"EコイルセパレーターまたはKコイルセパレーターに連結された、血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含む血清タンパク質結合ポリペプチドであって、前記ポリペプチド部分は前記血清タンパク質に結合することができ、前記EコイルセパレーターがEVAALEK配列番号299の4リピートヘプタマーであり、前記KコイルセパレーターがKVAALKE配列番号300の4リピートヘプタマーである、血清タンパク質結合ポリペプチド。前記血清結合タンパク質の前記ポリペプチド部分が前記セパレーターのN末端に位置する、請求項1に記載の血清タンパク質結合ポリペプチド。前記血清結合タンパク質の前記ポリペプチド部分が前記セパレーターのC末端に位置する、請求項1に記載の血清タンパク質結合ポリペプチド。前記血清結合タンパク質がアルブミン結合タンパク質である、請求項1~3のいずれか一項に記載の血清タンパク質結合ポリペプチド。前記アルブミン結合タンパク質が連鎖球菌Gタンパク質であり、前記ポリペプチドが前記連鎖球菌Gタンパク質のアルブミン結合ドメインABDである、請求項4に記載の血清タンパク質結合ポリペプチド。前記連鎖球菌Gタンパク質の前記アルブミン結合ドメインABDが連鎖球菌G148株のGタンパク質のアルブミン結合ドメイン3ABD3である、請求項5に記載の血清タンパク質結合ポリペプチド。請求項1~7のいずれか一項に記載の血清タンパク質結合ポリペプチドと複合体を形成したダイアボディであって、前記ダイアボディは第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含み、I前記第1のポリペプチド鎖がi第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL1の結合領域を含む第1のドメインと、ii第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH2の結合領域を含む第2のドメインとを含み、前記第1のドメインと第2のドメインは、前記第1のドメインと第2のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;II前記第2のポリペプチド鎖がi第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL2の結合領域を含む第4のドメインと、ii第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH1の結合領域を含む第5のドメインとを含み、前記第4のドメインと第5のドメインは、前記第4のドメインと第5のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;A前記第1のドメインと前記第5のドメインは会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位VL1VH1を形成し;B前記第2のドメインと前記第4のドメインは会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位VL2VH2を形成し;C前記ダイアボディの前記第1のポリペプチド鎖または前記第2のポリペプチド鎖のうち少なくとも一方がEコイルセパレーターまたはKコイルセパレーターをさらに含み;かつD前記第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドの前記セパレーターがEコイルである場合には、前記血清タンパク質結合ポリペプチドの前記セパレーターはKコイルであり、前記第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドの前記セパレーターがKコイルである場合には、前記血清タンパク質結合ポリペプチドの前記セパレーターはEコイルである、ダイアボディ。前記ダイアボディが2時間より長い、10時間より長いまたは20時間より長いinvivo血清半減期を示す、請求項7に記載の複合体を形成したダイアボディ。前記ダイアボディがナチュラルキラー群2DNKG2D受容体、T細胞受容体TCR結合ドメインまたはハプテンと結合する、請求項1~8のいずれか一項に記載の複合体を形成したダイアボディ。前記分子が腫瘍関連抗原と付加的に結合する、請求項9に記載の複合体を形成したダイアボディ。前記腫瘍関連抗原が乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頚癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫抗原、B細胞悪性腫瘍関連抗原、多発性骨髄腫関連抗原、非ホジキンリンパ腫関連抗原または慢性リンパ性白血病関連抗原である、請求項10に記載の複合体を形成したダイアボディ。前記腫瘍関連抗原がA33;ADAM-9;ALCAM;B1;BAGE;β-カテニン;CA125;カルボキシペプチダーゼM;CD5;CD19;CD20;CD22;CD23;CD25;CD27;CD28;CD32B;CD36;CD40;CD45;CD46;CD56;CD79a;CD79b;CD103;CD154;CDK4;CEA;CTLA4;サイトケラチン8;EGF-R;エフリン受容体;ErbB1;ErbB3;ErbB4;GAGE-1;GAGE-2;GD2;GD3;GM2;gp100;HER-2/neu;ヒト乳頭腫ウイルス-E6;ヒト乳頭腫ウイルス-E7;インテグリンα-V-β-6;JAM-3;KID3;KID31;KSA17-1A;LUCA-2;MAGE-1;MAGE-3;MART;MUC-1;MUM-1;N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ;オンコスタチンMオンコスタチン受容体β;p15;PIPA;PSA;PSMA;RAAG10;ROR1;SART;sTn;TES7;TNF-α受容体;TNF-β受容体;TNF-γ受容体;トランスフェリン受容体またはVEGF受容体である、請求項11に記載の複合体を形成したダイアボディ。前記腫瘍関連抗原がHER-2/neuである、請求項12に記載の複合体を形成したダイアボディ。前記腫瘍関連抗原がCD32Bである、請求項12に記載の複合体を形成したダイアボディ。3.発明の概要本発明は、共有結合型ダイアボディおよび/または共有結合型ダイアボディ分子、ならびに癌、自己免疫疾患、アレルギー性障害、および細菌、真菌もしくはウイルスにより引き起こされる感染性疾患を含む様々な疾患および障害の治療におけるそれらの使用に関する。好ましくは、本発明のダイアボディは2つの異なる細胞上の2つの異なるエピトープに結合することができ、この場合、第1のエピトープは第2のエピトープとは異なる細胞種に発現され、その結果、該ダイアボディはこれら2つの細胞を引き寄せることができる。一実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディは第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、i第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL1の結合領域を含む第1のドメイン、ii第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH2の結合領域を含む第2のドメイン、および場合によりiii少なくとも1個のシステイン残基を含む第3のドメインを含み、第1のドメインと第2のドメインは、第1のドメインと第2のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;第2のポリペプチド鎖は、i第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL2の結合領域を含む第4のドメイン、ii第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH1の結合領域を含む第5のドメイン、および場合によりiii少なくとも1個のシステイン残基を含む第6のドメインを含み、第4のドメインと第5のドメインは、第4のドメインと第5のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく;第1のドメインと第5のドメインは会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位VL1VH1を形成し;第2のドメインと第4のドメインは会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位VL2VH2を形成している。別の実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディは第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、i第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL1の結合領域を含む第1のドメイン、ii第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH2の結合領域を含む第2のドメイン、およびiiiFcドメインまたはその一部を含む第3のドメインを含み、第1のドメインと第2のドメインは、第1のドメインと第2のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;第2のポリペプチド鎖は、i第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL2の結合領域を含む第4のドメイン、ii第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH1の結合領域を含む第5のドメインを含み、第4のドメインと第5のドメインは、第3のドメインと第4のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく;第1のドメインと第5のドメインは会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位VL1VH1を形成し;第2のドメインと第4のドメインは会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位VL2VH2を形成している。特定の態様において、本発明はダイアボディ分子を対象とし、該分子は第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、i第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL1の結合領域を含む第1のドメイン、ii第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH2の結合領域を含む第2のドメイン、およびiiiFcドメインまたはその一部を含む第3のドメインを含み、第1のドメインと第2のドメインは、第1のドメインと第2のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;第2のポリペプチド鎖は、i第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL2の結合領域を含む第4のドメイン、ii第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH1の結合領域を含む第5のドメイン、およびiii少なくとも1個のシステイン残基を含む第6のドメインを含み、第4のドメインと第5のドメインは、第4のドメインと第5のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく;第1のドメインと第5のドメインは会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位VL1VH1を形成し;第2のドメインと第4のドメインは会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位VL2VH2を形成している。特定の実施形態では、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、i第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL1の結合領域を含む第1のドメイン、ii第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH2の結合領域を含む第2のドメイン、およびiiiFcドメインまたはその一部を含む第3のドメインを含み、第1のドメインと第2のドメインは、第1のドメインと第2のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;第2のポリペプチド鎖は、i第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL2の結合領域を含む第4のドメイン、ii第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH1の結合領域を含む第5のドメイン、およびiii少なくとも1個のシステイン残基を含む第6のドメインを含み、第4のドメインと第5のドメインは、第4のドメインと第5のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;各ダイアボディ分子の第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく;各ダイアボディ分子の第1のドメインと第5のドメインは会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位VL1VH1を形成し;各ダイアボディ分子の第2のドメインと第4のドメインは会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位VL2VH2を形成している。さらに他の実施形態において、本発明は共有結合型四重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第1のダイアボディ分子は第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、i第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL1の結合領域を含む第1のドメイン、ii第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH2の結合領域を含む第2のドメイン、およびiiiFcドメインまたはその一部を含む第3のドメインを含み、第1のドメインと第2のドメインは、第1のドメインと第2のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;第2のポリペプチド鎖は、i第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL2の結合領域を含む第4のドメイン、ii第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH1の結合領域を含む第5のドメイン、およびiii少なくとも1個のシステイン残基を含む第6のドメインを含み、第4のドメインと第5のドメインは、第4のドメインと第5のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく;第1のドメインと第5のドメインは会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位VL1VH1を形成し;第2のドメインと第4のドメインは会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位VL2VH2を形成し;かつ、第2のダイアボディ分子は第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、i第3のエピトープに特異的な第3の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL3の結合領域を含む第1のドメイン、ii第4のエピトープに特異的な第4の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH4の結合領域を含む第2のドメイン、およびiiiFcドメインまたはその一部を含む第3のドメインを含み、第1のドメインと第2のドメインは、第1のドメインと第2のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;第2のポリペプチド鎖は、i第4の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL4の結合領域を含む第4のドメイン、ii第3の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH3の結合領域を含む第5のドメイン、およびiii少なくとも1個のシステイン残基を含む第6のドメインを含み、第4のドメインと第5のドメインは、前記第4のドメインと第5のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく;第1のドメインと第5のドメインは会合して、第3のエピトープと結合する第1の結合部位VL3VH3を形成し;第2のドメインと第4のドメインは会合して、第4のエピトープと結合する第2の結合部位VL4VH4を形成している。本発明の特定の態様において、第1のエピトープ、第2のエピトープ、適当であれば、第3のエピトープおよび第4のエピトープは同一であり得る。他の態様では、第1のエピトープ、第2のエピトープ、適当であれば、第3のエピトープおよび第4のエピトープが他とそれぞれ異なっていてもよい。第3のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第1のエピトープと第3のエピトープが同一であり得る。第4のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第1のエピトープと第4のエピトープが同一であり得る。第3のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第2のエピトープと第3のエピトープが同一であり得る。第4のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第2のエピトープと第4のエピトープが同一であり得る。本発明の好ましい態様では、第1のエピトープと第2のエピトープは異なっている。第3のエピトープ結合ドメインと第4のエピトープ結合ドメインを含む本発明のさらに他の態様では、第3のエピトープと第4のエピトープは異なり得る。前述の任意の組合せが本発明に包含されると理解すべきである。本発明の特定の態様において、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第1のドメインと第5のドメインを同一の免疫グロブリンに由来するものであり得る。別の態様では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第2のドメインと第4のドメインを同一の免疫グロブリンに由来するものであり得る。さらに別の態様では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第1のドメインと第5のドメインを異なる免疫グロブリンに由来するものであり得る。さらに別の態様では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第2のドメインと第4のドメインを異なる免疫グロブリンに由来するものであり得る。前述の任意の組合せが本発明に包含されると理解すべきである。本発明の特定の態様において、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖の間の共有結合は、第1のポリペプチド鎖上の少なくとも1個のシステイン残基と第2のポリペプチド鎖上の少なくとも1個のシステイン残基の間のジスルフィド結合を介するものであり得る。ジスルフィド結合に関与する第1のポリペプチド鎖または第2のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第1、第2、第3、第4、第5または第6のドメイン内を含む、ポリペプチド鎖上のどこに存在してもよい。特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第1のドメインに、そして第2のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第5のドメインに存在する。第1、第2、第4および第5のドメインは結合に関与する可変領域に相当する。好ましい実施形態では、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖の間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基は、それぞれ第3のドメインおよび第6のドメイン内に位置する。この実施形態の特定の態様では、第1のポリペプチド鎖の第3のドメインは、配列番号17のアミノ酸配列によりコードされ得るヒトκ軽鎖のC末端の6個のアミノ酸FNRGEC配列番号23を含む。この実施形態の別の態様では、第2のポリペプチド鎖の第6のドメインは、配列番号17のアミノ酸配列によりコードされ得るヒトκ軽鎖のC末端の6個のアミノ酸FNRGEC配列番号23を含む。この実施形態のさらに別の態様では、第1のポリペプチド鎖の第3のドメインは、配列番号78のヌクレオチド配列によりコードされ得るヒトIgGのヒンジドメインに由来するアミノ酸配列VEPKSC配列番号77を含む。この実施形態の別の態様では、第2のポリペプチド鎖の第6のドメインは、配列番号78のヌクレオチド配列によりコードされ得る、ヒトIgGのヒンジドメイン由来のアミノ酸配列VEPKSC配列番号77を含む。この実施形態の特定の態様では、第1のポリペプチド鎖の第3のドメインは、ヒトκ軽鎖のC末端の6個のアミノ酸FNRGEC配列番号23を含み、第2のポリペプチド鎖の第6のドメインはアミノ酸配列VEPKSC配列番号77を含む。この実施形態の他の態様では、第2のポリペプチド鎖の第6のドメインは、ヒトκ軽鎖のC末端の6個のアミノ酸FNRGEC配列番号23を含み、第1のポリペプチド鎖の第3のドメインはアミノ酸配列VEPKSC配列番号77を含む。この実施形態のさらに他の態様では、第1のポリペプチド鎖の第3のドメインは、ヒトκ軽鎖のC末端の6個のアミノ酸FNRGEC配列番号23を含み、第2のポリペプチド鎖の第6のドメインはヒンジドメインを含む。この実施形態の他の態様では、第2のポリペプチド鎖の第6のドメインは、ヒトκ軽鎖のC末端の6個のアミノ酸FNRGEC配列番号23を含み、第1のポリペプチド鎖の第3のドメインはヒンジドメインを含む。この実施形態のさらに他の態様では、第1のポリペプチド鎖の第3のドメインは、ヒトκ軽鎖のC末端の6個のアミノ酸FNRGEC配列番号23を含み、第1のポリペプチド鎖の第6のドメインはFcドメインまたはその一部を含む。この実施形態のさらに他の態様では、第2のポリペプチド鎖の第6のドメインは、ヒトκ軽鎖のC末端の6個のアミノ酸FNRGEC配列番号23を含み、第1のポリペプチド鎖の第3のドメインはFcドメインまたはその一部を含む。他の実施形態において、ジスルフィド結合に関与する第1または第2のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第1のポリペプチド鎖上の第1、第2または第3のドメインの外側に、そして第2のポリペプチド鎖上の第4、第5または第6のドメインの外側に位置することができる。特に、第1のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第1のドメインのN末端にあっても、第1のドメインのC末端にあってもよい。第1のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第2のドメインのN末端にあっても、第2のドメインのC末端にあってもよい。第1のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第3のドメインのN末端にあっても、第3のドメインのC末端にあってもよい。さらに、第2のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第4のドメインのN末端にあっても、第4のドメインのC末端にあってもよい。第2のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第5のドメインのN末端にあっても、第5のドメインのC末端にあってもよい。これに応じて、第2のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第6のドメインのC末端にあっても、第6のドメインのN末端にあってもよい。特定の態様では、ジスルフィド結合は、第1のポリペプチド鎖上の少なくとも2個のシステイン残基と第2のポリペプチド鎖上の少なくとも2個のシステイン残基の間にあってよい。第3のドメインと第6のドメインがFcドメインまたはその一部を含まない特定の態様では、システイン残基は第1のポリペプチド鎖のC末端にあり、かつ第2のポリペプチド鎖のC末端にあり得る。前述の任意の組合せが本発明に包含されると理解すべきである。上記の本発明の特定の実施形態において、本発明の共有結合型ダイアボディはダイアボディ分子の二量体を包含し、この場合、各ダイアボディ分子は第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含む。この実施形態の特定の態様では、ダイアボディ分子同士が共有結合により連結されて二量体を形成し得るが、該共有結合はペプチド結合ではない。この実施形態の好ましい態様では、共有結合は二量体の各ダイアボディ分子の第1のポリペプチド鎖上にある少なくとも1個のシステイン残基の間のジスルフィド結合である。本発明のさらにより好ましい態様では、共有結合は二量体を形成している各ダイアボディ分子の第1のポリペプチド鎖上にある少なくとも1個のシステイン残基の間のジスルフィド結合であるが、該少なくとも1個のシステイン残基は各第1のポリペプチド鎖の第3のドメインに位置する。本発明の特定の態様において、第1のポリペプチド鎖上の第1のドメインは、第2のドメインのN末端にあっても、第2ドメインのC末端にあってもよい。第1のポリペプチド鎖上の第1のドメインは第3ドメインのN末端にあっても、第3ドメインのC末端にあってもよい。第1のポリペプチド鎖上の第2のドメインは、第1のドメインのN末端にあっても、第1のドメインのC末端にあってもよい。さらに、第1のポリペプチド鎖上の第2のドメインは、第3のドメインのN末端にあっても、第3のドメインのC末端にあってもよい。これに応じて、第1のポリペプチド鎖上の第3のドメインは、第1のドメインのN末端にあっても、第1のドメインのC末端にあってもよい。第1のポリペプチド鎖上の第3のドメインは、第2のドメインのN末端にあっても、第2のドメインのC末端にあってもよい。第2のポリペプチド鎖に関して、第4のドメインは、第5のドメインのN末端にあっても、第5のドメインのC末端にあってもよい。第4のドメインは、第6のドメインのN末端にあっても、第6のドメインのC末端にあってもよい。第2のポリペプチド鎖上の第5のドメインは、第4のドメインのN末端にあっても、第4のドメインのC末端にあってもよい。第2のポリペプチド鎖上の第5のドメインは、第6のドメインのN末端にあっても、第6のドメインのC末端にあってもよい。これに応じて、第2のポリペプチド鎖上の第6のドメインは、第4のドメインのN末端にあっても、第4のドメインのC末端にあってもよい。第2のポリペプチド鎖上の第6のドメインは、第5のドメインのN末端にあっても、第5のドメインのC末端にあってもよい。前述の任意の組合せが本発明に包含されると理解すべきである。特定の実施形態において、第1のドメインと第2のドメインは第1のポリペプチド鎖上の第3のドメインのC末端に位置してもよいし、あるいは、第1のドメインと第2のドメインは第1のポリペプチド鎖上の第3のドメインのN末端に位置してもよい。第2のポリペプチド鎖に関して、第4のドメインと第5のドメインは第6のドメインのC末端に位置してもよいし、あるいは、第4のドメインと第5のドメインは第6のドメインのN末端に位置してもよい。この実施形態の特定の態様では、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、i第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL1の結合領域を含む第1のドメイン、ii第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH2の結合領域を含む第2のドメイン、およびiiiFcドメインまたはその一部を含む第3のドメインを含み、第1のドメインと第2のドメインは、第1のドメインと第2のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され、かつ、第3のドメインは第1のドメインと第2のドメインの双方のN末端側に位置し;第2のポリペプチド鎖は、i第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL2の結合領域を含む第4のドメイン、ii第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH1の結合領域を含む第5のドメイン、およびiii少なくとも1個のシステイン残基を含む第6のドメインを含み、第4のドメインと第5のドメインは、第4のドメインと第5のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;各ダイアボディ分子の第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく;各ダイアボディ分子の第1のドメインと第5のドメインは会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位VL1VH1を形成し;各ダイアボディ分子の第2のドメインと第4のドメインは会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位VL2VH2を形成している。さらに別の実施形態において、本発明は共有結合型四重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第1のダイアボディ分子は第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、i第1のエピトープに特異的な第1の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL1の結合領域を含む第1のドメイン、ii第2のエピトープに特異的な第2の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH2の結合領域を含む第2のドメイン、およびiiiFcドメインまたはその一部を含む第3のドメインを含み、第1のドメインと第2のドメインは、第1のドメインと第2のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され、かつ、第3のドメインは第1のドメインと第2のドメインの双方のN末端側に位置し;第2のポリペプチド鎖は、i第2の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL2の結合領域を含む第4のドメイン、ii第1の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH1の結合領域を含む第5のドメイン、およびiii少なくとも1個のシステイン残基を含む第6のドメインを含み、第4のドメインと第5のドメインは、第4のドメインと第5のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;かつ、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく;第1のドメインと第5のドメインは会合して、第1のエピトープと結合する第1の結合部位VL1VH1を形成し;第2のドメインと第4のドメインは会合して、第2のエピトープと結合する第2の結合部位VL2VH2を形成し;かつ、第2のダイアボディ分子は第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、i第3のエピトープに特異的な第3の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL3の結合領域を含む第1のドメイン、ii第4のエピトープに特異的な第4の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH4の結合領域を含む第2のドメイン、およびiiiFcドメインまたはその一部を含む第3のドメインを含み、第1のドメインと第2のドメインは、第1のドメインと第2のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され、かつ、第3のドメインは第1のドメインと第2のドメインの双方のN末端に位置し;かつ、第2のポリペプチド鎖は、i第4の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインVL4の結合領域を含む第4のドメイン、ii第3の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインVH3の結合領域を含む第5のドメイン、およびiii少なくとも1個のシステイン残基を含む第6のドメインを含み、第4のドメインと第5のドメインは、第4のドメインと第5のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され;かつ、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく;第1のドメインと第5のドメインは会合して、第3のエピトープと結合する第1の結合部位VL3VH3を形成し;第2のドメインと第4のドメインは会合して、第4のエピトープと結合する第2の結合部位VL4VH4を形成している。上述のように、個々のポリペプチド鎖上のドメインは共有結合により連結されている。特定の態様では、第1のドメインと第2のドメインの間、第1のドメインと第3のドメインの間、第2のドメインと第3のドメインの間、第4のドメインと第5のドメインの間、第4のドメインと第6のドメインの間、および/または第5のドメインと第6のドメインの間の共有結合はペプチド結合であり得る。特に、第1のドメインと第2のドメイン、および第4のドメインと第5のドメインが会合して結合部位を形成することがない限り、第1のドメインと第2のドメイン、および第4のドメインと第5のドメインは、それぞれ第3のドメインと第6のドメインにより、または付加的なアミノ酸残基により隔てられていてもよい。アミノ酸残基の数は0、1、2、3、4、5、6、7、8または9個であってよい。好ましい一態様では、ドメイン間のアミノ酸残基の数は8個である。本発明の特定の態様では、Fcドメインを含む第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖のドメインすなわち、場合により、それぞれ第3のドメインおよび第6のドメインは、該ドメインがヒンジ-Fc領域を含むようにヒンジドメインをさらに含むことができる。別の実施形態では、第1のポリペプチド鎖または第2のポリペプチド鎖は、Fcドメインを含まなくともヒンジドメインを含むことができる。本発明で用いる重鎖、軽鎖、ヒンジ領域、Fcドメインおよび/またはヒンジ-Fcドメインは、IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMを含む、どの免疫グロブリン種に由来するものであってもよい。好ましい一態様では、免疫グロブリン種はIgGまたはそのいずれかのサブタイプ、すなわちIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4である。他の態様では、軽鎖および重鎖が由来する免疫グロブリンは、ヒト化またはキメラ化されている。さらに、ダイアボディまたはダイアボディ分子が結合する第1のエピトープと第2のエピトープ、および適当であれば、第3のエピトープと第4エピトープは、同じ抗原に由来する異なるエピトープであっても、異なる抗原に由来する異なるエピトープであってもよい。抗原は、抗体を生成することができるいずれの分子であってもよく、例えば、タンパク質、核酸、細菌毒素、細胞表面マーカー、自己免疫マーカー、ウイルスタンパク質、薬物などである。特定の態様では、ダイアボディの少なくとも1つのエピトープ結合部位は、B細胞、T細胞、食細胞、ナチュラルキラーNK細胞または樹状細胞などの特定の細胞上の抗原に特異的である。本実施形態の特定の態様において、ダイアボディまたはダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合部位はFc受容体に特異的であり、該Fc受容体は活性化Fc受容体または阻害型Fc受容体であり得る。特定の態様では、Fc受容体はFcγ受容体であり、このFcγ受容体はFcγRI、FcγRIIまたはFcγRIII受容体である。より好ましい態様では、FcγRIII受容体はFcγRIIIACD16A受容体またはFcγRIIIBCD16B受容体であり、より好ましくは、FcγRIII受容体はFcγRIIIACD16A受容体である。別の好ましい態様では、FcγRII受容体はFcγRIIACD32A受容体またはFcγRIIBCD32B受容体であり、より好ましくは、FcγRIIBCD32B受容体である。特に好ましい一態様では、ダイアボディの一方の結合部位はCD32Bに特異的であり、他方の結合部位はCD16Aに特異的である。本発明の特定の実施形態では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合部位は活性化Fc受容体に特異的であり、少なくとも1つの他の部位が阻害型Fc受容体に特異的である。この実施形態の特定の態様では、活性化Fc受容体はCD32Aであり、阻害型Fc受容体はCD32Bである。この実施形態の他の態様では、活性化Fc受容体はBCRであり、阻害型Fc受容体はCD32Bである。この実施形態のさらに他の態様では、活性化Fc受容体はIgERIであり、阻害型Fc受容体はCD32Bである。1つのエピトープ結合部位がCD16Aに特異的である場合には、VLドメインおよびVHドメインは、マウス抗体3G8この配列はクローニングされており、本明細書に示されているのVLドメインおよびVHドメインと同一であっても、類似していてもよい。1つのエピトープ結合部位がCD32Aに特異的である他の場合には、VLドメインおよびVHドメインは、マウス抗体IV.3のVLドメインおよびVHドメインと同一であっても、類似していてもよい。1つのエピトープ結合部位がCD32Bに特異的であるさらに他の場合には、VLドメインおよびVHドメインは、マウス抗体2B6この配列はクローニングされており、本明細書に示されているのVLドメインおよびVHドメインと同一であっても、類似していてもよい。3G8、2B6およびIV.3抗体のVLドメインまたはVHドメインのいずれもが任意の組合せで使用可能であると理解すべきである。本発明はまた、第1のエピトープがCD32Bに特異的であり、第2のエピトープがCD16Aに特異的である二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子も対象とする。他の態様では、エピトープ結合部位は病原性抗原に特異的であり得る。本明細書で用いる場合、病原性抗原とは、癌、感染性疾患、自己免疫疾患を含む特定の病原性疾患に関与する抗原のことである。従って、病原性抗原は腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または自己免疫抗原であり得る。病原性抗原の例としては、限定されるものではないが、リポ多糖、ウイルス抗原ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、西ナイルウイルス例えば、E16および/またはE53抗原、および肝炎ウイルスに由来するウイルス抗原からなる群から選択される、核酸DNAおよびRNA、およびコラーゲンであり得る。好ましくは、病原性抗原は中和抗原である。好ましい一態様において、一方のエピトープ結合部位がCD16AまたはCD32Aに特異的である場合、他方のエピトープ結合部位は自己免疫抗原を除く病原性抗原に特異的である。さらに別の好ましい態様において、一方のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的である場合、他方のエピトープ結合部位は任意の病原性抗原に特異的である。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子は同一細胞上の2つの異なる抗原と結合し、例えば、一方の抗原結合部位は活性化Fc受容体に特異的であるが、他方は阻害型Fc受容体に特異的である。他の実施形態では、ダイアボディ分子は2つの異なるウイルス中和エピトープ、例えば、限定されるものではないが西ナイルウイルスのE16およびE53と結合する。本発明のさらに別の実施形態において、本発明のダイアボディを用いて様々な疾患および障害を治療することができる。従って、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患または障害の治療方法を対象とし、この場合、少なくとも1つの結合部位が癌細胞の表面または細菌もしくはウイルス粒子の表面に発現される抗原のような病原性抗原に特異的であり、少なくとも1つの他の結合部位がFc受容体、例えばCD16Aに特異的である。さらに別の実施形態において、本発明は、有効量の本発明のダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患または障害の治療方法を対象とし、この場合、少なくとも1つの結合部位がCD32Bに特異的であり、少なくとも1つの他の結合部位がCD16Aに特異的である。さらに別の実施形態において、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、病原性抗原に対する免疫寛容の誘発方法を対象とし、この場合、少なくとも1つの結合部位がCD32Bに特異的であり、少なくとも1つの他の結合部位が該病原性抗原に特異的である。この実施形態の態様においては、病原性抗原はアレルゲンまたは免疫寛容が望まれる別の分子例えば、移植した組織に発現されるタンパク質であり得る。さらに別の実施形態において、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む解毒方法を対象とし、この場合、少なくとも1つの結合部位が細胞表面マーカーに特異的であり、少なくとも1つの他の結合部位が毒素に特異的である。特定の態様では、投与される本発明のダイアボディは、1つの結合部位がFcなどの細胞表面マーカーに特異的であり、他の結合部位が細菌毒素または薬物に特異的であるものである。一態様では、細胞表面マーカーは赤血球上に見られないものである。3.1定義特に断りのない限り、本明細書で用いる全ての技術用語、表記法、その他の科学用語または専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味を有するものとする。いくつかの場合には、通常理解される意味を有する用語であっても、明確さのためにおよび/または参考までに本明細書で定義されるが、このような定義を本明細書に含めたからといって、当技術分野で一般に理解されている意味に対する大きな相違を表すと必ずしも解釈されるべきでない。本発明の実施には、特に断りのない限り、当業者の技術の範囲内である分子生物学組換え技術を含む、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の慣用技術を利用する。このような技術は文献、例えば、CurrentProtocolsinImmunologyCurrentProtocolsinMolecularBiologyMolecularCloningALaboratoryManual第3版PCRThePolymeraseChainReactionTheImmunoassayHandbookBioconjugateTechniquesMethodsofImmunologicalAnalysisHarlowandLaneUsingAntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY1999およびBeaucageら編CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistryJohnWileySonsIncNewYork2000に詳しく説明されている。本明細書において抗体とは、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、一本鎖FvscFv、一本鎖抗体、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、ジスルフィド結合二重特異性FvsdFv、細胞内発現抗体および抗イディオタイプ抗Id抗体例えば、本発明の抗体に対する抗Idおよび抗-抗Id抗体を含む、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを意味する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性フラグメント、すなわち、抗原結合部位を含む分子を含む。免疫グロブリン分子はいずれのタイプ例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY、いずれのクラス例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2またはいずれのサブクラスであってもよい。本明細書において免疫特異的に結合する、免疫特異的に認識する、特異的に結合する、特異的に認識するおよび類似の用語は、抗原例えば、エピトープまたは免疫複合体と特異的に結合するが、他の分子とは特異的に結合しない分子を意味する。抗原と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、BIAcoreまたは当技術分野で公知の他のアッセイにより測定した場合に、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドと結合し得る。好ましくは、抗原と特異的に結合する分子は他のタンパク質と交差反応しない。抗原と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、BIAcoreまたは当業者に公知の他の技術によって同定することができる。本明細書において免疫複合体とは、少なくとも1つの標的分子と少なくとも1つの異種Fcγ領域含有ポリペプチドが互いと結合して、より大きな分子量の複合体を形成した際に生じる構造体を意味する。免疫複合体の例は抗原-抗体複合体であり、これは可溶性であっても粒状例えば、細胞表面上の抗原/抗体複合体であってもよい。本明細書において重鎖、軽鎖、可変領域、フレームワーク領域、定常ドメインなどの用語は、免疫学分野におけるそれらの通常の意味を有し、天然の免疫グロブリン中のドメインおよび合成例えば、組換え結合タンパク質例えば、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体などの対応するドメインを意味する。天然の免疫グロブリン例えば、IgGの基本的構造単位は、2本の軽鎖と2本の重鎖を有する四量体であり、通常は約150,000Daの糖タンパク質として発現される。各鎖のアミノ末端N部分は、主に抗原認識に関与する約100~110またはそれを越えるアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端C部分は定常領域を規定しており、軽鎖が1つの定常ドメインを有し、重鎖が通常3つの定常ドメインとヒンジ領域を有する。従って、IgG分子の軽鎖の構造はn-VL-CL-cであり、IgG重鎖の構造はn-VH-CH1-H-CH2-CH3-c式中、Hはヒンジ領域である。IgG分子の可変領域は、抗原と接触する残基を含む相補性決定領域CDRと、フレームワークセグメントと呼ばれる非CDRセグメントからなり、これが一般に構造を維持し、CDRループの位置を決定するただし、特定のフレームワーク残基が抗原と接触してもよい。従って、VLドメインおよびVHドメインは構造n-FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4-cを有する。結合タンパク質または抗体本明細書では広範に定義されるに言及する場合、各ドメインへのアミノ酸の割り当てはKabat、SequencesofProteinsofImmunologicalInterestの定義に従う。免疫グロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変領域由来のアミノ酸は、その鎖におけるアミノ酸の位置によって指定される。Kabatは多数の抗体アミノ酸配列を記載し、各サブグループに対してアミノ酸コンセンサス配列を同定し、各アミノ酸に残基番号を割り当てた。Kabatのナンバリング方式は、問題の抗体を、保存されているアミノ酸を基準にしたKabatのコンセンサス配列の1つとアラインすることにより、Kabatの一覧表には含まれない抗体にまで拡張することができる。残基番号を割り当てるこの方法は、当技術分野で標準的になってきており、キメラまたはヒト化変異体を含む種々の抗体において同じ位置のアミノ酸を容易に同定する。例えば、ヒト抗体軽鎖の50番のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の50番のアミノ酸と同じ位置を占めている。本明細書において重鎖とは、IgG抗体の重鎖を定義するために用いられる。完全な天然IgGでは、重鎖は免疫グロブリンドメインVH、CH1、ヒンジ、CH2およびCH3を含む。本明細書全体を通して、IgG重鎖中の残基の符番は、KabatらSequencesofProteinsofImmunologicalInterest第5版PublicHealthServiceNH1MD参照により本明細書に組み入れるにおけるようなEUインデックスの符番である。KabatにおけるようなEUインデックスとは、ヒトIgG1EU抗体の符番を意味する。ヒトIgG1のヒンジ、CH2およびCH3ドメインを含むアミノ酸配列の例を、以下に記載する図1Aおよび1Bに示す。図1Aおよび1Bには、IgG2、IgG3およびIgG4の重鎖のヒンジ、CH2およびCH3ドメインのアミノ酸配列も示される。IgG2、IgG3およびIgG4アイソタイプのアミノ酸配列は、それぞれのヒンジ領域において、重鎖間S-S結合を形成している最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、IgG1配列とアラインされる。IgG2とIgG3のヒンジ領域については、全ての残基がEUインデックスにより符番されるわけではない。ヒンジ領域またはヒンジドメインは、一般に、ヒトIgG1のGlu216からPro230までにわたると定義される。ヒトIgG1のヒンジ領域のアミノ酸配列の例を図1Aに示す図1Aのアミノ酸残基はKabatシステムに従って符番されている。他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、図1Aに示すように重鎖間S-S結合を形成している最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、IgG1配列とアラインさせることができる。本明細書においてFc領域、Fcドメインまたは類似の用語は、IgG重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。ヒトIgG1を含むアミノ酸配列の例を図1Bに示す。Kabatシステムに従って符番した場合に、境界はわずかに変化し得るが、Fcドメインはアミノ酸231からアミノ酸447にわたる図1Bのアミノ酸残基はKabatシステムに従って符番されている。図1Bには、IgGアイソタイプIgG2、IgG3およびIgG4のFc領域のアミノ酸配列の例も示される。IgGのFc領域は、2つの定常ドメイン、すなわち、CH2とCH3を含む。ヒトIgGFc領域のCH2ドメインは、通常、Kabatのナンバリングシステムによればアミノ酸231からアミノ酸341にわたる図1B。ヒトIgGFc領域のCH3ドメインは、通常、Kabatのナンバリングシステムによればアミノ酸342から447にわたる図1B。ヒトIgGFc領域のCH2ドメインCγ2ドメインとも呼ばれるは、それがもう1つのドメインと密接に対合していないという点でユニークである。それどころか、完全な天然IgGの2つのCH2ドメインの間には、2つのN結合分岐糖鎖が介在している。本明細書においてFcγR結合タンパク質、FcγR抗体および抗FcγR抗体という用語は互換的に用いられ、様々な免疫グロブリン様タンパク質または免疫グロブリン由来タンパク質を意味する。FcγR結合タンパク質は、VLドメインおよび/またはVHドメインとの相互作用を介してFcγRと結合するFcγ媒介結合とは区別される。FcγR結合タンパク質の例としては、完全ヒト抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体例えば、2本の重鎖と2本の軽鎖を含む、そのフラグメント例えば、Fab、Fab’、Fab’2およびFvフラグメント、二機能性もしくは多機能性抗体例えば、LanzavecchiaらTheUseOfHybridHybridomasToTargetHumanCytotoxicTLymphocytesEurJImmunol17105111参照、一本鎖抗体例えば、BirdらSingleChainAntigenBindingProteinsScience24242326参照、融合タンパク質例えば、ファージディスプレイ融合タンパク質、ミニボディ例えば、米国特許第5,837,821号参照、ならびにVLドメインおよび/またはVHドメインまたはそのフラグメントを含む他の抗原結合タンパク質が挙げられる。一態様において、FcγRIIIA結合タンパク質は四量体抗体であり、すなわち、一般に天然IgGの構造を有し、かつ、可変ドメインと定常ドメインを含むすなわち、VLドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む2本の軽鎖と、VHドメインおよび重鎖ヒンジおよび定常ドメインを含む2本の重鎖とを含む。本明細書においてFcγRアンタゴニストおよび類似の用語は、FcγRの少なくとも1つの生物学的活性に拮抗する例えば、シグナル伝達を遮断するタンパク質および非タンパク質性物質小分子を含むを意味する。例えば、本発明の分子はIgGとFcγRとの結合を遮断することによってシグナル伝達を遮断する。本明細書において、ポリペプチドまたはタンパク質に関して誘導体とは、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入により改変されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を意味する。本明細書において誘導体とはまた、改変された、すなわち、ポリペプチドまたはタンパク質への任意の分子種の共有結合により改変されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。例えば、限定されるものではないが、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞、抗原または他のタンパク質との結合などにより改変することができる。誘導体ポリペプチドまたはタンパク質は、限定されるものでないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含む、当業者に公知の技術を用いる化学修飾により作製することができる。さらに、誘導体ポリペプチドまたはタンパク質誘導体は、それが由来するポリペプチドまたはタンパク質と同様のまたは同一の機能を保持する。本明細書において、非タンパク質誘導体に関して誘導体とは、第1の有機または無機分子の構造に基づいて形成された第2の有機分子または無機分子を意味する。有機分子の誘導体は、限定されるものではないが、例えばヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキシルまたはアミン基の付加または欠失により改変された分子を含む。有機分子はまた、エステル化、アルキル化および/またはリン酸化されてもよい。本明細書においてダイアボディ分子とは、2本以上のポリペプチド鎖またはタンパク質の複合体であって、それぞれが少なくとも1つのVLドメインおよびVHドメインまたはそのフラグメントを含み、両ドメインが単一のポリペプチド鎖内に含まれている該複合体を意味する。特定の実施形態において、ダイアボディ分子には、Fcまたはヒンジ-Fcドメインを含む分子が含まれる。このような複合体の前述のポリペプチド鎖は同じでも異なっていてもよく、すなわち、ダイアボディ分子はホモ多量体であってもヘテロ多量体であってもよい。特定の態様では、ダイアボディ分子には二量体または四量体またはVLドメインとVHドメインの双方を含む前述のポリペプチド鎖が含まれる。多量体タンパク質を構成する個々のポリペプチド鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって多量体の少なくとも1つの他のペプチドと共有結合により連結されていてもよい。本明細書において障害および疾患は互換的に用いられ、被験体の症状を意味する。特に、用語自己免疫疾患は用語自己免疫障害と互換的に用いられ、被験体自身の細胞、組織および/または器官に対する被験体の免疫反応に起因する細胞、組織および/または器官の損傷を特徴とする被験体の症状を意味する。用語炎症性疾患は用語炎症性障害と互換的に用いられ、炎症、好ましくは慢性炎症を特徴とする被験体の症状を意味する。自己免疫障害は炎症を伴っても伴わなくてもよい。さらに、炎症は自己免疫障害に起因してもしなくてもよい。従って、特定の障害は自己免疫障害と炎症性障害の双方を特徴とする場合がある。本明細書において同一のポリペプチド鎖とはまた、ほぼ同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を意味し、例えば、1以上のアミノ酸の相違を有するポリペプチド鎖、好ましくは2つのポリペプチド鎖の活性が有意に異ならないような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチド鎖が含まれる。本明細書において癌とは、異常な無制御の細胞増殖から生じる新生物または腫瘍を意味する。本明細書において癌は、明確に白血病およびリンパ腫を含む。いくつかの実施形態では、癌は局在化したままの良性腫瘍を意味する。他の実施形態では、癌は、近傍の身体構造に侵入して破壊し、離れた部位に拡散する悪性腫瘍を意味する。いくつかの実施形態では、癌は特定の癌抗原を随伴する。本明細書において免疫調節剤およびその変形は、宿主の免疫系を調節する薬剤を意味する。特定の実施形態では、免疫調節剤は免疫抑制剤である。特定の他の実施形態では、免疫調節剤は免疫賦活剤である。免疫調節剤としては、限定されるものではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分子、ミメティック剤および有機分子が挙げられる。本明細書においてエピトープとは、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性または免疫原性を有するポリペプチドまたはタンパク質または非タンパク質分子のフラグメントを意味する。免疫原性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質のフラグメントである。抗原性を有するエピトープは、当業者に周知の方法、例えばイムノアッセイにより確認されるような、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質のフラグメントである。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。本明細書においてフラグメントとは、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも5個の連続するアミノ酸残基、少なくとも10個の連続するアミノ酸残基、少なくとも15個の連続するアミノ酸残基、少なくとも20個の連続するアミノ酸残基、少なくとも25個の連続するアミノ酸残基、少なくとも40個の連続するアミノ酸残基、少なくとも50個の連続するアミノ酸残基、少なくとも60個の連続するアミノ酸残基、少なくとも70個の連続するアミノ酸残基、少なくとも80個の連続するアミノ酸残基、少なくとも90個の連続するアミノ酸残基、少なくとも100個の連続するアミノ酸残基、少なくとも125個の連続するアミノ酸残基、少なくとも150個の連続するアミノ酸残基、少なくとも175個の連続するアミノ酸残基、少なくとも200個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも250個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。特定の実施形態では、ポリペプチドのフラグメントは、そのポリペプチドの少なくとも1つの機能を保持する。本明細書において核酸およびヌクレオチド配列とは、DNA分子例えば、cDNAまたはゲノムDNA、RNA分子例えば、mRNA、DNA分子とRNA分子の組合せまたはハイブリッドDNA/RNA分子、ならびにDNA分子またはRNA分子の類似体を含む。このような類似体は、例えば、限定されるものではないが、イノシンまたはトリチル化塩基を含むヌクレオチド類似体を用いて作製することができる。このような類似体はまた、分子に例えばヌクレアーゼ耐性または細胞膜通過能の向上などの有益な属性を与える改変された骨格を含むDNA分子またはRNA分子を含み得る。核酸またはヌクレオチド配列は一本鎖または二本鎖であってもよいし、一本鎖部分と二本鎖部分の双方を含んでもよく、また、三本鎖部分を含んでもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。本明細書において治療上有効な量とは、疾患または障害を治療または管理するのに十分な治療薬の量を意味する。治療上有効な量は、疾患の発症を遅延または最小化する、例えば、癌の拡散を遅延または最小化するのに十分な治療薬の量を意味する場合もある。治療上有効な量は、疾患の治療または管理において治療上の利益を与える治療薬の量を意味する場合もある。さらに、本発明の治療薬に関して治療上有効な量は、疾患の治療または管理において治療上の利益を与える、単独でのまたは他の療法と組み合わせた治療薬の量を意味する。本明細書において予防薬とは、障害の予防、または障害の再発もしくは拡散の予防に使用可能な薬剤を意味する。予防上有効な量は、過増殖性疾患、特に癌の再発または拡散、または患者限定されるものではないが、過増殖性疾患の素因がある患者、例えば、遺伝的に癌の素因があるかまたは過去に発癌物質に曝された患者を含むにおけるそれらの発生を予防するのに十分な予防薬の量を意味する場合がある。予防上有効な量はまた、疾患の予防において予防上の利益を与える予防薬の量を意味する場合もある。さらに、本発明の予防薬に関して予防上有効な量は、疾患の予防において予防上の利益を与える、単独でのまたは他の薬剤と組み合わせた予防薬の量を意味する。本明細書において予防とは、予防薬または治療薬の投与の結果としての、被験体における障害の1以上の症状の再発または発症の予防を意味する。本明細書において組み合わせては、2種以上の予防薬および/または治療薬の使用を意味する。用語組み合わせての使用は、予防薬および/または治療薬を、障害のある被験体に投与する順序を制限するものではない。第1の予防薬または治療薬は、障害のある被験体に第2の予防薬または治療薬を投与する前例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間または12週間前に、または第2の予防薬または治療薬の投与と同時に、または第2の予防薬または治療薬を投与した後例えば5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間または12週間後に、投与することができる。本明細書においてエフェクター機能とは、抗体のFc領域と、Fc受容体または抗原との相互作用によりもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能としては、限定されるものではないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用ADCC、抗体依存性細胞媒介性食作用ADCP、および補体依存性細胞傷害作用CDCがある。エフェクター機能には、抗原の結合後に作用するものと、抗原結合とは無関係に作用するもの双方が含まれる。本明細書においてエフェクター細胞とは、1以上のFc受容体を発現し、1以上のエフェクター機能を媒介する、免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞としては、限定されるものではないが、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、B細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラーNK細胞があり、また、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むいずれの生物に由来してもよい。本明細書において免疫複合体と特異的に結合するおよび類似の用語は、ある免疫複合体と特異的に結合するが、別の分子とは特異的に結合しない分子を意味する。免疫複合体と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、BIAcoreまたは当技術分野で公知の他のアッセイにより測定した場合に、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドと結合し得る。好ましくは、免疫複合体と特異的に結合する分子は、他のタンパク質と交差反応しない。免疫複合体と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、BIAcoreまたは当技術分野で公知の他の技術によって同定することができる。本明細書において安定な融合タンパク質とは、当業者に公知の通常の生化学アッセイおよび機能アッセイを用いて評価した場合に、生産および/または保存中に受ける分解が最小限であるか検出可能なレベルではない融合タンパク質を意味し、生物学的活性例えば、FcγRとの結合の低下なく長期間保存することができる。4.図面の簡単な説明5.好ましい実施形態の説明ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖はVLドメインとVHドメインを含み、それらはドメインの自己集合が起こらないように共有結合により連結されている。これらのポリペプチド鎖の2つの相互作用により2つのVL-VH対合が生じ、2つのエピトープ結合部位、すなわち、二価分子を形成する。VHドメインまたはVLドメインはポリペプチド鎖内のどの位置にも拘束されずすなわち、アミノN末端またはカルボキシC末端に制限されない、また、そのドメインは互いの相対的位置に制限されることもないすなわち、VLドメインがVHドメインのN末端側にあってもよいし、その逆であってもよい。唯一の制限は、機能的なダイアボディを形成するために、相補的ポリペプチド鎖が利用可能であるということである。VLドメインとVHドメインが同じ抗体に由来する場合、この2本の相補的ポリペプチド鎖は同一であり得る。例えば、結合ドメインがエピトープAに特異的な抗体に由来する場合すなわち、結合ドメインがVLA-VHA相互作用から形成される場合には、各ポリペプチドはVHAおよびVLAを含む。抗体の2つのポリペプチド鎖のホモ二量体形成は2つのVLA-VHA結合部位の形成をもたらし、その結果、二価の単一特異性抗体が生じる。