少なくとも1つのPEG重合体および少なくとも1つの多糖とコンジュゲートしたFVIIIバリアント。多糖がPSAである、請求項1に記載のFVIIIバリアント。前記バリアントが、末端欠失型Bドメイン内のO連結オリゴ糖を介してPEG重合体またはPSA重合体と共有結合によってコンジュゲートしたBドメイン末端欠失型FVIII分子であり、FVIII活性化が前記O連結重合体の除去をもたらす、請求項1~2のいずれか一項に記載のFVIIIバリアント。末端欠失型Bドメイン内のO連結オリゴ糖を介してPEG重合体と共有結合によってコンジュゲートしており、N連結オリゴ糖を介して少なくとも1つのPSA重合体と共有結合によってコンジュゲートしている、請求項1~3のいずれか一項に記載のFVIIIバリアント。A1ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖およびA3ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された2~4つのPSA重合体を含む、請求項4に記載のFVIIIバリアント。A1ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された1つまたは2つのPSA重合体を含む、請求項4に記載のFVIIIバリアント。A3ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された1つまたは2つのPSA重合体を含む、請求項4に記載のFVIIIバリアント。PEG重合体のサイズが30~50kDaである、請求項1~7のいずれか一項に記載のFVIIIバリアント。PSA重合体のサイズが40~50kDaである、請求項1~8のいずれか一項に記載のFVIIIバリアント。Bドメイン末端欠失型FVIIIバリアントであり、Bドメインが配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載のFVIIIバリアント。請求項1~10のいずれか一項に記載のFVIIIバリアントを作製する方法であって、FVIII分子を少なくとも1つのPEG重合体および少なくとも1つの多糖とコンジュゲートする工程を含む方法。請求項11に記載の方法によって取得可能なFVIIIバリアント。請求項1~10または12のいずれか一項に記載のFVIIIバリアントと、場合によって1つまたは複数の薬学的に許容できる添加剤とを含む医薬組成物。請求項1~10のいずれか一項もしくは請求項12に記載のFVIIIバリアントまたは請求項13に記載の医薬組成物の、医薬としての使用。請求項1~10のいずれか一項もしくは請求項12に記載のFVIIIバリアントまたは請求項13に記載の医薬組成物の、血友病Aを治療するための医薬としての使用。タンパク質への、例えばポリエチレングリコールまたはポリシアル酸のような重合体のカップリングによって、循環時間の増大、プロテアーゼに対する抵抗性の増大、および免疫原性の低減がもたらされることが長く知られている。しかし依然として、延長された循環半減期を有するFVIIIバリアントが当技術分野で必要とされている。本発明は、少なくとも1つのPEG重合体および少なくとも1つの多糖とコンジュゲートしたFVIIIバリアントならびにその使用に関する。本明細書において、そのようなヘテロコンジュゲートFVIIIバリアントが、例えば2つのPEG分子または2つの多糖分子とコンジュゲートしたFVIIIバリアントより改善された循環半減期の増大を有することが示される。定義第VIII因子分子FVIII第VIII因子は、主として肝細胞によって生成される大きな複合糖タンパク質である。ヒトFVIIIは、シグナルペプチドを含めると2351アミノ酸からなり、相同性によって定義されるいくつかの別々なドメインを含有している。3つのAドメイン、唯一のBドメイン、および2つのCドメインがある。ドメインの順序は、NH2A1A2BA3C1C2COOHと記載することができる。FVIIIは、BA3境界で分離された2本の鎖として血漿中を循環する。これらの鎖は、二価金属イオン結合によって接続される。A3C1C2は軽鎖と呼ばれ、一方、A1A2B鎖は重鎖と呼ばれる。FVIIIは、フォンウィルブランド因子と会合して循環する。VWFは、FVIIIの担体として働く大きな多量体糖タンパク質であり、血管壁構成要素への正常な血小板接着に必要である。VWFとの複合体中にあるFVIIIの血漿半減期は約12時間である。天然FVIIIは、配列番号1に示す完全長ヒトFVIII分子である。Bドメインは、配列番号1におけるアミノ酸741~1648にわたる。配列番号1ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY本発明によるFVIIIバリアントは、血漿由来のFVIIIおよびまたは組換え体のFVIIIであり得る。本発明によるFVIIIバリアントは、例えば、Bドメイン末端欠失型FVIII分子であり得、その際、例えば、残りのドメインは、配列番号1におけるアミノ酸番号1~740および1649~2332に記載の配列に密接に対応する。本発明によるBドメイン末端欠失型FVIIIバリアントは、配列番号1に記載の配列からわずかに相違し得る。これは、例えばvWF結合能力を低減させるために変異を導入することができるという事実により、残りのドメインが、わずかに、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9または10アミノ酸、相違し得ること、代替的には、配列番号1に記載のアミノ酸配列から約1、2、3、4または5相違し得ることを意味する。さらに、グリコシル化部位の導入およびまたは撤廃など、例えばLRP、様々な受容体、他の凝固因子、細胞表面などの様々な他の構成要素への第VIII因子の結合能力を改変するために、分子中の他の場所にアミノ酸改変を導入することが妥当なようである。本発明によるFVIIIバリアントは、FVIII活性を有し、これは、凝血カスケードにおいて、FVIIIに機能的に類似または同等な様式で機能し、活性血小板表面のFIXaとの相互作用を介してFXaの形成を誘導し、血餅の形成を支援する能力を意味する。FVIII活性は、例えば、色素生成アッセイ、血餅分析、内因性トロンビン産性能分析など、当技術分野で良く知られている技法によって、invitroで評価することができる。本発明によるFVIIIバリアントは、天然ヒトFVIIIの活性の少なくとも約10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、および100である、または100を超えることさえあるFVIII活性を有する。Bドメイン第VIII因子のBドメインは、配列番号1におけるアミノ酸741~1648にわたる。Bドメインは、いくつかの異なった部位で切断され、それにより、循環血漿FVIII分子における大きな不均一性が生じる。重度にグリコシル化されたBドメインの正確な機能は未知である。知られていることは、このドメインが、凝血カスケードにおけるFVIII活性に不必要であるということである。一見したところのこの機能不在は、Bドメイン欠失型末端欠失型FVIIIが、完全長天然FVIIIに関して見られるinvivo特性と同一のinvivo特性を有するようであるという事実によって支持される。それはそれとして、少なくとも無血清条件下では、Bドメインが細胞膜との会合を低減させ得るという徴候がある。Bドメイン末端欠失型欠失型第VIII因子分子内因性の完全長FVIIIは、単一鎖前駆体分子として合成される。分泌前に、前駆体は重鎖および軽鎖に切断される。組換え体のBドメイン欠失型FVIIIは、2つの異なったストラテジーから生成され得る。Bドメインのない重鎖および軽鎖が、2本の異なったポリペプチド鎖として個別に合成されるか、完全長FVIII前駆体と同様に重鎖および軽鎖に切断されるBドメイン欠失型FVIIIが単一の前駆体ポリペプチド鎖として合成されるかのいずれかである。Bドメイン欠失型FVIII前駆体ポリペプチドでは、重鎖および軽鎖部分は、通常、リンカーによって分離されている。Bドメイン欠失型FVIIIに免疫原性エピトープを導入する危険性を最小限にするため、リンカーの配列は、FVIIIBドメインに由来するものが好ましい。最小限、リンカーは、Bドメイン欠失型FVIII前駆体ポリペプチドを重鎖と軽鎖とに分離するプロテアーゼの認識部位を含まなければならない。完全長FVIIIのBドメインでは、アミノ酸1644~1648がこの認識部位を構成する。Bドメイン欠失型FVIIIの活性化の際にリンカーの除去をもたらすトロンビン部位は、重鎖中に位置している。したがって、トロンビン活性化による、残りのFVIII分子からのリンカーの除去に、リンカーのサイズおよびアミノ酸配列が影響を与える可能性は小さい。Bドメインの欠失は、FVIIIの生成のためには利点となる。それでもなお、生産性を低減させることなく、リンカーにBドメインの部分を含めることができる。生産性へのBドメインのマイナス効果は、Bドメインのいかなる特定のサイズまたは配列の結果とも考えられていない。末端欠失型Bドメインは、いくつかのOグリコシル化部位を含有し得る。しかし、好ましい実施形態によれば、この分子は、末端欠失型Bドメイン内に1つのみ、代替的には2、3または4つのO連結オリゴ糖を含む。好ましい実施形態によれば、末端欠失型Bドメインは、潜在的Oグリコシル化部位を1つだけ含み、このOグリコシル化部位に、親水性重合体が共有結合によってコンジュゲートされる。本発明によるBドメイン末端欠失分子におけるO連結オリゴ糖は、組換え手段によって、およびまたはBドメインの末端切除による隠されたOグリコシル化部位の露出によって人工的に創出されたOグリコシル化部位に付いているものであり得る。どちらの場合でも、そのような分子は、Bドメイン末端欠失型第VIII因子のアミノ酸配列を設計し、続いてそのアミノ酸配列を、末端欠失型Bドメイン内のOグリコシル化部位の確率を予測するinsilico分析にかけることによって作製できる。そのようなグリコシル化部位を有する確率が比較的に高い分子を、適した宿主細胞で合成することができ、その後、グリコシル化パターンの分析、およびそれに続く、末端欠失型Bドメイン内にO連結グリコシル化を有する分子の選択が行われる。組換え体第VIII因子タンパク質を生成するのに適した宿主細胞は、好ましくは、分子がグリコシル化されるのを確実にする哺乳類起源のものである。