"ヒトにおける自閉症に特徴的なメタボロミクスシグネチャを同定するための方法であって、a.約10ダルトンから約1500ダルトンまでの分子量を有する1つまたは複数の細胞代謝産物について自閉症患者から単離された生体試料をアッセイするステップと、b.約10ダルトンから約1500ダルトンまでの分子量を有する1つまたは複数の細胞代謝産物について非自閉症患者から単離された生体試料をアッセイするステップであって、ステップaおよびbが、該生体試料中に存在する細胞代謝産物の集団のメンバーを分離すること、および約10から約1500ダルトンまでの分子量を有する1つまたは複数の識別的に産生された細胞代謝産物を検出することをさらに含む、ステップと、c.自閉症患者において識別的に産生される、約10ダルトンから約1500ダルトンまでの分子量を有する1つまたは複数の代謝産物を選択するステップであって、該1つまたは複数の識別的に産生された代謝産物が自閉症についてのメタボロミクスシグネチャを含む、ステップとを含む方法。前記細胞代謝産物が物理的分離法を使用してアッセイされる、請求項1に記載の方法。前記物理的分離法が液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー-イオン化飛行時間型質量分析法である、請求項2に記載の方法。1つまたは複数の前記細胞代謝産物について化学的特定名を決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。1つまたは複数の前記細胞代謝産物の前記化学的特定名が、前記代謝産物の分子精密質量または前記代謝産物の質量分析断片化パターンを使用して決定される、請求項4に記載の方法。前記生体試料が脳脊髄液、脳組織、羊水、または血漿である、請求項1に記載の方法。前記細胞代謝産物が、セロトニン、システイン、メチオニン、グルタメート、ホモシステイン、トリプトファン、またはγアミノ酪酸GABAについての細胞代謝経路由来の化合物を含む、請求項1に記載の方法。前記細胞代謝産物が、N-アセチルアスパルチルグルタミン酸、L-シスタチオニン、2-アミノオクタン酸、5-ヒドロキシリジン、ビニルアセチルグリシン、プロリンベタイン、カフェイン、3-カルボキシ-1-ヒドロキシプロピルチアミンジホスフェート、3’-シアリルラクトサミン、3,4-ジヒドロキシベンジルアミン、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン、またはSAICARS-2-[5-アミノ-1-5-ホスホ-D-リボシルイミダゾール-4-カルボキサミド]サクシネートである、請求項1に記載の方法。請求項1に記載の方法に従って作製される自閉症についてのメタボロミクスシグネチャ。前記細胞代謝産物が、N-アセチルアスパルチルグルタミン酸、L-シスタチオニン、2-アミノオクタン酸、5-ヒドロキシリジン、ビニルアセチルグリシン、プロリンベタイン、カフェイン、3-カルボキシ-1-ヒドロキシプロピルチアミンジホスフェート、3’-シアリルラクトサミン、3,4-ジヒドロキシベンジルアミン、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン、またはSAICARS-2-[5-アミノ-1-5-ホスホ-D-リボシルイミダゾール-4-カルボキサミド]サクシネートである、請求項9に記載のメタボロミクスシグネチャ。ヒト試験対象における自閉症を診断するための方法であって、a.約10ダルトンから約1500ダルトンまでの分子量を有する1つまたは複数の細胞代謝産物についてその個体由来の患者試料をアッセイするステップと、b.患者試料において対照と比べて識別的に産生される、自閉症についてのメタボロミクスシグネチャを含む1つまたは複数の細胞代謝産物を検出するステップとを含む方法。前記細胞代謝産物が物理的分離法を使用してアッセイされる、請求項11に記載の方法。前記物理的分離法が液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー-イオン化飛行時間型質量分析である、請求項12に記載の方法。前記患者試料が脳脊髄液、脳組織、または血漿である、請求項11に記載の方法。前記細胞代謝産物が、セロトニン、システイン、メチオニン、ホモシステイン、トリプトファン、グルタメート、またはGABAについての細胞代謝経路由来の化合物を含む、請求項11に記載の方法。前記細胞代謝産物が、N-アセチルアスパルチルグルタミン酸、L-シスタチオニン、2-アミノオクタン酸、5-ヒドロキシリジン、ビニルアセチルグリシン、プロリンベタイン、カフェイン、3-カルボキシ-1-ヒドロキシプロピルチアミンジホスフェート、3’-シアリルラクトサミン、3,4-ジヒドロキシベンジルアミン、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン、またはSAICARS-2-[5-アミノ-1-5-ホスホ-D-リボシルイミダゾール-4-カルボキサミド]サクシネートである、請求項11に記載の方法。子宮内のヒト胎児における自閉症を診断するための方法であって、a.メタボロミクスシグネチャを含む1つまたは複数の細胞代謝産物について胎児試料をアッセイするステップと、b.自閉症に罹った胎児を診断するステップであって、該試料が、自閉症メタボロミクスシグネチャを含む1つまたは複数の該細胞代謝産物を識別的に産生するステップとを含む、方法。前記メタボロミクスシグネチャが、セロトニン、システイン、メチオニン、ホモシステイン、トリプトファン、グルタメート、またはGABAの代謝経路由来の1つまたは複数の細胞代謝産物を含む、請求項17に記載の方法。前記代謝シグネチャが、N-アセチルアスパルチルグルタミン酸、L-シスタチオニン、2-アミノオクタン酸、5-ヒドロキシリジン、ビニルアセチルグリシン、プロリンベタイン、カフェイン、3-カルボキシ-1-ヒドロキシプロピルチアミンジホスフェート、3’-シアリルラクトサミン、3,4-ジヒドロキシベンジルアミン、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン、またはSAICARS-2-[5-アミノ-1-5-ホスホ-D-リボシルイミダゾール-4-カルボキサミド]サクシネートのうちの1つまたは複数を含む、請求項17に記載の方法。自閉症についての代謝シグネチャであって、該自閉症代謝シグネチャが、自閉症において識別的に産生される、約10から約1500ダルトンまでの分子量を有する1つまたは複数の細胞代謝産物を含み、該複数の細胞代謝産物が、セロトニン、システイン、メチオニン、ホモシステイン、トリプトファン、グルタメート、またはGABAの代謝経路由来の代謝産物を含む、代謝シグネチャ。N-アセチルアスパルチルグルタミン酸、L-シスタチオニン、2-アミノオクタン酸、5-ヒドロキシリジン、ビニルアセチルグリシン、プロリンベタイン、カフェイン、3-カルボキシ-1-ヒドロキシプロピルチアミンジホスフェート、3’-シアリルラクトサミン、3,4-ジヒドロキシベンジルアミン、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン、またはSAICARS-2-[5-アミノ-1-5-ホスホ-D-リボシルイミダゾール-4-カルボキサミド]サクシネートのうちの1つまたは複数を含む、請求項20に記載の代謝シグネチャ。