"少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子上に結合した1つ以上のリガンドと、該金属粒子上に保持された1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されるアナライト検出プローブであって、2以上の当該プローブがリガンドを介してアナライトと複合体を形成したときに、2以上の金属粒子から生じた局在プラズモン共鳴による電場増強効果が得られる領域内で、FRETが起きる距離内に蛍光体が配置されうるよう、上記蛍光体が上記金属粒子上に保持されていることを特徴とする、アナライト検出プローブ。少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子に結合した1つ以上のリガンドと、該リガンドに結合した1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されることを特徴とする、請求項1に記載のアナライト検出プローブ。少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子に結合した1つ以上のリガンドと、該金属粒子に結合した1つ以上の直鎖状高分子と、該直鎖状高分子に結合した1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されることを特徴とする、請求項1に記載のアナライト検出プローブ。前記金属粒子が金、銀、銅、アルミニウム、白金およびこれら2種以上の合金からなる群より選択された金属からなる粒子である、請求項1~3のいずれかに記載のアナライト検出プローブ。前記金属粒子の体積平均粒径が10~100nmである、請求項1~4のいずれかに記載のアナライト検出プローブ。前記金属粒子の表面が誘電体からなる層で被覆されている、請求項1~5のいずれかに記載のアナライト検出プローブ。前記誘電体からなる層がSiO2からなる層を含む、請求項6に記載のアナライト検出プローブ。前記誘電体からなる層の厚さが1~20nmである、請求項6または7に記載のアナライト検出プローブ。前記リガンドが抗体またはそのFab断片もしくはF2断片である、請求項1~8のいずれかに記載のアナライト検出プローブ。FRETにおけるドナーとなる蛍光体を有する請求項1~9のいずれかに記載のアナライト検出プローブ以下プローブDと称する。と、アクセプターとなる蛍光分子を有する請求項1~9のいずれかに記載のアナライト検出プローブ以下プローブAと称する。とを含有することを特徴とする、アナライト検出試薬。請求項10に記載のアナライト検出試薬に含有されるプローブDおよびプローブAとアナライトとを接触させてそれらの複合体を形成させる工程1と、この複合体に励起光を照射したときに生じる蛍光シグナルを測定する工程2とを含むことを特徴とする、アナライト検出方法。前記工程2が、SPFS用測定装置を用いて、誘電体部材上に形成された金属薄膜の上部の領域に前記複合体が位置する状態で、前記励起光を金属薄膜の裏面から照射することにより行われる、請求項11に記載のアナライト検出方法。少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子に結合した1つ以上のリガンドと、該リガンドに結合した1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されることを特徴とする、アナライト検出プローブ。少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子に結合した1つ以上のリガンドと、該金属粒子に結合した1つ以上の直鎖状高分子と、該直鎖状高分子に結合した1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されることを特徴とする、アナライト検出プローブ。本発明は、迅速かつ簡便にアナライトの分析を行えるという液液系の利点を生かしつつ、従来よりも感度が向上した分析方法およびそれに用いられる検出プローブを提供することを目的とする。本発明者は、局在プラズモン共鳴を生じる2以上の金属粒子に挟まれた領域、すなわち著しい電場増強効果が得られる領域にFRETのドナーおよびアクセプターとなる蛍光体が配置されるよう、上記金属粒子および蛍光体を有する2以上の検出プローブを1つの標的物質に結合させるような測定系を構築すること、たとえば、上記蛍光体をアナライトに結合するリガンドに担持させる、または上記蛍光体を多糖類のような直鎖状高分子に多数担持させることにより、前述のような課題を解決しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は一つの側面において、アナライトを検出するための検出プローブとして、少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子上に結合した1つ以上のリガンドと、該金属粒子上に保持された1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されるアナライト検出プローブであって、2以上の当該プローブがリガンドを介してアナライトと複合体を形成したときに、2以上の金属粒子から生じた局在プラズモン共鳴による電場増強効果が得られる領域内で、FRETが起きる距離内に蛍光体が配置されうるよう、上記蛍光体が上記金属粒子上に保持されていることを特徴とする、アナライト検出プローブを提供する。上記アナライト検出プローブの第1の態様としては、少なくとも、プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子に結合した1つ以上のリガンドと、該リガンドに結合した1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されるものが挙げられる。