"融合タンパク質を含む組成物であって、前記融合タンパク質がプロテアーゼインヒビター及び所望のペプチドを含むことを特徴とする組成物。請求項1の組成物であって、前記融合タンパク質が配列番号2,4,6及び8から成る群より選択されたアミノ酸を含むことを特徴とする組成物。請求項2に記載の組成物であって、前記融合タンパク質が配列番号1,3,5及び7から成る群より選択される核酸配列によりコードされることを特徴とする組成物。請求項1に記載の組成物であって、前記プロテアーゼインヒビターがボウマン-バークインヒビター、ダイズトリプシンインヒビター、及びエグリンCから成る群より選択されるプロテアーゼインヒビターであることを特徴とする組成物。請求項4に記載の組成物であって、前記プロテゼーゼインヒビターがBBIであり、前記BBIがトリプシンループ及びキモトリプシンループから成る群より選択される少なくとも1のループを含むことを特徴とする組成物。請求項4に記載の組成物であって、前記プロテアーゼインヒビターが前記所望のペプチドのスキャッフォールドであることを特徴とする組成物。請求項5に記載の組成物であって、前記ループが前記所望のペプチドを含むことを特徴とする組成物。請求項5に記載の組成物であって、前記所望のペプチドが配列番号9で定義されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする組成物。請求項5に記載の組成物であって、前記融合タンパク質が配列番号4で定義されるアミノ酸配列を有することを特徴とする組成物。配列番号10及び12で定義されるポリペプチド配列から成る群から選択されるプロテアーゼインヒビターをコードする単離ポリヌクレオチド。スキャッフォールドタンパク質及び少なくとも1のペプチドを含む組成物であって、前記スキャッフォールドタンパク質がボウマンバークインヒビターを含むことを特徴とする組成物。請求項1乃至9及び11のいずれか1項に記載の組成物であって、前記少なくとも1のペプチドが血管内皮成長因子に結合することを特徴とする組成物。発明の開示本発明はバクテリア種の中でプロテアーゼインヒビター及びそれらの変異体を発現することに関係する組成物及び方法を提供する。本発明は更に融合核酸、ベクター、融合ポリペプチド、及びプロテアーゼインヒビターを得る工程を提供する。他の方法で示さない限り、本発明の実施は、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術に関する従来技術を含む。そのような技術は、当業者に知られており、多くのテキスト及び参考文献に記載されている1989及びAusbeletalCurrentProtocolsinMolecularBiology1987参照のこと。本明細書中で言及するすべての特許、特許出願、文献及び刊行物は参照により本明細書に援用する。他の違った方法で定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び化学的言語は、本出願に関係する技術分野において当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。例えば、SingletonandSainsburyDictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology2dEdJohnWileyandSonsNY及びHaleandMarhamTheHarperCollinsDictionaryofBiologyHarperPerennialNYは、本発明の技術分野の当業者が利用する、そして本発明において多く用いられている用語の一般的な辞書である。本明細書で述べられているのと同じかあるいは類似の多くの方法及び物質は本発明の実施に用いることができるけれども、本明細書中では特定の好ましい方法及び物質にのみ言及する。従って、以下で定義される文言は、本明細書全体を参照することで十分に説明される。本明細書で用いる記号、一つの及びこのという語は、他に違った形で定義されていない限り、複数を示す場合にも用いる。数値範囲は、範囲を定義している上限及び下限の数値も含ものとする。違った方法で示さない限り、核酸は左から右に向けて5’から3’に向けて表記されるものとし、アミノ酸配列は、左から右に向けて、アミノ末端からカルボキシ末端として表記する。本発明は記載した特定の方法、手順及び試薬に限定されないことは当然でありこれらは変更可能である。更に、本明細書で付す標題は本発明の各種側面を限定するものではない。発明は明細書全体を参照して理解されるべきである。従って、以下で示す定義は、明細書全体を参照して完全に定義される。しかしながら、本発明の迅速な理解のために多数の文言を以下で定義する。定義本明細書で用いる、発現カセット及び発現ベクターの語は、標的細胞の中で特定の核酸を転写させる一連の特定の核酸エレメントを持つ、組換え又は合成により生成された核酸構築体を意味する。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、色素体DNA、ウイスル又は核酸フラグメントに取り込ませることができる。通常、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。発現カセットの語は、本明細書において、DNA構築体及びこの等価物を指す場合に互換的に使用される。本明細書において、ベクター及びクローニングベクターの語は細胞内へ核酸配列を輸送することを意図する核酸構築体を意味する。本明細書において、発現ベクターの語は、異種細胞の中で異種DNAフラグメントを取り込み発現することができるベクターを意味する。多くの真核及び原核生物の発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターを選択することは当業者の知識の範囲内である。本明細書において、プラスミドの語は、クローニングベクターとして用いる環状二本鎖DNA構築体であり、種々の原核及び真核生物内で染色体外自己複製遺伝子要素を形成し、又は他の宿主細胞に組み込むことができるものを意味する。本明細書において、核酸分子及び核酸配列の語は、RNA、DNA、及びcDNA分子を含むがこれらに限定されない、任意の核酸の形態が含まれる。遺伝子コードの縮退の結果として、所定のタンパク質をコード化する多数のヌクレオチド配列が生産され得ることは当該技術分野において理解されている。本明細書において、融合DNA配列の語は、5’末端から3’末端に向けて、第一、第二、第三、及び第四DNA配列を含む。本明細書において、第一核酸配列又は第一DNA配列は、バクテリア種の中の分泌配列として機能するシグナルペプチドをコードしている。特に好ましいシグナル配列は融合ポリペプチドを発現及び分泌するために発現宿主により分泌されるポリペプチド由来の配列である。本明細書で用いるように、第一アミノ酸配列は、バクテリア種内で機能する分泌配列に対応している。そのようなアミノ酸配列は上に述べた第一DNA配列によりコードされる。本明細書において、第二DNA配列は選択されたバクテリア種により発現される分泌ポリペプチドをコードする。第一DNA配列と同様に、分泌ポリペプチドはバクテリア発現宿主が自然に分泌するものであることが好ましい。しかしながら、幾つかの態様において、この語は、異種タンパク質も意味する。例えば、幾つかの好ましい態様において、バチルススブチルス以外のバシルス属により発現されるセルラーゼは所望の分泌ポリペプチドとして用いられ、バチルススブチルスは、発現宿主として用いられる。本明細書で用いる、分泌ポリペプチドの機能部分及びこの同義語は、切り離された形状をしていても、正常な構造に折りたたまれる能力を有する切断された分泌ポリペプチドを意味する。幾つかの態様において、所望のポリペプチドに付着しているものとは関係なく、ポリペプチドが正規構造にホールドされるためには分泌ポリペプチドドメイン残渣の十分量が必要となる。しかしながら、大部分のケースにおいて、分泌ポリペプチドの一部のみでも正しく折りたたまれ、分泌ポリペプチドドメイン残渣欠失体と比較して、分泌が高まることが知られている。同様に、大部分の場合において、分泌ポリペプチドの切断体はその機能部分が生物学的機能を保持することを意味する。他の機能的なドメインも用いることができるけれども、本発明には分泌ポリペプチドの触媒ドメインを用いることが好ましい。加えて、好ましい態様において、触媒ドメイン及び全リンカー領域又は一部のリンカー領域が用いられる。本明細書で用いる、第三のDNA配列は、切断可能なリンカーポリペプチドをコードするDNA配列を含む。第三のDNA配列は、融合ポリペプチドを切断するための特定の酵素又は試薬により認識されるのに必要なアミノ酸配列のみをコードすることが必要であると解される。従って、適切な酵素による認識及び切断に必要なリンカー部分のみが必要とされる。本明細書で用いる、第四のDNA配列は所望のポリペプチドをコードする。そのような所望のポリペプチドは成熟型、又は未成熟型のいずれかのプロテアーゼインヒビター及びそれらの変異体を含む。対応する4のアミノ酸配列をコードする上で定義された4つのDNA配列は、融合DNA配列を形成するために結合される。そのような融合DNA配列は、固有のリーディングフレームの5’末端から3’末端に向かって、第一、第二、第三、第四DNA配列の順に結合される。そのように結合されているので、融合DNA配列は、そのアミノ末端から、バクテリア種の中で分泌配列として機能するシグナルペプチド、バクテリア種により通常分泌される分泌ポリペプチド又はその一部分、切断可能リンカーポリペプチド及び所望のポリペプチドをコードする融合ポリペプチド、融合タンパク質及び融合アナログをコードする。本明細書で用いる、所望のタンパク質および、所望のポリペプチドの語は、分泌増強構築体に融合されない、成熟型又は未成熟型ポリペプチド又はタンパク質を意味する。従って、所望のタンパク質及び所望のポリペプチドの語は、非融合形態で宿主細胞により発現され、分泌されるものを意味する。本明細書で用いる、融合ポリペプチド、融合タンパク質及び融合アナログは、アミノ末端から順に、宿主細胞の中で分泌配列として機能するシグナルペプチド、宿主細胞から通常分泌される分泌ポリペプチド又はその一部分、切断可能リンカーポリペプチド及び所望のポリペプチドをコードしている。幾つかの態様において、この融合タンパク質は宿主細胞酵素により、融合タンパク質の中の他のタンパク質配列から遊離した所望のタンパク質を生産するために処理される。本明細書において、融合アナログ、融合ポリペプチド及び融合タンパク質は互換的に使用する。本明細書で用いる、プロモーター配列の語は、発現の目的で、バクテリア宿主細胞により認識されるDNA配列を意味する。好ましい態様において、それは、融合ポリペプチドをコードしているDNA配列に作動可能に結合している。そのような結合は、融合DNA配列をコードしているDNA配列の翻訳開始コドンに関係するプロモーター位置を含む。特に好ましい態様において、このプロモーター配列は、融合DNA配列の発現を仲介する翻訳及び転写制御配列を含む。