"プローブを用いた変異型DNAの検出方法であって、1置換塩基、欠損塩基領域、若しくは挿入塩基領域を有する一本鎖DNA変異型DNA又は/及びそれに対応する野生型の一本鎖DNA野生型DNAを含有する試料と、両一本鎖DNAとハイブリダイズするプローブとを接触させて、変異型DNAとのハイブリッド体変異型ハイブリッド体又は/及び野生型DNAとのハイブリッド体野生型ハイブリッド体を形成させ、得られた変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方はステム構造を有するものであり、2得られた変異型ハイブリッド体又は/及び野生型ハイブリッド体を、ステム構造の有無又はステム構造の違いにより、電気泳動法で分離し、3試料中の変異型DNAの有無を検出することを特徴とする、変異型DNAの検出方法。変異型DNAが置換塩基を有する一本鎖DNAである、請求項1記載の検出方法。変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方は、プローブ側にステム構造を有するものである、請求項2記載の検出方法。変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、ゲノムDNA側にループ構造又はステム構造を有する、請求項3記載の検出方法。プローブが以下の何れかの配列で表されるものである、請求項3記載の検出方法。又は[上記配列中、1stSS1、2ndSS1は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X1及びX5は任意の塩基を表し、X2~X4は任意の塩基又は結合手を表し、そのうちの何れか1つは変異塩基と相補な塩基又は変異塩基に対応する正常塩基と相補な塩基であり、該変異塩基と相補な塩基又は正常塩基と相補な塩基は、ハイブリダイズした際に、変異型DNAの置換塩基及び野生型DNAの正常塩基と対応する位置に存在するものである。StP1はプローブ側でステム構造を形成する配列を表す。]変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方は、ゲノムDNA側にステム構造を有するものである、請求項2記載の検出方法。変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、プローブ側にループ構造又はステム構造を有する、請求項6記載の検出方法。プローブが以下の配列で表されるものである、請求項6記載の検出方法。配列中、1stSS31、2ndSS31は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X31、X32及びX33は、それぞれ任意の塩基を表し、X32は置換塩基に相補な塩基又は正常塩基に相補な塩基を表す。変異型DNAが欠損塩基領域を有する一本鎖DNAである、請求項1記載の検出方法。変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方は、プローブ側にステム構造を有するものである、請求項9記載の検出方法。変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、ゲノムDNA側にループ構造又はステム構造を有する、請求項10記載の検出方法。プローブが以下の配列の何れかで表されるものである、請求項10記載の検出方法。1stSS211、2ndSS211は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X211及びX212はそれぞれ任意の塩基を表し、DMは欠損塩基領域に相補な塩基配列を表す。又は1stSS221、2ndSS221は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X221及びX222はそれぞれ塩基を表す。DMは欠損塩基領域に相補な塩基配列を表し、StP221はプローブ側ステム配列を表す。欠損塩基がステム構造を形成し得るものであって、野生型ハイブリッド体が、ゲノムDNA側にステム構造を有するものである、請求項9記載の検出方法。変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、プローブ側にループ構造又はステム構造を有する、請求項13記載の検出方法。プローブが以下の配列で表されるものである、請求項13記載の検出方法。1stSS231は、欠損塩基を含まない、欠損塩基の3側と相補な一本鎖の塩基配列を表し、2ndSS231は、欠損塩基を含まない、欠損塩基の5側と相補な一本鎖の塩基配列をそれぞれ表す。変異型DNAが挿入塩基領域を有する一本鎖DNAである、請求項1記載の検出方法。変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方は、ゲノムDNA側にステム構造を有するものである、請求項16記載の検出方法。変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、プローブ側にループ構造又はステム構造を有する、請求項17記載の検出方法。プローブが以下の配列の何れかで表されるものである、請求項17記載の検出方法。1stSS311、2ndSS311は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X311及びX312はそれぞれ任意の塩基を表す。又は1stSS321、2ndSS321は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X321及びX322はそれぞれ塩基を表す。変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方は、プローブ側にステム構造を有するものである、請求項16記載の検出方法。変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体が、更に、ゲノムDNA側にループ構造又はステム構造を有する、請求項20記載の検出方法。プローブが以下の何れかの配列で表されるものである、請求項20記載の検出方法。1stSS321、2ndSS321は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X321及びX322はそれぞれ任意の塩基を表し、IM321は置換塩基領域と相補な塩基配列であって且つステム構造を形成する塩基配列を表す。、又は1stSS331、2ndSS331は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X331及びX332はそれぞれ任意の塩基を表し、IM331は置換塩基領域と相補な塩基配列を表し、Stp331は、プローブ側ステム配列を表す。本発明者らは、上記LH法では、野生型DNAと変異型DNAの電気泳動法による分離が完全ではなく、変異型DNAを検出できない場合があることを見出し、野生型DNAと変異型DNAとを完全に分離し、変異型DNAを高精度に検出できる方法を開発するため更に鋭意研究を重ねた。その結果、LH法で得られるハイブリッド体中のループ部分をステム構造とすることにより、野生型DNA由来のハイブリッド体と変異型DNA由来のハイブリッド体とを電気泳動で容易に分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、野生型DNAとプローブのハイブリッド体及び変異型DNAとプローブとのハイブリッド体とを形成し、それらを電気泳動により効率よく分離し、変異型DNAを検出する方法の提供を課題とする。即ち、本発明は、プローブを用いた変異型DNAの検出方法であって、1置換塩基、欠損塩基領域、若しくは挿入塩基領域を有する一本鎖DNA変異型DNA又は/及びそれに対応する野生型の一本鎖DNA野生型DNAを含有する試料と、両一本鎖DNAとハイブリダイズするプローブとを接触させて、変異型DNAとのハイブリッド体変異型ハイブリッド体又は/及び野生型DNAとのハイブリッド体野生型ハイブリッド体を形成させ、得られた変異型ハイブリッド体及び野生型ハイブリッド体の少なくとも一方はステム構造を有するものであり、2得られた変異型ハイブリッド体又は/及び野生型ハイブリッド体を、ステム構造の有無又はステム構造の違いにより、電気泳動法で分離し、3試料中の変異型DNAの有無を検出することを特徴とする、変異型DNAの検出方法に関する。本発明の方法によれば、変異型が存在するDNAに関し、そのDNAが変異型であるかどうかを容易に検出することを可能とする。特に、従来のループハイブリッド法では、分離検出できなかった変異型DNAであっても分離検出することを可能とする。よって、本発明の方法は、癌細胞の有無や、ある特定の遺伝子の有無による薬剤効果の適否の判断等臨床検査薬の種々の検査に適応することができる。また、本発明によれば、KRAS遺伝子検査のように隣接したコドン例えばコドン12と13で変異が発生する場合であっても、その両者の変異を同一の測定系にて精度よく検出する事が可能となる。本発明に係る変異型DNAは、置換塩基、欠損塩基領域、又は挿入塩基領域以下、これらを総称して単に変異塩基領域と記載する場合がある。を有するものであって、且つその野生型DNAの塩基配列が、少なくともこれら変異塩基領域の前後100~1000塩基について既知である一本鎖DNAであれば何れも用いることができる。即ち、動物、微生物、細菌、植物等の生物から単離されるゲノムDNA断片、ウイルスから単離可能なDNA断片、およびmRNAを鋳型として合成されたcDNA断片も含まれる。このような変異型DNAの中でも、ヒト細胞由来の癌遺伝子が好ましいものとして挙げられる。また、ハイブリッド体を形成する変異型DNAの鎖長測定の対象となる鎖長は、通常50~2000塩基、好ましくは100~500塩基である。尚、上記欠損塩基領域としては、野生型DNA中の1~200塩基の塩基配列が連続して欠損している領域を表す。また、上記挿入塩基領域としては、野生型DNAに1~200塩基の塩基配列が連続して挿入されている領域を表す。尚、本発明に係る変異型DNA及び野生型DNA両者とハイブリダイズするプローブは、特定の置換塩基、欠損塩基領域又は挿入塩基領域をターゲットとして本発明に係るステム構造を形成するため、ターゲットとするもの以外に置換塩基、欠損塩基領域又は挿入塩基領域が複数存在しても構わない。本発明に係る野生型DNAは、上記本発明に係る変異型DNAの変異を有さないDNAである。本発明の方法に於いて用いられる本発明に係る野生型DNAは、本発明に係る変異型DNAと変異塩基領域を除いた塩基配列が同一のものであり、その長さとしては変異型DNAと同程度のものを用いるのが好ましく、通常50~2000塩基、好ましくは100~500塩基である。上記本発明に係る変異型DNA及び野生型DNAは、上記DNAができる限り精製され、核酸断片以外の余分な成分が取り除かれているものが好ましい。具体的には、例えばシリカ担体を用いたBoom法BoometalJClinMicrobiol28495503、ヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法ProcNatlAcadSciUSA762p615619変異型DNAが置換塩基を有するDNAの場合プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合プローブが正常塩基と結合する場合プローブが置換塩基と結合する場合ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合プローブが正常塩基と結合する場合プローブが置換塩基と結合する場合変異型DNAが欠損塩基領域を有するDNAの場合プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合変異型DNAが挿入塩基領域を有するDNAの場合ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合:プローブ側にステム構造を有するDNAの場合少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合ステム構造を有する塩基鎖の反対側の鎖中に更にステム構造又はループ構造を形成する場合[本発明に係るプローブ及びハイブリッド体の具体例]I変異型DNAが置換塩基を有するDNAの場合I1プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。[該塩基配列中、1stSS1、2ndSS1は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X1及びX5はそれぞれ任意の塩基を表し、X2~X4は塩基又は結合手を表し、そのうちの何れか1つは変異塩基と相補な塩基又は変異塩基に対応する正常塩基と相補な塩基であり、該変異塩基と相補な塩基又は正常塩基と相補な塩基は、ハイブリダイズした際に、変異型DNAの置換塩基又は野生型DNAの正常塩基と対応する位置に存在するものである。StP1はプローブ側でステム構造を形成する配列以下、プローブ側ステム配列と略記する場合があるを表す。]上記X1~X5における任意の塩基とは、アデニン、グアニン、チミン、シトシンの何れかの塩基である。以下、本発明における任意の塩基とは、同じものを表す。X2~X4における結合手とは、塩基は存在せず、単に両隣の塩基と結合させている場合を表す。例えばX2がアデニンAで、X3が結合手で、X4がグアニンの場合、X2X3X4はAGを表す。以下、本発明における結合手とは、同じものを表す。本発明に係るプローブ側ステム配列は、ハイブリッド体を形成した際に、ゲノムDNAとハイブリダイズしない塩基対を形成しないものであって、且つプローブ内の一本鎖塩基鎖がそれ自身で塩基対を形成し得る配列であり、前記ステム構造を形成し得るものである。該プローブ側ステム配列は、それのみでステム構造となるものもあるが、ステム配列と隣接する、ゲノムDNAと塩基対を形成しない塩基又は塩基配列と連結し、ステム構造を形成してもよい。