"a第一の抗原に特異的に結合する、第一の全長抗体の重鎖および軽鎖;b第二の抗原に特異的に結合する、第二の全長抗体の重鎖および軽鎖であって、ペプチドリンカーを通じて、重鎖のN末端が軽鎖のC末端に連結されている、前記の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖を含む、二重特異性抗体。aの全長抗体の重鎖のCH3ドメインおよびbの全長抗体の重鎖のCH3ドメインが、互いに抗体CH3ドメイン間の元来の界面の改変を含む界面で向き合い、ここでi一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の腔中に配置可能な、一方の重鎖のCH3ドメインの界面内の隆起を生じるそしてii他方の重鎖のCH3ドメインにおいてアミノ酸残基は、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第一のCH3ドメインの界面内の隆起を配置可能な、第二のCH3ドメインの界面内の腔を生じることで特徴付けられる、請求項1記載の抗体。より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニンR、フェニルアラニンF、チロシンY、トリプトファンWからなる群より選択され、そしてより小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニンA、セリンS、スレオニンT、バリンVからなる群より選択されることで特徴付けられる、請求項2記載の抗体。どちらのCH3ドメインも、両方のCH3ドメイン間にジスルフィド架橋が形成可能であるように、各CH3ドメインの対応する位のアミノ酸として、システインCが導入されることによってさらに改変されていることで特徴付けられる、請求項2~3記載の抗体。b以下の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖の抗体重鎖可変ドメインVHおよび抗体軽鎖可変ドメインVLが、以下の位の間:i重鎖可変ドメイン44位から軽鎖可変ドメイン100位、ii重鎖可変ドメイン105位から軽鎖可変ドメイン43位、またはiii重鎖可変ドメイン101位から軽鎖可変ドメイン100位にジスルフィド結合が導入されることによって、ジスルフィド安定化されていることで特徴付けられる、請求項1~4記載の抗体。前記抗体がIgG1の定常領域を含む、請求項1~5記載の二重特異性抗体。a第一の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そして配列番号1のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号2のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号3のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる、請求項1記載の二重特異性抗体。a第一の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そして配列番号1のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号2のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号4のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる、請求項1記載の二重特異性抗体。a第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号7のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる、請求項1記載の二重特異性抗体。a第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号8のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる、請求項1記載の二重特異性抗体。a第一の全長抗体が、VEGFに特異的に結合し、そして配列番号9のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号10のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、ANG-2に特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号11のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる、請求項1記載の二重特異性抗体。a第一の全長抗体が、VEGFに特異的に結合し、そして配列番号9のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号10のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、ANG-2に特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号12のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる、請求項1記載の二重特異性抗体。Asn297で糖鎖にてグリコシル化されており、糖鎖内のフコースの量が65またはそれ未満である、請求項6~10記載の二重特異性抗体。請求項1~13記載の抗体を含む、医薬組成物。癌治療のための、請求項1~13のいずれか1項記載の二重特異性抗体。癌の治療のための薬剤調製のための、請求項1~13のいずれか1項記載の二重特異性抗体の使用。癌治療が必要な患者に、請求項1~13のいずれか1項記載の抗体を投与することによって、癌に罹患した患者を治療する方法。請求項1~13のいずれか1項記載の二重特異性抗体の鎖をコードする核酸分子。請求項18記載の核酸を含有し、原核または真核宿主細胞において前記核酸を発現可能な発現ベクター。請求項19記載のベクターを含む、原核または真核宿主細胞。aaa第一の抗原に特異的に結合する第一の全長抗体の重鎖および軽鎖;ならびにab第二の抗原に特異的に結合する、第二の全長抗体の重鎖および軽鎖であって、ペプチドリンカーを通じて、重鎖のN末端が軽鎖のC末端に連結されている、前記の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含むベクターで宿主細胞を形質転換し;そしてb前記抗体分子の合成を可能にする条件下で、宿主細胞を培養し;そしてc前記培養から前記抗体分子を回収する工程を含む、請求項1~13記載の二重特異性抗体を調製するための方法。配列番号1、配列番号2および配列番号3のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトIGF-1RおよびヒトEGFRに特異的に結合する二重特異性抗体。配列番号1、配列番号2および配列番号4のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトIGF-1RおよびヒトEGFRに特異的に結合する二重特異性抗体。配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトIGF-1RおよびヒトEGFRに特異的に結合する二重特異性抗体。配列番号5、配列番号6および配列番号8のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトIGF-1RおよびヒトEGFRに特異的に結合する二重特異性抗体。Asn297で糖鎖にてグリコシル化されており、糖鎖内のフコースの量が65またはそれ未満である、請求項22~25記載の二重特異性抗体。配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトVEGFおよびヒトANG-2に特異的に結合する二重特異性抗体。配列番号9、配列番号10および配列番号12のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトVEGFおよびヒトANG-2に特異的に結合する二重特異性抗体。しかし、多重特異性抗体の異なる問題および側面例えば薬物動態学的および生物学的特性、安定性、凝集、発現収量、副産物などを考慮すると、さらなる代替多重特異性抗体形式が必要である。1つの側面において、本発明は、a第一の抗原に特異的に結合する、第一の全長抗体の重鎖および軽鎖;b第二の抗原に特異的に結合する、第二の全長抗体の重鎖および軽鎖であって、ペプチドリンカーを通じて、重鎖のN末端が軽鎖のC末端に連結されている、前記の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖を含む、二重特異性抗体に関する。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、aの全長抗体の重鎖のCH3ドメインおよびbの全長抗体の重鎖のCH3ドメインが、互いに該界面は抗体CH3ドメイン間の元来の界面の改変を含む界面で向き合い、ここでi一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の腔中に配置可能な、一方の重鎖のCH3ドメインの界面内の隆起を生じるそしてii他方の重鎖のCH3ドメインにおいてアミノ酸残基は、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第一のCH3ドメインの界面内の隆起を配置可能な、第二のCH3ドメインの界面内の腔を生じることでさらに特徴付けられる。別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、どちらのCH3ドメインも、両方のCH3ドメイン間にジスルフィド架橋が形成可能であるように、各CH3ドメインの対応する位のアミノ酸として、システインCが導入されることによってさらに改変されていることで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、b以下の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖の抗体重鎖可変ドメインVHおよび抗体軽鎖可変ドメインVLが、以下の位の間:i重鎖可変ドメイン44位から軽鎖可変ドメイン100位、ii重鎖可変ドメイン105位から軽鎖可変ドメイン43位、またはiii重鎖可変ドメイン101位から軽鎖可変ドメイン100位にジスルフィド結合が導入されることによって、ジスルフィド安定化されていることで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、a第一の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そして配列番号1のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号2のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号3のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、a第一の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そして配列番号1のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号2のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号4のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、a第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結されている重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号7のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、a第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記のペプチドで連結された重鎖および軽鎖が配列番号8のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、IgG1の定常領域を含むことで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、Asn297で糖鎖にてグリコシル化されており、糖鎖内のフコースの量が65またはそれ未満であることで特徴付けられる。本発明のさらにさらなる側面は、前記二重特異性抗体を含む医薬組成物、癌治療のための前記組成物、癌治療のための薬剤製造のための前記二重特異性抗体の使用、癌治療が必要な患者に前記二重特異性抗体を投与することによって、癌に罹患した患者を治療する方法である。本発明のさらなる側面は、本発明記載の二重特異性抗体の鎖をコードする核酸分子である。本発明はさらに、原核または真核宿主細胞において、前記核酸を発現可能な本発明記載の前記核酸を含有する発現ベクター、および本発明記載の二重特異性抗体を組換え的に産生するためのこうしたベクターを含有する宿主細胞を提供する。本発明はさらに、本発明記載のベクターを含む、原核または真核宿主細胞を提供する。本発明はさらに、原核または真核宿主細胞において、本発明記載の核酸を発現し、そして前記細胞または細胞培養上清から、前記二重特異性抗体を回収することによって特徴付けられる、本発明記載の二重特異性抗体の産生法を含む。本発明はさらに、二重特異性抗体の産生のためのこうした方法によって得られる抗体を含む。本発明の別の側面は、aaa第一の抗原に特異的に結合する第一の全長抗体の重鎖および軽鎖;ならびにab第二の抗原に特異的に結合する、第二の全長抗体の重鎖および軽鎖であって、ペプチドリンカーを通じて、重鎖のN末端が軽鎖のC末端に連結している、前記の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含むベクターで宿主細胞を形質転換し;そしてb前記抗体分子の合成を可能にする条件下で、宿主細胞を培養し;そしてc前記培養から前記抗体分子を回収する工程を含む、本発明記載の二重特異性抗体を調製するための方法である。本発明記載の二重特異性抗体が、哺乳動物細胞HEK293細胞およびCHO細胞などにおける優れた発現収量、安定性、生物学的または薬理学的活性、薬物動態学的特性などの価値ある特性を有することが、現在、見出されてきている。これらを例えば、癌などの疾患の治療に用いてもよい。3つのポリペプチド鎖を含む、本発明記載のこれらの二重特異性抗体は、特に、哺乳動物細胞における発現中、価値ある副産物プロファイルを有する。1つの側面において、本発明は、a第一の抗原に特異的に結合する、第一の全長抗体の重鎖および軽鎖;b第二の抗原に特異的に結合する、第二の全長抗体の重鎖および軽鎖であって、ペプチドリンカーを通じて、重鎖のN末端が軽鎖のC末端に連結されている、前記の第二の全長抗体の重鎖および軽鎖を含む、二重特異性抗体に関する。用語全長抗体は、2つの全長抗体重鎖および2つの全長抗体軽鎖からなる抗体を示す図1を参照されたい。全長抗体重鎖は、抗体重鎖可変ドメインVH、抗体定常重鎖ドメイン1CH1、抗体ヒンジ領域HR、抗体重鎖定常ドメイン2CH2、および抗体重鎖定常ドメイン3CH3からなるポリペプチドであり、VH-CH1-HR-CH2-CH3と略され;そして場合によって、サブクラスIgEの抗体の場合には、抗体重鎖定常ドメイン4CH4が含まれる。好ましくは全長抗体重鎖は、N末端からC末端方向に、VH、CH1、HR、CH2およびCH3からなるポリペプチドである。全長抗体軽鎖は、N末端からC末端方向に、抗体軽鎖可変ドメインVL、および抗体軽鎖定常ドメインCLからなるポリペプチドであり、VL-CLと略される。抗体軽鎖定常ドメインCLはκカッパまたはλラムダであってもよい。2つの全長抗体鎖は、CLドメインおよびCH1ドメイン間ならびに全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を通じてともに連結される。典型的な全長抗体の例は、IgG例えばIgG1およびIgG2、IgM、IgA、IgD、およびIgEなどの天然抗体である。本発明記載の全長抗体は、単一種、例えばヒト由来であってもよいし、あるいはこれらはキメラ化またはヒト化抗体であってもよい。本発明記載の全長抗体は、どちらも同じ抗原に特異的に結合する、各々、VHおよびVLの対によって形成される2つの抗原結合部位を含む。前記全長抗体の重鎖または軽鎖のC末端は、前記重鎖または軽鎖のC末端の最後のアミノ酸を示す。前記全長抗体の重鎖または軽鎖のN末端は、前記重鎖または軽鎖のN末端の最後のアミノ酸を示す。用語ペプチドリンカーは、本発明内で用いた際、好ましくは合成起源であるアミノ酸配列を含むペプチドを示す。本発明記載のこれらのペプチドを用いて、第二の全長抗体第二の抗原に特異的に結合するの軽鎖C末端を重鎖N末端に連結する。第二の全長抗体重鎖および軽鎖内のペプチドリンカーは、少なくとも30アミノ酸の長さ、好ましくは32~50アミノ酸の長さのペプチドである。1つの態様において、ペプチドリンカーは、32~40アミノ酸の長さのアミノ酸配列のペプチドである。1つの態様において、前記リンカーはGxSn、ここでG=グリシン、S=セリンx=3、n=8,9または10およびm=0、1、2または3またはx=4およびn=6、7または8およびm=0、1、2または3であり、好ましくはx=4、n=6または7およびm=0、1、2または3であり、より好ましくはx=4、n=7およびm=2である。1つの態様において、前記リンカーは、G4S6G2である。好ましくは、本発明記載の二重特異性抗体のCH3ドメインは、例えば、WO96/027011、RidgwayJ.B.ら,ProteinEng91996617-621;およびMerchant,A.M.ら,NatBiotechnol161998677-681において、いくつかの例を用いて詳述される、ノブを穴に技術によって改変されてもよい。この方法において、2つのCH3ドメインの相互作用表面が改変されて、これらの2つのCH3ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化が増加する。2つの重鎖の2つのCH3ドメインの各々がノブである一方、他方は穴である。ジスルフィド架橋の導入によって、ヘテロ二量体が安定化されMerchant,A.Mら,NatureBiotech161998677-681;Atwell,S.らJ.Mol.Biol.270199726-35、そして収量が増加する。本発明の1つの側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、一方の重鎖のCH3ドメインおよび他方の重鎖のCH3ドメインが、互いに抗体CH3ドメイン間の元来の界面を含む界面で向き合う、ことでさらに特徴付けられ;前記界面は、二重特異性抗体の形成を促進するよう改変されており、ここで該改変は:a二重特異性抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元来の界面と出会う、一方の重鎖のCH3ドメインの元来の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の腔中に配置可能な、一方の重鎖のCH3ドメインの界面内の隆起を生じるように一方の重鎖のCH3ドメインが改変され、そしてb二重特異性抗体内の第一のCH3ドメインの元来の界面と出会う、他方の重鎖のCH3ドメイン内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第一のCH3ドメインの界面内の隆起を配置可能な、第二のCH3ドメインの界面内の腔を生じることで特徴付けられる。