洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のためのズブチラーゼ変異体の使用であって、位置95~103BASBPNナンバリングの活性部位ループb領域に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基を含むズブチラーゼ変異体の使用。追加のアミノ酸残基が、位置95と96、位置96と97、位置97と98、位置98と99、位置99と100、位置100と101、位置101と102、位置102と103、位置103と104の間およびそれらの組合せから成る群から選択される位置に挿入されている請求項1記載の使用。追加のアミノ酸残基が、位置98と99の間および99と100の間から成る群から選択される位置に挿入されている請求項2記載の使用。変異体が、本明細書中の実施例4に開示された卵抑制検定で試験された場合、少なくとも10、例えば少なくとも15、好ましくは少なくとも20、さらに好ましくは少なくとも25の残留活性を有する請求項1~3のいずれかに記載の使用。位置98と99の間の挿入がX98XA、X98XT、X98XGおよびX98XSから成る群から選択される請求項1~4のいずれかに記載の使用。位置99と100の間の挿入がX99XD、X99XE、X99XKおよびX99XRから成る群から選択される請求項1~4のいずれかに記載の使用。変異体が少なくとも1つのさらなる修飾を含む前記請求項のいずれかに記載の使用。さらなる修飾が、位置99における置換、位置133における置換、位置143における置換、位置167における置換、位置170における置換、位置194における置換、位置42と43の間の挿入、位置129と130の間の挿入、位置216と217の間の挿入、位置217と218の間の挿入およびそれらの組合せから成る群から選択される位置において実施される請求項7記載の使用。変異体が以下の:位置98と99の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置133および143における置換をさらに含む変異体、位置99と100の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置99における置換をさらに含む変異体、位置98と99の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置167、170および194における置換をさらに含む変異体、位置99と100の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置216と217の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体、位置99と100の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置217と218の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体、位置99と100の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置42と43の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体、ならびに位置99と100の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置129と130の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体から成る群から選択される請求項8記載の使用。親ズブチラーゼがIS1亜群に属する前記請求項のいずれかに記載の使用。親ズブチラーゼがBSS168、BASBPN、BSSDYおよびBLSCARまたはIS1亜群の特徴を保有しているそれらの機能的変異体から成る群から選択される請求項10記載の使用。親ズブチラーゼがIS2亜群に属する請求項1~9のいずれかに記載の使用。親ズブチラーゼがBLS147、BLSAVI、BAPB92、TVTHERおよびBYSYABまたはIS2亜群の特徴を保有している機能的変異体から成る群から選択される請求項12記載の使用。親ズブチラーゼがBLSAVI配列番号1である請求項13記載の使用。変異体がS99SDS99Aである請求項14記載の使用。変異体がS99SRS99Tである請求項14記載の使用。変異体がA98ASA133ET143Kである請求項14記載の使用。変異体がA98ATY167AR170SA194Pである請求項14記載の使用。変異体がS99SDS99AP129PDである請求項14記載の使用。変異体がS99SDS99AS216SPである請求項14記載の使用。変異体がS99SDS99AS216SDPである請求項14記載の使用。変異体がS99SDS99SAL217LPである請求項14記載の使用。変異体がS99SDD42DNである請求項14記載の使用。変異体がS99SDS99AD42DNである請求項14記載の使用。以下の:位置98と99の間の少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入に対応する活性部位bループ中に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基を含み、そして少なくとも1つの追加の修飾をさらに含む変異体BASBPNナンバリング、位置99と100の間の少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入に対応する活性部位bループ中に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基を含み、そして少なくとも1つの追加の修飾をさらに含む変異体BASBPNナンバリング、から成る群から選択されるズブチラーゼ変異体であって、本明細書中の実施例4に開示された卵抑制検定で試験された場合、少なくとも10、の残留活性を有する変異体。変異体が少なくとも15、好ましくは少なくとも20、さらに好ましくは少なくとも25の残留活性を有する請求項25記載の変異体。請求項9~24のいずれかに記載されているような特徴を有する請求項25~26記載の変異体。請求項9~24のいずれかで限定されるようなズブチラーゼ変異体。請求項25~28のいずれかで限定されるようなズブチラーゼ変異体をコードする単離されたDNA配列。請求項29の単離されたDNA配列を含む発現ベクター。請求項30の発現ベクターで形質転換される微生物宿主細胞。細菌、好ましくはバシラス属、特にBlentusである請求項31記載の微生物宿主細胞。真菌または酵母、好ましくは糸状真菌、特にアスペルギルス属である請求項31記載の微生物宿主細胞。請求項31~33のいずれかに記載の宿主が前記変異体の発現および分泌を行なう条件下で培養され、変異体が回収される請求項25~27のいずれかに記載のズブチラーゼ変異体の製造方法。請求項25~28のいずれかに記載の変異体を含む清浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物。セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、別のプロテアーゼ、アミラーゼまたはそれらの混合物をさらに含む請求項35記載の組成物。清浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯および/または食器洗浄用組成物中の請求項25~28のいずれかで限定されるような変異体の使用。硬質表面または洗濯物からの卵の染みの除去方法であって、卵の染み含有硬質表面または卵の染み含有洗濯物を、位置95~103BASBPNナンバリングからの活性部位ループb領域中に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基を含むズブチラーゼ変異体を含有する清浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物と接触させることを包含する方法。変異体が請求項2~24のいずれかで限定されるような特徴を有する請求項38記載の方法。組成物がセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、別のプロテアーゼ、アミラーゼまたはそれらの混合物をさらに含む請求項38~39のいずれかに記載の方法。洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のための、位置95~103BASBPNナンバリングからの活性部位ループb領域中に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基を含むズブチラーゼ変異体を含有する清浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物の使用。変異体が請求項2~24のいずれかで限定されるような特徴を有する請求項41記載の使用。組成物がセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、別のプロテアーゼ、アミラーゼまたはそれらの混合物をさらに含む請求項41~42のいずれかに記載の使用。定義本発明をさらに詳細に考察する前に、以下の用語および慣例を先ず定義する。変異体の名称に関する命名法および慣例本発明により製造または意図される種々のズブチラーゼ酵素変異体を説明する場合、参照を容易にするために以下の命名法および慣例が適応されてきた:参照の枠は、単離または親酵素をズブチリシンBPN‘BASBPNと一列に並べることにより先ず定義される。アラインメントは、以下のパラメーター:ギャップ作製ペナルティー=8およびギャップ延長ペナルティー=8ならびにそれらのデフォルト値に保持される全てのその他のパラメーターを用いて変異体をナンバリングするためにGCGパッケージバージョン91のGAPルーチンにより得られる。別の方法は、ズブチラーゼ間の既知のアラインメント、例えばWO9100345に示されたアラインメントを使用することである。ほとんどの場合、差はいかなる重要性も有さない。それにより多数の欠失および挿入がBASBPNに関連して定義される。図1において、ズブチリシン309サビナーゼ登録商標は、BASBPNと比較して、位置36、58、158、162、163および164に6つの欠失を有する。これらの欠失は、図1において、星印で示されている。親酵素において実施される種々の修飾は、概して、以下のような3つの素子を用いて示される:もとのアミノ酸位置置換アミノ酸したがって表示G195Eは、位置195におけるグリシンのグルタミン酸による置換を意味する。もとのアミノ酸残基が任意のアミノ酸残基であり得る場合には、略記表示が用いられて、位置および置換アミノ酸のみを示す:位置置換アミノ酸このような表示法は、同種ズブチラーゼにおける修飾単数または複数に関連して特に当てはまる下記を参照。同様に置換中のアミノ酸残基単数または複数の同定が実体のない場合には:もとのアミノ酸位置もとのアミノ酸単数または複数および置換アミノ酸単数または複数の両方が任意のアミノ酸を含み得る場合には、その位置は例えば:170と示される。もとのアミノ酸単数または複数および/または置換アミノ酸単数または複数が1つより多いがしかし全てというわけではないアミノ酸単数または複数を含み得る場合には、選定アミノ酸は括弧の内側に示される:もとのアミノ酸位置{置換アミノ酸1、、置換アミノ酸n}特定の変異体に関しては、任意のアミノ酸残基を示すために特定の三または一文字表記、例えば表記XaaおよびXが用いられる。置換:位置195におけるグリシンに代わるグルタミン酸の置換は以下のように示され:Gly195GluまたはG195Eあるいは位置195におけるグリシンに代わる任意のアミノ酸残基の置換は以下のように示される:Gly195XaaまたはG195XあるいはGly195またはG195。したがって位置170における任意のアミノ酸残基に代わるセリンの置換は、以下のように示される:Xaa170SerまたはX170Sあるいは170Serまたは170S。このような表示法は、同種ズブチラーゼにおける修飾単数または複数に関連して特に当てはまる下記を参照。したがって170Serは、例えばBASBPNにおけるLys170Ser修飾およびBLSAVIにおけるArg170Ser修飾の両方を含むことを意味する図1を参照。