"ClogPの値が11より小さい脂質からなる水溶性脂質成分Fwが溶解した水性溶媒W1を内水相とすることを特徴とする単胞リポソーム。前記水溶性脂質成分Fwが、リゾ脂質、短鎖リン脂質、PEG脂質および親水性基を有する化学合成脂質からなる群より選ばれる少なくとも1種を含有するものである、請求項1に記載の単胞リポソーム。前記水性溶媒W1にさらに水溶性薬剤が溶解している、請求項1または2に記載の単胞リポソーム。請求項1~3のいずれかに記載の単胞リポソームの乾燥粉末。請求項1~3のいずれかに記載の単胞リポソームを含有する、または請求項4に記載の乾燥粉末を水性溶媒に添加して得られる、水性懸濁液。下記工程1~3を含むことを特徴とする、単胞リポソームの製造方法:1水性溶媒W1に水溶性脂質成分Fwを溶解し、有機溶媒Oに当該水溶性脂質Fw以外の混合脂質成分F1を溶解し、これらを混合乳化することによりW1/Oエマルションを調製する一次乳化工程;2上記工程1を経て得られたW1/Oエマルションと水性溶媒W2とを混合乳化することによりW1/O/W2エマルションを調製する二次乳化工程;3上記工程2を経て得られたW1/O/W2エマルションに含まれる有機溶媒を除去することによりリポソームの水性懸濁液を調製する溶媒除去工程。前記水溶性脂質成分Fwが、リゾ脂質、短鎖リン脂質、PEG脂質および親水性基を有する化学合成脂質からなる群より選ばれる少なくとも1種を含有するものである、請求項6に記載の製造方法。前記一次乳化工程1がさらに水溶性薬剤を添加して行われるものである、請求項7に記載の製造方法。前記溶媒除去工程3がW1/O/W2エマルションの撹拌下に行われるものである、請求項7または8に記載の製造方法。請求項7~9のいずれかに記載の製造方法により製造された単胞リポソームあるいはその水性懸濁液またはその乾燥粉末。本発明は、水溶性薬剤のリポソームへの高内包率を実現させることができるとともに、W/O/Wエマルションの経時安定性を向上させ、そのプロセスにおいて内包率を維持させることができる単胞リポソームの製造方法、ならびにそのような製造方法により得られる、水溶性薬剤の高内包率の実現した単胞リポソームを提供することを目的とする。本発明者らは、二段階乳化法によりリポソームを製造する際に内水相に水溶性脂質を添加することにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、ClogPの値が11より小さい脂質からなる水溶性脂質成分Fwが溶解した水性溶媒W1を内水相とすることを特徴とする単胞リポソームを提供する。前記水溶性脂質成分Fwは、リゾ脂質、短鎖リン脂質、PEG脂質および親水性基を有する化学合成脂質からなる群より選ばれる少なくとも1種を含有するものであることが好ましい。前記水性溶媒W1にはさらに水溶性薬剤が溶解していることが好ましい。また、本発明は、上記の単胞リポソームの乾燥粉末や、上記の単胞リポソームを含有する、または上記の乾燥粉末を水性溶媒に添加して得られる、水性懸濁液を提供する。あわせて、本発明は、下記工程1~3を含むことを特徴とする、単胞リポソームの製造方法を提供する:1水性溶媒W1に水溶性脂質成分Fwを溶解し、有機溶媒Oに当該水溶性脂質Fw以外の混合脂質成分F1を溶解し、これらを混合乳化することによりW1/Oエマルションを調製する一次乳化工程;2上記工程1を経て得られたW1/Oエマルションと水性溶媒W2とを混合乳化することによりW1/O/W2エマルションを調製する二次乳化工程;3上記工程2を経て得られたW1/O/W2エマルションに含まれる有機溶媒を除去することによりリポソームの水性懸濁液を調製する溶媒除去工程。前記水溶性脂質成分Fwは、リゾ脂質、短鎖リン脂質、PEG脂質および親水性基を有する化学合成脂質からなる群より選ばれる少なくとも1種を含有するものであることが好ましい。前記一次乳化工程1は、さらに水溶性薬剤を添加して行われることが好ましい。前記溶媒除去工程3は、W1/O/W2エマルションの撹拌下に行われることが好ましい。本発明は、上記いずれかの製造方法により製造された単胞リポソームあるいはその水性懸濁液またはその乾燥粉末も提供する。なお、本発明において、単胞リポソームULV、単核リポソームと同義であるは、単一の内水相を有するリポソーム構造物を指し、通常は体積平均粒径の範囲が約20~500nmである。これに対して、多胞リポソームMVLmultivesicularliposomesは、複数の非同心円状の内水相を包囲する脂質膜を含んでなるリポソーム構造物を指し、また多重膜リポソームMLVは、複数のタマネギの皮のような同心円状の膜を有し、その間に殻様の同心円状の水系コンパートメントがあるリポソーム構造物を指す。多胞リポソームおよび多重膜リポソームの特徴は、体積平均粒径がマイクロメーターの範囲であり、通常は0.5~25μmである。所定の水溶性脂質を内水相に添加することによりリポソームの内膜側の安定性が改善され、W/O/Wエマルションを撹拌または放置してO相油相を除去する工程を含むような方法でリポソームを製造する場合であっても、水溶性の薬剤の内包率の低下を抑制することができる。従来、このようなリポソームの製造方法においてW/O/Wエマルションの作製が容易に進行するのは、O相がオリーブ油やデカン、ヘキサデカンといった沸点の高い油の場合であることが知られており、一方で、水より沸点の低い有機溶媒をO相に用いる場合はW/O/Wエマルションの作製は容易ではなく、これは有機溶媒の表面張力が低いために粒子の球形を維持する力が足りないため、と解釈されていた。本発明により、水より沸点の低い有機溶媒をO相に用いる場合もW/O/Wエマルションの作製が容易になり、水溶性薬剤の内包率が比較的高いリポソームが得られやすくなる。なお、上記の効果が生み出される原理は必ずしも明確にはなっていないが、たとえば、水溶性脂質がリポソーム膜の内壁近傍に集積することにより当該膜が強化されていること、あるいは、薬剤の種類によっては一部がリポソーム膜中に混入して膜を乱し、それにより膜の強度が低下する場合があったところ、そのような混入を防止できていることなどが考えられる。また、水溶性脂質が乳化剤のような機能を有し、乳化挙動をよくしているあるいは水溶性脂質が逆ミセルを形成して薬剤に作用し、その溶解度をコントロールしているということも考えられる。-製造原料-水溶性脂質成分Fw本発明において、水溶性脂質成分とは、ClogPの値が11より小さい脂質からなる成分をさす。ClogPは、有機化合物の水と1-オクタノールに対する親和性を示す係数であり、CambridgeSoft社の分子構造解析、物性計算ツールであるChemBioDrawUltra等により計算することができる。これは、実験によって水と1-オクタノールに対する溶解量を測定し、その比で表わされる分配係数を計算によって算出した値である。ClogPが大きければ相対的に1-オクタノールに溶けやすいことを表し、ClogPが小さければ相対的に水に溶けやすいことを表している。本発明に用いることのできる水溶性脂質としては、このClogPが11より小さい値を示すものであればよく、その中でもリゾ脂質、短鎖リン脂質、PEG脂質および親水性基を有する化学合成脂質が好ましい。これらの水溶性脂質は、いずれか1種を単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。水溶性脂質成分Fwの水性溶媒W1への添加量は、発明の作用効果および用いる水溶性脂質成分Fwの水への溶解量を考慮しながら適切な範囲で調整することができる。リゾ脂質は、グリセロリン脂質の一種で、グリセロールの1位または2位に結合した脂肪酸のいずれか一方が除かれたモノアシルグリセロリン脂質であり、たとえば、リゾレシチンリゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロールが挙げられる。短鎖リン脂質は、グリセロリン脂質またはスフィンゴリン脂質のうち、結合した脂肪酸の炭素数が少ないたとえば2~10のものであり、たとえば、ジデカノイルホスファチジルコリンが挙げられる。PEG脂質は、脂質にPEGポリエチレングリコール鎖を導入した誘導体であり、一方、親水性基を有する化学合成脂質は、脂質にPEG鎖以外の親水性基を導入した誘導体である。上記脂質としてはリン脂質やコレステロールなどが挙げられる。また、PEG鎖以外の親水性基としては、糖鎖、アルコール基、アミノ基、チオール基およびカルボン酸基、ならびにこれらを組み合わせたアミノ酸の鎖が挙げられる。特に親水性基として糖鎖を有する化学合成脂質合成ステロールの詳細は、たとえば国際公開WO2008/081686に開示されている。混合脂質成分F1F2一次乳化工程で有機溶媒Oに溶解する混合脂質成分F1は主としてリポソームの脂質二重膜の内膜を構成し、場合によっては外膜の構成にも寄与する。一方、必要に応じて二次乳化工程で添加する混合脂質成分F2は主としてリポソームの外膜を構成する。混合脂質成分F1およびF2は、同一の組成であっても、異なる組成であってもよい。これらの混合脂質成分の配合組成は特に限定されるものではなく、公知のリポソームの配合組成に準じたものとすることができる。一般的には、リン脂質動植物由来のレシチン;ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸またはそれらの脂肪酸エステルであるグリセロリン脂質;スフィンゴリン脂質;これらの誘導体等と、脂質膜の安定化に寄与するステロール類コレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、これらの誘導体等とを中心に構成され、さらに糖脂質、グリコール、脂肪族アミン、長鎖脂肪酸オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸等、その他各種の機能性を賦与する化合物が配合されていてもよい。また、F2には、たとえばPEG化リン脂質のような、リポソーム表面を修飾して各種の機能性を賦与するための脂質を配合することも可能である。これらの化合物の混合脂質成分中の配合比も、脂質膜の安定性やリポソームの生体内での挙動などの性状を考慮しながら、用途に応じて適切に調整すればよい。水性溶媒W1W2、有機溶媒O水性溶媒W1およびW2ならびに有機溶媒Oは、公知のリポソームの製造方法でも用いられているような、一般的なものを用いることができる。一次乳化工程で用いられる水性溶媒W1および有機溶媒Oは、それぞれW1/Oエマルションの水相および油相をなし、二次乳化工程で用いられる水性溶媒W2は、W1/O/W2エマルションの外水相をなす。水性溶媒としては、たとえば純水に必要に応じて水と混合する他の溶媒、浸透圧調整のための塩類糖類、pH調整のための緩衝液などを配合したものが挙げられる。有機溶媒としては、たとえばヘキサンn-ヘキサンやクロロホルム、シクロヘキサン、1,2‐ジクロロエテン、ジクロロメタン、1,2‐ジメトキシエタン、1,1,2‐トリクロロエテン、t‐ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、ペンタンなどの非水溶性有機溶媒が挙げられる。