"ビフィドバクテリウムロンガム菌由来の分泌シグナルペプチドをコードするDNA。配列番号6~28の塩基配列またはその配列の1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列のいずれかで示されるDNA配列を含む、請求項1に記載の分泌シグナルペプチドをコードするDNA。請求項1または2に記載のDNAでコードされる分泌シグナルペプチド。本発明の課題は、形質転換嫌気性菌作製用の形質転換用プラスミドであって、嫌気性菌で機能する分泌シグナルを具有し、しかも、当該嫌気性菌以外の菌で機能する複製開始点を有しない非シャトルプラスミド、該形質転換用プラスミドで形質転換された形質転換嫌気性菌、該形質転換嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、及び該形質転換嫌気性菌を含有する嫌気的疾患治療剤を提供することにある。また、本発明の他の課題は、該形質転換用プラスミドで形質転換された形質転換嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、及び該耐性菌を含有する嫌気的疾患治療剤を提供することにある。さらにまた、本発明の他の課題は、例えばビフィドバクテリウムロンガム105Aなどにおいても機能を発揮する、新規の分泌シグナルを提供することにある。本発明者らは、先に、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質の中のCDを発現する遺伝子を組み込んだプラスミドのpBLES100-S-eCD、pAV001-HU-eCD-M968などを作製した。そして、これを用いて組換えた偏性嫌気性菌、例えば、ビフィドバクテリウムロンガム105A/pBLES100-S-eCD、ビフィドバクテリウムロンガム105A/pAV001-HU-eCD-M968などが有用な悪性腫瘍の治療剤として期待できることを見出し、報告した。特許文献7、8上記特許文献7、8の形質転換菌の作製に用いられたプラスミドのpBLES100-S-eCDやpAV001-HU-eCD-M968は、いずれも大腸菌-ビフィズス菌のシャトルプラスミドであることから、これが大腸菌に水平伝達した場合、当該大腸菌で複製されるというおそれがあった。しかし、形質転換遺伝子輸送担体を用いる固形腫瘍の治療方法においては、用いる遺伝子輸送担体の形質転換遺伝子が、当該遺伝子輸送担体以外の、病原性菌または好気性若しくは通性嫌気性菌に水平伝達しないこと、さらに、例え水平伝達したとしても、その菌で複製されないことが極めて重要である。このことから、形質転換菌以外の菌で機能する複製開始点を有しない、すなわち、形質転換菌以外の菌とで相互複製することのない非シャトルプラスミドであることが求められる。そこで本発明者らは、当該課題を解決すべくプラスミドの改良を行い、大腸菌で機能する複製開始点を具有しない非シャトルプラスミドのpBifiCDを開発した。特許文献9一方、これらのプラスミドは何れも、分泌シグナルを具有していない形質転換用プラスミドであるため、これを用いて組換えた形質転換菌は発現したCDを菌体外に分泌せず、CDの発現量がCD酵素活性、すなわち薬効に直接反映しないという問題が依然として残っていた。さらに、CDのようなプロドラッグを抗腫瘍物質に変換する酵素ではなく、抗腫瘍性タンパク質や核酸などを産生する菌の場合には、産生した抗腫瘍物質を菌体外に放出させることが必要となり、そのためには嫌気的疾患組織で増殖した後、菌を殺破壊することが必要であった。このことから、偏性嫌気性菌、特にビフィズス菌で機能する分泌シグナルを具有した形質転換用プラスミドがより好ましいとの結論に至った。そして、鋭意研究を続けた結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、[1]形質転換嫌気性菌作製用のプラスミドであって、嫌気性菌で機能する分泌シグナルを含む発現カセットを具有し、且つ、非シャトルプラスミドである形質転換用プラスミド、[2]嫌気性菌が、ビフィズス菌である、[1]に記載のプラスミド、[3]分泌シグナルペプチドが、ビフィズス菌由来である、[1]または[2]に記載の形質転換用プラスミド、[4]分泌シグナルペプチドが、ビフィドバクテリウムロンガム菌由来である、[3]に記載の形質転換プラスミド、[5]分泌シグナルが、配列番号6~28の塩基配列またはその配列の1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列のいずれかで示されるDNAである、[1]~[4]のいずれかに記載の形質転換用プラスミド、[6]分泌シグナルが、配列番号6、7、8、9、12、14、15、17、21、25若しくは28の塩基配列またはその配列の1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列である、[5]に記載の形質転換用プラスミド、[7]分泌シグナルが、配列番号8若しくは25の塩基配列のいずれかで示されるDNAまたはその一塩基変異多型である、[6]に記載の形質転換用プラスミド、[8]発現カセットに含まれるプロモーターをコードする遺伝子が、配列番号29~44のプロモーター領域の塩基配列若しくは配列番号45の塩基配列またはその配列の1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列のいずれかで示されるDNAである、[1]~[7]のいずれかに記載の形質転換用プラスミド、[9]発現カセットに含まれるプロモーター遺伝子が、配列番号35のプロモーター領域の塩基配列もしくは45の塩基配列またはその配列の1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列である、[8]に記載の形質転換用プラスミド、[10]発現カセットに含まれるターミネーター遺伝子が、配列番号46の塩基配列またはその配列の1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるDNAである、[1]~[9]のいずれかに記載の形質転換用プラスミド、[11]発現カセットに含まれる標的遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子である、[1]~[10]のいずれかに記載の形質転換用プラスミド、[12]発現カセットに含まれる標的遺伝子が、抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードする遺伝子である、[1]~[10]のいずれかに記載の形質転換用プラスミド、[13]抗腫瘍活性を有する蛋白質が、インターフェロンIFN-α、IFN-β、IFN-γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、インターロイキンIL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、腫瘍壊死因子TNF-α、リンホトキシンLT-β、TNF関連アポトーシス誘発リガンドTRAIL、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF、マクロファージ遊走阻止因子MIF、白血病阻止因子LIF、T細胞活性化共刺激因子B7CD80及びB7-2CD86、キットリガンド、オンコスタチンM等のサイトカインおよび、エンドスタチン、アンジオスタチン、クリングル-1、クリングル-2、クリングル-3、クリングル-4、クリングル-5等の血管新生抑制物質からなる群から選ばれる一種である、[12]に記載の形質転換用プラスミド、[14]抗腫瘍活性を有する蛋白質が、腫瘍壊死因子TNF-αまたはTNF関連アポトーシス誘発リガンドTRAILのいずれかである、[13]に記載の形質転換用プラスミド、[15]標的遺伝子が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子である、[1]~[10]のいずれかに記載の形質転換用プラスミド、[16]抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質がシトシンデアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ-グルクロニダーゼからなる群から選ばれる一種である、[15]に記載の形質転換用プラスミド、[17]標的遺伝子が、虚血性疾患治療活性を有する蛋白質をコードする遺伝子である、[1]~[10]のいずれかに記載の形質転換用プラスミド、[18]虚血性疾患治療活性を有する蛋白質が、線維芽細胞増殖因子2FGF2、内皮細胞増殖因子ECGF、血管内皮増殖因子VEGF、肝実質細胞増殖因子HGFなどの血管新生促進活性を有する蛋白質からなる群から選ばれる一種である、[17]に記載の形質転換用プラスミド、[19]標的遺伝子が、嫌気的疾患の治療活性を有する核酸である、[1]~[10]のいずれかに記載の形質転換用プラスミド、[20]嫌気的疾患の治療活性を有する核酸が、線維芽細胞増殖因子2FGF2、内皮細胞増殖因子ECGF、血管内皮増殖因子VEGFおよび肝実質細胞増殖因子HGFなどからなる群から選ばれる少なくとも1種の腫瘍細胞増殖因子に関与するsiRNAsである、[19]に記載の形質転換用プラスミド、[21]配列番号5の塩基配列またはその配列の1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列のいずれかで示されるDNA配列を含む、[1]~[20]のいずれかに記載の形質転換用プラスミドpBifiSP3BTNFalpha、[22][1]~[21]のいずれかに記載の形質転換用プラスミドで形質転換された嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体、[23]嫌気性菌が、非病原性の腸内細菌である、[22]に記載の遺伝子輸送担体、[24]嫌気性菌が、ビフィズス菌である、[22]または[23]に記載の遺伝子輸送担体、[25]ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウムアドレッセンティス、ビフィドバクテリウムアングラタム、ビフィドバクテリウムアニマリス、ビフィドバクテリウムアステロイデス、ビフィドバクテリウムビフィダム、ビフィドバクテリウムボウム、ビフィドバクテリウムブレーベ、ビフィドバクテリウムカテヌラタム、ビフィドバクテリウムコエリナム、ビフィドバクテリウムコリネフォルメ、ビフィドバクテリウムクニクリ、ビフィドバクテリウムデンティコレンス、ビフィドバクテリウムデンティウム、ビフィドバクテリウムガリクム、ビフィドバクテリウムガリナラム、ビフィドバクテリウムグロボサム、ビフィドバクテリウムインディクム、ビフィドバクテリウムインファンティス、ビフィドバクテリウムイノピナタム、ビフィドバクテリウムラクティス、ビフィドバクテリウムラクテンティス、ビフィドバクテリウムリベロラム、ビフィドバクテリウムロンガム、ビフィドバクテリウムマグナム、ビフィドバクテリウムメリシクム、ビフィドバクテリウムミニマム、ビフィドバクテリウムモンゴリエンス、ビフィドバクテリウムパルブロラム、ビフィドバクテリウムシュードカテヌラタム、ビフィドバクテリウムシュードロンガム、ビフィドバクテリウムサイクラエロフィラム、ビフィドバクテリウムプロラム、ビフィドバクテリウムルミナレ、ビフィドバクテリウムルミナンチウム、ビフィドバクテリウムサエクラレ、ビフィドバクテリウムスカルドヴィ、ビフィドバクテリウムサブタイル、ビフィドバクテリウムスイス、ビフィドバクテリウムテルマシドフィラム、およびビフィドバクテリウムサーモフィラムからなる群より選ばれる1種である、[24]に記載の遺伝子輸送担体、[26]ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウムロンガムである、[25]に記載の遺伝子輸送担体、[27]嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、少なくとも1種の、嫌気的疾患の診断若しくは治療に有用な、蛋白質または核酸を発現し、分泌することができる、[22]~[26]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体、[28]嫌気的疾患の診断に有用な蛋白質が、蛍光蛋白質である、[27]に記載の遺伝子輸送担体、[29]嫌気的疾患の治療に有用な蛋白質が、抗腫瘍活性を有する蛋白質である、[27]記載の遺伝子輸送担体、[30]抗腫瘍活性を有する蛋白質が、インターフェロンIFN-α、IFN-β、IFN-γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、インターロイキンIL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、腫瘍壊死因子TNF-α、リンホトキシンLT-β、TNF関連アポトーシス誘発リガンドTRAIL、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF、マクロファージ遊走阻止因子MIF、白血病阻止因子LIF、T細胞活性化共刺激因子B7CD80及びB7-2CD86、キットリガンド、オンコスタチンM等のサイトカインおよび、エンドスタチン、アンジオスタチン、クリングル-1、クリングル-2、クリングル-3、クリングル-4、クリングル-5等の血管新生抑制物質からなる群から選ばれる一種である、[28]に記載の遺伝子輸送担体、[31]嫌気的疾患の治療に有用な蛋白質が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、[27]に記載の遺伝子輸送担体、[32]抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質がシトシンデアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ-グルクロニダーゼからなる群から選ばれる一種である、[31]に記載の遺伝子輸送担体、[33]嫌気的疾患の治療に有用な核酸が、嫌気的疾患因子に関与するsiRNAsである、[27]に記載の遺伝子輸送担体、[34]嫌気的疾患因子に関与するsiRNAsが、線維芽細胞増殖因子2FGF2、内皮細胞増殖因子ECGF、血管内皮増殖因子VEGFおよび肝実質細胞増殖因子HGFなどからなる群から選ばれる少なくとも1種の腫瘍細胞増殖因子に関与するsiRNAsである、[33]に記載の遺伝子輸送担体、[35][22]~[34]