"導入目的の内因性遺伝子と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素ALS遺伝子とを含む発現ベクターを用いて宿主トウモロコシに導入する形質転換トウモロコシの製造方法において、以下のa~cのいずれかに記載されたポリヌクレオチドを検出する工程と、a配列番号1の塩基配列を含むポリヌクレオチドb配列番号1の塩基配列において1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドc配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド上記ポリヌクレオチドが存在する個体を形質転換トウモロコシと判定する工程とを含む形質転換トウモロコシの製造方法。上記宿主トウモロコシは、Na65品種以外の品種であることを特徴とする請求項1記載の形質転換トウモロコシの製造方法。上記発現ベクターを宿主トウモロコシに導入する処理の後で、上記ポリヌクレオチドを検出する工程の前に、処理後のトウモロコシ個体を除草剤に接触させ除草剤耐性を有するトウモロコシ個体を選抜する工程を含む請求項1記載の形質転換トウモロコシの製造方法。上記除草剤は、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤から選ばれる少なくとも1種の除草剤であることを特徴とする請求項3記載の形質転換トウモロコシの製造方法。上記ポリヌクレオチドを検出する工程では、上記ポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅を行うことを特徴とする請求項1記載の形質転換トウモロコシの製造方法。導入目的の内因性遺伝子を挿入する部位と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素ALS遺伝子とを含む発現ベクターにおいて、当該変異型アセト乳酸合成酵素ALS遺伝子の3非翻訳領域に以下のa~cのいずれかに記載されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。a配列番号1の塩基配列を含むポリヌクレオチドb配列番号1の塩基配列において1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドc配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド上記内因性遺伝子が組み込まれたことを特徴とする請求項6記載の発現ベクター。請求項6又は7記載の発現ベクターを含む形質転換トウモロコシ。そこで、本発明は、トウモロコシの形質転換に変異型ALS遺伝子を利用する際、比較的簡便な方法により形質転換トウモロコシを選抜できる、形質転換トウモロコシの製造方法、当該製造方法に使用できる発現ベクター、当該発現ベクターを含む形質転換トウモロコシを提供することを目的とする。本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、特定のトウモロコシ自殖品種のターミネーターから3非翻訳領域に存在するMITEMiniatureInvertedrepeatTransposableElement様因子を特定し、これを利用することで変異型ALS遺伝子を含む発現ベクターが組み込まれたことを検出できることに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を包含する。1導入目的の内因性遺伝子と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素ALS遺伝子とを含む発現ベクターを用いて宿主トウモロコシに導入する形質転換トウモロコシの製造方法において、以下のa~cのいずれかに記載されたポリヌクレオチドを検出する工程と、a配列番号1の塩基配列を含むポリヌクレオチドb配列番号1の塩基配列において1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドc配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド上記ポリヌクレオチドが存在する個体を形質転換トウモロコシと判定する工程とを含む形質転換トウモロコシの製造方法。2上記宿主トウモロコシは、Na65品種以外の品種であることを特徴とする1記載の形質転換トウモロコシの製造方法。3上記発現ベクターを宿主トウモロコシに導入する処理の後で、上記ポリヌクレオチドを検出する工程の前に、処理後のトウモロコシ個体を除草剤に接触させ除草剤耐性を有するトウモロコシ個体を選抜する工程を含む1記載の形質転換トウモロコシの製造方法。4上記除草剤は、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤から選ばれる少なくとも1種の除草剤であることを特徴とする3記載の形質転換トウモロコシの製造方法。5上記ポリヌクレオチドを検出する工程では、上記ポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅を行うことを特徴とする1記載の形質転換トウモロコシの製造方法。