また、アセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノール、2‐プロパノールなどの水溶性有機溶媒や、上記以外のエーテル、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化エーテル、エステル類が挙げられる。なかでもクロロホルム、シクロヘキサン、ジクロロメタン、ヘキサン、t‐ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、ペンタン、アセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノール、2‐プロパノールなどが好ましい。溶媒除去工程を考慮すると有機溶媒は揮発性の化合物が好ましく、水よりも沸点の低い化合物が好ましい。これらの化合物は、いずれか1種単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。たとえば、得られるナノサイズのW1/Oエマルションの単分散性が良好なものとなることから、ヘキサンを主成分50体積以上とする有機溶媒、好ましくはヘキサンが60体積以上である有機溶媒を有機溶媒Oとすることも好ましい。水溶性薬剤リポソームに内包させる水溶性物質本発明における、リポソームに内包させる水溶性の物質水溶性薬剤と称する。は特に限定されるものではなく、リポソームの用途に応じて医薬品、化粧品、食品などの分野で知られている各種の物質を用いることができる。ただし、そのような水溶性薬剤には、前述した水溶性脂質成分は包含されない。水溶性薬剤のうち、医療用のリポソームなどに用いられるものとしては、たとえば、造影剤X線造影用の非イオン性ヨード化合物、MRI造影用のガドリニウムとキレート化剤とからなる錯体等、抗がん剤アドリアマイシン、ビラルビシン、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、マイトマイシン、5-フルオロウラシル、イリノテカン、エストラサイト、エピルビシン、カルボプラチン、イントロン、ジェムザール、メソトレキセート、シタラビンアイソボリン、テガフール、シスプラチン、エトポシド、トポテシン、ビラルビシン、ネダプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド、テスパミン、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバチン、エノシタビン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、ダウノマイシン、アクラルビシン、イビルビシン、アムルビシン、アクチノマイシン、タキソテール、トラスツブマブ、リツキシマブ、ゲムツズマブ、レンチナン、シゾフィラン、インターフェロン、インターロイキン、アスパラギナーゼ、ホスフェストロール、ブスルファン、ボルテゾミブ、アリムタ、ベバシズマブ、ネララビン、セツキシマブ等、抗菌剤マクロライド系抗生物質、ケトライド系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、オキサセフェム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、ベータラクタマーゼ配合剤、アミノグリコシド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、カルバペネム系抗生物質、ペネム系抗生物質、MRSAVREPRSP感染症治療剤、ポリエン系抗真菌剤、ピリミジン系抗真菌剤、アゾール系抗真菌剤、キャンディン系抗真菌剤、ニューキノロン系合成抗菌剤、抗酸化性剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進性剤、保湿剤、ホルモン剤、ビタミン類、核酸DNAもしくはRNAのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、プラスミド、ベクター、mRNA、siRNA等、タンパク質酵素、抗体、ペプチド等、ワクチン製剤破傷風などのトキソイドを抗原とするもの;ジフテリア、日本脳炎、ポリオ、風疹、おたふくかぜ、肝炎などのウイルスを抗原とするもの;DNAまたはRNAワクチン等などの薬理的作用を有する物質や、色素蛍光色素、キレート化剤、安定化剤、保存剤などの製薬助剤が挙げられる。水溶性薬剤を内包させる目的は、水溶性薬剤を内水相に溶解することによって達成される。したがって水溶性の高い薬剤は、内水相に高濃度で溶解すれば、内包される絶対量は増やすことができる。一方、内水相の量は適宜変えることができ、所定の粒径の粒子を作成しようとすれば、それに必要な脂質の量は計算できる。たとえば、100nmのW1Oエマルションを形成する場合、W1相10mLで製造すれば20x1015個のW1O粒子が生成する計算である。一方、100nmのW1Oナノエマルションはリン脂質分子04x105個で構成されている、と計算される。したがって、薬液10mLの1次乳化に必要な脂質量は、20x1015個x04x105個=08x1020個、すなわち0132mmolである。レシチン以外の脂質分子も、その表面積はおおよそ07nm2として差し支えないため、脂質の総量として0132mmolが100nmのW1Oナノエマルションを作成するのに必要最少量と考えられる。リポソームを作成するには、その倍の0264mmolが必要であり、代表的なリン脂質のDPPCで分子量換算すると193mgが必要である。そこで、薬剤を10mLに溶解し、100nmのリポソームを作成する場合を考えると、薬局法記載の通りシタラビンは01~10g溶解するので、薬剤重量比01g0193g~10g0193g、イオヘキソールは10g以上溶解するので、薬剤重量比10g0193g以上である。これは、脂質量を低減して効率的に薬剤を内包できることを意味し、脂質の投与量を減らすことができる点、臨床上有意義であり、本手法により薬剤重量比05~5が達成できる。さらに、より多くの薬剤を溶解すると、一般的に飽和状態に近づき粘度が上昇する。本手法により、内水相の粘度として10mPasまで内包可能である。また、100nmより大きい粒子を製造する場合には、脂質の必要量はそれより少なくて済むので、より効率的ということになる。リポソームおよびその水性懸濁液本発明のリポソーム、典型的には以下に説明するような本発明の製造方法により得られるリポソームは、水溶性脂質成分Fwが溶解した水性溶媒W1を内水相とするものであり、水溶性脂質成分が溶解していない水性溶媒を内水相とするものに比べて高い薬剤の内包率を達成することができる。本発明のリポソームは、典型的には以下に説明するような本発明の製造方法により、水性溶媒W2:外水相に懸濁した状態で得られる。このようなリポソームの水性懸濁液が各種の用途に供されるが、使用されるまでの間、たとえば凍結乾燥法などにより粉末状態のリポソームとして保存することもできる。使用の際には、粉末状態のリポソームを水性溶媒に添加し、再度懸濁させればよい。本発明のリポソームのサイズは特に限定されるものではないが、たとえば、体積平均粒子径が50~1,000nmとなるよう調整することができる。特に体積平均粒子径が50~200nmのリポソームは、毛細血管を閉塞するおそれがほとんどなく、またがん組織近辺の血管にできる間隙を通過することもできるため、医薬品等として人体に投与して使用する上で好都合である。なお、本発明における、リポソームおよびエマルションの体積平均粒子径は、動的光散乱法により測定されるものであり、たとえば、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計UPA-EX150、日機装株式会社を用いて算出することができる。リポソームの場合には、リポソームの水性懸濁液をたとえば等張PBS溶液で10倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計を用いて粒度分布や体積平均粒子径を算出することができ、エマルションの場合には、エマルションたとえば、W1/Oエマルションをたとえばクロロホルム/ヘキサン混合溶媒で10倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計を用いて粒度分布や体積平均粒子径を算出することができる。-リポソームの製造方法-本発明のリポソームの製造方法は、少なくとも下記工程1~3を含み、必要に応じてその他の工程をさらに含むことができるものである。1一次乳化工程一次乳化工程は、水性溶媒W1に水溶性脂質成分Fwを溶解し、有機溶媒Oに当該水溶性脂質Fw以外の混合脂質成分F1を溶解し、これらを混合乳化することにより、W1/Oエマルションを調製する工程である。W1/Oエマルションを調製するための方法は特に限定されるものではなく、従来のリポソームの製造方法でも用いられているような方法を採用することができる。たとえば、超音波乳化機、撹拌乳化機、膜乳化機、高圧ホモジナイザーなどの装置を用いた乳化方法が挙げられるが、平均粒径を広い範囲で制御でき、かつ得られるW1/Oエマルションが単分散性となるような方法が好ましい。水性溶媒W1のpHは、通常3~10の範囲で調節され、たとえば、混合脂質成分にオレイン酸を用いる場合、pHは6~8.5とすることが好ましい。pHを調整するためには適切な緩衝液を用いればよい。一次乳化工程におけるその他の条件、たとえば、混合脂質成分F1の量有機溶媒Oに対する割合、有機溶媒Oと水性溶媒W1の体積比、W1/Oエマルションの平均粒径などは、公知のリポソームの製造方法一次乳化工程に準じて、続く二次乳化工程の条件や最終的に調製するリポソームの態様などを考慮しながら、適宜調節することができる。通常、混合脂質成分F1の量は有機溶媒Oに対して1~50質量の割合であり、有機溶媒Oと水性溶媒W1の体積比は100:1~1:2である。W1/Oエマルションの体積平均粒径は、好ましくは50~1,000nmであり、より好ましくは50~200nmである。本発明では、リポソームに水溶性薬剤を内包させるために、i一次乳化工程の際に水溶性薬剤を添加し、水性溶媒W1に水溶性薬剤を溶解させ、二次乳化工程終了時点でそれを内包するリポソームが得られるようにする方法、ii水溶性薬剤を内包しない空のリポソームを得た後に、そのリポソームが分散している水性溶媒またはそのリポソームの凍結乾燥物を再分散させた水性溶媒に水溶性薬剤を添加し、撹拌するなどして、リポソームにそれを取り込ませる方法、いずれを用いることもできる。本発明の製造方法では、上記iの方法を用いた場合であっても内包率が比較的高く、効率的にリポソームに水溶性薬剤を内包させることができる。なお、必要であれば、脂溶性の物質脂溶性薬剤を、本発明のリポソームの脂質膜内に内包させることも可能である。その場合は、脂溶性薬剤を、上記iのように一次乳化工程の際に添加して有機溶媒Oに溶解させておくか、上記iiのように空のリポソームを得た後に添加するようにすればよい。