"第1の化学的部分を介して第2の化学的部分が間接的に結合した、配列番号2に示すアミノ酸配列を含む改変されたG-CSFポリペプチドを製造する方法であって、ainvitroで第1の化学的部分を外部ループに結合させる工程およびb第1の化学的部分を介して第2の化学的部分を間接的に外部ループに結合させる工程を含み、当該第1の化学的部分が多糖であり、第2の化学的部分がポリエチレングリコールであり、配列番号2のN末端メチオニンが存在し、または存在しておらず、当該改変G-CSFがG-CSF受容体に結合する生物活性を維持していることを特徴とする前記方法。外部ループがCDループである請求項1に記載の方法。外部ループがABループである請求項1に記載の方法。外部ループがBCループである請求項1に記載の方法。本実施例は結晶質G-CSFの製造、コンピューター生成画像による組換えヒトG-CSFの三次元構造の可視化、特定部位突然変異誘発又は核酸増幅法を使用した類似体の製造、G-CSF類似体を分析するために使用した生物アッセイ及びHPLC分析、並びに全体構造/機能関係の決定について説明する。全引用文献は参考資料として本明細書の一部とする。A.自動結晶化の使用組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子r-hu-G-CSFの三次元構造が必要であることと、大量の精製タンパク質が入手可能であることから、不完全階乗サンプリング及び接種による結晶成長法を実施した。JancarikとKim,J.Appl.Crystallogr.24:4091991に記載されている不完全階乗結晶化の実施から出発して、油滴及び複屈折凝集体を生成する溶液条件を確認した。また、自動ピペッティングシステムのソフトウェア及びハードウェアを改造して毎日約400の異なる結晶化条件を設定した。Weber,J.Appl.Crystallogr.20:366-3731987。この手順により、r-hu-G-CSF結晶を生成する結晶化溶液を調製した。結晶の寸法、再現性及び品質は、核生成開始単位の数を接種溶液の連続希釈により推定する接種法により改善された。これらの方法により、2.0mmのr-hu-G-CSF結晶を再現可能に成長させることができた。これらの結晶の空間群はP212121であり、セル寸法はa=90Å、b=110Å及びc=49Åであり、2.0Åの分解能まで回折する。1.全体的手法新規タンパク質の結晶化条件を探索するために、CarterとCarter,J.Biol.Chem.254:122219-122231979は不完全階乗法を提案した。同氏らによると、一般に有望であるとみなされるランダムに選択された多数の結晶化条件のサンプリングにより、タンパク質結晶化をもたらす好適な試薬組み合わせが得られる。このアイデアは、JancarikとKim,J.Appl.Crystallogr.24:4091991により実現され、同氏らはpH範囲、塩及び沈殿剤を考慮した初期結晶化試験のための32種の溶液を記載した。本発明では同氏らの作業を拡張し、70種までの溶液を記載する。溶液調製の人的労力及び誤差を最小限にするために、自動ピペッティング機にあわせて手法をプログラムした。Weberの連続自動格子探索法SAGS,J.Cryst,Growth90:318-3241988に従い、ロボットシステムを使用して温度、pH、塩及び沈殿剤の結晶化条件を連続的に最適化する一連の溶液を調製した。結晶を再現可能に成長させることが可能な溶液が決定されると、結晶の品質を著しく改善する接種技術が開発された。これらの方法を組み合わせると、数百種の回折品質結晶少なくとも約2.5Åに回折し、好ましくは少なくとも部分的に2Å未満、より好ましくは約1Åに回折する部分を有する結晶が数日で生成された。一般に、結晶化を所望する任意のタンパク質と共に使用され得る結晶化方法は、ai異なる塩濃度を各々有する塩溶液のアリコート又はii異なる沈殿剤濃度を各々有する沈殿剤溶液のアリコートと所望のタンパク質の水性アリコートとを一定範囲のpHの任意存在下で結合する段階と、bこうして結合したアリコートの予備結晶形成を観察し、予備結晶形態の生成に有効な前記塩もしくは沈殿剤組み合わせ及び前記pHを選択するか、又は予備結晶形態が生成されない場合には、タンパク質の前記水性アリコートのタンパク質出発濃度を増加させる段階と、c前記塩又は前記沈殿剤濃度を選択後、前記選択された濃度の存在下で前に選択しなかった前記溶液を用いて段階aを繰り返す段階と、d所望の品質の結晶が得られるまで段階b及び段階aを繰り返す段階とを含む。上記方法は任意に自動化することができ、時間と労力を著しく節約することができる。好適タンパク質出発濃度は10mg/ml~20mg/mlであるが、この出発濃度はタンパク質により異なる下記G-CSFは33mg/mlを使用して分析した。分析を開始するために好適な塩溶液範囲は0~2.5MNaClである。好適沈殿剤はポリエチレングリコール8000であるが、他の沈殿剤としては、有機溶媒例えばエタノール、分子量500~20,000のポリエチレングリコール分子、及び当業者に公知の他の沈殿剤を挙げることができる。好適pH範囲はpH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5及び9.0である。予備結晶化形態は、油状物、複屈折沈殿、小結晶<約0.05mm、中結晶約0.5~.5mm及び大結晶>約0.5mmを含む。結晶構造を検出するまでの好適待機時間は48時間であるが、週に一度の観察でも好適であり、一般には約1カ月後に別のタンパク質濃度を使用する一般にタンパク質濃度を増加させる。自動化はAccuflexシステムを改造すると好適である。好適自動化パラメーターを以下に説明する。一般に、濃度10mg/ml~20mg/mlのタンパク質を0~2.5MのNaCl溶液と組み合わせ、上記濃度範囲の存在下で別々にこのような各組み合わせを実施した。予備結晶化構造が観察されたら、所望の結晶品質に達するまで前記塩濃度及びpH範囲を別実験で最適化させる。次いで、pHレベルを変えながら沈殿剤濃度も最適化させる。両者が最適化されたら、最適条件を同時に実施し、所望の結果を得るこれを図6に示す。a.自動ピペッティングシステムの実施標準シリアルインターフェースを介してASCIIコードを送信するパーソナルコンピューターにより制御されるAccuflexピペッティングシステムICNPharmaceuticals,CostaMesa,CAにより、液滴及び液溜溶液を調製した。ピペッターは回転バルブにより6種の異なる溶液をサンプリングし、xy座標系内の並進を制御可能なプレートにこれらの溶液をピペット分注する。座標系の鉛直成分は液体を分配及び回収することが可能な注射器を操作する。Accuflexのソフトウェアは、CoxとWeber,J.Appl.Crystallogr.20:366-3731987により提案されているようなSAGS法を利用した。