標的核酸を以下を含む反応混合物と反応させる工程を含む、標的核酸の等温増幅のための方法:aヘリカーゼ活性を有する第1の酵素;ならびにb以下を有する第2の酵素:i逆転写酵素活性;およびiiDNA依存性DNAポリメラーゼ活性。標的核酸が、dsDNA、dsRNA、ssDNA、またはssRNAからなる群より選択される、請求項1記載の方法。逆転写酵素活性を有する第2の酵素がPYROPHAGE3173である、請求項1または2記載の方法。標的核酸がHPV核酸である、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。反応混合物が、標的特異的核酸プライマーをさらに含む、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。反応混合物がランダムプライマーを含む、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。反応混合物がトポイソメラーゼまたはジャイレースをさらに含む、請求項1~6のいずれか一項記載の方法。標的核酸が標的RNAであり、かつ前記第2の酵素が、逆転写反応を含む方法により標的RNAを標的DNAに変換する、請求項1~7のいずれか一項記載の方法。第2の酵素が標的DNAを増幅する増幅反応をさらに含む、請求項8記載の方法。反応混合物が以下を含む、請求項1~9のいずれか一項記載の方法:aKCl;bトリスHCl;cMgSO4;dNaCl;edNTP;fdATP;およびgプライマーセット。前記プライマーセットが、標的特異的核酸プライマーセットおよびランダムプライマーセットからなる群より選択される、請求項10記載の方法。前記プライマーセットが、SEQIDNO2からSEQIDNO7からなる群より選択されるプライマーを含む、請求項1~11のいずれか一項記載の方法。試料から標的核酸を単離する工程をさらに含む、請求項1~12のいずれか一項記載の方法。標的核酸が、以下を含む方法により試料から単離される、請求項13記載の方法:a標的核酸を含むDNARNAハイブリッドを生成する工程;bDNARNAハイブリッドを固相に結合させる工程;およびc固相に結合したDNARNAハイブリッドを試料から分離する工程。DNARNAハイブリッドが抗DNARNA抗体に結合する、請求項14記載の方法。抗DNARNA抗体が固相に結合するか、または固相に結合するよう適合される、請求項15記載の方法。標的核酸を増幅する前に、標的核酸が試料から精製される、請求項13記載の方法。標的核酸を増幅した後に、標的核酸が試料から精製される、請求項13記載の方法。以下を含むキット:aヘリカーゼ活性を有する第1の酵素;ならびにb以下を有する第2の酵素:i逆転写酵素活性;およびiiDNA依存性DNAポリメラーゼ活性。以下からなる群より選択される少なくとも1つの構成成分をさらに含み、各構成成分が任意で保存溶液の構成成分となる、請求項19記載のキット:aKCl;bトリスHCl;cMgSO4;dNaCl;edNTP;fdATP;gジャイレース;hトポイソメラーゼ;iプライマーセットj核酸プローブ;k抗DNARNAハイブリッド抗体;およびl固相。核酸プローブ、抗DNARNAハイブリッド抗体、および固相を含み、以下のいずれかである、請求項19または20記載のキット:a抗DNARNA抗体が、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される;またはb核酸プローブが、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される。KClおよびトリスHClを含む保存アニーリングバッファーを含む、請求項19~21のいずれか一項記載のキット。前記アニーリングバッファーが、10mMKClおよび20mMトリスHClの最終濃度に希釈可能であるように製剤化される、請求項22記載のキット。第2の酵素がPYROPHAGE3173である、請求項19~23のいずれか一項記載のキット。以下を含む混合物:a標的核酸;bヘリカーゼ活性を有する第1の酵素;ならびにc以下を有する第2の酵素:i逆転写酵素活性;およびiiDNA依存性DNAポリメラーゼ活性。以下からなる群より選択される少なくとも1つの構成成分をさらに含む、請求項25記載の混合物:aKCl;bトリスHCl;cMgSO4;dNaCl;edNTP;fdATP;gジャイレース;hトポイソメラーゼ;iプライマーセットj核酸プローブ;k抗DNARNAハイブリッド抗体;およびl固相。核酸プローブ、抗DNARNAハイブリッド抗体、および固相を含み、以下のいずれかである、請求項25または26記載の混合物:a抗DNARNA抗体が、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される;またはb核酸プローブが、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される。水性溶液中に以下の構成成分を含む、請求項25~27のいずれか一項記載の混合物:a10mMKCl;b20mMトリスHCl;c4mMMgSO4;d40mMNaCl;e04mMdNTP;f3mMdATP。第2の酵素がPYROPHAGE3173である、請求項25~28のいずれか一項記載の混合物。請求項1~18のいずれか一項記載の方法により得られる増幅核酸。詳細な説明1つの局面において、標的核酸の増幅は、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素により達成される。