本明細書で用いるターミネーター配列の語は、転写を終了させるために発現宿主により認識されるDNA配列を意味する。この配列は、発現される融合タンパク質をコードしている融合DNAの3’末端に作動可能に結合している。本明細書で用いる、選択マーカーコード核酸配列の語は、バクテリア細胞において発現できるヌクレオチド配列をいう。選択マーカーの発現は、対応する選択条件下において、発現している遺伝子を含む細胞に成長能力を付与する。核酸は、他の核酸配列と機能的な位置にある場合に作動可能に連結するという。例えば、分泌リーダーをコード化するDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、当該ポリペプチドについてのDNAに作動可能に連結し、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に連結し、又は、リボソーム結合部位は、翻訳を促進する位置に存在する場合にコード配列に作動可能に連結するという。一般に、作動可能に連結とは、結合するDNA配列が隣接することを意味し、分泌リーダーの場合には、隣接しかつリーディングフェーズ中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は、適宜の制限部位における連結反応により達成される。そのような部位が存在しない場合には、従来法にしたがって合成オリゴヌクレオチドアダプタ、又はリンカーを用いる。ここで用いる組換え体は、非相同核酸配列の導入により修飾された、またはそのように修飾された細胞に由来する細胞またはベクターに関するものを含む。従って、例えば組換え細胞は、天然型細胞内に見られない遺伝子を発現し、あるいは、意図的な人為的介入により、そうでなければ異常に発現し、発現不足であり又は全く発現しない天然遺伝子を発現させる。本明細書において、発現という語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成される工程をいう。この工程には、転写及び翻訳の両方が含まれる。従って、プロテアーゼインヒビター発現は、発現される特定のプロテアーゼインヒビター及びそれらの変異体の転写及び翻訳を意味する。その製品は、前駆体RNA、mRNA、ポリペプチド、翻訳後処理を受けたポリペプチド及びそれらの誘導体を含む。同様に、プロテアーゼインヒビター発現の語は、図1で示す発現カセットにより示されるプロテアーゼインヒビター及びそれらの変異体の転写、翻訳、及び構築を意味する。プロテアーゼインヒビター発現のアッセイの例は、特定の条件に曝したときのバクテリアコロニーを用いる試験及びプロテアーゼインヒビターのウエスタンブロットだけでなくノザンブロット解析及びプロテアーゼインヒビターmRNAの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイも含む。本明細書で用いる単離及び精製の語は、少なくとも1の天然由来成分が除去されている核酸又はポリペプチドを意味する。本明細書において用いる、実質的に含まないの語は、乾燥重量で20未満、10未満、5未満、又は1未満の他のタンパク質を含む所望のポリペプチド調製物を意味する。本明細書で用いる実質的に精製されたの語は、本発明のタンパク質又はそれらのフラグメントについて使用するときは、意図する使用のための実用的及び適切な他の物質が実質的に存在しないことを言う。例えば、タンパク質はタンパク質配列決定及び又は医薬品組成物の製造に対して使用するときは、宿主細胞の他の生物成分から十分に精製されており、このような成分を実質的に含まない。本明細書で用いる、標的タンパク質の語は、本明細書で提供される変異体インヒビターを結合することにより活性が阻害されるタンパク質を意味する。本明細書で用いる変異体配列の語は、野生型プロテアーゼインヒビター又は他のスキャッフォールドの結合ループと置き換わる短いペプチドループを意味する。この変異体配列はスキャッフォールドにおいて置き換わる場合には結合ループと同じ長さである必要はない。本明細書で用いるスキャッフォールドの語は、変異体配列が導入される野生型タンパク質配列を意味する。幾つかの態様において、スキャッフォールドは置き換わる部分を有する。例えば、本明細書で提供されるBBI配列は変異体配列に対するスキャッフォールドとして使用することができる。プロテアーゼインヒビター2のタンパク質プロテアーゼインヒビター、クニッツタイプトリプシンインヒビター及びボウマンバークインヒビターが大豆から単離されている。これらのインヒビターは、変異体配列に対するスキャッフォールドとして提供される。加えて、変異体配列を含むスキャッフォールドの修飾に加えて、本明細書で用いられる他の所望のタンパク質はC末端に6のヒスチジン残基を含む。ダイズトリプシンインヒビターSTIは、適切な化学量論的複合体を形成することによりトリプシンのタンパク質分解活性を抑制する。STIは2のジスルフィド結合を有する181アミノ酸残基からなり、荒い球形をしている。トリプシン抑制ループは第一ジスルフィド結合の中に存在する。クニッツタイプのダイズトリプシンインヒビターは、プロテイナーゼインヒビターの活性の標準的メカニズムの定義を導く生化学及び動態研究における主要な物質として用いられ、プロテイナーゼの初期の研究に重要な役割を果たしてきた。ボウマンバークインヒビターボウマンバークインヒビタータンパク質は、豆科の種及び各種草を含む他の植物から単離された、動態学的及び構造学的によく知られているスモールタンパク質のファミリーである。それらは、通常、それぞれ独立に結合ループを含んでいる2の三環式ドメインを含む左右対称構造をしている。しかしながら、1のドメインを有するもの、及び2より多いドメインを有するものもある。ダイズBBIから単離された主に8kDa以下のボウマンバークインヒビターは、2の分離した活性サイトループを有する。ループIはトリプシン様特異性を有するプロテアーゼを抑制し、ループIIは、キモトリプシン様特異性を有するプロテアーゼを抑制する。これらの結合領域はそれぞれ、各種セリンプロテイナーゼインヒビターに見られる構造であるカノニカルループ構造を含む。STI及びBBIはダイズの種の中のみに見られ、その植物の他の部分には見られない。多くのBBIのイソ型が特徴付けられているけれども、配列番号13は、約71アミノ鎖残基を含むBBI主鎖のアミノ酸配列を示す。ダイズにおいて、BBIは19アミノ酸長のN末端プロペプチドを有するプロタンパク質として生産される。従って、幾つかの態様において、BBIは、完全なプロペプチド又は少なくともプロペプチドの1部を用いて生産される。幾つかの態様において、BBIはN又はC末端のいずれかから10ものアミノ残渣が除去されて、切断されている。例えば、種子を乾燥するときに、幾つかのBBI分子は、9又は10アミノ酸残基が取り除かれたC末端を有する。従って、タンパク質分解は、通常、最初のジスルフィド結合の前及び最後のジスルフィド結合の直後が高くなる。この影響は標的タンパク質への結合にとり通常マイナスとはならない。しかしながら、異性体又は切断形態のいずれか1が本発明の各種態様で使用されることは評価されるであろう。プロテアーゼインヒビター変異体上で説明するように、STI及びBBIプロテアーゼインヒビターはプロテアーゼを抑制する結合ループを有する。本発明は、1以上の活性部位が修飾されているプロテアーゼインヒビター変異体を提供する。幾つかの好ましい態様において、標的タンパク質と相互作用する配列でこのループを置換する。例えば、幾つかの態様において、このループは、VEGF結合タンパク質、C2、C3、C4及びC5インヒビター等の補体経路のインヒビター、コンプスタチン、サイトカイン、他の所望のタンパク質等に由来する配列で置換される。すなわち、任意の適切な配列を本発明に用いることから、本発明はこれらのループのいずれかの中で置換された特定の配列に限定することは意図していない。幾つかの態様において、変異体配列は、ファージディスプレイ法及び他の適切な方法を含むがこれらに限定されない本技術分野で知られた各種方法により選択される。例えば、ランダムペプチド遺伝子ライブラリーは、ファージPIII遺伝子で融合され、このペプチドライブラリーは、ファージの表面に提示される。引き続き、このファージディスプレイライブラリーは、標的タンパク質に曝され、非特異結合を除去するために緩衝液で洗浄される。最終的に、結合しているファージ及びこのペプチドをコードするDNA配列のPCR産物が単離される。幾つかの態様において、このループの1は、変異体配列で置換される。それらが所望の結合及び又は抑制を示す限り、より長い配列を本発明に用いることができる。加えて、結合ループの置換に適したペプチドが固定ループ内に含まれる場合には、機能的な構造を採用することが好ましい。幾つかの態様において、このペプチドは7から9アミノ酸長である。これらの置き換え配列もまたプロテアーゼインヒビター又は標的配列への結合も提供する。幾つかの態様において、1のアミノ酸が置換されていることが好ましい。融合タンパク質好ましい態様において、各プロテインプロテアーゼインヒビター又はそれらの変異体は宿主バクテリア細胞により融合タンパク質として発現される。所望のタンパク質を遊離するために融合タンパク質を切断することは有用であるが、必要ではない。融合タンパク質として発現及び分泌されたプロテアーゼインヒビター及びそれらの変異体は、驚くべきことにそれらの機能を保持している。対応するアミノ配列をコードする、上で定義するDNA配列は融合DNA配列を形成するように結合される。そのようなDNA配列は、第一、第二、第三及び第四DNA配列の順で、5’末端から3’末端に向けて固有のリーディングフレーム中に構築される。そのように構築されるので、このDNA配列は、アミノ末端からバクテリア種の中で分泌配列として機能するシグナルペプチド、バクテリア種から通常分泌される分泌ポリペプチド又はそれらの一部、切断リンカーペプチド及び所望のタンパク質をコードしている融合ポリペプチドをコードする。融合タンパク質を生産するための各種方法は本技術分野で知られている。従って、任意の適切な方法を本発明に用いることができる。組換えプロテアーゼインヒビターの発現本発明は融合タンパク質の生産に依存しているので、本発明を実施するには組み換え遺伝子の分野の既存技術を用いる。本発明に用いる一般的方法が開示されている基本テキストには、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualKrieglerGeneTransferandExpressionALaboratoryManual及びAusubeletaledsCurrentProtocolsinMolecularBiologyがある。本発明は、プロテアーゼインヒビターをコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質導入、形質転換又は形質感染させたバクテリア宿主細胞を提供する。温度、pH等の培養条件は形質導入、形質転換、又は形質感染以前に親宿主細胞に用いられるものと同様であり、当業者にとって自明な事項である。