以下のステップ~を含む、DNAポリメラーゼ活性測定法:二価鉄イオンと、熱帯熱マラリア原虫のミトコンドリアDNAポリメラーゼと、鋳型DNAと、及び一種又は二種以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸誘導体と、を含む溶液をインキュベートするステップ;合成された二本鎖DNAを検出するステップ;ステップの検出結果より、前記DNAポリメラーゼの活性を算出するステップ。前記ミトコンドリアDNAポリメラーゼが、配列番号1~7のいずれかの配列又は該配列の一部を改変した配列を含み且つDNAポリメラーゼ活性を示すタンパク質からなる、請求項1に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。前記ミトコンドリアDNAポリメラーゼが無細胞合成系で調製したタンパク質からなる、請求項1又は2に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。前記鋳型DNAが、活性化二本鎖DNA、又は一本鎖DNAや一種類のデオキシリボヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチド鎖とそれに相補的なプライマーとの組合せ、である、請求項1~3のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。二本鎖DNAの検出が、二本鎖DNA特異的な蛍光染色により行われる、請求項1~4のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。前記溶液の二価鉄イオン濃度が5mM~15mMである、請求項1~5のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。前記溶液のpHが7~8である、請求項1~6のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。ミトコンドリアDNAポリメラーゼが50°C~90°Cの温度条件で予め熱処理されている、請求項1~7のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。ステップのインキュベートを被験物質の存在下で行うことを特徴とする、請求項1~8のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。以下のステップ~を含む、抗マラリア化合物のスクリーニング法:被験物質の存在下、二価鉄イオンと、熱帯熱マラリア原虫のミトコンドリアDNAポリメラーゼと、鋳型DNAと、及び一種又は二種以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸誘導体と、を含む溶液をインキュベートするステップ;合成された二本鎖DNAを検出するステップ;ステップの検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、二本鎖DNA合成の阻害が認められることが有効性の指標となるステップ。被験物質非存在下であること以外はステップと同一条件下でインキュベートしたサンプルコントロール群を用意し、該コントロール群についてのステップの検出結果と比較してステップにおける有効性の判定を行う、請求項10に記載のスクリーニング法。ステップにおいて有効性を認めた被験物質について、熱帯熱マラリア原虫の核内DNAポリメラーゼに対する阻害活性を評価するステップ、を更に含む、請求項10又は11に記載のスクリーニング法。ステップにおいて有効性を認めた被験物質について、ヒトのDNAポリメラーゼに対する阻害活性を示さないことを確認するステップ、を更に含む、請求項10~12のいずれか一項に記載のスクリーニング法。本発明は抗マラリア薬の開発等に有用な手段ツールを提供することを課題とする。本発明者らは、上記課題を解決すべく、マラリア原虫のmtDNAポリメラーゼに注目して検討を進めた。マラリア原虫のミトコンドリアは、マラリア原虫の生存に必須のオルガネラであり、またその構造のユニークさから新規創薬のターゲットとして有力と考えられ、mtDNAの複製機構を解明することは、医学的見地からも非常に重要である。近年、高等植物から大腸菌DNAポリメラーゼIに類似したDNAポリメラーゼが同定されたChristensenetalPlantCell17280528162005KimuraetalNucleicAcidsRes130158515922002MorietalBiochemBiophysResCommun1933443502005OnoetalPlantCellPhysiol48167916922007。また、本発明者らの研究グループにおいても、真正粘菌からDNAポリメラーゼI類似のミトコンドリアDNAポリメラーゼが同定された。このPpPolAは、最もDNAポリメラーゼIに類似しており、原始的なミトコンドリアDNAポリメラーゼであることが予想された。そこで、PpPolAの配列に基づき相同性検索や局在解析などを行い、マラリア原虫のミトコンドリアDNAポリメラーゼを見出すことを目指した。その結果、マラリア原虫のミトコンドリアDNAポリメラーゼとして機能する可能性の高い配列を特定することに成功した。そして、試行錯誤の末、無細胞合成系を利用することによって当該配列の発現にも成功した。発現させたタンパク質の特性を検討した結果、驚くべきことに、その活性の発揮に二価鉄イオンFe2が必要であることが判明した。即ち、他のDNAポリメラーゼと異なり、マグネシウムやマンガンなどの二価金属イオンではなく二価の鉄イオン要求性を示すという、予想し得ない特性が明らかとなった。この特性はミトコンドリア画分を用いた実験にもよっても確認された。以上の通り、本発明者らの検討によって、マラリア原虫ミトコンドリアDNAポリメラーゼの活性発揮に必須の条件が見出された。この成果により、本酵素の活性をinvitroで測定すること、即ち本酵素の活性測定系の構築が可能になった。当該活性測定系は研究用ツールとしてはもちろんのこと、抗マラリア化合物をスクリーニングするための手段としても利用できる。つまり、抗マラリア薬の開発に資する技術でもあり、その価値は計り知れない。尚、本酵素の特性を詳細に検討した結果、Fe2に関する濃度依存性やpH依存性等、活性測定系を最適化する上で有益な知見も得られた。以下に列挙する本発明は主として上記成果に基づく。