もとのアミノ酸単数または複数および/または置換アミノ酸単数または複数が1つより多いがしかし全てではないアミノ酸単数または複数を含み得る修飾に関しては、位置170におけるアルギニンに代わるグリシン、アラニン、セリンまたはトレオニンの置換は、以下のように示されて:Arg170{Gly、Ala、Ser、Thr}またはR170{G、A、S、T}、以下の変異体を示す:R170G、R170A、R170SおよびR170T。欠失:位置195におけるグリシンの欠失は、以下により示される:Gly195またはG195。同様に、1つより多いアミノ酸残基の欠失、例えば位置195および196におけるグリシンおよびロイシンの欠失は、以下のように示される:Gly195Leu196またはG195L196。挿入:G195後の追加のアミノ酸残基、例えばリシンの挿入は、以下により示される:Gly195GlyLysまたはG195GK、あるいはG195後に1つより多いアミノ酸残基、例えばLys、AlaおよびSerが挿入される場合、これは以下のように示される:Gly195GlyLysAlaSerまたはG195GKAS配列番号1。このような場合、挿入アミノ酸残基単数または複数は、挿入アミノ酸残基単数または複数に先行するアミノ酸残基の位置番号への小文字の付加によりナンバリングされる。前記の例において、配列194~196はしたがって以下のようである:194195196BLSAVIAGL194195195a195b195c196変異体AGKASL配列番号16既存のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基が挿入される場合、命名法における縮重が起こることは明らかである。例えば前記の例におけるグリシンの後にグリシンが挿入される場合、これはG195GGにより示される。同一の実際の変化は全く同様に、以下の:194195196BLSAVIAGLから、194195195a196変異体AGGL配列番号27194194a195196への変化に関してA194AGとして示され得る。このような例は当業者には明らかであり、表示G195GGおよびこの型の挿入に関する対応する表示は、したがって、このような等価の縮退表示を含むことを意味する。ギャップの埋め:酵素における欠失が、ナンバリングのために用いられるズブチリシンBPN配列との参照比較において存在する場合、このような位置での挿入は、位置36におけるアスパラギン酸の挿入に関しては以下のように示される:36Aspまたは36D。多重修飾:多重修飾を含む変異体は、例えば以下のようににより分離され:Arg170TyrGly195GluまたはR170YG195Eこれは位置170および195においてそれぞれアルギニンおよびグリシンに代えてチロシンおよびグルタミン酸を置換する修飾を表す。したがってTyr167{Gly、Ala、Ser、Thr}Arg170{Gly、Ala、Ser、Thr}は、以下の変異体を示す:この命名法は、特定の共通特性を有するアミノ酸残基、例えば正荷電K、R、H、負荷電D、Eの残基を置換、取替え、挿入または欠失するのを目指した修飾、あるいは小アミノ酸を別の小アミノ酸に置換することを意味する、例えばTy167{Gly、Ala、Ser、Thr}Arg170{Gly、Ala、Ser、Thr}の保存的アミノ酸修飾単数または複数に関して特に当てはまる。さらなる詳細に関しては、本発明の詳細な説明の節を参照されたい。プロテアーゼタンパク質基質におけるアミド結合を切断する酵素は、プロテアーゼまたは互換可能的にペプチダーゼと分類されるWalsh1979EnzymaticReactionMechanismsWHFreemanandCompanySanFransiscoChapter3参照。アミノ酸位置/残基のナンバリング別記しない限り、本明細書中で用いられるアミノ酸ナンバリングはズブチラーゼBPNBASBPN配列のナンバリングに対応する。BPN’配列をさらなる説明のためには、図1またはSiezenetalProteinEngng4719737を参照されたい。セリンプロテアーゼセリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、活性部位に必須セリン残基が存在する酵素であるWhiteHandlerandSmith1973PrinciplesofBiochemistryFifthEditionMcGrawHillBookCompanyNYpp271272。細菌セリンプロテアーゼは、20000~45000ダルトン範囲の分子量を有する。それらはジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。それらは単純な末端エステルを加水分解し、真核生物キモトリプシンこれもセリンプロテアーゼの1つであると活性が類似している。さらに範囲を狭めた用語であり、亜群を包含するアルカリ性プロテアーゼは、いくつかのセリンプロテアーゼの高pH最適条件を反映するPriestBacteriologicalRev41711753参照。ズブチラーゼズブチラーゼと仮に呼ばれるセリンプロテアーゼの一亜群が、SiezenetalProteinEngng4719737およびSiezenetalProteinScience6501523により提唱されている。それらは、ズブチリシン様プロテアーゼと従来は呼ばれたセリンプロテアーゼの170より多いアミノ酸配列の相同性分析により限定される。ズブチリシンは、従来はしばしば、グラム陽性細菌または真菌により産生されるセリンプロテアーゼと定義され、そしてSiezen等によれば、現在は、ズブチラーゼの一亜群である。広範な種々のズブチラーゼが同定されており、多数のズブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。このようなズブチラーゼおよびそれらのアミノ酸配列のさらに詳細な説明に関しては、Siezenetal1997を参照されたい。ズブチラーゼの一亜群であるIS1または真のズブチリシンは、古典的ズブチリシン、例えばズブチリシン168BSS168、ズブチリシンBPN配列番号38、ズブチリシンCarlsbergアルカラーゼ登録商標、NOVONORDISKASおよびズブチリシンDYBSSDYを含む。ズブチラーゼのさらに別の亜群であるIS2または高アルカリ性ズブチリシンは、Siezen等上記により認識されている。亜群IS2プロテアーゼは高アルカリ性ズブチリシンとして記載されており、ズブチリシンPB92BAALKPマキサカル登録商標、GistBrocadesNV、ズブチリシン309配列番号49サビナーゼ登録商標、NOVONORDISKAS、ズブチリシン147BLS147エスペラーゼ登録商標、NOVONORDISKASおよびアルカリ性エラスターゼYaBBSEYABのような酵素を含む。サビナーゼ登録商標サビナーゼ登録商標は、NOVONORDISKASにより市販されている。それはBLentusからのズブチリシン309であり、1つの位置においてのみBAALKPと異なるN87S、本明細書中の図1参照。サビナーゼ登録商標は、図1においてbで示された、そして配列番号49で示されるようなアミノ酸配列を有する。親ズブチラーゼ親ズブチラーゼという用語は、Siezen等1991および1997により定義されたズブチラーゼを意味する。さらなる詳細に関しては、すぐ上のズブチラーゼの説明を参照されたい。親ズブチラーゼは天然供給源から単離されたズブチラーゼでもあり得るが、この場合、ズブチラーゼの特徴を保持しながら、その後の修飾がなされてきた。さらに親ズブチラーゼは、JENessetalNatureBiotechnology17893896に記載されているようなDNAシャッフリング技法により調製されてきた。あるいは親ズブチラーゼという用語は、野生型ズブチラーゼと呼ばれ得る。ズブチラーゼ変異体の修飾単数または複数本明細書中で用いられる修飾単数または複数という用語は、ズブチラーゼの化学的修飾、ならびにズブチラーゼをコードするDNAの遺伝子操作を含むよう定義される。修飾単数または複数は、アミノ酸側鎖単数または複数の取替え、当該アミノ酸単数または複数中のまたはそこでの置換単数または複数、欠失単数または複数および/または挿入であり得る。ズブチラーゼ変異体本発明の情況において、ズブチラーゼ変異体または突然変異化ズブチラーゼという用語は、もとのまたは親遺伝子を保有し、対応する親酵素を産生する親微生物由来の突然変異体遺伝子を発現中の生物体により産生されたズブチラーゼを意味し、親遺伝子は、前記の突然変異化ズブチラーゼプロテアーゼが適切な宿主中で発現される場合に産生される突然変異体遺伝子を産生するために、突然変異化されている。相同ズブチラーゼ配列特定の活性部位ループ領域およびサビナーゼ登録商標ズブチラーゼの前記のループ中のアミノ酸挿入は、本発明のズブチラーゼ変異体を得るために本明細書中の修飾に関して同定される。しかしながら本発明はこの特定のズブチラーゼの修飾に限定されないが、しかしサビナーゼ登録商標との相同一次構造を有するその他の親野生型ズブチラーゼに及ぶ。2つのアミノ酸配列間の相同は、この情況においては、パラメーター同一性により説明される。2つのズブチラーゼ間の同一性の程度を確定するために、GCGパッケージバージョン91のGAPルーチンが、同一設定を用いて適用され得る下記。ルーチンからの出力は、アミノ酸アラインメントの他に、2つの配列間の同一性パーセントの算定である。この説明に基づいて、当業者が適切な相同ズブチラーゼおよび本発明により修飾され得る対応する相同活性部位ループ領域を同定することはルーチンである。単離されたDNA配列単離されたという用語は、DNA配列分子に適用される場合、DNA配列がその天然遺伝子環境から除去されており、したがってその他の外来のまたは望ましくないコード配列を含有せず、遺伝子工学処理タンパク質産生系内での使用に適した形態である。このような単離分子はそれらの天然環境から分離されたものであり、それらの例としては、cDNAおよびゲノムクローンが挙げられる。本発明の単離されたDNA分子は、それらが普通は会合されないその他の遺伝子を含有しないが、しかし天然5および3非翻訳化領域、例えばプロモーターおよびターミネーターを含み得る。会合領域の同定は、当業者には明らかである例えば、DynanandTijanNature316774781985参照。単離されたDNA配列という用語は、あるいはクローン化されたDNA配列と呼ばれ得る。単離されたタンパク質タンパク質に適用される場合、単離されたという用語は、タンパク質がその生来の環境から除去されていることを示す。好ましい形態では、単離タンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク質即ち、同種不純物を実質的に含有しない。単離されたタンパク質は、SDSPAGEにより確認した場合、純度が10より高い、好ましくは20より高い、さらに好ましくは30より高い。さらに、高精製形態で、即ちSDSPAGEにより確認した場合に、40より高い純度で、60より高い純度で、80より高い純度で、さらに好ましくは95より高い純度で、最も好ましくは99より高い純度でタンパク質を提供するのが好ましい。単離されたタンパク質という用語は、あるいは精製されたタンパク質と呼ばれ得る。同種不純物同種不純物という用語は、本発明のズブチラーゼが最初に得られる同種細胞から生じる任意の不純物例えば本発明のズブチラーゼとは別のポリペプチドを意味する。~から得られる~から得られるという用語は、特定の微生物供給源と結び付けて本明細書中で用いる場合、特定供給源により、または供給源からの遺伝子が挿入されていた細胞によりポリヌクレオチドおよび/またはズブチラーゼが産生されることを意味する。基質プロテアーゼに対する基質と結びつけて用いられる基質という用語は、その最も広い形態において、ズブチリシンプロテアーゼによる加水分解を受け易い少なくとも1つのペプチド結合を含有する化合物を含むと解釈されるべきである。生成物プロテアーゼ酵素反応から得られる生成物と結び付けて用いられる生成物という用語は、本発明の情況においては、ズブチラーゼプロテアーゼを包含する加水分解反応の生成物を含むと解釈されるべきである。生成物は、その後の加水分解反応における基質であり得る。洗浄性能本発明の情況においては、洗浄性能という用語は、例えば洗浄または硬質表面清浄化中に清浄にされる対象物上に存在する卵の染みを除去する酵素の能力として用いられる。本明細書中の実施例3中のモデル洗剤洗浄性能試験も参照されたい。