"血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3およびDEN-4の有効量の精製デングウイルスエンベロープEタンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤ならびに有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物であって、Eタンパク質は、各々、そのN末端のアミノ酸残基1から出発して野生型Eの長さの約80を構成し、DEN-4Eタンパク質は二量体であり、ならびに該組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する、前記免疫原性組成物。Eタンパク質が昆虫宿主細胞中で組換え的に産生されかつ発現される請求項1に記載の組成物。Eタンパク質がDrosophilamelanogasterSchneider2S2宿主細胞中で組換え的に産生されかつ発現される請求項1に記載の組成物。アジュバントがアルミニウム塩アジュバントである前記請求項のいずれかに記載の組成物。アジュバントがISCOM型アジュバントである前記請求項のいずれかに記載の組成物。アジュバントがISCOMATRIXである請求項5に記載の組成物。DEN4タンパク質の量がDEN1、DEN2およびDEN3タンパク質の個々の量の約1.5ないし約3倍である請求項5に記載の組成物。DEN4タンパク質の量がDEN1、DEN2およびDEN3タンパク質の個々の量の約2倍である請求項7に記載の組成物。血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3およびDEN-4の有効量の精製デングウイルスエンベロープEタンパク質単量体、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物であって、Eタンパク質は、宿主細胞において組換え的に発現されるとき、前記Eタンパク質が増殖培地中に分泌可能であるように、各々、そのN末端のアミノ酸残基1から出発して野生型Eの長さの約80を構成し、DEN4Eタンパク質の量はDEN1、DEN2およびDEN3Eタンパク質の個々の量の約1.5ないし約3倍であり、ならびに該組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する、前記免疫原性組成物。DEN4Eタンパク質の量がDEN1、DEN2、DEN3Eタンパク質の個々の量の約2倍である請求項9に記載の組成物。DENのEタンパク質の量が:aDEN1-80E約3μg、DEN2-80E約3μg、DEN3-80E約3μgおよびDEN4-80E約6μg;bDEN1-80E約10μg、DEN2-80E約10μg、DEN3-80E約10μgおよびDEN4-80E約20μg;cDEN1-80E約50μg、DEN2-80E約50μg、DEN3-80E約50μgおよびDEN4-80E約100μg;dDEN1-80E約3μg、DEN2-80E約3μg、DEN3-80E約3μgおよびDEN4-80EZip約6μg;eDEN1-80E約10μg、DEN2-80E約10μg、DEN3-80E約10μgおよびDEN4-80EZip約20μg;ならびにfDEN1-80E約50μg、DEN2-80E約50μg、DEN3-80E約50μgおよびDEN4-80EZip約100μg、から成る群から選択される請求項10に記載の組成物。ヒト患者における防御免疫応答を増強するための方法であって、前記請求項のいずれかに記載の治療的有効量の免疫原性組成物を患者に投与することを含む、該方法。請求項1~11のいずれかに記載の有効量の組成物を投与すること、それによってデング熱denguediseaseからの防御を提供することを含むデングウイルス誘発性疾患に対するヒトにおける免疫防御を提供する方法。ヒト患者において防御免疫応答を増強する方法であって、該増強方法は、精製デングウイルスエンベロープEタンパク質および薬学的に許容可能な賦形剤ここでEタンパク質は、そのN末端のアミノ酸残基1から出発して野生型Eの長さの約80を構成する、および有効量のアジュバントを含む治療的有効量の免疫原性組成物を投与することを含み、ワクチンがヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する前記の増強方法。免疫原性組成物が血清型DEN1、DEN2、DEN3およびDEN4のデングウイルスEタンパク質を含み、ここでDEN4タンパク質が二量体である、請求項14に記載の方法。組成物中のDEN4タンパク質の量がDEN1、DEN2およびDEN3タンパク質の個々の量の約2倍である請求項14または請求項15に記載の方法。組成物が筋肉内、皮下または皮内投与経路により投与される請求項13~16のいずれかに記載の方法。血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3およびDEN-4の有効量の精製デングウイルスエンベロープEタンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含み、Eタンパク質は、各々、そのN末端のアミノ酸残基1から出発して野生型Eの長さの約80を構成し、ならびにDEN-4Eタンパク質は二量体である、デング熱denguediseaseの防御または治療用の免疫原性組成物。免疫不全患者に投与することが予定される請求項16に記載の組成物。デング感染またはデング熱denguediseaseの治療または防御用の医薬品製造のための請求項1~11のいずれかに記載の組成物の使用。上記の通り、ヒト用のデングワクチンの開発においていくつかの試みがなされてきたが、しかしこれまでのところこれらの試みは安全性および/または効果に関する課題によって苦しめられてきた。そのために本発明は、ヒト被験者におけるデングウイルス感染、および/またはその臨床症状の防御および/または治療に有用である組成物を提供する。多くの従来の取り組みは、安全性と十分な免疫原性例えば、免疫化された個体群における平衡のとれた4価の応答の誘導可能性の両方を有するヒトデングワクチンの開発に向けられてきた。これらの取り組みにも関わらず、これらの条件を十分に満たす人間用のデングワクチンは、今日まで樹立されなかった。従って本発明によって解決すべき技術的課題は、2の主要な条件;すなわち1ワクチン接種を受けた個体群ヒト被験者において平衡のとれた4価防御免疫応答を誘導するための能力、および2幼児、高齢者および免疫不全状態患者を含むヒト被験者におけるすぐれた安全性プロファイルを維持するための能力、を満たすデングウイルスワクチンを発見することである。これはデングウイルスワクチン開発における重要な難題を示しており、今日までこの技術的課題の全ての態様を適切に処理するワクチン製剤は提示されていない。デングウイルス感染の流行が増加しているため、解決のための高度で、未だ対処されていない増大する要求がある。全てのフラビウイルスのエンベロープタンパク質は著しい相同性を共有する。エンベロープタンパク質の全て3の外部ドメイン内に含まれるエピトープに対して作られた抗体は、ウイルスの中和、すなわちインビトロでの感受性細胞のウイルス感染の阻害をすることができる。ウイルス中和抗体の力価が高いことは、一般にインビボでのフラビウイルス感染に対する防御およびフラビウイルス誘発性疾患の防御と、インビトロで最良の相関関係にあると認められているMarkoff,Vaccine200018:26-32;Ben-Nathanら,J.Inf.Diseases2003188:5-12;Kreilら,J.Virol.198872:3076-3081;Beasleyら,Vaccine200422:3722-26。従って高力価のデングウイルス中和応答を誘導するワクチンは、デングウイルスによって誘発される疾患に対しワクチン接種受容患者を防御するだろう。DHFおよびDSSの二次デング感染との関連頻度の高さは、一次感染の結果生じた交差反応性の非中和性の抗体の存在によるものと仮定され、その抗体はFc受容体介在経路により単球/マクロファージ等のFc受容体保有細胞の感染を促進することによって、二次感染する血清型の複製の発現を増加させるADE;Halstead1988;Halstead1989。あるいは最近の仮説は、抗原原罪の現象によって初期の免疫応答が一次感染の血清型に対して主に向けられ、そのことがより特異的な免疫応答が開始され得る前に、二次感染の血清型が複製し優位性を得ることを可能にする、と考えているMongkolsapayaら,2003。効果的なデングワクチンは、全ての4のデング血清型に対する平衡のとれた特異的中和抗体および特異的記憶細胞を同時に誘導しなければならないので、機構に関わらずこの二次感染増強という現象は、ワクチン開発に対し重要で密接な関係にあるHalsteadおよびDeen,2002。これはデングワクチン開発における主要な課題であることが判明した。この課題がデングワクチン開発においてどのような問題を起こしたかを説明するために、現在まで行われた取り組みを再検討することが有用である。候補の弱毒化生デングワクチン株を開発するために相当量の取り組みが行われたが、しかし試験されたウイルス株の多くは不十分であることが判明し、ならびにウイルスの血清型間の干渉が非常に厳しいことが判明した。典型的に弱毒化したウイルスを使用した2の開発プログラムが第II相臨床試験に進んだが、しかし干渉および/または生産性の課題のために第II相で留まるかまたは停止された。フラビウイルスワクチンを開発するための伝統的な弱毒化生ウイルス法に代えて、組換えキメラ法が利用された。この方法は基剤として周知の弱毒化ウイルス株を利用し、基剤ウイルスの等価の遺伝子の代わりに対象の関連するウイルス由来の適当な遺伝子フラビウイルスに関してはprMおよびEを置換する。WNおよびデングワクチン開発のために使用された一方法は、弱毒化DEN-4株を基剤にした内部型キメラの使用であるBray,M.ら,J.Virol.199670:4162-4166;Chen,W,ら,J.Virol.199569:5186-5190;Bray,M.およびLai,C.-J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA199188:10342-10346;Lai,C.J.ら,Clin.Diagn.Virol.199810:173-179。もう一つの方法は、JEウイルス、DENウイルスおよびWNウイルス用の組換えキメラワクチンを開発するための、基剤としての弱毒化YF17Dウイルス株の使用だった。