"対象に由来する生物学的サンプルにおける、ブチリルコリンエステラーゼ遺伝子の以下の変化、または連鎖不均衡にあるその多型:NCBI受理番号NG009031における位置68974の多型部位およびNCBI受理番号NG009031における位置4780から4786のポリチミン領域の遺伝子型を決定することを含む、レビー小体認知症を診断するためのinvitroの方法。NCBI受理番号NG009031における位置68974の多型部位およびNCBI受理番号NG009031における位置4780から4786のポリチミン領域の遺伝子型を決定することを含む、請求項1に記載の方法。以下のBChE遺伝子の変化、または連鎖不均衡にあるその多型:位置3687の多型部位、位置4206の多型部位、および位置4443における多型部位前記位置は、NCBI受理番号NG009031を参照とするの遺伝子型を決定することをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。位置3687の多型部位、位置4206の多型部位、および位置4443における多型部位前記位置は、NCBI受理番号NG009031を参照とするの遺伝子型を決定することを含む、請求項3に記載の方法。前記遺伝子型が、位置4780から4786が両アレルで7つのチミンであり;および、位置68974が一方のアレルでグアニンであり、他方のアレルでアデニンであってレビー小体認知症を示し、アルツハイマー病と区別できる遺伝子型である、請求項1または2に記載の方法。前記遺伝子型が、位置68974が一方のアレルでアデニンであり位置4780から4786が一方のアレルで8つのチミンであり;位置3687が両アレルでアデニンであり;位置4206が一方のアレルでアデニンであり、他方のアレルでグアニンであり;および位置4443が両アレルでシトシンであって;レビー小体認知症を示し、アルツハイマー病と区別できる遺伝子型である、請求項3または4に記載の方法。前記遺伝子型が、位置68974が一方のアレルでアデニンであり、他方のアレルでグアニンであり位置4780から4786が両アレルで7つのチミンであり;位置3687が両アレルでアデニンであり;位置4206が両アレルでアデニンであり;および位置4443が一方のアレルでシトシンであって;レビー小体認知症を示し、アルツハイマー病と区別できる遺伝子型である、請求項3または4に記載の方法。前記遺伝子型決定が、プライマー特異的多重PCRに続く検出、多重アレル特異的プライマー伸長、マイクロアレイに基づく方法、およびダイナミックアレル特異的ハイブリダイゼーションから成る群より選択される一つの技術によって行われる、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。前記決定がプライマー特異的多重PCRによる増幅に続く検出によって行われる、請求項8に記載の方法。前記生物学的サンプルが血液サンプルである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。BChE遺伝子おける変化の遺伝子型を決定するための適切な手段を含む、請求項1から10のいずれか一項に定義された方法を行うためのキット。プライマー特異的多重PCRを行うための適切な手段を含む、請求項11に記載のキット。レビー小体認知症の診断のための、請求項10から12のいずれか一項に記載のキットの使用。レビー小体認知症の診断マーカーとしての、位置4780から4786のポリチミン領域、位置3687の多型部位;位置4206の多型部位;位置4443の多型部位前記位置は、NCBI受理番号NG009031を参照とするから成る群から選択される一つまたは複数のBChE遺伝子における変化と組み合わせた、NCBI受理番号NG009031における位置68974の多型部位の使用。位置68974の多型部位が、位置4780から4786のポリチミン領域と組み合わせて使用される、請求項14に記載の使用。位置68974の多型部位が、位置4780から4786のポリチミン領域、位置3687の多型部位;位置4206の多型部位;および位置4443の多型部位と組み合わせて使用される、請求項14に記載の使用。本願発明者は、レビー小体認知症に罹患している患者を決定し、アルツハイマー病と区別をすることを可能にする、BChE遺伝子の特異的な変化を発見した。当該業界においては、BChEKバリアントとDLBの間の関連を発見することを目的とする文書があるが、以下に説明するように、近年の調査では有意な関連はないとみなしている。驚くべきことに、本願発明者は、DLBの診断のための特異的な情報が、BChE遺伝子、位置4780から4786のポリチミン領域における現在未知の変化の遺伝子型と同時発生するKバリアントの遺伝子型によって得られることを発見した。従って、これら二つの遺伝子型を決定することは、DLBをADから区別するのに有用であり、これら二つの遺伝子型は、DLBの特異的な遺伝子マーカーを構成する。