[1]以下のステップ~を含む、DNAポリメラーゼ活性測定法:二価鉄イオンと、熱帯熱マラリア原虫のミトコンドリアDNAポリメラーゼと、鋳型DNAと、及び一種又は二種以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸誘導体と、を含む溶液をインキュベートするステップ;合成された二本鎖DNAを検出するステップ;ステップの検出結果より、前記DNAポリメラーゼの活性を算出するステップ。[2]前記ミトコンドリアDNAポリメラーゼが、配列番号1~7のいずれかの配列又は該配列の一部を改変した配列を含み且つDNAポリメラーゼ活性を示すタンパク質からなる、[1]に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。[3]前記ミトコンドリアDNAポリメラーゼが無細胞合成系で調製したタンパク質からなる、[1]又は[2]に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。[4]前記鋳型DNAが、活性化二本鎖DNA、又は一本鎖DNAや一種類のデオキシリボヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチド鎖とそれに相補的なプライマーとの組合せ、である、[1]~[3]のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。[5]二本鎖DNAの検出が、二本鎖DNA特異的な蛍光染色により行われる、[1]~[4]のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。[6]前記溶液の二価鉄イオン濃度が5mM~15mMである、[1]~[5]のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。[7]前記溶液のpHが7~8である、[1]~[6]のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。[8]ミトコンドリアDNAポリメラーゼが50°C~90°Cの温度条件で予め熱処理されている、[1]~[7]のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。[9]ステップのインキュベートを被験物質の存在下で行うことを特徴とする、[1]~[8]のいずれか一項に記載のDNAポリメラーゼ活性測定法。[10]以下のステップ~を含む、抗マラリア化合物のスクリーニング法:被験物質の存在下、二価鉄イオンと、熱帯熱マラリア原虫のミトコンドリアDNAポリメラーゼと、鋳型DNAと、及び一種又は二種以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸誘導体と、を含む溶液をインキュベートするステップ;合成された二本鎖DNAを検出するステップ;ステップの検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、二本鎖DNA合成の阻害が認められることが有効性の指標となるステップ。[11]被験物質非存在下であること以外はステップと同一条件下でインキュベートしたサンプルコントロール群を用意し、該コントロール群についてのステップの検出結果と比較してステップにおける有効性の判定を行う、[10]に記載のスクリーニング法。[12]ステップにおいて有効性を認めた被験物質について、熱帯熱マラリア原虫の核内DNAポリメラーゼに対する阻害活性を評価するステップ、を更に含む、[10]又は[11]に記載のスクリーニング法。[13]ステップにおいて有効性を認めた被験物質について、ヒトのDNAポリメラーゼに対する阻害活性を示さないことを確認するステップ、を更に含む、[10]~[12]のいずれか一項に記載のスクリーニング法。用語上記の通り、本明細書中ではミトコンドリアDNAポリメラーゼのことをmtDNAポリメラーゼと略称する。尚、特に言及することなくmtDNAポリメラーゼと記載した場合には、マラリア原虫のmtDNAポリメラーゼを意味する。1.DNAポリメラーゼ活性測定法本発明の第1の局面はマラリア原虫PlasmodiumsppのミトコンドリアDNAポリメラーゼmtDNAポリメラーゼの活性測定法に関する。本発明の活性測定法はマラリア原虫のmtDNAポリメラーゼの研究用ツールとして有用である。また、当該mtDNAポリメラーゼに対して阻害活性を示す物質を探索する手段としても有用である。mtDNAポリメラーゼに対して阻害活性を示す物質は抗マラリア薬として或いは抗マラリア薬のリード化合物としてその利用応用が期待される。本発明の活性測定法では以下のステップ~を行う。二価鉄イオンと、熱帯熱マラリア原虫のミトコンドリアDNAポリメラーゼと、鋳型DNAと、及び一種又は二種以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸誘導体と、を含む溶液をインキュベートするステップ合成された二本鎖DNAを検出するステップステップの検出結果より、前記DNAポリメラーゼの活性を算出するステップ本発明者らの検討によって、マラリア原虫のmtDNAポリメラーゼが二価鉄イオン要求性を示すことが明らかとなった。この知見に基づきステップでは、反応液中に二価鉄イオンが存在する条件下で反応させる。この点が本発明の最大の特徴である。例えば、塩化鉄FeCl2や硫酸鉄FeSO4等、二価鉄イオンを生成する化合物を添加、溶解することによって、当該条件を満たす反応液を用意できる。反応液中の二価鉄イオンの量、即ち反応液の二価鉄イオン濃度は、mtDNAポリメラーゼの活性化が生ずる限り、特に限定されない。但し、本発明者らの検討によってもたらされた知見に従えば後述の実施例を参照、二価鉄イオン濃度を5mM~15mMにするとよい。より好ましくは、二価鉄イオン濃度を約10mMとする。尚、測定誤差の低減や再現性の向上などを図るために、脱気水を使用するなどして反応液中の二価鉄イオンの酸化を防止することが望ましい。反応液には、二価鉄イオンの他、酵素反応の主体であるmtDNAポリメラーゼ、DNA合成の開始点を提供する鋳型DNA、DNA合成の基質材料が含まれることになる。以下、これら各要素について説明する。amtDNAポリメラーゼmtDNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼ活性を示す限り、完全長でなくてもよい。換言すれば、DNAポリメラーゼ活性に必要な領域を含む限り、部分配列であってもよい。