この方法は、他の2つのパラメーターを変化させながら、pH及び沈殿剤濃度という2つの主要な結晶化パラメーターを体系的に変化させるものである。これらのコンセプトに基づきながら、本発明で使用するソフトウェアは自動格子探索ストラテジーで使用される結晶化溶液の設計及び実現により高いフレキシビリティーを提供する。このフレキシビリティーの結果として、本発明のソフトウェアはより多数の異なる溶液を生成することができた。これは、下記不完全階乗法の実施に不可欠である。自動格子探索ストラテジーの速度及び設計を改善するために、Accuflexピペッティングシステムはソフトウェア及びハードウェアの改造が必要であった。ハードウェアの改造により、懸垂液滴hangingdrop実験用トレーと、放置液滴sittingdrop実験用トレーとの2種の異なるマイクロタイタートレーと、24種の付加的緩衝液、塩及び沈殿剤溶液を保持するPlexglasトレーを使用できるようになった。これらの付加溶液により、調査可能な結晶化条件の格子を拡大した。ハードウェア改造を利用するために、ピペッティングソフトウェアを2つのサブルーチンに書き込んだ。結晶学者は一方のサブルーチンにより成分の濃度に基づいて結晶化溶液のマトリックスを設計することができ、第2のサブルーチンにより適正容量の溶液を結晶化トレーにピペット分注するコンピューターコードにこれらの濃度を翻訳することができる。濃度マトリックスは2種のプログラムのどちらかを使用して作成することができる。第1のプログラムThousandOaks,CAに所在のAmgenInc.の市販品MRFは結晶学者により供給されるストック溶液濃度のリストに関するものであり、指定濃度に達するために必要なピペット分注容量を計算する。より好適な第2の方法は、沈殿剤の勾配又はpHを改善するために使用可能なスプレッドシートプログラムLotusを組み込む。これらのプログラムにより生成される濃度マトリックスは制御プログラムAccuflexピペッターに元々内蔵されているプログラムの改造であり、ThousandOaks,CAに所在のAmgen,Inc.の市販品SUXにより翻訳され、ウェルはこれに従って充填される。b.不完全階乗法の実施改造ピペッティングシステムは種々の溶液を調製するのに便利であるため、拡張不完全階乗法の実施を改善することができた。3つの変数から1つの因子の96のランダムな組み合わせを含むリストを作成するプログラムINFACCarterら,J.Cryst.Growth90:60-731988を使用してランダムな成分を有する結晶化溶液の新しい組合わせを展開した。即座に沈殿したカルシウムとリン酸の組み合わせを除くと、沈殿剤、塩及び緩衝液の70種の異なる組み合わせが残った。自動ピペッターを使用してこれらの組み合わせを調製し、1週間インキュベートした。混合物を検査し、沈殿を形成した溶液をより低い成分濃度で再び調製した。全ウェルから沈殿が除去されるまでこれを繰り返した。c.r-hu-G-CSFの結晶化X線品質結晶を生成する溶液を見いだすために数種の異なる結晶化ストラテジーを使用した。これらのストラテジーは、不完全階乗法の使用、連続自動格子探索SAGSを使用した結晶化条件の最適化、接種技術の実施、及び数百の品質結晶を一晩で生成する結晶生成手順の開発を含むものであった。特に指定しない限り、スクリーニング及びr-hu-G-CSF結晶の生成は懸垂液滴蒸気拡散法を使用した。Afinsenら,Physicalprinciplesofproteincrystallization.:Eisenberg編,AdvancesinProteinChemistry41:1-331991。r-hu-G-CSFの結晶化条件の初期スクリーニングはJancarikとKim,J.Appl.Crystallogr.24:4091991の不完全階乗法を使用し、予備結晶化結果をもたらす数種の溶液を調製した。これらの結果は複屈折沈殿、油状物及び非常に小さい結晶<0.05mmを含むものであった。これらの予備結晶化溶液をその後、体系的スクリーニングの出発点として使用した。スクリーニングプロセスには結晶化マトリックスの開発が必要であった。これらのマトリックスは結晶化溶液中の成分の濃度に対応し、IBM-PCに基づくスプレッドシートLotus商標を使用して生成し、改造Accuflexピペッティングシステムを用いて実施した。マトリックスの設計におけるストラテジーは、他の条件例えばpH及び沈殿剤濃度を一定に維持しながら1つの結晶化条件例えば塩濃度を変化させることであった。スクリーニングの開始時に変更条件の濃度範囲は広かったが、マイクロタイタートレー中の全ウェルが同一結晶化結果を生じるまで濃度を連続的に最適化した。これらの結果を結晶、複屈折沈殿、顆粒状沈殿、油滴及び非晶質塊の分類により評点した。ある結晶化パラメーターの濃度が少なくとも沈殿を生成しなかった場合には、沈殿が形成されるまでこのパラメーターの濃度を増加させた。各トレーを調製後、少なくとも2日間撹乱せずに静置した後、結晶成長を検査した。この初期スクリーニング後、トレーを週に一度の割合で検査した。このスクリーニングプロセスから、pH及び沈殿剤が同一でありながら塩MgCl,LiSO4が異なり、小0.1×0.05×0.05mm結晶を生成した2種の別々の溶液を確認した。これらの結果に基づき、他の結晶化パラメーターを一定に維持しながらLiSO4に対してMgClの濃度を変化させた濃度マトリックスの新しい組合わせを作成した。この実験系の結果、約3週間で回折品質結晶>約0.5mmを生成する溶液が確認された。この結晶化成長溶液100mMMespH5.8,380mMMgCl2,220mMLiSO4及び8PEG8kを見いだすために、約300mgのタンパク質を消費した約8,000の条件をスクリーニングした。結晶の寸法は液滴当たりの結晶形成数に依存した。典型的には平均寸法1.0×0.7×0.7mmを有する3~5個の結晶が形成された。接種下記参照を実施したか否かに依存して、等しい空間群P212121及び単位セル寸法a=90.2,b=110.2,c=49.5を有する2種の形態が得られた。接種を実施しない場合には、r-hu-G-CSF結晶は1つの長い平坦な表面と丸みを帯びた縁部を有していた。接種を使用した場合には、4~6時間以内に鋭角面を有する結晶0.05×0.05×0.05mmが液滴内に観察された。24時間以内に結晶は0.7×0.7×0.7mmまで成長し、液滴中の結晶形成数に依存して2mmを越えるまで成長し続けた。d.接種及び核生成開始部位の決定本発明の結晶接種方法は、ここでは最適結晶成長条件を決定後に使用した各個ウェル中の核生成開始単位数を確定する。この方法は、種晶の数が結晶の品質に影響し、分解能に影響するという点で有利である。本発明の接種は更に、接種を実施しない場合には成長に約3週間を要するが、接種を実施すると、G-CSF結晶は約3日で成長するという利点がある。