"母体血液の試料を使用した胎児異数性の出生前診断の方法であって、a高メチル化DNA試料を得るために、母体の血液試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAと物理的に分離する工程;b高メチル化DNA試料の高メチル化値を得るために、高メチル化DNA試料において、複数の特異的メチル化領域DMRのレベルを決定する工程;c高メチル化DNA試料の高メチル化値を前記複数のDMRの標準参照高メチル化値と比較する工程;およびd前記比較に基づき、胎児異数性を診断する工程を含む、前記方法。母体血液試料が母体の末梢血試料である、請求項1に記載の方法。高メチル化DNAが、メチル化DNA免疫沈降MeDiPにより低メチル化DNAから物理的に分離される、請求項1に記載の方法。高メチル化DNAが低メチル化DNAから物理的に分離された後、該高メチル化DNAが増幅される、請求項1に記載の方法。高メチル化DNAがライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応LM-PCRにより増幅される、請求項4に記載の方法。複数のDMRが、添付A~Eに示されたリストから選択される、請求項1に記載の方法。複数のDMRレベルが、少なくとも3個のDMRに関して決定される、請求項1に記載の方法。複数のDMRレベルが、少なくとも5個のDMRに関して決定される、請求項1に記載の方法。複数のDMRレベルが、少なくとも8個のDMRに関して決定される、請求項1に記載の方法。複数のDMRレベルが、少なくとも10個のDMRに関して決定される、請求項1に記載の方法。複数のDMRが、添付A~Eに示されるリストから選択される、請求項7~10のいずれか1項に記載の方法。高メチル化DNA試料における複数のDMRレベルが、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応リアルタイムQPCRにより決定される、請求項1に記載の方法。LM-PCR効率のコントロールとして、複数のDMRのレベルが未処理の母体血液DNA試料全体においても決定される、請求項5に記載の方法。高メチル化DNA試料の高メチル化値を正常な母体血液DNA試料の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化DNA試料の高メチル化値が正常な母体血液DNA試料の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ、胎児異数性の診断が下される、請求項1に記載の方法。21トリソミー診断のための複数のDMRが21番染色体上にある、請求項1に記載の方法。21番染色体上の複数のDMRが、塩基対39279856-39280004SEQIDNO:33、塩基対44161178-44161323SEQIDNO:34、塩基対44161239-44161371SEQIDNO:35、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対29136735-29136844SEQIDNO:41、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43、塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される3個またはそれ以上の領域を含む、請求項1に記載の方法。21番染色体上の複数のDMRが、塩基対39279856-39280004SEQIDNO:33、塩基対44161178-44161323SEQIDNO:34、塩基対44161239-44161371SEQIDNO:35、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対29136735-29136844SEQIDNO:41、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43、塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される8個またはそれ以上の領域を含む、請求項1に記載の方法。21番染色体上の複数のDMRが、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43および塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44のヌクレオチド配列を有する8個の領域から成る、請求項17に記載の方法。複数のDMRが、13番染色体、18番染色体、X染色体およびY染色体から成る群から選択された染色体上にある、請求項1に記載の方法。母体の末梢血試料を使用した21トリソミーの出生前診断の方法であって、a高メチル化DNA試料を得るために、母体末梢血の試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAと物理的に分離する工程;b高メチル化DNA試料の高メチル化値を得るために、高メチル化DNA試料において、21番染色体上の複数の特異的メチル化領域DMRレベルを決定する工程であって、21番染色体上の複数のDMRが、塩基対39279856-39280004SEQIDNO:33、塩基対44161178-44161323SEQIDNO:34、塩基対44161239-44161371SEQIDNO:35、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対29136735-29136844SEQIDNO:41、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43、塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される8個またはそれ以上の領域を含み、および複数のDMRレベルがリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応リアルタイムQPCRにより決定される、工程;c高メチル化DNA試料の高メチル化値を21番染色体上の前記複数のDMRの標準正常参照高メチル化値と比較する工程;ならびにd前記比較に基づき21トリソミーを診断する工程を含む、前記方法。高メチル化DNAが、メチル化DNA免疫沈降MeDiPにより低メチル化DNAから物理的に分離される、請求項20に記載の方法。高メチル化DNAが低メチル化DNAから物理的に分離された後、高メチル化DNAが増幅される、請求項20に記載の方法。高メチル化DNAがライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応LM-PCRにより増幅される、請求項22に記載の方法。LM-PCR効率のコントロールとして、複数のDMRレベルが未処理の母体血液DNA試料全体においても決定される、請求項20に記載の方法。高メチル化DNA試料の高メチル化値を正常な母体血液DNA試料の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化DNA試料の高メチル化値が、正常な母体血液DNA試料の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ21トリソミーの診断が下される、請求項20に記載の方法。21番染色体上の複数のDMRが、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43、および塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44のヌクレオチド配列を有する8個の領域から成る、請求項20に記載の方法。胎児異数性の診断に利用するのに適し、関心対象の染色体上にある特異的メチル化領域DMRを同定する方法であって、a以下:i正常の成人女性の末梢血DNA試料PB試料;およびii正常な胎盤DNA試料PL試料を提供する工程;b以下:i分離されたPB試料;およびiii分離されたPL試料を得るために、aの各試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する工程;cbの分離された各試料において、関心対象の染色体上の複数の領域のレベルを決定する工程;およびd分離されたPB試料では低メチル化され、かつ分離されたPL試料では高メチル化されている領域を選択する工程であって、それによって関心対象の染色体上の特異的メチル化領域DMRを同定する、工程を含む、前記方法。PL試料が二つの異なる試料、すなわち、第1トリメスターPL試料および第3トリメスターPL試料を含み、前記工程dが、第1トリメスターの分離PL試料および第3トリメスターの分離PL試料の中で同じメチル化度を有する領域を選択する工程をさらに含む、請求項27に記載の方法。関心対象の染色体が21番染色体である、請求項27に記載の方法。関心対象の染色体が、13番染色体、18番染色体、X染色体およびY染色体から成る群から選択される、請求項27に記載の方法。異数性がトリソミーまたはモノソミーである、請求項27に記載の方法。以下を含む21トリソミーの出生前診断キット:a21番染色体上の複数の特異的メチル化領域DMRのレベルを決定するための、1種または複数種の核酸組成物;およびb21トリソミーの出生前診断のための核酸組成物の利用ガイド。21番染色体上の複数のDMRが、添付A~Eに示されたリストから選択される、請求項32に記載のキット。21番染色体上の複数のDMRが、塩基対39279856-39280004SEQIDNO:33、塩基対44161178-44161323SEQIDNO:34、塩基対44161239-44161371SEQIDNO:35、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対29136735-29136844SEQIDNO:41、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43、塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される3個またはそれ以上の領域を含む、請求項32に記載のキット。染色体21上の複数のDMRが、塩基対39279856-39280004SEQIDNO:33、塩基対44161178-44161323SEQIDNO:34、塩基対44161239-44161371SEQIDNO:35、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対29136735-29136844SEQIDNO:41、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43、塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される8個またはそれ以上の領域を含む、請求項32に記載のキット。21番染色体上の複数のDMRが、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43、および塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44のヌクレオチド配列を有する8個の領域から成る、請求項32に記載のキット。核酸組成物が、、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される1種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項32に記載のキット。血液試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する手段をさらに含む、請求項32に記載のキット。高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する手段が、メチル化DNAを免疫沈降させる抗体を含む、請求項38に記載のキット。高メチル化DNAを増幅する手段をさらに含む、請求項38に記載のキット。高メチル化DNAを増幅する手段が、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応LM-PCRを行うためのオリゴヌクレオチドリンカーまたはオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項40に記載のキット。、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される1種または複数種の単離オリゴヌクレオチドプライマーを含む、核酸組成物。詳細な説明本発明は、胎児DNAでは高メチル化、母体DNAでは低メチル化を示す、特異的メチル化領域DMRの大きなパネルを発明者が同定したことに、少なくとも部分的に基づいている。もっとさらに、本発明は、化学的に変性させることなく、または酵素的に高メチル化DNAまたは低メチル化DNA試料を消化することなく、2つのDNA群を物理的に分離することにより、高メチル化胎児DNAを低メチル化母体DNAから精製することができ、よって高メチル化胎児DNAが濃縮した試料となることを、本発明者が示したことに基づき、少なくとも部分的に基づいている。もっとさらに、本発明者は、本明細書で開示されるDMRの代表的実施例を用いて、母体の末梢血試料のパネルで、21トリソミーを正確に診断し、よって、同定されたDMRと開示された胎児異数性の診断法の有効性を提示した。本開示の様々な態様については、以下のサブセクションにさらに詳細が記述される。I.胎児異数性の非侵襲性出生前診断の方法1つの態様では、本発明は、母体の血液試料を用いて、胎児異数性の出生前診断を行う方法を提供する。当該方法には、以下が含まれる。a高メチル化DNA試料を得るために、母体の血試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離し;b高メチル化DNA試料の高メチル化値を得るために、高メチル化DNA試料において、複数の特異的メチル化領域DMRのレベルを決定し;c高メチル化DNA試料の高メチル化値を、前記複数のDMRの標準参照高メチル化値例えば、後述する、標準正常参照高メチル化値と比較し;およびd前記比較に基づき胎児異数性を診断する。母体の血液試料母体の血液試料は、針および注射器を用いる等の標準的技法により得られる。好ましい実施形態では、母体の血液試料は母体の末梢血試料である。代わりに、母体の血液試料は、母体の血漿試料等の末梢血の切片部分であり得る。いったん血液試料が得られると、標準的技法を用いて試料からDNA全体を抽出することができる。標準的技法の非限定的例の1つが、QIAmpDNABloodMidiKitQiagen社である。一般には、DNA全体はその後断片化し、好ましくは、約300bp~800bpの大きさに断片化する。例えば、DNA全体は高周波により分解され得る。高メチル化DNAの低メチル化DNAからの分離本方法において、高メチル化DNAは、高メチル化DNA試料を得るために、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、低メチル化DNAから物理的に分離される。この物理的分離は、メチル化DNA免疫沈降MeDiPにより行われることが好ましく、この技法は当業者の間ですでに詳細が記されている例えば、Weber,M.ら2005Nat.Genet.37:853-862;およびRakyan,ら2008GenomeRes.18:1518-1529を参照のこと。これらは共に、本明細書に引用により明示的に含まれるものとする。MeDiP技法では、インプットDNAは変性し、5-メチルシトシンに対抗する抗体でインキュベートされ、その後、メチル化されたDNAは免疫沈降により単離される。例えば、免疫沈降を達成するためには、抗5-メチルシトシン抗体を固相担体例えば、magneticdynabeads、巨視的なアガロースビーズまたは常磁性ビーズと結合させ、メチル化されたDNAが溶液中から沈殿するようにし得る直接免疫沈殿。代わりに、抗5-メチルシトシン抗体例えば、抗体の一定領域を認識し、固相担体と結合し、よってメチル化DNAを溶液から沈殿させる直接免疫沈殿という、第二の抗体または試薬を使用することもできる。直接または間接免疫沈殿にとって、ビオチン/アビジンまたはビオチン/ストレプトアビジン系等、試料内の成分を物理的に分離する方法として、当業者の間で知られているその他の方式を使用することもできる。例えば、抗5-メチルシトシン抗体をビオチンと結合させ、その後、固相担体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを使い、メチル化DNAを溶液から沈殿させることもできる。免疫沈殿を生じさせる方法として当業者の間で知られているその他の様々な方法も、本発明に適していることは、通常の当業者には明らかであろう。よって、本明細書で使用するメチル化されたDNAの免疫沈殿すなわちMeDiPという用語は、高メチル化DNAと低メチル化DNAの間を区別する抗体を、母体の血液試料のDNAと接触させ、その後、高メチル化DNAすなわち、抗体と特異的に結合するDNAを溶液から沈殿させる、任意のおよび全ての方式を包含するよう意図されている。高メチル化DNAを母体の血液試料由来の低メチル化DNAから物理的に分離させる点において、試料のDNAは化学的に変性もされず、酵素的に消化されることもない。本明細書で使用する化学的変性という用語は、DNAを、亜硫酸水素ナトリウム変換等、高メチル化DNAと低メチル化DNAを区別する非抗体化学物質と反応させることを意味するよう意図されている。よって、即時方法において、母体の血液試料由来のDNAは、亜硫酸水素ナトリウム変換を受けず、または、高メチル化DNAと低メチル化DNAを区別するその他類似の非抗体のいかなる化学反応にもさらされない。さらに、本明細書で使用する酵素的に消化するという用語は、DNAを、1つまたは複数のメチル化感受性制限酵素と反応させ、よって高メチル化DNAを除去するという意味であるよう意図している。