自閉症に罹っているヒトを同定するための方法であって、ヒト患者から単離された生体試料を、該生体試料から細胞代謝産物の集団のメンバーを分離することにより、約10ダルトンから約1500ダルトンまでの分子量を有する1つまたは複数の細胞代謝産物についてアッセイするステップを含み、自閉症患者において識別的に産生される、約10ダルトンから約1500ダルトンまでの分子量を有する該1つまたは複数の代謝産物の検出により、該ヒトが自閉症に罹っていると同定される、方法。発明の概要本発明は、自閉症患者において識別的に産生される複数の代謝化合物を同定するための試薬および方法、ならびに自閉症または自閉症圏障害の診断を提供するための1つまたは複数のそのような同定された代謝化合物を使用するための方法を提供する。患者の組織または生体液、特に脳脊髄液などの脳関連生体液において識別的に分泌される前記代謝産物は、本明細書に記載される方法を使用して見出される。これらの代謝産物は、非自閉症個体と比べた場合自閉症個体のほうが多い量でまたは少ない量で見出される。さらに、本発明は、自閉症個体、特に小児から生体液において識別的に検出される代謝産物を含むバイオマーカーを、個別にまたは複数の前記バイオマーカーのスペクトルの収集物で提供する。前記収集物またはスペクトルは、自閉症を診断するための本発明の方法の実行に有用である。本明細書に記載されるように、自閉症を含む複数の神経発生障害は、一般の代謝経路における変化を生じることがある。対照に対して自閉症試料に存在する代謝産物たとえば、約10ダルトンから約1500ダルトンまでの小分子は変動する相対レベルで検出することが可能であり、これにより患部組織にも健康な組織にも存在する化合物の生化学的スペクトルに関する情報が提供されることは当業者により理解されるであろう。そのようなスペクトルは、合わせると自閉症の特異的な指標として働くことができる変化を有する代謝産物の組合せを含む生化学的指紋を提供する。本明細書に示されるように、グルタメート、システイン、メチオニン、およびγアミノ酪酸GABA代謝に関与する代謝産物を含むある種の代謝産物は、自閉症の小脳発病に相乗的役割を果たすことができる。さらに、注釈なしのまたは未報告の代謝産物が、自閉症脳において統計的に有意な形態で存在することが見出され、自閉症および自閉症圏障害の有用な候補バイオマーカーも提供する。本明細書において同定される代謝産物は、前記障害の診断バイオマーカーとして有用である、自閉症の感度が良く特有の生化学的シグネチャを提供する。自閉症および自閉症圏障害のこれらの代謝シグネチャについての本明細書での本開示は、死後自閉症脳に対しメタボロミクスを初めて適用し、自閉症個体と非自閉症個体間の代謝産物の指紋およびその変化を提供するものである。本明細書に提供される研究により、非自閉症対照と比べた場合、自閉症対象の脳において著しく変化する代謝産物が同定された。さらに、自閉症組織において一般的に変化する代謝産物のサブセットが同定された。下にさらに詳細に説明されているように、約10ダルトンから約1500ダルトンまでの分子量を有する識別的に分泌される代謝産物が、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー-イオン化飛行時間型質量分析LC-ESI-TOF-MSおよび/または親水性相互作用クロマトグラフィーHILICにより同定されたが、熟練した研究者であれば、これらの方法が非限定的であり、自閉症患者由来の生体液において代謝産物を検出するための他の方法を本発明の方法の実行において利用することが可能であることを認識するであろう。しかし、熟練した研究者であれば、新鮮な凍結脳組織のメタボロミクス解析に適用される質量分析のこの様式は、高度に感度が良くたとえば、3ppmの分解能代謝産物を極めて低量でたとえば、マイクロモルからピコモル濃度まで検出することができることも認識するであろう。さらに、核磁気共鳴NMRなどの、メタボロミクス方法を実行するための当技術分野で公知の他の分析化学プラットフォームは、質量分析ほど感度が良くなく、著しく高い濃度で代謝産物を検出するにはさらに大量の生体試料が必要となるGlishら、2003年、NatRevDrugDiscov2巻:140~150頁に概説されているが、にもかかわらず、本発明は、適切な状況下でそのような方法および当技術分野で公知の他の方法を使用することをはっきりと描いている。本発明の特定の実施形態は、以下のある種の好ましい実施形態のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。本発明のこれらのおよび他の目的および特長は、図面と併せて採用される以下の詳細な説明からさらによく理解されるであろう。好ましい実施形態の詳細な説明本発明は下にさらに具体的に説明されており、その数多くの改変および変化が当業者には明らかになるので、本明細書に記載される実施例は説明的なものとしてのみ意図されている。本明細書の記載においておよびそれに続く特許請求の範囲全体において使用されているように、1つaおよびanならびにそのtheの意味は、文脈が他の方法で明確に指示していなければ、複数の参照物を含む。明細書において使用される用語は一般に、本発明の文脈内において、および各用語が使用される特定の文脈において、当技術分野でのその通常の意味を有する。一部の用語は、本発明の記載に関して実行者に追加の指示を与えるために下においてより具体的に定義されている。自閉症は、特にその病因およびその病因にとっての脳化学の任意の検出可能な変化の意味に関して、依然として十分に理解されていない疾患である。脳化学の多数の変化が自閉症脳すべて死後脳において検出されてきたが、そのような変化が前記疾患の発生もしくは進行と基本的に関連しているのかどうかまたはその結果として生じるのかどうかについて一貫して理解されてはいない。一方、本明細書に提供されるメタボロミクスシグネチャmetabolomicsignatureは、調査された自閉症脳における一貫した違いを反映しており、前記疾患に一貫して関連している特定の代謝経路を同定している。メタボロームは、細胞またはその周囲のマトリックスに存在する細胞代謝産物の全動的セットとして定義されるが、健康または疾患/傷害状態の産物である。メタボロミクスは、ゲノミクスおよびプロテオミクスなどの他のオミックomic研究領域と比べて特に環境効果に影響されやすい。細胞代謝産物には、糖、有機酸、アミノ酸および脂肪酸、特に、細胞から分泌される、排泄されるまたは他の方法で放出されたとえば、とりわけ化学的もしくは物理的外傷の結果として、病理学的または化学的傷害に対する細胞応答の機能的機序に関与する化学種が含まれるが、これらに限定されない。そのような細胞代謝産物は、正しく評価されたら、疾病または毒性応答のバイオマーカーとしての働きをすることが可能であり、生物体液中で検出することができるSogaら、2006年、JBiolChem281巻:16768~78頁;Zhaoら、2006年、BirthDefectsResAClinMolTeratol76巻:230~6頁。