"式で表される化合物を、式式中、Xは、pH8未満のバッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオであるで表される化合物で処理する工程を含む、EC145を調製するためのプロセス。Xは、2-チオピリジニルまたは3-ニトロ-2-チオピリジニルである、請求項1に記載のプロセス。Xは、2-チオピリジニルである、請求項1に記載のプロセス。前記バッファーは、pHが5.9~6.3である、請求項1~3のいずれかに記載のプロセス。前記バッファーは、pHが5.9~6.1である、請求項4に記載のプロセス。前記バッファーは、リン酸バッファーである、請求項1~5のいずれかに記載のプロセス。前記バッファーは、リン酸ナトリウムバッファーである、請求項6に記載のプロセス。pH5.9~6.3のリン酸ナトリウムバッファーの存在下、式で表される化合物を、式で表される化合物で処理する工程を含む、請求項1に記載のプロセス。アセトニトリルを含む溶液で前記処理を実施する、請求項1~8のいずれかに記載のプロセス。デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、前記式Y-CO-O-CH22-S-X式中、Yは脱離基であるで表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、式で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、前記式で表される化合物を、前記式で表される化合物を単離せずに、前記反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む、請求項1~9のいずれかに記載のプロセス。前記アシル化剤は、前記式で表されるアシル化剤またはその酸付加塩である、請求項10に記載のプロセス。前記アシル化剤は、前記式で表され、酸付加塩の形態で導入される、請求項11に記載のプロセス。前記アシル化剤は、前記式で表され、遊離塩基の形態で導入される、請求項11に記載のプロセス。アセトニトリルを含む溶媒中で、前記デスアセチルビンブラスチンヒドラジドが前記アシル化剤で処理される、請求項10~13のいずれかに記載のプロセス。前記デスアセチルビンブラスチンヒドラジドは、高度に精製された形態で提供される、請求項10~14のいずれかに記載のプロセス。デスアセチルビンブラスチンヒドラジドをアシル化剤で処理し、前記式で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、EC119を前記反応混合物で処理する工程とが、同一の反応容器で実施される、請求項10~15のいずれかに記載のプロセス。EC145を含有する前記反応混合物を、クエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液で希釈し、精製用のポリスチレン-ジビニルベンゼンポリマー樹脂カラムまたはカートリッジに通す工程をさらに含む、請求項1~16のいずれかに記載のプロセス。アセトニトリルとクエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液とを含む移動相を用いて、前記EC145生成物を前記カラムまたはカートリッジから溶出する工程をさらに含む、請求項17に記載のプロセス。EC145を精製生成物として水溶液で得るために限外濾過を使用する工程をさらに含む、請求項1~18のいずれか1項に記載のプロセス。どの工程で用いる水にも約0.9パーツパーミリオンppmを超えない濃度で溶存酸素が含まれる、請求項1~19のいずれか1項に記載のプロセス。請求項1~20のいずれかに記載のプロセスによって調製される、EC145結合体。式で表される化合物を、式式中、Xは、バッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオであり、前記バッファーは、pHが5.9~6.3であるで表される化合物で処理する工程を含むプロセスによって調製される、EC145結合体。Xは、2-チオピリジニルである、請求項22に記載の結合体。前記プロセスが、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、式Y-CO-O-CH22-S-X式中、Yは脱離基であるで表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、前記式で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、前記式で表される化合物を、前記式で表される化合物を単離せずに、前記反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む、請求項22または23に記載の結合体。前記アシル化剤は、前記式で表され、前記遊離塩基の形態で導入される、請求項24に記載の結合体。請求項21~25のいずれかに記載した前記EC145結合体を、希釈剤、賦形剤またはキャリアと一緒に含む、薬学的組成物。米国特許第7,601,332号およびWO2007/022493号に開示された、EC145を調製するための手順は、EC145を最大数十ミリグラムなどの実験室規模で調製するのには適しているが、規模を大きくすると問題が生じることがある。同公報に開示された手順では、式で表されるチオールEC119として知られるを用いて、チオスルホネート活性化またはピリジルジチオ活性化されたビンブラスチン中間体との間でジスルフィド結合を形成することで、EC145を調製する。たとえば、ジクロロメタンDCMにて、式で表されるカルバモイルジスルフィド中間体CDSIを調製した後、シリカゲルクロマトグラフィで単離した。