"センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子、あるいは順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、が挿入されたセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するための組成物。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる、請求項1に記載の組成物。該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、請求項2に記載の組成物。多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入細胞の製造方法であって、センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子、あるいは順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、が挿入されたセンダイウイルスベクターを細胞に導入することを含む方法。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入されたもう一つのセンダイウイルスベクターを該細胞に導入することをさらに含む、請求項4に記載の方法。該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、請求項5に記載の方法。センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子、あるいは順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、が挿入されたセンダイウイルスベクター。請求項7に記載のセンダイウイルスベクターのゲノムまたはアンチゲノムをコードする核酸。請求項7に記載のセンダイウイルスベクターおよびMYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するためのキット。該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、請求項9に記載のキット。本発明は、多能性幹細胞の誘導において用いられる新しい遺伝子導入用組成物およびその使用を提供することを課題とする。また本発明は、多能性幹細胞の誘導において用いられる新しい遺伝子導入ベクターを提供することを課題とする。本発明は具体的には、多能性幹細胞を誘導するためのリプログラミング因子をコードする遺伝子が特定の配置で組み込まれたセンダイウイルスベクター、および該ベクターを含む、多能性幹細胞の誘導において用いられる遺伝子導入用組成物およびその使用を提供することを課題とする。本発明者らは、リプログラミング因子であるKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を、センダイウイルスのゲノム上に配置したセンダイウイルスベクターを用いると、これらの3つの遺伝子を別々のベクターで導入するよりも有意に高い効率でiPS細胞を誘導することが可能であることを見出した。また、このベクターを、MYC遺伝子を発現するベクターを組み合わせて用いた場合にも、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を別々のセンダイウイルスベクターに搭載させるよりも、顕著に高い効率でiPS細胞を誘導できることを見出した。また、MYC遺伝子の代わりにGlis1遺伝子MaekawaetalNature4742252292011を発現するベクターを組み合わせてもよい。特にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で1つのセンダイウイルスベクターに挿入したベクターを用いることにより、iPS細胞の誘導効率を有意に上昇させることが可能である。また、MYC遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子のすぐ上流マイナス鎖RNAゲノムのすぐ3側に挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いた場合には、図1に示したように、極めて高い割合でiPS細胞のコロニーが出現した。また、OCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で1つのセンダイウイルスベクターに挿入したベクターを用いる場合は、KLF遺伝子を搭載するセンダイウイルスベクターをさらに組み合わせることができる。このようにKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を1つのセンダイウイルスベクターに挿入したベクターを用いることにより、iPS細胞の誘導効率を有意に上昇させることが可能である。すなわち本発明は、多能性幹細胞の誘導において用いられる新規な遺伝子導入用組成物およびその使用、および遺伝子導入ベクター等に関し、より具体的には請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の2つまたはそれ以上の任意の組み合わせからなる発明も、本明細書において意図された発明である。すなわち本発明は、1センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子、あるいは順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、が挿入されたセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するための組成物、2MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる、1に記載の組成物、3該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、2に記載の組成物、4多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入細胞の製造方法であって、センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子、あるいは順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、が挿入されたセンダイウイルスベクターを細胞に導入することを含む方法、5MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入されたもう一つのセンダイウイルスベクターを該細胞に導入することをさらに含む、4に記載の方法、6該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、5に記載の方法、7センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子、あるいは順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、が挿入されたセンダイウイルスベクター、87に記載のセンダイウイルスベクターのゲノムまたはアンチゲノムをコードする核酸、97に記載のセンダイウイルスベクターおよびMYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するためのキット、10該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、9に記載のキット、に関する。なお、本明細書に記載した任意の技術的事項およびその任意の組み合わせは、本明細書に意図されている。また、それらの発明において、本明細書に記載の任意の事項またはその任意の組み合わせを除外した発明も、本明細書に意図されている。また本発明に関して、明細書中に記載されたある特定の態様は、それを開示するのみならず、その態様を含むより上位の本明細書に開示された発明から、その態様を除外した発明も開示するものである。センダイウイルスベクターは宿主ゲノムに組み込まれる懸念がない安全性に優れたベクターであって、このベクターを用いてより高い効率でiPS細胞を誘導することができれば極めて実用性が高い。本発明はセンダイウイルスベクターによるiPS細胞の誘導効率を一段と上昇させることを可能とすると同時に、複数のリプログラミング遺伝子を一つのセンダイウイルスベクターに集約することを実現するもので、iPS細胞の誘導操作の簡略化および再現性向上にも貢献する。以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。本発明は、核リプログラミング因子nuclearreprogrammingfactorsKLF、OCT、およびSOX遺伝子が特定の配置で組み込まれたセンダイウイルスベクター、および該ベクターを用いて、分化した細胞のリプログラミングの誘導において該リプログラミング因子遺伝子を導入する方法、特に体細胞からの多能性幹細胞の製造において該リプログラミング因子の遺伝子を導入する方法を提供する。具体的にはこの方法は、少なくとも3つのリプログラミング因子をコードする遺伝子、すなわちKLF、OCT、およびSOXをコードする遺伝子が、この順番、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で組み込まれたセンダイウイルスベクターを、体細胞等の分化した細胞に接触させる工程を含む方法である。より具体的には本発明は、細胞のリプログラミングにおいて該リプログラミング因子遺伝子を導入するための方法であって、その必要のある細胞に、当該センダイウイルスベクターを用いて該3つのリプログラミング因子遺伝子を導入することを含む方法、およびその使用のための当該センダイウイルスベクターを含む組成物を提供する。本発明において多能性幹細胞とは、動物の胚盤胞期の胚の内部細胞塊より作られる幹細胞またはそれと類似した表現型を有する細胞を言う。具体的には、本発明において誘導される多能性幹細胞は、ES様細胞の指標であるアルカリホスファターゼを発現する細胞である。また好ましくは、多能性幹細胞は、培養することにより、細胞質に比べ核の容量の比率が高い細胞からなる扁平なコロニーを形成する。培養は、適宜フィーダーと共に培養してもよい。またMEFなどの培養細胞が数週間で増殖が停止するのに対し、多能性幹細胞は長期間の継代が可能であり、例えば3日ごとの継代で15回以上、好ましくは20回以上、25回以上、30回以上、35回以上、または40回以上継代しても、増殖性が失なわれないことにより確認することができる。また多能性幹細胞は、好ましくは内在性のOCT34またはNanog、より好ましくはその両方を発現する。また多能性幹細胞は、好ましくはTERTを発現し、テロメラーゼ活性テロメリックリピート配列を合成する活性を示す。また多能性幹細胞は、好ましくは三胚葉内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化する能力例えばテラトーマ形成および/または胚様体形成においてを持つ。より好ましくは、多能性幹細胞は、胚盤胞に移植することにより生殖系列キメラを生成する。Germlinetransmissionが可能な多能性幹細胞は、germlinecompetentな多能性幹細胞と言う。これらの表現型の確認は、周知の方法により実施することができるWO200769666IchisakaTetalNature44831372007。また本発明において分化したとは、それ以前よりも分化段階が進んだことを言い、例えば多能性幹細胞よりも分化していることであってよく、複数の細胞系列に分化する能力をまだ持っている状態例えば体性幹細胞など、および最終分化した状態を含む。分化した細胞とは、多能性幹細胞から由来する多能性幹細胞以外の細胞である。分化した細胞は、例えば三胚葉内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化する能力を持たないものであってよい。このような細胞は、初期化reprogrammingされなければ三胚葉を形成する能力を持たない。また分化した細胞は、例えば自身が属する胚葉型以外の細胞を生成できない細胞であってよい。分化した細胞は体細胞であってよく、例えば生殖細胞以外の細胞であってよい。本発明において初期化リプログラミング;reprogrammingとは、ある細胞の分化状態を、それより未分化な状態にすることを言い、例えば分化した細胞が脱分化すること、例えば分化多能性を持たない細胞から持つ細胞、例えば多能性幹細胞を誘導することが含まれる。また本発明において脱分化とは、ある細胞を、より未熟な例えば未分化な状態にすることを言う。脱分化とは、ある細胞が分化して来た最初または途上の状態に戻すことであってよい。また脱分化とは、自身が属する胚葉型以外の細胞を生成できない細胞から、他の胚葉の細胞にも分化できる状態になることであってよい。脱分化には、例えば三胚葉分化能を持たない細胞が、三胚葉分化能を獲得することが含まれる。また脱分化には、多能性幹細胞の生成が含まれる。また本発明において体細胞とは、例えば多能性幹細胞や生殖細胞以外の細胞である。体細胞には、例えば多細胞生物を構成する細胞のうち多能性幹細胞以外の細胞、およびその培養細胞が含まれる。体細胞には、例えば体性幹細胞および最終分化した細胞が含まれる。本発明においてウイルスベクターは、当該ウイルスに由来するゲノム核酸を有し、該核酸に導入遺伝子を組み込むことにより、該遺伝子を発現させることができるベクターである。センダイウイルスベクターは、染色体非組み込み型ウイルスベクターであって、ベクターは細胞質中で発現されるので、導入遺伝子が宿主の染色体核由来染色体に組み込まれる危険性がない。従って安全性が高く、またリプログラミングの完了後にベクターを除去することが可能である。本発明においてセンダイウイルスベクターには、感染ウイルス粒子の他、ウイルスコア、ウイルスゲノムとウイルス蛋白質との複合体、または非感染性ウイルス粒子などからなる複合体であって、細胞に導入することにより搭載する遺伝子を発現する能力を持つ複合体が含まれる。例えばセンダイウイルスにおいて、センダイウイルスゲノムとそれに結合するセンダイウイルス蛋白質NP、P、およびL蛋白質からなるリボヌクレオ蛋白質ウイルスのコア部分は、細胞に導入することにより細胞内で導入遺伝子を発現することができるWO0070055。細胞への導入は、適宜トランスフェクション試薬等を用いて行えばよい。このようなリボヌクレオ蛋白質RNPも本発明においてセンダイウイルスベクターに含まれる。センダイウイルスは、モノネガウイルス目ウイルスの1つでパラミクソウイルスParamyxoviridaeParamyxovirusMorbillivirusRubulavirusおよびPneumovirus属等を含むに属し、一本のマイナス鎖ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖のRNAをゲノムとして含んでいる。マイナス鎖RNAはネガティブ鎖RNAとも呼ばれる。モノネガウイルス目には、パラミクソウイルスパラミクソウイルス科ウイルスの他に、ラブドウイルスRhabdoviridaeVesiculovirusLyssavirusおよびEphemerovirus属等を含む、フィロウイルスFiloviridaeなどの科に属するウイルスが含まれるウイルス第57巻第1号、pp2936、2007AnnuRevGenet321231621998FieldsvirologyfourtheditionPhiladelphiaLippincottRaven130513402001MicrobiolImmunol436136241999FieldVirologyThirdeditionpp120512411996。センダイウイルス以外のパラミクソウイルス科ウイルスの例としては、ニューカッスル病ウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、牛疫ウイルス、ジステンパーウイルス、サルパラインフルエンザウイルスSV5、ヒトパラインフルエンザウイルス123型、オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルス、ラブドウイルス科の水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス等が挙げられ、さらに具体的に例示すれば、例えばSendaivirus、humanparainfluenzavirus1、humanparainfluenzavirus3、phocinedistempervirus、caninedistempervirus、dolphinmolbillivirus、pestedespetitsruminantsvirus、measlesvirus、rinderpestvirus、Hendravirus、Nipahvirus、humanparainfluenzavirus2、simianparainfluenzavirus5、humanparainfluenzavirus4a、humanparainfluenzavirus4b、mumpsvirus、およびNewcastlediseasevirusなどが含まれる。より好ましくは、Sendaivirus、humanparainfluenzavirus1、humanparainfluenzavirus3、phocinedistempervirus、caninedistempervirus、dolphinmolbillivirus、pestedespetitsruminantsvirus、measlesvirus、rinderpestvirus、Hendravirus、およびNipahvirusからなる群より選択されるウイルスが挙げられる。