"植物を形質転換する方法であって、前記植物の細胞を、pSB1の14.8KpnI断片を含む少なくとも1つのpTiヘルパープラスミドと、少なくとも1つの無害化T-DNA領域を有するpTiプラスミドとを有するアグロバクテリウムAgrobacterium株と接触させるステップを含み、前記T-DNA領域が少なくともT-DNA右側境界および前記境界に隣接する外来性DNAを含み、前記プラスミドが互いに対して異なる複製開始点を有する、方法。アグロバクテリウムAgrobacterium株中のpSB1から単離された14.8KpnIVirBCDG断片がRecA機能の欠損を有する、請求項1に記載の方法。植物を形質転換する方法であって、前記植物の細胞を、pSB1の14.8KpnIVirBCDG断片と少なくとも1つの無害化T-DNA領域を有するpTiプラスミドとを有するアグロバクテリウムAgrobacterium属の細菌と接触させるステップを含み、14.8KpnIVirBCDG断片が前記細菌の染色体の中立組込み部位へ組み込まれている、方法。前記細菌が少なくとも1つのアグロバクテリウムAgrobacteriumT-DNA境界に隣接するT-DNA領域を有するプラスミドをさらに含み、前記プラスミドがIncP不和合性グループの複製起点を有する、請求項1から2のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。前記細菌が少なくとも1つのアグロバクテリウムAgrobacteriumT-DNA境界に隣接するT-DNA領域を有するプラスミドをさらに含む、請求項3に記載の植物を形質転換する方法。前記アグロバクテリウムAgrobacterium株がRecA機能を欠損している、請求項3に記載の植物を形質転換する方法。前記T-DNA領域が3つ以上の遺伝子配列を含有する、請求項4から6のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。前記T-DNA領域が25,000以上のヌクレオチド塩基対を含有する、請求項4から7のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。前記植物が形質転換されるときに前記T-DNA領域が植物細胞中の単一の位置に挿入される、請求項4から8のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。前記T-DNA領域が複数の遺伝子配列を含み、前記遺伝子配列が60以上の配列相同性を有する、請求項4から9のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。前記T-DNA領域が殺虫タンパク質、除草タンパク質、または殺虫タンパク質および除草剤耐性タンパク質の混合物の1つまたは複数をコードする、請求項4から10のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。前記T-DNA領域がCry1Ca殺虫タンパク質、Cry1F殺虫タンパク質およびCry1Ab1殺虫タンパク質をコードする、請求項4から11のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。前記T-DNA領域がCry1Ca殺虫タンパク質、Cry1F殺虫タンパク質、Cry1Ab1殺虫タンパク質およびAAD-1除草剤耐性タンパク質をコードする、請求項4から12のいずれかに記載の植物を形質転換する方法。前記植物が単子葉植物である、請求項1から13のいずれかに記載の方法。14.8KpnIVirBCDG断片がpDAB9291プラスミドのKpnI部位へクローニングされる、請求項1から14のいずれかに記載の方法。前記pTiヘルパープラスミドがプラスミドpMP90である、請求項1から15のいずれかに記載の方法。前記pTiヘルパープラスミドがプラスミドpTiC58Δである、請求項1から16のいずれかに記載の方法。プラスミドpDAB9292DNAを使用して前記アグロバクテリウムAgrobacterium株を形質転換するステップをさらに含む、請求項15に記載の方法。形質転換細胞または形質転換組織を、前記培養組織を形質転換に供した後に、選択するステップをさらに含む、請求項1から18のいずれかに記載の方法。pSB1の14.8KpnI断片を含む少なくとも1つのpTiヘルパープラスミドと、少なくとも1つの無害化T-DNA領域を有するpTiプラスミドとを有するアグロバクテリウムAgrobacterium株であって、前記プラスミドが互いに対して異なる複製開始点を有する、アグロバクテリウムAgrobacterium株。RecA機能の欠損を有する、請求項20に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。pSB1から単離された14.8KpnIVirBCDG断片と、少なくとも1つの無害化T-DNA領域を有するpTiプラスミドとを含む、形質転換促進特性を有するアグロバクテリウムAgrobacterium株。少なくとも1つのアグロバクテリウムAgrobacteriumT-DNA境界に隣接するT-DNA領域を有するプラスミドをさらに含む、請求項20から21のいずれかに記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。少なくとも1つのアグロバクテリウムAgrobacteriumT-DNA境界に隣接するT-DNA領域を有するプラスミドをさらに含む、請求項22に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。RecA機能を欠損している、請求項24に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。前記T-DNA領域が3つ以上の遺伝子配列を含有する、請求項23から25のいずれかに記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。前記T-DNA領域が25,000以上のヌクレオチドを含有する、請求項23から26のいずれかに記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。前記T-DNA領域が複数の遺伝子配列を含み、前記遺伝子配列が60を超える配列相同性を有する、請求項23から27のいずれかに記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。前記T-DNA領域が殺虫タンパク質、除草タンパク質、または殺虫タンパク質および除草剤耐性タンパク質の混合物の1つまたは複数をコードする、請求項23から28のいずれかに記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。前記T-DNA領域がCry1Ca殺虫タンパク質、Cry1F殺虫タンパク質およびCry1Ab1殺虫タンパク質をコードする、請求項23から29のいずれかに記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。前記T-DNA領域がCry1Ca殺虫タンパク質、Cry1F殺虫タンパク質、Cry1Ab1殺虫タンパク質およびAAD-1除草剤耐性タンパク質をコードする、請求項23から30のいずれかに記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。ポリヌクレオチド配列がnilAゲノム遺伝子座へ組み込まれている、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensのnilAゲノム遺伝子座。前記ポリヌクレオチド配列がvir遺伝子を含む、請求項32に記載のnilAゲノム遺伝子座。アグロバクテリウムAgrobacterium染色体上の中立組込み部位へ組み込まれているSB1の14.8KpnIVirBCDG断片を含むアグロバクテリウムAgrobacterium株。前記中立組込み部位がnilAゲノム遺伝子座である、請求項34に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。RecA機能を欠損している、請求項34から35のいずれかに記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensである、請求項34から36のいずれかに記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株。pTiヘルパープラスミド上のpSB1の14.8KpnIVirBCDG断片と、少なくとも1つの無害化T-DNA領域を有し、少なくとも1つのアグロバクテリウムAgrobacteriumT-DNA境界に隣接する外来性DNAを有するpTiプラスミドとを含むアグロバクテリウムAgrobacteriumLB4404株であって、前記プラスミドが互いに対して異なる複製開始点を有する、アグロバクテリウムAgrobacteriumLB4404株。請求項1から19のいずれかに記載の植物。形質転換によって植物に導入された任意の遺伝形質が植物の後代で安定に生じる、請求項39に記載の植物。前記T-DNA領域が植物DNAへ安定に組み込まれている、請求項4から13のいずれかに記載の植物。前記T-DNA領域によってコードされている任意の遺伝子が前記植物で発現される、請求項41に記載の植物。前記T-DNA領域によってコードされている任意の遺伝子が前記植物の後代で安定に生じる、請求項41から42のいずれかに記載の植物。Cry1Ca殺虫タンパク質、Cry1F殺虫タンパク質、Cry1Ab1殺虫タンパク質およびAAD1除草タンパク質を安定に発現する、請求項41に記載の植物。トウモロコシである、請求項44に記載の植物。アグロバクテリウムAgrobacterium染色体上の中立組込み部位へ組み込まれているpSB1から単離された14.8KpnIVirBCDG断片由来の少なくとも1つのvir遺伝子を含む、アグロバクテリウムAgrobacteriumLBA4404株。殺虫量のCry1Caタンパク質、Cry1F殺虫タンパク質、Cry1Ab1殺虫タンパク質、および除草剤耐性量のAAD-1タンパク質を発現する、稔性トランスジェニックトウモロコシ植物またはその後代であって、Cry1Ca、Cry1F、Cry1Ab1およびAAD1タンパク質が、前記植物のゲノム中に安定に組み込まれている組換えDNAの単一遺伝子座からまとめて発現される、稔性トランスジェニックトウモロコシ植物またはその後代。組換えDNAの前記単一遺伝子座がpTiDNAプラスミド由来のベクター骨格配列を実質的に含まない、請求項47に記載の稔性トランスジェニックトウモロコシ植物。本願は、植物形質転換率を高めるために改変したアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciens株について記述する。これらの株の使用により、植物発現可能な外来遺伝子を植物細胞へ導入するための新規な植物形質転換系を提供する。さらに、これらの株は、形質転換効率を高めるさらなる改良を提供するとともに、外来遺伝子で植物を形質転換する場合の操作上の欠点を解消するのに顕著な利点を提供する。アグロバクテリウムAgrobacterium染色体、Tiプラスミド、および植物形質転換バイナリーベクターから独立して複製可能なプラスミド上の形質転換促進遺伝子を保持するアグロバクテリウムAgrobacterium株、ならびにそれらを使用するための方法を本明細書に記載する。アグロバクテリウムAgrobacterium株は、植物形質転換バイナリーベクターの不安定性または再構成につながるDNA組換え機能を欠損しており、アグロバクテリウムAgrobacterium染色体、Tiプラスミドおよび植物形質転換バイナリーベクターから独立して複製可能なプラスミド上の形質転換促進遺伝子を保持する。また、アグロバクテリウムAgrobacterium細胞の通常の増殖および植物形質転換能力を妨げないか、または他の方法で損なわないアグロバクテリウムAgrobacterium染色体の遺伝子座へ組み込まれている形質転換促進遺伝子を保持するさらなるアグロバクテリウムAgrobacterium株およびそれらの使用も記載する。本明細書に記載の方法の一実施形態において、植物は、植物の細胞を、pSB1の14.8KpnI断片を含む少なくとも1つのpTiヘルパープラスミドと、少なくとも1つの無害化disarmedT-DNA領域を有するpTiプラスミドとを有するアグロバクテリウムAgrobacterium株と接触させることにより形質転換され、T-DNA領域は少なくともT-DNA右側境界および該境界に隣接する外来性DNAを含み、該プラスミドは互いに対して異なる複製開始点を有する。本明細書に記載の方法のさらなる実施形態において、植物は、植物の細胞を、pSB1の14.8KpnIVirBCDG断片と少なくとも1つの無害化T-DNA領域を有するpTiプラスミドとを有するアグロバクテリウムAgrobacterium属の細菌と接触させることにより形質転換され、14.8KpnIVirBCDG断片は該細菌の染色体の中立組込み部位へ組み込まれている。本明細書に記載の方法のさらなる実施形態において、アグロバクテリウムAgrobacterium株は、pSB1の14.8KpnI断片を含む少なくとも1つのpTiヘルパープラスミドと少なくとも1つの無害化T-DNA領域を有するpTiプラスミドとを含み、該プラスミドは互いに対して異なる複製開始点を有する。さらなる実施形態において、形質転換促進特性を有するアグロバクテリウムAgrobacterium株は、pSB1から単離された14.8KpnIVirBCDG断片と、少なくとも1つの無害化T-DNA領域を有するpTiプラスミドとを含む。別の実施形態において、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensのnilAゲノム遺伝子座は、nilAゲノム遺伝子座へ組み込まれているポリヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態において、SB1の14.8KpnIVirBCDG断片を含むアグロバクテリウムAgrobacterium株は、アグロバクテリウムAgrobacterium染色体上の中立組込み部位へ組み込まれている。別の実施形態において、アグロバクテリウムAgrobacteriumLB4404株は、pTiヘルパープラスミド上のpSB1の14.8KpnIVirBCDG断片と、少なくとも1つの無害化T-DNA領域を有し、少なくとも1つのアグロバクテリウムAgrobacteriumT-DNA境界に隣接する外来性DNAを有するpTiプラスミドとを含み、該プラスミドは互いに関連する異なる複製開始点を有する。さらなる実施形態において、アグロバクテリウムAgrobacteriumLBA4404株は、アグロバクテリウムAgrobacterium染色体上の中立組込み部位へ組み込まれているpSB1から単離された14.8KpnIVirBCDG断片由来の少なくとも1つのvir遺伝子を含む。さらなる実施形態において、本明細書に記載の形質転換方法によって作出される植物を提供する。さらに別の実施形態において、稔性トランスジェニックトウモロコシ植物またはその後代は、殺虫量のCry1Caタンパク質、Cry1F殺虫タンパク質、Cry1Ab1殺虫タンパク質、および除草剤耐性量のAAD-1タンパク質を発現し、Cry1Ca、Cry1F、Cry1Ab1およびAAD1タンパク質は該植物のゲノム中に安定に組み込まれている組換えDNAの単一遺伝子座からまとめて発現される。アグロバクテリウムAgrobacteriumの株は、植物細胞を形質転換するそれらの能力において互いに異なる。野生型の腫瘍形成性アグロバクテリウムAgrobacterium株は、多くの宿主植物、特に双子葉植物種において根頭癌腫病腫瘍性異常増殖を誘発するその能力で知られている。通常の成長をしている植物細胞の自己制御されない腫瘍細胞へのこの形質転換は、植物ホルモンをコードしている植物発現可能な遺伝子をコードする特異的DNA塩基配列T-DNAを腫瘍誘発Tiプラスミドから植物細胞へ移入するこの場合、これらの配列は植物染色体へ安定に組み込まれる結果として起こる。Bo542株すなわち、pTiBo542由来のTiプラスミドは、一部のアグロバクテリウムAgrobacterium染色体バックグラウンドに入れた場合、それが一部の植物においてとりわけ激しく増殖する大きな腫瘍の誘導を促進するという点で注目されるHoodら、1986JBacteriol16812911301。この超病原性表現型に関与する遺伝子は、T-DNA領域の外側のpTiBo542上に存在する。さらなる研究において、pTiBo542由来の15.8キロ塩基対kbpKpnI断片を含有しており、完全なvirG、virBおよびvirCオペロンを含有したプラスミドが、そのプラスミドを欠損している株と比較された場合、A281株により腫瘍形成増強を促進したことが明らかになったJinら、1987JBacteriol16944174425。pTiBo542のvirG遺伝子は、アグロバクテリウムAgrobacteriumのA281株の超病原性表現型に関与していると考えられる。pTiBo542由来のvirGは、プロモーター領域内の2つの遺伝子、コード配列、および3’非翻訳領域の間の相違により、pTiA6由来のvirGと比べると、virB発現において1.7倍の増加を引き起こすChenら、1991MolecGenGenet230302309。したがって、pTiBo542由来のvirG遺伝子は、特に、pTiBo542のvirBオペロンおよびvirCオペロンも保持するpTiBo542プラスミドの大型KpnI断片上に存在する場合、T-DNAの高移入効率、したがって、植物の高形質転換率をより促進するために有利に使用することが可能である。pTiBo542の注釈付き全塩基配列は、2005年5月12日にアクセッション番号DQ058764としてGENBANKに提出した。KpnI制限断片マップおよび遺伝子注釈の試験によると、全virBオペロン遺伝子virB1、virB2、virB3、virB4、virB5、virB6、virB7、virB8、virB9、virB10およびvirB11を含む、virG遺伝子、virCオペロン遺伝子virC1およびvirC2を含むおよび遺伝子virD1を含んでいるvirDオペロンの部分が、14,815塩基対bpを含んでいるKpnI断片上で単離することができることが明らかである。恐らく、Jinら前掲で言及されている15.8kbpKpnI断片のサイズは、断片のアガロースゲル移動度から推定されたものであり、言及されている断片の実際のサイズは、実は14.8kbpである。分子生物学分野の当業者は、アガロースゲル電気泳動移動度によるこのような大きなDNA断片のサイズ評価は、1kbp以上によるDNA塩基配列分析によって決定される真の断片サイズとは異なる可能性があることは理解するであろう。記載を容易にするため、pTiBo542由来のこの断片は、本明細書では、14.8KpnIVirBCDG断片と呼ぶ。本明細書に記載の方法の実施形態は、少なくとも1つの無害化pTiヘルパープラスミドを保持するアグロバクテリウムAgrobacterium株中のpSB1から単離された14.8KpnIVirBCDG断片上にコードされている形質転換促進特性の使用を含み、ここで、14.8KpnIVirBCDG断片は、植物を形質転換するIncP以外の不和合性グループの複製起点を有するプラスミド上にある。さらなる実施形態は、本方法で使用するための記載したアグロバクテリウムAgrobacterium株を含む。