6導入目的の内因性遺伝子を挿入する部位と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素ALS遺伝子とを含む発現ベクターにおいて、当該変異型アセト乳酸合成酵素ALS遺伝子の3非翻訳領域に以下のa~cのいずれかに記載されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。a配列番号1の塩基配列を含むポリヌクレオチドb配列番号1の塩基配列において1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドc配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド7上記内因性遺伝子が組み込まれたことを特徴とする6記載の発現ベクター。8上記6又は7記載の発現ベクターを含む形質転換トウモロコシ。本発明によれば、変異型ALS遺伝子に含まれる特定の領域を使用することで、変異型ALS遺伝子が導入された形質転換トウモロコシを簡易に判定することができる。本発明を適用することによって、非常に簡便かつ低コストに形質転換トウモロコシを製造することができる。以下、本発明を詳細に説明する。1.マーカー領域本発明では、トウモロコシを宿主植物とした形質転換に際して、形質転換トウモロコシを判別するための新規マーカー領域を提供する。この新規マーカー領域は、以下のa~cのいずれかに記載されたポリヌクレオチドである。a配列番号1の塩基配列を含むポリヌクレオチドb配列番号1の塩基配列において1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドc配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドここで、配列番号1の塩基配列は、トウモロコシ自殖系統Na65のALS2ZmALS2遺伝子の3非翻訳領域でトランスポゾンMITEminiatureinvertedrepeattransposableelement配列配列番号2を含む塩基配列である。すなわち、配列番号1の塩基配列は、トウモロコシ自殖系統Na65のALS2ZmALS2遺伝子の終止コドンに隣接した塩基からMITE配列を含む540塩基からなる。また、上記bにおいて、複数の塩基とは、1~10個の塩基、好ましくは1~5個の塩基を意味する。また、配列番号1の塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加され得る領域としては、特に限定されない。さらに上記cにおいて、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecularCloningALaboratoryManualThirdEditionを参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細に、ストリンジェントな条件としては、ナトリウム濃度が25~500mM、好ましくは25~300mMであり、温度が42~68°C、好ましくは42~65°Cである。より具体的には、5×SSC83mMNaCl、83mMクエン酸ナトリウム、温度42°Cである。従来、ゲノムDNAに2個存在すると考えられるトウモロコシALS遺伝子のターミネーターから3非翻訳領域に至る配列はDDBJ/NCBI/EMBL公開のアクセッション番号BT042814、BT019211、DY398831、AW056264、EC899385、DT947958、DT943695、CF627002、DN215004、DR796514、AW165578、AW054309、DT943694、FM194841、CF044302、AC205154、GP518224、G71374及びI07769により公知である。しかしながら、これら登録された配列情報には、配列番号1の塩基配列は含まれていない。すなわち、ALS2ZmALS2遺伝子の3非翻訳領域に含まれるMITE配列は新規な塩基配列といえる。なお、DDBJ/NCBI/EMBL公開のアクセッション番号BU050334及びBM736838の配列は、トウモロコシALS遺伝子のターミネーターにMITE配列が隣接して結合しているが、MITE配列より更に3非翻訳領域に至る配列については明らかにしておらず、この配列情報を用いてPCR等の手法により遺伝子導入個体を識別することはできない。2.発現ベクター本発明の発現ベクターは、トウモロコシ自殖系統Na65以外のトウモロコシ品種系統に所望の遺伝子を導入する際に使用される。ここで、導入目的の遺伝子は、トウモロコシに内在する所謂、内因性遺伝子を挙げることができる。例えば、内因性遺伝子を過剰発現するように植物に導入した場合、当該内因性遺伝子が導入されたか否かは、内因性遺伝子を含むDNA断片を増幅する方法によっては判別することができない。内因性遺伝子が導入されていなくても、本来的に内在する遺伝子を含むDNA断片が常に増幅されるからである。