ある生成成長系列手法の項参照のことでは、確定された小結晶<0.01×0.01×0.01mmのシャワーが一晩で生成された。前に使用したピペット先端を再使用した以外は上記と同様の結晶化条件に従った。恐らく、使用済み先端に形成されており、結晶の核生成部位を提供する小核生成単位により結晶シャワー効果が生じたと予想される。標準生成成長条件下で結晶シャワーを含む少量0.5μlの液滴を新しい液滴に加えると、一晩で結晶のシャワーが生成された。この方法を使用して結晶シャワーを含む液滴のトレー数個を作成し、これを種晶ストックと名付けた。種晶ストック液滴内に含まれる核生成開始単位NIUの数を推定し、r-hu-G-CSF結晶の再現性及び品質を改善するように試みた。種晶ストック中のNIUの数を決定するために、96穴マイクロタイタープレートに沿って液滴のアリコートを連続希釈した。マイクロタイタープレートは、等容量のr-hu-G-CSF33mg/mlと上記結晶成長溶液を含有する溶液50μlを各ウェルに加えることにより調製した。種晶ストックのアリコート3μlをマイクロタイタープレートの第1のウェルに移した。ウェル内の溶液を混合した後、3μlをマイクロタイタープレートの行に沿って次のウェルに移した。マイクロタイタープレートの各行を同様に調製し、トレーをプラスチックテープで密閉した。一晩でマイクロタイタープレートのウェルの底に小結晶が形成されたので、ウェル中の結晶の数を元の種晶ストックの希釈液に相関させた。大きい単結晶を生成するために、種晶ストック液滴を新鮮なCGS中に適宜希釈した後、NIUを含有するこの溶液のアリコートを液滴に移した。結晶化条件が一旦最適化されたら、CGS及びr-hu-G-CSF33mg/ml各3mlを混合して5個のトレー各24穴を作成する生成法で結晶を成長させた。この方法は、リットル量の最適化結晶化溶液を調製し、この溶液をタンパク質と混合し、懸垂液滴又は放置液滴トレーにタンパク質/結晶化溶液を加えるものであった。この方法では典型的には約5日間で100~300の品質結晶>0.5mmが得られた。e.実験法材料図1に示すアミノ酸配列と比活性1.0±0.6×108U/mgpH4.0の10mM酢酸緩衝液中で細胞マイトジェン生成アッセイにより測定を有する濃度約3mg/mlのr-hu-G-CSFから出発して結晶学的情報を得た。YM10フィルターを使用して75psiでAmicon濃縮器を使用して溶液を濃縮した。溶液を典型的には4°Cで10倍に濃縮し、数カ月貯蔵した。初期スクリーニング懸垂液滴を使用して蒸気拡散平衡によりX線分析に適した結晶を得た。予備スクリーニングのために、上記のように調製した33mg/mlタンパク質溶液7μlを等容量のウェル溶液と混合し、シリコンガラスプレートに載せ、Linbro組織培養プレートMcLean,Vaに所在のFlowLaboratoriesを使用してウェル溶液上に懸垂させた。全ピペッティングはAccuflexピペッターを使用して実施したが、ウェル溶液の生成後はトレーを自動ピペッターから取り外し、卓上振盪機で少なくとも10分間十分に混合した。次にLinbroトレーを再びピペッターに取り付け、ウェル溶液及びタンパク質溶液をシリコンカバースリップに加えた。次にカバースリップを裏返し、ウェル溶液1mlをシリコン油脂で覆い、密封した。自動結晶化システムの成分は以下の通りである。PC-DOSコンピューターシステムを使用して、その成分の濃度に基づいて結晶化溶液のマトリックスを設計した。これらのマトリックスは上記MRF又はLotusスプレッドシートのいずれかを用いて作成した。これらのプログラムの終産物はデータファイルである。このファイルは、マトリックスに示された濃度を得るために適した容量のストック溶液をピペットするためにSUXプログラムにより必要とされる情報を含む。SUXプログラム情報をシリアルI/Oポートに送り、ストック溶液に対するバルブの位置、回収した後にマイクロタイタープレートのウェルにピペット分注すべき溶液の量及び各ウェルのXY位置各ウェルの行列をAccuflexピペッティングシステムに指令するためにこの情報を使用した。充填中の注射器のZ位置高さと、異なる溶液の充填間に注射器を洗浄するためにシステムを停止させるドレインの位置とを含む付加情報をピペッターに送信した。24穴マイクロタイタープレートLinbro又はCryschem及びカバースリップホルダーをプレートに載せ、プレートをXY面内で移動させた。プレートの移動により、ウェルにピペット分注するようにピペッターに注射器を位置決めさせた。プレートの移動により、カバースリップ及びバイアルも位置決めし、これらから溶液を抽出した。ピペット分注前に、Linbroマイクロタイタープレートはウェルの縁部の周囲に油脂薄膜を塗布しておいた。結晶化溶液をウェル内で調製してから、カバースリップに移す前に、マイクロタイタープレートをピペッティングシステムから取り外し、溶液を10分間卓上振盪機で混合した。混合後、ウェル溶液をカバースリップ懸垂液滴プロトコルの場合又はウェルの中央ポスト放置液滴プロトコルの場合に移した。タンパク質をバイアルから抽出し、ウェル溶液を含有するカバースリップ液滴又はポストに加えた。プラスチックテープをCryschemプレートの頂部に張り付けてウェルを密封した。生成成長結晶化条件が最適化されたら、生成法を使用して結晶成長を実施した。100mMMespH5.8、380mMMgCl2、220mMLiSO4及び8PEG8Kを含有する結晶化溶液1リットルを調製した。エッペンドルフ注射器ピペッターを使用してこの溶液の1mlアリコートをLinbroプレートのウェルの各々にピペット分注した。この溶液50及びG-CSF33mg/ml50を含有する混合溶液を調製し、シリコンカバースリップにピペット分注した。これらの液滴の典型量は50~100μlであり、これらの液滴の寸法が大きいため、カバースリップのめくれ上がり及び液滴のウェル懸垂に細心の注意を払った。データ収集R-AXISHouston,TXに所在のMolecularStructure,Corp.イメージングプレートデテクターで収集した2.2Åデータに対してX-PLORBruniger,X-PLORversion3.0,結晶分析システム及びNMR,NewHaveCTに所在のイエール大学を用いて構造を最適化させた。f.考察有効な組換えヒト治療剤として、r-hu-G-CSFは大量生産され、構造分析のためにグラムレベルが入手可能になっている。他の該当タンパク質が入手可能になるにつれ、本発明の結晶化方法は他の用途にも利用可能である。この方法は、大量のタンパク質>約200mgを有する任意の結晶学的プロジェクトに適用することができる。当業者に認識される通り、本発明の材料及び手法は変形可能であり、等価材料及び手法が他のタンパク質の結晶化に使用可能である。B.G-CSFの三次元構造を可視化するためのコンピュータープログラム添付図に示すような図はG-CSFの三次元構造を可視化するために有用であるが、分子を立体的観察を可能にするコンピュータープログラムが好適であると予想される。