この場合、ステム配列の構成が変化して上記塩基対を形成できず、本発明に係るステム構造を構成できないループ構造となる場合もあるので、変異型ハイブリッド体、野生型ハイブリッド体の少なくとも何れか一方が本発明に係るステム構造を有するように設計しておく必要がある。本発明に係るプローブ側ステム配列は、通常4~60mer、好ましくは6~20merからなるものである。また、該プローブ側ステム配列がステム構造を形成した際のステム構造中の塩基対は、通常2~20bp、好ましくは3~10bp、より好ましくは3~5bpの連続する二本鎖塩基対からなるもの又は2~20bp、好ましくは3~10bp、より好ましくは3~5bpの連続する二本鎖塩基対とループ配列とを含むものが挙げられ、中でも、連続する二本鎖塩基対からなるものが好ましい。上記プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS1、2ndSS1は上記と同じであり、1stDS1、2ndDS1は、それぞれ1stSS1、2ndSS1と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X1~X5は上記と同じであるが、X1及びX5は塩基を表し、X1とX1及びX5とX5はそれぞれ相補な塩基であり、X2~X4は塩基又は結合手を表し、そのうちの何れか1つは置換塩基であり、対応するX2~X4に対して相補な塩基又は結合手である。但し、プローブ中のX2~X4の何れかが正常塩基と相補な塩基である場合、対応するX2~X4の何れかの置換塩基とは相補なものとならない。また、上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS1、2ndSS1、1stDS1、2ndDS1、X1~X5、X1及びX5は上記と同じであるが、X1とX5及びX1とX5は、それぞれ相補な塩基であり、Y2~Y4は塩基又は結合手を表し、そのうちの何れか1つは変異塩基に対応する正常塩基であり、対応するX2~X4に対して相補な塩基又は結合手である。但し、プローブ中のX2~X4の1つが置換塩基と相補な塩基である場合、対応するY2~Y4の何れかの正常塩基とは相補なものとならない。変異型DNAが置換塩基を有するものであってプローブ側にステム構造を有する場合について、更に、プローブが正常塩基と相補な塩基を有する場合とプローブが置換塩基と相補な塩基を有する場合とに分けて以下で説明する。プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合であって、プローブが正常塩基と結合する場合変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブが正常塩基と結合し、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、該本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。該塩基配列中、1stSS11、2ndSS11は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X11及びX15は任意の塩基を表し、X12~X14は塩基又は結合手を表し、そのうちの何れか1つは変異塩基に対応する正常塩基と相補な塩基であり、該正常塩基と相補な塩基は、ハイブリダイズした際に、変異型DNAの置換塩基又は野生型DNAの正常塩基と対応する位置に存在するものである。StP11はプローブ側ステム配列を表す。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、X11~X15、StP11は上記と同じであるが、1stSS11、2ndSS11は上記と同じであり、1stDS11、2ndDS11は、それぞれ1stSS11、2ndSS11と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X11及びX15は塩基を表し、X11とX11及びX15とX15は相補な塩基であり、X12~X14は塩基又は結合手を表し、そのうちの何れか1つは置換塩基であり、X12~X14中の置換塩基は、対応するX12~X14に対して相補な塩基とはならないが、その他のものは、対応するX12~X14に対して相補な塩基又は結合手となる。尚、上記変異型ハイブリッド体中のX12~X14の何れか1つは正常塩基と相補な塩基であるため、X12~X14中の置換塩基と塩基対を形成しない。そのため、プローブ側ステム配列と正常塩基と相補な塩基の間に塩基がある場合、その塩基については、ゲノム側塩基と相補な塩基であっても結合が不安定となり、塩基対を形成できなくなる。その結果、X12~X14も塩基対を形成することができなくなる場合があり、このような塩基対を形成できなくなったものはステム配列と連結する。尚、この場合、これらの塩基は、ステム配列及び塩基対を形成できなくなった塩基の組合せによってはステム構造を形成するが、単なるループ構造となってもよい。例えば、下記図のように、X13が置換塩基図中はMで表示で、X13が正常塩基と相補な塩基図中はNで表示であった場合、X12とX12は通常であれば塩基対を形成するが、両隣の塩基がゲノム側の塩基と塩基対を形成しないため、StP11X12NX13は全て変異型DNAのゲノム側と塩基対を形成せずにこれらでステム構造を形成することとなる。また、上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS11、2ndSS11は上記と同じであり、1stDS11、2ndDS11、X11~X15、X11、X15及びStP11は、上記と同じであるが、X11とX15はそれぞれX11とX15に相補な塩基であり、Y12~Y14は塩基又は結合手を表し、そのうちの何れか1つは変異塩基に対応する正常塩基であり、対応するX12~X14に対して相補な塩基又は結合手である。上記野生型ハイブリッド体においては、プローブで設計されたステム配列のみでステム構造を形成する。本発明の変異型DNAの検出方法においては、該野生型ハイブリッド体が少なくともステム構造を有するものとなるため、上記変異型ハイブリッド体がステム構造を有さないものであってもよい。尚、上記変異型ハイブリッド体がステム構造を有する場合であっても、該野生型ハイブリッド体とは異なるステム構造を有することとなる。上記変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブが正常塩基と相補な塩基を有し、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合の変異型ハイブリッド体と野生型ハイブリッド体の具体的な組合せとしては、例えば下記表のものが挙げられる。表中、1stSS、2ndSSは、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、1stDS、2ndDSは、それぞれ1stSS、2ndSSとと共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、XはプローブとゲノムDNAの間で相補となる塩基を表し、Mは置換塩基を、Nは置換塩基に対応する正常塩基を、Nは正常塩基と相補な塩基を、Stはプローブ側ステム配列を表す。また、□で囲った範囲は、ゲノムDNAと塩基対を形成せず、ステム構造又はループ構造を形成していることを表す。プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合であって、プローブが置換塩基と結合する場合変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブが置換塩基と結合し、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、該本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。該塩基配列中、1stSS21、2ndSS21は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X21及びX25は任意の塩基を表し、X22~X24は塩基又は結合手を表し、そのうちの何れか1つは置換塩基と相補な塩基であり、該置換塩基と相補な塩基は、ハイブリダイズした際に、変異型DNAの置換塩基又は野生型DNAの正常塩基と対応する位置に存在するものである。StP21はプローブ側ステム配列を表す。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS21、2ndSS21、X21~X25、StP22は上記と同じであるが、1stDS21及び2ndDS21は、それぞれ1stSS21、2ndSS21と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X21及びX25は塩基を表し、X21とX21及びX25とX25は相補な塩基を表し、X22~X24は塩基又は結合手を表し、そのうちの何れか1つは置換塩基であり、対応するX22~X24に対して相補な塩基又は結合手である。該変異型ハイブリッド体においては、プローブで設計されたステム配列のみでステム構造を形成する。本発明の変異型DNAの検出方法においては、該変異型ハイブリッド体が少なくともステム構造を有するものとなるため、下記野生型ハイブリッド体がステム構造を有さないものであってもよい。尚、下記野生型ハイブリッド体がステム構造を有する場合であっても、該変異型ハイブリッド体とは異なるステム構造を有することとなる。また、上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS21、2ndSS21、1stDS21、2ndDS21、X21~X25、X21、X25及びStP21は上記と同じであるが、X21とX25はそれぞれX21とX25に相補な塩基であり、Y22~Y24は塩基又は結合手を表し、そのうちの何れか1つは置換塩基に対応する正常塩基であり、その他のY22~Y24は対応するY22~Y24に対して相補な塩基又は結合手である。尚、上記野生型ハイブリッド体中のX22~X24の何れか1つは置換塩基と相補な塩基であるため、Y22~Y24の何れかの正常塩基とは塩基対を形成しない。その結果、ステム配列の構造の影響により、X22~X24も塩基対を形成することができない場合があり、そのような塩基対を形成できないものはプローブ側ステム配列と連結する。尚、この場合、これらの塩基は、ステム配列及び塩基対を形成できなくなった塩基の組合せによってはステム構造を形成するが、単なるループ構造となってもよい。上記の変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブが置換塩基と相補な塩基を有し、プローブ側にステム配列を有するハイブリッド体を形成するものである場合の変異型ハイブリッド体と野生型ハイブリッド体の具体的な組合せとしては、例えば下記表のものが挙げられる。表中、1stSS、2ndSSは、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、1stDS、2ndDSは、それぞれ1stSS、2ndSSと共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、XはプローブとゲノムDNAの間で相補となる塩基を表し、Mは置換塩基を、Nは置換塩基に対応する正常塩基を、Mは置換塩基と相補な塩基を、Stはプローブ側ステム配列を表す。また、□で囲った範囲は、ゲノムDNAと塩基対を形成せず、ステム構造又はループ構造を形成していることを表す。上述の如き、変異型DNAが置換塩基を有するDNAであって、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのゲノム側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細についてはで記載する。ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。1stSS31、2ndSS31は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X31、X32及びX33は、それぞれ任意の塩基を表し、X32は置換塩基に相補な塩基又は正常塩基に相補な塩基を表す。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体[該ハイブリッド体中、1stSS31、2ndSS31、X31~X33は上記と同じ。1stDS31、2ndDS31は、それぞれ1stSS31、2ndSS31と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X31及びX33はそれぞれ塩基を表し、それぞれX31及びX33と相補な塩基である。M31は置換塩基を表し、StG31はゲノム側でステム構造を形成する配列以下、ゲノム側ステム配列と略記する場合があるを表す。]該ハイブリッド体においては、X32が置換塩基に相補な塩基である場合、ゲノム側ステム配列がステム構造を形成し、X32が正常塩基に相補な塩基である場合、ゲノム側ステム配列と置換塩基とが連結してステム構造又はループ構造を形成する。上記ゲノム側ステム配列は、上記プローブ側ステム配列と同様に、ハイブリッド体を形成した際に、プローブとハイブリダイズしない塩基対を形成しない、ゲノム内の一本鎖塩基鎖がそれ自身で塩基対を形成する配列であり、前記ステム構造を形成するものである。該ステム配列は、それのみでステム構造となるものであるが、X32が正常塩基に相補な塩基である場合、StG31M31でステム構造又はループ構造を形成する。尚、ループ構造を形成する場合には、野生型ハイブリッド体が本発明に係るステム構造を有するように、設計しておく必要がある。ゲノム側ステム配列は、通常6~60mer、好ましくは6~10merからなるものであり、該ゲノム側ステム配列がステム構造を形成した際のステム構造中の塩基対は、通常3~20bp、好ましくは3~5bpの連続する二本鎖塩基対からなるもの又は3~20bp、好ましくは3~5bpの連続する二本鎖塩基対を有するループ構造が挙げられ、中でも、3~20bp、好ましくは3~5bpの連続する二本鎖塩基対からなるものが好ましい。