"本願明細書に記載された発明。発明の要旨本発明は、いくつかの局面において、多糖調製物を特徴付けるための方法に関連する。複雑な多糖構造の結果として、多糖調製物の純度および/または活性を特徴付けることは困難であり、下手をすると不可能である。核酸サンプルおよびタンパク質サンプルとは異なり、多糖調製物は、一般的に、生物学的サンプル中の特定のレベルの活性を生成するためのそれらの能力に依存して特徴付けられる。これらのアッセイは、直接的な構造的特徴付けによって達成され得るレベルの正確さを達成しない。本発明のいくつかの局面に従って、多糖サンプルを分析および特徴付ける方法が提供される。この方法は、シグネチャー成分を有する改変された多糖を生成するためにサンプル中の多糖に実験的制限を適用する工程、多糖がこのサンプル中に存在する指標としてサンプル中のシグネチャー成分の存在を検出する工程、およびサンプルを分析するためのシグネチャー成分の存在または非存在を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、シグネチャー成分は、既知の生物学的活性を有し、他の実施形態において、シグネチャー成分は、生物学的に不活性である。サンプルに適用される実験的制限は、シグネチャー成分の存在または非存在の同定をもたらす任意の型の操作である。実験的制限は、例えば、以下の型の実験的制限のいずれか1つの単独または組み合わせであり得る:キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、ゲル透過クロマトグラフィー、核磁気共鳴、外酵素または内酵素を用いる消化のような酵素を用いる改変、化学的消化または化学的改変。シグネチャー成分は、サンプルについての情報を提供するために使用され得る。使用のいくつかは、シグネチャー成分が活性または不活性の生物学的成分であるか否かに依存する。例えば、シグネチャー成分が活性な生物学的成分であり、サンプルが多糖のバッチであるいくつかの場合、このシグネチャー成分は、バッチ中のシグネチャー成分の量を決定することによってそのバッチの純度をモニターするために使用され得る。他の実施形態において、この分析の方法は、サンプル中の活性成分の存在をモニタリングするための方法であり、ここで、サンプル中のシグネチャー成分の存在は、サンプル中の活性成分を示す。他の実施形態において、分析の方法は、サンプル中のシグネチャー成分の量を決定することによって、サンプル中の活性成分の量を決定するための方法である。この方法はまた、少なくとも2つのサンプルに対して行なわれ得、その結果、少なくとも2つのサンプルの各々におけるシグネチャー成分の相対量が決定され、そしてシグネチャー成分の最も高い相対レベルが最も活性なサンプルを示す。シグネチャー成分が不活性な生物学的サンプルであるいくつかの場合において、その分析の方法は、サンプル中の活性成分の存在をモニタリングするための方法であり得、ここで、サンプル中のシグネチャー成分の存在は、活性成分を欠くサンプルを示す。これらの方法はまた、生物学的に活性な分子を同定するためのいくつかの実施例において有用である。例えば、シグネチャー成分は、ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。従って、いくつかの実施例において、シグネチャー成分は、多糖の生物学的に活性な一部である。多糖の生物学的に活性な一部としては、ヘパリンのAT-III結合ドメインの四糖、ヘパリンのFGF結合ドメインの四糖、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;およびΔUHNS,6SGHNS,3Sが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、多糖は、グリコサミノグリカン例えば、低分子量ヘパリンLMWH、ヘパリン、生物工学的に調製されたヘパリン、化学的に改変されたヘパリン、合成ヘパリン、およびヘパラン硫酸である。別の実施形態において、サンプル中の多糖は、その多糖と同一のサイズの多糖の参照データベースと比較され、ここで、参照データベースの多糖もまた、サンプル中の多糖と同じ実験的制限に供され、ここで、比較は、サンプル多糖の組成分析を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、サンプルは薬学的生成物である。他の実施形態において、サンプルは、生物学的なサンプル例えば、血液サンプルである。多糖サンプルの品質を評価するための方法が、本発明の他の局面に従って提供される。この方法は、多糖サンプル中の成分を同定する工程、成分の量の定量的値を決定する工程であって、この成分の定量的値がその多糖サンプルの品質を示す、工程を包含する。1つの実施形態において、この方法は、多糖サンプル中の少なくとも2つの成分を同定する工程、および多糖サンプルの品質を評価するために少なくとも2つの成分の各々の量の定量的値を決定する工程を包含する。定量的値は、種々の異なる方法によって計算され得、サンプルが、成分を同定するためにどのように処理されるかに依存する。例えば、定量的値は、サンプルがキャピラリー電気泳動によって処理される場合、曲線の下の面積として、応答係数として、またはサンプル中に存在する各画分のパーセント相対量として、計算され得る。1つの実施形態において、サンプル中に存在する各画分のパーセント相対量を計算する工程は、以下の式:PRA=RF×AUCRに従って決定され、ここで、PRA=各画分のパーセント相対量RF=応答係数AUCR=パーセント相対AUC[100×AUCC/AUCT]AUCC=1つの成分についての曲線下の面積AUCT=全ての成分についての曲線下の面積の合計である。別の実施形態において、データ構造を作成するためのコンピューター実行方法は、コンピューター読み出し可能な媒体に実体的に具体化され、多糖の成分の定量的値を示し、この方法は、上の計算を実行する動作を含む。1つの実施形態において、成分は、シグネチャー成分ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sである。別の局面において、本発明は、グリコサミノグリカンの組成物を生成する方法に関連する。この方法は、第1のより高い分子量の画分および単離されたLMWHの第2の画分を生成するために溶媒中にてサンプルを含むグリコサミノグリカンの塩の沈澱を実施する工程、および濃縮されたLMWH調製物を生成するために単離されたLMWHの第2の画分を処理する工程を包含する。好ましい実施形態において、沈澱工程において使用される塩は、二価のカチオンおよび弱アニオンの塩である。先行技術は、一般的に、塩沈澱を使用してヘパリンを単離する方法が使用される場合、第1の画分は、LMWHを生成するために処理されるべきであり、第2の画分は、処分されるべきであることを教示する。第2の画分は、実際に、生物学的に活性なLMWHの好ましい供給源を含むことが発見された。いくつかの実施形態において、二価のカチオンおよび弱アニオンの塩は、以下を含む群の中より選択される;バリウム、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、銅、ニッケル、カドミウム、亜鉛、水銀、ベリリウム、ニッケル、パラジウム、白金、鉄、およびスズ。他の実施形態において、二価のカチオンおよび弱アニオンの塩は、二価の原子価を有する周期表のカチオン元素の酢酸塩である。LMWH画分の成分は、沈澱において使用される温度および溶媒の型を操作することによってさらに変更され得る。例えば、1つの実施形態において、沈澱は、0°C~70°Cの範囲の温度で実施され得る。他の実施形態において、混合物の温度は、70°C、60°C、50°C、40°C、30°C、25°C、20°C、15°C、10°C、5°C、3°C、2°C、1°C、または0°Cである。なお他の実施形態において、沈澱は、4°Cの温度で実行される。好ましくは、溶媒は、極性溶媒である。極性溶媒としては、H2O、エタノールと混合したH2O、アセトンと混合したH2O、またはH2O、エタノール、およびアセトンの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、沈澱において使用される極性溶媒は、99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、65:35、55:45、50:50、45:55、35:65、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、または1:99の範囲で、容量対容量のH2O:エタノール比を有する。他の実施形態において、沈澱において使用される極性溶媒は、99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、65:35、55:45、50:50、45:55、35:65、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、または1:99の範囲で、容量対容量のH2O:アセトン比を有する。1つの実施形態において、極性溶媒は、H2O、エタノール、およびアセトンの混合物である。1つの実施形態において、濃縮されたLMWH調製物を得るために第2の画分の処理の工程は、酵素的消化例えば、ヘパリナーゼIIIを用いる消化である。他の実施形態において、濃縮されたLMWH調製物を得るための第2の画分の処理は、化学的分解である。いくつかの実施形態において、化学的分解の方法は、H2O2またはCUおよびH2O2を用いる酸化的脱重合、亜硝酸イソアミルまたは亜硝酸を用いる脱アミノ切断、アルカリ処理またはヘパリナーゼによるヘパリンのベンジルエステルを用いるβ除去切断を含む群より選択される。他の実施形態において、濃縮されたLMWH調製物を得るための第2の画分の処理は、精製されたLMWH調製物を生成するための精製工程である。この方法は、薬学的なキャリア中に精製されたLMWH調製物を処方する工程をさらに包含し得る。他の実施形態において、グリコサミノグリカンは、ヘパリン、ヘパリンアナログ、LMWH、生物工学的ヘパリン、化学的に改変されたヘパリン、または合成ヘパリンからなる群より選択される。少なくとも150IU/mgの抗Xa活性を有するLMWH調製物および/または5より大きい抗Xa因子:抗IIa因子活性の比を有するLMWH調製物を含む組成物は、本発明の他の局面に従って、提供される。いくつかの実施形態において、LMWH調製物が単離され、そして他の実施形態において、それは合成である。いくつかの実施形態において、少なくとも150IU/mgの抗Xa活性を有するLMWH調製物は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の抗Xa因子:抗IIa因子活性の比を有する。他の局面において、組成物は、少なくとも15の二硫酸化二糖、75未満の三硫酸化二糖、3~5の単硫酸化二糖、および少なくとも2の4~7の4糖を有するLMWH調製物である。組成物は、皮下送達、静脈内送達、エアロゾル送達、または経口送達のような方法によって、被験体への治療的送達のために処方され得る。いくつかの実施形態において、LMWH調製物は、少なくとも3.5、4.0、または5.0のΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sを含む。ある状態を有する被験体を処置するための方法が、本発明の他の局面に従って提供される。この方法は、同定されたレベルのAT結合配列を有するLMWHの組成物を選択する工程であって、このAT結合配列のレベルが被験体において処置される状態に依存して選択される工程、および同定されたレベルのAT結合配列を有するLMWHの組成物の有効量を被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、被験体は、静脈もしくは動脈の血栓閉塞性疾患を有するか、または静脈もしくは動脈の血栓閉塞性疾患を発症する危険性がある。これらの被験体に投与されるLMWH調製物は、少なくとも3.5、4.0、または5.0のΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sを含み得る。他の実施形態において、LMWHの組成物は、少なくとも150IU/mgの抗Xa活性を有するLMWH調製物である。なお他の実施形態において、LMWHの組成物は、5より大きい抗Xa因子:抗IIa因子の活性比を有するLMWH調製物である。他の局面において、本発明は、以下を包含するプロセスによって調製されるLMWH調製物を含む組成物を含む:ヘパリン調製物を得る工程、およびヘパリナーゼI、ヘパリナーゼII、およびヘパリナーゼIIIを使用するヘパリン調製物の徹底的な消化を実施する工程。他の局面において、本発明は、以下を備える多糖サンプルを分析するためのキットに関連する:多糖のシグネチャー成分を同定するためのコントロール組成物、および多糖に特徴的なシグネチャー成分を有する改変された多糖を生成するために多糖サンプルに実験的制限を適用するための、そしてシグネチャー成分の存在または非存在を同定するためのコントロール組成物と改変された多糖を比較するための指示書。いくつかの実施形態において、このキットはまた、多糖サンプルに実験的制限を適用するための組成物例えば、外酵素または内酵素を備える。なお別の他の実施形態において、この指示書は、サンプル中の多糖のシグネチャー成分を定量するための工程を含む。本発明の制限の各々は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。従って、いずれか1つのエレメントまたはエレメントの組み合わせを含む、本発明の制限の各々は、本発明の各局面に含まれ得ることが理解される。例えば本願発明は、以下を提供する。項目1サンプルを分析する方法であって、該方法は、以下:Aサンプル中の多糖に、実験的制限を適用し、シグネチャー成分を有する修飾された多糖を生成する工程、B該多糖が該サンプル中に存在することの指標として、該サンプル中の該シグネチャー成分の存在を検出する工程、およびC該シグネチャー成分の存在または非存在を決定して、該サンプルを分析する工程、を包含する、方法。項目2前記シグネチャー成分が、既知の生物学的活性を有する、項目1に記載の方法。項目3前記シグネチャー成分が、生物学的に不活性である、項目1に記載の方法。項目4前記サンプルに適用される前記実験的制限が、キャピラリー電気泳動である、項目1に記載の方法。項目5前記サンプルに適用される前記実験的制限が、高圧液体クロマトグラフィーである、項目1に記載の方法。項目6前記サンプルに適用される前記実験的制限が、ゲル透過クロマトグラフィーである、項目1に記載の方法。項目7前記サンプルに適用される前記実験的制限が、核磁気共鳴である、項目1に記載の方法。項目8前記サンプルが、多糖のバッチであり、そして前記シグネチャー成分が、該バッチ中のシグネチャー成分の量を決定することによって、該バッチの純度をモニタリングするために使用される、項目1に記載の方法。項目9前記分析方法が、前記サンプル中の活性成分の存在をモニタリングするための方法であり、ここで、該サンプル中の前記シグネチャー成分の存在は、該サンプル中の活性成分を示す、項目2に記載の方法。項目10前記分析方法が、前記サンプル中の活性成分の存在をモニタリングするための方法であり、ここで、該サンプル中の前記シグネチャー成分の存在は、特定の活性を欠くサンプルを示す、項目3に記載の方法。項目11前期分析方法が、前記サンプル中のシグネチャー成分の量を決定することによって、該サンプル中の活性成分の量を決定するための方法である、項目2に記載の方法。項目12前記方法が、少なくとも2つのサンプルに対して実行され、ここで、該少なくとも2つのサンプルの各々におけるシグネチャー成分の相対的な量が決定され、ここで、シグネチャー成分の最も高い相対的レベルが、最も活性なサンプルを示す、項目2に記載の方法。項目13前記シグネチャー成分を使用して、生物学的に活性な分子を同定する工程をさらに包含する、項目2に記載の方法。項目14前記シグネチャー成分が、ライブラリーをスクリーニングするために使用される、項目13に記載の方法。項目15前記シグネチャー成分が、多糖の生物学的に活性な部分である、項目1に記載の方法。項目16前記多糖の生物学的に活性な部分が、ヘパリンのAT-III結合ドメインの四糖である、項目15に記載の方法。項目17前記多糖の生物学的に活性な部分が、ヘパリンのFGF結合ドメインの四糖である、項目15に記載の方法。項目18前記サンプルに適用される前記実験的制限が、外酵素による消化である、項目1に記載の方法。項目19前記サンプルに適用される前記実験的制限が、内酵素による消化である、項目1に記載の方法。項目20前記サンプルに適用される前記実験的制限が、化学的消化である、項目1に記載の方法。項目21前記サンプルに適用される前記実験的制限が、化学的修飾である、項目1に記載の方法。項目22前記サンプルに適用される前記実験的制限が、酵素による修飾である、項目1に記載の方法。項目23項目1に記載の方法であって、前記サンプル中の前記多糖が、該多糖と同一のサイズの多糖の参照データベースと比較され、ここで、該参照データベースの該多糖もまた、該サンプル中の該多糖と同じ実験的制限に供され、ここで、該比較が、該サンプルの多糖の組成分析を提供する、方法。項目24前記多糖が、グリコサミノグリカンである、項目1に記載の方法。項目25前記多糖が、低分子量ヘパリンである、項目1に記載の方法。項目26前記多糖が、ヘパリンである、項目1に記載の方法。項目27前記多糖が、生物工学的に調製されるヘパリンである、項目1に記載の方法。項目28前記多糖が、化学的に修飾されたヘパリンである、項目1に記載の方法。項目29前記多糖が、合成ヘパリンである、項目1に記載の方法。項目30前記多糖が、ヘパラン硫酸である、項目1に記載の方法。項目31前記サンプルが、薬学的生成物である、項目1に記載の方法。項目32前記サンプルが、生物学的サンプルである、項目1に記載の方法。項目33前記サンプルが、血液サンプルである、項目1に記載の方法。項目34前記シグネチャー成分が、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sのいずれか1つに対応するピークのうちの1つである、項目1に記載の方法。項目35多糖サンプルを分析するためのキットであって、該キットは、A多糖のシグネチャー成分を同定するためのコントロール組成物、ならびにB実験的制限を多糖サンプルに適用して、該多糖に特徴的なシグネチャー成分を有する修飾された多糖を生成する工程、そして該修飾された多糖を、該コントロール組成物に対して比較して、該シグネチャー成分の存在または非存在の同定する工程、に関する指示書、を備える、キット。項目36前記多糖が、グリコサミノグリカンである、項目35に記載のキット。項目37前記多糖が、低分子量ヘパリンである、項目35に記載のキット。項目38前記多糖が、ヘパリンである、項目35に記載のキット。項目39前記多糖が、ヘパラン硫酸である、項目35に記載のキット。項目40前記多糖が、生物工学的に調製されるヘパリンである、項目35に記載のキット。項目41前記多糖が、化学的に修飾されたヘパリンである、項目35に記載のキット。項目42前記多糖が、合成ヘパリンである、項目35に記載のキット。項目43実験的制限を前記多糖サンプルに適用するための組成物をさらに備える、項目35に記載のキット。項目44前記組成物が、外酵素である、項目43に記載のキット。項目45前記組成物が、内酵素である、項目43に記載のキット。項目46前記シグネチャー成分が、ヘパリンのAT-III結合ドメインの四糖である、項目43に記載のキット。項目47前記シグネチャー成分が、ヘパリンのFGF結合ドメインの四糖である、項目43に記載のキット。項目48前記シグネチャー成分が、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sのいずれか1つに対応するピークのうちの1つである、項目43に記載のキット。項目49前記指示書が、前記サンプル中の前記多糖の前記シグネチャー成分を定量するための工程を含む、項目35に記載のキット。項目50多糖サンプルの品質を評価するための方法であって、該方法は、該多糖サンプル内の成分を同定し、該成分の量の定量的な値を決定する工程であって、該成分の定量的な値が、該多糖サンプルの品質を示す、工程、を包含する、方法。項目51前記方法が、前記多糖サンプル内の少なくとも2つの成分を同定する工程、および該少なくとも2つの成分の各々の量の定量的な値を決定して、該多糖サンプルの品質を評価する工程を包含する、項目50に記載の方法。項目52前記定量的な値が、前記サンプルがキャピラリー電気泳動によって処理される場合に、曲線下の面積として計算される、項目51に記載の方法。項目53前記定量的な値が、応答係数として計算される、項目51に記載の方法。項目54前記定量的な値が、前記サンプル中に存在する各画分の相対的な量のとして計算される、項目51に記載の方法。項目55項目51に記載の方法であって、前記サンプル中に存在する各画分の相対的な量のを計算する前記工程が、以下の等式:PRA=RF×AUCRに従って決定され、ここで、PRA=各画分の相対的な量のRF=応答係数AUCR=AUCの相対的な[100×AUCC/AUCT]AUCC=1つの成分についての曲線下の面積AUCT=全ての成分についての曲線下の面積の合計、である、方法。項目56多糖の成分の定量的な値を示す、コンピューター読み取り可能な媒体中に実体的に具体化されるデータ構造を生成するための、コンピューターが実行する方法であって、該方法は、項目55に記載の計算を実行する作動を包含する、方法。項目57前記成分が、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sのいずれか1つに対応するピークのうちの1つである、項目50に記載の方法。項目58グリコサミノグリカンの組成物を生成する方法であって、該方法は、A溶媒中で、グリコサミノグリカン含有サンプルの塩沈殿を実行して、第一の高分子量画分、および単離されたLMWHの第二の低分子量画分を生成しする工程、ならびにB該単離されたLMWHの第二の画分を処理して、濃縮LMWH調製物を生成する工程、を包含する、方法。項目59前記沈殿工程で使用される塩が、二価のカチオンと弱アニオンとの塩である、項目58に記載の方法。項目60前記塩が、バリウム、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、銅、銀、金、ニッケル、カドミウム、亜鉛、水銀、ベリリウム、パラジウム、白金、鉄または錫を含む群の中からの元素より選択される、項目58に記載の方法。項目61前記二価のカチオンと弱アニオンとの塩が、二価の価を有する周期表の元素のカチオンの酢酸塩である、項目59に記載の方法。項目62前記二価のカチオンと弱アニオンとの塩が、酢酸バリウム、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、酢酸ストロンチウム、酢酸銅、酢酸ニッケル、酢酸カドミウム、または塩化カルシウムを含む群の中から選択される、項目58に記載の方法。項目63前記二価のカチオンと弱アニオンとの塩が、酢酸バリウムである、項目58に記載の方法。項目64前記二価のカチオンと弱アニオンとの塩が、酢酸カルシウムである、項目58に記載の方法。項目65前記沈殿が、0°C~70°Cの範囲の温度で実行される、項目58に記載の方法。項目66前記沈殿が、4°Cの温度で実行される、項目58に記載の方法。項目67前記溶媒が、極性溶媒である、項目58に記載の方法。項目68前記極性溶媒が、H2O、エタノールと混合したH2O、アセトンと混合したH2O、またはH2O、エタノールおよびアセトンの組み合わせである、項目67に記載の方法。項目69前記極性溶媒が、H2O、エタノールおよびアセトンの混合物である、項目67に記載の方法。項目70前記第二の画分を処理して、前記濃縮LMWH調製物を得る工程が、酵素的消化である、項目58に記載の方法。項目71前記酵素的消化に使用される酵素が、ヘパリナーゼIIIである、項目70に記載の方法。項目72前記第二の画分を処理して、前記濃縮LMWH調製物を得る工程が、化学的分解である、項目58に記載の方法。項目73前記化学的分解方法が、H2O2、またはCUおよびH2O2による酸化的脱重合;亜硝酸イソアミルまたは亜硝酸による脱アミノ的切断;アルカリ処理またはヘパリナーゼによる、ヘパリンのベンジルエステルによるβ脱離的切断、を包含する、項目72に記載の方法。項目74前記グリコアミノグリカンが、ヘパリン、ヘパリンアナログ、LMWH、生物工学的ヘパリン、化学的に修飾されたヘパリン、または合成ヘパリンからなる群より選択される、項目58に記載の方法。項目75前記第一の画分を処理して、前記濃縮LMWH調製物を得る工程が、精製LMWH調製物を生成するための精製工程である、項目58に記載の方法。項目76薬学的キャリア中に前記精製LMWH調製物を処方する工程をさらに包含する、項目75に記載の方法。