すなわち、本発明の発現ベクターは、上述したマーカー領域を含む変異型ALS遺伝子と、導入目的の内因性遺伝子と含む。ここで、変異型ALS遺伝子とは、非特許文献1や国際公開WO0244385号公報、国際公開WO03083118号公報に開示されるように、特定のアミノ酸変異を有することで特定の除草剤に対して耐性を有するALSをコードする遺伝子である。本発明において、変異型ALS遺伝子としては、これら従来公知の変異型ALS遺伝子のいずれも使用することができる。ここで、変異型ALS遺伝子とは、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤から選ばれる少なくとも1種の除草剤に対する抵抗性を示す変異型ALSをコードする遺伝子である。マーカー領域を含む変異型ALS遺伝子とは、言い換えると、トウモロコシ自殖系統Na65由来であって、3非翻訳領域のMITE配列を含む野生型ALS遺伝子に対して、特定のアミノ酸置換変異を伴う変異が導入された遺伝子と同義である。また、本発明の発現ベクターに含まれる導入目的の内因性遺伝子は、特に限定されず如何なるタンパク質をコードする遺伝子であっても良い。また、導入目的の内因性遺伝子は、公知のプロモーターと連結したかたちで発現ベクターに組み込まれても良い。かかるプロモーターは、トウモロコシ内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。プロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターCaMV35S、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのPR1a遺伝子プロモーター、トマトのリブロース1,5-二リン酸カルボキシラーゼオキシダーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、アクチン遺伝子プロモーター又はユビキチン遺伝子プロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、トウモロコシ内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。これらマーカー領域を含む変異型ALS遺伝子や導入目的の内因性遺伝子をベクターに挿入するには、まず、変異型ALS遺伝子や内因性遺伝子を含む精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明においては、任意遺伝子を発現させるため、上記発現ベクターに、さらに当該任意遺伝子を挿入することができる。任意の遺伝子を挿入する手法は、ベクターに本発明のDNA断片を挿入する方法と同様である。本発明の発現ベクターは、上述したマーカー領域を含む変異型ALS遺伝子と、導入目的の内因性遺伝子の他に、従来トウモロコシの形質転換に利用されている発現ベクターと同様な構成を有していても良い。従来トウモロコシの形質転換に利用されている発現ベクターとしては、いわゆるアグロバクテリウム法に使用されるバイナリーベクター、パーティクルガン法に使用されているベクターを挙げることができる。マーカー領域を含む変異型ALS遺伝子や導入目的の内因性遺伝子を挿入するベクターとしては、例えばpSTARAクミアイ化学工業株式会社、pBI101Clonetech社などのベクターを使用することができる。3.形質転換体の作製本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを宿主となるトウモロコシに導入することにより得ることができる。ここで、宿主となるトウモロコシとしては、トウモロコシ自殖系統Na65以外のトウモロコシ品種系統である。トウモロコシ自殖系統Na65は、配列番号1の塩基配列に含まれるMITE配列を本来的に有する。したがって、トウモロコシ自殖系統Na65に対しては、本発明の発現ベクターが導入されたか否かを上述したマーカー領域の存在非存在に基づいて判断できない。言い換えると、トウモロコシ自殖系統Na65以外のトウモロコシ品種系統であれば、本発明の発現ベクターが導入されたか否かを上述したマーカー領域の存在非存在に基づいて判断することができる。本発明において形質転換の対象となるトウモロコシは、トウモロコシの植物体全体、植物器官例えば葉、花弁、茎、根、種子等、植物組織例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。宿主となるトウモロコシ自殖系統としては、例えば、Mi29九州沖縄農業研究センター育成のデント型自殖系統、Ho102北海道農業研究センター育成のデント型自殖系統、Pa91アメリカ合衆国で育成されたデント型自殖系統、H99アメリカ合衆国で育成されたデント型自殖系統、A188アメリカ合衆国で育成されたデント型自殖系統等を挙げることができる。上述した本発明の発現ベクターは、通常の形質転換方法、例えば電気穿孔法エレクトロポレーション法、植物ウイルス法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等によって植物中に導入することができる。