"下記一般式1で表される化合物。式中、R3はアミノ酸残基の側鎖であり、R4はヒドロキシまたは反応性リンカーであり、R5は水素、C14アルキルまたはC24アルキニルであり、R6は水素、C14アルキルまたはC24アルキニルであり、nとmはそれぞれ独立して1~4の整数であり、および前記R1およびR2は重水素を含まないか、或いは前記R1およびR2の少なくとも一つは重水素を含む。R5は水素、プロピルまたはプロプ-1-イニルであり、R6は水素、プロピルまたはプロプ-1-イニルであり、およびnとmはそれぞれ独立して1~4の整数である、請求項1に記載の化合物。R1はオクチルであり、およびR2はヘプチルであることを特徴とする、請求項2に記載の化合物。R1はC110アルキルであり、R2はC110アルキルであるか、或いはことを特徴とする、請求項1に記載の化合物。前記R1およびR2は、それぞれCH3-C≡C-C6H4-CH2およびCD3-C≡C-C6H4-CD2-CH2であり、それぞれCH3-C≡C-C6H4-CD2およびCD3-C≡C-C6H4-CH2-CH2であり、それぞれCD3-C≡C-C6H4-CH2およびCH3-C≡C-C6H4-CD2-CH2であり、またはそれぞれCD3-C≡C-C6H4-CD2およびCH3-C≡C-C6H4-CH2-CH2であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。R3は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、チロシンおよびトリプトファンよりなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基の側鎖であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。R4は、ヒドロキシ、スクシンイミド-N-オキシ、3-スルホスクシンイミド-N-オキシ、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ、ペンタハロベンジルオキシ、4-ニトロフェノキシまたは2-ニトロフェノキシであることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。前記化合物は、12-N-4-プロプ-1-イニルベンジル-3-4-プロプ-1-イニルフェニルプロパンアミド酢酸、22-N-4-プロプ-1-イニルベンジル-3-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3フェニルプロパンアミド-3,3-d2酢酸、32-N-4-プロプ-1-イニルベンジル-1,1-d2-3-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3フェニルプロパンアミド酢酸、42-N-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3ベンジル-3-4-プロプ-1-イルフェニルプロパンアミド-3,3-d2酢酸、52-N-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3ベンジル-1,1-d2-3-4-プロプ-1-イニルフェニルプロパンアミド酢酸、62-N-4-プロピルベンジル-2-4-プロピルフェニルアセトアミド酢酸、72-5-フェニル-N-3-フェニルプロピルペンタンアミド酢酸、および82-N-オクチルオクタンアミド酢酸よりなる群から選ばれるいずれか一つの化合物であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。請求項1~8のいずれか1項の化合物を2種以上含む組成物。前記2種以上の化合物は互いに重水素の数が同一であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。前記組成物は、12-N-4-プロプ-1-イニルベンジル-3-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3フェニルプロパンアミド-3,3-d2酢酸、22-N-4-プロプ-1-イニルベンジル-1,1-d2-3-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3フェニルプロパンアミド酢酸、32-N-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3ベンジル-3-4-プロプ-1-イルフェニルプロパンアミド-3,3-d2酢酸、および42-N-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3ベンジル-1,1-d2-3-4-プロプ-1-イニルフェニルプロパンアミド酢酸よりなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とする、請求項9に記載の組成物。下記一般式2で表される化合物を含むラベリング剤を分析体と結合させる段階と、前記結合体をイオン化して断片イオンを生成させる段階と、前記断片イオンのうち、分析体とRCを含む断片イオンを定量する段階とを含む、分析体の定量方法。式中、RAは直鎖または分岐鎖のC1-C18アルキルであり、RBは質量調節基であり、RCは直鎖または分岐鎖のC1-C18アルキルであり、リンカーは分析体との結合を誘導する反応性リンカーであり、RAおよびRCは、同一のアルキルであり、その少なくとも一つが一つ以上の重水素を含む。前記RAおよびRCはそれぞれメチルであり、RAおよびRCの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含むことを特徴とする、請求項12に記載の定量方法。前記RAおよびRCはそれぞれエチルであり、RAおよびRCの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含むことを特徴とする、請求項12に記載の定量方法。前記RAおよびRCは、それぞれCH3およびCD3であり、或いはそれぞれCD3およびCH3であることを特徴とする、請求項13に記載の定量方法。前記RAおよびRCは、それぞれC2H5およびC2D5であるか、或いはそれぞれC2D5およびC2H5であることを特徴とする、請求項14に記載の定量方法。前記RBは天然または人工アミノ酸残基の側鎖であることを特徴とする、請求項12に記載の定量方法。前記RBは直鎖または分岐鎖のC118アルキルであることを特徴とする、請求項12に記載の定量方法。前記リンカーは、N-ヒドロキシスクシンイミジル基、N-ヒドロキシスルホスクシンイミジル基、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシル基、ペンタハロベンジル基、4-ニトロフェニル基、および2-ニトロフェニル基よりなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項12に記載の定量方法。前記ラベリング剤は、前記一般式1で表される化合物を2種以上含むことを特徴とする、請求項12に記載の定量方法。前記2種以上の化合物それぞれのRAおよびRCに含まれた重水素の数が異なり、前記2種以上の化合物は互いに重水素の数が同一であることを特徴とする、請求項20に記載の定量方法。前記一つの化合物のRAおよびRCがそれぞれCH3およびCD3であり、前記もう一つの化合物のRAおよびRCはそれぞれCD3およびCH3であることを特徴とする、請求項21に記載の定量方法。前記一つの化合物のRAおよびRCがそれぞれC2H5およびC2D5であり、前記もう一つの化合物のRAおよびRCはそれぞれC2D5およびC2H5であることを特徴とする、請求項21に記載の定量方法。前記分析体はタンパク質、炭水化物または脂質であることを特徴とする、請求項12に記載の定量方法。前記分析体はペプチドであることを特徴とする、請求項24に記載の定量方法。前記分析体は核酸、核酸誘導体およびステロイドであることを特徴とする、請求項24に記載の定量方法。前記定量方法は四重極イオントラップ質量分析器を用いることを特徴とする、請求項12に記載の定量方法。本発明は、水素同位元素を活用し、かつラベリング剤の合成費用は減らしながらも一度に多重の試料を定量することが可能な新しい化学構造の化合物を提供しようとする。また、本発明は、前記化合物を2種以上含む組成物を提供しようとする。また、本発明は、前記化合物または前記組成物を用いて2種以上の分析体を同時に定量分析することが可能な新規の定量分析方法を提供しようとする。また、本発明は、水素同位元素を含む、2つ以上のアミノ酸配列およびタンパク質多重定量同時分析用同重体可変質量ラベリング剤を用いて、分析体より大きい質量値から検出される定量分析信号で定量分析する方法を提供しようとする。上記課題を解決するために、本発明は、下記一般式1で表される化合物を提供する。式中、R3はアミノ酸残基の側鎖であり、R4はヒドロキシまたは反応性リンカーであり、R5は水素、C14アルキルまたはC24アルキニルであり、R6は水素、C14アルキルまたはC24アルキニルであり、nとmはそれぞれ独立して1~4の整数であり、および前記R1およびR2は重水素を含まないか、或いは前記R1およびR2の少なくとも一つは重水素を含む。次に、図1を参照して、前記一般式1で表される化合物の一例を説明する。図1に示すように、前記化学式1で表される化合物がタンデム質量分析に使用される場合、定量信号を示すイオンが発生し、特にR1およびR1-NH=CH-R3が定量信号を示すイオンとなる。本発明の一実施例によれば、R1にベンジル基が置換される場合、R1が強い定量信号を示すことを確認することができた。好ましくは、前記一般式1で表される化合物の定量信号は、4-1-プロピニルベンジル陽イオンである。R1に重水素が含まれることにより、定量信号が異なることがあり、一例として、定量信号は129ThCH3C≡CC6H4CH2、131ThCH3C≡CC6H4CD2、132ThCD3C≡CC6H4CH2または134ThCD3C≡CC6H4CD2が可能である。好ましくは、前記一般式1において、R5は水素、プロピルまたはプロプ-1-イニルであり、R6は水素、プロピルまたはプロプ-1-イニルであり、およびnとmはそれぞれ独立して1~4の整数である。より好ましくは、前記一般式1において、R1はオクチルであり、R2はヘプチルである。また、前記一般式式1において、R1とR2は種類が同一であることが好ましく、すなわち、R1はC110アルキル、R2はC110アルキルであり或いは、また、好ましくは、前記R1およびR2は、それぞれCH3C≡CC6H4CH2およびCD3C≡CC6H4CD2CH2であり、それぞれCH3C≡CC6H4CD2およびCD3C≡CC6H4CH2CH2であり、それぞれCD3C≡CC6H4CH2およびCH3C≡CC6H4CD2CH2であり、またはそれぞれCD3C≡CC6H4CD2およびCH3C≡CC6H4CH2CH2である。前記一般式1において、R3はアミノ酸の残基の側鎖であり、これは一般式1がアミノ酸のアミン基にR1およびR2が置換された構造を持つことに起因する。本発明で使用される用語アミノ酸は、天然アミノ酸または人工アミノ酸を意味し、好ましくは天然アミノ酸を意味する。例えば、前記アミノ酸は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、チロシンまたはトリプトファンを意味する。また、本発明で使用される用語アミノ酸の残基の側鎖とは、アミノ酸の構造のうち、NH2CH2COOHを除いた残りの構造、すなわちNH2CH2COOHのCH2に置換された基を意味する。例えば、グリシンの場合、グリシンの残基の側鎖は水素を意味し、セリンの場合、セリンの残基の側鎖はヒドロキシメチルを意味する。前記一般式1の製造過程において、前記R3をアミノ酸の種類によって自由に調節することができ、これにより定量信号の調節も可能である。前記一般式1において、R4はヒドロキシまたは反応性リンカーである。本発明で使用される用語反応性リンカーとは、前記一般式1の化合物と分析体が結合できるようにする反応基を意味する。本発明において、前記一般式1の化合物をタンパク質またはペプチドの分析に使用する場合、タンパク質またはペプチドに存在するアミン基またはヒドロキシ基と反応することが可能な反応基が好ましい。一例として、スクシンイミド-N-オキシ、3-スルホスクシンイミド-N-オキシ、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ、ペンタハロベンジルオキシ、4-ニトロフェノキシまたは2-ニトロフェノキシであってもよく、これに限定されない。また、R4がヒドロキシである場合には、前記化学式1が全体的にカルボキシ基を持つ化合物であるから、カルボキシ基を、反応性リンカーが置換されたカルボニル基とすることができる。