"サンプル中の標的核酸のヌクレオチド配列を測定する方法であって、1n個のサンプルを提供し、nは1以上の整数であり、前記サンプルは、好ましくは、哺乳類動物に由来し、更に好ましくは、ヒト、特にヒトの血液サンプルに由来する、解析すべきn個のサンプルをm個のグループに分けるのが好ましく、mは整数であり且つn≧m≧1である、2増幅:各サンプルに対して、1対又は複数対のタグプライマーを用いて、当該サンプルに由来のテンプレートが存在している場合に、標的核酸を増幅するのに適する条件下でPCR増幅を行い、その内、各1対のタグプライマーは、プライマータグを含む正方向タグプライマーと逆方向タグプライマーいずれも縮重プライマーであってもよいから構成され、正方向タグプライマーと逆方向タグプライマーに含まれるプライマータグは同じであってもよいし、異なっていてもよく、異なるサンプルに用いられるタグプライマー対におけるプライマータグは互いに異なる、3混合:n1の場合に、各サンプルのPCR増幅産物を一緒に混合する、4断片化:得られた増幅産物を不完全断片化し、精製回収する、5シークエンシング:回収されたDNA混合物に対して、次世代シークエンシング技術、好ましくはPairEnd技術例えば、IlluminaGAIlluminaHiseq2000によりシークエンシングを行い、断片化されたDNAの配列を得る、6組み立て:サンプルごとの独特なプライマータグを基にして、得られたシークエンシング結果をサンプルと一対一に対応付けさせ、対照プログラム例えばBlast、BWAプログラムを利用して、各シークエンシング配列をPCR産物の相応するDNAの参考配列に位置決めさせ、配列のオーバラップ及び連鎖関係に基づいて断片化されたDNAの配列から、完全な標的核酸を組み立てる、ことを含む方法。各1対のプライマータグとPCRプライマー対は1対のタグプライマーを組み合わせて構成し、正逆方向のPCRプライマーの5’末端に、正方向プライマータグと逆方向プライマータグをそれぞれに有する或いは任意の接続配列により接続されていることを特徴とする請求項1記載の方法。前記PCRプライマーは、HLA遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、特にHLAAB遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記HLAABの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表7に示すものであることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。前記PCRプライマーは、HLA遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、特にHLAC遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLACの第2、第3及び又は第4エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表3又は4に示すものであることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。前記PCRプライマーはHLA遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、特にHLADRB1遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLADQB1の第2及び又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表5に示すものであることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。前記プライマータグは、PCRプライマーに対して設計し、好ましくはHLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーに対して設計し、更に好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーに対して設計し、特に好ましくは表2又は表3又は表7に示されるようなPCRプライマーに対して設計し、前記プライマータグは、特に、表6に示される95対のプライマータグのうちの少なくとも10対、又は少なくとも20対、又は少なくとも30対、又は少なくとも40対、又は少なくとも50対、又は少なくとも60対、又は少なくとも70対、又は少なくとも80対、又は少なくとも90対、又は95対を含み或いは、前記1組のプライマータグは表1に示される95対のプライマータグのうちの10~95対例えば、10~95対、20~95対、30~95対、40~95対、50~95対、60~95対、70~95対、80~95対、90~95対、又は95対からなる、かつ、前記1組のプライマータグは、少なくとも表6に示される95対のプライマータグのうちのPI1~PI10、又はPI11~PI20、又はPI21~PI30、又はPI31~PI40、又はPI41~PI50、又はPI51~PI60、又はPI61~PI70、又はPI71~PI80、又はPI81~PI90、又はPI91~PI95、或いはこれらのうちのいずれか2個又は複数個の組み合わせを含むことが好ましいことを特徴とする請求項1記載の方法。前記DNAの断片化は、化学的断片化方法及び物理的断片化方法を含み、前記化学的方法は酵素切断方法を含み、前記物理的断片化方法は超音波断片化方法又は機械的断片化方法を含むことを特徴とする請求項1記載の方法。前記DNAを断片化した後、シークエンサーの最大読み取り長から、シークエンサーに適用されるDNAの最大長範囲までのあらゆるDNAバンドを精製回収し、前記精製回収方法は、電気泳動タッピングによる回収法に限られずに、磁気ビーズによる回収法であってもよいことを特徴とする請求項1記載の方法。請求項1に記載の1~4のことを含み、5ライブラリー構築:断片化されたPCR産物のライブラリーでPCRFreeシークエンシングライブラリーを構築し、異なるPCRFreeシークエンシングライブラリーと区別するように、ライブラリーに異なるライブラリーアダプターadapterを付け、用いられたシークエンサーの最大読み取り長から、用いられたシークエンサーに適用されるDNAの最大長範囲までのあらゆるDNAバンド、好ましくは450~750bpの長さ範囲のDNA断片を精製回収する、6シークエンシング:回収されたDNA混合物に対して、次世代シークエンシング技術、好ましくはPairEnd技術例えば、IlluminaGAIlluminaHiseq2000によりシークエンシングを行い、断片化されたDNAの配列を得る、7組み立て:各ライブラリーの異なるライブラリーアダプター配列とサンプルごとの独特なプライマータグを基にして、得られたシークエンシング結果をサンプルと一対一に対応付けさせ、対照プログラム例えばBlast、BWAプログラムを利用して、各シークエンシング配列をPCR産物の相応するDNAの参考配列に位置決めさせ、配列のオーバラップ及び連鎖関係に基づいて断片化されたDNAの配列から、完全な標的核酸を組み立てる、ことを更に含む特徴とする請求項1記載の方法。請求項1~7のいずれか1項の方法を利用して患者からのサンプル特に血液サンプルに対してシークエンシングを行い、シークエンシング結果を、HLAデータベース例えばIMGTHLA専門的データベースにおけるHLAのエキソン、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン、HLACの第2、第3及び又は第4エキソン、HLADQB1遺伝子の第2及び又は第3エキソン遺伝子及び又はHLADRB1の第2エキソンの配列のデータと対照を行い、配列の対照の結果が100で合致しているものが、対応するサンプルのHLA遺伝子型であることを特徴とする請求項1~9のいずれか1項に記載のサンプル中の標的核酸のヌクレオチド配列を測定する方法のHLAタイピングにおける用途。1組のプライマータグであって、表6に示される95対のプライマータグのうちの少なくとも10対、又は少なくとも20対、又は少なくとも30対、又は少なくとも40対、又は少なくとも50対、又は少なくとも60対、又は少なくとも70対、又は少なくとも80対、又は少なくとも90対、又は95対を含み或いは、前記1組のプライマータグは表1に示される95対のプライマータグのうちの10~95対例えば、10~95対、20~95対、30~95対、40~95対、50~95対、60~95対、70~95対、80~95対、90~95対、又は95対からなる、かつ、前記1組のプライマータグは、少なくとも表6に示される95対のプライマータグのうちのPI1~PI10、又はPI11~PI20、又はPI21~PI30、又はPI31~PI40、又はPI41~PI50、又はPI51~PI60、又はPI61~PI70、又はPI71~PI80、又はPI81~PI90、又はPI91~PI95、或いはこれらのうちのいずれか2個又は複数個の組み合わせを含むことが好ましい1組のプライマータグ。請求項9に記載の1組のプライマータグをPCRシークエンシング法に使用する用途であって、特に、各1対のプライマータグとPCRプライマー対は1対のタグプライマーを組み合わせて構成し、正逆方向のPCRプライマーの5’末端に、正方向プライマータグと逆方向プライマータグをそれぞれに有する或いは任意の接続配列により接続されている用途。PCRプライマーは、HLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記HLAABの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表7に示すものであり、或いは好ましくはHLAC遺伝子の第2、第3及び又は第4エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表3又は4に示すものであり、或いは好ましくはHLADQB1の第2及び又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表5に示すものであることを特徴とする請求項12に記載の用途。請求項11に記載の1組のプライマータグと測定すべき標的配列を増幅するPCRプライマー対とから組み合わせてなる1組のタグプライマーであって、各1対のプライマータグとPCRプライマー対は1対のタグプライマーを組み合わせて構成し、正逆方向のPCRプライマーの5’末端に、正方向プライマータグと逆方向プライマータグをそれぞれに有する或いは任意の接続配列により接続されているタグプライマー。前記PCRプライマーは、HLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記HLAABの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表7に示すものであり、或いは好ましくはHLAC遺伝子の第2、第3及び又は第4エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表3又は4に示すものであり、或いは好ましくはHLADQB1の第2及び又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表5に示すものであることを特徴とする請求項14に記載のタグプライマー。請求項14に記載のタグプライマーをPCRシークエンシング法に使用する用途。HLAタイピング方法であって、1n個のサンプルを提供し、nは1以上の整数であり、前記サンプルは、好ましくは、哺乳類動物に由来し、更に好ましくは、ヒト、特にヒトの血液サンプルに由来する、2解析すべきn個のサンプルをm個のグループに分け、mは整数であり且つn≧m≧1である、3増幅:各サンプルに対して、1対のタグプライマーを用いて、当該サンプル由来のテンプレートが存在している場合に、標的核酸を増幅するのに適する条件下でPCR増幅を行い、各1対のタグプライマーは、プライマータグを含む正方向タグプライマーと逆方向タグプライマーいずれも縮重プライマーであってもよいから構成され、正方向タグプライマーと逆方向タグプライマーに含まれるプライマータグは同じであってもよいし、異なっていてもよく、異なるサンプルに用いられるタグプライマー対におけるプライマータグは互いに異なる、4混合:各サンプルのPCR増幅産物を一緒に混合し、PCR産物のライブラリーを得る、5断片化:得られたPCR産物のライブラリーを不完全断片化する、6ライブラリー構築:ライブラリーアダプタータグ技術を結合して、断片化されたPCR産物のライブラリーでPCRFreeシークエンシングライブラリーを構築し、異なるPCRFreeシークエンシングライブラリーと区別するように、ライブラリーに異なるライブラリーアダプターadapterを付け、用いられたシークエンサーの最大読み取り長から、用いられたシークエンサーに適用されるDNAの最大長範囲までのあらゆるDNAバンド、具体的に450~750bpの長さ範囲のDNA断片を回収する、7シークエンシング:回収されたDNA混合物に対して、次世代シークエンシング技術、好ましくはPairEnd技術例えば、IlluminaGAIlluminaHiseq2000によりシークエンシングを行い、断片化されたDNAの配列を得る、8組み立て:各ライブラリーの異なるライブラリーアダプター配列とサンプルごとの独特なプライマータグを基にして、得られたシークエンシング結果をサンプルと一対一に対応付けさせ、対照プログラム例えばBlast、BWAプログラムを利用して、各シークエンシング配列をPCR産物の相応するDNAの参考配列に位置決めさせ、配列のオーバラップ及び連鎖関係に基づいて断片化されたDNAの配列から、完全な標的核酸を組み立てる、9タイピング:シークエンシング結果を、HLAデータベース例えばIMGTHLA専門的データベースにおけるHLAのエキソン、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン、HLACの第2、第3及び又は第4エキソン、HLADQB1遺伝子の第2及び又は第3エキソン遺伝子及び又はHLADRB1の第2エキソンの配列のデータと対照を行い、配列の対照の結果が100で合致しているものは、対応するサンプルのHLA遺伝子型である、ことを含むHLAタイピング方法。各1対のプライマータグとPCRプライマー対は1対のタグプライマーを組み合わせて構成し、正逆方向のPCRプライマーの5’末端に、正方向プライマータグと逆方向プライマータグをそれぞれに有する或いは任意の接続配列により接続されていることを特徴とする請求項17に記載の方法。前記PCRプライマーは、HLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記HLAABの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表7に示すものであり、或いは好ましくはHLAC遺伝子の第2、第3及び又は第4エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表3又は4に示すものであり、或いは好ましくはHLADQB1の第2及び又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表5に示すものであることを特徴とする請求項17に記載の方法。前記プライマータグは請求項6に記載されているものであることを特徴する請求項17に記載の方法。前記DNAの断片化は、化学的断片化方法及び物理的断片化方法を含み、前記化学的方法は酵素切断方法を含み、前記物理的断片化方法は超音波断片化方法又は機械的断片化方法を含むことを特徴とする請求項17に記載の方法。