"予防的に有効な量の第1免疫原性薬剤または前記の第1免疫原性薬剤をコードする核酸、予防的に有効な量の第2免疫原性薬剤または前記の第2免疫原性薬剤をコードする核酸、予防的に有効な量の第3免疫原性薬剤または前記の第3免疫原性薬剤をコードする核酸、および医薬的に許容できるキャリヤーを含み、その第1免疫原性薬剤がウイルス株A/インドネシア/CDC669/2006H5N1のヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含み、その第2免疫原性薬剤がウイルス株A/ベトナム1203/2004H5N1のヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含み、その第3免疫原性薬剤がウイルス株A/安徽/1/2005H5N1のヘマグルチニンもしくはその抗原性ペプチドまたは前記の第3免疫原性薬剤をコードする核酸を含む、汎用H5N1ワクチン組成物。その第1、第2および第3免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンを含む、請求項1に記載の組成物。その第1、第2および第3免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンの抗原性ペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。その第1、第2および第3免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンをコードする核酸を含む、請求項1に記載の組成物。その第1、第2および第3免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンの抗原性ペプチドをコードする核酸を含む、請求項1に記載の組成物。その第1、第2および第3免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンを提示する、または示すウイルスを含む、請求項1に記載の組成物。それぞれのウイルスがバキュロウイルスである、請求項6に記載の組成物。その第1、第2および第3免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンの抗原性ペプチドを提示する、または示すウイルスを含む、請求項1に記載の組成物。それぞれのウイルスがバキュロウイルスである、請求項8に記載の組成物。予防的に有効な量の請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象においてトリインフルエンザウイルスに対する免疫応答を調節するための方法。請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物を対象に投与することを含む、トリインフルエンザウイルスと関係する疾患を処置または予防するための方法。対象において免疫応答を調節するための、請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物の使用。対象においてトリインフルエンザウイルスと関係する疾患を処置または予防するための、請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物の使用。医薬品における使用のための、請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物。対象における免疫応答の調節における使用のための、請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物。対象におけるトリインフルエンザウイルスと関係する疾患の処置または予防における使用のための、請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物。対象において免疫応答を調節するための医薬の製造のための、請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物の使用。対象においてトリインフルエンザウイルスと関係する疾患を処置または予防するための医薬の製造のための、請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物の使用。0026本発明は汎用H5N1ワクチンに関する。より具体的には、本発明は、ほとんどのH5N1系列の間でヘマグルチニンの中和エピトープにおいて全変異株をカバーする3種類のH5N1株の同定に関する。本発明はさらに、その3種類のH5N1株を含む、またはこれらの3種類の株のそれぞれのヘマグルチニンペプチドを含む汎用H5N1ワクチンに関する。0027別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明単数または複数が属する技術の当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書における開示全体を通して参照される全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、Genbankの配列、ウェブサイトおよび他の出版物を、それらが開示している全てに関してそのまま援用する。0028現行のH5N1ワクチン候補は対応するクレード内のほとんどの分離株の優れた抗原的保護範囲を提供し続けているが、最近クレード1、2.2および2.3自体内の一部のウイルスが抗原的異種性の証拠を示していることが認識されている。H5N1ウイルスは既に多数の亜系列sublineagesまたはクレードに分かれているため、本発明は、H5亜型の間の、特に中和エピトープの領域における変異を代表するワクチン株の分析および選択を提供する。本発明に従うそのようなワクチン株の選択は、ほとんどのH5N1系列に対する広い範囲の保護を提供する。0029本明細書で示したように、完全にインフルエンザのHAに基づく汎用ワクチンの開発は、いくつかのHPAIH5N1クレードの間の中和エピトープの変異または保存を同定することができるならば、実行可能である。そのような中和エピトープの分布パターンを理解することは、そのワクチン組成物中に2種類以上の理想的なH5N1株を組み込むことによる汎用ワクチンの設計を助けた。選択されたウイルス株の中和エピトープは、ほとんどのH5N1亜型に対する広い範囲の防御免疫を獲得するために、ほとんどのH5亜型の間の変異をカバーしている。モノクローナル抗体による中和から逃れた変異株のHA配列内のアミノ酸置換を同定する以前の試みは、HAの中和エピトープ部位を明らかにした。以前の発見に加えて、本発明は中和モノクローナル抗体を用いてそれらのアミノ酸配列を位置付けることによるH5N1の他の主な中和エピトープの同定を提供する。H5亜型の間の全ての同定された中和エピトープの分布の分析は、ヒトおよびトリ両方の源からのH5N1亜型の抗原決定基内の変異を明らかにした。これらの結果に基づいて、本発明はそのH5N1系列内の全変異株をカバーするHAの主な中和エピトープを含む3種類のワクチン株を提供する。インビボで保護の広い範囲を試験して実証するため、選択されたワクチン株のHAタンパク質をバキュロウイルスの表面上で発現させ、そのワクチン配合物の有効性を、系統的に異なるH5N1株で負荷をかけたマウスモデルにおいて評価した。0030本発明に従って、その汎用ワクチン開発戦略は3つの工程を含んでいた:i中和モノクローナル抗体n-mAbを用いるH5N1ウイルスのヘマグルチニンの中和エピトープの位置づけ;ii全てのH5N1系列の間の中和エピトープの分布の分析;およびiii全H5N1ウイルスの中和エピトープ内の変異をカバーする理想的なワクチン株の選択。本発明に従って、5種類のn-mAb6B8、4C2、2D9、4F8および3H11の集団を用いてH5N1ウイルスの中和エピトープを位置付けた。