基本的に、融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列は宿主細胞の中で機能するプロモーター配列に作動可能に結合している。このプロモーター遺伝子単位は、複製及び又は発現のために宿主細胞の中で形質転換する前に仲介ベクター内でクローンされる。これらの仲介ベクターは、通常原核細胞ベクターである。しかしながら、この工程は幾つかの好ましい態様では省略することができるので、本発明は仲介ベクターを使用する方法に限定されない。一のアプローチにおいて、プロテアーゼをこの細胞の中で発現させるために、プロテアーゼインヒビターをコードする核酸配列に作動可能に結合する、プロモーター、生物学的に活性なプロモーターフラグメント、又は宿主細胞の中で機能する1以上のエンハンサーを有する発現ベクターによりバクテリア培地を形質転換する。幾つかの好ましい態様において、このDNA配列はプロテアーゼインヒビター又はそれらの変異体をコードする。他の好ましい態様において、プロモーターは調節可能なものである。核酸構築体発現ベクタープロテアーゼインヒビターをコードしている天然又は合成のポリヌクレオチドフラグメントは、異種の核酸構築体又はベクターに取り込まれ、バクテリア細胞の中に導入され、複製される。本明細書で開示するベクター及び方法は、プロテアーゼインヒビター及びそれらの変異体を発現させる各種宿主細胞に用いるのに適している。導入された細胞内で複製され、利用可能である限り、どのようなベクターでも用いることができる。本技術分野において数多くの適したベクター及びプロモーターが知られており、市販されている。適したクローニング及び発現ベクターは、本技術分野においてよく知られている文献に記載されている。適切なDNA配列は適切な方法を用いてプラスミド又はベクター内に挿入される。一般的にDNA配列は当該技術分野分野において既知の標準的方法を用いて適した制限エンドヌクレアーゼ内に挿入される。適切なベクターは、通常、選択マーカーコード核酸配列、挿入部位、及び転写終了配列等の適切な制御エレメントを備えている。幾つかの態様において、ベクターは例えば、コード配列に作動可能に結合している宿主細胞の中のコード配列の発現に効果的な制御エレメントを含む調節配列を含む。数多くの適切なベクター及びプロモーターは本発明の技術分野において知られており、それらの多くは市販されている。典型的なプロモーターは、構造プロモーター及び誘導プロモーターの両方を含む。そのようなプロモーターは、当該技術分野で知られている。当業者は、天然のプロモーターが有する機能を変えることなく1以上のヌクレオチドの交換、置換、付加又は排除により修飾することができることを知っている。本発明はプロモーターに対するそのような変更を包含するけれども、このことに限定されるものではない。遺伝子構築体に用いるプロモーターの選択は当業者の知識の範囲内である。適正な選択マーカーを選択することは宿主細胞に依存している。異なるバクテリア宿主に対して適切な選択マーカーを選択することは当業者の知識の範囲内である。典型的な選択マーカー遺伝子は抗生物質又は他の毒性に対する耐性を付与するタンパク質、又は宿主細胞における栄養素要求性変異又は自然発生栄養欠失を補うタンパク質をコードする。幾つかの態様において、選択されたPIコード配列は良く知られた組み換え技術に従って適切なベクター内に挿入され、PI発現が可能な細胞系統を用いた形質転換に用いられる。遺伝子コード固有の退縮により、実質的に同じ又は機能的に等しいアミノ酸配列をコードする他の核酸配列はクローニングに用いられ、及び上で詳述したように特定のプロテアーゼインヒビターを発現する。それゆえコード領域において、そのような置換をすることは本発明でカバーされる配列変異体に含まれる。これらの配列変異体のいずれか及びすべては、親PIコード核酸配列に対するのと同じ方法で本発明に用いることができる。当業者は異なるPIは異なった核酸配列によりコードされることを認識している。幾つかの態様において、プロテアーゼインヒビター核酸配列の所望の形態、相同体、変異体又はそれらのフラグメントが一旦形成されると、多くの方法により修飾される。非コードフランキング領域を含む配列の場合、このフランキング領域は、切除、変異等を受ける。従って、塩基転位、塩基転移、欠失及び挿入が天然配列上で起こる。幾つかの好ましい態様において、異種核酸構築体は少なくとも1のプロテアーゼインヒビター、又はそれらの変異体、フラグメント、又はスプライス変異体のコード配列を、単独で、PIコード配列が主なコード配列である場には、融合タンパク質又はシグナルペプチドコード配列のような追加的なコード配列と組み合わせて、適切な宿主細胞におけるコード配列の発現に有効な、プロモーター及び終了エレメント又は5’及び又は3’非翻訳領域等の調節エレメントのような非コード配列と組み合わせて、及び又はPIコード配列が異種の遺伝子となるようなベクター又は宿主細胞環境下に含んでいる。幾つかの態様において、適切なプロモーター及び制御配列と一緒に適切な核酸コード配列を含む異種の核酸は、少なくとも1のプロテアーゼインヒビター又はそれらの変異体を発現させるためにバクテリア宿主細胞内へ導入される。本発明の幾つかの態様において、異種の核酸構築体はインビトロにおいて細胞内へPIコード核酸配列を輸送するために用いられる。幾つかの好ましい態様において、この宿主細胞は本発明の核酸配列を安定に組み込む。従って、安定な形質転換体を効果的に生成するための任意の適切な方法を本発明に用いる。本発明の追加的な態様において、第一及び第二発現カセットは単一ベクター上に存在する。一方、他の態様においては、これらのカセットは分離したベクター上に存在する。幾つかの好ましい態様において、プロモーター配列に加えて、効果的な転写終了を提供するために、発現カセットは構造遺伝子組成物の下流に転写終了領域を含む。幾つかの態様において、転写終了領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られるが、他の態様においては、他の遺伝子から得られる。適切な転写終了シグナルの選択は当該技術分野においてよく知られている。更に、任意の適切な発現ベクターを本発明に用いることができる。すなわち、原核又は真核生物の細胞中の発現に用いる各種簡便なベクターが適しており、本発明に用いることができる。標準的なバクテリア発現ベクターは、pBR322ベースプラスミド、pSKF、pET23D等のプラスミド及びMBP、GST及びLacZ等の融合発現システムだけでなくバクテリオファージλ及びM13も含む。更なる態様において、単離を簡便にする目的でエピトープタグが組換えタンパク質に添加される。発現ベクターに通常含まれる追加的なエレメントは、レプリコン、組換えプラスミドを有するバクテリアを選択するのための抗生物質耐性をコードする遺伝子、及び異種配列を挿入するためのプラスミドの非必須領域における特徴的な制限部位である。特定の抗生物質耐性遺伝子を選択することは決定的な要素ではない。任意の多くの知られた抗生物質遺伝子が適している。宿主細胞へのプロテアーゼインヒビターコード核酸配列の導入幾つかの好ましい態様において、本発明の方法は、安定に組み込まれた所望の配列を含む宿主細胞を提供する。しかしながら、代替的な態様において、本発明の方法は、自己複製染色体外形質転換ベクターの維持も提供する。本発明は、外部から提供されたPIコード核酸配列を包含させるために遺伝的に修飾された細胞及び細胞組成物を提供する。幾つかの態様において、親宿主細胞は、発現ベクターで遺伝的に修飾されている。幾つかの態様において、このベクターはプラスミドであり、他の態様においてはこのベクターはウイス粒子、ファージ、ネイキッドDNA等である。従って、各種ベクターを本発明に用いることができるので、ベクターの形態を特定のベクターに限定することは意図しない。インビトロにおいて発現ベクターの輸送のために各種方法が用いられる。異種核酸配列の発現のために細胞内へ核酸を導入する方法は、当業者に知られており、エレクトロポレーション、無傷細胞によるプロトプラスト融合、形質感染、DNAコートマイクロプロジェクタイル法を用いた高速照射、修飾ウイスル核酸を用いた感染、化学媒介形質転換、コンピテンス等を含むがこれらに限定されない。更に、幾つかの態様において、PIコード核酸を含む異種核酸構築体は、インビトロで転写され、得られたRNAは宿主細胞内へ本技術分野でよく知られた方法を用いて導入される。プロテアーゼインヒビターのコード配列を含む異種核酸構築体の導入に続いて、遺伝的に修飾された細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択及び又はPIコード核酸配列の発現の増幅のために適切に調整された栄養培地中で培養される。温度、pH等の培養条件は発現のために選択された宿主細胞に対して用いている条件と同じであり、当業者に明らかである。このようにして異種核酸構築体が導入された細胞の子孫は、異種核酸構築体の中に存在したPIコード核酸配列を含むと考えられる。バクテリア宿主細胞及び発現適切な宿主細胞は任意の好適なバクテリア種を含む。幾つかの態様において、バクテリア宿主細胞は発現宿主細胞及び第一及び第二核酸の供給源として機能する。本発明の方法及び宿主細胞を用いて、驚くべきレベルの発現を得ることができる。本明細書で用いるシステムを用いて達成されるプロテアーゼインヒビターの発現及び分泌レベルは05gl以上である。発現ベクターが宿主細胞に導入された後で、形質転換された宿主細胞は、所望のタンパク質をコードする遺伝子の発現に好ましい環境下で培養される。形質転換細胞の大容量バッチを上で述べたように培養することができる。最終的に、生産物は当該技術分野において既知の方法により回収される。チオールジスルフィド酸化還元酵素又はシャペロンのような補足タンパク質は分泌されたタンパク質を活性構造へと折りたたむことを助けることから、本発明の幾つかの態様にこれらの補足的なタンパク質を用いることができる。チオールジスルフィド酸化還元酵素及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、タンパク質の中の正確なジスルフィド結合の形成を促進する。バチルススブチルスの中のbdbDCオペロンの過剰発現は、ジスルフィド結合を有するタンパク質の生成に有用であることが証明されている。シャペロンは、折りたたまれていない状態中の、曝されている疎水性の領域に結合することによって、分泌タンパク質が折りたたまれるのを助け、好ましくない相互作用を防ぎ、プロピルペプチドイルシストランスイソメメラーゼはプロリン残基に隣接するペプチド鎖の適正な立体構造の形成を補助する。本発明の幾つかの態様において、宿主細胞は少なくとも1のチオールジスルフィド酸化還元酵素又はシャペロンをコードする発現ベクターで形質転換される。本発明は特定のチオールジスルフィド酸化還元酵素又はシャペロンに限定することを意図していないので、本発明の技術分野で知られている任意の適切なチオールジスルフィド酸化還元酵素又はシャペロンが本発明に用いられる。本発明の幾つかの態様において、適切に折りたたまれた分泌タンパク質の分画は、成長培地にジスルフィド結合を酸化及び又は還元する試薬、及び又は通常の酸化還元電位を変更する試薬、及び又は溶媒の性質を変更し、タンパク質の構造及び凝集に影響を与える薬品を添加することにより増やすことができる。