Guy,B.ら,Vaccine2011,doi:10.1016/j.vaccine.2011.06.094;Lai,C.J.およびMonathT.P.AdvVirusRes200361:469-509;Monathら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2006103:6694。弱毒化生キメラ法の使用は伝統的な弱毒化生ウイルス法よりも有利であるとは言え、キメラ法は適当に弱毒化したウイルス株の開発およびデングウイルスに対する平衡のとれた4価の応答の達成に直面する困難さに未だに苦しまされている。現在、不活化全ウイルス法を使用するJEおよびTBE用に生産された市販のワクチンが入手できる。弱毒化生ウイルス法と同様に、一定のフラビウイルスに対する不活化ウイルス法の使用は、他のフラビウイルスに関する成功を保証しなかった。例えば不活化DENワクチンを開発するための取り組みは、限られた成功しか得られなかった。第一にこれらの方法は、細胞培養系から十分なウイルス収量を得ることができないことによって制限された。C6/36等の昆虫細胞からのウイルス収量は、一般的に104ないし105pfu/mlの範囲であり、費用効果がある不活化ウイルスワクチンを産生するために必要なレベルよりかなり低い。LLC-MK2およびベロ細胞を含む哺乳動物細胞からの収量はかなり高いが、しかしユニークなベロ細胞系からの最高の収量、約106pfu/mlでも本当に費用効果があるワクチン生産を達成するために必要なよりもまだ低い。低収量は、平衡のとれた4価応答を誘導する能力にさらに悪い影響を与え得る。また裸DNA法の使用は、DEN、JE、TBEおよびWN用の非複製型フラビウイルスワクチンを開発するための取り組みにおいても評価されたPorterら,1998;Raviprakashら,2000;Konishiら,1998;Changら,2000;Schmaljohnら,1997;Aberleら,1999;Davisら,2001。DNA法は、インビボでの抗原の発現のため、生産の容易さ、一定の配列の使用、液性免疫および細胞性免疫の両方を誘発する潜在能力において優位性を与える。これらの優位性にも関わらず、一貫した活発な免疫応答を誘導する能力がこの方法にとっての主要な障害であり続けている。動物モデルにおいて適切な防御免疫応答を誘導するいくつかの成功があったとは言えDavisら,2001、ヒトにおけるこれらの応答を誘導する能力は未だ確立されていない。さらにDNAワクチンは、宿主ゲノム中でのプラスミド配列の組込みおよび二重らせんDNAに対する自己抗体を産生する潜在能力に関する懸念のために、追加の法規制の調査に直面している。フラビウイルスワクチン開発のための組換えサブユニットタンパク質の使用は、非複製型ウイルス法のもう一つの例である。この方法は、詳細に明らかにされた産物の生産および特異的な免疫応答を誘導する潜在能力において優位性を与える。適切で活発な免疫応答を引き起こす能力が存在するとは言え、組換えサブユニットの使用に関連する難題がある。これはタンパク質の特性未変性様の構造および所期の免疫応答誘導でのアジュバントの必要性の両方のためである。組換えサブユニットワクチンは、組換えサブユニットB型肝炎ワクチン例えば、RECOMBIVAXHB登録商標MerckSharpDohmeCorp.,WhitehouseStation,NJおよびENGERIXB登録商標GlaxoSmithKlinneBiologicalsSACorp.,Belgiumによって、およびかなり最近ではヒトパピローマウイルスワクチン例えば、GARDASIL登録商標MerckSharpDohmeCorp.およびCERVARIX登録商標GlaxoSmithKlineBiologicalsSACorp.によって最も効果的に例証された、安全性および防御効率に関する長い歴史を有している。生産のどの時点においても複製型ウイルスが存在しないという事実は、予防的な設定での健康なまたは免疫不全状態の個体群へのサブユニットワクチンの投与に関連して、非常に限られたリスクしか存在しないことを保証するのを助長する。さらにB型肝炎ワクチンおよびヒトパピローマウイルスワクチンは、高度に免疫原性であり有効であることが示されてきた。組換えフラビウイルスタンパク質の発現は、構造タンパク質C、prMおよびEならびに非構造タンパク質NSIに重点がおかれてきた。Eタンパク質は、本タンパク質がウイルスの表面に曝され、ウイルスの重要な生物学的側面に関わっており、感染宿主における中和抗体の標的であるために、最も取り組まれてきた実験材料だったChambers,前掲書;Mason,P.W.,J.GenVirol198970:2037-2048。さらに精製フラビウイルスEタンパク質に対して作製されたモノクローナル抗体は、インビトロで中和され、そのいくつかはインビボで受動感染防御を与えることが示されたHenchal,E.A.ら,Am.J.Trop.Med.Hyg.198534:162-169;Heinz,F.X.ら,Virology1983130:485-501;Kimura-Kiroda,J.およびYasui,K.,J.Immunol.1988141:3606-3610;Trirawatanapong,T.ら,Gene1992116:139-150。ワクチンでの使用のための組換えフラビウイルスタンパク質を生産するという目標に向けて、大腸菌、酵母およびバキュロウイルス等の種々の発現系が利用されてきた。これらの試みは、低収量、フラビウイルスタンパク質の不適当なプロセッシングおよび中程度ないし乏しい免疫原性によって苦しまされてきたEckelsおよびPutnak,2003。組換えタンパク質が強力な免疫原として役に立つためには、Eタンパク質の未変性様構造を維持する必要がある。未変性様構造を有する組換えEタンパク質を産生する能力は、利用される発現系に高度に依存する。米国特許第6,165,477号は、酵母細胞におけるDENのEタンパク質サブユニットの発現プロセスを開示する。酵母細胞で発現されたEタンパク質は細菌系より改善された構造を示したが、しかしなおハイパーグリコシル化および収量の課題に直面した。かなり最近の研究において、Eタンパク質の切断型を発現するために安定して形質転換された昆虫細胞の使用が、X線結晶解析法によって決定された通り、未変性様構造を維持する産物をもたらすと確立されたModisら,2003;Modisら,2005;およびZhangら,2004。安定して形質転換された昆虫細胞系の使用が、DENの血清型1-4、JE、TBEおよびWN等の切断型組換えフラビウイルスEタンパク質の発現の成功をもたらした。米国特許第6,136,561号は、安定して形質転換された昆虫細胞系におけるDEN、JE、TBEおよびYFのEサブユニットタンパク質の発現プロセスを開示する。Ivyら米国特許6,432,411号は、ISCOM型構造を有するサポニンと組み合されたとき、安定して形質転換された昆虫細胞において発現されたフラビウイルスEサブユニットタンパク質DEN-2エンベロープポリペプチドのアミノ酸1-395と等価の候補ワクチンとしての有用性を開示する。Ivyらは、DEN1-4の80EおよびISCOMATIRX登録商標アジュバントを含む組成物と同様に、全ての4のDEN型DEN1-4由来の80Eタンパク質を含む4価サブユニットワクチンをさらに報告する。サルにおけるこの4価ワクチンの免疫原性および防御効率を解析する小規模な予備実験が実施されたClementsら,Vaccine28:2705-152010;Collerら,Vaccine29:7267-752011。該ワクチンは、2以上のデング型に対する中和抗体および防御免疫を誘導すると言われた。米国特許第6,749,857号は、本出願に記載のDEN4-80EZip等の切断型デングエンベロープタンパク質の二量体形の発現を開示する。米国特許第6,416,763号は、組換えEに基づくワクチン製剤において安定して形質転換された昆虫細胞系によって産生された非構造タンパク質1NS1を含むことの利益を記載する。これらの特許は、動物モデルにおいてISCOM型構造を含むサポニンと組み合されるとき、安定して形質転換された昆虫細胞から発現されたフラビウイルスサブユニットの有用性を示している。しかしこれらの特許は、ヒト被験者における免疫原性を実証されたアジュバントと製剤化されたEだけを基剤とするワクチン製剤を取り扱わず又は予想しない。多くのワクチン候補は動物モデルにおいて有望な効果が実証されたが、人間の使用への移行に成功せずに終わった。一般的に、不活化ウイルス、組換えサブユニットタンパク質およびDNA等の非複製型ウイルスワクチン法の使用は、弱毒化生ウイルスワクチン法にまさるいくつかの優位性を有する。これらの長所は、生ウイルスが被験者に送達されないので、主として安全性に関連する。他の優位性は、弱毒化生ウイルスと比較して投与計画の時期を早める能力、ならびに投与量およびアジュバント量を調整することによって免疫応答を調節し平衡する能力を含む。ヒト用のフラビウイルスワクチンの開発において、動物モデルにおける前臨床データに基づいてヒト被験者における候補ワクチンの安全性および免疫原性を予想することは困難だった。これは、ヒト臨床治験に進んだ弱毒化生ウイルスワクチン候補の多くにとって難題であることが判明した。最も酷い完全な失敗例は、非ヒト霊長目においては非常に魅力的な安全性プロファイルを示したが、香港のワクチン受容者においてデング熱を誘発した、クローン化デングウイルス3型単離株によって示された安全プロファイルだったSanchezら,FEMSImmunol.Med.Microbiol.200624:4914-26。この困難さは、ワクチン効力を達成するために、複製型ウイルスワクチンと同レベルのウイルス/宿主の相互作用を必要としない、非複製型ウイルスワクチンの使用によって低減されるかもしれない。しかし、前臨床モデルにおいて良好な安全性および防御効率を示しながら、ヒトにおける安全かつ効果的なワクチンとして機能しそこなった、おびただしい数の非複製型ウイルスワクチン候補が存在する例えば、不活化RSVワクチン;Murphyら,J.Clin.Microbiol.198624:197-202。このように、フラビウイルス用の安全かつ効果的なワクチンの開発に関連して複数の難題が存在し得て、開発はしばしば長年にわたる試行錯誤を要求する。さらに動物モデルに基づく前臨床試験は、ヒト被験者におけるワクチンの成績に関し予測的でないかもしれず、従ってヒトでの成績が候補ワクチンの能力の証明において決定的である。