"癌の治療における使用のための、Robo1タンパク質に由来する細胞外ドメインまたはこのドメインの一部を含む組換えタンパク質。癌が肝癌である、請求項1に記載の使用のための組換えタンパク質。内皮細胞増殖を阻害しない、請求項1または2のいずれか一項に記載の使用のための組換えタンパク質。細胞外ドメインが、Robo1タンパク質のアイソフォームbに由来する細胞外ドメインである、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のための組換えタンパク質。Robo1の細胞外ドメインまたはその一部が、前記細胞外ドメインのIg1およびIg2免疫グロブリンドメインからなる、請求項4に記載の使用のための組換えタンパク質。Robo1の細胞外ドメインが、配列番号2の配列と少なくとも80の同一性を有する、請求項5に記載の使用のための組換えタンパク質。リンカーおよび免疫グロブリンFcドメインをさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のための組換えタンパク質。Fcドメインが、ヒト免疫グロブリンG4に由来する、請求項7に記載の使用のための組換えタンパク質。FcドメインがS241PおよびL248E突然変異を含み、C末端位置にあるリジンが不在である、請求項8に記載の使用のための組換えタンパク質。組換えタンパク質の配列が、配列番号4、配列番号6または配列番号24の配列と少なくとも80の同一性を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の使用のための組換えタンパク質。組換えタンパク質の配列が、配列番号4、配列番号6または配列番号24の配列である、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のための組換えタンパク質。しかしながら、癌を治療するための代替アプローチ、特にSlit2シグナル伝達経路を阻害することができる分子を提案することは有利である。本発明者らは、Slitリガンドに結合することができ、結果的にRobo/Slit経路の細胞内シグナル伝達を阻害することができる可溶性キメラRobo1受容体の方策を開発した。驚くべきことに、本発明によるRobo1-Fc分子は、成熟血管の形成を防止することおよび内皮細胞の増殖を阻害しないことにより、抗血管新生効果を有する。本発明者らは、Robo1-Fc分子がまた、肺および肝臓癌において抗腫瘍効果を有することを示した。本発明の主題は、Robo1タンパク質アイソフォームbの細胞外ドメインまたはこのドメインの一部、結合領域リンカーおよび免疫グロブリンFcドメインを含むRobo-Fc組換えタンパク質である。1つの特定の実施形態において、Robo1タンパク質アイソフォームbの細胞外ドメインは、Ig1およびIg2ドメインからなる。これらのドメインは、配列番号1の核酸配列によりコードされる配列番号2のペプチドまたは配列番号2と少なくとも80、85、90、95もしくは99の同一性を有する配列に対応する。融合タンパク質は、リンカーとも称される結合領域も含む。本発明に関連して、リンカーにより、特にインビボ開裂を制限することにより組換えタンパク質の安定性を生じさせることが可能となる。Robo1-Fc分子において使用することができるリンカーは、例えばGluArgProSerPheValおよびGlyGlyGlyGlySerである。当業者は、この使用に好適なリンカーを選択するための十分な見識を有する。本発明によるRobo1-Fc組換え分子のFcドメインは、免疫グロブリンの結晶化可能な断片に対応する。このFc断片は、種々の免疫グロブリンIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4に由来し得る。この断片は、免疫応答のエフェクター機能を担うWO2008/065543。本発明による一実施形態において、Fcドメインは、IgG4免疫グロブリンに由来する。1つの特定の実施形態において、特に2種のFcドメインから構成されるヒンジ領域を安定化することにより分子の安定性を増加させAnglaetal.,1993,Mol.Immunol.,30:105-108、IgG4-Fcの残留活性、特にエフェクター活性を低減または排除しWO97/09351、組換えタンパク質の生成の間の均一性を増加させるように少なくとも1個の点突然変異または欠失をIgG4Fcドメイン内に導入した。特に、少なくとも2個の点突然変異、好ましくは3個の点突然変異をIgG4Fcドメイン内に導入した。本発明によるRobo1-FcL1、Robo1-FcL2およびRobo1-FcL3分子において、好ましい突然変異は以下のものである:Fcヒンジ領域内のジスルフィド架橋結合を安定化するためのS241PKabatナンバリング;IgG4-Fcドメインの残留エフェクター活性を排除するためのL248EKabatナンバリング;タンパク質の不均一性を低減するためのC末端リジンの不在。Robo1アイソフォームbのIg1およびIg2ドメイン、リンカーならびに上記の突然変異させたIgG4ドメインを含む本発明によるRobo1-Fc分子は、Robo1-FcL1、Robo1-FcL2およびRobo1-FcL3である。Robo1-FcL1は、配列番号3のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号4の配列のタンパク質に対応する。Robo1-FcL2は、配列番号5のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号6の配列のタンパク質に対応する。Robo1-FcL1およびRobo1-FcL2は、リンカーの性質の点で異なる。