VLドメインとVHドメインが異なる抗原に特異的な抗体に由来する場合、機能的な二重特異性ダイアボディの形成には、異なる2本のポリペプチド鎖の相互作用、すなわち、ヘテロ二量体の形成が必要となる。例えば、二重特異性ダイアボディの場合、1本のポリペプチド鎖がVLAおよびVLBを含み、このポリペプチド鎖のホモ二量体形成が、結合がないまたは予測できない結合の、2つのVLA-VHB結合部位の形成をもたらす。これに対して、2つの異なるポリペプチド鎖が、例えば組換え発現系において自由に相互作用できる場合、一方はVLAとVHBを含み、他方はVLBとVHAを含む、2つの異なる結合部位、すなわち、VLA-VHAおよびVLB-VHBを形成する。全てのダイアボディポリペプチド鎖対に関して、2つのポリペプチド鎖のアライメントミスまたは結合ミス、すなわち、VL-VLドメインまたはVH-VHドメインの相互作用の可能性があり得るが、機能的なダイアボディの精製は、当技術分野で公知のまたは本明細書で例示される方法例えば、アフィニティークロマトグラフィーに基づく親和性を用い、適切に二量体形成した結合部位の免疫特異性に基づいて容易に行うことができる。他の実施形態では、ダイアボディの1以上のポリペプチド鎖はFcドメインを含む。ダイアボディ分子のポリペプチド鎖におけるFcドメインは優先的に二量体を形成し、その結果、免疫グロブリン様の特性例えば、Fc-FcγR相互作用を示すダイアボディ分子の形成をもたらす。Fcを含むダイアボディは、例えば、それぞれがVHドメイン、VLドメインおよびFcドメインを含む2本のポリペプチド鎖からなる二量体であり得る。前述のポリペプチド鎖の二量体形成により、非改変型二価抗体の構造とは異なる構造であるにもかかわらず、Fcドメインを含む二価のダイアボディが生じる図11。このようなダイアボディ分子は、野生型免疫グロブリンと比較すると、例えば、血清半減期や結合特性の変化といった表現型の変化を示す。他の実施形態では、Fcドメインを含むダイアボディ分子は四量体であってもよい。このような四量体は、2本の重いポリペプチド鎖、すなわち、VL、VHおよびFcドメインを含むポリペプチド鎖と、2本の軽いポリペプチド鎖、すなわち、VLおよびVHを含むポリペプチド鎖とを含む。前述の軽い鎖および重い鎖は相互作用して単量体を形成し、これらの単量体は、それらの対合していないFcドメインを介して相互作用してIgG様分子を形成する。このようなIg様ダイアボディは四価であり、単一特異性、二重特異性または四重特異性であり得る。ダイアボディ分子の少なくとも2つの結合部位は、同じまたは異なるエピトープを認識できる。異なるエピトープは、同じ抗原に由来しても異なる抗原に由来してもよい。一実施形態では、エピトープは異なる細胞に由来する。別の実施形態では、エピトープは同じ細胞またはウイルス上の細胞表面抗原である。エピトープ結合部位は、抗体の生成が可能な抗原はいずれも認識できる。例えば、タンパク質、核酸、細菌毒素、細胞表面マーカー、自己免疫マーカー、ウイルスタンパク質、薬物などが挙げられる。特定の態様では、ダイアボディの少なくとも1つのエピトープ結合部位は、B細胞もしくはT細胞、貪食細胞、ナチュラルキラーNK細胞または樹状細胞などの特定の細胞上の抗原に対して特異的である。ダイアボディのポリペプチド鎖の各ドメイン、すなわち、VL、VHおよびFCドメインはペプチドリンカーによって隔てられていてもよい。ペプチドリンカーは、0、1、2、3、4、5、6、7、8または9個のアミノ酸であり得る。特定の実施形態では、アミノ酸リンカー配列は、核酸配列配列番号74によりコードされているGGGSGGGG配列番号10である。特定の実施形態では、ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖は少なくとも1個のシステイン残基を含むように操作され、このシステイン残基は、本発明の第2のポリペプチド鎖上の少なくとも1個のシステイン残基における対応物と相互作用して、鎖間ジスルフィド結合を形成する。該鎖間ジスルフィド結合はダイアボディ分子を安定化させる働きをし、組換え系における発現および回収を改善し、その結果、安定かつ一貫性のある調製物をもたらすとともに、単離および/または精製された産物のinvivo安定性を改善する。該少なくとも1個のシステイン残基は、単一のアミノ酸として、またはより長いアミノ酸配列例えばヒンジドメインの一部として、ポリペプチド鎖の任意の部分に導入することができる。特定の実施形態では、該少なくとも1個のシステイン残基をポリペプチド鎖のC末端に存在するように操作される。いくつかの実施形態では、該少なくとも1個のシステイン残基は、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列LGGC内に導入される。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖のC末端は、アミノ酸配列LGGCを含む。別の実施形態では、該少なくとも1個のシステイン残基は、ポリペプチドの、例えば配列番号1または配列番号4の、ヒンジドメインを構成するアミノ酸配列内に導入される。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子のポリペプチド鎖のC末端は、IgGのヒンジドメインのアミノ酸配列、例えば配列番号1を含む。別の実施形態では、本発明のダイアボディ分子のポリペプチド鎖のC末端は、ヌクレオチド配列配列番号78によりコードされ得るアミノ酸配列VEPKSC配列番号77を含む。他の実施形態では、該少なくとも1個のシステイン残基は、ポリペプチド鎖のヌクレオチド配列配列番号76によりコードされ得るアミノ酸配列LGGCFNRGEC配列番号17内に導入される。特定の実施形態では、本発明のダイアボディを構成するポリペプチド鎖のC末端は、ヌクレオチド配列配列番号76によりコードされ得るアミノ酸配列LGGCFNRGEC配列番号17を含む。さらに他の実施形態では、該少なくとも1個のシステイン残基は、ポリペプチド鎖の、ヌクレオチド配列配列番号75によりコードされ得るアミノ酸配列FNRGEC配列番号23内に導入される。特定の実施形態では、本発明のダイアボディを構成するポリペプチド鎖のC末端は、ヌクレオチド配列配列番号75によりコードされ得るアミノ酸配列FNRGEC配列番号23を含む。特定の実施形態では、ダイアボディ分子は少なくとも2本のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖はアミノ酸配列LGGCを含み、かつ、前述のLGGC配列中のシステイン残基間のジスルフィド結合により共有結合されている。別の特定の実施形態では、ダイアボディ分子は少なくとも2本のポリペプチド鎖を含み、そのうち1つは配列FNRGEC配列番号23を含み、他のものはヒンジドメイン少なくとも1個のシステイン残基を含むを含み、この場合、該少なくとも2本のポリペプチド鎖は、FNRGEC配列番号23中のシステイン残基とヒンジドメイン中のシステイン残基の間でジスルフィド結合によって共有結合されている。特定の態様では、ヒンジドメイン中に存在してジスルフィド結合に関与するシステイン残基はCys-128KabatEUによる符番;非改変型の完全IgG重鎖のヒンジドメイン中に位置するであり、配列番号23中の対応するシステイン残基はCys-214KabatEUによる符番;非改変型の完全IgG軽鎖のC末端に位置するであるElkabetzらCysteinesInCH1UnderlieRetentionOfUnassembledIgHeavyChainsJBiolChem2801440214412参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。さらに他の実施形態では、少なくとも1個のシステイン残基を、アミノ酸鎖のN末端に存在するように操作する。さらに他の実施形態では、少なくとも1個のシステイン残基を、ダイアボディ分子のポリペプチド鎖のリンカー部分に存在するように操作する。さらなる実施形態では、VHドメインまたはVLドメインを、親VHドメインまたはVLドメインと比較して少なくとも1個のアミノ酸の改変を含むように操作し、その結果、該アミノ酸改変は、親アミノ酸のシステインによる置換を含む。本発明は、Fcドメインまたはその一部例えば、CH2ドメインまたはCH3ドメインを含むダイアボディ分子を包含する。Fcドメインまたはその一部は、限定されるものではないがIgA、IgD、IgG、IgEおよびIgMを含む、いずれの免疫グロブリンのアイソタイプまたはアロタイプに由来してもよい。好ましい実施形態では、Fcドメインまたはその一部はIgGに由来する。特定の実施形態では、IgGアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4、またはそれらのアロタイプである。一実施形態では、ダイアボディ分子はFcドメインを含み、該Fcドメインは、任意の免疫グロブリンアイソタイプから独立に選択されるCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むすなわち、FcドメインはIgGに由来するCH2ドメインとIgEに由来するCH3ドメイン、またはIgG1に由来するCH2ドメインとIgG2に由来するCH3ドメインなどを含む。該Fcドメインは、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖において、該ポリペプチド鎖の他のドメインまたは部分に対していずれの位置にも遺伝子工学的に導入することができる例えば、Fcドメインもしくはその一部が、ポリペプチド鎖のVLおよびVHの両ドメインのC末端にあってもよく、VLおよびVHの両ドメインのN末端にあってもよく、または一方のドメインのN末端、他方のドメインのC末端にすなわち、ポリペプチド鎖の2つのドメインの間にあってもよい。本発明はまた、ヒンジドメインを含む分子も包含する。ヒンジドメインは、IgA、IgD、IgG、IgEおよびIgMを含む、いずれの免疫グロブリンのアイソタイプまたはアロタイプに由来してもよい。好ましい実施形態では、ヒンジドメインはIgGに由来し、そのIgGアイソタイプはIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4、またはそれらのアロタイプである。該ヒンジドメインは、ダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖にFcドメインとともに遺伝子工学的に導入することができ、その結果、該ダイアボディ分子はヒンジ-Fcドメインを含む。特定の実施形態では、ヒンジおよびFcドメインは、当技術分野で公知のまたは本明細書で例示される任意の免疫グロブリンアイソタイプから独立に選択される。他の実施形態では、このヒンジとFcドメインは、ポリペプチド鎖の少なくとも1つの他のドメイン、例えば、VLドメインにより隔てられている。ヒンジドメインまたは場合によりヒンジ-Fcドメインを、本発明のポリペプチドにおいて、前述のポリペプチド鎖の他のドメインまたは一部に対していずれの位置にも遺伝子工学的に導入することができる。特定の実施形態では、本発明のポリペプチド鎖はヒンジドメインを含み、このヒンジドメインは、Fcドメインを含まないポリペプチド鎖のC末端に存在する。さらに他の実施形態では、本発明のポリペプチド鎖は、ポリペプチド鎖のC末端に存在するヒンジ-Fcドメインを含む。さらなる実施形態では、本発明のポリペプチド鎖は、ポリペプチド鎖のN末端に存在するヒンジ-Fcドメインを含む。上述のように、本発明は、各ポリペプチド鎖がVHドメインとVLドメインを含むポリペプチド鎖の多量体を包含する。特定の態様において、該多量体のポリペプチド鎖はFcドメインをさらに含む。Fcドメインの二量体形成は、免疫グロブリン様機能、すなわち、Fc媒介機能例えば、Fc-FcγR相互作用、補体結合などを示すダイアボディ分子の形成をもらたす。特定の実施形態では、各ポリペプチド鎖を構成するVLおよびVHドメインは同じ特異性を有し、該ダイアボディ分子は二価であり、かつ、単一特異性である。他の実施形態では、各ポリペプチド鎖を構成するVLおよびVHドメインは異なる特異性を有し、該ダイアボディは二価であり、かつ、二重特異性である。さらに他の実施形態において、本発明のダイアボディ分子は、各ポリペプチド鎖がVHドメインとVLドメインを含むポリペプチド鎖の四量体を包含する。特定の実施形態では、四量体の2つのポリペプチド鎖はさらにFcドメインを含む。従って、四量体は、それぞれがVL、VHおよびFcドメインを含む2本の重いポリペプチド鎖と、VLおよびVHドメインを含む2本の軽いポリペプチド鎖を含む。重鎖と軽鎖の相互作用による二価単量体の形成は、重鎖のFcドメインによる該単量体の二量体形成と相まって、四価の免疫グロブリン様分子の形成をもたらす実施例6.2および6.3に例示。特定の態様では、これらの単量体は同一であり、四価のダイアボディ分子は単一特異性または二重特異性である。他の態様では、これらの単量体は異なり、四価の分子は二重特異性または四重特異性である。上記の四重特異性ダイアボディ分子の形成は、4本の異なるポリペプチド鎖の相互作用を必要とする。そのような相互作用を単細胞組換え生産系で効率的に達成することは、鎖の潜在的な誤対合による多数の変異体のために困難である。誤対合の可能性の増大に対する1つの解決策は、所望のポリペプチド鎖対にノブインホール型突然変異を遺伝子工学的に導入することである。このような突然変異には、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成が好都合である。例えば、Fc-Fc相互作用に関して、アミノ酸置換好ましくは、ノブを形成する嵩高の側基を含むアミノ酸、例えばトリプトファンによる置換をCH2ドメインまたはCH3ドメインに導入し、それにより、立体障害が類似の変異を有するドメインとの相互作用を妨げ、かつ、立体障害がその変異型ドメインを、相補的または適合する突然変異、すなわち、ホール例えばグリシンによる置換が遺伝子工学的に導入されたドメインと強制的に対合させるようにすることができる。このような突然変異のセットは、ダイアボディ分子を構成するポリペプチドのいずれの対にも遺伝子工学的に導入することができ、さらに、そのような対のポリペプチド鎖のいずれの部分にも遺伝子工学的に導入することができる。ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成に有利なタンパク質操作の方法、特に免疫グロブリン様分子の操作については、当技術分野で周知であり、本明細書に包含される例えば、RidgwayらKnobsIntoHolesEngineeringOfAntibodyCH3DomainsForHeavyChainHeterodimerizationProteinEngr9617621、AtwellらStableHeterodimersFromRemodelingTheDomainInterfaceOfAHomodimerUsingAPhageDisplayLibraryJMolBiol2702635、およびXieらANewFormatOfBispecificAntibodyHighlyEfficientHeterodimerizationExpressionAndTumorCellLysisJImmunolMethods29695101参照、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。本発明はまた、変異型Fcドメインもしくは変異型ヒンジ-Fcドメインまたはその一部を含むダイアボディ分子も包含し、この変異型Fcドメインは、対応する野生型のFcドメインもしくはヒンジ-Fcドメインまたはその一部と比較して、少なくとも1個のアミノ酸改変例えば、置換、挿入、欠失を含む。変異型のFcドメインもしくはヒンジ-Fcドメインまたはその一部を含む分子例えば、抗体は、野生型のFcドメインもしくはヒンジ-Fcドメインまたはその一部を含む分子と比較して、通常は表現型の変化を示す。変異型の表現型は、NK依存性またはマクロファージ依存性アッセイでアッセイされるような、血清半減期の変化、安定性の変化、細胞性酵素に対する感受性の変化、またはエフェクター機能の変化として発現される場合がある。エフェクター機能を変化させることが確認されたFcドメイン変異体は、国際公開第04/063351号、米国特許出願公開第2005/0037000号および同第2005/0064514号、米国仮出願第60/626,510号2004年11月10日出願、同第60/636,663号2004年12月15日出願および同第60/781,564号2006年3月10日出願、ならびに本発明者の同時出願である米国特許出願公開第11/271,140号2005年11月10日出願および同第11/305,787号2005年12月15日出願に開示されており、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。本発明の二重特異性ダイアボディは、2つの独立した、異なるエピトープに同時に結合することができる。特定の実施形態では、エピトープは同じ抗原に由来する。他の実施形態では、エピトープは異なる抗原に由来する。好ましい一実施形態では、少なくとも1つのエピトープ結合部位が、Tリンパ球、ナチュラルキラーNK細胞、または他の単核細胞で発現され、免疫エフェクター細胞上で発現される決定因子例えば、CD3、CD16、CD32、CD64などに特異的である。一実施形態において、ダイアボディ分子は、エフェクター細胞の決定因子に結合し、また該エフェクター細胞を活性化する。これに関して、本発明のダイアボディ分子は、それらがさらにFcドメインを含んでいるかどうかとは無関係に、Ig様機能を示すことができる例えば、当技術分野で公知の、または本明細書に例示される任意のエフェクター機能アッセイ例えばADCCアッセイでアッセイされる。特定の実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディは、腫瘍細胞上の癌抗原とエファクター細胞の決定因子の双方に結合すると同時に該細胞を活性化させる。別の実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子は、上記背景技術の節を参照のように、同じ細胞上の活性化受容体と阻害型受容体に同時に結合し例えば、CD32AとCD32Bの双方、BCRとCD32Bの双方、またはIgERIとCD32Bの双方に結合する、それらを連結することによって、標的例えばエフェクター細胞の活性化を阻害することができる。本実施形態のさらなる態様において、二重特異性ダイアボディは、ウイルス上の2つの中和エピトープ例えば、RSVエピトープ;E16およびE53のようなWNVエピトープに同時に結合することによって、抗ウイルス性を示すことができる。特定の実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディ分子は、特定の細胞種を標的とするための独特な機会を提供する。例えば、二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子は、標的細胞種または標的組織種に独特な抗原のセットを認識するエピトープ結合部位の組合せを含むように操作することができる。さらに、個々の抗原の一方または双方が、他の組織種および/または細胞種においてそれぞれかなり一般的なものである場合には、低親和性結合ドメインを用いて、ダイアボディまたはダイアボディ分子を構築することができる。このような低親和性結合ドメインは、治療目的に十分な結合力で個々のエピトープまたは抗原に結合することはできないであろう。しかしながら、エピトープまたは抗原の双方が、単一の標的細胞または標的組織に存在する場合には、その細胞または組織に対するダイアボディまたはダイアボディ分子の結合力は、抗原1つだけを発現している細胞または組織の場合と比較して高くなり、従って、該細胞または組織は本発明によって効率的に標的化され得る。このような二重特異性分子は、1つの抗原に対して特異性を持つだけの単一特異性ダイアボディまたは抗体と比較して、前述の両抗原を発現する細胞上の一方または双方の標的抗原に対する結合の増強を示し得る。好ましくは、本発明のダイアボディの結合特性は、結合活性および/または1以上のFcγRメディエーターエフェクター細胞機能Fc-FcγR相互作用を介して、またはFcγRに対するダイアボディ分子の免疫特異的結合によって媒介されるを測定するためのinvitro機能アッセイにより同定される第5.4.2節および第5.4.3節参照。FcγRに対する本発明の分子例えば、ダイアボディの親和性および結合特性を、結合ドメイン-抗原またはFc-FcγRの相互作用すなわち、それぞれ結合ドメインに対する抗原の特異的結合、またはFcγRに対するFc領域の特異的結合を測定するための当技術分野で公知のinvitroアッセイ生化学または免疫学に基づくアッセイを用いて測定することができ、これらには、限定されるものではないが、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイが含まれる第5.4.2節参照。最も好ましい実施形態では、本発明の分子はinvivoモデル本明細書に記載され、開示されるものなどにおいて、invitroに基づくアッセイにおけるものと同様の結合特性を有する。しかしながら、本発明はinvitroに基づくアッセイでは所望の表現型を示さないが、invivoでは所望の表現型を示す本発明の分子を排除するものではない。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、鋳型分子の対応する部分と比べて変化したグリコシル化パターンまたは変化したグリコフォームを含むように操作される。操作されたグリコフォームは、限定されるものではないが、エフェクター機能の増強を含む、様々な目的に有用であり得る。操作されたグリコフォームは、例えば、操作されたもしくは変異型の発現株の使用、1以上の酵素、例えばDIN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIGnTIIIとの同時発現、種々の生物もしくは種々の生物由来の細胞株における本発明のダイアボディの発現、またはダイアボディを発現させて精製した後の糖鎖を修飾によるなど、当業者に公知の任意の方法によって作製することができる。操作されたグリコフォームを作製する方法は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、UmanaらEngineeredGlycoformsOfAnAntineuroblastomaIgG1WithOptimizedAntibodyDependentCellularCytotoxicActivityNatBiotechnol17176180DaviesらExpressionOfGnTIIIInARecombinantAntiCD20CHOProductionCellLineExpressionOfAntibodiesWithAlteredGlycoformsLeadsToAnIncreaseInAdccThroughHigherAffinityForFcGammaRIIIBiotechnolBioeng74288294ShieldsらLackOfFucoseOnHumanIgG1NLinkedOligosaccharideImprovesBindingToHumanFcgammaRIIIAndAntibodyDependentCellularToxicityJBiolChem2772673326740ShinkawaらTheAbsenceOfFucoseButNotThePresenceOfGalactoseOrBisectingNAcetylglucosamineOfHumanIgG1ComplexTypeOligosaccharidesShowsTheCriticalRoleOfEnhancingAntibodyDependentCellularCytotoxicityJBiolChem27834663473米国特許第6,602,684号;米国特許出願公開第10/277,370号;米国特許出願公開第10/113,929号;国際公開第00/61739A1号;国際公開第01/292246A1号;国際公開第02/311140A1号;国際公開第02/30954A1号に記載されているもの;Potillegent商標技術Biowa,Inc.ニュージャージー州プリンストン;GlycoMAb商標グリコシル化エンジニアリング技術GLYCARTbiotechnologyAG、スイス、チューリッヒが含まれ、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。例えば、国際公開第00061739号;EA第01229125号;US第20030115614号;OkazakiらFucoseDepletionFromHumanIgG1OligosaccharideEnhancesBindingEnthalpyAndAssociationRateBetweenIgG1AndFcGammaRIIIAJMB336123949それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる参照。さらに本発明は、本発明のダイアボディを作製するために非天然アミノ酸を組み込むことを包含する。そのような方法は当業者には公知であり、例えば、天然の生合成機構を用いてタンパク質への非天然アミノ酸の組込みを可能にする方法などがある。例えば、WangらExpandingTheGeneticCodeChemComm1111WangらExpandingTheGeneticCodeOfEscherichiacoliScience292498500vanHestらProteinBasedMaterialsTowardANewLevelOfStructuralControlChemComm1918971904それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる参照。別法として、アミノアシルtRNAの生合成に関与する酵素に焦点を当てたものがある。例えば、TangらBiosynthesisOfAHighlyStableCoiledCoilProteinContainingHexafluoroleucineInAnEngineeredBacterialHostJAmChemSoc1231108911090KiickらIdentificationOfAnExpandedSetOfTranslationallyActiveMethionineAnaloguesInEscherichiacoliFEBSLett5022530それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる参照。いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化部位を付加するまたは欠失させることによって、本発明の分子のVL、VHまたはFcドメインを改変する方法を包含する。タンパク質の糖鎖を改変する方法は、当技術分野で周知であり、本発明に包含される。例えば、米国特許第6,218,149号;欧州特許第0,359,096B1号;米国特許出願公開第2002/0028486号;国際公開第03/035835号;米国特許出願公開第2003/0115614号;米国特許第6,218,149号;米国特許第6,472,511号全て参照によりその全内容を本明細書に組み入れる参照。本発明のダイアボディ分子は、ナチュラルキラー群2DNKG2D受容体に対する結合リガンドであるドメインを含むように構築することができる。このような結合リガンド、特に、正常細胞上では発現されないものとしては、組織適合性60H60分子、レチノイン酸早期誘導遺伝子-1RAE-1の産物、およびマウスUL16-結合タンパク質様転写物1MULT1が挙げられるRolesOfTheNKG2DImmunoreceptorAndItsLigandsNatureRevImmunol3781790CoudertJDらAlteredNKG2DFunctionInNKCellsInducedByChronicExposureToAlteredNKG2DLigandExpressingTumorCellsBlood10617111717。ヒトNKG2Dと反応性のあるさらなるリガンドとしては、多型性MHCクラスI鎖関連分子MICAおよびMICBNaturalKillerCellsStressOutTurnOnTuneInCurrBiol9R851R8533BauerSらActivationOfNKCellsAndTCellsByNKG2DAReceptorForStressInducibleMICAScience285727729StephensHAMICAandMICBgenescantheenigmaoftheirpolymorphismberesolvedTrendsImmunol22378385が挙げられる。MICAの配列は配列番号311:である。MICBの配列は配列番号312:である。T細胞受容体と特異的に結合する抗体としては、抗TCR抗体BMA031BMA031ATCRSpecificMonoclonalAntibodyForClinicalApplicationTransplantProc2110171019NashanBらFineSpecificityOfAPanelOfAntibodiesAgainstTheTCRCD3ComplexTransplantProc1942704272ShearmanCWらConstructionExpressionAndBiologicActivityOfMurineHumanChimericAntibodiesWithSpecificityForTheHumanαβTCellJImmunol146928935ShearmanCWらConstructionExpressionAndCharacterizationofHumanizedAntibodiesDirectedAgainstTheHumanαβTCellReceptorJImmunol14743664373が挙げられる。NKG2D受容体と特異的に結合する抗体としては、KYK-2.0GenerationAffinityMaturationAndCharacterizationOfAHumanAntiHumanNKG2DMonoclonalAntibodyWithDualAntagonisticAndAgonisticActivityJMolBiol38411431156およびPCT/US09/54911が挙げられる。このようなダイアボディの使用によって、標的細胞はこの場合、NKG2D受容体が並んだ細胞が結合できる細胞となるように再指示される。NKG2D受容体は、全てのヒトおよび他の哺乳動物のナチュラルキラー細胞上ActivationOfNKCellsAndTCellsByNKG2DAReceptorForStressInducibleMICAScience285727729JamiesonAMらTheRoleOfTheNKG2DImmunoreceptorInImmuneCellActivationAndNaturalKillingImmunity171929ならびに全てのCD8T細胞上で発現されるCostimulationOfCD8αβTCellsByNKG2DViaEngagementByMICInducedOnVirusInfectedCellsNatImmunol2255260JamiesonAMらTheRoleOfTheNKG2DImmunoreceptorInImmuneCellActivationAndNaturalKillingImmunity171929。あるいは、本発明のダイアボディ分子は、T細胞受容体TCRに対する結合リガンドであるドメインを含むように構築することもできる。TCRはCD4またはCD8T細胞により自然発現され、このような細胞に、抗原提示細胞のクラスIまたはクラスIIMHCタンパク質によって結合され提示される抗原ペプチドを認識させる。TCRによりpMHCペプチド-MHC複合体が認識されると、細胞性免疫応答の伝播が始まり、サイトカインの生産および抗原提示細胞の溶解がもたらされる例えば、ArmstrongKMらConformationalChangesAndFlexibilityInTCellReceptorRecognitionOfPeptideMHCComplexesBiochemJ415183196WillemsenRSelectionOfHumanAntibodyFragmentsDirectedAgainstTumorTCellEpitopesForAdoptiveTCellTherapyCytometryA7310931099BeierKCらMasterSwitchesOfTCellActivationAndDifferentiationEurRespirJ29804812MalloneRらTargetingTLymphocytesForImmuneMonitoringAndInterventionInAutoimmuneDiabetesAmJTher12534550参照。このようなダイアボディ分子を、例えば標的細胞の表面に存在する受容体と結合することができる少なくとも1つのエピトープ結合ドメインをさらに含むように構築すると、このようなダイアボディ分子はDART分子となり、そして標的細胞に結合することができるようになり、それにより、それらの標的細胞にナチュラルキラー群2DNKG2D受容体またはTCRに対する結合リガンドどちらも標的細胞が結合したダイアボディ上に存在するを提示させる例えば、GermainCらRedirectingNKCellsMediatedTumorCellLysisByANewRecombinantBifunctionalProteinProtEngineerDesignSelection21665672参照。このようなダイアボディを使用して、標的細胞をNK細胞媒介細胞溶解またはT細胞媒介細胞傷害性の標的である細胞へと向け直すことができる。一実施形態では、標的細胞の表面に存在する受容体に結合することができるダイアボディのエピトープ結合ドメインは、このような癌細胞をNK細胞媒介細胞溶解またはT細胞媒介細胞傷害性の基質へと向け直すよう腫瘍関連抗原に結合するエピトープである。乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頚癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫抗原、B細胞悪性腫瘍関連抗原、多発性骨髄腫関連抗原、非ホジキンリンパ腫関連抗原または慢性リンパ性白血病関連抗原である腫瘍関連抗原が特に注目される。このような使用のための好適な腫瘍関連抗原としては、A33結腸直腸癌抗原;AlmqvistY2006NuclMedBiolNov33991998;B169;BAGE57784;β-カテニン2509;CA125;CD516773;CD1913948;CD20112536;CD22E53251;CD23;CD2513948;CD27123440;CD28123440;CD36317;CD40/CD154;CD4533946;CD56123440;CD79a/CD79b13948ChuPGら2001ApplImmunohistochemMolMorphol997106;CD10313948;CDK421104;CEA癌胎児性抗原;MathelinC2006GynecolObstetFertil3463846TellezAvilaFIら2005RevInvestClin578149;CTLA420613;EGF-R上皮細胞増殖因子受容体;AdenisAら2003BullCancer90SpecNoS22832;ErbErbB1;ErbB3;ErbB4;ZhouHら2002Oncogene21873240RimonEら2004IntJOncol24132538;GAGEGAGE-1;GAGE-2;AkcakanatAら2006IntJCancer1181238;GD2/GD3/GM2101825;gp10061627;HER-2/neu38691;ヒト乳頭腫ウイルス-E6/ヒト乳頭腫ウイルス-E7;KSA17-1A;MAGE57784;MART37782;MUC-163846;MUM-132331;N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2134;p1566777;PSA前立腺特異的抗原;CraccoCMら2005MinervaUrolNefrol5730111;PSMA;sTn88191;TNF受容体TNF-α受容体、TNF-β受容体;またはTNF-γ受容体;vanHorssenRら2006Oncologist11397408GardnerovaMら2000CurrDrugTargets132764;またはVEGF受容体9928が挙げられる。このような使用のためのさらなる腫瘍関連抗原およびこのような抗原に対して特異的に反応性のある抗体を開示する刊行物としては、ADAM-9米国特許出願公開第2006/0172350号;国際公開第06/084075号;ALCAM国際公開第03/093443号;カルボキシペプチダーゼM米国特許出願公開第2006/0166291号;CD46米国特許第7,148,038号;国際公開第03/032814号;サイトケラチン8国際公開第03/024191号;エフリン受容体特に、EphA2米国特許第7,569,672号;国際公開第06/084226号;インテグリンα-V-Β-6国際公開第03/087340号;JAM-3国際公開第06/084078号;KID3国際公開第05/028498号;KID31国際公開第06/076584号;LUCA-2米国特許出願公開第2006/0172349号;国際公開第06/083852号;オンコスタチンMオンコスタチン受容体β米国特許第7,572,896号;国際公開第06/084092号;PIPA米国特許第7,405,061号;国際公開第04/043239号;RAAG10米国特許第7,527,969号;国際公開第04/001381号;ROR1米国特許第5,843,749号;TES7国際公開第08/066691号;およびトランスフェリン受容体米国特許第7,572,895号;国際公開第05/121179号が挙げられる。また、特定の病原体、例えば、限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルスHIV、B型肝炎ウイルスHBV、インフルエンザ、ヒトパピローマウイルスHPV、口蹄疫コクサッキーウイルス、狂犬病ウイルス、単純ヘルペスウイルスHSVを含むウイルス病原体;ならびにロタウイルス、アデノウイルス、カリシウイルス、アストロウイルスおよびノーウォークウイルスを含む胃腸炎の原因病原体;限定されるものではないが、大腸菌、ネズミチフス菌、緑膿菌、コレラ菌、淋菌、ピロリ菌、インフルエンザ菌、志賀赤痢菌、黄色ブドウ球菌、結核菌および肺炎連鎖球菌を含む細菌病原体;真菌病原体およびジアルジア鞭毛虫などの寄生虫に特異的な抗原も注目される。あるいは、このようなエピトープは、例えば急性単球性白血病細胞をNK細胞媒介細胞溶解の基質に向け直すために、Fc受容体例えば、FcγRIまたはFcγRIIに結合させることができる。5.1.ダイアボディ結合ドメイン本発明のダイアボディは、一般に免疫グロブリンまたは抗体に由来する抗原結合ドメインを含む。本発明の方法に使用される結合ドメインが由来する抗体は、鳥類および哺乳類例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリを含むいずれの動物起源からのものであってもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。本明細書においてヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーもしくは合成ヒト免疫グロブリンコード配列のライブラリーから、またはヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウスから、単離された抗体を含む。本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染性疾患の治療および/または予防に関して当技術分野で公知の任意の抗体を、本発明のダイアボディの結合ドメイン源として使用することを企図する。既知の癌抗体の非限定的な例を第5.7.1節に示すとともに、列挙した標的抗原に特異的な他の抗体、および第5.6.1節に列挙した癌抗原に対する抗体も示し、また、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療および/または予防に関して既知の抗体の非限定的な例を第5.7.2節に示すとともに、列挙した標的抗原に対する抗体および第5.6.2節で列挙した抗原に対する抗体も示し、他の実施形態では、第5.6.3節に列挙した感染性疾患に関連するエピトープに対する抗体を使用することができる。特定の実施形態では、抗体は1以上のアミノ酸改変を含む変異型Fc領域を含み、これらの抗体は本発明の方法によって、付与されたエフェクター機能を持ち、かつ/または野生型Fc領域を含む匹敵する分子と比較してFcγRIIBに対する親和性が増強され、また、FcγRIIIAに対する親和性が低減されていることが確認された。本発明により遺伝子工学的に作製され得る炎症性障害の治療または予防に使用される抗体の非限定的例を表9に示し、自己免疫障害の治療または予防に使用される抗体の非限定的例を表10に示す。ヒトにおける抗体のinvivo使用およびinvitro検出アッセイを含むいくつかの使用では、ヒト、キメラまたはヒト化抗体由来の可変ドメインを有するダイアボディを使用することが好ましい場合がある。完全ヒト抗体由来の可変領域は、ヒト被験者の治療処置に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。また、米国特許第4,444,887号および同第4,716,111号;ならびに国際公開第98/46645号、同第98/50433号、同第98/24893号、同第98/16654号、同第96/34096号、同第96/33735号および同第91/10741号も参照それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。ヒト化抗体とは、所定の抗原に結合でき、かつヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域と非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRとを含む抗体、その変異体またはフラグメントである。ヒト化抗体は、少なくとも1つの、一般には2つの可変ドメインの実質的に全部を含むことができ、該可変ドメインでは、CDR領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンすなわち、ドナー抗体のCDR領域に相当し、また、フレームワーク領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体のフレームワーク領域およびCDR領域は、親配列と正確に一致する必要はなく、例えば、ドナーCDRまたはコンセンサスフレームワークは、少なくとも1個の残基の置換、挿入もしくは欠失により変異誘発させて、その部位のCDRまたはフレームワーク残基がコンセンサスまたはドナー抗体に一致しないようにすることができる。しかしながら、そのような突然変異は広範囲に及ばないことが好ましい。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75、多くの場合には90を越え、最も好ましくは95を超える残基が、親のフレームワーク領域FRおよびCDR配列の残基と一致する。ヒト化抗体は当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができ、限定されるものではないが、CDRグラフト法欧州特許第239,400号、国際公開第91/09967号ならびに米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号および同第5,585,089号、ベニアリング法またはリサーフェイシング法欧州特許第592,106号および同第519,596号;PadlanAPossibleProcedureForReducingTheImmunogenicityOfAntibodyVariableDomainsWhilePreservingTheirLigandBindingPropertiesMolecularImmunology28489498StudnickaらHumanEngineeredMonoclonalAntibodiesRetainFullSpecificBindingActivityByPreservingNonCDRComplementarityModulatingResiduesProteinEngineering7805814およびRoguskaらHumanizationOfMurineMonoclonalAntibodiesThroughVariableDomainResurfacingProcNatlAcadSciUSA91969973、チェーンシャッフリング法米国特許第5,565,332号、ならびに、例えば米国特許第6,407,213号、同第5,766,886号、同第5,585,089号、国際公開第9317105号、Tanら’Superhumanized’AntibodiesReductionOfImmunogenicPotentialByComplementarityDeterminingRegionGraftingWithHumanGermlineSequencesApplicationToAnAntiCD28JImmunol169111925、CaldasらDesignAndSynthesisOfGermlineBasedHemiHumanizedSingleChainFvAgainstTheCD18SurfaceAntigenProteinEng1335360、MoreaらAntibodyModelingImplicationsForEngineeringAndDesignMethods2026779、BacaらAntibodyHumanizationUsingMonovalentPhageDisplayJBiolChem2721067884、RoguskaらAComparisonOfTwoMurineMonoclonalAntibodiesHumanizedByCDRGraftingAndVariableDomainResurfacingProteinEng9895904、CoutoらDesigningHumanConsensusAntibodiesWithMinimalPositionalTemplatesCancerRes555973s5977s、CoutoらAntiBA46MonoclonalAntibodyMc3HumanizationUsingANovelPositionalConsensusAndInVivoAndInVitroCharacterizationCancerRes55171722、SandhuARapidProcedureForTheHumanizationOfMonoclonalAntibodiesGene15040910、PedersenらComparisonOfSurfaceAccessibleResiduesInHumanAndMurineImmunoglobulinFvDomainsImplicationForHumanizationOfMurineAntibodiesJMolBiol235959973、JonesらReplacingTheComplementarityDeterminingRegionsInAHumanAntibodyWithThoseFromAMouseNature321522525、RiechmannらReshapingHumanAntibodiesForTherapyNature332323327、およびPrestaAntibodyEngineeringCurrOpBiotech3394398が挙げられる。多くの場合、抗原結合性を変更する、好ましくは改善するためには、フレームワーク領域のフレームワーク残基をCDRドナー抗体由来の対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、例えば、CDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリングによる抗原結合性に重要なフレームワーク残基の同定、および配列比較による特定の位置の通常でないフレームワーク残基の同定など、当技術分野で周知の方法により同定される。例えば、Queenらの米国特許第5,585,089号;米国特許出願公開第2004/0049014号および同第2003/0229208号;米国特許第6,350,861号;同第6,180,370号;同第5,693,762号;同第5,693,761号;同第5,585,089号;および同第5,530,101号、ならびにRiechmannらReshapingHumanAntibodiesForTherapyNature332323327全て、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる参照。最も好ましい実施形態では、ヒト化結合ドメインは、ドナーであるマウス抗体と同じエピトープに特異的に結合する。当業者ならば、本発明が一般に抗体のCDRグラフト法を包含することが分かるであろう。従って、ドナー抗体およびアクセプター抗体は、同種の動物、さらには同じ抗体クラスまたは同じ抗体サブクラスに由来してもよい。しかしながら、より通常には、ドナー抗体およびアクセプター抗体は異種の動物に由来する。典型的には、ドナー抗体は齧歯類のmAbなどの非ヒト抗体であり、アクセプター抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、ドナー抗体に由来する少なくとも1つのCDRがヒト抗体にグラフトされる。他の実施形態では、重鎖および/または軽鎖可変領域のそれぞれの、少なくとも2つ、好ましくは3つ全てのCDRがヒト抗体にグラフトされる。CDRはKabatCDR、構造的ループCDR、またはそれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも1つのCDRグラフト重鎖と少なくとも1つのCDRグラフト軽鎖とを含むヒト化FcγRIIB抗体を包含する。本発明の方法で用いられるダイアボディには、修飾された、すなわち、任意の分子種のダイアボディへの共有結合により修飾された誘導体が含まれる。例えば、限定されるものではないが、ダイアボディ誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質との結合などによって改変されたダイアボディが含まれる。限定されるものではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む公知の技術によって、多数の化学修飾のうちいずれを行ってもよい。さらに、誘導体は1以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。キメラ抗体とは、例えば非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体のように、そのキメラ抗体の部分によって異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体の作製方法は当技術分野で公知である。例えば、MorrisonTransfectomasProvideNovelChimericAntibodiesScience22912021207OiらChimericAntibodiesBioTechniques4214221GilliesらHighLevelExpressionOfChimericAntibodiesUsingAdaptedcDNAVariableRegionCassettesJImmunolMethods125191202;ならびに米国特許第6,311,415号、同第5,807,715号、同第4,816,567号および同第4,816,397号参照によりその全内容を本明細書に組み入れるを参照。多くの場合、抗原結合性を変更する、好ましくは改善するためには、フレームワーク領域のフレームワーク残基をCDRドナー抗体由来の対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、例えば、CDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリングによる抗原結合性に重要なフレームワーク残基の同定、および配列比較による特定の位置の通常でないフレームワーク残基の同定など、当技術分野で周知の方法により同定される。例えば、米国特許第5,585,089号;およびRiechmannらReshapingHumanAntibodiesForTherapyNature332323327参照によりその全内容を本明細書に組み入れるを参照。本発明のダイアボディのどの結合ドメインからのモノクローナル抗体も、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せの使用を含む当技術分野で公知の多様な技術を用いて作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で知られ、例えば、HarlowらAntibodiesALaboratoryManualHammerlingらMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomaspp563681双方とも参照によりその全内容を本明細書に組み入れるに教示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて作製することができる。本明細書においてモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を介して作製された抗体に限定されない。モノクローナル抗体とは、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を意味するものであって、それを生産する方法を意味するものではない。ハイブリドーマ技術を用いた特定の抗体の作製およびスクリーニング方法は慣例のものであり、当技術分野で周知である。非限定的例では、マウスを対象抗原またはそのような抗原を発現する細胞で免疫化することができる。例えば抗原特異的抗体がマウス血清中で検出されるなど、免疫応答が検出されれば、マウス脾臓が摘出され、脾細胞が単離される。その後、脾細胞を周知技術によって任意の好適な骨髄腫細胞と融合させる。ハイブリドーマを制限希釈によって選択しクローニングする。次に、これらのハイブリドーマクローンを当技術分野で公知の方法によって、抗原に結合できる抗体を分泌する細胞に関してアッセイする。マウスの腹腔内に陽性ハイブリドーマクローンを接種することによって、一般に高レベルの抗体を含む腹水を得ることができる。対象抗原としては、限定されるものではないが、第5.8.1節に示した癌に関連する抗原、第5.8.2節に示した自己免疫疾患および炎症性疾患に関連する抗原、第5.8.3節に示した感染性疾患に関連する抗原、および第5.8.4節に示した毒素が挙げられる。抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態では、このようなファージを利用して、レパートリーもしくはコンビナトリアル抗体ライブラリー例えば、ヒトまたはマウスから発現された抗原結合ドメイン例えば、FabおよびFvまたはジスルフィド結合安定化Fvを提示させることができる。対象抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて例えば、標識抗原、または固相表面もしくはビーズに結合または捕捉させた抗原を用いて選択または同定することができる。これらの方法で用いられるファージは、一般に、fdおよびM13を含む繊維状ファージである。抗原結合ドメインは、ファージ遺伝子IIIまたはVIIIタンパク質のいずれかに組換えで融合されたタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメントの作製に使用可能なファージディスプレイ法の例としては、BrinkmannらPhageDisplayOfDisulfideStabilizedFvFragmentsJImmunolMethods1824150AmesらConversionOfMurineFabsIsolatedFromACombinatorialPhageDisplayLibraryToFullLengthImmunoglobulinsJImmunolMethods184177186KettleboroughらIsolationOfTumorCellSpecificSingleChainFvFromImmunizedMiceUsingPhageAntibodyLibrariesAndTheReConstructionOfWholeAntibodiesFromTheseAntibodyFragmentsEurJImmunol24952958PersicらAnIntegratedVectorSystemForTheEukaryoticExpressionOfAntibodiesOrTheirFragmentsAfterSelectionFromPhageDisplayLibrariesGene187918BurtonらHumanAntibodiesFromCombinatorialLibrariesAdvancesinImmunology57191280;国際出願第PCT/GB91/01134号;国際公開第90/02809号;同第91/10737号;同第92/01047号;同第92/18619号;同第93/11236号;同第95/15982号;同第95/20401号;ならびに米国特許第5,698,426号;同第5,223,409号;同第5,403,484号;同第5,580,717号;同第5,427,908号;同第5,750,753号;同第5,821,047号;同第5,571,698号;同第5,427,908号;同第5,516,637号;同第5,780,225号;同第5,658,727号;同第5,733,743号および同第5,969,108号に開示されているものが挙げられるそれぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。ファージディスプレイ技術を使用して、抗原に対する抗体の親和性を増強することができる。この技術は、高親和性抗体を得るのに有用である。この技術は、親和性成熟と呼ばれ、突然変異誘発、または同種抗原を用いたCDRウォーキングおよび再選択を使用して、初期抗体もしくは親抗体と比較した場合に抗原に対してより高い親和性で結合する抗体を同定する例えば、GlaserらDissectionOfTheCombiningSiteInAHumanizedAntiTacAntibodyJImmunology14926072614参照。単一ヌクレオチドではなくコドン全体に対する突然変異誘発は、アミノ酸変異の半ランダムなレパートリーをもたらす。変異型クローンのプールからなるライブラリーを構築することができ、その各変異型クローンは、1つのCDR中の一アミノ酸の改変によって異なっており、かつ、各CDR残基に関してそれぞれ存在し得るアミノ酸置換を提示する変異体を含んでいる。抗原に対する結合親和性が増強されている突然変異体は、固定化した突然変異体を標識した抗原と接触させることによってスクリーニングすることができる。当技術分野で公知のいずれのスクリーニング方法も、抗原に対する結合力が増強された変異型抗体を同定するために使用可能である例えば、ELISAWuらStepwiseInVitroAffinityMaturationOfVitaxinAnAlphavBeta3SpecificHumanizedmAbProcNatlAcadSciUSA9560376042YeltonらAffinityMaturationOfTheBr96AntiCarcinomaAntibodyByCodonBasedMutagenesisJImmunology15519942004参照。軽鎖をランダム化するCDRウォーキングも可能であるSchierらIsolationOfPicomolarAffinityAntiCErbB2SingleChainFvByMolecularEvolutionOfTheComplementarityDeterminingRegionsInTheCenterOfTheAntibodyBindingSiteJMolBio263551567参照。本発明はまた、フレームワークまたはCDR領域に突然変異例えば、1以上のアミノ酸置換を持った、本明細書に記載のまたは当該分野で公知の任意の結合ドメインのアミノ酸配列を含む結合ドメインの使用を包含する。これらの結合ドメインにおける突然変異は、結合ドメインが免疫特異的に結合するFcγRIIBに対する、その結合ドメインの結合力および/または親和性を維持または増強することが好ましい。当業者に公知の標準的技術例えば、イムノアッセイを使用して、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。例えば、アミノ酸置換をもたらす、部位特異的突然変異誘発およびPCRにより媒介される突然変異誘発を含む、当業者に公知の標準的技術を使用して、抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することができる。誘導体は、元の抗体またはそのフラグメントと比較して、アミノ酸15個未満の置換、アミノ酸10個未満の置換、アミノ酸5個未満の置換、アミノ酸4個未満の置換、アミノ酸3個未満の置換、またはアミノ酸2個未満の置換を含むことが好ましい。好ましい一実施形態では、誘導体は、1以上の予測される非必須アミノ酸残基において生じた保存的アミノ酸置換を有する。5.1.1.FcγRIIBと免疫特異的に結合するエピトープ結合部位を含むダイアボディ特定の実施形態において、本発明のダイアボディの少なくとも1つの結合ドメインは、FcγRIIBの少なくとも1つの活性に促進作用を示す。本発明の一実施形態では、前述の活性は、B細胞受容体媒介シグナル伝達の阻害である。他の実施形態では、結合ドメインはB細胞の活性化、B細胞の増殖、抗体産生、B細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期の進行、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における1以上の下流シグナル伝達分子の活性を阻害する。さらに別の実施形態では、結合ドメインは、FcγRIIBのリン酸化またはSHIPの動員を増強する。本発明のさらなる実施形態では、結合ドメインはB細胞受容体媒介シグナル伝達経路においてMAPキナーゼの活性またはAktの動員を阻害する。別の実施形態では、結合ドメインは、FcεRIシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に促進作用を示す。特定の実施形態では、前述の結合ドメインは、FcεRIにより誘導されるマスト細胞の活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を阻害する。別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、FcγRIIBのリン酸化を刺激し、SHIPの動員を刺激し、SHIPのリン酸化およびそのShcとの会合を刺激し、またはMAPキナーゼファミリーメンバー例えば、Erk1、Erk2、JNK、p38などの活性化を阻害する。さらに別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、p62dokのチロシンリン酸化、ならびにそのSHIPおよびrasGAPとの会合を増強する。別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、単球またはマクロファージにおいてFcγR媒介食作用を阻害する。別の実施形態では、結合ドメインは、FcγRIIBの少なくとも1つの活性に拮抗作用を示す。一実施形態では、前述の活性は、B細胞受容体媒介シグナル伝達の活性化である。特定の実施形態では、結合ドメインは、B細胞活性、B細胞の増殖、抗体産生、細胞内カルシウム流入、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における1以上の下流シグナル伝達分子の活性を増強する。さらに別の実施形態では、結合ドメインは、FcγRIIBのリン酸化またはSHIPの動員を減少させる。本発明のさらなる実施形態では、結合ドメインは、B細胞受容体媒介シグナル伝達経路においてMAPキナーゼの活性またはAktの動員を増強する。別の実施形態では、結合ドメインは、FcεRIシグナル伝達のFcγRIIBにより媒介される阻害に拮抗作用を示す。特定の実施形態では、前述の結合ドメインは、FcεRIにより誘導されるマスト細胞の活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を増強する。別の実施形態では、結合ドメインは、FcγRIIBのリン酸化を阻害し、SHIPの動員を阻害し、SHIPのリン酸化およびそのShcとの会合を阻害し、MAPキナーゼファミリーメンバー例えば、Erk1、Erk2、JNK、p38などの活性化を増強する。さらに別の実施形態では、結合ドメインは、p62dokのチロシンリン酸化、ならびにそのSHIPおよびrasGAPとの会合を阻害する。別の実施形態では、結合ドメインは、単球またはマクロファージにおいてFcγR媒介食作用を増強する。別の実施形態では、結合ドメインは、脾臓マクロファージによるオプソニン化粒子の食作用、クリアランスを妨げる。他の実施形態では、少なくとも1つの結合ドメインを使用して、本発明のダイアボディをFcγRIIB発現細胞にターゲティングすることができる。特定の一実施形態では、結合ドメインの1つは、クローン2B6または3H7それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するにより産生されるマウスモノクローナル抗体に由来する。2B6および3H7抗体を産生するハイブリドーマは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定の下、2002年8月13日にAmericanTypeCultureCollectionに寄託され、それぞれ受託番号PTA-45912B6を産生するハイブリドーマおよびPTA-45923H7を産生するハイブリドーマが付与され、これらは参照により本明細書に組み入れる。好ましい実施形態では、結合ドメインはヒト型であるか、またはヒト化されたものであり、好ましくは、クローン3H7または2B6により産生されるヒト化型の抗体に由来する。本発明はまた、FcγRIIB、好ましくはヒトFcγRIIB、より好ましくは天然ヒトFcγRIIBと特異的に結合し、限定されるものではないが、1D5、2E1、2H9、2D11および1F2それぞれATCC受託番号PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960およびPTA-5959を有するを含むクローンに由来する他の抗体由来の結合ドメインを有するダイアボディも包含する。上記のクローンを産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定の下、2004年5月7日にAmericanTypeCultureCollectionに寄託され、これらは参照により本明細書に組み入れる。好ましい実施形態では、上記の抗体由来の結合ドメインはヒト化型である。特定の実施形態では、本発明のダイアボディに使用される結合ドメインは、抗体またはその抗原結合フラグメント由来である例えば、クローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2により産生される抗体の1以上の相補性決定領域CDR、好ましくは6つ全てCDRを含む。別の実施形態では、結合ドメインは、クローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2からそれぞれ産生されるマウスモノクローナル抗体と同じエピトープと結合し、かつ/または、例えばELISAアッセイまたは他の適当な競合イムノアッセイにおいて測定した場合に、クローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2から産生されたマウスモノクローナル抗体と競合し、かつまた、その結合ドメインがFcγRIIAと結合するよりも強い親和性でFcγRIIBと結合する。本発明はまた、クローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体の可変重鎖および/または軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、または少なくとも99同一である可変重鎖および/または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む結合ドメインを有するダイアボディも包含する。