"多発性骨髄腫患者における溶解性骨疾患を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、Dickkopf-1DKK1登録番号NM012242のヒトホモログに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗DKK1抗体、又はDKK1と相互作用する可溶性LRP受容体、を含むことを特徴とする医薬組成物。患者における悪性腫瘍関連骨減少を調節する医薬組成物であって、前記医薬組成物が、DKK1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗DKK1抗体、又はDKK1と相互作用する可溶性LRP受容体、を含むことを特徴とする医薬組成物。前記悪性腫瘍関連骨減少が、骨への乳がん転位又は骨への前立腺がん転移によって引き起こされることを特徴とする請求項2に記載の医薬組成物。先行技術は、多発性骨髄腫骨疾患の原因となり得る悪性形質細胞で発現されている遺伝子を同定するための比較分析、および、多発性骨髄腫骨疾患を診断および治療するための方法に欠けている。本発明は本分野におけるこの年来の必要及び要望を満たす。溶解性骨疾患の分子決定因子を同定するため、溶解性病変の放射線的証拠を示さないn=28新たに診断された多発性骨髄腫に由来するCD138濃縮形質細胞における最大12,000個の遺伝子の発現プロファイルを、3個以上の溶解性病変を有するものn=47と比較した。骨芽細胞分化におけるWNTシグナル伝達の決定的な役割と合致して、2種類の分泌型WNTシグナル伝達拮抗因子である、可溶性frizzled関連タンパク質3SFRP-3/FRZBおよびDickkopf-1DKK-1のヒトホモログが、溶解性骨病変を有する47例中40例で発現されていたが、骨病変を欠く28例中の16例だけで発現されていたP<0.05。免疫組織化学は、遺伝子発現が高い例に由来する形質細胞で、高レベルのDKK-1およびFRZBを示した。重要なことに、DKK-1およびFRZBは、正常骨髄ドナー45例、または、骨疾患を欠く関連する形質細胞悪性腫瘍であるワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症10例に由来する形質細胞では発現されていなかった。高いDKK-1を有する多発性骨髄腫患者に由来した血清は、Wntシグナル伝達および骨芽細胞分化の両方をinvitroで遮断した。重要なことに、DKK-1およびFRZB抗体との血清のプレインキュベートは、この機能を阻害した。DKK-1発現の調節および次にはアポトーシスにおけるJUNの主要な役割と合致して、髄外疾患および原発性難治性疾患に由来する形質細胞は、JUNおよびDKK-1の低発現を有した。多発性骨髄腫形質細胞は、invivo処理後にDKK-1およびFRZB遺伝子発現の大幅なアップレギュレーションを示した。DKK-1およびFRZBは、多発性骨髄腫形質細胞において、その疾患を治療するために用いられる遺伝毒性薬での患者の治療後に、アップレギュレートすることができ、そのようにして多発性骨髄腫細胞アポトーシスにおけるDKK-1の役割を助長する。invitro由来破骨細胞OCと共培養した原発性多発性骨髄腫細胞はアポトーシスを欠き、しかもこれはJUN、FOS、FOSB、およびDKK-1のダウンレギュレーションと密接に相関した。本発明で開示される結果は、DKK-1およびFRZBの産生および/または分泌を遮断することが多発性骨髄腫患者における骨減少を防ぐかまたは逆転させる可能性があることを示す。他の用途は、DKK-1およびFRZB阻害因子を一般人口における骨減少を防ぐために用いることを含む。加えて、Wntシグナル伝達は近年、造血幹細胞の自己再生能力にとって決定的に重要であることが示されている。さらに、HSC増殖に必要な骨髄ニッチは、成熟骨芽細胞によって形成される。Wntシグナル伝達に対するDKK1およびFRZBによる遮断は、直接的におよび間接的に肝星細胞HSC増殖を障害し、およびそのようにして、多発性骨髄腫で見られる免疫抑制および貧血の部分的な原因となり得る。このように、DKK1および/またはFRZBの遮断はまた、骨髄腫を有する患者の大部分に見られる造血の欠陥を、防ぐかまたは逆転することができる。本発明のその他の態様、特性、および利点は、本発明の現在好ましい実施形態の下記の説明から明らかになる。これらの実施形態は開示の目的のために与えられる。本発明の上述した特性、利点、および目的、およびその他明らかになる内容が達成されおよび詳細に理解可能となるように、上記に簡潔に要約した、より具体的な説明および本発明の一部の実施形態が、添付の図面に図解されている。これらの図面は本明細書の一部を成す。しかし、添付の図面は本発明の好ましい実施形態を図解し、およびしたがって実施形態の範囲を制限しないと考えられることに注意する。本発明は、分泌型WNTシグナル伝達拮抗因子DKK-1およびFRZBが多発性骨髄腫にみられる骨破壊を媒介することを実証する。Wntシグナル伝達が骨芽細胞増殖および分化に絶対的に必須であることの新たな証拠と共に、これらのデータは、これらの因子が骨減少に続く正常な補償的骨産生を抑制することによって骨芽細胞アネルギーを生じることおよび多発性骨髄腫骨疾患に寄与することを強く示唆する。破骨細胞活性を刺激することにおける多発性骨髄腫形質細胞の役割は集中的に研究されており、およびいくつかの鍵となる関連が確立されている。ここに示すデータは、多発性骨髄腫における骨芽細胞機能不全の、可能な機構的説明の証拠を初めて提供する。これらは、最近の研究がWNTシグナル伝達の阻害が骨芽細胞機能における欠陥を引き起こすことを示した点で有意義である。