また、上記アナライト検出プローブの第2の態様としては、少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子に結合した1つ以上のリガンドと、該金属粒子に結合した1つ以上の直鎖状高分子と、該直鎖状高分子に結合した1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されるものが挙げられる。なお、本発明では、検出プローブを使用する蛍光分析の対象となる物質主に生体関連物質をアナライトと称し、またアナライトと特異的に結合する物質をリガンドと称する。前記金属粒子としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金およびこれら2種以上の合金からなる群より選択された金属からなる粒子が好ましい。前記金属粒子の体積平均粒径は10~100nmが好ましい。また、前記金属粒子は、表面が誘電体からなる層で被覆されているものが好ましい。この誘電体からなる層は、たとえばSiO2からなる層を含むものが好ましく、また誘電体層の厚さは1~20nmが好ましい。一方、前記リガンドとしては、たとえば抗体またはそのFab断片もしくはF2断片を用いることができる。上記のような本発明のアナライト検出プローブは、FRETにおけるドナーとなる蛍光体を有するアナライト検出プローブ以下プローブDと称する。と、アクセプターとなる蛍光分子を有するアナライト検出プローブ以下プローブAと称する。とを組み合わせて用いることができる。すなわち、本発明は一つの側面において、上記プローブDとプローブAとを含有することを特徴とする、アナライト検出試薬を提供する。また、本発明は一つの側面において、上記アナライト検出試薬に含有されるプローブDおよびプローブAとアナライトとを接触させてそれらの複合体を形成させる工程1と、この複合体に励起光を照射したときに生じる蛍光シグナルを測定する工程2とを含むことを特徴とする、アナライト検出方法を提供する。前記工程2は、SPFS用測定装置を用いて、誘電体部材上に形成された金属薄膜の上部の領域に前記複合体が位置する状態で、前記励起光を金属薄膜の裏面から照射することにより行われることも好適である。本発明の検出プローブを用いることにより、アナライトが存在するときに発せられる蛍光シグナルは従来よりも極めて高くなる相対的にバックグラウンドノイズが低減されるので、従来の分析よりもアナライトの検出限界値を下げ、ごく微量のアナライトであっても高い精度で定量することができるようになる。しかも、本発明の検出プローブは、FRETを利用しているためB/F分離が不要であり、液々系において迅速かつ簡便に分析を行うことができる。本発明において、リガンドと金属粒子が結合するとは、本来の修飾されていないリガンドが金属粒子と直接反応して結合する場合に限らず、いわゆるリンカー分子、スペーサー分子のように、本来は結合し得ない2つの物質を連結する機能を果たす所定の分子を介してそれらが結合する場合、あるいは金属粒子コアの表面に特定の被覆層シェルが形成されていて、リガンドがその被覆層と結合する被覆層を介して金属粒子に結合する場合などを含むものとし、結合が直接的であるか間接的であるかを問わない。蛍光体とリガンド、直鎖状高分子と金属粒子、または蛍光体と直鎖状高分子が結合することについても同様、結合が直接的であるか間接的であるかを問わない。ただし、直鎖状高分子が金属粒子に結合することについては、直鎖状高分子がリガンドに結合し、そのリガンドが金属粒子に結合する、つまりリガンドを介して直鎖状高分子が間接的に金属粒子に結合する態様は、上記の結合することから除外される。-検出プローブ-本発明の第1態様の検出プローブ1および検出プローブ2は、図1に示す通り、少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子10と、該金属粒子10に結合した1つ以上のリガンド20と、該リガンド20に結合した1つ以上の蛍光体ドナー31またはアクセプター32とを構成要素として含み、さらに金属粒子10表面に形成された誘電体層11を含んでいてもよい。本発明の第2態様の検出プローブ1および検出プローブ2は、図2に示す通り、少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子10と、該金属粒子10に結合した1つ以上のリガンド20と、該金属粒子10に結合した1つ以上の直鎖状高分子30と、該直鎖状高分子30に結合した1つ以上の蛍光体ドナー31またはアクセプター32とを構成要素として含み、さらに金属粒子10表面に形成された誘電体層11を含んでいてもよい。第1態様、第2態様いずれにおいても、このような検出プローブ1および検出プローブ2とアナライト40とが複合体50を形成したときに励起光を照射すると、所定の距離内に近接するドナー31およびアクセプター32の間でFRETが起こる。金属粒子本発明の検出プローブは、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子を構成要素の一つとする。金属の種類は、プラズモン共鳴を生じる粒子を調製できる限り特に限定されるものではないが、金、銀、銅、アルミニウム、白金、またはこれら2種以上の合金が好ましい。また、金属粒子の粒径は、局在プラズモン共鳴が生じる範囲であれば特に限定されるものではなく、当業者が適切に設定することができるが、10~100nmが好ましく、平均粒径がそのような範囲にある金属粒子の集団を利用することが好適である。金属粒子そのコロイド溶液は公知の方法に従って調製することができ、また各種の商品が入手可能である。なお、本発明における金属粒子の平均粒径は体積平均粒径であり、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計などを用いることにより測定することができる。誘電体層本発明の検出プローブの金属粒子は、蛍光体の金属消光を防止するため、表面の一部または全部が誘電体からなる層で被覆されていてもよい。そのような誘電体層を構成する誘電体としては、たとえばSiO2や酸化チタン、合成ポリマーが好適であり、その他の公知の誘電体を用いることもできる。本発明では、誘電体層としてSiO2からなる層を含むことが好ましい。