"式I:式中、R1、R2、R3及びR4は、互いに独立して、H又はOH又はFのいずれかであり、そしてR5は、C1-C20-アルキル又はC1-C20-アルケニルであるの化合物、全てのその立体異性体の形態、及び全ての比率のそれらの混合物並びに生理的に許容されるその塩。R1、R2、R3及びR4のいずれか2つが互いに独立してFである、請求項1に記載の式Iの化合物。R1、R2、R3及びR4がOHである、請求項1に記載の式Iの化合物。R5がC12-アルキルである、請求項1~3のいずれか1項に記載の式Iの化合物。aラセミ体の1,4,5,6-テトラ-O-ベンジル-ミオ-イノシトールをリン酸化してテトラ-O-ベンジル-ミオ-イノシトール-1,2-シクロドデシルホスホン酸を得;bテトラ-O-ベンジル-ミオ-イノシトール-1,2-シクロドデシルホスホン酸を接触水素化してそれぞれの化合物を得る;ことを含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の化合物の製造方法。請求項1~4のいずれか1項に記載の少なくとも1つの式Iの化合物及び/又は生理的に許容される塩及び/又はそのプロドラッグ、及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。糖尿病の治療のために使用される薬剤の副作用を変えるか又はそれを治療するための医薬の製造における、請求項1~4のいずれか1項に記載の式Iの化合物及び/又は生理的に許容されるその塩及び/又はそのプロドラッグの使用。薬剤がグリメピリドである、請求項7に記載の式Iの化合物の使用。グリメピリド、抗糖尿病薬は、膵細胞からインスリン放出を刺激することによって、更に、少しの程度であるが、筋肉細胞におけるグルコース輸送の活性化及び脂肪細胞における脂肪分解の阻害のような、末梢組織での代謝的インスリン作用を模倣することによって、主に血糖を低下させる。スルホニルウレア、グリメピリド、の血糖低下効果は、部分的には、IRS-PI3K経路のインスリン受容体非依存性活性化を経た脂肪細胞及び筋肉細胞における非酸化的グルコース代謝の刺激によって引き起こされる。単離したラット脂肪細胞において、グリメピリドの作用の分子機構は、アシル化された非受容体チロシンキナーゼ、pp59Lyn、及びいくつかのGPIタンパク質のような脂質ラフト関連シグナリング成分の再分配及びそれに伴っておこる活性化、並びに、インスリンによって中程度に活性化もされる原形質膜グリコシルホスファチジルイノシトール特異的GPI-PLCの促進に関与していることが明らかにされている。グリメピリドは、膵臓β細胞からのインスリン放出を促進するスルホニルウレア剤であり、膵臓外の機構を経て作用するであろう。グリメピリドは、血糖症が食事及び運動だけではコントロールされない2型非インスリン依存性糖尿病患者に1日1回投与され、続発性スルホニルウレア障害の患者にインスリンと併用されることもある。グリメピリドの最大の血糖低下効果は、投与後最初の4時間に起こる。グリメピリドは、グリベンクラミドグリブリドよりも心臓血管変動に対する重篤な影響はより少ない。薬物動態は高齢の患者又は腎疾患や肝臓疾患のそれら患者において主として不変である。グリメピリドの薬物相互作用は殆んど報告されていない。2型糖尿病患者において、グリメピリドの有効投与範囲は、05から8mg/日であり、4mg/日と8mg/日の投与間に有効性の差が殆んどない。グリメピリドは、1年間の試験において、グリベンクラミド及びグリピジドの有効性と類似していた。しかしながら、グリメピリドは最初の数週間にわたる治療でグリピジドよりもより速く血糖を低下するようである。グリメピリド及びグリクラジドが、14週間の試験で基準線に良好に血糖コントロールができている患者で比較され、効果に差がないことが指摘された。グリメピリドとインスリンの併用は、絶食時血糖標的レベルが≦78mmol/Lに達する続発性スルホニルウレア障害の患者の治療において、インスリンとプラセボの併用と同程度の効果があったが、グリメピリドを用いることにより血糖症に対してより低いインスリン投与量とより速い効果が見られた。グリメピリド単独療法は、一般的に良好な耐容性を有するが、治療期間1年以下≦1年の患者の10から20、及び6ヶ月間同時にインスリンを投与された患者の50以下≦50において、低血糖症を発症した。集計した治験データは、グリメピリドは、グリベンクラミドよりも低血糖症の発生率が低く、特に治療第1ヵ月目において低いであろうことが示唆された。投与量は、通常1mg/日で開始され、1から2週間の間隔で血糖コントロールのために通常の投与範囲1から4mg/日に漸増する英国では最大6mg/日又は米国では8mg/日。グリメピリドは、主に膵臓β細胞からのインスリンの放出の促進によって、及び僅かな程度で、筋肉細胞におけるグルコース輸送の活性化及び脂肪細胞における脂肪分解の阻害のような、末梢組織における代謝性インスリン作用を模倣することによって、グルコースを低下させる。グリメピリドは、初代培養又は培養した齧歯類脂肪細胞を薬理学的濃度で処理すると、GPI-PLCの活性化によって、5’-Nuc、aP及びGce1のようなGPIタンパク質サブセットの両親媒性から親水性への変換を強力に誘導することが明らかにされた。本発明において初めて開示されたイノシトール誘導体、GPI-2350は、高力価IC50=02~10μM及び選択性で細菌、トリパノソーマ及び血清GPI-PLC及びGPI-PLDを阻害する。GPI-2350は、無処置のラット脂肪細胞のGPI-PLCを殆んど完全にダウンレギュレートする。GPI-PLCは、代謝性インスリンシグナリングでは役割を演じない一方で、GPI-PLCの活性化は、界面活性剤不溶性の糖脂質に富む脂質ラフト領域DIGからインスリン受容体基質1IRS-1へのインスリン受容体非依存性クロストークを経由するグリメピリドのインスリン模倣効果には必須である。脂肪細胞のような多くの最終分化細胞の原形質膜に多数発現しているDIGは、シグナル伝達並びにタンパク質及び脂質のトラフィッキング及び選別を包含する膜媒介生物学的過程のためのプラットフォームとして役目を果たしている、特殊な膜ミクロドメインである。それらは、外部原形質小葉中のコレステロール及びスフィンゴ糖脂質、及び内小葉の飽和アシル鎖を有するリン脂質及びコレステロールに濃縮されていて、二重層内に液状の秩序相を形成している。DIGは、冷状態で1トライトンX-100に不溶性であり、ショ糖勾配遠心分離法で低浮遊密度であることを特徴とする。これらの判断基準に基づいて、ある種のGPIアンカーされ、アシル化した、膜貫通シグナリングタンパク質が、原形質膜のDIG対非DIG領域に豊富にあることが見出された。更に、高コレステロール含有のDIGhcDIG及び低コレステロール含有のDIGlcDIGは、それぞれ、それらの低浮遊密度及び高浮遊密度に基いて互いに区別することができる。hcDIGからlcDIGへの、GPIアンカーされ、そしてアシル化されたある種のシグナリングタンパク質の刺激依存性再分配は、GPI-2350によってブロックされた。GPI-2350は、脂質ラフト関連GPI-PLCIC50=5~10μMによる無処置のラット脂肪細胞由来の、Gce1及び5’-Nucのような、GPIタンパク質の基本的及びグリメピリド/インスリン誘発脂肪分解放出を減少させた。GPI-235050μMによるGPI-PLCの阻害は、ipp59Lyn及びGce1のカベオリンからの解離、iihcDIGからlcDIGへの再分配、iiipp59Lyn及びIRS-1のチロシンリン酸化、ivグルコース輸送の促進及びvグリメピリドに応答する脂肪分解の阻害、の殆んど完全な遮断を導く。