2二次次乳化工程二次乳化工程は、上記工程1により得られたW1/Oエマルションと水性溶媒W2とを混合乳化することによりW1/O/W2エマルションを調製する工程である。W1/O/W2エマルションを調製するための方法は特に限定されるものではなく、従来のW1/O/W2エマルションの製造方法でも用いられているような方法を採用することができる。たとえば、乳化操作時の液滴の崩壊および液滴からの内包物質の漏出を抑えるため、乳化処理に大きな機械的剪断力を必要としないマイクロチャネル乳化法を用いることが好適である。マイクロチャネル乳化法では、たとえば、シリコン製マイクロチャンネル基板およびこの基板上部を覆うガラス板から構成される、マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用する。上記基板およびガラス板により形成される溝型マイクロチャネルの出口側、あるいは上記基板上に加工された貫通型マイクロチャネルの出口側には、外水相をなす水性溶媒W2を満たしておき、マイクロチャネルの入口側からW1/Oエマルションを圧入することで、W1/O/W2エマルションを形成できる。上記基板としては、デッドエンド型、クロスフロー型、貫通孔型など、種々の形態のものを用いることができる。また、W1/Oエマルションを乳化膜を通過させて水性溶媒W2中に液滴として分散させることによりW1/O/W2エマルションを調製する、膜乳化法を用いることもできる。特に、直径0.1~5.0μm程度の微細な細孔を有するSPGShirasuPorousGlass:シラス多孔質ガラスで形成された乳化膜を用いる膜乳化法が好適であり、コストが安く処理量が多い、工業的に有利な方法とすることができる。なお、W1/O/W2エマルションの平均粒径の単分散性を向上させるために、上記のような方法または他の方法による膜乳化でW1/O/W2エマルションを得た後、さらに1回ないし複数回、当該膜乳化で用いた膜と同じ膜またはそれとは異なる膜にW1/O/W2エマルションによる膜処理を行ってもよい。特に、膜乳化に用いる膜よりも小さな細孔径を有する膜を用いて膜処理を行うようにした場合、膜処理を行うことなく1回の膜乳化でW1/O/W2エマルションを調製する場合に較べて、膜乳化および膜処理それぞれの膜への負荷エマルションを膜に通過させるために必要な圧力を小さくすることができ、それにより膜の長寿命化や二次乳化工程に要する処理時間の短縮を図ることができ、リポソームの生産性の向上および低コスト化にも有利である。さらに、機械的剪断力の生じる可能性のある撹拌乳化においても、W1/O/W2エマルションを得ることができる。本発明においても、公知の撹拌乳化法において二液以上の流体を混合するために用いられる各種の方法装置を用いることができる。たとえば撹拌装置にはいろいろな形状の物が存在し、単に棒板プロペラ状の撹拌子を槽内で一定速度一方向に回転させるものが多いが、撹拌子を間欠回転させたり逆回転させる場合もある。特殊な状況では複数の撹拌子を並べ交互に逆回転させたり、槽側に撹拌子と組合された突起あるいは板を取り付けて撹拌子が発生するせん断応力を増強させるなどの様々な工夫がなされる。撹拌子への動力伝達方法も様々であり、回転軸を介して撹拌子を回転させるものが殆どであるが、磁石を封入しテフロン登録商標等でコーティングした撹拌子を容器の外部から回転する磁界で動力を伝達するマグネチックスターラーも存在する。撹拌子のサイズ半径や毎分回転数などの条件は、本発明の作用効果や公知の撹拌乳化法における条件を考慮しながら、適切な範囲で調整すればよい。二次乳化工程におけるその他の条件、たとえば、W1/Oエマルションと水性溶媒W2の体積比、W1/O/W2エマルションの平均粒径などは、公知のリポソームの製造方法二次乳化工程に準じて、最終的に調製するリポソームの用途などを考慮しながら適宜調節することができる。さらに、二次乳化工程では、水性溶媒W2およびW1/Oエマルションに、必要応じて混合脂質成分F2や、混合脂質成分F2の一部として或いはこれに代えて、混合脂質成分F1を添加してもよく、またそれらリポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤を添加してもよい。界面化学の分野では多くの乳化剤が知られており、代表的には、タンパク質、多糖類、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤などが、水溶性乳化剤として乳化分散プロセスに用いられている。上記タンパク質としては、ゼラチンコラーゲンを加熱により変性させた可溶性のタンパク質、アルブミンやトリプシンなどが挙げられる。ゼラチンは通常、数千~数百万の分子量分布を有するが、たとえば重量平均分子量が1000~100000であるものが好ましい。医療用ないし食品用として市販されているゼラチンを用いることができる。アルブミンには、卵アルブミン分子量約45000、血清アルブミン分子量約66000...ウシ血清アルブミン、乳アルブミン分子量約14000...α-ラクトアルブミンなどが含まれ、たとえば卵アルブミンである乾燥脱糖卵白が好ましい。上記多糖類としては、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、ペクチン、キトサン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、グァーガム、マルトトリオース、アミロース、プルラン、ヘパリン、デキストリンなどが挙げられ、たとえば重量平均分子量が1000~100000のデキストランが好ましい。上記イオン性界面活性剤としては、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。上記非イオン性界面活性剤としては、オクチルグルコシド等のアルキルグリコシド、ポリアルキレンオキサイド化合物、たとえばTween80東京化成工業株式会社,ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート,分子量130968やプルロニックF68BASF、ポリオキシエチレン160ポリオキシプロピレングリコール、数平均分子量9600の製品や、重量平均分子量が1000~100000のポリエチレングリコールなどが挙げられる。ポリエチレングリコールは、製品としてユニルーブ日油株式会社、GL4400NP、GL4800NP日油株式会社、PEG200000、マクロゴール三洋化成工業株式会社などが挙げられる。分子量は、小さすぎると脂質膜中に混入しやすくなってリポソームの形成を阻害するおそれがあり、逆に大きすぎるとW1/O/W2エマルションの外水相中への分散や界面への配向の速度が遅れてリポソームの合一や多胞リポソームの形成につながるおそれがある。そのため、水溶性乳化剤の重量平均分子量は1,000~100,000の範囲内にあることが好ましい。また、この範囲の重量平均分子量であると、リポソームの薬剤の内包率が良い。上記のようにして混合脂質成分F2および/または水溶性乳化剤を用いる場合の各種の条件、たとえば、それらの量や、水性溶媒W2およびW1/Oエマルションとの混合態様添加順序等は特に限定されるものではなく、公知のリポソームの製造方法に準じて、適切なものとすればよい。たとえばF2が主として水溶性脂質からなる場合、あらかじめそのようなF2および/または水溶性乳化剤をW2に添加しておき、それにW1/Oエマルションを添加して乳化処理を行うことができる。一方、F2が主として脂溶性脂質からなる場合、あらかじめW1/Oエマルション調製後そのようなF2をW1/Oエマルションの油相に添加しておき、それを、必要に応じて水溶性乳化剤が添加されているW2に添加して乳化処理を行うことができる。3溶媒除去工程溶媒除去工程は、前記二次乳化工程により得られたW1/O/W2エマルションに含まれる有機溶媒相Oを除去し、リポソームを形成させる工程である。すなわち、W1/O/W2エマルションを回収し、開放容器内に移し静置あるいは撹拌することで、W1/O/W2エマルションに含まれる有機溶媒Oを蒸発除去することができる。これにより、混合脂質膜成分F1および必要に応じて添加されるF2からなる脂質膜を内水相の周囲に形成し、リポソームを得ることができる。上記のような方法によるW1/O/W2エマルションから溶媒を除去は、定法に従い、必要に応じて加温、減圧、撹拌を用いながら行えばよい。有機溶媒Oに含まれる化合物の種類に応じて、それらの有機溶媒が突沸することのない条件範囲が設定される。温度条件は0~60°Cの範囲が好ましく、0~25°Cがより好ましい。また、減圧条件は溶媒の飽和蒸気圧~大気圧の範囲内に設定されることが好ましく、溶媒の飽和蒸気圧の1~10の範囲内に設定されることがより好ましい。異なる溶媒を混合して用いる場合、より飽和蒸気圧の高い溶媒種に合わせた条件が好ましい。これらの除去条件は、溶媒が突沸しない範囲で組み合わせてもよく、例えば、熱に弱い薬剤を使用する際は、より低温側でかつ減圧条件で溶媒を溜去することが好ましい。溶媒除去にはW1/O/W2エマルションの撹拌が無くともよいが、撹拌をしたほうがより均一に溶媒除去が進む。なお、上記のような製造方法により得られるリポソームには、製法の工程上、W/O/Wエマルション由来の多胞リポソームがある程度の割合含まれることがあるが、これを減じるために、撹拌、減圧、またはそれらの組み合わせを行うことが効果的である。たとえば、溶媒の大半が抜ける時間より長く減圧および撹拌を行なうことにより、リポソームを構成する脂質の水和が進み、内包物の漏出を起こさないまま、多胞リポソームが解けて単胞のリポソーム状態にばらけることが可能である。また、本法で副生する、あるいは残存する多胞リポソームはその内部がW/O由来の50~200nm程度の水滴を多く含む構造であるので、W/Oの粒子径よりもわずかに大きな孔径のフィルターを通過させることで、50~200nm程度の単胞リポソームへ変換することも可能である。このような操作をしても残った多胞リポソームがある場合には、フィルターにより除去することもできる。<カルセイン内包リポソーム>[実施例1]1.一次乳化工程W1/Oエマルションの調製ホスファチジルコリン含量が95である卵黄レシチンCOATSOMENC50日油株式会社0.3g、コレステロールChol0.152gおよびオレイン酸OA0.108gを含むヘキサン15mLを有機溶媒相Oとし、カルセイン0.4mMおよびMLysoPCミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリンリゾレシチン、日油株式会社、ClogP670.010gを含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/L5mLを内水相用の水分散相W1とした。50mLのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置UH-600S、株式会社エスエムテーにより、25°Cにて15分間超音波を照射し出力5.5、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたW1/Oエマルションは体積平均粒径約200nmの単分散W/Oエマルションであることが確認され、CV値は29であった。