よって、即時方法において、母体の血液試料由来のDNAは、高メチル化DNAと低メチル化DNAを区別するために、メチル化感受性制限酵素で処理されることはない。しかし、母体の末梢血試料由来DNAの断片化通常、高メチル化DNAを低メチル化DNAから分離する前に行われるは、通常は超音波せん断によるが、制限酵素によるDNA消化によっても成し遂げられる。しかしながら、断片化を達成するためのそのような一般的なDNA消化は、メチル化感受性制限酵素では行われない。よって、母体の血液試料由来のDNAが酵素的に消化しないようにする要件として、母体の血液試料DNAの全般的断片化すなわち、サイズ縮減を達成するために、非メチル化感受性制限酵素の利用を排除すること意図しない。DNA増幅診断法では、通常は、母体の血液試料における高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離した後に、高メチル化DNAを増幅する。本明細書で使用する増幅という用語は、DNAのコピーが追加され、よって、DNAのコピー数が増加するという意味であることを意図している。DNAのコピーは、通常は、ポリメラーゼ連鎖反応PCRを用いて達成される。高メチル化DNA増幅の好ましい方法は、当業者によりすでに詳述されている、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応LM-PCRである例えば、Ren,B.ら2000Science22:2306-2309;およびOberley,M.J.ら2004MethodsEnzymol.376:315-334を参照のこと;双方の内容は、本明細書に引用により明示的に含まれるものとする。LM-PCRでは、平滑末端ライゲーションを通じてリンカー末端が試料のDNA断片に連結し、その後、リンカー末端のヌクレオチド配列を認識したオリゴヌクレオチドプライマーがPCRで使用され、よって、リンカーが連結したDNA断片が増幅される。よって、即時診断方法の好ましい実施形態では、母体の血液試料由来のDNAが断片化した後例えば、約300~800bpの断片になる、および高メチル化DNAが低メチル化DNAから物理的に分離される前に例えば、MeDiPにより、リンカーアームは、平滑末端ライゲーションにより断片化されたDNAに連結する。その後、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離した後、回収した高メチル化DNAに対し、DNAにすでに連結しているリンカー末端を認識したヌクレオチドプライマーを使ってPCR処理を行う。これにより、高メチル化DNA試料が増幅される。特異的メチル化領域DMR本発明の診断法として、複数の特異的メチル化領域DMRが使われる。本明細書で使用する特異的メチル化領域またはDMRという用語は、胎児DNAと母体DNAの間で特異的にメチル化された染色体DNAの領域を指していることを意図しており、本発明の目的から、好ましい選択DMRは、胎児DNAでは高メチル化され、母体では低メチル化されている領域である。すなわち、これらの領域選択されたDMRでは、母体DNAに比べて、胎児DNAメチル化の度合いが高いすなわち、数が多い。理論的には、関心対象の染色体に上記の特徴を有する任意のDMRは、即時診断法に用いることができる。特に、当該DMRを同定する方法については、以下および実施例実施例1および2を参照のことにおいて詳細を記述する。さらに、13番、18番、21番、XおよびYの各染色体のDMRの大きなパネル約2000は、様々な診断での利用に適しているが、ここに同定された。当該DMRは、添付A~Eのリストに示されており、21番、13番、18番、XおよびY染色体それぞれに選択したDMRを提供している。本明細書で使用する複数のDMRという用語は、2個またはそれ以上のDMRを意味するよう意図している。好ましい実施形態では、複数のDMRは、21番、13番、18番、XまたはY染色体それぞれについて、添付A~Eに示されているリストから選択される。様々な実施形態では、複数のDMRのレベルは、少なくとも2つのDMR、少なくとも3個のDMR、少なくとも4個のDMR、少なくとも5個のDMR、少なくとも6個のDMR、少なくとも7個のDMR、少なくとも8個のDMR、少なくとも9個のDMR、少なくとも10個のDMR、少なくとも11個のDMRまたは少なくとも12個のDMRについて決定される。繰り返しになるが、複数のDMRは、添付A~Eに示されるリストから選択されるのが最も好ましい。好ましい実施形態では、複数のDMRは、21トリソミーの診断用に21番染色体上に存在する。特に好ましい実施形態では、21番染色体上の複数のDMRは、塩基対39279856-39280004SEQIDNO:33、塩基対44161178-44161323SEQIDNO:34、塩基対44161239-44161371SEQIDNO:35、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対29136735-29136844SEQIDNO:41、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43、塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される2個またはそれ以上の領域、3個またはそれ以上の領域、4個またはそれ以上の領域、5個またはそれ以上の領域、6個またはそれ以上の領域、7個またはそれ以上の領域、8個またはそれ以上の領域、9個またはそれ以上の領域、10個またはそれ以上の領域、11個またはそれ以上の領域、あるいは12個の領域が含まれる。これら領域の用語法に関して、塩基対39279856-39280004等という用語は、21番染色体上の特異的メチル化領域の最初と最後の塩基のペアのことである。よって、代表的なDMRとして21番染色体の塩基対39279856-39280004の場合、このDMRには、塩基対が39279856で始まり、39280004で終わるよって、この領域は148の塩基対から成る21番染色体上の領域が含まれる。先に列記したDMRを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーについては、実施例3および表7にさらに詳述し、またSEQIDNOs:1~24に示されている。先に列記したDMRのヌクレオチド配列は、表8およびSEQIDNOs:33~44に示されている。実施例3に詳細を記載するが、SEQIDNOs33~44に示されている12個のDMRのうち8個のサブセットがすでに選択されており、21トリソミー胎児を妊娠した女性の妊娠期間中に母体から採取する血液試料で21トリソミーを正確に診断するのに十分であることが確認されている。本発明の21トリソミー診断法で使用される、21番染色体上の8個の好ましいDMRは、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43および塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44から成る。様々なその他の実施形態において、複数のDMRは、13番染色体、18番染色体、X染色体およびY染色体から成る群から選択される染色体上に存在し、これら任意の染色体の異数性診断を可能にする。コントロールDMRもまた、本発明の診断法で用いることができる。例えば、高メチル化状態であるとして知られているもう一つのDMRを、高メチル化のコントロールとして診断法に含めることもできる。好ましいコントロールメチル化領域にはCHR13HYP1が含まれ、そのプライマーはSEQIDNOs:25および26に示されている。また、好ましいコントロールメチル化領域には、CHR13HYP2も含まれ、そのプライマーはSEQIDNOs:27および28に示されている。さらに、CHR13HYP1の増幅したPCR産物のヌクレオチド配列は、表8およびSEQIDNO:45に示されている。さらに、または代わって、高メチル化状態であるとして知られているもう一つのDMRを、高メチル化コントロールとして診断方法に含めることもできる。好ましい低メチル化コントロール領域にはCHR22U1が含まれ、そのプライマーはSEQIDNOs:29および30に示されている。また、好ましい低メチル化コントロール領域にはCHR22U2が含まれ、そのプライマーは、SEQIDNOs:31および32に示されている。さらに、CHR22U1の増幅されたPCR産物のヌクレオチド配列は、表8およびSEQIDNO:46に示されている。コントロールDMRおよびそのプライマーについては、実施例1でさらに議論し、表6、7および8でさらに記述する。添付A~Eに示される任意のDMRの実際のヌクレオチド配列は、当業者に周知のその他の情報と共に、本明細書で提供される情報から容易に取得できる。より具体的には、添付A~Eに示されている各DMRは、先に述べた通り、21番染色体の塩基39279856-39280004等、特定の染色体の塩基対の始まりと終わりにより定められる。ヒトの21番、13番、18番、XおよびY染色体のそれぞれの完全なヌクレオチド配列は、すでに決定しており、当業者の間で公に利用可能である。例えば、これら5つの各染色体の完全なヌクレオチド配列は、UCSCGenomeBrowser、Build36http://genome.ucsc.eduから取得できる。さらに、前記染色体上に伸びるDNAの実際のヌクレオチド配列を得るため、5つの染色体それぞれの特定のDMRそれぞれの塩基対の始点および終点を具体的にGenomeBrowserにインプットすることもできる。さらに、その後、標準的な分子生物学的手法を用いて、DMRのヌクレオチド配列に基づき、DMRを検知および/または増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。従って、本明細書で提供される、添付A~EのDMRそれぞれの塩基対始点および終点の情報を元に、UCSCGenomeBrowserから取得可能な染色体配列等、当業者の間で周知のその他の染色体配列を用いて、普通の当業者であれば本情報から容易に取得できる、これらDMRのヌクレオチド配列と共に、添付A~Eに示されるDMRそれぞれの完全なヌクレオチド配列を、よってここに、本明細書に引用により明示的に含むものとする。DMRのレベルの決定即時診断法において、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離し、好ましくは、回収した高メチル化DNAを増幅した後、複数の特異的メチル化領域DMRのレベルが高メチル化DNA試料において決定され、よって、高メチル化DNA試料の高メチル化値が得られる。本明細書で使用されている複数のDMRのレベルが決定されるという表現は、DMRの量、または大きさ、あるいはコピーの数が決定されることを意味するよう意図されている。この塩基は、胎児異数性を有する胎児において、正常の胎児と比較して、異数性の結果DMRの量が多いすなわち、コピーの数が大きい。好ましい実施形態では、高メチル化DNAにおける複数のDMRのレベルは、当業者の間で確立した技法である、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応リアルタイムQPCRにより決定される。リアルタイムQPCRの代表的な、非制限条件については、実施例において記載される。ある実施形態において、複数のDMRのレベルはまた、LM-PCR効率のコントロールとして、未処理の母体血液DNA試料全体において決定される例えば、リアルタイムQPCR。本明細書で使用される未処理の母体血液DNA試料全体という用語は、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離するための処理がまだなされていない母体の血液から取得されるDNA試料のことを指すよう意図されている。複数の特異的メチル化領域DMRのレベルは、高メチル化DNA試料において決定され、よって、高メチル化DNA試料の高メチル化値が得られる。本明細書で使用されている高メチル化値という用語は、試料中DMRレベルの任意の数量的表現を包含するよう意図されている。例えば、リアルタイムQPCRから取得した生データは、高メチル化DNA試料中の複数のDMRそれぞれのレベルを表示する、1つまたは複数の数値を取得するために、様々なコントロールおよび統計的分析に基づいて正規化される。試料に応用可能な、コントロールおよび統計的分析の代表的な非制限的実施例については、実施例3において詳細が記載される。しかし、実施例においてデータを評価するために使用される特定の統計検査は代表的な実施形態であり、実施例および図により提供されているガイダンスに基づけば、代替的統計手法も本発明に応用可能であることは、普通の当業者により理解されるであろう。標準参照値との比較いったん、母体の末梢血に存在する高メチル化された胎児DNAの高メチル化値検査DNAとも称されるが決定すると、この値を検査DNAで調べた同じ複数のDMRの標準参照高メチル化値と比較し、これに基づき胎児異数性の診断または、当該胎児異数性の非存在が行われる。通常は、高メチル化DNA試料の高メチル化値を、正常な胎児の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化DNA試料の高メチル化値が正常な胎児の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ、胎児異数性の診断が下される。すなわち、母胎の末梢血に存在する正常な胎児のDNAすなわち、胎児異数性の存在しない胎児のDNAから取得されたデータに基づき、正常な高メチル化値が設定され、検査DNAの高メチル化値が正常な値よりも高い時、検査試料に対する胎児異数性の診断が下される。最も好ましいのは、標準正常参照高メチル化値が、検査DNAと比べて妊娠期間が同じである例えば、検査DNAが少なくとも妊娠期間3ヵ月の胎児であれば、標準正常参照高メチル化値は、妊娠期間3ヵ月の正常な胎児を妊娠した女性の母体末梢血を用いて決定される正常な胎児すなわち、胎児異数性を有しない胎児を妊娠した女性から採取された母胎末梢血液試料を用いて決定されることである。例えば、標準正常参照高メチル化値を1と設定することもでき、その場合、検査DNAの高メチル化値が1より大きければ、胎児の異常を示し、高メチル化値が1またはそれ以下であれば、胎児の正常を示す。さらに、または代わって、高メチル化DNA試料の高メチル化値を胎児異数性の胎児の標準正常参照高メチル化値と比較することもでき、検査DNA試料の高メチル化値が、胎児異数性の胎児の標準正常参照高メチル化値と比較して、胎児異数性の診断を行うことができる。すなわち、母体末梢血に存在する胎児異数性の胎児DNAすなわち、胎児異数性を有する胎児由来のDNAから取得されたデータに基づき、標準化参照異常または胎児異数性高メチル化値を設定し、検査DNA高メチル化値が、異常または胎児異数性値と同程度類似、または同じ範囲である時、胎児異数性の診断が下される。正常な胎児の標準正常参照高メチル化値を確立するために、正常な胎児を妊娠した健康な妊婦のグループが選ばれた。これらの女性の妊娠期間は類似しており、子癇前症状、胎児染色体異数性、および早期陣痛等のスクリーニング条件に適した妊娠期間内にある。同様に、標準参照値は、健康な非妊婦のグループからの試料を使って確立することができる。選択された妊婦の健康状態および当該女性たちが妊娠している胎児は、女性の血圧監視、陣痛開始の記録および、CVS並びに羊水穿刺を用いて胎児の遺伝子解析を行う等、十分に確立され、通常使用されている方法により確認されるが、これらに限定されるわけではない。さらに、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦として選ばれたグループは、正常な胎児の標準正常参照高メチル化値が統計的に正確となるよう、相当のサイズでなければならない。好ましくは、選択されたグループは、少なくとも10名の女性を含む。正常な胎児の標準正常参照高メチル化値を確立するために、正常な胎児を妊娠しているこれら妊婦由来の母体血液試料に、上記の診断法aおよびbと同じ工程、すなわち、高メチル化DNA試料を得るために、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する工程を施し、その後、高メチル化DNA試料の高メチル化値を得るために、高メチル化DNA試料中の複数の特異的メチル化領域DMRのレベルを決定する。同様に、異常な胎児の標準化参照高メチル化値は、上記の、正常な胎児の標準化参照高メチル化値を確立するための手法と同じ手法を使って確立することができる。但し、異常な参照値を確立するために使われる母体の血液試料は、従来の侵襲性診断法を用いて胎児異数性を有する胎児を妊娠していると診断された妊婦から採取される。適切な統計解析手法について詳細を記載した実施例、特に実施例3は、DNA試料から取得したデータの解析に用いられ得る。例えば、実施例に詳細を記載するように、Mann-WhitneyU検査およびステップワイズモデル解析を用いた統計解析を行うことができる。しかし、実施例においてデータの評価を行うために用いられる特定の統計検査は、代表的な統計手法であり、実施例および図において提供されるガイダンスに基づき、代替的統計手法を本発明に応用することも可能であることは、普通の当業者であれば理解されるであろう。II.21トリソミーの非侵襲性出生前診断検査別の態様では、本発明は、21トリソミー本明細書ではNID21検査とも称されるの非侵襲性出生前診断検査を提供する。実施例3において詳細を記述するが、NID21検査は、実施例1および2の記載に従って同定されたDMRを使って開発し、有効化した。検査の開発において、正常20および異常20すなわち、21トリソミーを有する胎児を妊娠したことが判明した妊婦から成る40の事例から採取した母体の血液試料を使って、本明細書に開示の21番染色体上の12個のDMRを調べた。結果の統計解析実施例3において詳細を記述により、最も情報量が豊富な染色体領域が明らかにされ、正常および異常事例全ての診断において100感受性および正確性に到達するのに、当初試験した全部で12個のDMRのうち8個の特定DMRのみで十分であった。