a-以下の配列により定義される第1の可変ドメイン:;-以下の配列により定義される第2の可変ドメイン::からなるCD28結合部位を有する抗体b-配列番号1の可変ドメインのCDRを有する第1の可変ドメイン;-配列番号2の可変ドメインのCDRを有する第2の可変ドメイン:からなるCD28結合部位を有する抗体から選択されることを特徴とする抗CD28抗体。一価抗体である請求項1に記載の抗体。-配列番号4のアミノ酸21~251の配列を有する第1のタンパク質の鎖-配列番号6のアミノ酸21~234の配列を有する第2のタンパク質の鎖のヘテロ二量体である請求項2に記載の一価抗体。-N末端からC末端までが、請求項1に記載の抗体の重鎖可変ドメインである領域A;ペプチドリンカー並びにIgGイムノグロブリンのCH2及びCH3ドメインからなる領域B;から本質的になる第1のタンパク質の鎖:-N末端からC末端までが、請求項1に記載の抗体の軽鎖可変ドメインである領域A;第1のポリペプチドの領域Bと同一の領域B;から本質的になる第2のタンパク質の鎖:のヘテロ二量体である請求項2に記載の一価抗体。ペプチドリンカーが、-EPKSCDKTHTCPPCPの配列を有するヒトIgG1イムノグロブリンのヒンジ領域;-DKTHTCPPCPの配列を有するヒトIgG1イムノグロブリンのヒンジ領域:から選択される請求項4に記載の一価抗体。CH2及びCH3ドメインが、IgG4サブクラスのイムノグロブリンのものである請求項4又は5に記載の一価抗体。-第1のタンパク質の鎖のポリペプチド配列が配列番号10のアミノ酸21~368の配列であり、第2のタンパク質の鎖のポリペプチド配列が配列番号12のアミノ酸21~355の配列である一価抗体;-第1のタンパク質の鎖のポリペプチド配列が配列番号14のアミノ酸21~373の配列であり、第2のタンパク質の鎖のポリペプチド配列が配列番号16のアミノ酸21~360の配列である一価抗体:から選択される請求項6に記載の一価抗体。第2のタンパク質の鎖が、Xがアラニン又はアスパラギン残基を表す配列番号2の可変ドメインを含む請求項3に記載の一価抗体。a配列番号1のCDRを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;b配列番号2のCDRを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;c請求項1~8のいずれか1項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド:から選択されるポリヌクレオチド。請求項1~8のいずれか1項に記載の抗体を含む治療用組成物。移植拒絶、慢性同種異系移植血管症、移植片対宿主病、Tリンパ球媒介性自己免疫疾患、高血圧、アレルギー現象及び慢性炎症性疾患からなる群より選択される病的状態を治療するための請求項1~8のいずれか1項に記載の抗体。したがって、抗体のヒト化における大きな課題は、どのアミノ酸残基が抗原結合特性を保持するのに重要であるか決定することである。FR領域中の置換についてより適当な部位を予測するために様々な方法が提案されている。それらはヒト化の第1の工程において幾らかの助力となり得る一般的な原理を提供するが、最終的な結果は、抗体ごとに大きく変化する。よって、ある所定の抗体について、どの置換が望ましい結果を提供するか前もって知ることは非常に困難である。FR中の置換だけでなくCDR中の置換までもがヒトにおける免疫原性を満足に減少させるために必要となる場合には、最終的な結果は、完全に予測不可能となる。本発明者らは、低い免疫原性を有し、重鎖のCDR2中に非保存的なK→Q置換を含むアミノ酸置換を幾つか有しているが親マウスのCD283のCD28結合特性を保持するヒト化CD283を製造することに成功している。一価の形態で用いられるとき、本発明のhCD283もまた、親マウスCD283のCD28結合特性を保持する。