項目77前記濃縮LMWH調製物が、インタクトなAT結合ドメインを含有するLMWH調製物である、項目58に記載の方法。項目78前記第二の画分を、処理工程の前にイオン交換クロマトグラフィーに供する工程をさらに包含する、項目58に記載の方法。項目79少なくとも150IU/mgの抗Xa活性を有するLMWH調製物を含有する、組成物。項目80前記LMWH調製物が、1より大きい抗Xa因子:抗IIa因子の活性比を有する、項目79に記載の組成物。項目81前記LMWH調製物が、3より大きい抗Xa因子:抗IIa因子の活性比を有する、項目79に記載の組成物。項目82前記LMWH調製物が、4より大きい抗Xa因子:抗IIa因子の活性比を有する、項目79に記載の組成物。項目83前記LMWH調製物が、5より大きい抗Xa因子:抗IIa因子の活性比を有する、項目79に記載の組成物。項目84前記LMWH調製物が、単離されたLMWH調製物である、項目79に記載の組成物。項目85前記LMWH調製物が、合成LMWH調製物である、項目79に記載の組成物。項目86前記LMWH調製物が、皮下送達のために処方される、項目79に記載の組成物。項目87前記LMWH調製物が、静脈内送達のために処方される、項目79に記載の組成物。項目88前記LMWH調製物が、エアロゾル送達のために処方される、項目79に記載の組成物。項目89前記LMWH調製物が、経口送達のために処方される、項目79に記載の組成物。項目90前記LMWH調製物が、少なくとも3.5のΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sを含む、項目79に記載の組成物。項目91前記LMWH調製物が、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sに対応するピークのうちの1つの、少なくとも4.0を含む、項目79に記載の組成物。項目92前記LMWH調製物が、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNE,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNE,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sに対応するピークのうちの1つの、少なくとも5.0を含む、項目79に記載の組成物。項目935より大きい抗Xa因子:抗IIa因子の活性比を有するLMWH調製物を含む、組成物。項目94ある状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、A同一レベルのAT結合配列を有するLMWHの組成物を選択する工程であって、AT結合配列のレベルが、該被験体の処置されるべき状態に依存して選択される、工程、およびB該同一レベルのAT結合配列を有するLMWHの組成物の有効量を、被験体に投与する工程、を包含する、方法。項目95前記被験体が、静脈または動脈の血栓塞栓疾患を有するか、またはこれらを発症する危険性がある、項目94に記載の方法。項目96前記LMWHの組成物が、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sに対応するピークのうちの1つの、少なくとも3.5を含むLMWH調製物である、項目95に記載の方法。項目97前記LMWHの組成物が、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sに対応するピークのうちの1つの、少なくとも4.0を含むLMWH調製物である、項目95に記載の方法。項目98前記LMWHの組成物が、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sに対応するピークのうちの1つの、少なくとも5.0を含むLMWH調製物である、項目95に記載の方法。項目99前記LMWHの組成物が、少なくとも150IU/mgの抗Xa活性を有するLMWH調製物である、項目95に記載の方法。項目100前記LMWHの組成物が、5より大きい抗Xa因子:抗IIa因子の活性比を有するLMWH調製物である、項目95に記載の方法。項目101少なくとも15の二硫酸化二糖、75未満の三硫酸化二糖、3~5の一硫酸化二糖、および少なくとも2の4~7個の四糖を有するLMWH調製物を含有する、組成物。詳細な説明本発明は、多糖生物学の分野において新規の発展を導いたいくつかの発見を含む。多糖の特徴付けにおける主要な問題のうちの1つは、その構造多様性から生じる。この構造多様性は、多糖に関する配列-機能の関連性を研究することを困難にする要素のうちの1つである。規定された多糖の化学合成が、生物学的な活性に対する相対的な寄与を研究する際に使用されている例えば、ヘパリン五糖配列における特定の改変の高親和性AT-III結合Desai,U.R.,Petitou,M.,Bjork,IOlson,S.T.1998JBiolChem273,7478-87.。しかし、このような合成方法は、複雑であり、そして他の生物学的配列の研究に広範に適用されていない。目的のタンパク質と多糖の親和性分別および引続く特徴付けを含む代替アプローチが、親和性を決定する多糖の硫酸化パターンに関するいくつかの全体的な情報を提供しているParthasarathy,N.,Gotow,L.F.,Bottoms,J.D.,Kute,T.E.,Wagner,W.D.Mulloy,B.1998JBiolChem273,21111-4.;Sasaki,T.,Larsson,H.,Kreuger,J.,Salmivirta,M.,Claesson-Welsh,L.,Lindahl,U.,Hohenester,E.Timpl,R.1999EmboJ18,6240-8.;ならびにKreuger,J.,Prydz,K.,Pettersson,R.F.,Lindahl,U.Salmivirta,M.1999Glycobiology9,723-9.。本発明は、1つの局面において、多糖サンプルを特徴付けるための新規方法に基づく。多糖配列が、迅速かつ正確に配列決定されて、多糖のシグネチャー成分を同定し得ることが、発見された。このシグネチャー成分は、以前可能ではなかった様式で多糖サンプルを特徴付けるために使用され得る。薬品等級の多糖の分析は、米国薬局方USPおよび他の国定の薬局方によって管理される。一般的に、多糖に必要とされる分析の型は、機能的アッセイであり、そしていくつかの場合、非常に一般的な構造アッセイである。市販のヘパリン調製物の活性/純度を決定するために現在使用されているアッセイは、インビトロ凝集アッセイおよび細菌エンドトキシンについての試験である。ヘパリンの量は、USP参照標準単位/mlとして規定されるまたは未分別ヘパリンについての第五国際標準WHO-5国際単位/mlとして規定されると比較して、20°Cで1時間維持した場合に1mlのヒツジ血漿に半分の血塊を生じさせる量であるとして、決定される。Linhardt,R.J.Gunay,N.S.1999SeminThrombHemost25,5-16.。他非多糖薬物についての厳格な規制必要条件と比較して、これらの特徴付け標準は、時代遅れである。本発明の方法は、これらのサンプルを特徴付けるためのよりさらに正確な方法を提供する。この方法は、多糖を含むサンプルを操作して、シグネチャー成分の存在または非存在を同定する工程を包含する。サンプル中に存在するシグネチャー成分の量が、決定され得る。シグネチャー成分の量は、サンプルの正確な特徴付けを提供する。従って、いくつかの局面において、本発明は、シグネチャー成分を有するサンプル中の多糖に実験的制限を適用して改変多糖を生成し、多糖がそのサンプル中に存在することの指標としてサンプル中のシグネチャー成分の存在を決定し、そしてそのサンプルを分析するためにシグネチャー成分の存在または非存在を決定することによって、サンプルを分析する方法である。多糖は、互いに連結された単糖から構成されるポリマーである。多くの多糖において、多糖の基本的な構築ブロックは、実際は二糖単位であり、この二糖は、反復しても反復しなくてもよい。従って、多糖に関して使用される場合、単位は、多糖の基本的な構築ブロックをいい、そして単量体構築ブロック単糖または二量体構築ブロック二糖を含み得る。多糖サンプルを特徴付けるための方法は、ヘパリン様グリコサミノグリカンHLGAGの実験的な分析に基づいて開発されたが、本明細書中に教示される特性は、他の多糖にまで及び得る。本発明の方法は、例としてHLGAGに関して考察されるが、本方法は、HLGAGに限定されない。従って、1つの実施形態において、分析される多糖サンプルとしては、HLGAGまたはグリコサミノグリカンが挙げられる。本明細書中に使用される場合、用語HLGAGおよびグリコサミノグリカンは、交換可能に使用されて、ヘパリン様構造およびヘパリン様特性を有する分子のファミリーをいう。これらの分子としては、低分子量ヘパリンLMWH、ヘパリン、生物工学的に調製されたヘパリン、化学的に改変されたヘパリン、合成ヘパリン、および硫酸ヘパランが挙げられるが、これらに限定されない。用語生物工学的ヘパリンは、化学的に改変された天然の供給源の多糖から調製されたヘパリンを含み、そして、Raziら、Bioche.J.1995Jul15;309Pt2:465-72に記載される。化学的に改変されたヘパリンは、Yatesら、CarbohydrateRes1996Nov20;294:15-27に記載され、そして当業者に公知である。合成ヘパリンは、当業者に周知であり、そしてPetitou,M.ら、BioorgMedChemLett.1999Apr19;98:1161-6に記載される。以下の実施例に示されるように、AT-III分別した十糖AT-10これは、HLGAGのシグネチャー成分として使用され得るの配列が、特性コード化命名法/質量分析法PEN-MALDI、米国特許出願第09/557,997および同第09/558,1372000年4月24日出願これらは、共通した発明者を有するならびにVenkataraman,G.,Shriver,Z.,Raman,R.Sasisekharan,R.1999Science286,537-42.に記載される配列決定方法論を用いて、同定された。積分グリカン配列決定IntegralGlycanSequencingIGSTurnbull,J.E.,Hopwood,J.J.Gallagher,J.T.1999ProcNatlAcadSciUSA96,2698-703.および十糖の陽子核磁気共鳴1HNMR分析は、PEN-MALDIの結果と一致している。この配列決定戦略の順応性はまた、本発明者らがオリゴ糖存在する場合の汚染に関する配列情報を引き出し得るという事実によってもまた、実証される。化学的な複合体AT-III分別多糖の配列決定稀有であるグルコサミンの3-O-硫酸化を含むは、目的の他のHLGAGオリゴ糖例えば、増殖因子結合特性を有するHLGAGの分析に延長され得る方法論を確立した。これらの型の配列についての直接的な配列決定方法論は、この重要な分子クラスの構造-機能研究を可能にした。HLGAGおよび他の多糖全てが、シグネチャー成分を有する。シグネチャー成分は、特定の多糖に存在し、かつその特定の多糖の特徴である、オリゴ糖である。選択されるシグネチャーの特性は、研究される多糖の型およびその多糖に適用される実験的制限の型に依存し得る。このシグネチャーは、特定の実験的制限によって操作される特定の多糖の再生可能なエレメントである。例えば、同定され、かつ有用であることが実証されたHLGAGのいくつかのシグネチャーは、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sである。HLGAGを含むサンプルが、へパリナーゼ処理後にキャピラリー電気泳動に供される場合、このシグネチャーが同定され、そして定量化され得る。このシグネチャー成分は、生物学的に活性であっても不活性であってもよい。重要な情報は、シグネチャー成分から誘導され得るこのシグネチャー成分が活性な成分であるか不活性な成分であるかに関わらない。生物学的活性を有するシグネチャーは、特定の生物学的機能を生成することが公知のオリゴ糖である。例えば、HLGAGの四糖であるΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sは、第Xa因子の阻害を生じる抗凝固性活性を保有する配列の一部であることが公知である。従って、サンプル中のこの成分の存在は、HLGAGの抗凝固性活性の直接的な指標である。生物学的活性を有するシグネチャーが、種々の目的のために使用され得る。例えば、これらの型のシグネチャーは、多糖調製物のバッチ間変動性をモニタリングするのに有用である。各バッチの純度は、そのバッチ中の活性なシグネチャー成分の量を決定することによって、決定され得る。これらのシグネチャーはまた、サンプル中のシグネチャー成分の存在がそのサンプル中の活性な成分を示す場合、サンプル中の活性な成分の存在をモニタリングするのに有用である。例えば、シグネチャー成分は、加工手順を通して活性成分を追跡するために使用され得る。この方法を用いて、各分離工程後に生成物を試験し、生物学的に活性な成分を含む画分を決定し得る。サンプル中の活性な成分の量はまた、そのサンプル中のシグネチャー成分の量を決定することによって、定量され得る。この方法はまた、どのサンプルが最も高い活性を有するかを決定するためか、またはサンプルの純度を比較するために、少なくとも2つのサンプルに対して実行され得る。この場合、少なくとも2つのサンプルの各中のシグネチャー成分の相対量が決定される。シグネチャー成分の最も高い相対レベルが、最も活性なサンプルを示す。さらに、この活性なシグネチャーは、化合物または化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって生物学的に活性な分子を同定するために使用され得る。ライブラリーとしては、例えば、ファージディスプレイライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、ペプトイドおよび非ペプチド合成部分のライブラリーが挙げられる。ファージディスプレイは、シグネチャー成分と相互作用するペプチドヒト抗体を含むを同定する際に特に有効であり得る。簡単に言うと、従来の手順を用いて4~約80アミノ酸残基の挿入物を提示するファージライブラリー例えば、m13、fd、またはλファージを使用するを調製する。例えば、挿入物は、完全に縮重したアレイまたは偏ったアレイを提示し得る。次いで、シグネチャー成分に結合する挿入物保有ファージを選択し得る。このプロセスは、シグネチャー成分に結合するファージの数回の再選択を通して、繰り返され得る。回を繰り返すことによって、特定の配列を保有するファージの富化が導かれる。DNA配列分析を実施して、発現ポリペプチドの配列を同定し得る。シグネチャー成分に結合する配列の最小線状部分が、決定され得る。最小線状部分およびその上流または下流の1つ以上のさらなる縮重残基の一部または全てを含む挿入物を含む偏りライブラリーを用いて、この手順を繰り返し得る。酵母ツーハイブリッドスクリーニング方法もまた、シグネチャー成分に結合するポリペプチドを同定するために使用され得る。既知のシグネチャー成分に基づく、ペプチドおよび非ペプチドのライブラリーは、当業者によって容易に作製され得る。商業企業例えば、ArQuleWoburn,MAは、模倣化合物の生成のためのカスタムライブラリーを調製する。多糖の生物学的に活性な部分の例としては、ヘパリンのAT-III結合ドメインの4糖、ヘパリンのFGF結合ドメインの四糖、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNAC,6SGHNS,3S、またはΔUHNS,6SGHNS,3Sであるが、これらに限定されない。生物学的に不活性であるシグネチャーは、特定の公知の生物学的機能と関連しないオリゴ糖である。これらのオリゴ糖は、いくつかの生物学的機能を有し得るが、分析される特定の機能を有し得ない。例えば、オリゴ糖は、腫瘍細胞増殖の阻害を実際に引き起こし得るが、凝固カスケードに対するいかなる効果も有し得ない。多糖サンプルが抗凝固目的に有用な多糖の存在またはこのような多糖の量を同定する目的のために評価される場合、検出されるオリゴ糖は、生物学的に不活性なシグネチャーであると考えられる。一方、多糖サンプルは、腫瘍細胞増殖を予防するのに有用な多糖の存在またはこのような多糖の量を同定する目的のために評価され、検出されるオリゴ糖は、生物学的に活性なシグネチャーであると考えられる。生物学的に不活性であるシグネチャーは、生物学的に活性なシグネチャーと同じ目的のうちのいくつか、ならびに他の目的のために使用され得る。生物学的に不活性なシグネチャーはまた、多糖調製物のバッチ間の変動性をモニターするために使用され得る。2つのバッチは互いに比較されるので、不活性なシグネチャーおよび活性なシグネチャーの両方が使用され得る。サンプル中のシグネチャー成分の存在が、特定の活性を欠くサンプルを示すか、または低いレベルのこの活性を有するサンプルを示す場合、不活性なシグネチャー成分はまた、そのサンプル中の活性な成分の存在をモニタリングするために使用され得る。従って、不活性なシグネチャー成分の存在が活性な成分の存在と反比例する場合、不活性な成分の存在は、そのサンプルの活性に関する重要な情報を提供し得る。例えば、不活性なシグネチャー成分が、多糖の活性成分の分解産物である場合、不活性な成分の存在は、不活性な成分が存在しなかったというよりも、活性な成分のうちのいくつかが分解し、ゆえにそのサンプルは活性が低いということを示す。本明細書中に使用される場合、実験的制限は、サンプルの改変を生じさせてシグネチャーの検出を可能にする、多糖サンプルに対して実行される生物学的プロセスである。実験的制限としては、分離方法例えば、質量分析法、キャピラリー電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーHPLC、ゲル透過クロマトグラフィー、核磁気共鳴;酵素消化例えば、外酵素、内酵素;化学消化;化学改変;化学ピーリングすなわち、単糖単位の除去;ならびに酵素改変例えば、硫酸ヘパリンスルホトランスフェラーゼを用いた特定の位置における硫酸化が挙げられるが、これらに限定されない。シグネチャーは、使用される実験的制限と一貫する任意の手段によって同定され得る。例えば、シグネチャー成分の分子量は、質量分析法を含む幾つかの方法によって決定され得る。多糖の分子量を決定するための質量分析法の使用は、当該分野で周知である。質量分析法は、生成されたフラグメント例えば、酵素切断によるの質量を報告する際のその精度±1ダルトンに起因して、そしてまた、pMのサンプル濃度のみを必要とすることに起因して、多糖を特徴付けるための強力なツールとして使用されている。例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法MALDI-MSは、刊行物例えば、Rhomberg,A.J.ら、PNAS,USA,v.95,p.4176-41811998;Rhomberg,A.J.ら、PNAS,USA,v.95,p.12232-122371998;およびErnst,S.ら、PNAS,USA,v.95,p.4182-41871998これらの各々は、参考として本明細書によって援用される中に、多糖フラグメントの分子量を同定することについて記載されている。当該分野で公知の質量分析法の他の型例えば、エレクトロスプレー-MS、高速原子衝撃質量分析法FAB-MSおよび衝突活性化脱離質量分析法CADもまた使用して、多糖フラグメントの分子量を同定し得る。質量分析データは、多糖シグネチャー成分単独に関する情報を確認するため、または多糖が酵素または化学物質によって分解を引き起こした後に多糖シグネチャー成分に関する情報を確認するための価値のあるツールであり得る。多糖の分子量が同定された後、それは、他の既知多糖の分子量に対して比較され得る例えば、米国特許出願09/557,997および同09/558,1372000年4月24日出願の方法を用いて。これらの特許出願に示されるように、分子量を比較するための1つの技術は、質量ラインを生成し、そして未知の多糖の分子量をその質量ラインに対して比較し、同じ分子量を有する多糖の部分集団を決定することである。質量ラインは、情報データベースであり、好ましくは、多糖の分子量に基づいて、特有の配列を有する多糖の各可能な型に関する情報を保存する、グラフまたはチャートの形式である。質量分析法データは、1Daの精度までフラグメントの質量を示すので、長さは、その質量ライン上の質量を調べることによって、フラグメントに対して独自に割り当てられ得る。さらに、二糖よりも長い特定の長さのフラグメント内において、スルフェート基80.06Daと置換された2つのアセテート基84.08Daを示す、最小4.02Daの質量の差異が存在することが、質量ラインから決定され得る。従って、多糖フラグメントの多数のスルフェートおよび多数のアセテートは、質量分析法データから質量によって決定され得、そしてこのような数が、多糖フラグメントに対して割り当てられ得る。分子量に加えて、シグネチャー成分の他の特性が決定され得る。置換基または化学単位総置換基または化学単位の、量および型の組成比は、当該分野で公知の方法論例えば、キャピラリー電気泳動を用いて決定され得る。多糖は、最初の実験的制限例えば、酵素分解または化学分解に供されて、多糖をより小さいフラグメントの分離し得る。次いで、これらのフラグメントは、第2の実験制約に供され得、すなわち、これらは、キャピラリー電気泳動を用いて分離されて、多糖中に存在する置換基または化学単位の量および型を決定し得る。あるいは、多糖は、事前の酵素分解なしで、単一の実験的制限例えば、キャピラリー電気泳動に供され得る。キャピラリーゲル電気泳動の方法において、反応サンプルは、小さい直径のゲル充填キャピラリーによって分析され得る。小さい直径50μmのキャピラリーは、電気泳動の間に生成された熱の効率的な消散を可能にする。従って、高いフィールド強度を、過度のジュール熱400V/mを伴わずに使用し得、分離時間を1反応実行あたり約20分に低下させ、ゆえに、従来のゲル電気泳動を超えた分解を増大させる。さらに、多くのキャプラリーが並行して分析され得、生成された多糖情報の増幅を可能にする。シグネチャー成分を評価するための他の方法もまた、利用され得る。例えば、他の方法としては、粘性Jandik,K.A.,Gu,K.およびLinhardt,R.J.,1994,Glycobiology,4:284-296または総UV吸光度Ernst,S.ら1996Biochem.J.315:589-597のようなパラメーターに依存する方法が挙げられる。HLGAGフラグメントは、ヘパリンリアーゼ酵素ヘパリナーゼのような酵素または亜硝酸を用いて分解され得、そしてこれらはまた、スルフェート基を上記に言及した位置に移動させるかまたはスルフェート基をそれらの位置から取り除く異なる酵素を用いて改変され得る。改変酵素は、外溶解性かつ非進展的である酵素であり、このことは、これらの酵素が非還元末端に一度だけ作用し、そしてその鎖の残りを連続して改変することなく、そのヘパリン鎖を離れさせることを意味する。二糖単位中の改変可能な位置の各々について、改変酵素が存在する。スルフェート基を添加する酵素はスルホトランスフェラーゼと呼ばれ、そしてスルフェート基を取り除く酵素は、スルファターゼと呼ばれる。改変酵素としては、2-Oスルファターゼ/スルフォトランスフェラーゼ、3-Oスルファターゼ/スルフォトランスフェラーゼ、6-Oスルファターゼ/スルフォトランスフェラーゼおよびN-デアセチラーゼ-N-スルホトランスフェラーゼが挙げられる。これらの酵素の機能は、これらの名称から明らかであり、例えば、2-Oスルホトランスフェラーゼは、スルフェート基をイズロン酸の2-O位に転移させ2-Oスルフェートグルクロン酸は、HLGAG鎖中で希少な頻度である、そして2-Oスルファターゼは、スルフェート基をイズロン酸の2-O位から取り除く。HLGAG分解酵素としては、ヘパリナーゼ-I、ヘパリナーゼ-II、ヘパリナーゼ-III、D-グルクロニダーゼおよびL-イズロニダーゼ、改変バージョンのsofヘパリナーゼ、これらの改変体および機能的に活性なフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。Flavobacteriumheparinum由来の3つのヘパリナーゼは、LMWH5,000~8,00Daおよび超低分子量ヘパリン約3,000Daの生成のために使用されている酵素ツールである。ヘパリナーゼIは、2-O硫酸化ウロン酸においてHLGAGの高度に硫酸化された領域を切断し、一方ヘパリナーゼIIは、より広い基質特異性を有し、そして2-O硫酸化ウロン酸および2-O非硫酸化ウロン酸の両方を含むグリコシド連結を切断するErnst,S.,Langer,R.,Cooney,C.L.Sasisekharan,R.1995CritRevBiochemMolBiol30,387-444。