"重複を目的とするアスペルギルス属に属する菌の染色体上のターゲット領域の5’末端又は3’末端のいずれか一方の末端の外側に、コード領域の5’末端又は3’末端のいずれかの一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれ、該ターゲット領域の他方の末端の外側に他方の末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれて成り、該ターゲット領域が、夫々、コード領域の5’又は3’末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子によって挟み込まれ、且つ、組み込まれた形質転換マーカー遺伝子の欠損部分に接する配列が該ターゲット領域とは反対側に位置していることを特徴とする、形質転換体。コード領域の5’又は3’末端の一部が欠損した2つの形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分が約100bp~約2kbの塩基を有する、請求項1記載の形質転換体。形質転換マーカー遺伝子が、pyrG、sC及びniaDから成る群から選択される、請求項1又は2記載の形質転換体。形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め制限酵素認識部位が導入されている請求項1ないし3のいずれか一項に記載の形質転換体。制限酵素がIsceI、IceuI、PIpspI及びPIsceIから成る群から選択される、請求項4記載の形質転換体。制限酵素認識部位が相同組換えによって導入されたものである、請求項4又は5に記載の形質転換体。アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルスソーヤ又はアスペルギルスオリゼである請求項1ないし6のいずれかに記載の形質転換体。アスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複させる方法であって、1請求項1ないし7のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、2ターゲット領域の5’末端及び3’末端の外側に組み込まれた形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体の対応する染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複された菌株を得、3上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る、前記方法。形質転換体が多核の状態にあることを特徴とする、請求項8記載の方法。形質転換体をプロトプラストの状態で保持した後、培養することを特徴とする、請求項8又は9記載の方法。制限酵素の作用下に形質転換体を培養して相同組換えを生起させる、請求項8ないし10のいずれか一項に記載の方法。プロトプラストの状態にした形質転換体と制限酵素を融合補助剤の存在下で混合することによって制限酵素を該形質転換体に作用させる、請求項11記載の方法。請求項8~12のいずれか一項に記載の方法で得られた、染色体上に重複領域を有するアスペルギルス属に属する菌。アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルスソーヤ又はアスペルギルスオリゼである請求項13記載の形質転換体。重複領域が数十~数百kbである、請求項13又は14記載のアスペルギルス属に属する菌。請求項13ないし15のいずれか一項に記載のアスペルギルス属に属する菌を用いて製造される醤油。本発明は上記の問題点を解決し、麹菌の染色体上の任意の大領域を広範囲に渡って重複させる技術を提供し、従来は取得不能であった新たな形質を持つ麹菌の取得を安定的計画的に可能にすることを目的とする。本発明者は、アスペルギルス属に属する菌において、pyrG遺伝子等の形質転換マーカー選択マーカー遺伝子の配列を染色体中の任意の領域を挟むように該領域の5’及び3’末端の外側に配する形質転換体を作製することによって、該遺伝子の内部の相同領域で発生した二重鎖切断後の修復機能を介した相同組換えによって染色体の重複が起き、そのような株を該形質転換マーカーに基づき選抜することによって、狙った染色体大領域で重複が起きた株を作製することが出来ることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は以下の各態様に係る。[態様1]重複を目的とするアスペルギルス属に属する菌の染色体上のターゲット領域の5’末端又は3’末端のいずれか一方の末端の外側に、コード領域の5’末端又は3’末端のいずれかの一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれ、該ターゲット領域の他方の末端の外側に他方の末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれて成り、該ターゲット領域が、夫々、コード領域の5’又は3’末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子によって挟み込まれ、且つ、組み込まれた形質転換マーカー遺伝子の欠損部分に接する配列が該ターゲット領域とは反対側に位置していることを特徴とする、形質転換体。[態様2]コード領域の5’又は3’末端の一部が欠損した2つの形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分が約100bp~約2kbの塩基を有する、態様1記載の形質転換体。[態様3]形質転換マーカー遺伝子が、pyrG、sC及びniaDから成る群から選択される、態様1又は2記載の形質転換体。