したがって、本発明記載の抗体は、好ましくはaの全長抗体の重鎖のCH3ドメインおよびbの全長抗体の重鎖のCH3ドメインが、互いに抗体CH3ドメイン間の元来の界面の改変を含む界面で向き合い;ここでi一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の腔中に配置可能な、一方の重鎖のCH3ドメインの界面内の隆起を生じるそしてここでii他方の重鎖CH3ドメインにおいてアミノ酸残基は、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって第一のCH3ドメインの界面内の隆起を配置可能な、第二のCH3ドメインの界面内の腔を生じることで特徴付けられる。好ましくは、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニンR、フェニルアラニンF、チロシンY、トリプトファンWからなる群より選択される。好ましくは、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニンA、セリンS、スレオニンT、バリンVからなる群より選択される。本発明の1つの側面において、どちらのCH3ドメインも、両方のCH3ドメイン間にジスルフィド架橋が形成可能であるように、各CH3ドメインの対応する位のアミノ酸として、システインCが導入されることによってさらに改変されている。1つの態様において、二重特異性抗体は、ノブ鎖のCH3ドメイン中にT366W突然変異を、そして穴鎖のCH3ドメイン中にT366S、L368A、Y407V突然変異を含む。例えばノブ鎖のCH3ドメイン内にY349C突然変異を、そして穴鎖のCH3ドメイン内にE356C突然変異またはS354C突然変異を導入することによって、CH3ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋もまた用いてもよいMerchant,A.Mら,NatureBiotech161998677-681。別の態様において、本発明記載の二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方に、Y349C、T366W突然変異を、そして2つのCH3ドメインの他方に、E356C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含む。別の好ましい態様において、二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方に、Y349C、T366W突然変異を、そして2つのCH3ドメインの他方に、S354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含む一方のCH3ドメイン中のさらなるY349C突然変異、ならびに他方のCH3ドメイン中のさらなるE356CまたはS354C突然変異は鎖間ジスルフィド結合を形成する番号付けは常に、KabatのEUインデックスにしたがう。しかしまた、EP1870459A1に記載されるような他のノブを穴に技術を別にまたはさらに用いてもよい。したがって、二重特異性抗体の別の例は、ノブ鎖のCH3ドメイン中のR409D;K370E突然変異、および穴鎖のCH3ドメイン中のD399K;E357K突然変異である番号付けは常に、KabatのEUインデックスにしたがう。別の態様において、二重特異性抗体は、ノブ鎖のCH3ドメイン中のT366W突然変異、および穴鎖のCH3ドメイン中のT366S、L368A、Y407V突然変異を含み、そしてさらにノブ鎖のCH3ドメイン中のR409D;K370E突然変異、ならびに穴鎖のCH3ドメイン中のD399K;E357K突然変異を含む。別の態様において、二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方においてY349C、T366W突然変異を、そして2つのCD3ドメインの他方においてS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含むか、あるいは前記三価、二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方においてY349C、T366W突然変異を、そして2つのCD3ドメインの他方においてS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を、そしてさらにノブ鎖のCH3ドメイン中のR409D;K370E突然変異を、そして穴鎖のCH3ドメイン中のD399K;E357K突然変異を含む。1つの態様において、第二の全長抗体第二の抗原に特異的に結合するの重鎖および軽鎖の抗体重鎖可変ドメインVHおよび抗体軽鎖可変ドメインVLは、以下の位の間:i重鎖可変ドメイン44位から軽鎖可変ドメイン100位、ii重鎖可変ドメイン105位から軽鎖可変ドメイン43位、またはiii重鎖可変ドメイン101位から軽鎖可変ドメイン100位番号付けは常に、KabatのEUインデックスにしたがうにジスルフィド結合が導入されることによって、ジスルフィド安定化されている。1つの態様において、第二の全長抗体第二の抗原に特異的に結合するの重鎖および軽鎖の抗体重鎖可変ドメインVHおよび抗体軽鎖可変ドメインVLは、以下の位の間:重鎖可変ドメイン44位から軽鎖可変ドメイン100位にジスルフィド結合が導入されることによって、ジスルフィド安定化されている。こうしたさらなるジスルフィド安定化は、第二の全長抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインVHおよびVLの間にジスルフィド結合を導入することによって達成される。一本鎖Fvに関する安定化のため、非天然ジスルフィド架橋を導入する技術が、例えばWO94/029350、Rajagopal,V.ら,Prot.Engin.1019971453-59;Kobayashi,H.ら,NuclearMedicineBiology,Vol.25,1998387-393;またはSchmidt,M.ら,Oncogene199918,1711-1721に記載されている。1つの態様において、第二の全長抗体重鎖および軽鎖の可変ドメイン間の場合によるジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン44位および軽鎖可変ドメイン100位の間である。1つの態様において、可変ドメイン間の場合によるジスルフィド結合は、重鎖可変ドメイン105位および軽鎖可変ドメイン43位の間である番号付けは常に、KabatのEUインデックスにしたがう。1つの態様において、第二の全長抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインVHおよびVL間の前記の場合によるジスルフィド安定化を伴う、本発明記載の二重特異性抗体が好ましい。1つの態様において、第二の全長抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインVHおよびVL間の前記の場合によるジスルフィド安定化を伴わない、本発明記載の二重特異性抗体が好ましい。本発明記載の二重特異性抗体の両方の部分は、抗原結合部位を含む第一の全長抗体重鎖および軽鎖が1つの抗原結合部位を含み、そして第二の全長抗体重鎖および軽鎖が1つの抗原結合部位を含む。用語結合部位または抗原結合部位は、本明細書において、それぞれの抗原が実際に結合する、本発明記載の前記二重特異性抗体の領域単数または複数を示す。第一の全長抗体重鎖および軽鎖ならびに第二の全長抗体重鎖および軽鎖のいずれかの抗原結合部位は、各々、抗体軽鎖可変ドメインVLおよび抗体重鎖可変ドメインVHからなる対によって形成される。所望の抗原例えばEGFRに結合する抗原結合部位は、a抗原に対する既知の抗体例えば抗EGFR抗体から、あるいはbとりわけ抗原タンパク質もしくは核酸またはその断片のいずれかを用いた新規免疫法によって、あるいはファージディスプレイによって得られる新規抗体または抗体断片から、得られてもよい。本発明の抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位のアフィニティに多様な度合いで貢献する6つの相補性決定領域CDRを含有する。3つの重鎖可変ドメインCDRCDRH1、CDRH2およびCDRH3および3つの軽鎖可変ドメインCDRCDRL1、CDRL2およびCDRL3がある。配列間の可変性にしたがって領域が定義されているアミノ酸配列の蓄積データベースへの比較によって、CDRおよびフレームワーク領域FRの度合いを決定する。抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。例えば天然抗体は単一特異性である。用語二重特異性抗体は、本明細書において、2またはそれより多い抗原結合部位を有し、そして2つの異なる抗原または同じ抗原の2つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。本発明記載の二重特異性抗体は、2つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。1つの態様において、本発明の抗体は、2つの異なる抗原に対して二重特異性であり、すなわち第一の抗原としてVEGFそして第二の抗原としてANG-2であるか、または例えば第一の抗原としてEGFRそして第二の抗原としてIGF-1Rであるか、あるいはその逆である。用語単一特異性抗体は、本明細書において、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する1またはそれより多い結合部位を有する抗体を指す。用語価は、本出願において、抗体分子における明記された数の結合部位の存在を示す。こうしたものとして、用語三価、四価、五価および六価は、抗体分子における、それぞれ、3つの結合部位、4つの結合部位、5つの結合部位、および6つの結合部位を示す。例えば天然抗体または本発明記載の二重特異性抗体は、2つの結合部位を持ち、そして二価である。用語EGFRは、本明細書において、ヒト上皮増殖因子受容体HER-1またはErb-B1としてもまた知られる、配列番号13を指し、c-erbB癌原遺伝子によってコードされる170kDa膜貫通受容体であり、そして生得的なチロシンキナーゼ活性を示すModjtahedi,H.ら,Br.J.Cancer731996228-235;Herbst,R.S.およびShin,D.M.,Cancer9420021593-1611。SwissProtデータベースエントリーP00533はEGFRの配列を提供する。EGFRのアイソフォームおよび変異体例えば選択的RNA転写物、一部切除truncated型、多型等もまたあり、これには、限定されるわけではないが、Swissprotデータベースエントリー番号P00533-1、P00533-2、P00533-3、およびP00533-4に同定されるものが含まれる。EGFRは、α上皮増殖因子EGF、トランスフォーミング増殖因子-αTGf-アンフィレギュリン、ヘパリン結合性EGFhb-EGF、ベータセルリン、およびエピレギュリンHerbst,R.S.およびShin,D.M.,Cancer9420021593-1611;Mendelsohn,J.およびBaselga,J.,Oncogene1920006550-6565を含むリガンドに結合することが知られる。EGFRは、チロシンキナーゼ仲介性シグナル伝達経路によって多くの細胞プロセスを制御し、こうしたプロセスには、限定されるわけではないが、細胞増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管形成、有糸分裂誘発、および転移を調節するシグナル伝達経路の活性化が含まれるAtalay,G.ら,Ann.Oncology1420031346-1363;Tsao,A.S.およびHerbst,R.S.,Signal420034-9;Herbst,R.S.およびShin,D.M.,Cancer9420021593-1611;Modjtahedi,H.ら,Br.J.Cancer731996228-235。用語IGF-1Rは、本明細書において、ヒトインスリン様増殖因子I受容体IGF-IR、CD221抗原;配列番号14を指し、膜貫通プロテインチロシンキナーゼのファミリーに属するLeRoith,D.ら,Endocrin.Rev.161995143-163;およびAdams,T.E.ら,Cell.Mol.LifeSci.5720001050-1063。SwissProtデータベースエントリーP08069はIGF-1Rの配列を提供する。IGF-IRは、高アフィニティでIGF-Iに結合し、そしてinvivoで、このリガンドに対する生理学的反応を開始する。IGF-IRはまた、わずかにより低いアフィニティであるが、IGF-IIにも結合する。IGF-IR過剰発現は細胞の新生物性形質転換を促進し、そしてIGF-IRが細胞の悪性形質転換に関与し、そしてしたがって、癌治療のための療法剤開発に有用なターゲットである証拠が存在するAdams,T.E.ら,Cell.Mol.LifeSci.5720001050-1063。本発明の好ましい側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、ヒトIGF-1RならびにヒトEGFRに特異的に結合するすなわち、本発明記載の二重特異性抗体は、二重特異性抗IGF-lR/抗EGFR抗体である。二重特異性抗体は、ヒト<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587;WO2005/005635、<IGF-lR>クローンl8または<IGF-1R>AK18と略されるおよびヒト化<EGFR>ICR62WO2006/082515<EGFR>ICR62と略されるである。これらの二重特異性二価抗体の相当する軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3OA-Ak18-scFab-GA201に関する;配列番号5、配列番号6、配列番号7OA-GA201-scFab-Ak18に関する;配列番号1、配列番号2、配列番号4OA-Ak18-scFab-GA201_WTに関する、および配列番号5、配列番号6、配列番号8OA-GA201-scFab-Ak18_WTに関するに提供される。本発明記載の二重特異性<EGFR-IGF-1R>抗体は、EGFRおよびIGF-1Rターゲティング療法が必要なヒト患者に対する利益を示す。本発明記載の抗体は、こうした疾患に罹患した、特に癌に罹患した患者に対する利益を引き起こす、非常に価値ある特性を有する。本発明記載の二重特異性<EGFR-IGF-1R>抗体は、例えば、単一特異性親<IGF-1R>抗体と比較して、IGF-1R受容体の内在化の減少を示す。さらに、これらは、抗原EGFRおよびIGF-1R両方を発現している腫瘍細胞の優れたターゲティングを示し、これは抗原EGFRおよびIGF-1R両方を発現している癌に罹患した患者に対する、有効性/毒性比に関する利益に相当する。したがって、本発明の1つの側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そして配列番号1のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号2のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号3のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そして配列番号1のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号2のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号4のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号7のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号8のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる。したがって、本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、抗IGF-1R/抗EGFR抗体であり、そして配列番号1、配列番号2、および配列番号3のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。したがって、本発明の1つの側面は、配列番号1、配列番号2、および配列番号3のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトIGF-1RおよびヒトEGFRに特異的に結合する二重特異性抗体である。したがって、本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、抗IGF-1R/抗EGFR抗体であり、そして配列番号1、配列番号2、および配列番号4のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。したがって、本発明の1つの側面は、配列番号1、配列番号2、および配列番号4のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトIGF-1RおよびヒトEGFRに特異的に結合する二重特異性抗体である。したがって、本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、抗IGF-1R/抗EGFR抗体であり、そして配列番号5、配列番号6、および配列番号7のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。したがって、本発明の1つの側面は、配列番号5、配列番号6、および配列番号7のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトIGF-1RおよびヒトEGFRに特異的に結合する二重特異性抗体である。したがって、本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、抗IGF-1R/抗EGFR抗体であり、そして配列番号5、配列番号6、および配列番号8のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。したがって、本発明の1つの側面は、配列番号5、配列番号6、および配列番号8のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる、ヒトIGF-1RおよびヒトEGFRに特異的に結合する二重特異性抗体である。本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、抗IGF-1R/抗EGFR抗体であり、そしてa配列番号1、配列番号2、および配列番号3のアミノ酸配列を含むかb配列番号1、配列番号2、および配列番号4のアミノ酸配列を含むかc配列番号5、配列番号6、および配列番号7のアミノ酸配列を含むか、またはd配列番号5、配列番号6、および配列番号8のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。