少なくとも1つのHIV1O群envポリペプチドと少なくとも1つのHIV1M群envポリペプチドとの融合体を含んでなる抗原構築物であって、それぞれのポリペプチドが少なくとも5アミノ酸からなるO群又はM群envタンパク質に由来するポリペプチドである抗原構築物。a第1HIV1O群envポリペプチド、b第2HIV1O群envポリペプチド、c第1HIV1M群envポリペプチド、およびd第2HIV1M群envポリペプチドの融合体を含む、請求項1に記載の抗原構築物。該HIV1O群配列の少なくとも1つがHIV1O群分離株HAM112に由来する、請求項2に記載の抗原構築物。該第1O群envポリペプチドおよび該第1M群envポリペプチドが共にgp120ポリペプチドであり、該第2O群envポリペプチドおよび該第2M群envポリペプチドが共にgp41ポリペプチドである、請求項2に記載の抗原構築物。a該第1HIV1O群envポリペプチドが、HIV1O群分離株HAM112のgp120タンパク質の免疫反応性部分を含み、b該第2HIV1O群envポリペプチドが、HIV1O群分離株HAM112のgp41タンパク質の免疫反応性部分を含み、c該第1HIV1M群envポリペプチドが、B亜型の第1HIV1M群分離株のgp120タンパク質の免疫反応性部分を含み、かつd該第2HIV1M群envポリペプチドが、B亜型の第2HIV1M群分離株のgp41タンパク質の免疫反応性部分を含む、請求項2に記載の抗原構築物。a該第1HIV1M群envポリペプチドが、図12の配列配列番号108の残基251~292より実質的になるアミノ酸配列からなり、かつb該第2HIV1M群envポリペプチドが、図12の配列配列番号108の残基293~599またはその一部より実質的になるアミノ酸配列からなる、請求項5に記載の抗原構築物。該第2HIV1M群envポリペプチドが、図12の配列配列番号108の残基293~492より実質的になるアミノ酸配列からなる、請求項6に記載の抗原構築物。該第1HIV1O群envポリペプチドが、図1の配列配列番号61の残基1~520またはその一部より実質的になるアミノ酸配列からなる、請求項2、4、5、6および7のいずれか1項に記載の抗原構築物。配列番号91、配列番号93及び配列番号95よりなる群から選ばれるアミノ酸からなる請求項1に記載の抗原構築物。請求項1又は9に記載の抗原構築物をコードするポリヌクレオチド。試験サンプル中のHIV1に対する抗体を検出する方法であって、以下の工程を含む方法、a請求項1又は9に記載の少なくとも一つの抗原構築物を試験サンプルと組み合わせ、混合物を形成する工程、bサンプル中に抗体が存在し、免疫学的に抗原と反応性であれば抗原と抗体が複合体を形成するのに適した条件下で、混合物をインキュベートする工程、及びc形成された複合体の存在を検出する工程。請求項1又は9に記載の抗原構築物を含むHIV1に対する抗体を検出するためのイムノアッセイキット。発明の詳細な記載本発明の単離されたポリペプチドの1つの実施形態においては、HIV1O群分離株HAM112のenvタンパク質のアミノ酸配列を図1配列番号61に示す。この場合の単離されたは、そのようなポリペプチドが、該タンパク質の実質的に純粋な調製物にまで、通常はinsituで存在する他のウイルスまたは細胞成分に対して比較的に精製されていることを意味すると意図される。そのようなポリペプチドは、アッセイ試薬として、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のために、ワクチンの製造などにおいて使用することができる。また、前記ポリペプチドの免疫反応性部分または断片も有用と考えられる。免疫反応性は、宿主内で免疫応答を惹起しうる及び/又は特異的に抗体と反応しうる程度の長さの部分を意味し、好ましくは、そのような部分的ポリペプチドは、5アミノ酸長以上である。また、本発明で用いる部分一部なる語は、末端トランケート化配列、および介在配列の除去により短縮された配列の両方をさすことに注意すべきである。前記のポリペプチドおよび一部は、それをコードするポリヌクレオチドの発現により最良に産生されるであろう。これらはまた、例えば、遺伝暗号の縮重、コドンの偏り該ポリペプチドを発現する宿主細胞に有利なもの、および生じるタンパク質における同類アミノ酸置換によるそれらの配列の変異性を許容する。さらに、ある与えられたHIV1分離株または他の系統発生単位の間でそしておらくそれらの中においても、ある程度の配列変異が生じると予想される。そのため、本発明のポリペプチドおよび構築物は、前記配列と配列が同一であるものだけでなく、その示されている配列より実質的になるアミノ酸配列を有するものも含むこの場合の実質的になるなる語は、実質的に同じままである構造的および機能的特徴を有する変異ポリペプチドを包含する意である。好ましくは、そのような変異体または類似体は、図1の参照配列に対して80以上の配列相同性同一性を有する。この点において、アミノ酸配列の類似性を判定するための技術は、当技術分野でよく知られている。一般に、類似性は、アミノ酸が、同一であるか、または類似した化学的および/または物理的特性例えば、電荷または疎水性を有する場合、適当な位置における2以上のポリペプチドの厳密なアミノ酸対アミノ酸の類似comparisonを意味する。したがって、いわゆる類似性の割合は、比較するポリペプチド配列の間で決定することができる。また、核酸およびアミノ酸配列の同一性を判定するための技術は、当技術分野でよく知られており、その遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列を決定し通常は、cDNA中間体を介して、それにコードされるアミノ酸配列を決定し、これともう1つのアミノ酸配列とを比較することを含む。一般に、同一性は、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ、厳密なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致を意味する。2以上のポリヌクレオチド配列は、2以上のアミノ酸配列の場合と同様に、それらの同一性を決定することにより比較することができる。WisconsinSequenceAnalysisPackageVersion8GeneticsComputerGroupMadisonWIから入手可能において入手可能なプログラム、例えばGAPプログラムは、それぞれ、2つのポリヌクレオチド間の同一性、ならびに2つのポリペプチド配列間の同一性および類似性の両方を計算する能力を有する。配列間の同一性または類似性を計算するための他のプログラムが、当技術分野で公知である。本発明のもう1つの実施形態においては、抗HIV1抗体の検出における使用に適した抗原構築物を提供する。後記でさらに詳しく説明するとおり、そのような構築物は、組換え手段により、合成ペプチドなどとして製造することができる。さらに、それらは、それらを製造する方法および/または宿主細胞に応じて、グリコシル化または非グリコシル化されうる。そのため、本発明の抗原構築物は、糖タンパク質を含むかのように称されるが例えば、gp120ポリペプチド、細菌宿主大腸菌Ecoli内で発現され従って非グリコシル化形態であるものを含むと意図される。前記の構築物は種々の配列の融合体であるすなわち、該構築物は、例えば共発現、連結または逐次合成により、種々のエピトープ含有配列を結合させることにより得られることに注意すべきである。また、発現CKSポリリンカーおよび他のリンカー配列などの他のポリペプチド配列を結合させたり、所望により、それらを本発明の構築物に含めてもよい。それらの種々のポリペプチド配列の順序は、それほど重要ではない。したがって、該ポリペプチドおよびそれらのエピトープは、便宜上、再編成されているかもしれない。その他の修飾も可能である。例えば、ある領域、例えばgp41疎水性領域それの不存在下では、残りのポリペプチド部分の発現が増強されることが判明しているのランダム突然変異もしくは部位特異的突然変異誘発または更には欠失除去または省略が可能である。いずれの場合も、これらの修飾を受けたポリペプチドは、ほとんど同一あるか実質的に変更されているかにかかわらず、それらのそれぞれの起源から誘導されたそれに由来すると称されることが可能であり、得られたポリペプチドは誘導体と称されることが可能である。本発明の更にもう1つの態様においては、試験サンプル中の抗HIV1抗体の検出において本発明の構築物を使用するアッセイ方法を提供する。そのような方法は、生物学的試料の直接的な試験を可能にするが、該アッセイ方法はまた、予め加工された試料、例えば血清、溶解細胞および抽出物またはそれらから得た調製物例えば、濃縮、希釈、分離、固定および/または固定化によるの試験が可能となるように修飾することができる。また、所望のアッセイ様式アッセイフォーマットに応じて、該抗原構築物を、例えば標識、固相上などへの固定化、他のアッセイ試薬との共役により、そのようなアッセイでの使用のために修飾することができる。本明細書で用いる一定の用語は特別の意義を有すると意図される。特に示さない限り、後記の用語は以下の意義を有するものとする。プライマーなる語は、標的ヌクレオチド配列に相補的であり該標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるのに使用する特定のオリゴヌクレオチド配列を意味する。それは、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素により触媒されるヌクレオチドの重合の開始点として働く。本発明で用いるポリヌクレオチドなる語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。この用語は、該分子の一次構造のみをさす。したがって、該用語は、二本鎖および一本鎖のDNAならびに二本鎖および一本鎖のRNAを含む。また、それは、該ポリヌクレオチドのメチル化体またはキャップ形成体などの修飾体、および非修飾形態を含む。コードされているコード化は、ポリペプチド配列が核酸配列にコードされていることを意味する。また、該配列にコードされているポリペプチドで免疫学的に同定可能なポリペプチド配列も含まれる。したがって、本発明で特許請求するポリペプチド、タンパク質またはアミノ酸配列は、後記で特定する特定のポリペプチドまたはアミノ酸配列に対して少なくとも約60の類似性、好ましくは少なくとも約70の類似性、最も好ましくは約80の類似性を有する。本明細書では互換的に用いることがある組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質なる語は、本来的に又は操作により、天然において伴われているポリペプチドの全部または一部が伴われていないポリペプチド、および/または、天然で結合しているポリペプチド以外のポリペプチドに結合しているポリペプチドを意味する。組換え又はコード化ポリペプチドまたはタンパク質は、必ずしも、示されている核酸配列から翻訳されるわけではない。また、それは、化学合成または組換え発現系の発現を含む任意の方法で得ることができる。ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書中では互換的に用い、共有結合および/または非共有結合で結合したアミノ酸の分子鎖を示す。これらの用語は、特定の長さの該産物を意味するものではない。したがって、ポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれる。これらの用語は、該ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。また、タンパク質の断片、類似体、突然変異または変異タンパク質、融合タンパク質などが、ポリペプチドの意義に含まれる。特定されているポリペプチドの断片は、その特定されているポリペプチドに由来する少なくとも約3~5アミノ酸、より好ましくは少なくとも約8~10アミノ酸、より一層好ましくは少なくとも約15~20アミノ酸を含むアミノ酸配列を意味する。本発明で用いる合成ペプチドなる語は、当業者によく知られている方法で化学的に合成することが可能な、任意の長さのアミノ酸の重合形態を意味する。これらの合成ペプチドは、種々の用途において有用である。精製されたポリペプチドは、関心のあるポリペプチドが天然において伴われている細胞成分を実質的に含まないすなわち、その約50以上、好ましくは約70以上、より好ましくは約90以上を含有しない関心のあるポリペプチドまたはその断片を意味する。精製方法は当技術分野で公知である。単離されたなる語は、該物質が、その元の環境例えば、それが天然に生じるものである場合には天然環境から取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然系中の共存物質の一部または全部から分離されている同じポリヌクレオチドまたはDNAまたはポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部となることが可能であり、および/または、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部となることが可能であり、それらもまた、該ベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないため単離されている。組換え宿主細胞、宿主細胞、細胞、細胞系、細胞培養および単細胞体として培養される微生物または高等真核細胞系を示す他のそのような用語は、組換えベクターまたは他の導入DNAのレシピエントとして使用しうる又は使用されている細胞を意味し、トランスフェクトされた元の細胞の元の後代originalprogenyを含む。本発明で用いるレプリコンは、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律単位として挙動するプラスミド、染色体、ウイルスなどの任意の遺伝要素を意味する。ベクターは、別のポリヌクレオチドセグメントが結合しているレプリコンであり、例えば該結合セグメントの複製および/または発現を引き起こす。制御配列なる語は、それが結合しているコード配列の発現を引き起こすために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物では、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位およびターミネーターを含み、真核生物では、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、ターミネーター、および場合によってはエンハンサーを含む。したがって、制御配列なる語は、発現するために存在することを要する全成分を最低限含むと意図され、また、存在すれば有利である追加的な成分例えば、リーダー配列を含んでいてもよい。作動的に結合は、記載されている成分が、それらの意図される様態で機能しうる関係で存在している状況を意味する。したがって、例えば、コード配列に作動的に結合している制御配列は、該制御配列に適合しうる条件下で該コード配列の発現が達成されるように連結されている。コード配列は、適当な調節配列の制御下に配置された場合に、mRNAに転写されポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。該コード配列の境界は、5’末端の翻訳開始コドンと、3′末端の1以上の翻訳停止コドンとにより定められ、それらを含む。コード配列には、mRNA、cDNAおよび組換えポリヌクレオチド配列を含めることが可能であるが、これらに限定されるものではない。免疫学的に同定可能なる語は、示されているポリペプチド中に存在しそれに特有なエピトープおよびポリペプチドの存在を意味する。免疫学的同一性は、抗体結合および/または結合における競合により判定することができる。これらの技術は、当業者に公知であり、本明細書にも記載されている。また、エピトープの特有性は、エピトープをコードするポリヌクレオチド配列に関するGenBankなどの公知データバンクのコンピューター検索により、また、他の公知タンパク質とのアミノ酸配列の比較により判定することができる。本発明で用いるエピトープは、ポリペプチドの抗原決定基を意味する。エピトープは、該エピトープに特有の空間コンホメーションにおいて3個のアミノ酸を含むことが可能である、と考えられる。一般に、エピトープは、少なくとも5個のそのようなアミノ酸よりなり、通常、それは、少なくとも8~10個のアミノ酸よりなる。空間コンホメーションを調べる方法は、当技術分野で公知であり、例えば、X線結晶解析および二次元核磁気共鳴を含む。コンホメーションエピトープは、免疫学的に認識可能な構造のアミノ酸の特異的な配置を含むエピトープであり、そのようなアミノ酸は、連続的または不連続的な順序で同一ポリペプチド上に存在するか又は異なるポリペプチド上に存在する。ポリペプチド内に含有される特異的エピトープの抗体認識により該ポリペプチドが抗体に結合する場合、該ポリペプチドは抗体に対して免疫反応性である。免疫反応性は、抗体結合により、より詳しくは抗体結合の速度論により、および/または、該抗体に対するエピトープを含有する公知ポリペプチドを競合体として用いる結合における競合により測定することができる。ポリペプチドが抗体に対して免疫反応性であるか否かを判定する方法は、当技術分野で公知である。形質転換なる語は、宿主細胞内に外因性ポリヌクレオチドを挿入することを意味し、その挿入に用いる方法には無関係である。例えば、直接取込み、形質導入またはf接合が含まれる。外因性ポリヌクレオチドは、非組込みレプリコン例えば、プラスミドとして維持されることが可能であり、あるいは宿主ゲノム内に組込まれることが可能である。試験サンプルなる語は、被検体例えば、関心のある抗体または関心のある抗原の起源である個体の身体の成分を意味する。これらの成分は当技術分野でよく知られている。これらの試験サンプルには、本明細書に記載の本発明の方法により試験することができる生物学的サンプルが含まれ、ヒトおよび動物の体液、例えば、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、および気道、腸管および尿生殖路の種々の外分泌物、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫など;生物学的流体、例えば、細胞培養上清;固定しうる組織試料;および固定しうる細胞試料が含まれる。精製された産物は、該産物が通常伴っている細胞構成成分から、また、関心のあるサンプル中に存在しうる他の型の細胞から単離されている産物の調製物を意味する。本発明は、特異的結合メンバーを使用するアッセイを提供する。本発明で用いる特異的結合メンバーは、特異的結合ペアのメンバーである。すなわち、2つの異なる分子のうちの一方が、化学的または物理的手段により、もう一方の分子に特異的に結合する。