おびただしい数の治験のデングウイルスワクチンが前臨床試験および開発の種々のステージにあるとはいえ、たった6のワクチン候補だけがヒト臨床治験に進んだ。臨床試験で試験された6のワクチンは:1弱毒化生デング血清型4キメラ例えば、Durbinら,2006,HumanVaccines2:167;Blaneyら,2005,J.Virol.79:5516;2弱毒化生黄熱‐デングキメラChimerivax;例えば、Morrisonら,2010,J.Inf.Dis.201:370;3ウォーターリード陸軍研究所によって典型的に弱毒化されたウイルスワクチン例えば、Sunら,2009,HumanVaccines5:33;4弱毒化生デング血清型2キメラ例えば、Huangら,2003,J.Virol.77:11436;5prM-E発現性DNAワクチンRaviprakashら,2006,Virology353:166;および6マヒドン大学によって開発された典型的に弱毒化されたウイルスワクチン例えば、Bhamarapravatiら,1987、である。しかし、候補ワクチン各々に関連して固有の難点および潜在的な弱点が存在する。デングに対する弱毒化生ウイルス法に関するさらなる課題は、4価ワクチンにおける4の独立して複製するウイルスの組み合せに関連する難題を含む。干渉に関する課題は、今日まで試験された全ての4価製剤を苦しませ、平衡のとれない4価免疫および長い間隔例えば、0、6、12月での3回投与の必要性をもたらした。これは決して理想的とはいえず、部分的に免疫化されたのちに野生型ウイルスに暴露される個体群、これらの個体群は重度の疾患例えば、デング出血熱の高いリスクにあり得るので、に対する安全性の課題を提示するだろう。臨床治験で試験された最後のデングワクチンはDNAワクチンである。裸DNAワクチンは、現在のところどのような感染症に対しても証明さておらず、長期にわたるDNAに対する自己免疫反応の誘発による潜在的な免疫病理学的な課題は未解決である。潜在的な効力が欠如していることを示唆するが、ウイルス中和抗体は、試験したワクチン製剤によって全くまたは僅かしか誘発されなかった。本明細書に記載の発明の1態様は、組換え発現系を使用して産生および分泌され、次にワクチン製剤例えば、HBV-001D1においてアジュバントと組み合される、サブユニットデングウイルスエンベロープ糖タンパク質例えば、DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80EまたはDEN4-80EZipを提供する。開示されたワクチンは、ヒトボランティにおける相同デングウイルスに対するウイルス中和抗体応答の誘導化に有効であり、かつ健康なおよび危険にあるヒト被験者に対する許容可能な安全プロファイルを有する。目的に向けて、本発明の1態様は、血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3およびDEN-4の有効量の精製デングウイルスエンベロープEタンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物を提供し;ここでEタンパク質は、宿主細胞で組換え的に発現されたときに前記のEタンパク質が増殖培地の中に分泌可能であるように、各々、そのN末端のアミノン酸残基1から出発して野生型Eの長さの約80を構成し;ここでDEN-4Eタンパク質は二量体でありDEN4-80EZip;ならびにこおで組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、上記の組成物中のEタンパク質は、昆虫宿主細胞の中で組換え的に産生され発現される。より好ましい実施態様においてEタンパク質は、下記の通りDrosophilamelanogasterSchneider2S2の宿主細胞で組換え的に産生され発現される。本発明の組換えサブユニットデングウイルスEタンパク質は、DrosophilaSchneider2S2細胞を使用する細胞培養発現系の方法によって産生される。この系は、未変性様構造を維持するデング組換えエンベロープを産生することが証明されているCuzzubboら,Clin.Diagn.Lab.Immunol.20018:1150-55;Modisら,Proc.Natl.Acad.Sci.2003100:6986-91;Modisら,Nature2004427:313-9;Zhangら,Structure2004129:1607-18。この発現系は、また西ナイル、日本脳炎、C型肝炎およびダニ媒介脳炎ウイルス等の他のフラビウイルス由来の他の組換えエンベロープタンパク質を発現することも示された。組換えエンベロープタンパク質は、典型的には未変性エンベロープタンパク質の80を残してC末端で切断される80E。従って80Eは、そのN末端のアミノ酸1から出発して、Eタンパク質の連続したアミノ酸のおよそ最初の80と定義される。本発明で使用される切断型80Eタンパク質の範囲は、タンパク質の膜アンカー部分Eカルボキシ末端のおよそ最後の10を削除しているので、換言すれば、そのN末端のアミノ酸1から出発してEの連続するアミノ酸の最初の90までであるので、それを細胞外の培地に分泌することを可能とし、回収を容易にする。切断は、Eタンパク質の80Eタンパク質部分を膜アンカー部分と連結する基部部分をも削除している;基部部分は、注目すべき抗原エピトープを含まず、従って好ましい抗原であるDEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80EまたはDEN4-80EZip中には含まれない。Eタンパク質の少なくとも90から100未満は、クローン化し分泌することが可能であり、すなわちタンパク質は90の長さでカルボキシ末端を切断されることが可能であり、切断型Eタンパク質が分泌可能である限り膜貫通ドメインの部分を含むことが可能である。分泌可能Secretableとは分泌され得ることを意味し、典型的には発現系における形質転換細胞から分泌される。従って当業者であれば、タンパク質が分泌可能であるかぎり、本発明の組成物および方法に有用であるデングEタンパク質が、明細書で例示した80から変動し得ることを理解するだろう。本発明の各々の態様の好ましい実施態様において、DENのEタンパク質は、N末端アミノ酸から出発してエンベロープタンパク質の長さの約80であり、かつアミノ酸残基番号395ないし401の範囲のアミノ酸、例えばデングウイルス2型のアミン酸1ないしアミノ酸395で終わる。本発明の各々の態様の他の実施態様において、デングEタンパク質は、そのN末端のアミノ酸1で出発してEの連続するアミノ酸の約75、約85、約90、約95または約98であり得る。本明細書の本発明の態様の代表的な実施態様において、DENのEタンパク質は、配列番号6に示さるDEN1-80E、配列番号7に示されるDEN2-80E、配列番号8に示されるDEN3-80E、配列番号8に示されるDEN-80Eおよび配列番号9に示されるDEN4-80E等の様に、そのN末端のアミノン酸1で出発してEタンパク質の連続するアミノ酸の約80である。分泌されるEタンパク質は、組換えタンパク質の免疫原性がより増強されるように、例えばDEN4-80EZipタンパク質中のように二量体化を促進するドメインをさらに含んでもよい。代表的なDEN4-80EZipタンパク質は、配列番号10に示されるようなアミノ酸配列を含む。4のデングウイルス由来の組換えEタンパク質の二量体と単量体形を組み合わせることによって、免疫応答は平衡のとれた4価の応答が誘導されるように調節し得る。組換えデングウイルス80Eサブユニットタンパク質がヒト使用のために適切に調剤されると、それらはヒト被験者における強力なウイルス中和抗体を誘導し得る。従って、本発明は、重要な技術的課題に対する新規な解答、つまりヒト被験者における高レベルの安全性および平衡のとれた4価の免疫原性の両方を示すデングウイルスワクチンの産生を提供する。アジュバント本発明のワクチン製剤/免疫原性組成物は、ヒトの使用に適した少なくとも1のアジュバントを含む。好ましい実施態様において、デング80E組換えサブユニットタンパク質は、サポニンに基づくISCOM型アジュバント例えば、ISCOMATRIX登録商標アジュバントおよび/またはアルミニウムに基づくアジュバント一括してアラムまたはアラムに基づくアジュバントと製剤化される。アルミニウムは、主としてTH2応答を刺激することによって、同時投与された抗原に対する免疫応答を刺激することが長く示されてきており、アルミニウムに基づくアジュバントは米国において人間の使用のために登録された最初のアジュバントである。本明細書に記載のデング80E抗原に加えて、本発明のこの態様の組成物は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはその混合物等のアルミニウムアジュバントに吸着される。本明細者で提供される組成物のアルミニウムアジュバントは、アルミニウムの沈降物形態でないことが好ましい。アルミニウム沈降ワクチンは標的抗原に対する応答を増加させるかもしれないが、しかし高度に不均一な製剤であることが示され、不整合な結果が得られたLindbladE.B.ImmunologyandCellBiology82:497-5052004を参照されたい。対照的にアルミニウム吸着形態ワクチンは、それはヒトへの投与用のワクチン製剤の本質的特質であるが、標準法で実施し得る。さらに、おそらく一部は注射部位からの緩徐な排除を可能とすることによって、または抗原提示細胞による抗原のより効率的な取り込を可能とすることによって、所期の抗原のアルミニウムアジュバント上への物理吸着がアジュバント機能において重要な役割を担っていると考えられている。アラムに基づくアジュバントは、少なくとも一部はデポメカニズム抗原を保持する機構および未変性様構造を有する組換えデング80E抗原との組合せにより機能すると信じられており、アラムのアジュバント機能は、免疫不全個体群の患者を含むワクチン接種を受けた個体群において、強力な免疫応答を誘導するために十分である。本発明のアルミニウムアジュバントは、水酸化アルミニウムAlOH3、リン酸アルミニウムAlPO4、アルミニウムヒドロキシホスファート、アモルファスアルミニウムヒドロキシホスファートスルファートAAHSまたはいわゆるアラムKAlSO412H2Oの形態であってよいKleinら,Analysisofaluminumhydroxyphosphatevaccineadjuvantsby27AlMASNMR.,J.Pharm.Sci.893:311-212000を参照されたい。