この立体観察は当業者にはバーチャルリアリティーとも呼称され、高分子構造から原子レベルまで広範囲の分解能で全角度から構造を三次元形態で可視化することができる。本発明のコンピュータープログラムにより、例えば分子を回転させることにより、分子の観察角度の透視図を変更することもできる。本発明のプログラムは更に変更に応答するので、例えば完全アミノ酸残基を含む1個以上の原子画像を削除、追加もしくは置換えることができ、又は存在する基もしくは置換された基に化学的部分を付加することができ、構造変化を可視化することができる。他のコンピューターに基づくシステムを使用することもでき、その要素は、a例えばG-CSFの三次元構造の直交座標又は他の数値帰属座標等の情報を入力するための手段と、b前記座標を表現するための手段、例えば三次元構造を観察してこのような三次元構造をアミノ酸組成等のG-CSF分子の組成と相関できるようにする視覚手段と、c任意要素として、前記三次元構造の画像が改変組成を表示するように、表現されたG-CSF分子の組成を改変する情報を入力するための手段である。使用される好適コンピュータープログラムの座標を図5に示す。好適コンピュータープログラムはSanDiego,CAに所在のBiosymの市販品InsightII,version4である。粗結晶学的構造については、回折データの観察強度F-obs及び直交座標も米国,Upton,NewYork119723に所在のProteinDataBank,ChemistryDepartment,BrookhavenNationalLaboratoryに寄託されており、参考資料として本明細書の一部とする。座標をInsightIIプログラムに入力すると、コンピュータースクリーン上に三次元G-CSF分子像を容易に表示することができる。表示に好適なコンピューターシステムはSiliconGraphics320VGXSanDiego,CAである。立体観察の際には、G-CSF分子を三次元で立体的に観察することが可能な眼鏡CrystalEyes,SiliconGraphicsを装着し、分子を回転させて分子設計を想像することができる。従って、本発明はコンピューターを用いてG-CSF類似体を設計又は製造する方法を提供し、該方法は、aG-CSF分子の部分の組成の表示、好ましくは各アミノ酸の三次元配置の表示、より好ましくはG-CSF分子の各原子の三次元位置の表示を含めてG-CSF分子の三次元構造を表示するための手段を前記コンピューターに備える段階と、b前記表示を観察する段階と、c前記分子の組成又は部分の位置の改変のための部位を前記表示上で選択する段階と、d前記改変を有するG-CSF類似体を製造する段階とを含む。改変は、終産物G-CSF類似体の所望の構造特性に基づいて選択することができ、このような設計には以下に詳述する要素を考慮する。このような要素とは、特にG-CSF分子の螺旋構造の内側の残基であって、このような残基を改変すると、分子の内部コアの全体構造が変化し、レセプター結合を妨げ得る疎水性アミノ酸残基の位置及び組成と、改変しても、G-CSF分子の全体構造には影響しない外部ループ構造の位置及び組成を含む。図2A~4は、種々の方法で全体的三次元コンフォーメーションを示す。トポロジー図、リボン図、及びバレル図はいずれもG-CSFのコンフォーメーションの特徴を示す。図2A~Gは、G-CSFと他の分子との比較を示す。アーキテクチャーは類似しているが、これらの成長因子はそのループの局所コンフォーメーション及び螺旋束の幾何学的配置が異なる。他方、アミノ酸配列の相違にも拘わらず、これらの分子の全6種間には2つの長いクロスオーバー結合を含むアップ-アップ-ダウン-ダウントポロジーが保存されている。図3は組換えヒトG-CSFの二次構造を詳細に示す。このリボン図は螺旋の向きとその相対位置を示す。図4は組換えヒトG-CSFのコンフォーメーションを別の方法で示す。このバレル図は組換えヒトG-CSFの全体的なアーキテクチャーを示す。C.M13突然変異誘発を用いた類似体の調製本実施例は、PCT出願公開第WO85/00817号Souzaら,1985年2月28日公開、参考資料として本明細書の一部とするに記載の方法に従って、1本鎖バクテリオファージM13を用いる部位特異的突然変異誘発技術を使用したG-CSF類似体の調製に関する。この方法は主に非突然変異誘発配列の1本鎖核酸鋳型を使用し、配列中に所望の改変を含むより小さいオリゴヌクレオチドを前記鋳型に結合することからなる。非同一配列をハイブリダイズさせるようなハイブリダイゼーション条件を使用し、残りの配列は最初の鋳型と同一になるように充填する。その結果、2本の鎖の一方が所望の改変を含むような2本鎖分子が生成される。この突然変異誘発した1本鎖を分離し、その相補鎖の鋳型として使用する。こうして所望の改変を含む2本鎖分子を生成する。使用した改変前のG-CSF核酸配列を図1に示し、突然変異誘発した核酸を含むオリゴヌクレオチドを表2に示す。本明細書中でアミノ酸残基及びヌクレオチドに使用した略記は慣用通りであり、Stryer,Biochemistry,第3版,W.H.FreemanandCompany,N.Y.,N.Y.1988,裏内表紙を参照されたい。改変前のG-CSF核酸配列をまず最初にベクターM13mp21に挿入した。次に改変前のG-CSF配列を含む1本鎖ファージM13mp21からのDNAを単離し、水に再懸濁した。各反応につきこのDNA200ngをリン酸化オリゴヌクレオチド1.5pmolと混合し表2、0.1MTris,0.01MMgCl2,0.005MDTT,0.1mMATPpH8.0に懸濁した。65°Cまで加熱し、室温までゆっくりと冷却することによりDNAをアニールした。冷却後、ATP、dATP、dCTP、dGTP、TTP各0.5mM、T4DNAリガーゼ1単位及び大腸菌ポリメラーゼ1のKlenowフラグメント1単位を、0.1MTris,0.025MNaCl,0.01MMgCl2,0.01MDTTpH7.5中のアニールしたDNA1単位に加えた。こうして2本鎖になった閉環状DNAをそれ以上精製せずに使用して大腸菌にトランスフェクトした。プラークをニトロセルロースフィルターで釣り上げた後、P32で末端標識した1本鎖DNAとフィルターを1時間55~60°Cでハイブリダイズさせることによりプラークをスクリーニングした。ハイブリダイゼーション後、オリゴの融点A-Tでは2°C、G-Cでは4°Cよりも0~3°C低い温度でフィルターを洗浄し、突然変異配列を含むファージを有するプラークに対応するオートラジオグラフィーシグナルを選択的に発生させた。陽性クローンを配列決定により確認した。M13突然変異誘発法により製造した各G-CSF類似体毎に使用したオリゴヌクレオチドを下表に示す。命名法は、改変前のアミノ酸の残基及び位置例えば17位リジンと、置換したアミノ酸の残基及び位置例えばアルギニン17を示す。