トリクロロエテン分解酵素遺伝子であるTceA及び塩化ビニル分解酵素遺伝子であるBvcAとVcrAを保有し、トリクロロエテンをエテンまで分解する能力を有するデハロココイデスDehalococcoides属細菌。請求項1に記載のデハロココイデスDehalococcoides属細菌を含有する微生物群。Enterobacter属細菌、Azospira属細菌、Actinobacterium属細菌及びChlorobi属細菌を含有する、請求項2に記載の微生物群。NITEP1018受託番号である、請求項2に記載の微生物群。請求項1に記載のデハロココイデスDehalococcoides属細菌、又は、当該細菌を含有する請求項2~4のいずれかに記載の微生物群を、クロロエテン類を含む汚染物に作用させて当該クロロエテン類を脱塩素化する、浄化方法。クロロエテン類の脱塩素化の最終産物はエテンである、請求項5に記載の浄化方法。テトラクロロエテンPCEとトリクロロエテンTCE等のクロロエテン類の脱塩素化以下、上流分解ともいうはDehalococcoides属細菌を含む数種類の微生物により行われることが知られている。一方、ジクロロエテンDCE異性体から塩化ビニルVC、さらにはエテンまでの分解以下、下流分解ともいうは、一部のDehalococcoides属細菌DehalococcoidesspBAV1株VS株等のみが行うことができる。このため、ポリ乳酸を主成分とするHRC等の水素徐放剤を電子供与体として土壌に供給しても、これらの微生物が存在しない場所では浄化が進まないので、全てのクロロエテン類で汚染された土壌に対して有効とはいえない。また、存在したとしても、微生物の量が少ない場合には浄化に時間がかかるという問題もある。さらに、下流分解を行うDehalococcoides属細菌が存在しなければ、有害なDCEやVCを土壌中に蓄積することになる。このような問題を解決するために、Dehalococcoides属細菌等の供与を行うことで分解を促進するバイオオーグメンテーションが試みられている。しかし、Dehalococcoides属細菌を含むクロロエテン類の嫌気的脱塩素化を行う微生物は単離培養が困難であり、利用可能な微生物が限られている。さらに上記のように上流及び下流分解を行う2種類の微生物を投入することが必要となっており、特に下流分解を担う微生物は、培養が困難である。さらに、複数種類の微生物を環境中で安定に生育させることは困難である。Dehalococcoides属細菌の中で唯一Dehalococcoidesethenogenes195が、PCEからエテンまでの完全分解を行うことが可能であるが、Dehalococcoidesethenogenes195にはVC分解酵素が認められず、VCは共代謝で分解されるだけなので分解効率が悪く、有毒なVCが蓄積するという問題がある。DehalococcoidesspGTはVC分解酵素であるVcrAを保有し、TCEからエテンまでの比較的高い効率で完全脱塩素化を行うことができるが、TCE分解能は比較的弱い。そこで本発明は、クロロエテン類を上流から下流まで分解して、最終的にエテンまでの脱塩素化を単独で効率的に行うことが可能な脱塩素細菌、及び、それを含有する微生物群を見出して、これらを用いた汚染土壌等の汚染物の浄化方法を提供することを目的とする。本発明者は、上記の課題の解決に向けて、まず、クロロエテン類により汚染された様々なサイトから得られた地下水からシス1、2ジクロロエテンをエテンまで脱塩素化できる微生物群の集積培養を行い、その中でトリクロロエテンからエテンまで完全脱塩素化する能力を有する微生物群を得ることができた。16SrRNA遺伝子等の解析により、この微生物群はDehalococcoides属細菌を主に含むことが判明した。さらに、還元脱塩素化酵素遺伝子を対象とした遺伝子解析を行った結果、TCE分解酵素遺伝子であるTceA及びVC分解酵素遺伝子であるVcrAとBvcAの両方が存在する新規なDehalococcoides属細菌が存在することが明らかになった。