[態様4]形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め制限酵素認識部位が導入されている態様1ないし3のいずれか一項に記載の形質転換体。[態様5]制限酵素がIsceI、IceuI、PIpspI及びPIsceIから成る群から選択される、態様4記載の形質転換体。[態様6]制限酵素認識部位が相同組換えによって導入されたものである、態様4又は5に記載の形質転換体。[態様7]アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルスソーヤ又はアスペルギルスオリゼである態様1ないし6のいずれかに記載の形質転換体。[態様8]アスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複させる方法であって、1態様1ないし7のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、2ターゲット領域の5’末端及び3’末端の外側に組み込まれた形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体の対応する染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複された菌株を得、3上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る、前記方法。[態様9]形質転換体が多核の状態にあることを特徴とする、請求項8記載の方法。[態様10]形質転換体をプロトプラストの状態で保持した後、培養することを特徴とする、態様8又は9記載の方法。[態様11]制限酵素の作用下に形質転換体を培養して相同組換えを生起させる、態様8ないし10のいずれか一項に記載の方法。[態様12]プロトプラストの状態にした形質転換体と制限酵素を融合補助剤の存在下で混合することによって制限酵素を該形質転換体に作用させる、態様11記載の方法。[態様13]態様8~12のいずれか一項に記載の方法で得られた、染色体上に重複領域を有するアスペルギルス属に属する菌。[態様14]アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルスソーヤ又はアスペルギルスオリゼである態様13記載の形質転換体。[態様15]重複領域が数十~数百kbである、態様13又は14記載のアスペルギルス属に属する菌。[態様16]態様13ないし15のいずれか一項に記載のアスペルギルス属に属する菌を用いて製造される醤油。本発明によって、麹菌の染色体上において数十~数百kb例えば、約200kb~約500kbに及ぶ任意の大きな領域の重複を起こさせることが可能となった。このような技術は従来存在しなかった。また本発明は宿主に内在性の遺伝子しか使用しておらず、作出した重複株中にも外来遺伝子が残らないセルフクローニング株であることから、醤油の醸造等、食品製造に使用する微生物例えば、醤油麹の育種法としても極めて優れた方法である。更に、発明方法によって製造された染色体領域の重複を有する麹菌株においては、タンデムに並ぶ相同配列間の組換えにより染色体重複が脱落した場合、pyrG等の形質転換マーカー遺伝子が一緒に脱落して特定の栄養要求例えば、ウリジン要求性となり、その結果、通常の培地では生育不可能であるため、選択圧がかかり、染色体重複の脱落を回避することが可能である。このように、本発明方法は復帰変異が起こらない染色体重複株の作製方法としても有用で優れた方法である。本発明の形質転換体の親株として使用するアスペルギルス属に属する菌に属する菌株としては、アスペルギルスソーヤ、アスペルギルスオリゼ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスアワモリ等の任意の菌株が挙げられるが、そのうちアスペルギルスソーヤ及びアスペルギルスオリゼに属する菌株が好ましい。このような菌株としては、例えば、アスペルギルスソーヤ262FERMP-2188、アスペルギルスソーヤ2165FERMP-7280、アスペルギルスソーヤATCC42251、アスペルギルスオリゼIAM2638、及びアスペルギルスオリゼRIB40NBRC100959等の公的寄託機関で保存されており当業者には容易に入手可能であるような各菌株等を挙げることができる。外来DNAの染色体への組込みは染色体DNAの二重鎖切断時の修復機構を介して行われることが知られており、このDNA修復機構には相同組換えと非相同組換え非相同末端結合の2種類の機構が存在する。相同組換えの場合には外来DNAと相同性のある領域を介して組込みが起こるが、非相同組換えの場合には外来DNAの配列には関係なく染色体上のランダムな位置への組込みが起こり、これら2つの組換え機構は平衡して作用していると考えられているRisticetalNuclAcidsRes3152295237。相同組換え機構の中心をなす遺伝子はrad52グループと呼ばれる一連の遺伝子でその中にrad50、51、52、54、Mre11、XRS2等が含まれるKooistraetal2004。相同組換え機構はバクテリアから真核生物まで多くの生物種で存在が確認され、Aspergillus属の実験室株であり単核分生子を持つAspergillusnidulansにおいてもuvsC遺伝子がクローニングされ研究が進められており25465464、発現頻度を一定レベル上昇させることで相同組換頻度が向上することが報告されているNatsumeetalBiosciBiotechnolBiochem6816491656。一方で、非相同組換え機構は相同組換えとは全く異なる非相同末端結合NonHomologousEndJoiningによることがに明らかとなっており、この機構の中心になる遺伝子としてはKu70、Ku80、Xrcc4、LIG4、DNAPKcsなどが知られている。