2個以上の残基が置換されている場合には、位置を指定する上付き数字をカンマで区切るか、又はセミコロンで残基を区切る。置換でなく欠失の場合にはその旨明記した。M13に基づく突然変異誘発に使用したオリゴヌクレオチド配列を次の欄に示す。これらのオリゴヌクレオチドは合成により製造したが、その製法は限定的ではなく、任意の核酸合成法及び/又は装置を使用することができる。オリゴ長も示す。上述のように、これらのオリゴを1本鎖ファージベクターと接触させた後、単一ヌクレオチドを加え、G-CSF類似体核酸配列を完成させた。D.DNA増幅を使用したG-CSF類似体の調製本実施例は、DNA増幅技術を用いたG-CSF類似体の製造方法に関する。主に、各類似体をコードするDNAを別個の2部分として増幅して結合した後、完全配列を増幅した。改変前のG-CSFDNAのどの場所に所望の改変を加えるべきかに依存して、内部プライマーを使用して改変を組み込み、2つの別個の増幅部分を生成した。例えば、所望の類似体DNAの5’末端を増幅するためには、増幅すべき領域の一端には改変前のG-CSFDNAの上流のプラスミドの配列に相補的な5’フランキングプライマーを使用し、他方の末端をプライムするためには、改変前のDNAとハイブリダイズすることが可能でありながら所望の改変を含み得る内部プライマーを使用した。得られた増幅領域は5’フランキングプライマーから内部プライマーに及ぶ領域であっだ。改変前のG-CSFDNAの下流のプラスミドの配列に相補的な3’フランキングプライマーと所期突然変異の領域に相補的な内部プライマーを使用して3’末端も同様に処理した。内部プライマーの位置に依存して同一寸法でもよいし、同一寸法でなくてもよい2つの半部分を増幅後、2つの半部分を結合した。結合後、5’フランキングプライマーと3’フランキングプライマーを使用して所望の改変を含む完全配列を増幅した。2つ以上の改変が所望される場合には、内部プライマーに改変を組み込むように上記プロセスを変更するか、又は別の内部プライマーを使用してプロセスを繰り返す。あるいは、核酸配列に改変をもたらすための他の方法、例えば上記のようなファージに基づく突然変異誘発技術と遺伝子増幅法を併用してもよい。2つ以上の改変を有する類似体を製造する方法の例を以下に記載する。下記G-CSF類似体を生成するために使用した鋳型DNAは、図1の配列にG-CSFコーディング領域を含むプラスミドからの所定のフランキング領域を加えたものであった。これらのフランキング領域を以下に説明するように5’及び3’フランキングプライマーとして使用した。増幅反応は、10mMTris-HCl、1.5mMMgCl2、50mMKCl、0.1mg/mlゼラチンpH8.3を含有する40μl容量中で20°Cで実施した。40μl反応溶液は更に各dNTP0.1mM、各プライマー10pmol及び鋳型DNA1ngを含有するものとした。各増幅は15サイクル繰り返した。各サイクルは94°Cで0.5分間、50°Cで0.5分間、72°Cで0.75分間から構成した。フランキングプライマーは20ヌクレオチド長、内部プライマーは20~25ヌクレオチド長であった。こうして、所望のG-CSF類似体の前部又は後部をコードする2本鎖DNAの多重コピーを生成した。2つの半部分を結合するために、2つの反応物の各々の40分の1を第3のDNA増幅反応で結合した。突然変異を有するこれらの2部分の末端は相補的であるので、2部分を内部プライマー位置でアニールさせ、重合サイクル後、完全長DNA配列を得た。こうしてアニール後、5’及び3’フランキングプライマーを使用して完全類似体を増幅した。この増幅プロセスは上述のように15サイクル繰り返した。完全増幅類似体DNA配列をXbaI及びXhoI制限エンドヌクレアーゼで切断し、ベクターに挿入するための付着末端を生成した。切断したDNAをプラスミドベクターに挿入し、このベクターを使用して大腸菌を形質転換させた。形質転換細胞を50μg/mlのカナマイシンで攻撃し、30°Cでインキュベートした。G-CSF類似体タンパク質の生成を全細胞溶解物のポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。生成単離物から精製したプラスミドのDNA配列分析により所望の突然変異の存在を確認した。次に培養物を増殖させ、細胞を回収し、G-CSF類似体を以下のように精製した。下表3は遺伝子増幅を使用して製造した各類似体に使用した特定プライマーを示す。1.二重突然変異の構築G-CSF類似体Gln12.21→Glu12.21を製造するために、DNA増幅を2回別々に実施し、2つのDNA突然変異体を製造した。使用した鋳型DNAは図1の配列にG-CSFコーディング領域を含むプラスミドからの所定のフランキング領域を加えたものである。厳密な配列は下記の通りである。PerkinElmer/CetusDNA熱サイクラーを使用して2つのDNA増幅反応の各々を実施した。40μl反応混合物は、1×PCR緩衝液Cetus、4dXTPCetus各0.2mM、各プライマーオリゴヌクレオチド50pmol、プラスミドベクター上のG-CSF鋳型DNA2ng及びTaqポリメラーゼCetus1単位から構成した。増幅プロセスは30サイクル実施した。各サイクルは94°Cで1分間、50°Cで2分間、72°Cで3分間から構成した。DNA増幅Aは下記オリゴヌクレオチド:を使用した。DNA増幅Bは下記オリゴヌクレオチド:を使用した。DNA増幅A後に得られた109塩基対2本鎖DNA産物からDNA突然変異Gln12→Glu12を含む64塩基対XbaI-HindIIIDNAフラグメントを切り出し、単離した。DNA増幅B後に得られた509塩基対2本鎖DNA産物からDNA突然変異Gln21→Glu21を含む197塩基対HindIII-BsmIDNAフラグメントを切り出し、単離した。A及びBフラグメントを4.8kbpXbaI-BsmIDNAプラスミドベクターフラグメントと連結した。連結混合物は等モルDNA制限フラグメント、連結緩衝液25mMTris-HClpH7.8,10mMMgCl2,2mMDTT,0.5mMrATP及び100μg/mlBSA及びT4DNAリガーゼから構成し、14°Cで一晩インキュベートした。その後、BioRadGenePulsar装置BioRad,Richmond,CAを使用するエレクトロポレーションにより連結DNAを大腸菌FM5に形質転換した。クローンを単離し、DNA配列決定によりプラスミド構築物が2つの突然変異を含むことを確認した。この中間ベクターは更に193塩基対BsmI-BsmIDNAフラグメントを欠失していた。最終プラスミドベクターは中間ベクターから2kbpSstI-BamHIDNAフラグメント、プラスミドベクターから2.8kbpSstI-EcoRIDNAフラグメント、及びプラスミドベクターから360bpBamHI-EcoRIDNAフラグメントを切り出し、単離することにより得たDNAフラグメントの上記のような連結及び形質転換により構築した。