"血液凝固調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:1TMEM16F発現細胞と血液凝固調節物質の候補物質とを接触させる工程、および2該細胞の表面におけるホスファチジルセリンの露出を変化させる候補物質を選択する工程、ここで、ホスファチジルセリンの露出を増加させる候補物質が血液凝固促進物質として選択され、ホスファチジルセリンの露出を減少させる候補物質が血液凝固阻害物質として選択される。工程2が、該細胞に対するアネキシンVまたはMFG-E8の結合を調べることにより行われる、請求項1記載の方法。工程2が、血液凝固反応を調べることにより行われる、請求項1記載の方法。血液凝固調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:1TMEM16Fをコードする遺伝子を有する細胞と血液凝固調節物質の候補物質とを接触させる工程、および2該細胞におけるTMEM16Fの発現を変化させる候補物質を選択する工程、ここで、TMEM16Fの発現を増加させる候補物質が血液凝固促進物質として選択され、TMEM16Fの発現を減少させる候補物質が血液凝固阻害物質として選択される。TMEM16Fの機能を亢進する物質を有効成分として含有する、血液凝固促進用組成物。TMEM16Fの機能を抑制する物質を有効成分として含有する、血液凝固阻害用組成物。TMEM16Fの機能を亢進する物質を対象に投与することを含む、血液凝固を促進する方法。TMEM16Fの機能を抑制する物質を対象に投与することを含む、血液凝固を阻害する方法。TMEM16Fの機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:1TMEM16F発現細胞とTMEM16Fの機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、および2該細胞の表面におけるホスファチジルセリンの露出を変化させる候補物質を選択する工程、ここで、ホスファチジルセリンの露出を増加させる候補物質がTMEM16Fの機能を亢進する物質として選択され、ホスファチジルセリンの露出を減少させる候補物質がTMEM16Fの機能を抑制する物質として選択される。TMEM16Fの機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:1TMEM16Fをコードする遺伝子を有する細胞とTMEM16Fの機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、2該細胞におけるTMEM16Fの発現を変化させる候補物質を選択する工程、ここで、TMEM16Fの発現を増加させる候補物質がTMEM16Fの機能を亢進する物質として選択され、TMEM16Fの発現を減少させる候補物質がTMEM16Fの機能を抑制する物質として選択される。被験者のScott症候群の素因を調べる方法であって、該被験者がTMEM16Fをコードする遺伝子に変異を有するかを調べることを含む方法。被験者から採取された試料から調製されたゲノムDNAまたはmRNAにおける変異の存在を調べる、請求項11記載の方法。被験者から採取された試料における変異型TMEM16Fの発現を調べる、請求項11記載の方法。TMEM16Fをコードする遺伝子の変異を検出するためのプローブまたはプライマーとして使用される該遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、Scott症候群の診断用組成物。配列番号2の配列に特異的にハイブリダイズし、かつ配列番号2の全体または一部を増幅するためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項14記載の組成物。オリゴヌクレオチドが配列番号2の配列の一部に相補的である、請求項15記載の組成物。TMEM16Fを特異的に認識する抗体を含む、Scott症候群の診断用組成物。本発明者らは、8回膜貫通型タンパク質であるTMEM16FTransmembraneprotein16F本明細書中、スクランブレースαSCRαとも称する非特許文献15がリン脂質スクランブレースであることを見出した。さらに、リン脂質スクランブリング活性の異常に起因する出血性疾患であるScott症候群非特許文献16、17、18の患者がSCRα遺伝子に変異を有することを見出した。以上より、血液凝固経路の制御を可能とする新規ターゲットとしてSCRαを同定し、本発明を完成した。本発明は、以下を提供する:血液凝固調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:1TMEM16F発現細胞と血液凝固調節物質の候補物質とを接触させる工程、および2該細胞の表面におけるホスファチジルセリンの露出を変化させる候補物質を選択する工程、ここで、ホスファチジルセリンの露出を増加させる候補物質が血液凝固促進物質として選択され、ホスファチジルセリンの露出を減少させる候補物質が血液凝固阻害物質として選択される。本発明はまた、以下を提供する:血液凝固調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:1TMEM16Fをコードする遺伝子を有する細胞と血液凝固調節物質の候補物質とを接触させる工程、および2該細胞におけるTMEM16Fの発現を変化させる候補物質を選択する工程、ここで、TMEM16Fの発現を増加させる候補物質が血液凝固促進物質として選択され、TMEM16Fの発現を減少させる候補物質が血液凝固阻害物質として選択される。本発明はまた、TMEM16Fの機能を亢進する物質を有効成分として含有する、血液凝固促進用組成物、およびTMEM16Fの機能を抑制する物質を有効成分として含有する、血液凝固阻害用組成物、を提供する。本発明はまた、TMEM16Fの機能を亢進する物質を対象に投与することを含む、血液凝固を促進する方法、およびTMEM16Fの機能を抑制する物質を対象に投与することを含む、血液凝固を阻害する方法、を提供する。本発明はまた、以下を提供する:TMEM16Fの機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:1TMEM16F発現細胞とTMEM16Fの機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、および2該細胞の表面におけるホスファチジルセリンの露出を変化させる候補物質を選択する工程、ここで、ホスファチジルセリンの露出を増加させる候補物質がTMEM16Fの機能を亢進する物質として選択され、ホスファチジルセリンの露出を減少させる候補物質がTMEM16Fの機能を抑制する物質として選択される。本発明はまた、以下を提供する:TMEM16Fの機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:1TMEM16Fをコードする遺伝子を有する細胞とTMEM16Fの機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、2該細胞におけるTMEM16Fの発現を変化させる候補物質を選択する工程、ここで、TMEM16Fの発現を増加させる候補物質がTMEM16Fの機能を亢進する物質として選択され、TMEM16Fの発現を減少させる候補物質がTMEM16Fの機能を抑制する物質として選択される。本発明はまた、被験者のScott症候群の素因を調べる方法であって、該被験者がTMEM16Fをコードする遺伝子に変異を有するかを調べることを含む方法、を提供する。本発明はまた、TMEM16Fをコードする遺伝子の変異を検出するためのプローブまたはプライマーとして使用される該遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、Scott症候群の診断用組成物を提供する。本発明はまた、TMEM16Fを特異的に認識する抗体を含む、Scott症候群の診断用組成物を提供する。