分泌型DKK-1およびFRZBは、多発性骨髄腫でみられる全身性骨粗鬆症、および形質細胞病巣近傍の悪化した局所性骨破壊の両方を説明し得る。重要なことに、DKK-1およびFRZBは、独立した経路を介しWNTシグナル伝達を阻害するように作用し、このことはそれらの同時発現が相乗作用を有することを示す。したがって、これらの遺伝子は、骨疾患の程度および骨疾患を発症する将来のリスクを予測するのに用いることができる可能性がある。さらに、これらのタンパク質の阻害因子は、骨疾患を阻害するのに用いることができる可能性がある。また、これらの因子が一般集団における骨粗鬆症に関与している可能性もある。WNTシグナル伝達経路Wnt遺伝子は、脊椎動物胚発生中に空間的におよび組織限定パターンで発現される分泌型ポリペプチドの大きなファミリーを構成する。マウスでの突然変異分析は、体軸、中枢神経系および四肢のパターン化、および器官形成中の誘導現象の調節といったさまざまな発生段階を調節することにおけるWntの重要性を示している。分泌型増殖因子のWntファミリーは、FrizzledFz受容体およびその共受容体であるLDL受容体関連タンパク質5または6LPR5またはLRP6を介して、おそらくWntによって誘導されるFz-LPR5/LRP6複合体形成を通じて、シグナル伝達を開始する。Wntの分泌型拮抗因子は、FrizzledFz関連タンパク質FRPs、Cerberus、Wnt阻害因子WIFおよびDickkopfDKKを含む。FrizzledFz関連タンパク質、CerberusおよびWnt阻害因子は全部が、Wntに結合および封鎖することによって作用することが示されている。Fzの分子模倣または他の機構によるWnt封鎖によって作用を発揮するWnt拮抗因子とは異なり、Dickkopf-1DKK-1は受容体複合体のLPR5/LRP6成分に結合することによって正規のWntシグナル伝達を特異的に阻害する。DKK-1は脊椎動物頭部オーガナイザーから分泌される頭部誘導因子であり、およびWntシグナル伝達に拮抗することによって全部発生を誘導する。DKK-1はLRP6に対する高親和性リガンドであり、およびWntによって誘導されるFz-LRP6複合体形成を妨げることによってWntシグナル伝達を阻害する。DKK-1はWntともFzとも結合せず、Wnt-Fz相互作用にも影響しない。頭部誘導およびWntシグナル伝達阻害におけるDKK-1機能は、LPR5/LRP6と結合しおよびFz-LPR5/LRP6会合を破壊する能力と密接に相関する。LPR5/LRP6機能およびDKK-1阻害は、Wnt/Fzベータカテニン経路に特異的であるように見える。これらの知見はしたがって、Wntシグナル調節のための新規の機構を明らかにする。WNTシグナル伝達および骨芽細胞分化近年の研究は、Wntシグナル伝達経路が骨芽細胞分化および機能に決定的であることを示している。低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5LRP5の遺伝子にターゲッティング破壊を有するマウスは低骨量表現型を発生する。LRP5は骨芽細胞で発現され、および骨芽細胞における最適なWntシグナル伝達に必要である。Invivoおよびinvitro分析は、この表現型は生後に明らかになり、さらにそれはCbfa1非依存的な態様で骨芽細胞増殖および機能の低下に対して二次的なものである。ヒトでは、LRP5における突然変異は、常染色体劣性疾患である骨粗鬆症-偽神経膠腫症候群OPPGを引き起こす。骨粗鬆症-偽神経膠腫症候群のキャリヤーは、年齢および性別が一致する対照と比較した場合に骨量低下がある。重要なことに、LRPにおける別々のおよび異なる突然変異は、高骨量表現型を結果として生じる。骨粗鬆症-偽神経膠腫突然変異とは対照的に、高骨量の性質は機能突然変異の利益である。その変異を有する対象者において骨吸収のマーカーは正常であった一方、オステオカルシンといった骨形成のマーカーは顕著に増加していた。Wntによるシグナル伝達の既知の標的であるフィブロネクチンのレベルもまた上昇していた。Invitro試験は、Dickkopf-1DKK-1によるWntシグナル伝達の正常な阻害は本突然変異の存在下では不完全であったこと、およびこのことが抑制されないWnt活性によるシグナル伝達増加を結果として生じたことを示した。これらの知見は、高骨量でのLRP5機能変化の役割を実証し、および骨粗鬆症の予防または治療のための標的候補としてDKKを指し示す。多発性骨髄腫におけるWNTシグナル伝達および骨疾患骨芽細胞機能におけるDKK-1の役割の間接的証拠が、高骨量表現型と連鎖しているLRP-5における機能突然変異の利益の同定によって与えられている。加えて、FRZBSFRP-3のホモログである分泌型firzzled関連タンパク質SFRP-1のターゲッティング破壊は、骨芽細胞の減少および骨細胞アポトーシスおよび骨梁形成増加に繋がる。骨量に影響する量的形質遺伝子座QTLがLRP-5領域に局在化されており、一般の人口は骨粗鬆症を発症する異なるリスクを有することを示唆する。多発性骨髄腫骨疾患は、DKK-1/FRZB発現とLRP-5対立遺伝子によって与えられる低骨量の遺伝的素因との組み合わせ作用によって影響され得ると考えられる。多発性骨髄腫の症例をLRP-5対立遺伝子変異について遺伝子型分析することができ、およびこの情報を骨疾患、およびDKK-1およびFRZB発現と相関させることができる。意義不明単クローン性免疫グロブリン血症MGUSは、多発性骨髄腫を発症する傾向がある形質細胞疾患であり、明らかな骨疾患を欠くことによって多発性骨髄腫から区別される。