このアグロバクテリウムAgrobacterium株を使用して植物に導入するT-DNA領域は、少なくとも1つのアグロバクテリウムAgrobacteriumT-DNA境界に隣接するT-DNA領域を有するプラスミド上にあることが可能であって、該プラスミドは、IncP不和合性グループ、または、IncP以外の不和合性グループの複製起点を有するプラスミド上にある14.8KpnIVirBCDG断片の不和合性グループと適合する不和合性グループの複製起点を有している。このプラスミドのT-DNA領域は、アグロバクテリウムAgrobacteriumT-DNA右側境界および左側境界に隣接可能である。プラスミドは、プラスミドに含有されている配列に基づき、不和合性グループ遺伝子型表示:inc;グループ表示:Incに割り当てられる。inc決定基は、典型的には、同一宿主内の共存から同一または関連の不和合性グループの別のプラスミドを防ぐように機能し、細胞内のプラスミドの一定コピー数を維持するようにする。例えば、FernandezLopezら、FEMSMicrobiolRev3094266;ならびにAdamczykおよびJaguraBurdzyActaBiochimPol5042553を参照されたい。2つのプラスミドは、一方が、単独であった場合よりも他方の存在下において不安定であれば、不和合性である。同一不和合性グループの2つのプラスミドが同一細胞で確認される場合、細胞源に対する競合が生じる可能性がある。プラスミドがより速く自己複製され得るか、プラスミドが別のいくつかの利点を提供するかのどちらであっても、不和合系が許すコピーに不均衡な度合いが現れる。驚いたことに、プラスミドは、これらが両方とも娘細胞へそれら自体を分配するために同一機能を保持する場合にも、不和合性であってもよい。プラスミドは、典型的には、既存の数多くの不和合性グループのうちのほんの1つに該当するにすぎない。知られている不和合性グループは30以上存在する。不和合性グループIncPに属するプラスミドが詳細に検討され、このIncPグループに由来する数多くのプラスミドが構築されたSchmidhauserら、Biotechnology10287332。IncP不和合性グループを持つプラスミドの例示としては次のものが挙げられる:pMP90RK、pRK2013、pRK290、pRK404およびpRK415。これらのプラスミドは、大腸菌EcoliおよびアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensをはじめとする多数の細菌種において維持され得る。別の不和合性グループの例としては、限定するものではないが、例えば、実質的な配列または機能的関係を示す、IncN、IncW、IncL/M、IncT、IncU、IncW、IncY、IncB/O、IncFII、IncII、IncK、IncCom9、IncFI、IncFII、IncFIII、IncHIl、IncHI2、IncX、IncA/C、IncD、IncFIV、IncFV/FO、IncFVI、IncHl3、IncHII、Inc12、IncI、IncJ、IncV、IncQこれらの変異体を含むなどが挙げられる。表1に一般に知られている様々な不和合性グループを挙げ、これらの不和合性グループを示すプラスミドの例を提供するこの不和合性グループおよびプラスミドの一覧は例示としてのみ提供するものであり、本明細書に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株および方法で有用な不和合性グループおよびプラスミドを限定するものではない。本明細書に記載の方法の別の実施形態は、RecA機能の欠損を有し、少なくとも1つの無害化pTiヘルパープラスミドを保持するアグロバクテリウムAgrobacterium株のpSB1から単離された14.8KpnIVirBCDG断片にコードされている形質転換促進特性の使用であって、14.8KpnIVirBCDG断片がIncP以外の不和合性グループの複製起点を有するプラスミドにある、前記使用を含む。さらなる実施形態は、この方法で使用するための記載したアグロバクテリウムAgrobacterium株を含む。このアグロバクテリウムAgrobacterium株を使用して植物に導入されるT-DNA領域は、少なくとも1つのアグロバクテリウムAgrobacteriumT-DNA境界に隣接するT-DNA領域を有するプラスミド上にあることが可能であって、該プラスミドは、IncP不和合性グループ、または、IncP以外の不和合性グループの複製起点を有するプラスミド上にある14.8KpnIVirBCDG断片の不和合性グループと適合する不和合性グループの複製起点を有している。本明細書に記載の方法のさらに別の実施形態は、pSB1から単離され、少なくとも1つの無害化pTiヘルパープラスミドを保持する、14.8KpnIVirBCDG断片にコードされている形質転換促進特性の使用であって、14.8KpnIVirBCDG断片がC58株とは異なるアグロバクテリウムAgrobacterium株の染色体に配置されている中立組込み部位へ込み込まれる、前記使用を含む。さらなる実施形態は、この方法で使用するための記載したアグロバクテリウムAgrobacterium株を含む。このアグロバクテリウムAgrobacterium株を使用して植物に導入されるT-DNA領域は、少なくとも1つのアグロバクテリウムAgrobacteriumT-DNA境界に隣接するT-DNA領域を有するプラスミドをさらに含む。スーパーバイナリー系は知られており、例えば、国際公開第94/00977A1、国際公開第95/06722A1、および国際公開第95/16031A1を参照されたい。またKomariら前掲およびKomoriら前掲により開示されているが、これらの系には多数の欠点がある。スーパーバイナリー系の操作上の欠点これは、本明細書に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株および方法によって解消されるは、pSB11誘導体にある改変T-DNAがアグロバクテリウムAgrobacterium中で安定に維持される手段として、pSB1とpSB11およびその誘導体の間の同時組込み体プラスミドの形成が要求されることである。この同時組込み事象は、pSB1とpSB11の相同領域間の組換えにより、1対の大型約2.3kbpの直接反復配列を生成する。分子生物学の分野の当業者にはよく知られているように、特に反復がプラスミド構造の部位である場合、これらのような大型の反復配列は、DNA欠失および別の再構成を最終的にはもたらす分子内組換えの好ましい標的である。アグロバクテリウムAgrobacteriumスーパーバイナリー系において、そのような再構成は、pSB11誘導体により導入されたT-DNA領域の部分的な再構成または完全欠損をもたらす可能性があり、最終的に、完全な所望の外来遺伝子の宿主植物細胞への移入がほとんど行われないか、全く無くなる。上記のスーパーバイナリー系に対するさらなる欠点はまたこれも、本明細書に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株および方法によって解消されるが、pSB1誘導体とpSB11誘導体の間の同時組込み体プラスミドの形成が、2つの異なるColE1タイプ不和合性グループpMB1/ColE1複製開始点ori、ならびにRK2プラスミド不和合性グループIncP由来の第3oriを有する、大型のプラスミド最小43kbpより大きいを生成することである。通常の環境では、ColE1oriはアグロバクテリウムAgrobacteriumにおいて機能しないが、アグロバクテリウムAgrobacterium中にColE1oriを有するプラスミドを安定に維持させるゲノムの変異が知られているRuslyakovaら、RussianJGenet35327331。そのような変異を有する細胞において、3つの機能複製開始点を有するpSB1::pSB11誘導体同時組込み体のようなプラスミドは、高度に不安定であることが予想される。したがって、スーパーバイナリー系は不完全であるが、これは、本明細書に記載の植物を形質転換するためのアグロバクテリウムAgrobacterium株および方法のエレメントによって有利に対処される。外来遺伝子またはアグロバクテリウムAgrobacterium介在の形質転換によるトランスジェニック植物細胞における導入および発現の対象とされている遺伝子のDNA構造は、大腸菌EscherichiacoliおよびアグロバクテリウムAgrobacteriumの細胞でそれらの遺伝子を保持するバイナリーベクタープラスミドまたはシャトルベクタープラスミドの安定性に重大な影響を及ぼし得る。遺伝子構築物内に複数回用いられる遺伝子成分を外来遺伝子が含む場合、不安定性は特に顕著である。例えば、トランスジェニック植物中の異なるタンパク質コード領域の発現を作動させるために、特定の植物発現可能なプロモーターを用いることができることは珍しいことではない。別の遺伝子成分例えば3’非翻訳領域3’UTRすなわち、転写終止および配列決定に加えてポリアデニル化ならびに非常に高度に類似するタンパク質コード領域は、単一のT-DNA領域内のマルティプルコピーで複製されるか存在し得る。上述のように、逆方向反復配向または直接反復配向のいずれか存在し得る、これらの反復配列エレメントは、特に反復がプラスミド構造の部位である場合、DNA欠失および別の再構成をもたらし得る、分子内組換えの標的である。大腸菌Ecoliの多数の特定菌株が、そのような不安定性の問題の解消を手助けする分子クローニング宿主として機能するように開発されている例えば、INVITROGEN;Carlsbad、CAにより提供されているSTBL2商標株、STBL3商標株、およびSTBL4商標株。大腸菌Ecoliクローニング株のようなすべてに共通な特徴は、recA遺伝子中のゲノム変異の存在である。RecAタンパク質は、相同組換え、DNA修復および細菌性SOS反応の誘導で役割を果たす多機能酵素である。相同組換え方法において、このタンパク質は、DNA依存性ATPアーゼ、シナプシス促進、ヘテロデュプレックス形成および相同DNA間の鎖交換として機能する。したがって、RecA機能の欠損のある細胞は、再構成または欠失なく、相同DNA配列に対する耐性をより強く持つ傾向がある。反復配列を含有する大型DNA断片をクローニングする際に認められる不安定性の問題に対処するため、アグロバクテリウムAgrobacteriumのRecA欠損株が開発されているKlapwicjら、1979MolecGenGenet173171175;Farrandら、1989JBacteriol17153145321;Lazoら、1991BioTechnology9963967。これらの株は、場合によっては高分子量の形質転換構築物の安定化を促進するのに有用であることが分かったFraryおよびHamilton2001TransgenicRes10121132が、すべての場合ではないSongら、2003TheorApplGenet107958964。したがって、プラスミド維持および植物形質転換能力において非常に効率的である、開発株でrecAを欠損するアグロバクテリウムAgrobacterium染色体のバックグラウンドを有利に使用することができる。本明細書に記載の方法で使用するための開発株でrecAを欠損するアグロバクテリウムAgrobacterium染色体のバックグラウンドを使用する他に、recA機能は、本明細書に記載の方法でその株を有用にするために、既存株または生産株で非活性化することができる。例えば、Farrandら前掲を参照。例えば、RecA機能および所望する任意の染色体追加例えば、vir遺伝子の追加を持つ株を開発することが可能であり、その後、RecA機能を機能しないようにすることができる。植物および非植物の宿主細胞への大型DNA断片の効率的な形質転換を可能にすることを意図したBIBACベクターを利用することができる。例えば、米国特許第5,733,744号、米国特許第5,977,439号、および米国特許出願第2002/0123100A1号を参照されたい。BIBACベクターを用いて利用することが可能なアグロバクテリウムAgrobacterium株の1つは、Farrandら前掲によって開発されたRecA欠損株UIA143である。BIBAC系の改良には、別のvir遺伝子と組み合わせて14.8KpnIVirBCDG断片上に保有する遺伝子のサブセットを使用し、操作されるアグロバクテリウムAgrobacterium株の植物形質転換能力を増強した。特に、14.8KpnIVirBCDG断片由来のvirG遺伝子は、単独で用いるか、UIA143のRecA欠損株のpTiA6に由来するvirE1遺伝子およびvirE2遺伝子と組み合わせて用いられた。例えば、Hamiltonら、1996ProcNatlAcadSci9399759979Hamilton1997Gene200107116FraryおよびHamilton前掲を参照されたい。さらに、本明細書に記載の方法を用いて植物細胞を形質転換するために用いられる適切なベクターは、形質転換された植物細胞に抗生物質または除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている選択可能なマーカー遺伝子を含有することができる。したがって、個別に用いられる選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換細胞の選択を可能にし、一方、挿入DNAを含有していない細胞の増殖は選択的化合物により抑制することができる。使用される特定の選択可能なマーカー遺伝子は実験計画法または優先度に依存し得るが、以下のいずれかの選択可能なマーカー、ならびに、選択可能なマーカーとして機能し得る本明細書に記載されていない別の遺伝子を用いることができる。選択可能なマーカーの例としては、限定するものではないが、抗生物質例えば、カナマイシン、G418、ハイグロマイシン、ブレオマイシンおよびメトトレキサートなどに対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子、あるいは除草剤例えば、ホスフィノトリシンビアラホス、グリホサート、イミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジン、クロルスルフロン、ブロモキシニルおよびDALAPONなどに対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子が挙げられる。選択可能なマーカーの他に、レポーター遺伝子も使用することができる。場合によっては、選択可能なマーカーなしでレポーター遺伝子を使用することができる。レポーター遺伝子は、一般に、移植体の生物または組織に対して増殖効果は提供しない遺伝子である。レポーター遺伝子は、典型的には、表現型変更または酵素特性を提供するタンパク質をコードしている。適切なレポーター遺伝子としては、限定するものではないが、グルクロニダーゼGUS、ホタルルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質例えば、緑色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質をコードするものが挙げられる。植物を形質転換するための数多くの技術の他に、外来遺伝子と接触させる組織のタイプをさらに変更することができる。そのような組織としては、限定するものではないが、胚形成組織、カルス組織I型およびII型、胚軸および分裂組織を挙げることができる。植物組織はほとんどすべて、脱分化中に、当業者において適切とされる技術を使用して形質転換することができる。植物形質転換の分野の当業者には、多様な方法が形質転換植物の生産に利用可能であること、また、これらを改変し、特定化して各種の宿主植物種間の生物学的な相違を調整することが可能であることは理解されよう。用いられる特定の形質転換技術にかかわらず、外来遺伝子は、ベクターに植物プロモーターを含むことにより植物細胞中の外来遺伝子を発現するように適合された遺伝子導入ベクターへ組み込むことができる。植物プロモーターの他に、様々な起源由来のプロモーターを植物細胞中で有効に用いて、外来遺伝子を発現させることができる。例えば、細菌起源のプロモーター、例えば、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、マンノピン合成酵素プロモーター;ウイルス起源のプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウィルスCaMVの35Sおよび19Sのプロモーター、サトウキビ桿状ウイルス由来のプロモーターなどを使用することができる。植物由来のプロモーターとしては、限定するものではないが、リブロース-1,6-二リン酸RUBPカルボキシラーゼスモールサブユニットssuプロモーター、ベータコングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ADHアルコール脱水素酵素プロモーター、ヒートショックプロモーター、ADFアクチン脱重合因子プロモーター、および組織特異的プロモーターなどが挙げられる。またプロモーターは、転写効率を改善することができる特定のエンハンサー配列エレメントを含有していてもよい。典型的なエンハンサーとしては、限定するものではないが、アルコール脱水素酵素1ADH1イントロン1およびADH1-イントロン6が挙げられる。構成的プロモーターを使用してもよい。構成的プロモーターは、ほぼすべての細胞のタイプにおいて、またほぼすべての回で連続的遺伝子発現を導く例えば、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、CaMV35Sプロモーター。組織特異的プロモーターは、特定の細胞または組織のタイプ例えば、葉または種子における遺伝子発現に関与する。使用可能な別のプロモーターの例としては、植物の発育の特定段階中に活性であるもの、ならびに、特定の植物組織および器官において活性であるものが挙げられる。このようなプロモーターの例としては、限定するものではないが、根特異的、花粉特異的、胚特異的、トウモロコシ毛特異的、ワタ繊維特異的、種子内乳特異的、および師部特異的なプロモーターが挙げられる。特定の環境の下では、誘導性プロモーターの使用が望ましい可能性がある。誘導性プロモーターは、特異的シグナル、例えば物理的刺激例えばヒートショック遺伝子プロモーター;光線例えば、リブロース-ビス-ホスフェート1,5カルボキシラーゼプロモーター;ホルモン例えば、グルココルチコイド;抗生物質例えば、テトラサイクリン;代謝物質;およびストレス例えば干ばつに応じて遺伝子の発現に関与する。植物で機能する別の望ましい転写エレメントおよび翻訳エレメントも使用することが可能であり、例えば、5’非翻訳リーダー配列、RNA転写終止配列およびポリアデニレート添加シグナル配列などがある。当技術分野で知られている任意の適切な植物特異的遺伝子導入ベクターも使用することができる。耐虫性IR形質を含有するトランスジェニック作物は、北アメリカの至る所におけるトウモロコシおよびワタ植物において普及しており、これらの形質の使用は世界的に広がっている。IRおよび除草剤耐性HT形質を組み合わせている市販のトランスジェニック作物は、多くの種子会社によって開発されている。