オミクスomics科学内では、メタボロミクスは、代謝の最終産物を測定するために、他のオミクスomicsと比べて表現型にもっとも近いプラットフォームであると想定されているDettmerら、2007年、MassSpectromRev26巻:51~78頁。自閉症患者生体液により識別的に産生されるメタボロミクスシグネチャすなわち、細胞代謝産物の集団は、自閉症を検出するための信頼できる診断マーカーを提供する。本発明のある種の態様は、たとえば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー-イオン化飛行時間型質量分析ESI-TOFを含むがこれに限定されない、物理的分離法を使用する細胞代謝産物のアッセイを提供する。代謝産物は、その精密な分子質量、ならびに代謝産物の質量分析断片化パターンを使用して同定することが可能である。自閉症患者により産生される細胞代謝産物を検出することにそのような方法を適用する感度により、代謝生化学よりはむしろ生理学的、発生的および行動的評価に焦点を合わせてきた当技術分野のそれほど頑強ではない方法と比べて自閉症障害の改良された同定が提供される。遺伝子転写の変化すべてが表現型と相関しているわけではないという事実を考慮すると、メタボロミクス診断アプローチを使用することは、遺伝子特異的診断に対する自閉症表現型のより信頼できる指標となる。本発明の追加の実施形態には、自閉症に特有のメタボロミクスシグネチャが含まれる。一実施形態では、1つまたは複数の細胞代謝産物を含む代謝シグネチャが、および特定の実施形態では、セロトニン、システイン、トリプトファン、メチオニン、グルタメートまたはGABA代謝経路の1つまたは複数の細胞代謝産物が本明細書において提供される。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるメタボロミクスシグネチャを含む代謝産物は、N-アセチルアスパルチルグルタミン酸、L-シスタチオニン、2-アミノオクタン酸、5-ヒドロキシリジン、ビニルアセチルグリシン、プロリンベタイン、カフェイン、3-カルボキシ-1-ヒドロキシプロピルチアミン二リン酸、3’-シアリルラクトサミン、3,4-ジヒドロキシベンジルアミン、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン、SAICARS-2-[5-アミノ-1-5-ホスホ-D-リボシルイミダゾール-4-カルボキサミド]サクシネート、グルタメート、またはGABA中間体たとえば、L-グルタミン、L-グルタメート、αケトグルタレートketogluratate、コハク酸セミアルデヒド、4-アミノブチルアルデヒド、4-グアニジノブタノエート、もしくはL-オルニチンなど、GABAの同化または異化に関与する代謝産物のうちの1つまたは複数を含む。自閉症を診断するための方法を含む、自閉症の細胞効果および特に生化学的効果を同定し測定するための方法および試薬が提供される。本明細書で使用される用語代謝産物、細胞代謝産物または複数形の細胞代謝産物とは、細胞により分泌され、組織試料または生体液中に存在する約10ダルトンから約1500ダルトンまでの範囲の任意の分子または質量フィーチャーのことである。細胞代謝産物は、以下の種類の分子:酸、塩基、脂質、糖、グリコシド、アミン、有機酸、脂質、アミノ酸、オキシム、エステル、ジペプチド、トリペプチド、脂肪酸、コレステロール、オキシステロール、グリセロール、ステロイド、および/またはホルモンを含むことができるが、これらに限定されない。一実施形態では、細胞代謝産物は、N-アセチルアスパルチルグルタミン酸、L-シスタチオニン、2-アミノオクタン酸、5-ヒドロキシリジン、ビニルアセチルグリシン、プロリンベタイン、カフェイン、3-カルボキシ-1-ヒドロキシプロピルチアミン二リン酸、3’-シアリルラクトサミン、3,4-ジヒドロキシベンジルアミン、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン、SAICARS-2-[5-アミノ-1-5-ホスホ-D-リボシルイミダゾール-4-カルボキサミド]サクシネート、グルタメート、またはGABA中間体を含むことができるが、これらに限定されない。本明細書で使用される語句識別的に産生される...1つまたは複数の細胞代謝産物を同定するおよび識別的に産生するは、自閉症ヒト由来の細胞または組織と非自閉症ヒト由来の細胞または組織との比較を含むが、これに限定されない。自閉症と非自閉症対照試料間の代謝産物集団または質量フィーチャーの変動の検出または測定は、この定義に含まれる。好ましい実施形態では、様々な代謝産物の産生の変化は、対照試料に対する自閉症試料における代謝産物分子の変化のプロファイルを決定することにより測定される。本明細書で使用される用語物理的分離法とは、本発明の方法に従って自閉症ヒトの組織または生体液たとえば、外側半球、および後小脳虫部脳、脳脊髄液、血液、または血漿において産生される代謝産物の変化および差異のプロファイルを検出するのに十分な、当業者に公知の任意の方法のことである。好ましい実施形態では、物理的分離法は、糖、有機酸、アミノ酸、脂肪酸、ホルモン、ビタミン、およびペプチド、ならびにそのイオン断片および他の細胞代謝産物好ましくは、3000ダルトン未満、さらに具体的には10から1500ダルトンまで、さらに具体的には100から1000ダルトンまでの分子量を有するを含むが、これらに限定されない細胞代謝産物の検出を可能にする。ある種の実施形態では、物理的分離法は、液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレー-イオン化飛行時間型質量分析LC/ESI-TOF-MSおよび/または親水性相互作用クロマトグラフィーHILICであるが、本明細書に記載される細胞代謝産物は、代替の分光測定法またはこのサイズ範囲のこれらの種類の細胞化合物を分析するための当技術分野で公知の他の方法を使用して検出することが可能であることは理解されるであろう。統計解析のためのデータは、AgilentMassHunterソフトウェア製品番号G3297AA、AgilentTechnologies,Inc.SantaClara、CAなどの統計解析パッケージを使用してクロマトグラムすなわち、質量シグナルのスペクトルから抽出することができるが、代わりに代替の統計解析法を使用することができることは理解されるであろう。質量は、それが10ppm内であり2分の保持時間枠内で溶出されたら、一緒にビニングするのが都合がよい。ビニングされた質量本明細書では精密質量と呼ばれるは、検出された質量が±10ppm内であれば、異なるLC/ESI-TOF-MS解析にわたり同一分子と見なすことが可能である。データのビニングは、統計解析および実験全体の質量比較のために必要である。たとえば、MassHunterにより1個の試料内の同一保持時間で同一質量を有する複数のピークが検出された場合は、そのピークを平均化してデータ解析を支援することが可能である。