本明細書で提供する本発明の代表的な実施態様において、アルミニウムアジュバントは水酸化アルミニウムである。本発明のいくつかの実施態様において、アルミニウムアジュバントはAAHSの形態である本明細書において互換的にMerckアルミニウムアジュバントMAAと称する。MAAは中性pHで電荷を保有せず、一方AlOHは正の実効電荷を保有し、ALPO4は典型的には中性pHで負の実効電荷を保有する。潜在的に抗原結合能に影響するアルミニウムアジュバントの実効電荷のために、MAAはAlOHよりもいくつかの抗原に対する高い結合能を有する。本明細書に記載の本発明のさらに他の代表的な実施態様において、アルミニウムアジュバントはアルハイドロゲルである。当業者であれば、安全でかつワクチン組成物の標的デング80E抗原に対する免疫応答を増強するうえで有効であるアルミニウムアジュバントの最適用量を決定し得るだろう。FDA認可ワクチンに含まれるアルミニウム含量と同様に、アルミニウムの安全性プロファイルに関する議論に関してはBaylorら,Vaccine20:S18-S23200を参照されたい。一般的にアルミニウムアジュバントの有効かつ安全な用量は、200ないし1200μg/mLの濃度で変動する。本発明の特定の実施態様においてワクチンは、1.0と3.5mg/mLの間のアルミニウムアジュバントを含むアルミニウム元素として1.25mgまで。本発明の製剤および組成物の他の実施態様において、ワクチンの1用量当たり約100、150、200、250、300、350、400、450または500μgのアルミニウムアジュバントが存在する。アルミニウムに基づくアジュバントを有する製剤は、それによってデング80E抗原がアルミニウムアジュバントに結合することを可能とする混合剤を含み、例えばアルハイドロゲルは、その結果、抗原の≧75が水酸化アルミニウムに結合する。臨床開発を支援するためのcGMP下でのDEN1-80EアルハイドロゲルワクチンHBV-001D1の製剤化および充填は、実施例3に記載する。上記の通り、本発明の1態様は、アジュバントと組み合わせたデング80E抗原を含むワクチンおよび組成物を提供する。好ましいアジュバントはISCOMアジュバントである。本明細書で提供される製剤および方法において、ISCOMアジュバントは、サポニン、コレステロールおよびリン脂質を含み、免疫刺激複合体すなわちISCOMを形成する。一般的にはキラヤサポナリア樹木の樹皮から単離されるサポニンの強力な活性は、80年以上前に初めて実証された。総説としては、BarrおよびMitchell,ImmunologyandCellBiology74:8-251996;ならびにSkeneおよびSutton,Methods40:53-592006を参照されたい。アルミニウムアジュバントと比較してISCOM型アジュバントまたはISCOMは、T細胞および抗体応答の両方を含む同時投与された抗原に対するより広範な免疫応答を誘発しうる。しかし毒性および溶血活性に関する潜在能力が見出され、当時のヒトまたは動物への使用に対するサポニンの将来性を制限した。その後、サポニンは、コレステロールおよびリン脂質と組み合わせると、20以上のサブユニットから構成されるケージ型構造を有する特徴的な粒子を形成することが発見された。このユニークな構造は、ISCOMのアジュバント活性に寄与する。加えて、サポニンをコレステロールおよびリン脂質と共にISCOM内へ取り込むと、サポニンの溶血活性が排除されることが示された。また、ISCOMがアジュバントとして使用されるとき、免疫応答を誘導するために遊離サポニンと比較して、より少量のアジュバントしか必要としないことも示されたSkeneおよびSutton,前掲書を参照されたい。これらの理由により、ISCOMは可能性のあるワクチンアジュバントとして精力的に研究されてきた。上記の目的を達成するために、本発明は、デング80E抗原、ISCOMアジュバントおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関し、ここで前記ISCOMアジュバントはサポニン、コレステロールおよびリン脂質を含み、ここで前記デング80E抗原は、前記Eタンパク質が宿主細胞中で組換え的に発現されたときに増殖培地の中へ分泌され得るように、そのN末端のアミノ酸残基1から出発して野生型Eの長さの約80を構成する。上記の組成物はアルミニウム塩のアジュバントをさらに含んでもよい。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、組成物に含まれるDEN1、DEN2およびDEN3の80E抗原は単量体であり、かつDEN4の80E抗原は二量体である。単量体形のDEN1、DEN2およびDEN3の80Eタンパク質サブユニットおよび二量体形のDEN4DEN4-80EZipを含む4価組成物は、アカゲザルにおいて平衡のとれた4価の免疫応答を誘導し得ること、ならびにウイルス攻撃に対する防御を提供し得ることが本明細書で示された実施例6を参照されたい。上記の組成物はアルミニウム塩アジュバントをさらに含んでもよい。本発明のこの態様の他の実施態様において、組成物中のDEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-EおよびDEN4-80Eタンパク質は単量体である。このような実施態様において、DEN4成分は、DEN1、DEN2およびDEN3タンパク質の個々の量の約1.5ないし約3倍の量で、好ましくはDEN1、DEN2およびDEN3成分タンパク質の量の約2倍で存在する。本発明のこの態様の代表的な実施態様において、ISCOMアジュバントは、サポニンに基づくアジュバント、ISCOMATRIX登録商標アジュバントである。ISCOMATRIX登録商標アジュバントを有する製剤は、80E抗原がアジュバントと共に送達される混合剤を含む。本発明の他の実施態様においてワクチン成分は、アルミニウムに基づくアジュバントおよびISCOMまたはサポニンに基づくアジュバントの両方と共に製剤化される。デングウイルスエンベロープンパク質サブユニット単量体形のDEN1-80E、DEN2-80EおよびDEN3-80Eタンパク質サブユニットおよび二量体形のDEN4DEN4-80EZipを含む4価組成物は、アカゲザルにおいて平衡のとれた4価の免疫応答を誘導し得ること、およびウイルス攻撃感染に対する防御を提供し得ることが本明細書で示された実施例6を参照されたい。従って本発明のこの態様のいくつかの好ましい実施態様において、組成物に含まれるDEN1、DEN2およびDEN3の80E抗原は単量体であり、かつDEN4の80E抗原は二量体である。デング80Eタンパク質の二量体の形成は以下に記載する。また全ての4のデング型に対する高度に平衡のとれた免疫応答は、組成物中に存在するDEN4抗原成分DEN4-80EかまたはDEN4-80EZipの量がDEN1-80E、DEN2-80EまたはDEN3-80E抗原の量の約2倍であるように、DEN4-80E成分の抗原含量を調節することによって達成し得ることも本明細書で示された実施例7を参照されたい。従って本発明は、血清型DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80EおよびDEN4-80Eの有効量の精製デングウイルスエンベロープEタンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物を提供し;ここでEタンパク質は、前記のEタンパク質が宿主細胞で組換え的に発現されたときに増殖培地の中に分泌可能であるように、各々、そのN末端のアミノン酸残基1から出発して野生型Eの長さの約80を構成し;およびここで組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導し;ここでDEN4成分の抗原含量はDEN1、DEN2またはDEN3成分の個々の抗原含量の約1.5ないし約3倍である。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、組成物中のDEN1:DEN2:DEN3:DEN4抗原の比率は約1:1:1:2である。本発明のこの態様のいくつかの実施態様において、DEN4成分はDEN4-80Eである。従って組成物は、DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80EおよびDEN4-80Eの単量体を含む。本発明のこの態様の他の実施態様において、DEN4成分はDEN4-80EZipである。このような他の実施態様において、組成物は、DEN1-80E、DEN2-80EおよびDEN3-80Eおよび二量体のDEN4-80EZipを含む。本発明の好ましい実施態様において、本明細書に記載のデングウイルスワクチン製剤DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80および/またはDEN4-80EZipの組換えタンパク質成分は、真核細胞の細胞培養発現系、特にDrosophilamelanogasterS2細胞系によって産生されるJohansen.H.ら,GenesDev.19893:882-889;Ivey-Hoyle,M.,Curr.Opin.Biotechnol.19912:704-707;Culp,J.S.ら,BiotechnologyNY19919:173-177。この発現法は、デング血清型1-4、JE、TBEおよびWN等のフラビウイルス由来の切断型組換えエンベロープタンパク質を成功裡に産生する。これらのタンパク質は、未変性エンベロープタンパク質の約80を残してC末端で切断される80E。切断はタンパク質の膜アンカーを削除し、従ってタンパク質が細胞外の培地中に分泌されることを可能とし、回収を容易にし;また切断は、免疫原性の効果をほとんど有さない基部部分も削除する。さらに発現したタンパク質は、適切にグリコシル化され、ならびに立体構造的に感受性のモノクローナル抗体4G2との反応性によって決定された通り、未変性の立体構造を維持することが示された。既述の通りIvyら,米国特許第6,136,561号;Ivyら,米国特許第6,165,477号;McDonellら,米国特許第6,416,763号;Ivyら,米国特許第6,432,411号;およびPetersら,米国特許第6,749,857号および本明細書で用いられる通り、DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80EおよびDEN4-80EZipは、デングエンベロープタンパク質にまたがるタンパク質、好ましくは、エンベロープタンパク質のN末端アミノン酸から出発してかつアミノ酸残基番号395ないし401の範囲のアミノ酸で終わる、例えば80Eがデングウイルス2型のアミノ酸1ないし395を含むタンパク質であり得るようなタンパク質、を称する。