このような例としては、BtバチルススリンギエンシスBacillusthuringiensisの殺虫タンパク質により付与されているIR形質と、HT形質、例えば、アセト乳酸シンターゼALS阻害剤、例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、スルホンアニリドなどに対する耐性、グルタミン合成酵素GS阻害剤、例えば、ビアラホス、グルホシネートなどに対する耐性、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼHPPD阻害剤、例えば、メソトリオン、イソキサフルトールなどに対する耐性、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素EPSPS阻害剤、例えば、グリホサートなどに対する耐性、およびアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼACCase阻害剤、例えば、ハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップなどに対する耐性との組み合わせが挙げられる。遺伝子導入により提供されるタンパク質が、フェノキシ酸除草剤、およびピリジルオキシアセテートオーキシン除草剤国際公開第2007/053482A2を参照、またはフェノキシ酸除草剤およびアリールオキシフェノキシプロピオネート除草剤国際公開第2005107437A2、A3を参照などの除草剤化学分類に対する植物耐性を提供する別の例が知られている。IR形質により多数の有害生物問題を防除する能力は価値のある商品コンセプトであり、昆虫防除形質および雑草防除形質が同一植物中で組み合わされる場合、この製品コンセプトの便利さはさらに良くなる。さらに、上記のような1種または複数のさらなるHT形質、プラス1種または複数のさらなるインプット形質例えば、Bt由来または別の殺虫タンパク質によって付与される別の耐虫性、RNAiなどの機序により付与される耐虫性、耐病性、耐ストレス性、窒素利用の改善などまたはアウトプット形質例えば、油成分高含有量、健康的な油組成物、栄養上の改善などを含むBt殺虫タンパク質により付与されるIR形質の単一植物の組み合わせによって、価値が改善される。こうした組み合わせは、従来の品種改良例えば、品種改良スタックによって得ることができるか、複数遺伝子の同時導入に関する新規な形質転換の事象として例えば、分子スタック一緒に得ることができる。利点としては、作物中の害虫を管理する能力および雑草防除の改善が挙げられ、これは生産者およびまたは消費者に第2の利点を提供する。したがって、本明細書に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株および方法を用いて、様々な農業問題を柔軟かつコスト効率よくコントロールする能力を持つ改善された作物品質の完全なる農業用パッケージを含む、形質が組み合わされた形質転換植物を提供することができる。各種のpTiプラスミドのvirG遺伝子に関し、植物形質転換率を増強するその能力を解明するために研究されてきた。Liuら1992PlantMolecBiol2010711087は、多数の起源すなわち、異なるpTiプラスミド由来であるが、pTiBo542を含むもの由来のvirG遺伝子の余分なコピーが一部の植物の一過性形質転換を増強し、その効果の規模は、特定のvirG遺伝子がペアになっていたヘルパーpTiプラスミドの同一性に依存したことを発見した。virGN54Dこの変異はアミノ酸Asn54がAspで置き換えられていると命名されたvirG遺伝子の突然変異体pTiA6由来と推定は、アグロバクテリウムAgrobacterium中で構成的に発現される野生型virG遺伝子の誘導には、酸性pH、高モノサッカリド濃度、およびアセトシリンゴンなどのフェノール酸インデューサーの存在が必要である。Pazourら、JBacteriol17441694174を参照されたい。pTiA6のVirGN54Dはトウモロコシ形質転換の増強に有効であったが、親野生型virGのマルティプルコピーは効果がなかった。Hansenら、JBacteriol17441694174を参照されたい。pTi15955由来の構成的突然変異体virGN54D遺伝子のコピーが、無害化pTiヘルパープラスミドpAL4404および植物形質転換用の遺伝子を保持するバイナリーベクターを含んだアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensLBA4404株中のpBBR1-誘導プラスミド上に同時存在した、三成分すなわち3-プラスミド系が記載されている。vanderFitsら、PlantMolecBiol43495502を参照されたい。この構成的に発現されるvirGN54D遺伝子は、いくつかの植物種の一過性の形質転換効率と安定な形質転換効率の両方を大幅に高めること分かった。pBRR1複製制御域を含有するプラスミドは、任意の知られている不和合性グループに属するので分類することができない。したがって、それらのプラスミドは、単一宿主で広範囲の別のプラスミドと共存し得る。さらに、タバコ、ワタおよびイネにおいて植物形質転換効率に影響する、次のvir遺伝子の各種組み合わせの能力が詳しく試験された:pTiA6由来の突然変異体virGN54D遺伝子、pTiBo542由来のvirG遺伝子、pTiA6由来のVirE1/E2遺伝子、および後者2種の遺伝子セットの組み合わせ。Parkら、TheorApplGenet10110151020を参照されたい。形質転換効率の増加が一部の植物種およびvir遺伝子の追加コピーで認められた。欧州特許出願第2042602A1および米国特許出願第2010/0132068A1号には、pTiヘルパープラスミドを保持するアグロバクテリウムAgrobacterium細胞中に存在する場合、ターナリープラスミド系のさらなる例示を構成する、コスミドバイナリーベクターおよびブースタープラスミドが記載されている。それらの中に記載されているブースタープラスミドは、IncW不和合性グループの複製起点を有し、またvirGN54D遺伝子を有するプラスミドpVGWおよびプラスミドpVGW2これはクローニングおよび選択を促進するように改変されているpVGWの誘導体であるを含む。アグロバクテリウムAgrobacterium中の染色体遺伝子によってコードされている機能は、2種類の遺伝学的手法によって典型的に測定された。第1の方法、またはフォワード遺伝学的方法は、研究対象の遺伝子の分子クローンを取得し、次いで、遺伝環境中にそのクローン遺伝子を配置することが必要とされ、そこで、機能の獲得表現型を評価することができる。第2の方法、またはリバース遺伝学的方法では、染色体の遺伝子の中または周囲の配列の挿入または欠失により遺伝子の構造を破壊し、次いで、タンパク質または表現型が遺伝子機能の消失により除かれたことを測定することが必要である。これは、前述のC58株のRecA欠損変異株を構築するために用いられる手法である。Farrandら前掲を参照されたい。アグロバクテリウムAgrobacterium細胞の遺伝子操作分野の当業者には、様々なベクターや多数の方法がそのような遺伝子破壊実験を可能にすることが記載されていることは理解されよう。この方法は、変異株の活力度、増殖および植物形質転換能力に関与しない遺伝子の同定に使用する場合に特に有用であることが分かった。アグロバクテリウムAgrobacteriumC58株のそのような遺伝子座の1つは、pgl/picA遺伝子座である。Leeら、PlantMicrobeInteract14577579およびLeeInMethodsinMolecularBiologyNo343AgrobacteriumProtocolsHUMANAPRESSIncTotowaNJpp5566を参照されたい。virD2遺伝子が相同組換えによってこの染色体座へ組み込まれた細胞は、自己複製するプラスミドに配置されたvirD2遺伝子を保持するアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciens株から得た結果と同一の植物形質転換表現型を有することが分かった。Leeら前掲を参照されたい。さらに、C58のpgl/picA遺伝子座に組み込まれたT-DNA領域は、植物細胞に機能的に送達され得るOltmannsら、2010PlantPhysiol15211581166。したがって、C58株において、pgl/picA遺伝子座は、C58染色体へ遺伝子を導入するための中立組込み部位として役立ち得る。本明細書では、中立組込み部位とは、植物形質転換に必要なすべての機能を果たすために細胞の成長または細胞の能力にとって正常機能が必要でない、アグロバクテリウムAgrobacterium細胞の染色体にもともと存在する遺伝子または染色体座を意味する。その遺伝子内に通常存在しないDNA塩基配列の組込みによって破壊される場合、破壊した中立組込み部位遺伝子を保持する細胞は、植物形質転換を生産的に達成することができる。例として、Hoekemaら1984EMBOJ324852490は、Tn3転位によりC58染色体中の特性化されていない遺伝子座へ組み込まれた機能T領域が生産的に植物細胞に移入されたことを証明した。本明細書で論じたアグロバクテリウムAgrobacterium株は、1種または複数の遺伝子を植物に導入するために、例えば、個別のまたは多数の殺虫特性または除草特性を植物に提供するために有利に使用することができる。例えば、本アグロバクテリウムAgrobacterium株は、1つまたは複数、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上または6つ以上の遺伝子を植物に導入するために使用することができる。本明細書に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株を使用する際、選択可能な遺伝子配列を含有するポリヌクレオチドは、植物細胞が形質転換されるときに植物細胞中の単一の位置に挿入される。遺伝子の挿入に用いられるT-DNA領域のサイズに関して、T-DNA領域は、15,000ヌクレオチド塩基対以上、20,000ヌクレオチド塩基対以上、25,000ヌクレオチド塩基対以上、26,000ヌクレオチド塩基対以上、27,000ヌクレオチド塩基対以上、28,000ヌクレオチド塩基対以上、29,000ヌクレオチド塩基対以上、または30,000ヌクレオチド塩基対以上であってよい。本明細書に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株を使用する場合、選択可能な遺伝子配列は、60以上、65以上、67以上、69.5以上、70以上、75以上、または80以上の配列相同性を有していてよく、また、それらの転写可能な配列同一性を保持していてもよい。導入可能な遺伝子のタイプは、殺虫タンパク質、除草タンパク質、または殺虫タンパク質および除草タンパク質の混合物をコードし得る。導入可能な遺伝子の具体例としては、Cry1Ca殺虫タンパク質、Cry1F殺虫タンパク質、Cry1Ab1殺虫タンパク質、およびAAD1除草タンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、これらは様々な組み合わせで、または4種すべてを含む一セットとして導入することができる。単子葉の種単子葉植物および双子葉の種双子葉植物は、これらのアグロバクテリウムAgrobacterium株を使用して形質転換することができる。また、ポリヌクレオチド配列が組み込まれ得る、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensのnilAゲノム遺伝子座も本明細書で開示する。このような組込みポリヌクレオチド配列は、任意のvir遺伝子またはvirオペロンまたは別の有用遺伝子を含み得る。実施例17~20には、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensのnilAゲノム遺伝子座の同定、特性決定および使用、ならびに、染色体に配置されている多数のvir遺伝子を含むアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciens株の生産を示す。nilAゲノム遺伝子座、または85~100のヌクレオチド配列同一性を共有する任意の遺伝子座は、本明細書に記載の同定技術および特性決定技術を使用して、別のアグロバクテリウムAgrobacterium株で同定することができる。また、vir遺伝子または別の適切な遺伝子例えば、植物形質転換効率を高めることができる遺伝子を組み込むために、任意のそのような同定nilA座を本明細書で記載した方法と同様の方法で使用することができる。本明細書に記載のそのようなゲノム遺伝子座の同定および特性決定の技術は、アグロバクテリウムAgrobacterium株が植物を形質転換する可能性を維持するように、virまたは別の遺伝子を含有するポリヌクレオチド配列が組み込まれ得る、アグロバクテリウムAgrobacterium染色体上の別の中立組込み部位を同定するために使用することもできる。中立組込み部位として使用可能な一部の染色体部位は既に知られており、例えば、RecA欠損株のRecA部位、およびアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensC58株のpgl/picA遺伝子座である。しかし、pgl/picA遺伝子座は別の一部の株例えば、LBA4404株で検出されないので、C58に加えて、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciens株中の新しい中立部位を同定する必要があるOltmannsら、前掲。中立組込み部位として使用可能なさらなる染色体部位は、米国特許第6,323,396号に記載されている。したがって、アグロバクテリウムAgrobacterium染色体上の中立組込み部位へ組み込まれたvir遺伝子を含むアグロバクテリウムAgrobacterium株も開示する。そのようなアグロバクテリウムAgrobacterium株は、nilAゲノム遺伝子座または別の中立組込み部位をvir遺伝子の組込みに使用することができる。T-ヘルパープラスミドの使用が不要とされるこの方法では、多数のタイプの有用遺伝子を染色体に加えることができる。例えば、異なる菌株由来のさらなるvir遺伝子および有用なvir遺伝子のマルティプルコピーを使用することができる。また、本明細書では、IncP以外の不和合性グループの複製起点を有するヘルパープラスミドおよび少なくとも1つのアグロバクテリウムAgrobacteriumT-DNA境界に隣接するT-DNA領域を有するプラスミド前記プラスミドはIncP不和合性グループの複製起点を有する上のvir遺伝子を含有するアグロバクテリウムAgrobacterium株も開示する。さらに、本明細書に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株を使用して、本明細書に記載の方法によって作出される植物も開示する。そのような植物は、本明細書に記載の方法を使用して導入される任意のT-DNA領域を安定に組み込む。さらに、そのような植物は、任意の遺伝子を発現させ、それらのT-DNA領域により付与された任意の遺伝形質を示す。さらに、本明細書に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株を使用して、本明細書に記載の方法によって作出される植物の任意の後代は、任意の遺伝子を安定に生じ、親で確認されるそれらのT-DNA領域によって付与された任意の遺伝形質を示す。特定の実施形態において、Cry1Ca殺虫タンパク質、Cry1F殺虫タンパク質、Cry1Ab1殺虫タンパク質およびAAD1除草タンパク質を安定に発現する植物を記載する。この植物は、例えば、トウモロコシであってよい。本明細書では特定例のアグロバクテリウムAgrobacterium株が記載されているが、同一の基準を用いて、論じた機能を別のアグロバクテリウムAgrobacterium株、例えば、RecAに欠損のある別の菌株またはRecAに欠損を作製することが可能な別の菌株に展開することができる。本明細書に記載の菌株および方法を用いて使用することが可能な別の菌株の例としては、限定するものではないが、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensC58株、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensChry5株、アグロバクテリウムリゾゲネスAgrobacteriumrhizogenes株、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensEHA101株、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensEHA105株、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensMOG101株、およびアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensT37株が挙げられる。本明細書で言及した、または本明細書で引用したすべての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらが本明細書の明白な教示と矛盾しない程度まで参照によりそれら全体を組み込むものとする。下記は、本明細書に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株を利用し、本明細書に記載の方法を実施するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は、限定するものとして解釈されるべきでない。特に断りのない限り、パーセンテージはすべて重量パーセントであり、溶媒混合比率はすべて容量比である。温度はすべて摂氏度である。特に指示または示唆のない限り、本明細書では、1つの1種のa、1つの1種のanおよびその本、または該theという用語は、少なくとも1つを示す。[実施例]プラスミドpUCD2の欠失変異体の構築プラスミドpUCD2の構築はCloseら、1984Plasmid12111118によって記載されており、13,239bpの完全DNA配列は、初めて本明細書に配列番号1として開示している。pUCD2は、抗生物質に対する細菌耐性、詳しくは、スペクチノマイシン、カナマイシン、テトラサイクリンおよびアンピシリンに対する耐性図1を付与する4つの遺伝子を保持する。例えば、Sambrookら、1989MolecularCloningALaboratoryManualおよびAusubelら、1995CurrentProtocolsinMolecularBiologyGREENEPUBLISHINGANDWILEYINTERSCIENCENewYorkおよびそれらの最新版に教示されている標準の分子生物学方法を、本開示のこの実施例および別の実施例に記載されているこのステップおよび別のステップで用いた。pUCD2への第1の改変は、制限酵素SacIおよびSacIIでpUCD2DNAを切断し、SacIまたはSacII生成オーバーハングと適合する適切なオーバーハングの付着末端を有する通常二本鎖のオリゴヌクレオチド断片にライゲーションすることにより作製される。この二本鎖オリゴヌクレオチド図1は、配列番号2および配列番号3として開示されている、2つの相補的オリゴヌクレオチド配列をアニールすることにより生成された。配列番号2および配列番号3のオリゴヌクレオチドの配列は、SacIおよびSacIIで切断されたpUCD2DNAとのライゲーションの際に機能カナマイシン耐性遺伝子を回復するように設計されている。