号;同第6,441,163号;同第6,716,821号;RE39,151号および7,276,497号に記載されているものである。これらのうち、N2’-デアセチル-N2’-3-メルカプト-1-オキソプロピル-メイタンシンDM1およびN2’-デアセチル-N2’-4-メルカプト-4-メチル-1-オキソペンチルメイタンシンDM4がこのましい。本発明の本態様において、例えば、本明細書に記載されるもののような、他の薬剤も使用することができる。他の実施例が、米国仮特許出願第61/049,296号および米国特許出願第12/574,430号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。抗CD20抗体またはその断片は、二機能性の架橋試薬を抗CD20抗体またはその断片と反応させることにより改変することができ、結果として、リンカー分子の抗CD20抗体またはその断片との共有結合が生じる。本明細書に使用される通り、二機能性架橋試薬は、本明細書に記載される薬剤などの、細胞結合剤を共有結合的に薬剤に結合させるあらゆる化学的な部分である。もう一つの方法において、結合部分linkingmoietyの一部は、薬剤によって提供される。この点において、薬剤は、細胞結合剤を薬剤と結合させるために使用されるより大きなリンカー分子の一部である結合部分linkingmoietyを含む。例えば、メイタンシノイドDM1を形成するために、メイタンシンのC-3ヒドロキシル基における側鎖は、改変されて遊離スルフヒドリル基SHを有する。このチオラート型のメイタンシンは、改変された細胞結合剤と反応して、複合体を形成することができる。従って、最終リンカーは、二つの成分から構築されるが、そのうち1つは架橋試薬によって供給され、もう1つはDM1からの側鎖によって供給される。薬剤分子は、血清アルブミンなどの中間担体分子を介して、抗体分子に結合することもできる。本明細書で使用される通り、細胞結合剤に結合したまたは抗CD20抗体または断片に結合したという表現は、適切な結合基またはその前駆体を介して細胞結合剤抗CD20抗体または断片に結合した、少なくとも1つの薬剤誘導体を含む複合体分子を表す。好ましい結合基はSMCCである。本発明において有用な特に好ましい細胞傷害性薬物は、メイタンシノイド類およびメイタンシノイド類似体である。適切なメイタンシノイド類の例としては、メイタンシノールのエステル類およびメイタンシノール類似体が挙げられる。メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体と同様に、微小管形成を阻害し、哺乳類細胞に非常に有毒なあらゆる薬剤が含まれる。適切なメイタンシノールエステル類の例としては、改変された芳香族環を有するもの、および他の位置における改変を有するものが挙げられる。そのような適切なメイタンシノイド類は、米国特許第4,424,219号;同第4,256,746号;同第4,294,757号;同第4,307,016号;同第4,313,946号;同第4,315,929号;同第4,331,598号;同第4,361,650号;同第4,362,663号;同第4,364,866号;同第4,450,254号;同第4,322,348号;同第4,371,533号;同第5,208,020号;同第5,416,064号;同第5,475,092号;同第5,585,499号;同第5,846,545号;同第6,333,410号;同第7,276,497号および同第7,473,796号に開示されている。改変された芳香族環を有するメイタンシノールの適切な類似体の具体例としては以下が挙げられる:1C-19-デクロロ米国特許第4,256,746号アンサミトシンP2のLAH還元により調製;2C-20-ヒドロキシまたはC-20-デメチル/-C-19-デクロロ米国特許第4,361,650号および同第4,307,016号ストレプトマイセスStreptomycesまたはアクチノマイセスActinomycesを使用した脱メチル化またはLAHを使用した脱塩素反応により調製;および3C-20-デメトキシ、C-20-アシルオキシ-OCOR、/-デクロロ米国特許第4,294,757号塩化アシル類を使用したアシル化により調製。他の位置の改変を有するメイタンシノールの適切な類似体の具体例としては以下が挙げられる:1C-9-SH米国特許第4,424,219号メイタンシノールとH2SまたはP2S5の反応により調製;2C-14-アルコキシメチルデメトキシ/CH2OR米国特許第4,331,598号;3C-14-ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチルCH2OHまたはCH2OAc米国特許第4,450,254号ノカルディア属Nocardiaから調製;4C-15-ヒドロキシ/アシルオキシ米国特許第4,364,866号ストレプトマイセスStreptomycesによるメイタンシノールの変換により調製;5C-15-メトキシ米国特許第4,313,946号および同第4,315,929号トレウィアヌディフローラTrewianudifloraより単離;6C-18-N-デメチル米国特許第4,362,663号および同第4,322,348号ストレプトマイセスStreptomycesによるメイタンシノールの脱メチル化により調製;および74,5-デオキシ米国特許第4,371,533号メイタンシノールの三塩化チタン/LAH還元により調製。好ましい態様において、本発明の複合体は、公式にはN2’-デアセチル-N2’-3-メルカプト-1-オキソプロピル-メイタンシンと呼ばれる、チオール含有メイタンシノイドDM1を、細胞傷害性薬物として利用する。DM1は、以下の構造式IV:で表される。好ましい態様において、本発明の複合体は、チオール含有メイタンシノイド、N2’-デアセチル-N2’4-メチル-4-メルカプト-1-オキソペンチル-メイタンシン例えば、DM4を細胞傷害性薬物として利用する。DM4は以下の構造式V:で表される。立体障害のあるチオール結合を含む側鎖を含む、他の好ましいメイタンシノイドは、以下の構造式VI:で表される、N2’-デアセチル-N-2’4-メルカプト-1-オキソペンチル-メイタンシンDM3と呼ばれるである。付加的なメイタンシノイド類としては、式VII-L、VII-D、またはVII-D、L:で表される化合物が挙げられ、式中、YはCR7R8lCR5R5mCR3R4nCR1R2SZを表し、ここで、R1およびR2はそれぞれ独立して、1~10個の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、3~10個の炭素原子を有する分枝または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環基であり、またさらにR1およびR2の1つは水素であり得;R3、R4、R5、R6、R7およびR8はそれぞれ独立して、水素、1~10個の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、3~10個の炭素原子を有する分枝または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり;l、mおよびnはそれぞれ独立して、1~5の整数であり、さらにnは0であり得;Zは水素、SRまたは-CORであり、ここでRは1~10個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキルまたはアルケニル、3~10個の炭素原子を有する環状アルキルまたはアルケニル、または非置換または置換アリールまたは複素環基であり;およびMayは、C-3、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシまたはC-20デスメチルに側鎖を有するメイタンシノイドを表す。式VII-L、VII-DおよびVII-D,Lの好ましい態様は、式VII-L、VII-DおよびVII-D,Lで表される化合物を含み、ここで、R1は水素であり、R2はメチルであり、R5、R6、R7、およびR8はそれぞれ水素であり、lおよびmはそれぞれ1であり、nは0であり、およびZは水素である。R1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7、R8はそれぞれ水素であり、lおよびmは1であり、nは0であり、およびZは水素である。R1は水素であり、R2はメチルであり、R5、R6、R7、R8はそれぞれ水素であり、lおよびmはそれぞれ1であり、nは0であり、およびZは-SCH3である。R1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7、R8はそれぞれ水素であり、lおよびmは1であり、nは0であり、およびZは-SCH3である。付加的なメイタンシノイド類には、式VIII:で表される化合物も含まれ、式中Yは式VIIで定義されたものと同じである。式VIIIの好ましい態様は、式VIIIで表される化合物を含み、ここで、R1は水素であり、R2はメチルであり、R5、R6、R7、およびR8はそれぞれ水素であり、lおよびmはそれぞれ1であり、nは0であり、およびZは水素である。R1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7、およびR8はそれぞれ水素であり、lおよびmは1であり、nは0であり、およびZは水素である。R1は水素であり、R2はメチルであり、R5、R6、R7、およびR8はそれぞれ水素であり、lおよびmはそれぞれ1であり、nは0であり、およびZはSCH3である。R1およびR2はメチルであり、R5、R6、R7、およびR8はそれぞれ水素であり、lおよびmは1であり、nは0であり、およびZはSCH3である。付加的なメイタンシン類はさらに、式IX-L、IX-D、またはIX-D、L:で表される化合物を含み、式中、Y2はCR7R8lCR9=CR10pC≡CqAoCR5R6mDuCR11=CR12rC≡CsBtCR3R4nCR1R2SZ2を表し、ここで、R1およびR2はそれぞれ独立して、1~10個の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、3~10個の炭素原子を有する分枝または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環基であり、さらにR1およびR2の1つが水素であり得;A、B、およびDはそれぞれ独立して、3~10個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、単純または置換アリール、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり;R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12はそれぞれ独立して水素、1~10個の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、3~10個の炭素原子を有する分枝または環状アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環基であり;l、m、n、o、p、q、r、s、およびtはそれぞれ独立して0または1~5の整数であり、但し、l、m、n、o、p、q、r、sおよびtの少なくとも2つは同時に0ではなく;およびZ2はSRまたは-CORであり、ここでRは1~10個の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、3~10個の炭素原子を有する分枝または環状アルキルまたはアルケニル、または単純または置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり;およびMayはメイタンシノイドである。式IXで表される化合物の好ましい態様は、R1が水素でありR2がメチルである、およびR1がメチルでありR2がメチルである化合物を含む。さらにメイタンシノイド類は、式X:で表される化合物を含み、式中、Y2’は式IXで定義されたY2と同じである。米国特許第5,208,020号および同第7,276,497号で教示された各メイタンシノイド類もまた、本発明の複合体に使用し得る。この点については、該米国特許第5,208,020号および同第7,276,697号の全開示が、参照により本明細書に組み入れられている。メイタンシノイド類の多くの位置が、結合部分linkingmoietyを化学的に結合する位置として機能し得る。例えば、C-3位置ヒドロキシル基を有する、ヒドロキシメチルで改変されたC-14位置、ヒドロキシで改変されたC-15位置、およびヒドロキシ基を有するC-20位置は、すべて有用であると期待される。しかし、C-3位置が好ましく、メイタンシノールのC-3位置が特に好ましい。好ましい複合体の構造的表象を以下に示す。このような抗体-メイタンシノイド複合体を製造するための、いくつかの開示は、米国特許第6,333,410号、並びに米国特許出願第09/867,598号、第10/161,651号及び第10/024,290号において提供される。一般に、抗体の水性バッファー中の溶液を、反応基を有するジスルフィド部分を有する、モル過剰量のメイタンシノイドとインキュベートしてもよい。反応混合物は、過剰のアミン例えば、エタノールアミン、タウリン等を加えることにより、反応を停止することができる。次いで、メイタンシノイド抗体複合体をゲルろ過により精製してもよい。抗体分子あたりの結合するメイタンシノイド分子の数は、252nm及び280nmにおける吸光度の比を分光光度法で測定することにより決定することができる。平均1~10メイタンシノイド分子/抗体分子が好ましく、平均2~5が更に好ましい。抗体のメイタンシノイド薬剤との複合体は、インビトロにおける種々の好ましくない細胞系の増殖を抑制する能力について評価することができる。例えば、ヒトリンパ腫細胞系Daudi及びヒトリンパ腫細胞系Ramosのような細胞系を、化合物の細胞毒性の評価のために容易に用いることができる。評価すべき細胞を化合物に4~5日間さらし、公知の方法による直接アッセイにおいて細胞の生存率を測定する。次いで、アッセイの結果からIC50値を計算することができる。米国仮出願番号61/150,201号に開示されたベンゾジアゼピン化合物例えば、インドリノベンゾジアゼピン類又はオキサゾリジノベンゾジアゼピン類、それらの誘導体、それらの中間体も、抗-CD20抗体画分又は複合体を調製するために用いることができる。有用なベンゾジアゼピン類には、二量体化合物が、細胞結合剤との結合を可能にする連結基を有していてもよい、式XIX、XX及びXXI式中、N及びCの間の二重線は単結合又は二重結合を表わし、ただし、二重結合である場合にはXは存在せず、YはHであり、単結合である場合には、XはH又は化合物をプロドラッグに変換させるアミン保護部分であり;Yは、-OR、-OCOR’により表わされるエステル、-OCOOR’により表わされるカルボネート、-OCONR’R’’により表わされるカルバメート、アミン又はNR’R’’により表わされるヒドロキシルアミン、-NRCOR’により表わされるアミド、NRCOPにより表わされるペプチドここで、Pはアミノ酸、又は2~20個のアミノ酸単位を含むポリペプチド、SR’により表わされるチオエーテル、SOR’により表わされるスルホキシド、-SO2R’により表わされるスルホン、亜硫酸塩-SO3、亜硫酸水素塩-OSO3、ハロゲン、シアノ、アジド又はチオールここで、R、R’、R’’は同一であるか又は異なり、H、置換されているか又は置換されていない、1~10個の炭素原子を有する直鎖、分岐又は環状アルキル、アルケニル又はアルキニルから選択される、ポリエチレングリコール単位-OCH2CH2nここで、nは1~2000の整数である、6~10個の炭素原子を有するアリール、3~10個の炭素原子を有する複素環ここで、置換基は、ハロゲン、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、SOR’により表わされるスルホキシド、-SO2R’により表わされるスルホン、亜硫酸塩-SO3、亜硫酸水素塩-OSO3、SO2NRR’により表わされるスルホンアミド、シアノ、アジド、-COR11、OCOR11又はOCONR11R12から選択されここで、R7、R8、R9、R10、R11及びR12は上記に定義された通りである。から選択され、R’’はOHであってもよく;Wは、C=O、C=S、CH2、BH、SO又はSO2であり;R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及びR4’は、それぞれ独立して、H、置換されているか又は置換されていない、1~10個の炭素原子を有する直鎖、分岐又は環状アルキル、アルケニル又はアルキニル、ポリエチレングリコール単位-OCH2CH2nここで、nは1~2000の整数である、又はハロゲン、グアニジウム-NHC=NHNH2、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、SOR’により表わされるスルホキシド、-SO2R’により表わされるスルホン、亜硫酸塩-SO3、亜硫酸水素塩-OSO3、SO2NRR’により表わされるスルホンアミド、シアノ、アジド、-COR11、OCOR11又はOCONR11R12から選択されここで、R7、R8、R9、R10、R11及びR12は、それぞれ独立して、H、1~10個の炭素原子を有する直鎖、分岐又は環状アルキル、アルケニル又はアルキニル、ポリエチレングリコール単位-OCH2CH2nここで、nは1~2000の整数である、6~10個の炭素原子を有するアリール、3~10個の炭素原子を有する複素環から選択される、場合により、R10はSR13又はCOR13でありここで、R13は、1~10個の炭素原子を有する直鎖、分岐又は環状アルキル、アルケニル又はアルキニル、ポリエチレングリコール単位-OCH2CH2nここで、nは1~2000の整数である、6~10個の炭素原子を有するアリール、3~10個の炭素原子を有する複素環から選択される、場合により、R11はOR14でありここで、R14は、Rと同じ定義を有し、場合により、R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及びR4’の任意の1つは、共有結合により細胞結合剤と連結可能な連結基であり、又は細胞結合剤と連結可能な連結基を有していてもよい、ポリピロロ、ポリ-インドリル、ポリ-イミダゾリル、ポリピロロ-イミダゾリル、ポリ-ピロロ-インドリル又はポリイミダゾロ-インドリル単位である;Zは、CH2nここで、nは1、2又は3である、CR15R16、NR17、O又はSでありここで、R15、R16及びR17は、それぞれ独立して、H、1~10個の炭素原子を有する直鎖、分岐又は環状アルキル、ポリエチレングリコール単位-OCH2CH2nここで、nは1~2000の整数であるから選択され;R6は、OR、SR又はNRR’でありここで、R及びR’は上記に定義された通りである;X’は、CH2、NR、CO、BH、SO又はSO2から選択されここで、Rは上記と同じ定義を有する;Y’は、O、CH2、NR又はSでありここで、Rは、上記と同じ定義を有する;Z’はCH2又はCH2nでありここで、nは2、3又は4であり、ただし、X’、Y’及びZ’は、全てが同時にCH2ではなく;A及びA’は同一であるか又は異なり、O、-CRR’O、S、-CRR’S、-NR15又はCRR’NHR15から選択されここで、R及びR’は上記と同じ定義を有し、R15は、Rに対する上記と同じ定義を有する;D及びD’は同一であるか又は異なり、それぞれ独立して、ハロゲン、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、SOR’により表わされるスルホキシド、-SO2R’により表わされるスルホン、亜硫酸塩-SO3、亜硫酸水素塩-OSO3、SO2NRR’により表わされるスルホンアミド、シアノ、アジド、-COR11、OCOR11又はOCONR11R12から選択されるここで、R7、R8、R9、R10、R11及びR12は、上記に定義した通りである任意の1つで置換されていてもよい、1~10個の炭素原子を有する直鎖、分岐又は環状アルキル、アルケニル又はアルキニル、ポリエチレングリコール単位-OCH2CH2nここで、nは1~2000の整数であるから選択され;Lは、置換されていてもよい3~10個の炭素原子を有するフェニル基又は複素環であってもよく、前記置換基は、共有結合により細胞結合剤と連結可能な連結基であり、又はハロゲン、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、SOR’により表わされるスルホキシド、-SO2R’により表わされるスルホン、亜硫酸塩-SO3、亜硫酸水素塩-OSO3、SO2NRR’により表わされるスルホンアミド、シアノ、アジド、-COR11、OCOR11又はOCONR11R12から選択されるここで、R7、R8、R9、R10、R11及びR12は、上記に定義した通りであるの任意の1つで置換されていてもよい、1~10個の炭素原子を有する直鎖、分岐又は環状アルキル、アルケニル又はアルキニル、ポリエチレングリコール単位-OCH2CH2nここで、nは1~2000の整数であるから選択され;場合により、L自体が共有結合により細胞結合剤と連結可能な連結基であるの化合物、その薬学的に許容される溶媒和物、塩、水和物又は水和塩、その光学異性体、ラセミ化合物、ジアステレオマー、エナンチオマー又はそれらの化合物の多形結晶構造が含まれるただし、化合物は、共有結合により細胞結合剤と連結可能な1つ又はそれ以上の連結基を有しない。