実施例1:hCD283一価抗体の構築及び真核発現重鎖:ヒトCH1領域をコードする配列及び天然のマウスCD283抗体の重鎖のリーダーペプチドをコードする配列と融合している、hCD283のVH領域をコードする配列を化学的に合成し、増幅のために、クローニングベクターpGA18に導入した。次いで、配列をKpnIBamHI制限酵素を用いて消化により切り出し、プラスミドpcDNA31hygroのKpnIBamHIサイトにサブクローニングした。陽性クローンを増幅し、トランスフェクション工程のために、Midiprependotoxinfreeにより精製した。得られたプラスミドをpSignalVHhCH1と呼ぶ。それは、CD283の重鎖のリーダーペプチドをコードする配列とヒトCH1領域をコードする配列との間にhCD283のVH領域をコードする配列を含む構築物を含む。この構築物のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図1に示す。また、それらは、同封される配列表において、配列番号3及び配列番号4と表される。軽鎖:ヒトcκ領域をコードする配列及び天然のマウスCD283抗体の軽鎖のリーダーペプチドをコードする配列と融合している、hCD283のVL領域をコードする配列を化学的に合成し、増幅のために、クローニングベクターpGA18に導入した。次いで、配列をKpnIBamHI制限酵素を用いて消化により切り出し、プラスミドpcDNA3AhygroのKpnIBamHIサイトにサブクローニングした。陽性クローンを増幅し、トランスフェクション工程のために、Midiprependotoxinfreeにより精製した。得られたプラスミドをpSignalVLhCκと呼ぶ。それは、CD283の軽鎖のシグナルペプチドをコードする配列とヒトcκ領域をコードする配列との間にhCD283のVL領域をコードする配列を含む構築物を含む。この構築物のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図2に示す。また、それらは、同封される配列表において、配列番号5及び配列番号6と表される。真核発現COS細胞を、2μgのpSignalVLhCH1及びpSignalVHhCH1で、Fugeneリポフェクションキットを用いて、製造業者の説明書に従ってコトランスフェクトした。培養物を3日間37°Cで維持し、3分の1に分け、更に3日間の培養を再開し、その後細胞上清を回収した。hCD283一価抗体の活性は、以下の実施例2に記載されるようにして、ELISAにより直接上清中において評価する。実施例2:ELISAによるhCD283Fabフラグメント結合活性の検出hCD283Fabフラグメントの結合特性を、Cos細胞をCD283Fabをコードするプラスミドでトランスフェクションした後に得られた結合特性と、2つのELISAアッセイを用いて比較した。第1に、トランスフェクトされたCOS細胞の培地上清中のhCD283及びCD283Fabフラグメントの濃度を、サンドイッチELISAを用いて測定した。簡潔には、上清中に含まれる抗CD28FabをまずCD283の重鎖及び軽鎖可変ドメインに特異的なウサギポリクローナル抗体により捕捉する。捕捉したタンパク質を、次いで、ヒトIgGのκ鎖を指向するマウスモノクローナル抗体、続いてペルオキシダーゼで標識したヤギポリクローナル抗マウス抗体を用いて明らかにする。結合した抗体は、TMB基質を用いて比色法により明らかにし、405nmで読み出した。種々の上清希釈度に対応するODを、次いで、トランスフォームされたCHO細胞の培地上清からクロマトグラフィの標準的技術を用いて精製され、BCAアッセイで定量した既知量のCD283Fabを用いて得られた標準曲線と比較する。FR104は、天然の、CD283抗体のVH及びVL領域を含む。したがって、細胞上清中に存在するFabタンパク質の量を評価することができる。第2に、CD283Fabと比較したhCD283Fabフラグメントの結合活性を分析するために、カーボネートバッファー005MpH92中の2μgmlのヒトCD28Fcキメラを用いて、マイクロタイタープレートのウェルを一晩4°Cでコーティングした。