"複数の試料から配列決定される出発ポリヌクレオチド分子の数を推定する方法であって、複数の異なる試料内の出発ポリヌクレオチド分子にアダプターを付着させることであって、このとき、それぞれの試料の前記アダプターが、前記試料に特異的な固有のMIDと、R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N、およびこれらの修飾型から選択される少なくとも1つのヌクレオチド塩基を含む、縮重塩基領域DBRと、を含むものであることと、前記複数の異なるアダプターを付着させた試料をプールして、プール試料を生成することと、前記プール試料内の前記アダプターを付着させたポリヌクレオチドを増幅させることと、複数の前記増幅したアダプターを付着させたポリヌクレオチドを配列決定することであって、このとき、前記MID、前記DBR、および前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部分の配列が、前記複数のアダプターを付着させたポリヌクレオチドのそれぞれについて得られるものであることと、それぞれの試料から前記複数の配列決定されたアダプターを付着させたポリヌクレオチド内に存在する別個のDBR配列の数を決定して、前記配列決定工程で配列決定されたそれぞれの試料から出発ポリヌクレオチドの数を決定することと、を含む、方法。前記アダプターが、配列決定プライマー部位をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記アダプターが、再帰的配列、およびプロモーター部位のうちの1つ以上をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記DBRが、少なくとも2個のヌクレオチド塩基を含み、前記少なくとも2個のヌクレオチド塩基のそれぞれが、R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、およびNから選択される、請求項1に記載の方法。前記DBRが3~20個のヌクレオチド塩基を含み、前記3~10個のヌクレオチド塩基のそれぞれが、R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、およびNから選択される、請求項4に記載の方法。前記配列決定工程で配列決定されたそれぞれの試料から決定された前記ポリヌクレオチドの数が、対立遺伝子を呼び出すための方法において用いられる、請求項1に記載の方法。前記配列決定工程が、次世代配列決定プロセスを行うことを含む、請求項1に記載の方法。前記複数の試料のそれぞれが、ゲノムDNA試料である、請求項1に記載の方法。前記複数の異なるゲノムDNA試料のそれぞれが、異なる対象に由来する、請求項8に記載の方法。前記対象がヒトである、請求項9に記載の方法。さらに前記試料が、前記付着工程の前に、目的とする領域に対して富化される、請求項1に記載の方法。目的とする領域に対して、前記アダプターを付着させたポリヌクレオチドを富化することをさらに含む、請求項1に記載の方法。前記アダプターが非対称アダプターであり、第1のアダプタードメインが前記ポリヌクレオチドの第1の末端に存在し、第2のアダプタードメインが前記ポリヌクレオチドの第2の末端に存在し、前記DBRが、前記第1のアダプタードメイン内の少なくとも2個のヌクレオチド塩基のうちの1つ以上と、前記第2のアダプタードメイン内の少なくとも2個のヌクレオチド塩基のうちの1つ以上とを含む、分割DBRである、請求項4に記載の方法。前記アダプターが、増幅反応において前記ポリヌクレオチド分子に付着され、前記DBRが、前記増幅反応に用いられる合成プライマーに存在する、請求項1に記載の方法。前記増幅反応がPCRである、請求項14に記載の方法。前記方法が、前記PCR反応で増幅された前記出発ポリヌクレオチドの数を決定することをさらに含む、請求項14に記載の方法。前記方法が、前記試料中の前記ポリヌクレオチドの遺伝的異質性を決定するように設計される、請求項1に記載の方法。前記試料が、腫瘍組織に由来するポリヌクレオチドを含む、請求項17に記載の方法。前記試料が、微生物および/またはウイルスに由来するポリヌクレオチドを含む、請求項17に記載の方法。前記方法が、前記複数の異なる試料に存在する前記ポリヌクレオチドの遺伝的異質性を決定するように設計される、請求項1に記載の方法。前記複数の異なる試料が、腫瘍の異なる区域に由来する、請求項20に記載の方法。前記複数の異なる試料が、対象からの異なる腫瘍に由来する、請求項20に記載の方法。前記複数の異なる試料が、経時的に対象に由来する、請求項22に記載の方法。前記対象が感染を有し、経時的に前記感染性病原体一又は複数の遺伝的異質性が決定される、請求項23に記載の方法。定義別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、この発明が属する技術分野において通常の技術を有する者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。さらに、所定の要素は、明白性および参照の容易性のために定義される。本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、その分野の標準的な論文およびテキスト、例えば、KornbergandBaker,DNAReplication,SecondEditionW.H.Freeman,NewYork,1992、Lehninger,Biochemistry,SecondEditionWorthPublishers,NewYork,1975、StrachanandRead,HumanMolecularGenetics,SecondEditionWiley-Liss,NewYork,1999、Eckstein,editor,OligonucleotidesandAnalogs:APracticalApproachOxfordUniversityPress,NewYork,1991、Gait,editor,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproachIRLPress,Oxford,1984等の用語および記号に従う。単位複製配列は、ポリヌクレオチド増幅反応の生成物を意味する。つまり、1つ以上の出発配列から複製される、通常二本鎖のポリヌクレオチドの集団である。1つ以上の出発配列は、同一配列の1つ以上の複製であり得るか、または異なる配列の混合であってよい。単位複製配列は、その生成物が1つ以上の標的核酸の複数の複製である様々な増幅反応により生成され得る。一般に、単位複製配列を生成する増幅反応は、テンプレート主導型であり、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのいずれかの反応物質の塩基対合は、反応生成物の形成に必要なテンプレートポリヌクレオチドの相補体を有する。一態様では、テンプレート主導型反応は、核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長または核酸リガーゼによるオリゴヌクレオチド結紮である。そのような反応には、これらに限定されないが、参照することにより本明細書に組み込まれる以下の参考文献、Mullisらの米国特許第4,683,195号、第4,965,188号、第4,683,202号、第4,800,159号PCR、Gelfandらの米国特許第5,210,015号TAQMAN登録商標プローブを有するリアルタイムPCR、Wittwerらの米国特許第6,174,670号、Kacianらの米国特許第5,399,491号NASBA、Lizardiの米国特許第5,854,033号、Aonoらの日本特許公開第JP4-262799ローリングサークル増幅等に開示される、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、線形ポリメラーゼ反応、核酸配列ベースの増幅NASBA、ローリングサークル増幅等が挙げられる。一態様では、本発明の単位複製配列は、PCRにより生成される。反応生成物が増幅反応の進行として測定されるのを許す検出化学が使用可能な場合、増幅反応は、リアルタイム増幅、例えば、以下に記載されるリアルタイムPCRまたはLeoneetal,NucleicAcidsResearch,26:2150-21551998および同様の参考文献に記載されるリアルタイムNASBAであってよい。本明細書で使用するところの用語増幅するは、増幅反応を行うことを意味する。反応混合物は、これらに限定されないが、反応の間にpHを選択されたレベルで維持する緩衝剤、塩、共因子、スカベンジャー等を含み得る、反応を行うための全ての必要な反応物質を含有する溶液を意味する。用語査定するは、測定の任意の形態を含み、要素が存在するか否かを決定することを含む。用語決定する、測定する、評価する、推定する、査定する、および分析するは、交換可能に使用され、定量的および定性的測定を含む。の存在を査定するは、存在する何かの量を決定すること、および/またはそれが存在するか、または非存在であるかを決定することを含む。非対称的にタグ付けされたポリヌクレオチドは、同一でない左右アダプタードメインを有する。このプロセスは、一般的にアダプターを非対称的に付着させること、またはポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチド断片を非対称にタグ付けすることと称される。非対称アダプター末端を有するポリヌクレオチドの生成は、任意の従来の方法で達成されてよい。例示的な非対称アダプターは、米国特許第5,712,126号および第6,372,434号、米国特許公開第2007/0128624号および第2007/0172839号、ならびにPCT公開第WO/2009/032167号に記載され、これらの全ては参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる。所定の実施形態では、用いられる非対称アダプターは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、2009年4月29日に出願された米国特許出願第12/432,080号に記載される。一例として、対象発明の使用者は、非対称アダプターを使用してポリヌクレオチドをタグ付してよい。非対称アダプターは、二本鎖核酸断片の量末端に結紮されると、目的とするゲノム挿入に隣接する非同一配列を有する、プライマー伸長または増幅生成物の生成をもたらす。結紮は、通常、非同一の末端アダプター配列を生成するように、後次処理ステップが続く。例えば、非対称アダプターが付着された断片の複製複数可は、ポリヌクレオチド生成物を生じ、末端アダプター配列の間に、少なくとも1つの核酸配列差、またはヌクレオチド/ヌクレオシド修飾が存在する。アダプターを非対称的にポリヌクレオチド例えば、ポリヌクレオチド断片に付着させることは、他方の末端上のアダプター配列と比較して、存在しないか、または異なる核酸配列を有するかのいずれかである、一方の末端上に1つ以上のアダプター配列例えば1つ以上の領域またはドメイン、例えばプライマー結合部位を有するポリヌクレオチドを生じる。非対称アダプターと呼ばれるアダプターは、必ずしもそれ自体が構造的に非対称であるとは限らず、非対称アダプターをポリヌクレオチド断片に付着させる単なる行為が即時にそれを非対称にするものでもないことが指摘される。むしろ、同一の非対称アダプターをそれぞれの末端に有する、非対称のアダプターが付着したポリヌクレオチドは、反対端上のアダプター配列に関して非対称である、複製生成物または単離された一本鎖ポリヌクレオチドを生成する例えば、増幅/プライマー伸長を少なくとも一周した後。任意の便利な非対称アダプター、またはアダプターを非対称的に付着させるためのプロセスは、本発明を実施する際に用いられてよい。