DKK-1および/またはFRZB発現が意義不明単クローン性免疫グロブリン血症の3分の1で発見されることの意義は不明であるが、しかしこれらの症例が多発性骨髄腫を発症するより高いリスクにある可能性があることを示唆し得る。多発性骨髄腫と同様に、この素因はまた遺伝するLRP5対立遺伝子と関連する可能性がある。代替的に、これらの意義不明単クローン性免疫グロブリン血症の例は、放射線スキャンではまだ明らかでない基礎となる発症前骨疾患を有するであろう。ここに示すデータは、多発性骨髄腫形質細胞によるDKK-1発現がどのように多発性骨髄腫疾患増殖調節および骨破壊に結びつき得るか、およびこれらの二つの現象がどのように1つの分子によって統合され得るかについてのモデルを示唆する。そのモデルでは、原発性多発性骨髄腫は高レベルのDKKを発現し、およびこれらのレベルはその疾患を治療するのに用いられる薬物療法で上昇させることができる。高レベルのDKK-1は多発性骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導する可能性が高く、および、細胞増殖が高率のDKK-1誘導性アポトーシスによって緩和されるため、本疾患の初期における相対的に遅い進行を説明し得る。しかし、疾患が進行するにつれ、JUNおよびDKK-1に、破骨細胞に誘導される低下が生じ、これは最終的に髄外疾患に見られるような、JUNおよびDKK-1発現の構成的消失に発展する。このように、DKK-1発現を多発性骨髄腫形質細胞の視点から見るならば、高レベルのDKK-1発現は本疾患を肯定する性質と見なすことができる。しかし、DKK-1誘導性アポトーシスに対して極めて感受性である間葉性細胞系譜については、高レベルのこの分泌産物は、前駆骨芽細胞のおよびおそらく間葉幹細胞さえの大規模なプログラム細胞死もまた誘導する点で、二通りの効果を有するであろう。疾患初期における高レベルのDKK-1は間葉幹細胞の永久的損失に繋がる可能性があると考えられ、この概念は、寛解誘導後または疾患進行中に破骨細胞が多発性骨髄腫形質細胞によるDKK-1分泌を抑制する可能性が高い際に、骨修復の欠如が観察されることによって支持される。したがって、この知識の活用は、多発性骨髄腫形質細胞に対するDKK-1の作用を強調するが同時に骨芽細胞またはその前駆細胞に対するDKKの骨損傷作用を妨げる、多発性骨髄腫のための新しい治療法の開発に繋がり得る。本発明の一実施形態では、WNTシグナル伝達拮抗因子の発現レベルを調べることによって、多発性骨髄腫患者において骨疾患を発症する可能性を判定する方法が提供される。その拮抗因子の、正常個体における発現と比較して増加した発現は、その患者が骨疾患を発症する可能性を有することを示す。好ましくは、そのWNTシグナル伝達拮抗因子は可溶性frizzled関連タンパク質3SFRP-3/FRZB、またはDickkopf-1DKK1のヒトホモログである。一般的に、これらのタンパク質の発現レベルは、核酸またはタンパク質レベルで測定することができる。別の一実施形態では、WNTシグナル伝達拮抗因子の発現を阻害することによって、多発性骨髄腫患者において骨疾患を治療する方法が提供される。好ましくは、そのWNTシグナル伝達拮抗因子は可溶性frizzled関連タンパク質3SFRP-3/FRZB、またはDickkopf-1DKK1のヒトホモログである。一般的に、これらの拮抗因子の発現は、核酸またはタンパク質レベルで阻害することができる。さらに別の一実施形態では、WNTシグナル伝達拮抗因子の発現を阻害することによって、個体において骨減少を防ぐ方法が提供される。好ましくは、そのWNTシグナル伝達拮抗因子は可溶性frizzled関連タンパク質3SFRP-3/FRZB、またはDickkopf-1DKK1のヒトホモログである。一般的に、これらの拮抗因子の発現は、核酸またはタンパク質レベルで阻害することができる。さらに別の一実施形態では、DKK1遺伝子登録番号NM012242の発現またはDKK1遺伝子によって発現されるタンパク質の活性を阻害する工程を含む、個体において骨減少を調節する方法が提供される。DKK1遺伝子発現は、たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または抗DKK1抗体または可溶性LRP受容体によることを含む、当業者に既知である任意の方法によって阻害される。さらに別の一実施形態では、DKK1タンパク質の阻害薬を個体に投与する工程を含む、個体において骨減少を調節する方法が提供される。一般的に、この方法はその個体が多発性骨髄腫、骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症または悪性腫瘍関連骨減少といった疾患を有する場合に有効である。一般的に、悪性腫瘍関連骨減少は、骨への乳がん転移または骨への前立腺がん転移によって引き起こされる。下記の実施例は本発明のさまざまな実施例を説明する目的のために与えられ、および本発明をいかなる方法でも制限しないことが意図される。当業者は、本発明は目的を実施および上記の結果および利点、およびここに内在する目的、結果および利点を得るためによく適合されていることを容易に理解し得る。請求項の範囲によって定義される通りの本発明の精神の内に包含される、その中の変化および他の用途を当業者は考えることができる。実施例1患者新たに診断された多発性骨髄腫の患者174名、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症の患者16名、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症の患者9名、および健常者45名を試験した。米国アーカンソー医科大学の施設内倫理委員会は本研究を承認し、およびすべての被験者はインフォームドコンセントを書面で提供した。