二重活性を有するこの酵素は、DNA依存性DNAポリメラーゼおよび/または逆転写酵素を用いる代わりに、またはそれに追加して用いられる。本明細書で用いられる核酸は、二本鎖dsまたは一本鎖ssのDNA分子、RNA分子またはDNARNAハイブリッドを指す。二本鎖核酸分子は、ニックが入ってもよく、またはインタクトであってもよい。二本鎖または一本鎖の核酸分子は、線状または環状であってもよい。二重鎖は、平滑断片にされてもよく、または一本鎖の末端部を有してもよい。一本鎖分子は、ヘアピンまたはループおよびステムの形態の二次構造を有してもよい。核酸は、環境、食物、農業、発酵、血液、ミルク、脳脊髄液、痰、唾液、便、肺吸引液、粘膜組織のぬぐい液もしくは組織試料などの生体液、または細胞を含む、様々な供給源から単離されてもよい。核酸試料は、細胞、細菌またはウイルスから得られてもよく、以下のいずれかを含んでもよい:染色体DNA、プラスミドDNAを含む染色体外DNA、組換えDNA、DNA断片、メッセンジャーRNA、転移RNA、リボソームRNA、二本鎖RNAまたは細胞、細菌もしくはウイルスで生じる他のRNA。核酸は、化学合成の手段によりインビトロで単離、クローン化または合成されてもよい。任意の上記核酸は、核酸内の個別の核酸を例えばメチル化により化学的に変化させる修飾に供してもよい。修飾は、自然にまたはインビトロでの合成により生じてもよい。用語二重鎖duplexは、全体的にまたは部分的に二本鎖である核酸分子を指す。本明細書で用いられる用語標的核酸は、増幅させることを意図する任意の核酸配列を指す。増幅させるべき標的核酸分子の大きさは、例えば、100を上回り5000bpまでの範囲を含む約50bpから約100kbの範囲であってもよい。標的核酸は、より長い二本鎖または一本鎖の核酸内に含まれてもよい。あるいは、標的核酸は、二本鎖または一本鎖の核酸全体であってもよい。1つの態様において、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素はPYROPHAGE3173である。PYROPHAGE3173は、その内容が全体として組み入れられる、USPatentApplicationPublicationNo20080268498として公開されたUSPatentApplicationNo12089221に記載されている。PYROPHAGE3173は、LUCIGENCorporationから入手可能であり、忠実度が高い増幅をもたらす、固有の3→5エキソヌクレアーゼ校正活性を有する耐熱性バクテリオファージ酵素である。この活性のため、ホスホロチオエートプライマーを使用し、増幅前に標的核酸鋳型およびプライマーへの曝露を最小とすることが好ましい可能性がある。あるいは、3→5エキソヌクレアーゼ活性が不活性化されているPYROPHAGE3173Exo変異体変異体バージョンが用いられてもよい。PYROPHAGE3173はまた、二本鎖DNAによるDNA合成を可能にする鎖置換活性も有する。それはニックでも効率的に開始され、したがってDNA合成はプライマーによりまたは部位特異的ニッキング酵素により導入されるニックで開始されうる。PYROPHAGE3173はまた、逆転写活性も有し、よってRNA鋳型に対して単一チューブ、単一酵素逆転写PCRを行うことができる。この二重活性のために、PYROPHAGE3173は、RTHDAで逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼの代わりとして用いられてもよい。さらに、PYROPHAGE3173酵素の高い熱安定性は、より高いRNA増幅率を可能にする可能性がある。1つの態様において、標的核酸は等温増幅を用いて増幅される。等温増幅は、単一の温度で行われる増幅を指す。これは、増幅手法と同じ温度またはより高い温度で実行される可能性がある、増幅の開始時の1回の短い時間15分未満を含まない。1つの態様において、等温増幅法はRTHDAである。典型的には、RTHDAでは3種類の酵素が用いられる:逆転写酵素、ヘリカーゼ、およびDNA依存性DNAポリメラーゼ。逆転写酵素RNA依存性DNAポリメラーゼとしても公知であるは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸dNTPを重合することにより一本鎖RNAssRNAを相補的一本鎖DNAcDNAへと転写するDNAポリメラーゼ活性を有する酵素である。同様のpyrophage酵素もまたdsDNAを形成するcDNAの第2の鎖を重合する可能性がある。これは、ssRNAからdsDNAを合成する従来工程における2種類の酵素逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼの使用を否定する。ヘリカーゼは、dsDNAの上鎖topstrandおよび下鎖bottomstrandのプライマー依存性DNA重合の繰り返し増幅のためにdsDNAを巻き戻す酵素活性を有する。次いで、DNA依存性DNAポリメラーゼは、dNTPを重合することによりcDNAを相補的一本鎖DNAに転写する。この工程は、指数関数的増幅がサーモサイクリングの必要無しに単一の温度で達成できるように繰り返される。1つの態様において、RTHDAは、単一の酵素を用いて行われ、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方が提供される。