Robo1-FcL3は、配列番号23のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号24の配列のタンパク質に対応する。本発明の1つの特定の実施形態において、生成の間の均一性を増加させるように1個以上の点突然変異または欠失を導入した。特に、1個のアミノ酸、好ましくは2個のアミノ酸をN末端位置においてトランケートした。本発明によるこのようなRobo1-Fc分子は、2個のアミノ酸Ser20およびArg21がトランケートされ、アミノ酸Leu22がインターロイキン2のシグナルペプチドに融合しているRobo1-FcL3分子である。本発明によるRobo1-Fc分子の均一性は、上記のとおりC末端Lysを欠失させることによっても増加する。本発明の主題はまた、タンパク質配列が配列番号2、配列番号4、配列番号6もしくは配列番号24の配列に対応し、または配列番号2、配列番号4、配列番号6もしくは配列番号24の配列と少なくとも80、85、90、95もしくは99の同一性を有するタンパク質である。これらのタンパク質バリアントは、配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号24の配列を有するタンパク質と同一の生物学的活性、特にSlitファミリーのタンパク質とのこれらの相互作用能を有する。本発明によるRobo1-Fcタンパク質は、これらのタンパク質をコードする発現プラスミドを、真核組換えタンパク質の発現に好適な任意の細胞タイプ:HEK293、CHOなどに形質移入し、次いで培養上清中で回収し、慣用の方法に従って精製することにより生成することができる。本発明によるRobo1-FcL1、Robo1-FcL2およびRobo1-FcL3タンパク質の特徴付けにより、これらのタンパク質が生物学的治療剤としての投与に要求される質を有することを確認することが可能となった。本発明によるRobo1-Fcタンパク質は、Slitファミリーのタンパク質との相互作用能を有する。本発明によるRobo1-Fcタンパク質は、具体的には、ヒトSlit1、Slit2およびSlit3タンパク質ならびにマウスSlit2タンパク質を、特にこれらのD2ドメインとの相互作用により認識する。これらの親和性は、Slitファミリーの3種のメンバーに関して同様である。本発明による別の主題は、本発明によるタンパク質をコードする核酸分子に対応する。従って、配列番号1、配列番号3、配列番号5もしくは配列番号23の配列に対応し、または配列番号1、配列番号3、配列番号5もしくは配列番号23の配列を有する分子と少なくとも80、85、90、95もしくは99の同一性を有する核酸分子は、本発明の一部である。本発明による別の主題は、Slitファミリーのタンパク質が過剰発現される疾患を治療するための、本発明によるRobo1-Fcタンパク質の使用からなる。本発明によるRobo1-Fcにより標的化することができるSlitファミリーのタンパク質は、Slit1、Slit2またはSlit3である。Robo1は、Slitファミリーの種々のメンバーと相互作用することができることが示された。結果的に、本発明によるRobo1-Fcタンパク質が、Slit1、Slit2およびSlit3により媒介されるシグナル伝達経路を同時に阻害することができ、このことによりこれらの経路の1種のみに特異的な抗体と比較して治療スペクトルを拡大することが可能となることに留意することは有利である。別の実施形態において、Robo1-Fcタンパク質は、内皮細胞増殖を阻害することなく血管新生を阻害することにより、Slitファミリーのタンパク質が過剰発現される疾患を治療するために使用される。血管成熟欠如に結びつくこの抗血管新生活性は、非生産的血管新生と称される。具体的には、実験的研究は、本発明によるRobo1-Fc分子が内皮細胞増殖を阻害することなく小管の形成を阻害することができることを示した。このことにより、肺癌のマウスモデルにおける腫瘍容積を極めて顕著に低減することが可能となる。1つの好ましい実施形態において、Slitタンパク質が過剰発現される疾患を治療するために使用することができるRobo1-Fcタンパク質は、Robo1-FcL1、Robo1-FcL2およびRobo1-FcL3ならびにこれらから誘導され、特に分子の生物学的特性を顕著に改変することなく生成の間の均一性を増加することを目的とする点突然変異または欠失を含む分子である。一般に、本発明によるRobo-1-Fcタンパク質により治療することができる疾患は、Slit経路の阻害が治療効果を有することができる全ての疾患、特にSlitファミリーのタンパク質が過剰発現される疾患および特にSlit2が過剰発現される疾患である。本発明によるRobo1-Fc分子はSlit2分子に特異的に結合するので、前記分子が、Slit2が関与する2種の経路、即ちRobo1/Slit2およびRobo4/Slit2経路を同時に阻害することができることに留意することは興味深い。本発明の具体的な実施形態において、本発明によるRobo1-Fcタンパク質は、癌、特に膵癌、結腸癌、リンパ行性転移を有するまたは有さない結腸直腸癌、乳癌、肺癌および肺転移、卵巣癌、子宮頸癌、黒色腫、腎癌、口腔癌、前立腺癌、肝臓癌などを治療するために使用される。具体的な実施形態において、前記癌はSlit2が過剰発現される癌である。1つの特定の実施形態において、Robo-Fcタンパク質は、肺癌を治療するために使用される。別の特定の実施形態において、Robo-Fcタンパク質は、肝臓癌、例えば肝癌、肝細胞癌HCC、線維層板癌肝細胞癌の病理学的バリアント、胆管癌、肝芽腫、または肝臓の血管肉腫などを治療するために使用される。本発明によるRobo1-Fc分子は、現行治療の代替物または補助物としての抗癌医薬品として使用することもできる。特に、これらの分子は、抗癌化合物と組み合わせて場合により同時に投与することができる。