例示的な非対称アダプターは、米国特許第5,712,126号および第6,372,434号、米国特許公開第2007/0128624号および第2007/0172839号、ならびにPCT公開第WO/2009/032167号に記載され、これらの全ては参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる。所定の実施形態では、用いられる非対称アダプターは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、2009年4月29日に出願された米国特許出願第12/432,080号に記載されるものである。相補的なまたは実質的に相補的なは、ヌクレオチドもしくは核酸の間、例えば、二本鎖DNA分子の二本鎖の間、または一本鎖核酸上のオリゴヌクレオチドプライマーとプライマー結合部位との間のハイブリダイゼーションもしくは塩基対合または二本鎖の形成を指す。相補的ヌクレオチドは、一般に、AおよびTもしくはAおよびU、またはCおよびGである。最適に整列および比較され、適切なヌクレオチド挿入または欠失を有する、一本鎖のヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約80、通常は少なくとも約90~95、およびより好ましくは約98~100と対合するとき、2つの一本鎖RNAまたはDNA分子は、実質的に相補的であると言われる。あるいは、RNAまたはDNA鎖が、その相補体に対して選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするとき、実質的な相補性が存在する。典型的に、少なくとも14~25ヌクレオチドにわたって、少なくとも約65の相補性、好ましくは少なくとも約75、より好ましくは少なくとも約90の相補性があるとき、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。参照することにより本明細書に組み込まれる、M.KanehisaNucleicAcidsRes.12:2031984を参照されたい。二本鎖は、完全または部分的に相補的である少なくとも2つのオリゴヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドは、それらのヌクレオチドの全てまたは大部分の中でワトソン-クリック型塩基対合を経て、安定した複合体が形成されるようにする。用語アニーリングおよびハイブリダイゼーションは、安定した二本鎖の形成を意味するように交換可能に使用される。二本鎖に関して完全に適合したは、二本鎖を形成するポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖は、互いに二本鎖構造を形成し、それぞれの鎖の全てのヌクレオチドが、他の鎖のヌクレオチドとワトソン-クリック塩基対合を経ることを意味する。安定した二本鎖は、二本鎖の鎖の間にワトソン-クリック塩基対合および/または非ワトソン-クリック塩基対合を含み得る塩基対合は、水素結合の形成を意味する。所定の実施形態では、非ワトソン-クリック塩基対合は、ヌクレオシド類似体、例えば、デオキシイノシン、2,6-ジアミノプリン、PNA、LNA等を含む。所定の実施形態では、非ワトソン-クリック塩基対合は、ゆらぎ塩基、例えば、デオキシイノシン、8-オキソ-dA、8-オキソ-dGなどを含み、ゆらぎ塩基とは、相補核酸鎖の第1のヌクレオチド塩基と塩基対合できるが、核酸合成のテンプレート鎖として用いられると、第2の異なるヌクレオチド塩基対の合成鎖への組み込みをもたらす核酸塩基を意味するゆらぎ塩基は、以下でさらに詳述される。2つのオリゴヌクレオチドポリヌクレオチド間の二本鎖の不適合は、二本鎖の一対のヌクレオチドが、ワトソン-クリック結合に失敗したことを意味する。ゲノムまたは標的ポリヌクレオチドに関する遺伝子座、座、または目的とする座は、ゲノムまたは標的ポリヌクレオチドの隣接する小領域またはセグメントを意味する。本明細書で使用するところの、遺伝子座、座、もしくは目的とする座は、ミトコンドリアDNAもしくは他の非染色体DNA例えば、細菌プラスミドを含む、ゲノムのヌクレオチド、遺伝子もしくは遺伝子の一部分を指し得るか、またはそれが遺伝子内にあるか、もしくは遺伝子と関連付けられるかに関わらず、ゲノム配列の任意の隣接部分を指し得る。遺伝子座、座、または目的とする座は、単一ヌクレオチドから数百もしくは数千ヌクレオチド長以上であり得る。一般に、目標とする座は、それと関連付けられた参照配列を有する以下参照配列に関する説明を参照。キットは、本発明の方法を実行するための材料または試薬を送達する任意の送達システムを指す。反応分析の文脈において、そのような送達システムは、反応試薬例えば、適切な容器中のプローブ、酵素等および/または支持材料例えば、緩衝剤、分析を行うための文書指示等を一方の位置から別の位置に保管、輸送、または送達するのを可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連反応試薬および/または支持材料を含有する、1つ以上の筐体例えば、ボックスを含む。そのような含有物は、一緒に、または別個に意図される受容体に送達されてよい。例えば、第1の容器は、分析に使用するための酵素を含有し得るが、第2の容器は、プローブを含有する。結紮ライゲーションは、2つ以上の核酸、例えば、オリゴヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドの末端間に共有結合または連結を形成することを意味する。結合または連結の性質は、広く異なってよく、結紮は、酵素的または化学的に実行され得る。本明細書で使用するところの結紮は、通常、酵素的に実行されて、あるオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの5′炭素と、別のオリゴヌクレオチドの3′炭素との間にリン酸ジエステルを形成する。様々なテンプレート主導型結紮反応は、参照することにより組み込まれる、以下の参考文献:Whiteleyらの米国特許第4,883,750号、Letsingerらの米国特許第5,476,930号、Fungらの米国特許第5,593,826号、Koolの米国特許第5,426,180号、Landegrenらの米国特許第5,871,921号、XuおよびKoolのNucleicAcidsResearch,27:875-8811999、HigginsらのMethodsinEnzymology,68:50-711979、EnglerらのTheEnzymes,15:3-291982、およびNamsaraevの米国特許公開第2004/0110213において説明される。本明細書で使用するところの多重識別子MultiplexIdentifierMIDは、ポリヌクレオチドと関連付けられたタグまたはタグの組合せを指し、それらの同一性例えば、タグDNA配列を使用して、試料中のポリヌクレオチドを区別することができる。所定の実施形態では、ポリヌクレオチド上のMIDを使用して、ポリヌクレオチドが由来する源を同定する。例えば、核酸試料は、異なる源に由来するポリヌクレオチド例えば、異なる個体、異なる組織もしくは細胞、または異なる時点で単離されたポリヌクレオチドのプールであってよく、それぞれ異なる源からのポリヌクレオチドは、固有のMIDでタグ付けされる。そのためMIDは、ポリヌクレオチドとその源との間に相関を提供する。所定の実施形態では、MIDを用いて、試料中のそれぞれ個別のポリヌクレオチドを固有にタグ付けする。試料中の固有のMIDの数の同定は、試料中に個別のポリヌクレオチドがいくつ存在するかまたは操作されたポリヌクレオチド試料がいくつの原ポリヌクレオチドに由来するか、例えば、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、2009年5月26日に発行された米国特許第7,537,897号を参照に関する読み出しを提供することができる。MIDは、典型的に、ヌクレオチド塩基で構成され、2~100個のヌクレオチド塩基長以上の範囲であり得、複数のサブユニットを含んでもよく、それぞれ異なるMIDは、独自の同一性および/またはサブユニットの順序を有する。MIDとしての使用が見出される例示的な核酸タグは、2009年6月6日に発行された米国特許第7,544,473号、表題NucleicAcidAnalysisUsingSequenceTokensならびに2008年7月1日に発行された米国特許第7,393,665号、表題MethodsandCompositionsforTaggingandIdentifyingPolynucleotidesに記載され、それらはいずれも、核酸タグおよびポリヌクレオチドを同定する際のそれらの使用に関する説明について、参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる。所定の実施形態では、本明細書に記載される方法が、広範な固有のMID群を収容できるため、複数の試料をタグ付けするために用いられるMIDの群は、任意の特定の共通特性例えば、Tm、長さ、塩基組成等を有する必要はない。MIDが単に所与の実験において固有である必要があることが強調される。したがって、同一のMIDを使用して、異なる実験で処理される異なる試料をタグ付けしてもよい。さらに、所定の実験では、ユーザは、同一のMIDを使用して、同一の実験において異なる試料のサブセットをタグ付けしてもよい。例えば、特定の表現型を有する個体に由来する全ての試料、例えば、対照または野生型対象に由来する全ての試料は、第1のMIDでタグ付けされ得るが、病態を有する対象は、第2のMID第1のMIDとは異なるでタグ付けされ得る。別の例として、同一の源に由来する異なる試料例えば、経時的に派生する試料または組織内の異なる部位に由来する試料を異なるMIDでタグ付けすることが望ましい場合がある。さらに、MIDは、多様な異なる方法、例えば、第1のMIDが結紮によって付着され、第2のMIDがプライマー伸長によって付着される、複合タグ付けアプローチによって生成され得る。したがって、MIDは、プロセスおよび分析中にポリヌクレオチド断片を追跡するように、多様な異なる方法で設計および実施することができ、したがって、この点に関していかなる制限も意図されない。本明細書で使用するところの次世代配列決定NGSは、従来の配列決定法例えば、標準サンガーまたはマクサム-ギルバート配列決定法を使用して前例のなかった速度で、ポリヌクレオチドを配列決定する能力を有する、配列決定技法を指す。これらの前例のない速度は、数千~数百万の配列決定反応を並行して行うことによって達成される。NGS配列決定プラットホームには、これらに限定されないが、以下のMassivelyParallelSignatureSequencingLynxTherapeutics、454pyro配列決定454LifeSciences/RocheDiagnostics、固相、可逆的終了配列Solexa/Illumina、SOLiD技法AppliedBiosystems、イオン半導体配列決定IonTorrent、およびDNAナノボール配列決定CompleteGenomicsが挙げられる。所定のNGSプラットホームに関する記述は、以下のShendure,etal.,′′Next-generationDNAsequencing,′′Nature,2008,vol.26,No.10,1135-1145、Mardis,′′Theimpactofnext-generationsequencingtechnologyongenetics,′′TrendsinGenetics,2007,vol.24,No.3,pp.133-141、Su,etal.,′′Next-generationsequencinganditsapplicationsinmoleculardiagnostics′′ExpertRevMolDiagn,2011,113:333-43、およびZhangetal.,′′Theimpactofnext-generationsequencingongenomics′′,JGenetGenomics,2011,383:95-109において見出され得る。