Ku70およびKu80はヘテロダイマーとして機能し、ヌクレオチドキナーゼおよびDNALigaseVIとともに複合体を形成して、DNA二重鎖切断DSB時にその修復のためにDNA末端に結合してNonHomologousEndJoiningを促進することが知られている。WalkeretalNature412607614。このKuを介した非相同組換え機構に関しては真核生物でのみ存在が確認されている。本発明の形質転換体を使用して、アスペルギルス属に属する菌の染色体上において数十~数百kbに及ぶ任意の大きな領域を重複させることが可能である。即ち、本発明の形質転換体は、重複を目的とする麹菌染色体上のターゲット領域の5’末端又は3’末端のいずれか一方の末端の外側に、コード領域の5’末端又は3’末端のいずれか一方の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれ、該ターゲット領域の他方の末端の外側に他方の末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれて成り、該ターゲット領域が、夫々、コード領域の5’又は3’末端の一部が欠損した2つの形質転換マーカー遺伝子によって挟み込まれ、且つ、組み込まれた形質転換マーカー遺伝子の欠損部分に接する配列欠損部分を有する各末端領域配列が該ターゲット領域とは反対側に位置していることを特徴とする。即ち、重複を目的とするアスペルギルス属に属する菌の染色体上のターゲット領域の5’末端の外側にコード領域の5’末端の一部適当な長さの塩基配列から成る5’末端領域が欠損した形質転換マーカー遺伝子を組み込み、一方、ターゲット領域の3’末端の一部適当な長さの塩基配列から成る3’末端領域の外側にコード領域の3’末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子を組み込むことが出来る。或いは、重複を目的とするアスペルギルス属に属する菌の染色体上のターゲット領域の5’末端の外側にコード領域の3’末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子を組み込み、一方、ターゲット領域の3’末端の外側にコード領域の5’末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子を組み込んでもよい。いずれの場合でも、重複の対象となるターゲット領域を挟み込んでいる、夫々、コード領域の5’又は3’末端の一部が欠損した2つの形質転換マーカー遺伝子において、欠損した部分に接する配列が該ターゲット領域とは反対側に位置していることが必要である。このような構造上の特徴を有する形質転換体を培養することによって、対応する染色体の間で、夫々、ターゲット領域の5’末端又は3’末端の外側に組み込まれた形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域図1,図2及び図10中で斜線で示した部分間における二重鎖切断時の修復機構を介する相同組換えが生起し、その結果、該ターゲット領域が重複された菌株が得られる。ここで、対応する染色体とは、実施例で示されるように、形質転換体の多核に含まれる相同染色体、例えば、各菌において有用物質例えば、各種酵素類をコードする遺伝子が多数含まれている、複数の8番及び第2番等の染色体を意味する。従って、本発明で使用するアスペルギルス属に属する菌としては、上記のような非相同組換え機構に関与する各種遺伝子が抑制又は欠失している形質転換菌特開2006-158269号公報を使用することもできる。又、該形質転換体における該ターゲット領域の5’及び3’末端の外側に組み込まれる形質転換マーカー遺伝子は、相同組換えを効率よく生起するのに十分な長さ、例えば、数百bp以上、数百bp~数kb程度例えば、約100bp~約2kbの塩基配列がコード領域の中間部分に残るように、そのコード領域の5’末端又は3’末端の一部が欠損していることが好ましい。即ち、重複を目的とするアスペルギルス属に属する菌の染色体のターゲット領域の5’及び3’末端の外側に組み込まれた、コード領域の5’末端又は3’末端の一部が欠損している2つの形質転換マーカー遺伝子のいずれにおいても、元の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に存在する上記の長さの塩基配列が共通して残っていることが好ましい。従って、形質転換マーカー遺伝子のコード領域において欠損させる5’末端又は3’末端領域の塩基配列の長さは、使用する形質転換マーカー遺伝子の種類及び全長等に応じて、当業者が適宜決めることが出来る。例えば、pyrG遺伝子を使用する場合には、通常、例えば、約0.4kb~約1.4kbである。又、欠損させる5’末端又は3’末端領域の塩基配列の長さは同じである必要はない。本発明の形質転換体を培養した場合に、上記の相同組換えによって該ターゲット領域が重複された菌株においては同時に形質転換マーカー遺伝子コード領域の完全長が構築される結果、形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を該ターゲット領域が重複されていない即ち、形質転換マーカー遺伝子コード領域の完全長が構築されていない菌株から選択すること出来る。本発明で使用するこのような形質転換マーカーに特に制限はないが、ポジティブ選択可能なマーカー遺伝子の代表例として、pyrG、sC及びniaD等を挙げることが出来、これらマーカー遺伝子を使用した際には、夫々の栄養要求性ウリジン要求、イオウ資化、及び、硝酸資化を補償する形質によって該ターゲット領域が重複された菌株を選択することが可能となる。