表1は多発性骨髄腫の患者の特性を示す。実施例2骨画像処理画像は、遺伝子発現データの予備知識無しで、CanonPACS画像保存およびカタログ化システムを用いて検査した。MRIスキャンは1.5テスラGESignaスキャナで実施した。X線は米国放射線医学会ACR規格に準拠してフィルムからデジタル化した。MRIスキャンおよびX線はACRのDICOM医用デジタル画像処理および通信規格を用いてCanonPACSシステムに接続した。画像処理は取扱説明書に従って実施した。MRI画像は、ガドリニウムT1前および後強調処理およびSTIR短τ反転回復強調処理を用いて作成した。実施例3形質細胞単離および遺伝子発現プロファイリングフィコールハイパック勾配遠心分離後に、骨髄から得られた形質細胞を単核細胞画分から、モノクローナルマウス抗ヒトCD138抗体Miltenyi-Biotec,Auburn,CAを用いる免疫磁気ビーズ選択によって単離した。CD138/CD45-およびCD38/CD45-マーカーを用いた二色フローサイトメトリー、免疫細胞化学法による免疫グロブリン軽鎖の存在、およびライト-ギムザ染色による形態で示された通り、遺伝子発現プロファイリングに使用した細胞の90パーセント超が形質細胞であった。総RNAはRneasyミニキットQiagen,Valencia,CAを用いて単離した。標識化cRNAの調製および約10,000遺伝子を含むU95Av2マイクロアレイAffymetrix,SantaClara,CAへのハイブリダイゼーションは以前に記載した通りに実施したZhanetal.,2002;Zhanetal.,2003。RNA増幅は不要であった。実施例4免疫組織化学ヒト総DKK1タンパク質RDSystems,Minneapolis,MNに対して免疫化したヤギに由来する抗体をTris緩衝液で1:200希釈し、およびホルマリン固定してパラフィン包埋された骨髄生検切片に2時間室温にて加えた。隣接する切片をHEで染色した。抗原-抗体反応はDABビオチニル化抗ヤギ抗体VectorLaboratories,Burlingame,CA1:400希釈およびストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼDako染色後を用いて発色させ、およびヘマトキシリン-2を用いて対比染色した。実施例5酵素結合免疫吸着測定法ELISANunc-ImmunoMaxiSorp表面マイクロタイタープレートを、1xリン酸緩衝生理食塩水、pH7.2に溶解した1mg/mlの抗DKK1抗体50mlを用いて4°Cにて一夜被覆し、および4パーセントウシ血清アルブミンを用いてブロックした。骨髄形質を希釈緩衝液1×リン酸緩衝生理食塩水0.1Tween-201パーセントウシ血清アルブミンで1:50希釈した。ウェル当たり計50μlを負荷し、および4°Cにて一夜インキュベートし、洗浄し、および緩衝液で0.2mg/mlに希釈したビオチニル化ヤギ抗ヒトDKK1IgGRDSystemsとインキュベートし、その後ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼVectorLaboratoriesの1:10,000希釈50μlを加え、すべて取扱説明書に従った。発色はOPD基質系Dakoを用いて取扱説明書に基づいて達成した。組み換えヒトDKK1RDSystemsの連続希釈を用いて標準曲線を作成した。内因性DKK1を発現しない細胞株T293、および安定にトランスフェクションされたDKK1を有するT293Fedi,etal.,1999を用いて本ELISA測定法のバリデーションを行った。実施例6骨芽細胞分化測定法C2C12間葉性前駆細胞AmericanTypeTissueCulture,Reston,VAは、10パーセント熱不活化ウシ胎仔血清を添加したDMEMInvitrogen,Carlsbad,CA中で培養した。C2C12細胞におけるアルカリホスファターゼ活性は記載の通りに測定したGallea,etal.,2001;Spinella-Jaegle,etal.,2001。細胞溶解物はタンパク質含量についてマイクロBCA測定法キットPierce,Rockford,ILを用いて分析した。各実験は3連で実施した。実施例7統計解析多発性骨髄腫患者における骨疾患は、ロジスティック回帰を用いてモデル化した。考慮した独立変数は、新たに診断された多発性骨髄腫174例からバージョン5.01MASAffymetrix,SantaClara,CAを用いて測定した最大10,000個の遺伝子12,625個のプローブセットからの遺伝子発現強度値アベレージディファレンスコールであった。各プローブセットについて、遺伝子発現の定量尺度であるシグナルは、ロジスティック回帰モデルおよび順列調整分析への入力前にlog2に変換した。骨髄腫において骨疾患に関連し得る遺伝子については、先行する仮説は無かった。結果として、12,625個のプローブセットのそれぞれについて骨疾患の一変量モデルが用いられた。候補遺伝子は、順列調整された有意水準でのt検定WestfallおよびYoung,1993を用いて選別した。ウェストフォールおよびヤングの分析を用いて、複数の単変量仮説検定に合わせて調節した。DKK1シグナルおよびDKK1タンパク質レベルの群差は、ウィルコクソンの順位和検定を用いて検定した。骨疾患の状態による患者の特徴における有意差は、フィッシャーの正確確率検定またはカイ二乗検定のどちらかを用いて検定した。ロジスティック回帰によって同定された遺伝子の発現強度は、ClusterviewGolub,et.al.,1999を用いて視覚化した。スピアマンの相関係数を用いて、遺伝子発現およびタンパク質レベルの相関を測定した。