前記一般学式1で表される化合物のうち、好ましい化合物の例は、下記のとおりである:12-N-4-プロプ-1-イニルベンジル-3-4-プロプ-1-イニルフェニルプロパンアミド酢酸、22-N-4-プロプ-1-イニルベンジル-3-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3フェニルプロパンアミド-3,3-d2酢酸、32-N-4-プロプ-1-イニルベンジル-1,1-d2-3-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3フェニルプロパンアミド酢酸、42-N-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3ベンジル-3-4-プロプ-1-イルフェニルプロパンアミド-3,3-d2酢酸、52-N-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3ベンジル-1,1-d2-3-4-プロプ-1-イニルフェニルプロパンアミド酢酸、62-N-4-プロピルベンジル-2-4-プロピルフェニルアセトアミド酢酸、72-5-フェニル-N-3-フェニルプロピルペンタンアミド酢酸、および82-N-オクチルオクタンアミド酢酸。また、本発明は、前記一般式1で表される化合物を2種以上含む組成物を提供する。本発明で使用される用語2種以上とは、互いの化学構造が同一でない化合物が2種以上含まれたことを意味し、2~4種の化合物を含むことが好ましい。より好ましくは、重水素と水素の置換有無についてのみ化学構造が同一でない化合物を2種以上含む。前記2種以上の化合物は互いに重水素の数が同一であることが好ましい。互いの化学構造が同一でないながらも、互いに重水素の数は同一であるため、定量信号を示すイオンの質量差が生ずるので、質量分析スペクトルまたはタンデム質量分析スペクトル上での各試料の質量が異なる。よって、その相対存在量を比較分析して定量分析が可能である。前記組成物の一例としては、下記化合物よりなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物を含む組成物が挙げられる:12-N-4-プロプ-1-イニルベンジル-3-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3フェニルプロパンアミド-3,3-d2酢酸、22-N-4-プロプ-1-イニルベンジル-1,1-d2-3-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3フェニルプロパンアミド酢酸、32-N-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3ベンジル-3-4-プロプ-1-イルフェニルプロパンアミド-3,3-d2酢酸、および42-N-4-プロプ-1-イニル-3,3,3-d3ベンジル-1,1-d2-3-4-プロプ-1-イニルフェニルプロパンアミド酢酸。また、本発明は、前記一般式1で表される化合物、または前記一般式1で表される化合物を2種以上含む組成物を用いて分析体を定量分析する方法を提供する。分析体を定量分析するためには前記化合物を分析体に結合させなければならず、前記化合物と分析体との結合は、リンカーが分析体のアミンと反応し、脱離基として作用して分離されることにより行われる。前記分析体はタンパク質、炭水化物または脂質であることを特徴とする。また、前記分析体はペプチドであることを特徴とする。また、前記分析体は核酸または核酸誘導体であることを特徴とする。また、前記分析体はステロイドであることを特徴とする。また、本発明は、前記一般式1で表される化合物を2種以上含む組成物を分析体に結合させる段階と、前記分析体を分解して前記分析体を定量する段階とを含むことを特徴とする、アミノ酸配列およびタンパク質定量同時分析方法を提供する。前記定量のための分解法はタンデム質量分析法であることが好ましい。前記定量信号の質量を与える定量信号はR1またはR1NH=CHR3の内部断片であり、好ましい様態として、前記定量信号の質量を与える定量信号は4-1-プロピニルベンジル陽イオンである。好ましくは、前記定量信号の質量を与える定量信号は、129ThCH3C≡CC6H4CH2、131ThCH3C≡CC6H4CD2、132ThCD3C≡CC6H4CH2または134ThCD3C≡CC6H4CD2である。また、本発明は前記一般式1で表される化合物の製造方法を提供し、具体的な製造方法を図3~図5に基づいて説明する。図3に示すように、前記一般式1で表される化合物は、ハロアルカン形態のreporterunitとカルボン酸形態のbalanceunitおよびエステル化されたアミノ酸を用いて合成される。また、重水素を含む前記一般式1で表される化合物は、reporterunitとbalanceunitに重水素を導入する反応を行った後、これを用いて製造することができる。重水素を導入する方法は、本発明の属する分野における公知の方法を使用することができる。具体的に、図2に示された方法を使用することができる。一つの重水素を導入する方法には、塩基性の重水D2Oにおいて末端アルキンの水素を重水素に置換する方法と、一つのカルボニル基を重水素化ホウ素ナトリウムNaBD4または重水素化アルミニウムリチウムLiAlD4で部分的に還元する方法がある。2つの重水素を導入する方法には、アルケンを金属触媒の存在下に重水素気体D2で還元する方法と、ペプチド結合またはエステル結合のカルボニル基をLiAlD2で還元する方法と、メトキシドナトリウムNaOCD3を用いてエステル化合物のアルファ位置に重水素を導入する方法がある。3つの重水素はヨウ化メタン-d3CD3Iを用いて2次アミンまたは末端アルキンをアルキル化させる方法で導入することができる。4つの重水素を導入する方法には、2つのカルボニル基をLiAlD4により還元する方法と、アルキルを金属触媒の存在下にD2で還元する方法がある。これらの方法の中でも、本発明では、一実施例として、エステル結合のカルボニル基をLiAlD4で還元して2つの重水素を導入する方法と、アルキンをCD3Iでアルキル化して3つの重水素を導入する方法とを組み合わせて4重の同重体ラベリング剤図1b、tagαを合成した。本発明では、一例として、reporterunitをまず合成し、合成されたreporterunitの一部を3段階の追加反応で変形させてbalanceunitを合成した。具体的なreporterunitおよびbalanceunitの製造方法は図4を参照して説明する。まず、reporterunitの合成方法について説明する。パラジウム触媒とヨウ化第一銅を用いた薗頭カップリング法を用いて、4-ブロモ安息香酸メチルエステルにトリメチルシリルTMSで保護されたアルキルを導入する。次いで、エステルをアルコールに還元する。この際、水素化アルミニウムリチウムLiAlH4または重水素化アルミニウムリチウムLiAlD4を使用すると、それぞれの場合に水素または重水素が2つずつ置換された化合物が生成される。生成されたアルコールを塩化tert-ブチルジメチルシランTBSClで処理してtert-ブチルジメチルシランTBSで保護し、炭酸カリウムを用いて、アルキンを保護しているTMSのみを選択的に除去する。このように生成された末端アルキンにヨウ化メタン-d0CH3Iまたは-d3CD3Iを用いてメチル-d0または-d3を導入する。次いで、フッ化テトラ-n-ブチルアンモニウムTBAFを用いてTBSを除去する。生成された化合物に塩化メタンスルホン酸を処理し、ヨウ化ナトリウムを用いてヨウ素に置換すると、reporterunitが合成される。反応中間にLiAlH4/LiAlD4とCH3I/CD3Iの組み合わせによって総4種のreporterunitが得られる。LiAlH4とCH3Iを使用すると、重水素のないreporter-d0が生成され、LiAlD4とCH3Iを使用すると、2つの重水素が含まれたreporter-d2が生成され、LiAlH4とCD3Iを使用すると、3つの重水素が含まれたreporter-d3が生成され、LiAlD4とCD3Iを使用すると、5つの重水素が含まれたreporter-d5が生成される。次に、balanceunitの合成方法について説明する。合成されたreporterunitの一部を用いてマロン酸ジエチルをアルキル化する。還流を通してマロン酸のカルボキシル基の一つを除去した後、水酸化ナトリウム水溶液でエチルエステルを加水分解してbalanceunitを合成する。reporterunitをbalanceunitに変形させる過程には重水素を使用しないので、balanceunitの重水素の数は使用したreporterunitによって決定される。上述したように製造されたreporterunitとbalanceunitを用いて、重水素を含む化学式1で表される化合物を図3に示された方法で製造することができ、この際、reporterunitとbalanceunitに含まれた重水素の全体数を維持する。すなわち、図6のように4重同重体ラベリング剤tagαを例として挙げると、reporter-dnを使用した場合には、balanceunitは5-n個の重水素が含まれたものbalance-d5nを用いて同重体を合成する。グリシンメチルエステルのアミンをreporter-dnn=0、2、3および5でアルキル化する。合成された化合物とbalance-d5nを1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDC、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBt、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミンDIPEAを用いて結合反応させ、水酸化ナトリウム水溶液でメチルエステルを加水分解すると、定量信号の質量値が129nである酸型の同重体ラベリング剤tagα129nが得られる。また、上述と同様の方法で、図5のようにtagβを製造することができる。また、本発明は、下記一般式2で表される化合物を含むラベリング剤を分析体と結合させる段階段階1と、前記結合体をイオン化して断片イオンを生成させる段階段階2と、前記断片イオンのうち、分析体とRCを含む断片イオンを定量する段階段階3とを含む、分析体の定量方法を提供する。式中、RAは直鎖または分岐鎖のC1-C18アルキルであり、RBは質量調節基であり、RCは直鎖または分岐鎖のC1-C18アルキルであり、Linkerは分析体との結合を誘導する反応性リンカーであり、RAおよびRCは、同一のアルキルであり、その少なくとも一つが一つ以上の重水素を含む。前記段階1は、前記一般式2で表されるラベリング剤を分析体と結合させる段階であって、分析体にラベリング剤を結合させ、後続の定量分析に利用するための段階である。前記結合は、ラベリング剤のリンカーと分析体のアミン基とが反応することにより行われる。結合方法は、韓国特許公開第2010-0009466号、韓国特許公開第2010-0009479号、および国際特許公開WO2010/008159号に開示されているとおりであり、当業界における公知のアミン基とリンカーの結合反応で結合させることができる。分析体に多数のアミン基が2つ以上存在する場合には、前記一般式2で表されるラベリング剤が2つ以上結合できる。本発明で使用される用語ラベリング剤とは前記化学式2で表される化合物を意味し、前記化合物は韓国特許公開第2010-0009466号、韓国特許公開第2010-0009479号、および国際特許公開WO2010/008159号に開示されているとおりであり、これらの特許文献は本発明の参照として含まれる。具体的に、本発明で使用される用語リンカーは、アミンの求核性攻撃により脱離基となる活性エステルであることを意味する。前記アミンは1次アミンであることを特徴とする。また、前記反応性リンカーは、N-ヒドロキシスクシンイミジル基、N-ヒドロキシスルホスクシンイミジル基、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシル基、ペンタハロベンジル基、4-ニトロフェニル基、および2ニトロフェニル基よりなる群から選択できる。また、本発明で使用される用語前記質量調節基RBは、分析体と結合した後、質量分析過程で分解されるとき、N-アシル化されたアミノ酸断片の質量を調節して定量信号がスペクトル上で他の断片と重ならないようにするために導入されるものを意味する。RBの種類を変えることにより、定量信号の質量を様々に変化させることができる。前記質量調節基は、類似または同一物性の天然または人工アミノ酸残基の側鎖の一つであってもよい。また、前記質量調節基は類似または同一の物性を有することを特徴とする。また、前記質量調節基はC118の直鎖または分岐鎖のアルキルであってもよく、一例としてメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチルなどの直鎖または分岐鎖のアルキルであってもよい。前記RAおよびRCは、同一のアルキルであり、その少なくとも一つは重水素を含み、同位元素の質量差による定量分析を可能とする役割を果たす。