これらの固定化されたCD28標的分子は、抗CD28活性を有する免疫反応性分子だけに結合する。次いで、ウェルを200μLのPBS005Tweenを用いて連続的に3回洗浄し、100μLのPBSTween01BSA1を用いて2時間37°Cで飽和させた。次いで、200μLのPBS005Tweenを用いて3回洗浄後、既知濃度のCD283又はhCD283Fabフラグメントを含む上清を、PBS01Tween中に種々の希釈度で加え、2時間37°Cでインキュベートした。200μLのPBS005Tweenを用いて3回洗浄後、ヒトIgGのκ鎖を指向するマウスモノクローナル抗体を加え、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を加え、TMB基質を用いて比色法により明らかにし、405nmで読み出した。次いで、結果を、結合ELISAを用いて測定した吸光として、サンドイッチELISAを用いて測定したFab濃度に対してプロットする。結合アッセイにおいて最大の光学密度の50に達するために必要とされる抗CD28Fabの濃度として、線形領域における曲線の傾きを算出した後、AC50を決定する。結果を図3及び表Iに示す。図3Aは、結合ELISAにおける漸増濃度のFR104、hCD283Fab又はCD283Fabの405nmでの光学密度を示す。図3Bは、比較値AC50の決定を可能にする回帰曲線の算出結果を示す。下記の表Iに、標準FR104、並びにFabフラグメントVH野生型VL野生型及びFabhCD283についてのOD50、等式及びAC50を纏める。これらの結果は、FabフラグメントVH野生型VL野生型及びhCD283Fabについて同様の濃度でCD28に対する結合活性の50に達し得ることを示す。標準についての濃度は、おそらくそれがアッセイ前に精製されるためにわずかに低い。よって、hCD283は、CD28の野生型VH及びVL配列のCD28結合特性を保持する。実施例3:短縮型γ1ヒンジ及びγ4CH2CH3ドメインを有するhCD283一価抗体の構築及び真核発現重鎖:ヒトIgG1のヒンジ領域の一部をコードする配列、ヒトIgG4のCH2CH3ドメインとC末端側で融合し、天然のマウスCD283抗体の重鎖のリーダーペプチドをコードする配列をN末端の位置に有する、hCD283のVH領域をコードする配列を化学的に合成し、増幅のために、クローニングベクターpMAに導入した。次いで、配列をNheIEcoRI制限酵素を用いて消化により切り出し、プラスミドpCIneoのNheIEcoRIサイトにサブクローニングした。Eコリ細胞のトランスフォーメーション後、陽性クローンを増幅し、抽出したプラスミドをMidiprependotoxinfreeカラムにより精製した。得られたプラスミドをpSignalhVHshorthingeγ1hγ4CH2CH3と呼ぶ。それは、CD283の重鎖のシグナルペプチドをコードする配列とヒトγ1ヒンジ領域の一部をコードする配列及びヒトγ4CH2CH3ドメインの配列との間にhCD283のVH領域をコードする配列を含む構築物を含む。この構築物のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図4に示す。また、それらは、同封される配列表において、配列番号9及び配列番号10と表される。軽鎖:ヒトIgG1のヒンジ領域の一部をコードする配列、ヒトIgG4のCH2CH3ドメインと融合し、天然のマウスCD283抗体の重鎖のリーダーペプチドをコードする配列をN末端の位置に有する、hCD283のVL領域をコードする配列を化学的に合成し、増幅のために、クローニングベクターpMAに導入した。次いで、配列をNheIEcoRI制限酵素を用いて消化により切り出し、プラスミドpCINeoのNheIEcoRIサイトにサブクローニングした。Eコリ細胞のトランスフォーメーション後、陽性クローンを増幅し、抽出したプラスミドをMidiprependotoxinfreeカラムにより精製した。得られたプラスミドをpSignalhVLshorthingeγ1hγ4CH2CH3と呼ぶ。