好ましい一態様においては、N及びCの間の二重線が単結合又は二重結合を表し、ただし、二重結合である場合にはXは存在せず、YがHであり、単結合である場合には、XはH又は化合物をプロドラッグに変換させるアミン保護部分であり;Yが、-OR、NR’R’’、亜硫酸塩-SO3、又は亜硫酸水素塩-OSO3でありここで、Rは、H、1~10個の炭素原子を有する、直鎖、分岐、又は環状アルキル、アルケニル又はアルキニル、ポリエチレングリコール単位-OCH2CH2nここで、nは1~2000の整数である、6~10個の炭素原子を有するアリール、3~10個の炭素原子を有する複素環から選択され;Wが、C=O、CH2又はSO2であり;R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及びR4’が、それぞれ独立して、H、NO2、又は共有結合により細胞結合剤と連結可能な連結基から選択され;R6がOR18でありここで、R18はRと同じ定義を有する;Zが、CH2nここで、nは1、2又は3である、CR15R16、NR17、O又はSでありここで、R15、R16及びR17は、それぞれ独立して、H、1~10個の炭素原子を有する、直鎖、分岐又は環状アルキルである、ポリエチレングリコール単位-OCH2CH2nここで、nは1~2000の整数であるから選択され;X’が、CH2、又はC=Oから選択され;Y’が、O、NR又はSでありここで、Rは前記に定義した通りである;Z’が、CH2又はCH22であり;A及びA’が、それぞれOであり;D及びD’が同一であるか、又は異なり、1~10個の炭素原子を有する、直鎖、分岐、又は環状アルキル、アルケニル又はアルキニルから独立して選択され;Lが、置換されていてもよい3~10個の炭素原子を有するフェニル基又は複素環であってもよく、前記置換基は、共有結合により細胞結合剤と連結可能な連結基であり、又はハロゲン、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、SOR’により表わされるスルホキシド、-SO2R’により表わされるスルホン、亜硫酸塩-SO3、亜硫酸水素塩-OSO3、SO2NRR’により表わされるスルホンアミド、シアノ、アジド、-COR11、OCOR11又はOCONR11R12の任意の1つで置換されていてもよい、1~10個の炭素原子を有する直鎖、分岐又は環状アルキル、アルケニル又はアルキニル、ポリエチレングリコール単位-OCH2CH2nここで、nは1~2000の整数であるから選択され;場合により、L自体が共有結合により細胞結合剤と連結可能な連結基である;の化合物、その化合物の薬学的に許容される溶媒和物、塩、水和物又は水和塩、その光学異性体、ラセミ化合物、ジアステレオマー、エナンチオマー又はそれらの多形結晶構造。本発明の化合物の他の好ましい態様は、式XXII:式中、N及びCの間の二重線は単結合又は二重結合を表し、ただし、二重結合である場合にはXは存在せず、YがHであり、単結合である場合には、XはH又は化合物をプロドラッグに変換させるアミン保護部分であり;Yは、OH、-ORにより表わされるエーテル、亜硫酸塩-SO3、又は亜硫酸水素塩-OSO3から選択されここで、Rは、1~10個の炭素原子を有する、直鎖、分岐、又は環状アルキル、アルケニル又はアルキニルから選択され、R2、R3の1個は、共有結合により細胞結合剤と連結可能な連結基であり、他はHである;L’、L’’又はL’’’の1つは、細胞結合剤と連結可能な連結基であり、他はHであり;好ましくはL’は連結基であり、GはCH又はNであるにより表わされる。他の例は、米国特許出願第61/150,201号に開示されており、その全体の開示は参照により本明細書に組み入れられる。本発明の細胞毒性複合体において用いられる細胞傷害性薬物は、タキサン又はその誘導体であってもよい。タキサンは、癌の治療に広く用いられている2種の化合物、細胞毒性天然産物であるパクリタクセルTaxol、及び半合成誘導体であるドセタキセルTaxotereが含まれる化合物群である。タキサン類は、チューブリンの脱重合を阻害し、その結果、細胞死をもたらす紡錘体毒である。ドセタキセル及びパクリタクセルは癌の治療において有用な薬剤であるが、それらの抗腫瘍活性は、正常細胞に対する、それらの非特異的毒性のために限界がある。更に、パクリタクセル及びドセタキセルのような化合物自体は、本発明の抗-CD20抗体及びその断片のような細胞結合剤の複合体において有用であるほど十分に強力でない。本発明において用いるのに適したタキサン類は、米国特許第6,372,738号及び第6,340,701号に開示されている。本発明のタキサン類及び細胞結合剤の複合体は、現在公知である、又は後で開発される技術のいずれかを用いて形成することができる。多くの結合法が、米国特許第5,416,064号及び第5,475,092号に教示されている。タキサン類は、第7,598,290号、第20090099336号、第20070031402号、第20060233814号、第20060233811号、第20050123549号、第20050085513号、及び第20040039176号にも教示されており、その全体の開示は参照により本明細書に組み入れられる。CC-1065及びその類似体も、本発明において用いるための好ましい細胞傷害性薬物である。CC-1065及びその類似体は、米国特許第6,372,738号;第6,340,701号;第5,846,545号;第5,585,499号に開示されている。CC-1065は、ストレプトマイセスゼレンシスStreptomyceszelensisの培養液から分離された、強力な抗腫瘍抗生物質である。CC-1065は、インビボにおいて、ドキソルビシン、メトトレキセート及びビンクリスチンのような一般に用いられている抗癌剤よりも約1000倍以上強力であるB.K.Bhuyanら.,CancerRes.,42,3532-35371982。デュオカルマイシンは、本発明において用いられるのに適切な細胞傷害性薬物であり、先行技術、例えば、米国特許第6,281,354号;第6,066,742号;第5,703,080号;第4,994,578号;第4,923,990に開示されている。各文献は、全体が参照として本明細書に組み入れられる。カリケアマイシンのようなエンジイン類は、本発明において用いられるのに適切な細胞傷害性薬物であり、先行技術、例えば、米国特許第5,436,361号;第5,053,394号;及び第20090105461号に開示されている。各文献は、全体が参照として本明細書に組み入れられる。ドラスチン類、及びアウリスタチン類を含むドラスチン類似体は、本発明において用いられるのに適切な細胞傷害性薬物であり、先行技術、例えば、米国特許第7,084,110号;第6,737,409号;第6,686,445号;第6,632,795号;第6,458,765号;第6,323,315号;第6,248,865号;第6,239,104号;第6,143,721号;第6,103,698号;第6,034,065号;第5,985,837号;第5,965,537号;第5,886,147号;第5,554,725号;第5,138,036号;第5,076,973号;第4,986,988号;第4,978,744号;及び第4,879,278号に開示されている。各文献は、全体が参照として本明細書に組み入れられる。トママイシン誘導体は、本発明において用いられるのに適切な細胞傷害性薬物であり、先行技術、例えば、米国特許第4,427,588号、Arimaら,J.Antibiotics,vol.25,No.8,pp.437-444,1972;Kariyoneら,Chem.Pharm.Bull.,vol.19,No.11,pp.2289-2293,1971;及びLeimgruber,J.Am.Chem.Soc.,vol.90,pp.5641-5643,1968に開示されている。各文献は、全体が参照として本明細書に組み入れられる。レプトマイシン誘導体は、本発明において用いられるのに適切な細胞傷害性薬物であり、先行技術、例えば、米国特許第7,446,196号;Kudoら,ExperimentalCellResearch,1998,2422,54-546;Kuhntら,AppliedEnvironmentalMicrobiology,1998,642,714-720;米国特許出願第10/856,703号;Carlら,J.Med.Chem.1981,243,479-480,ANovelConnectorLinkageApplicableinProdrugDesign;ChemicalAbstractsNo.105:102629日本国特許出願公開特開昭61-109717A2の要約1986;Dohertyら,J.Nat.CancerInst.2003,9524,1859-1868,CellCycleCheckpointFunctioninBladderCancer;Fukudaら,Nature1997,390,308-311,CRM1は、核外搬出シグナルに介在される細胞内輸送に関与しているCRM1isresponsibleforintracellulartransportmediatedbythenuclearexportsignal;Hamamotoら,J.Antibiotics1983,366,639-645,レプトマイシンA及びB、新規抗真菌剤抗生物質I.生産株の分類及びその発酵、精製及び特徴づけLeptomycinsAandB,NewAntifungalAntibioticsI.TaxonomyoftheProducingStrainandTheirFermentation,PurificationandCharacterization;Hayakawaら.,J.Antibiotics1987,409,1349-1352,新規抗腫瘍抗生物質.アングイノマイシンA及びBNewAntitumorAntibiotics,AnguinomycinsAandB;Inoueら,J.Biol.Chem.2002,27717,15053-15060,p53関連蛋白質p73における、核内及び核外輸送のシグナルNuclearImportandExportSignalsinControlofthep53-relatedProteinp73;Kobayashiら,Ensho,Saisei2004,245,578-583,皮膚炎症におけるマトリクスメタノプロテイナーゼ9の発現の役割:レプトマイシンBの塗布による考え得る治療Roleofmatrixmetalloproteinase-9expressiononcutaneousinflammation:possibletreatmentbyleptomycinBapplication要約;Komiyamaら,J.Antibiotics1985,382,220-223,新規抗腫瘍抗生物質、カズサマイシンの構造研究StructuralStudyofaNewAntitumorAntibiotic,Kazusamycin;Komiyamaら,J.Antibiotics1985,382,224-229,新規抗生物質、カズサマイシンの抗腫瘍活性AntitumorActivityofaNewAntibiotic,Kazusamycin;Komiyamaら,J.Antibiotics1985,383,427-429,レプトマイシンBの抗腫瘍活性AntitumoractivityofleptomycinB;Kudoら,Exp.CellRes.1998,242,540-547,CRM1への直接結合による、シグナル介在性核外輸送のレプトマイシンBによる阻害LeptomycinBInhibitionofSignalMediatedNuclearExportbyDirectBindingtoCRM1;Kudoら,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA1999,963,9112-9117,レプトマイシンBは、中央保存領域におけるシステイン残基における共有結合修飾により、CRM1/エクスポーチンを不活性化するLeptomycinBinactivatesCRM1/exportin1bycovalentmodificationatacysteineresidueinthecentralconservedregion;Kuhntら,AppliedEnviron.Microbiol.1998,642,714-720,レプトマイシンBによる、微生物変換生成物MicrobialConversionProductsofLeptomycinB;Laneら,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA2000,97,8501-8506,小分子による、子宮頸癌中のp53の活性化Activationofp53incervicalcarcinomacellsbysmallmolecules;Marabeseら.,NucleicAcidsRes.20033122,6624-6632,DNAの損傷は、E2F1におけるC-EBPaの抑制を除去することにより、p73の転写活性化を誘導するDNAdamageinducestranscriptionalactivationofp73byremovingC-EBParepressiononE2F1;Meissnerら,FEBSLetters2004,5761-2,27-30,ラトジャドン及びレプトマイシンBは、同一のメカニズムによりCRM1-依存性核外輸送を遮断するRatjadoneandleptomycinBblockCRM1-dependentnuclearexportbyidenticalmechanisms要約;Nishiら,J.Biol.Chem.1994,2699,6320-6324,レプトマイシンBは、分裂酵母核蛋白質である、高次構造の染色体構造及び遺伝子発現に関与するcrm1の調節カスケードを標的とするLeptomycinBTargetsaRegulatoryCascadeofcrm1,aFissionYeastNuclearProtein,InvolvedinControlofHigherOrderChromosomeStructureandGeneExpression;Peehlら,Prostate2003,54,258-267,レプトマイシンBは、原発性前立腺上皮細胞内のp53を活性化し、LNcaP細胞系内でアポトーシスを誘発するLeptomycinBStabilizesandActivatesp53inPrimaryProstaticEpithelialCellsandInducesApoptosisintheLNCaPCellLine;及び2004年12月6日にアクセスした、UniversityofDundee,Dept.SurgeryMolecularOncology,LainGroupのウェブサイト、http://www.dundee.ac.uk/surgery/Non-Genotoxic.htm,p53腫瘍抑制機能の遺伝毒性のない活性化Non-genotoxicactivationofthep53tumorsuppressorfunctionに開示されている。各文献は、全体が参照として本明細書に組み入れられる。本発明の他の態様においては、siRNA分子は、薬剤に代わり、本発明の抗体に連結し得る。siRNAsは、オリゴヌクレオチドの修飾のために通常に用いられている方法により、本発明の抗体に連結し得る例えば、米国特許出願公開第20050107325及び第20070213292号を参照されたい。従って、その3’又は5’-ホスホラミダイト型内のsiRNAは、siRNAと架橋剤との間のエステル結合を与えるために、ヒドロキシル感応基を有する架橋剤の一方の末端と反応させることができる。同様に、siRNAホスホラミダイトと末端アミノ基を有する架橋剤との反応は、アミンを介したsiRNAへの架橋剤の連結をもたらす。また、siRNAは、標準的な化学的手法により、チオ基を導入するように誘導体化され得る。このチオール含有siRNAは抗体と反応し、活性なジスルフィド又はマレイミドを導入するように修飾され、開裂可能又は開裂不可能な複合体を産生し得る。1~20個のsiRNA分子は、この方法により抗体と連結し得る。診断及び研究用途本明細書で議論する抗体の治療的使用に加え、本発明の抗体及び/又は断片は、多くの公知の診断及び研究用途に使用することができる。本発明の抗体及び又は断片は、例えば、インビボ及びインビボの療法の診断法に含まれる、CD20の精製、検出及び標的化に用いることができる。例えば、抗体及び/又はその断片は、生物学的試料中の細胞により発現するCD20のレベルを定性的及び定量的に測定するための免疫アッセイにおいて用いることができる。例えば、全体が本明細書に参照として組み入れられる、Harlowら,Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1988を参照されたい。本発明の抗体は、例えば、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイにおいて用いることができるZola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,pp.147-158CRCPress,Inc.,1987。例えば、本発明は、CD20が介在する病状を有するか、有することが疑わしいことが知られている患者におけるCD20を検出するための診断法において用いるために、後述するような、検出可能に標識された、上記抗-CD20ペプチド及び抗体をも提供する。本発明の抗-CD20ペプチド及び/又は抗体は、試料中のCD20又は抗-CD20抗体を検出又は定量する免疫アッセイに有用である。CD20のための免疫アッセイは、通常、CD20に選択的に結合し得る、検出可能に標識された、本発明の高親和性抗-CD20ペプチド及び/又は抗体の存在下に生物学的試料をインキュベートすること、並びに試料中で結合する標識されたペプチド又は抗体を検出することを含む。当該技術分野において、例えば、Immunoassaysforthe80’s,A.Vollerら著,UniversityPark,1981において開示されたような、種々の臨床的検査手技が周知である。従って、抗-CD20ペプチド又は抗体又はその断片を、ニトロセルロース、又は細胞、細胞粒子若しくは可溶性蛋白質を固定化し得る、他の固体支持体に加えることができる。次いで、支持体を適切なバッファーで洗浄し、次いで検出可能に標識されたCD20-特異的ペプチド、又は抗体若しくはその断片で処理する。次いで、固相担体をバッファーで洗浄し、二度目には、結合していないペプチド又は抗体若しくはその断片を除去する。次いで、固相支持体上の結合したラベルの量を、公知の方法段階により検出し得る。固体支持体又は担体は、ペプチド、抗原、又は抗体若しくはその断片を結合し得る任意の担体を意味する。周知の支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及びマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性であっても、不溶性であってもよい。支持体材料は、結合した分子が、CD20、又は抗-CD20抗体若しくはその断片に結合し得る限り、任意の可能な構造配置を有していてもよい。従って、支持体の構造は、ビーズのような球状、試験管の内面又は棒の外面のような円筒形状であってもよい。また、表面は、シート、培養皿、試験紙等のような平面であってもよい。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが含まれる。当業者は、抗体若しくはその断片、ペプチド又は光源を結合するための他の多くの適切な担体を知り、所定の実験により同じものを確認することができるであろう。周知の方法段階により、所望の大量の抗-CD20ペプチド及び/又は抗体若しくはその断片の結合活性を検出することができる。当業者は、所定の実験により、有効かつ最適なアッセイ条件を決定することができる。CD20-特異的ペプチド及び/又は抗体若しくはその断片を検出可能に標識することは、酵素免疫測定法EIA又は酵素免疫吸着測定法ELISAにおいて用いるための酵素に連結することにより達成され得る。連結した酵素は、露出した基質と反応し、例えば、分光光度法、蛍光分析法又は視覚による手段によって検出し得る、化学的部分を生成する。本発明のCD20-特異的抗体若しくはその断片を検出可能に標識するための用い得る酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ-グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。