第2態様の検出プローブにおいては、そこに用いられるデキストラン等の直鎖状高分子が誘電体層に相当しうるが、必要に応じてそれ以外の誘電体層たとえばSiO2からなる層をさらに金属表面に設けておいてもよい。表面に誘電体からなる層が形成された金属粒子は公知の方法に従って調製することができる。たとえば、SiO2からなる誘電体層を有する金属粒子は、金属粒子を酸性ケイ酸液に添加するなどの方法により調製することができる。また、デキストラン等からなる誘電体層を金属粒子に形成する場合は、後記直鎖状高分子に記載するような方法を適用することができる。誘電体層たとえばSiO2からなるものの厚さは1~20nmとすることが好ましく、誘電体層の材質に応じて誘電体層を形成する際の反応条件を調整することにより、厚さを上記の範囲内にすることができる。リガンド本発明の検出プローブは、アナライトと複合体を形成するためのリガンドを構成要素の一つとする。リガンドは分析対象とするアナライトに応じて適切なものを選択すればよく、特に限定されるものではない。たとえばアナライトがタンパク質であれば、その特定の構造単位エピトープに結合する抗体免疫グロブリンをリガンドとすることができる。この場合、ドナー蛍光体を有するプローブDの抗体およびアクセプター蛍光体を有するプローブAの抗体としては、ポリクローナル抗体か、互いに異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が用いられる。同一のモノクローナル抗体を用いると、プローブDおよびAが競合し、1分子のタンパク質にこれら両方のプローブが結合できず、FRETが起きなくなるためである。一方、ウイルスやバクテリアなどをアナライトとする場合には、同一種類のエピトープが通常は複数個存在するので、プローブDおよびAのリガンドとして同一のモノクローナル抗体を用いることもできる。また、抗体Fab領域およびFc領域を含む全体ではなく、Fab、F2などの抗原認識部位を有する抗体断片を用いてもよい。リガンドは公知の方法に従って金属粒子またはその表面に形成された被覆層に結合させることができる。たとえば、一端に金属粒子または被覆層に結合する官能基チオール基、シラノール基等を有し、もう一端にリガンドと結合しうる官能基アミノ基、カルボキシル基、水酸基等を有する分子SAM、シランカップリング剤などを用いて、リガンドと金属粒子または被覆層とを結合させることができる。このようなSAM試薬としては、たとえば10-カルボキシ-1-デカンチオール、7-カルボキシ-1-ヘプタンチオール、5-カルボキシ-1-ペンタンチオール、チオセミカルバジド、チオ尿素、チオアセトアミド、チオカルバジドチオカルボヒドラジド、11-アミノ-1-ウンデカンチオール、8-アミノ-1-オクタンチオール、6-アミノ-1-ヘキサンチオールが挙げられる。またシランカップリング剤としては、たとえば2SiCl-m-CO-NHS、2エチルトリメトキシシラン、3グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、3グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、3グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、N23アミノプロピルメチルジメトキシシラン、N23アミノプロピルトリメトキシシラン、N23アミノプロピルトリエトキシシラン、3アミノプロピルトリメトキシシラン、3アミノプロピルトリエトキシシランが挙げられる。上記のような分子を先にリガンドと反応させ、得られたリガンド誘導体を金属粒子に反応させることも、また先に金属粒子と反応させ、そのような分子で表面が修飾された金属粒子にリガンドを反応させることもできる。反応条件を調整することにより、金属粒子に結合するリガンドの数密度を増減させることも可能である。直鎖状高分子本発明の検出プローブは、蛍光体を担持するための直鎖状高分子を構成要素の一つとする。直鎖状高分子としては、金属粒子またはその表面に形成された被覆層と結合させるための官能基と、リガンドと結合させるための通常は複数の反応性官能基とを有する、直鎖状の分岐構造は有していてもよいが、架橋構造を有さない構造の高分子を用いることができる。生体関連物質を対象とする分析は通常水性溶媒中で行われることから、直鎖状高分子は、ヒドロキシル基やカルボキシル基などの親水基を多数有する、水性溶媒との親和性が高い水溶性のものであることが好ましい。そのような直鎖状高分子としては、たとえば、デキストラン、グリコーゲン、デンプンアミロース、アミロペクチン、セルロース、グルカンβ1,3-グルカンなどの多糖類これらはいずれもグルコースの重合体である、またはそれらに水溶性を高めるための官能基カルボキシメチル基等やリガンドを連結させるための部位などを導入した誘導体が挙げられる。特に、分岐構造が少なく冷水への溶解度が高いカルボキシメチルデキストランデキストランのグルコース単位の水酸基の一部がカルボキシメチル基で置換された化合物が好適である。直鎖状高分子の分子量は、結合させる蛍光体の数などを考慮しながら適切な範囲で調整すればよい。たとえばカルボキシメチルデキストランであれば平均分子量が約3000~10万の範囲にあるものが好ましく、通常は分子量1万あたり数個程度の蛍光体を結合させることができる。直鎖状高分子は公知の方法に従って金属粒子またはその表面に形成された被覆層に結合させることができる。たとえば、一端に金属粒子または被覆層に結合する官能基チオール基、シラノール基等を有し、もう一端に直鎖状高分子の還元性末端のアルデヒド基等と結合しうる官能基アミノ基等を有する分子いわゆるシランカップリング剤を用いて、直鎖状高分子と金属粒子または被覆層とを結合させることができる。上記分子を先に直鎖状高分子と反応させ、得られた直鎖状高分子誘導体を金属粒子に反応させることも、また先に金属粒子と反応させ、そのような分子で表面が修飾された金属粒子に直鎖状高分子を反応させることもできる。反応条件を調整することにより、金属粒子に結合する直鎖状高分子の数密度を増減させることも可能である。