本明細書で使用するところのヌクレオチドには、天然ヌクレオチドが挙げられ、KornbergandBaker,DNAReplication,2ndEd.Freeman,SanFrancisco,1992に記載される、2′-デオキシおよび2′-ヒドロキシル形態を含む。ヌクレオシドに関する類似体は、それらが特異的なハイブリダイゼーションが可能であるという条件で、Scheit,NucleotideAnalogsJohnWiley,NewYork,1980、UhlmanandPeyman,ChemicalReviews,90:543-5841990等に記載される、修飾された塩基部分および/または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオシドを含む。そのような類似体は、結合特性を強化し、複雑性を低減し、特異性を高める等するように設計される合成ヌクレオシドを含む。強化されたハイブリダイゼーションまたは耐ヌクレアーゼ特性を有する類似体を含むポリヌクレオチドは、UhlmanandPeyman上述、Crookeetal,Exp.Opin.Ther.Patents,6:855-8701996、Mesmaekeretal,CurrentOpinioninStructualBiology,5:343-3551995等に記載される。二本鎖の安定性を強化することができるポリヌクレオチドの例示型には、オリゴヌクレオチドN3′→P5′ホスホルアミド酸塩本明細書ではアミド酸塩と称される、ペプチド核酸本明細書ではPNAと称される、オリゴ-2′-O-アルキルリボ核酸、C-5プロピニルピリミジンを含有するポリヌクレオチド、ロックド核酸LNA等が挙げられる。そのようなオリゴヌクレオチドは、市販されているか、または文献に記載される方法を使用して合成されてもよい。ポリメラーゼ連鎖反応またはPCRは、DNAの相補鎖の同時プライマー伸長による、特定のDNA配列のインビトロ増幅のための反応を意味する。換言すれば、PCRは、両側にプライマー結合部位が並ぶ標的核酸の複数コピーまたは複製を作製するための反応であり、そのような反応は、i標的核酸を変性させる工程と、iiプライマーをプライマー結合部位にアニーリングする工程と、iiiヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、核酸ポリメラーゼによりプライマーを伸長させる工程と、を1回以上反復することを含む。通常、反応は、熱循環装置において、それぞれの工程について最適化される異なる温度によって循環される。特定の温度、それぞれの工程における期間、および工程間の変化率は、当業者に良く知られている多くの要因に依存し、例えば、参考文献McPhersonetal,editors,PCR:APracticalApproachandPCR2:APracticalApproachそれぞれIRLPress,Oxford,1991and1995により例示される。例えば、TaqDNAポリメラーゼを使用する従来のPCRにおいて、二本鎖標的核酸は、90°Cを超える温度で変性し、プライマーは、50~75°Cの範囲の温度でアニールされ、プライマーは、72~78°Cの範囲の温度で伸長され得る。用語PCRは、RT-PCR、リアルタイムPCR、ネストしたPCR、定量的PCR、多重化PCR等を含むが、これらに限定されない反応の派生形態を含む。反応体積は、数ナノリットル例えば、2nL~数百μL例えば、200μLの範囲である。逆転写PCRまたはRT-PCRは、標的RNAを相補的一本鎖DNAに変換する、逆転写反応が先行し、次いで増幅されるPCRを意味し、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、Tecottらの米国特許第5,168,038号を参照されたい。リアルタイムPCRは、反応が進行するにつれて反応生成物、すなわち、単位複製配列の量がモニターされるPCRを意味する。主に反応生成物をモニターするために使用される検出化学が異なるリアルタイムPCRの多くの形態があり、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、Gelfandらの米国特許第5,210,015号TAQMAN登録商標、Wittwerらの米国特許第6,174,670号および第6,569,627号挿入染料、Tyagiらの米国特許第5,925,517号分子ビーコンを参照されたい。リアルタイムPCRの検出化学は、これもまた参照することにより本明細書に組み込まれる、MackayらのNucleicAcidsResearch,30:1292-13052002においてレビューされる。ネストしたPCRは、2段階PCRを意味し、第1のPCRの単位複製配列は、新しいプライマー群を使用して、第2のPCRの試料になり、それらのうちの少なくとも1つは、第1の単位複製配列の内部位置に結合する。ネストした増幅反応に関する、本明細書で使用するところの初期プライマーは、第1の単位複製配列を生成するために使用されるプライマーを意味し、二次プライマーは、第2のネストした単位複製配列を生成するために使用される1つ以上のプライマーを意味する。多重化PCRは、複数の標的配列または単一の標的配列および1つ以上の参照配列は、同一の反応混合物内で同時に実行され、例えば、BernardらのAnal.Biochem.,273:221-22819992色リアルタイムPCRを参照されたい。通常、別個のプライマーの群が、増幅されるそれぞれの配列に用いられる。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、交換可能に使用され、それぞれヌクレオチドモノマーの線形ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを作製するモノマーは、規則的なパターンのモノマー対モノマー相互作用、例えば、ワトソン-クリック型の塩基対合、塩基の積み重ね、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型の塩基対合、ゆらぎ塩基対合等によって、天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。以下に詳述されるように、ゆらぎ塩基とは、相補的核酸鎖内の第1のヌクレオチド塩基と塩基対合できるが、核酸合成のテンプレート鎖として用いられるとき、第2の異なるヌクレオチド塩基の合成鎖への組み込みをもたらすことを意味する。そのようなモノマーおよびそれらのインターヌクレオシド結合は、自然発生し得るか、またはその類似体、例えば、自然発生または非自然発生する類似体であってよい。非自然発生する類似体は、ペプチド核酸PNA、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第5,539,082号に記載される、ロックド核酸LNA、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第6,670,461号、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、標識の付着を可能にする塩基含有連結基、例えば、蛍光色素分子またはハプテン等を含み得る。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が酵素処理、例えば、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによる結紮等を必要とするたびに、当業者は、そのような場合のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ヌクレオシド間結合の所定の類似体、糖部分、または任意もしくはいくつかの位置の塩基を含まないことを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、典型的に、それらが通常オリゴヌクレオチドと称されるとき、数個のモノマー単位例えば、5~40~数千モノマー単位のサイズの範囲である。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがATGCCTG等の文字配列大文字または小文字により表されるときはいつも、別段の指示がないか、または文脈から明らかでない限り、ヌクレオチドは左から右に5′→3′の順序であり、Aはデオキシアデノシンを示し、Cはデオキシシチジンを示し、Gはデオキシグアノシンを示し、Tはチミジンを示し、Iはデオキシイノシンを示し、Uはウリジンを示すことを理解されたい。特に断りのない限り、用語論および原子番号付け規則は、StrachanandRead,HumanMolecularGenetics2Wiley-Liss,NewYork,1999に開示されるものに従う。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合により結合される、4つの天然ヌクレオシド例えば、DNAのデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、それらのRNAのリボーゼ対応物を含むが、それらは、非天然ヌクレオチド類似体、例えば、修飾された塩基、糖、またはヌクレオシド間結合も含む。活性の酵素が特定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件、例えば、一本鎖DNA,RNA/DNA二本鎖等を有し、次にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質に対する適切な組成物の選択は、特にSambrooketal,MolecularCloning,SecondEditionColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1989等の論文および同様の参考文献からのガイダンスとともに、十分に当業者の知識の範囲内であることは、当業者には明らかである。プライマーは、ポリヌクレオチドテンプレートを用いて二本鎖を形成するとき、核酸合成の開始点として作用し、伸長した二本鎖が形成されるように、テンプレートに沿ってその3′末端から伸長され得る、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。伸長プロセスの間に添加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列により決定される。通常、プライマーは、DNAポリメラーゼにより伸長される。プライマーは、一般に、プライマー伸長生成物の合成におけるその使用に適合する長さであり、通常、8~100ヌクレオチド長、例えば、10~75、15~60、15~40、18~30、20~40、21~50、22~45、25~40等の範囲内であり、より典型的に、18~40、20~35、21~30ヌクレオチド長の範囲内、および規定された範囲の間の任意の長さであり得る。典型的なプライマーは、10~50ヌクレオチド長、例えば、15~45、18~40、20~30、21~25等、および規定された範囲内の任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、通常、約10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、または70ヌクレオチド長以下である。プライマーは、通常、増幅の最大効率のために一本鎖であるが、代替として二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、プライマーは、通常、伸長生成物を調製するために使用される前に、最初にその鎖を分離するように処理される。この変性工程は、典型的に、熱により影響を受けるが、代替としてアルカリを使用して実行された後、中和されてもよい。