この操作によりプラスミドpDAB9290が作製されたが図1、これは、スペクチノマイシン耐性に関するコード領域の欠失、カナマイシン耐性に関するコード領域内部から得られるKpnI制限酵素認識部位の除去、およびカナマイシン耐性コード領域の下流の新規KpnI部位の作製によりpUCD2とは異なる。プラスミドpDAB9290のDNAは、テトラサイクリン耐性およびアンピシリン耐性をコードしている遺伝子を無効にするために、第1に制限酵素PstIおよびSalIで切断し、これらの酵素によって得られたオーバーハンギング末端をQUICKBLUNTING商標kitNEWENGLANDBIOLABS;Ipswich、MAで処理して平滑末端を作製し、これによって得られた断片を円形状にするために自己ライゲーションを行うことによって、さらに操作した。得られたプラスミドpDAB9291はカナマイシン細菌性抗生物質耐性遺伝子のみを保持し、カナマイシン耐性遺伝子の下流でKpnIにより切断するための特有の部位を有する。pDAB9291の配列は、配列番号4として開示している。プラスミドpDAB9291には2つの複製開始点があり、1つはプラスミドpBR322由来のものcolE1不和合性グループで、2つにはプラスミドpSa由来のもの不和合性グループWである。したがって、プラスミドpDAB9291は、大腸菌EcoliおよびアグロバクテリウムAgrobacteriumにおいて平均コピー数を維持することができる。14.8KpnIvirBCDG断片のpDAB9291へのクローニング超病原性pTiBo542由来のvirG、virBおよびvirCオペロンならびにvirD1を含有する14.8kbpKpnI断片図1は、プラスミドpSB1Komariら、前掲;およびKomoriら、前掲から単離され、pDAB9291の特有のKpnI部位へクローニングした。挿入断片の2つの可能な配向をそれぞれ含有するプラスミドが得られ、pDAB9292およびpDAB9293と命名された。1つのプラスミド、pDAB9292図1を以降の試験に選択した。pDAB9292のDNA配列を配列番号5として開示している。ヘルパープラスミドpTiEHA105を保持するRecA-欠損アグロバクテリウムAgrobacterium株の構築アグロバクテリウムAgrobacteriumUIA143株はC58遺伝的バックグラウンドを有するRecA-欠損株であり、Farrandら前掲により構築され、記載された。染色体のrecA遺伝子が欠失され、150μg/mLでエリスロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子カセットと置き換えられた。このUIA143株は、TiプラスミドやTiプラスミド誘導体を含有していない。Hoodら1993TransgenicResearch2208221によって構築され、記載されたアグロバクテリウムAgrobacteriumEHA105株は、超病原性pTiBo542プラスミド由来のヘルパープラスミド本明細書ではpTiEHA105と呼ぶを保持する。プラスミドpTiEHA105DNAはEHA105株から調製され、標準方法WeigelおよびGlazebrookArabidopsisALaboratoryManualCOLDSPRINGHARBORPRESSColdSpringHarborNY354pagesMersereauら、Gene90149151Mattanovichら、NuclAcidsRes176747によりエレクトロコンピテント作製したUIA143株の細胞へエレクトロポレーションによって導入された。pTiEHA105で形質転換されたUIA143株の細胞は、精製寒天と増殖用の唯一の炭素源および窒素源としてマンノピン2mg/mLを使用するAB最少培地Watsonら、JBacteriol123255264で増殖するその能力により選択されたGuyonら、ProcNatlAcadSci7726932697Dessauxら、MolecGenGenet208301308。pTiEHA105の存在は、pTiBo542virD2遺伝子およびvirG遺伝子の断片が増幅するように設計されたプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応PCRにより確認され、さらに、塩化セシウム勾配遠心分離により精製したpTiEHA101の32P標識化DNAでプローブした候補コロニーから調製した全DNAについてサザンブロット分析を行い特徴決定した。このアグロバクテリウムAgrobacterium株すなわち、pTiEHA105含有UIA143はDA2552と称する。ヘルパープラスミドpTiC58Δを保持するRecA-欠損アグロバクテリウムAgrobacterium株の構築Z707株は、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensC58株のpTiC58プラスミドの全T-DNA領域を、カナマイシンに対する耐性を付与するTn903のnptI遺伝子で置き換えることにより得た。得られたプラスミド本明細書ではpTiC58Δというの全vir領域は、完全なままであったHepburnら、JGenMicrobiol13129612969。Z707株から得たヘルパープラスミドpTiC58Δは塩化セシウム勾配遠心分離により精製し、エレクトロコンピテントUIA143細胞へエレクトロポレートされた。pTiC58Δプラスミド由来のカナマイシン耐性遺伝子および染色体由来のエリスロマイシン耐性遺伝子に基づいて形質転換体が選択され、その株をDA2569と命名した。DA2569中のpTiC58Δの存在は、選択したvir遺伝子領域を検出するためのプライマーを使用してPCR増幅により、また、Z707株の細胞から塩化セシウム勾配遠心分離によって精製したpTiC58Δの32P標識化DNAでプローブしたDA2569候補コロニーから調製した全DNAをサザンブロット分析することにより確認した。ヘルパープラスミドpMP90を保持するRecA-欠損アグロバクテリウムAgrobacterium株の構築アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensGV3101pMP90株は、全T-DNA領域が欠失され、ゲンタミシンに対する耐性を付与する遺伝子と置き換えられたpMP90と呼ばれるpTiC58の欠失型を保持するKonczおよびSchellMolGenGenet204383396。プラスミドpMP90のDNAは、塩化セシウム勾配遠心分離またはMACHEREY-NAGELNUCLEOBONDXTRAMAXIKITLOWCOPYMACHEREY-NAGELInc.;Bethelem、PAなどの方法により調製され、UIA143細胞へエレクトロポレートされる。形質転換体は、pMP90プラスミド由来のゲンタミシン耐性遺伝子100μg/mLに基づいて選択され、その株はDAt20538と命名される。DAt20538中のpMP90の存在は、選択されたvir遺伝子領域を検出するためにプライマーを使用するPCR増幅により、また、DAt20538から調製した全DNAをサザンブロット分析することにより確認される。ヘルパープラスミドpMP90RKを保持するRecA-欠損アグロバクテリウムAgrobacterium株の構築実施例5に記載のヘルパープラスミドpMP90は、プラスミドpRK2013由来の42kbpEcoRI断片をダブルクロスオーバー相同組換えにより導入することによってさらに改変したFigurskiおよびHelinskiProcNatlAcadSciUSA7916481652。42kbp断片は、プラスミド複製および移動に関するプラスミドRK2由来の遺伝子例えば、trfA、tra1、tra2、tra3およびoriTおよびカナマイシン耐性を付与する遺伝子を含有する。この操作をプラスミドpMP90のゲンタミシン耐性遺伝子に置き換え、得られたプラスミドがpMP90RKと命名されたKonczおよびSchell、前掲。プラスミドpMP90RKのDNAは、塩化セシウム勾配遠心分離またはMACHEREY-NAGELNUCLEOBONDXTRAMAXIKITLOWCOPYなどの方法によって調製され、エレクトロコンピテントUIA143細胞へエレクトロポレートされる。形質転換体はpMP90RKのプラスミド由来のカナマイシン耐性遺伝子に基づいて選択され、その株はDAt20539と命名される。DAt20539中のpMP90RKの存在は、選択したvir遺伝子領域を検出するプライマーを使用するPCR増幅によって、また、DAt20539から調製した全DNAのサザンブロット分析によって確認される。アグロバクテリウムAgrobacterium株DA2552内へのpDAB9292DNAのエレクトロポレーションエレクトロコンピテントDA2552細胞は、標準プロトコルを使用して調製した実施例3を参照。コンピテントDA2552細胞50μLを氷上で溶解させ、300~400ngのプラスミドpDAB9292DNAを使用して形質転換した。DNAおよび細胞ミックスは、予備冷却したエレクトロポレーションキュベット0.2cmおよびBIO-RADGENEPULSERエレクトロポレーターBIO-RADInc.;Hercules、CA.を使用してエレクトロポレートした。条件は以下のとおりである:電圧:2.5kV、パルス長:5msec、キャパシタンスアウトプット:25μFarad、抵抗:200オーム。エレクトロポレーション後、1mLのYEPgm/L:酵母抽出物10、ペプトン10、NaCl5ブロスをキュベットに加え、細胞-YEP懸濁液を15mLの培養試験管に移した。細胞を4時間温和な撹拌を行いながら28°Cでインキュベートし、その後、50μg/mLのカナマイシンおよび150μg/mLのエリスロマイシンを含有するYEP寒天上でこの培養物を平板培養した。プレートを28°Cで2~4日間インキュベートし、コロニーを選択し、上記のような抗生物質を含む新鮮なYEP寒天平板上に平板画線し、1~3日間28°Cでインキュベートした。これらのコロニーは、ケトラクトース試験Bouzarら、InMethodsinMolecularBiologyAgrobacteriumProtocolsHUMANAPRESSTotowaNJpp913を使用し、アグロバクテリウムAgrobacteriumとして確認された。3mLのYEP抗生物質を含有種培養を開始するため、いくつかのケトラクトース陽性コロニーを選択し、振盪しながら28°Cで終夜増殖させた。300μLの各種培養を用いて200mLのYEP抗生物質を含有に接種し、終夜培養物を200rpmで振盪しながら28°Cで増殖させた。プラスミドDNAは、MACHEREY-NAGELNUCLEOBOND登録商標XTRAMAXIPLASMIDDNAPURIFICATIONキットを使用して、それぞれ終夜培養物200mLの165mLから調製した。緩衝液RES、LYSおよびNEUをそれぞれ30mL使用すること以外は、製造者のプロトコルに従った。溶出されたDNAは、4°Cで保存した。BamHIによるプラスミドDNAの制限酵素消化を用いてこれらの単離物中のpDAB9292の存在を確認し、次いで、単一コロニー単離の2継代を使用して、正確なパターンを有するコロニーをさらに精製した。プラスミドDNAは上記のように終夜培養物から調製し、制限消化分析を用いて完全なpDAB9292の存在を確認した。DA2552形質転換でオリジナルとして使用したpDAB9292ベクターのプラスミドDNAが消化基準として含まれていた。4つの個別の消化反応PstI、BamHI、MfeIおよびHindIIIが750ng~1μgのDNAを使用して行われた。この反応は1~2時間実施され、アガロースゲル電気泳動0.8w/vによって分析され、DNA断片は臭化エチジウム染色によって視覚化した。このアグロバクテリウムAgrobacterium株すなわち、pDAB9292を保持するDA2552は、DAt13192と命名される。この株は、組換え欠損ターナリー植物形質転換系に対するベースを提供する。アグロバクテリウムAgrobacterium株GV3101pMP90へのpDAB9292DNAのエレクトロポレーションアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciens株GV3101pMP90の細胞KonczおよびSchell、前掲は、標準プロトコルによりエレクトロコンピテントが作製された実施例3を参照。50μLのコンピテントGV3101pMP90細胞を氷上で溶解させ、300~400ngのプラスミドpDAB9292DNAを使用して形質転換した。DNAおよび細胞ミックスは、予備冷却したエレクトロポレーションキュベット0.2cmおよびBIO-RADGENEPULSERエレクトロポレーターを使用してエレクトロポレートした。条件は以下のとおりである:電圧:2.5kV、パルス長:5msec、キャパシタンスアウトプット:25μFarad、抵抗:200オーム。エレクトロポレーション後、1mLのYEPブロスをキュベットに加え、細胞-YEP懸濁液を15mLの培養試験管に移した。細胞を4時間温和な撹拌を行いながら28°Cでインキュベートし、その後、50μg/mLのカナマイシンおよび100μg/mLのゲンタマイシンを含有するYEP寒天上でこの培養物を平板培養した。プレートを28°Cで2~4日間インキュベートし、コロニーを選択し、上記のような抗生物質を含む新鮮なYEP寒天平板上に平板画線し、1~3日間28°Cでインキュベートした。これらのコロニーは、ケトラクトース試験を使用し、アグロバクテリウムAgrobacteriumとして確認された。3mLのYEP抗生物質を含有種培養を開始するため、いくつかのケトラクトース陽性コロニーを選択し、振盪しながら28°Cで終夜増殖させた。300μLの各種培養を用いて200mLのYEP抗生物質を含有に接種し、終夜培養物を200rpmで振盪しながら28°Cで増殖させた。プラスミドDNAは、MACHEREY-NAGELNUCLEOBOND登録商標XTRAMAXIPLASMIDDNAPURIFICATIONキットを使用して、それぞれ終夜培養物200mLの165mLから調製した。緩衝液RES、LYSおよびNEUをそれぞれ30mL使用すること以外は、製造者のプロトコルに従った。溶出されたDNAは、4°Cで保存した。BamHIによるプラスミドDNAの制限酵素消化を用いてこれらの単離物中のpDAB9292の存在を確認し、次いで、単一コロニー単離の2継代を使用して、正確なパターンを有するコロニーをさらに精製した。プラスミドDNAは上記のように終夜培養物から調製し、制限消化分析を用いて完全なpDAB9292の存在を確認した。GV3101pMP90形質転換でオリジナルとして使用したpDAB9292ベクターのプラスミドDNAが消化基準として含まれていた。4つの個別の消化反応PstI、BamHI、MfeIおよびHindIIIが750ng~1μgのDNAを使用して行われた。この反応は1~2時間実施され、アガロースゲル電気泳動0.8w/vによって分析され、DNA断片は臭化エチジウム染色によって視覚化した。pMP90TiヘルパープラスミドおよびpDAB9292を保持するこのアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensGV3101単離物は、DAt20712と呼ばれる。アグロバクテリウムAgrobacterium株LBA4404へのpDAB9292DNAのエレクトロポレーションアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensLBA4404株の細胞Oomsら、Plasmid71529は、標準プロトコルによりエレクトロコンピテントが作製された実施例3を参照。50μLのコンピテントLBA4404細胞を氷上で溶解させ、300~400ngのプラスミドpDAB9292DNAを使用して形質転換した。DNAおよび細胞ミックスは、予備冷却したエレクトロポレーションキュベット0.2cmおよびBIO-RADGENEPULSERエレクトロポレーターを使用してエレクトロポレートした。条件は以下のとおりである:電圧:2.5kV、パルス長:5msec、キャパシタンスアウトプット:25μFarad、抵抗:200オーム。エレクトロポレーション後、1mLのYEPブロスをキュベットに加え、細胞-YEP懸濁液を15mLの培養試験管に移した。細胞を4時間温和な撹拌を行いながら28°Cでインキュベートし、その後、50μg/mLのカナマイシンおよび250μg/mLのストレプトマイシンを含有するYEP寒天上でこの培養物を平板培養した。プレートを28°Cで2~4日間インキュベートし、コロニーを選択し、上記のような抗生物質を含む新鮮なYEP寒天平板上に平板画線し、1~3日間28°Cでインキュベートした。これらのコロニーは、ケトラクトース試験を使用し、アグロバクテリウムAgrobacteriumとして確認され、単一コロニー単離の2継代を使用して、さらに精製した。3mLのYEP抗生物質を含有種培養を開始するため、いくつかのケトラクトース陽性コロニーを選択し、振盪しながら28°Cで終夜増殖させた。300μLの各種培養を用いて200mLのYEP抗生物質を含有に接種し、終夜培養物を200rpmで振盪しながら28°Cで増殖させた。プラスミドDNAは、MACHEREY-NAGELNUCLEOBOND登録商標XTRAMAXIPLASMIDDNAPURIFICATIONキットを使用して、それぞれ終夜培養物200mLの165mLから調製した。緩衝液RES、LYSおよびNEUをそれぞれ30mL使用すること以外は、製造者のプロトコルに従った。溶出されたDNAは、4°Cで保存した。制限消化分析を用いて完全なpDAB9292プラスミドの存在を確認した。LBA4404形質転換でオリジナルとして使用したpDAB9292ベクターのプラスミドDNAが消化基準として含まれていた。3つの個別の消化反応PstI、BamHI、およびHindIIIが750ng~1μgのDNAを使用して行われた。この反応は1~2時間実施され、アガロースゲル電気泳動0.8w/vによって分析され、DNA断片は臭化エチジウム染色によって視覚化した。pDAB9292を保持するアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensLBA4404単離物はDAt20711と呼ばれる。この株は、組換え能の高いターナリー系に対してベースを提供する。アグロバクテリウムAgrobacteriumDAt20538株へのpDAB9292DNAのエレクトロポレーションエレクトロコンピテントDAt20538細胞は、標準プロトコルを使用して調製した実施例3を参照。50μLのコンピテントDAt20538細胞を氷上で溶解させ、300~400ngのプラスミドpDAB9292DNAを使用して形質転換した。DNAおよび細胞ミックスは、予備冷却したエレクトロポレーションキュベット0.2cmおよびBIO-RADGENEPULSERエレクトロポレーターを使用してエレクトロポレートした。条件は以下のとおりである:電圧:2.5kV、パルス長:5msec、キャパシタンスアウトプット:25μFarad、抵抗:200オーム。エレクトロポレーション後、1mLのYEPブロスをキュベットに加え、細胞-YEP懸濁液を15mLの培養試験管に移した。細胞を4時間温和な撹拌を行いながら28°Cでインキュベートし、その後、50μg/mLのカナマイシンおよび100μg/mLのゲンタマイシンを含有するYEP寒天上でこの培養物を平板培養した。プレートを28°Cで2~4日間インキュベートし、コロニーを選択し、上記のような抗生物質を含む新鮮なYEP寒天平板上に平板画線し、1~3日間28°Cでインキュベートした。