したがって、一般的なイムノアッセイの抗原および抗体特異的結合ペアに加えて、他の特異的結合ペアとして、ビオチンおよびアビジン、炭水化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターおよび受容体分子、補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素などを含めることができる。さらに、特異的結合ペアには、元の特異的結合メンバーの類似体例えば、被検体類似体であるメンバーを含めることができる。免疫反応性特異的結合メンバーには、組換えDNA分子により形成されたものを含む、抗原、抗原断片、抗体および抗体断片モノクローナルおよびポリクローナルの両方ならびにそれらの複合体が含まれる。本発明で用いる捕捉試薬は、サンドイッチアッセイにおいては該被検体に特異的な、あるいは競合アッセイにおいては指示試薬に特異的な、あるいは間接アッセイにおいては補助的特異的結合メンバーそれ自体は、該被検体に特異的であるに特異的な未標識の特異的結合メンバーを意味する。該アッセイの実施前または該アッセイの実施中に、該捕捉試薬を固相材料に直接的または間接的に結合させて、試験サンプルから固定化複合体を分離できるようにすることが可能である。指示試薬は、特異的結合メンバーに共役付加している、外的手段により検出可能な測定可能なシグナルを生成する能力を有し該シグナルを生成するシグナル生成化合物標識を含む。本発明で用いる特異的結合メンバーは、特異的結合ペアのメンバーを意味する。すなわち、2つの異なる分子のうちの一方が、化学的または物理的手段により、もう一方の分子に特異的に結合する。該指示試薬は、特異的結合ペアの抗体メンバーであることに加えて、ハプテン-抗ハプテン系例えば、ビオチンまたは抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭水化物またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターまたは受容体分子、酵素補因子および酵素、酵素阻害剤または酵素などを含む任意の特異的結合ペアのメンバーとなることも可能である。免疫反応性の特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイにおける関心のあるポリペプチド、または競合アッセイにおける捕捉試薬、または間接アッセイにおける補助的特異的結合メンバーのいずれかに結合する能力を有する抗体、抗原または抗体/抗原複合体でありうる。意図される種々のシグナル生成化合物標識には、発色性物質、触媒例えば、酵素、発光性化合物例えば、フルオレセインおよびローダミン、化学発光性化合物例えば、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウムおよびルミノール、放射性元素および直接可視標識が含まれる。酵素には、例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼなどが含まれる。個々の標識の選択は、決定的に重要ではないが、それは、それ自体で又は1以上の追加的物質と共にシグナルを生成する能力を有するものであろう。固相固体支持体は、当業者に公知であり、反応トレーのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロース小片、膜、微粒子例えば、ラテックス粒子、ヒツジまたは他の動物の赤血球およびDuracytesAbbottLaboratoriesAbbottParkILから入手可能な、ピルビン酸アルデヒドおよびホルムアルデヒドで固定された赤血球などを含む。固相は決定的に重要なものではなく、当業者であれば選択することが可能である。例えば、ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジまたは他の適当な動物の赤血球およびDuracytesはすべて、適当な具体例である。ペプチドを固相上に固定化するための適当な方法には、イオン、疎水性、共有結合相互作用などが含まれる。本発明で用いる固相は、不溶性であるか又は後続の反応で不溶性にすることができる任意の材料を意味する。固相は、捕捉試薬を誘引し固定化するその固有能力に関して選択することができる。あるいは、固相は、捕捉試薬を誘引し固定化する能力を有する追加的な受容体を保有することが可能である。追加的な受容体には、捕捉試薬自体とは反対に荷電した、あるいは捕捉試薬に共役した荷電物質とは反対に荷電した荷電物質を含めることが可能である。あるいはまた、該受容体分子は、特異的結合反応により捕捉試薬を固定化する能力を有し固相上に固定化付加されている任意の特異的結合メンバーであってもよい。該受容体分子は、アッセイの実施前またはアッセイの実施中に捕捉試薬が固相材料に間接的に結合するのを可能にする。したがって、固相は、プラスチック、誘導プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジまたは他の適当な動物の赤血球、Duracytes登録商標および当業者に公知の他の形態であってもよい。検出抗体の接近を許容するのに十分な多孔性と、抗原を結合させる適当な表面親和性とを有する、適当な任意の多孔性材料を、固相が含むことも可能であると意図され、そのような場合も本発明の範囲内に含まれる。多孔性構造が一般に好ましいが、水和化状態のゲル構造を有する材料も使用できる。そのような有用な固体支持体には、ニトロセルロースおよびナイロンが含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載のそのような多孔性固体支持体は、好ましくは、約001~05mm、好ましくは約01mmの厚さのシートの形態であると意図される。該孔径は、広範囲の値を取ることが可能であり、好ましくは約0025~15ミクロン、特に好ましくは約015~15ミクロンである。そのような支持体の表面は、該支持体に対する抗原または抗体の共有結合を引き起こす化学的方法により活性化することができる。しかしながら、一般には、十分には理解されていない疎水性力による多孔性材料上での吸着により、抗原または抗体の不可逆的結合を得る。他の適当な固体支持体は、当技術分野で公知である。本発明は、関心のあるヒト免疫不全ウイルスに由来するポリヌクレオチド配列およびそれにコードされるポリペプチドを提供する。該ポリヌクレオチドは、mRNAまたはDNAの形態であってもよい。DNA、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAの形態のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。該DNAは、二本鎖または一本鎖であってもよく、一本鎖である場合には、コードセンス鎖または非コードアンチセンス鎖であってもよい。該ポリペプチドをコードするコード配列は、本発明で提供するコード配列と同一であってもよく、遺伝暗号の重複または縮重の結果、本発明で提供するDNAと同じポリペプチドをコードする異なるコード配列であってもよい。このポリヌクレオチドは、該ポリペプチドのコード配列のみを含んでいたり、あるいは該ポリペプチドのコード配列と追加的なコード配列例えば、リーダーまたは分泌配列またはプロタンパク質配列とを含んでいたり、あるいは該ポリペプチドのコード配列および所望により追加的なコード配列と非コード配列例えば、該ポリペプチドのコード配列の5′および/または3′側の非コード配列とを含んでいてもよい。また、本発明は、ポリヌクレオチドの欠失、置換または付加などの修飾を含有する変異ポリヌクレオチド、および該変異ポリヌクレオチド配列から生じる任意のポリペプチド修飾体を含む。また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明で提供するコード配列の天然に生じる対立遺伝子変異体であるコード配列を有していてもよい。さらに、該ポリペプチドのコード配列は、宿主細胞におけるポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド配列例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に、同じリーディングフレームで融合させることができる。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、それは、該ポリペプチドを形成するために宿主細胞により切断されるリーダー配列を有していてもよい。また、該ポリヌクレオチドは、該タンパク質と追加的な5′アミノ酸残基とを含むプロタンパク質をコードしていてもよい。プロ配列を有するタンパク質は、プロタンパク質であり、場合によっては、該タンパク質の不活性形態であってもよい。プロ配列が切断されると、活性タンパク質が残される。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質をコードしたり、あるいはプロ配列を有するタンパク質をコードしたり、あるいはプレ配列リーダー配列とプロ配列とを有するタンパク質をコードしてもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列とインフレームで融合したコード配列を有していてもよい。該マーカー配列は、細菌宿主の場合には、該マーカーと融合したポリペプチドの精製をもたらすための、pQE9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであることが可能であり、あるいは例えば、哺乳動物宿主例えば、COS7細胞系を使用する場合には、該マーカー配列は赤血球凝集素HAタグであることが可能である。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。例えば、IWilsonらCell37767を参照されたい。本発明はさらに、本発明で提供する推定アミノ酸配列を有するHIV1ポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの断片、類似体および誘導体に関する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然の精製ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってもよい。そのようなポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、該アミノ酸残基の1以上が同類アミノ酸残基または非同類アミノ酸残基好ましくは、同類アミノ酸残基で置換されているものであってもよい。そのような置換アミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされていてもコードされていなくてもよい。あるいはそれは、該アミノ酸残基の1以上が置換基を含むものであってもよい。あるいはそれは、該ポリペプチドが別の化合物例えば、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物、例えばポリエチレングリコールに融合しているものであってもよい。あるいはそれは、追加的なアミノ酸例えば、リーダーもしくは分泌配列、または該ポリペプチドの精製のために使用する配列、またはプロタンパク質配列が該ポリペプチドに融合しているものであってもよい。そのような断片、誘導体および類似体は、本発明の範囲内に含まれる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離好ましくは精製された形態で提供される。したがって、本発明のポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列と同じであるか又は1以上のアミノ酸の置換による小さな変異により異なるアミノ酸配列を有していてもよい。該変異は、典型的には、約1~5アミノ酸の範囲の同類変化であることが可能であり、この場合、該置換アミノ酸は、類似した構造的または化学的特性を有する例えば、ロイシンからイソロイシンへの置換またはトレオニンからセリンへの置換。これに対して、変異には、非同類変化例えば、グリシンからトリプトファンへの置換を含めることができる。また、類似した小さな変異には、アミノ酸の欠失または挿入またはそれらの両方を含めることができる。生物学的または免疫学的活性の変化を引き起こさずに置換し、挿入し又は欠失させるアミノ酸の種類および個数を決定する際の指針は、当技術分野でよく知られているコンピュータープログラム、例えばDNASTARソフトウェアDNASTARIncMadisonWIを用いて得ることができる。本発明の組換えポリペプチドは、後記に示すとおりに製造できるほかに、その他の多数の方法に従い、種々の宿主細胞および発現ベクターを使用して製造することができる。宿主細胞は、クローニングベクターまたは発現ベクターであることが可能な本発明のベクターで遺伝的に操作形質導入または形質転換またはトランスフェクトする。該ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であることが可能である。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し形質転換細胞を選択し又はHIVに由来するHIV由来遺伝子を増幅するために必要に応じて改変された通常の栄養培地中で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で既に用いられているものであり、当業者には明らかなものである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によるポリペプチドの製造に使用することができる。したがって、ポリペプチドを発現させるためのいずれか1つの種々の発現ビヒクル特に、ベクターまたはプラスミド中に該ポリヌクレオチド配列を含めることが可能である。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成DNA配列、例えば、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクター、ウイルスDNA例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病ウイルスが含まれる。しかしながら、宿主内で増殖可能かつ生存可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターを使用することも可能である。適当なDNA配列を、種々の方法によりベクター中に挿入することができる。一般には、該DNA配列を、当技術分野で公知の方法により、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の技量の範囲内であると考えられる。該発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指令する適当な発現制御配列プロモーターに作動的に結合させる。そのようなプロモータの代表例には、LTRまたはSV40プロモーター、大腸菌Ecolilacまたはtrp、ファージλPsubLプロモーター、および原核性もしくは真核性細胞またはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。発現ベクターはまた、翻訳の開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。該ベクターはまた、発現の増幅のための適当な配列を含むことが可能である。さらに、該発現ベクターは、好ましくは、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質例えば、真核細胞培養におけるジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、または大腸菌Ecoliにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を与える遺伝子を含有する。前記の適当なDNA配列と適当なプロモーターまたは制御配列とを含有するベクターを使用して、適当な宿主を形質転換して、該宿主が該タンパク質を発現できるようにすることが可能である。適当な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌Ecoli、サルモネラティフィムリウムSalmonellatyphimurium;ストレプトマイセスエスピーStreptomycessp;真菌細胞、例えば酵母;昆虫細胞、例えばショウジョウバエおよびSf9;動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣CHO、COSまたはBowes黒色腫;植物細胞などが挙げられる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示に基づけば当業者の技量の範囲内に含まれると考えられる。より詳しくは、本発明はまた、前記で広く記載されている配列の1以上を含んでなる組換え構築物を含む。該構築物は、本発明の配列が順配向または逆配向で挿入されているベクター例えば、プラスミドまたはウイルスベクターを含む。この実施形態の好ましい態様では、該構築物はさらに、該配列に作動的に結合した調節配列例えば、プロモーターなどを含む。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、商業的に入手可能である。以下のベクターを例示する:細菌性:pINCYIncytePharmaceuticalsIncPaloAltoCA、pSPORT1LifeTechnologiesGaithersburgMD、pQE70、pQE60、pQE9QiagenpBs、phagescript、psiX174、pBluescriptSK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46aStratagene;pTrc99A、pKK2233、pKK2333、pDR540、pRIT5Pharmacia;真核性:pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSGStratagenepSVK3、pBPV、pMSG、pSVLPharmacia。しかしながら、宿主内で複製可能で生存可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターを使用することが可能である。プロモーター領域は、CATクロラムフェニコールトランスフェラーゼベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、所望の任意の遺伝子から選択することができる。2つの適当なベクターとして、pKK2328およびpCM7が挙げられる。挙げられる個々の細菌性プロモーターには、lacI、lacZ、T3、SP6、T7、gpt、λPsubR、PsubL、およびtrpが含まれる。真核性プロモーターには、サイトメガロウイルスCMV前初期、単純ヘルペスウイルスHSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインIが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内に十分に含まれるものである。