好ましくは、前記RAおよびRCはメチル、または一つ以上の重水素を含むメチルであり、或いは前記RAおよびRCはそれぞれエチルであり、RAおよびRCの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含むことを特徴とする。また、前記RAおよびRCは炭素の個数が同じアルキルからなっているが、含まれた重水素の数が互いに異なるべきである。このような観点から、前記RAとRCはそれぞれCH3およびCD3であり、或いはCD3およびCH3であることが好ましい。すなわち、前記化合物において、RAとRCは、RAがCH3であれば、RCはCD3であり、RCがCH3であれば、RAがCD3である。或いは、前記RAおよびRCは、それぞれC2H5およびC2D5であり、またはそれぞれC2D5およびC2H5であることが好ましい。すなわち、前記化合物において、RAとRCは、RAがC2H5であればRCはC2D5であり、RCがC2H5であればRAがC2D5である。前記一般式2は、N末端がアシル化され、C末端に、アミンの求核性攻撃により脱離基となるリンカーが付着し、同位元素で標識されるジペプチドであることを特徴とする。また、前記ジペプチドは重水素で標識されるジペプチドであることを特徴とする。次に、前記ラベリング剤の化学構造および分析原理を図13~図15を参照して説明する。図13はラベリング剤の化学構造を図式的に示す。特許文献韓国特許公開第2010-0009466号、韓国特許公開第2010-0009479号、および国際特許公開WO2010/008159号に開示された化合物をMBITと命名し、理論的に限定されたものではないが、N末端がアシル化され且つC末端にリンカーが付着したジペプチドの構造を持つ。図14は、理論的に限定されるものではないが、ペプチドおよびタンパク質にMBIT物質が結合する様子を図式的に示す図である。ペプチドおよびタンパク質のN末端の1次アミンだけでなく、リシン側鎖の1次アミンとも結合が起こりうる。よって、一つのペプチドまたはタンパク質にラベリング剤を結合させるとき、タンパク質およびペプチドが含まれるリシンの個数に応じて2つ以上のラベリング剤が多重結合できる。分析体がタンパク質またはペプチドではなくても、分析体が持っている1次または2次アミンの個数だけのラベリング剤が最大に分析体と結合することができる。特に、本発明は、RAおよびRCに含まれた総重水素の数が一定である、前記化学式2で表される化合物の2種以上、好ましくは2種を一つのセットとして使用することが好ましい。前記セットを構成する化合物対をそれぞれ第1化合物、第2化合物とするとき、前記第1化合物と第2化合物は同一の質量調節基RBを有することが好ましい。また、化合物対において、第1化合物のRAおよびRCのいずれか1つがもう1つに比べて多数の重水素を含んでいると、第2化合物では第1化合物のRCをRAとし、第1化合物のRAをRCとすることが好ましい。一例として、化合物対において、第1化合物のRAおよびRCがそれぞれCH3、CD3の場合、第2化合物のRAおよびRCはCD3、CH3から構成される化合物の対を挙げることができる。或いは、化合物対において、第1化合物のRAおよびRCがそれぞれC2H5、C2D5の場合、第2化合物のRAおよびRCはC2D5、C2H5からなる化合物の対を挙げることができる。特に、本発明はySイオンを用いて定量するために、第1化合物と第2化合物のうちいずれか1つのRCにのみ重水素を含むことが好ましい。前記ラベリング剤セットの第1化合物と第2化合物でそれぞれ区分標識された分析体をタンデム質量分析したとき、RAおよびRCが分離されるようにラベリング剤が分解される場合、分解を介して生成された断片イオンは、RAおよびRCにおいて異なる重水素の質量だけの差を示し、その結果がタンデム質量分析スペクトルに現れることになる。これらの相対的な強さを比較して分析体の相対的な量を定量することができる。理論的に限定されたものではないが、一般にタンデム質量分析過程で分離されて生成される、互いに異なる相補的な2つの断片イオンがそれぞれ独立な定量分析信号として活用できる。本発明で使用される用語分析体は、本発明に係るラベリング剤によって分析される物質を意味する。前記分析体は、タンパク質、炭水化物または脂質であってもよく、ペプチド、核酸または核酸誘導体、或いはステロイドであってもよい。前記段階2は、前記結合体をイオン化して断片イオンを生成させる段階であって、結合体に存在するアミド結合が壊されながら断片イオンを生成させる段階である。本発明の結合体のアミド結合が壊されて生成できる断片イオンのうち、RAおよびRBを含む断片イオン、およびRCと分析体を含む断片イオンが生成できる。本発明において、RAおよびRBを含む断片イオンをbSイオンと命名し、RCと分析体を含む断片イオンをySイオンと命名する。次に、これを図15および図16を参照して説明する。図15は結合体がタンデム質量分析過程で分解されたときに生成される断片イオンを示す図である。この際、同一の分子式に重水素が標識された部位のみ異なるMBIT試薬対を便宜によってHMBITとLMBITに区分するが、RAまたはRBに重水素が標識されたものをHMBITと呼び、RCに重水素が標識されたものをLMBITと呼ぶ。HMBITとLMBITが結合した分析体は、全体的な重さは同一である。同位元素暗号化基として選択された2つのうち、重水素を含むものとそうでないものの左側上端にそれぞれH重水素を含むとL重水素を含まないを添え字として表記した。図15に示すように、理論的に限定されるものではないが、結合体は、タンデム質量分析過程でジペプチドの2つのアミノ酸間のアミド結合が壊されながら、RAとRBを含む断片イオンbSと、RCと分析体を含む断片イオンySに分離できる。分析体から化学式2に該当する部分のみ離れた断片イオンを-tagと命名する。図16は、理論的に限定されるものではないが、2つ以上の一般式2の化合物と結合したペプチドをタンデム質量分析したときに理論的に生成できるタンデム質量分析スペクトルを示している。図16に示すように、ペプチドのN末端およびC末端のアミノ酸を含んで2つ以上のアミン基と一般式2の化合物とが結合した場合、ペプチドから生成可能な全てのbおよびyタイプ配列イオンの質量は-tagの質量より小さい質量値を有する。よって、-tagより質量が大きいySイオンは、理論的にペプチドから誘導される他の断片イオンの妨害を全く受けない質量範囲で現れる。理論的に限定されるものではないが、最も広く活用されているタンパク質分解酵素であるトリプシンまたはLysCを用いてタンパク質を酵素分解すると、C末端にリシンを含んでいるペプチドを得ることができるため、N末端のアミン基とC末端のリシン側鎖のアミン基に2つの化学式2の化合物を結合させることができる。前記段階3は、前記断片イオンのうち、分析体とRCを含む断片イオンySを定量する段階であって、大きい質量を有する断片イオンで分析体を分析するための段階である。yS定量信号の質量値は、親イオンの質量値の1/3以上であるため、イオントラップ質量分析器で共鳴励起衝突由来分解法を用いてタンデム質量分析を行う場合にも、low-masscutoffに関係なくySイオンの検出が可能である。よって、小さい質量値を有する定量信号を活用する既存の他の同重体標識とは異なり、四重極イオントラップ質量分析器においてもyS定量信号を活用した定量分析を行うことができるという特徴がある。前記分析方法に係る本発明の一実施例によれば、一般式2の化合物を用いて、大きい質量値を有するyS断片イオンで定量分析が可能であることを確認することができる。特に、分析体自体より大きい質量を有する断片イオンを活用するから、四重極イオントラップ質量分析器においても定量分析が可能であり、また信号の強さも増幅される。よって、既存の一般式2の化合物を用いた分析よりさらに効果的な分析が可能である。本発明は、水素同位元素を含みながら、定量信号の強さを強く発生させることができ、2つ以上のタンパク質を同時に定量異分析することができる新規化合物、および前記化合物を2種以上含む組成物を提供し、前記ラベリング剤または組成物を用いてアミノ酸配列を分析すると同時にタンパク質の量を定量分析する方法を提供することができる。また、本発明は、同重体ラベリング剤を活用して、ペプチドのアミノ酸配列を分析すると同時に量を定量分析する新規方法を提供することができる。既存の他の同重体標識試薬の場合は、標識物質を分析体と結合させた後、タンデム質量分析で標識物質中間の結合を分解させた後、分析体を含まない小さい質量の断片イオンを活用して定量分析を行うが、これに対し、本発明は、同重体ラベリング剤を活用して標識物質の結合をタンデム質量分析過程で分解させた後、断片イオンのうち、分析体を含み且つ大きい質量値を有する断片イオンySを活用して定量分析を行うことができるという特徴がある。これにより、既存の小さい質量値を有する定量信号イオンを活用する場合に比べて、最大5倍以上強い信号強さで定量分析が可能であり、四重極イオントラップ質量分析器を含む全ての質量分析器でペプチドおよびタンパク質の相対的な量を定量することができる。以下、実施例および添付図面を参照して、本発明に係る化合物と、これを用いたアミノ酸配列およびタンパク質定量同時分析方法について詳細に説明する。本発明が後述の内容に限定されるのではなく、該当分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想を外れない範囲内で本発明を多様な形態に実現することができるであろう。図1aで代表される化合物ラベリング剤において、R1、R2、およびR3位置に多様な構造または官能基を導入することができる。本発明では、実施例として、図1b~図1eに示すように、4つの構造を持つ化合物tagα~δを合成し、各構造または作用基によって定量信号がどのように現れるかを確認した。4つの構造の中でも、図1bは水素同位元素を用いて多重のタンパク質を定量することが可能な同重体ラベリング剤に合成した例である。図1bのX1~X4は置換された重水素の位置を示す。実施例1-1非同重体ラベリング剤の合成ラベリング剤は、図3に示したような順序で合成した。非同重体ラベリング剤の中でも、reporterunitとbalanceunitを商業的に入手することが可能なtagγとtagδの場合は、各unitγのreporterunit、3-ヨードプロピルベンゼン;δのreporterunit、1-ヨードオクタン;γのbalanceunit、5-フェニルペンタン酸;およびδのbalanceunit、オクタン酸を購入して各ラベリング剤の合成を行った。tagβの場合は、ラベリング剤を構成するreporterunit1-ヨードメチル-4-プロピルベンゼンとbalanceunit2-4-プロピルフェニル酢酸は図5の過程で合成し、これらを用いてtagβを合成した。tagβの合成まず、reporeterunitを合成した過程、および各段階で生成された化合物の核磁気共鳴NMRの結果を下記の段階1~段階8に示す。段階1:4-トリメチルシリルエチニル安息香酸メチルエステルの合成アルゴン条件の下で10mLのよく乾燥したテトラヒドロフランdryTHFに4-ブロモ安息香酸メチルエステル500mg、2.33mmol、ビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリドPdPPh32Cl2:86.1mg、0.116mmol、トリフェニルホスフィンPPh3:18.3mg、0.0698mmol、トリメチルシリルアセチレンTMSアセチレン:493μL、3.49mmol、およびトリエチルアミンEt3N:486μL、3.49mmolを溶かした後、20分間室温で攪拌した。ここにさらにヨウ化第一銅CuI:8.86mg、0.0465mmolを加え、室温で15時間攪拌した。反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で除去した後、n-ペンタン20mLを入れてセライトパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を503mg2.16mmol、93得た。1HNMRd793748388022段階2:4-トリメチルシリルエチニルフェニルメタノールの合成アルゴン条件の下でdryTHF5mLに4-トリメチルシリルエチニル安息香酸メチルエステル316mg、1.36mmolを溶かした後、0°Cに冷却し、LiAlH42.04mL、1.0MTHF溶液、2.04mmolをゆっくり加えた。30分間0°Cで攪拌した後、反応が完結すると、順次水77μL、10水酸化ナトリウム水溶液154μLおよび水231μLを加えて反応を終結させた。白色の粘性沈殿が生成されると、シリカパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を258mg1.26mmol、93得た。1HNMRd744727466167023段階3:tert-ブチルジメチル4-トリメチルシリルエチニルベンジルオキシシランの合成アルゴン条件の下でdryTHF5mLに4-トリメチルシリルエチニルフェニルメタノール258mg、1.26mmolを溶かした後、0°Cに冷却し、イミダゾール103mg、1.52mmolとdryTHF3mLに溶かしたTBSCl228mg、1.52mmolを加えた。