これらのコロニーは、ケトラクトース試験を使用し、アグロバクテリウムAgrobacteriumとして確認され、ケトラクトース陽性コロニーを、単一コロニー単離の2継代を用いてさらに単離した。3mLのYEP抗生物質を含有種培養を開始するため、コロニーを選択し、振盪しながら28°Cで終夜増殖させた。300μLの各種培養を用いて200mLのYEP抗生物質を含有に接種し、終夜培養物を200rpmで振盪しながら28°Cで増殖させた。プラスミドDNAは、MACHEREY-NAGELNUCLEOBOND登録商標XTRAMAXIPLASMIDDNAPURIFICATIONキットを使用して、それぞれ終夜培養物200mLの165mLから調製した。緩衝液RES、LYSおよびNEUをそれぞれ30mL使用すること以外は、製造者のプロトコルに従った。溶出されたDNAは、4°Cで保存した。制限消化分析を用いて完全なpDAB9292プラスミドの存在を確認した。DAt20538形質転換でオリジナルとして使用したpDAB9292ベクターのプラスミドDNAが消化基準として含まれていた。4つの個別の消化反応PstI、BamHI、MfeI、およびHindIIIが750ng~1μgのDNAを使用して行われた。この反応は1~2時間実施され、アガロースゲル電気泳動0.8w/vによって分析され、DNA断片は臭化エチジウム染色によって視覚化した。pDAB9292を保持するアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensDAt20538単離物はDAt20538pDAB9292と呼ばれる。複数の反復配列エレメントを有する植物形質転換ベクターの構築およびアグロバクテリウムAgrobacterium株への導入14.8KpnIVirBCDG断片により提供されるvir補助遺伝子と組み合わせたRecA機能の欠損を有する操作されたアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciens株の有用性を本明細書で説明する。バイナリー植物形質転換ベクター、pDAB101513図4Aは、標準クローニング方法の組み合わせによって例えば、Sambrookら1989、前掲およびAusubelら1995、前掲ならびにGATEWAY商標technologyINVITROGENに記載されているようにして大腸菌Ecoliクローニング株STBL2商標で構築した。バイナリーベクターpDAB101513はプラスミドRK2のIncP-タイプ複製起点をベースとし、ベクター骨格は、100μg/mLでスペクチノマイシン図4中のSpcRに対する耐性を付与する細菌遺伝子を保持する。T-DNA境界反復は、pTi15955のTL領域から誘導される。プラスミドpDAB101513のT-DNA領域の右側境界図4のT-DNA境界Bおよびトリプル左側境界図4のT-DNA境界A内では、4つの植物発現可能な、植物-コドン-最適化タンパク質コード配列CDSが配置されており、各々の転写は、関連するイントロン1で1,991bpのトウモロコシユビキチン1プロモーターにより作動される米国特許第5,510,474号。これらのコード領域の3つは、それぞれ約3,500bpを含む個別のBtCry1タンパク質Cry1Ca、配列番号7;Cry1Fa、配列番号9;およびCry1Ab、配列番号11をコードしている。これらのコード領域は、GENBANK寄託から得られた706のトウモロコシタンパク質コード領域の分析から計算されたトウモロコシZeamaysコドンバイアス表を使用する、トウモロコシ植物での発現において最適化されたコドンであった。合成遺伝子の設計および生産に関するさらなるガイダンスは、例えば、国際公開第97/13402A1、米国特許第6,166,302号および米国特許第5,380,831号で確認することができる。3つのB.tタンパク質コード領域は、以下の様式で相互に関連する:cry1Ca配列番号6に関するコード領域とcry1Fa配列番号8に関するコード領域は、67の配列相同性を共有し;cry1Ca配列番号6に関するコード領域とcry1Ab配列番号10に関するコード領域は69.5の配列相同性を共有し、cry1Fa配列番号8に関するコード領域とcry1Ab配列番号10に関するコード領域は、67の配列相同性を共有する。さらに、cry1Ca、cry1Faおよびcry1Abに関するCDSのC末端1,600bpは、73の配列相同性を共有する。これらの3つのそれぞれのコード領域は、365bpのトウモロコシPer53’非翻訳領域3’UTRにより終止する米国特許第6,384,207号。第4の遺伝子は、AAD1選択可能なマーカータンパク質配列番号13をコードする植物-コドン-最適化aad1コード領域配列番号12を含む米国特許第7,838,733号。このaad1コード領域は、cry1Ca、cry1Faまたはcry1Abに関し、CDSと関連していない。aad1に関するコード領域は、植物-コドンバイアス表を用いて設計した。トウモロコシコドンバイアス表は、GENBANKに寄託されている配列から得られた、706のトウモロコシタンパク質コード配列から計算された。タバコNicotianatabacum、1268CDSキャノーラBrassicanapus、530CDS、ワタGossypiumhirsutum、197CDS、およびダイズGlycinemax;約1000CDSに関するコドン利用表は、ウェブサイトhttp://www.kazusa.or.jp/codon/のデータからダウンロードした。適切な設計し直された平均相対量で、トウモロコシおよび双子葉植物の両方のデータセットに共通してたびたび用いられるコドンを含む偏位コドンセットは、いずれかの植物タイプのアミノ酸に対する全コドンの使用の約10未満で使用されるすべての余分のコドンを省いた後に計算した。aad1遺伝子はトウモロコシリパーゼ3’UTRにより終端している米国特許第7,179,902号。したがって、pDAB101513の22,729bpT-DNA領域の内に、トウモロコシubi1プロモーターの4つのコピーは、約2kbpキロ塩基対の4つの直接反復中にそれぞれ配置されている、合計7,964塩基を含み、それぞれの反復は互いに100関連している。Per53’UTRの3つのコピーは、3つの直接反復単位で配置されている、合計1,095塩基を含み、それぞれの反復は互いに100関連しており、3つのコード領域cry1Ca、cry1Faおよびcry1Abは、相互に67~73の間の相同性を有する直接反復として配置されている。合計で、pDAB101513のT領域は約86の高度に反復された配列を含み、下記のように簡便に説明することができる:RB>Ubi1プロモーター:cry1CaCDS:Per53’UTR>Ubi1プロモーター:cry1FaCDS:Per53’UTR>Ubi1プロモーター:cry1AbCDS:Per53’UTR>Ubi1プロモーター:aad1CDS:Lip3’UTR>LB。この構築物の高度に反復された性質は、クローニングステップが大腸菌Ecoliクローニング株STBL2商標で終わることが求められ、それはそのような高度に反復されたDNA配列を含有するクローンの完全性を維持するように特別に操作される。プラスミドpDAB101513は、エレクトロポレーションによって自発的な染色体突然変異によってストレプトマイシン耐性が付与されたアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensEHA105株のエレクトロコンピテント細胞へ導入され、スペクチノマイシン/ストレプトマイシン耐性単離物は、完全なプラスミドpDAB101513を含有していることが制限消化分析により確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、-80°Cで保存した。この株は、EHA105pDAB101513と命名する。EHA105pDAB101513の凍結グリセロールストックから得られた細胞から確立された多数の個々の培養物は、pDAB101513プラスミドの再構成バージョンまたは欠失バージョンを含有していることが確認された。トウモロコシ形質転換に関して、EHA105株pDAB101513のバルク細胞を冷凍グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例13に記載されているように直接使用した。プラスミドpDAB101513は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensDA2552株本質的にEHA105株のRecA-欠損バージョンのエレクトロコンピテント細胞へ順調に導入され、DA2552株pDAB101513が生産された。エリスロマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性により選択された形質転換体は、プラスミドDNAの制限酵素消化によって確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、-80°Cで保存した。凍結グリセロールストックから得られた細胞から確立された多数の個々の培養物は、完全なpDAB101513プラスミドを含有していることが確認された。DA2552株pDAB101513のバルク細胞を冷凍グリセロールストックから接種された寒天平板から回収し、トウモロコシ形質転換に使用した実施例13。プラスミドpDAB101513はエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensDAt13192株プラスミドpDAB9292を保持するDA2552株のエレクトロコンピテント細胞に順調に導入され、DAt13192株pDAB101513が得られた。エリスロマイシン、カナマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性によって選択された形質転換体は、プラスミドDNAの制限酵素消化によって確認された後、凍結グリセロールストックを調製し、-80°Cで保存した。凍結グリセロールストックから得られた細胞から確立された多数の個々の培養物は、完全なpDAB101513プラスミドを含有していることが確認された。DAt13192株pDAB101513のバルク細胞を凍結グリセロールストックから接種された寒天平板から回収し、トウモロコシ形質転換に使用した実施例13。同様の方法で、pDAB101513のものと類似のT-DNA領域を有する、pSB11の誘導体スーパーバイナリー系のシャトルベクターを構成した。LBA4404pSB1において標準方法によりスーパーバイナリープラスミドを構築する複数の試みは失敗であった。すべての試みでは、高度に再構成され欠失したpSB1ベースの同時組込み体プラスミドが単離された。複数の反復配列エレメントを有する植物形質転換ベクターpDAB101514の構築とアグロバクテリウムAgrobacterium株への導入14.8KpnIVirBCDG断片により提供されるvir補助遺伝子と組み合わせたRecA機能の欠損を有する、操作されたアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciens株の有用性を本明細書でさらに説明する。バイナリー植物形質転換ベクター、pDAB101514図4Bは、標準クローニング方法およびGATEWAY商標技術の組み合わせによって大腸菌Ecoliクローニング株STBL2商標で構築した。バイナリーベクターpDAB101514の構造は、cry1Ca遺伝子の発現を作動するのに用いられる発現要素を除いて、pDAB101513前の実施例の構造とほとんど同じである。pDAB101514中のcry1CaCDSの転写は、1429bpのサトウキビ桿状ウイルスプロモーターにより作動されるSCBVTzafrirら、PlantMolecBiol38347356。5’UTRは、本質的に、20塩基のエキソン6と11塩基のエキソン7に隣接している、トウモロコシアルコール脱水素酵素遺伝子GENBANKアクセッションX04049のイントロン6で構成されている。この遺伝子の転写は、ジャガイモpinII3’UTRにより終止されるAnら、PlantCell1115122。cry1Fa、cry1Abおよびaad1遺伝子の発現を調節するために使用される発現エレメントは、pDAB101513中で用いられたものと同じ物である。したがって、pDAB101514の22,586bpT-DNA領域の内部では、トウモロコシubi1プロモーターの3つのコピーは、約2kbpの3つの直接反復中にそれぞれ配置され、各反復が互いに100関連している、合計5,973塩基を含む。Per53’UTRの2つのコピーは、2つの直接反復単位に配置され、各反復単位が互いに100関連している、合計730塩基を含み、3つのコード領域cry1Ca、cry1Faまたはcry1Abは、直接反復が、互いに67~73の間のDNA配列相同性を有するように配置される。合計で、pDAB101514のT領域は約76の高度に反復されたDNA配列を含み、物理的な配置は、以下のように簡単に説明することができる:RB>SCBVプロモーター:cry1CaCDS:pinII3’UTR>Ubi1プロモーター:cry1FaCDS:Per53’UTR>Ubi1プロモーター:cry1AbCDS:Per53’UTR>Ubi1プロモーター:aad1CDS:Lip3’UTR>LB。この構築物の高度に反復された性質は、このような高度に反復されたDNA配列を含有するクローンの完全性を維持するために特に操作される、クローニングステップが大腸菌Ecoliクローニング株STBL2商標で終わることが必須である。プラスミドpDAB101514は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのEHA105株のエレクトロコンピテント細胞自発的な染色体突然変異によってストレプトマイシン耐性が付与されたものへ導入され、スペクチノマイシン/ストレプトマイシン耐性の単離物は、制限消化分析によって完全なプラスミドpDAB101514を含有していることが確認された後、凍結グリセロールストックを調製し、-80°Cで保存した。この株はEHA105pDAB101514と命名された。凍結グリセロールストックから得られたEHA105pDAB101514細胞から確立された多数の個々の培養物は、pDAB101514プラスミドの再構成バージョンまたは欠失バージョンを含有していることが確認された。トウモロコシ形質転換に関し、EHA105株pDAB101514のバルク細胞を凍結グリセロールストックから接種された寒天平板から回収し、実施例13で開示した方法により使用した。プラスミドpDAB101514は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのDA2552株のエレクトロコンピテント細胞本質的にEHA105株のRecA-欠損バージョンへ順調に導入され、DA2552株pDAB101514を得た。エリスロマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性によって選択された形質転換体をプラスミドDNAの制限酵素消化により確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、-80°Cで保存した。凍結グリセロールストックから得られた細胞から確立された多数の個々の培養物は、完全なpDAB101514プラスミドを含有していることが確認された。DA2552株pDAB101514のバルク細胞を凍結グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例13で記載した方法によってトウモロコシ形質転換に使用した。プラスミドpDAB101514は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのDAt13192株プラスミドpDAB9292を保持するDA2552株の細胞へ順調に導入され、DAt13192pDAB101514株を得た。エリスロマイシン、カナマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性によって選択された形質転換体をプラスミドDNAの制限酵素消化によって確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、-80°Cで保存した。凍結ストックから得られたDAt13192pDAB101514細胞から確立された多数の個々の培養物は、完全なpDAB101514プラスミドを含有していることが分かった。DAt13192pDAB101514株のバルク細胞は凍結グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例13で開示した方法によってトウモロコシ形質転換に使用した。同様の方法で、pSB11の誘導体スーパーバイナリー系のシャトルベクターは、pDAB101514のものと類似のT-DNA領域を有して構築された。LBA4404pSB1での標準方法によるスーパーバイナリープラスミドを構築する複数の試みは失敗であった。すべての試みでは、高度に再構成され、欠失したpSB1ベースの同時組込み体プラスミドが単離された。バイナリーベクターpDAB101513およびpDAB101514を保持するアグロバクテリウムAgrobacterium株によるトウモロコシの形質転換トウモロコシのアグロバクテリウムAgrobacteriumによる形質転換。IIF1crossArmstrongら、MaizeGenetCoopNewslett659293に由来する種子が、95のMETRO-MIX360ソイルレス系成長培地SUNGROHORTICULTURE、Bellevue、WAおよび5のclay/loam土壌からなる混合物を含む5ガロンのポット内に植栽された。植物を、高圧ナトリウムランプおよびメタルハライドランプを併用する温室内で、16:8時間の明光:暗光周期にて成長させた。形質転換用の未成熟のF2胚を得るために、制御された同胞受粉sibpollinationが実施された。未成熟の胚が約1.0~2.0mmのサイズになる受粉後およそ8~10日目に、トウモロコシ雌穂Maizeearsが回収された。感染および共培養。トウモロコシ雌穂Maizeearsは、液体石鹸で洗浄し、次に20の市販漂白剤5の次亜塩素酸ナトリウムを含む中に約20分間浸漬することにより外皮除去および表面滅菌処理され、次いで滅菌水で3回すすいだ。pDAB101513またはpDAB101514、BtCry1Ca、Cry1FaおよびCry1Abタンパク質をコードしている3つの遺伝子を有し、aad-1植物選択可能なマーカー遺伝子を含有する、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciens細胞の懸濁液は、1または2白菌耳の細菌適切な抗生物質を含有するYEP寒天培地で2~3日間28°Cで成長させたものを、200μMのアセトシリンゴンを含有する5mLの液体感染培地LS基本培地、LinsmaierおよびSkoog1965PhysiologiaPlantarum18100127N6ビタミンChuら、ScientiaSinica18659668、1.5mg/Lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸2,4-D、68.5gm/Lのスクロース、36.0gm/Lのグルコース、6mMのL-プロリン、pH5.2に移植することにより調製された。