2.二次乳化工程W1/O/W2エマルションの調製続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、実験用デッドエンド型マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用して、マイクロチャネル乳化法によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。上記モジュールのマイクロチャネル基板はシリコン製であり、マイクロチャネル基板のテラス長、チャネル深さおよびチャネル幅はそれぞれ約60μm、約11μmおよび約16μmであった。上記マイクロチャネル基板にガラス板を圧着させてチャネルを形成し、このチャネルの出口側に外水相溶液W2である3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5を含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを満たしておき、チャネルの入口側から前記W1/Oエマルションを供給して、W1/O/W2エマルションを製造した。3.溶媒除去工程リポソームの水性懸濁液の調製次に、上記W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで15分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間、撹拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。カルセインの内包率は71であった。[実施例2]溶媒除去工程において、W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで360分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は68であった。[実施例3]溶媒除去工程において、W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで360分振とうしたのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は61であった。[比較例1]1.一次乳化工程W1/Oエマルションの調製ホスファチジルコリン含量が95である卵黄レシチンCOATSOMENC50日油株式会社0.3g、コレステロールChol0.152gおよびオレイン酸OA0.108gを含むヘキサン15mLを有機溶媒相Oとし、カルセイン0.4mMを含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/L5mLを内水相用の水分散相W1とした。50mLのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置UH-600S、株式会社エスエムテーにより、25°Cにて15分間超音波を照射し出力5.5、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたW1/Oエマルションは体積平均粒径約200nmの単分散W/Oエマルションであることが確認され、CV値は29であった。2.二次乳化工程W1/O/W2エマルションの調製続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、実験用デッドエンド型マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用して、マイクロチャネル乳化法によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。上記モジュールのマイクロチャネル基板はシリコン製であり、マイクロチャネル基板のテラス長、チャネル深さおよびチャネル幅はそれぞれ約60μm、約11μmおよび約16μmであった。上記マイクロチャネル基板にガラス板を圧着させてチャネルを形成し、このチャネルの出口側に外水相溶液W2である3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5を含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを満たしておき、チャネルの入口側から前記W1/Oエマルションを供給して、W1/O/W2エマルションを製造した。3.溶媒除去工程リポソームの水性懸濁液の調製次に、上記W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで15分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間、撹拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。カルセインの内包率は65であった。[比較例2]溶媒除去工程において、W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで360分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は比較例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は48であった。[比較例3]溶媒除去工程において、W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで360分振とうしたのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は比較例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は31であった。[実施例4]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにSLysoPCステアロイル基を有するリゾホスファチジルコリン、日油株式会社、ClogP87を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は73であった。[実施例5]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにSLysoPCを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は70であった。[実施例6]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにSLysoPCを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は65であった。[実施例7]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPGNaジラウロイルホスファチジルグリセロールナトリウム塩、日油株式会社、ClogP902を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は82であった。[実施例8]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPGNaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は77であった。[実施例9]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPGNaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は71であった。[実施例10]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりに短鎖リン脂質DDPCジデカノイルホスファチジルコリン、日油株式会社、ClogP10を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は70であった。[実施例11]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりに短鎖リン脂質DDPCを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は70であった。[実施例12]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりに短鎖リン脂質DDPCを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は66であった。[実施例13]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにPEGリン脂質PM020CNジミリストイルホスファチジルエタノールアミンにPEG鎖数平均分子量約2000を導入したPEGリン脂質、日油株式会社、ClogP8を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は81であった。[実施例14]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにPEGリン脂質PM020CNを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は75であった。[実施例15]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにPEGリン脂質PM020CNを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は77であった。[実施例16]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりに、国際公開WO2008/081686に記載の方法合成例1参照に従って調製した合成ステロールman3cholコレステロールの3位にマンノースを導入した化合物、ClogP95を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は74であった。[実施例17]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにman3cholを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は70であった。[実施例18]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにman3cholを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は70であった。