特に好ましい態様において、2メルカプトエタノールのようなジスルフィド結合を還元する試薬は、適切に折りたたまれたタンパク質の分画を高めるために好ましい。しかしながら、他の態様及び使用する培地によっては、他のジスルフィド還元及び酸化試薬を単独で、又は組み合わせて本発明に用いることがきでる。単独で、又は、βME等のジスルフィド酸化還元試薬と組み合わせて成長培地に添加する溶媒の性質を変更する他のアジュバンド80等も、適切に折りたたまれた分泌ペプチドの分画を増やし、本発明の各種態様に用いることができる。幾つかの好ましい態様において、βMEは05mM乃至4mMの濃度の幅で、他の態様においては、01mMから10mMの濃度で用いられる。すなわち、当業者は、用いるべきチオール酸化還元試薬及び他のアジュバンドの濃度だけでなく、添加するチオール酸化還元試薬及び又は他のアジュバンドの影響を最適化するための最良の成長培地及び最良の成長条件をどのように選択するかを知っている。本発明は特定のジスルフィド還元酸化試薬又はアジュバンドに限定することを意図していないので、本発明の技術分野において知られている任意の適切な試薬を本発明に用いることができる。発酵指標本発明は培養されたバクテリア種に対する発酵方法に関係する。バクテリア種による異種タンパク質の生産に対する発酵方法は当該技術分野でよく知られている。培養は、水溶性ミネラル塩、培地、有機成長因子、炭素源及び栄養源となる物質、酸素分子を含み、用いられる1以上の特定の微生物種の開始接種をした培地中で行われる。適切な微生物の成長を確実にし、この微生物の転化工程における細胞による炭素及びエネルギー源の同化を最大限にし、発酵培地の中で最大細胞濃度で、最大細胞生産を達成するために、炭素及び栄養源、同化窒素並びに微生物の接種に加えて、適切な割合のミネラルを適切な量供給することが必要である。当該技術分野で知られているように、各種培養培地を本発明に用いることができる。しかしながら、標準的なバクテリア培養培地も本発明に用いられる。幾つかの好ましい態様において、培地は、窒素に加えて、適切な量のリン酸、マグネシウム、カルシウム、カリウム、硫黄、及びナトリウムを適切な可溶性同化イオン及び結合状態で含み、銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、ホウ素、及びヨウ素等の微量元素も、適切な可溶性同化形態で培地中に含まれる。幾つかの態様において、発酵反応は、微生物を勢い良く成長させるために有効な適切な酸素分圧力において、発酵管の内容物を維持するために空気、酸素高含量空気、又は実質的に純粋な酸素分子等の酸素分子含有ガスにより必要な酸素分子が供給される好気プロセスを含む。実際には、酸素化炭化水素基質を用いることにより、微生物の成長に必要な酸素を減らすことができる。しかしながら、好気性微生物及びより程度は低いが嫌気性微生物の生長為に酸素分子の供給は必要である。通気割合は非常に広範囲にわたり変動させることができが、通常の通気速度は、一分間に発酵槽中の液体当たりに供給される酸素含有気体の容量は、約05乃至10容量、好ましくは約05乃至7容量である。この量は反応器に供給される通常の酸素含量の空気に基づいている、そして、精製酸素に換算すると、前記割合は、1分間に発酵槽の中の液体当たりに供給される酸素は約01乃至17容量又は好ましくは01乃至13容量である。微生物転化プロセスに対して用いられる圧力は幅広く変動する。通常の圧力は、装置及び操作コストに対して達成される溶存酸素の理由から、0乃至50psig、好ましくは0乃至30psig、より好ましくは少なくとも大気圧よりわずかに高い圧力である。大気圧より高い圧力は水性発酵槽内の溶存酸素を増やす傾向があり、それによって、細胞の成長速度を高めることから大気圧より高い圧力は有利である。同時に、高い大気圧は装置及び操作のコストを高めるという事実とバランスする必要がある。発酵温度は若干変動させることができるが、大部分のバクテリア種にとって、本発明の技術分野において知られているように、バクテリア種にもよるけれども、通常20°C乃至40°C、一般的に好まれている温度は、28°C乃至37°Cである。微生物は、同化窒素源も必要とする。同化窒素の源は、微生物による代謝の利用に適した形態で窒素を放出することができる任意の窒素含有化合物である。タンパク質の加水分解物等の各種有機窒素化合物を用いることができるけれども、通常、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の各種アンモニウム塩、又は、安価な他の各種アンモニウム化合物を用いることができる。アンモニアガスは大規模操作に対して便利であり、、水性発酵槽中への通気により適切な量を用いることができる。同時に、そのようなアンモニアはpH調節にも用いることができる。水溶性微生物発酵物の中のこのpHの幅は、約20乃至80の典型的な幅である。しかしながら、特定の微生物に対して適したpH幅は、微生物だけでなく、用いる培地にも依存する。従って、当該技術分野で知られているように、培地組成によりpHを幾分変更することも可能である。発酵槽内での発酵混合物の平均滞留時間は、本発明の技術分野で知られているように、発酵温度及び用いられる培地に部分的に依存して変動する。幾つかの態様において、発酵は、炭素含有基質が制限因子として制御でき、それゆえ、良い炭素含有基質の転化が細胞に提供され、非常に大量の転化されない基質による細胞の汚染を避けるような方法が好ましい。残留微量元素は容易に取り除くことができるので、汚染は水溶性基質では問題とならない。しかしながら、非水溶性基質の場合には問題となるので、適切な洗浄工程等の追加的な生産工程が必要とされる。この制限された基質レベルを達成するために必要な時間は、重要ではなく、実施される特定の微生物及び発酵工程により変動する。しかしながら、発酵培地の中の炭素源濃度及び望ましい炭素源レベルが達成されたか否かの決定方法は本発明の技術分野において知られている。幾つかの態様において、発酵はバッチ又は連続操作で実施されるけれども、フェドバッチ操作は制御が容易で、生成物の質が均一であり、全装置の使用が経済的であることから好ましい。必要ならば、炭素及び栄養源物質の一部又は全部及び又はアンモニア等の同化窒素源は発酵槽内に水溶性ミネラル培地を供給する前に添加することができる。すなわち、反応器に導入される原材料流れの各々は、予め決められた速度で、又は発酵槽から出てくるオフガス中の炭素源及びエネルギー基質、pH、溶存酸素、酸素又は二酸化炭素、光透過度により測定される細胞密度等の濃度モニタリングで決定される必要性に応じて制御される。各種物質の供給速度は、チャージされた基質に対してできる限り高い微生物細胞の産生を達成し、効果的な炭素及びエネルギー源の利用と矛盾しないようにできるだけ早い細胞成長を得るために変動させることができる、しかし、より重要なのは、容量単位当たり最も多い生成物を得ることである。各バッチにおいて、好ましくはフェドバッチ操作において、全部の装置、反応器、又は発酵手段、発酵管又はコンテナ、配管、付属の循環又は冷却装置等は、初めに通常約121°Cで約15分間蒸気に曝すことにより滅菌される。滅菌された反応器では、酸素を含む必要な全ての栄養素及び炭素含有基質の存在下で選択された微生物を培地に接種する。用いられる発酵槽のタイプは、重要ではないが、幾つかの態様において、15Lのバイオラフィッテが好ましい。タンパク質の分離好ましい態様において、一旦所望のタンパク質が発現すると、分泌タンパク質が分離される。本発明はその融合類似体から所望のタンパク質を分離する方法を提供する。本明細書で述べる方法はプロテアーゼインヒビター及びその変異体を融合類似体から分離することに用いることができる。発酵ブロスから所望のタンパク質を収集及び精製することは、本発明の技術分野で知られている方法を用いて行うことができる。発酵ブロスは通常、所望のタンパク様物質のほかに、細胞を含む細胞の破片、各種懸濁された固形物、及び他の生物汚染物質を含む。これらは、本発明の分野で既知の方法により発酵ブロスから除去することが望ましい。そのような除去に適した工程は、細胞を含まないろ液を生産するための従来の固体液体分離技術である。幾つかの態様において、発酵ブロス又は他の無細胞ろ液を精製及び又は結晶化工程に用いる前に、精密ろ過、エバポレーション、及び又は透析を用いて、更に濃縮することが好ましい。上清中のタンパク様成分の沈殿又はろ過は、塩又は低いpHを用いて行い、次いで、各種クロマトグラフ手段等又はこれと同様の方法による精製が続く。本発明は特定の分離方法に限定されないので、任意の分離方法を本発明に用いることができる。特に好ましい態様において、発現された所望のポリペプチドがバクテリア細胞から分泌されると、このポリペプチドは成長培地から精製される。好ましい態様において、発現宿主細胞はこのポリペプチドの精製の前に、培地から除去される。発現された所望の組換えペプチドが宿主細胞から分泌されない場合には、宿主細胞を崩壊させ、及び水相に放出されたポリペプチドを抽出することが精製の第一工程となることが好ましい。この場合、発現宿主細胞は、細胞を崩壊させる前に培地から集められることが好ましい。細胞破壊は、リゾチーム、又はベータグルカナーゼ消化により、又は、細胞を高圧で処理すること等の本発明の技術分野で知られている方法を用いて行われる。幾つかの態様において、6のヒスチジン残基をC末端に付加することは所望のタンパク質及びその融合アナログの精製における補助として用いられる。精製の補助としてのヒスタグの使用は、当該技術分野においてよく知られている。6のヒスタグを付加されたタンパク質は、当該技術分野で知られている固定金属イオン親和クロマトグラフィーを用いて容易に精製することができる。精製特定の使用目的のためには、本発明を用いて製造されたプロテアーゼインヒビターは高度に精製されていることが重要となる。精製タンパク質が治療に用いられるときには高度に精製されていることは特に重要であるが、他の使用目的においても必要である。本発明の明細書で述べる方法は、実質的に精製された所望のタンパク質を製造する方法である。本明細書で述べる所望のタンパク質は、医薬品及びパーソナルケア製品に有用である。しかしながら、各種精製レベルのタンパク質が本発明の方法を用いて製造され、本発明の方法を用いて精製したタンパク質が特定の精製レベルであることは意図しない。精製の間のBBIの活性化本発明の幾つかの態様において、精製工程における育成の後、ジスルフィド結合を酸化及び又は還元する組成物、及び又は通常の酸化還元電位を変更する組成物、及び又は溶媒の性質を変更しタンパク質の構造及び凝集に影響を与える組成物を添加することによりタンパク質の活性が増強される。幾つかの特定の好ましい態様において、2メルカプトエタノールのようなジスルフィド結合を還元する試薬の添加は、タンパク質の活性を高めるのに使用される。しかしながら、当該技術分野において知られているように、精製度及び緩衝液の組成に依存して、他のジスルフィド還元又は酸化試薬を単独で、又は組み合わせて本発明に用いることができる。