本発明はさらに、抗体またはそのフラグメントがFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合し、かつ、クローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体の1以上のCDRのアミノ酸配列と少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、または少なくとも99同一である1以上のCDRのアミノ酸配列を含む結合ドメインを有するダイアボディも包含する。2つのアミノ酸配列の同一性パーセントの決定は、BLASTタンパク質検索を含む当業者に公知のいずれの方法によっても決定することができる。本発明はまた、結合ドメインがFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合し、ストリンジェント条件下でクローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている結合ドメインを含むダイアボディの使用も包含する。好ましい実施形態では、結合ドメインは、FcγRIIAよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合し、かつ、クローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体の可変軽鎖および/または可変重鎖のヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている可変軽鎖および/または可変重鎖を含む。別の好ましい実施形態では、結合ドメインは、FcγRIIAよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合し、かつ、クローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体の1以上のCDRのヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている1以上のCDRを含む。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件としては、限定されるものではないが、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSC中、約45°Cでフィルターに結合させたDNAとハイブリダイズさせた後、0.2×SSC/0.1SDS中、約50~65°Cで1回以上の洗浄、6×SSC中、約45°Cでのフィルターに結合させたDNAとハイブリダイズさせた後、0.1×SSC/0.2SDS中、約60°Cでの1回以上の洗浄といった高ストリンジェント条件、または、当業者に公知の他の任意のストリンジェントハイブリダイゼーション条件が挙げられる例えば、AusubelFMら編1989CurrentProtocolsinMolecularBiologyvol1GreenPublishingAssociatesIncandJohnWileyandSonsIncNY631~636および2103頁参照、参照により本明細書に組み入れる。本発明はまた、フレームワークまたはCDR領域に突然変異例えば、1以上のアミノ酸置換を有する上記の結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列を含む結合ドメインの使用も包含する。これらの結合ドメインにおける突然変異は、結合ドメインが免疫特異的に結合するFcγRIIBに対する結合ドメインの結合力および/または親和性を維持または増強することが好ましい。当業者に公知の標準的技術例えば、イムノアッセイを用いて、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。例えば、アミノ酸置換をもたらす、部位特異的突然変異誘発およびPCRにより媒介される突然変異誘発を含む、当業者に公知の標準的技術を用いて、抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することができる。誘導体は、元の抗体またはそのフラグメントに対してアミノ酸15個未満の置換、アミノ酸10個未満の置換、アミノ酸5個未満の置換、アミノ酸4個未満の置換、アミノ酸3個未満の置換、またはアミノ酸2個未満の置換を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、誘導体は、1以上の予測される非必須アミノ酸残基に生じた保存的アミノ酸置換を有する。好ましい実施形態では、結合ドメインはヒト化抗体に由来する。ヒト化FcγRIIB特異的抗体は、少なくとも1つ、一般に2つの可変ドメインの実質的に全てを含んでいてもよく、この可変ドメインでは、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンすなわち、ドナー抗体のCDR領域に相当し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。本発明のダイアボディは、FcγRIIBに特異的なヒト化可変ドメインを含み、この可変ドメインでは、ヒト抗体レシピエント抗体の重鎖および/または軽鎖可変領域の1以上のCDRの1以上の領域が、FcγRIIAよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合するドナーモノクローナル抗体例えば、クローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2により産生されるモノクローナル抗体の1以上のCDRの類似部分で置換されている。他の実施形態では、ヒト化抗体は、それぞれ2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2と同じエピトープと結合する。好ましい実施形態では、ヒト化FcγRIIB結合ドメインのCDR領域は、FcγRIIBに特異的なマウス抗体に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗体は、限定されるものではないが、アクセプター抗体すなわち、ドナーモノクローナル抗体の結合特異性を保持するために必要なヒト重鎖および/または軽鎖可変ドメインフレームワーク領域のアミノ酸欠失、挿入、修飾を含む改変を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗体のフレームワーク領域は、必ずしも天然ヒト抗体可変領域のフレームワーク領域の正確なアミノ酸配列からなる必要はなく、限定されるものではないが、ヒト化抗体の特性を変更する例えば、マウスFcγRIIB特異的抗体と同じ標的に特異的なヒト化抗体領域の結合特性を改善するアミノ酸欠失、挿入、修飾を含む様々な改変を含む。最も好ましい実施形態では、非ヒトフレームワーク残基の大規模導入を避け、かつ、ヒトにおいてヒト化抗体の最小限の免疫原性を確保するために、フレームワーク領域に対して最少数の改変がなされる。ドナーモノクローナル抗体は、クローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2により産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。特定の実施形態では、結合ドメインは、そのCDRグラフト抗体がFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合するCDRグラフト抗体の可変ドメインを包含し、ここで、CDRグラフト抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、ドナーモノクローナル抗体由来の残基とを含む重鎖可変領域ドメインを含み、該ドナーモノクローナル抗体は、その抗体がFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する、例えば、クローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2から産生されるモノクローナル抗体である。別の特定の実施形態では、本発明のダイアボディは、そのCDRグラフト抗体がFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合するCDRグラフト抗体由来の可変ドメインを含み、ここで、CDRグラフト抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、ドナーモノクローナル抗体由来の残基とを含む軽鎖可変領域ドメインを含み、該ドナーモノクローナル抗体は、その抗体がFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIBと特異的に結合する、例えば、クローン2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2から産生されるモノクローナル抗体である。本発明で用いられるヒト化抗FcγRIIB可変ドメインは、CDR1配列番号24もしくは配列番号25および/またはCDR2配列番号26もしくは配列番号27および/またはCDR3配列番号28もしくは配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに/あるいはCDR1配列番号30もしくは配列番号31および/またはCDR2配列番号32、配列番号33、配列番号34もしくは配列番号35および/またはCDR3配列番号36もしくは配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有してよい。特定の一実施形態では、ダイアボディは、ヒト化2B6抗体由来の可変ドメインを含み、この場合、VH領域はヒト生殖細胞系VHセグメントであるVH1-18TheCompleteNucleotideSequenceOfTheHumanImmunoglobulinHeavyChainVariableRegionLocusJExpMed18821512162およびJH6StructureOfTheHumanImmunoglobulinMuLocusCharacterizationOfEmbryonicAndRearrangedJAndDGenesCell2758391に由来するFRセグメントと、配列番号24、配列番号26または配列番号28のアミノ酸配列を有する2B6VHの1以上のCDR領域とからなる。一実施形態では、2B6VHは配列番号38のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、2B6VHドメインは、配列番号85のHu2B6VHのアミノ酸配列を有し、配列番号86のヌクレオチド配列によりコードされ得る。別の特定の実施形態では、ダイアボディはVL領域をさらに含み、このVL領域はヒト生殖細胞系VLセグメントであるVK-A26TheHumanImmunoglobulinKappaLocusCharacterizationOfTheDuplicatedARegionsEurJImmunol2210231029およびJK4EvolutionOfHumanImmunoglobulinKappaJRegionGenesJBiolChem257151622のFRセグメントと、配列番号30、配列番号32、配列番号33、配列番号34および配列番号36のアミノ酸配列を有する、2B6VLの1以上のCDR領域とからなる。一実施形態では、2B6VLは、配列番号39、配列番号40または配列番号41のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、2B6VLは、配列番号87のHu2B6VLのアミノ酸配列を有し、配列番号88で示されるヌクレオチド配列によりコードされ得る。別の特定の実施形態では、ダイアボディは、ヒト化3H7抗体由来の可変ドメインを有し、この場合、VH領域はヒト生殖細胞系VHセグメント由来のFRセグメントと、配列番号35のアミノ酸配列を有する3H7VHのCDR領域とからなる。別の特定の実施形態では、ヒト化3H7抗体はさらにVL領域を含み、このVL領域はヒト生殖細胞系VLセグメントのFRセグメントと、配列番号42のアミノ酸配列を有する3H7VLのCDR領域とからなる。特に、結合ドメインは、天然ヒトFcγRIIBの細胞外ドメインと免疫特異的に結合し、かつ、以下の組合せのいずれかで2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2のCDR配列を含むあるいは、からなる:VHCDR1およびVLCDR1;VHCDR1およびVLCDR2;VHCDR1およびVLCDR3;VHCDR2およびVLCDR1;VHCDR2およびVLCDR2;VHCDR2およびVLCDR3;VHCDR3およびVHCDR1;VHCDR3およびVLCDR2;VHCDR3およびVLCDR3;VH1CDR1、VHCDR2およびVLCDR1;VHCDR1、VHCDR2およびVLCDR2;VHCDR1、VHCDR2およびVLCDR3;VHCDR2、VHCDR3およびVLCDR1;VHCDR2、VHCDR3およびVLCDR2;VHCDR2、VHCDR2およびVLCDR3;VHCDR1、VLCDR1およびVLCDR2;VHCDR1、VLCDR1およびVLCDR3;VHCDR2、VLCDR1およびVLCDR2;VHCDR2、VLCDR1およびVLCDR3;VHCDR3、VLCDR1およびVLCDR2;VHCDR3、VLCDR1およびVLCDR3;VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3およびVLCDR1;VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3およびVLCDR2;VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3およびVLCDR3;VHCDR1、VHCDR2、VLCDR1およびVLCDR2;VHCDR1、VHCDR2、VLCDR1およびVLCDR3;VHCDR1、VHCDR3、VLCDR1およびVLCDR2;VHCDR1、VHCDR3、VLCDR1およびVLCDR3;VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1およびVLCDR2;VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1およびVLCDR3;VHCDR2、VHCDR3、VLCDR2およびVLCDR3;VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1およびVLCDR2;VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1およびVLCDR3;VHCDR1、VHCDR2、VLCDR1、VLCDR2およびVLCDR3;VHCDR1、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2およびVLCDR3;VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2およびVLCDR3;または本明細書に開示されるVHCDRおよびVLCDRの任意の組合せ。本発明のダイアボディに含まれる結合ドメインの由来となる抗体は、FcγRIIAと比較してFcγRIIBに最も強い特異性を有する抗体を選択できるようなエピトープマッピングによってさらに特性決定を行うことができる。抗体のエピトープマッピング法は当技術分野で周知であり、本発明の方法に包含される。特定の実施形態では、FcγRIIBの1以上の領域を含む融合タンパク質を、本発明の抗体のエピトープをマッピングする際に使用することができる。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ヒトIgG2のFc部分に融合された、FcγRIIBの領域のアミノ酸配列を含む。各融合タンパク質は、下表2に示すようなアミノ酸置換および/または該受容体の特定領域の、相同受容体例えばFcγRIIAの対応領域による置換をさらに含むことができる。pMGX125およびpMGX132は、FcγRIIB受容体のIgG結合部位を含み、前者はFcγRIIBのC末端を有し、後者はFcγRIIAのC末端を有し、C末端の結合性を識別するために使用することができる。その他は、IgG結合部位におけるFcγRIIA置換、およびFcγRIIAまたはFcγRIIBのいずれかのN末端を有する。これらの分子は、抗体が結合する受容体分子の部分を決定するのに役立ち得る。表2はモノクローナル抗FcγRIIB抗体のエピトープを調べるために使用可能な融合タンパク質の一覧。残基172~180はFcγRIIAおよびBのIgG結合部位に属す。FcγRIIA配列由来の特異的アミノ酸を太字で示す。融合タンパク質は、本発明の抗FcγRIIB抗体との結合を測定するためのいずれかの生化学的アッセイ、例えばELISAで使用することができる。他の実施形態では、特定の残基をFcγRIIA配列の残基で置換したペプチドを用いて、エピトープ特異性のさらなる確認を行うことができる。抗体は、本発明の抗体の機能、特にFcγRIIBシグナル伝達を調節するための活性を同定するアッセイ法を用いて特性決定を行うことができる。例えば、本発明の特性決定アッセイは、FcγRIIBのITIMモチーフ中のチロシン残基のリン酸化を測定したり、またはB細胞受容体によって生じるカルシウム動員の阻害を測定したりすることができる。本発明の特性決定アッセイは、細胞系アッセイまたは無細胞系アッセイであり得る。マスト細胞においては、FcγRIIBと、高親和性IgE受容体FcεRIとの共凝集が、抗原誘導性脱顆粒、カルシウム動員、およびサイトカイン産生の阻害をもたらすことは当技術分野で十分に確認されているMastCellsPhysiolRev7710331079LongEORegulationOfImmuneResponsesThroughInhibitoryReceptorsAnnuRevImmunol17875904。このシグナル伝達経路の分子的詳細が最近解明されたDownstreamOfKinasep62IsAMediatorOfFcgammaIIBInhibitionOfFcEpsilonRISignalingJImmunol16244304439。ひとたびFcεRIと共凝集すると、FcγRIIBは、そのITIMモチーフ中のチロシン上ですぐにリン酸化され、その後、SH2ドメイン含有イノシトールポリホスフェート5-ホスファターゼであるSrcホモロジー2含有イノシトール-5-ホスファターゼp62AConstitutivelyTyrosinePhosphorylatedGAPAssociatedProteinInChronicMyelogenousLeukemiaProgenitorCellsCell88197204YamanshiらIdentificationOfTheAblAndrasGAPAssociated62kDaProteinAsADockingProteinDokCell88205211。本発明で使用される抗FcγRIIB抗体は、同様に、1以上のIgE媒介応答を調節する能力について特性決定を行うことができる。IgEに対して高親和性の受容体およびFcγRIIBに対して低親和性の受容体を同時発現する細胞株を、IgE媒介応答の調節における抗FcγRIIB抗体の特性決定に用いることが好ましい。特定の実施形態では、全長ヒトFcγRIIBでトランスフェクトしたラット好塩基球性白血病細胞株RBL-H23;BarsumianELらIgEInducedHistamineReleaseFromRatBasophilicLeukemiaCellLinesIsolationOfReleasingAndNonreleasingClonesEurJImmunol11317323、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる由来の細胞が使用される。RBL-2H3は、十分に特性決定されたラット細胞株であり、IgE媒介細胞活性化後のシグナル伝達機構を研究するのに広く使用されている。RBL-2H3細胞で発現され、FcεRIと共凝集すると、FcγRIIBは、FcεRI誘導カルシウム動員、脱顆粒およびサイトカイン産生を阻害するFcEpsilonReceptorIAssociatedLynDependentPhosphorylationOfFcGammaReceptorIIBDuringNegativeRegulationOfMastCellActivationJImmunol16016471658DaeronらRegulationOfHighAffinityIgEReceptorMediatedMastCellActivationByMurineLowAffinityIgGReceptorsJClinInvest95577OttVLDownstreamOfKinasep62IsAMediatorOfFcgammaIIBInhibitionOfFcEpsilonRISignalingJImmunol16244304439。本発明で使用される抗体は、FcεRI誘導型マスト細胞活性化の阻害についても特性決定を行うことができる。例えば、FcγRIIBでトランスフェクトされたラット好塩基球性白血病細胞株RBL-H23;BarsumianELらIgEInducedHistamineReleaseFromRatBasophilicLeukemiaCellLinesIsolationOfReleasingAndNonreleasingClonesEurJImmunol11317323由来の細胞にIgEを感作させ、FcεRIだけを凝集させるウサギ抗マウスIgGのFab’2フラグメント、またはFcγRIIBとFcεRIを共凝集させる完全ウサギ抗マウスIgGで刺激する。この系では、感作および刺激した細胞に本発明の抗体を添加した際に、下流シグナル伝達分子の間接的な調節をアッセイすることができる。例えば、FcγRIIBのチロシンリン酸化およびSHIPの動員とリン酸化、限定されるものではないがErk1、Erk2、JNKまたはp38を含むMAPキナーゼファミリーメンバーの活性化、ならびにp62dokのチロシンリン酸化およびそのSHIPおよびRasGAPとの会合をアッセイすることができる。本発明の抗体によりFcεRI誘導型マスト細胞活性化の阻害を測定するための1つの例示的アッセイは、RBL-H23細胞をヒトFcγRIIBでトランスフェクトすること;RBL-H23細胞にIgEを感作させること;RBL-H23細胞をウサギ抗マウスIgGのFab’2対照として、FcεRIのみを凝集させ、FcεRI媒介シグナル伝達を惹起させるで刺激するか、またはRBL-H23細胞を完全ウサギ抗マウスIgGFcγRIIBとFcεRIを共凝集させ、FcεRI媒介シグナル伝達の阻害を生じさせるで刺激することを含み得る。完全ウサギ抗マウスIgG抗体で刺激した細胞をさらに本発明の抗体とともにプレインキュベートすることができる。本発明の抗体とともにプレインキュベートした細胞、および本発明の抗体とともにプレインキュベートしなかった細胞のFcεRI依存性活性を測定し、これらの細胞におけるFcεRI依存性活性のレベルを比較することで、本発明の抗体によるFcεRI依存性活性の調節が示される。上記の例示的アッセイを使用して、例えば、FcγRIIB受容体へのリガンドIgGの結合を遮断し、かつ、FcγRIIBとFcεRIの共凝集を妨げることによってFcεRIシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に拮抗作用を示す抗体を同定することができる。同様にこのアッセイは、FcγRIIBとFcεRIの共凝集を増強し、かつ、FcγRIIBとFcεRIの共凝集を促進することによってFcεRIシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に促進作用を示す抗体も同定する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の、または当技術分野で既知の、同定された抗FcγRIIB抗体のエピトープ結合ドメインを含む本発明の抗FcγRIIBダイアボディは、好ましくは細胞系アッセイにおいて、マスト細胞もしくは好塩基球の脱顆粒をモニタリングかつ/または測定することにより、IgE媒介応答の調節能について特性決定される。このようなアッセイで使用されるマスト細胞または好塩基球は、当業者に公知の標準的な組換え法を用いて、ヒトFcγRIIBを含むように操作されていることが好ましい。特定の実施形態では、本発明の抗FcγRIIB抗体は、細胞系のβヘキソサミニダーゼ顆粒中に含まれる酵素放出アッセイでIgE媒介応答の調節能について特性決定される。マスト細胞および好塩基球からのβヘキソサミニダーゼの放出は、急性アレルギー症状および急性炎症症状の初期事象であるCorrelationBetweenCytosolicCalciumConcentrationAndDegranulationInRBL2H3CellsInThePresenceOfVariousConcentrationsOfAntigenSpecificIgEsImmunolLett75185189AketaniらAScreeningMethodForAntigenSpecificIgEUsingMastCellsBasedOnIntracellularCalciumSignalingAnalChem7226532658。限定されるものではないが、セロトニンおよびヒスタミンを含む、の炎症性メディエーターの放出を本発明の方法に従ってアッセイし、IgE媒介応答を測定することもできる。特定の作用機序に縛られるものではないが、マスト細胞および好塩基球からのβヘキソサミニダーゼ含有顆粒のような顆粒の放出は、FcγRIと多価抗原との架橋によって開始される細胞内カルシウム濃度依存的プロセスである。ヒトマスト細胞の研究の可能性は、適切な長期ヒトマスト細胞培養物がないことで制限されている。最近になって、LAD1およびLAD2と呼ばれる2種の新規な幹細胞因子依存性のヒトマスト細胞株が、マスト細胞肉腫/白血病患者由来の骨髄液から確立されたKirshenbaumらCharacterizationOfNovelStemCellFactorResponsiveHumanMastCellLinesLAD1And2EstablishedFromAPatientWithMastCellSarcomaLeukemiaActivationFollowingAggregationOfFcRIOrFcγRILeukemiaresearch2767782、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。両細胞株とも、FcεRIおよびいくつかのヒトマスト細胞マーカーを発現することが記載されている。LAD1細胞およびLAD2細胞は、IgE媒介応答に対する本発明の抗体の効果を評価するために使用することができる。特定の実施形態では、上記のような細胞系のβヘキソサミニダーゼ放出アッセイをLAD細胞で使用して、本発明の抗FcγRIIB抗体によるIgE媒介応答のいずれの調節も測定することができる。例示的アッセイでは、例えば、LAD1などのヒトマスト細胞を、ヒトキメラIgE抗ニトロフェノールNPでプライムし、多価抗原BSA-NPで刺激し、細胞の脱顆粒を、上清中に放出されるβヘキソサミニダーゼを測定することによりモニタリングするKirshenbaumらCharacterizationOfNovelStemCellFactorResponsiveHumanMastCellLinesLAD1And2EstablishedFromAPatientWithMastCellSarcomaLeukemiaActivationFollowingAggregationOfFcRIOrFcγRILeukemiaresearch2767782、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の標準的な方法、例えばFACS染色を用いて測定した場合に、ヒトマスト細胞の内因性FcγRIIBの発現が低ければ、本発明の抗FcγRIIBダイアボディにより媒介される阻害経路の活性化の差異をモニタリングおよび/または検出することは困難かもしれない。従って、本発明は、サイトカインおよび特定の増殖条件を用いてFcγRIIBの発現をアップレギュレートすることのできる別法を包含する。FcγRIIBは、例えばTHP1およびU937などのヒト単球細胞株RegulatedExpressionAndInhibitoryFunctionOfFcgammaRIIBInHumanMonocyticCellsJBiolChem27750825089、およびヒト初代単球DifferentialModulationOfStimulatoryAndInhibitoryFcGammaReceptorsOnHumanMonocytesByTh1AndTh2CytokinesJofImmunol166531537において、IL-4によって著しくアップレギュレートされることが記載されている。ジブチリル環状AMPによるU937の分化は、FcγRIIの発現を増強することが記載されているDifferentiationOfTheHumanMonocyteCellLineU937WithDibutyrylCyclicAMPInducesTheExpressionOfTheInhibitoryFcReceptorFcgammaRIIBImmunologyLetters83171179。従って、検出感度を高めるために、本発明の方法で使用されるヒトマスト細胞での内因性FcγRIIBの発現を、例えばIL-4、IL-13などのサイトカインを用いてアップレギュレートすることができる。また、抗FcγRIIBダイアボディは、B細胞受容体BCR媒介シグナル伝達の阻害についてアッセイすることもできる。BCR媒介シグナル伝達は、少なくとも1以上の下流の生物応答、例えばB細胞の活性化および増殖、抗体産生などを含み得る。FcγRIIBとBCRの共凝集は、細胞周期の進行および細胞の生存の阻害をもたらす。さらに、FcγRIIBとBCRの共凝集は、BCR媒介シグナル伝達の阻害をもたらす。特に、BCR媒介シグナル伝達は、下流シグナル伝達分子の調節、例えば、FcγRIIBのリン酸化状態、SHIPの動員、Btkおよび/またはPLCγの局在、MAPキナーゼ活性、Akt抗アポトーシスシグナルの動員、カルシウム動員、細胞周期の進行、および細胞増殖のうち少なくとも1つ以上を含む。BCRシグナル伝達のFcγRIIBにより媒介される阻害のエフェクター機能の多くはSHIPを介するものであるが、最近、SHIP欠損マウス由来のリポ多糖LPS活性化B細胞が、カルシウム動員、Ins1,4,5P3産生、ならびにErkおよびAktのリン酸化の顕著なFcγRIIB媒介阻害を示すことが実証されたPartiallyDistinctMolecularMechanismsMediateInhibitoryFcgammaRIIBSignalingInRestingAndActivatedBCellsJournalofImmunology167204211。従って、SHIP欠損マウス由来のexvivoB細胞を用いて、本発明の抗体の特性決定を行うことができる。本発明の抗体によるBCRシグナル伝達のFcγRIIBにより媒介される阻害を測定するための例示的アッセイは、SHIP欠損マウスから脾臓B細胞を単離すること、前述の細胞をリポ多糖で活性化すること、および前述の細胞をFab’2抗IgMで刺激してBCRを凝集させるか、または抗IgMで刺激してBCRをFcγRIIBと共凝集させることを含み得る。完全な抗IgMで刺激し、BCRをFcγRIIBと共凝集させた細胞を、さらに本発明の抗体とともにプレインキュベートすることができる。細胞のFcγRIIB依存性活性は、当技術分野で公知の標準的技術によって測定することができる。抗体とともにプレインキュベートした細胞およびプレインキュベートしなかった細胞のFcγRIIB依存性活性のレベルを比較することで、その抗体によるFcγRIIB依存性活性の調節が示される。FcγRIIB依存性活性の測定は、例えば、フローサイトメトリーにより細胞内カルシウムの動員を測定すること、Aktおよび/もしくはErkのリン酸化を測定すること、PI3,4,5P3のBCR媒介蓄積を測定すること、またはFcγRIIBにより媒介されるB細胞の増殖を測定することを含み得る。アッセイを用いて、例えば、本発明で使用されるダイアボディまたは抗FcγRIIB抗体該ダイアボディまたは抗FcγRIIB抗体は、FcγRIIB受容体に対するリガンドIgG結合部位を遮断し、かつ、FcγRIIBとBCRの共凝集を妨げることによりBCRシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に拮抗作用を示すことによって、BCRシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害を調節するを同定することができる。また、アッセイを用いて、FcγRIIBとBCRの共凝集を増強し、かつ、BCRシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に促進作用を示す抗体を同定することもできる。抗FcγRIIB抗体は、ヒト単球/マクロファージにおいてFcγRII媒介シグナル伝達についてアッセイすることもできる。FcγRIIBと免疫受容体チロシン活性化モチーフimmunoreceptortyrosinebasedactivationmotif:ITAMを有する受容体との共凝集は、SHIPをエフェクターとして用いるFcγR媒介食作用をダウンレギュレートする働きをするRegulatedExpressionAndInhibitoryFunctionOfFcgammaRIIBInHumanMonocyticCellsJBiolChem27750825089。FcγRIIAとFcγRIIBの共凝集は、FcγRIIBのITIMモチーフ上のチロシン残基の迅速なリン酸化をもたらし、これはSHIPのリン酸化の増強、SHIPとShcの会合、ならびに120kDaおよび60~65kDaの分子量を有するタンパク質のリン酸化に至る。さらに、FcγRIIAとFcγRIIBの共凝集は、細胞の調節に関与し、アポトーシスを抑制する働きをするセリントレオニンキナーゼであるAktのリン酸化のダウンレギュレーションをもたらす。抗FcγRIIBダイアボディはまた、ヒト単球/マクロファージにおいてFcγR媒介食作用の阻害についてアッセイすることもできる。例えば、ヒト単球系細胞株THP-1由来の細胞を、FcγRIIに対するマウスモノクローナル抗体IV.3のFabフラグメントとヤギ抗マウス抗体で刺激するFcγRIIAのみを共凝集させるか、完全IV.3マウスモノクローナル抗体とヤギ抗マウス抗体で刺激するFcγRIIAとFcγRIIBを共凝集させることができる。この系では、刺激した細胞に本発明の分子を付加した際に、下流シグナル伝達分子の調節、例えば、FcγRIIBのチロシンリン酸化、SHIPのリン酸化、SHIPとShcの会合、Aktのリン酸化、ならびに120kDaおよび60~65kDaの分子量を有するタンパク質のリン酸化などをアッセイすることができる。さらに、単球系細胞株のFcγRIIB依存性食作用効率を、本発明の抗体の存在下および不在下で直接測定することもできる。本発明の抗体によるヒト単球/マクロファージにおけるFcγR媒介食作用の阻害を測定するための別の例示的アッセイは、THP-1細胞をIV.3マウス抗FcγRII抗体のFabとヤギ抗マウス抗体で刺激するFcγRIIAのみを凝集させ、FcγRIIA媒介シグナル伝達を惹起するか、マウス抗FcγRII抗体とヤギ抗マウス抗体で刺激するFcγRIIAとFcγRIIBを共凝集させ、FcγRIIA媒介シグナル伝達を阻害することを含み得る。マウス抗FcγRII抗体とヤギ抗マウス抗体で刺激した細胞を、さらに本発明の分子とともにプレインキュベートすることができる。本発明の分子とともにプレインキュベートした刺激済み細胞および本発明の分子とともにプレインキュベートしなかった細胞のFcγRIIA依存性活性を測定すること、およびこれらの細胞におけるFcγRIIA依存性活性のレベルを比較することで、本発明の抗体によるFcγRIIA依存性活性の調節を示される。記載された例示的アッセイを使用して、例えば、以下のような結合ドメイン、すなわち、FcγRIIB受容体のリガンド結合を遮断し、かつ、FcγRIIBとFcγRIIAの共凝集を妨げることによってFcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に拮抗作用を示す結合ドメインを同定することができる。同様に、このアッセイで、FcγRIIBとFcγRIIAの共凝集を増強し、かつ、FcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に促進作用を示す結合ドメインを同定することができる。対象となるFcγRIIB結合ドメインは、従前に記載されている方法TheAdapterProteinLATEnhancesFcgammaReceptorMediatedSignalTransductionInMyeloidCellsJBiolChem275204807により、フルオレセイン化IgGオプソニン化ヒツジ赤血球sheepredbloodcells:SRBCを貪食するTHP-1細胞の能力を測定することによりアッセイできる。例えば、食作用を測定するための例示的アッセイは、THP-1細胞を本発明の抗体でまたはFcγRIIに結合しない対照抗体で処理すること、前述の細胞の活性レベルを比較することを含み、細胞の活性例えば、ロゼット形成活性IgGコーティングSRBCと結合しているTHP-1細胞の数、付着活性THP-1細胞に結合したSRBCの総数、および食作用率の差異が、本発明の抗体によるFcγRIIA依存性活性の調節を示す。このアッセイを用いて、例えば、FcγRIIB受容体のリガンド結合を遮断し、かつ、食作用のFcγRIIB媒介阻害に拮抗作用を示す抗体を同定することができる。このアッセイはまた、FcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害を増強する抗体を同定することもできる。好ましい実施形態では、結合ドメインは、以下の方法:下流シグナル伝達分子の調節例えば、FcγRIIBのリン酸化状態の調節、SHIPリン酸化の調節、SHIPとShcの会合の調節、Aktのリン酸化の調節、120kDa前後および60~65kDaのさらなるタンパク質のリン酸化の調節および食作用の調節のうち少なくとも1以上において、ヒト単球/マクロファージにおけるFcγRIIB依存性活性を調節する。5.1.2CD16A結合ドメイン以下の節では、共有結合型ダイアボディの作製のための軽鎖および重鎖可変領域の供給源として使用することができるCD16A結合タンパク質について述べる。本発明では、CD16A結合タンパク質は、抗CD16A抗体のVLドメインとVHドメインを含む分子を含み、このVHドメインおよびVLドメインが本発明のダイアボディの作製に使用される。様々なCD16A結合タンパク質を、本発明に関連して用いることができる。好適なCD16A結合タンパク質は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体、ならびにCD16A結合抗体フラグメント例えば、scFvまたは一本鎖抗体、Fabフラグメント、ミニボディ、および軽鎖可変領域ドメイン、重鎖可変領域ドメインまたはその双方との相互作用を介してCD16Aに結合する他の抗体様タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本発明に従って使用されるCD16A結合タンパク質は、非ヒト抗CD16A抗体例えば、マウス抗CD16A抗体に由来する配列を有する1以上のCDRと、1以上のヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列に由来する1以上のフレームワーク領域とを有する、VLドメインおよび/またはVHドメインを含む。CDRおよび他の配列を得ることのできる多数の非ヒト抗CD16Aモノクローナル抗体が知られている例えば、TammらTheBindingEpitopesOfHumanCD16MonoclonalAntibodiesImplicationsForLigandBindingJImm157157681Fleitらp159LEUKOCYTETYPINGIIHUMANMYELOIDANDHEMATOPOIETICCELLSReinherzら編NewYorkSpringerVerlagLEUCOCYTETYPINGIIIWHITECELLDIFFERENTIATIONANTIGENSMcMichaelAJ編OxfordOxfordUniversityPress1986LEUKOCYTETYPINGIVWHITECELLDIFFERENTIATIONANTIGENSKappら編OxfordUnivPressOxfordLEUKOCYTETYPINGVWHITECELLDIFFERENTIATIONANTIGENSSchlossmanら編OxfordUnivPressOxfordLEUKOCYTETYPINGVIWHITECELLDIFFERENTIATIONANTIGENSKishimoto編TaylorFrancis参照。さらに、実施例に示すように、細胞上で発現されるヒトCD16Aを認識する新規なCD16A結合タンパク質は、モノクローナル抗体または関連の結合タンパク質の作製および選択のための周知の方法例えば、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイなどを用いて得ることができる。例えば、OConnellらPhageVersusPhagemidLibrariesForGenerationOfHumanMonoclonalAntibodiesJMolBiol3214956HoogenboomらNaturalAndDesignerBindingSitesMadeByPhageDisplayTechnologyImmToday21371078KrebsらHighThroughputGenerationAndEngineeringOfRecombinantHumanAntibodiesJImmMethods2546784およびそこに引用されている他の参照文献を参照。非ヒト種由来のモノクローナル抗体は、当技術分野で公知の抗体のヒト化技術を用いてキメラ化またはヒト化することができる。あるいは、CD16Aに対する完全ヒト抗体は、ヒト免疫系の要素を有するトランスジェニック動物を用いて例えば、米国特許第5,569,825号および同第5,545,806号参照、ヒト末梢血細胞を用いてHumanMonoclonalsFromAntigenSpecificSelectionOfBLymphocytesAndTransformationByEBVScience234476479、ヒトB細胞由来のDNAライブラリーをHuseらGenerationOfALargeCombinatorialLibraryOfTheImmunoglobulinRepertoireInPhageLambdaScience24612751281が概説している一般プロトコールに従ってスクリーニングすることにより、また、他の方法により、作製することができる。好ましい実施形態では、結合ドナーは、例えば、米国特許出願公開第2004/0010124号参照によりその全内容を本明細書に組み入れるに開示されているものなどの3G8抗体またはそのヒト化型に由来する。目的によっては、3G8が結合するエピトープと同じエピトープにおいて、または3G8による結合を遮断するために該エピトープに少なくとも十分に近接するエピトープにおいて、CD16A受容体と結合するCD16A結合タンパク質を使用することが有利な場合がある。所望の結合特性を有する結合タンパク質を同定するためのエピトープマッピングおよび競合的結合実験の方法は、実験免疫学の熟練者には周知である。例えば、HarlowandLane前掲StahliらDistinctionOfEpitopesByMonoclonalAntibodiesMethodsinEnzymology92242253KirklandらAnalysisOfTheFineSpecificityAndCrossReactivityOfMonoclonalAntiLipidAAntibodiesJImmunol13736143619MorelらMonoclonalAntibodiesToBovineSerumAlbuminAffinityAndSpecificityDeterminationsMolecImmunol25715CheungらEpitopeSpecificAntibodyResponseToTheSurfaceAntigenOfDuckHepatitisBVirusInInfectedDucksVirology176546552およびMoldenhauerらIdentityOfHML1AntigenOnIntestinalIntraepithelialTCellsAndOfBly7AntigenOnHairyCellLeukaemiaScandJImmunol327782参照。例えば、2つの抗体が同じ部位に結合するかどうかは、一方の抗体を用いてELISAプレート上に抗原を捕捉した後、捕捉された抗原に対する第2の抗体の結合能を測定することによって決定することができる。また、エピトープの比較は、第1の抗体を酵素、放射性核種または蛍光団で直接的または間接的に標識し、第1の抗体と、細胞上の、溶液中のまたは固相上の抗原との結合を阻害する非標識の第2の抗体の能力を測定することによって達成することもできる。CD16A受容体とELISAプレート上に形成された免疫複合体との結合を遮断する抗体の能力を測定することも可能である。このような免疫複合体は、まず、フルオレセインなどの抗原でプレートをコーティングし、次に、特異的な抗フルオレセイン抗体をプレートに適用することによって形成される。この免疫複合体は、その後、sFcRIIIaなどの可溶性Fc受容体のリガンドとして働く。あるいは、可溶性の免疫複合体を形成させて、酵素、放射性核種または蛍光団で直接的または間接的に標識することもできる。その後、これらの標識された免疫複合体と、細胞上の、溶液中のまたは固相上のFc受容体との結合を阻害する抗体の能力を測定することができる。本発明のCD16A結合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンFc領域を含んでいても含んでいなくてもよい。Fc領域は、例えば、scFv結合タンパク質中には存在しない。Fc領域は、例えば、ヒトもしくはヒト化四量体モノクローナルIgG抗体に存在する。上記のように、本発明のいくつかの実施形態では、CD16A結合タンパク質は、エフェクター機能が改変されている、例えば、非改変Fc領域例えば、天然IgG1タンパク質のFcと比較してFc受容体または補体のC1成分などのエフェクターリガンドに対する親和性が低下したFc領域を含む。一実施形態では、Fc領域は、297位に相当するFc領域のアミノ酸がグリコシル化されていない。このような抗体はFcエフェクター機能を欠いている。従って、CD16A結合タンパク質は、結合タンパク質中にFcドメインが存在しないために、Fc受容体または補体のC1成分などのエフェクターリガンドへのFc媒介結合を示すことができず、他の場合では、結合またはエフェクター機能の欠如は抗体の定常領域の変化によるものである。5.1.2.1mAb3G8CDR配列に類似のCDR配列を含むCD16A結合タンパク質本発明の実施に際して使用することができるCD16A結合タンパク質は、マウスモノクローナル抗体3G8のCDRに由来するすなわち、同一もしくは類似の配列を有するCDR配列を含むタンパク質を包含する。マウス3G8モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする相補的cDNACDRをコードする配列を含むを、記載のようにクローニングし配列決定した。3G8の核酸配列およびタンパク質配列を以下に示す。マウス可変領域およびCDR配列を用いて、3G8のCDRに由来する相補性決定領域を含む多数のキメラおよびヒト化モノクローナル抗体を作製し、それらの特性を分析した。CD16Aと高い親和性で結合し、さらに他の所望の特性を有するヒト化抗体を同定するために、3G8由来のCDRを有するVH領域を含む抗体重鎖を作製し、3G8由来のCDRを有するVL領域を含む抗体軽鎖と同時発現により組み合わせて、分析用の四量体抗体を作製した。得られた四量体抗体の特性を以下に記載のように測定した。以下に記載するように、3G8のCDRを含むCD16A結合タンパク質、例えば、本明細書に記載のヒト化抗体タンパク質を本発明に従って使用することができる。5.1.2.1.1VH領域一態様において、本発明のCD16A結合タンパク質は、少なくとも1つのCDR通常は3つのCDRがマウスモノクローナル抗体3G8重鎖の1つのCDRより一般には3つ全てのCDRの配列を有し、該結合タンパク質の残りの部分が実質的にヒト型であるヒト抗体の重鎖可変領域に由来し、実質的にそれに類似する、重鎖可変ドメインを含むことができる。一態様において、本発明は、実質的にヒトのフレームワーク中に3G8抗体由来のCDRを含むヒト化3G8抗体または抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメインの少なくとも1つのCDRが、対応するマウス抗体3G8重鎖CDRと配列が異なる、上記抗体を提供する。例えば、一実施形態では、CDRは、当技術分野で公知のように、または表3および表4A~Hに開示されるように、3G8のCD16Aへの結合に影響を及ぼすことが当技術分野で知られている1以上のCDR置換を少なくとも有することで、3G8のCDR配列とは異なる。好適なCD16結合タンパク質は、これらの置換を0、1つ、2つ、3つまたは4つ、あるいはそれより多く含んでよく多くの場合、これらの置換を1~4つ有する、所望により付加的置換も有することができる。一実施形態では、CD16A結合タンパク質は、Hu3G8VH-1構築物その配列は配列番号68に示すのVHドメインと同一または類似の重鎖可変ドメイン配列を含むことができる。例えば、本発明は、1表1に示される0、1または2以上のCDR置換によりHu3G8VH-1配列番号68のVHドメインとは異なり、2表1に示される0、1または2以上のフレームワーク置換によりHu3G8VH-1のVHドメインとは異なり、かつ、3残りの位置ではHu3G8VH-1のVH配列と少なくとも約80同一、多くの場合には少なくとも約90同一、場合により少なくとも約95同一、またはさらには少なくとも約98同一である、配列を有するVHドメインを含むCD16A結合タンパク質を提供する。本発明のCD16結合タンパク質の例示的VHドメインは、3G8VH、Hu3G8VH-5およびHu3G8VH-22の配列それぞれ配列番号79、配列番号69および配列番号70を有する。3G8VHおよびHu3G8VH-5の配列それぞれ配列番号79および配列番号69をコードする例示的ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号80および配列番号81に示す。VHドメインは、表3に示される置換の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つまたは少なくとも6つによってHu3G8VH-1配列番号68の配列と異なる配列を有することができる。これらの置換は、CD16Aに対する親和性の増強をもたらし、かつ/またはヒトに投与した際にCD16A結合タンパク質の免疫原性を低減すると考えられている。特定の実施形態では、残りの位置のHu3G8VH-1のVHドメインとの配列同一性の程度は、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、または少なくとも約98である。限定ではなく例示として、いくつかのCD16A結合タンパク質のVHドメインの配列を表4に示す。ヒトCγ1定常領域と融合させたこれらの配列を含む重鎖を、hu3G8VL-1軽鎖以下に記載と同時に発現させて四量体抗体を形成させ、CD16Aに対する該抗体の結合を測定して、アミノ酸置換の効果をhu3G8VH-1のVHドメインと比較して評価した。VHドメインがhu3G8VH-1、2、3、4、5、8、12、14、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、42、43、44および45の配列を有する構築物は高親和性結合を示し、hu3G8VH-6およびhu3G8VH-40のVHドメインは中間の結合性を示した。hu3G8VH-5およびhu3G8VH-22それぞれ配列番号69および配列番号70のVHドメインを含むCD16A結合タンパク質は、特に好ましい結合特性を有すると考えられる。5.1.2.2VL領域好ましい結合特性を有する軽鎖可変ドメイン配列を同定するために同様の研究を行った。一態様において、本発明は、少なくとも1つのCDR通常は3つのCDRがマウスモノクローナル抗体3G8軽鎖の1つのCDRより一般には3つ全てのCDRの配列を有し、該結合タンパク質の残りの部分は実質的にヒトの配列型であるヒト抗体の重鎖可変領域に由来し、実質的にそれに類似する軽鎖可変ドメインを含む、CD16A結合タンパク質を提供する。一態様において、本発明は、実質的にヒトフレームワーク中に3G8抗体由来のCDRを含むヒト化3G8抗体のフラグメントであって、軽鎖可変ドメインの少なくとも1つのCDRがマウスモノクローナル抗体3G8の軽鎖CDRと配列が異なる、上記抗体フラグメントを提供する。一実施形態では、CDRは、CDRにおける1以上のアミノ酸置換、例えば表2で示される1以上の置換例えば、CDR1の24位のアルギニン;CDR1の25位のセリン;CDR1の32位のチロシン;CDR1の33位のロイシン;CDR2の50位のアスパラギン酸、トリプトファンもしくはセリン;CDR2の53位のセリン;CDR2の55位のアラニンもしくはグルタミン;CDR2の56位のトレオニン;CDR3の93位のセリン;および/またはCDR3の94位のトレオニンを少なくとも有することで、3G8配列と異なる。様々な実施形態において、可変ドメインは、このような置換を0、1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれより多く有し多くの場合、1~4つのこれらの置換、所望により付加的置換も有することができる。一実施形態では、適当なCD16A結合タンパク質は、Hu3G8VL-1配列番号71構築物のVLドメインと同一または類似の軽鎖可変ドメイン配列を含むことができ、この配列を表6に示す。例えば、本発明は、1表5に示される0、1またはそれより多いCDR置換によりHu3G8VL-1配列番号71のVLドメインとは異なり、2表5に示される0、1またはそれより多いフレームワーク置換によりHu3G8VL-1のVLドメインとは異なり、かつ、3残りの位置ではHu3G8VL-1のVL配列配列番号71と少なくとも約80同一、多くの場合には少なくとも約90同一、場合により少なくとも約95同一、またはさらには少なくとも約98同一である、配列を有するVLドメインを含むCD16A結合タンパク質を提供する。本発明のCD16結合タンパク質の例示的VLドメインは、表5および6に示される3G8VL、Hu3G8VL-1またはHu3G8VL-43の配列それぞれ配列番号82、配列番号71および配列番号72を有する。3G8VL配列番号82およびHu3G8VL-1配列番号71をコードする例示的ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号83および配列番号84に示す。VLドメインは、表2に示される置換の0、1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つまたは少なくとも9つによってHu3G8VL-1配列番号71とは異なる配列を有することができる。これらの置換は、CD16Aに対する親和性の増強をもたらし、かつ/またはヒトに投与した際にCD16A結合タンパク質の免疫原性を低減すると考えられている。特定の実施形態では、残りの位置の配列同一性の程度は、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、または少なくとも約98である。限定ではなく例示として、いくつかのCD16A結合タンパク質のVLドメインの配列を表6に示す。ヒトCκ定常ドメインと融合させたこれらの配列を含む軽鎖を、Hu3G8VH重鎖上記と同時に発現させて四量体抗体を形成させ、CD16Aに対する該抗体の結合を測定して、アミノ酸置換の効果をHu3G8VL-1のVLドメイン配列番号71と比較して評価した。VLドメインがhu3G8VL-1、2、3、4、5、10、16、18、19、21、22、24、27、28、32、33、34、35、36、37および42の配列を有する構築物は高親和結合を示し、hu3G8VL-15、17、20、23、25、26、29、30、31、38、39、40および41は中間の結合性を示した。hu3G8VL-1、hu3G8VL-22およびhu3G8VL-43のVLドメインを含むCD16A結合タンパク質は、特に好ましい結合性質を有すると考えられるそれぞれ配列番号71、配列番号73および配列番号72。5.1.2.2.1VLドメインおよび/またはVHドメインの組合せ当該分野で知られ、また本明細書の他所に記載されるように、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それらが会合してダイアボディを形成する条件下で、組換えにより発現させることができ、あるいはinvitroでそのように組み合わせることができる。従って、本明細書に記載の3G8由来VLドメインを本明細書に記載の3G8由来VHドメインと組み合わせてCD16A結合性ダイアボディを作製することができ、そのような組合せの全てが企図されることが分かるであろう。限定ではなく例示として、有用なCD16Aダイアボディの例は、少なくとも1つのVHドメインと少なくとも1つのVLドメインを含むダイアボディであり、該VHドメインがhu3G8VH-1、hu3G8VH-22またはhu3G8VH-5それぞれ配列番号68、配列番号70および配列番号69に由来し、該VLドメインがhu3G8VL-1、hu3G8VL-22またはhu3G8VL-43それぞれ配列番号71、配列番号73および配列番号41に由来する。特に、hu3G8VH-22配列番号22とhu3G8VL-1、hu3G8VL-22もしくはhu3G8VL-43それぞれ配列番号71、配列番号70および配列番号72のいずれか、またはhu3G8VH-5配列番号69とhu3G8VL-1配列番号71を含むヒト化抗体は好ましい特性を有する。当業者ならば、本明細書に記載のVLドメインおよびVHドメインの配列は、当技術分野で公知の方法、例えば親和性成熟SchierらIsolationOfPicomolarAffinityAntiCErbB2SingleChainFvByMolecularEvolutionOfTheComplementarityDeterminingRegionsInTheCenterOfTheAntibodyBindingSiteJMolBiol263551567DaughertyらAntibodyAffinityMaturationUsingBacterialSurfaceDisplayProteinEng11825832BoderらYeastSurfaceDisplayForScreeningCombinatorialPolypeptideLibrariesNatBiotechnol15553557BoderらDirectedEvolutionOfAntibodyFragmentsWithMonovalentFemtomolarAntigenBindingAffinityProcNatlAcadSciUSA971070110705HudsonらEngineeredAntibodiesNatureMedicine912939参照によってさらに改変できることが分かるであろう。例えば、CD16A結合タンパク質を、親和性成熟技術を用いて改変し、CD16Aに対する親和性が増強され、かつ/またはCD16Bに対する親和性が低減されたタンパク質を同定することができる。1つの例示的CD16結合タンパク質がマウス3G8抗体である。ヒト化3G8のVHドメインおよびVLドメインを含むアミノ酸配列を図2、9、14に記載し、配列番号9、配列番号11、配列番号12、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71および配列番号72に示す。5.2Fc領域またはその一部を含むダイアボディ本発明は、Fcドメインまたはその一部例えば、CH2またはCH3ドメインを含むダイアボディ分子を包含する。特定の実施形態では、Fcドメインまたはその一部は、IgG2、IgG3またはIgG4のFc領域例えば、CH2またはCH3の1以上の定常ドメインを含む。他の実施形態では、本発明は、Fcドメインまたはその一部を含む分子を包含し、ここで、前述のFcドメインまたはその一部は、匹敵する野生型Fcドメインまたはその一部に対して少なくとも1つのアミノ酸改変例えば、置換を含む。変異型Fcドメインは当技術分野で周知であり、前述の変異型Fcドメインを含む抗体の表現型当技術分野で周知の結合活性解析法またはエフェクター機能アッセイのいずれか、例えばELISA、SPR解析もしくはADCCでアッセイされるを変更するのに主として用いられる。このような変異型Fcドメインまたはその一部は、Fcドメインまたはその一部を含む本発明のダイアボディ分子によって示されるエフェクター機能例えばNK依存的またはマクロファージ依存的アッセイで機能的にアッセイされるを付与するまたは改変することにより、本発明において使用される。エフェクター機能を変更すると同定されたFcドメイン変異体は、国際公開第04/063351号、米国特許出願公開第2005/0037000号および同第2005/0064514号、2004年11月10日出願の米国仮出願第60/626,510号、2004年12月15日出願の同第60/636,663号および2006年3月10日出願の同第60/781,564号、ならびに本発明者の同時出願である2005年11月10日出願の米国特許出願第11/271,140号および2005年12月15日出願の同第11/305,787号それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れるに開示されている。他の実施形態では、本発明は、当技術分野で公知のいずれのFc変異体の使用も包含し、例えば、DuncanらLocalizationOfTheBindingSiteForTheHumanHighAffinityFcReceptorOnIgGNature332563564LundらHumanFcGammaRIAndFcGammaRIIInteractWithDistinctButOverlappingSitesOnHumanIgGJImmunol14726572662LundらMultipleBindingSitesOnTheCH2DomainOfIgGForMouseFcGammaRIIMolImmunol295359AlegreらANonActivatingHumanizedAntiCD3MonoclonalAntibodyRetainsImmunosuppressivePropertiesInVivoTransplantation5715371543HutchinsらImprovedBiodistributionTumorTargetingAndReducedImmunogenicityInMiceWithAGamma4VariantOfCampath1HProcNatlAcadSciUSA921198011984JefferisらRecognitionSitesOnHumanIgGForFcGammaReceptorsTheRoleOfGlycosylationImmunolLett44111117LundらOligosaccharideProteinInteractionsInIgGCanModulateRecognitionByFcGammaReceptorsFASEBJ9115119JefferisらModulationOfFcRAndHumanComplementActivationByIgG3CoreOligosaccharideInteractionsImmunolLett54101104LundらMultipleInteractionsOfIggWithItsCoreOligosaccharideCanModulateRecognitionByComplementAndHumanFcGammaReceptorIAndInfluenceTheSynthesisOfItsOligosaccharideChainsJImmunol15749634969ArmourらRecombinantHumanIgGMoleculesLackingFcgammaReceptorIBindingAndMonocyteTriggeringActivitiesEurJImmunol2926132624IdusogieらMappingOfTheC1QBindingSiteOnRituxanAChimericAntibodyWithAHumanIgG1FcJImmunol16441784184ReddyらEliminationOfFcReceptorDependentEffectorFunctionsOfAModifiedIgG4MonoclonalAntibodyToHumanCD4JImmunol16419251933XuらInVitroCharacterizationOfFiveHumanizedOKT3EffectorFunctionVariantAntibodiesCellImmunol2001626IdusogieらEngineeredAntibodiesWithIncreasedActivityToRecruitComplementJImmunol16625712575ShieldsらHighResolutionMappingOfTheBindingSiteOnHumanIgG1ForFcgammaRIFcgammaRIIFcgammaRIIIAndFcRnAndDesignOfIgG1VariantsWithImprovedBindingToTheFcgammaRJBiolChem27665916604JefferisらInteractionSitesOnHumanIgGFcForFcgammaRCurrentModelsImmunolLett825765PrestaらEngineeringTherapeuticAntibodiesForImprovedFunctionBiochemSocTrans30487490;米国特許第5,624,821号;米国特許第5,885,573号;米国特許第6,194,551号;国際公開第00/42072号;同第99/58572号それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れるで開示されたものが挙げられる。特定の実施形態では、Fc領域のアミノ酸に対する前述の1以上の改変は、Fc領域の、従って、本発明のダイアボディ分子の、1以上のFcγR受容体に対する親和性および結合力を低減する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域またはその一部を含むダイアボディを包含し、ここで、前述の変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、変異型Fc領域のみが1つのFcγRと結合し、該FcγRがFcγRIIIAである。別の特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域またはその一部を含むダイアボディを包含し、ここで、前述の変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、変異型Fc領域のみが1つのFcγRと結合し、該FcγRがFcγRIIAである。別の特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域またはその一部を含むダイアボディを包含し、ここで、前述の変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、変異型Fc領域のみが1つのFcγRと結合し、該FcγRがFcγRIIBである。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fcドメインを含む分子を包含し、ここで、前述の変異体は、当業者に公知であり、本明細書に記載されている方法を用いて測定した場合に、Fcドメインを含まない分子または野生型Fcドメインを含む分子と比較して、ADCC活性の増強および/またはFcγRIIACD32Aに対する結合の増強を付与または媒介する。