本明細書で用いられるHDAは、二本鎖核酸を巻き戻すためにヘリカーゼ調製物を用いて増幅用の鋳型を生成することにより核酸を増幅するためのインビトロでの方法である、ヘリカーゼ依存性増幅HelicaseDependentAmplificationを指す。本明細書で用いられるヘリカーゼまたはヘリカーゼ活性を伴うまたは有する酵素は、二本鎖核酸を巻き戻すことができる任意の酵素を指す。例えば、ヘリカーゼは、全ての生物体、および複製、組換え、修復、転写、翻訳およびRNAスプライシングなどの核酸に関係する全てのプロセスで見いだされる酵素である。DNAまたはRNAに沿って5→3方向または逆の3→5方向に移動する任意のヘリカーゼが用いられてもよい。これは、原核生物、ウイルス、古細菌、および真核生物から得られたヘリカーゼ、または天然に存在する酵素の組換え型、ならびに特定の活性を有する類似体または誘導体を含む。天然に存在するDNAヘリカーゼの例は、大腸菌EcoliヘリカーゼI、II、III、およびIV、Rep、DnaB、PriA、PcrA、T4Gp41ヘリカーゼ、T4Ddaヘリカーゼ、T7Gp4ヘリカーゼ、SV40ラージT抗原、酵母RADを含む。有用である可能性があるさらなるヘリカーゼは、RecQヘリカーゼ、TテングコンジェンシスTtengcongensisおよびTサーモフィルスTthermophilus由来の耐熱性UvrDヘリカーゼ、TアクアチクスTaquaticus由来の耐熱性DnaBヘリカーゼ、および古細菌および真核生物由来のMCMヘリカーゼを含む。別の態様において、ヘリカーゼは、耐熱性のヘリカーゼである。核酸二重鎖の変性は、例えば45°Cから75°Cの範囲の高温を含むインキュベーション条件下で耐熱性ヘリカーゼ調製物を用いることにより促進することができる。耐熱性ヘリカーゼ調製物および耐熱性ポリメラーゼを用いて高温でHDAを行うことは、増幅の特異性を改善することができる、プライマー結合の特異性を増加させる可能性がある。さらなる態様において、複数の異なるヘリカーゼ酵素が増幅反応に用いられる。複数のヘリカーゼの使用は、異なるヘリカーゼが種々の機能を連携して働かせ二重鎖核酸の巻き戻しの効率を高める特定の条件下で、HDAにおける標的増幅の収率および長さを向上させる可能性がある。例えば、処理能力は低いが平滑末端DNAを融解できるヘリカーゼは、優れた処理能力を有しているが巻き戻しの開始のために二重鎖領域の境界で一本鎖末端部を認識する第2のヘリカーゼと併用されてもよい。この例では、第1のヘリカーゼが最初に、長い核酸二重鎖の平滑末端を分離し5および3一本鎖末端部を生じさせ、次いでその限定された処理能力のためにその基質から解離する。続いて、この部分的に巻き戻された基質は、第2のヘリカーゼにより認識され、次いでその第2のヘリカーゼは非常に優れた処理能力によって巻き戻しプロセスを続ける。このようにして、核酸二重鎖中の長い標的は、複数のヘリカーゼを含むヘリカーゼ調製物の使用により巻き戻され、続いてHDA反応で増幅されてもよい。さらなる態様において、アクセサリータンパク質が反応混合物に含まれる。アクセサリータンパク質は、ヘリカーゼ活性を刺激する能力を有する任意のタンパク質を指す。例えば、大腸菌MutLタンパク質は、UvrDヘリカーゼ活性を高めるためのアクセサリータンパク質である。アクセサリータンパク質は、選択されるヘリカーゼによって有用である。しかしながら、核酸の巻き戻しは、アクセサリータンパク質の非存在下でヘリカーゼにより達成されてもよい。別の態様において、少なくとも1つの一本鎖結合タンパク質SSB反応混合物に含まれる。中温性のヘリカーゼは、SSBの存在下で活性の改善を示す。このような状況では、BBSの選択は概して、特定のタンパク質に限定されない。一本鎖結合タンパク質の例は、T4遺伝子32タンパク質、大腸菌SSB、T7gp25SSB、ファージphi29SSBおよびこれらのタンパク質の切断型である。よって、ある態様において、1つまたは複数のSSBが増幅反応に加えられてもよい。さらに別の態様において、少なくとも1つのコファクターが提供される。コファクターは、ヘリカーゼ巻き戻し活性に必要とされる低分子作用物質を指す。ヘリカーゼコファクターは、ヌクレオシド三リン酸NTPおよびデオキシヌクレオシド三リン酸dNTPおよびマグネシウムまたは他の二価カチオンを含む。例えば、ATPアデノシン三リン酸は、01から100mMの範囲、好ましくは1から10mMの範囲例えば3mMの濃度で、UvrDヘリカーゼのコファクターとして用いられてもよい。同様に、dTTPデオキシチミジン三リン酸は、1から10mMの範囲例えば3mMでT7Gp4Bヘリカーゼのコファクターとして用いられてもよい。さらなる態様において、DNA依存性DNAポリメラーゼは、配列依存性増幅においてcDNAを転写する。配列依存性合成または配列依存性増幅は、標的特異的プライマーの使用による試料中に存在する非標的配列に対する標的配列の増幅を指す。本明細書で用いられる標的特異的プライマーは、標的核酸上で予め決定された一本鎖領域に結合し、選択的に増幅すべき標的核酸のポリメラーゼ依存性複製を促進することができる一本鎖核酸を指す。1つの態様において、一方が標的配列の5隣接部にハイブリダイズしかつ他方が標的の3隣接部にハイブリダイズする1対の標的特異的プライマーが、標的配列の指数関数的な増幅を達成するために用いられる。別の態様において、複数対の標的特異的プライマーが、多重反応における異なる検出タグを同時に用いて複数の標的を増幅するための単一反応において利用されうる。