n-mAbによる中和エピトープの位置付けは、138または155または189または223位におけるアミノ酸がH5N1ウイルスのヘマグルチニンの主な中和エピトープの形成に関わっていることを明らかにした。加えて、主な中和エピトープの一部として同定された他のアミノ酸140、159、194および218も、それに続く分析に関して考慮に入れた。本明細書で示すように、H5N1ウイルスの主な中和エピトープの配列の、インフルエンザ研究データベースとの比較は、全てのヒトおよびトリH5N1ウイルスのヘマグルチニンのエピトープ領域内の変異を明らかにした。下記の表2を参照。0031本明細書で記述されるエピトープ分布分析に基づいて、集合的に全てのH5N1亜型の間の変異を代表するために、3種類の異なる株、A/インドネシア/CDC669/2006H5N1クレード2.1、A/ベトナム/1203/2004H5N1クレード1.0および安徽/1/2005H5N1クレード2.3が選択された。その選択されたワクチン株を、異なる中和mAbとの反応性パターンに関して、ウイルス中和およびHI力価により確認した。下記の表4Aおよび4Bにおいて示すように、n-mAb4C2および4F8はA/インドネシア/CDC669/2006H5N1株のみを認識し、A/ベトナム/1203/2004H5N1およびA/安徽/1/2005H5N1株とは反応しなかった。この反応性のパターンは、A/インドネシア/CDC669/2006H5N1株は189位においてArgを有し、一方でA/ベトナム/1203/2004H5N1およびA/安徽/1/2005H5N1株では同じ位置にLysが存在するため、おそらく189位におけるアミノ酸の変化によるものである可能性がある。一方、n-mAb6B8はおそらく189位における共通の残基Lysの存在のためA/ベトナム/1203/2004H5N1およびA/安徽/1/2005H5N1株の両方と反応する。同様に、155位のアミノ酸はH5N1株の抗体認識に重大な影響を有することも分かっている。さらに、下記の表2において示すように、150のループは2種類の変異型を有し、ヒトH5N1分離株の63.4はこの位置においてアミノ酸Serを有し、残りの34.4はアミノ酸Asnを有する。また、HAの受容体結合部位に位置する189位におけるアミノ酸は、全てのH5N1のヒトの株の64.26においてアミノ酸Argを含有し、一方で残りの34.65はこの位置においてアミノ酸Lysを有する。従って、本発明に従って選択されたワクチン株はヒトおよびトリ両方のウイルスが含まれる全てのH5N1系列のほとんど99の主な抗原性エピトープ内の変異を代表するはずであると推測するのは理にかなっている。0032選択した株のHAタンパク質をそれぞれバキュロウイルスの表面上で発現させ、そのワクチン配合物をマウスモデルにおいて評価した。昆虫および哺乳類細胞におけるインフルエンザH5ヘマグルチニンの高レベル発現を促進するため、WSSVの最初期プロモーター1ie1を有する組み換えバキュロウイルスを構築した。ie1の最初期プロモーターとしての性質は、そのバキュロウイルスのライフサイクルの初期相におけるそのタンパク質の発現を支持し、結果としてそのバキュロウイルスのエンベロープ上の機能するヘマグルチニンの増進された提示をもたらす。そのタンパク質を獲得するためのバキュロウイルスに関する必要条件として、そのHAタンパク質の宿主細胞膜への効率的な輸送のためにオリゴマー化が必要であるため、そのバキュロウイルスの表面上に示されたHAはそれらのオリゴマーの形で提示されていたはずであると推定される。従って、このモデルはそのタンパク質の天然の構造を真似るのを助け、そうして野生型インフルエンザウイルスを模倣するであろう。そのバキュロウイルスの表面上に示されたHAは、血球凝集活性およびHA0のHA1およびHA2への信頼のおける切断により証明されるように、その天然の構造を保持していたデータは示していない。バキュロウイルスで発現させたインフルエンザのヘマグルチニンHAは一般に昆虫細胞では切断されないが、その切断部位に多数の塩基性アミノ酸を有する高病原性トリインフルエンザウイルス例えばH5およびH7はトリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼの非存在下でHA1およびHA2サブユニットに切断されることが示されている。本試験におけるHA0の部分的な切断は、おそらく昆虫細胞におけるサブチリシン様プロタンパク質コンバターゼ類PCの存在によるものである可能性があり、それの基質特異性および阻害因子プロフィールは哺乳類のPC類と同じである。0033本明細書で示すように、A/インドネシア/CDC669/2006H5N1、A/ベトナム/1203/2004H5N1またはA/安徽/1/2005H5N1からのHAを示すそれぞれのバキュロウイルスの抗原性補強したadjuvanted混合物Tri-BacHAの皮下免疫は、それの抗原性補強していない対応物と比較した場合に、血清HI力価を有意に高める。さらに、抗原性補強したTri-BacHAをワクチン接種したマウスのHI力価は、抗原性補強した全RG-H5N1ウイルスまたは抗原性補強したH5N1-A/ベトナム/1203/2004H5N1のHAを示すバキュロウイルスMono-BacHAをワクチン接種したマウスのHI力価A/ベトナム/1203/2004H5N1に対すると比較可能であった。加えて、抗原性補強したTri-BacHAはより高い中和抗体力価を誘導し、それは抗原性補強していないTri-BacHAと比較して様々なクレードクレード1.0、クレード2.1、クレード2.2、クレード4.0、クレード7.0およびクレード8.0からの異種のH5N1株の100TCID50を効率的に中和した。抗原性補強したMono-BacHAまたは不活化RG-H5N1ワクチンのみを含有するワクチン配合物は、クレード1同種、クレード2.1およびクレード8.0を中和することができたが、他のクレードクレード2.2、クレード4.0およびクレード7.0からのH5N1ウイルスを効率的に中和しなかった。抗原性補強したTri-BacHAワクチン配合物の強いクレードをまたぐ免疫は、H5N1系列の中和エピトープ内の変異をカバーしていることによるものである可能性がある。0034そのワクチンの保護的有効性を、ワクチン接種したマウスにクレード1、クレード2.1およびクレード7からのH5N1株を用いて負荷をかけることにより評価した。本明細書で示すように、抗原性補強したTri-BacHAまたはMono-BacHAまたはクレード1.0およびクレード2.1に対する不活化全ウイルスワクチンをワクチン接種したグループに関して100パーセントの生存率が得られた。加えて、抗原性補強したTri-BacHAは何の感染症状もなくクレード7.0H5N1ウイルスに対して100の保護を提供した。しかし、抗原性補強した不活化全ウイルスワクチンおよびMono-BacHAは、クレード7.0H5N1の感染に対してそれぞれ66.6および83.3の保護しか提供しなかった。また、感染の進行はその異なるグループにおける体重の減少の異なる傾向により示された。抗原性補強したMono-BacHAまたは抗原性補強した全ウイルスワクチンをワクチン接種したマウスは、クレード7.0に対して6日目において17までのより高い体重の減少を示した。これは、単価ワクチンは多様なH5N1亜型に対する保護を与えることができないことを示しており、それは異なるウイルス亜型の抗原決定基例えば中和エピトープ内の変異によるものである可能性がある。0035要約すると、3種類の選択されたワクチン株からのヘマグルチニンを示すバキュロウイルスによるマウスの皮下免疫は全身的な免疫応答を誘導し、何の臨床症状もなしにH5N1ウイルス感染に対する交差保護を示した。また、本発見は、亜型間の中和エピトープ内の変異に基づくワクチン株の選択は新しく生じたH5N1変異体により仲介される感染を防ぐのを助けるであろうことを明らかにした。この試験において用いられたワクチン配合物は、何の生物安全性の懸念もなしに迅速に生成された。