本発明の1つの態様において、前記二重特異性抗体抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、以下の特性実施例4および5に記載するようなアッセイにおいて決定されるの1またはそれより多くを有することで特徴付けられる:-抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、H322M腫瘍細胞に対して、5nMまたはそれ未満好ましくは2nMまたはそれ未満のIC50で、IGF-1Rのリン酸化を阻害する;-二重特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、H322M腫瘍細胞に対して、5nMまたはそれ未満好ましくは2nMまたはそれ未満のIC50で、EGFRのリン酸化を阻害する;-二重特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587と比較して、50またはそれより多く、IGF-1Rの下方制御を減少させる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、CDRにおける1アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号7のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのKD値が、配列番号7の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのKD値と比較した際、等しいかまたは4倍未満減少していることで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、CDRにおける1アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号8のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのKD値が、配列番号8の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのKD値と比較した際、等しいかまたは4倍未満減少していることで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、CDR3Hにおける1アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号7のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのKD値が、配列番号7の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのKD値と比較した際、等しいかまたは4倍未満減少していることで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、CDR3Hにおける1アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号8のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのKD値が、配列番号8の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのKD値と比較した際、等しいかまたは4倍未満減少していることで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、CDRにおける1アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号7のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのKD値が、配列番号7の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのKD値と比較した際、等しいかまたは4倍未満減少しており;そして以下の特性実施例4および5に記載するようなアッセイにおいて決定される-抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、H322M腫瘍細胞に対して、5nMまたはそれ未満好ましくは2nMまたはそれ未満のIC50で、IGF-1Rのリン酸化を阻害する;-二重特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、H322M腫瘍細胞に対して、5nMまたはそれ未満好ましくは2nMまたはそれ未満のIC50で、EGFRのリン酸化を阻害する;-二重特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587と比較して、50またはそれより多く、IGF-1Rの下方制御を減少させるの1またはそれより多くを有することで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、CDRにおける1アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号8のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのKD値が、配列番号8の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのKD値と比較した際、等しいかまたは4倍未満減少しており;そして以下の特性実施例4および5に記載するようなアッセイにおいて決定される-抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、H322M腫瘍細胞に対して、5nMまたはそれ未満好ましくは2nMまたはそれ未満のIC50で、IGF-1Rのリン酸化を阻害する;-二重特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、H322M腫瘍細胞に対して、5nMまたはそれ未満好ましくは2nMまたはそれ未満のIC50で、EGFRのリン酸化を阻害する;-二重特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587と比較して、50またはそれより多く、IGF-1Rの下方制御を減少させるの1またはそれより多くを有することで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、CDR3Hにおける1アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号7のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのKD値が、配列番号7の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのKD値と比較した際、等しいかまたは4倍未満減少しており;そして以下の特性実施例4および5に記載するようなアッセイにおいて決定される-抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、H322M腫瘍細胞に対して、5nMまたはそれ未満好ましくは2nMまたはそれ未満のIC50で、IGF-1Rのリン酸化を阻害する;-二重特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、H322M腫瘍細胞に対して、5nMまたはそれ未満好ましくは2nMまたはそれ未満のIC50で、EGFRのリン酸化を阻害する;-二重特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587と比較して、50またはそれより多く、IGF-1Rの下方制御を減少させるの1またはそれより多くを有することで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体はa第一の全長抗体が、EGFRに特異的に結合し、そして配列番号5のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号6のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、IGF-1Rに特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が、CDR3Hにおける1アミノ酸残基より多い置換を含まない配列番号8のアミノ酸配列を有し、そして結合アフィニティのKD値が、配列番号8の非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのKD値と比較した際、等しいかまたは4倍未満減少しており;そして以下の特性実施例4および5に記載するようなアッセイにおいて決定される-抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、H322M腫瘍細胞に対して、5nMまたはそれ未満好ましくは2nMまたはそれ未満のIC50で、IGF-1Rのリン酸化を阻害する;-二重特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、H322M腫瘍細胞に対して、5nMまたはそれ未満好ましくは2nMまたはそれ未満のIC50で、EGFRのリン酸化を阻害する;-二重特異性抗IGF-1R/抗EGFR抗体は、抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587と比較して、50またはそれより多く、IGF-1Rの下方制御を減少させるの1またはそれより多くを有することで特徴付けられる。結合アフィニティのKD値が、非突然変異アミノ酸配列の結合アフィニティのKD値と比較した際、等しいかまたは4倍未満減少している配列番号7または配列番号8のCDR3Hのアミノ酸残基置換の例は、例えばEP10166860.6に記載される。用語VEGFは、本明細書において、例えばLeung,D.W.ら,Science24619891306-9;Keck,P.J.ら,Science24619891309-12およびConnolly,D.T.ら,J.Biol.Chem.264198920017-24に記載される、ヒト血管内皮増殖因子VEGF/VEGF-A配列番号15を指す。VEGFは、腫瘍および眼内障害に関連する、正常および異常血管形成および血管新生の制御に関与するFerrara,N.ら,Endocr.Rev.1819974-25;Berkman,R.A.ら,J.Clin.Invest.911993153-159;Brown,L.F.ら,HumanPathol.26199586-91;Brown,L.F.ら,CancerRes.5319934727-4735;Mattern,J.ら,Brit.J.Cancer.731996931-934;およびDvorak,H.ら,Am.J.Pathol.14619951029-1039。VEGFは、いくつかの供給源から単離されているホモ二量体糖タンパク質である。VEGFは、内皮細胞に対して非常に特異的な有糸分裂誘発活性を示す。用語ANG-2は、本明細書において、ヒトアンジオポエチン-2ANG-2あるいはANGPT2またはANG2と略される配列番号16と称され、Maisonpierre,P.C.ら,Science277199755-60およびCheung,A.H.ら,Genomics481998389-91に記載される。アンジオポエチン-1および-2ならびにANG-2は、血管内皮内で選択的に発現されるチロシンキナーゼファミリーであるTieに対するリガンドとして発見された。Yancopoulos,G.D.ら,Nature4072000242-48。現在、アンジオポエチンファミリーの4つの確定メンバーがある。アンジオポエチン-3および-4Ang-3およびAng-4は、マウスおよびヒトにおいて、同じ遺伝子座の広く分岐した対応物に相当しうる。Kim,I.ら,FEBSLet,4431999353-56;Kim,I.ら,JBiolChem274199926523-28。ANG-1およびANG-2は、元来、それぞれ、アゴニストおよびアンタゴニストとして、組織培養実験中で同定されたANG-1に関しては:Davis,S.ら,Cell8719961161-69を;そしてANG-2に関しては:Maisonpierre,P.C.ら,Science277199755-60を参照されたい。既知のアンジオポエチンはすべて、主にTie2に結合し、そしてAng-1および-2はどちらも3nMKdのアフィニティでTie2に結合する。Maisonpierre,P.C.ら,Science277199755-60。好ましい態様において、本発明記載の前記二重特異性抗体は、ヒトVEGFならびにヒトANG-2に特異的に結合するすなわち本発明記載の二重特異性抗体は、二重特異性抗VEGF/抗ANG-2抗体である。二重特異性抗体は、好ましくは抗VEGF抗体ベバシズマブおよびANG2i-LC06WO2010/040508PCT出願PCT/EP2009/007182に記載され、そしてファージディスプレイを通じて得られたに基づく。これらの二重特異性二価抗体の相当する軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、配列番号9、配列番号10、配列番号11Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06SSに関するに、そして配列番号9、配列番号10、配列番号12Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06に関するに提供される。したがって、本発明の1つの側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、a第一の全長抗体が、VEGFに特異的に結合し、そして配列番号9のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号10のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、ANG-2に特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号11のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる。本発明の別の側面において、本発明記載の二重特異性抗体は、a第一の全長抗体が、VEGFに特異的に結合し、そして配列番号9のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号10のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含み、そしてb第二の全長抗体が、ANG-2に特異的に結合し、そしてペプチドリンカーを通じて軽鎖に連結された重鎖を含み、前記の連結された重鎖および軽鎖が配列番号12のアミノ酸配列を有することで特徴付けられる。したがって、本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は抗VEGF/抗ANG-2抗体であり、そして配列番号9、配列番号10、および配列番号11のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。したがって、本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は抗VEGF/抗ANG-2抗体であり、そして配列番号9、配列番号10、および配列番号12のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。本発明の全長抗体は、1またはそれより多い免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスには、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEアイソタイプ、ならびにIgGおよびIgAの場合、そのサブタイプが含まれる。好ましい態様において、本発明の全長抗体は、IgGタイプ抗体の定常ドメイン構造を有する。用語モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体組成物は、本明細書において、単一アミノ酸組成物の抗体分子の調製を指す。用語キメラ抗体は、1つの供給源または種由来の可変領域、すなわち結合領域、および異なる供給源または種由来の定常領域の少なくとも部分を含み、通常は組換えDNA技術によって調製される抗体を指す。ネズミ可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明に含まれるキメラ抗体の他の好ましい型は、定常領域が元来の抗体のものから修飾されているか、または変化しており、本発明記載の特性、特にC1q結合および/またはFc受容体FcR結合に関する特性を生じているものである。こうしたキメラ抗体はまた、クラススイッチ抗体とも称される。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメントおよび免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を産生するための方法は、慣用的な組換えDNAおよび遺伝子トランスフェクション技術を伴い、これらの技術は当該技術分野に周知である。例えば、Morrison,S.L.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA8119846851-6855;US5,202,238およびUS5,204,244を参照されたい。用語ヒト化抗体は、フレームワークまたは相補性決定領域CDRが、親免疫グロブリンのものと比較した際、異なる特異性の免疫グロブリンのCDRを含むよう修飾されてきているものを指す。好ましい態様において、ネズミCDRをヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、ヒト化抗体が調製されてきている。例えば、Riechmann,L.ら,Nature3321988323-327;およびNeuberger,M.S.ら,Nature3141985268-270を参照されたい。特に好ましいCDRは、キメラ抗体に関して上に示される抗原を認識する配列に相当するものに対応する。本発明に含まれるヒト化抗体の他の型は、定常領域が元来の抗体のものからさらに修飾されているか、または変化しており、本発明記載の特性、特にC1q結合および/またはFc受容体FcR結合に関する特性を生じているものである。用語ヒト抗体は、本明細書において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むよう意図される。ヒト抗体は、当該技術分野において周知であるvanDijk,M.A.およびvandeWinkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.52001368-374。ヒト抗体はまた、免疫に際して、内因性免疫グロブリン産生を伴わずに、ヒト抗体の全レパートリーまたは選択を産生することが可能なトランスジェニック動物例えばマウスにおいても産生可能である。こうした生殖系列突然変異体マウスにおいて、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをトランスファーすると、抗原曝露に際してヒト抗体の産生が生じるであろう例えばJakobovits,A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA9019932551-2555;Jakobovits,A.