CD20-特異的抗体及び/又はその断片を放射性物質で標識することにより、放射免疫測定法RIAの使用により、CD20を検出することが可能である例えば、Workら,LaboratoryTechniquesandBiochemistryinMolecularBiology,NorthHollandPublishingCompany,N.Y.1978を参照されたい。放射性同位元素は、ガンマカウンター又はシンチレーションカウンターを使用する手段、又はオートラジオグラフィーにより検出することができる。本発明の目的のために特に有用な同位元素は:3H、125I、131I、35S、14Cであり、好ましくは125Iである。CD20-特異的抗体及び又はその断片を、蛍光化合物により標識することも可能である。蛍光標識された抗体が適切な波長の光にさらされると、その存在は蛍光のために検出することができる。最も一般的に用いられる蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド及びフルオレスカミンである。CD20-特異的抗体又はその断片は、125Euのような蛍光放射金属、又はランタニド系列の他のものを用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ五酢酸DTPA又はエチレンジアミン四酢酸EDTA等の金属キレート基を用いて、CD20-特異的抗体又はその断片に結合し得る。CD20-特異的抗体又はその断片は、化学発光化合物との結合によって検出可能に標識することもできる。次いで、化学反応の経過の際に上昇する発光の存在を検出することにより、化学発光標識された抗体を検出する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、サロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。同様に、本発明のCD20-特異的抗体、その断片若しくは誘導体を標識するために、生物発光化合物を用いることができる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を上昇させる、生体系中に見出されるタイプの化学発光である。発光の存在を検出することにより、生物発光タンパク質の存在を検出する。標識の目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。CD20-特異的抗体、その断片若しくは誘導体の検出は、例えば、検出可能な標識が放射性ガンマ線放出体である場合はシンチレーションカウンターにより、標識が蛍光物質である場合は蛍光光度計により実施する。酵素標識の場合、検出は、酵素についての基質を使用する比色分析法により実施することができる。検出は、同様に調製した標準品と比較し、基質の酵素反応の程度の視覚的比較により実施することもできる。本発明の目的のために、上記アッセイにより検出されるCD20は、生物学的試料中に存在し得る。CD20を含む、あらゆる試料を用いることができる。好ましくは、試料は、例えば、血液、血清、リンパ液、尿、炎症性滲出液、脳脊髄液、羊水、組織抽出物又はホモジネート等の体液である。しかし、本発明は、これらの試料を用いるアッセイに限定されず、当業者は、適切な条件を決定し、他の試料の使用を可能にすることができる。その場における検出は、患者から組織学的標本を除去し、このような標本に本発明の標識された抗体の組合せを提供することにより実施することができる。抗体又はその断片は、好ましくは、標識された抗体又はその断片を、生物学的試料に塗布又はかぶせることにより提供される。このような手段を用いることにより、CD20の存在のみならず、検査した組織内のCD20の分布をも検出することが可能である。本発明を用いることにより、当業者は、このようなインサイチューにおける検出を実施するために、多種多様の組織学的方法例えば、染色法を修飾することができることを容易に理解するであろう。本発明の抗体又はその断片は、ツーサイト又はサンドウィッチアッセイとしても知られている免疫測定法における利用に適合し得る。通常の免疫測定法においては、ある量の標識されていない抗体又はその断片を、試験を行う液体中で不溶性の固体支持体に結合させ、ある量の検出可能に標識された可溶性抗体を加え、固相抗体、抗原及び標識抗体の間に形成された三元複合体の検出及び/又は定量化を可能にする。通常、また好ましくは、免疫測定法には、固相に結合した抗体を、試験を行う試料と最初に接触させ、二成分の固相抗体-CD20複合体の形成により、試料からCD20を抽出する、フォワードアッセイが含まれる。適切なインキュベーション時間の後、固体支持体を洗浄し、未反応のCD20を含む液体試料の残渣を除去し、次いで、既知量の標識抗体レポーター分子として機能するを含む溶液と接触させる。2度目のインキュベーションの後、標識抗体と、未反応の抗体又はその断片を介して固体支持体に結合したCD20との複合体を形成し、固体支持体を2度洗浄し、未反応の標識抗体又はその断片を除去した。このタイプのフォワードサンドウィッチアッセイは、CD20が存在するか否かを決定するための簡単な陽/陰のアッセイであるか、又は標識抗体又はその断片の量を、既知量のCD20を含む標準試料について得られたものと比較することにより定量することができる。このようなツーサイト又はサンドウィッチアッセイは、WideRadioimmuneAssayMethod,Kirkham編,Livingstone,Edinburgh,1970,pp.199-206により開示されている。CD20のためにも有用であり得る1つのタイプのサンドウィッチアッセイは、いわゆる同時及びリバースアッセイである。同時アッセイは、固体支持体に結合した抗体、及び標識抗体を、いずれも試験を行う試料に同時に加える、1回のインキュベーション工程を含む。このインキュベーションが完了した後、固体支持体を洗浄し、残りの液体試料及び複合体を形成していない標識抗体を除去する。次いで、従来のフォワードサンドウィッチアッセイにおけるようにして、固体支持体と結合する標識抗体の存在を検出する。リバースアッセイにおいては、標識抗体の溶液を最初に液体試料に滴下して加え、次いで、適切なインキュベーション時間の後に、固体支持体に結合した未標識抗体を添加することが利用される。2度目のインキュベーションの後、固相を従来の方法により洗浄し、試験を行う試料の残渣及び未反応の標識抗体の溶液を除去する。次いで、固体支持体に結合する標識抗体の検出を、同時及びフォワードアッセイにより実施する。一つの態様においては、分離エピトープについて特異的な本発明の抗体の組合せを用いて、感受性のスリーサイト免疫放射測定アッセイを構築することができる。本発明の抗体又はその断片は、インビボにおける画像処理にも有用である。放射線不透過剤又は放射性同位元素のような、検出可能な部分で標識した抗体又はその断片を被験者に、好ましくは血流に投与し、宿主内の標識抗体の存在及び位置をアッセイする。画像処理技術は、悪性腫瘍の病期診断及び治療に有用である。抗体又はその断片は、宿主内で、核磁気共鳴、放射線医学、又は当該技術分野において公知の他の検出法により、検出可能な任意の部分で標識される。標識は、直接的又は間接的に検出可能なシグナルを生成し得る、任意の検出可能な部分であってもよい。例えば、標識は、ビオチン標識、酵素標識例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ、放射標識例えば、3H、14C、32P、35S及び125I、蛍光又は化学発光化合物例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンのようなフルオロフォア、造影剤例えば、Tc-m99及びインジウム111In及び金属イオン例えば、ガリウム及びユーロピウムであってもよい。抗体又はその断片を標識と結合させるための当該技術分野における、あらゆる方法を使用することができ、これらは、Hunterら,1962,Nature144:945;Davidら,1974,Biochemistry13:1014;Painら,1981,J.Immunol.Meth.40:219;Nygren,J.,1982,Histochem.andCytochem.30:407により開示された典型的な方法を含む。本発明の抗体又はその断片は、細胞内におけるCD20の機能の阻害に基づき、生物学的研究における試薬としても有用である。本発明の抗体又はその断片は、親和性生成試薬としても有用である。この過程においては、例えば、当該技術分野において周知の方法を用いて、抗体を適切な支持体、例えば、Sephadex樹脂又はろ紙に固定化する。従って、CD20は、生物学的試料から分離され、精製され得る。本発明は、更に、本発明の抗体若しくはその断片、又はそのエピトープ結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、CD20と結合し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に、本発明の抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをも包含し、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、6×SSC、0.5SDS、5×デンハート溶液、及び100μg/mLの熱変性したサケ精子DNA中、60°Cで2時間プレハイブリダイゼーションし;60°Cで18時間ハイブリダイゼーションし;4×SSC、0.5SDS、0.1ピロリン酸ナトリウム中で30分間、2回洗浄し、2×SSC、0.1SDS中、60°Cで30分間、2回洗浄することを含む。ポリヌクレオチドが得られ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知の任意の方法により決定することができる。例えば、本明細書に示される抗体又はその断片のヌクレオチド配列を用い例えば、Kutmeierら、1994,BioTechniques17:242、化学的に合成したオリゴヌクレオチドから抗体をコードするヌクレオチドを組み立てることができる。すなわち、抗体をコードする配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリング及び連結し、次いでPCRによる連結オリゴヌクレオチドを増幅することを含む。抗-CD20抗体を含む組換えベクターの構築、又は配列、並びに適切な転写及び翻訳制御シグナルをコードする断片の構築のための方法は当該技術分野において周知である。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組み換えが含まれる。従って、本発明は、プロモーターに動作可能に連結した、本発明の抗体分子、又はその重若しくは軽鎖、又は重若しくは軽鎖可変領域、又はそれらのエピトープ結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。組換えベクターを、従来の技術により宿主細胞に形質移入し、次いで、従来の技術により形質移入細胞を培養し、本発明の抗体を生産させる。従って、本発明は、異種プロモーターに動作可能に連結した、本発明の抗体、又はそのエピトープ結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を包含する。好ましい態様においては、重及び軽鎖の両方をコードするベクターは、完全な免疫グロブリン分子を発現するために、宿主細胞内で共発現し得る。本発明の抗-CD20抗体又は断片分子を発現させるために、種々の宿主-発現ベクター系を利用することができる。このような宿主-発現系は、興味のあるコード配列が生成され、次いで精製されるが、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換又は形質移入された場合に、インサイチューで本発明の抗体分子を発現し得る細胞を示す、媒体を表す。これらには、抗体コード配列を含む、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌例えば大腸菌、枯草菌のような微生物;抗体コード配列を含む、組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母例えば、サッカロミセス、ピチア;抗体コード配列を含む組換えウィルス発現ベクター例えばバキュロウィルスで感染させた昆虫細胞系;組換えウィルス発現ベクター例えばカリフラワーモザイクウィルス、CaMV;タバコモザイクウィルス、TMVで感染させた、又は抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター例えばTiプラスミドで形質転換した植物細胞系;又は哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター例えばメタロチオネインプロモーター又は哺乳類ウィルス由来のプロモーター例えばアデノウィルス遅発性プロモーター;ワクシニアウィルス7.5Kプロモーターを含む組換え発現構築物を含む哺乳類細胞系例えばCOS、CHO、BHK、293、3T3細胞が含まれる。好ましくは、大腸菌のような細菌細胞、より好ましくは真核細胞が、組換え抗体分子の発現のために、特に完全な組換え抗体分子の発現のために用いられる。例えば、ヒトサイトメガロウィルスからの主要中間体初期遺伝子プロモーター要素のようなベクターと併用される、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOのような哺乳動物細胞が、抗体の効果的な発現系であるFoeckingら,1986,Gene45:101;Cockettら,1990,Bio/Technology8:2。組換えタンパク質の長期の高収率生産のためには、安定した発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞系が作出され得る。ウィルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりはむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御因子例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等及び選択可能マーカーにより制御されたDNAで形質転換することができる。外来DNAの導入後、作出された細胞を改良培地で1~2日間増殖し、次いで選択培地に移す。組換えプラスミドの選択可能マーカーにより、選択に耐性が付与され、細胞は、安定にプラスミドをそれらの染色体に組込むことができ、且つクローニングされ及び細胞株に拡充されうる増殖巣を形成するために増殖し得る。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を作出するために有利に用いられる。このように作出された細胞株は、抗体分子と直接又は非直接的に相関する化合物のスクリーニング及び評価に特に有用であり得る。いったん、本発明の抗体分子が組換え的に発現されると、免疫グロブリン分子の精製について当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインAの後の特異的抗原についての親和性により、また、サイズ処理カラムクロマトグラフィー、遠心分離、溶解度の差、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的技術により精製することができる。これに関し、米国特許第7,358,195号は、本発明の開示に言及し、その教示は参照により本明細書に組み入れられる。他の態様においては、本明細書に開示された、又は当該技術分野において公知の方法を用い、特定の一連のCDRsをフランクする可変及び定常領域内での、変異、欠失及び/又は挿入により、種々の抗体及び抗体断片、並びに抗体模倣体を容易に作出することができる。従って、例えば、種々のクラスのAbは、種々の重鎖の置換により、所定の一連のCDRsのために可能であり、これにより、例えば、IgG1-4、IgM、IgA-2、IgD、IgE抗体型及びイソ型を産生し得る。同様に、完全な合成フレームワーク内の所定の一連のCDRsに組み込むことにより、本発明の範囲内の人工抗体を製造することができる。本明細書で用いられる場合、可変という用語は、抗体中の配列が異なり、その抗原についてのそれぞれ特定の抗体の結合及び特異性において用いられる、可変領域の特定の部分を意味する。しかし、可変性は、通常は、抗体の可変領域を通じて均一に分配されていない。それは、相補性決定領域CDRsと呼ばれる3つの部分、又は軽鎖及び重鎖の可変領域の両方の超可変領域に集中している。可変領域のより高度に保存されている部分はフレームワークFRと呼ばれる。重及び軽鎖の可変領域は、それぞれ3つのCDRsに連結している、主としてベータ-シート構造をとる4つのフレームワーク領域を含み、ある場合には、ベータ-シート構造の一部を形成する。核鎖内のCDRsは、RF領域及び他の鎖からのCDRsにごく接近して一緒に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与しているE.A.KabatらSequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,1991,NIH。定常領域は、抗原の抗体との結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような、種々のエフェクター機能を示す。ヒト化抗体、又は他の哺乳動物により拒絶されないように適合させた抗体は、再表面形成及びCDR移植のような、数種の技術を用いて製造することができる。再表面形成技術においては、分子モデリング、統計分析及び突然変異生成を組み合わせ、可変領域の非CDR表面を、標的宿主の既知の抗体の表面に類似するように調節する。抗体を再表面形成する計画及び方法、並びに種々の宿主内の抗体の免疫原性を低下させる他の方法は、米国特許第5,639,641号に開示されており、その全体の開示は参照により本明細書に組み入れられる。本発明は、本明細書に開示した抗体の機能的同等物をも含む。機能的同等物はこれらの抗体と同程度の結合特性を有し、例えば、キメラ、ヒト化及び1本鎖抗体並びにそれらの断片を含む。このような機能的同等物を製造する方法は、PCT出願WO93/21319、欧州特許出願第239,400号;PCT出願WO89/09622;欧州特許出願第338,745号;及び欧州特許出願第332,424号に開示されており、その全体の開示は参照により本明細書に組み入れられる。機能的同等物は、本発明の抗体の可変又は超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。アミノ酸配列に適用される実質的に同一のは、本明細書においては、Pearson及びLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,2444-24481988によるFASTAサーチ法により決定し、他のアミノ酸配列と少なくとも約90、更に好ましくは少なくとも約95の配列同一性を有する配列として定義される。キメラ抗体は好ましくは、実質的に又は専らヒト抗体定常域に由来する定常領域及び実質的に又は専らヒト以外の哺乳動物の可変域配列に由来する可変域を有する。抗体のヒト化型は、例えば、マウス抗体の相補性決定領域をヒトフレームワークドメイン中に置換することにより製造される。例えば、PCT公開第W092/22653号を参照されたい。ヒト化抗体は、好ましくは、実質的に又は専ら対応するヒト抗体領域に由来する定常領域及び相補性決定領域CDRs以外の可変領域、並びに実質的に又は専らヒト以外の哺乳動物に由来するCDRを有する。機能性同等物は、1本鎖抗体scFvsとしても知られる1本鎖抗体断片をも含む。これらの断片は、1つ又はそれ以上の相互接続リンカーを用いて、又は用いずに、少なくとも1つの抗体可変軽鎖配列VLの断片と連結された少なくとも1つの抗体可変重鎖配列VHの断片を含む。このようなリンカーは、短いフレキシブルなペプチドであって、VLとVHドメインが連結されるとそれらの適当な3次元フォールディングが起こり、1本鎖抗体断片が誘導された元の全抗体の標的分子結合特異性を維持することを確保するように選択することができる。一般に、VL又はVH配列のカルボキシル末端を、このようなペプチドリンカーにより相補的なVL及びVH配列のアミノ酸末端と共有結合で連結してもよい。1本鎖抗体断片は、分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリー又は類似の技術により製造することができる。これらのタンパク質は、真核生物細胞又は細菌を含む原核生物細胞のいずれで産生させてもよい。1本鎖抗体断片は、本明細書に開示された記載の全抗体の可変又は相補性決定領域CDRsの少なくとも1つを有するが、これらの抗体の定常領域の一部又は全てを欠失している。これらの定常領域は抗原結合に必要ではないが、全抗体構造の主要部を構成する。従って、1本鎖抗体断片は、定常領域の一部又は全てを含有する抗体の利用に関連するいくつかの問題を克服し得る。例えば、1本鎖抗体断片は、生物学的分子と重鎖定常領域との間の望ましくない相互作用、又は他の望ましくない生物学的活性を有しない傾向がある。