HAを示すバキュロウイルスは、世界的流行および世界的流行前の状況におけるワクチンに関する理想的な選択肢として役立ち、高度な生物封じ込めbiocontainment施設または退屈なタンパク質精製プロセスを必要としないワクチン技術を促進するであろう。0036本明細書で用いられる際、用語処置するおよび処置は、形はどうであれ病気もしくは症状を治療する、病気もしくは疾患の確立を予防する、またはそうでなければ病気もしくは疾患もしくは他の望ましくない症状の進行を防ぐ、妨げる、遅くする、改善する、もしくは逆転させる、あらゆるおよび全ての使用を指す。0037本明細書で用いられる際、用語有効量または予防的に有効な量には、その意味の範囲内に、非毒性であるが十分な量のその望まれる作用を提供するための薬剤または化合物が含まれる。例えば、免疫応答の調節に関する予防的に有効な量は、その対象においてその免疫応答を調節する望まれる作用を提供するその薬剤または化合物の量である。同様に、トリインフルエンザウイルスと関係する疾患の処置または予防に関する予防的に有効な量は、その対象においてその疾患を処置または予防する望まれる作用を提供するその薬剤または化合物の量である。必要とされる正確な量は、処置される種、その対象の年齢および全身状態、処置される病気の重篤さ、投与される個々の薬剤、ならびに投与の方式等のような要因に依存して対象ごとに異なるであろう。従って、正確な有効量を具体的に述べるのは不可能である。しかし、あらゆる所与の場合に関して、当業者は適切な有効量を型にはまった実験法のみを用いて決定することができる。0038本明細書で用いられる際、用語ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸残基のポリマーを、およびその断片、変種、類似体、オルソログまたは相同体を指して互換的に用いられる。従って、これらの用語は、1個以上のアミノ酸残基が合成による天然起源でないアミノ酸、例えば対応する天然起源アミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然起源アミノ酸ポリマーの両方に適用される。0039本明細書で用いられる際、用語ポリヌクレオチドまたは核酸は互換的に用いられ、1個以上のヌクレオチドを含む分子、またはオリゴヌクレオチド、またはその断片を意味し、それにはRNAもしくはDNAヌクレオチドまたはそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。0040本明細書で用いられる際、語句H5N1亜型トリインフルエンザウイルスと関係する疾患は、H5N1亜型トリインフルエンザウイルスにより引き起こされる、またはH5N1亜型トリインフルエンザウイルスと関係するあらゆる疾患、疾患状態または障害を意味する。0041本明細書で用いられる際、用語調節するは、免疫応答に関連して用いられる場合、抗原に対する免疫応答を直接的にまたは間接的にのどちらかで増大または減少させることを意味する。ワクチンは典型的には抗原に対する免疫応答を増大させる。0042従って、第1観点において、本発明は対象における疾患の処置または予防のための汎用H5N1ワクチンを提供し、ここでその疾患はトリインフルエンザウイルスのH5N1亜型と関係している。1態様において、その汎用H5N1ワクチンは予防的に有効な量の第1免疫原性薬剤、予防的に有効な量の第2免疫原性薬剤および予防的に有効な量の第3免疫原性薬剤を含む。別の態様において、その対象はヒト、飼いならされた動物イヌ、ネコ、サル等;家畜ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等、野鳥野生のガン、野生のカモ等および飼いならされたトリニワトリ、アヒル、ガチョウ等であってよい。00431態様において、それぞれの免疫原性薬剤はヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分またはヘマグルチニンもしくはそれの抗原性部分をコードする核酸を含む。本明細書で用いられる際、ヘマグルチニンの抗原性部分はその中和エピトープが含まれるヘマグルチニンの部分を指す。追加の態様において、その抗原性部分にはヘマグルチニンのエピトープが含まれる。さらなる態様において、免疫原性薬剤はヘマグルチニンを含むウイルスである。別の態様において、そのウイルスは不活化されている。追加の態様において、そのウイルスは弱毒化ウイルスである。別の態様において、そのウイルスはビロソームの形である。さらなる態様において、そのウイルスは卵由来または細胞培養由来である。別の態様において、免疫原性薬剤はヘマグルチニンを含むスプリットウイルスまたはスプリットウイルス抗原性製剤である。1態様において、その免疫原性薬剤はヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分である。別の態様において、そのヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分は単離されたものである。追加の態様において、そのヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分は、ウイルス発現ベクターによりそれがそのウイルスの表面上に提示される、または示されるように生成される。1態様において、そのウイルス発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターであり、そのヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分を提示する、または示すウイルスはバキュロウイルスである。別の態様において、そのウイルス発現ベクター、例えば改変ワクシニアウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、ポックスウイルス発現ベクター、および同様のもの。1態様において、その免疫原性薬剤は対象において発現することができるヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分をコードする核酸である。00441態様において、その免疫原性薬剤は同じ種類のものであってよく、例えばそれらは全て不活化ウイルスまたはそのヘマグルチニンもしくはそれの抗原性部分を提示する、もしくは示すバキュロウイルスであってよい。別の態様において、その免疫原性薬剤は異なる種類のものであってよく、例えばその第1免疫原性物質は不活化ウイルスであってよく、その第2免疫原性薬剤はヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分を提示する、または示すバキュロウイルスであってよく、その第3免疫原性薬剤はこれらの2つの種類の内の1つと同じ種類または異なる種類であってよい。0045本発明に従って汎用H5N1ワクチンが調製され、ここでその第1免疫原性薬剤はウイルス株A/インドネシア/CDC669/2006H5N1のヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含み、その第2免疫原性薬剤はウイルス株A/ベトナム1203/2004H5N1のヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含み、その第3免疫原性薬剤はウイルス株A/安徽/1/2005H5N1のヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含む。本明細書で記述される場合、それぞれの免疫原性薬剤は、その明記されたウイルスのヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含む、またはコードするウイルス、タンパク質、ペプチド、核酸または同様のものであってよい。0046その免疫原性薬剤は、中性または塩の形として組成物中に配合されてよい。