本発明の別の主題は、上記定義のRobo1-Fcタンパク質および1種以上の医薬として許容される賦形剤を含む組成物に関する。本発明によるRobo1-Fcタンパク質は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与などを目的とする医薬組成物に配合することができる。好ましくは、医薬組成物は注射配合物のための医薬として許容されるビヒクルを含有する。これらのビヒクルは、特に等張滅菌生理食塩溶液リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物または適切な場合に滅菌水もしくは生理食塩水の添加により注射溶質の形成を可能とする乾燥、特に凍結乾燥組成物であり得る。本発明の別の態様は、患者におけるSlitファミリーの分子の過剰発現を検出するための診断ツールとしてのRobo1-Fc分子の使用からなる。これは、Slit経路が多くの癌に関与することが示されているからである。Slitシグナル伝達経路の撹乱を評価するための試験の提供は、Robo1-Fc分子の投与に基づく治療に応答することができる患者を選択する目的に極めて有用である。この診断ツールは、Slit分子の過剰発現を示す傾向がある患者からの生物試料血液、尿、腫瘍生検物との接触に好適な形態のRobo1-Fc分子を含む既製のキットの形態であり得る。Robo-Fc分子は、場合により予備標識することができ、Robo-FcおよびSlitの組合せを検出して対照試料と比較して生物試料中のSlitタンパク質の発現の増加を評価する。このキットは、例えばELISAキットの形態であり得る。[実施例1]Robo1-Fcタンパク質の調製a.生物学的治療剤として使用されるRobo1-Fc組換えタンパク質の発現を可能とする構築物。Robo1-Fc組換えタンパク質は、ヒトRobo1タンパク質アイソフォームbNP_598334の最初の2種の免疫グロブリンドメインIg1-Ig2と、ヒト免疫グロブリンG4のFcドメインhIgG4-Fc、SwissProtIGHG4_HUMANとの融合物からなる。Robo1-FcL1構築物を得るため、このタンパク質配列番号2の免疫グロブリンIgドメインIg1およびIg2に続くGluArgProSerPheValリンカーに対応するcDNA配列番号1の断片を、ヒト胎児心臓cDNAライブラリー商品番号HL5042T、Clontechを使用するPCRにより増幅した。次いで、Robo1の2種のIgドメインがC末端位置におけるヒトIgG4のFcドメインとの融合物として発現されるように、この増幅された断片を真核発現ベクターpXL4904図1に記載中にクローニングした。以下の特徴を得るように3個の点突然変異をIgG4-Fcドメイン中に導入した:Fcヒンジ領域内のジスルフィド架橋結合を安定化するためのS241PKabatナンバリング;IgG4-Fcドメインの残留エフェクター活性を排除するためのL248E;タンパク質の不均一性を低減するためのC末端リジンの不在。この組換えタンパク質を発現させるために使用したcDNA配列は、配列番号3の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をRobo1-FcL1と称し、このタンパク質は配列番号4のタンパク質配列に対応する。Robo1-FcL2構築物を得るため、Ig1-Ig2ドメインに対応するが上記リンカーを有さない同一のcDNAを、真核発現ベクターpXL4909図1に記載中にクローニングし、Robo1-FcL1の構築において記載の3個の点突然変異を含有するIgG4の同一Fcドメインとの融合物としてのこれらのIgドメインの発現を可能としたが、このときGlyGlyGlyGlySerリンカーをFcドメインの上流に導入した。この組換えタンパク質を発現させるために使用したcDNA配列は、配列番号5の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をRobo1-FcL2と称し、このタンパク質は配列番号6のタンパク質配列に対応する。b.対照として使用されるRobo1-Fcタンパク質の構築Robo1-FcSlit2-マイナス構築物を得るため、pXL4904プラスミド中に事前にクローニングされたcDNAを、38位におけるロイシンのグルタミンへの置換および89位におけるフェニルアラニンのチロシンへの置換を可能とする点突然変異を導入するようにPCRにより改変した。この組換えタンパク質を発現させるために使用したcDNA配列は、配列番号7の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をRobo1-FcSlit2-マイナスと称し、このタンパク質は配列番号8のタンパク質配列に対応する。Robo1-Fcヘパリン-マイナス構築物を得るため、pXL4904プラスミド中にクローニングされたcDNAを、97位におけるアルギニンのアニリンへの置換および98位におけるリジンのアラニンへの置換を可能とする点突然変異を導入するようにPCRにより改変した。この組換えタンパク質を発現させるために使用したcDNA配列は、配列番号9の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をRobo1-Fcヘパリン-マイナスと称し、このタンパク質は配列番号10のタンパク質配列に対応する。c.種々のRobo1-Fcタンパク質の生成2種のタンパク質Robo1-FcL1およびRobo1-FcL2を、それぞれpXL4904およびpXL4909プラスミドならびに出願WO2008/065543に記載の2種のN-グリカングリコシル化酵素、即ちα-2,3-シアリルトランスフェラーゼおよびβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を可能とするヘルパープラスミドpXL4544およびpXL4551を使用するHEK293系FreeStyle293-F細胞商品番号51-0029、Invitrogen、供給業者の推奨に従う。