ヘパリナーゼIとは対照的に、ヘパリナーゼIIIは、主に、HLGAGの硫酸化にある領域すなわち、非硫酸化ウロン酸を含むグリコシド連結を切断するErnst,S.,Langer,R.,Cooney,C.L.Sasisekharan,R.1995CritRevBiochemMolBiol30,387-444。ヘパリナーゼの基質特異性への複数の調査は、HLGAGに関する構造-機能関係を発展させるためのツールとして、その有用性が高まっている。いくつかの特許および特許出願は、ヘパリナーゼの有用な改変ならびにヘパリナーゼの改変体およびフラグメントを記載する。米国特許第6,217,863B1号ならびに係属出願09/384,959および09/802,285を含む。他の改変および改変体もまた、有用である。薬理学的LMWHの生成因子としてのこれらのヘパリナーゼの有用性を最大化するために、より詳細な理解が必要とされる。本発明の発見は、これらの詳細のいくつかを提供する下に記載する。名前を挙げるとすると、グルクロニダーゼおよびイズロニダーゼは、それぞれ、グルクロン酸およびイズロン酸の後でグリコシド連結にて切断する。亜硝酸は、N硫酸化ヘキソサミン後のグリコシド連結においてランダムにクリップし、6員環ヘキソサミン環を5員環無水マンニトール環に変換する。シグネチャー成分の存在を同定することによって多糖を分析するための方法は、多糖の定性的評価例えば、シグネチャー成分が存在するかしないかにかかわらず、または定量的評価例えば、シグネチャー成分の量は、異なるサンプルを比較するためのサンプル品質例えば、活性、純度を示すため、または異なるサンプルと簡単に比較するために、表される。いくつかの局面において、この方法は、多糖サンプル中の成分を同定する工程、および成分の量の定量的な値を決定する工程によって実行される。いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも2つの成分を同定および定量する工程を包含する。定量的な値は、任意の平均値、例えば、サンプルをキャピラリー電気泳動、レセプター因子RF、またはサンプル中に存在する各画分の相対量のパーセントによって処理される場合、曲線下の面積AUCを決定することによって、計算され得る。これらの型の計算を行う方法は、以下の実施例の節に詳細に記載される。簡単に言うと、AUCがCEスペクトルから直接計算され得る。応答係数は、コントロールオリゴ糖と同じ応答を与えるシグネチャーの量である。RFは、例えば、吸光度に関して計算され得、そしてコントロールサンプルの吸光度と比較される。サンプル中に存在する各画分の相対量のパーセントは、以下の式:PRA=RF×AUCRここで、PRA=各画分の相対的な量の、RF=応答係数AUCR=AUCの相対的な[100×AUCc/AUCT]]AUCc=1成分についての曲線下の面積AUCT=全成分についての曲線下の面積の合計に従って、決定され得る。このデータは、個別に処理されるかまたはコンピューターによって処理され得る。例えば、多糖の成分の定量的な値を表す、コンピューター読み取り可能な媒体中に実体的に具体化される、データ構造を作成するためのコンピューターによる実行方法が、本発明に従って実行され得る。定量的な決定が、上記の計算を実行することによってなされる。コンピュータープログラムとして上記を実行し得るコンピューターシステムは、典型的には、使用者へ情報を表示する出力デバイスおよび使用者からの入力を受け取る入力デバイスの両方に接続された主要ユニットを含む。この主要ユニットは、一般的に相互接続機構を介して記憶システムに接続されたプロセッサーが含む。入力デバイスおよび出力デバイスの両方はまた、相互接続機構を介してこのプロセッサーおよび記憶システムに接続され得る。1以上の出力デバイスが、コンピューターシステムに接続され得る。出力デバイスの例としては、陰極線管CRTディスプレイ、液晶表示器LCD、プリンター、連絡デバイス例えば、モデムおよびオーディオ出力が挙げられる。1以上の入力デバイスがまた、コンピューターシステムに接続され得る。入力デバイスの例としては、キーボード、キーパッド、トラックボール、マウス、ペンおよびタブレット、連絡デバイス、ならびにデータ入力デバイス例えば、センサーが挙げられる。本明細書中で開示される内容は、コンピューターシステムと組合わせて使用される特定の入力デバイスもしくは出力デバイス、または本明細書中に記載される入力デバイスもしくは出力デバイスに限定されない。コンピューターシステムは、コンピュータープログラム可能な言語例えば、C、Java登録商標または他の言語例えば、スクリプト言語またはアセンブリ言語を使用してコンピュータープログラム可能な、一般用途のコンピューターシステムであり得る。コンピューターシステムはまた、特別にプログラムされた、特別な目的のハードウェア例えば、Application-SpecificIntegratedCircuitASICのようなを含み得る。一般用途のコンピューターシステムにおいて、プロセッサーは、典型的には、市販のプロセッサーであり、X86シリーズプロセッサー、Celeronプロセッサー、およびPentium登録商標プロセッサーIntelより入手可能、ならびにAMDおよびCyrixからの類似のデバイス、680X0シリーズマイクロプロセッサーMotorolaから入手可能、IBMからのPowerPCマイクロプロセッサーおよびDigitalEquipmentCorporationからのAlpha-シリーズプロセッサーがその例である。多くの他のプロセッサーが、利用可能である。このようなマイクロプロセッサーは、オペレーティングシステムと呼ばれるプログラムを実行する。このプログラムは、Windows登録商標NT、Linux、UNIX登録商標、DOS、VMSおよびOS8がその例であり、これは、他のコンピュータープログラムの実行を制御し、スケジューリング、デバッギング、入力/出力制御、計算accounting、編集、記憶割当て、データ管理およびメモリー管理、ならびに連絡制御および関連サービスを提供する。プロセッサーおよびオペレーティングシステムは、高レベルにプログラムされている言語におけるアプリケーションプログラムが書き込まれ得るコンピュータープラットホームを規定する。メモリーシステムとしては、典型的にはコンピューター読み取り可能な記録媒体および書き込み可能な揮発性記録媒体が挙げられ、磁気ディスク、フラッシュメモリーおよびテープがその例である。このディスクは、フレキシブルディスクのような取り外し可能ディスクであっても、ハードドライブとして公知の永久的なディスクであっても良い。ディスクは、信号が記録される多くのトラック、典型的には、二進法の形態すなわち、1または0の配列として翻訳された形態を有する。このような信号は、マイクロプロセッサーによって実行されるアプリケーションプログラム、またはアプリケーションプログラムによって処理されるディスク上に保存される情報を規定し得る。典型的には、操作において、プロセッサーは、非揮発性の記録媒体から集積回路メモリーエレメントに読み取られるデータを生じる。この集積回路メモリーエレメントは、典型的には、揮発性のランダムアクセスメモリー例えば、ダイナミックランダムアクセスメモリーDRAMまたはスタティックメモリーSRAMである。集積回路メモリーエレメントは、典型的には、ディスクで行うよりもプロセッサーによる情報へのより速いアクセスを可能にする。プロセッサーは、一般的には、集積回路メモリー内のデータを操作し、次いで、処理が完了した後にディスクにデータをコピーする。ディスクと集積回路メモリーエレメントとの間のデータの動きを管理するための種々の機構が、公知であり、本明細書中に開示される内容は、このような機構に限定されない。さらに、本明細書中に開示される内容は、特定のメモリーシステムに限定されない。本明細書中に開示される内容は、特定のコンピュータープラットホーム、特定のプロセッサーまたは特定の高レベルにプログラムされた言語に限定されない。さらに、コンピューターシステムは、マルチプロセッサーコンピテントシステムであっても、コンピューターネットワークにわたって接続された多様なコンピューターを含んでもよい。図1中の各モジュール例えば、110、120は、コンピュータープログラムの別々のモジュールであっても、別々のコンピュータープログラムであってもよいことが理解されるべきである。このようなモジュールは、別々のコンピューター上で操作可能であり得る。データ例えば、104、106、110、114および116は、メモリーシステムに記憶されても、コンピューターシステム間で送信されてもよい。本明細書中に開示される内容は、ソフトウェアまたはハードウェアまたはファームウェア、あるいはこの組合わせを使用するいずれの特定の実行にも限定されない。このシステムの種々のエレメントは、個々にかまたは組合わせて、機械読み取り可能な記憶デバイスにおいて具体的に体系化されたコンピュータープログラム製品として、コンピュータープロセッサーによって実行され得る。この処理の種々の工程は、入力を操作しかつ出力を生成することによって機能を実行するために、コンピューター読み取り可能な媒体において具体的に体系化されたコンピュータープロセッサーを実行するプログラムによって行われ得る。このようなシステムを実行するために適切なコンピューターをプログラミングする言語としては、手続き型プログラミング言語、オブジェクト指向プログラミング言語およびこの2つの組み合わせが挙げられる。LMWH組成物を調製するための改善された方法はまた、本発明に従って見出された。臨床使用のために低分子量ヘパリンLMWHを精製する現在の方法は、グリコサミノグリカン混合物の沈殿および1~14,000Daのサイズの範囲のヘパリンフラグメントを含む画分の回収を含む。ヘパリンの精製に利用される標準的な方法は、N.Volpi,BiochemicatBiophysicaActa12901996299-307において利用される:...ヘパリンの移動の遅い成分および移動の速い成分を、以前に報告したように、異なる温度でバリウム塩として精製した。精製したウシ腸粘膜ヘパリンを、水に溶かし、そして酢酸バリウム5を攪拌しながら徐々に添加したこの溶液のpHを、6.0~7.0に調整した。50~70°Cに加熱した後、この溶液を、室温20~25°Cに24時間放置した。得られた沈殿物を、水に可溶化にし、AmberliteIR-120樹脂上でそのナトリウム塩に変換した。粗精製の移動の遅いヘパリン種のナトリウム塩を、2.0倍容のアセトンを用いる沈殿によって回収し、そして乾燥した。上清を、5°Cで24時間維持し、そして沈殿物を、5°Cでの遠心分離によって回収した。移動の速い種のバリウム塩を、移動の遅い種について報告したように精製した。この方法論によって得られた生成物は、患者に投与した場合に多くの問題点が存在するヘパリンフラグメントの雑多な混合物である。この問題点は、生成物の雑多な性質およびこの混合物中の活性成分のレベルを定量する能力の欠如に起因する。対照的に、本明細書中に記載される新規な精製戦略は、定量可能かつ際限成可能であり、それゆえに先行技術の生成物に関連する副作用の多くを欠いたLMWHの実質的に純粋な画分を提供する。驚くことに、先行技術の方法では実際に破棄されていた移動の速い成分第二画分といわれる画分が顕著な量の治療活性を有することが、本発明に従って発見された。従って、本発明の方法は、類似の型の沈殿反応を含むが、以前は破棄されていた物質の単離および操作を含む。一般には、本発明の方法は、二価カチオンおよび弱アニオンの塩を用いる、HLGAGサンプルの沈殿を含む。いくつかの実施形態において、二価カチオンおよび弱アニオンの塩は、以下を含む群より選択される:バリウム、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、銅、ニッケル、カドミウム、亜鉛、水銀、ベリリウム、ニッケル、パラジウム、白金、鉄またはスズ。いくつかの実施形態において、二価カチオンおよび弱アニオンの塩は、二価の原子価を有する、周期表のカチオンの元素の酢酸塩である。好ましい実施形態において、二価カチオンおよび弱アニオンの塩は、酢酸バリウムである。他の実施形態において、二価カチオンおよび弱アニオンの塩は、酢酸カルシウムまたは塩化カルシウムである。いくつかの実施形態において、当業者に公知である他の酢酸塩沈殿法が使用され得る。沈殿は、0°C~70°Cの温度範囲で実施され得る。沈殿についての温度は、0°C、2°C、5°C、10°C、15°C、20°C、30°C、40°C、50°C、60°Cもしくは70°Cであり得るか、またはこの範囲内の任意の温度であり得る。好ましい実施形態において、沈殿の温度は、4°Cである。他の実施形態において、沈殿の温度は、18°C~22°Cの範囲の温度を含む室温である。沈殿において使用される溶媒は、極性溶媒である。いくつかの実施形態において、極性溶媒はH2O、エタノール、アセトン、エタノール混合H2O、アセトン混合H2O、アセトンである。いくつかの実施形態において、極性溶媒は、99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、65:35、55:45、50:50、45:55、35:65、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95または1:99の範囲のH2O:エタノールの容量対容量の比を有する。他の実施形態において、極性溶媒は、99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、65:35、55:45、50:50、45:55、35:65、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95または1:99の範囲のH2O:アセトンの容量対容量の比を有する。さらに他の実施形態において、極性溶媒は、H2O、エタノールおよびアセトンの混合物である。沈殿工程に続いて、サンプル第二画分は、さらに処理される前に、必要に応じてイオン交換処理に供され得る。いくつかの例において、サンプルは、アンバーライトIR-120カラムのようなイオン交換カラム中を通される。この型のカラムの使用は、沈殿工程で使用した塩を除去しナトリウムのような別のイオンに置換するために有用である。グリコサミノグリカン含有サンプルは、グリコサミノグリカンまたはHLGAGで構成される少なくとも1つの画分であるサンプルである。上記で検証されるように、用語グリコサミノグリカンまたはHLGAGとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:ヘパリン、ヘパリンアナログ、LMWH、生物工学的ヘパリン、化学修飾されたヘパリンまたは合成ヘパリン。グリコサミノグリカンは、温度、溶媒および酵素について本明細書中で記載される条件を変化させることによって特定のサイズのヘパリンに分画され得る。温度変化の結果の例は、限定されることを意図しないが、温度に基づく沈殿画分の含有量における変化を例示する。5w/v酢酸バリウムを4°Cで使用することにより、FDAによって規定されるようなLMWHから構成される第二画分を生じる。この画分は、抗凝固についての高い活性、および低い硫酸化量<70を有する。4°Cで上清中に残った画分は、超低分子量ヘパリンとして分類され得る。4°Cでの沈殿と対照的に、4°Cで実施した沈殿物が生じる第二画分よりも高いMWヘパリンMW:10,000~14,000、高い硫酸化量>85および抗凝固についてのより低い活性を有する第一画分を、室温での沈殿によって生じる。別の非限定的な例は、5酢酸バリウムの代わりに5の酢酸カルシウムまたは酢酸マグネシウムを使用することである。4°Cにて、この変化は、第一画分高分子量ヘパリンの沈殿を生じるが、上清中に第二画分低分子量ヘパリンを残す。次いで、第二画分は、エタノールまたはアセトンのような極性溶媒を添加することによって上清より沈殿され得る。一般に、より大きい分子量および/またはより強い電荷の画分は、より少量の極性溶媒例えば、エタノールまたはアセトンを用いて、より高い温度で沈殿する。温度の低下および/または極性溶媒の量の増加は、より低い分子量、より弱い電荷およびより高い抗凝固活性を有する画分の沈殿を生じる。沈殿パラメータは、当業者によって過度の実験を要することなく変更され得る。沈殿に続いて、第二画分LMWH画分を処理して、濃縮したLMWH沈殿物を生成する。用語濃縮した濃縮されたLMWH調製物は、第二の単離された画分からあれこれ変更された調製物をいう。処理工程は、分離工程または沈殿のような精製工程を含み得る。LMWH調製物の処理はさらに、濃縮したLMWH調製物を得るための酵素的消化または化学的消化によって達成され得る。1つの実施形態において、この画分は消化され、そして消化に使用された酵素は、ヘパリナーゼIIIまたはその機能的に活性な改変体もしくはフラグメントである。用語ヘパリナーゼを一般的に使用して、ネイティブなヘパリナーゼに加えてその機能的に活性な改変体およびフラグメントを包含する。米国特許第6,217,863号B1ならびに係属中の出願09/384,959号および同09/802,285号を含むいくつかの親特許および親特許出願は、ヘパリナーゼの有用な修飾および改変体およびフラグメントを記載する。ヘパリナーゼIIIは、ヘパリンの脱重合を引き起こす。使用されるヘパリナーゼIIIの濃度、および使用される時間部分的消化対徹底的な消化に依存して、特定の分子量および/または電荷のヘパリンを得る。例えば、限定されることを意図しないが、1モル等量のヘパリナーゼIIIでのヘパリンの部分消化は、より長い消化時間での反応よりも、より大きい分子量および/またはより強い電荷の画分を生じる。また、ヘパリナーゼIIIのモル等量の増加は、より小さいモル等量のヘパリナーゼIIIが使用される場合よりも、より低い分子量および/またはより弱い電荷の画分を生じる。いくつかの実施形態において、特定の分子量、電荷および/または生物学的活性のヘパリンを得るために、ヘパリナーゼIIIの濃度および消化物の長さは、本明細書中に記載されるような塩、温度、および溶媒組成物と組合わせて使用され得る。あるいは、第二画分を化学的に分解して、濃縮したLMWH調製物を取得し得る。1つの実施形態において、この画分は、以下が挙げられるがこれらに限定されない群より選択される方法を使用して化学的に分解される:H2O2、もしくはCUおよびH2O2を用いる酸化的脱重合、亜硝酸イソアミルもしくは亜硝酸での脱アミノ切断、アルカリ処理によるヘパリンのベンジルエステルを用いるβ-脱離切断、あるいはヘパリナーゼによる方法。Volpi参考文献において移動の速いヘパリンといわれる沈殿物の第二画分は、Volpi参考文献によって移動の遅いヘパリンといわれる第一画分とは異なる。第二画分の平均分子量は、8,000ダルトンであり、第一画分の平均分子量は14,000ダルトンである。さらに、第二画分は、8,000Da未満の平均分子量のヘパリン亜種として規定されるLMWHを有する100LMWHから構成され、ここで、少なくとも60の分子が、8,000Da未満の分子量を有する。この規定を使用すると、第一画分は0LMWHである。本発明はまた、LMWH調製物の組成物を含む。LMWHの組成物は、種々の分子量の分子の混合物である。上記のように、雑多な混合物は、分子量が変動し得るが、8,000D未満の平均分子量を有するフラグメントを含む。4,000~6,000ダルトンの範囲の分子量を有するLMWHの化合物の組成物は、例えば、平均サイズが4,000~6,000Daの範囲である種々のKMWHの混合物である。いくつかの実施形態において、サンプル中の4,000~6,000DaであるLMWHのパーセントは、サンプル中の成分の20、30、40、50、60、70、80、90または100である。いくつかの局面において、この組成物は、少なくとも150IU/mgの抗Xa活性を有するLMWH調製物である。いくつかの実施形態において、LMWH調製物は、1、2、3、4または5より大きい、抗Xa因子:抗IIa因子の活性比を有する。他の局面において、この組成物は、5より大きい、抗Xa因子:抗IIa因子の活性比を有するLMWH調製物である。なお他の局面において、この組成物は、少なくとも3.5のΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNAC,6SGHNS,3Sを有するLMWH調製物である。いくつかの実施形態において、LMWH調製物は、少なくとも4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0または20.0のΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNAC,6SGHNS,3Sを有する。本発明のLMWH組成物は、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア中に処方され得る。この組成物はさらに、特定の送達デバイス中に処方され得る。よって、本発明のいくつかの実施形態において、この組成物は、静脈内、皮下、経口、エアロゾルまたは他の粘膜の送達形態に具体的に処方される。いくつかの実施形態において、この組成物は、以下に記載されるような徐放性デバイス中に処方される。本発明の開示の観点から、当業者は、LMWH組成物の実質的に純粋な調製物を生成し得る。LMWH調製物は、HLGAG供給源より調製される。本明細書中で使用される場合、HLGAG供給源は、標準的技術酵素的分解などを含むを使用してLMWHを生成するために操作され得る、ヘパリン様グリコサミングリカン組成物をいう。上記のように、HLGAGとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:単離されたヘパリン、化学修飾されたヘパリン、生物工学で調製されたヘパリン、合成ヘパリン、硫酸ヘパランおよびLMWH。よって、HLGAGは、天然の供給源より単離され得、直接合成、変異誘発などによって調製される。いくつかの実施形態において、HLGAGは、実質的に純粋であり得る。本明細書中で使用される場合、用語実質的に純粋は、この意図された使用に対して実用的かつ適切な程度に、他の物質を実質的に含まない。特に、多糖は、実質的に純粋であり、そして例えば、薬学的調製物を生成するに有用であるようにその宿主環境の他の生物学的構成物を実質的に含まないことを意味する。本明細書中で使用される場合、LMWH調製物は、8000Da未満の平均分子量MWを有しかつ全分子の少なくとも60について8000Da未満のMWを有する、硫酸化GAGの塩である。規定によって、LMWH調製物は、HLGAGサンプルより生成され得る。用語LMWHは、LMWH例えば、SR90107Aとして直接合成される多糖を包含しない。SR90107Aは、約1500Daの分子量を有する合成多糖である。HLGAGの供給源より調製されるのではなく低分子量化合物として直接調製される、これらの型の化合物は、LMWHのクラス内に入るとみなされない。しかし、用語LMWHは、LMWHを生成するように処理される合成HLGAGを含まない。いくつかの異なる方法が、LMWHの商業的調製物のために使用されている。直接サイズ分画を使用して、実験規模でLMWHFraxiparinを調製してきたが、その貧弱な収量は工業規模でのこの使用を一般に否定した。工業生成目的のために、多くの化学的処理または酵素的処理が利用されてきた。化学的処理は、部分的な亜硝酸脱重合Fragmin、H2O2での酸化的切断NormifloおよびFluxum、CuおよびH2O2での酸化的切断、またはベンジル化に続くβ-脱離およびアルカリ加水分解によってEnoxaparinのような広範な反応を利用する。ヘパリナーゼILogiparinによる部分的β-脱離脱重合を使用するLMWHを生成するための酵素的方法もまた、記載されている。本発明に従って生成されるLMWHは、先行技術のLMWH調製物を超えて機能的特性を改善された。本発明の組成物の1つの利点は、抗凝固活性の量が治療目的について変更され得ることである。処置されるべき被験体および/またはその被験体の状態に依存して、この化合物の抗凝固活性を増加または減少させることが所望され得る。例えば、被験体が急性の凝固事象を起こしている場合、抗凝固活性を有するLMWH調製物例えば、少なくとも150IU/mgの活性を有する組成物の1つを、被験体に投与することがしばしば所望される。他の被験体は、血栓の障害が発生する危険にさらされ得るのみである。低い抗凝固活性を有するLMWH調製物をこれらの被験体に投与することが、一般に所望される。サンプル中の切断されていないAT結合領域例えば、構造ΔU2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAC,6SGHNS,3S、6Sを有する10糖、または4糖ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;またはΔUHNS,6SGHNS,3Sもしくは関連化合物のパーセントを同定する能力は、組成物を特定の量の切断されていないインタクトなAT結合領域とともに処方し得る。