GPI-PLCのインスリン活性化は、脂質ラフト分布に対する適度な効果を有し、及び、それ例えば、IRS-1のチロシンリン酸化及び脂肪分解の阻害が僅かに減少するだけであったので、あったとしても代謝性インスリンシグナリングにおける軽微な役割がGPI-2350のみの存在下で明らかにされた。グリメピリドに誘導されたGPI-PLCによって生成する脂肪分解的に切断されたGPIタンパク質は、それらの非切断両親媒性のもの及びpp59Lynのように、lcDIGに再分配するよりもむしろhcDIGと会合して残っている。ラット脂肪細胞において再分配され、活性化されたpp59LynによるIRSのチロシンリン酸化を経るインスリンシグナリングカスケードへのグリメピリドのクロストークは、hcDIGが関与するGPI-PLCの活性化を必要とする。本発明は、哺乳類のGPI-PLCの活性を調節する化合物の同定方法であって、a哺乳類細胞をグリメピリドと共にインキュベートし;baの細胞のhcDIGを調製し;cbからのhcDIGを化合物と共にインキュベートし;そしてdcのhcDIGからのGPI-PLCの活性を定量する;ことを含む方法に関する。方法のステップaに記載の哺乳類細胞は、齧歯類又はイヌの細胞に関する。齧歯類は、例えば、マウス、ラット又はモルモットである。本方法は、ヒト、又は例えばチンパンジー、ゴリラ又はボノボのような類人猿の細胞にも関する。そのような細胞は、例えば、膵臓細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、脳細胞、脂肪細胞である。哺乳類細胞は、細胞培養によっても提供することができる。細胞を取得し、処理し、収穫し、加工するために、通常の技術が使われる例えば、CurrentProtocolsinCellBiologyJohnWileySons0471241083Looseleaf0471241059CDROM。本発明の方法のステップcに記載のhcDIGからのGPI-PLCの活性を定量するには、hcDIGからpp59Lynの解離を測定することによって、又はhcDIGからlcDIGへのpp59Lyn及び/又はGce1の再分配を測定することによって、又はpp59Lyn及び/又はIRS-1のリン酸化の変化を測定することによって、又はグルコース輸送の促進及び/又は脂質分解の阻害を測定することによって実行される。本発明は、更に、前に開示したように本発明の方法によって同定することができる化合物に関する。そのような化合物は、例えば、本発明に開示されているような式Iを有する化合物又はその誘導体である。本発明は、又、全ての立体異性体の形態における、および全ての比率のその混合物である式Iの化合物:式中、R1、R2、R3及びR4は、互いに独立して、OH又はFのいずれかであり、そしてR5はC1-C20-アルキル又はC1-C20-アルケニルである及び生理的に耐容されるその塩に関する。本発明は、又、R1、R2、R3及び/又はR4のいずれか2つが互いに独立してFである、前記に記載の式Iの化合物に関する。本発明は、又、R1、R2、R3及びR4が各々の場合においてOHである、前記に記載の式Iの化合物に関する。本発明は、又、R5がC12-アルキルである、前記に記載の式Iの化合物に関する。本発明のそのような化合物は、例えば、全てのその立体異性体の形態を含む、以下の式を有する。又は、本発明のそのような化合物は、例えば、以下の式を有する。そのような本発明の化合物は、例えば、その全ての立体異性体の形態を含む、ミオ-イノシトール-1,2-シクロドデシルホスホン酸であり得る。本発明の記載において、用語C1-C20-アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、デュオデシル、トレデシル、クアトルデシル、クインデシル、セスデシル、セプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシルの全ての立体異性体の立体構造を有する、全ての直鎖状又は分枝鎖状の化合物に関するものとする。本発明の記載において、用語C2-C20-アルケニルは、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、デシレン、ウンデシレン、デュオデシレン、トレデシレン、クアトルデシレン、クインデシレン、セスデシレン、セプタデシレン、オクタデシレン、ノナデシレン、エイコシレンの全ての立体異性体の立体構造を有する、全ての直鎖状又は分枝鎖状の化合物を包含するものとする。本発明は、更に、ミオ-イノシトール-1,2-シクロドデシルホスホン酸の製造方法であって、aラセミ体の1,4,5,6-テトラ-O-ベンジル-ミオ-イノシトールをリン酸化してテトラ-O-ベンジル-ミオ-イノシトール-1,2-シクロドデシルホスホン酸を得ること;及びbテトラ-O-ベンジル-ミオ-イノシトール-1,2-シクロドデシルホスホン酸を接触水素化すること;を含む方法に関する。該製造方法は、前に特定したようなR1、R2、R3、R4及び/又はR5を含む適切な出発物質を使用することによって、本発明の別のいずれかの化合物の製造に適用し得るものである。本発明は、又、式Iを有する少なくとも1つの化合物及び/又は生理的に耐容される塩及び/又はそのプロドラッグ及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物に関する。本発明は、更に、糖尿病の治療のために使用される薬剤の副作用を変えるための、式Iの化合物及び/又は生理的に耐容されるその塩及び/又はそのプロドラッグの使用に関する。そのような薬剤は、例えば、グリメピリドである。副作用は、例えば、グリメピリドの誤った投与量に起因する低血糖である。本発明は、又、糖尿病の治療のために使用される薬剤例えば、グリメピリドの副作用の治療用の医薬組成物を製造するための、式Iを有する化合物の使用に関する。本発明は、又、脂肪細胞の原形質膜を横切るシグナル伝達の間にDIG中のシグナル伝達タンパク質を同定するための、又は、GPI-PLC及び/又は依存性のシグナル伝達因子の哺乳類の変異体を同定及び特性付けるための、式Iの化合物の使用に関する。本発明は、又、グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法であって、a哺乳類細胞をグリメピリドと化合物との混合物と共にインキュベートし;baの細胞のhcDIGを調製し;そしてcbのhcDIGからのGPI-PLCの活性を定量する;ことを含む方法に関する。本発明の記載における化合物は、化学合成によって製造されるものか、天然源から単離されるもののいずれかであって、50と50000ダルトンの間の分子量を有する、いずれかの有機及び/又は炭水化物化合物を意味するものとする。グリメピリドの活性の調節とは、活性が、促進されるか、阻害されるか、活性をある一定のレベルに安定させるという意味で保持されるか、を意味するものとする。グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法のステップaにおける哺乳類細胞は、例えばラット又はマウスのような齧歯類の細胞、イヌの細胞又はヒトの細胞を包含するものとする。そのような細胞は、例えば、膵臓細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、脳細胞又は脂肪細胞であり得る。又、使用することができるのは、細胞培養例えば、初代細胞培養の細胞である。グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法のステップcに記載のGPI-PLCの活性の定量は、hcDIGからのpp59Lynの解離を測定することによって、又はhcDIGからlcDIGのpp59Lyn及び/又はGce1再分配を測定することによって、又はpp59Lyn及び/又はIRS-1のリン酸化の変化を測定することによって、又はグルコース輸送の促進及び/又は脂質分解の阻害を測定することによって、達成することができる。グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法のステップcに記載のhcDIGからのGPI-PLCの活性が弱められている場合は、同定された化合物がグリメピリドの活性を不活化しているか又は減少させている。GPI-PLCの活性が増強されている場合は、同定された化合物がグリメピリドの活性を促進しているか、又は支持している。医薬として許容される陰イオンを有する式Iの化合物の塩は、医薬として許容される塩の製造又は精製のための、及び/又は非治療、例えばインビトロでの応用において使用するための有用な中間体として本発明の範囲内に、同様に包含される。式Iの化合物の塩は、当業者によく知られている通常の方法を用いて製造することができる。塩は、例えば、式Iの化合物を、溶媒又は希釈剤中で、無機若しくは有機酸又は塩基と組み合わせることによって製造することができる。本明細書で使用される用語生理的に活性な誘導体は、例えば、ヒトのような哺乳類に投与されると、式Iの化合物又はその活性代謝物を直接的に、又は間接的に形成することができる、本発明の式Iの化合物の生理的に許容される誘導体のいずれか、例えばエステル、に関する。生理的に活性な誘導体は、又、本発明の化合物のプロドラッグを包含する。そのようなプロドラッグは、本発明の化合物にインビボで代謝され得る。これらのプロドラッグはそれ自体活性又は不活性であることができる。本発明の化合物は、種々の多形相、例えば、非晶性及び結晶性多形相として存在することができる。本発明の化合物の全ての多形相は、本発明の範囲内に包含され、本発明の更なる態様である。以下、式Iの化合物類についての全ての言及は、上に記載した式Iの化合物/化合物類、並びに、本明細書に記載したそれらの塩、溶媒和物及び生理的に活性な誘導体を意味する。所望の生物学的効果を達成するために必要な式Iの化合物の量は、多くの因子、例えば、選択された特異的化合物、目的とする使用、投与様式及び患者の臨床状態に依存している。一般的に、1日投与量は、体重1キログラム当たり1日につき03mgから100mg典型的には3mgから50mgの範囲内、例えば、3~10mg/kg/日である。静脈内投与量は、例えば、03mgから10mg/kgの範囲であり、これは1分当たり体重1キログラムにつき10ngから100ngの注入として適切に投与することができる。これらの目的のための適切な注入溶液は、例えば、1ミリリットル当たり01ngから10mg、典型的には1ngから10mgを含有することができる。個々の投与量は、例えば、1mgから10gの活性化合物を含有することができる。それ故、注射用アンプルは、例えば、1mgから100mg、を含有することができ、そして、例えば、錠剤又はカプセルのような経口投与可能な個々の剤形は、例えば、10から1000mg、典型的には10から600mgを含有することができる。医薬として許容される塩の場合、上記した重量の詳細は、塩から由来するジヒドロチアゾリウムイオンの重量と関連している。上に挙げた状態の予防又は治療のために、式Iの化合物は、化合物としてそれ自体使用することができるが、それらは耐容される賦形剤との医薬組成物の形態で存在するのが好ましい。賦形剤は、勿論、それが組成物の別の構成物と相性がいいこと、及び患者の健康に有害でないことという意味において、耐容性でなければならない。賦形剤は、固体又は液体又は両者であり得、好ましくは、例えば、活性化合物の005質量から95質量までを含有することができる錠剤として、個々の投与量として化合物と処方される。更に医薬として活性な物質も、式Iの更なる化合物を包含して存在し得る。本発明による医薬組成物は、本質的に成分を薬理学的に許容される賦形剤及び/又は助剤と混合することから成る、公知の薬学的方法の一つによって製造することができる。本発明による医薬組成物は、個々の場合における最も適切な投与方法が、治療される状態の性質及び重症度、並びに各々の場合に使用される式Iによる化合物の性質に依存するものの、口腔、直腸、局所、経口例えば、舌下及び非経口例えば、皮下、筋肉内、皮内又は静脈内投与に適したものである。糖衣をかけた剤形及び糖衣をかけた遅延放出剤形も、又、本発明の範囲内に包含される。耐酸性及び腸溶性剤形が好ましい。好適な腸溶性コーティングとしては、酢酸フタル酸セルロース、ポリ酢酸ビニルフタル酸塩、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びメタクリル酸及びメタクリル酸メチルのアニオン性ポリマーが挙げられる。経口投与用に好適な医薬化合物は、例えば、各々の場合において式Iの化合物の一定量を含有する、カプセル、カシェ剤、トローチ剤又は錠剤のような分離された単位で存在することができ、粉剤又は顆粒剤として、水性又は非水性の溶液又は懸濁液として、又は水中油又は油中水エマルジョンとして、分離された単位で存在することができる。既に挙げたように、これらの組成物は、活性化合物と1つ又はそれ以上の付加的成分からなり得る賦形剤が接触されるステップを包含するいかなる好適な薬学的方法によっても製造することができる。一般的に、組成物は、活性化合物を液体及び/又は微細に分割した固体の賦形剤と均一及び均質に混合し、その後、必要により生成物を成形することにより、製造される。かくして、例えば、錠剤は、化合物の粉末又は顆粒を加圧又は成型によって、もし適切ならば、1つ又はそれ以上の追加の成分と共に、製造することができる。圧縮した錠剤は、化合物を、例えば粉末又は顆粒のような自由に流れる形態で、適切な場合は結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤及び/又は1つの多くの界面活性/分散剤と混合して、好適な装置で錠剤化することによって製造することができる。成形された錠剤は、粉体化合物を、不活性液体希釈剤でぬらし、好適な機械で成型することによって製造することができる。経口舌下投与に好適な医薬組成物は、式Iの化合物と香味料、通常ショ糖及びアラビアゴム又はトラガカントゴムを含有するトローチ錠、及びゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアラビアゴムのような不活性基剤中に化合物を含んだ芳香錠を包含する。好適な非経口投与用医薬組成物は、好ましくは、意図した被投与者の血液と好ましくは等張である、式Iの化合物の滅菌水性製剤を包含する。これらの製剤は、投与は注射として皮下、筋肉内又は経皮で行うことができるが、好ましくは、静注で投与される。これらの製剤は、好ましくは、化合物を水と混合し、得られた溶液を滅菌し、血液と等張にすることによって製造することができる。本発明の注射できる組成物は、一般的に、活性化合物を01から5質量含有している。直腸投与に好適な医薬組成物は、好ましくは、個々の投与量の座薬として存在する。それらは、式Iの化合物を1又はそれ以上の通常の固体賦形剤、例えば、カカオバターと混合し、得られた混合物を成形することによって製造することができる。皮膚に局所適用する好適な医薬組成物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、スプレー、エーロゾル又はオイルとして存在する。使用することのできる賦形剤は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール及びこれらの物質の2つ又はそれ以上の組合せである。活性化合物は、一般的に、組成物の01から15質量の濃度、例えば、05から2質量の濃度で存在する。経皮投与も、又、可能である。経皮投与用に好適な医薬組成物は、患者の表皮と長期間密接に接触するのに適している個々のパッチとして存在することができる。