従って、別の態様においては、本発明は、母体末梢血の試料を使って、21トリソミーの出生前診断を行う方法を提供する。当該方法には、以下が含まれる:a高メチル化DNA試料を得るために、母体末梢血試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離し;b高メチル化DNAの高メチル化値を得るために、高メチル化DNA試料において、21番染色体上の複数の特異的メチル化領域DMRのレベルを決定し、ここで、21番染色体上の複数のDMRは、塩基対39279856-39280004SEQIDNO:33、塩基対44161178-44161323SEQIDNO:34、塩基対44161239-44161371SEQIDNO:35、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対29136735-29136844SEQIDNO:41、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43、塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される8個またはそれ以上の領域を含み、ここで、複数のDMRのレベルは、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応リアルタイムQPCRにより決定され;c高メチル化DNA試料の高メチル化値を、21番染色体上の前記複数のDMRの標準正常参照高メチル化値と比較し;およびd当該比較に基づき21トリソミーを診断する。好ましい実施形態では、21番染色体上の複数のDMRは、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43および塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44のヌクレオチド配列を有する8領域から成る。好ましくは、高メチル化DNAは、メチル化DNA免疫沈降MeDiP上記セクションIにおいて詳細を記述により低メチル化DNAから物理的に分離する。好ましくは、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離した後、例えばライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応LM-PCR上記セクションIにおいて詳細を記述により、高メチル化DNAを増幅する。21番染色体の上記DMRを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーについては、実施例3および図7においてさらに記述し、SEQIDNOs:1~24に示す。さらに、コントロールDMRも診断法に利用することができる、例えば、高メチル化であるとして知られているもう一つのDMRを、高メチル化のコントロールとして診断法に含めることができる。好ましい高メチル化コントロール領域にはCHR13HYP1が含まれ、そのプライマーはSEQIDNOs:25および26に示されているおよび、そのヌクレオチド配列はSEQIDNO:45に示されている。また、好ましいコントロール高メチルか領域にはCHR13HYP2も含まれ、そのプライマーは、SEQIDNOs:27および28に示されている。さらに、または代わって、高メチル化状態であるとして知られているもう一つのDMRを、高メチル化コントロールとして診断法に含むことができる。好ましい低メチル化コントロール領域にはCHR22U1が含まれ、そのプライマーはSEQIDNOs:29および30に示されているおよび、そのヌクレオチド配列はSEQIDNO:46に示されている。並びに、好ましい低メチル化コントロール領域にはCHR22U2も含まれ、そのプライマーはSEQIDNOs:31および32に示されている。よって、コントロールDMRおよびプライマーについては実施例1においてさらに論じ、表6で詳述する。1つの実施形態では、複数のDMRのレベルは、LM-PCR効率上記セクションIにおいて詳細を記述のコントロールとして、未処理の母体血液DNA試料の全体においても決定される。好ましくは、高メチル化DNA試料の高メチル化値を、正常な胎児の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化DNA試料の高メチル化値が正常な胎児の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ、21トリソミーの診断が下される。すなわち、母体末梢血に存在する正常な胎児DNAすなわち、胎児異数性を有しない胎児のDNA先に詳細を記載から取得したデータに基づき、21番染色体上の複数のDMRの正常な高メチル化値を設定することができ、検査DNAの高メチル化値が正常値よりも高ければ、21トリソミーの診断を下すことができる。例えば、実施例3において記述するように、12個のDMRそれぞれに正常な高メチル化値を計算し、これに基づき、検査試料の21トリソミー診断を正確に行うに十分であるとして、好ましいDMRを8つ選択した。さらに、または代わって、高メチル化DNA試料の高メチル化値を、21トリソミー胎児の標準参照高メチル化値と比較し、DNA試料の高メチル化値が、21トリソミー胎児の標準参照高メチル化値と比較して高ければ、21トリソミーの診断を下すことができる。すなわち、21トリソミー胎児DNAすなわち、21トリソミーを有する胎児のDNAから取得されたデータに基づき、21番染色体上の複数のDMRの異常な高メチル化値を設定することができ、検査DNAの高メチル化値が異常値と同程度類似、または同じ範囲であれば、21トリソミーの診断を下すことができる。III.特異的メチル化領域DMRの同定法別の態様では、本発明は、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離することに基づき、胎児DNAの高メチル化された、および母体DNAの低メチル化された、特異的メチル化領域DMRの同定法を提供する。実施例1および2において記載されるように、本明細書に記載の手法は、胎児DNAにおいて、成人女性の末梢血DNAと比較して高メチル化レベルを呈する、21番、13番、18番、XおよびY染色体上の特異的メチル化領域高メチル化の大きなパネルを同定するために、染色体全体に適用された。されに、これら同じ手法が、これら同じ染色体上の追加DMRを同定するために、およびその他の染色体上の新たなDMRを同定するために、適用され得る。従って、別の態様では、本発明は、胎児異数性の診断に利用するのに適している、関心対象の染色体上の特異的メチル化領域DMRを同定する方法を提供する。当該方法には、以下が含まれる:a以下を提供することi正常な成人女性の末梢血DNA試料PB試料;およびii正常な胎盤DNA試料PL試料;baの各サンプルにおいて、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離し、i分離したPB試料;およびiii分離したPL試料;を得;およびcbの分離した試料それぞれにおいて、関心対象の染色体上の複数の領域のレベルを決定し;およびd分離したPB試料では低メチル化され、分離したPL試料では高メチル化されている領域を選択し、よって、本明細書に記載の診断法で利用するのに適している、関心対象の染色体上の特異的メチル化領域DMRを同定する。1つの実施形態では、PL試料には、2つの異なる試料、すなわち、第1トリメスターPL試料および第3トリメスターPL試料が含まれ、ここで、前記工程dにおいてさらに、第1トリメスターの分離PL試料および第3トリメスターの分離PL試料の中で同じメチル化度を有する領域を選択することが含まれる。好ましい実施形態では、関心対象の染色体は21番染色体である。その他の様々な実施形態では、関心対象の染色体は、13番染色体、18番染色体、X染色体およびY染色体から成る群から選択される。好ましくは、異数性はトリソミーである。本明細書で使用されている正常な成人女性とは、染色体異数性を有しない女性のことである。本明細書で使用されている正常な胎盤DNAとは、染色体異数性を有しない胎児の胎盤由来のDNAのことである。先にセクションIで記載した通り、各試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから分離する。この分離は、セクションIに記載の通り、分離した試料を得るために、メチル化DNA免疫沈降MeDiPにより達成されることが好ましい。本明細書で使用されている分離されたPB試料および分離されたPL試料という用語は、低メチル化DNAから分離された高メチル化DNAを含有すると推定されるオリジナル末梢血試料またはオリジナル胎盤DNA試料の一部のことである。例えば、MeDiPが分離に使用される時、分離された試料とは、免疫沈降した末梢血DNA試料または胎盤DNA試料の断片のことである。好ましくは、分離後、分離されたPB試料および分離されたPL試料のDNAを、好ましくはLM-PCRで増幅する。よって、本実施形態では、リンカー末端は分離前にDNAと平滑末端ライゲーションされ、それから、分離した後に、先にセクションIに記載の通り、リンカー末端が認識するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、分離されたDNA試料にPCR法を実施する。関心対象の染色体上の複数領域レベルは、先のセクションIに記載の通り、分離された試料において、好ましくはリアルタイムQPCRにより、決定される。また、上記の通り、複数領域の高メチル化値を決定するために、コントロールおよび統計解析を生データに応用することもできる。最後に、関心対象の染色体上の特異的メチル化領域DMRを同定するために、正常な成人女性由来の分離された末梢血PB試料では低メチル化され、正常な胎児由来の分離された胎盤PL試料では高メチル化されている領域を選択する。IV.本発明のキット別の態様において、本発明では、本発明の診断法で利用され得るキットをも提供する。当該キットには、通常は、少なくとも1つの試薬およびキットの使用ガイドが含まれる。好ましい実施形態では、本発明は、21トリソミーの出生前診断のキットを提供する。当該キットには、以下が含まれる。a21番染色体上の複数の特異的メチル化領域DMRレベルを決定するための、1種または複数種の核酸組成物;およびb21トリソミーの非侵襲性出生前診断のための核酸組成物の使用ガイド。21番染色体上の複数のDMRは、例えば、添付Aのリストに示される21番染色体DMRから選択され得る。好ましくは、21番染色体の複数のDMRは、塩基対39279856-39280004SEQIDNO:33、塩基対44161178-44161323SEQIDNO:34、塩基対44161239-44161371SEQIDNO:35、塩基対33320735-33320829SEQIDNO:36、塩基対42189557-42189683SEQIDNO:37、塩基対42355712-42355815SEQIDNO:38、塩基対42357215-42357341SEQIDNO:39、塩基対22403649-22403792SEQIDNO:40、塩基対29136735-29136844SEQIDNO:41、塩基対32268843-32268943SEQIDNO:42、塩基対44079235-44079322SEQIDNO:43、塩基対37841284-37841411SEQIDNO:44、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも1つの領域を含む。別の実施形態では、21番染色体上の複数のDMRには、上に挙げた、2個またはそれ以上、3個またはそれ以上、4個またはそれ以上、5個またはそれ以上、6個またはそれ以上、7個またはそれ以上、8個またはそれ以上、9個またはそれ以上、あるいは10個またはそれ以上の領域が含まれる。好ましい実施形態では、21番染色体の複数のDMRには、SEQIDNOs:36、37、38、39、40、42、43および44を有する8個の領域から成る。上に列記された12個のDMRを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、実施例3および表7においてさらに詳細に記載され、SEQIDNOs:1~24に示されている。従って、キットの好ましい実施形態では、核酸組成物は、SEQIDNOs:1~24、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される1種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。さらに、高メチル化コントロール領域または低メチル化コントロール領域を増幅するための1種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーもキットに含めることができる。例えば、好ましい高メチル化コントロール領域にはCHR13HYP1が含まれ、そのプライマーはSEQIDNOs:25および26に示されているおよび、そのヌクレオチド配列はSEQIDNO:45に示されている。また、好ましい高メチル化コントロール領域にはCHR13HYP2も含まれ、そのプライマーはSEQIDNOs:27および28に示されている。好ましい低メチル化コントロール領域にはCHR22U1が含まれ、そのプライマーはSEQIDNOs:29および30に示されているおよび、そのヌクレオチド配列はSEQIDNO:46に示されている。また、好ましい低メチル化コントロール領域にはCHR22U2が含まれ、そのプライマーはSEQIDNOs:31および32に示されている。よって、コントロールDMRおよびプライマーについては、実施例1でさらに論じ、表6で詳述する。別の実施形態では、キットにはさらに、血液試料において、高メチル化DNAまたは低メチル化DNAを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する手段が含まれる。高メチル化DNAを低メチル化DNAから物理的に分離する好ましい手段には、5-メチルシトシンに特異的に結合する抗体等、メチル化DNAを免疫沈降する抗体が含まれる。別の実施形態では、キットにはさらに、高メチル化DNAを増幅する手段が含まれる。高メチル化DNAを増幅するのに好ましい手段には、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応LM-PCRを惹起する、オリゴヌクレオチドリンカーおよび/またはオリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。V.核酸組成物別の実施形態では、本発明では、本発明の方法およびキットで使用され得る核酸組成物を提供する。これら核酸組成物は、DMRを検知するのに有効である。例えば、好ましい実施形態では、核酸組成物には、添付Aに示されるリストから選択された、1個または複数のDMR等、本発明の1個または複数のDMRを増幅するのに有効である1種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。オリゴヌクレオチドプライマーは単離されている、すなわち、異なる望ましくない特異性を有しないその他のプライマーから精製されている、または分離されていることが好ましい。さらに、単離されたオリゴヌクレオチドプライマーは、染色体DNAまたはその他自然または天然由来の核酸等、自然または天然に存在する場所にプライマー配列を並べることができる、その他の核酸から精製され、または分離される。好ましい実施形態では、本発明は、DMRのEP1~EP12表7を増幅するために、、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される1種または複数種の単離されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む核酸組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、高メチル化コントロール領域または低メチル化コントロール領域を増幅するために、、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される1種または複数種の単離されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む核酸組成物を提供する。VI実施例以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これらは本発明を限定するものと解釈するべきではない。すべての参照、添付、遺伝子バンクエントリー、本願で引用されている特許および公開特許出願は、その全体を、本明細書に引用により明示的に含めるものとする。実施例1:胎盤血液および末梢血液の間の特異的DNAメチル化の部位同定本実施例では、高スループット方式でDNAメチル化パターンの全染色体同定を可能とするよう、メチル化DNA免疫沈降MeDiPと高解像度タイリングオリゴヌクレオチドアレイ解析を組み合わせたシステムを利用して、13番、18番、21番、XおよびY染色体の特異的メチル化領域DMRが同定された。本実施例に記載の実験はまた、Papageorgiou,E.A.ら2009Am.J.Pathol.174:1609-1618に記載されており、その内容全体を、補足的データおよび資料として本明細書に引用により明示的に含めるものとする。材料および方法ヒトの試料本研究で使用された試料は、AMSBiotechnologyEuropeLtdOxon、イギリスより取得された。これらの試料は、元々はBiochain社Hayward、カリフォルニアから取得されたものであるが、組織内倫理審査委員会IRB承認のプロトコルによる同意を得た。本研究では、全部で5人の女性の正常な末梢血液試料および5つの正常な胎盤DNA試料が使われた。胎盤DNA試料のうち3つは妊娠第1トリメスターから採取され、そのうち1つは女の胎児から、2つは男の胎児から採取された。残り2つの胎盤DNA試料は妊娠第3トリメスターから採取され、1つは女の胎児から、もう一つは男の胎児から得られた。