その後、CDSIをテトラヒドロフランTHFに溶解させ、これをEC119の水溶液に加え、この溶液のpHを炭酸水素ナトリウムで調整して、EC119を可溶化した。反応終了時、少量の混合物5~10mLであれば、ロータリーエバポレータを用いてTHFを除去することができた。ただし、真空下で泡が出る操作には、規模が大きくなるとうまくいかないという問題があった。したがって、反応が終了したら混合物を水で希釈し、凍らせて、凍結乾燥させた。この粗固体を水に溶解させ、逆相クロマトグラフィで精製した。EC145のピークエリアが90を超えるクロマトグラフィの画分を合わせ、水で希釈し、凍結乾燥させた。典型的には、精製後の収率は30~40の範囲で、純度は90~93の範囲であった。凍結乾燥に伴う容積では、調製物がグラム単位を超える量になると、扱いが非常に難しくなった。さらに、規模を大きくすると、ジスルフィド結合の形成時に遊離するメルカプトピリジンによる反応混合物の反応が進む際に、EC145の一部が分解されることがわかった。この分解は抑制可能であることがわかり、それが本発明の一態様を提供するものである。よって、一実施形態として、式で表される化合物を、式式中、Xは、pH8未満のバッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオであるで表される化合物で処理する工程を含む、EC145を調製するためのプロセスが提供される。このプロセスの一実施形態では、Xは、2-チオピリジニルまたは3-ニトロ-2-チオピリジニルである。このプロセスの一実施形態では、Xは、2-チオピリジニルである。上記のいずれについても、一実施形態では、バッファーは、pHが約7未満である。もうひとつの実施形態では、バッファーは、pHが6.5未満である。もうひとつの実施形態では、バッファーは、pHが5.9~6.3である。もうひとつの実施形態では、バッファーは、pHが5.9~6.1である。上記のいずれについても、一実施形態では、バッファーは、リン酸バッファーである。もうひとつの実施形態では、バッファーは、リン酸ナトリウムバッファーである。本明細書で開示するように、バッファーを用いると、炭酸水素ナトリウムを使用する場合よりも、pHと分解の問題を制御しやすくなる。上記のプロセスのもうひとつの実施形態は、pH5.9~6.3のリン酸ナトリウムバッファーの存在下、式の化合物を式の化合物で処理する工程を含む。上記のいずれについても、一実施形態は、アセトニトリルを含む溶液で処理を実施する、プロセスである。上記のいずれについても、別の態様は、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、式Y-CO-O-CH22-S-X式中、Yは脱離基であるで表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、式で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、式で表される化合物を、式で表される化合物を単離せずに、当該反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む、プロセスである。脱離基Yは、ヒドラジドのアシル化に適した多数の脱離基のうちのいずれであってもよい。一実施形態では、Yは、カルボン酸との間または炭酸のモノエステルとの間で活性エステルを形成するアルコールの残基、たとえば4-ニトロフェノキシ残基、1-ベンゾトリアゾールイルオキシ残基または7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ残基である。一実施形態では、アシル化剤は、式で表されるアシル化剤またはその酸付加塩である。もうひとつの実施形態では、アシル化剤は、式で表され、酸付加塩の形態で導入される。アシル化剤を酸付加塩の形で導入する場合、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの塩基を用いて、これを遊離状態にする。もうひとつの実施形態では、アシル化剤は、式で表され、遊離塩基の形で導入される。上記のいずれについても、一実施形態は、アセトニトリルを含む溶媒中で、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドがアシル化剤で処理されるプロセスである。上記のいずれについても、一実施形態は、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドが高度に精製された形態で提供されるプロセスである。後述の実施例で説明するように、酢酸エチルおよびトルエンからの溶解/沈殿結晶化と記載を伴う手順を用いて、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを高度に精製された固体として得るようにしてもよい。上記のいずれについても、一実施形態は、EC119が高度に精製された形態で提供されるプロセスである。EC119は、Fmocを用いる固相法で合成される。まず、ジイソプロピルエチルアミンDIPEAの存在下、2-クロロトリチルクロリド樹脂とのエステル化によって、FmocCysOHを樹脂に結合させる。次に、0.1MのHOBtをジメチルホルムアミドDMFに加えた溶液で、この樹脂を6ピペラジンで処理することによって、樹脂結合CysのFmoc保護基を除去する。この樹脂を、DMF、メチルt-ブチルエーテルMTBEで洗浄する。FmocAspOHをN,N′-ジイソプロピルカルボジイミドDICおよびN-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBtで樹脂に結合させる。