天然の同位体分布を欠くまたは3未満のシグナル-ノイズ比を有する質量は、解析に先立ってデータから除かれる。これらのアッセイから得られる結果は、20ppm以内の注釈付きの値に従って評価される相対値を提供し、化学データベースに従って検出される分子量には推定同一性を与えた。したがって、20ppm内の質量変化は、イオン源および計測手段の差異たとえば、異なる実験間または異なる計測手段を使用するによる当技術分野で公知の特定の注釈付き細胞代謝産物の同一性を決定することと一致すると見なされた。本明細書で使用されるように、質量は、先ずデータを質量および保持時間により分類するアルゴリズムを使用して別々のLC/ESI-TOF-MS注入物にわたって同一であると見なすことができる。分類後、化合物は、それが3分未満または3分に等しい保持時間差および加重式0.00002×質量未満または加重式に等しい質量差を有する場合には唯一であると見なすことができる。異なる分離物由来の一連の測定値がこの定義に一致する場合には、前記測定値は同一化合物の分離から生じると見なされる。質量または保持時間のどちらかが上に挙げられる限度以上に変動することが見出される場合には、その質量は異なる化合物であると見なされ、それ独自の命名が与えられる。対数底2に基づくANOVAなどの有意性検定を使用して、各時点での非自閉症試料に対する自閉症試料に存在する特有の化合物の存在量値を変換することができる。診断、実験、および余剰項を含むANOVAモデルを使用する無作為完備型ブロック計画は、以下の式:Log2存在量tb=診断tセクションbエラーtbを使用して表現することができる。欠陥データは試験から除かれ、自由度を変える欠陥データは非存在であったと仮定するのではない。MassHunterソフトウェアにより実施される広範なフィルタリングは、ある種のピークをそれが一定存在量閾値より下でありゼロではないという理由で見逃すまたは濾過することがあるために、この仮定が設けられた。ANOVAF検定は、そのp値が0.05未満である場合には、有意であると見なされた。倍変化は、所与の時間および処置についての最小二乗平均を使用して計算された。本明細書で使用される用語代謝シグネチャおよびバイオマーカープロファイルとは、本発明の方法により同定される1つまたは複数の代謝産物のことである。本発明に従った代謝シグネチャおよびバイオマーカープロファイルは、自閉症圏障害の分子指紋を提供し、自閉症圏障害に罹っている個体において著しく変化した細胞代謝産物の1つまたは好ましくは集団を同定することができる。好ましい実施形態では、代謝シグネチャまたはバイオマーカープロファイルを使用して、個体における自閉症を診断することができる。本明細書で使用される用語バイオマーカーとは、患部と対照の間で著しい変化を示す細胞代謝産物のことである。好ましい実施形態では、バイオマーカーは、LC/ESI-TOF-MSを含む方法により、上に記載される通りに同定される。メタボロミクスバイオマーカーは、その特有の分子質量および一貫性により同定され、したがって、バイオマーカーに一致する根底にある化合物の実際の同一性は本発明の実行のためには必要ではない。代わりに、ある種のバイオマーカーは、たとえば、リアルタイムPCR、RT-PCR、ノーザン解析、およびインサイツハイブリダイゼーションを含む遺伝子発現解析により同定することができるが、これらは、一般には本明細書に記載される用語細胞代謝産物の定義内には含まれない。本明細書に記載される代謝産物プロファイリングは、生きた患者から収集される試料とは対照的に死後組織で行われた。最終的に、インビボで発見されたバイオマーカーは、たとえば、脳脊髄液、血液、血漿、羊水および尿、すなわち細胞外生体分子の複雑な混合物を含む生体液などの試料を分析するのに有用であると予想される。本発明の方法は、生体液中の代謝産物は細胞内化合物と対照的に非侵襲的に検出することができるために、組織生検などの侵襲的手技よりも有利である。さらに、質量分析のために細胞上清を処理することは細胞抽出物よりも頑強であり面倒が少ない。しかし、たとえば、組織生検または溶解された細胞由来の細胞抽出物は本発明の方法に包含される。用語試料または生体試料または患者試料は、脳脊髄液、脳組織、羊水、血液、または血漿を含むが、これらに限定されない。生体液解析に先立つ、自閉症脳において主に冒される器官中の差次的代謝産物の同定は、新規の診断学の発展に向けての目標を定めたアプローチを提供する。限定された組の候補なしで、脳脊髄液、尿または血漿などの生体液中の自閉症に特異的なバイオマーカーを同定するのは特に困難であると考えられる。生体液は、内在性と外来性要因の両方遺伝学、食餌、環境により影響を受ける全身的副産物の複雑な混合物である。本発明の方法を使用すれば、特定の分析化学プロトコールを、特定の候補バイオマーカーの限定された精密質量および保持時間について生体液を評価するために使用することが可能である。下の実施例においてより詳細に記載されるように、本明細書に記載される方法を使用する自閉症組織プログラムAutismTissueProgramATPからの15件の新鮮な凍結試料6件の自閉症および9件の対照の解析により、死後自閉症と非自閉症脳試料間の複数の代謝産物の存在量に統計的有意差が検出された。親水性相互作用クロマトグラフィーHILICとそれに続いてポジティブモードESI-TOFイオン化を使用する予備実験では、自閉症と非自閉症脳間で識別的に産生された合計で98の代謝産物が同定された。たとえば、5-ヒドロキシリジン精密質量162.0981は有意な変化を示したp<0.05。C18クロマトグラフィーとそれに続いてポジティブモードESI-TOFイオン化を使用する並列予備実験では、47の統計的に有意な代謝産物を生じたp<0.05。これらの代謝産物の化学的特定名は、タンデム質量分析MS-MSにより決定的に確証することが可能である。新鮮な凍結死後脳由来の代謝産物は、最初、液体クロマトグラフィーLCにより分離され、その後イオン化されて、エレクトロスプレー-イオン化飛行時間型質量分析ESI-TOF-MSにより検出された。この質量分析の様式は、新鮮な凍結脳組織のメタボロミクスに特に適しているために選択された。すなわち、この様式は高度に感度が良く、小分子代謝産物を極めて低い存在量で検出したとえば、マイクロモルからピコモル濃度まで、代謝産物の精密質量の高度に正確な測定値を3ppmの分解能で提供する。NMR核磁気共鳴などの、メタボロミクスに用いられる他の分析化学プラットフォームは、質量分析ほど感度が良くなく、代謝産物を著しくより高い濃度で検出するためにはさらに大量の生体試料を必要とするGlishら、2003年、NatRevDrugDiscov2巻:140~150頁に概説されている。本明細書に記載されるように、死後脳試料のメタボロミクス解析により、自閉症と非自閉症脳間に複数の生化学的差異が明らかにされた。自閉症脳により識別的に分泌される細胞代謝産物の同定により、本明細書に特に記載されているように、自閉症を診断するためのバイオマーカーが提供される。