ら,Nature3621993255-258;Bruggemann,M.ら,YearImmunol.7199333-40。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいても産生可能であるHoogenboom,H.R.およびWinter,G.,J.Mol.Biol.2271992381-388;Marks,J.D.ら,J.Mol.Biol.2221991581-597を参照されたい。ColeらおよびBoernerらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用可能であるColeら,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.771985;およびBoerner,P.ら,J.Immunol.147199186-95。本発明記載のキメラおよびヒト化抗体に関してすでに言及したように、用語ヒト抗体は、本明細書において、また、例えばクラススイッチングによって、すなわちFc部分の変化または突然変異によって例えばIgG1からIgG4および/またはIgG1/IgG4突然変異によって、定常領域が修飾されて、本発明記載の特性、特にC1q結合および/またはFcR結合に関する特性を生じている抗体も含む。用語組換えヒト抗体は、本明細書において、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるか、または単離されるすべてのヒト抗体、例えばNS0またはCHO細胞などの宿主細胞から単離された、あるいは宿主細胞にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを用いて発現されたヒト免疫グロブリン遺伝子または抗体に関してトランスジェニックである動物例えばマウスから単離された抗体を含むよう意図される。こうした組換えヒト抗体は、再編成された形の可変および定常領域を有する。本発明記載の組換えヒト抗体はinvivo体細胞超変異に供されてきている。したがって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VHおよびVL配列に由来し、そしてこれらに関連する一方、invivoのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しない可能性もある。可変ドメイン軽鎖の可変ドメインVL、重鎖の可変領域VHは、本明細書において、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖および重鎖対各々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖は同じ一般構造を有し、そして各ドメインは、3つの超可変領域または相補性決定領域、CDRによって連結された、その配列が広く保存された4つのフレームワークFR領域を含む。フレームワーク領域はβシートコンホメーションを採用し、そしてCDRは、βシート構造を連結するループを形成しうる。各鎖中のCDRは、フレームワーク領域によってその三次元構造に保持され、そして他方の鎖由来のCDRと一緒に、抗原結合部位を形成する。抗体重鎖および軽鎖CDR3領域は、本発明記載の抗体の結合特異性/アフィニティにおいて特に重要な役割を果たし、そしてしたがって本発明のさらなる目的を提供する。用語超可変領域または抗体の抗原結合部分は、本明細書において、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、相補性決定領域またはCDR由来のアミノ酸残基を含む。フレームワークまたはFR領域は、本明細書に定義するような超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖は、N末端からC末端に、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。各鎖上のCDRは、こうしたフレームワークアミノ酸によって分離される。特に、重鎖CDR3は、抗原結合に最も寄与する領域である。CDRおよびFR領域は、Kabatら,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD1991の標準的定義にしたがって決定される。本明細書において、用語に結合するまたはに特異的に結合するものまたはに特異的に結合するは、invitroアッセイにおける、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイBIAcore、GE-Healthcareスウェーデンウプサラにおける、抗原のエピトープへの抗体の結合を指す。結合のアフィニティは、用語ka抗体/抗原複合体からの抗体の会合に関する速度定数、kD解離定数、およびKDkD/kaによって定義される。1つの態様において、結合または特異的結合は、10-8mol/lまたはそれ未満、好ましくは10-9M~10-13mol/lの結合アフィニティKDを意味する。したがって、本発明記載の二重特異性抗体は、好ましくは、10-8mol/lまたはそれ未満、好ましくは10-9M~10-13mol/lの結合アフィニティKDで、特異的である各抗原に対して特異的に結合する。FcγRIIIへの抗体の結合を、BIAcoreアッセイGE-Healthcareスウェーデンウプサラによって調べてもよい。結合のアフィニティは、用語ka抗体/抗原複合体からの抗体の会合に関する速度定数、kD解離定数、およびKDkD/kaによって定義される。用語エピトープには、抗体への特異的結合が可能ないかなるポリペプチド決定因子も含まれる。特定の態様において、エピトープ決定因子には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的活性表面基が含まれ、そして該因子は、特定の態様において、特異的三次元構造特性およびまたは特異的電荷特性を有してもよい。エピトープは、抗体が結合する、抗原の領域である。特定の態様において、抗体が、タンパク質および/または巨大分子の複合混合物において、ターゲット抗原を優先的に認識する場合、該抗体は、抗原に特異的に結合すると言われる。用語定常領域は、本出願において、可変領域以外の抗体ドメインの合計を示す。定常領域は、抗原の結合には直接関与しないが、多様なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体はクラス:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに分けられ、そしてこれらのいくつかは、さらにサブクラス、例えばIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、IgA1およびIgA2に分けられうる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。5つの抗体クラスすべてに見出されうる軽鎖定常領域CLは、κカッパおよびλラムダと呼ばれる。用語ヒト起源由来の定常領域は、本出願において、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のヒト抗体の定常重鎖領域および/または定常軽鎖カッパまたはラムダ領域を示す。こうした定常領域は、当該技術分野において知られ、そして例えば、Kabat,E.A.によって記載される例えば、Johnson,G.およびWu,T.T.,NucleicAcidsRes.282000214-218;Kabat,E.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA7219752785-2788を参照されたい。用語補体依存性細胞傷害性CDCは、大部分のIgG抗体サブクラスのFc部分への補体因子C1qの結合によって開始されるプロセスを示す。抗体へのC1qの結合は、いわゆる結合部位での定義されるタンパク質-タンパク質相互作用によって引き起こされる。こうしたFc部分結合部位は当該技術分野において知られる上記を参照されたい。こうしたFc部分結合部位は、例えば、アミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、およびP329番号付けは、KabatのEUインデックスにしたがうによって特徴付けられる。サブクラスIgG1、IgG2、およびIgG3は、通常、C1qおよびC3結合を含む補体活性化を示し、一方、IgG4は補体系を活性化せず、そしてC1qおよび/またはC3に結合しない。IgG4サブクラスの抗体は、Fc受容体FcγRIIIa結合減少を示すが、他のIgGサブクラスの抗体は、強い結合を示す。しかし、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297Fc炭水化物の喪失、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、およびHis435は、改変された場合、やはりFc受容体結合減少を提供する残基であるShields,R.L.ら,J.Biol.Chem.27620016591-6604;Lund,J.ら,FASEBJ.91995115-119;Morgan,A.ら,Immunology861995319-324;EP0307434。1つの態様において、本発明記載の抗体は、IgG1抗体と比較して、FcR結合減少を有し、そして全長親抗体は、FcR結合に関して、IgG4サブクラスあるいはIgG1またはIgG2のFcR結合のため、S228、L234、L235および/またはD265に突然変異を伴い、そして/またはPVA236突然変異を含有する。1つの態様において、全長親抗体における突然変異は、S228P、L234A、L235A、L235Eおよび/またはPVA236である。別の態様において、全長親抗体は、IgG4S228PおよびL235E、ならびにIgG1L234AおよびL235Aである。さらなる態様において、本明細書記載の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトIgG1サブクラスであることで特徴付けられる。用語抗体依存性細胞傷害性ADCCは、エフェクター細胞の存在下での本発明記載の抗体によるヒトターゲット細胞の溶解を指す。ADCCは、好ましくは、EGFRおよびIGF-1R発現細胞の調製物を、新鮮に単離されたPBMCなどのエフェクター細胞またはバフィーコート由来の精製エフェクター細胞、例えば単球またはナチュラルキラー細胞、あるいは永続的に増殖しているNK細胞株の存在下、本発明記載の抗体で処理することによって測定される。用語補体依存性細胞傷害性CDCは、大部分のIgG抗体サブクラスのFc部分への補体因子C1qの結合によって開始されるプロセスを示す。抗体へのC1qの結合は、いわゆる結合部位での定義されるタンパク質-タンパク質相互作用によって引き起こされる。こうしたFc部分結合部位は当該技術分野において知られる上記を参照されたい。こうしたFc部分結合部位は、例えば、アミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、およびP329番号付けは、KabatのEUインデックスにしたがうによって特徴付けられる。サブクラスIgG1、IgG2、およびIgG3は、通常、C1qおよびC3結合を含む補体活性化を示し、一方、IgG4は補体系を活性化せず、そしてC1qおよび/またはC3に結合しない。抗体の定常領域は、ADCC抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性およびCDC補体依存性細胞傷害性に直接関与する。補体活性化CDCは、大部分のIgG抗体サブクラスの定常領域への補体因子C1qの結合によって開始される。抗体へのC1qの結合は、いわゆる結合部位での定義されるタンパク質-タンパク質相互作用によって引き起こされる。こうした定常領域結合部位は、当該技術分野に知られ、そして例えば、Lukas,T.J.ら,J.Immunol.12719812555-2560;Brunhouse,R.およびCebra,J.J.,Mol.Immunol.161979907-917;Burton,D.R.ら,Nature2881980338-344;Thommesen,J.E.ら,Mol.Immunol.372000995-1004;Idusogie,E.E.ら,J.Immunol.16420004178-4184;Hezareh,M.ら,J.Virol.75200112161-12168;Morgan,A.ら,Immunology861995319-324;およびEP0307434によって記載される。こうした定常領域結合部位は、例えば、アミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、およびP329番号付けは、KabatのEUインデックスにしたがうによって特徴付けられる。1つの態様において、本発明記載の二重特異性抗体は、好ましくはヒト起源由来のIgG1またはIgG3サブクラス好ましくはIgG1サブクラスの定常領域を含む。1つの態様において、本発明記載の二重特異性抗体は、好ましくはヒト起源由来のIgG1またはIgG3サブクラス好ましくはIgG1サブクラスのFc部分を含む。モノクローナル抗体の抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性ADCCは、Umana,P.ら,NatureBiotechnol.171999176-180、およびUS6,602,684に記載されるように、オリゴ糖構成要素を操作することによって増進されうる。最も一般的に用いられる療法抗体であるIgG1型の抗体は、各CH2ドメイン中のAsn297で保存されたN連結グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Asn297に付着した2つの複合二分岐オリゴ糖は、CH2ドメイン間に包埋され、ポリペプチド主鎖と伸長された接触を形成し、そしてその存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害性ADCCなどのエフェクター機能を仲介するために必須であるLifely,M.R.ら,Glycobiology51995813-822;Jefferis,R.ら,Immunol.Rev.163199859-76;Wright,A.およびMorrison,S.L.,TrendsBiotechnol.15199726-32。Umana,P.らNatureBiotechnol.171999176-180およびWO99/154342は、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞において、二分岐オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ1,4-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIGnTIIIを過剰発現させると、抗体のinvitroADCC活性が有意に増加することを示した。Asn297炭水化物の組成の改変またはその除去はまた、FcγRおよびC1qへの結合にも影響を及ぼすUmana,P.ら,NatureBiotechnol.171999176-180;Davies,J.ら,Biotechnol.Bioeng.742001288-294;Mimura,Y.ら,J.Biol.Chem.276200145539-45547;Radaev,S.ら,J.Biol.Chem.276200116478-16483;Shields,R.L.ら,J.Biol.Chem.27620016591-6604;Shields,R.L.ら,J.Biol.Chem.277200226733-26740;Simmons,L.C.ら,J.Immunol.Methods2632002133-147。フコースの量を減少させることによって、モノクローナル抗体の細胞仲介性エフェクター機能を増進させる方法が、例えば、WO2005/018572、WO2006/116260、WO2006/114700、WO2004/065540、WO2005/011735、WO2005/027966、WO1997/028267、US2006/0134709、US2005/0054048、US2005/0152894、WO2003/035835、WO2000/061739、Niwa,R.ら,J.Immunol.Methods3062005151-160;Shinkawa,T.ら,JBiolChem,27820033466-3473;WO03/055993またはUS2005/0249722に記載される。ヒトIgG1またはIgG3のグリコシル化は、最大2つのGal残基で終わる、コアフコシル化二分岐複合体オリゴ糖グリコシル化として、Asn297で起こる。IgG1またはIgG3サブクラスのヒト定常重鎖領域は、Kabat,E.A.ら,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.1991によって、そしてBrueggemann,M.ら,J.Exp.Med.16619871351-1361;Love,T.W.ら,MethodsEnzymol.1781989515-527によって詳細に報告される。これらの構造は、末端Gal残基の量に応じて、G0、G1α-1,6-またはα-1,3-、またはG2グリカン残基と称されるRaju,T.S.,BioprocessInt.1200344-53。抗体Fc部分のCHO型グリコシル化は、例えば、Routier,F.H.,GlycoconjugateJ.141997201-207に記載される。非糖修飾CHO宿主細胞において組換え的に発現される抗体は、通常、少なくとも85の量で、Asn297でフコシル化される。全長親抗体の修飾オリゴ糖は、ハイブリッドまたは複合体であってもよい。好ましくは、二分岐、還元/非フコシル化オリゴ糖はハイブリッドである。別の態様において、二分岐、還元/非フコシル化オリゴ糖は複合体である。本発明にしたがって、フコース量は、Asn297での糖鎖内での前記糖の量を意味し、MALDI-TOF質量分析によって測定され、そして平均値として計算される、Asn297に付着したすべての糖構造例えば複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造の合計に関連する。フコースの相対量は、MALDI-TOF実施例10を参照されたいによる、N-グリコシダーゼF処理試料において同定されるすべての糖構造例えばそれぞれ、複合体、ハイブリッドならびにオリゴおよび高マンノース構造に関連するフコース含有構造の割合である。本発明記載の二重特異性<EGFR-IGF-1R>抗体は、親<EGFR>および/または<IGF-1R>抗体と比較して、EGFRおよびIGF-1R受容体の内在化の減少を示す。したがって、本発明の1つの好ましい態様において、二重特異性<EGFR-IGF-1R>抗体は、Asn297で糖鎖にてグリコシル化されIgG1またはIgG3サブクラス、好ましくはIgG1サブクラス、それによって、前記糖鎖内でのフコースの量は65またはそれより少ない番号付けはKabatにしたがう。別の態様において、前記糖鎖内のフコースの量は、5~65の間、好ましくは20~40の間である。本発明記載のAsn297は、Fc領域中の297位周囲に位置するアミノ酸アスパラギンを意味する。抗体の重要でない配列変動に基づいて、Asn297はまた、297位の上流または下流、すなわち294位~300位の間に位置するいくつかのアミノ酸であってもよい通常、±3アミノ酸より大きくない。こうした糖操作抗体はまた、本明細書において、無フコシル化抗体とも呼ばれる。