単独で、又はβME等のジスルフィド酸化還元試薬と組み合わせて溶媒の性質を変更する他のアジュバンド80、アルギニン、尿素、等も、タンパク質の活性を高めるために本発明に用いることができる。特定の好ましい態様において、部分的に精製されたタンパク質が緩衝液の中に溶解され80を用いた両性イオン緩衝液bME及びジスルフィド酸化試薬を用いて活性化される。更に、必要ならば、タンパク質の最適な活性を決定するための条件が選択される。例えば、各種βME濃度、酸化試薬濃度、pH、温度、希釈倍率、インキュベーション時間、通気、緩衝液タイプ、TAPS、他の両性イオン緩衝液等、緩衝液濃度、及び溶媒の性質を変え、それゆえタンパク質の立体構造に影響を与え、凝集をさせることが知られている各種アジュバンド80、アルギニン、尿素、等の添加、が用いられる発現システムの最適な条件を決定するために試験される。本発明は特定の還元酸化試薬、希釈倍率、温度、pH、緩衝液タイプ、又は組成物、並びにアジュバンドに限定することを意図していないので、当該技術分野で既知の好適な試薬を本発明に用いることができる。実施例本発明は、以下の実施例においてより詳細に説明されるが、これら実施例に本発明を限定することは意図していない。添付の図は、明細書及び本発明の不可欠な部分である。引用された全ての文献は本発明の開示のために参照により本明細書に援用される。以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。以下の実施例において、以下の略字を用いる。PI、BBI、STI、VEGF及びVegF、ppm、M、mM、μM、nM、mol、mmol、μmol、nmol、gm、mg、μg、pg、L、ml及びmL、μl及びμL、cm、mm、μm、nm、U、V、MW、sec、min、h及びhr、°C、QS、ND、NA、rpm、H2O、dH2O、HCl、aa、bp、kb、kD、cDNA、DNA、ssDNA、dsDNA、dNTP、RNA、MgCl2、NaCl、wv、vv、g、OD、ダルベッコリン酸緩衝溶液、SOCテリフィックブロス、OD280、OD600、A405、Vmax、PAGE、PBS、PBST20、PEG、PCR、RTPCR、SDS、Trisアミノメタン、HEPES、HBS、SDS、bMEBME及びβME、TrisHCl、Tricineメチルグリシン、CHESエタンスルホン酸、TAPSメチルアミノプロパンスルホン酸、CAPSプロパンスルホン酸、DMSO、DTT、Glut及びGSH、GSSG、TCEP、Ci、mCi、μCi、TLC、Ts、Bn、Ph、Ms、Et、Me、TaqDNAポリメラーゼ、Klenowフラグメント、rpm、EGTANNNN四酢酸、EDTA、bla、GEHealthcare、DNA20、OXOID、Megazyme、Coming、NEN、PharmaAS、Dynal、BioSynthesis、ATCC、GibcoBRL、Sigma、Pharmacia、NCBI、AppliedBiosystems、Clontech、OperonTechnologies、MWGBiotech、OligosEtc、Bachem、Difco、Mediatech、SantaCruz、BioVeris、Oxoid、Worthington、GIBCOBRL又はGibcoBRL、Millipore、BioRad、Invitrogen、NEB、Sigma、Pierce、Takara、Roche、EMScience、Qiagen、Biodesign、Aptagen、MolecularDevices、RDSystems、Stratagene、Marsh、BioTek、Biacore、PeproTech、SynPep、及びMicrosoft。バチルススブチルスにおけるBCE103BBI融合タンパク質の生産この実施例では、バチルススブチルス中にBCE103BBI融合タンパク質を生産するために行った試験を説明する。この試験に用いられるC末端にヘキサヒスチジンタグを有するプロBBIタンパク質をコードする合成遺伝子のDNA配列は以下である。上記合成遺伝子によりコードされるC末端にヘキサヒスチジンタグを有するプロBBIタンパク質配列は以下である。成熟型BBIをコードする合成遺伝子のDNA配列の一部は以下である。上の合成遺伝子によりコードされる成熟型BBIのタンパク質配列は以下である。pJ10ベクター中のBCE103セルラーゼ発現カセットへ融合させるBBI遺伝子の増幅に用いるPCRプライマーは以下である。pJM103組込みベクター内へクローンされるaprEBCE103BBIヒスタグ発現カセットの配列を図1に示す。PJM103BBIヒス発現ベクターのプラスミドマップの概略を図2に示す。バチルススブチルスaprEプロモーター及びシグナル配列に融合されたアルカリセルラーゼ遺伝子は、pUCAPR103をEcoRIBamHIフラグメントとしてpJM103内でクローニングしたAmericanSocietyforMicrobiologyWashingtonDCpp6156241993。C末端にヒスチジンタグを有するダイズボウマンバークプロテアーゼインヒビターは、オペロンテクノロジーにより合成された。3’HindIII部位を用いてBBI遺伝子をpJM103ベクター内でクローンさせた後に、BCE103遺伝子を用いる正確なりーディングフレーム中に5’BamHI部位及び3’末端に導入された強力な転写終了因子を生成するプライマーを用いてBBI遺伝子をPCRにより増幅した。合成BBI遺伝子をテンプレートとして用いて、BBIfusionFW及びBBIHISHindIIIRV、又はBBIfusionFW及びBBIHindIIIRVのプライマーをそれぞれ用いてC末端にHisTagを有する、又は有しないPCRフラグメントを生成した。他の方法で示さない限り、製造会社の説明書に従いハイフェデリティープラチナTaqポリメラーゼを用いてPCRを30サイクル行った。aprEBCE発現カセットを運ぶBamHIHindIIIフラグメントとして、PCRフラグメントをpJM103内でクローニングした。正確な遺伝子配列をDNA配列決定により確認した。従って、図1に示すように、BCE103セルラーゼ遺伝子によりコードされる第一CBDリンカー配列のC末端コード領域に対するフレーム中にBBI遺伝子の成熟コード領域のN末端を融合した。それゆえ、2のBCE103のCBDは、最終的な発現カセットの中のBBIにより置き換えられ、pJM103BBI又はpJM103BBIhisとなった。このaprEプロモーターはBCE103BBI遺伝子融合体の発現を制御する。有用なバチルススブチルス細胞、BG3934comKを発現プラスミド、pJM103BBI又はpJM103BBIhisで形質転換した。バクテリアは、キシロース誘発プロモーターの存在下でcomK遺伝子により誘発させることにより有用にすることができる。形質転換体を、5μgmlクロラムフェニコールを含むウリアブロスアガープレート上で選択した。遺伝子増幅での発現を高めるために、コロニーが縞状になり、抗生物質を含む培地における成長率がクロラムフェニコールが欠失している培地における成長率と同じになるまで、25μgmlのクロラムフェニコールを用いて、LAプレート上で育成した。BCEBBI融合タンパク質は、TSB培地、30gL又はMOPSベース合成培地中であるMBD培地において、37°Cの振とうフラスコの中で育成することにより生成された。NH4Cl2、FeSO4、及びCaCl2を培地から除き、3mMのK2HPO4を用い、60mMの尿素、75gLのグルコース及び1のソイトンを供給した以外は、に記載されたようにMBD培地を調製した。微量栄養素は、100倍濃度の貯蔵溶液として調製された。この溶液は1リットル中400mgのFeSO47H2O、100mgのMnSO4H2O、100mgのZnSO47H2O、50mgのCuCl22H2O、100mgのCoCl26H2O100mgのNaMoO42H2O、100mgのNa2B4O71OH2O、10mlの1MCaCl2、及び10mlの05Mクエン酸ナトリウムを含む。BCE103BBI融合タンパク質は、標準的なタンパク質染色方法Pierceを用いて44kDa付近のSDSPAGEゲル上の主要なタンパク質バンドとして視認することができる。BCE103BBI融合タンパク質は製造会社の説明書に記載の手順を用いたSDSPAGEゲルの免役ブロットにより確認された、RocheAppliedScience抗ヒスタグ抗体又は抗BCE103セルラーゼポリクローナル抗体を検出に用いた。BCE103活性は、LAセルラーゼ指標プレート上でセルラーゼ消化を定性的に評価し、当該技術分野で知られている方法を用いて、合成基質、4ニトロフェニルβDセロビオースを用いた培養ブロス中のアッセイ緩衝液を直接アッセイすることにより定量的に評価された。BBI活性を決定するのアッセイ緩衝液の中でトリプシン抑制アッセイを行った。特に、標準曲線は、2μgmlの標準BBI溶液を1:1の連続希釈することにより作製した。疎水性相互作用カラムを用いて、20mMMESpH60中1mgmlトリプシンキモトリプシンインヒビターからこの標準BBIを精製した。このカラムを20mMMESpH60で平衡化し、5mgのインヒビターを負荷し、平衡化に用いた緩衝液で洗浄した、その後、BBIを水で溶出した。抑制アッセイで試験する未知のBBIサンプルを、2以上のデータポイントが標準曲線の範囲内に入るように必要に応じて希釈した。希釈した各標準BBI及びサンプル20μLに、80μLの5ngmlのウシ脾臓トリプシン。便宜上、この標準物質とサンプルを96ウェルマイクロタイタープレート中に整列させた。混合及び25°C15分間のインキュベーションにより反応を行った。インキュベーションの後、05mgmlのトリプシン基質100μL、SucAAPRpNAを添加し、混合し、ODを15分間モニターした。ペクトラマックス250を用いて少なくとも12秒毎に一回記録をとった。記録されたデータのポイントは、各反応に対するVmaxの決定に用いた。標準曲線は、BBI濃度に対するVmaxのプロットにより作製し、4の指標曲線に当てはめた。全てのデータのフィッティングは製造会社が提供するソフトウェアを用いて行われた。未知サンプルのBBI濃度を標準曲線を用いて計算した。代替的に、BBI活性は同じ手順を用いてウシ脾臓キモトリプシン抑制を検出することにより測定されたの添加により測定された。振とうフラスコサンプルの力価が、通常、04乃至09mgmlBCE活性及び40乃至150μgmlBBIトリプシン抑制活性になるように培養が行われる。しかしながら、力価はバクテリア系統、培養培地及び育成条件の最適化により、更に改善することができる。野生型BBIに対するBCE103融合に加えて、BBIに対する融合タンパク質変異体及びBCE103及びBBIの間の各種リンカーを有する融合タンパク質は上で概説した方法を用いて、以下の実施例のように製造することができる。更に、融合タンパク質はBBIを精製工程において第一CBDを用いることの助けとなる第二CBDリンカーに結合させたときにも生成される。