本発明の実施において、細胞は、哺乳動物細胞であり、より好ましくは、限定されるものではないが、CHO細胞系、COS1細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞系、およびHEK293細胞系を含めた、樹立された哺乳動物細胞系である。好ましいBHK細胞系は、以下BHK570細胞と呼ばれる、tkts13BHK細胞系である。BHK570細胞系は、ATCCから、ATCC受託番号CRL10314の下、利用可能である。tkts13BHK細胞系も、受託番号CRL1632の下、ATCCから利用可能である。好ましいCHO細胞系は、受託番号CCI61の下でATCCから利用可能であるCHOK1細胞系、ならびにCHODXB11細胞系およびCHODG44細胞系である。他の適した細胞系には、ラットHepI、ラットHepII、TCMK、ヒト肺、NCTC1469DUKX細胞およびDG44が含まれるが、これらに限定されない。3T3細胞、Namalwa細胞、骨髄腫および他の細胞と骨髄腫との融合細胞も有用である。一部の実施形態では、細胞は、変異体または組換え体の細胞、例えば、それらが由来する細胞型とは質的または量的に異なったスペクトルの、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素を発現する細胞であり得る。DUKX細胞が特に好しい。現在好ましい細胞は、HEK293、COS、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓および骨髄腫細胞であり、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞である。N連結オリゴ糖およびO連結オリゴ糖NグリカンおよびOグリカンは両方とも、そのタンパク質を生成する細胞によって、タンパク質に付けられる。細胞のNグリコシル化機構は、アミノ酸鎖中のNグリコシル化シグナルを認識し、グリコシル化し、これは、新生タンパク質がリボソームから小胞体に移動される際に行われ、ゴルジ装置への輸送の後まで続く2515490Glabeら、JBC2559236Lentingら、Haemophilia16194。N連結FVIIIオリゴ糖は、当技術分野で記載されている天然存在のもの16194およびそこに引用された参考文献でもよく、またはそれは遺伝的操作によって導入されたものでもよい。同様に、Oグリカンは、特異的なOグリコシル化部位に付いている。一般的に見られるムチン型O連結グリコシル化は、Ser残基およびThr残基へのNアセチルガラクトサミン部分の付着を要し、これは、タンパク質がゴルジ装置に達したときに起こる過程である。Oグリカンは、アミノ酸鎖で特異的なOグリコシル化部位に付着するが、Oグリコシル化の引き金となるモチーフは、Nグリコシル化シグナルよりもはるかに不均一であり、アミノ酸配列中のOグリコシル化部位を予測する我々の能力は未だ十分なものではない15153およびJuleniusら、BioinformaticsforGlycobiologyandGlycomics163。したがって、末端欠失型因子VIIIBドメインにおけるO連結オリゴ糖は、天然存在のO連結グリコシル化配列、または組換え技法によって人工的に構築されたO連結グリコシル化配列に、共有結合によって連結され得る。その例が、Bドメイン末端欠失型因子VIIIバリアントであり、ここで、Bドメインは、配列番号1におけるアミノ酸742~763に対応している。このバリアントは、Bドメインリンカー中のOグリコシル化部位を含む。別の例は、N8である。これは、Bドメイン欠失型第VIII因子であり、完全長ヒト第VIII因子のアミノ酸1~740を含む第VIII因子重鎖および完全長ヒト第VIII因子のアミノ酸1649~2332を含む第VIII因子軽鎖である。重鎖配列および軽鎖配列は、21アミノ酸リンカーによって接続されており、完全長ヒト第VIII因子のアミノ酸741~750および1638~1648の配列を含む16349。シアリルトランスフェラーゼシアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を新生オリゴ糖に転移させる酵素である。各シアリルトランスフェラーゼは、特定の糖基質に特異的である。シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸をシアル酸付加糖脂質の末端部分または糖タンパク質のN連結もしくはO連結糖鎖に付加する。約20種の異なったシアリルトランスフェラーゼがあり、それらは、それらが作用するアクセプター構造およびそれらが形成する糖連結のタイプに基づいて識別することができる。本発明による好ましいシアリルトランスフェラーゼは、ST3GalIおよびST3GalIIIである。したがって、例えば、特異的なシアリルトランスフェラーゼの選択およびまたは特定のグリコシル化パターンを有する第VIII因子分子の操作によって、本発明によるコンジュゲート第VIII因子分子の構造を操作することが可能である。O連結または連結オリゴ糖への重合体のグリココンジュゲーションOグリカンの生合成は、生合成における比較的早期にシアル酸残基の付加によって修飾および終了され得る。ある種のシアリルトランスフェラーゼ酵素は、GalNAcαSerThr、またはコア1GalT作用後の早期のOグリカンコアサブタイプに作用することができる。T抗原という用語は、Galβ13GalNAcαSerThr二糖の存在に関連している。これらの構造の生成は、同一の基質に対する、グリコシルトランスフェラーゼ間の競合を伴い、したがって、ゴルジ装置内のグリコシルトランスフェラーゼの発現レベルおよび細胞内分布が、Oグリカン生合成における構造的結果および多様化を決定する。Galβ13GalNAcαSerThr二糖のみがグリコ誘導体化に適用できる。しかし、この構造の利用可能な量は、シアリダーゼもしくはコア1GalTまたはこれらの組合せによるタンパク質の治療を経ることで、大いに増強され得る。重合体のグリココンジュゲーションの過程の結果として、標的タンパク質のGalβ13GalNAcαSerThr二糖へのα23結合を介して、シアル酸重合体が末端Gal部分に付加される。多くの親水性重合体を、O連結オリゴ糖に付けることができる。Oグリカンを介してFVIIIに親水性重合体を酵素的にコンジュゲートするための基本の要件は、WO03031464に開示のように、それらを、遊離アミノ基を介してシチジン一リン酸5グリシルノイラミン酸誘導体にカップリングする能力である。これは、当業者に知られている様々なカップリング化学を介して実現できる。活性生体適合重合体の例には、ポリアルキレンオキシド、例えば、限定されるものではないがポリエチレングリコール、2エチルホスホリルコリン重合体、デキストラン、コロミン酸または他の炭化水素ベースの重合体、アミノ酸もしくは特定のペプチド配列の重合体、ビオチン誘導体、ポリビニルアルコール、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコリンゴ酸無水物、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、へパリン、アルブミン、セルロース、キトサンの加水分解産物、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアールガム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラゲナン、ペクチン、アルギン酸加水分解産物、他の生体高分子、ならびにこれらの任意の等価物などが含まれる。側鎖は、例えばWO0331464に開示されている、シアリルトランスフェラーゼ媒介の方法によってN連結オリゴ糖に付けることができる。そのような方法によると、しばしば、いくつかの側鎖が第VIII因子分子に付く結果となる。FVIIIのN連結オリゴ糖に付いた側鎖は、側鎖FVIIIと記載される。O連結オリゴ糖に付いた側鎖は、側鎖FVIIIと記載される。例えば、PEGPSAFVIIIは、PEGがO連結オリゴ糖に付いており、PSAがN連結オリゴ糖に付いていることを意味する。化学コンジュゲーション本発明に記載のFVIIIバリアントを、様々な化学的酵素的方法を用いて、PEGおよび多糖ポリマーとコンジュゲートすることできる。関連する部分の、薬物への化学コンジュゲーションは、通常、アシル化または還元アルキル化によるリジン残基のランダムな誘導体化のような技法を採用してきたが、これらの方法の有用性は、概ね、生成物の不均一性と、最も頻繁には、得られる生成物の生理活性の低減とにより限定される。部位選択的なコンジュゲーション方法では、タンパク質の生物活性に影響を与えず、同時に、安定性、薬物動態学的パラメータ、免疫原性、生物学的パートナーへの結合などについての望ましい結果が得られるであろう部位を選択するのに利用可能な、タンパク質の構造的および生物学的知識を利用できることが必須である。N末端特異的、または少なくともN末端選好的なコンジュゲーションは、N末端の一級アミノが78のpKaを有し、一方、リジン側鎖のεアミノ基のpKaははるかに高いという事実を用いて実現することができる。より狭い適用方法は、タンパク質のアミノ末端におけるグリオキシル基の導入を用いる。しかし、それは厳しい過ヨウ素酸酸化反応に耐えることができ、かつN末端セリン残基またはトレオニン残基を含有しているタンパク質に限定される。対になっていないシステイン残基へのチオール選択的なコンジュゲーションも、コンジュゲートする関連部分のマレイミドまたはハロアセテート誘導体を用いて部位選択的なコンジュゲーションを実現するための潜在的に有用な手順である。以下において、コンジュゲーションができる。天然で遊離のシステイン。但し、システインはかなり疎水性のアミノ酸であるので、しばしば、タンパク質構造中に埋め込まれており、したがって、試薬への接近性が乏しい。または、より高い蓋然性において、部位特異的変異導入によって、タンパク質中に導入されたシステイン残基。但し、起こり得るタンパク質構造変化および免疫原性のすべての潜在的な問題が伴う。酵素的コンジュゲーション方法も用いられており、タンパク質中の限られた数のアミノ酸残基にアクセスするための貴重なツールとなり得る。