例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧500~1600V、25~1000μF、20~30msecの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入する。また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置例えばBioRad社のPDS1000He等を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は1000~1800psi程度の圧力、5~6cm程度の距離で行う。また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体から切り出し、植物宿主に接種することによって、目的遺伝子を植物宿主に導入することができる。アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用する方法においては、アグロバクテリウムAgrobacterium属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドDNAの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、目的遺伝子を植物宿主に導入する。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensは、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成し、また、アグロバクテリウムリゾゲネスAgrobacteriumurhizogenesは、植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にTiプラスミド又はRiプラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド上のTDNA領域TransferredDNAと呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。Ti又はRiプラスミド上のTDNA領域中に、植物ゲノム中に組み込みたいDNAを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物宿主に感染する際に目的とするDNAを植物ゲノム中に組込むことができる。なお、形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモンオーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等の投与などにより植物体に再生させることができる。導入目的の内因性遺伝子が宿主トウモロコシに組み込まれたか否かの確認は、PCR法により行うことができる。例えば、得られた形質転換トウモロコシから定法に従ってDNAを調製し、上述したマーカー領域を特異的に増幅するように設計された一対のプライマーを用いてPCRを行う。PCRは、ディネーチャーを94~98°Cで10秒~1分、アニールを50~65°Cで30秒~2分、エロンゲーションを65~75°Cで30秒~2分とするサイクルを、例えば20~40サイクル行う条件とすることができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBRGreen液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出する。これにより、上述したマーカー領域が形質転換トウモロコシに存在することを確認することができ、導入目的の内因性遺伝子が導入されたと判断することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。なお、上述したようにPCR法によりマーカー領域の存在非存在を確認するのに先立って、変異型ALS遺伝子により付与された除草剤抵抗性により形質転換トウモロコシを選抜しても良い。すなわち、上述したように各種方法により形質転換を行った後、得られた個体を除草剤の存在下に培養生育する。変異型ALS遺伝子を有しない個体や野生型の個体は、除草剤の存在下において死滅したり生育が大幅に抑制される。一方、本発明の発現ベクターを有する個体は、変異型ALS遺伝子が発現することにより除草剤の存在下にて生育できる。この除草剤抵抗性の獲得を指標として形質転換トウモロコシを選抜し、その後、上述したマーカー領域の存在非存在をPCRによって確認しても良い。ここで、除草剤としては、発現ベクターに使用した変異型ALS遺伝子により適宜選択して使用することができる。除草剤としては、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤を使用することができる。ピリミジニルカルボキシ系除草剤としては、ビスピリバックナトリウム塩、ピリチオバックナトリウム塩、ピリミノバックを例示することができる。