mtDNAポリメラーゼの配列の一例PFF1225cを配列表の配列番号1に示す。当該配列は公共のデータベースにおいてDNAポリマラーゼIlikeタンパク質としてアノテーションされていた配列であるNCBIProteinDatabaseDEFINITIONDNApolymerase1putativePlasmodiumfalciparum3D7ACCESSIONXP966236。当該アミノ酸配列をコードする塩基配列遺伝子のコード領域を配列番号8に示す。また、当該アミノ酸配列のDNAポリメラーゼドメインpolAcを含む部分配列の例を配列番号2~7に示す。これらの部分配列が対応する領域は以下の通りである。配列番号2:配列番号1の配列の104番アミノ酸~1444番アミノ酸配列番号3:配列番号1の配列の276番アミノ酸~1444番アミノ酸配列番号4:配列番号1の配列の426番アミノ酸~1444番アミノ酸配列番号5:配列番号1の配列の618番アミノ酸~1444番アミノ酸配列番号6:配列番号1の配列の732番アミノ酸~1444番アミノ酸配列番号7:配列番号1の配列の990番アミノ酸~1444番アミノ酸使用可能なmtDNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼ活性を示す限り、上記の例配列番号1~7に限定されるものではない。例えば、上記の例のいずれかの配列の一部を改変した配列からなり、DNAポリメラーゼ活性を示すもの典型的にはpolAcを含むことになるであれば、同様にmtDNAポリメラーゼとして使用可能である。ここでの一部の改変とは、アミノ酸配列を構成する1~数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは1~数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変化が生ずることをいう。アミノ酸配列の変異の位置は特に限定されず、また、複数の位置で変異を生じていてもよい。ここでの複数とは、アミノ酸配列を構成する全アミノ酸の例えば10以内に相当する数であり、好ましくは全アミノ酸の5以内に相当する数である。さらに好ましくは全アミノ酸の1以内に相当する数である。このような改変はpolAc以外の領域に対して施されることが好ましい。尚、polAc以外の領域が改変対象になる場合には、DNAポリメラーゼ活性への影響が小さい或いは実質的にないことから、大幅な改変も許容される。mtDNAポリメラーゼは、例えば、公知のタンパク質合成系を利用して調製することができる。但し、汎用的な大腸菌発現系を利用する場合には、大腸菌による当該タンパク質の発現が困難であったこと後述の実施例を参照を踏まえ、コドンの使用頻度を考慮した配列の調整修正を施した上で発現させるとよい。mtDNAポリメラーゼの合成に利用可能なDNA配列即ち、mtDNAポリメラーゼをコードするDNAの具体例として、大腸菌での発現に最適化したDNA配列配列番号6のアミノ酸配列に対応するを配列番号9に示す。好ましくは無細胞合成系を利用してmtDNAポリメラーゼを調製する。本発明において無細胞合成系無細胞転写系、無細胞転写/翻訳系とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の或いは遺伝子工学的手法で得られたリボソームや転写翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸DNAやmRNAからそれがコードするmRNAやタンパク質をinvitroで合成することをいう。無細胞合成系では一般に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。細胞抽出液には一般に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、tRNAなどの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、この細胞抽出液に各種アミノ酸、ATP、GTPなどのエネルギー源、クレアチンリン酸など、タンパク質の合成に必要なその他の物質を添加する。勿論、タンパク質合成の際に、別途用意したリボソームや各種因子、及び/又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。タンパク質合成に必要な各分子因子を再構成した転写/翻訳系の開発も報告されているShimizuYetalNatureBiotech197517552001。この合成系では、バクテリアのタンパク質合成系を構成する3種類の開始因子、3種類の伸長因子、終結に関与する4種類の因子、各アミノ酸をtRNAに結合させる20種類のアミノアシルtRNA合成酵素、及びメチオニルtRNAホルミル転移酵素からなる31種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いてタンパク質合成系をinvitroで再構成している。本発明ではこのような再構成した合成系を利用してもよい。用語無細胞タンパク質合成系は、無細胞転写/翻訳系、invitro翻訳系又はinvitro転写/翻訳系と交換可能に使用される。invitro翻訳系ではRNAが鋳型として用いられてタンパク質が合成される。鋳型RNAとしては全RNA、mRNA、invitro転写産物などが使用される。他方のinvitro転写/翻訳系ではDNAが鋳型として用いられる。鋳型DNAはリボソーム結合領域を含むべきであって、また適切なターミネータ配列を含むことが好ましい。尚、invitro転写/翻訳系では、転写反応及び翻訳反応が連続して進行するように各反応に必要な因子が添加された条件が設定される。無細胞タンパク質合成系には以下の利点がある。まず第1に、生細胞を維持する必要がないため操作性が良好で系の自由度も高い。したがって、目的のタンパク質の性質に応じて様々な修正や修飾を施した合成系を設計することが可能となる。次に、細胞系の合成では使用する細胞に毒性のあるタンパク質の合成は基本的にできないが、無細胞系ではそのような毒性のタンパク質であっても生産することができる。さらに、多種類のタンパク質を同時にかつ迅速に合成できることからハイスループット化が容易である。生産されるタンパク質の分離精製が容易であるという利点も備え、これはハイスループット化に有利に働く。加えて、非天然型のアミノ酸を取り込ませるなどして非天然型タンパク質を合成することも可能であるという利点も併せ持つ。