性能係数性能係数という用語は、以下の式に関して定義される:P=R変異体-R親式中、Pは性能係数であり、R変異体はモデル洗剤洗浄性能試験に記載されたようなズブチラーゼ変異体で処理された後の被験物質の反射率460nmで測定であり、そしてR親はモデル洗剤洗浄性能試験に記載されたような対応する親ズブチラーゼで処理された後の被験物質の反射率460nmで測定である。さらなる詳細に関しては、本明細書中のモデル洗剤洗浄性能試験を参照されたい。残留活性残留活性という用語は、本明細書中の卵抑制検定に記載されているように定義される。本発明の詳細な説明本発明は、活性部位ループb領域が現在知られているものより長いズブチリシン変異体が、卵の染み除去に関して洗浄性能改良を示す、ということが判明した。その同定は、親野生型酵素と比較してモデル洗剤組成物における洗浄性能特性改良を示すズブチリシン変異体、特にズブチリシン309BLSAVIまたはサビナーゼ登録商標の構築に際して成された。いかなる特定の理論にも限定されずに考えると、現在、作用改良は、ズブチラーゼ変異体の活性部位ループb領域における卵白阻害剤の結合の妨害による。これは次に、恐らくは、酵素のこの特定の部位における1つまたはそれ以上の追加のアミノ酸残基の挿入のための活性部位ループb領域の構造変化のためである。したがって本明細書中に記載された使用に適しているとして意図される変異体は、野生型ズブチラーゼと比較した場合、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が1つまたはそれ以上の以下の位置に挿入された変異体である:位置95と96の間、位置96と97の間、位置97と98の間、位置98と99の間、位置99と100の間、位置100と101の間、位置101と102の間、位置102と103の間、位置103と104の間およびそれらの組合せ。好ましくは、挿入は、位置97と98の間、位置98と99の間、位置99と100の間および/または位置100と101の間、特に位置98と99の間および位置99と100の間で成される。本発明の第一の局面のズブチラーゼ変異体は、天然物から同定され、単離された親または野生型ズブチラーゼであり得る。このような親野生型ズブチラーゼは、当業界で既知の標準技法により特異的にスクリーニングされ得る。これを実行する好ましい一方法は、多数の異なる微生物、好ましくは異なるバシラス属菌株からのズブチラーゼ中の活性部位ループをコードすることが既知のDNA領域を特異的にPCR増幅することにより得る。ズブチラーゼは、それらのDNAおよびアミノ酸配列が相同であるという意味で、保存された酵素の一群である。したがって、活性部位ループにフランキングする相対的に特異的なプライマーを構築することができる。これを実行する一方法は、異なるズブチラーゼのアラインメントを調べることによる501523参照。それは、このルーチンの作業から、例えばBLSAVIからのような、IS1またはIS2群のいずれかにおけるアミノ酸残基95~103間の活性部位ループbに対応する活性部位ループにフランキングするPCRプライマーを当業者が構築することである。多数の異なる微生物、好ましくは異なるバシラス属菌株からのDNAを増幅し、その後前記の増幅PCR断片をDNAシーケンシングするためにこのようなPCRプライマーを用いて、位置95~103までの活性部位ループ領域に対応する、例えばBLSAVIと比較して長い活性部位領域を含むこれらの群のズブチラーゼを産生する菌株を同定することができる。菌株およびこのような注目のズブチラーゼの部分DNA配列が同定されれば、このようなズブチラーゼのクローニング、発現および精製を当業者が完了することはルーチン作業である。しかしながら本発明のズブチラーゼ変異体は主に親ズブチラーゼの変異体であるということが意図される。本明細書中に記載された使用に適したズブチラーゼ変異体は、当業界で既知の標準技法により、例えば部位特異的/無作為突然変異誘発により、または異なるズブチラーゼ配列のDNAシャッフリングにより構築され得る。さらなる詳細に関しては、本明細書中の材料と方法の節を参照されたい。当業者により認められるように、本明細書中に記載された変異体は、位置95~103までの少なくとも1つの挿入のほかに、少なくとも1つのさらに別の修飾を含む。例えば変異体は、活性部位ループb領域に1つまたはそれ以上の置換を、ならびに前記の領域の外側に1つまたはそれ以上の置換を含み得る。さらに変異体は、活性部位ループb領域の外側に1つまたはそれ以上のさらなる挿入を含み得る。さらに、本明細書中に記載された領域における挿入は、1つより多いアミノ酸残基の挿入を包含する。例えば本発明の変異体は、1つの挿入、2つの挿入または2つより多い挿入、例えば3、4または5つの挿入を含有し得る。本発明の好ましい実施態様では、以下の:位置99における置換、位置133における置換、位置143における置換、位置167における置換、位置170における置換、位置194における置換、位置42および43間における挿入、位置129および130間における挿入、位置216および217間における挿入、位置217および218間における挿入ならびにそれらの組合せから成る群から選択される位置において、さらなる修飾が実施される。本発明の興味深い実施態様において、追加のアミノ酸残基は位置98および99間に挿入されるBASBPNナンバリング。位置98および99間の挿入は、好ましくは以下の群から選択されるBASBPNナンバリングで:あるいはより特定的なズブチリシン309および密接に関連したズブチラーゼ、例えばBAALKP、BLSUBLおよびBSKSMK:さらに、位置98および99間の挿入がさらなる修飾と、即ち位置133~143におけるアミノ酸残基の置換、ならびに位置167、170および194におけるアミノ酸残基の置換と併有される、というのが目下好ましい。それぞれ位置133および134における位置98および99間の挿入に加えての置換は、好ましくは以下のものから成る群から選択される:好ましい実施態様では、位置133における置換は、X133{D、E、K、R}、好ましくはX133DまたはX133E、特にX133Eからなる群から選択される。別の好ましい実施態様では、位置143における置換は、X143{D、E、K、R}、好ましくはX143KまたはX143R、特にX143Kから成る群から選択される。好ましい変異体の一例は、以下の挿入および置換を含むズブチラーゼ変異体である:X98XSX133EX143K。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換を含むサビナーゼ登録商標変異体である:A98ASA133ET143K。さらに、それぞれ位置167、170および134における位置98および99間の挿入のほかの置換は、好ましくは以下のものから成る群から選択される:好ましい実施態様では、位置167における置換は、X167{A、T、G、S}から成る群から選択され、特にX167A;位置170における置換は、X170{A、T、G、S}から成る群から選択され、特にX170S;そして位置194における置換は、X194{F、I、L、M、P、W、Y}から成る群から選択され、特にX194P;である。好ましい変異体の一例は、以下の挿入および置換:X98XTX167AX170SX194Pを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換:A98ATY167AR170SA194Pを含むサビナーゼ登録商標変異体である。本発明のさらに興味深い実施態様では、追加のアミノ酸残基は位置99および100間に挿入されるBASBPNナンバリング。位置99および100間の挿入は、好ましくは以下のものから成る群から選択されるBASBPNナンバリングで:あるいはより特定的なズブチリシン309および密接に関連したズブチラーゼ、例えばBAALKP、BLSUBLおよびBSKSMK:位置99および100間の挿入に関しては、本発明の興味深い一実施態様においては、挿入は位置99における置換と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前記の挿入のほかに、位置99における以下の置換が関連すると考えられる:好ましい実施態様では、位置99における置換は、X99{A、T、G、S}、特にX99AまたはX99Tから成る群から選択される。好ましい変異体の一例は、以下の挿入および置換:X99XDX99AまたはX99XRX99Tを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換:S99SDS99AまたはS99SRS99Tを含むサビナーゼ登録商標変異体である。位置99および100間の挿入に関しては、本発明の別の興味深い実施態様においては、挿入は位置216および217間の少なくとも1つのアミノ酸残基のさらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前期の挿入のほかに、位置216および217間の以下の挿入が関連すると考えられる:好ましい実施態様では、位置216および217間の挿入は、X216X{F、I、L、M、P、W、Y}から成る群から選択され、特にX216XPである。好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換:X99XDX99AX216XPならびにX99XDX99AX216XDPを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換:S99SDS99AS216SPならびにS99SDS99AS216SDPを含むサビナーゼ登録商標変異体である。位置99および100間の挿入に関しては、本発明のさらに別の興味深い実施態様では、挿入は、位置217および218間の少なくとも1つのアミノ酸残基のさらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前記の挿入のほかに、位置217および218間の以下の挿入が関連すると考えられる:好ましい実施態様では、位置217および218間の挿入は、X217X{F、I、L、M、P、W、Y}から成る群から選択され、特にX217XPである。好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換:X99XDX99AX217XPならびにX99XDX217XPを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換:S99SDS99AL217LPならびにS99SDL217Pを含むサビナーゼ登録商標変異体である。位置99および100間の挿入に関しては、本発明のさらに興味深い実施態様においては、挿入は、位置42および43間の少なくとも1つのアミノ酸残基のさらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前記の挿入のほかに、位置42および43間の以下の挿入が関連すると考えられる:好ましい実施態様では、位置42および43間の挿入は、X42X{H、V、C、N、Q}から成る群から選択され、特にX42XNである。好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換:X99XDX42XNならびにX99XDX99AX42XNを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換:S99SDD42DNならびにS99SDS99AD42DNを含むサビナーゼ登録商標変異体である。位置99および100間の挿入に関しては、本発明のさらに興味深い実施態様においては、挿入は、位置129および130間の少なくとも1つのアミノ酸残基のさらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前記の挿入のほかに、位置129および130間の以下の挿入が関連すると考えられる:好ましい実施態様では、位置129および130間の挿入は、X129X{D、E、K、R}から成る群から選択される。好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換:X99XDX129XDならびにX99XDX99AX129XDを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換:S99SDP129PDならびにS99SDS99AP129PDを含むサビナーゼ登録商標変異体である。あるアミノ酸残基の類似のアミノ酸残基へのいわゆる保存的置換は、酵素の特徴の小変化のみを生じると予測されることは、当業者には周知である。以下の表Iは、保存的アミノ酸置換の群を列挙する。