その後、室温に温度を上げ、15時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し10mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を383mg1.20mmol、95得た。1HNMRd741723470090022000段階4:tert-ブチル4-エチニルベンジルオキシジメチルシランの合成アルゴン条件の下でメタノール4mLにtert-ブチルジメチル4-トリメチルシリルエチニルベンジルオキシシラン383mg、2.40mmolと炭酸カリウム332mg、2.40mmolを溶かした後、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し5mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を280mg1.14mmol、95得た。1HNMRd744725472302092001段階5:tert-ブチルジメチル4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルオキシシランの合成アルゴン条件の下でdryTHF5mLにtert-ブチル4-エチニルベンジルオキシジメチルシラン247mg、1.00mmolを溶かした後、-78°Cに冷却し、n-ブチルリチウム805μL、2.49Mn-ヘキサン溶液、2.00mmolをゆっくり加えた。20分間-78°Cで攪拌した後、ここにさらにヨウ化メタン313μL、5.00mmolを加えた。その後、室温に温度を上げ、30分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し5mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を253mg0.971mmol、97得た。1HNMRd735722470203093007段階6:tert-ブチルジメチル4-プロピルベンジルオキシシランの合成酢酸エチル20mLにtert-ブチルジメチル4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルオキシシラン252mg、0.968mmolを溶かした後、20barの水素圧力を有するH-Cube装備に10Pd/Cカートリッジを装着し、室温で分当り0.5mLの速度で通過させた。通過した溶液を減圧蒸留で濃縮させて目的化合物を251mg0.949mmol、98得た。1HNMRd723712469226165158094085008段階7:4-プロピルフェニルメタノールの合成アルゴン条件の下でdryTHF5mLにtert-ブチルジメチル4-プロピルベンジルオキシシラン275mg、1.04mmolを溶かした後、フッ化-n-ブチルアンモニウムTBAF;1.56mL、1.0Mテトラヒドロフラン溶液、1.56mmolをゆっくり加え、30分間0°Cで攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し5mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を198mg0.838mmol、95得た。1HNMRd725718457297262174162099段階8:1-ヨードメチル-4-プロピルベンゼンの合成よく乾燥したジクロロメタンDCM3mLにアルゴン条件の下で4-プロピルフェニルメタノール100mg、0.666mmolを溶かした後、0°Cに冷却し、塩化メタンスルホン酸MsCl:62.1μL、0.799mmolとトリエチルアミンEt3N:140μL、0.999mmolを加えた。30分間0°Cで攪拌した後、反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し3mLずつ合計3回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去し、沈殿物を濾別した。得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、これをさらにアセトン6mLに溶かした後、ヨウ化ナトリウムNaI:150mg、0.999mmolを加えた。15分間室温で攪拌した後、反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で乾燥させる。ここに水10mLを加え、酢酸エチルで抽出し5mLずつ合計3回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物tagβreporterunitを157mg0.604mmol、90得た。1HNMRd727708444253167154092前記で合成されたtagβのreporterunitからbalanceunitを合成する過程、および各段階で生成された化合物のNMR結果を下記の段階9と段階10に示す。段階9:2-4-プロピルフェニルアセトニトリルの合成アルゴン条件の下でよく乾燥したN,N-ジメチルホルムアミドdryDMF1mLに1-ヨードメチル-4-プロピルベンゼン73.6mg、0.283mmolを溶かした後、シアン化ナトリウムNaCN:27.7mg、0.566mmolを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加え、反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し3mLずつ合計3回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を41.0mg0.257mmol、91得た。1HNMRd723716369258169157193段階10:2-4-プロピルフェニル酢酸の合成30水酸化ナトリウム水溶液1mLに2-4-プロピルフェニルアセトニトリル41.0mg、0.257mmolを溶かした後、4時間還流条件の下で攪拌した。反応が完結すると、10塩化水素水溶液3mLを加えて溶液を酸性化させ、ジエチルエーテルで抽出し3mLずつ合計3回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物tagβのbalanceunitを34.8mg0.195mmol、76得た。1HNMRd724713316258170158095前記で製造されたreporterunitとbalanceunitを用いて、図3のような過程でtagβの合成を行った。具体的な合成方法、および各段階で合成された化合物のNMR結果を下記の段階11~段階13に示す。段階11:メチル2-4-プロピルベンジルアミノアセテートの合成アルゴン条件の下でdryDMF5mLにグリシンメチルエステル448mg、3.57mmolを溶かした後、N,N-ジイソプロピルエチルアミンDIPEA:777μL、4.46mmolと1-ヨードメチル-4-プロピルベンジル232mg、0.892mmolを加え、1日間室温で攪拌した。反応が完結すると、水10mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し10mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を152mg0.687mmol、77得た。1HNMRd720710373368338254194167154091段階12:メチル2-N-4-プロピルベンジル-2-4-プロピルフェニルアセトアミドアセテートの合成よく乾燥したDCM1mLにアルゴン条件の下でメチル2-4-プロピルベンジルアミノアセテート24.5mg、0.0983mmolと2-4-プロピルフェニル酢酸17.5mg、0.0983mmolを溶かした後、EDC56.5mg、0.295mmol、HOBt39.8mg、0.295mmolおよびDIPEA84.3μL、0.491mmolを加え、20時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し3mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物31.1mg0.0789mmol、80得た。Majorisomer1HNMRd724710696694455420380369257251167154194188Minorisomer1HNMRd724710696694462390367361257251167154194188段階13:2-N-4-プロピルベンジル-2-4-プロピルフェニルアセトアミド酢酸の合成メタノール0.5mLにメチル2-N-4-プロピルベンジル-2-4-プロピルフェニルアセトアミドアセテート30.0mg、0.0786mmolを溶かした後、20水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル3mLを加えて希釈し、10塩化水素水溶液200μLを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物は濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を26.4mg0.0718mmol、91得た。Majorisomer1HNMRd724688454398377255247164151093087Minorisomer1HNMRd724688458383363255247164151093087tagγの合成購入したreporterおよびbalanceunitを用いて、図3のような過程でtagγの合成を行った。具体的な合成方法、および各段階で合成された化合物のNMR結果を下記の段階1~段階3に示す。段階1:メチル2-3-フェニルプロピルアミノアセテートの合成アルゴン条件の下でdryDMF3mLにグリシンメチルエステル330mg、2.63mmolを溶かした後、DIPEA573μL、3.29mmolと1-ブロモ-3-フェニルプロパン100μL、0.658mmolを加え、1日間室温で攪拌した。反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し4mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を19.6mg0.0946mmol、14を得た。1HNMRd728723718713370339268260186176段階2:メチル2-5-フェニル-N-3-フェニルプロピルペンタンアミドアセテートの合成よく乾燥したDCM1mLにアルゴン条件の下でメチル2-3-フェニルプロピルアミノアセテート20.0mg、0.0965mmolと5-フェニル吉草酸22.0mg、0.116mmolを溶かした後、EDC55.5mg、0.289mmol、HOBt39.1mg、0.289mmolおよびDIPEA82.7μL、0.482mmolを加え、20時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し3mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を34.2mg0.0931mmol、96得た。Majorisomer1HNMRd731723721714401369330262256224190185168159Minorisomer1HNMRd731723721714395372342262256218190185168159段階3:2-5-フェニル-N-3-フェニルプロピルペンタアミド酢酸の合成メタノール0.5mLにメチル2-5-フェニル-N-3-フェニルプロピルペンタンアミドアセテート34.2mg、0.0931mmolを溶かした後、20水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル3mLを加えて希釈し、10塩化水素水溶液200μLを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物は濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を26.2mg0.0741mmol、80得た。Majorisomer1HNMRd726712399328261252221191176161155Minorisomer1HNMRd726712391340261252221191176161155tagδの合成購入したreporterおよびbalanaceunitを用いて、図3のような過程でtagδの合成を行った。具体的な合成方法、および各段階で合成された化合物のNMR結果を下記の段階1~段階3に示す。段階1:メチル2-オクチルアミノアセテートの合成アルゴン条件の下でdryDMF2mLにグリシンメチルエステル358mg、2.85mmolを溶かした後、DIPEA620μL、3.56mmolと1-ブロモオクタン123μL、0.712mmolを加え、1日間室温で攪拌した。