スルホニルウレア系除草剤としては、クロルスルフロンを例示することができる。イミダゾリノン系除草剤としては、イマザキンを例示することができる。トリアゾロピリミジン系除草剤としては、ペノキススラム、ピロクススラムを例示することができる。トリアゾリノン系除草剤としては、フルカルバゾンナトリウム塩、プロポキシカルバゾンナトリウム塩を例示することができる。4.植物の製造本発明においては、上記形質転換植物細胞等から形質転換植物体に再生することができる。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、LS培地、MS培地などが例示される。本発明の植物体を製造する方法は、本発明の発現ベクターで形質転換した形質転換トウモロコシ細胞を得て、該形質転換トウモロコシ細胞から形質転換トウモロコシを再生し、得られた形質転換トウモロコシから種子を得て、該種子からトウモロコシを生産する工程を含む。形質転換トウモロコシから種子を得るには、例えば、形質転換トウモロコシを発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる。また、種子から植物体を生産するには、例えば、形質転換トウモロコシ上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する。以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。実施例1トウモロコシALS2ターミネーターから3非翻訳領域に至る配列の決定図1公知であるトウモロコシALS2遺伝子accessionNoX63554のシークエンスを基にし、プロモーター領域352bpを含むALS2のDNA断片807bpの増幅ができるプライマーセットZmALS2センスプライマー、5CGAGACTAGTCGATAACTCGATAGC3:配列番号3ZmALS3アンチセンスプライマー、5AGCAACGCGTCTGCGAGCGCAGAGACTA3:配列番号4を用いてトウモロコシ自殖系統Na65のゲノムDNAを鋳型にPhusionDNApolymeraseThermoFisherScientific社を用いPCRを行った。PCRは初期denature98°C5min、denature98°C30secannealing58°C30secelongation72°C1minを40サイクル、最終elongation72°C7minの条件で行った。GC含量が高いので、PCRの際、DMSOを5添加した。反応終了後アガロースゲル電気泳動で約800bpのサイズのPCR産物を確認し、BigDyeTerminatorv11CycleSequencingKitLifeTechnologies社を用いてダイレクトシークエンスを行った。その結果、ALS2と相同性の高い配列であることが確認された。引き続き、トウモロコシNa65系統のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーセットZmALS2同上ZmALS13アンチセンスプライマー、5GTGCGGGACGATTATATCCAAGAG3:配列番号5でPhusionDNApolymeraseThermoFisherScientific社を用いPCRを行い、ALS2遺伝子の352~1833番目の塩基配列を増幅した。DMSOを5添加し、初期denature98°C5min、denature98°C30secannealing58°C30secelongation72°C2minを40サイクル、最終elongation72°C7minの条件で反応した。アガロースゲル電気泳動の結果、約2kbのサイズのバンドが確認できたので、それを回収しBigDyeTerminatorv11CycleSequencingKitLifeTechnologies社を用いてダイレクトシークエンスを行い、配列を決定した。ターミネーターから3非翻訳領域に至る配列は、Seegene社のDNAWalkingSpeedUpKitを用いたゲノムウォーキングによりPCRクローニングし配列を決定した。PhushionDNApolymeraseThermoFisherScientific社を用い、トウモロコシNa65系統ゲノムDNAを鋳型とし、配列特異的センスプライマーZmALS55CCAGATTTTGTGGCAATTGCTAAAGGG3:配列番号6とキット添付のDWACP1、2、3及び4の組合わせで反応溶液を調製し、98°C5分42°C1分72°C2分の条件で反応した後、98°C40秒55°C40秒72°C1分のサイクルを40回繰り返し、最後に72°Cで7分間反応を行った。引き続き1回目のPCR反応液1μLを鋳型として用い2回目のPCRを行った。配列特異的プライマーZmALS5上記とキット添付のプライマーDWACPNの組合わせで、98°C5分保持し、98°C30秒58°C30秒72°C1分のサイクルを40回繰り返し、最後に72°Cで7分間反応を行った。プライマーDWACP1を用いた反応液を鋳型とした2回目のPCR生成物に約800bpのPCR産物が増幅されたのでこれをアガロースゲルから回収した。