ある種の実施形態では、本発明は、自閉症のバイオマーカーとして単独で、集団として、または任意の情報価値のある組合せで採られる、以下の代謝産物:N-アセチルアスパルチルグルタミン酸、L-シスタチオニン、2-アミノオクタン酸、5-ヒドロキシリジン、ビニルアセチルグリシン、プロリンベタイン、カフェイン、3-カルボキシ-1-ヒドロキシプロピルチアミン二リン酸、3’-シアリルラクトサミン、3,4-ジヒドロキシベンジルアミン、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン、SAICARS-2-[5-アミノ-1-5-ホスホ-D-リボシルイミダゾール-4-カルボキサミド]サクシネート、グルタメート、またはGABA中間体を提供する。神経化学経路の異常は、自閉症の発病および/または臨床症状の潜在的基盤と仮定されてきた。セロトニン、キヌレニン、グルタメート、システイン、およびメチオニン代謝に対する攪乱が自閉症においてある役割を果たしている可能性があることが、様々な量の支持的な一般的事例証拠をもって推測されてきた。これとは対照的に、本明細書で提供される方法およびこれらの方法の実行に従って提供されるバイオマーカーは、1つまたは複数の前記バイオマーカーの検出を個体における自閉症または自閉症圏障害の存在と結び付けることに実験的な証拠に基づく基礎を提供する。以下に続く実施例は本発明の特定の実施形態およびその様々な使用を説明するものである。これらの実施例は説明目的のためだけに記載されており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。実施例1死後脳組織の調製自閉症患者および同年齢の対照由来の死後脳組織は自閉症組織プログラムATPから入手した。全部で、メリーランド大学の発達障害のための脳および組織バンクtheUniversityofMarylandBrainandTissueBankforDevelopmentalDisordersからの6件の自閉症および9件の非自閉症死後脳試料が調査された表1参照。上記試料由来の外側半球および後小脳虫部の新鮮な凍結切片を用いてメタボロミクスは実施された。小脳は、それが自閉症患者においてもっとも一貫性のある異常な神経解剖学的所見が局在している領域であるために選択されたKemperら、1998年、JNeuropatholExpNeurol57巻:645~652頁。年齢、PMI死後の間隔および臨床症状の程度の違いは、メタボロミクスにより測定される代謝産物の存在量および性質の変動原因であると認められた。メタボロミクスに先立って、凍結脳検体は、30ショ糖を使用するLeicaSM200Rミクロトームの前冷却されたステージ上に載せられ、薄片にされて重量約50mgの均一な試料を作製した。代謝産物は、円錐形グラスホモジナイザーにおいて試料をホモジナイズすることにより湿組織重量比あたりの容積に基づいて80メタノール/200.5ギ酸に抽出された。次に、試料は-20°Cで30分間保管されて、タンパク質および不溶性物質を沈殿させた。その後、冷却インキュベーション試料は、16,000×g、4°Cで25分間遠心分離され、細胞片、タンパク質、および他の不溶性物質をペレット状にした。次に、上清は新しいチューブに移され、300μlの抽出バッファーを用いて再抽出された。試料は、乾燥して抽出バッファーを取り除くまで6~7時間回転式エバポレーターにおいて乾燥された。次に、抽出物は500μlの20アセトニトリル/800.1ギ酸に溶解され、13,000×gで3時間Millipore3kDaMicroconカラムMillipore中で遠心分離されて、大きな分子量>3kDaの生体分子を取り除いた。フロースルーは回転式エバポレーターにおいて乾燥され、2μl/mgの950.1ギ酸/5アセトニトリルに溶解され、LC-MSによる分析に先立って-80°Cで保管された。液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー-イオン化飛行時間型質量分析LC-ESI-TOF-MSは、精密質量MSおよびMS/MSイオン断片化が可能なG6520AAQTOF高分解能質量分析計からなるAgilentQTOFLC/MSシステムを使用して、これらの抽出物で実施された。各試料の極性代謝産物画分は、最大分離および小分子分解能のために2つの異なるクロマトグラフィー法、すなわちa3×100mmPhenomenex3μmLuna親水性相互作用クロマトグラフィーHILICおよびb2.1×50mmZorbax1.8μmC18-SBカラムC18を使用して解析された。このアプローチは、分離されそれに続いてイオン化され測定される代謝産物の数を最大にした。超高圧液体クロマトグラフィーUPLC解析は、5アセトニトリル/95水/0.1ギ酸から100アセトニトリル/0.1ギ酸までの15分勾配を流速400μl/分で使用してZorbaxC18カラムを用いて実施された。HILICHPLC法は、95アセトニトリル/5水/0.1ギ酸から60アセトニトリル/40水/0.1ギ酸までの16分勾配を500μl/分の流速で使用して実施された。エレクトロスプレー-イオン化は、Agilent均一濃度ポンプが内部質量基準溶液をほぼ0.01ml/分でソース内に絶えず送る二重ESIソースを使用して用いられた。機器の質量範囲は75~1500Daに設定され、データはダイナミックレンジを最大にするために2GHzモードで得られた。データ取得は、高分解能精密質量条件を使用するAgilentMassHunterB.02.00バージョンを用いて実施された。実施例2自閉症脳において識別的に産生される代謝産物の同定データ解析に先立って、各試料の全イオンクロマトグラムTICは、MSシグナルの質および再現性について慎重に検査された。TIC存在量がLC-MS勾配全体の中央値から25を超えて逸脱した試料では、LC-MS解析が繰り返された図1。データは、脱同位体化deisotopedされ、次にオープンソースmzDataフォーマットに変換された。データ解析は、オープンソース統計プログラミングおよび解析ソフトウェアRを使用して実施された。XCMSパッケージSmithら、2006年、AnalChem78巻:779~787頁を使用し、ピークピッキングのCentwaveアルゴリズムを使用してLC-ESI-TOF-MSから得られるファイルを解析したTautenhahnら、2008年、BMCBioinf9巻:504頁。LC-MS試料全体の保持時間偏差は、すべてのLC-MS試料に共通のフィーチャーのレクター保持時間補正ロエスloess回帰を使用して補正され、そのフィーチャーはXCMSにおける密度ベースの関数を使用してグループ化された。HILICクロマトグラフィーの最大観察偏差は15秒であり、C18クロマトグラフィーでは4秒であった。グルーピング関数を実施した後、LC-MS試料において失われたフィーチャーは、フィーチャーグループの範囲に基づくm/zおよび保持時間枠を使用して反復的に積分された。ピーク強度表は、単変量と多変量統計解析の両方を使用して評価された。汚染物イオンは、脳組織抽出物と偽抽出ブランクを比較することにより取り除かれた。脳組織抽出物と偽抽出ブランクの両方に存在するフィーチャーは、その存在量が抽出ブランクの5倍未満の場合にはデータセットから取り除かれた。