医薬的に許容できる塩類には酸付加塩類そのペプチドの遊離アミノ基により形成されるが含まれ、それは例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、および同様のもののような有機酸を用いて形成される。その遊離カルボキシル基により形成される塩類は、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または第2鉄のような無機塩基basis、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、および同様のもののような有機塩基basisに由来してもよい。0047一般に、適切な組成物は当業者に既知の方法に従って調製されてよく、医薬的に許容できる希釈剤、アジュバントおよび/または賦形剤が含まれてよい。その希釈剤、アジュバントおよび賦形剤は、その組成物の他の成分と適合可能であり、その受容者に有害でない点で許容できなければならない。0048医薬的に許容できる希釈剤の例は、脱塩水または蒸留水;生理食塩水溶液;植物に基づく油、例えばピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、例えばピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油またはヤシ油;ポリシロキサン類、例えばメチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサンおよびメチルフェニルポリシロキサンが含まれるシリコン油;揮発性シリコン類;鉱油、例えば流動パラフィン、ソフトパラフィンまたはスクアラン;セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース;低級アルカノール類、例えばエタノールまたはイソプロパノール;低級アラルカノール類aralkanols;低級ポリアルキレングリコール類または低級アルキレングリコール類、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコールまたはグリセリン;脂肪酸エステル類、例えばイソプロピルパルミテート、イソプロピルミリステートまたはエチルオレエート;ポリビニルピロリドン;寒天;カラギーナンcarrageenan;トラガカントガムgumtragacanthまたはアカシアガム、およびワセリンpetroleumjellyである。典型的には、そのキャリヤー単数または複数はその組成物の1重量から99.9重量までを形成するであろう。最も好ましくはその希釈剤は生理食塩水である。0049注射可能な溶液または懸濁液としての投与に関して、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤またはキャリヤーには、リンガー溶液、中鎖トリグリセリドMCT、等張生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノールおよび1,2プロピレングリコールが含まれることができる。経口使用のための適切なキャリヤー、希釈剤、賦形剤およびアジュバントのいつくかの例には、ピーナッツ油、流動パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアガム、トラガカントガム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンおよびレシチンが含まれる。加えて、これらの経口配合物は適切な香味剤および着色剤を含有していてよい。カプセルの形で用いられる場合、そのカプセルは崩壊を遅らせるグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートのような化合物でコートされていてよい。0050アジュバントには典型的には皮膚軟化薬、乳化剤、増粘剤、保存剤、殺菌剤および緩衝剤が含まれる。その組成物の調製において有用なアジュバントまたは免疫賦活性構成要素には、アルミニウム塩類、鉱油、ミコバクテリア製品例えば完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントまたはビヒクル、例えば植物配糖体サポニン、コレステロールおよびホスファチジルコリンの混合物が含まれるが、それらに限定されず、それは数コピーのそのタンパク質をかごのような構造上に提示するためのビヒクルを提供する。この明細書の目的に関して、アジュバントは免疫原または抗原に対する免疫応答を強調する、増大させる、加減する、または増進する物質である。アジュバントは典型的には体液性および細胞性免疫応答の両方を増進するが、他方なしでのどちらかへの増大された応答はアジュバントと定義される資格がある。さらに、アジュバントおよびそれらの使用は免疫学者には周知であり、典型的には免疫原の用量が限られている場合、その免疫原の免疫原性が乏しい場合、またはその投与経路が最適以下である場合にその免疫応答を増進するために用いられる。従って、用語抗原性補強量adjuvatingamountは、所与の免疫原または抗原に対する免疫応答を増進することができるアジュバントの量である。抗原性補強量と等しい量は様々であると考えられ、その免疫原の特性、投与される免疫原の量、受容者の種、投与経路、およびその免疫原を投与するためのプロトコルが含まれるがそれらに限定されない様々な要因に依存する。その抗原性補強量は、特定の状況のセットが与えられれば、型にはまった実験法により容易に定量化することができる。これは十分に当業者の理解の範囲内であり、典型的には様々な量の投与される免疫原およびアジュバントに対する型にはまった用量応答決定の使用が用いられる。応答は、その免疫原に対して生じた血清抗体力価または細胞に仲介される応答を酵素結合免疫吸着immunosorbant測定法、放射性免疫測定法、血球凝集アッセイおよび同様のものを用いて決定することにより測定される。0051経口投与のための固体の形は、ヒトおよび獣医学の医薬的実施において許容できる結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、香味料、コーティング剤、保存剤、潤滑剤および/または時間遅延剤timedelayagentsを含有していてよい。適切な結合剤には、アカシアガム、ゼラチン、トウモロコシデンプン、トラガカントガム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリエチレングリコールが含まれる。適切な甘味料には、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンが含まれる。適切な崩壊剤には、トウモロコシデンプン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天が含まれる。適切な希釈剤には、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたはリン酸二カルシウムが含まれる。適切な香味剤には、ペパーミント油、ウィンターグリーンの油、サクランボ、オレンジまたはラズベリー香味料が含まれる。適切なコーティング剤には、アクリル酸および/またはメタクリル酸および/またはそれらのエステル類のポリマーまたはコポリマー、ろう剤、脂肪アルコール類、ゼイン、シェラックまたはグルテンが含まれる。適切な保存剤には、安息香酸ナトリウム、ビタミンE5アルファ-トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは重亜硫酸ナトリウムが含まれる。適切な潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクが含まれる。0052経口投与のための液体の形は、上記の薬剤に加えて、液体キャリヤーを含有していてよい。