BigDyeTerminatorv11CycleSequencingKitLifeTechnologies社を用いたダイレクトシークエンシングによってターミネーター領域から3非翻訳領域に至る配列の決定を試みたが、ダイレクトシークエンシングではシグナルが急激に減衰し、解析が困難であった。そこでこれをpUC18プラスミドにサブクローニングした後、シークエンス解析を行った。PCR産物の5末端をT4polynucleotidekinaseTakaraBio社を用いてリン酸化し、これをSmaIBAP処理したpUC18ベクターに平滑末端同士で連結し、pUC18プラスミドへサブクローニングし、大腸菌JM109株に導入した。50ppmアンピシリン含有LB培地上でシングルコロニーを選び、4コロニーからプラスミドを抽出し、ターミネーター領域から3非翻訳領域に至る配列540bpを含むALS2のシークエンスを解析した。これら4個のコロニー由来のシークエンス配列が全て一緒の配列であったことから、PCRで用いたDNA合成酵素に由来する変異導入はないと考え、正しい配列として確定した。実施例2トウモロコシALS2のプロモーター領域の塩基配列決定図1実施例1でトウモロコシ自殖系統Na65由来ALS2のプロモーター領域の352bpの配列が明らかになったが、更に上流のプロモーター領域の配列解析をゲノムウォーキングにより行った。DNAWalkingSpeedUpKitSeegene社及びPhusionDNApolymeraseThermoFisherScientific社を用いゲノムウォーキングを行った。PCRは5XPhusionHFbuffer5μL、dNTP25mMeach2μL、DWACPprimer25μM2μL、配列特異的アンチセンスプライマーZmALS225GGGTAGAAAATTATTGACGGTAGGTCC3配列番号7、32μM15μL、DMSO125μL、トウモロコシ自殖系統Na65ゲノムDNA05μL、PhushionDNApolymeraseThermoFisherScientific社025μLを最終量25μLとなるように混和した。98°C5分42°C1分72°C2分でインキュベート後、98°C40秒55°C40秒72°C1分の反応を40サイクル行い、最後に72°Cで7分間インキュベートした。1回目のPCRに引き続き、配列特異的アンチセンスプライマーZmALS21、5GCTTGAGACGCATACACGTGGTCATT3:配列番号8とキットに添付されたプライマーDWACPNでnestedPCRを行った。1回目のPCR生成物をGFXPCRDNAandGelBandPurificationKitGEHealthcareScience社を用いてカラム精製し、精製液1μLを鋳型として用い、プライマーDWACPN10μM05μL及び配列特異的プライマーZmALS2132μM2μLを用いた。これら以外は最初のPCRと同様の組成で反応を行った。98°C5分保持し、98°C30秒58°C30秒72°C1分の反応を40サイクル行い、最後に72°Cで7分間インキュベートした。その結果、プライマーDWACP4を用いた反応液を鋳型とした2回目のPCR生成物に約950bpのPCR産物が増幅されたので、これをゲルからGFXPCRDNAandGelBandPurificationKitGEHealthcareScience社を用いて精製した。ダイレクトシークエンシングによって本PCR産物の配列を解析し、プロモーター領域のシークエンスを決定した。実施例3トウモロコシ自殖系統Na65のゲノムDNAを鋳型としたALS2プロモーター領域ALS2遺伝子ALS2ターミネーター領域の増幅図2トウモロコシ自殖系統Na65のゲノムDNAを鋳型として以下の2組のプライマーを用いて、DNA断片を増幅させた。ZmALSpro35TTAATTAACGCCAAGCCATTTAACCTCTCTTG3:配列番号9、下線部はPacIサイトとZmALSter15AGATCTTGGAACACCTAATGACCTGCTCCAC3:配列番号10、下線部はBglIIサイトのプライマーセットを用いて618bpALS2プロモーター領域ALS2遺伝子520bpALSターミネーター領域の配列を増幅し図2のP1を、ZmALSpro125AAAAGAATTCttaattaaGGACTAGTCTGGTGACGATGAAAG3:配列番号11、下線部はEcoRIサイト、小文字はPacIサイトとZmALS185ACAACATACTACACACAGGGTTGG3:配列番号12のプライマーセットで1013bpALSプロモーターALSORF140bpALSターミネーターカセットP2を増幅し取得した。実施例1~3により取得したALS2プロモーター領域ALS2遺伝子ALS2ターミネーター領域の塩基配列を配列番号13に示した。また、ALS2遺伝子がコードするALS2タンパク質のアミノ酸配列を配列番号14に示した。実施例4618bpALS2プロモーターALS2ORF520bpALS2ターミネーターカセット上のALSへの2点変異W542LS621Iアミノ酸に対応する遺伝子変異の導入図3トウモロコシALS2上への2点変異W542LS621Iの導入は、P1をpUC18プラスミドにサブクローニングした後に行った。