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、[36]ビフィドバクテリウムロンガム菌由来の分泌シグナルペプチドをコードするDNA、[37]配列番号6~28の塩基配列またはその配列の1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列のいずれかで示されるDNA配列を含む、[36]に記載の分泌シグナルペプチドをコードするDNA、[38][36]または[37]に記載のDNAでコードされる分泌シグナルペプチド、[39][36]または[37]に記載のDNAを含む、形質転換用プラスミド、[40]さらに、嫌気的疾患の診断または治療に有用なタンパク質または核酸をコードするDNAを含む、[39]に記載の形質転換用プラスミド、[41]嫌気的疾患の診断に有用な蛋白質が、蛍光蛋白質である、[40]に記載の形質転換用プラスミド、[42]嫌気的疾患の治療に有用な蛋白質が、抗腫瘍活性を有する蛋白質である、[40]記載の形質転換用プラスミド、[43]抗腫瘍活性を有する蛋白質が、インターフェロンIFN-α、IFN-β、IFN-γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、インターロイキンIL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、腫瘍壊死因子TNF-α、リンホトキシンLT-β、TNF関連アポトーシス誘発リガンドTRAIL、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF、マクロファージ遊走阻止因子MIF、白血病阻止因子LIF、T細胞活性化共刺激因子B7CD80及びB7-2CD86、キットリガンド、オンコスタチンM等のサイトカインおよび、エンドスタチン、アンジオスタチン、クリングル-1、クリングル-2、クリングル-3、クリングル-4、クリングル-5等の血管新生抑制物質からなる群から選ばれる一種である、[42]に記載の形質転換用プラスミド、[44]嫌気的疾患の治療に有用な蛋白質が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、[40]に記載の形質転換用プラスミド、[45]抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質がシトシンデアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ-グルクロニダーゼからなる群から選ばれる一種である、[44]に記載の形質転換用プラスミド、[46]嫌気的疾患の治療に有用な核酸が、嫌気的疾患因子に関与するsiRNAsである、[40]に記載の形質転換用プラスミド、[47]嫌気的疾患因子に関与するsiRNAsが、線維芽細胞増殖因子2FGF2、内皮細胞増殖因子ECGF、血管内皮増殖因子VEGFおよび肝実質細胞増殖因子HGFなどからなる群から選ばれる少なくとも1種の腫瘍細胞増殖因子に関与するsiRNAsである、[46]に記載の形質転換用プラスミド、[48][39]~[47]のいずれかに記載の形質転換用プラスミドで形質転換された嫌気性菌である、遺伝子輸送担体、[49]嫌気性菌が、ビフィズス菌である、[48]に記載の遺伝子輸送担体、[50]ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウムアドレッセンティス、ビフィドバクテリウムアングラタム、ビフィドバクテリウムアニマリス、ビフィドバクテリウムアステロイデス、ビフィドバクテリウムビフィダム、ビフィドバクテリウムボウム、ビフィドバクテリウムブレーベ、ビフィドバクテリウムカテヌラタム、ビフィドバクテリウムコエリナム、ビフィドバクテリウムコリネフォルメ、ビフィドバクテリウムクニクリ、ビフィドバクテリウムデンティコレンス、ビフィドバクテリウムデンティウム、ビフィドバクテリウムガリクム、ビフィドバクテリウムガリナラム、ビフィドバクテリウムグロボサム、ビフィドバクテリウムインディクム、ビフィドバクテリウムインファンティス、ビフィドバクテリウムイノピナタム、ビフィドバクテリウムラクティス、ビフィドバクテリウムラクテンティス、ビフィドバクテリウムリベロラム、ビフィドバクテリウムロンガム、ビフィドバクテリウムマグナム、ビフィドバクテリウムメリシクム、ビフィドバクテリウムミニマム、ビフィドバクテリウムモンゴリエンス、ビフィドバクテリウムパルブロラム、ビフィドバクテリウムシュードカテヌラタム、ビフィドバクテリウムシュードロンガム、ビフィドバクテリウムサイクラエロフィラム、ビフィドバクテリウムプロラム、ビフィドバクテリウムルミナレ、ビフィドバクテリウムルミナンチウム、ビフィドバクテリウムサエクラレ、ビフィドバクテリウムスカルドヴィ、ビフィドバクテリウムサブタイル、ビフィドバクテリウムスイス、ビフィドバクテリウムテルマシドフィラム、およびビフィドバクテリウムサーモフィラムからなる群より選ばれる1種である、[49]に記載の遺伝子輸送担体、[51]ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウムロンガムである、[50]に記載の遺伝子輸送担体、[52][48]~[51]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する、医薬組成物に関する。本発明のプラスミドは、分泌シグナルを有する発現カセットを具有し、かつ非シャトルプラスミドである、固形腫瘍等の嫌気的疾患治療用形質転換嫌気性菌作製に有用な新規プラスミドである。本発明のプラスミドは、形質転換菌以外の菌で機能する複製開始点を具有せず、形質転換菌以外の菌とで相互複製することのない非シャトルプラスミドであるため、極めて安全なベクターである。そして、本発明の形質転換用プラスミドで形質転換した嫌気性菌は、嫌気的疾患組織特異的に生着、増殖し、当該疾患組織において、嫌気的疾患の治療活性を有する蛋白質または核酸を産生、分泌させることができ、嫌気的疾患治療剤として極めて有用で、高品質の遺伝子輸送担体として期待できる。さらに、本発明の新規な分泌シグナルは、上記のように、プラスミドに挿入すること以外に、これを直接嫌気性菌のゲノムに組み込むことによって、嫌気的疾患治療用として有用な、形質転換嫌気性菌を作製することもできる。本願明細書において非シャトルプラスミドとは、形質転換対象の嫌気性菌で機能する複製開始点のみを具有し、それ以外の菌で機能する複製開始点を具有せず、形質転換嫌気性菌と形質転換嫌気性菌以外の菌とで相互複製することのないプラスミドを意味する。本願明細書において分泌シグナルとは、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるDNA断片を意味する。本願明細書においては、抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするDNA、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするDNA、および、虚血性疾患治療活性を有する蛋白質をコードするDNAなどを、目的蛋白質をコードするDNAという場合もある。本願明細書においてsiRNAsとは、小型干渉RNAsmallinterferingRNAまたは短鎖干渉RNAshortinterferingRNAと呼ばれるsiRNAおよび、標的細胞内でダイサーDicerなどの酵素によって切断されてsiRNAになる短鎖ヘアピンRNAshorthairpinRNA、shRNAのいずれも含むものを意味する。また、siRNA修飾体およびsiRNA複合体を含めて総称するときもある。本願明細書において発現カセットとは、プロモーター、発現蛋白質をコードする遺伝子標的遺伝子、ターミネーターなどの発現ユニットを含み、さらに任意に他の有用なユニットを含んでもよい、特定の蛋白質またはペプチド断片を発現させるための遺伝子のセットをいう。他の有用なユニットとしては、例えば分泌シグナルなどのシグナルペプチドをコードする遺伝子、標識蛋白質をコードする遺伝子などが挙げられる。本発明は、形質転換嫌気性菌作製用のプラスミドであって、嫌気性菌で機能する分泌シグナルを含む発現カセットを具有し、且つ、非シャトルプラスミドである形質転換用プラスミドに関する。固形腫瘍や虚血性疾患等の疾患部位が嫌気的環境下にある疾患以下、嫌気的疾患というの治療に用いる形質転換遺伝子輸送担体としては、安全性の観点から非病原性であることが求められる。さらに、嫌気的状態にある疾患組織等だけにおいて生着、増殖し、嫌気的状態ではない正常な組織では生着、増殖しない偏性嫌気性菌であることがより好ましい。本発明者らは先に、偏性嫌気性菌のビフィズス菌を用いる悪性腫瘍の治療方法について研究を重ね、プロドラッグの5-FCを抗腫瘍物質の5-FUに変換する酵素のCDの遺伝子を組み込んだプラスミドで形質転換したビフィドバクテリウムロンガム105Aを開発した。特許文献7、8これらの形質転換ビフィズス菌は、嫌気的疾患の固形腫瘍モデル動物に静脈内投与した場合、低酸素状態にある嫌気的疾患組織特異的に生着、増殖し、低酸素状態にない正常組織では速やかに消失することが確認されている。非特許文献1、2参照しかしながら、上記特許文献7、8の形質転換ビフィズス菌は、大腸菌-ビフィズス菌のシャトルプラスミドのpBLES100-S-eCDやpAV001-HU-eCD-M968などを用いて形質転換されていることから、大腸菌に水平伝達した場合、その大腸菌で複製されるというおそれがあった。そこで本発明者らは、当該課題を解決すべくプラスミドの改良を行い、大腸菌で機能する複製開始点を具有しない非シャトルプラスミドのpBifiCDを開発した。特許文献9これらの形質転換菌を用いる悪性腫瘍の治療方法、すなわち、酵素-プロドラッグ療法CD-5-FC療法においては、抗腫瘍物質の5-FUの副作用をできる限り抑えるために、抗腫瘍物質の5-FUが腫瘍組織特異的に作用することが望ましいことから、本発明者らは、産生したCDを菌体外に分泌することなく、菌体内に取り込まれた5-FCを5-FUに変換して菌体外に排出して、5-FUの抗腫瘍作用を腫瘍組織のみで発揮するように、これらの形質転換ビフィズス菌をいずれも分泌シグナルを具有していないプラスミドで形質転換した。これらの分泌シグナルを具有していないプラスミドで形質転換したビフィズス菌は、低酸素状態にある嫌気的疾患組織特異的に生着、増殖するという特長と、酵素のCDが嫌気的疾患組織特異的に生着、増殖した菌の内部に留まるという特長の両面から、抗腫瘍物質の5-FUの全身的な副作用を解消できるという利点を有していたが、その一方で、5-FUの生成量が、形質転換ビフィズス菌が産生するCD量ではなく、菌体内に取り込まれる5-FC量と相関し、産生したCDの酵素機能が十分に発揮されないという問題点も同時に見出した。さらには、CDのようなプロドラッグを抗腫瘍物質に変換する酵素ではなく、抗腫瘍性タンパク質や核酸などを産生する菌の場合には、産生した抗腫瘍物質を菌体外に放出させるために、嫌気的疾患組織で増殖した後、菌を殺破壊することが必要であった。これらの問題点の解決のため、嫌気性菌、好ましくは非病原性の偏性嫌気性菌で機能し、産生した活性物質を分泌させるための分泌シグナルを具有するプラスミドの開発に着手し、当該プラスミド作製に有用な、少なくとも嫌気性菌で機能し、優れた発現蛋白質の分泌作用を示す、分泌シグナルペプチドの開発を行った。また、形質転換遺伝子輸送担体を用いる固形腫瘍等の治療方法においては、上記のとおり、用いる遺伝子輸送担体の形質転換遺伝子が、当該遺伝子輸送担体以外の、病原性菌または好気性若しくは通性嫌気性菌に水平伝達しないこと、さらに、例え水平伝達したとしても、その菌で複製されないことも極めて重要である。従って、上記、分泌シグナルを具有するプラスミドについては、形質転換菌以外の菌で機能する複製開始点を有しない非シャトルプラスミドであることが好ましい。本発明のプラスミドは、形質転換嫌気性菌作製用のプラスミドであって、少なくとも嫌気性菌で機能する分泌シグナルを含む発現カセットを具有するプラスミドである。しかも、形質転換菌以外の菌で機能する複製開始点を具有せず、形質転換菌以外の菌とで相互複製しない非シャトルプラスミドである。より具体的には、少なくともビフィズス菌で機能し、優れた分泌作用を示す分泌シグナルを有する発現カセットを具有しており、且つ、形質転換菌以外の菌で機能する複製開始点を具有せず、形質転換菌以外の菌とで相互複製することのない、形質転換嫌気性菌作製用のプラスミドである。本発明の形質転換用プラスミドは、これを用いることにより、任意の目的蛋白質または核酸を発現し、さらに発現カセットに含まれる分泌シグナルペプチドの働きにより、優れた、実用性の高い分泌機能を発揮することができる形質転換嫌気性菌を作製できるという点に特徴を有するものである。さらに本発明の形質転換用プラスミドは、形質転換菌以外の菌で機能する複製開始点を具有せず、形質転換菌以外の菌とで相互複製することのない、非シャトルプラスミドベクターであるという点に特徴を有するものである。これまでに、嫌気性菌、特にビフィズス菌で機能するシグナルペプチドとして、例えば、ビフィドバクテリウムアドレッセンティスのアミラーゼやビフィドバクテリウムブレーベのSec1、Sec2、Sec3などが報告されており、それらの分泌シグナルを導入したプラスミドも報告されている。しかしながら、これらのプラスミドで形質転換したビフィズス菌は目的タンパクの分泌量が少ないものと推測された。しかも、当該ビフィドバクテリウムアドレッセンティスのアミラーゼの分泌シグナルおよびプロモーター領域をクローニングし、これらと、UV最適化緑色蛍光タンパク質変異体GFPuv;CLONTECHLaboratoriesIncをコードする遺伝子を組み合わせたプラスミドを作製し、そのプラスミドを用いて形質転換したビフィドバクテリウムロンガム菌について、発現蛋白質GFPの分泌機能を確認したところ、GFPの分泌機能を示さず、この分泌シグナルペプチドは任意の目的タンパク質を分泌できるものではないものと推定された。さらに、これまでに報告されている発現蛋白質を菌体外に分泌する形質転換嫌気性菌作製用のプラスミドベクターは、大腸菌由来のプラスミドと形質転換菌由来のプラスミドを融合した、大腸菌と形質転換菌との双方で機能するシャトルベクターであり、大腸菌以外の形質転換菌のみで機能する形質転換用プラスミドは報告されていない。本発明の形質転換用プラスミドが具有する、嫌気性菌で機能する分泌シグナルペプチドは、少なくとも嫌気性菌で機能する分泌シグナルペプチドであればいかなるものでも用いることができるが、好ましくはビフィズス菌で機能するものである。