前記精製回収方法は、電気泳動タッピングによる回収法に限られず、磁気ビーズによる回収法であってもよいことを特徴とする請求項17に記載の方法。前記ライブラリーアダプタータグ技術を結合して、断片化されたPCR産物のライブラリーでPCRFreeシークエンシングライブラリーを構築することは、m種のライブラリーを用いて、2で得られたm個のPCR産物のライブラリーにアダプターを付加し、各PCR産物のライブラリーごとに異なるライブラリーアダプターを使用することによって、m個のアダプタータグシークエンシングライブラリーを構築することであり、m個のアダプタータグシークエンシングライブラリーを等モルで混合して混合アダプタータグシークエンシングライブラリーを構築し、その中のライブラリーアダプターの接続方法とは、PCR工程を行うことなくDNA接続酵素で直接的に接続することを指していることを特徴とする請求項17に記載の方法。HLA遺伝子タイピング用のPCRプライマーであって、前記PCRプライマーは、HLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記HLAABの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表1または表2に示す如くであり、好ましくは前記HLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表7に示すものであり、或いは、HLAC遺伝子の第2、第3及び又は第4エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表3又は4に示すものであり、或いはHLADQB1の第2及び又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表5に示すものであることを特徴とするHLA遺伝子タイピング用のPCRプライマー。請求項24に記載のPCRプライマーがシークエンシングに用いる方法であって、サンプル、特に血液サンプルを提供し、前記血液サンプルは、好ましくは、哺乳類動物、特にヒトに由来する、増幅:前記PCRプライマーを利用して血液サンプル由来のDNAを増幅してPCR産物を取得するとともに、PCR産物を精製する、シークエンシング:前記PCR産物に対してシークエンシングを行い、シークエンシング法としてはサンガー法sangerか、第2世代シークエンシング法例えばHiseq2000、IlluminaGAとRoche454が挙げられることを含む方法。請求項24に記載のPCRプライマーを使用して請求項25に記載の方法により得られた結果に基づいて組立と対照解析を行い、シークエンシング結果をデータベースにおける標準配列と比較し、HLA遺伝子タイピング結果を得る、請求項24に記載のPCRプライマーがHLA遺伝子タイピングに用いられる用途。HLA遺伝子タイピングを行うための試薬箱であって、前記試薬箱は請求項24に記載のPCRプライマーを含む試薬箱。HLAA、B遺伝子タイピング用の1セットのPCRプライマーであって、前記PCRプライマーは表1又は表2に示すものであり、好ましくは前記タイピングは、第2世代シークエンシング法とサンガー法を含めるシークエンシング法により行われる1セットのPCRプライマー。請求項28に記載のPCRプライマーがシークエンシングに用いられる方法であって、サンプル、特に血液サンプルを提供し、前記血液サンプルは、好ましくは、哺乳類動物、特にヒトに由来する、増幅:前記PCRプライマーを利用して血液サンプル由来のDNAを増幅してPCR産物を取得するとともに、PCR産物を精製する、シークエンシング:前記PCR産物に対してシークエンシングを行い、シークエンシング法としてはサンガー法sangerか、第2世代シークエンシング法例えばHiseq2000、IlluminaGAとRoche454が挙げられる、ことを含む方法。請求項28に記載のPCRプライマーがHLA遺伝子タイピングに用いる用途であり、請求項1に記載のPCRプライマーを使用して請求項29に記載の方法により得られた結果に基づいて組立と対照解析を行い、シークエンシング結果をデータベースにおける標準配列と比較し、HLA遺伝子タイピング結果を得ることを特徴する用途。HLA遺伝子タイピングを行うための試薬箱であって、前記試薬箱は請求項28に記載のPCRプライマーを含む。SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29及びSEQIDNO:30、若しくはSEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35及びSEQIDNO:36のいずれか1項に示される配列を有するポリヌクレオチド。HLAC遺伝子の第2、3及び又は第4エキソンの増幅方法であって、SEQIDNO:25及びSEQIDNO:26、SEQIDNO:27及びSEQIDNO:28、SEQIDNO:29及びSEQIDNO:30、若しくはSEQIDNO:31及びSEQIDNO:32、SEQIDNO:33及びSEQIDNO:34、SEQIDNO:35及びSEQIDNO:36からなる群より選ばれるプライマー対を用いてPCR増幅を行い、HLAC遺伝子の第2、3及び又は第4エキソンを増幅することを特徴とするHLAC遺伝子の第2、3及び又は第4エキソンの増幅方法。サンプル中のHLAC遺伝子の第2、3及び又は4エキソンにシークエンシングを行う方法であって、1サンプルを1つ提供して当該サンプルのDNAを抽出する、2SEQIDNO:25及びSEQIDNO:26、SEQIDNO:27及びSEQIDNO:28、SEQIDNO:29及びSEQIDNO:30、若しくはSEQIDNO:31及びSEQIDNO:32、SEQIDNO:33及びSEQIDNO:34、SEQIDNO:35及びSEQIDNO:36からなる群より選ばれるプライマー対を用いて前記DNAを増幅してPCR産物を取得し、好ましくはPCR産物を精製する、3前記PCR産物に対してシークエンシングを行う、ことを含む方法。前記サンプルは、血液サンプルであることを特徴する請求項34に記載の方法。前記血液サンプルは、哺乳動物又はヒトに由来することを特徴する請求項35に記載の方法。HLAC遺伝子タイピング方法であって、1SEQIDNO:25及びSEQIDNO:26、SEQIDNO:27及びSEQIDNO:28、SEQIDNO:29及びSEQIDNO:30、若しくはSEQIDNO:31及びSEQIDNO:32、SEQIDNO:33及びSEQIDNO:34、SEQIDNO:35及びSEQIDNO:36からなる群より選ばれるプライマー対を用いてPCR増幅を行い、決定すべきサンプルのHLAC遺伝子の第2、3及び又は4エキソンを増幅する、2増幅されたエキソンに対してシークエンシングを行い、シークエンシング結果をデータベースにおける基準サンプルと比較して遺伝子タイピング結果を特定する、ことを含むHLAC遺伝子タイピング方法。前記シークエンシングはサンガー法sanger或いは第2世代シークエンシング法により行われることを特徴する請求項34又は37に記載の方法。前記第2世代シークエンシング法としては、IlluminaSolexa又はRoche454が挙げられることを特徴する請求項38に記載の方法。HLAC遺伝子タイピング用の試薬箱であって、前記試薬箱は、SEQIDNO:25及びSEQIDNO:26、SEQIDNO:27及びSEQIDNO:28、SEQIDNO:29及びSEQIDNO:30、若しくはSEQIDNO:31及びSEQIDNO:32、SEQIDNO:33及びSEQIDNO:34、SEQIDNO:35及びSEQIDNO:36からなる群より選ばれるPCRプライマー対を含み、前記試薬箱は好ましくは、DNA増幅、DNA精製及びまたはDNAシークエンシングに用いられる試薬をさらに含む試薬箱。請求項32に記載のポリヌクレオチド、請求項37に記載の方法又は請求項40記載の試薬箱がHLAC遺伝子タイピングに使用される用途。SEQIDNO:37~SEQIDNO:40のいずれか1項に示される配列を有するポリヌクレオチド。SEQIDNO:37及びSEQIDNO:38、及び又はSEQIDNO:39及びSEQIDNO:40のプライマー対を使用してPCR増幅を行うことを特徴とするHLADQB1の第2及び又は第3エキソンの増幅方法。サンプル中のHLADQB1の第2及び又は第3エキソンにシークエンシングを行う方法であって、1サンプルを1つ提供して当該サンプルのDNAを抽出する、2SEQIDNO:37及びSEQIDNO:38、及び又はSEQIDNO:39及びSEQIDNO:40のプライマー対を使用して前記DNAを増幅してPCR産物を取得し、好ましくはPCR産物を精製する、3前記PCR産物に対してシークエンシングを行う、ことを含む方法。前記サンプルは血液サンプルであることを特徴する請求項44に記載の方法。前記血液サンプルは哺乳動物又はヒトに由来することを特徴する請求項45に記載の方法。HLADQB1遺伝子タイピング方法であって、1SEQIDNO:37及びSEQIDNO:38、及び又はSEQIDNO:39及びSEQIDNO:40のプライマー対を用いてPCR増幅を行い、決定すべきサンプルのHLAC遺伝子の第2及び又は第3エキソンを増幅する、2増幅されたエキソンに対してシークエンシングを行い、シークエンシング結果をデータベースにおける基準サンプルと比較して遺伝子タイピング結果を特定する、ことを含むHLADQB1遺伝子タイピング方法。前記シークエンシングはサンガー法sanger或いは第2世代シークエンシング法により行われることを特徴する請求項44又は47に記載の方法。前記第2世代シークエンシング法としては、IlluminaSolexa又はRoche454が挙げられることを特徴する請求項48記載の方法。HLADQB1遺伝子タイピング用の試薬箱であって、前記試薬箱は、SEQIDNO:37及びSEQIDNO:38、及び又はSEQIDNO:39及びSEQIDNO:40のプライマー対を含み、前記試薬箱は好ましくは、DNA増幅、DNA精製及びまたはDNAシークエンシングに用いられる試薬をさらに含む試薬箱。請求項42に記載のポリヌクレオチド、請求項47に記載の方法又は請求項50に記載の試薬箱がHLADQB1遺伝子タイピングに使用される用途。現在、第2世代シークエンシング技術を利用して、大量のサンプルの特定の遺伝子関連配列に対してシークエンシング解析を同時に行う場合に、一般的にPCRシークエンシングの技術を用い、プライマータグ次世代シークエンシング技術との組み合わせを直接的に利用する。用いられたシークエンサーのシークエンシング長は、PCR産物全体の長さをカバーすることができるようになったら、前記技術は十分に要求を満足することができる。一方、用いられたシークエンサーのシークエンシング長は、PCR産物全体の長さをカバーすることができなくなった場合に、IlluminaGAに替わり、長いシークエンシング長を有する第2世代シークエンサー例えば、Roche454GSFLXを用いるか、シークエンシング長はまだ要求を満足しなかったら、コストとスループットを犠牲にして第1世代シークエンサーを使用するよりほかはない。現実には、IlluminaGAは超ハイスループットを有するが、そのシークエンシング長は200bpにしか達していない。Roche454GSFLXのシークエンシング長は500bpにも達することができるが、その配列決定コストが高く、スループットが小さい。これに対して、第1世代シークエンサーのシークエンシング長は1000bp以上になるが、そのスループットとコストは第2世代シークエンサーとは比べものにならない。コストとスループットを兼ねて、シークエンサーにより測定し得るPCR産物の長さを向上可能となる技術がなかろうか。本出願におけるプライマータグDNA不完全断片化技術次世代シークエンシング技術の組み合わせは、第2世代シークエンサーのハイスループット、低コストなどの特徴を活かすと同時に、シークエンサーにより測定し得るPCR産物の長さがシークエンサーそれ自身のシークエンシング長以上となるようにすることができるので、その適用範囲が大幅に拡がっている。本発明中に用いられる次世代シークエンシング技術は、第2世代シークエンシング技術中のPairendシークエンシング技術と、PCRテンプレートに対してDNA参照配列DNAReferenceSequenceが付いているPCRシークエンシング技術とを含んでいる。本発明は、PCRシークエンシング法を提供することである。前記方法により、自身のシークエンシング読み取り長が短いことによる制限を低減させ、第2世代DNAシークエンシング技術のPCRシークエンシング応用分野における適用を拡げている。例えば、次世代シークエンシング技術によるシークエンシング工程中に、5’末端にプライマータグprimerindex配列を付加したタグ付きプライマーを使用して行い、増幅後のPCR産物を断片化し、断片化された産物に末端修復を行うと共に、その3’末端にデオキシアデノシンAを結合させ、その後、異なるPCRfreeアダプターを結合させることができる。DNA分子タグ技術及びDNA不完全断片化技術に基づくPCRシークエンシング法の使用は、プライマータグの数を増やさない状況下で、唯一にマークされることが可能なサンプルの数を大きく高めることができる図5。本発明では、正、逆方向のPCRプライマーにプライマータグを付け、DNA不完全断片化技術を結合することにより、第2世代シークエンシング技術をPCRシークエンシングの分野に使用するとき、実に測定されたPCR産物の長さがシークエンサーによるシークエンシングの最大長よりも長くなっている。増幅用プライマーの先端に、一部のタグ配列を結合させるのは、複数のサンプルに対するシークエンシングを同時に実現することを目的とする。具体的に言えば、PCRindexbarcode技術を結合して、PCRプライマーの5’末端にプライマータグprimerindex配列を付加してタグ付きプライマーを合成することにより、PCRの工程中に、サンプルごとに独特なプライマータグを導入することができる。これにより、第2世代DNAシーケンス技術による検査中に、PCRの手順で1サンプルずつ処理する必要があるが、これ以外の他の実験の手順では、複数のサンプルを混ぜて同時に処理してもよい。最終的な各サンプルの検査結果は、その独特なプライマータグ配列により取り戻すことができる。アダプターadapter又はライブラリアダプターlibraryadapterタグ技術とは、複数のシークエンシングライブラリに対して異なるライブラリアダプターを付加し異なるライブラリアダプターの構成配列が異なり、配列が異なる部分はアダプタータグadapterindexと呼ばれる、タグシークエンシングライブラリを構築することにより、複数の異なるタグ付きシークエンシングライブラリーの混合シークエンシングを実現すると共に、最終的に各タグ付きシークエンシングライブラリーのシークエンシング結果を相互に区分可能とするためのライブラリタグ技術をいう。PCRFreeライブラリーアダプターadapterという術語は、設計された一部の塩基をいうものであり、主な作用は、DNA分子のシークエンシング用チップでの固定を補助し、共通のシークエンシングプライマーの結合部位を提供することである。PCRFreeライブラリーアダプターはDNAリガーゼを介してシークエンシングライブラリー中のDNA断片の両端に直接的に結合することができ、アダプターの導入工程中にPCRは参与しないため、PCRFreeライブラリーアダプターと呼ばれている。例えば、本発明の実施例の中に用いられるPCRFREEライブラリーアダプターはILLUMIAに由来している。ライブラリーアダプタータグ技術を結合するPCRFREEのライブラリー構築法は、ライブラリーアダプターをシークエンシングライブラリー中のDNA断片の両端に直接的に結合し、ライブラリーアダプターの導入工程中にPCRは参与しないため、PCRFREEのライブラリー構築法と呼ばれている。