Petersら,米国特許第6,749,857に記載の通り、組換え80Eタンパク質は、フロッピーリンカーによって80Eタンパク質に結合された二量体化ドメインを含んでもよい例、DEN4-80EZip。二量体形のタンパク質の包含は、選択された成分に対する免疫応答を調節するために使用され、平衡のとれた4価応答の誘導をもたらす。DEN-80Eタンパク質の発現は実施例1に記載する。本発明の好ましい実施態様において、DEN4タンパク質成分が二量体である4価の成分が提供される例、DEN4-80EZip。二量体の80Eタンパク質サブユニット、例えばDEN4の80E二量体は当該技術分野で周知の方法によって産生し得る例えば、Petersら,米国特許第6,749,857B1を参照されたい。簡潔に説明すると、基本的な3方法が、二量体の80E分子を構築するためにPetersらによって前掲書に記載されている。第一の方法は、可動性リンカーによって共有結合的に相互に付着した80Eのタンデムコピーを使用することを含む。DEN2の80Eの2のコピーを共有結合的に連結するアミノ酸のストレッチは、2の80E分子が未変性のヘッドトゥテールの二量体の配向で関連することを可能とし、一方では相互の共有結合を維持する、可動性テザーとして役立つように設計されている。当業者にとって、同様に他のリンカー配列を選択することは容易に明らかである。本発明は、開示された特定のリンカーに限定されるものではないが、しかし2の80E分子が未変性のヘッドトゥテールの二量体の配向で関連することを可能とし、一方では相互の共有結合を維持する任意のアミノ酸配列に限定される。第二の方法は、2の80E-ロイシンジッパー分子間の二量体化を増強するための、単量体80E分子へのカルボキシ末端ロイシンジッパードメインの付加を含む。この方法の2のバージョンを採用し得る。一方のバージョンは、ロイシンジッパードメインを連結して結果として共有結合した二量体産物を生じるジスルフィド結合を含み、一方、他方はロイシンジッパードメインの非共有結合的会合に基づいている。ロイシンジッパードメインは、もう一つの80Eのジッパー分子由来の同一の配列と二量体化するように設計されている。非共有結合的に連結したロイシンジッパーの形成は、80E分子の二量体化を増強し得るし、それは80E分子をロイシンジッパードメインに結合する可動性リンカーにより未変性のヘッドトゥーテールの立体構造に関連し得る。ロイシンジッパードメインは、もう一つの80Eのジッパー分子由来の同一の配列と二量体化するように設計されている。いったんロイシンジッパーが二量体化すると、両者の末端間でジスルフィド結合が形成され結果として共有結合した二量体産物が生じる。共有結合的に連結したロイシンジッパーの形成は、80E分子の二量体化を増強し得るし、それは80E分子をロイシンジッパードメインに結合する可動性リンカーにより未変性のヘッドトゥーテールの立体構造に関連し得る。80Eの二量体化を増強するために使用される最後の方法は、80Eのカルボキシ末端へのへリックスターンへリックスドメインの付加である。一方の修飾された80E分子由来のへリックスターンへリックスドメインは、二量体の4へリックスバンドルドメインを形成するために、他方の当該物と会合するであろう。非共有結合的に会合した4へリックスバンドルドメインの形成は、80E分子の二量体化を増強するであろうし、80Eをヘリックスバンドルに結合する可動性リンカーにより未変性のヘッドトゥーテールの立体構造に関連し得る。本発明の他の実施態様において、DEN-80Eは、Cys1-Cys2、Cys3-Cys8、Cys4-Cys6、Cys5-Cys7、Cys9-Cys10およびCys11-Cys12の6のジスルフィド架橋を含むデングウイルスエンベロープタンパク質サブユニットとしてより広く定義され;ここで該タンパク質は、Drosohila細胞から組換えタンパク質として分泌され;ならびにここで該タンパク質は、ヒト被験者に投与されたときに相同性のフラビウイルスに対する中和抗体応答を発生させる。より好ましい実施態様において、組換えデングウイルスエンベロープタンパク質サブユニットは、既述のジスルフィド型、および未変性のデングウイルスエンベロープタンパク質のN末端の最初のアミノ酸から出発してエンベロープタンパク質の相同な80の部分80Eの親水性プロファイル特性をさらに含む。換言すればアミノン酸は、組換えサブユニットタンパク質が未変性様構造および適当な免疫原性ウイルス中和抗体誘発能を保持するのを保証するためにジスルフィドおよび親水性プロファイルが維持される限り、デングウイルス80Eを含む配列の中で置換され得る。好ましくは、デングウイルス80Eサブユニットは、マスターセルバンクを使用して無血清培地中で発現され、既述の通りクロマトグラフィーによって精製されるIvyら,米国特許第6,432,411号。臨床試験を支援するためのcGMP下でのDEN1-80Eのバッチ製造は、実施例2に記載する。動物で試験したデングウイルス製剤中の非構造タンパク質1NS1等の非構造タンパク質の包含に関し記載された追加された利点McDonellら,米国特許6,416,763号と対照的に、本発明のDEN-80Eタンパク質は、NS1を包含しなくてもヒト被験者における強力で、免疫原性のワクチンとして役に立つ。投与および使用本発明は、デングウイルス感染が誘発する疾患を防御または軽減するための方法を提供する。本明細書で使用するときワクチンとは、仮に個体へのワクチンの投与が、疾患に対する完全もしくは部分的な個体の免疫かまたは疾患に関連する兆候もしくは症状の完全もしくは部分的な軽減例、抑制かを結果として生じるならば、疾患を防御または軽減することを言う。従って本発明は、ヒト患者における防御免疫応答を増強するための方法であって、本明細書のいずれかに記載の治療的有効量の免疫原性組成物を患者に投与することを含む方法に関する。本発明の治療用組成物は、非経口的に皮下、筋肉内または皮内注射によって投与され得るが、しかし他の全身モードの投与が採用されてもよい。本発明の好ましい投与法は、筋肉内経路である。従って、本発明の方法のいくつかの実施態様において組成物は、筋肉内経路で患者に投与される。他の実施態様において、皮内または皮下送達が考慮される。また本明細書では、本発明の有効量の組成物を患者に投与することを含む、デングウイルス誘発性疾患に対するヒトにおける免疫防御を供給する方法も提供し、それによってデング疾患からの防御を提供する。本発明のこの態様において、好ましい投与経路は、筋肉内、皮下および皮内から成る群から選択される。また本発明は、ヒト患者における防御免疫応答を増強するための方法にも関連し、該方法は、精製デングウイルスエンベロープEタンパク質および薬学的に許容可能な賦形剤、ここでEタンパク質は、前記のEタンパク質が宿主細胞で組換え的に発現されたときに増殖培地の中に分泌可能であるように、そのN末端のアミノン酸残基1から出発して野生型Eの長さの約80を構成し;および有効量のアジュバントを含む治療的有効量の免疫原性組成物を投与することを含み、ここでワクチンはヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する。本発明の他の態様は、血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3およびDEN-4の有効量の精製デングウイルスエンベロープEタンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含む、デング熱および/またはデング感染の防御または治療用の免疫原性組成物を提供し;ここでEタンパク質は、前記のEタンパク質が宿主細胞で組換え的に発現されたときに増殖培地の中に分泌可能であるように、各々、そのN末端のアミノン酸残基1から出発して野生型Eの長さの約80を構成し;ならびにここでDEN-4Eタンパク質は二量体であってもよい。本発明のいくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、免疫不全個体群に投与されることが予定される。さらなる態様において、該組成物は小児科の個体群に投与されることが予定される。本発明のこの態様のいくつかの実施態様において、組成物のDEN4成分はDEN4-80EZipである。他の実施態様において、DEN4成分は、DEN4-80EまたはDEN4-80EZipであり、ならびにDEN4タンパク質の量は、DEN1-80E、DEN2-80EまたはDEN3-80E成分の量の約1.5ないし3倍である。また本発明の他の態様は、デング感染またはそれが誘発する疾患の治療または防御用薬品の製造のための、上記または明細書に記載の組成物の使用をも記載する。本明細書に記載の組成物の活性医療成分デング80Eおよび/または80Ezipは、治療的有効量で、換言すれば発明の概要に記載の通り生理的に意味のある量で、患者に送達される。仮に患者への組成物の投与が受容者である患者の生理機能において検出可能な変化を生じるならば、本発明の組成物の活性成分は生理学的に意味ある量で存在する。本発明において、受容者である患者における検出可能な変化は、相同性のデングウイルスに対する中和抗体の誘導である。本発明の活性なワクチンは、単独でまたは利用可能な範囲において他の活性なサブユニットを含むような他の活性なワクチンと併用して使用し得る。1種または数種のウイルスまたは血清型由来の一致するまたは異なるサブユニットが特定の製剤に含まれてよい。本発明の活性なワクチンは、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよい。複数回投与計画が利用されるきは、ワクチン接種の時機に関して多くの異なる技術が存在する。免疫化された被験者によって発現される免疫グロブリンのレパートリーの発現のレベルおよび多様性を増強するためには、本発明の組成物を複数回使用することが好ましい。仮に複数回の接種がされるのであれば、典型的には1ないし2月の間隔で接種し得る。本発明の好ましい接種計画は、被験者を0、1および2月で接種することである。また他の接種計画も利用し得る。例えば、0、1および3月、または0、1および6月等の他の接種計画が利用し得るであろう。