本発明記載の無フコシル化二重特異性抗体は、Fc領域において、オリゴ糖を部分的にフコシル化するのに十分な量のGnTIII活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸を発現するように操作された糖修飾宿主細胞において発現可能である。1つの態様において、GnTIII活性を有するポリペプチドは融合ポリペプチドである。あるいは、宿主細胞のα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を、US6,946,292にしたがって減少させるかまたは排除して、糖修飾宿主細胞を生成してもよい。例えば発酵条件例えば発酵時間によって、または異なるフコシル化量を持つ少なくとも2つの抗体の組み合わせによってのいずれかで、抗体フコシル化の量をあらかじめ決定してもよい。こうした無フコシル化抗体およびそれぞれの糖操作法は、WO2005/044859、WO2004/065540、WO2007/031875、Umana,P.ら,NatureBiotechnol.171999176-180、WO99/154342、WO2005/018572、WO2006/116260、WO2006/114700、WO2005/011735、WO2005/027966、WO97/028267、US2006/0134709、US2005/0054048、US2005/0152894、WO2003/035835、WO2000/061739に記載される。これらの糖操作抗体ではADCCが増加している。本発明記載の無フコシル化抗体を生じる他の糖操作法は、例えば、Niwa,R.ら,J.Immunol.Methods3062005151-160;Shinkawa,T.ら,JBiolChem,27820033466-3473;WO03/055993またはUS2005/0249722に記載される。1つの態様は、WO2005/044859、WO2004/065540、WO2007/031875、Umana,P.ら,NatureBiotechnol.171999176-180、WO99/154342,WO2005/018572、WO2006/116260、WO2006/114700、WO2005/011735、WO2005/027966、WO97/028267、US2006/0134709、US2005/0054048、US2005/0152894、WO2003/035835orWO2000/061739に記載される方法を用いた、Asn297で糖鎖にてグリコシル化され、それによって前記糖鎖内のフコースの量が65またはそれ未満である、IgG1またはIgG3サブクラスの二重特異性抗体の調製法である。1つの態様は、Niwa,R.ら,J.Immunol.Methods3062005151-160;Shinkawa,T.ら,JBiolChem,27820033466-3473;WO03/055993またはUS2005/0249722に記載される方法を用いた、Asn297で糖鎖にてグリコシル化され、それによって前記糖鎖内のフコースの量が65またはそれ未満である、IgG1またはIgG3サブクラスの二重特異性抗体の調製法である。本発明記載の抗体は、組換え手段によって産生される。したがって、本発明の1つの側面は、本発明記載の抗体をコードする核酸であり、そしてさらなる側面は、本発明記載の抗体をコードする前記核酸を含む細胞である。組換え産生のための方法は、当該技術分野に広く知られ、そして原核および真核細胞におけるタンパク質発現に続く抗体の単離、および通常は薬学的に許容されうる純度までの精製を含む。宿主細胞における前述のような抗体の発現のため、それぞれの修飾軽鎖および重鎖をコードする核酸を、標準法によって発現ベクター内に挿入する。CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母、または大腸菌E.coli細胞などの適切な原核または真核宿主細胞において、発現を行い、そして抗体を細胞上清または溶解後の細胞から回収する。抗体の組換え産生のための一般的な方法が当該技術分野において周知であり、そして例えば、Makrides,S.C.,ProteinExpr.Purif.171999183-202;Geisse,S.ら,ProteinExpr.Purif.81996271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.162000151-161;Werner,R.G.,DrugRes.481998870-880の総説に記載される。本発明記載の二重特異性抗体は、慣用的な免疫グロブリン精製法、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーなどの慣用的な免疫グロブリン精製法によって、培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNAおよびRNAは、慣用的な方法を用いて、容易に単離され、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、DNAおよびRNAの供給源として働きうる。ひとたび単離されたら、DNAを発現ベクターに挿入してもよく、これを次いで、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないHEK293細胞、CHO細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクションして、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成を得る。抗体DNAに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはヌクレオチド合成によって、二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体または突然変異体を調製する。こうした修飾は、しかし、非常に制限された範囲でのみ実行可能である。例えば、修飾は、IgGアイソタイプおよび抗原結合などの上述の抗体特性を改変しないが、組換え体産生収量、タンパク質安定性を改善するか、または精製を容易にすることは可能である。用語宿主細胞は、本出願において、本発明記載の抗体を生成するように操作可能である任意の種類の細胞系を示す。1つの態様において、HEK293細胞およびCHO細胞を宿主細胞として用いる。本明細書において、表現細胞、細胞株、および細胞培養は、交換可能に用いられ、そしてすべてのこうした名称には子孫が含まれる。したがって、用語形質転換体および形質転換細胞には、初代対象細胞、およびトランスファー数に関わらず、そこから由来する培養物が含まれる。計画的なまたは偶発性の突然変異のため、すべての子孫が、DNA内容物において、正確に同一でない可能性もあることもまた理解される。元来の形質転換された細胞において、スクリーニングされるのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。別個の呼称が意図される場合、文脈から明らかであろう。NS0細胞における発現は、例えば、Barnes,L.M.ら,Cytotechnology322000109-123;Barnes,L.M.ら,Biotech.Bioeng.732001261-270に記載される。一過性発現は、例えば、Durocher,Y.ら,Nucl.Acids.Res.302002E9に記載される。可変ドメインのクローニングは、Orlandi,R.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA8619893833-3837;Carter,P.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA8919924285-4289;およびNorderhaug,L.ら,J.Immunol.Methods204199777-87に記載される。好ましい一過性発現系HEK293が、Schlaeger,E.-J.およびChristensen,K.,Cytotechnology30199971-83に、そしてSchlaeger,E.-J.,J.Immunol.Methods1941996191-199に記載される。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、場合によるオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られる。核酸は、別の核酸配列と機能する関連で配置された場合、機能可能であるように連結されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されているならば、ポリペプチドに関するDNAに機能可能であるように連結されており;プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に機能可能であるように連結されており;またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されているならば、コード配列に機能可能であるように連結されている。一般的に機能可能であるように連結されるは、連結されるDNA配列が連続しており、そして分泌リーダーの場合、連続しており、そして読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続である必要はない。連結は、慣用的な制限部位での連結によって達成される。こうした部位が存在しない場合、慣用的な実施にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いる。細胞構成要素または他の混入物質、例えば他の細胞核酸またはタンパク質を除去するため、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当該技術分野に周知の他のものを含む標準技術によって、抗体の精製を行う。Ausubel,F.ら監修CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork1987を参照されたい。タンパク質精製に関する異なる方法がよく確立され、そして広く用いられており、例えば微生物タンパク質を用いたアフィニティクロマトグラフィー例えば、プロテインAまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー例えば陽イオン交換カルボキシメチル樹脂、陰イオン交換アミノエチル樹脂および混合様式交換、チオ親和性thiophilic吸着例えばベータ-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いる、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー例えばフェニル-セファロース、アザ-アレノ親和性arenophilic樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸を用いる、金属キレートアフィニティクロマトグラフィー例えばNiIIおよびCuIIアフィニティ材料を用いる、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などがあるVijayalakshmi,M.A.Appl.Biochem.Biotech.75199893-102。用語形質転換は、本明細書において、宿主細胞内へのベクター/核酸のトランスファープロセスを指す。厄介な細胞壁バリアを持たない細胞が宿主細胞として用いられる場合、トランスフェクションは、例えば、Graham,F.L.およびvanderEb,A.J.,Virology521973456ffに記載されるようなリン酸カルシウム沈殿法によって行われる。しかし、核注入によるかまたはプロトプラスト融合によるものなどの、細胞にDNAを導入するための他の方法もまた使用可能である。原核細胞または実質的な細胞壁構成を含有する細胞を用いる場合、例えばトランスフェクションの1つの方法は、Cohen,F.Nら,PNAS.6919727110ffに記載されるような塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。本明細書において、発現は、核酸がmRNAに転写されるプロセスおよび/または転写されたmRNA転写物とも称されるが続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、集合的に、遺伝子産物と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、真核細胞における発現には、mRNAのスプライシングが含まれうる。ベクターは、挿入された核酸分子を宿主細胞内および/または宿主細胞間でトランスファーする核酸分子、特に自己複製性の核酸分子である。該用語には、主に、細胞へのDNAまたはRNAの挿入例えば染色体組込みのために機能するベクター、DNAまたはRNAの複製のために主に機能する複製ベクター、およびDNAまたはRNAの転写および/または翻訳のために機能する発現ベクターが含まれる。やはり含まれるのは、記載するような機能の1より多くを提供するベクターである。発現ベクターは、適切な宿主細胞内に導入された際、転写され、そしてポリペプチドに翻訳されうることが可能なポリヌクレオチドである。発現系は、通常、機能して所望の発現産物を生じることが可能な発現ベクターを含む適切な宿主細胞を指す。本発明記載の二重特異性抗体が、哺乳動物細胞における優れた発現収量、安定性、生物学的または薬理学的活性、薬物動態学的特性または毒性などの価値ある特性を有することが現在、見出されてきている。これらは、例えば、癌などの疾患の治療に使用可能である。本発明記載の抗体、特に二重特異性<IGF-1R-EGFR>抗体は、受容体IGF-1RおよびEGFR両方を発現している癌細胞の増殖阻害、および癌に罹患した患者に利益を引き起こす抗腫瘍有効性のような非常に価値ある特性を示す。本発明記載の二重特異性<IGF-1R-EGFR>抗体は、受容体IGF-1RおよびEGFR両方を発現している癌細胞に対して、親単一特異性<IGF-1R>および<EGFR>抗体と比較した際、EGFRおよびIGF-1R受容体両方の内在化の減少を示す。本発明の1つの側面は、本発明記載の抗体を含む医薬組成物である。本発明の別の側面は、医薬組成物製造のための、本発明記載の抗体の使用である。本発明のさらなる側面は、本発明記載の抗体を含む医薬組成物の製造法である。別の側面において、本発明は、本発明記載の抗体を含有する組成物、例えば薬学的キャリアーと一緒に配合された、医薬組成物を提供する。本発明の1つの態様は、癌治療のための本発明記載の二重特異性抗体である。本発明の別の側面は、癌治療のための前記医薬組成物である。本発明の別の側面は、癌治療用の薬剤製造のための本発明記載の抗体の使用である。本発明の別の側面は、癌治療が必要な患者に、本発明記載の抗体を投与することによる、癌に罹患した患者の治療法である。本明細書において、薬学的キャリアーには、生理学的に適合する、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、キャリアーは、静脈内、筋内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与例えば注射または注入によるに適切である。本発明の組成物を当該技術分野に知られる多様な方法によって投与してもよい。当業者に認識されるであろうように、投与経路および/または様式は、所望の結果に応じて多様であろう。特定の投与経路によって、本発明の化合物を投与するため、化合物を、その不活性化を防止する物質でコーティングするか、またはこうした物質とともに化合物を共投与する必要がありうる。例えば、化合物を適切なキャリアー、例えばリポソーム、または希釈剤中で、被験体に投与してもよい。薬学的に許容されうる希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液が含まれる。薬学的キャリアーには、無菌水性溶液または分散剤、および無菌注射可能溶液または分散物の即時調製のための無菌粉末が含まれる。薬学的活性物質のためのこうした媒体および剤の使用が当該技術分野に知られる。句非経口投与および非経口的に投与されるは、本明細書において、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、通常、注射により、そして限定なしに、静脈内、筋内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨下注射および注入が含まれる。用語、癌は、本明細書において、増殖性疾患、例えばリンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺NSCL癌、細気管支肺胞性細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌stomachcancer、gastriccancer、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓または尿道の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系CNSの新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平細胞癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫を指し、上記癌いずれかの難治性型、あるいは上記癌の1またはそれより多くの組み合わせが含まれる。これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの佐剤もまた含有してもよい。微生物の存在の防止は、上記滅菌法によって、そしてかつ多様な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含むことによって、確実にされうる。等張性剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を組成物に含むことが望ましい可能性もまたある。さらにモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる剤を含むことによって、注射可能薬学的型の延長された吸収を達成してもよい。選択した投与経路に関わらず、適切な水和型で使用可能な本発明の化合物、および/または本発明の医薬組成物は、当業者に知られる慣用的な方法によって、薬学的に許容されうる投薬型に配合される。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与様式に関して、望ましい療法反応を達成するのに有効な活性成分の量が得られるように、多様であることも可能である。選択される投薬レベルは、使用する本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排出速度、治療期間、他の薬剤、使用する特定の組成物と組み合わせて用いられる化合物および/または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態および以前の病歴、ならびに医学業に知られる同様の要因を含む、多様な薬物学的要因に応じるであろう。組成物は、無菌であり、そして組成物をシリンジで送達可能である度合いまで流動性でなければならない。水に加え、キャリアーは、好ましくは等張緩衝生理食塩水溶液である。