既知のパーセントのインタクトなAT結合領域を有するLMWHを調製するこの能力は、LMWHの治療組成物の活性を定量する方法を提供する。よって、本発明の方法は、処置された被験体および障害に依存して、当業者がLMWHの適切な組成物を調製または同定することを可能にする。本明細書中で使用される場合、語インタクトは、切断されていなくて完全であることを意味する。用語AT結合領域は、AT-IIIと特異的に相互作用するHLGAGの領域をいう。AT結合領域は、以下の構造ΔU2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAC,6SGHNS,3S、6Sを有する10糖化合物および4糖ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S、ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S;ΔUHNAC,6SGHNS,3S;およびΔUHNS,6SGHNS,3Sを含む。いくつかの実施形態において、LMWH調製物は、組成物であって、この組成物中の多糖配列の少なくとも20がインタクトなAT結合領域である。他の実施形態において、この組成物中の多糖配列の少なくとも25、30、35、40、45、50または55がインタクトなAT結合領域である。上記で検証したように、処置のための組成物中のインタクトなAT-10の最適なパーセントは、処置下の医療状態に依存して変化する。より高レベルの活性は、抗凝固活性が所望されない、癌について処置下である患者においてよりも、血液-血餅形成の危険性のある患者に所望され得る。他の局面において、この組成物は、>15の二硫酸化二糖、<75の三硫酸化二糖、3~5の単硫酸化二糖、>2の4-7四糖を有するLMWH調製物である。LMWH調製物は、少なくとも60の鎖が<8,000のMWを有するものの、<8,000の平均MWを有する。これらの特性を有するLMWH調製物は、>150IU/mgの抗XA活性および>1.5の抗Xa/IIA値を有する。これらの特性を有する組成物は、上記の方法によって調製され得る。画分2のLMWH調製物としていわれる物質は、これらの特性を有する組成物である。画分1の組成物は、<15の二硫酸化二糖、>75の三硫酸化二糖、0~3の単硫酸化二糖、0~2の4-7四糖、および8000~14000の平均MWを有するヘパリン物質である。画分1物質は、<150IU/mgの抗XA活性および<2の抗Xa/IIA値を有する。LMWH調製物中のAT結合領域の量は、種々の実験パラメーターによって操作され得る。本発明の方法は、識別特性成分を使用してLMWH調製物の品質制御を可能にすることによって、LMWHの豊富な調製物の単離を生じる改善された単離手順を提供することによって、そしてヘパリナーゼの切断特異性に対する新たな役割を提供することによって、LMWH調製物中のAT結合領域の量の制御を可能にする。これらの特性の最初の2つは、上記に詳細に検証される。インタクトなAT結合領域を有するLMWHを調製する際のヘパリナーゼの役割は、先行技術に記載されている。特に、インタクトなAT-III結合部位を含む公開された配列は、ΔU2SHNS,6SIHNAC,6SGHNS,3S、6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SToida,T.,Hileman,R.E.,Smith,A.E.,Vlahova,P.I.Linhardt,R.J.1996JBiolChem271,32040-7として記載される。さらに、3-Oサルフェートを含む四糖は、ヘパリナーゼのいずれによっても切断可能ではないことが先行技術に示されているYamada,S.,Yoshida,K.,Sugita,M,Sugahara,K.,Khoo,K.H.,Morris,H.R.Dell,A.1993JBiolChem268,4780-7。このことは、3-O硫酸化グルコサミンを有する結合が切断に耐性であることを示唆する。驚くことに、これら先行技術の開示が正しくないことが発見された。実施例において、本発明者らは、AT-10の実際の構造がΔU2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAC,6SGHNS,3S、6Sであり、よってインタクトなAT-III結合部位を含まないことを、種々の物理化学技術によって決定的に示した。このAT-10構造の再解釈の観点から、本発明者らは、AT結合性である3-Oスルフェート含有オリゴ糖に対するヘパリナーゼI~IIIの作用を再試験するように努めた。AT-10超LMWH、MW=2769.3Daがヘパリンの制御されたヘパリナーゼI切断に由来することを考慮して、本発明者らはまた、確立された生物分析技術を使用して、オリゴ糖の機能的帰結を試験するように努めた。ヘパリナーゼの作用および機能的帰結の両方をこのように理解することは、臨床使用に対するLMWHの効果的で最適な生成を必要とする。従って、実施例に示されるように、ヘパリナーゼIおよびIIがHLGAGのAT結合領域を実際に切断してインタクトなAT結合領域の消失を生じるが、ヘパリナーゼIIIが切断しなかったことを見出した。さらに、グリコシド連結の還元末端でのグルコサミン3-O硫酸化が、ヘパリナーゼI、IIおよびIIIの切断に対する耐性を与えることを見出した。部分的なAT-III結合部位のみを含むヘパリンオリゴ糖の生物学的帰結および薬理学的帰結の試験は、このようなオリゴ糖が顕著な抗Xa活性を有するが、インタクトなAT-III部位を含むヘパリン様グリコサミノグリカンの機能的属性のいくつかを欠くことを示す。従って、例えば、上記の精製方法によってHLGAGの調製物が生成される場合、この調製物は、ヘパリナーゼによる酵素的切断によってより高いかまたはより低い抗凝固活性を有するようにさらに修飾され得る。この調製物がヘパリナーゼIおよび/またはIIによる酵素的消化に供される場合、抗凝固活性は減少される。この調製物がヘパリナーゼIIIで処理される場合、抗凝固活性は、増強される。これらの方法はまた、より広いクラスの化合物に対してあてはまる。本発明の教示を使用して、広範な種々の多糖開始材料から特定の多糖治療薬を開発し得る。一旦、活性成分が多糖において同定されると、その活性成分は、サンプルの品質制御に対する識別特性として使用され得、そして特定の治療活性について増強されかつ副作用の原因である領域を除去された治療組成物を生成および同定するために、使用され得る。組成物は、治療的に被験体に投与され得る。本明細書中で使用される場合、被験体は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類である。特にHLGAGおよびLMWHは、多くの治療有用性を有する。本発明のLMWH組成物は、任意の型の状況を処置するために使用され得、ここで、LMWH治療は、有用な療法として同定された。従って、本発明は、LMWH治療が有用である種々のインビトロ法、インビボ法およびエキソビボ法において有用である。例えば、LMWH組成物は、凝固の阻止、癌細胞増殖および転移の阻害、新脈管形成の阻止、新生血管形成の阻止、乾癬の阻止に有用である。LMWH組成物はまた、品質が制御されたサンプルのようなインビボアッセイにおいて使用され得る。これらの障害の各々は、当該分野において周知であり、そして、例えば、Harrison’sPrinciplesofInternalMedicineMcGrawHill,Inc.,NewYorkこれは、参考として援用されるに記載される。従って、LMWH調製物は、凝固関連障害を処置または阻止するために有用である。本明細書中で使用される場合、凝固関連疾患は、心筋または大脳の梗塞形成について見られるような組織への血液供給を担う血管のブロックに起因する組織への血液供給の妨害より生じる局所炎症により特徴付けられる状態をいう。大脳虚血性発作または大脳虚血は、脳への血液供給がブロックされる虚血状態の形態である。脳への血液供給におけるこの妨害は、種々の原因より生じ得、この原因としては、血管自体の内因性ブロックまたは閉塞、遠く離れて起こる閉塞の供給源、不適切な脳血流を生じる灌流圧の減少または血液粘度の上昇、あるいはクモ膜下腔または大脳内組織において破裂した血管が挙げられる。本発明の方法はまた、大脳虚血を処置するためにも有用である。大脳虚血は、一過性または持続性のいずれかの欠損を生じ得、そして大脳虚血を被った患者における神経学的損傷の重篤度は、その虚血事象の強度および持続期間に依存する。一過性の虚血発作は、脳への血流が一時的にのみ妨害されるものであり、そして24時間未満の間にしばしば清浄化される一時的な神経学的欠損を生じる。TIAの徴候としては、以下が挙げられる:顔または指の麻痺または愚鈍、はっきり話す能力の喪失および/または他者の話を理解する能力の喪失、視覚の喪失または不明瞭な視覚、およびめまいの感覚。持続的な大脳虚血発作発作strokeともいうは、いずれかの血栓塞栓症により生じる脳への血流におけるより長い妨害によって生じる。発作は、ニューロンの喪失を生じ、典型的には、改善され得るが完全には消散しない神経学的欠損を生じる。血栓塞栓症性の発作は、血栓または塞栓による頭蓋外または頭蓋内の血管の閉塞に起因する。発作が血栓症または塞栓症によって生じるか否かを識別することはしばしば困難であるので、用語血栓塞栓症を使用して、これらの機構のいずれかによって生じる発作をカバーする。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、LMWHを使用する急性血栓塞栓症性発作の処置に関する。急性の発作は、脳への血液供給を妨害する虚血事象より生じる神経学的傷害を含む医療症候群である。有効量のLMWH調製物単独、または発作の処置のための別の治療薬との組合わせは、発作により生じるインビボでの脳の傷害を減少するに十分な量である。脳傷害の減少は、本発明の処置のない血栓塞栓症性発作を被っている被験体において生じたであろう脳に対する傷害の阻止である。いくつかの生理学的パラメータを使用して、脳傷害の減少を評価し得る。このパラメータは、例えば、前処置した患者のパラメータ、未処置の発作患者もしくは血栓溶解剤単独で処置した発作患者と比較して、より小さい梗塞サイズ、改善された局所的脳血流、および頭蓋内圧の減少を含む。薬学的LMWH調製物は、単独で使用しても、凝固と関連する疾患を処置するための治療薬と組合わせて使用してもよい。凝固と関連する疾患の処置に有用な治療薬の例としては、抗凝固剤、抗血小板剤、および血栓溶解剤が挙げられる。抗凝固剤は、血液成分の凝固を阻止し、よって血塊形成を阻止する。抗凝固薬としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:ヘパリン、ワルファリン、クマジン、ジクマロール、フェンプロクーモン、アセノクマロール、エチルビスクマセテートbiscoumacetateおよびインダンジオン誘導体。抗血小板剤は、血小板凝集を阻害し、しばしば一過性の虚血発作または発作の被る患者において血栓塞栓症性発作を阻止するために使用される。抗血小板剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:アスピリン、チエノピリジン誘導体例えば、チクロポジンticlopodineおよびクロピドグレールclopidogrel、ジピリダモールおよびスルフィンピラゾンおよびRGD模倣物ならびに抗トロンビン剤例えば、ヒルジン、しかしこれに限定されない。血栓溶解剤は、血栓塞栓症性発作を生じる血栓を溶解する。血液溶解剤は、急性の静脈性血栓塞栓症および肺塞栓の処置において使用され、そして当該分野において周知である例えば、Hennekensら、JAmCollCardiol;v.257supp,p.18S-22S1995;Holmesら、JAmCollCardiol;v.257suppl,p.10S-17S1995を参照のこと。血栓溶解剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:プラスミノーゲン、a2-アンチプラスミン、ストレプキナーゼ、アンチストレプラーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子tPAおよびウロキナーゼ。本明細書中で使用される場合、tPAは、ネイティブなtPAおよび組換えtPA、ならびにネイティブなtPAの酵素活性または線溶活性を残すtPAの改変型形態を含む。tPAの酵素活性は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する分子の能力を評価することによって測定され得る。tPAの線溶活性は、当該分野において公知のインビトロ血栓溶解活性例えば、精製した血塊溶解アッセイCarlsonら、Anal.Biochem.168,428-4351988によって記載されるおよびその改変型形態Bennett,W.F.ら、1991、上述、これらは、その全体が参考として本明細書中に援用されるのいずれかによって決定され得る。1つの実施形態において、LMWH調製物は、新脈管形成を阻害するために使用される。新脈管形成を阻害するための有効量のLMWH調製物は、その処置の必要な被験体に投与される。本明細書中で使用される場合、新脈管形成は、新血管の不適切な形成である。新血管の生成を生じる内皮細胞の伸長および増殖を引き起こす、内皮細胞に対してマイトジェンである一群の増殖因子を、内皮細胞が分泌する場合に、新脈管形成はしばしば、腫瘍において生じる。いくつかの血管形成性マイトゲンは、内皮細胞増殖因子に関連するヘパリン結合ペプチドである。新脈管形成の阻害は、動物モデルにおいて腫瘍退行を引き起こし、これは、治療的抗癌剤としての使用を示唆する。新脈管形成を阻害するための有効量は、腫瘍への血管増殖の数を減少するに十分なLMWH調製物の量である。この量は、腫瘍および新脈管形成の動物モデルにおいて評価され得、これらの多くは、当該分野において公知である。LMWH調製物はまた、眼疾患に関連する新生血管形成を阻害するために有用である。別の実施形態において、LMWH調製物は、乾癬を処置するために投与される。乾癬は、慢性炎症によって引き起こされる一般的な皮膚科の疾患である。LMWH含有組成物はまた、癌細胞増殖および転移を阻害し得る。従って、本発明の方法は、被験体において腫瘍細胞の増殖または転移を処置および/または阻止するに有用である。本明細書中で使用される場合、用語阻止および阻止するは、生物学的影響例えば、新脈管形成または癌もしくは腫瘍細胞の増殖もしくは転移を完全にかまたは部分的に阻害すること、および生物学的影響例えば、新脈管形成または癌もしくは腫瘍細胞の増殖もしくは転移における任意の増加を阻害することをいう。癌は、悪性または非悪性の癌であり得る。癌または腫瘍としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:胆道癌;脳癌;乳癌;子宮頸癌;絨毛癌;結腸癌;子宮内膜癌;食道癌;胃癌;上皮内新生物;リンパ腫;肝癌;肺癌例えば、小細胞および非小細胞;黒色腫;神経芽腫;口腔癌;卵巣癌;膵臓癌;前立腺癌;直腸癌;肉腫;皮膚癌;精巣癌;甲状腺癌;および腎癌、ならびに他の癌腫および肉腫。処置を必要とする被験体は、癌の発生の可能性の高い被験体であり得る。これらの被験体としては、例えば、遺伝的異常を有する被験体この遺伝的異常の存在は、癌の発生の可能性が高いことと相関関係を有する、および癌を引き起こす薬剤例えば、タバコ、石綿、もしくは他の化学毒素に暴露された被験体または癌について以前に処置されかつ現在寛解している被験体が挙げられる。本発明のLMWHを含む組成物の有効量は、このような処置の必要のある被験体に投与される。有効量は、細胞の増殖もしくは転移において所望の低下を生じる量、または医学的に受容可能ではない他の副作用を引き起こすことなく凝固を阻止する量である。このような量は、もはや慣用的な実験で決定され得る。投与の様式に依存して、1ng/kg~100mg/kgの範囲の投与量が、効果的であると考えられる。インタクトなLMWHの効果的なパーセントは、もはや慣用的な実験で決定し得る。絶対量は、種々の因子投与が他の処置方法との組合わせであるか否か、投与量の数、ならびに個々の患者のパラメータ例えば、年齢、身体的状態、サイズおよび体重を含むに依存し、そして慣用的実験で決定され得る。最大用量、すなわち、信頼できる医療判断に従う最も安全な投与量が使用されることは、一般に好ましい。投与の様式は、吸入、経口、皮下、静脈などを含む医学的に受容可能な任意の様式であり得る。本発明のいくつかの局面において、LMWHを含む組成物の有効量は、障壁を越える腫瘍細胞の侵入を阻止するに有効な量である。癌の侵入および転移は、細胞接着特性の変化これは、形質転換した細胞が細胞外マトリクスECMを介して浸潤および移動し、そして足場非依存的増殖特性を獲得することを可能にするを含む複合プロセスである。Liotta,L.A.ら、Cell64:327-3361991。これらの変化のいくつかは、膜結合細胞骨格および細胞内シグナル伝達分子を含む細胞/ECM接着点であり接着斑focaladhesionにて生じる。転移性疾患は、腫瘍細胞の播種性病巣が腫瘍細胞の増殖および繁殖を支持する組織に播種する場合に生じる。そしてこの二次的な腫瘍細胞の伸展は、多数の癌に関連する罹患率および死亡率の原因である。従って、本明細書中で使用される場合、用語転移は、最初の腫瘍部位から離れた、腫瘍細胞の浸潤および移動をいう。腫瘍細胞の障壁は、インビトロでの人工の障壁またはインビボでの天然の障壁であり得る。インビトロの障壁としては、膜で覆われた細胞外マトリクス例えば、Matrigelが挙げられるがこれに限定されない。よって、LMWH組成物は、Parish,C.R.ら、ABasement-MembranePermeabilityAssaywhichCorrelateswiththeMetastaticPotentialofTumourCells、Int.J.Cancer199252:378-383に記載されるようなMatrigel浸潤アッセイ系において腫瘍細胞浸潤を阻害する能力について試験され得る。Matrigelは、IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン例えば、bFGFに結合しbFGFを局在化させるパーレカンperlecan、ビトロネクチンならびに形質転換増殖因子TGF、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子uPA、組織プラスミノーゲン活性化因子tPAおよびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1型PAI-1として公知のセルピンを含む再構成された基底膜である。転移についての他のインビトロアッセイおよびインビボアッセイは、先行文献に記載されている。例えば、1999年8月10日に発行された米国特許第5,935,850号参考として本明細書中に援用されるを参照のこと。インビボでの障壁は、被験体の身体中に存在する細胞性障壁をいう。本発明の別の局面に従って、循環するヘパリンの枯渇を必要とする被験体を処置するための方法を提供する。この局面において、有効量のヘパリナーゼI、IIおよびIIIまたはその改変型の組み合わせが使用される。例えば、開心術または血液透析を受ける被験体はしばしば、手術または血液透析の結果としての、医学的に受容可能でない量の血中ヘパリンの枯渇を必要とする。ヘパリナーゼIまたはIIとヘパリナーゼIIIとの組み合わせの使用によって、適切な量の治療的に活性体active抗凝固因子機能は、凝固カスケードの適切なバランスを得るために被験体に投与され得る。ヘパリナーゼの組み合わせの有効量は、完全な枯渇を引き起こすことなく、そして医学的に受容可能ではない任意の他の副作用を引き起こすことなく、循環するヘパリンレベルにおける所望の減少を生じる量である。一般に、治療的に有用な量のヘパリナーゼの組合わせは、もはや慣用的な実験で決定し得る。投与の様式に依存して、1ng/kg~100mg/kgの範囲の投与量が効果的であると考えられている。絶対量は、種々の因子投与が他の処置方法との組合わせであるか否か、投与量の数、ならびに個々の患者のパラメータ例えば、年齢、身体的状態、サイズおよび体重を含むに依存し、そして慣用的実験で決定され得る。最大用量、すなわち、信頼できる医療判断に従う最も安全な投与量が使用されることは、一般に好ましい。投与の様式は、経口、皮下、静脈などを含む医学的に受容可能な任意の様式であり得る。一般に、治療目的のために投与される場合、本発明の処方物は、薬学的に受容可能な溶液にて適用される。このような調製物は、薬学的に受容可能な濃度の塩、緩衝化剤、保存薬、適合性キャリア、アジュバントおよび必要に応じて他の治療成分を含み得る。本発明の組成物は、それ自体で生でneatかまたは薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。医薬において使用される場合、この塩は、薬学的に受容可能であるべきであるが、非薬学的に受容可能な塩は、その薬学的に受容可能な塩を調製するために便利に使用され得、そして、本発明の範囲からは除外されない。このような薬理学的および薬学的に受容可能な塩としては、以下の酸より調製される塩が挙げられるがこれらに限定されない:塩酸、臭化水素、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、マロン酸、琥珀酸、ナフタレン-2-スルホン酸および硫酸ベンゼンスルホン酸。また、薬学的に受容可能な塩は、アルカリ金属の塩またはアルカリ土塁金属の塩例えば、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩として調製され得る。適切な緩衝化剤としては、以下が挙げられる:酢酸および塩1~2W/V;クエン酸および塩1~3W/V;ホウ酸および塩0.5~2.5W/V;ならびにリン酸および塩0.8~2W/V。適切な保存薬としては、以下が挙げられる:塩化ベンズアルコニウム0.003~0.03W/V;クロロブタノール0.3~0.9W/V;パラベン0.01~0.25W/Vおよびチメロサール0.004~0.02W/V。本発明は、1以上の薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の治療成分と一緒にLMWH調製物を含む、医療用途のための薬学的組成物を提供する。本明細書中で使用される場合および以下でより十分に記載される場合、用語薬学的に受容可能なキャリアは、1以上の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤、またはヒトまたは他の動物への投与に適切なカプセル化物質を意味する。本発明において、用語キャリアは、適用を容易にするように活性成分が組合わせられている、天然または合成の有機成分または無機成分を示す。薬学的組成物の成分もまた、所望の薬学的効力を実質的に損なう相互作用がないような様式で、本発明のLMWHと、および互いに混合され得る。非経口投与に適切な組成物は、多糖の滅菌水性調製物を都合よく含み、これは、レシピエントの血液と等張であり得る。利用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒としては、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌した不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として簡便に利用される。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の刺激のない不揮発性油が利用され得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注入可能な注入可能な調製物における使用を見出す。皮下、筋肉内、腹膜内、静脈内などの投与に適切なキャリア処方物は、Remington’sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton,PAに見出され得る。種々の投与経路が利用可能である。選択された特定の様式は、もちろん選択されたLMWHの特定のパーセント、処置される特定の状態および治療効果に必要とされる投薬量に依存する。一般的にいうと、本発明の方法は、医学的に受容可能な任意の投与様式、つまり医学的に受容可能ではない不利な影響を引き起こすことなく効果的レベルの生物学的効果を生成する任意の様式を使用して実施され得る。治療における使用について、有効量のLMWH調製物を投与して、LMWHを所望の表面例えば、粘膜表面、全身性表面に送達する任意の様式によって、被験体に投与され得る。本発明の薬学的組成物を投与することは、当業者に公知の任意の方法によって達成され得る。好ましい投与経路としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、気管内、吸入、眼、膣および直腸。