デングウイルス誘発疾患に対し被験者を免疫化するために、例えば、サブユニットを含むワクチンは、ワクチンの複数回投与を通常含む伝統的なワクチン接種プロトコルで被験者に投与される。投与は典型的には注射、典型的には筋肉内注射または皮下注射によるが、しかしまた他の全身モードの投与法が採用されてもよい。免疫原性組成物上記の通り本発明の1態様は、血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3およびDEN-4の有効量の精製デングウイルスエンベロープEタンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤および有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物であり;ここでEタンパク質は、各々、そのN末端のアミノン酸残基1から出発して野生型Eの長さの約80を構成し;ここでDEN4-Eタンパク質は二量体であり;ならびにここで組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する。本発明のこの態様の実施態様において、各々の血清型に対するデングEタンパク質の量は、約1μgないし約150μg、約1μgないし約10μg、約1μgないし約5μg、約2μgないし約4μg、約3μgないし約6μg、約5μgないし約25μg、約10μgないし約20μg、約5μgないし約10μg、約20μgないし約25μg、約40μgないし約60μg、約75μgないし約125μg、または約90μgないし約110μgである。他の実施態様において、各々のデングタンパク質量は、約1μg、約2μg、約3μg、約4μg、約5μg、約6μg、約7μg、約8μg、約9μg、約10μg、約15μg、約20μg、約25μg、約30μg、約35μg、約40μg、約45μg、約50μg、約55μg、約60μg、約65μg、約70μg、約75μg、約80μg約85μg、約90μg、約95μg、約100μg、約110μg、約120μg、約130μg、約140μgまたは約150μgである。本発明の好ましい実施態様において、各々のデングEタンパク質の量は、約3μg、約6μg、約10μg、約20μg、約50μg、約100μg、3μg、6μg、10μg、20g、50μgまたは100μgである。また血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3およびDEN-4の有効量の精製デングウイルスエンベロープEタンパク質、薬学的に許容可能な賦形剤、および有効量のアジュバントを含む免疫原性組成物も提供され;ここでEタンパク質は、各々、そのN末端のアミノン酸残基1から出発して野生型Eの長さの約80を構成し;ここでDEN4のタンパク質の量はDEN1、DEN2およびDEN3のタンパク質の個々の量の約1.5ないし約3倍であり、ならびにここで該組成物はヒト被験者における中和抗体の産生を誘導する。本発明のこの態様において、DEN1、DEN2、DEN3およびDEN4Eタンパク質は単量体例、DEN-80Eであるか、またはDEN1、DEN2およびDEN3Eタンパク質は単量体でありかつDEN4タンパク質は二量体である。本発明のこの態様において、DEN4Eタンパク質が単量体か二量体かに関わらず、DEN1、DEN2およびDEN3Eタンパク質の個々の量の約1.5ないし3倍の量で存在するという条件付きで、組成物中のデングEタンパク質は上記の量で存在する。従って、単なる例であるが、仮にDEN1、DEN2およびDEN3Eタンパク質が組成物中に約3μgの量で存在するとすれば、DEN4Eタンパク質は組成物中に約4.5μgないし約9μg、好ましくは約6μg存在する。さらなる例として、仮にDEN1、DEN2およびDEN3Eタンパク質が組成物中に約10μgの量で存在するとすれば、DEN4Eタンパク質は組成物中に約15μgないし約30μg、好ましくは約20μg存在する。さらに他の例において、仮にDEN1、DEN2およびDEN3Eタンパク質が組成物中に約50μgの量で存在するとすれば、DEN4Eタンパク質は組成物中に約75μgないし約150μg、好ましくは約100μg存在する。当業者であれば、DEN1、DEN2およびDEN3Eタンパク質の量がほぼ等しいとしても、量は変動し得て正確に1:1:1の比率で存在しなければならないのではないことを理解するであろう。当業者であれば、安全でかつDEN1、DEN2、DEN3およびDEN4に対する平衡のとれた4価の免疫応答を誘導する各々のDENのEタンパク質の最適用量を決めることができるであろう。本発明の好ましい実施態様において、免疫原性組成物は、約3μgのDEN1、DEN2およびDEN3Eタンパク質および約6μgのDEN4Eタンパク質DEN4-80EまたはDEN4-80EZipを含む。より好ましい実施態様において、免疫原性組成物は、約10μgのDEN1、DEN2およびDEN3Eタンパク質および約20μgのDEN4Eタンパク質DEN4-80EまたはDEN4-80EZipを含む。より好ましい実施態様において、免疫原性組成物は、約50μgのDEN1、DEN2およびDEN3Eタンパク質および約100μgのDEN4Eタンパク質DEN4-80EまたはDEN4-80EZipを含む。本発明の組成物において有用な薬学的に許容可能な担体は、採用される投与量および濃度で患者に対し無毒性である任意の共存性の試剤、例えば水、生理的食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノール、緩衝剤およびそれに類するもの、およびその組み合せを含む。また担体は、安定剤、可溶化剤、NaCl、MgCl2またはCaCl2等の浸透圧調節剤、界面活性剤およびその混合物、等の追加の成分をさらに含んでもよい。本記載の発明によれば、治療組成物の有効量とは、所期の生物学的効果を達成するために十分な量である。一般的に、有効量の組成物を提供するために必要とされる投与量は、被験者の年齢、容態、性別、病気の程度等の要因、もしあれば、および他の可変要素、それは当業者によって調節され得るが、に依存して変動し得る。本発明の抗原調製剤は、有効量の単回投与かまたは複数回投与かによって投与され得る。本発明の組成物の有効量は、製品の1用量当たり0.01ないし500μg、より好ましくは製品の1用量当たり1ないし100μg、最も好ましくは製品の1用量当たり5ないし50μgで変動し得る。本発明の組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよい。本発明に従って、ヒト被験者への投与を支援するための、DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80EおよびDEN4-80EZip活性成分およびHBV-001D1および4価デングワクチンの、cGMP下の大規模での生産を示す実施例1ないし4。非ヒト霊長目および健康な成人ボランティアにおける、本発明のワクチンの安全性および免疫原性効力の定量について記載する実施例5ないし8。本発明のデングワクチンの実施態様は二つの重要な態様を組み合わせる。第一の態様において、アジュバントと組み合された組換えサブユニットタンパク質の固有安全性は、健康な個体群および易感染性の個体群におる疾患の防御に対する最適の方法を提供する。第二の態様において、立体構造的に適切な組換えDEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80EおよびDEN4-80EXip抗原の、実際の使用に十分な量の現行の適正製造基準cGMP下での生産は、非ヒト霊長目およびヒト被験者における平衡のとれた4価ウイルス中和抗体を誘導し、疾患に対する防御機構を提供する、ワクチンを結果としてもたらす。単量体および二量体80Eタンパク質および種々の比率のユニークな組み合せが、DHF等の重症疾患のリスクを最小化するために重要である4価の平衡を保証するために利用される。これらの新規な態様の組み合せが、ヒト被験者における安全でかつ効果的なデングウイルスワクチンの新規発明をもたらす。これらのワクチン製剤は、非構造タンパク質NS1の包含は、効果的な免疫原性および防御にとって要求されないという予期しない発見によってさらに特徴づけられる。さらに、開示されたデングワクチンは、幼児、高齢者および易感染性の個体群を含む特に重篤な疾患の高度のリスクにある個体群に対する許容可能な安全性プロファイルを維持する一方で、ワクチン接種された個体群における適切な防御免疫応答を誘導するという技術課題に取り組む。本明細書に記載の全ての刊行物は、本発明と関連して使用し得る方法論および材料を記載しおよび開示する目的で参照により援用される。明細書のいかなるものも、本発明が先行発明の当該開示より前である権利を有さないと認めるものと解釈されるものではない。添付図面を参照して本発明の好ましい実施態様を記載するが、本発明は当該実施態様そのものに限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲において定められる本発明の範囲または精神から逸脱することなく、当業者によって種々の変更および修飾が本発明にもたらされ得ると理解されるべきである。以下の実施例は本発明を例示するものであり限定するものではない。DrosophilaS2系におけるデング80Eタンパク質の発現および精製発現プラスミドpMttbnspMttPA由来は、以下のエレメント:Drosophilamelanogasterメタロチオネインプロモーター、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子分泌リーダーtPALおよびSV40初期ポリアデニル化信号、を含む。14塩基対のBamHIBacillusamyloliqufacience由来の制限酵素断片が、現存するBglIIBacillusglobigii由来の制限酵素のユニークサイトに加えてXhoIXanthomonasholicicola由来の制限酵素のユニークサイトを含むpMttΔXhoを産生するためにpMttbnsベクターから切除された。この発現ベクターは、発現タンパク質の細胞培養液への分泌を促進する。デング配列は、これらのBglIIおよびXhoIのユニークサイトを使用してpMttΔXhoベクターに導入された。本明細書に記載の研究に使用されたデング配列は、以下の配列番号1ないし5:1配列番号1;DEN1prM-80E;2配列番号2;DEN2prM-80E;3配列番号3;DEN3prM-80E;4配列番号4;DEN4prM-80E;および5配列番号5;DEN4prM-80EZp、によって表される。