における一過性形質移入により生成した。これらのタンパク質は、それぞれpXL4904およびpXL4909プラスミドを使用するCHO系CHO-S細胞、商品番号11619-012、Invitrogen、供給業者の推奨に従う。における形質移入によっても生成した。HEK293細胞の浮遊培養物中で発現させたRobo1-FcL1およびRobo1-FcL2タンパク質を、プロテインAアフィニティーカラムMabSelect商品番号17-5199-02、AmershamBiosciences上でのクロマトグラフィーおよび20mMのNaCl/100mM酢酸緩衝液中での溶出により精製し、次いでPBS緩衝液商品番号14190-094、Invitrogen中に配合した。Robo1-FcSlit2-マイナスおよびRobo1-Fcヘパリン-マイナス組換えタンパク質を同一の手法において生成および精製した。d.Robo1-Fc組換えタンパク質の物理化学的特徴付けSDS-PAGEおよびゲル浸透分析により、タンパク質が二量体であり、96超の純度であることを示すことが可能となった。質量分析により、これらのタンパク質のアイデンティティーを実証することが可能となり、測定された脱グリコシル化タンパク質の重量はインシリコで計算された重量と完全に一致した。Saddicetal.2002.MethodsMol.Biol.194:23-36およびAnumulaetal.1998.Glycobiology8:685-694により記載のとおり単糖組成の分析およびN-グリカンシアル酸の定量により、タンパク質が極めて広範にシアリル化されることを実証することが可能となった。結果を表1に挙げる。Robo1-FcL1およびRobo1-FcL2分子のN末端分析が、これらの精製タンパク質が変動する割合0から40のトランケートされた最初の2個の残基Ser20およびArg21を有する形態を含有することを示したことが留意される。[実施例2]リガンドとして使用されるSlitタンパク質の調製ヒトSlit2タンパク質をコードするcDNAは、基準タンパク質NP_004778に対応する。このcDNAの断片を、ヒト脳cDNAライブラリー商品番号639300、Clontechを使用するPCRにより増幅した。D2ドメインに対応するcDNAを、真核発現ベクターpXL4911中にクローニングしてC末端位置におけるHisタグを含有するこのドメインを発現させた。この組換えタンパク質を発現させるために使用したcDNA配列は、配列番号11の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をSlit2-D2と称し、このタンパク質は配列番号12のタンパク質配列に対応する。D1-D2ドメインに対応するcDNAを真核発現ベクターpXL4912中にクローニングしてC末端位置におけるHisタグを含有するこれらの2種のドメインを発現させた。この組換えタンパク質を発現させるために使用したcDNA配列は、配列番号13の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をSlit2-D1D2と称し、このタンパク質は配列番号14のタンパク質配列に対応する。Slit2タンパク質の細胞外部分Ntに対応するcDNAを真核発現ベクターpXL5033中にクローニングしてC末端位置におけるHisタグを有するこのタンパク質を発現させた。この組換えタンパク質を発現させるために使用したcDNA配列は、配列番号15の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をSlit2-Nと称し、このタンパク質は配列番号16のタンパク質配列に対応する。マウスSlit2タンパク質のD2ドメインをコードし、記載の基準タンパク質NP_848919のD2ドメインに対応するcDNAを、pXL4911プラスミド中にクローニングされたcDNAから得た。5個の点突然変異を生じさせることを可能とする4種の断片を、テンプレートとしてpXL4911を用いるPCRにより作製し、次いでこれらの断片をテンプレートとして使用して完全なD2ドメインをコードするcDNAを逐次PCRにより増幅させた。タンパク質は、マウスSlit2タンパク質のD2ドメインと同一であることを可能とするThr311Ser、Lys313Arg、Ile329Leu、Ile411ValおよびPro418Ala突然変異を有する。このプラスミドにより、C末端位置におけるHisタグを有するマウスSlit2タンパク質のD2ドメインを発現させることが可能となる。この組換えタンパク質を発現させるために使用したcDNA配列は、配列番号17の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をmSlit2-D2と称し、このタンパク質は配列番号18のタンパク質配列に対応する。ヒトSlit1タンパク質をコードするcDNAは、記載の基準タンパク質NP_003052に対応する。このcDNAの断片を、ヒト脳cDNAライブラリー商品番号639300、Clontechを使用するPCRにより増幅した。D2ドメインに対応するcDNAを真核発現ベクターpXL5020中にクローニングして発現してC末端位置におけるHisタグを含有するこのドメインを発現させた。この組換えタンパク質を発現させるために使用したcDNA配列は、配列番号19の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をSlit1-D2と称し、このタンパク質は配列番号20のタンパク質配列に対応する。ヒトSlit3タンパク質をコードするcDNAは、記載の基準タンパク質NP_003053に対応する。