蛍光体本発明の検出プローブは、アナライトを蛍光標識化するための蛍光体を構成要素の一つとする。上記蛍光体としては、より具体的には、FRETのドナーとなる蛍光体以下単にドナーと称することもある。およびアクセプターとなる蛍光体以下単にアクセプターと称することもある。、つまり一方の蛍光体の蛍光スペクトルがもう一方の蛍光体の励起スペクトルと大きく重複していてドナー/アクセプターとして適切な関係にある蛍光体が用いられる。FRETペアドナー/アクセプターの組み合わせは特に限定されるものではないが、たとえば、以下のようなものが挙げられる:AlexaFluor647/Cy5,HiLyteFluor647/Cy5,フルオレセインイソチオシアネートFITC/テトラメチルローダミンイソチオシアネートTRITC,R-フィコエリトリンRPE/アロフィコシアニンAPC,フルオレセイン/Cy5,Naphthalene14/Dansyl,Dansyl95/FITC,Dansyl14/ODR,εA14/NBD,IAF14/TMR,Pyrene14/Coumarin,FITC14/TMRI,AEDANS14/FITC,IAEDANS14/IAF,IAF14/EIA,CF/TR,Bodipy25/Bodipy,BPE14/Cy5,Terbium96/Rhodamine,Europium94/Cy5,Europium97/APC;蛍光タンパク質ではCFP/YFP,GFP/RFP。また、ユウロピウムEu錯体をドナーとし、アロフィコシアニンをアクセプターとする、LANCETRFRETで用いられている組み合わせも好適である。ユウロピウムEu、テルビウムTb等の希土類の錯体は、一般的に励起波長310~340nm程度と発光波長Eu錯体で615nm付近、Tb錯体で545nm付近との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長いしたがって、時間分解蛍光測定により、様々な短寿命のバックグラウンド蛍光をなくすことができ、高感度な測定が可能である。という特徴がある。上記のような蛍光体としては各種の商品が入手可能であり、励起蛍光スペクトルや金属粒子の吸収スペクトルなどを考慮して、公知の蛍光体のなかから適切なものを選択すればよい。本発明では、2以上の検出プローブがアナライトと複合体を形成したときに、ドナー蛍光体Dおよびアクセプター蛍光体AをFRETが起きる距離内かつ金属粒子に挟まれた電場増強効果が高い領域に効率的に位置させるようにする。そのため、それらの蛍光体は、第1態様では、リガンドと別個に金属粒子に結合されるのではなくリガンドに結合担持され、第2態様では、直鎖状高分子に結合担持される。第1態様において、蛍光体は公知の方法に従って各種のリガンドに結合させることができる。たとえば、リガンドとして抗体タンパク質を用いる場合、それを構成するアミノ酸の側鎖または末端に現れるアミノ基、カルボキシル基、チオール基等を利用することができる。それらの官能基に結合しうる官能基を有する蛍光体またはそのような官能基を導入した蛍光体誘導体を用意し、その蛍光体または蛍光体誘導体とリガンドを所定の方法で反応させることにより、両者を結合することができる。また、炭素数3~20程度のアルキレン基やポリエチレングリコール鎖のような、いわゆるリンカーと呼ばれる分子を介してリガンドと蛍光体を結合させてもよい。さらに、リガンドをビオチン化し、これにアビジンストレプトアビジン等を含むを反応させた後、ビオチン化した蛍光体を反応させることにより、アビジン1分子あたり1~4の蛍光体を結合させることもできる。なお、リガンドは上記のようにして蛍光体を結合させる前にあらかじめ金属粒子に結合させておいてもよく、上記蛍光体を結合させたリガンドを金属粒子に結合させるようにしてもよい。第2態様において、蛍光体は公知の方法に従って直鎖状高分子高分子多糖類に結合させることができる。たとえば、直鎖状高分子が有する水酸基、構成単糖に含まれる1,2-ジオール部分の一部をメタ過ヨウ素酸等で酸化的に開裂して形成したアルデヒド基、その他高分子多糖類に導入された反応性官能基たとえばカルボキシメチルデキストランが有するカルボキシル基を利用することができる。それらの官能基と反応し得る官能基を有する蛍光体、あるいはそのような官能基を導入した蛍光体誘導体を用意し、その蛍光体または蛍光体誘導体と上記直鎖状高分子を所定の方法により反応させることにより、両者を結合することができる。また、炭素数3~20程度のアルキレン基やポリエチレングリコール鎖のような、いわゆるリンカーと呼ばれる分子を介して直鎖状高分子と蛍光体を結合させてもよい。さらに、直鎖状高分子をアビジンストレプトアビジン等を含む化し、蛍光体をビオチン化した後にこれらを反応させることにより、アビジン1分子あたり1~4のビオチン化した蛍光体を結合させることもできる。なお、直鎖状高分子は上記のようにして蛍光体を結合させる前にあらかじめ金属粒子に結合させておいてもよく、上記蛍光体を結合させた直鎖状高分子を金属粒子に結合させるようにしてもよい。反応性官能基や反応条件などを変更することにより、リガンドまたは直鎖状高分子に結合する蛍光体の位置や数を調整することが可能である。FRETは、ドナーおよびアクセプターがおよそ1~10nmの範囲の適切な距離にあるときに高いエネルギー移転効率を達成しうるので、そのような位置にドナーおよびアクセプターが位置する可能性をなるべく高めるように設計することが望ましい。たとえば、抗体または抗体断片をリガンドとする場合、そのFab領域N末端に蛍光体蛍光タンパク質が結合した合成タンパク質を用いてもよい。アナライト検出試薬本発明のアナライト検出試薬は、ドナーとなる蛍光体を有するプローブDとアクセプターとなる蛍光体を有するプローブAの両方を含有する。少なくとも1種のドナー/アクセプターの組み合わせが含有されていればよく、同時に複数のアナライトの分析を行うような用途のために2種以上のドナー/アクセプターの組み合わせが含有されていてもよい。アナライト検出試薬は、すべてのプローブDおよびAを含有する1液型の試薬として調製されていても、プローブDおよびAが分包された2液型または多液型の試薬として調製されていてもよい。