尚、これらのマーカー遺伝子は、選択用の薬剤を含む培地で培養することによって、該マーカー遺伝子を含有する菌はそこに含まれている該マーカー遺伝子の発現産物によって選択用の薬剤が細胞毒性物質に変換され細胞死に至らしめることによって、ネガティブ選択にも使用することが出来る。更に、重複を目的とする染色体上のターゲット領域の5’及び3’末端の外側に組み込む形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め、IsceI、IceuI、PIpspI及びPIsceI等の当業者に公知の適当な制限酵素認識部位を導入しておくことが出来る。このような制限酵素部位は、相同組換え等の当業者に公知の任意の手段によって導入することが出来る。従って、本発明は、上記の形質転換体を使用してアスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複させる方法にも係る。この方法の概略は図1に示したとおりである。即ち、本発明方法は、1上記の特徴を有する本発明の形質転換体を培養し、2ターゲット領域の5’末端及び3’末端の外側に組み込まれた形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体の対応する染色体の間での相同組換えによって該ターゲット領域が重複された菌株を得、3上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る。本発明方法は、本発明の形質転換体を通常の条件で培養することによって、形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間において二重鎖の切断が適当な頻度で生じた時に働く修復機構を介した相同組換えを利用するものである。本発明方法において、形質転換体を当業者に公知の任意の方法で一度プロトプラストの状態にして適当な条件下で一定時間例えば、数十分間~1時間程度保持し、その後、培養することによって相同組換えの効率を高めることが出来る。尚、アスペルギルスソーヤ及びアスペルギルスオリゼ等の麹菌は分生子の状態も含めてその生活環において常に多核の状態を保っているので、対応する染色体の間で上記の相同組換えが容易に起こると考えられる。一方、アスペルギルス属のその他の菌、例えば、Aspergillusnidulansnigerfumigatusawamori等は単核の世代を持つが、それらの菌であっても菌糸からであれば多核状態のプロトプラストを容易に得ることができる。更に、コード領域の中間部分に存在する相同配列領域に、予め、IsceI、IceuI、PIpspI及びPIsceI等の当業者に公知の適当な制限酵素認識部位が導入された形質転換マーカー遺伝子を使用する場合には、該制限酵素の作用下に形質転換体を培養して相同組換えを生起させることが出来る。具体的には、例えば、プロトプラストの状態にした形質転換体と制限酵素を融合補助剤例えば、PEG等の存在下で混合することプロトプラストPEG法によって、制限酵素を該形質転換体に効率よく作用させることが可能である。尚、本発明の形質転換体は、本願明細書の実施例に記載されているような当業者の公知の手段を用いて作製することが出来る。又、形質転換体の培養は当業者に公知の適当な条件で実施することが出来る。更に、本発明は、以上の方法で得られた、染色体上に、例えば、数十~数百kb例えば、約200kb~約500kbの重複領域を有する麹菌にも係るものである。重複の対象となるターゲット領域は任意に選択することができるので、有用な酵素類をコードする公知の各種領域をターゲット領域とすることによって、醤油の醸造等、食品製造に有用な麹菌例えば、醤油麹を得ることが出来る。従って、本発明は、このような該麹菌を用いて製造される醤油等の食品にも係るものである。以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。実験方法使用菌株AspergillusoryzaeRP1株ΔpyrG。AspergillusoryzaeRP1株はRIB40由来のpyrGdeletion株TakahashietalBiosciBiotechnolBiochem70135143。使用培地ポリペプトンデキストリンPD培地polypepton1dextrin2KH2PO405NaNO301MgSO4005casaminoacid01pH60、CzapekDox最小培地、再生培地として12MソルビトールCZを使用した。15mgml5fluoroorticacid5FOAおよび20mMウリジンを含むCZ培地プレートをpyrGウリジン要求株のポジティブセレクション用の培地として使用した。形質転換150ml容三角フラスコ中の20mMUridineを含むポリペプトンデキストリン液体培地50mlに分生子を接種し、30°Cで約20時間振とう培養を行い、菌体を回収した。回収した菌体を07MKClbufferで洗浄し、1Lysingenzymeを含む07MKClbuffer中で30°C、3時間緩やかに振とうし、プロトプラストを調製した。得られたプロトプラストを12Mソルビトールbufferで洗浄した後、プロトプラストPEG法により形質転換を行った。形質転換体の再生は05agarを含む12MソルビトールCZ培地上で行った。サザンハイブリダイゼーションサザンハイブリダイゼーションはHybondNのメンブレンフィルターアマシャムファルマシア社を使用し、一般的な方法により行った。検出にはDIGLuminescentDetectionKitロシュ社を使用し、メーカーの推奨する方法で行った。H160、TDAおよびTDBの各プローブの作製はそれぞれH160iUとH160iL、TDAUとTDALおよびTDBUとTDBLのプライマーを用い表1、PCRDIGProbeSynthesisKitロシュ社によって行った。ISceIを用いた染色体重複株の作製染色体重複株の作製は、以下の通りに行った。