表I保存的アミノ酸置換一般特性アミノ酸塩基性正荷電K=リシンH=ヒスチジン酸性負荷電E=グルタミン酸D=アスパラギン酸極性Q=グルタミンN=アスパラギン疎水性L=ロイシンI=イソロイシンV=バリンM=メチオニン芳香族F=フェニルアラニンW=トリプトファンY=チロシン小G=グリシンA=アラニンS=セリンT=トレオニンこの原則によれば、保存的置換を含むズブチラーゼ変異体は、互いに徹底的には異ならない特徴を示すと予測される。本明細書中に開示されたおよび/または例示されたズブチラーゼ変異体を基礎にして、同様に改良された洗浄性能を示す他のズブチラーゼ変異体を得るために、これらの変異体に対する適切な保存的修飾単数または複数を当業者が同定するのは、ルーチン作業である。構造分散性の天然または人工的作製から酵素を単離するために、そして親ズブチラーゼから変異体を設計および産生するためにも、親ズブチラーゼは亜群IS1およびIS2、特に亜群IS2に属するのが好ましい。亜群IS1からの変異体に関しては、BSS168BSSAS、BSAPRJ、BSAPRN、BMSAMP、BASBPN、BSSDY、BLSCARBLKERA、BLSCA1、BLSCA2、BLSCA3、BSSPRCおよびBSSPRDまたは亜群IS1の特徴を保有しているその機能的変異体からなる群から親ズブチラーゼを選択するのが好ましい。亜群IS2からの変異体に関しては、BSAPRQ、BLS147BSAPRM、BAH101、BLSAVIBSKSMK、BAALKP、BLSUBL、BYSYAB、BAPB92、TVTHERおよびBSAPRSまたは亜群IS2の特徴を保有しているその機能的変異体からなる群から親ズブチラーゼを選択するのが好ましい。特に親ズブチラーゼはBLSAVIサビナーゼ登録商標、NovoNordiskASであり、本発明の好ましいズブチラーゼ変異体はしたがって、サビナーゼ登録商標の変異体である。したがって特に興味深い変異体は、サビナーゼ登録商標変異体、即ちBLSAVI変異体であって、この場合、1.SeRが位置98および99間に挿入されており、位置133のAlaがGluで置換されており、そして位置143のThrがLysで置換されているBASBPNナンバリングか、あるいは2.Aspが位置99および100間に挿入されており、そして位置99のSerがAlaで置換されているかBASBPNナンバリング、あるいは3.Thrが位置98および99間に挿入されており、位置167のTyrがAlaで置換されており、位置170のArgがSerで置換されており、そして位置194のAlaがProで置換されているかBASBPNナンバリング、あるいは4.Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そしてProが位置217および218間に挿入されているBASBPNナンバリング。5.Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そしてProが位置216および217間に挿入されているBASBPNナンバリング。6.Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そしてAspProが位置216および217間に挿入されているBASBPNナンバリング。7.Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そしてAspが位置129および130間に挿入されているBASBPNナンバリング。8.Aspが位置99および100間に挿入されており、そしてAsnが位置42および43間に挿入されているBASBPNナンバリング。9.Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そしてAsnが位置42および43間に挿入されているBASBPNナンバリング。10.Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがThrで置換されている。11.Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そして位置131のProがThrで置換されている。本発明は、前記のズブチラーゼ変異体のいずれかの、そのアミノ酸配列に対する任意のその他の修飾と組合せた使用も包含する。特に、改良された特性を酵素に提供するための当業界で既知のその他の修飾との組合せが意図される。当業界は異なる改良特性を有する多数のズブチラーゼ変異体を記載し、そしてそれらの多くが本明細書中の発明の背景の節に記載されている上記参照。それらの参考文献は、本明細書中に記載されたズブチラーゼ変異体と有益に併有され得るズブチラーゼ変異体を同定するための参考文献として、本明細書に開示される。このような組合せは、位置:222酸化安定性を改良する、218熱安定性を改良する、酵素を安定化するCa結合部位、例えば位置76における置換、ならびに従来技術から明らかな多数のその他のものを含む。さらに別の実施態様では、本明細書中に記載されたズブチラーゼ変異体は、以下の位置のいずれかにおける1つまたはそれ以上の修飾単数または複数と併有され得る:特に以下のBLSAVI、BLSUBL、BSKSMKおよびBAALKP変異体は、組合せのために適切であると考えられる:さらに、変異体S101GV104N、S87NS101GV104N、K27RV104YN123ST274A、N76DS103AV104IまたはN76DV104Aのいずれかあるいはこれらの突然変異V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104Aのその他の組合せ、あるいは前記の修飾単数または複数のうちのいずれかひとつまたはそれ以上と組合せたS101GS103AV104IG159DA232VQ236HQ245RN248DN252Kを含む変異体は、改良された特性を示す。さらに本発明の主局面単数または複数のズブチラーゼ変異体は、好ましくは位置129、131および194のいずれかにおける1つまたはそれ以上の修飾単数または複数と、好ましくは129K、131Hおよび194P修飾として、最も好ましくはP129K、P131HおよびA194P修飾として併有される。任意のそれらの修飾単数または複数は、それらの産生においてより高い発現レベルのズブチラーゼ変異体を提供すると予測される。前記のように、本明細書中に開示された変異体は、限定程度に、IV0型トリプシン阻害剤により抑制されるだけであり、その結果、それらは卵の染みに及ぼす優れた洗浄性能を示す。したがって、当業者に、開発作業の初期段階で、この目的のための有効且つ好ましい変異体を選定させるために、本発明者は、問題の変異体の性能を最初に査定するために、当業者により容易に実行され得る適切な予備試験を提供した。したがって、本明細書中の実施例4に開示された卵抑制検定は、選定の変異体の能力を最初に査定するために用いられ得る。言い換えれば、卵抑制検定は、IV0型トリプシン阻害剤により、選定変異体が抑制され得るか否かならびにその程度を査定するために用いられ得る。この試験を用いて、卵の染みを除去するための選定変異体の適格性が査定され得る。その論理的根拠は、選定変異体がIV-0型トリプシン阻害剤により強く抑制される場合には、それは、普通はさらなる試験的実験を実行する必要がないということである。したがって、本明細書中に記載された使用のために特別に興味深い変異体は、本明細書中の実施例4に記載された卵抑制検定で試験した場合に、少なくとも10、例えば少なくとも15、例えば少なくとも20、好ましくは少なくとも25、例えば少なくとも30、さらに好ましくは少なくとも35の残留活性を有する変異体である。本発明の特に興味深い実施態様では、変異体は、本明細書中の実施例4に記載された卵抑制検定で試験した場合に、少なくとも40、例えば少なくとも45、例えば少なくとも50、好ましくは少なくとも55、例えば少なくとも60、さらに好ましくは少なくとも65、例えば少なくとも70、さらに好ましくは少なくとも75、例えば少なくとも80、例えば少なくとも90の残留活性を有する。明らかに、本発明の変異体は、少なくとも記述された最低レベルに関して、さらに好ましくは記述された中間レベルで、最も好ましくは記述された最高レベルに関して、前記の判定基準を満たすのが好ましい。あるいは、または前記の検定に加えて、選定変異体の適格性は、本明細書中の実施例3に開示されたモデル洗剤洗浄性能試験で試験され得る。モデル洗剤洗浄性能試験は、標準洗剤組成物中に混入された場合に、参照系、即ち親ズブチラーゼ同一モデル洗剤系に混入され、同一条件下で試験されると比較して、標準テキスタイルから卵の染みを除去する変異体の能力を査定するために用いられ得る。この試験を用いて、卵の染みを除去するための選定変異体の適格性が最初に検査され得る。その論理的根拠は、選定変異体が親ズブチラーゼと比較される試験において有意の改良を示さない場合、それは普通はさらなる試験的実験を実行する必要がないということである。したがって本明細書中に記載された使用のために特別に興味深い変異体は、本明細書中の実施例3に開示されたモデル洗剤洗浄性能試験に記載されたような以下の:62LASナンサ80S2C16~C18の脂肪酸のナトリウム塩4非イオン性界面活性剤プルラファックスLF40422ゼオライトP105Na2CO34Na2Si2O52カルボキシメチルセルロースCMC68アクリレート液CP54020過ホウ酸ナトリウム実験式NaBO2H2O202EDTA21Na2SO4水残余量を含むモデル洗剤組成物で試験した場合に、同一条件下で試験された親ズブチラーゼと比較して、卵の染みに及ぼす洗浄性能の改良を示すような変異体である。洗浄性能における改良は、本明細書中の実施例3で定義されたいわゆる性能係数を用いることにより定量され得る。本発明の非常に興味深い実施態様では、本発明の変異体は、洗浄性能試験で試験した場合、少なくとも1、例えば少なくとも15、例えば少なくとも2、好ましくは少なくとも25、例えば少なくとも3、例えば少なくとも35、特に少なくとも4、例えば少なくとも45、例えば少なくとも5つの性能係数を有する。明らかに、本発明の変異体は、少なくとも記述された最低レベルに関して、さらに好ましくは記述された中間レベルで、最も好ましくは記述された最高レベルに関して、前記の判定基準を満たすのが好ましい。前記のように、本発明は新規のズブチラーゼ変異体も提供する。本発明の新規のズブチラーゼ変異体局面に関する詳細および明細は、本発明の使用局面と結びつけて前記された変異体の詳細および明細と同一であるかまたは類似する。これは、適切な場合はいつでも、本明細書中で詳細に考察された使用例えば好ましい挿入および置換等に関する記述は、必要な変更を加えて、本発明の新規のズブチラーゼ変異体に、ならびに本発明の方法局面に、そして清浄用および洗剤組成物局面に適用する。ズブチラーゼ変異体の産生ズブチラーゼをクローニングするための、ならびに遺伝子例えばズブチラーゼ遺伝子中への挿入を導入するための多数の方法は、当業界で周知である発明の背景の節で引用された参考文献を比較されたい。概して、遺伝子のクローニングおよび前記遺伝子中への挿入無作為および/または部位特異的の導入のための標準手法は、本発明のズブチラーゼ変異体を生成するために用いられ得る。適切な技法のさらなる説明に関しては、本明細書中の実施例下記参照、ならびにSambrooketalMolecularcloningAlaboratorymanualColdSpringHarborLabColdSpringHarborNYAusubelFMetalCurrentprotocolsinMolecularBiologyJohnWileyandSons1995HarwoodCRandCuttingSMMolecularBiologicalMethodsforBacillusJohnWileyandSons1990およびWO9634946を参照されたい。さらにズブチラーゼ変異体は、多彩性の人工的作製のための標準技法により、例えば異なるズブチラーゼ遺伝子のDNAシャッフリングにより構築され得るWO9522625StemmerWPCNature37038991。例えばサビナーゼ登録商標の活性部位bループより長い活性部位bループ領域を含むことが天然で同定された1つまたはそれ以上の部分ズブチラーゼ配列を有するサビナーゼ登録商標をコードする遺伝子のDNAシャッフリングは、改良型洗浄性能変異体に関するその後のスクリーニング後に、本明細書中に記載された目的に適したズブチラーゼ変異体を提供する。