そのようなパッチは、場合によっては緩衝性水性溶液中の活性化合物を、接着剤中に溶解及び/又は分散させて、又はポリマー中に分散させて、好適に含有している。適切な活性化合物濃度は、約1から35、好ましくは約3から15である。特別な可能性として、活性化合物は、例えば、PharmaceuticalResearch2318に記載されているように、エレクトロトランスポート又はイオントフォレーゼによって放出することができる。材料及び方法:ヒト組換えインスリン、PIG41FrickWetalBiochemistry371342113436に開示されている及びグリメピリド商品名アマリール、Amarylは、AventisPharmaGermanyの薬化学合成部から入手した。12-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イルアミノドデカン酸NBD-FAは、MuelleretalBiochemBiophysActa13472339の記載に従って合成された。コラゲナーゼWorthingtonCLStypeI250単位/mgは、Biochromにより提供された。牛乳由来リポタンパク質リパーゼLPL、アフィニティ精製、ホスホリパーゼA2ミツバチ毒、粗ブタ膵リパーゼPL、組換えPC及びPI-PLCBacilluscereus、粗PLDキャベツ及び脱脂BSA画分Vは、SigmaAldrichDeisenhofenGermanyから購入し、粗PI-PLCラット肝及びプロテイナーゼ阻害剤は、RocheMolecularBiochemicalsMannheimGermanyから購入した。組換えGPI-PLCTrypanosmabruceiは、OxfordGlycosystemsOxfordUKから得た。PLA2AACOCF3及びPLCU73122の阻害剤は、Tocrisから入手した。BisbodipyC11PCは、MolecularProbesEugeneORから購入した。脂質は、AvantiPolarLipidsから購入した。カベオリン1クローンC060の免疫沈降用抗体及び、カベオリン1ウサギ及びpp59Lynクローン32の免疫ブロッティング用抗体はTransductionLaboratoriesから入手した。ホスホチロシンクローン4G10の免疫ブロッティング用抗体は、UpstateBiotechnologyによって供された。昆虫細胞で発現した総ヒト組換えタンパク質に対するIRS-1の免疫ブロッティング用抗体ウサギ、アフィニティ精製、5’-Nucラット及びaPウシは、Biotrendによって製造された。ECLRenaissanceケミルミネッセンス検出キットは、NENDuPontから得た。スプラーグドーリーラットは、CharlesRiverLaboratoriesから供給された。GPI-2350の合成図1の図式も参照:出発物質として、ラセミ体1,4,5,6-テトラ-O-ベンジル-ミオ-イノシトール以下、化合物1は、ZhaiHXetalTetrahedronLett3674037406に記載の方法によって製造された。化合物1は、次いで、トリエチルアミン及びジメチルアミノピリジンの存在下、ドデシルホスホン酸ジクロライドでリン酸化し、テトラ-O-ベンジル-ミオ-イノシトール-1,2-シクロ-ドデシルホスホン酸以下、化合物2を得た。10パラジウム炭で接触水素化することによって、化合物2を脱ベンジル化し、ミオ-イノシトール-1,2-シクロ-ドデシルホスホン酸以下、化合物3、又はGPI-2350をジアステレオマーの混合物として得た。化合物2図1の合成のために、1g18mmolの化合物1を、メチレンクロリド60ml及びトリエチルアミン1mlに溶解し、ジメチルアミノピリジン200mg及びドデシルホスホン酸ジクロライド1g10mmolを加えた。この反応溶液を45分間室温で放置した。次いで、酢酸エチル50mlを加え、混合物をシリカゲルで濾過した。溶媒を濃縮後、残留物をフラッシュクロマトグラフィーn-ヘプタン:酢酸エチル=1:1、v/vで精製した。化合物2の収量収率:580mg43、白色非晶質固体。TLC:n-ヘプタン/酢酸エチル1/1、v/v、Rf=07。MS:MLi=7614、計算値C60H59O7P、M=7549。化合物3図1の合成のために、505mg067mmolの化合物2を酢酸エチル5mlとメタノール15mlの混合物に溶解した。パラジウム10炭700mgを加えた後、反応混合物を水素添加6時間、1気圧H2した。パラジウムをシリカゲルで濾過し、メタノール100mlで洗浄した。溶媒を濃縮後、残留物をフラッシュクロマトグラフィーメチレンクロリド/メタノール、5/1、v/vによって精製した。化合物3の収量収率:179mg68、白色非晶質固体。TLC:メチレンクロリド/メタノール5/1、v/v、Rf=015。MS:MLi=4012、計算値C18H35O7P、M=3944。化合物3は、塩基性溶媒よりも酸性溶媒下の方が不安定である。メタノール中では何日も安定であり、乾燥非晶質固体は4°Cで何年も安定である。ラット脂肪細胞の調製及びインキュベーション:雄性ラット120~140g、自由給餌、文献53を参照の精巣上体脂肪体から消化によって単離した脂肪細胞を、1w/vBSA含有KRH20mMHepes/KOH、pH74、12mMKH2PO4、140mMNaCl、47mMKCl、25mMCaCl2、12mMMgSO4で2回洗浄し、次いで、100μg/mlゲンタマイシン、100nM1-メチル-2-フェニルエチルアデノシン、05U/mlアデノシンデアミナーゼ、1mMピルビン酸ナトリウム及び5mMD-グルコースを補充した同じ培地中で、GPI-2350DMSO中に10mM保存溶液として調製し、インビトロ及び脂肪細胞培養における最終DMSO濃度は、いずれの阻害剤濃度でも05で一定に保たれた、インスリン又はグリメピリドMuelleretalJCellBiol12612671276に記載されたようにして調製したの存在下又は非存在下で、37°Cにて振とう水浴中で、5CO2/95O2で一定でバブリングしながら、インキュベーション容積1ml当たりパックした細胞容積100μlの最終力価少量の一定量アリコートを毛細管ヘマトクリットチューブに吸引し、脂肪細胞による懸濁液の分画占有を定量するためにマイクロヘマトクリット遠心機で60秒遠心して決定する;10サイトクリットは約15×106細胞/mlに相当するで、指定された期間インキュベートした。原形質膜及びlc/hcDIGの調製:原形質膜及びDIGを、溶解バッファー25mMモルポリノエタンスルフォン酸MES、pH60、140mMNaCl、2mMEDTA、05mMEGTA、025Mショ糖、50mMNaF、5mMピロリン酸ナトリウム、10mMグリセロール-3-リン酸、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム及びプロテアーゼ阻害剤中、モーター駆動テフロンインガラスホモジナイザー10ストロークを用いてホモジナイズし、前処理し洗浄した脂肪細胞のポストニュークレアーインフラネイタントpostnuclearinfranatantから調製した。原形質膜を脱脂したポストニュークレアーインフラネイタントの分画遠心法によって得、前に記載した48、53ようにしてショ糖及びパーコールクッションを通して2回逐次遠心によって精製し、最後に25mMトリス/HClpH74、025Mショ糖、1mMEDTAに2mgタンパク質/mlで懸濁した。hc/lcDIGを、MuellerGetalMolMed8120136に報告されたようにして界面活性剤法及び不連続ショ糖勾配遠心分離によって得た。15~22画分4~5及び28~35画分8~9ショ糖インターフェースの光散乱乳白色バンドを、屈折率を用いた濃度測定で、それぞれ、hcDIG及びlcDIGとして集めた。