本発明で用いる宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞、または酵母細胞などの下等真核細胞であることが可能であり、あるいは該宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞であることが可能である。該宿主細胞内への該構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーションLDavisらBasicMethodsinMolecularBiology第2版AppletonandLangParamountPublishingEastNorwalkCT1994により行なうことができる。宿主細胞内の構築物は、該組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生させるために常法で使用することができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、通常のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。組換えタンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞内で発現させることができる。また、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用してそのようなタンパク質を製造するために、無細胞翻訳系を使用することができる。原核性または真核性宿主と共に使用するための適当なクローニングおよび発現ベクターは、SambrookらMolecularCloningALaboratoryManual第2版それを参照により本明細書に組み入れることとするに記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、該ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増強される。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増強する、通常約10~300bpのシス作用性のDNA要素である。具体例には、複製起点の後期側bp100~270のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。一般には、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー例えば、大腸菌Ecoliのアンピシリン耐性遺伝子およびエスセレビシエScerevisiaeTRP1遺伝子、および下流の構造配列の転写を指令するための、高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターを含むであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ3ホスホグリセリン酸キナーゼPGK、α因子、酸性ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質などの解糖酵素をコードするオペロンに由来するものであってもよい。該異種構造配列を、翻訳開始配列および終結配列、および好ましくは、周辺腔または細胞外培地中への翻訳タンパク質の分泌を指令しうるリーダー配列と、適当な段階で合体させる。所望により、該異種配列は、所望の特性例えば、発現された組換え産物の安定化または簡便な精製を付与するN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードしていてもよい。細菌において使用するための有用な発現ベクターは、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を、機能的プロモーターに対して作動可能な読取りが一致するように挿入することにより構築する。該ベクターは、該ベクターの維持を保証し、所望により該宿主内での増幅をもたらすための、1以上の形質選択マーカーと複製起点とを含むであろう。形質転換のための適当な原核性宿主には、大腸菌Ecoli、バシラスサチリスBacillussubtilis、サルモネラティフィムリウムSalmonellatyphimurium、およびシュードモナスPseudomonas属、ストレプトマイセスStreptomyces属およびスタヒロコッカスStaphylococcus属内の種々の種が含まれるが、その他の原核性宿主を通常の選択物として使用することも可能である。細菌において使用するための有用な発現ベクターは、選択マーカーおよび細菌性複製起点よく知られたクローニングベクターpBR322ATCC37017の遺伝要素を含むプラスミドに由来するものを含む。他のベクターには、PKK2233PharmaciaFineChemicalsUppsalaSwedenおよびGEM1PromegaBiotecMadisonWIが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのpBR322バックボーン切片を、適当なプロモーターおよび発現させる構造配列と合体させる。適当な宿主を形質転換し、該宿主を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な手段例えば、温度変化または化学的誘導により抑制解除し、細胞を更に一定期間培養する。細胞は、典型的には、遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために保存する。タンパク質の発現において使用した微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む簡便な任意の方法で破壊することができる。そのような方法は、当業者によく知られている。組換えタンパク質を発現させるためには、種々の哺乳動物細胞培養系を使用することができる。哺乳動物発現系には、例えば、GluzmanCell23175に記載のサル腎線維芽細胞のCOS7系、および和合性ベクターを発現する能力を有する他の細胞系例えば、C127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサーならびに必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終結配列、5′フランキング非転写配列、および選択マーカー例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むであろう。SV40ウイルスゲノムに由来するDNA配列例えば、SV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を使用して、必要な非転写遺伝要素を得ることが可能である。代表的で有用なベクターには、pRcCMVおよびpcDNA3InvitrogenSanDiegoCAから入手可能が含まれる。硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはレクチンクロマトグラフィーなどの公知方法により、HIV由来ポリペプチドを組換え細胞培養物から回収し、精製する。精製中に存在するカルシウムイオンを低濃度約01~5mMにするのが好ましいPriceらJBiolChem2449171969。該ポリペプチドの立体配置を完全なものにする際に、必要に応じて、タンパク質のリフォールディング工程を行なうことが可能である。最後に、最終精製工程として高速液体クロマトグラフィーHPLCを行なうことができる。本発明のポリペプチドは、高発現細胞系から発現された天然に精製された産物、または化学方合成法により又は原核性もしくは真核性宿主から例えば、培養における細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞により組換え技術で得られた産物であってもよい。組換え製造法で使用する宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、哺乳動物または他の真核生物の炭水化物でグリコシル化されたり、あるいは非グリコシル化されうる。また、本発明のポリペプチドは、開始メチオニンアミノ酸残基を含むこともあろう。本発明はさらに、グリコシル化が排除された酵母、昆虫または哺乳動物発現系における該タンパク質の、減少した炭水化物形態の発現は許容される組換えポリペプチドの修飾形態を含む。グリコシル化部位を不活性化するための公知方法には、米国特許第5071972号およびEP276846それらを参照により本明細書に組み入れることとするに記載されているものが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明に含まれる他の変異体には、該タンパク質産物の生物活性を減少させる不適当な分子内ジスルフィド架橋の形成を妨げるためにシステイン残基をコードする配列を除去することにより得られるものが含まれる。また、本発明の構築物は、問題のあるプロテアーゼ例えば、酵母におけるKEX2プロテアーゼを含有する系における発現を可能にするためにタンパク質分解プロセシングの部位を除去することにより製造することができる。そのようなプロテアーゼ部位を除去するための公知方法には、EP212914に記載のKEX2部位を除去するための1つの方法が含まれるが、これに限定されるものではない。本発明は、オリゴマー、二量体、三量体およびより高次のオリゴマーの形態の前記ペプチドを含む。オリゴマーは、ペプチド間のジスルフィド結合、ペプチド間の非共有相互作用およびペプチド間のポリエチレングリコール連結を含むこれらに限定されるものではないいくつかの手段により形成させることができる。オリゴマーを促進しうるペプチドリンカーまたはペプチドに対する前記ペプチドの融合体も、本発明に含まれる。そのようなペプチドには、ロイシンジッパーおよび抗体に由来するペプチド例えば、ConstructionofImmunoglobinFusionProteinsCurrentProtocolsinImmunologySupplement4pgs10191101911JohnWileyandsonsNewYorkNYに記載のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。出発プラスミドは、入手可能なプラスミドから、公開されている公知方法に従い構築することができる。さらに、記載されているものと同等のプラスミドが、当技術分野において公知であり、当業者には明らかであろう。組換え細胞の均一培養が得られたら、多量の組換え産生タンパク質を、ならし培地から回収し、当技術分野でよく知られているクロマトグラフィー法で分析することができる。多量の分泌タンパク質のもう1つの製造法は、哺乳動物胚の形質転換、およびトランスジェニックウシ、ヤギ、ヒツジなどが産生する乳から該組換えタンパク質を回収することを含む。ポリペプチド、および密接に関連している分子は、タンパク質の精製を容易にするような方法で組換え的に発現させることができる。1つのアプローチは、ヒトポリペプチド上に天然には存在しない1以上の追加的ポリペプチドドメインを含むキメラタンパク質の発現を含む。精製を容易にするそのようなドメインには、固定化された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド例えば、ヒスチジントリプトファンドメイン、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、およびFLAGS伸長/アフィニティー精製系ImmunexCorpSeattleWAで使用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。切断可能なリンカー配列、例えばXA因子またはエンテロキナーゼInvitrogenSanDiegoCAから入手可能を該ポリペプチド配列と該精製ドメインとの間に含有させることは、該ポリペプチドの回収に有用かもしれない。前記の組換え抗原は、直接および間接アッセイを含むそれらに限定されるものではない種々のイムノアッセイ様式において使用されると意図され、本発明の範囲内に含まれる。該抗原をそのような種々の様式に適合させるための手段例えば、標識または巨大分子への共役、または適当な支持体表面上での固定化によるものは、十分に理解されており、当業者によく知られているはずである。例えば、本発明のポリペプチドそれらの断片、誘導体および類似体を含むまたはそれらを発現する細胞は、HIVおよび抗体を産生する免疫原に対する抗体の検出のために使用することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体およびFab断片、またはFab発現ライブラリーの産物であることが可能である。そのような抗体および断片の産生のためには、当技術分野で公知の種々の方法を用いることができる。さらに、本発明の配列に対応するポリペプチドに対して産生される抗体は、該ポリペプチドを動物に直接注入することにより、あるいは該ポリペプチドを動物例えば、マウス、ウサギ、ヤギまたはヒトに投与することにより得ることができる。マウス、ウサギまたはヤギが好ましい。ついで、そのようにして得た抗体は、該ポリペプチド自体に結合することとなる。このように、該ポリペプチドの断片だけをコードする配列でさえ、天然ポリペプチドに結合する抗体を産生させるために使用することができる。ついで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを含有する疑いのある組織などの試験サンプルから該ポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体の製造には、連続継代細胞株培養により産生される抗体を与える任意の技術を用いることができる。具体例には、KohlerおよびMilsteinNature256495497に記載のハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、KozborらImmunToday472に記載のヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびColeらMonoclonalAntibodiesandCancerTherapyAlanRLissIncNewYorkNYpp7796に記載のヒトモノクローナル抗体を産生させるためのEBVハイブリドーマ技術が含まれる。一本鎖抗体の産生のための記載されている技術を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を産生させるために適用することができる。例えば、米国特許第4946778号それを参照により本明細書に組み入れることとするを参照されたい。そのような抗体は、サンドイッチイムノアッセイおよびプローブアッセイを含む種々のアッセイ様式において使用することができる。例えば、前記のモノクローナル抗体または断片は、試験サンプル中のHIV由来ポリペプチドの存在を判定するための種々のアッセイ系で使用することができる。例えば、第1のアッセイ様式では、固相上にコーティングされている、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはその断片、またはこれらの抗体の組合せを、試験サンプルと接触させて、第1混合物を形成させる。この第1混合物を、抗原/抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、シグナル生成化合物が結合しているモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはその断片、またはこれらの抗体の組合せを含む指示試薬を、該抗原/抗体複合体と接触させて、第2混合物を形成させる。ついで、この第2混合物を、抗体/抗原/抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。シグナル生成化合物により生成した測定可能なシグナルを検出することにより、試験サンプル中に存在し固相上に捕捉されたHIV由来ポリペプチド抗原の存在を判定する。試験サンプル中に存在するHIV由来ポリペプチド抗原の量は、生成したシグナルに比例する。あるいは、ポリクローナルもしくはモノクローナルHIV由来ポリペプチド抗体またはその断片またはそのような抗体の組合せ固体支持体に結合しているもの、試験サンプル、および指示試薬シグナル生成化合物が結合している、HIV由来ポリペプチド抗原に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはその断片またはこれらの抗体の組合せを含むものを接触させることにより、混合物を得る。この混合物を、抗体/抗原/抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。該シグナル生成化合物により生成した測定可能なシグナルを検出することにより、試験サンプル中に存在し固相上に捕捉されたHIV由来ポリペプチドの存在を判定する。試験サンプル中に存在するHIV由来ポリペプチドタンパク質の量は、生成したシグナルに比例する。もう1つのアッセイ様式では、本発明の少なくとも2つのモノクローナル抗体の1つまたは組合せを、HIV由来ポリペプチドタンパク質に対する抗体の検出のための競合プローブとして使用することができる。例えば、HIV由来ポリペプチドタンパク質例えば、本明細書に開示の組換え抗原を、単独で又は組合せて、固相上にコーティングする。ついで、HIV由来ポリペプチド抗原に対する抗体を含有する疑いのある試験サンプルを、シグナル生成化合物と少なくとも1つのモノクローナル抗体とを含む指示試薬と共に、固相に結合している試験サンプルおよび指示試薬または固相に結合している指示試薬のいずれかの抗原/抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。固相に対するモノクローナル抗体の結合の減少を定量的に測定することができる。さらにもう1つの検出方法では、本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体のそれぞれを、免疫組織化学的分析による固定組織切片および固定細胞中のHIV由来ポリペプチド抗原の検出において使用することができる。これらの抗体を直接的に標識例えば、フルオレセイン、金コロイド、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどでの標識したり又は二次標識化抗種抗体を使用して標識本明細書に例示する種々の標識する細胞化学的分析を用いて、疾患の組織病理を追跡することが可能である。