形質転換菌への毒性や機能性の観点から、ビフィズス菌由来の分泌シグナルペプチドがより好ましく、ビフィドバクテリウムロンガム菌由来の分泌シグナルペプチドがさらに好ましい。ビフィドバクテリウムロンガム菌由来の分泌シグナルペプチドとしては、例えば、配列番号6~28のいずれかの塩基配列またはその1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるDNAによってコードされる分泌シグナルペプチドなどを例示することができる。これらの中で、分泌機能の高さから、配列番号6、7、8、9、12、14、15、17、21、25または28のいずれかの塩基配列またはその1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるDNAでコードされる分泌シグナルペプチドが好ましく、配列番号8または25のいずれかの塩基配列またはその1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるDNAでコードされる分泌シグナルペプチドが最も好ましい。また、本発明の形質転換用プラスミドが具有する、発現カセット中のプロモーターとしては、嫌気性菌で機能し、分泌シグナルペプチドのプロモーターとして機能するものであればいかなるものでもよく、例えば、ビフィズス菌由来の分泌シグナルペプチドの上流に隣接しているプロモーターpromoterXまたはビフィズス菌で機能するヒストン様DNA結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターHUpromoterなどが挙げられる。具体的には、配列番号29~44のいずれかで示される塩基配列のプロモーター領域のDNAおよび配列番号45で示される塩基配列またはその1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列のDNAでコードされるプロモーターが挙げられる。これらの中で、配列番号35で示される塩基配列のプロモーター領域のDNA若しくはその一塩基変異多型でコードされるプロモーターまたはHUプロモーターが好ましく、HUプロモーターがより好ましく、配列番号45の塩基配列またはその1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるDNAでコードされるプロモーターが最も好ましい。さらに、本発明の形質転換用プラスミドが具有するターミネーターとしては、ビフィズス菌で機能し、分泌シグナルペプチドのターミネーターとして機能するものであればいかなるものでもよいが、ビフィズス菌で機能するヒストン様DNA結合蛋白質をコードする遺伝子のターミネーターHUterminatorが好ましく、特に、配列番号46の塩基配列またはその1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるDNAが最も好ましい。なお、本発明で言う一塩基変異体とは、少なくとも1箇所の塩基が変異した一塩基変異多型以下、SNPというを意味し、1箇所のみでのSNPだけでなく、複数個所でのSNPを含む。したがって、1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列と相互に置き換え可能である。本発明の形質転換用プラスミドが具有する分泌させる目的の蛋白質または核酸をコードする遺伝子すなわち標的遺伝子としては、例えば、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、虚血性疾患治療活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子などの遺伝子であれば、いかなるものでも用いることができる。蛍光蛋白質としては、各種の緑色蛍光蛋白質GFP、赤色蛍光タンパク質RFPなどを挙げることができる。また、抗腫瘍活性を有する蛋白質としては、例えばサイトカインが挙げられ、具体的なサイトカインとしては、例えば、インターフェロンIFN-α、β、γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、インターロイキンIL-1α、1β、2、3、4、6、7、10、12、13、15、18、腫瘍壊死因子TNF-α、リンホトキシンLT-β、TNF関連アポトーシス誘発リガンドTRAIL、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF、マクロファージ遊走阻止因子MIF、白血病阻止因子LIF、T細胞活性化共刺激因子B7CD80及びB7-2CD86、キットリガンド、オンコスタチンM等が挙げられる。また、エンドスタチン、アンジオスタチン、クリングル-1、2、3、4、5等の血管新生抑制物質も挙げられる。抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質としては、5-フルオロシトシン以下、5-FCというを抗腫瘍活性物質の5-フルオロウラシル以下、5-FUというに変換する酵素のシトシンデアミナーゼ以下、CDというや、5-アジリジノ-2,4-ジニトロベンズアミド以下、CB1945というを抗腫瘍活性アルキル化剤に変換する酵素のニトロリダクターゼや、ガンシクロビルを抗腫瘍活性代謝物に変換する酵素の単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ以下、HSV1-TKというや、グルクロン酸抱合抗腫瘍活性物質を抗腫瘍活性物質に変換する酵素のβ-グルクロニダーゼなどを挙げることができる。さらに、虚血性疾患治療活性を有する蛋白質としては、虚血性疾患治療に有用な血管新生促進活性を有する蛋白質挙げることができ、具体的には、線維芽細胞増殖因子2FGF2、内皮細胞増殖因子ECGF、血管内皮増殖因子VEGF、肝実質細胞増殖因子HGFなどを挙げることができる。これらの蛋白質の配列は様々な生物において知られており、その配列情報に基づいてPCR法や人工遺伝子合成等の公知の手法を利用することにより、目的の蛋白質をコードするDNAを入手することができる。また、嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する核酸としては、嫌気的疾患因子に関与するsiRNAsを挙げることができ、より具体的には、線維芽細胞増殖因子2FGF2、内皮細胞増殖因子ECGF、血管内皮増殖因子VEGFおよび肝実質細胞増殖因子HGFなどの腫瘍細胞増殖因子に関与するsiRNAsを挙げることができる。同様に、これらの核酸の配列も知られており、その配列情報に基づいてPCR法等の公知の手法を利用することにより、入手することができる。本発明のプラスミドは、例えば、以下のようにして作製することができる。例えば、通常の手法に従って、形質転換菌と形質転換菌以外の菌、例えば大腸菌でそれぞれ機能する複製開始点を有するシャトルプラスミドに、少なくともビフィズス菌で機能する分泌シグナルおよびそのプロモーター遺伝子と、その下流に、少なくとも1種の、所望の嫌気的疾患の診断または治療に有用な蛋白質をコードする遺伝子または核酸標的遺伝子と、さらにその下流に、嫌気性菌で機能するターミネーター遺伝子を挿入する事により、シャトルプラスミドを作製することができる。さらに、所望に応じて、このシャトルプラスミドから形質転換菌以外の菌の複製開始点を除去することにより、非シャトルプラスミドを作製することができる。なお、各工程における操作は、文献記載等の公知の方法に準じて行うことができる。本発明の嫌気的疾患治療用遺伝子輸送担体は、形質転換する任意の嫌気性菌を、上記本発明の形質転換用プラスミドを用いて、遺伝子工学分野の公知の方法にしたがって形質転換する事により作製することができる。本発明の形質転換用プラスミドで形質転換された嫌気性菌は、固形腫瘍等の嫌気的疾患の治療剤に用いるものであるから、偏性嫌気性で且つ非病原性であることが必須であり、クロストリジウムやサルモネラなどの病原性の菌であっても非病原性化したものであればよく、また、ラクトバチルスなどの通性嫌気性菌であっても偏性嫌気性に変異化したものであればよい。好ましくは非病原性の嫌気性バクテリアが挙げられ、より好ましくは非病原性の腸内細菌が挙げられ、中でも、ビフィドバクテリウム属細菌が最も好ましい。ビフィドバクテリウム属細菌としては、例えばビフィドバクテリウムアドレッセンティス、ビフィドバクテリウムアングラタム、ビフィドバクテリウムアニマリス、ビフィドバクテリウムアステロイデス、ビフィドバクテリウムビフィダム、ビフィドバクテリウムボウム、ビフィドバクテリウムブレーベ、ビフィドバクテリウムカテヌラタム、ビフィドバクテリウムコエリナム、ビフィドバクテリウムコリネフォルメ、ビフィドバクテリウムクニクリ、ビフィドバクテリウムデンティコレンス、ビフィドバクテリウムデンティウム、ビフィドバクテリウムガリクム、ビフィドバクテリウムガリナラム、ビフィドバクテリウムグロボサム、ビフィドバクテリウムインディクム、ビフィドバクテリウムインファンティス、ビフィドバクテリウムイノピナタム、ビフィドバクテリウムラクティス、ビフィドバクテリウムラクテンティス、ビフィドバクテリウムリベロラム、ビフィドバクテリウムロンガム、ビフィドバクテリウムマグナム、ビフィドバクテリウムメリシクム、ビフィドバクテリウムミニマム、ビフィドバクテリウムモンゴリエンス、ビフィドバクテリウムパルブロラム、ビフィドバクテリウムシュードカテヌラタム、ビフィドバクテリウムシュードロンガム、ビフィドバクテリウムサイクラエロフィラム、ビフィドバクテリウムプロラム、ビフィドバクテリウムルミナレ、ビフィドバクテリウムルミナンチウム、ビフィドバクテリウムサエクラレ、ビフィドバクテリウムスカルドヴィ、ビフィドバクテリウムサブタイル、ビフィドバクテリウムスイス、ビフィドバクテリウムテルマシドフィラム、ビフィドバクテリウムサーモフィラムなどが挙げられ、ビフィドバクテリウムロンガムが最も好ましい。これらの菌は、いずれも市販されているか、又は寄託機関から容易に入手することができる。例えば、ビフィドバクテリウムロンガムATCC-15707、ビフィドバクテリウムビフィダムATCC-11863、ビフィドバクテリウムインファンティスATCC-15697等は、ATCCTheAmericanTypeCultureCollectionから容易に入手することができる。また、それぞれの菌の株についても特に限定されず、例えば、ビフィドバクテリウムロンガムの株については、ビフィドバクテリウムロンガム105-A株、ビフィドバクテリウムロンガムaE-194b株、ビフィドバクテリウムロンガムbs-601株、ビフィドバクテリウムロンガムM101-2株を挙げることができ、中でもビフィドバクテリウムロンガム105-A株が好ましい。ビフィドバクテリウムブレーベの株については、例えば、ビフィドバクテリウムブレーベ標準株JCM1192、ビフィドバクテリウムブレーベaS-1株、ビフィドバクテリウムブレーベI-53-8W株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウムブレーベ標準株、ビフィドバクテリウムブレーベaS-1株が好ましい。ビフィドバクテリウムインファンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウムインファンティス標準株JCM1222、ビフィドバクテリウムインファンティスI-10-5株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウムインファンティス標準株、ビフィドバクテリウムインファンティスI-10-5株が好ましい。また、ビフィドバクテリウムラクテンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウムラクテンティス標準株JCM1210を挙げることができる。本発明の遺伝子輸送担体は、本発明の形質転換用プラスミドで形質転換された上記の嫌気性菌からなる遺伝子輸送担体であり、嫌気的環境下にある組織内で生育でき、且つ、目的とする活性を有する蛋白質を発現することができ、さらに、形質転換菌以外の、特に病原性又は好気性菌若しくは通性嫌気性菌への水平伝達のおそれのないものである。本発明の遺伝子輸送担体の作製は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル講談社、高木康敬編遺伝子操作実験法講談社、モレキュラークローニングMolecularCloningコールドスプリングハーバーラボラトリーColdSpringHarborLaboratory1982、モレキュラークローニング第2版MolecularC1oning,2nded.コールドスプリングハーバーラボラトリーColdSpringHarborLaboratory1989、メソッズインエンザイモロジーMethodsinEnzymol.,1941991、等に記載された方法に従って行うことができる。本発明の医薬組成物は、本発明の遺伝子輸送担体を含有している限り特に制限はされない。また、本発明の嫌気的疾患治療剤は、本発明の遺伝子輸送担体を含有している限り特に制限はされない。また、本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、本発明の遺伝子輸送担体の2種以上を含有していてもよい。さらに、本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、本発明の遺伝子輸送担体以外の嫌気的疾患治療効果を示す化合物を含有する医薬組成物や嫌気性疾患治療剤と組み合わせて用いることができる。また、本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、本発明の効果を妨げない限り、本発明の遺伝子輸送担体のほかに任意の成分を含有していてもよい。そのような任意成分として、例えば、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤の剤型は特に制限されないが、例えば、本発明の遺伝子輸送担体を含有する液剤あるいは固形製剤を挙げることができる。液剤は、本発明の遺伝子輸送担体の嫌気性菌の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩液若しくは補液又は医薬添加物を加えてアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。