本願発明者はさらに、遺伝子型の組み合わせは、DLBに罹患している患者群を同定しADから区別することに繋がることを見いだした。この組み合わせは、NCBI受理番号NG009031における位置3687、4206および4443の多型部位、位置4780から4786のポリチミン領域、および、NCBI受理番号NG009031の位置68974の多型部位の遺伝子型により形成される。BChEヌクレオチド配列の変化の位置は、プロモーターおよび遺伝子に対応するNCBI受理番号NG009031のヌクレオチド配列から得られる。この配列は2010年1月に発表された。多型部位3687、4206、4443および位置4780から4786のポリチミン領域は、プロモーター領域中である。これらの部位については、NCBIのBChEの全配列のヌクレオチド1からヌクレオチド5040に由来する配列に対応する、配列番号1も参照せよ。しばしば使用されるヌクレオチドの可能な番号付けは、転写開始点を1とし、結果としてこの位置より上流のヌクレオチド上流は負の位置とする。転写開始点1は、NG0090031の位置5001に対応する。本願明細書で使用される番号付けと負の番号付けの対応は、本願明細書中で以下のように示される:A3687GはA1314Gに対応するA4206GはA795Gに対応するC4443TはC558Tに対応する4780から4786のポリチミンは、215から221に対応する。位置68974の多型部位は、NG009031がコードする領域中にある。NG009031の位置68041から7020の領域は、配列番号28として含まれている。この領域だけをとって再度番号付けすると、結果として、全遺伝子配列中の位置68974は配列番号28の位置934となる。この多型は、BChEのエキソン4におけるアミノ酸の変化に関連し、結果としてKバリアントとなる。さらにこの多型の文献で使用される前記位置は、異なる配列番号付けのために、1615である。以下の実施例に記載の通り、独立して評価されたBChE遺伝子における5つの各変化とDLBの間に、特異的な関連は発見されなかったが、驚くべきことに、これらの変化を組み合わせた場合に、DLBに関する特異的な情報が得られた。従って、本願発明の1つの実施態様は、対象の生物学的サンプルにおいて、ブチリルコリンエステラーゼ遺伝子における以下の変化またはその連鎖不均衡における多型の遺伝子型を決定することを含む、DLBを診断するinvitroの方法を提供する。本願発明の特定の実施態様において、前記方法はさらに、BChE遺伝子における以下の変化またはその連鎖不均衡にある多型:位置3687、4206および4443の多型部位、の遺伝子型の決定を含む。以下の実施例に記載の通り、AD死後サンプル、純粋型DLB、通常型DLBおよび対照と、223人のADおよび160人の対照の対象から得られた臨床的に診断されたサンプルを分析した。結果として、3タイプの遺伝子マーカーを記載する。最初に、二つの多型部位における特異的な変化の同時発生は、一方のアレルの位置4780から4886における7つのチミンが存在すること、および、一方のアレルの位置68974においてグアニンが、他方のアレルにアデニンが存在することよって特徴づけられる。この同時発生は、ADに対するDLBの差異的な診断のための特異的な遺伝子マーカーである。誤診断の可能性を有する約50のDLB患者が、このマーカーの使用により救済され得る。本願発明の他の実施態様は、遺伝子型の組み合わせ、AAAGCC8Kである、2番目の遺伝子マーカーに関する。それは、位置3687、4206、4443、4780から4786および68974の多型部位の特異的な遺伝子型によって構成される。認知症患者におけるこの遺伝子型の組み合わせの決定は、臨床的なDLB診断を提供する差異的な診断マーカーとしての役割を果たすが、無症状の個人におけるDLBの早期の診断マーカーとしての機能も果たしうる。本願発明のもうひとつの実施態様は、遺伝子型の組み合わせ、AAAAC77KWである、3番目の遺伝子マーカーに関する。それは、位置3687、4206、4443、4780から4786および68974の多型部位の特異的な遺伝子型によって構成される。認知症患者におけるこの遺伝子型の組み合わせの決定は、臨床的なDLB診断を提供する差異的な診断マーカーとしての役割を果たすが、無症状の個人におけるDLBの早期の診断マーカーとしての機能も果たしうる。有利なことに、DLBの多数の不均一性の範囲内で実施例に従い、本願発明の方法により、さもなければADとして診断されたDLB症例の45~60を差異的に検出することが可能になる。臨床現場において診断することが困難であるこの割合の患者は、疾患の始まりから正しい診断を受けることが可能である。疾患に対する特異性は99である。これは、DLBに対する最初の特異的なマーカーであることを意味している。現在まで、利用可能な最新の道具は、臨床現場においてDLBを特異的に同定することは不可能であった。