このカップリング反応を、カイザーテストで監視する。以下、FmocAspOH、FmocArgOH、FmocAspOH、FmocGluOtBuを用いて、脱保護とカップリングとを繰り返す。N10TFAPteOHのカップリングでは、1.2当量のN10TFAPte、1.2当量のPyBOP、1.2当量のHOBt、2.4当量のDIPEAを用いる。トリフルオロアセチル基を、DMFにて2ヒドラジンで除去する。約85のトリフルオロ酢酸、10のエタンジチオール、2.5のトリイソプロピルシラン、2.5の脱イオン水を含有する切断試薬を用いて、ペプチドを樹脂から切断する。この反応では、tBu、Pbfとトリチル保護基も同時に除去される。この粗生成物をMTBEで沈殿させ、濾過して単離する。粗EC119の純度は約90である。調製については、実施例でさらに詳細に説明する。上記のいずれについても、一実施形態は、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドをアシル化剤で処理し、式で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、EC119を当該反応混合物で処理する工程とが、同一の反応容器で実施されるプロセスである。上記のいずれについても、一実施形態は、EC145を含有する反応混合物を、クエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液で希釈し、精製用のポリスチレン-ジビニルベンゼンポリマー樹脂カラムまたはカートリッジに通す工程をさらに含む、プロセスである。このプロセスは、希釈と添加という一連の作業を可能にするものである。このような希釈と添加による手法では、反応混合物を緩衝食塩水で希釈し希釈溶液用にアセトニトリル含有量10を目標にする、この溶液をクロマトグラフィのカラムに通す必要がある。これによって、一連の限外濾過作業が必要なくなり、処理時間を約12~24時間節約できる。もうひとつの実施形態は、アセトニトリルとクエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液とを含む移動相を用いて、EC145生成物をカラムまたはカートリッジから溶出する工程をさらに含む。緩衝食塩水の移動相を用いると、クロマトグラフィの過程がいくつかの側面で改善される。まず、緩衝食塩水の移動相のイオン強度が高まることで、移動相と固定相とに生成物を分けることへの影響がおよぶ。固定相に対する生成物の親和性は、粗EC145に対するカラムのキャパシティが2倍を上回るほど高くなる。固定相の親和性が増すと、粗EC145をカラムに加えている間に生成物の漏れ添加作業の際にカラムを流れる生成物の一部が発生しなくなる。また、イオン強度が高くなると、クロマトグラフィのプロセスでの時間的動態が改善され、クロマグラフィで得られるピークの形状が、ガウシアン曲線に近似して画分のカットポイントを一層簡単に同定できるものになる。さらに、移動相に塩化ナトリウムを用いることで、保持容量と生成物の溶出領域が再現可能になる。上記のいずれについても、一実施形態は、EC145を精製生成物として水溶液で得るために限外濾過を使用する工程をさらに含む、プロセスである。このプロセスを用いると、大規模な凍結乾燥に付随する時間的な損失と生成物の純度の損失約1が生じることがない。また、このプロセスでは、0.2ミクロンのアブソリュートフィルターで濾過する別の実施形態に適した条件で、精製生成物が水溶液で提供される。この濾過は、濾過をしないプロセスよりも微生物数とエンドトキシン濃度を低減するものである。本明細書のいずれかの実施形態に記載したようなプロセスに伴う潜在的な問題のひとつに、酸素によるEC145の分解がある。上記のいずれについても、一実施形態は、どの工程で用いる水にも約0.9パーツパーミリオンppmを超えない濃度で溶存酸素が含まれる、プロセスである。本発明の一態様として、本明細書にて上述したプロセスによって調製される結合体EC145が、一実施形態として提供される。一実施形態は、式で表される化合物を、式式中、Xは、バッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオであり、このバッファーは、pHが5.9~6.3であるで表される化合物で処理する工程を含むプロセスによって調製される、EC145結合体である。上記の一実施形態では、Xは、2-チオピリジニルである。上記の結合体の別の実施形態では、このプロセスは、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、式Y-CO-O-CH22-S-X式中、Yは脱離基であるで表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、式で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、式で表される化合物を、式で表される化合物を単離せずに、当該反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む。上記の別の実施形態は、アシル化剤が式で表され、遊離塩基の形態で導入される、結合体24である。本発明の一態様として、上述の実施形態のいずれかに記載した上記のEC145結合体を、希釈剤、賦形剤またはキャリアと一緒に含む薬学的組成物が、一実施形態として提供される。<関連出願へのクロスリファレンス>本出願は、2010年5月19日にファイルされた米国仮特許出願第61/346,444号および2010年6月3日にファイルされた同第61/351,022号の優先権の利益を主張するものであり、それぞれを本明細書に援用する。