経口投与について、化合物すなわち、LMWH調製物は、活性化合物を当該分野において周知の薬学的に受容可能なキャリアと組合わせることによって、容易に処方され得る。このようなキャリアによって、本発明の化合物を、処置されるべき被験体による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、懸濁液、懸濁物などとして処方し得る。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤として得られ得る必要に応じて、所望ならば適切な補助剤を添加した後、錠剤または糖剤核を得るために、生じる混合物を粉砕し、顆粒の混合物をプロセスする。適切な賦形剤は、特に充填剤例えば、糖乳糖、蔗糖、マンニトールまたはソルビトールを含む;セルロース調製物例えば、ダイズデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチントラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドンPVPである。所望ならば、崩壊剤例えば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩例えば、アルギン酸ナトリウムが、添加され得る。必要に応じて、経口処方物はまた、内部酸性条件を中和するための生理食塩水または緩衝液中に処方されても、いずれのキャリアもなしに投与されてもよい。糖剤核は、適切なコーティングを有して提供される。この目的のために、濃縮された糖溶液が使用され得、これは、必要に応じて、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルcarbopolゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタニウム、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。染料または顔料は、活性成分用量の異なる組合せを同定もしくは特徴付けるために、錠剤、または糖剤コーティングに添加され得る。経口的に使用され得る薬学的調製物としては、ゼラチンでできた押出しpush-fitカプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤例えば、グリセロールまたはソルビトールでできた柔らかい封印されたカプセルが挙げられる。この押出しカプセルは、活性成分を、充填剤例えば、乳糖、結合剤例えば、デンプンおよび/または潤滑剤例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムならびに必要に応じて安定化剤と混合して含み得る。柔らかいカプセルにおいて、活性化合物は、適切な液体例えば、脂肪油、流動パラフィン、もしくは液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁され得る。さらに、安定化剤が添加され得る。経口投与のために処方されたミクロスフェアもまた使用され得る。このようなミクロスフェアは、当該分野において十分規定されている。経口投与のための全ての処方物は、このような投与に適切な投薬量であるべきである。頬投与について、組成物は、簡便な様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。吸入による投与について、本発明に従う使用のための化合物は、適切な噴霧剤例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用とともに、加圧されたパックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー調製物の形態で簡便に送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量meteredamountを送達するための値を提供することによって決定され得る。呼吸器または吸入器における使用のための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物および乳糖またはデンプンのような適切な粉末ベースを含んで処方され得る。全身性に送達されることが所望される化合物は、注入例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方物は、添加した保存薬を有する単位投薬量形態例えば、アンプル中または多用量容器中で示され得る。組成物は、懸濁物、溶液または油性もしくは水溶性のビヒクル中のエマルジョンのような形態をとり得、そして、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤のような処方剤を含み得る。非経口投与のための薬学的処方物としては、水溶性形態での活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油性注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油例えば、ゴマ油もしくは合成脂肪酸エステル例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含み得る。必要に応じて、懸濁物はまた、適切な安定化剤、または高度に濃縮された溶液の調製物に対する化合物の溶解性を増加させ得る薬剤を含み得る。あるいは、活性化合物は、使用前に適切なビヒクル例えば、パイロージェンを含まない滅菌水とともに構成されるための粉末形態であり得る。化合物はまた、直腸用または膣用の組成物例えば、坐剤または貯留浣腸例えば、慣用的な坐剤ベース例えば、ココアバターまたは他のグリセリドを含む中に処方され得る。先に記載された処方物に加えて、この化合物はまた、蓄積depot調製物として処方され得る。このような長期作用処方物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料例えば、受容可能なオイル中のエマルジョンとしてまたはイオン交換樹脂とともに、あるいは乏しい可溶性の誘導体例えば、乏しい可溶性の塩として処方され得る。薬学的組成物はまた、適切な固体またはゲル相のキャリアまたは賦形剤を含み得る。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、限定しないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられる。適切な液体または固体の薬学的調製物形態は、例えば、吸入、マイクロカプセル化、コクリート化encochleated、微視的金粒子上へのコーティング、リポソーム中への含有、噴霧、エアロゾル、皮膚への移植のためのペレット、または皮膚へ引っ掻かれる鋭い物体上への乾燥のための水溶液または生理食塩水溶液である。薬学的組成物としてはまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、マイクロカプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップまたは活性化合物の長引いた放出を伴う調製物が挙げられ、この調製物には、賦形剤ならびに添加剤および/または補助剤例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、矯味矯臭剤、甘味料または可溶化剤が、上記のように通常使用される。薬学的組成物は、種々の薬物送達系における使用に適切である。薬物送達についての方法の手短な総説について、Langer,Science249:1527-15331990これは、本明細書中で参考として援用されるを参照のこと。組成物は、簡便に、単位投薬形態で提供され得、薬学の分野で周知な方法のいずれかによって調製され得る。全ての方法が、活性なLMWHを1つ以上の補助成分を構成するキャリアと関連させる工程を包含する。一般的に、組成物は、多糖を、液体キャリア、微細分割固体キャリア、またはその両方と均一にそして密接に関連させ、次いで、必要な場合、製品を成形することによって調製される。多糖は、凍結されて保存され得る。他の送達系としては、時間放出送達系、遅延放出送達系または持続放出送達系が挙げられ得る。このような系は、本発明のLMWHの反復投与を回避し得、被験体および医師に対して利便性を増加する。多くの型の放出送達系が、当業者に利用可能であり、そして公知である。それらは、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ポリ無水物およびポリカプロラクトンのようなポリマーベースの系;コレステロールのようなステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸または中性脂肪例えば、モノ-、ジおよびトリグリセリドを含む脂質である非ポリマー系;ヒドロゲル放出系;シラスティック系;ペプチドベースの系;ワックスコーティング;従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤、部分的に融合した移植片などを含む。特定の例としては、限定しないが、a多糖がマトリクス内の形態で含まれる浸食erosional系米国特許第4,452,775号Kent;同第4,667,014号Nestorら;ならびに同第4,748,034号および同第5,239,660号Leonardに見出されるならびにb活性成分が制御された速度でポリマーを通って浸透する拡散系米国特許第3,832,253号Higuchiらおよび同第3,854,480号Zaffaraniに見出されるが挙げられる。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系が使用され得、そのうちのいくつかは、移植のために適合される。癌処置を受けている患者に投与される場合、LMWH組成物は、他の抗癌剤を含むカクテルで投与され得る。この組成物はまた、放射線治療の副作用を処置する薬剤例えば、制吐薬、放射線保護剤などを含むカクテルで投与され得る。本発明の化合物と同時投与され得る抗癌薬としては、限定しないが、以下が挙げられる:Acivicin;Aclarubicin;AcodazoleHydrochloride;Acronine;Adriamycin;Adozelesin;Aldesleukin;Alitretamine;Ambomycin;AmetantroneAcetate;Aminoglutethimide;Amsacrine;Anastrozole;Anthramycin;Asparaginase;Asperlin;Azacitidine;Azetepa;Azotomycin;Batimastat;Benzodepa;Bicalutamide;BisantreneHydrochloride;BisnafideDimesylate;Bizelesin;BleomycinSulfate;BrequinarSodium;Bropirmine;Busulfan;Cactinomycin;Calusterone;Caracemide;Carbetimer;Carboplatin;Carmustine;CarubicinHydrochloride;Carzelesin;Cedefingol;Chlorambucil;Cirolemycin;Cisplatin;Cladribine;CrisnatolMesylate;Cyclophosphamide;Cytarabine;Dacarbazine;Dactinomycin;DaunombicinHydrochloride;Decitabine;Dexormaplatin;Dezaguanine;DezaguanineMesylate;Diaziquone;Docetaxel;Doxorubicin;DoxorubicinHydrochloride;Droloxifene;DroloxifeneCitrate;DromostanolonePropionate;Duazomycin;Edatrexate;EflornithineHydrochloride;Elsamitrucin;Enloplatin;Enpromate;Epipropidine;EpirubicinHydrochloride;Erbulozole;EsorubicinHydrochloride;Estramustine;EstramustinePhosphateSodium;Etanidazole;Etoposide;EtoposidePhosphate;Etoprine;FadrozoleHydrochloride;Fazarabine;Fenretinide;Floxuridine;FhidarabinePhosphate;Fluorouracil;Flurocitabine;Fosquidone;FostriecinSodium;Gemcitabine;GemcitabineHydrochloride;Hydroxyurea;IdarubicinHydrochloride;Ifosfamide;Ilmofosine;InterferonAlfa-2a;InterferonAIfa-2b;InterferonAlfa-n1;InterferonAlfa-n3;InterferonBeta-Ia;InterferonGamma-Ib;Iproplatin;IrinotecanHydrochloride;LanreotideAcetate;Letrozole;LeuprolideAcetate;LiarozoleHydrochloride;LometrexolSodium;Lomustine;LosoxantroneHydrochloride;Masoprocol;Maytansine;MechlorethamineHydrochloride;MegestrolAcetate;MelengestrolAcetate;Melphalan;Menogaril;Mercaptopurine;Methotrexate;MethotrexateSodium;Metoprine;Meturedepa;Mitindomide;Mitocarcin;Mitocromin;Mitogillin;Mitomalcin;Mitomycin;Mitosper;Mitotane;MitoxantroneHydrochloride;MycophenolicAcid;Nocodazole;NogalamycinOrmaplatin;Oxisuran;Paclitaxel;Pegaspargase;Peliomycin;Pentamustine;PeplomycinSulfate;Perfosfamide;Pipobroman;Piposulfan;PiroxantroneHydrochloride;Plicamycin;Plomestane;PorfimerSodium;Porfiromycin;Prednimustine;ProcarbazineHydrochloride;Puromycin;PuromycinHydrochloride;Pyrazofurin;Riboprine;Rogletimide;Safingol;SafngolHydrochloride;Semustine;Simtrazene;SparfosateSodium;Sparsomycin;SpirogermaniumHydrochloride;Spiromustine;Spiroplatin;Streptonigrin;Streptozocin;Sulofenur;Talisomycin;TecogalanSodium;Tegafur;TeloxantroneHydrochloride;Temoporfin;Teniposide;Teroxirone;Testolactone;Thiamiprine;Thioguanine;Thiotepa;Tiazofurin;Tirapazamine;TopotecanHydrochloride;ToremifeneCitrate;TrestoloneAcetate;TriciribinePhosphate;Trimetrexate;TrimetrexateGlucuronate;Triptorelin;TubulozoleHydrochloride;UracilMustard;Uredepa;Vapreotide;Verteporfin;VinblastineSulfate;VincristineSulfate;Vindesine;VindesineSulfate;VinepidineSulfate;VinglycinateSulfate;VinleurosineSulfate;VinorelbineTartrate;VinrosidineSulfate;VinzolidineSulfate;Vorozole;Zeniplatin;Zinostatin;ZorubicinHydrochloride。LMWH組成物はまた、標的化分子に連結され得る。標的化分子は、特定の細胞または組織に特異的であり、そしてLMWHをその細胞または組織に方向づけるために使用され得る任意の分子または化合物である。好ましくは、標的化分子は、癌細胞または腫瘍と特異的に相互作用する分子である。例えば、標的化分子は、腫瘍抗原を認識し、そして特異的に相互作用するタンパク質または他の型の分子であり得る。腫瘍抗原としては、以下が挙げられる:Melan-A/MART-1、ジペプチジルペプチダーゼIVDPP1V、アデノシンデアミナーゼ-結合タンパク質ADAbp、シクロフィリンb、結腸直腸関連抗原CRC--C017-1A/GA733、癌胎児性抗原CEAならびにその免疫原性エピトープCAP-1およびCAP-2、etv6、aml1、前立腺特異的抗原PSAならびにその免疫原性エピトープPSA-1、PSA-2、およびPSA-3、前立腺特異的膜抗原PSMA、T細胞レセプター/CD3-ζ鎖、腫瘍抗原のMAGEファミリー例えば、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2MAGE-B2、MAGE-Xp3MAGE-B3、MAGE-Xp4MAGE-B4、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5、腫瘍抗原のGAGEファミリー例えば、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAQE-8、GAGE-9、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、チロシナーゼ、p53、MUCファミリー、HER2/neu、p21ras、RCAS1、フェトプロテイン、E-カドヘリン、カテニン、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、SSX-1、SSX-2HOM-MEL-40、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1、CT-7、cdc27、腺腫様結腸ポリポーシスタンパク質APC、ホドリン、P1A、Connexin37、Ig-イディオタイプ、p15、gp75、GM2およびGD2ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質のようなウイルス産物、腫瘍抗原のSmadファミリー、lmp-1、EBVコード核抗原EBNA-1、およびc-erbB-2。MHCクラスI分子およびMHCクラスII分子のいずれかまたは両方に結合する腫瘍抗原の例は、以下の参考文献を参照のこと:Coulie、StemCells13:393-403、1995;Traversariら,J.Exp.Med.176:1453-1457、1992;Chauxら,J.Immunol.163:2928-2936、1999;Fujieら、Int.J.Cancer80:169-172、1999;Tanzarellaら、CancerRes.59:2668-2674、1999;vanderBruggenら、Eur.J.Immunol.24:2134-2140、1994;Chauxら、J.Exp.Med.189:767-778、1999;Kawashimaら、Hum.Immunol.59:1-14、1998;Taharaら、Clin.CancerRes.5:2236-2241、1999;Gauglerら、J.Exp.Med.179:921-930、1994;vanderBruggenら、Eur.J.Immunol.24:3038-3043、1994;Tanakaら、CancerRes.57:4465-4468,1997;Oisoら、Int.J.Cancer81:387-394,1999;Hermanら、Immunogenetics43:377-383、1996;Maniciら、J.Exp.Med.189:871-876、1999;Duffourら、Eur.J.Immunol.29:3329-3337、1999;Zornら、Eur.J.Immunol.29:602-607、1999;Huangら、J.Immunol162:6849-6854、1999;Boelら、Immunity2:167-175、1995;VandenEyndeら、J.Exp.Med.182:689-698、1995;DeBackerら、CancerRes.59:3157-3165、1999;Jagerら、J.Exp.Med.187:265-270、1998;Wangら、J.Immunol161:3596-3606、1998;Aarnoudserら、Int.J.Cancer82:442-448、1999;Guillouxら,J.Exp.Med.183:1173-1183、1996;Lupettiら,J.Exp.Med.188:1005-1016、1998;Wolfelら、Eur.J.Immunol.24:759-764、1994;Skipperら,J.Exp.Med.183:527-534、1996;Kangら,J.Immunol.155:1343-1348,1995;Morelら、Int.J.Cancer83:755-759、1999;Brichnrdら、Eur.J.Immunol.26:224-230、1996;Kittlesenら、J.Immunol.160:2099-2106、1998;Kawakamiら、J.Immunol161:6985-6992、1998;Topalianら,J.Exp.Med.183:1965-1971、1996;Kobayashiら、CancerResearch58:296-301、1998;Kawakamiら,J.Immunol.154:3961-3968、1995;Tsaiら、J.Immunol.158:1796-1802、1997;Coxら、Science264:716-719、1994;Kawakamiら,Proc.Natl.AcadSci.USA91:6458-6462、1994;Skipperら,J.Immunol.157:5027-5033、1996;Robbinsら、J.Immunol.159:303-308、1997;Castelliら、J.Immunol.162:1739-1748、1999;Kawakamiら、J.Exp.Med.180:347-352、1994;Castelliら、J.Exp.Med.181:363-368、1995;Schneiderら、Int.J.Cancer75:451-458、1998;Wangら、J.Exp.Med.183:1131-1140、1996;Wangら、J.Exp.Med184:2207-2216、1996;Parkhurstら、CancerResearch58:4895-4901、1998;Tsangら、J.Natl.CancerInst87:982-990、1995;Correaleら、J.NatlCancerInst89:293-300、1997;Coulieら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7976-7980,1995;Wolfelら、Science269:1281-1284、1995;Robbinsら,J.Exp.Med.183:1185-1192、1996;Brandleら、J.Exp.Med.183:2501-2508、1996;tenBoschら、Blood88:3522-3527、1996;Mandruzzatoら,J.Exp.Med.186:785-793、1997;Gueguenら、J.Immunol.160:6188-6194、1998;Gjertsenら、Int.J.Cancer72:784-790、1997;Gaudinら、J.Immunol.162:1730-1738、1999;Chiariら、CancerRes.59:5785-5792、1999;Hoganら、CancerRes.58:5144-5150、1998;Pieperら、J.Exp.Med.189:757-765、1999;Wangら、Science284:1351-1354、1999;Fiskら、J.Exp.Med181:2109-2117、1995;Brossartら、CancerRes.58:732-736、1998;Reopkeら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:14704-14707、1996;Ikedaら、Immunity6:199-208,1997;Ronsinら、J.Immunol163:483-490、1999;Vonderbeideら、Immunity10:673-679,1999。