この方法において、対象はADと診断された際に、ADにおける精神的症状に対して最も適切な治療である神経弛緩薬による治療を受けたが、50より多くのDLB患者はこの種類の治療に対して、多くの症例で死亡を引き起こす薬害反応を示した。本願発明の方法は、医学界が、DLBに罹患した患者に対して、誤った治療の危険性なしに適切な治療を適用することを可能にするため、重要である。従って、本願発明の方法を適用すると、DLBの診断の特異性が増大すると共に、神経弛緩薬による治療の薬害効果によって引き起こされる死亡が減少する。さらには、本願発明の方法はDLB患者を特異的に診断することを可能にするため、臨床試験に含まれるべき患者の明確な群を得ることが可能になった医療における診断により、外見的な症状、兆候および潜在的な生理学的生化学的症例によって疾患または状態を認識する行動または段階を意味する。本願明細書中の意味では、BChE遺伝子における変化は、野生型を考慮して、ヌクレオチド配列における任意の構造的変化を意味する。変化の例は、単一ヌクレオチド多型、欠失、挿入、置換またはひとつまたは複数のヌクレオチドの重複、および、ヌクレオチド上の化学的修飾を含み得る。本願明細書中の遺伝子型を決定することにより、所与の位置におけるヌクレオチドを同定することを意味する。本願明細書における1つのアレルにおける所与のヌクレオチドは、対象は、その遺伝子におけるそのヌクレオチドがヘテロ接合体であることを意味し、両アレルにおいては、そのヌクレオチドがホモ接合体であることを意味する。本願発明に従い、前記方法はBChE遺伝子上で示された変化を決定することだけでなく、同じ情報を与えうる前記変化での連鎖不均衡にある多型を決定することも含む。集団遺伝学においては、連鎖不均衡は、必ずしも同じ染色体上ではない2つまたはそれ以上の位置におけるアレルの非作為的相関である。本願発明の診断方法に従い、DLBの分析は以下の通りであり得る認知症の始まりが疑われる患者およびまたは決定的ではない臨床性家族性評価を有する患者が、前記のBChE遺伝子の変化を決定する遺伝子試験によって診断され得る。DLB特異的な遺伝子型を検出する場合、追加的な試験または検査は、正しくDLBを診断するために必要ではない。遺伝子型決定の直接的な利用は、日常的な臨床現場において、資金の重要な節約を意味する。本願発明の方法は、以下の疑われる診断において役立つ推定AD対潜在DLB潜在AD対推定DLB潜在AD対潜在DLB推定AD対推定DLB推定AD対潜在AD潜在DLB推定DLB。医師は、個人および家族の病歴を対象とし、実施された任意の神経科学的、精神医学的および実験室的試験の結果を組み合わせた、多くの患者インタビューに基づいて潜在ADを診断する。患者が記憶の減弱の段階的進行を訴える場合、および、記憶喪失を説明し得る任意のその他の状態を発見できない場合、医者はADを予期する傾向にある。医者はうつもしくは甲状腺機能低下などの病期、脳卒中によって引き起こされる神経科学的障害または記憶喪失の原因となり得る任意の医薬を探す。原因となりうる任意の病気を明らかにできない場合、ADの可能性があるという決定に繋がる。推定ADは、潜在アルツハイマーを越えた次の段階であり、医者が、患者が疾患を有していることを比較的確信していることを意味する。有利なことに、本願発明の方法は、生検などの侵襲的な方法この場合においては脳組織マイクロ生検、でサンプルを得る必要なくDLBの診断を可能にする。本願発明の方法は遺伝子試験であり、身体の任意の細胞型に利用できるため、血液などの、対象から分離した任意の生物学的サンプルで実施される。その他の実施態様において、遺伝子型の決定は、プライマー特異的多重PCR技術に続く検出、多重アレル特異的プライマー伸長、マイクロアレイに基づく方法およびダイナミックアレル特異的ハイブリダイゼーションからなる群より選択される技術の1つによって行われる。特定の実施態様においては、プライマー特異的多重PCRに続く検出によって行われる。ポリメラーゼ鎖反応は、invitroでの核酸の増幅のために最も広く使用されている方法である。PCRは、標識したプローブによる標的遺伝型の存在の検出が増幅に対してほとんど即時的である、リアルタイムPCRであり得る。標的多型の増幅は、プライマー特異的多重PCRと、続くポリアクリルアミドゲル電気泳動による検出または遺伝学的分析装置による分析によって実施され得る。あるいは、様々なPCR反応と、続くアガロースゲル電気泳動により、または、シーケンシングにより実施され得る。遺伝子型の決定は、AlleleSpecificPrimerExtentionによって実施され得る。これは、1つの試験管内での多重SNPのアッセイに使用し得る配列特異的酵素反応技術である。前記ASPE法は、2つの段階、標的遺伝子型を決定する酵素反応と、続く、検出のための固体微粒子表面での捕捉を伴う。溶液段階の動態を利用すると、この技術では配列標識された微粒子を、新しい鋳型を検出するために使用することができる。これは、アレル特異的なオリゴヌクレオチドに付着したふさわしいキャプチャー配列を利用して行われる。