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合、必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持されうる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。アミノ酸配列の説明配列番号1<IGF-1R>重鎖、OA-Ak18-scFab-GA201WT配列番号2<IGF-1R>軽鎖、OA-Ak18-scFab-GA201WT配列番号3<EGFR>OA-Ak18-scFab-GA201のジスルフィド安定化VH44/VL100を含む、ペプチドで連結された重鎖および軽鎖配列番号4<EGFR>OA-Ak18-scFab-GA201_WTのペプチドで連結された重鎖および軽鎖配列番号5<EGFR>重鎖、OA-GA201-scFab-Ak18WT配列番号6<EGFR>軽鎖、OA-GA201-scFab-Ak18WT配列番号7<IGF-1R>VH44/VL100-OA-GA201-scFab-Ak18のジスルフィド安定化を含む、ペプチドで連結された重鎖および軽鎖配列番号8<IGF-1R>OA-GA201-scFab-Ak18_WTのペプチドで連結された重鎖および軽鎖配列番号9<VEGF>重鎖、Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06SS配列番号10<VEGF>軽鎖、Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06SS配列番号11<ANG-2>Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06SSのジスルフィド安定化VH44/VL100を含む、ペプチドで連結された重鎖および軽鎖配列番号12<ANG-2>Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06のペプチドで連結された重鎖および軽鎖配列番号13ヒトEGFR配列番号14ヒトIGF-1R配列番号15ヒトVEGF配列番号16ヒトANG-2以下の実施例、配列表および図は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は、付随する請求項に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示す方法において、修飾を作製することが可能であることが理解される。材料および方法組換えDNA技術標準法を用いて、Sambrook,J.ら,Molecularcloning:Alaboratorymanual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989に記載されるようにDNAを操作した。製造者の指示にしたがって、分子生物学試薬を用いた。DNAおよびタンパク質配列分析、ならびに配列データ管理ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は:Kabat,E.A.ら,1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,NIHPublicationNo91-3242に提供される。抗体鎖のアミノ酸は、EU番号付けにしたがって番号付けられるEdelman,G.M.ら,PNAS63196978-85;Kabat,E.A.ら,1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,NIHPublicationNo91-3242。GCGGeneticsComputerGroup、ウィスコンシン州マディソンソフトウェアパッケージ、バージョン10.2およびInfomaxのVectorNTIAdvanceパッケージソフト、バージョン8.0を配列生成、マッピング、分析、アノテーションおよび例示のために用いた。DNA配列決定DNA配列は、SequiServeドイツファターシュテッテンおよびGeneartAGドイツレーゲンスブルクで行った二本鎖配列決定によって決定された。遺伝子合成GeneartAGドイツレーゲンスブルクによって、自動化遺伝子合成により、合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物から所望の遺伝子セグメントを調製した。非修飾VHドメインまたはscFab抗体断片、ならびに抗体軽鎖と組み合わせて、CH3ドメインにS354CおよびT366W突然変異を所持するノブを穴に抗体重鎖、ならびにY349C、T366S、L368AおよびY407V突然変異を所持するノブを穴に重鎖をコードする遺伝子セグメントに単一制限エンドヌクレアーゼ切断部位BamHI-XbaIまたはBamHI-KpnIを隣接させ、そしてpGA18ampRプラスミド内にクローニングした。形質転換細菌からプラスミドDNAを精製し、そしてUV分光によって濃度を決定した。サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定によって確認した。すべての構築物が、真核細胞における分泌のためにタンパク質をターゲティングするリーダーペプチドMGWSCIILFLVATATGVHSをコードする5’端DNA配列を含むよう設計した。発現プラスミドの構築すべてのノブを穴に重鎖の構築物にRoche発現ベクター、ならびに抗体軽鎖をコードする発現プラスミドを用いた。該ベクターは、以下の要素を含む:-選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、-エプスタイン-バーウイルスEBVの複製起点、oriP、-大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製起点-大腸菌におけるアンピシリン耐性を与えるベータ-ラクタマーゼ遺伝子、-ヒトサイトメガロウイルスHCMV由来の極初期エンハンサーおよびプロモーター、-ヒト1-免疫グロブリンポリアデニル化ポリAシグナル配列、および-ユニークなBamHIおよびXbaI制限部位。記載するように、遺伝子合成によって、ノブを穴に重鎖と非修飾VHドメインまたはscFab断片ならびに非修飾軽鎖を含む免疫グロブリン遺伝子を調製し、そしてpGA18ampRプラスミド内にクローニングした。合成DNAセグメントおよびRoche発現ベクターを所持するpG18ampRプラスミドをBamHIおよびXbaIまたはBamHIおよびKpnI制限酵素RocheMolecularBiochemicalsで消化し、そしてアガロースゲル電気泳動に供した。次いで、精製されたノブを穴に重鎖および非修飾軽鎖をコードするDNAセグメントを単離Roche発現ベクターBamHI/XbaIまたはBamHI/KpnI断片に連結して、最終発現ベクターを生じた。最終発現ベクターを大腸菌細胞に形質転換し、発現プラスミドDNAを単離しMiniprep、そして制限酵素分析およびDNA配列決定に供した。正しいクローンを150mlLB-Amp培地中で増殖させ、再びプラスミドDNAを単離しMaxiprep、そして配列完全性をDNA配列決定によって確認した。HEK293細胞における二重特異性抗体の一過性発現製造者の指示Invitrogen、米国にしたがって、FreeStyleTM293発現系を用いて、ヒト胚性腎293-F細胞の一過性トランスフェクションによって、組換え二重特異性抗体を発現させた。簡潔には、懸濁FreeStyleTM293-F細胞をFreeStyleTM293発現培地中、37°C/8CO2で培養し、そしてトランスフェクションした日に、1~2x106生存細胞/mlの密度で新鮮な培地中に植え付けた。250mlの最終トランスフェクション体積に関して、325μlの293フェクチンTMInvitrogen、ドイツ、ならびに1:1:1または1:2:1のモル比の250μgのノブを穴に重鎖1および2、ならびに軽鎖プラスミドDNAを用いて、Opti-MEM登録商標I培地Invitrogen、米国中、ノブを穴にDNA-293フェクチン複合体を調製した。14000gで30分間の遠心分離によって、抗体を含有する細胞培養上清をトランスフェクション7日後に採取し、そして無菌フィルター0.22μmを通じてろ過した。上清を精製するまで-20°Cで保存した。二重特異性抗体の精製プロテインA-セファロースTMGEHealthcare、スウェーデンおよびSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、細胞培養上清から二重特異性抗体を精製した。簡潔には、無菌ろ過細胞培養上清を、PBS緩衝液10mMNa2HPO4、1mMKH2HPO4、137mMNaClおよび2.7mMKCl、pH7.4で平衡化したHiTrapプロテインAHP5mlカラム上に適用した。未結合タンパク質を平衡化緩衝液で洗浄した。抗体および抗体変異体を0.1Mクエン酸緩衝液、pH2.8で溶出させ、そしてタンパク質含有分画を0.1mlの1MTris、pH8.5で中和した。次いで、溶出したタンパク質分画をプールし、Amicon超遠心フィルター装置MWCO:30K、Miliporeで体積3mlまで濃縮して、そして20mMヒスチジン、140mMNaCl、pH6.0で平衡化したSuperdex200HiLoad120ml16/60ゲルろ過カラムGEHealthcare、スウェーデン上に装填した。5未満の高分子量凝集体しか含まない精製二重特異性抗体を含有する分画をプールし、そして-80°Cで、1.0mg/mlアリコットとして保存した。精製タンパク質の分析アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280nmの光学密度ODを測定することによって精製タンパク質試料のタンパク質濃度を決定した。還元剤5mM1,4-ジチオスレイトールの存在下および非存在下でのSDS-PAGE、ならびにクーマシーブリリアントブルーでの染色によって、二重特異性抗体および対照抗体の純度および分子量を分析した。製造者の指示にしたがって、NuPAGE登録商標プレキャストゲル系Invitrogen、米国を用いた4~20Tris-グリシンゲル。25°Cで、200mMKH2PO4、250mMKCl、pH7.0中、Superdex200分析用サイズ排除カラムGEHealthcare、スウェーデンを用いた高性能SECによって、二重特異性および対照抗体試料の凝集物含量を分析した。25μgのタンパク質を流速0.5ml/分でカラム上に注入し、そして均一濃度で50分間に渡って溶出させた。安定性分析のため、1mg/mlの濃度の精製タンパク質を4°Cおよび40°Cで7日間インキュベーションし、そして次いで、高性能SECによって評価した。ペプチド-N-グリコシダーゼFRocheMolecularBiochemicalsでの酵素処理によってN-グリカンを除去した後、ナノエレクトロスプレーQ-TOF質量分析によって、還元された二重特異性抗体軽鎖および重鎖のアミノ酸主鎖の完全性integrityを検証した。表面プラズモン共鳴表面プラズモン共鳴技術BIAcore登録商標、GE-Healthcare、スウェーデンウプサラなどの標準的結合アッセイを用いて、25°Cで、結合アフィニティを決定する。アフィニティ測定のため、SPR装置BiacoreT100上の標準的アミンカップリングおよびブロッキング化学によって、CM-5センサーチップの表面に、30μg/mlの抗Fcγ抗体ヤギ由来、JacksonImmunoResearchをカップリングした。コンジュゲート化後、単一または二重特異性Her3/cMet抗体を25°C、流速5μL/分で注入し、その後、30μL/分で、ヒトHER3またはc-MetECDの希釈シリーズ0nM~1000nMを注入した。結合実験のためのランニング緩衝液として、PBS/0.1BSAを用いた。次いで、60sパルスの10mMグリシン-HCl、pH2.0溶液でチップを再生した。EGFR/IGF-1R表面プラズモン共鳴BiacoreT100装置GEHealthcareBiosciencesAB、スウェーデンウプサラを用いて、SPR実験を行った。標準的アミンカップリング化学を用いて、CM5バイオセンサーチップの表面上に、IGF-1RまたはEGFRを固定した。200RUIGF-1Rまたは100RUEGFRを目指す固定化ウィザード法を用いて、1μg/mlで、酢酸ナトリウム、pH5.0中で、IGF-1RまたはEGFRを注入した。参照対照フローセルを同じ方式だがビヒクル緩衝液のみで処理した。抗体を1xPBS、pH7.4、0.05Tween20RocheDiagnosticsGmbH中で希釈し、そして30μl/分の流速で、3.125~50nMの間の増加する濃度で注入した。接触時間会合期は3分間EGFR結合および5分間IGF-1R結合であり、解離時間は10分間EGFRおよび3分間IGF-1Rであった。流速5μl/分で30s、0.85リン酸を注入することでEGFR結合を再生した。5μl/分で1分間、4M塩化マグネシウムを注入することでIGF-1R結合を再生した。Biaevaluationソフトウェア内の1:1ラングミュア結合モデルを用いることによって、動力学速度定数および平衡解離定数を計算した。同時結合を立証するため、二重特異性抗体を、5μl/分の流速で、25nMで1分間、EGFR表面上に注入する。EGFR表面に抗体を捕捉した後、IGF-1Rを、流速30μl/分で、2.5~80nMの間の増加する濃度で注入する。流速5μl/分で30s、0.85リン酸を注入することで、表面を再生する。Biaevaluationソフトウェア内の1:1ラングミュア結合モデルを用いることによって、動力学速度定数および平衡解離定数を計算する。ANG-2結合表面プラズモン共鳴BiacoreBIACORET100装置GEHealthcareBiosciencesAB、スウェーデンウプサラを用いて、表面プラズモン共鳴によって、抗原、例えばヒトANG-2に対する抗体の結合を調べる。簡潔には、アフィニティ測定のため、ヒトANG-2に対する抗体の提示のため、アミンカップリングを通じて、CM5チップ上にヤギ<hIgG-Fcガンマ>ポリクローナル抗体を固定した。HBS緩衝液HBS-P10mMHEPES、150mMNaCl、0.005Tween20、pH7.4中、25°Cで、結合を測定した。精製したANG-2-HisRDSystemsまたは社内精製を、溶液中、6,25nM~200nMの間の多様な濃度で添加した。3分間のANG-2注入によって会合を測定し;チップ表面をHBS緩衝液で3分間洗浄することによって解離を測定し、そして1:1ラングミュア結合モデルを用いてKD値を概算した。ANG-2調製物の不均一性のため、1:1結合はまったく観察不能であり;KD値はしたがって、相対的概算でしかない。系に生得的なベースラインドリフトの補正およびノイズシグナル減少のため、陰性対照データ例えば緩衝液曲線を試料曲線から減じた。BiacoreT100評価ソフトウェア、バージョン1.1.1を、sensorgramの分析のため、そしてアフィニティデータの計算のため、用いた。あるいは、アミンカップリングBSA不含を通じてCM5チップ上に固定したPentaHis抗体PentaHis-Ab、BSA不含、Qiagen第34660号を通じて、Ang-2を2000~1700RU捕捉レベルで捕捉することも可能である以下を参照されたい。VEGF結合表面プラズモン共鳴Biacore以下のプロトコルにしたがって、BiacoreT100装置上での表面プラズモン共鳴技術を用いて、二重特異性<VEGF-Ang-2>抗体のVEGF結合を分析し、そしてT100ソフトウェアパッケージを用いて分析する:簡潔には、ヤギ抗ヒトIgGJIR109-005-098への結合を通じて、CM5-Chip上で<VEGF>抗体を捕捉した。以下のように標準的アミノカップリングを用いて、アミノカップリングによって捕捉抗体を固定した:HBS-N緩衝液はランニング緩衝液として働き、700RUのリガンド密度を目指してEDC/NHSの混合物によって活性化を行った。捕捉抗体をカップリング緩衝液NaAc、pH5.0、c=2μg/mL中で希釈し、最後に、1Mエタノールアミンの注入によって、なお活性化されているカルボキシル基をブロッキングした。流速5μL/分およびcMabs<VEGF>=10nMでMab<VEGF>抗体の捕捉を行い、ランニング緩衝液1mg/mLBSAで希釈し;およそ30RUの捕捉レベルに達しなければならなかった。rhVEGFrhVEGF、RD-Systemsカタログ番号293-VEを分析物として用いた。<VEGF>抗体に対するVEGF結合の動力学的性質決定を、ランニング緩衝液としてのPBS0.005v/vTween20中、37°Cで行った。300~0.29nMの一連の濃度のrhVEGFとともに、試料を、50μL/分の流動ならびに80秒間の会合時間および1200秒間の解離時間で注入した。各分析物サイクル後、10mMグリシンpH1.5および接触時間60秒で、未結合捕捉抗体表面の再生を行った。通常の二重参照法対照参照:捕捉分子ヤギ抗ヒトIgGに対するrhVEGFの結合、測定フローセル上でのブランク、rhVEGF濃度0、モデル:ラングミュア結合1:1捕捉分子結合のため、Rmaxを局所に設定した。HEK293-Tie2細胞株の生成ANG2に刺激されたTie2リン酸化および細胞上のTie2に対するANG2の結合への、アンジオポエチン-2抗体の干渉を決定するため、組換えHEK293-Tie細胞株を生成した。簡潔には、トランスフェクション試薬としてFugeneRocheAppliedScienceを用いて、CMVプロモーターおよびネオマイシン耐性マーカーの調節下で、全長ヒトTie2配列番号108をコードするpcDNA3に基づくプラスミドRB22-pcDNA3TopohTie2をHEK293細胞ATCCにトランスフェクションし、そして耐性細胞をDMEM10FCS、500μg/mlG418中で選択した。クローニングシリンダーを通じて、個々のクローンを単離し、そして続いて、FACSによって、Tie2発現に関して分析した。G418の非存在下であってさえ、高くそして安定なTie2発現を持つクローンとしてクローン22を同定したHEK293-Tie2クローン22。HEK293-Tie2クローン22を、続いて、細胞アッセイ:ANG2誘導性Tie2リン酸化およびANG2細胞性リガンド結合アッセイに用いた。VEGF誘導性HUVEC増殖アッセイVEGF抗体の細胞機能を測定するために、VEGF誘導性HUVECヒト臍帯静脈内皮細胞、PromocellC-12200増殖を選択した。簡潔には、96ウェルあたり5000HUVEC細胞低継代数、≦5継代を、100μl飢餓培地EBM-2内皮基本培地2、PromocellC-22211、0.5FCS、ペニシリン/ストレプトマイシン中、コラーゲンIでコーティングしたBDBiocoatコラーゲンI96ウェルマイクロタイタープレートBD354407/35640中で一晩インキュベーションした。多様な濃度の抗体をrhVEGF30ng/ml最終濃度、BD354107と混合し、そして室温で15分間プレインキュベーションした。続いて、混合物をHUVEC細胞に添加し、そしてこれらを37°Cで72時間、5CO2でインキュベーションした。分析当日、プレートを室温に30分間平衡化させ、そしてマニュアルPromega、G7571/2/3にしたがって、CellTiter-GloTM発光細胞生存度アッセイキットを用いて、細胞生存度/増殖を決定した。分光光度計において、発光を決定した。ANG2誘導性Tie2リン酸化アッセイ以下のアッセイ原理にしたがって、二重特異性<ANG2-VEGF>抗体によるANG2誘導性Tie2リン酸化の阻害を測定した。HEK293-Tie2クローン22を、<ANG2-VEGF>抗体の非存在下または存在下で、ANG2で5分間刺激し、そしてサンドイッチELISAによってP-Tie2を定量化した。