したがって、プライマーは、テンプレートに相補的であり、水素結合またはテンプレートを用いたハイブリダイゼーションにより複合して、ポリメラーゼによる合成の開始のためのプライマー/テンプレート複合体を生じ、これは、DNA合成のプロセスにおいて、テンプレートに相補的なその3′末端で連結される、共役結合塩基の添加により伸長される。本明細書で使用するところのプライマー対は、標的核酸の核酸ベースの増幅に適した核酸配列を有する第1および第2のプライマーを指す。そのようなプライマー対は、一般に、標的核酸の第1の部分の配列と同一または類似する配列を有する第1のプライマーと、標的核酸の第2の部分に相補的な配列を有する第2のプライマーと、を含み、標的核酸またはその断片の増幅を提供する。本明細書における第1のおよび第2のプライマーに関する言及は、特に別段の指定のない限り、任意である。例えば、第1のプライマーは、順方向プライマー標的核酸の5′末端から核酸合成を開始するまたは逆方向プライマー順方向プライマーから開始される合成から生成された生成物の伸長の5′末端から核酸合成を開始するとして設計され得る。同様に、第2のプライマーは、順方向プライマーまたは逆方向プライマーとして設計され得る。読み出しは、数または値に変換され得る、測定および/または検出されるパラメータ複数可を意味する。いくつかの文脈では、読み出しは、そのような収集または記録されたデータの実際の数値表現を指し得る。例えば、マイクロアレイからの蛍光強度信号の読み出しは、マイクロアレイのそれぞれのハイブリダイゼーション部位で生成される信号のアドレスおよび蛍光強度であり、したがって、そのような読み出しは、様々な方法、例えば、マイクロアレイの画像、数値の表等として登録または保存されてよい。再帰的部位、再帰的配列、および相当物を使用して、ポリヌクレオチドのその初期位置から異なる位置までドメインを分子内的に移動させるように用いられる、ポリヌクレオチドに存在する1つ以上の配列を示す。再帰的配列の使用は、参照することにより本明細書に組み込まれる、PCT出願第PCT/IB2010/02243号、2011年2月24日に公開された表題′′CompositionsandMethodsforIntramolecularNucleicAcidRearrangement′′第WO2011/021102号に詳述される。所定の実施形態では、再帰的配列は、ポリヌクレオチドの他の配列と異なるように選択されるすなわち、ポリヌクレオチドに存在する可能性がある他の配列、例えば、処理されるゲノムまたはサブゲノム配列に対して配列相同性をほとんど有しない。そのように、再帰的配列は、再帰的プロセスで用いられる条件下で、その相補体を除く任意の配列に対してハイブリダイズされないように選択されるべきである。再帰的配列は、合成または人工的に生成された配列例えば、アダプタードメイン内のポリヌクレオチドに添加されるまたは分析されるポリヌクレオチド内に通常存在する配列例えば、分析されるポリヌクレオチドにおいて目的とする領域内に存在する配列であり得る。再帰的システムでは、再帰的配列に対する相補体は、再帰的配列と同一のポリヌクレオチド鎖上例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの同一鎖または同一の一本鎖ポリヌクレオチド上に存在し例えば、アダプタードメインに挿入される、相補体は、そのような特定の鎖上の分子内結合および重合イベントを促進するように、特定の位置に配置される。本明細書に記載される再帰的プロセスで用いられる再帰的配列は、したがって、広範な長さおよび配列を有し得る。再帰的配列は、5~200ヌクレオチド塩基長であり得る。固体支持体、支持体、および固相支持体は、交換可能に使用され、剛性または半剛性表面複数可を有する材料または材料の群を指す。多くの実施形態では、固体支持体の少なくとも1つの表面は、実質的に平坦であるが、いくつかの実施形態では、例えば、ウェル、隆起した領域、ピン、エッチングされたトレンチ等を有する異なる化合物について、合成領域を物理的に分離することが望ましい場合がある。他の実施形態に従って、固体支持体複数可は、ビーズ、樹脂、ゲル、微小球の形態、または他の幾何学的形状を取る。マイクロアレイは、通常、ガラス顕微鏡スライド等の少なくとも1つの平坦な固相支持体を含む。ある分子をプローブの標識された標的配列等の別の分子に結合することに関する特異的または特異性は、2つの分子間の安定した複合体の認識、接触、および形成と一緒に、その分子と他の分子とのそれよりも低い認識、接触、または複合体形成を意味する。一態様では、第1の分子を第2の分子に結合することに関する特異的とは、第1の分子が反応液または試料中の別の分子との複合体を認識および形成する程度に、第2の分子と最大数の複合体を形成する。好ましくは、この最大数は、少なくとも50である。一般に、特異的な結合イベントに関与する分子は、それらの表面上または空洞内に面積を有し、互いに結合する分子間に特異的な認識を生じる。特異的結合の例には、抗体-抗原相互作用、酵素-基質相互作用、ポリヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチドの中での二本鎖または三本鎖の形成、ビオチン-アビジンまたはビオチン-ストレプトアビジン相互作用、受容体-リガンド相互作用等が挙げられる。特異性または特異的結合に関して本明細書で使用するところの接触は、2つの分子が、非共有化学相互作用、例えば、ファンデルワールス力、水素結合、塩基積み重ね相互作用、イオンおよび疎水性相互作用等を脆弱化するのに十分近接し、分子の相互作用を支配することを意味する。本明細書で使用するところの用語Tmは、溶融温度に関して使用される。溶融温度は、二本鎖核酸分子の集団が、一本鎖に半解離される温度例えば、°Cで測定されるである。核酸のTmを計算するためのいくつかの等式は、当該技術分野において既知である例えば、AndersonandYoung,QuantitativeFilterHybridization,inNucleicAcidHybridization1985を参照。他の参考文献例えば、Allawi,H.T.SantaLucia,J.,Jr.,Biochemistry36,10581-941997は、Tmの計算に構造的特徴および環境的特徴、ならびに配列特徴を考慮する代替の計算方法を含む。試料は、標的核酸の検出、測定、または標識が求められる生物学的、環境的、医学的、または患者源に由来する、ある量の材料を意味する。一方で、それは標本または培養物例えば、微生物培養物を含むことを意味する。他方で、それは生物学的試料および環境的試料の両方を含むことを意味する。試料は、合成起源の標本を含んでよい。生物学的試料は、ヒト、流体、固体例えば、排泄物または組織、ならびに液体および固体食品および食餌生成物、および乳製品、野菜、肉および肉複製品、および廃棄物等の成分であり得る。生物学的試料は、これらに限定されないが、培養物、血液、唾液、骨髄液、胸水、乳汁、リンパ液、痰、精液、針穿孔等を含む、患者から取られた材料を含み得る。生物学的試料は、これらに限定されないが、有蹄動物、クマ、魚類、齧歯類等の動物を含む、家畜ならびに野生化または野生動物の様々な系統から得られてよい。環境試料には、表面物質、土壌、水、および産業試料等の環境物質、ならびに食品および乳製品加工装置、器具、設備、工具、使い捨ておよび非使い捨て物品から得られる試料が挙げられる。これらの例は、本発明に適用可能な試料型を制限するとみなされるものではない。核酸分子の配向および/または重合について説明する際の用語上流および下流は、本明細書において、当業者に理解されるように使用される。そのように、下流は、概して、5′から3′方向、すなわち、ヌクレオチドポリメラーゼが通常配列を伸長する方向に進行することを意味し、上流は、概して、その逆を意味する。例えば、同一の標的核酸分子上の第2のプライマーの上流をハイブリダイズする第1のプライマーは、第2のプライマーの5′側に位置するおよびしたがって、第1のプライマーからの核酸重合は、第2のプライマーに向かって進行する。請求項は、いかなる任意の要素をも除外するように草案され得ることがさらに指摘される。そのように、この陳述は、請求要素の列挙と併せて単に、~のみ等の排他的用語を使用するか、または負の制限を使用するための先行詞として機能するものとする。発明の詳細な説明本発明を説明する前に、この発明は、記載される特定の実施形態に制限されるものではなく、そのため当然のことながら変動し得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ制限されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であり、制限するものではないことも理解されたい。一連の値が提供される場合、文脈上明らかに他の指示がない限り、下限の単位の10分の1まで、その範囲の上限と下限との間に介在するそれぞれの値も特異的に開示されることを理解されたい。表示される範囲内の任意の表示される値または介在する値と、その表示される範囲内の任意の他の表示される値または介在する値との間のより小さい範囲それぞれは、本発明に含まれる。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してその範囲内に含まれるか、または除外されてよく、一方を制限する、両方を制限しない、または両方を制限するそれぞれの範囲は、より小さい範囲に含まれ、これもまた表示される範囲内の任意の特異的に除外される制限を条件として、本発明に包含される。表示される範囲は、制限の一方または両方を含み、それらの包含される制限の一方または両方を除く範囲もまた本発明に含まれる。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、この発明が属する技術分野において通常の技術を有する者によって共通して理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものに類似するか、または相当する任意の方法および材料は、本発明の実践または試験に使用され得るが、いくつかの潜在的かつ好適な方法および材料がここで説明される。本明細書に記述される全ての発行物は、参照することにより本明細書に組み込まれ、その発行物が引用されるものと併せて、方法および/または材料を開示および説明する。本開示は、矛盾が存在する限度において、組み込まれる発行物の任意の開示を優先することを理解されたい。本明細書で使用されるとおり、かつ添付の請求項において、単数形a、an、およびtheは、文脈上明らかに他の指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、核酸に関する言及は、複数のそのような核酸を含み、化合物に関する言及は、当業者に既知の1つ以上の化合物およびその相当物等に関する言及を含む。本発明の実践は、別段の指示がない限り、当該技術分野の範囲内である、有機化学、ポリマー技術、分子生物学組み換え技術を含む、細胞生物学、生物化学、および免疫学の従来技術および説明を用いてよい。そのような従来技術は、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、結紮、および標識を使用するハイブリダイゼーションの検出を含む。適切な技術の特異的な例証は、本明細書において以下の例を参照して行われ得る。しかしながら、他の相当する従来の手順も当然のことながら使用することができる。