発現ベクター本発明の酵素をコードするDNA構築物を含む組換え発現ベクターは、組換えDNA法を便利に施され得る任意のベクターであり得る。ベクターの選択はしばしば、それが導入される宿主細胞に依存する。したがってベクターは、自律的複製ベクター、即ち染色体外存在物として存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター、例えばプラスミドであり得る。あるいはベクターは、宿主細胞中への導入時に、一部分またはその全体を宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体単数または複数と一緒に複製されるものであり得る。ベクターは、好ましくはその中で本発明の酵素をコードするDNA配列が、DNAの転写に必要とされる追加のセグメントと操作可能的に連結される発現ベクターである。概して発現ベクターはプラスミドまたはウイルスDNAに由来し、あるいは両方の素子を含有し得る。操作可能的に連結されるという用語は、セグメントが、それらの意図された目的と共同して機能するよう、例えば転写がプロモーターで開始して、酵素をコードするDNA配列を介して進行するよう整列されることを示す。プロモーターは、選定宿主細胞中で転写活性を示す任意のDNA配列であり得るし、そして宿主細胞と同種または異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。細菌宿主細胞中での使用のための適切なプロモーターの例としては、バシラス属のBacillusstearothermophilusマルトゲン性アミラーゼ遺伝子、Bacilluslicheniformisα-アミラーゼ遺伝子、デンプン液化バシラスBacillusamyloliquefaciensα-アミラーゼ遺伝子、枯草菌Bacillussubtilusアルカリ性プロテアーゼ遺伝子またはBacilluspumilusキシロシダーゼ遺伝子、あるいはラムダファージPRまたはPLプロモーター、あるいは大腸菌lac、trpまたはtacプロモーターが挙げられる。本発明の酵素をコードするDNA配列は、必要な場合、適切なターミネーターとも操作可能的に連結され得る。本発明の組換えベクターは、当該宿主細胞中でベクターを複製させるDNA配列をさらに含み得る。ベクターは、選択可能マーカー、例えばその産物が宿主細胞中の欠陥を補足する遺伝子、または例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン等のような抗生物質に対する耐性、あるいは重金属または除草剤に対する耐性をコードする遺伝子も含み得る。宿主細胞の分泌経路に本発明の酵素を向けるために、分泌シグナル配列リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られているが組換えベクター中に提供される。分泌シグナル配列は、的確なリーディングフレーム中で酵素をコードするDNA配列と接合される。分泌シグナル配列は一般に、酵素をコードするDNA配列に対して5‘に置かれる。分泌シグナル配列は、普通は酵素と会合するものであり得るし、あるいは別の分泌タンパク質をコードする遺伝子からであり得る。それぞれ本発明の酵素、プロモーターおよび任意にターミネーターおよび/または分泌シグナル配列をコードするDNA配列を結繋するために、あるいは適切なPCR増幅計画によりこれらの配列を集合するために、そして複製または組込みに必要な情報を含有する適切なベクター中にそれらを挿入するために用いられる手法は、当業者には周知である例えば、Sambrooketal前記引用を比較されたい。宿主細胞宿主細胞中に導入される本発明の酵素をコードするDNA配列は、当該宿主に対して同種または異種であり得る。宿主細胞に対して同種である、即ち、天然に宿主細胞により産生される場合、それは典型的には別のプロモーター配列と操作可能的に連結され、あるいは適切な場合には、その天然環境におけるのとは違う別の分泌シグナル配列および/またはターミネーター配列と操作可能的に連結される。同種のという用語は、当該宿主生物体にとって天然である酵素をコードするDNA配列を含むよう意図される。異種のという用語は、天然で宿主により発現されないDNA配列を含むよう意図される。したがってDNA配列は別の生物体からであり得るし、あるいはそれは合成配列であり得る。その中に本発明のDNA構築物または組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明の酵素を産生し得る任意の細胞であり、その例としては、細菌、酵母、真菌および高等真核生物細胞、例えば植物が挙げられる。培養時に本発明の酵素を産生し得る細菌宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばバシラス属の菌株、例えば枯草菌Bsubtilus、Blicheniformis、Blentus、短バシラスBbrevis、Bstearothermophilus、Balkalophilus、デンプン液化バシラスBamyloliquefaciens、Bcoagulans、Bcirculans、Blautus、巨大菌BmegatheriumまたはBthuringiensis、あるいはストレプトミセス属の菌株、例えばSlividansまたはSmurinus、あるいはグラム陰性細菌、例えば大腸菌である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、電気穿孔、接合により、あるいはそれ自体既知の方法でコンピテント細胞を用いることにより実行され得るSambrooketal上記を比較されたい。細菌、例えば大腸菌中で酵素を発現する場合、酵素は典型的には不溶性顆粒封入体として既知であるとして細胞質中に保持され得るし、あるいは細菌分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒は回収されて、変性され、その後、変性剤を希釈することにより酵素は構造復元される。後者の場合には、細胞を粉砕することにより、例えば音波処理または浸透圧ショックにより酵素を細胞周辺腔から回収して、細胞周辺腔の内容物を放出し、酵素を回収し得る。グラム陽性細菌、例えばバシラス属またはストレプトミセス属菌株中で酵素を発現する場合、酵素は細胞質中に保持され得るし、あるいは細菌分泌配列により細胞外培地に向けられる。後者の場合、酵素は下記のように培地から回収され得る。ズブチラーゼ変異体の産生方法本発明は、本発明の単離酵素の産生方法であって、酵素をコードするDNA配列で形質転換された適切な宿主細胞が酵素の産生を可能にする条件下で培養され、その結果生じた酵素が培養から回収される方法を提供する。酵素をコードするDNA配列を含む発現ベクターが異種宿主中で形質転換される場合、本発明の酵素の異種組換え体産生を可能にし得る。それにより、同種不純物を含有しないことを特徴とする高度精製ズブチラーゼ組成物を製造することができる。この情況では、同種不純物は、本発明の酵素が本来得られる同種細胞から生じるあらゆる不純物例えば本発明の酵素以外の他のポリペプチドを意味する。形質転換化宿主細胞を培養するために用いられる培地は、当該宿主細胞を増殖するのに適した任意の慣用的培地であり得る。発現ズブチラーゼは、培地中に分泌されるのが便利であり、周知の手法により、例えば遠心分離または濾過により培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩により培地のタンパク質様構成成分を沈殿し、その後、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィー処理することにより、そこから回収される。清浄用および洗剤組成物概して、清浄用および洗剤組成物は当業界で十分記載されており、適切な清浄用および洗剤組成物のさらなる説明に関しては、WO9634946WO9707202WO9530011を参照されたい。さらに本明細書中の実施例は、多数のズブチラーゼ変異体に関する卵の染みに及ぼす洗浄性能における改良を立証する。洗剤組成物ズブチラーゼ変異体は、付加され、したがって洗剤組成物の一構成成分になり得る。本発明の洗剤組成物は、例えば手洗いまたは機械洗い洗濯用洗剤組成物、例えば汚れた布帛の前処理に適した洗濯用添加剤組成物およびリンス付加布帛柔軟剤組成物として処方され得るし、あるいは一般家庭硬質表面清浄作業における使用のための洗剤組成物として処方され、あるいは手洗いまたは機械食器洗浄作業のために処方され得る。特定の局面において、本発明は、本発明のズブチラーゼ酵素を含む洗剤添加剤を提供する。洗剤添加剤ならびに洗剤組成物は、1つまたはそれ以上の他の酵素、例えば別のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼおよび/またはペルオキシダーゼを含み得る。概して、選択される酵素単数または複数の特性は、選定洗剤と相溶性であり即ち、pH-最適条件、他の酵素および非酵素成分との相溶性等、そして酵素単数または複数は有効量で存在すべきである。プロテアーゼ:適切なプロテアーゼとしては、動物、植物または微生物起源のものが挙げられる。微生物起源が好ましい。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異体が包含される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、ズブチリシン、特にバシラス属から得られるもの、例えばズブチリシンNovo、ズブチリシンCarlsberg、ズブチリシン309、ズブチリシン147およびズブチリシン168であるBiochemicaetBiophysicaActa1131253360、BstearothermophilusJP64744992またはBPumilusWO9116422からのリパーゼが挙げられる。その他の例は、例えば、WO9205249WO9401541、欧州特許第407225号、欧州特許第260105号、WO9535381、WO9600292、WO9530744、WO9425578、WO9514783、WO9522615、WO9704079およびWO9707202に記載されているもののようなリパーゼ変異体である。好ましい市販リパーゼ酵素としては、リポラーゼTMおよびリポラーゼウルトラTMNovoNordiskASが挙げられる。アミラーゼ:適切なアミラーゼαおよび/またはβとしては、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異体が包含される。アミラーゼとしては、例えばバシラス属Bacillus、例えば英国特許第号により詳細に記載されているBlicheniformisの特定菌株から得られるα-アミラーゼが挙げられる。有用なアミラーゼの例は、WO9402597、WO9418314、WO9623873およびWO9743424に記載されている変異体、特に以下の位置:15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408および444のうちの1つまたはそれ以上に置換を伴う変異体である。市販アミラーゼは、デュラミルTM、テルマミルTM、フンガミルTMおよびBANTMNovoNordiskAS、ラピダーゼTMおよびプラスターTMGenencorInternationalIncである。セルラーゼ:適切なセルラーゼとしては、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異体が包含される。適切なセルラーゼとしては、米国特許第4435307号、米国特許第5648263号、米国特許第5691178号、米国特許第5776757号およびWO8909259に開示されているバシラス属、シュードモナス属、フミコラ続、フザリウム属、チエラビア属、アクレモニウム属、からのセルラーゼ、例えばHumicolainsolens、MyceliophthorathermophilaおよびFusariumoxysporumから産生される真菌セルラーゼが挙げられる。特に適切なセルラーゼは、色保護利点を有するアルカリ性または中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第0495257号、欧州特許第0531372号、WO9611262、WO9629397、WO9808940に記載されたセルラーゼである。その他の例は、例えばWO9407998、欧州特許第0531315号、米国特許第5457046号、米国特許第5686593号、米国特許第5763254号、WO9524471WO9812307PCTDK9800299に記載されたもののようなセルラーゼ変異体である。