さらに、これらのモノクローナル抗体を、CNBr活性化セファロースに類似したマトリックスに結合させて、細胞培養または生物学的組織からの特異的HIV由来ポリペプチドタンパク質のアフィニティー精製例えば、組換え及び天然HIV由来ポリペプチド抗原およびタンパク質の精製に使用することができる。また、治療用途または他の同様の用途のためのキメラ抗体の産生にも、モノクローナル抗体を使用することができる。モノクローナル抗体またはその断片は、HIV由来ポリペプチド抗原の検出のために個々に提供されうる。また、該モノクローナル抗体およびその断片の組合せを、少なくとも1つのHIV由来ポリペプチド抗体と他のHIV由来ポリペプチド領域に対する抗体各抗体は、異なる結合特異性を有するとの混合物またはカクテル中の成分として、一緒に使用することができる。したがって、このカクテルは、HIVのHIV由来ポリペプチドタンパク質に対するモノクローナル抗体と、該HIV由来ポリペプチドゲノムの他の抗原決定基に対する他のモノクローナル抗体とを含むことが可能である。該アッセイ様式で使用しうるポリクローナル抗体またはその断片は、該アッセイで使用するHIV由来ポリペプチド領域または他のHIV由来ポリペプチドタンパク質に特異的に結合すべきである。好ましく使用されるポリクロナール抗体は、ヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジ抗HIV由来ポリペプチドポリクローナル抗体などの哺乳動物に由来するものである。最も好ましくは、該ポリクローナル抗体は、ウサギポリクローナル抗HIV由来ポリペプチド抗体である。該アッセイで使用するポリクローナル抗体は、単独で又はポリクローナル抗体のカクテルとして使用することができる。該アッセイ様式で使用するカクテルは、異なるHIV由来ポリペプチド特異性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含むため、それらは、HIV由来ポリペプチドの状態の診断、評価および予後判定ならびにHIV由来ポリペプチドタンパク質の識別および特異性の研究に有用である。組換え抗原の使用により、およびHIV由来ポリペプチドのアミノ酸配列を含有する合成ペプチドまたは精製ペプチドの使用により、アッセイにおいてHIV由来ポリペプチドの検出が可能となると意図され、それが本発明の範囲内に含まれる。また、そのような各HIV由来ポリペプチドの異なるエピトープを定める異なる合成、組換えまたは精製ペプチドを、HIV病態の診断、評価または予後判定のためのアッセイにおいて併用することも、本発明の範囲内に含まれる。この場合、これらのペプチドを1つの固相上にコーティングしたり、あるいはそれぞれ分離したペプチドを、分離した固相例えば、微粒子上にコーティングし、ついで、後にアッセイにおいて使用しうるペプチド混合物を形成するように合体させることが可能である。さらに、HIV疾患の診断、評価または予後判定のために、異なるポリペプチドからのエピトープを定める複数のペプチドを併用することができると意図される。ついで、固相上にコーティングされた又は検出可能な標識で標識されたペプチドを、一定量の抗体に関して、患者のサンプルからのペプチドと競合させる。該抗体に対する該合成、組換えまたは精製ペプチドの結合の減少は、患者のサンプル中のHIVにより分泌されたポリペプチドの存在の指標となり、それは今度は、患者におけるHIV遺伝子の存在を示す。アッセイ様式の変形は、当業者に公知であり、本明細書において後に検討する。もう1つのアッセイ様式では、以下のとおり、抗原および/またはHIV由来ポリペプチドに対する抗体の存在を同時アッセイにおいて検出することができる。試験サンプルを、同時に、第1被検体に対する捕捉試薬該捕捉試薬は、固相に結合した第1被検体に特異的な第1結合メンバーを含むおよび第2被検体に対する捕捉試薬該捕捉試薬は、第2固相に結合した第2被検体に対する第1結合メンバーを含むと接触させて、混合物を得る。この混合物を、捕捉試薬/第1被検体および捕捉試薬/第2被検体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、そのようにして生成したこれらの複合体を、シグナル生成化合物で標識された第1被検体に特異的な結合ペアのメンバーと、シグナル生成化合物で標識された第2被検体に特異的な結合ペアのメンバーとを含む指示試薬に接触させて、第2混合物を得る。この第2混合物を、捕捉試薬/第1被検体/指示試薬複合体および捕捉試薬/第2被検体/指示試薬複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。いずれかの又は両方の固相上で形成した複合体に関して生成したシグナルを、試験サンプル中の1以上の被検体の存在の指標として検出することにより、1以上の被検体の存在を判定する。このアッセイ様式では、組換え抗原、およびそれから産生させたモノクローナル抗体を使用することができる。そのようなアッセイ系は、EP公開第0473065号に、より詳しく記載されている。その他のアッセイ様式では、本明細書に開示するポリペプチドを使用して、試験サンプル中のHIV由来ポリペプチドに特異的な抗体の存在を検出することができる。例えば、試験サンプルを、少なくとも1つの組換えタンパク質が結合している固相と共にインキュベートする。これらを、抗原/抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で反応させる。インキュベーション後、該抗原/抗体複合体を検出する。選択するアッセイ系に応じて、検出を容易にするために、指示試薬を使用することができる。もう1つのアッセイ様式では、試験サンプルを、本明細書に記載のとおりに産生させた組換えタンパク質が結合している固相と接触させ、また、指示試薬で好ましくは標識されている、該タンパク質に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体と接触させる。抗体/抗原複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベーションした後、固相を遊離相から分離し、該標識をHIV由来ポリペプチド抗体の存在の指標として該固相中または該遊離相中で検出する。本明細書に開示する組換え抗原を使用する他のアッセイ様式が意図される。これらは、第1起源からの少なくとも1つの抗原が結合している固相と試験サンプルとを接触させ、抗原/抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で該固相と試験サンプルとをインキュベートし、ついで該固相を標識抗原該抗原は、同一起源に由来する、あるいは第1起源とは異なる第2起源に由来すると接触させることを含む。例えば、大腸菌Ecoliなどの第1起源に由来する組換えタンパク質を、固相上の捕捉抗原として使用し、そのように調製された固相に試験サンプルを加え、必要に応じて標準的なインキュベーションおよび洗浄工程の後、異なる起源すなわち、非大腸菌Ecoliに由来する組換えタンパク質を指示試薬の一部として使用する。同様に、固相上の組換え抗原と合成ペプチド指示相中との組合せも可能である。第1起源からのHIV由来ポリペプチドに特異的な抗原捕捉抗原としてと、第2起源からのHIV由来ポリペプチドに特異的な抗原とを使用する任意のアッセイ様式が意図される。このように、組換え抗原の種々の組合せ、および合成ペプチド、精製タンパク質などの使用が、本発明の範囲内に含まれる。このようなアッセイおよび他のアッセイは、米国特許第5254458号それは共通の所有権を享受しており、それを参照により本明細書に組み入れることとするに記載されている。また、種々の他の固相を使用する他の実施形態も意図され、本発明の範囲内に含まれる。例えば、速い液相免疫化学的反応を行なうために、負に荷電した重合体との固定化可能反応複合体を固定化するためのイオン捕捉法EP公開第0326100号およびEP公開第0406473号に記載されているを本発明で使用することができる。固定化可能な免疫複合体は、その負に荷電したポリアニオン/免疫複合体と、予め処理されている正に荷電した多孔性マトリックスとの間のイオン相互作用により、該反応混合物の残部から分離され、既に記載されている種々のシグナル生成系例えば、EPO公開第0273115号に記載の化学発光シグナルの測定において記載されているものを用いて検出される。また、固相が微粒子磁性または非磁性を含む微粒子技術を用いる系例えば、自動化系および半自動化系での使用に、本発明の方法を適合させることが可能である。そのような系には、例えば、公開されているEPO出願EP0425633およびEP0424634にそれぞれ記載されている系が含まれる。イムノアッセイにおける走査型プローブ顕微鏡検査法scanningprobemicroscopySPMの使用も、本発明のモノクローナル抗体を容易に適合させることが可能な技術として挙げられる。走査型プローブ顕微鏡検査法、特に原子間力顕微鏡検査法においては、捕捉相、例えば、本発明のモノクローナル抗体の少なくとも1つを固相に付着させ、走査型プローブ顕微鏡を使用して、固相の表面上に存在しうる抗原/抗体複合体を検出する。通常、多数のイムノアッセイ系においては、抗原/抗体複合体を検出するために標識を使用しなければならないが、走査型トンネル顕微鏡検査法を使用すると、そのような標識が不要になる。特異的結合反応をモニターするためのSPMの使用は、多数の方法で実施することが可能である。1つの実施形態では、特異的結合パートナーのメンバーの1つ本発明のモノクローナル抗体である被検体特異的物質を、走査に適した表面に結合させる。該被検体特異的物質の結合は、当業者に公知の方法に従って行なう、プラスチックまたは金属表面の固相を含む試験片に対する吸着によるものであってもよい。あるいは、誘導体化プラスチック、金属、シリコンケイ素またはガラスの固相を含む試験片に対する特異的結合パートナー被検体特異的物質の共有結合を用いてもよい。共有結合方法は、当業者に公知であり、特異的結合パートナーを試験片に不可逆的に結合させるための種々の手段を含む。該試験片がシリコンまたはガラスである場合には、特異的結合パートナーを結合させる前に、該表面を活性化する必要がある。また、特異的結合パートナーを試験片の表面上に化学的方法で固定化するために、混成電極相互作用を用いることができる。好ましい結合方法は、共有的手段によるものである。特異的結合メンバーの結合の後、非特異的結合を最小限に抑えるために、該表面を血清、タンパク質または他のブロッキング剤などの物質で更に処理することができる。また、アッセイ目的に対する適合性を確認するために、該表面を、製造部位または使用点において走査することができる。走査過程は、試験片の特異的結合特性を変えないと考えられる。本発明は、主として固相の使用に関して開示されているが、本発明の抗体、タンパク質、ペプチドなどの試薬は、非固相アッセイ系においても使用可能であると意図される。これらのアッセイ系は、当業者に公知であり、本発明の範囲内に含まれるとみなされる。本発明を更に、以下の実施例により説明するが、これらの実施例は例示にすぎず、本発明の精神および範囲を限定するものではない。クローニング方法遺伝子の構築および配列決定のためのオリゴヌクレオチドは、AbbottLaboratoriesSyntheticGeneticsSanDiegoCAまたはOligoEtcWilsonvilleCAで合成した。AmpliTaqDNAポリメラーゼおよびUlTmaDNAポリメラーゼを含むすべてのポリメラーゼ連鎖反応PCR試薬は、特に示さない限り、PerkinElmerCorporationFosterCityCAから購入し、製造業者の仕様書に従い使用した。PCR増幅はGeneAmp9600サーマルサイクラーPerkinElmer上で行なった。特に示さない限り、制限酵素はNewEnglandBioLabsBeveryMAから購入し、消化は製造業者の推奨どおりに行なった。クローニングに使用したDNA断片は、特に示さない限り、アガロースLifeTechnologiesGaithersburgMDゲル上で単離した。所望の断片を切り出し、該DNAをQIAEXIIゲル抽出キットまたはQIAquickゲル抽出キットQiagenIncChatsworthCAで製造業者の推奨どおりに抽出した。DNAをH2OまたはTE1mMエチレンジアミン四酢酸、10mMトリスアミノメタン塩酸塩に再懸濁した。StratageneDNA連結キットStratageneCloningSystemsLaJolaCAを製造業者の推奨どおりに使用して、連結を行なった。連結物は16°Cで一晩インキュベートした。MAXEFFICIENCYDH5αコンピテント細胞BRLLifeTechnologiesまたはEpicurianColiXL1Blueスーパーコンピテント細胞StratageneCloningSystemsを製造業者のプロトコールに従い使用して、細菌の形質転換を行なった。特に示さない限り、形質転換および細菌の再ストリークrestreakは、150μgmlアンピシリンM1090MicroDiagnosticsLombardILを含有するLB寒天Lennoxプレート上または示されているとおり20mMの最終濃度までグルコースで補足されたLB寒天アンピシリンプレート上でプレーティングした。すべての細菌のインキュベーションプレートおよび一晩の培養は、37°Cで一晩~16時間行なった。所望のクローンを同定するための形質転換体のスクリーニングは、ミニプレップDNAの配列決定により及び/又はコロニーPCRにより行なった。特に示さない限り、ミニプレップDNAはQiagenTip20PlasmidPrepKitまたはQiagenQIAwell8PlasmidPrepKitを製造業者の仕様書に従い使用して調製した。コロニーPCRスクリーニングには、個々のコロニーを形質転換プレートから拾い、100μlの無菌H2Oを含有する無菌平底96ウェルプレートCostarCambridgeMA中のウェル中に移した。該容量の3分の1をもう1つのプレートに移し、4°Cで保存した。元の96ウェルプレートを電子レンジに5分間かけて該細胞を破壊した。ついで1μlの容量を鋳型としてPCRチューブに移した。1μlの10×PCRバッファー、1μlの2mMdNTPs、1μl10pmolのセンスプライマー、1μl10pmolのアンチセンスプライマー、008μlのAmpliTaqDNAポリメラーゼ04単位および42μlのH2Oを含有する9μlのPCRマスター混合物を該PCRチューブに加えた。反応は、一般には、94°Cで30秒間、50~60°Cプライマーアニーリング温度によるで30秒間および72°Cで60秒間の20~25サイクルで増幅した。プライマーは該インサートによって異なり、サイクル条件はプライマーアニーリング温度および予想産物の長さに基づいて改変した。サイクリングの後、該反応容量の約13を、分析用にアガロースゲル上にローディングした。所望のクローンを含有するコロニーを該トランスファープレートから増殖させた。特に示さない限り、DNA配列決定は自動ABIModel373AStretchSequencerPerkinElmer上で行なった。配列決定反応を、FSTACSDyeTermReadyReactionKitPerkinElmerからの試薬および250~500ngのプラスミドDNAで製造業者の仕様書に従い調製した。Sequencer上へのローディングの前に、反応をCentriSepカラムPrincetonSeparationsAdelphiaNJ上で加工処理した。配列データを、Sequencher30GeneCodesCorporationAnnArborMIおよびGeneWorks245OxfordMolecularGroupIncCampbellCAを使用して分析した。HIV1O群分離株HAM112のenv配列の決定QIAampBloodKitQiagenおよび該製造業者が推奨している方法を用いて、HAM112と称されるHIV1O群分離株HHamplらInfection233693701995に感染したヒト末梢血単核細胞の培養上清からウイルスRNAを抽出した。RNAを、ヌクレアーゼを含有しない50μl容量の水5Prime3PrimeIncBoulderCO中で溶出し、70°Cで保存した。env領域の配列を得るための方法は、4つの重複env遺伝子断片のcDNA合成およびPCRネスティド増幅を含むものであった。該増幅産物を自動ABIModel373AStretchSequencer上で直接配列決定した。増幅反応は、GeneAmpRNAPCRおよびGeneAmpPCRKitsPerkinElmerを製造業者の概略説明のとおりに使用して行なった。オリゴヌクレオチドプライマーの位置はHIV1ANT70env配列GMyersら編前掲に対応する。プライマーenv10Rヌクレオチド791772配列番号62、env15Rnt15921574配列番号63、env22Rnt23212302配列番号64、env26Renvの3’側nt250232配列番号65を、それぞれ断片1~4のcDNA合成に使用した。逆転写反応物を、42°Cで30分間、ついで99°Cで5分間インキュベートした。第1ラウンドのPCR増幅は、以下のプライマーの組合せを使用する95°Cで30秒間、52°Cで30秒間および72°Cで1分間の30サイクルよりなるものであった:断片1~4に関してそれぞれenv1Fenvの5’側nt184166配列番号66およびenv10R配列番号62、env7Fnt564586配列番号67およびenv15R配列番号63、env12Fnt12891308配列番号68およびenv22R配列番号64、env19Fnt20202040配列番号69およびenv26R配列番号65。第2ラウンドの増幅ネスティドPCRでは、以下のプライマーの組合せと共に5μlのそれぞれの第1ラウンドPCR反応物を鋳型として使用した:断片1~4に関してそれぞれenv2Fenvの5’側nt3715配列番号70およびenv9Rnt740721配列番号71、env8Fnt631650配列番号72およびenv14Rnt14371416配列番号73、env13Fnt13331354配列番号74およびenv21Rnt22822265配列番号75、env20Fnt21222141配列番号76およびenv25Renvの3’側nt11194配列番号77。第2ラウンドの増幅条件は、第1ラウンドで用いたものと同じであった。断片をアガロースゲル精製し、QuiagenQIAEXIIGelExtractionKitで抽出した。ネスティドPCRに使用したプライマーと、断片1にはプライマーenv4F配列番号78およびenv5R配列番号79、断片2にはプライマーenv10F配列番号80、env11F配列番号81、env11R配列番号82、env12F配列番号68およびAG1配列番号87、断片3にはプライマーenv15F配列番号83およびenv19R配列番号84、断片4にはプライマーenv22F配列番号85およびenv24R配列番号86を使用して、断片を直接配列決定した。HIV1O群分離株HAM112からのenvの推定アミノ酸配列配列番号61を図1に示す。合成HIV1O群envgp120gp41遺伝子の構築図2は、合成HIV1O群envgp120gp41遺伝子構築物を得るために用いる方法を示す。