骨芽細胞分化における対照と各実験条件との間の有意差は、ウィルコクソンの順位和検定を用いて検定した;独自のC2C12実験それぞれについて別個の比較を実施した。両側p値0.05未満を有意とし、および両側p値0.10未満を傾向差とした。実施例8骨髄腫細胞の発現プロファイリング過剰発現されおよび骨病変の存在に伴っていた遺伝子を同定するために、骨病変を有するかまたは有しない患者に由来するマイクロアレイデータの比較を実施した。MRIで定義される骨の限局性病変は、放射線で同定可能な溶解性病変の前に生じ得るので、骨病変を評価するためにT1強調およびSTIR強調画像処理を用いた。骨病変の無い患者n=36およびMRIで定義される限局性病変1個以上1を有する患者n=137の骨髄に由来する精製形質細胞中の遺伝子約10,000個の遺伝子発現パターンを、ロジスティック回帰分析によってモデル化した。そのモデルによって、2群の患者で発現に差のあったP<0.000157個の遺伝子が同定された図1A。これらの遺伝子57個をさらに、順列調整された有意性でt検定によって分析したWestfallおよびYoung,1993。これらの統計検定は、その57個の遺伝子のうち4個が、MRI病変1個以上を有する患者で過剰発現されていたことを示した:ジヒドロ葉酸還元酵素DHFR、プロテアソーム活性化因子サブユニットPSME2、CDC28プロテインキナーゼ2CKS2、およびdickkopfホモログ1DKK1。Wnt/β-カテニンシグナル伝達拮抗因子の遺伝子DKK1が4個のうちで唯一分泌型因子をコードすること、およびWnt/β-カテニンシグナル伝達は骨の生物学に関与することを考慮して、DKK1に関する追加の試験を実施した。骨髄腫の患者173名からの結果の分析は、MRI病変1個以上およびX線病変なしの患者についてのDKK1シグナルは、MRI病変なしおよびX線病変なしの患者と比較して有意に異なるが中央値シグナル:2,220対285;p<0.001、MRI病変1個以上およびX線病変1個以上の患者と比較して有意差がない中央値シグナル:2,220対1,865;p=0.63ことを示した図1B、表2。意義不明単クローン性免疫グロブリン血症MGUSは、溶解性骨病変を伴わない形質細胞疾患であり、および多発性骨髄腫に先行し得る。MGUSの16例中15例で、DKK1は骨髄形質細胞によって、骨のMRI病変またはX線病変が無い多発性骨髄腫におけるレベルと同等のレベルで発現されていた図1B。DKK1は、正常ドナー45名、および骨病変を欠く骨の形質細胞悪性腫瘍であるワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症の患者9名に由来する形質細胞では検出不能であった図1B。実施例9全遺伝子発現は、多発性骨髄腫において溶解性骨病変と関連するDKK-1およびFRZBを明らかにする溶解性骨疾患の分子決定因子をさらに特定するために、骨検査で溶解性病変の放射線的証拠を示さない新たに診断された多発性骨髄腫患者n=28に由来するCD138濃縮形質細胞における最大12,000個の遺伝子の発現プロファイルを、3個以上の溶解性病変を有する患者n=47と比較した。アブソルートコール遺伝子発現の定性尺度のカイ二乗検定を用いて、疾患の2つの型を区別した遺伝子30個を同定したP<0.05。シグナルコール遺伝子発現の定量尺度のウィルコクソンの順位和WRS検定は、104個の遺伝子アップレギュレート49個およびダウンレギュレート55個が2つの疾患亜型で差があったP<0.001ことを明らかにした。カイ二乗検定は、RHAMM前がん遺伝子をその2群間の最も有意な識別子として同定した。それは骨疾患の患者47名中34名と比較して、骨疾患のない患者28名中7名にしか発現されていなかった図2。予想される通り、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症11例中の1例に由来する形質細胞しかRHAMMを発現しなかった図3。WRSはRHAMMを溶解性病変群と非溶解性病変群の間の14番目に有意な識別子として順位づけた。NCALDは、神経細胞シグナル伝達に関与するカルシウム結合タンパク質であるが、非溶解性病変群の11/28例40に存在したが溶解性病変群の2/47例4にしか存在しなかった。カイ二乗分析によって同定された他の注目すべき遺伝子は、Wntシグナル伝達の拮抗因子である、溶解性病変群の40/47例85および非溶解性病変群の15/2853に存在したFRZBを含んだ。CBFA2/AML1BはMIP1α発現と結びつけられており、および非溶解性病変群の50および溶解性病変群の79に存在した。染色体分離に関与するPTTG1securinはWRSによって最も有意な識別遺伝子P=4x10-6と同定された。それは非溶解性病変群の11で存在するとされたが溶解性病変群の50で存在した図4。WRS検定での他の注目すべき遺伝子は、溶解性病変群でより低レベルに発現されたP=3x10-5TSC-22ホモログDSIPIを含んだ。DSIPIはまた、破骨細胞とのex-vivo共培養後の多発性骨髄腫形質細胞12例中12例でダウンレギュレートされた。加えて、非溶解性病変群に対して溶解性病変群でより高頻度に見出されたp<0.054個のいわゆるスパイク遺伝子が同定された:非溶解性病変群0/28例および溶解性病変群7/47例でスパイクを示すIL6p=0.032;非溶解性病変群0/28例および溶解性病変群7/47例でスパイクを示すオステオナイドジェンNID2p=0.032;非溶解性病変群1/28例および溶解性病変群11/47例でスパイクを示すGタンパク質シグナル伝達調節因子RGS13p=0.023;および非溶解性病変群1/28例および溶解性病変群1/47例でスパイクを示すピリミジン受容体P2YP2RY6p=0.023。