別の実施形態では、本発明は変異型Fcドメインを含む分子を包含し、ここで、前述の変異体は、当業者に公知であり、本明細書に記載されている方法を用いて測定した場合に、Fcドメインを含まないまたは野生型Fcドメインを含む分子と比較して、ADCC活性もしくは他のエフェクター機能の低下および/またはFcγRIIBCD32Bに対する結合の増強を付与または媒介する。本発明はまた、2以上のIgGアイソタイプに由来するドメインまたは領域を含むFcドメインの使用も包含する。当技術分野で公知のように、Fc領域のアミノ酸改変は、Fc媒介エフェクター機能および/または結合活性に大きな影響を及ぼし得る。しかしながら、機能的特徴のこれらの改変は、選択されたIgGアイソタイプに関して実施する場合には、さらに精密化され、かつ/または操作され得る。同様に、Fcアイソタイプの天然の特徴は、1以上のアミノ酸改変により操作することができる。複数のIgGアイソタイプすなわち、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4は、ヒンジおよび/またはFcドメインのアミノ酸配列の違いのために、血清半減期、補体結合、FcγR結合親和性およびエフェクター機能活性例えば、ADCC、CDCを含む異なる物理的および機能的特性を示す。特定の実施形態では、所望の特徴を有するダイアボディを設計するために、アミノ酸改変およびIgGFc領域は、それらのそれぞれの個別の結合性および/またはエフェクター機能活性に基づいて独立に選択される。ほとんどの実施形態では、前述のアミノ酸改変およびIgGヒンジ/Fc領域は、IgG1に関して本明細書に記載される、または当技術分野で公知の、結合性および/またはエフェクター機能活性に関して別々にアッセイされている。特定の実施形態では、前述のアミノ酸改変およびIgGヒンジ/Fc領域は、ダイアボディ分子または他のFc含有分子例えば、免疫グロブリンに関してFcγR結合性またはエフェクター機能について別々にアッセイした場合に、類似の機能性、例えば、FcγRIIAに対する親和性の増強を示す。前述のアミノ酸改変と選択されたIgGFc領域の組合せは、その後、相加的に、またはより好ましくは相乗的に作用して、野生型Fc領域を含む本発明のダイアボディ分子と比較して、本発明のダイアボディ分子の前述の機能性を改変する。他の実施形態では、前述のアミノ酸改変およびIgGFc領域は、本明細書に記載される、または当技術分野で公知の、野生型Fc領域を含むダイアボディ分子または他のFc含有分子例えば、免疫グロブリンに関してFcγR結合性および/またはエフェクター機能について別個にアッセイした場合に、相反する機能性、例えば、FcγRIIAに対する親和性のそれぞれ増強および低下を示し、この相反するアミノ酸改変と選択されたIgG領域の組合せは、Fc領域を含まない、または同じアイソタイプの野生型Fc領域を含む本発明のダイアボディと比較して、本発明のダイアボディの特異的機能性を選択的に弱めるまたは低減する働きをする。あるいはまた、本発明は、新規の特性を示す、当技術分野で公知のアミノ酸改変と選択されたIgG領域との組合せを含む変異型Fc領域を包含し、このような特性は、前述の改変および/または領域を本明細書で記載したように独立にアッセイした場合には検出不能である。複数のIgGアイソタイプおよびそのドメインの機能的特性は当技術分野で周知である。IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のアミノ酸配列を図1A~1Bに示す。本発明の方法に使用される特定のIgGアイソタイプに由来する2以上のドメインの選択および/または組合せは、FcγRに対する親和性を含む、親アイソタイプの任意の既知のパラメーターに基づくものであってよい表7;FleschらFunctionsOfTheFcReceptorsForImmunoglobulinGJClinLabAnal14141156ChappelらIdentificationOfASecondaryFcGammaRIBindingSiteWithinAGeneticallyEngineeredHumanIgGAntibodyJBiolChem332512425131ChappelらIdentificationOfTheFcGammaReceptorClassIBindingSiteInHumanIgGThroughTheUseOfRecombinantIgG1IgG2HybridAndPointMutatedAntibodiesProcNatlAcadSciUSA8890369040、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。例えば、FcγRIIBに対する結合が限定されているか、または全く示されないIgGアイソタイプ例えば、IgG2またはIgG4に由来する領域またはドメインの使用は、活性化受容体に対する結合を最大にし、阻害受容体に対する結合を最小にするようにダイアボディを操作することが望まれる場合に特に有用であり得る。同様に、C1qまたはFcγRIIIAと優先的に結合することが知られる、例えば、IgG3ComparisonOfTheEffectorFunctionsOfHumanImmunoglobulinsUsingAMatchedSetOfChimericAntibodiesJExpMed16613511361などのIgGアイソタイプに由来するFc領域またはドメインの使用は、ADCCを増強することが当技術分野で知られているFcアミノ酸改変と組み合わせて、エフェクター機能活性例えば、補体の活性化またはADCCが最大となるようにダイアボディ分子を操作することができる。5.3分子コンジュゲート本発明のダイアボディ分子を、異種ポリペプチドすなわち、無関連ポリペプチドまたはその一部、好ましくはそのポリペプチドの少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個もしくは少なくとも100個のアミノ酸と、組換えにより融合させて、または化学的にコンジュゲート共有結合および非共有結合の双方を含むさせて、融合タンパク質を作製することができる。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して生じてもよい。さらに、本発明のダイアボディ分子すなわち、ポリペプチドは、治療薬または所与の生物学的応答を改変する薬物成分とコンジュゲートさせてもよい。直接的なコンジュゲートに代わるものとして、本発明の多価例えば、四価のダイアボディ分子上の複数のエピトープ結合部位により、ダイアボディの少なくとも1つの結合領域は、ダイアボディの結合に影響を及ぼすことなく、治療薬または所望の薬物成分と結合するように設計することができる。治療薬または薬物成分は、古典的な化学治療薬であるとは限らない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素すなわち、PE-40またはジフテリア毒素などの毒素;リシン、ゲロニンおよびブタクサ抗ウイルスタンパク質;腫瘍壊死因子、インターフェロン限定されるものではないが、αインターフェロンIFN-αおよびβインターフェロンIFN-βを含む、神経成長因子NGF、血小板由来増殖因子PDGF、組織プラスミノーゲン活性化因子TPA、アポトーシス剤例えば、TNF-α、TNF-β、国際公開第97/33899号に開示されているAIMI、AIMII国際公開第97/34911号参照、Fasリガンド、およびVEGI国際公開第99/23105号などのタンパク質;血栓剤もしくは抗血管新生剤例えば、アンギオスタチンもしくはエンドスタチン;または例えばリンホカイン例えば、インターロイキン1IL-1、インターロイキン2IL-2、インターロイキン6IL-6、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSFおよび顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、マクロファージコロニー刺激因子M-CSFまたは成長因子例えば、成長ホルモンGHといった生物応答修飾物質;プロテアーゼ;あるいはリボヌクレアーゼが挙げられる。本発明のダイアボディ分子すなわち、ポリペプチドを、精製を容易にするペプチドなどのマーカー配列と融合させることができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチドであり、例えば、市販されている多くのものの中でも、pQEベクターに提供されているタグである。GentzらBioassayForTransActivationUsingPurifiedHumanImmunodeficiencyVirusTATEncodedProteinTransActivationRequiresmRNASynthesisProcNatlAcadSciUSA86821824に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに相当するヘマグルチニンHAタグTheStructureOfAnAntigenicDeterminantInAProteinCell37767778およびFlagタグAnImprovedAffinityTagBasedOnTheFLAGPeptideForTheDetectionAndPurificationOfRecombinantAntibodyFragmentsBiotechniques17754761が挙げられる。さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリングおよび/またはコドンシャッフリングDNAシャッフリングと総称されるの技術によって作製することができる。DNAシャッフリングを使用すれば、本発明の分子の活性を変更することができる例えば、より高い親和性とより低い解離速度を有するエピトープ結合部位。一般に、米国特許第5,605,793号;同第5,811,238号;同第5,830,721号;同第5,834,252号;および同第5,837,458号、ならびにPattenらApplicationsOfDNAShufflingToPharmaceuticalsAndVaccinesCurrOpinionBiotechnol8724733HarayamaArtificialEvolutionByDNAShufflingTrendsBiotechnol167682HanssonらEvolutionOfDifferentialSubstrateSpecificitiesInMuClassGlutathioneTransferasesProbedByDNAShufflingJMolBiol287265276andLorenzoらPCRBasedMethodForTheIntroductionOfMutationsInGenesClonedAndExpressedInVacciniaVirusBioTechniques24308313参照これらの特許および刊行物は参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。本発明のダイアボディ分子、または本発明の分子をコードする核酸は、組換え前に、エラープローンPCR、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム突然変異誘発を施すことによってさらに改変することができる。本発明の分子をコードするポリヌクレオチドの1以上の部分を、1以上の異種分子の1以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えることができる。また、本発明は、診断薬もしくは治療薬、または他のいずれかの分子血清半減期の延長/短縮および/または特定の細胞サブセットへの標的化が望まれる分子とコンジュゲートされるか、またはそれらを免疫特異的に認識する本発明のダイアボディ分子も包含する。本発明の分子を診断上使用して、例えば、疾患、障害または感染の発症または進行を臨床試験手順の一環としてモニタリングして、例えば所与の治療計画の有効性を測定することができる。本発明の分子を検出可能な物質と結合させることにより、または検出可能な物質を免疫特異的に認識する分子により、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、各種酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、当技術分野で公知の技術を用い、本発明の分子と直接的に、または媒介物質例えば、当技術分野で公知のリンカーを介して間接的に、結合またはコンジュゲートすることができ、あるいは、該分子は検出可能な物質を免疫特異的に認識するすなわち、前述の物質と免疫特異的に結合することもできる。例えば、本発明の診断薬として使用される抗体とコンジュゲートさせることができる金属イオンについては、米国特許第4,741,900号を参照。このような診断および検出は、検出可能な物質を免疫特異的に認識するように分子をデザインするか、または本発明の分子を検出可能な物質、例えば、限定されるものではないが、各種酵素、限定されるものではないが、例えば、セイヨウワザビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ;補欠分子族複合体、限定されるものではないが、例えば、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチン;蛍光物質、限定されるものではないが、例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリン;発光物質、限定されるものではないが、例えば、ルミノール;生物発光物質、限定されるものではないが、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン等;放射性物質、限定されるものではないが、例えば、ビスマス213Bi、炭素14C、クロム51Cr、コバルト57Co、フッ素18F、ガドリニウム153Gd、159Gd、ガリウム68Ga、67Ga、ゲルマニウム68Ge、ホルミウム166Ho、インジウム115In、113In、112In、111In、ヨウ素131I、125I、123I、121I、ランタン140La、ルテチウム177Lu、マンガン54Mn、モリブデン99Mo、パラジウム103Pd、亜リン32P、プラセオジム142Pr、プロメチウム149Pm、レニウム186Re、188Re、ロジウム105Rh、ルテニウム97Ru、サマリウム153Sm、スカンジウム47Sc、セレン75Se、ストロンチウム85Sr、硫黄35S、テクネチウム99Tc、タリウム201Ti、スズ113Sn、117Sn、トリチウム3H、キセノン133Xe、イッテルビウム169Yb、175Yb、イットリウム90Y、亜鉛65Zn;各種陽電子放射断層撮影で用いる陽電子放出金属;ならびに非放射性常磁性金属イオンと結合させることにより達成することができる。本発明のダイアボディ分子は、細胞毒素例えば、細胞増殖抑制剤もしくは殺細胞剤、治療薬、または放射性元素例えば、α放射体、γ放射体などのような治療成分を免疫特異的に認識するか、またはそれらとコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害性薬剤は細胞に有害な任意の薬剤を含む。例として、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-ジハイドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびプロマイシン、ならびにそれらの類似体または同族体が挙げられる。治療薬としては、限定されるものではないが、代謝拮抗物質例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、ダカルバジン、アルキル化剤例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチンBSNUおよびロムスチンCCNU、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンCおよびシスジクロロジアミン白金IIDDPシスプラチン、アントラサイクリン類例えば、ダウノルビシンかつてのダウノマイシンおよびドキソルビシン、抗体例えば、ダクチノマイシンかつてのアクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシンAMC、ならびに有糸分裂阻害剤例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチンが挙げられる。さらに、本発明のダイアボディ分子は、治療成分、例えば放射性物質または放射性金属イオンとコンジュゲートさせるのに有用な大環状キレート剤と結合させることもできるし、あるいはそれらを免疫特異的に認識するように設計することもできる放射性物質の例としては上記を参照。特定の実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介してポリペプチドに結合させることのできる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N’,N’’,N’’’-四酢酸DOTAである。このようなリンカー分子は、当技術分野で通常知られており、DenardoらComparisonOf14710TetraazacyclododecaneNNNNTetraaceticAcidPeptideChL6ANovelImmunoconjugateWithCatabolizableLinkerTo2Iminothiolane2pbenzylDOTAChL6InBreastCancerXenograftsClinCancerRes424832490PetersonらEnzymaticCleavageOfPeptideLinkedRadiolabelsFromImmunoconjugatesBioconjugChem10553andZimmermanらATriglycineLinkerImprovesTumorUptakeAndBiodistributionsOf67CuLabeledAntiNeuroblastomamAbchCE7F2FragmentsNuclMedBiol26943950それぞれ参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れるに記載されている。このような治療成分を、例えばFcドメインを含むポリペプチドにコンジュゲートさせる技術は周知である。例えば、ArnonらMonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapyMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapyReisfeldら1985pp24356AlanRLissIncHellstromらAntibodiesForDrugDeliveryControlledDrugDeliveryRobinsonら1987pp62353MarcelDekkerIncThorpeAntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapyAReviewMonoclonalAntibodies‘84BiologicalAndClinicalApplicationsPincheraら1985pp475506AnalysisResultsAndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapyMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapyBaldwinら1985pp30316AcademicPressandThorpeらThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibodyToxinConjugatesImmunolRev62119158参照。本発明のダイアボディ分子は、治療成分をコンジュゲートさせて投与してもコンジュゲートさせずに投与してもよく、単独で投与してもよいし、または治療処置として使用される細胞傷害性因子および/またはサイトカインと併用投与してもよい。単独で投与する場合、多価の、例えば四価のダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープを、治療薬、例えば細胞傷害性因子および/またはサイトカイン本発明の分子と同時にまたは本発明の分子の後に投与することができるを免疫特異的に認識するように設計することができる。このように、ダイアボディ分子は、直接的結合と類似の方法で治療薬を特異的に標的とすることができる。あるいは、本発明の分子を抗体とコンジュゲートさせて、Segalが米国特許第4,676,980号参照によりその全内容を本発明に組み入れるに記載しているように抗体ヘテロコンジュゲートを形成させることもできる。本発明のダイアボディ分子は、固相支持体に結合させることもでき、特に標的抗原のイムノアッセイまたは精製に有用である。このような固相支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。5.4ダイアボディ分子の結合の特性決定本発明のダイアボディ分子は、様々な方法で特性決定を行うことができる。特に、本発明の分子は、例えばFcRIIIAもしくはFcRIIBなどの抗原と免疫特異的に結合する能力について、または該分子がFcドメインもしくはその一部を含む場合には、Fc-FcγR相互作用、すなわち、Fcドメインもしくはその一部のFcγRへの特異的結合を示す能力について、アッセイすることができる。このようなアッセイは溶液中で例えば、HoughtenTheUseOfSyntheticPeptideCombinatorialLibrariesForTheIdentificationOfBioactivePeptidesBioTechniques13412421、ビーズ上でANewTypeOfSyntheticPeptideLibraryForIdentifyingLigandBindingActivityNature3548284、チップ上でMultiplexedBiochemicalAssaysWithBiologicalChipsNature364555556、細菌上で米国特許第5,223,409号、胞子上で米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号および同第5,223,409号、プラスミド上でScreeningForReceptorLigandsUsingLargeLibrariesOfPeptidesLinkedToTheCTerminusOfTheLacRepressorProcNatlAcadSciUSA8918651869またはファージ上でSearchingForPeptideLigandsWithAnEpitopeLibraryScience249386390DevlinRandomPeptideLibrariesASourceOfSpecificProteinBindingMoleculesScience249404406CwirlaらPeptidesOnPhageAVastLibraryOfPeptidesForIdentifyingLigandsProcNatlAcadSciUSA8763786382およびFeliciSelectionOfAntibodyLigandsFromALargeLibraryOfOligopeptidesExpressedOnAMultivalentExpositionVectorJMolBiol222301310行うことができるこれらの参照文献はそれぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。抗原、例えばFcγRIIIAに免疫特異的に結合することが確認された分子は、その後、抗原に対する特異性および親和性についてアッセイすることができる。複数のエピトープ結合ドメインを含むように操作した本発明の分子は、1以上の抗原例えば、癌抗原に対する免疫特異的結合および他の抗原例えば、FcγRとの交差反応性について、またはその分子がFcドメインもしくはその一部を含む場合には、Fc-FcγR相互作用について、当技術分野で公知のいずれかの方法によってアッセイすることができる。免疫特異的結合、交差反応性およびFc-FcγR相互作用を分析するために用いることができるイムノアッセイとしては、限定されるものではないが、数例を挙げると、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、ELISA酵素結合免疫吸着アッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、Aタンパク質イムノアッセイなどの技術を用いた競合および非競合アッセイ系が含まれる。このようなアッセイは、当技術分野では慣例であり、周知である例えば、Ausubelら編1994CurrentProtocolsinMolecularBiologyVol1JohnWileySonsIncNewYork参照によりその全内容を本明細書に組み入れる参照。抗原-結合ドメインの相互作用、またはFc-FcγR相互作用の結合親和性および解離速度は、競合結合アッセイによって測定することができる。競合結合アッセイの一例としてラジオイムノアッセイがあり、この方法は、標識された抗原、例えば四量体FcγR例えば、3Hまたは125I、第5.4.1節参照と対象分子例えば、複数のエピトープ結合ドメインを含む本発明の分子とを、四量体FcγR第5.4.1節参照などの、漸増量の非標識エピトープの存在下でインキュベートし、標識抗原に結合した分子を検出することを含む。抗原に対する本発明の分子の親和性および結合解離速度は、スキャッチャード分析法により飽和率のデータから求めることができる。抗原またはFcγRに対する本発明の分子の親和性および結合特性は、初めに抗原-結合ドメインまたはFc-FcγRの相互作用について当技術分野で公知のinvitroアッセイ生化学または免疫学に基づくアッセイ限定されるものではないが、ELISA、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイを含むを用いて測定することができる。また、本発明の分子の結合特性を、第5.4.2節に記載したような1以上のFcγR媒介エフェクター細胞機能を測定するためのinvitro機能アッセイによって特性決定を行うことが好ましい。最も好ましい実施形態では、本発明の分子は、invitro系アッセイにおける結合特性と同様の結合特性をinvivoモデル例えば、本明細書に記載され開示されるものでも有する。しかしながら、本発明は、invitro系アッセイでは所望の表現型を示さないが、invivoでは所望の表現型を示す本発明の分子を排除するものではない。いくつかの実施形態では、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりFcドメインまたはその一部を含む分子のスクリーニングおよび同定は、機能に基づくアッセイを、好ましくはハイスループット方式で行う。機能に基づくアッセイは、例えば、本明細書の第5.4.2節および第5.4.3節に記載されているような、1以上のFcγR媒介エフェクター細胞機能の特性決定を行うための当技術分野で公知のいずれのアッセイであってもよい。本発明の方法に従って使用可能なエフェクター細胞機能の非限定的な例としては、限定されるものではないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用ADCC、抗体依存性食作用、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、細胞結合、ロゼット形成、C1q結合、および補体依存性細胞媒介性細胞傷害作用が挙げられる。好ましい実施形態では、BIAcore動態分析を使用して、抗原または/およびFcγRに対する本発明の分子の結合速度および解離速度を測定する。BIAcore動態分析は、抗原またはFcγRの結合と解離を、固定した分子例えば、それぞれエピトープ結合ドメインまたはFcドメインもしくはその一部を含む分子をその表面に担持したチップから分析することを含む。BIAcore分析は第5.4.3節に記載する。本発明の分子の特性決定を行うための免疫学または機能に基づくアッセイには、当業者に公知のいずれかの方法を用いた蛍光活性化細胞選別fluorescenceactivatedcellsorting:FACSを使用することが好ましい。フローソーターは、本発明の分子が結合した、例えば本発明の分子によってオプソニン化された、多数の個々の細胞を迅速に調べることができる例えば、1時間あたり1000万~1億個の細胞PracticalFlowCytometry。さらに、ダイアボディの挙動を至適化するために使用される特定のパラメーターとしては、限定されるものではないが、抗原濃度すなわち、FcγR四量体複合体、第5.4.1節参照、動態競合時間、またはFACSストリンジェンシーが含まれ、これらをそれぞれ変化させて、特異的な結合特性例えば、複数のエピトープへの同時結合を示す本発明の分子を含むダイアボディ分子を選択することができる。生体細胞を選別して調べるフローサイトメーターは当技術分野では周知である。公知のフローサイトメーターは、例えば、米国特許第4,347,935号;同第5,464,581号;同第5,483,469号;同第5,602,039号;同第5,643,796号;および同第6,211,477号に記載されているこれらの文献の全内容を参照により本明細書に組み入れる。他の公知のフローサイトメーターとしては、BectonDickinsonandCompany製のFACSVantage商標システム、およびUnionBiometrica製のCOPAS商標システムがある。標的抗原結合親和性またはFc-FcγR結合親和性の特性決定、および細胞表面の標的抗原またはFcγRの密度の評価は、スキャッチャード分析法などの当技術分野で周知の方法によるか、または例えばQuantum商標SimplyCellular登録商標BangsLaboratories,Inc.、インディアナ州フィッシャーズなどの製造者の説明書に従ったキットの使用によって行うことができる。1以上の機能アッセイは、当業者に公知のまたは本明細書に記載されている1以上のFcγR媒介エフェクター細胞機能の特性決定を行うために当技術分野で公知のいずれのアッセイであってもよい。特定の実施形態では、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりFcドメインまたはその一部を含む本発明の分子は、1以上の標的抗原または1以上のFcγR例えば、FcγRIIIA、FcγRIIA、FcγRIIAに対する結合に関してELISAアッセイでアッセイされ、その後、1以上のADCCアッセイが行われる。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、さらに表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ、例えば、BIAcoreを用いてアッセイされる。表面プラズモン共鳴に基づくアッセイは当技術分野で周知であり、第5.4.3節に詳しく述べ、本明細書の例えば実施例6.1で例示する。最も好ましい実施形態では、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりFcドメインまたはその一部を含む本発明の分子は、標的抗原例えば、FcγRとの相互作用またはFc-FcγR相互作用について動物モデルでさらに特性決定が行われる。Fc-FcγR相互作用をアッセイする場合、本発明の方法での使用に好ましい動物モデルは、例えば、ヒトFcγRを発現するトランスジェニックマウス、例えば、米国特許第5,877,397号および同第6,676,927号参照によりその全内容を本明細書に組み入れるに記載されているいずれかのマウスモデルである。さらに、このような方法で使用されるトランスジェニックマウスとしては、限定されるものではないが、ヒトFcγRIIIAを担持しているFcγRIIIAノックアウトヌードマウス;ヒトFcγRIIAを担持しているFcγRIIIAノックアウトヌードマウス;ヒトFcγRIIBおよびヒトFcγRIIIAを担持しているFcγRIIIAノックアウトヌードマウス;ヒトFcγRIIBおよびヒトFcγRIIAを担持しているFcγRIIIAノックアウトヌードマウス;ヒトFcγRIIIAおよびFcγRIIAを担持しているFcγRIIIAおよびFcγRIIAノックアウトヌードマウス、ならびにヒトFcγRIIIA、FcγRIIAおよびFcγRIIBを担持しているFcγRIIIA、FcγRIIAおよびFcγRIIBノックアウトヌードマウスが挙げられる。5.4.1FcγRを含む結合アッセイFcドメインまたはその一部を含み、かつ/またはFcγRに特異的なエピトープ結合ドメインを含む分子によるFcγRに対する結合の特性決定は、限定されるものではないが、FcγRの多型変異体を含む、いずれのFcγRを使用して行ってもよい。いくつかの実施形態では、158位にフェニルアラニンを含むFcγRIIIAの多型変異体が使用される。他の実施形態では、158位にバリンを含むFcγRIIIAの多型変異体を用いて特性決定が行われる。FcγRIIIA158Vは、IgG1に対して158Fよりも高い親和性、およびADCC活性の増強を示し例えば、KoeneらFcgammaRIIIa158VFPolymorphismInfluencesTheBindingOfIgGByNaturalKillerCellFcgammaRIIIaIndependentlyOfTheFcgammaRIIIa48LRHPhenotypeBlood90110914WuらANovelPolymorphismOfFcgammaRIIIaAltersReceptorFunctionAndPredisposesToAutoimmuneDiseaseJClinInvest100105970参照、双方とも参照によりその全内容を本明細書に組み入れる、この残基は実際に、IgG1-FcγRIIIAの共結晶化研究によって最近示されたように、IgG1の下方ヒンジ領域と直接相互作用する例えば、SondermannらThe32ACrystalStructureOfTheHumanIgG1FcFragmentFcgammaRIIIcomplexNature406267273参照、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。研究により、いくつかのケースにおいて、治療用抗体はFcγRIIIA-158V同型接合患者において有効性の向上を示すことが示された。例えば、ヒト化抗CD20モノクローナル抗体リツキシマブは、FcγRIIIA158Fホモ接合患者と比較してFcγRIIIA158V同型接合患者では治療上より有効であった例えば、CartronらTherapeuticActivityOfHumanizedAntiCD20MonoclonalAntibodyAndPolymorphismInIgGFcReceptorFcgammaRIIIAGeneBlood99754758参照。他の実施形態では、この領域を含む治療用分子はまた、FcγRIIIA-158VおよびFcγRIIIA-158Fに関して異型接合の患者において、ならびにFcγRIIA-131Hを有する患者でも、より有効であり得る。特定の作用機序に縛られるものではないが、別のアロタイプを有する本発明の分子を選択すると、ひとたび治療用ダイアボディに遺伝子工学的に導入すれば、そのようなアロタイプについて同型接合性の患者に対して臨床上より有効となる変異体が得られる。FcγR結合アッセイが、本発明の分子とFcγRとの結合を測定するために、特に、FcドメインとFcγRとの結合を測定するために開発された。このアッセイにより、リガンドに対する受容体の親和性が本質的に弱くても、例えば、FcγRIIBとFcγRIIIAについてマイクロモルの範囲であっても、Fc-FcγR相互作用の検出および定量が可能となった。前述の方法は、国際公開第04/063351号および米国特許出願公開第2005/0037000号および同第2005/0064514号それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れるに詳細に記載されている。簡単に述べると、この方法は、当技術分野で公知のいずれかの標準的なイムノアッセイ、例えばFACS、ELISA、表面プラズモン共鳴などで追跡することができるFcγR複合体の形成を含む。さらに、FcγR複合体は、複合体を形成していないFcγRと比較して、Fc領域に対して結合力の向上を示す。本発明によれば、好ましい分子複合体は、aFcγRの可溶性領域例えば、FcγRIIIA、FcγRIIAまたはFcγRIIBの可溶性領域;bFcγRの可溶性領域例えば、FcγRIIIA、FcγRIIAまたはFcγRIIBの可溶性領域のC末端に機能し得る形で連結されたビオチン化15アミノ酸AVITAG配列AVITAG;およびcストレプトアビジン-フィコエリトリンSA-PEを、四量体FcγR複合体を形成するモル比で好ましくは5:1のモル比で含む四量体の免疫複合体である。この融合タンパク質は、例えばアミノ酸15個のAVITAG配列中のリジン残基を特異的にビオチン化する大腸菌ビオチンリガーゼBirA酵素を用いて、酵素的にビオチン化される。ビオチン化された可溶性FcγRタンパク質を、その後、SA-PEと1×SA-PE:5×ビオチン化可溶性FcγRのモル比で混合して四量体FcγR複合体を形成させる。Fc領域を含むポリペプチドは、複合体を形成していない単量体FcγRよりも少なくとも8倍高い親和性で四量体FcγR複合体と結合することが示されている。Fc領域を含むポリペプチドの四量体FcγR複合体との結合性は、当業者に公知の標準的な技術、例えば、蛍光活性化細胞選別FACS、ラジオイムノアッセイ、ELISAなどを用いて測定することができる。本発明は、細胞系アッセイまたは無細胞系アッセイでFc領域を含む分子の機能性を測定するための、上記方法により形成される本発明の分子を含む免疫複合体の使用を包含する。便宜上、試薬は、アッセイキットで、すなわち、Fc領域を含んだ分子の、FcγR四量体複合体との結合能をアッセイするためにパッケージされた試薬の組合せで提供することができる。本発明の方法における使用には、Fc-FcγR相互作用の測定に、例えば、2003年1月13日出願の米国仮出願第60/439,709号参照としてその全内容を本明細書に組み入れるに記載されているように形成された融合タンパク質などの他の形態の分子複合体も企図される。5.4.2変異型重鎖を有する分子の機能アッセイ本発明は、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりFcドメインまたはその一部を含む本発明の分子の、該分子のエフェクター細胞機能を同定するための当業者に公知のアッセイを用いた特性決定を包含する。特に、本発明は、本発明の分子を、FcγR媒介エフェクター細胞機能について特性決定を行うことを包含する。さらに、本発明のダイアボディ分子の標的抗原の少なくとも1つがFcγRである場合、ダイアボディ分子によるFcγRの結合は、FcγR-Fc結合により活性化される経路と類似したFcγR媒介経路を活性化するのに役立ち得る。従って、ダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合ドメインがFcγRを認識する場合には、ダイアボディ分子は、Fcドメインまたはその一部を含まなくても、またはFc-FcγR結合が付随しなくても、FcγR媒介エフェクター細胞機能を誘発することができる。本発明に従ってアッセイすることができるエフェクター細胞機能の例としては、限定されるものではないが、抗体依存性細胞傷害性、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、C1q結合および補体依存性細胞媒介性細胞傷害作用が挙げられる。エフェクター細胞機能活性を測定するために、当業者に公知のいずれの細胞系アッセイまたは無細胞系アッセイも使用可能であるエフェクター細胞アッセイについては、PerussiaらAssaysForAntibodyDependentCellMediatedCytotoxicityAndReverseADCCInHumanNaturalKillerCellsMethodsMolBiol12117992BaggioliniらCellularModelsForTheDetectionAndEvaluationOfDrugsThatModulateHumanPhagocyteActivityExperientia44841848LehmannらPhagocytosisMeasurementByFlowCytometryJImmunolMethods24322942BrownInVitroAssaysOfPhagocyticFunctionOfHumanPeripheralBloodLeukocytesReceptorModulationAndSignalTransductionMethodsCellBiol4514764MunnらPhagocytosisOfTumorCellsByHumanMonocytesCulturedInRecombinantMacrophageColonyStimulatingFactorJExpMed172231237AbdulMajidらFcReceptorsAreCriticalForAutoimmuneInflammatoryDamageToTheCentralNervousSystemInExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitisScandJImmunol557081DingらTwoHumanTCellReceptorsBindInASimilarDiagonalModeToTheHLAA2TaxPeptideComplexUsingDifferentTCRAminoAcidsImmunity8403411を参照、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。一実施形態では、本発明の分子をヒト単球でFcγR媒介食作用についてアッセイすることができる。あるいは、本発明の分子のFcγR媒介食作用をその他の食細胞、例えば、好中球多形核白血球:PMN;ヒト末梢血単球、単球由来マクロファージでアッセイすることもでき、これらは当業者に公知の標準的手順を使用して取得することができる例えば、BrownInVitroAssaysOfPhagocyticFunctionOfHumanPeripheralBloodLeukocytesReceptorModulationAndSignalTransductionMethodsCellBiol45147164参照。一実施形態では、従前に記載されている方法TheAdapterProteinLATEnhancesFcgammaReceptorMediatedSignalTransductionInMyeloidCellsJBiolChem2752048020487により、フルオレセイン化IgGオプソニン化ヒツジ赤血球細胞sheepredbloodcells:SRBCを貪食するTHP-1細胞の能力を測定することによって本発明の分子の機能の特性決定を行う。本発明の分子の食作用を測定するための別の例示的アッセイは、抗体依存性オプソニン食作用アッセイantibodydependentopsonophagocytosisassay:ADCPであり、このアッセイは、大腸菌標識FITCMolecularProbesまたは黄色ブドウ球菌FITCなどの標的生体粒子を、iFcγR依存性ADCPの対照抗体としての、フルオレセインに対する抗体である野生型4-4-20抗体BedzykらComparisonOfVariableRegionPrimaryStructuresWithinAnAntiFluoresceinIdiotypeFamilyJBiolChem26415651569参照、参照によりその全内容を本明細書に組み入れるで、またはiiFcγR依存性ADCPのバックグラウンド対照としての、FcγRIIIへの結合をノックアウトするD265A突然変異を保有する4-4-20抗体で、iii4-4-20のエピトープ結合ドメインとFcドメインおよび/またはFcγRIIIに特異的なエピトープ結合ドメインとを含むダイアボディでコーティングすること;およびオプソニン化粒子を形成させること;記載したオプソニン化粒子i~iiiのいずれかをTHP-1エフェクター細胞ATCCより入手可能な単球細胞株に1:1、10:1、30:1、60:1、75:1または100:1の比で添加して、FcγR媒介食作用を生じさせること;好ましくは、該細胞と大腸菌-FITC/抗体を37°Cで1.5時間インキュベートすること;インキュベーション後、細胞にトリパンブルーを添加して好ましくは、室温で2~3分、内部移行されずに細胞表面の外側に付着した細菌の蛍光を消光させること;細胞をFACSバッファー例えば、PBS中0.1のBSA、0.1アジ化ナトリウム中に移し、FACS例えば、BDFACSCaliburを用いてTHP1細胞の蛍光を分析することを含む。好ましくは、このアッセイに用いられるTHP-1細胞を、FACSにより細胞表面上のFcγRの発現について分析する。THP-1細胞はCD32AとCD64の双方を発現する。CD64は、本発明の方法に従ってADCPアッセイを行う際に遮断される高親和性FcγRである。THP-1細胞は、好ましくは100μg/mLの可溶性IgG1または10ヒト血清で遮断する。ADCPの程度を分析するため、ゲートを好ましくはTHP-1細胞に設定し、蛍光強度の中央値を測定する。個々の突然変異体についてのADCP活性を算出し、野生型chMab4-4-20に対して得られた、正規化した数値として記録する。これらのオプソニン化粒子をTHP-1細胞に添加して、オプソニン化粒子とTHP-1細胞の比が30:1または60:1になるようにする。最も好ましい実施形態では、ADCPアッセイを対照、例えば、培地中の大腸菌-FITC、大腸菌-FITCとTHP-1細胞FcγR非依存性ADCP活性として、大腸菌-FITCとTHP-1細胞と野生型4-4-20抗体FcγR依存性ADCP活性として、大腸菌-FITCとTHP-1細胞と4-4-20D265AFcγR依存性ADCP活性についてのバックグラウンド対照としてを用いて行う。別の実施形態では、本発明の分子を、当業者に公知の標準的方法のいずれかを用いて、エフェクター細胞、例えばナチュラルキラー細胞で、FcγR媒介ADCC活性についてアッセイすることができる例えば、PerussiaらAssaysForAntibodyDependentCellMediatedCytotoxicityAndReverseADCCInHumanNaturalKillerCellsMethodsMolBiol12117992WengらTwoImmunoglobulinGFragmentCReceptorPolymorphismsIndependentlyPredictResponseToRituximabInPatientsWithFollicularLymphomaJClinOncol2139403947DingらTwoHumanTCellReceptorsBindInASimilarDiagonalModeToTheHLAA2TaxPeptideComplexUsingDifferentTCRAminoAcidsImmunity8403411参照。本発明の分子のADCC活性を測定するための例示的アッセイは、標的細胞を[51Cr]Na2CrO4で標識することこの細胞膜透過性分子は細胞質タンパク質と結合し、それらの細胞から緩慢な速度で自然放出されるが、標的細胞の壊死の後に大量に放出されることから、この分子が標識用に慣用される;その標的細胞を、変異型重鎖を含む本発明の分子でオプソニン化すること;オプソニン化した放射性標識標的細胞とエフェクター細胞とを、標的細胞とエフェクター細胞の適当な比で、マイクロタイタープレート内で混合すること;その細胞混合物を16~18時間37°Cでインキュベートすること;上清を回収すること;および放射活性を分析することを含む51Cr放出アッセイに基づくものである。その後、本発明の分子の細胞傷害性を、例えば下式:溶解=試験cpm-標的漏出cpm/界面活性剤溶解cpm-標的漏出cpm×100、あるいは、溶解=ADCC-AICC/最大放出-自然放出を用いて算出することができる。比溶解は下式:比溶解=本発明の分子の存在下での溶解-本発明の分子の不在下での溶解を用いて算出することができる。標的:エフェクター細胞の比または抗体濃度のいずれかを変更することによってグラフを作成することができる。好ましくは、本発明のADCCアッセイで使用されるエフェクター細胞は末梢血単核細胞peripheralbloodmononuclearcells:PBMCであり、これは好ましくは、当業者に公知の標準的方法、例えば、フィコール-パーク密度勾配遠心分離を用いて正常ヒト血液から精製される。本発明の方法における使用に好ましいエフェクター細胞は、異なるFcγR活性化受容体を発現する。本発明は、重鎖抗体突然変異体が、野生型IgGl抗体と比較して増強されたADCC活性および食作用を示すかどうかを判定するために、エフェクター細胞、FcγRI、FcγRIIAおよびFcγRIIBを発現するTHP-1、ならびにFcγRIIIAとFcγRIIBの双方を発現する、ヒト全血に由来する単球由来初代マクロファージを包含する。ヒト単球細胞株THP-1は、高親和性受容体FcγRIおよび低親和性受容体FcγRIIAの発現を介して食作用を活性化するTheHumanMonocyteLikeCellLineTHP1ExpressesFcGammaRIAndFcGammaRIIJLeukBiol49556565。THP-1細胞は、FcγRIIAまたはFcγRIIBを構成的に発現しない。これらの細胞をサイトカインで刺激すると、FcR発現パターンに影響を及ぼすDifferentialModulationOfStimulatoryAndInhibitoryFcGammaReceptorsOnHumanMonocytesByTh1AndTh2CytokinesJofImmunol166531537。THP-1細胞をサイトカインIL4の存在下で増殖させるとFcγRIIBの発現が誘導され、FcγRIIAおよびFcγRI発現の低下が起こる。また、FcγRIIB発現は細胞密度の増加によっても増強され得るRegulatedExpressionAndInhibitoryFunctionOfFcgammaRIIBInHumanMonocyticCellsJBiolChem27750825089。対照的に、IFNγはFcγRIIIAの発現を導くことができると報告されているInterferonGammaInducedTranscriptionOfTheHighAffinityFcReceptorForIgGRequiresAssemblyOfAComplexThatIncludesThe91kDaSubunitOfTranscriptionFactorISGF3ProcNatAcadSciUSA9043144318。細胞表面上の受容体の有無は、当業者に公知の一般的方法を用いて、FACSにより判定することができる。サイトカインにより誘導される細胞表面上でのFcγRの発現は、FcγRIIBの存在下で活性化および阻害の双方を試験する系を提供する。THP-1細胞がFcγRIIBを発現することができなければ、本発明は別のヒト単球細胞株U937をさらに包含する。これらの細胞は、IFNγおよびTNFの存在下で、最終的にマクロファージへと分化することが示されているInVitroActivationOfAHumanMacrophageLikeCellLineNature279328331。FcγR依存性腫瘍細胞死は、マウス腫瘍モデルではマクロファージとNK細胞により媒介されるFcReceptorsAreRequiredInPassiveAndActiveImmunityToMelanomaProcNatAcadSciUSA95652656。本発明は、食作用およびADCCアッセイの双方で、標的細胞の細胞傷害を誘発するFc突然変異体の有効性を分析するため、ドナー由来の分離した単球の、エフェクター細胞としての使用を包含する。FcγRI、FcγRIIIAおよびFcγRIIBの発現パターンは、増殖条件の違いによって影響を受ける。凍結させた分離単球、新鮮な分離単球、10FBS中で維持した単球、ならびにFBSGM-CSF中および/またはヒト血清中で培養した単球からのFcγR発現は、当業者に公知の一般的方法を用いて測定することができる。例えば、細胞をFcγR特異的抗体で染色し、FACSにより分析してFcγRプロフィールを決定することができる。その後、マクロファージのinvivoFcγR発現を最もよく模倣する条件を本発明の方法に使用する。いくつかの実施形態では、本発明は、特に、適正なFcγRプロフィールを持つヒト細胞を取得することができない場合には、マウス細胞の使用を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトFcγRIIIAでトランスフェクトすることができるマウスマクロファージ細胞株RAW264.7ATCC、および当技術分野で公知の方法を用いて単離された安定なトランスフェクタントを包含する例えば、RalphらAntibodyDependentKillingOfErythrocyteAndTumorTargetsByMacrophageRelatedCellLinesEnhancementByPPDAndLPSJImmunol1199504参照。トランスフェクタントは、慣例の試験を用いたFACS分析によって、FcγRIIIA発現について定量し、高発現体を本発明のADCCアッセイに使用することができる。他の実施形態では、本発明は、本明細書で開示されるものなどのノックアウトトランスジェニックマウスからの、ヒトFcγRを発現する脾臓腹腔マクロファージの単離を包含する。リンパ球は、フィコール-パーク勾配Pharmaciaを用いて、ドナーの末梢血PBMから回収することができる。単離された細胞の単核集団内では、大部分のADCC活性が、その表面にFcγRIIIAを含むがFcγRIIBは含まないナチュラルキラー細胞NKを介して生じる。これらの細胞での結果は、NK細胞ADCCの誘発に対する突然変異体の有効性を示し、分離単球を用いて試験するための試薬を確立する。本発明のADCCアッセイで使用される標的細胞としては、限定されるものではないが、乳癌細胞株、例えば、SK-BR-3ATCC受託番号HTB-30例えば、TrempらHumanBreastCancerInCultureRecentResultsCancerRes3341参照;Bリンパ球;バーキットリンパ腫由来細胞、例えば、Raji細胞ATCC受託番号CCL-86例えば、EpsteinらCharacteristicsAndModeOfGrowthOfTissueCultureStrainOfHumanLymphoblastsFromBurkittsLymphomaJNatlCancerInst34231240参照、およびDaudi細胞ATCC受託番号CCL-213例えば、KleinらSurfaceIgMKappaSpecificityOnABurkittLymphomaCellInVivoAndInDerivedCultureLinesCancerRes2813001310参照が挙げられる。標的細胞はアッセイするダイアボディ分子の抗原結合部位によって認識されなければならない。ADCCアッセイは、アポトーシス経路によって細胞死を媒介するNK細胞の能力に基づいている。NK細胞は、一部には、FcγRIIIAの、細胞表面の抗原に結合したIgGFcドメインの認識によって、細胞死を媒介する。本発明の方法に従って使用されるADCCアッセイは、放射性に基づくアッセイでも蛍光に基づくアッセイでもよい。変異型Fc領域を含む本発明の分子の特性決定を行うために使用されるADCCアッセイは、標的細胞、例えば、SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji、Daudi細胞を標識すること;標的細胞を、その抗原結合部位を介して標的細胞上の細胞表面受容体を認識する抗体でオプソニン化すること;標識されたオプソニン化標的細胞とエフェクター細胞とを適当な比慣例の試験によって決定することができるで混合すること;前述の細胞を回収すること;溶解した標的細胞の上清中の標識を、使用した標識に基づく適当な検出スキームを用いて検出することを含む。標的細胞は当技術分野で公知の標準的方法を用いて、放射性標識または蛍光標識のいずれかで標識することができる。例えば、標識としては、限定されるものではないが、[51Cr]Na2CrO4;および蛍光増強リガンド2,2’:6’,2’’-ターピリジン-6-6’’-ジカルボキシレートTDAのアセトキシメチルエステルが挙げられる。特定の好ましい実施形態では、蛍光増強リガンド2,2’:6’,2’’-ターピリジン-6-6’’-ジカルボキシレートTDAのアセトキシメチルエステルで標識した標的細胞に対するADCC活性を測定するために、時間分解蛍光測定アッセイを使用する。このような蛍光測定アッセイは当技術分野で公知である。例えば、BlombergらTimeResolvedFluorometricAssayForNaturalKillerActivityUsingTargetCellsLabelledWithAFluorescenceEnhancingLigandJournalofImmunologicalMethods193199206参照によりその全内容を本明細書に組み入れる参照。簡単に述べると、標的細胞を膜透過性TDAアセトキシメチルジエステルビスアセトキシメチル2,2’:6’,2’’-ターピリジン-6-6’’-ジカルボキシレートBATDAで標識するが、これは生細胞の細胞膜を通過して迅速に拡散する。細胞内エステラーゼがエステル基を開裂させ、再生された膜非透過性TDA分子は細胞内に捕捉される。エフェクター細胞および標的細胞を例えば少なくとも2時間、最大3.5時間、37°C、5CO2下でインキュベートした後、溶解した標的細胞から放出されたTDAをEu3でキレート化し、生成したユーロピウム-TDAキレートの蛍光を時間分解蛍光計例えば、Victor1420、PerkinElmer/Wallaceで定量する。別の特定の実施形態では、複数のエピトープ結合部位と場合によりFcドメインまたはその一部を含む本発明の分子の特性決定を行うために使用されるADCCアッセイは以下を含む。好ましくは4~5×106個の標的細胞例えば、SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji細胞をビスアセトキシメチル2,2’:6’,2’’-ターピリジン-t-6’’-ジカルボキシレートDELFIABATDA試薬、PerkinElmer/Wallacで標識する。最適な標識効率のため、ADCCアッセイで使用する標的細胞の数は好ましくは5×106個を超えないようにすべきである。これらの細胞にBATDA試薬を添加し、混合物を37°C、好ましくは5CO2下で、少なくとも30分間インキュベートする。次に、その細胞を生理学的バッファー例えば、0.125mMスルフィンピラゾンを含むPBS、および0.125mMスルフィンピラゾンを含有する培地で洗浄する。その後、標識された標的細胞を、EcγRIIAに特異的なエピトープ結合ドメインと場合によりFcドメインまたはその一部を含む本発明の分子でオプソニン化コーティングする。好ましい実施形態では、ADCCアッセイで使用する分子はまた、細胞表面受容体、腫瘍抗原または癌抗原に特異的である。本発明のダイアボディ分子は、第5.6.1節に挙げられているものなどの癌または腫瘍抗原と特異的に結合することができる。ADCCアッセイの標的細胞は、本発明のダイアボディが標的細胞の細胞表面受容体に特異的に結合するように、該ダイアボディに遺伝子工学的に導入されたエピトープ結合部位に応じて選択される。標的細胞をエフェクター細胞、例えばPBMCに、エフェクター:標的比が約1:1、10:1、30:1、50:1、75:1、または100:1になるように添加する。これらのエフェクター細胞および標的細胞を少なくとも2時間、最大3.5時間、37°C、5CO2下でインキュベートする。細胞上清を回収し、酸性ユーロピウム溶液例えば、DELFIAユーロピウム溶液、PerkinElmer/Wallacに添加する。生成したユーロピウム-TDAキレートの蛍光を時間分解蛍光計例えば、Victor1420、PerkinElmer/Wallacで定量する。最大放出MRおよび自然放出SRは、標的細胞を、それぞれ1TX-100および培地単独とインキュベートすることによって測定する。抗体非依存性細胞傷害作用AICCを、試験分子例えば本発明のダイアボディの不在下で標的細胞およびエフェクター細胞をインキュベートすることによって測定する。各アッセイは好ましくは3反復で実施する。比溶解の平均パーセンテージを、試験放出値ADCC-AICC/MR-SR×100のように算出する。本発明は、Fcドメインまたはその一部を含む本発明の分子によるC1qの結合および補体依存性細胞傷害作用CDCの媒介の特性決定を行うための、当技術分野において公知であり本明細書に例示されるアッセイを包含する。C1qの結合を測定するために、C1q結合ELISAを実施することができる。例示的アッセイは以下のステップを含み得る。アッセイプレートを、コーティングバッファー中、本発明の分子を含むポリペプチドまたは出発ポリペプチド対照で4°Cにて一晩コーティングする。次に、これらのプレートを洗浄し、遮断する。洗浄後、ヒトC1qのアリコートを各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートする。さらに洗浄した後、100μLのヒツジ抗補体C1qペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートする。前述のプレートを再び洗浄バッファーで洗浄し、OPDO-フェニレンジアミン二塩酸塩Sigmaを含有する100μlの基質バッファーを各ウェルに添加する。黄色の出現によって観察される酸化反応を30分間進行させ、100μlの4.5NH2SO4の添加により反応を停止させる。その後、吸光度を492~405nmで読み取る。補体の活性化を評価するために、補体依存性細胞傷害CDCアッセイを、例えば、GazzanoSantoroらANonRadioactiveComplementDependentCytotoxicityAssayForAntiCD20MonoclonalAntibodyJImmunolMethods202163171参照によりその全内容を本明細書に組み入れるに記載されているように実施することができる。簡単に述べると、変異型Fcドメインまたはその一部を含む分子およびヒト補体を様々な濃度にバッファーで希釈する。ダイアボディ分子が結合する抗原を発現する細胞は、約1×106細胞/mlの密度に希釈する。変異型Fcドメインまたはその一部を含むダイアボディ分子と希釈したヒト補体と抗原を発現する細胞の混合物を平底組織培養96ウェルプレートに添加し、37°C、5CO2下で2時間インキュベートして補体媒介細胞溶解を促進させる。その後、50μLのアラマーブルーAccumedInternationalを各ウェルに添加し、37°Cで一晩インキュベートする。吸光度を、96ウェル蛍光光度計を用い、励起530nmおよび発光590nmで測定する。結果は相対蛍光単位RFUで表すことができる。サンプル濃度を標準曲線からコンピュータにより計算し、非変異型分子すなわち、Fcドメインを含まないかまたは非変異型Fcドメインを含む分子と比較した際の活性を対象の変異体について報告する。5.4.3その他のアッセイ複数のエピトープ結合ドメインと場合によりFcドメインを含む本発明の分子は、抗原結合ドメインまたはFc-FcγR結合の速度論的パラメーターを特定するための、当技術分野で公知の、任意の表面プラズモン共鳴surfaceplasmonresonance:SPRに基づくアッセイを用いてアッセイすることができる。限定されるものではないが、BiacoreABウプサラ、スウェーデンから入手可能なBIAcore装置;AffinitySensorsマサチューセッツ州フランクリンから入手可能なIAsys装置;WindsorScientificLimitedバークス、UKから入手可能なIBISシステム;日本レーザ電子北海道、日本から入手可能なSPR-CELLIAシステム;およびTexasInstrumentsから入手可能なSPRDetectorSpreetaテキサス州ダラスを含む市販のSPR装置が本発明において使用可能である。SPRに基づく技術の総説としては、MulletらSurfacePlasmonResonanceBasedImmunoassaysMethods227791DongらSomenewaspectsinbiosensorsReviewsinMolBiotech8230323FivashらBIAcoreForMacromolecularInteractionCurrentOpinioninBiotechnology997101RichらAdvancesInSurfacePlasmonResonanceBiosensorAnalysisCurrentOpinioninBiotechnology115461全て参照によりその全内容を本明細書に組み入れる参照。さらに、米国特許第6,373,577号、同第6,289,286号、同第5,322,798号、同第5,341,215号、同第6,268,125号全て参照によりその全内容を本明細書に組み入れるに記載されているタンパク質間相互作用を測定する任意のSPR装置およびSPRに基づく方法も、本発明の方法において企図される。簡単に述べると、SPRに基づくアッセイは、結合対の一方を表面に固定化すること、および溶液中の結合対の他方との相互作用をリアルタイムでモニタリングすることを含む。SPRは、複合体の形成または解離時に生じる表面付近での溶媒の屈折率の変化を測定することに基づく。固定化を行う表面はセンサーチップであり、これがSPR技術の心臓部となる。これは金の薄層でコーティングされたガラス表面からなり、分子の表面への結合を至適化するように設計された特殊な表面の一領域の基礎を形成する。様々なセンサーチップが特に上記に挙げた会社から市販されており、全て本発明の方法において使用可能である。センサーチップの例としては、BIAcoreAB,Inc.から市販されているもの、例えば、SensorChipCM5、SA、NTAおよびHPAが挙げられる。本発明の分子は、限定されるものではないが、アミン基を介した直接共有結合、スルフヒドリル基を介した直接共有結合、アビジンコーティング表面へのビオチンの結合、糖鎖基へのアルデヒドの結合およびヒスチジンタグを介したNTAチップとの結合を含む、当技術分野で公知の固定化法および固定化化学のいずれかを用いてセンサーチップの表面に固定化することができる。いくつかの実施形態では、複数のエピトープ結合部位と場合によりFcドメインを含む本発明の分子と、抗原またはFcγRとの結合の速度論的パラメーターは、BIAcore装置例えば、BIAcore装置1000、BIAcoreInc.,ニュージャージー州ピスカタウェイを用いて測定することができる。上記で述べたように第5.4.1節参照、ダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合部位がFcγRを免疫特異的に認識する場合、および/またはダイアボディ分子がFcドメインまたはその一部を含む場合、任意のFcγRを使用して本発明の分子の結合を評価することができる。特定の実施形態では、FcγRはFcγRIIIA、好ましくは可溶性の単量体FcγRIIIAである。例えば、一実施形態では、可溶性単量体FcγRIIIAは、リンカー-AVITAG配列に連結されたFcγRIIIAの細胞外領域である2003年1月9日出願の米国仮出願第60/439,498号および2003年3月19日出願の米国仮出願第60/456,041号参照、参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れる。別の特定の実施形態では、FcγRはFcγRIIB、好ましくは可溶性の二量体FcγRIIBである。例えば、一実施形態では、可溶性二量体FcγRIIBタンパク質を2003年1月13日出願の米国仮出願第60/439,709号参照によりその全内容を本明細書に組み入れるに記載されている方法に従って作製する。全ての免疫学的アッセイにおいて、本発明の分子によるFcγRの認識/結合は複数のドメインによって影響を受け得る。すなわち、ある特定の実施形態では、本発明の分子は複数のエピトープ結合ドメインのうちの1つを介してFcγRを免疫特異的に認識し;本発明の分子がFcドメインまたはその一部を含むさらに他の実施形態では、ダイアボディ分子はFc-FcγR相互作用を介してFcγRを免疫特異的に認識することができ;本発明の分子がFcドメインまたはその一部とFcγRを免疫特異的に認識するエピトープ結合部位の双方を含むさらなる実施形態では、ダイアボディ分子はエピトープ結合ドメインとFcドメインまたはその一部の一方または双方を介してFcγRを認識することができる。