更に、1本鎖抗体フラグメントは全抗体よりかなり小さく、従って、より大きい毛細管透過性を有するので、1本鎖抗体断片が局在化して標的抗原結合部位とより効率的に結合することが可能になる。また、抗体断片は真核生物細胞において比較的大規模に生産することができるので、その生産が容易になる。更に、1本鎖抗体断片は比較的サイズが小さいので、全抗体より受容者の免疫応答を引き起す可能性が低い。本明細書に開示された抗-CD20抗体及びそのヒト化変異体に対するアミノ酸及び核酸配列の知識を利用し、ヒトCD20とも結合する他の抗体を開発することができる。いくつかの研究は、1又はそれ以上のアミノ酸の変異を、抗体の配列の種々の位置に導入することの影響を、1次抗体配列の知識に基づいて、例えば結合及び発現のレベルのような特性について調査しているYang,W.P.ら,1995,J.Mol.Biol.,254,392-403;Rader,C.ら,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,8910-8915;Vaughan,T.J.ら,1998,NatureBiotechnology,16,535-539。これらの研究において、オリゴヌクレオチドが介在する位置指定突然変異誘発、カセット突然変異誘発、エラーが発生しやすいerror-pronePCR、DNAシャッフリング、又は大腸菌E.coliの変異誘発株のような方法を用いて、CDR1、CDR2、CDR3、またはフレームワーク領域の重及び軽鎖遺伝子の配列を変えることにより、1次抗体の変異体が生成されているVaughan,T.J.ら,1998,NatureBiotechnology,16,535-539;Adey,N.B.ら,1996,第16章,pp.277-291,inペプチド及びタンパク質のファージディスプレイPhageDisplayofPeptidesandProteins,Kay,B.K.ら編,AcademicPress。1次抗体の配列を変えるこれらの方法は、2次抗体の親和性の改良をもたらしているGram,H.ら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,3576-3580;Boder,E.T.ら,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,10701-10705;Davies,J.及びRiechmann,L.,1996,Immunotechnolgy,2,169-179;Thompson,J.ら,1996,J.Mol.Biol.,256,77-88;Short,M.K.ら,2002,J.Biol.Chem.,277,16365-16370;Furukawa,K.ら,2001,J.Biol.Chem.,276,27622-27628。全体が参照として本明細書に組み入れられる、特許出願第20090246195号に開示された方法のような抗体の1又はそれ以上のアミノ酸残基を代える、類似の直接的方法により、本発明に開示されている抗体配列は、機能の向上した抗-CD20抗体を開発するために用いることができる。Hunter,ら,Nature144:9451962;Davidら,Biochemistry13:10141974;Painら,J.Immunol.Meth.40:2191981;及びNygren,J.Histochem.andCytochem.30:4071982に開示された、これらの方法を含む、検出可能な部分に抗体を連結させるための当該技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。本発明の抗体は、競合的結合アッセイ、直接及び間接的サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイのような、任意の公知のアッセイ法において使用することができるZola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,pp.147-158CRCPress,Inc.,1987。本発明の抗体は、放射線不透過剤又は放射性同位元素のような、検出可能な部分で標識した抗体を被験者に、好ましくは血流に投与し、宿主内の標識抗体の存在及び位置をアッセイする、インビボにおける画像処理にも有用である。画像処理技術は、悪性腫瘍の病期診断及び治療に有用である。抗体は、宿主内で、核磁気共鳴、放射線医学、又は当該技術分野において公知の他の検出法により、検出可能な任意の部分で標識される。本発明の抗体は、親和性精製剤としても有用である。この過程においては、抗体を、当該技術分野において周知の方法を用いて、Sephadex樹脂又はろ紙のような適切な支持体に固定化支持体に固定化する。治療への適用本発明は、CD20を発現する細胞の増殖を阻害する方法をも含む。これらの方法は、本発明の抗体又は断片又は複合体を使用し、並びに本発明の抗体又は断片又は免疫複合体を1又はそれ以上の追加の治療薬と併用して使用する。適切な治療薬には、CD20を発現する細胞の増殖を直接的又は間接的に阻害するものが含まれる。本明細書で用いられる場合、阻害する及び阻害することという用語は、細胞死を含む、細胞増殖における任意の阻害効果を含むものと理解すべきである。阻害効果には、一時的な効果、持続的な効果、及び恒久的な効果が含まれる。本発明の治療的適用には、疾患を患っている被験者の治療法が含まれる。本発明の方法により治療される疾患は、CD20の発現により特徴づけられるものである。このような疾患には、CD20陽性B細胞が、疾患の病態生理学において役割を果たしている、非ホジキンリンパ腫、B-細胞慢性リンパ性白血病及び急性リンパ性白血病のようなB細胞性悪性腫瘍、並びにRAを含む非悪性自己免疫又は炎症性疾患が含まれる。当業者は、本発明の方法が、開示されていないが、CD20の発現によって特徴づけられている他の疾患の治療にも用いることができることを理解するであろう。本発明の治療的適用は、インビトロ及びエクスビボにおいても実施することができる。インビトロにおける使用例には、B-細胞系列の細胞のようなCD20-陽性細胞が混入した細胞集団の精製が含まれる。この方法は、細胞毒性huCD20-7複合体の存在下に細胞集団を培養し、次いで、死滅したCD20-陽性細胞を除去することを含む。非臨床インビボにおける使用の条件は周知である例えば、Uckunら,1986,JExp.Med.163,347-368;Uckunら,1985,J.Immunol.134,3504-3515;Ramakrishnanら,1985,J.Immunol.135,3616-3622を参照されたい。支持体に結合した、本発明の抗体、断片及び領域、断片又は誘導体は、液体又は組織又は細胞抽出物からCD20を除去するためにも用いることができる。好ましい態様においては、それらは、血液又は血漿産物からCD20を除去するために用いられる。他の好ましい態様においては、マウス及びキメラ抗体、断片及び領域は、当該技術分野において公知の体外免疫吸着装置において有利に用いられる例えば、SeminarsinHematology,262Suppl.11989を参照されたい。患者の血液又は他の体液を結合抗体にさらし、循環するCD20遊離型又は免疫複合体の部分的又は完全な除去をもたらし、液体を身体に戻す。この免疫沈降は、細胞遠心分離工程を介入させるか、又はさせないで、連続的に流れる配置において実施することができる。例えば、Termanら,J.Immunol.117:1971-19751976を参照されたい。本発明は、抗体又は複合体を、薬学的に許容される剤形で被験者に投与する、本発明の抗体又は複合体の治療的適用をも含む。それらは、急速静注として、又は長時間の連続注入により、筋肉内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、経口、局所又は吸入経路により、投与することができる。それらは、局所並びに全身的治療効果に影響を及ぼすために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、又は病変部周囲経路により投与してもよい。医薬製剤治療的適用のために、本発明の抗体又は複合体を、薬学的に許容される剤形において、被験者に投与する。それらは、急速静注として、又は長時間の連続注入により、筋肉内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、経口、局所又は吸入経路により、投与することができる。抗体又は複合体は、局所並びに全身的治療効果に影響を及ぼすために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、又は病変部周囲経路により投与してもよい。適切な薬学的に許容される担体、希釈剤及び賦形剤は周知であり、臨床的症状の認可として、当業者によって決定され得る。適切な担体、希釈剤及び/又は賦形剤の例には:1約1mg/mL~25mg/mLのヒト血清アルブミンを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、pH約7.4、20.9食塩水0.9w/vNaCl、35w/vブドウ糖及び410mMヒスチジン硫酸塩pH5.8、6ショ糖、0.02ポリソルベート20が含まれる。凍結乾燥するよりも、液状の剤形で存在する場合、抗体又は複合体は、通常、約0.1mg/mL~100mg/mLの濃度で製剤化されるが、この範囲外の変形は許容される。疾患の治療のために、適切な抗体又は断片又は複合体の適切な用量は、治療すべき疾患のタイプ、前記に定義したように、疾患の重症度及び経過、予防又は治療目的のために抗体又は複合体を投与したかどうか、以前の治療の経過、患者の病歴及び治療に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。抗体又は断片又は複合体は、適切には、一度に、又は一連の治療にわたって患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に依存し、患者の体重1kgあたり約0.015~25mgの抗体又は複合体が、患者に対する投与についての最初の候補用量であるが、例えば、1回又はそれ以上の分割投与によるか、又は連続注入によって投与する。数日又はそれ以上にわたる繰り返し投与については、症状に依存し、書状の疾患症状の抑制が生じるまで治療を繰り返す。しかし、他の用量計画も有用であり、排除すべきでない。肺投与のためには、好ましくは、少なくとも1種の抗-CD20抗体又は抗体断片又は複合体組成物は、肺又は血脈とうの下気道に達するために効果的な粒径で送達される。本発明によれば、少なくとも1種の抗-CD20抗体又は抗体断片又は複合体組成物は、吸入による治療薬の投与について当該技術分野で公知の、任意の種々の吸入又は鼻内噴霧装置により送達することができる。患者の鼻腔又は胃小窩においてエアロゾル化した製剤を沈着し得るこれらの装置には、定量吸入器、噴霧器、ドライパウダー発生器、噴霧器等が含まれる。抗体の肺又は鼻投与に向けるのに適した他の装置は当該技術分野においても公知である。エアロゾルにおける抗体の投薬のための投与に適した製剤のための全てのこのような装置を用いることができる。このようなエアロゾルは、溶液水性及び非水性の両方又は固体粒子のいずれかを含み得る。Ventolin登録商標定量吸入器のような定量吸入器は、通常は噴射剤を用い、吸息の際に作動を必要とする例えば、WO94/16970、WO98/35888を参照されたい。Turbuhaler登録商標Astra、Rotahaler登録商標Glaxo、Diskus登録商標Glaxo、Spiros登録商標吸入器Dura、InhaleTherapeuticsにより市販されている装置、及びSpinhaler登録商標粉末吸入器Fisonsのようなドライパウダー吸入器は、混合粉末の呼吸-作動を用いる全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第No.4,668,218号Astra、EP237507Astra、WO97/25086Glaxo、WO94/08552Dura、米国特許第5,458,135号Inhale、WO94/0649。AERXTMARADIGIN,THEULTRAVENTTM噴霧器MALLINCKRODT、及びACORNIITM噴霧器MARQUESTMEDICALPRODUCTS全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,404,871号ARADIGM、WO97/22376のような噴霧器は溶液からエアロゾルを形成するが、定量吸入装置、ドライパウダー吸入器等は、一般に小粒子エアロゾルを形成する。市販の吸入装置の具体例は、本発明の実施に適した特定の装置の代表を意味し、本発明の範囲を限定することを意図していない。好ましくは、少なくとも1種の抗-CD20抗体又は断片又は複合体を含む組成物は、ドライパウダー吸入器等又は噴霧器により送達される。本発明の少なくとも1種の抗体を投与するための吸入装置についていくつかの所望の特徴がある。例えば、吸入装置による送達は、有利には信頼され、再現性があり、正確である。吸入装置は、良好な呼吸のために、例えば、約10μm未満、好ましくは約1~5μmの小さい乾燥粒子を送達してもよい。粘膜表面を通した吸収のために、少なくとも1種の抗-CD20抗体又は断片又は複合体を投与するための組成物及び方法は、エマルション粒子の粘膜接着を達成することにより粘膜表面を通した吸収を促進する、多数のサブミクロン粒子、粘膜接着性高分子、生物学的に活性なペプチド、及び水性連続相を含むエマルションを含有する米国特許第5,514,670号。本発明のエマルションの塗布に適した粘膜表面には、角膜、結膜、頬、舌下、膣、肺、胃、腸、及び直腸の投与経路を含み得る。膣又は直腸投与のための製剤、例えば座薬は、賦形剤、例えば、ポリアルキレングリコール、ワセリン、カカオ脂を含有してもよい。鼻内投与のための製剤は固体であってもよく、これに、例えば乳糖を賦形剤として含有させてもよく、又は鼻液滴の水性若しくはは油性溶液であってもよい。口腔投与のためには、賦形剤には、糖類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、あらかじめゼラチン状にしたデンプン等が含まれる米国特許第5,849,695号。経皮投与のためには、少なくとも1種の抗-CD20抗体を送達用デバイス、例えばリポソーム又は重合体ナノ粒子、微小粒子、マイクロカプセル又は微小球特に明記しない限り、集合的に微小粒子と呼ぶの中に封じ込める。多くの適切な装置が公知であり、それには合成重合体、例えばポリヒドロキシ酸、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸及びこれらの共重合体、ポリオルトエステル、ポリ無水物及びポリホスファゼン等、並びに天然重合体、例えばコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン及び他のタンパク質、アルギン酸塩及び他の多糖等、並びにこれらの組み合わせで製造されている微小粒子が含まれる米国特許第5,814,599号。本明細書に引用される全ての出版物又は特許は、全体が参照として本明細書に組み入れられ、当該技術分野の状態の証拠である。出版物は、任意の科学又は特許の出版物、又は全ての記録された、電子的、又は印刷された形式を含む、あらゆるメディア形式において利用できる他の任意の情報を意味する。以下の文献は、特に、本明細書に開示されたような、抗-CD20抗体、断片、複合体、薬剤、組成物の製造に関連する内容に対して、全体が参照として本明細書に組み入れられる:Ausubelら編,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,Inc.,NY,N.Y.1987-2001;Sambrookら,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2.sup.ndEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.1989;HarlowandLane,antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.1989;Colliganら編,CurrentProtocolsinImmunology,JohnWileySons,Inc.,N.Y.1994-2001;Colliganら,CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWileySons,NY,N.Y.,1997-2001。本発明の精神及び範囲を逸脱しないで、抗体及び断片に対する種々の文献は、例えば、複合体についても言及していることが当業者には明らかである。現在、一般的に本発明を説明したが、更に、例示のみの目的のために本明細書に含まれ、特に指定のない限り限定することを意図しない、特定の実施例を参照することによって、同じことが理解されるであろう。細胞系及び増殖細胞系は、特に示さない限り、適切な培地、例えば、10ウシ胎児血清、2mMグルタミン及び1ペニシリン-ストレプトマイシン全ての試薬はInvitorogen製を追加したRPMI-1640培地内で、5CO2で加湿したインキュベーター中、37°Cで培養した。週に2回、新鮮な培地で希釈することによって細胞を継代し、0.2~1×106細胞/mLに維持した。実施例1マウスCD20抗体の産生ヒトCD20GI23110989の発現が可能な、XbaI及びBamHI制限部位でフランクした完全なCD20コード配列CDSを含む、発現プラスミドpSRa-CD20を構築した。Balb/Cマウス由来のプレ-B細胞、300-19細胞Rethら,Nature,317:353-3551985に、この発現プラスミドをトランスフェクションし、高レベルの細胞表面上のヒトCD20を安定的に発現させ、Balb/cVAFマウスの免疫に用いた。当業者に公知の標準免疫プロトコール、例えば、ImmunoGen,Incで用いられているプロトコールにより、2~3週間毎に、マウスあたり、5×106個のCD20-発現300-19細胞で皮下に免疫した。免疫したマウスに、ハイブリドーマ生成のために犠牲にする3日前に追加免疫を行った。標準的動物プロトコールに従い、マウスから脾臓を集め、例えば、2つの無菌のつや消しした顕微鏡用スライドガラスの間で組織を粉砕し、RPMI-1640培地中の単細胞懸濁液を得た。脾臓細胞を遠心分離し、沈殿させ、洗浄し、ポリエチレングリコール-150Roche783641を用い、マウスミエローマ、例えば、P3X63Ag8.653細胞Kearneyら,J.Immunol.,123:1548-15501979と融合させた。融合細胞を、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジンHATSigmaH-0262を含むRPMI-1640選択培地に再懸濁し、5CO2において、37°Cで、平底の96ウェル培養プレートCorning-Costar3596、ウェルあたり200μLの細胞内で、増殖について選択した。インキュベーションの5日後、100μLの培養上清を各ウェルから取り除き、ヒポキサンチン-チミジンHTSigmaH-0137を追加したRPMI-1640培地で置換した。5CO2において、37°Cでのインキュベーションを、ハイブリドーマクローンが抗体スクリーニングについて準備するまで継続した。Langoneら編集,ImmunochemicalTechniques,PartI,MethodsinEnzymology,AcademicPress,volume121,Florida及びHarlowらAntibodies:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork1988に開示されたものを含む、免疫付与及びハイブリドーマ産生のための他の技術を用いることもできる。ハイブリドーマスクリーニング及び選択CD20発現細胞、例えば、CD20-発現300-19細胞トランスフェクションしていない300-19細胞ではないと結合するマウスモノクローナル抗体のスクリーニングのため、ハイブリドーマからの培養上清をフローサイトメトリーによりスクリーニングした。100μLのハイブリドーマ上清を、100μLのFACSバッファー2正常ヤギ血清を追加したRPMI-1640培地中、CD20-発現300-19細胞又はトランスフェクションしていない300-19細胞のいずれかと1×105細胞/試料、3時間インキュベーションした。次いで、細胞を遠心分離し、沈殿させ、洗浄し、100μLのPE-接合ヤギ抗-マウスIgG抗体例えば、JacksonLaboratoryから得られ、FACSバッファー中、6μg/mLと1時間インキュベートした。HTSマルチウェルサンプラーを備えたFACSCaliburフローサイトメータ、又はFACSアレイフローサイトメータを用いて細胞を得、CellQuestPro全て、BDBiosciences,SanDiego,US由来であるを用いて分析した。陽性ハイブリドーマを、限界希釈によりサブクローニングした。