約2X107100μl量のプロトプラスト溶液に対し、20μlのPEG溶液を加えた後、50Uまたは0UのISceIを加え、氷中に40分保持した後、70μlのPEG溶液を加え、さらに室温で20分保持した後、12MソルビトールCZ培地プレート上で再生させた。CZ培地上で生育の見られた株を染色体重複候補株として以後の解析に使用した。定量PCRリアルタイムPCRを用いた染色体中の遺伝子コピー数の比較定量PCRはMx3000Pストラタジーン社を用いて行った。他の染色体に位置するrad52をノーマライザーとして相対定量法により、H19、H74、H99、H158の各遺伝子のコピー数を親株であるF5株と染色体重複株との間で比較した。PCRの条件は95°Cで10分保持した後、95°C20秒-58°C30秒-72°C30秒を45サイクル繰り返した。PCRにはRad52、H19、H74、H99、H158の各遺伝子の増幅にはそれぞれr52Ur52L、H19UH19L、H74UH74L、H99UH99L、H158UH158Lの各プライマーを使用した表1。形質転換体の作製染色体の重複は染色体の二重鎖切断修復の過程で生じると考えられているが、そのメカニズムは判っていない。しかし酵母においてガンマ線照射によって取得された変異株の染色体を解析すると染色体の重複が起きた領域の境界付近に繰り返し配列が存在することが報告された非特許文献1ことから、相同領域を持つ5’ΔpyrGおよび3’ΔpyrGで重複ターゲット領域を挟んだコンストラクトを作製し、相同配列内部で二重鎖切断を引き起こすことにより、染色体の重複を作製出来るのではないかと考えられる図1。そこで、まず、5’ΔpyrGおよび3’ΔpyrGを作製するために、図2に示すような基本ユニットを作製した。5’ΔpyrGあるいは3’ΔpyrGユニットの作製はPCRとライゲーションを用いて行った。pyrGユニットの作製は、当業者に公知の方法を用いて、pyrG全長の転写開始点付近あるいはコード領域の3’側付近に図2中で斜線で示す相同配列適当な制限酵素認識部位を含んでいても良いを組込むことにより行った。各ベクターが染色体上に組込まれた後5FOA耐性株を選択ネガティブ選択することにより、それぞれ相同領域での組換えにより内部が切り出された5’ΔpyrGあるいは3’ΔpyrG株が得られた。次に5’ΔpyrGおよび3’ΔpyrGそれぞれのユニットを染色体上のターゲットとする領域に組込むためのベクターを構築した。標的とする領域はAoryzaeの8番染色体中のSC103領域のAO090103000072~AO090103000160の各遺伝子の領域に対応する部分を含む210kbの領域である図3。本明細書内では以後簡略化のため、各遺伝子名のAO090103000部分を省略し、Hで表現する例:AO090103000160→H160。SC103領域と対応する各遺伝子の配列は独立行政法人製品評価技術基盤機構NITEのゲノム解析データベースであるDOGANDatabaseOftheGenomesAnalyzedatNITEに基づいている。httpwwwbionitegojpdoganGeneMapGENOMEIDaoG2。染色体上のH72の領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpH725’ΔとH160の領域に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpH1603’Δの構築を、以下の通り行った。H72およびH160の領域は、上述のとおりAoryzaeの8番染色体中のAO090103000072およびAO090103000160のORF領域に対応している。まずプライマーH72UとH72LおよびH160UとH160Lを用いてAoryzaeのゲノムDNAよりPCRによりH72およびH160それぞれを含む約3kbの領域を増幅し、ベクターにクローニングした。プライマーH72iUおよびH72iLを用いて増幅したH72を含むベクターを、プライマーpyrUおよびpyrLを用いて増幅後、リン酸化処理した5’ΔpyrGユニットとライゲーションし、染色体上のH72の領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpH725’Δを構築した。続いてプライマーH160iUおよびH160iLを用いて増幅したH160を含むベクターを、プライマーpyrUおよびpyrLを用いて増幅後、リン酸化処理した3’ΔpyrGユニットとライゲーションし、H160の領域に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpH1603’Δを構築した。まずH72の領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpH725’Δを用いてAoryzaeのΔpyrG株に対して形質転換を行った。得られた形質転換体11株をPCRおよびサザンハイブリダイゼーションにより調べた。結果、1株で目的部位にベクターが組込まれていることが確認された。次にこの株から分生子を採取し、約1×105を5FOAを含むCZ培地プレート上へ塗布し、得られた5FOA耐性株を解析したところ、H72部位に5’ΔpyrGのコンストラクトを持つことが確認された。このH72部位に5’ΔpyrGのコンストラクトを持つΔpyrG株ku70株を親株として、H160部位210kb領域重複用に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpH1603’Δで形質転換を行った。H160部位にベクターが組込まれた株をPCRおよびサザンハイブリダイゼーションを用いて選抜して分生子を回収し、5FOA-CZプレート上で耐性を示すコロニーを選択した結果、重複ターゲット領域中210kb領域の最もセントロメア側であるH72部位に5’ΔpyrGが組込まれ、最もテロメア側であるH160部位に3’ΔpyrGが組込まれた株F5株の構築が確認された。