個々の質量フィーチャーの統計的有意性は、対照脳と自閉症死後脳との間にはその存在量の差はないという帰無仮説の下で実施された。差次的代謝産物、またはフィーチャーは、複合脳領域に関するモデルlog2存在量からセクション診断を用いる不完備型ブロック計画ANOVAを使用して決定された。フィーチャーは、それがANOVAモデルの診断要因において25を超える倍変化および0.05未満のp値を示す場合は統計的に有意と見なされた。各統計的に有意なフィーチャーの抽出されたイオンクロマトグラムはさらに評価されて、偽の結果の包含を減らすために自閉症と正常な抽出物間の観察可能な差を確認した。直接注入物は、XCMSにおける連続ウェーブレット変換ContinuousWaveletTransformDuら、2006年、Bioinformatics、22巻:2059~2065頁ピークピッキングアルゴリズムを使用して解析された。Agilent質量定性分析MassQualitativeAnalysisソフトウェアバージョン2.00Bを使用して、ベンダー特有の生データファイルをオープンソースmzDataファイルに変換した。1000に等しいまたはそれより大きい高さを有するフィーチャーは解析に含まれ、次に、質量フィーチャーを同定することに先立って脱同位体化された。質量フィーチャー推定代謝産物の作製は、R/Bioconductor由来のXCMSSmithら、2006年、AnalChem78巻:779~787頁ライブラリー中に存在する方法を使用して実行された。各ESI極性は個別に処理された。高分解能高質量精度データにおけるピークの検出を目的とするcentwaveアルゴリズムTautenhahnら、2008年、BMCBioinf9巻:504頁はピークピッキングのために利用された。centwaveアルゴリズムのための入力変数は、QTOF設定およびクロマトグラフィー法に基づいていた。ピークピッキングに続いて、保持時間における偏差はロエス回帰を使用して補正された。質量フィーチャービンまたはグループは、LC-MS勾配に最適化されたパラメータを使用する密度ベースのグループ化アルゴリズムを使用して作製された。データを質量フィーチャーにグループ化した後、失われたフィーチャーは、XCMSにおける反復ピークフィリング法を使用して、フィーチャーの保持時間および質量範囲に基づいて積分された。個々のLC-MSにおいて検出される質量フィーチャーのビニングを使用して、注入物にわたって同一保持時間に存在しているフィーチャーを同定した。精密質量と保持時間の両方に基づくビニングアルゴリズムを使用して、質量フィーチャーは異なるLC/ESI-MS-QTOF実験を通じて同一であると見なした。ビニング基準は、より低い分子量でより大きな質量差を可能にするスライディング質量差スケールとクロマトグラフィーの再現性に基づく一定の保持時間枠の両方に基づいていた。個々の質量フィーチャーの統計的有意性試験は、順列ベースの検定統計量を使用して、対照と自閉症小脳虫部試料間にはその存在量の差はないという帰無仮説の下で実施された。この解析は、RにおけるpcaMethodsライブラリーを使用するローディングおよびスコアプロットにおけるメタデータの異なる組合せを探索することにより実施されたStackliesら、2007年、PcaMethodsAcollectionofPCAmethodsRpackageversion1120、CRANRprojectorgから利用可能。対照と自閉症死後脳試料間の一般差はウェルチt検定を使用して評価された。ベイジアン主成分分析は、代謝の全体的変化が対照と自閉症脳組織間に存在するかどうかを決定する場合にこの方法が失われたデータを許容することができるためにObaら、2003年、Bioinformatics、19巻:2088~2096頁、実施された。この解析は、RにおけるpcaMethodsライブラリーを使用するローディングおよびスコアプロットにおけるメタデータの異なる組合せを探索することにより実施されたStackliesら、2007年、PcaMethodsAcollectionofPCAmethodsRpackageversion1120、CRANRprojectorgから利用可能。統計的に有意なフィーチャーは、試料を教師なしの形態で分類するその能力を調べるために、主要クラスター分析PrincipalClusterAnalysisPCAベースの方法および階層的クラスタリングを使用してモデル化もされた。その結果、死後自閉症脳と非自閉症対照間の統計的に有意差のある低代謝産物の包括的リストが、実験あたり平均で6,000フィーチャーの統計的解析に続いて同定された。質量分析ベースのメタボロミクスプロファイリングまたはメタボロミクスにより、HILICを使用して98件の代謝産物およびC18クロマトグラフィーを使用して47件の代謝産物において自閉症脳に有意な変化p値<0.05が明らかにされた。実施例3自閉症特異的代謝産物の化学的アノテーション実施例2に記載される自閉症小脳において識別的に分泌される代謝産物の同定に続いて、これらの分子の化学的アノテーションは、イオン断片化パターン解析MS-MSによりさらに精密にされた。具体的には、上で同定された各小分子の断片化パターンおよび保持時間は、分析用化学標準物質と比較された。各小分子の化学的特定名の確認は自閉症バイオマーカー決定には必要ではないが、注釈付きの同一性は、それが小分子バイオマーカーごとにより均一な命名法を与えるという点で都合がよい。識別的に産生される代謝産物のそれに続く化学的同定により、バイオインフォマティクスGeneGoソフトウェアによる特定の経路上への代謝産物のインシリコマッピングも可能になる。したがって、この情報により、自閉症の死後脳と非自閉症年齢適合対照間の生化学的差異の根底にある全身的代謝経路および/またはネットワークが明らかにされた。各化合物のニュートラル精密質量は、候補同一性については、公開の検索可能なデータベースMETLINmetlinscrippsedu、ヒトメタボロームデータベースwwwhmdbca、および遺伝子とゲノムの京都エンサイクロペディアwwwgenomejpkegg、または生物学磁気共鳴バンクwwwbmrbwiscedumetabolomicsに対して照合された。測定された質量フィーチャーは、その精密質量が注釈付きのデータベース分子の百万分の200.00002×質量以内である場合は、データベースに存在する代謝産物と適合すると見なされる。バイオマーカー候補の化学的特定名は、以下の3種類の基準:1分子精密質量、2MS/MS断片化パターンおよび3クロマトグラフィー保持時間のうちの1つまたはそれよりも多くを使用して確認された。エレクトロスプレー-イオン化飛行時間型質量分析LC-ESI-TOF-MS/MSすなわち、タンデム質量分析データの解釈により決定される、各候補バイオマーカーの精密質量すなわち、質量フィーチャーは、推定分子同一性について上に記載される様々な公開の検索可能なデータベースに対して照合された。