CD20に対し、フローサイトメトリーにより親細胞と同じ反応性を示す各ハイブリドーマからの1つのサブクローンを、以下の分析のために選択した。安定なサブクローンを培養し、抗-CD20抗体を分泌するそれぞれのアイソタイプを、市販のアイソタイピング試薬Roche1493027を用いて同定した。抗体の精製標準的方法、例えば、プロテインA又はGクロマトグラフィーHiTrapProteinAorGHP,1mL,AmershamBiosciencesを用いて、ハイブリドーマサブクローンの上清から抗体を精製した。すなわち、1/10容量の1MTris/HClバッファー、pH8.0を加えることにより、クロマトグラフィー用の上清を調製した。pHを調製した上清を0.22μmのフィルター膜を通して濾過し、結合バッファーPBS、pH7.3で平衡化したカラムに装填した。カラムを、280nmにおける吸光度のない、安定なベースラインが得られるまで結合バッファーで洗浄した。0.5mL/分の流速を用い、0.15MNaCl、pH2.8を含む0.1M酢酸バッファーで抗体を溶出させた。約0.25mLの画分を集め、1/10容量の1MTris/HClバッファー、pH8.0を加えることにより中和した。ピーク画分を、1×PBSで2回、一晩透析し、0.2μmのフィルター膜を通してろ過することにより滅菌した。精製抗体を、A280における吸光度により定量した。マウス抗体のための四級アンモニウムQクロマトグラフィーによるイオン交換クロマトグラフィーIEXを用いて、プロテインA精製画分を更に精製した。次いで、調製した試料を、120cm/時の流速で結合バッファーにより平衡化したQ高速流樹脂GELifesciencesに装填した。試料中の全てのMAbが結合するのに十分な容量を有するように、カラムのサイズを選択した。次いで、カラムを、280nmにおける吸光度のない、安定なベースラインが得られるまで結合バッファーで洗浄した。20倍のカラム容量CV中、10mMから500mMまでの塩化ナトリウムの勾配を開始することにより、抗体を溶出させた。ピーク画分を、280nmにおける吸光度測定A280を基準にして集めた。AgilentHPLC1100システムAgilent,SantaClara,CAを用い、SWXLガードカラム、6.0×40mmTosohBioscience,Montgomeryville,PAを有するTSKゲルG3000SWXL、7.8×300mmによるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、単量体の割合を評価した。95以上の単量体含有量を有する画分を集め、TFFシステムを用いてバッファーをPBSpH7.4に交換し、0.2μmのフィルター膜を通してろ過することにより滅菌した。精製抗体のIgG濃度は、1.47の吸光係数を用いてA280により測定した。他の方法、例えば、セラミックハイドロキシアパタイトCHTも、良好な選択性をもって抗体を精製するために用いられた。40μmの粒径を有するII型CHT樹脂Bio-RadLaboratoriesを、IEXクロマトグラフィーについて開示されたのと類似のプロトコールにより用いた。CHTのための結合バッファーは20mMリン酸ナトリウム、pH7.0に相当し、抗体は、20CVにわたり、20~160mMリン酸ナトリウムの勾配を用いて溶出した。実施例2フローサイトメトリーによる結合特性結合特性は、精製抗体を用いたフローサイトメトリーにより試験した。CD20発現300-10細胞に対するmuCD20-7及びmuCD20-6の結合、並びに親細胞300-19細胞に対して結合しないことを示すFACSヒストグラムを図1に示す。100μLのFACSバッファー2の正常ヤギ血清を追加したRPMI-1640培地中、muCD20-7又はmuCD20-6抗体を、CD20発現300-19細胞又はトランスフェクションしていない300-19細胞1×105細胞/試料とインキュベートした。次いで、細胞を沈殿させ、洗浄し、100μLのFITC-連結ヤギ抗マウスIgG抗体例えば、JacksonLaboratoryから入手でき、FACSバッファー中、6μg/mLと1時間インキュベーションした。細胞を、再度沈殿させ、FACSバッファーで洗浄し、1ホルムアルデヒドを含む、200μLのPBSに再懸濁した。HTSマルチウェルサンプラーを備えたFACSCaliburフローサイトメータ、又はFACSアレイフローサイトメータを用いて細胞を得、CellQuestPro全て、BDBiosciences,SanDiego,US由来であるを用いて分析した。muCD20-7又はmuCD20-6とインキュベートした、CD20-発現300-19細胞のFACSヒストグラムは蛍光シフトを示したが、親細胞300-19細胞は示さなかった図1。また、いずれかの細胞を、FITC-連結ヤギ抗マウスIgG抗体のみとインキュベートした場合には、有意な蛍光シフトは検出されなかった図1の下部。BJABリンパ腫細胞を、muCD20-7又はmuCD20-6とインキュベートした場合にも、蛍光シフトは観察された図2。BJAB細胞を、種々の濃度のmuCD20-7又はmuCD20-6抗体とインキュベートし、フローサイトメトリー分析について上述したようにして処理した。CellQuestPro全て、BDBiosciences,SanDiego,USを用いてデータの分析を実施し、各試料について、FL1MF1についての平均蛍光強度を出力し、片対数プロットにおいて抗体濃度に対してプロットした。非線形回帰により用量反応曲線を作成し、BJAB細胞に対する結合についてのmuCD20-7又はmuCD20-6の見かけの解離定数Kdの値を、GraphPadPrismv4GraphPadsoftware,SanDiego,CAを用いて計算し、それぞれ0.3nM又は0.4nMに相当する。実施例3マウス抗-CD20抗体のプロアポトーシス活性抗-CD20抗体、muCD20-2、muCD20-6及びmuCD20-7は、リンパ腫細胞系のアポトーシスを誘発した。Annexin-VInvitrogen及びTO-PRO登録商標-3InvitoとのFITC複合体を用いた染色後のフローサイトメトリー分析により、アポトーシスの程度を測定した。健康な正常細胞においては、ホスファチジルセリンは細胞膜二重層の内側にあり、原形質膜の内側から外層へのホスファチジルセリンの転移は、アポトーシスの早期に検出可能なシグナルの1つである。Annexin-Vは、無傷細胞の細胞膜二重層外側ではホスファチジルセリンと結合するが、内側では結合しない。従って、Annexin-Vの結合の程度は、アポトーシスの誘発の指標である。TO-PRO登録商標-3は、アポトーシスの後期に発生するような、膜の完全性が破壊されたときにのみ原形質膜を透過し得る、単量体シアニン核酸染色剤である。細胞の3種の集団は以下の二色フローサイトメトリーにおいて識別し得る:非アポトーシス細胞Annexin-V陰性及びTO-PRO登録商標-3陰性、初期アポトーシス細胞Annexin-V陽性及びTO-PRO登録商標-3陰性、及び壊死細胞又は後期アポトーシス細胞Annexin-V陽性及びTO-PRO登録商標-3陽性。10ウシ胎児血清FBS、2mMLグルタミン及び50μg/mLゲンタマイシンを追加したRMPI-1640培地以下、完全RMPI-1640培地を意味する中、25ウェルプレート内に、対数増殖期細胞を播種した。特に指摘しない限り、細胞は、一般にRMPI-1640培地内で増殖する。5CO2で加湿し、37°Cにおいて、細胞を10nMの抗-CD20抗体とインキュベートした。次いで、細胞を沈殿させ、500μLのPBSで2回洗浄し、100μLの結合バッファー10mMHepes-NaOH、pH7.4、140mMNaCl、2.5mMCaCl2に再懸濁し、氷上で5μLのAnnexin-V-FITCにより染色した。次いで、400μLの結合バッファー及び1μMのTO-PRO登録商標-3を加えて混合し、FITC及びTO-PRO登録商標-3の細胞結合型蛍光を、フローサイトメトリーによりすぐに測定した。50000のイベントが各試料について集められた。TO-PRO登録商標-3の蛍光FL4-H;y-軸及びAnnexin-V-FITCFL1-H;x-軸のドットプロットを、BDCellQuestソフトウェアを用いて作成した。Annexin-V陽性細胞TO-PRO登録商標-3陽性及び陰性細胞の割合は、これらのプロットから各試料について測定し、図3に示す。抗体スクリーンから分離したいくつかの抗体を、リツキシマブと比較してプロアポトーシス活性について試験した。意外にも、muCD20-2、muCD20-6及びmuCD20-7は、非常に強いプロアポトーシス活性を示した。未処理細胞のたったの約5と比較し、muCD20-6、muCD20-7又はmuCD20-2のいずれかにさらしたRamos細胞の70以上はAnnexin-V陽性であった。抗-CD20抗体、リツキシマブによる処理により、たったの13のAnnexin-V陽性細胞がもたらされた。同様に、抗体muCD20-5による処理により、12のAnnexin-V陽性細胞がもたらされた。同様に、未処理細胞の5と比較し、muCD20-7又はmuCD20-2で処理したRaji細胞の60以上がAnnexin-V陽性細胞であった。この予想外の活性は、42のAnnexin-V陽性細胞をもたらす、以前に分離されたII型抗体、B1よりも、更に強い。リツキシマブとのインキュベーションにより、14のAnnexin-V陽性細胞がもたらされた。muCD20-5抗体は、未処理細胞と比較し、高い割合のAnnexin-V陽性細胞を誘発しなかった。実施例4脂質ラフト抗体結合に続く脂質ラフトへのCD20の再変性は、抗体が効果的に補体因子を補充し、CDCの活性を誘発する能力と関連している。抗体の測定は脂質ラフトにCD20の再分布を誘発するので、我々は、Craggら2003上記参照から修飾された方法に基づくフローサイトメトリーを使用した。このアッセイの原理は、低温における脂質ラフト区画のTritonX-100の不溶性に基づいている。遠心分離により細胞を集め、洗浄し、1BSAを含むRPMI-1640に再懸濁した。2.5×106細胞、0.2mLを、二連におけるそれぞれのアッセイに用いた。10μg/mLで抗-CD20抗体を加え、試料を37°Cで15分間インキュベートした。試料を遠心分離し、2回洗浄し、2mLのFACSバッファー1×PBS、1BSA、20mMNa-アジドに再懸濁した。氷上で試料を冷却し、この時点から冷却を維持した。抗体処理に応答して脂質ラフトと関連する抗原の画分を決定するため、試料を、氷上で0.5TritonX-100により15分インキュベートした。試料をFACSバッファー内で2回洗浄し、1:200に希釈した、FITCを結合したヤギ抗マウスAbを用いて、氷上で1時間染色した。試料を遠心分離し、FACSバッファーで2回洗浄し、固定のために、200μLBPS、1ホルムアルデヒドに細胞を再懸濁した。試料は、FL-1の平均値として、結合する抗-CD20抗体を測定するため、フローサイトメトリーにより試料を得た。TritonX-100のインキュベーションの非存在未処理又は存在Triton処理における各試料について平均蛍光強度MFIをプロットした。我々は、TritonX-100が不溶性の脂質ラフトにCS20を効率的に移動させることが既に示されている、I型抗体の例である、リツキシマブをコントロールとして用いた。予想されるように、リツキシマブで処理した細胞は、TritonX-100処理されたものとされていないもので、同じ傾向レベルを示した。一方、muCD20-2で染色した細胞のMFIは、TritonX-100で処理していないものより、処理したものが、より低い。これは、既に開示されたII型CD20抗体の特徴、脂質ラフトにCD20を再分配するmuCD20-2の無力と一致している。意外にも、muCD20-7で染色した細胞のMFIは、TritonX-100で処理していないものと類似している。更に、我々は、脂質ラフトの活性について、muCD20-5及びmuCD20-6についても試験を行った。muCD20-7について見られるように、muCD20-5又はmuCD20-6で染色した細胞のMFIは、TritonX-100で処理した、又はしていないものと類似している。このデータは、muCD20-5、muCD20-6及びmuCD20-7が、リツキシマブと同様、CD20を、リンパ腫細胞膜の脂質ラフト区画に効率的に移動し得ることを示す。Annexin-Vアッセイからの結果と一緒に、これは、muCD20-2がII型抗体の特徴を有することを示す。それは強力にアポトーシスを誘発するが、脂質ラフトへCD20を再分配することができない。胃法、muCD20-5はI型抗体の特徴を有する。それは脂質ラフトへCD20を再分配し得るが、プロアポトーシス活性を有していない。この意外な結果は、muCD20-6及びmuCD20-7が特有かつ意外な機能特性の組合せを有していることを示す:それらは、I型抗体の脂質ラフト活性、及びII型抗体に典型的に見られる、強力なプロアポトーシス活性の両者を有している。実施例5CD20-7及びCD20-6抗体のVL及びVH領域のクローニング及び配列決定RNeasyキットQIAgenを用い、製造業者のプロトコールに従い、CD20-7及びCD20-6ハイブリドーマの細胞5×106個から総細胞内RNAを調製した。次いで、SuperScriptIIcDNA合成キットInvitrogenを用いて、総RNAからcDNAを合成した。ハイブリドーマ細胞に由来するcDNAにおける第一ラウンドの変性PCR反応のための工程は、Wanら2000JImmunolMethods.Jan13;2331-2:167-77及びCoら1992JImmunol.Feb15;1484:1149-54に開示された方法に基づいていた。以下の変性プライマーを用い、PCRによりVH配列を増幅した:EcoMH1CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC配列番号:37、EcoMH2CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG配列番号:48及びBamIgG1GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC配列番号:38。以下の変性プライマーを用い、PCRによりVL配列を増幅した。SacIMKGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA配列番号:39及びHindKLTATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC配列番号:40。混合塩基は、以下のように定義される:N=GATC、S=GC、Y=CT、M=AC、R=AG、W=AT。次いで、PCR反応混合物を1の低融点アガロースゲルで電気泳動し、300~400塩基対のバンドを切り取り、ZymoDNAミニカラムを用いて精製し、配列決定のためにAgencourtBiosciencesに送った。5’及び3’それぞれのPCRプライマーを、シークエンシングプライマーとして用い、両方向から可変領域のcDNAを生成した。VH及びVL領域のアミノ酸配列は、DNA配列決定の結果から推測した。抗体の配列が由来する、マウス生殖細胞の配列についてのNCBIIgBlastサイトwww.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/を調査するために予備的cDNA配列を用いた。次いで、PCRプライマーを、マウスの抗体のリーダー配列に連結する生殖細胞系列にアニーリングし、この新たなPCR反応が、PCRプライマーによって変更されない完全な可変領域のcDNA配列をもたらすように設計した。更に、CD20-7重鎖の完全な可変領域の配列を決定するために、RACEWPCR胞を、Coら上述に記載された通りに実施した。PCR反応、バンド精製及び配列決定は上述した通りに実施した。配列確認のための質量決定完全長抗体cDNA配列を得るために、可変領域についてのcDNA配列情報を、生殖細胞の定常領域と連結させた。次いで、重鎖及び軽鎖の分子量を計算し、CD20-7及びCD20-6抗体のLC/MS分析により得られた分子量と比較した。分子量測定は、CD20-7及びCD20-6の軽及び重鎖の両方についてのcDNA配列と一致する。キメラ化軽鎖可変領域についての可変配列を、pchCD20-7LCZプラスミド内のEcoRI及びBsiWI部位にクローニングする。重鎖可変領域を、重鎖可変領域を、pchCD20-7HCNプラスミド内のHindIII及びApaI部位にクローニングする。chCD20-2、chCD20-9について、対応するプラスミドを構築した。標準的リン酸カルシウム法BDBiosciences,CalPhosMammalianTransfectionKit,Cat番号631312を用い、HEK-293T細胞内でキメラ抗体を発現するために、これらのプラスミドを用いた。上述したような、標準的プロテインAクロマトグラフィー法を用いて上清を精製したが、カルボキシメチルCM高速流イオン交換IEX樹脂GELifesciences及び10mMリン酸カリウム、10mM塩化ナトリウム結合バッファーpH7.5又は上述した他のCHT法のいずれかを用い、ポリッシングクロマトグラフィーを実施した。実施例6キメラCD20-7のプロアポトーシス活性Ramos細胞においてアポトーシスを誘導する、キメラ抗体の能力を、上記実施例においてマウス抗体について記載されたような、Annexin-V及びTO-PRO登録商標-3染色を用いることにより測定した。それぞれ10nMのキメラ抗体を、Ramos細胞と20時間インキュベートし、次いでAnnexin-V染色及びフローサイトメトリー分析を実施し、結果を図5に示す。未処理の試料における、たったの11と比較し、chCD20-7処理は、59のAnnexin-V陽性細胞をもたらした。chCD20-7処理は、43のAnnexin-V陽性細胞を誘発したが、リツキシマブ処理は、未処理細胞と同等のレベルのAnnexin-V染色をもたらした。従って、CD20-7は、キメラ化後のRamos細胞における、著しく強力なアポトーシスを誘発する能力を維持していた。キメラCD20-7のCDC活性キメラ抗-CD20抗体の補体依存性細胞傷害CDCを評価するため、公開された方法Gazzano-Santoro,J.Immunol.Methods,2022:163-1711997に従い、細胞に基づくアッセイを実施した。種々の濃度、通常、RHBPRPMI-1640、20mMHEPES、0.1BSA、1ペニシリン-ストレプトマイシン培地中に5μg/mL=3.3×10-8M~2.3ng/mL=1.5×10-11Mの範囲で、抗体を、平底の96ウェルの組織培養プレートに50μL/ウェルになるように、二連で一定量ずつ入れた。標的細胞を、ウェルあたり100μLのRHPB培地中、5×104細胞になるように、抗体に加えた。凍結乾燥したヒト補体Sigma-Aldrich,St.Louis,USを、バイアル当たり1mLの滅菌精製水を用いて再構築し、使用直前に、RHBP培地を用いて20ストックに5倍希釈した。プレートを5CO2中、37°Cで加湿したインキュベーター中、2時間インキュベートし、補体が介在する溶解を可能にした。このインキュベーション時間の後、各ウェルに、最終濃度が10になるようにAlamarBlue試薬Invitrogenを加え、残った細胞の生存度を測定した。プレートを37°Cで16~20時間インキュベートし、EX540/EM590nmで蛍光相対蛍光単位、RFUを測定した。コントロールは、培地及び補体を含むが細胞を含まない培地のみ、0生存ウェル、及び細胞及び補体を含むが抗体を含まない細胞のみ、100生存ウェルを含む、三連のウェルを含有する。各試料についての細胞生存の割合を、以下の式により決定した:生存割合=試料-培地のみ/細胞のみ-培地のみ。意外にも、図6に示すように、chCD20-7抗体は、Daudi及びWSU-DLCL-2リンパ腫細胞において、リツキシマブと類似のCDC活性を有していた。chCD20-7は、Daudi細胞において1.0nM、WSU-DLCL-2細胞において2.2nMのEC50をもって両方の細胞系において細胞生存率を完全に低下させた。リツキシマブは、Daudi細胞において1.1nM、WSU-DLCL-2細胞において2.8nMのEC50のCDC活性を有していた。II型抗体について予想されるように、chCD20-2は、Daudi又はWSU-DLCL-2細胞のいずれかに対し、CDC活性を有していなかった。実施例7抗体のヒト化CD20-8抗体は、例えば、全体が参照として本明細書に組み入れられる、Roguskaら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,913:969-9731994及びRoguskaら,ProteinEng.910:895-9041996において既に開示されている、以下の再表面形成法に従ってヒト化された。再表面形成は、一般に、軽及び重鎖中の可変領域表面を同定すること、並びにそれらをヒトの同等物と置換することを含む。例示的なCDRsは、表1に示すように定義される。再表面形成について定義されるような、CD20-7の軽及び重鎖CDRは、例示の目的のために表1に与えられる。重鎖CDR2についてのKabatの定義も、マウス及びヒトCD20-7について与えられる。