すなわち、本発明は、トリクロロエテン分解酵素遺伝子であるTceA及びビニルクロライド分解酵素遺伝子であるBvcAとVcrAを保有し、トリクロロエテンをエテンまで完全に脱塩素化する能力を有するDehalococcoides属細菌以下、本発明の微生物ともいう、及び当該微生物を含む微生物群以下、本発明の微生物群ともいうを提供する発明である。また、本発明は、本発明の微生物、又は、微生物群を、クロロエテン類を含む汚染物に作用させて当該クロロエテン類を脱塩素化する、浄化方法以下、本発明の浄化方法ともいうを提供する発明である。本発明により、単独でトリクロロエテン、ジクロロエテン異性体から塩化ビニルまでをエテンまで脱塩素化することができるDehalococcoides属細菌、及び、当該細菌を含有する微生物群が提供される。さらに、当該Dehalococcoides属細菌、及び、当該細菌を含有する微生物群を用いる、揮発性汚染土壌や汚染地下水の汚染物の浄化方法が提供される。[本発明の微生物]1概略本発明の微生物は、既存のDehalococcoides属細菌の遺伝子に、遺伝子工学的手法によりトリクロロエテン分解酵素遺伝子であるTceA及びビニルクロライド分解酵素遺伝子であるBvcAまたはVcrAを組み込んで得られる組換え微生物として得ることも可能であるが、Dehalococcoides属細菌の遺伝子組み換えが困難であるだけでなく、組換え微生物を用いたバイオレメディエーションが社会的に受け入れにくいという問題がある。ゆえに、有機塩素化合物による汚染土壌や汚染地下水等の汚染物におけるサンプリングを行い、所望する上流分解から下流分解までの塩化ビニル分解活性を有する微生物群をサンプリングして、これを継体培養や集積培養を行うことにより得ることが好ましい。そこで、クロロエテンで汚染された地下水から、存在が少ないジクロロエテンと塩化ビニルを分解できる微生物の培養系を構築し、その中から目的とするトリクロロエテンの完全脱塩素化が可能な微生物を得ることとした。トリクロロエテン分解酵素遺伝子であるTceA及びビニルクロライド分解酵素遺伝子であるBvcAとVcrAの存在の確認は、遺伝子のPCR増幅とシークエンシング配列決定を行うことにより実行することができる。本発明の微生物と微生物群の取得過程の概略は下記の通りである。より具体的な内容については、実施例の欄において後述する。2微生物の取得過程クロロエテン汚染地下水を微生物源として用い、ミネラル基礎培養液に、滅菌した土壌、酢酸、水素、シス12ジクロロエテンを添加して、バイアル瓶で嫌気培養を開始した。その後、液量に対して4質量の継体培養を繰り返し、微生物群微生物コンソーシアを構築した。ガスクロマトグラフィー測定の結果、3週間程度で10mgLのシス12ジクロロエテンをエテンにまで完全に脱塩素化可能な微生物のコンソーシアが得られたことが確認された。16SrRNA遺伝子の解析を行った結果、Dehalococcoides属細菌が当該コンソーシアの大部分を占めていることが確認された。さらに、脱塩素酵素遺伝子の解析から、当該コンソーシアに存在するDehalococcoides属細菌にはトリクロロエテン分解酵素遺伝子であるTceAと共に、ビニルクロライド分解酵素遺伝子であるBvcA及びVcrAが存在していることが明らかになった。また、この微生物コンソーシアのゲノムを次世代DNAシークエンサーにより解析したところ、当該Dehalococcoides属細菌はDehalococcoidesethenogenes195と高い相同性があり、トリクロロエテン分解酵素遺伝子であるTceAの保有が認められた。TceAがDehalococcoidesの16SrRNA遺伝子やBvcA及びVcrAとほぼ同程度存在し、この微生物コンソーシアがシス12ジクロロエテンで継体培養されているにも拘わらず、高いトリクロロエテン脱塩素化活性を有することから、本微生物がBvcA及びVcrAの他にTceA遺伝子を保有し、トリクロロエテンをエテンまで完全に脱塩素化する能力を有する、本発明の微生物であることが明らかになった。