これらの抗原および他の抗原は、PCT出願PCT/US98/18601に開示される。実施された実験の以下の説明は、例示であり、特許請求される本発明の範囲を制限しない。実施例実施例1:部分的アンチトロンビンIII結合部位を有する3-Oスルフェート含有十糖の配列決定導入部:ヘパリンおよびヘパランスルフェートグリコサミノグリカンは、増殖因子、酵素、およびモルフォゲンと相互作用し、そしてそれらの活性を調節する、重要なクラスの分子を表す。このクラスの分子についての多くの生物学的機能のうち、その最も重要な機能の1つは、アンチトロンビンIIIAT-IIIとの相互作用である。特定のヘパリン5糖配列N硫酸化、6-O硫酸化グルコサミン上に異常な3-Oスルフェートを含むに結合するAT-IIIは、凝固カスケードにおける特定のプロテアーゼを阻害するAT-III能力を1000倍増加する。この様式において、ヘパリン様グリコサミノグリカンHLGAGは、血液凝固の調節において重要な生物学的および薬理学的役割を果たす。最近、配列決定方法論が、この重要なクラスの分子のさらなる構造-機能関係に対して、開発された2000年4月24日に出願され、同一の発明者を有する、米国特許出願第09/557,997号および同第09/558,137号これらは、参考として援用されるならびにVenkataraman,G.,Shriver,Z.,Raman,R.Sasisekharan,R.1999Science286,537-42。この方法論は、HLGAGの大量の情報内容性質を扱うための性質コード命名法スキームPENと、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析MALDI-MSならびにピコモル量のHLGAGオリゴ糖を迅速に配列決定するための実験的制約としての酵素的分解および化学的分解とを組み合わせる。上記PEN-MALDIアプローチを使用して、本発明者らは、本研究において使用される十糖の配列が、ΔU2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S±DDD4-7であることを見出した。本発明者らは、完全グリカン配列決定および一次元プロトン核磁気共鳴を使用して、本発明者らの結果を確認した。さらに、本発明者らは、このアプローチが、柔軟であり、オリゴ糖混合物からの配列情報を導き得ることを示した。従って、この方法論は、重要な生物学的活性を有するヘパリン/ヘパランスルフェートのような多糖における他の異常な配列の分析を可能にし、そしてこれらのヘパリン/ヘパランスルフェートのこれらの薬理学的に重要な基の構造的分析のための基礎を提供する。方法略語:HLGAG、ヘパリン様グリコサミノグリカン;AT-III、アンチトロンビンIII;AT-10、ヘパリンの部分消化から単離されたAT-III画分十糖;IGS、完全グリカン配列決定;PEN、性質コード命名法;MALDI-MS、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析;CE、キャピラリー電気泳動;以下のようなHLGAG配列の略語、I、α-L-イズロン酸;G、β-D-グルクロン酸;ΔU、Δ4,5ウロン酸;2S、3Sおよび6S、それぞれ、2-O、3-O、または6-O硫酸化;NSおよびNAc、グルコサミンのN-硫酸化およびN-アセチル化。材料。十糖AT-10は、以前の研究において使用される同じ糖であるRhomberg,A.J.,Shriver,Z.,Biemann,K.Sasisekharan,R.1998ProcNatlAcadSciUSA95,12232-7およびErnst,S.,Rhomberg,A.J.,Biemann,K.Sasisekharan,R.1998ProcNatlAcadSciUSA95,4182-7。オリゴ糖を、10~35μMの濃度で脱イオン水中に溶解した。Flavobacteriumheparinum由来のヘパリナーゼI~IIIを、先に記載のように精製した。外酵素α-L-イズロネート2-Oスルファターゼ、α-L-イズロニダーゼ、β-D-グルクロニダーゼおよびN-アセチルグルコサミン-6-スルファターゼは、OxfordGlycosciencesから購入した。亜硝酸ナトリウムの40水溶液を、AldrichChemicalから購入した。組成分析のための二糖標準は、Sigma-AldrichSt.Louis,MOから購入した。組成分析。オリゴ糖の組成分析を、先に記載のように、AT-10の30μMサンプルの徹底的な消化、続くキャピラリー電気泳動CEによって完了したRhomberg,A.J.,Ernst,S.,Sasisekharan,R.Biemann,K.1998ProcNatlAcadSciUSA95,4176-81。簡単に述べると、1nmolのオリゴ糖に、200nMのヘパリナーゼI、IIおよびIIIの25mM酢酸ナトリウム、100mMNaCl、5mM酢酸カルシウム緩衝液pH7.0を添加した。反応を30°Cで一晩進行させ、次いで、50mMトリス/ホスフェート10μMデキストランスルフェートpH2.5の電気泳動緩衝液を用いて、逆の極性でCEにより分析した。消化。ヘパリナーゼI消化を、短くまたは徹底的に、のいずれかで消化した。短い消化について、50nMヘパリナーゼIを、分析の前に10分間基質とともにインキュベートした。徹底的な消化は、200nM酵素を用いて一晩で完了した。酵素反応は、10μMオボアルブミン、1μMデキストランスルフェート、5mM酢酸カルシウムおよび10mMエチレンジアミン緩衝液pH7.0を含む緩衝液中の1μLの酵素溶液を、4μLの基質水溶液に添加することによって行った;消化を、先に記載のように、室温で進行させたVenkataraman,G.,Shriver,Z.,Ranian,RSasisekharan,R.1999Science286,537-42およびRhomberg,A.J.,Ernst,S.,Sasisekharan,R.Biemann,K.1998ProcNatlAcadSciUSA95,4176-81。部分的な亜硝酸切断は、公開された手順の改変を使用して完了したTurnbull,J.E.,Hopwood,J.J.Gallagher,J.T.1999ProcNatlAcadSciUSA96,2698-703。外酵素消化は、同時にまたは連続的に、のいずれかで完了した。最終の酵素濃度は、20~40ミリ単位/mLの範囲であり、そして消化を37°Cで実行した。質量分析法。質量スペクトル分析は、遅延抽出を伴う線形モードのPerSeptiveBiosystemsVoyagerElitereflectron飛行時間機器で実行された。消化物からのサンプルは、0.5μLの反応混合物を取り出し、そしてそれを二倍モル過剰のベーシックペプチドRG19RMHイオンの計算質量=4226.8を含む、4.5μLのマトリクス溶液30アセトニトリル中の12mg/mLカフェイン酸に添加することによって調製した。HLGAGオリゴ糖に特異的にキレートするベーシックペプチドの添加および質量スペクトル収集パラメーターによって、さらなる精製の必要なしに、直接的なサンプル分析が可能であるRhomberg,A.J.,Ernst,S.,Sasisekharan,R.Biemarm,K.1998ProcNatlAcadSciUSA95,4176-81。サンプルを標的上にスポットし、そして質量スペクトルを、先に概説されたパラメーターを使用して集めたRhomberg,A.J.,Ernst,S.,Sasisekharan,R.Biemarm,K.1998ProcNatlAcadSciUSA95,4176-81。ベーシックペプチドのMHイオンおよび1:1ペプチド:糖複合体のMHが、それぞれの質量スペクトルにおいて観測され、糖の質量は、1:1複合体のMHイオンの測定されたm/z値から、そのペプチドのMHイオンの測定されたm/z値を引くことによって決定されるJuhasz,P.Biemann,K.1995CarbohydrRes270,131-47。プレート上の全てのスペクトルを、同一機器パラメーター下で、RG19Rの標準および配列I2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SMan6S1655.4の計算された質量の亜硝酸誘導六糖とのその複合体を使用して、外部から較正した。この方法論は、効率的な複合体化を確実にするための糖の十分な硫酸化を必要とする。このように、小さな過小硫酸化undersulfated糖すなわち、単糖および二糖は、この方法論では観測されないJuhasz,P.Biemann,K.1995CarbohydrRes270,131-47。完全グリカン配列決定。電気泳動分離を使用する完全グリカン配列決定IGSを、記載されるように行ったTurnbull,J.E.,Hopwood,J.J.Gallagher,J.T.1999ProcNatlAcadSciUSA96,2698-703。部分的亜硝酸切断条件を、25mMHClおよび2.5mM亜硝酸ナトリウム、ならびに5分、10分、20分、30分、120分、および240分の停止時点を使用することによって改変した。1HNMR分光法。1HNMR分光法を、以前に記載される条件を使用して行ったNadkarni,V.D.,Toida,T.,VanGorp,C.L.,Schubert,R.L.,Weller,J.M.,Hansen,K.P.,Caldwell,E.E.Linhardt,R.J.1996CarbohydrRes290,87-96。AT-10を、イオン交換クロマトグラフィーに供して、常磁性不純物を除いた。AG50W-X8Bio-RadJapanTokyoのカラム1cm×10cmを、5mLの0.1MNaOHでの処理によってナトリウム形態に転換し、そして使用の前に12時間、水で洗浄した。NMR実験のためのサンプルを、カラムに適用し、20mLの水で溶出し、そして凍結乾燥した。次いで、サンプル約1mgを99.8D2OMerk、Germanyから3回凍結乾燥し、そして5mmチューブ中でのNMR分光法のために0.5mLの100D2OAldrichJapan、Tokyo中に溶解させた。AT-10の1D1HNMR分光法を、5-mmフィールド勾配調製可能プローブを備えるJEOLGSX500A分光器で298Kで行った。結果配列決定方法論への導入最近、±1Daより良い精度で、HLGAG複合体オリゴ糖二糖~十糖の質量の決定を可能にするマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析MALDI-MSが開発されたJuhasz,P.Biemann,K1995CarbohydrRes270、131-47およびJuhasz,P.Bieman,K1994ProcNatlAcadSciUSA91,4333-7。個々のHLGAGの得られる分子質量測定の精度に起因して、フラグメントの長さならびに置換基の数および種類の独特の割り当てが、特に、オリゴ糖が十四糖以下である場合、可能であるVenkataraman,G.,Shriver,Z.,Rama,R.Sasisekharan,R1999Science286,537-42。さらに、MALDI-MSは、オリゴ糖の酵素分解または化学分解時に生成されるオリゴ糖フラグメントを検出し得るRhomberg,A.,Shriver,Z.,Biemann,K.Sasisekharan,R.1998ProcNatlAcadSciUSA95,12232-7;Ernst,S.,Romberg,A.J.,Biemann,K.Sasisekharan,R.1998ProcNatlAcadSciUSA95,4182-7;およびRhomberg,A.J.,Ernst,S.,Sasisekharan,R.Biemann,K.1998ProcNatlAcadSciUSA95,4176-81。最後に、MALDI-MSの感度は、100フェムトモルという少量の物質が容易に検出され得るような感度である。MALDI-MS実験技術に加えて、16進数コード系を使用する、32個の二糖単位を表すための性質コード命名法PENが開発されたVenkataraman,G.,Shriver,Z.,Rama,R.Sasisekharan,R1999Science286,537-42。PENの開発は、HLGAGの大量の情報内容性質を扱うのに必要である。16進数のそれぞれは、特定の構築ブロック単位上のスルフェートの分布の観点からそれ自体明らかにする内部論理internallogicに基づいて導かれ、各二糖単位を同定するために無作為に単純に割り当てられない。この系は、単純な数学演算または2進演算を使用して配列の迅速な操作を可能にし、従って、複合体多糖の大量の情報に対する操作を提供する点で、HLGAGについて重要である。さらに、HLGAGにおける内在的構造的多様性が、性質の違い荷電スルフェート基およびアセテート基の位置から生じ、それによってPENをHLGAGの自然な割り当てスキームにする。これは、DNAのヌクレオチドおよびまたはタンパク質のアミノ酸を表すために使用されるアルファベットコードこれらは、単なる識別子として役立ち、そしてこれらの生体高分子のいかなる情報性質もコードせず、それらの化学的不均質性をとらえないと正反対である。16進数コード系は、英数字0~9およびA~Fを含む。二糖単位が、改変され得る4つの位置すなわち、2-O、N-、3-Oおよび6-Oを有するので、これらの化学位置の1つに16進数コードの4つの2進位取りのそれぞれを割り当てることが直接的である。さらに、それぞれの位置で二つのみの改変が可能である2-O、3-Oおよび6-Oは、硫酸化されるかまたはそのままであり得、そしてN-位は、硫酸化されるかまたはアセチル化されるので、2進数系の使用は、単純なオン状態またはオフ状態としてこれらの改変をとらえる。例えば、所与の二糖単位において、2-O位が硫酸化される場合、1の2進数値が割り当てられる。逆に、所与の二糖の2-O位が、硫酸化されない場合、0の2進数値が割り当てられる。いくつかのわずかなHLGAG配列が非置換N-位を有し、これは、余分のビットを加えることによってPEN系で考慮され得る。しかし、本発明者らの研究において、組成分析以下を参照を含む最初の実験は、二糖を含むフリーアミンの存在を示さなかった。英数字を用いて二糖を同定するために、4つの2進数位置を以下の様式で割り当てた:2-O位が最も左の2進数位置に、続いて、6-O、3-OおよびN-位でその順番で割り当てた。それぞれの場合において、上で概説されるように、2進数コード1は、硫酸化位置を表すために使用され、そして0は、2-O、6-Oおよび3-Oの場合には、硫酸化されていない位置、Nの位置の場合には、アセチル化を表すために使用された。ウロン酸の異性体状態すなわち、イズロン酸対グルクロン酸をコードするために、本発明者らは、二糖単位を/-と示した。この方法において、イズロン酸含有単位に対する正の16進法コードおよびグルクロン酸含有単位に対する負の16進法コードを割り当て得る。従って、同一の16進法コードであるが異符号である二糖単位は、ウロン酸の異性体状態においてのみ異なる同一の硫酸化パターンを有する。表1は、本研究で示す二糖単位に対するPENの使用を概説する。表1:本研究において使用した二糖単位に対するPENの誘導AT-10に生じる二糖単位について誘導された16進法コードを、表1に示す。列1は、ウロン酸の異性体状態についてコードする二進位である。列2~5は、二糖単位の2-O、6-O、3-OおよびN-位での修飾をコードする。列6は、列2~5における二進の桁によって示される16進法コードを示す。列7は、列6中のコードによって示される二糖単位である。列8は、配列中に存在する二糖単位の算出した理論質量を示す。これらの二糖に対する化学修飾または酵素修飾について、以下の命名を使用する:Δ4-5不飽和結合ΔUを有するウロン酸=±;質量タグを有する還元末端二糖単位=t;5員無水マンノース環を有する二糖単位=’。従って、PEN-MALDIによるHLGAGオリゴ糖の配列割り当てについてのストラテジーは、以下の工程を実質的に含む。第一に、インタクトなオリゴ糖のMALTI-MSを使用して、このオリゴ糖に存在するスルフェートおよびアセテートの長さおよび総数を割り当てる。次いで、組成分析を使用して、二糖基礎単位buildingblockの数および型を決定する。この情報を用いて、マスターリストは、二糖単位を含む実行可能な配列全てを構成する。この様式において、所定の配列がどんなに独特であり得ても、この分析から排除される配列はない。実験的拘束およびこれらの拘束を満たさない配列が排除される場合、酵素的消化または化学的分解から生成された二糖フラグメントの質量を、適用する。反復様式において、実験的拘束から絶えず減少する実行可能な配列のマスターリストへ移すことによって、最小の材料を使用する独特な配列解に迅速に到達し得る。重要なことに、別々の実験拘束を用いる多重経路を使用して、配列の収束し得、割当て精度を保障する。AT-10の分析AT-10、および酵素的処理または化学的処理のいずれかに基づくAT-10由来のオリゴ糖を、基本ペプチドRG19Rとの非共有結合複合体としてMALDI-MSを用いて検出するRhomberg,A.J.,Ernst,S.,Sasisekharan,R.Biemann,K.1998ProcNatlAcadSciUSA95,4176-81およびJuhasn、P.Biemann,K.1995CarbohydrRes270,131-47。この方法論を使用して、RG19RのMHイオン、およびペプチド:糖複合体についてのMHイオンの2種を観察する。1:1の糖:ペプチド複合体のMH値からのペプチドのMH値を差し引くことによって、オリゴ糖の分子量を得た。表2は、本研究において観察された全てのフラグメント、これらの算出した実験的に誘導された質量値、およびAT-10の配列割当て後のフラグメントの推定された構造を列挙する。図1は、AT-10の主要成分がm/z値6999.3を有することを示す。プロトン化ペプチドのm/z値が差し引かれる場合、このオリゴ糖の質量についての実験値が、2770.2であることを見出す。これは、13のスルフェート基および1つのアセテート基を有する二糖に対して独特に割り当てられ得る。AT-10の質量スペクトルは、12のスルフェート基および1つのアセテート基を有するオリゴ糖に対応する、質量2690.1の別の種本明細書中以降では、夾雑物というの存在を示す。表2:質量スペクトルにおけるピークm/z値およびその推定構造dは、セミカルバジド質量タグを示すΔ=56.1ダルトン。糖と基本ペプチドRG19Rとのプロトン化1:1複合体のm/z値を、列1に示す。列2は、このプロトン化1:1複合体から、スペクトル中で観察されるプロトン化ペプチドの値を差し引くことによって得られる、観察された多糖の質量を示す。質量スペクトルにおける対応するピークについて推定された糖の化学構造を、列3に示す。この推定構造について算出された理論質量を、列4に示す。観察された質量列2が常に算出された質量列4の±1ダルトン以内であることに注意せねばならない。CEを使用する組成分析は、ΔU2S-HNS,6S±D、ΔU-HNAC,6S±4、ΔU-HNS,6S±5およびΔU-HNS,3S,6S±7に対応するそれぞれ2.90:1.00:1.05:0.15の相対比での、4つの二糖の基礎単位の存在を示す。従って、このサンプルの組成分析は、2つの種一方は主要約85であり、もう一方は少数約15であるが存在することを確認した。AT-10は、3:1:1の比である基礎単位ΔU2S-HNS,6S±D、ΔU-HNAC,6S±4およびΔU-HNS,3S,6S±7でできている二糖でなければならない。一緒になって、CEおよびMALTI-MSデータを使用して、AT-10についての実行可能な配列のマスターリストを構築した。本発明者らは、320個の配列がCEおよびMSデータの両方を計上し得ることを見出す表2。これら320個の配列は、単一の解で集束するまで実験的拘束に基づいて配列が除去されるマスターリストを構成する。さらに、組成分析は、ΔU-HNS,6S±5の存在を除いてAT-10に構造的に類似する夾雑物が存在することを確認した。CEデータより、夾雑物の組成は、逐次減法から2:1:1:1の相対比であるΔU2S-HNS,6S±D、ΔU-HNAC,6S±4、ΔU-HNS,3S,6S±7およびΔU-HNS,6S±5であることが決定された。配列実行のマスターリストを構築した場合、PEN-MALDI、IGSTurnbull,J.E.,Hopwood,J.J.Gallagher,J.T.1999ProcNatlAcadSciUSA96,2698-703およびNMR分析の組み合わせを使用して、AT-10を配列決定し、次いで、夾雑物の配列を分析した。AT-10のMALDI-MS配列決定組成物データから生成した320個の実行可能な配列のリストより、本発明者らは、AT-10の配列を割り当てるために、ヘパリナーゼIおよび亜硝酸それぞれの使用を含む一連の実験的拘束を使用した。ヘパリナーゼIを用いるAT-10の短時間の不完全な消化は、分子量557.7、1073.9、1155.6、1614.6および2192.2の5つのフラグメントを生じた図2a。質量577.7を有するフラグメントは、±Dに対応する。1155.6フラグメントは、以下の構造の1つを有する必要のある六硫酸化六糖に対応する:±DD、±D-D、±D7、±D-7、±7Dまたは±7-D。1614.6を有するフラグメントは、七硫酸モノアセチル化六糖に対応し、そして2192.2を有するフラグメントは、十硫酸化モノアセチル化八糖に対応する。1073.9での最後のピークは、明らかに夾雑物に対して割り当てられた分析については以下を参照のこと。320個の配列のリストがシュミレートされたヘパリナーゼI消化によって形成されるこれらのフラグメントに対して検索された場合、これは、52個の配列に減少した表2。ヘパリナーゼIによる基質消化の速度は、サイズ依存的であるLinhardt,R.J.,Turnbull,J.E.,Wang,H.M.,Loganathan,D.Gallagher,J.T.1990Biochemistry29,2611-7。AT-10中の2-O硫酸化イズロン酸含有結合を全て同定するために、AT-10を、全ての感受性結合の完全な切断を生じる条件下でヘパリナーゼIで処理した。これらの条件下で、夾雑物由来の六糖および四糖は、インタクトなままであった表2b。しかし、六硫酸化四糖図2aから質量1155.6を切断した。よって、この糖は、配列±DDを有する。AT-10についての52個の実行可能な配列割当てのうち、28個のみが、ヘパリナーゼIの徹底的な消化データを満たし得る。次に、AT-10を、セミアルバジドで処理して、アノマー位でセミカルバゾンを得た。この様式において、質量タグΔ=56.1を導入して、非還元末端に対抗させるように還元末端由来のフラグメントを差別化した。ヘパリナーゼIでのタグ化AT-10の処理によって、5つのフラグメントを得た図2c。ヘパリナーゼI処理の非誘導体化AT-10との比較より図2a、七硫酸化モノアセチル化六糖は、タグ化されたようであり、よって、AT-10の還元末端由来であるはずである。28個の残りの配列に対するこの拘束の適用は、12個を除くを排除した表3。表3:AT-10配列の収束十糖サンプルを配列決定するために使用した逐次戦略を、表3に示す。320個の配列のマスターリストからの配列を排除するための実験的拘束の適用を、最終配列に収束させるために使用した。実験的拘束を満たした配列の数を、左側のボックスに示した。右側のボックスは、表の最初の括弧に示した質量について形成された実行可能なフラグメントとともに実験的拘束を満たす配列を示す。表3中の12個の残りの配列の検査は、最初の差異が還元末端六糖の同定にあることを示す。従って、AT-10の亜硝酸消化およびエキソ酵素の賢明な使用を介して、還元末端四糖の配列を決定した。第一に、タグ化したAT-10を、亜硝酸で徹底的に処理し、そして2種が容易に検出可能であった図3。質量1013.8を有する一方は、4つのスルフェートおよび1つのアセテートを有するタグ化した無水マンノース四糖に対応する。質量958.8を有する他方は、タグ化されていない同一の四糖に対応する。両方が、以下の配列の1つを張り当てられた:±47、±4-7、±4-D。従って、この情報に基づいて、実行可能な配列の半分を、AT-10について6個のみの実行可能な配列解を残して排除し得た表3。AT-10の還元末端で2つの二糖単位の独特な異性体状態を割当てるために、以下の実験的拘束を使用した:徹底的な亜硝酸消化を、非還元末端でイズロン酸を特異的に剪定するエキソ溶解性exolytic酵素α-イズロニダーゼとともにインキュベートした。