例えば、ヒト成長ホルモンの13のグルタミン残基のうち、微生物のトランスグルタミナーゼ酵素の基質は2つのみである601328およびそこに引用されている参考文献、Bonoraら、PosttranslationalModificationofProteinBiopharmaceuticalsWiley341およびそこに引用されている参考文献。PEG本発明との関連においてPEGという用語には、アルコキシPEG、二官能性PEG、マルチアームPEG、フォーク状PEG、分枝PEG、ペンダントPEG、または分解可能な連結を有するPEGを含めた、その形態のうちの任意の形態にあるポリが含まれる。重合体バックボーンは、線状または分岐状であり得る。分枝重合体バックボーンは、当技術分野で一般的に知られている。通常、分枝重合体は、中心分枝コア部分と、中心分枝コアに連結した複数の線状重合体鎖とを有する。PEGは、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの様々なポリオールへのエチレンオキシドの付加によって調製することができる分枝形態で一般的に用いられる。中心分枝部分は、リジンまたはシステインなどのいくつかのアミノ酸から誘導することもできる。一例では、分枝ポリを、Rmとして、一般形で表すことができる。式中、Rは、グリセロールまたはペンタエリスリトールなどのコア部分を表し、mは腕の数を表す。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第5932462号に記載のものなど、マルチアームPEG分子も、重合体バックボーンとして用いることができる。重合体バックボーン各鎖の分子量は変動し得るが、それは通常、例えば約5000Daから約100000Daまでなど、約100Daから約160000Daまでの範囲にある。より詳細には、本発明による各コンジュゲート親水性重合体のサイズは、例えば、約1000Daから約80000Da約2000Daから約70000Da約5000から約70000Da約5000から約60000Da約10000から約70000Da約20000から約60000Da約30000から約60000Da約30000から約50000Daまたは約30000から約40000Daなど、約500Daから約80000Daまで変動し得る。これらのサイズは、正確な尺度ではなく、むしろ見積りを表すことを理解するべきである。好ましい実施形態によれば、本発明による分子は、例えば、10000、40000、または80000Da約5000、約4000、約3000、約2000、または約1000Daのサイズの例えばPEGなど、親水性重合体の不均一な集団とコンジュゲートされる。多糖本発明との関連における多糖は、グルコース、ガラクトース、スルホガラクトース、Nアセチルガラクトース、フコース、フルクトース、キシローズ、アラビノース、グルクロン酸、スルホグルクロン酸、イズロン酸、スルホイズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、Nアセチルグルコサミン、スルホグルコサミン、ガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミンスルフェート、Nアセチルガラクトサミンジスルフェート、Nアセチルガラクトサミンスルフェート、Nアセチルノイラミン酸、スルホNアセチルノイラミン酸、Nグリコリルノイラミン酸、2ケト3デオキシノヌロソン酸のような単量体ユニットからなる、ホモまたはヘテロ多糖を含めた、多糖に基づく重合体である。本発明との関連における多糖の例には、ラクトース、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミラーゼ、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、ヒアルロン酸、ポリソルビトール、ポリマンニトール、へパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸塩、へパリンまたはコンドロイチン硫酸、硫酸化ポリシアル酸およびポリシアル酸が含まれる。本発明による好ましい多糖は、PSAである。PSAは、哺乳動物に存在する重合体であり、すなわち、それは免疫原性ではない。哺乳動物には、既知のPSA受容体がない。PSAは、プロテアーゼ分解への抵抗性が増大している治療用タンパク質をもたらすことが示されている。好ましくは、糖残基の大部分またはすべてがNアセチルノイラミン酸残基であり、好ましくはNeu5Ac残基のみである。細菌によって生成されたポリシアル酸は、ポリシアル酸の好ましい供給源である。それらには、髄膜炎菌C由来の血清型C莢膜多糖C、および大腸菌K92由来の多糖K92、および髄膜炎菌B由来の血清型B莢膜多糖、大腸菌K1、モラクセラノンリクファシエンス、ヘモリチカ菌A2A2として知られるが含まれる。大腸菌K92由来の多糖は、アルファ28およびアルファ29連結Neu5Acユニットを含む。髄膜炎菌C群由来の多糖Cは、アルファ29連結Neu5Acユニットを有する。好ましいポリシアル酸は、B群由来のものであり、それらは28アルファ連結Neu5Acを含む。PSAの分子量は、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa、80kDa、85kDa、90kDa、95kDa、または100kDa以上であることが好ましい。本発明との関連におけるPSA重合体は、分子量分布の狭いものが好ましい。本発明の方法において、PSAの反応性アルデヒドは、多糖の非還元末端にあることが好ましい。しかし、例えばUS4356170に記載のように、還元末端に反応性アルデヒドを用意してもよい。本発明の別の態様において、ポリシアル酸化部分は、シアリルトランスフェラーゼおよびポリシアリルトランスフェラーゼの組合せを用いて酵素的に作成することができる。シアリルトランスフェラーゼは、基質としてN8のアシアログリカン、または基質としてN8の複合型グリカンを用いる、カンピロバクタージェジュニシアリルのトランスフェラーゼCstll277327であることが好ましい。この結果得られる、アルファ23アルファ28連結ジシアリル末端モチーフを保持するグリカンを、次いで、髄膜炎菌または大腸菌K1のアルファ28ポリシアリルトランスフェラーゼのような細菌性ポリシアリルトランスフェラーゼの基質として用いることができる18177、WO2008151448A1、ChoおよびTroy、PNAS9111427。代替的には、WO2007087711A1に記載のように、二機能性シアリルトランスフェラーゼおよびポリシアリルトランスフェラーゼを含む融合タンパク質を用いて、ポリシアル酸化部分を酵素的に作成してもよい。代替的には、基質としてN8のグリカンを用いる、STXおよびまたはPSTのような哺乳動物アルファ28ポリシアリルトランスフェラーゼ36808およびそこに引用されている参考文献を用いて、ポリシアル酸化部分を酵素的に作成してもよい。医薬組成物本明細書において、医薬組成物は、好ましくは、例えば、使用準備済の無菌水性組成物または例えば水もしくは水性バッファー中で再構成することができる乾燥無菌組成物などの非経口投与に適した第VIII因子分子と任意で組み合わせた、本発明に記載の第VIII因子抗体を含む組成物を包含するものとする。本発明による組成物は、様々な薬学的に許容できる添加剤、安定化剤などを含み得る。そのような組成物の追加成分には、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、充填剤、張度調節剤、キレート剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質および双生イオンが含まれ得る。そのような追加成分は、当然ながら、本発明の医薬製剤の総合的な安定性に悪い影響を与えるべきでない。シリンジ、場合によってペン様シリンジによる、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によって、非経口的投与を行うことができる。代替的には、輸液ポンプによって非経口投与を行うこともできる。さらなるオプションは、鼻噴霧または肺噴霧の形における、FVIII抗体化合物の投与のための溶液または懸濁液であり得る組成物である。なおさらなるオプションとして、本発明のFVIII化合物を含有する医薬組成物は、経皮投与、例えば無針注射による、もしくはパッチ、場合によってイオントフォレーシスパッチからの投与、または経粘膜投与、例えば頬側投与に適合させることもできる。治療という用語は、本明細書で使用される場合、それを必要とするヒト対象または他の動物対象の薬物療法を指す。前記対象は、前記特定の治療の使用が前記ヒト対象または他の動物対象の健康に有益であることを述べる仮の診断または決定的な診断を与えた医者による身体検査を受けていることが期待される。前記治療のタイミングおよび目的は、対象の健康の現状に従って、個体によって変動し得る。したがって、前記治療は、予防的、緩和的、およびまたは症候的であり得る。本明細書において本発明のある特定の特徴を例示および記載したが、当業者ならば、今、多くの修正、置換、変更、および均等物を見出すであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのような修正および変更をすべて包含するように意図されていることを理解するべきである。第1の態様では、本発明は、少なくとも1つのPEG重合体および少なくとも1つの多糖とコンジュゲートしたFVIIIバリアントに関する。そのようなヘテロコンジュゲートバリアントは、驚いたことにホモコンジュゲートFVIIIバリアントと比較して、改善されたinvivo循環半減期を有する。本発明の一実施形態では、多糖がPSAである。別の実施形態では、本発明による前記FVIIIバリアントが、末端欠失型Bドメイン内のO連結オリゴ糖を介してPEG重合体またはPSA重合体と共有結合によってコンジュゲートしたBドメイン末端欠失型分子であり、FVIII活性化が前記O連結重合体の除去をもたらす。別の実施形態では、前記バリアントが、N連結オリゴ糖を介して、少なくとも1つのPEG重合体またはPSA重合体と共有結合によってコンジュゲートしている。このN連結オリゴ糖は、天然存在のものでもよく、または遺伝的操作によってそれを導入してもよい。