均一な懸濁液が得られるまでこの溶液をボルテックス処理し、濃度は550nmで最終吸光度を約0.4に調節した。未成熟の胚は、2mLの感染培地を含むマイクロ遠心管に直接単離された。培地は除去され、アグロバクテリウムAgrobacterium溶液1mLと置き換えられ、アグロバクテリウムAgrobacterium/胚溶液は室温で5~10分間インキュベートされた。次いで、200μMのアセトシリンゴンを含有する胚は共培養培地LS基本培地、N6ビタミン、1.5mg/Lの2,4-D、30.0gm/Lのスクロース、6mMのL-プロリン、0.85mg/LのAgNO3、2.8gm/LのGELLANGUM商標PHYTOTECHNOLOGYLABORATORIES.、Lenexa、KS、pH5.8へ移され、暗光下で3~4日間、20°Cで共培養された。共培養後、胚はMS塩およびビタミンFrameら、2011GeneticTransformationUsingMaizeImmatureZygoticEmbryosInPlantEmbryoCultureMethodsandProtocolsMethodsinMolecularBiologyTAThorpeおよびECYeungSPRINGERSCIENCEANDBUSINESSMEDIALLCpp327341、6mMのL-プロリン、100mg/Lのミオイノシトール、500mg/LのMES2-N-モルホリノエタンスルホン酸一水和物;PHYTOTECHNOLOGIESLABR.、30gm/Lのスクロース、1.5mg/Lの2,4-D、0.85のAgNO3、250mg/Lのセホタキシム、2.8gm/LのGELLANGUM商標、pH5.8を含有する休止培地に移された。約7日後に、胚は100nMのハロキシホップで補充した同一培地に移された。約8週後に形質転換された単離物が同定され、再生および分析を行うために2週間の間隔で新鮮な選択培地に移すことにより蓄積させた。再生および種子生産。再生する場合、培養物は、100nMのハロキシホップを補充した28導入培地MS塩およびビタミン、30gm/Lのスクロース、5mg/Lのベンジルアミノプリン、0.25mg/Lの2,4-D、250mg/Lのセホタキシム、2.5gm/LのGELLANGUM商標、pH5.7に弱光条件下14μEm-2s-1に移した。インキュベーションは、微弱光条件下14μEm-2s-1で1週間、次に強光条件下約89μEm-2s-1で1週間行った。その後、組織は36再生培地植物成長調節剤を含まない点を除き、導入培地に同じに移植された。苗が長さ3~5cmに成長したときに、それらはSHGA培地[SchenkandHildebrandtsaltsandvitamins,PHYTOTECHNOLOGIESLABR、1.0gm/Lのミオイノシトール、10gm/Lのスクロース、および2.0gm/LのGELLANGUM商標、pH5.8]を含むガラス製培養チューブに移植されて、さらに成長しおよびシュートと根が発生するようにさせた。植物は本明細書にこれまでに記載したものと同一の土壌混合物に移植され、および温室内で開花するまで育成された。植物組織の試料が回収され、実施例14に開示の方法による昆虫バイオアッセイ、および分子生化学的分析において用いた。種子生産のために調節受粉を行う。トウモロコシ形質転換の当業者には、その他の植物で発現可能な選択可能なマーカー遺伝子例えば、除草剤耐性遺伝子が用いられる場合には、トウモロコシ形質転換および形質転換植物の選択にその他の方法が利用可能であることは理解されよう。トウモロコシ害虫に対する葉試料のインビトロバイオアッセイアッセイする鱗翅目の種は、オオタバコガCEW;HelicoverpazeaBoddie、アワノメイガECB;OstrinianubilalisHubner、およびツマジロクサヨトウFAW;SpodopterafrugiperdaJ.E.Smithであった。これらの昆虫に関する卵は、BENZONRESEARCHCarlisle、PAから入手した。第1のティアバイオアッセイTierBioassay:ハイスループット96ウェルバイオアッセイ。96ウェルトレーTPP-US;St.Louis、MOに2寒天溶液SIGMA-ALDRICHで部分充填し、寒天を固化させた。標準の携帯型ペーパーパンチを使用し、このフォーマットで試験される2種のそれぞれの昆虫種CEWおよびFAW用に、3つの直径1/8インチの葉片をサンプリングした。1つの葉片を、96ウェルプレートの単一ウェルに置いた。試験するそれぞれの昆虫に対してプレートは3枚であったそれぞれの複製/葉片について1プレート。卵播種装置を使用して、96ウェルプレートの各ウェルへ昆虫の卵を投入した。次いで、プレートは穴を空けた粘着性の蓋で密閉され、さらに、プレートに付属するプラスチック蓋で封入した。プレートは、30°C、40の相対湿度RH、16時間の明光下:8時間の暗光下で3日間保持した。等級は0-1-2尺度を使用して実施したが、この場合、各ウェル内で、0は葉片被害が<25であることを示し、1は葉片被害が25~50であることを示し、2は葉片被害が>50であることを示す。各試験の被害スコアを平均し、相関分析を行うためにタンパク質発現分析を同時に使用した。その平均昆虫被害スコアが0.67以下であった植物は、試験有害生物に対して活性があると考えられた。第2のティアバイオアッセイ:32ウェルのバイオアッセイ。32ウェルトレーC-DINTERNATIONAL;Pitman、NJに2寒天溶液を部分充填し、寒天を固化させた。各植物から約1インチ正方形の葉切片を取得し、32ウェルトレーのウェルに1つずつ入れた。1つの葉片をそれぞれのウェルに入れ、2つの葉片が植物に対して、また昆虫に対して試験された。昆虫ECBおよびFAWは、絵筆を使用し、各ウェルに10~20匹の誕生後の幼虫を入れることにより多量感染させた。トレーは、試験期間に通気できるように穴を空けた粘着性の蓋で密閉した。トレーは、28°C、40の相対湿度RH、16時間の明光下:8時間の暗光下で3日間保持した。試験期間の後に、簡易パーセント被害スコアをそれぞれの葉片に対して得た。各試験の被害スコアを平均し、相関分析を行うためにタンパク質発現分析を同時に使用した。その平均昆虫被害評価が25以下であった植物は、試験有害生物に対して活性があると考えられた。統計的分析。分析はすべてJMP8.0.2SASINSTITUTEInc.、Cary、NorthCarolinaで行われた。一元配置分散分析を用いて、昆虫被害データに関するそれらの処理と陰性対照植物の間の有意差を決定した。さらに平均のTukey-KramerHSD比較を使用して、処理中の有意差を評価した。加えて、線形回帰最小二乗適合分析を用いて、定量的タンパク質発現と昆虫活性測定と相関させた。バイオアッセイの結果を表2にまとめる。pDAB101513で形質転換されたトウモロコシ組織の生化学的分子的な特性決定多重形質転換実験は、操作したアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのEHA105pDAB101513株、DA2552pDAB101513株およびDAt13192pDAB101513株を用いて実施した。トランスジェニックT0植物における4つの導入遺伝子のコピー数は遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用し、加水分解プローブアッセイBubnerおよびBaldwinPlantCellRep23263271により推定した。遺伝子の1~3コピー低コピーを含む植物から得たタンパク質抽出物は、BtCry1Ca、Cry1FaおよびCry1Abタンパク質の産生について、またAAD1タンパク質について、工業生産された抗体キットENVIROLOGIX商標、Portland、MAを使用するELISA法によってさらに試験した。4つのタンパク質をすべて産生するいくつかの植物が見つかった表3。さらに、植物の葉片を、摂食アッセイにおいて3種のトウモロコシ害虫:オオタバコガCEW;Helicoverpazea、ツマジロクサヨトウFAW;Spodopterafrugiperda、およびアワノメイガECB;Ostrinianubilalisに対する活性をバイオアッセイした実施例14。低コピー数に4つの導入遺伝子をすべて有し、4つのタンパク質をすべて産生し、3種の有害生物すべてに対する昆虫活性を有する、いくつかの植物が見つかった表4。これらの基準を満たす形質転換された植物は、EHA105pDAB101513株またはDA2552pDAB101513株を使用する実験からは得られなかった表4。したがって、染色体recA遺伝子の欠失を含み、pTiEHA105上に保持されているpTiBo542誘導vir遺伝子のフルセットをさらに含み、pDAB9292の14.8KpnIVirBCDG断片上に保持されているpTiBo542誘導vir遺伝子の部分的セットをさらに含む、DAt13192株の特徴は、高度に反復された配列エレメントで構成されている大型T-DNA領域で形質転換されたトウモロコシ植物を効率的に生産することができるということである。pDAB101514で形質転換されたトウモロコシ組織の生化学的分子的な特性決定多重形質転換実験は、操作したアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのEHA105pDAB101514株、DA2552pDAB101514株およびDAt13192pDAB101514株を用いて実施した。トランスジェニックT0植物における4つの導入遺伝子のコピー数は遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用し、加水分解プローブアッセイBubnerおよびBaldwinにより推定した。遺伝子の1~3コピー低コピーを含む植物から得たタンパク質抽出物は、BtCry1Ca、Cry1FaおよびCry1Abタンパク質の産生について、またAAD1タンパク質について、工業生産された抗体キットENVIROLOGIX商標、Portland、MAを使用するELISA法によってさらに試験した。さらに、植物から得た葉片を、摂食アッセイにおける3種のトウモロコシ害虫に対する活性についてバイオアッセイした実施例14。低コピー数に4つの導入遺伝子すべて有し、4つのタンパク質をすべて産生し、3種の有害生物すべてに対する昆虫活性を有する、いくつかの植物が見つかった表5。これらの基準を満たす形質転換された植物は、EHA105pDAB101514株またはDA2552pDAB101514株を使用する実験からは得られなかった。したがって、染色体recA遺伝子の欠失を含み、pTiEHA105上に保持されているpTiBo542誘導vir遺伝子のフルセットをさらに含み、pDAB9292の14.8KpnIVirBCDG断片上に保持されているpTiBo542誘導vir遺伝子の部分的セットをさらに含む、DAt13192株の特徴は、高度に反復された配列エレメントで構成されている大型T-DNA領域で形質転換されたトウモロコシ植物を効率的に生産することができるということである。アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensLBA4404染色体中の中立組込み部位の同定および特性決定アグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensC58株染色体の植物誘導性picA/pgl遺伝子座GENBANKアクセッションAE0009243は、DNA断片が組み込まれ得る非必須遺伝子であることが確認されたRongら、JBacteriol17258285836Rongら、JBacteriol17351105120。アグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensLBA4404株のゲノム中の同様の中立組込み部位は未だ報告されていない。本発明者らは、C58picA/pgl遺伝子座に部分的に相同な配列を含むLBA4404のゲノム領域の同定および配列決定について本明細書に記載する。LBA4404INVITROGENの細胞を、30°Cで終夜、YM培地gm/L:酵母抽出物、0.4;マンニトール、10;NaCl、0.1;MgSO47H2O、0.2;K2HPO43H2O、0.5で増殖させた。ゲノムDNAを、製造者のプロトコルに従って、EASYDNAkitINVITROGENを使用して1mL培養物から調製した。縮重プライマーは、C58PicAタンパク質配列とシロイヌナズナArabidopsisthaliana、カルジセルロシルプトルサッカロリチクスCaldicellulosiruptorsaccharolyticus、アルカリフィルスメタリレジゲネスAlkaliphilusmetalliredigenesおよびクロストリジウムアセトブチルイクムClostridiumacetobutylicumから同定された相同体との間の2つの相同領域に基づいて設計した。LBA4404ゲノムDNAは、HERCULASE商標MASTERMIXSTRATAGENE;SanDiego、CA、および縮重プライマーAtnilA1Fa5’-GACAGTCCNAATACSGAYGG-3’;配列番号14;C58PicAタンパク質のアミノ酸273~279に対応およびAtnilA3R5’-GTYTTSAGNCGSAGSCCSCGRTCSGT-3’;配列番号15、C58PicAタンパク質のアミノ酸364~369をコードしている相補鎖に対応を使用するポリメラーゼ連鎖反応PCRに鋳型として使用した。使用する熱サイクル条件は以下のとおりであった:94°Cの1サイクル、2分;[94°C、30秒;55°C、30秒;72°C、60秒]の25サイクル;72°Cの1サイクル、7分。プライマー配列中の縮重ヌクレオチドの呼称は、以下のようなDNAヌクレオチドに対応する:N=A、C、GまたはT;Y=TまたはC;R=AまたはG;およびS=CまたはG。285塩基対bp生成物が単離され、大腸菌EscherichiacoliTOP10細胞INVITROGEN中のベクターpCR2.1-TOPOINVITROGENへクローニングされ、DNA配列が決定された。この配列は、C58picA遺伝子の領域と相同であるしかし同一ではないことが分かった85の配列同一性。また、それが示すLBA4404ゲノム領域を本明細書ではnilA断片と呼ぶ。285bpのLBA4404nilA断片に相補的な追加プライマーを、285bp配列の両端に隣接するゲノム断片のPCR増幅にアンカーとして使用されるように設計した。これらは、C58picA遺伝子の隣接領域の配列から設計されたプライマーとPCR反応で対になった。285bp配列内部から生じ、nilA断片の両隣接領域へ広がる増幅された断片の配列が決定され、それを用いて後続のPCR反応の別プライマーを設計した。LBA4404ゲノムDNA鋳型をプライマーnilA2F5’-CCATCCTCATAACACCAGCT-3’;配列番号16およびnilA2R5’-GCAGATCATCGATACGACCA-3’;配列番号17と一緒に使用し、約2キロ塩基kbpのPCR断片を生成させ、TOPOTAクローニングキットINVITROGENを用いてpCR登録商標-BLUNTII/XL-TOPO登録商標へクローニングし、プラスミドpDOW3719を生成した図2。pDOW3719の挿入物断片の配列分析により1,796bp配列配列番号18が得られたが、これは531個のアミノ酸の推定上のタンパク質をコードする最長のオープンリーディングフレームORFを含んでいる。同一リーディングフレーム中のより短いORFは、523個のアミノ酸の推定上のタンパク質をコードする。LBA4404の523個アミノ酸の推定上のタンパク質は、C58PicAタンパク質と88の類似性、85の同一性を示す。LBA4404の523個アミノ酸の推定上のタンパク質に関するコード配列とC58PicAタンパク質に関するコード配列は81の同一性を有する。したがって、実質的にC58picA遺伝子から分化した推定上の遺伝子を含む、LBA4404のnilA断片はゲノムセグメントを表す。本開示において、配列番号18により表される1.8kbpのゲノム配列をnilA遺伝子座と称する。複製のcolE1起源を有するプラスミドpDOW3719は、アグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensの細胞で自発的に自己複製することは予測されない。プラスミドpDOW3719のDNAを使用し、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのLBA4404株の細胞を形質転換した。カナマイシン耐性pDOW3719上に保持に関する選択を行い、LBA4404染色体中に、またpDOW3719上に存在する1.8kbp相同性領域により介在されている組換えによるLBA4404染色体へpDOW3719を組み込まれた形質転換体を同定した。このような組込み事象により、ここで複製された1.8kbp相同性領域によりそれぞれの側に隣接されているpDOW3719ベクタープラスミド配列の線状コピーが作製される。カナマイシン耐性LBA4404形質転換体が単離され、PCR分析によりpDOW3719の挿入に関してスクリーニングした。形質転換体のゲノムDNA調製物を、以下の5つのプライマーセットを用いるPCR反応における鋳型として使用した:ipDOW3719中の挿入物に隣接する、M13Rプライマーと対になるM13Fプライマー、iiプライマーAS4Rと対になるM13Fプライマー配列番号18の残基1041~1060に相補的な塩基を含む、iiiプライマーAS10Rと対になるM13Fプライマー配列番号18の残基1,320~1,337に相補的な塩基を含む、ivプライマーAS11Rと対になるM13Fプライマー配列番号18の残基1,391~1,406に相補的な塩基を含む、およびvプライマーAS9Fと対になるM13Rプライマー配列番号18の634~649の塩基を含む。コントロール反応において、pDOW3719プラスミドDNAが鋳型として使用された場合、これらのプライマーセットはすべて予想されるサイズの断片を増幅した。しかし、カナマイシン耐性LBA4404形質転換体から得たゲノムDNAが鋳型として使用された場合、M13FおよびM13Rプライマー対を使用するPCRは増幅産物を産出しなかった。このことは、完全ではない組み込まれなかったpDOW3719プラスミドDNAがゲノムDNAにより同時精製されなかったことを示唆する。別の4つのプライマー対を用いるゲノムDNA試料のPCR分析によって、予想されるサイズのDNA断片の産生が示された。これらの結果は、LBA4404形質転換体のカナマイシン耐性がゲノムへ組み込まれたpDOW3719DNAにより付与されることを示唆している。このような形質転換体[LBA4404nilA-int1]の1つを使用して、シロイヌナズナArabidopsisthalianaを形質転換するその株の能力に対するnilA遺伝子座へのゲノムの挿入が有する効果を試験した。PATタンパク質除草剤BASTA商標に対して耐性を付与するをコードしている植物発現可能な遺伝子を含有する、バイナリーベクターpDAB3779は、スペクチノマイシン耐性に関する選択性を持つ株LBA4404nilA-int1株およびLBA4404株の細胞に形質転換した。次いで、これらの株は、WeigelおよびGlazebrook前掲の方法を使用して、アラビドプシス形質転換試験を実施するために使用した。2つの株で得られた形質転換率に相違は見出されなかった。