反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し4mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を31.6mg0.157mmol、22得た。1HNMRd368336254177147140124122083段階2:メチル2-N-オクチルオクタアミドアセテートの合成よく乾燥したDCM1mLにアルゴン条件の下でメチル2-オクチルアミドアセテート31.6mg、0.157mmolとn-オクタン酸30.0μL、0.188mmolを溶かした後、EDC90.3mg、0.471mmol、HOBt63.6mg、0.471mmolおよびDIPEA135μL、0.785mmolを加え、12時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し4mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を44.7mg0.136mmol、87得た。Majorisomer1HNMRd400368328232164143125086082Minorisomer1HNMRd398372332215164143125086082段階3:2-N-オクチルオクタンアミド酢酸の合成メタノール0.5mLにメチル2-N-オクチルオクタアミドアセテート44.7mg、0.136mmolを溶かした後、20水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル3mLを加えて希釈し、10塩化水素水溶液200μLを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物は濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を36.5mg0.116mmol、86得た。Majorisomer1HNMRd401330224164154126087083Minorisomer1HNMRd397332219164154126087083実施例1-2多重同重体ラベリング剤の合成まず、4種のreporterunitの中でもreporter-d5とreporter-d0を合成する過程、および各段階で生成された化合物のNMR結果を下記の段階1~段階7に示す。段階1:4-トリメチルシリルエチニル安息香酸メチルエステルの合成アルゴン条件の下で10mLのdryTHFに4-ブロモ安息香酸メチルエステル500mg、2.33mmol、ビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリドPdPPh32Cl2:86.1mg、0.116mmol、トリフェニルホスフィンPPh3:18.3mg、0.0698mmol、トリメチルシリルアセチレンTMSアセチレン:493μL、3.49mmol、トリエチルアミンEt3N:486μL、3.49mmolを溶かした後、20分間室温で攪拌した。ここにさらにヨウ化第一銅CuI:8.86mg、0.0465mmolを加え、室温で15時間攪拌した。反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で除去した後、n-ペンタン20mLを入れ、セリットパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を503mg2.16mmol、93得た。1HNMRd793748388022段階2:14-トリメチルシリルエチニルフェニルメタノール-d2の合成アルゴン条件の下でdryTHF20mLに4-トリエチルシリルエチニル安息香酸メチルエステル1.00g、5.16mmolを溶かした後、0°Cに冷却し、LiAlD4217mg、5.16mmolをゆっくり加えた。30分間0°Cで攪拌した後、反応が完結すると、水220μL、10水酸化ナトリウム水溶液440μLおよび水660μLを順次加えて反応を終結させた。白色の粘性沈殿が生成されると、シリカパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を788mg3.82mmol、89得た。1HNMRd74472716702324-トリメチルシリルエチニルフェニルメタノールの合成アルゴン条件の下でdryTHF5mLに4-トリメチルシリルエチニル安息香酸メチルエステル316mg、1.36mmolを溶かした後、0°Cに冷却し、LiAlH42.04mL、1.0MTHF溶液、2.04mmolをゆっくり加えた。30分間0°Cで攪拌した後、反応が完結すると、順次水77μL、10水酸化ナトリウム水溶液154μL、水231μLを加えて反応を終結させた。白色の粘性沈殿が生成されると、シリカパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を258mg1.26mmol、93得た。1HNMRd744727466167023段階3:1tert-ブチルジメチル4-トリメチルシリルエチニルベンジルオキシシラン-d2の合成アルゴン条件の下でdryTHF15mLに4-トリメチルシリルエチニルフェニルメタノール-d2600mg、2.94mmolを溶かした後、0°Cに冷却し、イミダゾール240mg、3.52mmolとdryTHF5mLに溶かした塩化tert-ブチルジメチルシランTBSCl:531mg、3.52mmolを加えた。その後、室温に温度を上げ、15時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液20mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し20mLずつ合計3回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を895mg2.79mmol、95得た。1HNMRd7417230900220002tert-ブチルジメチル4-トリメチルシリルエチニルベンジルオキシシラン-d0の合成アルゴン条件の下でdryTHF5mLに4-トリメチルシリルエチニルフェニルメタノール258mg、1.26mmolを溶かした後、0°Cに冷却し、イミダゾール103mg、1.52mmolとdryTHF3mLに溶かしたTBSCl228mg、1.52mmolを加えた。その後、室温に温度を上げ、15時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し10mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を383mg1.20mmol、95得た。1HNMRd741723470090022000段階4:1tert-ブチル4-エチニルベンジルオキシジメチルシラン-d2の合成アルゴン条件の下でメタノール12mLにtert-ブチルジメチル4-トリメチルシリルエチニルベンジルオキシシラン-d21.16g、3.62mmolと炭酸カリウム1.00g、7.24mmolを溶かした後、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液15mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し10mLずつ合計3回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を858mg3.45mmol、95得た。1HNMRd7447253020920012tert-ブチル4-エチニルベンジルオキシジメチルシラン-d0の合成アルゴン条件の下でメタノール4mLにtert-ブチルジメチル4-トリメチルシリルエチニルベンジルオキシシラン383mg、2.40mmolと炭酸カリウム332mg、2.40mmolを溶かした後、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し5mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を280mg1.14mmol、95得た。1HNMRd744725472302092001段階5:1tert-ブチルジメチル4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルオキシシラン-d5の合成アルゴン条件の下でdryTHF5mLにtert-ブチル4-エチニルベンジルオキシジメチルシラン-d2263mg、1.06mmolを溶かした後、-78°Cに冷却し、n-ブチルリチウム851μL、249Mn-ヘキサン溶液、2.12mmolをゆっくり加えた。20分間-78°Cで攪拌した後、ここにさらにヨウ化メタン-d3331μL、5.30mmolを加えた。その後、室温に温度を上げ、30分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し5mLずつ合計3回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を280mg1.05mmol、99得た。1HNMRd7357220930072tert-ブチルジメチル4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルオキシシラン-d0の合成アルゴン条件の下でdryTHF5mLにtert-ブチル4-エチニルベンジルオキシジメチルシラン247mg、1.00mmolを溶かした後、-78°Cに冷却し、n-ブチルリチウム805μL、2.49Mn-ヘキサン溶液、2.00mmolをゆっくり加えた。20分間-78°Cで攪拌した後、ここにさらにヨウ化メタン-d0313μL、5.00mmolを加えた。その後、室温に温度を上げ、30分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し5mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を253mg0.971mmol、97得た。1HNMRd735722470203093007段階6:14-プロプ-1-イン-1-イルフェニルメタノール-d5の合成アルゴン条件の下でdryTHF5mLにtert-ブチルジメチル4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルオキシシラン-d5280mg、1.05mmolを溶かした後、フッ化-n-ブチルアンモニウムTBAF:1.58mL、1.0Mのテトラヒドロフラン溶液、1.58mmolをゆっくり加え、30分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し5mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を198mg0.838mmol、88得た。1HNMRd73372024-プロプ-1-イン-1-イルフェニルメタノール-d0の合成アルゴン条件の下でdryTHF5mLにtert-ブチルジメチル4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルオキシシラン-d0326mg、1.25mmolを溶かし後、フッ化-n-ブチルアンモニウムTBAF:1.88mL、1.0Mテトラヒドロフラン溶液、1.88mmolをゆっくり加え、30分間0°Cで攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し5mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を182mg1.24mmol、99得た。1HNMRd733720456244201段階7:11-ヨードメチル-4-プロプ-1-イン-1-イルベンゼン-d5の合成よく乾燥したDCM5mLにアルゴン条件の下で4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルメタノール-d5140mg、0.926mmolを溶かした後、0°Cに冷却し、塩化メタンスルホン酸MsCl:86.3μL、1.11mmolとトリエチルアミンEt3N:194μL、1.39mmolを加えた。30分間0°Cで攪拌した後、反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し5mLずつ合計3回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去し、沈殿物を濾別した。得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、これをさらにアセトン10mLに溶かした後、ヨウ化ナトリウムNaI:207mg、1.39mmolを加えた。1時間室温で攪拌した後、反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で乾燥させる。ここに水10mLを加え、酢酸エチルで抽出して10mLずつ合計3回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物reporter-d5を220mg0.843mmol、91得た。