複数のエピトープ結合部位と場合によりFcドメインまたはその一部を含む本発明の分子の、抗原および/またはFcγRに対する速度論的パラメーターを、BIAcore装置を用いて測定するための例示的アッセイは以下を含む。第1の抗原をセンサーチップ表面の4つのフローセルの1つに、好ましくはアミンカップリング化学を介して固定化し、それにより約5000応答単位RUの第1の抗原が表面に固定化される。好適な表面が調製されたところで、第1の抗原を免疫特異的に認識する本発明の分子を、好ましくは20μg/mL溶液を流速5μL/mLで1分間注入することによって、前述の表面を通過させる。この段階で表面に結合した本発明の分子のレベルは、一般に400~700RUの間の範囲である。次に、HBS-Pバッファー20mMHEPES、150mMNaCl、3mMEDTA、pH7.5中の第2の抗原例えば、FcγRまたはFcγR受容体の希釈系列を前述の表面に100μL/分で注入する。異なる第2の抗原または受容体希釈物間での分子の再生は、好ましくは100mMNaHCO3pH9.4;3MNaClを5秒間の注入を1回行うことによって行われる。当技術分野で公知のいずれの再生技術も本発明の方法において企図される。全データセットが収集されたところで、SPR装置製者、例えばBIAcore,Inc.ニュージャージー州ピスカタウェイによって提供されているコンピュータアルゴリズムを用いて得られた結合曲線のグローバルフィッティングを行う。これらのアルゴリズムでは、KonおよびKoffの双方を算出し、これらから見かけの平衡結合定数Kdを、2つの速度定数の比すなわち、Koff/Konとして推定する。個々の速度定数をどのようにして導くかについてのさらに詳細な処理法は、BIAevaluaionソフトウエアハンドブックBIAcore,Inc.、ニュージャージー州ピスカタウェイに見出すことができる。作成したデータの解析は、当技術分野で公知のいずれの方法を用いて行ってもよい。作成した速度論的データを解釈する各種方法の総説としては、MyszkaKineticAnalysisOfMacromolecularInteractionsUsingSurfacePlasmonResonanceBiosensorsCurrentOpinioninBiotechnology8507FisherらSurfacePlasmonResonanceBasedMethodsForMeasuringTheKineticsAndBindingAffinitiesOfBiomolecularInteractionsCurrentOpinioninBiotechnology538995O’ShannessyDeterminationOfKineticRateAndEquilibriumBindingConstantsForMacromolecularInteractionsACritiqueOfTheSurfacePlasmonResonanceLiteratureCurrentOpinioninBiotechnology56571ChaikenらAnalysisOfMacromolecularInteractionsUsingImmobilizedLigandsAnalyticalBiochemistry201197210MortonらInterpretingComplexBindingKineticsFromOpticalBiosensorsAComparisonOfAnalysisByLinearizationTheIntegratedRateEquationAndNumericalIntegrationAnalyticalBiochemistry22717685O’Shannessyら1996AnalyticalBiochemistry23627583全て参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れるを参照。好ましい実施形態では、SPR分析、例えばBIAcoreを用いて測定した速度論的パラメーターは、本発明の分子が機能的アッセイ、例えばADCCにおいて、どのように機能するかの予測指標として使用することができる。SPR分析から取得した速度論的パラメーターに基づいて本発明の分子の有効性を予測するための例示的方法は、本発明の分子のエピトープ結合ドメインおよび/またはFcドメインもしくはその一部を介したFcγRIIIAおよびFcγRIIBとの結合についてのKoff値を測定すること;ADCCデータに対して、1FcγRIIIAの場合はKoffwt/Koffmut;2FcγRIIBの場合はKoffmut/Koffwtをプロットすることを含み得る。1よりも高い数値は、野生型と比較して、FcγRIIIAの場合には低下した解離速度を、そしてFcγRIIBの場合には増大した解離速度を示し、ADCC機能の増強を有する。5.5本発明のダイアボディ分子の製造方法本発明のダイアボディ分子は、denovoタンパク質合成および結合タンパク質をコードする核酸の組換え発現を含む、当技術分野で周知の様々な方法により製造することができる。所望の核酸配列は組換え法例えば、所望のポリヌクレオチドの以前に作製された変異体のPCR突然変異誘発により、または固相DNA合成により作製することができる。通常は組換え発現が用いられる。一態様では、本発明はCD16AVHおよび/またはVLをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し、別の態様では、本発明はCD32BVHおよび/またはVLをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。遺伝子コードの縮重のため、それぞれの免疫グロブリンアミノ酸配列を種々の核酸配列がコードしており、本発明は本明細書に記載の結合タンパク質をコードする全ての核酸を含む。5.5.1本発明の分子をコードするポリヌクレオチド本発明はまた、本発明の分子ポリペプチドおよび抗体を含むをコードするポリヌクレオチドも含む。当技術分野で公知のいずれの方法によって、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定してもよい。本発明の方法によって同定される分子のヌクレオチド配列が決定されれば、当技術分野で周知の方法、例えば、組換えDNA技術、部位特異的突然変異誘発、PCRなどを用いてそのヌクレオチド配列を操作し例えば、Sambrookら2001MolecularCloningALaboratoryManual第3版ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNYおよびAusubelら編1998CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNYに記載されている技術を参照、双方とも参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れる、例えば、アミノ酸の置換、欠失および/または挿入を生じさせることによって、例えば異なるアミノ酸配列を有する抗体を作出することができる。一実施形態では、ヒトライブラリーまたは当技術分野で利用可能な他のいずれかのライブラリーを当技術分野で公知の標準的技術によってスクリーニングして、本発明の分子をコードする核酸をクローニングすることができる。5.5.2本発明の分子の組換え発現本発明の分子すなわち、抗体をコードする核酸配列が得られれば、それらの分子を産生するためのベクターを、当技術分野で周知の技術を用い、組換えDNA技術によって作製することができる。当業者に周知の方法を使用して、本発明の分子のコード配列および適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、invitro組換えDNA技術、合成技術、およびinvivo遺伝子組換えが挙げられる例えば、Sambrookら1990MolecularCloningALaboratoryManual第2版ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNYおよびAusubelら編1998CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNYに記載されている技術を参照。本発明の方法により同定された分子のヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、従来技術例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクションおよびリン酸カルシウム沈降により宿主細胞に導入し、次いで、トランスフェクト細胞を従来技術により培養して、本発明の分子を生産することができる。特定の実施形態では、本発明の分子の発現を構成的、誘導性または組織特異的プロモーターにより調節される。本発明の方法により同定された分子を発現させるために使用される宿主細胞は、大腸菌などの細菌細胞であるか、または好ましくは、特に完全な組換え免疫グロブリン分子を発現させるためには、真核細胞であり得る。特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞Chinesehamsterovarycells:CHOなどの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併用する、免疫グロブリンのための有効な発現系であるPowerfulAndVersatileEnhancerPromoterUnitForMammalianExpressionVectorsGene45101106CockettらHighLevelExpressionOfTissueInhibitorOfMetalloproteinasesInChineseHamsterOvaryCellsUsingGlutamineSynthetaseGeneAmplificationBiotechnology8662667。様々な宿主-発現ベクター系を利用して、本発明の方法により同定された分子を発現させることができる。このような宿主-発現系は、本発明の分子のコード配列を産生し、続いて精製することができるビヒクルに相当するが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると本発明の分子をinsituで発現することができる細胞にも相当する。これらのものとしては、限定されるものではないが、例えば、本発明の方法により同定された分子のコード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌例えば大腸菌および枯草菌などの微生物;本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母例えば、サッカロミセス属、ピキア属;本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター例えば、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞系;本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMVおよびタバコモザイクウイルスTMVを感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター例えば、Tiプラスミドで形質転換された、植物細胞系;あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター例えば、メタロチオネインプロモーターまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーターを含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系例えば、COS、CHO、BHK、293、293T、3T3細胞、リンパ球米国特許第5,807,715号参照、PerC.6細胞Crucellにより開発されたヒト網膜細胞が挙げられる。細菌系においては、発現される分子に対して意図される用途に応じて、多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を作製するためにこのようなタンパク質を大量産生させるべき場合には、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベル発現を指令するベクターが望ましいものであり得る。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、抗体コード配列をベクター中にlacZコード領域とともにインフレームで個々に連結して融合タンパク質が産生されるようにする大腸菌発現ベクターpUR278EasyIdentificationOfcDNAClonesEMBOJ217911794;pINベクターUpPromoterMutationsInThelppGeneOfEscherichiaColiNucleicAcidsRes1331013110VanHeekeらExpressionOfHumanAsparagineSynthetaseInEscherichiaColiJBiolChem2455035509などが挙げられる。また、pGEXベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼGSTとの融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン-アガロースビーズへ吸着および結合させた後に遊離グルタチオンの存在下で溶出させることにより容易に精製することができる。pGEXベクターはトロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、クローニングされた標的遺伝子産物をGST成分から遊離させることができる。昆虫系においては、オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルスAcNPVが、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスはスポドプテラフルギペルダ細胞中で増殖する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域例えば、ポリヘドリン遺伝子中に個々にクローニングし、AcNPVプロモーター例えば、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。哺乳動物宿主細胞においては、多くのウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、目的の抗体コード配列を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三分節リーダー配列と連結させることができる。次に、このキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムにinvitroまたはinvivo組換えにより挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域例えば、E1またはE3領域への挿入により、感染した宿主内で生存可能でありかつ免疫グロブリン分子を発現することができる組換えウイルスが得られる例えば、LoganらAdenovirusTripartiteLeaderSequenceEnhancesTranslationOfmRNAsLateAfterInfectionProcNatlAcadSciUSA8136553659参照。また、挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルが必要とされる場合もある。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、全インサートの翻訳を確実にするために、目的のコード配列のリーディングフレームと同じ位相になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源のものであってよく、天然物でも合成物でもよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強させることができるBitterらExpressionAndSecretionVectorsForYeastMethodsinEnzymol153516544参照。さらに、挿入した配列の発現を変調したり、その遺伝子産物を所望の特定の様式で修飾またはプロセシングしたりする宿主細胞株を選択してもよい。このようなタンパク質産物の修飾例えば、グリコシル化およびプロセシング例えば、切断はタンパク質の機能にとって重要であり得る。例えば、特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子を含むポリペプチドは単一の遺伝子産物として例えば、単一のポリペプチド鎖として、すなわち、ポリタンパク質前駆体として発現させることができるが、これには本発明のダイアボディ分子の別個のポリペプチドを形成するために、天然型または組換え型の細胞機構によるタンパク質分解切断が必要となる。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを含むポリタンパク質前駆体分子をコードする核酸配列前述のポリタンパク質前駆体の翻訳後切断を指令することができるコード配列を含むを遺伝子工学的に作製することを包含する。ポリタンパク質前駆体の翻訳後切断は、本発明のポリペプチドをもたらす。本発明のポリペプチドを含む前駆体分子の翻訳後切断はinvivoですなわち、天然型または組換え型の細胞系/機構、例えば、適当な部位でのフューリンの切断により宿主細胞内で起こってもよいし、invitro例えば、既知の活性のプロテアーゼもしくはペプチダーゼを含む組成物中および/または所望のタンパク質分解作用を促すことが知られている条件もしくは試薬を含む組成物中での前述のポリペプチド鎖のインキュベーションで起こってもよい。組換えタンパク質の精製および修飾は当技術分野で周知であり、ポリタンパク質前駆体の設計には当業者が容易に理解するいくつかの実施形態が含まれる。記載の前駆体分子の修飾のためには当技術分野で公知のプロテアーゼまたはペプチダーゼのいずれを使用してもよく、例えば、トロンビンアミノ酸配列LVPR^GS配列番号89を認識する、またはXa因子アミノ酸配列IE/DGR^配列番号90を認識するNagaiらOxygenBindingPropertiesOfHumanMutantHemoglobinsSynthesizedInEscherichiaColiProcNatAcadSciUSA8272527255、およびJennyらACriticalReviewOfTheMethodsForCleavageOfFusionProteinsWithThrombinAndFactorXaProteinExprPurif31111の総説、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる、エンテロキナーゼアミノ酸配列DDDDK^配列番号91を認識するCollinsRacieらProductionOfRecombinantBovineEnterokinaseCatalyticSubunitInEscherichiaColiUsingTheNovelSecretoryFusionPartnerDsbABiotechnology13982987、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる、フューリンアミノ酸配列RXXR^を認識し、RXK/RR^それぞれ配列番号92および配列番号93を優先的に認識するP6位の追加のRは切断を促進すると思われる、およびAcTEVアミノ酸配列ENLYFQ^G配列番号94を認識するParksらReleaseOfProteinsAndPeptidesFromFusionProteinsUsingARecombinantPlantVirusProteinaseAnalBiochem216413417、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる、ならびに口蹄疫ウイルスプロテアーゼC3がある。例えば、第6.4節を参照。様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に対して特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞株または宿主系を選択することにより、発現される外来タンパク質の適正な修飾とプロセシングを確保することができる。このために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を持つ真核宿主細胞を用いることができる。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定されるものではないが、CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47D、CRL7030およびHs578Bstが挙げられる。組換えタンパク質の長期、高収量産生のためには、安定した発現が好ましい。例えば、本発明の抗体を安定に発現する細胞株を遺伝子工学的に作製することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、適当な発現制御エレメント例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などにより制御されるDNAおよび選択マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAを導入した後に、遺伝子操作細胞を富化培地中で1~2日間増殖させることができ、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞に安定してプラスミドをその染色体に組み込ませ、増殖させて細胞叢を形成させ、続いてクローニングおよび細胞株への拡大が可能である。この方法は、本発明の抗体を発現する細胞株を遺伝子工学的に作製するために有利に使用することができる。このような遺伝子操作細胞株は、本発明の分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。多くの選択系を利用することができ、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼTransferOfPurifiedHerpesVirusThymidineKinaseGeneToCulturedMouseCellsCell11223232、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼUseOfTheHPRTGeneAndTheHATSelectionTechniqueInDNAMediatedTransformationOfMammalianCellsFirstStepsTowardDevelopingHybridomaTechniquesAndGeneTherapyBioessays14495500、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼIsolationOfTransformingDNACloningTheHamsteraprtGeneCell22817823遺伝子はそれぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞において使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性は以下の遺伝子:メトトレキセート耐性を付与するdhfrTransformationOfMammalianCellsWithAnAmplifiableDominantActingGeneProcNatlAcadSciUSA7735673570O’HareらTransformationOfMouseFibroblastsToMethotrexateResistanceByARecombinantPlasmidExpressingAProkaryoticDihydrofolateReductaseProcNatlAcadSciUSA7815271531;ミコフェノール酸耐性を付与するgptSelectionForAnimalCellsThatExpressTheEscherichiacoliGeneCodingForXanthineGuaninePhosphoribosyltransferaseProcNatlAcadSciUSA7820722076;アミノグリコシドG-418耐性を付与するneoGeneTherapyConceptsCurrentTrialsAndFutureDirectionsAnnRevPharmacolToxicol32573596MulliganTheBasicScienceOfGeneTherapyScience260926932およびMorganらHumanGeneTherapyAnnRevBiochem62191217、ならびにハイグロマイシン耐性を付与するhygroExpressionOfProkaryoticGenesForHygromycinBAndG418ResistanceAsDominantSelectionMarkersInMouseLCellsGene30147156を選択するための基礎として使用することができる。組換えDNA技術の分野で一般的に知られる、使用可能な方法は、Ausubelら1993CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNYKriegler1990GeneTransferandExpressionALaboratoryManualStocktonPressNYおよび第12章と13章Dracopoliら1994CurrentProtocolsinHumanGeneticsJohnWileySonsNYColberreGarapinらANewDominantHybridSelectiveMarkerForHigherEukaryoticCellsJMolBiol150114に記載されている。本発明の分子の発現レベルはベクターの増幅により増加させることができる総説としては、BebbingtonandHentschelTheuseofvectorsbasedongeneamplificationfortheexpressionofclonedgenesinmammaliancellsinDNAcloningVol3AcademicPressNewYork1987を参照。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルを増加させると、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅された領域はダイアボディ分子のポリペプチドのヌクレオチド配列と結びついているので、該ポリペプチドの産生も増加するExpressionAndAmplificationOfEngineeredMouseDihydrofolateReductaseMinigenesMolCellBiol3257266。宿主細胞は、本発明の2つの発現ベクター、すなわち、ダイアボディ分子の第1のポリペプチドをコードする第1のベクターとダイアボディ分子の第2のポリペプチドをコードする第2のベクターで同時にトランスフェクトすることができる。これら2つのベクターは、双方のポリペプチドの同等の発現を可能にする同じ選択マーカーを含有してもよい。あるいは、双方のポリペプチドをコードする単一のベクターを用いてもよい。本発明の分子のポリペプチドのコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含み得る。本発明の分子すなわち、ダイアボディが組換えにより発現されたならば、これをポリペプチド、ポリタンパク質またはダイアボディの精製のための当技術分野で公知の任意の方法例えば、抗原選択性に基づく抗体精製スキームに類似、例えば、クロマトグラフィー例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に特異的抗原に対するアフィニティークロマトグラフィー場合により、ダイアボディ分子がFcドメインまたはその一部を含む場合にはAタンパク質選択の後に、およびサイジングカラムクロマトグラフィー、遠心分離、示差溶解度、またはポリペプチド、ポリタンパク質もしくはダイアボディを精製するための他の任意の標準的技術によって精製することができる。5.6予防および治療方法本発明の分子は、FcγRにより媒介されるエフェクター細胞機能例えば、ADCCが望まれる疾患、障害または感染例えば、癌、感染性疾患を治療および/または予防するのに特に有用である。以上で述べたように、本発明のダイアボディは、Fcドメインを含まないが、エフェクター機能の誘発に抗体様の機能性を示し得る。FcγRを免疫特異的に認識する少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含むことにより、該ダイアボディ分子はFc-FcγR相互作用に類似したFcγR結合および活性を示し得る。例えば、本発明の分子は、免疫エフェクター細胞例えば、NK細胞上の細胞表面抗原およびFcγR例えば、FcγRIIIAと結合して、該細胞に対するエフェクター機能例えば、ADCC、CDC、食作用、オプソニン化などを刺激することができる。他の実施形態では、本発明のダイアボディ分子はFcドメインまたはその一部を含む。このような実施形態では、Fcドメインは野生型Fcドメインまたはその一部に対して少なくとも1つのアミノ酸修飾をさらに含み、かつ/または1以上のIgGアイソタイプ例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4由来のドメインを含むことができる。変異型Fcドメインを含む本発明の分子は、野生型Fcドメインを含む分子と比較して、付加的なまたは変更された表現型、例えば、変更されたまたは付加的なエフェクター機能活性例えば、NK依存性またはマクロファージ依存性アッセイでアッセイされるを示し得る。前述の実施形態において、付加的なまたは変更されたエフェクター機能活性を有する本発明の分子は、エフェクター機能活性の有効性の増強が望まれる疾患、障害または感染の治療および/または予防に有用である。特定の実施形態では、Fcドメインまたはその一部を含む本発明のダイアボディ分子が補体依存性カスケードを媒介する。エフェクター機能を変更することが確認されたFcドメイン変異体は、本発明者らの同時出願である、国際出願第04/063351号、米国特許出願公開第2005/0037000号および同第2005/0064514号、2004年11月10日出願の米国仮出願第60/626,510号、2004年12月15日出願の同第60/636,663号、および2006年3月10日出願の同第60/781,564号、ならびに2005年11月10日出願の米国特許出願公開第11/271,140号、および2005年12月15日出願の同第11/305,787号それぞれ参照により全内容を本明細書に組み入れるに開示されている。本発明は、被験体に、治療上有効な量の1種類以上の分子1以上のエピトープ結合部位と場合により、本発明に従って遺伝子操作されたFcドメインまたはその一部とを含み、該分子はさらに癌抗原と結合するを投与することを含む、被験体の癌を治療、予防または管理するための方法ならびに組成物を包含する。本発明の分子は原発性腫瘍、癌細胞の転移および感染性疾患の予防、阻害、増殖の低減または退縮に特に有用である。特定の作用機序に縛られるものではないが、本発明の分子はエフェクター機能を媒介して腫瘍の消失、腫瘍の低減、またはその双方をもたらす。別の実施形態では、本発明のダイアボディは、細胞表面抗原および/もしくは受容体の架橋、ならびにアポトーシスもしくは負の増殖調節シグナル伝達の増強により治療活性を媒介する。特定の作用機序に縛られるものではないが、本発明のダイアボディ分子は当技術分野で公知の治療用抗体と比較して治療有効性の増強を示すが、これは一部には、例えばダイアボディ-エピトープ相互作用の結合力が向上しているために標的細胞上により長く留まれるダイアボディの能力によって、ダイアボディが、特定の抗原例えば、FcγRの発現が低レベルである標的細胞とも免疫特異的に結合できるためである。抗原例えば、FcγRに対する親和性および結合力が増強された本発明のダイアボディは、標的細胞集団でFcγRの発現が低レベルである被験体における、癌または別の疾患もしくは障害の治療、予防または管理に特に有用である。本明細書において、細胞でのFcγR発現は、当業者に公知の通常の方法を用いて測定される、細胞あたりの該分子の密度によって定義される。複数のエピトープ結合部位と場合によりFcγRまたはその一部を含む本発明の分子はまた、好ましくは、標的抗原、例えば癌抗原を30,000~20,000分子/細胞の密度で、20,000~10,000分子/細胞の密度で、10,000分子/細胞以下の密度で、5000分子/細胞以下の密度で、または1000分子/細胞以下の密度で発現する細胞において、結合力および親和性および/またはエフェクター機能が付与されているか、または増強されている。本発明の分子は、標的細胞集団で標的抗原の発現が低レベルである部分集団において、癌などの疾患または障害を治療、予防または管理するのに特に有用である。本発明の分子はまた、癌、自己免疫疾患、炎症性障害または感染性疾患などの疾患を治療または予防するための当技術分野で公知の他の治療薬と有利に併用することができる。特定の実施形態では、本発明の分子を、例えば該分子と相互作用して免疫応答を高めるエフェクター細胞の数または活性を増大させるのに役立つ、モノクローナルもしくはキメラ抗体、リンホカイン、または造血系増殖因子例えば、IL-2、IL-3およびIL-7などと併用してもよい。本発明の分子はまた、疾患、障害または感染を治療するために使用される1種類以上の薬物、例えば、抗癌薬、抗炎症薬または抗ウイルス薬と有利に併用することもできる例えば、第5.7節に詳述。5.6.1癌本発明は、被験体に複数のエピトープ結合ドメインを含む1種類以上の分子の治療上有効な量を投与することを含む、被験体の癌を治療または予防するための方法および組成物を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、FcγR多型を有する被験体例えば、FcγRIIIA-158VまたはFcγRIIIA-158F対立遺伝子について同型接合性の被験体の癌を治療または予防するための方法および組成物を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、ダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを、FcγRIIIA158Fと免疫特異的に結合するように操作することを包含する。他の実施形態では、本発明は、ダイアボディ分子の少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを、FcγRIIIA158Vと免疫特異的に結合するように操作することを包含する。標準的なモノクローナル抗体療法の有効性は、被験体のFcγR多型に依存するCartronらTherapeuticActivityOfHumanizedAntiCD20MonoclonalAntibodyAndPolymorphismInIgGFcReceptorFcRIIIaGeneBlood99754758WengらTwoImmunoglobulinGFragmentCReceptorPolymorphismsIndependentlyPredictResponseToRituximabInPatientsWithFollicularLymphomaJClinOncol2139403947、双方とも参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れる。これらの受容体はエフェクター細胞の表面で発現され、ADCCを媒介する。低親和性活性化受容体の高親和性対立遺伝子は、エフェクター細胞のADCC媒介能を改善する。Fc-FcγR相互作用に頼ってエフェクター機能を果たすのとは対照的に、本発明の方法は、低親和性活性化受容体を免疫特異的に認識するように分子を操作して、該分子を特定の多型に合わせて設計可能とすることを包含する。その代わりに、またはそれに加えて、本発明の分子はエフェクター細胞上のFcγRに対して野生型Fcドメインと比較して増強された親和性を示す変異型Fcドメインを含むように操作してもよい。本発明の操作された分子は、そのFcγR多型にかかわらず、患者に対してよりよい免疫療法試薬を提供する。本発明に従って操作されたダイアボディ分子は、培養細胞株または患者由来のPMBC細胞のいずれかを用いたADCCにより試験し、Fc変異体のADCC増強能を判定する。本明細書に開示された方法を用いて標準的ADCCを実施する。フィコール-パーク勾配Pharmaciaを用いて末梢血からリンパ球を回収する。標的細胞、すなわち、培養細胞株または患者由来の細胞にユーロピウムPerkinElmerを添加し、エフェクターとともに37°Cで4時間インキュベートする。蛍光プレートリーダーWallacを用いて、放出されたユーロピウムを検出する。得られたADCCデータは、NK細胞媒介細胞傷害を誘発する本発明の分子の効力を示し、どの分子が患者サンプルおよび分離単球の双方を用いて試験可能であるかを確認する。その後、ADCC活性を誘発させる最大の能力を示すダイアボディ分子を、患者由来のPBMCを用いたADCCアッセイで試験する。健康なドナー由来のPBMCをエフェクター細胞として用いる。よって、本発明は、ダイアボディ分子を、癌抗原を免疫特異的に認識するように操作するその結果、該ダイアボディ分子はそれ自体、細胞傷害性アポトーシスまたは増殖性シグナルのダウンレギュレーションの増大をもたらす細胞表面受容体の架橋によるとなり、かつ/または本発明に従ってFcドメインを含み、かつ/または1以上のエフェクター機能例えば、ADCC、食作用を媒介するようになることによって、癌抗原により特徴付けられる癌を予防または治療する方法を提供する。本発明に従って操作されたダイアボディは、細胞傷害活性例えば、増強された腫瘍細胞死および/または増強された、例えばADCC活性もしくはCDC活性を持つので、癌の予防または治療に有用である。癌抗原を伴う癌は、癌抗原に結合しかつ細胞傷害性であり、かつ/または本発明の方法に従ってエフェクター機能を示すように操作された、ダイアボディの投与によって治療または予防することができる。例えば、限定されるものではないが、以下の癌抗原を伴う癌を本発明の方法および組成物によって治療または予防することができる:KS1/4汎癌腫抗原IsolationAndCharacterizationOfACdnaEncodingTheKs14EpithelialCarcinomaMarkerJImmunol14236623667MollerらBispecificMonoclonalAntibodyDirectedLysisOfOvarianCarcinomaCellsByActivatedHumanTLymphocytesCancerImmunolImmunother33210216、卵巣癌抗原CA125CoexpressionOfDifferentAntigenicMarkersOnMoietiesThatBearCA125DeterminantsCancerRes51468475、前立腺酸性ホスファターゼNucleotideSequenceOfHumanProstaticAcidPhosphataseDeterminedFromAFullLengthcDNACloneNuclAcidsRes184928、前立腺特異的抗原cDNACodingForTheEntireHumanProstateSpecificAntigenShowsHighHomologiesToTheHumanTissueKallikreinGenesBiochemBiophysResComm10903910IsraeliらMolecularCloningOfAComplementaryDNAEncodingAProstateSpecificMembraneAntigenCancerRes53227230、黒色腫関連抗原p97TransfectedMouseMelanomaLinesThatExpressVariousLevelsOfHumanMelanomaAssociatedAntigenp97JNatlCancerInstit81445454、黒色腫抗原gp75TheMelanomaAntigenGp75IsTheHumanHomologueOfTheMouseBLocusGeneProductJExpMed17113751380、高分子量黒色腫抗原HMW-MAAImmunohistochemicalDetectionOfAntigenInHumanPrimaryAndMetastaticMelanomasByTheMonoclonalAntibody140240AndItsPossiblePrognosticSignificanceCancer595563MittelmanらActiveSpecificImmunotherapyInPatientsWithMelanomaAClinicalTrialWithMouseAntiidiotypicMonoclonalAntibodiesElicitedWithSyngeneicAntiHighMolecularWeightMelanomaAssociatedAntigenMonoclonalAntibodiesJClinInvest8621362144、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原CEAImmuneResponseToTheCarcinoembryonicAntigenInPatientsTreatedWithAnAntiIdiotypeAntibodyVaccineJClinInvest9633442、多型性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪小球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原例えば、CEA、TAG-72RapidTumorPenetrationOfASingleChainFvAndComparisonWithOtherImmunoglobulinFormsCancerRes5234023408、CO17-1AEffectOfMonoclonalAntibody171AAndGMCSFInPatientsWithAdvancedColorectalCarcinomaLongLastingCompleteRemissionsCanBeInducedIntJCancer53751758、GICA19-9MonoclonalAntibodyDetectionOfACirculatingTumorAssociatedAntigenIPresenceOfAntigenInSeraOfPatientsWithColorectalGastricAndPancreaticCarcinomaJClinImmunol2135140、CTA-1およびLEA、バーキットリンパ腫抗原-38.13、CD19AntiCD19InhibitsTheGrowthOfHumanBCellTumorLinesInVitroAndOfDaudiCellsInSCIDMiceByInducingCellCycleArrestBlood8313291336、ヒトBリンパ腫抗原-CD20DepletionOfBCellsInVivoByAChimericMouseHumanMonoclonalAntibodyToCD20Blood83435445、CD33ModelingAndDosimetryOfMonoclonalAntibodyM195InAcuteMyelogenousLeukemiaJNuclMed34422430、黒色腫特異的抗原例えば、ガングリオシドGD2GenerationOfAHumanAntiIdiotypicAntibodyThatMimicsTheGD2AntigenJImmunol15133903398、ガングリオシドGD3AMouseHumanChimericAntiAntibodyWithEnhancedAntitumorActivitiesCancerImmunolImmunother36373380、ガングリオシドGM2ImprovedSurvivalInStageIIIMelanomaPatientsWithGM2AntibodiesARandomizedTrialOfAdjuvantVaccinationWithGM2GangliosideJClinOncol1210361044、ガングリオシドGM3MolecularCloningOfAHumanMonoclonalAntibodyReactiveToGangliosideGM3AntigenOnHumanCancersCancerRes5352445250、腫瘍特異的移植型細胞表面抗原tumorspecifictransplantationtypeofcellsurfaceantigen:TSTA例えば、DNA腫瘍ウイルスのT抗原およびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘導腫瘍抗原など、癌胎児性抗原-α-フェトプロテイン例えば、結腸のCEA、膀胱腫瘍癌胎児性抗原MonoclonalAntibodiesToCellSurfaceAntigensSharedByChemicallyInducedMouseBladderCarcinomasCancerRes4522102188、分化抗原例えば、ヒト肺癌抗原L6、L20MonoclonalMouseAntibodiesRaisedAgainstHumanLungCarcinomaCancerRes4639173923、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T細胞抗原-Gp37IdiotypeVaccinesAgainstHumanTCellLeukemiaIIGenerationAndCharacterizationOfAMonoclonalIdiotypeCascadeJImmunol14113981403、新生糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳癌抗原例えば、EGFR上皮成長因子受容体、HER2抗原p185HER2、多型上皮ムチンpolymorphicepithelialmucin:PEMCellMembraneAssociatedMucinsAndTheirAdhesionModulatingPropertyTrendsinBiochemSci17359363、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1MonoclonalAntibodyMediatedTumorRegressionByInductionOfApoptosisScience245301304、分化抗原DemonstrationByMonoclonalAntibodiesThatCarbohydrateStructuresOfGlycoproteinsAndGlycolipidsAreOncoDevelopmentalAntigensNature3145357例えば、胎児赤血球および初期内胚葉に見られるI抗原、胃腺癌に見られるIMa、乳房上皮に見られるM18およびM39、骨髄細胞に見られるSSEA-1、結腸直腸癌に見られるVEP8、VEP9、Myl、VIM-D5およびD156-22、結腸腺癌に見られるTRA-1-85血液型H、C14、肺腺癌に見られるF3、胃癌に見られるAH6、胚性癌細胞に見られるYハプテンLey、A431細胞に見られるTL5血液型A、EGF受容体、膵癌に見られるE1系列血液型B、胚性癌細胞、胃腺癌に見られるFC10.2、腺癌に見られるCO-514血液型Lea、腺癌に見られるNS-10、結腸腺癌に見られるCO-43血液型Leb、G49、EGF受容体、血液型ALeb/Ley、結腸癌、胃癌ムチンに見られる19.9、骨髄細胞に見られるT5A7、黒色腫に見られるR24、胚性癌細胞に見られる4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1:22:25:8、ならびに4~8細胞期の胚に見られるSSEA-3、SSEA-4。別の実施形態では、抗原は皮膚T細胞リンパ腫のT細胞受容体由来ペプチドであるEdelsonCutaneousTCellLymphomaAModelForSelectiveImmunotherapyCancerJSciAm46271参照。本発明の方法および組成物によって治療または予防することができる癌および関連の障害としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる:限定されるものではないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血球性白血病および脊髄形成異常症候群など、慢性白血病限定されるものではないが、慢性骨髄性顆粒球性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病などを含む白血病;真性赤血球増加症;限定されるものではないが、ホジキン病、非ホジキン病などのリンパ腫;限定されるものではないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫などの多発性骨髄腫;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症;良性単クローン性免疫グロブリン血症;重鎖病;限定されるものではないが、骨部肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管腫血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫などの骨および結合組織肉腫;限定されるものではないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹膠腫、上衣細胞腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫などの脳腫瘍;限定されるものではないが、腺癌、小葉小細胞癌、管内癌、髄様乳癌、粘液乳癌、管状乳癌、乳頭癌、ページェット病および炎症性乳癌などの乳癌;限定されるものではないが、クロム親和性細胞腫および副腎皮質癌などの副腎癌;限定されるものではないが、乳頭状もしくは濾胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および未分化甲状腺癌などの甲状腺癌;限定されるものではないが、膵島細胞腫、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍およびカルチノイドもしくは膵島細胞腫瘍などの膵癌;限定されるものではないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症および尿崩症などの下垂体癌;限定されるものではないが、眼部黒色腫例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫および毛様体黒色腫および網膜芽腫などの眼の癌;限定されるものではないが、扁平上皮癌、腺癌および黒色腫などの膣癌;限定されるものではないが、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫およびページェット病などの外陰部癌;限定されるものではないが、扁平上皮癌および腺癌などの子宮頚部癌;限定されるものではないが、子宮内膜癌および子宮肉腫などの子宮癌;限定されるものではないが、卵巣上皮癌、境界性腫瘍、生殖細胞腫瘍および間質腫瘍などの卵巣癌;限定されるものではないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌および燕麦細胞小細胞癌などの食道癌;限定されるものではないが、腺癌、菌状ポリープ状、潰瘍性、表在拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫および癌肉腫などの胃癌;結腸癌;直腸癌;限定されるものではないが、肝細胞癌および肝芽腫などの肝癌;限定されるものではないが、腺癌などの胆嚢癌;限定されるものではないが、乳頭状、結節性および拡散性などの胆管癌;限定されるものではないが、非小細胞肺癌、扁平上皮癌表皮癌、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌などの肺癌;限定されるものではないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化性、古典的典型的、精子細胞癌、非精上皮腫、胎児性癌、奇形腫、絨毛癌卵黄のう腫瘍などの精巣癌;限定されるものではないが、腺癌、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫などの前立腺癌;陰茎癌;限定されるものではないが、扁平上皮癌などの口腔癌;基底癌;限定されるものではないが、腺癌、粘膜表皮癌および腺様嚢胞癌などの唾液腺癌;限定されるものではないが、扁平上皮癌および疣状癌などの咽頭癌;限定されるものではないが、基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫などの皮膚癌;限定されるものではないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行性細胞癌腎骨盤および/または子宮などの腎癌;ウィルムス腫瘍;限定されるものではないが、移行性細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫などの膀胱癌。さらに、癌としては、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌が挙げられるこのような障害の総説としては、FishmanらMedicine第2版JBLippincottCoPhiladelphiaおよびMurphyらInformedDecisionsTheCompleteBookofCancerDiagnosisTreatmentandRecoveryVikingPenguinPenguinBooksUSAIncUnitedStatesofAmericaを参照。従って、本発明の方法および組成物は、限定されるものではないが、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、前立腺、子宮頚部、甲状腺および皮膚の癌を含む癌;扁平上皮癌;白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含むリンパ造血系腫瘍;急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病を含む骨髄造血系腫瘍;線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍;黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽腫および神経膠腫を含むその他の腫瘍;星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫および神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍;線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍;ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形癌を含むその他の腫瘍を含む多様な癌またはその他の異常増殖性疾患の治療または予防においても有用である。アポトーシスの異常により引き起こされる癌も、本発明の方法および組成物によって治療されることが企図される。このような癌としては、限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、p53突然変異を伴う癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに家族性腺腫様ポリープ症および脊髄形成異常症候群などの前癌性病変が挙げられる。特定の実施形態では、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓または子宮において、悪性腫瘍もしくは増殖異常変化異形成および形成不全など、または過剰増殖性疾患を、本発明の方法および組成物によって治療または予防する。他の特定の実施形態では、肉腫、黒色腫または白血病を本発明の方法および組成物によって治療または予防する。特定の実施形態では、本発明の分子例えば、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりFcドメインまたはその一部を含むダイアボディは、癌細胞の増殖を、本発明の該分子の不在下での癌細胞の増殖と比較して、少なくとも99、少なくとも95、少なくとも90、少なくとも85、少なくとも80、少なくとも75、少なくとも70、少なくとも60、少なくとも50、少なくとも45、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも35、少なくとも30、少なくとも25、少なくとも20、または少なくとも10阻害または低減する。特定の実施形態では、本発明の分子例えば、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりFcドメインまたはその一部を含むダイアボディは、親分子よりも少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、または少なくとも100良好に細胞を死滅させるか、または癌細胞の増殖を阻害もしくは低減する。5.6.2自己免疫疾患および炎症性疾患いくつかの実施形態では、本発明の分子は、本発明の方法に従って操作された、FcγRIIBに特異的なエピトープ結合ドメインおよび/または変異型Fcドメインまたはその一部を含み、該Fcドメインは野生型Fcドメインと比較して、FcγRIIBに対してより大きな親和性とFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性の低下を示す。そのような結合特性を有する本発明の分子は、免疫応答の調節、例えば、自己免疫疾患または炎症性疾患に関連する免疫応答の阻害において有用である。いずれの作用機序にも縛られるものではないが、FcγRIIBに対する親和性を有し、かつ/またはFcγRIIBに対する親和性が増強され、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が低減されたFcドメインを含む本発明の分子は、FcγRに対する活性化応答の弱化および細胞応答性の阻害をもたらし、従って、自己免疫疾患の治療および/または予防に対して治療有効性を有すると考えられる。本発明はまた、被験体における炎症性障害に関連する1以上の症状を予防、治療または管理する方法を提供し、該方法は、1種類以上の抗炎症薬の治療上または予防上有効な量を該被験体に投与することをさらに含む。本発明はまた、自己免疫疾患に関連する1以上の症状を予防、治療または管理する方法も提供し、該方法は、1種類以上の免疫調節薬の治療上または予防上有効な量を該被験体に投与することをさらに含む。第5.7節に、抗炎症薬および免疫調節薬の非限定的な例を示す。本発明の分子を投与することにより治療可能な自己免疫障害の例としては、限定されるものでないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎および睾丸炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群CFIDS、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼蒼、本態性混合型寒冷グロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギラン-バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病ITP、IgA神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合型結合組織病、多発性硬化症、1型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性紅斑性狼瘡、紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎などの血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。炎症性障害の例としては、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患COPD、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性的ウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が挙げられる。本明細書の第2.2.2節に記載されているように、いくつかの自己免疫障害は炎症症状を伴っている。このように、自己免疫障害と考えられる障害と炎症性障害と考えられる障害との間には重複がある。従って、いくつかの自己免疫障害は炎症性障害としても特徴付けることができる。本発明の方法に従って予防、治療または管理可能な炎症性障害の例としては、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患COPD、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性的ウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が挙げられる。FcγRIIBに特異的な少なくとも1つのエピトープ結合ドメインおよび/またはFcγRIIBに対する親和性が増強され、かつ、FcγRIIIAに対する親和性が低減された変異型Fcドメインを含む本発明の分子はまた、炎症性障害を有する動物、特に哺乳動物が受ける炎症を軽減するために使用することもできる。特定の実施形態では、本発明の分子は動物の炎症を、前述の分子を投与されてない動物の炎症と比較して、少なくとも99、少なくとも95、少なくとも90、少なくとも85、少なくとも80、少なくとも75、少なくとも70、少なくとも60、少なくとも50、少なくとも45、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも35、少なくとも30、少なくとも25、少なくとも20,または少なくとも10軽減する。FcγRIIBに特異的な少なくとも1つのエピトープ結合ドメインおよび/またはFcγRIIBに対する親和性が増強され、かつ、FcγRIIIAに対する親和性が低減された変異型Fcドメインを含む本発明の分子はまた、移植拒絶を防止するために使用することもできる。5.6.3感染性疾患本発明はまた、被験体における感染性疾患を治療または予防する方法も包含し、該方法は、感染性疾患と関連した感染性病原体に特異的な少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含む、1種類以上の本発明の分子の治療上または予防上有効な量を投与することを含む。特定の実施形態では、本発明の分子は感染性病原体に対して有毒であり、前述の分子の不在下での免疫応答と比較して、前述の病原体に対する免疫応答を増強するか、または前述の病原体に対するエフェクター機能を増強する。本発明の分子によって治療または予防可能な感染性疾患は、限定されるものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原虫およびウイルスを含む感染性病原体により引き起こされる。本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防可能なウイルス性疾患としては、限定されるものではないが、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、I型単純ヘルペスウイルスHSV-I、II型単純ヘルペスウイルスHSV-II、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エコーウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘ウイルス、エプスタイン-バーウイルス、I型ヒト免疫不全ウイルスHIV-I、II型ヒト免疫不全ウイルスHIV-II、およびウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱または天然痘などのウイルス性疾患の病原体により引き起こされるものが挙げられる。本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防可能な細菌性疾患としては、限定されるものではないが、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、肺炎球菌、ライム病ボレリアライム病、炭疽菌炭疽病、破傷風菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、マイコバクテリウム、破傷風菌、百日咳菌、コレラ菌、ペスト菌、ジフテリア菌、クラミジア、黄色ブドウ球菌およびレジオネラ菌を含む細菌により引き起こされるものが挙げられる。本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防可能な原虫性疾患としては、限定されるものではないが、リーシュマニア、コクシジウム、トリパノソーマまたはマラリア原虫を含む原虫により引き起こされるものが挙げられる。本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防可能な寄生虫性疾患としては、限定されるものではないが、クラミジアおよびリケッチアを含む寄生虫により引き起こされるものが挙げられる。本発明の一態様によれば、感染性病原体に特異的な少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含む本発明の分子は、該病原体例えば、病原性タンパク質に対する抗体エフェクター機能を示す。感染性病原体の例としては、限定されるものではないが、細菌例えば、大腸菌、肺炎桿菌、黄色ブドウ球菌、大便連鎖球菌、カンジダアルビカンス、プロテウスブルガリス、スタフィロコッカスビリダンスおよび緑膿菌;病原体例えば、Bリンパ球向性パポバウイルスLPV;ボルダテラペルツッシス;ボルナ病ウイルスBDV;ウシコロナウイルス;脈絡髄膜炎ウイルス;デング熱ウイルス;ウイルス、大腸菌;エボラ;エコーウイルス1;エコーウイルス11EV;エンドトキシンLPS;腸内細菌;腸内オーファンウイルス;腸内ウイルス;ネコ白血病ウイルス;口蹄疫ウイルス;テナガザル白血病ウイルスGALV;グラム陰性細菌;ヘリコバクターピロリ;B型肝炎ウイルスHBV;単純ヘルペスウイルス;HIV-1;ヒトサイトメガロウイルス;ヒトコロナウイルス;インフルエンザA、BおよびC;レジオネラ菌;リーシュマニアメキシカーナ;リステリアモノサイトゲネス;麻疹ウイルス;髄膜炎菌;麻疹ウイルス;マウス肝炎ウイルス;マウス白血病ウイルス;マウスガンマヘルペスウイルス;マウスレトロウイルス;マウスコロナウイルス;マウス肝炎ウイルス;鳥結核菌M;リン菌;ニューカッスル病ウイルス;パルボウイルスB19;熱帯熱マラリア原虫;ポックスウイルス;シュードモナス;ロタウイルス;ネズミチフス菌;赤痢菌;連鎖球菌;T細胞リンパ球ウイルス1;ワクシニアウイルスが挙げられる。5.6.4解毒本発明はまた、毒素例えば、毒性薬物分子に曝された被験体の解毒方法を包含し、該方法は、毒性薬物分子に特異的な少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含む1種類以上の本発明の分子の治療上または予防上有効な量を投与することを含む。特定の実施形態では、本発明の分子の毒素への結合は、該毒素の有害な生理学的作用を軽減または排除する。さらに他の実施形態では、本発明のダイアボディの毒素への結合は、該ダイアボディの不在下での毒素の除去、分解または中和と比較して、毒素の除去、分解または中和を増大または増強する。