現在広く利用されている無細胞タンパク質合成系には以下のものがある。即ち、大腸菌S30抽出液の系原核細胞の系、コムギ胚芽抽出液の系真核細胞の系、及びウサギ網状赤血球可溶化物の系真核細胞の系である。これらの系はキットとしても市販されており、容易に利用することが可能である。歴史的には大腸菌S30抽出液の系の開発が最も古く、この系を利用して様々なタンパク質の合成が試みられてきた。大腸菌30S画分は、大腸菌の集菌、菌体破砕、精製の工程を経て調製される。大腸菌30S画分の調製及び、無細胞転写翻訳共役反応はPrattらの方法PrattJMChapter7inTranscriptionandTranslationApracticalapproachedbyBDHamesSJHigginspp179209IRLPressNewYorkやEllmanらの方法EllmanJetalMethodsEnzymol202301336を参考にして行うことができる。コムギ胚芽抽出液の系は、高品質の真核生物タンパク質を効率的に合成できるという利点を有し、大腸菌S30抽出液の系では合成が困難な真核生物のタンパク質を合成する際によく利用される。最近になって、種子胚乳成分を洗浄除去した胚芽から抽出液を調製することによって高効率かつ安定な合成系が構築されることが報告され注目を集めているMadinKetalProcNatlAcadSciUSA975595642000。その後、高翻訳促進能を有するmRNA非翻訳配列、PCRを利用した多品目機能解析用のタンパク質合成法、専用高発現ベクターの構築などの技術開発が行われSawasakiTetalProcNatlAcadSciUSA9914652146572002、様々な分野への応用が期待されている。コムギ胚芽抽出液は、コムギ胚芽をすり潰して遠心分離した後、上澄み液をゲルろ過で分離することによって得ることができる。翻訳反応については、Andersonらの方法AndersonCWetalMethodsEnzymol101638644を参考にできる。改良法についても報告されており、例えば河原崎らの方法KawarasakiYetalBiotechnolProg16517521やMadinらの方法MadinKetalProcNatlAcadSciUSA975595642000等を参考にできる。その他、コムギ胚芽抽出液の系についてはWO0068412A1、WO0127260A1、WO2002024939A1、WO2005063979A1、特開平67134号公報、特開2002529531号公報、特開2005355513号公報、特開2006042601号公報、特開2007097438号公報、特開2008029203号公報等が参考になる。ウサギ網状赤血球可溶化物の系はグロブリン生産に適する。ウサギ網状赤血球可溶化物は、ウサギにフェニルヒドラジンを数日間静脈注射して貧血状態とし、所定期間後例えば第8日目に採血し、その後溶血させた液から超遠心分離処理などを経て得られる。ウサギ網状赤血球可溶化物の調製法は、JacksonとHuntの方法JacksonRJandHuntTMethodsEnzymol965074を参考にして行うことができる。本発明の実施に際して利用できる無細胞合成系は上記のものに限られるものではなく、例えば大腸菌以外のバクテリアやコムギ以外の植物の抽出液、昆虫由来の抽出液、動物細胞由来の抽出液、又はゲノム情報を基に構築した系などを利用してもよい。ここで、無細胞合成系を利用してmtDNAポリメラーゼを合成する際に利用可能なDNA配列即ち、mtDNAポリメラーゼをコードするDNAの具体例として、コムギ胚芽抽出液の系用に最適化したDNA配列配列番号6のアミノ酸配列に対応するを配列番号10に示す。最適化によって15~2倍程度の発現量の増大が認められた。ところで、後述の実施例に示す通り、mtDNAポリメラーゼのpH依存性を検討した結果、pH7から8にかけて活性のピークを示した至適pHは75。そこで、反応液のpHを好ましくはpH7~8、更に好ましくは約75にするとよい。また、後述の実施例に示す通り、mtDNAポリメラーゼを熱処理することによってその活性が向上するという驚くべき現象を認めた。この知見に基づき本発明の一態様では、50°C~90°Cの温度条件で予め熱処理されているmtDNAポリメラーゼを使用する。熱処理の温度条件は更に好ましくは60°C~80°Cであり、最も好ましくは約70°Cである。熱処理の時間は例えば1分~1時間、好ましくは2分~30分、更に好ましくは3分~15分である。このようにして活性を高めたmtDNAポリメラーゼを使用することは測定感度の向上、測定時間の短縮化、酵素使用量の低減等の効果をもたらす。尚、熱処理の温度が低すぎたり処理時間が短すぎたりすれば所望の効果を十分に発揮できない。逆に熱処理の温度が高すぎたり処理時間が長すぎたりすれば酵素の失活を招くおそれがある。b鋳型DNA鋳型DNAはDNA合成の開始点を提供する。簡便性を担保しつつ精度ないし信頼性の高い測定を実現できる鋳型DNAを用いるとよい。当該条件を満足する鋳型DNAとして活性化二本鎖DNAを例示できる。活性化二本鎖DNAとは、適当なDNAサケ精子DNA、ウシ胸腺DNAなどを処理し、ニック切れ目を入れたものである。活性化にはデオキシリボヌクレアーゼI処理、熱処理、ソニケーションなどが用いられる。好適な鋳型DNAのもう一つの例は、一本鎖DNAに適当な長さのプライマーをアニーリングさせるものである。具体例として、一種類のデオキシリボヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチド鎖例えばポリアデニル酸とそれに相補的なプライマー例えばオリゴプライマーとの組合せ挙げられる。本明細書では、以上の2つの例に代表されるように、二本鎖DNA鎖の合成開始点を提供する材料を包括的に鋳型DNAと表現する。cDNA合成の基質材料DNA合成の基質にはデオキシリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸誘導体が用いられる。使用する鋳型DNAに対応する基質を用意する。例えば、活性化二本鎖DNAを鋳型DNAとした場合には、原則として、デオキシアデノシン三リン酸dATP又はその誘導体、デオキシシチジン三リン酸dCTP又はその誘導体、デオキシグアノシン三リン酸dGTP又はその誘導体、及びチミジン三リン酸dTTP又はその誘導体の4種類の基質を併用する。