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、末端欠失型Bドメイン内のO連結オリゴ糖を介してPEG重合体と共有結合によってコンジュゲートしており、N連結オリゴ糖を介して少なくとも1つのPSA重合体と共有結合によってコンジュゲートしている。その活性化段階において、このFVIIIバリアントは、重合体基がBドメイン内でグリカンにコンジュゲートされる場合、内因性の活性化FVIIIに類似したものであり得る。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A1ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖およびA3ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された2~4つのPSA重合体を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、N連結オリゴ糖を介して少なくとも1つのPEG重合体またはPSA重合体と共有結合によってコンジュゲートしている。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、末端欠失型Bドメイン内のO連結オリゴ糖を介してPEG重合体と共有結合によってコンジュゲートしており、N連結オリゴ糖を介して少なくとも1つのPSA重合体と共有結合によってコンジュゲートしている。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A1ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖およびA3ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された2~4つのPSA重合体を含む。一実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A1ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された1つまたは2つのPSA重合体を含む。一実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A3ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された1つまたは2つのPSA重合体を含む。一実施形態では、前記FVIIIバリアントが、末端欠失型Bドメイン内のO連結オリゴ糖を介してPSA重合体と共有結合によってコンジュゲートしており、N連結オリゴ糖を介して少なくとも1つのPEG重合体と共有結合によってコンジュゲートしている。一実施形態では、末端欠失型Bドメイン内のO連結オリゴ糖を介してPEG重合体と共有結合によってコンジュゲートしており、N連結オリゴ糖を介して少なくとも1つのPSA重合体と共有結合によってコンジュゲートしている。一実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A1ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖およびA3ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された2~4つのPEG重合体を含む。一実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A1ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された1つから2つのPEG重合体を含む。一実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A3ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された1つまたは2つのPEG重合体を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、30~50kDaのサイズを有するPEG重合体を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、15~50kDaのサイズを有するPSA重合体を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、40~50kDaのサイズを有するPSA重合体を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、Bドメイン末端欠失型FVIIIバリアントであり、Bドメインが配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、多糖が、ヒドロキシエチルデンプンである。第2の態様は、本発明によるFVIIIバリアントを作製する方法であって、FVIII分子を少なくとも1つのPEG重合体および少なくとも1つの多糖とコンジュゲートする工程を含む方法に関する。一実施形態では、前記方法におけるコンジュゲーション工程の少なくとも1つが酵素的過程である。第3の態様は、本発明による方法によって取得される、または取得可能であるFVIIIバリアントに関する。第4の態様は、本発明によるFVIIIバリアントと、場合によって、1つまたは複数の薬学的に許容できる添加剤とを含む医薬組成物に関する。そのような組成物は、IVまたは皮下投与用に意図されていることが好ましい。第5の態様は、本発明によるFVIIIバリアントまたは医薬組成物の、医薬としての使用に関する。第6の態様は、本発明によるFVIIIバリアントまたは医薬組成物の、血友病Aを治療するための医薬としての使用に関する。第7の態様は、本発明によるFVIIIバリアントまたは医薬組成物の治療有効量を患者に投与する工程を含む、血友病Aを治療する方法に関する。略語DICジイソプロピルカルボジイミドHOBt1ヒドロキシベンゾトリアゾールTHFテトラヒドロフランDCMジクロロメタンDMFジメチルホルムアミドTFAトリフルオロ酢酸HC、LCN8の重鎖および軽鎖CMPシチジン一リン酸GSCシチジン一リン酸5グリシルノイラミン酸GSCONH25アミノ4710トリオキサドデカノイルアミノエタノイルノイラミン酸シチジン一リン酸HOAt1ヒドロキシ7アザベンゾトリアゾールPSAポリシアル酸。ここでは、α28ポリシアル酸によって例示される。NANCMPNアセチルノイラミン酸シチジン一リン酸SECMALS多角度光散乱検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーIEXイオン交換。CVカラム容積PEG40PSAN8型のN8コンジュゲートの合成概説市販のコロミン酸を陰イオン交換カラムで分画し、約20kDまたは約45kDのいずれかの分子量を有する画分をプールした。得られた物質を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した。酸化PSAをGSCヒドロキシルアミン誘導体、5アミノ4710トリオキサドデカノイルアミノエタノイルノイラミン酸シチジン一リン酸とカップリングさせ、GSCONPSA試薬を得た。これが、NアシアロPEG40N8のST3GalIII触媒ポリシアル酸付加におけるドナーとして用いられた。この型のコンジュゲートの合成について以下に詳述する。12アミノ4710トリオキサドデカン酸3の合成Fmocアミノキシ酢酸1、12アミノ4710トリオキサドデカノネートtブチルエステル2、およびHOBtをTHF中に可溶化させた。次いで、DICを添加した。混合物を周囲温度で終夜、撹拌した。LCMS分析は、所望の生成物が形成されたことを示した。反応混合物をDCMと重炭酸ナトリウムとの間で分配した。有機相を重炭酸ナトリウムで2回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残留物を20TFADCM中に溶解させ、周囲温度で30分間、撹拌し、蒸発させた。LCMS分析は、所望の生成物、12アミノ4710トリオキサウンデカン酸3の存在を示した。40ml分の流速の溶媒ADCMと溶媒B5CH3OHを含むDCMとを用いて、シリカ上でフラッシュクロマトグラフィーによって、油性残留物を精製した。勾配は以下の通りであった05CVにわたって0B、115CVにわたって0から100B、25CVにわたって100B。生成物を90から100Bで溶出した。関連する画分をTLCで検査し、純粋な画分をプールし、蒸発させ、収率75で無色の油を得た。LCMSmz5171HNMRδ255ppm345~375422442452732741757775807879。GSC誘導体の合成アミノ4710トリオキサドデカノイルアミノエタノイルノイラミン酸シチジン一リン酸6カルボン酸3の乾燥THF溶液にHOAtおよびDICを添加した。反応混合物を周囲温度で05時間撹拌した。次いで、同量のDICを添加し、続いて、100mMHEPES水性バッファー中に新たに調製されたGSC4溶液を添加した。反応混合物は黄変した。55時間の反応時間の後に、DICをさらに添加した。次いで、反応混合物を周囲温度で終夜インキュベートした。LCMS分析は、予測された生成物5が形成されたことを示した。PTFEフィルターを通して反応混合物を濾過し、溶媒としてアセトニトリルおよび250mM炭酸水素アンモニウムを用いた、逆相C18カラム上のHPLCによって精製した。関連する画分をプールし凍結乾燥させた。凍結乾燥の前後に、溶媒Aアセトニトリル、BH2O、C05MNH4HCO3pH79を用いた逆相C18カラム上の分析用HPLCによって純度を検査した。線形勾配は、1ml分の流速で15分間にわたり、BCの混合物で始まり、混合物ABCで終わった。カラムオーブンは42°Cの温度に設定した。凍結乾燥下においてわずかな分解が起こった。次いで、以下の通り、Dowex50W樹脂を用いて、アンモニウム陽イオンをナトリウムと交換した。Dowex50WX2、100~200メッシュを20mlのフィルターシリンジに入れた。溶出液が塩基性になるまで、樹脂を1NNaOHで洗浄した。次いで、溶出液がpH中性になるまで、樹脂を水で洗浄した。生成物をTHFH2O中に溶解させ、樹脂上にアプライし、滴状に溶出させた。