任意で、検出は、任意のメカニズムで配置されたオリゴヌクレオチドで作られたDNAバイオチップマイクロアレイによって、insituで合成されたオリゴヌクレオチドで作られたDNAチップによってフォトリソグラフィーまたは任意の他のメカニズムによって、実施され得る。標的の増幅または完全な減少の必要なく、全ヒトゲノムDNAの多重SNPの遺伝子型決定を可能にするマイクロアレイに基づいた方法は、BChE変化の遺伝子型決定のために使用され得る。この直接的なSNP遺伝子型決定手法は、酵素が一切必要なく、金ナノコロイドプローブの高い感受性に依存している。特異性は、アレル特異的な表面固定化キャプチャープローブおよび遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド機能化金ナノコロイドプローブによる、標的への2つの連続的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに由来する。前記アッセイのフォーマットは、単純で、迅速で、しっかりしていて、ポイントオブケアで多重SNPをプロファイルするための安定性を示している。さらには、遺伝子型の決定は、幾つかの実験室におけるスループットSNP遺伝子型決定のための基礎を意味する、ダイナミックアレル特異的ハイブリダイゼーションによっても実施され得る。DASHの核となる反応原理は、DNA変性の過程におけるアレル特異的な差異のリアルタイム追跡である。これを達成するため、最初にオリゴヌクレオチドプローブを、本質的にすべての遺伝子型決定方法で必要な要素である、ターゲットDNAにハイブリダイズさせる。標的DNAは、固相表面に固定化されたPCR産物のうちの一方の鎖を含み、標的アレルのうちの1つと相補的である単一プローブが使用される。このアッセイの概念は非常に正確であることが示された。第二の態様において、本願発明は、BChE遺伝子における変化の遺伝子型を決定するための適切な手段を包含する、前記に定義の方法を実施するためのキットを提供する。特定の実施態様では、前記キットはプライマー特異的多重PCRによる増幅を実施するための適切な手段を含む。本願発明によって提供されるキットは、日常的な臨床現場において、DLBに罹患している患者を同定するために使用され得て、従って、前記患者はADに罹患している他の患者と区別される。本願発明のキットを使用すると、医療従事者は、より個人に合わせた、危険性に適合した治療戦略を、DLBに罹患している患者に利用することが可能になる。他の実施態様においては、本願発明は前記で定義されたキットのDLB患者の診断のための使用に関する。本願発明はまた、レビー小体認知症を診断するためのマーカーとして使用される、位置4780から4786のポリチミン、位置3687の多型部位;位置4206の多型部位;および位置4443の多型部位から成る群より選択された、BChE遺伝子の1つまたは複数の変化と組み合わせた、位置68974の多型部位の使用に関する。特定の実施態様において、位置68974の多型部位は、位置4780から4786のポリチミン領域との組み合わせにおいて使用される。他の実施態様において、位置68974の多型部位は位置4780から4786のポリチミン領域、ならびに位置3687、4206および4443の多型部位との組み合わせにおいて使用される。本願発明はまた、BChE遺伝子における前記の変化の遺伝子型の分析により、対象が神経弛緩薬による治療に応答するか否かを決定する方法に関する。前記方法は、患者がDLBに罹患しているのかADに罹患しているのかを決定することができるので、適切な治療を施すことを可能にする。本願明細書と特許請求の範囲にわたり、包含するという単語および、包含しているなどの語に類するものは、その他の技術的特徴、添加物、要素またはステップを除外することを意図していない。本願発明のさらなる目的、利点および特徴は、本願明細書の審査において当業者に明らかであり、本願発明の実施によって学習され得る。さらには、本願発明は、本願明細書に開示された、特定のおよび好ましい可能性のあるすべての態様の組み合わせの範囲に及ぶ。以下の実施例および図面は、例示によって提供され、本願発明を限定することを意図していない。臨床的および神経病理学的診断を受けた死後前頭葉サンプルは、地方倫理委員会で設立された規則に則って、バルセロナ大学の神経組織バンクおよびBellvitgeInstituteofNeuropathologyBrainBankにより促進された。それらは、一般的なレビー小体疾患である24の脳、純粋レビー小体認知症である12の脳は、ADである26の脳、および対象である23脳に対応する。神経病理学的試験は、すべてのADの脳がADBraakBraakステージVIを呈することを明らかにした。BraakBraakは、脳におけるADを評価定量化するための病期分類である。それは、神経病理学者によって、アミロイド斑および神経原線維変化の密度を評価するために使用される。