例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、NP遺伝子についてはM29343、M30202M30203M30204M51331M55565M69046X17218、P遺伝子についてはM30202M30203M30204M55565M69046X00583X17007X17008、M遺伝子についてはD11446K02742M30202M30203M30204M69046U31956X00584X53056、F遺伝子についてはD00152D11446D17334D17335M30202M30203M30204M69046X00152X02131、HN遺伝子についてはD26475M12397M30202M30203M30204M69046X00586X02808X56131、L遺伝子についてはD00053M30202M30203M30204M69040X00587X58886を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、NP遺伝子N遺伝子とも言うについては、CDVAF014953DMVX75961HPIV1D01070HPIV2M55320HPIV3D10025MapueraX85128MumpsD86172MVK01711NDVAF064091PDPRX74443PDVX75717RPVX68311SeVX00087SV5M81442およびTupaiaAF079780、P遺伝子については、CDVX51869DMVZ47758HPIVlM74081HPIV3X04721HPIV4aM55975HPIV4bM55976MumpsD86173MVM89920NDVM20302PDVX75960RPVX68311SeVM30202SV5AF052755およびTupaiaAF079780、C遺伝子についてはCDVAF014953DMVZ47758HPIV1M74081HPIV3D00047MVABO16162RPVX68311SeVAB005796およびTupaiaAF079780、M遺伝子についてはCDVM12669DMVZ30087HPIV1S38067HPIV2M62734HPIV3D00130HPIV4aD10241HPIV4bD10242MumpsD86171MVAB012948NDVAF089819PDPRZ47977PDVX75717RPVM34018SeVU31956およびSV5M32248、F遺伝子についてはCDVM21849DMVAJ224704HPN1M22347HPIV2M60182HPIV3X05303HPIV4aD49821HPIV4bD49822MumpsD86169MVAB003178NDVAF048763PDPRZ37017PDVAJ224706RPVM21514SeVD17334およびSV5AB021962、HNHまたはG遺伝子についてはCDVAF112189DMVAJ224705HPIV1U709498HPIV2D000865HPIV3AB012132HPIV4AM34033HPIV4BAB006954MumpsX99040MVK01711NDVAF204872PDPRZ81358PDVZ36979RPVAF132934SeVU06433およびSV5S76876が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。これらのいずれかの遺伝子に由来するウイルス遺伝子を持つセンダイウイルスベクターは、本発明のベクターとして有用である。例えば本発明のセンダイウイルスベクターは、上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列と、90以上、好ましくは95以上、96以上、97以上、98以上、または99以上の同一性を持つ塩基配列を含む。また、本発明のセンダイウイルスベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列と、90以上、好ましくは95以上、96以上、97以上、98以上、または99以上の同一性を持つアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。また、本発明のセンダイウイルスベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列において、10個以内、好ましくは9個以内、8個以内、7個以内、6個以内、5個以内、4個以内、3個以内、2個以内、または1個のアミノ酸が置換、挿入、欠失、およびまたは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。なお本明細書に記載した塩基配列およびアミノ酸配列などのデータベースアクセッション番号が参照された配列は、例えば本願の出願日および優先日における配列を参照するものであって、本願の出願日および優先日のいずれ時点における配列としても特定することができ、好ましくは本願の出願日における配列として特定される。各時点での配列はデータベースのリビジョンヒストリーを参照することにより特定することができる。本発明において用いられるセンダイウイルスベクターは誘導体であってもよく、誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。またセンダイウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。例えばZ株が挙げられるMedicalJournalofOsakaUniversityVol6No1March1955p115。つまり、当該ウイルスは、目的とするリプログラミングを誘導できる限り、天然から単離されたウイルスと同様の構造を持つウイルスベクターであっても、遺伝子組み換えにより人為的に改変したウイルスであってもよい。例えば、野生型ウイルスが持ついずれかの遺伝子に変異や欠損があるものであってよい。また、DI粒子JVirol68841384171994などの不完全ウイルスを用いることも可能である。例えば、ウイルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも1つの遺伝子に変異または欠損を有するウイルスを好適に用いることができる。このようなウイルスベクターは、例えば感染細胞においてはゲノムを複製することはできるが、感染性ウイルス粒子を形成できないウイルスベクターである。このような伝搬能欠損型のウイルスベクターは、周囲に感染を拡大する懸念がないので安全性が高い。例えば、FおよびまたはHNなどのエンベロープ蛋白質またはスパイク蛋白質をコードする少なくとも1つの遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないマイナス鎖RNAウイルスを用いることができるWO0070055およびWO0070070LiHOetalJVirol7465646569。ゲノム複製に必要な蛋白質例えばN、P、およびL蛋白質をゲノムRNAにコードしていれば、感染細胞においてゲノムを増幅することができる。欠損型ウイルスを製造するには、例えば、欠損している遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウイルス産生細胞において外来的に供給するWO0070055およびWO0070070LiHOetalJVirol7465646569。また、欠損するウイルス蛋白質を完全に相補することなく、非感染性のウイルス粒子VLPとしてウイルスベクターを回収する方法も知られているWO0070070。また、ウイルスベクターをRNP例えばN、L、P蛋白質、およびゲノムRNAからなるRNPとして回収する場合は、エンベロープ蛋白質を相補することなくベクターを製造することができる。また、変異型のウイルス蛋白質遺伝子を搭載するウイルスベクターを用いることも好ましい。本発明は、特にウイルス遺伝子に変異および/または欠失を有するセンダイウイルスベクターを用いた、リプログラミングにおける遺伝子導入方法、リプログラムされた細胞の製造方法、組成物、およびキットを提供する。例えば、エンベロープ蛋白質や外殻蛋白質において弱毒化変異や温度感受性変異を含む多数の変異が知られている。これらの変異蛋白質遺伝子を有するセンダイウイルスを本発明において好適に用いることができる。本発明においては、望ましくは細胞傷害性を減弱したベクターを用い得る。細胞傷害性は、例えば細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼLDHの放出を定量することにより測定することができる。例えば細胞傷害性が野生型に比べ有意に減弱化したベクターを用いることができる。細胞傷害性の減弱化の程度は、例えば、ヒト由来HeLa細胞ATCCCCL2またはサル由来CV1細胞ATCCCCL70にMOI感染価3で感染させて3日間培養した培養液中のLDH放出量が野生型に比べ有意に低下したもの、例えば20以上、25以上、30以上、35以上、40以上、または50以上低下したベクターを用いることができる。また細胞傷害性を低下させる変異には、温度感受性変異も含まれる。温度感受性変異とは、低温に比べ、ウイルス宿主の通常の温度例えば37°Cないし38°Cにおいて有意に活性が低下する変異のことである。このような、温度感受性変異を持つ蛋白質は、許容温度低温下でウイルスを作製することができるので便利である。本発明において有用な温度感受性変異を持つウイルスベクターは、例えば培養細胞において32°Cで感染させた場合に比べ、37°Cで感染させた場合に、増殖速度または遺伝子発現レベルが、少なくとも12以下、好ましくは13以下、より好ましくは15以下、より好ましくは110以下、より好ましくは120以下である。本発明において用いられるセンダイウイルスベクターは、リプログラミングを阻害せず、リプログラミング因子によるリプログラミングを誘導または誘導を補助できる限り野生型でもよく、また、好ましくは少なくとも1つ、より好ましくは少なくとも2、3、4、5、またはそれ以上のウイルス遺伝子に欠失または変異を有する。欠失と変異は、各遺伝子に対して任意に組み合わせ導入してよい。ここで変異とは、機能低下型の変異または温度感受性変異であってよく、少なくとも37°Cにおいて、野生型に比べウイルスの増殖速度または搭載するいずれかの遺伝子の発現レベルを好ましくは12以下、より好ましくは13以下、より好ましくは15以下、より好ましくは110以下、より好ましくは120以下に低下させる変異である。このような改変ウイルスベクターを用いることは、特に多能性幹細胞の誘導には有用であり得る。例えば本発明において好適に用いられるセンダイウイルスベクターは、少なくとも2つのウイルス遺伝子が、欠失または変異している。このようなウイルスには、少なくとも2つのウイルス遺伝子が欠失しているもの、少なくとも2つのウイルス遺伝子が変異しているもの、少なくとも1つのウイルス遺伝子が変異しており少なくとも1つのウイルス遺伝子が欠失しているものが含まれる。変異または欠失している少なくとも2つのウイルス遺伝子は、好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子である。例えばF遺伝子を欠失し、Mおよび/またはHN遺伝子をさらに欠失するか、Mおよび/またはHN遺伝子に変異例えば温度感受性変異をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また、例えばF遺伝子を欠失し、MまたはHN遺伝子をさらに欠失し、残るMおよび/またはHN遺伝子に変異例えば温度感受性変異をさらに有するベクターも、本発明において好適に用いられる。本発明において用いられるベクターは、より好ましくは、少なくとも3つのウイルス遺伝子好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする少なくとも3つの遺伝子;FHNおよびMが、欠失または変異している。このようなウイルスベクターには、少なくとも3つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも3つの遺伝子が変異しているもの、少なくとも1つの遺伝子が変異しており少なくとも2つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも2つの遺伝子が変異しており少なくとも1つの遺伝子が欠失しているものが含まれる。より好ましい態様を挙げれば、例えばF遺伝子を欠失し、MおよびHN遺伝子をさらに欠失するか、MおよびHN遺伝子に変異例えば温度感受性変異をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また例えばF遺伝子を欠失し、MあるいはHN遺伝子をさらに欠失し、残るMあるいはHN遺伝子に変異例えば温度感受性変異をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。このような変異型のウイルスは、公知の方法に従って作製することが可能である。例えば、センダイウイルスのM遺伝子の温度感受性変異としては、M蛋白質における69位G69、116位T116、および183位A183からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられるInoueMetalJVirol20037732383246。センダイウイルスのM蛋白質に上記の3つの部位のいずれか、好ましくは任意の2部位の組み合わせ、さらに好ましくは3つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異M蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。アミノ酸変異は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましく、例えばBLOSUM62マトリックスHenikoffSandHenikoffJGProcNatlAcadSciUSA891091510919の値が3以下、好ましくは2以下、より好ましくは1以下、より好ましくは0個のアミノ酸に置換する。具体的には、センダイウイルスM蛋白質のG69、T116、およびA183を、それぞれGlu、Ala、およびSerへ置換することができる。また、麻疹ウイルス温度感受性株P253505MorikawaYetalKitasatoArchExpMed1991641530のM蛋白質の変異と相同な変異を利用することも可能である。変異の導入は、例えばオリゴヌクレオチド等を用いて、公知の変異導入方法に従って実施すればよい。また、HN遺伝子の温度感受性変異としては、例えばセンダイウイルスのHN蛋白質の262位A262、264位G264、および461位K461からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられるInoueMetalJVirol20037732383246。3つの部位のいずれか1つ、好ましくは任意の2部位の組み合わせ、さらに好ましくは3つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異HN蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。好ましい一例を挙げれば、センダイウイルスHN蛋白質のA262、G264、およびK461を、それぞれThr、Arg、およびGlyへ置換する。また、例えば、ムンプスウイルスの温度感受性ワクチン株UrabeAM9を参考に、HN蛋白質の464及び468番目のアミノ酸に変異導入することもできるWrightKEetalVirusRes2000674957。またセンダイウイルスは、P遺伝子および/またはL遺伝子に変異を有していてもよい。このような変異としては、具体的には、SeVP蛋白質の86番目のGluE86の変異、SeVP蛋白質の511番目のLeuL511の他のアミノ酸への置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeVL蛋白質の1197番目のAsnN1197および/または1795番目のLysK1795の他のアミノ酸への置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、2次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。さらに、エンベロープ蛋白質遺伝子の変異および/または欠損を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。またL遺伝子は、SeVL蛋白質の1214番目のTyrY1214および/または1602番目のMetM1602の他のアミノ酸への置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1214番目のアミノ酸のPheへの置換、1602番目のアミノ酸のLeuへの置換などが例示できる。以上に例示した変異は、任意に組み合わせることができる。例えば、SeVM蛋白質の少なくとも69位のG、116位のT、及び183位のA、SeVHN蛋白質の少なくとも262位のA,264位のG,及び461位のK、SeVP蛋白質の少なくとも511位のL、SeVL蛋白質の少なくとも1197位のN及び1795位のKが、それぞれ他のアミノ酸に置換されており、かつF遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、ならびに、細胞傷害性がこれらと同様またはそれ以下、およびまたは温度感受性がこれらと同様またはそれ以上のF遺伝子欠損または欠失センダイウイルスベクターは、本発明において核初期化因子nuclearreprogrammingfactorsを発現させるために特に好適である。具体的な置換例を例示すれば、例えばM蛋白質についてはG69E,T116A,及びA183Sの置換を、HN蛋白質についてはA262T,G264,及びK461Gの置換を、P蛋白質についてはL511Fの置換を、そしてL蛋白質についてはN1197S及びK1795Eの置換を挙げることができる。また、L蛋白質の変異としては、SeVL蛋白質の942位Y942、1361位L1361、および1558位L1558から任意に選択される部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換も挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、942番目のアミノ酸のHisへの置換、1361番目のアミノ酸のCysへの置換、1558番目のアミノ酸のIleへの置換などが例示できる。特に少なくとも942位または1558位が置換されたL蛋白質を好適に用いることができる。例えば1558位に加え、1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。また、942位に加え、1558位およびまたは1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。これらの変異により、L蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。またP蛋白質の変異としては、SeVP蛋白質の433位D433、434位R434、および437位K437から任意に選択される部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、433番目のアミノ酸のAlaへの置換、434番目のアミノ酸のAlaへの置換、437番目のアミノ酸のAlaへの置換などが例示できる。