本発明により、TMEM16Fを標的とした血液凝固調節物質のスクリーニングが可能となった。本発明は、新規メカニズムに基づく血液凝固促進剤や血液凝固阻害剤の提供を可能とする。1.血液凝固調節物質のスクリーニング方法本発明者らは、8回膜貫通型タンパク質であるTMEM16Ftransmembraneprotein16Fが血液凝固に関与するリン脂質スクランブレースscramblaseであることを同定した。よって、本発明は、TMEM16Fを標的とした、血液凝固調節物質のスクリーニング方法を提供する。本発明の血液凝固調節物質には、血液凝固促進物質と血液凝固阻害物質とが含まれる。本発明において血液凝固とは、血小板同士や血小板と血管内皮細胞が接着し、または血液細胞が血管壁に接着し、凝固因子とともに血餅を形成する一連の分子作用をいう。本発明において血液凝固促進とは、前記血液凝固を促進して止血を促進することを意味し、血液凝固阻害とは、前記血液凝固をいずれかの段階で阻害することを意味する。血液凝固調節物質の候補物質は、天然に存在する物質または合成された物質のいずれであってもよく、例えば微生物、植物もしくは動物の細胞抽出物または培養上清、合成低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体などが挙げられる。候補物質は、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー等、ライブラリーの形態であってもよい。本発明におけるTMEM16F発現細胞およびTMEM16Fをコードする遺伝子を有する細胞には、各種生物、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ等由来の、血小板、巨核球細胞や、巨核球由来細胞株を含む各種細胞株、TMEM16Fをコードする遺伝子を導入し発現させた細胞が含まれる。ヒトNamalwa細胞、マウスBa/F3細胞などのB細胞株も利用可能である。ある態様において、本発明のスクリーニング方法は、TMEM16Fの酵素活性の変化を調べることにより行われる。TMEM16FはホスファチジルセリンPSを細胞表面に露出させるスクランブレースとしての機能を有することから、TMEM16Fの酵素活性の変化は、TMEM16F発現細胞の表面におけるPSの露出の変化により調べることができる。血小板におけるPSの露出は血小板を活性化し、血液凝固を誘導することから、PSの露出を増加させる候補物質は血液凝固促進物質として選択され、PSの露出を減少させる候補物質は血液凝固阻害物質として選択される。PSの露出は、PSに結合する性質を有する物質、例えばアネキシンVAnnexinVやMFG-E8ラクトアドヘリンとも呼ばれると細胞表面のPSとの結合により調べることができる。具体的には、例えば、TMEM16F発現細胞を候補物質で処理し、蛍光等で標識したアネキシンVとインキュベートして、細胞表面に結合するアネキシンVの量を調べればよい。この場合、対照と比較してアネキシンVの結合を増加させる候補物質は血液凝固促進物質として選択され、減少させる候補物質は血液凝固阻害物質として選択される。PSの露出は、また、血液凝固反応の誘導によっても調べることができる。血液凝固反応を調べる方法は周知である。例えば、TMEM16F発現細胞を候補物質で処理し、さらに候補物質の処理後またはその処理と同時に細胞内にCa2を流入させるカルシウムイオノフォアで処理した細胞を、血液凝固に必要な因子例えば、ファクターXa、ファクターVa、プロトロンビンと混合し、トロンビンの生成の有無を調べる。あるいは、さらにフィブリノーゲンと混合して、フィブリンの生成を調べても良い。別の態様において、本発明のスクリーニング方法は、候補物質がTMEM16Fの発現を変化させるか否かを調べることにより行われる。この場合、TMEM16Fの発現を増加させる候補物質は血液凝固促進物質として選択され、TMEM16Fの発現を減少させる候補物質は血液凝固阻害物質として選択される。かかる態様における血液凝固調節物質の候補物質の具体例としては、TMEM16Fの発現を調節するプロモーターやエンハンサー等の調節配列に作用する物質、TMEM16Fをコードする遺伝子の配列に基づき作製したアンチセンスオリゴヌクレオチドDNAまたはRNA、siRNA、shRNAや、miRNA、リボザイムが挙げられる。TMEM16Fの発現を調べる方法は特に限定されない。例えば、タンパク質の発現をウエスタンブロット法、ELISA法などにより調べてもよいし、mRNAの発現をノーザンブロット法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法などにより調べてもよい。2.血液凝固調節用組成物および血液凝固調節方法本発明はまた、TMEM16Fの機能を調節する物質を有効成分として含有する血液凝固調節用組成物、およびTMEM16Fの機能を調節する物質を対象に投与することを含む血液凝固を調節する方法を提供する。本発明におけるTMEM16Fの機能を調節する物質には、TMEM16Fの機能を亢進する物質とTMEM16Fの機能を抑制する物質が含まれる。TMEM16Fの機能を亢進/抑制するとは、細胞または生物におけるTMEM16Fのリン脂質スクランブレースとしての生化学的機能や生物学的機能を促進/抑制することを意味し、これにはTMEM16Fの酵素活性の促進/抑制やTMEM16Fの発現の増加/減少が含まれる。TMEM16Fの発現の増加/減少には、TMEM16Fをコードする遺伝子からのmRNAの発現の増加/減少、およびTMEM16Fタンパク質の発現の増加/減少が含まれる。具体的には、TMEM16Fの機能を促進する物質としては、例えば、野生型TMEM16Fタンパク質が挙げられる。また、TMEM16Fの機能を抑制する物質としては、例えば、TMEM16Fの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、miRNAやTMEM16Fの機能を抑制する抗TMEM16F抗体が挙げられる。本発明の血液凝固促進用組成物は、血管損傷などによる出血を止めるために使用できる他、血友病、vonwillebrand病、播種性血管内凝固症候群等の血液凝固作用に対する異常疾患の治療にも使用することができる。一方、本発明の血液凝固阻害用組成物は、血栓が血管の損傷等を原因として形成された部位以外の部位に異動して血管を塞ぐ、血栓塞栓症例えば、静脈血栓症、心筋梗塞症、脳塞栓症等の治療に使用することができる。また、本発明の血液凝固阻害用組成物は、異常な血液凝固を阻害することにより、血液循環の促進やうっ血予防に使用することができる。さらに、過剰な血液凝固や血栓の形成は動脈硬化や梗塞を誘発することから、本発明の血液凝固阻害用組成物は動脈硬化や梗塞の予防にも使用することができる。本発明はまた、TMEM16Fの機能を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、前記1.1.血液凝固調節物質のスクリーニング方法に記載のように行えばよい。3.Scott症候群の診断方法および診断用組成物本発明者らは、TMEM16Fが、血小板表面へのPSの移動障害を原因とする出血性疾患であるScott症候群の原因遺伝子であることを見出した。よって、本発明は、TMEM16Fをコードする遺伝子の変異を調べることによる、Scott症候群の診断方法を提供する。本明細書におけるTMEM16Fをコードする遺伝子には、TMEM16Fのコーディング配列のみならず、TMEM16Fの発現を調節するプロモーター等の調節配列も含まれる。また、TMEM16Fをコードする遺伝子には、エクソンおよびイントロンの両方が含まれる。TMEM16Fをコードする遺伝子の変異には、細胞または生物におけるTMEM16Fの酵素活性を失活させるあらゆる変異例えば、1もしくは数個の塩基の欠失、置換、付加および/または挿入等によるが含まれる。