ADは、BraakBraakに従って、IIV神経原線維変化、ACアミロイド斑、と病期分類する。cLBDサンプルのうちの2つはBraakBraakステージIIIに対応し、3つはBraakBraakステージIVに対応し、残り19サンプルはステージVおよびVIに対応した。pDLBの脳においては、BraakBraakステージ0からIIが検出され、対照群においては、AD関連の変化はなかった。ADの脳も対象の脳もいずれも、PD関連病変を示さなかったが、すべてのpDLBとcDLBは、BraakBraakの分類に従うと、PD関連変化に対応するステージ5および6を示した。NINCDSADRDAおよびDSMIV基準に従って、DepartmentofNeurologyofourHospitalGermansTriasiPujolにおいて診断された、223人のAD患者より血液サンプルを得た。さらに、年齢をマッチさせた対照対象は59人であった。追加の実施態様において、160人の年齢をマッチさせた対照対象を鰓安打。この調査は、前記Hospitalの倫理委員会の承認後、インフォームドコンセントへのサインを得て行った。凍結脳サンプル由来のDNAは、TRIReagentを使用して、製造者の手引書に従って抽出した。TRIReagent溶液は、単相の溶液中でフェノールおよびグアニジンチオシアネートと組み合わせ、RNA、DNAおよびタンパク質を同じサンプルから連続的に抽出するために使用する。純度および濃度を分光光度法で決定した後、DNAサンプルを使用時まで4°Cで保存した。血液からのDNA抽出は、ガラスフィルター膜状へのDNA結合に基づいた標準的な手法によって実施した。BChEプロモーター配列は、約5000bpより構成されているため、配列分析のために3つのオーバーラップPCR断片を増幅した。PCR1では、位置1869から位置1031におよぶ838bpの断片を得た。PCR2においては、位置1152から315におよぶ837bpの断片を、そしてPCR3においては、位置473から位置231までにおよぶ688塩基対の断片を得た。PCR反応は、最終体積15μlで、17mMのMgCl2、200μMの各dNTP、2pmolの各プライマー、1unitのEcoTaqDNAポリメラーゼおよび約300ngのDNAを含有していた。標準的なPCRプログラムは、PCR1に対するアニーリング温度は58°C、PCR2および3に対するアニーリング温度は60°Cで、PCR1は30サイクル、PCR2および3は35サイクルで構成された。PCR産物を、ExoSapITkitを使用して精製した。シーケンス反応はBigDye、10pmolμlの各プライマーおよび35μgの精製PCR産物で行った。サイクルシーケンシングおよびDNA沈殿の後、ABIPRISMTM3100にて配列を得た。BChE遺伝子のプロモーター領域において、4つの新しい多型を発見した。それらのうち3つは、良く知られたKバリアント多型と同様で、mutationspecificPCRを使用して:A3687G、A4206G、C4443TおよびBChEKにおいて調査された。最終体積15μlの各PCR反応は、17mMのMgCl2、200μMの各dNTP、2pmolの3つの各プライマー、1ユニットのEcoTaqDNAポリメラーゼおよび300ngのDNAを含有した。35サイクルの標準的なPCRプログラムで、A3687G、BChEKについてはアニーリング温度62°C、A4206G、C4443Tについては57°Cで増幅を行った。得られたPCR断片を、高分離能アガロースゲルにて分離した。BChEA3867G多型のAアレルは153bpの断片であり、Gアレルは133bpの断片であった。Kアレルは149bpの断片であり、Kバリアント多型に由来する、野生型の対応するアレルは、169bpのバンドであった。BChEA4206G多型のAアレルは124bp長で、Gアレルは104bpであった。最後に、C4443T多型については、Tアレルは145bpの断片に対応し、Cアレルは125bpの断片に対応した。PolyT多型はただ一つのヌクレオチドによって異なる断片サイズで構成された。その遺伝子型決定は、フッ化クロム標識プライマーを用いたABIPRISM3100でのキャピラリー電気泳動によって達成された。前記PCRは、30サイクルのプログラムを使用する標準的条件下で行った。前記7Tアレルは、8Tアレルを表す196bpおよび197bpの断片を生じた。対応分析FacultyofSocialandBehavioralSciencesLeidenUniversityTheNetherlandsにより、神経病理学的に診断された患者群についての対応表が得られた。両患者群に対する遺伝子型の組み合わせの分布は、SSPSversion110にて計算した。最初に、臨床的診断および神経病理学診断の間の一致を、NeurologicalTissueBankから得られたサンプルにおいて分析した。