該envgp120gp41配列は、HIV1O群分離株HAM112配列番号61に基づく。HAM112のenv配列の決定の概要は、前記実施例2に説明されている。envgp120のC末端の45アミノ酸およびenvgp41の327アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを設計したヌクレオチド1は、該合成遺伝子中のgp120の第1コドンの1番目のものである。gp41の高度に疎水性Hの領域膜貫通領域を含む天然HAM112gp41と比べて、該合成遺伝子は26アミノ酸ヌクレオチド643~720の欠失を有する。したがって、構築される完全長合成gp41遺伝子は327アミノ酸である。該合成オリゴヌクレオチドにおいては、大腸菌Ecoliにおける組換えタンパク質の発現レベルを増加させるために大腸菌Ecoliのコドンの偏りに適合するように天然HIV1コドンを改変した。例えば、MGouyおよびCGautierNucleicAcidsResearch107055HGrosjeanおよびWFiersGene18199JWatsonら編MolecularBiologyoftheGene第4版BenjaminKummingPublishingCopp440を参照されたい。該遺伝子構築方法は、相補性末端を有する一連の重複オリゴヌクレオチドOsynA~OsynL、A~Lとして記載されているの合成を含むものであった。アニーリングの際、該末端は該相補鎖の伸長のためのプライマーとして働く。ついで該断片をPCRにより増幅した。この過程オリゴヌクレオチドのPCRニッティングPCRknittingを繰返して、該遺伝子断片を連続的に拡大させる。オリゴヌクレオチドOsyn5′を、PLベクターpKRR826中へのクローニング用に設計した。発現ベクターpKRR826は、米国特許出願第08314570号それを参照により本明細書に組み入れることとするに記載のλPLプロモーターベクターpSDKR816の修飾体である。pKRR826は、温度感受性cIリプレッサー遺伝子を含有するpBR322の高コピー数誘導体であるBenardらGene5591979。しかしながら、pKRR826は、翻訳ターミネーターrrnBt1を欠き、λPLおよびλpRプロモーターをpSDKR816に対して逆配向で有する。pKRR826のポリリンカー領域は、EcoRIおよびBamHI制限酵素部位を含有するが、ATG開始コドンを欠く。該遺伝子インサートの5′末端N末端メチオニンを含むをEcoRI部位中にクローニングする場合に、最適な発現が得られる。Osyn5′は、クローニング用のEcoRI制限部位と該組換えタンパク質の適切な翻訳開始をもたらすATGコドンメチオニンとを含有するように設計した。アンチセンスオリゴヌクレオチドOsynO3′配列番号15、OsynP3′配列番号16およびOsynM配列番号14はそれぞれ、2つの連続した翻訳終結コドンTAA、TAGおよびBamHI制限部位を含有する。外側プライマーOsyn5′配列番号11およびOsynM配列番号14を使用した場合には、完全長gp41327アミノ酸遺伝子が合成されたpGO11PL配列番号52。外側オリゴヌクレオチドOsyn5′配列番号11およびOsynO3′配列番号15は、199アミノ酸のトランケート化gp41産物pGO9PL配列番号48を与えた。あるいは、外側オリゴヌクレオチドOsyn5′配列番号11およびOsynP3′配列番号16は、169アミノ酸長のトランケート化gp41産物を与えたpGO8PL配列番号58。また、該合成遺伝子を、CMPKDOシンテターゼCKS融合タンパク質として発現させた。pKRR826からpJO200への該合成遺伝子のPCR媒介導入参照により本明細書に組み入れる米国特許出願第572822号に記載されているを、別の外側センスオリゴヌクレオチドPCRプライマー5′末端Osyn5′CKS配列番号25を使用して行なった。Osyn5′CKSは、EcoRI制限部位を含有し、発現ベクターpJO200におけるCKSに対する該合成遺伝子インサートのインフレーム融合体を与えた。3′外側プライマーアンチセンスOsynM配列番号14、OsynO3′配列番号15およびOsynP3′配列番号16をOsyn5′CKS配列番号25と共に使用して、それぞれpGO11CKS配列番号54、pGO9CKS配列番号50およびpGO8CKS配列番号60を得た。これらの工程は後記において詳しく説明する。A.合成オリゴヌクレオチドのPCRニッティング3つのPCR反応100μl容量を以下のとおりに調製した。1反応1B:AmpliTaqDNAポリメラーゼ25Uおよび1×バッファー、ならびに40μMの各dNTPdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、それぞれ25pmolのオリゴヌクレオチドOsynA配列番号3およびOsynD配列番号5およびそれぞれ025pmolのオリゴヌクレオチドOsynB配列番号17およびOsynC配列番号4。2反応2A:UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファー、ならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、それぞれ25pmolのオリゴヌクレオチドOsynE配列番号6およびOsynH配列番号9およびそれぞれ025pmolのオリゴヌクレオチドOsynF配列番号7およびOsynG配列番号8、および3反応3A:UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファー、ならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、それぞれ25pmolのオリゴヌクレオチドOsynI配列番号10およびOsynL配列番号13およびそれぞれ025pmolのオリゴヌクレオチドOsynJ配列番号18およびOsynK配列番号12。増幅は、97°Cで30秒間、52°Cで30秒間および72°Cで60秒間の20サイクルよりなるものであった。ついで反応物を72°Cで7分間インキュベートし、4°Cに維持した。PCR由来産物1B、2Aおよび3Bを1アガロースゲル上でゲル単離した。B.反応1Bおよび反応2AからのPCR産物のPCRニッティングPCR反応を、UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファーならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、244pmolのオリゴヌクレオチドOsyn5′配列番号11、25pmolのオリゴヌクレオチドOsynP3′配列番号16および前記実施例3第1A節からのそれぞれ~10ngのゲル単離1Bおよび1A産物で調製した。サイクリング条件は実施例3第1A節と同じであった。第2ラウンドの増幅を用いて、さらなる所望の産物を得た。これは、49pmolのOsyn5′配列番号11、50pmolのOsynP3′配列番号16および鋳型としての第1ラウンドからのPCR産物5μlで前記UlTma混合物100μlの反応容量を調製することにより行なった。これらの反応物を94°Cで90秒間インキュベートし、ついで前記第3A節のとおりにサイクルを行なった。Osyn5′OsynP3′PCR産物を、前記のとおりにゲル単離した。C.Osyn5′OsynP3′PCR産物のクローニングOsyn5′OsynP3′PCR産物を制限エンドヌクレアーゼEcoRIBamHIで消化し、EcoRIBamHIで消化されゲル単離されているベクターpKRR826前記のとおり中に連結した。該連結産物を使用してDH5αコンピテント細胞を形質転換した。オリゴヌクレオチドpKRREcoRIフォワード配列番号38およびpKRRBamHIリバース配列番号39を使用するコロニーPCRにより、所望のクローンを同定した。ミニプレップDNAをpGO8候補クローンA2の一晩培養から調製し、Osyn5′OsynP3′プラスミドインサートをオリゴヌクレオチドプライマーpKRREcoRIフォワード配列番号38、pKRRBamHIリバース配列番号39、41sy1配列番号44および41sy2配列番号41で配列決定した。D.pGO8候補クローンA2の修飾100μl容量のPCR反応を、UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファーならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、50pmolのオリゴヌクレオチドOsyn5′修復配列番号24、50pmolのOsynP3′配列番号16および鋳型としての~1ngのpGO8候補クローンA2ミニプレップDNA前記反応から得たもので調製した。該反応物を94°Cで90秒間インキュベートし、ついで94°Cで30秒間、50°Cで30秒間および72°Cで60秒間の20サイクルで増幅した。ついでOsyn5’修復OsynP3′PCR産物をゲル単離し、EcoRIBamHIで消化した。該消化産物を、EcoRIBamHIで消化されたpKRR826ベクター中に連結した。該連結産物を使用してDH5αコンピテント細胞を形質転換した。オリゴヌクレオチドpKRREcoRIフォワード配列番号38およびpKRRBamHIリバース配列番号39を使用するコロニーPCRにより、所望のクローンを同定した。pGO8候補クローン6の一晩培養を準備し、ミニプレップDNAを調製した。Osyn5′修復OsynP3′プラスミドインサートを、オリゴヌクレオチドプライマーpKRREcoRIフォワード配列番号38、pKRRBamHIリバース配列番号39、41sy1配列番号44および41sy2配列番号41で配列決定した。配列決定の結果に基づき、pGO8候補クローン6をpGO8PLDHSαと称することにした。配列番号57は、該コード領域のヌクレオチド配列を示す。図5は、pGO8PL組換えタンパク質のアミノ酸配列配列番号58を示す。pGO8PL組換えタンパク質は、N末端メチオニン、45アミノ酸のenvgp120HIV1GroupOHAM112分離株および169アミノ酸のenvgp41HIV1O群HAM112分離株よりなる。E.pGO8CKSXL1の構築pGO8CKSXL1配列番号59は該コード領域のヌクレオチド配列を示すは、組換えタンパク質pGO8CKSをコードしている。図6は、pGO8CKSのアミノ酸配列配列番号60を示す。このタンパク質は、246アミノ酸のCKSポリリンカー、45アミノ酸のenvgp120HIV1O群HAM112分離株および169アミノ酸のenvgp41HIV1O群HAM112分離株よりなる。pGO8CKSXL1の構築は以下のとおりに行なった。PCR反応100μl容量を、UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファーならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、50pmolのOsyn5′CKS配列番号25、50pmolのOsynP3′配列番号16および1ngのpGO8PLクローン6ミニプレップDNAで調製した。該反応物を94°Cで90秒間インキュベートし、ついで94°Cで30秒間、55°Cで30秒間および72°Cで90秒間の25サイクルで増幅した。ついでOsyn5′CKSOsynP3′PCR産物をゲル単離した。EcoRIBamHIは該Osyn5′CKSOsynP3′PCR産物およびベクターpJO200を消化した。その消化されたpJO200ベクターをゲル単離し、消化されたOsyn5′CKSOsynP3′PCR産物に連結した。XL1Blueスーパーコンピテント細胞を該連結物で形質転換し、20mMグルコースで補足されたLBアンピシリンプレート100μgml上にプレーティングした。コロニーを同じタイプのプレート上での単離のために再ストリークした。クローンpGO8CKSXL1の一晩培養をLBブロス100μgmlカルベニシリンSigmaChemicalCo20mMグルコースSigmaChemicalCo中で増殖させた。凍結ストック05mlの一晩培養05mlのグリセロールを作製し、DNAを配列分析用に調製した。以下のオリゴヌクレオチドを配列決定プライマーとして使用した:CKS1配列番号30、CKS2配列番号31、CKS3配列番号32、CKS4配列番号33、43461配列番号2、43285配列番号1、41sy1B配列番号29、41sy2B配列番号34、CKS1761配列番号19およびCKS3583配列番号20。F.pGO9PLDH5αの構築図3A~3Dは、pGO9PLDH5αの構築にかかわる工程の概要を図示する。pGO9PLDH5αは、組換えタンパク質pGO9PLをコードしている。配列番号47は、pGO9PLDH5αのコード領域のヌクレオチド配列を示す。図7は、pGO9PL組換えタンパク質のアミノ酸配列配列番号48を例示する。このタンパク質は、N末端メチオニン、45アミノ酸のenvgp120HIV1O群HAM112分離株および199アミノ酸のenvgp40HIV1O群HAM112分離株よりなる。pGO9PLDH5αの構築は以下のとおりに行なった。工程1:100μlのPCR反応を、UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファーならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、50pmolのOsyn5′配列番号11、50pmolのOsynH配列番号19および鋳型としての~2ngのpGO8候補クローン6ミニプレップDNA前記実施例3第D節から得たもので調製した。該反応物を94°Cで120秒間インキュベートし、ついで94°Cで30秒間、50°Cで30秒間および72°Cで60秒間の8サイクルで増幅した。工程2:100μlのPCR反応を、UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファーならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、50pmolのOsyn5′配列番号11、50pmolのOsynO3’配列番号15および鋳型としての工程1からのPCR反応物で調製した。該反応物を94°Cで120秒間インキュベートし、ついで94°Cで30秒間、55°Cで30秒間および72°Cで60秒間の18サイクルで増幅し、ついで72°Cで5分間インキュベートした。ついで該Osyn5′OsynO3′PCR産物2A2Bをゲル単離し、EcoRIBamHIで消化した。該消化産物を、EcoRIBamHIで消化されたpKRR826ベクター中に連結した。つぎに該連結産物を使用してDH5αコンピテント細胞を形質転換した。pGO9PL候補クローン3の一晩培養を調製し、ミニプレップDNAを調製した。該Osyn5′OsynO3′プラスミドインサートを、オリゴヌクレオチドプライマーpKRREcoRIフォワード配列番号38、pKRRBamHIリバース配列番号39、41sy1C配列番号40、41sy2配列番号41、41sy3配列番号42および41sy4配列番号23で配列決定した。ついでpGO9PLクローン3を単離のために再ストリークした。単離されたコロニーを拾い、その一晩培養を増殖させ、凍結ストック05mlのグリセロール05mlの一晩培養を作製した。該ストックを80°Cで保存した。前記プライマーをプライマーを使用して該配列を確認し、このクローンをpGO9PLDH5αと称することにした配列番号47は該コード領域のヌクレオチド配列を示し、配列番号48はコード領域のアミノ酸配列を示す。pGO9PLDH5αを再ストリークし、一晩培養を増殖させ、ミニプレップDNAを調製したこのプレップをH5と称することにした。G.pGO9CKSXL1の構築図3A~3Dは、pGO9CKSXL1の構築にかかわる工程の概要を図示する。pGO9CKSXL1は、組換えタンパク質pGO9CKSをコードしている。図8は、pGO9CKS組換えタンパク質のアミノ酸配列配列番号50を示す。このタンパク質は、246アミノ酸のCKSおよびポリリンカー、およびそれに続く45アミノ酸のenvgp120HIV1O群HAM112分離株および199アミノ酸のenvgp41HIV1O群HAM112分離株よりなる。pGO9CKSXL1の構築は以下のとおりに行なった。2つのPCR反応100μlの容量を、UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファーならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、50pmolのOsyn5′CKS配列番号25、50pmolのOsynO3′配列番号15および鋳型としての1ngのpGO9PL候補クローン3ミニプレップDNA前記実施例3第F節から得たもので調製した。各反応物を94°Cで120秒間インキュベートし、ついで94°Cで30秒間、55°Cで30秒間および72°Cで120秒間の24サイクルで増幅し、ついで72°Cで5分間インキュベートした。ついで該Osyn5′CKSOsynO3′PCR産物をゲル単離した。該Osyn5′CKSOsynO3′PCR産物をおよびベクターpJO200をEcoRIBamHIで消化した。その消化されたpJO200ベクターをゲル単離し、消化されたOsyn5′CKSOsynO3′PCR産物に連結した。XL1Blueスーパーコンピテント細胞を該連結物で形質転換し、20mMグルコースで補足されたLBアンピシリンプレート上にプレーティングした。コロニーを同じタイプのプレート上での単離のために再ストリークした。クローンpGO9CKS候補クローン4の一晩培養をLBブロス100μgmlカルベニシリンSigmaChemicalCo20mMグルコースSigmaChemicalCo中で増殖させた。凍結ストック05mlの一晩培養05mlのグリセロールを作製し、DNAを配列分析用に調製した。以下のオリゴヌクレオチドを配列決定プライマーとして使用した:CKS1配列番号30、CKS2配列番号31、CKS3配列番号32、CKS4配列番号33、43461配列番号2、43285配列番号1、41sy1B配列番号29、41sy2B配列番号34、41sy3B配列番号35、CKS1761配列番号19およびCKS3583配列番号20およびpTBS8配列番号28。クローンpGO9CKS候補クローン4をpGO9CKSXL1と称することにした配列番号49はコード領域のヌクレオチド配列を示し、配列番号50はコード領域のアミノ酸配列を示す。H.OsynIM断片の構築OsynOM断片を以下のとおりに構築した。100μlのPCR反応を、AmpliTaqDNAポリメラーゼ25U、1×バッファー、50μMの各dNTP、50pmolのIPCR配列番号26、50pmolのOsynM配列番号14および10ngのゲル単離されたPCR断片3A前記実施例3第A節を使用して調製した。該反応物を95°Cで105秒間インキュベートし、ついでそれを95°Cで30秒間、55°Cで30秒間、72°Cで60秒間の15サイクルで増幅し、ついでそれを72°Cで7分間維持した。