多重化は通常、一塩基多型SNP解析および病原体の検出で用いられる。概して、適当な標的特異的プライマー対は、短い合成オリゴヌクレオチドであり、例えば10ヌクレオチド以上かつ50ヌクレオチド未満の長さを有する。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマー設計は、ストリングstringに基づくアライメントスコア、融解温度、プライマーの長さおよびGC含量などの種々のパラメータに関係する。標的特異的プライマーを設計するとき、重要な因子の1つは、増幅させるべき核酸分子に特異的な標的断片内で配列を選択することである。別の重要な因子は、反応用の標的特異的プライマーの融解温度を計算することである。標的特異的プライマーの融解温度は、そのオリゴヌクレオチドの長さおよびGC含量により決定される。好ましくは、プライマーの融解温度は、プライマーハイブリダイゼーションおよび標的増幅が行われる温度より約10から30°C高い。プライマーハイブリダイゼーションは、プライマーが1つの鋳型鎖上でその相補配列にのみ特異的に結合する条件下での一本鎖核酸鋳型の領域へのオリゴヌクレオチドプライマーの結合を指し、鋳型中の他の領域への結合は指さない。ハイブリダイゼーションの特異性は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さ、ハイブリダイゼーション反応が行われる温度、イオン強度および反応混合物のpHによって影響される可能性がある。各標的特異的プライマーは、標的核酸の各末端にハイブリダイズし、鋳型として標的ヌクレオチド配列を用いるポリメラーゼにより3→5方向に伸長されてもよい。特異的増幅を達成するために、相同なまたは完全に一致する標的特異的プライマーが好ましい。しかしながら、標的特異的プライマーは、5末端に標的ヌクレオチド配列に相補的ではない配列を含んでもよい。あるいは、標的特異的プライマーは、その全体わたって標的核酸に正確に相補的ではないヌクレオチドまたは配列を含んでもよい。標的特異的プライマーは、任意のデオキシリボヌクレオチド塩基A、T、GもしくはC、および/または1つまたは複数のリボヌクレオチド塩基A、C、U、G、および/または1つまたは複数の修飾ヌクレオチドデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドを含んでもよく、修飾は、プライマーの核酸へのハイブリダイゼーションまたは標的特異的プライマーの伸長または二本鎖分子の変性を妨げない。標的特異的プライマーは、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸などの化学基または非ヌクレオチドリンカーで修飾され、その能力を向上させるかまたは増幅産物の特徴付けを容易にしてもよい。概して、標的特異的プライマーの鋳型認識およびその後のアニーリングの特異性を可能にするのに適した変性の温度は、例えば20°Cから75°Cの温度範囲にわたって生じてもよい。好ましい変性温度は、どのヘリカーゼが融解工程のために選択されるかによって選択されてもよい。選択されたヘリカーゼの存在下での核酸の増幅のための至適温度を決定するための試験は、反応混合物の温度を変えてゲル電気泳動を用いて増幅産物を比較することにより日常的な実験により決定されうる。標的特異的プライマーは、蛍光または化学発光標識、およびビオチン化などの修飾例えば、カルボキシフルオレセインのアミン反応性フルオレセインエステルなどの蛍光タグに供されてもよい。他の標識方法は、放射性同位元素、発色団、およびビオチンまたはハプテンなどのリガンドを含み、それらは、直接的に検出できないが、その特異的結合パートナー、例えばアビジンおよび抗体の標識形態それぞれとの反応により容易に検出することができる。そのような修飾は、増幅産物を検出するために用いることができる。融解、巻き戻し、または変性は、核酸二重鎖の2本の相補鎖の全体または一部を分離することを指す。さらなる態様において、DNA依存性DNAポリメラーゼは、配列非依存性増幅においてcDNAを転写する。本明細書において用いられる配列非依存性増幅は、特定の配列を増幅しないDNA依存性DNAポリメラーゼにより行われる任意の増幅を指す。限定はしないが、例えば、ランダムプライマー混合物またはニック誘導剤は、配列非依存性増幅を開始するために用いられる可能性がある。本明細書で用いられるランダムプライマー混合物は、短く無作為に作製されたオリゴヌクレオチド配列の混合物を指す。本明細書で用いられるニック開始性nickinitiatedポリメラーゼ活性は、外部からのプライマーの非存在下でのポリメラーゼ活性を指し、それは鋳型中の一本鎖切断により開始される。合成は、外因性合成プライマーの末端ではなくDNA中の一本鎖切断で開始される。ニック開始性合成により、プライマーの除去は不必要であり、コスト、取り扱い時間および産物の損失または分解の可能性を低減させる。さらに、ニック開始性合成は、プライマーの自己伸長により引き起こされる偽の増幅シグナルを減少させる。ニックは、認識配列でニックを導入する酵素を用いることにより定義された位置に導入されてもよく、または標的ポリヌクレオチドに無作為に導入されてもよい。本明細書で用いられるニック誘導剤は、二本鎖核酸の一方の鎖の2つの隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合に切れ目を導入する任意の酵素的もしくは化学的試薬または物理的処理を指す。