1HNMRd73072721-ヨードメチル-4-プロプ-1-イン-1-イルベンゼン-d0の合成よく乾燥したDCM4mLにアルゴン条件の下で4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルメタノール-d0182mg、1.24mmolを溶かした後、0°Cに冷却し、塩化メタンスルホン酸MsCl:116μL、1.49mmolとトリエチルアミンEt3N:260μL、1.87mmolを加えた。30分間0°Cで攪拌した後、反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し5mLずつ合計3回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去し、沈殿物を濾別した。得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、これをさらにアセトン12mLに溶かした後、ヨウ化ナトリウムNaI:280mg、1.87mmolを加えた。1時間室温で攪拌した後、反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で乾燥させる。ここに水10mLを加え、酢酸エチルで抽出し10mLずつ合計3回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物reporter-d0を279mg1.09mmol、88得た。1HNMRd730727442202前記で合成されたreporterunitからbalance-d5とbalance-d0を合成する過程、および各段階で生成された化合物のNMR結果を下記の段階8~段階10に示す。段階8:1ジエチル-2-4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルマロネート-d5の合成アルゴン条件の下でdryDMF2mLに1-ヨードメチル-4-プロプ-1-イン-1-イルベンゼン-d50.392mmolと水酸化ナトリウムNaH:19.8mg、60ミネラルオイル混合物、0.473mmolを溶かした後、0°Cに冷却し、ジエチルマロン酸89.8μL、0.592mmolを加えた。その後、室温に温度を上げ、3時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し3mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を88.5mg0.302mmol、77得た。1HNMRd7287237117074174063571211142ジエチル2-4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルマロネート-d0の合成アルゴン条件の下でdryDMF3mLに1-ヨードメチル-4-プロプ-1-イン-1-イルベンゼン-d098.0mg、0.383mmolと水素化ナトリウムNaH:18.4mg、60ミネラルオイル混合物、0.459mmolを溶かした後、0°Cに冷却し、ジエチルマロン酸87.2μL、0.574molを加えた。その後、室温に温度を上げ、3時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し3mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を94.8mg0.329mmol、86得た。段階9:13-4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルプロピオン-d5エチルエステルの合成アルゴン条件の下でdryDMF2mLにジエチル2-4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルマロネート-d588.5mg、0.302mmolを溶かした後、塩化ナトリウム35.3mg、0.604mmolと水100μLを加え、2日間還流条件の下で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し3mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を50.0mg0.226mmol、75得た。1HNMRd7287084082561192エチル3-4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルプロピオン-d0エチルエステルの合成アルゴン条件の下でdryDMF2mLにジエチル2-4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルマロネート-d094.8mg、0.329mmolを溶かした後、塩化ナトリウム38.5mg、0.658mmolと水200μLを加え、2日間還流条件の下で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し3mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を50.0mg0.231mmol、70得た。1HNMRd728708408289256200119段階10:13-4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルプロピオン酸-d5メタノール0.5mLに3-4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルプロピオン-d5エチルエステル43.0mg、0.194mmolを溶かした後、20水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル3mLを加えて希釈し、10塩化水素水溶液200μLを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物balance-d5を32.2mg0.167mmol、86得た。1HNMRd73071026423-4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルプロピオン酸-d0メタノール0.5mLに3-4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルプロピオン-d0エチルエステル50.0mg、0.231mmolを溶かした後、20水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル3mLを加えて希釈し、10塩化水素水溶液200μLを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物balance-d0を37.3mg0.198mmol、86得た。1HNMRd730710291264202前記で製造されたreporterunitとbalanceunitを用いて、同重体および多重同重体ラベリング剤の合成方法、および各段階で合成された化合物のNMR結果を下記の段階11~段階13に示す。多重同重体の合成方法は同一であるから、同重体ラベリング剤tagα129の場合を詳細に記述し、他の同重体ラベリング剤の場合は合成過程の相違点を記述した。段階11:メチル2-4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルアミノアセテート-d0の合成アルゴン条件の下でdryDMF2mLにグリシンメチルエステル169mg、1.34mmolを溶かした後、DIPEA292μL、1.68mmolと1-ヨードメチル-4-プロプ-1-イン-1-イルベンゼン-d0reporter-d0:232mg、0.892mmolを加え、1日間室温で攪拌した。反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し5mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を58.6mg0.270mmol、80得た。1HNMRd730719372367335220199段階12:メチル2-N-4-プロプ-1-イン-1-イルベンジル-3-4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルプロパンアミドアセテート-d5の合成よく乾燥したDCM1mLにアルゴン条件の下でメチル2-4-プロプ-1-イン-1-イルベンジルアミノアセテート-d018.3mg、0.0845mmolと3-4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルプロパン酸-d5balance-d5:13.6mg、0.0704mmolを溶かした後、EDC40.5mg、0.211mmol、HOBt28.5mg、0.211mmolおよびDIPEA60.3μL、0.352mmolを加え、20時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し3mLずつ合計4回、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を25.0mg0.0759mmol、91得た。Majorisomer1HNMRd733724711696451400364265202Minorisomer1HNMRd733724711696458381360252202段階13:2-N-4-プロプ-1-イン-1-イルベンジル-3-4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルプロパンアミド酢酸-d5の合成メタノール0.5mLにメチル2-N-4-プロプ-1-イン-1-イルベンジル-3-4-プロプ-1-イン-1-イルフェニルプロパンアミドアセテート-d525.0mg、0.0637mmolを溶かした後、20水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル3mLを加えて希釈し、10塩化水素水溶液200μLを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して同重体ラベリング剤tagα129を21.0mg0.0554mmol、87得た。Majorisomer1HNMRd7732723709794447397262202Minorisomer1HNMRd732723709794456379253200上記の段階11~段階13と類似した方法で下記のとおり同重体ラベリング剤tagα131、tagα132およびtagα134を製造した。同重体ラベリング剤α131同重体ラベリング剤tagα129と同様の過程で合成するが、合成過程中における段階11にはreporter-d2を使用し、段階12にはbalance-d3を使用して合成した。Majorisomer1HNMRd732723709794397290264202Minorisomer1HNMRd732723709794379293255200同重体ラベリング剤α132同重体ラベリング剤α129と同様の過程で合成するが、合成過程中における段階11にはreporter-d3を使用し、段階12にはbalance-d2を使用して合成した。Majorisomer1HNMRd732723709794447397262202Minorisomer1HNMRd732723709794456379253200同重体ラベリング剤α134同重体ラベリング剤α129と同様の過程で合成するが、合成過程中における段階11にはreporter-d5を使用し、段階12にはbalance-d0を使用して合成した。Majorisomer1HNMRd732723709794397290264202Minorisomer1HNMRd732723709794379293255200上記で製造された化合物を用いて下記のとおり定量分析実験に使用した。実施例1-3定量分析実験段階1:ラベリングジと分析体の結合実施例1-2の化合物とペプチドの結合反応を図7に示した。実施例1-2の化合物とEDCとN-ヒドロキシスクシンイミドNHSをDMFに溶かし、それぞれの濃度が60、35および40mMとなるように混ぜて室温で45分間反応させ、ラベリング剤のカルボン酸の末端基をシクインイミジルエステルで活性化させた。ウシ血清アルブミンをトリプシン酵素で分解して得たペプチドtrypticBSAまたはアンジオテンシンIIDRVYIHPFを炭酸水素ナトリウム水溶液NaHCO3、100mMに溶かした後、活性化されたラベリング剤を入れて6時間反応を行った。ヒドロキシル基に起こる標識反応は、エステル結合を形成して不安定な結合を形成し、反応の効率も低いから、正確な定量のために、炭酸水素ナトリウム水溶液100mMに溶かしたヒドロキシルアミン80mMを用いて、ペプチドのヒドロキシル基に標識された副反応を除去した。全体反応はトリフルオロ酢酸TFAを加えて終結させた。