それは、CD283の軽鎖のシグナルペプチドをコードする配列とヒトγ1領域の一部をコードする配列及びヒトγ4CH2CH3ドメインの配列との間にhCD283のVL領域をコードする配列を含む構築物を含む。この構築物のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図5に示す。また、それらは、同封される配列表において、配列番号11及び配列番号12と表される。真核発現COS細胞を、1μgのpSignalhVLshorthingeγ1hγ4CH2CH3及びpSignalhVHshorthingeγ1hγ4CH2CH3で、Lipofectamineリポフェクションキットを用いて、製造業者の説明書に従ってコトランスフェクトした。培養物を3日間37°Cで維持し、その後細胞上清を回収した。一価抗体の活性は、以下の実施例5に記載されるようにして、ELISAにより直接上清中において評価した。実施例4:完全長γ1ヒンジ及びγ4CH2CH3ドメインを有するhCD283一価抗体の構築及び真核発現重鎖:ヒトIgG1の完全長ヒンジ領域をコードする配列、ヒトIgG4のCH2CH3ドメインとC末端側で融合し、天然のマウスCD283抗体の重鎖のリーダーペプチドをコードする配列をN末端の位置に有する、hCD283のVH領域をコードする配列を化学的に合成し、増幅のために、クローニングベクターpMAに導入した。次いで、配列をNheIEcoRI制限酵素を用いて消化により切り出し、プラスミドpCIneoのNheIEcoRIサイトにサブクローニングした。Eコリ細胞のトランスフォーメーション後、陽性クローンを増幅し、抽出したプラスミドをMidiprependotoxinfreeカラムにより精製した。得られたプラスミドをpSignalhVHfullhingeγ1hγ4CH2CH3と呼ぶ。それは、CD283の重鎖のシグナルペプチドをコードする配列とヒトγ1ヒンジ領域及びヒトγ4CH2CH3ドメインをコードする配列との間にhCD283のVH領域をコードする配列を含む構築物を含む。この構築物のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図6に示す。また、それらは、同封される配列表において、配列番号13及び配列番号14と表される。軽鎖:ヒトIgG1の完全長ヒンジ領域をコードする配列、ヒトIgG4のCH2CH3ドメインと融合し、天然のマウスCD283抗体の重鎖のリーダーペプチドをコードする配列をN末端の位置に有する、hCD283のVL領域をコードする配列を化学的に合成し、増幅のために、クローニングベクターpMAに導入した。次いで、配列をNheIEcoRI制限酵素を用いて消化により切り出し、プラスミドpCIneoのNheIEcoRIサイトにサブクローニングした。Eコリ細胞のトランスフォーメーション後、陽性クローンを増幅し、抽出したプラスミドをMidiprependotoxinfreeカラムにより精製した。得られたプラスミドをpSignalhVLfullhingeγ1hγ4CH2CH3と呼ぶ。それは、CD283の軽鎖のシグナルペプチドをコードする配列とヒトγ1の完全長ヒンジ領域をコードする配列及びヒトγ4CH2CH3ドメインの配列との間にhCD283のVL領域をコードする配列を含む構築物を含む。この構築物のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図7に示す。また、それらは、同封される配列表において、配列番号15及び配列番号16と表される。真核発現COS細胞を、1μgのpSignalhVHfullhingeγ1hγ4CH2CH3及びpSignalhVLfullhingeγ1hγ4CH2CH3で、Lipofectamineリポフェクションキットを用いて、製造業者の説明書に従ってコトランスフェクトした。培養物を3日間37°Cで維持し、その後細胞上清を回収した。hCD283一価抗体の活性は、以下の実施例5に記載されるようにして、ELISAにより直接上清中において評価した。