その中の接続法はDNAリガーゼにより接続してもよい。ライブラリー構築の全工程中に、PCRの参与がないから、高配列類似度を有するPCR産物プーリングpoolingライブラリーの構築過程中に、PCRの誤導入により最後の結果が正確ではなくなることが避けられている。本発明に言及されているDNA増幅方法、サンプルからDNAの抽出方法、DNAの精製方法及びDNA配列の対照方法は、当分野における任意の利用可能な方法であってもよい。前記方法は、当業者が具体的な状況に応じて選択し得る。DNAシークエンシング法について、当業者は通常の方法により実行するか、或いはシークエンシング機器の取扱説明書に従い実行することができる。プライマータグの設計は、使用される実験用プラットフォームによって異なる。IlluminaGAシークエンシングプラットフォーム自身の特徴を考慮したうえ、本発明はプライマータグを設計する際に考慮する点を以下にいくつか挙げる。1、プライマータグ配列中に、3個以上3個を含むの単一塩基の反復配列を回避すること;2、あらゆるプライマータグの同一部位中の塩基Aと塩基Cの総量が全塩基総量の30~70を占めること;3、プライマータグ配列自身のGC含量が40~60であること;4、プライマータグ間の配列相違度が4個の塩基以上であること;5、プライマータグ配列中に、IlluminaGAのシークエンシングプライマーと類似度の高い配列を回避すること;6、プライマータグ配列をPCRプライマーに付けた後、PCRプライマーに招来される厳しいヘアピンhairpinやダイマーdimmerなどの状況の発生を低減させること。本発明は、PCR反応により、PCR産物の両端のそれぞれに、1つのプライマータグを付加しプライマータグ配列は同じであってもよいし、異なっていてもよい、これにより、PCR産物のいずれか一方端のプライマータグでもPCR産物のサンプル情報を特異的にマークすることができる。得られたPCR産物は不完全に断片化される。いわゆる不完全断片化とは、最終的な産物中に含まれている、全てが断片化されていないPCR産物と、一部が断片化されたPCR産物を断片化することをいう。前記断片化方法は、化学的断片化方法例えば、酵素切断及び物理的断片化方法を含むが、これらに制限されることはない。前記物理的断片化方法は、超音波断片化方法と機械的断片化方法などを含む。断片化されたDNAを2アガロースゲル電気泳動して、シークエンサーの最大読み取り長から適用されるDNAの最大長範囲までのあらゆるDNAバンドをタッピングして精製回収するIlluminaGAシークエンサーに適用される最大長のDNAは700bpであり、この長さはDNAのオリジナル長であり、ライブラリーアダプター配列の長さを含まない。精製回収方法は、電気泳動タッピング法による回収を含むが、これに限られず、磁気ビーズ法による回収などであってもよい。回収されたDNA断片は第2世代シークエンサーのシークエンシングライブラリーから構築されるプロセスに従いシークエンシングライブラリーを作製し、その後シークエンシングを行う。PCRFREEシークエンシングライブラリーから構築されるプロセスに従いシークエンシングライブラリーを作製することが好ましく、シークエンシング方法としては、PairEnd方法を利用してシークエンシングを行うことが好ましい。PCRFreeシークエンシングライブラリーから構築されるプロセスは当業者の既知の方法に基づいて作製される。得られたシークエンシングの総データ中に、プライマータグ配列により、あらゆる測定されるサンプルの配列情報を見出すことができる。BWAにより、各シークエンシング配列をPCR産物の相応するDNAの参考配列ReferenceSequenceに位置決めさせ、シークエンシング配列間のオーバラップ及び連鎖関係に基づいてPCR産物の完全な配列を組み立てる図1。ここの連鎖とは、PairEndシークエンシングの特徴に決定されるpairend連鎖関係をいう。IlluminaGAシークエンシングIllumina社製のGenomeAnalyzerシークエンサー、IlluminaGAと略するは、合成しつつシークエンシングを行う原理によるDNA配列解析であり、ハプロタイプを検査可能となり、最終的に生成されるデータは一連の塩基配列であり、HLAデータベース中の参考配列と直接的に対照を行うことができる。よって、従来のタイピングソフトウェアのピークの誤検査という問題がなく、ソフトウェアタイピングの自動化に有利である。IlluminaGAのシークエンシングスループットが大きく、現在の1つの実験手順では、50G500億の塩基のデータを生成し、一日平均50億の塩基のデータを生成することができる。シークエンシング配列数が特定された場合に、高いデータスループットでは、各配列はより高いシークエンシング深度を得ることができるから、シークエンシング結果の確実性が確保される。現在に、IlluminaGAをHLAタイピング分野に応用する研究がまだ進んでいない。本発明は初めてIlluminaGAシークエンシングをHLAタイピング分野に応用し、DNA分子タグ技術、DNA不完全断片化およびPCRFREEライブラリー構築によるPCRシークエンシング技術を結合することにより、HLAの低コスト、ハイスループット、高正確率、高分解能のタイピングを図ろうとする。本発明において、DNA分子タグ技術、DNA不完全断片化およびPCRFREEライブラリー構築に基づいたPCRシークエンシング技術を採用して、被解析のサンプルをグループ化し、各グループのサンプルに対して双方向プライマータグでマークされるプライマーにより、HLA遺伝子標的断片を増幅しPCR産物の最大長はシークエンサーの結合可能なDNAの最大長により決定され、現在のIlluminaGAシークエンサーに適用される最大長のDNAは700bpであり、この長さはDNAのオリジナル長であり、ライブラリーアダプター配列の長さを含まない、得られたPCR産物を等量で混合し、DNA不完全断片化処理により、PCRFreeタグ付きシークエンシングライブラリーを構築する。サンプルグループごとに得られた異なるタグ付きシークエンシングライブラリーを等モルで混合し、断片化長がシークエンサーの最大シークエンシング長を超えるすべてのDNA断片を選択的に回収し、次いでIlluminaGAシークエンサーを利用してシークエンシングを行う。シークエンシング結果のうちのアダプタータグadapterindex、プライマータグ及びPCRプライマーの配列情報を選別することによって、それぞれのサンプルのDNA配列情報を得ることができる。得られたDNA配列を組み立って、IMGTHLA専門的データベースにおける対応するデータとの対照を行うことによって、最終的にサンプルのHLA遺伝子型が得られている。上述の方法において、前記DNAを断片化した後、PCRFreeタグ付きライブラリーの構築中に、グループ別のサンプルのDNAに異なるライブラリーアダプターを結合させ、その結果、後続のタイピングステップにおいて、サンプル別に用いられるプライマータグ及びアダプタータグに基づいて、得られたシークエンシング結果をサンプルと一対一に対応付けさせる。対照工程により、各サンプルのシークエンシング配列をそのPCR産物の既知の相応するDNAの参考配列ReferenceSequenceに位置決めさせ、配列間のオーバラップ及び連鎖関係に基づいて、断片化されたDNAの配列から、PCR産物の完全な配列を組み立てる。本発明は、IlluminaGAシークエンシング技術に基づいたHLA遺伝子の高分解能のタイピング方法を提供している。これにより、ハプロタイプのシークエンシング、ソフトウェアタイピングの自動化を図るとともに、HLA遺伝子タイピングのスループットを向上させコストを低下させる。既存の新たなシークエンシング技術のDNAテンプレートの長さに対する要求と、新たなシークエンシング技術の読み取り長が短い事実に鑑みて、HLASBT法に用いられていたPCRプライマーは、新たなシークエンシング技術に基づくHLAの高分解能のタイピング方法に適用することができなくなる。本発明は、HLAA、Bをそれぞれ単独で増幅する新しい第2、3、4エキソンの特異性及び保守性に優れたPCRプライマーを設計し、かつPCR産物の長さは700bp未満であるから、IlluminaGAに特に適用する現在のIlluminaGAに適するDNAの最大長は700bpである。本発明に提供されるPCRプライマーセットは、被験者特に人に対する大規模且つハイスループット及び低コストのHLA遺伝子タイピングに用いることができる。本発明に採用されている技術案においては、IMGTHLAインタネットサイトhttpwwwebiacukimgthlaからあらゆる最新のHLAAB遺伝子配列をダウンロードし、その後、HLAAデータセットとしてローカルディスクに記憶させる一方、あらゆる最新のHLAAではないHLAI類遺伝子配列を比較データセットとしてダウンロードする。2つのデータセットを比較し、第2、3、4エキソンの両端及び内部から、各遺伝子座の保守的且つ特異的な配列を見つけるとともに、設計されたPCRプライマー配列とヒトゲノム配列の相同性を比較する。HLAAB遺伝子は、同じくHLA1類分子に該当するほかの遺伝子と高い配列類似性を有するため、PCRプライマーを設計するとき、プライマーの3’末端の特異性を最大程度で確保し、プライマーでHLAAB遺伝子を増幅する特異性を確保する。また、PCR産物の長さを700bpとし、かつ正逆方向のプライマーのアニール温度をほぼ一致させるように保持する。設計要求を満足する複数対の候補HLAABプライマーを用いて、HLAABの通常の血清型を有する少数のテンプレートDNAを増幅し、その中から、保守性及び特異性に最も優れている、第2、3、4エキソンをそれぞれに増幅するための2セット各6対ずつのHLAABのPCRプライマーを選別する。選別された2セット各6対ずつのPCRプライマーを基礎プライマーとし、これに基づいて、HLAABの通常の血清型を有する95個と950個のDNAテンプレートをそれぞれに増幅するための95セットのタグプライマーを設計する当該部分のテンプレートのHLA型はあらゆる通常のHLAABの血清型を含む。あらゆるPCR産物を等量で混合した後、IlluminaGAPairEnd100でシークエンシングを行い、組み立てられたシークエンシング結果をタイピングして原タイピング結果と比較してPCRプライマーの保守性及び特異性を検証する。本発明により設計されたHLAA、B遺伝子座のプライマー、即ち、第2、3、4エキソンをそれぞれに増幅するための2セット各6対ずつのHLAABのPCRプライマーはそれぞれ下記表1及び表2に示すものである。表中、縮重プライマーとは、1つのアミノ酸をコードするあらゆる異なる塩基の可能性を示す異なる配列の混合物をいう。特異性を向上させるために、コドン使用表を参照して、異なる生物の塩基の使用時の好みに応じて縮重性を低減させることが考えられる。その中に、R=AG、Y=CT、M=AC、K=GT、S=CG、W=AT、H=ACT、B=CGT、V=ACG、D=AGT、NACGT。本発明は、上記の如くHLAAB遺伝子の第2、3及び4エキソンを増幅するためのPCRプライマーに関する方法を利用して、HLACの第2、3及び4エキソンを増幅する2セット各3対ずつのPCRプライマーを設計する。下記の実施例において、選別された2セット各3対ずつのPCRプライマーを用いて、95例と950例の既知のHHLAの通常の遺伝子型の血液サンプルに対してHLAC遺伝子座のPCR増幅をそれぞれに行い、増幅産物をサンガー法sanger及び第2世代シークエンシング法によりシークエンシングを行う。シークエンシング結果をHLACタイピングして、原タイピング結果と比較してPCRプライマーの保守性及び特異性を検証する。本発明は、HLAC遺伝子の第2、3及び4エキソンを増幅する2セット各3対ずつのPCRプライマーを提供する。それらはそれぞれ表3に示されるSEQIDNO:25及び26、27及び28と29及び30、表4に示されるSEQIDNO:31及び32、33及び34と35及び36である。前記6対のPCRプライマーは良好な保守性及び特異性を有するとともに、HLAC遺伝子座の第2、3及び4エキソンの全配列長をカバーすることができる。PCR産物の長さはいずれも700bp未満であり、正常なIlluminaSolexaのシークエンシングの要求を満足する。なお、本発明のプライマーは更にサンガー法sangerに適用されている。上述したような方法により、第2世代シークエンシング技術をHLADQB1遺伝子のタイピングに使用するために、本発明は、HLADQB1の第2及び又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマーを提供する。それらは表5に示すSEQIDNO:37~40である。前記PCRプライマーは良好な保守性及び特異性を有するとともに、HLADQB1遺伝子座の第2、3エキソンの全配列長をカバーすることができる。PCR産物の長さはいずれも700bp未満であり、正常なIlluminaSolexaのシークエンシングの要求を満足する。なお、本発明のプライマーは更にサンガー法sangerによるシークエンシングに適用されている。本発明から提供されている増幅用プライマー対及び遺伝子タイピング方法を使用すれば、HLADQB1遺伝子座の第2及び又は第3エキソンを増幅するうえで遺伝子のタイピングを行うことができる。従来技術に対して、当該タイピング方法はIlluminaSolexaによるシークエンシング技術を利用している。当該技術は、高分解能のHLAタイピング結果をハイスループット且つ低コストで得ることができる特徴を有する。核酸のシークエンシング方法本発明は、下記のステップを含むサンプル中の標的核酸のヌクレオチド配列を測定する方法を提供する。1n個のサンプルを提供しnは1以上の整数である、前記サンプルは、好ましくは、哺乳類動物に由来し、更に好ましくは、ヒト、特にヒトの血液サンプルに由来する。解析すべきn個のサンプルをm個のグループに分けるのが好ましいmは整数であり且つn≧m≧1、2増幅:各サンプルに対して、1対又は複数対のタグプライマーを用いて、当該サンプル由来のテンプレートが存在している場合に、標的核酸を増幅するのに適する条件下でPCR増幅を行う。各1対のタグプライマーは、プライマータグを含む正方向タグプライマーと逆方向タグプライマーいずれも縮重プライマーであってもよいから構成され、正方向タグプライマーと逆方向タグプライマーに含まれるプライマータグは同じであってもよいし、異なっていてもよい。異なるサンプルに用いられるタグプライマー対におけるプライマータグは互いに異なる、3混合:n1の場合に、各サンプルのPCR増幅産物を一緒に混合する、4断片化:得られた増幅産物を不完全断片化し、精製回収する、5シークエンシング:回収されたDNA混合物に対して、次世代シークエンシング技術、好ましくはPairEnd技術例えば、IlluminaGAIlluminaHiseq2000によりシークエンシングを行い、断片化されたDNAの配列を得る、6組み立て:サンプルごとの独特なプライマータグを基にして、得られたシークエンシング結果をサンプルと一対一に対応付けさせ、対照プログラム例えばBlast、BWAプログラムを利用して、各シークエンシング配列をPCR産物の相応するDNAの参考配列に位置決めさせ、配列のオーバラップ及び連鎖関係に基づいて断片化されたDNAの配列から、完全な標的核酸を組み立てる。本発明の一方面により、各1対のプライマータグとPCRプライマー対は1対のタグプライマーを組み合わせて構成する。正逆方向のPCRプライマーの5’末端に、正方向プライマータグと逆方向プライマータグをそれぞれに有する或いは任意の接続配列により接続されている。本発明の1つの具体的な実施形態では、前記PCRプライマーはHLA遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、特にHLAAB遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーである。好ましくは前記HLAABの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表7に示すものである。本発明の1つの具体的な実施形態では、前記PCRプライマーはHLA遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、特にHLAC遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLACの第2、第3及び又は第4エキソンを増幅するためのPCRプライマーである。好ましくは前記PCRプライマーは表3又は4に示すものである。本発明の1つの具体的な実施形態では、前記PCRプライマーはHLA遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、特にHLADRB1遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLADQB1の第2及び又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマーである。好ましくは前記PCRプライマーは表5に示すものである。本発明の一方面において、前記プライマータグはPCRプライマー対して設計し、好ましくはHLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーに対して設計し、更に好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーに対して設計し、特に好ましくは表1又は表2又は表7に示されるようなPCRプライマーに対して設計する。前記プライマータグは、特に、表6に示される95対のプライマータグのうちの少なくとも10対、又は少なくとも20対、又は少なくとも30対、又は少なくとも40対、又は少なくとも50対、又は少なくとも60対、又は少なくとも70対、又は少なくとも80対、又は少なくとも90対、又は95対を含み或いは、前記1組のプライマータグは表1に示される95対のプライマータグのうちの10~95対例えば、10~95対、20~95対、30~95対、40~95対、50~95対、60~95対、70~95対、80~95対、90~95対、又は95対からなる、かつ、前記1組のプライマータグは、少なくとも表6に示される95対のプライマータグのうちのPI1~PI10、又はPI11~PI20、又はPI21~PI30、又はPI31~PI40、又はPI41~PI50、又はPI51~PI60、又はPI61~PI70、又はPI71~PI80、又はPI81~PI90、又はPI91~PI95、或いはこれらのうちのいずれか2個又は複数個の組み合わせを含むことが好ましい。本発明の1つの具体的な実施形態では、前記DNAの断片化は、化学的断片化方法及び物理的断片化方法を含む。前記化学的方法は酵素切断方法を含み、前記物理的断片化方法は超音波断片化方法や機械的断片化方法などを含む。本発明の1つの具体的な実施形態では、前記DNAを断片化した後、シークエンサーの最大読み取り長から、シークエンサーに適用されるDNAの最大長範囲までのあらゆるDNAバンドを精製回収する。前記精製回収方法は電気泳動タッピングによる回収法を含むが、これに限られず、磁気ビーズによる回収法であってもよい。本発明の他方面において、サンプル中の標的核酸のヌクレオチド配列を測定する方法は、請求項1に記載のステップ1~4及び下記のステップを更に含む。5ライブラリー構築:断片化されたPCR産物のライブラリーでPCRFreeシークエンシングライブラリーを構築し、異なるPCRFreeシークエンシングライブラリーと区別するように、ライブラリーに異なるライブラリーアダプターadapterを付け、用いられたシークエンサーの最大読み取り長から、用いられたシークエンサーに適用されるDNAの最大長範囲までのあらゆるDNAバンド、好ましくは450~750bpの長さ範囲のDNA断片を精製回収する、6シークエンシング:回収されたDNA混合物に対して、次世代シークエンシング技術、好ましくはPairEnd技術例えば、IlluminaGAIlluminaHiseq2000によりシークエンシングを行い、断片化されたDNAの配列を得る、7組み立て:各ライブラリーの異なるライブラリーアダプター配列とサンプルごとの独特なプライマータグを基にして、得られたシークエンシング結果をサンプルと一対一に対応付けさせ、対照プログラム例えばBlast、BWAプログラムを利用して、各シークエンシング配列をPCR産物の相応するDNAの参考配列に位置決めさせ、配列のオーバラップ及び連鎖関係に基づいて断片化されたDNAの配列から、完全な標的核酸を組み立てる。本発明の一方面は、上述の方法を利用して患者からのサンプル特に血液サンプルに対してシークエンシングを行い、シークエンシング結果を、HLAデータベース例えばIMGTHLA専門的データベースにおけるHLAのエキソン、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン、HLACの第2、第3及び又は第4エキソン、HLADQB1遺伝子の第2及び又は第3エキソン遺伝子及び又はHLADRB1の第2エキソンの配列のデータと対照を行い、配列の対照の結果が100で合致しているものを、対応するサンプルのHLA遺伝子型とする工程を含むことを特徴とする前記方法をHLAタイピングに使用する用途をさらに提供する。1組のプライマータグ本発明の他方面は、1組のプライマータグを提供する。それは、表6に示される95対のプライマータグのうちの少なくとも10対、又は少なくとも20対、又は少なくとも30対、又は少なくとも40対、又は少なくとも50対、又は少なくとも60対、又は少なくとも70対、又は少なくとも80対、又は少なくとも90対、又は95対を含み或いは、前記1組のプライマータグは表1に示される95対のプライマータグのうちの10~95対例えば、10~95対、20~95対、30~95対、40~95対、50~95対、60~95対、70~95対、80~95対、90~95対、又は95対からなる、かつ、前記1組のプライマータグは、少なくとも表6に示される95対のプライマータグのうちのPI1~PI10、又はPI11~PI20、又はPI21~PI30、又はPI31~PI40、又はPI41~PI50、又はPI51~PI60、又はPI61~PI70、又はPI71~PI80、又はPI81~PI90、又はPI91~PI95、或いはこれらのうちのいずれか2個又は複数個の組み合わせを含むことが好ましい。本発明は、さらに、前記方法をHLAタイピングに使用する用途をさらに提供する。その中に、各1対のプライマータグと、決定すべき標的配列を増幅するためのPCRプライマー対は1対のタグプライマーを組み合わせて構成する。正逆方向のPCRプライマーの5’末端に、正方向プライマータグと逆方向プライマータグをそれぞれに有する或いは任意の接続配列により接続されている。本発明の一方面では、前記PCRプライマーはHLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記HLAABの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表7に示すものであり、或いは好ましくはHLAC遺伝子の第2、第3及び又は第4エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表3又は4に示すものであり、或いは好ましくはHLADQB1の第2及び又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表5に示すものである。本発明の他方面では、前記1組のプライマータグと、決定すべき標的配列を増幅するためのPCRプライマー対を組み合わせてなる1対のタグプライマーを提供する。その中に、各1対のプライマータグとPCRプライマー対は1対のタグプライマーを組み合わせて構成する。正逆方向のPCRプライマーのそれぞれの5’末端に、1つのプライマータグを有する或いは任意の接続配列により接続されている。本発明の1つの具体的な実施形態では、前記PCRプライマーは、HLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記HLAABの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマーは、表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表7に示すものであり、或いは好ましくはHLAC遺伝子の第2、第3及び又は第4エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表3又は4に示すものであり、或いは好ましくはHLADQB1の第2及び又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表5に示すものである。本発明の他方面は、さらに、前記タグプライマーをPCRシークエンシング方法に使用する用途をさらに提供する。HLAのタイピング方法本発明の一方面において、下記のステップを含むHLAタイピング方法を提供する。1n個のサンプルを提供しnは1以上の整数である、前記サンプルは、好ましくは、哺乳類動物に由来し、更に好ましくは、ヒト、特にヒトの血液サンプルに由来する、2解析すべきn個のサンプルをm個のグループに分けるmは整数であり且つn≧m≧1、3増幅:各サンプルに対して、1対のタグプライマーを用いて、当該サンプル由来のテンプレートが存在している場合に、標的核酸を増幅するのに適する条件下でPCR増幅を行う。各1対のタグプライマーは、プライマータグを含む正方向タグプライマーと逆方向タグプライマーいずれも縮重プライマーであってもよいから構成され、正方向タグプライマーと逆方向タグプライマーに含まれるプライマータグは同じであってもよいし、異なっていてもよい。異なるサンプルに用いられるタグプライマー対におけるプライマータグは互いに異なる、4混合:各サンプルのPCR増幅産物を一緒に混合し、PCR産物のライブラリーを得る、5断片化:得られたPCR産物のライブラリーを不完全断片化する、6ライブラリー構築:ライブラリーアダプタータグ技術を結合して、断片化されたPCR産物のライブラリーでPCRFreeシークエンシングライブラリーを構築し、用いられたシークエンサーの最大読み取り長から、用いられたシークエンサーに適用されるDNAの最大長範囲までのあらゆるDNAバンド、具体的に450~750bpの長さ範囲のDNA断片を回収する、7シークエンシング:回収されたDNA混合物に対して、次世代シークエンシング技術、好ましくはPairEnd技術例えば、IlluminaGAIlluminaHiseq2000によりシークエンシングを行い、断片化されたDNAの配列を得る、8組み立て:各ライブラリーの異なるライブラリーアダプター配列とサンプルごとの独特なプライマータグを基にして、得られたシークエンシング結果をサンプルと一対一に対応付けさせ、対照プログラム例えばBlast、BWAプログラムを利用して、各シークエンシング配列をPCR産物の相応するDNAの参考配列に位置決めさせ、配列のオーバラップ及び連鎖関係に基づいて断片化されたDNAの配列から、完全な標的核酸を組み立てる、9タイピング:シークエンシング結果を、HLAデータベース例えばIMGTHLA専門的データベースにおけるHLAのエキソン、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン、HLACの第2、第3及び又は第4エキソン、HLADQB1遺伝子の第2及び又は第3エキソン遺伝子及び又はHLADRB1の第2エキソンの配列のデータと対照を行い、配列の対照の結果が100で合致しているものは、対応するサンプルのHLA遺伝子型である。本発明に記載のHLAタイピング方法において、各1対のプライマータグとPCRプライマー対は1対のタグプライマーを組み合わせて構成する。正逆方向のPCRプライマーの5’末端に、正方向プライマータグと逆方向プライマータグをそれぞれに有する或いは任意の接続配列により接続されている。本発明の1つの具体的な実施形態では、前記PCRプライマーはHLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記HLAABの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表7に示すものであり、或いは好ましくはHLAC遺伝子の第2、第3及び又は第4エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表3又は4に示すものであり、或いは好ましくはHLADQB1の第2及び又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表5に示すものである。本発明の1つの具体的な実施形態では、前記プライマータグは上記に述べられたような1組のプライマータグである。本発明に記載のHLAタイピング方法の1つの具体的な実施形態では、前記DNAの断片化は、化学的断片化方法及び物理的断片化方法を含む。前記化学的方法は酵素切断方法を含み、前記物理的断片化方法は超音波断片化方法や機械的断片化方法などを含む。本発明に記載のHLAタイピング方法の1つの具体的な実施形態では、前記精製回収方法は電気泳動タッピングによる回収法を含むが、これに限られず、磁気ビーズによる回収法であってもよい。本発明に記載のHLAタイピング方法において、前記ライブラリーアダプタータグ技術を結合して、断片化されたPCR産物のライブラリーでPCRFreeシークエンシングライブラリーを構築することは、m種のライブラリーを用いて2で得られたm個のPCR産物のライブラリーにアダプターを付加し、各PCR産物のライブラリーごとに異なるライブラリーアダプターを使用してm個のアダプタータグシークエンシングライブラリーを構築することである。m個のアダプタータグシークエンシングライブラリーを等モルで混合して混合アダプタータグシークエンシングライブラリーを構築する。その中のライブラリーアダプターの接続方法とは、PCR工程を行うことなくDNA接続酵素で直接的に接続することをいう。HLA遺伝子タイピング用のPCRプライマー本発明の一方面では、HLA遺伝子タイピング用のPCRプライマーであって、前記PCRプライマーはHLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記HLAABの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーは表7に示すものであり、或いは好ましくはHLAC遺伝子の第2、第3及び又は第4エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表3又は4に示すものであり、或いは好ましくはHLADQB1の第2及び又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記PCRプライマーは表5に示すものであることを特徴とするHLA遺伝子タイピング用のPCRプライマーを提供する。本発明は、下記のステップを含む前記PCRプライマーのシークエンシングに用いる方法をさらに提供する。サンプル、特に血液サンプルを提供し、前記血液サンプルは、好ましくは、哺乳類動物、特にヒトに由来する、増幅:前記PCRプライマーを利用して血液サンプル由来のDNAを増幅してPCR産物を取得するとともに、PCR産物を精製する、シークエンシング:前記PCR産物に対してシークエンシングを行い、シークエンシング法としてはサンガー法sangerか、第2世代シークエンシング法例えばHiseq2000、IlluminaGAとRoche454が挙げられる。