集めた勾配画分を25mMMESpH65、1トライトンX-100、150mMNaClで3倍希釈した後、遠心分離50000×g、30分、4°CによりhcDIG及びlcDIGを収集し、次いで、MuellerGetalMolMed8120136及び/又はMuellerGetalMolCellBiol2145534587に記載されているように適切なマーカーの豊富な部分/乏しい部分により特徴づけ免疫ブロット法、酵素アッセイ法、或いはトライトンX-114分画法下記を参照にかけた。カベオリンの免疫沈降のために、DIGを10mMトリス/HClpH74、150mMNaCl、1トライトンX-100、60mMβ-オクチルグルコシド、03デオキシコール酸、5mMEDTA、05mMEGTA、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム、50mMNaF、1μMミクロシスチン及びプロテアーゼ阻害剤の溶液に可溶化し1時間、4°C、遠心分離した50000×g、30分間。直接免疫ブロット法のために、DIGを2倍のLaemmli試料バッファーに可溶化し遠心分離した10000×5、5分間。上清を使用した。GPI-PLC/Dアッセイ:GPI-PLDラット血清を、HarietalBiochimBiophysActa1355293302に従って、200mMトリス/マレイン酸pH70及び1NonidetP-40溶液100μl中のヒト胎盤aP溶液10mMHepes/NaOH、pH70、150mMNaCl中100単位/ml10μlと10分間、37°Cにてインキュベーションし、次いで04mlの氷冷停止バッファー10mMHepes/NaOH、pH70、150mMNaCl、01mMMgCl2及び001mM酢酸亜鉛を添加して反応を停止することによってアッセイした。GPI-PLCT.bruceiを、MensaWilmotetalMethodsEnzymol250641655の記載のようにして、50mMトリス/HClpH80、025Nonidet/P-40及び5mMEDTA溶液50μl中のひと胎盤aP溶液上記を参照5μlと、30分間、37°Cにてインキュベーションし、次いで停止バッファー045mlを添加して反応を停止することによってアッセイした。PI-PLCB.cereus及び脂肪細胞GPI-PLC5~25μg原形質膜又はhc/lcDIGを、20mMHepes/KOHpH78、144mMNaCl、01TX-100、02mMMgCl2溶液100μl中のウシ赤血球アセチルコリンエステラーゼAChE溶液10μl10mMトリス/HCl、pH74、144mMNaCl、01TX-100中12単位/mlと1時間、25°Cにてインキュベーションし、次いで氷酢酸5μl及び次いで10mMトリス/HClpH74、144mMNaCl、04mlを加えて反応を停止することによってアッセイした。各反応混合物を、TX-114分配にかけた以下を参照。GPI-PLC/D活性は、TX-114消耗相中で測定された親水性aP又はAChEの活性と分配前に測定された総活性の比率から計算され、そしてGPI-PLC/Dを欠いたブランクのインキュベーションで現れたTX-114消耗相総活性の10~20の割合を占める中の非酵素バックグランドに対して補正された。その他のリパーゼアッセイ:ホルモン感受性リパーゼHSL及びリポプロテインリパーゼLPLは、VertesyetalJournalAntibiotics55480494に記載されたようにして、放射能標識トリオレイン液滴エマルジョンを使用して測定された。膵リパーゼPLは、5mMトリス/HClpH65、6mMタウロデオキシコール酸ナトリウム、150mMNaCl、1mMCaCl2溶液2ml中の025mmolのトリブチリンを、記録pHスタット1000rpm、25°Cで撹拌を用いてpHを65に調節しつつ、同じバッファー中のブタPL及びコリパーゼとインキュベーションすることによって定量した。PC-PLCは、10mMジパルミトイルレシチン02ml、10mMSDC01ml及び003MCaCl201mlをバクテリアPC-PLC50mMトリス/HCl、pH75、01BSAと、10分間、37°Cにてインキュベーションすることでアッセイした。反応は、50TCAを01ml、次いでクロロホルム/メタノール66/33/1、容量比を25ml加えることによって停止した。遠心分離1500×g、15分後、メタノール/水相約133mlの上部02ml部を除き、60HCIO405mlを補充し、次に170°Cで1時間加熱して、最終的に無機リン酸塩を分析した。哺乳類PI-PLCは、10mMPI0.1ml、08デオキシコール酸ナトリウム01ml、01BSA、100mMホウ酸ナトリウムpH7502ml、及びラット肝PI-PLCを20分間、37°Cでインキュベーションすることによって測定した。反応を停止し、PC-PLCで記載したようにして更に処理した。PLDを40mMHepes/KOHpH60、4mMCaCl2及びキャベツPLD溶液250μl中16mMU-14Cホスファチジルコリン約2000-4000dpm/nmolでアッセイした。30分間、37°Cにてインキュベーションの後、反応を、キャリアーホスファチジン酸含有クロロホルム/メタノール2/1、v/v5mlを加えて停止した。水可溶性物質を除去した後、最後の洗浄低クロロホルム相中に含有される脂質を、加熱活性化したシリカゲルプレートに転送し、第1次元方向にクロロホルム/メタノール/アンモニア65/35/4、体積比を使用し、第2次元方向にクロロホルム/アセトン/メタノール/酢酸/水50/20/10/10/5、体積比で2次元的に分離した。放射性ホスファチジン酸を蛍光イメージングにより検出した。PLA2を、1-パルミトイル-2-パルミトイル-sn-グリセロール-3-ホスホコリン/ビスボジピ-C11-PC/ホスファチジル-グリセロール/コレステロール10/005/2/3、体積比からなる単層リポソーム基質で、KimTSetalJBiolChem27225422550に従って定量した。濃度-反応曲線を、MarquardtLevenberg非線形最小二乗演算手法を使用してフィットさせた。対数直線軸にプロットするとき、この式はシグモイド曲線となるSigmaPlotSoftwareJandelScientific。カベオリンの免疫沈降:可溶性DIG上記を参照、5~20μgタンパク質は、プロテインA/G-セファロースでインキュベーションし、次いで遠心分離10000×g、5分間することにより事前に確かめた。上清を、10mMトリス/HClpH74、150mMNaCl、1TX-100の1ml中で、プロテインA/G-セファロースに前もって吸着させた抗カベオリン1抗体と4°Cにて1時間インキュベートした。免疫複合体を、同じバッファーで2回、次いでTX-100不含のバッファーで2回洗浄し、最後にβ-メルカプトエタノールなしで行うSDS-PAGEにかけた。免疫沈降カベオリンの回収は、膜の細片化に次いで、同じブロットの抗カベオリン抗体による均一免疫ブロッティングを行うことによって正常化された。免疫ブロット法:SDS-PAGEによって分離されたポリペプチドを、MuellerGetalMolCellBiol2145534567に記載されたように半乾燥法を用いてポリビニリデンジフルオライド膜に移した。洗浄した膜を抗カベオリン1抗体1:2000、抗pp59Lyn抗体1:1250、抗aP抗体1:500、抗5’-Nuc抗体1:750および抗IRS-1抗体1:2000を15°Cにて4時間インキュベートした。洗浄した膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した、ヤギ抗マウスIgG2次抗体1:2000又はヤギ抗ウサギIgG2次抗体1:4000とインキュベートした。