LM-PCR増幅と組み合わせたMeDiPアッセイMeDiPアッセイWeber,M.ら2005Nat.Genet.37:853-862に続いて、Ren、B.ら2000Science22:2306-2309およびOberley、M.J.ら2005MethodsEnzymol.376:315-334に記載の通りに、だが修正を加えて、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応LM-PCRを行った。手短には、全体で100μlの量のうち2.5μgのDNAを、まず、Virsonic300超音波発生装置Virtis;Gardiner、ニューヨークを使って超音波により約300bp~1000bpの断片に分断した。最終量が最大120μlとなるように、1XNEBbuffer2NewEnglandBioLabs;Ipswich、イギリス、10XBSANewEnglandBioLabs;Ipswich、イギリス、100mMのdNTPミックス、T4DNAポリメラーゼ3U/μlNewEnglandBioLabs;Ipswich、イギリスおよび蒸留水と組み合わせた後、DNA断片を平滑末端にした。12°Cで20分間インキュベートした後、DNACleanandConcentrator-5TMZymoResearchCorp;Glasgow、スコットランドを用いて、製造者のプロトコルに従って反応のクリーンアップを行った。しかし、最後の溶出ステップは、QiAquickPCR精製キットQiagen;WestSussex、イギリスにより提供される30μlのEBバッファで行った。クリーンアップされた試料は、その後、先にRen,Bら2000supra、Oberley,M.J.ら2004supraにより記載されたように、40μlのアニールしたリンカー50μMSIGMAGenosys;Gillingham、イギリス、T4DNAリガーゼ10XバッファRoche;Mannheim、ドイツ、6μlのT4DNAリガーゼ5U/μlRoche;Mannheim、ドイツおよび蒸留水と混合し、最終量が最大101μlとなるようにした。その後、試料を一晩、16°Cでインキュベートし、アダプターがライゲーションするようにした。上記のDNACleanandConcentrator-5TMZymoResearchCorp;Glasgow、スコットランドを用いて試料を精製した。その後、溶出された試料を、100mMのdNTPミックス、1xPCRGoldBufferRoche;Mannheim、ドイツ、1.5mMのMgCl2Roche;Mannheim、ドイツ、および5UのAmpliTaqポリメラーゼと合わせた。その後、70°Cで10分間インキュベートし、DNAオーバーハングを充填し、上記のDNACleanandConcentrator-5TMZymoResearchCorp;Glasgow、スコットランドを用いて試料を精製した。50ngのDNAを取り除き、遺伝子コントロールDNAとして利用するために保有した。反応を適宜スケールダウンした後に、先に記述されているようにWeber,M.ら2005supra、残りのライゲーションしたDNA試料700ng~1.2μgをMeDiP処理した。その後、免疫沈降したDNAを、DNACleanandConcentrator-5TM700μlのライゲーションバッファを使用してを用いて、製造者の指示書に従ってクリーンアップした。Advantage-GCGenomicPCRキットClontech;Saint-Germain-en-Laye、フランスを用いて、10ngの各インプットおよび免疫沈降したDNA断片を使って、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応LM-PCRを行った。適用した温度循環条件は、95°Cで2分間であり、94°Cで30秒間および68°Cで3分間を20サイクル、および68°Cで10分間であった。PCR増幅の後、QIAquickPCR精製キットQiagen;WestSussex、イギリスを用いて反応を精製し、予め50°Cに温めた50μlの蒸留水で溶出した。アレイハイブリダイゼーションインプットおよび女性の末梢血DNA由来の免疫沈降DNA断片、妊娠第3トリメスター中の胎盤DNA試料および妊娠第1トリメスターDNA胎盤試料胎盤試料は共に男の胎児から採取されたを、ハイブリダイゼーションのためにRocheNimbleGenIncReykjsvik、アイスランドに送った。使用されたアレイプラットフォームは、13番、18番、21番、XおよびY染色体に特化された解像度タイリングオリゴヌクレオチドアレイ解析法であり、プローブ間隔の中央値は、13番染色体で225bp、18番染色体で170bp、21番染色体で70bp、X染色体で340bpおよびY染色体で20bpであった。手短には、インプット遺伝子コントロールDNAおよび各試料の免疫沈降DNAは、蛍光性染料Cy3、Cy5で特異的にラベル化し、その後オリゴヌクレオチドアレイで共ハイブリダイズさせた。生データに関しては、ArrayExpresshttp://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae/で、アクセション番号E-TABM-507を指定してアクセス可能である。タイリングオリゴヌクレオチドアレイのデータ解析胎盤と末梢血との間のメチル化の相対的差分を計算するために、末梢血DNAから得られたオリゴヌクレオチドアレイ正規化log2比値免疫沈降物対インプット断片を、Rstatisticalcomputingenvironmenthttp://www.r-project.orgを使って、胎盤DNAから採取したlog2比値免疫沈降物対インプット断片から差し引いた。正の差分は胎盤DNAにおける相対的高メチル化を表し、負の差分は、相対的低メチル化を表す。その後、差し引いたlog2比率データの一般的な特徴の形式GFFファイルを作成し、その結果を、SignalMapviewerNimbleGensystem;Reykjsvik、アイスランドを使って、遺伝子、CpGアイランドおよび13番、18番、21番、XおよびY染色体全てのCG内容と共に閲覧した。遺伝子データは、Ensemblgenomebrowser、NCBIbuild36http://www.ensembl.org.からダウンロードし、CpGアイランドとCG内容は、UCSCゲノムブラウザNCBIbuild36http://genome.ucsc.edu.からダウンロードした。末梢血と胎盤の間の重要な特異的メチル化の豊富な領域を自動的に選択するために、先に、CopyNumberVariationCNVコーリングPrice,T.S.ら2005NucleicAcidsRes.16:3455-3464に用いられてきたArray-CGHSW-ARRAYに適合させたSmith-Watermanダイナミックプログラミングアルゴリズムを応用した。本アルゴリズムは、末梢血DNAと比較して胎盤DNAではメチル化濃縮またはメチル化枯渇のいずれかを示す連続的オリゴヌクレオチド類のセグメントまたはアイランドを同定するのに用いられた。各オリゴヌクレオチドアレイデータを染色体アームにより分析した。0.2と1との間のSW-ARRAYの閾値t0は、同じメチル化状態を有し、異なる閾値t0で得られたスコアのうち最も高いスコアを示す、少なくとも2つの連続的オリゴヌクレオチドの同定に基づき、相対的にスコアの高いセグメントまたはアイランドをコーリングするのに最適な値を同定するために検査された。SW-ARRAYにより同定された特異的メチル化領域と、遺伝子の位置、プロモーター領域各遺伝子の5末端の2kb上流までさかのぼる領域として定義したおよびCpGアイランドとの間を直接比較が行われた。上記の分析により、非侵襲性出生前診断のためのコピー数すなわち、例えば、21トリソミーの同定用の定量的アッセイ前の濃縮方法としてMeDiPを利用するための、特異的メチル化遺伝子領域が同定されるが、選択された標的が胎児において高メチル化されたことも重要である。よって、MeDiPは、母体の低メチル化DNAを枯渇させ、胎児の高メチル化DNAアッセイが行えるようにするために使われるであろう。よって、免疫沈降対インプットの比率が胎盤では正であり、末梢血試料胎盤の高メチル化では負である全領域を同定した。他者が調べたその他のアッセイシステムについて、胎盤におけるDNAの高メチル化が求められ、そのため、免疫沈降対インプットの比率が、胎盤において負であり、末梢血試料において正である全領域も記録した。これを達成するために、末梢血DNAから採取されたオリゴヌクレオチド正規化log2比値免疫沈降物対インプット断片を、比率の印が異なる場合にのみ胎盤DNAから得られたlog2比値免疫沈降物対インプット断片から差し引いた。胎盤の中の最も特異的に高メチル化されている少数の領域21番染色体上には8領域、および、18番染色体SERPINB5プロモーター領域には1領域が、1.0より大きい任意の異なるカットオフ比率連続的プローブのうち少なくとも1つがlog2比値>1を示すを用いてさらなる検証およびアッセイ開発を行うために、このデータから選択された。リアルタイム定量PCRによるタイリングオリゴヌクレオチドアレイデータの確認21番染色体および18番染色体上の選択された領域のメチル化濃縮は、リアルタイム定量PCRで確認された。この目的のために、5人の女性の末梢血DNA試料、および、妊娠第1トリメスターおよび妊娠第3トリメスターの胎盤のDNA試料5人分を使用した。関心対象の領域に特異なプライマーを、primer3のウェブサイトhttp://frodo.wi.mit.edu/.を使って設計した。プライマー設計は、SYBRGreen蛍光融解曲線解析で推奨されているように、長さ80~150bpの産物を生じるよう最適化された。さらに、全プライマーのTmは、60°Cで閉じるよう選択された。プライマー配列とPCR産物配列双方の一意性に関しては、Blatを使ってヒト参照配列上にこれらをマッピングすることにより確認された。プライマーは、SigmaGenosysGillingham、イギリスより購入した。免疫沈降したメチル化DNAまたはインプット遺伝子DNAのいずれかを20ngを有し、最終量を25μlとして、それぞれの定量PCRを行った。SYBRGreenPCRマスターミックスEurogentec;Seraing、ベルギーおよびABIPrism7900HTSequenceDetectionSystemAppliedBiosystemsが使用された。最初に、正常な遺伝子DNAを使って一連の希釈を検査した後150~900nM、各プライマーにとって最適な濃度が選択された。それぞれ選択された濃度ついて、1:2の連続希釈200ng削減して3.125ngへで検量線を計算し、最終的に3倍で試料反応を行った。増幅プログラムは、50°Cで2分間と95°Cで10分間から成り、その後、95°Cで15秒間の変性を40サイクル、および、60°Cで1分間のアニーリング/伸張を行った。増幅後に、反応混合物を60°C~95°Cで、0.2°C/秒の割合で加熱することにより、融解曲線解析を行った。増幅反応では常に、アガロースゲル電気泳動による非特異産物のチェックが行われる。MeDiPアッセイの後、標的の配列の濃縮を評価するために、検査DNA免疫沈降またはインプットDNACTtestと、インプットゲノムDNAに対する免疫沈降DNA中の未処理の正常ゲノム遺伝子DNAとの間で計算されたサイクル差分の比率を計算した。加えて、末梢血と比較して胎盤試料のメチル化濃縮を評価するために、胎盤の免疫沈降DNA対末梢血免疫沈降DNAの比率を計算した。さらに、本実施例のヌクレオチドアレイの結果により判明した、末梢血DNA試料と胎盤DNA試料で同様のメチル化状態を示すコントロール領域を、MeDiPまたはPCR増幅バイアスの可能性を検査する度に、使用した。個人間または技術的複写実験間における、メチル化濃縮の変動性および再現性の中央値は、検査対象の異なる試料の全比値、または、特定の領域の技術的複製の全比値の平均値IP/INPUTの平均を計算することにより得られた。その後、各検査の再現性評価のために各比値を平均比値で除算し、パーセンテージIPi/INPUTi/中央値IPi/INPUTi、IPii/INPUTii、=Riで表した。IPi:i番目試料の免疫沈降DNA、INPUTi:i番目試料のインプットDNA、RI:i番目試料の再現性。再現性の中央値は、異なる再現性値全ての中央値を計算して得たRi、Riis...。最後に、変動性は、以下の公式を使って計算した:1-Rix100=Viおよび変動性の中央値:中央値Vi、Vii、。Vi=i番目試料の変動性。結果特異的メチル化マーカー候補の選択当初、胎盤DNAと末梢血DNAの比率差相対的メチル化を計算するために、胎盤DNA試料および末梢血DNA試料双方の13番、18番、21番、XおよびY染色体のオリゴヌクレオチドアレイ正規化log2比値が使われた。本発明では、末梢血と胎盤との間で特異的メチル化領域を同定するためにSW-ARRAYを使用した。領域の同定に最適なSW-ARRAY閾値は、全染色体に対し0.9であることが分かった。第1トリメスターおよび第3トリメスターにおいて、末梢血DNAと比較してSW-ARRAY分析により同定された特異的メチル化領域については、21番、13番、18番、XおよびY染色体のそれぞれに関して、添付A~Eに示されている。本発明では、高メチル化であると同定した領域の数は、以下の表1に概要を示すように、検査対象となった5つの染色体全てにおいて低メチル化の領域数とほぼ同じであった。さらに、特異的メチル化領域の合計数は、表1に概要を示すように、第1トリメスターおよび第3トリメスターの胎盤に匹敵する。同定された遺伝子座、添付A~Eに示されるように、遺伝子の位置、プロモーター領域並びにCpGアイランドの位置と直接相関関係にある。表113番、18番、21番、XおよびY染色体における、末梢血DNA試料との比較した胎盤の特異的メチル化領域同定された領域の17.5~43.6は遺伝子内に位置し、それらのメチル化状態は、表2に示すように、染色体により並びにトリメスターにより異なっていた。13番染色体およびY染色体に関しては、特異的メチル化領域遺伝子内に存在は、第1トリメスターの胎盤の大部分は、第1トリメスターでは低メチル化状態であるが、その大部分は、第3トリメスターで高メチル化された。表2に概要が示されているように、21番染色体およびX染色体では、大部分の領域は第1トリメスターおよび第3トリメスター双方とも低メチル化状態であったが、18番染色体では、高メチル化と低メチル化の領域数は等しかった。表213番、18番、21番、XおよびY染色体の遺伝子内に位置する特異的メチル化領域さらに、以下の表3Aに概要が示されているように、同定された領域ゲノムおよび非ゲノム領域のわずかなパーセンテージ1.6~11.0は、CpGアイランドと重複していた。特異的メチル化領域と同定されたCpGアイランドの大部分は、遺伝子内に各遺伝子の最大5末端2kb上流領域と同定された、適切なプロモーター部位を含む位置し、これらの相当数最大65.5は、プロモーター領域内に特異的に位置していた。各染色体における、および第1トリメスター並びに第3トリメスターにおけるこれら領域のメチル化状態については、以下の表3Bに示されている。表3A13番、18番、21番、XおよびY染色体における、CpGアイランドと重複するメチル化領域の数表3B13番、18番、21番、XおよびY染色体の特異的メチル化領域に位置するゲノム、非ゲノムおよびプロモーターCpGアイランドのメチル化状態タイリングオリゴヌクレオチドアレイ結果の検証アレイ解析を検証するために、まず、リアルタイム定量PCRによる従来の調査領域のメチル化状態を分析した。本発明では、SERPINB5プロモーター領域は、胎盤では低メチル化状態、末梢血では高メチル化状態であったが、これは、Chim,S.S.ら2005Proc.Natl.Acad.Sci.USA11:14753-14758の研究と一致している。さらに、抗画像アレイ解析により同定されたメチル化を検証するために、SERPINB5プロモーター領域を含む追加の9領域Chim,S.S.ら2005supraについて、リアルタイム定量PCRで解析した。各領域を対象とするため、様々なプライマーが設計された。各プライマーは、使用前に検査し、各プライマーに最適な濃度を決定した。一つの実施例として、21番染色体図1に位置する領域のオリゴヌクレオチドアレイの結果を、図2に示すリアルタイム定量PCR結果と比較することができる。オリゴヌクレオチドアレイ混成で使用したのと同じ末梢血および胎盤DNA試料を、PCR検証のためにも使用した。両方法において、末梢血と比較した胎盤のメチル化濃縮が報告されている。さらに、オリゴヌクレオチドアレイおよびリアルタイム定量PCR双方とも、第3トリメスター胎盤DNA試料と比較して、第1トリメスター胎盤DNA試料におけるメチル化濃縮の度合いが低いことを示している。しかしながら、第1トリメスターで観察されたメチル化濃縮は、末梢血DNA試料から得られたメチル化濃縮に比べて高かった。本発明者は、アレイ解析と定量PCRの間で、9つの全領域並びにSERPINB5プロモーター領域の特異的メチル化に一致が見られることを発見した。しかし、リアルタイム定量PCRを使って得られた相対的濃縮倍率は、オリゴヌクレオチドアレイ解析により得られた濃縮より一般的に大きいことが分かった。MeDiP-LMPCR効率の評価MeDiP手順による実験的再現性を単一の胎盤DNA試料の技術的複製を行うことにより評価し、21番染色体上の2個の領域のメチル化状態をリアルタイム定量PCRにより評価した。再現性の中央値は、98.62および95.84であった。異なる個体の選択された領域のメチル化状態を評価する個体間のメチル化状態の正常な変動性を評価するために、本発明者は、前記の9つの選択された領域のリアルタイム定量PCRアッセイを、5つの異なる末梢血および3つの異なる第1トリメスター胎盤に応用した。第3トリメスター胎盤のうち2つのメチル化状態は、選択された領域の4つのみで検査した。妊娠第1トリメスター期間が、非侵襲性出生前診断の開発に最も適しているため、第1トリメスター胎盤を好んで使用した本研究においては、第3トリメスター胎盤の個体間変動性のさらなる調査は必要なかった。