本発明の他方面では、前記PCRプライマーを使用して前記シークエンシング法により得られた結果を組み立て及び対照解析し、シークエンシング結果をデータベースにおける基準配列と比較してHLA遺伝子タイピングの結果を取得することを特徴とする前記PCRプライマーをHLA遺伝子タイピングに用いる用途をさらに提供する。本発明の他方面では、HLA遺伝子タイピングを行う試薬箱をさらに提供する。前記試薬箱の中に、前記PCRプライマーを含む。HLAA、B遺伝子タイピング用のPCRプライマー本発明の一方面では、HLAA、B遺伝子タイピング用のPCRプライマーであって、前記PCRプライマーは表1又は表2に示すものであることを特徴とするHLAA、B遺伝子タイピング用のPCRプライマーを提供する。本発明の他方面では、下記のステップを含む本発明のHLAA、B遺伝子タイピング用のPCRプライマーのシークエンシングに用いる方法を提供する。サンプル、特に血液サンプルを提供し、前記血液サンプルは、好ましくは、哺乳類動物、特にヒトに由来する、増幅:前記PCRプライマーを利用して血液サンプル由来のDNAを増幅してPCR産物を取得するとともに、PCR産物を精製する、シークエンシング:前記PCR産物に対してシークエンシングを行い、シークエンシング法としてはサンガー法sangerか、第2世代シークエンシング法例えばHiseq2000、IlluminaGAとRoche454が挙げられる。本発明の他方面では、前記PCRプライマーを使用して前記方法により得られたシークエンシング結果を組み立て及び対照解析し、シークエンシング結果をデータベースにおける基準配列と比較してHLA遺伝子タイピングの結果を取得することを特徴とする本発明のHLAA、B遺伝子タイピング用のPCRプライマーのHLA遺伝子タイピングに用いる用途を提供する。他方、本発明は、HLA遺伝子タイピングを行う試薬箱をさらに提供する。前記試薬箱の中に、本発明のHLAA、B遺伝子タイピング用のPCRプライマーを含む。HLAC遺伝子タイピング用のPCRプライマー本発明は、本発明の増幅用プライマー対を使用してPCR増幅を行い、前記増幅用プライマー対の配列は表3又は表4に示されることを特徴とする新たなHLAC遺伝子の第2、3及び4エキソンの増幅方法をさらに提供する。PCR反応によりHLACの第2、3及び4エキソンを増幅可能となる。よって、本発明の方法をHLAC遺伝子タイピングに特に有利に使用することができる。従来のHLAC遺伝子タイピング方法に比べ、本発明の方法及び増幅用プライマーを用いた産物は700bp以内に制御されているため、更なるタイピングを行うに際して、IlluminaSolexaシークエンシング技術によるHLASBTを利用することができる。本発明は、下記のステップを含むサンプル中のHLAC遺伝子の第2、3及び又は4エキソンにシークエンシングを行う方法をさらに提供する。1サンプルを1つ提供して当該サンプルのDNAを抽出する、2本発明のHLAC遺伝子タイピング用のPCRプライマー対、好ましくはSEQIDNO:25及びSEQIDNO:26、SEQIDNO:27及びSEQIDNO:28、SEQIDNO:29及びSEQIDNO:30、若しくはSEQIDNO:31及びSEQIDNO:32、SEQIDNO:33及びSEQIDNO:34、SEQIDNO:35及びSEQIDNO:36からなる群より選ばれるプライマー対を用いて前記DNAを増幅してPCR産物を取得し、好ましくはPCR産物を精製する、3前記PCR産物に対してシークエンシングを行い、前記シークエンシングは好ましくは第2世代シークエンシング法により行われる。前記第2世代シークエンシング法としては、IlluminaSolexa又はRoche454が挙げられる。本発明は、下記のステップを含むHLAC遺伝子タイピング方法をさらに提供する。1本発明のHLAC遺伝子タイピング用のPCRプライマー対、好ましくはSEQIDNO:25及びSEQIDNO:26、SEQIDNO:27及びSEQIDNO:28、SEQIDNO:29及びSEQIDNO:30、若しくはSEQIDNO:31及びSEQIDNO:32、SEQIDNO:33及びSEQIDNO:34、SEQIDNO:35及びSEQIDNO:36からなる群より選ばれるプライマー対を用いてPCR増幅を行い、決定すべきサンプルのHLAC遺伝子の第2、3及び又は4エキソンを増幅する、2増幅されたエキソンに対してシークエンシングを行い、シークエンシング結果をデータベースにおける基準サンプルと比較して遺伝子タイピング結果を特定する。前記シークエンシングはサンガー法sanger或いは第2世代シークエンシング法により行われる。前記第2世代シークエンシング法としては、IlluminaSolexa又はRoche454が挙げられる。他方、本発明は、HLAC遺伝子タイピング用の試薬箱をさらに提供する。前記試薬箱は、本発明のHLAC遺伝子タイピング用のPCRプライマー対、好ましくはSEQIDNO:25及びSEQIDNO:26、SEQIDNO:27及びSEQIDNO:28、SEQIDNO:29及びSEQIDNO:30、若しくはSEQIDNO:31及びSEQIDNO:32、SEQIDNO:33及びSEQIDNO:34、SEQIDNO:35及びSEQIDNO:36からなる群より選ばれるプライマー対を含む。1つの実施案において、前記試薬箱は、さらに、他の試薬、例えばDNA増幅、DNA精製及びまたはDNAシークエンシングに用いられる試薬を含む。本発明に提供されている増幅用プライマー対及び遺伝子タイピング方法を利用すれば、HLAC遺伝子の第2、3及び4エキソンを増幅するうえで遺伝子タイピングを行うことができる。従って、従来技術に対して、当該タイピングは、IlluminaSolexaシークエンシング技術を利用しているから、スループットを向上させ工程を簡単化させると同時に、時間とコストも節約している。HLADQB1遺伝子タイピング用のPCRプライマー本発明は、本発明の増幅用プライマー対を使用してPCR増幅を行い、前記増幅用プライマー対の配列は表5に示されることを特徴とする新たなHLADQB1遺伝子の第2及び又は第3エキソンの増幅方法をさらに提供する。PCR反応によりHLADQB1の第2及びまたは第3エキソンを増幅可能となる。よって、本発明の方法をHLADQB1遺伝子タイピングに特に有利に使用することができる。従来のHLADQB1遺伝子タイピング方法に比べ、本発明の方法及び増幅用プライマーを用いた産物は300~400bp間に制御されているため、更なるタイピングを行うに際して、IlluminaSolexaシークエンシング技術によるHLASBTを利用することができる。本発明は、下記のステップを含むサンプル中のHLADQB1遺伝子の第2及び又は第3エキソンにシークエンシングを行う方法をさらに提供する。1サンプルを1つ提供して当該サンプルのDNAを抽出する、2本発明のHLADQB1遺伝子タイピング用のPCRプライマー対、好ましくは表5に示されるPCRプライマー対を用いて前記DNAを増幅してPCR産物を取得し、好ましくはPCR産物を精製する、3前記PCR産物に対してシークエンシングを行い、シークエンシングは第2世代シークエンシング法、例えば、IlluminaSolexa又はRoche454であってもよい。本発明の他方面では、本発明は、下記のステップを含む改良されたHLADQB1遺伝子タイピング方法を提供する。1本発明のHLADQB1遺伝子タイピング用のPCRプライマー対、好ましくは表5に示されるPCR増幅用プライマー対を用いて、決定すべきHLADQB1遺伝子の第2及び又は第3エキソンを増幅する、2増幅されたエキソンに対してシークエンシングを行い、シークエンシング結果をデータベースにおける基準サンプルと比較して遺伝子タイピング結果を特定する。前記シークエンシングはサンガー法sanger或いは第2世代シークエンシング法により行われる。前記第2世代シークエンシング法としては、IlluminaSolexa又はRoche454が挙げられる。他方、本発明は、HLADQB1遺伝子タイピング用の試薬箱をさらに提供する。前記試薬箱は、本発明のHLADQB1遺伝子タイピング用のPCRプライマー対、好ましくは表5に示されるPCR増幅用プライマー対を含む。1つの実施案において、前記試薬箱は、さらに、他の試薬、例えばDNA増幅、DNA精製及びまたはDNAシークエンシングに用いられる試薬を含む。以下にて、実施例を結合して本発明の実施形態を詳細に説明する。しかし、当業者が理解できるように、下記の実施例は本発明を説明するだけに用いられ、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の実施例1~6において、プライマータグDNA不完全断片化技術IlluminaGAシークエンサーによるPairEnd100シークエンシング技術の組み合わせにより、95個のサンプルのHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンの遺伝子をタイピングすることによりPCR産物の長さは290bp~500bpの間にある、当該技術は第2世代シークエンサーのハイスループットと低コストの特徴を十分に発揮できるとともに、シークエンサー自身のシークエンシング長以上の遺伝子断片化のタイピングを図れることが証明されている。原理:解析すべきサンプルをPCR反応させて、HLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンのPCR産物の両端にプライマータグを付けることにより、PCR産物のサンプル情報を特異的にマークする。各グループ内のサンプルのHLAABDRB1の3つの遺伝子座のPCR増幅産物を混合してPCR産物ライブラリーを取得する。得られたPCR産物ライブラリーを超音波により不完全断片化した後、PCRFreeシークエンシングライブラリーを構築し、シークエンシングライブラリーを2低融点アガロースゲル電気泳動して、450~750bpの長さ範囲の間にあるのあらゆるDNAバンドをタッピングして精製回収するPCRFreeシークエンシングライブラリーの構築過程中に、DNA断片化の両端にライブラリーアダプターを付加し、その結果、DNA断片化の電気泳動図に体現される長さが実際的な長さよりほぼ250bp長くなっている。よって、ここで450bp~700bpの断片化の回収は、実際的に、元の長さが200bp~500bpであるDNA断片化の回収に相当する。回収されたDNAをIlluminaGAPE100によりシークエンシングを行う。プライマータグ配列から、配列決定されるあらゆるサンプルの配列情報を見出すことができ、それから、既知のDNA断片化の参考配列情報とDNA断片化配列との間のオーバラップ及び連鎖関係に基づいてPCR産物全体の配列を組み立て、HLAABDRB1の相応するエキソンの標準データベースとの対照結果に基づいて、原PCR産物の全配列を組み立ててHLAABDRB1の遺伝子タイピングを図ることができる。実施例1サンプルの抽出KingFisher自動抽出機器米国Thermo社を利用して、95部の既知のHLASBTタイピング結果をもつ血液サンプル中国造血幹細胞ドナーデータベース以下、中華骨髄バンクというからDNAを抽出する。主なステップは下記の通りである。KingFisher自動抽出機器とセットになる6個のディープウェルプレートと1個のシャローウェルプレートを取り出し、明細書に従い、セットになる所定量の試薬をそれぞれに加えてマークし、要求に応じて、試薬を添加した後のすべてのウェルプレートを相応する位置に置き、Bioeasy200ulBloodDNAKFmszとのプログラムを選定し、starボタンを押して当該プログラムを実行して核酸の抽出を行う。プログラムの終了後に、plateElutionから約100ulの溶離産物を収集したものは抽出されたDNAである。実施例2PCRの増幅5’末端に異なるプライマータグを有するPCRプライマーを合成することにより異なるPCRタグプライマーを作製し、これにより、異なるPCRタグプライマーを異なるサンプルに使用することができる。前記PCRプライマーは、HLAABの第2、3、4エキソン及びHLADRB1の第2エキソンを対象とするPCR産物である。その後、PCR反応によりPCR産物の両端にプライマータグを付けて異なるサンプルに由来するPCR産物を特異的にマークする。95部のDNAサンプルを95セットのPCRタグプライマーでそれぞれに増幅し、1セットごとのPCRタグプライマーは1対の双方向プライマータグ表6とHLAABの第2、3、4エキソン表1及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するPCRプライマー表7からなる。それぞれの正方向のPCRプライマーの5’末端に1対のプライマータグの正方向プライマータグを結合させ、逆方向のPCRプライマーの5’末端に1対のプライマータグの逆方向プライマータグを結合させる。プライマータグを、プライマーの合成時にPCRプライマーの5’末端に直接的に添加する。実施例1のサンプル抽出ステップで得られた95部のDNAを1~95に順次に番号をつけ、PCR反応を96ウェルプレート中で行わせ、合計7プレートを有し、それぞれの番号はHLAPA2、HLAPA3、HLAPA4、HLAPB2、HLAPB3、HLAPB4及びHLAPDRB12であるA234B2B3B4DRB12は増幅する遺伝子座を表す。プレート内に、テンプレートを付加しない陰性対照が設置されており、陰性対照用のプライマーはテンプレート1の対応するプライマーと同じである。実験すると同時に、各対のプライマータグに対応するサンプル番号情報を記録する。D2F1、D2F2、D2F3、D2F4、D2F5、D2F6、D2F7は、HLADRB1遺伝子の第2エキソンを増幅する正方向プライマーであり、D2‐Rは、HLADRB1遺伝子の第2エキソンを増幅する逆方向プライマーである。HLAABDRB1のPCRプログラムは下記のものである。即ち、96°C2min95°C30s→60°C30s→72°C20s32cycles15°C∞HLAABのPCR反応体系中の下記のあらゆる試薬はいずれもPromega北京生物技術有限公司Promegaから購入されている。HLADRB1のPCR反応体系は以下のものである。ただし、PInfABD2F1234567は、プライマーの5’末端にn番目の正方向プライマータグ配列表6を付けたHLAABDRB1のFプライマーを表し、PInrABD2R234は、プライマー5’末端にn番目の逆方向プライマータグ配列を付けたHLAABDRB1のRプライマーを表すここに、n≦95、その他はこれによって類推する。かつ、各サンプルは特定の1セットのPCRプライマーに対応するPInfABD2F1234567PInrABD2R234。PCR反応をBioRad社製のPTC200PCR機器上で実行させる。PCRを完了した後、2ulのPCR産物を1アガロースゲル電気泳動で検出する。図2は、1番目サンプルのHLAABDRB1の相応するエキソンのPCR産物の電気泳動結果を示す。DNA分子はDL2000Takara社としてマークされる。タッピング図の中に、断片化の大きさが300bp500bpである一連の単一バンドが存在しており、1番目サンプルのHLAABDRB1の各エキソンA2、A3、A4、B2、B3、B4、DRB12PCRの増幅成功が表明されており、陰性対照Nには増幅バンドがない。他のサンプルの結果はこれと類似している。実施例3PCR産物の混合と精製96ウェルプレートHLAHLAPA2の余剰のPCR産物陰性対照を除くから20ulずつ取り出して3mlのEP管内で混合し、HLAA2Mixとしてマークし、他の6個の96ウェルプレートに対して同様な操作を行い、それぞれHLAA3Mix、HLAA4Mix、HLAB2Mix、HLAB3Mix、HLAB4Mix及びHLAD2Mixとしてマークし、振動して均一に混合する。