上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体1stSS31、2ndSS31、1stDS31、2ndDS31、X31~X33、X31、X33及びStG31は上記と同じ。N31は置換塩基に対応する正常塩基を表す。該ハイブリッド体においては、X32が正常塩基に相補な塩基である場合、ゲノム側ステム配列がステム構造を形成し、X32が置換塩基に相補な塩基である場合、ゲノム側ステム配列と置換塩基とが連結してステム構造またはループ構造を形成する。aゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合であって、プローブが正常塩基と結合する場合変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブが正常塩基と結合し、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。1stSS41、2ndSS41は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X41及びX43は、それぞれ塩基を表し、N41は正常塩基に相補な塩基を表す。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS41、2ndSS41、X41、X43及びN41は上記と同じ。1stDS41、2ndDS41は、それぞれ1stSS41、2ndSS41と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X41及びX43は塩基配列を表し、それぞれX41及びX43と相補な塩基であり、M41は置換塩基を表し、StG41はゲノム側ステム配列を表す。上記ハイブリッド体において置換塩基M41は、N41と塩基対を形成できないため、StG41と連結してステム構造又はループ構造を形成する。上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体1stSS41、2ndSS41、1stDS41、2ndDS41、X41、X42及びX43、X41、X43及びStG41は上記と同じ。N41は置換塩基に対応する正常塩基を表す。該ハイブリッド体においては、ゲノム側ステム配列がステム構造を形成する。変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ゲノム側にステム配列を有するハイブリッド体を形成する場合の変異型ハイブリッド体と野生型ハイブリッド体の具体的な組合せとしては、例えば下記表のものが挙げられる。表中、1stSS、2ndSSは、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、1stDS、2ndDSは、それぞれ1stSS、2ndSSと共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、XはプローブとゲノムDNAの間で相補となる塩基を表し、Mは置換塩基を、Nは置換塩基に対応する正常塩基を、Nは正常塩基と相補な塩基を、はゲノム側ステム配列を表す。また、□で囲った範囲は、プローブと塩基対を形成せず、ステム構造又はループ構造を形成していることを表す。bゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合であって、プローブが置換塩基と結合する場合変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブが置換塩基と結合し、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。1stSS51、2ndSS51は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X51及びX53は、それぞれ塩基を表し、M51は置換塩基に相補な塩基を表す。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS51、2ndSS51、X51、X53及びM51は上記と同じ。1stDS51、2ndDS51は、それぞれ1stSS51、2ndSS51と共に塩基対を形成する塩基配列領域を表し、X51及びX53は塩基を表し、X51とX51及びX53とX53はそれぞれ相補な塩基である。M51は置換塩基を表し、StG51はゲノム側ステム配列を表す。該ハイブリッド体においては、ゲノム側ステム配列がステム構造を形成する。上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS51、2ndSS51、1stDS51、2ndDS51、X51~X53は上記と同じ。Y51及びY53はそれぞれ塩基を表し、それぞれY51及びX53と相補な塩基である。N51は置換塩基に対応する正常塩基を表し、StG51はゲノム側ステム配列を表す。上記ハイブリッド体においては、N51はM51と塩基対を形成できないため、StG51と連結してステム構造又はループ構造を形成する。変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブが置換塩基と相補な塩基を有するものであって、ハイブリダイズした際に、ゲノム側にステム配列を有するハイブリッド体を形成する場合の変異型ハイブリッド体と野生型ハイブリッド体の具体的な組合せとしては、例えば下記表のものが挙げられる。表中、1stSS、2ndSSは、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、1stDS、2ndDSは、それぞれ1stSS、2ndSSと共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、XはプローブとゲノムDNAの間で相補となる塩基を表し、Mは置換塩基を、Nは置換塩基に対応する正常塩基を、Mは置換塩基と相補な塩基を、はゲノム側ステム配列を表す。また、□で囲った範囲は、プローブと塩基対を形成せず、ステム構造又はループ構造を形成していることを表す。上述の如き、変異型DNAが置換塩基を有するDNAであって、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのプローブ側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細についてはで記載する。II変異型DNAが欠損塩基領域を有するDNAの場合II1プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合a少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合変異型DNAが欠損塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ステム構造がプローブ側に形成され、少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。1stSS211、2ndSS211は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X211及びX212はそれぞれ任意の塩基を表し、DMは欠損塩基領域に相補な塩基配列であって、且つステム構造を形成する塩基配列を表す。上記欠損塩基領域とは、変異型DNAで欠損している、野生型DNA中の塩基領域を意味する。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS211、2ndSS211、X211、X212及びDMは上記と同じ。1stDS211、2ndDS211は、それぞれ1stSS211、2ndSS211と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X211及びX212は塩基を表し、X211とX211及びX212とX212はそれぞれ相補な塩基である。上記ハイブリッド体に於いては、欠損塩基領域に相補な塩基配列がステム構造を形成する。上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS211、2ndSS211、1stDS211、2ndDS211、X211及びX212は上記と同じ。X211及びX212はそれぞれ塩基を表し、それぞれX211及びX212と相補な塩基である。DMは、欠損塩基領域を表し、DMは欠損塩基領域と相補な塩基であってDMと塩基対を形成している。上記ハイブリッド体は、プローブとゲノムが完全に塩基対を形成するため、ステム構造を形成しない。少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合変異型DNAが欠損塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ステム構造がプローブ側に形成され、少なくとも野生型ハイブリッド体はステム構造を形成する野生型ハイブリッド体が設計されたステム構造を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。1stSS221、2ndSS221は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X221及びX222はそれぞれ塩基を表す。DMは欠損塩基領域に相補な塩基配列を表し、StP221はプローブ側ステム配列を表す。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体1stSS221、2ndSS221、X221、X222、DM及びStP221は上記と同じである。1stDS221、2ndDS221は、それぞれ1stSS221、2ndSS221と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X221及びX222は塩基を表し、X221とX221及びX222とX222はそれぞれ相補な塩基である。上記ハイブリッド体においては、DMStP221とStP221、即ち、欠損塩基領域に相補な塩基配列とプローブ側ステム配列が連結してステム構造又はループ構造を形成する。上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体1stSS221、2ndSS221は、1stDS221、2ndDS221、X221、X222、DM及びStP221は上記と同じ。X221及びX222はそれぞれ塩基を表し、それぞれX221及びX222と相補な塩基である。DMは、欠損塩基領域を表す。上記ハイブリッド体においては、プローブ側ステム配列がステム構造を形成するため、上記ハイブリッド体はプローブで設計されたステム構造を有する。上述の如き、変異型DNAが欠損塩基領域を有するDNAであって、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのゲノム側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細についてはで記載する。ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合変異型DNAが欠損塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ステム構造がゲノム側に形成され、少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。1stSS231は、欠損塩基領域を含まない、欠損塩基の3側と相補な一本鎖の塩基配列を表し、2ndSS231は、欠損塩基領域を含まない、欠損塩基の5側と相補な一本鎖の塩基配列をそれぞれ表す。上記欠損塩基領域とは、変異型DNAで欠損している、野生型DNA中の塩基領域を意味する。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS231及び2ndSS231は上記と同じ。1stDS231、2ndDS231は、それぞれ1stSS211、2ndSS211と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表す。上記ハイブリッド体は、プローブとゲノムが完全に塩基対を形成するため、ステム構造を形成しない。上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS231、2ndSS231、1stDS231、2ndDS231は上記と同じ。DMは、欠損塩基領域であって且つステム構造を形成する配列を表す。上記ハイブリッド体に於いては、ゲノムDNA側において欠損塩基領域がステム構造を形成するため、該ハイブリッド体はステム構造を有する。上述の如き、変異型DNAが欠損塩基領域を有するDNAであって、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのプローブ側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細についてはで記載する。III変異型DNAが挿入塩基領域を有するDNAの場合ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合a少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合変異型DNAが挿入塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、少なくとも変異型ハイブリッド体がゲノム側にステム構造を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。1stSS311、2ndSS311は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X311及びX312はそれぞれ塩基を表す。