CHR21B4の結果は図3に示した。表4に概要が示されているように、5つの末梢血試料全てが、個体間でDNAメチル化濃縮の変動性を有する5つの胎盤DNAと比較して低メチル化であることが分かった。第3トリメスター胎盤と比較して、第1トリメスター胎盤ではメチル化濃縮が少なく、オリゴヌクレオチドアレイの結果を確認した図3参照。より低い変動性レベルが、同じ妊娠月齢の異なる胎盤間で観察された。表4同じ組織末梢血PBまたは胎盤PLから採取された異なる試料間のメチル化変動性パーセンテージ、および18番染色体並びに21番染色体に位置する複数領域用に計算された妊娠月齢胎盤リアルタイム定量PCRによるこの時点までの検査領域の大部分では、妊娠月齢の異なる胎盤DNA試料間のメチル化変動性が示された表4を参照。しかし、全ての領域でこの効果が表れたわけではなかった。一つの実施例では、表4に示すように、18番染色体CHR18A上に位置する領域である。第1トリメスター胎盤と第3トリメスター胎盤のメチル化レベルの違いは、この領域に関してはわずかであることが分かった。さらに、第1トリメスター胎盤と第3トリメスター胎盤との間でDNAメチル化状態が逆である領域、並びに特異的メチル化を示す領域を同定した。その例を以下の表5に示す。表5第1トリメスター胎盤DNAと第3トリメスター胎盤DNAではメチル化状態が逆である、または、末梢血DNAと比べて特定の胎児月齢において特異的にメチル化されていることが判明した領域の例特異的メチル化コントロール領域全実験におけるMeDiP効率を評価するために、本発明者は、コントロールとして用いるためのアレイ実験から特異的メチル化が同程度であった、2つの高メチル化領域と2つの低メチル化領域を選択した。これらのコントロール領域を検知するために使われたプライマーについては、以下の表6に概要を示した。その中で、CHR13HYP1プライマーおよびCHR13HYP2プライマーは、高メチル化コントロール領域を検知し、CHR22U1およびCHR22U2は低メチル化コントロール領域を検知する。表6リアルタイム定量PCRにより異なる試料のMeDiP効率を評価するために使用されるコントロールプライマーこれら領域のメチル化状態は、末梢血および胎盤の複数の試料においてリアルタイム定量PCRにより評価した。13番染色体の領域の結果については、末梢血DNAおよび胎盤DNAの双方とも高メチル化であると予想されていたが、図4に示した。同じDNA試料が、全コントロールプライマーの検査に使用された。個体間のメチル化濃縮の再現性の中央値は、CHR13HYP1では98.48、CHR13HYP2では96.02、CHR22U1では98.71、およびCHR22U2では99.75であった。実施例2:特異的メチル化領域DMRの同定に関する追加の記載本実験では、特異的メチル化領域DMRがどのように同定されたか、また、これらDMRのうち、母体DNAでは低メチル化であり、胎児DNAでは高メチル化である特異的メチル化領域がどのように優先的に選択されたか、これらに関する追加の詳細な説明を提供する。本方法のフローチャート図は、図5に示されている。当該図では、13番染色体、18番、21番、XおよびY染色体全体のDMR同定に向けたMeDiPLM-PCRおよびオリゴーアレイハイブリダイゼーション手順の適用を示している。試料1人の正常な成人女性の末梢血PB由来のDNA試料、1つの正常な第1トリメスター胎盤PL1および1つの正常な第3トリメスター胎盤PL3が非血縁同士の個人から採取された。試料は、元々は、Biochain社Hayward、カリフォルニアで採取されたものだが、AMSBiotechnologyヨーロッパLtdOxon、イギリスを通じて供給された。これら試料に対する同意書は、組織内倫理審査委員会IRBにより承認されたプロトコルに従って取得された。DMRの同定最初に、メチル化DNA免疫沈降MeDiPおよびライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応LM-PCRを、1人の正常な成人女性の末梢血PB由来のDNA試料、1つの正常な第1トリメスター胎盤PL1および1つの正常な第3トリメスター胎盤PL3に適用された。さらに詳細には、MeDiPアッセイWeber、M.ら2005Nat.Genet.37:853-862に詳細が記載されているに続き、LM-PCRRen,B.ら2000Science22:2306-2309;Oberley,M.J.ら2004MethodsEnzymol.376:315-334に詳細が記載されているを行った。当該方法論に関しては、先の記述にRakyan、K.V.ら2008GenomeResearch18:1518-1529に微修正を加えた方法を行った。図5に、当該手順のフローチャート図が提供されている。DNA断片化およびリンカーのアニール手短に、総量100μl中のDNA試料2.5μgを、VirSonicDigital600超音波発生装置Virtis;Gardiner、ニューヨーク図1を使って超音波により約300bp~1000bpの大きさにせん断した。試料のDNA断片は、1XNEBbuffer2NewEnglandBioLabs;Ipswich、イギリス、10XBSANewEnglandBioLabs;Ipswich、イギリス、100mMのdNTPミックス、T4DNAポリメラーゼ3U/μlNewEnglandBioLabs;Ipswich、イギリスおよび蒸留水と合わせ、最終量を最大120μlにした後、平滑末端にした図5。12°Cで20分間インキュベートした後、QIAquickPCR精製キットQiagen;WestSussex、イギリスを使い、製造者のプロトコルに従って反応をクリーンアップした。しかし、最終溶出ステップでは、30μlのEBバッファで行った。クリーンアップされた試料はその後、以前の記載Ren,B.ら2002、supra;Oberley,M.J.ら2004、supraに従って生成された40μlのアニールされたリンカー50μMSIGMAGenosys;Gillingham、イギリス、T4DNAリガーゼ10XバッファRoche;Mannheim、ドイツ、6μlのT4DNAリガーゼ5U/μlRoche;Mannheim、ドイツ、および蒸留水と混ぜ合わせ、最終量を最大101μlにした。試料はその後、16°Cで一晩インキュベートし、アダプターがライゲーションするようにした図5。上記のQIAquickPCR精製キットを使って試料を精製した。溶出試料は、その後、100mMのdNTPミックス、1xPCRGoldBufferRoche;Mannheim、ドイツ、1.5mMのMgCl2Roche;Mannheim、ドイツ、および5UAmpliTaqポリメラーゼと配合された。これらの試料を70°Cで10分間インキュベートし、DNAオーバーハングを充填し、上記のQIAquickPCR精製キットを使って精製した図5。インプットおよびMeDiPDNA単離各試料から合計50ngのライゲーションしたDNAを取り除き、インプットゲノムコントロールDNAとして保有した図5。反応を適宜スケールダウンしたWeber,M.ら2005supra後に、残りのライゲーションしたDNA試料800ng-1.2μgを、先に記載した通りにMeDiP処理した。その後、免疫沈降したDNAを、前記QIAquickPCR精製キットを使って、製造者のプロトコルに従って精製した図5。LM-PCRライゲーション仲介PCR増幅LM-PCR反応は、Advantage-GCゲノムLAポリメラーゼミックスClontech;Saint-Germain-en-Laye、フランスを用いて、各インプットおよびIPDNA断片10ngとの間で行われた図5。適用した温度循環条件は、94°Cで1分間、94°Cで30秒、60°Cで30秒、および72°Cで2分間を20サイクル、および72°Cで5分間であった。PCR増幅後、前記QIAquickPCR精製キットを使って精製し、予め50°Cに温めた50μlの蒸留水で溶出した図5。13番、18番、21番、X、Y染色体に特化したオリゴ-アレイとの共ハイブリダイゼーションおよびデータ解析各試料のインプットおよびIPDNAを、13番、18番、21番、XおよびY染色体専用のオリゴアレイと共ハイブリダイズさせた。第1トリメスター胎盤および第3トリメスター胎盤双方の関心対象の染色体13番、18番、21番、XおよびY染色体全体のDMRを明らかにするために、PB比値をPL1比値およびPL3比値から差し引いた。さらに、末梢血DNAと比較して胎盤DNAの主要な特異的メチル化を有する領域を自動的に選択するために、Array-CGHSW-ARRAYに適合させたダイナミックプログラミングアルゴリズムを用いて応用した図5。先に同定されたDMRを解析し、検証するために、いくつかの実験が行われた。これらの実験には、複数のDNA試料に対しリアルタイム定量PCRを行うことにより、これら多数のDMRのメチル化状態を確認することが含まれる。異なる妊娠月齢の胎盤間の任意の特異的メチル化を同定するために、第1トリメスター胎盤と第3トリメスター胎盤との間から得られた結果比較した。さらに、個体間および技術的複製物間におけるメチル化レベルの変動性および再現性の評価を行った実施例1。実施例3:21トリソミーの非侵襲性診断検査の開発および検証本実施例において、実施例1および2に記載の方法に従って同定されたDMRが、21トリソミー本明細書ではNID21と称するの非侵襲性診断の開発および検証に使用された。当該方法論のフローチャート図は、図6に示されている。当該図には、NID21検査の開発及び検証に向けて、正常なケース20件および21トリソミーのケース20件を使用した実験手順が示されている。21トリソミーの非侵襲性診断検査開発のためのDMRの選択女性の末梢血試料および胎盤DNA試料実施例1および2との間で同定されたDMRをさらに掘り下げて調査し、21番染色体上に位置する12個の領域を選択した。NID21検査開発のために選択された領域と共に、13番染色体および22番染色体上に追加された2つの領域が、それぞれ高メチル化コントロールおよび低メチル化コントロールとして使用された。12個の領域の選択基準は、まず、末梢血DNA試料および胎盤DNA試料における領域のメチル化状態に基づいていた。さらに具体的には、胎盤の選択領域では高メチル化状態を示し、末梢血の選択領域では低メチル化状態を示さなければならない。第二に、選択領域には、メチル化状態の組織特異性を確実にするために、第1トリメスター胎盤と第3トリメスター胎盤との間に共通なメチル化状態を有しなければならない。最後に、これら領域で観察された特異的なメチル化のレベルは、高バックグラウンドな低メチル化DNAの中に存在する微量の高メチル化DNA試料を検査する時に効率的にメチル化状態を区別するよう、対数目盛で1の値より上でなければならない。上記の評価に基づき、選択されたDMR、またはそれらの一部を、NID21検査のDMRとして使用することができる。しかし、NID21検査に用いられ得るとして添付A~Eに示したリストのその他のDMRも、本明細書に記載の評価と同様の評価を示し得る。さらに、DMRの評価および選択は、13番、18番、XおよびY染色体の異数性のNIPDのために同様または異なる方法で使用することもできる。試料NID21検査の開発目的のために、本発明では、正常な胎児を妊娠している女性由来の20の母体末梢血試料と、ダウン症候群21トリソミー胎児T21胎児を妊娠している女性由来の20の母体末梢血を用いた。母体末梢血DNA試料はすべて、キプロスおよびギリシャの協力を通じて、CyprusInstituteofNeurologyandGeneticsにおいて、妊娠第1トリメスターから採取した。CyprusNationalBioethicsCommitteeにより承認された同意書が、参加者の各試料採取のために回収された。NID21検査の開発および検証MeDiPおよびLM-PCR準備QIAampDNAbloodMidiKitQiagen;WestSussex、イギリスを用いて、全試料からDNAを抽出した。正常な胎児を妊娠している女性由来の20の母体末梢血試料およびT21胎児を妊娠している女性由来の20の末梢血試料から単離されたDNAに対し、DNA断片化、リンカーアニーリング、MeDiPおよびLM-PCR処理を施し、その結果、図6に示すように、インプットおよびIPDNA断片を生じさせた。上記の方法論は、実施例1および2に記載されている。リアルタイムqPCRおよびデータ評価40の母体末梢血試料全てにおいて、予め選択された21番染色体上の12個のDMRおよび13番染色体並びに22番染色体の2つのコントロール領域に関するインプットおよびIP断片全てにリアルタイムqPCRを適用した図6。最初に、関心対象の領域に特異的なプライマーを、プライマー3ウェブサイトhttp://frodo.wi.mit.edu/.を使って設計した。リアルタイムqPCRに使用されたプライマーを表7に示す。表721番染色体の検査領域および13番染色体と22番染色体のコントロール領域用に設計されたプライマープライマー設計には、最適なSYBRGreen蛍光融解曲線解析に推奨されているように、長さ80~150bpの産物を生じるよう最適化された。さらに、全プライマーのTmは、60°Cで閉じるよう選択された。表7に記載のプライマーにより増幅された12個のDMREP1~EP12のヌクレオチド配列は、2個のコントロール領域HYP113およびU122のヌクレオチド配列と共に、以下の表8に示す。表821番染色体上の検査領域のヌクレオチド配列および13番染色体と22番染色体上のコントロール領域のヌクレオチド配列双方のプライマー配列およびPCR産物配列の独自性は、Blatを使って、これらをヒト参照配列上にマッピングすることにより確認した。プライマーは、SigmaGenosysGillingham、イギリスより購入した。各リアルタイムqPCR反応は、インプットまたはIPDNAのいずれか20ngを含む最終量25μlで行われた。本発明では、SYBRPCRマスターミックスEurogentec;Seraing、ベルギーおよびABIPrism7900HTSequenceDetectionSystemAppliedBiosystemsを使用した。当初は、各プライマーの最適濃度は、正常なゲノムDNA図7を使用した一連の希釈検査150~900nMの後に選択した。選択した各プライマーの濃度について、1:2の連続希釈200ng削減して3.125ngへで検量線を計算し、最終的に3回試料反応を行った。増幅プログラムは、50°Cで2分間、95°Cで10分間、次いで、95°C、15秒間の変性と60°C、1分のアニーリング/伸長とのサイクルを40回行うことから成っていた。増幅後、反応混合物を60°C~95°Cへ、02°C/秒の速度で加熱することにより融解曲線分析を行った。上記のリアルタイムqPCRにより、全てのインプットおよびIP断片図6CT値が得られた。取得されたCT値に一連の正規化ステップを施した。最初は、三重リアルタイムqPCR反応の平均CT値を、インプットおよびIP試料それぞれに計算した。よって、MeDiPおよびLM-PCRを適用中に行われたPCR反応の効率は、以下の数式を使って正規化された。ΔCTPBNormalCTPBNormalInputCTPBNormalIPΔCTPBT21CTPBT21InputCTPBT21IP但し、式中PB=末梢血であり、T21=21トリソミーである。上記の正規化は、全ての試料に対し、および、全ての選択されたDMRとコントロールに対し別々に行われた。その後、さらなる正規化のために、以下の数式によりリアルタイム定量PCRプライマーの効率が行われた。NormΔCTvaluePBNormalEΔCTPBNormalNormΔCTvaluePBT21EΔCTPBT21但し、式中E101slopeプライマーの効率Norm正規化正規化値は、各検査試料の各コントロール領域のメチル化濃縮に対応するコントロールプライマーから得た。PCR反応の正規化、およびリアルタイムqPCRプライマーの効率に基づく正規化に続いて、以下の数式を使って、選択されたDMRそれぞれに、別々に、NormΔCTPBNormalの中央値が計算された。MedianNormΔCTPBNormalMedianMedianNormΔCTPBNormalの計算には、検査対象の各DMRにおける各試料の比値を決定することが求められる。この比値は、以下の数式により決定される。RatioValueSampleDMRNormΔCTPBSampleMedian正常なケースから得られた比値は、正常なケースと異常なケースを区別する度合いを評価するために、検査対象の各DMRの21トリソミーから得られた比値と比較した。しかし、上記データの統計解析は、正常なケースと異常なケースを区別する統計的有意性を正確に決定するために重要である。統計解析正常なケースと21トリソミーのケースを区別するにあたり、12個のDMRそれぞれの統計的有意性を、Mann-WhitneyUTestを使って評価した。本検査は、2つの独立した観察セット本発明においては、正常試料および21トリソミー試料を有するセットが、同じ分布由来であるかどうかを評価するための、ノンパラメトリック検査である。その後、12個の各DMRにつきp値が報告された。p値が<0.05であれば有意とした。上記の結果のデータ評価に加えて、検査対象のDMR全てにつき、正常なケースおよび21トリソミーのケースの比値が、正常なケースと21トリソミーのケースを再評価するために使われた。最初に、正常なケースと21トリソミーのケースを区別するにあたり、12個の各領域の有意性を評価した。最後に、21トリソミーの全ケースおよび正常な全ケースの比値の中央値が、各DMRにつき別々に計算された。使用された数式は、以下の通りである。MedianratiovaluesPBNormalMedianMedianratiovaluesPBT21Medianその後、以下の数式に示すように、21トリソミーのケースの比値の中央値を、正常なケースの比値の中央値で除算した。MedianRatioValueDMRMedianratiovaluesPBT21MedianratiovaluesPBNormalDMRより得た比値の中央値は、降順に並べ、正常なケースと21トリソミーのケースの間の分離の度合いを示した。その後、ノンパラメトリックの中央値検査を行った。