他方、一種類のデオキシリボヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチド鎖とそれに相補的なプライマーを鋳型DNAとした場合には、原則として、鋳型となるポリヌクレオチド鎖と呼応する、一種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸又はその誘導体を用いる。例えば、ポリアデニル酸とオリゴプライマーを採用した場合にあっては、基質にはデオキシグアノシン三リン酸dGTP又はその誘導体が用いられる。ここでの誘導体は、通常のデオキシリボヌクレオシド三リン酸と同様にDNAポリメラーゼの基質として利用され、二本鎖DNA鎖の合成伸長を生じさせるものであれば特に制約はない。放射性同位体3H、32P等や蛍光物質CyTM3、CyTM5、TexasRed登録商標、フルオレセイン等による標識化、保護基の導入、又は特定の原子団の置換などによって誘導体化されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸をデオキシリボヌクレオシド三リン酸誘導体として用いることができる。本発明の一態様では、二本鎖DNA鎖の合成の際即ちステップにおいてに標識化も同時に行う。例えば、基質の一つとして放射性同位体3H、32P等や蛍光物質CyTM3、CyTM5、TexasRed登録商標、フルオレセイン等により標識されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を用い、当該標識化デオキシリボヌクレオシド三リン酸を取り込ませることによって、標識化された二本鎖DNAが合成されるようにする。この態様の場合、取り込ませた標識を利用して二本鎖DNAを検出することになる。ステップのインキュベートの条件は、mtDNAポリメラーゼが活性を示し、且つ検出可能なレベルの二本鎖DNAが合成される限りにおいて、特に限定されない。当業者であれば予備実験などを通して適切なインキュベート条件を設定可能である。インキュベート条件の例を示すと30°C~40°Cで5分~6時間である。好ましくは、35°C~40°Cで10分~3時間、更に好ましくは約37°Cで15分~1時間の条件とする。ステップでは、合成された二本鎖DNAを検出する。通常、反応を停止後、合成された二本鎖DNAを検出する。但し、積極的な反応の停止は必須ではない。経時的な検出やリアルタイム検出を行うことにしてもよい。mtDNAポリメラーゼが二価鉄イオン要求性であることから、反応を停止させるためには例えばキレート剤の添加が有効である。もっとも、合成された二本鎖DNAの検出に影響を与えない限り、他の手段により反応を停止させることにしてもよい。ここでの検出には各種方法を用いることができる。例えば、後述の実施例に示した二つの方法、即ち放射性同位体を利用した方法と蛍光を利用した方法を採用可能である。前者の場合、二本鎖DNAの合成の際即ちステップに放射性同位体標識したデオキシリボヌクレオシド三リン酸を取り込ませることにし、放射性同位体の取込量を液体シンチレーションカウンター等で計測する。他方、蛍光を利用した方法では、例えば、二本鎖DNA特異的な蛍光物質を添加することによって、合成された二本鎖DNAを蛍光染色し、蛍光量を蛍光リーダー等で測定する。二本鎖DNA特異的な蛍光物質の例としてPicoGreen登録商標、SYBRGreenI登録商標、等を挙げることができる。尚、二本鎖DNAの合成の際即ちステップに蛍光標識したデオキシリボヌクレオシド三リン酸を取り込ませ、蛍光標識された二本鎖DNAが合成されるようにしてもよい。即ち、二本鎖DNAの合成と同時に蛍光標識化を行うことにしてもよい。ところで、インキュベート条件や測定条件にもよるが、ステップの際に反応液中の二価鉄が酸化により三価鉄となり、Feの沈澱が生ずるおそれがある。当該沈澱の形成は、消光クエンチングを引き起こし、計測の支障となる。そこで、このような問題を回避すべく、反応液中に没食子酸等を添加し、三価鉄を錯体化しておくとよい。ステップでは、ステップの検出結果を用いてmtDNAポリメラーゼの活性を算出する。典型的には、検出値からmtDNAポリメラーゼ活性を定量することになるが、半定量的又は定性的な判断をすることにしてもよい。本発明の一態様では、ステップのインキュベートを被験物質の存在下で行うことにし、ステップで算出した活性値に基づき、被験物質がmtDNAポリメラーゼの活性に与える影響を判定する。換言すれば、mtDNAポリメラーゼ活性に対する被験物質の作用効果を評価する。例えば被験物質を添加したことによってmtDNAポリメラーゼ活性の低下を認めれば、mtDNAポリメラーゼに対する阻害作用を被験物質が有すると判断できる。これとは逆に被験物質の添加がmtDNAポリメラーゼ活性の上昇をもたらしたのであれば、被験物質にmtDNAポリメラーゼの活性促進作用があると判断できる。このように本発明の活性測定法は、mtDNAポリメラーゼ活性に対する被験物質の作用効果を評価する上で有用である。本発明の活性測定法の利用形態の一つとして、この点に注目したスクリーニング法を後述する。以上の説明において特に言及しないその他の条件その他の成分、反応条件については、DNAポリメラーゼの反応に一般的なものを採用すればよい。この点に関して、例えば、例えばMolecularCloningThirdEditionColdSpringHarborLaboratoryPressNewYork、CurrentprotocolsinmolecularbiologyeditedbyFrederickMAusubeletal1987等が参考になる。尚、ステップにおける反応液中のmtDNAポリメラーゼの使用量、鋳型DNAの使用量、基質の使用量などは、活性測定法の使用目的や他の条件などを考慮して設定することができる。当業者であれば、DNAポリメラーゼの一般的な反応条件や過去の報告を参照すること、或いは予備実験を行うなどして、各々について適切な使用量を決定することができる。以下に使用量の例を示す。mtDNAポリメラーゼ:5μgml~50μgml鋳型DNA:50μgml~5000μgml活性化DNAを使用する場合、01nM~10nMポリヌクレオチド鎖と相補的プライマーを使用する場合基質:1mM~16mM総量2.抗マラリア化合物のスクリーニング法本発明の第2の局面は抗マラリア化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明のスクリーニング法によって選抜された化合物は抗マラリア薬の有効成分或いはリード化合物として有望である。