詳細な説明本発明の実施形態について、以下に列挙する項によってさらに説明する。1.式で表される化合物を、式式中、Xは、pH8未満のバッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオであるで表される化合物で処理する工程を含む、EC145を調製するためのプロセス。2.Xは、2-チオピリジニルまたは3-ニトロ-2-チオピリジニルである、第1項に記載のプロセス。3.Xは、2-チオピリジニルである、第1項に記載のプロセス。3.1バッファーは、pHが約7未満である、第1項~第3項のいずれかに記載のプロセス。3.2バッファーは、pHが6.5未満である、第1項~第3項のいずれかに記載のプロセス。4.バッファーは、pHが5.9~6.3である、第1項~第3項のいずれかに記載のプロセス。5.バッファーは、pHが5.9~6.1である、第4項に記載のプロセス。6.バッファーは、リン酸バッファーである、第1項~第5項に記載のプロセス。7.バッファーは、リン酸ナトリウムバッファーである、第6項に記載のプロセス。8.pH5.9~6.3のリン酸ナトリウムバッファーの存在下、式で表される化合物を、式で表される化合物で処理する工程を含む、第1項に記載のプロセス。9.アセトニトリルを含む溶液で処理を実施する、第1項~第8項のいずれかに記載のプロセス。10.デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、式Y-CO-O-CH22-S-X式中、Yは脱離基であるで表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、式で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、式で表される化合物を、式で表される化合物を単離せずに、当該反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む、第1項~第9項のいずれかに記載のプロセス。10.1Yは、カルボン酸との間または炭酸のモノエステルとの間で活性エステルを形成するアルコールの残基である、第10項に記載のプロセス。10.2Yは、4-ニトロフェノキシ残基、1-ベンゾトリアゾールイルオキシ残基または7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ残基である、第10項に記載のプロセス。11.アシル化剤は、式で表されるアシル化剤またはその酸付加塩である、第10項に記載のプロセス。12.アシル化剤は、式で表され、酸付加塩の形態で導入される、第11項に記載のプロセス。13.アシル化剤は、式で表され、遊離塩基の形態で導入される、第11項に記載のプロセス。14.アセトニトリルを含む溶媒中で、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドがアシル化剤で処理される、第10項~第13項のいずれかに記載のプロセス。15.デスアセチルビンブラスチンヒドラジドは、高度に精製された形態で提供される、第10項~第14項のいずれかに記載のプロセス。16.デスアセチルビンブラスチンヒドラジドをアシル化剤で処理し、式で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、EC119を当該反応混合物で処理する工程とが、同一の反応容器で実施される、第10項~第15項のいずれかに記載のプロセス。17.EC145を含有する反応混合物を、クエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液で希釈し、精製用のポリスチレン-ジビニルベンゼンポリマー樹脂カラムまたはカートリッジに通す工程をさらに含む、第1項~第16項のいずれかに記載のプロセス。18.アセトニトリルとクエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液とを含む移動相を用いて、EC145生成物をカラムまたはカートリッジから溶出する工程をさらに含む、第17項に記載のプロセス。19.EC145を精製生成物として水溶液で得るために限外濾過を使用する工程をさらに含む、第1項~第18項のいずれか1項に記載のプロセス。20.どの工程で用いる水にも約0.9パーツパーミリオンppmを超えない濃度で溶存酸素が含まれる、第1項~第19項のいずれか1項に記載のプロセス。21.第1項~第20項のいずれかに記載のプロセスによって調製される、EC145結合体。22.式で表される化合物を、式式中、Xは、バッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオであり、このバッファーは、pHが5.9~6.3であるで表される化合物で処理する工程を含むプロセスによって調製される、EC145結合体。23.Xは、2-チオピリジニルである、第22項に記載の結合体。24.上記のプロセスが、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、式Y-CO-O-CH22-S-X式中、Yは脱離基であるで表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、式で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、式で表される化合物を、式で表される化合物を単離せずに、当該反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む、第22項または第23項に記載の結合体。25.アシル化剤は、式で表され、遊離塩基の形態で導入される、第24項に記載の結合体。26.