ニック誘導酵素の例は、Bpu10I、BstNBI、AlwI、BbvCI、BbvCI、BsmI、BsrD、および大腸菌エンドヌクレアーゼIを含む。1つの態様において、少なくとも1つのニック誘導酵素が、反応混合物においてヘリカーゼの代わりとして含まれる。別の態様において、少なくとも1つのニック誘導酵素は、少なくとも1つのヘリカーゼに加えて反応混合物に加えられる。他の増幅反応構成要素は、バッファー、バイオ分子、塩類、尿素、ジメチルスルホキシドDMSO、ポリエチレングリコールPEG、マグネシウム、トポイソメラーゼ、アクセサリータンパク質、変性剤、コファクターまたはそれらの組み合わせを適切な状況において含んでもよい。プライマー開始増幅が望まれているとき、プライマーが増幅反応構成要素に加えられる。デオキシリボヌクレオチド三リン酸dNTPすわなち、dATP、dGTP、dCTPおよびdTTPは加えられ、DNAの新しい鎖を構築するために用いられる。ATPまたはTTPはエネルギー源として加えられる。ATPまたはTTPは、高い処理能力を有するヘリカーゼの一般的に好ましいエネルギー源である。平均して、1個のATP分子は、DNAヘリカーゼにより消費され1から4塩基対を巻き戻す。より長い標的を増幅するために、より短い標的と比べて、より多くのATPが消費される可能性がある。このような状況では、ヘリカーゼとともに使用するためのピルビン酸キナーゼに基づくATP再生システムを含むことが望ましい可能性がある。よって、特定の態様において、ATPもしくはTTPまたは組み合わせまたはピルビン酸キナーゼに基づくATP再生システムが、増幅反応構成要素に加えられる可能性がある。トポイソメラーゼは、長いHDA反応で用いられ、HDAの長い標的単位複製配列を増幅する能力を向上させることができる。非常に長い直鎖DNA二重鎖がヘリカーゼにより分離されると、トポイソメラーゼの旋回swivel緩和機能がねじれを取り除き、巻きすぎを妨げる。例えば、大腸菌トポイソメラーゼIは、一方のDNA鎖にニックを導入することにより負の超らせんDNAを緩和するために用いられうる。DNAジャイレーストポイソメラーゼIIは、DNA内に一過性の二本鎖切断を導入し、DNA鎖が相互に通り抜けることを可能にする。よって、特定の態様において、トポイソメラーゼもしくはジャイレース、または両方は、増幅反応に加えられる可能性がある。さらなる態様において、増幅核酸産物は、エチジウムブロマイド染色および限定されないが放射標識、蛍光標識および酵素などの標識手段による増幅配列の検出を含む種々の方法により検出される可能性がある。例えば、HDA増幅産物は、ヘパリン構造の3末端の近くにフルオロフォアを備えて設計されたオリゴヌクレオチドである、蛍光標識されたLUXプライマーInvitrogenCorporationCarlsbadCalifを用いて実時間で検出することができる。この立体構造は、別の消光成分なしに蛍光消光能を内因的に与える。プライマーが二本鎖増幅産物に導入されると、フルオロフォアは、脱消光されdequenched、蛍光シグナルの有意な増加をもたらす。本開示はまた、ヘリカーゼ活性を有する酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を含むキットも包含する。キットは、1つまたは複数のdNTP、ATP、TTP、プライマー、マグネシウム、トポイソメラーゼ、SSBタンパク質、アクセサリータンパク質、変性剤、ポリエチレングリコール、コファクター、またはそれらの混合物から選択されるがこれらに限定されない、増幅反応構成成分をさらに含んでもよい。さらなる態様は、等温増幅の標的である核酸を含む混合物に関する。核酸標的は、ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、RNADNAハイブリッド、または上記の任意の混合物であってもよい。標的核酸を含む混合物はまた、ヘリカーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素、ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する少なくとも1つの酵素も含む。標的核酸および酵素を含む混合物はまた、前記の増幅反応構成成分の1つまたは複数も含むことができる。別の局面は、記載の増幅方法により得られた増幅核酸である。増幅核酸は、DNAまたはRNAであってもよい。別の局面において、等温性逆転写酵素/増幅反応を用いてHPVRNAを検出するためのキットが提供され、キットは、逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する少なくとも1つの酵素を含む。1つの態様において、キットは、ヘリカーゼ活性およびニック誘導活性からなる群より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素をさらに含む。別の態様において、キットは、ヘリカーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素およびニック誘導活性を有する少なくとも1つの酵素をさらに含む。