また、固形製剤は、液剤に適当な保護剤を添加してアンプル又はバイアル瓶などに充填した後凍結乾燥又はL乾燥するか、液剤に適当な保護剤を添加して凍結乾燥又はL乾燥した後これをアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤の投与方法としては、経口投与、非経口投与共に可能であるが、非経口投与が好ましく、例えば静脈注射、皮下注射、局所注入、脳室内投与等を行うことができ、静脈注射が最も好ましい。本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤の遺伝子輸送担体の投与量は、疾患部位において生育でき、且つ、有効治療量の活性蛋白質を発現するのに十分な量である限り特に制限はされないが、経済上の観点及び副作用を可能な限り回避する観点から、必要な治療効果が得られる範囲においてできる限り少ない方が好ましい。本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤における遺伝子輸送担体の投与量は、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することができる。例えば、本発明の嫌気的疾患治療剤を固形腫瘍治療剤として用いる際には、用いる嫌気性菌の菌自体が示す抗腫瘍活性、用いる嫌気性菌が産生する抗腫瘍活性を有する蛋白質等の種類、抗腫瘍物質前駆体から変換される抗腫瘍物質の有効治療量、および用いる嫌気性菌の当該活性蛋白質の産生量などによって、適宜設定する。具体的には、例えば静脈内投与の場合には、特に、菌塊による塞栓等のリスクを低減することが求められるため、できるだけ低濃度の注射用製剤を複数回に分けて分注するか、または適当な補液で希釈して持続注入することが好ましい。例えば、成人の場合、本発明の嫌気性菌の菌体を、体重1kg当たり106~1012cfuを1日1~複数回に分け、1~複数日間、連続してまたは適宜、間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明のビフィズス菌の菌体を104~1010cfu/mL含有する製剤を、成人1人あたり1~1000mLを直接、または適当な補液で希釈して、1日1~数回に分け、1~数日連続して投与する。また、疾患組織へ直接投与する局所投与の場合は、できるだけ疾患組織全体へ菌が生着、増殖することが求められるため、高濃度の注射剤を、疾患組織の複数個所に投与することが望ましい。例えば、成人の場合、本発明のビフィズス菌の菌体を、体重1kg当たり106~1012cfuを1日1~複数回、必要に応じ1~複数日間、連続してまたは適宜、間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明のビフィズス菌の菌体を104~1010cfu/mL含有する製剤を、成人1人あたり1~1000mLを直接、1日数回、必要に応じ1~数日連続して投与する。治療期間中に疾患組織中の菌が消失していることが確認された場合は、一旦治療を中断し、上記と同様にして菌を投与する。なお、本発明におけるXとYと組み合わせてなるには、XとYを別の形態としたもの、XとYを同一の形態例えばXとYを含有する形態としたもののいずれの場合も含む。また、XとYを別の形態としたものの場合、X、Yのいずれも他の成分をさらに含有している場合も含まれる。本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、嫌気的環境下にある疾患、好ましくは各種固形癌に適用できる。固形癌としては、例えば大腸癌、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、絨毛癌、結腸癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、卵巣癌、子宮癌、絨毛癌、甲状腺癌、悪性カルチノイド腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマ、扁平上皮癌などが挙げられる。また、嫌気的環境下にある他の疾患としては、虚血性疾患、例えば、心筋梗塞または閉塞性動脈硬化症や、バージャー病などの下肢虚血疾患等を挙げることができる。また、本発明は、特に上記のプラスミド、遺伝子輸送担体または医薬組成物に用いるのに有用な、新規な分泌シグナルペプチドもまた包含する。本発明者らはまず、ビフィズス菌で機能し、優れた発現蛋白質の分泌作用を示す、分泌シグナルペプチドを見出すべく、上記形質転換ビフィズス菌の親株であるビフィドバクテリウムロンガム105Aのゲノム解析を行い、分泌シグナルを有し、且つ、膜貫通領域を持たない分泌タンパク質と推測されるタンパク質を25種選び出した。25種のタンパク質の中で、分泌シグナルがプロモーターと隣接しているものが16種、分泌シグナルがプロモーターと隣接していないものが9種であった。25種のタンパク質のコード領域の塩基配列を精査して、25種の分泌タンパク質のうち、不完全なタンパク質コード配列CDSと推測される3個No17、18、20を除いた22個と、アミノ酸レベルで相同性の高い塩基配列を示す蛋白質の検索を行い、その分泌シグナルペプチドについても、検討を行った。すなわち、当該分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子と上記ビフィズス菌のヒストン様ペプチドHUのプロモーターHUpromoter遺伝子を組み合わせてクローニングし、これらと、緑色蛍光タンパク質GFPをコードする遺伝子、および、上記ビフィズス菌のヒストン様ペプチドHUのターミネーターHUterminatorを組み合わせたプラスミドを作製し、上記と同様に、そのプラスミドpSec2-GFPを用いて形質転換したビフィズス菌について、発現蛋白質GFPの分泌機能を確認したところ、優れた発現蛋白質の分泌機能を示すことを確認した。次に、上記で分泌傾向が認められた13種のプラスミドについて、GFPをコードする遺伝子に代えて別の目的タンパク質のヒトTNF-αをコードする遺伝子を挿入したプラスミドを作製し、それらのプラスミドを用いてビフィズス菌を形質転換し、その発現蛋白質分泌機能を確認した。その結果、9種のプラスミドpSP7ATNFα,pSP1BTNFα,pSP3BTNFα,pSP4BTNFα,pSP7BTNFα,pSP12BTNFα,pSP16BTNFα,pSP23BTNFα,pSec2BTNFαで分泌機能を示し、2種のプラスミドpSP3BTNFα,pSP23BTNFαで、特に優れた発現蛋白質の分泌機能を示すことを確認した。さらに、これらのプラスミドから、ビフィズス菌以外の菌で機能する複製開始点、例えば、pUCOriを取り除いたプラスミドを作製した。そして、そのプラスミドを用いて形質転換したビフィズス菌について、発現蛋白質の分泌機能を確認したところ、ビフィズス菌以外の菌で機能する複製開始点のpUCOriを取り除いたプラスミドも、同様に優れた発現蛋白質の分泌機能を発揮させ得ることを確認できた。かくして、少なくともビフィズス菌で機能し、優れた発現蛋白質の分泌作用を示す、新規な分泌シグナルペプチドを見出した。上述のように、本発明の分泌シグナルペプチドは優れた分泌活性を有し、また非病原性の偏性嫌気性菌であるビフィズス菌で機能するため、上記のプラスミド、遺伝子輸送担体または医薬組成物に用いるのに特に好適である。したがって、分泌シグナルペプチドとして本発明の新規分泌シグナルペプチドを含む、あらゆる態様の上記プラスミド、遺伝子輸送担体または医薬組成物もまた、本発明に包含される。以下、製造例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。参考例1:分泌シグナルのinSilicoスクリーニングBifidobacteriumlongum105Aの全ゲノム配列より推定した全翻訳領域のアミノ酸配列1941個に対して、PrediSiを用いたシグナルペプチド予測を行ない、188個のシグナルペプチドを推定した。予測に際しては、GramPositiveBacteriaのパラメータセットを用いた。推測した188個のシグナルペプチドのうち、膜貫通領域を持たない25個を分泌タンパク質候補として選定した。この推定分泌タンパク質コード領域を表1に示した。製造例1:分泌型GFP発現プラスミドpSPxAGFPの構築シグナルペプチド候補のプロモーターにて分泌型GFPを発現させるプラスミドを構築した。概要を図1に示す。詳細は以下のとおりである。インサート調製上記25個の分泌タンパク質候補のうち、その遺伝子がオペロンの先頭に位置する16種類表1No.1~16に関して、以下のようにプロモーター領域を含む推定シグナルペプチド部分及びその下流部分の60~90塩基をPCR法にて増幅した。翻訳開始点の300bp上流にforwardprimerを設計し、シグナルペプチドをコードするDNAの60~90bp下流にreverseprimerを設計した。Bifidobacteriumlongum105AのゲノムDNA30ngを鋳型とし、2×PhusionFlashPCRMastermixを用いてPCRを行なった。PCRのプログラムは、98°Cで10秒の後、98°Cで1秒、55°Cで5秒、72°Cで9秒を30サイクル、72°Cで1分とした。各シグナルペプチドのPCRプライマーを表2.1に示した。各プライマーの5’側の15塩基は、以下に示すベクターと相同な配列を有する。PCR産物の一部を2アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りを用いて解析を行い、推定されるサイズのシングルバンドである事を確認した。シングルバンドでない場合には、アニーリング温度を55°Cから60°Cに変更して再度PCRを行なった。PCR産物をPCR産物精製キットを用いて精製し、精製PCR産物量を吸光光度計にて定量した。この自身のプロモーター領域を含むシグナルペプチド断片を、シグナルペプチドxASPxAx=1~16とした。ベクター調製SPxAクローニング用ベクターを以下のように調製した。調製の概要を図1に示す。プラスミドpAmyBGFPuvベクターを、BamHI及びEco147I何れもFermentasにて完全分解した。反応条件は、酵素の使用説明書に従った。消化後のプラスミドを、0.8精製用アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入り電気泳動にて分離し、約4.2kbpのLargefragmentを切り出し、ゲルからのDNA抽出キットQIAquickGelExtractionKitQIAGENにてアガロースゲルからDNAを抽出及び精製した。精製DNA断片ベクターを0.8アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りにDNA濃度マーカーとともに電気泳動し、その濃度を見積もった。なお、pAmyBGFPuvベクター中のGFPuvコード配列は、ビフィズス菌用にコドンを最適化GenScriptしたものである。Recombination反応上記で調製したベクターとインサートを1:3~10のモル比にて混合し、組換え反応により連結したCloneEZKitGenScript。反応条件は製品説明書に従った。大腸菌の形質転換上記Recombination反応液2μLを用いて大腸菌TOP10chemicallyCompetentCellの形質転換を行い、LB75μg/mLスペクチノマイシン含有プレートに塗布後37°Cで一晩培養した。形質転換条件は、製品説明書に従った。形質転換した大腸菌コロニーをLB液体培地にて37°Cで一晩培養し、これよりプラスミドを抽出したQIAprepSpinMiniprepKitキアゲン株式会社。このプラスミドのインサート配列を決定し、プラスミド名を、pSPxAGFPx=1~16とした。ビフィズス菌の形質転換上記形質転換した大腸菌より抽出したプラスミドDNAを3~5μL用いて、ビフィズス菌Bifidobacteriumlongum105Aの形質転換をエレクトロポレーションシステムジーンパルサーII、バイオラッドラボラトリーズ株式会社により行なった。電気ショック後は、キュベットにIMR液体培地800μLとビタミンC添加液50μLの混合液を即時に加え、これを滅菌済みの2mLマイクロチューブに回収した。各チューブについて同様の操作を行い、これら2mLチューブの蓋をゆるめてデシケータに入れた。デシケータ内の空気を真空ポンプにて脱気したのち、炭酸ガスを封入した。この操作を3回繰り返してデシケータ内の空気を炭酸ガスに置換した後、デシケータを37°Cに設定したインキュベータに入れ、3時間保温した。保温後の各菌懸濁液をよく混ぜた後、その100μLを量り取り、IMR寒天培地75μg/mLSPCMを含有2枚にそれぞれ塗抹した。これらのプレートを脱酸素炭酸ガス発生剤アネロパックRケンキ、三菱ガス化学株式会社とともに密閉容器に入れ、37°Cに設定したインキュベータにて2日間培養した。製造例2:分泌型GFP発現プラスミドpSPxBGFPの構築ビフィズス菌のヒストン様プロモーターHuプロモーターにて分泌型GFPを発現させるプラスミドを構築した。概要を図2に示す。詳細は以下のとおりである。インサート調製上記25個の分泌タンパク質候補のうち、不完全なタンパク質コード配列CDSと推測される3個No.17、18、20を除いた22個No.1~16、19、21~25について、推定シグナルペプチドコード部分及びその下流60~90塩基を含むDNA断片をPCR法にて増幅した。翻訳開始点にforwardprimerを設計し、シグナルペプチドをコードするDNAの60~90bp下流にreverseprimerを設計した。各シグナルペプチドのPCRプライマーを表2.2に示した。各プライマーの5’側の15塩基は、以下に示すベクターと相同な配列を有する。上記製造例1と同様にPCRを行い、調製したPCR産物をSPxx=1~16、19、21~25とした。ベクター調製SPxクローニング用ベクターを以下のように調製した。調製の概要を図2に示す。プラスミドpScHuGFPuvベクター図2、上段の右図;配列番号2を、HindIIIFermentasにて完全分解した。反応条件は、酵素の使用説明書に従った。消化後のプラスミドを、0.8精製用アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入り電気泳動にて分離し、約4.6kbpの直鎖DNAd断片を切り出し、ゲルからのDNA抽出キットQIAquickGelExtractionKitQIAGENにてアガロースゲルからDNAを抽出及び精製した。精製DNA断片ベクターを0.8アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りにDNA濃度マーカーとともに電気泳動し、その濃度を見積もった。なお、pScHuGFPuvベクター中のGFPuvコード配列は、ビフィズス菌用にコドンを最適化GenScriptしたものである。