特にこれら3つの部位全てが置換されたP蛋白質を好適に用いることができる。これらの変異により、P蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。SeVP蛋白質の少なくとも433位のD、434位のR、および437位のKの3箇所が、他のアミノ酸に置換された変異P蛋白質、およびSeVL蛋白質の少なくとも1558位のLが置換された変異L蛋白質好ましくは少なくとも1361位のLも他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質をコードする、F遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、ならびに、細胞傷害性がこれと同様またはそれ以下、およびまたは温度感受性がこれと同様またはそれ以上のF遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクターも、本発明において好適に用いられる。各ウイルス蛋白質は、上記の変異以外に他のアミノ酸例えば10以内、5以内、4以内、3以内、2以内、または1アミノ酸に変異を有していてもよい。上記に示した変異を有するベクターは高い温度感受性を示すので、リプログラミングが完了した後、細胞をやや高温例えば375~39°C、好ましくは38~39°C、または385~39°Cで培養することにより、ベクターを簡便に除去することができる。より具体的に例を挙げれば、例えばTS7:LTS12:PTS13:PLTS14:PLTS15:PLなどの変異を持つセンダイウイルスベクターを好適に用いることができる。具体的なベクターを例示すれば、例えばM蛋白質にG69ET116A及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262TG264及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター例えばZstrainであってよく、このベクターにさらにTS7、TS12、TS13、TS14、またはTS15の変異を導入したベクターはより好ましい。具体的には、SeV18TSΔFWO2010008054、WO2003025570やSeVTSΔF、および、これらにさらにTS7、TS12、TS13、TS14、またはTS15の変異を導入したベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。なおTSΔFは、M蛋白質にG69ET116A及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262TG264及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持ち、F遺伝子を欠失することを言う。特にSeVKOSTSΔF、SeVKOSTS7ΔF、SeVKOSTS12ΔF、SeVOSKTSΔFなどが好ましいベクターとして挙げられるが、これらに限定されない。またこのとき、SeVcrMYCTS12ΔF、SeVcrMYCTS13ΔF、またはSeVcrMYCTS15ΔF等を用いてMYC遺伝子を導入することができる。また、さらにKLF遺伝子を発現するセンダイウイルスベクターを導入してもよい。特に、OCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子を順に含むセンダイウイルスベクターと組み合わせることで、好適な結果を得ることができる。KLF遺伝子は、センダイウイルスベクターのN遺伝子の上流ゲノム上のN遺伝子の3側に挿入することができる。ベクターとしては、本明細書に記載した所望のF遺伝子欠失型およびまたは変異型ベクターを使用することができ、具体的にはSeV18KLF4TSΔFが挙げられるが、これに制限されない。すなわち本発明は、1センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するための組成物であって、KLF遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる組成物、2MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる、1に記載の組成物、3該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、2に記載の組成物、4多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入細胞の製造方法であって、センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクター、およびKLF遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターを細胞に導入することを含む方法、5MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターを該細胞に導入することをさらに含む、4に記載の方法、6該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、5に記載の方法、7センダイウイルスのP遺伝子の直後に、順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、が挿入されたセンダイウイルスベクター、およびKLF遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターを含む、多能性幹細胞の誘導における遺伝子導入に使用するためのキット、8MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターを含む、7に記載のキット、9該MYC遺伝子またはGlis1遺伝子がセンダイウイルスのL遺伝子の直前に挿入されている、8に記載のキット、も提供する。ベクターの細胞傷害性は、例えば細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼLDHの放出を定量することにより測定することができる。具体的には、例えばHeLaATCCCCL2またはサルCV1ATCCCCL70にMOI3で感染させて3日間培養した培養液中のLDH放出量を測定する。LDH放出量が少ないほど細胞傷害性は低い。また温度感受性は、ウイルス宿主の通常の温度例えば37°Cないし38°Cにおけるウイルスの増殖速度または搭載遺伝子の発現レベルを測定することにより決定することができる。変異を有さないものに比べ、ウイルスの増殖速度およびまたは搭載遺伝子の発現レベルが低下するほど、温度感受性は高いと判断される。またエンベロープウイルスを用いる場合は、ウイルスが本来持つエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むウイルスを使用してもよい。例えば、ウイルス製造の際に、所望の外来性エンベロープ蛋白質をウイルス産生細胞で発現させることにより、これを含むウイルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はなく、哺乳動物細胞への感染能を付与する所望の接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質が用いられる。具体的には、例えば水疱性口内炎ウイルスvesicularstomatitisvirusVSVのG蛋白質VSVGを挙げることができる。VSVG蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよく、例えばIndiana血清型株JVirology39519528由来のVSVG蛋白を用いることができるが、これに限定されない。本発明において用いられるセンダイウイルスベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。核初期化因子nuclearreprogrammingfactorsを持つ組換えセンダイウイルスの再構成は公知の方法を利用して行えばよい。具体的な手順として、典型的には、aセンダイウイルスゲノムRNAマイナス鎖またはその相補鎖プラス鎖をコードするcDNAを、ウイルス粒子形成に必要なウイルス蛋白質N、P、およびLを発現する細胞で転写させる工程、b生成したウイルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。粒子形成に必要なウイルス蛋白質は、転写させたウイルスゲノムRNAから発現されてもよいし、ゲノムRNA以外からトランスに供給されてもよい。例えば、N、P、およびL蛋白質をコードする発現プラスミドを細胞に導入して供給することができる。ゲノムRNAにおいて粒子形成に必要なウイルス遺伝子が欠損している場合は、そのウイルス遺伝子をウイルス産生細胞で別途発現させ、粒子形成を相補することもできる。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、該蛋白質やゲノムRNAをコードするDNAを宿主細胞で機能する適当なプロモーターの下流に連結したベクターを宿主細胞に導入する。転写されたゲノムRNAは、ウイルス蛋白質の存在下で複製され、感染性ウイルス粒子が形成される。エンベロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウイルスを製造する場合は、欠損する蛋白質またはその機能を相補できる他のウイルス蛋白質などをウイルス産生細胞において発現させることもできる。例えば、センダイウイルスの製造は、以下の公知の方法を利用して実施することができるWO9716539WO9716538WO0070055WO0070070WO0118223WO03025570;WO2005071092WO2006137517WO2007083644WO2008007581HasanMKetalJGenVirol78281328201997、KatoAetal1997EMBOJ16578587及びYuDetal1997GenesCells2457466DurbinAPetal1997Virology235323332WhelanSPetal1995ProcNatlAcadSciUSA9283888392SchnellMJetal1994EMBOJ1341954203RadeckeFetal1995EMBOJ1457735784LawsonNDetalProcNatlAcadSciUSA9244774481GarcinDetal1995EMBOJ1460876094KatoAetal1996GenesCells1569579BaronMDandBarrettT1997JVirol7112651271BridgenAandElliottRM1996ProcNatlAcadSciUSA931540015404TokusumiTetalVirusRes2002863338、LiHOetalJVirol20007465646569。またウイルスの増殖方法および組み換えウイルスの製造方法については、ウイルス学実験学各論、改訂二版国立予防衛生研究所学友会編、丸善、1982も参照のこと。上記のセンダイウイルスには、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子が、この順番、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番でセンダイウイルスに組み込まれる。これらの外来遺伝子は、一般に、いずれかのウイルス遺伝子NPPMFHNまたはLの直前ゲノムの3側または直後ゲノムの5側に挿入することができる。好ましくはKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子は、この順番、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番でセンダイウイルスのP遺伝子の直後、すなわちP遺伝子のすぐ下流マイナス鎖RNAゲノムのすぐ5側に組み込まれる。例えば前者の順番の場合、P遺伝子とKLF遺伝子の間後者に場合はP遺伝子とOCT遺伝子の間には、転写開始シグナルS配列、転写終結シグナルE配列、およびスペーサー配列介在配列などは含まれうるものの、他の転写単位例えば蛋白質をコードする遺伝子をコードする転写単位は含まれない。センダイウイルスはマイナス鎖RNAをゲノムに持つことから、通常とは逆で、ゲノムの3側が上流にあたり、5側が下流にあたる。センダイウイルスのゲノム上でKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子がこの順番で並ぶとき、KLF遺伝子が3つの遺伝子の中では最も3側に配置され、SOX遺伝子が最も5側に配置される。なおマイナス鎖RNAは遺伝子をアンチセンスにコードすることから、ゲノム上のKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子は、蛋白質のコード鎖センス鎖ではなくアンチセンス鎖としてコードされている。センダイウイルスゲノムは、細胞に入るとこのゲノムを鋳型にしてアンチゲノムRNAが生成する。アンチゲノムはプラス鎖であって、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子は、蛋白質をコードする鎖センス鎖が搭載されている。アンチゲノムRNAにおいては、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子の配置は、KLF遺伝子が3つの遺伝子の中では最も5側に配置され、SOX遺伝子が最も3側に配置されている。3つの遺伝子は、好ましくは互いに隣接しているすなわち3つの遺伝子の間に他の遺伝子が入ることはない。それぞれの遺伝子は、適宜センダイウイルスSStart配列とEEnd配列で挟まれていてよい。S配列は転写を開始させるシグナル配列であり、E配列で転写が終結する。S配列とE配列で挟まれた領域は、1つの転写単位となる。ある遺伝子のE配列と次の遺伝子のS配列の間は、適宜スペーサーとなる配列介在配列;interveningsequenceを挿入することができる。例えばSKLF遺伝子EISOCT遺伝子EISSOX遺伝子ESIおよびEはそれぞれS配列、I配列、およびE配列を表すの構成をもつ核酸をゲノムに含むセンダイウイルスベクターを好適に用いることができる。センダイウイルスゲノム上のP遺伝子とKLF遺伝子は、P遺伝子EISKLF遺伝子のように結合される。OCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で配置される場合は、例えばSOCT遺伝子EISSOX遺伝子EISKLF遺伝子ESIおよびEはそれぞれS配列、I配列、およびE配列を表すの構成をもつ核酸をゲノムに含むセンダイウイルスベクターを好適に用いることができる。センダイウイルスゲノム上のP遺伝子とSOX遺伝子は、P遺伝子EISSOX遺伝子のように結合される。S配列としては、センダイウイルスの所望のS配列を用いることができるが、例えば3UCCCWVUUWC5WAまたはUVACまたはG配列番号:1の配列を好適に用いることができる。特に3UCCCAGUUUC5配列番号:2、3UCCCACUUAC5配列番号:3、および3UCCCACUUUC5配列番号:4が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードするDNA配列で表すとそれぞれ5AGGGTCAAAG3配列番号:5、5AGGGTGAATG3配列番号:6、および5AGGGTGAAAG3配列番号:7である。センダイウイルスベクターのE配列としては、例えば3AUUCUUUUU5配列番号:8プラス鎖をコードするDNAでは5TAAGAAAAA3配列番号:9が好ましい。I配列は、例えば任意の3塩基であってよく、具体的には3GAA5プラス鎖DNAでは5CTT3を用いればよい。野生型センダイウイルスのゲノムは、3の短いリーダー領域に続き、ヌクレオキャプシドNP遺伝子、ホスホP遺伝子、マトリックスM遺伝子、フュージョンF遺伝子、ヘマグルチニンノイラミニダーゼHN遺伝子、およびラージL遺伝子、及び短い5トレイラー領域をこの順序で含んでいる。センダイウイルスベクターにおいても、この順番でウイルス遺伝子を配置することができる。野生型ウイルスに相当する組み換えベクターや、様々な変異型ベクターの作製が既に知られている。さらには、そのエンベロープを除いたRNPのみでも遺伝子導入が可能であることが示されているWO0070055。よって、センダイウイルスRNPをウイルスベクターとして用いてリプログラミングを行うことができる。センダイウイルスはNP遺伝子、P遺伝子、およびL遺伝子があればベクターとして十分機能でき、細胞中でゲノムを複製し、搭載されている外来遺伝子KLF、OCT、およびSOXを発現させることができる。ウイルス遺伝子としてNP遺伝子、P遺伝子、およびL遺伝子の3遺伝子を含むセンダイウイルスであれば、KLF、OCT、およびSOX遺伝子のセットは、例えばP遺伝子とL遺伝子の間に挿入される。M遺伝子を含むベクターであれば、KLF、OCT、およびSOX遺伝子のセットは、例えばP遺伝子とM遺伝子の間に挿入されるWO9716539。M遺伝子欠失型のセンダイウイルスベクターでF遺伝子を含む場合は、KLF、OCT、およびSOX遺伝子のセットはP遺伝子とF遺伝子の間に挿入されるWO0070070。MおよびF遺伝子欠失型であればP遺伝子とHN遺伝子の間に、F、M、HN遺伝子欠失型であればP遺伝子とL遺伝子の間に挿入されるWO2003025570、WO2006137517。ウイルス遺伝子を欠失するベクターは安全性が高いので好ましい。本発明においては、少なくともF遺伝子を欠失したベクターを好適に用いることができる。KLF、OCTおよびSOX遺伝子を含む上記センダイウイルスはそれだけを用いて適宜リプログラミングにおける遺伝子導入に使用することができるが、MYC遺伝子またはGlis1遺伝子をさらに導入するリプログラミングにおいて使用することがより好ましい。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は上記のKLF、OCTおよびSOX遺伝子を含むセンダイウイルスベクターの中に挿入することもできるが、別のベクターに挿入して使用してもよい。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子を別のベクターに挿入する場合、ベクターはプラスミド、ウイルスベクター、非ウイルスベクター例えばリポソームなど所望のベクターを使用することができる。ウイルスベクターとしてはアデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。より好ましくは、MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、センダイウイルスベクターに挿入される。本発明においては、KLF、OCTおよびSOX遺伝子を含む上記センダイウイルスは、MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いることがより好ましい。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子を挿入する元となるセンダイウイルスベクターは、上記に記載したセンダイウイルスベクターを使用することができる。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子をセンダイウイルスゲノムに挿入する場合、遺伝子のベクター中の挿入位置は所望の部位を選択することができる。例えばMYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、マイナス鎖RNAゲノムの後方5側、例えばマイナス鎖RNAウイルスのゲノムの中央よりも5端側順番が真中の遺伝子よりも5端側、すなわちゲノム上に配置される複数の蛋白質コード配列において、3側から数えるよりも5側から数えた方が早い位置に配置することが好ましい実施例参照。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、例えば最も5側すなわち5側から1番目、あるいは5側から2または3番目に配置することができる。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、例えばゲノムの5側から2番目、具体的には、ゲノムの最も5側にL遺伝子があり、その次にHN遺伝子がある場合に、HN遺伝子とL遺伝子の間HNL間に配置してもよい。特にMYC遺伝子またはGlis1遺伝子をセンダイウイルスゲノム上のL遺伝子のすぐ上流3側、例えばHN遺伝子とL遺伝子の間、またはすぐ下流5側、例えばL遺伝子と5トレイラー配列の間に挿入することが好ましい。センダイウイルスベクターとしては、例えばM蛋白質にG69ET116A及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262TG264及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター例えばZstrainであってよく、このベクターにさらにTS7、TS12、TS13、TS14、またはTS15の変異を導入したベクターはより好ましい。具体的には、SeVcrMYCTSΔF、SeVcrMYCTSΔF、SeVcrMYCTS15ΔFWO2010008054FusakietalProcJpnAcadSerBPhysBiolSciVol85p348362などが挙げられ、特に好ましくはSeVcrMYCTS15ΔFが挙げられるが、これらに限定されない。MYC遺伝子は、野生型cMYCのみならず、T58A変異体や、NMYC、LMYCでも多能性幹細胞を誘導できるWO200769666BlellochRetalCellStemCell12452472007。このように、ファミリーの遺伝子を様々に選択して使用することが可能であるので、MYCファミリー遺伝子を適宜選択して、リプログラミングを誘導することができる。またMYC遺伝子は、コードされるアミノ酸配列を変えないように適宜サイレント変異を導入し、連続したAまたはTの塩基配列を置換することができる。例えば野生型cMYCはセンダイウイルスベクターなどのRNAウイルスベクターからの発現量が少ないことが判明した。しかし野生型cMYCに、a378g、t1122c、t1125c、a1191g、およびa1194gから選択される1つ以上、好ましくは2以上、3以上、4以上、または5つ全ての変異を導入することにより、ベクターから遺伝子を安定して高発現させることが可能となる。本発明においては、例えばWO2010008054の配列番号:45に示された改変型cMYC遺伝子を好適に用いることができる。上記のKLF、OCTおよびSOX遺伝子を含むセンダイウイルスベクターおよびまたはMYC遺伝子を含むセンダイウイルスベクターには、適宜、細胞のリプログラミングのための遺伝子などをさらに搭載させることができる。また、それらの遺伝子を搭載した他のベクターを、上記センダイウイルスベクターと組み合わせてもよい。搭載する遺伝子は、分化した細胞からの多能性幹細胞などの種々の幹細胞の誘導等に関与する所望の遺伝子であってよい。例えばリプログラミングの効率を上昇させる遺伝子を搭載させることができる。本発明は、本発明のセンダイウイルスベクターの、細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための使用、そして、細胞においてリプログラミング因子を発現させ、該細胞のリプログラミングを誘導するための使用を提供する。また本発明は、本発明のセンダイウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための剤導入剤、遺伝子導入剤、細胞においてリプログラミング因子を発現させるための剤を提供する。また本発明は、本発明のセンダイウイルスベクターを含む、細胞においてリプログラミング因子を発現させ、該細胞のリプログラミングを誘導するための剤に関する。また本発明のベクターは、細胞の核初期化を行う際に、所望の遺伝子を該細胞においてさらに発現させるためにも有用である。本発明のセンダイウイルスベクターは、本発明に従い、細胞のリプログラミングのために利用することができる。リプログラミングの誘導とは、具体的には多能性幹細胞の誘導であってよい。本発明は、医学的用途および非医学的用途のために用いることができ、メディカルおよびノンメディカルの態様において有用である。例えば本発明は、治療、手術、およびまたは診断、あるいは非治療、非手術、およびまたは非診断の目的に用いることができる。本発明において核初期化因子anuclearreprogrammingfactorとは、単独で、または複数の因子と共同して、ある細胞の分化状態をより未分化な状態に誘導するために用いられる遺伝子またはその産物を言い、例えば分化した細胞の脱分化を誘導するために用いられる遺伝子またはその産物が含まれる。本発明において核初期化因子anuclearreprogrammingfactorには、核の初期化reprogrammingに必須の因子、および核初期化の効率を上昇させる補助的な因子補助因子が含まれる。本発明においては、核初期化nuclearreprogrammingに用いるための所望の遺伝子をベクターに搭載してよい。例えば多能性幹細胞の製造に用いるための遺伝子をさらに搭載することができる。多能性幹細胞を誘導するための核初期化因子nuclearreprogrammingfactorsとしては、具体的には、例えばES細胞や初期胚などで発現するが、分化した多くの体細胞では発現しないか、発現が低下する遺伝子ES細胞特異的遺伝子などを用いることができる。このような遺伝子は、好ましくは転写因子や核蛋白質等をコードする遺伝子である。核初期化遺伝子nuclearreprogrammingfactorsを同定する方法は既に知られておりWO200580598、実際、この方法を用いて同定された遺伝子は、多能性幹細胞へのreprogrammingに有用であることが示されているWO200769666。そのような遺伝子の例を挙げれば、DPPA5accessionnumbersNM001025290NM025274XM236761、Fboxprotein15、NanogNM024865AB093574、ECAT1EScellassociatedtranscript1;AB211062AB211060、ERASEScellexpressedRasNM181532NM181548、DNMT3LDNAmethyltransferase3likeNM013369NM019448、ECAT8AB211063AB211061、GDF3growthdifferentiationfactor3NM020634NM008108、SOX15SRYbox15NM006942NM009235、DPPA4developmentalpluripotencyassociated4NM018189NM028610、DPPA2NM138815NM028615、FTHL17ferritinheavypolypeptidelike17NM031894NM031261、SALL4sallike4NM020436NM175303、OCT34POU5F1とも呼ばれるNM002701NM203289NM013633NM001009178、SOX2NM003106NM011443XM574919、Rex1ZFP42NM174900NM009556、Utf1undifferentiatedembryoniccelltranscriptionfactor1NM003577NM009482、TCL1ATcellleukemialymphoma1ANM021966NM009337、DPPA3Stellaとも呼ばれるNM199286NM139218XM216263、KLF4Kruppellikefactor4NM004235NM010637、cateninβ1cadherinassociatedproteinbeta1NM001904NM007614S33Y変異体を含む、cMYCNM002467NM010849T58A変異体を含む、STAT3signaltransducerandactivatoroftranscription3NM139276NM213659、GRB2growthfactorreceptorboundprotein2NM002086NM008163、Glis1遺伝子MaekawaetalNature4742252292011NM147193NM147221ならびにこれらの遺伝子が属するファミリーの他のメンバーの遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子は、細胞に導入することにより多能性幹細胞を誘導するWO200769666。従って、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む本発明のセンダイウイルスベクターに、上記の遺伝子のうち、まだベクターに搭載されていない遺伝子をさらに搭載させたり、あるいはそれらの遺伝子を搭載する他のベクターを、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む上記本発明のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いることができる。これらの遺伝子は、1つずつ別のベクターに組み込んでもよいし、複数の遺伝子をまとめて1つのベクターに組み込むこともできる。また、それぞれの遺伝子を一種類のベクターに組み込んでもよく、あるいは異なる種類のベクター染色体組み込み型ウイルスベクターおよび/または非ウイルスベクターを含むを、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順に、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順に含む上記本発明のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いてもよい。また個々のウイルスベクターは、別々にパッケージされており使用時に組み合わせて用いることができる。あるいは搭載する遺伝子が異なる複数のウイルスベクターを、予めまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また、これらの遺伝子の任意の組み合わせまたは全てを含む、1つまたはそれ以上の非組み込み型ウイルスベクター、および該ベクターをさらに含むキットまたは組成物も、細胞のリプログラミング、特に多能性幹細胞の製造において好適に用いることができる。組成物の場合は、ベクターは適宜、薬学的に許容される担体およびまたは媒体と組み合わせてよく、例えば、滅菌水、pH緩衝液、生理的食塩水、培養液等の中に混合されていてよい。尚、これらの系は、核初期化遺伝子の一部または大部分をその発現産物であるタンパク質に置き換えることもできる。すなわち本発明の組成物およびキットは、少なくともKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む上記センダイウイルスベクターを含む限り、リプログラム因子を発現する他のベクター染色体組込み型ウイルスベクターおよび/または非ウイルスベクターおよび/またはリプログラムを誘導する化合物、蛋白質等を含んでもよい。リプログラミングに必要な因子は、その全てをセンダイウイルスベクターから発現させてもよく、あるいは一部のみをセンダイウイルスベクターから発現させ、その他を他のベクターおよび/または化合物例えば蛋白質や低分子化合物により供給してもよい。また、本発明のリプログラムされた細胞の製造方法は、全ての遺伝子導入をセンダイウイルスベクターを用いて行う方法に限定されない。すなわち本発明の方法は、少なくともKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む上記センダイウイルスベクターを用いればよく、リプログラム因子を発現する他のベクター染色体組込み型ウイルスベクターおよび/または非ウイルスベクターおよび/またはリプログラムを誘導する化合物等を併用することが含まれる。好ましくは、MYC遺伝子またはGlis1遺伝子を含む上記センダイウイルスベクターと組み合わせて用いられる。また、OCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含むセンダイウイルスベクターを用いる場合は、KLF遺伝子を含む別のセンダイウイルスベクターを組み合わせることが有用である。本発明は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む上記センダイウイルスベクターを発現ベクターとして含む、細胞のリプログラミングに用いるための組成物に関する。また本発明は、該センダイウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングに用いるための使用に関する。例えば本発明は、該センダイウイルスベクターの使用であって、細胞のリプログラミングにおいてその必要がある細胞にリプログラミング因子遺伝子KLF、OCT、およびSOXを導入するための使用を提供する。また本発明は、細胞のリプログラミングにおいて該遺伝子を導入するための方法であって、該ウイルスベクターを用いて、その必要がある細胞に該遺伝子を導入する方法に関する。また本発明は、該ウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおける該遺伝子の導入に用いるための組成物、細胞のリプログラミングにおける該遺伝子の導入に用いるための剤細胞のリプログラミングにおける該遺伝子の導入に用いるための導入剤、細胞のリプログラミングにおける該遺伝子の導入剤にも関する。また本発明は、該ウイルスベクターの使用であって、細胞のリプログラミングにおいてその必要がある細胞に該遺伝子を導入するための薬剤の製造における使用にも関する。また本発明は、該ウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングに用いるための該遺伝子の導入剤該遺伝子発現剤、または発現ベクターを提供する。また本発明は、該ウイルスベクターを含む、該リプログラミング遺伝子の導入剤該遺伝子発現剤、または発現ベクターを提供する。また本発明は、該ウイルスベクターを含む、核初期化因子nuclearreprogrammingfactorsであるKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子、あるいは順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子、の発現剤該核初期化遺伝子導入剤、該核初期化遺伝子発現ベクターを提供する。また本発明は、該核初期化因子nuclearreprogrammingfactorsをコードする該ウイルスベクターを含む、多能性幹細胞誘導剤および多能性幹細胞誘導補助剤を提供する。また本発明は、該ウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングのための使用を提供する。また本発明は、該ウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングのための薬剤、試薬および/または医薬の製造における使用を提供する。また本発明は、該ウイルスベクターの、分化した細胞への該核初期化因子nuclearreprogrammingfactorsKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子導入剤の製造における使用にも関する。ここでリプログラミングは、例えば分化した細胞からの多能性幹細胞の誘導であってよい。ベクターは、リプログラミングのための因子をコードする遺伝子KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を組み込んで使用される。リプログラミング因子をコードする遺伝子としては、例えば上記、あるいは以下に例示した因子のいずれかをコードする遺伝子が挙げられる。なお、導入する因子KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子などは、リプログラムしたい細胞の由来に合わせて適宜選択すればよく、ヒト由来であっても、その他の哺乳動物由来、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の霊長類由来であってもよい。また、遺伝子および蛋白質の配列は必ずしも野生型の配列でなくてもよく、リプログラミングを誘導できる限り、変異を有していてもよい。変異型遺伝子を用いて多能性幹細胞を作製した例は既に知られているWO200769666。例えば、1または少数例えば数個、3個以内、5個以内、10個以内、15個以内、20個以内、25個以内のアミノ酸が付加、欠失、置換、および/または挿入されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、リプログラミングを誘導できる遺伝子は、本発明において使用することができる。