本検査は、2群が同じ中央値を有するかどうかを決定するためのカイ二乗検査である。その後、12個の各DMRのp値が報告された。p値が<0.05であれば有意とした。さらに、フィッシャーの多重検定が適用された。本検査では、様々なDMRのp値をまとめ、正常なケースと21トリソミーのケースを区別する統計的有意性について全般的評価を行った。本解析の最終目的は、新しいケースの結果を正確に解釈し、正常ケースまたは21トリソミーケースとして正確に分類できるようにすることであった。これを達成するために、コンピュータプログラムSPSSv16.0を使って行う判別分析DiscriminantAnalysisDAと呼ばれる解析を行った。DAは、各ケースの観察された特性に基づき、群の構成員の予測モデルを構築するために使われるテクニックである。すなわち、DAにおいて、通常は連続的予測変数のセットから、群の構成員を予測することが期待される。DAは、群の構成員が周知であるケースのサンプルから関数を導き出す。その後、予測変数の測定値を有するがどの群の構成員かは分からない新しいケースに適用され得る。2群のD値ができるだけ異なるよう線形判別方程式を組み立てる。線形判別方程式は以下の通りである。Di=ab1X1b2X2bPXP,1a=定数、b=非標準化係数、Xp=ratiovalueSampleDMRさらに詳細に、aおよびbは、周知のサンプルのセットを使って計算した値であり、方程式の組み立てに使われる。各b値は、1つのDMRに固有であり、よって、新しいケースを分類するたびに、特定のDMRのX値を、先に計算した同じDMRのb値と乗算する。本研究において、正常なケースおよび21トリソミーのケース正常なケース20件、21トリソミーのケース20件が同じ数であったため、Dが正の値D>0であれば、新しいケースは異常21トリソミーのケースであり、負の値D<0であれば、新しいケースは正常であるとみなすよう、方程式を組み立てた。正常または21トリソミーとしてケースを分類する別の方法として、いわゆるフィッシャーの分類関数係数を適用した。それぞれのケースにつき、各群のD関数を計算し、対応するD関数の値が最も高い群に分類される。本研究において、2つの群1つは正常なケース、もう1つは21トリソミーのケースが作られ、よって、1のような2つの関数が組み立てられた。D1は第1群正常なケースの関数を有し、D2は第2群21トリソミーのケースの係数を有する。新しいケースX1,,Xpの分類のために、2つの関数が評価された。D1>D2であれば、対象は第1群正常なケースに分類され、そうでなければ第2群21トリソミーに分類される。本研究の目的のため、様々なタイプのDAの中から、統計基準によりエントリの順番が決定する段階的判別解析を使用した。本実施例では、最も経済的な選択テクニック、すなわち、Wilkslambda基準を用いた段階的DAに集中した。段階的重回帰と同様に、エントリ基準および除外基準F基準またはp基準を設定することもできる。正確に分類する能力を有する判別関数を導き出す判別解析の能力は、分散等分分散性の正規性、線形性、均一性、予測値の独立性、多重共線性、および外れ値の影響が満たされている時に向上する。本研究では、上記の通り、本研究のデータを評価するために特定の統計検査を用いたが、代替的統計手法を利用しても、同じ結論に至る可能性がある。本研究では、21トリソミー胎児を妊娠した女性の妊娠期間中に、母体末梢血試料を検査して21トリソミーを正確に同定するには、表8EP1~EP12に記載のヌクレオチド配列を有する12個のDMRを使って、それらのDMRのうち8領域のみから成るサブセット、すなわち、EP4SEQIDNO:36、EP5SEQIDNO:37、EP6SEQIDNO:38、EP7SEQIDNO:39、EP8SEQIDNO:40、EP10SEQIDNO:42、EP11SEQIDNO:43およびEP12SEQIDNO:44から成るサブセットで十分であることが判明した。実施例4:21トリソミーの非侵襲性診断検査の追加説明および検証本実施例では、実施例3に記載の21トリソミーの非侵襲性診断検査について、さらに詳細に記述する。さらに、この胎児特異的メチル化比率方式を用いて、46の正常な妊娠および34の21トリソミー妊娠を100正確に診断することが示された。本実施例で使用された試料ここで行う診断戦略の目的のために、当初、周知の核型を有する40の母体末梢血試料正常な妊娠から20、21トリソミー妊娠から20を用いた。これら40の末梢血試料は、妊娠月齢11.1~14.4週の間から採取された。さらに、対象のアイデンティティおよび核型結果が、本検査を実行する試験者に分からないようにするために、40の追加試料が無作為に使用された。使用された80の試料は、キプロスおよびMitera病院,アテネ,ギリシャの協力を通じて、CyprusInstituteofNeurologyandGeneticsにおいて、妊娠第1トリメスターから採取した。これらの試料は、EDTAチューブで回収され、使用時まで-80°Cで、回収から最大6時間保管された。CyprusNationalBioethicsCommitteeにより承認された同意書が、参加者の各試料採取のために回収された。40の試料を6つの群に分けて検査した3つの正常なケースおよび3つの21トリソミーのケース。本実験に参加した3つの正常な試料の中央値を、特定の実験の21トリソミー試料とのみ比較した。21トリソミーの非侵襲性出生前検知のためのDMRの選択本発明者が先に同定したDMRについては、実施例1に記載されているが、それをさらに深く調べていくと、さらなる研究対象として、21番染色体上に位置する12個のDMRの選択という点に導かれた。12個のDMRは、3つの基準に基づき選択された。第一に、12個のDMRは、胎児特異的DMRメチル化濃縮を達成し、よって母体循環におけるffDNA量を増加させるために、胎盤においては高メチル化状態、末梢血においては低メチル化状態を示さなければならない。第二に、12個のDMRは、メチル化状態の組織特異性を確実にするために、第1トリメスター胎盤と第3トリメスター胎盤との間に共通なメチル化状態を有しなければならない。最後に、これらDMRで観察された特異的なメチル化のレベルが、当該領域に含まれるオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも1つにおいて、対数目盛で1の値より大きくなければならない。12個のDMRと共に、13番染色体HYP113および22番染色体U122上に位置する2つの追加領域は、実施例3に記載の通り、それぞれ、高メチル化コントロールおよび低メチル化コントロールとして使用された。胎児特異的DNAメチル化比率方式の開発および検証MeDiPおよびリアルタイムQPCRの応用DNAは、QIAampDNAbloodMidiKitQiagen;WestSussex、イギリスを用いて、各試料から1mlずつ抽出した。80の試料から単離されたDNAに対し、実施例1~3に記載の通り、メチル化部位の免疫沈降の処理を行った。簡潔に、2.5μgのDNAを、約300bp~1000bpの大きさの断片に超音波によりせん断した。DNA断片を平滑末端として、リンカーを作られた両端に追加した。各試料から合計50ngのライゲーションしたDNAを取り除き、インプットゲノムコントロールDNAとして保有した。残りのライゲーションしたDNA試料800ng~1.2μgには、実施例1~3に記載の通り、MeDiP処理を施した。最後に、DNAの量を増加させるために、インプットおよびIPDNA断片をそれぞれ10ngずつ用いて、ライゲーション仲介PCRLM-PCR反応を行った。その後、リアルタイムQPCRを、21番染色体上および二つのコントロール領域上の選択されたDMRのインプットおよびIPDNA断片全てに適用した。使用されたプライマー設計、最適化および循環条件の手順については、実施例1~3に記載の通りであった。21番染色体上の検査領域および13番染色体および22番染色体上のコントロール領域のために使用されたプライマーは、実施例3の表7に記載されている。統計解析法12個の選択されたDMRの区別の度合いを評価するために、既知の核型を有する40の試料を使用した。これを達成するために、12個の各DMRに関して、20の正常なケースの胎児特異的メチル化比値を20の21トリソミーケースの比値と比較した。生データを正規化するために、上記のリアルタイムqPCRにより、インプットおよびIP断片すべてにCT値を得た。取得されたCT値に一連の正規化ステップを施した。最初は、三重リアルタイムqPCR反応の平均CT値を、インプットおよびIP試料それぞれのために計算した。その後、MeDiPおよびLM-PCR適用中のPCR反応の効率を、以下の数式を使って正規化した。ΔCTPBNormalCTPBNormalInputCTPBNormalIPΔCTPBT21CTPBT21InputCTPBT21IP式中、PB=末梢血T21=21トリソミーIP=免疫沈降である。上記正規化は、全ての試料に対し、また、選択されたDMRおよびコントロールのすべてに対し別々に行った。その後、以下の公式によるさらなる正規化のために、リアルタイムqPCRのプライマー効率を使用したNormΔCTvaluePBNormalEΔCTPBNormalNormΔCTvaluePBT21EΔCTPBT21式中、E101slopeプライマーの効率、Norm正規化である。コントロールプライマーから得た正規化値は、検査された各試料の各コントロール領域のメチル化濃縮に対応する。PCR反応の正規化およびリアルタイムqPCRのプライマー効率に基づく正規化の後、以下の数式を使って、選択された各DMRのために、別々に、NormΔCTPBNormalの中央を計算した。MedianNormΔCTPBNormalMedian検査対象の各DMRにおける各試料の胎児特異的メチル化比値を決定するために、MedianNormΔCTPBNormalの計算が必要であった。本比値は、以下の数式を用いて決定した。RatioValueSampleDMRNormΔCTPBSampleMedian理論的には、正常なケースの比値は、21番染色体の場合、1および1.5でなければならない。しかし、観察された比率は通常、メチル化レベルの個体間変動性実施例1に記載並びに母体DNAバックグラウンドの存在のため、正常なケースの値よりも小さく、21トリソミーケースの値よりも大きい。各DMRの統計的有意性を正確に決定するためには、さらなる統計解析が必須であった。Mann-WhitneyU検査を用いて、統計評価を行った。本検査は、2つの独立した観察セットが同じ分布由来であるかどうかを評価するためのノンパラメトリック検査である。本解析の最終目的は、ケースの結果を正確に解釈し、正常または21トリソミーとして正確に分類することであった。これを達成するために、判別分析DiscriminantAnalysysDAと呼ばれる解析を行った。DAは、群の構成員が既知であるケースのサンプルから関数を導き出す。その後、予測変数の測定値を有するがどの群の構成員かは分からない新しいケースに適用され得る。2群のDA関数ができるだけ異なるように線形判別方程式を組み立てる。本研究の目的のために、異なるタイプのDAのうち、統計基準がエントリの順番を決定する段階的判別分析を用いた。本実施例では、最も経済的な技法、すなわちWilkslambda基準を用いた段階的DAに集中した。DMRが最終モデル含まれるには、多くの基準が満たされる必要があるF基準。DMRの最終モデルへのエントリには、DMRのFの最大有意性計算し、DMRの最終モデルからの除外には、Fの最小有意性を計算することにより基準が設定された。予測方程式が完成したら、無作為試験を行い、さらに結果を検証した。40の無作為試料を使って、8個の選択されたDMRのメチル化濃縮を検査した。各試料から得られた比値を予測方程式にあてはめ、それらの状態を正常かまたは21トリソミーかを判断した。MeDiP効率の評価MeDiP方法論の効率を評価するために、上記の80の母体末梢血試料を使って、既知の高メチル化HYP113領域および低メチル化U122領域を検査した。試料P1~P40は、予測方程式を作るために使用された既知の核型を有する試料であり、一方、試料P41~P80は、無作為試験に参加した試料である。試料P1~20およびP41~P66は、正常な胎児を妊娠した女性から採取した試料であり、一方、P21~P40およびP67~P80は、21トリソミーを有する胎児を妊娠した女性から採取した試料である。試料P1~20およびP41~66正常な試料に関して、HYP113コントロール領域のメチル化濃縮値は、3.66~8.68の範囲中央値=5.27であり、試料P21~P40およびP67~P8021トリソミー試料に関して、HYP113コントロール領域のメチル化濃縮値は、3.15~12.32の範囲中央値=4.68であった。試料P1~20およびP41~66正常試料に関して、U122コントロール領域のメチル化濃縮値は、0.00~0.15中央値=0.03であり、試料P21~P40およびP67~P8021トリソミー試料に関して、U122コントロール領域のメチル化濃縮値は、0.00~0.51中央値=0.04であった。よって、HYP113コントロール領域を試験すると高メチル化濃縮が観察されたが、これは、正常および21トリソミーの両ケースにおいて、3.15倍率変化またはそれ以上の値を有するメチル化状態であることを示している。一方、U122コントロール領域を検査すると、正常および21トリソミーの両ケースにおいて予想通り、0.51倍率変化またはそれ以下の低メチル化状態が示された。胎児特異的DNAメチル化比率方式の効率本明細書で記載されているように、40の既知の核型試料を用いて正常が20、21トリソミーが20、正常および21トリソミーケースのDNAメチル化比率を決定するための方式を開発した。本明細書で使用された胎児特異的メチル化比率方式は、図7にその略図を示した。その中で、正常なケースを21トリソミーのケースから区別する能力は、正常なケースと21トリソミーのケースから得られた比値を、21番染色体に位置する胎児特異的メチル化領域を使って比較することにより達成される。21トリソミーを有する胎児は、正常な胎児と比べて、胎児特異的メチル化領域の余分なコピーを有している。DNAメチル化濃縮の完成後、胎児DNAの量が母体循環で増加する。しかし、21トリソミーを有する胎児ではでは、領域に余分なコピーがあるため、正常なケースと比べて胎児特異的領域の量がより増加する。よって、正常な試験試料を有する正常なコントロールケースの母体末梢血比率は、21トリソミーケースと比較して、正常なコントロールケースの比値から逸脱する。正常なケースおよび21トリソミーケースにおけるDNAメチル化比率を決定するための分析方式について、図8にその略図が示されている。いったん胎児特異的メチル化領域のメチル化濃縮が完成すれば、正常なケースおよび21トリソミーケースにおける胎児DNAの量の相対的定量化を行うために、リアルタイムQPCRを胎児特異的メチル化領域に適用する。DNAメチル化比率を得るために、正常なケースから得られた正規化正規CT値を、正常なコントロールケースの正規中央値で除算した。同じ手順が、21トリソミーケースにも行われた。正常なケースの予測比値は1またはそれ以下であり、21トリソミーのケースでは、1またはそれ以上である。判別/予測方程式の作成に参加した、既知の核型を有する40の試料から得られた、12個の選択されたDMREP1~EP12の比値については、以下の表9に概要を示した。表9周知の核型を有する40の各試料由来の選択された12個の各DMRのために取得された胎児特異的メチル化比値の概要表9に示すように、正常なケースの比率中央値は、1.00またはそれより小さいのに対し、21トリソミーの比率中央値は、EP8広範な高メチル化比値を示したおよびEP11を除いて、1.00またはそれより大きい。図9は、正常なケースおよび21トリソミーケースにおける4個のDMR、すなわち、EP1、EP4、EP7およびEP10から得られた結果の箱髭図を示している。この箱髭図は5数要約を示している。すなわち、最小値および最大値、第3四分位点Q3および第1四分位点Q1、および中央値である。中央値は、箱の内側の線によって定められる。箱の長さは四分位間の範囲を表すIQR=Q3-Q1。箱のいずれかの端より3IQRより大きい値は極端外れ値として、アステリスクを付ける。箱のいずれかの端より1.5IQRを超えるが、3IQR未満の値は、軽度外れ値として丸印0を付ける。統計解析胎児特異的メチル化比値をさらに評価するために、本研究において、正常なケースを21トリソミーケースから区別するにあたり、12個の各DMRの統計的有意性を明らかにする、詳細な単変量統計解析を行うことが必須であった。これを達成するために、p値について各DMRの有意性を評価するMann-WhitneyUTestを使用した。各DMRに対し両側検定により得られたp値を、以下の表10に示す。表10p値計算により評価された各DMRの統計的有意性EP1、EP4、EP7およびEP10p<0.001等、正常なケースを21トリソミーケースと効率的に区別するDMRは、21トリソミーケース由来の値と比べて、正常なケース由来の値の範囲を明確に区別している。21トリソミーケース由来の値それぞれの値=1.74、1.79.2.17および2.03と比較した正常なケースの値値=1.00の中央値との差分によっても、特異的DMRに関してDMRの統計的有意性を評価できる。一方、EP8およびEP11等、統計的に有意でないp>0.05DMRにおいて、正常なケースおよび21トリソミーケースから得られた中央値は、1.00に近似している、例えば、EP11においては、中央値は、正常なケースにおいて1.00、21トリソミーケースにおいて0.94である。単一のDMRでは、正常妊娠であるかまたは21トリソミー妊娠であるか確信をもって正確に診断できないかもしれないが、複数のDMRを組み合わせることで、これを達成できるかもしれないと仮説を立てた。この仮説を検証するために、複数のDMRのサブセットまたは全体から理想的な組み合わせを作り出す統計ツールを使用した。判別分析DiscriminantAnalysisDAと称されるアプリケーションにより、正常妊娠または21トリソミー妊娠を正確に決定する統計手法が得られるとの結論に至った。