こうして8番染色体中の210kbの領域を重複させるための基本的なコンストラクトを持った株F5株の構築に成功した。尚、形質転換体の第8番染色体に組み込まれた一部欠損した2つの形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分は約500bpであった。染色体重複株の作製次に、この株F5株を用いて染色体の重複実験を行った。実験はISceI使用量0Uおよび50Uの条件で行った。その結果、各プレートからそれぞれ1個づつのpyrGのコロニーが得られた。続いて、得られたpyrGの2株0C株、50B株から染色体DNAを抽出し、PCRおよびサザンハイブリダイゼーションおよび定量PCRリアルタイムPCRにより、染色体が重複しているかどうかの確認を試みた。まず、PCRの結果を図4に示す。重複領域の両端であるH72あるいはH160を増やすためのプライマーH72UとH72LあるいはH160UとH160Lを用いた場合には、コントロール、重複株ともに48kbおよび39kbのバンドが増幅するのに対し、H160UH72Lの組合わせでPCRを行った場合にはコントロールや親株では全くバンドの増幅が見られないが、染色体重複株0C株、50B株では、はっきりと44kbのバンドの増幅が見られた。これは染色体の領域が重複している場合にのみ得られるバンドであると考えられるため、染色体重複株0C株、50B株では8番染色体上のこの領域H72~H160の210kbが重複していることが示唆された。次に、サザンハイブリダイゼーションを行った結果を図5~7に示す。まず重複領域の末端に位置するH160をプローブとし、BglIIで消化したゲノムDNAを使用して実験を行った。図5の上部は親株および染色体重複株中での8番染色体上の重複ターゲット領域の制限酵素地図およびプローブの位置を示している。H160プローブを用いた場合、親株では56kbと16kbの2つのバンドのみが出るのに対し、8番染色体上での染色体の重複が狙った通りに起こった場合、完全型のpyrGを含む138kbの新しいバンドが出現すると考えられる。図5によれば、コントロールおよび親株レーン1~3では2つのバンドのみであるのに対し、染色体重複の2株レーン4、5では新たに138kbの位置にバンドが出現していることが判る。このことから染色体重複株では狙った通りに染色体の重複が起きているものと考えられる。続いて、同一のメンブレンを用いてやはり重複領域の末端であるH72付近に位置するTDBをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った図6。コントロールおよび親株レーン1~3では66kbのバンドのみが見られるのに対し、染色体重複の2株レーン4、5では新たに138kbのバンドが出現していることからやはり染色体の重複がおきていることを示すデータが得られた。それに対し、重複領域外に位置するTDAをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った場合図7、コントロール、親株、染色体重複株のいずれにおいても66kbのバンドのみが見られ、変化はなかった。続いて定量PCRを用いて8番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数をコントロール株および染色体重複株で比較した図8。実験では他の染色体に存在し、コピー数が1であるrad52をノーマライザーとして使用し、重複領域内のセントロメア側の端に位置するH74遺伝子タンナーゼとそこから60kb離れた位置に存在するH99遺伝子およびテロメア側の端に位置するH158遺伝子、そして重複領域外に位置するH19遺伝子をターゲットとして、SYBRGreenを用いた相対的定量法により、親株におけるコピー数との比較を行った。その結果、コントロール株F5株およびCT株では、H19遺伝子、H74遺伝子、H99遺伝子、H158遺伝子ともに1倍程度の値を示していることから、それぞれコピー数が1であると考えられるのに対し、染色体重複株0C株および50B株では重複領域外に位置するH19の値は1程度であるが、重複領域内に位置するH74遺伝子、H99遺伝子、H158遺伝子はいずれも2倍以上の値を示しており、コピー数が2に増幅していることが確認された。以上、PCR、サザンハイブリダイゼーション、定量PCRの結果から、上記の染色体重複株0C株、50B株では確かに狙った領域である8番染色体の210kbの領域が重複していることが確認された。次に、麹菌2番染色体重複株の作製を行った。尚、以下の実験方法に記載されていない事項使用菌株、使用培地、形質転換、染色体重複株の作製、等に関しては、実施例1と同様に実施した。実験方法定量PCRリアルタイムPCRを用いた染色体中の遺伝子コピー数の比較定量PCRはMx3005Pアジレントテクノロジー社を用いて行った。他の染色体に位置するrad52をノーマライザーとして相対定量法により、2番染色体上のAlp、amyR、prtT、1258Dの各遺伝子のコピー数を親株と染色体重複株との間で比較した。PCRの条件は95°Cで10分保持した後、95°C20秒-58°C30秒-72°C30秒を45サイクル繰り返した。PCRにはRad52、Alp、amyR、prtT、1258Dの各遺伝子の増幅にはそれぞれr52Ur52L、amyRUamyRL、AlpUAlpL、prtTUprtTL、1258DU1258DLの各プライマーを使用した表2。ふすま麹の作製法麹菌の酵素活性評価は定法に従って行なった。すなわち、80散水した小麦ふすま5gを150ml容三角フラスコに入れ、121°C、50分滅菌した後、麹菌を2白金耳程度接種し30°C、4日間培養する。