このように、これらのデータは遺伝子発現パターンが骨疾患と関連し得るということを示唆する。溶解性骨疾患の出現および意義不明単クローン性免疫グロブリン血症から顕性多発性骨髄腫への転換の予測指標として潜在的に有用であることに加えて、それらはまた潜在的介入のための標的を特定し得る。実施例10DDK1およびFRZBは無作為の骨髄由来よりも限局性病変由来の形質細胞でより高レベルに発現される傾向がある溶解性病変に対するDKK-1およびFRZBの関係を考慮して、無作為の腸骨稜の骨髄吸引液由来の形質細胞と、脊椎の限局性病変のCT補助穿刺吸引で得られたものとで、DKK-1およびFRZB発現を比較した。これらの結果は、限局性病変由来の形質細胞における有意に高いレベルでの発現を示した。実施例11DKK-1およびFRZBはワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症由来の形質細胞で発現されていないワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症は、モノクローナルIgM異常蛋白血症および骨髄、リンパ節および脾臓のリンパ形質細胞浸潤によって特徴づけられる稀な形質細胞疾患である。その臨床症状は、臨床経過がそうであるように非常に変わりやすく、しかし多発性骨髄腫とは異なり骨病変は稀である。ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症10例に由来するCD138濃縮骨髄形質細胞の全遺伝子発現プロファイリングは著しい異常を示したがZhanetal.,2002、これらの細胞は、正常骨髄形質細胞のように、FRZBおよびDKKの発現を欠いた図20。実施例12FRZBおよびエンドセリン受容体BはDKK-1と相関するエンドセリン1は21アミノ酸の血管収縮因子である。エンドセリンの2種類の受容体である受容体AおよびBが同定されている。乳がんおよび前立腺がん細胞はエンドセリン1を産生することができ、および、エンドセリン1およびエンドセリン受容体Aの濃度上昇が骨転移を伴う進行前立腺がんで見出されている。エンドセリン1を産生した乳がん細胞は雌マウスで骨芽細胞転移を生じた。条件付け培地および外因性エンドセリン1はマウス頭頂骨培養において骨芽細胞増殖および新しい骨形成を刺激した図31。これらの結果は、エンドセリンが骨形成に関連することを示唆する。表3は、エンドセリン受容体BENDRBの発現がDKK-1の発現と相関したことを示す。エンドセリン受容体Bは新たに診断された多発性骨髄腫の3分の1においてスパイク遺伝子であった図29。エンドセリン受容体Bはまた、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症MGUSおよびくすぶり型多発性骨髄腫の部分集合で発現されていたが、正常形質細胞では発現されていなかった図30。実施例13InVivo薬物治療はDKK-1をアップレギュレートするDKK-1発現はUV照射およびいくつかの他の遺伝毒性刺激によって大幅にアップレギュレートされることが示されている。多発性骨髄腫形質細胞もまたこの疾患を治療するのに用いられる薬物に反応してその遺伝子をアップレギュレートするかどうか調べるために、多発性骨髄腫形質細胞の遺伝子発現プロファイリングを、サリドマイド図33、ImiD図34、PS-341図32、またはデキサメタゾン図35を用いた48時間のinvivo処理の前後に実施した。これらのデータは、DKK-1およびFRZB発現を多くの例で大幅にアップレギュレートすることができ、およびそのようにして多発性骨髄腫形質細胞のアポトーシスを誘発することにおけるDKK-1の直接的役割を支持することを示した。最初の予備試験で試験したすべての物質に対して一次性に不応性であった新たに診断された患者がDKK-1の低レベルを示したこと、および薬物治療後にDKK-1またはFRZBの発現増大を示さなかったことに注目するのは興味深く、アポトーシスof多発性骨髄腫形質細胞のアポトーシスを促進することにおけるDKK-1発現の役割を支持する。この概念を支持して、DKK-1およびFRZBは、30例のHMCLおよび数例の髄外疾患で、低レベルから検出不能レベルにて発現されていた図15。実施例14破骨細胞との多発性骨髄腫の共培養の結果としてJUN、FOS、およびDKK-1の大幅なダウンレギュレーションが生じる骨髄腫細胞と破骨細胞の間の密接な関係は、消耗性溶解性骨破壊の多発性骨髄腫との関連によって臨床的に現れている。溶解性骨病変の発生は、骨髄腫形質細胞との直接的および間接的相互作用を介して破骨細胞の活性化によって引き起こされる。骨髄腫細胞の生存および増殖および疾患過程の維持における破骨細胞の決定的役割は、臨床的に調べられており、および原発性ヒト骨髄腫に関するSCID-huモデルといった実験モデルにおいてinvivoで実証されている。多発性骨髄腫形質細胞/破骨細胞相互作用の分子的結果を調査するために、CD138濃縮多発性骨髄腫形質細胞を、多発性骨髄腫の末梢血幹細胞PBSCまたは健常ドナー由来PBSCおよびMNCから得られた破骨細胞と共培養するexvivo系を開発した。正常ドナーまたは多発性骨髄腫患者に由来する末梢血幹細胞から得られたヒト破骨細胞と共培養したCD138濃縮多発性骨髄腫形質細胞は、アネキシンVフローサイトメトリー、BrdU標識化指数および3HTdR取り込みによって示される生存度および増殖活性を50日間の長期にわたって維持した。共培養の前後の形質細胞の純度レベルは、CD38/CD45フローサイトメトリーによって測定された通り、95より大であった。