DNA配列決定により最終構築物がG-CSF遺伝子を含むことを確認した。下記のように培養物を増殖し、細胞を回収し、G-CSF類似体を精製した。上述のように、突然変異誘発法の任意の組み合わせを使用して、1つ以上の改変を有するG-CSF類似体核酸及び発現産物を製造することができる。M13に基づく突然変異誘発及び遺伝子増幅に基づく突然変異誘発を使用した上記2例はその実例である。E.G-CSF類似体DNAの発現次にG-CSF類似体DNAをプラスミドベクターに挿入し、大腸菌株FM5ATCC53911を形質転換させるために使用した。プラスミド上及び細菌宿主細胞中に含まれる本発明のG-CSF類似体DNAは、Rockville,MDに所在のAmericanTypeCultureCollectionから入手可能であり、その受託番号は以下に示す。トリプトン10g、酵母エキス5g及びNaCl5gを含有するブロスで密度A600=0.5に達するまで1リットル培養物を30°Cで増殖させ、前記密度に達したら42°Cまで迅速に加熱した。フラスコを3時間振盪し続けた。他の原核又は真核宿主細胞も使用可能であり、例えば他の細菌細胞、株もしくは種、哺乳動物培養細胞COS、CHO又は他の型、昆虫細胞もしくは多細胞器官もしくは生物、又は植物細胞もしくは多細胞器官もしくは生物を使用することができ、当業者は適切な宿主に想到しよう。本発明のG-CSF類似体及び関連組成物は、例えば固相ペプチド合成法又は他の化学的製法により合成することもできる。他のクローニング及び発現系は当業者に自明である。F.G-CSF類似体タンパク質の精製遠心分離10,000×G,20分間,4°Cにより細胞を回収した。ペレット通常は5gを1mMDTT30mlに再懸濁し、10,000psiのフレンチプレスセルに3回通した。破壊した細胞懸濁液を10,000gで30分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを水30~40mlに再懸濁した。これを10,000×Gで30分間再遠心分離し、このペレットを2Sarkosyl及び50mMTrispH825mlに溶解させた。硫酸銅を濃度40μMまで加え、混合物を少なくとも15時間15~25°Cで撹拌した。次いで混合物を20,000×Gで30分間遠心分離した。得られた可溶化タンパク質混合物を13.3mMTrispH7.7で4倍に希釈し、Sarkosylを除去した後、20mMTrispH7.7で平衡化したDEAE-セルロースWhatmanDE-52カラムに上清を充填した。カラム充填及び同一緩衝液でカラムを洗浄後、類似体を20mMTris/NaCl下記のように類似体に依存して35mM~100mMpH7.7で溶離した。類似体のほとんどはDEAEカラムからの溶出液を50酢酸でpH5.4に調整し、必要に応じて適正な導電率を得るために5mM酢酸ナトリウムpH5.4で希釈した。次に20mM酢酸ナトリウムpH5.4で平衡化したCM-セファロースカラムに溶液を充填した。次いで280nmの吸光度がほぼ0になるまでカラムを20mMNaAcpH5.4で洗浄した。次いでG-CSF類似体を下表4に記載する濃度の酢酸ナトリウム/NaClで溶離した。CM-セファロースカラムに充填しなかった類似体のDEAEカラム溶出液を10mMNaAcpH4.0緩衝液で直接透析した。次いで精製G-CSF類似体をinvitro分析のために適宜単離した。類似体の溶離に使用した塩濃度は上述のように変化させた。DEAEセルロースカラム及びCM-セファロースカラムの濃度を下表に示す167欠失のデータは得られなかった。これらの類似体ではDEAEセルロースカラムを単独で精製に使用した。上記精製法は例示であり、当業者には自明の通り、発明のG-CSF類似体を得るために他の手段も使用可能である。G.生物アッセイ本発明のG-CSF類似体をどの方法で製造したかに関係なく、類似体の生物活性をアッセイした。3H-チミジンアッセイを実施して細胞分裂度を確認した。他の生物アッセイを使用して所望の活性を確認することもできる。マウスWEHI-3BD白血病細胞系に末端分化を誘導する能力をアッセイする等の生物アッセイによりG-CSF活性を得ることもできる。Nicolaら,Blood54:614-271979参照。生物活性を確認するために他のinvitroアッセイも使用できる。Nicola,Annu.Rev.Biochem.58:45-771989参照。一般に、生物活性試験では非改変G-CSFと比較した生物活性の増加又は低下、非改変G-CSFと比較した生物活性の相違、レセプターアフィニティー分析又は血清半減期分析等の所望の結果を分析すべきである。これらの例に止まることなく、当業者は所望の最終結果の試験に有用な他のアッセイにも想到しよう。常法を使用して3H-チミジンアッセイを実施した。雌BalbCマウスを殺して骨髄を取り出した。骨髄細胞を成長培地に短時間懸濁し、遠心分離し、再懸濁した。約10,000個の細胞を含む160μlアリコートを96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。上記のように調製した精製G-CSF類似体のサンプルを各ウェルに加え、68時間インキュベートした。3H-チミジンをウェルに加え、更に5時間インキュベートした。5時間のインキュベーション時間後、細胞を回収し、濾過し、十分に濯いだ。シンチレーション液を収容するバイアルにフィルターを加えた。β線を計数したLKBβプレートシンチレーションカウンター。標準及び類似体を3回ずつ分析し、標準曲線よりも実質的に上又は下に位置するサンプルを適正な希釈度で再アッセイした。ここに報告する結果は非改変組換えヒトG-CSF標準結果に対する3回の類似体データの平均である。H.HPLC分析類似体の精製サンプルで高圧液体クロマトグラフィーを実施した。逆相HPLCカラム上のピークの位置は2種のタンパク質間の構造類似を決定的に示すものではないが、類似の保持時間を有する類似体はHPLCカラムに対して非改変分子と同一型の疎水性相互作用を有し得る。これは全体構造の類似を示す1面である。類似体及び非改変組換えヒトG-CSFのサンプルを逆相0.46×25cmVydac214TP54カラムSeparationsGroup,Inc.Hesperia,CAで分析した。類似体がカラム中でどのように挙動したかに依存して0.1mg/ml~5mg/mlの最終濃度まで20mM酢酸及び40mMNaCl緩衝溶液pH5.2中で精製類似体G-CSFサンプルを調製した。1イソプロパノール、52.8アセトニトリル及び0.38トリフルオロ酢酸TFAを含有する水溶液で予め平衡化しておいたHPLCカラムに濃度に依存して種々の量を充填した。サンプルを0.86/分のアセトニトリル及び0.002TFAの勾配にかけた。I.結果上記生物アッセイ及びHPLC分析の結果を以下に示す。