本発明のスクリーニング法では以下のステップ~を行う。被験物質の存在下、二価鉄イオンと、熱帯熱マラリア原虫のミトコンドリアDNAポリメラーゼと、鋳型DNAと、及び一種又は二種以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸誘導体と、を含む溶液をインキュベートするステップ合成された二本鎖DNAを検出するステップステップの検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、二本鎖DNA合成の阻害が認められることが有効性の指標となるステップステップ及びは被験物質を使用すること以外、本発明の活性測定法のステップ及びとそれぞれ同一であるため、その詳細な説明は省略する。被験物質としては様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質単純脂質、複合脂質ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミンB1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等を例示できる。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被験物質として用いてもよい。また、既存の薬剤を被験物質としてもよい。2種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。ステップではステップの検出結果に基づき被験物質の有効性を判定する。そして、当該判定結果に基づき有効な被験物質が選抜される。本発明では、被験物質が有効であることの指標として二本鎖DNA合成の阻害が認められることを採用する。即ち、二本鎖DNA合成を阻害していることを認めた場合に被験物質は有効であると判定し、二本鎖DNA合成を阻害していることを認めない場合に被験物質は有効でないと判定する。複数の被験物質を用いた場合には、阻害の程度に基づき、各被験物質の有効性を比較評価することができる。通常は、比較対象として、被験物質非存在下その他の条件はステップと同一とするでインキュベートした群コントロール群を用意し、それに対する検出ステップも並行して行う。そして、当該コントロール群の検出結果と試験群の検出結果を比較することによって、二本鎖DNAの合成を被験物質が阻害したか判断する。このようにコントロール群との比較によって被験物質の有効性を判定すれば、より信頼性の高い判定結果が得られる。試験群及びコントロール群のサンプル数は特に限定されない。一般に使用するサンプルが多くなるほど信頼性の高い結果が得られるが、多数のサンプルを同時に取り扱うことは主に操作の面で困難を伴う。そこで例えば各群に含まれるサンプル数を1~50、好ましくは2~30、さらに好ましくは3~20とする。ステップにおいて有効性を認めた被験物質について、マラリア原虫の核内DNAポリメラーゼDNAポリメラーゼα、DNAポリメラーゼβなどに対する阻害活性の有無及び/又は程度を評価することにしてもよい。この追加のステップの結果として核内DNAポリメラーゼに対しては阻害活性を示さないことが判明した場合、mtDNAポリメラーゼに対する特異性が高い物質であると評価できる。このように評価された被験物質はmtDNAに標的を絞った抗マラリア薬の有効成分又はリード化合物として有望といえる。一方、核内DNAポリメラーゼに対しても阻害活性を示すことが判明した被験物質には、mtDNAポリメラーゼのみならず核内DNAポリメラーゼをも標的とした薬効を期待できる。このように、上記ステップを追加することによって、抗マラリア薬の開発実用化にとって有益な情報がもたらされる。一方、その毒性を評価するために、ステップにおいて有効性を認めた被験物質について、ヒトのDNAポリメラーゼに対する阻害活性を示さないことを確認することにしてもよい。本発明のスクリーニング方法によって選択された物質が十分な薬効を有する場合には、当該物質をそのまま抗マラリア薬の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で、抗マラリア薬の有効成分として使用することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。マラリア原虫のミトコンドリアDNA複製機構を解明することを目指し、ミトコンドリアDNAポリメラーゼの特性を詳細に検討した。1.方法1PFF1225cの全長クローニング熱帯熱マラリア原虫の細胞株3D7は既報の方法TragerWandJensenJBScience1976Aug20193673675を一部変更して踏襲し、ヒト赤血球内で培養した。トロホゾイト期のマラリア原虫を回収し、RNeasyを用いて全RNAを抽出した。その後、GeneRacerTMInvitrogenを用いてcDNAを作製した。3’race、5’race法を用い、PFF1225cの全長配列4335bpACCESSIONXM961143DEFINITIONPlasmodiumfalciparum3D7DNApolymerase1putativemRNAcompletecds配列番号8をクローニングした。2小麦胚芽無細胞発現系を用いた組換えタンパク質の発現精製小麦胚芽無細胞発現は株セルフリーサイエンス社のENDEXT登録商標WheatGermExpressionHKitを用いて行った。2-1発現ベクターの作成PFF1225cのDNAポリメラーゼドメインpolAcを含む様々な長さの部分配列A1:1041444aa配列番号2、A2:2761444aa配列番号3、B1:4261444aa配列番号4、B2:6181444aa配列番号5、C1:7321444aa配列番号6、C2:9901444aa配列番号7を小麦胚芽無細胞発現系のベクターpEUE01HisTEVMCSN3:図6のBamHIHindIIIサイトにフレームが合うようにして挿入した。LB液体培地600ml分を集菌し、QIAGENplasmidPlusMidikitQIAGENを用いてプラスミドを精製した。この際、キットに添付されているRNaseは添加せずに精製を行った。その後、イソプロパノール沈殿し、TEに懸濁した。2-2転写反応精製したベクター120μg、5×転写バッファー240μl、25mMNTPs120μl、80UμlRNaseインヒビター15μl、80UμlSP6ポリメラーゼ15μlを混合し、milliQ水でトータル1200μlに調整し、37°Cのウォーターバスで6時間インキュベートした。