[比較例4]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPEジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、日油株式会社、ClogP112を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は70であった。[比較例5]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPEを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は60であった。[比較例6]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPEを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は33であった。[比較例7]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPEジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、日油株式会社、ClogP189を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は70であった。[比較例8]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPEを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は52であった。[比較例9]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPEを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は40であった。[比較例10]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDEPEジエルコイルホスファチジルエタノールアミン、日油株式会社、ClogP245を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は71であった。[比較例11]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDEPEを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は51であった。[比較例12]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDEPEを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は39であった。[比較例13]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPGNaジステアロイルホスファチジルグリセロールナトリウム塩、日油株式会社、ClogP167を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は69であった。[比較例14]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPGNaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は56であった。[比較例15]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPGNaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は38であった。[比較例16]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDEPGNaジエルコイルホスファチジルエタノールアミンナトリウム塩、日油株式会社、ClogP225を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は70であった。[比較例17]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDEPENaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は55であった。[比較例18]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDEPENaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は40であった。[比較例19]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPCジラウロイルホスファチジルコリン、日油株式会社、ClogP122を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は72であった。[比較例20]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPCを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は52であった。[比較例21]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPCを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は44であった。[比較例22]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDPPCジパルミトイルホスファチジルコリン、日油株式会社、ClogP178を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は75であった。[比較例23]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDPPCを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は55であった。[比較例24]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDPPCを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は40であった。[比較例25]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPE020ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンにPEG鎖数平均分子量約2000を導入したPEGリン脂質、日油株式会社、ClogP136を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は80であった。[比較例26]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPE020を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は60であった。[比較例27]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPE020を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は38であった。[比較例28]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりに、国際公開WO2008/081686に記載の方法合成例13参照従って調製した合成ステロールman6cholコレステロールの6位にマンノースを導入した化合物、ClogP111を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例1と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は74であった。[比較例29]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにman6cholを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例2と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は58であった。[比較例30]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにman6cholを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例3と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は45であった。<シタラビン内包リポソーム>[実施例19]1.一次乳化工程W1/Oエマルションの調製ホスファチジルコリン含量が95である卵黄レシチンCOATSOMENC50日油株式会社0.3g、コレステロールChol0.152gおよびオレイン酸OA0.108gを含むヘキサン15mLを有機溶媒相Oとし、シタラビン80mMおよびMLysoPCミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリンリゾレシチン、日油株式会社、ClogP670.010gを含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/L5mLを内水相用の水分散相W1とした。50mLのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置UH-600S、株式会社エスエムテーにより、25°Cにて15分間超音波を照射し出力5.5、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたW1/Oエマルションは体積平均粒径約200nmの単分散W/Oエマルションであることが確認され、CV値は29であった。2.二次乳化工程W1/O/W2エマルションの調製続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、実験用デッドエンド型マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用して、マイクロチャネル乳化法によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。