当該微生物を含む上記微生物群は、受託番号NITEP1018として独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部特許微生物寄託センターに寄託されている。この微生物群もDehalococcoidesspATV1という名称にて寄託されている。[本発明の浄化方法]本発明の浄化方法は、上述の本発明の微生物又は微生物群以下、本発明の微生物等ともいうを、クロロエテン類を含む汚染物に作用させて当該クロロエテン類を脱塩素化することを特徴とする、浄化方法である。ここでクロロエテン類を含む汚染物とは、トリクロロエテンTCE、ジクロロエテンDCE異性体、及び、塩化ビニルVCから選ばれる1種又は2種以上のクロロエテン類を含有する汚染物であり、テトラクロロエテンPCEを含む他の種類の汚染物質、例えば、第1種特定有害物質として指定されている四塩化炭素、12ジクロロエタン、13ジクロロプロペン、ジクロロメタン、111トリクロロエタン、112トリクロロエタン、ベンゼンを含んでいてもよい。また、第2種特定有害物質として指定されている重金属等、第3種特定有害物質として指定されている農薬等、さらに、油類、ダイオキシン類等が含まれていてもよい。また、汚染物は、通常は汚染された土壌、地下水等が該当するが、必要に応じて他の対象物、例えば、廃棄物や排水処理後の汚泥等も汚染物として例示される。また、土壌や地下水は環境から分離されている状態であっても、非分離の状態、すなわち汚染された土地地下部分を含むそのものであってもよい。分離の状態とは、いわゆる汚染土壌の掘削による汚染物質の除去を行う場合であり、事前調査により把握した範囲の汚染土壌を掘削し、掘削した汚染土壌以外の清浄な土壌の他、浄化処理を行った当該掘削土壌にて埋め戻す作業である。浄化された掘削土壌は、別の場所に載置する場合もある。いずれにしても、本発明の浄化方法を掘削土壌に適用する場合には、ランドファーミング、バイオパイル、スラリーバイオ等の手法を用いることが可能である。ランドファーミングは、掘削した汚染土壌を敷き広げ、栄養源や水を添加することにより汚染土壌中の微生物の活性を高めて有害物質を分解する方法である。バイオパイルは、掘削した汚染土壌を畝型に成型して、栄養源と水を供給しつつ微生物の活性を高め有害物質を分解する方法である。スラリーバイオは、掘削した汚染土壌に水を加えてスラリー状に調整して、これをスラリーリアクターという反応槽に移し、そこに栄養源を供給して混合することにより微生物を活性化する方法である。ここで栄養源の中には、本発明の微生物等の電子供与体となる物質を含めることが好適である。具体的には、ポリ乳酸を主成分とするHRC、アデカジオメイトADEKA社、EDCエコサイクル社等の水素徐放剤を挙げることができる。また、酢酸や水素ガスを用いることもできる。非分離の状態とは、汚染土壌を掘削せずに、原位置において浄化する原位置浄化法原位置バイオレメディエーションを意味するものである。本発明の微生物等は嫌気性細菌であるために、本発明の浄化方法ではこの手法を用いることが好適である。原位置浄化法にて、本発明の浄化方法を行う場合には、本発明の微生物等とHRC等の電子供与体は、浄化領域の上流地下水の上流を意味するに設けた1個又は2個以上の井戸から供給することが好適である。このようにすることにより、地下水により本発明の微生物等と電子供与体が、クロロエテン類を脱塩素化しつつ徐々に下流に移行し、結果として汚染全領域におけるクロロエテン類のエテンへの浄化を行うことができる。本発明の微生物は絶対嫌気性であり、高密度培養が困難であるという問題がある。本発明の微生物の培養液をそのまま井戸から汚染サイトに投入することも可能であるが、より効果的にするためには、培養した微生物を濃縮し、嫌気的に土壌や地下水中に投入し、安定に保持することが必要である。これには様々な手法が考えられるが、固定化担体に固定化することが1つの方法として考えられる。一般的に微生物の固定化に用いられているアルギン酸ナトリウムやκカラゲナン等を用いることが考えられる。