下線を引いた配列は、再形成のためにCDRと考えられないKabatの重鎖CDRの部分を示す。表面残基の位置は、30以上の相対的な接近しやすさを有する任意の位置として定義されるPedersenら,J.Mol.Biol.,2353:959-9731994。表面残基は、最も相同的なヒトの表面配列を識別するために、ヒトの生殖細胞の表面配列と一致している。CD20-7について、交換用表面として用いられるヒトの生殖細胞配列は、VL及びVHについて、それぞれIGKV7-301及びIGHV3-1504である。図7中の一覧からわかるように、軽鎖中の4つの表面残基及び重鎖中の9つの表面残基の全てはヒトの対応物と置換された。重鎖の残基S28はCDR-H1に接近しており、そのヒトT28への置換は結合親和性の低下をもたらすので、第二の再表面形成バージョンは、維持されたマウスのS28残基を用いて生成された。図8は、マウスの対応物を有する、軽鎖及び重鎖の両方のCD20-7可変領域について再表面形成された配列の配置を示す。huCD20-7抗体の組換え発現huCD20-7についての可変領域配列をコドン最適化し、BlueHeronBiotechnologyにより合成した。配列は、1本鎖哺乳動物用発現プラスミド内のそれぞれの定常配列を用い、インフレームクローニングのための制限酵素部位によりフランクされる。軽鎖可変領域を、phCD20-7LCZプラスミド内のEcoRI及びBsiWI部位にクローニングする。重鎖可変領域を、phCD20-7HCNプラスミド内のHindIII及びApaI部位にクローニングする。哺乳動物細胞内で、一時的又は安定的のいずれかのトランスフェクションにおいて、huCD20-7を発現するために、これらのプラスミドを用いることができる。HEK-293T細胞内でhuCD20-7を発現するための一時的トランスフェクションは、修飾されたPEI法Durocher,Y.ら,NucleicAcidsRes.302:E92002により実施した。キメラ抗体について上述した、プロテインA及びポリッシングクロマトグラフィー工程により、上清を精製した。基準抗体の発現huCD20-7の活性を比較するため、以前に同定した抗-CD20抗体をクローニングし、発現させた。2F2抗体オファツムマブのHC及びLC可変領域についてのアミノ酸配列は、HC可変領域についてはWO2004/035607の配列番号:2、LC可変領域についてはWO2004/035607の配列番号:4を用い、WO2004/035607Teelingら2004、上述に由来した。同様に、GA101抗体アフツズマブの基礎のHC及びLC可変領域についてのアミノ酸配列は、WO2005/0448959Umana,米国特許第5,639,041号2005に由来した。開示されたB-HH6構築物に対応する、WO2005/0448959の配列番号:40は、HC可変領域のために用いられ、開示されたB-KV1構築物に対応する、WO2005/0448959の配列番号:76は、LC可変領域のために用いられた。両方の抗体についての可変領域配列をコドン最適化し、BlueHeronBiotechnologyにより合成した。配列は、1本鎖哺乳動物用発現プラスミド内のそれぞれの定常配列を用い、インフレームクローニングのための制限酵素部位によりフランクされる。クローニング、発現及び精製は、上記huCD20-7について記載された通りに実施した。得られたGA101-F抗体は、定常領域において典型的なフコシル化を示し、その結果、アフツズマブについて用いられる、脱フコシル化バージョンではなかった。実施例8huCD20-7の結合親和性実施例2に記載した通りに、BJAB細胞と、muCD20-7、chCD20-7又はhuCD20-7抗体とを用いるフローサイトメトリー結合アッセイを実施し、分析した。図9は、各抗体について非線形回帰により生成した用量反応曲線である。各抗体の見かけの解離定数Kdの値をGraphPadPrismv4GraphPadsoftware,SanDiego,CAを用いて計算した。キメラ化又はヒト化は、muCD20-7、chCD20-7及びhuCD20-7についてのKdが、それぞれ0.4nM、0.5nM及び0.5nMであるように、CD20-7の結合親和性に影響しなかった。ELISAによる結合特性WSU-DLCL-2細胞例えば、CD20抗原の起源から粗細胞を調製し、ELISAにより結合親和性を測定した。10ウシ胎児血清、2mMグルタミン及び1ペニシリン-ストレプトマイシン全ての試薬はInvitrogen製を追加したRPMI-1640培地中、ローラーボトル内で、5CO2で加湿したインキュベーター中、37°Cで増殖させた。細胞を遠心分離により集め、細胞ペレットを冷却した1×PBSで2回洗浄し、次いで、溶解バッファー50mMTris,pH8,150mMNaCl,5mMEDTA,1NP-40,0.25デオキシコール酸ナトリウム,25mMオクチルグルコシド中に溶解した。1mLの容量の溶解バッファーを、1×107細胞の溶解液を得集めるために用いた。22ゲージの注射針を10回通過させることによって細胞溶解物を均質化し、溶解物を4°Cで45分間回転させた。10,000gで、4°C、45分間遠心分離することにより、溶解物を澄ませた。上清を、0.22ミクロンのフィルターでろ過し、一定量ずつ分け、液体窒素で急速冷凍し、-80°Cに保存した。総タンパク質濃度をBCAアッセイ例えば、MicroBCAProteinAssayKit,PIERCE,USにより測定した。ELISA実験のために、溶解物調製物をコーティングバッファー15mMNa2CO3,35mMNaHCO3,pH9.6中、総タンパク質5μg/mLまで希釈し、4°Cで、Immulon2HBプレートに、100μL/ウェルで18~24時間コーティングした。次いで、プレートを洗浄バッファーTBST:0.1Tween-20/TBS,pH7.4を用い、200μL/ウェルで3回洗浄した。プレートを、200μL/ウェルのブロッキングバッファー1カゼイン/TBS,pH7.4を用いて、室温で1時間ブロッキングした。プレートを前述と同様に洗浄し、次いで一連の抗体希釈物をプレートに、100μL/ウェルで加えた。プレートを室温で3時間インキュベートし、次いで前述と同様に洗浄した。ブロッキングバッファー中、1:5000希釈したヤギ抗ヒトHRPを二次抗体として100μL/ウェルで加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを前述と同様に洗浄し、TMB1基質BioFXを100μL/ウェルで加えた。反応を20分間実施し、450nm停止試薬BioFXを100μ/ウェル用いて反応を停止した。450nmにおける吸光度を読み取り、各試料について抗体濃度に対してプロットした。シグモイド用量反応曲線は、GraphPadPrismv4GraphPadsoftware,SanDiego,CAを用いた結合曲線に一致した。見かけの解離定数Kdの値を、図10に示すhuCD20-7についての結合曲線から計算し、0.8nMに相当する。実施例9mu及びhuCD20-7のプロアポトーシス活性huCD20-7のプロアポトーシス活性を、muCD20-7の活性と比較した。Ramos細胞を10nM、1nM又は0.1nM濃度のmuCD20-7、huCD20-7又はhuIgGアイソタイプコントロール抗体と、20時間、次いで、Annexin-V-FITC及びTO-PRO登録商標-3染色剤とインキュベートし、フローサイトメトリー分析を行った。各条件についてのAnnexin-V陽性細胞の割合を図11に示す。huCD20-7は、muCD0-7の強いプロアポトーシス活性を維持していた。約60のRamos細胞は、6のアイソタイプコントロール処理細胞と比較し、10nMのいずれかの抗体による処理後にAnnexin-V陽性である。huCD20-7のプロアポトーシス活性Ramos細胞に対するhuCD20-7のプロアポトーシス活性を、他のCD20抗体と比較した。リツキシマブ及び2F2は、既に開示された限定的なプロアポトーシス活性を有するI型抗体であるが、GA101及びB1は、公知の強力なプロアポトーシス活性を有するII型抗体である。B1は、BexxarTMCoulterの未標識型に相当する;しかし、GA101-Fは、アフツズマブ又はGA101Rocheのフコシル化バージョンに相当し;2F2はオファツムマブGenmabに相当する。種々の量の各抗体を、Ramos細胞と、20時間、次いで、Annexin-V-FITC及びTO-PRO登録商標-3染色剤とインキュベートし、フローサイトメトリー分析を行った。Annexin-V陽性細胞の割合を、図12の片対数プロットにおいて抗体濃度に対してプロットし、非線形回帰分析を用いて適合した曲線から、EC50を計算した。huCD20-7は、50のAnnexin-V陽性細胞の最大割合、及び0.2nMのEC50を有し、強力なプロアポトーシス活性を有する。それは、0.8nMのEc50を有し、34のAnnexin-V陽性細胞をもたらすB1よりも更に強力である。GA101-Fはあまり効果的でなく、1.7nMのEC50を有し、22のAnnexin-V陽性細胞をもたらす。リツキシマブは、Ramos細胞のアポトーシスについて限られた効果を有し、1.7nMのEC50を有し、たったの12のAnnexin-V陽性細胞をもたらす。2F2処理した試料及び未処理の両方の試料は、2のAnnexin-V陽性細胞を含み、これは、2F2がRamos細胞のアポトーシスを誘発しないことを示す。未処理のコントロール値を引いた後、これは、B1による32、GA101-Fによる20、及びリツキシマブによる10と比較し、huCD20-7により誘発される48のAnnexin-V陽性Ramos細胞に相当する。細胞系のパネルに対するプロアポトーシス活性huCD20-7のプロアポトーシス活性を、更に細胞系の拡張パネルに対するリツキシマブ及びB1と比較した。各細胞系を10nM又は1.5μg/mLのhuCD20-7又はリツキシマブと20時間、次いでAnnexin-V及びTO-PRO登録商標-3染色剤とインキュベートし、フローサイトメトリー分析を行った。各抗体及び未処理試料について、Annexin-V陽性細胞の割合をプロットし、図13A~13Eに示す。huCD20-7抗体は、Ramos及びRajiリンパ腫細胞系内でリツキシマブ及びB1よりも活性であった。huCD20-7は、B1についての29、リツキシマブについての9及び未処理細胞についての6と比較し、Ramosリンパ腫細胞内で60のAnnexin-V陽性細胞を誘発した。未処理のコントロール値を引いた後、これは、B1による23、リツキシマブによる3と比較し、huCD20-7により誘発される54のAnnexin-V陽性Ramos細胞に相当する。huCD20-7は、B1についての42、リツキシマブについての14及び未処理細胞についての5と比較し、Rajiリンパ腫細胞内で58のAnnexin-V陽性細胞を誘発した。未処理のコントロール値を引いた後、これは、B1による37、リツキシマブによる9と比較し、huCD20-7により誘発される53のAnnexin-V陽性Raji細胞に相当する。更に、huCD20-7は、リツキシマブについての26及び未処理細胞についての5と比較し、WSU-DLCL-2DLBCL細胞内で39のAnnexin-V陽性細胞を誘発した。未処理のコントロール値を引いた後、これはhuCD20-7により誘発される34のAnnexin-V陽性WSU-DLCL-2細胞、及びリツキシマブによる21に相当する。huCD20-7は、リツキシマブについての9及び未処理細胞についての8と比較し、Jeko-1MCL細胞内で20のAnnexin-V陽性細胞を誘発した。未処理のコントロール値を引いた後、これはhuCD20-7により誘発される12のAnnexin-V陽性Jeko-1細胞、及びリツキシマブによるたったの1に相当する。最終的に、huCD20-7は、リツキシマブについて23、及び未処理細胞について18と比較し、Granta-519MCL細胞内で58のAnnexin-V陽性細胞を誘発した。未処理のコントロール値を引いた後、これはhuCD20-7により誘発される40、及びリツキシマブによる21によるたったの5のAnnexin-V陽性Granta-519細胞に相当する。実施例10ヒト抗体を用いた脂質ラフトアッセイRamos細胞に対する脂質ラフトアッセイを、他のCD20抗体と比較し、前述した通りに、huCD20-7について実施した。リツキシマブ及び2F2抗体は、既に開示されている脂質ラフト活性を有するI型抗体であるが、GA101-F及びB1は、脂質ラフトを欠き、その結果としてCDC活性を欠いているII型抗体である。予想通り、リツキシマブ及び2F2で処理した細胞は、TritonX-100処理したもの、及びしないもので同じレベルの蛍光を示す図14。一方、B1又はGA101-Fで染色した細胞の平均蛍光は、TritonX-100で処理しないよりもした方が低く、これは、脂質ラフト内へのCD20の再分解能力と一致する。意外にも、huCD20-7で染色した細胞の平均蛍光は、TritonX-100で処理したもの、又はしないもので同様である。従って、huCD20-7は、リツキシマブ及び2F2と同様、B細胞膜の脂質ラフト区画へCD20を効率的に移行し得る。huCD20-7のCDC活性リツキシマブ及びGA101-Fと比較したhuCD20-7のCDC活性を、実施例6のキメラ抗体について記載された通りに測定した。意外にも、huCD20-7抗体は、図15Aに示すように、Daudiリンパ腫細胞においてリツキシマブと類似のCDC活性を有していた。リツキシマブ又はhuCD20-7の処理は、それぞれ0.23及び0.25μg/mLのEC50をもって、Caudi細胞の生存度を完全に低下させた。予想通り、典型的なII型抗体であるGA101-Fは、Daudi細胞に対してCDC活性をなんら示さなかった。図15Bに示すように、Ramosリンパ腫細胞について同様の結果が示された。リツキシマブ又はhuCD20-7の処理は、それぞれ0.09及び0.014μg/mLのEC50をもって、Ramos細胞の生存度を完全に低下させた。予想通り、典型的なII型抗体であるGA101-Fは、Ramos細胞に対して最小のCDC活性を有していた。更に、huCD20-7は、WSU-DLCL-2及びRLリンパ腫に対し、リツキシマブよりも、強力なCDC活性を有していた。リツキシマブは、1.9μg/mLのEC50で、最高濃度において、WSU-DLCL-2細胞の細胞生存度を34まで低下させた。一方、huCD20-7は、0.58μg/mLのEC50で、最高濃度において、WSU-DLCL-2細胞の細胞生存度を11まで低下させた図16A。リツキシマブは、4.3μg/mLのEC50で、最高濃度において、RL細胞の細胞生存度を56まで穏やかに低下させた。一方、huCD20-7は、より低い0.67μg/mLのEC50で、最高濃度において、RL細胞の細胞生存度を11まで低下させた。実施例11huCD20-7のADCC活性エフェクター細胞として、新しく分離したヒトナチュラルキラーNK細胞を用い、腫瘍細胞系の抗体依存性細胞傷害ADCCを測定するために、ラクテートデヒドロゲナーゼLDHリリースアッセイを用いた例えば、Shields,J.Biol.Chem.,2769:6591-66042001。NK細胞は、NKIsolationKitIIMiltenyiBiotech,130-091-152を用い、正常供与者ResearchBloodComponents,Inc.,Brighton,MA由来のヒト血液から最初に分離された。血液を1×PBSで2倍に希釈した。25mLの希釈した血液を、50mLの円錐管中の25mLのFicollPaqueに注意深く積層し、室温で、400gで45分間遠心分離した。接触面から末梢血単核細胞PBMCを集め、新しい50mLの円錐管に移し、1×PBSで1回洗浄した。PBMCを2mLのNK-分離バッファー1×PBS、0.5BSA、2mMEDTAに再懸濁し、次いで、細胞懸濁液に500μLのビオチン-抗体混合物を加えた。ビオチン-抗体混合物は、NK細胞を除いてリンパ球と結合するビオチニル化抗体を含み、NK細胞の陰性選択をもたらす。混合物を4°Cで10分間インキュベートし、次いで1.5mLのNK-分離バッファー及び1mLの抗-ビオチンミクロビーズを加えた。細胞-抗体混合物を4°Cで更に15分間インキュベートした。次いで、細胞を50mLのNK-分離バッファーで1回洗浄し、3mLのNK-分離バッファーに再懸濁した。次いで、MACSLSカラムを自動MACS分離器MiltenyiBiotechに積層し、3mLのNK-分離バッファーで予備洗浄した。細胞懸濁液をカラムに自動的に積層し、洗浄し、未標識NK細胞を含む溶出画分を、新しい50mLの円錐管に集めた。得られたNK細胞を、30mLの完全RPMI培地5ウシ胎児血清、1ペニシリン-ストレプトマイシン、1mMHEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、1の100×MEM非必須アミノ酸溶液を追加したRPMI-1640内に一晩まいた。次のアッセイ及び全ての希釈は、RHBP培地20mMHEPESpH7.4、0.1BSA、1ペニシリン-ストレプトマイシンを追加したRPMI-1640で実施した。RHBP培地内の種々の濃度の抗体を、丸底型の96ウェルプレートに、50μL/ウェルになるように、二連で一定量ずつ加えた。標的細胞を、RHBP培地内に、106細胞/mLで再懸濁し、抗体希釈物を含む各ウェルに100μL/ウェルで加えた。標的細胞及び抗体希釈物を含むプレートを37°Cで30分間インキュベートした。次いで、NK細胞を、標的細胞を含むウェルに50μL/ウェルで加えた。通常の比は、3~4個のNK細胞に対して約1個の標的細胞であった。各実験について、少なくとも以下のコントロールを設定した:NK細胞のみ、標的細胞のみ自発的なLDH遊離、標的細胞及びNK細胞抗体依存LDH遊離、標的細胞及び10TritonX-100最大のLDH遊離。混合物を37°Cで4時間インキュベートし、細胞を溶解させた。プレートを1200rpmで10分間遠心分離し、100μLの上清を、新しい丸底型の96ウェルプレートに注意深く移した。CytotoxicityDetectionKitRoche1644793由来のLDH反応混合物100μL/ウェルを各ウェルに加え、室温で5~30分間インキュベートした。試料の吸光度は490nmで測定したOD490。各試料の特異的溶解の割合は、以下の式を用いて決定した:特異的溶解の割合=試料の値-自発的な遊離/最大遊離-自発的な遊離100。huCD20-7とのインキュベーションは、ヒトNKエフェクター細胞の存在下に、Ramosリンパ腫及びJVM-13慢性リンパ球性白血病に対して良好なADCC活性をもたらす。Ramosリンパ腫細胞におけるADCC活性を、huCD20-7、リツキシマブ、GA101-F及び2F2と比較した図17。huCD20-7を用いた処置は、他のCD20抗体を用いて観察される活性と同様、約80のRamos細胞溶解をもたらした。huCD20-7によるADCC活性は1.1ng/mLのEC50を有し、リツキシマブは3.5ng/mL、2F2は1.2ng/mL、GA101-Fは0.59ng/mLのEC50を有していた。JVM-13CLL細胞におけるhuCD20-7のADCC活性を、リツキシマブ及び2F2と比較した。huCD20-8の処置は、リツキシマブ又は2F2と同様、40のJVM-13細胞の溶解を起こした。huCD20-7によるADCC基アッセイは0.23nm/mLのEC50を、リツキシマブは0.29ng/mL、2F2は0.17ng/mLのEC50を有していた。実施例12エピトープマッピングCD20の細胞外ドメインは2子の細胞外ループを含む。大きいループは、第三及び第四の膜透過性ドメインの間に約44個のアミノ酸からなる。従って、開示されたほとんどのCD20抗体は、効果的な結合のために、より大きいループ内にアミノ酸残基を必要とする。突然変異分析は、抗体結合のための重要な残基として、少なくともアラニン170A170及びプロリン172P172を識別するPolyak,Blood,99:3256-32622002;及びPolyak,J.Immunol.,161:3242-32481998。マウスCD20のこの位置に見られる、A170及びP172残基をセリンに変換すると、B1のようなCD20抗体結合を無効にする。同様に、マウスの大きな細胞外ループを含むCD20にA170及びP172残基を導入すると、B1及びリツキシマブを含むほとんどのCD20抗体の結合を可能にする。一方、2F2を含む、独特な一連の抗体は、CD20A170SP172S変異体と結合することが報告されていることが開示されたTeelingら,2006上述。更に、残基アスパラギン163N163又はアスパラギン166N166をアスパラギン酸に変換すると、2F2の結合を低下させるが、B1又はリツキシマブを含む他の抗CD-20抗体の結合には影響しなかったTeelingら、2006Blood.177:363-371。この新規なエピトープは、強力なCDC活性が種湯細胞に対する限定的な直接プロアポトーシス活性を伴う、それらの生物学的活性と連結していることを示唆している。CD20-7及びCD20-6を更に特徴づけるため、我々は、CD20変異体への結合を分析した。