OsynIMと称される該産物をゲル単離し、製造業者が推奨している方法に従いPCRIIベクターTACloningKitInvitrogenSanDiegoCA中にクローニングした。得られた連結産物を使用してDH5αコンピテント細胞を形質転換した。プラスミドミニプレップDNAをクローンIM6の一晩培養から作製し、該遺伝子インサートを56759配列番号45および55848配列番号46で配列決定した。I.PCR断片I6RおよびIM6Fの合成およびニッティングこれらの操作は以下のとおりに行なった。工程1:以下のPCR反応100μl容量を調製した:aI6Rでは、AmpliTaqDNAポリメラーゼ25U、1×バッファー、50μMの各dNTP、50pmolのIPCR配列番号26、50pmolのIM6R配列番号22および鋳型としての281ngのクローンIM6実施例3第H節から得たもの;b6FMでは、AmpliTaqDNAポリメラーゼ25U、1×バッファー、50μMの各dNTP、50pmolのIM6F配列番号21、50pmolのMPCR配列番号27および鋳型としての281ngのクローンIM6実施例3第H節から得たもの。該反応物を95°Cで105秒間インキュベートし、ついで94°Cで15秒間、60°Cで30秒間、72°Cで60秒間の20サイクルで増幅し、ついで72°Cで7分間インキュベートした。つぎに該PCR産物I6Rおよび6FMを前記の方法に従いゲル単離した。工程2:PCR反応100μl容量を、UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファーならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、50pmolのIPCR配列番号26、50pmolのMPCR配列番号27、~50ngのI6Rおよび~20ngの6FMで調製した。該反応物を95°Cで105秒間インキュベートし、ついでそれを94°Cで15秒間、55°Cで30秒間、72°Cで60秒間の20サイクルで増幅し、ついで72°Cで7分間インキュベートした。該PCR産物をCentrisepカラムPrincetonSeparations上で製造業者の指示書に従い加工した。J.pGO11PLDH5αの構築図4A~4Fは、pGO11PLDH5αの構築にかかわる工程の概要を図示する。pGO11PLDH5αは、組換えタンパク質pGO11PLをコードしている。図9は、pGO11PL組換えタンパク質のアミノ酸配列配列番号52を示す。このタンパク質は、N末端メチオニン、45アミノ酸のenvgp120HIV1O群HAM112分離株および327アミノ酸のenvgp41HIV1O群HAM112分離株よりなる。pGO11PLDH5αは以下のとおりに構築した。実施例3第I節からの最終PCR産物およびpGO9PLベクター実施例3第F節からのミニプレップH5を、AgeIおよびBamHIで順次消化した。ついで、消化されたpGO9PLを仔ウシ腸アルカリホスファターゼBRLLifeTechnologiesで37°Cで15分間処理し、フェノールクロロホルムで抽出し、NaOAcおよびEtOHで沈殿させた。ついで該ベクターpGO9PLをゲル単離した。消化されたpGO9PLと消化された該PCR産物とを連結し、該連結産物を使用してDH5αコンピテント細胞を形質転換した。コロニーを単離のために再ストリークした。ついでクローンpGO114を同定し、単離のために再ストリークした。pGO114の一晩培養を調製して、凍結ストックを得、配列決定用のミニプレップDNAを得た。クローンpGO114を以下のオリゴヌクレオチドプライマーで配列決定した:pKRREcoR1フォワード配列番号38、pKRRBamHIリバース配列番号39、41sy1C配列番号40、41sy2配列番号41、41sy3配列番号42、41sy4配列番号23、41sy5B配列番号43、41sy5C配列番号36および41sy6B配列番号37。該配列決定の結果に基づき、このクローンをpGO11PLDH5αと称することにした配列番号51は該コード領域のヌクレオチド配列を示し、配列番号52はコード領域のアミノ酸配列を示す。K.pGO11CKSXL1の構築図4A~4Gは、pGO11CKSXL1の構築にかかわる工程の概要を図示する。pGO11CKSXL1は、組換えタンパク質pGO11CKSをコードしている。図10は、pGO11CKS組換えタンパク質のアミノ酸配列配列番号54を示す。このタンパク質は、246アミノ酸のCKSおよびポリリンカー、およびそれに続く45アミノ酸のenvgp120HIV1O群HAM112分離株および327アミノ酸のenvgp41HIV1O群HAM112分離株よりなる。pGO11CKSXL1は以下のとおりに構築した。PCR反応100μl容量を、UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファーならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、50pmolのOsyn5′CKS配列番号25、50pmolのOsynM配列番号14および1ngのpGO114実施例3第J節から得たもので調製した。該反応物を94°Cで105秒間インキュベートし、ついで94°Cで30秒間、55°Cで30秒間および72°Cで120秒間の20サイクルで増幅し、ついで72°Cで7分間インキュベートした。該Osyn5′CKSOsynMPCR産物をゲル単離した。つぎに該Osyn5′CKSOsynMPCR産物およびベクターpJO200をEcoRIBamHIで消化した。その消化されたpJO200ベクターをゲル単離した。一晩16°Cの連結を該消化PCR産物で行なった。XL1Blueスーパーコンピテント細胞を該連結物で形質転換し、20mMグルコースで補足されたLBアンピシリンプレート上にプレーティングした。コロニーを同じプレート上での単離のために再ストリークした。ついでクローンpGO11CKSクローン候補2の一晩培養LBブロス100μgmlカルベニシリン20mMグルコース調製した。凍結ストック05mlの80グリセロール05mlの一晩培養および配列分析用のミニプレップDNAを調製した。以下のオリゴヌクレオチドを配列分析用のプライマーとして使用した:CKS1配列番号30、CKS2配列番号31、CKS3配列番号32、CKS4配列番号33、43461配列番号2、43285配列番号1、41sy1B配列番号29、41sy2B配列番号34、41sy3B配列番号35、41sy4配列番号23、41sy5C配列番号36、41sy6B配列番号37、CKS1761配列番号19、CKS3583配列番号20およびpTBS8配列番号28。pGO11CKSクローン2をpGO11CKSXL1と称することにした。配列番号53は、pGO11CKSXL1のコード領域のヌクレオチド配列を示し、配列番号54は、pGO11CKSXL1のコード領域のアミノ酸配列を示す。pHIV210XL1Blueの構築図11は、pHIV210組換えタンパク質配列番号55のアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、247アミノ酸のCKSリンカー配列、envgp120からの60アミノ酸432491HIV2分離株D19410および159アミノ酸のenvgp36492650HIV2D19410よりなる。pHIV210XL1Blueの構築は以下のとおりに行なった。HIV2分離株D19410のゲノムDNAHKuhnelらNucleicAcidsResearch186142をEMBL3λクローニングベクター中にクローニングした。HKuhnelらProcNatlAcadSciUSA8623832387およびHKuhnelらNucleicAcidsResearch186142それらを参照により本明細書に組み入れることとするを参照されたい。D19410を含有するλクローンλA10をDiagenCorporationDusseldorfGermanyから得た。PCR反応100μl容量を、AmpliTaqDNAポリメラーゼ375単位、200μMの各dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、05μgのプライマー3634HIV2分離株D19410EMBL受託X52223上の7437~7455位にアニーリングする配列番号88、05μgのプライマー36368095~8077位にアニーリングする配列番号89、1×PCRバッファーおよび150に希釈した5μlのλA10DNAを使用して調製した。該反応物を94°Cで5分間インキュベートし、ついで94°Cで1分間、45°Cで1分間、72°Cで2分間の35サイクルで増幅し、ついで72°Cで5分間インキュベートした。該PCR反応物をフェノールクロロホルムBoehringerMannheimCorporationIndianapolisINで抽出し、該DNAをエタノールAAPERAlcoholChemicalCompanyShelbyvilleKYで沈殿させた。該DNAをEcoRIBamHIで消化し、15アガロースゲルSeaKemGTGアガロースFMCCorporationRocklandMaine上でゲル精製した。800単位のT4DNAリガーゼNewEnglandBioLabsを使用して、該精製産物を、EcoRIBamHIで消化されたpJO200ベクター中に連結した。XL1Blueスーパーコンピテント細胞Stratageneを、製造業者が概要説明しているとおりに2μlの該連結物で形質転換し、アンピシリンSigmaChemicalCompanyで補足されたLBプレート上にプレーティングした。50μgmlアンピシリンSigmaおよび20mMグルコースSigmaで補足されたSuperbrothII培地GIBCOBRLGrandIslandNY中に単コロニーを接種することにより、一晩培養物を樹立した。03mlの80グリセロールを07mlの一晩培養物に加えることにより、凍結ストックを得た。混合後、ストックを70°Cで保存した。アルカリ溶解法、ついでPEG沈殿を用いて、該一晩培養物からミニプレップDNAを調製した。7デアザdGTPReagentKitおよびSequenaseVersion20UnitedStatesBiochemicalCorporationClevelandOHを製造業者の概要説明のとおりに使用して、配列決定反応を行なった。IBIゲル装置を製造業者の推奨どおりに使用して、6アクリルアミドゲルGIBCOBRLGelMix6上で反応を行なった。配列決定の結果に基づき、pHIV210クローン7をpHIV210と称することにした。pHIV210コード領域のアミノ酸配列を、配列番号55として示す。HIV1O群組換えgp41抗原構築物を有する大腸菌Ecoli株の増殖および誘導pGO9CKSXL1およびpGO11CKSXL1の一晩種培養物を、100μgmlアンピシリンナトリウムで補足された500mlの無菌ExcellTerrificBrothSigmaChemicalCorpStLouisMoから入手可能中で調製し、振とうオービタルorbitalインキュベーター中、32°Cまたは37°Cで配置した。種培養からの100μlの接種物を、100μgmlアンピシリンナトリウムで補足された1リットルの無菌ExcellTerrificBrothを含有するフラスコに移した。培養が中期対数増殖に達するまで該培養を37°Cでインキュベートし、ついで1mMITPGイソプロピルチオガラクトシドで37°Cで3時間誘導したPLベクター構築物の場合には、培養が中期対数増殖に達するまで該培養をインキュベートし、ついで培養温度を42°Cに変化させることにより3時間誘導した。誘導期の後、細胞を遠心分離によりペレット化し、標準的な技術に従い収穫した。ペレット化細胞を、さらなる加工処理まで70°Cで保存した。大腸菌Ecoli内で不溶性封入体として産生されたHIV1O群組換えgp41抗原の単離および可溶化実施例5から得た凍結細胞を、50mMTrispH8、10mMNaEDTA、150mMNaCl、8ショ糖、5TritonX100、1mMPMSFおよび1μMペプスタチンAを含む冷溶解バッファー中でホモジナイズすることにより再懸濁させた。リゾチームを、加工細胞1g当たり13mgの濃度で該ホモジネートに加え、得られた混合物を氷上で30分間インキュベートして該細胞を溶解した。封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。これらのペレット化封入体を洗浄し、1溶解バッファー、210mMNaEDTApH8、30ショ糖、および3水中で順次ペレット化した。洗浄された封入体を50mMTrispH8、10mMNaEDTA、150mMNaClおよび3M尿素に再懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。ついで該封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。該ペレット化封入体を、7MグアニジンHCl、50mMTrispH8、01βメルカプトエタノールBME中で4°Cで一晩、完全に可溶化した。該可溶化組換え抗原を遠心分離により清澄化し、02μmのフィルターに通過させ、クロマトグラフィーによる精製まで20°Cで保存した。クロマトグラフィーによる組換えHIV1O群gp41抗原の精製実施例6から得た可溶化HIV1O群組換えgp41抗原を、以下のとおり、2工程の方法により精製した。不溶性抗原のグアニジンHCl抽出物を、50mMTrispH8、8M尿素および01BMEで平衡化したSephacrylS300カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。SDSポリアクリルアミド電気泳動を用いて画分を分析した。組換えgp41抗原を含有する画分をプールし、ついで限外濾過により濃縮した。該組換え抗原濃縮物を4SDSおよび5BMEで室温にて3時間処理した。SDSで処理した抗原をさらに、25mMTrispH8、015MNaCl、01vvBME、01SDSで平衡化したSephacrylS300上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。SDSポリアクリルアミド電気泳動を用いて該画分を分析した。精製組換え抗原を含有する画分をプールし、02μmのフィルターに通過させ、70°Cで保存した。HIV1M群抗原の調製実施例5に記載のとおりに、プラスミドpTB319を含有する細胞を増殖させ、誘導した。細胞を溶解し、封入体を加工した参照により本明細書に組み入れる米国特許第5124255号の実施例5に記載されているのと実質的に同じ方法で行なった。ついで該ペレット物質をSDS、リン酸塩pH68中で可溶化し、ついでS300カラム上でのクロマトグラフィーに付した。HIV2抗原の調製実施例5に記載のとおりに、pHIV210XL1Blue細胞前記実施例4を増殖させ、誘導した。ベンゾナーゼ、リゾチームおよびPMSFで補足されたリン酸塩、MgCl2、NaEDTA、TritonX100pH74を含有するバッファーで細胞を溶解した。封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。該ペレットを、蒸留H2O、TritonX100、デオキシコラート、NaCl、リン酸塩pH70;50mMリン酸塩pH70;尿素、SDSリン酸塩pH70中BMEで順次洗浄した。タンパク質をSDS、リン酸塩pH70およびBME中で可溶化し、ついでS300カラム上でのクロマトグラフィーに付した。HIV1M群、HIV1O群およびHIV2の同時検出および識別のための1工程免疫クロマトグラフィーアッセイA.試薬の調製1.セレンSeコロイド懸濁液を、実質的に以下のとおりに調製した。SeO2を水に00625gmmlの濃度にまで溶解した。ついでアスコルバートを水に032gmmlの濃度にまで溶解し、70°Cの水浴中で24時間加熱した。ついで該アスコルバート溶液を水中で00065gmmlにまで希釈した。該SeO2溶液を該希釈アスコルバート溶液に素早く加え、42°Cでインキュベートした。吸光度の最大値が、542nm~588nmの波長において30を超えた時点最低で42時間後で、インキュベーションを終了した。該コロイド懸濁液を2~8°Cに冷却し、ついで保存した。セレンコロイド懸濁液は、AbbottLaboratoriesAbbottParkIllinoisCode25001から入手可能である。2.セレンコロイド抗体共役体を、以下のとおりに調製した。該セレンコロイド懸濁液を、蒸留水中で25OD500~570の吸光度にまで濃縮した。ついで1MMOPSを10mMpH72の最終濃度まで加えた。ヒトIgGFc領域に特異的なヤギ抗体またはヒトIgGFc領域に特異的な他の種の抗体を50mMリン酸バッファーで075mgmlの濃度にまで希釈し、ついで、得られた抗体調製物を、前記のとおりに調製したセレンコロイド懸濁液に、75μgmlの最終抗体濃度まで、混合しながら加えた。攪拌を40分間続けた。ついで1重量のウシ血清アルブミンBSAを該溶液に加え、該セレンコロイド抗体共役体溶液を更に15分間攪拌し、5000×gで90分間遠心分離した。この後、該上清の90を除去し、該ペレットを残りの上清と共に再懸濁した。このセレンIgG共役体をガラス繊維パッド上にコーティングする直前に、それを共役体希釈剤1重量のカゼイン、01重量のTritonX405および50mMTrispH82で110に希釈した。3.操作対照試薬を、HIV1M群、HIV1O群およびHIV2陽性血清の混合物として調製し、該アッセイの陽性対照として別々のストリップ装置上で使用した。4.使用した陰性対照試薬は、該アッセイの陰性対照として別々の試験装置上で正常のヒトで使用されるものであった。B.適用パッドの調製適用パッド材は、樹脂結合ガラス繊維紙Lydallを含む。調製した共役体前パラグラフ2に記載の約01mlを適用パッドに加える。C.クロマトグラフィー材の調製すべての試薬を、充填およびデフレクト試薬の噴射chargeanddeflectreagentjettingにより、ニトロセルロースメンブレンに適用する。該ニトロセルロースは、感圧接着剤でコーティングされたMYLARメンブレンにより支持する。試験サンプル捕捉試薬を、aHIV1O群捕捉試薬pGO9CKS、配列番号50に関しては、前記のとおりに調製した特異的抗原を05mgmlの濃度にまで噴射希釈剤1重量のショ糖、09のNaClおよび5μgmlのフルオレセインを含有する100mMTrispH76で希釈し、bHIV1M群B亜群捕捉試薬pTB319、配列番号56に関して、およびcHIV2捕捉試薬pHIV210、配列番号55に関して調製した。0098μlの第1捕捉試薬試薬HIV1M群B亜群、配列番号56を該ストリップの所定の捕捉位置に適用し、それは1つの患者用捕捉部位を構成した。同様に、0098μlの第2捕捉試薬試薬HIV1O群、配列番号50を該ストリップの所定の捕捉位置に適用し、それは1つの患者用捕捉部位を構成した。そして、0098μlの第3捕捉試薬試薬HIV2、配列番号55を該ストリップの所定の捕捉位置に適用し、それは1つの患者用捕捉部位を構成した。