段階2:MALDIおよびLC-MALDI質量分析標識されたアンジオテンシンIIは、50TA溶液0.1TFA/50アセトニトリル/50H2Oで希釈した後、HCCAマトリックス溶液acyano4hydroxycinnamicacid、5mg/mL、50TAと1:1で混ぜてMALDIプレートにのせて乾燥させた後、タンデム飛行時間型質量分析器timeofflighttimeofflightmassspectrometryを用いて分析した。タンデム質量分析によって設計したとおりに定量信号および標識信号が観測されるか、また、その強さがどれほどであるかを確認した。標識されたtrypticBSAを用いて同重体ラベリング剤で測定可能な分析試料の濃度或いは量の範囲を確認し、液体クロマトグラフィーLCと連動して多重の試料を同時に定量分析することができるかを確認した。同重体ラベリング剤で測定可能な試料の濃度範囲を確認するために、多重同重体のうちtagα129とtagα131で標識された試料を3:1の比率で混ぜた後、50TAを用いて希釈する過程を繰り返し行った。各濃度の試料をHCCAマトリックス溶液と1:1の比率で混ぜてMALDIプレートにロードした。この際、ロードされたペプチドの量はスポット当たり約4200、1300、420、130、42および13フェムトモルである。LCと連動した多重定量分析をテストするためには、4種の同重体で標識されたtrypticBSAを2:1:4:8の比率で混ぜてnanoLCで分離し、LCから溶出されるペプチドをHCCAマトリクス溶液と共にMALDIプレートにロードしてMALDI-TOF/TOFで分析した。実験結果1モデルペプチドを用いたラベリング剤の検証各ラベリング剤と結合したモデルペプチドangiotensinII、DRVYIHPFを質量分析した結果、一つのラベリング剤と結合した質量値tagα129-α134は1406.7、tagβは1395.7、tagγは1381.7、そしてtagβは1341.8Thでイオンが観測された。さらに正確な検証のために、質量スペクトルで観測されたイオンを選択してタンデム質量分析を行った。結果は図8に示す。図8a~図8dは多重同重体tagα129-α134で標識されたペプチドの結果であり、図8e~図8gはそれぞれ非同重体であるtagβ、tagγ、およびtagδで標識されたペプチドの結果である。各ラベリング剤で生成されるイオン、すなわち標識信号と定量信号は設計された質量値で観測された。標識信号はtagα129-α134は361、tagβは350、tagγは336、そしてtagδは296Thで観測された。定量信号は、tagα129は129、tagα131は131、tagα132は132、tagα134は134、tagβは133、tagγは148、およびtagδは142Thで観測された。各ラベリング剤で生成される定量信号の強さをモデルペプチドの断片イオンのうち最も強く観測されるヒスチジンインモニウムイオン110Thと比較して図9に示す。ラベリング剤の構造によって異なるタイプの定量信号が観測された。すなわち、reporterunitがベンジル誘導体であるtagαとtagβはベンジル陽イオン構造の定量信号が観測され、ベンジル誘導体でないtagγとtagδはイミニウム陽イオン構造の定量信号が観測された。たとえラベリング剤によって定量信号のタイプは異なっても、各ラベリング剤の定量信号はモデルペプチドの断片イオンに比べて一層強く観測された。モデルペプチドの断片イオンを見ると、ペプチドのC末端基を含む断片イオン、すなわちy2、y3およびy7はラベリング剤を問わずに同位置で観測されたとともに、ペプチドのN末端基を含む断片イオン、すなわちb2、b3-NH3、a5、およびb7H2Oなどは{各ラベリング剤の分子量-H2O}だけ質量が増加したところで観測された。質量分析およびタンデム質量分析の結果より、合成された全ての各ラベリング剤の分子量と定量および標識信号が予想とおり観測されることにより各ラベリング剤が設計とおりに合成されたことを確認した。ペプチドの断片イオンからラベリング剤がN末端基にのみ標識されたことを確認した。多重同重体で標識されたモデルペプチドを一定の比率で混ぜ、タンデム質量分析した結果を図10に示す。混合比率モル比がtagα129:α131:α132:α134=2:1:2:1の場合は図10aに示し、1:2:1:2の場合は図10bに示す。各多重同重体ラベリング剤の定量信号は逆三角形に表示した。多重同重体それぞれを別途分析した図8a~図8dに比べて、多重定量分析を行う場合にはそれぞれの定量信号の強さは相対的に弱くなり、ペプチドの断片イオンはさらに強く観測された。このように全体分子量は同一であり、定量信号の質量値のみ異なる多重同重体を使用する場合には、定量信号とは異なり、それ以外のイオンは質量値が同一であるため、重畳してその強さが強化される。このような理由により、本発明で開発されたラベリング剤のように、定量信号が強く観測されるほど多重定量分析に有利である。2trypticBSAを用いた多重同重体の性能検証多重同重体を用いて測定することが可能なペプチドの量または濃度の範囲を図11に示す。BSAの絶対量をよく反映することができるように、同重体で標識されたtrypticBSAのうち、比較的強く観測されたペプチドであるFGER、VASLR、およびSEIAHRを用いて実験を行った。tagα129とtagα131で標識されたペプチドを3:1の比率で混ぜ、全体タンパク質の量を4.2ピコモルから13フェムトモルまで変化させながらタンデム質量分析を行った。MALDI質量分析器は、レーザーによってイオン化される量が制限されて試料の量が少ないときに比べて、量が多いときはロードされた試料の量に対する親イオンの強さが小さく測定されるが、タンデム質量分析による定量分析には関係ないことを確認した。また、本発明の同重体ラベリング剤は、定量信号が強いため、13フェムトモルの少ない量の試料も定量分析することができた。また、LCとMALDI質量分析器を連動した定量分析結果を図12に示す。図12aはLCから溶出した親イオンの強さを示し、図12bは各スポットで測定された定量信号の量をtagα129の定量信号と比較して示す。総6種のペプチドFGER、VASLR、QEPER、AWSVAR、SEIAHR、およびYLYEIARをタンデム質量分析で定量した。ペプチドの種類を問わず、各同重体ラベリング剤によって一定の比率tagα129:α131:α132:α134=1:0.51:1.96:3.81で測定された。また、同一ペプチドの場合にはLCから溶出する間に同一の定量信号の比率で測定された。これは本発明の同重体で多重標識されたペプチドがnanoLC上で同時に移動しており、これにより特定時点の溶出液のみでも正確な定量が行われることを意味する。また、モデルペプチドを介して観測されたように、観測される定量信号の比率が試料の全体量には影響されないことを確認した。実施例2-1ラベリング剤の製造韓国特許公開第10-2010-0009466号、韓国特許公開第10-2010-0009479号および国際特許公開WO2010/008159号を参照して、本発明の一般式2のラベリング剤を製造した。まず、同位元素暗号化基であるRAとRCがメチルCH3またはCD3であり、質量調節基であるRBがバリンVal、グルタミンGln、ヒスチジンHis、フェニルアラニンPheおよびアルギニンArgの側鎖であるラベリング剤を製造した。質量調節基がバリンVal、グルタミンGln、ヒスチジンHis、フェニルアラニンPheおよびアルギニンArgの側鎖であるものを、便宜上、それぞれVal-tag、Gln-tag、His-tag、Phe-tag、およびArg-tagと命名した。また、同位元素暗号化基であるRAとRCがエチルC2H5またはC2D5であり、質量調節基RBがメチルであるラベリング剤を製造した。これは、便宜上、Ethyl-tagと命名した。実施例2-2結合体の製造実施例2-1で製造されたラベリング剤を、3種のモデルペプチドLISFYAGRまたはLISFYAGKまたはYGGFLにVal-、Gln-、His-、Phe-、Arg-tagおよびEthyl-tagを結合させた。また、ウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンタンパク質を相異なる量で混合した2つのタンパク質混合物試料を準備した。混合試料Aにはウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンがそれぞれ4mg/mL、2mg/mL、および0.2mg/mLの濃度で準備され、混合試料Bにはウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンがそれぞれ2mg/mL、0.5mg/mL、および0.4mg/mLの濃度で準備された。混合試料AとBをそれぞれトリプシンで酵素分解した後、混合試料AにはLMBITを、混合試料BにはHMBITを結合させた。この際、Gln-tagをMBIT標識で使用した。ペプチド試料にMBITで結合させる方法は韓国特許公開第10-2010-0009466号、韓国特許公開第10-2010-0009479号および国際特許公開WO2010/008159号を参照した。ラベリング剤で結合したモデルペプチドは、ZipTip-C18Millipore社で塩を除去した後、最終的に各5Mの濃度でアセトニトリルと水が体積比1:1で混合され且つ0.5のギ酸が添加された溶液に溶けている状態で準備した。ラベリング剤で結合した混合試料AとBは、1:1の体積比で混合され、真空で完全に溶媒が除去された後、0.5のギ酸が添加された水溶液に溶けている状態で準備した。実施例2-3定量分析実施例2-2の結合体を用いて、下記のとおり定量分析を行った。実施例2-2に記述されたモデルペプチドとMBITとの結合体の定量分析実施に活用された質量分析器は、エレクトロスプレーイオン化四重極イオントラップ装備としてBruker社製のEsquireHST製品またはThermo社製のLTQVelosを使用した。試料溶液100μLが注射器ポンプにロードされた後、1μL/minの流速でエレクトロスプレーチップに運搬された。エレクトロスプレーは4kVの電圧で行われた。1周期に一つのスペクトル測定のためにイオントラップの内部に最大200msの間試料イオンが捕集されて質量分析されたうえ、1分間最大250周期の反復測定が行われた。実施例2-2に記述された混合試料AおよびBとMBITとの結合体の定量分析実施に活用された質量分析器は、液体クロマトグラフィーと連結されているエレクトロスプレーイオン化四重極イオントラップ装備としてThermo社製のLTQXLを使用した。試料溶液は0.3μL/minの流速で液体クロマトグラフィーを通過してエレクトロスプレーイオン化された。この際、エレクトロスプレーは2kVの電圧で行われた。液体クロマトグラフィーから溶出するペプチドの0.2秒毎の質量分析およびタンデム質量分析スペクトルを得た。1LISFYAGRおよびLISFYAGKにそれぞれVal-、Gln-、His-、Phe-、およびArg-tagを結合させた場合の質量分析結果LISFYAGRおよびLISFYAGKにそれぞれVal-、Gln-、His-、Phe-、およびArg-tagを結合させた場合について定量分析を行った。結果を図17に示す。図17はモデルペプチドLISFYAGR図17aおよびLISFYAGK図17bにVal-、Gln-、His-、Phe-、およびArg-tagを結合させた後、これをエレクトロスプレーイオン化して四重極イオントラップ質量分析器を用いて得た質量分析スペクトルを示す。それぞれ1、2の電荷を帯びるペプチドイオンが検出された。LISFYAGRペプチドの元来質量は925.5Daであり、プロトンが1つまたは2つ付いて検出される1価、2価イオンMH、MH22が926.5Th、463.8Thでそれぞれ検出される。このペプチドにラベリング剤を結合させた場合、各標識物質1個の質量に該当する分だけ増加した質量でペプチドが検出された。Val-、Gln-、His-、Phe-、およびArg-tagを結合させた場合、それぞれ1価イオンはm/z1141.6、1170.6、1179.6、1189.6、および1198.6Thで検出されており、2価イオンはm/z571.3、585.8、590.3、595.3および599.9Thで検出されている。LISFYAGKペプチドの元来質量は897.5Daであり、プロトンが1つまたは2つ付いて検出される1価、2価イオンMH、MH22が898.5Th、449.8Thでそれぞれ検出された。前記ペプチドにラベリング剤を結合させた場合、各標識物質2つの質量に該当する分だけ増加した質量でペプチドが検出される。Val-、Gln-、His-、Phe-、およびArg-tagを結合させた場合、それぞれ1価イオンはm/z1328.9、1386.9、1404.9、1424.9、および1442.9Thで検出されており、2価イオンはm/z654.9、693.9、703.0、712.9、および721.9Thで検出されている。前記の結果より、1つのアミンを持つLISFYAGRには1つのラベリング剤、2つのアミンを持つLISFYAGKには2つのラベリング剤が結合したことを確認することができる。