キットは、以下を含むがこれに限定されない、所望の増幅を実行するのに必要な他の試薬をさらに含んでもよい:バッファー;バイオ分子;塩類;尿素;ジメチルスルホキシドDMSO;ポリエチレングリコールPEG;マグネシウム;トポイソメラーゼ;ジャイレース;アクセサリータンパク質;変性剤;コファクター;dNTP;ATP;TTP;未標識プライマーならびにビオチン化プライマーおよびLUXプライマーなどの標識プライマーを含むがこれに限定されない、配列特異的プライマーのセット;ならびにランダムプライマー。用いられる用語含むcomprisingは、本質的にからなるconsistingessentiallyofおよびからなるconsistingofを包含する。実施例1:RTHDAにおけるRT酵素の代わりとしてのPYROPHAGE3173の使用PYROPHAGE3173DNAポリメラーゼは、トランスクリプターTranscriptorおよびサーモスクリプトThermoscript逆転写酵素と比べて複数の利点を有する。例えば、サーモスクリプトおよびトランスクリプターは、HDAバッファーにおいて65°Cで活性が限定されることが公知である。PYROPHAGE3173DNAポリメラーゼがワンステップ等温RTHDA増幅においてこれらの逆転写酵素の代わりとなりうるか否かを決定するために、PYROPHAGE3173DNAポリメラーゼを試験した。簡単に言うと、以下を含む25μL反応混合物を作製した:1クラジミアトラコマチス潜在プラスミドRNActRNAを含む、0、10、または100コピーのインビトロで転写した合成RNAGenBankアクセッション番号X06707;2フォワードプライマー5ATCGCATGCAAGATATCGAGTATGCGT3およびリバースプライマー5CTCATAATTAGCAAGCTGCCTCAGAAT3ctorfプライマー;325Uのサーモスクリプト、ThermoX、トランスクリプター、またはPyrophage3173;42UのBstポリメラーゼ;および51UのuvrDヘリカーゼ。増幅は65°Cで75分間行われた。反応混合物は、表1に記載の最終濃度の試薬を含んだ。図1からわかるように、PYROPHAGE3173は、他のRT酵素の増幅と同じように機能する。実施例2:RTおよびDNA依存性DNAポリメラーゼ両方の代わりとしてのPYROPHAGE3173の使用PYROPHAGE3173がワンステップ等温RTHDA増幅において逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ両方の代わりとなりうるか否かを決定するために、PYROPHAGE3173DNAポリメラーゼを試験した。簡単に言うと、以下を含む25μL反応混合物を作製した:10、25、または100コピーのctRNA;2ctorfプライマー;325UのPyrophage3173;40Uまたは2UいずれかのBstポリメラーゼ;および51UのuvrDヘリカーゼ。反応混合物は、表1に記載された最終濃度の試薬を含んだ。増幅は、62°Cまたは65°Cで75分間行われた。結果を図2に示す。わかるように、PYROPHAGE3173は、ワンステップ等温RTHDAにおいて逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ両方の代わりとなる能力を有する。PYROPHAGE3173DNAポリメラーゼを、別のDNA依存性DNAポリメラーゼの非存在下でRTHDAを行う能力についても、逆転写酵素活性を有する他の酵素と比較した。簡単に言うと、以下を含む25μLの反応混合物を作製した:10、25、または100コピーのctRNA;2ctorfプライマー;325Uのサーモスクリプト、ThermoX、トランスクリプター、またはPyrophage3173;および41UのuvrDヘリカーゼ。増幅は、65°Cで75分間行われた。実施例1のようなLuminexによる検出。結果を図3に示す。PYROPHAGE3173とは対照的に、他の逆転写酵素は、RTHDAのBstポリメラーゼの有効な代わりではなかった。Bstポリメラーゼが除外されると、ThermoX、サーモスクリプトまたはトランスクリプターを利用するRTHDA反応では、ほとんどあるいは全くアッセイシグナルが観察されなかった。PYROPHAGE3173だけが、Bstポリメラーゼを有さない反応においてシグナルを生じることができた。実施例3:DNA増幅でのPYROPHAGE3173の使用標的増幅HPV16DNAをHDAアッセイにおける標的DNAとして用いた。二本鎖DNA標的を5μlの01MNaOHで65°Cで10分間変性させた。次いで、等量の02Mヘペスを加え、変性した標的を中和した。15μlのプレミックスおよび25μlの増幅ミックスを標的に加え、65°Cで15時間インキュベートした。プレミックスおよび増幅ミックスの成分を表2に記載する。単位複製配列検出HDA産物5μLをU底ハイブリダイゼーションプレートに移し、次いで、5μlの1×変性試薬DigeneHC2DNRQiagenGaithersburgIncGaithersburgMDで希釈した。次いで、プレートを密封し、30秒間1100rpmでDigene振とう機で振とうし、室温で15分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション希釈剤5μlの1×hc2プローブ希釈剤、QiagenGaithersburgIncGaithersburgMDを加え、プレートを再密封し、30秒間1100rpmでDigene振とう機で振とうした。単位複製配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを有するLuminexビーズカクテル10μlの1×TEを各ウェルに加え3000ビーズ/ウェル、プレートを再び密封し、暗所で振とうしながら50°Cで30分間インキュベートした。