また、マイクロカプセルに微生物を閉じ込める方法も考えられる。さらに、ポリ乳酸等の生分解性プラスチックやポリN-イソプロピルアクリルアミド等の温度応答性高分子を用いることで、放出を制御することも考えられる。所望の固定化微生物は、固相化担体を浸漬等により本発明の微生物等の培養液と接触させることにより製造することができる。特に、当該固定化微生物がビーズ形態の場合は、原位置浄化法を行う場合において、スラリー状として、これを圧力等により容易に地中に注入することができる。また、微生物の空気との接触容積を減ずることができるので、嫌気性菌である本発明の微生物等を扱う上では好適である。現在、原位置バイオレメディエーションでは、事前に浄化微生物の存在の有無とその分解能力を評価するトリータビリティ試験が行われる。本発明の浄化方法により、トリータビリティ試験で汚染場所に存在する微生物の活性化では浄化が困難であると判断された場所での浄化が可能になる。また、トリータビリティ試験には数ヶ月必要であることから、経済性や時間短縮の観点でトリータビリティ試験を行わずに浄化を開始することも可能になる。現行のクロロエテン類を含む汚染物のバイオレメディエーションによる浄化方法に比べると、飛躍的に簡便になり、かつ、浄化の効率の向上も図ることができる。微生物の生育状況のモニタリングは、例えば、RealTimePCR法で16SrRNA等を増幅させて、微生物の特定と定量を行うことにより実行することができる。その他、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法DGGE法、細胞内蛍光標識法FISH法、キノンプロファイル法、直接活性計測法DVC法、CFDA染色法、CTC法等を、単独で又は組み合わせて汚染浄化対象における微生物のモニタリングを行うことができる。以下、本発明の実施例を開示する。以下の方法により、テトラクロロエテンにより汚染した地下水から本発明の微生物DehalococcoidesspATV1を獲得し、その微生物学的特性の評価を行った。1.ミネラル基礎培養液1Lメディウム瓶に900mLの脱イオン水を入れ、脱気及びオートクレーブ滅菌後、培地の温度を高温で保ったまま、以下の溶液と試薬を添加した。10mL100×Saltstocksolution1mLTraceelementsolutionA1mLTraceelementsolutionB50μLレザズリンナトリウム溶液05wv1mM酢酸カリウム0206gLCysteine252g炭酸水素ナトリウム0048g硫化ナトリウム二水和物脱イオン水脱気、オートクレーブ滅菌済みで1Lまでメスアップし、CO2ガスによりpHを70~75に調整した。100×SaltstocksolutionTraceelementsolutionA及びTraceelementsolutionBは各1Lを以下の組成で作製した。100×Saltstocksolution100gNaCl50gMgCl26H2O20gKH2PO430gNH4Cl30gKCl15gCaCl22H2O1LTraceelementsolutionA10mLHCl25solutionww15gFeCl24H2O019gCoCl26H2O01gMnCl24H2O70mgZnCl26mgH3BO336mgNa2MOO42H2O24mgNiCl26H2O2mgCuCl22H2O1LTraceelementsolutionB6mgNa2SeO35H2O8mgNa2WO42H2O05gNaOH1L2.サンプルリングサンプルは愛知県熱田市の表層から約9mから採取した地下水をサンプルとした。この地下水はトリクロロエテンで汚染されており、水素徐放剤の投入によりDehalococcoides属細菌が増殖し、エテンまでの分解が促進されていることが分かっていた。地下水は空気に触れないように密閉した容器に入れ、4°Cで冷却して輸送し、到着後ただちに第1世代の培養に用いた。3.クロロエテン及びエテンの定量クロロエテン類及びエチレンはヘッドスペースサンプルをFID炎イオン検出器ガスクロマトグラフィーGC2014、島津製作所を用いて分析した。