次に、注釈付きの候補は、候補分子イオンについてのMS/MSプロダクトイオンスペクトルを獲得し、次に公知の分析用標準的基準化合物について得られるプロダクトイオンスペクトルに対してMS/MS断片化パターンを適合させることにより検証されたCummingsら、2009年、JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci、877巻:1221頁。L-シスタチオニン、2-アミノオクタン酸およびN-アセチルアスパルチルグルタミン酸の分析用化学標準物質は、比較質量分析のためにSigmaChemicalCo.、St.Louis、MOから購入された。化学基準物質は、原試料のメタボロミクス解析において使用される同一クロマトグラフィー法を使用して評価された。さらに、7つの原試料4つの自閉症および3つの対照は、保持時間およびイオン断片化適合を保証するために、化学標準物質との比較のため再解析された。化学基準物質は適切なバッファーに溶解され、100μM標準物質は、950.1ギ酸/5アセトニトリルに希釈することにより調製された。実験試料および化学標準物質は、衝突エネルギーを決定するための以下の式:衝突エネルギー=前駆体のm/z-100/1003V10Vを使用して断片化された。推定アノテーションは、原試料における保持時間および断片化パターンが化学基準と適合する場合は、正しいと見なされた。推定代謝産物が、断片化される試料抽出物において存在量が不十分である場合には、保持時間だけがアノテーションを確認するために使用された。第三の確認基準は、化学標準物質のクロマトグラフィー保持時間およびイオン化断片化パターン図2がバイオマーカー候補の保持時間と適合するかどうかを決定するために、内在性代謝産物を公知の基準化合物と一緒に同時注入するすなわち、スパイクすることにより確立された。タンデム質量分析、またはMS-MSを使用して、これらの実験における内在性代謝産物の同一性を確認した。データ解析が完了した後、統計的に有意な代謝産物のサブセットを公知の化学標準物質に対して確認するために選択した。これらのアッセイでは、上記の質量フィーチャーを同定するために使用される新鮮な凍結脳抽出物は1mMの化学標準物質でスパイクされ、次にMS-MSにより解析された。残りの未使用の試料またはスパイクされた試料はLC-ESI-MS/MSにより処理されて、推定的に同定された化合物のイオンの構造および存在量を確認した。これらの実験で対照として使用された標準物質は公知の保持時間を有していた。スパイクされた試料において観察された並行保持時間により、代謝産物同一性がさらに確認された。候補バイオマーカーの化学的特定名の最終確認は、断片イオンの検出図2、Aと保持時間図2、Bの両方に基づいて行われた。ヒットの分類は、分析新鮮な凍結脳抽出物と化学基準MS/MSスペクトル間で共有される断片イオンの質量を同定する共有ピークカウント法に基づいていた。統計的な有意差は、死後自閉症と非自閉症脳試料間の複数の代謝産物の存在量において検出された表2。有意である高い可能性のある代謝産物に焦点を合わせ、潜在的な誤った人為的結果を排除するために、各データセットHILICおよびC18クロマトグラフィーは、対照と自閉症脳試料間の存在量の25倍変化の中等度フィルターを使用してフィルターされた。HILICクロマトグラフィーとそれに続くポジティブモードESI-QTOFイオン化により25を超える倍変化を示す988件の質量フィーチャーが同定され、そのうちの98件の代謝産物が自閉症と非自閉症脳間で統計的に有意差があったp<0.05。さらに、C18クロマトグラフィーとそれに続くポジティブモードESI-QTOFイオン化により、少なくとも25の倍変化を有する938件の質量フィーチャーが測定され、47件の統計的に有意な代謝産物が生じたp<0.05。表2は、自閉症と対照死後脳試料間で存在量に少なくとも25の変化を有する測定された有意な代謝産物のサブセットを示しており、対応する抽出されたイオンクロマトグラムEICは自閉症と対照脳試料間で際立った差を示している。メタボロミクス研究のもっとも厄介な面の1つは測定された小分子の多くが公開されたデータベースではまだ注釈が付いていないことである。現在の方法は、特有の質量による小分子代謝産物の同定を可能にしているが、化合物名による同定はさらに厄介である。同定された代謝産物は新規のバイオマーカーを表しており、重要なことに、自閉症の病因の一因となる追加の経路を指摘している。識別的に分泌された代謝産物の化学的アノテーション化学的アノテーションは、識別的に分泌された代謝産物の以下のサブセットについて確認された。L-シスタチオニンシステインおよびメチオニン代謝経路におけるいくつかの代謝産物は、対照と比べて自閉症脳において著しく増加していた。HILICクロマトグラフィーを使用して、自閉症脳試料の後小脳虫部でも外側半球でもL-シスタチオニン精密質量222.067では統計的有意差が検出されたp=0.019、図3Aおよび3D。L-シスタチオニンの化学的特定名は、死後脳試料図4Aと化学標準物質図4B間の保持時間図3Bおよび3Cならびにイオン断片化パターンの比較により二次的に確認された。2-アミノオクタン酸L-シスタチオニンとは対照的に、代謝産物2-アミノオクタン酸精密質量159.125の存在量は、自閉症患者の後小脳虫部でも外側半球でも著しく減少していたp=0.027、図5Aおよび5D。2-アミノオクタン酸の全体脳減少は、自閉症と対照試料間で144であった。2-アミノオクタン酸はこれまで脳試料において調べられたことがなく、したがって、2-アミノオクタン酸濃度の変化が自閉症と関係している初めての証拠が本明細書で提供される。以前の研究では尿中でのこの化合物が報告され測定されているだけであるParryら、1957年、ClinicaChimicaActa、2巻:115~125頁。化学標準物質図5Bと死後脳試料図5C間の比較質量分析により、代謝産物保持時間の適合が実証された。死後脳試料における2-アミノオクタン酸の低い存在量範囲は、本研究における他の代謝産物について用いられた標準MS-MS法に従ってそのイオン断片化を得る障害となっていた。N-アセチルアスパルチルグルタミン酸NAAGN-アセチルアスパルチルグルタミン酸精密質量304.091の存在量は、正常な対照と比べて死後自閉症脳において増加していた。これらの結果は、自閉症のヒトインビトロモデルについて以前報告されたグルタメート経路の攪乱Cezarら、2007年、StemCellsDev16巻:869~882頁、ならびに他の臨床研究Blaylockら、2009年、CurrMedChem16巻:157~170頁;Friedmanら、2006年、ArchGenPsychiatry、63巻:786~794頁;Kleinhansら、2007年、BrainRes1162巻、85~97頁;Pardoら、2007年、BrainPathol17巻:434~447頁;Shinoheら、2006年、ProgNeuroPsychopharmacolBiolPsychiatry、30巻:1472~1477頁と一致している。しかし、以前の報告と違って、本明細書に記載される結果は、グルタメート代謝中間体であるN-アセチルアスパルチルグルタミン酸に対する以前は認識されていなかった直接的攪乱を示している。