ストレプトアビジンフィコエリトリンMossCorp10μl、PBSで125ngμlに希釈を加え、プレートを再び密封し、光を遮ったDigene振とう機で5分間1100rpmで振とうした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水150μlを加え、プレートを再密封し、800rpmで1分間振とうした。Luminex100およびLuminex17ソフトウエアを用いて、平均蛍光強度MFIを決定した。結果を図4に示す。バックグラウンドレベルを上回るMFIは、DNA標的の存在と相関する。実施例4:ワンステップRTHDAを用いる2つHPV16mRNA配列の検出HPV16E67遺伝子およびHPV16L1遺伝子に相当する、インビトロで転写した合成RNAを標的として用いた。各標的核酸を25または250コピーいずれかで各反応中に含んだ。Ctorfプライマーの代わりに表3に記載のプライマーを用いる、ワンステップ等温RTHDA反応を実施例2のように実行した。リバースプライマーは75mMの最終濃度で用いられ、一方フォワードプライマー濃度は35mM、40mM、45mM、50mM、または55mMであった。結果を図5に示す。25コピーの2つのHPV16RNAそれぞれの検出は、RTHDA反応に対して頑健性を有していた。この実験での至適プライマー濃度は、75mMの各ビオチン化リバースプライマー、および40または45mMの各フォワードプライマーであった。SNの変動係数n=3は、これらの反応では低かった12から22。実施例5:ハイブリッドキャプチャーにおけるPYROPHAGE3173の使用Aハイブリッドキャプチャー技術ハイブリッドキャプチャー技術は、試料中の特定の標的核酸を精製および検出する種々の方法において、RNADNAハイブリッドに結合する能力を有する特定の抗体を利用する。ハイブリッドキャプチャー法の様々な反復法iterationは、とりわけ、USPatentNo5994079、6027897、6277579、6686151、および7439016USPatentPublicationNo20060051809A1、20090162851A1、および20090298187A1ならびにPCTPublicationNoWO0196608に記載され、そのそれぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる。基本のハイブリッドキャプチャープロトコルは以下を含む:1核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、DNARNAハイブリッドを生成する工程;2DNARNAハイブリッドを固相に結合し、標的核酸の単離を容易にする工程;および3DNARNAハイブリッドを検出する工程。様々な反復法では、抗DNARNAハイブリッド抗体が、段階2または段階3のいずれかで用いられうる。限定はしないが例えば、抗DNARNAハイブリッド抗体は、固相に結合され共有結合的にまたは他の方法で、それによってDNARNAハイブリッドの固相への捕捉を媒介してもよい。あるいは、固相に結合した共有結合的にまたは他の方法で核酸プローブが、固相にDNARNAハイブリッドを捕捉してもよく、次いで検出可能に標識された抗DNARNAハイブリッド抗体により検出されてもよい。Bハイブリッドキャプチャーにより単離された標識の検出前述の通り、ハイブリッドキャプチャーはDNARNAハイブリッドを利用する。したがって、所望の標的のアイデンティティは重要である。標的核酸分子がDNAであるとき、プローブは好ましくはRNAであり、標的核酸がRNAであるとき、プローブは好ましくはDNAである。標的核酸を含む試料をチューブ内に集め、アルカリ溶液などの変性試薬で処理し、標的核酸分子をハイブリダイゼーションで利用しやすい状態にする。さらに、タンパク質のアルカリ処理は、被検物を効果的にホモジナイズし、与えられた試料の解析結果の再現性を確かなものにする。キネティクスを向上させること、試料をホモジナイズすること、および試料中の任意の内因性の一本鎖RNA核酸、DNARNAハイブリッドまたはRNARNAハイブリッドを破壊することによりバックグラウンドを低減させることも、試料の粘度を低下させることができる。それはまた、試料中に存在する可能性があるRNaseおよびDNaseなどの酵素を不活性化するのを助ける。DNAとは対照的にRNAが標的核酸である場合、フェノール抽出およびTCA/アセトン沈殿、ならびにグアニジンチオシアネートフェノールクロロホルム抽出を含むがこれに限定されない、異なる試薬が好ましい可能性があることを当業者なら理解するであろう。核酸を含む試料を変性させた後、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが試料中の標的核酸にハイブリダイズし二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分な条件下で、それを1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブに接触させる。プローブは、全長DNA、切断型DNA、合成DNA、全長RNA、切断型RNAまたは合成RNAでありうる。標的核酸がDNAである場合、プローブはRNAであってよく、標的核酸がRNAである場合、プローブはDNAであってよい。