反応終了後は室温に静置した。2-3翻訳反応翻訳反応は6穴プレートで行わせた。上層液のSUBAMIX登録商標を44mlずつ各穴に分注し、その後、下層液4004μlを、液面を乱さないよう静かに重層した。下層液はmRNA200μl、40mgmlクレアチンキナーゼ04μl、WEG200μlを混合した。乾燥を防ぐためにシールで蓋をし、17°Cインキュベーター内で16時間インキュベートした。合成終了後、穏やかにピペッティングし、全量をチューブに移した。2-4Histag精製翻訳反応産物である総タンパク質48mlに、イミダゾールpH80を20mMの濃度で添加してよく混合した。8000rpm、4°Cで20分間遠心した後に上清を分取し、そこに50μlのNiビーズを加えて穏やかに16時間攪拌した。その後、4000rpm、4°C、5分間の遠心分離を行って上清を取り除き、05mlの洗浄バッファーで2回Niビーズを洗浄し、最後に50μlの溶出バッファーで3回溶出した。各溶出画分は、透析バッファー、10グリセリン、1mMEDTA、5mMメルカプトエタノール、01NP40で12時間透析を行い、イミダゾールを除去した。3RIを用いたDNAポリメラーゼ活性測定反応液は50mMTrisHCl、05mMdATPdGTPdCTP、50μMdTTP、活性化DNA05μgml、08μM3HdTTPThymidine5triphosphatetetrasodiumsaltmethyl3Hを加え、そこにさらに各濃度の酵素溶液、金属イオン、阻害剤等を加えた総量10μl。10μlあたり、01μgのC1フラグメントを加えることとした。混合した反応液は37°Cで30分間インキュベートした後にろ紙に吸着、乾燥させ、5Na2HPO4で4回洗浄した後に各10分間、蒸留水DWで2回洗浄し各5分間、最後に100エタノールで5分間振とうした。その後ろ紙を乾燥させ、乾燥したろ紙を4mlのトルエンカクテルの入ったバイアル瓶に入れ、液体シンチレーションカウンターで、3Hの取り込み量を測定した。4鉄イオンを添加した場合のRIを用いたDNAポリメラーゼ活性測定図1液体シンチレーションカウンターでDNA鎖に取り込まれた3H量を測定する場合に、鉄イオンの色素がクエンチングをおこし、正確な測定ができない。クエンチングには化学消光、酸素消光、および着色消光の3種類があり、液体シンチレーションカウンターの計数効率が低下する。軟β線である3Hの場合に特に問題となり、鉄イオンの場合には着色消光が問題となる。そこで、鉄と錯体を形成する没食子酸を用い、紫色の錯体である没食子酸鉄を形成させた。その結果、消光クエンチングを大幅に減少させることができた。以下に、鉄イオンを添加した場合のプロトコールを示す。反応液は50mMTrisHCl、05mMdATPdGTPdCTP、50μMdTTP、活性化DNA05μgml、08μM3HdTTPThymidine5triphosphatetetrasodiumsaltmethyl3H、10mMFeCl2を加え、総量9μlとした。鉄の酸化を防ぐために、反応液を窒素ガスに30分間さらし、脱気した。反応液9μlあたり、1μlのC1フラグメントを加えることとした。混合した反応液は37°Cで30分間インキュベートした後に、反応液と等量10μlの1没食子酸を加えてよく懸濁し没食子酸鉄を形成させた。その後、全量をろ紙に吸着、乾燥させ、5Na2HPO4で10回洗浄合計で30分間した後に、蒸留水DWで2回洗浄し各5分間、最後に100エタノールで5分間振とうした。その後、ろ紙を乾燥させ、乾燥したろ紙を4mlのトルエンカクテルの入ったバイアル瓶に入れ、液体シンチレーションカウンターで、3Hの取り込み量を測定した。5PicoGreen登録商標を用いたDNAポリメラーゼ活性測定図2反応液は50mMTrisHCl、1mMdTTP、40nMPolydAdT12、10mMFeCl2を加え脱気した蒸留水DWで総量20μlとした。そこにC1フラグメントを5μl加え、37°Cで30分間インキュベートした。インキュベーション後、100mMEDTA10μlを加えることで鉄イオンをキレートし、反応を停止させた。DNAポリメラーゼにより合成されたDNA量を定量するために、二本鎖DNAに特異的に結合するPicoGreen登録商標を用いた。96穴プレート上でTEで1200希釈したPicoGreen登録商標200μlと上記の反応産物10μlを混合し、CytoFluor登録商標MultiWellPlateReaderseries4000を用い、励起波長Ex48520、蛍光波長Em53025の条件で測定した。2.結果1マラリア原虫のミトコンドリアDNAポリメラーゼの同定動物でこれまでに見つかっているミトコンドリアDNAポリメラーゼはDNAポリメラーゼγpolγのみである。しかし、植物や藻類でpolγのホモログは見出されていなかった。近年、高等植物であるイネ、アラビドプシス、タバコや紅藻から大腸菌のDNAポリメラーゼIに類似したDNAポリメラーゼが同定されたChristensenetalPlantCell17280528162005KimuraetalNucleicAcidsRes130158515922002MorietalBiochemBiophysResCommun1933443502005OnoetalPlantCellPhysiol48167916922007。これらの酵素は色素体とミトコンドリアの両方に局在し、酵素活性をもつことが分かった。また、当研究室においても原生動物である真正粘菌からDNAポリメラーゼIに類似したミトコンドリアDNAポリメラーゼが同定された。PpPolAは、最もDNAポリメラーゼIに類似しており、原始的なミトコンドリアDNAポリメラーゼであることが予想された。そこで、PpPolAの配列を用いてマラリア原虫のデータベースであるPlasmoDBでBLAST検索を行った。その結果、相同性の高い配列として、PF140112、PFF1225c、PFB0180wが得られた。これらの配列のドメイン構造をPROSITEなどの複数のサイトで予測したところ、DNAポリメラーゼドメインをもつ配列はPF140112、PFF1225cの二つであった。そのうちの一つ、PF140112はアピコプラストDNAポリメラーゼとしてすでに報告が既になされていた。一方、PFF1225cは、DNAポリメラーゼIlikeタンパク質としてアノテーションされていたが、その機能などは解析されていない。マラリア原虫の細胞内局在予測サイトであるPlasMitを用いて解析した結果、ミトコンドリアに局在することが予測された。