Recombination反応上記で調製したベクターとインサートを1:3~10のモル比にて混合し、組換え反応により連結したCloneEZKitGenScript。反応条件は製品説明書に従った。大腸菌の形質転換上記Recombination反応液2μLを用いて大腸菌TOP10chemicallyCompetentCellの形質転換を行い、LB75μg/mLスペクチノマイシン含有プレートに塗布後37°Cで一晩培養した。形質転換条件は、製品説明書に従った。形質転換した大腸菌コロニーをLB75μg/mLスペクチノマイシン含有液体培地にて37°Cで一晩培養し、これよりプラスミドを抽出したQIAprepSpinMiniprepKitキアゲン株式会社。このプラスミドのインサート配列を決定し、プラスミド名をpSPxBGFPx=1~16、19、21~25とした。ビフィズス菌の形質転換上記製造例1と同様の方法にてビフィズス菌の形質転換を行った。製造例3:分泌型GFP発現プラスミドpSec2GFPの構築BifidobacteriumbreveUCC2003にて分泌ペプチドSec2が報告されているLauraEMacConailletalAppliedandEnvironmentalMicrobiology2003Vol69pp69947001。Blongum105Aのゲノム配列よりSec2と相同性の高い配列を検索し、これの分泌シグナルをGFPのコード配列とつなげた。これをHuプロモーターにて発現させるプラスミドを、製造例2のプラスミドpScHuGFPuvベクターを用いて構築した。概要を図3に示す。詳細は以下のとおりである。インサート調製Blongum105AのSec2遺伝子の翻訳開始点にSec2F1プライマー、シグナルペプチドコード配列の123bp下流にSec2R2プライマーを設計した。プライマー配列を表2.3に示す。各プライマーの5’側の15塩基は、以下に示すベクターと相同な配列を有する。上記製造例1と同様にPCRを行い、調製したPCR産物をSec2とした。ベクター調製プラスミドpScHuGFPuvベクター図3、上段の右図;配列番号2を用いて上記製造例2と同様に調製した。Recombination反応上記で調製したベクターとインサートを1:10のモル比にて混合し、組換え反応により連結したCloneEZKitGenScript。反応条件は製品説明書に従った。大腸菌の形質転換上記Recombination反応液2μLを用いて大腸菌TOP10chemicallyCompetentCellの形質転換を行った。形質転換条件は、製品説明書に従った。形質転換した大腸菌コロニーをLB75μg/mLスペクチノマイシン含有液体培地にて37°Cで一晩培養し、これよりプラスミドを抽出したQIAprepSpinMiniprepKitキアゲン株式会社。このプラスミドのインサート配列を決定し、プラスミド名をpSec2GFP配列番号3とした。ビフィズス菌の形質転換上記製造例1と同様の方法にてビフィズス菌の形質転換を行った。実施例1:組換えビフィズス菌のGFPタンパク質発現製造例1~3で得た組換えビフィズス菌Bifidobacteriumlongum105ApSPxAGFPx=1~16、Bifidobacteriumlongum105ApSPxBGFPx=1~16、19、21~25及びBifidobacteriumlongum105ApSec2GFPのグリセリンストックを、APS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地に1植菌し、37°Cで24時間嫌気培養した活性化培養液。次に、APS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地20mLあたり1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.84mLを添加した培地に、活性化培養液0.5を植菌した。これを37°Cで18時間嫌気培養した。この培養液を用いて、培養上清及び細胞内タンパク質を以下のように調製した。培養液を遠心分離後、培養上清を回収した。この培養上清中のタンパク質をトリクロロ酢酸TCAにより沈殿させ、アセトンにて洗浄後、電気泳動用バッファーに溶解し、培養上清中のタンパク質を濃縮した。別に、細胞内タンパク質を以下のように抽出した。培養液1mLを4mLのPBSと混合し、12,000rpm、5分、4°Cにて遠心分離後、上清を除去し、この沈殿に5mLのPBSを加え懸濁、遠心分離し上清を除去する操作を2回行なった。洗浄後の菌体にPBSを加え全量を1mLとした後、超音波処理により菌体を破砕した。これを遠心分離後、上清を回収し、これを細胞内抽出物とした。同様の操作を野生株Bifidobacteriumlongum105Aについても行い、陰性コントロールとした。GFPタンパク質の陽性コントロールには、recombinantGFPuvを用いた。上記培養上清濃縮物培養液1mL相当、細胞内タンパク抽出物培養液7.5μL相当を12.5トリス-グリシンゲルアトー株式会社,e-パジェルにて電気泳動した。これをPVDF膜Invitrogen、iBlotTransferStacksにiBlotTransferDeviceInvitrogenを用いて転写した。ブロッティング終了後の膜をブロッキングした後、一次抗体にウサギGFP抗体ClontechAvpeptideAntibodyLivingColors、二次抗体にantiRabbitIgGHRPConjugateを使用して反応を行ない、ECLAdvanceWesternBlottingDetectionKitにて発光させた。これをイメージングアナライザーFluorSMax,バイオラッドにて解析した。その結果、13種の菌Blongum105ApSP1BGFP、Blongum105ApSP2BGFP、Blongum105ApSP3BGFP、Blongum105ApSP4BGFP、Blongum105ApSP7BGFP、Blongum105ApSP9BGFP、Blongum105ApSP10BGFP、Blongum105ApSP12BGFP、Blongum105ApSP16BGFP、Blongum105ApSP23BGFP、Blongum105ApSP7AGFP、Blongum105ApSP12AGFP、Blongum105ApSec2GFPで分泌傾向が認められた。同様な試験を2回行い、特に、5種Blongum105ApSP3BGFP、Blongum105ApSP7BGFP、Blongum105ApSP23BGFP、Blongum105ApSP7AGFP、Blongum105ApSec2GFPについて顕著な分泌作用が確認された図4。製造例4:分泌型TNFalpha発現ビフィズス菌の作製pSPxATNFalpha及びpSPxBTNFalphaプラスミドベクターpTNF1の構築ヒトTNFαのコード配列をビフィズス菌用にコドン最適化しpUC57ベクターに挿入したプラスミドGenScript社に合成委託を鋳型にしてTNFF1プライマー及びTNFR1プライマー表3にてTNFαコード領域をターゲットとしたPCRを行なったPrimeSTARHSPremixタカラバイオ株式会社。PCR産物を精製QIAquickPCRpurificatonKitキアゲンにて精製後、0.8アガロースゲルにて電気泳動を行い、約0.7kbpのDNA断片を切り出した。このゲルよりDNAを抽出QIAquickGelExtractionKitキアゲンし、インサートとした。別に、以下のようにベクターを調製した。プラスミドpCDshuttle特許文献9;WO2009128272A110μgに制限酵素FastDigestBsp119IFastDigestPstIFastDigestNdeIFastDigestAclIFermentas社を各10μL加え37°Cにて4.5時間加温し、プラスミドを完全分解した。これを、0.8アガロースゲルにて電気泳動を行い、約3.9kbpのDNA断片を切り出した。このゲルよりDNAを抽出QIAquickGelExtractionKitキアゲンし、ベクターとした。上記ベクター20ng及びインサート36ngをCloneEZKitGenScript社を用いて末端配列の組換えを行いつなげた。詳細はCloneEZKitの製品説明書に従った。このDNA2μLを用いて大腸菌TOP10chemicallyCompetentCellの形質転換を行った。形質転換条件は、製品説明書に従った。形質転換した大腸菌コロニーをLB75μg/mLスペクチノマイシン含有液体培地にて37°Cで一晩培養し、これよりプラスミドを抽出したQIAprepSpinMiniprepKitキアゲン株式会社。このプラスミドをpTNF1図5、上段の右図;配列番号4とした。プラスミドpSPxAGFP及びpSPxBGFPのGFP部分をTNFalphaに替えたプラスミドpSPxATNFalpha及びpSPxBTNFalphaの構築概要を図5及び図6にぞれぞれ示す。プラスミドpTNF1を鋳型として、TNFvecF1プライマー及びTNFvecR1プライマー表4にてPCRを行ないPrimeSTARHSPremixタカラバイオ株式会社約38kbpのPCR産物を取得し、これをベクターとした。別に、実施例1で分泌傾向を示したプラスミドpSPxAGFPx=7、12またはpSPxBGFPx=1~4,7,9,10,12,16,23を鋳型として、表5のプライマーにてインサートのPCR増幅を行ないPrimeSTARHSPremixタカラバイオ株式会社、これをインサートとした。上記ベクター100ngとインサート40ngをInFusionTMAdvantagePCRCloningKitにて連結させた。このDNA2μLを用いて大腸菌TOP10chemicallyCompetentCellの形質転換を行った。形質転換条件は、製品説明書に従った。形質転換した大腸菌コロニーをLB75μg/mLスペクチノマイシン含有液体培地にて37°Cで一晩培養し、これよりプラスミドを抽出したQIAprepSpinMiniprepKitキアゲン株式会社。このプラスミドの全長配列を決定し、プラスミド名を、pSP7ATNFalphapSP12ATNFalphapSP1BTNFalphapSP2BTNFalphapSP3BTNFalphapSP4BTNFalphapSP7BTNFalphapSP9BTNFalphapSP10BTNFalphapSP12BTNFalphapSP16BTNFalphapSP23BTNFalphaとした。ビフィズス菌のpSPxATNFalpha及びpSPxBTNFalphaによる形質転換プラスミドpSPxATNFalpha及びpSPxBTNFalphaを用いてBlongum105Aの形質転換を製造例1と同様の方法を用いて行なった。参考例2:プラスミドpTNF3の構築ビフィズス菌由来のHuプロモーター下流に成熟ヒトTNFαコード配列を配したシャトルベクタービフィズス菌大腸菌を構築した。概要を図12に示す。詳細は以下のとおりである。インサート調製ヒトTNFαのコドンをビフィズス菌用に最適化した人工DNA、その上流及び下流にビフィズス菌由来のHuプロモーター及びHuターミネーターを配したプラスミドhumanTNFalphainpUC57を合成したGenScriptにカスタム合成依頼。プラスミドhumanTNFalphainpUC571ngを鋳型として、TNFαのコード領域の成熟TNFα部分をPrimeSTARHSPremixタカラバイオ株式会社にてPCR増幅した。プライマーは、TNFF3プライマー及びTNFR1プライマー用い、各プライマーの5’側15塩基は、ベクターの末端と相同な配列を配した表6。PCRのプログラムは、98°Cで10秒、60°Cで5秒、72°Cで30秒を30サイクル行った後、72°Cで30秒とした。PCR産物の一部を、DNA濃度マーカーとともに2アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りに電気泳動し、約0.5kbpのシングルバンドである事を確認し、またその濃度を見積もった。ベクター調製プラスミドpCDshuttle1ngを鋳型として、ベクター骨格をPrimeSTARHSPremixタカラバイオ株式会社にてPCR増幅した。プライマーは、pCDshuttleF1プライマー及びpCDshuttleR1プライマー用い、各プライマーの5’側15塩基は、インサートの末端と相同な配列とした。PCRのプログラムは、98°Cで10秒、55°Cで5秒、72°Cで4分を30サイクル行った後、72°Cで30秒とした。PCR産物の一部を、DNA濃度マーカーとともに0.8アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りにて電気泳動し、約3.9kbpのシングルバンドである事を確認し、またその濃度を見積もった。クローニング上記ベクター100ng及びインサート50ngをInFusionAdvantagePCRCloningKitタカラバイオ株式会社を用いて末端配列の組換えを行いつなげた。この時、CloningEnhancerタカラバイオ株式会社も反応液に加え、インサート及びベクター中に含まれる鋳型プラスミドの分解も同時に行った。詳細は、InFusionAdvantagePCRCloningKitの製品説明書に従った。上記インフュージョン反応液2μLを用いて大腸菌TOP10chemicallyCompetentCellInvitrogen社の形質転換を行った。形質転換条件は、製品説明書に従った。形質転換した大腸菌コロニーをLB75μg/mLスペクチノマイシン含有液体培地にて37°Cで一晩培養し、これよりプラスミドを抽出したQIAprepSpinMiniprepKit、キアゲン株式会社。このプラスミドの全長配列を決定し、pTNF3とした配列番号51。ビフィズス菌の形質転換プラスミドpTNF3を用いてBlongum105Aの形質転換を製造例1と同様の方法を用いて行った。製造例5:分泌型TNFα発現ビフィズス菌の作製pSec2TNFalphaプラスミドpSec2GFPのGFP部分をTNFalphaに替えたプラスミドpSec2TNFalphaの構築概要を図7に示す。ベクター調製プラスミドpCDshullteをBamHI、BcuI及びPstI何れもFermentasにて完全分解した。反応条件は、酵素の使用説明書に従った。消化後のプラスミドを、1精製用アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入り電気泳動にて分離し、約3.4kbpのLargefragmentを切り出し、DNA抽出キットQIAquickGelExtractionKitQIAGENにてアガロースゲルからDNAを抽出及び精製した。