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体ハイブリッド体中、1stSS311、2ndSS311、X311及びX312は上記と同じである。1stDS311、2ndDS311は、それぞれ1stSS311、2ndSS311と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X311及びX312はそれぞれ塩基を表し、X311とX311及びX312とX312は相補な塩基である。IMは挿入塩基領域配列を表す。該ハイブリッド体においては、挿入塩基領域配列がステム構造を形成する。上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体1stSS311、2ndSS311、1stDS311、2ndDS311、X311及びX312は上記と同じ。X311及びX312はそれぞれ塩基を表し、それぞれX311及びX312と相補な塩基を表す。該ハイブリッド体においては、プローブとゲノムが完全に塩基対を形成するため、ステム構造を形成しない。少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合変異型DNAが挿入塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ゲノム側にステム構造が形成され、少なくとも野生型ハイブリッド体がステム構造を形成する野生型ハイブリッド体が設計されたステム構造を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。1stSS321、2ndSS321は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X321及びX322はそれぞれ塩基を表す。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS321、2ndSS321、X321及びX322は上記と同じ。1stDS321、2ndDS321は、それぞれ1stSS321、2ndSS321と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X321及びX322は塩基を表し、それぞれX321とX322と相補な塩基である。IMは挿入塩基領域配列を表し、StG321はゲノム側ステム配列を表す。該ハイブリッド体においては、IMStG321塩基鎖、即ち、挿入塩基領域とゲノム型ハイブリッド体が連結してステム構造又はループ構造を形成する。上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体該ハイブリッド体中、1stSS321、2ndSS321、1stDS321、2ndDS321、X321、X322、X321、X322及びStG321は、上記と同じ。該ハイブリッド体においては、ゲノム側ステム配列がステム構造を形成する。上述の如き、変異型DNAが挿入塩基領域を有するDNAであって、ゲノム側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのプローブ側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細についてはで記載する。プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合少なくとも野性型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合変異型DNAが挿入塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブ側にステム構造が形成され、少なくとも野生型ハイブリッド体はステム構造を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。1stSS321、2ndSS321は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X321及びX322はそれぞれ任意の塩基を表し、IM321は置換塩基領域と相補な塩基配列であって且つステム構造を形成する塩基配列を表す。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体ハイブリッド体中、1stSS321、2ndSS321、X321、X322及びIM321は上記と同じである。1stDS321、2ndDS321は、それぞれ1stSS321、2ndSS321と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X321及びX322はそれぞれ塩基を表し、X321とX321及びX322とX322は相補な塩基である。IM321は挿入塩基領域配列を表す。該ハイブリッド体においては、プローブとゲノムが完全に塩基対を形成するため、ステム構造を形成しない。上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体ハイブリッド体中、1stSS321、2ndSS321、X321、X322、IM321、1stDS321、2ndDS321、X321、及びX322は上記と同じ該ハイブリッド体においては、挿入塩基領域と相補な塩基鎖がステム構造を形成する。少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合変異型DNAが挿入塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブ側にステム構造が形成され、少なくとも変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する変異型ハイブリッド体がステム構造を形成する場合、本発明に係るプローブは、例えば以下の構造を有するものが用いられる。1stSS331、2ndSS331は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X331及びX332はそれぞれ任意の塩基を表し、IM331は置換塩基領域と相補な塩基配列を表し、Stp331は、プローブ側ステム配列を表す。1stSS331、2ndSS331、X331、X332、IM331及びStp331は、上記と同じ。上記プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体又はハイブリッド体中、1stSS331、2ndSS331、X331、X332及びIM331は上記と同じである。1stDS331、2ndDS331は、それぞれ1stSS331、2ndSS331と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X331及びX332はそれぞれ塩基を表し、X331とX331及びX332とX332はそれぞれ相補な塩基である。IM331は挿入塩基領域配列であり、IM331と相補な塩基を表し、Stp331はプローブ側ステム配列を表す。該ハイブリッド体においては、プローブ中のプローブ側ステム配列がステム構造を形成するため、該ハイブリッド体はプローブで設計されたステム構造を有する。上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体又はハイブリッド体中、1stSS331、2ndSS331、X331、X332、IM331、Stp331、1stDS331、2ndDS331、X331及びX332は上記と同じ。上記変異型ハイブリッド体においては、プローブ側ステム配列と欠損塩基領域とが連結してステム構造又はループ構造を形成する。上述の如き、変異型DNAが挿入塩基領域を有するDNAであって、プローブ側にステム構造を有するハイブリッド体を形成する場合のハイブリッド体は、そのゲノム側に更にステム構造又はループ構造を形成するものも含む。その詳細については下記で記載する。ステム構造を有する塩基鎖の反対側の鎖中にステム構造又はループ構造を形成する場合上記~で記載した本発明に係るハイブリッド体においては、ステム構造を有する配列の反対側の鎖に、即ち、ゲノム側にステム構造がある場合にはプローブ側にも、プローブ側にステム構造がある場合にはゲノム側にも、更にステム構造又はループ構造を形成させることにより、好ましくはステム構造を形成させることにより、変異型ハイブリッド体と野生型ハイブリッド体の分離精度を上げることができる。その場合のプローブとしては、ゲノム側にステム構造を有する場合には、上記プローブの配列中に更に、ステム配列又はプローブを形成するための配列を挿入すればよく、プローブ側にステム構造を有する場合には、ゲノム中にステム構造又はループ構造を形成させるために、これらを形成する配列に対応する相補鎖をプローブから取り除けばよい。具体的には例えば変異型DNAが挿入塩基領域を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、ゲノム側にステム構造が形成され、少なくとも変異型ハイブリッド体はステム構造を形成する場合上記III1に該当に更にプローブ側にステム構造又はループ構造を形成する場合には、例えば以下の構造を有する本発明に係るプローブを用いればよい。1stSS411、2ndSS411は、それぞれ野生型DNA及び変異型DNAと相補な一本鎖の塩基配列を表し、X411及びX412はそれぞれ塩基を表し、Stopはプローブ側ステム配列又はプローブ側にループ構造を形成する配列を表す。該プローブと変異型DNAをハイブリッドさせると、下記変異型ハイブリッド体が形成される。変異型ハイブリッド体ハイブリッド体中、1stSS411、2ndSS411、X411及びX412は上記と同じである。1stDS311、2ndDS311は、それぞれ1stSS311、2ndSS311と共に相補二重鎖を形成する塩基配列領域を表し、X411及びX412はそれぞれ塩基を表し、X411とX411及びX412とX412は相補な塩基である。IMは挿入塩基領域配列を表す。該ハイブリッド体においては、ゲノム側で挿入塩基領域配列がステム構造を形成し、プローブ側で、プローブ側ステム配列又はプローブ側にループ構造を形成する配列がステム構造又はループ構造を形成する。上記プローブと野生型DNAをハイブリッドさせると、下記野生型ハイブリッド体が形成される。野生型ハイブリッド体1stSS411、2ndSS411、1stDS411、2ndDS411、X411及びX412は上記と同じ。該ハイブリッド体においては、プローブ側で、プローブ側ステム配列又はプローブ側にループ構造を形成する配列がステム構造又はループ構造を形成する。尚、ゲノム側にステム又はループ構造を更に形成させる場合に関しては、例えば変異型DNAが置換塩基を有するものであって、プローブがハイブリダイズした際に、プローブ側にステム構造が形成させ上記I1に該当、更にゲノム側にステム構造又はループ構造を形成させる場合には、プローブ側から、ステム構造又はループ構造を形成する配列と相補となる塩基鎖をを取り除けばよく、例えばプローブ側ステム配列に連結する4~60mer、好ましくは6~30mer、より好ましくは6~20merの塩基鎖を除いたプローブを用いればよい。[本発明の変異DNAの検出方法]本発明の変異DNAの検出方法は、1置換塩基、欠損塩基領域、若しくは挿入塩基領域を有する一本鎖DNA変異型DNA又は/及びそれに対応する野生型の一本鎖DNA野生型DNAを含有する試料と、両一本鎖DNAとハイブリダイズするプローブとを接触させて、変異型DNAとのハイブリッド体変異型ハイブリッド体又は/及び野生型DNAとのハイブリッド体野生型ハイブリッド体を形成させ、2得られた変異型ハイブリッド体又は/及び野生型ハイブリッド体とを電気泳動法により分離し、3試料中の変異型DNAの有無を検出することによりなされる。上記1における変異型一本鎖DNA又は/及び野生型DNAを含有する試料とプローブとを接触させて、変異型ハイブリッド体又は/及び野生型ハイブリッド体を形成させる方法としては、変異型DNA又は/及び野生型DNAを含有溶液に、本発明に係るプローブを溶液中の濃度が20nM~2μM、好ましくは100nM~500nMとなるように添加し、その後、例えば、90~100°Cで2~4分熱変性、30~55°Cで1~30秒DNA分子会合反応、65~75°C1~4分残存ポリメラーゼによる鋳型伸長反応で1~4サイクルさせることにより以下、該反応をステムループハイブリッド反応又はステムループハイブリッド法と呼ぶことがある、変異型ハイブリッド体又は/及び野生型ハイブリッド体を形成させればよい。なお、上記ステムループハイブリッド法におけるDNA分子会合反応は、残存ポリメラーゼによる鋳型伸長反応時の条件であっても反応が進行するため、ステムループハイブリッド法を、90~100°Cで2~4分熱変性、DNA分子会合反応、65~75°C1~4分残存ポリメラーゼによる鋳型伸長反応で1~4サイクルさせることにより行ってもよい。また、ステムループハイブリッド反応はそのサイクル数が多いほど、その反応物である変異型ハイブリッド体又は野生型ハイブリッド体を多く得ることができる。しかし、4サイクル以上行ってもその量はほとんど変化しないため、通常2~4サイクルが好ましく、3~4サイクルがより好ましい。より具体的には、先ず、例えば変異型DNA又は/及び野生型DNAを100ngを溶解した例えば10~50mMトリス緩衝液等の緩衝溶液20~40μLに、本発明に係るプローブを溶液中の濃度が20nM~2μM、好ましくは100nM~500nMとなるように、より好ましくは100~200nMとなるように添加する。その後、例えば、90~100°Cで2~4分熱変性、30~55°Cで1~30秒DNA分子会合反応、65~75°C1~4分残存ポリメラーゼによる鋳型伸長反応で1~4サイクルさせることにより変異型ハイブリッド体又は/及び野生型ハイブリッド体は形成される。上記1の反応における変異型一本鎖DNA又は野生型DNAは、前述の如き公知のPCR反応に従って増幅させたものを用いてもよく、その場合、1のステップは、具体的には以下の如くなされる。