上記モジュールのマイクロチャネル基板はシリコン製であり、マイクロチャネル基板のテラス長、チャネル深さおよびチャネル幅はそれぞれ約60μm、約11μmおよび約16μmであった。上記マイクロチャネル基板にガラス板を圧着させてチャネルを形成し、このチャネルの出口側に外水相溶液W2である3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5を含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを満たしておき、チャネルの入口側から前記W1/Oエマルションを供給して、W1/O/W2エマルションを製造した。3.溶媒除去工程リポソームの水性懸濁液の調製次に、上記W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで15分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間、撹拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。シタラビンの内包率は47であった。[実施例20]溶媒除去工程において、W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで360分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例19と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は43であった。[実施例21]溶媒除去工程において、W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで360分振とうしたのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例19と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は40であった。[実施例22]1.一次乳化工程W1/Oエマルションの調製ホスファチジルコリン含量が95である卵黄レシチンCOATSOMENC50日油株式会社0.3g、コレステロールChol0.152gおよびオレイン酸OA0.108gを含むヘキサン15mLを有機溶媒相Oとし、シタラビン80mMおよびMLysoPCミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリンリゾレシチン、日油株式会社、ClogP670.010gを含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/L5mLを内水相用の水分散相W1とした。50mLのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置UH-600S、株式会社エスエムテーにより、25°Cにて15分間超音波を照射し出力5.5、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたW1/Oエマルションは体積平均粒径約200nmの単分散W/Oエマルションであることが確認され、CV値は29であった。2.二次乳化工程W1/O/W2エマルションの調製得られたW1/Oエマルションを分散相として、SPG膜乳化法によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。SPG膜乳化装置SPGテクノ社製、商品名外圧式マイクロキットに直径10mm、長さ20mm、細孔径10μmの円筒形SPG膜を用い、装置出口側に外水相溶液W2である3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5を含むトリス-塩酸緩衝液pH7.4、50mMを満たしておき、装置入口側から上記W1/Oエマルションを供給して、W1:W2が1:40となるようにW1/O/W2エマルションを製造した。3.溶媒除去工程リポソームの水性懸濁液の調製次に、上記W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで15分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間、撹拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。シタラビンの内包率は50であった。[実施例23]溶媒除去工程において、W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで360分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例22と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は46であった。[実施例24]溶媒除去工程において、W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで360分振とうしたのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例22と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は40であった。[実施例25]1.一次乳化工程W1/Oエマルションの調製ホスファチジルコリン含量が95である卵黄レシチンCOATSOMENC50日油株式会社0.3g、コレステロールChol0.152gおよびオレイン酸OA0.108gを含むヘキサン15mLを有機溶媒相Oとし、シタラビン80mMおよびMLysoPCミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリンリゾレシチン、日油株式会社、ClogP670.010gを含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/L5mLを内水相用の水分散相W1とした。50mLのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置UH-600S、株式会社エスエムテーにより、25°Cにて15分間超音波を照射し出力5.5、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたW1/Oエマルションは体積平均粒径約200nmの単分散W/Oエマルションであることが確認され、CV値は29であった。2.二次乳化工程W1/O/W2エマルションの調製得られたW1/Oエマルションを分散相とし、3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5を含むトリス-塩酸緩衝液pH7.4、50mMの水分散相W2を外水相として、撹拌乳化法によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。撹拌乳化は、スターラーによりW2を強く撹拌しているところに、上記W1/Oエマルションを供給し、W1:W2が1:40となるようにW1/O/W2エマルションを製造した。3.溶媒除去工程リポソームの水性懸濁液の調製次に、上記W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで15分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間、撹拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。シタラビンの内包率は50であった。[実施例26]溶媒除去工程において、W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで360分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例25と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は43であった。[実施例27]溶媒除去工程において、W1/O/W2エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20°Cで360分振とうしたのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例25と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は39であった。[実施例28]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPGNaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例22と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は49であった。[実施例29]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPGNaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例23と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は48であった。[実施例30]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDLPGNaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例24と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は45であった。[実施例31]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにPM020CNを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例25と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は53であった。[実施例32]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにPM020CNを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例26と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は51であった。[実施例33]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにPM020CNを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例27と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は53であった。