かかる変異は、例えば、1もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加および/または挿入、mRNAの異常スプライシングによるエクソンの欠失、mRNAの翻訳時のフレームシフト等、TMEM16Fのアミノ酸配列の変異をもたらす。そのような変異の例としては、本願明細書に記載される変異の他、CastoldiEetalCompoundheterozygosityfor2novelTMEM16FmutationsinapatientwithScottsyndromeBlood11743994400非特許文献47に記載の変異が挙げられる。なお、本明細書において数個とは、2、3、4、5、6、7、8、9または約10個を意味する。本発明者らは、Scott症候群の患者が、TMEM16Fの2つの対立遺伝子の両方においてイントロン12におけるグアニンG配列番号1の11423位のチミンTへの変異を有し、その両親が一方の対立遺伝子において当該変異を有することを見出した。よって、好ましくは、本発明の診断方法は、配列番号1の11423位のGからTへの変異を調べることを含む。配列番号1図9-1~9-9は、ヒトTMEM16F染色体遺伝子のエクソン12-エクソン16の配列を示す。エクソン12-エクソン16の各配列はそれぞれイタリック体で示した。配列中の下線はPCRで用いたEx12-FWおよびEx16-RVの位置を示す。ヒトTMEM16FのmRNAの配列はGenBankにNM_001025356として、ゲノム配列は、EntrezGeneに196527として、またはHGNCに25240として開示されている。これらの開示はいずれも引用により本願に含まれる変異は、被験者から採取された試料から公知の方法によって調製されたゲノムDNA、mRNA、タンパク質を用いて調べることができる。試料は、特に限定されず、例えば被験者の各種細胞、組織、臓器、血液、体液等が使用可能である。変異は、被験者のゲノムDNAまたはmRNAの配列を直接調べることにより検出することができる。変異の検出には種々の方法を用いることができ、例えば以下が挙げられる:TaqManPCR法GenetAnal14143149JClinMicrobiol3429332936;インベーターInvader法Science5109778783JBiolChem302138721394NatBiotechnol17292296;モレキュラービーコンMolecularBeacons法NatBiotechnol,1p4953、遺伝子医学、4p4648;DNAマイクロアレイまたはDNAチップ法;ダイレクトシークエンス法Biotechniques11246249;RFLP制限酵素切断断片長多型法;PCRSSCP法Biotechniques16296297Biotechniques21510514;ASOAlleleSpecificOligonucleotideハイブリダイゼーション法ClinChimActa189153157;変性剤濃度勾配ゲル電気泳動DenaturingGradientGelElectrophoresis、DGGE法Biotechniqus2710161018;RNaseA切断法DNACellBiol148794;MALDITOFMSMatrixAssistedLaserDesorptiontimeofFlightMassSpectrometry法GenomeRes7378388EurJClinChemClinBiochem35545548;RCA法NatGenet19225232。上記文献は引用により本明細書に含まれる。本発明者らの同定したScott症候群の患者における変異は、TMEM16Fをコードする遺伝子のイントロン12のスプライスアクセプターサイトに位置するため、当該変異を有する被験者ではmRNAのスプライシングが正常に行われず、その結果エクソン13が欠損する。よって、変異の有無は、被験者のTMEM16FのmRNAにおけるエクソン13の欠損の有無を調べることによっても調べることができる。野生型TMEM16FのcDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号2および3に示す。また、本発明者らの同定したScott症候群の患者における変異型TMEM16FのcDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号4および5に示す。例えば、TMEM16Fをコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いてRT-PCRを行ってエクソン13を含む領域を増幅し、被験者の試料から増幅されるDNAの長さを対照健常人と比較する。被験者が当該変異を有する場合、対照と比較して短いDNA断片の増幅が観察される。あるいは、TMEM16Fをコードする遺伝子のエクソン13に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いてRT-PCRを行った場合、当該被験者の試料からはDNA断片が増幅されない。また、TMEM16Fをコードする遺伝子のエクソン13に特異的にハイブリダイズするプローブを作製し、被験者の試料から調製したmRNAとハイブリダイズさせた場合、当該変異を有する被験者の試料ではハイブリダイゼーションシグナルが観察されない。このようにして、被験者における当該変異を検出することができる。本発明者らの同定した変異以外のTMEM16Fをコードする遺伝子の変異も、同様に変異に応じたプライマーやプローブを作製することによって、検出することができる。また、本発明者らの同定した変異の存在により、エクソン13の欠損に加えてエクソン14におけるフレームシフトが起こり、その結果TMEM16Fの第3膜貫通ドメインをコードするエクソン14内においてタンパク質の翻訳が終了する。よって、被験者における未成熟な変異型TMEM16Fの発現を調べることによっても、当該変異の有無を調べることができる。変異型TMEM16Fの発現は、TMEM16Fを特異的に認識する抗体を用いて調べることができる。例えば、野性型TMEM16Fと変異型TMEM16Fの両方に共通するアミノ酸配列部分を抗原として、野生型TMEM16Fと変異型TMEM16Fの両方を認識する抗体を作製し、ウエスタンブロット法により被験者で発現するタンパク質のサイズを調べ、これを野性型TMEM16Fのサイズと比較すればよい。あるいは、変異型TMEM16Fに存在しない領域のアミノ酸配列部分を抗原として、野生型TMEM16Fを認識するが変異型TMEM16Fを認識しない抗体を作製し、被験者が当該抗体に認識されるタンパク質を有するか否かをウエスタンブロット法、ELISA法、ドットブロット法により調べてもよい。本発明者らの同定した変異以外のTMEM16Fをコードする遺伝子の変異も、変異が野生型TMEM16Fと異なるアミノ酸配列を有する変異型TMEM16Fをもたらす場合、同様にして検出することができる。本発明はまた、TMEM16Fをコードする遺伝子の変異を検出するためのプローブまたはプライマーとして使用される前記遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、Scott症候群の診断用組成物を提供する。本発明の診断用組成物は、上記診断方法に使用されるものである。ある態様において、本発明の診断用組成物は、以下のいずれかを含む:1配列番号1の11423位を含む領域に特異的にハイブリダイズする、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチド;2配列番号1の11424~11649位の配列に特異的にハイブリダイズする、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチド;および3配列番号1の配列に特異的にハイブリダイズし、かつ配列番号1の11424~11649位の全体または一部を含む領域を増幅するためのプライマーとして使用される、オリゴヌクレオチド。