方法のセクションにおいて論じたように、方程式の組み立てに最も適切なDMRを選択するために、続いて段階的選択手順を踏んだ。40のケースに判別分析DAを行った結果、12個のうち8個のDMRが予測方程式の最終モデルとなり、取り除かれるものはなかった。よって、段階的分析は8ステップから成り、それぞれに新たに予測変数が選択された。予測変数は、WilksLambda統計に従って、以下の順番で選択された。すなわち、EP40.646、EP120.456、EP60.340、EP50.251、EP70.210、EP110.159、EP100.133、およびEP80.122である。DMRのEP1、EP2、EP3およびEP9は、最終モデルから除外された。DMRの選択が終わると、各DMRの判別関数係数が計算された、値は、ケースを分類するのに用いられ得る予測方程式を組み立てるために使われた。以下の表11は、DA関数で8つの選択された各DMRの推定係数を示している。表11判別関数係数本予測方程式における係数の解釈は単純である。例えば、EP5で1単位増加すると、予測方程式値が1.188単位増加する表11。その結果、予測方程式は以下の通りとなる。D63310959XEP41188XEP50424XEP60621XEP70028XEP80387XEP100683XEP110897XEP12式中、XEPiratiovalueSampleEPi、i1、12である。正常ケースおよび21トリソミーケースの分類予測値、またはD値がカットポイントを超えるケースは、21トリソミーと分類し、カットポイントを下回ると評価したケースは、正常と評価する。ケースで構成される2群のサイズは等しく、カットポイントは0とする。よって、D>0の場合ケースは21トリソミーと分類され、そうでなければ正常と分類される。明らかに正常な妊娠から採取した試料は全て、D値が負であったが、明らかに21トリソミー妊娠から採取した試料は全てD値が正であった。正常であるかそれとも21トリソミーであるかかが明らかな40のケースのD値の範囲並びに中央値は、以下の表12に示されている。表12予測方程式を使った場合の、核型が判明している40の試料から得られた予測値オリジナルの検証方法によりDA関数の診断係数を統計的に評価したところ、正常なケースおよび21トリソミーケース全てを完全に分類したことが判明した。これらの結果は、方法論の特異度100および感度100に相当する。ケースを正確に分類する診断ルールが目的であるため、結果的に得られた判別関数の能力向上のために、すべての仮説を確認しなければならない。DA関数では、直線性の仮説は対となる予測因子間の関係にのみ適用される。非直線性では関係性の検知能が低減するため、研究者は通常、ある予測因子が常に他の予測因子と非直線的関係にあると明確に分かっている時にのみ注目する。本分析においては、そのような可能性を示す証拠は存在しない。予測因子の多変量正規性を仮定しても、関与する全ての予測因子に対する検査は容易に行えた。歪度および尖度の適切な信頼区間は、少なくとも部分的に-1、1の範囲を対象とする。これは、正規分布の変数の範囲である。外れ値に関しては、一般的に、各ケースとケースが属する群の重心との間のマハラノビス距離が評価されてきた。有意な偏差の報告はなく、いかなる影響も観察されていない。依存変数により定義された群の均一な共分散マトリックスの仮説のみが、判別分析の分類段階に影響を与え、BoxsMtestで評価される。本分析の場合がそうであるように、データに重要な外れ値が含まれないならば、判別関数分析は、分散均一性の仮説が満たされない時でもロバストである。1つの予測因子が、1つまたは複数の他の予測因子と強い相関関係にある場合、独立変数に対する当該因子の関係が誤って解釈される傾向にあるため、多重共線性が発生する。その結果、独立変数の説明に対する可能な一意の貢献が、他の予測因子に対する強い関係性のために最小化することとなる。独立変数の許容値が0.10より小さい場合、多重共線性が示唆される。結果として得られるDA関数の独立変数全てに対する許容値は、0.10より大きい。多重共線性は、本判別分析においては問題とはならない。提案するDA関数の適正を評価するために、本発明者は、DA関数で説明される独立変数において、分散の部分を示す関連固有値を取得した。値が大きければ大きいほど、関数は強くなる。さらに、標準係数を評価し、その平方根が、DAの予測因子で半別された独立変数の変量パーセントを表す。これらの値は、重要な関数は幾つあるかを決定するために使われる。本明細書では、判別関数はわずか1つであるため、ここでは問題とはならない。但し、固有値が1よりも大きいため、それは7.207となり、その正準相関は非常に高く93.7である。最後に、固有値の有意性に対する適切なWilksLambdatestを実施し、統計的に有意であることが判明したWilksLambda=1.222、p値=0.00。正常ケースおよび21トリソミーケースの無作為試験方法の特異度および感度は、40のサンプルから成る無作為試験により再評価された。本無作為試験は、予測方程式を構成する8個のDMRのメチル化状態を評価することにより行われた。試料の状態正常または21トリソミーを判断するD値を明らかにするために、本無作為試験で40のサンプルの8DMRから得られた比値を予測方程式に当てはめた。合計26のケースのD値は負であり、14のケースのD値は正であった。従って、表13にまとめるように、予測方程式によると26のケースは正常であり、14のケースは21トリソミーである。表13予測方程式を用いて、無作為試験に参加した40の試料から得られた予測値上記結果は、試料の核型と相互参照した後に確認し、先に予測した通り、NIPDアプローチの100特異度および100感度を示した。興味深いことに、本研究の結果は、RNA-SNP戦略それぞれ90および96.5Lo,Y.M.ら2007Nat.Med.13:218-223を用いた従来の研究と比較して、高い診断感度および特異度を示した。RNA-SNP研究には、12~20週の範囲にあるわずか10の21トリソミーケースしか含まれておらず、その21トリソミーケースのうちの1つは正しく分類されていなかった。本研究では、既知の核型を有する合計40のサンプル20は正常で、20は21トリソミー、並びに40の無作為サンプル26が正常で、14が21トリソミーが正確に分類され、100感度および100特異度をもたらした。全てのサンプルは、具体的に、妊娠第1トリメスターの月例11.1~14.4から採取された。さらに、本戦略の診断感度および特異度は、現在利用されている、後頚部浮腫およびバイオマーカーを含む第1トリメスターのスクリーニングプロトコルWald,N.J.ら1999NewEng.J.Med.341:461-467;Weisz、B.およびRodeck,C.H.2006Hum.Reprod.Update12:513-518と比較して、有意に大きいことが判明した。高コストで診断ラボへのアクセスが容易ではない次世代配列テクノロジーの応用等、新たに開発された方法と比較して、本研究にはさらに利点のあることが観察された。本方式では、MeDiPおよびリアルタイムQPCR方法を活用し、当該方法は、大型かつ高額なインフラを必要としないため、基礎的な診断を行うラボであればどこでもアクセス可能であり、技術的に容易であり、またコストも安価である。さらに、DNAの亜硫酸水素ナトリウム変換では、最大96のDNAが分解する可能性がありGrunau,C.ら2001Nucl.AcidsRes.29:E65-E65、限られた量のffDNAの定量化をさらに複雑にすることもあり得るが、本方式では、現在利用されているこのような方法論に比べて改良されている。さらに、本診断方式は、従来の研究Lo,Y.M.ら2007Nat.Med.13:218-223;Tsui,N.B.ら2009Prenat.Diagn.29:1031-1037;Tsui,N.B.ら2005Clin.Chem.51:2358-2362;Tsui,N.B.およびLo、Y.M.2008MethodsMol.Biol.444:275-289;Tong,Y.K.ら2009Clin.Chem.56:90-98と対照的に、胎児の性別または情報的多型部位informativepolymorphicsitesの存在による影響を受けない。本技術は広く利用される得るため、非常に重要である。本明細書に記載の本アプローチは、21トリソミーのNIPDへの道を開き、全ての診断ラボで日常的に利用され、全ての妊娠に応用可能となる可能性がある。係る非侵襲性アプローチは、現在行われている侵襲性のために正常な妊娠において流産するリスクを回避する。配列の概要添付A:21番染色体39頁中1頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中2頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中3頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中4頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中5頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中6頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中7頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中8頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中9頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中10頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中11頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中12頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中13頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中14頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中15頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中16頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中17頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中18頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中19頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中20頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中21頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中22頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中23頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中24頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中25頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中26頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中27頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中28頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中29頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中30頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中31頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中32頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中33頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中34頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中35頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中36頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中37頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中38頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付A:21番染色体39頁中39頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中1頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中2頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中3頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中4頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中5頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中6頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中7頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中8頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中9頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中10頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中11頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付B:13番染色体49頁中12頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsced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番染色体72頁中42頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中43頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中44頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中45頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中46頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中47頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中48頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中49頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中50頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中51頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中52頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中53頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中54頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中55頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中56頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中57頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中58頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中59頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中60頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中61頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中62頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中63頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