2LISFYAGRおよびLISFYAGKにそれぞれVal-、Gln-、His-、Phe-、およびArg-tagを結合させた場合のタンデム質量分析結果LISFYAGRおよびLISFYAGKにそれぞれVal-、Gln-、His-、Phe-、およびArg-tagを結合させた場合のタンデム質量分析を行った。この際、LMBITで標識されたペプチドとHMBITで標識されたペプチドを1:1の比率で混合して実験した。その結果を図18~図21に示す。図18はN末端に1つのアミンを持つペプチドLISFYAGRにラベリング剤が結合した親イオンのうち、2電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルである。ペプチドのN末端にのみラベリング剤と結合したため、yタイプの断片イオンはいずれもラベリング剤の種類を問わずに一定の質量対電荷の比m/zで検出されている。これに対し、bタイプの断片イオンはラベリング剤の種類に応じて質量対電荷の比m/zが増加して検出が行われている。定量信号として活用できるLyS、HySイオンは、1価の電荷を帯びたままm/z987Thと1000Thでそれぞれ検出されている。強い塩基性を持つHis-およびArg-tagの場合はySイオンが強く検出されている。Val-、Gln-、およびPhe-tagの場合にも信号の強さが弱いものの、yS定量信号イオンが検出されていることが分かる。図19はN末端に1つのアミンを持つペプチドLISFYAGRにラベリング剤が結合した親イオンのうち、1電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。この場合、定量信号イオンが検出されるものの、非常に小さい信号強さと測定されているから、定量分析への活用に適さないことが分かる。図20はN末端とリシンの側鎖にそれぞれ1個ずつ総2個のアミンを持っているペプチドLISFYAGKにラベリング剤が結合した親イオンのうち、2電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。図8に示すように、N末端のアミンとC末端のリシンのアミンにそれぞれラベリング剤が結合したため、ラベリング剤の種類に応じてbタイプおよびyタイプの断片イオンがいずれも一定の質量対電荷の比だけ増加して検出されることも確認することができる。特に、1価電荷を帯びるySイオンは-tagより大きい質量対電荷の比で測定され、他の配列イオンに全く妨害されていない領域で検出されていることが分かる。また、信号の強さも、他の配列イオンと同様に強く現れており、1:1の混合比によく合う[LyS]:[HyS]イオンの強さ比を示した。Val-、Phe-tagの場合、2価を帯びるySイオンも検出されており、これも1:1の混合比によく合うイオン強さ比を示した。これに対し、弱く塩基性を帯びるGln-tag、および強い塩基性を帯びるHis-、Arg-tagの場合は、2価のySイオンが殆ど検出されておらず、それだけ1価のySイオンが強く検出されている。理論的に限定されるものではないが、2価のySイオンは1価の他の配列イオンによって妨害され得るため、1価のySイオンを定量分析信号として活用することが一層有利であると判断される。図21はN末端とリシンの側鎖にそれぞれ1個ずつ総2個のアミンを持っているペプチドLISFYAGKにラベリング剤が結合した親イオンのうち、1電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。2価親イオンで実験した場合と同様に、ラベリング剤の種類に応じてbタイプおよびyタイプの断片イオンがいずれも一定の質量対電荷の比だけ増加して検出されることを確認することができる。ところが、特徴的に、1価親イオンを選択して実験した結果では、1価のyS定量信号イオンが非常に強く現れることを確認することができる。また、[LyS]:[HyS]イオンの信号の強さ比も1:1の混合比と殆ど一致するように検出されていることが分かる。3yS定量信号の強さ測定図22および図23は、ラベリング剤で標識されたモデルペプチドをタンデム質量分析したときに現れるyS定量信号の強さが全体断片イオンの信号の強さの総和において占有する比率を示す図である。図10は、ラベリング剤で標識されてエレクトロスプレーイオン化された後、2価電荷を帯びる親イオンを選択して分解した結果を示している。一つのラベリング剤が結合したLISFYAGRの場合に比べて、2つのラベリング剤がN末端とC末端に結合したLISFYAGKの場合、定量信号イオンySの強さが2倍以上強く発生することを確認することができた。図23aと図23bは、ラベリング剤で標識されてエレクトロスプレーイオン化されて1価電荷を帯びるLISFYAGRとLISFYAGKをそれぞれ選択して分解した結果を示す。既存のbSイオンを活用する場合と比較するために、図23cには、ラベリング剤で標識されたLISFYAGR1価親イオンをMALDI-TOF/TOF装備で検出したときのbS定量信号イオンの比率を示した。2つのラベリング剤が結合したLISFYAGKはMALDIイオン化方法によっては検出されなかった。その結果、N末端のアミンとC末端のリシンのアミンに2つのラベリング剤が結合したLISFYAGKを分解して生成されるySイオンの相対的な強さが、既存のbSを活用する場合に比べて5倍以上強い定量信号の強さを得ることができることを確認することができた。前記結果に基づいて、理論的に限定されたものではないが、N末端に追加してリシンの側鎖までラベリング剤が結合して総2個以上のラベリング剤が結合した場合、非常に強いyS定量信号を得ることができることが分かった。また、N末端のアミンとC末端のリシンにラベリング剤が2つ結合した場合、1価のySイオンは他の配列イオンの妨害を全く受けない質量対電荷の比で非常に強い信号の強さで検出されて雑音信号の妨害なく非常に正確で再現性のある定量分析を可能にすることが分かった。大きい質量値を有するySを利用すると、既存の小さい質量値を有する定量信号イオンを活用する場合に比べて最大5倍以上強い信号強さで定量分析が可能である。4ySイオンを再びイオントラップ内で選択してさらに衝突由来分解して得たMS3タンデム質量分析スペクトルの分析図24はN末端とリシンの側鎖にそれぞれ1個ずつ総2個のアミンを持っているペプチドLISFYAGKにラベリング剤が結合した親イオンのうち、2価電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して生成された1価のySイオンを再びイオントラップ内で選択してさらに衝突由来分解して得たMS3タンデム質量分析スペクトルを示す。Val-tagと結合したLISFYAGKのLySイオンを選択して実験した結果を示した。もしN末端のラベリング剤が分解されてySイオンが生成された場合には、MS3スペクトルではbnイオンがいずれも144Thずつ減少して現れなければならず、もしリシンの側鎖に結合したラベリング剤でySイオンが生成された場合には、MS3スペクトルではynイオンがいずれも144Thずつ減少して現れなければならない。MS3スペクトルで144Th減少して現れるbnおよびyn断片イオンをそれぞれbn’、yn’と命名する。図24bから確認できるように、N末端を含むbタイプの断片イオンの位置は同一に維持されるが、C末端を含むyタイプの断片イオンの位置はいずれも144Thだけ減少してyn’と検出されることを確認することができた。bn’は殆ど検出されなかった。結果として、タンデム質量分析によって強く示されるyS定量信号は、ペプチドのN末端に付いたラベリング剤ではなくリシンの側鎖のアミン基と結合したラベリング剤に由来することを確認することができた。図18~図24の結果を考慮するとき、ySを活用する定量分析は、理論的に限定されるものではないが、リシンを含んでおり2つ以上のラベリング剤が結合しうるペプチドを分析体とするときに最も良い性能を示すものと判断することができる。特に、理論的に限定されるものではないが、ペプチドのC末端にリシンがある場合、1価のySイオンが他の断片イオンの妨害を全く受けることなく検出できるという大きい利点を持つ。5標準定量曲線の分析図25はHMBITとLMBITで区分標識して多様な比率で混ぜたモデルペプチドをタンデム質量分析して生成されたLySおよびHySイオンの強さで定量分析を行って得た標準定量分析曲線を示す図である。実施に活用されたラベリング剤はGln-tagであり、モデルペプチドとしてはLISFYAGKが活用された。1価、2価の電荷を帯びるペプチドイオンについてそれぞれ実施結果を得た。ラベリング剤で標識されたペプチド溶液の濃度は混合比を問わずに約5μMに維持された。図25に示すように、強い信号の強さを示すySイオンを活用した定量分析は、実際混合比によく合う測定比を示していることが分かった。特に1価親イオンを選択した場合、ySの信号の強さが上述の如く特異的に強く示されるため、1:64の混合比に達するまで非常に良い定量分析結果を得ることができることが分かる。2価親イオンを選択して定量分析する場合も、1:36の混合比まで非常に優れた線形性を示す。既存の小さい質量を有するbS定量信号を活用した場合には、1:16の混合比が定量限界であったことを考えると、ySを導入しながら最大約4倍程度定量限界が改善された。6YGGFLKおよびLISFYAGKにEthyl-tagを結合させた場合のタンデム質量分析結果同位元素暗号化基であるRAおよびRCとしてメチル基を活用する場合、定量信号イオンの質量差が3Daであって、LyS定量信号イオンの自然同位元素パターンによってHyS定量信号イオンが干渉される可能性がある。このような問題点は、同位元素暗号化基であるRAおよびRCとしてエチル基を使用すると、定量信号イオンの質量差が5Daと十分に大きくなって克服が可能である。これを実施するためにモデルペプチドにEthyl-tagを結合させてタンデム質量分析した。YGGFLKにEthyl-tagを結合させてタンデム質量分析した結果を図26および図27に示す。LISFYAGKにEthyl-tagを結合させてタンデム質量分析した結果は図28に示す。図26はN末端とリシンの側鎖にそれぞれ1個ずつ総2個のアミンを持っているペプチドYGGFLKにEthyl-tagが結合した親イオンのうち、1電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して得たタンデム質量分析スペクトルを示す。特に、図26aと図26bはEthyl-tagのHMBITとLMBITがそれぞれ結合した場合の結果である。Ethyl-tagのHMBITで標識された場合、質量対電荷の比986.5で1価のLySイオンが検出され、LMBITで標識された場合、991.5で1価のHySイオンが検出された。図26cと図26dはySイオンが検出される領域を拡大した図であって、LySとHySイオンの質量差が5Daであるから、自然同位元素分布によって互いに干渉されないことを確認するこができる。図27はLISFYAGKの配列を有するペプチドにEthyl-tagのLMBITを結合させたものと、HMBITを結合させたものを2:1の比率で混合してタンデム質量分析した結果である。質量対電荷の比1332.6で検出される、1価の電荷を帯びるイオンを選択してタンデム質量分析した結果、質量対電荷の比1200.6と1205.6で1価のLySおよびHySイオンが[HyS]:[LyS]=2:1の比率でLMBITとHMBITの混合比を成功的に再現しながら検出された。7タンパク質混合試料をGln-tagで定量分析した結果実際タンパク質をMBITのySイオンで定量分析した実施を行うために、3種のタンパク質が相異なる比率で混合されている2つのタンパク質混合試料混合試料AとBを準備し、Gln-tagを用いて分析した。混合試料Aのウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンは混合試料Bのウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンに比べて量的にそれぞれ2倍、4倍および0.5倍となるように準備した。これをトリプシンで酵素分解し、Gln-tagのLMBITおよびHMBITで標識して液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析によって定量分析した結果が図28に示されている。図28aは検出されたペプチドの液体クロマトグラフィーの溶出時間に対して測定された[HyS]:[LyS]の比率を示す図であり、図28bは検出されたペプチドの質量対電荷の比に対して測定された[HyS]:[LyS]の比を示す図である。ウシ血清タンパク質に由来するものと解明されたペプチドの場合は[HyS]:[LyS]=2.01±0.06、ミオグロビンの場合は[HyS]:[LyS]=4.13±0.11、ユビキチンの場合は[HyS]:[LyS]=0.49±0.02の結果をそれぞれ得ることができた。これは混合試料AとBにおける各タンパク質の比率を5誤差範囲以内で成功的に定量分析した実施である。"