即ち、例えば、鋳型となるDNA1~100pgを20~40μLの反応溶液に溶解し、2種のプライマーForwardReverseそれぞれを通常1~100pmol、好ましくは1~50pmol、4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸dNTPsそれぞれを通常001~50nmol、好ましくは、01~20nmolとなるように添加し、TaqDNAポリメラーゼ、KODDNAポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼを1~5U含有するトリス塩酸緩衝液等の緩衝液中で、例えば93~98°C、10秒~10分→50~60°C、10秒~3分→65~75°C、1~5分間のサイクルを30~40回繰り返すことによりなされる。その後、得られた反応溶液に、本発明に係るプローブをPCRプライマーの01~5倍量、例えば通常01~500pmol、好ましくは01~50pmol添加し、上記と同様に、ステムループハイブリッド反応を行うことによりなされる。また、上記の如くPCR反応により変異型一本鎖DNA又は/及び野生型DNAを増幅させる場合、該PCR反応と同時にステムループハイブリッド反応を行うこともできる。その場合、本発明に係るプローブとしては、3末端及び5末端をリン酸基等で修飾したものを用い、該プローブの存在下、上記PCR反応を行えばよい。具体的には、例えば、鋳型となるDNA1~100pgを20~40μLの反応溶液に溶解し、2種のプライマーForwardReverseそれぞれを通常1~100pmol、好ましくは1~50pmol、4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸dNTPsそれぞれを通常001~50nmol、好ましくは01~20nmol、3末端及び5末端が修飾された本発明に係るプローブを通常01~500pmol、好ましくは01~50pmol添加し、耐熱性DNAポリメラーゼを例えば1~5U含有する10~50mMトリス塩酸緩衝液等の緩衝液中で、例えば93~98°C、10秒~10分→50~60°C、10秒~3分→65~75°C、1~5分間のサイクルを30~40回繰り返すことによりなされる。上記2の電気泳動法としては、上記変異型ハイブリッド体と野生型ハイブリッド体とを分離し得るものであれば特に限定はされないが、例えば等電点電気泳動法、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法、アガロースゲル電気泳動法、アクリルアミド電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法等の電気泳動法や誘電泳動法等の電気的分離法が挙げられ、冷却効率がよく、高電圧をかけることができ、効率よく分離し得る等の点から、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法が好ましく、微量サンプル分析に適しているキャピラリーチップ電気泳動法が特に好ましい。尚、これら分離方法の条件は、自体公知の方法に準じて行えばよく、例えばキャピラリーチップ電気泳動は、WO2007027495等に記載の方法に準じて行えばよい。上記3における検出方法は、自体公知の方法であれば何れでも用いることができるが、示差屈折検出器、蛍光検出器、UV検出器等の機器により検出されればよく、中でも、UV検出器、蛍光検出器による検出が好ましく、蛍光検出器による検出がより好ましい。蛍光検出を行う場合には、種々の蛍光検出方法を利用すればよい。例えば、I予め蛍光標識したプローブを用いて、上記1の反応後、2の電気泳動を行って蛍光検出をする方法、II蛍光標識しているプローブを用いて1の反応後、電気泳動を行い、泳動後にDNAをインターカレーター等で標識する等の方法等により行えばよい。ここで用いられるプローブの蛍光標識としては、例えばシアニン色素が挙げられる。ここでいうシアニン色素とは、2個の複素環をメチン基又はポリメチン基で結合し、且つ該複素環の少なくとも1個が含窒素複素環である化合物であり、前記2個の複素環の両者が含窒素複素環であるものが好ましい。上記シアニン色素由来の置換基としては、例えばUS4981977、US5268486、US5486616等に記載のCy系色素由来のもの、US6083485等に記載のDy系色素由来のもの、WO2006047452等に記載のHiLyte系色素由来のもの、Alexa系色素由来のもの等が好ましい。また、市販のものに由来するものを用いてもよく、例えばCy系色素由来のものを用いる場合としては、Cy3、Cy35、Cy5、Cy55、Cy7等由来のもの何れもアマシャムバイオサイエンス社AmershamBiosciences商品名が、Dy系色素由来のものとしては、DY700、DY701、DY730、DY731、DY732、DY734、DY750、DY751、DY752、DY776、DY780、DY781、DY782等由来のものが、HiLyte系色素由来のものとしては、HiLyteFluor555、HiLyteFluor647、HiLyteFluor680、HiLyteFluor750等由来のもの何れもアナスペック社AnaSpec製商品名が、Alexa系色素由来のものとしては、AlexaFluorDye532、AlexaFluorDye546、AlexaFluorDye555、AlexaFluorDye568、AlexaFluorDye594、AlexaFluorDye633、AlexaFluorDye647、AlexaFluorDye660、AlexaFluorDye680、AlexaFluorDye700、AlexaFluorDye750等由来のもの何れもモレキュラープローブス社MolecularProbes商品名が好ましいものとして挙げられる。中でもCy系色素由来のものが好ましく、その中でもCy5由来のものが好ましい。また、上記で用いられるインターカレーターとしては、核酸鎖に結合することによって強い蛍光を発するものであればよく、具体的には、例えばアクリジンオレンジ等のアクリジン色素、例えば臭化エチジウム,エチジウムホモダイマー1EthD1,エチジウムホモダイマー2EthD2,臭化エチジウムモノアジドEMA,ジヒドロエチジウム等のエチジウム化合物、例えばヨウ素化プロピジウム,ヨウ素化ヘキシジウム等のヨウ素化合物、例えば7-アミノアクチノマイシンD7AAD、例えばPOPO1BOBO1YOYO1TOTO1JOJO1POPO3LOLO1BOBO3YOYO3TOTO3等のシアニンダイマー系色素何れもモレキュラープローブ社商品名、例えばPOPRO1BOPRO1YOPRO1TOPRO1JOPRO1POPRO3LOPRO1BOPRO3YOPRO3TOPRO3TOPRO5等のシアニンモノマー系色素何れもモレキュラープローブ社商品名、例えばSYBRGoldSYBRGreenIandSYBRGreenIISYTOXGreenSYTOXBlueSYTOXOrange等のSYTOX系色素何れもモレキュラープローブ社商品名等が挙げられる。また、DNA二重らせんのマイナーグルーブに結合するもの例えば46ジアミジノ2フェニルインドールDAPI:モレキュラープローブ社商品名,ペンタハイドレ-トビス-ベンズイミドHoechst33258:モレキュラープローブ社商品名,トリヒドロクロライドHoechst33342:モレキュラープローブ社商品名,ビスベンズイミド色素Hoechst34580:モレキュラープローブ社商品名等、アデニン-チミンAT配列に特異的に結合するもの例えば9アミノ6クロロ2メトキシアクリジンACMA,ビス6クロロ2メトキシ9アクリジニルスペルミンアクリジンホモダイマー等のアクリジン色素、例えばヒドロキシスチルバミジン等等もインターカレーターと同様にして用いることができる。本発明の変異DNAの検出方法は、具体的には例えば以下のようになされる。即ち、例えばがん患者由来のヒトゲノムDNAについて変異DNAを検出する場合、市販のキット等により抽出精製したヒトゲノムDNAを試料として、PCR反応を行う。PCR反応用試料は、例えば、検出対象とするDNAのプライマーForwardとReverseそれぞれを通常100~1000nM、4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸dNTPsがそれぞれ通常01~500nM、TaqDNAポリメラーゼが1~5unitとなるように、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液20μL中に溶解した後、ヒトゲノムDNA1ng~100ngを添加して調製すればよく、PCR反応は、例えば93~98°C、10~30秒、50~60°C、10~30秒、68~72°C、1~3分間のサイクルを35~40サイクル行うことにより、対象の一本鎖DNAを増幅することができる。PCR反応の後、PCRのプライマーの01~10倍量のプローブを添加し、ハイブリッド反応を行う。即ち、例えばPCR産物に、最終濃度が100~500nMとなるように本発明に係るプローブを添加し、それを、90~100°Cで2~4分、30~55°Cで1~30秒、65~75°C1~4分で1~4サイクルさせることにより、検出目的のDNAのハイブリッド体が得られる。得られた溶液を、適当な分離方法、例えばキャピラリーチップ電気泳動により分離し、例えば蛍光検出器等により検出することにより、変異型DNAを検出することができる。以下に実施例、参考例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。実施例1ステム構造を有するハイブリッド体を形成し得るプローブによるKRAS遺伝子の一塩基置換変異DNAの検出1大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAの調製大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAはキアゲン社QIAampDNAMiniKitを用い、凍結したがん組織25mgをホモゲナイズ後、キットに添付のバファーを添加しさらにproteinaseKを加えて56°Cで完全溶解しRNaseAで処理後、キットに添付のバッファーにより除タンパク後、遠心上清をキットに添付のスピンカラムで抽出精製し、そのうち50ngを鋳型材料として準備した。得られた精製ゲノムDNAを、次項3記載のPCR反応により増幅後、ミリポア社のモンタージュPCRにより精製した増幅DNAをサンプルDNAとし、プライマーKRASRv配列番号15をシーケンスプライマーとして用い、後述の合成例1の2と同様の方法にてシーケンス確認を行い、KRAS遺伝子のコドン12上に一塩基置換変異がある事を確認した。2ステム型LoopHybrid反応SLH反応用プローブの作成プローブが変異塩基と結合するように、且つハイブリッド体形成時にできるループがステム構造となるように設計した、下記プローブを、SLH反応用のプローブとして用いたIN1。上記プライマーおよびプローブのオリゴ合成については、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtatatatataggcgtaggcaagagtgccttgacgatacag配列番号17尚、該プローブを用いた場合、下記ステム構造がプローブ上に形成されると考えられる。3大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAのSLH反応上記1で調製した大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAを試料として、アキュプライムTaqポリメラーゼシステムPCR反応用キット、インヴィトロジェン社製を用いてPCR反応を行った。即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマーKRASFwaaggcctgctgaaaatgactg配列番号16とKRASRvggtcctgcaccagtaatatgca配列番号15を2μLずつおよびキットに添付のPCR反応バッファー2μLを使用し、PCR用反応液20μLを調製した。その後、大腸がん患者由来ヒトゲノムDNA25ngをPCR用反応液20μlに懸濁添加し、PCR用試料とした。尚、上記プライマーのオリゴ合成については、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。このPCR用試料を用い、MJResearch社のDNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200を使用して、下記の反応条件で36サイクルのPCR反応を行った。PCR反応条件:熱変性:95°C、15secアニーリング:55°C、15sec重合反応:68°C、47sec反応終了後、PCR反応産物に対してSLHプローブIDIN1;aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtatatatataggcgtaggcaagagtgccttgacgatacag配列番号17を最終濃度200nMとなるように添加し、DNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200、MJResearch社製を使用して、下記の反応条件にて1サイクル反応を行った。SLHreactionPCRproduct45μlSLHprobe05μlof2μMstock105°Chotlid95°C2min55°C030sec68°C4min4°Cpause4SLH反応によるハイブリッド体の分離検出マイクロチップ電気泳動上記3で得られた反応生成物を、Agilent2100バイオアナライザーシステムアジレント社を用いてマイクロチップ電気泳動方法に供した。本泳動方法では専用試薬であるAgilentDNA1000Assayキットアジレント社製を使用し、キットに添付の製品プロトコールに従い、各反応生成物10μLをアプライした。また電気泳動後のピーク解析には、システムに付属のAgilent2100エキスパートソフトウェアを使用して、波形解析およびピーク移動度の算出を行った。