T4polynuleotidekinaseを用いてP1の5末端をリン酸化し、これをSmaIBAP処理したpUC18プラスミドに平滑末端で組み込み、Plasmid1を得た。この精製したプラスミドのALS遺伝子のアミノ酸配列上621番目のセリンSerに対応するコドンAGTをイソロイシンIleに対応するコドンATTに変換後、542番目のトリプトファンTrpに対応するコドンTGGをロイシンLeuに対応するコドンTTGに変換した。Plasmid1を鋳型として、プライマーZmALSmutS621I5CTATTGGTGGGGCTTTCAAGG3:配列番号15、センスとZmALS295GGATCATAGGCAACACATGC3:配列番号16、アンチセンスを用いてプラスミド全長を一周してPCRで増幅させた。PCRはPhushionDNApolymeraseThermoFisherScientific社を用い、98°Cで5分間インキュベート後、98°C30秒58°C30秒72°C1分の反応を40サイクル行い、最後に72°Cで7分間インキュベートした。PCR産物の両末端をT4polynucleotidekinaseを用いてリン酸化した後、セルフライゲーションさせALS2上にS621Iの変異の入ったプラスミドPlasmid2を作製した。更に本プラスミドを鋳型として、W542Lの変異を導入した。S621I変異導入と同様のPCR条件で、プライマーZmALSmutW542L5GTTGGAGGACAGGTTCTATAAG3:配列番号17、センスZmALS285TGCACCACCATCCCGAGGTG3:配列番号18、アンチセンスのセットでプラスミド全長をPCRで増幅させた。PCR産物の両末端をT4polynucleotidekinaseを用いてリン酸化した後、セルフライゲーションさせW542LS621Iの2点変異を含むプラスミドPlasmid3を作製した。尚、ライゲーションしたプラスミドは大腸菌JM109株に導入後、50ppmアンピシリン含有LB培地でシングルコロニーを形成させ、選抜したコロニーの大腸菌をLB液体培地で培養し、QIAprepSpinMiniprepKitQIAGENで精製し取得した。実施例51013bpALS2プロモーターALS2W542LS621I520bpALS2ターミネーターカセットの取得図3実施例4で作製したPlasmid3をSalIで処理し、ORFの2点変異型ALS2W542LS621Iを含むC末端側領域1331bpおよび520bpターミネーター領域を含むDNA断片F3を得た。一方、1013bpプロモーター領域を含むP2をEcoRIおよびSalIで処理し、1013bpプロモーター領域およびORFのN末端領域586bpのDNA断片を得た。次にこのDNA断片を同制限酵素で処理したpUC18に導入した。このプラスミドをSalI処理後、セルフライゲーションを防ぐため脱リン酸化BAP処理を行った。これとF3をライゲーションさせ、1013bpALS2プロモーターALS2W542LS621I520bpALS2ターミネーターカセットを組み込んだpUC18ベクターを作製した。このプラスミドをPlasmid4とした。実施例61013bpALS2プロモーターALS2W542LS621I520bpALS2ターミネーターカセットのpSTARAバイナリーベクターへの導入図4実施例5で作製したPlasmid4をPacIおよびBglIIで処理し、1013bpALS2プロモーターALS2W542LS621I520bpALS2ターミネーターカセットを含むDNA断片F4を切り出した。一方、同様にイネALSを組み込んだpSTARAベクターであるR4クミアイ化学をPacIおよびBglIIで処理し、pSTARAベクターのバックボーンを切り出した。F4とpSTARAプラスミドのバックボーンをライゲーションさせ、1013bpALS2プロモータートウモロコシALS2W542LS621I520bpALS2ターミネーターカセットを組み込んだpSTARAバイナリーベクタープラスミドPlasmid5を得た。既に作製してあったシロイヌナズナ2点変異型ALSW574LS653I遺伝子を持つA3バイナリーベクタープラスミドクミアイ化学にLR反応でsGFPS65Tを導入したプラスミドPlasmid6からCaM35SプロモーターsGFPS65TNOSターミネーターカセットを切り出し、Plasmid5に組込んだ。Plasmid6をSphI、EcoRIで処理し、約2kbのCaM35SpromotersGFPS65TNOSterminatorを切り出した。尚、同時にBglIIでも処理しpSTARAプラスミドの基本骨格部分を消化し、CaM35SプロモーターsGFPS65TNOSターミネーターカセット断片とアガロースゲル泳動で重ならないようにした。次にCaM35SプロモーターsGFPS65TNOSターミネーターカセット断片のSphIとEcoRI突出末端をT4DNApolymeraseで平滑化した。一方、Plasmid5をSwaIで処理し平滑断片とした後、BAP処理を行い5末端のリン酸基を除去した。これら2つのDNA断片をライゲーションさせ、大腸菌HST02株に導入した。