標識したタンパク質を増強したケミルミネセンスによって可視化した。TX-114分配:ペレット化したhc/lcDIG10~50μgタンパク質又はGPI-PLC反応混合物05mlを、それぞれ氷冷TX-1141、25mMトリス/HClpH74、144mMNaCl溶液1ml中に懸濁することにより、又は氷冷TX-114205mlと混合することにより、BordierCJBiolChem27225422550に記載された、TX-114が豊富な相とTX-114が枯渇した相との間の分配を使用して、両親媒性タンパク質及び親水性タンパク質に分離した。氷上で1時間インキュベーションした後、混合物を氷上で025Mショ糖及び25mMトリス/HClpH74溶液04mlのクッション上に重層した。相分離を37°Cに暖め、次いで遠心分離10000×g、1分間することによって誘導した。下のTX-114が豊富な相の再抽出後、集めた上のTX-114が枯渇した相の一定量を5’-Nuc、aP及びAChE活性について測定するか、又は、SDS-PAGE分析用に沈殿15ポリエチレングリコール4000させた。グルコース輸送アッセイ:グルコース輸送を、50μl部分中、最終濃度50μM033μCi/mlの2-デオキシ-D-2,6-3Hグルコースとともに、洗浄した10000~20000個の脂肪細胞を、20μMサイトカラシンBの存在下又は非存在下において20分間、37°Cでインキュベーションすることにより、MuellerGetalJCellBiol12612671276に記載されたようにして定量した。種々の手順:電気せん孔法は、MuellerGetalMolCellBiol2047084723に記載されたようにして実施した。脂肪分解は、MuellerGetalBiochimie8512451256に記載されたようにして、前もって標識され、イソプロテレノール刺激をされた脂肪細胞からの、グリセロール又は蛍光NBD-FAの放出として測定した。Gce1は、MuellerGetalBiochemistry331214912159に記載されたようにして、可溶化原形質膜又はhc/lcDIG10~50μgタンパク質を8-N3-[32P]cAMPで光標識化し、次いで蛍光イメージングすることによって検出した。5’-Nuc、aP及びAChE活性は、EliakimRetalBiochimBiophysActa1355293302に従って測定した。タンパク質は、PierceRockfordILのBCAタンパク質測定キット、及び較正基準としてBSAを使用して測定した。SDS-PAGEは、前もって成型されたゲルNovexSanDiegoCA;10Bis-Tris分離ゲル、モルホリノプロパンスルホン酸-SDSランニングバッファーを使用して実施された。ルミイメージlumiimageは、ルミイメージャーLumiImagerソフトウエアRocheDiagnosticsを使用したルミイメージャーで評価した。リン光イメージ及び蛍光イメージは、Storm860PhosphorImagersystemを使用して処理し定量化した。図は、AdobePhotoshopソフトウエアAdobeSystemsMountainViewCAを使用して構築した。GPI-2350は、高力価及び選択性を有する種々の起源のGPI-PLC/Dを阻害する:精製した、又は、未精製のB.cereusPI-PLC、T.bruceiGPI-PLC及びラット血清GPI-PLDに対するGPI-2350の効果を、適切な条件下低又は高界面活性剤濃度で、GPI-2350の濃度を増加しつつ、部分的に精製した可溶化GPIタンパク質と共にそれらをインキュベーションすることによって観察した。次いで、総GPIタンパク質に対する、消化混合物中に脂肪分解的に切断されたGPIアンカーを内蔵する親水性GPIタンパク質の比率を、TX-114分配で界面活性剤が枯渇している相、及び分配前の総消化混合物、それぞれにおける酵素活性の測定によって定量した図2。GPI-2350は、細菌、トリパノソーマ及び血清GPI-PLC/Dを、それぞれ10、2及び1μMのIC50で、明らかに阻害した。GPI-2350は、又、酵素源として可溶化原形質膜、lcDIG又はhcDIGを、及び基質としてAChEを使用すると、ラット脂肪細胞GPI-PLCを02~05μMのIC50で遮断した。脂肪細胞GPI-PLCの切断特異性を明らかにするため、本発明者らは、ミオ-14C-イノシトールで代謝的に標識されたサッカロマイセスセレヴィシエスフェロブラストから調製したGPIタンパク質、Gce1を使用した。hcDIGとのインキュベーションで、親水性及び14C標識されたGce1が生成され、それはcIPに対して生じる抗CRD抗体と濃度及び時間依存的に免疫沈降したデータは示さない。脂肪酸アシル鎖を欠きcIPを内蔵するGPIタンパク質の、hcDIG依存的な生成により、ラット脂肪細胞の原形質膜にGPI-PLCの発現が確認された。次に、GPI-2350の選択性を試験した。種々の起源からのいくつかの天然リパーゼHSL、PL、LPL及び異なった特異性A2、C、DのPC/PI特異的ホスホリパーゼそしてウシAChEこれらは全ていわゆる触媒三点セットを経て作動することが知られているは、細菌、トリパノソーマ、血清及びラット脂肪細胞GPI-PLC/Dを60から95遮断する濃度50μM下では有意な影響は受けなかった図3。cIPの代わりにオープンopenを内蔵するGPI-2350の二つの誘導体2-デオキシ-2-フルオロ-scyllo-イノシトール-1-O-ドデシル-ホスホン酸GPI-1793及びミオ-イノシトール-1-O-ドデシル-ホスホン酸メチルエステルGPI-2349は、試験した最高濃度で脂肪細胞GPI-PLCに対して、それぞれ温和から非常に温和な効果を有するだけであったが、しかし、細菌及びトリパノソーマGPI-PLCを同程度の力価で阻害した表1。これらの知見は、安定した又は一過性の1,2-環状リン酸結合の生成を含む触媒機構における類似性を示しているが、しかしながら、細菌、トリパノソーマ及び脂肪細胞GPI-PLCの間の基質認識における幾分かの相異も示している。後者がcIP中間体を経由して作動、予備的な動態試験に基づいていると仮定すると、GPI-2350は拮抗阻害剤Ki=3~20μMとして作用することを仮定しなければならない。このことは、中性リパーゼ及び哺乳類PC/PI特異的ホスホリパーゼはGPI構造を認識しないので、その顕著な選択性を説明できるであろう。拮抗的作用機構に一致して、GPI-2350による細菌及びトリパノソーマGPI-PLCの半値阻害は、過剰の新鮮なGPIタンパク質基質との反応混合物の10倍希釈において完全に逆転した。対照的に、再単離及び充分な洗浄に先立って50μMGPI-2350で処理した脂肪細胞hcDIGは、GPI-2350非存在下でインキュベーションすると、精製した可溶化AChEに対しては、低い脂肪分解的切断のみを呈したデータは示さない。このことは、両親媒性GPI-2350のhcDIGとの相互作用により説明することができるであろう。あるいは、GPI-2350は、遷移状態類似体として作用し、脂肪細胞GPI-PLCの活性部位への一過性の共有結合を受けるのであろう。GPI-2350の環状リン酸結合がGPI-PLC/Dによって開環されるかどうかを知ることは、興味あることであろう。GPI-2350は、単離されたDIG及び無処置の脂肪細胞においてGPIタンパク質のインスリン誘導及びグリメピリド誘導切断をブロックする:GPI-2350及びGPI-PLCの両者が別々の複合体それぞれ、界面活性剤ミセル及びDIGで存在するとき、インビトロにおける脂肪細胞原形質膜GPI-PLCによるGPIタンパク質の切断に対するGPI-2350の介入の観察に基づいて、次に、基質としての内因性又は外因性GPIタンパク質の無処置の脂肪細胞及び単離されたDIGにおける基本的及び促進されたGPI-PLC活性に対するGPI-2350の効果について試験した図4。