サンプリングはガスタイトシリンジハミルトンで行い、カラムはキャピラリーカラムDB624長さ:60m、内径:032mm、膜厚:180μm、JW社を用いた。測定条件は、入口圧2066kPa、カラム流量493mlmin、線速度493cms、スプリット比250、全流量1312mlmin、注入モードSPLITLESS、制御モード線速度、キャリアガスHeである。注入口および検出器側の温度は、それぞれ200°Cおよび250°Cである。オーブン温度は、最初に35°Cで15分間保持し、4°Cminで75°Cまで昇温させた後に40°Cminで200°Cまで昇温させた。トリクロロエテン、シス12ジクロロエテン、ビニルクロライドおよびエテンの保持時間は、それぞれ105分、75分、28分および21分であった。4.第1世代の培養10gの滅菌した泥を添加したバイアル瓶容量100mL外径405mm×高さ128mmにミネラル基礎培養液を40mL分注した。バイアル瓶にアルミホイルをかぶせてオートクレーブ滅菌処理を行った。培地が常温まで下がった後に、レザズリンによる培地の赤色が無色になるまでの約5分間アルゴンガスで気相液層置換を行った。培地が無色になったのを確認した後に、採取した地下水を50mL添加し、直ちにテフロン登録商標コートブチルゴムセプタムジーエルサイエンスとアルミシールジーエルサイエンスで栓をした。その後、カテラン針テルモ22G×70、ガンマ線滅菌済と注射針テルモ18G×112、ガンマ線滅菌済を用いて約5分間アルゴンガスで気相液層置換を行った。5mlシリンジニプロシリンジGA、ガンマ線滅菌済を用いてバイアル瓶1本当り1mLヘッドスペース容量の33の水素ガスを封入した後、ドラフト内で注射針付シリンジテルモ25G×1を用いてシス12ジクロロエテンを10ppm程度になるように封入した。全てのバイアル瓶は、反転させて25°Cの暗所で培養を開始し、3日に1回の転倒攪拌を行った。図1はシス12ジクロロエテンの濃度変化を示したものであり、34日目にシス12ジクロロエテンの濃度はほぼゼロになった。5.第2世代の培養培養開始37日後、添加したシス12ジクロロエテンのほぼ完全な分解が見られたので、継体を行った。10gの滅菌した泥を加えた100mL容量バイアル瓶に864mLミネラル基礎培養液を分注しオートクレーブ滅菌処理後に、第1世代培養液を36mL添加して、直ちにテフロン登録商標コートブチルゴムおよびアルミシールで栓をした。その後、約5分間アルゴンガスで気相液層置換を行い、バイアル瓶1本当り1mLヘッドスペース容量の33の水素ガスを封入し、ドラフト内でシス12ジクロロエテンを約100μMになるように封入した。全てのバイアル瓶は、反転させて25°Cの暗所で培養を開始し、3日に1回の転倒攪拌を行った。6.継体培養第3世代以降は、600mLロット瓶日電理化硝子株式会社を用いて以下の条件で培養した。継体量:最終液量の4培地量:バイアル瓶の75水素量:ヘッドスペースの5滅菌泥量:最終液量の5weight図2は第4世代培養液中のシス12ジクロロエテン、ビニルクロライド及びエテンの濃度変化を示したものである。シス12ジクロロエテンの分解に伴い、ビニルクロライドが生成し、約3週間でほぼ完全にエテンまだ脱塩素化が進んだ。以後の継体では、ほぼ同じ速度で分解が進むことが確認された。7.ゲノムDNAの抽出第4世代培養微生物群の全ゲノムDNAを、PowerMaxTMSoilDNAIsolationKitMOBIOを用いて抽出した。地下水または培養液90mLを20000×g、60分間遠心して得られた沈殿物を15mLBeadSolutionで懸濁し、BeadSolutionTubeに加えて1分間ボルテックスした。12mLのSolutionS1を加え、30秒間ボルテックスして、4mLSolutionIRSを加える。65°Cのウォーターバス内に入れて10分毎にボルテックスにかけて、最大スピードで30分間振とうさせる。その後、室温で2500×g、3分間遠心させ、上清を注意深く新しいCollectionTube50mLに移す。