別の態様において、本発明の診断用組成物は、配列列番号2の配列に特異的にハイブリダイズし、かつ配列番号2の全体または一部を増幅するためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号2の1402-1627位の全体または一部を含む領域を増幅するものである。別の態様において、本発明の診断用組成物は、配列番号2の1402-1627位の配列に特異的にハイブリダイズする、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号1または2の配列と特異的にハイブリダイズしうる限り前記配列に完全に相補的である必要はないが、好ましくは配列番号1または2の配列の一部に相補的である。本発明において特異的にハイブリダイズするとは、オリゴヌクレオチドのTm値に基づきMolecularCloningALaboratoryManual3rdeditionなどの教示にしたがい決定されるストリンジェントな条件下例えば、6×SSC、05SDS、50ホルムアミド中で目的の配列にハイブリダイズすることを意味する。プライマーとして使用される場合、オリゴヌクレオチドは、通常15~100塩基、好ましくは15~30塩基、より好ましくは18~24塩基である。プローブとして使用される場合、オリゴヌクレオチドは、通常10~100塩基、好ましくは10~50塩基、より好ましくは15~25塩基である。オリゴヌクレオチドは、それが使用される方法に応じて、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素、ビオチン等によって修飾されていてもよい。また、プローブとして使用される場合、固相、例えばガラス板、ナイロンメンブラン、マイクロビーズ、キャピラリー等に固定されていてもよい。別の態様において、本発明の診断用組成物は、TMEM16Fを特異的に認識する抗体を含む。本発明の抗体は、TMEM16Fの全体または一部を抗原として作製すればよく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、本発明の抗体には、Fab、F2、およびFvのような抗体断片も含まれる。抗体の作製方法は当業界にて周知である例えばAntibodiesALaboratoryManualLaneHDetaledsColdSpringHarborLaboratoryPressNewYork1989を参照。以下、実施例により本発明を詳細に説明する。1.方法1細胞株、組換タンパク質、抗体、血清マウスインターロイキン依存性BaF3細胞は、RPMI10ウシ胎児血清、45ユニットml組換マウスIL3、および50μMβメルカプトエタノール含有中で維持した。Scott症候群患者およびその両親由来のEBV形質転換ヒト細胞株は、RPMI164010FCS、および50μMβメルカプトエタノール含有中で増殖させた。ヒト293T細胞は、10FCS含有DMEM中で培養した。PlatEパッケージング細胞非特許文献42は、10FCS含有DMEM中で増殖させた。組換マウスIL3は、既報のとおり非特許文献43、マウスIL3cDNAを有するウシパピローマウイルス発現ベクターにより形質転換されたマウスC127I細胞により産生された。Flag標識マウスMFGE8は、既報のとおり非特許文献44、ヒト293T細胞において産生され、分泌型MFGE8は抗FlagM2ビーズを用いて精製した。Ca2Mg2不含RPMI1640培地は、CellScienceTechnologyInstituteより購入した。Ca2不含RPMI培地は05mMMgSO4を含有した。Ca2不含FCSは、FCSを2日間PBSに対してバッファーを4回交換して透析することで調製した。2Ca2イオノフォアによる処理、フローサイトメトリー、および細胞ソーティングホスファチジルセリンを細胞表面に露出させるため、96ウェルマイクロタイタープレート中の細胞をPBSで洗浄し、200μlのHanksBalancedSaltSolutionに再懸濁し、A23187により37°Cで15分間処理した。この細胞を氷上で15分間25005000倍に希釈したCy5標識アネキシンV染色バッファー10mMHepesNaOHバッファーpH74、140mMNaClおよび25mMCaCl2含有中により5μgmlのヨウ化プロピジウムの存在下で染色した。フローサイトメトリーをFACSAriaまたはFACSCaliburで行い、データをFlowJoソフトウェアで解析した。Ca2イオノフォア誘発PS露出に感受性のBaF3細胞のサブラインは、FACSソーティングを繰り返すことで選択した。簡単に説明すると、2x107個のBaF3細胞HBSS中を37°Cで15分間A23187により処理し、これを事前に4°Cに冷却した1mlのアネキシンV染色バッファーに懸濁した。この細胞を前述のようにCy5アネキシンVにより氷上で染色し、インジェクションチャンバーを4°Cに維持したFACSAriaを用いてソーティングした。最も高いレベルのCy5蛍光シグナルを提供する細胞を回収し、10x105細胞mlよりも高い密度でCa2不含RPMI5透析FCS、45ユニットmlIL3、および50μMβメルカプトエタノール含有に再懸濁した。24時間後、細胞を通常のCa2含有RPMI培地に再懸濁し、次のソーティングのため増殖した。3cDNAライブラリーの構築全RNAをBaF3PS19細胞からRNeasyMiniKitを用いて調製し、ポリRNAをmRNAPurificationKitによりオリゴセルロースカラムクロマトグラフィーを2サイクル行って精製した。二本鎖cDNAをランダムなヘキサマーをプライマーとして用いてcDNA合成キットにより合成した。BstXIアダプターを付加し、このフラグメントを1アガロースゲルにおける電気泳動によってサイズに応じて分画した。25kbよりも長いDNAフラグメントをゲルからDNA抽出キットにより回収し、BstXI消化pMXsベクター非特許文献45にライゲートした。大腸菌DH10B細胞をGenePulserを用いてエレクトロポレーションにより形質転換した。約93x105個のクローンが産生され、プラスミドDNAをQIAfilterPlasmidMaxiKitにより調製した。4細胞融合BaF3PS0細胞およびBaF3PS19細胞にpMXspuroEGFPおよびpMXsneoDsRedをそれぞれ導入し、1μgmlのピューロマイシンまたは1mgmlのG418の存在下で培養した。BaF3PS0EGFP細胞とBaF3PS19DsRed細胞をPEG1500の存在下で融合し、1μgmlのピューロマイシンおよび1mgmlのG418の存在下で培養した。EGFPDsRed二重陽性細胞をFACSAriaを用いてソーティングした。5cDNAライブラリーのスクリーニングcDNAライブラリー由来のプラスミドDNAを、FuGENE6を用いたリポフェクションにより、18枚の10cmディッシュで増殖させた72x107個のPLATEパッケージング細胞非特許文献42に導入した。トランスフェクションの2日後、培養上清中のウイルスを6000xgで16時間遠心して4°Cで遠沈させ、RPMI1640培地10FCSおよび45ユニットmlIL3含有に再懸濁し、これを使用して72x106個のBaF3細胞に8μgmlのポリブレンの存在下で感染させた。24時間培養した後、培地を新鮮培地と置き換え、細胞をさらに2時間培養した。イオノフォア誘発PS露出に感受性の細胞のソーティングは、前述のとおり行った。6アネキシンV陽性BaF3細胞からのcDNAフラグメントの単離レトロウイルスベクターに組み込まれたcDNAを単離するため、BaF3形質転換細胞からWizardRGenomicDNAPurificationSystemを用いてゲノムDNAを抽出し、ExpandLongTemplatePCRSystemを用いてPCRにかけた。PCRプライマーはpMXsベクター由来の配列を有しており、PCRの条件は、96°C10秒、58°C30秒、および68°C4分、35サイクルであった。PCRフラグメントをpGEMTEasyvectorにクローニングし、ABIPRISM3100GeneticAnalyzerを使用してDNA配列解析を行った。