そのような従来技術および説明は、あらゆる目的で全て参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる、GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeriesVols.I-IV,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,Cells:ALaboratoryManual,PCRPrimer:ALaboratoryManual,andMolecularCloning:ALaboratoryManual全てColdSpringHarborLaboratoryPress,Stryer,L.1995Biochemistry4thEd.Freeman,NewYork,Gait,′′OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach′′1984,IRLPress,London,NelsonandCox2000,Lehninger,A.,PrinciplesofBiochemistry3rdEd.,W.H.FreemanPub.,NewYork,N.Y.andBergetal.2002Biochemistry,5thEd.,W.H.FreemanPub.,NewYork,N.Y.等の標準研究質マニュアルに見出され得る。本明細書で論じられる発行物は、本出願の出願日に先行して、単にそれらの開示のために提供される。本発明におけるいずれも、本発明が、先行発明によるそのような発行物に先行することは認めらないという許可とみなされるものではない。さらに、提供される発行日は、実際の公開日とは異なる場合があるため、独立して確認される必要があり得る。上で要約されるように、本発明の態様は、ポリヌクレオチドに添加される、変性ヌクレオチド塩基例えば、縮重塩基領域またはDBRにおけるの使用について描かれ、特定の配列解析構成またはプロセスにおいて配列決定された同一の原試料の同一ゲノム領域を起源とする個別のポリヌクレオチド分子の数を確立する際の使用を見出す、配列解析を経る。配列解析を経るポリヌクレオチドにDBRを含めることは、多様な遺伝子解析における使用を見出し、対立遺伝子呼び出しの統計的値を決定する機序を提供することにより対立遺伝子呼び出しの信頼度を増加させることを含み、値は、読み出し数のみに由来し得ない。DBRは、配列決定されるポリヌクレオチドに付着したアダプターまたはアダプターのプールの一部として含む、任意の従来の方法でポリヌクレオチドに添加されてよく、例えば、DBRは、配列決定プライマー部位も含むアダプター内にあり得るか、またはDBRは、核酸合成プライマー、例えば、PCRプライマー内に存在してよく、プライマーが重合反応で使用されるとき、DBRが標的ポリヌクレオチドに添加されるようにする。DBRは、プールされたポリヌクレオチド試料に関して遺伝子解析を行う際の利用も見出され、プールされた試料中のそれぞれのポリヌクレオチドは、その試料の起源に特異的なMIDを含む以下に詳述される。これは、ユーザが、プールされた試料を生成するように複合された試料の起源のそれぞれから、特異的なポリヌクレオチド種または多種の配列カバレージを決定するのを可能にする。したがって、本発明の実施形態は、プールされた試料中のポリヌクレオチドの配列解析を含み、それぞれのポリヌクレオチドは、MIDおよびDBRを含有する。核酸本発明以下に詳述されるは、ゲノムDNA、相補的DNAcDNA、RNA例えば、メッセンジャーRNA,リボソームRNA、低分子干渉RNA、マイクロRNA等、プラスミドDNA、ミトコンドリアDNA、合成DNA等を含むが、これらに限定されない、事実上任意の核酸源から目的とする核酸配列またはポリヌクレオチドの操作および解析に用いられ得る。さらに、任意の有機体、有機材料、または核酸含有物質は、本発明に従って処理される核酸の源として使用され得、植物、動物例えば、爬虫類、哺乳類、昆虫、蠕虫、魚類等、組織試料、細菌、菌類例えば、酵母菌、ファージ、ウイルス、死体組織、考古学的/古代試料等を含むが、これらに限定されない。所定の実施形態では、核酸試料中の核酸は、哺乳類に由来し、所定の実施形態では、哺乳類はヒトである。所定の実施形態では、核酸配列は富化される。富化されるとは、核酸例えば、ポリヌクレオチド試料中が、一般に試料中の特定の核酸種の相対濃度を増加させることによって、核酸の複雑性を低減するプロセスに供されること例えば、目的とする特異的遺伝子座を有する、特定の核酸配列を含む、遺伝子座または配列を欠失する、特異的なサイズ範囲内である等を意味する。特異的な特徴複数可または配列を有する核酸を富化する様々な方法が存在し、そのためこれを達成する任意の従来の方法が用いられてよい。富化または複雑性の低減は、プロセスの多くの工程のいずれかにおいて行うことができ、使用者の希望により決定される。例えば、富化は、個別の親試料例えば、アダプター結紮前のタグ無し核酸または多重試料例えば、MIDをコードするアダプター配列でタグ付けされた核酸。MIDは以下に詳述されるにおいて行われ得る。所定の実施形態では、核酸試料中の核酸は、解析前に増幅される。これらのうちのある実施形態では、増幅反応は、目的とする配列または遺伝子座の出発核酸試料を富化する役割も果たす。例えば、出発核酸試料は、目的とする1つ以上の領域を増幅する、ポリメラーゼ連鎖反応PCRに供され得る。所定の実施形態では、増幅反応は、増幅反応は、指数関数的増幅反応であるが、所定の他の実施形態では、増幅反応は線形増幅反応である。出発核酸試料に対して増幅反応を行うための任意の従来の方法は、対象の発明を実践する際に使用され得る。所定の実施形態では、増幅反応に用いられる核酸ポリメラーゼは、プルーフリード能力を有するポリメラーゼである例えば、phi29DNAポリメラーゼ、サーモコッカスリトラリスDNAポリメラーゼ、パイロコッカスフリオサスDNAポリメラーゼ等。所定の実施形態では、解析される核酸試料は、単一源例えば、単一の有機体、ウイルス、組織、細胞、対象等に由来するが、他の実施形態では、核酸試料は、複数の源から抽出された核酸のプールであり例えば、複数の有機体、組織、細胞、対象等からの核酸のプール、複数のとは、2つ以上を意味する。そのように、所定の実施形態では、核酸試料は、2以上の源、3以上の源、5以上の源、10以上の源、50以上の源、100以上の源、500以上の源、1000以上の源、5000以上の源、10,000以上の源、25,000以上の源等からの核酸を含み得る。所定の実施形態では、核酸断片は、複数の源例えば、複数の有機体、組織、細胞、対象等に由来する核酸断片とともにプールされ、複数のとは2つ以上を意味する。そのような実施形態では、それぞれの源に由来する核酸は、多重識別子MIDを含み、それぞれのタグ付けされた核酸断片からの源が決定され得るようにする。そのような実施形態では、それぞれの核酸試料の源は、固有のMIDと相関され、固有のMIDとは、用いられるそれぞれの異なるMIDが、少なくとも1つの特徴、例えば、MIDの核酸配列に基づいて、用いられる1つおきのMIDから区別され得ることを意味する。任意の型のMIDを使用することができ、これらに限定されないが、いずれもそれらの核酸タグに関する記述およびポリヌクレオチドを識別する際のそれらの使用に関して、参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる、2007年1月22日に出願された係属中の米国特許出願第11/656,746号、表題′′NucleicAcidAnalysisUsingSequenceTokens′′ならびに2008年7月1日に発行された米国特許第7,393,665号、表題′′MethodsandCompositionsforTaggingandIdentifyingPolynucleotides′′に記載されるものを含む。所定の実施形態では、非対称タグ付け法およびこれらに限定されないが、タグの配列決定またはタグの長さの測定を含む、多くのタグ読み出し法は、多様な固有のMID群に対応し得るため、複数の試料をタグ付けするために用いられるMIDの群が、任意の特定の共通特性例えば、Tm、長さ、塩基組成物等を有する必要はない。縮重塩基領域DBR本発明の態様は、特定の配列解析構成またはプロセスにおいて配列決定された同一起源の試料の同一ゲノム領域から生じる個別のポリヌクレオチド分子の数を決定または推定するための方法および組成物を含む。本発明のこれらの態様では、縮重塩基領域DBRは、後次に配列決定される出発ポリヌクレオチド分子に付着される例えば、所定のプロセスステップ、例えば、増幅および/または富化、例えばPCRが行われた後。以下に詳述されるように、配列決定ランに存在する異なるDBR配列の数および場合によっては組み合わせは、特定のポリヌクレオチドまたは目的とする領域、regionofinterestROIについて配列決定された異なる出発ポリヌクレオチドの数または最小数の確立を可能にする。この数を使用して、例えば、対立遺伝子呼び出しの信頼度の統計的測定を付与し、したがって、そのような対立遺伝子決定を行う際の信頼度を増加させる例えば、ホモ接合性対立遺伝子を呼び出すcallingとき。DBRは、検出されない場合、遺伝子解析に負の影響を及ぼす、潜在的配列決定または増幅エラーの同定も可能にする。DNA配列決定は、典型的に、配列決定される試料中のポリヌクレオチドにアダプターを付着させる工程を含み、アダプターは、配列決定プライマー部位例えば、結紮によるを含む。本明細書で使用するところの配列決定プライマー部位は、配列決定プライマーの配列に同一であるか、または相補的であるかのいずれかであるポリヌクレオチドの領域一本鎖形態であるとき、または配列決定プライマー配列とその相補体との間に形成される二本鎖領域である。配列決定プライマー部位の特異的配向は、配列決定プライマー部位を含有する特異的ポリヌクレオチドの構造特徴から当業者により推定され得る。配列決定プライマー部位に加えて、縮重塩基領域DBRはまた、配列決定プライマー部位を含有するアダプターの一部として、または独立して例えば、ポリヌクレオチドに付着される第2のアダプターにおいてポリヌクレオチドに付着される。DBRをポリヌクレオチドに付着または添加するための任意の従来の方法が用いられてよい。DBRは、試料中の他のタグ付けされたポリヌクレオチドと比較して、様々な塩基組成物または配列を有し得るランダムとして考慮され得る領域である。試料中のポリヌクレオチド集団における異なるDBRの数は、DBR内の塩基数ならびにそれぞれの位置に存在し得る異なる塩基の潜在的数に依存する。したがって、それぞれの位置がA、C、G、およびTのいずれか1つであり得る、2つの塩基位置を有するDBRを付着させたポリヌクレオチドの集団は、潜在的に16の異なるDBRAA、AC、AG等を有する。DBRは、したがって、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上、15以上、20以上等の塩基を含んでよい。所定の実施形態では、DBRは、3~10塩基の長さである。さらに、DBR内のそれぞれの位置は、異なる塩基組成物を有し得る。例えば、4つの塩基DBRは、以下の組成物:NNNN、NRSN、SWSW、BDHVのいずれかを有し得るIUPACヌクレオチドコードについては、以下の表を参照。所定の実施形態では、DBR内の塩基が、検出可能な修飾、またはそこに付着される他の部分を有することにより異なり得ることがさらに指摘される。例えば、所定の次世代配列決定プラットホーム例えば、PacificBiosciences登録商標を使用して、配列決定プロセス中の塩基におけるメチル化差を検出することができる。そのためDBR内の非メチル化塩基は、DBR内のメチル化塩基から区別され得る。したがって、DBRの長さまたは塩基組成物に関していかなる制限も意図されない。DBRは、単一領域であり得るかすなわち、互いに隣接する全てのヌクレオチド塩基を有する、またはポリヌクレオチド上の異なる位置に存在し得るすなわち、DBRの塩基は、非DBR配列分割DBRとも呼ばれるにより分離される。例えば、DBRは、ポリヌクレオチド上の第1の位置で、第1のアダプター内に1つ以上の塩基、および同一ポリヌクレオチド上の第2の位置で、第2のアダプター内に1つ以上の塩基を有し得る例えば、DBRは、非対称的にタグ付けされたポリヌクレオチド、すなわち非対象アダプターを有するポリヌクレオチドの両末端に存在する塩基を有し得る。この点に関して、いかなる制限も意図されない。DBRは、配列決定反応自体において発生する配列解析および/またはエラーに先行して実行される、増幅プロセスの間にDBR内で発生するエラーの検出を促進するように設計され得る。