このようなアナライト検出試薬は、分析の利便性を向上させるための各種の部材と組み合わせてキット化されていてもよい。たとえば、試料や試薬などの混合液を調製して分析装置に装着するための容器、検量線を作製するためのアナライトを所定の濃度で含有する標準溶液などをキットの構成部材とすることができる。-測定方法-本発明の検出プローブを使用する蛍光分析は、基本的には従来のFRETを利用した蛍光分析と同じような手順によって、すなわちプローブDおよびプローブAをアナライトに接触させてそれらの複合体を形成させる工程1、およびこの複合体に励起光を照射したときに生じる蛍光シグナルを測定する工程2を経ることによって、アナライトを定性的または定量的に検出することができる。工程1においてプローブDおよびプローブAとアナライトとを接触させるためには、通常はプローブDおよびプローブAが溶解した溶液アナライト検出試薬とアナライトが溶解した溶液試料とを混合すればよく、接触ないし混合の態様は特に限定されるものではない。アナライト検出試薬が1液型であれば、通常は試料にその試薬を添加して混合するようにし、またアナライト検出試薬が2液型であれば、通常は試料にそれぞれに溶液を同時または順次添加するようにして混合する。工程2において蛍光を測定する際は、上記のような操作により作製された混合液に、ドナー蛍光体Dの励起波長を含む光以下単に励起光と称する。を照射する。ただし、この励起光は、金属粒子の吸収波長、すなわち局在プラズモン共鳴が発生し電場増強効果が得られる波長をさらに含んでいなければならない。この電場増強効果によって、金属粒子に挟まれた領域における励起波長、ドナー蛍光体Dの蛍光波長、および最終的なアクセプター蛍光体Aの蛍光波長の強度を飛躍的に向上させることが可能となる。励起光は、適切な光源レーザーダイオード、水銀ランプ等から照射すればよく、また必要に応じて波長スペクトルを調整するための適切な部材フィルター、ダイクロックミラー等を透過させたものであってもよい。金属粒子の吸収波長のスペクトル極大波長は、金属粒子の金属種や粒径、金属粒子の表面の修飾状態等によって変動するが、その吸収波長のスペクトル極大波長からやや長波長側にドナーDの励起波長のスペクトル極大波長が存在するような関係となるよう、金属粒子およびドナーDを設計することが適切である。励起光を照射した際に、混合液中でアナライトと検出プローブの複合体が形成されていない場合、偶然近接した蛍光体間を除いてFRETは起きないため、観察される蛍光はほとんどドナーDのみのものである。一方、混合液中でアナライトと検出プローブの複合体が形成された場合、FRETによってドナーDの蛍光が弱まるとともにアクセプターAの蛍光が観察されるようになる。混合の前後に亘って蛍光の波長および強度を測定すれば、そのような変化が起きているかどうかを観察することができる。蛍光は、必要に応じて適切なフィルターを透過させ、適切な検出器を用いて検出すればよい。別途、アナライトの濃度が既知の一または複数の標準試料、および必要に応じてアナライトを含有しない標準試料バックグラウンドノイズ用を用い、上記と同様にして蛍光強度を測定し、その測定結果から検量線を作製すれば、各試料について測定された蛍光強度から、その試料中のアナライトの濃度を定量することができる。工程2は、一般的なFRETを利用した蛍光観察を行うときと同様に、蛍光プレートリーダなどの測定装置を用いて行うことができるが、本発明の一態様として、SPFSSurfacePlasmonfieldenhancedFluorescenceSpectroscopy:表面プラズモン励起増強蛍光分光法用の測定装置を利用して行ってもよい。なお、SPFSの原理および基本的な態様は、たとえば特許第3294605号公報および特開2006-218169号公報などにより公知である。SPFSでは、誘電体部材プリズムまたは透明平面基板の上に形成された金属薄膜に誘電体部材側から全反射減衰ATRが生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が当該金属薄膜に生ずる表面プラズモンと共鳴して数十倍~数百倍に増強される効果を利用して、蛍光体が発する蛍光を測定する。したがって、工程2が、SPFS用測定装置を用いて、誘電体部材上に形成された金属薄膜の上部の領域に前記複合体が位置する状態で、前記照射光を金属薄膜の裏面から照射することにより行われる場合、通常よりも強い励起光エバネッセント波がアナライトと検出プローブの複合体に照射される効果が得られる。また、上記SPFSと組み合わせて利用することのできるLPFSLocalizedsurfacePlasmonfieldenhancedFluorescenceSpectroscopy:局在表面プラズモン励起増強蛍光分光法においても見られる効果であるが、上記金属薄膜の近傍に金属粒子が位置すると、その金属粒子の表面にもプラズモン局在プラズモンが発生し、この局在プラズモンとの共鳴によってもエバネッセント波が増強されるという効果も得られる。このような効果が、励起光が2以上の金属粒子に挟まれた領域において増強される本発明の本来の効果に加わることにより、SPFS用測定装置を用いない態様に比べてより一層高感度で試料中のアナライトの濃度を定量することができる。上記のような態様において用いられるSPFS用測定装置検出システムは、基本的に光源、プリズム、光検出器などを備え、通常はさらに集光レンズ、カットフィルタなどを備えるものであって図3参照、公知のSPFS測定法で用いられている装置を利用することができる。各種の流体を所定の流速、タイミング等で所定の領域に送液するための手段送液ポンプなどや、各種の操作や情報処理を制御するコンピュータなどが上記測定装置に一体化されていてもよい。金属薄膜は、プリズムの水平面に直接形成されていてもよいが、多数のサンプルを分析するための利便性などを考慮すると、プリズムの水平面上に着脱可能な透明平面基板ガラス等の一方の表面に形成されていることが望ましい。