AD患者の100が、臨床的および神経病理学的診断を同時に受けていたのに対して、pDLB患者の42がDLBの診断を受けており、cLBD患者では臨床的にDLBの診断を受けたのはわずか17であった。一方で、彼らの62がADとして診断され、21は他の認知症関連疾患であると診断された。この観察結果は、cLBDの診断基準がな不足していることと大いに関連している。BChEKバリアントは、位置68974、WおよびaアレルKと名付けられたgアレルにおける、gからaへの単一のヌクレオチド置換で構成される。この分析の興味深い発見は、cLBDばかりでなく、pDLDおよびADにおいても、対照と比べてKアレル保有遺伝子型が過剰に出現していることであった。さらなる遺伝子型分析では、KW遺伝子型はADおよび対照と似た頻度で存在すること、pDLBではわずかに高いが、cLBDサンプルの約3分の1がKW遺伝子型保有者であることが明らかになった。調査サンプルにおいてはHバリアントもJバリアントも存在しなかったが、Aバリアント保有遺伝子型は、異なる疾患において非常に低い頻度で発見された。BChEプロモーターシーケンシングにより、以前は記載されていなかった4つの多型の存在が明らかになった。それらのうち3つは、単一のヌクレオチド変化であった:位置3687においてAがGに変化した位置4206においてAがGに、位置4443においてCがT置換された。4つめの多型は、様々な長さのpolyT配列に対応し、位置4780から4786の間に位置していた。C4443TおよびBChEKにおいて調査した。同定された二つのアレルのうち、一方は7つのTによって構成され、他方は8つのTによって構成されていた。興味深いことに、8Tアレルは共通のエキソン4の多型のKアレルによって分離された。多型が疾患特異的な関連性を有するか否かを解明するため、神経病理学的に診断された、cLBD、pDLB、ADおよび対照を含む脳サンプルにおいて、4つのプロモーター多型すべてについてアレルおよび遺伝子型の頻度を決定した。まず、多型を独立して分析し、その後さらに遺伝子型の組み合わせを試験した。A3687G多型の調査では、ADにおけるAA遺伝子型が、cLBD、pDLBおよび対照と比較して約3倍増大していることが明らかになった。一方、A4206G多型に対応するGアレル保有遺伝子型は、野生型と比較して、cLBD、pDLBとADで蓄積していた。Gアレル保有遺伝子型の蓄積は疾患特異的ではなかったが、対照群においてはGアレル保有遺伝子型がほとんどないことから、この蓄積はある程度重要であるように思われる。C4443T多型に対応するCC遺伝子型は、cLBDおよび対照と比較する際、pDLBでは非常に低い頻度で存在する。逆に、TC遺伝子型の頻度は、ADと比較して、pDLBおよびcDLBの両方においてはほとんど2倍に増大し、対照よりも有意に高かった。8Tアレル保有遺伝子型の頻度は、対照と比較してcLBD、pDLBおよびADにおいて約2倍に増加していたが、これらの差は有意ではなかった。PolyT77KバリアントKW遺伝子型の組み合わせBChE遺伝子型の独立した分析で、疾患間の重要の差異は明らかにならなかったあと、2つの多型によって構成されるすべての遺伝子型の組み合わせの分析で、DLBにおいて特異的にKWpolyT77遺伝子型の同時発生することが明らかになった。この遺伝子型の組み合わせはAD患者および対照には存在しなかったが、その頻度はcLBD群で03、pDLB群で017であり、DLBでの一般頻度025を構成していた。対応分析4つのプロモーターおよびKバリアント多型によって構成されるGenCombの分布、頻度および特異性のさらなる分析を調査した。これらGenCombの対応分析は、cLBD、ADおよび対照間と、cLBDおよびAD間の、BChEに基づいた遺伝的差異を明らかにした。これらの差異は四象限のダイアグラムで明らかに示され得た。対照群が第一及び第二次元の負の象限内に位置する一方で、cLBDは第一次元の負の象限および第二次元の正の象限に位置し、ADは両次元の正の象限に位置していた。これらの結果は、3つの群はBChE遺伝的特徴に関して関連がないこと、および疾患特異的GenCombの存在に対応することを強く示唆した。共通遺伝子型組み合わせまず、総合的な分析により、31の異なるGenCombの存在が明らかになった。それらの多くは1つまたは2つのサンプルにのみ存在したため、その頻度は非常に低かった。もっとも頻度が高いGenCombは、すべての多型のホモ接合性野生型によって構成され、全サンプルの176を示し、すべての群に同じ頻度で存在した。他の2つのもっとも頻度の高いGenCombも、4つすべての群に存在したため非特異的であった。ADおよび対照とは対照的に、両方のLB認知症のタイプでは、BChE遺伝的特徴に関して、最も不均一な疾患であった。興味深いことに、ADは、両DLBおよび対照よりも疾患特異的なGenCombによって特徴づけられた。疾患特異的遺伝子型組み合わせ疾患によって分析した際、二つの重要な疾患特異的GenCombが検出された。