第21項~第25項のいずれかに記載した上記のEC145結合体を、希釈剤、賦形剤またはキャリアと一緒に含む、薬学的組成物。本明細書で使用する場合、アルキルという用語は、任意に分枝状または環状で、任意に置換され、あるいは、ヘテロアルキルとして酸素、硫黄または窒素原子を含むものであってもよい、炭素原子の鎖を含む。また、特定の実施形態では、アルキルは、C1~C6およびC1~C4など、長さが都合よく限定されている旨も理解できよう。例示としてのアルキル基として、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、シクロヘキシルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。本明細書で使用する場合、アリールという用語は、単環および多環の芳香族炭素環基を含み、それぞれ任意に置換されていてもよい。本明細書に記載の例示としての芳香族炭素環基は、フェニル、ナフチルなどであるが、これらに限定されるものではない。本明細書で使用する場合、ヘテロアリールという用語は、芳香族複素環基を含み、それぞれ任意に置換されていてもよい。例示としての芳香族複素環基として、2-ピリジニル、3-ニトロ-2-ピリジニルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。任意に置換されたという表現は、本明細書で使用する場合、水素原子が任意に置換されたラジカルの他の官能基に代わる置換を含む。このような他の官能基としては、例示的に、ハロ、ニトロなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載するような薬学的組成物は、EC145の非経口投与に適するようにした薬学的組成物を意味する。以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態をさらに例示するものである。しかしながら、以下の例示的な実施例は、いかなる形にも本発明を限定するものとは解釈されるべきものではない。溶媒、試薬、保護基などに対して一般に用いられる略号を、本明細書でも使用する。カルバモイルジスルフィド中間体carbamoyldisulfideintermediate4に対しては、CDSIという表記を使用する。実施例で分画と試料の評価に用いるHPLC法には、以下のものを含む。EC145CMCIP0001試料調製物:8MのグアニジンHClを用いて約0.5mg/mLまで希釈した希釈物質カラム:WatersXBridgeBEHC18、3.5μm、2.1×100mm移動相:A500mMの炭酸水素アンモニウム、pH9.2;B75:25アセトニトリル-メタノール.注入容量:10μLUV検出:280nmカラム温度:50°C試料温度5°C勾配時間流速AB0005595505055955100558020500557352652100557152852700557030290055554530005530703300553070331075955400075955EC145CMCAM0001バージョン2.3試料調製物:リン酸緩衝食塩水または1:1アセトニトリル水vvを用いて約1mg/mLまで希釈した希釈物質カラム:WatersSymmetryC18、3.5μm、4.6×75mm移動相:A10mMトリエチルアンモニウムアセテート、pH7.5;Bアセトニトリル注入容量:10μLUV検出:280nmカラム温度:25°C試料温度5°C勾配時間流速AB00108515200105050250102080300102080310108515410108515実施例1EC119の調製Fmocを用いる固相法で、以下のようにしてEC119を合成する。1回目のカップリング2-クロロトリチルクロリド樹脂をペプチド合成容器に加える。DMFで膨潤させる樹脂10mL/g。DMFで2回洗浄する樹脂10mL/g。0.8当量のFmocCysOHのDCM/DMF溶液を加える。2当量のDIPEAを加える。30分間攪拌する。メタノール樹脂1gあたり1mLを加え、10分間攪拌する。DMFで3回洗浄する。MTBEで3回洗浄する。DMFで3回洗浄する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。DMFで3回洗浄する。MTBEで3回洗浄する。カイザーテストを実施して、カップリングが終了していることを確認する。2回目のカップリングDMFで3回洗浄する樹脂10mL/g。2当量のFmocAspOHのDMF溶液を加える。2当量のHOBtのDMF溶液を加える。2当量のDICを加える。1.5~3時間攪拌する。カイザーテストでカップリングを確認する。MTBEで2回洗浄する。DMFで2回洗浄する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。DMFで3回洗浄する。MTBEで3回洗浄する。カイザーテストを実施する。3回目のカップリングDMFで3回洗浄する。2当量のFmocAspOHのDMF溶液を加える。2当量のHOBtのDMF溶液を加える。2当量のDICを加える。1.5~3時間攪拌する。カイザーテストでカップリングを確認する。MTBEで2回洗浄する。DMFで2回洗浄する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。DMFで3回洗浄する。MTBEで3回洗浄する。カイザーテストを実施する。4回目のカップリングDMFで洗浄する。2当量のFmocArgOHのDMF溶液を加える。2当量のHOBtのDMF溶液を加える。2当量のDICを加える。1.5~3時間攪拌する。カイザーテストでカップリングを確認する。MTBEで2回洗浄する。