なお、便宜上、誘電体部材から金属薄膜に向かう方向を上、その反対の方向を下と称し、また誘電体部材および金属薄膜を含む積層体の金属薄膜の位置する側の面を表、誘電体部材が位置する側の面を裏と称する。そのような、少なくとも透明平面基板と当該透明平面基板の上層に形成された金属薄膜とからなる部材センサ基板と称する。は、通常はさらに、各種の流体を送液したり貯留したりするための流路を形成する部材流路の側壁を形成する厚みを有するシートまたはプレート、天板等と組み合わせて用いられる。これらはしばしば一体化され、チップ状の構造体フローセルと称する。の態様をとる。このフローセルには、流体を導入または排出するための開口が設けられ、たとえばポンプおよびチューブを用いて外部と流体を行き来させる。送液の条件流速、時間、温度、検体や標識リガンドの濃度等は、適宜調整することができる。フローセルセンサ基板の金属薄膜は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強効果が大きい、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも1種の金属からなる合金の形態であってもよいことが好ましく、特に金からなることが好ましい。透明平面基板としてガラス製平面基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。表面プラズモンが発生し易いよう、金、銀、アルミニウム、銅、白金、またはそれらの合金からなる金属薄膜の厚さはそれぞれ5~500nmが好ましく、クロム薄膜の厚さは1~20nmが好ましい。電場増強効果の観点からは、金:20~70nm、銀:20~70nm、アルミニウム:10~50nm、銅:20~70nm、白金:20~70nm、およびそれらの合金:10~70nmがより好ましく、クロム薄膜の厚さは1~3nmがより好ましい。アナライト本発明におけるアナライトは、FRETが起きる距離にリガンドが結合しうるものであれば特に限定されないが、たとえば、腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモン等のタンパク質ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む、ウイルスやバクテリア等の病原微生物などが挙げられる。また、核酸一本鎖または二本鎖の、DNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNAペプチド核酸等を含む、糖質オリゴ糖、多糖類、糖鎖等を含む、脂質などのその他の分子も、必要に応じてビオチン化等の修飾処理をした上で、アナライトとすることが可能である。なお、アナライトを含むまたは含んでいる可能性のある、本発明の検出プローブを使用する蛍光分析に供される物質を検体と称する。たとえば、ヒト、ヒト以外のほ乳類モデル動物、ペット等、その他の動物から採取される血液血清血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液髄液、腹水、胸水等などが検体として挙げられる。分析の際、検体は必要に応じて、各種の溶媒純水、生理食塩水、緩衝液、試薬溶液等と混合して用いてもよい。このような混合物または検体そのもの、あるいは所定の目的のために調製したアナライトを含有する溶液で、本発明のアナライト検出試薬と混合されるものを試料またはサンプルと総称する。[実施例1]本発明の第1態様作製例1:アナライト検出プローブの作製ステップ1金属粒子の準備1金ナノ粒子:粒径50nm金コロイドの調製超純水200mlに、テトラクロロ金III酸四水和物の1水溶液を10ml添加し、80°Cに加熱した。溶液を撹拌しながら、その中にクエン酸の3水溶液を20ml加え、80°Cに加熱したまま更に20分激しく撹拌した。粒径は50nmであった。粒径は体積平均粒径を測定することで求めた。体積平均粒径は動的光散乱式粒子径粒度分布測定装置NanotracUPAEX150日機装株式会社にて測定を行った。以下金属ナノ粒子の粒径は同様の手法にて測定を行った。2金ナノ粒子:粒径1.4nm金コロイド粒径1.4nmの金ナノ粒子はフナコシ株式会社より購入し入手した。商品名はNanogoldParticlesφ14nmである。3合金ナノ粒子:粒径10nm合金コロイドの調製Au-Ag合金コロイドAu:Ag50:50重量比は、Au源としてNa3Au2水溶液、Ag源としてAgNO3水溶液を所定量混合して総金属固形分として0.03wtになる水溶液を作成し、さらにクエン酸3ナトリウム2水和物を金属成分に対して等モル量添加溶解して原料水溶液とした。この原料水溶液を40°Cに加温した後、NaBH4を原料水溶液の金属成分に対して0.5モル量溶解した水溶液を5分で滴下させ、還元反応を行った。得られたコロイドは10nm程度の平均粒径を有しほぼ均一な粒径分布を示すことを確認した。ステップ2SAM被覆金属粒子の調製ステップ1の1~3により準備した金属粒子を10carboxy1decanethiolの2μMエタノール溶液に浸し、表面が10carboxy1decanethiolからなるSAMで被覆された金属粒子を調製した。ステップ3シリカ被覆金属粒子の調製前記ステップ1の1または3により準備した金属粒子の分散液100gを採取し、これに濃度1重量のNaOH水溶液を添加して分散液のpHを10.5に調整し、95°Cに昇温し30分間加熱した。その後、SiO2濃度3重量の酸性珪酸液1.3gを15分間で添加して、シリカ被覆金ナノ粒子分散液を調製した。この分散液から粒子を分離した後、120°Cで1時間乾燥してシリカ被覆金ナノ粒子を調製した。シリカ層の厚みは3nm程度であった。そして、上記シリカ被覆金ナノ粒子の懸濁液にシランカップリング剤2SiCl-m-CO-NHS式中、NHSはNHydroxysulfosuccinimideを表す。アルテック株式会社を添加することで、表面にNHSエステルを有するシリカ被覆金ナノ粒子を調製した。ステップ4蛍光標識抗体の調製表1に示す蛍光標識抗体を蛍光物質ラベリングキットを利用して作製した。