適切な液体キャリヤーには、水、油、例えばオリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、サフラワー油、落花生油、ヤシ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール類、トリグリセリド類またはそれらの混合物が含まれる。0053経口投与のための懸濁液は、さらに分散剤および/または懸濁化剤を含んでいてよい。適切な懸濁化剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウムまたはアセチルアルコールが含まれる。適切な分散剤には、レシチン、脂肪酸、例えばステアリン酸のポリオキシエチレンエステル類、ポリオキシエチレンソルビトールモノ-またはジ-オレエート、-ステアレートまたは-ラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノ-またはジ-オレエート、-ステアレートまたは-ラウレート、および同様のものが含まれる。経口投与のためのエマルジョンは、さらに1種類以上の乳化剤を含んでいてよい。適切な乳化剤には、上記で例示したような分散剤または天然ガム類、例えばグアーガム、アカシアガムまたはトラガカントガムが含まれる。0054非経口的に投与可能な組成物を調製するための方法は当業者には明らかであり、例えばRemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy第21版EdDBTroyLippincottWilliamsWilkinsBaltimore2006においてより詳細に記述されており、それを本明細書に援用する。0055その組成物はあらゆる適切な界面活性剤、例えば陰イオン性、陽イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばソルビタンエステル類またはそのポリオキシエチレン誘導体を組み込んでよい。懸濁化剤、例えば天然ガム類、セルロース誘導体または無機材料、例えばシリカ性silicaceousシリカ類、および他の成分、例えばラノリンも含まれてよい。0056その組成物の調製は、当業者に既知の型にはまった方法を用いる。典型的には、そのような組成物は液体溶液または懸濁液のどちらかとして注射可能なものとして調製され;注射前の液体中での溶解、または懸濁に適した固体の形が調製されてもよい。その製剤は乳化されていてもよい。その有効免疫原性成分はしばしば、医薬的に許容でき、その有効成分と適合可能である賦形剤と混合される。0057第2観点において、本発明は、対象に予防的に有効な量の汎用H5N1ワクチンを投与することを含む、トリインフルエンザウイルスに対する免疫応答を調節するための方法を提供する。その汎用H5N1ワクチンは上記で記述した通りのものである。その汎用H5N1ワクチンは単一の組成物として投与されるのが好ましいが、そのワクチンの個々の構成要素を別々に、しかし同時にその対象に投与することができるであろうことも意図されている。0058本発明の方法に従って、ワクチンおよび組成物はあらゆる適切な経路により、全身的に、局部的にまたは局所的にのいずれかで投与されてよい。あらゆる所与の状況において用いられるべき個々の投与経路は、処置される予定の疾患の性質、その疾患の重篤さおよび程度、送達される予定の個々の化合物の必要とされる投与量、ならびにその望まれるワクチンまたは組成物の可能性のある副作用が含まれるいくつかの要因に依存するであろう。0059例えば、適切な濃度のその望まれるワクチンまたは組成物がその処置される予定の部位に直接送達されることが必要とされる状況では、投与は全身的ではなく局部的であってよい。局部的投与は、非常に高い局所濃度のその望まれるワクチンまたは組成物をその必要とされる部位に送達する能力を提供し、従って望まれる療法的または予防的作用を達成する一方でその体の他の器官がそのワクチンまたは組成物に曝露されるのを避け、それにより潜在的に副作用を低減するのに適している。例として、本発明の態様に従う投与は、腔内、膀胱内、筋内、動脈内、静脈内、皮下、局所または経口が含まれるあらゆる標準的な経路により達成することができる。腔内投与は腹腔内または胸腔内であってよい。0060望まれるならば、持続放出または断続放出に適したその免疫原性薬剤を含有する装置または組成物を、そのような物質の体の中への比較的遅い放出のために、事実上体の中に移植する、またはそれに局所的に適用することができるであろう。0061発現ベクターまたは宿主細胞の投与には、直接経口摂取、全身性の注入による送達、もしくは選択された組織単数または複数もしくは細胞への送達が含まれてよく、または対象もしくは適合性の提供者から分離された細胞への送達により間接的に投与されてよい。核酸に基づく組成物に関して、そのような組成物の全ての送達の方式が本発明により意図されている。0062その組成物はリポソームの形で投与されてもよい。リポソームは一般にリン脂質または他の脂質物質に由来し、水性媒体中に分散した単または多層状水和液体結晶により形成される。リポソームを形成することができる、あらゆる非毒性の生理的に許容でき、代謝可能な脂質を用いることができる。リポソームの形の中の組成物は、安定剤、保存剤、賦形剤および同様のものを含有していてよい。好ましい脂質は、天然および合成両方のリン脂質およびホスファチジルコリン類レシチン類である。リポソームを形成するための方法は当技術において周知である。0063あらゆる個々の対象に関する投与される化合物の有効な投与レベルは、以下:処置される疾患のタイプおよびその疾患の段階;用いられる化合物の活性;用いられる組成物;その対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事;投与の時間;投与経路;化合物の隔離の程度;その処置の期間;その処置と組み合わせて、または同時に用いられる薬物が含まれる様々な要因に、当技術で周知の他の関連する要因と共に、依存するであろう。0064第3観点において、本発明は、対象に予防的に有効な量の汎用H5N1ワクチンを投与することを含む、トリインフルエンザウイルスと関係する疾患の予防または処置のための方法を提供する。その汎用H5N1ワクチンは、上記で記述した通りのものである。適切な組成物、投与および投与量は、上記で記述した通りである。0065第4観点において、本発明は、トリインフルエンザウイルスに対する免疫応答を調節するための汎用H5N1ワクチンの使用を提供する。その汎用H5N1ワクチンは、上記で記述した通りのものである。0066第5観点において、本発明は、トリインフルエンザウイルスと関係する疾患の処置のための汎用H5N1ワクチンの使用を提供する。その汎用H5N1ワクチンは、上記で記述した通りのものである。0067ワクチンを調製および投与するための方法は当技術で周知であり、米国特許第7,510,719号、第7,537,768号、第7,666,439号および第7,691,368号;米国特許出願公開第2008/0187557号、第2009/0136532号、第2009/0263422号、第2009/0304730号、第2010/0047271号、第2010/0074916号および第2010/0086485号;ならびに国際出願公開第WO2007/129984号、第WO2008/048984号、第WO2008/115314号、第WO2009/069447号、第WO2009/115917号、第WO2010/021289号および第WO2010/036948号により例示されており、それぞれ本明細書に援用する。0068本発明の実施は、別途示さない限り、化学、分子生物学、微生物学、組み換えDNA、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来の技法を用い、それは当業者の技術の範囲内である。