市販セルラーゼとしては、セルザイムTMおよびカレザイムTMNovoNordiskAS、クラジナーゼTMおよびプラダックスHATMGenencorInternationalIncならびにKAC500BTMKaoCorporationが挙げられる。ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ:適切なペルオキシダーゼ/オキシダーゼとしては、植物、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼの例としては、WO9324618、WO9510602およびWO9815257に記載されているもののような、ヒトヨタケ属Coprinusからの、例えばCcinereusからのペルオキシダーゼおよびそれらの変異体が挙げられる。市販ペルオキシダーゼとしては、ガードザイムTMNovoNordiskASが挙げられる。洗剤酵素単数または複数は、1つまたはそれ以上の酵素を含有する別個の添加剤を付加することにより、あるいはこれらの酵素の全てを含む併合添加剤を付加することにより、洗剤組成物中に含入され得る。本発明の洗剤添加剤、即ち別個の添加剤または併合添加剤は、例えば顆粒、液体、スラリー等として処方され得る。好ましい洗剤添加剤処方物は、顆粒、特に無粉塵性顆粒、液体、特に安定化液、あるいはスラリーである。無粉塵性顆粒は、例えば米国特許第4106991号および第4661452号に開示されているように生成され、そして任意に、当業界で既知の方法により被覆され得る。蝋質コーティング物質の例は、1000~20000の平均分子量を有するポリエチレンオキシド製品ポリエチレングリコール、PEG;16~50エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール;アルコールが12~20個の炭素原子を有し、15~80エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール;脂肪アルコール;脂肪酸;ならびに脂肪酸のモノ-およびジ-およびトリグリセリドである。流動床技術による適用に適した皮膜形成コーティング物質の例は、英国特許第1483591号に示されている。液体酵素調製物は、確立された方法にしたがって、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を付加することにより安定化され得る。保護酵素は、欧州特許第238216号に開示された方法により調製され得る。本発明の洗剤組成物は、任意の便利な形態で、例えば棒、錠剤、粉末、顆粒、ペーストまたは液体であり得る。液体洗剤は、水性で典型的には70までの水および0~30の有機溶媒を含有するか、または非水性あり得る。洗剤組成物は、典型的には1つまたはそれ以上の界面活性剤を含み、それらは非イオン性、例えば半極性および/または陰イオン性および/または陽イオン性および/または両イオン性であり得る。界面活性剤は、典型的には01重量~60重量のレベルで存在する。その中に含入される場合、洗剤は通常は約1~約40の陰イオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、α-オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート脂肪アルコールスルフェート、アルコールエトキシスルフェート、第二級アルカンスルホネート、α-スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル-またはアルケニルコハク酸または石鹸を含有する。その中に含入される場合、洗剤は普通は、約02~40の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミドまたはグルコサミンのN-アシルN-アルキル誘導体グルカミドを含有する。洗剤は、0~65の洗剤ビルダーまたは錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、カルボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキルまたはアルケニルコハク酸、可溶性シリケートまたは層化シリケート例えば、SKS-6Hoechstを含有し得る。洗剤は、1つまたはそれ以上のポリマーを含み得る。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピリジン-N-オキシド、ポリビニルイミダゾール、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー、ならびにラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーがある。洗剤は、過酸生成漂白活性剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミンまたはノナノイルオキシベンゼンスルホネートと併合され得るH2O2供給源、例えばペルボレートまたはペルカルボネートを含み得る漂白系を含有し得る。択一的に、漂白系は、例えばアミド、イミドまたはスルホン型のペルオキシ酸を含み得る。本発明の洗剤組成物の酵素単数または複数は、慣用的安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸またはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステルまたはフェニルホウ素酸誘導体、例えば4-ホルミルフェニルホウ素酸を付加することにより安定化され、そして組成物は、例えばWO9219709およびWO9219708に記載されたように処方され得る。洗剤は、その他の慣用的洗剤成分、例えば布帛コンディショナー、例えば粘土、起泡増進剤、石鹸泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ沈殿防止剤、汚れ再沈着防止剤、染料、殺細菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇り抑制剤または香料も含有し得る。洗剤組成物中に、任意の酵素、特に本発明の酵素が、001~100mgの酵素タンパク質/洗浄液1リットル、好ましくは005~5mgの酵素タンパク質/洗浄液1リットル、特に01~1mgの酵素タンパク質/洗浄液1リットルに対応する量で付加され得る、ということが目下意図される。本発明の酵素は、WO9707202この記載内容は、参照により本明細書中に含まれるに開示された洗剤処方物中に追加のに混入され得る。本発明は、以下の実施例でさらに詳細に記載されるが、それらの実施例は、いかなる点においても、特許請求されるような本発明の範囲を限定するよう意図されない。洗剤組成物において、省略構成成分表記は、以下の意味を有する:LAS:線状C12アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムTAS:獣脂アルキル硫酸ナトリウムXYAS:C1X~C1Yのアルキル硫酸ナトリウムSS:式2-ブチルオクタン酸の第二級石鹸界面活性剤25EY:平均Yモルのエチレンオキシドと縮合されるC12~C15の主に線状の第一級アルコール45EY:平均Yモルのエチレンオキシドと縮合されるC14~C15の主に線状の第一級アルコールXYEZS:平均Zモルのエチレンオキシド/モルと縮合されるC1X~C1Yのアルキル硫酸ナトリウム非イオン性:平均エトキシル化度38および平均プロポキシル化度45のC~Cの混合エトキシル化/プロポキシル化脂肪アルコール。プルラファックスLF404の商品名でBASFGmbHから販売されているCFAA:C12~C14のアルキルN-メチルグルカミドTFAA:C16~C18のアルキルN-メチルグルカミドシリケート:非晶質ケイ酸ナトリウムSiO2:Na2O比=20NaSKS6:式δNa2Si2O5の結晶層化シリケートカルボネート:無水炭酸ナトリウムホスフェート:トリポリ燐酸ナトリウムMA/AA:平均分子量約80000の14マレイン酸/アクリル酸のコポリマーポリアクリレート:平均分子量8000のポリアクリレートホモポリマー。PA30の商品名でBASFGmbHから販売されているゼオライトA:1~10μmの範囲の一次粒子サイズを有する式Na12AlO2SiO21227H2Oの水和アルミノケイ酸ナトリウムシトレート:クエン酸三ナトリウム二水和物シトリック:クエン酸ペルボレート:無水過ホウ酸ナトリウム一水和物漂白剤。実験式NaBO2H2O2PB4:無水過ホウ酸ナトリウム四水和物ペルカルボネート:実験式2Na2CO33H2O2の無水過炭酸ナトリウム漂白剤TAED:テトラアセチルエチレンジアミンCMC:ナトリウムカルボキシメチルセルロースDETPMP:ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸。デクエスト2060の商品名でMonsantoにより販売されているPVP:ポリビニルピロリドンポリマーEDDS:エチレンジアミン-NN-二コハク酸。ナトリウム塩の形態の[SS]異性体石鹸泡抑制剤:25パラフィン蝋、融点50°C、17疎水性シリカ、58パラフィン油粒状石鹸泡抑制剤:12シリコーン/シリカ、18ステアリルアルコール、70粒状形態のデンプンスルフェート:無水硫酸ナトリウムHMWPEO:高分子量ポリエチレンオキシドTAE25:獣脂アルコールエトキシレート洗剤実施例I本発明の粒状布帛清浄用組成物は、以下のように調製され得る:線状C12アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム65硫酸ナトリウム150ゼオライトA260ニトリロ三酢酸ナトリウム50酵素01PVP05TAED30ホウ酸40ペルボレート180フェノールスルホネート01少量成分全量で100まで洗剤実施例II圧縮粒状布帛清浄用組成物密度800glは、本発明にしたがって以下のように調製し得る:45AS8025E3S2025E53025E330TFAA25ゼオライトA170NaSKS6120クエン酸30カルボネート70MAAA50CMC04酵素01TAED60ペルカルボネート220EDDS03粒状石鹸泡抑制剤35水/少量成分全量で100まで洗剤実施例III着色布帛の洗濯に際して特に有用である本発明の粒状布帛清浄用組成物を、以下のように調製した:LAS107-TAS24-TFAA-4045AS3110045E740-25E3S-3068E1118-25E5-80シトレート15070カルボネート-100クエン酸2530ゼオライトA321250NaSKS6-90MAAA5050DETPMP0208酵素010005シリケート25-スルフェート5230PVP05-ポリ4-ビニルピリジン-N-オキシド/ビニルイミダゾールとビニルピロリドンのコポリマー-02ペルボレート10-フェノールスルホネート02-水/少量成分全量で100まで洗剤実施例IV洗浄による柔軟化能力を提供する本発明の粒状布帛清浄用組成物は、以下のように調製し得る:45AS-100LAS76-68AS13-25E3-50ココアルキルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド1410シトレート5030NaSKS6-110ゼオライトA150150MAAA4040DETPMP0404ペルボレート150-ペルカルボネート-150TAED5050緑粘土100100HMWPEO-01酵素010005シリケート3050カルボネート100100粒状石鹸泡抑制剤1040CMC0201水/少量成分全量で100まで洗剤実施例V本発明のヘビーデューティー液体布帛清浄用組成物は、以下のように調製し得る:LAS酸形態-250クエン酸502025AS酸形態80-25AE2S酸形態30-25AE780-CFAA5-DETPMP1010脂肪酸8-オレイン酸-10エタノール4060プロパンジオール2060酵素010005ココアルキルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド-30緑粘土-50PVP20-水/少量成分全量で100まで粉末自動食器洗浄用組成物I非イオン性界面活性剤04~25メタケイ酸ナトリウム0~20二ケイ酸ナトリウム3~20三リン酸ナトリウム20~40炭酸ナトリウム0~20過ホウ酸ナトリウム2~9テトラアセチルエチレンジアミンTAED1~4