このcDNAの断片を、ヒト脳cDNAライブラリー商品番号639300、Clontechを使用するPCRにより増幅した。D2ドメインに対応するcDNAを真核発現ベクターpXL5021中にクローニングしてC末端位置におけるHisタグを含有するこのドメインを発現させた。この組換えタンパク質を発現させるために使用したcDNA配列は、配列番号21の配列に対応する。得られた組換えタンパク質をSlit3-D2と称し、このタンパク質は配列番号22のタンパク質配列に対応する。Slit2-D2、Slit2-D1D2およびSlit2-Nと称される3種のタンパク質を、pXL4911プラスミドそれぞれpXL4912またはpXL5033を使用するHEK293系供給業者の推奨に従うFreeStyle293-F細胞、Invitrogenにおける一過性形質移入により生成した。HEK293細胞の培養物上清中に発現させたSlit2-D2およびSlit2-D1D2タンパク質を、Ni-キレート化セファロースカラム商品番号17-0409-03、AmershamBiosciences上でのクロマトグラフィーおよびイミダゾール緩衝液中での溶出により精製し、次いで1MNaClに調整したPBS緩衝液商品番号14190-094、Invitrogen中に配合した。質量分析LC/MSにより、これらのタンパク質のアイデンティティーを実証することが可能となった。mSlit2-D2、Slit1-D2およびSlit3-D2と称される3種のタンパク質を、同等の様式において生成し、精製し特徴付けた。[実施例3]3種の方法:ELISA、SPRおよびFACSによるSlitタンパク質およびヘパリンについてのRobo1-Fc組換えタンパク質の親和性の試験a.ヘパリンについてのRobo1-Fcタンパク質の親和性ヘパリンについてのRobo1-Fc構築物の親和性を決定するため、精製し、10mMリン酸塩、pH7.0中に配合した2mgのRobo1-Fcタンパク質を、0から1.5MのNaClの線形勾配を用いる溶出によりヘパリンカラム上1mLのHiTrapHeparin-SepharoseHP、GEHeathcareでクロマトグラフィーにかけた。表2は、文献Fukuhara,N.etal.2008J.Biol.Chem.283p16226-16234に記載のとおりRobo1-FcL1タンパク質の溶出に必要な448mMのNaCl濃度を示す。これらの結果は、Robo1-Fcヘパリン-マイナスタンパク質がこのカラム上で保持されず、従ってこのタンパク質がもはやヘパリンについてのいかなる親和性も有さないことを示す。従って、このタンパク質はヘパリン陰性突然変異体である。b.Robo1-Fcタンパク質バリアントとヒトSlit2タンパク質のD2ドメインとの相互作用の評価本実施例は、ELISAアッセイによるRobo1-FcL1およびRobo1-FcL2と称される2種のバリアントと、これらの天然リガンドこれらの実験において、ヒトSlit2のD2ドメインとの相互作用を説明する。ヒトSlit2-D2タンパク質を、Immulon-4酵素結合プレートVWRScientificInc.Swedesboro,NJに結合させた。ある濃度範囲20μg/mLから0.02μg/mLのRobo1-FcL1およびRobo1-FcL2バリアントを添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG抗体Sigma;商品番号A0170、1:50000に希釈により検出した。可視化は、TMB-H2O2基質Interchim;商品番号UP664780を用いて実施し、測定は、プレートリーダーを用いて450nmにおいて実施した。結果を図2に報告する。これらの結果は、2種のバリアントRobo1-FcL1およびL2がヒトSlit2タンパク質と特にD2ドメインと特異的に相互作用することを示す。c.Robo1-Fcタンパク質とSlitファミリー、即ちSlit1およびSlit3のヒトバリアントとの相互作用の評価本実施例は、ELISAアッセイによるRobo1-FcL1融合タンパク質とSlit1-D2、Slit2-D2およびSlit3-D2バリアントとの相互作用を説明する。ヒトSlitバリアントのD2ドメインをImmulon-4酵素結合プレートVWRScientificInc.Swedesboro,NJに結合させた。ある濃度範囲1μg/mLから0.001μg/mLのRobo1-FcL1融合タンパク質を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG抗体Sigma;商品番号A0170、1:50000に希釈を使用して検出した。可視化は、TMB-H2O2基質Interchim;商品番号UP664780を用いて実施し、測定は、プレートリーダーを用いて450nmにおいて実施した。同様に、Slit2結合部位のレベルにおいて突然変異させたRobo1-FcSlit2-マイナスバリアントを、ある濃度範囲20μg/mLから0.02μg/mLに従って上記と同一の条件下でELISAアッセイにより評価した。結果を以下の表3に報告する。これらの結果は、Robo1-Fcタンパク質がファミリーSlit1、Slit2およびSlit3の3種のタンパク質と特にこれらのD2ドメインと特異的に相互作用することを示す。さらに、Robo1-FcSlit2-マイナスタンパク質は、もはやヘパリンについての親和性を有さず、従ってこのタンパク質はヘパリン陰性突然変異体である。d.Robo1-Fcタンパク質とマウスSlit2タンパク質との相互作用の評価本実施例は、ELISAアッセイによるRobo1-FcL1融合タンパク質とマウスタンパク質mSlit2-D2との相互作用を説明する。マウスタンパク質mSlit2-D2をImmulon-4酵素結合プレートVWRScientificInc.Swedesboro,NJに結合させた。