DMFで2回洗浄する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。DMFで3回洗浄する。MTBEで3回洗浄する。カイザーテストを実施する。5回目のカップリングDMFで3回洗浄する。2当量のFmocAspOHのDMF溶液を加える。2当量のHOBtのDMF溶液を加える。2当量のDICを加える。1.5~3時間攪拌する。カイザーテストでカップリングを確認する。MTBEで2回洗浄する。DMFで2回洗浄する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。DMFで3回洗浄する。MTBEで3回洗浄する。カイザーテストを実施する。6回目のカップリングDMFで3回洗浄する。2当量のFmocGluOtBuのDMF溶液を加える。2当量のHOBtのDMF溶液を加える。2当量のDICを加える。カイザーテストでカップリングを確認する。MTBEで2回洗浄する。DMFで2回洗浄する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。6ピペラジンを0.1MHOBtのDMF溶液に加え、10~20分間攪拌する。DMFで3回洗浄する。MTBEで3回洗浄する。カイザーテストを実施する。7回目のカップリングDMFで3回洗浄する。1.2当量のN10TFAPteOHを最小量のDMSOに入れた溶液を加える。1.2当量のHOBtのDMF溶液を加える。1.2当量のPyBOPのDMF溶液を加える。2.4当量のDIPEAを加える。3~5時間攪拌する。カイザーテストでカップリングを確認する。DMFで2回洗浄する。MTBEで2回洗浄する。脱保護-トリフルオロアセチル基の除去DMFで2回洗浄する。2ヒドラジンのDMF溶液を加え、5分間攪拌する。2ヒドラジンのDMF溶液を加え、5分間攪拌する。2ヒドラジンのDMF溶液を加え、5分間攪拌する。DMFで3回洗浄する。MTBEで3回洗浄する。樹脂を室温にて真空下で乾燥させる。樹脂からの切断85のTFA、2.5のトリイソプロピルシラン、2.5の水、10のエタンジチオールを含有する切断試薬樹脂10mL/gを、フラスコに入れる。混合物を氷槽で冷却する。樹脂を加えて、室温にて2~3時間反応させる。これを濾過し、濾液を回収する。濾液を冷たいMTBEに加える濾液1mLあたりMTBEを10mL。0~5°Cで30±10分間攪拌する。沈殿した生成物を、多孔度が中程度ガラスフィルターで濾過する。沈殿物を冷たいMTBEで3回洗浄する。生成物を室温にて真空下で乾燥させる。窒素下、-20°Cで保管する。精製分取用HPLCで、逆相C18カラム6インチのカラム、2.8kg、10μm、100Åを使用して、粗EC119を精製する。移動相は、0.5NH4OAcAと0.5NH4OAc/ACN1:4Bである。40gの粗EC119を1~5TFAに溶解させ、1μmのガラス製フィルターで濾過し、6インチのカラムに通す。画分を回収し、HPLC分析用に試料を得る。回収直後に窒素下で50AcOHを用いて各画分のpHを3~4に調整し、生成物を沈殿させる。沈殿した生成物を遠心し、0.1AcOHで洗浄し、さらに処理するまで2~8°Cで保管する。遠心操作時、容器を窒素で置換して酸化の可能性を抑える。プール基準は、純度で≧98、DArg4、DGlu2、DAsp3の異性体≦0.25、その他の不純物≦0.5である。DAsp5、DAsp6、DCysの異性体は、Prep-HPLCでは除去できないため、合成段階で抑制しておく必要がある。プール基準を満たす物質を、できるだけすみやかに凍結乾燥させるEC119溶液および湿った沈殿物は不安定である。最終生成物の純度は98を超える。固相合成および精製を含めて、純粋なEC119の全体としての収率は、約40である。生成物を窒素下で茶色のガラス瓶に充填し、-20°Cで保管する。実施例2A.硫酸ビンブラスチンからデスアセチルビンブラスチンヒドラジドへの一般的な変換材料硫酸ビンブラスチン:USP;FW=909.05g/モル;メタノール:無水;ヒドラジン:無水;FW=32g/mol;脱イオン水;酢酸エチル:LCGCgrade;トルエン:LCGCgrade;リン酸二水素ナトリウム:≧99.0;FW=120g/モル;リン酸水素ナトリウム:≧99.0;FW=142g/モル;塩化ナトリウム:reagentgrade;FW=58.4g/モル;硫酸ナトリウム:無水;5-ノルボルネン-2-カルボン酸手順反応、抽出作業、単離を窒素下またはアルゴン下で実施する。加圧濾過器を用いて硫酸ナトリウムを除去し、生成物を捕捉する。クエンチと洗浄に用いる塩化ナトリウム溶液に、溶存酸素濃度が0.9ppm以下になるまで窒素またはアルゴンを通気する。硫酸ビンブラスチンと無水メタノールを、アルゴンでパージした反応器に投入する。5-ノルボルネン-2-カルボン酸と無水ヒドラジンを、反応器に加える。混合物を攪拌し、固体の溶解後、混合物を60°Cのあたりまで加熱する。HPLC分析によって、反応が終了したら、混合物を冷却し、クエンチし、酢酸エチルに抽出する。乾燥後、生成物を酢酸エチルおよびトルエンから結晶化する。固体を真空下で一晩、室温にて乾燥させる。緩衝NaClに、10.0gのNaCl、7.10~7.30gのNaH2PO4、4.40~4.60gのNa2HPO4、90mLの水を含有する。溶液にアルゴンまたは窒素を通気する溶存酸素含有量<0.9ppm。単離後の典型的な収率は、理論最大値の50~60である。B.EC145のプロセスの工程2および3工程2および工程3のプロセス材料デスアセチルビンブラスチンヒドラジド:FW=768.9g/mol;20.5g、26.7mmol;混合炭酸塩3:FW=384.9g/mol;10.7g、27.8mmol;アセトニトリル:適量:トリエチルアミン:FW=101.2g/mol;2.67g、26.4mmol;Na2PO47H2O:47.84g;EC119:29.9g28.6ミリモル;0.5NHCl:適量;WFI:適量手順このプロセスで用いる水はすべて、注射用水WFIである点に注意されたい。