統計的有意性を示してp=0.054、図6Aおよび6D、N-アセチルアスパルチルグルタミン酸の化学的特定名は、死後脳試料図4Cと化学標準物質図4D間の保持時間図6Bおよび6Cとイオン断片化パターンの両方を明らかにしている比較質量分析により確かめられた。不特定化合物上に記載される代謝産物に加えて、本明細書に記載されるメタボロミクス解析により、複数の注釈なしの代謝産物すなわち、公開されたデータベースでは注釈が付いていないの変化が同定された。これらの代謝産物の存在量は、対照と比べた場合、自閉症脳試料において有意に増加しているまたは減少していたp<0.05。2つのそのような不特定小分子代謝産物の抽出されたイオンクロマトグラムは図7Aおよび7Bに示されているそれぞれ、精密質量366.1426および422.2482。これらの注釈なしの内在性代謝産物の両方とも自閉症脳領域において著しく増加していた。フィーチャーA精密質量366.1426は自閉症と対照脳試料間で存在量が42増加していた。フィーチャーB精密質量422.2482の存在量は自閉症脳試料において181増加していた。公開されているデータベースにこれらの代謝産物のアノテーションが現在ないからといって、自閉症についての候補診断バイオマーカーとしてこれらの代謝産物が排除されることはない。本明細書で用いられる分析化学検出システムの高度に感度が良く定量的性質は、測定可能なエンドポイントすなわち、精密質量を提供し、このエンドポイントは自閉症患者由来の患者試料たとえば、組織または生体液において測定することが可能である。さらに、NMRなどの他の分析プラットフォームを使用して、これらの化合物の化学式を確認することができる。化学的アノテーションがないと特定の生化学経路上へのその分子のマッピングが妨げられるだけである。要約すると、死後自閉症と非自閉症脳試料間で約10から約1500ダルトンまでサイズに幅がある複数の代謝産物の存在量において統計的有意差が検出された表2。HILICクロマトグラフィーとそれに続くポジティブモードESI-QTOFイオン化により、自閉症脳と非自閉症対照間で統計的な有意差p<0.05のある合計で98件の代謝産物が同定された。さらに、C18クロマトグラフィーとそれに続くポジティブモードESI-QTOFイオン化により、47件の統計的に有意な代謝産物p<0.05が生じた。この包括的シグネチャは、これらの内在性化学物質に対する攪乱を生体液においても定量的な形態で測定されるかどうかを調べるトランスレーショナルアプローチに即時的手段を提供する。実施例4患者生体液において分泌される代謝産物の同定および評価自閉症により主に冒される器官である脳組織を評価すれば本明細書に記載される自閉症バイオマーカーの同定が可能であるが、本発明の方法は脳組織の検査に限定されない。たとえば、脳脊髄液、血液、血漿、羊水および尿を含む生体液、すなわち、細胞外生体分子の複雑な混合物などの患者試料を分析すれば、識別的に分泌される代謝産物の同定および評価も可能になる。この方法は、生体液中に存在する小分子を非侵襲的に細胞内化合物とは対照的に検出することができるために、組織生検などの侵襲的手法よりも都合がよい。さらに、質量分析のために細胞上清を処理するのは細胞抽出物よりも頑強であり手間がかからない。たとえば、組織生検または溶解された細胞由来の細胞抽出物は本発明の方法に包含されている。さらに、当業者であれば、脳代謝産物の周囲の脳脊髄液への分泌を認識しているであろう。今度は、記載された方法すなわち、メタボロミクス解析による脳脊髄液の収集および評価により、識別的に発現される代謝産物の解析および同定が可能になる。本発明の方法を使用すれば、特定の候補バイオマーカーの定義された精密質量および保持時間について脳脊髄液および他の生体液を評価するために特定の分析化学プロトコールを使用することが可能である。したがって、本発明の方法のこれらの態様では、従来の技法たとえば、腰椎穿刺を使用して脳脊髄液などの生体液が得られ、その生体液は本明細書に記載される通りに処理されて、タンパク質および約3000ダルトンを超える分子量を有する他の生体物質を取り除く。分離法、たとえば、LC-TOF質量分析は、処理された生体液およびそこで検出された代謝産物に適用される。自閉症に特徴的な1つまたは複数の識別的に産生される代謝産物の検出を使用して、自閉症に罹っているまたは自閉症になるリスクのある対象を同定し、追加の行動学的方法および他の診断法が指示される必要を示す。同様に、当業者であれば、脳小代謝産物の血液脳関門を越える分泌を認識しているであろう。血漿のメタボロミクス解析は、記載されている通りに哺乳動物から得られる血液試料で実施されてきた。すなわち、血漿を解凍し、450μlの氷冷MeOH対H2O8対1v/vを添加し、2~8°Cで10分間攪拌する。次に、試料を18,400×g、4°Cで20分間遠心分離し、上清をチューブに移し、ペレットが観察されなくなるまでステップ3および4を繰り返す。試料を乾燥させ、次に50μlの50対50のACN対0.1ギ酸に再溶解し、続いて代謝解析をする。要約すると、本発明の方法は、2つの例として脳脊髄液および血漿を含む生体液に適用される。実施例5自閉症脳において変化した生化学および代謝経路の同定その化学的特定名が上記の通りに確認された統計的に有意な代謝産物は、遺伝子とゲノムの京都エンサイクロペディアKEGG経路データベースと比較されインシリコでマッピングされた。フィッシャー直接検定を使用して、統計的に大きな比率を占める生化学経路を見つけた。試料全体で共通の傾向を示すフィーチャーのグループ化も、カノニカルKEGG経路上に表されていない分子間に何か生化学的相互作用が存在するかどうかを決定するためにKEGGデータベースを使用して評価された。このアプローチにより、インビボで観察される代謝変化の根底にある機構的経路を同定することができた。差次的メタボロミクスプロファイルを、遺伝子とゲノムの京都エンサイクロペディアKEGG、release411wwwgenomejpkeggに概要が述べられているそのそれぞれの生化学経路にマッピングすることにより、非自閉症対照と比べて自閉症対象の小脳において上方調節されているまたは下方調節されている特定の代謝経路が明らかになった。非自閉症対照と比べて自閉症脳において、グルタメート、システイン、メチオニン、トリプトファンおよびGABA代謝経路への著しい変化が検出された。本明細書に記載されるメタボロミクス法の結果は、複数の生化学経路およびネットワークにおける同時変化を測定しており、特定の自閉症脳領域の定量的事実上の生化学シグネチャを提供している。自閉症患者の死後脳と非自閉症対照間の比較メタボロミクスにより、頑強なバイオマーカー、ならびに自閉症の初期診断のための手段を提供する生化学変化が明らかにされた。本明細書に提供される識別的に分泌される代謝産物は、自閉症についてのいくつかの候補診断バイオマーカーを含む。本発明は、本発明の開示された実施形態に限定されることを意図していない。前述の開示は本発明のある種の特定の実施形態を強調しており、あらゆる改変またはそれと同等の代替手段は、添付される特許請求の範囲に記載されている本発明の精神および範囲内であることは理解されるべきである。"