また生物学的活性リプログラミングの誘導能を維持している限り、例えばN末端および/またはC末端の1~数残基例えば2、3、4、5、6、10、15または20残基のアミノ酸が欠失または付加されたポリペプチド、及び1~数残基例えば2、3、4、5、6、10、15または20残基のアミノ酸が置換されたポリペプチドなども使用できる。使用し得るバリアントとしては、例えば天然の蛋白質の断片、アナログ、派生体、及び他のポリペプチドとの融合蛋白質例えば異種シグナルペプチドまたは抗体断片を付加したもの等が含まれる。具体的には、野生型のアミノ酸配列の1またはそれ以上のアミノ酸を置換、欠失、および/または付加した配列を含み、野生型蛋白質と同等の生物学的活性例えばリプログラミングを誘導する活性を有するポリペプチドが含まれる。野生型蛋白質の断片を用いる場合は、通常、野生型ポリペプチド分泌蛋白質の場合は成熟型の形態の70以上、好ましくは80以上、85以上、より好ましくは90以上、95以上または98以上の連続領域を含む。アミノ酸配列のバリアントは、例えば天然のポリペプチドをコードするDNAに変異を導入することにより調製することができるWalkerandGaastraedsTechniquesinMolecularBiologyKunkelProcNatlAcadSciUSA824884921985KunkeletalMethodsEnzymol1543673821987SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual1989USPatNo4873192。生物学的活性に影響を与えないようにアミノ酸を置換するためのガイダンスとしては、例えばDayhoffらDayhoffetalinAtlasofProteinSequenceandStructure1978が挙げられる。改変されるアミノ酸数に特に制限はないが、例えば天然の成熟型ポリペプチドの全アミノ酸の30以内、好ましくは25以内、より好ましくは20以内、より好ましくは15以内、より好ましくは10以内、5以内、または3以内であり、例えば15アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは8アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、より好ましくは3アミノ酸以内である。アミノ酸を置換する場合は、側鎖の性質が似たアミノ酸に置換することにより蛋白質の活性を維持することが期待できる。このような置換は、本発明において保存的置換という。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン、酸性アミノ酸の全アミノ酸数における一致するアミノ酸数の割合を計算する。また遺伝子は、コードされるアミノ酸配列を変えないようにサイレント変異を導入することができる。特にATrichな遺伝子においては、5個以上の連続したAまたはTの塩基について、コードされるアミノ酸配列を変えないようにGまたはCに置換することにより、安定して遺伝子の高発現を得ることができる。また改変蛋白質あるいはリプログラミングに用いるタンパク質は、野生型蛋白質をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、野生型蛋白質と同等の活性リプログラミングを誘導する活性を有する蛋白質が挙げられる。ハイブリダイゼーションにおいては、例えば野生型蛋白質遺伝子のコード領域の配列またはその相補配列を含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば5xSSC、7SDS、100μgml変性サケ精子DNA、5xデンハルト液1xデンハルト溶液は02ポリビニールピロリドン、02牛血清アルブミン、及び02フィコールを含むを含む溶液中、60°C、好ましくは65°C、より好ましくは68°Cでハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で2xSSC中、好ましくは1xSSC中、より好ましくは05xSSC中、より好ましくは01xSSC中で、振蘯しながら2時間洗浄する条件である。細胞のリプログラミングを誘導するために特に好ましい遺伝子を一般的に例示すれば、Fboxprotein15、NanogNM024865AB093574、ERASEScellexpressedRasNM181532NM181548、DPPA2NM138815NM028615、OCT34POU5F1とも呼ばれるNM002701NM203289NM013633NM001009178、SOX2NM003106NM011443XM574919、TCL1ATcellleukemialymphoma1ANM021966NM009337、KLF4Kruppellikefactor4NM004235NM010637、cateninβ1cadherinassociatedproteinbeta1NM001904NM007614S33Y変異体を含む、cMYCNM002467NM010849T58A変異体を含む、およびGlis1遺伝子MaekawaetalNature4742252292011NM147193NM147221、ならびにこれらの遺伝子が属するファミリーの他のメンバーの遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子を導入した場合、多能性幹細胞の形態を示したコロニーの割合は、4種類の遺伝子OCT34、SOX2、KLF4、およびcMYCの導入の場合よりも高いことが報告されているWO200769666。従って、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子に加えて、上記のいずれかまたはそれらの組み合わせをさらに搭載するセンダイウイルスベクター、あるいはKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を搭載する本発明のセンダイウイルスベクターと、上記のいずれかまたはそれらの組み合わせを搭載するセンダイウイルスベクターやそれらのベクターの組み合わせは、本発明において細胞のリプログラミングの誘導に用いるために有用であり、特に、多能性幹細胞の誘導に好適に用いることができる。個々のウイルスベクターは、使用時に組み合わせて用いることができる。また予めまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子に加えて、上記のいずれかの遺伝子の任意の組み合わせまたは全てを含む、1つまたはそれ以上のセンダイウイルスベクター、および該ベクターを含むキットまたは組成物も本発明に含まれる。KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を発現する本発明のベクターは、特にMYC遺伝子およびまたはGlis1遺伝子を発現するベクターと組み合わせることが好ましいTakahashiKandYamanakaSCell1266636762006LowryWEetalProcNatlAcadSciUSA105288382008MasakiHetalStemCellRes11051152008MaekawaetalNature4742252292011WO200769666。ここでSOX蛋白質、KLF蛋白質、MYC蛋白質、およびOCT蛋白質、ならびにそれらの遺伝子とは、それぞれSOXファミリー、KLFファミリー、MYCファミリー、およびOCTファミリーに属するメンバーの蛋白質および遺伝子を言う。これらの4つのファミリーのメンバーをそれぞれ1つ以上発現するように調整することで、分化した様々な細胞から多能性幹細胞を誘導できることが報告されている。例えばSOXファミリーの遺伝子については、SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX17のいずれの遺伝子を用いても、多能性幹細胞を誘導できることが報告されているWO200769666。またKLFファミリーについても、KLF4でもKLF2でも多能性幹細胞を誘導できたWO200769666。MYCファミリーについても、野生型cMYCのみならず、T58A変異体や、NMYC、LMYCでも多能性幹細胞を誘導できたWO200769666BlellochRetalCellStemCell12452472007。このように、ファミリーの遺伝子を様々に選択して使用することが可能であるので、上記の4種のファミリー遺伝子を適宜選択して、リプログラミングを誘導することができる。具体的には、KLFファミリーとしては、KLF1NM006563NM010635、KLF2NM016270NM008452、KLF4NM004235NM010637、KLF5NM001730NM009769が含まれ、MYCファミリーとしては、cMYCNM002467NM010849T58A変異体を含む、NMYCNM005378NM008709、LMYCNM005376NM005806が含まれ、OCTファミリーとしては、OCT1ANM002697NM198934、OCT34NM002701NM203289NM013633NM001009178、OCT6NM002699NM011141が含まれ、SOXファミリーとしては、SOX1NM005986NM009233、SOX2NM003106NM011443XM574919、SOX3NM005634NM009237、SOX7NM031439NM011446、SOX15NM006942NM009235、SOX17NM022454NM011441、SOX18NM018419NM009236が含まれる。これらの遺伝子のいずれかを本発明の順番に従って搭載するセンダイウイルスベクターは、本発明において細胞の脱分化の誘導に用いるために有用であり、特に多能性幹細胞の誘導に好適に用いることができる。なお、MYCファミリーの遺伝子は多能性幹細胞の誘導に必須ではなく、MYCファミリー遺伝子を除く3つのファミリーの遺伝子だけでも多能性幹細胞は誘導できるNakagawaMetalNatBiotechnol2610162008WeringMetalCellStemCell21022008。MYC遺伝子を発現させない場合、例えばp53siRNAおよびUTF1により多能性幹細胞の誘導効率を有意に上昇させることがでいるYZhaoetalCellStemCell34754792008NMaheraliandKHochedlingerCellStemCell35956052008。また、KLFファミリーの遺伝子を除く3つのファミリーの遺伝子だけでも多能性幹細胞を誘導できることが報告されているParkIHetalNature45114162008。また、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤BIX01294KubicekSetalMolCell254734812007を併用することにより、胎児由来のNPCからKLF遺伝子、SOX遺伝子、およびMYC遺伝子の3つの遺伝子のみで多能性幹細胞を誘導できることが報告されているShiYetalCellStemCell252582008。それぞれの遺伝子をコードするウイルスベクターは別々に単体として準備されてもよい。それらは、使用時に組み合わせて用いることができる。また任意の組み合わせまたは全てをまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また本発明は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を搭載する本発明のセンダイウイルスベクターに加えて、該3遺伝子以外の遺伝子や化合物の任意の組み合わせまたは全てを含む、1つまたはそれ以上の染色体非組み込み型ウイルスベクター、および該ベクターをさらに含むリプログラミングのためのキットまたは組成物にも関する。更には、このキットに含まれる一部の組換えベクターは、相当の機能を有するタンパク質、合成化合物などに置き換えることも可能である。以上に記載した遺伝子の組み合わせに、さらに別の遺伝子を組み合わせて、リプログラミングの誘導効率を上昇させることもできる。このような遺伝子としては、TERTNM198253NM009354および/またはSV40largeTantigenNC0016691FiersWNature273113120が挙げられるParkIHetalNature45114162008。また、HPV16E6、HPV16E7、BmilNM005180NM007552からなる群より選択される1つ以上の遺伝子をさらに組み合わせてもよい。また、Fbx15MolCellBiol2326997082003、NanogCell1136316422003、ERasNature4235415452003、DPPA2Development130167316802003、TCL1ADevelopment130167316802003、βCateninNatMed1055632004からなる群より選択される1つまたは任意の組み合わせを発現させてもよい。さらに、ECAT1AB211062AB211060、DPPA5、ECAT8AB211063AB211061、GDF3NM020634NM008108、SOX15NM006942NM009235、DPPA4NM018189NM028610、FTHL17NM031894NM031261、SALL4NM020436NM175303、Rex1NM174900NM009556、Utf1NM003577NM009482、DPPA3NM199286NM139218XM216263、STAT3NM139276NM213659、およびGRB2NM002086NM008163からなる群より選択される1つ以上の遺伝子を組み合わせてもよい。また、KLF遺伝子、OCT遺伝子、SOX遺伝子に加えて、NANOG遺伝子NM024865AB093574、およびLIN28遺伝子の各遺伝子を含む組み合わせも、多能性幹細胞の誘導に有用であるYuJetalScience3181917202007。また、これらにMYC遺伝子をさらに組み合わせたものも好適であるLiaoJetalCellRes1860032008。これらの遺伝子を付加的に発現させることで、多能性幹細胞の誘導を促進し得るWO200769666。成熟B細胞を対象とする場合は、例えば骨髄球系転写因子CEBPαCCAATenhancerbindingproteinαNM004364を異所発現させるか、あるいはB細胞系転写因子Pax5pairedbox5NM016734の発現を抑制してリプログラミングを促進することができるHannaJCell133250642008。これらの因子も、本発明におけるセンダイウイルスベクターを用いて発現させることができる。更には、このキットに含まれる一部の組換えベクターは、相当の機能を有するタンパク質、合成化合物などに置き換えることも可能である。また、上記の因子を発現させる以外にも、例えば化合物の添加を組み合わせることでリプログラミングの効率を向上させることができる。例えば、bFGFbasicfibroblastgrowthfactorおよび/またはSCFstemcellfactorは多能性幹細胞の誘導を促進し、さらに多能性幹細胞の誘導におけるcMYCの機能を代替することができるWO200769666。またMAPキナーゼ阻害剤PD98056も、よりES細胞に近い多能性幹細胞の樹立等に有用であるWO200769666。また、DNAメチル化酵素Dnmt阻害剤および/またはヒストン脱アセチル化酵素HDAC阻害剤により、多能性幹細胞の誘導効率が改善することが報告されているHuangfuDetalNatBiotechnolNatBiotechnol26795797。例えばHDACVPAを併用することにより、OCT4とSOX2の2遺伝子のみの導入により多能性幹細胞を誘導することができるHuangfuDetalNatBiotechnol200826126975。本発明のベクターは、これらの化合物の投与と組み合わせて用いるための剤として有用である。Dnmt阻害剤としては、例えば5アザシチジン等、HDAC阻害剤としては、例えばスベロイラニリドハイドロザミック酸SAHA、トリコスタチンATSA、バルプロ酸VPA等が有用である。また5アザシチジンを用いる場合、グルココルチコイドデキサメタゾンを併用することにより効率を上昇させることができる。細胞をリプログラミングさせるには、例えば1KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を発現する本発明のベクター、21のベクターとMYC遺伝子またはGlis1遺伝子を発現するセンダイウイルスベクターとの組み合わせ、32にさらにNANOG遺伝子を発現するセンダイウイルスベクター、およびLIN28を発現するセンダイウイルスベクターを加えた組み合わせ、42の組み合わせにさらにKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をそれぞれ単独で発現するセンダイウイルスベクターを1種類または2種類加えた組み合わせ例えばOCT34SOX2KLF4遺伝子搭載SeVベクターとMYC遺伝子搭載ベクターとKLF遺伝子搭載ベクターの組み合わせ等、または51のベクターと上記の他の所望のリプログラミング因子を搭載するベクターおよびまたはリプログラミングを誘導する所望の化合物との組み合わせ等を、細胞に導入することができる。1のベクターには、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で、あるいはOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で含む本発明のセンダイウイルスベクターが含まれる。複数のベクターおよび/または化合物を組み合わせて導入する場合、導入は同時に行うことが好ましく、具体的には、最初のベクターまたは化合物等を添加してから48時間以内、好ましくは36時間以内、より好ましくは24時間以内、18時間以内、12時間以内、10時間以内、8時間以内、6時間以内、3時間以内、2時間以内、または1時間以内にリプログラミング因子をコードする全てのベクターおよび/または化合物の添加を完了することが好ましい。ベクターの用量は適宜調製することができるが、例えばMOIは01以上、好ましくは03以上、05以上、1以上、2以上、または3以上、また、100以下、好ましくは90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下、20以下、10以下、または5以下である。