一方は、GenCombAAAATT77WWで、ADサンプルにのみ、比較的高い頻度029で存在した。関連したGenCombAAAATT77KKもひとつのADサンプルに存在し、疾患特異性の基礎となっていた。polyT8TアレルはKアレルと同時分離するという事実は、関連するものとしてGenComb9~11が成立することおよび共通のGenCombAAAGCC8Kとしてそれらを定義することを可能にした。このGenCombは、cLBDで発見されるもっとも頻度が高い疾患特異的GenCombであった。3つの関連のないpDLB特異的GenCombは008という低い頻度であった。4つのGenCombは対照に特異的に発見された。それらのうち2つはは関連があったが、その頻度は01を超えなかった。臨床診断されたサンプルにおける遺伝子型組み合わせの分析神経病理学的に診断された死後のAD、DLBおよび対照サンプルの調査によるデータを確認するため、我々は230人のAD患者群と59人の対照群を調査した。AD患者は1998年から2002年の間に診断されていた。臨床的DLB診断の最新のガイドラインは2005年に成立しており、これらAD患者の10から25は誤診断されたDLB患者である可能性があると予想され得る。PolyT77KバリアントのKW遺伝子型の組み合わせバリアントKとPolyT遺伝子型の同時発生の分析により、AD群および対照群の両方におけるKWpolyT77遺伝子型の同時発生の頻度と類似していることが明らかになった。それにもかかわらず、KW77遺伝子型を保有する42人の患者の病歴は改正され、42人の患者にDLB診断に適合する兆候を呈した。遺伝子型KW77の同時発生は、患者および対照で同じ頻度で存在したが、ADとDLBを遺伝学的に区別する特異性の上昇によって特徴づけられた。AD患者の20~40が誤診断されたDLB患者であることを考慮すると、KW77遺伝子型の疾患特異的頻度は50よりも多くまで増大していた。第2のDLB特異的BChE遺伝子型組み合わせの同定BChE遺伝子発現分析の結果のために、臨床サンプルにおけるすべての遺伝子型組み合わせの再分析を実施した。77KWの遺伝子型の組み合わせの保有者は、AD群および対照群の両方に同じ頻度で発見された。代わりに、GenCombAAAAC77KWがAD群の11人の患者および対照群の2個体で存在した。病歴の改正は、DLBに適合するこれらすべての兆候を明らかにした。われわれのAD群20~40が実際はDLB患者であることを考慮すると、GenCombAAAGCC8Kと同様に、AAAAC77KW頻度は12~25である。AAAAC77KWの特異性は987であり、その感度は30以下である。その後、両方のGenCombを組み合わせた場合、BChE遺伝子型組み合わせ試験は、特異性968、感度60まででDLB症例の検出が可能になった可能性がある。対応分析臨床的に診断されたサンプルを、AD群および対照群の2つの群によってしか示していなかったので、対応分析の結果を分割表で得た。分析される遺伝子型の組み合わせの範囲内に含まれる5つの多型を考慮すると、289個体から構成されるサンプルでわずか25の異なる遺伝子型の組み合わせしか発見されなかったのは非常におどろくべきことである。検出されたすべての遺伝子型の組み合わせの64は、神経病理学的に診断されたサンプル中においても観察された。表8の共通の遺伝子型5つの最も頻度が高い遺伝子型の組み合わせは頻度034の組み合わせ25、頻度016の組み合わせ19,頻度010の組み合わせ15、頻度010の組み合わせ16、および最後に、頻度008の組み合わせ21、であった。最も頻度が高い遺伝子型の組み合わせは、両方:神経病理学的および臨床的サンプル、で同じであった。さらには、他の2つの遺伝子型の組み合わせは、両サンプルにおいて最も頻度が高く同時に起こった。表8の疾患特異的遺伝子型の組み合わせ初期にDLBおよびAD特異的であると検出されたGenCombnoの分布を分析し、我々は両方についてはるかに低く表現することを発見した。GenCombAAAATT77WWがADサンプルにおいてわずか2しか存在しなかった一方で、対照群においては33検出された。関連するGenCombAAAATT77KKはAD対照群のわずか1つのADサンプルでのみ発見された。GenComb9~11は神経病理学的なサンプルのGenCombと同時発生し、さらに共通GenCombAAAGCC8Kとして定義された。このGenCombは、AD群にのみ006の頻度で存在した。約8年前、DLB診断の新しいガイドラインが成立するよりもはるかに前は、AD患者は臨床的に診断されていたことを考慮し、GenCombAAAGCC8Kを保有する13人の患者の臨床的病歴を改正した。13人の患者すべてが、特異的なDLBマーカーであるAAAGCC8Kと共同し、潜在または推定DLBに適合する兆候を示した。さらに、AD患者群の20~40が誤診断されたDLB患者であることを考慮する場合、疾患特異的AAAGCC8Kの頻度は増大し、15~28の範囲になるだろう。