生物活性は3回のデータの平均であり、対照標準非改変G-CSFの百分率として示す。相対HPLCピーク位置は対照標準非改変G-CSFピークに対する類似体G-CSFの位置である。又は-の記号は、類似体HPLCピークが対照標準ピークよりも何分先又は後に現れるかを示す。変異体の全部について相対HPLCピークを分析した訳ではなく、分析したもののみを下表に示す。上記のように調製した本発明の類似体をコードする核酸を含む大腸菌宿主細胞のAmericanTypeCollection番号も示す。1.構造-機能関係の確認本発明の類似体を設計するために使用した第1段階は、G-CSF分子の構造完全性にどの部分が必要であるかを決定することであった。これはアミノ酸残基レベルで実施したが、原子レベルも分析に利用できる。構造完全性に必要な残基を修飾すると、G-CSF分子の全体構造が変化する。これは製造しようとする類似体に依存して望ましい場合と望ましくない場合がある。本実施例は、G-CSFレセプター本項で以下に記載するG-CSFレセプターは造血細胞に存在する天然G-CSFレセプターを意味するへの類似体のG-CSFレセプター結合を維持する目的で、G-CSF分子の全体構造完全性を維持するように設計した。G-CSFレセプター結合は上記生物アッセイにより決定されるような少なくとも1種の生物活性に必要な段階であると仮定され、本試験により確認された。図面に示すように、G-CSFここでは組換えヒトmet-G-CSFは45Å×30Å×24Åの全体寸法を有する左巻き螺旋を有する逆平行4α螺旋束である。螺旋束内の4つの螺旋は螺旋A、B、C及びDと呼称され、その結合ループはAB、BC及びCDループとして知られる。螺旋交差角度は-167.5°~-159.4°である。螺旋A、B及びCは直鎖であり、螺旋Dは組換えヒトmet-G-CSFのGly150及びSer160に2種の構造特徴を含む。全体としてG-CSF分子は外部ループにより直列に結合された4つの螺旋からなる束である。この構造情報を公知機能情報と相関させた。1位メチオニンを含む残基47、23、24、20、21、44、53、113、110、28及び114を修飾することができ、生物活性に及ぼす作用は相当のものであることが判明した。生物活性を低下させた単一突然変異の多くは30Åの間隔で4螺旋束の異なった面に位置するG-CSFの2つの領域の周囲に集中していた。一方の領域はA螺旋とD螺旋の相互作用をもたらす。これは更に下記非改変分子における塩橋の存在により確認される。ここに報告する距離は図5A~FFFに示すような分子Aの距離である3つのG-CSF分子は共に結晶化し、A、B及びCと命名した。螺旋A及びDの間には塩橋ウェブが存在し、螺旋A構造を安定化させるように機能するので、G-CSF分子の全体構造に影響する。残基Glu20、Arg23及びLys24の周囲の領域はA螺旋の親水性面残基20~37に存在する。20及び23位の非帯電アラニン残基で残基を置換すると、類似のHPLC保持時間が得られ、構造の類似性が予想される。本アッセイにより示されるようにこれらの部位を改変すると、生物活性が変化した。Lys24を置換した場合には生物活性は変化したが、他の2種の改変のように類似のHPLC保持時間は得られなかった。改変により生物活性が低下した第2の部位はAB螺旋である。47位のグルタミンをアラニンで置換する上記類似体19と、チミジン取り込みアッセイにおいて生物活性がゼロに低下した。AB螺旋はアミノ及びカルボキシ末端を除いて主に疎水性であり、310螺旋1回転を含む。各末端には2個のヒスチジンHis44及びHis56と、His44との塩架橋を形成することが可能な残基46の付加的グルタミンとが存在する。類似体のフーリエ変換赤外スペクトログラフィー分析FTIRによると、この類似体は非改変組換えG-CSF分子に構造的に類似する。更に試験した結果、この類似体は非改変組換え分子と同一条件下では結晶化しないことが判明した。カルボキシ末端の改変Gln174、Arg167及びArg170は生物活性にほとんど影響しなかった。他方、最後の8個の残基167~175が欠失すると、生物活性は低下した。これらの結果から、欠失は全体構造を不安定にし、突然変異体がG-CSFレセプターと適正に結合するのを妨げるその結果、シグナル変換の開始を妨げると予想される。一般に、G-CSF内部コア外部ループを欠く内部4螺旋束では疎水性内部残基は構造完全性に必須である。例えば螺旋Aにおいて内部疎水性残基はメチオニンを1位としてPhe14、Cys18、Val22、Ile25、Ile32及びLeu36である。他の疎水性残基同様にmetを1位とするは螺旋BのAla72、Leu76、Leu79、Leu83、Tyr86、Leu90、Leu93であり、螺旋CのLeu104、Leu107、Val111、Ala114、Ile118、Met122であり、螺旋DのVal154、Val158、Phe161、Val164、Val168、Leu172である。本発明により製造したG-CSF類似体からの上記生物活性データによると、外部ループの改変はG-CSF全体構造にほとんど影響しない。類似体製造のための好適ループはABループ及びCDループである。ループは螺旋に比較して比較的にフレキシブルな構造である。ループは該分子のタンパク分解により分解され得る。該分子を使用する目的は生物攻撃に対する応答を発生すること、即ち好中球を選択的に刺激することであるので、G-CSFはinvivoで比較的迅速に作用する。G-CSF代謝回転も比較的迅速である。ループのフレキシビリティーはプロテアーゼが該分子と結合する手を提供し、該分子を不活性化する。プロテアーゼ分解を阻止しながら非改変G-CSFの全体構造の保持を介して生物活性を低下させないようにループを改変することができる。この現象は恐らくG-CSF分子に限定されず、図2に示すような類似の公知全体構造を有する他の分子にも共通すると思われる。例えばhGH、インターフェロンB、IL-2、GM-CSF及びIL-4の外部ループを改変しても全体構造の変化は最小に止まる。GM-CSF分子上の外部ループはG-CSF分子上に存在する外部ループほどフレキシブルではないので、GM-CSFはその広い生物活性に一致して血清寿命が長いと予想される。従って、β-シート構造から外部ループを解放することにより、G-CSFと同様にループをよりフレキシブルにし、分子をプロテアーゼ分解に対してより感受性にするその結果、回転率を増加するようにGM-CSFの外部ループを改変することができる。これらの外部ループの改変は、内部螺旋の1つ以上と結合することによりループを安定化することにより実施し得る。βシート、塩橋、ジスルフィド結合又は疎水性相互作用の形成等の結合手段が当業者に公知であり、他の手段も使用可能である。更に、1個以上のアミノ酸残基又はその部分等の1個以上の部分を欠失させ、短縮分子を製造し、こうして外部ループの所定の部分を除去することもできる。