ある濃度範囲2μg/mLから0.002μg/mLのRobo1-FcL1融合タンパク質を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG抗体Sigma;商品番号A0170、1:50000に希釈を使用して検出した。可視化は、TMB-H2O2基質Interchim;商品番号UP664780を用いて実施し、測定は、プレートリーダーを用いて450nmにおいて実施した。結果を以下の表4に報告する。これらの結果は、Robo1-Fcタンパク質がマウスSlit2タンパク質と特異的に相互作用することを示す。e.SPRにより測定されたSlitタンパク質についてのRobo1-Fcの親和性本実施例は、SPR表面プラズモン共鳴;BIAcore2000による、Robo1-FcL1融合タンパク質とヒトSlit2タンパク質本実験においてはSlit2-D2との親和性定数の決定を説明する。Robo1-Fcタンパク質とヒトSlit2タンパク質との相互作用を、Robo1-Fc融合タンパク質をCM5チップに結合させた後に分析した。動態的測定をCanzianietal.2004.Anal.Biochem.325:301-307のプロトコルに従って実施した。Robo1-FcL1融合タンパク質とヒトSlit2タンパク質との親和性定数を決定することからなる第2の方法を、Slit2-D2タンパク質をCM5チップに結合させた後に分析した。動態的測定を、2種の非等価結合部位を有するモデルに従うScatchard法を使用するCanzianietal.2004.Anal.Biochem.325:301-307のプロトコルに従って実施した。f.FACSにより測定されたSlitについてのRobo1-Fcの親和性本実施例は、Slit2を発現するHEK293哺乳動物細胞に対するRobo1-Fcタンパク質の親和性を説明する。実施例1に記載し、使用したHEK293細胞に、哺乳動物細胞内でコードするcDNAを有さないバラストプラスミドballastplasmidまたは実施例2に記載のSlit2-D2タンパク質をコードするpXL4911プラスミドまたはSlit2-D1D2タンパク質をコードするpXL4912プラスミドまたはSlit2-Nタンパク質をコードするpXL5033を形質移入した。細胞を形質移入の48時間後に96ウェルプレート中に分配し、Robo1-Fcタンパク質を0.01から3□mg/Lの濃度範囲で4°Cにおいて30分間添加した。Robo1-Fcタンパク質は、Robo1-FcL1生物学的治療剤またはRobo1-FcSlit2-マイナス突然変異体またはRobo1-Fcヘパリン-マイナス突然変異体である。細胞を洗浄し、Alexa488商品番号:A-11013、Invitrogenにより標識された抗ヒトFc抗体を4°Cにおいて30分間インキュベートした。次いで標識されたHEK293細胞をFACSGeomeanにより定量する。図3は、Slit2発現の不在下でFACSにより測定される蛍光を介してRobo1-Fcタンパク質へのHEK293細胞の結合を説明する。Robo1-Fcタンパク質およびさらにはRobo1-FcSlit2-マイナス突然変異体は、HEK293細胞に結合する一方、Robo1-Fcヘパリン-マイナス突然変異体は結合しない。従って、Robo1-Fcは、0.3から0.03mg/Lの低いRobo1-Fc濃度においてヘパリン結合を介してHEK293細胞に部分的に結合する。図4は、Slit2-Nを一過性形質移入により発現させる場合にFACSにより測定される蛍光を介してRobo1-Fcタンパク質へのHEK293細胞の結合を説明する。Robo1-Fcタンパク質のみが、Slit2-Nを発現させるHEK293細胞に結合する。Robo1-FcSlit2-マイナスおよびRobo1-Fcヘパリン-マイナス突然変異体は、生物学的治療Robo1-FcL1タンパク質と比較して3.0から0.3mg/LのRobo1-Fc濃度範囲において結合しないまたは実質的に結合しない。。表7は、Slit2-N、Slit2-D1D2またはSlit2-D2タンパク質をHEK293系内で発現させる場合にRobo1-Fcタンパク質についてFACSにより測定される親和性定数を説明する。上記実施例のとおり、Robo1-FcSlit2-マイナス突然変異体はSlit2陰性であると証明され、Robo1-Fcヘパリン-マイナス突然変異体は、Slit2について生物学的治療タンパク質よりも弱い親和性を有する。Robo1-Fcは、HEK293細胞により発現させたSlit2-NおよびSlit2-D1D2に、Slit2-D2についての親和性よりも良好な同等の親和性で結合する。[実施例4]Robo1-FcL1およびRobo1-FcL2タンパク質の薬物動態特性本実施例は、マウスにおいて静脈内ivで1回注射したRobo1-Fcタンパク質の薬物動態プロファイルおよび血漿濃度を説明する。3匹のBalb/Cマウス各時間についてに、Robo1-Fcタンパク質のそれぞれを2.5mg/mLにおいて100μL/10g約25mg/kgの割合で尾静脈を介して注射した。所定の時間投与後、0.5、1、6、24、48および72時間後において、マウスに麻酔をかけ、血液をサンプリングし、10μLのクエン酸塩CPD-A、C-4431Sigmaおよび2μLのプロテアーゼ阻害剤CompleteProteaseInhibitorMix、RocheMolecularBiochemicalを含有する試験管中に回収した。試験管を遠心分離し、血漿試料を回収し、-20°Cにおいて冷凍した。96ウェルプレートのウェルをSlit2タンパク質Slit2-D2によりコーティングし、1/5000および1/20000に希釈した血漿試料を37°Cにおいて1時間接触させた。続いてペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトFc抗体商品番号31413、Pierceをインキュベートし、次いでTMB-H2O2商品番号UP664780、Interchimを用いて可視化し、吸光度を450nmにおいて読み取った。較正範囲は各精製Robo1-Fcタンパク質を用いて作成した。Robo1-FcL1およびRobo1-FcL2タンパク質の血漿濃度を図5に表す。薬物動態パラメーターを以下の表8に説明し、このパラメーターはタンパク質がマウスにおける注射後に安定であることを示す。[実施例5]N末端位置における均一性に関して改善されたRobo1-Fc生物学的治療タンパク質の説明本実施例は、最初の2個の残基Ser20およびArg21が存在しない点でRobo1-FcL1タンパク質とは異なるRobo1-FcL3と称される別のRobo1-Fcタンパク質の発現プラスミド、生成および物理化学的特徴付けを説明する。pXL4904プラスミド中にクローニングされたcDNAを、Ser20およびArg21コドンを排除し、次のコドンLeu22をインターロイキン2のペプチドシグナルのコーディング配列に融合させるようにPCRにより改変した。次いで、pXL5004発現プラスミドを作製した。図1を参照のこと。この組換えタンパク質を発現させるために使用したcDNA配列は、配列番号23の配列に対応する。Robo1-FcL3タンパク質を実施例1に記載のとおり生成し、精製し特徴付けた。N末端分析は、この精製タンパク質が完全に均一であることを示した。得られた組換えタンパク質をRobo1-FcL3と称し、このタンパク質は配列番号24のタンパク質配列に対応する。[実施例6]Robo1-FcL3タンパク質とヒトSlit2タンパク質との相互作用の評価本実施例は、ELISAアッセイによるRobo1-FcL3融合タンパク質とヒトSlit2タンパク質Slit2-D2との相互作用を説明する。ヒトSlit2-D2タンパク質を、Immulon-4酵素結合プレートVWRScientificInc.Swedesboro,NJに結合させた。ある濃度範囲1μg/mLから0.001μg/mLのRobo1-FcL3融合タンパク質を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG抗体Sigma;商品番号A0170、1:50000に希釈により検出した。可視化は、TMB-H2O2基質Interchim;商品番号UP664780を用いて実施し、測定は、プレートリーダーを用いて450nmにおいて実施した。得られた結果を以下の表9に報告する。これらの結果は、Slit2-D2タンパク質についての2種のバリアントRobo1-FcL1およびRobo1-FcL3の親和性が同等であることを示す。[実施例7]新血管形成に対するRobo-Fcタンパク質の活性の評価a.インビトロ内皮細胞および線維芽細胞共培養モデル:Robo1-FcL1分子の特異的活性インビトロ血管新生モデルは、ヒト皮膚線維芽細胞の単層上のヒト静脈内皮細胞のリアレンジメントに対応する。手短に述べると、線維芽細胞Lonzaを24ウェルプレートBectonDickinson中に40000個の細胞/ウェルにおいて1mlの培地中で播種する。増殖3日後D3、ヒト静脈内皮細胞HUVEC-Lonzaを線維芽細胞単層上に10000個の細胞/ウェルにおいて500μlのEGM登録商標培地内皮基礎培地、Lonza2FCS仔ウシ血清-Lonza10μg/mlhEGF組換えヒト表皮成長因子-Lonza中で播種する。細胞を30ng/mLのVEGFRDSystems、Robo1-FcL1分子またはRobo1-FcSlit2-マイナス陰性対照により500μg/mlの濃度において刺激するD3からD9。3日後、培地を交換し、ウェルを実験の条件に従って刺激する。2日後、細胞をエタノールにより固定し、HUVECに特異的な抗CD31抗体により標識し、続いて抗アルカリホスファターゼ抗体により標識し、次いでアルカリホスファターゼ基質を用いて可視化するD11。抗CD31抗体により標識した小管の定量を顕微鏡×4対物レンズ下でなされる画像収集により実施し、擬小管の長さを画像分析ソフトウエアBiocomVisiolab2000ソフトウエアを使用して分析する図6。このインビトロ血管新生アッセイにおいて、Robo1-FcL1500μg/mlはHUVECにより形成される小管の形成に対して阻害活性を示す。この阻害率は82であり、Robo1-FcSlit2-マイナス分子陰性対照を用いて得られる効果と比較して統計的に有意である。b.エクスビボマウス大動脈輪モデル:Robo1-FcL1分子の特異的活性Robo1-FcL1分子を、マウス大動脈輪モデルにおいて評価した。手短に述べると、マウス大動脈を切除し、洗浄し、1mmの区画に切断するD0。これらの輪をラットコラーゲン中に、10ng/mlにおけるVEGF、500μg/mlの濃度におけるRobo1-FcL1分子または500μg/mlの濃度におけるRobo1-FcSlit2-マイナス陰性対照の存在下で埋設する。小管は輪から形成し、こうしてインビトロで新血管の形成を模倣する。6日後、標識小管の定量を顕微鏡×3対物レンズ下でなされる画像収集により実施し図7A、擬小管の長さを画像分析ソフトウエアBiocomVisiolabソフトウエア2000を使用して分析した図7。これらの実験条件下、Robo1-FcL1500μg/mlは、陰性対照として使用されるRobo1-FcSlit2-マイナス分子と比較して形成される小管の形成に対して強力な阻害活性を示す。これらの結果は、Robo1-FcL1が内皮細胞増殖を阻害することなく新血管の形成を阻害することができることを示唆する。血管成熟欠如に結びつくこの抗血管新生活性は、非生産的血管新生と称される。