表10の共通する遺伝子型の組み合わせ5つの最も頻度が高い遺伝子型の組み合わせは頻度033の組み合わせ29、頻度015の組み合わせ22、頻度012の組み合わせ18、頻度011の組み合わせ19、および最後に、頻度007の組み合わせ25、であった。最も頻度が高い遺伝子型の組み合わせは、両方:神経病理学的および臨床的サンプル、で同じであった。さらには、他の2つの遺伝子型の組み合わせは、すべてのサンプルにおいて最も頻度が高く同時に起こった。疾患特異的遺伝子型の組み合わせ初期にDLBおよびAD特異的として検出されたGenCombの分布を分析し、我々は両方についてはるかに低く表現することを発見した。GenCombAAAATT77WWがADサンプルにおいてわずか2しか存在しなかった一方で、対照群においては31検出された。関連するGenCombAAAATT77KKは、わずか1つのADサンプルでのみ発見された。GenComb9~11は神経病理学的なサンプルのGenCombと同時に起こり、さらに共通GenCombAAAGCC8Kとして定義された。このGenCombは、AD群には006の頻度で、対照群には001の頻度で存在した。約8年前、DLB診断の新しいガイドラインの成立よりもはるかに前は、AD患者は臨床的に診断されていたことを考慮し、GenCombAAAGCC8Kを保有する13人の患者の臨床的病歴を改正した。13人の患者すべてが、特異的なDLBマーカーAAAGCC8Kと共同し、潜在または推定DLBに適合する兆候を示した。さらに、AD患者群の20~40が誤診断されたDLB患者であることを考慮する場合、疾患特異的AAAGCC8Kの頻度は増大し、15~28の範囲になった。遺伝子型の組み合わせに依存したDLBにおけるBChE発現RNA抽出および逆転写RNA抽出には、TRIReagentを製造者の手引書に従って使用した。簡潔に述べると、100mgの組織サンプルを、10mlのTRIReagent中で、無菌ピストンを使用して15mlチューブ中でホモジナイズした。ホモジネートを室温で5分間インキュベートし、4°C、12000gで10分間遠心分離し、不溶性材料および高分子量DNAをペレットにした。分離段階の後、RNAをイソプロパノールで沈殿させ、適切な容量のDEPC処理水で再懸濁した。RNA量は分光光度法でA260において決定し、RNA純度は、260nmと280nmの吸光度比率から確定した。RNA品質は、Agilent2100Bioanalyzerを使用して確定した。RIN値が6より高いサンプルのみ、使用時まで80°Cで保存した。第一鎖cDNA合成はReadytogoYouPrimeFirstStrandBeadsを使用して行った。2mgのRNAをランダムヘキサマーおよびFirstStrandBeadsと共に37°Cで1時間インキュベートした。結果として得られたcDNAを直ちにPCRに使用するか、使用時まで-20°Cで保存した。リアルタイムPCRBChEmRNAの相対的発現を、RotorGene6000を使用して決定した。QuantiTectSYBRGreenPCRKitをプライマーダイマー含量が最少となるように使用した。15mlの反応はさらに16pmolの各プライマーおよび1mlのcDNAを含有していた。相対BChE量を調査するため、2つの、ハウスキーピング遺伝子であるベータアクチンおよびベータグルコシターゼも分析した。15分間の変性ステップの後、続いて全てのBChE遺伝子、GUSおよびベータアクチンに対して56°Cで30秒アニーリングし、72°Cの伸長ステップの間にエンドポイントの蛍光データを得た。最終的なメルティング分析は、全ての産物についてランし、特異的な増幅を決定した。相対的発現データは、同じPCR効率であるとの仮定に基づくデルタデルタCt法で相対的遺伝子発現を分析することによって達成したmethodNatProtoc2008vol3pp11018。従って、各遺伝子およびアイソフォームの異なるプライマー対を試験し、同じ効率で増幅する100から150塩基対の長さの断片を得た。PCR効率は各ランによって異なるので、標準曲線は最初のランだけではなく各ランに含まれた。正しい標準曲線である同じ効率のランのみが、さらなる分析に適していた。段階的に希釈された同じcDNA対照サンプルの増幅によって、標準曲線が生じた。すべてのアッセイは、2度行われ、独立して再現性を確認し、可能性のある誤差を最少にし、各ランにさらに陰性対照を含んだ。結果遺伝子型組み合わせの存在に依存した、BChEの脳における相対的発現レベルの分析により、遺伝子型組み合わせ77KWの保有者は脳におけるBChE発現が13未満に減少していること;および、遺伝子型組み合わせAAAGCC8Kの保有者は、BChE発現が50未満まで減少していることが示された。このことにより、すでにBChEが減少しているためにコリンエステラーゼおよび阻害因子、並びに、具体的にはブチリルコリンエステラーゼ阻害因子での治療に応答しない可能性があるDLBのサブグループが定義される。[参考文献]"