HLAA2Mix、HLAA3Mix、HLAA4Mix、HLAB2Mix、HLAB3Mix、HLAB4Mix及びHLAD2Mixから200ulずつ取り出して3mlのEP管内で混合し、HLAMixとしてマークし、HLAMixから500ulのDNA混合物を取り出してQiagenDNAPurificationkit試薬箱QIAGEN社によりカラムによる精製を行い具体的な精製ステップは詳しくは説明書参照、精製により得られた200ulのDNAを、Nanodrop8000により測定した結果、HLAMixDNAの濃度が48ngulである。実施例4PCR産物の断片化、及びIlluminaGAPCRFreeシークエンシングライブラリーの構築1.DNAの断片化精製されたHLAMixから総量5ugのDNAを抽出し、AFA繊維製蓋付きのCovaris微小管を用いてConvarisS2DNA断片化機器Convaris社製上で断片化する。断片化の条件は下記の通りである。即ち、2.断片化後の精製HLAMixのあらゆる断片化産物をQIAquickPCRPurificationKitにより回収精製し、それぞれ375ulのEBQIAGENElutionBufferに溶解させる。3.末端修復反応断片化後に精製されたHLAMixに対してDNA末端修復反応を行わせる。その体系は以下のものである試薬がいずれもEnzymatics社から購入されている。反応条件は、恒温混合均一機器ThermomixerEppendorf社製で20°Cの恒温で30min水浴させるということである。反応産物をQIAquickPCRPurificationKitにより回収精製し、34μlのEBQIAGENElutionBufferに溶解させる。4.3’末端へのA付加反応前工程で精製されたDNAの3’末端にAを付加して反応させる。その体系は下記の通りである試薬がいずれもEnzymatics社から購入されている。反応条件は、恒温混合均一機器ThermomixerEppendorf社製で37°Cの恒温で30min水浴させるということである。反応産物をMiniElutePCRPurificationKitQIAGEN社製により回収精製し、13μlのEB溶液QIAGENElutionBufferに溶解させる。5.IlluminaGAPCRFreeライブラリーアダプターadapterの結合PCRFreeライブラリーアダプターadapterという術語は、設計された一部の塩基であり、その主な作用は、DNA分子のシークエンシング用チップでの固定を補助し、共通のシークエンシングプライマーの結合部位を提供することである。PCRFreeライブラリーアダプターはDNAリガーゼを介してシークエンシングライブラリー中のDNA断片の両端に直接的に結合することができ、アダプターの導入工程中にPCRは参与しないため、PCRFreeライブラリーアダプターと呼ばれている。A付加後の産物にIlluminaGAPCRFreeライブラリーアダプターを付加させる。その体系は以下の通りである試薬がいずれもIllumina社から購入されている。反応条件は、恒温混合均一機器ThermomixerEppendorf社製で20°Cの恒温で15min水浴させるということである。反応産物をAmpureBeadsにより回収精製し、50ulの脱イオン水に溶解させ、蛍光定量PCRQPCRで検出した結果、DNAのモル濃度の結果は以下の通りである。6タッピングによる回収HLAMixを30μl取り出して2低融点アガロースゲルにより回収する。電泳条件は、100V、100minである。DNAmarkerは、NEB社製の50bp長をもつDNAmarkerである。長さ範囲が450~750bpであるDNA断片化をタッピングにより回収する図3。タッピングにより回収された生成物をQIAquickPCRPurificationKitQIAGEN社製により回収精製し、精製後の体積が32μlであり、蛍光定量PCRQPCRにより検出されたDNAの濃度結果は1016nMである。実施例5IlluminaGAシークエンスQPCRの検出結果により、DNAを10pmol取り出してIlluminaGAPE100プログラムを用いてシークエンスを行う。具体的な取り扱い工程は、詳しくはIlluminaGA取扱説明書を参照するIlluminaGAIIx。実施例6結果解析IlluminaGAによるシークエンシング結果は、一連のDNA配列であり、シークエンシング結果の中の正逆方向プライマータグ配列及びプライマー配列を見つけることにより、各プライマータグに対応するサンプルHLAABDRB1の各エキソンのPCR産物のシークエンシング結果のデータベースを構築する。BWABurrowsWheelerAlignerにより、各エキソンのシークエンシング結果を相応するエキソンの参考配列上に位置決めさせると同時に参考配列由来:httpwwwebiacukimgthla、各データベースの合意性consensus配列を構築し、その後、データベースにおけるDNA配列に対して選別及びシークエンシングの誤り補正を行う。補正後のDNA配列は、配列のオーバラップoverlap及び連鎖PairEnd連鎖関係に基づいてHLAABDRB1の各エキソンの相応する配列として組み立て可能である。得られたDNA配列を、IMGTHLA専門データベースにおけるHLAABDRB1の相応する各エキソンの配列データベースと対照を行い、配列の対照の結果が100で合致しているものは、対応するサンプルのHLAABDRB1遺伝子型である。図4を参照して、1番目サンプルのHLAA遺伝子座の第2エキソンの合意性配列構築工程の断面図を例示的に説明することができる。あらゆる95個のサンプルにつき、得られたタイピング結果は、元の既知のタイピング結果と完全に合致している。その中の1~32番目サンプルの具体的な結果は下記の通りである。注:HLADRB1型の中のDRB11201から、DRB1120612101217の可能性を除外せず、DRB11454からDRB11401の可能性を除外することができない。何故なら、前記アレルのHLADRB1の第2エキソンでの配列が完全に同じであるからである。実施例7第2世代シークエンシング技術IlluminaGAによるHLAA、BとDRB1の遺伝子タイピングサンプルの抽出KingFisher自動抽出機器サプライヤーの情報を提供されたい米国Thermo社を利用して、95部の既知のHLASBTタイピング結果をもつ血液サンプル中国造血幹細胞ドナーデータベース以下、中華骨髄バンクというからDNAを抽出する。具体的な方法は実施例1に述べられている通りである。PCRの増幅サンプル抽出ステップで得られた95部のDNAを1~950に順次に番号をつけ、10グループに分け、各グループに95部のDNAを有し、それぞれHLA1、HLA2、HLA3、HLA4、HLA5、HLA6、HLAー7、HLA8、HLA9、HLA10としてマークする。各グループサンプルに対して、95セットの双方向プライマータグ表6付きの、HLAABの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマー表1及びHLADRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマー表7を利用して95部のDNAサンプルをそれぞれに増幅する。PCR反応を96ウェルプレート中で行わせ、合計70プレートを有し、それぞれの番号はHLAXPA2、HLAXPA3、HLAXPA4、HLAXPB2、HLAXPB3、HLAXPB4及びHLAXPDRB12であるXはサンプルグループ番号情報12345678910を表し、A234、B234、DRB12は増幅する遺伝子座を表す。それぞれのプレート内に、テンプレートを付加しない陰性対照が設置されており、陰性対照用のプライマーはPI―1表1でマークされるプライマーである。実験すると同時に、各サンプルに対応するサンプルグループ番号情報及びプライマータグ情報を記録する。具体的な方法は実施例2に述べられている通りである。PCR産物の混合及び精製第XグループXは12345678910であるのサンプルに対して、96ウェルプレートHLAXPA2の余剰のPCR産物陰性対照を除くから20ulずつ取り出して3mlのEP管内で混合し、HLAXA2Mixとしてマークし、第Xグループのサンプルの他の6個の96ウェルプレートに対して同様な操作を行い、それぞれHLAXA3Mix、HLAXA4Mix、HLAXB2Mix、HLAXB3Mix、HLAXB4Mix及びHLAXD2Mixとしてマークし、振動して均一に混合する。HLAXA2Mix、HLAXA3Mix、HLAXA4Mix、HLAXB2Mix、HLAXB3Mix、HLAXB4Mix及びHLAXD2Mixから200ulずつ取り出して3mlのEP管内で混合し、HLAXMixとしてマークする。その中からDNA混合物を500ulずつ取り出してQiagenDNAPurificationkitによりカラムによる精製を行い具体的な精製ステップは詳しくは説明書参照、精製により得られた200ulのDNAを、Nanodrop8000により測定したDNA濃度につき、他のグループの操作が同じであり、最終的に測定したDNA濃度はそれぞれ下記の通りである。具体的な方法は実施例3に述べられている通りである。その後、実施例4に記載の方法によりIlluminaGAシークエンシングライブラリーの構築を行う。その中のサンプルグループとライブラリーアダプターとの対応付け関係は以下の通りである。反応産物をAmpureBeadsにより精製した後、50ulの脱イオン水に溶解させ、蛍光定量PCRQPCRで検出した結果、DNAのモル濃度の結果は以下の通りである。6.タッピング法による回収HLA1Mix、HLA2Mix、HLA3Mix、HLA4Mix、HLA5Mix、HLA6Mix、HLA7Mix、HLA8Mix、HLA9Mix及びHLA10Mixを等モルで混合し最終濃度7213nMul、HLAMix10としてマークし、HLAMix10を30μL取り出して2低融点アガロースゲルで回収する。電気泳動の条件は、100V、100minである。DNAmarkerは、NEB社製の50bp長のDNAmarkerである。450~750bpの長さ範囲にあるDNA断片化をタッピングして回収する。タッピングして回収された産物をQIAquickPCRPurificationKitQIAGEN社により回収精製し、精製後の体積は32ulとなっており、蛍光定量PCRQPCRにより検出した結果、DNA濃度の結果は996nMである。その後、実施例5及び6に記載の方法によりシークエンシング及び結果解析を行い、あらゆる950個のサンプルにつき、得られたタイピング結果は元の既知のタイピング結果と完全に合致している。実施例8第2世代シークエンシング技術IlluminaGAによるHLACの遺伝子タイピング1.サンプルのDNA抽出ステップは実施例1と同じである。2.PCRの増幅ステップは実施例2と同じである。ただ用いられたPCRプライマーはHLACの第2、3、4エキソンを対象とするPCRプライマーであり、表3に示すものである。95部のDNAサンプルを95セットのPCRタグプライマーでそれぞれに増幅し、1セットごとのPCRタグプライマーは、HLACの第2、3、4エキソンを増幅するためのPCRプライマー表3と、1対の双方向プライマータグ下記に記述のものであるからなる。それぞれの正方向のPCRプライマーの5’末端に1対のプライマータグの正方向プライマータグを結合させ、逆方向のPCRプライマーの5’末端に1対のプライマータグの逆方向プライマータグを結合させる。プライマータグを、プライマーの合成時にPCRプライマーの5’末端に直接的に添加する。サンプル抽出ステップで得られた95部のDNAを1~95に順次に番号をつけ、PCR反応を96ウェルプレート中で行わせ、合計3プレートを有し、それぞれの番号はHLAPC2、HLAPC3、HLAPC4であるC234は増幅する遺伝子座を表す。プレート内に、テンプレートを付加しない陰性対照が設置されており、陰性対照用のプライマーはプライマーPI96と同じである。実験すると同時に、各対のプライマータグに対応するサンプル番号情報を記録する。用いられたプライマータグは表6に列挙されているプライマータグPI1~PI95、及び下記の陰性対照プライマータグPI96と同じである表8。ステップ1においてKingFisher自動抽出機器により抽出されたDNAをテンプレートとし、5’末端にタグを付けたHLACの各エキソンのプライマーを単管でPCR増幅を行う。PCRプログラムは以下の通りである。C296°C2分間95°C30s→62°C30秒→72°C20秒15°C∞C396°C2分間95°C30秒→56°C30秒→72°C20秒15°C∞C496°C2分間95°C30秒→60°C30秒→72°C20秒15°C∞HLACのPCR反応体系は以下の通りである。即ち、PInfCF234は、プライマーの5’末端にn番目の正方向プライマータグ配列表2を付けたHLACのFプライマーを表し、PInfCF234は、プライマー5’末端にn番目の逆方向プライマータグ配列を付けたHLACのRプライマーを表すここに、n≦96、その他はこれによって類推する。かつ、各サンプルは特定の1セットのPCRプライマーに対応する。PCR反応をBioRad社製のPTC200PCR機器上で実行させる。PCRを完了した後、2ulのPCR産物を15アガロースゲル電気泳動で検出する。図6は、前の20個のサンプルのHLACの相応するエキソンのPCR産物の電気泳動結果を示す。DNA分子はDL2000Takara社としてマークされる。タッピング図の中に、断片化の大きさが400bp500bpである一連の単一バンドが存在しており、この部分のサンプルのHLACの各エキソンC2、C3、C4PCRの増幅成功が表明されている。他のサンプルの結果はこれと類似している。PCR産物の混合と精製96ウェルプレートHLAPC2の余剰のPCR産物陰性対照を除くから20ulずつ取り出して3mlのEP管内で混合し、HLAC2Mixとしてマークし、他の2個の96ウェルプレートに対して同様な操作を行い、それぞれHLAC3Mix及びHLAC4Mixとしてマークし、振動して均一に混合する。HLAC2Mix、HLAC3Mix及びHLAC4Mixから200ulずつ取り出して15mlのEP管内で混合し、HLAMixとしてマークし、HLAMixから500ulのDNA混合物を取り出してQiagenDNAPurificationkit試薬箱QIAGEN社製によりカラムによる精製を行い具体的な精製ステップは詳しくは説明書参照、精製により得られた200ulのDNAを、Nanodrop8000により測定した結果、HLAMixDNAの濃度が50ngulである。4.IlluminaGAPCRFreeシークエンシングライブラリーの構築41PCR産物の断片化精製されたHLAMixから総量5ugのDNAを抽出し、CovarismicroTubewithAFAfiberandSnapCapを用いてConvarisS2Convaris社製上で断片化する。断片化の条件は下記の通りである。即ち、42断片化後のPCR産物の精製HLAMixのあらゆる断片化産物をQIAquickPCRPurificationKitにより回収精製し、それぞれ375ulのEBQIAGENElutionBufferに溶解させる。43末端修復反応精製された産物に対してDNA末端修復反応を行わせる。その体系は以下の通りである試薬がいずれもEnzymatics社から購入されている。反応条件は、ThermomixerEppendorf社製で20°Cの恒温で30分間水浴させることである。反応産物をQIAquickPCRPurificationKitにより回収精製し、32μlのEBQIAGENElutionBufferに溶解させる。443’末端へのA付加反応前工程で精製されたDNAの3’末端にAを付加して反応させる。