D.HIVに対する抗体の存在に関する高速アッセイ試験サンプル血清、全血、唾液および尿サンプル中のHIVに対する抗体の存在に関する高速アッセイを、以下のとおりに行なった。15mlのエッペンドルフチューブ中に、5μlの血清および600μlのサンプル溶出バッファーSEB50mMTris、1BSA、04TritonX405、15カゼイン、3ウシIgG、4大腸菌EcoliライセートpH82を含有を混合した。この混合物の4滴をSTARハウジングのサンプルウェルに適用した。つぎに1μlの血清または全血をマイクロタイタープレートのウェル中の100μlのSEBに加え、該ニトロセルロースストリップを該ウェル中に加えた。この後、1μlの血清または全血を本発明のサンプルウェルの試験装置中に直接スポットし、4滴のSEBを加えた。唾液を試験する場合には、50または75μlの唾液を、マイクロタイタープレートのウェル中のそれぞれ50μlまたは25μlのSEBに加え、ついで該ニトロセルロース試験ストリップを該ウェルに加えた。尿を試験する場合には、50μlの尿をマイクロタイタープレート中のウェル中の50μlのSEBに加え、該ニトロセルロース試験ストリップを該ウェル中に加えた。あるいは、100μlの尿をマイクロタイタープレートのウェル中で使用し、SEBを使用することなく該ニトロセルロース試験ストリップを加えた。サンプル中のIgGを、該コンジュゲートパッド中のセレンヤギ抗ヒトIgGコロイドにより結合させ、該複合体を、該ニトロセルロースメンブレン試験ストリップこれには予め、正確な滴サイズを用いて容積式分配をもたらすバイオドット装置を使用して、3つの組換え抗原pGO9CKS配列番号50、pTB319HIV1M群、配列番号56およびpHIV210HIV2、配列番号55が1mgmlの濃度で適用されているの長さに沿ったクロマトグラフィーに付した。ついで該試験装置を室温で2分間インキュベートし、その結果を視覚的に読取った。E.スパイクspiked全血アッセイ15mlのエッペンドルフチューブ中に、確認された陽性HIV1O群、HIV1M群もしくはHIV2または確認された陰性HIV1O群、HIV1M群もしくはHIV2全血試験サンプルからの1μlの血液の等価体を、5μlの確認された陰性HIV1O群、HIV1M群もしくはHIV2血清および100μlのSEBに加え、混合した。この混合物を、本発明の試験装置のサンプルウェルに適用した。該サンプル中のIgGを、該コンジュゲートパッド中のセレンヤギ抗ヒトIgGコロイドにより結合させ、該複合体を、該ニトロセルロースメンブレン試験ストリップこれには予め、正確な滴サイズを用いて容積式分配をもたらすバイオドット装置を使用して、3つの組換え抗原pGO9CKS配列番号50、pTB319HIV1M群、配列番号56およびpHIV210HIV2、配列番号55が1mgmlの濃度で適用されているの長さに沿ったクロマトグラフィーに付した。ついで該試験装置を室温で2分間インキュベートし、その結果を視覚的に読取った。F.結果抗原1に対する抗体が試験サンプル中に存在する場合には、可視反応が抗原1の捕捉帯域およびアッセイ完了帯域において示されたが、抗原2または抗原3の帯域においては示されなかった。抗原2に対する抗体が試験サンプル中に存在する場合には、可視反応が抗原2の捕捉帯域およびアッセイ完了帯域において示されたが、抗原1または抗原3の帯域においては示されなかった。抗原3に対する抗体が試験サンプル中に存在する場合には、可視反応が抗原3の捕捉帯域およびアッセイ完了帯域において示されたが、抗原1または抗原2の帯域においては示されなかった。また、陰性対照は、抗原1、抗原2および抗原3の帯域においては無反応性である可視反応を示さないはずであるが、アッセイ完了帯域においては反応性であるはずである。陽性対照抗原1、2および/または3に対する既知反応性抗体は、それが抗原/抗体反応において特異的に結合する適当な抗原の帯域において反応性であるはずである。陽性反応が抗原捕捉帯域の1つにおいては生じたが、アッセイ完了帯域においては生じなかった場合には、結果を無効とみなし、試験を繰返した。i血液、尿および唾液中の抗体のアッセイ3人の患者患者番号0109、4068および4475で識別するの血液、尿および唾液を、本明細書に記載の本発明のニトロセルロース固相装置上で、前記のアッセイプロトコールに従い試験した。患者0109、4068および4475のそれぞれの各血液および尿試験サンプルは、抗原1pTB319配列番号56に対して反応性であった。患者4068および4475の唾液試験サンプルも抗原1に対して反応性であったが、患者0109の唾液試験サンプルは本発明の試験装置において無反応性であった。患者0109の唾液試験サンプルを後で、標準的なEIAにより再試験したところ、それはHIV1gp4に対する抗体に対して無反応性であると確認された。このことは、患者0109の唾液試験サンプルについて得られた結果が有効であったことを示している。iiHIV抗体に対する陰性サンプルのアッセイ2つの陰性血清および2つの陰性全血試験サンプルそれぞれは同じ2つの陰性血清でスパイクされたものを試験した。サンプルは関連抗原に特異的な抗体を含有しておらず、該試験サンプルは、該試験に関するアッセイ後に陰性であったすなわち、O、Mまたは2のいずれの位置にも反応を示す可視的バーが存在しないことから示されるとおり、無反応性であった。試験サンプル反応帯域中の陽性反応バーにより示されるとおり、試験サンプルは各試験装置中に存在した。iiiHIV1M群抗体に関するアッセイ5つのHIV1M群血清および5つの全血サンプルHIV1M群陽性血清でスパイクされたものを、10個の装置を使用して試験した。HIV1M群抗原帯域の反応線の現像から示されるとおり、HIV1M群サンプルは、HIV1M群抗原pTB319に特異的な抗体を含有することが認められ、試験装置10個中9個のアッセイ完了帯域中に可視反応線が認められた。1つの特定の試験装置においては、HIV1M群抗体に関する捕捉帯域中にバンドが存在したが、試験サンプルがアッセイ完了帯域まで到達せず、したがって、この特定のサンプルについては、該アッセイを繰返す必要があった。HIVO群およびHIV2に関する捕捉試薬に対する交差反応性は認められなかった。ivHIV1O群抗体に関するアッセイ2つの確認された陽性HIV1O群血清および2つの全血試験サンプルHIV1O群血清でスパイクされたものを、さらに4個の装置を使用して試験した。HIV1O群抗原捕捉帯域中に陽性バーの結果が認められ、各装置のアッセイ完了帯域中に反応線が認められたことから示されるとおり、HIV1O群サンプルは、HIV1O群抗原に特異的な抗体を含有することが判明した。HIV1M群またはHIV2捕捉抗原に対する交差反応性は認められなかった可視的なバーは存在しなかった。vHIV2抗体に関するアッセイさらに10個の試験装置を使用して、確認された5つのHIV2陽性血清および全血5つのHIV2血清でスパイクされたものを試験した。HIB2抗原帯域の反応バーにより示されるとおり、該HIV2サンプルは、HIV2抗原pHIV210に特異的な抗体を含有することが判明した。これらの試験サンプルとHIV1O群またはHIV1M群抗原との間で反応は認められず、各装置のアッセイ完了帯域において可視的な反応線が認められた。viHIV1M群、HIV1O群、HIV2および陰性サンプルのアッセイ最後の4個の装置を使用して、HIV1M群陽性試験サンプル、HIV1O群陽性試験サンプル、HIV2陽性試験サンプルおよび陰性対照サンプルを試験した。陰性試験血清は、抗原捕捉帯域中のいずれの抗原とも反応しなかった。HIV1M群陽性試験サンプルは、HIV1M群抗原のみに対して反応性であった。HIV1O群陽性試験サンプルは、HIV1O群抗原のみに対して反応性であった。HIV2陽性試験サンプルは、HIV2抗原のみに対して反応性であった。各装置のアッセイ完了帯域中に、可視的な反応線が認められた。使用した5つのHIV1M群および2つのHIV1O群試験サンプルが、血清陽性サンプルそれらは予め、商業的に入手可能な酵素イムノアッセイAbbott3A77を用いて試験されており、PCR増幅され、配列決定され、系統発生分析により亜型決定されていると確認された。使用した5つのHIV2サンプルは、同じEIAを使用した場合には血清陽性であり、HIV2ウエスタンブロット試験Sanofiを用いてHIV2陽性サンプルと確認された。合成HIV1M群およびHIV1O群ハイブリッド遺伝子の構築A.pTB319の修飾プラスミドpTB319参照により本明細書に組み入れる米国特許第5124255号は、フレームシフトを引き起こす合成HIV1M群gp41遺伝子内の1つの塩基の欠失によるトランケート化gp41組換えタンパク質をコードする。HIV1M群およびO群ハイブリッド遺伝子構築物の産生を容易にするために、部位特異的突然変異誘発を用いて、TB319のgp41コード領域内のフレームシフトを排除した。これは、TB319を制限エンドヌクレアーゼRsrIIおよびBstXIで順次消化することにより達成された。合成オリゴヌクレオチドpTB319A配列番号98およびpTB319T配列番号99をアニールさせ、RsrIIおよびBstXIで消化されたpTB319中に連結した。該連結産物を使用して、スーパーコンピテントXL1Blue細胞を形質転換し、該細胞を、150μgmlアンピシリンで補足されたLB寒天プレート上にプレーティングした。プライマーの組合せpTBS4配列番号100pTBS7配列番号101およびpTBS4配列番号10063168配列番号121を使用するコロニーPCRを用いて、正しく修飾されたクローンを同定した。ミニプレップDNAの調製のために3mMグルコースおよび200μgmlアンピシリンで補足されたLBブロス中の候補クローンに関して一晩培養を樹立した。オリゴヌクレオチドプライマー43461配列番号2、43285配列番号1、CKS1配列番号30、CKS3配列番号32、pTBS1配列番号102、pTBS2配列番号103、pTBS3配列番号104、pTBS4配列番号100、pTBS5配列番号105、pTBS6配列番号106、pTBS7配列番号101およびpTBS8配列番号28を使用して、全コード領域を配列決定した。配列決定の結果によれば、クローンpTB319A31pGMcks1は所望のコード領域の配列を有する。ついでこのクローンをpGM1CKSXL1配列番号107は、該コード領域のヌクレオチド配列を示すと称することにした。図12は、pGM1CKS組換えタンパク質のアミノ酸配列配列番号108を示す。B.pGO12CKSXL1の構築pGO12CKSXL1は、組換えタンパク質pGO12CKSをコードしており、そのアミノ酸配列配列番号91を図13に示す。このタンパク質は、42アミノ酸のenvgp120HIV1M群HXB2R分離株と融合した250アミノ酸のCKSポリリンカー、45アミノ酸のenvgp120HIV1O群HAM112分離株および199アミノ酸のenvgp41HIV1O群HAM112分離株よりなる。pGO12CKSXL1は以下のとおりに構築した。PCR反応100μl容量を、UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファーならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、50pmolのpTBO5′配列番号109、50pmolのpGO9Kpn配列番号10および鋳型としての1ngのpG09PLDNAミニプレップH5;前記実施例3第F節から得たもので調製した。各反応物を94°Cで105秒間インキュベートし、ついで94°Cで30秒間、55°Cで30秒間および72°Cで75秒間の22サイクルで増幅し、ついで72°Cで5分間インキュベートした。該pTBO5′pGO9KpnPCR産物をゲル上で単離した。該pTBO5′pGO9KpnPCR産物およびpGM1CKSプラスミド前記第A節に記載のものを、Asp718BoehringerMannheimBiochemicalsおよびBstXIで順次消化した。ついで、その消化されたベクターを仔ウシ腸アルカリホスファターゼBoehringerMannheimBiochemicalsで処理し、フェノールクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。その消化されたPCR産物をCentriSepカラムPrincetonSeparations上で精製した。消化されたPCR産物を、消化されホスファターゼ処理されたpGM1CKSベクター中に16°Cで一晩連結した。XL1Blueスーパーコンピテント細胞を該連結産物で形質転換し、20mMグルコースで補足されたLBアンピシリンプレート上にプレーティングした。コロニーを同じタイプのプレート上での単離のために再ストリークした。クローンpGO12CKSクローン1の一晩培養LB培地100μgmlカルベニシリン20mMグルコースを調製した。凍結ストック05mlの80グリセロール05mlの一晩培養を作製し、ミニプレップDNAを配列分析用に調製した。以下のオリゴヌクレオチドを配列分析用のプライマーとして使用した:CKS1配列番号30、CKS2配列番号31、CKS3配列番号32、CKS4配列番号33、CKS1761配列番号19、3962配列番号111、3965配列番号113、pTBS2配列番号103、pTBS3配列番号104、pTBS4配列番号100、pTBS5配列番号105、sy120S1配列番号112、41sy1B配列番号29、41sy2B配列番号34、41sy4配列番号23、pTBS8配列番号28。該配列分析の結果に基づき、pGO12CKS候補クローン1をpGO12CKSXL1と称することにした配列番号90は、該コード領域のヌクレオチド配列を示し、配列番号91は、コードされるアミノ酸配列を示す。C.pGO13CKSXL1の構築pGO13CKSは、組換えタンパク質pGO13CKSをコードしており、そのアミノ酸配列配列番号93を図14に示す。このタンパク質は、42アミノ酸のenvgp120HIV1M群HXB2R分離株と融合した250アミノ酸のCKSポリリンカー、200アミノ酸のenvgp41HIV1M群HXB2R分離株、45アミノ酸のenvgp120HIV1O群HAM112分離株および169アミノ酸のenvgp41HIV1O群HAM112分離株よりなる。pGO13CKSXL1は以下のとおりに構築した。PCR反応100μl容量を、UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファーならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、50pmolのpTBO5′配列番号109、50pmolのpGO8Kpn配列番号114および鋳型としての1ngのpG09PLDNAミニプレップH5;前記実施例3第F節から得たもので調製した。各反応物を94°Cで105秒間インキュベートし、ついで94°Cで30秒間、55°Cで30秒間および72°Cで75秒間の22サイクルで増幅し、ついで72°Cで5分間インキュベートした。該pTBO5’pGO8KpnPCR産物をゲル上で単離した。該pTBO5′pGO8KpnPCR産物およびpGM1CKSプラスミド前記第A節に記載のものを、Asp718BoehringerMannheimBiochemicalsおよびBstXIで順次消化した。ついで、その消化されたベクターを仔ウシ腸アルカリホスファターゼBoehringerMannheimBiochemicalsで処理し、フェノールクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。その消化されたPCR産物をCentriSepカラムPrincetonSeparations上で精製した。消化されたPCR産物を、消化されホスファターゼ処理されたpGM1CKSベクター中に16°Cで一晩連結した。XL1Blueスーパーコンピテント細胞を該連結産物で形質転換し、20mMグルコースで補足されたLBアンピシリンプレート上にプレーティングした。コロニーを同じタイプのプレート上での単離のために再ストリークした。クローンpGO13CKSクローン1の一晩培養LB培地100μgmlカルベニシリン20mMグルコースを調製した。凍結ストック05mlの80グリセロール05mlの一晩培養を作製し、ミニプレップDNAを配列分析用に調製した。以下のオリゴヌクレオチドを配列分析用のプライマーとして使用した:CKS1配列番号30、CKS2配列番号31、CKS3配列番号32、CKS4配列番号33、43461配列番号2、43285配列番号1、pTBS1配列番号102、pTBS2配列番号103、pTBS3配列番号104、pTBS4配列番号100、pTBS5配列番号105、sy120S1配列番号112、41sy1B配列番号29、41sy2B配列番号34、41sy4配列番号23、pTBS8配列番号28。該配列分析の結果に基づき、pGO13CKS候補クローン1をpGO13CKSXL1と称することにした配列番号92は、該コード領域のヌクレオチド配列を示し、配列番号93は、コードされるアミノ酸配列を示す。D.pGO14PLDH5αの構築pGO14PLDH5αは、組換えタンパク質pGO14PLをコードしており、そのアミノ酸配列配列番号95を図15に示す。このタンパク質は、N末端メチオニンおよびそれに続く45アミノ酸のenvgp120HIV1O群HAM112分離株、42アミノ酸のenvgp120HIV1M群HXB2R分離株と融合した200アミノ酸envgp41HIV1O群HAM112分離株および200アミノ酸のenvgp41HIV1M群HXB2R分離株よりなる。pGO14PLDH5αは以下のとおりに構築した。PCR反応100μl容量を、UlTmaDNAポリメラーゼ3Uおよび1×バッファーならびに15mMMgCl2、40μMの各dNTP、50pmolのpTBAge5′配列番号115、50pmolのpGOB3′配列番号116および鋳型としての1ngのpGM1CKSDNApTB319A31のミニプレップ;前記第A節から得たもので調製した。各反応物を95°Cで30秒間インキュベートし、ついで94°Cで30秒間、55°Cで30秒間および72°Cで60秒間の22サイクルで増幅し、ついで72°Cで5分間インキュベートした。該pTBAge5′pGOB3′PCR産物をゲル上で単離した。該pTBAge5′pGOB3′PCR産物およびpGO9PLプラスミド前記実施例3第F節から得たものをAgeIおよびBamHIで順次消化した。ついで、その消化されたベクターを仔ウシ腸アルカリホスファターゼBoehringerMannheimBiochemicalsで処理し、フェノールクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。その消化されたPCR産物をCentriSepカラムPrincetonSeparations上で精製した。消化されたPCR産物を、消化されホスファターゼ処理されたpGM1CKSベクター中に16°Cで一晩連結した。DH5αコンピテント細胞を該連結産物で形質転換し、LBアンピシリン150μgmlプレート上にプレーティングした。ベクタープライマーpKRREccoR1フォワード配列番号38およびpKRRBamHIリバース配列番号39を使用するコロニーPCRにより、適切なインサートの存在に関してコロニーを分析した。