好ましくは、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブは、塩基性の変性試薬を中和するための中和ハイブリダイゼーションバッファーとしても機能しうるプローブ希釈剤で希釈される。DNAプローブまたはRNAプローブに対して用いられるプローブ希釈剤は、RNAとDNAの安定のために必要とされる要件が異なっているため相違する。例えば、プローブがRNAである場合、NaOHがRNAを破壊しうるため、最初に試料を中和し、次いでプローブを添加するか、あるいはRNAプローブおよび中和剤プローブ希釈剤を試料に同時に添加することが好ましい。プローブ希釈剤は、プローブを溶解および希釈するために用いることができ、さらに試料を中性近くのpH、例えば約pH6から約pH9に回復させハイブリダイゼーションにより都合のよい環境を提供するのも助けることができる。十分な量、好ましくは試料の12量のプローブ希釈剤が、塩基処理された試料を中和するために用いられてもよい。プローブを標的核酸分子へハイブリダイズさせかつ二本鎖核酸ハイブリッドを形成させた後、ハイブリッドは、常磁性ビーズの上に固定化した抗ハイブリッド抗体により捕捉される。ハイブリッドは、抗ハイブリッド抗体と共に約67°Cから約70°Cで約30分間インキュベートされる。次いで、磁場をチューブに適用し、ビーズから上清を取り除く。次いで、例えば40mMトリス、pH82、100mMNaCl、05TritonX100および0.05アジ化ナトリウムを含む、適当な洗浄バッファーでビーズを洗浄してもよい。次いで、捕獲された核酸は、本明細書に記載の任意の増幅スキームを用いて検出されてもよい。Cハイブリッドキャプチャーアッセイの感度の増加いくつかの反復法において、増幅は、特に標的核酸が低コピー数で存在することが予測されるときに、ハイブリッドキャプチャーアッセイの感度を増すために用いることができる。しかしながら、標準的な増幅技術は、ハイブリッドキャプチャーが用いられる可能性がある条件に常に適合するわけではない。例えば、ハイブリッドキャプチャー技術の1つの特定の利用は、高価なサーモサイクラーおよび経験のある技術者が多くの場合いない農村社会におけるスクリーニングアッセイを目的とする。そのような状況では、関係する複雑な試薬の数を低減し、工程を単純化することが有益であり、多くの場合標準的なPCRプロトコルの使用を不可能にする。そのような状況では、PYROPHAGE3173などの耐熱性ポリメラーゼが有用である。一例をあげると、本明細書に記載の増幅は、例えばUSPatentNo5994079、6027897、6277579、6686151、および7439016;USPatentPublicationNo20060051809A1、20090162851A1、および20090298187A1;ならびにPCTPublicationNoWO0196608に記載のハイブリッドキャプチャーアッセイにより精製および検出された結果として得られる単位複製配列を伴う試料に対して行われてもよい。あるいは、標的核酸は、実施例5Bに記載の通り精製され、次いで本明細書に記載の通り増幅されてもよい。分離後、標的は、変性され、ビーズから分離され、例えばUSPatentNo5994079、6027897、6277579、6686151、および7439016;USPatentPublicationNo20060051809A1、20090162851A1、および20090298187A1;ならびにPCTPublicationNoWO0196608に記載のようなハイブリッドキャプチャーアッセイにより検出されてもよい。D利用可能な試薬による使用への不適合な標的の適応上記の通り、ハイブリッドキャプチャーは好ましくはDNARNAハイブリッドと組み合わせて用いられる。しかしながら、標的核酸およびハイブリッドキャプチャープローブが両方ともRNAである事例が存在する可能性がある。そのような場合、ハイブリッドキャプチャーを行う前に標的RNAをDNAに変換することが望ましい。PYROPHAGE3173の逆転写酵素活性は、そのような態様において有用でありうる。mRNAが所望の標的であるときなど、特に所望の標的が試料中に存在する可能性が高いDNA相当物である場合、RNAは任意で、逆転写反応を行う前に試料から抽出されてもよい。全RNAおよびそのサブセットを単離する多くの方法が当技術分野において周知であり、例えば、酸グアニジンチオシアネートフェノールクロロホルム抽出およびRNeasy登録商標製品系列のキットQiagenGmbHHildenDEなどの市販のキットを含む。逆転写反応およびそれを行う的確な方法を行う前にRNAを単離するか否かは、具体的な標的および適用に大部分依存し、当業者により決定されうる。ひとたび試料を所望のように調製したら、逆転写反応は本質的に本明細書に記載のとおり行うことができる。感度の増加が必要または望まれる場合、ワンステップRTHDA反応がさらに行われてもよい。次いで、標的単離は、実施例5Bに記載のハイブリッドキャプチャーにより行われてもよく、および/または標的検出は、例えばUSPatentNo5994079、6027897、6277579、6686151、および7439016;USPatentPublicationNo20060051809A1、20090162851A1、および20090298187A1;ならびにPCTPublicationNoWO0196608に記載のとおりに行われてもよい。