[実施例34]一次乳化工程においてMLysoPCの代わりにPM020CNを内水相W1に溶解させたこと、また二次乳化工程において3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5の代わりに0.1のプルロニックF68ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、数平均分子量9600、登録商標、非イオン界面活性剤プロノンを含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを用いたこと以外は、実施例19と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は60であった。[実施例35]一次乳化工程においてMLysoPCの代わりにPM020CNを内水相W1に溶解させたこと、また二次乳化工程において3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5の代わりに0.1のプルロニックF68を含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを用いたこと以外は、実施例20と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は60であった。[実施例36]一次乳化工程においてMLysoPCの代わりにPM020CNを内水相W1に溶解させたこと、また二次乳化工程において3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5の代わりに0.1のプルロニックF68を含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを用いたこと以外は、実施例21と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は52であった。[比較例31]一次乳化工程において、MLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと以外は実施例19と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は40であった。[比較例32]一次乳化工程において、MLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと以外は実施例20と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は32であった。[比較例33]一次乳化工程において、MLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと以外は実施例21と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は12であった。[比較例34]一次乳化工程において、MLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと以外は実施例22と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は43であった。[比較例35]一次乳化工程において、MLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと以外は実施例23と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は30であった。[比較例36]一次乳化工程において、MLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと以外は実施例24と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は20であった。[比較例37]一次乳化工程において、MLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと以外は実施例25と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は43であった。[比較例38]一次乳化工程において、MLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと以外は実施例26と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は34であった。[比較例39]一次乳化工程において、MLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと以外は実施例27と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は23であった。[比較例40]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPGNaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例22と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は49であった。[比較例41]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPGNaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例23と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は39であった。[比較例42]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPGNaを内水相W1に溶解させたこと以外は実施例24と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は26であった。[比較例43]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPE020を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例25と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は51であった。[比較例44]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPE020を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例26と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は40であった。[比較例45]一次乳化工程において、MLysoPCの代わりにDSPE020を内水相W1に溶解させたこと以外は実施例27と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は32であった。[比較例46]一次乳化工程においてMLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと、また二次乳化工程において3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5の代わりに0.1のプルロニックF68を含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを用いたこと以外は、実施例19と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は44であった。[比較例47]一次乳化工程においてMLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと、また二次乳化工程において3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5の代わりに0.1のプルロニックF68を含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを用いたこと以外は、実施例20と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は30であった。[比較例48]一次乳化工程においてMLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと、また二次乳化工程において3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5の代わりに0.1のプルロニックF68を含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを用いたこと以外は、実施例21と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は22であった。[比較例49]一次乳化工程においてMLysoPCの代わりにDSPE020を内水相W1に溶解させたこと、また二次乳化工程において3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5の代わりに0.1のプルロニックF68を含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを用いたこと以外は、実施例19と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は58であった。[比較例50]一次乳化工程においてMLysoPCの代わりにDSPE020を内水相W1に溶解させたこと、また二次乳化工程において3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5の代わりに0.1のプルロニックF68を含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを用いたこと以外は、実施例20と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は44であった。[比較例51]一次乳化工程においてMLysoPCの代わりにPM020CNを内水相W1に溶解させたこと、また二次乳化工程において3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5の代わりに0.1のプルロニックF68を含むトリス-塩酸緩衝液pH8、50mmol/Lを用いたこと以外は、実施例21と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は32であった。