画分をTLC上にスポットした。関連する画分をプールし、凍結乾燥させた。窒素検出器を装備し、逆相PhenomenexJupiterC18100×46mm5μ300Aカラム上で生成物を流すHPLCで生成物を定量化した。溶媒は、AH2O、B2プロパノール、C1TFAであった。勾配は、ACの混合物から始まり、混合物で終わった。流速は1ml分であった。収率は46であった。5を10水性メタノール中に溶解させた。ジメチルアミンおよび反応混合物を周囲温度で15時間、撹拌した。10~15分後、混合物が混濁した。反応をLCMSによってモニターした。反応は、20°Cで1時間後に完了した。反応混合物を水で希釈し、ジクロロメタンで洗浄した。両方の相をLCMSで検査した。水相が生成物を含有しており、フルオレン部分は検出できなかった。有機相中には、生成物を検出することができなかった。水相を凍結乾燥し、無色の固形物として、GSC誘導体、5アミノ4710トリオキサドデカノイルアミノエタノイルノイラミン酸シチジン一リン酸、6を得た。分子量約20kDaの物質を得るコロミン酸分画用いられたコロミン酸は、SigmaAldrichから市販されている化合物であった。より均質な物質を得るために、WO2008074032に記載のイオン交換カラム上で分画した。約20kDの分子量に対応する画分を後続の実験で用いた。実施例3で単離された20kDPSA物質の過ヨウ素酸ナトリウム酸化PSA重合体の非還元末端のポリオールの過ヨウ素酸ナトリウム酸化を、本質的に文献16224249に記載の通りに、一部改変して行った。20kDPSAの溶液に過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加した。暗中、23°Cで15分間、反応物をインキュベートした。過剰の過ヨウ素酸塩を3メチルチオ1プロパノールによってクエンチングした。反応物を23°Cで2時間さらにインキュベートした。MilliporeUltra、5kDカットオフでの限外濾過によって、反応混合物を水にバッファーシフトさせ、凍結乾燥させた。凍結乾燥した物質は、それをGSCONH2と反応させた次の工程でそのまま用いた。シアリルトランスフェラーゼST3GalIII基質であるGSCONPSAを産生させるための、過ヨウ素酸ナトリウム酸化されたPSAの、GSCONH2へのカップリング溶液反応バッファー100mMイミダゾールpH68GSCONH2反応バッファー中に82mgml。過ヨウ素酸酸化されたPSA反応バッファー中に175mgmlアニリンメチルヒドロキシルアミン塩酸塩反応バッファー中に585mgml手順反応バッファー中の過ヨウ素酸酸化されたPSA溶液に反応バッファー中のGSCONH2溶液を添加した。激しい磁気撹拌下での1MHClの添加によってpHを69に調整した。次いで、アニリンを添加した。黄色がかりわずかに混濁した混合物を25°Cでインキュベートした。10~15分後にいくらかの沈殿が観察された。反応が進行した後、溶出液として100mMリン酸バッファーpH68、流速06ml分、周囲温度、212および272nmにおけるDAD検出器を用いて、サイズ排除カラムWatersBiosuite125HRESC300×78mm上で分析を行った。30分、2時間、および18時間の反応時間の後に分析を行った。GSCONH2は、このシステムでは185分で溶出する。生成物は、約138分の保持時間の広いピークとして溶出する。PSAおよび生成物GSCONPSAの両方が同じ保持時間で溶出するので、反応の進行は、に対するの比率を見ることによってモニターした。比率は、30分から2時間まで増大し、18時間の反応時間まで一定のまま残っていた。19時間の反応時間の後に、反応していないいかなるアルデヒドも、メチルヒドロキシルアミン溶液の添加によってクエンチングし、混合物を周囲温度で1時間インキュベートした。次いで、低分子量試薬を取り除くために、反応混合物を045μフィルターで濾過し、15glLヒスチジン、3glショ糖、18glNaCl、01glTween80025glCaCl2、2H2O、pH73バッファー中に調整したProSpinCS800でさらに精製した。最終生成物の定量化は、CMPとの比較において行い、既知濃度のCMP溶液の272nmの吸光を測定することによって、標準曲線を作成した。GSCONPSAは、過ヨウ素酸酸化されたPSAに対して45の収率で得られた。GSCONPSAとのアシアロPEGN8のシアリルトランスフェラーゼST3GalIII触媒反応によるPSAPEGN8の調製第1工程PEGアシアロN8N8この化合物は、特許WO2009108806A1に開示の手順に従って合成した。第2工程GSCONPSAによるPEGアシアロN8のST3GalIII触媒PSA化溶液反応バッファー15glLヒスチジン、3glショ糖、18glNaCl、01glTween80025glCaCl2、2H2O、pH73GSCONPSA反応バッファー中に078mMST3GalIII142mgmlPEGアシアロN8反応バッファー中に176mgml手順PEGアシアロN8溶液にGSCONPSA溶液を添加した。反応バッファーを添加した。反応は、酵素の添加によって開始した。反応混合物は、32°Cで22時間インキュベートした。10μlの反応バッファー中のNANCMP溶液の添加によって、生成物をキャッピングした。反応混合物を32°Cで1時間インキュベートした。ワークアップおよび精製用いられたバッファーは以下の通りであった。バッファーA10mMCaCl2、1Mグリセロール、002Tween80を含有し、NaClを含まない20mMイミダゾールバッファーpH74バッファーB、バッファーA1MNaCl反応バッファー15glLヒスチジン、3glショ糖、18glNaCl、01glTween80、025glCaCl2、2H2O、pH73ワークアップおよび精製バッファーA中に希釈した後、反応混合物を、製造業者説明書に従ってVivapureQMiniMデバイスにおけるイオン交換によって精製した。生成物をバッファーB中に回収した。生成物をサイズ排除カラムSuperdex20010×300GL上で、溶出液として反応バッファーを用いて、さらに流した。タンパク質回収率は32であった。生成物の特性分析SDSPAGE分析回収された生成物を7Tris酢酸SDSゲルにおいて、還元条件下で流し、クマシーブルー染色を用いた。タンパク質標準物質は、InvitrogenのHiMark無染色HMWタンパク質標準物質であった。PEGアシアロN8のペグ化重鎖バンドは、約240kDに現れ、軽鎖は約83kDに現れた。PSA化の後に、PSA化重鎖に相当すると想定されたバンドが、予測された通り、より高いMWに現れた。加えて、PSA化軽鎖に相当すると想定される広く拡散したバンドが97~116kDに現れた。N8の重鎖に相当する残りのバンドは検出することができず、見ることができたのは、軽鎖の痕跡のみであった。これは、PSAが実際にPEG40kDN8の重鎖および軽鎖の両方に移されたことを示す。逆相HPLCでの分析分析は、逆相Daiso300A、250×21、5μカラムで行われた。溶出液はAH2OTFA01およびBH2OACNTFA、流速025ml分、カラムオーブンの温度40°Cであった。勾配は、30分にわたる、35から84までであった。HPLCは、DAD検出器と、励起波長が280nmであり、発光波長が348nmである蛍光検出器との2つの検出器を備えていた。生成物の重鎖および軽鎖の保持時間は、下記の表に示されている通りであった。FVIIIの重鎖および軽鎖、ならびに中間体PEGN8の保持時間を比較のために示す。したがって、より極性の最終生成物PSAPEGN8について予測される通り、重鎖および軽鎖の保持時間は、開始化合物および中間化合物のHCおよびLCの保持時間より短い。ポリシアル酸のカップリングの後に、保持時間に、より大きな影響が生じないことは、いくぶん驚くべきことである。しかし、PSAのカルボン酸部分に由来する負電荷を、溶出液中に存在する酸が中和するので、このシステムは、生理的な条件を反映していない。活性最終生成物の活性を、Chromogenixの色素産生アッセイCoA試験SPFVIIIで測定した。開始FVIIIと比較して、80を超える活性が回収された。分子量約45kDの物質を得るためのコロミン酸断片化用いられたコロミン酸は、SigmaAldrichから市販されている化合物であった。より均質な物質を得るために、それを、バッファーAおよびBを用いて、HiPrep1610QFF陰イオン交換カラム上で分画した。A10mMトリエタノールアミンpH74、25mMNaClB10mMトリエタノールアミンpH74、1MNaCl8CVのバッファーAでカラムを均衡化した後、コロミン酸は、流速2ml分、24CVにわたる175Bから100Bへの勾配を用いて分画した。UV検出を210nmで行った。MilliporeAmiconUltra3kDカットオフにおける限外濾過によって、画分を水にバッファーシフトさせ、凍結乾燥し、SECMALSおよびUVによって分析した。38~77kDの分子量範囲にある約45kDの分子量に相当する画分をプールして、後続の実験で用いた。45kDPSAの過ヨウ素酸ナトリウム酸化実施例7で得られた物質の水溶液に、4mM過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加した。暗中、周囲温度で15分間、反応物をインキュベートした。過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを3メチルチオ1プロパノールによってクエンチングした。反応物を周囲温度で2時間さらにインキュベートした。MilliporeAmiconUltra45kDカットオフでの限外濾過によって、反応混合物を水にバッファーシフトさせ、凍結乾燥させた。凍結乾燥した物質をそのまま次の工程で用いた。シアリルトランスフェラーゼST3GalIII基質GSCONPSAを産生するための、過ヨウ素酸ナトリウム酸化されたPSAの、GSCONH2へのカップリング溶液反応バッファー100mMイミダゾールpH68GSCONH2反応バッファー中に83mgml過ヨウ素酸酸化された45kDaPSA反応バッファー中に355mgml飽和したアニリン水溶液メチルヒドロキシルアミン塩酸塩反応バッファー中に585mgml手順反応は、本質的に実施例5に記載の通りに行った。