簡潔には、100μlDMEM、10FCS、500μg/mlジェネティシン中、ポリ-D-リジンでコーティングした96ウェルマイクロタイタープレート上で、ウェルあたり2x105HEK293-Tie2クローン22細胞を一晩増殖させた。翌日、<ANG2-VEGF>抗体の力価決定列をマイクロタイタープレート中に調製し4倍濃縮、75μl最終体積/ウェル、2つ組、そして75μlのANGPT2RDsystems、623-AN希釈4倍濃縮溶液として3.2μg/mlと混合した。抗体およびANG2を室温で15分間プレインキュベーションした。100μlの混合物をHEK293-Tie2クローン22細胞1mMNaV3O4、SigmaS6508と5分間プレインキュベーションしたに添加し、そして37°Cで5分間インキュベーションした。続いて、ウェルあたり200μlの氷冷PBS1mMNaV3O4で細胞を洗浄し、そして氷上でウェルあたり120μlの溶解緩衝液20mMTris、pH8.0、137mMNaCl、1NP-40、10グリセロール、2mMEDTA、1mMNaV3O4、1mMPMSFおよび10μg/mlアプロチニンを添加することによって溶解した。マイクロタイタープレート振盪装置上、4°Cで30分間細胞を溶解し、そして100μl溶解物を、あらかじめ遠心分離をせず、そして総タンパク質決定をせずに、p-Tie2ELISAマイクロタイタープレートRDSystems、RDDY990内に直接トランスファーした。製造者の指示にしたがって、P-Tie2量を定量化し、そしてExcel用のXLfit4分析プラグイン用量反応一部位、モデル205を用いて阻害に関するIC50値を決定した。細胞力価グローアッセイ細胞力価グローアッセイPromegaを用いて、細胞生存度および増殖を定量化した。製造者の指示にしたがってアッセイを実行した。簡潔には、所望の期間、総体積100μL中、96ウェルプレート中で細胞を培養した。増殖アッセイのため、細胞をインキュベーターから取り出し、そして室温に30分間置いた。100μLの細胞力価グロー試薬を添加し、そしてマルチウェルプレートを軌道振盪装置上に2分間置いた。マイクロプレート読み取り装置Tecan上に15分間置いた後、発光を測定した。実施例1a二重特異性二価<VEGF-ANG-2>抗体分子の発現および精製上記の材料および方法に記載する方法にしたがって、二重特異性二価<VEGF-ANG-2>抗体分子Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06SSおよびAng2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06を発現させ、そして精製した。<VEGF>部分のVHおよびVLは、ベバシズマブに基づく。<ANG2>部分のVHおよびVLは、ANG2i-LC06PCT出願第PCT/EP2009/007182号に記載され、そしてファージディスプレイを通じて得られたのVHおよびVL配列に基づく。これらの二重特異性二価抗体の相当する軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、配列番号9、配列番号10、配列番号11Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06SSに関する、および配列番号9、配列番号10、配列番号12Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06に関するに提供される。Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06SSおよびAng2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06の発現はウェスタンブロットによって確認された。Ang2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06SSおよびAng2-VEGFOA-Ava-N-scFabLC06の精製は、以下の収量を導いた。質量分析:ホモ二量体重鎖二量体はまったく検出されなかった。結合および他の特性を記載するように決定した。実施例1b二重特異性二価<IGF-1R-EGFR>抗体分子の発現および精製表:二重特異性二価<IGF-1R-EGFR>抗体分子の概要上記の材料および方法に記載する方法にしたがって、二重特異性二価<IGF-1R-EGFR>抗体分子、OA-Ak18-scFab-GA201およびOA-GA201-scFab-Ak18を1:1:1プラスミド比で発現し、そして精製した。二重特異性抗体は、<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587;WO2005/005635、<IGF-lR>クローン18または<IGF-1R>AK18と略されるおよびヒト化<EGFR>ICR62WO2006/082515<EGFR>ICR62と略されるの抗原結合部位に基づく。これらの二重特異性二価抗体の相当する軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3OA-Ak18-scFab-GA201に関する、および配列番号5、配列番号6、配列番号7OA-GA201-scFab-Ak18に関するに提供される。OA-Ak18-scFab-GA201およびOA-GA201-scFab-Ak18の発現はウェスタンブロットによって確認された。細胞培養上清のプロテインA精製後、両構築物は、分析用SECによって検出した際、およそ148kDaの予期される分子量を持つ、50~58の間の二重特異性抗体、および分子量100kDaの多量の半抗体を示した。SEC精製後、両構築物は、148kDaの分子量を持つ86~90の均質な単量体、および100kDaの残りの副産物を示した。また、OA-GA201-scFab-Ak18を1:2:1プラスミド比でも発現し、そしてプロテインAおよびSEC精製に供した。1:1:1発現比と比較して、プロテインA後の半抗体の量は、BioanalyzerCaliperanalysisによって検出した際、1:2:1発現レベルでは、30から6に減少した。SEC精製タンパク質の質量分析によって、トランスフェクションに際するプラスミド比の変化により、半重鎖1ヒト化<EGFR>ICR62抗体が効率的に除去されることが確認された。OA-GA201-scFab-Ak18精製収量は、HEK293細胞における発現に際して、1:2:1プラスミド比で40増加した。二重特異性二価<IGF-1R-EGFR>抗体分子OA-GA201-scFab-Ak18_WT適切な軽鎖および重鎖アミノ酸配列が配列番号5、配列番号6、配列番号8に提供されるを、同様に1:1:1および1:2:1プラスミド比で発現し、そして精製した。1:2:1プラスミド比に関する結果:3つのプラスミドのみを用いたOA-scFab構築物は、4つの発現プラスミドを用いて二重特異性分子を生成する、ノブを穴へ技術を用いた類似のヘテロ二量体アプローチに勝る、価値ある副産物プロファイルの利点を有する例えばWO2009/080253を参照されたい。本発明記載の抗体は、誤って対形成した軽鎖または軽鎖を欠く抗体の完全な不在を示すデータ未提示。記載する1:2:1法は、高純度の二重特異性分子および半抗体の明確な減少、ならびに誤って対形成した軽鎖または軽鎖を欠く抗体の完全な非存在を生じることが示されたデータ未提示。結合および他の特性を、記載するように決定した。二重特異性二価<IGF-1R-EGFR>抗体分子、OA-Ak18-scFab-GA201_WT適切な軽鎖および重鎖アミノ酸配列が配列番号1、配列番号2、配列番号4に提供されるOA-Ak18-scFab-GA201_WTに関するを同様に発現し、そして精製してもよい。実施例2両抗原に対する二重特異性抗体の同時結合異なる二重特異性抗体形式の結合を、結合モジュールおよび二重特異性抗体が由来する野生型IgGの結合と比較した。上述のような表面プラズモン共鳴Biacoreを適用することによって、これらの分析を実行した。IGF-1RおよびEGFRに対する二重特異性抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WTの同時結合を検出可能である。装置:BiacoreT100GEHealthcare、T200感受性増進ソフトウェア:T200制御、バージョン1.0ソフトウェア:T200評価、バージョン1.0チップ:CM5-チップアッセイ製造者の指示にしたがった、フローセル1~4上の標準的アミンカップリング:ランニング緩衝液:HBS-N緩衝液、リガンド密度を目指すEDC/NHSの混合物による活性化。EGFRをカップリング緩衝液NaAc、pH4.5、c=15μg/mL中で希釈し;最後に維持された活性化カルボキシル基を1Mエタノールアミンの注入によってブロッキングした。フローセル1上のアミンカップリング化EGFRを、ありうる緩衝液効果または非特異的結合の補正のための参照対照表面として用いた。流速30μL/分、25°Cで、同時結合を測定した。c=10nMの濃度で2分間、二重特異性Abを注入した直後、ヒトまたはカニクイザルcynoIGF1Rの連続注入を行った会合時間:2分間、解離時間:3分間、c=150nM。ランニング緩衝液1mg/mLBSAですべての試料を希釈した。各周期後、15mMNaOH、接触時間1分間、流速30μL/分を用いて再生を行った。陰性対照:IGF1Rの代わりに、陰性対照として希釈緩衝液を注入した。結果二重特異性Ab:OA-GA201-scFab-Ak18_WTは、アミンカップリング化ヒトEGFRおよびヒトIGF1Rに同時結合を示した図9のsensogramを参照されたい。実施例3aANG2-VEGF-MabTie2リン酸化阻害上述のアッセイ原理にしたがって、二重特異性<ANG2-VEGF>抗体によるVEGF誘導性HUVEC増殖の阻害を測定した。結果を図5に示す。実施例3bANG2-VEGF-MabTie2リン酸化阻害上述のアッセイ原理にしたがって、二重特異性<ANG2-VEGF>抗体によるANG2誘導性Tie2リン酸化の阻害を測定した。結果を図6に示す。実施例4二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体によるIGF-1Rの内在化/下方制御ヒト抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587は、IGF-1Rシグナル伝達を阻害し、そしてIGF-1Rの内在化およびそれに続く下方制御を誘導する。二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体の潜在的な阻害活性を評価するため、IGF-1Rの下方制御の度合いを分析した。腫瘍細胞におけるIGF-1受容体IGF-1Rの量に対する本発明の抗体の影響を検出するため、IGF-1RおよびEGFR特異的抗体を用いた経時実験およびそれに続くELISA分析を行った。ヒトH322M腫瘍細胞NCIから得たを96ウェルプレート中1x104細胞/ウェルで、10ウシ胎児血清、2mML-グルタミンおよび1PenStrepを補ったRPMI培地中、37°Cおよび5CO2で一晩培養した。培地を注意深く除去し、そして総体積100μl中、RPMI培地中で希釈した二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体溶液によって置換した。細胞を37°Cおよび5CO2で少なくとも3時間だが24時間を超えずにインキュベーションした。吸引によって培地を注意深く除去し、そして細胞を120μl/ウェルの冷MES溶解緩衝液25mMMESpH6.5、2TritonX-100、60nMオクチルグルコシド、150mMNaCl、10mMNa3VO4、およびComplete登録商標プロテアーゼ阻害剤で溶解した。プレートをさらなる分析まで-20°Cで保存した。IGF-1R検出のためPBS、3BSAおよび0.2Tween登録商標20中、最終濃度2.4μg/mlの1:200希釈の抗体AK1a-ビオチニル化WO2004/087756に記載される<IGF-1R>HUMABクローン1aDSMACC2586、Roche、ドイツを、ストレプトアビジンでコーティングしたMTPRocheID番号:11965891001の各ウェルに添加した。ストレプトアビジンMTPをRTで1時間攪拌し、そして次いで0.1Tween登録商標20を含有するウェルあたり200μlのPBSで3回洗浄した。PBS/Tween溶液を除去した後、100μlの細胞溶解物を抗体でコーティングしたストレプトアビジン-MTPの各ウェルに添加した。次いで、MTPをRTでさらに1時間攪拌しながらインキュベーションし、そして続いて、0.1Tween登録商標20を含有するPBSで3回洗浄した。PBS、3BSAおよび0.2Tween登録商標20中で1:750希釈したIGF-1Rβウサギ抗体200μg/ml、SantaCruzBiotechnology、カタログ番号sc-713を用いて、捕捉抗体AK1aが結合したIGF-1Rを検出した。ウェルあたり100μlを添加し、そして一定の攪拌を伴いながらRTで1時間インキュベーションした。続いて溶液を除去し、そして0.1Tween登録商標20を含有する200μlのPBSでウェルを3回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG-HRPCellSignalingカタログ番号7074を、PBS、3BSAおよび0.2Tween登録商標20の希釈で二次検出抗体として用いた。このうち100μlを各ウェルに添加し、そして攪拌しながらRTで1時間インキュベーションした。次いで、0.1Tween登録商標20を含有するPBSで6回、プレートを洗浄した。ウェルあたり100μlのペルオキシダーゼ基質3,3’-5,5’-テトラメチルベンジジンRoche、BM-BlueID番号:11484581を添加し、そして攪拌しながらRTで20分間インキュベーションした。ウェルあたり25μlの1MH2SO4を添加し、そしてRTでさらに5分間インキュベーションすることによって、発色性colourigenic反応を停止した。450nmで吸光度を測定した。二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WTは、ヒト抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMABクローン18よりも少ない下方制御を誘導する。OA-GA201-scFab-Ak18_WTによる下方制御は、<IGF-1R>HUMABクローン18と比較して>50減少した。実施例5二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体によるEGFRならびにIGF-1Rシグナル伝達経路の阻害ヒト抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587は、IGF-1Rシグナル伝達を阻害し、そしてヒト化ラット抗EGFR抗体ICR62は、EGFRによるシグナル伝達を阻害する。二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体の潜在的な阻害活性を評価するため、両方の経路に向かうシグナル伝達の阻害の度合いを分析した。10ウシ胎児血清、2mML-グルタミンおよび1PenStrepを補充したRPMI培地中、ヒト腫瘍細胞H322M、3x104細胞/ウェルを、96ウェルマイクロタイタープレート中に植え付け、そして37°Cおよび5CO2で一晩培養した。培地を注意深く除去し、そして100μlの血清不含DMEM培地1mg/mlRSA、10mMHepes、1PenStrepを補充によって置換し、そして37°Cおよび5CO2で、少なくとも2.5時間インキュベーションした。培地を再び注意深く除去し、そして総体積50μlで、血清不含DMEM培地中、二重特異性抗体、および対照抗体最終濃度0.01mg/mlの<IGF-1R>HUMABクローン18および<EGFR>ICR62の希釈物によって置換し、その後、37°Cおよび5CO2で、30分間インキュベーションした。50μlIGF-110nMまたはEGF20ng/ml血清不含DMEM培地中で希釈の添加によって、細胞を刺激し、そして37°Cおよび5CO2で10分間インキュベーションした。培地を注意深く除去し、そして100μl/ウェルの氷冷PBSで1回洗浄した。100μl/ウェルBioRad細胞溶解緩衝液BioRad細胞溶解キットBioRadカタログ番号171-304012の添加によって細胞を溶解した。さらに分析するまで、プレートを-20°Cで保存した。500g5分間の遠心分離によって、MultiScreenHTSフィルタープレートを通じて細胞溶解物をろ過することによって、細胞破片を除去した。EGFRリン酸化の分析のため、P-EGFRTyrビーズキットMilliporeカタログ番号46-603を、そしてIGF-1Rリン酸化の分析のため、P-IGF-1RTyr1131ビーズキットBioRadカタログ番号171V27343を用いて、Luminex系でろ過細胞溶解物におけるEGFRおよびIGF-1Rリン酸化を分析した。二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WTは、H322M腫瘍細胞に対して、IGF-1Rのリン酸化IC50:1nM、最大阻害:>70およびEGFRのリン酸化IC50:1nM、最大阻害>90を効率的に阻害した。実施例6二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体による3D培養におけるNCI-H322M腫瘍細胞の増殖阻害ヒト抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587は、IGF-1Rを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害するWO2005/005635。同様の方式で、ヒト化ラット抗EGFR抗体<EGFR>ICR62は、EGFRを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害することが示されてきているWO2006/082515。腫瘍細胞株の増殖アッセイにおいて、二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体の潜在的な阻害活性を評価するため、EGFRならびにIGF-1Rを発現するH322M細胞における阻害の度合いを分析した。10FBSPAA、1mMピルビン酸ナトリウムGibco、ドイツダルムシュタット、非必須アミノ酸Gibcoおよび2mML-グルタミンSigma、ドイツシュタインハイムを補充したRPMI1640培地PAA、オーストリアパッシング中で、H322M肺癌細胞NCIを培養した。25000細胞/ウェルを、培地を含有する96ウェルポリ-HEMAポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレートPolysciences、米国ペンシルバニア州ワーリントンコーティングプレートに植え付けた。同時に、異なる濃度の二重特異性抗体を添加し、そして7日間インキュベーションした。CellTiterGlo登録商標Promega、米国ウィスコンシン州マディソンアッセイを用いて、製造者の指示にしたがって、細胞のATP含量を測定することによって、細胞生存度を検出した。結果を図8に示した。二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WTは、H322M細胞の増殖を用量依存性に阻害する。1000nMの用量で、二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WTは、親単一特異性抗体<IGF-1R>HUMABクローン18または<EGFR>ICR62と比較した際、増殖阻害の改善を示した。