CD20変異体のクローニング及び発現発現プラスミドpSRa-CD20は、pSRaベクターへのクローニングのためのXbaI及びBamHI制限部位によりフランクされる、BlueHeronByotechnologiesによりコドン最適化及び合成された、完全ヒトCD20cDNA配列を含む。CD20-A170SP172S変異体CD20-APは、A170SP172S突然変異を含む、pSRa-CD20プラスミドのSacIからMfe1断片を増幅するため、5’プライマーhCD20sacAP-SSATTAGAGCTCACACACCATATATTAACATATACAACTGTGAACCATCGAATTCCTCTGAGAAAAACT配列番号:41を、3’末端逆方向プライマーSRaMfe1RAATGCAATTGTTGTTGTTAACT配列番号:42を用いて、PCRにより生成した。PCR産物を、pSRa-CD20プラスミドのSacI及びMfe1部位にクローニングした。突然変異生成は、得られたクローン中に、EcoRI部位及びCD20配列変化を導入し、これは、制限酵素消化、それに続くDNA配列決定により証明された。5’末端プライマー内の特定のコドンを修飾することにより、同じSacIからMfe1断片のPCR突然変異生成により、CD20N163DN166D二重CD20-NNDD及びCD20N163DCD20-N163D単一突然変異を生成した。TheCD20N163DN166D変異断片は、hCD20sacNN-DD5’末端プライマーATTAGAGCTCACACACCATATATCGATATATACGATTGTGAACCA配列番号:43を用いて増幅し、CD20N163D断片は、hCD20sacN163D5’末端プライマーATTAGAGCTCACACACCATATATTGATATCTACAACTGTGA配列番号:44を用いて増幅した。SacIからMfe1断片を、pSRa-CD20のSacI及びMfe1部位にクローニングし、構築物は、それぞれ導入されたCla1又はEcoRv部位についてスクリーニングした。DNA配列決定により、陽性クローンを更に確認した。公知のエレクトロポレーション法を用い、300-19細胞にCD20変異体発現プラスミドをトランスフェクションすることにより、安定な細胞を作成した。すなわち、5×106個の300-19細胞を、260V及び960μFにセットしたBioRadGenePulserを用い、低温のRPMI-1640培地にエレクトロポレートした。次いで、細胞を希釈し、10FBS及び50μMβ-メルカプトエタノールを追加したRPMI-1640培地を入れた96ウェルプレートに播種した。24時間後、G418例えば、Invitrogenから入手できるを最終濃度2mg/mLになるように加え、トランスフェクト細胞を選択した。2週間後、単一のコロニーを分離して広げた。CD20変異体への抗体結合ヒトCD20野生型及び変異体を発現するCD20APに対する種々のCD20抗体の結合をフローサイトメトリーにより分析した。図18A及び18Bに示し得るように、CD20-7及びCD20-6を含む全ての抗体は野生型のCD20発現細胞と結合する。CD20AP変異体について得られたデータを図19に示す。予想通りに、リツキシマブ及びGA101-FはCD20AP変異体と結合しなかったが、B1は最小の結合を示した。それに対し、2F2は、既に報告されているようにTeelingら2006,上述、CD20AP変異体と結合することができる。意外にも、huCD20-7は、CD20AP変異体と結合する図19Aを参照されたい。同様に、muCD20-6及びmuCD20-7も、CD20AP変異体と結合し得る図19B。N163D及びN166D変異体は、2F2の結合を低下させることが示されたが、B1又はリツキシマブのような他の抗-CD20抗体の結合に影響しない。予想通り、リツキシマブ及びGA101-FはCD20-N163D変異体と結合するが、2F2は、結合の低下を示す図20A。一方、huCD20-7、muCD20-7及びmuCD20-6は、CD20N163Dに対する結合を欠失していた。同様に、リツキシマブ及びGA101-FはCD20-N163DN166D変異体と結合するが、2F2は最小の結合を示した図21。また、huCD20-7、muCD20-7及びmuCD20-6は、CD20N163DN166Dに対する結合を欠失していた。この予想外の結果は、huCD20-7が、GA101及びB1のようなII型抗体と機能的に関連しているが、これらの抗体とは異なるエピトープを明らかに必要とすることを示す。他のほとんどの抗体と同様、huCD20-7は、CD20のA170及びP172残基に依存しない。従って、huCD20-7は、物理的及び機能的特徴の組合せを実現されていない組合せを備えた、新しいCD20抗体である。実施例13CD20-7-SPP-DM1の調製N-スクシニミジル4-2-ピリジルジチオ9ペンタノエートSPPをエタノールに溶解した。huCD20-7抗体を、50mMNaCl、2mMEDTA及び5エタノールを含む50mMリン酸カリウムバッファーpH6.5内で、室温で約100分間、7倍のモル過剰のSPPリンカーと8mg/mLでインキュベートした。前述したリン酸カリウムバッファーで平衡化した、HADEX商標G25Fを用いて反応混合物を精製した。抗体含有画分を集め、次の工程で用いた。典型的なメイタンシノイドDM1をジメチルアセトアミドに溶解しDMA、最終濃度は3、リンカーに対して1.7倍モル過剰をSPP修飾抗体に滴下して加えた。室温で一晩インキュベーションした後、連結抗体を、リン酸緩衝生理食塩水PBS、pH6.5で平衡化したHADEX商標G25Fによるクロマトグラフィーにより精製した。次いで、huCD20-7-SPP-DM1複合体を、10mMヒスチジン、250mMグリシン、1ショ糖、pH5.5を含むバッファーで透析した。抗体分子あたりに連結したDM1分子の数を、既に報告されている、抗体及びDM1についての吸光係数Liuら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,8618-86231996を用いて決定した。複合反応後に存在する遊離のメイタンシノイドの割合を、100mM酢酸アンモニウムバッファー、pH7.0中、25アセトニトリルで平衡化し、アセトニトリル中で溶出する、HiSep商標カラムに20~50μgの複合体を注入することにより測定した。遊離のメイタンシノイドの全ピーク面積勾配により溶出し、既知の標準品との溶出時間の比較により同定を、252nmの波長に設定した吸光度検出器を用いて測定し、結合型メイタンシノイドカラムを通過する画分中の複合体ピーク内の溶出に対するピーク面積と比較し、全ての遊離のメイタンシノイド種の割合を計算した。huCD20-7抗体あたり3.5~4個のDM1分子を有する複合体を、未連結メイタンシノイドとして<1で得た。huCD20-7-SMCC-DM1の調製スクシニミジル4-N-マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレートSMCC、PierceBiotechnology,IncリンカーをDMAに溶解した。50mMリン酸カリウム、50mMNaCl、2mMEDTA、pH6.5中で、8mg/mLの抗体を、7.5~10倍モル過剰量のSMCCとインキュベートすることにより、抗体中にマレイミドを導入し、SMCCによりhuCD20-7抗体を修飾した。室温で、アルゴン雰囲気下、2~4時間撹拌した後、反応混合物を、同じリン酸カリウムバッファーで平衡化したHADEX商標G25カラムを用いて精製した。抗体含有画分を集め、次の工程で用いた。SMCC修飾抗体を、マレイミドリンカーに対して1.7倍モル過剰量で、DM1の10mM溶液と反応させた。反応物を、アルゴン雰囲気下、室温で4~約16時間撹拌した。連結反応混合物を、pH6.5で、1×PBSで平衡化したHADEX商標G25カラムでろ過した。次いで、huCD20-7-SMCC-DM1複合体を、1mMヒスチジン、250mMグリシン、1ショ糖、pH5.5を含むバッファーで透析した。抗体分子あたりに連結したDM1分子の数及び遊離の全メイタンシノイドの割合を、上述した通りに測定した。huCD20-7抗体あたり3.5~4個のDM1分子を有する複合体を、未連結メイタンシノイドとして<1で得た。huCd20-7-SPDB-DM4の調製典型的なN-スクシニミジル4-2-ピリジルジチオブタノエートSPDBリンカーをエタノールに溶解した。50mMNaCl、2mMEDTA、及び3エタノールを含む50mMリン酸カリウムpH6.5中、huCD20-7抗体を、8mg/mLで5倍モル過剰量のSPDBリンカーと約10分間、室温でインキュベートした。反応混合物を、上述のリン酸カリウムバッファーで平衡化したHADEX商標G25Fカラムを用いて精製した。抗体含有画分を集め、次の工程で用いた。メイタンシノイドDM4をジメチルアセトアミドDMA、最終濃度は3に溶解し、リンカーに比較して1.7倍モル過剰量をSPDB修飾抗体に滴下して加えた。室温で一晩インキュベーションした後、連結抗体を、1×PBSpH6.5で平衡化したHADEX商標G25Fカラムによるクロマトグラフィーにより精製した。次いで、huCD20-7-SPDB-DM4複合体を、10mMヒスチジン、250mMグリシン、1ショ糖pH5.5を含むバッファーで透析した。抗体分子あたりに連結したDM4の数を、抗体及びメイタンシノイドについて既に報告されている吸光係数Widdison,WCら、JMedChem,49:4392-44082006を用いて測定した。全ての遊離のメイタンシノイド種の割合を上述の通りに計算した。huCD20-7抗体あたり3.5~4個のDM4分子を有する複合体を、未連結メイタンシノイドとして<1で得た。huCD20-7-PEG4-mal-DM4の調製DM4-mal-PEG4-NHS試薬をDMAに溶解し、12mM貯蔵液を調製した。50mMリン酸カリウム、50mMNaCl、2mMEDTA、pH7.5及び10容量DMA中、4mg/mLの抗体濃度で、huCD20-7抗体を、15当量のDM4-mal-PEG4-NHSを用いて修飾した。アルゴン雰囲気下、室温で2~4時間撹拌した後、反応混合物を、同じリン酸カリウムバッファーで平衡化したHADEX商標G25カラムを用いて精製した。次いで、huCD20-7-PEG4-mal-DM4複合体を、10mMヒスチジン、250mMグリシン、1ショ糖pH5.5を含むバッファーで透析した。抗体分子あたりに連結するDM4分子の数、及び遊離の全メイタンシノイド種の割合を、既に開示された通りにして測定した。huCD20-7抗体あたり3.5~4個のDM4分子を有する複合体を、未連結メイタンシノイドとして<1で得た。huCD20-7-スルホ-mal-DM4の調製60DMA/40200mMコハク酸バッファーpH5中、3-フルオロ-mal-NHSリンカーを1.6当量のL-DM4-SHと、室温で2時間反応させることにより、DM4-mal-3-スルホ-NHSをインサイチューで生成した。50mMリン酸カリウム、50mMNaCl、2mMEDTA、pH7.5及び10容量DMA中、huCD20-7抗体5mg/mLあたり、8当量の反応混合物4mMリンカー濃度を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で2~4時間撹拌した後、反応混合物を、同じリン酸カリウムバッファーで平衡化したHADEX商標G25カラムを用いて精製した。次いで、huCD20-7-スルホ-mal-DM4複合体を、10mMヒスチジン、250mMグリシン、1ショ糖pH5.5を含むバッファーで透析した。抗体分子あたりに連結したDM4分子の数、及び遊離の全メイタンシノイド種の割合を、上述した通りにして測定した。huCD20-7抗体あたり3.5~4個のDM4分子を有する複合体を、未連結メイタンシノイドとして<1で得た。実施例14複合体の結合親和性SMCC-DM1又はSPP-DM1と連結した後のhuCD20-7の結合親和性を、前記実施例に記載された通りにELISAによりアッセイした。見かけの解離定数Kdの値は図22に示す結合曲線から計算し、huCD20-7について0.7nM、SMCC-DM1について0.9nM、及びSPP-DM1複合体について1.1nMに相当する。この結果は、例えば、SMCC-DM1又はSPP-DM1の連結が抗体の親和性を著しく変化させないことを証明する例えば、CD20-7。更に、例えばスルホ-mal-DM4に連結後のhuCD20-7の結合親和性を、上記実施例に記載された通りにアッセイした。見かけの解離定数Kdの値は、図22Bに示す結合曲線から計算し、huCD20-7について0.8nM、スルホ-mal-DM4複合体について1.3nMに相当する。この結果は、スルホ-mal-DM4の連結が抗体の親和性を著しく変化させないことを証明する例えば、CD20-7。複合体のプロアポトーシス活性SMCC-DM1又はSPDB-DM4へと連結した後のhuCD20-7のプロアポトーシス活性を、例えば、上記に記載したようなAnnexin-Vアッセイにより、Ramos細胞によりアッセイした。Ramos細胞を、種々の濃度のhuCD20-7抗体又は複合体と20時間インキュベートし、次いでAnnexin-V-FITC及びTO-PRO登録商標-3染色し、フローサイトメトリー分析を行った。Annexin-V陽性細胞の割合を、図23の片対数プロットにおいて抗体濃度に対してプロットした。huCD20-7による処理は、未処理細胞についての3と比較し、Annexin-Vの51の最大をもたらす。リツキシマブによる処理は、たったの10のAnnexin-V陽性細胞を誘発した。huCD20-7-SMCC-DM1複合体による処理は、Annexin-V陽性細胞の73までの増加をもたらしたが、huCD20-7-SMCC-DM4は、82までの更なる増加をもたらした。一方、非結合アイソタイプコントロール抗体のSMCC-DM1又はSPDB-DM4複合体は、それぞれ、4又は8のAnnexin-V陽性細胞をもたらした。例えば、Ramos細胞に対するhuCD20-7のプロアポトーシス活性は、メイタンシノイド連結により増強する。複合体のCDC活性例えば、連結後のhuCD20-7のCDC活性を、前述した通りに、ヒト補体の存在下におけるリンパ腫細胞においてアッセイした。Daudiリンパ腫細胞について図24Aに示すように、例示的な、huCD20-7のSPDB-DM4及びPEG4-mal-DM4複合体は、未連結抗体として、類似のCDC活性、及び約0.4μg/mLのEC50を有していた。WSU-DLCL-2びまん性B細胞リンパ腫図24Bにおいては、huCD20-7、huCD20-7-SPDB-DM4及びhuCD20-7-PEG4-mal-DM4は、同様のCDC活性、及び約0.5μg/mLのEC50を有していた。WSU-DLCL-2細胞について図25Aに示すように、huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、-SPP-DM1及びスルホ-mal-DM4は同様のCDC活性及び約0.5μg/mLのEC50を有していた。Ramosリンパ腫細胞図25Bにおいては、huCD20-7、huCD20-7-SMCC-DM1、-SPP-DM1及びスルホ-mal-DM4は同様のCDC活性及び約0.2μg/mLのEC50を有していた。従って、例えば、huCD20-7のCDC活性は、メイタンシノイド連結の後に維持されている。複合体のADCC活性例えば、SMCC-DM1と連結後のhuCD20-7のADCC活性を、前述したような、LDHリリースアッセイにより、ヒトNKエフェクター細胞の存在下に、Ramos及びGranta-519細胞において評価した。図26に示すように、huCD20-7-SMCC-DM1複合体は、Ramos細胞において未連結のhuCD20-7抗体と同様のADCC活性、40の最大細胞溶解、並びにそれぞれ1.8ng/mL及び1.4ng/mLのEC50を有する。標的細胞として他の細胞例えば、Granta-519MCL細胞を用いて同様の結果が得られた。huCD20-7-SMCC-DM1複合体は、Granta-519細胞において、未連結のhuCD20-7抗体と、同程度のADCC活性を有し、約25の最大細胞溶解、並びにそれぞれ0.22ng/mL及び0.14ng/mLのEC50を有する。CDCについて見られるように、huCD20-7のADCC活性は、メイタンシノイド連結後に維持されている。実施例15インビトロにおける細胞毒性アッセイ例示的なhuCD20-7複合体の、細胞増殖を阻害する能力を、インビトロ細胞毒性アッセイを用いて測定した。通常、標的細胞を、100μLの完全RPMI培地RPMI-1640、10ウシ胎児血清、2mMグルタミン、1ペニシリン-ストレプトマイシン、全ての試薬はInvitrogen製中、ウェルあたり5,000細胞に播種した。抗体及び複合体を、3倍希釈系列を用いて、完全RPMI培地で希釈し、ウェルあたり100μLを加えた。最終濃度は、通常は3×10-8M~4.6×10-12Mの範囲であった。細胞を、加湿した5CO2インキュベーター内で、37°Cで4~5日間インキュベートした。残存する細胞の生存度を、比色分析WST-8アッセイDojindoMolecularTechnologies,Inc.,Rockville,MD,USにより測定した。WST-8は、組織培養培地内で可溶性であるオレンジ色のホルマザン産物に対して、生細胞内のデヒドロゲナーゼにより減少する。ホルマザン産物の量は、生細胞の数に直接比例する。WST-8を、最終容積の10で加え、プレートを、加湿した5CO2インキュベーター中で、更に2~4時間、37°Cでインキュベートした。マルチウェルプレートリーダー内で、450nmの吸光度A450を測定することにより、プレートを分析した。培地及びWST-8のみを含むウェルのバックグラウンドのA450の吸光度を全ての値から引いた。生存度の割合は、処理した、各試料の値を、未処理の細胞を含むウェルの平均値で割ることにより計算した。生存度の割合=100処理した試料のA450-バックグラウンドのA450/未処理の試料のA450-バックグラウンドのA450。生存度の割合の値を、各処理について、片対数プロットにおいて、抗体又は複合体濃度に対してプロットした。Ramos細胞における、huCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロにおける細胞毒性Ramos細胞に対する、huCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロにおける細胞毒性を、リツキシマブ及び非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体の活性と比較した。図27Aに示すように、huCD20-7のインキュベーションは、生存度の60までの低下をもたらしたが、リツキシマブは生存度を80まで低下させた。huCD20-7-SMCC-DM1による処理は、生存度を完全に低下させ、0.68nMのEC50を有していたが、非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体は20nMのEC50を有しており、huCD20-7-SMCC-DM1について、予想外の有意な29倍の特異性ウインドウをもたらした。Ramos細胞に対するhuCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロにおける細胞毒性を、リツキシマブ及び非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体の活性と比較した。図27Aに示すように、huCD20-7のインキュベーションは、生存度の60までの低下をもたらしたが、リツキシマブは80まで生存度を低下させた。huCD20-7-SMCC-DM1による処理は、生存度を完全に低下させ、0.68nMのEC50を有していたが、非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体は20nMのEC50を有しており、huCD20-7-SMCC-DM1について、予想外の有意な29倍の特異性ウインドウをもたらした。Daudi細胞における、huCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性Daudi細胞に対する、huCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性を、リツキシマブ及び非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体の活性と比較した。図27Bに示すように、huCD20-7のインキュベーションは、最大濃度において、生存度の65までの低下をもたらしたが、リツキシマブは80まで穏やかに生存度を低下させた。huCD20-7-SMCC-DM1による処理は、試験した最大濃度で、生存度を完全に低下させ、0.77nMのEC50を有していたが、非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体は、12nMのEC50を有し、Daudi細胞に対して、huCD20-7-SMCC-DM1について予想外の有意な16倍の特異性ウインドウをもたらした。