その結果を図1に示した。比較例1ステム構造を有さないハイブリッド体を形成するプローブLHプローブによるKRAS遺伝子の一塩基置換変異DNAの検出ハイブリッド体形成時にループ構造が形成される、下記プローブを、LH反応用のプローブとして用いたDel7。LHプローブIDDel7;aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagct配列番号18尚、該プローブを用いた場合、下記構造のループ構造がゲノムDNA上に形成されると考えられる。上記プローブを用いた以外は、実施例1と同じ方法により、大腸がん患者由来ヒトゲノムDNAの測定を行った。その結果を図2に示す。図1及び2の結果から明らかなように、ステム構造を有するハイブリッド体を形成しないプローブループ構造のみを形成するプローブ、Del7を用いた場合図2では分離できなかった大腸癌患者由来ヒトゲノムDNAが、ステム構造を有するハイブリッド体を形成するプローブIN1を用いた場合図1では、分離できることが判った。即ち、ハイブリッド体にステム構造を持たせることにより、単なるループ構造を有するハイブリッド体と比較して、変異型DNAと野生型DNAの識別能が格段に向上できることが判った。合成例1KRAS遺伝子における変異型DNAと野生型DNAの配列を持つサンプルクローンの調製KRAS遺伝子エクソン1のコドン12およびコドン13における一塩基置換は、コドン内の第一塩基および第二塩基それぞれの3種類の変異を合わせると12種類の変異が存在する。そこで、合成オリゴヌクレオチドを用いたoverlapextensionPCR変異導入法BioTechniquesVol48No6June2010pp463465により、これらの変異を導入した野生型DNA配列をPCRにより増幅し、更に、その増幅産物をpGEMTVectorシステムプロメガ社を用いてプラスミドにクローニングし、これら12種類の変異型DNAと野生型の配列を持つサンプルクローンを得た。このクローニングの手順の詳細を以下に示す。即ち、まず、正常ヒトゲノムDNAを正常健康人の全血2mlからキアゲン社QIAampDNABloodMidiKitに付属のプロトコールに従い以下の如く抽出精製した。即ち、血液2mlにキット付属のQIAGENProtease200μLを添加し、混和した。次いで、キット付属のBufferAL24mlを添加し、完全に混和した後、70°Cで10分間インキュベートした。その後、サンプルにエタノール96~1002mlを添加し、完全に混和した後、得られた溶液を、キット付属の遠心チューブ中のQIAampMidiカラムに移した。1850xg3000rpmで3分間遠心分離し、QIAampMidiカラムを取り除き、ろ液を捨て、QIAampMidiカラムを遠心チューブに戻し、1850xg3000rpmで3分間遠心分離した。再度、QIAampMidiカラムを取り除き、ろ液を捨て、QIAampMidiカラムを15ml遠心チューブに戻した。次いで、キット付属のBufferAW12mlをQIAampMidiカラムに添加し、4500xg5000rpmで1分間遠心分離した。更に、キット付属のBufferAW22mlを、QIAampMidiカラムに添加し、4500xg5000rpmで15分間遠心分離した。新しいキット付属の遠心チューブにQIAampMidiカラムを移し、ろ液の入ったチューブを除去した。最後に、室温15~25°Cでキット付属のBufferAE300μLをQIAampMidiカラムのメンブレン上に直接ピペッティングして蓋を閉め、室温で5分間インキュベートした後、4500xg5000rpmで2分間遠心分離し、正常健康人の全血から正常ヒトゲノムDNAを含む溶出液を回収した。次いで、得られた正常ヒトゲノムDNAを鋳型として、PlatinumTaqポリメラーゼシステムPCR反応用キット、インヴィトロジェン社製を用いてPCR反応を行った。即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、10μMの下記12種のプライマー121112121213122112221223131113121313132113221323それぞれと1204catgaaaatggtcagagaaacc配列番号1の組合せ各1μLおよびキットに添付のPCR反応バッファー5μL、10mMdNTPsを1μLを使用し、正常ヒトゲノムDNA50ngをPCR用反応液50μLに懸濁添加し、PCR用試料とした。このPCR用試料を用い、MJResearch社のDNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200を使用して、下記の反応条件で35サイクルのPCR反応を12種について行った。PCR反応条件:熱変性:94°C、20secアニーリング:55°C、20sec重合反応:72°C、20sec。これらの12種のPCR産物を1000倍に希釈後、変異の導入効率の精度を高めるために複製精度が最も高いポリメラーゼであるPwoSuperYieldDNAPolymeraseを用いPCR反応をさらに行った。即ち、PCR反応液は10μMの変異導入用プライマー対12種のそれぞれについて各1μLと、キット添付の反応バッファー5μL、10mMdNTPs1μLを使用し、1000倍に希釈した対応する前項の変異導入PCR産物を025μL加えて、PCR用反応液50μLを調製した。このPCR用試料を用い、下記の反応条件で20サイクルのPCR反応を12種の変異導入PCR産物について行った。PCR反応条件:熱変性:94°C、15secアニーリング:55°C、30sec重合反応:68°C、20sec。これにより、コドン12またはコドン13に変異が導入された12種の高品位の変異導入PCR産物が得られた。次に、目的とする最終PCR産物の上流部を含みかつ、上記の変異導入PCR産物と重複する部分をもつDNAを高精度PCRで増幅するために、正常ヒトゲノムDNAを鋳型とし、PwoSuperYieldDNAPolymeraseを用い、10μMのプライマー1203Ngtactggtggagtatttgatagtg配列番号14とプライマーRggtcctgcaccagtaatatgca配列番号15、各1μL、およびキットに添付のPCR反応バッファー5μLと10mMdNTPsを1μL使用し、正常ヒトゲノムDNA25ngをPCR用反応液50μlに懸濁添加し、PCR用試料とし、下記の反応条件で30サイクルのPCR反応を行った。PCR反応条件:熱変性:94°C、15secアニーリング:55°C、30sec重合反応:68°C、20sec。こうして得られた246bpの上流側用PCR産物1203NRと、前段で得られた12種の変異導入PCR産物のそれぞれを使用し、PlatinumTaqDNAPolymeraseHighFidelityを用いてoverlapextensionPCRを行った。反応液は、添付のPCR反応バッファー5μL、10mMdNTPsを1μL、50mMMgSO4を2μL使用し、上流側用PCR産物1203NRと変異導入PCR産物の各1μLをPCR用反応液50μlに懸濁添加し、PCR用試料とし、下記の反応条件で2サイクルのPCR反応を行った。PCR反応条件:熱変性:94°C、20secアニーリング:50°C、30sec重合反応:68°C、20sec。このoverlapextensionPCR反応終了後、10μMのプライマー1203Ngtactggtggagtatttgatagtg配列番号14と1204catgaaaatggtcagagaaacc配列番号1を各1μL上記のPCR反応液に添加し、下記の反応条件で25サイクルのPCR反応を引き続き行った。PCR反応条件:熱変性:94°C、20secアニーリング:55°C、20sec重合反応:68°C、20sec。野生型に対応するPCR産物はPlatinumTaqDNAPolymeraseHighFidelityにより10μMのプライマー1203Nと1204を各1μLと、添付のPCR反応バッファー5μL、10mMdNTPs1μL、50mMMgSO4を2μL使用し、正常ヒトゲノムDNA50ngを鋳型として、PCR用反応液50μlに懸濁添加し、下記の反応条件で30サイクルのPCR反応を行った。PCR反応条件:熱変性:94°C、20secアニーリング:55°C、20sec重合反応:68°C、20sec。これらの一連のPCR反応によって得られた287bpの12種の変異導入PCR産物と1種の野生型PCR産物をpGEMTVectorSystemを用いてTAクロ-ニング法によりプラスミドベクターpGEMTeasyに挿入した。ライゲーション反応はキットに添付のRapidLigationBufferとT4リガーゼを用いて室温で1時間行った。その後、東洋紡社製EcoliJM109CompetentCellsを用い、その製品プロトコールに従って、上記で得られた組み換えDNAを用いて42°C45secでEcoliJM109CompetentCellsの形質転換を行った。その後、100μgmlのアンピシリン、02mMイソプロピルβチオガラクトピラノシドIPTG、40μgmlXGalを含むLB寒天培地に、得られた形質転換体を37°Cで16時間プレート培養した。培養後、培地中の白色コロニーをピックアップし、目的のDNA断片を挿入した組み換えDNAが導入された、各クローンに対する形質転換体を得た。その後、QIAGEN社のプラスミド抽出キットQIAprepSpinMiniprepを用いて、DNAの抽出精製までの工程を行った。即ち、5mlの100μgmlのアンピシリン含有LB液体培地で一夜増殖させた各クローンに対する形質転換体を遠心により集菌し、アルカリ法で溶菌後、酢酸カリウム酸性液で中和し、それらの遠心後の上清液からキットに添付の精製カラムによりプラスミッドDNAを精製した。212種類の変異DNAと野生型DNAの配列の確認次に、上記でクローニングされた、12種類の変異DNAと野生型の配列を持つサンプルクローンを用いて、BigDyeTerminatorキットアプライドバイオシステムズ社製により、製品プロトコールに従って以下の手順でシークエンス解析を行った。サンプルDNA各クローン;2μLT7プロモータープライマー;1μLpremix;8μL即ち、上記の混合物に、総量20μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、DNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200、MJResearch社製を使用して、下記の反応条件で30サイクルのシークエンス反応を行った。96°C2min→96°C10sec→50°C5sec→60°Cmin×25→4°C得られたシークエンス反応産物をゲルろ過カラムQIAGEN社製で精製後、シークエンサーBaseStation、MJResearch社製を用いて機器付属の手順書に従い、候補配列すべてのシークエンス解読を完了した。その結果、コドン12又はコドン13において、下記表1及び2の12種類の変異型DNAと野生型DNAの配列を持つサンプルクローンが作製できた事を確認した。実施例2アクリルアミドゲル電気泳動法によるKRAS遺伝子の一塩基置換変異DNAの検出1SLH反応上記合成例1で調製した各サンプルクローンを試料として、アキュプライムTaqポリメラーゼシステムPCR反応用キット、インヴィトロジェン社製を用いてPCR反応を行った。即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマーKRASFwaaggcctgctgaaaatgactg配列番号16とKRASRvggtcctgcaccagtaatatgca配列番号1510μLおよびキットに添付のPCR反応バッファー20μLを使用し、PCR用反応液200μLを調製した。その後、各サンプルクローン2pgをPCR用反応液20μlに懸濁添加し、PCR用試料とした。尚、上記プライマーおよびプローブのオリゴ合成については、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。このPCR用試料を用い、MJResearch社のDNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200を使用して、下記の反応条件で30サイクルのPCR反応を行った。PCR反応条件熱変性:95°C、15secアニーリング:55°C、15sec重合反応:68°C、47sec反応終了後、PCR反応産物に対してSLHプローブIDIN1;aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtatatatataggcgtaggcaagagtgccttgacgatacag配列番号17を最終濃度200nMとなるように添加し、DNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200、MJResearch社製を使用して、下記の反応条件にて1サイクル反応を行った。SLHreactionPCRproduct45μlSLHprobe05μlof2μMstock105°Chotlid95°C2min55°C30sec68°C4min4°Cpause2SLH反応によるハイブリッド体の分離検出アクリルアミド重合ゲル電気泳動上記1で得られた各種SLH反応生成物のうち7種の変異型DNAKR12CG、KR12TG、KR12GA、KR12GC、KR12GT、KR13CG及びKR13TGと野生型DNAを用いたものの15μlにゲルローディングバッファー15μlをそれぞれ添加し、非変性10ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。また分子量マーカーとしては、100bpladderforsizemarkerpromega社製15μlを使用して、同一ゲルにローディングし電気泳動を行った。ポリアクリルアミドゲルは7cmx7cmのコンパクトゲルコンパクトゲルC10L、アトー社製を用い、トリスグリシン緩衝液375mMTris,288mMGlycineを泳動緩衝液として小型電気泳動装置アトー社、AE7300コンパクトPAGEで室温で泳動した。