単離されたラット脂肪細胞において、GPI-PLC活性内因性5’-Nuc、Gce1及びaPの切断として、それらの両親媒性から親水性への変換の観察が伴うは、グリメピリド及びインスリンの両者によってそれぞれ、5倍及び3倍まで促進されたパネルE、G。促進は、これらの前処置した脂肪細胞から調製されたhcDIGにおいて部分的に保存されていたパネルCそれぞれ、3倍及び17倍。GPI-PLCは、グリメピリドで処理されなかった脂肪細胞から調製されたhcDIGの直接インキュベーションにより際だって活性化されたが、インスリンではそうでなかったパネルA。GPI-2350は、基本よりも低く、そして単離されたhcDIG及び未処理の脂肪細胞の両者において同じようなレベルで、濃度依存的に基本のGPI-PLC活性を減少させ、同様にグリメピリド及びインスリン誘導GPI-PLC活性を減少させた図4、全てのパネル。阻害剤がインスリン又はグリメピリドとのインキュベーションより前に、及びインキュベーションの間に存在していたので、明らかにGPI-2350は、GPI-PLCの活性を妨害しないパネルC、E。未処理の脂肪細胞でアッセイする場合、GPI-PLCの阻害のIC50は5~10μM、パネルFは、単離された未処理のhcDIGに比較してより高く1μM、パネルB、D、同様に可溶化hcDIG及び原形質膜02~05μM、図2に比較して、より高かった。このことは、単離されたDIGと比較して未処理の脂肪細胞の原形質膜においてDIGの中に埋め込まれた場合、GPI-2350に対してGPI-PLCの触媒部位の接近し易さが損傷されたことを反映しているのであろう。しかし、GPI-PLCの主要な基質、GPI脂質及びタンパク質アンカーは原形質膜の外小葉に局在化しており、そしてGPI-2350はGPI-PLCの触媒部位の拮抗阻害剤として作用しているようであるので上記を参照、その両親媒性を基本として、むしろ高いと予測されている、GPI-2350の細胞透過性の必要性は、多分除外することができる。むしろ、DIGの液体定序ドメインよりもむしろ非DIG領域の無秩序ドメインへ選択的に分配される界面活性剤に類似している脂肪細胞原形質膜総細胞表面の80~90を含むの非DIG領域に、GPI-2350はそのドデシル鎖を経て自然に分配されることが考えられる。DIG及び原形質膜の単離に使用された実験的条件下で、単離された総原形質膜中のGPI-PLC活性の65~85外因性AChEの切断として測定が、脂肪細胞の処理に関係なくDIG即ち、hcDIGプラスlcDIGにより回復した。同様の回復が、典型的なDIGマーカータンパク質、カベオリン170~90免疫ブロット法により定量した、及びDIG常在性タンパク質、p11555~75合成PIGの結合により定量したについて観察された。更に、区別を付けて処理した脂肪細胞からDIGhcDIGプラスlcDIGで回復したaP、5’-Nuc及びGce1の総量両親媒性プラス親水性のものは、おおよそ一定基準を100と設定して90~140であって、このことは種々の条件下でDIGの単離手順の再現性を明示している。単離されたhcDIGは、lcDIG及び非DIG領域よりも比較的低いタンパク質含量により特徴づけられているので、GPI-PLCは、残りの原形質膜に対してhcDIGが非常に豊富であり、GPIタンパク質基質の局在化と一致している。DIG内にGPIアンカーされた及びアシル化されたシグナル伝達タンパク質の再分配にはラット脂肪細胞におけるGPI-PLC作用を必要とする:次に、GPIタンパク質の脂肪分解的切断の阻害が、脂肪細胞原形質膜のDIG内でGPIアンカーされた及びアシル化されたシグナル伝達タンパク質の局在及び刺激依存性再分配に影響するかどうかを研究した。このために、グリメピリドで処理する前にGPI-2350の非存在下又は存在下でインキュベートした脂肪細胞からhc/lcDIGを調製し、次いでいくつかのGPIアンカーされた又はアシル化されたシグナル伝達タンパク質の存在につき分析した図5。基本の脂肪細胞に比べてhcDIGの量の70から90の損失に相当する、lcDIGの量の3から5倍の増加に見られるように、グリメピリドに反応したhcDIGからlcDIGへのpp59Lyn、Gce1及び5’-Nucのしっかりした再分配は、GPI-2350の最大有効濃度の存在下で殆んど完全に止められた。対照的に、lcDIGに対してhcDIGにおいて、hcDIG常駐タンパク質であるカベオリン1及びIRβが比較的豊富であること、並びにhcDIG及びlcDIGにおいてグルコース輸送体イソ型4Glut4が同様に多量であることの両者は、グリメピリドに影響されず、GPI-2350の存在下で顕著には変化しなかった図5。このことはGPI-PLCの強力な阻害は、DIGの構造における一般的且つ非特異的変化をもたらすよりはむしろhcDIGからlcDIGへの、Gce1及びpp59Lynのような、ある種の脂質修飾シグナル伝達タンパク質の刺激依存性転移を、特異的に妨げることを明らかにしている。次に、GPI-PLCの作用とGPIタンパク質の再分配の間の推定因果関係、即ち脂肪分解的切断及び/又は非切断GPIタンパク質は、刺激された単離ラット脂肪細胞において、実際にlcDIGに転移するのか否か、の根底にあるメカニズムを研究した。このために、ラット脂肪細胞をGPI-2350と共に、又は、無しにインキュベートし、インスリン又はグリメピリドを作用させた。総原形質膜、hcDIG及びlcDIGから回収されたGPIタンパク質、即ち5’-Nuc、aP及びGce1の親水性型及び両親媒性型の量は、TX-114分配によって定量された表2。インスリン及びより強力なグリメピリドでの処理は、GPI-2350によって完全にブロックされた原形質膜の親水性GPIタンパク質の増加をもたらし、効率的なGPI-PLC阻害を示している。インスリン及びグリメピリドの両者に応じて、親水性GPIタンパク質の量の増加が、もっぱらhcDIGにおいてのみ検出され、同じ位置での両親媒性型の減少を伴っていた。これらの変化は、GPI-2350の存在下で更に低い基本値に逆転し、この両親媒性から親水性への変換という脂肪分解性を示していた。それ故、hcDIGでのインスリン/グリメピリド促進GPI-PLCによって生成する親水性GPIタンパク質は、GPIアンカーによらない分子機構を経てhcDIGに関連して残る表2。興味深いことに、hcDIGからlcDIGへの5’-Nuc、Gce1及びaPのグリメピリド誘導再分配図5参照は非切断型に限定され、両親媒性においては3から4倍上昇したレベルであるが、lcDIGで回復した親水性GPIタンパク質では変らない低レベルであることを反映していたが、それにもかかわらず、GPI-2350によって完全に除去されていた表2。対照的に、親水性5’-Nuc、Gce1及びaPのインスリン誘導生成は、lcDIGで両親媒性の対応物の非常にゆるやかな増加有意差の限界を伴ったのみであったが、それは再びGPI-2350の存在で排除された。試験した3つのGPIタンパク質全てが、ほんの少しの量的差異だけで、もっぱら、刺激依存性脂肪分解的切断と両親媒性型の再分配との間に相関性を示した表2。総合すると、hcDIGで脂肪分解的に切断されたGPIタンパク質の生成及び蓄積のためのGPI-PLC活性化が必要であるグリメピリド。GPI-PLCの阻害は、GPIアンカー型及びアシル化シグナル伝達タンパク質のカベオリンからの解離を妨げる:ラット脂肪細胞におけるhcDIGからlcDIGへのシグナル伝達タンパク質の再分配は、最近、カベオリン1からの解離と活性化を伴うことが示されている。