178.0によるスペクトルにおける移動は、ウロン酸を4、その異性体状態をすなわち、IHNAC,6Sまたは4として確認した。3つの配列のみが、観察されたフラグメントすなわち、±7DD4-D、±DDD4-7、±DDD47を示し得た。3±Ds、±4および±7の組成を有する実行可能な十糖全てを得るために、本発明者らは、全ての実行可能な方法において十糖を得るために上記の二糖を整列するしなければならない。また、各二糖単位は、イズロン酸またはグルクロン酸に対応してまたは-であり得る。実行可能な配列の数=5C35位での整列3Ds2C12つの残りの位置での4つの整列24糖がヘパリナーゼ由来であるので、非還元末端以外の全ての位置においてまたは-とみなすために=10216=320これら最後の3つの選択肢を区別するため、および還元末端二糖を同定するために、イズロニダーゼ処理産物を、先ず6-OスルファターゼおよびN-デアセチラーゼで処理して、ヘキソサミンを除き、還元末端二糖のみを残した。β-グルクロニダーゼでのこのサンプルの処理によって、単糖への分解を生じた。このことは、還元末端二糖を-7G-HNS,3S,6Sと同定した。従って、AT-IIIの分画化十糖の推定配列は、±DDD4-7ΔU2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAC,6SGHNS,3S,6Sである。注目すべきは、この配列が同一の様式において生成された十糖に対する配列割当てと一致しない事実であるToida,T.,Hileman,R.E.,Smith,A.E.,Vlahova,P.I.Linhardt,R.J.1996J.Biol.Chem.,271,32040-7。従って、本発明者らは、他の分析法を使用して本発明の配列割当てを確認することを探索した。AT-10のIGS配列決定AT-10をまた、最近確立された技術であるIntegralGlycanSequencingIGSを使用して配列決定した。これは、還元末端を蛍光でタグ化した糖の電気的分離を使用する。糖の部分的な亜硝酸切断およびエキソ酵素的消化は、配列が決定され得るラダーを生成した。PEN-MALDIデータに従って、蛍光タグ化サンプルの電気泳動的分析は、単一の主要な十糖を生成したが、さらに、より小さな夾雑物もまた、明らかであった。部分的亜硝酸切断の産物は、十糖、八糖、六糖および四糖であり、二糖産物は観察されなかった。この結果は、NS部分およびNAc部分の全ての位置を規定し、還元末端に近接する位置にたった1つのN-アセチル化二糖を有する。エキソ酵素の異なる組み合わせでのこれらの産物の処理に起因するゲルシフトは、3つの位置でのイズロン酸残基そのうちの2つが2-O-硫酸化されているおよび6-O-硫酸化グルコサミン残基の3つの位置での存在を示した。非還元末端は、完全に2-O-硫酸化されていたが、非還元末端グルコサミン残基上の6-O-スルフェートの存在を確認し、そしてこの還元末端単糖上の硫酸化パターンの詳細は、この分析において得られなかった。このデータは、AT-10の構造をΔU2SHNS,±6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAC,6SGHNAC/NS,±3S,±6Sと規定する。独立した配列決定手法由来のこのデータは、PEN-MALDI分析と完全に一致した。AT-10夾雑物の配列分析質量スペクトルデータをまたCE組成分析と組合わせて使用して、AT-10の12硫酸化1アセチル化夾雑物について提唱した配列に到達し得た。上記で述べたように、ヘパリナーゼI消化図2aは、この夾雑物に対してのみ割当て可能な8硫酸化四糖±D±5、±7±5または±5±7に対応するピークを1073.9のm/zで得た。この四糖フラグメントは、この夾雑物の還元末端由来ではなかった。なぜなら、±5を含有する標識糖は、この条件下で見出されなかったからである。さらに、タグ化十糖のヘパリナーゼI消化は、両方の夾雑物およびAT-10に対する還元末端において4-7を配列する。ヘパリナーゼI消化において観察されたD5四糖またはD-5四糖の位置を配列するために、十糖を、イズロン酸2-Oで処理した後にヘパリナーゼIで処理した。これらの条件下で、5硫酸化四糖は、スルフェートの消失によって生じる1073.9から993.9までの質量で80Da減少した。従って、この四糖は、夾雑物の非還元末端由来であるはずである。まとめると、この情報は、この夾雑物の配列が±D5D4-7または±D-5D4-7であることを示唆する。AT-10およびこの夾雑物についての割当ては、この十糖が亜硝酸で不完全に分解される場合に確認された図4。還元末端で無水マンノースを有するAT-10質量2673.0を、At-10の亜硝酸切断より生じるフラグメントである質量2209.2、2113.2および1633.2として完全に観察した。さらに、質量1057.9を有する種は、ΔU2SHNS,6SI2SMan6Sよりのみ得られ、AT-10の非還元末端の独特な質量シグネチャーを提供する。重要なことに、これらの種の全てが、AT-10または夾雑物のいずれかに対して割当てられ得る。AT-10のNMRスペクトルの解釈AT-10のNMRスペクトルを、表6に示す。本発明者らの分析と一致して、HNS,3S,6SのαH-1、αH-2およびαH-3の小さなシグナルそれぞれ、5.45ppm、3.45ppmおよび4.50ppmは、HNS,3S,6Sとして還元末端単糖単位を割り当てることを可能にする。この場合において、還元末端HNS,3S,6S残基のアノマー性プロトンは、α-配置とβ-配置とに分けられなければならない。HNS残基のアノマー性プロトンのα-配置は、アノマー性効果に基づいてプロトン性溶媒例えば、重水素中で優勢約95である。さらに、2つのI2S部分の存在が、検出され得た。驚くことに、この2つのI2Sのアノマー性シグナル通常、約5.20ppmで共鳴するが、シフトした。これは、おそらく1C4から2S0への内部I2S部分のコンフォーメーションにおける変化から生じる。また、オリゴ糖がHNS,6SのH-2プロトンの統合値ならびにそれぞれ3.27ppmおよび3.38ppmで観察されるG残基に基づく3つのHNS,6Sおよび1つの非硫酸化G残基を含むことが確認され得る。2.1ppmでのHNAc,6S残基の1つのN-アセチル化メチルシグナルの存在は、このオリゴ糖が1つのHNAc,6S残基を含むことを完全に示す。約4.3ppmおよび3.9ppmでの6-O-硫酸化HNY残基Y=AcまたはSのH-6プロトンに対応するシグナルの存在は、このオリゴ糖の全てのHNY残基がC-6でO-硫酸化されていることを確認する。まとめると、このデータは、AT-10サンプル中の主要な種の配列割当てをΔU2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAC,6SGHNS,3S,6Sとし得る。要約本実施例において、いくつかの厳密な分析技術が複合体HLGAGオリゴ糖の構造に対して収束されるように使用され得ることを、示した。さらに、2つの配列決定手順すなわち、IGSおよびPEN-MALDIを使用する配列割当てが同一であることを示した。これは、十糖の部分的および徹底的な亜硝酸処理においてほぼ明らかである図3。重要なことに、本発明者らの分析によって、現在、ゲル電気泳動およびMALTI-MSで観察される十糖、八糖、六糖および四糖に対して以下の配列すなわちDDD4-7、DD4-7、D4-7および亜硝酸耐性四糖4-7を割当てることが可能になった。次の実施例において、部分的にインタクトなAT-III結合部位の機能的帰結およびAT-III結合部位に対するヘパリナーゼの酵素的作用を調査した。さらに、PEN-MALDI手法が十分に高感度であり、そしてオリゴ糖混合物についての配列情報を決定し得ることを区別化することが実証された。PEN-MALDIを使用したAT-10についての単一の解への収束は多数の直交する実験的拘束Venkataraman,G.,Shriver,Z.,Raman,R.Sasisekharan,R.1999Science286,537-42を使用して可能であり、よって、単一の実験的拘束例えば、亜硝酸切断に対する信頼性を最小化する。最後に、示した実施例は、生物学的および薬理学的に関連するオリゴ糖についての決定的な配列情報を得るためのPEN-MALDIの値を例示する。実施例2:ヘパリンにおけるアンチトロンビンIII結合部位の、ヘパリナーゼによる切断、および低分子量ヘパリンの生成におけるその関連導入ヘパリンは、臨床的抗凝集剤として50年以上も使用され、最も効果的な公知の薬理学的薬剤の1つとされてきた。ヘパリン活性の多くは、アンチトロンビンIIIAT-IIIを結合するその能力について見出され得る。ヘパリンの制御された崩壊によってヘパリンに由来する低分子ヘパリンLMWHは、多くの一連の副作用なしにヘパリンの抗トロンビン活性の多くを維持する。LMWHの臨床的意義は、これを生成させる臨床的手段および酵素的手段を理解および発達させる必要性を強調させてきた。低分子量ヘパリンの生成について使用される基本的な酵素的道具は、Flavobacteriumheparinum由来のヘパリナーゼ、特にヘパリナーゼIおよびIIである。五糖モデル化合物および六糖モデル化合物を使用して、本発明者らは、ヘパリナーゼIおよびIIヘパリナーゼIIIではないがAT-III結合部位を切断することを示す。さらに、本発明者らは、グリコシド結合の還元末端でのグルコサミン3-O硫酸化がヘパリナーゼI、IIおよびIIIに対する耐性を付与することを本明細書中に示す。最後に、本発明者らは、ヘパリンオリゴ糖の生物学的および薬理学的な帰結を試験する。本発明者らは、このようなオリゴ糖がインタクトなAT-III部位を含むHLGAGの機能的特性のいくつかを欠くことを示す。方法材料ペンタPenta1および2を、Dr.RobertRosenberg,DepartmentofBiology,MITより惜しみなく供与された。ヘキサHexa1を、ヘパリンのヘパリナーゼI消化を使用して生成したErnst,S.,Langer,R.,Cooney,C.L.Sasisekharan,R.1995CritRevBiochemMolBiol30,387-444。ヘパリンを、CelsusLaboratoriesCinncinati,OHより購入し、モル濃度のストックを、平均分子量13,000Daに基づいて算出した。エノキサシンを、AvantisPharmaceuticalsChicago,ILより購入した。消化。ヘパリナーゼI消化物を、記載のようにVenkataraman,G.,Shriver,Z.,Raman,R.Sasisekharan,R.1999Science286,537-42およびRhomberg,A.J.,Ernst,S.,Sasisekharan,R.Biemann,K.1998ProcNatlAcadSciUSA95,4176-81行った。ヘパリナーゼIIまたはヘパリナーゼIIIの反応を、10μMオボアルブミン、1μM硫酸デキストラン、および10mMエチレンジアミン、pH7.0中で、室温にて本質的に同じ方法で行った。短時間の消化を、50nM酵素を用いて10分間で行う一方で、徹底的な消化を、200nM酵素を用いて一晩にわたって行った。上記で概説したパラメーターを用いて質量スペクトルを集めShriver,Z.,Raman,R.,Venkataraman,G.,Drummond,K.,Turnbull,J.,Toida,T.,Linhardt,R.,Biemann,K.Sasisekharan,R.2000ProcNatlAcadSciUSA,2000Sep12;9719:10359-64もまた参照のこと、プロトン化RG19Rおよび配列I2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SMan6Sの亜硝酸誘導体化六糖とのその複合体についてのシグナルを用いることによって外部較正した。平衡蛍光力価測定実験。ヒトAT-IIIのAT-10十糖またはヘパリンいずれかを用いた力価測定を、Fluorolog2機器SpexInstrumentsを用いて25°Cで行ったMeagher,J.L.,Beechem,J.M.,Olson,S.T.Gettins,P.G.1998J.BiolChem273,23283-9およびDesai,U.R.,Petitou,M.,Bjork,I.Olson,S.T.1998J.BiolChem273,7478-87。pH7.4もしくは6.0のいずれかに合わせた20mMリン酸ナトリウム0.1mMEDTAおよび0.1PEG8000含有中で、測定を行った。pH7.4の緩衝液を用いて、塩化ナトリウムを100mMに終濃度まで添加した。蛍光発光スペクトルを、280nm励起波長および5秒の積分時間を用いて300~400nmから集めた。簡潔には、力価測定実験を、以下のように行った。十糖もしくはヘパリンいずれかのアリコートを、AT-IIIの1μM溶液に添加し、この溶液を、1分間にわたり平衡に到達させ、発光スペクトルを集めた。連続的な糖アリコートの追加および蛍光シグナルをタンパク質希釈について計算するために調節した。十糖の活性の生物学的測定。インビトロでの抗凝固活性を、米国薬局方に従って、以前に記載のように決定したHoppensteadt,D.A.,Jeske,W.P.,Walenga,J.M.,Fu,K.,Yang,L.H.,Ing,T.S.,Herbert,J.M.Fareed,J.1999ThrombRes96,115-24およびDietrich,C.P.,Paiva,J.F.,Castro,R.A.,Chavante,S.F.,Jeske,W.,Fareed,J.,Gorin,P.A.,Mendes,A.Nader,H.B.1999BiochimBiophysActa1428,273-83。トロンビンFIIaおよび第Xa因子FXa生成阻害アッセイを、本質的に以下に記載のように行った。完結には、この研究に用いたAT-10十糖、EnoxaparinLMWHまたは合成AT-III結合五糖Penta1のいずれかを、指定した濃度で滅菌生理食塩水に溶解した。このサンプルに、100mMTris-HClpH8.5で1:8希釈した等量のフィブリノゲン除去血漿を添加した。別のサンプルで、同じ濃度のヘパリンオリゴ糖およびアクチンを、SpectrozymeTHまたはFXaのいずれかに1:1の比で添加した。このようにして、内因性のIIa生成およびXa生成を測定した。さらに、トロンビンおよびFXaの外因性の生成の阻害を計算するために、トロンボプラスチンCを、SpectrozymeTHまたはFXaいずれかで1:6希釈した。すべてのサンプルに関して、光学密度を405nmで測定し、結果を、補充していない生理食塩水コントロールと比較した場合の阻害として表した。これらのアッセイに関して、トロンビン試薬Fibrindexを、OrthoDiagnosticSystems,Inc.Raritan,NJから入手し、第Xa因子を、EnzymeResearchSouthBend,INから入手した。SpectrozymeTHおよびFXaを、AmericanDiagnosticaGreenwich,CTから入手した。全血データをまた用いて、AT-10の抗凝固活性を決定した。このアッセイ、活性化部分的トロンボプラスチン時間APTTおよびプロトロンビン時間PTを、以前に報告したものと同様の様式で行ったDietrich,C.P.,Paiva,J.F.,Castro,R.A.,Chavante,S.F.,Jeslce,W.,Fareed,J.,Gorin,P.A.,Mendes,A.Nader,H.B.1999BiochimBiophysActa1428,273-83。APTT試薬を、OrganonTeknikaDurham,NCから入手し、HepTest試薬を、HaemachemSt.Louis,MOから入手した。結果:AT-III結合部位に対するヘパリナーゼの酵素作用:以前に、本発明者らは、AT-10に対するヘパリナーゼIおよびIIの基質特異性を調査したRhomberg,A.J.,Shriver,Z.,Biemann,K.Sasisekharan,R.1998ProcNatlAcadSciUSA95,12232-7およびErnst,S.,Rhomberg,A.J.,Biemann,K.Sasisekharan,R.1998ProcNatlAcadSciUSA95,4182-7。しかし、これらの研究を、公開された構造Toida,T.,Hileman,R.E.,Smith,A.E.,Vlahova,P.I.Linhardt,R.J.1996JBiolChem271,32040-7を前提として行った。本明細書中に記載の新たに決定されたAT-10の構造に鑑みるとShriver,Z.,Raman,R.,Venkataraman,G.,Drummond,K.,Turnbull,J.,Toida,T.,Linhardt,R.,Biemann,K.Sasisekharan,R.2000ProcNatlAcadSciUSA,2000Sep12;9719:10359-64もまた参照のこと、本発明者らは、高親和性AT-III結合に重要な3-O硫酸を含むオリゴ糖に対するヘパリナーゼI、II,およびIIIの酵素作用を再試験した。これらの研究に関して、本発明者らは、3つのオリゴ糖、2つの五糖Penta1およびPenta2、図5および六糖Hexa1、図5を用いた。五糖を合成して誘導体化した一方、Hexa1をヘパリナーゼIによるヘパリンの処理によって誘導体化したという事実に注意のこと。結果として、Penta1またはPenta2とは異なり、Hexa1は、非還元末端にΔ4,5ウロン酸を含む。さらに、Penta1およびPenta2は、内部グルコサミン残基上の3-O硫酸の存在Penta1および非存在Penta2によってのみ互いに異なる図5。本明細書中で用いられるストラテジーは、本質的に、それぞれ、徹底的な消化条件下でのヘパリナーゼI、II、またはIIIを用いた糖各々の処理、続いて得られた生成物の質量分析による同定を含む。糖基質および生成物の計算された質量、それらの正体、および観察された質量を、表4に示す。表4:HLGAGオリゴ糖の化学構造およびm/z値表4の第1列に示されるものは、糖と塩基性ペプチドRG19Rとのプロトン化した1:1複合体のm/z値である。第2列は、プロトン化した1:1複合体の質量からプロトン化した塩基性ペプチドの質量を引くことにより得られた糖の観察された質量を示す。質量スペクトルにおける対応するピークの糖の化学構造を、第3列に示す。第4列は、この化学構造について計算された理論的質量を示す。観察された質量が、計算された質量の±1Da以内にあることに注意のこと。Penta1の場合、ヘパリナーゼIIIではなく、ヘパリナーゼIおよびIIのみが、このオリゴ糖を、I2S含有グリコシド結合図5の結合A.2での切断の指標である、質量916.7の5硫酸化三糖および質量591.3の3硫酸化二糖に切断する図6。図6に示されたデータは、3-O含有結合が、ヘパリナーゼI、IIまたはIIIの切断に耐性であることを示す。この耐性は、長さとは無関係であるようである。AT-10の構造に関する以前の理解Toida,T.,Hileman,R.E.,Smith,A.E.,Vlahova,P.I.Linhardt,R.J.1996J.BiolChem271,32040-7に基づいて、十分な長さがあれば、ヘパリナーゼIIが3-O硫酸含有糖を切断することが報告されたRhomberg,A.J.,Shriver,Z.,Biemann,K.Sasisekharan,R.1998ProcNatlAcadSciUSA95,12232-7。AT-10十糖の新たに決定された構造Shriver,Z.,Raman,R.,Venkataraman,G.,Drummond,K.,Turnbull,J.,Toida,T.,Linhardt,R.,Biemann,K.Sasisekharan,R.2000ProcNatlAcadSciUSA,2000Sep12;9719:10359-64もまた参照のことおよび図6に示されたデータに鑑みて、以前の知見は、再解釈されなければならず、本明細書中で、ヘパリナーゼIIが、還元末端付近の3-O硫酸グルコサミンを伴う結合を切断しないことが結論付けられる。さらに、ヘパリナーゼI、IIおよびIIIの作用にこの結合が耐性であることは、完全に、Penta2のヘパリナーゼI、II、およびIII処理により示される3-O硫酸の存在に起因する図7。この場合、すべてのヘパリナーゼは、この基質を効率的に切断する。Penta1を用いた場合、ヘパリナーゼIは、I2S含有結合で切断し、質量837.3の三糖および質量591.9の二糖を生じる図5における結合B.2での切断。逆に、ヘパリナーゼIIおよびIIIはともに、すぐに切断可能な硫酸化されていないG含有結合図5の結合B.1で切断する。ヘパリナーゼIIIは、この結合のみを切断し、質量1428.3の四糖および単糖を生じる認められなかった。ヘパリナーゼIIは、結合B.2およびB.1で切断し、Penta2を1つの単糖および2つの二糖に還元する。この二糖のうちの一方が観察され、質量592.0を有する図7。3-O硫酸化糖に対するヘパリナーゼの基質特異性をさらに調査するために、本発明者らは、Hexa13-O硫酸含有のヘパリナーゼI由来六糖を用いた図8。Hexa1をまた、この研究のための基質として選択した。なぜなら、HexaIがAT-10の非還元末端短縮を示し、還元末端に同じGHNS,3S,6S部分を含むからである。本発明者らは、Hexa1がヘパリナーゼIIおよびIIIでの切断に感受性であるが、ヘパリナーゼIでの切断には感受性でないことを見出している。Hexa1のヘパリナーゼIIまたはIIIいずれかによる切断が、G含有結合で生じるのではなく、むしろI含有結合図5におけるC.2ではなくC.1での切断で生じるという事実に注意のこと。ヘパリナーゼIIでの切断の場合、生成物は、質量1036.5の四糖および質量577.4の二糖である。ヘパリナーゼIIIでの切断については、同じ生成物、すなわち、質量1036.1の四糖および質量577.8の二糖が観察される。これらの結果により、還元末端付近の3-O硫酸を伴う結合が、ヘパリナーゼ作用ヘパリナーゼIIを含むから保護されるという本発明者らの評価が確認される。Hexa1のヘパリナーゼIIおよびIII両方での処理の場合、ヘパリナーゼ耐性四糖配列ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sを有するが形成される。この四糖がさらなるヘパリナーゼ切断に耐性であるということは、以前の観察Yamada,S.,Yoshida,K.,Sugiura,M.,Sugahara,K.,Khoo,K.H.,Morris,H.R.Dell,A.1993JBiolChem268,4780-7と一致する。また、ヘパリナーゼIの公知の基質特異性と一致して、Hexa1これはI2S結合を含まないは、この酵素により切断されない。これらの研究に鑑みて、いまや、ヘパリナーゼIおよびIIが、HNS,3S,6S↓I2SHNS,6S結合でAT-III部位を切断し得ることは明らかであり、ここでこの切断可能な結合は、矢印で示されるPenta1のA.2およびPenta2のB.2、図5。さらに、AT-10についての新たに割り当てられた構造に対して、本発明者らは、還元末端グルコサミン、すなわち、HNS,6S↓GHNS,3S,6S上の3-O硫酸を伴う結合が、ヘパリナーゼIIまたはIIIいずれによっても切断可能でないことを見出しているPenta1のA.1およびPenta2のB.1、図5。さらに、本発明者らは、この阻害が、完全に、通常でない3-O硫酸改変に起因することを見出している。最後に、ヘパリナーゼIの酵素作用についての本発明者らの以前の研究をまとめると、AT-10構造は、ヘパリナーゼIが、ヘパリン/ヘパランオリゴ糖上で、エキソ分解性処理様式で作用するという事実を補強するErnst,S.,Rhomberg,A.J.,Biemann,K.Sasisekharan,R.1998ProcNatlAcadSciUSA95,4182-7。AT-10十糖へのAT-III結合:本発明者らの、本明細書中およびShriver,Z.,Raman,R.,Venkataraman,G.,Drummond,K.,Turnbull,J.,Toida,T.,Linhardt,R.,Biemann,K.Sasisekharan,R.2000ProcNatlAcadSciUSA,2000Sep12;9719:10359-64で報告したAT-10の配列分析は、この十糖が、インタクトなAT-III結合五糖配列を含むのではなく、むしろ非還元末端三糖ユニットのみを含むことを明らかにした。本発明者らは、この配列割り当てを拡張し、AT-10のAT-III結合親和性を測定することによりこの結果に機能的関係を与えようとした。pH7.4、I=0.15において、AT-10は、AT-IIIに対してほとんど親和性を有さなかった図9。