実施例5:ELISAによるhCD283完全長γ1ヒンジγ4CH2CH3ドメイン及びhCD283短縮型γ1ヒンジγ4CH2CH3ドメイン一価抗体の結合活性の評価トランスフェクトされたCOS細胞により産生されたhCD283一価抗体であるhCD283完全γ1ヒンジγ4CH2CH3ドメイン及びhCD283短縮型γ1ヒンジγ4CH2CH3ドメインの結合特性を、2つのELISAアッセイを用いて分析した。第1に、トランスフェクトされたCOS細胞の培地上清中のhCD283一価抗体の濃度を、サンドイッチELISAを用いて測定した。簡潔には、上清中に含まれる一価抗体をまずヒトIgGを指向するヤギポリクローナル抗体により捕捉する。捕捉したタンパク質を、次いでビオチン化されたFc特異的ヤギポリクローナル抗ヒトIgG抗体、続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いて明らかにする。結合した抗体は、TMB基質を用いて比色法により明らかにし、405nmで読み出した。種々の上清希釈度に対応するODを、次いで、トランスフォームされたCHO細胞の培地上清からクロマトグラフィの標準的技術を用いて精製され、BCAアッセイで定量した既知量のhCD283一価抗体を用いて得られた標準曲線と比較する。第2に、hCD283一価抗体の結合活性を分析するために、カーボネートバッファー005MpH92中の2μgmlのヒトCD28Fcキメラを用いて、マイクロタイタープレートのウェルを一晩4°Cでコーティングした。これらの固定化されたCD28標的分子は、抗CD28活性を有する免疫反応性分子だけに結合する。次いで、ウェルを200μLのPBS005Tweenを用いて連続的に3回洗浄し、100μLのPBSTween01BSA1を用いて2時間37°Cで飽和させた。次いで、200μLのPBS005Tweenを用いて3回洗浄後、既知濃度の分析される一価抗体を含む上清を、PBS01Tween中に種々の希釈度で加え、2時間37°Cでインキュベートした。200μLのPBS005Tweenを用いて3回洗浄後、CD283の重鎖及び軽鎖可変ドメインに特異的なウサギポリクローナル抗血清を加えた。これに続いて、ペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギ抗体、続いてTMB基質を用いる比色法により明らかにし、405nmで読み出した。次いで、結果を、結合ELISAを用いて測定した吸収として、サンドイッチELISAを用いて測定した一価抗体濃度に対してプロットする。結合アッセイにおいて最大の光学密度の50に達するために必要とされる一価抗体の濃度として、線形領域における曲線の傾きを算出した後、AC50を決定する。図8は、結合ELISAにおいて、hCD283完全IgG1ヒンジIgG4CH2CH3ドメイン一価抗体の結合活性をhCD283短縮型IgG1ヒンジIgG4CH2CH3ドメイン一価抗体の結合活性と比較している。図8Bに、一価抗体についての等式、回帰係数及びAC50を纏める。これらの結果は、CD28に対する結合活性の50がhCD283完全γ1ヒンジγ4CH2CH3ドメイン又はhCD283短縮型γ1ヒンジγ4CH2CH3ドメインの一価抗体に類似する濃度に達し得ることを示す。実施例6:hCD283一価抗体はT細胞活性化を妨害するhCD283一価抗体がCD28依存的T細胞活性化をブロックすることを確かめるために、RajiB細胞系により提示されるSEEスーパー抗原でヒトT細胞を刺激した。エンドトキシンであるSEEは、クラスII陽性B細胞リンパ芽球様Raji系に提示されるとき、Vβ8を発現するT細胞Jurkat系を活性化してIL2を分泌する。Jurkat細胞が高レベルのCD28を発現し、Raji細胞がCD8086を発現するので、この反応は部分的にCD28依存的である。このアッセイにおいて、ELISAにより、48時間後、漸増濃度のhVHVLCD283短縮型γ1ヒンジγ4CH2CH3ドメインの存在下にインターロイキン2の合成を測定した。結果を図9に示す。