硫酸ナトリウム5~33酵素00001~01粉末自動食器洗浄用組成物II非イオン性界面活性剤例えばアルコールエトキシレート1~2二ケイ酸ナトリウム2~30炭酸ナトリウム10~50ホスホン酸ナトリウム0~5クエン酸三ナトリウム二水和物9~30ニトリロ三ナトリウム酢酸NTA0~20過ホウ酸ナトリウム一水和物5~10テトラアセチルエチレンジアミンTAED1~2ポリアクリレートポリマー例えばマレイン酸/アクリル酸コポリマー6~25酵素00001~01香料01~05水5~10粉末自動食器洗浄用組成物III非イオン性界面活性剤05~20二ケイ酸ナトリウム25~40クエン酸ナトリウム30~55炭酸ナトリウム0~29重炭酸ナトリウム0~20過ホウ酸ナトリウム一水和物0~15テトラアセチルエチレンジアミンTAED0~6マレイン酸/アクリル酸コポリマー0~5粘土1~3ポリアミノ酸0~20ポリアクリル酸ナトリウム0~8酵素00001~01粉末自動食器洗浄用組成物IV非イオン性界面活性剤1~2ゼオライトMAP15~42二ケイ酸ナトリウム30~34クエン酸ナトリウム0~12炭酸ナトリウム0~20過ホウ酸ナトリウム一水和物7~15テトラアセチルエチレンジアミンTAED0~3ポリマー0~4マレイン酸/アクリル酸コポリマー0~5有機ホスホネート0~4粘土1~2酵素00001~01硫酸ナトリウム残余量粉末自動食器洗浄用組成物V非イオン性界面活性剤1~7二ケイ酸ナトリウム18~30クエン酸三ナトリウム10~24炭酸ナトリウム12~20モノペルスルフェート2KHSO5、KHSO4、K2SO415~21漂白安定剤01~2マレイン酸/アクリル酸コポリマー0~6ジエチレントリアミンペンタアセテート、五ナトリウム塩0~25酵素00001~01硫酸ナトリウム、水残余量清浄界面活性剤系を有する粉末および液体食器洗浄用組成物VI非イオン性界面活性剤0~15オクタデシルジメチルアミンN-オキシド二水和物0~5オクタデシルジメチルアミンN-オキシド二水和物およびヘキサデシルジメチルアミンN-オキシド二水和物の8020重量C18/C16配合物0~4オクタデシルビスヒドロキシエチルアミンN-オキシド無水物およびヘキサデシルビスヒドロキシエチルアミンN-オキシド無水物の7030重量C18/C16配合物0~5平均エトキシル化度3のC13~C15のアルキルエトキシスルフェート0~10平均エトキシル化度3のC12~C15のアルキルエトキシスルフェート0~5平均エトキシル化度12のC13~C15のエトキシル化アルコール0~5平均エトキシル化度9のC12~C15のエトキシル化アルコール0~65平均エトキシル化度30のC13~C15のエトキシル化アルコールの配合物0~4二ケイ酸ナトリウム0~33トリポリ燐酸ナトリウム0~46クエン酸ナトリウム0~28クエン酸0~29炭酸ナトリウム0~20過ホウ酸ナトリウム一水和物0~115テトラアセチルエチレンジアミンTAED0~4マレイン酸/アクリル酸コポリマー0~75硫酸ナトリウム0~125酵素00001~01非水性液体自動食器洗浄用組成物VII液体非イオン性界面活性剤例えばアルコールエトキシレート20~100アルカリ金属ケイ酸塩30~150アルカリ金属リン酸塩200~400高級グリコール、ポリグリコール、ポリオキシド、グリコールエーテルから選択される液体担体250~450安定剤例えばリン酸およびC16~C18のアルカノールの部分エステル05~70発泡抑制剤例えばシリコーン0~15酵素00001~01非水性液体食器洗浄用組成物VIII液体非イオン性界面活性剤例えばアルコールエトキシレート20~100ケイ酸ナトリウム30~150アルカリ金属炭酸塩70~200クエン酸ナトリウム00~15安定剤例えば微粉砕シリコーンおよび低分子量ジアるきるポリグリコールエーテルの混合物05~70低分子量ポリアクリレートポリマー50~150粘土ゲル増粘剤00~100ヒドロキシプロピルセルロースポリマー00~06酵素00001~01高級グリコール、ポリグリコール、ポリオキシド、グリコールエーテルから選択される液体担体残余量チキソトロピック液体自動食器洗浄用組成物IXC12~C14の脂肪酸0~05ブロックコポリマー界面活性剤15~150クエン酸ナトリウム0~12トリポリ燐酸ナトリウム0~15炭酸ナトリウム0~8三ステアリン酸アルミニウム0~01スルホン酸クメンナトリウム0~17ポリアクリレート増粘剤132~25ポリアクリル酸ナトリウム24~60ホウ酸~40ギ酸ナトリウム0~045ギ酸カルシウム0~02ナトリウムn-デシジフェニルオキシドジスルフォネート0~40モノエタノールアミン~186水酸化ナトリウム509~9312-プロパンジオール0~94酵素00001~01石鹸泡抑制剤、染料、香料、水残余量液体自動食器洗浄用組成物Xアルコールエトキシレート0~20脂肪酸エステルスルホネート0~30ドデシル硫酸ナトリウム0~20アルキルポリグリコシド0~21オレイン酸0~10二ケイ酸ナトリウム一水和物18~33クエン酸ナトリウム二水和物18~33ステアリン酸ナトリウム0~25過ホウ酸ナトリウム一水和物0~13テトラアセチルエチレンジアミンTAED0~8マレイン酸/アクリル酸コポリマー4~8酵素00001~01保護化漂白剤粒子を含有する液体自動食器洗浄用組成物XIケイ酸ナトリウム5~10ピロリン酸四カリウム15~25三リン酸ナトリウム0~2炭酸カリウム4~8保護化漂白剤粒子、例えば塩素5~10高分子増粘剤7~15水酸化カリウム0~2酵素00001~01水残余量XII:I、II、III、IV、VIおよびXに記載されたような自動食器洗浄用組成物。この場合、ペルボレートはペルカルボネートに置換される。XIII:マンガン触媒を追加のに含有するI~VIに記載されたような自動食器洗浄用組成物。マンガン触媒は、例えば、EfficientmanganesecatalystsforlowtemperaturebleachingNature369637639に記載された化合物の1つであり得る。方法および材料テキスタイル:WFK10N標準テキスタイル片卵の染みは、WFKTestgewebeGmbHChristenfeld10D41379BruggenBrachtGermanyから入手した。菌株:枯草菌BsubtilusDN1885Diderichsenetal1990。Blentus309および147は、NCIBに保管され、寄託番号NCIB10309および10147を与えられた、そして米国特許第3723250号この記載内容は、参照により本明細書中に含まれるに記載されているバシラス属のBacilluslentusの特定菌株である。大腸菌MC1000MJCasadabanandSNCohenJMolBiol138179207は、慣用的方法によりr、mを作製されたものであって、米国特許出願第039298号に記載されている。プラスミド:pJS3配列番号60:ズブチラーゼ309をコードする合成遺伝子を含有する大腸菌-枯草菌シャトルベクターJacobSchiodtetalinProteinandPeptideletters33944により記載されている。pSX222:枯草菌発現ベクターWO9634946に記載一般分子生物学的方法:別記しない限り、DNA操作および形質転換は、分子生物学の標準方法を用いて実施したSambrooketalMolecularcloningAlaboratorymanualColdSpringHarborLabColdSpringHarborNYAusubelFMetalCurrentprotocolsinMolecularBiologyJohnWileyandSons1995HarwoodCRandCuttingSMMolecularBiologicalMethodsforBacillusJohnWileyandSons1990。DNA操作のための酵素は、供給元の使用説明書にしたがって用いた。DNA操作のための酵素別記しない限り、DNA操作用の酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ等は全て、NewEnglandBiolabsIncから入手する。タンパク質分解活性本発明の情況において、タンパク質分解活性は、KiloNOVOプロテアーゼ単位KNPU中で発現される。活性は酵素標準サビナーゼ登録商標に対して相対的に確定され、確定は、標準条件、即ち50°C、pH83、反応時間9分、測定時間3分でのタンパク質分解酵素によるジメチルカゼインDMC溶液の消化を基礎にしている。フォルダーAF220/1は、NovoNordiskASDenmarkに要請して入手可能であるこのフォールダーは参照により本明細書中に含まれる。GUは、標準条件下で、基質としてN-アセチルカゼインを用いた40°Cで15分のインキュベーション中に、1mmoleのグリシンと等価の量のNH2基を産生するタンパク質分解酵素活性と定義されるグリシン単位である。酵素活性は、可溶性基質であるスクシニル-アラニン-アラニン-プロリン-フェニル-パラ-ニトロ-フェノールとの反応により、PNA検定を用いても測定し得る。これは、JournalofAmericanOilChemistsSocietyRothgebTMGoodlanderBDGarrisonPHandSmithLAに記載されている。発酵:ズブチラーゼ酵素の製造のための発酵は、5日間、100mlBPX培地を含入する500mlバッフルドエーレンマイヤーフラスコ中で、回転振盪台300rpm上で、30°Cで実施した。その結果として、例えば2リットルのブロスを製造するためには、20個のエーレンマイヤーフラスコを同時に発酵させた。培地:BPX培地組成1リットル当たりジャガイモデンプン100g大麦groundbarley50gダイズ粉20gNa2HPO4x12H2O9gプルロニック01gナトリウムカゼイネート10g培地中のデンプンをα-アミラーゼで液化し、120°Cで45分間加熱することにより培地を滅菌する。滅菌後、NaHCO3の付加01Mにより、pHを9に調整する。実施例1.酵素変異体の構築および発現:部位特異的突然変異誘発:所望の挿入物を含有するオリゴ体を用いたPCRにより産生されるDNA断片の伝統的クローニングSambrooketalMolecularcloningAlaboratorymanual2ndEdColdSpringHarbor1989により、特定の挿入を含み、そして特定の置換を含む本発明のズブチラーゼ309サビナーゼ登録商標部位特異的変異体を作製した下記参照。鋳型プラスミドDNAはpJS3下記参照またはズブチラーゼ309の変異体を含有するこの類似体であった。オリゴ特異的突然変異誘発により、挿入および置換を変異体の構築に導入した。ズブチラーゼ309変異体を大腸菌中で形質転換させた。これらの形質転換体の一夜培養から精製されたDNAを、制限エンドヌクレアーゼ消化、DNA断片の精製、結繋、枯草菌の形質転換により枯草菌中で形質転換させた。枯草菌の形質転換は、Dubnauetal1971JMolBiol56pp209221により記載されているように実施した。特定領域において挿入および置換を導入するための部位特異的突然変異誘発:部位特異的突然変異誘発を実施するために用いるための全体的戦略:挿入および置換の部位にフランキングするDNA配列に対応し、挿入および置換を限定するDNA塩基対により分離される突然変異原性プライマーオリゴヌクレオチドを合成した。その後、結果的に生じた突然変異原性プライマーを、修飾化プラスミドpJS3とのPCR反応に用いた前記参照。その結果生じたPCR断片を精製し、二次PCR反応で伸長させて、その結果生じたPCR産物を精製し、大腸菌-枯草菌シャトルベクター中でクローン化する下記参照か、または三次PCR反応で伸長させた後、エンドヌクレアーゼにより消化させて、大腸菌-枯草菌シャトルベクター中でクローン化した下記参照。PCR反応は、通常条件下で実施する。この戦略後、サビナーゼ登録商標において挿入および置換を構築したが、この場合、挿入および置換は、下記の表にしたがって導入した。各PCR過程に用いたプライマーが、用いたクローニング部位と同様に示されている。前記の戦略にしたがって、詳細な例を以下に示す:2つの挿入および1つの置換をサビナーゼ登録商標で構築したが、この場合、挿入は位置9999aDおよび217217aPにそれぞれ導入し、置換は位置S99Aに導入した下記参照。位置99での挿入および置換は、対立プライマー5’GAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCG3’アンチセンス配列番号83とのPCR反応に用いられた突然変異原プライマー5’CCGAACCTGAACCATCCGCGGCCCCTAGGACTTTAACAGC3’センス配列番号71により導入した。