適当な容器をアルゴンでパージする。20.5±0.3gのデスアセチルビンブラスチンヒドラジドを投入する。この投入量は、活性によって調節されている。すなわち、仮に活性が90.0であったとすると、投入量は22.8gとなろう。10.7±0.2gの混合炭酸塩を投入する活性によって調節。800±30mLのアセトニトリルと、2.67±0.11gのトリエチルアミンを投入する。アルゴン下、10~14°Cで20~28時間、混合する。HPLC用の試料を取得するEC145CMCAM0001、バージョン2.3。想定した結果は、CDSIとヒドラジドの比が≧25:1である。そうでない場合、アルゴン下、10~14°Cで2~4時間混合を継続し、再び試料を取得する。780~820mLの水に、溶存酸素濃度が0.9ppm未満になるまでアルゴンを通気する。溶存酸素濃度を記録する。47.8±0.5gのリン酸水素ナトリウム七水和物を脱酸素水に溶解させる。好適な容器に、29.8±0.5gのEC119を加える投入量は、活性によって調節されている。リン酸ナトリウム溶液をEC119に加え、アルゴン下で攪拌する。溶液のpHを測定し、必要に応じて0.5NのHClでpHを5.8~6.2に調整する。緩衝EC119溶液を反応混合物に加える。アルゴン下、20~25°Cで60~75分間、混合する。HPLC用の試料を取得するEC145CMCAM0001、バージョン2.3。EC145とCDSIの比が≧25:1である場合は、先に進む。そうでなければ、アルゴン下、20~25°Cで混合を継続し、再び試料を取得する。EC145とCDSIの比が≧25:1であれば、先に進む。そうでなければ、さらに1gのEC119を加え、アルゴン下、20~25°Cで30分間混合し、再び試料を取得する。6.9L~7.1Lの25mMリン酸バッファー、185~195mMNaCl、pH7.2~7.5を、溶存酸素濃度が0.9ppm未満になるまでアルゴンを通気した水から調製する。このバッファーで反応混合物を希釈する。かすかな状態をこえた曇りが混合物に生じたら、この生成物の溶液を濾過する必要があるWhatmanPolycapTC75またはTC150、0.45または1.0ミクロン。この濾過は、生成物をBiotageカラムに通しながら実施してもよい。液体クロマトグラフィによる精製Biotage150M、C18カートリッジを使用する。このサイズのカートリッジは、現在説明しているサイズの2倍の反応混合物を収容することができる。カラムの調製:a.カラムを、i.アセトニトリル12~13Lii.アセトニトリル80と水20vvで12~13Liii.アセトニトリル50と水50vvで12~13Liv.アセトニトリル10と水90vvで12~13Lでフラッシュする。精製:25mMのリン酸バッファー185~195mmolNaCl、pH7.3~7.5を調製する。バッファーに溶存酸素含有量が≦0.9ppmになるまでアルゴンを通気する。調製:10アセトニトリルの緩衝食塩水溶液vv41L;16アセトニトリルの緩衝食塩水溶液vv13L、27アセトニトリルの緩衝食塩水溶液vv52L移動相溶液の溶存酸素含有量を確認する。溶存酸素含有量が0.9ppmを超える場合、移動相に溶存酸素濃度が≦0.9ppmになるまでアルゴンまたは窒素を通気する。カラムを10アセトニトリル移動相26~27Lでフラッシュする。生成物の溶液をカラムに通す。以下の一連の移動相を用いて、生成物を溶出する。i.10アセトニトリル移動相13~14Lii.16アセトニトリル移動相13Liii.27アセトニトリル移動相51~52L注:インラインのUV検出器が役に立つ。生成物は、27アセトニトリル移動相15~19Lから開始して、溶出領域8~13Lで溶出される。画分の評価i.HPLC法EC145CMCIP0001ii.通過画分=≧97.0EC145および不純物なし≧0.8実施後のカラム処理:カラムを1回だけ再利用することができる。カラムを2回目の実施に用いる場合、ii~ivを実施する。i.カラムを12~13Lの1:1アセトニトリル/水でフラッシュするii.カラムを20~22Lのアセトニトリルでフラッシュするiii.カラム調製工程ii~ivを繰り返す限外濾過適量の水に、溶存酸素濃度が0.9ppm未満になるまでアルゴンまたは窒素を通気する。クロマトグラフィの通過画分を合わせ、等量の通気後の水で希釈する。Millipore社の再生セルロース膜を公称MWカットオフ1000カタログ番号CDUF002LAで用いて限外濾過装置をアセンブルし、9Lの脱酸素水ですすぐ。生成物溶液の限外濾過を開始する。背圧30~50psiを維持する。保持液容量が2~3Lになるまで限外濾過を継続する。11~12Lの脱酸素水を加える。保持液容量が2~3Lになるまで限外濾過を継続する。11~12Lの脱酸素水を加える。保持液容量が2~3Lになるまで限外濾過を継続する。8~10Lの脱酸素水を加える。保持液容量が2Lになるまで限外濾過を継続する。限外濾過のエンドポイントについては、保持液の試料をGCと濃度で分析して判断しなければならない。仕様はEC145を1ミリグラムあたりアセトニトリル≦50マイクログラムである。達成されていない場合、もう1サイクル限外濾過を実施する。充填した物質が6~12mg/mLになるように、API溶液の濃度を調整しなければならない。限外濾過の終了時、1リットルの水で装置をすすぐ。したがって、必要に応じて、限外濾過を継続するか、水を加える。生成物の溶液を限外濾過装置から排出したら、この限外濾過装置を1Lの脱酸素水ですすいで、生成物の溶液と合わせる。