それらは、hCD283一価抗体が用量依存的様式でT細胞によるIL2合成を減少させることを明らかにする。実施例7:PEG化されたhCD283一価抗体の製造実施例1に記載されるようにして製造されたhCD283Fabフラグメントを、還元及びPEG化の標準的な条件を用いて、マレイミドで活性化された40KDaのPEGでPEG化した。簡潔には、Fab抗体フラグメントを1mgmLに濃縮し、次いで20mMリン酸ナトリウム、2mMEDTA、pH70に対してダイアフィルトレーションした。次いで、Fab抗体フラグメントを、塩化システアミンをモル当量比=30:1で室温にて加えることにより還元した。5時間後、溶液を脱塩カラムにアプライした。ポリエチレングリコールを20mMホスフェート、2mMEDTApH70中に溶解し、9の溶液を得た。脱塩したFab溶液及びPEGをモル当量比=1:15で混合し、周囲温度にて3時間インキュベートした。PEG化の後に、Fabpegを、クロマトグラフィによりSPセファロースHP媒体を用いて精製した。標的タンパク質を0~1MNaClの塩勾配で溶出した。溶出したピークをSDSPageにより分析した。ピーク1はモノPEG化された物質を、ピーク2はPEG化されていない物質を、ピーク3はポリPEG化された物質を表した。結果を図10に示す。これらの結果は、CD283mAbからのFabタンパク質の大部分が、わずか約5のモノPEG化されたFab収率をもたらす乱されたPEG化プロフィールを表すことを示す。CD283mAbは、鎖内又は鎖間ジスルフィドブリッジに携わらないシステイン残基を可変ドメイン軽鎖の96位に含む。フリーなシステインは、ジスルフィドブリッジに携わるシステイン残基よりも高い反応性を有し、したがって、優先的にマレイミドで活性化されたPEGの標的となる。したがって、第2の望まれないPEG化がこの残基で起こる蓋然性が高い。この問題を解決するため、本発明者らは、VLC96変異の研究を行い、C96残基を別のアミノ酸により抗体の結合特性を改変することなく置換することが可能かどうか判定した。軽鎖中に改変されていないC96を有するか、又はC96からのA、G、S、V、T、N若しくはR変異を有するヒト化抗CD283Fabをコードするプラスミドを構築し、実施例1に開示されるようにして、リポフェクションによりCos細胞にトランスフェクトした。細胞上清をまずサンドイッチELISAにより分析し、実施例2に開示されるようにして、Fabの全濃度を測定した。次いで、上清をELISAにより分析し、実施例2に開示されるようにして、固定化された組換えCD28に対する結合活性を測定した。結果を図11に示す。これらの結果は、分析された全ての他の置換とは異なって、C96A置換が十分に活性な抗体をもたらしたこと及びC96N置換が活性の穏やかな減少だけをもたらしたことを示す。C96AFabフラグメントのバリアントをPEG化し、上記のクロマトグラフィで精製した。PEG化されたタンパク質のプレクロマトグラフィ及び溶出ピークは、SDSPageにより分析した。結果を図12に示す。ピーク1は、モノPEG化された物質を表す。これらの結果は、C96AFabフラグメントが41に達する効率でPEG化され得ることを示す。重鎖のCAAC末端の利点フリーなシステインのすぐ近くの分子環境は、システインのマレイミドPEG化しやすさを改変し、したがって、PEG化反応率を改変する可能性がある。C末端側システインについて1つの可能な選択肢は、重鎖の最後のアミノ酸となることである。別の選択肢は、最後のシステインの後のC末端側の位置にスタッフアミノ酸を付加することである。したがって、重鎖の最後のアミノ酸である最後のC末端システインを有するヒト化CD283MabのC96AバリアントからのFab分子のPEG化効率を、最後のC末端システインの後に2つのアラニンを有する類似の分子と比較した。本発明者らのデータは、CAAバリアントが20高い効率でPEG化され得ることを明確かつ再現可能に証明した。実際、C96ACバリアントについて41だったPEG化率は、C96ACAAバリアントについては52に達した。