実施例7EGFRおよびIGF-1R発現を伴う皮下異種移植片モデルにおける、二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体のinvivo有効性ヒト抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587は、IGF-1Rを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害するWO2005/005635。同様の方式で、ヒト化ラット抗EGFR抗体<EGFR>ICR62は、EGFRを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害することが示されてきているWO2006/082515。invivo腫瘍増殖に対する、二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体の潜在的な阻害活性を評価するため、EGFRならびにIGF-1Rの発現によって特徴付けられる皮下異種移植片モデルBxPC-3を用いた。10ウシ胎児血清SeraPlus;PANTMBiotechGmbHおよび2mML-グルタミンPANTMBiotechGmbHを補充したRPMI1640培地PANTMBiotechGmbH中、ヒト膵臓癌細胞株BxPC-3ATCCから得たの細胞を、5CO2の水飽和大気中、37°Cで培養した。接種当日、培養フラスコからBxPC-3腫瘍細胞を採取し1xトリプシン-EDTA、RocheDiagnostics、そして培地内に移し、遠心分離し、1回洗浄し、そしてPBS中に再懸濁した。細胞を注射するため、最後の力価を1x108細胞/mlに調整した。続いてこの懸濁物100μl1x107細胞に対応するをメスSCIDベージュマウスの右脇腹内に皮下注射した。腫瘍が確立され、そして平均サイズ150~250mm3に到達した後、ビヒクル、<EGFR-IGF1R>抗体および対照抗体<IGF-1R>HUMABクローン18および<EGFR>ICR62での治療を開始した。腫瘍体積を週2回測定し、そして平行して動物体重を監視した。単一治療および単一抗体の組み合わせを、二重特異性抗体での療法と比較した。二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WT20mg/kg;i.p.、毎週1回q7dは、s.c.BxPC3異種移植片モデルにおいて、強い抗腫瘍有効性を示し図10および以下の表を参照されたい、そして単一特異性抗体<IGF-1R>HUMABクローン1810mg/kg;i.p.、毎週1回q7dおよび<EGFR>ICR6210mg/kg;i.p.、毎週1回q7dの組み合わせよりわずかに優れて、腫瘍増殖を阻害した。実施例8二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体の糖操作誘導体の調製リン酸カルシウムトランスフェクションアプローチを用いて、哺乳動物抗体重鎖および軽鎖発現ベクターで、HEK293-EBNA細胞を同時トランスフェクションすることによって、二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体の糖操作誘導体を産生した。指数関数的に増殖しているHEK293-EBNA細胞をリン酸カルシウム法によってトランスフェクションした。非修飾抗体の産生のため、1:1比の抗体重鎖および軽鎖発現ベクターのみで細胞をトランスフェクションした。糖操作抗体の産生のため、細胞を4つのプラスミド、それぞれ4:4:1:1の比の、抗体発現のための2つ、融合GnTIIIポリペプチド発現のための1つ、およびマンノシダーゼII発現のための1つで同時トランスフェクションする。10FCSを補充したDMEM培地を用い、Tフラスコ中、接着単層培養として細胞を増殖させ、そしてこれらが50~80集密confluentである際にトランスフェクションした。T75フラスコのトランスフェクションのため、750~800万細胞を、FCS10V/V最終でを補充したおよそ14mlDMEM培地最終的に250μg/mlネオマイシン中にトランスフェクション24時間前に植え付け、そして5CO2大気のインキュベーター中に、37°Cで一晩、細胞を入れた。トランスフェクションしようとする各T75フラスコに関して、軽鎖および重鎖発現ベクター間で等しく分けた47μg総プラスミドベクターDNA、235μlの1MCaCl2溶液を混合し、そして最終体積469μlまで水を添加することによって、DNA溶液、CaCl2および水を調製した。この溶液に、469μlの50mMHEPES、280mMNaCl、1.5mMNa2HPO4溶液、pH7.05を添加し、直ちに10秒間混合し、そして室温で20秒間静置した。2FCSを補充したおよそ12mlのDMEMで懸濁物を希釈し、そして存在する培地の代わりに、T75に添加した。細胞を37°C、5CO2で約17~20時間インキュベーションし、次いで、培地をおよそ12mlのDMEM、10FCSで置換した。トランスフェクション5~7日後に馴化培地を採取し、210~300gで5分間遠心分離し、0.22μmフィルターを通して滅菌ろ過しあるいは1200rpmで5分間遠心分離した後、4000rpmで10分間、2回目の遠心分離をし、そして4°Cに維持した。プロテインAアフィニティクロマトグラフィー、ならびに緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水に交換し、そして純粋な単量体IgG1抗体を収集するSuperdex200カラムAmershamPharmacia上の最終サイズ排除クロマトグラフィー工程によって、分泌抗体を精製した。280nmでの吸光度から、分光光度計を用いて、抗体濃度を概算する。25mMリン酸カリウム、125mM塩化ナトリウム、100mMグリシン溶液、pH6.7中で抗体を配合する。抗体発現ベクターとともに、GnT-IIIグリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターを、またはGnT-III発現ベクターに加えてゴルジマンノシダーゼII発現ベクターを同時トランスフェクションすることによって、二重特異性抗体の糖操作変異体を産生した。糖操作抗体を精製し、そして非糖操作抗体に関して上述したように配合した。以下に記載するようなMALDI/TOF-MSによって、抗体のFc領域に付着したオリゴ糖を分析して、フコースの量を決定した。PNGアーゼF消化によって抗体からオリゴ糖が酵素的に放出され、抗体はPVDF膜上に固定されるかまたは溶液中にあるかいずれかである。放出されたオリゴ糖を含有する生じた消化溶液を、MALDI/TOF-MS分析用に直接調製するか、またはMALDI/TOF-MS分析用に試料を調製する前に、エンドHグリコシダーゼでさらに消化するかいずれかを行う。すべての本発明記載の二重特異性抗体に関して、GEは糖操作を意味する。実施例9二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体のFcgRIIIaへの結合およびADCC適格性所定の抗体によるADCC仲介の度合いは、結合した抗原だけに依存するのではなく、ADCC反応を誘発するFc受容体として知られるFcgRIIIaに対する定常領域のアフィニティにも応じる。FcgRIIIaに対する二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体の結合分析のため、Biacore技術を適用する。この技術によって、組換え的に産生されたFcgRIIIaドメインに対する二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体の結合を評価する。すべての表面プラズモン共鳴測定を、BIAcore3000装置GEHealthcareBiosciencesAB、スウェーデン上、25°Cで行う。ランニングおよび希釈緩衝液は、PBS1mMKH2PO4、10mMNa2HPO4、137mMNaCl、2.7mMKCl、pH6.0、0.005v/vTween20であった。可溶性ヒトFcgRIIIaを10mM酢酸ナトリウム、pH5.0に希釈し、そして標準的アミンカップリングキットGEHealthcareBiosciencesAB、スウェーデンを用いてCM5バイオセンサー上に固定して、およそ1000RUのFcgRIIIa表面密度を得た。HBS-P10mMHEPES、pH7.4、150mMNaCl、0.005サーファクタントP20;GEHealthcareBiosciencesAB、スウェーデンを固定中のランニング緩衝液として用いる。XGFR二重特異性抗体を、PBS、0.005v/vTween20、pH6.0で450nMの濃度に希釈し、そして流速30μl/分で3分より長く注入する。次いで、PBS、pH8.0、0.005v/vTween20で1分間、センサーチップを再生する。BIAevaluationソフトウェアBIAcore、スウェーデンを用いて、データ分析を行う。FcgRIIIaに対する二重特異性<EGFR-IGF1R>のどのくらいの度合いの結合適格性が、また、腫瘍細胞に対するinvitroADCC活性に相当するtranslatesかを分析するため、細胞アッセイにおいて、ADCC適格性を決定する。これらのアッセイに関して、糖修飾誘導体二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体を調製し上記を参照されたい、そしてBIAcoreADCC適格性アッセイ形式で、そしてまた以下に記載するようなinvitroADCCアッセイで試験する。ヒト末梢血単核細胞PBMCをエフェクター細胞として用い、そして本質的に製造者の指示にしたがって、Histopaque-1077GreinerLeucosep227288を用いて調製した。簡潔には、健康な志願者から、ヘパリン処理シリンジを用いて静脈血を採取する。血液をPBSCaまたはMgを含有しないで1:0.75~1.3に希釈して、そしてHistopaque-1077に上層する。ブレーキを使用せず、室温RTで30分間、800xgで勾配を遠心分離した。PBMCを含有する中間相を収集し、そしてPBS2つの勾配由来の細胞あたり50mlで洗浄し、そして400xgで10分間、RTで遠心分離することによって採取する。ペレットをPBSに再懸濁した後、PBMCを計数し、そして400xgで10分間、RTで遠心分離することによって、2回目の洗浄を行う。次いで、続く方法のため、適切な培地中に、細胞を再懸濁する。ADCCアッセイに用いるエフェクター対ターゲット比は、PBMCに関して25:1である。丸底96ウェルプレートのウェルあたり50μlを添加するため、適切な濃度で、AIM-V培地中、エフェクター細胞を調製する。ターゲット細胞は、10FCSを含有するDMEM中で増殖させたヒトEGFR/IGFR発現細胞例えばH322M、A549、またはMCF-7であった。ターゲット細胞をPBS中で洗浄し、計数し、そして1x10E6細胞/mlに調整する。37°C/5CO2、カルセインAM10μMで細胞を30分間標識する。細胞を標識した後、PBS中で2回洗浄し、そして96ウェル丸底プレート中、50μlAIM-V培地中で、5000細胞/ウェルに植え付ける。抗体をAIM-V中で希釈し、あらかじめプレーティングしたターゲット細胞に、50μlで添加する。次いでエフェクター細胞を添加し、そして5CO2を含有する加湿大気中、37°Cで4時間、プレートをインキュベーションする。インキュベーション期間後、プレートを200gで10分間遠心分離し、そして80μl上清を黒い蛍光プレート/透明な底に移し、そしてTecanInfinite読み取り装置で、蛍光Ex485nm/Em535nmを測定する。以下の対照をアッセイに含める:-バックグラウンド:細胞を標識した後の50μl上清アリコット100μl培地-自然溶解:50μlターゲット細胞懸濁物100μl培地-最大溶解:50μlターゲット細胞懸濁物100μl培地/1.5TritonX-100-抗体を含まない溶解対照:50μlターゲット細胞懸濁物50μl培地50μlPBL抗体依存性細胞傷害性を以下のように計算する:ADCC=x-自然放出/最大溶解-自然溶解x100実施例10二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体の糖構造の分析フコースおよび非フコース無フコース含有オリゴ糖構造の相対的な比を決定するため、MALDI-Tof質量分析によって、精製抗体物質の放出されたグリカンを分析する。このため、タンパク質主鎖からオリゴ糖を放出させるため、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中、5mUN-グリコシダーゼFProzymeGKE-5010Bと、37°Cで一晩、抗体試料約50μgをインキュベーションする。続いて、放出されるグリカン構造を単離し、そしてNuTip-CarbonピペットチップGlygenから得た:NuTip1-10μl、カタログ番号NT1CARを用いて脱塩する。第一の段階として、NuTip-Carbonピペットチップは、3μL1MNaOHでこれらを洗浄し、その後、20μLの純水例えばBaker、4218からのHPLC-勾配等級、3μLの30v/v酢酸および再び20μl純水が続く。このため、それぞれの溶液をNuTip-Carbonピペットチップ中のクロマトグラフィー物質の最上部に装填し、そして圧力を掛けて通すpressedthrough。その後、上述のようなN-グリコシダーゼF消化物を約4~5回、引き上げ、そして引き下ろすことによって、10μg抗体に対応するグリカン構造をNuTip-Carbonピペットチップに結合させる。NuTip-Carbonピペットチップ中の物質に結合したグリカンを上述と同じ方式で20μL純水で洗浄し、そしてそれぞれ0.5μLの10および2.0μLの20アセトニトリルで段階的に溶出させる。この工程のため、溶出溶液を0.5mL反応バイアル中に満たし、そして各々4~5回、引き上げ、そして引き下ろす。MALDI-Tof質量分析による分析のため、両方の溶出物を合わせる。この測定のため、0.4μLの合わせた溶出物を、1.6μLSDHBマトリックス溶液20エタノール/5mMNaCl中に5mg/mlで溶解させた、2,5-ジヒドロキシ安息香酸/2-ヒドロキシ-5-メトキシ安息香酸[BrukerDaltonics209813]とともに、MALDIターゲット上で混合し、そして適切にチューニングしたBrukerUltraflexTOF/TOF装置で分析する。ルーチンには、50~300ショットを記録し、そして単一の実験に合計する。flex分析ソフトウェアBrukerDaltonicsによって、得たスペクトルを評価し、そして検出したピーク各々に関して、質量を決定する。続いて、計算した質量、およびそれぞれの構造例えばそれぞれ、フコースを含むおよび含まない、複合体、ハイブリッド、およびオリゴまたは高分子量マンノースに理論的に予期される質量を比較することによって、ピークをフコースまたは無フコース非フコース含有グリコール構造に割り当てる。ハイブリッド構造の比を決定するため、抗体試料をN-グリコシダーゼFで消化し、そしてエンド-グリコシダーゼHとN-グリコシダーゼFは、併用されると、すべてのN連結グリカン構造複合体、ハイブリッドならびにオリゴおよび高マンノース構造をタンパク質主鎖から放出させ、そしてエンド-グリコシダーゼHは、さらにグリカンの還元端の2つのGlcNAc残基間のすべてのハイブリッド型グリカンを切断する。この消化物を続いて、N-グリコシダーゼF消化試料に関して上述したのと同じ方式で、処理し、そしてMALDI-Tof質量分析によって分析する。N-グリコシダーゼF消化物および併用N-グリコシダーゼF/エンドH消化物のパターンを比較することによって、特定の糖構造のシグナルの減少度合いを用いて、ハイブリッド構造の相対含量を概算する。個々のグリコール構造のピークの高さおよび検出されたすべての糖構造のピークの高さの合計の比から、各糖構造の相対量を計算する。フコース量は、N-グリコシダーゼF処理試料中で同定されるすべての糖構造例えば、それぞれ、複合体、ハイブリッド、ならびにオリゴおよび高マンノース構造に関連するフコース含有構造の割合である。無フコシル化の量は、N-グリコシダーゼF処理試料において同定されるすべての糖構造例えば、それぞれ、複合体、ハイブリッド、ならびにオリゴおよび高マンノース構造に関連するフコース欠如構造の割合である。OA-GA201-scFab-Ak18_WTに関して決定されるフコースの量は、25~40の間であった。実施例11異なるEGFRおよびIGF-1R発現を示す細胞への二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体の結合ヒト抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMABクローン18DSMACC2587は、IGF-1Rを発現している細胞に結合し、そしてヒト化ラット抗EGFR抗体ICR62は、表面上にEGFRを発現する細胞に結合する。EGFRおよびIGF-1Rに対する単一特異性二価抗体と比較して、二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体の結合特性を評価するため、異なるIGF-1R/EGFR発現比を持つ細胞に対して、競合的結合アッセイを行った。氷冷緩衝液PBS2FCS、Gibco中で希釈したヒト腫瘍細胞例えばA549、TC-71、MDA-MB-231、2x105細胞/ウェルを、96ウェルマイクロタイタープレート中、標識単一特異性抗体HUMABクローン18またはヒト化ラット抗EGFR抗体ICR62最終濃度1μg/mlおよび異なる濃度の非標識<EGFR-IGF1R>抗体または非標識単一特異性抗体または対照としてのFab断片の混合物100~0.002μg/mlの最終力価範囲に添加した。150~200μlの緩衝液PBS2FCSを添加することによって細胞を2回洗浄し、そして続いて遠心分離した300g;5分間、4°C。次いで、6.25μl/ml7-AADBD559925を含有する200μlの固定緩衝液1xCellFix、BD340181中に細胞を再懸濁し、そして氷上で10~20分間インキュベーションして、固定および死んだ細胞における7-AADの浸透を可能にした。FACSによって、試料の蛍光シグナルを分析し、そしてIC50値を計算した。<IGF-1R>HUMABクローン18IC50値に対する競合結合分析の結果を表Xに示す。IGF-1RおよびEGFRの両方を発現するA549腫瘍細胞上、二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WTの結合は、<IGF-1R>HUMABクローン18~3xより優れており、そして<IGF-1R>HUMABクローン18Fab断片~30xより優れており、これはおそらく、二重特異性抗体が、IGF-1RおよびEGFRの両方に同時に結合する能力を有するためであるアビディティ効果。IGF-1Rを発現するが、EGFRを発現しないTC-71腫瘍細胞上、<EGFR-IGF1R>抗体OA-GA201-scFab-Ak18_WTの結合は、<IGF-1R>HUMABクローン18Fab断片に匹敵した。この設定では、IGF-1Rのみが発現され、EGFRが発現されず、OA-GA201-scFab-Ak18_WTは、一つの結合アームでIGF-1Rに結合可能であるのみである。二重特異性<EGFR-IGF1R>抗体が、IGF-1RおよびEGFRを発現する細胞に、より強く結合するこの能力を利用して、腫瘍組織に対する優れたターゲティングを達成し、そして単一特異性IGF-1RおよびEGFRターゲティング抗体と比較して、潜在的に、好ましい安全プロファイルおよびPK特性を生じることも可能である。"