詳述は下記に含まれる。反応バッファー中の過ヨウ素酸酸化された45kDPSAの溶液に反応バッファー中のGSCONH2溶液を添加した。次いで、アニリンの飽和水溶液を添加した。反応混合物を周囲温度でインキュベートした。反応が進行した後、サイズ排除カラムWatersBiosuite125HRESC300×78mmを用いて、HPLC分析を行った。溶出液は、100mMリン酸バッファーpH68、流速06ml分であった。214nmおよび272nmにおけるDAD検出器を用いて、分析を周囲温度で行った。GSCONH2は185分で溶出し、酸化45kDPSAおよび反応生成物は、103分の同じ保持時間で溶出した。酸化45kDPSAおよび生成物GSCONPSAの両方が同じ保持時間で溶出するので、に対するの比率を見ることによって、反応の進行をモニターした。1時間、1時間45分、3時間、4時間30分、5時間30分、10時間、および23時間30分の反応時間の後に、分析を行った。比率は、1時間から1時間45分まで増大したが、1時間45分と3時間の間では変化しなかった。したがって、さらに多くのGSCONH2試薬を反応時間4時間に添加した。同様に、さらに多くの試薬を10時間の反応時間の後に添加し、混合物を周囲温度で合計23時間30分置いた。MicroAktaシステムを用いて、Superdex20010300GLカラム上で反応混合物を精製した。溶出液は、流速04ml分、画分容積05mlの20mMイミダゾールバッファーpH73、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、05MNaClであった。検出を210nmおよび272nmで行った。関連する画分をプールし、MilliporeAmiconUltra5kDカットオフでの限外濾過で濃縮し、次の工程でそのまま用いた。最終生成物の濃度は、027mMであると見積もられたの標準曲線との比較による。GSCONPSAを用いたPEGN8のシアリルトランスフェラーゼST3GalIII触媒反応によるNPSAPEGN8グリカンの調製第1工程PEG40kDアシアロN8化合物は、特許WO2009108806A1に記載された手順に従って合成された。第2工程GSCONPSAを用いたアシアロPEGアシアロN8のST3GalIII触媒PSA化溶液反応バッファー20mMイミダゾールバッファーpH73、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、05MNaClアシアロOPEG40kDN8278mgmlGSCONPSA反応バッファー中に027mMST3GalIIIMBPSBPST3GalIII1mgml手順アシアロPEG40kDN8溶液にGSCONPSA溶液を添加した。反応は、酵素の添加によって開始した。反応混合物を32°Cで17時間インキュベートした。15μl反応バッファー中のNANCMP溶液の添加によって生成物をキャッピングした。反応混合物を32°Cで1時間インキュベートした。ワークアップおよび精製20mMイミダゾールバッファーpH73、10mMCaCl2、1Mグリセロール、002Tween80、25mMNaClで反応混合物を16mlに希釈し、その後、MonoQ550GLにおけるイオン交換によって精製した。用いられたバッファーは以下の通りであった。バッファーA10mMCaCl2、1Mグリセロール、002Tween80を含有する20mMイミダゾールバッファーpH74およびバッファーB10mMCaCl2、1Mグリセロール、002Tween80、1MNaClを含有する20mMイミダゾールバッファーpH74。流速は07ml分であった。カラムを20CVで平衡化した。溶出プロファイルは以下の通りであった3CVにわたって0B、5CVにわたって0から20B、15CVにわたって20B、15CVにわたって20から100B、10CVにわたって100B。UV検出を280nmで行った。分画は周囲温度で行った。最初に酵素を溶出させ、後で小さな肩のあるピークとして生成物を溶出する。主要ピークに相当する画分をプールし、さらに精製し、溶出液として、15glLヒスチジン、3glショ糖、18glNaCl、01glTween80025glCaCl22H2O、pH73を含有するバッファーを用いて、サイズ排除カラムSuperdex20010×300GLにおいてバッファー交換した。流速は05ml分であった。UV検出を280nmで行った。生成物を主要ピークとして溶出し、その後、ピーク間のベースライン分離を用いて小さなピークを溶出した。主要ピークに相当する画分をプールし、MilliporeAmiconUltra50kDカットオフにおける限外濾過によって濃縮した。タンパク質回収率は52であった。生成物の特性分析SDSPAGE分析回収した生成物を、還元条件下、7Tris酢酸SDSゲルにおいて流し、クマシーブルー染色を用いた。タンパク質標準物質は、InvitrogenのHiMark無染色HMWタンパク質標準物質であった。PEGN8を用いると、ペグ化された重鎖バンドが約240kDに現れた。PSA化の後、MWがより高いバンドが約290kDに現れた。加えて、広く拡散したバンドが120kDと160kDの間に現れた。FVIIIの重鎖の分子量に相当する極めてかすかなバンドを検出することができた。また、FVIIIの軽鎖に相当するバンドの痕跡を見ることができた。HPLCでの分析逆相Daiso300A、250×21、5μカラムで分析を行った。溶出液は、AH2OTFA01、およびBH2OACNTFA、流速025ml分であり、カラムオーブンの温度は40°Cであった。勾配は、30分にわたる、35から84までであった。HPLCは、2つの検出器DAD検出器を備えていた。生成物の重鎖および軽鎖の保持時間は下記の表の通りであった。N8の重鎖および軽鎖、ならびに中間体PEGN8の保持時間を比較のために示す。PSAPEGN8について、PSAPEGN8と同じ一般プロファイルが得られた。すなわち、より極性である最終生成物PSAN8は、予測された通り、開始化合物および中間化合物のHCおよびLCの保持時間より短い、重鎖および軽鎖の保持時間を示す。活性最終生成物の活性は、製造業者の説明書に従って、Chromogenixの色素産生アッセイCoA試験SPFVIIIで測定した。開始N8と比較して、約55の活性が回収された。PSAPSAN8型のN8コンジュゲートの合成概説アシアロアシアロN8を得るために、N8を脱シアリル化した由来のシアリダーゼによって触媒される反応。アシアロアシアロN8を用いたGSCONPSAのST3GalI触媒反応によって、PSAをアシアログリカンに移した。イオン交換による精製の後、GSCONPSA試薬を、NアシアロPEG40N8のST3GalIII触媒ポリシアル酸付加におけるドナーとして用いた。最後に、NANCMPを反応混合物に添加することによって、未反応の残ったガラクトース部分をすべてキャッピングした。この型のコンジュゲートの合成を以下に詳述する。第1工程N8の脱シアリル化およびN8のアシアログリカンへのPSAのST3GalI触媒転移によるPSAアシアロN8の調製溶液反応バッファー20mMイミダゾールバッファーpH73、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、05MNaClN8反応バッファー中に57mgmlシアリダーゼアルスロバクターウレアファシエンス由来。04mgml、242Umg。GSCONPSA中に25mgmlHisST3GalIAA46~343中に25mgml手順反応バッファー中のN8の溶液にAウレアファシエンスシアリダーゼの溶液およびST3GalI酵素の溶液を添加した。GSCONPSAの溶液を添加した。反応混合物を24時間、23°Cでインキュベートした。ワークアップおよび精製を含有するバッファーで反応混合物を20倍希釈し、イオン交換カラムで精製した。溶出バッファーは、バッファーA20mMイミダゾールバッファーpH73、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、およびバッファーB15MNaClを添加したバッファーAであった。流速は035ml分であった。精製は15°Cで行った。検出はUV、280nmで行った。溶出は以下の通りであった5CVにわたって0から20B、25CVにわたって20から100B、5CVにわたって100B。1ml画分を96ディープウェルプレート内に収集した。関連する画分を、還元条件下のSDSPAGEによって、銀染色を用いて分析した。タンパク質標準物質は、InvitrogenのHiMark無染色HMWタンパク質標準物質であった。主要ピークに相当する画分は、N816194およびPSA化N8の混合物を含有する。シアリダーゼまたはST3GalI酵素の痕跡は検出することができなかった。主要ピークに相当する画分をプールし、限外濾過によって濃縮して、逆相HPLC分析によると55mgmlのタンパク質濃度を有する溶液を得た。タンパク質回収率は約79であった。第2工程PSAアシアロN8のアシアログリカンへのPSAのST3GalIII触媒転移によるPSAPSAN8の合成溶液PSAアシアロN8およびN8の混合物55mgタンパク質mlGSCONPSA中に25mgml。ST3GalIII中に033mgml。054Uml。MilliporeBiomaxカットオフ5kDでの限外濾過によって濃縮。NANCMP20mMイミダゾールバッファーpH73、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール中に50mgml手順第1工程で得られたPSAアシアロN8およびN8の混合物にGSCONPSAの溶液を添加した。ST3GalIII酵素溶液の添加によって、反応を開始させた。反応混合物を32°Cでインキュベートした。3時間の反応時間の後、GSCONPSA溶液の新しい部分を添加した。反応混合物を21時間インキュベートした。キャッピング上記の反応混合物に、NANCMPの溶液を添加した。混合物を32°Cで2時間インキュベートした。ワークアップおよび精製反応混合物を20mMイミダゾールバッファーpH74、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロールで20倍希釈した。次いで、それを、洗浄バッファーとしてバッファーA、および溶出バッファーとしてバッファーBを用い、製造業者の説明書に従って、IEX膜上で精製した。