<造影剤内包リポソーム>[実施例37]1.一次乳化工程W1/Oエマルションの調製オムニパーク350イオヘキソール含有量750mg/mL,10mPas0.25mLにMLysoPCミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリンリゾレシチン、日油株式会社、ClogP670.010gを溶解させて内水相W1とし、DPPCジパルミトイルホスファチジルコリン、MC6060、日油株式会社50mg、およびDPPGジパルミトイルホスファチジルグリセロール、COATSOMEMG6060LA、日油株式会社10mgを含む混合溶媒ヘキサン/ジクロロメタン=3/11.25mLを有機溶媒相Oとした。3.5mLのサンプル瓶にこれらの混合液を入れ、φ7mmのプローブをセットした超音波分散装置UH-600S、株式会社エスエムテーにより、20°Cにて15分間超音波を照射し乳化処理を行った。2.二次乳化工程W1/O/W2エマルションの調製得られたW1/Oエマルションを、0.1のプルロニックF68を含むトリス-塩酸緩衝液W2、pH7.4、50mM15mL中にスターラー撹拌下で添加し、15分間撹拌して、W1/O/W2エマルションを製造した。3.溶媒除去工程リポソームの水性懸濁液の調製得られたW1/O/W2エマルションを密閉容器に移し替え、20°C500mbarの減圧条件下で約8時間撹拌し、次いで20°C180mbarの減圧条件下で約8時間撹拌し、段階的に溶媒を揮発させた。得られたリポソーム懸濁液は半透明の黄色であり、この粒子内には造影剤イオヘキソールが含まれていることが確認された。リポソームのイオヘキソール内包率は48であった。[比較例52]一次乳化工程において、MLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと以外は実施例37と同様にしてリポソームの水性懸濁液を調製した。イオヘキソールの内包率は39であった。<siRNA内包リポソーム>[実施例38]内水相W1として、等張PBS溶液0.25mLにsiRNAランダム配列10mgおよびMLysoPCミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリンリゾレシチン、日油株式会社、ClogP670.010gを溶解させた溶液を用いたこと、および外水相W2として0.1のプルロニックF68を含む等張PBS溶液を用いたこと以外は実施例37と同様にしてリポソームの水性懸濁液を調製した。siRNAの内包率は57であった。[比較例53]一次乳化工程において、MLysoPCを内水相W1に溶解させなかったこと以外は実施例38と同様にしてリポソームの水性懸濁液を調製した。siRNAの内包率は48であった。[実施例39]SPG2次乳化で20倍スケールアップ一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造ホスファチジルコリン含量が95である卵黄レシチンCOATSOMENC50日油株式会社製6.0g、コレステロールChol3.04gおよびオレイン酸OA2.16gを含む混合溶媒ヘキサン:ジクロロメタン=8:2300mLを有機溶媒相Oとし、シタラビンMW243.22,20mg/mL,80mMおよびMLysoPCミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリンリゾレシチン、日油株式会社、ClogP670.20gを含むトリス-塩酸緩衝液pH7.4、50mmol/L100mLを内水相用の水分散相W1とした。高圧ホモジナイザーナノマイザー、吉田機械興業社製を用いて100MPaの圧力条件で一次乳化工程の処理を行った。得られたW1/Oエマルションの室温下での平均粒径は137nmであった。二次乳化工程によるW1/O/W2エマルションの製造上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相として、SPG乳化法によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。SPG膜乳化装置SPGテクノ社製、商品名高速ミニキットKH125に直径10mm、長さ125mm、細孔径1.0μmの円筒形SPG膜用い、装置出口側に外水相溶液W2である3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5を含むトリス-塩酸緩衝液pH7.4、50mmol/Lを満たしておき、装置入口側から上記W1/Oエマルションを供給して、W1/O/W2エマルションを製造した。膜乳化に必要とした圧力は約10kPaであった。有機溶媒相の除去によるリポソームの製造上記二次乳化工程により得られたW1/O/W2エマルションを密閉容器に移し替え、500mbarの減圧室温条件下で約4時間撹拌し、次いで180mbarの減圧室温条件下で約18時間撹拌し、溶媒を揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはシタラビンが含まれていることが確認された。得られたリポソームのシタラビン内包率は47であった。考察処理量の増加に伴い、SPG膜乳化に90分かかった。その後20°Cで270分静置してから有機溶媒の除去を実施したので、おおよそ実施例23と同様の静置を実施したことになる。スケールアップ実験においても実施例23と同様のシタラビン内包率を得ることができた。[実施例40]撹拌2次乳化で20倍スケールアップ二次乳化工程によるW1/O/W2エマルションの製造において、外水相溶液W2である3のアルカリ処理ゼラチン等電点約5を含むトリス-塩酸緩衝液pH7.4、50mmol/Lを用いて撹拌乳化法によるW1/O/W2エマルションの製造を行ったこと以外は実施例39と同様に実験した。撹拌乳化は、スターラーによりW2を強く撹拌しているところに、上記W1/Oエマルションを供給し、W1:W2が1:40となるようにW1/O/W2エマルションを製造した。得られたリポソームのシタラビン内包率は47であった。考察処理量の増加に伴い、撹拌時間を30分とした。その後20°Cで330分静置してから有機溶媒の除去を実施したので、おおよそ実施例26と同様の静置を実施したことになる。スケールアップ実験においても実施例26と同様のシタラビン内包率を得ることができた。考察2撹拌2次乳化によるリポソーム製造法は、マイクロカプセル化法たとえばIshiietalJDispersSciTechnolvol9No1pp1151988参照として知られているが、内包する薬剤によっては高い内包率を実現できない。せん断力によってやわらかいWOW粒子が壊れて内包された薬剤が外に出てしまうのが原因と考えられ、内包率数という結果に終わることもある。大きなスケールで撹拌効率を維持するためには大きなトルクで撹拌する必要があり、撹拌羽の近くの局所的にはせん断力が大きくなってしまうので、この傾向は顕著になる。しかしながら、水溶性脂質添加による膜を強化する効果が表れて大きなスケールでも再現性が得られたものと考えられる。フィルターろ過実施例31,32,33および比較例43,44,45で得られたリポソーム懸濁液を顕微鏡で観察したところ多胞リポソームの存在が確認され、粒度分布測定結果もマイクロ粒子が確認できた。得られたリポソーム懸濁液をメンブランフィルタDISMIC02μmのセルロースアセテート製、アドバンテック東洋製を20°Cで通過させることで、顕微鏡観察および粒度分布測定から多胞リポソームがなくなったことが確認でき、なおかつメンブランフィルタろ過の前後で内包率に変化がないことを確認できた。なお、他の実施例および比較例においては、多胞リポソームは観察されなかった。カルセインの内包率測定方法リポソーム水溶液3mL全体の蛍光強度Ftotalを分光光度計U-3310、日本分光株式会社により測定した。次に0.01M,CoCl2トリス塩酸緩衝液30μLを加えて外水相に漏出したカルセインの蛍光をCo2により消光することで、ベシクル内の蛍光強度Finを測定した。さらに、カルセインを加えないでサンプルと同じ条件でベシクルを作製し、脂質自身が発する蛍光Flを測定した。内包率は下記式より算出した;内包率E=/×100粒度分布の測定方法実施例および比較例の一次乳化工程で得られたW1/Oエマルションの体積平均粒径およびCV値は、下記の方法に従って測定した。W1/Oエマルションをヘキサン/ジクロロメタン混合溶媒体積比:1/1で10倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計UPA-EX150、日機装株式会社を用いて粒度分布を測定し、これに基づき体積平均粒径およびCV値=標準偏差/体積平均粒径×100[]を算出した。また、リポソームの体積平均粒径は、同装置を用いて、作製したリポソーム懸濁液をそのまま測定した。シタラビンの内包率測定方法リポソーム粒子の懸濁液を超遠心条件のもと超遠心装置を用い成分分離し、固形分と上澄溶液とに含まれるシタラビンの量をそれぞれHPLCカラム:VarianPolarisC18A3μm2x40mmで定量した。固形分リポソームの定量値、すなわちリポソームに内包されているシタラビンの量と、上澄溶液の定量値、すなわちリポソームに内包されていないシタラビンの量との合計値で、前者のリポソームに内包されているシタラビンの量を除した値に100を乗じて、シタラビンの内包率を算出した。イオヘキソールの内包率測定方法造影剤用化合物イオヘキソール内包リポソームの分散液50μLを採取し1.8生理食塩水950μLを加えて遠心分離6,000rpm、20分を行った。得られた上清および残渣リポソームを完全に分離した後、各々アルコールを加えて溶解し20mLに仕上げた。波長約245nmにおける吸光度を測定し、内包造影剤用化合物の吸光度と造影剤用化合物の濃度の検量線に基づき、リポソームに内包される造影剤用化合物の質量および系内の全造影剤用化合物の質量を計算して、以下の式で造影剤用化合物の内包率を求めた。ここで、リポソーム内包造影剤用化合物質量は残渣から測定された造影剤用化合物質量、全造影剤用化合物質量は上清と残渣から測定された造影剤用化合物質量の和とする。造影剤用化合物内包率=リポソーム内包造影剤用化合物質量/全造影剤用化合物質量×100siRNAの内包率測定方法siRNAの内包率は、リポソーム液を超遠心分離して外液とリポソームを分離し、各siRNA量をHPLCで測定することで求めた。ClogPの算出方法分配係数は、実際に測定しなくても定量的構造活性相関アルゴリズムを用いた計算によって求めることができる。フラグメント法では、ある分子の分配係数を、その分子の部分構造ごとの分配係数の総和によって計算する。ソフトウェアChemDrawに搭載された計算プログラムで、フラグメントのClogP値を算出し、BioByte社が開発したフラグメントベースでのClogP値計算に準じ、その値を加算して算出した。たとえばMLysoPCはその構造式を二つのフラグメントに分けることができ、それぞれのClogPを計算すると518、142であるので、MLysoPCのClogP値はそれらを加算して67とした。"