例えば、Maniatisetal1982MolecularCloningSambrooketal1989MolecularCloning第2版SambrookandRussell2001MolecularCloning第3版Ausubeletal1992CurrentProtocolsinMolecularBiologyGlover1985DNACloningRussell1984MolecularbiologyofplantsalaboratorycoursemanualAnandTechniquesfortheAnalysisofComplexGenomesGuthrieandFinkGuidetoYeastGeneticsandMolecularBiologyHarlowandLane1988AntibodiesNucleicAcidHybridizationTranscriptionAndTranslationCultureOfAnimalCellsImmobilizedCellsAndEnzymesBPerbalAPracticalGuideToMolecularCloningthetreatiseMethodsInEnzymologyMethodsInEnzymologyVols154および155ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiologyHandbookOfExperimentalImmunologyVolumesIIVRiottEssentialImmunology第6版BlackwellScientificPublicationsオックスフォード1988FireetalRNAInterferenceTechnologyFromBasicSciencetoDrugDevelopmentCambridgeUniversityPressケンブリッジ2005SchepersRNAInterferenceinPracticeWileyVCH2005EngelkeRNAInterferenceTheNutsBoltsofsiRNATechnologyDNAPress2003GottRNAInterferenceEditingandModificationMethodsandProtocolsHumanPressニュージャージー州トトワ2004SohailGeneSilencingbyRNAInterferenceTechnologyandApplicationCRC2004を参照。0069本発明は以下の実施例への参照により記述され、それは説明として提供されており、決して本発明を限定することを意図していない。当技術で周知の標準的な技法または下記で具体的に記述される技法を利用した。実施例1材料および方法0070ウイルス:クレード2.1A/インドネシア/CDC669/2006、A/インドネシア/TLL013/2006からのH5N1ヒトインフルエンザウイルスおよび1種類のトリの株A/インドネシア/TLL014/2006は、インドネシア共和国の保健省MOHから得た。トリH5N2亜型はシンガポールの農産物家畜庁Agri-FoodandVeterinaryAuthorityから得た。異なる系統的クレード/サブクレードからのH5N1ウイルス表1は、逆遺伝学によりレスキューされた[WHO,2004]。簡潔には、クレード1、2.1、2.2、2.3、4、7および8からのH5N1ウイルスのヘマグルチニンHAおよびノイラミニダーゼNA遺伝子を、NCBIインフルエンザデータベースからの配列に基づいて合成したGenScript,米国。その合成HAおよびNA遺伝子をインフルエンザA逆遺伝学のための二重プロモータープラスミドの中にクローニングした。その二重プロモータープラスミドは、疾病管理予防センター米国ジョージア州アトランタから得た。合併結合変異ウイルスReassortantvirusesを、HAおよびNAを含有するプラスミドを高増殖マスター株masterstrainA/プエルトリコ/8/34H1N1由来の残りの6個のインフルエンザ遺伝子と共に共培養された293TおよびMDCK細胞中にLipofectamine2000InvitrogenCorp.を用いて形質移入することによりレスキューした。形質移入の72時間後に、その培地を発育卵またはMDCK細胞中に接種した。第2継代からの合併結合変異ウイルスのHAおよびNA遺伝子を配列決定し、導入したHAおよびNA遺伝子が存在することおよび変異が存在しないことを確認した。ストックウイルスを11日齢の発育卵の尿膜腔中で増殖させ、ウイルスを含有する尿膜腔液を回収し、分割量aliquotsで-80°Cにおいて保管した。ウイルス含有量を標準的な血球凝集HAアッセイにより決定した。高病原性ウイルスを用いた全ての実験は、生物安全性レベル3BSL-3封じ込め施設においてCDC/NIHおよびWHOの推奨に従って実施された。0071中和モノクローナル抗体n-mAb:回避変異体の特性付けのために、H5N1ウイルスのHAに対する5種類の異なる中和mAbの集団を選択した。簡潔には、BALB/cマウスを、アジュバントPIC,フランスと混合した精製したホルマリン不活化A/インドネシア/CDC669/2006またはA/インドネシア/TLL014/2006またはA/ニワトリ/シンガポール/98H5N2抗原により、2週間間を置いて2回皮下注射により免疫した。マウスは脾臓細胞のSP2/0細胞との融合の3日前に同じウイルス抗原の追加の静脈注射を受けた。0072n-mAbを用いることによるH5HA中和エピトープの位置付け:H5の主な中和エピトープを、回避変異体の5種類の異なる中和モノクローナル抗体6B8、4C2、2D9、4F8および3H11による特性付けにより位置付けた。簡潔には、H5N1ウイルスを過剰量のn-mAbと共に1時間保温し、その混合物を11日齢の発育鶏卵中に接種した。その卵を37°Cで48時間保温した。ウイルスを回収し、発育鶏卵における限界希釈でのクローニングに用いて、回避変異体をプラーク精製したplaquepurified。次いでHA遺伝子中の変異を、配列決定して親ウイルスのその配列と比較することにより同定した。0073エピトープ分布分析:Kaverinら2007により同定されたH5HAの中和エピトープを、この研究において同定された主なエピトープと共に、配列分析に関して考慮に入れた。そのH5N1ウイルスの間のその中和エピトープの分布を分析するため、完全長HA配列をNCBIインフルエンザデータベースからのトリおよびヒトH5N1ウイルスと比較した。H5N1のタンパク質多型をインフルエンザ研究データベースを用いて分析し、317種類に及ぶヒトの株および2028種類に及ぶトリの株をこの研究において配列比較した。そのエピトープにおける変異を評価するため、それぞれのH5N1ウイルスに関する多数の配列比較から位置的頻度の表を生成した。0074ワクチン株の選択:ほとんどのH5N1系列の間のHAの中和エピトープ内の変異をカバーするため、3種類の異なるH5N1株を選択した。さらに、その選択されたワクチン株の反応性を、適切な中和モノクローナル抗体を用いる血球凝集阻止アッセイおよびマイクロ中和アッセイにより確証した。0075組み換えバキュロウイルスの生成:組み換えバキュロウイルスベクターの生成のため、前に記述したように、WSSVie1プロモーターで制御されるHA発現カセットをシャトルベクターpFastBac1の中に挿入し、Bac-To-BacシステムInvitrogenのプロトコルに従ってDH10BAC商標内のバキュロウイルスゲノムの中に組み込んだ。簡潔には、その完全長HA遺伝子を3種類の異なるインフルエンザ株から標準的なPCR法94°Cで20秒、55°Cで30秒、および72°Cで2分間、を30サイクルで増幅した。H5HA配列を、プライマーH5FSal5’ACGCGTCGACATGGAGAAAATAGTGCTTCT3’SEQIDNO:1およびH5RNot5’ATAAGGCGGCCGCTTAAATGCAAATTCTGCATTG3’SEQIDNO:2を用いて以下のH5N1ウイルスから増幅した:A/インドネシア/CDC669/2006H5N1GenBankアクセス番号CY014481およびABI36428;SEQIDNO:3ヌクレオチド配列およびSEQIDNO:4アミノ酸配列;A/ベトナム/1203/2004H5N1GenBankアクセス番号EU122404およびABW90135;SEQIDNO:5ヌクレオチド配列およびSEQIDNO:6アミノ酸配列;ならびにA/安徽/1/2005H5N1GenBankアクセス番号DQ371928およびABD28180;SEQIDNO:7ヌクレオチド配列およびSEQIDNO:8アミノ酸配列。