たとえば、標識抗体1はantiαfetoprotein1D5IgG1κ抗体にCy5を、標識抗体4はantiαfetoprotein6D2IgG2aκ抗体にAlexaFluor647を、それぞれキット付属のプロトコールにしたがって標識を行ったCyDyeAntibodyLabellingKits。その他の標識抗体についても同様に、1D5または6D2に各々のキット付属のプロトコールにしたがって標識を行った。なお、標識抗体4/1AlexaFluor647/Cy5、標識抗体5/2FITC/TRITC、標識抗体6/3RPE/APCは、それぞれFRETペアドナー/アクセプターを形成する。ステップ5SAM被覆金属粒子への蛍光標識抗体の固定NHydroxysulfosuccinimideNHS:同仁化学研究所社製および1Ethyl33dimethylaminopropylcarbodiimidehydrochlorideEDC:同仁化学研究所社製それぞれを50mgmLの濃度で25mMMESbufferに溶解した。得られたNHS溶液およびEDC溶液をミックスした溶液に、ステップ2で調製したSAMで被覆された金属粒子を添加し、粒子表面をスクシンイミド基で修飾した。そして、ステップ4で調製した蛍光標識抗体を加え、室温で30分間インキュベートし、金属粒子表面のスクシンイミド基とantiαfetoprotein抗体のアミノ基を反応させることにより、蛍光標識抗体を金属粒子表面に固定化した。金属粒子表面の未反応のスクシンイミド基は、trisaminomethaneを添加して脱離させた。このようにして表2に示すアナライト検出プローブ1~8,11,12を作製した。ステップ6シリカ被覆金属粒子への蛍光標識抗体の固定ステップ3で調製したすでに表面がスクシンイミド基で修飾されているシリカ被覆金属粒子に対しては、その分散液にステップ4で調製した蛍光標識抗体を加え、室温で30分間インキュベートし、金属粒子表面のスクシンイミド基NHSエステルとantiαfetoprotein抗体のアミノ基を反応させることにより、蛍光標識抗体を金属粒子表面に固定化した。金属粒子表面の未反応のスクシンイミド基は、trisaminomethaneを添加して脱離させた。このようにして表2に示すアナライト検出プローブ9,10,13,14を作製した。測定例1まず、作製例1で作製したantiαfetoprotein抗体を固定化した検出プローブ2種類:6D21D5を固定化したもの、実験によっては1種類を溶液中に分散させた。そこに、antiαfetoprotein抗体の抗原となるαfetoproteinAFPを含む溶液を添加した図3参照。抗原を添加する前0minの状態を初期値とし、また抗原を添加してから10分後10minおよび20分後20minの蛍光量を計測した。10minおよび20minのシグナルそれぞれを0minのシグナルで割った値を検出プローブの性能S/N値として算出し、検出プローブの性能を評価した。本測定例で用いた検出装置蛍光プレートリーダはフルオロスキャンアセントThermoFisherScientificIncアメリカである。また、この検出装置に装着したフィルターは、励起用フィルター:584nm、測定用フィルター:612nmであり、これに装着した。結果を表3に示す。表3の実験No1-1,1-2の結果から、1種類の検出プローブを使用しただけではほとんどシグナルが得られないことを確認した。実験No1-3の結果から、直径14nmの金ナノ粒子を用いた場合、金微粒子表面にてプラズモンが発生しないため電場増強効果が得られず、ごく小さなシグナルしか得られないことを確認した。一方、実験No1-4,1-5,1-6の結果から、FRETペアである2種類の検出プローブを使用した場合、抗原添加とともにシグナルが徐々に上昇し抗原添加していない状態に比べ有意に高いシグナル値を得られることが確認できた。また、3種類のFRETペアを利用しそれぞれシグナル値は異なるがどれも十分なSN比が得られていることを確認した。実験No1-7の結果から、金ナノ粒子表面に誘電体層SiO2で被覆した微粒子では電場増強効果が高いためか最も良いSN比が得られることを確認した。実験No1-8の結果から、金と銀の合金を利用した場合も十分なSN比が得られていることを確認した。また、プローブAおよびDともに合金が誘電体層SiO2で被覆されている実験No1-9では、実験No1-8より高いSN比が得られた。プローブAまたはDの一方のみが誘電体層SiO2で被覆されている実験No1-10,1-11はいずれも、両方のプローブが誘電体層SiO2で被覆されている実験No1-7と同等とまではいかないが、十分なSN比が得られることを確認した。測定例2まず、作製例1で作製したantiαfetoprotein抗体を固定化した検出プローブ2種類:6D21D5を固定化したもの、実験によっては1種類を溶液中に分散させた。そこに、antiαfetoprotein抗体の抗原となるαfetoproteinAFPを含む溶液を添加した。添加後ただちに図4に示すSPFS用測定装置検出システムのフローセルに送液し、フローセルが溶液で十分満たされたら送液を停止した。その後、励起光を金膜下部より照射して金膜表面にプラズモンによる強力な電場が発生させ、励起された蛍光量を経時的に測定した。結果を表4に示す。蛍光プレートリーダフルオロスキャンアセントを用いた前記測定例1と同様の傾向が見られるが、検出装置の金薄膜による表面プラズモンの効果により測定例1よりもSN比が向上していることを確認した。さらに、金ナノ粒子表面に誘電体層を持った検出プローブが最も性能が高いことが確認できた。[実施例2]本発明の第2態様作製例2:アナライト検出プローブの作製ステップ1金属粒子の準備1金ナノ粒子:粒径50nm金コロイドの調製超純水200mlに、テトラクロロ金III酸四水和物の1水溶液を10ml添加し、80°Cに加熱した。溶液を撹拌しながら、その中にクエン酸の3水溶液を20ml加え、80°Cに加熱したまま更に20分激しく撹拌した。粒径は50nmであった。2金ナノ粒子:粒径1.4nm金コロイド粒径1.4nmの金ナノ粒子はフナコシ株式会社より購入し入手した。商品名はNanogoldParticlesφ14nmである。