すすぎ液を生成物の溶液と合わせた後、この溶液を0.2ミクロンのアブソリュートフィルターで濾過しなければならず、この濾液を充填する不活性気体中で実施。単離した生成物の典型的な収率は、理論最大値の50~60である。実施例3EC145のプロセスの工程2および3工程2および工程3のプロセス材料デスアセチルビンブラスチンヒドラジド:FW=768.9g/mol;1.00g、1.30mmol;混合炭酸塩3:FW=348.4g/mol;0.445g、1.28mmol;アセトニトリル:適量:Na2PO4:1.10g;EC119:1.46g1.40ミリモル;0.5NHCl:適量;WFI:適量手順このプロセスで用いる水はすべて、WFIである点に注意されたい。適当な容器をアルゴンでパージする。1.00±0.02gのデスアセチルビンブラスチンヒドラジドを投入する。この投入量は、活性によって調節されている。すなわち、仮に活性が90.0であったとすると、投入量は1.11gとなろう。0.445±0.005gの混合炭酸塩を投入する活性によって調節。46±1mLのアセトニトリルを投入する。アルゴン下、10~20°Cで22~23時間、混合する。HPLC用の試料を取得するEC145CMCAM0001、バージョン2.3。想定した結果は、CDSIとヒドラジドの比が≧20:1である。そうでない場合、アルゴン下、10~20°Cで2~3時間混合を継続し、再び試料を取得する。41mLの水に、溶存酸素濃度が0.9ppm未満になるまでアルゴンを通気する。溶存酸素濃度を記録する。1.10±0.0.07gのリン酸水素ナトリウムを脱酸素水に溶解させる。好適な容器に、1.46±0.03gのEC119を加える投入量は、活性によって調節されている。リン酸ナトリウム溶液をEC119に加え、アルゴン下で攪拌する。溶液のpHを測定し、必要に応じて0.5NのHClでpHを5.9~6.3に調整する。緩衝EC119溶液を反応混合物に加える。アルゴン下、20~25°Cで60~75分間、混合する。HPLC用の試料を取得するEC145CMCAM0001、バージョン2.3。EC145とCDSIの比が≧20:1である場合は、先に進む。そうでなければ、アルゴン下、13~23°Cで混合を継続し、再び試料を取得する。EC145とCDSIの比が≧25:1であれば、先に進む。そうでなければ、さらに1gのEC119を加え、アルゴン下、13~23°Cで30分間混合し、再び試料を取得する。溶存酸素濃度が0.9ppm未満になるまでアルゴンを通気した水から、399~401mLの0.02mMクエン酸緩衝、0.1MNaCl水溶液、pH5.7~6.5を調製する。反応混合物をこのバッファーで希釈する。かすかな状態をこえた曇りが混合物に生じたら、この生成物の溶液を濾過する必要があるWhatmanPolycapTC75またはTC150、0.45または1.0ミクロン。この濾過は、生成物をBiotageカラムに通しながら実施してもよい。液体クロマトグラフィによる精製ポリスチレン-ジビニルベンゼンポリマー樹脂を充填したBiotageカートリッジを使用する。カラムの調製:b.カラムを、i.アセトニトリルii.アセトニトリル50と水50vviii.アセトニトリル10と水90vvでフラッシュする。精製:クエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液、pH6.0~6.6を調製する。バッファーに、溶存酸素含有量が≦0.9ppmになるまでアルゴンを通気する。調製:12アセトニトリルの緩衝塩化ナトリウム水溶液vv;16アセトニトリルの緩衝塩化ナトリウム水溶液vv、22.5アセトニトリルの緩衝塩化ナトリウム水溶液vv。移動相溶液の溶存酸素含有量を確認する。溶存酸素含有量が0.9ppmを超える場合、移動相に、溶存酸素濃度が≦0.9ppmになるまでアルゴンまたは窒素を通気する。カラムを10アセトニトリル移動相でフラッシュする。生成物の溶液をカラムに通す。以下の一連の移動相を用いて、生成物を溶出する。iv.16アセトニトリル移動相.v.22.5アセトニトリル移動相.画分の評価iii.HPLC法EC145CMCIP0001iv.通過画分=≧97.0EC145および不純物なし≧0.8限外濾過適量の水に、溶存酸素濃度が0.7ppm未満になるまでアルゴンまたは窒素を通気する。クロマトグラフィの通過画分を合わせ、等量の通気後の水で希釈する。Millipore社の再生セルロース膜を公称MWカットオフ1000で用いて限外濾過装置をアセンブルし、脱酸素水ですすぐ。生成物溶液の限外濾過を開始する。背圧30~50psiを維持する。保持液容量が元の容量の約20になるまで限外濾過を継続する。脱酸素水を保持液に加える。保持液容量が元の容量の約20になるまで限外濾過を継続する。脱酸素水を保持液に加える。保持液容量が元の容量の約20になるまで限外濾過を継続する。脱酸素水を保持液に加える。保持液容量が元の容量の約20になるまで限外濾過を継続する。限外濾過のエンドポイントについては、保持液の試料をGCと濃度で分析して判断しなければならない。仕様はEC145を1ミリグラムあたりアセトニトリル≦50マイクログラムである。達成されていない場合、もう1サイクル限外濾過を実施する。充填した物質が約12mg/mLになるように、API溶液の濃度を調整しなければならない。限外濾過の終了時、水で装置をすすぐ。したがって、必要に応じて、限外濾過を継続するか、水を加える。生成物の溶液を限外濾過装置から排出したら、この限外濾過装置を脱酸素水ですすいで、生成物の溶液と合わせる。すすぎ液を生成物の溶液と合わせた後、この溶液を0.2ミクロンのアブソリュートフィルターで濾過しなければならず、この濾液を充填する不活性気体中で実施。単離した生成物の典型的な収率は、理論最大値の50~60である。"