2mLSolutionS2を加え、2回転倒混和させ、氷上に10分間置く。室温で2500×g、4分間遠心させ、上清を注意深く新しいCollectionTube50mLに移す。30mLSolutionS3を加え、2回転倒混和させ、Spinfiltersunitsin50mLに移す。室温で2500×g、2分間遠心させ、スピンフィルターを通過した溶液を捨て、残りをSpinfiltersunitsin50mLに移す。室温で2500×g、2分間遠心させ、Spinfilterを通過した溶液を捨てる。6mLSolutionS4を加え、室温で2500×g、3分間遠心させ、Spinfilterを通過した溶液を捨てる。室温で2500×g、2分間遠心させ、新しいCollectionTube50mLにSpinfilterを移す。Spinfilterに30mLSolutionS5を加え、室温で2500×g、3分間遠心させて、ゲノムDNAを抽出した。8.RealTimePCRによるDehalococcoides属細菌の検出RealTimePCRを用いて地下水及び培養液中のシス12ジクロロエテンの脱塩素化に関わるDehalococcoides属細菌を定量した。Dehalococcoides属細菌に共通な16SrRNA遺伝子配列、DehalococcoidesspBAV1由来ビニルクロライド分解酵素遺伝子BvcA及びDehalococcoidesspVS由来ビニルクロライド分解酵素遺伝子VcrAを対象として解析を行った。解析に用いたプライマーとプローブの配列を表1に示す。解析は、StepOneTMRealTimePCRSystemを用いて行った。スタンダードカーブは、1μLあたり103から107のコピー数の遺伝子を含むサンプルを調製して作成した。Dehalococcoides属細菌由来16SrRNA遺伝子及びBvcA遺伝子のRealTimePCR条件は、03mMForwardPrimer03mMReversePrimer03mMProbe2×TaqManUniversalPCRMasterMixAppliedBiosystems3μLSampleDNAを、DistilledWaterDNAseRNAseFreeInvitrogenで30μLに調製して、RealTimePCRで解析した。VcrA遺伝子のPCR条件は、03mMForwardPrimer03mMReversePrimer1×FastSYBRGreenMasterMixAppliedBiosystems2μLSampleDNAを、DistilledWaterDNAseRNAseFreeで20μLに調製して、RealTimePCRで解析した。表1中のプライマー及びプローブの塩基配列に対して、上から順番に配列番号1~8を割り振った。9.Dehalococcoides属細菌の占有率得られたゲノムDNAの量とDehalococcoides属細菌の16SrRNA遺伝子の定量結果表2から、地下水ではDehalococcoides属細菌が微生物全体の約1程度だったものが第4世代で90以上に達していることが分かった。10.還元脱塩素化酵素遺伝子の定量各世代におけるDehalococcoides属細菌の16SrRNA遺伝子、VcrA、BvcAの遺伝子の定量の結果を図3に示した。コントロールとの配列の違い等から増幅効率のずれがあるがDehalococcoides属細菌16SrRNAの増加に伴い、VcrA及びBvcA遺伝子が増加している。ほぼ同じパターンで増加していることから、1種類のDehalococcoides属細菌がVcrA及びBvcA遺伝子を有していることが示唆された。11.ゲノム解析により菌の解析-既知Dehalococcoides属細菌ゲノム配列との比較第4世代目でDehalococcoides属細菌が主に占有していることから、第4世代の培養微生物群をLifeTechnologies社の次世代DNAシークエンサーSOLiD3を用いてゲノム解析した。精製したゲノムDNAを、同社の推奨するプロトコールに従って処理し解析を行った。