本発明の方法に従う免疫毒素療法は、限定されるものではないが、ジゴキシン、PCP、コカイン、コルヒチン、三環式抗鬱薬を含む薬物の過剰投与または薬物への曝露を治療するために使用することができる。5.7併用療法本発明はさらに、本発明の分子を、限定されるものではないが、現行の標準的および試験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法または外科手術を含む、癌、自己免疫疾患、感染性疾患または中毒の治療または予防のための当業者に公知の他の療法と併用投与することを包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子を、治療上または予防上有効な量の1種類以上の薬剤、治療用抗体、または癌、自己免疫疾患、感染性疾患もしくは中毒の治療および/または予防のための当業者に公知の他の薬剤と併用投与することができる。特定の実施形態では、1種類以上の本発明の分子を、癌の治療に有用な他の1種類以上の治療薬と同時に、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。同時にとは、予防薬または治療薬の厳密な同じ時点での投与に限定されるものではなく、むしろ本発明の分子と他の薬剤を哺乳動物に連続的かつ一定の時間間隔内に投与して、本発明の分子が他の薬剤とともに作用して、それらを別々に投与した場合よりも増大した利益を提供するようにすることを意味する。例えば、予防薬または治療薬例えば、化学療法、放射線療法、ホルモン療法または生物学的療法のそれぞれを、同じ時点に、または任意の順序で異なる時点で連続的に投与することができるが、同じ時点に投与されない場合には、所望の治療効果または予防効果が提供されるように十分近接した時点で投与すべきである。各治療薬は、任意の適当な形態で、かつ任意の好適な経路で、別々に投与することができる。種々の実施形態では、予防薬または治療薬を、1時間未満の間隔、約1時間の間隔、約1時間~約2時間の間隔、約2時間~約3時間の間隔、約3時間~約4時間の間隔、約4時間~約5時間の間隔、約5時間~約6時間の間隔、約6時間~約7時間の間隔、約7時間~約8時間の間隔、約8時間~約9時間の間隔、約9時間~約10時間の間隔、約10時間~約11時間の間隔、約11時間~約12時間の間隔、24時間以下の間隔または48時間以下の間隔で投与する。好ましい実施形態では、2種類以上の成分を患者の同一来診時に投与する。他の実施形態では、予防薬または治療薬を、約2~4日の間隔、約4~6日の間隔、約1週間の間隔、約1~2週間の間隔、または2週間以上の間隔で投与する。好ましい実施形態では、予防薬または治療薬を、両薬剤が活性を維持している時間枠内で投与する。当業者ならば、投与する薬剤の半減期を測定することによって、このような時間を決定することができる。特定の実施形態では、本発明の予防薬または治療薬を、被験体に周期的に投与する。周期的療法には、第1薬剤をある期間投与した後、第2薬剤および/または第3薬剤をある期間投与し、この連続投与を反復することを含む。周期的療法は、1種類以上の療法に対する耐性の進行を軽減し、一療法の副作用を回避または軽減し、かつ/または治療の有効性を向上させることができる。特定の実施形態では、予防薬または治療薬を、約3週間未満の周期で、約2週間毎に1回、約10日毎に1回、または約1週間毎に1回投与する。1周期には、周期毎に約90分間、周期毎に約1時間、周期毎に約45分間かけて注入することによる治療薬または予防薬の投与を含むことができる。各周期は少なくとも1週間の休止、少なくとも2週間の休止、少なくとも3週間の休止を含むことができる。投与する周期の回数は約1~約12周期、より一般には約2~約10周期、より一般には約2~約8周期である。さらに他の実施形態では、本発明の治療薬および予防薬を、メトロノーム的投与計画で、長期の休止期間を設けずに連続注入または高頻度投与のいずれかによって投与する。このようなメトロノーム的投与には、休止期間を設けない一定間隔での投与が含まれ得る。一般には、治療薬、特に細胞傷害性薬剤を低用量で使用する。このような投与計画には、長期間の比較的低用量の連日投与が含まれる。好ましい実施形態では、低用量の使用は、毒性副作用を最少にし、休止期間を排除することができる。特定の実施形態では、治療薬および予防薬は、約24時間から約2日まで、約1週間まで、約2週間まで、約3週間まで、約1ヶ月まで、約2ヶ月まで、約3ヶ月まで、約4ヶ月まで、約5ヶ月まで、約6ヶ月までの範囲の連日低用量投与または連続注入によって送達される。このような投与計画のスケジュールは腫瘍専門家が至適化することができる他の実施形態では、複数の治療クールを哺乳動物に同時に投与するすなわち、個別の用量の治療薬を、別々にではあるが、本発明の分子が他の薬剤とともに作用できるような時間間隔で投与する。例えば、ある成分を1週間に1回投与し、それと組み合わせて、他の成分を2週間毎に1回、または3週間毎に1回投与してもよい。言い換えれば、治療薬の投与計画は、治療薬が同時にまたは患者の同一来診時に投与されない場合であっても、同時に実施される。他の予防薬および/または治療薬と併用する場合、本発明の分子と予防薬および/または治療薬は相加的に、より好ましくは相乗的に作用することができる。一実施形態では、本発明の分子を1種類以上の治療薬とともに同一の医薬組成物として同時に投与する。別の実施形態では、本発明の分子を1種類以上の治療薬とともに別々の医薬組成物として同時に投与する。さらに別の実施形態では、本発明の分子を、別の予防薬または治療薬の投与前または投与後に投与する。本発明は、同一または異なる投与経路、例えば、経口経路と非経口経路による、本発明の分子と他の予防薬または治療薬との併用投与を企図する。特定の実施形態では、本発明の分子を、限定されるものではないが、毒性などの有害副作用をもたらす可能性がある別の予防薬または治療薬と同時に投与する場合には、予防薬または治療薬は、有害副作用が誘発される閾値より低い用量で投与することが有利であり得る。本明細書で提供される用量および投与頻度は、治療上有効なおよび予防上有効なという用語により包含されている。用量および頻度はさらに、一般には各患者に特有な因子に従って、投与する特定の治療薬または予防薬、癌の重篤度およびタイプ、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答性および過去の病歴に応じて異なる。好適な投与計画は、このような因子を考慮し、例えば文献に報告され、Physician’sDeskReference第56版、2002年で推奨されている用量に従って当業者が選択可能である。5.7.1抗癌薬特定の実施形態では、本発明の方法は、1種類以上の本発明の分子を、癌の治療および/または予防のために使用される1種類以上の治療薬とともに投与することを包含する。一実施形態では、血管新生阻害薬を本発明の分子と併用投与することができる。本発明の方法および組成物において使用可能な血管新生阻害薬としては、限定されるものではないが、アンギオスタチンプラスミノーゲンフラグメント;抗血管新生抗トロンビンIII;アンギオザイム;ABT-627;Bay12-9566;ベネフィン;ベバシズマブ;BMS-275291;軟骨由来阻害薬CDI;CAI;CD59補体フラグメント;CEP-7055;Col3;コンブレタスタチンA-4;エンドスタチンコラーゲンXVIIIフラグメント;フィブロネクチンフラグメント;Gro-β;ハロフギノン;ヘパリナーゼ;ヘパリンヘキササッカライドフラグメント;HMV833;ヒト絨毛性ゴナドトロピンhCG;IM-862;インターフェロンα/β/γ;インターフェロン誘導性タンパク質IP-10;インターロイキン-12;クリングル5プラスミノーゲンフラグメント;マリマスタット;メタロプロテイナーゼ阻害薬TIMP;2-メトキシエストラジオール;MMI270CGS27023A;MoAbIMC-1C11;ネオバスタット;NM-3;パンゼム;PI-88;胎盤リボヌクレアーゼ阻害薬;プラスミノーゲン活性化因子阻害薬;血小板因子-4PF4;プリノマスタット;プロラクチン16kDaフラグメント;プロリフェリン関連タンパク質PRP;PTK787/ZK222594;レチノイド;ソリマスタット;スクアラミン;SS3304;SU5416;SU6668;SU11248;テトラヒドロコルチゾール-S;テトラチオモリブダート;サリドマイド;トロンボスポンジン-1TSP-1;TNP-470;トランスフォーミング増殖因子βTGF-b;バスキュロスタチン;バソスタチンカルレティキュリンフラグメント;ZD6126;ZD6474;ファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬FTI;およびビスホスホネートが挙げられる。本発明の医薬組成物および投与形およびキットを含む本発明の種々の実施形態において、本発明の分子と併用可能な抗癌薬としては、限定されるものではないが、アシビシン;アクラルビシン;塩酸アコダゾール;アクロニン;アドゼレシン;アルデスロイキン;アルトレタミン;アンボマイシン;酢酸アメタントロン;アミノグルテチミド;アムサクリン;アナストロゾール;アントラマイシン;アスパラギナーゼ;アスペルリン;アザシチジン;アゼテパ;アゾトマイシン;バチマスタット;ベンゾデパ;ビカルタミド;塩酸ビサントレン;二メシル酸ビスナフィド;ビゼレシン;硫酸ブレオマイシン;ブレキナルナトリウム;ブロピリミン;ブスルファン;カクチノマイシン;カルステロン;カラセミド;カルベチマー;カルボプラチン;カルムスチン;塩酸カルビシン;カルゼレシン;セデフィンゴール;クロラムブシル;シロレマイシン;シスプラチン;クラドリビン;メシル酸クリスナトール;シクロホスファミド;シタラビン;ダカルバジン;ダクチノマイシン;塩酸ダウノルビシン;デシタビン;デキソルマプラチン;デザグアニン;メシル酸デザグアニン;ジアジクオン;ドセタキセル;ドキソルビシン;塩酸ドキソルビシン;ドロロキシフェン;クエン酸ドロロキシフェン;プロピオン酸ドロモスタノロン;ジュアゾマイシン;エダトレキサート;塩酸エフロルニチン;エルサミトルシン;エンロプラチン;エンプロマート;エピプロピジン;塩酸エピルビシン;エルブロゾール;塩酸エソルビシン;エストラムスチン;リン酸エストラムスチンナトリウム;エタニダゾール;エトポシド;リン酸エトポシド;エトプリン;塩酸ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フロクスウリジン;リン酸フルダラビン;フルオロウラシル;フルロシタビン;フォスキドン;フォストリエシンナトリウム;ゲムシタビン;塩酸ゲムシタビン;ヒドロキシ尿素;塩酸イダルビシン;イフォスファミド;イルモフォシン;インターロイキンII組換えインターロイキンIIまたはrIL2を含む、インターフェロンα-2a;インターフェロンα-2b;インターフェロンα-n1;インターフェロンα-n3;インターフェロンβ-Ia;インターフェロンγ-Ib;イプロプラチン;塩酸イリノテカン;酢酸ランレオチド;レトロゾール;酢酸ロイプロリド;塩酸リアロゾール;ロメトレキソールナトリウム;ロムスチン;塩酸ロソキサントロン;マソプロコール;マイタンシン;塩酸メクロレタミン;酢酸メゲストロール;酢酸メレンゲストロール;メルファラン;メノガリル;メルカプトプリン;メトトレキサート;メトトレキサートナトリウム;メトプリン;メツレデパ;ミチンドミド;ミトカルシン;ミトクロミン;ミトジリン;ミトマルシン;マイトマイシン;ミトスペル;ミトタン;塩酸ミトキサントロン;ミコフェノール酸;ノコダゾール;ノガラマイシン;オルマプラチン;オキシスラン;パクリタキセル;ペグアスパルガーゼ;ペリオマイシン;ペンタムスチン;硫酸ペプロマイシン;ペルホスファミド;ピポブロマン;ピポスルファン;塩酸ピロキサントロン;プリカマイシン;プロメスタン;ポルフィマナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニムスチン;塩酸プロカルバジン;ピューロマイシン;塩酸ピューロマイシン;ピラゾフリン;リボプリン;ログレチミド;サフィンゴール;塩酸サフィンゴール;セムスチン;シムトラゼン;スパルフォセートナトリウム;スパルソマイシン;塩酸スピロゲルマニウム;スピロムスチン;スピロプラチン;ストレプトニグリン;ストレプトゾシン;スロフェヌル;タリソマイシン;テコガランナトリウム;テガフール;塩酸テロキサントロン;テモポルフィン;テニポシド;テロキシロン;テストラクトン;チアミプリン;チオグアニン;チオテパ;チアゾフリン;チラパザミン;クエン酸トレミフェン;酢酸トレストロン;リン酸トリシリビン;トリメトレキサート;グルクロン酸トリメトレキサート;トリプトレリン;塩酸ツブロゾール;ウラシルマスタード;ウレデパ;バプレオチド;ベルテポルフィン;硫酸ビンブラスチン;硫酸ビンクリスチン;ビンデシン;硫酸ビンデシン;硫酸ビンエピジン;硫酸ビングリシナート;硫酸ビンロイロシン;酒石酸ビノレルビン;硫酸ビンロシジン;硫酸ビンゾリジン;ボロゾール;ゼニプラチン;ジノスタチン;塩酸ゾルビシンが挙げられる。他の抗癌薬としては、限定されるものではないが、20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3;5-エチニルウラシル;アビラテロン;アクラルビシン;アシルフルベン;アデシペノール;アドゼレシン;アルデスロイキン;ALL-TK拮抗薬;アルトレタミン;アンバムスチン;アミドックス;アミフォスチン;アミノレブリン酸;アムルビシン;アムサクリン;アナグレリド;アナストロゾール;アンドログラホリド;血管新生阻害薬;拮抗薬D;拮抗薬G;アンタレリクス;抗背方化形態発生タンパク質-1;抗アンドロゲン、前立腺癌薬;抗エストロゲン薬;抗ネオプラストン薬;アンチセンスオリゴヌクレオチド;グリシン酸アフィジコリン;アポトーシス遺伝子モジュレーター;アポトーシスレギュレーター;アプリン酸;アラ-CDP-DL-PTBA;アルギニンデアミナーゼ;アスラクリン;アタメスタン;アトリムスチン;アキシナスタチン1;アキシナスタチン2;アキシナスタチン3;アザセトロン;アザトキシン;アザチロシン;バッカチンIII誘導体;バラノール;バチマスタット;BCR/ABL拮抗薬;ベンゾクロリン;ベンゾイルスタウロスポリン;βラクタム誘導体;βアレチン;βクラマイシンB;ベツリン酸;bFGF阻害薬;ビカルタミド;ビサントレン;ビスアジリジニルスペルミン;ビスナフィド;ビストラテンA;ビゼレシン;ブレフラート;ブロピリミン;ブドチタン;ブチオニンスルフォキシミン;カルシポトリオール;カルフォスチンC;カンプトテシン誘導体;カナリア痘IL-2;カペシタビン;カルボキサミド-アミノ-トリアゾール;カルボキシアミドトリアゾール;CaRestM3;CARN700;軟骨由来阻害薬;カルゼレシン;カゼインキナーゼ阻害薬ICOS;カスタノスペルミン;セクロピンB;セトロレリクス;クロリン;クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト;シスポルフィリン;クラドリビン;クロミフェン類似体;クロトリマゾール;コリスマイシンA;コリスマイシンB;コンブレタスタチンA4;コンブレタスタチン類似体;コナゲニン;クラムベシジン816;クリスナトール;クリプトフィシン8;クリプトフィシンA誘導体;キュラシンA;シクロペンタアントラキノン;シクロプラタム;シペマイシン;シタラビンオクホスファート;細胞溶解因子;シトスタチン;ダクリキシマブ;デシタビン;デヒドロジデムニンB;デスロレリン;デキサメタゾン;デキシホスファミド;デクスラゾキサン;デクスベラパミル;ジアジクオン;ジデムニンB;ジドックス;ジエチルノルスペルミン;ジヒドロ-5-アザシチジン;ジヒドロタキソール,9-;ジオキサマイシン;ジフェニルスピロムスチン;ドセタキセル;ドコサノール;ドラセトロン;ドキシフルリジン;ドロロキシフェン;ドロナビノール;ジュオカルマイシンSA;エブセレン;エコムスチン;エデルホシン;エドレコロマブ;エフロルニチン;エレメン;エミテフル;エピルビシン;エプリステリド;エストラムスチン類似体;エストロゲン作動薬;エストロゲン拮抗薬;エタニダゾール;リン酸エトポシド;エキセメスタン;ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フィルグラスチム;フィナステリド;フラボピリドール;フレゼラスチン;フルアステロン;フルダラビン;塩酸フルオロダウノルビシン;ホルフェニメクス;フォルメスタン;フォストリエシン;フォテムスチン;ガドリニウムテキサフィリン;硝酸ガリウム;ガロシタビン;ガニレリックス;ゼラチナーゼ阻害薬;ゲムシタビン;グルタチオン阻害薬;ヘプスルファム;ヘレグリン;ヘキサメチレンビスアセトアミド;ヒペリシン;イバンドロン酸;イダルビシン;イドキシフェン;イドラマントン;イルモホシン;イロマスタット;イミダゾアクリドン;イミキモド;免疫刺激ペプチド;インスリン様増殖因子-1受容体阻害薬;インターフェロン作動薬;インターフェロン;インターロイキン;ヨードベングアン;ヨードドキソルビシン;イポメアノール,4-;イロプラクト;イルソグラジン;イソベンガゾール;イソホモハリコンドリンB;イタセトロン;ジャスプラキノリド;カハラリドF;三酢酸ラメラリン-N;ランレオチド;レイナマイシン;レノグラスチム;硫酸レンチナン;レプトルスタチン;レトロゾール;白血病抑制因子;白血球αインターフェロン;ロイプロリドエストロゲンプロゲステロン;ロイプロレリン;レバミゾール;リアロゾール;線状ポリアミン類似体;親油性ジサッカライドペプチド;親油性白金化合物;リッソクリナミド7;ロバプラチン;ロンブリシン;ロメトレキソール;ロニダミン;ロソキサントロン;ロバスタチン;ロキソリビン;ルルトテカン;テキサフィリンルテチウム;リソフィリン;溶解性ペプチド;マイタンシン;マンノスタチンA;マリマスタット;マソプロコール;マスピン;マトリライシン阻害薬;マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬;メノガリル;メルバロン;メテレリン;メチオニナーゼ;メトクロプラミド;MIF阻害薬;ミフェプリストン;ミルテホシン;ミリモスチム;ミスマッチ二本鎖RNA;ミトグアゾン;ミトラクトール;マイトマイシン類似体;ミトナフィド;マイトトキシン線維芽細胞増殖因子-サポリン;ミトキサントロン;モファロテン;モルグラモスチム;モノクローナル抗体、ヒト絨毛ゴナドトロピン;モノホスホリル脂質Aミオバクテリウム細胞壁sk;モピダモール;多剤耐性遺伝子阻害薬;多発性腫瘍抑制因子1に基づく療法;マスタード抗癌薬;ミカペルオキシドB;マイコバクテリア細胞壁抽出物;ミリアポロン;N-アセチルジナリン;N-置換ベンズアミド;ナファレリン;ナグレスチップ;ナロキソンペンタゾシン;ナパビン;ナフテルピン;ナルトグラスチム;ネダプラチン;ネモルビシン;ネリドロン酸;中性エンドペプチダーゼ;ニルタミド;ニサマイシン;一酸化窒素モジュレーター;ニトロキシド抗酸化剤;ニトルリン;06-ベンジルグアニン;オクトレオチド;オキセノン;オリゴヌクレオチド;オナプリストン;オンダンセトロン;オンダンセトロン;オラシン;経口サイトカイン誘導薬;オルマプラチン;オサテロン;オキサリプラチン;オキサウノマイシン;パクリタキセル;パクリタキセル類似体;パクリタキセル誘導体;パラウアミン;パルミトイルリゾキシン;パミドロン酸;パナキシトリオール;パノミフェン;パラバクチン;パゼリプチン;ぺグアスパラガーゼ;ペルデシン;ポリ硫酸ペントサンナトリウム;ペントスタチン;ペントロゾール;パーフルブロン;パーホスファミド;ペリリルアルコール;フェナジノマイシン;酢酸フェニル;ホスファターゼ阻害薬;ピシバニール;塩酸ピロカルピン;ピラルビシン;ピリトレキシム;プラセチンA;プラセチンB;プラスミノーゲンアクチベーター阻害薬;白金複合体;白金化合物;白金-トリアミン複合体;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニゾン;プロピルビス-アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテアソーム阻害薬;タンパク質Aに基づく免疫調節薬;タンパク質キナーゼC阻害薬;タンパク質キナーゼC阻害薬類、微細藻類;タンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害薬;プルプリン;ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート;raf拮抗薬;ラルチトレキセド;ラモセトロン;rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬;ras阻害薬;ras-GAP阻害薬;脱メチル化レテリプチン;エチドロン酸レニウムRe186;リゾキシン;リボザイム;RIIレチナミド;ログレチミド;ロヒツキン;ロムルチド;ロキニメックス;ルビギノンB1;ルボキシル;サフィンゴール;サイントピン;SarCNU;サルコフィトールA;サルグラモスチム;Sdi1ミメティクス;セムスチン;老化誘導阻害薬1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害薬;シグナル伝達調節薬;一本鎖抗原結合タンパク質;シゾフィラン;ソブゾキサン;ボロカプタートナトリウム;フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロール;ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミン;スパルホス酸;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン;スポンギスタチン1;スクアラミン;幹細胞阻害薬;幹細胞分裂阻害薬;スチピアミド;ストロメリシン阻害薬;スルフィノシン;超活性血管作用性腸管ペプチド拮抗薬;スラジスタ;スラミン;スワインソニン;合成グリコサミノグリカン;タリムスチン;タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム;テガフール;テルラピリリウム;テロメラーゼ阻害薬;テモポルフィン;テモゾロミド;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン;タリブラスチン;チオコラリン;トロンボポエチン;トロンボポエチンミメティック;チマルファシン;チモポエチン受容体作動薬;チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;エチルエチオプルプリンスズ;チラパザミン;二塩化チタノセン;トプセンチン;トレミフェン;全能性幹細胞因子;翻訳阻害薬;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキサート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド;チロシンキナーゼ阻害薬;チルホスチン;UBC阻害薬;ウベニメクス;尿生殖洞由来成長抑制因子;ウロキナーゼ受容体拮抗薬;バプレオチド;バリオリンB;ベクター系、赤血球遺伝子治療;ベラレソール;ベラミン;ベルジン;ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン;ビタキシン;ボロゾール;ザノテロン;ゼニプラチン;ジラスコルブ;およびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。好ましい他の抗癌薬は、5-フルオロウラシルおよびロイコボリンである。本発明の方法に使用可能な治療用抗体の例としては、限定されるものではないが、ZENAPAXS登録商標ダクリズマブRochePharmaceuticals、スイス急性腎同種移植拒絶の予防のための免疫抑制性ヒト化抗CD25モノクローナル抗体;PANOREX商標マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体GlaxoWellcome/Centocor;BEC2マウス抗イディオタイプGD3エピトープIgG抗体ImCloneSystem;IMC-C225キメラ抗EGFRIgG抗体ImCloneSystem;VITAXIN商標ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体AppliedMolecularEvolution/MedImmune;SmartM195ヒト化抗CD33IgG抗体ProteinDesignLab/Kanebo;LYMPHOCIDE商標ヒト化抗CD22IgG抗体Immunomedics;ICM3ヒト化抗ICAM3抗体ICOSPharm;IDEC-114霊長類化抗CD80抗体IDECPharm/Mitsubishi;IDEC-131ヒト化抗CD40L抗体IDEC/Eisai;IDEC-151霊長類化抗CD4抗体IDEC;IDEC-152霊長類化抗CD23抗体IDEC/Seikagaku;SMART抗CD3ヒト化抗CD3IgGProteinDesignLab;5G1.1ヒト化抗補体因子5C5抗体AlexionPharm;D2E7ヒト化抗TNF-α抗体CAT/BASF;CDP870ヒト化抗TNF-αFabフラグメントCelltech;IDEC-151霊長類化抗CD4IgG1抗体IDECPharm/SmithKlineBeecham;MDX-CD4ヒト抗CD4IgG抗体Medarex/Eisai/Genmab;CDP571ヒト化抗TNF-αIgG4抗体Celltech;LDP-02ヒト化抗α4β7抗体LeukoSite/Genentech;OrthoCloneOKT4Aヒト化抗CD4IgG抗体OrthoBiotech;ANTOVA商標ヒト化抗CD40LIgG抗体Biogen;ANTEGREN商標ヒト化抗VLA-4IgG抗体Elan;およびCAT-152ヒト抗TGF-β2抗体CambridgeAbTechが挙げられる。本発明に従って使用可能な治療用抗体の他の例を表8に示す。5.7.2免疫調節薬および抗炎症薬本発明は、本発明の分子を他の治療薬とともに投与することを含む、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療方法を提供する。免疫調節薬の例としては、限定されるものではないが、メトトレキサート、エンブレル、レミケード商標、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンAおよびマクロライド抗生物質例えば、FK506タクロリムス、メチルプレドニゾロンMP、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシンシロリムス、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナル、マロノニトリルアミド例えば、レフルナミド、T細胞受容体調節薬およびサイトカイン受容体調節薬が挙げられる。抗炎症薬は、炎症性疾患および自己免疫疾患の治療において成功をおさめており、現在、このような障害のための共通かつ標準の治療薬となっている。当業者に周知のいずれの抗炎症薬も本発明の方法に使用することができる。抗炎症薬の非限定的な例としては、非ステロイド系抗炎症薬NSAID、ステロイド系抗炎症薬、β作動薬、抗コリン作動薬およびメチルキサンチンが挙げられる。NSAIDの例としては、限定されるものではないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブCELEBREX商標、ジクロフェナクVOLTAREN商標、エトドラクLODINE商標、フェノプロフェンNALFON商標、インドメタシンINDOCIN商標、ケトロラクTORADOL商標、オキサプロジンDAYPRO商標、スリンダックCLINORIL商標、トルメチンTOLECTIN商標、ロフェコキシブVIOXX商標、ナプロキセンALEVE商標、NAPROSYN商標、ケトプロフェンACTRON商標およびナブメトンRELAFEN商標が挙げられる。このようなNSAIDはシクロオキシゲナーゼ酵素例えば、COX-1および/またはCOX-2を阻害することにより機能する。ステロイド系抗炎症薬の例としては、限定されるものではないが、グルココルチコイド、デキサメタゾンDECADRON商標、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾンDELTASONE商標、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、ならびにエイコサノイド例えば、プロスタグランジン、トロンボキサンおよびロイコトリエンが挙げられる。炎症性障害の治療または予防に本発明の分子と併用可能な抗体の非限定的な例を表9に示し、また、自己免疫障害の治療または予防に使用可能な抗体の非限定的な例を表10に示す。5.7.3感染性疾患の治療に使用される薬剤いくつかの実施形態では、本発明の分子は、感染性疾患の治療および/または予防のための当業者に公知の1種類以上の付加的治療薬の治療上または予防上有効な量と併用投与することができる。本発明は、本発明の分子の、感染性疾患の治療および/または予防のための当業者に公知の抗生物質との併用を企図する。本発明の分子と併用可能な抗生物質としては、限定されるものではないが、マクロライド例えば、トブラマイシンTobi登録商標、セファロスポリン例えば、セファレキシンKeflex登録商標、セフラジンVelocef登録商標、セフロキシムCeftin登録商標、セフプロジルCefzil登録商標、セファクロールCeclor登録商標、セフィキシムSuprax登録商標またはセファドロキシルDuricef登録商標、クラリスロマイシン例えば、クラリスロマイシンBiaxin登録商標、エリスロマイシン例えば、エリスロマイシンEMycin登録商標、ペニシリン例えば、ペニシリンVV-CillinK登録商標またはPenVeeK登録商標またはキノロン例えば、オフロキサシンFloxin登録商標、シプロフロキサシンCipro登録商標またはノルフロキサシンNoroxin登録商標、アミノ配糖体系抗生物質例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレネート、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシンおよびスペクチノマイシン、アムフェニコール系抗生物質例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコールおよびチアムフェニコール、アンサマイシン系抗生物質例えば、リファミドおよびリファンピン、カルバセフェム系例えば、ロラカルベフ、カルバペネム系例えば、ビアペネムおよびイミペネム、セファロスポリン系例えば、セファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミドおよびセフピロム、セファマイシン系例えば、セフブペラゾン、セフメタゾールおよびセフミノクス、モノバクタム系例えば、アズトレオナム、カルモナムおよびチゲモナム、オキサセフェム系例えば、フロモキセフおよびモキサラクタム、ペニシリン系例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナメシリン、ヨウ化水素酸ペネタメート、ペニシリンo-ベネタミン、ペニシリンO、ペニシリンV、ペニシリンVベンザチン、ペニシリンVヒドラバミン、ペニメピサイクリンおよびフェネチシリンカリウム、リンコサミド系例えば、クリンダマイシンおよびリンコマイシン、アムホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンジュラシジン、エンビオマイシン、テトラサイクリン系例えば、アピサイクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリンおよびデメクロサイクリン、2,4-ジアミノピリミジン系例えば、ブロジモプリム、ニトロフラン系例えば、フラルタドンおよび塩化フラゾリウム、キノロンおよびその類似体例えば、シノキサシン、クリナフロキサシン、フルメキンおよびグレパフロキサシン、スルホンアミド系例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、ノプリルスルファミド、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジンおよびスルファシチン、スルホン系例えば、ジアチモスルホン、グコスルホンナトリウム、およびソラスルホン、サイクロセリン、ムピロシンおよびチュベリンが挙げられる。特定の実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効な量の1種類以上の抗真菌薬と併用投与することができる。本発明の分子と併用可能な抗真菌薬としては、限定されるものではないが、アムフォテリシンB、イトラコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、イントラセカル、フルシトシン、ミコナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、ナイタチン、テルコナゾール、チオコナゾール、シクロピロクス、エコナゾール、ハロプログリン、ナフチフィン、テルビナフィン、ウンデシレネートおよびグリセオフルビンが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効な量の1種類以上の抗ウイルス薬と併用投与することができる。本発明の分子と併用可能な有効な抗ウイルス薬としては、限定されるものではないが、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびヌクレオシド類似体が挙げられる。抗ウイルス薬の例としては、限定されるものではないが、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジンおよびリバビリン、ならびにホスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、αインターフェロン;アデホビル、クレブジン、エンテカビル、プレコナリルが挙げられる。5.8ワクチン療法本発明は、本発明の組成物を用いて、抗原性または免疫原性物質に対する免疫応答を誘発することをさらに包含し、該物質としては、限定されるものではないが、癌抗原および感染性疾患抗原これらの例は後述するが含まれる。本発明のワクチン組成物は、免疫応答が望まれる1種類以上の抗原性または免疫原性物質を含み、該1種類以上の抗原性または免疫原性物質が、FcγRIIIAに対する親和性が増強されている本発明の変異型抗体でコーティングされる。本発明のワクチン組成物は、抗原性または免疫原性物質に対する免疫応答、好ましくは防御性免疫応答を誘発するのに特に有効である。いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物中の抗原性または免疫原性物質は、免疫応答が望まれるウイルスを含む。ウイルスは組換え体でもキメラでもよく、好ましくは弱毒化されている。組換え体、キメラおよび弱毒化ウイルスの産生は、当業者に公知の標準的な手法を用いて行うことができる。本発明は、本発明に従って製剤化される組換え生ウイルスワクチンまたは組換え不活化ウイルスワクチンを包含する。生ワクチンが好ましいが、これは宿主内での複製が自然感染の場合と同種かつ同程度の持続的刺激をもたらし、従って、実質的な長期免疫を付与するからである。このような組換え生ウイルスワクチン製剤の生産は、細胞培養物またはニワトリ胚尿膜中でのウイルス増殖と、その後の精製を含む従来法を用いて達成することができる。特定の実施形態では、組換えウイルスは、それが投与される被験体に対して非病原性である。これに関して、遺伝子操作ウイルスをワクチンとして使用するには、これらの株が弱毒性である必要がある。トランスフェクションに用いる鋳型に適当な突然変異例えば欠失を導入すると、弱毒性を有する新規ウイルスが得られる。例えば、温度感受性または寒冷適応に関連する特定のミスセンス突然変異を欠失突然変異に導入することができる。これらの突然変異は、寒冷または温度感受性変異体に関連する点突然変異よりも安定であるはずであり、復帰突然変異の頻度が極めて低いはずである。組換えウイルスを作製するための組換えDNA技術は当技術分野で公知であり、本発明に包含される。例えば、負鎖RNAウイルスの改変のための技術が当技術分野において公知である例えば、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる米国特許第5,166,057号を参照。あるいは、自殺特性を有するキメラウイルスが、本発明の皮内ワクチン製剤での使用のために構築され得る。このようなウイルスは、宿主内でわずかに1~数回の複製しか行うことがない。ワクチンとして使用する際には、組換えウイルスは限られた複製サイクルを行って十分なレベルの免疫応答を誘発するが、ヒト宿主中でさらに複製サイクルを行って疾病を引き起こすことはない。あるいは、不活化死滅ウイルスを本発明に従って製剤化することもできる。不活化ワクチン製剤は、キメラウイルスを死滅させるための、従来法を用いて作製することができる。不活化ワクチンは、その感染性が破壊されているという意味で死んでいる。ウイルスの感染性がその免疫原性を損なうことなく破壊されることが理想的である。不活化ワクチンを作製するためには、キメラウイルスを細胞培養物またはニワトリ胚尿膜中で増殖させ、ゾーン超遠心分離により精製し、ホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンにより不活化し、プールすればよい。特定の実施形態では、完全に外来のエピトープ他のウイルス性または非ウイルス性病原体に由来する抗原を含むに遺伝子操作を施して本発明の皮内ワクチン製剤に使用するためのウイルスとすることができる。例えば、HIVgp160、gp120、gp41などの無関連なウイルスの抗原、寄生虫抗原例えばマラリア、細菌もしくは真菌抗原または腫瘍抗原に遺伝子操作を施して弱毒化株とすることができる。事実上いずれの異種遺伝子配列でも、皮内ワクチン製剤に使用するための本発明のキメラウイルスへと構築が可能である。異種遺伝子配列は生物学的応答の改変因子として働く部分またはペプチドであることが好ましい。様々な病原体のいずれかに対して防御性免疫応答を誘導するエピトープ、または中和抗体に結合する抗原が、キメラウイルスによってまたはその一部として発現され得ることが好ましい。例えば、本発明のキメラウイルスへと構築可能な異種遺伝子配列としては、限定されるものではないが、インフルエンザおよびパラインフルエンザ血球凝集素ノイラミニダーゼおよび融合糖タンパク質例えば、ヒトPIV3のHNおよびF遺伝子が挙げられる。さらに別の実施形態では、操作によりキメラウイルスとすることができる異種遺伝子配列には、免疫調節活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。免疫調節タンパク質の例としては、限定されるものではないが、サイトカイン、I型インターフェロン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-12、およびこれらの因子のアンタゴニストが含まれる。さらに他の実施形態では、本発明は、変異型抗体を表面で発現する病原性細胞またはウイルス、好ましくは弱毒化ウイルスを包含する。別の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、抗原性または免疫原性物質がFcγRIIIAに対する親和性が増強された本発明の変異型抗体と機能し得る形で連結されている、融合ポリペプチドを含む。本発明のワクチン組成物に使用するための融合ポリペプチドの操作は、慣例的な組換えDNA技術の方法を用いて行われ、通常の技能の範囲内である。本発明は、本発明の組成物を投与することにより、被験体において免疫寛容を誘発する方法をさらに包含する。好ましくは、被験体において免疫寛容を誘発するのに適した組成物は、本発明の変異型抗体でコーティングされた抗原性または免疫原性物質を含み、ここで、該変異型抗体はFcγRIIBに対してより高い親和性を有する。特定の作用機序に縛られるものではないが、このような組成物はFcγRIIB媒介阻害経路を活性化することにより免疫寛容を誘発するのに有効である。5.9組成物および投与方法本発明は、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりFcドメインまたはその一部を含む本発明の分子すなわち、ダイアボディを含む方法および医薬組成物を提供する。本発明はまた、被験体に有効量の本発明の融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子、または本発明の融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を投与することによる、疾患、障害または感染に関連する1以上の症状を治療、予防および改善する方法を提供する。好ましい態様では、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲート分子は実質的に精製されているすなわち、その効果を限定するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない。特定の実施形態では、被験体は動物、好ましくは哺乳動物、例えば非霊長類例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなどおよび霊長類例えば、サル、例えばカニクイザル、およびヒトである。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。さらに別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は被験体と同種のものに由来する。様々な送達系が公知であり、本発明の分子を含む組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への封入、抗体または融合タンパク質を発現し得る組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス例えば、WuらReceptorMediatedInVitroGeneTransformationByASolubleDNACarrierSystemJBiolChem26244294432参照、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などがある。本発明の分子を投与する方法には、限定されるものではないが、非経口投与例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下、硬膜外および粘膜例えば、鼻腔内および口腔経路が含まれる。特定の実施形態では、本発明の分子を筋肉内、静脈内または皮下に投与する。組成物は任意の便宜な経路、例えば、注入またはボーラス注射、上皮または皮膚粘膜内層例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜などを介する吸収により投与してもよく、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与してもよい。投与は全身投与であって局所投与であってもよい。さらに、例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用いた製剤化により肺投与を採用することもできる。例えば、米国特許第6,019,968号;同第5,985,320号;同第5,985,309号;同第5,934,272号;同第5,874,064号;同第5,855,913号;同第5,290,540号;および同第4,880,078号;ならびに国際公開第92/19244号;同第97/32572号;同第97/44013号;同第98/31346号;および同第99/66903それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる参照。本発明はまた、本発明の分子を密閉容器例えば、アンプルまたはサシェ中にパッケージして、抗体の量を表示したものを提供する。一実施形態では、本発明の分子を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として密閉容器で供給し、例えば水または生理食塩水を用いて被験体に投与するのに適当な濃度に再構成することができる。好ましくは、本発明の分子を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末として密閉容器にて、少なくとも5mg、より好ましくは少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mgまたは少なくとも75mgの単位用量で供給する。凍結乾燥した本発明の分子はその元の容器内で2~8°Cの間で貯蔵しなければならず、また、該分子は、再構成した後12時間以内、好ましくは6時間以内、5時間以内、3時間以内または1時間以内に投与しなければならない。別の実施形態では、本発明の分子を、液体形態として密閉容器にて、該分子、融合タンパク質またはコンジュゲート分子の量および濃度を表示して供給する。好ましくは、本発明の分子の液体形態は、密閉容器にて、少なくとも1mg/ml、より好ましくは少なくとも2.5mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/kg、少なくとも25mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも100mg/ml、少なくとも150mg/ml、少なくとも200mg/mlの分子で供給する。障害に関連する1以上の症状を治療、予防または改善するのに有効な本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。製剤中で用いる正確な用量はまた、投与経路および病態の重篤度によっても異なり、医師の判断および各患者の状況によって決定されるべきである。有効な用量はinvitroまたは動物モデル試験系から導いた用量応答曲線から推定することができる。本発明により包含されるダイアボディの場合、患者に投与される用量は、一般に、0.0001mg/kg~100mg/kg患者体重である。好ましくは、患者に投与される用量は、0.0001mg/kg~20mg/kg、0.0001mg/kg~10mg/kg、0.0001mg/kg~5mg/kg、0.0001~2mg/kg、0.0001~1mg/kg、0.0001mg/kg~0.75mg/kg、0.0001mg/kg~0.5mg/kg、0.0001mg/kg~0.25mg/kg、0.0001~0.15mg/kg、0.0001~0.10mg/kg、0.001~0.5mg/kg、0.01~0.25mg/kgまたは0.01~0.10mg/kg患者体重の間である。本発明のダイアボディ分子の用量と頻度は、例えば脂質化などの修飾によりダイアボディの取込みおよび組織浸透を増強することによって低減または変更することができる。一実施形態では、患者に投与される本発明の分子の用量は、単剤療法として用いる場合には0.01mg~1000mg/日であり得る。他の実施形態では、本発明の分子を他の治療用組成物と併用され、患者に投与される用量は、上記分子を単剤療法として用いる場合よりも低い。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を治療の必要な部位に局所投与することが望ましい場合があり、これは、例えば、限定されるものではないが、局所注入、注射またはインプラント該インプラントはシアラスチックメンブランなどのメンブランまたは繊維を含む、多孔質、非多孔質またはゼラチン状材料かであるの手段によって達成することができる。好ましくは、本発明の分子を投与する場合、該分子が吸収されない材料を使用するように注意しなければならない。別の実施形態では、組成物を小胞、特にリポソームにて送達することができるLangerNewMethodsOfDrugDeliveryScience24915271533TreatらLiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancerLopezBeresteinandFidlerLissNewYorkpp353365LopezBerestein同書pp317327参照;一般には前掲を参照。さらに別の実施形態では、組成物を制御放出系または徐放系で送達することができる。本発明の1種類以上の分子を含む徐放性製剤を作製するために当業者に公知のいずれの技術を用いてもよい。例えば、米国特許第4,526,938号;国際公開第91/05548号;同第96/20698号;NingらIntratumoralRadioimmunotheraphyOfAHumanColonCancerXenograftUsingASustainedReleaseGelRadiotherapyOncology3917989SongらAntibodyMediatedLungTargetingOfLongCirculatingEmulsionsPDAJournalofPharmaceuticalScienceTechnology50372397CleekらBiodegradablePolymericCarriersForAbFGFAntibodyForCardiovascularApplicationProInt’lSympControlRelBioactMater24853854およびLamらMicroencapsulationOfRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyForLocalDeliveryProcInt’lSympControlRelBioactMater24759760それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる参照。一実施形態では、ポンプを制御放出系で使用することができるLanger前掲SeftonImplantablePumpsCRCCritRevBiomedEng14201240BuchwaldらLongTermContinuousIntravenousHeparinAdministrationByAnImplantableInfusionPumpInAmbulatoryPatientsWithRecurrentVenousThrombosisSurgery88507516およびSaudekらAPreliminaryTrialOfTheProgrammableImplantableMedicationSystemForInsulinDeliveryNEnglJMed321574579参照。別の実施形態では、抗体の制御放出を達成するためにポリマー材料を使用することができる例えば、MedicalApplicationsofControlledReleaseLangerandWiseCRCPresBocaRatonFloridaControlledDrugBioavailabilityDrugProductDesignandPerformanceSmolenandBallWileyNewYorkLevyらInhibitionOfCalcificationOfBioprostheticHeartValvesByLocalControlledReleaseDiphosphonateScience228190192DuringらControlledReleaseOfDopamineFromAPolymericBrainImplantInVivoCharacterizationAnnNeurol25351356HowardらIntracerebralDrugDeliveryInRatsWithLesionInducedMemoryDeficitsJNeurosurg7105112;米国特許第5,679,377号;同第5,916,597号;同第5,912,015号;同第5,989,463号;同第5,128,326号;国際公開第99/15154号;および同第99/20253参照。徐放性製剤に使用されるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリル酸、ポリエチレン-コ-酢酸ビニル、ポリメタクリル酸、ポリグリコリドPLG、ポリ無水物、ポリN-ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリラクチドPLA、ポリラクチド-コ-グリコリドPLGAおよびポリオルトエステルが挙げられる。さらに別の実施形態では、制御放出系を治療標的例えば、肺の近位に配置することで、全身用量の一部しか必要としないようにすることができる例えば、GoodsonMedicalApplicationsofControlledRelease前掲vol2pp115138参照。別の実施形態では、制御放出インプラントとして有用なポリマー組成物が、Dunnら米国特許第5,945,155号参照に従って用いられる。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性物質のinsitu制御放出の治療効果に基づく。移植は一般に、治療処置を必要とする患者の体内のいずれの場所に行ってもよい。別の実施形態では、非ポリマー性の徐放系が使用され、被験体の体内の非ポリマー性インプラントが薬物送達系として使用される。体内に移植すると、インプラントの有機溶媒がその組成物から周囲組織液中に散逸、分散または浸出し、非ポリマー材料が徐々に凝集または沈降して、固体の微孔質マトリックスを形成する米国特許第5,888,533号参照。制御放出系は、Langerによる総説に述べられている。本発明の1種類以上の治療薬を含む徐放性製剤を作製するためには、当業者に公知のいずれの技術を用いてもよい。例えば、米国特許第4,526,938号;国際公開第91/05548号および同第96/20698号;NingらIntratumoralRadioimmunotheraphyOfAHumanColonCancerXenograftUsingASustainedReleaseGelRadiotherapyOncology39179189SongらAntibodyMediatedLungTargetingOfLongCirculatingEmulsionsPDAJournalofPharmaceuticalScienceTechnology50372397CleekらBiodegradablePolymericCarriersForAbFGFAntibodyForCardiovascularApplicationProInt’lSympControlRelBioactMater24853854およびLamらMicroencapsulationOfRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyForLocalDeliveryProcInt’lSympControlRelBioactMater24759760それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる参照。本発明の組成物が本発明のダイアボディをコードする核酸である特定の実施形態では、この核酸を適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、レトロウイルスベクターの使用米国特許第4,980,286号参照、または直接注射、または微粒子衝撃例えば、遺伝子銃;Biolistic、Dupont、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤でコーティングすること、または核に侵入することが知られているホメオボックス様ペプチドと連結して投与することJoliotらAntennapediaHomeoboxPeptideRegulatesNeuralMorphogenesisProcNatlAcadSciUSA8818641868参照などによって、これを投与して細胞内に存在させることにより、そのコードされているダイアボディの発現を促進するために該核酸をinvivo投与することができる。あるいは、核酸を細胞内に導入し、発現のために宿主細胞のDNA内に相同的組換えにより組み込むことができる。治療上または予防上有効な量の本発明の分子を用いる被験体の治療は、単回の処置を含んでもよいが、好ましくは、一連の処置を含み得る。好ましい例では、約0.1~30mg/kg体重の範囲の本発明の分子で、週1回、約1~10週間、好ましくは2~8週間、より好ましくは約3~7週間、いっそうより好ましくは約4、5または6週間、被験体を処置する。他の実施形態では、本発明の医薬組成物を1日1回、1日2回、または1日3回投与する。他の実施形態では、本医薬組成物を週1回、週2回、2週毎に1回、月1回、6週毎に1回、2ヶ月毎に1回、年2回または年1回投与する。また、治療に使用する分子の有効用量は特定の治療クールにおいて増減可能であることも分かるであろう。5.9.1医薬組成物本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用な原薬組成物例えば、不純なまたは非滅菌の組成物および単位投与形の調製に使用可能な医薬組成物すなわち、被験体または患者に投与するのに適した組成物を含む。このような組成物は、予防上または治療上有効な量の本明細書に開示される予防薬および/もしくは治療薬またはそれらの薬剤の組合せと、薬学上許容される担体とを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防上または治療上有効な量の1種類以上の本発明の分子と薬学上許容される担体とを含む。本発明はまた、本発明のダイアボディ分子と、特定の癌抗原に特異的な治療用抗体例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体と、薬学上許容される担体とを含む医薬組成物を包含する。特定の実施形態において、薬学上許容されるとは、動物、より詳しくはヒトでの使用について、連邦政府または州政府の規制当局により認可されていること、または米国薬局方もしくは他の一般的に認知されている薬局方に揚げられていることを意味する。担体とは、治療薬が一緒に投与される希釈剤、アジュバント例えば、フロイントアジュバント完全および不完全、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような製薬担体は、水および油例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含むなどの無菌液体であり得る。医薬組成物を静脈内投与する場合には、水が好ましい担体である。また、生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も液体担体として、特に注射液として使用可能である。好適な製薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、ドライスキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望であれば、組成物はまた、少量の湿潤剤、乳化剤またはpH緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの剤形をとり得る。一般に、本発明の組成物の成分は、別々にまたは一緒に混合して単位投与形で、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、アンプルまたはサシェなどの密閉容器にて、有効薬剤の量を表示して供給される。組成物を注入により投与する場合には、医薬級の無菌の水または生理食塩水を含有する点滴ボトルを用いて分配することができる。組成物を注射により投与する場合には、無菌の注射水または生理食塩水のアンプルを提供し、それらの成分を投与前に混合することができる。本発明の組成物は、中性または塩形態として製剤化することもできる。薬学上許容される塩としては、限定されるものではないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの陰イオンを伴って形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものなどの陽イオンを伴って形成される塩が含まれる。5.9.2遺伝子療法特定の実施形態では、本発明の分子をコードする配列を含む核酸を投与して、遺伝子療法により疾患、障害または感染に関連する1以上の症状を治療、予防または改善する。遺伝子療法とは、発現されるまたは発現可能な核酸を被験体に投与することにより行われる療法を意味する。本発明のこの実施形態では、核酸が、治療効果または予防効果を媒介するそのコードされている抗体または融合タンパク質を産生する。当技術分野で利用可能な遺伝子療法の方法はいずれも、本発明に従って使用することができる。例示的な方法を以下に記載する。遺伝子療法の方法の一般的な総説としては、GoldspielらHumanGeneTherapyClinicalPharmacy12488505WuらDeliverySystemsForGeneTherapyBiotherapy38795TolstoshevGeneTherapyConceptsCurrentTrialsAndFutureDirectionsAnnRevPharmacolToxicol32573596MulliganTheBasicScienceOfGeneTherapyScience260926932およびMorganらHumanGeneTherapyAnnRevBiochem62191217を参照。使用可能な組換えDNA技術の分野で一般に知られている方法は、AusubelらCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNYandKrieglerGeneTransferandExpressionALaboratoryManualStocktonPressNYに記載されている。好ましい態様では、本発明の組成物は本発明のダイアボディをコードする核酸を含み、その核酸は好適な宿主内で該抗体を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸は、抗体コード領域と機能し得る形で連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、そのプロモーターは誘導性または構成的、場合によっては組織特異的であり得る。別の特定の実施形態では、抗体コード配列および他の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位での相同的組換えを促進する領域によって挟まれており、これにより抗体をコードする核酸の染色体内発現をもたらすような核酸分子が使用されるInactivatingTheBeta2MicroglobulinLocusInMouseEmbryonicStemCellsByHomologousRecombinationProcNatlAcadSciUSA8689328935およびZijlstraらGermLineTransmissionOfADisruptedBeta2MicroglobulinGeneProducedByHomologousRecombinationInEmbryonicStemCellsNature342435438。別の好ましい態様では、本発明の組成物は融合タンパク質をコードする核酸を含み、その核酸は好適な宿主において融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部分である。特に、このような核酸は、融合タンパク質のコード領域と機能し得る形で連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、そのプロモーターは誘導性または構成的、場合によっては組織特異的であり得る。別の特定の実施形態では、融合タンパク質のコード配列および他の任意の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位での相同的組換えを促進する領域によって挟まれており、これにより融合タンパク質の染色体内発現をもたらすような核酸分子が使用される。核酸の被験体への送達は、直接的この場合には、被験体は核酸または核酸担持ベクターに直接曝されるまたは間接的この場合には、細胞は最初にinvitroにおいて核酸で形質転換され、次いで被験体に移植されるのいずれであってもよい。これらの2つのアプローチは、それぞれinvivoまたはexvivo遺伝子療法として知られている。特定の実施形態では、核酸配列は直接invivo投与され、そこで発現されて、コードされている産物を産生する。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかにより、例えばそれらの核酸配列を適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、このベクターを投与して細胞内に存在させること例えば、欠陥型もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染による米国特許第4,980,286号参照によるか、または裸のDNAの直接注入によるか、または微粒子衝撃例えば、遺伝子銃;Biolistic、Dupontによるか、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤のコーティングによるか、またはリポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセル内への封入によるか、または核に侵入することが知られているペプチドと連結してそれらを投与することによるか、または受容体媒介エンドサイトーシスを受ける抗原と連結してそれを投与すること例えば、WuらReceptorMediatedInVitroGeneTransformationByASolubleDNACarrierSystemJBiolChem26244294432この方法は受容体を特異的に発現する細胞種を標的とするために使用することができるなどによって実施することができる。別の実施形態では、核酸-抗原複合体この場合、抗原が、エンドソームを破壊するための融合性ウイルスペプチドを含むを形成させて、核酸のリソソーム分解を回避させることができる。さらに別の実施形態では、核酸は、特異的受容体を標的とすることにより、invivoで細胞特異的な取込みおよび発現に関して標的化することができる例えば、国際公開第92/06180号;同第92/22635号;同第92/20316号;同第93/14188号;同第93/20221号参照。あるいは、核酸は、細胞内に導入し、相同的組換えによって、発現のために宿主細胞DNA内に組み込むこともできるInactivatingTheBeta2MicroglobulinLocusInMouseEmbryonicStemCellsByHomologousRecombinationProcNatlAcadSciUSA8689328935およびZijlstraらGermLineTransmissionOfADisruptedBeta2MicroglobulinGeneProducedByHomologousRecombinationInEmbryonicStemCellsNature342435438。特定の実施形態では、本発明の分子例えば、ダイアボディまたは融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターが用いられる。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができるMillerらUseOfRetroviralVectorsForGeneTransferAndExpressionMethEnzymol217581599参照。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞DNA中への組込みのために必要な成分を含有する。遺伝子療法に用いる抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を1以上のベクターにクローニングするが、これによりヌクレオチド配列の被験体への送達が容易となる。