BCE103BBI融合タンパク質としてのBBI反応部位ループのペプチド置換体の生成この実施例では、BCE103BBIのようにBBI反応部位へ置換するペプチドを生成するための試験を説明する。これらの試験の各工程に用いるプライマー及び他の配列を以下に記載する。BCE103融合部位から遺伝子の終わりまでの12BBIck81配列を図3に示す。CK37281ペプチド配列をトリプシン及びキモトリプシン抑制ループの両方に挿入した。QuikChange部位直接変異誘発を用いたBBI遺伝子中にEcoRI部位を導入するために用いるプライマーは以下である。VegF結合ペプチドCK37281でトリプシン抑制部位を置換するためにアニールされ、BBI遺伝子の中でクローニングされるDNAオリゴヌクレオチド配列は以下である。VegF結合ペプチドCK37281でキモトリプシン抑制部位を置換するためにアニールされ、BBI遺伝子の中でクローニングされるDNAオリゴヌクレオチド配列は以下である。合成BBI遺伝子のトリプシン又はキモトリプシン反応部位ループに中にペプチドを導入するためのカセットを作るために用いるオリゴヌクレオチドペアのDNA配列を以下に記載する。これらのペプチドコード配列はp2JM103発現ベクター内にSacISalIフラグメントとして導入された。QuickChangeIIXL部位直接変異誘発キットを用いてトリプシン又はキモトリプシン反応部位へペプチド配列を導入するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーペアのDNA配列を以下に記載する。製造会社の説明書及びこの実施例に記載の通りに反応を行った。68°Cで6分間の伸長を行い、95°Cで50秒間の変性を行い、55°Cで50秒間のアニーリングを20サイクル行った。20サイクル終了後、68°Cで20分間の最終伸長を行った。p2JM103lnk2BBI発現ベクターのキモトリプシン反応部位ループへMM021ペプチドを導入するためのカセットを作るために用いるオリゴヌクレオチドペアのDNA配列を以下に記載する。このカセットはベクター内のSphI及びSalI制限部位へ結合された。システインコンストレインドペプチドcysteineconstrainedpeptidesからできているライブラリーは所望の基質に結合するペプチドの選択のための良く知られた試薬である。BBIはペプチド結合を選択するために用いられる各種方法で提示されるペプチドループに似た構造を有する2のシステインコンストレインド反応部位ループを有する。従って、一旦システインコンストレインド結合ペプチドが選択されると、BBIは結合反応におけるペプチドを提供するためのスキャッフォールドとして使用するのに適している。DNAオリゴヌクレオチドカセットを用いて、CK37281ペプチド配列で、トリプシン、キモトリプシン、又は両方の活性部位ループを置換することによりVegF結合ペプチドCK37281をBBIの中へ移植した。構築を促進させるために、上で示すBowBecoF及びBowBecoRプライマーを用いたQuikChange部位直接変異誘発を用いて製造会社の説明書に記載従い、トリプシン及びキモトリプシン反応部位ループの間のBBI遺伝子のコード領域にEcoRIサイトを導入した反応に用いた。97°Cで3分間の第一変性工程の後、68°Cで12分間、95°Cで30秒間及び55°Cで1分間のPCRサイクルを18回行い、その後に68°Cで15分間の最終伸長を行った。トリプシン抑制ペプチドループの置換のために、2のDNAオリゴヌクレオチドをアニールし、SacI及びEcoRI反応部位に結合した。同様に、キモトリプシン抑制ループの置換のために、EcoRI及びSalIサイトをオリゴヌクレオチドのアニーリングにより作られたDNAカセットの挿入に用いた。CK37281ペプチドは、トリプシンループを初めにCK37281ペプチドで置換した後に、オリゴヌクレオチドを用いてキモトリプシンループの中にCK37281を挿入することにより両ループの中に移植した。トリプシンループの中CK37281を有するBBIをSacISphIフラグメントとしてpJM103BB発現カセット内に移動した。キモトリプシンループ又は両者のループの中のCK37281を有するBBIを、SacISalIフラグメントとしてpJM103BBIの中に挿入した。正確な配列はDNA配列決定を用いて確認した。得られたベクター、pJK1031BBIck81、pJK1032BBIck81又はpJK10312BBIck81をバチルススブチルスBG3934comKの形質転換に用い、上の実施例1に示すように、BCE融合タンパク質の生産を確認した。無細胞ブロスに存在する主要タンパク質である44kDa付近の融合タンパク質がSDSPAGEで検出された。幾つかのケースにおいて、BCE触媒コアに対応する34kDa付近の主要タンパク質バンドの存在により視認することができる有意なBBI部分の退縮が見られた。このケースにおいて、BCE103セルラーゼの力価は、野生型BBIに融合させて測定したの同様であるが、BBIの活性は通常の半分以下であった。育成の間のBBI変異体のタンパク質分解を減らすために、9のプロテアーゼ遺伝子を欠失させたバチルススブチルス系統を発現宿主細胞として用いた。育成温度及び通気量を減らした。これらの変更により、主要融合タンパク質バンドはBCE触媒コアと思われる分子量で存在するバンドと大差なく、SDSPAGE上で観察された。BCE103セルラーゼのC末端に融合させたBBIのトリプシン及び又はキモトリプシン活性部位ループへの置換を行ったときに、CK37281ペプチドに加えて、多くのシステインコンストレインドペプチドcysteineconstrainedpeptidesが生産された。特定の例を以下に示す。1相補的な抑制因子として設計又は選択されたペプチド、第一又は第二反応部位ループへ導入されたコンプスタチン、C2c、C3c、C4c、及びC5c、又は1B、2B、4A、5A、61A、7A、8B、9A、10B、111A、12B、13A、及び151Aへ結合する反応においてFactorBにより選択されたペプチド2プロテアーゼファクターXa、又は角質溶解キモトリプシンXal又はhSCC1に結合するためのペプチド3FGF5結合反応により選択されたペプチド;1A6、1C2、2E2、2E5FGFns、FGFkr、FGFhl、FGFgy、MM005、MM007、MM009、MM010、MM017、FGFps1、FGFps2、及びFGFpsB、及び4TGF1結合反応により選択されたペプチド;1A8、lA12lE11、TGFpsl及びMM021。これらのペプチドをトリプシン又はキモトリプシン活性部位ループのいずれかへ導入するために用いるオリゴヌクレオチド及びこれらのペプチドをBBIに移植するために用いる方法は上に記載されている。全てのケースにおいて、生産された融合タンパク質をDSDPAGEゲルにより評価した。CK37281置換ペプチドに対して説明したのと同様に、幾つかの置換ペプチドをもちいて、タンパク質分解を減少させることによりにより無傷の融合タンパク質の生成量が高められた。チオール還元酸化試薬によるBBIの活性化育成の後のBBIの活性は、無細胞上清中で測定されるBCE103セルラーゼの活性から予想されるものよりも通常5乃至20倍低い。BCE103BBI融合タンパク質中のBBI活性の増加は、接種の後、14mMの濃度のbMEをMBD成長培地に添加した後14時間育成することにより確実に得ることができる。融合タンパク質中のBBIのトリプシン又はキモトリプシン抑制活性は、結合ペプチドをキモトリプシン又はトリプシン反応部位ループにそれぞれ置換したときよりも低くなる。野生型BBIを用いて、bMEで処理することによって、抑制活性は増加させることができる。予想しないことに、これらの試験においてBBI育成の間の活性における他のチオール還元試薬及びトリス2カルボキシメチルフォスフィンの影響は小さいか、無視できる程度であった。抗酸化剤、他のアジュバンド80を培地に添加すること、又は30°Cにおける育成も、BCE103:BBI活性の比を改善しなかった。特に育成の間のBBI活性を決定するために、p2JM103E32BBIcK81で形質転換させたバチルススブチルスBG6006を含む培地を、250mlの振とうフラスコ内で37°C、13時間、40mlのMBD中で育成した。その後、図4で示すチオール還元試薬を添加し、62時間の育成の後に細胞の上清を収穫した。2メルカプトエタノール、システイン、還元グルタチオン及びDLジチオスレイトールを図4に提供されているグラフで示す最終濃度になるように成長培地に添加した。5mMβMEの濃度はより良いBCE103BBI活性比となったが、通常は、試薬の添加がバクテリア成長を減少させることから、BCE103及びBBI力価は全体的に減少した。BCE103及び2BBIck81の力価は実施例1で説明したアッセイを用いて測定した。Qセファロースイオン交換クロマトグラフィーによる融合タンパク質の部分的な精製の後にもBBIの活性化を行うことがきでる。融合タンパク質を作動している振とうタンク又は発酵槽から得られた無細胞ブロスから精製した。このブロスを、ろ過し、5乃至10倍の水で希釈し、pHを75乃至80に調製した。希釈サンプルはQセファロースレジンを充填したカラムに負荷した。このカラムを50mMトリスpH75で洗浄し、300mMNaClを含む同じ緩衝液で再度洗浄した。融合タンパク質は、700mMのNaClで溶出した。BBIを活性化させるために収集された融合タンパク質分画を10倍のアッセイ緩衝液の中で溶出し、その後、2mMのβME及び02mMの酸化グルタチオンを添加し約24時間室温で、スターラープレート又はロックプラットフォーム上で攪拌を続けることにより処理した。BBIは、BCE103セルラーゼで測定される濃度にもとづき予測されるトリプシン抑制活性の約70乃至100を達成した。上で概説した活性化方法は、通常最良の結果を出すけれども、幾つかのケースにおいて、所与のサンプルの活性を最大化するために96ウェルプレートにおいて、スクリーニングを行った。最初にスクリーニングする典型的な条件は、アッセイ緩衝液による希釈倍率、βME濃度及び酸化グルタチオン濃度である。BCElnk22BBIck81融合タンパク質の活性化を図5に示す。この特定の態様において、Qセファロース精製後の融合タンパク質を0005のTween80含むダルベッコPBSを用いて1:10に希釈した。βメルカプトエタノールを3mMの最終濃度で添加し、振とう機上で室温、一晩インキュベートした。このサンプルは、更に磁気攪拌プレート上で激しく攪拌しながら60時間室温でインキュベートした。BCE103及び2BBIck81の力価を、それぞれ、セルラーゼアッセイ及びトリプシン抑制アッセイにより決定した。幾つかの態様において、大容量発酵槽のからの無細胞ブロス中のBBI又はその変異体の活性化のような、活性化反応において、希釈及びβME濃度を減少させることが好ましい。このことは、高濃度緩衝液、又はCHES等の両性イオン緩衝液に変更することにより達成できる。例えば、無細胞ブロスは375mMのCHESpH68中、0005のTWEEN80で希釈し、その後に、1mMのβME及び10mMのNa2SO3で活性化し、攪拌しながら室温で約24時間インキュベーションする。