中64頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中65頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中66頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中67頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中68頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中69頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中70頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中71頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付C:18番染色体72頁中72頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中1頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中2頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中3頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中4頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中5頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中6頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中7頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中8頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中9頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中10頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中11頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中12頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中13頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中14頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中15頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中16頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中17頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中18頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中19頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中20頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中21頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中22頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中23頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中24頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中25頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中26頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中27頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中28目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中29目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中30目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中31頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中32頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中33頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中34頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中35頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中36頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中37頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中38頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中39頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中40頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中41頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中42頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中43頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中44頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中45頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中46頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中47頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中48頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中49頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中50頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中51頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中52頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中53頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中54頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中55頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中56頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中57頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中58頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中59頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中60目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中61頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中62頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中63頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中64頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中65頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中66頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中67頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中68頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中69頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中70頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中71頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中72頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付D:X染色体73頁中73頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中1頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中2頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中3頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中4頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中5頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中6頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中7頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中8頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中9頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中10頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中11頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中12頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中13頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中14頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中15頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中16頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中17頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中18頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中19頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中20頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中21頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中22頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中23頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中24頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中25頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中26頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中27頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中28頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中29頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中30頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中31頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中32頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中33頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中34頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中35頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中36頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中37頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中38頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中39頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中40頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中41頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中42頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中43頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中44頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中45頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中46頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中47頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中48頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中49頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中50頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中51頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中52頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中53頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中54頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中55頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中56頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中57頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。添付E:Y染色体58頁中58頁目染色体上の位置はUCSCゲノムブラウザhttpgenomeucsceduビルド36から得た。"