従って、外部ループ、好ましくはABループr-hu-metG-CSFのアミノ酸58~72又はCDループr-hu-met-G-CSFのアミノ酸119~145、これらのループより好ましくはないがアミノ末端アミノ酸1~10の改変により、G-CSFG-CSFレセプター結合を除去せずに生物機能を変えることができる。例えば、1例えばプロテアーゼがG-CSF分子に作用する能力を低下させることにより又は、上記のようにG-CSF分子の所定の特徴を変化させる例えば血清もしくは他の半減期を増加させるか又は抗原性を低下させるように機能する1個以上のポリエチレングリコール分子もしくは経口製剤用腸溶性コーティング等の化学修飾をG-CSF分子に加えることにより、G-CSF分子の半減期を増加させる又は例えば経口剤形を製造することもできるし、2G-CSFG-CSFレセプター輸送メカニズムを介する細胞侵入によりシグナル変換を行う別のサイトカイン又は別のタンパク質等の別のタンパク質の一部又は全部とG-CSFとを結合するなどしてハイブリッド分子を作成することもできるし、3例えば非改変G-CSF分子に比較して好中球を選択的に刺激する能力等の生物活性を増加させることができる。このような改変は上記例に限定されない。上記データから観察される別の特徴は、安定化表面相互作用が生物活性に影響し得ることである。これは類似体23と40を比較すると明白である。類似体23は28位の中性帯電アラニン残基を同位の帯電アスパラギン残基で置換したものであり、この置換の結果、本明細書に開示のチミジン取り込みアッセイにより測定されるように生物活性は50増加した。28位のアスパラギン残基は113位のアスパラギン残基との表面相互作用を有しており、両者の残基は負に帯電しているので、同様の帯電部分の排斥により所定量の不安定が存在する。他方、113位のアスパラギンを中性帯電アラニンで置換すると、本アッセイシステムでは生物活性はゼロまで低下する。このことから明らかなように、113位のアスパラギンは生物活性に重要であり、28位のアスパラギンを除去すると、113位のアスパラギンが有する作用が増加する。上記のように製造した類似体及びG-CSF構造に基づいてG-CSFレセプター結合に必要なドメインも決定した。G-CSFレセプター結合ドメインはメチオニンを1位として残基11~57A及びAB螺旋間及び100~118B及びC螺旋間に位置する。外部ループ構造を改変し、レセプター結合領域を無傷のままにすることにより、G-CSFレセプターと結合することが可能な短縮分子を製造し、好中球を選択的に刺激するためのシグナル変換を開始することもできる。生物活性に必須であり、恐らくG-CSFレセプター結合又はシグナル変換にも必須であると予想される残基を同定した。二次構造の2つの異なる領域には2つの別個の部位が位置する。ここで部位Aなる部位は、螺旋束の他の2つの構成員間の塩橋接触により限定される螺旋上に位置する。第2部位部位Bは比較的フレキシブルな螺旋AB上に位置する。AB螺旋はカルボキシ及びアミノ末端における残基の種類及び位置の理由から、局所pH変化の影響を受け易い。このフレキシブル螺旋の機能的重要性は、G-CSFレセプターとの結合時にコンフォーメンションを誘導適合できるという点にある。更に、直接突然変異及び間接相対タンパク質構造分析により確認されるように、D螺旋の延長部分もG-CSFレセプター結合ドメインである。r-hu-met-G-CSFのカルボキシ末端を欠失させると、hGHの場合と同様に活性が低下するCunninghamとWells,Science244:1081-10841989参照。類似のトポロジーを有すると予想されるIL-6及びGM-CSF等の類似構造を有するサイトカインもD螺旋のカルボキシ末端に沿ってその生物活性の中心を有するBazan,ImmunologyToday11:350-3541990参照。G-CSFとhGHとのG-CSFレセプター結合決定基の構造及び位置を比較すると、両者分子は類似のシグナル変換手段を有すると予想される。hGHでは2つの別個のG-CSFレセプター結合部位が確認されているDeVosら,Science255:306-321991。これらの結合部位の一方部位Iと呼称するは螺旋1及び2と螺旋4の間の結合領域であるhGHの螺旋1の露出面上の残基により形成される。第2の結合部位部位IIと呼称するは螺旋1と螺旋3の表面残基により形成される。G-CSFに確認されたG-CSFレセプター結合決定基はhGHに確認されると同一の相対位置に位置する。AB螺旋上の螺旋A及びB間の結合領域に位置するG-CSFレセプター結合部位部位Aは、hGHの螺旋の小部分残基38~47に報告されている位置と類似する。G-CSFのAB螺旋における単一点突然変異は、本アッセイで確認されるように生物活性を著しく低下させるので、G-CSFレセプター-リガンド界面に作用するとも思われる。G-CSFレセプターの結合は、この領域の310螺旋を不安定にし、リガンド/G-CSFレセプター複合体の結合エネルギーを改善するコンフォーメーション変化をもたらす。hGHレセプター複合体において、螺旋束の第1の螺旋はhGHレセプターを二量体化するために必要な残基を結合部位の両方に与える。G-CSFの対応する螺旋螺旋Aの突然変異分析の結果、生物活性に必要な3個の残基が確認された。これらの3個の残基のうちでGlu20及びArg24は螺旋Cに向かう螺旋束の1つの表面に位置し、非対称単位における3分子のうちの2分子に存在するArg23の側鎖は螺旋Dに向かう束の表面に向いている。これらの生物学的に重要な残基の側鎖の位置は、hGHの場合と同様にG-CSFが螺旋A及び螺旋C間の界面に沿って第2のG-CSFレセプター結合部位を有することを示す。hGH分子とは対照的に、最初の11個の残基の欠失は生物活性にほとんど影響しないので、G-CSFのアミノ末端は制限された生物機能を有する。上述のように例えば図2参照、G-CSFは他のサイトカインとトポロジー類似性を有する。構造と上記生物化学試験との相関、突然変異分析及びhGHレセプター複合体の特定残基の直接比較によると、G-CSFは2つのレセプター結合部位を有する。部位Aは螺旋A及びDの界面に沿って存在し、小さいAB螺旋中に残基を含む。部位BもA螺旋中に残基を含むが、螺旋A及びCの間の界面に沿って位置する。G-CSFとhGHとの間の生物学的に重要な残基の構造と相対位置の保存は、共通のシグナル変換方法でレセプターが2地点で結合されることを示す1つの指標である。従って、G-CSFレセプター結合部位残基20~57及び145~175のいずれか一方の改変により、改変G-CSFレセプター結合ドメインを有するG-CSF類似体を製造できるとみなされる。G-CSFタンパク質の三次元構造の知見と組成の相関により、G-CSF類似体の体系的合理的製造方法が可能になる。上記実施例から明らかなように、構造のコア内の側鎖の寸法及び極性の制限は、全体構造が変化する前に分子がどの程度の変化に耐え得るかを決定する。"