3合金ナノ粒子:粒径10nm合金コロイドの調製Au-Ag合金コロイドAu:Ag50:50重量比は、Au源としてNa3Au2水溶液、Ag源としてAgNO3水溶液を所定量混合して総金属固形分として0.03wtになる水溶液を作成し、さらにクエン酸3ナトリウム2水和物を金属成分に対して等モル量添加溶解して原料水溶液とした。この原料水溶液を40°Cに加温した後、NaBH4を原料水溶液の金属成分に対して0.5モル量溶解した水溶液を5分で滴下させ、還元反応を行った。得られたコロイドは10nm程度の平均粒径を有しほぼ均一な粒径分布を示すことを確認した。ステップ2蛍光標識デキストランの調製NHydroxysulfosuccinimideNHS:同仁化学研究所社製および1Ethyl33dimethylaminopropylcarbodiimidehydrochlorideEDC:同仁化学研究所社製それぞれを115mgmL192mgmLの濃度でMilliQ水に溶解した。得られたNHS溶液およびEDC溶液をミックスした溶液とカルボキシルメチルデキストラン分子量500000Daをそれぞれ5μLずつとり混合した。さらに300μLのPBSで希釈した後、蛍光体Cy5またはAlexaFluor647を添加した。室温で30分間インキュベートし標識反応を行い、つづけて限外ろ過により蛍光標識デキストランを精製した。なお、AlexaFluor647/Cy5はFRETペアドナー/アクセプターを形成する。ステップ3抗体への有機硫黄分子の導入NHydroxysulfosuccinimideNHS:同仁化学研究所社製および1Ethyl33dimethylaminopropylcarbodiimidehydrochlorideEDC:同仁化学研究所社製それぞれを50mgmLの濃度で25mMMESbufferに溶解した。得られたNHS溶液およびEDC溶液をミックスした溶液に10-カルボキシ-1-デカンチオールを添加し、続いて、antiαfetoprotein抗体1D5IgG1κ抗体または6D2IgG2aκ抗体を加え、室温でインキュベートした。その後、未反応のカルボキシデカンチオールを限外ろ過により除去し、抗体-カルボキシデカンチオール複合体を精製した。ステップ4蛍光標識デキストランへの有機硫黄分子の導入ステップ2で調製された蛍光デキストランへの有機硫黄分分子の導入は、還元的アミノ化反応を応用した。アルデヒドまたはケトンを第一級アミン第二級アミンとともにヒドリド還元剤の存在下反応させると、還元的アミノ化が起こり、対応するアミンが得られる。還元剤としてSodiumcyanoborohydrideを用いる条件で反応を行い、蛍光デキストランの還元末端と11-アミノ-1-ウンデカンチオールのアミノ基との間にアミンを形成させた。生成物を精製後、凍結乾燥により得た白色粉末を得た。ステップ5金属粒子への抗体および蛍光標識デキストランの固定ステップ3で調製された抗体-有機硫黄分子およびステップ4で調製された蛍光デキストラン-有機硫黄分子をそれぞれ終濃度1μMで混合し、ステップ1で準備した金ナノ粒子1~3を添加することで、抗体および蛍光デキストランを適度な密度で固定化したナノ粒子の形成を行った。このようにして表5に示すアナライト検出プローブ15~20を作製した。測定例3まず、作製例2で作製したantiαfetoprotein抗体を固定化した検出プローブ2種類:6D21D5を固定化したもの、実験によっては1種類を溶液中に分散させた。そこに、antiαfetoprotein抗体の抗原となるαfetoproteinAFPを含む溶液を添加した図3参照。抗原を添加する前0minの状態を初期値とし、また抗原を添加してから10分後10minおよび20分後20minの蛍光量を計測した。10minおよび20minのシグナルそれぞれを0minのシグナルで割った値を検出プローブの性能S/N値として算出し、検出プローブの性能を評価した。本測定例で用いた検出装置蛍光プレートリーダはフルオロスキャンアセントThermoFisherScientificIncアメリカである。また、この検出装置に装着したフィルターは、励起用フィルター:584nm、測定用フィルター:612nmであり、これに装着した。結果を表6に示す。実験No3-1,3-2の結果から、1種類の検出プローブを使用しただけではほとんどシグナルが得られないことを確認した。実験No3-3の結果から、直径14nmの金ナノ粒子を用いた場合、金微粒子表面にてプラズモンが発生しないため電場増強効果が得られず、ごく小さなシグナルしか得られないことを確認した。一方、実験No3-4の結果から、FRETペアである2種類の検出プローブを使用した場合、抗原添加とともにシグナルが徐々に上昇し抗原添加していない状態に比べ有意に高いシグナル値を得られることを確認した。実験No3-5の結果から、金と銀の合金を利用した場合も十分なSN比が得られていることを確認した。なお、実験No3-4シグナルの値およびSN比の方が、同様の蛍光体ドナーおよびアクセプターを用いた前記実施例1の実験No1-4よりも有意に高い。すなわち、この対比において、蛍光標識抗体を用いた第1態様のプローブに比べ、蛍光標識デキストランを用いた第2態様のプローブの方が、より高いシグナル値およびSN比が得られるために好ましいことが示された。測定例4まず、作製例2で作製したantiαfetoprotein抗体を固定化した検出プローブ2種類:6D21D5を固定化したもの、実験によっては1種類を溶液中に分散させた。そこに、antiαfetoprotein抗体の抗原となるαfetoproteinAFPを含む溶液を添加した。添加後ただちに図4に示すSPFS用測定装置検出システムのフローセルに送液し、フローセルが溶液で十分満たされたら送液を停止した。その後、励起光を金膜下部より照射して金膜表面にプラズモンによる強力な電場が発生させ、励起された蛍光量を経時的に測定した。結果を表7に示す。蛍光プレートリーダフルオロスキャンアセントを用いた前記測定例3と同様の傾向が見られるが、検出装置の金薄膜による表面プラズモンの効果により測定例3よりもSN比が向上していることを確認した。"