そのような実施形態では、用いられるDBR配列は、DBR配列におけるエラーが、必ずしも別の可能なDBR配列の生成に至らないように設計されるそれによって、DBR変異に起因して異なるテンプレートに由来するものと同一のテンプレートから派生するレプリコンの不適切な同定を生じる。例えば、配列Nを有するDBRの使用を考慮する。Nにおけるエラーは、あるDBRを別のDBRに変えるため、遺伝子型を正確に割り当てる可能性を過大評価させる可能性がある。これを、配列Yを有するDBRと比較する。この位置でRを見る場合、エラーが存在したことが分かる。正しいDBRは、必ずしもこのエラーを含有するDBRに割り当てられ得るとは限らないが、それがエラーに起因することを検出することができる例えば、配列決定または増幅において。いくつかの実施形態では、変性塩基配列は、1試料同定の割当ておよび2分子の追跡/計数の両方を行うことができる、複合されたMID-DBRとして使用されてよい。例えば、2つの試料一方はYYYでタグ付けされ、他方はRRRでタグ付けされるを考慮する。配列決定反応では、複合MID-DBR配列構造のいずれにも適合しない配列TATを有するMID-DBRを観察する。YYYをTATに変換するには、1つの変異が必要である。RRRをTATに変換するには、2つの変異が必要である。したがって、MID-DBRがRRRではなくYYYであった可能性が高いと言うことができる。例示的なエラー同定またはエラー訂正配列に関する説明は、文献全体で見出され得る例えば、いずれも参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許出願第US特許出願公開第US2010/0323348号、表題′′Methodandcompositionsforusingerror-detectingand/orerror-correctingbarcodesinnucleicacidamplificationprocess′′および同第US2009/0105959号、表題′′Systemandmethodforidentificationofindividualsamplesfromamultiplexmixture′′に記載される。DBRが他の機能ドメイン例えば、配列決定プライマー部位、MID、再帰的配列を含むアダプター集団内に存在する所定の実施形態では、アダプター集団内の機能ドメインは、互いに同一であるが、DBRは異なる。換言すれば、アダプター集団内の他のドメインとは異なり、DBRは、可変またはランダム塩基組成物を有する。アダプター集団、アダプターの集団等は、試料中のポリヌクレオチドに付着されるように設計される、アダプター分子の試料を意味する。DBRを有するアダプターを生成することは、任意の従来の方法、例えば、当該技術分野において良く知られているDNA合成法を使用して達成されてよい上記定義のセクションの引用を参照。一旦親試料内のポリヌクレオチドに付着されると、ポリヌクレオチドは、さらなる処理に供され、最終的に配列決定され得る。行われ得る処理工程は、使用者により所望される任意のプロセスステップ、例えば、富化、増幅等を含む。配列決定工程では、DBRの配列ならびにポリヌクレオチドの一部分例えば、目的とする領域を含有するが得られる。一旦配列が得られると、目的とするポリヌクレオチドに付着された異なるDBRの数が決定される。この数を用いて、配列決定の結果に表される出発親試料から目的とする異なるポリヌクレオチドの数を決定または推定することができ、いくつかの実施形態では、決定された数は、配列決定の結果に表される出発親試料からの、目的とする異なるポリヌクレオチドの最小数である。例えば、特定の対象試料について対立遺伝子呼び出しを行うために遺伝子座を配列決定する際に用いられるすなわち、対象がその遺伝子座においてホモ接合性であるか、またはヘテロ接合性であるか、塩基組成物NNを有する2つの塩基DBRを考慮するNは、任意のデオキシヌクレオチド塩基、すなわち、A、G、C、またはTである。オリゴヌクレオチド合成からいくつかのバイアスが存在し得るが、アダプターの集団内に16の異なるDBRが、ほぼ等しい確率で存在すると予想することができる上述のとおり。潜在的なホモ接合性対立遺伝子呼び出しが識別されると、配列決定ランに存在するDBRの数の決定を使用して、実際に配列決定されたポリヌクレオチド分子の数または最小数およびしたがって、処理工程の間に増幅された数を決定/推定することができる。2倍体ゲノムの場合、対立遺伝子呼び出し理想的または理論的例においては、二項分布によりモデル化され得る。2つの対立遺伝子の複製XおよびYは、いくつかの部位において異なることを前提として、全てのXまたは全てのYを観察する確率は、式cにより付与され、cは部位の観察読み出し数である。ある部位においてXを10回観測する場合Yはない、試料は、X型に対してホモ接合性である可能性があると言うことができる。この同定におけるエラーの確率は、したがって1/210である1000に1つ未満。当実験は、試料調製の早期段階において、少量のDNAは、1つの対立遺伝子に対応する全ての読み出しの高いカバレージをもたらし得ること、およびこれは、二項分布に従って予測されるはずの何倍も多く発生し得ることを示す。これは、単一染色体上の遺伝子座から派生する多数の読み出しを生じるDNAの数個の分子またはさらには単一分子すなわち、実際に目的とする試料に存在する2つの2倍体染色体の1つのみの増幅に起因する。この結果は、カバレージの関数としてのエラーが、予測されるニ項エラーから大幅に逸脱することである。本明細書に記載されるとおりDBRを使用することは、制限された量のDNAを有する試料から対立遺伝子呼び出しを行う際の信頼度を増加させる。例えば、全ての遺伝子座から1つの対立遺伝子の16配列決定読み出しが、DBR配列GAを含有する場合、次にこれらの読み出しは全て、同一の親ポリヌクレオチド分子に由来する可能性があるおよびしたがって、ホモ接合性対立遺伝子呼び出しは正当化されない。しかしながら、16の配列決定読み出しがそれぞれ異なるDBR配列を有する場合、それぞれの読み出しが異なる親ポリヌクレオチド分子から生じるため、ホモ接合性の同定をより高い信頼度で行うことができる。多くの実施形態では、複数の同一DBRが、DBRが付着されたポリヌクレオチド内に存在し得るため、同一のDBR配列を有するポリヌクレオチドが、同一の親ポリヌクレオチド分子から派生すると結論することは不可能であることがここで指摘される。例えば、2つのN塩基のDBRを含有するアダプター集団を使用して、16を超えるポリヌクレオチドを含有する試料をタグ付けする場合、タグ付けされたポリヌクレオチドのサブセットは、同一のDBRを有し、したがって、それらの配列が、異なる親ポリヌクレオチド分子から派生したと決定することは不可能である。出発分子または親分子の実際の数をより正確に決定する1つの例示的な方法は、全ての単一分子が異なるDBRを有する可能性が高くなるように、DBRの変性を増加させることすなわち、目的とする特定の試料を標識するために使用されるDBR内の固有配列の数を増加させることである。任意のイベントでは、例示的な方法で、観察されたDBRの数を使用するか、または観察されたDBRの数を生成する可能性がある読み出しの予想数の確率分布を使用するかのいずれかを行うことができる。特定の対立遺伝子呼び出しがヘテロ接合性であるか、またはホモ接合性であるかの推定を計算するとき、rを参照、vを変異型読み出しとして、遺伝子型の尤度を戻す適切な関数Lr、vを作製/採用することができる。本明細書に記載されるようにDBRを用いるとき、推定値Lr′、v′を計算するための修正された関数が使用されてよく、r′は参照読み出しの固有DBRの数であり、v′は変異型読み出しの固有DBRの数である。対立遺伝子呼び出しを行うための任意の従来の関数を用いて、本明細書に記載されるように、DBR読み出しに関するデータを用いてもよい。本発明の態様を使用して、ポリヌクレオチド試料、例えば、ゲノム試料内の複製数の変動を同定することにおける信頼度を高めることができる。複製数の変動は、欠失、複製、反転、および転位等のゲノム再配置、または一染色体、二染色体、三染色体、四染色体、および五染色体等の全染色体異数性を含み得る。例えば、親が遺伝子型ACおよびCCを所与のSNPに有する複製イベントでは、プロバンドは遺伝子型ACCを有する。遺伝子型ACを有する親では、十分な深度の配列決定カバレージすなわち、十分な配列決定読み出しを条件として、C-対立遺伝子およびA-対立遺伝子と関連付けられたDBRの数は、類似することが予想される。プロバンドでは、十分な深度の配列決定カバレージを条件として、C-対立遺伝子と関連付けられたDBRの数は、A-対立遺伝子と関連付けられたDBRの数の2倍となることが予想され、C-対立遺伝子を包含する複製イベントに対する証拠を提供する。配列決定読み出しの数ではなく、DBRの使用は、DBRを使用して、異なるポリヌクレオチド分子から派生する読み出しを同定できるため、複製数の変動を同定する際により高い信頼度を提供する。DBRの例示的な適用上で詳述されるように、DBRは、複雑なゲノムまたはプールを含む、不均一試料中の配列変異型の統計的検証を可能にする。例えば、DBRは、腫瘍試料、微生物試料、環境試料等における複雑なゲノムの解析での使用が見出される。DBRの例示的な統計方法および例示的な適用は以下に提供される。以下の説明は、単なる例示の目的であり、ポリヌクレオチド解析においてDBRを用いる範囲を制限することを意図するものではない。統計方法上述のように、本発明の態様では、変性塩基ランDBRを使用して、所与のプロセスで配列決定または解析されたテンプレート分子の実際の数を推定するか、または定量測定を行う。2つの読み出しは、その読み出しが同一のテンプレート分子を起源とするためか、または分子が偶然に同一のDBRを受容したために、同一のDBRを有し得る。配列決定された別個のテンプレート分子の潜在的な数は、DBRの数から読み出しの数の範囲である。出発分子の数からのDBRの分布は、占有分布により付与される[C.A.CharalambidesandC.A.Charalambides.Combinatorialmethodsindiscretedistributions.JohnWileyandSons,2005を参照]。DBRの観測された数を条件として、出発分子の可能な数は、最大の可能な推定、または他の適切な技法を使用して計算され得る。あるいは、それぞれのDBRについて、最も可能性の高いテンプレート分子は、その特定のDBRとともに、全ての読み出しのコンセンサス配列を使用して推定され得る。このアプローチは、特定の変異型と関連付けられたテンプレート分子の数の正確な推定を生成するように組み合わされ得る。PCR増幅におけるDBRDBRを使用して、PCR反応のテンプレートとして使用される出発分子の数を推定するか、または測定を行うことができる。例えば、出発ポリヌクレオチド試料は、PCRプライマー対を使用して、最初のサイクルまたは最初の数サイクルのためにPCR増幅されてよく、一方または両方のプライマーは、一般的プライマー配列および標的特異的配列に対するDBR5′を含む。初期サイクル複数可の後、このDBRを含有するPCRプライマー対は、除去され得るか、または不活性化され、残りのサイクルに対するDBRを有しないPCRプライマーと置き換えられてよい。DBRを含有するプライマーの除去/不活性化は、任意の便宜的な方法で、例えば、物理的または生化学的手段により達成されてよい。例えば、DBRを含有するプライマーは、そこに結合対の第1の構成要因例えば、ビオチンを付着させてもよく、それによって固体支持体に付着された結合パートナー例えば、固体支持体に結合されたストレプトアビジンに試料を接触させて、非結合画分を収集することにより、これらのプライマーの除去を促進する。