WSSVie1プロモーターをベクターの中にSnabIおよびSalI部位を用いて挿入し、HA遺伝子をpFastBac1ベクターの中にNotI-SalI部位を用いて挿入した。トランスファーベクターのDH10BAC中への形質転換の後、組み換えバクミドをSf9細胞の中に形質移入し、発芽し培地中に放出されたバキュロウイルス粒子を形質移入後の4日目に回収した。0076ワクチン試験:特定病原体除去Specific-pathogen-freeのメスのBALB/cマウス6週齢をシンガポール国立大学の実験動物センターから得て、テマセク生命科学研究所の動物維持設備AnimalHoldingUnitにおいて維持した。それぞれの実験グループあたり24匹のマウスn=24/グループに、100μlのH5N1-A/ベトナム/1203/2004のHAを示すバキュロウイルスをMono-BacHA、またはA/インドネシア/CDC669/2006-H5N1、A/ベトナム/1203/2004-H5N1、A/安徽/1/2005-H5N1からのHAを示すそれぞれのバキュロウイルスの混合物としてTri-BacHA、アジュバントMontanideISA563油中水エマルジョンPIC,フランスと共に、またはアジュバントなしで、28日間の通常の間隔で2回皮下にワクチン接種した。また、不活化RG-H5N1ウイルスA/ベトナム/1203/2004-H5N1を参照ワクチン対照として用いた。14、28日目および42日目に実験グループあたり10匹のマウスから血清を集めた。血球凝集阻止アッセイおよび間接ELISAを実施してHA特異的抗体応答を評価したasses。加えて、血清のクレードをまたぐ中和能力をマイクロ中和アッセイにより測定した。そのワクチンの有効性を、異なるクレードからのHPAIH5N1インフルエンザ株に対する宿主負荷により評価した。全ての動物実験は、国立感染症研究所NIIDの動物実験に関する指針に従って実施され、実験プロトコルはテマセク生命科学研究所シンガポール国立大学、シンガポールの施設動物実験委員会InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeにより精査され、承認された。0077血球凝集阻止アッセイ:血球凝集阻止アッセイを以前に記述されたように実施した。受容体破壊酵素RDEで処理した血清を、V底96ウェルプレートにおいて系列希釈2倍した。おおよそ4HA単位のウイルス抗原を血清と共に室温で30分間保温し、続いて1ニワトリ赤血球RBCを添加し、室温で40分間保温した。0078マイクロ中和アッセイ:以前に記述されたプロトコルに従ってマイクロ中和試験を実施した。簡潔には、MDCK細胞を96ウェル培養プレートにまき、37°Cで培養して単層を形成させた。熱非働化56°Cで45分間血清試料の系列2倍希釈物を10050組織培養感染量TCID50の異なるクレードからのH5N1ウイルスと別々に混合し、室温で1時間保温し、その混合物をMDCK細胞の単層に3通りtriplicateのウェルで添加した。あらゆる細胞変性作用を完全に防いだマウス抗血清の中和力価を、希釈度の逆数reciprocaldilutionsで計算した。0079H5N1ウイルス感染に対する疾患負荷試験:最後のワクチン接種の3週間後、マウスを動物BSL3封じ込め施設に移した。グループあたり6匹のマウスを、5MLD50マウス致死用量50の同種A/ベトナム/1203/2004H5N1クレード1.0ならびに異種のクレード2.1A/インドネシア/TLL13/2006H5N1およびクレード7.0A/ニワトリ/陜西/2/06HPAIH5N1株で鼻腔内に負荷をかけた。鼻腔内負荷実験に必要なインフルエンザウイルスの50パーセントマウス致死用量MLD50は前もって決定された。マウスを毎日観察して体重および死亡率を監視した。監視は全ての動物が死ぬまで、または負荷後14日目まで続けられた。組織病理学のため、マウスを死体解剖し、肺を10重量/体積中性緩衝ホルマリン中で保管し、パラフィン中に包埋し、薄切した。切片をヘマトキシリンおよびエオジンH/Eで染色した後、光学顕微鏡検査を行い、肺の病理に関して評価した。全ての負荷実験は生物安全性レベル3の封じ込め施設で実施された。実施例2n-mAbを用いるH5HAの中和エピトープの同定および特性付け0080インフルエンザヘマグルチニンHAに対する5種類の異なる中和mAb6B8、4C2、2D9、4F8および3H11の集団が以前に我々の研究室で生成された。全てのn-mAbはH5の立体構造的エピトープを認識し、インビトロでインフルエンザウイルスの感染を中和する能力を有していた。また、これらのn-mAbは血球凝集阻止活性を有することが確認されているデータは示していない。そのn-mAbのエピトープの形成に関わっているアミノ酸を、ウイルス回避変異体を用いて分析した。多数の回避変異株から分離された完全なHA遺伝子の配列決定を行い、an-mAb6B8に対するものはアミノ酸位置189LysがAsnにまたは155AsnがAspににおいて単一の点変異を有しており、bn-mAb4F8に対するものはアミノ酸位置155AsnがAspににおいて単一の点変異を有しており、そしてcn-mAb2D9に対するものはアミノ酸位置189ArgがTrpにまたは223SerがArgににおいて単一の点変異を有していた。n-mAb4C2に関する同様の分析は、そのエピトープの形成にアミノ酸155SerがIleにまたは189ArgがLysにが関わっていることを明らかにし、一方でn-mAb3H11に関する同様の分析はアミノ酸位置138Leu、139Glyおよび140Serにおける単一の点変異を有していた。ここで示した全てのアミノ酸位置は、HAのシグナルペプチドを除いたものである。A/インドネシア/CDC669/2006H5N1、A/ベトナム/1203/2004H5N1およびA/安徽/1/2005H5N1に関する成熟HAタンパク質のアミノ酸配列に関して、それぞれSEQIDNO:9~11を参照。実施例3エピトープ分布分析0081トリおよびヒトH5N1ウイルスの完全長HA配列を、国立バイオテクノロジー情報センターにより維持されているインフルエンザウイルスデータベースから得た。ヒトおよびトリH5N1分離株のHA配列を、主な中和エピトープ配列HA1領域のアミノ酸位置138、140、155、189、159、194および218と比較した。その結果は、その主な抗原性エピトープ領域のほとんどはヒトおよびトリH5N1系列の間の重要な変異を含有していることを明らかにした表2。高度に異なる140のループ140aaの分析は、全てのH5N1ヒト分離株中でこの位置にはアミノ酸Lys22.5およびSer28.5が主に存在し、位置140においてThrがごくわずかに存在する6ことを示した表2。さらに、150のループの155aaは2種類の変異型しか有していなかったこの位置においてヒトH5N1分離株の63.4がアミノ酸Serを有し、残りの34.4がアミノ酸Asnを有する。また、受容体結合部位に位置するインフルエンザヘマグルチニンの189位のアミノ酸は、全てのH5N1のヒトの株の64.26においてアミノ酸Argを含有し、一方で残りの34.65はこの位置においてアミノ酸Lysを有する表2。実施例4ワクチン株の選択0082その中和エピトープ内のアミノ酸配列分析に基づいて、H5N1ウイルスの集団317種類のヒトの株および2028種類のトリの株をHAの主な中和エピトープ内のアミノ酸変異の頻度に関して分析した。我々は3種類の異なるH5N1株A/インドネシア/CDC669/2006H5N1クレード2.1、A/ベトナム/1203/2004H5N1クレード1.0およびA/安徽/1/2005H5N1クレード2.3を、これらの株の組み合わせがそのH5HAの中和エピトープの全ての主なアミノ酸変異をカバーするであろうように選択した表3。