解析ソフトウエアCoronaLiteにより、得られた配列情報を既知のDehalococcoides属細菌ゲノム配列:NC002936、NC009455、NC007356、NC013552、NC013890との比較を行った。その結果を図4に示す。SOLiD3ではゲノム配列が50塩基のタグ配列として得られる。このタグ配列を既知の配列とマッチングを行い、50塩基のうちミスマッチが3個以内のタグ配列の数をカウントし、グラフにした。培養しているDehalococcoides属細菌のゲノムはDehalococcoidesethenogenes195株のゲノムと全長にわたって高い相同性を示すことが明らかになった。12.還元脱塩素化酵素遺伝子の解析さらに、どのような還元脱塩素化酵素遺伝子が含まれるかを明らかにするために、各Dehalococcoides属細菌のゲノムにおける還元脱塩素化酵素遺伝子とのマッチングを解析した。表3~6は各還元脱塩素化酵素遺伝子の配列にマッチしたタグ配列の数Coverageの平均値を示している。Dehalococcoidesethenogenes195のゲノムに存在する17種類の還元脱塩素化酵素遺伝子の内トリクロロエテン分解酵素遺伝子であるTceAを含む7種類の還元脱塩素化酵素遺伝子が存在することが分かった。他のDehalococcoides属細菌の還元脱塩素化酵素とはほとんど高い相同性は示さなかったが、DehalococcoidesspBav1及びDehalococcoidesspVSのビニルクロライド酵素遺伝子であるBvcA及びVcrAとは高い相同性を有する遺伝子が含まれることが確認された。この結果はRealTimePCRの結果と合致している。RealTimePCRの結果から、BvcA及びVcrAを有するDehalococcoides属細菌が培養中の微生物の大部分を占めていることが明らかになっており、BvcA及びVcrAのCoverageの平均値が、存在が確認されたDehalococcoidesethenogenes195のTceAを含む7種類の還元脱塩素化酵素遺伝子のCoverageの平均値と近いことから、このDehalococcoides属細菌はDehalococcoidesethenogenes195株とゲノム配列が極めて高い相同性があり、TceAの他にBvcA及びVcrAも含むことが示唆された。一方、テトラクロロエテン分解酵素遺伝子であるPceAは存在しなかった。13.共存する微生物の同定と定量既知の全ての微生物の16SrRNA遺伝子配列を対象として同様の解析を行った。その結果、表7に示す微生物種の16SrRNA遺伝子の存在が確認された。それらの配列にマッチするタグの数からそれぞれの微生物の存在率を推定した。Dehalococcoides属細菌の存在割合は471と計算された。培養系中の微生物群の主な構成微生物であることが、ゲノム解析データからも証明された。さらに、Dehalococcoides属細菌のCoverageがTceA、BvcA及びVcrAとほぼ同じであることから、1種類のDehalococcoides属細菌がこれらの遺伝子を全て含むことを示している。もし、複数の種のDehalococcoides属細菌が存在し、それらのゲノムにTceA、BvcA及びVcrAが存在すると仮定すると、これらの遺伝子の存在量がDehalococcoides属細菌の16SrRNA遺伝子よりも多くなることになり、矛盾する。また、考えにくいことだが、他の微生物にいずれかの遺伝子が存在すると仮定しても、これらの遺伝子は他のどの種の微生物の16SrRNA遺伝子よりも多いことから、その可能性も否定される。以上のことから、本培養系に存在する微生物群を主に構成するDehalococcoides属細菌は主なものは1種類であり、TceA、BvcA及びVcrAを含むものであるという結論に達した。本菌をDehalococcoidesspATB1と命名し、当該微生物を含む上記微生物群を、受託番号NITEP1018として独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部特許微生物寄託センターに寄託した。