BCE103セルラーゼ融合変異体等のBBIあるいはこの変異体の力価はこの方法により、予測値に対して70乃至100まで活性化することができる。BCE103BBI融合タンパク質の切断による遊離BBI変異体の放出この実施例は、BCE103BBI融合タンパク質を切断による遊離BBI又はその変異体の放出について説明する。培地育成の間にBCE103触媒ドメイン及びBBIの間に切断可能部位を作り出すために、アニールされ、pJM103のBamHI及びSacIサイトへ結合するDNAオリゴヌクレオチドペアの配列を以下に示す。BCE103セルラーゼの第二CBDリンカーへBBIを融合するために、へアニールされ、p2JM103BBIのBamHI及びSacI部位へ結合されるDNAオリゴヌクレオチドペアの配列を以下に示す。アスパラギン酸及びプロリン残渣の間の酸切断をするのに適したペプチド配列を以下に示す。QuikChange部位直接変異誘発によりBssHII部位をpJM103BBIへ導入するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーを以下に示す。BBIの停止コドンの後にHIndIII及びXhoI部位を導入し、LATの後にPacI部位を導入し、本来のHindIII部位を除去するためのカセットとしてアニールされるDNAオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。BCE103触媒ドメイン及びBBIの間に挿入される上で提供される酸ラベルリンカーを生成するために用いるPCRプライマーを以下に示す。上で説明する第一CBDリンカーに挿入する酸ラベルリンカーを生成するために用いるPCRプライマーを以下に示す。BBI及びBCE103触媒ドメインの間に挿入された酸ラベルリンカーのタンパク質配列を以下に示す。酸ラベルリンカーを太字で示し、第一CBDドメイン配列を下線で示す。精製工程の間にBBI及びBCE103触媒ドメインの間に切断可能部位を生成するために、アニールされ、pJM103BBIのBamHI及びSacIへ結合されるDNAオリゴヌクレオチドペアの配列を以下に示す。精製工程の間にBBI及びBCE103触媒ドメインの間に挿入される切断可能部位を生成するために、へアニールされ、pJM103lnk21BBIck81のBamHI及びSacI結合されるDNAオリゴヌクレオチドペアの配列を以下に示す。QuikChange部位直接変異誘発を用いてリンカー2へE及びE3リンカーを導入するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーペアの配列を以下に示す。BCE103触媒ドメイン及びBBIの間のE3リンカーのタンパク質配列はDNNDPIPEPDDESFNMPIPEPである。この配列において、Eリンカーを下線で示し、大腸菌における間違った組換えにより生成された配列を太字で示す。Mprによる切断はE3リンカーの中にある3のグルタミン酸のいずれかの後に引き起こすことができる。従って、この構築体は、BCEBBIとなる。BBI及びBCE103触媒ドメインの間に挿入されるGenenaseI切断可能部位を生成するために、へアニールされ、p2JM103lnk22BBIck81のBamHI及びSacIへ結合されるDNAオリゴヌクレオチドペアの配列を以下に示す。BDE103触媒ドメイン及びBBIの間に挿入されるGenenaseI感受性切断部位のタンパク質配列は、DNNDPIPDPGAAHYVEFQである。GeneaseI部位で、リンカー2は下線で示。Mprによる切断もGen4リンカーの中のバリンの後のグルタミンの後に発生させることができる。本発明で用いられる配列はBCEBBIである。BCE103lnk22BBIck81融合タンパク質における切断部位を以下に示す。BCE103触媒ドメインのC末端のアミノ酸、リンカー2配列及び2BBIck81配列を示す。酸熱に不安定なAspPro結合は塗りつぶし矢印、グルタミン酸の後のMpr感受性結合は線矢印で示した。遊離BBI又はその変異体を単離するために、BCE103BBI融合タンパク質からBBI部分を切り離すことが必要になる。幾つかの態様において、バチルススブチルスにより製造される固有のプロテアーゼを用いてこれは育成の間に行われる。幾つかの代替的な態様において、この切断は育成の後の精製工程dで行われる。リンカーは育成の間の切断に感受性を有する可能性のあるものが設計され、BamHISacIカセットとして、pJM103BBI又はp2JM103BBI発現ベクター内でクローニングされる。融合タンパク質に対するBCE103触媒ドメインの生成は実施例1で説明されるSDSPAGEゲル上で解析された。proリンカーを除く、全てのリンカーにおいて、BCE103触媒コアに対応する大きなバンドのほかに、ほぼ完全に切断されていると考えられる融合タンパク質の小さな切断が観察された。不幸なことに、育成の間に切断を行うと無細胞上清中で測定されるBBI活性は無視できるほどとなり、SDSPAGEゲル上で同定するされるBBIバンドを生じなかった。本発明を特定の方法又は理論に制限することは意図しないけれども、BBIはその不活性形態において、タンパク質分解に影響を受けやすいことが明らかでる。従って、活性化後の精製工程の間に切断することが通常好ましい。幾つかの態様において、アスパラギン酸及びプロリン残渣の間の結合は、当該技術分野で知られている様に、酸性pHにおける熱処理により切断される。BCE103セルラーゼの中の第一CBDリンカーは酸熱処理により切断される可能性のある3のAspProペプチド配列を有する。しかしながら、これらの部位において、酸熱処理による切断は効率が悪いことがわかった。特に酸熱に不安定なタンパク質配列は文献に記載されている。そのような3の配列は、WGDPHY、DNNDPI、及びWADPNである。これらの酸に不安定なリンカーが、BCE103BBI発現ベクター、pJM103BBI、へ導入される前に、QuikChangeXL変異誘発部位を用いて、BCEbssF及びBCEbssRのオリゴヌクレオチドを用いて、aprEシグナル配列コード領域にaBssHII部位を挿入した。その後、HindIII及びXhoI部位をLATターミネーターの前に挿入し、SalI及び元のHindII部位へのオリゴヌクレオチドカセットの挿入により、このターミネーターの後にPacI部位を付加した。この新しいベクターをp2JM103BBIと称した。前方向プライマー、BCE103coreBssHIIFw、リンカーWGDPHYR、リンカーDNNDPIRV又はリンカーVVADPNRVの各リバースプライマーを用いて、及びpJM103BBIをテンプレートとして用いたPCRにより、酸に不安定なリンカーフラグメントを製造した。970bpのPCRフラグメントをBanHI及びPstIで消化し、酸リンカーフラグメントをコードしている154bpのフラグメントを電気泳動の後、アガロースから単離し、BanHI及びPstIで消化ししたpJM103ベクター内へ結合した。最終発現ベクターにおけるリンカー配列、p2LM103lnkBBI、p2JM103lnk2BBI及びp2JM103lnkBBIをDNA配列決定により確認した。有能なバチルススブチルス系統、BG3934comK又はBG6006を、プラスミドを用いて形質転換し、コロニーを5μgmlクロラムフェニコールを含むLAプレート上で選択し、実施例1で説明する様に、25μgmlクロラムフェニコールを用いて増幅した。同様に、第一CBDリンカーに挿入した。特に、PCRフラグメントは、前方向プライマー、BCE103corePstIFW、LplusDNNDPIRV又はLplusVVADPNRVのリバースプライマーを用いて、テンプレートをp2JM103BBIとして酸に不安定なリンカーを生成した。約150bpのフラグメントを、BamHI及びPstIを用いて消化し、精製し、BanHI及びPstIを用いて消化したp2JM103BBIに結合した。正確な配列をDNA配列決定法により確認し、上で述べたように、p2JM103plnkBBI、p2JM103plnk2BBI及びp2JM103pllnk3BBIは、バチルススブチルスの形質転換に用いた。MBD培地での育成の後、上で説明したイオン交換クロマトグラフィーにより融合タンパク質を精製した。融合タンパク質は10のギ酸中、55°C、16時間での処理することにより切断された。BCE103触媒ドメインは、酸処理の間に沈殿し、遠心分離により分離された。上清中の遊離BBIをスピードバクで一晩乾燥した。SDSPAGEゲルに負荷する前に50mMトリスpH8の中にサンプルを懸濁した。SDSPAGEのタンパク質染色解析により、酸切断は、リンカー2がBCE103触媒ドメイン及びBBIの間に挿入されている場合には、融合タンパク質において有効であることが観察された。このリンカーは、pH2、75°C、20mMのグリシン中で数時間処理することで切断されることがわかった。代替的な態様において、精製工程の間にプロテアーゼで処理することにより融合タンパク質を切断した。グルタミン酸特異プロテアーゼ、フリンブリスターゼ、GenenaseI及びエンテロペプチダーゼに対する切断部位を用いてリンカーを消化した。リンカーは、BenHI及びSacI部位を用いて、発現ベクター中のBCE103触媒コア及びBBIの間にオリゴヌクレオチドカセットとして導入された。オリジナルの発現ベクターのコード領域において、第一CBDドメインの中及びBBIの中の第三残渣にバチルススブチルスMpr又はV8プロテアーゼ等のグルタミン酸特異プロテアーゼにより切断されやすいと予測されるグルタミン酸残渣がある。しかしながら、BsMpr又はV8プロテアーゼのいずれもがこれらの部位でBCEBBI融合タンパク質を切断することが困難であることがわかった。従って、これらのプロテアーゼにより切断されやすい他のリンカーを設計することが必要であった。上で説明した6の不安定なリンカーの切断をBsMprにより試験した。これらの融合タンパク質は室温で、16μgのBsMprを用いて16時間処理することにより切断された。切断の後、BCE103触媒ドメインを10のギ酸を添加することにで乾燥させた。DSDPAGEに負荷する前に50mMトリスpH8にサンプルを懸濁した。酸切断と同様、BCEDNNDPIPDPBBI融合タンパク質は、他のリンカーのどれよりもBsMprで効果的に切断された。それゆえ、BBI及びその変異体は、酸熱処理又はBsMpr等のグルタミン酸特異プロテアーゼを用いたタンパク質分解のいずれかによりBCEDNNDPDPDPBBI融合タンパク質から、効果的に放出されていることがわかった。Mprにより切断されるように設計された幾つかの他のリンカーも試験されたが、リンカー2よりも効果的なこのはなかった部位切断変異誘発を用いた形質転換の後に大腸菌内の誤った組換えにより生成された。上に示す様に、リンカー2の中に、酸熱に不安定な切断部位と、Mrpにより切断されやすい3の部位がある。フリン又はブリスターゼ又は、エンテロペプチダーゼによる切断のために構築されたリンカーが試験されたが、これらのプロテアーゼより効果的に切断された配列はなかった。