したがって、本明細書に記載の実施形態および方法の特徴は、配列番号18を含むアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensLBA4404株の染色体nilA遺伝子座への外来性DNA断片の挿入は、こうした操作を行った株の増殖または植物形質転換能力に対して影響がないということである。LBA4404nilA遺伝子座へ組込みを行うためのpDOW3719の自殺誘導体の構築pDOW3719でクローニングされたnilA遺伝子座中の多重クローニング部位の挿入は、オーバーラップ伸長によるスプライシングSOEPCRHortonら、BioTechniques8528535により達成した。SOEPCR反応は、製造者のプロトコルに従って、HERCULASE商標マスターミックスを使用して行った。nilA遺伝子座の一部分は、pDOW3719DNAを鋳型として、プライマーnilA_MCS_SOER5’-GAATGGTGAAACCTCTAGATTAATTAAGGATCCCCGGGTACCGAAAAGCCCGACATTGC-3’;配列番号20と対になるプライマーnilA5’5’-CCGGCTCTTCCAGCTCCTCATGCACGAACAACGAGAAACGAGC-3’;配列番号19と一緒に使用して増幅し、約800bpの断片を得た。nilA遺伝子座の第2の部分は、鋳型としてpDOW3719DNA、およびプライマーnilA3’5’-GGAATTCTCAGTGGCTTTCATGGGTTTTCTCG-3’;配列番号22と対になるプライマーnilA_MCS_SOEF5’-GCAATGTCGGGCTTTTCGGTACCCGGGGATCCTTAATTAATCTAGAGGTTTCACCATTC-3’;配列番号21を使用して増幅し、約900bpの断片を得た。次いで、得られた断片をゲル精製しNUCLEOSPIN商標、CLONTECH;MountainView、CA、プライマーnilA5’およびnilA3’と一緒に鋳型として増幅に使用し、1.6kbpの断片を得た。この配列は配列番号23として開示するnilAMCS。得られた断片はPvuIおよびSapINEBで消化し、同一制限酵素で消化したpBCSKsacBIDNAINVITROGENにT4DNAリガーゼNEBを使用してライゲートした。大腸菌EcoliTOP10細胞をこのライゲーション混合物で形質転換し、形質転換体を、30μg/mLクロラムフェニコール補充のLB大豆寒天培養基TEKNOVA;Hollister、CA上で選択した。クローンは、PvuIおよびKpnINEBを使用する制限消化によってスクリーニングした。陽性クローンのnilA遺伝子座領域は確認された配列であり、得られたプラスミドはpDOW3721と命名した。pDOW3721の特徴は、制限酵素SphI、KpnI、SmaI、BamHI、PacI、AseIおよびXbaIに対する認識配列を含有する多重クローニング部位MCSが、852bpのLBA4404誘導塩基により1つの側に隣接されており、745bpのLBA4404誘導塩基によりもう1つの側に隣接されていることである。したがって、外来性DNA断片はpDOW3721のMCSへクローニングし、それから、LBA4404誘導隣接配列により介在される相同組換えによってLBA4404の染色体nilA遺伝子座へ組み込むことができる。このpDOW3721プラスミド配列全体をLBA4404染色体へ組み込む手段による、単一クロスオーバー事象は、スクロース含有培養基上の対抗選択によって二重クロスオーバー事象へ分けることができる。このような培養基では、スクロースは、sacB遺伝子によってコードされているSacBタンパク質によって酵素性分解の際に毒性生成物に変換されるReidおよびCollmerGene57239246Quandtら、Gene1271521。したがって、スクロース含有増殖培地上で生存し得る形質転換体は、組み込まれた外来性DNA断片を含有する破壊nilA遺伝子座を残して、染色体からpDOW3721プラスミドベクター骨格を除く、第2のクロスオーバー事象を経ている。ベクター骨格配列の導入がかなり一般的であるという多くの報告が過去10年間に開示されている。形質転換体で骨格配列が得られる植物の割合は典型的には20~50の間の範囲にあり、時に、75以上の高い割合があった。pDOW3721の有用性の1つの例証として、14.8KpnIVirBCDG断片をプラスミドpSB1から調製し、T4DNAリガーゼを使用して、KpnIで消化したpDOW3721DNAへライゲートした。大腸菌EcoliTOP10細胞がこのライゲーション混合物で形質転換され、形質転換体が30μg/mLクロラムフェニコール補充のLB大豆寒天培養基上で選択された。クローンは、EcoRIおよびHindIIIを用いる制限消化によってスクリーニングした。得られたプラスミドはpDOW3722と命名した。nilAの上流および下流のヌクレオチド配列の同定プラスミドpDOW3719のゲノム組込みを含有している図2および実施例18、アグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのLBA4404nilA-int1株を使用して、nilAゲノム領域の上流および下流に位置している付加配列を同定した。pDOW3719は、PCR-BLUNTII/XL-TOPO登録商標INVITROGENへクローニングされたアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensLBA4404株nilA遺伝子座の1,796bpのPCR増幅産物を含有する。このプラスミドは、相同組換えによりアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensLBA4404株のゲノムへ組み込まれた。この組込みプラスミドを含有したコロニーは、カナマイシンに対する耐性により同定した実施例17。この組込みプラスミド、またその内部に含有されたエレメントは、プラスミドレスキュー技術による付加ヌクレオチド配列の単離および特性決定にツールとして使用することができる。ゲノムDNAgDNAは、細菌性ゲノムDNA単離のプロトコルSambrookら、前掲によってLBA4404nilA-int1株の細胞から調製した。1マイクログラムのgDNAを以下の酵素すべてNEBから得られたもので個別に消化した:HindIII、BamHI、PstI、AscIおよびSacII。これらの制限酵素は、nilA遺伝子座の上流および下流にマップするgDNA断片を特異的に得るために選択された。認識部位がpDOW3719配列内に特有であることから、HindIII、BamHIおよびPstIの制限酵素が選択された。さらに、これらの酵素認識部位は、nilA遺伝子座増幅産物断片とPCR-BLUNTII/XL-TOPO登録商標ベクターの間の結合点に配置されている図2。したがって、これらの酵素によるgDNAの切断と得られた断片の自己ライゲーションにより、pDOW3917プラスミドのM13フォワードユニバーサルプライマーまたはM13リバースユニバーサルプライマー結合部位に隣接してライゲートされている、特性決定されていないゲノム配列を含有するプラスミドレスキュー断片が生じる。このようなクローンは、pDOW3917により保持されているカナマイシン耐性遺伝子に対する選択で、ライゲーション混合物を大腸菌Ecoli細胞に形質転換することにより単離される。さらに、pDOW3719プラスミドは、AscIおよびSacII制限酵素に対する認識部位を含有していない。したがって、これらの制限酵素により生成されるgDNA断片は、組込みpDOW3719プラスミド配列の全長に及び、組込みpDOW3719プラスミドの両側に隣接するgDNA領域を含む、キメラDNA断片を生成する。上記のような制限酵素消化から得られたgDNA断片は、T4リガーゼROCHEAPPLIEDSCIENCES;Indianapolis、INを使用して、自己ライゲートされた。ライゲーション生成物は、大腸菌EcoliONESHOT登録商標TOP10CELLSINVITROGENに形質転換され、カナマイシン50μg/mLを含有するLB培地上で平板培養した。個別のコロニーが選択され、プラスミドDNAが単離され、プラスミド制限酵素消化パターンにより特性決定された。相互に比較した場合に一貫した制限酵素消化バンドパターンを示すプラスミドを含有するクローンを、シークエンシング反応で使用するために用いた。nilA遺伝子座から得たgDNAの上流および下流のヌクレオチド配列は、ゲノムウォーキング技術を使用して決定した。知られているgDNA配列に対応するシークエンシングプライマーpDOW3719中に存在する場合が設計され、製造者BECKMANCOULTER;Fullerton、CAの情報に従い、CEQ商標DYETERMINATORCYCLESEQUENCINGKITを使用した。決定した配列から、以前は未知であったゲノム配列に配置されている、第2のプライマーのセットを設計し、追加のシークエンシングデータを得るために使用した。利用可能なgDNAヌクレオチド配列がすべて決定されるまで、この方法を繰り返した。この技術により、nilA遺伝子座から上流の2,936bpの配列と、nilA遺伝子座から下流の4,361bpの配列を得た。以前に同定されたnilA遺伝子座の1,796bpと組み合わせて、新しく同定された上流および下流の隣接配列領域は、nilAゲノム領域を含む9,093bpの配列配列番号24をカバーし、これは、もともと同定されているnilA遺伝子座から両方向に伸展している。LBA4404nilAゲノム領域へ組込みを行うためのベクターの構築外来性DNA配列のアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensLBA4404nilAのゲノム領域への相同性による組込みを行うための組込みベクターを設計し、構築した。nilA遺伝子座にまたがるnilAゲノム領域の6.3kbpの断片は、FAILSAFE商標PCRKITEPICENTRE登録商標、Madison、WIを使用し、PCR増幅した。増幅した断片は、PCR登録商標8/GW/TOPO登録商標ベクターINVITROGENへライゲートされ、陽性クローンが制限酵素消化およびDNA塩基配列検証により確認された。得られたベクター、pDAB9615は、特有の重複制限酵素認識部位を含有するオリゴヌクレオチド断片の付加によりさらに改変させた。nilAゲノム領域の3,244bp領域および3,128bp領域により隣接されている、これらの制限部位は、外来性ヌクレオチド配列を導入するためのクローニング部位として有用である。得られたベクターはpDAB9618と命名した図3。pSB1の14.8KpnIVirBCDG断片および細菌性カナマイシン耐性遺伝子を含有する15,549bp断片を、KpnIプラスBst1107IでpDAB9292DNAを消化することにより調製した。次いで、この断片を、KpnIプラスSwaIで消化したpDAB9618のDNAにライゲートし、ベクターpDAB9621を得た図3。次いで、GATEWAY登録商標反応を使用して、3kbpのLBA4404nilAゲノム領域配列によりそれぞれの側に隣接されている、14.8KpnIVirBCDG断片および細菌性カナマイシン耐性遺伝子を含有するpDAB9621の部分を、ANL-RCLONASE登録商標反応INVITROGENによりGATEWAY登録商標PDEST商標14ベクターへ移入した。得られたプラスミド、pDAB9698図3、配列番号25が制限酵素消化およびDNAシークエンシング反応により確認された。pDAB9698は、14.8KpnIVirBCDG断片上に保持されているpSB1由来のpTiBo542誘導vir遺伝子をアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensLBA4404株のnilA染色体領域へ組み込むために組込みベクターとして利用した。相同組換えによる14.8KpnIVirBCDG断片の染色体組込みプラスミドpDAB9698のDNAは、NUCLEOBOND登録商標AXANIONEXCHANGECHROMATOGRAPHYPLASMIDDNAISOLATIONKITMACHEREY-NAGELを使用して得た。この精製プラスミドDNAを、アグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensLBA4404CELLSINVITROGENへエレクトロポレートした。簡潔に説明すると、500ngのプラスミドDNAをこれらの細胞と4°Cで10分間インキュベートした。この混合物を、氷冷した0.2cmのGENEPULSER登録商標CUVETTEBIO-RADへピペットで移し、以下の設定でBIO-RADGENEPULSERを使用してエレクトロポレートした:キャパシタンスアウトプット25μFarad、キャパシタンスエクステンダー960μFarad、抵抗200オーム、および電圧2.5kV。エレクトロポレーション直後に、950μLのSOC培地INVITROGENを加え、その混合物をFalcon2059チューブBECTONDICKINSONANDCO.;FranklinLakes、NJに移した。次いで、形質転換細胞を28°Cで5~6時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、カナマイシン50μg/mL含有の個別のYEP中板上で平板培養した。プレートを逆さにして28°Cで36~48時間増殖させた。単一コロニーを選抜し、28°Cで約36時間、5mLのカナマイシン50μg/mL含有液体YEP中で増殖させた。これらの培養物を使用して、等量の100滅菌済みグリセロールとの激しい混合によってグリセロールストック培養物を調製した後、-80°Cで凍結保存した。14.8KpnIVirBCDG断片の染色体組込みの表現型および分子の確認複製のcolE1起源を有するpDAB9698は、アグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciens細胞で自発的に自己複製するとは予想されない。したがって、pDAB9698DNAのLBA4404細胞への形質転換に際して、安定性のあるカナマイシン耐性は、pDAB9698のDNAの自発的に自己複製するアグロバクテリウムAgrobacterium遺伝因子への組込みから得られる。これらのプラスミド組込み体は、本明細書に記載のアグロバクテリウムAgrobacterium株およびそれらを使用するための方法に関する各種実施形態に従って使用することができる、4つのクラスに分類される。第1のクラスは、pDAB9698DNAが非相同性組換えによりnilAゲノム領域から遠位へ組み込まれた細胞を含む。これらの細胞は、14.8KpnIVirBCDG断片に隣接するカナマイシン耐性遺伝子によりカナマイシン耐性であるはずであり、さらに、pDAB9698骨格ベクターpDEST商標14に保持されているアンピシリン耐性遺伝子によりアンピシリンに耐性があるはずである。第2のクラスは、pDAB9698に存在するpTiBo542誘導VirBCDG遺伝子およびpAL4404に存在するpTiACH5誘導VirBCDG遺伝子により介在される相同組換えによって、pDAB9698DNAが自発的に自己複製するpAL4404Tiヘルパープラスミド本来LBA4404内に存在するへ組み込まれた細胞を含む。これらの細胞もまた、カナマイシンおよびアンピシリンの両方に耐性があるはずである。第3のクラスは、pDAB9698に保持されている約3kbpのnilAゲノム領域配列、pSB1の14.8KpnIVirBCDG断片およびカナマイシン耐性遺伝子を含有する15,549bp断片に隣接するもののいずれかにより介在される単一相同組換えクロスオーバー事象によって、pDAB9698DNAがLBA4404nilAゲノム領域へ組み込まれた細胞を含む。これらの細胞もまた、カナマイシンおよびアンピシリンの両方に耐性があるはずである。第4のクラスは、上記の第3のクラスの細胞の単一クロスオーバー事象が、単一クロスオーバー事象の結果として生じるここで複製された3kbpのnilAゲノム領域配列により介在される第2のクロスオーバー事象を経る細胞を含む。単一クロスオーバー事象を生じる隣接する3kbpのnilAゲノム領域配列のいずれかに依存して、また第2のクロスオーバー事象を生じるこれらの隣接する配列のいずれかに依存して、得られた細胞は、カナマイシン感受性であるかアンピシリン耐性のいずれかであり、またはカナマイシン耐性およびアンピシリン感受性であるはずである。本明細書に記載の好ましい細胞は後者のクラス、すなわち、カナマイシン耐性およびアンピシリン感受性である細胞を含む。pDEST商標14プラスミド骨格を含有しない、これらの二重クロスオーバーの事象は、これらが余分の遺伝因子、例えばcolE1複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有していないので望ましい。実施例21で単離された推定上の形質転換体は、望ましい二重相同組換えによる組込み事象のためにスクリーニングした。pSB1の14.8KpnIVirBCDG断片およびカナマイシン耐性遺伝子を含有しておりまたpDEST商標14ベクター骨格を欠損している15,549bp断片を有するカナマイシン耐性単離物は、アンピシリンに対する感受性により同定した。推定上の形質転換体は、28°Cで約36時間、カナマイシン50μg/mLを含有するYEP3mLで増殖させた。次いで、これらの培養物は、以下μg/mLの濃度のような各種の単一抗生物質を含有する固体YEP培地上に平板画線した:リファンプシンRifampcin、100;カナマイシン、50;ストレプトマイシン、125;クロラムフェニコール、50;エリスロマイシン、200;テトラサイクリン、12.5;およびアンピシリン、100。プレートを28°Cで48時間インキュベートし、コロニー増殖を記録した。カナマイシン、リファンピシン染色体マーカーおよびストレプトマイシンに耐性があった株が同定されたpAL4404マーカー;Oomsら、前掲。さらに、この株はクロラムフェニコール、エリスロマイシンおよびテトラサイクリンに感受性であった。最も重要なのは、この株はアンピシリン感受性であった。この薬剤スクリーニング表現型は望ましい二重クロスオーバー相同組換え事象を示すが、この場合、pSB1の14.8KpnIVirBCDG断片およびカナマイシン耐性遺伝子を含有する15,549bp断片は、アグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensLBA4404染色体へ組み込まれる。この株はDAt16174と称する。DAt16174株のpTiBo542誘導VirBCDG遺伝子の存在は、分子の特性決定によりさらに確認した。DAt16174株のゲノムDNAは、細菌性ゲノムDNA単離プロトコルを使用して単離したSambrookら、前掲およびそれらの最新情報。PCRプライマーは、染色体に組み込まれたVirBCDG遺伝子のオーバーラッッピング断片を増幅するように設計した。表6に記載のプライマーを使用するPCR反応は、製造者の指示によりFAILSAFE商標PCRKITEPICENTRE登録商標を使用して完了した。組込みVirBCDG遺伝子の総分子サイズが大きいため、5つのオーバーラップ断片が得られるように増幅を行った。予想されるサイズの増幅産物を、製造者のプロトコルに従い、QIAEXIIGELEXTRACTIONKITQIAGEN;Valencia、CAを使用して、アガロースゲルから精製した。これらの断片は、PCR2.1登録商標-TOPO登録商標TACLONING登録商標KITINVITROGENを使用して、PCR2.1登録商標-TOPO登録商標TAベクターへクローニングした。