[実施例8]マウスの肺腫瘍モデルにおけるRobo1-FcL1タンパク質の評価Robo1-FcL1分子を、C57/Bl6マウスの肺癌腫瘍のモデルにおいて評価した。a.マウス肺腫瘍モデルマウス肺腫瘍モデルを確立するため、8週齢雌C57/Bl6マウスに麻酔をかけた。マウスの左肩胛骨の高さにおける領域を剃り、消毒した。1cmの切開をこの肩胛骨上で行った。注射すべき細胞は、Lewis肺癌腫瘍系ATCC、CRL-1642に由来する。細胞をMatrigel登録商標と、1容量のMatrigelと4容量の細胞との比で混合した。細胞濃度は62500個の細胞/mlであった。細胞を肺内にマウス当たり20μlの割合において注射し、次いで傷口を縫合した。23日後、マウスを安楽死させた。胸郭を切開し、左肺および縦隔リンパ節を切除した。左肺上に存在する腫瘍を、電子キャリパー定規を使用して測定して式:l2×L×0.52に従って腫瘍容積を測定した。縦隔リンパ節を秤量する。結果を、平均値±この平均からの標準偏差として表現する。統計分析をパラメトリックStudent検定により実施した。b.Robo1-Fc組換えタンパク質による肺腫瘍を担持するマウスの処置Robo1-Fcタンパク質を使用する処置を以下のとおり実施した:Robo1-Fcタンパク質を含有する調製物を、25mg/kg/日の用量において、腫瘍細胞の注射後D10、D14、D17およびD21に静脈内注射した。対照群にはPBS緩衝液10ml/kgを注射した。c.結果D23において、Robo1-Fc組換えタンパク質により処置した群において得られた腫瘍の平均容積は21.45±2.16mm3であり、対照群において得られた腫瘍の平均容積は39.93±8.41mm3であった。Robo1-Fcタンパク質により処置した動物における腫瘍容積の低減率は46である。この差は統計的に有意であるp<0.05。Robo1-Fcタンパク質により処置した群において得られた縦隔リンパ節転移リンパ節の平均重量は、12.50±1.26mgである。対照群において得られた縦隔リンパ節の平均重量は、30.67±7.69mgである。Robo1-Fcタンパク質により処置した群についての縦隔リンパ節の重量の低減率は、有意限界p=0.07において59である。[実施例9]ヒト肝癌の2種のモデルにおけるRobo1-Fcタンパク質の評価Robo1-FcL1分子をSCIDマウスにおけるヒト肝癌の2種のモデルにおいて評価した。A.HepG2細胞系を使用したSCIDマウスにおけるヒト肝癌の同所性モデルa.モデルの説明雌のSCIDマウスをケタミン/キシラジンの混合物を用いて麻酔し、切開領域を剃る。皮膚内および筋肉壁内に1cmの肋骨下切開を生成する前に皮膚を洗浄し、殺菌する。肝葉の一部を腹膜から注意深く抽出して細胞注射を実施する。50μl容量の細胞懸濁液ATCC由来のHepG2、40×106個の細胞/mlにてMatrigel登録商標と混合したヒト肝芽腫細胞を左葉内に注射する。その葉を腹腔内に戻す。腹膜を外科的接着剤を用いて閉じ、次いで皮膚をステープルを用いて縫合する。1週間に2回、25mg/kgにてPBS中に可溶化したRobo1-Fcを用いてマウスを処置、即ちマウスにi.p.注射する。細胞注入の2週間後に処置を開始する。細胞接種の4週間後に、剖検のために動物を屠殺する。b.Robo1-Fc組換えタンパク質を用いたヒト肝癌を保有しているマウスの処置25mg/kgの用量にて1週間に2回の処置を用いてRobo1-Fcをこのモデルにおいて評価した。プロトコルの初日および最後の日にマウスの重量を測定した。動物を屠殺した後、腫瘍の重量を細胞注射の28日後に測定した。c.結果腫瘍増殖はプロトコルの間、対照動物による重量のかなりの喪失を導くのに対して、Robo1-Fcを用いて処理した動物は実験の終わりに同一の重量を有する表10。実験の終わりに、Robo1-Fcの4回のi.p.注射後、Robo-1-Fcで処置した群の平均腫瘍重量は、溶媒注射を受けた対照群と比較して30p<0.05著しく減少する図8。B.Hep3B細胞系を使用したSCIDマウスにおけるヒト肝癌の同所性モデルa.モデルの説明このHCCモデルにおいて、Hep3B細胞系を使用した。この腫瘍細胞系は、若い患者の肝芽腫に由来する市販の細胞系ATCC由来である。上記の実施例9Aaに記載したものと同じプロトコルの細胞注射を使用した。細胞の開始濃度は50μlの注射容量中に2.106個である。b.Robo1-Fcを用いたHep3B腫瘍を保有するマウスの処置5mg/kgにおける1週間に2回の処置により、このモデルにおいてRobo1-Fcを評価した。処置前、および次の処置前の各時間にマウスを秤量して注射容量を用いて投与量を調整した。屠殺前のプロトコルの最後の日にもまた、マウスを秤量した。プロトコルの最後の日に屠殺した後に腫瘍を有する葉を測定した。さらに、屠殺前に、マウスの血液を引き抜き、血清をαフェトプロテインAFP測定のために捨てた。AFPは肝臓癌細胞により分泌され、AFPは現在、ヒトにおけるHCC進行のバイオマーカーとして承認されているFimusetal.,2004,MolDiagn84:207-12.Review。c.結果35日間の腫瘍進行の間、マウスは重量が増加しなかった。5mg/kgにおけるRobo1-Fcの処置はマウスの重量に対する効果を示さなかった表11。実験の終わりに、対照群の平均腫瘍重量は895±156mgであった。Robo1-Fcで処置した群の平均腫瘍重量は483±55mgであった図9。Robo1-Fcを用いた処置は腫瘍量の46の著しい減少を誘発した。さらに、血漿AFP濃度は対照の腫瘍を保有するマウスにおいて316±73μg/mlであり、Robo1-Fcで処置したマウスにおいて139±28μg/mlであり、処置した動物において血漿AFPの56の阻害を示した図10。血漿AFPのこの阻害はRobo1-Fcの抗腫瘍活性と十分に相関する。"