4のリンカーも消化され、GenenaseIによる切断について試験された。融合タンパク質の効果的な切断は、Gene4リンカーを用いたときに観察された。BsMprもまた、Gene4リンカーを効果的に切断した。精製されたBCElnk22BBIck81融合タンパク質の活性化の後の、BsMprによる切断はSDSPAGE上では観察されなかった。しかしながら、リンカー2を有するBCEBBI融合タンパク質の活性化の後の切断は、バチルスリケニフォルミスから単離されたMprプロテアーゼを用いて成し遂げることができる。本発明を特定のメカニズムに限定することは意図しないけれども、成熟BBIの中の3番目のアミノ酸の切断はBIMprに対してより感受性があることが明らかである一方で、BBIのC末端から6番目のアミノ酸はBsMpr切断に対してより敏感である。幾つかの態様において、切断の後、BBIは、上で述べるBCE103触媒ドメインの選択的酸沈殿により、イオン交換クロマトグラフィー、又は、50mMトリスpH80を用いた無水トリプシンアガロースに負荷し、150mMNaClで50mMトリスpH80を洗浄し、その後、300mMNaCldepH2250mMグリシンで結合BBIを溶出することにより、BCE103触媒ドメインから単離精製された。BBIck81のVegFへの結合本実施例は、BBIcK81のVegFへの結合を評価するために行う試験について述べる。BCE103lnk22BBIck81融合タンパク質は実施例2で述べたように、バチルススブチルスを用いて生成された。融合タンパク質を生成し、実施例3に記載されているように、βME及び酸化グルタチオンを用いた処理により、BBIトリプシン抑制活性が増加された。融合タンパク質はBsMprプロテアーゼにより切断され、Qセファロースカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーによりBCE103触媒ドメインから2BBIcK81を精製した。すなわち、切断の後、切断されたサンプルのpHを55に調製し、このサンプルをその後、カラムに負荷した。遊離2BBIck81は、25mM酢酸ナトリウムをカラムに通すことにより洗浄されるが、BCE103触媒コアは樹脂に結合したままであった。2BBIcK81分画は精密ろ過により濃縮され、結合アッセイに基づく、電気化学発光分析を用いて解析された。抗VegF抗体及びVegFは、製造会社の説明書に従って電気化学発光ダイ及びビオチンでそれぞれ標識した。全ての材料は01Tween80を用いてダルベッコPBS中に溶解した。抗VegF抗体の一連の希釈物及びVegFの一連の希釈物は、強固なECLシグナルを与える濃度を決定するためにアッセイされた。2BBIck81結合テストのために、50μLの500ngmlECL標識抗VerF抗体、50μLの250ngmlビオチン標識VegF及び100μL2BBIcL81を振とうしながら、室温で2時間インキュベーションした。その後、50μLの02mgmlストレプトアビジンコートビーズを添加し、室温で30分インキュベートした。ECLシグナルは、製造会社の説明書に従い、BioVerisM8384解析を用いて測定した。図6に示すように、ECLシグナルは2BBIck81濃度が増加する毎に減少した。標識された抗VegF抗体のより多くが磁気ビースが付着しているVegFに結合したことを示す。従って、CK37281ペプチドは、BBIキモトリプシン抑制ループ上に移植されたときに、μモルの濃度で抗VergF抗体とVegFの結合について競合することがわかった。実際には、2BBIck81はVegF結合に対して、合成CK3781ペプチド自身よりも強固に競合することがわかった。CK37281ペプチドは、トリプシン抑制ループ、1BBIc81内に挿入され、BioVerisアッセイにおいて、抗VegF抗体と競合した。従って、BBIは各種スクリーニング法により選択される本発明の活性結合ペプチドのスキャッフォールドとして有用である。2BBIck81の生産に対する融合代替パートナーの使用本実施例は、融合代替パートナーを評価するための試験を説明する。pET40由来のdsbc遺伝子を増殖させるのに用いるオリゴヌクレオチドプライマーのDNA配列を以下に示す。このプライマーはp2JM103Gen42BBIck81内へのクローニングのために5’末端にBssHII部位を、3’末端にBanHI部位を生成する。リンカー2を有するBBIへ、シュードモナスメンドセラクチナーゼ遺伝子の融合のためのカセットを作るために共にアニールされるオリゴヌクレオチドのDNA配列を以下に示す。BBI部分は7個のジスルフィド結合を有することから、BCE103セルロース触媒ドメイン以外の融合タンパク質を用いて、活性BBIの高い力価が得られることが予測される。例えば、幾つかの態様において、チオールジスルフィド酸化還元酵素及び又はタンパク質ジスルフィドイソメラーゼは正しく折りたたまれたBBIを生産するための融合タンパク質として用いられる。この態様において、追加的な活性化ステップが大部分の環境下において必要とされない。追加的な態様において、バチルススブチルスの中で高い力価で製造される他のタンパク質も融合パートナーとして用いることができる。例えば、フミコーラインソレンス由来の熱安定タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、バチスルスブレビスの中の免役グロブリンの軽鎖の融合パターンとして用いられている参照のこと。BBI生産に関して、hiPDIがBCE103よりも良い融合パートナーであるかどうかを決定するために、hiPDI遺伝子を合成し、発現ベクター、p2JM103lnk22BBIck81、の中で、BssHIISacIフラグメントとしてクローニングした。制限部位が導入された又は欠失されている場合を除き、高頻度で、高発現するバチルススブチルス遺伝子の発生コドンが合成遺伝子の設計のために選択された。最終濃度において、成熟hiPDI遺伝子のN末端をAprEシグナル配列に融合し、C末端はエンテロペプチダーゼ切断部位を有するリンカーに融合した。それらを順番に、2BBIck81に融合する。この発現ベクター、p2JMPDIEK2BBIck81はバチルススブチルスBG6006を形質転換するために用いた。融合タンパク質の生成はMBD培地中で2mMβMEを添加、あるいは無添加した状態で、接種後14時間で評価に用いた。SDSPAGEゲルにより評価されるように、PDI2BBIck81融合タンパク質の生産は、通常同じ条件で育成されたBCE2BBIck81によりわずかに少ない。PDI2BBIck81細胞を含まない上清を用いて測定されたBBI力価も又、通常BCE2BBIck81融合細胞よりもわずかに少なかった。BCE103への融合と同様に、PDIへ融合させたときに測定されるBBI力価は、2mMβME中で育成したときに高くなり、BBI活性はβMEフリー培地中で育成したときの育成の後、細胞フリー上清にβMEを添加することにより高められた。したがって、PDIのチオールジスルフィド酸化還元活性は、融合タンパク質の中の活性か2BBIck81の力価を有意に改善しなようであり、BBI分子を活性化する必要を排除した。育成の間のBBI力価を改善すると思われる融合タンパク質の還元電位を増加させるために、大腸菌由来のDsbCが2BBIcK81に対する融合パートナーとして用いられた。dsbC遺伝子は、DsbCBBIF及びDsbCBBIRをプライマーとして用いて、pET40をテンプレートとして用いて、製造会社の説明書に従い、HerculaseEnhancedDNAポリメラーゼを用いたPCRにより増幅させた。単離されたPCRフラグメントはベクターp2JM103Gen42BBIck81の中で、BssHIIBsmHIフラグメントとして用いてクローニングした。融合遺伝子の正確な配列はDNA配列決定により確認された。このケースにおいて、DSbC2BBIck81融合タンパク質の力価はSDSPAGEゲル上で判断した時に、BCE2BBIck81融合タンパク質よりも有意に低かった。トリプシン抑制により測定される活性2BBIck81力価も又十分に低かった。バチルススブチルスの中で高い力価を伴い生産される他のタンパク質は、BBIの生産に対する融合パートナーとして用いることができる。そのようなタンパク質の一つは、バチルススブチルス由来のaprEプロモーターを用いて高力価が発現されるシュードモナスメンドシナ由来のクチナーゼである。aprEクチナーゼ遺伝子融合は、EcoR1Aln44Iフラグメントとして、Alw44IBamHIリンカーオリゴヌクレオチドカセットを用いて、EcoRI及びBamHIを用いて切断されたp2JM103lnk22BBIck81へ結合した。このクチナーゼリンカー22BBIcK81発現ベクターは、バチルススブチルスBG6006細胞の形質転換に用いて、融合タンパク質はMBD培地の中で他の融合タンパク質に対して記載したのと同様に生産された。このケースにおいて、クチナーゼリンカ-22BBIck融合タンパク質はSDSPAGE上で見られる主要バンドではなく、測定されたリパーゼ力価及びBBIの力価はBCE2BBIck81融合タンパク質で見られたものよりも大部低くなっていた。クチナーゼ融合タンパク質中のBBI力価は育成培地に、3mMのβMEを添加したときにも改善されなかった。したがって、活性2BBIck81の最高力価はBCE2BBIck融合タンパク質の活性化により、確実に得られるのである。しかしながら、各種融合タンパク質も本発明に用いることができるだろう。本明細書中で言及する全ての特許及び文献は本発明の技術分野における出願時の技術常識を示している。全ての特許及び文献が明確かつ別個に示している内容を参照により本発明の明細書に援用する。本明細書に開示されいてる好ましい態様を用いて、当業者が開示されている態様の変法をなすことができることは明らかであり、そのような変更は発明の範囲内である。本発明は課題を実行するために最適化されており、本明細書に内在するものだけでなく、目標及び有利な結果を得るために適していることを当業者は容易に理解する。本明細書で開示されている組成物及び方法は好ましい態様の代表例であり、例示であり、本発明を限定するものではない。当業者が本明細書に開示されている発明の各種置換、及び変更を本発明の範囲及び精神から逸脱することなくなしうることは明らかである。本明細書で例示する発明は、本明細書で特に開示されていない、構成要素、限定を伴わずに実行することができる。採用された文言及び表現は説明のために用い、限定のために用いるものではない。しかしながら、それらが示す、あるいは、それらの一部の特徴を有するあらゆる等価物を含む文言及び表現の使用を意図するものではない。したがって、本発明は好ましい態様を追加的な特徴により構成されるものであり、そのような変更及び変法は明示の請求項により定義される発明の範囲内である。この発明は、本明細書に幅広く一般的に記載されている。開示されている属のより狭義の又は亜種グループも本発明の一部を構成する。これは、削除された物質がとくに本発明に引用されたかどうかは別として、この属から除去する旨の規定又は負の限定を伴う本発明の包括的な記載を含む。"