カルボキシ切断デングエンベロープタンパク質の発現のために、適切な遺伝子断片がウイルスのRNAまたはcDNAクローンから増幅された。合成prM80Eプレ膜タンパク質‐80糖タンパク質E遺伝子断片は、デングコドンの直後に2の停止コドンを含んでいた。S2細胞は、発現プラスミドおよびiリン酸カルシウム共沈法またはii生産者の推奨に従ってCellfectinInvitrogenKits,Carlsbad,CAを使用してハイグロマイシン耐性をコードするpCoHygro選択プラスミドの両者により同時形質転換した。細胞は、発現プラスミド対選択プラスミドの比率が20:1の全DNA20μgにより同時形質転換した。形質転換体は、300μgmlのハイグロマイシンBRocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,INにより選択した。選択後、細胞は無血清培地Excel420JRH,Lenexa,KSでの増殖に順応させた。発現研究のために細胞は、ハイグロマイシン300μg/mlを含むExcel420で増殖し、200μMのCuSO4で誘導した。細胞は2X106細胞数/mlの密度で播種し、6ないし7日間増殖させた。最適条件下で、6ないし7日間の増殖後に1.5ないし2X107細胞数/mlの細胞密度が達成された。培養上清は、発現されたタンパク質に関しSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって調べた。ウェスタンブロット上でのDEN-80Eの検出のために、抗ウサギIgGアルカリホスファターゼ二次抗体複合体を伴う、精製不活化デングウイルスに対し開発したウサギポリクローナル抗デングウイルス抗体を使用した。ブロットは、NBT/BCIPSigmaChem.Co.,St.Louis,MO固相アルカリ性ホスファターゼ基質により発色させた。DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80EまたはDEN4-80EZipタンパク質の精製は、モノクローナル抗体MAb4G2を使用する免疫アフィニティークロマトグラフィーIACによって行った。簡潔に説明すると、手順は発現後培養液の清澄化を含む。次に未精製の物質は、N-ヒドロキシスクシンイミド反応により共有結合した固定化MAbを含むIACカラムに負荷する。試料を負荷した後にマトリクスは、Tween-20を0.05v/v含むpH7.2の10mMリン酸緩衝食塩水PBSPBST、140mMのNaClで洗浄する。結合したタンパク質は、pH2.5の20mMグリシン緩衝液によりIACカラムから溶出する。溶出液は中和し、次に緩衝液をPBSに交換する。精製産物は、それぞれ純度、同一性、含量および生物活性を検討するために、常法通りクーマシーまたは銀染色を伴うSDS-PAGE、ウェスタンブロット、紫外線吸収、および酵素結合免疫吸着測定法ELSAにより分析する。さらに試料は、N末端アミノン酸配列分析およびアミノン酸分析によって分析した。これらの分析は、精製産物の同一性および含量に関する確証を提供した。図1は精製DEN-80Eタンパク質の代表的なSDS-PAGEパネルAおよびウェスタンブロットパネルBのプロファイルを提供する。分析の間、試料は非還元条件下で泳動した。DEN1-80E、DEN2-80EおよびDEN3-80E分子は、アミノ酸組成から決定された分子量と一致する相対分子量すなわち45kDを有する単一バンドとして泳動する。DEN4-80EZipタンパク質は、非還元条件下で主として見かけの分子量約90kDを有する二量体として泳動する。DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80EまたはDEN4-80EZipのcGMPロットの生産マスターセルバンクMCBは、cGMP条件下でS2細胞系の各々から調製した。cGMP製造工程は、S2MC細胞系の撹拌タンク型バイオリアクターへの拡大、およびその後の分泌タンパク質を含む培養液の回収を含む。細胞は、デプスフィルターを利用する濾過によって培養液から分離する。DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80EまたはDEN4-80EZipは次に、生じた澄明化した上清から、4G2モノクローナル抗体を使用する免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。免疫アフィニティー精製産物については、その後、低pHのウイルス不活性化ステップ、および20nm粒子を除去可能な孔径を有する膜を使用するウイルス濾過ステップを実施した。組換えサブユニットワクチン成分を用いて、低pHウイルス不活化およびウイルス濾過ステップが実施できる能力は、これが可能でない弱毒化生ワクチンに優る優位性である。これらのウイルス排除ステップは偶発性媒介物試験を著しく簡略化して、製品に対するさらなるレベルの安全性を提供する。DEN-80Eタンパク質の最終処理は、緩衝液交換および0.2μmのフィルターによる最終濾過を伴う限外濾過による濃縮を含んだ。cGMP下でのDEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80EまたはDEN4-80EZipのロットの製造は下記の通りに行った。各々のMCBのバイアルを解凍し、各々の解凍したバイアルの内容物を、10mL容のEX-CELL培地中26°Cで5日間培養した。各々の培養液は、500mLのディスポーザブル振盪フラスコに拡大した。培養液は、1.5X107/mLの細胞密度に達するまで増殖させた。フラスコはプールして、ディスポーザブル振盪フラスコ中のより多量の培地を接種するために使用し、次にそれを3ないし4日間培養した。培養液は、2X107細胞数/mLの細胞密度に達するまで培養した。培養液は、次にディスポーザブル振盪フラスコの複数の培養液に拡大した。これらの培養液は、1.6X107細胞数/mLの平均細胞密度に達するまで培養した。フラスコの細胞はプールして、20Lのステンレス鋼製バイオリアクターに接種するために使用した。培養液は、1.2X107細胞数/mLの細胞密度に達するまで培養した。20Lバイオリアクターからの適当な量の細胞を、2X106細胞数/mLの初期細胞密度となるように、100Lのステンレス鋼製バイオリアクターへ移植した。培養液は、>4.0X106細胞数/mLの細胞密度に達するまで培養した。培養液は、次に硫酸銅を0.2mMの終濃度となるように硫酸銅を培養液に添加することによって誘導した。培養液は、その後5日間培養した。各々の100Lの培養液は、0.2μmフィルターカートリッジを伴う0.45μmフィルターカートリッジを使用するデプス濾過によって採取した。濾液は、10L容のシングルユースバッグに収集し、-20°Cで貯蔵した。DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80EまたはDEN4-80EZipのバルクハーベストは、雰囲気温度下15ないし25°C約24時間で解凍した。微粒子は、その後、孔径5μmのフィルターに物質を通して除去した。濾過したバルクハーベストは、4G2-セファロースカラムに直接負荷した。負荷後カラムは、Tween-20を0.05含むpH7.1の11mMのPBSPBSTにより洗浄し、次に保持された80Eは、グリシン緩衝液によりpHを下げて溶出した。サブバッチはプールし、次に最終pH3.8までpHを下げてウイルスを不活性化し、次に物質を雰囲気温度15ないし25°Cで16ないし24時間インキュベートし、その後pHを7.0±0.5に調整した。物質は、小さな粒子を除去するために0.2μmのプレフィルターに通し、次に20nm孔径の膜を使用して限外ろ過したviralfiltered。次に物質は濃縮し、次に限外濾過膜によって緩衝液を交換し、次に0.2μmのフィルターを通して直接滅菌バッグの中へ最終の濾過滅菌を行った。精製80E生物物質は、ワクチン製品の製剤化に放出する前に、広範な安全性、同一性、耐久力および純度の評価を受けた。臨床試験使用のためのHBV-001D1ワクチンの製剤化1価のDEN1-80Eアラム吸着HBV-001D1ワクチンの製剤化は、cGMP下で行った。簡潔に説明すると、実施例2に記載の精製生物物質であるDEN1-80Eを解凍し、次にクラス100のラミナーフローエリアに移動した。DEN1-80Eは、0.20mg/mlのタンパク質標的終濃度になるように、滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水DPBSで希釈し、次に希釈80E溶液は濾過滅菌した。DPBSおよびアルハイドロゲル85を2.50mg/mLの最終アルミニウム濃度となるまで、希釈DEN1-80E溶液に容量的に添加した。溶液は2ないし8°Cで一晩穏やかに混合した。一晩吸着後、吸着されなかったDEN1-80Eタンパク質の量を測定した。HBV-001D1ワクチンの充填へ進むには最小限75の吸着が必要とされた。適当な量のHBV-001ワクチンを準備した滅菌バイアルに移した。充填したバイアルは栓をし、密封し次に圧着した。ワクチンを充填したバイアルは2ないし8°Cで貯蔵した。臨床試験でワクチンを使用する前に、広範な安全性、耐久力、同一性、有効性および純度の試験を行った。臨床試験使用のための4価デング抗原の製剤化4価DEN-80Eワクチンの製剤化はcGMP下で行った。簡潔に説明すると、実施例2に記載の精製生物物質であるDEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80EおよびDEN4-80EZipを解凍し、クラス100のラミナーフローエリアに移動した。解凍した抗原は濾過滅菌し、次に濾過後のタンパク質濃度を測定した。DEN-80E抗原は、0.50mg/mLの最終タンパク質標的濃度に達するまで、滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水DPBSにより各々独立して希釈した。4のタンパク質溶液は、次にDEN1-80Eを0.1mg/mL、DEN2-80Eを0.1mg/mL、DEN3-80Eを0.1mg/mLおよびDEN4-80EZipを0.2mg/mL含む4価の溶液を産生するために、DEN1-80E:DEN2-80E:DEN3-80E:DEN4-80EZipに関し1:1:1:2の比率で容量的に混合した。