7SCRαおよびその変異体のための発現ベクターFlag標識配列をレトロウイルスベクターpMXspuroのEcoRI部位とXhoI部位に組み込み、pMXspurocFlagを得た。マウスTMEM16Fの完全長コード配列およびヒトTMEM16Fの完全長コード配列を、BaF3細胞またはNamalwa細胞由来のmRNAを用いてRTPCRにより調製した。使用したプライマーは以下である:mTMEM16F5ATATGAATTCGACATGCAGATGATGACTAGGAA3配列番号8および5ATATGAATTCGACATGCAGATGATGACTAGGAA3配列番号9;hTMEM16F5ATATGAATTCGACATGAAAAAGATGAGCAGGAA3配列番号10および5ATATGAATTCTTCTGATTTTGGCCGTAAAT3配列番号11。PCRフラグメントをpMXspurocFlagのEcoRI部位に挿入し、cDNAの信頼性をDNA配列決定により検証した。発現プラスミドSCRαmRFPのため、pcDNAmRFP中のmRFPのコード配列をマウスTMEM16FのC末にフレームをあわせて結合し、pMXsベクターに導入した。8マウスBaF3細胞およびヒト293T細胞における発現Flag標識SCRαのためのpMXspuroにおける発現ベクターをPlatE細胞に導入した。産生されたレトロウイルスを前述のように濃縮し、BaF3に感染させ安定な形質転換体を樹立するために使用した。ピューロマイシンを含む培地中で細胞を培養することで形質転換体を選択した。SCRαmRFPを発現させるため、ヒト293T細胞にFuGENE6を用いたリポフェクションによりSCRαmRFP配列を有するpMXsベクターを導入した。一日後、導入細胞を蛍光顕微鏡により観察した。9ウェスタンブロッティング細胞をRIPAバッファーに溶解した。溶解物を5xSDSサンプルバッファー200mMTrisHCl、10SDS、25グリセロール、05βメルカプトエタノール、および005ブロモフェノールブルーと混合し、5分間煮沸し、10ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動により分離した。タンパク質をPVDFメンブレンに転写した後、メンブレンにHRP結合マウス抗FLAGM2を結合させ、ペルオキシダーゼ活性をWesternLightningRECLsystemにより検出した。10SCRαcDNAのRTPCRおよびScott症候群患者におけるSCRα染色体遺伝子の配列決定Scott患者およびその両親、並びに健常人対照に由来するEBV形質転換細胞株から全RNAを調製した。このRNAをSuperscriptIIIを用いて製造元のプロトコールにしたがい逆転写し、SCRαcDNAを以下のプライマーセットを用いたPCRにより解析した:Ex1FW配列番号12およびEx1112RV配列番号13Ex1112FW配列番号14およびEx20RV配列番号15Ex12FW配列番号16およびEx16RV配列番号17。ヒトSCRα染色体遺伝子の配列解析のため、ゲノムDNAをヒト細胞株から調製し、226bpのエクソン13およびその5および3フランキング領域を有する964bpのDNAフラグメントを以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した:5CCAGAGTATGCTACTAGTTG3配列番号18および5TCTCAGCAACCGAGGAACAT3配列番号19。PCR産物をWizardRSVPCRおよびGelCleanupSystemにより精製した。BigDyeTerminatorv31CycleSequencingkitを用いてプライマー5ACATATGTGGATGCGCCTTC3配列番号20によりサイクルシークエンシングを行い、ABIPRIZM3100GeneticAnalyzerにより解析した。11PSおよびPEの露出の解析PSおよびPEの露出を解析するため、初期指数増殖期の細胞をPBSで洗浄し、10mlの冷アネキシンV染色バッファーに25005000倍希釈のCy5標識アネキシンVまたは800倍希釈のビオチンRo090198非特許文献26とともに懸濁し、次いで10μgmlAPC標識ストレプトアビジン、および5μgmlPIを加えた。サンプルを氷上で15分間インキュベートし、FACSAriaまたはFACSCaliburにより前述のとおりフローサイトメトリーを行った。MFGE8の結合のため、細胞を10FCS含有RPMI1640に懸濁し、氷上で20分間04μgmlのFlag標識MFGE8D89E変異体非特許文献44とインキュベートした。細胞を上記培地で洗浄し、氷上で20分間10μgmlのマウスMFGE8に対するハムスターモノクローナル抗体mAbとインキュベートし、次いでPE標識マウス抗ハムスターIgGとともにインキュベートし、FACSAriaを用いたフローサイトメトリーにより解析した。細胞内Ca2の必要性を調べるため、細胞を10μMのBAPTAAM10FCS含有RPMI1640培地中と37°CでPS露出のため5分間またはPE露出のため60分間インキュベートした。この細胞をアネキシンV染色バッファーで洗浄し、Cy5アネキシンVまたはビオチンRo090198で前述のとおり染色した。Ca2誘発PS露出および同PE露出の速度論研究のため、細胞をPBSで洗浄し、10mlの冷アネキシンV染色バッファーに、Cy5標識アネキシンVまたはビオチンRo090198とAPC標識ストレプトアビジンの混合物、および5μgmlPIともに懸濁した。細胞を氷上でA23187と最終濃度025または05μMで混合し、20°Cまたは37°Cに設定したFACSAriaのインジェクションチャンバーにアプライし、A23187反応を誘導した。データを表示の期間記録し、PI陽性細胞を解析から除いた。12NBDPCおよびNBDSMの取り込みNBD脂質アナログの取り込みは、基本的にWilliamsonら非特許文献17が記載するようにフローサイトメトリーにより解析した。簡単に説明すると、細胞をHBSSで洗浄し、05mlのHBSS2mMCaCl2含有に再懸濁した。等量のHBSS2mMCaCl2および1μM1オレオイル26アミノヘキサノイルsnグリセロ3ホスホコリン、または1オレオイル26アミノヘキサノイルスフィンゴシン1ホスホコリン含有を細胞懸濁液に添加し、室温でインキュベートした。各時点で、150μlの細胞懸濁液を回収し、150μlの冷却済HBSS5mgml脂肪酸不含BSA取り込まれなかった蛍光脂質を抽出するためおよび500nMSytoxblue含有と混合した。全蛍光量を測定するため、サンプルをBSA非存在下でHBSSと混合した。10分間4°Cでインキュベートして脂質を抽出した後、細胞をFACSAriaにより、前方散乱、側方散乱、対数緑色蛍光、およびSytoxblue蛍光について解析した。Sytoxblue陽性の死細胞は解析から除いた。データは、FlowJoSoftwareにより解析した。BSA抽出に抵抗性のNBDリン脂質の蛍光を、細胞に取り込まれたものと評価した。Ca2イオノフォアの効果を調べるため、細胞をHBSSで洗浄し、05mlの冷HBSS2mMCaCl2含有に再懸濁し、氷上で7分間インキュベートした。冷HBSS02μMNBDPCまたはNBDSM含有を細胞懸濁液に添加し、氷上でさらに3分間インキュベートした。この細胞を次いでA23187と混合し、室温でインキュベートして脂質取り込みを誘導した。150μlのアリコートを用いて、前述のように取り込まれた脂質の量を測定した。13薄層クロマトグラフィー細胞をNBD標識PCとインキュベートした後、クロロホルムとメタノールの混合物により、リン脂質を細胞から抽出した。このリン脂質をシリカゲル60プレートにおける薄層クロマトグラフィーにより、クロロホルムアセトンメタノール酢酸水を溶媒として用いて分離した。プレート上の蛍光はLAS4000イメージアナライザーにより検出した。14細胞内Ca2およびCa2流入細胞内Ca2濃度を測定するため、細胞をHBSSに懸濁し、37°Cで10分間、04μMFluo4AMとともにインキュベートし、HBSSで洗浄し、そしてFACSAriaにより解析した。