Granta-519細胞における、huCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性Granta-519MCL細胞に対する、huCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性を、リツキシマブ及び非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体の活性と比較した。図28Aに示すように、huCD20-7のインキュベーションは、最大濃度において、生存度の45までの低下をもたらしたが、リツキシマブは60まで穏やかに生存度を低下させた。huCD20-7-SMCC-DM1による処理は、試験した最大濃度で、生存度を完全に低下させ、0.03nMのEC50を有していたが、非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体は、13nMのEC50を有し、Granta-519細胞に対して、huCD20-7-SMCC-DM1について予想外の有意な419倍の特異性ウインドウをもたらした。SC-1細胞における、huCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性SC-1FL細胞に対する、huCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性を、リツキシマブ及び非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体の活性と比較した。図28Bに示すように、huCD20-7のインキュベーションは、最大濃度において、生存度の35までの低下をもたらしたが、リツキシマブは75まで穏やかに生存度を低下させた。huCD20-7-SMCC-DM1による処理は、試験した最大濃度で、生存度を完全に低下させ、0.39nMのEC50を有していたが、非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体は、31nMのEC50を有し、SC-1細胞に対して、huCD20-7-SMCC-DM1について予想外の有意な79倍の特異性ウインドウをもたらした。DOHH-2細胞におけるhuCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性DOHH-2FL細胞に対する、huCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性を、リツキシマブ及び非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体の活性と比較した。図29Aに示すように、huCD20-7のインキュベーションは、最大濃度において、生存度の20までの低下をもたらしたが、リツキシマブは25まで生存度を低下させた。huCD20-7-SMCC-DM1による処理は、試験した最大濃度で、生存度を完全に低下させ、0.12nMのEC50を有していたが、非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体は、35nMのEC50を有し、DOHH-2細胞に対して、huCD20-7-SMCC-DM1について予想外の有意な292倍の特異性ウインドウをもたらした。Molt-4細胞に対するhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性huCD20-7-SMCC-DM1細胞毒性の特異性を更に検証するため、その活性を、非CD20発現Molt-4T-細胞急性リンパ性白血病細胞系に対する非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体と比較した。本実験においては、相対的に低い非特異的細胞毒性をとらえるために、濃度の高い、両複合体を用いた。図29Bに示すように、huCD20-7-SMCC-DM1及び非特異的複合体は、33nMのEC50を有しており、同じ細胞毒性を示した。huCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性の概要例えば、意外にも、huCD20-7は、Ramos、Daudi、Granta-519、SC-1及びDOHH-2細胞に対し、リツキシマブよりも活性である。標的細胞の生存度の低下は、huCD20-7とのインキュベーション後の、リツキシマブとの処理よりも大きい。更に、例えば、huCD20-7のSMCC-DM1複合体は、抗体に対して強力な細胞毒性活性をもたらす。腫瘍細胞の生存度は、抗体処理のみと比較し、複合体処理に応答し、より完全に低下した。非標的huIgG-SMCC-DM1複合体の効力に対してhuCD20-7-SMCC-DM1の効力を比較した場合、各CD20発現細胞系について、有意な特異性ウインドウが観察され、これは、細胞毒性が、huCD20-7抗体標的細胞と結合した結果であることを示す。更に、例えば、huCD20-7-SMCC-DM1及び複合体は、抗原陰性のMolt-4細胞に対して同一の低い細胞毒性を示した。従って、huCD20-7-SMCC-DM1について観察された細胞毒性は、CD20の発現に依存する。SMCC-DM1複合体についてのEC50実施例16huCD20-7-SMCC-DM1は、Ramos細胞に対して、リツキシマブ-SMCC-DM1よりも活性である例えば、Ramosリンパ腫細胞に対する、huCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性を、リツキシマブ、リツキシマブ-SMCC-DM1及び非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体の活性と比較した。図30Aに示すように、huCD20-7によるインキュベーションは、最大濃度において、生存度の55までの低下をもたらしたが、リツキシマブは大幅に生存度を低下しなかった。huCD20-7-SMCC-DM1による処理は、生存度を完全に低下させ、0.72nMのEC50を有していたが、非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体は、22nMのEC50を有していた。リツキシマブ-SMCC-DM1による処理は、3.3nMのEC50をもって細胞毒性をもたらした。従って、huCD20-7-SMCC-DM1複合体は、リツキシマブ-SMCC-DM1よりもインビトロにおける強力な細胞毒性活性を有していた。huCD20-7-SMCC-DM1は、Daudi細胞に対して、リツキシマブ-SMCC-DM1よりも活性である例えば、Daudiリンパ腫細胞に対する、huCD20-7及びhuCD20-7-SMCC-DM1のインビトロ細胞毒性を、リツキシマブ、リツキシマブ-SMCC-DM1及び非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体の活性と比較した。図30Bに示すように、huCD20-7によるインキュベーションは、最大濃度において、生存度の50までの低下をもたらしたが、リツキシマブは65まで生存度を低下させた。huCD20-7-SMCC-DM1による処理は、生存度をなくし、1.0nMのEC50を有していたが、非特異的huIgG-SMCC-DM1複合体は、15nMのEC50を有していた。リツキシマブ-SMCC-DM1による処理は、2.6nMのEC50をもって細胞毒性をもたらした。従って、huCD20-7-SMCC-DM1複合体は、リツキシマブ-SMCC-DM1よりもインビトロにおける強力な細胞毒性活性を有していた。実施例17放射性標識複合体の調製huCD20-7及びリツキシマブの放射標識複合体は、トリチウム標識DM1[3H]DM1を用いることを除き、非標識複合体についてWiddisonらWiddisonら、JMedChem2006;49:4392-408に開示されたのと基本的に同一の方法を用いて調製した。この方法は、EricksonらEricksonらBioconjugChem2010;21:84-92にも詳細に開示されている。すなわち、最初に、抗体を、そのリジン残基を、N-スクシニミジル4-N-マレイミドメチルシクロヘキサン-1カルボキシレートSMCCで修飾し、ゲルろ過により精製し、トリチウムを、そのC-20-メトキシ基に安定に導入し、DM1と連結させた。トリチウム標識DM1は、アンサミトシンP-3から調製した。細菌株ストレプトマイセスプラテンシスとインキュベートすることにより、アンサミトシンP-3のC20メトキシ基を除去し、アンサミトシンPDM-3を得たAsaiら、米国特許第4,307,016号。次いで、アンサミトシンPDM-3のC-20-OH部分を、SawadaSawadaら.BioconjChem1993;4:284-289に開示された方法により、トリチウム標識ヨウ化メチルを用いてメチル化した。抗体分子あたりの連結メイタンシノイド分子の比D/A及び比放射能を以下の通りであった:リツキシマブ-SMCC-[3H]DM13.5D/A、1.9Ci/ミリモル及びhuCD20-7-SMCC-[3H]DM13.4D/A、1.8ci/ミリモル。リツキシマブ-SMCC-[3H]DM1及びhuCD20-7-SMCC-[3H]DM1の活性2種の複合体及び関連未修飾抗体が、CD20陽性SU-DHL-4細胞に対する類似の結合親和性を有することがわかった図31A。CD20-陽性SU-DHL-4細胞及びCD20-陰性COLO205についての2種の複合体の細胞毒性の効力を、実施例15に開示されたような、細胞に基づく生存度アッセイを用いて評価した。両方の複合体は、huCD20-7-SMCC-[3H]DM1及びリツキシマブ-SMCC-[3H]DM1複合体、それぞれについて、約0.1nM及び0.24nMのIC50値をもって強力であることがわかった図31B。予想通り、両方の複合体は、huCD20-7-SMCC-[3H]DM1及びリツキシマブ-SMCC-[3H]DM1複合体、それぞれについて34nM及び11nMのEC50値を有し、抗原-陰性COLO205大腸癌に対して効力は弱かった。これは、これら2種の複合体による細胞死滅がCD20-依存的であることを示す。Ramos及びDaudi細胞について実施例16に示すように、huCD20-7-SMCC-[3H]DM1複合体は、SU-DHL-4細胞に対して、リツキシマブ-SMCC-DM1よりも強力な細胞毒性活性を有していた。リツキシマブ-SMCC-[3H]DM1及びhuCD20-7-SMCC-[3H]DM1の標的細胞代謝産物放射標識複合体に標的細胞をさらした後に形成される代謝産物の量及びタイプを評価するために、10FBSを追加した21mLのRPMI-1640培地内のSU-DHL-4細胞の培養物17×106を、37°C、6CO2中、40nMの3H-複合体に30分間さらした。細胞をRMPI-1640培地で3回洗浄し、あらゆる未結合複合体を除去し、新鮮な培地に再懸濁し8×105細胞/mL、37°C、6CO2で22時間インキュベートした。細胞を集め、0.3mLのTris緩衝生理食塩水、pH7.5に懸濁した。アセトン4:3v/vを加え、試料を混合し、-80°Cで1時間凍結し、タンパク質を沈殿させた。試料を解凍し、2,000×gで15分間遠心分離し、再懸濁し、沈殿物を分離した。真空遠心分離evacuatedcentrifugeを用いて、タンパク質を含まないメイタンシノイド代謝産物を含む上清を蒸発して乾燥した。抽出物を、0.025のトリフルオロ酢酸を含む20アセトン水溶液0.12mLに溶解し、メイタンシノイドについて分離されたメイタンシノイド代謝産物を、分析用C-18カラムVydac,0.46×25cmEricksonら.CancerRes2006;66:4426-33により分離した。溶出物を1mLの画分に集め、各画分についての放射活性を、各バイアルを4mLのUltimaGold液体シンチレーションカクテルと混合し、Tri-Carb2900T液体シンチレーションカウンターでカウントすることにより測定した。アセトン沈殿物を0.3mLの水に再懸濁し、1mLのSolvable試薬PerkinElmerを加えることにより溶解した。次いで、試料を50°Cの水浴中で一晩インキュベートした。インキュベーションから試料を取り除き、0.1mLの0.1MEDTA及び0.3mLの30過酸化水素を各試料に加え、次いで室温で15分間インキュベートした。次いで、試料を50°Cで1時間インキュベートした。0.2mLの1NHClを各試料に加え、15mLのUltimaGoldシンチレーション液を加えた。試料を激しく撹拌し、暗所に一晩置き、LSCによりカウントした。SU-DHL-4細胞を、huCD20-7-SMCC-[3H]DM1及びリツキシマブ-SMCC-[3H]DM1に短時間さらすことにより、細胞あたりに結合する同様の高レベルの複合体が得られた図32A。細胞あたりに結合する各複合体の量を、複合体への初期暴露及び洗浄工程後の細胞に関連する全放射活性から測定した。アセトン抽出及び放射線測定を伴うHPLC分離により、暴露の22時間後に、メイタンシノイド代謝産物を定量した。両方の複合体にさらした22時間後の細胞に観察されるたった1種の代謝産物はリシン-SMCC-[3H]DM1であることがわかった。他の代謝産物は観察されなかった。リシン-SMCC-[3H]DM1代謝産物は、huC242-SMCC-[3H]DM1のたった1種の標的細胞代謝産物であると、すでに同定されていたEricksonらCancerRes2006;66:4426-33。細胞をhuCD20-7-SMCC-[3H]DM1複合体にさらした22時間後のリシン-SMCC-[3H]DM1のレベルは、約0.6ピコモル/106細胞であることがわかった。一方、細胞をリツキシマブ-SMCC-[3H]DM1複合体にさらした22時間後のリシン-SMCC-[3H]DM1のレベルは、約0.3ピコモル/106細胞であることがわかった。従って、細胞を、リツキシマブ-SMCC-[3H]DM1にさらした後よりも、huCD20-7-SMCC-[3H]DM1複合体にさらした後に2倍多いレベルの代謝産物が形成される図32B。この、huCD20-7複合体により形成される代謝産物のレベルの上昇は、huCD20-7複合体のインビトロにおける活性を増大させる。従って、例えば、huCD20-7は、インビトロで非開裂複合体として、より効果的な、独特の物理的及び機能的特性を有する抗体である。実施例18種々のリンカーを有するhuCD20-7複合体のインビトロ細胞毒性huCD20-7-SMCC-DM1の細胞毒性を、種々のリンカーを用いて調製した複合体のものと比較した。図33Aに示すように、例えば、huCD20-7のSPDB-DM4及びPEG4-mal-DM4複合体は、Granta-519細胞に対して、SMCC-DM1複合体と類似の細胞毒性活性を有する。いずれの複合体も、細胞生存度の完全な低下をもたらし、0.06nMのEC50を有する。図33Bに示すように、例えば、huCD20-7のSPP-DM1及びスルホ-mal-DM4複合体も、Granta-519細胞に対して、SMCC-DM1複合体と類似の細胞毒性活性を有する。全ての複合体は、細胞生存度の完全な低下をもたらし、0.1nMのEC50を有する。実施例19SU-DHL-4異種移植片モデル内におけるhuCD20-7抗体のインビボ効果典型的なhuCD20-7抗体は、確立された、SCIDマウスに皮下移植するSU-DHL-4びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞の異種移植モデルを用いて試験した。マウスを体重により無作為に処理群に分け、10又は1mg/kgのhuCD20-7又はリツキシマブのいずれかを用いて、接種の14、21及び28日後に、週に3回処理した。種々の処理群の平均腫瘍容積を、図34においてプロットする。1mg/kg用量より強力な10mg/kgの用量を有する両方の用量のPBSコントロールと比較し、リツキシマブによる処理は、腫瘍容積の減少をもたらした。1mg/kgにおけるhuCD20-7による処理は、同じ用量におけるリツキシマブよりも、PBSと比較し、平均腫瘍容積において、言明される減少をもたらした。10mg/kgにおけるhuCD20-7による処理は、リツキシマブに関して劇的な腫瘍増殖の減少をもたらした。試験の66日に、huCD20-7処理は10個中7個の生存TFSをもたらしたが、リツキシマブ処理は10個中たったの1個のTFSをもたらした。PBSコントロール、また1mg/kgの処理分のいずれにもTFSは観察されなかった。実施例20Daudi異種移植片モデルにおける、huCD20-7抗体、-SPP-DM1、SMCC-DM1及びBMPS-DM1複合体のインビボにおける効果SCIDマウス内に静脈注射により移植したDaudiリンパ腫細胞を用いた異種移植片モデルにおいて、huCD20-7抗体及びその複合体を試験した。マウスを、体重により無作為に処理群に分け、10mg/kgのhuCD20-7、10mg/kgのhuCD20-7-SMCC-DM1、又は5mg/kgのhuCD20-7-SPP-DM1のいずれかを用いて細胞接種の7日後に1回処理した。種々の処理群中の生存マウスの数を図35Aにプロットする。マウスのPBS処理群についての平均生存期間は27日であった。huCD20-7処理は、平均生存期間を45日に増大した。複合体は両者とも、抗体と比べ、平均生存期間を更に増大した。huCD20-7-SMCC-DM1及びhuCD20-7-SPP-DM1は、それぞれ64日及び58日の平均生存期間をもたらした。SCIDマウスに静脈注射により移植したDaudiリンパ腫細胞を用いた、同様の異種移植片モデルにおいては、細胞接種7日に、10mg/kgのhuCD20-7、リツキシマブ、huCH20-7-SMCC-DM1又はhuCH20-7-BMPS-DM1のいずれかでマウスを処理した。種々の処理群の生存マウスの数を、図35Bにおいてプロットする。PBS処理したマウスの群についての平均生存期間は31日であり、huCH20-7による処理は、平均生存期間を49日に増大した。一方、リツキシマブによる処理は、平均生存期間を40日に増大した。huCD20-7-をベースとする両者の複合体は、抗体と比較して生存期間の更なる増大をもたらし、huCH20-7-SMCC-DM1及びhuCH20-7-BMPS-DM1は、それぞれ、5日における90及び100の生存をもたらした。DOHH-2異種移植片モデルにおける、huCD20-7抗体及び-SPP-DM1及びSMCC-DM1複合体のインビボにおける効果SCIDマウスに皮下移植したDOHH-2濾胞性リンパ腫細胞を用いて、予め容易に触知できる異種移植片モデルにおいて、典型的なhuCD20-7抗体及びその複合体の試験を行った。マウスを、体重により無作為に処理群に分け、10mg/kgのhuCD20-7、10mg/kgのhuCD20-7-SMCC-DM1、又は5mg/kgのhuCD20-7-SPP-DM1のいずれかを用いて細胞接種の3日後に1回処理した。種々の処理群の平均腫瘍容積を図36にプロットする。huCD20-7抗体による処理は、PBSコントロールと比べ、平均腫瘍容積の減少をもたらした。未連結抗体と比べ、huCD20-7複合体については更に良好な効果が見られた。90日の試験の終わりに、huCD20-7による処理は、10頭中2頭の腫瘍のない生存マウスTFSをもたらしたが、huCD20-7-SMCC-DM1による処理は、10頭中6頭のTFS、huCD20-7-SPP-DM1による処理は、10頭中10頭のTFSをもたらした。PBSコントロール群にはTFSは観察されなかった。huCD20-7-をベースとする複合体のインビボにおける効果の概要CD20抗体の複合体は既に開示されている。1つのケースにおいて、抗-CD20抗体の開裂不可能なSMCC-DM1複合体は、未連結抗体と同じ効果を示したが、同じ抗体の開裂可能なSPP-DM1複合体は、SCIDマウスにおけるGranta-519異種移植片モデルにおいて、向上した効果を示したPolsonら、上述。同様に、酸安定アミドリンカーを用いて製造されたリツキシマブのカリケアマイシン複合体は、ヌードマウスにおけるRamos異種移植片モデルにおいて、向上したインビボ効果を示さなかった。酸に不安定なジメチルヒドラジドAc-Butリンカーを用いて製造されたリツキシマブのカリケアマイシン複合体のみが、本研究において向上したインビボ効果を示したDiJosephら、上述。意外にも、例えば、SMCC-DM1又はBMPS-DM1複合体のようなhuCD20-7の開裂不可能な複合体は、未連結抗体と比較し、2種の異種移植片モデルにおいて劇的に向上したインビボ効果を示す。更に、例えばSPP-DM1複合体のような、huCD20-7の開裂可能な複合体は、未連結抗体と比べ、同様に向上したインビボ効果を示す。例えば、huCD20-7は、インビボにおける開裂不可能な複合体のように効果的なものとする、独特な物理的及び機能的特性を有する抗体である。本発明を詳細に、また特定の態様を参照して説明したが、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、種々の変形及び修飾をなし得ることは当業者には明らかである。"