その体系は下記の通りである試薬がいずれもEnzymatics社から購入されている。反応条件は、Thermomixerで37°Cの恒温で30分間水浴させることである。反応産物をMiniElutePCRPurificationKitQIAGEN社製により回収精製し、38μlのEB溶液QIAGENElutionBufferに溶解させる。45IlluminaGAPCRFreeライブラリーアダプターadapterの結合A付加後の産物にIlluminaGAPCRFreeライブラリーアダプターを付加させる。その体系は以下の通りである試薬がいずれもIllumina社から購入されている。反応条件は、Thermomixerで16°Cの恒温で一夜水浴させることである。反応産物をAmpureBeadsにより精製した後、50ulの脱イオン水に溶解させ、蛍光定量PCRQPCRで検出した結果、DNAのモル濃度の結果は以下の通りである。46タッピング法による回収HLAMixを30μL取り出して2低融点アガロースゲルで回収する。電気泳動の条件は、100V、100分間である。DNA標準分子量マーカーは、NEB社製の50bp長のDNALadderである。400~750bpの長さ範囲にあるDNA断片化をタッピングして回収する図7。タッピングして回収された産物をQIAquickPCRPurificationKitQIAGEN社製により回収精製し、精製後の体積は32ulとなっており、蛍光定量PCRQPCRにより検出した結果、DNA濃度の結果は1716nMである。5.IlluminaGAシークエンシングQPCR検出結果により、DNAを10pmol取り出してIlluminaGAPE100プログラムによりシークエンシングを行う。具体的な操作プロセスは詳しくIlluminaGA取扱説明書IlluminaGAIIxを参照されたい。6.結果解析IlluminaGAによるシークエンシング結果は、一連のDNA配列であり、シークエンシング結果の中の正逆方向プライマータグ配列及びプライマー配列を見つけることにより、各プライマータグに対応するサンプルHLACの各エキソンのPCR産物のシークエンシング結果のデータベースを構築する。BWABurrowsWheelerAlignerにより、各エキソンのシークエンシング結果を相応するエキソンの参考配列上に位置決めさせると同時に参考配列由来:httpwwwebiacukimgthla、各データベースの合意性consensus配列を構築する。塩基シークエンシング品質値と、シークエンシング配列とconsensus配列との差異度を結合して、シークエンシング配列に対して選別及びシークエンシングの誤り補正を行う。補正後のDNA配列は、配列のオーバラップoverlap及び連鎖PairEnd連鎖関係に基づいてHLACの各エキソンの相応する配列として組み立て可能である。図8の断面図は、2番目サンプルのHLAC遺伝子座の第2エキソンの合意性配列の構築工程を例示的に説明している。シークエンシングを行うHLAC内のDNA配列をIMGTHLA専門データベースにおけるHLACの相応する各エキソンの配列データベースと対照を行い、配列の対照の結果が100で合致しているものは、対応するサンプルのHLAC遺伝子型である。あらゆる95個のサンプルにつき、得られたタイピング結果は、元の既知のタイピング結果と完全に合致している。その中の1~32番目サンプルの具体的な結果とサンプルの元のタイピング結果との対照は以下の通りである例えば表9、全部の検出結果は元の検出結果と同じである。注:HLAC型の中のC0303から、C0320Nの可能性を除外せず、C0401からC0409N0430の可能性を除外せず、C0702から、C0750の可能性を除外せず、C0801からC0822の可能性を除外せず、C1505から、C1529の可能性を除外することができない。何故なら、前記アレルのHLACの第2、3、4エキソンでの配列が完全に同じであるからである。実施例9サンガー法sangerによるHLACの遺伝子タイピング1.サンプルDNAの抽出実施例に記載されているように、KingFisher自動抽出機器で抽出された95部のサンプルのうちの26部の既知のHLA遺伝子型のDNAを抽出する。2.PCR増幅前記KingFisher自動抽出機器で抽出されたDNAをテンプレートとし、CF2、CR2、CF3、CR3、CF4、CR4合計3対のPCRプライマー表3を単管でPCR増幅を行う。各対のプライマーのPCRプログラムは以下の通りである。C296°C2分間95°C30s→62°C30秒→72°C20秒15°C∞C396°C2分間95°C30秒→56°C30秒→72°C20秒15°C∞C496°C2分間95°C30秒→60°C30秒→72°C20秒15°C∞HLACのPCR反応体系は以下の通りである。即ち、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により検出した後図9、精製する。3.PCR産物の精製Millipore精製板を用いてPCR産物を精製する。基本的なステップは下記の通りである。マークペンを用いて、96ウェルPCR産物精製板上に、使用する必要がある孔をマークするとともに、使用する必要がある孔中に50ulの超純水を加え、余剰の孔をシールフィルムで封止し、室温で15分間静かに放置するか、或いは吸引濾過系に接続させ、10Paで、5分間後に取り外す。抽出濾過系から精製板を取り外すたびに、精製板の底部の液体排出口に残されている液体を吸水紙で吸い込まなければならない。精製すべきPCR産物を4000rpmで1分間遠心させる;精製すべきPCR産物の蓋又はシリコーンマットを開き、各PCR反応体系中に100ulの超純水を加える。その後、精製すべきPCR産物を加えた精製板を吸引濾過系に接続させ、気圧表に10Paを表示させるまで真空度を調節し、精製板の底部の微小孔再生繊維フィルム上に液体がなくなるまで吸引濾過する。光照射下で観察したら、完全な液体面の反射光沢が見られない。精製すべきPCR産物を有する孔に50ulの超純水またはTEを微小孔再生繊維フィルムに加える;室温下で微量振動器のミッドレンジを用いて精製板を5分間振動し、相応する孔内のすべての液体を新たな96ウェルPCR板の対応する孔へと移す。4.シークエンシング反応を行うとともにシークエンシング反応産物を精製する以上の精製後のPCR産物をテンプレートとしてシークエンシング反応を行う。シークエンシング反応の条件96°C2分間96°C10秒→55°C5秒→60°C2分15°C∞シークエンシング反応の体系は以下の通りである。下記のステップにより、シークエンシング反応産物を精製する。即ち、シークエンシング反応プレートを取り外してトリミングし、3000g下で1分間遠心させる。96ウェルプレートの5μLずつの反応体系に0125molLのEDTANa2溶液を2ul、85のエタノールを33μL加え、シリコーンマットをカバーし、3分間十分に振動させ、4°C下で3000gで30分間遠心させる。遠心終了後にシークエンシングプレートを取り出してシリコーンマットを開き、シークエンシング反応プレートを吸水紙に反転させて置き、反転遠心させて遠心力が185gになれば、直ちに中止する。96ウェルプレートの各孔に70のエタノールを50μL加え、シリコーンマットをカバーし15分間振動させ、4°C下で3000gで15分間遠心させる。シークエンシング反応プレートを日陰且つ通風のよい場所に30分間放置し、エタノールの匂いがなくなるまで風で乾燥させる。96ウェルプレートの孔ごとに10μLずつ384ウェルプレートの孔ごとに8μLずつ加えるのHIDIホルムアミドを加え、シールフィルムで封止し、5秒振動させた後、1000rpmとなるように遠心させる。5シークエンシング及び結果の解析精製後のシークエンシング反応産物をABI3730XL上で毛細管電気泳動によるシークエンシングを行い、シークエンシングピーク図をuTypeソフトウェアInvitrogenにより解析したところ図10、HLAタイピング結果を取得し、表10に示される通りである。実施例10第2世代シークエンシング技術IlluminaSolexaによるHLADQB1の遺伝子タイピング実施例8に記載の方法により、94部の既知のHLASBTタイピング結果の血液サンプルに対してHLADQB1の遺伝子タイピングを行う。異なるところは下記の通りである。94部のDNAサンプルを94セットのPCRタグプライマーでそれぞれに増幅し、1セットごとのPCRタグプライマーは、HLADQB1の第2又は第3エキソンを増幅するためのPCRプライマー表5と、1対の双方向プライマータグ下記に記述のものであるからなる。それぞれの正方向のPCRプライマーの5’末端に1対のプライマータグの正方向プライマータグを結合させ、逆方向のPCRプライマーの5’末端に1対のプライマータグの逆方向プライマータグを結合させる。プライマータグを、プライマーの合成時にPCRプライマーの5’末端に直接的に添加する。プライマーは上海Invitrogen会社により合成されている。サンプル抽出ステップで得られた94部のDNAを1~94に順次に番号をつけ、PCR反応を96ウェルプレート中で行わせ、各サンプルのDQB1の第2、3エキソンは同一の反応孔中で増幅される。プレート内に、テンプレートを付加しない2つの陰性対照が設置されており、陰性対照用のプライマーに対応するタグ番号はPI95とPI96である。実験すると同時に、各対のプライマータグに対応するサンプル番号情報を記録する。用いられたプライマータグは表6に列挙されているプライマータグPI1~PI94、及び下記の陰性対照プライマータグPI95及びPI96と同じである表11。HLADQB1のPCRプログラムは以下の通りである。96°C2分間95°C30s→60°C30秒→72°C20秒15°C∞HLADQB1のPCR反応体系は以下の通りである。即ち、PInfQF23は、プライマーの5’末端にn番目の正方向プライマータグ配列表1を付けたHLADQB1のFプライマーを表し、PInfQR23は、プライマー5’末端にn番目の逆方向プライマータグ配列を付けたHLADQB1のRプライマーを表すここに、n≦96、その他はこれによって類推する。かつ、各サンプルは特定の1セットのPCRプライマーに対応する。PCR反応をBioRad社製のPTC200PCR機器上で実行させる。PCRを完了した後、2ulのPCR産物を15アガロースゲル電気泳動で検出する。図11は、94個のサンプルのHLADQB1の第23エキソンのPCR産物の電気泳動結果を示す。DNA標準分子量マーカーMはDL2000Takara社製である。3.PCR産物の混合と精製96ウェルプレートHLAPDQB1の余剰のPCR産物陰性対照を除くから20ulずつ取り出して3mlのEP管内で混合し、HLAQMixとしてマークし均一に混合する。HLAQMixからDNA混合物を500ulずつ取り出してQiagenDNAPurificationkitによりカラムによる精製を行い具体的な精製ステップは詳しくは説明書参照、精製により得られた200ulのDNAを、Nanodrop8000により測定した結果、HLAQMixDNAの濃度が48ngulである。断片化の条件は下記の通りである。即ち、末端修復反応された反応産物をQIAquickPCRPurificationKitにより回収精製し、34ulのEBQIAGENElutionBufferに溶解させる。3’末端へのA付加反応を行った反応産物をMiniElutePCRPurificationKitQIAGEN社製により回収精製し、13μlのEB溶液QIAGENElutionBufferに溶解させる。ライブラリーアダプターを付加した反応産物をAmpureBeadsにより精製した後、50ulの脱イオン水に溶解させ、蛍光定量PCRQPCRで検出した結果、DNAのモル濃度の結果は以下の通りである。350~550bpの長さを有するDNA断片化をタッピングして回収する図12。タッピングして回収された産物を精製した後、蛍光定量PCRQPCRにより検出した結果、DNA濃度の結果は1883nMである。6.結果解析IlluminaGAによるシークエンシング結果は、一連のDNA配列であり、シークエンシング結果の中の正逆方向プライマータグ配列及びプライマー配列を見つけることにより、各プライマータグに対応するサンプルHLADQB1の各エキソンのPCR産物のシークエンシング結果のデータベースを構築する。BWABurrowsWheelerAlignerにより、各エキソンのシークエンシング結果を相応するエキソンの参考配列上に位置決めさせると同時に参考配列由来:httpwwwebiacukimgthla、各データベースの合意性consensus配列を構築する;塩基シークエンシング品質値と、シークエンシング配列とconsensus配列との差異度を結合して、シークエンシング配列に対して選別及びシークエンシングの誤り補正を行う。補正後のDNA配列は、配列のオーバラップoverlap及び連鎖PairEnd連鎖関係に基づいてHLADQB1の第2、3エキソンの相応する配列として組み立て可能である。図13の断面図は、7番目サンプルのHLADQB1遺伝子座の第2エキソンの合意性配列の構築工程を例示的に説明している。シークエンシングを行うHLADQB1の第2、3エキソンのDNA配列をIMGTHLA専門データベースにおけるHLADQB1の相応する各エキソンの配列データベースと対照を行い、配列の対照の結果が100で合致しているものは、対応するサンプルのHLADQB1遺伝子型である。あらゆる94個のサンプルにつき、得られたタイピング結果は、元の既知のタイピング結果と完全に合致している。その中の1~32番目サンプルの具体的な結果は下記表12に示される。実施例11サンガー法sangerによるHLADQB1の遺伝子タイピング1.サンプルDNAの抽出実施例1に記載されているように、KingFisher自動抽出機器で抽出された94部のサンプルのうちの20部の既知のHLA遺伝子型のDNAを抽出する。2.PCR増幅前記KingFisher自動抽出機器で抽出されたDNAをテンプレートとし、表5に列挙されているQF2及びQR2、QF3及びQR3合計3対のPCRプライマーをそれぞれ単管でPCR増幅を行う。各対のプライマーのPCRプログラムは以下の通りである。96°C2分間95°C30秒→62°C30秒→72°C20秒15°C∞HLAQのPCR反応体系は以下の通りである。即ち、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により検出した後、精製する。3.PCR産物の精製方法ステップは実施例9と同じである。4.シークエンシング反応を行うとともにシークエンシング反応産物を精製する方法ステップは実施例9と同じである。5.シークエンシング及び結果の解析精製後のシークエンシング反応産物をABI3730XL上で毛細管電気泳動によるシークエンシングを行い、シークエンシングピーク図をuTypeソフトウェアInvitrogenにより解析したところ図15、HLAタイピング結果を得る。すべての検出結果は元の検出結果と同じである表13。実施例12950個のサンプルのHLAABCの第2、3、4エキソン及びHLADQB1の第2、3エキソンの遺伝子タイピング本発明の実施例において、プライマータグ、DNA不完全断片化、ライブラリータグ及びPCRFREEライブラリー構築によるIlluminaGAPairEndシークエンシング法により、950個のサンプルのHLAABの第2、3、4エキソン及びHLADQB1の第2、3エキソンの遺伝子をタイピングするPCR産物の長さは300bp~500bpの間にある。これにより、当該技術はシークエンサー自身のシークエンシング長以上の遺伝子断片化に対する遺伝子タイピングを実現できることを証明するとともに、当該発明はHLA遺伝子タイピングを低コスト且つハイスループットで、高正確率且つ高分解能で行えることを証明する。