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、BoesenらCircumventionOfChemotherapyInducedMyelosuppressionByTransferOfTheMdr1GeneBiotherapy6291302に見出すことができ、これには、化学療法に対してより耐性のある造血幹細胞を作出する目的でmdr1遺伝子をこの幹細胞へ送達するためのレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献としては、ClowesらLongTermBiologicalResponseOfInjuredRatCarotidArterySeededWithSmoothMuscleCellsExpressingRetrovirallyIntroducedHumanGenesJClinInvest93644651KeimらRetrovirusMediatedGeneTransductionIntoCaninePeripheralBloodRepopulatingCellsBlood8314671473SalmonsらTargetingOfRetroviralVectorsForGeneTherapyHumanGeneTherapy4129141およびGrossmanらRetrovirusesDeliveryVehicleToTheLiverCurrOpinGeneticsandDevel3110114がある。遺伝子療法に使用可能な他のウイルスベクターとしてアデノウイルスがある。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸器上皮に送達するための特に注目されるビヒクルである。アデノウイルスは本来、呼吸器上皮に感染して軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスには非分裂細胞に感染し得るという利点がある。Kozarskyらは、アデノウイルスに基づく遺伝子療法の総説を示している。Boutらは、遺伝子をアカゲザルの呼吸器上皮へ導入するためのアデノウイルスベクターの使用を示した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、RosenfeldらAdenovirusMediatedTransferOfARecombinantAlpha1AntitrypsinGeneToTheLungEpitheliumInVivoScience252431434RosenfeldらInVivoTransferOfTheHumanCysticFibrosisTransmembraneConductanceRegulatorGeneToTheAirwayEpitheliumCell68143155MastrangeliらDiversityOfAirwayEpithelialCellTargetsForInVivoRecombinantAdenovirusMediatedGeneTransferJClinInvest91225234国際公開第94/12649号およびWangらAPackagingCellLineForPropagationOfRecombinantAdenovirusVectorsContainingTwoLethalGeneRegionDeletionsGeneTherapy2775783に見出すことができる。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが用いられる。アデノ随伴ウイルスAAVも遺伝子療法における使用が提案されている例えば、WalshらGeneTherapyForHumanHemoglobinopathiesProcSocExpBiolMed204289300および米国特許第5,436,146号参照。遺伝子療法に対する他のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを介したトランスフェクションまたはウイルス感染などの方法により、組織培養物中の細胞に遺伝子を導入することを含む。通常、導入の方法は、選択マーカーの細胞への導入を含む。次いで細胞を選択下に置き、採取された、導入遺伝子を発現している細胞を単離する。その後、それらの細胞を被験体に送達する。この実施形態では、核酸を細胞に導入した後、得られた組換え細胞をinvivo投与する。このような導入は、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体を介した遺伝子導入、微小細胞を介した遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含む当技術分野で公知のいずれかの方法によって実施することができる。外来遺伝子を細胞に導入するための多くの技術が当技術分野で公知であり例えば、LoefflerらGeneTransferIntoPrimaryAndEstablishedMammalianCellLinesWithLipopolyamineCoatedDNAMethEnzymol217599618CottenらReceptorMediatedTransportOfDNAIntoEukaryoticCellsMethEnzymol217618644参照、レシピエント細胞の必要な発生的および生理的機能が破壊されない限り、本発明に従って使用することができる。その技術は、細胞への核酸の安定導入を提供し、それにより核酸が細胞により発現可能となり、好ましくは細胞の後代に遺伝して、その細胞後代に発現可能となるものでなければならない。得られた組換え細胞は、当技術分野で公知の様々な方法により被験体に送達することができる。組換え血液細胞例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、好ましくは静脈投与される。意図される細胞の使用量は、所望の効果、患者の状態などによって異なり、当業者が決定することが可能である。遺伝子療法の目的で核酸が導入可能な細胞は、いずれの所望の入手可能な細胞種も包含し、限定されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞;Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞;様々な幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られるものが挙げられる。好ましい実施形態では、遺伝子療法に使用される細胞は被験体自身のものである。組換え細胞を遺伝子療法に使用する実施形態では、抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入して、それらが該細胞またはその後代により発現可能となるようにし、その後、その組換え細胞を治療効果を得るためにinvivo投与する。特定の実施形態では、幹細胞または前駆細胞を用いる。単離可能でありかつinvitroで維持可能な幹細胞および/または前駆細胞はいずれも本発明のこの実施形態に従って使用できる可能性がある例えば、国際公開第94/08598号;StempleらIsolationOfAStemCellForNeuronsAndGliaFromTheMammalianNeuralCrestCell71973985RheinwaldSerialCultivationOfNormalHumanEpidermalKeratinocytesMethCellBio21A229254およびPittelkowらNewTechniquesForTheInVitroCultureOfHumanSkinKeratinocytesAndPerspectivesOnTheirUseForGraftingOfPatientsWithExtensiveBurnsMayoClinicProc61771777参照。特定の実施形態では、遺伝子療法の目的で導入される核酸は、コード領域と機能し得る形で連結された誘導プロモーターを含み、それにより適当な転写インデューサーの存在または不在を制御することによって核酸の発現が制御可能となる。5.9.3キット本発明は、本発明の分子を充填した1以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。さらに、疾患の治療に有用な1種類以上の他の予防または治療薬を該医薬パックまたはキットに含んでもよい。本発明はまた、本発明の医薬組成物の1以上の成分を充填した1以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。場合によっては、このような容器に、医薬または生物製品の製造、使用または販売を規制する政府当局が指示した形式で、ヒト投与のための製造、使用または販売が行政当局により認可されていることを表す注意書きを添付してもよい。本発明は、上記の方法において使用可能なキットを提供する。一実施形態では、キットは1種類以上の本発明の分子を含む。他の実施形態では、キットはさらに、1以上の容器に、癌の治療に有用な1種類以上の他の予防薬または治療薬を含む。別の実施形態では、キットはさらに、癌に関連する1以上の癌抗原と結合する1種類以上の細胞傷害性抗体を含む。特定の実施形態では、他の予防薬または治療薬は化学療法薬である。他の実施形態では、予防薬または治療薬は生物学的治療薬またはホルモン治療薬である。5.10治療上の有用性の特徴付けおよび検証本発明の医薬組成物、予防薬または治療薬のいくつかの態様は、ヒトに使用する前に、invitroにて細胞培養系および動物モデル生物、例えば、齧歯類動物モデル系で、所望の治療活性について試験することが好ましい。例えば、特定の医薬組成物の投与が望ましいかどうかを判定するために使用可能なアッセイとしては細胞培養アッセイを含み、該アッセイにおいては、患者の組織サンプルを培養増殖させ、本発明の医薬組成物に曝すかまたはそうでなければ接触させ、該組織サンプルに対する該組成物の効果を観察する。組織サンプルは患者から生検により得ることができる。この試験により、個々の患者に対して治療上最も有効な予防分子または治療分子を同定することができる。様々な特定の実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害に関与する細胞種の代表的細胞例えば、T細胞を用いてinvitroアッセイを行い、本発明の医薬組成物がそのような細胞種に対して所望の効果を有するかどうかを判定することができる。予防薬および/または治療薬の組合せは、ヒトで使用する前に、適当な動物モデル系で試験することができる。このような動物モデル系としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。当技術分野で周知のいずれの動物系を使用してもよい。本発明の特定の実施形態では、予防薬および/または治療薬の組合せはマウスモデル系で試験する。このようなモデル系は広く使用されており、当業者に周知である。予防薬および/または治療薬は反復投与することができる。手順のいくつかの態様は可変である。このような態様には、予防薬および/または治療薬の投与の時間的管理、およびこのような薬剤を別々に投与するのか混合物として投与するのかが含まれる。本発明の方法で使用するのに好ましい動物モデルは、例えば、マウスエフェクター細胞上でヒトFcγRを発現するトランスジェニックマウスであり、例えば、米国特許第5,877,396号参照によりその全内容を本明細書に組み入れるに記載されているいずれのマウスモデルも本発明において使用可能である。本発明の方法に使用するトランスジェニックマウスとしては、限定されるものではないが、ヒトFcγRIIIAを保有するマウス;ヒトFcγRIIAを保有するマウス;ヒトFcγRIIBとヒトFcγRIIIAを保有するマウス;ヒトFcγRIIBとヒトFcγRIIAを保有するマウスが挙げられる。好ましくは、上記の機能アッセイにおいて最高レベルの活性を示した突然変異を、ヒトで使用する前に、動物モデル研究での使用について試験する。上記の方法を用いた動物モデルで使用するために十分な量の抗体は、調製することが可能であり、例えば本明細書に開示され例示される哺乳動物発現系および精製法を用いて作製することができる。マウス異種移植モデルを用いて、腫瘍特異的標的に対して作製されたマウス抗体の有効性を、本発明のダイアボディ分子のエピトープ結合ドメインの親和性と特異性、およびダイアボディの免疫応答誘発能に基づいて調べることができるMouseModelsForMultistepTumorigenesisTrendsCellBiol11S29。マウスエフェクター細胞上でヒトFcγRを発現するトランスジェニックマウスは独特であり、ヒトFc-FcγR相互作用の有効性を試験するためのテーラーメイドの動物モデルである。JeffreyRavetch博士の研究室で作出されたロックフェラー大学とスローンケタリング癌センターとのライセンス契約によるFcγRIIIA、FcγRIIIBおよびFcγRIIAトランスジェニックマウス系統のペアが使用可能であり、例えば、下表11に挙げられたものがある。本発明の併用療法の抗炎症活性は、当技術分野で公知であり、CroffordLJandWilderRLArthritisandAutoimmunityinAnimalsArthritisandAlliedConditionsATextbookofRheumatologyMcCartyらChapter30に記載されている炎症性関節炎の様々な実験動物モデルを用いて測定することができる。炎症性関節炎および自己免疫リウマチ疾患の実験的動物モデルおよび自然発生的動物モデルもまた、本発明の併用療法の抗炎症活性を評価するために使用可能である。以下は例として示されるいくつかのアッセイであり、これに限定されるものではない。当技術分野で公知であり、広く使用されている関節炎または炎症性疾患の主な動物モデルとしては、アジュバント誘発性関節炎ラットモデル、コラーゲン誘発性関節炎ラットおよびマウスモデル、ならびに抗原誘発性関節炎ラット、ウサギおよびハムスターモデルがあり、これらは全て、参照によりその全内容を本明細書に組み入れるCroffordLJandWilderRLArthritisandAutoimmunityinAnimalsArthritisandAlliedConditionsATextbookofRheumatologyMcCartyらChapter30に記載されている。本発明の併用療法の抗炎症活性は、カラギーナン誘発性関節炎ラットモデルを用いて評価することができる。カラギーナン誘発性関節炎はまた、慢性関節炎または炎症の研究において、ウサギ、イヌおよびブタでも使用されている。定量的な組織形態計測的評価が治療有効性の決定に用いられる。このようなカラギーナン誘発性関節炎モデルを用いる方法は、HansraPらCarrageenanInducedArthritisInTheRatInflammation24141155に記載されている。また、当技術分野で公知であり、記載されているようにザイモサン誘発性炎症動物モデルも一般に使用されている。本発明の併用療法の抗炎症活性はまた、ラットのカラギーナン誘発性足浮腫の抑制を、WinterCAらCarrageenanInducedEdemaInHindPawOfTheRatAsAnAssayForAntiInflammatoryDrugsProcSocExpBiolMed111544547に記載されている方法の改変法を用いて測定することにより評価することもできる。このアッセイはほとんどのNSAIDの抗炎症活性に対する一次invivoスクリーニングとして用いられており、ヒトでの有効性を予測すると考えられる。試験予防薬または治療薬の抗炎症活性は、ビヒクルを投与した対照群に対する試験群の後足重量増加の阻害パーセントとして表される。さらに、炎症性腸疾患の動物モデルを、本発明の併用療法の有効性を評価するために使用することもできるExperimentalColitisInAnimalModelsScandJGastroentrol27529537StroberAnimalModelsOfInflammatoryBowelDiseaseAnOverviewDigDisSci303S10S。潰瘍性大腸炎およびクローン病は、動物で誘発することができるヒト炎症性腸疾患である。硫酸化された多糖類限定されるものではないが、アミロペクチン、カラギーン、硫酸アミロペクチンおよび硫酸デキストランを含むまたは化学刺激剤限定されるものではないが、トリニトロベンゼンスルホン酸TNBSおよび酢酸を含むを動物に経口投与して炎症性腸疾患を誘発することができる。自己免疫障害の動物モデルもまた、本発明の併用療法の有効性を評価するために使用することができる。1型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性紅斑性狼瘡および糸球体腎炎などの自己免疫障害の動物モデルが開発されているPreventionOfType1DiabetesFromLaboratoryToPublicHealthAutoimmunity29235246RasmussenらModelsToStudyThePathogenesisOfThyroidAutoimmunityBiochimie81511515FosterRelevanceOfSystemicLupusErythematosusNephritisAnimalModelsToHumanDiseaseSeminNephrol191224。さらに、当業者に公知のアッセイはいずれも、自己免疫疾患および/または炎症性疾患に対する、本明細書に開示されている併用療法の予防上および/または治療上の有用性を評価するために使用することができる。本発明の予防および/または治療プロトコールの毒性および有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法に、例えば、LD50集団の50に対する致死量およびED50集団の50における治療有効量を決定する手法により判定することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。大きな治療指数を示す予防薬および/または治療薬が好ましい。毒性副作用を示す予防薬および/または治療薬を使用することもできるが、非感染細胞の損傷の可能性を最小限にし、それにより副作用を軽減するために、このような薬剤を罹患組織の部位にターゲッティングする送達系を設計するように注意を払うべきである。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用する予防薬および/または治療薬の用量範囲を設定するために使用することができる。このような薬剤の用量は、毒性がほとんどないかまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、用いる投与形および用いる投与経路によってこの範囲内で異なり得る。本発明の方法で使用されるいずれの薬剤に対しても、治療上有効な用量はまず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決定したIC50すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて設定することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。本発明に従って使用される療法の抗癌活性はまた、癌研究用の様々な実験動物モデル、例えばSCIDマウスモデルまたはトランスジェニックマウスまたはヒト異種移植片を有するヌードマウス、当技術分野で公知であり、RelevanceofTumorModelsforAnticancerDrugDevelopmentContributionstoOncologyTheNudeMouseinOncologyResearchおよびAnticancerDrugDevelopmentGuide参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れるに記載されている、ハムスター、ウサギなどの動物モデルを用いることにより決定することもできる。本発明の分子の治療有効性を決定するのに好ましい動物モデルは、マウス異種移植モデルである。異種移植腫瘍の供給源として使用可能な腫瘍細胞株としては、限定されるものではないが、SKBR3およびMCF7細胞を含み、それらは乳腺癌の患者に由来するものであり得る。これらの細胞は、erbB2受容体とプロラクチン受容体の双方を有する。SKBR3細胞は、ADCCおよび異種移植腫瘍モデルとして、当技術分野において通常用いられている。あるいは、ヒト卵巣腺癌に由来するOVCAR3細胞を異種移植腫瘍の供給源として使用することもできる。本発明のプロトコールと組成物は、ヒトで使用する前に、invitro、次いでinvivoで、所望の治療活性または予防活性について試験することが好ましい。治療薬および治療法は、腫瘍または悪性細胞系統の細胞を用いてスクリーニングすることができる。当技術分野において標準的な多くのアッセイを、このような生存および/または増殖を評価するために使用することができ、例えば、細胞増殖は3H-チミジンの取込みを測定することによるか、直接的細胞計数によるか、癌原遺伝子例えば、fos、mycまたは細胞周期マーカーなどの既知遺伝子の転写活性の変化を検出することによって評価することができ;細胞生存率はトリパンブルー染色により評価することができ;分化は形態の変化、軟寒天中での増殖および/もしくはコロニー形成の減少、または三次元基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中の管状ネットワーク形成などに基づいて視覚的に評価することができる。療法に用いる化合物は、ヒトで試験する前に、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどを含む好適な動物モデル系、例えば、上記の動物モデルで試験することができる。該化合物はその後、適当な臨床試験で使用することができる。さらに、当業者に公知のアッセイはいずれも、癌、炎症性障害または自己免疫疾患の治療または予防に対する、本明細書に開示されている併用療法の予防上および/または治療上の有用性を評価するために使用することができる。6.1共有結合型二重特異性ダイアボディの設計および特性決定単一特異性共有結合型ダイアボディおよび二重特異性共有結合型ダイアボディを構築し、それぞれの組換え体の生産、精製および結合特性を評価した。本明細書に記載した組換え発現系によって生産されたアフィニティー精製ダイアボディ分子は、SDS-PAGEおよびSEC分析により単一の二量体種からなることが判明した。さらに、ELISAおよびSPR分析により、共有結合型二重特異性ダイアボディは双方の標的抗原に親和性を示し、双方の抗原と同時に結合できることが明らかになった。材料および方法ポリペプチド分子の構築および設計:図2で図示した4つのポリペプチド構築物を生産するために核酸発現ベクターを設計した。構築物1配列番号9は、FcγRIIBを認識するヒト化2B6抗体のVLドメインと、FcγRIIIAを認識するヒト化3G8抗体のVHドメインを含んだ。構築物2配列番号11は、Hu3G8のVLドメイン、およびHu2B6のVHドメインを含んだ。構築物3配列番号12は、Hu3G8のVLドメインとHu3G8のVHドメインを含んだ。構築物4配列番号13は、Hu2B6のVLドメインとHu2B6のVHドメインを含んだ。PCRおよび発現ベクターの構築:VLまたはVHドメインのコード配列を、第1のPCR産物が重複配列を含むように設計したフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて鋳型DNAから増幅し、これにより、重複PCRによって所望のポリペプチド構築物のコード配列を作製することが可能であった。鋳型DNAの第1のPCR増幅:約35ngの鋳型DNA例えば、目的抗体の軽鎖および重鎖、1μlの10μMフォワードプライマーおよびリバースプライマー、2.5μlの10×pfuUltraバッファーStratagene,Inc.、1μlの10mMdNTP、1μlの2.5単位/μlのpfuUltraDNAポリメラーゼStratagene,Inc.および蒸留水総量25μlとするを微量遠心管内で静かに混合し、微量遠心機で短時間回転させて反応混合物を遠心管の底に集めた。PCR反応は、GeneAmpPCRSystem9700PEAppliedBiosystemで下記の設定:94°Cで2分間;94°Cで各15秒間、58°Cで30秒間および72°Cで1分間の25サイクルを用いて行った。Hu2B6のVLは、Hu2B6の軽鎖から、フォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および56を用いて増幅した。Hu2B6のVHは、Hu2B6の重鎖から、フォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号57および58を用いて増幅した。Hu3G8のVLは、Hu3G8の軽鎖から、フォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および59を用いて増幅した。Hu3G8のVHは、Hu3G8の重鎖から、フォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号60および61を用いて増幅した。PCR産物は、1アガロースゲルにて120ボルトで30分間電気泳動した。PCR産物をゲルから切り出し、MinEluteゲル抽出キットQiagen,Inc.を用いて精製した。重複PCR:第1のPCR産物を下記のように組み合わせ、鋳型DNAの最初の増幅に関して記載したものと同じPCR条件を用いて増幅した。重複PCRの産物も上記のように精製した。構築物1をコードする核酸配列配列番号9図2に図示を、VLHu2B6およびVHHu3G8のPCR増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および61を合わせることで増幅した。構築物2をコードする核酸配列配列番号11図2に図示を、VLHu3G8およびVHHu2B6のPCR増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および58を合わせることで増幅した。構築物3をコードする核酸配列配列番号12図2に図示を、VLHu3G8およびVHHu3G8のPCR増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および61を合わせることで増幅した。構築物4をコードする核酸配列配列番号13図2に図示を、VLHu2B6およびVHHu2B6のPCR増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および58を合わせることで増幅した。VLドメインのフォワードプライマーすなわち、配列番号55およびVHドメインのリバースプライマーすなわち、配列番号58および配列番号61は、発現ベクター内への最終産物のクローニングを可能にするユニークな制限部位を含んでいた。精製された重複PCR産物を制限エンドヌクレアーゼNheIおよびEcoRIで消化し、pCIneo哺乳動物発現ベクターPromega,Inc.にクローニングした。構築物をコードするプラスミドは表12に示すように呼称した。ポリペプチド/ダイアボディの発現:リポフェクタミン2000を製造者Invitrogenの説明書に従って用い、構築物1をコードするpMGX0669を構築物2をコードするpMGX0667とともに、HEK-293細胞に同時トランスフェクトした。これら2つのプラスミドの同時トランスフェクションは、FcγRIIBおよびFcγRIIIAの双方に対して免疫特異的な共有結合型二重特異性ダイアボディCBDh2B6-h3G8ダイアボディの発現をもたらすように設計した。構築物3および4をそれぞれコードするpMGX0666およびpMGX0668を、それぞれFcγRIIIAに対して免疫特異的な共有結合型単一特異性ダイアボディCMDh3G8ダイアボディおよびFcγRIIBに対して免疫特異的な共有結合型単一特異性ダイアボディCMDh2B6ダイアボディの発現のために、HEK-293細胞に個別にトランスフェクトした。培養3日後に、分泌された産物を細胞馴化培地から精製した。精製:ダイアボディを細胞馴化培地から、CNBr活性化セファロース4Bに結合させた関連抗原を用いて捕捉した。ローディング前にアフィニティーセファロース樹脂を20mMのTris/HClpH8.0で平衡化した。ローディング後、溶出前に、樹脂を平衡化バッファーで洗浄した。洗浄した樹脂から、50mMグリシンpH3.0を用いてダイアボディを溶出させた。溶出したダイアボディをすぐに1MTris/HClpH8.0で中和し、遠心分離型濃縮器を用いて濃縮した。濃縮したダイアボディをさらに、PBSで平衡化したSuperdex200カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーSECによって精製した。SEC:サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、カラムから溶出したダイアボディのおよそのサイズとヘテロ性を分析した。SEC分析は、PBSで平衡化したGEhealthcareSuperdex200HR10/30カラムで行った。全長IgG約150kDa、Fabフラグメント約50kDaおよび一本鎖Fv約30kDaの溶出プロファイルとの比較を対照として用いた。ELISA:溶出および精製されたダイアボディの結合性を、第5.4.2節に記載したようにELISAアッセイにより特徴付けた。2μg/mlのsCD32B-Ig溶液50μl/ウェルを、炭酸バッファー中、4°Cで一晩、96ウェルMaxisorpプレートにコーティングした。このプレートをPBS-TPBS、0.1Tween20で3回洗浄し、室温で30分間、PBS-T中0.5のBSAでブロッキングした。続いて、h2B6-h3G8CBD、h2B6CMDまたはh3G8CMDを、ブロッキングバッファーで希釈して2倍希釈系列とし、0.5μg/ml~0.001μg/mlの範囲のダイアボディ濃度を作製した。その後、このプレートを室温で1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄した後、0.2μg/mlのsCD16A-ビオチン50μl/ウェルを各ウェルに加えた。このプレートを再び室温で1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄した後、1:5000希釈のHRPコンジュゲートストレプトアビジンAmershamPharmaciaBiotech50μl/ウェルを検出のために用いた。HRP-ストレプトアビジンを45分間室温でインキュベートした。このプレートをPBS-Tで3回洗浄し、80μl/ウェルのTMB基質を用いて発色させた。10分間インキュベートした後、40μl/ウェルの1H2SO4を加えることによって、HRP-TMB反応を停止させた。96ウェルプレートリーダーとSOFTmaxソフトウェアを用いてOD450nmを読み取り、結果をGraphPadPrism3.03ソフトウェアを用いてプロットした。BIAcoreアッセイ:溶出および精製されたダイアボディの結合の動態パラメーターを、第5.4.3節に記載したように、BIAcoreアッセイBIAcoreinstrument1000、BIAcoreInc.、ニュージャージー州ピスカタウェイおよび付属のソフトウェアを用いて分析した。sCD16A、sCD32BまたはsCD32A陰性対照を、センサーチップ表面の4つのフローセルのうちの1つフローセル2に、約1000応答単位RUの各受容体が表面に固定されるように、アミン結合化学NHS/EDCの混合物を用いたカルボキシメチル基の修飾によるにより固定化した。その後、未反応の活性エステルを、1MのEt-NH2を注入してキャップオフした。好適な表面が調製されたら、共有結合型二重特異性ダイアボディh2B6-h3G8CBDまたは共有結合型単一特異性ダイアボディh2B6CMDもしくはh3G8CMBを、6.25~200nM溶液を70mL/分の流速で180秒間注入することにより、前述の表面に流した。比較のためにh3G8scFVも供試した。全データセットを回収したところで、製造者であるBIAcore,Inc.ニュージャージー州ピスカタウェイにより提供されるコンピュータアルゴリズムを用いて、得られた結合曲線のグローバルフィッティングを行った。これらのアルゴリズムでは、KonおよびKoffの双方を算出し、これらから見かけの平衡結合定数KDを、2つの速度定数の比すなわち、Koff/Konとして推定する。個々の速度定数をどのようにして導くかについてのさらに詳細な処理法は、BIAevaluaionソフトウェアハンドブックBIAcore,Inc.、ニュージャージー州ピスカタウェイに見出すことができる。結合期および解離期は別々にフィッティングを行った。解離速度定数は180秒の解離期において32~34秒間隔で得、結合期のフィットは1:1Langmuirモデルによって得、基底部のフィットは二重特異性ダイアボディとscFvに関するRmaxおよびカイ二乗法に基づいて選択し、二価分析物のフィットをCMD結合に使用した。結果非還元条件下でのSDS-PAGE分析により、h3G8CMD、h2B6CMDおよびh2B6-h3G8CBD発現系の精製産物は、それぞれ約50kDaの推定分子量を有する単一種であることが明らかとなった図3のそれぞれレーン4、5および6。還元条件下では、各CMD発現系から精製された産物は、単一バンドとして移動したがレーン1および2、h2B6-h3G8CBD系から精製された産物は、2つの別個のタンパク質であることが明らかとなった図3のレーン3。この発現系から精製され、還元条件下でSDS-PAGEによって可視化されたポリペプチドは全ておよそ28kDaの位置に移動した。各発現系産物のSEC分析でも、それらが単一分子種であり図4B、それぞれIgGのFabフラグメント約50kDaとほぼ同時に溶出されること図4Aが明らかとなった。これらの結果は、アフィニティー精製した産物がCMD発現系の場合には均質な共有結合型ホモ二量体であり、またh2B6-h3G8CBDの場合には均質な共有結合型へテロ二量体であることを示している。ELISAサンドイッチアッセイを使用して、CD32Bおよび/またはCD16Aのいずれか一方または双方に対するh2B6-h3G8CBDの結合特異性を試験した図5。CD32Bを標的抗原として使用し、CD16Aを二次プローブとして使用した。ELISAにおいて陽性シグナルが見られたことから、ヘテロ二量体であるh2B6-h3G8CBDは両抗原に対して特異性を有することが明らかとなった。h3G8CMDCD32Bに結合しないはずであるでの同様の試験では、シグナルは見られなかった。SPR分析により、h3G8CMDがsCD16を免疫特異的に認識するがsCD32Bは認識しないこと、h2B6CMDがsCD32Bを免疫特異的に認識するがsCD16は認識しないこと、そしてh2B6-h3G8CBDがsCD16とsCD32Bの双方を免疫特異的に認識することが示された図6A~B。試験したダイアボディはいずれも、対照受容体sCD32Aには結合しなかった図6C。また、SPR分析を使用して、sCD16および/またはsCD32Bに対するCMDおよびh2B6-h3G8CBDの速度定数および平衡定数を推定した。結果をh3G8scFVについて算出した同じ定数と比較した。図7A~Eは、SPR分析の結果をグラフで示したものである。図7に示す結果から算出された、結合速度および解離速度、ならびに平衡定数を表13に示す。ELISA分析の結果と合わせると、これらの検討により、h2B6-h3G8共有結合型へテロ二量体はCD32BおよびCD16の双方に対する特異性を保持していること、および両抗原に同時に結合できることが確認される。この分子を図8に図示する。6.2Fcドメインを含む共有結合型二重特異性ダイアボディの設計と特性決定IgG様分子、すなわち、Fcドメインを含む分子を作出するために、実施例6.1で示したヘテロ二量体CBD分子を含むポリペプチドの1つを、Fcドメインをさらに含むように改変した抗体の重鎖および軽鎖に類似する重い鎖および軽い鎖を作出する。従って、このヘテロ二量体二重特異性分子は同種の分子と二量体化するFcドメインを含むことで、四価の四量体IgG様分子が形成されるすなわち、ヘテロ二量体二重特異性分子のFcドメインを介して二量体化することにより形成される。興味深いことに、このような四量体分子は、例えば細胞馴化培地を標的抗原に対する免疫特異的結合に関して試験するなどの機能アッセイを用いても、組換え発現系の細胞馴化培地では検出されなかった。その代わりに、VL、VHおよびFcドメインからなる単量体を含む二量体分子のみが、前述の機能アッセイで検出された。理論上の四量体構造が安定性の面で問題となるかどうかを試験するために、Fcドメインを含むポリペプチドがヒンジ領域をさらに含むように操作し、一方、軽い鎖を含むポリペプチドは、ヒトκ軽鎖の定常ドメインの6個のC末端アミノ酸をさらに含むように操作した。このように再操作した重い鎖と軽い鎖を組換え発現系で同時に発現させた場合に、機能アッセイによって、標的抗原と抗Fc抗体の双方に免疫特異的に結合できるダイアボディ分子が検出された。材料および方法ポリペプチド分子の構築および設計:実施例6.1で示した構築物1および2の改変型を作製するために、核酸発現ベクターを設計した。構築物1および2をそれぞれFcドメインをさらに含むように操作することにより、構築物5配列番号14および6配列番号15を作出した。構築物1をそのC末端に配列FNRGEC配列番号23をさらに含むように操作することにより、構築物7配列番号16を作出した。構築物2をヒンジ領域とFcドメインV215A突然変異を含むをさらに含むように操作することにより、構築物8配列番号18を作出した。構築物5~8の模式図を図9に示す。PCRおよび発現ベクターの構築:PCRおよびPCR産物の精製プロトコルは全て、実施例6.1に記載した通りである。プラスミドpMGX0669およびpMGX0667を、それぞれ構築物1および2のコード配列用の鋳型として用いた。HuIgGのFcドメインのコード配列および/またはヒンジドメインのコード配列はそれぞれ配列番号5または配列番号1および配列番号5であった。PCR産物が重複配列を含み、重複PCRが所望の産物のコード配列を生成させるようなフォワードプライマーとリバースプライマーを用い、鋳型DNAのコード配列を増幅した。構築物1のコード配列は、pMGX0669から、フォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および配列番号62を用いて増幅した。構築物2のコード配列は、pMGX0667から、フォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および配列番号63を用いて増幅した。HuIgGヒンジ-Fcは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号65および配列番号66を用いて増幅した。構築物7配列番号16は、pMGX0669から、フォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および配列番号67を用いて増幅した。重複PCR:第1PCR産物を下記のように組み合わせ、実施例6.1で記載したように増幅および精製した。構築物5配列番号14図9に図示をコードする核酸配列は、構築物1およびHuIgGFcのPCR増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および配列番号64を合わせることで増幅した。構築物6配列番号15図9に図示をコードする核酸配列は、構築物2およびHuIgGFcのPCR増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および配列番号66を合わせることで増幅した。構築物8配列番号18図9に図示をコードする核酸配列は、構築物2およびHuIgGヒンジ-FcのPCR増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ配列番号55および配列番号66を合わせることで増幅した。最終産物を、前述のようにpCIneo哺乳動物発現ベクターPromega,Inc.にクローニングした。構築物をコードするプラスミドは表14に示すように呼称した。ポリペプチド/ダイアボディの発現:第6.1節で記載したように、リポフェクタミン2000を用い、HEK-293細胞に以下の4種類の異なる同時トランスフェクションを行った:構築物1および6をそれぞれコードするpMGX0669およびpMGX0674、構築物2および5をそれぞれコードするpMGX0667およびpMGX0676、ならびに構築物7および8をそれぞれコードするpMGX0677およびpMGX0678。これらのプラスミドの同時トランスフェクションは、FcγRIIBおよびFcγRIIIAの双方に免疫特異的な、IgG様構造を有する四価の二重特異性ダイアボディCBDの発現をもたらすように設計した。構築物6および5をそれぞれコードするpMGX0674およびpMGX0676の付加的同時トランスフェクションも行った。培養3日後、細胞馴化培地を回収した。細胞馴化培地中の分泌産物の量を、精製Fcを標準として用いる抗IgGFcELISAにより定量した。その後、サンプル中の産物の濃度を定量値に基づいて正規化し、この正規化サンプルを以降のアッセイに使用した。ELISA:培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を、上記のようなサンドイッチELISAによりアッセイした。特に示さない場合には、CD32Bをプレートのコーティングにすなわち、標的タンパク質として用い、HRPコンジュゲートCD16をプローブとして用いた。結果ELISAアッセイを用いて、構築物1および6を含む組換え発現系pMGX669-pMGX674、構築物2および5を含む組換え発現系pMGX667-pNGX676、ならびに構築物5および6を含む組換え発現系pMGX674-pMGX676由来の正規化サンプルを、CD32BおよびCD16Aと同時に結合可能なダイアボディ分子の発現に関して試験した図10。ELISAデータは、構築物1および6を用いた同時トランスフェクション、または構築物2および5を用いた同時トランスフェクションでは、一方または双方の抗原に結合できる産物は生じないことを示した図10のそれぞれ□および▲。しかしながら、構築物5および6の同時トランスフェクションは、CD32BおよびCD16の両抗原に結合できる産物の分泌をもたらした。後者の産物は構築物5および6の二量体であり、図11に図示した構造を有し、各抗原につき1つの結合部位を含んでいる。IgG様へテロ四量体構造の形成を促すために、6つの付加的アミノ酸のコード配列を構築物1のC末端に付加して、構築物7配列番号16;図9に図示を作出した。6つの付加的6アミノ酸FNRGEC配列番号23は、κ軽鎖のC末端に由来し、通常IgG分子内で重鎖の上部ヒンジドメインと相互作用する。そして、ヒンジドメインを構築物6に導入して構築物8配列番号18および図9を作出した。構築物8は、さらに、上部ヒンジ領域中にアミノ酸変異A215Vを含んだ。次に、構築物7および構築物8をコードする発現プラスミドそれぞれpMGX677およびpMGX678を上記のようにHEK-293細胞に同時トランスフェクトして発現させた。構築物7および8を含む組換え発現系pMGX0677pMGX0678から産生されたダイアボディ分子を、ELISAアッセイでCD32BおよびCD16Aとの結合に関して、構築物1および6を含む発現系pMGX669pMGX674、構築物2および8を含む発現系pMGX669pMGX678、ならびに構築物6および7を含む発現系pMGX667pMGX674から産生されたダイアボディ分子と比較した図12。すでに述べたように、構築物1および6を含む発現系pMGX669pMGX674によって産生された分子は、CD32AおよびCD16Aのいずれにも結合できないことが分かった図10および図12。これに対して、構築物7および6の同時発現pMGX0677MGX0674から、または構築物7および8の同時発現pMGX0677-pMGX0678から得られる産物は、CD32BおよびCD16の双方と結合できた図12。構築物7が、これがC末端配列FNRGEC配列番号23を含むこと以外は構築物1と同様であること、および構築物8が、これがヒンジドメインおよび突然変異A215Vを含むこと以外は構築物6と同様であることに留意されたい。このデータは、C-κ軽鎖のC末端に由来する6つの余分なアミノ酸FNRGEC;配列番号23を、Fcを持たない軽い鎖に付加することが、対応する重い鎖がヒンジドメインを含むかどうかにかかわらずすなわち、図12のpMGX0677pMGX0674とpMGX0677-pMGX0678、四量体IgG様ダイアボディ分子の形成を安定化させるのに役立つことを示している。Fcを有する重いポリペプチドにヒンジドメインを付加しても、対応する軽い鎖へのFNRGEC配列番号23C末端配列の付加なしでは、明らかに同様の安定化を達成することができなかったすなわち、構築物2および8の同時トランスフェクションpMGX669pMGX678の産物による結合が欠如。四量体ダイアボディ分子の構造を図13に図示する。6.3四量体IgG様ダイアボディの形成におけるドメインの順序および付加的ジスルフィド結合の影響四量体IgG様ダイアボディ分子の軽いポリペプチド鎖と重いポリペプチド鎖の間の付加的な安定化の影響を、ポリペプチド鎖上の選択された残基をシステインで置換することにより調べた。付加的なシステイン残基は、重い鎖と軽い鎖の間に付加的なジスルフィド結合を付与する。さらに、Fcドメインまたはヒンジ-Fcドメインをポリペプチド鎖のC末端からN末端へ移すことで、結合活性におけるドメインの順序を調べた。付加的なジスルフィド結合を含む分子の結合活性は、そのような結合を有する先に構築されていたダイアボディ分子と変わらなかったが、Fcもしくはヒンジ-Fcドメインを、ダイアボディを構成する重いポリペプチド鎖のN末端へ移すと、その標的抗原の一方もしくは双方に対する二重特異性分子の結合親和性および/または結合力が驚くほど向上した。材料および方法ポリペプチド分子の構築および設計:実施例6.2で示した構築物5、6および8の改変型を作製するために、核酸発現ベクターを設計した。構築物9配列番号19および構築物10配列番号20いずれも図13に図示は、それぞれFcドメインまたはヒンジ-FcドメインがポリペプチドのC末端からN末端へ移動していること以外は、構築物8および6と同様であった。さらに、使用したFcドメインは全て、野生型IgG1Fcドメインであった。構築物11配列番号21図14に図示は、C末端が配列FNRGEC配列番号23をさらに含むように設計されていること以外は、実施例6.1の構築物2と同様であった。構築物12配列番号22図14に図示は、Fcドメインがさらにヒンジ領域を含むこと以外は、実施例6.2の構築物5と同様であった。また、構築物11および12に関しては、2B6VLドメインおよび2B6VHドメインが、各ドメインのグリシンがシステインに置換するような一アミノ酸の改変それぞれG105CおよびG44Cを含んでいた。PCRおよび発現ベクターの構築:PCRおよびPCR産物精製のプロトコールは全て、実施例6.1および6.2に記載した通りである。重複PCR:実施例6.1および6.2に記載の方法を用いて、最終産物を構築し、増幅し、精製した。最終産物を、前述のようにpCIneo哺乳動物発現ベクターPromega,Inc.にクローニングした。構築物をコードするプラスミドは表15に示すように呼称した。ポリペプチド/ダイアボディの発現:第6.1節で記載したように、リポフェクタアミン2000を用い、HEK-293細胞に以下の3種類の異なる同時トランスフェクションを行った:構築物1および9をそれぞれコードするpMGX0669およびpMGX0719、構築物1および10をそれぞれコードするpMGX0669およびpMGX0718、ならびに構築物11および12をそれぞれコードするpMGX0617およびpMGX0717。これらのプラスミドの同時トランスフェクションは、FcγRIIBおよびFcγRIIIAの双方に免疫特異的な、IgG様構造を有する四価の二重特異性ダイアボディCBDの発現をもたらすように設計した。培養3日後、細胞馴化培地を回収した。細胞馴化培地中の分泌産物の量を、精製Fcを標準として用いる抗IgGFcELISAにより定量した。その後、サンプル中の産物の濃度を定量値に基づいて正規化し、この正規化サンプルを以降のアッセイに使用した。ELISA:培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を、上記のようなサンドイッチELISAによりアッセイした。特に示さない場合には、CD32Bをプレートのコーティングにすなわち、標的タンパク質として用い、HRPコンジュゲートCD16をプローブとして用いた。ウェスタンブロット:上記の3種類の同時トランスフェクションからの細胞馴化培地約15mlを非還元条件下のSDS-PAGEにより分析した。1枚のゲルをSimplyBlueSafestainInvitrogenで染色し、同じゲルを標準的な転写方法を用いてPVDFメンブレンInvitrogenに転写した。転写後、メンブレンを1×PBS中5のドライスキムミルクでブロッキングした。その後、メンブレンを、2ドライスキムミルク1×PBS/0.1Tween20中、1:8000希釈したHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1HL抗体10ml中で室温にて1時間静かに振盪しながらインキュベートした。1×PBS/0.3Tween20で、各5分間2回洗浄した後、ECLウェスタンブロッティング検出システムAmershamBiosciencesを製造者の説明書に従って用い、室温で20分間、メンブレンを露光した。このフィルムをX線プロセッサで現像した。結果構築物1および9、構築物1および10、ならびに構築物11および12を含む組換え発現系由来の細胞馴化培地を、SDS-PAGE非還元条件下分析およびウェスタンブロッティング抗IgGをプローブとして使用によって分析した。ウェスタンブロットにより、構築物11および12を含む系または構築物9および1を含む系由来の産物は、主に約150kDaの単一分子種それぞれ図14のレーン3および2を形成することが明らかとなった。これらの産物はいずれも、ダイアボディを構成する軽い鎖と重い鎖の間に内部ジスルフィド結合が導入されている。これに対し、軽い鎖と重い鎖の間に内部ジスルフィド結合が導入されていない、構築物10および1から形成された分子は、分子量約75kDaと約100kDa図14のレーン1の少なくとも2つの分子種を形成した。ウェスタンブロットの結果にもかかわらず、3つの産物はそれぞれ、CD32AおよびCD16の双方と結合できることが分かった図15。驚くべきことに、C末端ヒンジ-Fcドメインを含む産物構築物11および12から形成されると比較して、FcまたはFc-ヒンジドメインが、Fc含有ポリペプチド鎖すなわち重い鎖のアミノ末端にある双方の系に由来する産物構築物91および構築物101は、その標的ペプチドすなわち、CD32Bおよび/またはCD16の一方または双方に対する親和性および/または結合力の増強を示した。6.4ポリタンパク質前駆体のプロセシングおよび共有結合型二重特異性ダイアボディの発現に対する内部/外部切断部位の効果;ヒトIgGλ鎖およびヒンジドメインの部分を含む二重特異性ダイアボディの設計および特性決定本明細書に記載されるように、本発明のダイアボディまたはダイアボディ分子の個々のポリペプチド鎖は、単一のポリタンパク質前駆体分子として発現させることができる。実施例6.1~6.3で記載した組換え系の、ポリタンパク質前駆体から機能的なCBDを適切にプロセシングして発現する能力は、内部切断部位特にフューリン切断部位によって隔てられた、CBDの第1ポリペプチド鎖と第2ポリペプチド鎖の双方をコードする核酸を遺伝子工学的に作出することによって試験した。機能的CBDを、ポリタンパク質前駆体分子を含む組換え系から単離した。実施例6.3で述べたように、ヒトκ軽鎖由来の6つのC末端アミノ酸FNRGEC配列番号23を付加するとダイアボディ形成が安定化されることが分かったが、これはおそらく、配列番号23を含むドメインと、Fcドメインまたはヒンジ-Fcドメインを含むドメインとの間で鎖間相互作用が増強されるためであると思われる。このλ鎖/Fc様相互作用の安定化効果を、どちらのポリペプチド鎖にもFcドメインを含まないCBDで試験した。ダイアボディの一方のポリペプチド鎖をそのC末端に配列番号23を含むように操作し、相手のポリペプチド鎖を、IgGのヒンジドメインに由来するアミノ酸配列VEPKSC配列番号77を含むように操作した。このCBDと構築物1および2を含むCBD実施例6.1由来とを比較したところ、ヒンジドメインおよびλ鎖に由来するドメインを含むCBDは、その標的エピトープの一方または双方に対してやや大きい親和性を示すことが明らかとなった。材料および方法ポリペプチド分子の構築および設計:ポリタンパク質前駆体:2つのポリタンパク質前駆体分子双方とも図17に図示を作製するために核酸発現ベクターを設計した。構築物13配列番号95は、ポリペプチド鎖のN末端側から順に、3G8のVLドメイン、2.4G2のVHドメインmCD32Bに結合する、フューリン切断部位、2.4G2のVLドメイン、および3G8のVHドメインを含んでいた。構築物13をコードするヌクレオチド配列を配列番号96に示す。構築物14配列番号97図17は、ポリペプチド鎖のN末端側から順に、3G8のVLドメイン、2.4G2のVHドメインmCD32Bに結合する、フューリン切断部位、FMD口蹄疫ウイルスプロテアーゼC3部位、2.4G2のVLドメイン、および3G8のVHドメインを含んでいた。構築物14をコードするヌクレオチド配列を配列番号98に示す。核酸発現ベクターを、実施例6.1で示した構築物1および2の改変型を作製するために設計した。構築物15配列番号99図17は、構築物15のC末端がアミノ酸配列FNRGEC配列番号23を含むこと以外は、実施例6.1で示した構築物1配列番号9と同様であった。構築物15をコードする核酸配列を配列番号100に示す。構築物16配列番号101図17は、構築物16のC末端がアミノ酸配列VEPKSC配列番号77を含むこと以外は、実施例6.1で示した構築物2と同様であった。構築物16をコードする核酸配列を配列番号102に示す。PCRおよび発現ベクターの構築:PCRおよびPCR産物精製のプロトコールは全て、実施例6.1および6.2に記載した通りである。重複PCR:適当なプライマーとともに実施例6.1および実施例6.2に記載の方法を用いて、最終産物を構築し、増幅し、精製した。最終産物を、前述のようにpCIneo哺乳動物発現ベクターPromega,Inc.にクローニングした。構築物をコードするプラスミドは表16に示すように呼称した。ポリペプチド/ダイアボディの発現:第6.1節で記載したように、リポフェクタミン2000を用い、HEK-293細胞に以下の1種類のトランスフェクションと1種類の同時トランスフェクションを行った:単独トランスフェクション:構築物13をコードするpMGX0750;同時トランスフェクション:構築物15および16をそれぞれコードするpMGX0752およびpMGX0753。培養3日後、細胞馴化培地を回収し、分泌された産物を上記のようにアフィニティー精製した。ELISA:培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を、上記サンドイッチELISAによってアッセイした。マウスCD32Bをプレートのコーティングにすなわち、標的タンパク質として用い、HRPコンジュゲートCD16Aを、構築物15および16の同時トランスフェクション産物のプローブとして用いた。mCD32Bを標的タンパク質として用い、ビオチンコンジュゲートCD16Aを構築物13を含む組換え系のプローブとして用いた。結果構築物13を含む組換え発現系から得られた細胞馴化培地を、サンドイッチELISAにより分析した。ELISAアッセイにより、mCD32Bおよび/またはCD16のいずれか一方または双方に対するCBDの結合特異性を試験した図18。CD32Bを標的抗原として使用し、CD16Aを二次プローブとして使用した。ELISAにおいて陽性シグナルが見られたことから、前述のポリタンパク質前駆体から産生されるヘテロ二量体であるh2.4G2-h3G8CBDは両抗原に対して特異性を有することが明らかとなった。同様に、構築物15および16をコードするベクターの同時トランスフェクションによって生じた精製産物をELISAアッセイで試験し、構築物1および2からなる産物実施例6.1と比較した。CD32Bを標的抗原として使用し、CD16Aを二次プローブとして使用した。構築物1および2からなる産物と同様に、構築物15および16の産物は、CD32BおよびCD16Aに同時に結合できることが分かった。実際に、構築物15および16の産物は、標的抗原、すなわちCD32BまたはCD16Aの一方または双方に対してやや増強された親和性を示した。これは、おそらく構築物1および2からなる産物には存在しない、λ鎖領域FNRGEC配列番号23とヒンジ領域VEPKSC配列番号77の相互作用によって与えられる鎖間会合の安定性および/または忠実度の増大野生型のVH-VLドメインの相互作用と比較してによるものと思われる。6.5複数の親和性を一緒に連結するための二重親和性再標的化試薬DARTの使用本発明の一態様は、新規な二重親和性再標的化試薬DART、ならびに複数の親和性を一緒に連結する新規な方法に関する。DARTは、単一特異性、二重特異性、三重特異性などであり得、これにより1個、2個、3個またはそれを越える異なるエピトープ同じ抗原または異なる抗原のものであり得るに同時に結合することができる。DARTはさらに、一価、二価、三価、四価、五価、六価などであり得、これにより1個、2個、3個、4個、5個、6個またはそれを越える分子に同時に結合することができる。図35に示すように、DARTのこれら2つの属性を組み合わせて、例えば、四価である二重特異性抗体などを作製することができる。1つの進歩は、原型の免疫受容体であるhuCD32Bに対する親和性ならびにハプテンであるフルオレセインに対する親和性を有するDARTの開発である。2B6/4420と呼ばれるこのDARTは、huCD32Bと、フルオレセインコンジュゲート結合パートナーと相互作用する分子とを同時に連結することができる万能アダプターとして働く。CD32Bは、活性化シグナル伝達免疫複合体とのクラスター化によって活性化シグナルを抑制する能力を有するFc受容体である。その最初の実装形態において、この技術は、新規なDART構築物を作製する必要なく、huCD32Bとのクラスター化のための複数種の生物学的標的の迅速なスクリーニングを可能とする。2B6/4420は、細胞表面受容体に対するフルオレセイン化抗体と簡単に混合することができ、これにより、該受容体に対して親和性を有するDARTの作用を模倣することができる図20。さらに、この試薬は、容易に発現または産生されない親和性試薬の効率的な連結を可能とし、これにより、技術的な限界を克服することができる。2B6/4420含有DARTは、研究ツールとして、また、臨床候補としても有用であることが明らかである。HEK293細胞から産生された2B6/4420は、ELISAアッセイにおいて、CD32Bおよびフルオレセインに同時に結合することができる。さらに、2B6/4420は、CD79との同時連結によってCD32BをBCR複合体に動員することにより、細胞増殖を阻害することもできる。DARTの2B6アームは、異なる抗体配列で、または他の関連特異性を有する結合配列で置換することができる。材料および方法:プラスミド構築物:2B6/4420は、ヒト化2B6MAbhu2B6、MGA321の配列と、キメラマウスFv/ヒトFc型の抗フルオレセインMAbである4420の配列とに由来する。完全に構築されたDARTは2つのポリペプチドからなり、その結果、2つのFv領域の共有結合が起こる。第1のポリペプチドは、分泌シグナル配列と、それに続くアミノ酸残基GGGSGGGGからなるリンカーにより隔てられた4420VHとの融合タンパク質として産生されるhu2B6VLからなる。κ軽鎖のC末端に由来する配列FNRGECを、このポリペプチドのC末端に付加する。他のポリペプチドは、シグナル配列-4420VL-GGGSGGGG-hu2B6VHからなり、ヒトIgG1FdフラグメントのC末端に由来する配列VEPKSCをC末端に付加する。これら2鎖中のシステインがジスルフィド結合を形成し、その2つのポリペプチドが共有結合で連結される図20。記載のポリペプチドをコードするDNA配列を既存のプラスミドからPCR増幅させ、重複PCRにより組み合わせ、pCIneoPromegaのNheI部位とEcoRI部位の間にクローニングした。最後に、上記の方法と同様の方法を用いてすでに構築したhuCD32BとhuCD16に対する親和性を有するDART2B6/3G8を対照として用いた。抗体:抗ヒトCD79bマウスモノクローナル抗体であるCB3.1およびCB3.2ハイブリドーマは、アラバマ州バーミンガム、アラバマ大学バーミンガム校のCooperMD博士から入手した。イソチオシアン酸フルオレセインFITCを製造者Pierce、イリノイ州ロックフォードの説明書に従って用い、CB3.1およびCB3.2を標識した。Fcフラグメント特異的なヤギ抗マウスGAMIgGのFab’2フラグメントは、JacksonLaboratoriesペンシルベニア州ウェストグローブから入手した。抗huCD32BマウスMAbである3H7は、自社で作製および精製した。ヤギ抗2B6Fvは、ヤギにhu2B6完全抗体を感作させ、hu2B6のFv領域に対してアフィニティー精製することにより作製した。huIgG、FITC-huIgGおよびHRP-抗マウスIgGは、JacksonImmunoResearchから入手した。HRP-抗ヤギは、SouthernBiotechから入手した。DARTの発現:リポフェクタミン2000Invitrogenを製造者の説明書に従って用い、各鎖をコードするプラスミドを293H細胞Invitrogenに同時トランスフェクトした。3日間隔で3~4回、分泌されたタンパク質を回収し、固定化された可溶形態のCD32Bに対する液体クロマトグラフィーにより精製した。ELISA:FITC標識Sタンパク質Novagen、ヒトIgGまたはFITC-huIgGでコーティングしたMaxiSorpプレートNalgeNunc上に、2B6/4420DARTまたは2B6/3G8DARTを捕捉した。検出は、可溶性CD32Bエクトドメイン、次いで3H7CD32Bに特異的なマウスモノクローナル抗体、最後に抗マウスHRPと結合させることによって行った。あるいは、アフィニティー精製したヤギ抗2B6Fvポリクローナル抗血清、次いで抗ヤギ抗体-HRPと結合させることにより検出を行った。HRP活性は、比色分析用TMB基質BioFXを用いて検出し、VersaMaxELISAプレートリーダーで読み取った。B細胞の精製および増殖アッセイ:健康なドナー由来の血液を用いるフィコール/パークプラスAmershamPharmaciaBiotech、UK勾配法により、末梢血単核細胞を分離した。DynalBCellNegativeIsolationキットDynalBiotechnologyInc.、ニューヨーク州を製造者の説明書に従って用い、Bリンパ球を単離した。単離されたB細胞CD20の純度は、FACS分析により推定したところ90を超えた。増殖アッセイでは、精製されたB細胞を、平底96ウェルマイクロタイタープレートの完全RPMI1640培地中に、最終容量200μl中、1×105細胞/ウェルの細胞密度で播種し、5のCO2中37°Cの抗体およびダイアボディの存在下または不在下で48時間インキュベートした。次いで、1μCi/ウェルの[3H]チミジンPerkinElmer、マサチューセッツ州ウェルズリーを添加し、回収前にさらに16~18時間インキュベーションを継続した。[3H]チミジンの取込みは、液体シンチレーションカウント法により測定した。結果2B6/4420DARTが活性を持ち、かつ特異的であることを証明するために、2つのELISA試験を実施した。まず、2B6/4420または2B6/3G8陰性対照としてを、ELISAプレートにコーティングしたフルオレセインコンジュゲートタンパク質Sタンパク質に結合させた。次に、DARTの2B6アームを可溶性CD32BNに結合させた。結合は、2B6のエピトープと重複しないエピトープを有するCD32Bに対する別の抗体と、その後のHRPコンジュゲート二次抗体により検出した。2B6/4420DARTはフルオレセインとCD32Bに同時に結合することができるが、2B6/3G8にはその能力がない図21のパネルA。可溶性CD32Bでコーティングしたプレート上に該DARTが捕捉され、hu2B6Fvに特異的な抗体により結合を検出すると、両DARTとも良好な結合を示す。2B6/4420DARTは、ヒトIgGにコンジュゲートさせたフルオレセインと結合できることこれは本試薬の最初の実装形態に関するものであると考えられるを証明するために、フルオレセインで標識しない、または標識したHuIgGをELISAプレートに結合させ、これを2B6/4420の捕捉に用いた。この場合にも、2B6/3G8を陰性対照として用いた。結合は、Hu2B6Fvに特異的な抗体を用いて検出した。2B6/4420DARTは、FITC-HuIgGには明らかに結合するが、非標識HuIgGには結合せず、このことから、このDARTは抗体にコンジュゲートされたフルオレセインと結合することができること、および抗体単独とは有意な結合が見られないことを示す。予測されたように、これらのいずれの場合にも、2B6/3G8DARTによる結合は検出されなかった。2B6/4420DARTが、細胞系アッセイの場合のシグナル伝達に対して効果を持ち得る二重親和性試薬として機能し得ることを証明するための試験を行った。CD32BとBCRの共凝集はB細胞の活性化を阻害することが示されている。2B6/4420DARTが、CD32Bと、フルオレセインで標識されたαCD79b抗体でコーティングされたBCRとを同時結合させて細胞増殖の阻害を誘発する能力を調べた。B細胞はヒト血液から陰性選択し、漸増濃度のFITC標識マウス抗ヒトCD79b抗体であるクローンCB3.1およびCB3.2で処理し、BCRを架橋する二次試薬としてのFc特異的GAMのFab’2フラグメントを、固定濃度5μg/mLの2B6/4420DARTまたは、フルオレセインを標的としないことから対照として用いられる分子である同等量の2B6/3G8DARTとともに添加することにより活性化させた。[3H]チミジンの取込みとして測定される細胞増殖は、該DARTの不在下または対照2B6/3G8DARTの存在下で、モノクローナル抗CD79b抗体-FITCアクチベーターの濃度上昇とともに増大した。2B6/4420DARTの存在は、抗ヒトCD79b-FITCの全ての濃度において、B細胞増殖の著しい低下をもたらした図22のパネルAおよびB、ならびに図23のパネルA。非標識CB3.2でコーティングし、同じ試験条件を用いて活性化させたB細胞を2B6/4420DARTで処理しても増殖の阻害は見られなかったことから、その標的特異性が判明する図23、パネルB。これらのデータは、2B6/4420DARTが、CD32BとBCRとを架橋して抗原-受容体により誘導される細胞活性化を遮断し得る阻害シグナルを送達できることを示す。6.6CD32Bを発現するB細胞悪性腫瘍に対するDART免疫療法薬現行では、B細胞悪性腫瘍は、リツキサン登録商標抗CD20抗体を用いて治療されている。しかし、一部のB細胞悪性腫瘍はCD20を発現しないか、またはリツキサンに対して耐性となっている。本発明のDARTは、リツキサン登録商標抗CD20抗体に関連する問題を克服し得る代替免疫療法薬を提供する。MGD261は、hCD32Bにh2B6抗体を介してならびにhCD16AおよびhCD16Bにh3G8抗体を介して結合する二重親和性再標的化DART分子である。MGD261の有効性B細胞枯渇および安全性を、mCD32-/-hCD16AC57Bl/6マウス、mCD32-/-hCD32BC57Bl/6マウス、およびmCD32-/-hCD16AhCD32BC57Bl/6マウスにおいて試験した。この反復投与試験では、マウスに6回の静注毎週2回、3週間を行った。B細胞枯渇はFACSによりモニタリングした。安全性はケージ越しの観察によりモニタリングした。データは、MGD261に、二重トランスジェニックマウスにおいて、顕著な副作用を誘発することなくB細胞を枯渇させる能力があることを示す。データ:0、3、7、10、14および17日目に、MarcoGenics繁殖コロニーのmCD32-/-hCD16AC57Bl/6マウス、mCD32-/-hCD32BC57Bl/6マウスおよびmCD32-/-hCD16AhCD32BC57Bl/6マウスに、MGD26110、3、1もしくは0.3mg/kgまたは無関連抗体10mg/kgのhE16を静注した。19日前血液採取前、4、11、18、25および32日目にFACS分析用に血液を採取した。週3回、動物の健康および活動を記録した。FACS分析法:h2B6-h3G8投与の18日前、ならびに処置の4、11、18、25および32日後に全血液サンプルを採取した。FACSに基づくアッセイにより血液サンプルを分析し、B細胞総数に対するh2B6-h3G8の効果を決定した。BechmanCoulterから入手したFlowCountビーズを用いることにより、B細胞総数、T細胞総数およびPMN総数には洗浄なしのプロトコールを用いた。分析で用いた抗体パネルは、PMNが1A8-FITC、T細胞がCD3-PE、B細胞がCD19-APC、および全白血球がCD45-PerCPであった。結果hE16またはMGD261どの濃度でもで処置したマウスは、試験期間中のどの時点でも不快感の徴候を見せなかった。