好ましくは、例えばMOI03~100、より好ましくはMOI05~50、より好ましくはMOI1~40、より好ましくはMOI1~30、より好ましくはMOI2~30、例えばMOI3~30で感染させる。誘導された多能性幹細胞は、ES細胞とよく似た扁平なコロニーを形成し、アルカリホスファターゼを発現する。また誘導された多能性幹細胞は、未分化細胞マーカーであるNanog、OCT4、および/またはSOX2等を発現してよい。また誘導された多能性幹細胞は、好ましくはTERTを発現およびまたはテロメラーゼ活性を示す。本発明は、アルカリホスファターゼを発現し、好ましくは未分化細胞マーカーであるNanogおよびまたはTERTをさらに発現する細胞の製造方法、および該細胞の製造および該細胞を誘導する薬剤の製造におけるセンダイウイルスベクターの使用にも関する。本発明によれば、成人皮膚細胞および新生児包皮細胞を含む所望の細胞から多能性幹細胞のコロニーを、少なくともある細胞に関して、例えば003×105以上、01×105以上、03×105以上、05×105以上、08×105以上、または1×105以上例えば1×105~1×103の出現率で、好ましくは15×105以上、17×105以上、20×105以上、25×105以上、3×105以上、4×105以上、5×105以上、8×105以上、1×104以上、2×104以上、3×104以上、5×104以上、8×104以上、1×103以上、15×103以上、2×103以上、5×103、1×102以上、15×102以上、2×102以上、25×102以上、3×102以上、4×102以上、または5×102以上の出現率で誘導することができる。また本発明のベクターによる多能性幹細胞のコロニーの出現効率は、少なくともある細胞に関して、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をそれぞれ別のセンダイウイルスベクターに搭載した対照に比べて、例えば15倍以上、好ましくは2倍以上、25倍以上、3倍以上、35倍以上、4倍以上、45倍以上、または5倍以上である。またKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で含む本発明のベクターによる多能性幹細胞のコロニーの出現効率は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を他の順番、例えばOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で1つのセンダイウイルスベクターに搭載した対照に比べて、少なくともある細胞に関して例えば15倍以上、好ましくは2倍以上、25倍以上、3倍以上、35倍以上、4倍以上、45倍以上、または5倍以上である。尚、順にOCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子が挿入された本発明のベクターを用いた場合は、iPS細胞の成長が早いコロニーの成長が早い点が優れている特徴がある。リプログラミングを誘導する対象となる分化した細胞は、特に限定はなく、所望の体細胞等を用いることができる。体細胞からの多能性幹細胞の生成は、マウス胎児由来の細胞からのみならず、成体マウスの尾部から採取した分化した細胞や、肝細胞および胃粘膜細胞からでも可能であることが示されており、細胞型や分化状態によらないことが示唆されるWO2007069666AoiTetalSciencePublishedOnlineFebruary142008Science2008321699702。またヒトにおいても、成人の顔皮膚由来線維芽細胞、成人滑膜細胞、新生児包皮由来線維芽細胞、成人間葉系幹細胞、成人の手のひらの皮膚細胞、胎児細胞等の多様な細胞から、多能性幹細胞が誘導できることが確認されているTakahashiKetalCell131861872ParkIHetalNature45114162008。また、膵臓β細胞やBリンパ球のような最終分化した細胞からも、同様に多能性幹細胞が誘導できることが報告されているStadtfeldMetalCurrBiol2008May21PubMedPMID18501604CurrBiol2008188904HannaJetalCell133250642008。これらの知見は、多能性幹細胞の誘導が、元になる細胞によらないことを示唆している。これらの所望の体細胞からの多能性幹細胞の誘導において、本発明の方法を適用することができる。具体的には、リプログラミングの対象となる分化した細胞としては、線維芽細胞、滑膜細胞、口腔または胃などの粘膜細胞、肝細胞、骨髄細胞、歯胚細胞、血液細胞例えばリンパ球、白血球、その他の所望の細胞が含まれる。また細胞は、例えば胚、胎児、新生児、子供、成人または老人の細胞に由来してよい。また、動物の由来は特に制限はなく、ヒトおよび非ヒト霊長類サルなど、マウス、ラットなどのげっ歯類、およびウシ、ブタ、ヤギなどの非げっ歯類を含む哺乳動物等が含まれる。リプログラミングが完了した細胞のコロニーからは、ベクターが除去された細胞を適宜選択することができる。例えばベクターが自然除去された細胞を選択すればよい。このために、例えばウイルスベクターに特異的な抗体例えば抗HN抗体でネガティブ選択を行うことができる。また、温度感受性ベクターを用いた場合は、高温例えば375~39°C、好ましくは38~39°C、または385~39°Cで培養することによりベクターを簡便に除去することができる。また、SeVTSΔFや、これにさらにTS7、TS12、TS13、TS14、またはTS15などの変異を導入したベクターを用いた場合は、継代により自然にベクターを脱落させることができる。好ましいベクターとしては、例えばSeVKOSTS12ΔFが挙げられるが、これに限定されない。またこのとき、SeVcrMYCTS12ΔF、SeVcrMYCTS13ΔF、またはSeVcrMYCTS15ΔF等を用いてMYC遺伝子を導入することができる。また、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を搭載するセンダイウイルスベクターにMYC遺伝子を搭載させないことで、癌化に関連するMYC遺伝子を用いずにリプログラミングを行うことができる利点がある他、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子に加え、4つ目の因子としてcMYC、LMYC、またはGlis1などを自由に選択して用いること可能となる点でも優れている。本発明の方法により製造された細胞は、様々な組織や細胞に分化させるために有用であり、所望の試験、研究、診断、検査、治療等において用いることができる。例えば誘導した幹細胞は、幹細胞療法において利用されることが期待される。例えば患者から採取した体細胞を用いて初期化reprogrammingを誘導し、その後、分化誘導して得られる体性幹細胞やその他の体細胞を患者に移植することができる。細胞の分化誘導の方法は特に限定されず、例えばレチノイン酸処理や、様々な増殖因子サイトカイン処理、ホルモンによる処理により分化を誘導することができる。また得られた細胞は、所望の薬剤や化合物の効果を検出するために使用することができ、これを通して薬剤や化合物のスクリーニングを実施することが可能である。以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。また、本明細書中に引用された文献およびその他の参照は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。実施例1pSeVTSΔFの構築本発明で用いた外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターの作製方法を以下に示す。特に断らない限り、すべての実施例で外来遺伝子の導入にはこのベクターを用いた。尚、本発明においてとは、P遺伝子とM遺伝子の間にリプログラミング遺伝子を挿入することを表し、とは、HN遺伝子とL遺伝子の間にリプログラミング遺伝子を挿入することを表す。また本発明においてTSとは、M蛋白質にG69ET116A及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262TG264及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つことを表し、ΔFとは、F遺伝子を欠失していることを表す。また下記SeVTSΔFとは、M蛋白質にG69ET116A及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262TG264及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターZstrainである。このベクターは、P遺伝子の直下immediatedownstreamP遺伝子とM遺伝子の間に導入遺伝子挿入部位を有する。但しこれらは例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。pSeVTSΔFの構築は以下の通りに行った。LitmusSalINheIfrgPmutMtsHNtsΔFGFPdelGFPを鋳型にしてPMNOTIF5’GAAATTTCACCTAAGCGGCCGCAATGGCAGATATCTATAG3’およびPMNOTIR5’CTATAGATATCTGCCATTGCGGCCGCTTAGGTGAAATTTC3’を用いてPCR反応を行った。得られた約11kbのPCR産物をDpnI処理後、この反応液20μlを大腸菌DH5αを用いてトランスフォーメーションを行った。6個の大腸菌のコロニーをピックアップし、ミニプレップを行い、NotI消化によりNotI配列の導入されたプラスミドを選択し、次にシークエンスにより配列の正しいクローンを選択しLitmusSalINheIfrgPmutMtsHNtsdFを得た。次にこのLitmusSalINheIfrgPmutMtsHNtsdFをSalIおよびNheIで消化して回収したフラグメント約8kbpとL遺伝子に二カ所の変異を有するプラスミドpSeVΔSalINheIfrgLmutをSalINheIで消化して回収したフラグメント約8kbpをライゲーションして、pSeVTSΔFを得た。このベクターは、P遺伝子およびM遺伝子の間に導入遺伝子挿入部位を有する。実施例2KLF4OCT34SOX2遺伝子搭載SeVベクター作製用のプラスミドの作製KLF4遺伝子は、PrimeStarHSDNApolymeraseを用いて、pSeV18KLF4TSΔFWO2010008054を鋳型として、NotIKIF4F5’ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG3’及びKOSKOR5’TCCGAAGCCAGGTGTCCCGCCATGGCGGCTGTTAGGTGGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAAAATGCCTC3’のプライマーによりPCRを行い増幅した。PCR産物はQiaquickPCRPurificationkitを用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。OCT34遺伝子は、PrimeStarHSDNApolymeraseを用いて、pSeV18OCT34TSΔFWO2010008054を鋳型として、KOSKOF5’GAGGCATTTTTAACCGTAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCCACCTAACAGCCGCCATGGCGGGACACCTGGCTTCGGA3’及びKOSOSR5’CCGTCTCCATCATGTTGTACATGGCGGCGTGTTAGGTGAAATCTTTCACCCTAAGTTTTTCTTATTCTACGGTCAGTTTGAATGCATGGG3’のプライマーによりPCRを行い増幅した。PCR産物はQiaquickPCRPurificationkitを用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。SOX2遺伝子は、PrimeStarHSDNApolymeraseを用いて、pSeV18SOX2TSΔFWO2010008054を鋳型として、KOSOSF5’CCCATGCATTCAAACTGACCGTAGAATAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGATTTCACCTAACACGCCGCCATGTACAACATGATGGAGACGG3’及びNotISOX2R5’ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG3’のプライマーによりPCRを行い増幅した。PCR産物はQiaquickPCRPurificationkitを用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。精製したこれらのPCR産物を用いて2回目のPCRを行った。PrimeStarHSDNApolymeraseを用いて上記、精製したKLF4遺伝子PCR産物、OCT34遺伝子PCR産物、SOX2遺伝子PCR産物を1μlずつ添加し、NotIKIF4F5’ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG3’、NotISOX2R5’ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG3’のプライマーによりPCRを行い増幅した。また、もう一つの条件として、上記精製したKLF4遺伝子PCR産物、OCT34遺伝子PCR産物、SOX2遺伝子PCR産物をそれぞれH2Oで10倍希釈した溶液を1μlずつ添加し、NotIKIF4F5’ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG3’、NotISOX2R5’ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG3’のプライマーによりPCRを行い増幅した。PCR産物はQiaquickPCRPurificationkitを用いて精製し、キットに付属の溶出液50μlに溶出した。この精製産物をNotIで消化し、1アガロースゲル電気泳動により分離し、約36kbpのバンドを切り出し、QiaquickGelExtractionKitで精製した。キットに付属の溶出液100μlに溶出した。このKLF4遺伝子、OCT34遺伝子、SOX2遺伝子を含むNotI断片をpSeVTSΔFベクターのNotIサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeVKOSTSΔFを得た。実施例3ヒトKLF4OCT34SOX2遺伝子搭載SeVベクター作製トランスフェクションの前日に6ウェルプレートに1ウェル当たり106細胞の293T17細胞を播種し、37°CのCO2インキュベーターで培養した。その293T17細胞にpCAGGSNPpCAGGSP4CpCAGGSLpCAGGST7pCAGGSF5Rおよび上記で示したヒト転写因子を搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドpSeVKOSTSΔFをそれぞれ05μg05μg2μg05μg05μgおよび50μgを混合し、TransITLT1を15μl使用してトランスフェクションを行った。37°CのCO2インキュベーターで2日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質を発現する細胞LLCMK2FAWO0070070を1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T17細胞に重層し、37°CのCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地1mlで細胞を1度洗浄し、25μgmlのトリプシンを含むPSMEM培地を1ウェル当たり1ml添加し、32°CのCO2インキュベーターで2日間培養した。3~4日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLCMK2FA細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAampViralRNAMiniKitを用いてRNAを回収し、搭載した転写因子の領域を標的にRTPCRを行った。得られたRTPCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、SeVKOSTSΔFベクターを得た。実施例4OCT34SOX2KLF4遺伝子搭載SeVベクター作製用のプラスミドの作製OCT34遺伝子は、PrimeStarHSDNApolymeraseを用いて、pSeV18OCT34TSΔFWO2010008054を鋳型として、F65’ACAAGAGAAAAAACATGTATGG3’及びOSKOSR5’GGCGGCGTGTTAGGTGGATGACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGTTTGAATGC3’のプライマーによりPCRを行い増幅した。PCR産物はQiaquickPCRPurificationkitを用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。SOX2遺伝子は、PrimeStarHSDNApolymeraseを用いて、pSeV18SOX2TSΔFWO2010008054を鋳型として、OSKOSF5’TAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTCATCCACCTAACACGCCGCCATGTACAACATGATGGAG3’及びOSKSKR5’TGTTAGGTGGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGG3’のプライマーによりPCRを行い増幅した。PCR産物はQiaquickPCRPurificationkitを用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。KLF4遺伝子は、PrimeStarHSDNApolymeraseを用いて、pSeV18KLF4TSΔFWO2010008054を鋳型として、OSKSKF5’TAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCCACCTAACACGCCGCCATGGCTGTCAGCGACGC3’及びR1995’GATAACAGCACCTCCTCCCGACT3’のプライマーによりPCRを行い増幅した。