あるいは、遊離DBRを含有するプライマーは、試料を一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ例えば、エキソヌクレアーゼIで処理するか、プライマーをさらなるプライマー伸長工程に関与できないようにするか例えば、ジデオキシヌクレオチドを3′末端に組み込むことによる、または固相可逆的不動化SPRIプロセス例えば、AgencourtAMPureXP-PCRPurification,BeckmanCoulterによりプライマーを除去され得る。第2のPCRプライマーは、最初のサイクル/最初の数サイクルで使用されるDBRを含有するPCRプライマーから生成されたテンプレートでDBRを複製するように、第1群のプライマーのそれぞれの5′末端上に存在する配列を含むように設計される。したがって、PCRの残りのサイクルは、DBRを含有する最初のサイクル/最初の数サイクルの生成物のみを増幅させる。別の実施形態では、DBRを含有するプライマーは、DBRを含有しない第2群のプライマーよりも高いTmを有するように設計され得るすなわち、第1のPCRプライマーの標的特異的配列のTmが、5′一般的プライマー配列に特異的な第2のPCRプライマーのそれよりも高い。この例示的なシナリオでは、DBRを含有するプライマーは、制限量で存在する場合があり、PCRの最初のサイクル/最初の数サイクルは、より高いTmで行われ、DBRを含有するプライマーのみがアニールし、核酸合成に関与するようにする。DBRを含有するプライマーが制限量で存在するため、それらは最初のサイクル/最初の数PCRサイクルで使い果たされる。残りのPCRサイクルをより低いTmで行うことは、DBRを含まない第2群のPCRプライマーによるさらなる増幅を可能にするが、最初のサイクル/最初の数サイクルの生成物からDBRを複製する上述のとおり。PCRプライマーの多くの異なる組み合わせ、および上述のDBRPCR増幅を達成するために用いられ得る増幅条件が存在することが指摘される。例えば、そのような反応は、3つのプライマーを含んでよく、プライマー1標的ポリヌクレオチドに特異的な順行性プライマーであり、DBRおよび5′一般的プライミング配列を含有するおよびプライマー2標的ポリヌクレオチドに特異的な逆行性プライマーであり、DBRを含まないを使用して、最初のサイクル/最初の数サイクルで標的を増幅させ、プライマー3プライマー1の5′一般的プライミング配列に特異的な順行性プライマーおよびプライマー2は、残りのサイクルに使用される。DBRを有するPCR生成物の両端をタグ付けするすなわち、最初のサイクル/最初の数サイクルで使用される両方のプライマーが、DBRを含むことは、増幅された出発ポリヌクレオチドの数を推定する際の信頼度の増加を提供し得ることが指摘される。2サイクルを超えるPCRを使用してDBRを付着させる場合、次にDBRを使用して、生成物がそこから増幅された初期テンプレートまたは出発分子を追跡するとき、データの解析中に追加の予防策を取る必要があることが指摘される。これは、PCRの第3サイクル目に、DBRを有するPCRプライマーが、以前に生成されたPCR生成物内の既存のDBR部位を越えて結合し得る可能性に起因し、それによって、新しいDBR配列を導入する。以下で概説されるように、PCRの最初の3サイクルの理論的解析は、分子の系統を追跡することが可能であることを示す。以下の解析は、理論的に、DBR配列を追加するための任意の数のPCRサイクルに使用することができるが、配列決定の深度は十分でなければならないことが指摘される。以下に記載される方法は、DBRを含有するPCRプライマーを使用する1サイクル以上のDBR追加後に、配列読み出しを分類するのを可能にする。表Iは、単一の二本鎖テンプレートから3つのPCRサイクルのそれぞれで生成されるPCR生成物のそれぞれを示す図3のサイクル0に示される、上鎖Aおよび下鎖Bを有するテンプレート。表Iにおいて、それぞれのサイクルに存在するそれぞれの鎖文字A~Pとして表されるは、そのそれぞれのテンプレート鎖すなわち、表示される鎖の合成中にテンプレートとして機能した鎖および、存在する場合は、その鎖上に存在する5′DBRおよび3′DBR番号1~14として示されるとともに示される。5′DBRとは、それがPCRプライマーの一部として組み込まれたDBR配列を意味する。3′DBRは、5′DBR配列の相補的配列すなわち、既存の5′DBR配列にわたるプライマー伸長の結果として生成されるを意味する。サイクル3において、DBRの上書きが発生し得ることが分かる右端のカラムに示される。例えば、サイクル3で生成された鎖KおよびNを参照。表I単一の二本鎖テンプレートAおよびBに対するPCR反応のサイクル0~3におけるDBRタグ付け上記表Iおよび図3は、全体PCRプロセス中に蓄積した鎖を示すサイクル0~サイクル1、2、および3からの鎖AおよびBのキャリーオーバー、サイクル1~サイクル2、および3における鎖CおよびDのキャリーオーバー等。十分な配列決定深度を条件として、DBRの上書きが発生した場合であっても、DBRを使用して起源となる分子を遡ることができる。例えば、鎖Kは、5′DBR9および3′DBR4を有する。DBR4は、鎖Fと共有され、5′DBR4および3′DBR1を有する。DBR1は、鎖Cと共有される。したがって、鎖KおよびFは、本来、鎖Cから派生する。同様に、鎖Nは、5′DBR12および3′DBR5を有する。DBR5は、5′DBR5および3′DBR2を有する、鎖Gと共有される。DBR2は、鎖Dと共有される。したがって、鎖NおよびGは、本来、鎖Dから派生する。上述のように、DBRを含有するPCRプライマーは、最初の数サイクル後に除去される例えば、表Iに示されるサイクル3の完了後。図3は、表Iに示される、単一の二本鎖テンプレートについて、PCRの最初の2サイクルの概略を示す。サイクル0では、二本鎖テンプレート鎖のみ、すなわち、上鎖Aおよび下鎖Bが存在する。図3のそれぞれの鎖上の矢印の方向は、5′~3′方向を示すことに留意されたい。最初のPCRサイクルサイクル1において、2つの生成物は、PCRプライマー対DBR配列を含むプライマー対の両方の要素、DBR1図に示される1を有する第1のCおよびDBR2を有する第2のD図に示される2により生成される。PCRの第2のサイクルサイクル2では、4つのテンプレートA、B、C、およびDは、4つの生成物E、F、G、およびHを生成し、それぞれ後次DBRを付着させているそれぞれDBR3、4、5、および6。テンプレートCおよびDFおよびGから生成される生成物は、ここで両端にDBRを有することに留意されたい。サイクル3図3に示されないは、次にサイクル2からの8つのテンプレートを使用して、8つの生成物を生成し、それぞれ追加のDBRを付着させている表Iに示される生成物を参照。サイクル3は、DBRの上書きが発生し得る最初のサイクルであるすなわち、後次DBR標識されたPCRプライマーによるテンプレートFおよびGのプライミングおよび伸長は、DBR1およびDBR2を上書きし、これらは、鎖KおよびNとして表Iに示される。DBRの上書きが可能なポリヌクレオチドのDBRを解析する際に、読み出しは5′および3′DBR配列により分類され、親分子の系統が追跡される。上記から明らかであるように、DBRは、1早期サイクル中に生じるPCRエラーの同定および2正確な対立遺伝子呼び出し/複製数の決定に有用である。エラー同定の場合、独立したプライミングイベントを分類することは明らかに許容され得る。対立遺伝子呼び出しの計算精度は、プライミングイベントが必ずしも独立した出発分子を表すとは限らないことを条件として、複雑性がわずかに増加する。しかしながら、プライミングイベントがいずれかの対立遺伝子上で等しく可能であるということは合理的な仮定であり、したがってこの解析は、対立遺伝子呼び出しの精度を向上させるために有用である。極めて低い初期テンプレートの場合、DBR追加の複数サイクルを使用する複製が有利であり得る。例えば、極めて低いDNA濃度では、標準アプローチを使用して、正確な遺伝子型を付与するために十分な数のDBRを回復できない場合がある。同一のテンプレート分子上に複数のプライミングイベントを可能にすることは、この場合、より多くのデータを提供することにより対立遺伝子呼び出しを行うために十分な信頼度を付与する。最初の増幅生成物におけるDBRの解析を使用して、反応で増幅された出発分子の数を推定することができる。そのような解析は、使用者が、PCR反応の生成物がたった数個またはさらには1つの出発ポリヌクレオチドの選択的増幅を表し、および/または増幅数に発生したPCRエラーの決定を支援するか否かを決定するのを可能にする例えば、上述のとおり。異種腫瘍試料におけるDBRDBRはまた、腫瘍試料中、例えば、対象の単一腫瘍内または異なる腫瘍間の染色体異常の異種性を評価する際の使用が見出される。例えば、1つ以上の腫瘍試料は、単一の腫瘍から例えば、腫瘍内または周囲の異なる位置および/または対象の異なる腫瘍から取得され、1つ以上の染色体位置での遺伝的変異について解析され得る。所定の実施形態では、試料は、経時的に腫瘍または対象から取得され得る。そのような変異は、当該技術分野において知られているように、特異的な塩基変化、欠失、挿入、複製等を含み得る。DBRを用いて、特異的な遺伝的変異を同定する前に、腫瘍試料複数可内のポリヌクレオチドをタグ付けしてよく、それにより同定される任意の変異型を認証する統計解析を行う方法を提供する。例えば、統計解析を使用して、検出された変異が、腫瘍の細胞のサブセットにおける変異を表すか否か、対象における特定の腫瘍に特異的な変異であるか否か、個体の非腫瘍細胞において見出される変異であるか否か、または変異型が同定されたプロセスのアーチファクト例えば、PCRアーチファクトであるか否かを決定することができる。微生物多様性の評価におけるDBRDBR解析は、単一試料中または異なる試料例えば、異なる時点で、または異なる位置から収集された試料の間でマイクローブ/ウイルスの集団の遺伝的変異/多様性を決定する際に使用することもできる。例えば、感染の経過で個体から収集された試料は、本明細書に記載されるDBRを使用して、感染プロセス中の遺伝的変異について解析され得る。しかしながら、微生物/ウイルス試料の型に関するいかなる制限も意図されず、そのため試料は任意の源、例えば、感染した対象、環境源土壌、水、植物、動物、または動物の排泄物等、食物源、または1つ以上の遺伝子座または領域において、試料中の微生物の遺伝的多様性の決定が望ましい任意の他の試料に由来し得る。この方法を実践する際に、試料から派生したポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、DBRで標識され富化工程の前または後のいずれか、目的とする1つ以上の遺伝子部位または遺伝子座における遺伝的変動を同定するように処理される。次にDBRの解析を行って、目的とする遺伝子座複数可において決定された試料中のマイクローブの遺伝的多様性の高い信頼度を提供することができる。そのような解析は、様々な源から、および/または源からの様々な時点で収集された試料上で行うことができる。微生物多様性を評価する際に使用が見出される例示的な遺伝子座は、これらに限定されないが、リボソームRNA、例えば、16SリボソームRNA,抗生物質耐性遺伝子、代謝酵素遺伝子等が含まれる。試料中の異なるポリヌクレオチド種のレベルの評価におけるDBRDBR解析は、試料中の異なるポリヌクレオチド種のレベルを評価する際にも使用することができる。特異的に、DBR解析は、試料中の親ポリヌクレオチドの数を決定または推定することができるため、相対量または定量の特異的ポリヌクレオチド種およびそのような種の決定における信頼度が評価され得る。例えば、DBRを使用するcDNA試料の解析を用いて、試料中の異なるcDNA種の相対レベルまたは定量レベルを評価することができ、したがって、それらの相対遺伝子発現レベルを決定する方法を提供する。プールされた試料の解析におけるDBRDBRの別の適用は、プールされた試料中のそれぞれのポリヌクレオチドが、その試料の起源に特異的なMIDを含む上で詳述される、プールされたポリヌクレオチド試料に関して遺伝子解析を行うことにある。これは、使用者が、プールされた試料を生成するために複合された試料のそれぞれの起源から、特異的なポリヌクレオチド種または複数の種の配列カバレージを決定することを可能にする。