精製DNA断片ベクターを0.8アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りにDNA濃度マーカーとともに電気泳動し、その濃度を見積もった。インサート調製プラスミドpSec2GFPを鋳型として、Sec2out1primer及びSec2aR1primer表5にてHuプロモーターを含むSec2シグナルペプチドコード配列をPCR増幅したPCR産物1。別に、プラスミドpTNF1を鋳型として、Sec2aF1primer及びTNFout1primer表5にてHuターミネーターを含むTNFalphaのコード配列をPCR増幅したPCR産物2。PCR産物1及び2をPCR産物精製キットQIAquickPCRpurificationkitキアゲン株式会社にて精製後、吸光度測定によりPCR産物量を見積もった。PCR産物1及びPCR産物2を等モル量混ぜた。このPCR産物混合溶液1ng、2×PCRSolutionPrimeSTARHSに、0.1×TEバッファーを加え49μLとした。この溶液をサーマルサイクラーにセットし、98°Cで10秒、72°Cで36秒を1サイクルとして5サイクル反応を行い、2つのPCR断片を連結した。さらに、これにSec2out1プライマー及びTNFout1プライマーを加えて、98°Cで10秒、55°Cで5秒、72°Cで70秒を1サイクルとして25サイクル反応させた後、72°Cで30秒伸長反応を行い、連結PCR産物を増幅した。これを、1精製用アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入り電気泳動にて分離し、約1.2kbpの断片を切り出し、DNA抽出キットQIAquickGelExtractionKitQIAGENにてアガロースゲルからDNAを抽出及び精製した。この精製DNA断片をBamHI及びBcuIにて完全分解した。反応条件は、酵素の使用説明書に従った。消化後のプラスミドを、1精製用アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入り電気泳動にて分離し、約1.2kbpのDNA断片を切り出し、DNA抽出キットQIAquickGelExtractionKitQIAGENにてアガロースゲルからDNAを抽出及び精製した。この精製PCR産物をBamHZおよびBcuIで完全分解後、これを1精製用アガロースゲルにて分離精製した。精製DNA断片インサートを0.8アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りにDNA濃度マーカーとともに電気泳動し、その濃度を見積もった。ライゲーション上記ベクター及びインサートを1:3モル比にて混合し、ライゲーションを行なったRapidDNALigationKit、Fermentas。詳細は、製品説明書に従った。大腸菌の形質転換上記ライゲーション反応液2μLを用いて大腸菌TOP10chemicallyCompetentCellの形質転換を行った。形質転換条件は、製品説明書に従った。形質転換した大腸菌コロニーをLB75μg/mLスペクチノマイシン含有液体培地にて37°Cで一晩培養し、これよりプラスミドを抽出したQIAprepSpinMiniprepKitキアゲン株式会社。このプラスミドのインサート部分について全長配列を決定し、PCRエラーがない事を確認し、プラスミド名を、pSec2TNFalphaとした。ビフィズス菌のpSec2TNFalphaによる形質転換プラスミドpSec2TNFalphaを用いてBlongum105Aの形質転換を製造例1と同様の方法を用いて行なった。実施例2:組換えビフィズス菌のTNFalphaタンパク質発現製造例4及び製造例5で得た組換えビフィズス菌Bifidobacteriumlongum105ApSPxATNFalphax=7,12、Bifidobacteriumlongum105ApSPxBTNFalphax=1~4,7,9,10,12,16,23及びBifidobacteriumlongum105ApSec2TNFalphaのグリセリンストックをAPS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地に1植菌し、37°Cで24時間嫌気培養した活性化培養液。次に、APS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地20mLあたり1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.84mLを添加した培地に、活性化培養液0.5を植菌した。これを37°Cで18時間嫌気培養した。培養液を遠心分離後、培養上清を回収した。この培養上清中のタンパク質をトリクロロ酢酸TCAにより沈殿させ、アセトンにて洗浄後、電気泳動用バッファーに溶解し、培養上清中のタンパク質を濃縮した。別に、細胞内タンパク質を以下のように抽出した。培養液1mLを4mLのPBSと混合し、12,000rpm、5分、4°Cにて遠心分離後、上清を除去し、この沈殿に5mLのPBSを加え懸濁、遠心分離し上清を除去する操作を2回行なった。洗浄後の菌体にPBSを加え全量を1mLとした後超音波処理を行い、菌体を破砕した。これを遠心分離後、上清を回収し、これを細胞内抽出物としてウェスタンブロッティング解析に供した。同様の操作を野生株Bifidobacteriumlongum105Aについても行い、陰性コントロールとした。TNFalphaの陽性コントロールには、ヒト組換えTNFalphaPEPROTECHINCを用いた。上記培養上清培養液7.5μL相当、培養上清濃縮物培養液1mL相当、細胞内タンパク抽出物培養液7.5μL相当を16TrisGlycineゲルにて電気泳動した。ただし、以下のサンプルについてはゲルへのアプライ量を次のように調整した。SP3BTNFalphaの上清を培養液0.15μL相当、SP16BTNFalphaの細胞内抽出物を0.15μL相当、SP23BTNFalphaの細胞内抽出物を0.75μL相当、同培養上清濃縮物を20μL及び100μL相当を電気泳動に供した。これをPVDF膜Invitrogen、iBlotTransferStacksにiBlotTransferDeviceInvitrogenを用いて転写した。ブロッティング終了後の膜をブロッキングした後、一次抗体にantihumanTNFalpha、二次抗体にantiGoatIgGHRPConjugateを使用して反応を行ない、ECLAdvanceWesternBlottingDetectionKitにて発光させた。これをイメージングアナライザーFluorSMax、バイオラッドにて解析した。解析結果を図8に示した。その結果、9種Blongum105ApSP1BTNFalpha、Blongum105ApSP3BTNFalpha、Blongum105ApSP4BTNFalpha、Blongum105ApSP7BTNFalpha、Blongum105ApSP12BTNFalpha、Blongum105ApSP16BTNFalpha、Blongum105ApSP23BTNFalpha、Blongum105ApSP7ATNFalpha、Blongum105ApSec2TNFalphaについて分泌が確認され、2種Blongum105ASP3BTNFalpha及びBlongum105ASP23BTNFalphaの培養上清への発現が特に強かった。参考例3:TNFα非分泌型の菌であるBlongum105ApTNF3の分泌確認参考例2で得た、Blongum105ApTNF3と野生株であるBlongum105AグリセリンストックをAPS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地に1植菌し、37°Cで24時間嫌気培養した活性化培養液。APS2S25SE液体培地20mLに1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.84mLを添加した培地75μg/mLスペクチノマイシンに、活性化培養液0.5を植菌した。これを37°Cで18時間嫌気培養した。ただし、野生株はスペクチノマイシンを添加しない培地にて培養した。この培養液を遠心分離し、培養上清を回収した。また、細胞内抽出物を以下のように調製した。培養液1mLをPBSバッファーにて洗浄後、菌体をPBSバッファーにて懸濁して1mLとし、超音波破砕を行った。これを遠心分離後、その上清を回収し、これを細胞内抽出物とした。野生株より得た試料を陰性コントロールとした。陽性コントロールには、ヒト由来組換えTNFalphaPEPROTECHINCを用いた。上記培養上清培養液75μL相当、細胞内抽出物培養液0.075μL相当を15ポリアクリルアミゲルアトー株式会社にて電気泳動した。これをPVDF膜Invitrogen、iBlotTransferStacksにiBlotTransferDeviceInvitrogenを用いて転写した。ブロッティング終了後の膜をブロッキングした後、一次抗体にantihumanTNFalphaRDSystems、二次抗体にantiGoatIgGHRPConjugateSantaCruzBiotechnologyを使用して反応を行ない、ECLAdvanceWesternBlottingDetectionKitGEHealthcareにて発光させた。これをイメージングアナライザーFluorSMax、バイオラッドにて解析した。解析結果を図9に示した。その結果、Blongum105ApTNF3と野生株のBlongum105Aの細胞内抽出物を比較すると、Blongum105ApTNF3ではTNFαの発現を示すバンドが確認されたが、野生株のBlongum105Aでは確認できなかった。したがって、プラスミドpTNF3で形質転換された菌株は、TNFαを正常に発現することがわかった。しかしながら、両者の培養上清を比較してみると、どちらの培養上清中にもTNFαは確認されず、Blongum105ApTNF3からはTNFαが細胞外に分泌されていないことがわかった。製造例6:pBifiSP3BTNFの構築製造例4で得たプラスミドpSP3BTNFalpha大腸菌―ビフィズス菌シャトルベクターより大腸菌中での複製起点を除去したプラスミドpBifiSP3BTNFを構築した。構築の概要を図10に示す。pUCori除去断片の調製組換え大腸菌TOP10pSP3BTNFalphaより抽出したプラスミド2.4μgにBamHI及びBglIIを加え37°Cにて消化した。これを、0.8精製用アガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、約3.8kbpのDNA断片を切り出した。切り出したゲルからDNAを抽出精製しQIAquickGelExtractionKit、QIAGEN、吸光度測定によりDNA濃度を測定した。pUCori除去断片のセルフライゲーション上記pUCori除去断片のセルフライゲーションをチューブ6本にて行なった。1チューブあたり、pUCori除去断片50ngを用いて50μLの反応系にて22°Cにて5分間セルフライゲーションを行なったRAPIDDNALIGATIONKITFermentas後、65°Cにて5分間加熱してLigaseを失活させた。ライゲーション反応液6本を1本にまとめ、ProteinaseKによるタンパク質の分解次いで、フェノールクロロホルム抽出による除タンパク質後、エタノール沈殿を行なった。DNAの溶解は、10μLの0.1×TEにて行なった。ビフィズス菌の形質転換Bifidobacteriumlongum105Aコンピテントセルの形質転換エレクトロポレーション、ジーンパルサーII、バイオラッドラボラトリーズ株式会社を、上記ライゲーション反応後の精製物150ng5μLを用いて行なった。電気ショック後、キュベットにIMR液体培地800μLとビタミンC添加液50μLの混合液を即時に加え、これを滅菌済みの2mLマイクロチューブに回収した。このチューブの蓋を緩めた状態てデシケータに入れ、真空ポンプにて脱気したのち、炭酸ガスを封入した。この操作を3回繰り返してデシケータ内の空気を炭酸ガスに置換した後、デシケータを37°Cに設定したインキュベータに入れ、3時間保温した。保温後の菌懸濁液をよく混ぜた後、IMR寒天培地75μg/mLSPCMを含有に塗抹した。このプレートを脱酸素炭酸ガス発生剤アネロパックRケンキ、三菱ガス化学株式会社とともに密閉容器に入れ、37°Cに設定したインキュベータにて2日間培養した。形質転換体の確認および組換えビフィズス菌のグリセリンストック作製上記IMR寒天培地75μg/mLSPCMを含有上に形成した組換え体候補コロニーを、BL-bS寒天培地スペクチノマイシンを含むBL寒天培地、ただし馬脱繊血を含まないに画線し、脱酸素炭酸ガス発生剤アネロパックRケンキ、三菱ガス化学株式会社とともに密閉容器に入れ、37°Cにて1日間培養した。画線培養したビフィズス菌をAPS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地にて37°Cで1日間嫌気培養し、これよりプラスミドDNAQIAprepSpinMiniprepKitキアゲン株式会社を抽出した。抽出DNAを鋳型として、CheckprimerF1AAD9カセット上及びCheckprimerR2Huプロモーター上にてPCR増幅を行い、PCR産物の大きさをアガロースゲル電気泳動にて確認した。プライマー配列を表7に示す。PCRプライマーの位置を図10に示す。PCR産物サイズは、約0.5kbpであり、pUCori断片が除去されている事を確認した。これより、この組換えビフィズス菌は、プラスミドpSP3BTNFalphaよりpUCoriが除かれたプラスミド、pBifiSP3BTNFalphaを有することを確認した。BL-bS寒天培地上の画線培養物を、APS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地に植菌し、37°Cで24時間嫌気培養した。この培養液に最終濃度20になるようにグリセリン溶液を混合し、グリセリンストックとした。プラスミドpBifiSP3BTNFの塩基配列決定Bifidobacteriumlongum105ApBifiSP3BTNFグリセリンストックをAPS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地にて嫌気的に培養した。培養液より遠心分離により菌体を回収し、30mMGTAbufferで懸濁後、N-アセチルムラミダーゼ処理を行なった。さらに、ProteinaseK処理を行なった後、プラスミドDNA精製キットによる精製を行ったQIAprepSpinMiniprepKitQIAGEN。