例えば、A/ベトナム/1203/2004H5N1およびA/インドネシア/CDC669/2006H5N1株は155位においてSerを含有しており、一方でA/安徽/1/2005H5N1株は同じ位置にAsnを有する。さらに、A/ベトナム/1203/2004H5N1およびA/安徽/1/2005H5N1株は189位においてLysを含有しており、一方でA/インドネシア/CDC669/2006H5N1株は同じ位置にアミノ酸Argを有する表3。実施例5n-mAbによる選択されたワクチン株の差次的認識0083選択されたワクチン株A/ベトナム/1203/2004H5N1クレード1.0、A/インドネシア/CDC669/2006H5N1クレード2.1およびA/安徽/1/2005H5N1クレード2.3内の変異を、異なるn-mAbによるウイルス中和および血球凝集阻止HIの結果に基づいて確認した。ワクチン株のn-mAbへの曝露は、結果として差次的なn-mAbとの反応性のパターンをもたらした。表4Aおよび4Bにおいて示すように、n-mAb6B8はA/ベトナム/1203/2004H5N1およびA/安徽/1/2005H5N1株への優先的な結合を示し、一方で血球凝集阻止およびマイクロ中和アッセイにより示されるようにその同じn-mAbによるA/インドネシア/CDC669/2006H5N1の中和は存在しない。しかし、n-mAb4C2はA/インドネシア/CDC669/2006H5N1株のみを中和する。認識のパターンにおける類似の違いは他のn-mAbに関しても観察された。これらの発見は、A/インドネシア/CDC669/2006H5N1およびA/ベトナム/1203/2004H5N1株の間の強い抗原性の相違の存在も示した表4AおよびB。加えて、ワクチン組成物中にA/安徽/1/2005H5N1を含めることは、ワクチン株の155位のアミノ酸の変異Asnをカバーし、それはヒトH5N1分離株の34を構成する。実施例6血清血球凝集阻止HIアッセイ0084HAA/ベトナム/1203/2004H5N1の機能的能力を阻害するような抗体応答の有効性を測定する血球凝集阻止力価も得た。そのHI力価の結果は、28および42日目において、抗原性補強されたTri-BacHAで免疫したマウスは抗原性補強されていないTri-BacHAと比較した場合に血清HI力価を有意に高めたことを示した図1。0085さらに、抗原性補強されたTri-BacHAをワクチン接種したマウスのHI力価は、抗原性補強されたRG-H5N1ウイルスまたは抗原性補強されたMono-BacHAのどちらかをワクチン接種したマウスのHI力価と比較可能であった図1。実施例7血清のクレードをまたぐ中和抗体の力価008642日目における100TCID50の異なるクレードのH5N1株に対する血清中和抗体力価は、抗原性補強されたTri-BacHAによるワクチン接種は抗原性補強されていないTri-BacHAをワクチン接種したマウスと比較して異なるクレードクレード1.0、クレード2.1、クレード2.2、クレード4.0、クレード7.0およびクレード8.0からのウイルスを有意に中和したことを示した図2Aおよび2B。0087さらに、抗原性補強されたTri-BacHAで免疫したマウスは、抗原性補強されたワクチン:RG-H5N1またはMono-BacHAワクチンをワクチン接種したマウスと比較した場合に、クレード2.2、クレード4およびクレード7に対する中和力価を有意に高めた図2Aおよび2B。さらに、Mono-BacHAまたはRG-H5N1を含有するワクチン組成物両方ともSeppicで抗原性補強したは、クレード1同種、クレード2.1およびクレード8.0を中和することができたが、他のクレードクレード2.2、クレード4.0およびクレード7.0H5N1株に対する効率的な中和はもたらさなかった。実施例8ワクチン接種後の負荷試験0088最後の免疫処置の3週間後、全てのグループのマウスに5MLD50のクレード1.0またはクレード2.1またはクレード7.0からのHPAIH5N1株で鼻腔内に負荷をかけた。抗原性補強したTri-BacHAまたはMono-BacHAまたはRG-H5N1で免疫したマウスのグループは、クレード1.0およびクレード2.1に対して100の保護を得た図3および図4。さらに、抗原性補強したTri-BacHAはクレード7.0H5N1感染に対して100の保護を提供した。しかし、抗原性補強したRG-H5N1ワクチンおよびMono-BacHAワクチンで免疫したマウスは、クレード7.0H5N1感染に対してそれぞれ66.6および83.3の保護しかもたらさなかった図6。0089感染の進行は、その異なるグループにおける体重の減少の異なる傾向により示された。H5N1クレード7.0A/ニワトリ/陜西/2/06H5N1株で負荷をかけたマウスのグループにおいて、抗原性補強したTri-BacHAをワクチン接種したマウスではその負荷の後に体重の有意な減少は観察されなかった図5。しかし、Mono-BacHAをアジュバントと共にワクチン接種したマウスは体重の12までの減少を示したが、その体重は負荷の6日後に徐々に回復している。抗原性補強したRG-H5N1ワクチンをワクチン接種したグループは、6日目に17までのより高い体重の減少を示し、その後それは負荷後14日目にゆっくりと回復している図5。0090本発明を記述する文脈における特に以下の特許請求の範囲の文脈における用語aおよびanおよびtheならびに類似の指示物の使用は、本明細書において別途示さない限り、または文脈により明確に否定されない限り、単数形および複数形の両方を含むものと解釈されるべきである。用語含む、有する、含まれる、および含有するは、別途言及しない限り、開放型の用語open-endedtermsであるすなわち、含まれるが、それに限定されないを意味すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別途示さない限り、単にその範囲内に入るそれぞれの個別の値に個々に言及する省略表現法としての役目を果たすことを意図しており、それぞれの個別の値はあたかもそれが本明細書において個々に列挙されたかのように本明細書中に組み込まれる。例えば、範囲10~15が開示されている場合、11、12、13、および14も開示されている。本明細書で記述されている全ての方法は、本明細書において別途示さない限り、またはそうでなければ文脈により明確に否定されない限り、あらゆる適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されたあらゆる、および全ての例、または例示的用語例えば、例えばの使用は、本発明をよりよく明らかにすることだけを意図しており、別途特許請求しない限り、本発明の範囲を限定しない。本明細書における用語は、いずれかの特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すものと解釈されるべきではない。0091本発明の方法および組成物は様々な態様の形で組み込むことができ、ごく少数のそれが本明細書において開示されていることは理解されるであろう。この発明の態様は、本発明の実施に関して発明者らに既知の最高の方式を含めて、本明細書において記述されている。上記の記述を読んだ際に、それらの態様の変形が当業者に明らかになる可能性がある。本発明者らは、当業者がそのような変形を必要に応じて用いることを期待しており、本発明者らは本発明が本明細書において具体的に記述した以外のやり方で実施されることを意図している。従って、この発明には、準拠法により許容されるような本明細書に添付された特許請求の範囲において列挙されている主題の全ての修正および均等物が含まれる。さらに、上記で記述した要素のその全ての可能な変形でのあらゆる組み合わせは、本明細書において別途示さない限り、またはそうでなければ文脈により明確に否定されない限り、本発明に含まれる。参考文献一覧"