溶出された生成物を限外濾過によって濃縮した後、精製し、サイズ排除カラムにおいてバッファーシフトさせた。バッファーはショ糖、Lヒスチジン、NaCl、Tween80、およびCaCl2pH73を含有していた。流速は04ml分であり、検出は280nmのUVによって行った。05ml画分を収集した。残りのST3GalIIIは、主要ピークの前に溶出する肩として現れた。主要ピークに相当する画分をプールし、HPLCによって定量化した。総タンパク質回収率は28であった。生成物特性分析SDSPAGE分析回収した生成物を、還元条件下、7Tris酢酸SDSゲルにおいて流し、クマシーブルー染色を用いた。タンパク質標準物質は、InvitrogenのHiMark無染色HMWタンパク質標準物質であった。非常に広く拡散したバンドが97kDと160kDの間に現れた。これは、PSA化重鎖および軽鎖に相当すると想定される。誘導体化されていない重鎖および軽鎖の痕跡が検出可能である。240kDと280kDの間に現れるバンドは、PSA化単一鎖N8に相当すると想定された。HPLCでの分析分析は、実施例10に示した通りに行った。生成物の重鎖および軽鎖の保持時間は下記の表の通りであった。N8の重鎖および軽鎖の保持時間を比較のために示す。したがって、より極性のタンパク質について予測される通り、PSA化HCの保持時間は低減する。PSA化軽鎖については、その影響がそれほど明白ではなく、重鎖では3カ所が利用可能であるグリカンおよびグリカンのに、2カ所の潜在的誘導体化部位のみが利用可能であるという事実も反映していた。活性最終生成物の活性をChromogenixの色素産生アッセイCoA試験SPFVIIIで測定した。開始FVIIIと比較して、約55の活性が回収された。PSAN8型のN8コンジュゲートの合成概説アシアロN8を得るためにウェルシュ菌由来のシアリダーゼを用いてN8を脱シアリル化した。GSCONPSA試薬を、NアシアロPEG40N8のST3GalIII触媒ポリシアル酸付加におけるドナーとして用いた。最後に、NANCMPを反応混合物に添加することによって、未反応の残ったガラクトース部分をすべてキャッピングした。この型のコンジュゲートの合成の詳述を以下に示す。PSAN8の合成第1工程ウェルシュ菌シアリダーゼによるN8の脱シアリル化溶液反応バッファー20mMイミダゾールバッファーpH73、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、05MNaCl。シアリダーゼ03mgml200UmlN8反応バッファー中に57mgml手順N8溶液に反応バッファーおよび酵素溶液を添加した。混合物を、23°Cで45分間インキュベートした。ワークアップおよび精製反応混合物をで10倍希釈した。得られた溶液を、AktaPurifierにおける陰イオン交換カラムで精製した。用いられたバッファーは、バッファーA20mMイミダゾールバッファーpH73、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、25mMNaCl、およびバッファーB1MNaClを含むバッファーAであった。流速は05ml分であり、検出はUV、280nmによって行った。溶出は以下の通りであった5CVにわたって0から20B、10CVにわたって20B、10CVにわたって100B。溶出液は、最終勾配工程における05ml画分で収集した。タンパク質回収率は45であった。第2工程アシアロN8へのPSAのST3GalIII触媒転移によるPSAN8の合成試薬反応バッファー20mMイミダゾールバッファーpH7310mMCaCl2002Tween801Mグリセロール、05MNaCl。NアシアロN820mMイミダゾールバッファーpH73、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、025MNaCl中に239mgmlGSCONPSA反応バッファー中に約027mMST3GalIIIMBPSBPST3GalIII、1mgml、12Umg手順NアシアロN8の溶液に、GSCONPSAの溶液を添加した。酵素の添加によって反応を開始した。混合物を32°Cで終夜インキュベートした。キャッピングNANCMPの溶液を添加し、その結果得られた混合物を32°Cで1時間インキュベートした。ワークアップおよび精製反応混合物を20mMイミダゾールバッファーpH73、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、25mMNaClで10倍希釈し、AktaPurifierシステムにおける陰イオン交換によって精製した。用いられたバッファーは、バッファーA20mMイミダゾールバッファーpH7310mMCaCl2002Tween801Mグリセロール、25mMNaCl、およびバッファーB1MNaClを含むバッファーAであった。流速は07ml分であり、検出はUV、280nmによって行った。精製を15°Cで行った。溶出は以下の通りであった5CVにわたって0から20B、15CVにわたって20B、15CVにわたって20から100B、10CVにわたって100B。溶出液は05ml画分で収集した。タンパク質回収率は32であった。生成物の特性分析SDSPAGE分析回収した生成物を、還元条件下、7Tris酢酸SDSゲルにおいて流し、クマシーブルー染色を用いた。タンパク質標準物質は、InvitrogenのHiMark無染色HMWタンパク質標準物質であった。かなり広く拡散したバンドが約125kDと165kDの間に現れた。これは、PSA化重鎖および軽鎖に相当すると想定される。誘導体化されていない重鎖および軽鎖の痕跡が検出可能である。逆相HPLC分析分析は、実施例10に示した通りに行った。生成物の重鎖および軽鎖の保持時間は下記の表の通りであった。N8の重鎖および軽鎖の保持時間を比較のために示す。したがって、より極性のタンパク質について予測される通り、PSA化HCの保持時間は低減する。この効果は、PSA化軽鎖の保持時間には、ほとんど無視できるものである。活性最終生成物の活性をChromogenixの色素産生アッセイCoA試験SPFVIIIで測定した。開始FVIIIと比較して、約60の活性が回収された。PSAN8の合成合成は、PSAN8の合成と同様に行った。タンパク質回収率は39であった。特性分析SDSPAGE分析実施例12の通りに行った。非常に広く拡散したバンドが約97kDと160kDの間に現れた。これは、PSA化重鎖および軽鎖に相当すると想定される。誘導体化されていない重鎖および軽鎖の痕跡に相当するバンドが検出可能である。逆相HPLC分析逆相Daiso300A、250×245μカラムで分析を行った。溶出液は、AH2OTFA01、およびBH2OACNTFAであり、流速は1ml分であり、カラムオーブンの温度は40°Cであった。勾配は、30分にわたる、35から84までであった。HPLCは、2つの検出器DAD検出器を備えていた。生成物の重鎖および軽鎖の保持時間は下記の表の通りであった。N8の重鎖および軽鎖の保持時間を比較のために示す。したがって、PSAN8化合物に関して、より極性のタンパク質について予測されるように、PSA化HCの保持時間は減少する。この効果は、PSA化軽鎖の保持時間には、無視できるものである。活性最終生成物の活性をChromogenixの色素産生アッセイCoA試験SPFVIIIで測定した。開始FVIIIと比較して、約88の活性が回収された。3FVIIIKOマウスにおけるPK研究様々なN8グリコPEGPSA誘導体の半減期の比較。N8のグリココンジュゲートの薬物動態学的特性分析rFVIIIバリアントの薬物動態をFVIII欠失マウスマウスで評価した。FVIIIKOマウスは、検出可能なFVIIICを有していなかった。おおよその体重25グラムおよび週齢幅16~28週の雄性および雌性の混合集団を用いた。rFVIIIの単回iv注射をマウスの尾静脈に行った。投与の64時間後までの時点で、コーティングされていないガラス毛細管を用いて眼窩静脈叢から採血した。各マウスから3つの試料を採取し、各時点に2から4つの試料を収集した。血液は直ちにクエン酸ナトリウムで安定化させ、4容のFVIIICoatestSPバッファーで希釈し、その後、4000×gで5分間、遠心処理した。希釈血液から得られた血漿は、ドライアイスで凍結させ、80°Cで保持した。FVIIICは、製造業者説明書に従ってCoatestSP試薬を用いた色素産生アッセイで測定した。薬物動態学的な分析は、WinNonlinProソフトウェアを用いて非区分化方法によって行った。下記の表は半減期の見積りを示す。化合物Cは、PEG40kD部分がグリカンに連結されており、14時間の半減期を有し、すなわち、N8の半減期が2倍に延長されている。Nグリカンへの重合体のさらなるコンジュゲーションは、その結果得られる化合物の半減期に著しく異なった影響を与える別のPEG40kD部分のコンジュゲーションは、その結果得られる化合物Eにいかなる影響も与えない、一方、PSAのコンジュゲーションは、その結果得られる化合物に顕著な影響を与える化合物FおよびGはそれぞれ177時間および195時間の半減期を有し、元のN8分子の半減期をそれぞれ26倍、29倍に延長している。同様に、グリカンとグリカンの両方においてPSAで誘導体化されたN8は、グリカンとグリカンの両方においてPEGで誘導体化されたN8の半減期と同じ半減期を示すT12126時間対13時間。これは、グリカンでのみ誘導体化されたN8の半減期と比較して、わずかな改善にすぎない。しかし、グリカンにPSAの代わりにPEGが存在する場合には、その結果得られる化合物FPEG40kDPSAN8の半減期は著しく増大する126時間に対して、化合物Dでは177時間。これらの結果は、グリコ誘導体化のためのPEGとPSAの組合せが、1つの重合体タイプのみの使用より優れていることを強く示唆する。これらの結果は驚くべきものである分枝PEG40kDは、タンパク質の表面を被覆し、それによって、プロテアーゼがN8の表面に接近するのを阻止する、もしくはより困難にする、またはクリアランス受容体へのN8の結合を阻止もしくは低減する能力により延長する影響を有すると予測された。分枝PEG40kDは、分枝重合体として、線状重合体が行うよりも効果的にそれを行うと予測される12196。