プライマー;5’CATCGATGTACCGTTTGGTAAGCTGGCATATGTTG3’配列番号94を用いて位置217で挿入を導入する2回目のPCRにより、生成されたPCR断片をサビナーゼのC末端に向けて延長させた。pJS3中のMluI部位の下流に位置するプライマー;5’AACCGCACAGCGTTTTTTTATTGATTAACGCGTTGC3’配列番号105を用いた3回目のPCRにより、2回目のPCR産物を、サビナーゼのC末端に向けて延長させた。PCR反応は全て、鋳型としてプラスミドpJS3を用いた。3回目のPCRから生じた延長DNA断片を、修飾化プラスミドpJS3のSalIおよびMluI-部位中でクローン化した前記参照。周知の技法によりプラスミドDNAを大腸菌中で形質転換させ、一大腸菌コロニーをシーケンシングして、意図した突然変異を確証した。他の変異体は全て、同様の方法で構築した。本発明のズブチラーゼ変異体を精製するために、本発明の変異体を含む枯草菌pJS3発現プラスミドを、コンピテント枯草菌菌株中で形質転換させ、10μgmlクロラムフェニコールを含有する培地CAM中で前記と同様に発酵させた。プライマーおよびクローニング部位:実施例2酵素変異体の精製:本手法は、枯草菌宿主細胞における本発明のズブチラーゼの産生のための2リットル規模発酵の精製に関する。約16リットルの発酵ブロスを、1リットルビーカー中で5000rpmで35分間遠心分離した。10酢酸を用いて上清をpH65に調整し、SeitzSupraS100フィルタープレートで濾過した。濾液を、AmiconS1Y10UFカートリッジを装備したAmiconCH2AUFユニットを用いて、濾液を約400mlに濃縮した。UF濃縮物を遠心分離し、濾過した後、pH7でバシトラシン親和性カラムで室温で吸収させた。pH7に調整した001ジメチルグルタル酸、01Mホウ酸および0002M塩化カルシウムを含有する緩衝溶液中の252-プロパノールおよび1M塩化ナトリウムを用いて、バシトラシンカラムから、室温でプロテアーゼを溶離した。バシトラシン精製過程からのプロテアーゼ活性を有する分画を併合し、pH65に調整した001ジメチルグルタル酸、02Mホウ酸および0002M塩化カルシウムを含有する緩衝液で平衡させた750mlのセファデックスG25カラム直径5cmに適用した。セファデックスG25カラムからのタンパク質分解活性を有する分画を併合し、pH65に調整した001Mジメチルグルタル酸、02Mホウ酸および0002M塩化カルシウムを含有する緩衝液で平衡させた150mlのCMセファロースCL6B陽イオン交換カラム直径5cmに適用した。2リットルの同一緩衝液中の0~01M塩化ナトリウムズブチリシン147の場合は0~02M塩化ナトリウムの線状勾配を用いて、プロテアーゼを溶離した。最終精製過程において、CMセファロースカラムからのプロテアーゼ含有分画を併合し、GR81PP膜DanishSugarFactoriesIncを装備したAmicon限外濾過セル中で濃縮した。構築および発酵のための実施例1の技法を、そして前記の単離手法を用いて、以下のズブチリシン309変異体を生成し、単離した:位置96挿入変異体:L96LAL96LAA98TA108CA138C位置97挿入変異体:G97GIS99T位置98挿入変異体:位置99挿入変異体:実施例3.モデル洗剤洗浄性能試験:標準洗剤組成物中の選定ズブチラーゼ変異体の洗浄性能を査定するために、以下の実験条件を用いて標準洗浄実験を実施し得る:洗剤:モデル洗剤洗剤用量:40glpH:101洗浄時間20分温度30°C水硬度:15°dH酵素濃度:10nm洗剤溶液中試験系:10mlビーカー撹拌棒付テキスタイル/容積:5テキスタイル片直径25cm50ml洗剤溶液被験物質:WFK10N卵の染みモデル洗剤の組成を以下に示す:62LASNansa80S2C16~C18脂肪酸のナトリウム塩4非イオン性界面活性剤プルラファックスLF40422ゼオライトP105Na2CO34Na2Si2O52カルボキシメチルセルロースCMC68アクリレート液CP54020過ホウ酸ナトリウム実験式NaBO2H2O202EDTA21Na2SO4水HClまたはNaOHの付加により、洗剤溶液のpHを101に調整する。試験系へのCaCl2およびMgCl2Ca2:Mg2=41の付加により、水硬度を15°dHに調整する。洗浄後、テキスタイル片を水道水で洗い流して、風乾した。MacbethColorEye7000光度計MacbethDivisionofKollmorgenInstrumentsCorporationGermanyを用いて460nmで、被験物質上での反射率R変異体の測定を実施する。測定は、メーカーのプロトコールにしたがって実施する。ブランク値を決定するために、酵素を付加せずに同様の洗浄実験を実施する。反射率Rブランクのその後の測定は、直ぐ上で記載したように実施する。次に前記と同様に参照実験を実施するが、この場合、親酵素の洗浄性能を試験する。その後の反射率R親測定は、直ぐ上で記載したように実施する。以下の式にしたがって限定される性能係数Pによって、洗浄性能を評価する:P=R変異体-Rブランク-R親-Rブランク=R変異体-R親前記の試験方法を用いて、以下の結果を得た:明らかなように、ズブチラーゼ変異体は、親ズブチラーゼ、即ちサビナーゼ登録商標との比較において、卵の染みに及ぼす洗浄性能改良を示す。実施例4.卵抑制検定以下の抑制検定は、試験されるズブチラーゼ変異体がペプチド-pNA結合の加水分解を触媒し、それにより黄色pNAを放出するという原理に基づいており、これは405nmで追跡調査し得る。所定時間後の放出pNAの量は、ズブチラーゼ活性の直接測定値である。それぞれ阻害剤を用いておよび用いずにこのような加水分解実験を実行することにより、ある種のズブチラーゼ変異体が抑制される程度に関する定量的測定値を得ることができる。反応条件:酵素濃度:00003mgmlIV0型トリプシン阻害剤の濃度:00015mgml初期基質濃度:081mM反応時間:11分検定温度:25°C検定pH:86吸光度測定:405nm検定溶液:基質溶液2mM:500mgのSucAlaAlaProPhepNAを4mlDMSO200mM中に溶解する。この溶液を下記の緩衝溶液で100倍に希釈する。その結果生じる基質溶液中の基質の濃度は、2mMである。阻害剤溶液0005mgml:5mgのIV0型トリプシン阻害剤SigmaT-1886を10mlの水に溶解する。この溶液を下記の緩衝溶液で100倍に溶解する。その結果生じる阻害剤溶液中の阻害剤の濃度は、0005mgmlである。酵素溶液0001mgml:酵素1mgを水10ml中に溶解する。この溶液を下記の緩衝溶液で100倍に溶解する。その結果生じる酵素溶液中の酵素の濃度は、0001mgmlである。緩衝溶液pH86:トリス157mgを適量の水に溶解し、075mlの30wvBRIJBRIJ35ポリオキシエチレンラウリルエーテル、30wv、Sigmaカタログ番号430AG6を付加する。4MNaOHを用いてpHを86に調整し、溶液を水で1リットルに希釈する。阻害剤を用いた検定1容積単位例えば80μlの阻害剤溶液を適切な反応容器例えば分光光度計セルまたは微小滴定プレート中で1容積単位例えば80μlの酵素溶液と混合し、25°Cで15分間平衡させる。1375容積単位例えば110μlの基質溶液を反応容器に付加し、その後、405nmでの吸光度を11分間追跡調査する例えば10秒毎または30秒毎に測定することにより。線状回帰分析を用いて吸光度曲線の勾配を算定する。吸光度曲線の勾配は、αinhibitorで示される。阻害剤を用いない検定1容積単位例えば80μlの緩衝溶液を適切な反応容器例えば分光光度計セルまたは微小滴定プレート中で1容積単位例えば80μlの酵素溶液と混合し、25°Cで15分間平衡させる。1375容積単位例えば110μlの基質溶液を反応容器に付加し、その後、405nmでの吸光度を11分間追跡調査する例えば10秒毎または30秒毎に測定することにより。線状回帰分析を用いて吸光度曲線の勾配を算定する。吸光度曲線の勾配は、αで示される。ブランク1容積単位例えば80μlの阻害剤溶液を適切な反応容器例えば分光光度計セルまたは微小滴定プレート中で1容積単位例えば80μlの緩衝溶液と混合し、25°Cで15分間平衡させる。1375容積単位例えば110μlの基質溶液を反応容器に付加し、その後、405nmでの吸光度を11分間追跡調査する。これらの測定値は計算に用いられないが、しかし単に、緩衝溶液および/または基質溶液に酵素が付加されなかった対照として役立つ。残留活性RAの算定以下の式にしたがって、残留酵素活性RAを算定する:RA=αinhibitor/αx100前記の試験を用いて、以下の結果を得た:明らかなように、ズブチラーゼ変異体は、親ズブチラーゼ、即ちサビナーゼ登録商標よりはるかに小程度に阻害された。実施例5.自動食器洗浄ADWにおける本発明のズブチラーゼ変異体の性能標準条件を用いて、市販家庭用食器洗浄用組成物ソマットターボ、HenkelWashmittelGmbH中で、ADWにおける本発明の変異体の性能を試験した。用いた汚れは、スチールプレート上に被覆された卵/ミルク混合物であった。さらに種々の食品を含有するバラスト汚れを付加した。洗剤:ソマットターボ洗剤用量:40glpH:107水硬度:3°dH機械イオン交換温度55°C酵素濃度:機械中の洗浄水の総容積を基礎にして、20nMおよび40nM試験方法:下記のようなスチールプレート上を卵/ミルク汚染する機械:シリンダコンパクトCylindaCompact洗浄プログラム:予洗なしでプログラム4材料220ml非脱脂乳卵15個、中サイズスチールプレート、直径18cm組成物中の酵素活性を不活性化するために、ソマットターボ食器洗浄用組成物を電子レンジで5分間、85°Cで加熱した。スチールプレートの汚染220mlの非脱脂乳をBraunUK20調理機中で2分間、15個の卵と混合した。篩に掛けた後、浸漬により混合物中でステンレススチールプレートを汚染した。プレートを、直立位置で室温で一夜乾燥させた。次に、表面のタンパク質を変性するために、乾燥プレートを120°Cで45分間加熱した。ADW実験各実験に関しては、10枚の汚れたプレートを、シリンダコンパクト機中で、予洗なしで洗浄したプログラム4。汚れたプレートのほかに、機械には10枚の磁器プレート、4個のガラス、4個のカップおよび16片の刃物類を充填した。さらに50gのバラストスラリーを機械に付加した。スラリーの組成を以下に示す:ジャガイモデンプン543、小麦粉438、植物油432、マーガリン432、ラード432、クリーム876、非脱脂乳876、卵876、トマトケチャップ300、バーベキューソース219、マスタード400、安息香酸073、水3mMCa2Mg2367。測定および計算ミノルタ彩度計CR300型を用いて、プレート上の6つの異なる位置で、光反射値R値を測定した。測定は、清浄プレート上R清浄、加熱後の汚損プレート上R汚染および洗浄後のプレート上R洗浄後で成された。以下の式にしたがって、除去タンパク質皮膜RPFを算定した:RPF=100xR洗浄後-R汚染/R清浄-R汚染前記の試験方法を用いて、以下の結果を得た±は標準偏差を示す:明らかなように、本発明の変異体は、サビナーゼ登録商標と比較した場合、優れた性能を有する。実施例6.市販粉末洗剤中の本発明のズブチラーゼ変異体の洗浄性能市販洗剤組成物中の選定ズブチラーゼ変異体の洗浄性能を査定するために、以下の実験条件を用いて標準洗浄実験を実施した:洗剤用量:40gl洗浄温度:30°C洗浄時間20分水硬度:15°dHCa2:Mg2=41pH:調整せず酵素濃度:1、2、5、10、30nM試験系:150mlガラスビーカー撹拌棒付テキスタイル/容積:5テキスタイル片直径25cm、50ml洗剤中被験物質:WFK10N卵の染み使用した洗剤は、ドイツのスーパーマーケットPersilMegapearlsから入手した。使用前に、電子レンジ処理85°Cで5分間により、洗剤中の全酵素活性を不活性化した。反射率測定は、本明細書中の実施例3に記載したように実施した。データR値は、以下のように評価した:サビナーゼ登録商標より高いR値を有する変異体は、値1とした。サビナーゼ登録商標より低いR値を有する変異体は、値-1とした。サビナーゼ登録商標と同様のR値を有する変異体は、値0とした。結果:変異体値サビナーゼ登録商標0L96LA1L96LAA98TA108CA138C1G97GIS99T1明らかなように、ズブチラーゼ変異体は、サビナーゼ登録商標と比較した場合、市販洗剤中での洗浄性能改良を示す。