Ca2流入は、既報のとおり測定した非特許文献46。簡単に説明すると、細胞をFluo4AM10FCS含有RPMI中により30分間37°Cで標識した。アネキシンV染色バッファーで洗浄した後、細胞をアネキシンV染色バッファーに懸濁し、4°Cで維持した。この混合物にCa2イオノフォアA23187を最終濃度05μMで添加し、平均蛍光強度における変化をFACSCaliburシステムを用いて直接記録した。データはFlowJoSoftwareにより解析した。15shRNAピューロマイシン耐性遺伝子を有するpRSshRNAベクターにおけるマウスSCRαのためのshRNA発現プラスミドは、OriGeneから購入した。このSCRαに対するshRNAの標的配列は5CATCTACTCTGTGAAGTTCTTCATTTCCT3配列番号21であった。pRSにおけるスクランブルな無効のshRNAはOriGeneから購入した。BaF3細胞にshRNAを含むレトロウイルスを感染させ、10μgmlのピューロマイシンの存在下で培養した。ピューロマイシン耐性細胞を限界希釈によるクローニングに供した。SCRαmRNAをリアルタイムPCRにより定量し、SCRαの発現減少を示したクローンを以降の実験に使用した。2.結果1構成的にPSを発現するマウスBaF3細胞の樹立Ca2イオノフォアで細胞を処置すると、PS露出を起こさせることができる。本発明者らは、このプロセスがマウスB細胞株であるBaF3において低Ca2条件下で可逆的に生じることを見出した。すなわち、BaF3細胞をCa2イオノフォアであるA2318710μMにより15分間05mMCaCl2の存在下で処理すると、細胞がネクローシスを起こすか、破裂するか、またはヨウ化プロピジウムPI陽性となった。しかしながら、同じ処理をCa2非存在条件下で行うと、大部分の細胞がPSを露出するかアネキシンV陽性となり、またPI陽性集団は少なかった図1a。細胞内Ca2をBAPTAAMエチレングリコールNNNN四酢酸、テトラアセトキシメチルエステルでキレートすると、PS露出が阻害され図1b、このことはPS露出のプロセスが細胞内カルシウムの移動を必要とすることを示唆する。このPS露出は37°Cで少なくとも5分間図1c、またはA23187の除去後4°Cで数時間データ非提示、継続した。PS露出細胞をBAPTAAMにより37°Cで5分間処理する図1cか、あるいはCa2不含培地において37°Cで12時間培養するデータ非提示と、細胞表面からPSが除去された。これらの結果は、低Ca2条件下において、A23187が細胞内Ca2を移動させ、それによりリン脂質スクランブレースが活性化され、PSが露出されたことを示唆する。細胞内Ca2濃度が減少すると、リン脂質スクランブレースは活性を消失し、フリッパーゼによりPSが内葉に戻った。PS露出プロセスを明らかにするため、本発明者らは、低Ca2条件下のPS露出の可逆的性質を利用して、PSを過剰露出した細胞株を樹立した。マウスBaF3細胞を10μMA23187により添加カルシウム非存在下において処理し、PS露出に基づくFACSソーティングにかけた。強いアネキシンV染色を示す集団を回収し、15時間Ca2不含培地中で培養し、次いで通常培地に戻した。このソーティングと増殖のサイクルを12回繰り返した後、選択された細胞は、より低い濃度のA23187による処理でも元のBaF3細胞より約100倍高いアネキシンVによる平均染色を示した図1d。このソーティングと増殖をさらに7回繰り返し、得られた細胞株を以下の実験に使用した。BaF3PS19における強いPS露出の原因には2つの可能性があった。1つはリン脂質スクランブレースの過剰発現または過活性化であり、もう1つはフリッパーゼの不活性化であった。いずれの可能性が正しいのか調べるため、DsRed発現BaF3PS19をGFP標識親BaF3細胞と融合した。このハイブリッド細胞の10μMA23187に対するPS露出応答は、BaF3PS19と同様か、あるいはわずかに低く図1e、このことはBaF3PS19の表現型がBaF3PS0の表現型より優勢であること、およびリン脂質スクランブレースがBaF3PS19において過活性化されていることを示唆する。この明らかに増強されたリン脂質スクランブレース活性に関与する遺伝子スクランブレースαと称するを同定するため、レトロウイルスベクターにおけるcDNAライブラリーをBaF3PS19から調製し、親BaF3細胞に導入した。安定な形質細胞を125nMA23187で処理し、アネキシンVにより強く染色された集団約06をソーティングし、増殖した図1f。ソーティングと増殖の3回目のサイクルPS3において、約35の細胞が構成的にすなわち、A23187処理なしでPSを露出し、この細胞集団をさらなる特徴決定のため増殖した。2SCRαの分子クローニングおよびPS露出に対するその効果LDPS4細胞には23の異なるcDNAが組み込まれていたが、TMEM16FcDNAは2つの独立した実験独立したcDNAライブラリーによる形質転換およびFACSソーティングにおいて存在し、このことからTMEM16FがSCRαであることが示唆された。異なる実験で同定された2つのSCRαcDNAは、異なる5末端を有していたにも関わらず、第2の細胞内ループに位置するコドン409のアスパラギン酸をグリシンに置換するヌクレオチド1226のAからGへの移行変異をいずれも有していた図2a。最近、TMEM16ファミリーの別のメンバーであるTMEM16AがCa2依存的Clチャンネルであることが示された非特許文献19-21。しかしながら、TMEM16FのClチャンネル活性はTMEM16Aと比較して非常に低かった非特許文献22。SCRαの機能を調べるため、SCRαの野生型フォームおよび変異型フォームのC末端にFlagまたはmRFPを付加し、BaF3細胞またはヒト293T細胞において発現させた。BaF3細胞由来の細胞溶解物の抗Flag抗体によるウェスタンブロッティングによって、SDSPAGEにおいて125kDaと500kDaに幅の広いバンドが示され図2b、マウスSCRαがグリコシル化されており、加えて/あるいは、凝集していることが示唆された。SCRαmRFPキメラタンパク質を発現する293T細胞の観察により、SCRαが細胞膜に存在することが示唆された図2c。アネキシンVは、D409G変異体を発現するBaF3細胞には結合したが、野生型SCRαを発現するBaF3細胞には結合せず図2d、SCRα変異体を発現する細胞が構成的にPSを露出していることが示唆された。このことは、ホスファチジルセリンに特異的に結合するMFGE8ラクトアドヘリン非特許文献23、24がD409G変異体発現細胞に結合したことにより確認された図6。細胞内Ca2をBAPTAAMによりキレートすると、SCRα変異体発現細胞における露出PSのレベルが減少した図2d。野生型SCRαを発現する細胞をA23187で処理すると、PSが遅滞なく露出し、ベクターで形質転換したBaF3よりも迅速に飽和レベルに到達した図2e。Fluo4AM染色により決定された細胞内Ca2濃度は、ベクター、野生型SCRα、およびD409G変異体SCRα発現細胞の間で類似していた非特許文献25、26で染色した。図3aに示すように、この変異体を発現する細胞はROにより染色され、PSのように通常は内葉に隔離されているリン脂質であるPEを構成的に露出していることが示唆された。BaF3のA23187による処理もまた、PS露出を起こさせた。このプロセスは、野生型SCRαを過剰発現させることにより促進された図3b。前述のとおり、リン脂質スクランブレースはリン脂質の2方向性の輸送を仲介するはずである。1オレオイル26アミノドデカノイルsnグリセロ3ホスホコリンを培養物に添加すると、D409G変異体発現細胞に迅速に取り込まれた図3c。すなわち、細胞に結合したNBDPCのうち、40を超えるNBDPCが6分以内にBSA抽出に対して抵抗性となった。野生型SCRαを過剰発現する細胞をA23187で処理すると、これら細胞は親細胞よりも速くNBDPCを取り込み、細胞に結合したNBDPCの約25が4分以内に細胞内に観察された図3d。