12例の多発性骨髄腫形質細胞における最大12,000個の遺伝子の発現のマイクロアレイ分析を、4日間の共培養の前および後に実施した。12例の多発性骨髄腫形質細胞対および150例の新たに診断された多発性骨髄腫形質細胞の、7,913個のプローブセット遺伝子を用いた階層的クラスター分析は、共培養前標本が3つの主要なクラスター群内に分布した一方、共培養後標本は主要な枝のうち2つに互いに密にクラスター化したことを明らかにした。共培養後のその顕著な遺伝子発現変化の分析は、95個のプローブセット遺伝子が、共培養後に多発性骨髄腫形質細胞12例中少なくとも8例で2~50倍変化したことを示したアップレギュレート77個、およびダウンレギュレート18個。健常ドナー5名に由来するCD138濃縮形質細胞はその同じ遺伝子のうち多数で同様の変化を示し、多発性骨髄腫形質細胞は破骨細胞に対して反応の変化を示さないことを示唆した。しかし、正常形質細胞は、その悪性対応物とは対照的に、破骨細胞との長期共培養で生存しなかった。最も著しい変化は、ケモカインGRO1、GR02、GR03、SCYA2、SCYA8、SCYA18、およびIL8のアップレギュレーションにあった。他の注目すべき遺伝子は、ケモカイン受容体CCR1、オステオポンチンSPP1、インテグリンITGB2およびITGB5、マトリクスメタロプロテイナーゼ9MMP9、カテプシンKCTSKおよびカテプシンLCTSLを含んだ。驚くべきことに、多数の破骨細胞関連遺伝子が、77個のアップレギュレートされた遺伝子に含まれた。ダウンレギュレートされた遺伝子は、サイクリンBCCNB1、サイクリンB特異的ユビキチンリガーゼUBE2C、TSC-22ホモログDSIPI、およびJUN、JUND、FOS、およびFOSBを含んだ。遺伝子発現変化はまた、単独で培養された、および多発性骨髄腫形質細胞との共培養後の、破骨細胞10例で試験した。24個の遺伝子アップレギュレート14個およびダウンレギュレート10個が、共培養後の破骨細胞10例中少なくとも7例で2~10倍変化した。多発性骨髄腫患者からまたは健常ドナーから得られた破骨細胞と共に培養した多発性骨髄腫形質細胞の間に遺伝子発現の有意差は無く、多発性骨髄腫破骨細胞は正常ドナーから得られたものと質的に異ならないことを示唆した。共培養実験から得られた培地で多発性骨髄腫形質細胞を培養した際に、遺伝子発現に有意差は観察されず、接触が重要であることを示唆した。共培養実験における多発性骨髄腫形質細胞の破骨細胞に対する低い比1000:1を考慮すると、すべての形質細胞が破骨細胞と同時に接触できる可能性は低い。したがって、破骨細胞と接触している多発性骨髄腫形質細胞と他の多発性骨髄腫形質細胞との間の何らかの細胞間情報伝達が起こる可能性が高い。破骨細胞が多発性骨髄腫骨疾患で主要な役割を果たすことおよび多発性骨髄腫に抗アポトーシス性シグナルを提供することが知られている。近年の研究は、JUNが直接的にDKK-1発現を調節すること、および、JUNおよびDKK-1がアポトーシスを調節することを示している。JUNおよびDKK-1を調節することによって破骨細胞が多発性骨髄腫形質細胞のアポトーシスを阻害し得るかどうかを判定するため、原発性多発性骨髄腫12例に由来する精製した形質細胞について、invitroで得られた破骨細胞との48時間の共培養の前および後に、遺伝子発現プロファイリングを実施した。共培養中の多発性骨髄腫形質細胞は単独で培養された細胞よりも有意に高い長期生存度を有した。破骨細胞共培養の前後の多発性骨髄腫形質細胞の遺伝子発現プロファイリングは、JUN、FOS、およびFOSBは全例で2倍より大きくダウンレギュレートされた40個の遺伝子のうちの3個であることを明らかにしたn=12/12。共培養後の多発性骨髄腫形質細胞で顕著に調節された95個の遺伝子を用いたHMCLおよび原発性多発性骨髄腫細胞の階層的クラスター分析は、HMCL、破骨細胞と共培養した原発性多発性骨髄腫、および新たに診断された多発性骨髄腫の部分集合の間に、これらの細胞型が相対的に低レベルのc-JUNおよびc-FOSを有した点で著しい類似性を明らかにした。重要なことに、原発性多発性骨髄腫細胞は単独で培養した際に高い程度の自発的アポトーシスを示す一方、破骨細胞の存在下で培養した多発性骨髄腫形質細胞は無限に生存することができる。これらのデータはJUNとDKK-1の間の関連を支持し、およびまた、髄外疾患および常に髄外疾患に由来するHMCLはJUNおよびDKKの両方を欠くため、多発性骨髄腫におけるJUNおよびDKK発現の消失は疾患進行と関連し得ることを示唆する。多発性骨髄腫増殖および挙動に対する破骨細胞の主要な影響の1つが、JUNおよびDKK-1をダウンレギュレートすることであってこれが直接的に形質細胞アポトーシスに影響を与えると推測するのは興味深い。HMCLおよび原発性多発性骨髄腫/破骨細胞共培養のDKK-1を用いた処理は、多発性骨髄腫形質細胞のアポトーシスを結果として生じることが予想される。DKK-1は破骨細胞に対して作用を有しない可能性が高く、それはこれらの細胞がWnt共受容体LRP-5を発現しないためである。正常骨髄由来形質細胞もまたDKK-1を発現せず、およびそれらの長命性を説明するのに役立つであろう。実施例15形質細胞によるDKK1タンパク質の合成多発性骨髄腫65例の骨髄生検由来の連続切片を、DKK1の存在に関して染色した。これらの例中の形質細胞は、遺伝子発現データと一致する形でDKK1を含んだ図39。正常ドナー5例由来の生検を用いた同様の実験は、どの細胞にもDKK1を検出できなかった。DKK1陽性骨髄腫には、間質性増殖パターンを伴う軽度の形態核小体が見えない多量の細胞質を有する強い傾向があった。この染色は骨に隣接する形質細胞で最も強かった。