次に、GPI-PLCを阻害することによるラット脂肪細胞における、カベオリンからの解離/活性化と、GPIタンパク質の刺激依存性脂質分解的切断との間の推定因果関係、及び、それに続いて、Gce1とpp59Lynのカベオリン1との相互関係、及び後者のキナーゼ活性の解析が研究された図6。単離及び可溶化されたhcDIGから調製されたカベオリン1免疫沈降物からのpp59Lyn及びGce1の両者のインスリン誘発最大損失35~45及びグリメピリド誘発最大損失75~85最大損失は、5~10μMのIC50図6、パネルBを有するGPI-235050μM:図6、パネルAによって完全に妨げられた。この力価は、未処理の脂肪細胞におけるGPI-2350によるGPI-PLC阻害に類似している図3。非受容体チロシンキナーゼのようなシグナル伝達タンパク質のカベオリン結合ドメインCBDへのカベオリン1の足場scaffoldingドメインCSDの結合、及び、逆に、CBDへの結合からのCSDの除去は、全ての場合ではないが多くの場合、インビトロアッセイにおけるシグナル伝達タンパク質の不活化及び活性化のそれぞれの引き金を引くことが示された。このことは、原形質膜DIGで作動しているシグナル伝達における、CSD-CBD相互関係の調節機能を暗示している。ラット脂肪細胞におけるGPI-PLCの阻害は、グリメピリドの代謝活性をダウンレギュレートするがインスリンはされない:次いで、インスリン及びグリメピリドに反応したIRS-1チロシンリン酸化におけるGPI-PLC阻害の差動効果が、インスリン標的細胞における代謝活性に反映するか否かを研究した。このために、単離したラット脂肪細胞を、どちらかの刺激で作用させる前にGPI-2350で前処理し、次いでグルコース輸送及びイソプロテレノール誘導脂肪分解についてアッセイした図8。グリメピリドによるグルコース輸送の促進及びイソプロテレノール誘導脂肪分解の阻害は、GPI-2350の存在下、濃度依存的様式IC50=2~5μMで対照値50μMでよりも低く損なわれた。従って、グリメピリド濃度-反応曲線は右に移動し、阻害剤がない場合と比較してGPI-23505μMによるGPI-PLCの最大半量阻害の途中で平坦になった。対照的に、グルコース輸送のインスリンによる促進及びイソプロテレノール誘導脂肪分解の阻害は、グリメピリドに比較して2から3倍、より顕著であるが、50μMで、GPI-2350のみによってそれぞれ最大25及び33減少した図8。これらのGPI-PLC阻害の差動効果は、蛍光脂肪酸誘導体で前もって標識したラット脂肪細胞からのグリセロールに代わってNBD-FAの放出として測定した場合、グリメピリド及びインスリンによるイソプロテレノール誘導脂肪分解の阻害に対するGPI-2350の効果の分析によって確認された図9。グリメピリドIC50=3μMの濃度増加に反応してイソプロテレノール誘導脂肪細胞から放出された酸化分解産物を包含するNBD-FAの量の減少は、50μMグリメピリドの存在で完全に消失されたパネルA、B。対照的に、NBD-FA及び分解産物放出のインスリン阻害は、インスリンに対する見かけのIC50の少しの増加01対03μMを伴うGPI-235050μMのみによって、最大25~30損なわれた。GPI-PLC阻害に対するこれらGPI-2350媒介効果の特異性は、ラット肝PI-PLC及びハチ毒PLA2の阻害剤の損傷によって、基本的な及びグリメピリド調節グルコース輸送及び脂肪分解に顕著に影響を与えることで確認された図8。最後に、DIG内でGPIタンパク質の再分配に依存性であるか、無関係であるかのいずれかである、グリメピリド以外のインスリン模倣刺激のシグナル伝達におけるGPI-PLCの関与について調べた。ラット脂肪細胞において、m-β-CDを用いたコレステロール枯渇によるhcDIGの崩壊、トリプシン/塩/NEM処理によるPIG受容体p115の不活化又は合成リガンドPIG41でのp115の占拠は、lcDIGでの5’-Nucの顕著な増加及びグルコース輸送活性化を導いた表3。対照的に、オルトバナジウム酸ナトリウム及び合成CBDPはlcDIGへの5’-Nuc転位の同時誘導なしにグルコース輸送を促進した。このことは、よく知られている、チロシンホスファターゼ阻害剤、バナジウム酸塩によるインスリン受容体及びIRS-1脱リン酸化、及びCBDPによるpp59Lyn及びIRS-1チロシンリン酸化の直接促進といった作用機序に一致している。これらの刺激によるIRS-1チロシンリン酸化でもなくグルコース輸送でもない促進表3は、GPI-2350の存在下で顕著に影響され、それらは全てGPI-PLCの下流の点でグルコース輸送システムにクロストークしていることを暗示している。表の説明表1:GPI-PLC阻害剤の特徴。表2:hcDIG、lcDIG及び総原形質膜における脂肪分解的切断及び非切断GPIタンパク質の局在化に対する、インスリン、グリメピリド及びGPI-2350の効果。表3:ラット脂肪細胞における種々のインスリン模倣刺激によって誘導される5’-Nuc転位及びグルコース輸送に対するGPI-2350の効果。表についての説明表1:ラット脂肪細胞由来のhcDIGのGPI-PLC、T.brucei由来GPI-PLC及びB.cereus由来PI-PLCを、適切な条件下で指示した阻害剤の増加する濃度005μM~1mMのない場合とある場合における、可溶化した及び部分精製ウシ赤血球AChE又はヒト胎盤aPとインキュベートした材料と方法を参照。切断率は、親水性AChEの量及びTX-114分配の際TX-114枯渇相で回復したaP活性から計算した。少なくとも3回の独立したインキュベーションと分配/4回の酵素アッセイ、から得られた平均SDを記した。n.a.:該当なし。表2:単離したラット脂肪細胞を、GPI-235050μMなし又はありで処理し5分間、37°C、次いで指示したように、グリメピリド20μM又はインスリン10nMの非存在下又は存在下にインキュベートした120分間、37°C。総原形質膜PM、hcDIG及びlcDIGを調製し、次いでTX-114分配にかけた。TX-114豊富相及び枯渇相を5’-Nuc及びaP活性測定及びGce1光親和性標識についてアッセイした。両親媒性及び親水性GPIタンパク質の量は、GPI-2350の非存在下に基本の脂肪細胞から調製した、総原形質膜及びhcDIGの両親媒性型のそれぞれに対して計算した各100arb単位に設定した。hcDIGプラスlcDIGからの親水性及び両親媒性GPIタンパク質の回収は、種々のインキュベーション条件下で同程度であった。少なくとも3回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれ活性測定及びゲルランを2回行って、平均±SDを得た。表3:単離したラット脂肪細胞を、メチル-β-シクロデキストリンm-β-CD、10mM、50分間、CBDP300μM、電気穿孔法、次いで、洗浄及びそれに続く30分間のインキュベーション、PIG4110μM、15分間、オルトバナジウム酸ナトリウム1mM、15分間、トリプシン10μg/ml、15分間、次いで05MNaCl処理及びそれに続く洗浄及びN-エチルマレイミド1mM、5分間、次いでDTTの添加の存在下でインキュベートした。脂肪細胞懸濁液の半分にGPI-2350最終濃度50μMを加え、更にインキュベーション60分間、37°Cの後、細胞の一部分を、単離したlcDIG中の5’-Nuc活性についてアッセイした。基本的なインキュベーション中の5’-Nucの増加を100arb単位に設定した。細胞の別の部分は15分間のインキュベーション後、基本のインキュベーションについて100arb単位に設定したグルコース輸送につきアッセイした。少なくとも3回独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれ3回ずつ活性を測定して、平均SDを得た。"