候補クローンを含有するコロニーを同じタイプのプレート上での単離のために再ストリークした。凍結ストックおよびミニプレップDNAを得るために、一晩培養LB培地100μgmlカルベニシリンを調製した。凍結ストック05mlの80グリセロール05mlの一晩培養を作製し、ミニプレップDNAを配列決定用に調製した。以下のオリゴヌクレオチドを配列分析用のプライマーとして使用した:pTBS1配列番号102、pTBS2配列番号103、pTBS3配列番号104、pTBS4配列番号100、pTBS5配列番号105、41sy1C配列番号40、41sy2配列番号41、41sy3配列番号42、41sy4配列番号23、pKRREcoR1フォワード配列番号38、pKRRBamH1リバース配列番号39。該配列分析の結果に基づき、pGO14PL候補クローン11をpGO14PLDH5αと称することにした配列番号94は、該コード領域のヌクレオチド配列を示し、配列番号95は、コードされるアミノ酸配列を示す。C末端に融合したgp41免疫優性領域IDRの第2コピーを有するHIV1O群envgp120gp41合成遺伝子の構築A.pGO15CKSXL1の構築pGO15CKSXL1は、組換えタンパク質pGO15CKSをコードしており、そのアミノ酸配列配列番号97を図16に示す。このタンパク質は、45アミノ酸のenvgp120HIV1O群HAM112分離株と融合した246アミノ酸のCKSポリリンカー、199アミノ酸のenvgp41HIV1O群HAM112分離株、およびそれに続く4アミノ酸のリンカーGly、Gly、Gly、Serおよびenvgp41HIV1O群HAM112分離株のIDR領域を含む32アミノ酸よりなる。pGO15CKSXL1は以下のとおりに構築した。XL1Blue細胞中で増殖させたプラスミドpGO11CKS実施例3第K節で得たものを、AgeIおよびBamHIで順次消化し、フェノールクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。合成オリゴヌクレオチドsynIDR2A配列番号117およびsynIDR2B配列番号118を、製造業者が推奨している方法に従いポリヌクレオチドキナーゼBoehringerMannheimBiochemicalsでキナーゼ処理した。該キナーゼ処理オリゴヌクレオチドをアニールさせ、該二本鎖を、消化AgeIBamHIされたpGO11CKSベクターに連結した。スーパーコンピテントXL1Blue細胞を該連結産物で形質転換し、該細胞を、150μgmlアンピシリンで補足されたLBプレート上にプレーティングし、一晩インキュベートした。コロニーPCRプライマー41sy1B配列番号29およびpTBS8配列番号28を用いて、候補クローンを同定した。コロニーを、150μgmlアンピシリンで補足されたLBプレート上での単離のために再ストリークした。該候補クローンの一晩培養を、100mgmlカルベニシリンおよび20mMグルコースSigmaChemicalCoで補足された2×LBブロスLifeTechnologiesInc中で樹立した。Promega373DNA単離キットPromegaCorporationMadisonWIを製造業者が推奨している方法に従い使用して、ミニプレップDNAを該一晩培養から調製した。また、該一晩培養を用いて、凍結ストックを得た。細胞をペレット化し、20グリセロールJTBakerPhillipsburgNJを含有する2×LBブロスに再懸濁し、70°Cで凍結した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを配列分析に使用した:CKS1配列番号30、CKS3配列番号32、43285配列番号1、43461配列番号2、41sy1B配列番号29、41sy2B配列番号34、41sy3B配列番号35、41sy4配列番号23およびCKS3583配列番号20。配列決定の結果に基づき、候補クローンpGO15CKS48をpGO15CKSXL1と称することにした配列番号96は、該コード領域のヌクレオチド配列を示し、配列番号97は、コードされているアミノ酸配列を示す。B.pGO15PLDH5αの構築pGO15PLDH5αは、組換えタンパク質pGO15PLをコードしており、そのアミノ酸配列配列番号120を図17に示す。このタンパク質は、N末端メチオニン、およびそれに続く45アミノ酸のenvgp120HIV1O群HAM112分離株、199アミノ酸のenvgp41HIV1O群HAM112分離株、4アミノ酸のリンカーGly、Gly、Gly、Serおよびenvgp41HIV1O群HAM112分離株のIDR領域を含む32アミノ酸よりなる。pGO15PLDH5は以下のとおりに構築した。PCR反応100μl容量を、AmpliTaqDNAポリメラーゼ25Uおよび1×バッファーならびに40μMの各dNTP、50pmolの41sy3B配列番号35、50pmolpTBS38配列番号28および鋳型としての1ngのpGO15CKSDNA候補クローンpGO15CKS48のミニプレップ;前記第A節から得たもので調製した。該反応物を95°Cで30秒間インキュベートし、ついで94°Cで20秒間、50°Cで30秒間および72°Cで60秒間の35サイクルで増幅し、ついで72°Cで7分間インキュベートした。該増幅産物を、QIAquickPCRPurificationKitQiagenを用いて精製した。精製された41sy3BpTBS8増幅産物を、AgeIおよびBamHIで順次消化し、ついでpGO9PL前記実施例3第J節からのAgeIBamHIで消化され/ホスファターゼ処理されたベクタープレップ中に廉潔した。該連結産物を用いてコンピテントDH5α細胞を形質転換し、150μgmlアンピシリンで補足されたLBプレート上にプレーティングした。プライマー41sy3配列番号42およびpKRRBamHIリバース配列番号39でのコロニーPCR、およびそれに続く、AgeIでの該PCR産物の消化により、候補クローンを同定した。候補クローン4を単離のために再ストリークした。クローン4の培養を、100μgmlカルベニシリンSigmaChemicalCoで補足された2×LBブロスLifeTechnologies中で樹立し、34°Cで一晩インキュベートした。Promega373DNAIsolationKitPromegaCorpを該製造業者の概要説明のとおりに使用して、該一晩培養の一部からミニプレップDNAを調製した。残りの一晩培養をペレット化し、該細胞を、20グリセロールJTBakerCoを含有するTerrificブロスに再懸濁し、70°Cで凍結した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを配列分析に使用した:pKRREcoR1フォワード配列番号38、pKRRBamHIリバース配列番号39、41sy1C配列番号40、41sy2配列番号41、41sy3配列番号42、41sy3B配列番号35および41sy4配列番号23。配列決定の結果に基づき、候補pGO15PLクローン4をpGO15PLDH5αと称することにした配列番号119は、該コード領域のヌクレオチド配列を示し、配列番号120は、コードされるアミノ酸配列を示す。HIV1O群組換えgp41抗原pGO8PL、pGO9PL、pGO12CKS、pGO14PLおよびpGO15CKSの調製および精製実施例5に記載のとおりに、それぞれのHIV1O群組換えgp41抗原構築物を含有する大腸菌Ecoli株を増殖させ、誘導することにより、前記抗原を調製した。得られた凍結細胞を、50mMTrispH8、10mMNaEDTA、150mMNaCl、8ショ糖、5TritonX100、1mMPMSFおよび1μMペプスタチンAを含む冷溶解バッファー中でホモジナイズすることにより再懸濁させた。リゾチームを、加工細胞1g当たり13mgの濃度で該ホモジネートに加え、氷上で30分間のインキュベーションを行なって該細胞を溶解した。封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。これらのペレット化封入体を洗浄し、1溶解バッファー、210mMNaEDTApH8、30ショ糖、および3水中で順次ペレット化した。洗浄された封入体を50mMTrispH8、10mMNaEDTA、150mMNaClおよび3M尿素に再懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。ついで該封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。該ペレット化封入体を、7MグアニジンHCl、50mMTrispH8、01βメルカプトエタノールBME中で4°Cで一晩、完全に可溶化した。該可溶化組換え抗原を遠心分離により清澄化し、02μmのフィルターに通過させた。1MグアニジンHClの最終濃度まで水で希釈17することにより、該可溶化gp41抗原を7MグアニジンHCl溶液から沈殿させた。4°Cで30分間のインキュベーションの後、沈殿したタンパク質を遠心分離し、50mMTrispH8、9M尿素、01BME中、4°Cで一晩、再び可溶化した。つぎに可溶化HIV1O群組換えgp41抗原を、以下のとおりに精製した。まず、該組換え抗原を、QSepharosePharmaciaまたはSSepharosePharmaciaカラムを使用する陰イオンおよび/または陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。該可溶化gp41抗原溶液を、50mMTrispH8、8M尿素および01BMEで予め平衡化されているQSepharoseまたはSSepharoseカラム上にローディングした。該gp41抗原を、1カラムに直接通過させボイドボリューム中に集めるか、あるいは2該カラムマトリックスに結合させた。吸着したら、該gp41抗原を01MNaCl勾配により該カラムから溶出した。SDSポリアクリルアミド電気泳動を用いて、QSepharoseまたはSSepharoseカラムからの画分を分析した。該組換えgp41抗原を含有する画分をプールし、ついで限外濾過により濃縮した。該組換え抗原濃縮物を4SDSおよび5BMEで室温にて3時間処理した。SDSで処理した抗原をさらに、25mMTrispH8、015MNaCl、01vvBME、01SDSで平衡化したSephacrylS300Pharmaciaカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。SDSポリアクリルアミド電気泳動を用いて、該S300カラムからの画分を分析した。精製組換え抗原を含有する画分をプールし、02μmのフィルターに通過させ、70°Cで保存した。HIV1M群およびO群サンプルに対する組換え抗原の反応性の試験A.ビーズのコーティング組換えHIV1抗原の反応性を調べるために、精製組換え体を14インチポリスチレンビーズ上にコーティングした。これらの抗原コート化ビーズを、HIV1M群およびO群サンプルに対する反応性を評価するための一連の捕捉アッセイで使用した。組換え抗原を、05μgmlPBS中で14インチビーズ上にコーティングした。以下の組換え抗原をコーティングした:pTB319M群、pGO9CKS、pGO11PL、pGO12CKS、pGO14PLおよびpGO15CKSすべてO群。該組換え抗原を該ビーズ上にコーティングするための方法は、以下のとおりである。各抗原について、355gm~250のビーズAbbottLaboratoriescode932556、lot6840M100を、水中の15Nプロパノール中、40°Cで30分間洗浄した。すべてのインキュベーションおよび洗浄は、シェーカープラットフォーム上の小さな褐色のガラスジャー中で行なった。該Nプロパノール溶液を吸引除去し、5825mlの抗原溶液を加え、該ビーズを40°Cで2時間インキュベートした。該抗原溶液を吸引除去し、60mlの01TritonX100溶液PBS中を40°Cで30分間加えた。ついで該ビーズを60mlのPBSで2回洗浄し、60mlの2BSAPBS中で40°Cにて30分間インキュベートした。該BSAを吸引し、該ビーズをPBS中で再び洗浄した。ついで該ビーズを、60mlの05ショ糖PBS中中、室温で15分間インキュベートした。15分後、該ショ糖を吸引し、該ビーズを風乾させた。コーティングされたビーズを、乾燥剤入りのポリスチレンボトル中、4°Cで保存した。B.アッセイ組換え抗原でコーティングされたビーズを、AbbottLaboratories3A11キット第1世代の間接アッセイ様式を使用して、種々のサンプルに対する反応性に関して試験した。サンプルを希釈し、ポリスチレントレー中のウェルに加えた。ビーズを加え、該トレーを40°Cで1時間インキュベートした。該トレーを、AbbottLaboratoriesQUICKWASH装置中、水で洗浄した。つぎに該キット共役体抗ヒトIgGホースラディッシュペルオキシダーゼを加え、該トレーを再び40°Cで1時間インキュベートした。該トレーを再び洗浄し、300μlの基質溶液002過酸化水素を含有するクエン酸リン酸バッファー中128mgmlのoフェニレンジアミンHClを室温で30分間、各ウェルに加えた。1mlの1N硫酸を加えて反応を停止し、該トレーをAbbottQUANTUM分光光度計中で読取った。この研究に使用したサンプルは、正常なヒト血漿AbbottLaboratoriescode99800、lot17535M400陰性対照として使用、HIVPL31M群陽性血清および以下のO群陽性血清であった:14283、189404、193Ha、14791、267HaおよびESP1。正常なヒト血漿対照を除くすべてのサンプルは、11000、110000および1100000キット試料希釈剤中の3つの希釈度で使用した。各サンプルの各希釈物を、6個のビーズのそれぞれに対して二重に使用し、各希釈物の結果を各ビーズについて平均しプロットした。C.結果図18~23に示す前記試験の結果は、本発明の組換え抗原の使用により得られうる感度および選択性における改善を示している。HIV1M群組換え抗原pTB319でコーティングされたビーズは、M群血清サンプルを検出したが、1つを除くすべてのO群サンプルを検出しなかった。HIV1O群組換え抗原pGO9CKS、pGO11PLおよびpGO15CKSのみでコーティングされたビーズは、O群血清サンプルを検出したが、HIV1M群サンプルの検出においてはより低い感度を示した。ハイブリッドM群およびO群組換え抗原pGO12CKSおよびpGO14PLでコーティングされたビーズは、HIV1M群陽性サンプルおよびHIV1O群陽性サンプルの両方を検出する能力を有していた。最後に、pGO15CKSこれは、該タンパク質のカルボキシ末端に組換え手段により結合したgp41のO群免疫優性領域に相当する追加的な配列を有するは、低力価O群サンプルに対して、より大きな反応性を示した。O群組換え抗原pGO9CKSおよびpGO11CKSを使用するHIV1O群感染サンプルに関するアッセイ感度の検討A.アッセイ本発明の抗原構築物のイムノアッセイにおける性能を評価するために、組換え抗原pGO9CKSおよびpGO11CKSを、HIV1M群B亜型試薬を含有する4つのHIV1HIV2イムノアッセイに組み入れた。1つのビーズアッセイアッセイ1および微粒子に基づく3つの自動化アッセイアッセイ2~4を用いて、該構築物を試験した。すべての場合に、HIV1O群組換え体を組み入れてフォーマットFormat2および組み入れないでフォーマット1、HIV1O群感染試料の反応性を評価した。該コート化ビーズ/微粒子を、HIV1O群陽性ヒト血清ESP1、189404、193Ha、341Ha、2156およびABB996の複数の希釈物と反応させた。アッセイAssay1では、精製されたpGO11CKSを、14インチポリスチレンビーズ上に該抗原構築物をコーティングすることにより、ビーズに基づく商業的に入手可能なアッセイに組み入れた。該コート化ビーズを、一定範囲の希釈度のHIV1O群陽性ヒト血清と反応させ、洗浄し、ついで、ホースラディッシュペルオキシダーゼと共役した精製pGO9CKSと反応させた。洗浄し、結合pGO9CKS共役体を未結合pGO9CKS共役体から分離した後、基質を加え、該アッセイを完了した実施例14に記載のとおり。アッセイ2では、精製pGO11CKSを、該抗原構築物を微粒子上にコーティングすることにより、もう1つの商業的に入手可能なアッセイに組み入れた。該コート化微粒子を、アッセイ1で用いたのと同じ範囲の希釈度のHIV1O群陽性ヒト血清と反応させた。ついで該微粒子を洗浄し、ついでビオチン化pGO9CKSと反応させた。さらに洗浄した後、該微粒子を、アルカリホスファターゼと共役したポリクローナル抗ビオチン抗体と反応させた。基質メチルウンベリフェリルホスファートを加えることにより、該アッセイシグナルを現像した。アッセイ3では、精製pGO11CKSを、該抗原構築物を微粒子上にコーティングすることにより、もう1つの商業的に入手可能なアッセイに組み入れた。この場合もまた、該コート化微粒子を、アッセイ1で用いたのと同じ範囲の希釈度のHIV1O群陽性ヒト血清と反応させた。つぎに該微粒子を洗浄し、ついでビオチン化pGO9CKSと反応させた。洗浄後、該微粒子を、シグナル生成化合物としてのアクリジニウムと共役した抗ビオチン抗体と反応させた。アッセイ4では、精製pGO11CKSを、該抗原構築物を磁性微粒子上にコーティングすることにより、展開developmentalアッセイに組み入れた。アッセイ1の場合と同様、該コート化微粒子を、一定範囲の希釈度のHIV1O群陽性ヒト血清と反応させ、洗浄し、ついでアクリジニウムと共役したpGO9CKSと反応させた。B.結果前記試験の結果を以下の表1および2に示す。表中のデータは、シグナルカットオフSCO比として示されている。フォーマット1は、本発明の抗原構築物の不存在下での通常のアッセイを意味し、フォーマット2は、該HIV1O群構築物で補足されたアッセイを意味する。これらのデータから、HIV1O群組換え体の添加は、試験した全希釈度のHIV1O群感染血清に関するアッセイ感度の有意な増強をもたらすことが認められる。例えば、アッセイ1およびサンプル193Haの場合、フォーマット1を用いた場合には110の希釈度において714のSCO比が得られたが、フォーマット2を用いた場合には160倍大きな希釈度11600において同様のSCO722が得られた。この傾向は、試験したアッセイプラットフォームのすべてにわたり維持された。該O群組換え体の有用性は、サンプル2156これは、該O群組換え体の添加前に4つすべてのアッセイにおいて陰性SCO1を示したに関して特に明らかであった。しかしながら、HIV1O群構築物の添加により、このサンプル2156は、1400希釈度における4つすべてのアッセイにおいて陽性を示した。アッセイ1においては、2156は15000の希釈度においても依然として陽性であった。このように、前記の直接フォーマットイムノアッセイを用いた場合、組換え試薬pGO9CKSおよびpGO11CKSの添加は、HIV1O群感染血清に関して、実質的に、より良好な感度を与えることが判明した。