泳動後、サイバーグリーンIタカラバイオ社、F0513で10分間染色し、水洗後、レーザーイメージングスキャナーアマシャム社、STORM860を用い励起波長450nm、検出フィルター520LPで検出した。尚、各ハイブリッド体予測されるステム構造は、以下の通りである。表中、小文字は、ゲノムDNAと相補になっていない塩基を表し、下線部は、ステム構造を形成していると考えられる配列である。3結果7種類の変異DNAと野生型の配列を持つサンプルクローンについて、SLH反応後に得られた電気泳動による実験結果を図3に示した。尚、図3中の1~5レーンは、それぞれ、KR12CG、KR12TG、KR12GA、KR12GC、KR12GTを用いた結果を、6~7レーンは、それぞれKR13CGKR13TGを用いた結果を表し、wtは野生型を用いた結果を表す。図3の結果から、アクリルアミド重合ゲル電気泳動を用いて本発明により得られたSLH反応産物を測定した結果、コドン12がそれぞれ、CGT、TGT、GAT、GCT、GTTである5種の変異DNA、並びにコドン13がそれぞれ、CGC、TGCである2種の変異DNAについて変異型の識別ができることが判った。実施例3アクリルアミドゲル電気泳動法によるKRAS遺伝子の一塩基置換変異DNAの検出1SLH反応上記実施例2の1におけるSLHプローブIDIN1の代わりにSLHプローブ[IDIN4:aaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggttctgcagaaggtgtaggcaagagtgccttgacgatacag配列番号22]を用いた以外は、実施例2と同様の方法により、合成例1で調製した各サンプルクローンのSLH反応を行った。尚、上記プローブを用いた場合、下記構造のステム構造がプローブ側に合成されると考えられる。2SLH反応によるハイブリッド体の分離検出アクリルアミド重合ゲル電気泳動上記1で得られた各種SLH反応生成物として、12種の変異型DNAと野生型DNAを用いた以外は、上記実施例2の2と同様の方法により、SLH反応生成物のゲル電気泳動を行った。3結果12種類の変異DNAと野生型の配列を持つサンプルクローンについて、SLH反応後に得られた電気泳動による実験結果を図4に示した。尚、図3中の1~6レーンは、それぞれ、KR13AG、KR13CG、KR13TG、KR13GA、KR13GC、KR13GTを用いた結果を、7~12レーンは、それぞれKR13CGKR13TGを用いた結果を表し、Wは野生型を用いた結果を表す。図4の結果から、上記IN4のプローブを用いて、本発明により得られたSLH反応産物をアクリルアミド重合ゲル電気泳動で分離検出した結果、コドン12がそれぞれ、AGT、CGT、TGT、GAT、GCT、GTTである、6種の変異DNA並びにコドン13がそれぞれ、AGC、CGC、TGC、GAC、GCC、GTCである、6種の変異DNAについても変異型の識別ができることが判った。実施例4KRAS遺伝子における各種一塩基置換変異DNAの検出マイクロチップ電気泳動法上記実施例21で得られたSLH反応生成物を、Agilent2100バイオアナライザーシステムアジレント社を用いてマイクロチップ電気泳動方法に供した。本泳動方法では専用試薬であるAgilentDNA1000Assayキットアジレント社製を使用し、キットに添付の製品プロトコールに従い、各反応生成物10μLをアプライした。また電気泳動後のピーク解析には、システムに付属のAgilent2100エキスパートソフトウェアを使用して、波形解析およびピーク移動度の算出を行った。その結果を図5に示した。尚、図5中のピークは、それぞれ1がKR12AG、2がKR12CG、3がKR12TG、4がKR12GA、5がKR12GC、6がKR12GT、7がKR13AG、8がKR13CG、9がKR13TG、10がKR13GA、11がKR13GC、12がKR13GTを用いたものを表す。図5の結果から明らかなように、本発明のSLH反応を用いてマイクロチップ電気泳動で検出を行った結果、コドン12およびコドン13上に変異を有する変異DNAのピークは、何れも野生型DNAのピークと分離しており、変異DNAとして完全に識別できることが判った。即ち、この結果から、SLH反応により得られた変異型DNAは、マイクロチップ電気泳動により容易に検出できることが分かった。これは、ステム構造が熱の発生により変化するが、熱の発生が少ないマイクロチップ電気泳動法によれば安定した構造を維持することができるため、分離を容易にしたものと考えられた。更に、マイクロチップ電気泳動法は、ゲル電気泳動と比較してピーク分析が容易であるため、このようなSLH反応を用いた変異型DNAの検出に適していることが示された。尚、KRAS遺伝子検査のように隣接したコドン例えばコドン12と13で変異が発生する場合、その両者の変異を検出する必要があったが、ループ構造のみを形成するプローブDel7等を用いた従来のループハイブリッド法では、隣接したコドンの変異全てを検出することはできなかった。しかし、図5の結果からも明らかな如く、本発明者らにより考案されたステム構造を有するハイブリッド体を用いる方法により、隣接したコドン12および13に発生し得る変異を同一の測定系にて精度よく検出する事が可能となる。実施例5UGT1A1の挿入塩基領域を有する変異型DNAの検出1ヒト血液由来ヒトゲノムDNA及びの調製ヒト血液に由来するサンプルを複数準備し、ヒトゲノムDNAをキアゲン社QIAampDNABloodMidiKitに従い全血2mlをproteinaseKで70°C10分処理後エタノールを添加し、遠心後の上清をQIAmpMidiカラムで抽出精製した。そのうちの50ngを鋳型材料として準備し、合成例12と同様の方法にてシーケンス確認を行った。その中から、野生型DNATA6のホモ、野生型DNATA6と変異型DNATA7;野生型DNAにTAが挿入されたDNAのヘテロ、変異型DNATA7のホモの3種の検体を得て、試料とした。野生型DNATA6のプロモータ部の塩基配列TATATATATATA変異型DNATA7のプロモータ部の塩基配列TATATATATATATA2SLH反応用プローブの作成ハイブリッド体形成時にゲノム配列上にステム構造が形成されるように設計した、下記プローブを、SLH反応用のプローブとして用いたUGT1Adel12F。ctttgtggactgacagctttttatagtcacgtgacacagtcaaacattaacttggtgtatcgattggtttttgatataagtaggagagggcgaac配列番号21尚、該プローブを用いた場合、目的とするゲノム配列より増幅されたDNA増幅断片上に下記構造のステム構造が形成されると考えられる。野生型DNATA6を用いた場合:変異型DNATA7を用いた場合:3SLH反応上記1で調製した3種のサンプルを用いて、アキュプライムTaqポリメラーゼシステムPCR反応用キット、インヴィトロジェン社製でPCR反応を行った。即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマーctttgtggactgacagctttttatag配列番号19とgctgccatccactgggatc配列番号20を10μLずつおよびキットに添付のPCR反応バッファー20μLを使用し、PCR用反応液200μLを調製した。その後、正常ヒト血液由来ヒトゲノムDNA1ngをPCR用反応液20μlに懸濁添加し、PCR用試料とした。尚、上記プライマーおよびプローブのオリゴ合成については、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。このPCR用試料を用い、MJResearch社のDNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200を使用して、下記の反応条件で36サイクルのPCR反応を行った。PCR反応条件:熱変性:95°C、15secアニーリング:55°C、15sec重合反応:68°C、47sec反応終了後、SLHプローブIDUGT1Adel12Fを最終濃度200nMとなるように添加し、MJResearch社のDNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200を使用して、下記の反応条件にて1サイクル反応を行った。SLHreactionPCRproduct45μlSLHprobe05μlof2μMstock105°Chotlid95°C2min55°C30sec68°C4min4°Cpause4SLH反応によるハイブリッド体の分離検出マイクロチップ電気泳動上記3で得られたSLH反応生成物ハイブリッド体を、Agilent2100バイオアナライザーシステムアジレント社を用いてマイクロチップ電気泳動方法に供した。本泳動方法では専用試薬であるAgilentDNA1000Assayキットアジレント社製を使用し、キットに添付の製品プロトコールに従い、各反応生成物10μLをアプライした。また電気泳動後のピーク解析には、システムに付属のAgilent2100エキスパートソフトウェアを使用して、波形解析およびピーク移動度の算出を行った。得られた結果を図6に示した。尚、図中の左図は、野生型DNATA6と変異型DNATA7のヘテロを測定した結果、真ん中の図は、変異型DNATA7のホモを測定した結果、右図は野生型DNATA6のホモを測定した結果をそれぞれ表す。図6の結果から明らかな如く、本発明の方法によれば、UGT1A1遺伝子プロモータの遺伝子多型28の遺伝型の識別判定を可能とすることが判った。即ち、挿入塩基を有する変異型DNAであっても、本発明の方法により、野生型DNAと変異型DNAを分離検出できることが判った。また、このようなヘテロやホモとなる変異遺伝子の検出の場合、変異の有無のみならず、これらの遺伝型の区別を兼ねた検出は難しいことが多いが、本発明の方法を用いれば、ヘテロ、ホモの何れの遺伝型であるかについても明瞭に識別できることが確認された。なお、UGT1A1遺伝子は、上述の多型28以外にエキソン1の多型6の検出も重要となるが、本発明の方法を応用し、6と28のSLH反応液を同一の電気泳動に供することにより、これらの型判別を同時に行うことができる。即ち、多型6と28に対しそれぞれの蛍光SLHプローブを調製し、6および28のそれぞれとハイブリダイズさせたものを混合して電気泳動用の試料とすることにより、SLHプローブとの反応体のみをそのプローブの蛍光により特異的に検出し、それらが異なる移動度で分離する条件を設定することで、各多型のそれぞれの変異型の判別が一回の試行で可能でとなる。実施例6UGT1A1多型28での変異体に対するLHバンドの特異的検出1UGT1A1遺伝子における変異型DNAと野生型DNAの配列を持つサンプルDNAの調製200人のサンプルを用いてスクリーニングし、野生型DNATA6、並びに、野生型TA6に対して28座位がヘテロ接合型のアリルを持つ、変異型DNA野生型DNAからTAが欠損しているDNA、TA7野生型DNAにTAが挿入されたDNA及びTA8野生型DNAにTATAが挿入されたDNAを得、サンプルDNAとした。尚、野生型DNATA6、変異型DNATA5、変異型DNATA7及び変異型DNATA8の各プロモータ部の塩基配列は以下の通りである。野生型DNATA6:TATATATATATA変異型DNATA5:TATATATATA変異型DNATA7:TATATATATATATA変異型DNATA8:TATATATATATATATA具体的には、以下の如く行った。即ち、28座位がヘテロ接合型のアリルを持つ200人のサンプルより得られた各ゲノムDNAサンプル5ngをAccuprimeTaqを使用してPCR反応を行ったPCR反応条件:95°C、15sec、55°C、15sec、68°C、47secで36サイクル。得られたPCR増幅産物をTOPOTAクローニングシステムInvitrogen社を使用してTAクローニングベクターpCR21TOPOに組み込み、エレクトロポレーションで大腸菌OneShotTOP10Invitrogen社に導入した。その後、カナマイシン25ngmlを含むLB寒天培地で37°C18時間培養し、抗生物質耐性を指標として選択して得たコロニーをランダムにクローン化した。各コロニーの大腸菌の1白金耳を、25ngmlのアンピシリンを含む液体LB培地50μLで2~4時間37°C培養し遠心した。遠心後の菌体沈査に対しクローンチェッカーInvitrogenのグリーン液8μLを加えて浮遊させたのち、98°C30秒で菌からDNAを遊離させた。このDNA液を100μLの蒸留水に分散させたものをtempliphiGEhealthcareで増幅後、サンガー法でplasmidDNAの配列を決定した。このスクリーニングにより、野生型DNATA6、変異型DNATA5、変異型DNATA7及び変異型DNATA8を得、これらをサンプルDNAとした。2SLH反応用プローブの作成ハイブリッド体形成時にゲノム配列上にステム構造が形成し得るように設計した、下記プローブUGT1Adel8Fを合成した。ctttgtggactgacagctttttatagtcacgtgacacagtcaaacattaacttggtgtatcgattggtttttgatatatataagtaggagagggcgaac配列番号23サイバーグリーンISYBRGreenIの蛍光検出によりハイブリッド体を測定する場合には、該プローブ以下、プローブ1と略記するをSLH反応用のプローブとして用いた。また、Cy5の蛍光検出用によりハイブリッド体を測定する場合には、該プローブ配列の5末端をCy5で蛍光修飾したもの以下、プローブ2と略記するをSLH反応用のプローブとして用いた。尚、蛍光修飾には、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。上記プローブ1及び2を用いた場合、目的とするゲノム配列より増幅されたDNA増幅断片のゲノム側に下記構造のステム構造が形成されると考えられる。変異型DNATA5を用いた場合:野生型DNATA6を用いた場合:変異型DNATA7を用いた場合:変異型DNATA8を用いた場合:3SLH反応上記1で調製した4種のサンプルDNAを用いて、それぞれについて、アキュプライムTaqポリメラーゼシステムPCR反応用キット、インヴィトロジェン社製でPCR反応を行った。