立体的なパラメータのみが効果を現すのであるならば、線状重合体によるよりも、分枝重合体によって、N8の表面のさらに良い保護が得られると予測するであろう。分枝重合体の半分しか分子進路がない線状重合体ならばなおさらである。両方の重合体は、ともに高度に水和され、それらの構造は類似している。シアリルトランスフェラーゼ基質グリシルシアル酸シトシン5一リン酸エステルの調製4ホルミル安息香酸スクシンイミジルをTHF中に溶解させ、TRISバッファーを添加した。グリシルシアル酸シチジン5一リン酸エステルを秤量して、NHSエステルの溶液に添加し、25時間、室温で反応させた。反応混合物を、15mlの10mM重炭酸アンモニウムバッファーで4mlに希釈し、RPHPLCによって精製した。システムWaters2545勾配コントローラ、2489UV検出器。カラムC18、直径2cm。10mM重炭酸アンモニウム存在下で030CH3CN勾配。関連する画分をLCMSによって同定し、凍結乾燥した。次いで、RPHPLCによって生成物を再精製した。収率62mg。生成物をLCMSによって同定した。上記プロトコールを用いて、化学選択的なアルデヒド官能基を保持するシアリルトランスフェラーゼ基質を調製した。アルコキシルアミン官能基化されたヒドロキシエチルデンプンの調製HES20005輸液を13ビスアミノキシプロパン2HClの溶液と混合し、pHを166にした。混合物を周囲温度で終夜、撹拌した。20mlの量の反応混合物を250mlの水で希釈した。希釈された試料を、Vivaflow50システムを用いた、5lの水に対するタンジェンシャル濾過によって精製した。最後に、それを50mlに濃縮し、システムを50mlの水で流した。凍結乾燥の後、690mgの生成物が得られた。同様にして、Voluven輸液から開始して、HES13004からHESONH2を調製した。上記プロトコールを用いて、化学選択的なアルコキシルアミン官能基を有するヒドロキシエチルデンプンを調製した。HESGSCコンジュゲートを得るための、アルコキシルアミン官能基化されたヒドロキシエチルデンプンHESONH2との、アルデヒドGSCのカップリングHESONH2を1000μlのPBSバッファーpH74中に溶解させ、アルデヒドGSCを添加した。22時間、室温で反応を進行させ、その後、反応混合物をPBSバッファーpH73で100mlで希釈した。希釈された試料を、Vivaflow50システムを用いたタンジェンシャル濾過によって4lのPBSバッファーに対して精製した。140mgHESGSCを含有する100mlバッファー中で生成物を得た。276nmでのシチジンの検出を行うSECによって、生成物を特性分析した。高分子量のシチジン誘導体のみが、この方法によって生成物中に検出され、生成物は、開始物質であるアルデヒドGSCを本質的に含まないと結論された。上記プロトコールを用いて、ヒドロキシエチルデンプンを糖タンパク質の脱シアリル化グリカンに付けるのに有用なシアリルトランスフェラーゼ基質を調製した。HESFVIIIコンジュゲートを得るための、HESGSC基質J3およびST3GalIを用いた、OグリカンにおけるHESによるwtBドメイン欠失型ヒトFVIIIの修飾HESGSCを濃縮し、AmiconUltra超限外濾過バイアルを用いて、20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、pH73、1MNaClにバッファー交換した。最終容積22ml。HESGSC試薬を、N8、シアリダーゼAウレアファシエンス、およびHisST3GalIと混合し、32°Cでインキュベートした。22時間後、SDSPAGE分析によって、HCおよびLCFVIIIバンドの両方よりも高いMWで移動するスメアなバンドとして生成物形成が示された。伝導率を下げるために、反応混合物を、20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、pH73、25mMNaClのバッファー約50mlで希釈し、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラムMonoQ550GL、開始バッファー20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、pH73、25mMNaCl、溶出バッファー20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、pH73、1MNaCl。所望の生成物を含有する、関連する画分は、3本の主要バンド完全なLC、強度が非常に低減しているHCバンド、およびHCにコンジュゲートしたHESを表す高MWのスメアなバンドを有するものとして、SDSPAGE分析から同定された。単離され、プールされた画分は、111mgの生成物を含有していた。プールされた画分を、100μlのCMPNANおよびST3GalIIIと混合し、32°Cで1時間インキュベートした。次いで、反応混合物を、20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、pH73、25mMNaClのバッファーで希釈し、VivapureQMaxiMスピンフィルターにロードした。フィルターを2×15mlの20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、pH73、25mMNaClで洗浄し、最初に2×15mlの20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、pH73、200mMNaClを用いて、次いで、生成物を溶出するために、3×05mlの20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002Tween80、1Mグリセロール、pH73、1MNaClを用いて溶出した。最初の2つの画分が、それぞれ800μgおよび110μgで、所望の生成物を含有していた。これらの2つの画分をSEC、CaCl2、Tween80、NaCl、ショ糖によって別々に精製し、その結果、それぞれ218μgおよび66μgが回収された。HPLCによるタンパク質濃度測定は、収率を、それぞれ130μgおよび40μgとした。上記プロトコールを用いて、BドメインリンカーのOグリカンを介してHESがFVIIIとカップリングされているHESFVIIIコンジュゲートを調製した。このコンジュゲーション戦略は、部位選択的にHES化されたFVIII分子をもたらす。さらに、シアリルトランスフェラーゼ媒介のコンジュゲーションは、穏やかである。同時にペグ化およびHES化されたFVIIIコンジュゲートを得るための、HESGSC基質J3およびST3GalIを用いた、OグリカンにおけるHES、ならびにPEGGSCおよびST3GalIIIを用いた、NグリカンにおけるPEGによる、wtBドメイン欠失型ヒトFVIIIの修飾実施例18に従って調製されたコンジュゲートを、水性バッファー中の1ポット反応において、固定されたシアリダーゼ、PEGGSC、およびST3GalIIIで処理する。完全な反応の後に、濾過によってシアリダーゼを除去し、いかなる末端ガラクトースも遮断するために、大過剰のCMPNANを反応混合物に添加する。完全な反応の後に、生成物をST3GalIIIおよびシアリルトランスフェラーゼ基質から分離するために、陰イオン交換およびSECクロマトグラフィーによって、コンジュゲートを精製する。このプロトコールを用いて、それぞれ、OグリカンおよびNグリカンにHESおよびPEGがコンジュゲートしたFVIIIが生成される。同時にペグ化およびHES化されたFVIIIコンジュゲートを得るための、HESGSC基質J3およびST3GalIIIを用いた、NグリカンにおけるHES、ならびにPEGGSCおよびST3GalIを用いた、OグリカンにおけるPEGによる、wtBドメイン欠失型ヒトFVIIIの修飾Oグリカンペグ化されたFVIIIは、WO2009108806A1に従って調製される。水性バッファー中の1ポット反応において、このコンジュゲートを、固定されたシアリダーゼ、実施例17のHESGSCJ3、およびST3GalIIIで処理する。完全な反応の後に、濾過によってシアリダーゼを除去し、いかなる末端ガラクトースも遮断するために、大過剰のCMPNANを反応混合物に添加する。完全な反応の後に、生成物をST3GalIIIおよびシアリルトランスフェラーゼ基質から分離するために、陰イオン交換およびSECクロマトグラフィーによって、コンジュゲートを精製する。このプロトコールを用いて、それぞれ、NグリカンおよびOグリカンにHESおよびPEGがコンジュゲートしたFVIIIが生成される。硫酸化PSAの調製調製は、公表されている手順に従って行う1451およびそこに引用されている参考文献。開始物質は、実施例3および7に記載の通りに得られる、分子量約20kDのPSAまたは分子量約45kDのPSAのいずれかである。簡潔には、有機溶剤中におけるその溶解度を増大させるために、PSAのナトリウム塩をトリnブチルアンモニウム塩に変える。これは、樹脂イオン交換で行われる。凍結乾燥したトリブチルアンモニウム塩の硫酸化は、0°Cの不活性雰囲気下において、無水DMF中で、硫酸化試薬としてSO3ピリジン複合体を用いて行われる。反応は、水を添加し、pHを9に調整することによって終了させる。生成物は、大容量のアセトンに反応混合物を滴状で添加することによって回収する。生成物は、この結果得られる沈殿の遠心分離によって回収される。生成物は、ゲル濾過でさらに精製され、溶出液は、凍結乾燥される。硫酸化PSAの過ヨウ素酸ナトリウム酸化過ヨウ素酸酸化は、実施例21で得られた硫酸化PSAから開始して、実施例8と同様に行う。シアリルトランスフェラーゼST3GalIIIの基質であるGSCON硫酸化PSAを産生するための、GSCONH2への過ヨウ素酸ナトリウム酸化された硫酸化PSAのカップリングカップリングは、開始化合物として、実施例2からのGSCONH2と、実施例22からの酸化された硫酸化PSAとを用いて、実施例9に従って行う。GSCON硫酸化PSAとの、アシアロPEGN8のシアリルトランスフェラーゼST3GalIII触媒反応による、硫酸化PSAPEGN8の調製化合物は、ST3GalIIIの存在下で、アクセプターとしてアシアロPEGN8を用い、ドナーとしてGSCON硫酸化PSAを用いて、実施例10に従って調製する。