逆に、同じ条件下で、豚腸粘膜ヘパリンは、36nMの見かけのKDでAT-IIIを結合した。AT-IIIに対するAT-10の親和性を正確に測定するために、力価測定を、pH6.2の代わりに、糖へのATIII結合を促進することが公知の条件で行った。これらの条件下で、AT-10は、AT-IIIを0.8μMの見かけのKDで結合したが、全長ヘパリンのKDは10nMに減少した。このAT-10について測定されたKDは、短縮化還元末端を有する類似の糖に匹敵する0.3~2μMのKD値と測定されているDesai,U.R.,Petitou,M.,Bjork,I.Olson,S.T.1998JBiolChem273,7478-87。従って、この力価測定実験の結果は、部分的にインタクトなAT-III五糖結合配列を含むAT-10と一致するDesai,U.R.,Petitou,M.,Bjork,I.Olson,S.T.1998JBiolChem273,7478-87。五糖配列、すなわちHNAc,6SGHNS,3S,6Sの非還元末端における3つの糖ユニットは、主に、AT-IIIのネイティブな状態の結合を担う一方で、還元末端二糖ユニットI2SHNS,6Sこれは、AT-10にはないは、活性な、コンホメーションが変化したAT-IIIの結合に重要である。AT-10について測定されたKDpH6.0、I=0.05で0.8μMは、全長ヘパリンのKDより約100倍高く、このことにより、AT-10が、インタクトなAT-III五糖配列を含まないことが確認される。AT-10について観察されたAT-III親和性の減少は、以前の研究では、五糖のみが全長ヘパリンと類似の親和性を有することが示されていたDesai,U.R.,Petitou,M.,Bjork,I.Olson,S.T.1998JBiolChem273,7478-87ので、単にサイズの問題に起因するのではないはずである。次に、AT-IIIと十糖との間の結合相互作用を測定して、本発明者らは、部分的AT-III結合部位のみを含むHLGAGオリゴ糖の機能的結論を明確にしようとした。AT-10の生物学的活性:インタクトなAT-III部位を含まないオリゴ糖について予測され得るように、AT-10の生物学的活性は、enoxaparinここでLMWHの例として用いられるまたは五糖であるPenta1のいずれよりも小さい図10。トロンビン活性のAT-IIIによるヘパリン媒介性阻害の公知の機構と一致して、十糖も五糖も有意な抗IIa活性を有さない図10a。五糖の場合、この活性の欠如は、完全に、そのサイズが、AT-III/IIa複合体の形成のテンプレートとして作用するには不十分であることに起因している。十糖については、このサイズ制限はまた、あり得る説明であるがなぜなら、厳密な生化学的研究により、少なくとも18の単糖ユニットを有するオリゴ糖が、効率的な複合体形成に重要であることが示されているからであるPetitou,M.,Herault,J.P.,Bernat,A.,Driguez,P.A.,Duchaussoy,P.,Lormeau,J.C.Herbert,J.M.1999Nature398,417-22、インタクトなAT-III部位の欠如はまた、その減少した抗IIa活性に寄与し得る。これらの結果は、血清からの第Xa因子図10bまたは精製第Xa因子図10cを用いて、この3つの抗Xa活性を試験することにより確認され、拡張されている。以前に示されたように、AT-IIIによる第Xa因子の阻害には、AT-IIIにおけるコンホメーション変化にのみ付随した五糖モチーフの結合が必要である。抗Xaアッセイにおいて、enoxaparinおよび五糖はともに、十糖より顕著に高い活性を有する。enoxaparinおよび合成五糖のIC50値は、それぞれ、66nMおよび39nMであるが、AT-10のIC50値は、280nMであり、10倍高い。これらの値は、AT-III蛍光力価測定実験において決定されたヘパリンと比較して、AT10のAT-IIIに対する低い親和性と一致する図9。十糖が抗Xa活性を有するということは、驚くべきことではない。なぜなら、非還元三糖ユニット十糖に存在するが、主に、AT-IIIへのヘパリンの最初の結合を担うからである。還元末端二糖ユニット、すなわち、I2SHNS,6SAT-10にはないは、コンホメーションが変化した抗トロンビンIIIに結合して、これを安定化すると予測される。HepTest測定図10dにより、類似の結果が得られた。すなわち、enoxaparinおよび五糖が、AT-10十糖より有意に高い活性を有した。まとめると、十糖の抗IIa活性および抗Xa活性は、五糖およびenoxaparinと比較して、AT-III力価測定実験、ならびにヘパリンが凝固カスケードを阻害する機構の公知の薬力学とよく一致する。要約すると、この実施例において、ヘパリナーゼIおよびIIが、AT-III結合部位を切断し、オリゴ糖の還元末端において三糖ユニットを遊離することが示される。本発明者らはまた、ヘパリナーゼIIIが、内部グルコサミン残基上に3-O硫酸が存在するので、AT-III部位を切断しないことを実証する。従って、LMWHの生成のためにヘパリナーゼIまたはIIを使用することは、確実にLMWHフラグメントにおけるインタクトな抗トロンビンIII部位を保持するように、極度の用心を必要とする。実際に、本明細書中で示した結果は、ヘパリナーゼIまたはIIが、ヘパリンの薬理学的用量の中和に理想的な薬剤であり得ることを示す。実施例3:ヘパリンの組成分析法の開発および構造的特徴づけ緒言UFHを精製し、その成分を同定するために、UGHを、徹底的に消化し、キャピラリー電気泳動およびMALDI質量分析を用いて分析した。キャピラリー電気泳動CEは、ヘパリンの二糖組成分析のための高い分解能を有する、非常に感度の高い方法である。UFHおよびLMWHの二糖構成ブロックを定量するためにCEを用いる組成分析法CAMを開発した。この方法は、1μg未満のヘパリンを用い、時間効率がよく各CEの実行は、25分の長さである、濃度非依存性であり、高再現性である。この方法の1つの利点は、品質制御プロセスとしてのその有効性であり、異なるLMWHの組成におけるバッチ間変化を最小にするに役立ち得る。従って、オフラインMALDI質量分析と合わせたCEは、UFHおよびLMWHの徹底的な消化において独特の四糖を同定するために用いられてきた。この四糖これは、グリコサミノグリカンのAT-III結合五糖ドメインの一部を形成するは、ヘパリナーゼI、IIまたはIIIでのさらなる消化に耐性である。この独特の四糖の利用が、ヘパリンの抗Xa因子の直接測定において抗凝固活性を媒介したことを以下に示す。方法化合物および材料:UFHを、CelsusLaboratoriesCincinnati,OHから購入し、ストックのモル濃度を、13,000Daの平均分子量に基づいて計算した。二糖標準物質を、SigmaAldrichSt.Louis,MOから購入した。ヘパリナーゼIおよびIIIは、組換えヘパリナーゼである。ヘパリナーゼIIは、以前に記載のようにShriveretal.JournalofBiologicalChemistry1998,273,22904-22912精製したFlavobacteriumheparinum由来のものである。組成分析:UFHを、ヘパリナーゼI、ヘパリナーゼII、およびヘパリナーゼIIIから作製した酵素カクテルを用いて徹底的な脱重合に供した。H2O中の10μg/μ1濃度のUFH9μlを、25mM酢酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、5mM酢酸カルシウム緩衝液pH7.0中のヘパリナーゼI、IIおよびIIIの各々100nMからなる酵素カクテル1μlを用いて、37°Cで12時間消化した。1μlの消化物を9μlのH2Oで希釈することにより、CEサンプルを調製した。このサンプルを、50mMトリス/リン酸、10μM硫酸デキストランpH2.5の泳動緩衝液を用いた逆極性におけるCEにより分析した。57nLの各サンプルを、CEに注入し、泳動時間は、25分であった。各サンプルを、二連で消化し、実験を各サンプルにつき2回繰り返し、1サンプルにつき4回の読み取りを得た。8つの得られたピークのすべてを集め、集めたサンプルの純度をCEに再注入することによりチェックし、それらの質量を、オフラインMALDI質量分析により測定した。ピーク1~7の正体を、それらの移動時間と、標準的な市販の二糖の移動時間とをマッチングさせることによりさらに確認した。例えば、ピーク1のCEスペクトルを、UFHの総酵素消化物のCE分析から集め、ピーク1のMALDI質量スペクトルを生成した。質量スペクトルを、以前に概説したパラメーターを用いて集め、プロトン化RG19Rおよび配列I2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SMan6Sの亜硝酸誘導体化六糖とのその複合体についてのシグナルを用いることにより外部較正した。結果図11Aに認められるように、8つのピークがCEスペクトルにおいて認められる。1~8と表示されたピークの各々は、異なるサンプルにおいて同じ移動時間を有する。各ピークの収集およびCEへの再注入による各サンプルの純度チェックの後、それらの質量を、オフラインMALDI質量分析により測定した。ピーク1は、3硫酸化ヘパリン二糖ΔU2S,HNS,6Sと同じ質量を有する。Sigmaから市販されるΔU2S,HNS,6Sは、同一のCE条件下でピーク1と同じ移動時間を有する。これにより、ピーク1がΔU2S,HNS,6Sと同定される。同様に、2~7に由来する7つのピークの正体を、UFHの消化物の組成分析において、確立した。この結果を図3Aおよび3B、6Aおよび6Bに示す。各ピークの正体を、それらの移動時間と、標準的な市販の二糖の移動時間とをマッチングすることによりさらに確認した。ピーク2、3、および4は、2硫酸化二糖であり、ピーク5、6、および7は、モノ硫酸化二糖である。ピーク2のわずかなCEおよびMALDI質量スペクトルを生成した。このピークは、ΔU2S,HNSと同じ質量を有する。また、Sigmaから市販されるΔU2S,HNSは、同一のCE条件下でピーク2と同じ移動時間を有する。このことにより、ピーク2がΔU2S,HNSであることが確認される。ピーク3のわずかなCEおよびMALDI質量スペクトルを生成した。これは、ΔU,HNS,6Sと同じ質量を有する。また、Sigmaから市販されるΔU,HNS,6Sは、同一のCE条件下でピーク3と同じ移動時間を有する。このことにより、ピーク3がΔU,HNS,6Sであることが確認される。ピーク5のわずかなCEを生成した。これは、ΔU,HNSと同じ質量を有する。また、Sigmaから市販されるΔU,HNSは、同一のCE条件下でピーク5と同じ移動時間を有する。このことにより、ピーク5がΔU,HNSであることが確認される。ピーク6のわずかなCEを生成した。これは、ΔU2S,HNACと同じ質量を有する。また、Sigmaから市販されるΔU2S,HNACは、同一のCE条件下でピーク6と同じ移動時間を有する。このことにより、ピーク6がΔU2S,HNACであることが確認される。ピーク7のわずかなCEを生成した。これは、ΔU,HNAC,6Sと同じ質量を有する。また、Sigmaから市販されるΔU,HNAC,6Sは、同一のCE条件下でピーク7と同じ移動時間を有する。このことにより、ピーク7は、ΔU,HNAC,6Sであることが確認される。7つの二糖に加えて、ヘパリナーゼI、IIおよびIIIでのヘパリンの徹底的な消化における1つの四糖ピーク8もまた同定された。この四糖を単離し、その質量を、MALDI質量分析により決定した。これは、CEにおいて四糖ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6Sこれは、以前、構造が決定された十糖ΔU2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAC,6SGHNS,3S,6Sの一部であったと同じ移動時間を有した。これにより、四糖ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6Sとしてピーク8の確認を導く。このピークは、ヘパリナーゼI、IIまたはIIIでのさらなる消化に耐性である。ピーク1~8に加えて、少量の硫酸化されていない二糖は、図11Bに示されるように、硫酸化糖よりもはるかにゆっくりと移動した。硫酸化されていない二糖は、表5下記に示されるように、UFHの2未満を構成すると予測される。図12は、AT-10五糖であるΔU2SHNS,6SΔU2SHNS,6SΔU2SHNS,6SIHNAC,6SGHNS,3S,6Sの徹底的な消化のCE追跡を示す。ヘパリンの徹底的な消化における四糖8は、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6Sと同じ質量および移動時間を有する。このことにより、ピーク8は、ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6Sと確認される。実施例4:二糖1~7のUV応答緒言二糖1-7の各々のUV応答係数RFを、徹底的な消化からの二糖の成分をさらに同定するために決定した。二糖についてのRFは、1ngのΔU2S,HNS,6Sと同じ応答を与える二糖の量ngと規定される。方法応答係数の決定:異なる二糖についてのRFを、二糖各々の57ngのUV応答を測定し、表5に示されるように、これを、ΔU2S,HNS,6SのUV応答と正規化することにより計算した。結果7つの二糖1~7の各々は、異なる程度のA232UV応答を有する。この四糖についてのA232UV吸光度の測定を可能にするには、四糖8ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6Sの量は不十分であった。四糖は、二糖より低いA232UV吸光度を有することが予測され、従って、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6Sが二糖、すなわち1ΔU2S,HNS,6Sの最小の応答と同じ応答を有すると想定されている。表5において、ピーク1~8についての応答係数RFを計算した。第2列は、1ng/nL濃度を57nLすなわち、57ngの市販の標準的二糖1~7注入した場合の232nMでのUV吸光度を与える。本発明者らは、十分な量でサンプルを利用することができなかったので、既知の濃度の8について232nMでUV吸光度を測定できなかった。8は、7つの二糖すなわち、1の最小の応答と同じ応答を有すると想定される。第3列は、7つのピークの各々についてのRFを与え、二糖についてのRFは、1ΔU2S,HNS,6Sの1ngと同じ応答を与えるngの分数として規定される。実施例5:ヘパリンにおける硫酸化されていない糖の決定緒言ヘパリンは硫酸化グリコサミノグリカンとして分類されているが、これは、微量の硫酸化されていない糖を含む。ヘパリンにおける硫酸化されていない糖の量を決定するための手順を行った。この決定の後に、ピーク1~8について計算したRFを用いて、CEにより測定されたAUCからヘパリンの硫酸化構成ブロックの重量を予測し得る。方法酵素カクテルを用いた徹底的消化に供した既知の重量のヘパリンを、CEに注入した。図11におけるピーク1~8について測定された曲線下の面積AUCを、ピーク1~8の既知の量についての応答を用いて、硫酸化糖の重量に変換した。CEに注入したヘパリン糖の総量と、硫酸化二糖および硫酸化四糖の総量との間の差異は、UFHの完全な消化における硫酸化されていない糖の量を与える。相対的AUCとRFとをかけて、ΔU2S,HNS,6Sに関して、較正された相対濃度またはピーク1~8の相対AUCを与える。結果表6は、ヘパリンにおける硫酸化されていない糖の予測を示す。表6に示されるように、硫酸化されていない糖は、ヘパリンの2未満を構成することが決定された。硫酸化されていない糖は、以下に説明されるように、ヘパリンの組成分析表を作成する際に考慮されない。表7の第1列は、ピーク1~8について測定されたAUCを与える。第2列は、相対AUCを与える。相対AUCとRFとをかけて、ΔU2S,HNS,6Sに関して、較正された相対濃度またはピーク1~8の相対AUCを与える。次いで、これらを正規化して、二糖ピーク1~7および四糖ピーク8の重量を得る。本明細書中で実証されるように、この組成分析表の作成は、CEにより分析されるヘパリン消化物の濃度または重量とは無関係である。表6は、ヘパリナーゼI、IIおよびIIIでのUFHの徹底的な消化における硫酸化されていない糖の量の予測を示す。ピーク1~7は、図2~6に説明されるように、既知の二糖として示される。ピーク8は、四糖ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6Sこれは、ヘパリナーゼI、IIまたはIIIのいずれかによるさらなる消化にも耐性であるである。第2列は、UFHの1ng/nL濃度の組成分析消化物を57nL注入した場合のピークの各々について測定された曲線下の面積AUCを与える。第3列は、1ng/nL濃度の7つの市販の標準的二糖1~7の各々を57nL注入した場合の232nMでのUV吸光度を与える。第4列は、種々の硫酸化糖の重量をngで与える。これらの合計55.9ngとヘパリン注入の量57×1=57ngとの間の差異は、UFHの組成分析消化物に存在する硫酸化されていない糖の量を与える。実施例6:機器の確認および消化の完全性緒言機器の再現性を確認し、組成分析消化物が、使用される酵素濃度の下で実際に完全であるか否かを確認するために、UHFのサンプルを、二連で消化し、CDにより2回分析した。次いで、結果を比較して、実行の間に変動性があるか否かを決定した。方法UHFを実施例1Aの方法に記載のように、1μlまたは5μlのいずれかの酵素カクテルECで消化した。各サンプルを、二連で消化し、各消化物をCEにより2回分析した。結果同じサンプルの2連の分析の比較UFH1/1とUFH1/2、UFH2/1とUFH2/2、およびUFH3/2とUFH3/2により、良好な機器の再現性が示された。UFH1/1もしくはUFH1/2と、UFH2/1もしくはUFH2/2とのいずれかの比較により、最小限の実行間の変動性しかないことが示される。1μlのECで消化したUFHと、5μlのECで消化したUFHとを比較すると、漸増酵素量が、容易に認知できるほどには、二糖プロフィールを変化しないことが示される。このことにより、図11に示されるように、徹底的な消化が、1μlのECを用いることにより達成されることが確認される。図11および表7に概説されるプロトコルにより、CEによって行われたLMWHの組成分析を用いて、LMWHの異なるバッチを厳密に比較し得る。表7は、UFHについての組成分析の値を示す。曲線下の面積AUCは、図11に示される酵素カクテルで消化したUFHのCEスペクトルから各ピークについて測定した。表6に示される各糖について計算された応答係数を用いて、酵素消化物におけるそれらの較正相対濃度を計算した。最後の列は、UFHの構成ブロックの各々の重量パーセントを与える。硫酸化されていない糖これは、UFHの2未満を構成するは、この組成分析表を作成する際には考慮に入れない。本明細書中で実証されるように、この方法により示される組成分析表の作成は、CEにより分析したヘパリン消化物の濃度または重量とは無関係である。実施例7:ヘパリンのAT-III媒介性抗Xa因子抗凝固作用の有効性の決定:IHNAC,6SGHNS,3S,6Sと抗Xa活性との間の相関関係緒言ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S四糖のCAMによる定量は、ヘパリンのAT-III媒介性抗Xa因子抗凝固作用の有効性を予測する際にさらなる役割を有する。ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6Sは、AT-III結合五糖の一部である。ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6Sの定量は、ヘパリンに存在するAT-III結合五糖の量を決定する尺度である。従って、これは、ヘパリンのAT-III結合五糖ドメインに依存する、ヘパリンの抗Xa因子媒介性抗凝固の直接的な測定に役立つ。方法UFHをP10サイズ排除カラムによりサイズ分画した。組成分析を、得られた画分に対して行って、ΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S含有量を予測した。これらの画分をまた、それらの抗Xa因子活性についてアッセイした。結果それらのΔUHNAC,6SGHNS,3S,6Sの関数としての異なる画分の抗Xa因子活性のプロットは、図11に示されるように、直線を生じるr=0.91。このことは、ヘパリンの抗Xa因子媒介性抗凝固作用が、それらのΔUHNAC,6SGHNS,3S,6S含有量から直接測定され得ることを示す。データはまた、表8に示される。表8は、図11に概説されるプロトコルによりCEによって行われたUFHの組成分析を示し、表7は、LMWHの異なるバッチを厳密に比較するために用いられ得る。UFHを、1μlまたは5μlのいずれかの酵素カクテルECで消化した。各サンプルを、二連で消化し、各消化物をCEにより二連で分析した。全てのサンプルにおいて、糖ピーク1~8は、同じ移動時間を有した。同じサンプルの2連の分析の比較UFH1/1とUFH1/2、UFH2/1とUFH2/2、およびUFH3/1とUFH3/2により、良好な機器再現性が示される。UFH1/1もしくはUFH1/2と、UFH2/1もしくはUFH2/2とのいずれかの比較により、最小限の実行間の変動性しかないことが示される。1μlのECで消化したUFHと、5μlのECで消化したUFHとを比較すると、漸増酵素量により、容易に認知できるほどには、二糖プロフィールは変化しないことが示される。このことにより、図11に示されるように、徹底的な消化が、1μlのECを用いることにより達成されることが示される。実施例8:LMWH画分の生成および生物学的活性の特徴づけ方法LMWH画分MS57-1~MS57-4およびMS59-1~MS59-4を、200μgのヘパリナーゼIIIで上記のようにUFHを処理し、得られた生成物をP10カラムを通すことにより調製した。LMWH画分MS56-1~MS56-4を、1000μgのヘパリナーゼIIIでUFHを処理し、得られた生成物をP10カラムに通すことにより調製した。LMWH画分MS60-1~MS60-3、およびMS55-1~MS55-4を、200μgのヘパリナーゼIIIで画分2を処理し、得られた生成物をP10カラムに通すことにより生成した。LMWH画分MS66-1およびMS66-2を、1000μgのヘパリナーゼIIIで画分2を処理し、得られた生成物をP10カラムに通すことにより調製した。画分1は、上記のVolpi参考文献に記載されるように、室温で酢酸バリウムでUFHを処理する際に沈殿した高分子量ヘパリンである。画分2は、4°Cで酢酸バリウムで処理したヘパリンを保持する際に沈殿した低分子量の第2の画分である。これは、本発明の方法に従って用いられる画分である。MS55-2の皮下吸収プロフィールおよびインビボ吸収プロフィールを測定した。MS55-2の吸収プロフィールを、市販のLMWHArdeparin、およびEnoxaparinの吸収プロフィールと比較した。種々のヘパリン種の抗Xa活性もまた、それらのインビトロ生物学的活性についてアッセイした。結果表9は、本発明に従って調製したLMWH調製物およびコントロール画分1の組成分析および機能分析を提供する。この表は、種々の画分の分子量、インビトロ活性、および組成を列挙する。MS55-2は、匹敵する吸収相および排除相、ならびにTmaxにおいて明らかなように、enoxaparinと非常に類似の薬物動態を示した。バイオアベイラビリティーおよびピーク濃度は、皮下注射により試験された3つのLMWH全ての中で比較可能であった。IV経路により投与された場合、最初の抗Xa活性は、Aredeparinと比較して、MS55-2についてはるかに大きい。再び、2つのLMWH間のバイオアベイラビリティーは、ほとんど同一であった。ardeparinおよびMS55-2はともに、抗Xa活性において指数関数的な減少を示し、従って、第1次薬物動態の後に排除が続く。MS55-2の抗Xa活性は、205IU/mgであることが観察された。これは、現在米国で利用可能なEnoxaparin135IU/mg、Ardeparin93IU/mgのようなLMWHより高い。この結果をまた、図13に示す。前述の示された明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするに十分であると考えられる。本発明は、提供された実施例により範囲が限定されるのではない。なぜなら、実施例は、単に本発明の1局面の例示として意図されるに過ぎず、他の機能的に等価な実施形態が本発明の範囲内にあるからである。本明細書中で示され、記載されたものに加えて、本発明の種々の改変が、前述の詳細な説明から当業者に明らかになり、これらの改変は、添付の特許請求の範囲内に入る。"