このプラスミドDNAを用いて全塩基配列を決定し、pUCoriを含んでいないことを確認した配列番号5。実施例3:組換えビフィズス菌のTNFalphaタンパク質分泌確認製造例6で得た、Bifidobacteriumlongum105ApBifiSP3BTNFalphaグリセリンストックをAPS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地に1植菌し、37°Cで24時間嫌気培養した活性化培養液。APS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地20mLに1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.84mLを添加した培地に、活性化培養液0.5を植菌した。これを37°Cで18時間嫌気培養した。この培養液を遠心分離し、培養上清を回収した。また、細胞内抽出物を以下のように調製した。培養液1mLをPBSにて洗浄後、PBSにて懸濁して1mLとし、超音波破砕を行った。これを遠心分離後、その上清を回収し、これを細胞内抽出物とした。同様の操作をシャトルベクターであるBifidobacteriumlongum105ApSP3BTNFalpha及び野生株Bifidobacteriumlongum105Aについても行った。ただし、野生株はスペクチノマイシンを添加しない培地にて培養した。野生株より得た試料を陰性コントロールとした。陽性コントロールには、ヒト由来組換えTNFalphaPEPROTECHINCを用いた。上記培養上清培養液0.75μL相当、細胞内タンパク抽出物培養液1.5μL相当を15ポリアクリルアミゲルアトー株式会社にて電気泳動した。これをPVDF膜Invitrogen、iBlotTransferStacksにiBlotTransferDeviceInvitrogenを用いて転写した。ブロッティング終了後の膜をブロッキングした後、一次抗体にantihumanTNFalpha、二次抗体にantiGoatIgGHRPConjugateを使用して反応を行ない、ECLAdvanceWesternBlottingDetectionKitにて発光させた。これをイメージングアナライザーFluorSMax,バイオラッドにて解析した。解析結果を図11に示した。実施例4:pBifiSP3BTNFalpha及びpSP3BTNFでの大腸菌形質転換製造例6で得たプラスミドpBifiSP3BTNFalpha及びpSP3BTNFalphaを用いて、大腸菌TOP10株の形質転換を行った。大腸菌TOP10コンピテントセルライフテクノロジーズジャパン株式会社の製品説明書に従い形質転換を行い、LB75μg/mLスペクチノマイシン含有寒天培地に100μLずつ2枚塗布し、37°Cにて1晩培養した。コロニーは、シャトルベクターpSP3BTNFalphaを導入した場合のみで形成され266cfu及び226cfu、pBifiSP3BTNFalphaを導入した大腸菌は選択培地上でコロニーを形成しなかった。参考例4:プラスミドpBEshuttleの構築インサートを含まないタンパク質発現ユニットを持つモックベクターとして、pBEshuttleを以下のように構築した。概要を図13に示した。PCR断片の調製プラスミドpCDshuttle5ngを鋳型として、2つのPCR断片A及びBをPrimeSTARHSPremixタカラバイオ株式会社を用いて増幅した。PCR断片Aの増幅には、MCSF1primer及びTNFvecR1primerを、PCR断片Bの増幅には、pUCoriF2primer及びMCSR1primerを用いた。PCR断片A増幅用プライマーの5’側15塩基は、PCR断片Bの末端と相同な配列を、PCR断片B増幅用プライマーの5’側15塩基は、PCR断片Aの末端と相同な配列をもつよう設計した。PCRのプログラムは、98°Cで10秒、55°Cで5秒、72°CでX秒PCR断片A増幅:X=3分20秒、PCR断片B増幅:X=35秒を30サイクル行った後、72°Cで30秒とした。PCR産物の一部をアガロースゲル1×TBEbufferエチジウムブロマイド入り。PCR産物A用:0.8アガロースゲル、PCR産物B用:2アガロースゲルにDNA濃度マーカーとともに電気泳動し、シングルバンドPCR産物A:約3.3kbp、PCR産物B:約0.6kbpである事を確認し、またその濃度を見積もった。クローニング上記PCR産物A100ng及びPCR産物B35ngをInFusionAdvantagePCRCloningKitタカラバイオ株式会社を用いて末端配列の組換えを行いつなげた。この時、CloningEnhancerタカラバイオ株式会社も反応液に加え、インサート及びベクター中に含まれる鋳型プラスミドの分解も同時に行った。詳細は、InFusionAdvantagePCRCloningKitの製品説明書に従った。上記インフュージョン反応液2μLを用いて大腸菌TOP10chemicallyCompetentCellInvitorogen社の形質転換を行った。形質転換条件は、製品説明書に従った。形質転換した大腸菌コロニーをLB75μg/mLスペクチノマイシン含有液体培地にて37°Cで一晩培養し、これよりプラスミドを抽出したQIAprepSpinMiniprepKit、キアゲン株式会社。このプラスミドの全長配列を決定し、pBEshuttleとした配列番号50。ビフィズス菌の形質転換プラスミドpBEshuttleを用いてBlongum105Aの形質転換を製造例1と同様の方法を用いて行った。製造例7:組換えビフィズス菌BbrevepSP3BTNFalphaの作製製造例1の、ビフィズス菌の形質転換と同様の方法にて、プラスミドpSP3BTNFalphaによるBifidobacteriumbreveJCM1192の形質転換を行った。実施例5:組換えビフィズス菌のTNFαタンパク質の発現量確認参考例4で得たBlongum105ApBEshuttle、製造例4で得た、Blongum105ApSP3BTNFalpha、製造例6で得たBlongum105ApBifiSP3BTNFalpha及び製造例7で得たBbrevepSP3BTNFalphaグリセリンストックをAPS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地に1植菌し、37°Cで24時間嫌気培養した活性化培養。APS2S25SE液体培地20mLに1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.84mLを添加した培地75μg/mLスペクチノマイシンに、活性化培養液0.5を植菌した。これを37°Cで18時間嫌気培養した。この培養液を遠心分離し、培養上清を回収した。培養上清をELISA法により培養上清中のTNFα量を測定した。測定結果を表9に示した。Blongum105ApSP3BTNFalpha、Blongum105ApBifiSP3BTNFalphaおよびBbrevepSP3BTNFalphaのいずれも培養上清中にTNFαが分泌されていたが、Blongum105ApBEshuttleでは観察されなかった。実施例6:組換えビフィズス菌で分泌したTNFαタンパク質の生理活性と抗hTNFα抗体による生理活性の中和被験菌の培養及び培養上清の調製参考例4で得たBlongum105ApBEshuttle、製造例4で得た、Blongum105ApSP3BTNFalpha及び製造例6で得たBlongum105ApBifiSP3BTNFalphaグリセリンストックをAPS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地に1植菌し、37°Cで24時間嫌気培養した活性化培養。APS2S25SE液体培地20mLに1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.84mLを添加した培地75μg/mLスペクチノマイシンに、活性化培養液0.5を植菌した。これを37°Cで18時間嫌気培養した。この培養液を遠心分離し、培養上清を回収した。TNFαの細胞毒性試験rhTNFαの生理活性と中和は、TNFαの生理活性であるTNFα受容体を介した細胞毒性を調べる事により判定した。被験細胞としてヒト乳癌細胞株のKPL-1細胞を用いた。KPL-1細胞はDMEM培地10v/vFBS及び0.1v/vペニシリン50000U/mLストレプトマイシン50mg/mL液を添加したDMEM培地にて37°C、5CO2の条件下で培養した。この細胞1×104個/ウェルを96ウェルプレートに播種し37°C、5CO2で24時間培養しコンフルエントの細胞を得た。この細胞より古い培地を吸引除去し、新しく終濃度5μg/mLアクチノマイシンDとなるように、アクチノマイシンDを添加した10v/vFBS及び0.1ペニシリン50000U/mLストレプトマイシン50mg/mL液添加DMEM培地を80μL/ウェルずつ添加した。次に、測定試料としてビフィズス菌用培地APS2S25SE培地、rhTNFα標準品として100ng/mLに調製したrhTNFalpha、Blongum105ApBEshuttle培養上清5倍希釈液、Blongum105ApSP3BTNFalpha培養上清5倍希釈液及びBlongum105ApBifiSP3BTNFalpha培養上清5倍希釈液を10μL/ウェルずつ添加した。ここに、rhTNFα生理活性の中和能測定のため、抗hTNFα抗体antihumanTNFalphaRDSystems、0.0125~0.1mg/mL、正常ヤギIgGnormalGoatIgGRDSytems、0.0125~0.1mg/mL及び10v/vFBS及び0.1v/vペニシリン50000U/mLストレプトマイシン50mg/mL液を添加したDMEM培地の各10μL/ウェルを添加した。このプレートを37°C、5CO2で48時間培養した。細胞毒性の測定はCellCountingKit8DOJINDOを使用し、この液10μL/ウェルずつを各ウェルに添加後、さらに4時間37°C、5CO2にてインキュベートし、波長450nmと630nmで吸光度を測定した630nmを参照波長とした。解析結果を図14に示した。これにより、組換え菌Blongum105ApSP3BTNFalpha及びBlongum105ApBifiSP3BTNFalphaの培養上清は、KPL-1細胞に対し細胞毒性を示し、なおかつ抗TNFα抗体により中和されたことから、培養上清中に分泌された組換えhTNFαが生理活性を有するものであることを確認した。実施例7:Blongum105ApSP3BTNFalphaおよびBbrevepSP3BTNFalphaの抗腫瘍効果測定製造例4で作製したBlongum105ApSP3BTNFalphaおよび製造例7で作製したBbrevepSP3BTNFalphaの抗腫瘍効果を測定した。1移植腫瘍細胞の培養ヒト乳癌細胞株のKPL-1細胞は、10v/vFBS及び0.1v/vペニシリン50000U/mLストレプトマイシン50mg/mL液を添加したDMEM培地にて37°C、5CO2の条件下で培養した。コンフルエントとなった時点で1×PBS-で洗浄後1×トリプシン-EDTAを加えて細胞を剥がし、遠心操作1000回転/5分間で回収した細胞を、DMEM培地にて適宜希釈して継代培養した。移植実験には5回継代後の細胞を用いた。トリパンブルーで染色されない生細胞数をThoma血球計算盤で計数し、ハンクス液に懸濁して細胞数を2.5×106個/mLに調製した。2担癌ヌードマウス作製と腫瘍体積の測定調製したKPL-1細胞懸濁液0.2mLをヌードマウスの右前肢背部側の皮下に移植した5×105個/マウス。移植後の腫瘍体積は、腫瘍径長径、短径、厚みをノギスで測定し、下式により求めた。腫瘍体積mm3=長径mm×短径mm×厚みmm/23群分けおよび群構成KPL-1担癌ヌードマウスの腫瘍体積がおよそ80~135mm3程度のマウス24匹を選別して、平均腫瘍体積が同程度になるように3群1群8匹に分けた。この日をDay0と設定した。試験群構成は表10に示すとおりである。すなわち、第一群:無処理群、第二群:Blongum105ApSP3BTNFalpha投与群、第三群:BbrevepSP3BTNFalpha投与群とした。4菌の培養及び投与用菌液の調製菌の培養製造例4で作製したビフィズス菌Blongum105ApSP3BTNFalpha及び製造例7で得たBbrevepSP3BTNFalphaのグリセリンストックを、APS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地に1植菌し、37°Cで23.5時間嫌気培養した活性化培養液。次に、APS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地20mLに活性化培養液の1を植菌し、37°Cで18時間嫌気培養した本培養液。投与用培養生菌の調製Blongum105ApSP3BTNFalpha上記で得られた本培養液の10mLをメスピペットで量りとり、40mLのよく冷やしたPBSバッファーの入ったコニカルチューブに加え、転倒混和にて穏やかに混ぜた後、4°Cに冷却した遠心機にて8000rpmで10分間遠心した。遠心後、上清を除き新しいPBSバッファーを40mL加え、ボルテックスにて穏やかに混ぜた。この操作を4回繰り返し菌体の洗浄を行った。洗浄した菌体を5mLのPBSバッファーに懸濁し、これを投与用培養生菌とした。投与用培養生菌の調製BbrevepSP3BTNFalpha上記で得られた本培養液の10mLをメスピペットで量りとり、40mLのよく冷やしたPBSバッファーの入ったコニカルチューブに加え、転倒混和にて穏やかに混ぜた後、4°Cに冷却した遠心機にて8000rpmで10分間遠心した。遠心後、上清を除き新しいPBSバッファーを40mL加え、ボルテックスにて穏やかに混ぜた。この操作を4回繰り返し菌体の洗浄を行った。洗浄した菌体を10mLのPBSバッファーに懸濁し、これを投与用培養生菌とした。5菌およびマルトースの投与菌の投与第二群および第三群にマウスあたり0.2mLの各培養生菌第二群:Blonum105ApSP3BTNFalpha、第三群:BbrevepSP3BTNFalphaを1日2回AM/PM、週に2回Day14811のペースで2週間に渡って静脈内投与した。培養生菌は、総投与容量として1.6mL、総投与菌数としてBlonum105ApSP3BTNFalphaでは3.1×109cfu/マウス、BbrevepSP3BTNFalphaでは4.8×109cfu/マウスを投与した。投与生菌数は以下のようにして測定した。