PCR増幅産物のクローンを含有すると思われる細菌コロニーは、制限酵素消化により確認した。増幅産物断片のDNA配列は、CEQ商標DYETERMINATORCYCLESEQUENCINGKITを使用し、製造者の使用説明書に従って決定し、シークエンシングデータは、SEQUENCHER商標バージョン4.1.4ソフトウェアGENECODESCORP.;AnnArbor、MIを使用して分析した。得られた配列は、pSB1の14.8KpnIVirBCDG断片およびカナマイシン耐性遺伝子、プラス、nilAのゲノム領域に隣接する約3kbpの両配列を含有する全15,549bp断片にまたがり、nilAゲノム領域の上流および下流へさらに伸展している、22kbpの連続配列を生じたこれにより、pDAB9698に本来含有されていなかったLBA4404染色体配列を含む。DAt16174株のアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciens同定は、ケトラクトース試験により確認した。推定上の形質転換コロニーはラクトース寒天上で平板画線を行い、28°Cで48時間インキュベートした。次いで、プレートをベネディクト溶液で浸し、室温でモニターした。ベネディクト溶液と下層の寒天が青色から黄色に変化した単離物は、これによりアグロバクテリウムAgrobacteriumであると確認した。アグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのDAt16174株の特徴は、例えば、IncP、IncWまたはVS1のクラスの複製起点を有するバイナリーベクターからT-DNA遺伝子を移入するための植物形質転換剤として有利に使用することができることである。広義には、導入バイナリーベクターは、アグロバクテリウムAgrobacterium中の任意の複製可能なクラスの複製起点を有していてもよく、一方、DAt16174にあるpAL4404プラスミドの複製および関連する機能のpTi起点と適合し得る。したがって、プラスミドが適合可能な複製起点を有する場合すなわち、異なる不和合性グループである場合、複数のバイナリーベクタープラスミドはDAt16174株中に同時存在していてもよいことは、DAt16174株の使用可能な範囲内である。このような導入バイナリーベクターの選択は、カナマイシン、リファンピシンまたはストレプトマイシン耐性のいずれかを付与する細菌性選択可能なマーカー遺伝子に依存するべきではない。なぜならDAt16174株がこれらの3つの抗生物質に耐性であるからである。バイナリーベクターは、大腸菌EcoliおよびアグロバクテリウムAgrobacterium細胞の両方で自発的に自己複製することができる。これらは、形質転換植物細胞、クローニングリンカー、クローニングポリリンカー、または植物細胞形質転換の対象とされている遺伝子に対する導入部位として機能し得る別の配列の選択に機能する選択可能なマーカー遺伝子を含み得る、T-DNA右側境界反復および左側反復領域により囲まれている配列を含む。これらは、エレクトロポレーションによって、細菌接合で導入される、化学的介在性直接DNA形質転換によって、または別の方法によって、アグロバクテリウムAgrobacterium細胞に直接形質転換することができる。宿主細胞として使用されるアグロバクテリウムAgrobacteriumは、vir領域を有する少なくとも1個のプラスミドを保持する。vir領域は、T-DNAの植物細胞への移入に関与するすべての必要条件機能を果たすVirタンパク質を提供するのに必要である。一般に、vir領域を有するプラスミドは、T-DNA領域T-DNA右側および左側境界反復を含むが欠失した、変異型TiプラスミドまたはRiプラスミドヘルパープラスミドである。ヘルパープラスミドを含有しており、植物形質転換に有用なアグロバクテリウムAgrobacterium株の例としては、例えば、LBA4404、GV3101pMP90、GV3101pMP90RK、GV2260、GV3850、EHA101、EHA105およびAGL1が挙げられる。バイナリーベクター系の多くの例がHellensら2000TrendsPlantSci5446451により論じられている。さらに、pSB1プラスミド上に保持されている、pTiBo542誘導virBオペロン遺伝子virB1、virB2、virB3、virB4、virB5、virB6、virB7、virB8、virB9、virB10およびvirB11を含む、virG遺伝子、virCオペロン遺伝子virC1およびvirC2を含む、および遺伝子virD1を含むvirDオペロンの一部により[スーパーバイナリー系で使用される]LBA4404pSB1株に付与された植物形質転換の利点は、DAt16174株に保持される。上記で列挙したスーパーバイナリーvir遺伝子はLBA4404染色体へ組み込まれるので、DAt16174株はSUPERCHROME株と呼ばれる。スーパーバイナリー系とは反対に、DAt16174株を使用する場合、pSB1とpSB11などのシャトルベクターの間の相同組換えによる不安定なスーパーバイナリープラスミドの形成は必要とされない。SUPERCHROME株のさらなる利点は、植物形質転換において標準バイナリーベクターがこの株へ導入され得るということである。pDAB101556を保持する各種アグロバクテリウムAgrobacterium株で形質転換されたトウモロコシ組織の生化学的および分子的特性決定バイナリー植物形質転換ベクター、pDAB101556図5は、標準クローニング方法およびGATEWAY商標技術の組み合わせにより構築した。バイナリーベクターpDAB101556はプラスミドRK2のIncPタイプ複製起点に基づき、そのベクター骨格は、100μg/mLでスペクチノマイシンに対する耐性を付与する細菌遺伝子を保持する。T-DNA境界反復は、pTi15955のTL領域由来である。プラスミドpDAB101556のT-DNA領域の右側境界RBおよび複数の左側境界LB内には、位置している2つの植物発現可能なタンパク質コード配列CDSがある。第1の遺伝子選択可能なマーカーは、AAD1選択可能なマーカータンパク質に対するコード領域配列番号13米国特許第7,838,733号を含むが、これは関連するイントロン1を含む1,991bpのトウモロコシユビキチン1プロモーターの転写調節の下にある米国特許第5,510,474号。この遺伝子はトウモロコシリパーゼ3’UTRにより終止する米国特許第7,179,902号。第2の遺伝子選択可能なマーカーは、黄色蛍光タンパク質実質的に米国特許第7,951,923号に開示されているようなYFPに対するCDSを含み、この転写は、関連するイントロン1とともにトウモロコシユビキチン1プロモーターにより調節される。この遺伝子はトウモロコシPer53’UTRによって終止する米国特許第6,384,207号。プラスミドpDAB101556は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのLBA4404株の細胞へ順調に導入され、LBA4404pDAB101556株を得た。したがって、この株/プラスミドの組み合わせは、標準バイナリー植物形質転換系を含む。ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性により選択された形質転換体は、プラスミドDNAの制限酵素消化によって確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、-80°Cで保存した。LBA4404pDAB101556株のバルク細胞は、凍結グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例24で開示の方法によってトウモロコシ形質転換に使用した。プラスミドpDAB101556は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのDAt13192株の細胞へ順調に導入され実施例7を参照、DAt13192pDAB101556株を得た。したがって、この株/プラスミドの組み合わせは、組換え欠損のあるターナリー植物形質転換系を含む。エリスロマイシン、カナマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性によって選択される形質転換体はプラスミドDNAの制限酵素消化によって確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、-80°Cで保存した。DAt13192pDAB101556株のバルク細胞は、凍結グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例24で開示の方法によってトウモロコシ形質転換に使用した。DAt20711株へプラスミドpDAB101556のDNAを導入するいくつかの試みがなされた実施例9を参照組換え能の高いターナリー系。すべての事例において、プラスミドpDAB101556がこの株では不安定であることが判明し、Dat20711pDAB101556株は構築されなかった。プラスミドpDAB101556は、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのDAt16174株実施例22の細胞へ順調に導入され、DAt16174pDAB101556株が得られた。したがって、この株/プラスミドの組み合わせは、SUPERCHROME/バイナリー植物形質転換系を含む。ストレプトマイシン、カナマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性によって選択された形質転換体はプラスミドDNAの制限酵素消化によって確認した後、凍結グリセロールストックを調製し、-80°Cで保存した。DAt16174pDAB101556株のバルク細胞は、凍結グリセロールストックから接種した寒天平板から回収し、実施例24で開示の方法によってトウモロコシ形質転換に使用した。バイナリーベクターpDAB101556を保持するアグロバクテリウムAgrobacterium株によるトウモロコシの形質転換未熟胚生産。同系交配されたB104から得た種子を、METROMIX360SUNGROHORTICULTUREInc.;Bellevue、WAを入れた3.5インチSVD鉢に植えた。植物がV4~V5の成長段階に達したとき、添加剤として20グラムのOSMOCOTE19-6-12と20グラムのIRONITE商標を含む、METROMIX360とPROFILEGREENSGRADE焼成粘土PROFILEPRODUCTSLLC;BuffaloGrove、ILを1:1の混合で入れた4ガロン鉢へ移植した。外部光線が450W/m2を超えないならば、16:8の明光/暗光光周期になるまで1000WのHPS高圧ナトリウムおよび1000WのMH金属ハロゲン化物ランプセットの組み合わせを使用し、植物を温室で成長させた。形質転換用の未熟胚を得るために、同胞コントロールまたは自己受粉を行った。胚が約1.6~2.0mmのサイズであった場合、未熟胚は受粉後10~13日で単離した。感染および共培養。トウモロコシ穂は、20分間、LIQUINOX商標洗剤500mL当たり1または2滴を入れた市販の20漂白液に浸漬することによって表面殺菌し、滅菌水で3回すすいだ。バイナリーベクターpDAB101556を含有しているアグロバクテリウムAgrobacterium細胞の懸濁液は、20°Cで2~3日間、AB固形培地上で増殖した後、28°Cで1~2日間、YEP固形培地上で増殖した細菌から調製した。ABおよびYEPの両培地は、バイナリーベクターpDAB101556で試験した各アグロバクテリウムAgrobacterium株について実施例23で記載したような適切な補充抗生物質を含有していた。YEPプレートから掻き取った白金耳量の細胞を、MS塩Frameら、前掲、ISU改変MSビタミンFrameら、前掲、3.3mg/Lのジカンバエタノール、68.4gm/Lのスクロース、36gm/Lのグルコース、700mg/LのL-プロリンを含みpH5.2、100~200μMのアセトシリンゴンを含有する、10~15mLの液体感染培地へ移植した。この溶液は、均一な懸濁液になるまで、滅菌済み5mLピペットまたはボルテックスミキサーを使用して上下に穏やかにピペットで移し、Hewlett-PackardP8452a分光光度計を使用して、600nmで約1.0の吸光度OD600まで濃度を調節した。共培養。未熟胚は、2mLの感染培地を含有しているミクロ遠心分離管へ直接単離した。培地が除去され、1~2mLの新鮮な感染培地と置き換えられた後、1.5mLのアグロバクテリウムAgrobacterium溶液と置き換えられた。アグロバクテリウムAgrobacteriumおよび胚の溶液を室温で5分間インキュベートし、次いで、共培養培地MS塩、ISU改変MSビタミン、3.3mg/Lのジカンバエタノール、30gm/Lのスクロース、700mg/LのL-プロリン、100mg/Lのミオイノシトール、100mg/Lのカゼイン酵素加水分解物、15mg/LのAgNO3、100~200μMのアセトシリンゴン、および2.3gm/LのGELRITE商標SIGMA-ALDRICH;St.Louis、MOを含有、pH5.8に移した。共培養インキュベーションは、3日間、20°Cの暗所にて行った。休止および選択。共培養後、胚は、非選択MSベース休止培地MS塩、ISU改変MSビタミン、3.3mg/Lのジカンバエタノール、30gm/Lのスクロース、700mg/LのL-プロリン、100mg/Lのミオイノシトール、100mg/Lのカゼイン酵素加水分解物、15mg/LのAgNO3、0.5gm/LのMES、250mg/Lのセホタキシム、および2.3gm/LのGELRITE商標を含有、pH5.8に移した。インキュベーションは、7日間、28°Cで暗所にて継続した。7日の休止期の後、胚を選択培地に移した。植物で発現し得るaad-1選択可能なマーカー遺伝子を含有するスーパーバイナリーまたはバイナリープラスミドで形質転換されたトウモロコシ組織を選択するため、MSベースの休止培地上述をハロキシホップを補充して使用した。まず、100nMのハロキシホップを含有する選択培地Iに胚を移し、2週間インキュベートし、次いで、500nMのハロキシホップを含む選択培地IIに移し、さらに2週間インキュベートした。形質転換された単離物は、28°Cの暗所で約5週間かけて得た。必要ならば、回収された単離物は、さらに2週間、新しい選択培地IIに移すことによりバルクアップし、その後、再生培地に移した。トウモロコシ形質転換分野の当業者には、別の植物で発現し得る選択可能なマーカー遺伝子例えば、除草剤耐性遺伝子が用いられる場合、形質転換植物の別の選択方法が利用可能であることが理解されよう。再生I。選択ステップの後、培養物を、MS塩、ISU改変MSビタミン、60gm/Lのスクロース、350mg/LのL-プロリン、100mg/Lのミオイノシトール、50mg/Lのカゼイン酵素加水分解物、1mg/LのAgNO3、250mg/Lのセホタキシム、2.5gm/LのGELRITE商標および500nMのハロキシホップを含有するMSベースの再生培地IpH5.8に移した。インキュベーションは、28°Cの暗所で2週間継続した。再生II。培養を、pH5.8で、MS塩、ISU改変MSビタミン、30gm/Lのスクロース、100mg/Lのミオイノシトール、250mg/Lのセホタキシム、2.5gm/LのGELRITE商標、および500nMのハロキシホップを含有するMSベースの再生培地IIに移した。28°Cで3週間、白色蛍光条件約80μEm-2s-1で、16/8時間の光周期下に置いた後、苗を切除し、MS塩または1/2MS塩、ISU改変MSビタミン、0.5gm/LのMES、30gm/Lのスクロース、100mg/Lのミオイノシトール、2.5gm/LのGELRITE商標からなるMSベースのまたは1/2MSベースのシュート/根伸長培地pH5.8に移した。苗が長さ4~6cmに達したとき、これらをグロースチャンバーに、最終的には温室に移した。種子生産。再生された植物は、METROMIX360を入れた3.5インチのSVD鉢へ移植し、グロースチャンバーに置いて慣れさせた。植物がV3成長段階に達したときに、これらを温室に移し、V4/V5の成長段階で、添加剤として20グラムのOSMOCOTE19-6-12と20グラムのIRONITE商標を含む、METROMIX360およびPROFILEGREENSGRADE焼成粘土を1:1の混合で含有する、5ガロンの鉢へこれらを移した。植物は、16:8の明光/暗光光周期下の温室で成長させた。T1種子が調節受粉を行うことにより生成されたB104への戻し交雑。種子は、受粉の6週間後に回収した。操作したアグロバクテリウムツメファシエンスAtumefaciensのLBA4404pDAB101556株、DAt13192pDAB101556株およびDAt16174pDAB101556株を用いて、多重トウモロコシ形質転換実験を実施し、ハロキシホップの阻害濃度で選択したトランスジェニックカルスをこれ以降の苗再生とさらなる試験のために得た。合計で、16の事象がLBA4404pDAB101556形質転換で保持され、49の事象がDAt13192pDAB101556形質転換で保持され、60の事象がDAt16174pDAB101556形質転換で保持された表7。トランスジェニックT0植物のaad-1導入遺伝子のコピー数は、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用し、加水分解プローブアッセイBubnerおよびBaldwin、前掲により推定した。32P-標識化プローブとしてaad-1遺伝子のPCR増幅断片を使用して、セチルトリメチルアンモニウムブロミド抽出法により選択された事象から調製したNcoI切断DNAのサザンブロット解析を行った。さらに、pDAB101556起源の挿入骨格ベクター配列の存在を加水分解プローブ分析により検出した。したがって、DAt16174株、pAL4404上に保持されているpTiACH5-誘導vir遺伝子のフルセットを含み、LBA4404染色体のnilA遺伝子座へ組み込まれたpTiBo542-誘導vir遺伝子の部分的セットをさらに含むSUPERCHROME株は、形質転換トウモロコシ植物を効率的に生産することができる。さらに、ターナリー株を用いて得られた場合よりも全体的な形質転換効率は多少低いが、SUPERCHROMEで得られる事象の質は優れており、得られた事象の90は検出可能な骨格コンタミネーションのない単一コピー挿入物を有している。本発明を特定実施例の実施形態で記載したが、これは本発明のいくつかの態様を説明することを意図したものであり、本発明は、本開示の趣旨および範囲内でさらに改変させることができる。したがって、本願は、その一般的な原則を使用する、本発明のあらゆる変化形態、利用または改良を網羅するものである。さらに、本願は、本発明が関連し、添付の特許請求の範囲内にある、当技術分野で公知または慣用の実施に入る場合、本開示から得られるそのような展開を網羅するものである。本明細書に引用されたすべての参考文献刊行物、特許および特許出願を含むは、あたかもそれぞれの参考文献が、個別にまたは詳細に参照により組み込まれることを示すのと同程度まで、また、その全体が本明細書で述べられているのと同程度まで、これによって参照により援用されるものとする。本明細書で論じられている参考文献は、本願の出願日前にそれらの開示が提供されているにすぎない。本発明者らが先発明によるそのような開示に先行する権利がないということを承認するものと解釈されるべきではない。"