さらに、実際にGFPを用いた解析でもミトコンドリアに局在することが示された。よって、PFF1225cはミトコンドリアDNAポリメラーゼとして働く可能性が高いと予想された。2小麦胚芽無細胞発現系をもちいたPFF1225c組換えタンパク質の発現熱帯熱マラリア原虫のcDNAを用いて、PFF1225cの全長をクローニングした結果、1444アミノ酸からなるタンパク質であることがわかった図5。また、相同性検索により、C末端側11261335aaにDNAポリメラーゼドメインpolAcを含むDNAポリメラーゼIに類似したタンパク質であることもわかった。実際に、PFF1225cがDNAポリメラーゼ活性を保持しているか否かを確かめるために、大腸菌を用いてPFF1225c組換えタンパク質の発現を試みた。しかし、大腸菌系では発現させることができなかった。そこで、マラリア原虫のタンパク質を効率よく発現することが報告されている、小麦胚芽無細胞発現系を用いて発現を試みた図6。PFF1225cのDNAポリメラーゼドメインpolAcを含む様々な長さの部分配列A1:1041444aa配列番号2、A2:2761444aa配列番号3、B1:4261444aa配列番号4、B2:6181444aa配列番号5、C1:7321444aa配列番号6、C2:9901444aa配列番号7を、小麦胚芽無細胞発現系で発現させた結果、すべての組換えタンパク質が可溶化画分に確認できた図7。特に、C1の発現量が高かったための、以降の解析にはC1を用いることにした。3小麦胚芽無細胞発現系で作製したタンパク質を用いたDNAポリメラーゼ活性の測定一般的に、DNAポリメラーゼはマグネシウムやマンガンなどの二価金属イオンが活性に必要である。まずPFF1225cの金属イオン要求性を明らかにするために、さまざま二価金属イオン10mMを用いて酵素活性を3HdTTPの取り込みで測定した。真正粘菌のミトコンドリアDNAポリメラーゼでは、通常報告されているようにMg2イオン添加時にのみ高い活性が見られたが、PFF1225cにおいては、Mg2イオン添加では全く活性が見られず、Fe2イオンを添加したときのみ高い活性がみられた図8。また、二価鉄イオン濃度は10mMのときに最大の活性を示した図9a。このようなFe2イオン添加によるDNAポリメラーゼの活性化は、ヒトのミトコンドリアDNAポリメラーゼγを用いてアッセイしたときも観察されなかったことから図10、マラリア原虫のミトコンドリアDNAポリメラーゼに特徴的な性質であるといえる。さらに、至適pHの検討を行った結果、pH75で最大の活性を示した図9b。次に、酵素の熱耐性を調べるために、酵素溶液をあらかじめ各温度で5分間プレインキュベートした後に、氷冷してから通常通りのDNAポリメラーゼ活性の測定を行った。その結果、非常に興味深いことに、酵素は90°Cの熱処理でも失活せず、むしろ熱処理によって活性が上昇し、70°Cの熱処理で最大の活性を示した37°Cで処理した場合と比較して、約3倍高い図9c。さらに、DNAポリメラーゼの阻害剤に対する感受性について検討した。まず、細胞核のDNAポリメラーゼαの特異的阻害剤であるアフィディコリンを10~100μMの濃度で加えた場合、活性はほとんど低下しなかった。また、DNAポリメラーゼγの阻害剤であるNEMとddTTPについてもその感受性を調べたところ、NEMの場合、高濃度存在下でも、ほとんど活性は低下しなかった。また、ddTTPの場合、DNAポリメラーゼγでは50~100mMでほとんどその活性が阻害されてしまうことが報告されているが、PFF1125cでは、濃度が上昇するに従って弱い阻害効果がみられるが、400mMまで濃度を高くしても50までにしか活性は低下しなかった。このような、阻害剤への感受性は、これまでに報告されている粘菌や植物のミトコンドリアDNAポリメラーゼと類似しており、DNAポリメラーゼγとは異なっていることがわかった。次に、マラリア原虫のアピコプラストDNAポリメラーゼPOMIPfprexの阻害剤として報告されているクロロキンとスラミンに対する感受性について調べた。クロロキンとスラミンは、それぞれマラリアやトリパノゾーマの治療薬として使われており、クロロキンは、マウスのDNAポリメラーゼαやDNAポリメラーゼγの活性は阻害しないことが既に報告されている。まず、クロロキンのDNAポリメラーゼ活性への阻害作用を調べたところ、ヒトのDNAポリメラーゼγや真正粘菌のPpPolAでは阻害効果は見られなかったが、PFF1225cの活性を阻害した図12。また、スラミンは、さまざまなDNAポリメラーゼと非特異的に結合し、その活性を阻害することが報告されているが、PFF1225cの活性も阻害した図13。4マラリア原虫ミトコンドリア粗画分のDNAポリメラーゼ活性の測定上記の解析により、小麦胚芽無細胞発現系により作製したPFF1225cは、Mg2イオン存在下でDNA合成活性を示さず、Fe2イオン添加により活性を示すことが判明した。しかし、2000年にCharavalitshewinkoonPermitrらは、マラリア原虫から粗精製したミトコンドリア画分を用いた解析では、Mg2イオン存在下でDNA合成活性があることを報告しているCharavalitshewinkoonPermitretalParasitologyInternational492792882000。その解析のミトコンドリア画分にはアピコプラストが混入していることも考えられ、Mg2イオン要求性であるアピコプラストDNAポリメラーゼの活性を測定してしまった可能性がある。そこで、アピコプラストの混入のないミトコンドリア画分を調製し、DNAポリメラーゼ活性を測定した。その結果、ミトコンドリア画分においてもMg2イオン存在下でDNA合成活性は見られず、Fe2イオン添加時にのみ活性が見られることが分かった図14。5コドンの最適化最大の発現量を示したC1について、コドンを最適化したDNA配列配列番号10を使用して発現させた。結果、15~2倍程度の発現量の増大が認められたデータ示さず。尚、大腸菌発現系を利用した場合には、コドンの最適化最適化したDNA配列を配列番号9に示すによって産生効率の飛躍的な向上を認めたデータ示さず。3.まとめ以上の通り、無細胞発現系の利用によってマラリア原虫のミトコンドリアDNAポリメラーゼの発現に成功するとともに、当該DNAポリメラーゼがFe2要求性であることを明らかにした。また、Fe2に関する濃度依存性やpH依存性等、当該DNAポリメラーゼの活性測定に有益且つ重要な知見が得られた。