生菌数測定培養生菌を嫌気性希釈液で106倍に希釈し、その100μLをBLFSプレート各3枚に塗布し、密閉容器アネロパック角型ジャー、三菱ガス化学内に脱酸素炭酸ガス発生剤と共に37°Cの恒温器で3日間嫌気培養した。コロニー数が30~300程度検出されるプレートから下式により投与菌数を算出した。投与菌数cfu=コロニー数a×プレート塗布時の希釈率b×培養生菌1mL当たりの換算係数c×投与量mLa:P1P2P3/33プレートP1,P2,P3の平均コロニー数b:×106106倍希釈c:×101プレートあたり100μLを塗布マルトースの投与第二、三群に、菌の糖源として10マルトース溶液1mLをマウスに1日に2回200mg/body/day腹腔内投与した。投与期間は培養生菌投与日から21日間Day1~21とした。6腫瘍増殖抑制効果の確認全てのマウスについて、治療開始前群分け時および治療開始後22日間、3~4日に1回の頻度で腫瘍径を測定し、腫瘍増殖に対する効果を確認した。各群のマウスの腫瘍体積の平均値±SDを算出し、対照群第一群に対する相対腫瘍体積比率T/Cを指標として抗腫瘍効果を判定した。また第一群と第二群、第一群と第三群の間での統計学的解析2群間比較:t-testを実施した。各群の腫瘍体積平均値±SDを以下の表11に示す。またこの時の経日的な腫瘍体積の変動を図15に示す。Blonum105ApSP3BTNFalphaおよびBbrevepSP3BTNFalphaのどちらを投与した群においても、無処理群と比較して、有意な腫瘍体積の減少が観察された。実施例8:Blongum105ApSP3BTNFalphaの抗腫瘍効果測定製造例4で作製したBlongum105ApSP3BTNFalphaのアドリアマイシン併用における抗腫瘍効果を測定した。1移植腫瘍細胞の培養ヒト乳癌細胞株のKPL-1細胞は、10v/vFBS及び0.1v/vペニシリン50000U/mLストレプトマイシン50mg/mL液を添加したDMEM培地にて37°C、5CO2の条件下で培養した。コンフルエントとなった時点で1×PBS-で洗浄後1×トリプシン-EDTAを加えて細胞を剥がし、遠心操作1000回転/5分間で回収した細胞を、DMEM培地にて適宜希釈して継代培養した。移植実験には5回継代後の細胞を用いた。トリパンブルーで染色されない生細胞数をThoma血球計算盤で計数し、ハンクス液に懸濁して細胞数を2.5×106個/mLに調製した。2担癌ヌードマウス作製と腫瘍体積の測定調製したKPL-1細胞懸濁液0.2mLをヌードマウスの右前肢背部側の皮下に移植した5×105個/マウス。移植後の腫瘍体積は、腫瘍径長径、短径、厚みをノギスで測定し、下式により求めた。腫瘍体積mm3=長径mm×短径mm×厚みmm/23群分けおよび群構成KPL-1担癌ヌードマウスの腫瘍体積がおよそ80~120mm3程度のマウス18匹を選別して、平均腫瘍体積が同程度になるように4群1群6匹に分けた。この日をDay0と設定した。試験群構成は表12に示すとおりである。すなわち、第一群:無処理群、第二群:アドリアマイシン単独投与群、第三群:菌アドリアマイシン併用投与群とした。4菌の培養製造例4で作製したビフィズス菌Blongum105ApSP3BTNFalphaのグリセリンストックを、APS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地に1植菌し、37°Cで23.5時間嫌気培養した活性化培養液。次に、APS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地20mLに活性化培養液の1を植菌し、37°Cで18時間嫌気培養した本培養液。投与用培養生菌の調製上記本培養液の5mLをメスピペットで量りとり、20mLのよく冷やしたPBSバッファーの入ったコニカルチューブに加え、転倒混和にて穏やかに混ぜた後、4°Cに冷却した遠心機にて8000rpmで10分間遠心した。遠心後、上清を除き新しいPBSバッファーを20mL加え、ボルテックスにて穏やかに混ぜた。この操作を4回繰り返し菌体の洗浄を行った。洗浄した菌体を2.5mLのPBSバッファーに懸濁し、これを投与用培養生菌とした。5菌、マルトースおよびアドリアマイシンの投与菌の投与第三群に、マウスあたり0.2mLの培養生菌被験薬を1日に2回AM/PM、週に2回Day15812静脈内投与した。培養生菌は、総投与容量として1.6mL、総投与菌数として3.0×109cfu/マウスを投与した。投与生菌数は以下のようにして測定した。生菌数測定培養生菌を嫌気性希釈液で106倍に希釈し、その100μLをBLプレート各3枚に塗布し、密閉容器アネロパック角型ジャー、三菱ガス化学内に脱酸素炭酸ガス発生剤と共に入れ37°Cの恒温器で3日間嫌気培養した。コロニー数が30~300程度検出されるプレートから下式により投与菌数を算出した。投与菌数cfu=コロニー数a×プレート塗布時の希釈率b×培養生菌1mL当たりの換算係数c×投与量mLa:P1P2P3/33プレートP1,P2,P3の平均コロニー数b:×106106倍希釈c:×101プレートあたり100μLを塗布マルトースの投与第三群に、菌の糖源として10マルトース溶液1mLをマウスに1日に2回200mg/body/day腹腔内投与した。投与期間は培養生菌投与日から20日間Day1~20とした。アドリアマイシンの投与第二群および第三群に、アドリアマイシン溶液1.0mg/mL0.1mLを初回菌投与の前日Day0のみマウスに静脈内投与した。6腫瘍増殖抑制効果の確認全てのマウスについて、治療開始前群分け時および治療開始後21日間、3~4日に1回の頻度で腫瘍径を測定し、腫瘍増殖に対する効果を確認した。各群のマウスの腫瘍体積の平均値±SDを算出し、対照群第一群に対する相対腫瘍体積比率T/Cを指標として抗腫瘍効果を判定した。またTNFαを分泌する本菌の抗腫瘍能を判定するため、第二群と第三群の間で統計学的解析2群間比較:t-testを実施した。各群の腫瘍体積平均値±SDを以下の表13に示す。またこの時の経日的な腫瘍体積の変動を図16に示す。Blongum105ApSP3BTNFalphaとアドリアマイシンとを併用した群は、無処理の群のみならず、アドリアマイシンのみを投与した群と比較しても有意に腫瘍体積が減少していた。これはすなわち、アドリアマイシンとBlongum105ApSP3BTNFalphaを併用することで効果を高めることができることを意味する。製造例8:非分泌型ヒトIL-18発現ビフィズス菌の作製プラスミドphIL18mutHisの構築ビフィズス菌由来のHuプロモーター下流にヒトIL-18のみを配し、分泌シグナルを有していないシャトルベクタービフィズス菌-大腸菌を構築した。概要を図17に示す。詳細は以下のとおりである。インサート調製ヒトIL-18AccessionNoNM001562、成熟タンパク質コード領域329番目から799番目の塩基配列のコドンをビフィズス菌用に最適化した人工DNA、その上流及び下流にビフィズス菌由来のHuプロモーター及びHuターミネーターを配したプラスミド:humanIL18optinpUC57GenScriptにカスタム合成依頼を使用した。人工DNA合成の際には、成熟ヒトIL-18の7番目のアミノ酸E→A及び54番目のアミノ酸K→Aの2ヶ所にアミノ酸置換を導入し、IL-18結合タンパクによる中和を減少させ、C末端にヒスチジンタグを付加した成熟ヒトIL-18のアミノ酸配列:配列番号47。プラスミドhumanIL18optinpUC572μgにBamHI25unit及びBcuI15unit酵素は何れもFermentasを添加し、37oCにて3時間保温し完全分解した。消化後のプラスミドを、1精製用アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りにて電気泳動してDNA断片を分離した。約1kbpの小断片を切り出し、DNA抽出キットQIAquickGelExtractionKitQIAGENにてアガロースゲルからDNAを抽出及び精製した。精製DNA断片インサートを0.8アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りにDNA濃度マーカーとともに電気泳動し、その濃度を見積もった。ベクター調製プラスミドpCDshuttleをBamHI、BcuI、PstI、Bsp119I何れもFermentas、PstI及びBsp119Iは、CD上に認識部位があるにて完全分解した。反応条件は、酵素の使用説明書に従った。消化後のプラスミドを、1精製用アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入り電気泳動にて分離し、約3.4kbpの大断片を切り出し、DNA抽出キットQIAquickGelExtractionKit、キアゲン株式会社にてアガロースゲルからDNAを抽出及び精製した。精製DNA断片ベクターを0.8アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りにDNA濃度マーカーとともに電気泳動し、その濃度を見積もった。クローニング上記ベクター及びインサートを1:3モル比にて混合し、ライゲーションを行なったRapidDNALigationKit、Fermentas。詳細は、製品説明書に従った。上記ライゲーション反応液2μLを用いて大腸菌TOP10chemicallyCompetentCellの形質転換を行った。形質転換条件は、製品説明書に従った。形質転換した大腸菌コロニーをLB75μg/mLスペクチノマイシン含有液体培地にて37oCで一晩培養し、これよりプラスミドを抽出したQIAprepSpinMiniprepKitキアゲン株式会社。このプラスミド名を、phIL18mutHisとした。pSP3BhIL18mutの構築ビフィズス菌由来のHuプロモーター下流にシグナルペプチドと融合したhumanIL18mutを配したシャトルベクタービフィズス菌-大腸菌を構築した。概要を図18に示す。詳細は以下のとおりである。インサート調製プラスミドphIL18mutHis5ngを鋳型として、hIL18mutコード領域をPrimeSTARRHSPremixタカラバイオ株式会社にてPCR増幅した。プライマーは、IL18F2プライマー及びIL18R2プライマーを用い、各プライマーの5’側15塩基は、ベクターの末端と相同な配列とした表14。PCR産物にIL-18のC末端のヒスチジンタグが含まれないようプライマー設計を行った。PCRのプログラムは、98°Cで10秒、55°Cで5秒、72°Cで30秒を30サイクル行った後、72°Cで30秒とした。PCR産物の一部を、DNA濃度マーカーとともに2アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りにて電気泳動し、約0.5kbpのシングルバンドである事を確認し、またその濃度を見積もった。ベクター調製プラスミドpSP3BTNFalpha5ngを鋳型として、シグナルペプチドSP3及びベクター骨格をPrimeSTARHSPremixタカラバイオ株式会社にてPCR増幅した。プライマーは、vectorF3プライマー及びvectorR2プライマー表14を用い、各プライマーの5’側15塩基は、インサートの末端と相同な配列とした。PCRのプログラムは、98°Cで10秒、55°Cで5秒、72°Cで4分を30サイクル行った後、72°Cで30秒とした。PCR産物の一部を、DNA濃度マーカーとともに0.8アガロースゲル1×TBEbuffer、エチジウムブロマイド入りにて電気泳動を行い、約4kbpのシングルバンドである事を確認し、またその濃度を見積もった。クローニング上記ベクター100ng及びインサート40ngをInFusionAdvantagePCRCloningKitタカラバイオ株式会社を用いて末端配列の組換えを行いつなげた。この時、CloningEnhancerタカラバイオ株式会社も反応液に加え、インサート及びベクター中に含まれる鋳型プラスミドの分解も同時に行った。詳細は、InFusionAdvantagePCRCloningKitの製品説明書に従った。上記インフュージョン反応液2μLを用いて大腸菌TOP10chemicallyCompetentCellInvitorogen社の形質転換を行った。形質転換条件は、製品説明書に従った。形質転換した大腸菌コロニーをLB75μg/mLスペクチノマイシン含有液体培地にて37°Cで一晩培養し、これよりプラスミドを抽出したQIAprepSpinMiniprepKit、キアゲン株式会社。このプラスミドの全長配列を決定し、pSP3BhIL18mutとした配列番号49。ビフィズス菌の形質転換プラスミドpSP3BhIL18mutを用いてBlongum105A及びBbreveJCM1192の形質転換を製造例1と同様の方法を用いて行なった。実施例9:組換えビフィズス菌のヒトIL-18タンパク質発現試料調製製造例8で得た組換えビフィズス菌Bifidobacteriumlongum105ApSP3BhIL18mut及び参考例4で得たBifidobacteriumlongum105ApBEshuttleのグリセリンストックをAPS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地に1植菌し、37°Cで24時間嫌気培養した活性化培養液。次に、APS2S25SE75μg/mLスペクチノマイシン液体培地20mLあたり1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.84mLを添加した培地に、活性化培養液0.5を植菌した。これを37°Cで18時間嫌気培養した本培養液。上記と同様の方法にて、BifidobacteriumbreveJCM1192pSP3BhIL18mutの培養を行なった。ただし、本培養は14時間培養とした。本培養液を、1.5mL容チューブに1.3mLとり、遠心分離14,000rpm、5分、4°Cした後、その上清を回収し、これをIL-18測定用試料とした。IL-18測定HumanIL18ELISAキットMBLを用いて各上清のヒトIL-18タンパク量を測定した。その結果、Bifidobacteriumlongum105ApSP3BhIL18で986pg/mL、BifidobacteriumbreveJCM1192pSP3BhIL18mutで1632pg/mLのIL-18が検出されたが、モックでは検出されなかった。本発明の分泌シグナルペプチドを、発現ユニットに導入することにより、生理活性を失うことなく発現タンパク質を効率的に形質転換菌体外に分泌させることが可能となる。したがって、本発明のベクターおよび該ベクターで形質転換された嫌気性微生物は従来のものと比較して、嫌気性疾患組織において、治療剤を効率的に疾患部位に供給することができるため、高い治療効果を得ることができる。"