CaM35SプロモーターsGFPS65TNOSターミネーターカセットがセンス方向に挿入したプラスミドをPlasmid7とした。実施例7Plasmid7のアグロバクテリウムへの導入Plasmid7をアグロバクテリウム菌AgrobacteriumtumefacienceEHA105にエレクトロポレーションBIORAD社GenePulserXCell、24KV、25μF、200Ωにより導入し、YeastMalt寒天培地125ppmリファンピシリン、25ppmクロラムフェニコール、50ppmスペクチノマイシンを含むに塗布し、27°Cで3日間静置培養を行った。得られたシングルコロニーをYM液体培地に植菌し、27°Cで3日間振とう培養を行い、その培養液をグリセロールストックとして保存した。実施例8トウモロコシ自殖系統Mi29及びNa65の作出トウモロコシデント種Fl品種P3352パイオニア社を種子親、H84XR2040XH84を母材とするSI系統307042を花粉親として交配し、NX694を作成した。その後NX694とP3352とを交配し、S0世代母材として自殖系統の育成を開始した。各種病害抵抗性についての個体選肢と自殖による固定化を進め、S5世代まで育成し、諸特性の評価で有望と認められたのでこれを自殖系統Na65とした。デン卜種自殖系統間の単交雑Fl系統NX220を種子親とし、デント種Fl品種P3358パイオニア社を花粉親として交配し、その後P3358が戻し交配された。NX220はPa91ペンシルパニア大学xR2040クライドブラックサン社の掛け合わせで構成されている。戻し交配系統NX220XP3358XP3358をS0世代母材として自殖系統の育成を開始し、耐倒伏性と各種病害抵抗性についての有望であった系統の固定化を進め、これを自殖系統Mi29とした。実施例9アグロバクテリウム菌KLB348を用いたトウモロコシ自殖系統Mi29の形質転換Mi29の形質転換はIshidaetalの方法NatureProtocol27161416212007により未熟胚へのアグロバクテリウム感染により行った。自家受粉後約10日のトウモロコシ自殖系統Mi29の未熟胚を摘出し、アグロバクテリウム菌EHA105株、グリセロールストック番号KLB348に浸した後、46°Cの高温処置と遠心分離処理を行いLSAS培地アセトシリンゴンを含むMS培地で25°C暗所で約1週間培養した。未熟胚からはカルスが形成されるが、その後ビスピリバックナトリウム塩02μMとカルベニシリンを含む培地に移し25°C暗所で2週間~1ヶ月培養した。ビスピリバックナトリウム塩耐性を示し成長を続けたカルスを28°C連続照明下でゼアチンを含むLSZ培地で2週間~1ヶ月培養し、シュート形成を促した。シュートが形成されたカルスはさらに棒びん中のLSF培地02mglのIBAを含むに移植し発根を促した。棒びん内で十分発根した組換え体を鉢上げした。実施例10トウモロコシ自殖系統Na65及びMi29のゲノムDNAトウモロコシ自殖系統Na65及びMi29の葉100mgよりゲノムDNAをDNeasyPlantMiniKitQiagen社を用い抽出し、濃度100μgmlの水溶液を50μl得た。引き続きPCRを全量50μlで調製した。反応液組成は鋳型ゲノムDNA5μl、PhushionDNApolymeraseThermoFisherScientific社05μl、5×PhushionHFBufferMgCl2含10μl、dNTPs25mM4μlである。プライマーは50pmol加え、ZmALS30ZmALS18、ZmALS30ZmALS31、ZmALS14ZmALS18、ZmALS14ZmALS31の4通りの組合わせで混合した図5参照。反応条件は95°Cからのホットスタートで開始し、95°C30秒50°C1分72°C2分の増幅サイクルを40回繰り返し、最終サイクルの後、72°Cで7分間インキュベートし反応を完結させた。PCR生成物はアガロースゲル電気泳動に供しPCR生成物のサイズを確認した図6。なお、使用したプライマーとPCR生成物のサイズとの関係を表1に示す。実施例11アグロバクテリウム菌KLB348を用いて形質転換したトウモロコシ自殖系統Mi29のゲノムDNAアグロバクテリウム菌KLB348を用いて形質転換したトウモロコシ自殖系統Mi29の葉100mgよりゲノムDNAをDNeasyPlantMiniKitQiagen社を用い抽出し、濃度100μgmlの水溶液を50μl得た。引き続きPCRを全量50μlで調製した。反応液組成は鋳型ゲノムDNA5μl、PhushionDNApolymeraseThermoFisherScientific社05μl、5×PhushionHFBufferMgCl2含10μl、dNTPs25mM4μlである。プライマーは50pmol加え、ZmALS14ZmALS31の組合わせで混合した。反応条件は95°Cからのホットスタートで開始し、95°C30秒50°C1分72°C2分の増幅サイクルを40回繰り返し、最終サイクルの後、72°Cで7分間インキュベートし反応を完結させた。PCR生成物はアガロースゲル電気泳動に供しPCR生成物のサイズを確認した図7。"