hCD16AおよびhCD32Bの二重トランスジェニックマウスでは、B細胞枯渇が見られた。ダイアボディh2B6-3G8は、hCD16A発現エフェクター細胞およびhCD32B発現B細胞に結合し、B細胞の死滅にはこれらの結合が必要であった。単一トランスジェニックマウスではB細胞枯渇は見られなかった図24。試験中、T細胞レベルおよびPMNレベルに有意な変化は見られなかった。本発明の代替的な免疫療法薬に対するさらなる実証として、2.4G2-3G8DBと呼ばれるMGD261のサロゲートを構築した。2.4G2-3G8DBは、mCD32Bに2.4G2抗体を介して、ならびにhCD16AおよびhCD16Bにh3G8抗体を介して結合する二重親和性再標的化DART分子である。2.4G2-3G8DBの有効性B細胞枯渇および安全性を、mCD16-/-マウス、mCD16-/-hCD16AC57Bl/6マウス、mCD16-/-hCD16Bマウス、およびmCD16-/-hCD16AhCD16Bマウスにおいて試験した。この反復投与試験では、マウスに9回の腹腔内注射毎週3回、3週間を行った。B細胞枯渇はFACSによりモニタリングした。安全性はケージ越しの観察によりモニタリングした。データは、2.4G2-3G8DBに、hCD16トランスジェニックマウスにおいて、顕著な副作用を誘発することなくB細胞を枯渇させる能力があることを示す。データ:0、2、4、7、9、11、14、16および18日目に、MarcoGenics繁殖コロニーのmCD16-/-マウス、mCD16-/-hCD16AC57Bl/6マウス、mCD16-/-hCD16Bマウス、およびmCD16-/-hCD16AhCD16Bマウスに、2.4G2-3G8DB75μg/匹またはPBSを腹腔内注射した。10日前血液採取前、4、11および18日目にFACS分析用に血液を採取した。毎週3回、動物の健康および活動を記録した。FACS分析法:2.4G2-3G8投与の10日前、ならびに処置開始の4、11および18日後に、全血液サンプルを採取した。FACSに基づくアッセイにより血液サンプルを分析し、B細胞総数に対する2.4G2-3G8の効果を決定した。BDImmunocytometrySystemから入手したTruCOUNTチューブを用いることにより、B細胞総数、T細胞総数およびPMN総数には洗浄なしのプロトコールを用いた。分析で用いた抗体パネルは、PMNが1A8-FITC、T細胞がCD3-PE、B細胞がCD19-APC、および全白血球がCD45-PerCPであった。結果hE16または2.4G2-3G8DBで処置したマウスは、実験期間中のどの時点でも不快感の徴候を見せなかった。mCD16-/-hCD16AマウスまたはmCD16-/-hCD16AhCD16BマウスではB細胞枯渇が見られたが、mCD16-/-マウスでは見られなかった。これらのデータは、B細胞の死滅にはhCD16Aを担持するエフェクター細胞が必要であったことを示す図25。試験中、T細胞レベルおよびPMNレベルに有意な変化は見られなかった。静脈内IVモデル:ヒト腫瘍細胞株Rajiの静脈内IVモデルを用いて、MGD261の抗腫瘍活性を試験した。Rajiは、hCD32Bを発現するヒトバーキットリンパ腫細胞株である。mCD16-/-マウス、hCD16Aマウス、RAG1-/-マウスに静注すると、腫瘍細胞が脊椎に局在し、後肢麻痺が生じる。データは、MGD261に、mCD16-/-マウス、hCD16Aマウス、RAG1-/-マウスにおいてinvivoでRaji腫瘍細胞増殖を遮断する能力があることを示す。データは、MGD261がヒトにおけるCD32B発現B細胞悪性腫瘍の治療に使用可能であることを示す。データ:0日目に、MarcoGenics繁殖コロニーの12~20週齢のmCD16-/-マウス、hCD16Aマウス、RAG1-/-C57Bl/6マウスに、5×106個のRaji細胞を静注した。6、9、13、16、20、23、27および30日目に、マウスにまた250、25または2.5μgのMGD261またはPBS陰性対照の腹腔内IP処置も施した。その後、マウスを毎日観察し、毎週2回体重を記録した。後肢麻痺を発症するマウスは安楽死させた。結果:PBSで処置したマウスは、25日目~50日目の間に死に至った。MGD261で処置したマウスは、少なくとも第90日目まで生存した図26。この生存率の増加は統計学的に有意であった。ログランク検定を用いる生存曲線の比較により、96.46のχ2df=9;P値<0.0001が得られた。6.7原核生物におけるDARTの発現非哺乳動物宿主においてもDARTを作製できることを証明するために試験を行った。よって、大腸菌をDART発現プラスミドで形質転換し、DARTの現をモニタリングした。材料および方法:プラスミドの構築:3G8は、HuCD16に対するヒト化モノクローナル抗体である。本明細書に記載されるDARTは、その各々がVLの後にスペーサーを有し、次いで、VHの後に対向鎖に対してジスルフィド結合を形成にするのに良好な関係でCysを有する、2本の共有結合鎖からなる。3G8VL-GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly配列番号10-3G8VH-LeuGlyGlyCysをコードするDART配列を既存の真核細胞発現構築物からPCR増幅し、NcoIおよびEcoRIにより消化した。標的ベクターは、大腸菌内における分泌のためのpelBリーダー配列を含むpET25bベクターNovagenであった。3G8/3G8DART配列の挿入前に、ベクターを次のように改変した。まず、たとえ低レベルであっても、その制御下にある可溶性のタンパク質発現に有利なように、T7プロモーターを、活性の低いlacプロモーターに置き換えた。さらに、pelBリーダーの開始部に存在するMetでの開始に有利なように、多重クローニング部位MCSの開始部に存在する2個の内部Metコドンを除去するために2つの点突然変異を導入した。この構築物により作製されるDARTは、同一の特異性、すなわち、HuCD16を有する2本のV領域アームからなる。発現:BL21DE3細胞NovagenをpET25bT7-lac3G8/3G8プラスミドで形質転換し、amp耐性コロニーを用いてブロス培養へ播種を行った。培養物がOD6000.5単位に達したところで、0.5mMのIPTGを添加して発現を誘導した。30°Cで2時間培養物を増殖させ、無細胞培地を回収した。精製:3G8/3G8DARTを、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーを用いる2段階法で精製した。アフィニティークロマトグラフィーを用いて、細胞馴化培地からDARTを捕捉した。特に、CD16AをCNBr活性化セファロース4BGEHealthcareに結合させた。ローディング前に、20mMトリス/HClpH8.0でCD16A-セファロース樹脂を平衡化した。ローディングが完了したところで、この樹脂を平衡化バッファーで洗浄した後、結合したDARTを50mMグリシンpH3.0で溶出させた。溶出したDARTは、すぐに1Mトリス/HClpH8.0で中和化し、遠心分離型濃縮器Vivaspin20、10kMWCOPES、VivaScienceInc.を用いて濃縮した。濃縮したDARTをさらに、PBSで平衡化したSuperdex200カラムGEHealthcareを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。結果大腸菌を培養した1.7リットルの細胞馴化培地をCD16Aセファロースカラムで処理した。DARTの収量は0.12mgであった。精製したDARTをSDS-PAGEおよびSECにより分析したところ、哺乳動物細胞CHO細胞により発現された対照DARTとの同等性が示された図27。大腸菌により発現されたh3G8-h3G8DARTの結合ELISA:大腸菌におけるh3G8-h3G8DARTの発現を、ELISAを用いて測定した。50μl/ウェルの2μg/ml抗h3G8Fv特異的抗体2C11を、96ウェルMaxisorpプレートに、炭酸バッファー中、4°Cにて一晩コーティングした。このプレートをPBS-TPBS、0.1Tween20で3回洗浄し、次いで、室温で30分間、PBS-T中0.5のBSAでブロッキングした後に供試DARTを添加した。ブロッキング中に大腸菌により発現されたh3G8-h3G8DART、h2B6-h3G8DART、およびh2B6-h2B6DART陰性対照を、PBST/BSAで1μg/mlおよび0.3μg/mlに希釈した。50μl/ウェルの希釈DARTを各ウェルに添加した。このプレートを室温で1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄した後、50μl/ウェルの0.1μg/mlビオチニル化sCD16-Fc融合体をプレートに添加した。このプレートを室温で1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄した後、50μl/ウェルのHRPコンジュゲートストレプトアビジンAmershamPharmaciaBiotechの1:5000希釈液を検出に用い、室温で1時間インキュベートした。このプレートをPBS-Tで3回洗浄し、80μl/ウェルのTMB基質で発色させた。5分間インキュベートした後、40μl/ウェルの1H2SO4により反応を停止させた。96ウェルプレートリーダーとSOFTmaxソフトウェアを用いてOD450nmを読み取った。この読み取り結果を、GraphPadPrism3.03ソフトウェアを用いてプロットした図28。6.8DARTにより誘導されるヒトB細胞死ヒトPBMCを、CD16-CD32B-hu3G8-hu2b6上記、ch2B6-aglyc-非グリコシル化キメラ2B6抗体参照により本明細書に組み入れるUS2005/0260213として公開された同時係属米国特許出願第11/108,135号に記載、およびCD16-CD79とともに一晩インキュベートした。CD16-CD79のDNA配列およびコードされているタンパク質配列は以下の通りである。H3G8VL-CB3.1VHヌクレオチド配列配列番号226:アミノ酸配列配列番号227:CB3.1VL-h3G8VHヌクレオチド配列配列番号228:アミノ酸配列配列番号229:アポトーシスをFACS分析により、ゲート設定されないFSC/SSC総細胞集団に対するB細胞CD20細胞のPIアネキシンV集団のパーセンテージとしてアッセイした図29。6.98B5-CB3.1DART8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC8B5VLは、プライマーとしてH9およびlgh630Rを、鋳型としてch8B5Lcを用いることにより増幅した。CB3.1VHは、プライマーとしてlgh628Fおよびlgh629Rを、鋳型としてch8B5Hcを用いることにより増幅した。リンカー配列は、プライマーlgh630Rおよびlgh628F内に組み込んだ。c末端リンカーおよび停止コドンをlgh629Rプライマーに組み込んだ。PCR産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、プライマーとしてH9およびlgh630Rを用いることにより増幅した。次いで、この重複PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。CB3.1VL-8B5VH-FNRGECCB3.1VLは、プライマーとしてH9と、FR4において8B5VLと同じ配列を共有するlgh630Rを、鋳型としてchCB3.1Lcを用いることにより増幅した。8B5VHは、プライマーとしてlgh631Fおよびlgh640Rを、鋳型としてch8B5Hcを用いることにより増幅した。リンカー配列をプライマーlgh630Rおよびlgh631Fに組み込んだ。c末端リンカーおよび停止コドンをlgh640Rプライマーに組み込んだ。PCR産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、プライマーとしてH9およびlgh640Rを用いることにより増幅した。次いで、この重複PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。抗Flagタグ-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC抗Flagタグは、重複PCRによりシグナル配列と8B5VLとの間に挿入した。シグナル配列およびFlagタグは、プライマーとしてH9およびlgh647Rを、鋳型としてch8B5Lcを用いることにより増幅した。8B5VL-CB3.1VH-VEPKSCは、プライマーとしてlgh647Fおよびlgh629Rを、鋳型として8B5VL-CB3.1VH-VEPKSCを用いることにより再増幅した。PCR産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、プライマーとしてH9およびlgh629Rを用いることにより増幅した。次いで、この重複PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。8B5VL-CB3.1VH-LGGC8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC構築物内に異なるC末端リンカーを作製するため、プライマーとしてH9およびlgh646Rを用いることにより該構築物を再増幅した。C末端LGGCリンカーをlgh646Rプライマーに組み込んだ。次いで、このPCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。CB3.1VL-8B5VH-LGGC同じ戦略を用いて、CB3.1VL-8B5VH-LGGCを作出した。C末端LGGCリンカーをlgh648Rプライマーに組み込み、CB3.1VL-8B5VH-FNRGECを鋳型として用いた。次いで、このPCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。抗Flagタグ-8B5VL-CB3.1VH-LGGCまた同じ戦略を用いて、抗Flagタグ-8B5VL-CB3.1VH-LGGCも作出した。C末端LGGCリンカーをlgh648Rプライマーに組み込み、抗Flagタグ-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSCを鋳型として用いた。次いで、このPCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。8B5-CB3.1-VEPKSCヌクレオチド配列配列番号230:8B5-CB3.1-VEPKSCアミノ酸配列配列番号231:CB3.1-8B5-FNRGECヌクレオチド配列配列番号232:CB3.1-8B5-FNRGECアミノ酸配列配列番号233:8B5VL-CB3.1VH-LGGC8B5VLは、プライマーとしてH9およびlgh694Rを、鋳型としてch8B5Lcを用いることにより増幅した。8B5VHは、プライマーとしてlgh695Fおよびlgh696Rを、鋳型としてch8B5Hcを用いることにより増幅した。リンカー配列をプライマーlgh694Rおよびlgh695Fに組み込んだ。HuIgG1Fcは、プライマーとしてlgh355Fおよびlgh366Rを、鋳型としてch8B5Hcを用いることにより増幅した。これらのPCR産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、プライマーとしてH9およびlgh366Rを用いることにより増幅した。次いで、この重複PCR産物をNheI/EcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化し、pCIneoベクターにクローニングした。8B5VL-CB3.1VH-LGGCヌクレオチド配列配列番号234:8B5VL-CB3.1VH-LGGCアミノ酸配列配列番号235:CB3.1-8B5-LGGCヌクレオチド配列配列番号236:CB3.1-8B5-LGGCアミノ酸配列配列番号237:プライマー:発現:構築物5および6、または6および7、または8および9、または9および10によりコードされる発現プラスミド図30を、リポフェクタアミン2000Invitrogenを用いてHEK-293細胞内に同時トランスフェクトし、抗flagタグを伴うまたは伴わない8B5-CB3.1DARTを発現させた。3日毎に3回、細胞馴化培地を回収した。次いで、この細胞馴化培地を、CD32Bアフィニティーカラムを用いて精製した。ELISA:ELISAは次のように実施した。50μl/ウェルの2μg/mlCD32B-Fcを、96ウェルMaxisorpプレートに、炭酸バッファー中、4°Cにて一晩コーティングした。このプレートをPBS-TPBS、0.1Tween20で3回洗浄し、次いで、室温で30分間、PBS-T中0.5のBSAでブロッキングした後に供試単鎖Fc融合タンパク質を添加した。ブロッキングの際、8B5-CB3.1DARTを希釈して、2μg/mlで始まる2倍希釈系列とした。25μl/ウェルの50ng/mlch8B5と混合した25μl/ウェルの希釈DARTを、希釈プレートからELISAプレートに移した。このプレートを室温で1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄した後、50μl/ウェルの1:10,000希釈HRPコンジュゲートFab’2ヤギ抗ヒトIgGFab’2JacksonImmunoResearchをプレートに添加した。このプレートを室温で1時間にわたりインキュベートした。このプレートをPBS-Tで3回洗浄し、80μl/ウェルのTMB基質で発色させた。5分間インキュベートした後、40μl/ウェルの1H2SO4により反応を停止させた。96ウェルプレートリーダーとSOFTmaxソフトウェアを用いてOD450nmを読み取った。この読み取り結果を、GraphPadPrism3.03ソフトウェアを用いてプロットした図31。6.10Ig様四価DARTの設計および特性決定4本のポリペプチド鎖を用いて、四価の抗原結合部位を有するIg様DART種を作出した図32、図33。このIg様DART種は、そのドメインが同じエピトープと結合するように従って、4つの同一の抗原分子に結合することができる四価の一エピトープ特異的Ig様DARTを形成するように、または異なるエピトープもしくは抗原に結合するように設計することができることから、独特な特性を有する。例えば、そのドメインを、同じ抗原の2個のエピトープと結合するように従って、四価の単一抗原特異的な二エピトープ特異的Ig様DARTを形成するように、または異なる抗原分子のエピトープと結合するように従って、第1の抗原に特異的な結合部位の対と、第2の抗原に特異的な第2の結合部位の対とを有する四価Ig様DARTを形成するように設計することができる。このような属性の組合せを有するハイブリッド分子を容易に作出することができる。このようなIg様DART種の特性を例示するため、CD32に特異的な結合部位の対と、CD16Aに特異的な第2の結合部位の対とを有する、例示的な四価Ig様DART種を作出した。このIg様DART種は、以下の4本のポリペプチド鎖を用いて作出した。2.4G2-3G8-hκヌクレオチド配列配列番号247:2.4G2-3G8-hκによりコードされるアミノ酸配列配列番号248:3G8-2.4G2-hG1ヌクレオチド配列配列番号249:3G8-2.4G2-hG1によりコードされるアミノ酸配列配列番号250:上記配列を有するIg様DART分子の調製物を異なるプラスミド単離物から得、IgDART1およびIgDART2と呼称した。ELISAにおいてこれらのIg様DART種がmCD32-hCD16Aと結合する能力を、培地単独、単一のCD32結合部位と単一のCD16A結合部位とを有するDARTDART、および対照抗ch-mCD32mAbの能力と比較した図34。本発明のIg様DARTは、DARTまたは対照抗体のいずれよりも遙かに大きな抗原結合親和性を有することが判明した。6.11CD32B-CD79-1二重特異性ダイアボディおよびCD32B-CD79-2二重特異性ダイアボディの設計および特性決定CD79VL-CD32BVH配列1、CD32BVL-CD79VH-1配列2、およびCD32BVL-CD79VH-2配列3をコードする遺伝子を、発現ベクターpEE13にクローニングし、それぞれ、発現構築物1、2および3を得た。構築物1の発現プラスミドを、発現プラスミド2または3とともにHEK-293細胞に同時トランスフェクトし、それぞれCD32B-CD79-1二重特異性ダイアボディおよびCD32B-CD79-2の二重特異性ダイアボディを作製した。3日毎に3回、細胞馴化培地を回収した。次いで、この細胞馴化培地を、CD32Bアフィニティーカラムを用いて精製した。ELISAは次のように実施した。50μl/ウェルの2μg/mlCD32B-Fcを、96ウェルMaxisorpプレートに、炭酸バッファー中、4°Cにて一晩コーティングした。このプレートをPBS-TPBS、0.1Tween20で3回洗浄し、次いで、室温で30分間、PBS-T中0.5のBSAでブロッキングした後に供試単鎖Fc融合タンパク質を添加した。ブロッキングの際、CD32B-CD79-1二重特異性ダイアボディまたはCD32B-CD79-2の二重特異性ダイアボディを希釈して、2μg/mlで始まる2倍希釈系列とした。25μl/ウェルの希釈二重特異性ダイアボディを、25μl/ウェルの50ng/ml抗CD32B抗体と混合し、ELISAプレートに添加した。このプレートを室温で1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄した後、50μl/ウェルの1:10,000希釈HRPコンジュゲートFab’2ヤギ抗ヒトIgGFab’2JacksonImmunoResearchをプレートに添加した。このプレートを室温で1時間インキュベートした。このプレートをPBS-Tで3回洗浄し、80μl/ウェルのTMB基質で発色させた。5分間インキュベートした後、40μl/ウェルの1H2SO4により反応を停止させた。96ウェルプレートリーダーとSOFTmaxソフトウェアを用いてOD450nmを読み取った。この読み取り結果を、GraphPadPrism3.03ソフトウェアを用いてプロットした。この実験により、CD32B-CD79-1二重特異性ダイアボディおよびCD32B-CD79-2の二重特異性ダイアボディに、抗CD32B対照抗体の親和性と同等の親和性でCD32-Fcに免疫特異的に結合する能力があることが明らかになった。上記構築物のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を以下に示す。配列1-CD79VL-CD32BVHヌクレオチド配列配列番号251:配列2-CD79VL-CD32BVHアミノ酸配列配列番号252:配列3-CD32BVL-CD79VH-1ヌクレオチド配列配列番号253:配列4-CD32BVL-CD79VH-1アミノ酸配列配列番号254:配列5-CD32BVL-CD79VH-2ヌクレオチド配列配列番号255:配列6-CD32BVL-CD79VH-2アミノ酸配列配列番号256:6.12H8B5-HBCRC生体機能性ダイアボディの構築物および至適化CD32およびB細胞受容体複合体BCRCと結合することができる可変領域を含むダイアボディを構築した。クローニング標準PCR/重複PCRを用いて構築物を構築した。h8B5VL-G3SG4-hBCRCVHM48I-LGGC:完全ヒト化8B5VLCD32を認識するは、プライマーとしてlgh321Fおよびlgh788Rを用いることにより増幅した。hBCRCVHM48Iは、プライマーとしてlgh784Fおよびlgh386Rを用いることにより増幅した。これらのPCR産物をゲル精製して混合し、lgh321Fおよびlgh386Rを用いることにより増幅した。次いで、この重複PCRフラグメントをpEE6のXbaI-EcoRI部位にクローニングした。G3SG4は、配列:GGGSGGGG配列番号10を有するリンカーである。hBCRCVLR45N-G3SG4-h8B5VH-LGGChBCRCVLR45Nは、プライマーとしてlgh321Fおよびlgh785Rを用いることにより増幅した。h8B5VHは、プライマーとしてlgh787Fおよびlgh786Rを用いることにより増幅した。これらのPCR産物をゲル精製して混合し、lgh321Fおよびlgh786Rを用いることにより増幅した。次いで、この重複PCRフラグメントをpEE13のXbaI-EcoRI部位にクローニングした。単一ベクターの構築pEE6hHBCRCVLR45N-h8B5VHをBglII-SalI部位で消化し、3.3kbフラグメントを精製し、pEE13hHBCRCVL45N-h8B5VHのBamHI-SalI部位に挿入した。BglIIとBamHIは適合する付着末端を共通に持つ。DARTの配列、同DARTの構築に用いたプライマーを以下に示す。hHBCRCVL.R45N-h8B5VH-LGGCヌクレオチド配列配列番号257:hHBCRCVL.R45N-h8B5VH-LGGCアミノ酸配列配列番号258:H8B5VL-hHBCRCVHM48I-LGGCヌクレオチド配列配列番号259:H8B5VL-HBCRCVHM48I-LGGCアミノ酸配列配列番号260:Hu3G8VL1-G3SG4-Hu2B6VH4-LGGC発現プラスミドをHu2B6VL5-G3SG4-Hu3G8VH5-LGGCとともにHEK-293細胞に同時トランスフェクトし、CD32およびCD79を認識するHu2B64.5-Hu3G85.1生物分子特異的ダイアボディを作出した。同時に、Hu2B6VL5-G3SG4-Hu2B6VH4-LGGCおよびHu3G8VL1-G3SG4-Hu3G8VH5-LGGCを個々にHEK-293細胞にトランスフェクトし、Hu2B64.5ダイアボディおよびHu3G85.1ダイアボディを作出した。培養3日後に細胞馴化培地を回収し、結合ELISAにより特性決定を行った。この試験の結果を図36に示す。試験計画:100ng/ウェルの可溶性FcRIIb-G2-Aglyを96ウェルMaxisorpプレートに、炭酸バッファー中、40°Cで一晩コーティングした。プレートをPBS/0.1Tween20で3回洗浄し、次いで、室温で30分間、PBS/0.1Tween20中0.5のBSAでブロッキングした後、ダイアボディを添加した。生物分子特異的なHu2B64.5-Hu3G85.1ダイアボディ、Hu2B64.5ダイアボディ、およびhu3G85.1ダイアボディの細胞馴化培地の、25ng/ウェルで始まる2倍希釈系列を各ウェルに添加した。このプレートを室温で1時間インキュベートした。PBS/0.1Tween20で3回洗浄した後、10ng/ウェルのFcRIIIa-G2-ビオチンをプレートに添加した。このプレートを室温で1時間インキュベートした。PBS/0.1Tween20で3回洗浄した後、50μlのHRPコンジュゲートストレプトアビジンAmershamPharmaciaBiotech1:5000希釈液を検出に用いた。室温で45分間インキュベートした後、このプレートをPBS/0.1Tween20で3回洗浄し、TMB基質を用いて発色させた。10分間インキュベートした後、1H2SO4により反応を停止させた。SOFTmaxプログラムによりOD450nmを読み取った。この読み取り結果を、GraphPadPrism3.03ソフトウェアを用いてプロットした。6.13IgDARTダイアボディの構築CD32およびB細胞受容体複合体BCRCと結合することができる可変領域を含むIgDARTダイアボディを構築した。第1のダイアボディは、分子のVH配列とFc配列の間にLGGCGGGS配列番号267リンカーを用いた。第2のダイアボディは、配列LEIK配列番号268を有するLEIKリンカーまたは配列TVSS配列番号269を有するTVSSリンカーのいずれかを用いた。これらのダイアボディの鎖の配列およびコードポリヌクレオチドを以下に示す。H8B5VL-hBCRCVHM48I、M62K_LGGCG3S_hκ配列番号270:H8B5VL配列は、108~115位に位置するリンカーGGGSGGGG配列番号10によってhBCRCVH配列に融合されている。hBCRCVH配列は、229~236位に位置するリンカーLGGCGGGS配列番号267によってFc配列に融合されている双方とも上記に下線で示す。H8B5VL-hBCRCVHM48I,M62K_LGGCG3S_hκ配列をコードするポリヌクレオチドは下記の通りである。配列番号271:ここで、リンカー:GGGSGGGG配列番号10およびLGGCGGGS配列番号267をコードする配列は、それぞれ322~345位および685~708に位置している双方とも上記に下線で示す。HBCRCVLR45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hG1配列番号272:hBCRCVL配列は、113~120に位置するリンカーGGGSGGGG配列番号10によってH8B5VH配列に融合されている。H8B5VH配列は、237~244に位置するリンカーLGGCGGGS配列番号267によってFc配列に融合されている双方とも上記に下線で示す。HBCRCVLR45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hG1配列をコードするポリヌクレオチドは下記の通りである。配列番号273:ここで、リンカー:GGGSGGGG配列番号10およびLGGCGGGS配列番号267をコードする配列は、それぞれ337~360位および709~732位に位置している双方とも上記に下線で示す。H8B5VL-HBCRCVHM48I,M62K_-4LEIK_hκ配列番号274:H8B5VL配列は、108~115位に位置するリンカーGGGSGGGG配列番号10によってHBCRCVH配列に融合されている。HBCRCVH配列は、225~228位に位置するリンカーLEIK配列番号268によってFc配列に融合されている双方とも上記に下線で示す。H8B5VL-HBCRCVHM48I,M62K_-4LEIK_hκ配列をコードするポリヌクレオチドは下記の通りである。配列番号275:ここで、リンカー:GGGSGGGG配列番号10およびLEIK配列番号268をコードする配列は、それぞれ322~345位および673~684位に位置している双方とも上記に下線で示す。HBCRCVLR45N-h8B5VH_-4TVSS-hG1=HBCRCVLR45N-h8B5VH_-hG1配列番号276:HBCRCVL配列は、113~120位に位置するリンカーGGGSGGGG配列番号10によってh8B5VH配列に融合されている。h8B5VH配列は、233~236位に位置するリンカーTVSS配列番号269によってFc配列に融合されている双方とも上記に下線で示す。HBCRCVLR45N-h8B5VH_-4TVSS-hG1をコードするポリヌクレオチドは下記の通りである。配列番号277:ここで、リンカー:GGGSGGGG配列番号10およびTVSS配列番号269をコードする配列は、それぞれ337~360位および697~708位に位置している双方とも上記に下線で示す。6.14リンカーの至適化上述のように、本発明のIgDARTダイアボディは、その分子のVH配列とFc配列の間にリンカーを含むことが好ましい。収量および活性を最大にするためにリンカーを至適化する実験を行った。以下のリンカーを使用した。種々の組合せのリンカーを有するIgDARTダイアボディのセットを作製するために、上記のリンカーをプラスミドに導入した。作製されたIgDARTの凝集特性を調べた。予期しないことに、データは、901A/901B;903A/903B;および908A/908Bに用いられたものなどのリンカーを有する構築物が、910A/911Bなどのリンカーを有する構築物よりも劇的に優れた結果オリゴマー化が少なく、かつ/またはフラグメントの生成が少ないをもたらすことを示した。6.15Eコイル/KコイルDART以上のことから分かるように、二重特異性DARTの個々のポリペプチドは2種のホモ二量体と1種のヘテロ二量体を形成することができる。本発明の一実施形態では、荷電ポリペプチドを一方、またはより好ましくは双方のDARTポリペプチドのC末端に付加することができる。二重特異性DARTの個々のポリペプチドに反対の電荷の荷電ポリペプチドを選択することにより、このような荷電ポリペプチドを含むことは、ヘテロ二量体の形成に有利であり、ホモ二量体の形成を少なくする。好ましくは、正電荷ポリペプチドは実質的含量のアルギニン、グルタミン、ヒスチジンおよび/またはリシンまたはこのようなアミノ酸の混合物を含有し、負電荷ポリペプチドは実質的含量のアスパラギン酸またはグルタミン酸またはこのようなアミノ酸の混合物を含有する。実質的含量のリシンを含有する正電荷ポリペプチドおよび実質的含量のグルタミン酸を含有する負電荷ポリペプチドが特に好ましい。このような反対の電荷を有するポリペプチド間の静電気引力を最大とするためには、自発的にらせんコンフォメーションをとり得るポリペプチドを使用することが好ましい。よって、好ましい実施形態では、正電荷を有するEコイルを二重特異性DARTを形成するために用いる一方のポリペプチドに付加し、負電荷を有するKコイルを該DARTのもう一方のポリペプチドに付加する図37。特に好ましいEコイルは配列:EVAALEK4:を有する。特に好ましいKコイルは配列:KVAALKE4:を有する。このようなEコイルを有する好ましいDARTポリペプチドは、一般配列:[VLドメイン][GGGSGGGG][VHドメイン][EVAALEK4]GGGNSを有し、ここで、VLはDARTの軽鎖可変Igドメインであり、GGGSGGGGは配列番号10であり、VHはDARTの重鎖可変Igドメインであり、EVAALEK4は配列番号299であり、GGGNSは配列番号301である。このようなKコイルを有する好ましいDARTポリペプチドは、一般配列:[VLドメイン][GGGSGGGG][VHドメイン][KVAALKE4]GGGNSを有し、ここで、VLはDARTの軽鎖可変Igドメインであり、GGGSGGGGは配列番号10であり、VHはDARTの重鎖可変Igドメインであり、KVAALKE4は配列番号300であり、GGGNSは配列番号301である。6.16Eコイル/KコイルFC含有DARTさらなる実施形態では、Fc領域はEコイルまたはKコイルDARTのEコイルおよび/またはKコイルに連結することができる。さらに、Fc含有DARTのFc領域とDARTVHドメインがよく分離されずに配置されていると、このようなドメインとそれらの結合リガンドの間の相互作用がなくなるか、そうでなければDARTの集合を妨害するような場合には、Fc含有DARTのFc領域とDARTVHドメインとの間を離すことが望ましい。任意のアミノ酸配列のセパレーターを用いてもよいが、Fcドメインを最大限延長させて可変ドメインから突き出るようにαヘリックスコイルを形成するセパレーターを用いるのが好ましい図37。上記の、反対の電荷を有するコイル状のポリペプチドはヘテロ二量体の形成を促進する付加的機能も持つことから、このような分子は特に好ましいセパレーターである。このようなコイルを含むFc-DART分子は、血清半減期の向上およびエフェクター機能の動員を含む、Fc-DARTの場合と同様の利益を提供する。上記のEコイルおよびKコイルポリペプチドはこの目的で特に好ましい。よって、好ましい実施形態では、EコイルFc含有DARTは、一般配列:D234Kabatのナンバリングで始まる[VLドメイン][GGGSGGGG][VHドメイン][EVAALEK4]GGGFcドメインを有し、ここで、VLはDARTの軽鎖可変Igドメインであり、GGGSGGGGは配列番号10であり、VHはDARTの重鎖可変Igドメインであり、EVAALEK4は配列番号299である。同様に、好ましい実施形態では、KコイルFc含有DARTは、一般配列:D234Kabatのナンバリングで始まる[VLドメイン][GGGSGGGG][VHドメイン][KVAALKE4]GGGFcドメインを有し、ここで、VLはDARTの軽鎖可変Igドメインであり、GGGSGGGGは配列番号10であり、VHはDARTの重鎖可変Igドメインであり、KVAALKE4は配列番号300である。上記で示したように、コイル含有DART分子またはコイル含有Fc含有DART分子はこのようなコイルセパレーターを1個だけ含んでもよいし、またはこのようなセパレーターを2個以上含んでもよい例えば、2つのセパレーター、好ましくは反対の電荷のもの、そのうち1つはDARTポリペプチドの各VHドメインに連結されている。Fc領域をこのようなセパレーター分子に連結することで、鎖の交換によりFc-DART分子の二価型、四価型などの作製能が高まる図39。図39に示されるように、FcドメインがDARTVHドメインの一方に連結されるか双方に連結されるかによって、単量体または二量体を形成するFc-DART分子を作出することができる。6.17Eコイル/KコイルFC含有DARTの機能活性EコイルFc-DART種および/またはKコイルFc-DART種を、1CD79bBCR複合体反応性抗体CB3の軽鎖可変領域および重鎖可変領域と、2CD32B反応性抗体2B6の低親和性変異体YA変異体と呼称の軽鎖可変領域および重鎖可変領域とを有する二重特異性DART分子から作出した。この抗体の軽鎖可変領域は、突然変異N50YおよびV51Aを含有することで抗体2B6の軽鎖可変領域とは異なる。よって、抗体YA2B6は以下の軽鎖可変領域配列を有する。この抗体の重鎖可変領域の配列は以下の通りである。この低親和性抗体は、CD79bを発現する細胞B細胞上のCD32Bとシスで優先的に結合することから選択された。従って、この構成は、他のCD32B発現細胞単球、内皮細胞、肝臓との相互作用ならびに望ましくないトランス相互作用をなくすことができる。このようなh2B6YAhCB3DARTのEコイル誘導体および/またはKコイル誘導体ならびにEコイルFc含有誘導体および/またはKコイルFc含有誘導体を作出した。サイズ排除クロマトグラフィーを用いておよそのサイズと産生された分子のヘテロ性を分析した。図40に示されるように、二量体は、Kコイルドメインに連結されるとともに、Eコイルドメインに連結された単一の連結Fc領域を有するEコイル/KコイルDARTとも連結された、単一の連結Fc領域を有するEコイル/KコイルDARTから形成された。望ましい単量体分子ならびに二量体分子が、Fc領域が同じDART分子のEコイルとKコイルの双方に連結された調製物から回収されたなお、この単量体は形成された主要産物であった。図41に、作出された二量体分子の考えられ得る構造を示す。これらのサイズ排除クロマトグラフィー画分を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてさらに分析し、作出された分子の構造をさらに解析した図42。Eコイル/KコイルDART誘導体Fc領域不含は、それぞれおよそ28kDの2つの主要バンドKFc含有ポリペプチドとやや短いEFc含有ポリペプチドに相当と、およそ49kDの主要でないバンドEコイル/KコイルDARTに相当として移動した。サイズ排除クロマトグラフィーから得られたEコイル/KコイルFc含有DART誘導体EFc/KまたはE/KFcの単量体画分は、DARTがKFc含有DARTより大きな分子量のバンドであるかEFc含有DARTより小さな分子量のバンドであるかに応じておよそ28kDより大きい分子量か小さい分子量のいずれか一方のみを示した。物質は主としておよそ49kDに移動したEコイル/KコイルDARTに相当。著しく高い分子量のバンドも見られた。作出された分子の特性決定を行うために二重特異性結合ELISAを行った。CD79をELISAプレートに入れた。次いで、このプレートにDARTを結合させた。sCD32B-ビオチンを用いてDART結合を検出した後、ストレプトアビジン-HRPとともにインキュベートした。図43に示されるように、Eコイル/KコイルFc含有h2B6YAhCB3DART誘導体EFc/KまたはE/KFcは、h2B6YAhCB3DART誘導体またはEFc/KFch2B6YAhCB3DART誘導体と比較して結合の有意な増強を示した。CD79bと結合した抗体の架橋はB細胞の活性化をもたらすCrossLinkingOfAntigenReceptorViaIgΒCanInduceBothPositiveAndNegativeSignalsInCD40ActivatedHumanBCellsClinExpImmunol110509515。h2B6YAhCB3DART分子はCD79bおよびCD32B阻害受容体の双方に結合することができるので、それらはCD79b結合部位にCD32Bを動員し、それによってB細胞の増殖を遮断することができる。この能力を証明するために、DARTSを、結合した抗CD79b抗体を架橋することができる抗体に曝したB細胞とともにインキュベートした。この実験の結果を図44に示す。結果は、CD79bまたはCD32B単独に対する抗体それぞれCh2B6N297QおよびChCB3.1N297QがB細胞の増殖を阻害できなかったことを示す。EFc/KFch2B6YA誘導体×hCB3DART誘導体は、h2B6YA×hCB3DART自体およびh2B6YA×hCB3VF対照と同様に、B細胞の増殖の阻害に実質的により有効であった。単一の連結Fc領域のみを有するEコイル/KコイルDARTE/KFch2B6YA×hCB3DART誘導体およびEFc/Kh2B6YA×hCB3DART誘導体は、B細胞の増殖に対して最大の阻害を示すことが分かった。6.18invivoにおいて血清半減期を変更するためのDARTの改変上述のように、二重特異性単鎖分子例えば、およそ55kDaの分子量を有するものなどの組換え抗体小分子は、循環から急速に排除される。マウスにおけるDART分子のinvivo薬物動態研究によれば、およそ2時間といった短い終末半減期が予想された。急性炎症病態の治療における場合などのいくつかの実施形態では、このような短い半減期が望まれるが、癌および慢性疾患および病態の治療の場合などの他の実施形態では、本発明のDART分子が長い半減期を示すことが好ましい。このような用途のDART分子のinvivo薬物動態特性を改善するために、DART分子を、DART分子の1以上の末端に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含むように改変することができる。このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、DART分子のC末端に導入するのが最も好ましい。この目的で特に好ましい血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、連鎖球菌Gタンパク質由来のアルブミン結合ドメインABDである。連鎖球菌G148株のGタンパク質のアルブミン結合ドメイン3ABD3が特に好ましい。連鎖球菌G148株のGタンパク質のアルブミン結合ドメイン3ABD3は、安定な三重らせん束を形成している46個のアミノ酸残基からなり、広いアルブミン結合特異性を有するStructureSpecificityAndModeOfInteractionForBacterialAlbuminBindingModulesJBiolChem27781148120。アルブミンは血漿中で最も豊富なタンパク質であり、ヒトでの半減期は19日である。アルブミンは、他のタンパク質との非共有結合的結合を許容するいくつかの小分子結合部位を持っており、それにより血清半減期を延長する。血清タンパク質のポリペプチド部分の、DART半減期延長能を証明するために、連鎖球菌Gタンパク質のABD3ドメインを組換え二重特異性DARThCD16抗原およびhCD32B抗原と免疫反応性があると融合させて組換え抗体分子hCD16-hCD32BABD-DARTを作出した図45。このABD-DARTは、両抗原ならびにヒト血清アルブミンHSAとの特異的結合を示し、invitroにおいてエフェクター細胞を再標的化することができた。対照DARTと比較して、このABD-DARTは、マウスにおいて血清半減期の著しい延長を示した。このアプローチは、DARTなどの潜在的に重要な医薬の半減期を90分超、2時間超、5時間超、10時間超、20時間超、最も好ましくは、30時間超に延長するための実行可能な経路として使用することができる。材料および方法:ABDDARTの設計および構築:hCD16-hCD32BABDDARTを、第1鎖としてhCD16VL-G3SG4-hCD32BVH-Kコイル[KVAALKE4]ここで、CD16VLは3G8CD16VLを表し、G3SG4は配列番号10を表し、hCD32BVHは2B6CD32BVHを表し、KVAALKE4は配列番号300を表す;および第2鎖としてhCD32BVL-G3SG4-hCD16VH-GGCGGG-Eコイル[EVAALEK4]-GGGNS-ABDここで、CD32BVLはCD32BVLを表し、G3SG4は配列番号10を表し、hCD16VHはCD16VHであり、GGCGGGは配列番号267の残基2~7であり、Eコイル[EVAALEK4]は配列番号299であり、GGGNSは配列番号301を表し、ABDは、であるを用いて作製した。よって、第1鎖h3G8VL1-G3SG4-h2B6VH4-Kコイル-GGGNSの配列は下記の通りである。第1鎖h3G8VL1-G3SG4-h2B6VH4-Kコイル-GGGNSをコードする好ましいポリヌクレオチドは下記の通りである。よって、第2鎖h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-Eコイル-GGGNS-ABDの配列は下記の通りである。第2鎖h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-Eコイル-GGGNS-ABDをコードする好ましいポリヌクレオチドは下記の通りである。VLおよびVHの各セグメントを、鋳型としてhCD16-hCD32BDARTを用いてPCRにより増幅した。第2鎖については、EコイルとABDを含有するヌクレオチド配列をプライマー二量体により形成した後、制限消化とライゲーションを用いてhCD16のVH領域のC末端にサブクローニングした。両鎖をpCIneoベクターPromegainc.のNheI-NotII部位にクローニングした。次いで、NgoMIV-NheIにおいて消化された各第1鎖とBstBI-PmeIにおいて消化された第2鎖発現カセットとを担持する個々のプラスミドを、CHO細胞へのトランスフェクションのための単一のプラスミドにクローニングし、安定細胞株を作出した。タンパク質の発現および精製:安定なトランスフェクションのために、CHO-S細胞をhCD16-hCD32BEKABD-DARTプラスミドDNAでトランスフェクトした。ABD-DARTタンパク質を、CNBr活性化セファロース4Bに結合させた可溶型FcRIIB抗原を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。この濃縮されたタンパク質を、スーパーデックス200HR10/30を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。ELISAによる結合アッセイ:CD-16に基づく捕捉のために、プレートを4°Cで一晩、2μg/mL濃度にてFcRIIB抗原でコーティングした。次いで、プレートをPBS-T中0.5のペプトンでブロッキングした。精製されたタンパク質を希釈して2倍希釈系列とし、室温で1時間プレートに結合させた。最後に、ビオチン化CD32B50ng/mL、次いでHRPコンジュゲートストレプトアビジン1/1000、BD-Pharmを用いて検出を行った。HRP活性をTMBの添加により測定し、プレートをプレートリーダーにてOD450nmで読み取った。ヒト血清アルブミンHSAの捕捉のために、プレートを4°Cで一晩、2μg/mL濃度にてHSAでコーティングした。その後、同じ手順に従ってデュアルアフィニティーELISAを行った。末梢血単核細胞媒介ADCCアッセイ:細胞傷害性をLDH放出アッセイにより測定した。末梢血単核細胞PBMCをヒト全血LonzaWalkersville,Inc、メリーランド州ゲーサーズバーグから、製造者の説明書に従ってフィコール-ハイパークAmershamBiosciences、ニュージャージー州ピスカタウェイ密度勾配遠心分離によって精製した。2×104個の標的細胞を丸底96ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種する。種々のDARTまたは抗体分子の1~4連続希釈液をプレート中の細胞に加える。その後、同じウェルに6×105個のPBMCを加える。次いで、プレートを37°C、5CO2インキュベーターにて一晩インキュベートした。次に、このプレートを1200rpmで5分間回転させ、50μlの上清を平底ELISAプレートに移す。50μlのLDH基質溶液Promegaを各ウェルに加え、プレートを暗所、室温で30分間インキュベートする。その後、50μlの停止溶液を各ウェルに加え、1時間以内にプレートを490nmで読み取る。各ウェルの細胞傷害性パーセントは、O.D.読み取りの生データを用い、サンプル-AICC/標的最大値-標的自発値×100式中、AICCは抗体非依存的細胞傷害性であるとして算出する。用量応答曲線はPrismソフトウエアを用いて作製する。薬物動態試験:C57Bl/6マウスに、hCD16-hCD32BDART5mg/kgの単回静注を施した。マウス血清を投与前、2分、30分、1時間、3時間、6時間、24時間および72時間に採取した。血清中のhCD16-hCD32BDART濃度を定量した。hCD16-hCD32BDARTの薬物動態計算は薬物動態ソフトウエアパッケージWinNonlinProfessional5.1PharsightCorporation、USAにより行った。パラメーターをノンコンパートメント分析NCAにより決定した。ノンコンパートメント分析は、薬物の静注を要求するモデルモデル201に基づいた。パラメーターの計算には線形台形法を用いた。結果ELISAによる発現および結合試験:hCD16-hCD32BABD-DARTは、哺乳動物CHO-S細胞において6.5mg/lの濃度で効率的に発現された。精製されたABD-DARTタンパク質の、個々の抗原に対する結合活性をELISAにより評価した。結果は、hCD16-hCD32BABD-DARTが両抗原、すなわちCD16ならびにCD32Bと同時に結合することを示した図46A。結合特性は対照hCD16-hCD32BDARTタンパク質結合と一致している。精製されたhCD16-hCD32BABD-DARTの、ヒト血清アルブミンHSAに対する親和性もELISAにより示された図46B。結果は、HSAに対するABD融合DARTの強い結合が示されたが、対照hCD16-hCD32BDARTでは結合は見られなかった。ABD-DART分子がCD32B、CD16AおよびHSAに同時に結合可能であったことを証明するために、HSAを固定化した表面にABD-DARTを注入した後に、200nMのCD32Bおよび200nMのCD16AF158の連続的注入を行った図46Cの実線。対照実験図46Cの破線では、抗原をバッファーに置き換えた。これらの結果は、ABD-DART分子がCD32B、CD16AおよびHSAに同時に結合可能であったことを示す。hCD16-hCD32BABD-DARTおよびそのABD融合物誘導体は、可溶性CD32BsCD32Bおよび可溶性CD16A158FsCD16Aと同等の結合性を示すことが分かったが、これらのDARTはDARTABD融合物の、ヒト血清アルブミンHSAとの結合能によって容易に識別することができた図46D~46I。DARTをはCD16Aコーティングプレート上でインキュベートし、3mg/mlのHSAの存在下または不在下でビオチン化sCD32Bを用いて結合を検出したブロキングはPBS-T中0.5のペプトンを用いて行った。DARTABD融合物は、親DARTの二重特異的結合を保持し、sCD16AおよびCD32Bとの結合を示し、この結合はヒト血清アルブミンの存在により影響を受けなかったことが分かった図46J。ABD-DARTのinvitro細胞傷害性:この二重特異性ABD-DARTの、2つの抗原1つはエフェクター細胞上、もう1つは標的細胞上との同時結合を証明するために、再指向細胞死アッセイを行った。ヒトPBMCをエフェクター細胞として用いたところ、hCD16-hCD32BABD-DARTは、CD32B陽性B細胞株Daudiに対して強力な用量依存的細胞傷害性を誘導した図47A。この結果は、ABD-DARTの効力が親DARTの効力と同等であることを示した。CD16×CD32BDARTはCD16B発現エフェクター細胞と結合することができ、それにより、そのような細胞を動員して、CD32Bを発現する細胞を再指向細胞死を介して死滅させることができる。従って、CD16×CD32BDARTは、Raji細胞に対して強力な致死性を示すことが分かった図47B。ABD-DARTの薬物動態特性:hCD16-hCD32BABD-DARTの薬物動態特性は、C57Bl/6マウスへの単回用量のi.v.注射の後に血清サンプルのELISAにより分析した図48。両タンパク質DARTおよびABD-DARTは、循環からの二相排出を示した。ABD-DARTのPK試験は循環時間の延長を示し、通常のDARTの1.2時間と比較して35.1時間という終末半減期の延長を示した図48、表22。薬物動態特性の改善は、曲線下面積AUCの比較によっても証明された。構築物ABD-DARTについては、AUCはABDの融合後にほぼ30倍に増大した表22。ABD-DARTのinvivo生物活性:hCD16-hCD32BABD-DARTがinvivoにおいて生物活性を保持していたことを証明するために、単回用量のABD-DARTまたはその親DARTをTgmCD16-/-hCD16A32Bマウスに投与し、B細胞、T細胞およびPM細胞の濃度をモニタリングした。これらの結果は、DARTがB細胞の濃度を抑えることができることを示し図49A、標的化された再指向B細胞死が、DARTがマウス循環から除去されるまでにinvivoにおいて達成されたことを示唆すると解釈される。T細胞の濃度図49BおよびPM細胞の濃度図49CはDARTによって抑制されなかったが、このことによりそれらの特異性が確認される。要するに、アルブミン結合ドメインが融合したDARTタンパク質ABD-DARTと呼称の設計および産生は成功を収めた。hCD16-hCD32BABD-DARTは、認識されるその2つの抗原決定基CD16およびCD32Bに対する特異性を保持していることが分かった。ABD-DARTは、ヒト血清アルブミンと高い親和性を示すことが分かった。ABDを融合しても、生物活性すなわち、再指向腫瘍細胞死に関するDARTの効力は低下しなかった。ABDにDART分子を融合すると、そのinvivo半減期が実質的に改善し延長し、大きさを劇的に大きくすることなくこの目標を達成した。小型に保持できるということは、DARTの腫瘍組織への拡散能を助けることから、重要かつ有利なことである。6.19Her2/B細胞受容体DARTHer2/neuおよびT細胞受容体TCRと結合することができる可変領域を含んだIgDARTダイアボディを構築した。上述のように、TCRはCD4T細胞またはCD8T細胞によって天然に発現され、このような細胞に、抗原提示細胞のクラスIまたはクラスIIMHCタンパク質により結合および提示される抗原ペプチドを認識させる。TCRによるpMHCペプチド-MHC複合体の認識は、サイトカインの産生および抗原提示細胞の溶解をもたらす細胞性免疫応答の伝達を開始させる。ErbBファミリーの重要な一員であるHER2/neuは、数種のヒト癌腫および哺乳動物の発生におけるその役割のために鋭意検討されてきたBiochimetBiophysActa1198165184およびDougallらOncogene921092123LeeらNature378394398。ヒトHER2/neu遺伝子およびHER2/neuタンパク質は、SembaらProcNatlAcadSci8264976501およびYamamotoらNature319230234に記載されており、その配列はGenBankで受託番号X03363として入手可能である。HER2/neuは4つのドメイン、すなわち、リガンドが結合する細胞外ドメイン;親油性トランスメンブランドメイン;保存されている細胞内チロシンキナーゼドメイン;およびリン酸化され得る数個のチロシン残基を担持するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含むProcNatlAcadSci9017461750。HER2/neu細胞外ECDドメインの配列は、FranklinらCancerCell5317328に記載され、ProteinDataBankRecord1S782004で入手可能である。HER2/neuは増殖因子受容体として機能し、多くの場合、乳癌、結腸癌、膀胱細胞癌、卵巣癌および肺癌などの腫瘍によって発現される。HER2/neuは、ヒト乳癌および卵巣癌の25~30で過剰発現され、これらの患者における急速進行型の臨床進行および予後の悪さに関連しているScience235177182SlamonらScience244707712。HER2/neuの過剰発現は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓および膀胱の癌腫を含む他の癌腫においても見出されている例えば、KingらScience229974McCannらCancer658892YonemuraらCancerResearch511034参照。HER-1またはHER2/neuを標的とするいくつかのモノクローナル抗体および小分子チロシンキナーゼ阻害剤が開発されており、これには特に、HER2/neuのシステインリッチIIドメインこのタンパク質のトランスメンブラン領域に近接している内の細胞外エピトープアミノ酸529~627を認識するマウスモノクローナル抗体のヒト化変異体4D5ハーセプチン登録商標、Genentech,Inc.として知られるが含まれる。研究によれば、HER2/neuを過剰発現する乳癌細胞において、HER2/neuに特異的な抗体を化学療法薬例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、タキソールと組み合わせて処置すると、化学療法の単独処置よりも高い細胞傷害性応答を誘発することが示されたCancerRes5145754580ArteagaらCancer5437583765PietrasらOncogene918291838。HER2/neu抗体が化学療法薬に対する応答を増強する1つの可能性のある機構は、HER2/neuタンパク質発現の調節を介するものか、またはDNA修復の妨害によるものであるProcNatlAcadSci8886918695BacusらCellGrowthDiff3401411BacusらCancerRes5352515261KlapperらOncogene1420992109KlapperらCancerRes6033843388ArteagaらJClinicalOncology1932s40s。ある特定の場合では、ハーセプチン登録商標などの抗HER2/neu抗体は患者に治療上の利益を与えるが、大多数の乳癌その他の患者はこのような抗体に対して不応性を示す。これらの応答は、一部には、患者の癌細胞によるHER2/neuの過剰発現の程度の違いを反映する。Her2/neuおよびT細胞受容体TCRと結合し得る可変領域を含む結果として、このDARTはHER2発現細胞と結合し、それによりこのような細胞に、T細胞受容体と結合し得るドメインを付加する能力を有する。このようなT細胞がこのドメインと結合すると、それらは活性化して、HER2発現細胞の死滅をもたらす免疫応答を誘発する。このようなDARTのアミノ酸配列および核酸配列を以下に示すが、VL配列およびVH配列はプレーンテキストで示し、VL-VHリンカーは下線で示し、C末端ヘテロ二量体形成モチーフをコードする配列配列番号313:GFNRGECまたは配列番号314:GVEPKSCを太字斜体で示す。TCRVL-HER2VHアミノ酸配列配列番号315TCRVL-HER2VHコード核酸配列配列番号316HER2VL-TCRVHアミノ酸配列配列番号317HER2VL-TCRVHコード核酸配列配列番号318好ましい実施形態では、このような構築物は、ヘテロ二量体すなわち、TCRVL-HER2VH×HER2VL-TCRVH二量体の形成を促進するEコイルドメインまたはKコイルドメインを含むように改変される。このようなDARTのアミノ酸配列および核酸配列を以下に示すが、VL配列およびVH配列はプレーンテキストで示し、VL-VHリンカーは下線で示し、二量体形成のためのCys含有リンカーGGCGGG;配列番号267の残基2~7をコードする配列は斜体で示す。EコイルまたはKコイルヘテロ二量体形成ドメインは二重下線で示す好ましいEコイル配列はEVAALEK;配列番号299の4リピートヘプタマーであり、好ましいKコイル配列はKVAALKE配列番号300の4リピートヘプタマーである。EコイルまたはKコイルに続く配列には割り当てられた機能はない。TCRVL-HER2VH-Eコイルアミノ酸配列配列番号319TCRVL-HER2VH-Eコイルコード核酸配列配列番号320HER2VL-TCRVH-Kコイルアミノ酸配列配列番号321HER2VL-TCRVH-Kコイルコード核酸配列配列番号322Her2結合ドメインとT細胞受容体TCR結合ドメインを有するDART分子の、HER2発現レベルが低いと従前に特定されている従って、抗Her2/neu抗体ハーセプチン登録商標による処置に不応である多発性乳癌、結腸癌および膀胱癌細胞株における細胞傷害性の媒介能を試験した。供試乳癌細胞株はZR75-1HER22図50A、MCF-7HER21図50BおよびMDA-MB468HER2-ve図50Cである。供試した非乳癌細胞株はHT-29結腸癌細胞株図50DおよびSW780膀胱癌細胞株図50Eである。図49A~Eに示されるように、このようなDART分子は、腫瘍由来細胞株の細胞傷害性を媒介する上で、同等の細胞傷害性を達成するのに要する濃度という点でも、見られる細胞傷害性の最大レベルという点でも、ハーセプチン登録商標よりも実質的に有効であった。6.20EコイルおよびKコイルを介したDARTとABDのinvitro融合上述のように、本発明のDART分子は、NKG2D受容体と、フルオレセインコンジュゲート結合パートナーと相互作用する分子とを同時に連結することができる万能アダプターとして働き得るように、ハプテンであるフルオレセインと親和性のあるNKG2D受容体と二重特異的結合を示すように設計することができる。さらにABDの使用を例示するために、下記のポリペプチド鎖を用いてDARTを構築した。1KYK2VL-4420VH-GFNRGEC配列番号313-Eコイル:このポリペプチドは、上記のKYK2.0抗体GenerationAffinityMaturationAndCharacterizationOfAHumanAntiHumanNKG2DMonoclonalAntibodyWithDualAntagonisticAndAgonisticActivityJMolBiol38411431156およびPCTUS0954911のVLドメインと上記の抗フルオレセインMAb4420のVHドメインを用いて構築した。24420VL-KYK2VH-GVEPKSC配列番号314:このポリペプチドは、上記の抗フルオレセインMAb4420のVLドメインとKYK2.0抗体のVHドメインを用いて構築した。Eコイルは、EVAALEK;配列番号299の4リピートヘプタマーのEコイルアミノ酸配列を表す。KYK2VL-4420VH-GFNRGEC配列番号313-Eコイルおよび4420VL-KYK2VH-GVEPKSC配列番号314ポリペプチドをCHO細胞にトランスフェクトし、KYK24420VFEコイルと呼称するDARTを発現させた。これらの分子の精製を図51Aおよび51Bに示す。KYK24420VFEコイルDARTの親和性は、DARTと捕捉されたFITC抗原との結合をNKG2DFc012210を用いて検出することにより判定した。この実験の結果は、DARTが両分子に結合可能であったことを示す図52。さらに、Kコイル-GGGNS配列番号301-ABD融合物を作製したここで、Kコイルは、KVAALKE配列番号300の4リピートヘプタマーのKコイルアミノ酸配列を表す。図53はプラスミドpPAL7の制限地図を示し、精製を容易にするためのPROFINITYEXACT商標Bio-Rad、カルフォルニア州ハーキュリーズタグを用いた、Kコイル-ABD融合物を発現するプラスミドpPAL7KコイルABDの構築を表す。pPAL7KコイルABDベクターを大腸菌BL21DE3細胞に形質転換した。タグを有するKコイルABDの発現は、2mMのIPTGを4時間添加することによって誘導した。タンパク質の発現は、SDS-PAGEまたはウエスタンブロットのいずれかによって確認した。簡単に述べれば、このPROFINITYEXACT商標融合タグ系は、細胞の溶解を媒介すること、放出されたタンパク質を固定化スブチリシンプロテアーゼアフィニティーカラムに結合させること、このカラムを洗浄して結合していないタンパク質を溶出させること、フッ化物含有溶出バッファーを適用して、サブチリシンに融合タンパク質の切断認識配列の後でタグを迅速かつ正確に切断するように促し、このような切断の後にタグを含まないタンパク質をカラムから洗浄すること、および溶出されたタンパク質をPBS中で透析することを含む。図54は、PROFINITYEXACT商標精製樹脂小規模、10ml培養からにより精製されたKコイルABDタンパク質のウエスタンブロット分析を示す。PROFINITYEXACT商標精製樹脂から得られたKコイル-AFDタンパク質を、SDS-PAGEを用いてさらに精製した図55。250mlの大腸菌培養物から6.523mgの精製タンパク質が得られた表23。KYK24420VFEコイルDARTおよびKコイルABDタンパク質を室温で30分間、PBS中でインキュベートし、特性の向上したEコイル-KコイルABDDARTを形成させた。ELISAの結果は、これらの複合体において全てのドメインがそれらの個々のリガンドと結合できることを示す図56A~56C。所望により、KYK24420VFEコイルおよびK-ABD複合体のさらなる精製は、抗EKカラムを用いて達成することができる。この複合体の形成はDARTの特定の結合ドメインに依存しないことから、上記の方法を用いて、他の結合特異性を有するEコイル-KコイルABDDARTを例えば、CD32B例えば、抗体2B6/CD16A例えば、抗体3G8VFEDARTとKコイルABDの複合体を形成させることにより作出することもできる。よって、上記で示したように、本発明の一実施形態では、DARTの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドの双方は、ヘテロ二量体の形成を促進する働きをする付加的配列例えば、KコイルまたはEコイルを含むことができ、場合により、このようなポリペプチドの一方は、血清タンパク質と結合することができる血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含んでもよい例えば、図45。別の実施形態では、DARTの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドの一方、好ましくは一方だけがヘテロ二量体の形成を促すためのこのような付加的配列例えば、KコイルまたはEコイルを含むことができ、DARTは、抗原結合部位を含まないが、ヘテロ二量体形成を促すための相補的配列例えば、DARTの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドがEコイルを含む場合にはKコイル;またはDARTの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドがKコイルを含む場合にはEコイルと所望により血清タンパク質と結合することができる血清結合タンパク質のポリペプチド部分とを有するポリペプチドを含むさらなる例えば、第3のポリペプチドとの複合体を含む。このようなさらなる例えば、第3のポリペプチドのこのような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、このような相補的配列を有するポリペプチドのN末端またはC末端のいずれかに位置することができる。当業者には自明であるように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく多数の改変および変形を行うことができる。本明細書に記載した具体的な実施形態は、単に例として示すものであって、本発明は、添付の特許請求の範囲とともにそのような特許請求の範囲が権利を付与される均等物の全範囲によってのみ限定される。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあるものとする。本明細書に引用される全ての特許および非特許の参照文献は、個々の刊行物または特許または特許出願の全内容があらゆる目的で参照により組み入れられることが具体的かつ個々に示される場合と同程度に、その全内容があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられる。"