PCR産物はQiaquickPCRPurificationkitを用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。精製したこれらのPCR産物を用いて2回目のPCRを行った。PrimeStarHSDNApolymeraseを用いて上記、精製したOCT34遺伝子PCR産物、SOX2遺伝子PCR産物、KLF4遺伝子PCR産物を1μlずつ添加し、F65’ACAAGAGAAAAAACATGTATGG3’、SOX2R4705’ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG3’のプライマー、または、SOX2F2945’AGCGCTGCACATGAAGGAGCACC3’、KLF4R4055’CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC3’のプライマーによりPCRを行い増幅した。これらのPCR産物と上記KLF4遺伝子のPCR産物精製物を05μlずつ用いてF65’ACAAGAGAAAAAACATGTATGG3’及びR1505’AATGTATCGAAGGTGCTCAA3’配列番号:26のプライマーでPrimeStarHSDNApolymeraseによりPCRを行った。増幅してきた約36kbpのバンドを切り出してQiaquickGelExtractionKitで精製した。キットに付属の溶出液100μlに溶出した。このOCT34遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子を含むPCR産物をNotIで消化し、QiaquickPCRPurificationkitを用いて精製し、このNotI断片をpSeVTSΔFベクターのNotIサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeVOSKTSΔFを得た。実施例5ヒトOCT34SOX2KLF4遺伝子搭載SeVベクター作製トランスフェクションの前日に6ウェルプレートに1ウェル当たり106細胞の293T17細胞を播種し、37°CのCO2インキュベーターで培養した。その293T17細胞にpCAGGSNPpCAGGSP4CpCAGGSLpCAGGST7pCAGGSF5Rおよび上記で示したヒト転写因子を搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドpSeVOSKTSΔFをそれぞれ05μg05μg2μg05μg05μgおよび50μgを混合し、TransITLT1を15μl使用してトランスフェクションを行った。37°CのCO2インキュベーターで2日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質を発現する細胞LLCMK2FAWO0070070を1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T17細胞に重層し、37°CのCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地1mlで細胞を1度洗浄し、25μgmlのトリプシンを含むPSMEM培地を1ウェル当たり1ml添加し、32°CのCO2インキュベーターで2日間培養した。3~4日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLCMK2FA細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAampViralRNAMiniKitを用いてRNAを回収し、搭載した転写因子の領域を標的にRTPCRを行った。得られたRTPCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、SeVKOSTSΔFベクターを得た。実施例6外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターによるES様細胞の作製ヒト新生児包皮由来線維芽細胞CRL252215x105を10FBS及びペニシリンストレプトマイシンナカライテスクCode2625384を含むDMEM10FBS中で37°C、5CO2インキュベータにて終夜培養した。培養後、MOI3の濃度で下記のベクターを上記培養した細胞に投与した。条件1SeVKOSTSΔFベクターSeV18crMYCTSΔFベクター条件2SeVKOSTSΔFベクターSeVcrMYCTSΔFベクター条件3SeVKOSTSΔFベクターSeVcrMYCTSΔFベクター条件4SeVKOSTSΔFベクターSeVcrMYCTS15ΔFベクター条件5SeVKOSTSΔFベクター条件6SeVOSKTSΔFベクターSeV18crMYCTSΔFベクター条件7SeVOSKTSΔFベクターSeVcrMYCTSΔFベクター条件8SeVOSKTSΔFベクターSeVcrMYCTSΔFベクター条件9SeVOSKTSΔFベクターSeVcrMYCTS15ΔFベクター条件10SeVOSKTSΔFベクター条件11SeV18OCT34TSΔFベクターSeV18SOX2TSΔFベクターSeV18KLF4TSΔFベクターSeVcMYCTS15ΔFベクター条件12ベクターなし上記ベクターを投与後、10FBSPSDMEMで毎日培地交換を行い、37°C、5CO2インキュベータにて培養した。その後、ゼラチンコート6ウェルプレートに用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞125×105に対し、025トリプシンで剥がした上記導入細胞の10×105を添加し、その上で培養した。翌日、10FBSPSDMEMから霊長類ES用培地に培地交換し、5CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。感染14日後、MEF上に継代して7日後に、従来の方法条件11と比較して3遺伝子搭載した条件下条件2、条件3、条件4で顕著に高い効率でヒトES細胞様のコロニーが出現した。図1に従来型と条件2の細胞の状態を示す。図1の写真を見ると、誘導前の線維芽細胞と明らかに異なる、ヒトES細胞に見られるのと同様の扁平なコロニーが見られたpp35402008。感染21日目に、ES細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCTBCIPにて染色すると、従来の条件上記条件11やOSKOCTSOXKLFの遺伝子の並びと比較して、KOSKLFOCTSOXの遺伝子の並びのベクターを用いた条件2、条件3、条件4において非常にたくさんのアルカリホスファターゼ陽性の青色に染まったコロニーが観察された。このように、アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率は、KOSKLFOCTSOXの遺伝子の並びのベクターにおいて特異的に高いことが判明した図4。実施例7ヒト胎児由来線維芽細胞CCL17115x105を10FBS及びペニシリンストレプトマイシンナカライテスクCode2625384を含むDMEM10FBS中で37°C、5CO2インキュベータにて終夜培養した。培養後、下記のベクター条件で上記培養した細胞に投与した。条件1SeVKOSTSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi3条件2SeVKOSTSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi9条件3SeVKOSTSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi30条件4SeVKOSTSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi90条件5SeVOSKTSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi3条件6SeVOSKTSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi9条件7SeVOSKTSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi30条件8SeVOSKTSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi90条件9SeV18OCT34TSΔFベクターMoi3SeV18SOX2TS15ΔFベクターMoi3SeV18KLF4TSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi3条件10SeV18OCT34TSΔFベクターMoi3SeV18SOX2TSΔFベクターMoi3SeV18KLF4TSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi9条件11SeV18OCT34TSΔFベクターMoi3SeV18SOX2TSΔFベクターMoi3SeV18KLF4TSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi30条件12SeV18OCT34TSΔFベクターMoi3SeV18SOX2TSΔFベクターMoi3SeV18KLF4TSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi90条件13ベクターなし上記ベクターを投与後、10FBSPSDMEMで毎日培地交換を行い、37°C、5CO2インキュベータにて培養した。その後、ゼラチンコート6ウェルプレートに用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞125×105に対し、025トリプシンで剥がした上記導入細胞の10×105を添加し、その上で培養した。翌日、10FBSPSDMEMから霊長類ES用培地に培地交換し、5CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。感染27日後、MEF上に継代して21日後に、従来の方法条件9~12と比較して3遺伝子搭載した条件下条件1~8でヒトES細胞様のコロニー出現率の有意な上昇が見られ、特にMIO90未満条件1~35~7において高い効率でコロニーが出現した。ES細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCTBCIPにて染色すると、従来の条件上記条件9~12と比較してKOSKLFOCTSOXの遺伝子、OSKOCTSOXKLFの遺伝子の並びのベクターを用いた条件1~8、特に条件1~3および5~7において効率的にアルカリホスファターゼ陽性の青色に染まったコロニーが観察された。アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率は、従来の条件よりも効率的であった図6。また、KOSKLFOCTSOXの並びのベクターを用いた場合の方が、OSKOCTSOXKLFの並びのベクターを用いた場合よりも誘導効率は有意に高かった。実施例8pSeVTS7ΔFの構築pSeVTSΔFをPmlI及びXhoI消化して、約127kbpのバンドを切り出し、QIAquickGelExtractionkitにて精製した。pSeV18Oct34TS7ΔF国際公開番号WO2010008054をNotIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、約164Kbpのバンドを切り出し、QIAquikGelExtractionkitにて精製した。その後、セルフライゲーションを行い、Oct34遺伝子を含むNotI断片を含まないクローンを選択し、pSeV18TS7ΔFを得た。pSeV18TS7ΔFをPmlI及びXhoI消化して、約36kbpのバンドを切り出し、QIAquickGelExtractionkitにて精製した。これら2つの精製物を用いてライゲーションを行い、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeVTS7ΔFを得た。このベクターは、P遺伝子およびM遺伝子の間に導入遺伝子挿入部位を有する。実施例9KLF4OCT34SOX2遺伝子搭載SeVTS7ΔFベクター作製用のプラスミドの作製pSeVTS7ΔFをNotIで消化後、QIAquickPCRpurificationkitで精製し、BAP処理を行った。その後、QIAquickPCRpurificationkitで精製した。pSeVKOSTSΔFをNotIで消化し、1アガロースゲル電気泳動により分離し、約36kbpのバンドを切り出し、QiaquickGelExtractionKitで精製した。キットに付属の溶出液100μlに溶出した。このKLF4遺伝子、OCT34遺伝子、SOX2遺伝子を含むNotI断片をpSeVTS7ΔFベクターのNotIサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeVKOSTS7ΔFを得た。実施例10KLF4OCT34SOX2遺伝子搭載SeVTS7ΔFベクターの作製293T17細胞にpCAGGSNPpCAGGSP4CpCAGGSLpCAGGST7pCAGGSF5Rおよび上記で示したヒト転写因子crMycを搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドpSeVKOSTS7ΔFをそれぞれ05μg05μg2μg05μg05μgおよび50μgを混合し、TransITLT1を15μl使用してトランスフェクションを行った。37°CのCO2インキュベーターで3日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質Fタンパク質を発現する細胞LLCMK2FAを1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T17細胞に重層し、37°CのCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地以下PSMEM1mlで細胞を一度洗浄し、25μgmlのトリプシンを含むPSMEM培地以下TryPSMEMとするを1ウェル当たり1ml添加し、32°CのCO2インキュベーターで2日間培養した。その後、適宜培地交換を行いながら、場合によっては、LLCMK2FA細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAampViralRNAMiniKitキアゲンカタログ番号52906を用いてRNAを回収し、搭載したcrMycの領域を標的にRTPCRを行った。得られたRTPCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、SeVKOSTS7ΔFベクターを得た。実施例11pSeVTS12ΔFの構築pSeVTSΔFを鋳型にして、F3208及びR3787のプライマーを用いて、PrimeSterを使用し、94°C3分、98°C10秒、55°C15秒、72°C15分のサイクルを30サイクル、72°C5分、4°C∞の条件でPCRを行い、増幅された約600bpのバンドをQIAquickPCRpurificationkitにて精製した。pSeV18Oct34TS12ΔFを鋳型にして、F2001及びR3390のプライマーを用いて、PrimeSterを使用し、94°C3分、98°C10秒、55°C15秒、72°C15分のサイクルを30サイクル、72°C5分、4°C∞の条件でPCRを行い、増幅された約14kbpのバンドをQIAquickPCRpurificationkitにて精製した。これらのPCR産物を混合し、F2001及びR3787のプライマーを用いて、PrimeSterを使用し、94°C3分、98°C10秒、55°C15秒、72°C2分のサイクルを30サイクル、72°C5分、4°C∞の条件でPCRを行った。そのPCR産物をQIAquickPCRpurificationkitにて精製し、SalI及びNotIで消化後アガロースゲル電気泳動にて分離後、約16kbpのバンドを切り出し、QIAquickGelExtractionkitにて精製した。pSeVTSΔFをSalI及びNotIで消化後アガロースゲル電気泳動にて分離後、約148kbpのバンドを切り出し、QIAquickGelExtractionkitにて精製した。この2つのSalI及びNotI消化、精製産物を用いてライゲーションを行い、シークエンスにより配列を正しいクローンを選択し、pSeVTS12ΔFを得た。このベクターは、P遺伝子およびM遺伝子の間に導入遺伝子挿入部位を有する。実施例12KLF4OCT34SOX2遺伝子搭載SeVTS12ΔFベクター作製用のプラスミドの作製pSeVTSΔFをNotIで消化後、QIAquickPCRpurificationkitで精製し、BAP処理を行った。その後、QIAquickPCRpurificationkitで精製した。pSeVKOSTSΔFをNotIで消化し、1アガロースゲル電気泳動により分離し、約36kbpのバンドを切り出し、QiaquickGelExtractionKitで精製した。キットに付属の溶出液100μlに溶出した。このKLF4遺伝子、OCT34遺伝子、SOX2遺伝子を含むNotI断片をpSeVTS12ΔFベクターのNotIサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeVKOSTS12ΔFを得た。実施例13KLF4OCT34SOX2遺伝子搭載SeVTS12ΔFベクターの作製293T17細胞にpCAGGSNPpCAGGSP4CpCAGGSLpCAGGST7pCAGGSF5Rおよび上記で示したヒト転写因子crMycを搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドpSeVKOSTS7ΔFをそれぞれ05μg05μg2μg05μg05μgおよび50μgを混合し、TransITLT1を15μl使用してトランスフェクションを行った。37°CのCO2インキュベーターで3日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質Fタンパク質を発現する細胞LLCMK2FAを1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T17細胞に重層し、37°CのCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地以下PSMEM1mlで細胞を一度洗浄し、25μgmlのトリプシンを含むPSMEM培地以下TryPSMEMとするを1ウェル当たり1ml添加し、32°CのCO2インキュベーターで2日間培養した。