DKK1陰性骨髄腫は結節状または閉塞性増殖パターンを伴う重度の形態大型化した核および顕著な核小体を有する傾向があった。間質性増殖パターンについての生検では、DKK1は存在した細胞のさまざまな割合でかまたは存在しなかった。対照的に、より悪性の結節状増殖パターンを有する骨髄腫では一律にDKK1は存在しなかった。重要なことに、間質性および結節状増殖の両方を伴う例では、間質性細胞は陽性でありおよび結節状細胞は陰性であった。実施例16骨髄形質中のDKK1タンパク質酵素結合免疫吸着測定ELISAは、遺伝子発現データもまた利用可能である新たに診断された多発性骨髄腫患者173例のうち107例に由来する骨髄形質中のDKK1タンパク質の濃度は24.02ng/mlS.D.49.58であったことを示した。対照的に、DKK1は健常ドナー14例では8.9ng/mlS.D.4.2、MGUS14例では7.5ng/mlS.D.4.5、およびワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症9例では5.5ng/mlS.D.2.4であった。DKK1遺伝子発現および骨髄形質中のDKK1のレベルは、骨髄腫107例で正に相関していたr=0.65、P<0.001図40A。また、骨髄形質および末梢血形質中のDKK1タンパク質レベル間に、両方の標本を同時に採取した骨髄腫41例において強い相関があったr=0.57、P<0.001。骨髄形質中のDKK1タンパク質レベルおよび骨病変の存在の両方が測定された患者68例のうち、MRI病変1個以上およびX線病変なしの患者におけるDKK1タンパク質は、MRI病変なしおよびX線病変なしの患者と比較して有意に差があったが中央値レベル:20ng/ml対9ng/ml;p=0.002、MRI病変1個以上およびX線病変1個以上の患者と比較して有意差は無かった中央値レベル:20ng/ml対14ng/ml;p=0.36図40B、表2。実施例17invitro骨芽細胞分化に対する骨髄血清の作用骨形成タンパク質-2は、運命決定されていない間葉性前駆細胞株C2C12Katagiri,etal.,1994の骨芽細胞への分化を、Wnt/b-カテニンシグナル伝達Bain,etal.,2003;Roman-Roman,etal.,2002が関与する経路を介して誘導することができる。骨芽細胞分化の特異的マーカーであるアルカリホスファターゼは、5パーセントウシ胎仔血清中で5日間培養したC2C12細胞において検出不能であった図41A。C2C12細胞の、50ng/mlのBMP-2を用いた5日間の処理は、C2C12細胞がアルカリホスファターゼを産生するように誘導したが、一方、アルカリホスファターゼはBMP-2および50ng/ml組み換えヒトDKK1と一緒に培養したC2C12細胞によって産生されなかった。アルカリホスファターゼ産生に対するこのinvitro作用は、ポリクローナル抗DKK1抗体によって中和されたが、非特異的ポリクローナルヤギIgGでは中和されなかった。骨髄腫患者5例に由来する、DKK1濃度が12ng/mlを超える骨髄血清は、BMP-2で処理したC2C12細胞によるアルカリホスファターゼの産生を阻害し、およびこの作用は抗DKK1抗体によって逆転されたが非特異的IgGでは逆転されなかった図41B。対照的に、50ng/mlBMP-2および正常ドナーの骨髄由来の血清10パーセントで処理したC2C12細胞は、細胞によるアルカリホスファターゼの産生を誘導した図41B。下記の参考文献をここで引用した:Zhanetal.,Globalgeneexpressionprofilingofmultiplemyeloma,monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance,andnormalbonemarrowplasmacells.Blood99:1745-17572002.Zhanetal.,Geneexpressionprofilingofhumanplasmacelldifferentiationandclassificationofmultiplemyelomabasedonsimilaritiestodistinctstagesoflate-stageB-celldevelopment.Blood101:1128-11402003.Fedietal.IsolationandbiochemicalcharacterizationofthehumanDkk-1homologue,anovelinhibitorofmammalianWntsignaling.JBiolChem274:19465-721999.Galleaetal.Bone28:491-82001.Spinella-Jaegleetal.Bone29:323-302001.WestfallandYoung.Resampling-basedmultipletesting:Examplesandmethodsforp-valueadjustment.Hoboken,NJ:Wiley-Interscience,3601993.Golubetal.Science286:531-71999.Katagirietal.JCellBiol127:1755-661994.Bainetal.BiochemBiophysResCommun301:84-912003.Roman-Romanetal.AmericanSocietyofBoneMineralResearch,2002.本明細書中で言及した特許または出版物はいずれも、本発明が関係する分野の当業者のレベルを示す。さらに、これらの特許および出版物は、個々の出版物が参照により本開示に含まれると具体的および個別に示されたのと同等に、参照により本開示に含まれる。"