取り込まれたNBDPCは細胞内で無傷であり図7、その取り込みが細胞内における迅速なNBDPCの分解によるものでないことが示唆された。同様の結果、すなわち、変異体SCRα発現細胞による構成的取り込みと、野生型SCRα発現細胞による増強されたA23817誘発取り込みが、NBDSMについて得られた図3eおよび3f。これら結果から、SCRαがCa2依存的に様々なリン脂質の細胞膜外葉から内葉への内向きの輸送を仲介しうることが示唆された。リン脂質のスクランブリングにおける内因性の細胞SCRαの役割を確認するため、マウスSCRα特異的shRNA発現プラスミドを野生型BaF3細胞に導入することにより、内因性SCRαの発現をノックダウンした。図4aおよび図8に示すように、リアルタイムPCRで評価した5つの形質転換体におけるSCRαmRNAの発現レベルは、対照のshRNAを発現する細胞の発現レベルの2035に減少した。10μMのA23187の15分間の処理により誘導されるこれら形質転換体のPS露出は、対照のshRNAにより形質転換されたBaF3と比較してそれほど顕著ではなかった。アネキシンVとRo090198の結合により検出されるPSおよびPEのA23817誘導露出の割合は、SCRαノックダウン細胞において減少した図4bおよび4c。同様に、NBDPCとNBDSMの取り込みは、shRNA形質転換細胞の方が低かった図4dおよび4e。4Scott症候群の患者におけるSCRαのスプライスサイト変異Scott症候群の患者から得た血小板および他の血液細胞は、Ca2イオノフォアに応答してPSを露出する能力に欠ける非特許文献27。Kojimaら非特許文献28は、Scott症候群患者および患者の両親から、EBV形質転換B細胞株を樹立した。先の報告非特許文献17、28と一致して、患者由来の細胞はCa2イオノフォアに応答してPSを露出しなかった図5a。これに対して、患者の両親由来の細胞株では、A23187は無関係な健常ボランティア由来の細胞株と同じレベルでPS露出を誘導した。患者のSCRα遺伝子の欠損を調べるため、患者および両親からRNAを調製し、SCRαmRNAを、5’側半分と3’側半分の2つの部分においてPCRにより解析した。5’側半分の1320bpのDNAフラグメントは患者と両親で同一であったが、患者由来の3’側半分のフラグメントは両親のフラグメントより短かった図5b。DNA配列解析により、患者のcDNAはエクソン13に相当する226bpの配列が欠けていることが示唆された。染色体DNAの直接配列決定により、患者のSCRα遺伝子はイントロン12におけるコンセンサススプライスアクセプターサイトにGからTへのホモ接合性の変異を有するが、両親はこの位置の変異がヘテロ接合性であることが示唆された図5c。エクソン12および16に結合するように設計されたプライマーを用いたSCRαmRNAのPCR解析により、対照の細胞株からは608bpのバンドが、Scott症候群の患者の細胞株からは382bpのバンドが示され図5d、スプライスアクセプターサイトの変異によってエクソン13がスキップされたことが示唆された。このスキッピングは、フレームシフトを生じさせ、その結果ヒトSCRαの第3の膜貫通部分図5fをコードするはずのエクソン14においてタンパク質が未成熟に終結する図5e。患者の両親においてエクソン13欠損型のSCRαmRNAの濃度が低いこと図5dは、ナンセンス変異によるmRNAの減衰非特許文献29により説明できる可能性がある。以上のとおり、TMEM16FSCRαが細胞膜におけるリン脂質の分布を制御するリン脂質スクランブレースであること、およびTMEM16Fが血小板表面へのPSの移動障害を原因とする出血性疾患であるScott症候群の原因遺伝子であることが明らかとなった。よって、TMEM16Fは血液凝固調節物質の新規ターゲットとして有用である。以下の文献は引用により本明細書に含まれる。[先行技術文献][非特許文献]1LeventisPAGrinsteinSTheDistributionandFunctionofPhosphatidylserineinCellularMembranesAnnuRevBiophys394074272LentzBExposureofplateletmembranephosphatidylserineregulatesbloodcoagulationProgLipidRes424234383BalasubramanianKSchroitAJAminophospholipidasymmetryAmatteroflifeanddeathAnnuRevPhysiol657017344NagataSHanayamaRKawaneKAutoimmunityandtheclearanceofdeadcellsCell1406196305DalekeDPhospholipidflippasesJBiolChem2828218256FolmerDElferinkRPaulusmaCP4ATPaseslipidflippasesandtheirroleindiseaseBiochimBiophysActa17916286357OramJVaughanAABCA1mediatedtransportofcellularcholesterolandphospholipidstoHDLapolipoproteinsCurrOpinLipidol112532608WilliamsonPetalTransbilayerphospholipidmovementsinABCA1deficientcellsPLoSONE2e7299ZhaoJZhouQWiedmerTSimsPJLevelofexpressionofphospholipidscramblaseregulatesinducedmovementofphosphatidylserinetothecellsurfaceJBiolChem2736603660610ZhouQetalMolecularcloningofhumanplasmamembranephospholipidscramblaseAproteinmediatingtransbilayermovementofplasmamembranephospholipidsJBiolChem272182401824411SchlegelRWilliamsonPPStoPSpertinentproteinsinapoptoticcellclearanceSciSTKE2007pe5712SahuSGummadiSManojNAradhyamGPhospholipidscramblasesanoverviewArchBiochemBiophys46210311413WiedmerTZhaoJNanjundanMSimsPPalmitoylationofphospholipidscramblase1controlsitsdistributionbetweennucleusandplasmamembraneBiochemistry421227123314ZhouQZhaoJWiedmerTSimsPJNormalhemostasisbutdefectivehematopoieticresponsetogrowthfactorsinmicedeficientinphospholipidscramblase1Blood994030403815GaliettaLTheTMEM16proteinfamilyanewclassofchloridechannelsBiophysJ973047305316WeissHLagesBFamilystudiesinScottsyndromeBlood9047547617WilliamsonPetalPhospholipidscramblaseactivationpathwaysinlymphocytesBiochemistry408065807218WieldersSJetalAbsenceofplateletdependentfibrinformationinapatientwithScottsyndromeThrombHaemost102768219CaputoAetalTMEM16AamembraneproteinassociatedwithcalciumdependentchloridechannelactivityScience32259059420SchroederBChengTJanYJanLExpressioncloningofTMEM16AasacalciumactivatedchloridechannelsubunitCell1341019102921YangYetalTMEM16AconfersreceptoractivatedcalciumdependentchlorideconductanceNature4551210121522SchreiberRetalExpressionandfunctionofepithelialanoctaminsJBiolChem2857838784523ShiJGilbertGLactadherininhibitsenzymecomplexesofbloodcoagulationbycompetingforphospholipidbindingsitesBlood1012628263624HanayamaRTanakaMMiwaKNagataSExpressionofdevelopmentalendotheliallocus1inasubsetofmacrophagesforengulfmentofapoptoticcellsJImmunol1723876388225EmotoKToyamaSorimachiNKarasuyamaHInoueKUmedaMExposureofphosphatidylethanolamineonthesurfaceofapoptoticcellsExpCellRes23243043426AokiYUenakaTAokiJUmedaMInoueKAnovelpeptideprobeforstudyingthetransbilayermovementofphosphatidylethanolamineJBiochem11629129727TotiFSattaNFressinaudEMeyerDFreyssinetJScottsyndromecharacterizedbyimpairedtransmembranemigrationofprocoagulantphosphatidylserineandhemorrhagiccomplicationsisaninheriteddisorderBlood871409141528KojimaHetalProductionandcharacterizationoftransformedBlymphocytesexpressingthemembranedefectofScottsyndromeJClinInvest942237224429ShyuAWilkinsonMvanHoofAMessengerRNAregulationtotranslateortodegradeEMBOJ2747148130KavathasPHerzenbergLAAmplificationofagenecodingforhumanTcelldifferentiationantigenNature30638538731SudaTTakahashiTGolsteinPNagataSMolecularcloningandexpressionoftheFasligandanovelmemberofthetumornecrosisfactorfamilyCell751169117832BerridgeMBootmanMRoderickHCalciumsignallingdynamicshomeostasisandremodellingNatRevMolCellBiol451752933HartzellHCYuKXiaoQChienLTQuZAnoctaminTMEM16familymembersareCa2activatedClchannelsJPhysiol5872127213934FerreraLetalRegulationofTMEM16AchloridechannelpropertiesbyalternativesplicingJBiolChem284333603336835ZwaalRComfuriusPBeversEScottsyndromeableedingdisordercausedbydefectivescramblingofmembranephospholipidsBiochimBiophysActa163611912836BrooksMetalAgenomewidelinkagescaninGermanshepherddogslocalizescanineplateletprocoagulantdeficiencytocaninechromosome27Gene450707537BrooksMCatalfamoJBrownHIvanovaPLovaglioJAhereditarybleedingdisorderofdogscausedbyalackofplateletprocoagulantactivityBlood992434244138SchoenwaelderSMetalTwodistinctpathwaysregulateplateletphosphatidylserineexposureandprocoagulantfunctionBlood11466366639MiyanishiMetalIdentificationofTim4asaphosphatidylserinereceptorNature45043543940KaganVEetalAroleforoxidativestressinapoptosisoxidationandexternalizationofphosphatidylserineisrequiredformacrophageclearanceofcellsundergoingFasmediatedapoptosisJImmunol16948749941TyurinaYYetalLipidantioxidantetoposideinhibitsphosphatidylserineexternalizationandmacrophageclearanceofapoptoticcellsbypreventingphosphatidylserineoxidationJBiolChem2796056606442MoritaSKojimaTKitamuraTPlatEanefficientandstablesystemfortransientpackagingofretrovirusesGeneTher71063106643FukunagaRIshizakaIkedaENagataSPurificationandcharacterizationofthereceptorformurinegranulocytecolonystimulatingfactorJBiolChem265140081401544HanayamaRetalIdentificationofafactorthatlinksapoptoticcellstophagocytesNature41718218745KitamuraTetalRetrovirusmediatedgenetransferandexpressioncloningpowerfultoolsinfunctionalgenomicsExpHematol311007101446BernhagenJetalMIFisanoncognateligandofCXCchemokinereceptorsininflammatoryandatherogeniccellrecruitmentNatMed1358759647CastoldiEetalCompoundheterozygosityfor2novelTMEM16FmutationsinapatientwithScottsyndromeBlood11743994400"