培養後、滅菌水100mlを入れ、ゴム栓をして十分に振とうし、4時間室温にて静置した後、No2の濾紙アドバンテック社製で濾過して得られた抽出液を酵素サンプルとした。プロテアーゼ活性の測定法得られた酵素サンプルを適宜希釈し、しょうゆ試験法財団法人日本醤油研究所昭和60年、287ページに記載の方法に従って測定した。プロテアーゼ活性は、ふすま麹1g当り1分間に1μモルのチロシンを生成する活性を1Uユニットまたは単位として示した。αアミラーゼ活性の測定法得られた酵素サンプルを適宜希釈し、αアミラーゼ測定キットキッコーマン醸造分析キット、コード60213を用い、キットのプロトコルに従って測定を行なった。αアミラーゼ活性は、ふすま麹1g当り1分間に1μモルの2クロロ4ニトロフェノールを遊離する力価を1Uユニットまたは単位として示した。形質転換体の作製次に5’ΔpyrGおよび3’ΔpyrGそれぞれのユニットを染色体上のターゲットとする領域に組込むためのベクターを構築した。標的とする領域はAoryzaeの2番染色体中のSC003領域のAO090003001036~AO090003001212の各遺伝子の領域に対応する部分を含む499kbの領域である図9、斜線部。本明細書内では以後簡略化のため、各遺伝子名のAO090003000部分を省略し、Bで表現する例:AO090003000160→B160。SC003領域と対応する各遺伝子の配列は独立行政法人製品評価技術基盤機構NITEのゲノム解析データベースであるDOGANDatabaseOftheGenomesAnalyzedatNITEに基づいている。httpwwwbionitegojpdoganGeneMapGENOMEIDaoG2。染色体上のB1035およびB1036の中間領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpB1035C5’ΔとB1212およびB1214の中間領域に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpB1213C3’Δの構築を、以下の通り行った。B1035、B1036、B1212およびB1214の領域は、上述のとおりAoryzaeの2番染色体中のAO090003001035、AO090003001036、AO090003001212、およびAO090003001214のORF領域に対応している。まずプライマーB1035CUとB1035CLおよびB1213CUとB1213CLを用いてAoryzaeのゲノムDNAよりPCRによりB1035とB1036の中間領域およびB1212とB1214の中間領域を含む約3kbの領域を増幅し、ベクターにクローニングした。プライマーB1035iUおよびB1035iLを用いて増幅したB1035とB1036の中間領域を含むベクターを、プライマーpyrUおよびpyrLを用いて増幅後、リン酸化処理した5’ΔpyrGユニットとライゲーションし、染色体上のB1035とB1036の中間領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpB1035C5’Δを構築した。続いてプライマーB1213iUおよびB1213iLを用いて増幅したB1212とB1214の中間領域を含むベクターを、プライマーpyrUおよびpyrLを用いて増幅後、リン酸化処理した3’ΔpyrGユニットとライゲーションし、B1212とB1214の中間領域に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpB1213C3’Δを構築した。まずB1035とB1036の中間領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpB1035C5’Δを用いてAoryzaeのΔpyrG株に対して形質転換を行った。得られた形質転換体をPCRおよびサザンハイブリダイゼーションにより調べた。結果、1株で目的部位にベクターが組込まれていることが確認された。次にこの株から分生子を採取し、約1×105を5FOAを含むCZ培地プレート上へ塗布し、得られた5FOA耐性株を解析したところ、B1035とB1036の中間領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを持つことが確認された。このB1035とB1036の中間領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを持つΔpyrG株を親株として、B1212とB1214の中間領域499kb領域重複用に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクターpB1213C3’Δで形質転換を行った。B1212とB1214の中間領域にベクターが組込まれた株をPCRおよびサザンハイブリダイゼーションを用いて選抜して分生子を回収し、5FOA-CZプレート上で耐性を示すコロニーを選択した結果、重複ターゲット領域中499kb領域の最もセントロメア側であるB1035とB1036の中間領域に5’ΔpyrGが組込まれ、最もテロメア側であるB1212とB1214の中間領域に3’ΔpyrGが組込まれた株の構築が確認された。こうして2番染色体中の499kbの領域を重複させるための基本的なコンストラクトを持った株の構築に成功した図9。重複株の作製に使用したプライマーを表3に示す。尚、形質転換体の第2番染色体に組み込まれた形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分は約500bpであった。染色体重複株の作製次に、このC4hap株を親株として、前述の方法により、染色体重複株の取得実験を行った。その結果、再生プレートから1個のpyrGのコロニーが得られたので、これをC4499k株とした。