これは、プールされた試料中のそれぞれの出発試料からのポリヌクレオチドが適切に表されることを保証する機序を提供する。したがって、本発明の実施形態は、プールされた試料中のポリヌクレオチドの配列解析を含み、それぞれのポリヌクレオチドは、MIDおよびDBRを含有する。これらの実施形態では、試料特異的配列解析で使用されるのはMID/DBRの複合であるため、同一のDBR設計は、全ての親試料/MIDと併用されてよい。MIDおよびDBRを使用するプールされた試料の解析は、対立遺伝子呼び出し、配列のエラー訂正、相対的および定量的遺伝子発現解析等を含む、多数の遺伝子解析における使用が見出される。本発明の態様によりプールされた試料中のポリヌクレオチドを解析する際に、一方または他方のドメインの喪失は得られる結果に負の影響を及ぼすため、用いられるワークフローの各工程において、MIDおよびDBRドメインの両方を維持することが重要であることが指摘される。遺伝子解析におけるMIDおよびDBRドメインの使用は、次世代配列決定NGSプラットホームと併用されると、特に強力であり、それらの多くは、配列決定される試料中に存在するそれぞれの個別のポリヌクレオチドについて配列データを提供することがさらに指摘される。ポリヌクレオチドの個別のクローンが独立して配列決定される従来の配列決定アプローチとは反対に、NGSプラットホームは、試料中の複数の異なるポリヌクレオチドの配列を同時に提供する。この差異は、それぞれのポリヌクレオチドをクローン化し、独立して配列決定する必要により拘束されない、試料特異的統計解析が行われるのを可能にする。したがって、本明細書に記載されるMID/DBRドメイン解析は、NGSプラットホームと相乗作用して、プールされた試料からの極めて大量の配列を解析する向上した統計アプローチを提供する。キットおよびシステム対象の方法を実践するため、すなわち、DBRを使用して特定のポリヌクレオチドについて配列決定された異なる出発ポリヌクレオチドの数または最小数を決定するためのキットおよびシステムも対象の発明により提供される。そのためシステムおよびキットは、DBRを含有するポリヌクレオチド例えば、アダプターならびに本明細書に記載される目的とする任意の他の機能ドメイン例えば、配列決定プライマー部位、MID、再帰的配列等を含んでよい。システムおよびキットは、親試料中のポリヌクレオチドにアダプターを付着させること、アダプター/DBR付着のための親試料、ならびに/または配列決定反応を行うための試薬例えば、リガーゼ、制限酵素、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、プライマー、配列決定プライマー、dNTP、ddNTP、エキソヌクレアーゼ等を調製することにおける任意の工程を行うための試薬も含み得る。このシステムおよびキットの様々な構成要素は、別個の容器に存在し得るか、または必要に応じて、所定の適合構成要素が単一の容器に、事前に組み入れられてもよい。対象のシステムおよびキットは、対象の方法により核酸試料を調製または処理するための1つ以上の他の試薬を含んでもよい。試薬は、1つ以上のマトリクス、溶媒、試料調製試薬、緩衝液、脱塩試薬、酵素試薬、変性試薬を含んでよく、正の対照および負の対照などの較正基準も同様に提供され得る。そのためキットは、バイアルまたはボトル等の1つ以上の容器を含んでよく、それぞれの容器は、本発明により試料の処理または調製工程を行うための別個の構成要素を含有する。上述の構成要素に加えて、対象キットは、典型的に、キットの構成要素を使用して対象方法を実践する、例えば、上述のようにDBRを用いるための指示をさらに含む。対象方法を実践するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は、紙またはプラスチック等の基材にプリントされてよい。そのため指示は、キットの容器またはその構成要素のラベル付において、パッケージ挿入物としてキットに存在してもよいすなわち、パッケージングまたはサブパッケージングと関連付けられる。他の実施形態では、指示は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、CD-ROM、ディスク等に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示は、キットに存在しないが、遠隔ソースから、例えば、インターネットを介して指示を取得するための手段が提供される。この実施形態の例は、指示を見ることができ、および/またはそこから指示をダウンロードすることができる、ウェブアドレスを含むキットである。この指示に関して、指示を取得するためのこの手段は、適切な基材に記録される。対象データベース、プログラミング、および指示に加えて、キットは、1つ以上の対照試料および試薬、例えば、キットを試験する際に使用する2つ以上の対照試料を含んでもよい。方法マウスゲノムDNAの2つの同一試料をアダプターで標識した。1つの例は、7つの塩基RYBDHVBから成る重複して合成された領域を有するアダプターを使用し、それぞれ塩基ACAに続く2つの塩基RおよびY位または3つの塩基B、D、H、またはV位または合計972の異なる配列のうちの1つであり得、第2の試料は、7つの塩基RYBDHVBから成る重複して合成された領域を有するアダプターを使用し、それぞれ塩基ACGに続く2つの塩基RおよびY位または3つの塩基B、D、H、またはV位または合計972の異なる配列のうちの1つであり得る。太字の下線付き塩基は、合成多形部位に対応することに留意されたい。これらのアダプターにおいて、配列RYBは、DBR領域として機能し、DHVBはMIDとして機能する。したがって、12の可能なDBR2×2×3コードおよび81の異なるMID3×3×3×3が存在した。次いで当量の2つの試料を一緒に混合して、事実上、MIDから下流にあるAおよびGの3つの塩基の完全な50/50ヘテロ接合体すなわち、DHVB配列を形成する。異なる量の混合物100ng、300ng、600ng、2500ng、5000ng、および10,000ngは、TiAおよびTiBプライマーを有するPCRの10サイクルを経る増幅に続いてハイブリダイゼーションプルダウン反応に供された。用いられる捕捉プローブは、5′-ビオチニル化60-mer逆相カートリッジ精製されたオリゴヌクレオチドBioSearchであった。TiAおよびTiBによる増幅後、Tiaおよび末尾にTiBを有する配列特異的プライマーによる二次PCR反応5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGGGACACCCAGCCAAGACAGC-3′配列番号1を使用して、特異的断片を増幅させた。ハイブリダイゼーションプルダウン/PCRにおいて各試料から精製されたPCR断片は、DBR、MID、およびA/G対立遺伝子を決定するように、454TiShot配列決定に送られた。ハイブリダイゼーションプルダウン/PCRからの単位複製配列を以下に示す配列番号2。DBR領域は下線、MIDは太字、対立遺伝子AまたはGに対応するRは太字の下線である。結果図1は、試料中の各MIDの対立遺伝子比を示す。6つのパネルのそれぞれの上部にある数字は、使用されるゲノムDNAのインプット質量ナノグラムを示す。横座標は、任意の特定のMIDについて、A配列読み出しの画分、または決定の総数に対する決定すなわち、合成SNP位における多形塩基の1つの読み出し数の比、例えば、A決定/A決定G決定の比を示す。これは、対立遺伝子比と呼ばれる。座標は、特定の対立遺伝子比上記のMIDの総数は81で観察されるMIDの数である。インプットDNAは、50/50のA/G比であることが知られているため、それぞれの試料の対立遺伝子比は、0.5であるはずである。低インプット質量で、対立遺伝子比は、第1のPCR工程に対するインプット上の分子が制限され、2つの対立遺伝子のうちの1つが選好的に観察されたため、過剰に高いか過剰に低いかのいずれかに歪められる。第1の工程への質量が増加するにつれて、両方の対立遺伝子が観察され、予想される0.5比に徐々に近づく。この解析は、100ng、300ng、600ngで相当の対立遺伝子の脱落が存在したが、より高いインプットレベルでは対立遺伝子の脱落はほとんどまたは全く発生しなかったことを示す。図2は、それぞれの対立遺伝子と関連付けられたそれぞれのMIDについて、DBR配列の画分を示す。インプット材料は、合成多形位置において、名目上50/50AおよびGであるため、81の有効なMIDのそれぞれが50A読み出しおよび50G読み出しと関連付けられると予想する上記のとおり。さらに、12DBRはランダムかつ81の異なるMIDのそれぞれと関連付けられるため、十分なインプットDNA複製とともに、A対立遺伝子については12個のDBR全てが観察され、G対立遺伝子については12個全てが観察される。したがって、理想的な例において特定の塩基について観察されるDBRの画分は、それぞれの対立遺伝子について12/24または0.5である。不十分な数の分子が処理工程に進む範囲で、それぞれのMID対立遺伝子について12個未満のDBRが存在し得るため、比率は理想から外れ得る。図2において、横座標は、任意の特定のMIDについて、それぞれの対立遺伝子に実際に観察されたDBRを実際に観察されたDBRの総数で割った比率を示す。座標は、対立遺伝子と関連付けられた特定の比率またはDBRとともに観察されたMIDの数である。合計81個の異なるMIDが見られ、かつ見られるはずである。低インプット質量において、過度に高いか過度に低いかのいずれかである歪んだ比率を頻繁に見ることができる。これは、第1のPCR工程への分子インプットの制限数に起因する可能性があり、2つの対立遺伝子のうちの1つは、選好的に観察された。第1の工程への質量が増加するにつれて、両方の対立遺伝子は、より頻繁に観察され、それぞれの対立遺伝子と関連付けられて、より多くのDBRが観察されるため、比率は0.5に近づく。図1および2の日付の比較は、本明細書に記載されるDBRを用いる追加の特徴を示す。真のヘテロ接合体の場合、DBR解析図2においてより早い段階ですなわち、より低い質量で、分布が予想される0.5比の周囲に集合するのを見始める。例えば、A対立遺伝子の場合12個のDRBのうち6個、G対立遺伝子の12個のDBRのうち4個の観察が、6/[64]=0.60の比率を生じ、実際に予想される0.5にかなり近いため、これは意味を為す。正味の影響は、DBRの使用が真のヘテロ接合体または真のホモ接合体の存在下ではるかに高い信頼度を付与することである。前記の発明は、理解を明確にする目的で、例証および実施例によりある程度詳細に説明されたが、本発明の教示に照らして、添付の請求項の趣旨または範囲から逸脱することなく、所定の変更および修正をそこに行ってよいことは当業者には容易に明らかである。したがって、前述は発明の原則を例証するに過ぎない。当然のことながら、当業者は、本明細書に明示的に説明または図示されていないが、発明の原則を具体化し、その趣旨および範囲内に含まれる様々な手配を考案することができるであろう。さらに、本明細書に列挙される全ての実施例および条件的言語は、原則的に、発明の原則およびこの技術分野を促進するように発明者らにより寄与される概念を理解することにおいて、読者を支援することが意図され、そのような特異的に列挙された実施例および条件を制限しないものとみなされる。さらに、本発明の原則、態様、および実施形態、ならびにそれらの特異的な実施例に関する本明細書における全ての陳述は、その構造的および機能的相当物の両方を包含することが意図される。加えて、そのような相当物は、現在知られている相当物および今後開発される相当物の両方、すなわち、構造に関係なく、同一の機能を行うように開発された任意の要素を含むことが意図される。本発明の範囲は、したがって、本明細書に図示および記載される例示的実施形態に限定されるものではない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の請求項により具体化される。"