その後、適宜培地交換を行いながら、場合によっては、LLCMK2FA細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAampViralRNAMiniKitキアゲンカタログ番号52906を用いてRNAを回収し、搭載したcrMycの領域を標的にRTPCRを行った。得られたRTPCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、SeVKOSTS12ΔFベクターを得た。実施例14外来遺伝子を保持する温度感受性センダイウイルスベクターによるヒト新生児包皮由来繊維芽細胞BJからのiPS細胞誘導ヒト新生児包皮由来繊維芽細胞を10FBS及びペニシリンストレプトマイシンナカライテスクCode2625384を含むDMEM10FBSを用いて12ウェルプレートに20x105で播き、37°C、5CO2インキュベータにて終夜培養した。培養後、下記のベクター条件で上記培養した細胞に投与した。条件1:従来型SeV18OCT34TSΔFベクターMoi3SeV18SOX2TSΔFベクターMoi3SeV18KLF4TSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi3条件2SeVOSKTSΔFベクターMoi3SeV18KLF4TSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi3条件3SeVKOSTSΔFベクターMoi3SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi3条件4SeVKOSTS7ΔFベクターMoi30SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi30条件5SeVKOSTS12ΔFベクターMoi30SeVcrMYCTS15ΔFベクターMoi30条件6ベクターなし上記ベクターを投与後、10FBSPSDMEMで毎日培地交換を行い、36°C、37°Cの各温度、5CO2インキュベータにて培養した。その後、ゼラチンコート6ウェルプレートに用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞125×105に対し、025トリプシンで剥がした上記導入細胞の10×105を添加し、その上で培養した。翌日、10FBSPSDMEMから霊長類ES用培地に培地交換し、36°C、37°Cの各温度で5CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。感染28日目に、ES細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCTBCIPにて染色すると、従来の条件上記条件1と比較して、KOSKLFOCTSOXを搭載したベクターを使用した条件では、アルカリホスファターゼ陽性の青色に染まったコロニーが観察された。温度感受性ベクターを用いた場合は、36°Cがより効率的にアルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞を誘導した。図8に各条件でのアルカリホスファターゼ陽性でiPS細胞様細胞の誘導効率を示す。アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率は、3初期化因子同時搭載させた温度感受性センダイウイルスベクターを用いても従来の条件よりも効率的であることを示している。ここで示した条件以外にも、SeVKOSTS12ΔFベクターとSeVcrMYCTS12ΔFベクターWO2010008054に記載したpSeV18crMycTS12ΔFを用いて作製したHNとLの間にcrMYCを搭載したTS12の変異を有するベクター、SeVKOSTS12ΔFベクターとSeVcrMYCTS13ΔFベクターWO2010008054に記載したpSeV18crMycTS13ΔFを用いて作製したHNとLの間にcrMYCを搭載したTS13の変異を有するベクターを用いても効率的にアルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導に成功した。BJ細胞以外にもヒト成人皮膚由来繊維芽細胞HDFやヒト胎児肺細胞由来繊維芽細胞MRC5;ATCCCCL171からのiPS細胞の誘導にも成功した。実施例15RTPCRによるiPS細胞のESマーカー発現3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞がESマーカー遺伝子を発現しているかを確かめるために、SeVKOSTSΔFとSeVcrMYCTS15ΔFを用いて誘導、樹立したiPSクローンKOSO1、KOSO6、KOSO7、KOSO10BJ細胞由来、及びSeVOSKTSΔF、SeVcrMYCTS15ΔFおよびSeV18KLF4TSΔFを用いて誘導、樹立したiPSクローンOSKK1OSKK2、OSKK4BJ細胞由来の株からトータルRNAを抽出し、ランダムプライマーを用いてRT反応を行い、各遺伝子検出用のプライマーを用いてPCRを行った。評価したES細胞マーカーは、NANOG、TERTSALL4ZFP42TDGF1DNMT3BLIN28GABRA3CYP26A1FOXD3GDF3である。内部コントロールとしてβACTINを用いた。また、センダイウイルスベクター検出のためのPCRも行った。図9に示したように、3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞は、評価したすべてのESマーカー遺伝子を発現していることが確認された。また、センダイウイルスベクターRNAは検出されなかった。同様にSeVKOSTS12ΔFとSeVcrMYCTS15ΔFを用いて36°Cで誘導、樹立したiPSクローンBJ細胞、HDF細胞由来においても評価したすべてのESマーカー遺伝子を発現していることが確認された図10。SeVKOSTS12ΔFとSeVcrMYCTS12ΔFを用いて37°Cで誘導し、39°Cで7日間培養を行い樹立したiPSクローンBJ細胞、HDF細胞由来においても評価したすべてのESマーカー遺伝子を発現していることが確認された図11。また、センダイウイルスベクターRNAは検出されなかった。なお使用した各プライマーは以下の通りである。NANOGについては、NANOGFおよびNANOGRCTCACACGTCTTCAGGTTGCATGTTCTERTについてはTERTF2847TGCCCGGACCTCCATCAGAGCCAGおよびTERTR3399TCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCTG、Sall4についてはSall4FAAACCCCAGCACATCAACTCおよびSall4RGTCATTCCCTGGGTGGTTC、Zfp42についてはZfp42F1ATGAGCCAGCAACTGAAGAAACGGGCAAAGおよびZfp42R933CTACTTTCCCTCTTGTTCATTCTTGTTCG、TDGF1についてはTDGF1F1ATGGACTGCAGGAAGATGGCCCGCおよびTDGF1R567TTAATAGTAGCTTTGTATAGAAAGGC、Dmmt3bについてはDnmt3bFGCAGCGACCAGTCCTCCGACTおよびDnmt3bRAACGTGGGGAAGGCCTGTGC、LIN28についてはLIN28FCCACCATGGGCTCCGTGTCCAACCAGCおよびLIN28RGTCAATTCTGTGCCTCCGGGAGC、GABRB3についてはGABRB3FCTTGACAATCGAGTGGCTGAおよびGABRB3RTCATCCGTGGTGTAGCCATA、CYP26A1についてはCYP26A1FAACCTGCACGACTCCTCGCACAおよびCYP26A1RAGGATGCGCATGGCGATTCG、FOXD3についてはFoxD3F418GTGAAGCCGCCTTACTCGTACおよびFoxD3R770CCGAAGCTCTGCATCATGAG、GDF3についてはGDF3FGGCGTCCGCGGGAATGTACTTCおよびGDF3RTGGCTTAGGGGTGGTCTGGCC、βACTINについてはbetaactinFCAACCGCGAGAAGATGACおよびbetaactinRAGGAAGGCTGGAAGAGTG、センダイウイルスベクターについてはF15204GGATCACTAGGTGATATCGAGCおよびR15397eACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC実施例16免疫染色によるiPS細胞のESマーカー発現3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたBJ由来のiPS細胞クローンであるKOSO1、KOSO6、KOSO7、KOSO10の培養細胞をマイルドホルム10N和光純薬工業株式会社、カタログ番号13310311で固定を行った。抗Nanog抗体リプロセル、カタログ番号RCAB0003P、抗Oct34抗体SantaCruz社カタログ番号sc‐5279、抗SSEA4Cellsignaling、カタログ番号4755S抗体を用いて免疫染色を行った。この際、核を染色するために、同時にDAPI染色も行い蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、評価したすべての3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたBJ由来のiPS細胞クローンにおいて、ESマーカータンパク質の発現が確認された図12。SeVKOSTS12ΔFとSeVcrMYCTS15ΔFを用いて36°Cで誘導、樹立したHDF細胞由来のiPSクローン図13、SeVKOSTS12ΔFとSeVcrMYCTS12ΔFを用いて37°Cで誘導し、39°Cで7日間培養を行い樹立したHDF細胞由来のiPSクローン図14を各種抗体で免疫染色を行った。同時にDAPI染色も行い蛍光顕微鏡にて観察した。使用した抗体は、抗Nanog抗体CSTジャパン株式会社、カタログ番号4893S、抗Oct34抗体SantaCruz社カタログ番号sc‐5279、抗SSEA4Cellsignaling、カタログ番号4755S、抗Tra160抗体Stemgentカタログ番号090068、抗Tra181抗体Stemgentカタログ番号090069免疫ESマーカータンパク質の発現が確認された。その結果、評価したすべての3初期化因子同時搭載温度感受性センダイウイルスベクターを用いて誘導されたヒト成人HDF由来のiPS細胞クローンにおいて、ESマーカータンパク質の発現が確認された。実施例17invitroにおけるiPS細胞の多分化能3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞の多分化能を確認するため、invitroの胚様体形成実験を行った。SeVKOSTSΔFとSeVcrMYCTS15ΔFを用いて誘導を行い樹立したiPSクローンKOSO6BJ由来、SeVOSKTSΔF、SeVcrMYCTS15ΔFおよびSeV18KLF4TSΔFを用いて誘導を行い、樹立したiPSクローンOSKK4BJ由来コロニーをコラゲナーゼIVでシャーレから剥がし、細胞塊をMPCコートのウェルに移し、10FBSを含んだDMEM中にて8日間浮遊培養を行い、胚様体の形成を顕微鏡下で確認した。センダイウイルスベクター誘導iPSは分化能を持っており、いずれのiPSも胚様体を形成し、多数の嚢胞状を含む胚様体が認められた図15。その後、ゼラチン処理したプレートに継代し、さらに8日間培養を行った。その後、抗αフェトプロテインAFP抗体シグマアルドリッジ、カタログ番号A8452、抗Brachyury抗体シグマアルドリッジ、カタログ番号B8436、抗ヒトグリア線維性酸性蛋白質GFAP抗体コスモバイオ、カタログ番号ROI003を用いて抗免疫染色を行い蛍光顕微鏡で観察を行った結果、3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞は、三胚葉分化できることが確認された図15。実施例18invivoにおけるiPS細胞の多分化能BJ細胞由来のiPSクローンKOSO6およびOSKK4を用いてinvivoでの多分化能を評価するために、免疫不全マウスへのテラトーマ形成で確認を行った。KOSO6およびOSKK4クローンはSCIDマウス皮下および筋肉内に接種し、105日後に検体を回収し、10ホルマリン固定後、株式会社組織化学研究所に依頼し、パラフィン包埋、組織切片の作製、ヘマトキシリンエオジン染色、病理解析を行い、三胚葉分化を確認した。実施例19核型解析BJ細胞由来のiPSクローンKOSO6およびOSKK4の核型解析を日本遺伝子研究所に依頼して行った。その結果、ともに46本の染色体を有し、核型が正常であることが示された図19。実施例20iPS細胞のプロモーター解析ES細胞で発現する遺伝子プロモーターOct34のiPS細胞における活性化状況について、以下のバイサルファイトシークエンス法によりメチル化解析を行った。その結果、対照の親株BJおよびHDFではOct34プロモーターのメチル化が多く認められた。つまり、遺伝子発現は抑制されていることを示している。一方で、3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞の各クローンに於いては、多くの脱メチル化が認められ、SeViPS細胞はES細胞同様にOct34プロモーター領域が活性化されていることが明らかになった。バイサルファイトシークエンス法iPS細胞よりDNAゾル試薬インビトロジェン、カタログ番号:10503027または、WizardGenomicDNAPurificationKitプロメガ、カタログ番号:A1120を用いて、キットのプロトコールに従いゲノムDNAを抽出した。次に、抽出したゲノムDNAををMethylEasyXceedRapidDNABisulphiteModificationKitタカラ、コード番号:GE004を用いて、キットのプロトコールに従いバイサルファイト修飾を行った。バイサルファイト修飾ゲノムDNAを鋳型としてOct34遺伝子のプロモーター領域を標的として特異的プライマーを用いてPCRを行った。PCR産物をQIAquickPCRpurificationkitキアゲン、カタログ番号:28106にて精製した。精製したPCR産物は、pGEMTEasyVectorSystemIプロメガ、カタログ番号:A1360を用いて、キットのプロトコールに従い、TAクローニングを行った。次に、コロニーPCR用のプライマーを用いてコロニーPCRを行った。コロニーPCRは、GoTaqGreenMasterMixプロメガ、カタログ番号M7123を用いて行った。その産物はアガロースゲル電気泳動を行いバンドサイズの正しいクローンを10クローン以上選択した。そのクローンについて、コロニーPCR産物をQIAquickPCRpurificationkitキアゲン、カタログ番号:28106にて精製し、T7プライマー、SP6プライマーを用いてシークエンスを行った。バイサルファイト修飾後の標的配列との比較を行いプロモーター領域のメチル化状態を評価した。Oct34遺伝子プロモーター領域増幅用およびコロニーPCR用プライマーJBiolChem2005Vol28062576260mOct43F5ATTTGTTTTTTGGGTAGTTAAAGGT3配列番号:57mOct43R5CCAACTATCTTCATCTTAATAACATCC3配列番号:58コロニーPCR用プライマーPGEMTF5CACGACGTTGTAAAACGACGGCC3配列番号:59PGEMTR5CAGCTATGACCATGATTACGCC3配列番号:60シークエンス用のプライマーT75TAATACGACTCACTATAGGG3配列番号:61SP65CATACGATTTAGGTGACACTATAG3配列番号:62実施例21ベクターの除去3初期化因子同時搭載温度感受性センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞からのベクターの除去を評価するために、SeVKOSTS12ΔFとSeVcrMYCTS12ΔFを用いて誘導したiPS細胞を39°Cで1,2,3,4,5,6,7日間培養後、継代を行いさらに7日間培養を行ったiPS細胞を抗センダイウイルス抗体により免疫染色を行いベクターが除去されているかどうかを評価した。その結果、図21に示したように39°Cでの培養3日目から培養時間依存的にセンダイウイルスベクターの除去割合が増加し、6から7日の培養によりベクターがほぼ完全に除去できることが示された。実施例22ベクターの自然脱落従来型の方法を用いて誘導されたiPS細胞を一般的な方法で継代培養することにより、センダイウイルスベクターが自然に除去されることが明らかとなっているFusakiNetalProcJpnAcadSerBPhysBiolSci85348362。3初期化因子同時搭載センダイウイルスベクター、3初期化因子同時搭載温度感受性センダイウイルスベクターを用いて誘導されたiPS細胞についても自然除去が観察された。特に、SeVKOSTS12ΔFとSeVcrMYCTS15ΔFを用いて36°Cで誘導されたiPS細胞は、従来型の方法で誘導した場合に比べてベクターの自然脱落の効率が非常に高いことが明らかになった。従来型の方法で誘導されたBJiPSとSeVKOSTS12ΔFとSeVcrMYCTS15ΔFを用いて36°Cで誘導されたBJiPS細胞を各3クローンピックアップし、37°Cで継代を行い3、5、7継代目に一部の細胞を抗センダイウイルス抗体による免疫染色を行い、センダイウイルスの除去について検討を行った。その結果、SeVKOSTS12ΔFとSeVcrMYCTS15ΔFを用いて36°Cで誘導されたBJiPS細胞は3継代目で3クローンの全てにおいてセンダイウイルスベクターが陰性となっていた。従来型は、3クローン中1クローンでベクター陰性となっていたが、残りの2クローンは7継代目においても完全にはベクター陰性には至らなかった図22。また、BJ細胞以外の細胞、例えば、ヒト成人皮膚由来繊維芽細胞HDFやヒト胎児肺細胞由来繊維芽細胞MRC5;ATCCCCL171からSeVKOSTS12ΔFとSeVcrMYCTS15ΔFを用いて36°Cで誘導されたiPS細胞についても、3から5継代目でベクターが除去されたことを確認した。従って、SeVKOSTS12ΔFとSeVcrMYCTS15ΔFを用いて36°Cで誘導されたiPS細胞は、ベクターの除去効率の非常に優れたiPS誘導法である。"