続いて、得られたpyrG株C4499k株から染色体DNAを抽出し、PCRおよび定量PCRリアルタイムPCRにより、染色体が重複しているかどうかの確認を試みた。PCRによる染色体重複の確認まず、PCRにより狙った染色体上の領域の重複が起きているかどうかの確認を行なった。その結果を図10に示す。重複領域のセントロメア側の端に位置し、ベクターpB1035C5’Δが組込まれているB1035とB1036の中間領域を増やすためのプライマーB1035CUとB1035CLを用いた場合図10上には、コントロール株親株:C4hap株、重複株C4499k株ともに44kbのバンドの増幅が見られた図10下、レーン1および2。また重複領域のテロメア側の端に位置し、ベクターpB1213C3’Δが組込まれているB1212とB1214の中間領域を増やすためのプライマーB1213CUとB1213CLを用いた場合図10上には、コントロール、重複株ともに39kbのバンドの増幅が見られた図10下、レーン5および6。一方、B1213CUB1035CLの組合わせでPCRを行った場合図10中にはコントロールでは全くバンドの増幅が見られないのに対し、染色体重複株では、はっきりと48kbのバンドの増幅が見られた図10下、レーン3および4。染色体重複株でのみ見られた48kbのバンドは、染色体上の狙った領域が重複し、図10中に示すような構造が染色体上に存在する場合にのみ得られるバンドであると考えられる。このことから、染色体重複株499k株では2番染色体上のこの領域B1035~B1212の499kbが重複していることが示唆された。リアルタイムPCRによるコピー数の確認続いてリアルタイムPCR定量PCRを用いて2番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数をコントロール株親株:C4hap株および染色体重複株C4499k株で比較した図11。実験では他の染色体に存在し、コピー数が1であるrad52をノーマライザーとして使用し、重複領域内のセントロメア側の端に位置するB1036遺伝子Alpとそこから490kb離れた位置に存在するB1208遺伝子およびテロメア側の端に位置するB1212遺伝子、そして重複領域外に位置するB1258D遺伝子をターゲットとして、SYBRGreenを用いた相対的定量法により、親株におけるコピー数との比較を行った。図11にはコントロール株C4hap株でのコピー数に対する相対値を示す。その結果、染色体重複株であるC4499k株では、染色体重複領域外に位置するB1258Dの相対値は約1程度であったが、重複領域の内部に位置するB1036遺伝子、B1208遺伝子、B1212遺伝子についてはいずれもコントロール株でのコピー数に対して2倍程度の値を示した。これらの結果から染色体重複株C4499k株においては、重複領域内に位置する遺伝子のコピー数が2に増幅していることが確認された。これらのPCRおよびリアルタイムPCR定量PCRの結果から、染色体重複株C4499k株では2番染色体上の狙った領域である499kbの領域が確かに重複していることが確認された。活性の測定2番染色体の重複株については、特許文献1で、麹菌の2番染色体上のSC003のAO090003001003~AO090003001259に対応するゲノム領域の重複株で、プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性の顕著な上昇が見られることが報告されている。本実験で2番染色体を重複させた重複株について、同様の活性上昇が見られるかどうかを調べるために、酵素活性の測定を行なった。酵素活性の比較対照とするために、本実験での方法を用いて2番染色体上のAO090003001003~AO090003001258B1003~B1258に対応する695kbの領域を重複させたD2695k株を用いた。プロテアーゼ活性測定の結果前述の方法にてふすま麹より得られた酵素抽出液を用いて全プロテアーゼ活性の測定を行い、染色体重複を持たない親株と重複株とで比較を行なった。その結果を図12に示す。プロテアーゼ活性については、親株の活性に対し、染色体重複株C4499k株では約3倍に活性値が上昇していた。また、この値は695kbの領域の染色体重複株D2695k株で得られた活性値であるとほぼ同等であった。このことから本発明で作製した499kbの領域の染色体重複株C4499k株では、ふすま培養において、695kbの領域の染色体株重複D2695k株と同様のプロテアーゼ活性の上昇が見られることが判明した。α‐アミラーゼ活性測定の結果続いてα‐アミラーゼ活性についても同一の酵素液を用いて測定を行なった。その結果を図13に示す。その結果、親株の活性値に対し、染色体重複株C4499k株では約16倍程度に上昇していることが明らかとなった。この値は695kbの領域の染色体重複株D2695k株において得られた値とほぼ同じであった。このことから本発明で作製した499kbの領域の染色体重複株C4499k株では、ふすま培養において、695kbの領域の染色体株重複D2695k株と同様のアミラーゼ活性の上昇が見られることが判明した。以上の結果より、本実施例で作製したC4499k株においては、2番染色体のB1036~1212の499kbの領域が確かに重複しており、ふすま培養において、695kbの領域の染色体重複株と同様に、染色体重複のない親株に比較して、顕著なプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性の上昇が見られることが判った。このことから、2番染色体の重複によるプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性の上昇にはより短い領域であるB1036~1212を含む499kb領域の重複で十分であることが示された。"