即ち、まず、キットに添付の製品プロトコールに従い、各10μMのプライマーctttgtggactgacagctttttatag配列番号19とgctgccatccactgggatc配列番号20を10μLずつおよびキットに添付のPCR反応バッファー20μLを使用し、PCR用反応液200μLを調製した。その後、サンプルDNA1ngをPCR用反応液20μlに懸濁添加し、PCR用試料とした。尚、上記プライマーのオリゴ合成については、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。このPCR用試料を用い、MJResearch社のDNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200を使用して、下記の反応条件で36サイクルのPCR反応を行った。PCR反応条件:熱変性:95°C、15secアニーリング:55°C、15sec重合反応:68°C、47sec反応終了後、得られた4種類のPCR産物それぞれに、SLHプローブ1を最終濃度200nMとなるように添加し、MJResearch社のDNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200を使用して、下記の反応条件にてSLH反応を1サイクル行った。SLH反応PCRproduct45μlSLHprobe05μlof2μMstock105°Chotlid95°C2min55°C30sec68°C4min4°Cpauseまた、同様にして、得られた4種類のPCR産物それぞれに、SLHプローブ2を最終濃度200nMとなるように添加して、上述の条件でSLH反応を1サイクル行った。4SLH反応によるハイブリッド体の分離検出アクリルアミド重合ゲル電気泳動上記3でSLHプローブ1を用いて得られたSLH反応生成物ハイブリッド体4サンプル各15μlにゲルローディングバッファー15μlをそれぞれ添加し、非変性10ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。また分子量マーカーとしては、100bpladderforsizemarkerpromega社製15μlを使用して、同一ゲルにローディングし電気泳動を行った。ポリアクリルアミドゲルは7cmx7cmのコンパクトゲルコンパクトゲルC10L、アトー社製を用い、トリスグリシン緩衝液375mMTris,288mMGlycineを泳動緩衝液として小型電気泳動装置アトー社、AE7300コンパクトPAGEで室温で泳動した。泳動後、サイバーグリーンIタカラバイオ社、F0513で10分間染色し、水洗後、レーザーイメージングスキャナーアマシャム社、STORM860を用いて検出を行った。この際、サイバーグリーンIの蛍光検出には励起波長450nm、検出フィルター520LPを使用した。得られた結果を図7の左図に示した。尚、レーン1は変異型DNATA5を用いた結果を、レーン2は変異型DNATA6を用いた結果を、レーン3は変異型DNATA7を用いた結果を、レーン4は変異型DNATA8を用いた結果をそれぞれ表す。また、同様に、上記3でSLHプローブ2を用いて得られたSLH反応生成物ハイブリッド体4サンプル各15μlを用いて、上記方法と同じ方法により電気泳動した後、そのまま蛍光検出励起波長635nm、検出フィルター650LPを行った。得られた結果を図7の右図に示した。尚、レーン1は変異型DNATA5を用いた結果を、レーン2は変異型DNATA6を用いた結果を、レーン3は変異型DNATA7を用いた結果を、レーン4は変異型DNATA8を用いた結果をそれぞれ表す。サイバーグリーンIで検出を行った場合図7左図、PCRバンドとLHバンドも確認できるが、これら以外の、TA反復配列が原因で出現すると考えられる非特異的な増幅産物による他のバンドも見られた。一方、Cy5で検出を行った場合図7右図では、LHプローブとループハイブリッドのみが顕著に見られた。これは、Cy5で修飾したLHプローブを用いているため、LH反応に関与しない増幅産物は検出されず、LHプローブと結合するもののみが特異的に検出されたことに起因すると考えられた。よって、Cy5のような蛍光基を直接プローブに結合させて修飾することにより、より特異的な検出が可能となることが判った。また、図7の結果から明らかな如く、本発明の方法によれば、野生型TA6、変異型、TA7、TA8それぞれのLHバンドが異なる位置で検出されるため、一度の泳動でこれらを検出できることも判った。実施例7UGT1A1の挿入塩基領域を有する変異型DNAの検出LHサイクルの違いによるループハイブリッド体量への影響1ヒト血液由来ヒトゲノムDNA及びその調製ヒト全血2mlを、QIAampDNABloodMidiKitキアゲン社を使用してproteinaseKで70°C10分処理した。その後エタノールを添加して、遠心後の上清をQIAmpMidiカラムで抽出精製したものをサンプルDNAとした。そのうちの50ngを鋳型材料として準備し、合成例1と同様の方法にてシーケンス確認を行った。その結果、野生型DNATA6と変異型DNATA7を有するヘテロの検体であることを確認した。野生型DNATA6のプロモータ部の塩基配列TATATATATATA変異型DNATA7のプロモータ部の塩基配列TATATATATATATA2SLH反応用プローブの作成実施例62で記載したものと同じものを使用した。即ち、サイバーグリーンISYBRGreenIの蛍光検出用にはプローブ1を、Cy5の蛍光検出用にはプローブ2を使用した。尚、該プローブを用いた場合、目的とするゲノム配列より増幅されたDNA増幅断片上に下記構造のステム構造が形成されると考えられる。野生型DNATA6を用いた場合:変異型DNATA7を用いた場合:3SLH反応上記1で調製したサンプルDNAを用いて、実施例63記載のPCR反応と同様にPCR反応を行った。反応終了後、得られたPCR産物に、SLHプローブ1を最終濃度200nMとなるように添加し、MJResearch社のDNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200を使用して、下記の反応条件にて1-4サイクルでの反応を行った。SLHreactionPCRproduct45μlSLHprobe05μlof2μMstock105°Chotlid95°C2min55°C30sec68°C4minまた、同様にして、得られたPCR産物に、SLHプローブ2を最終濃度200nMとなるように添加して、上述の条件でSLH反応を1~4サイクル行った。4SLH反応によるハイブリッド体の分離検出アクリルアミド重合ゲル電気泳動上記3でSLHプローブ1を用いて得られた、1~4サイクルのSLH反応を行ったSLH反応生成物ハイブリッド体とPCR反応産物SLH反応0サイクルを準備し、各15μlそれぞれにゲルローディングバッファー15μlを添加し、非変性10ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。分子量マーカーとしては、100bpladderforsizemarkerpromega社製15μlを使用して、同一ゲルにローディングし電気泳動を行った。ポリアクリルアミドゲルは7cmx7cmのコンパクトゲルコンパクトゲルC10L、アトー社製を用い、トリスグリシン緩衝液375mMTris,288mMGlycineを泳動緩衝液として小型電気泳動装置アトー社、AE7300コンパクトPAGEで室温で泳動した。泳動後、サイバーグリーンIタカラバイオ社、F0513で10分間染色し、水洗後、レーザーイメージングスキャナーアマシャム社、STORM860を用いての検出を行った。この際、サイバーグリーンIの蛍光検出には励起波長450nm、検出フィルター520LPを使用した。得られた結果を図8の右図に示した。尚、レーン0はPCR反応産物を用いた結果を、レーン1~4はそれぞSLH反応を1~4サイクル行った結果をそれぞれ表す。また、同様に、上記3でSLHプローブ2を用いて得られた、1~4サイクルのSLH反応を行ったSLH反応生成物ハイブリッド体とPCR反応産物SLH反応0サイクルを準備し、上記方法と同じ方法により電気泳動した後、そのまま蛍光検出励起波長635nm、検出フィルター650LPを行った。得られた結果を図8の左図に示した。尚、レーン0はPCR反応産物を用いた結果を、レーン1~4はそれぞSLH反応を1~4サイクル行った結果をそれぞれ表す。左図ではLHプローブ図中のssLHprobeとループハイブリッドが顕著に見えており、LHサイクルの回数が多いほど、LHプローブの単体量が減少し、ループハイブリッドの量が増加していることが判った。また、TA6とTA7が別々のバンドとして現れることも確認できた。尚、24回のLHサイクルにより得たハイブリッド体の泳動結果においては、LHプローブのすぐ上に別のバンドが見られたが、これはSLH反応において、Taqポリメラーゼの伸長反応によりLHプローブにprimer領域が付加されたものがテンプレートになり、増幅したhomoduplex図中のshortLHduplexであると考えられた。また、SYBRGreenIによる検出でも、同様に、LHサイクルの回数が多いほど、ループハイブリッド図中のLHbandsの量が増加することが判り、TA6とTA7が別々のバンドとして現れることも確認できた。このように、上記結果から明らかな如く、LH反応のサイクル数を増やすことでループハイブリッド量を増加することが判った。これは、ループハイブリッド形成率が低い系で有効であり、特に、3~4回行うことで効率よくハイブリッド体が得られることが判った。尚、図中では示していないが、5回のLHサイクルの結果は4回の時とほぼ同じ結果であった。実施例8TOMM40遺伝子配列中のpolyT鎖長多型の検出両側にステム構造を有するハイブリッド体による分離検出1TOMM40遺伝子のrs10524523マーカー配列における様々なpolyT鎖長多型に対応させたpolyT固定鎖長を持つサンプルDNAの合成TOMM40遺伝子におけるpolyT鎖長多型のモデル塩基配列として、下記表3中の5種類のサンプルDNAを合成した。尚、表中PolyTは、polyAの鎖長を表す。2SLH反応用プローブの作成ターゲット配列とのハイブリッド体形成時に、ゲノム配列上のpolyT鎖長の塩基数を反映したループ構造をとり、なおかつSLH反応用プローブ上にステム構造をとるように設計した、下記プローブcy5delTINGCを合成した。gacctcaagctgtcctcttgccccagccctccaaagcattgggattactggcatgagccattgcatctggacgcgcgtagatggggtctcaccatg配列番号30また、Cy5の蛍光検出用によりハイブリッド体を測定するために、該プローブ配列の5末端をCy5で蛍光修飾したものをSLH反応用のプローブとして用いた。尚、蛍光修飾には、シグマジェノシス社の受託合成サービスを利用した。該プローブを用いた場合、目的とするゲノム配列とのハイブリッド体形成により下記構造のステムループ構造が形成されると考えられる。尚、図中のはpolyT多型の鎖長によって異なる値をとる。3SLH反応上記1で調製した5種のサンプルDNAそれぞれを鋳型DNAとし、SLH用プローブとして上記cy5delTINGCを用いて、SLH反応を4サイクル行った。即ち、5μMの各サンプルDNA10μL反応溶液中の濃度として500nMに対して、2μMのSLHプローブを10μL反応溶液中の濃度として200nMをそれぞれ添加した後、アキュプライムTaqポリメラーゼHighFidelityインヴィトロジェン社製004μLならびに製品付属の10xbufferを10μLおよびddH2O296μLをそれぞれ添加して、5種の反応溶液10μLをそれぞれ調製した。次に、MJResearch社のDNAサーマルサイクラーDNAEnginePTC200を使用して、5種の反応溶液を用いて下記の反応条件にてSLH反応を4サイクル行った。SLH反応サイクル条件105°Chotlid95°C2min55°C15sec68°C4min4SLH反応によるハイブリッド体の分離検出アクリルアミド重合ゲル電気泳動上記3でSLHプローブを用いて得たSLH反応生成物ハイブリッド産物5種各15μlにゲルローディングバッファー15μlをそれぞれ添加し、非変性10ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。また分子量マーカーとしては、100bpladderforsizemarkerpromega社製15μlを使用して、同一ゲルにローディングし電気泳動を行った。ポリアクリルアミドゲルは6cmx6cmのCPAGELC10L、アトー社製を用い、トリスグリシン緩衝液375mMTris,288mMGlycineを泳動緩衝液として小型電気泳動装置アトー社、AE7300コンパクトPAGEで室温で泳動した。泳動後、レーザーイメージングスキャナーアマシャム社、STORM860を用いて蛍光検出励起波長635nm、検出フィルター650LPを行った。得られた結果を図9に示した。図9の結果から明らかな如く、上記のcy5delTINGCプローブを用いて、本発明により得られたSLH反応産物をアクリルアミド重合ゲル電気泳動で分離検出した結果、5塩基ずつ鎖長の異なるpolyT配列を含む各サンプルDNAの識別検出が可能である事が示された。なお、本実験結果より、各サンプル間での識別能が非常に高い事がわかったため、polyT配列長における2塩基あるいは1塩基の差であっても十分に識別検出できると考えられた。ここで、TOMM40遺伝子多型に係る診断技術の臨床的意義を考えた場合、polyT配列鎖長が11~16塩基の場合にはアルツハイマー病発症の低リスク群とされ、19~39塩基の場合には高リスク群として識別区分されるThePharmacogenomicsJournal10375384。従って、本実施例で示した結果は、診断技術として求められる基準をクリアし得る性能を示唆しているものである。また、Monoおよび、diあるいはtriヌクレオチドリピートの多型解析については、従来技術であるダイレクトシークエンス法での対応が困難である場合が多いため、本発明による簡便で高精度な測定技術の有用性は非常に高いと言える。"