4価ワクチン混合液の適当量を用意した滅菌バイアルに移した。充填したバイアルは栓をし、密封し次に圧着した。ワクチンを充填したバイアルは、2ないし8°Cで貯蔵した。またDEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80EおよびDEN4-80Eを含む類似の製剤も臨床試験を支援するために調製した。臨床試験でワクチンを使用する前に、広範な安全性、耐久力、同一性、有効性および純度の試験を行った。4価抗原は、単独またはヒト被験者への投与前に医薬品の臨床試験実施基準に従って滅菌し充填したアジュバントと混合して投与する。HBV-001D1デング1型組換えサブユニットワクチンの臨床試験実施例3に記載の通り、cGMP下で製造されたHBV-001ワクチンを臨床治験で試験した。健康な成人ボランティアでの生物学的製剤であるHBV-001D1を評価するために、単一医療センター、二重盲検、無作為化の第I相試験により、同量のアルハイドロゲル85アジュバントを有するワクチンの活性成分DEN1-80Eの2の異なる用量レベルを評価した。被験者は、試験ワクチンの単回の筋肉内注射を0、4および8週に受けた。試験計画を以下の表1に要約する。安全性および忍容性は、対象身体的検査、通常の実験室内試験血液学、臨床化学および検尿および試験ボランティアにおける生命徴候および有害事象の記録による試験を通して評価した。さらに被験者は、特定の有害事象と同様に反応源性および忍容性データを記録するために、各々のワクチン接種の2日前から14日後の間ダイアリーカードを使用した。この研究の有効性評価は、≧1:10のPRNT50プラーク減少中和試験アッセイによって測定される、ウイルス中和抗体力価の量および範囲すなわち免疫原性の測定を含んだ。試験において、ワクチンがヒト被験者にとって安全であると示唆する安全なシグナルは確認されなかった。免疫化した個体からの免疫原性データを表2に要約する。低用量コホートの6人のワクチン受容者のうち、全ての被験者は0、2および4週で中和抗体力価が陰性だった。被験者の大部分4/6は、3回目のワクチン投与後2週の10週で中和抗体を発生した。どの被験者も34周では検出可能な抗体を示さなかった。1の被験者007は、初期の6週に2回目のワクチン投与後2週陽性の結果を示し、それは10週にも存在したが、34周では投与3後26週検出不能だった。高用量コホートの6人のワクチン受容者のうち、全ての被験者は0、2および4週で中和抗体力価が陰性だった。1の被験者は、初期の6週に2回目のワクチン投与後2週陽性の結果を示した。2の被験者は8週3回目のワクチン投与日に中和抗体を示し、被験者の大部分5/6は、10週では中和抗体を発生した。2の被験者は34週で検出可能な抗体力価を示し続けた。これは、ヒト被験者におけるデング用の非複製型ワクチンのウイルス中和抗体誘導に関する最初の証明であることを意味している。全ての4人のプラセボ受容者は、全ての測定時点において検出不能な抗体力価しか有さなかった。結果は、HBV-001D1ワクチンがヒト患者において安全でありかつDEN1に対する免疫応答を誘導することができることを証明する。さらに、この適切な防御免疫応答は、強力な防御のためにNS1に対する必要性が予想されたにも関わらずMcDonellら,米国特許6,416,763号、製剤中にNS1を包含せずにワクチン接種を受けた個体群において誘導された。アカゲザルにおける4価デング80E組換えサブユニットワクチンw/DEN4-80EZipの試験単量体DEN1-80E、単量体DEN2-80E、単量体DEN3-80Eおよび二量体DEN4-80EZipのユニークな組み合せを含む4価製剤は、各々のDEN-80Eの1μgおよびISCOMATRIX登録商標アジュバントの47ISCO単位の用量をアカゲザルに送達するために、ISCOMATRIX登録商標アジュバントとの混合剤として調製した群1。第二の混合剤を調製したが、それは同じ4価組成物を含んだがまた0.1μgのDEN2由来のNS1タンパク質の0.1μgの投与量をも含んだ群2。12匹のサルから成る群は各々、混合剤かまたはISCOMTRIX登録商標単独群3の3用量を2月の間隔で投与した。免疫原性は、ワクチンの3回投与後の30日150試験日に評価した。NS1を含まない4価製剤により免疫した個々の動物の抗体力価を表3に示す。明らかな通り、単量体および二量体抗原のユニークな組み合せは、結果として動物における高力価で、平衡のとれた4価のウイルス中和応答をもたらす。プラーク減少中和試験において50減少のカットオフ値で定量したウイルス中和抗体力価最後のワクチン投与を受けた後の5月に、動物を野生型デングウイルスで攻撃感染した。攻撃感染のために、各々12匹のサルから成る各群は、4のデングウイルス型の1型による攻撃感染のために無作為に各々3匹のサルから成る4群に細区画した。各々のサルを、野生型のデングウイルスの約105プラーク形成単位により皮下経路によって攻撃感染した。動物から次の11日間、毎日血液試料を採取した。血液試料は、ベロ細胞上への直接プレーティングまたは蚊C6/36細胞上での増幅に続くベロ細胞へのプレーティングによって、ウイルスの存在ウイルス血症の評価を行った。野生型デングウイルスに感染するとき、アカゲザルは病徴を発症しないが一方、それらはウイルス血症を発生するために、ウイルス血症の防御が防御効力を代用する物と考えられる。攻撃感染データを表2に示す。ISCOMATRIX登録商標アジュバントだけを受容した12匹の対照動物の中の11匹が攻撃感染後にウイルス血症を発生した一方、NS1を含まない4価ワクチン製剤を受容した全ての動物群1は検出可能なウイルス血症から完全に防御された。またNS1を含んだ4価ワクチン製剤を受容した12匹の動物群2の中の11匹もウイルス血症から防御されたが、しかし驚くべきことにNS1を含む製剤を受容した1匹のサルが1日だけウイルス血症を発症した。従って、NS1を含まない単量体および二量体のタンパク質から成るユニークな組み合せを含む4価ワクチン製剤は、平衡のとれた4価免疫およびウイルス攻撃感染からの完全な防御を示したが、しかも驚くべきことにはNS1を含む製剤と比較してよりすぐれた防御を示したように見える。アカゲザルにおける4価デング80E組換えサブユニットワクチンの試験このGLPに無いnon-GLPアカゲザル試験の目的は、1DEN4-80EとDEN4-80EZipの免疫原性および防御効果を比較すること、および2他の単量体DEN-80E組換えサブユニットDEN1-80E、DEN2-80EおよびDEN3-80Eを有する4価製剤中のDEN4-80Eの免疫原性および防御効果を評価することだった。DEN4-80EおよびDEN4-80Ezipは、低、中および高用量6、20および100μg/用量で評価した。同様に4価製剤は、低それぞれ3、3,3,6μgのDEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80EおよびDEN4-80E、中10、10、10、20μgおよび高50、50、100μg用量で評価した。試験製剤の大部分は、ISCOMATRIX登録商標アジュバントを用量当たり90ISCO単位で含んだ。ISCOMATRIX登録商標アジュバントだけを用量当たり90ISCO単位受容した負の対照群を含めた。試験には、比較の目的で追加の2群を含めた。225μgのアルハイドロゲルと製剤化した中用量のDEN4-80E20μgを受容した一群、および37.6ISCO単位と製剤化した中用量の4価ワクチンを受容した一群を含めた。各々のワクチンまたは対照製剤は、ELISAアッセイでフラビウイルスDEN1、2、3及び4ならびにWN抗体陰性だった、健康な大人で、雌雄の体重3kg以上アカゲザルに投与した。単価DEN4ワクチンを評価するときは群当たり3匹のサルを使用し、4価製剤またはISCOMATRIX登録商標の負の対照群を評価するために群当たり12匹のサルを使用した。上記の候補ワクチン製剤は、全量0.5mLで筋肉内接種によって投与した。ワクチンの3用量を4週の間隔で投与した。ウイルス中和活性は、マイクロ中和試験に基づくLiCorを使用して4週毎T=0、4、8、12、16、20、24、28、32に測定する。12週投与3後4週に対するLiCor結果を以下の表4に要約する。12週の結果からの重要な結論の一つは、DEN4-80EとDEN4-80Ezipの免疫原性が、評価された用量にわたり極めて同等であることに帰着する。DEN4-80Eに対する低、中及び高用量の幾何平均中和力価は、それぞれ508、508及び320だったが、一方DEN4-80Ezipに対する力価は640、1016及び320だった。またISCOMATRIX登録商標によりアジュバント化された中用量のDEN4-80Eを受容した群は、アルハイドロゲルを受容した群32よりも実質的に高い幾何平均中和力価508を有することも認められた。また4価ワクチン製剤を受容した群において、全てのデング型にわたり高度に平衡のとれた応答が達成されることもわかった。明らかな用量反応は、単一成分ワクチンDEN4-80EまたはDEN4-zipにも4価ワクチンにも認められなかった。4価デング80E組換えサブユニットワクチンの臨床治験cGMP下で製造した4価デングウイルス80Eワクチンを臨床治験における試験用に調製する。治験は4価デング80Eワクチンの第I相試験からなり得るだろう。治験は、無作為、二重盲検、プラセボ対照、投与量増加の試験であり得て、それは健康なフラビウイルスにナイーブな18ないし45才の成人における4価DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80EおよびDEN4-80Eデングワクチンの異なる製剤の安全性、忍容性及び免疫原性を評価し得るだろう。免疫原性データは、3回接種後の6月および1年と同様に各々のワクチン接種後の1月に収集し得るだろう。全部で90人の被験者が、0、4及び8週で投与される活性ワクチンかまたはプラセボの3回の筋肉内注射を受けるために、治験に登録され得るだろう。表5に示す通り、デング1、デング2、デング3およびデング4-80E抗原の3用量レベル:すなわち低用量それぞれ3、3、3および6μg、中用量それぞれ10、10、10および20μgおよび高用量それぞれ50、50、50および100μgの製剤が評価され得るだろう。各々の用量レベル内で、試験される特定のワクチンは、ISCOMATRIX登録商標でアジュバント化した30または60ISCO単位含有、アルハイドロゲル登録商標でアジュバント化した製剤、またはアジュバントを含まない製剤を含み得るだろう。"