この寄託された微生物群の名称は、単独微生物と同じくDehalococcoidesspATB1であることは前述した通りである。この方法で計算されたDehalococcoides属細菌の存在割合はRealTimePCRから推定された割合よりも低かったが、これは検量線の作成に用いたDNAと若干配列が異なるために、RealTimePCRの増幅効率が異なったことが原因であると考えられる。これらの微生物が共存していることを確認するために、継体を続けた培養菌体を対象としてPCRを行った。培養菌から精製したゲノムDNAを鋳型として表8に示すプライマーを用いてPCRを行った。表8中のプライマーの塩基配列に対して、上から順番に配列番号9~18を割り振った。増幅した結果を図5に示す。いずれも増幅していることが確認された。14.16SrRNA遺伝子及び還元脱塩素化酵素遺伝子のクローニングと解析16SrRNA遺伝子及び存在が確認されたTceA、VcrAおよびBvcAをPCRで増幅し、配列の解析を行った。DNA、アミノ酸配列及び既知の遺伝子との相同性を図6に示す。図6Aは、DehalococcoidesspATV1単独微生物及びDehalococcoidesethenogenes由来16SrRNA配列の比較の結果を示しているDehalococcoidesspATV1の16SrRNA配列:配列番号19、Dehalococcoidesethenogenesの16SrRNA配列:配列番号20。図6Bは、DehalococcoidesspATV1単独微生物及びDehalococcoidesethenogenes由来のTceAの、DNA及びアミノ酸配列の比較を示した図面であるDehalococcoidesspATV1のDNA配列とアミノ酸配列:配列番号21、22、DehalococcoidesethenogenesのDNA配列とアミノ酸配列:配列番号23、24。図6Cは、DehalococcoidesspATV1単独微生物及びDehalococcoidessp.BAV1由来のBvcAの、DNA及びアミノ酸配列の比較を示した図面であるDehalococcoidesspATV1のDNA配列とアミノ酸配列:配列番号25、26、Dehalococcoidessp.BAV1のDNA配列とアミノ酸配列:配列番号27、28。図6Dは、DehalococcoidesspATV1単独微生物及びDehalococcoidessp.VS由来のVcrAの、DNA及びアミノ酸配列の比較を示した図面であるDehalococcoidesspATV1のDNA配列とアミノ酸配列:配列番号29、30、Dehalococcoidessp.VSのDNA配列とアミノ酸配列:配列番号31、32。15.トリクロロエテン分解活性の確認今回培養することに成功したDehalococcoidesspATV1のゲノムにトリクロロエテン分解酵素遺伝子であるTceAが存在することから、本菌がトリクロロエテンをエテンまで分解する活性を有することが示唆された。そこで、とりクロロエテンを電子受容体として培養を行った。その結果、約13日間で10ppbのトリクロロエテンが完全に分解した。この結果は、DehalococcoidesspATV1がトリクロロエテンをエテンまで分解する能力がある菌であることを示している。図7は培養開始時と4日目と13日目のガスクロマトグラフィーによる分析の結果である。13日目にはトリクロロエテンのピークが完全に消失し、エテンのピークが出現している。16.DehalococcoidesspATB1の電子顕微鏡写真4代目培養液からサンプルを調整し、DehalococcoidesspATV1を電子顕微鏡で観察し、その電子顕微鏡像を図8に示す。撮影条件は以下の通りである。電子顕微鏡:JEM1400最大加速電圧120kV測定条件80kV1TPA染色200メッシュ支持膜グリッド10000倍観察された形態は既に報告されている他のDehalococcoides属細菌とほぼ同じであった。