原理:解析すべきサンプルを10グループに分け、各グループのサンプルをPCR反応によりHLAABCの第2、3、4エキソン及びHLADQB1の第2、3エキソンのPCR産物の両端にプライマータグを付けることにより、PCR産物のサンプル情報を特異的にマークする。各グループ内のサンプルのHLAABCDQB1の4つの遺伝子座のPCR増幅産物を等体積で混合してPCR産物ライブラリーを取得する。得られたPCR産物ライブラリーを超音波により不完全断片化した後、PCRFreeシークエンシングライブラリーを構築し各グループのサンプルのPCR産物ライブラリーごとに異なるアダプターを1つ付けるから、10個のタグシークエンシングライブラリーを構築する、10個のタグシークエンシングライブラリーを等モルで混合して混合タグシークエンシングライブラリーを構築し、混合タグシークエンシングライブラリーを2低融点アガロースゲル電気泳動して、450~750bpの長さ範囲の間にあるのあらゆるDNAバンドをタッピングして精製回収する。回収されたDNAをIlluminaGAPE100によりシークエンシングを行う。ライブラリータグ及びプライマータグ配列から、配列決定されるあらゆるサンプルの配列情報を見出すことができ、それから、既知のDNA断片化の参考配列情報とDNA断片化配列との間のオーバラップ及び連鎖関係に基づいてPCR産物全体の配列を組み立て、HLAABCDQB1の相応するエキソンの標準データベースとの対照結果に基づいて、原PCR産物の全配列を組み立ててHLAABCDQB1の遺伝子タイピングを図ることができる。1.サンプルの抽出KingFisher自動抽出機器サプライヤーの情報を提供されたい米国Thermo社を利用して、950部の既知のHLASBTタイピング結果をもつ血液サンプル中国造血幹細胞ドナーデータベース以下、中華骨髄バンクというからDNAを抽出する。具体的な方法は実施例1に述べられている通りである。2.PCRの増幅サンプル抽出ステップで得られた950部のDNAを1~950に順次に番号をつけ、10グループに分け、各グループに95部のDNAを有し、それぞれHLA1、HLA2、HLA3、HLA4、HLA5、HLA6、HLA7、HLA8、HLA9、HLA10としてマークする。各グループサンプルに対して、95セットの双方向プライマータグ表6付きの、HLAABの第2、3、4エキソン表2、HLACの第2、3、4エキソン表4及びHlADQB1の第2、3エキソンを増幅するためのPCRプライマー表5を利用して95部のDNAサンプルをそれぞれに増幅する。PCR反応を96ウェルプレート中で行わせ、合計100プレートを有し、それぞれの番号はHLAXPA2、HLAXPA3、HLAXPA4、HLAXPB2、HLAXPB3、HLAXPB4、HLAXPC2、HLAXPC3、HLAXPC4及びHLAXPDQB1であるXはサンプルグループ番号情報12345678910を表し、A234、B234、C234、DQB1は増幅する遺伝子座を表す。それぞれのプレート内に、テンプレートを付加しない陰性対照が1つ設置されており、陰性対照用のプライマーはPI1表6でマークされるプライマーである。実験すると同時に、各サンプルに対応するサンプルグループ番号情報及びプライマータグ情報を記録する。例えば、PI1、PI2プライマータグの関連情報は以下の通りである。その他はこれによって類推される。HLAABCのPCRプログラムとPCR反応体系は実施例2と同じであり、用いられたHLAABの相応するエキソンを増幅するためのPCR産物は表2に示されるものであり、用いられたHLACの相応するエキソンを増幅するためのPCR産物は表4に示される通りである。HLADQB1のPCRプログラムは下記の通りである。即ち、96°C2min95°C30s→55°C30s→72°C20s32cycles15°C∞HLADQB1の多重第2、3エキソンをともに増幅するPCR反応体系は実施例10と同じであり、用いられたHLADQB1の相応するエキソンを増幅するためのPCR産物は表5に示される通りである。PInfABCF234及びPInfQF2F3は、プライマーの5’末端にn番目の正方向プライマータグ配列表6を付けたHLAABCDQB1のFプライマーを表し、PInfABCR234及びPInfQR2R3は、プライマー5’末端にn番目の逆方向プライマータグ配列を付けたHLAABCDQB1のRプライマーを表すここに、n≦95、その他はこれによって類推する。かつ、各サンプルは特定の1セットのPCRプライマーに対応するPInfABCF234PInrABCR234PInfQF2F3,PInrQR2R3。PCR反応をBioRad社製のPTC200PCR機器上で実行させる。PCRを完了した後、3ulのPCR産物を2アガロースゲル電気泳動で検出する。図16は、1番目サンプルのHLAABCDQB1の相応するエキソンのPCR産物の電気泳動結果を示す。DNA分子はDL2000Takara社としてマークされる。タッピング図の中に、断片化の大きさが300bp500bpである一連の単一バンドが存在しており、1番目サンプルのHLAABCDQB1の各エキソンA2、A3、A4、B2、B3、B4、C2、C3、C4、DQB1のPCRの増幅成功が表明されており、陰性対照Nには増幅バンドがない。他のサンプルの結果はこれと類似している。3.PCR産物の混合及び精製第XグループXは12345678910であるのサンプルに対して、96ウェルプレートHLAXPA2の余剰のPCR産物陰性対照を除くから20ulずつ取り出して3mlのEP管内で混合し、HLAXA2Mixとしてマークし、第Xグループのサンプルの他の9個の96ウェルプレートに対して同様な操作を行い、それぞれHLAXA3Mix、HLAXA4Mix、HLAXB2Mix、HLAXB3Mix、HLAXB4Mix、HLAXC2Mix、HLAXC3Mix、HLAXC4Mix及びHLAXDQB1Mixとしてマークし、振動して均一に混合する。HLAXA2Mix、HLAXA3Mix、HLAXA4Mix、HLAXB2Mix、HLAXB3Mix、HLAXB4Mix、HLAXC2Mix、HLAXC3Mix、HLAXC4Mix及びHLAXDQB1Mixから200ulずつ取り出して3mlのEP管内で混合し、HLAXMixとしてマークする。その中からDNA混合物を500ulずつ取り出してQiagenDNAPurificationkitによりカラムによる精製を行い具体的な精製ステップは詳しくは説明書参照、精製により得られた200ulのDNAを、Nanodrop8000により測定したDNA濃度につき、他の9グループの操作が同じであり、10グループのサンプルを測定したDNA濃度はそれぞれ下記の通りである。4.IlluminaGAシークエンシングライブラリーの構築実施例4に記載されている方法のように、精製後のHLAXMixから総量5ugずつのDNAを取り出して、DNA断片化、断片化後の精製、末端修復反応、3’末端へのA付加反応、IlluminaGAPCRFreeライブラリーアダプターadapterの結合をそれぞれに行う。サンプルグループとライブラリーアダプターとの対応付け関係は以下の通りである。反応産物をAmpureBeadsにより精製した後、50ulの脱イオン水に溶解させ、蛍光定量PCRQPCRで検出した結果、DNAのモル濃度の結果は以下の通りである。6.タッピング法による回収HLA1Mix、HLA2Mix、HLA3Mix、HLA4Mix、HLA5Mix、HLA6Mix、HLA7Mix、HLA8Mix、HLA9Mix及びHLA10Mixを等モルで混合し最終濃度7086nMul、HLAMix10としてマークし、HLAMix10を30μL取り出して2低融点アガロースゲルで回収する。電気泳動の条件は、100V、100minである。DNAmarkerは、NEB社製の50bp長のDNAmarkerである。450~750bpの長さ範囲にあるDNA断片化をタッピングして回収する図17。タッピングして回収された産物をQIAquickPCRPurificationKitQIAGEN社により回収精製し、精製後の体積は32ulとなっており、蛍光定量PCRQPCRにより検出した結果、DNA濃度の結果は1025nMである。5.IlluminaGAシークエンシング及び結果の解析実施例5及び6の方法により、シークエンシング及び結果の解析を行う。各プライマータグに対応するサンプルHLAABCDQB1の各エキソンのPCR産物のシークエンシング結果のデータベースを構築する。得られたDNA配列を、IMGTHLA専門データベースにおけるHLAABCDQB1の相応する各エキソンの配列データベースと対照を行い、配列の対照の結果が100で合致しているものは、対応するサンプルのHLAABCDQB1遺伝子型である。図18を参照して、1番目サンプルのHLAC遺伝子座の第2エキソンの合意性配列の構築工程の断面図を例示的に説明することができる。あらゆる950個のサンプルにつき、得られたタイピング結果は、元の既知のタイピング結果と完全に合致している。その中の1~32番目サンプルの具体的な結果は以下の通りである。注:HLAABC遺伝子座のうちの第2、3、4エキソンの配列が完全に同じであるという結果が現れた場合、通常型をとる。本発明の技術的路線を採用して、950部の既知のHLASBTタイピング結果のサンプルに対して、HLAABCDQB1遺伝子座の遺伝子タイピングを行う。その結果、本発明の技術的路線により得られたタイピング結果は元の結果と完全に一致していることを発見した。本発明の具体的な実施形態について詳細に説明しているが、当業者が理解できるように、開示されたあらゆる教示に基づいて、詳細な箇所に対して様々な補正や置換を行うことができる。これらの変更はいずれも本発明の保護範囲内のものである。本発明の全ての範囲は添付されている請求項及びその任意の同等物から提供されている。参考文献1httpwwwebiacukimgthlastatshtml2TiercyJMMolecularbasisofHLApolymorphismimplicationsinclinicaltransplantationJTransplImmunol200291731803CAntoineSMullerACantetalLongtermsurvivalandtransplantationofhaemopoieticstemcellsforimmunodeficienciesreportoftheEuropeanexperience196899JTheLancet200393575535604HAErlichGOpelzJHansenetalHLADNATypingandTransplantationJImmunity2001143473565LilloR,BalasA,VicarioJLeta1.TwonewHLAclassalleleDPB102014bysequencebasedtypingJTissueAntigens20025947486ADormoyNFroelichLeisenbachetalMonoallelicamplificationofexons24usingallelegroupspecificprimersforsequencebasedtypingoftheHLAABandCgenesPreparationandvalidationofreadytousepreSBTminikitsJTissueAntigens2003622012167ElaineRMardisTheimpactofnextgenerationsequencingtechnologyongeneticsJTrendsinGenetics2008241331418ChristianHoffmann1NanaMinkah1JeremyLeipzigDNAbarcodingandpyrosequencingtoidentifyrareHIVdrugresistancemutationsJNucleicAcidsResearch2007189ShannonJOdelbergRobertBWeiss,AkiraHataTemplateswitchingduringDNAsynthesisbyThermusaquaticusDNApolymeraseIJNucleicAcidsResearch1995232049205710SayerDWhidborneRBrestovacBHLADRB1DNAsequencingbasedtypinganapproachsuitableforhighthroughputtypingincludingunrelatedbonemarrowregistrydonorsJTissueAntigens200157465411IwankaKozarewaZeminNingMichaelAQuailAmplificationfreeIlluminasequencinglibrarypreparationfacilitatesimprovedmappingandassemblyofbiasedgenomesJNatureMethods2009629129512MarshSGEParhamPBarberLDTheHLAFactsBook39113CampbellKJetalCharacterizationof47MHCclassIsequencesinFilipinocynomolgusmacaquesImmunogenetics6117718714GoulderPJRWatkinsDIImpactofMHCclassIdiversityonimmunecontrolofimmunodeficiencyvirusreplicationNatRevImmunol861963015O’LearyCEetalIdentificationofnovelMHCclassIsequencesinpigtailedmacaquesbyampliconpyrosequencingandfulllengthcDNAcloningandsequencingImmunogenetics6168970116RobinsonJMalikAParhamPBodmerJGMarshSGEIMGTHLAdatabaseasequencedatabaseforthehumanmajorhistocompatibilitycomplexTissueAntigens55,807200017HoffmannCMinkahNLeipzigJWangGArensMQTebasPBushmanFDDNAbarcodingandpyrosequencingtoidentifyrareHIVdrugresistancemutationsNucleicAcidsRes200735e9118WUDLetalComparativeanalysisofserologictypingandHLAIItypingbymicroPCRSSPDiYiJunYiDaXueXueBao20022224724919AlHusseinKARamaNRButtAIetalHLAclassIIsequencebasedtypinginnormalSaudiindividualsTissueAntigens20026025926120DCSayerDMGoodridgePilotstudyassessmentofinterlaboratoryvariabilityofsequencingbasedtypingDNAsequencedataqualityTissueAntigens200769Suppl666821HortonVStrattonIBottazzoGFetalGeneticheterogeneityofautoimmunediabetesageofpresentationinadultsisinfluencedbyHLADRB1andDQB1genotypesDiabetologia19994260861622CEMVoorterMCKik1EMvandenBergLoone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