"第一シグナル伝達インヒビター、第二シグナル伝達インヒビター、および第三シグナル伝達インヒビターを含むキットであって、ここで、該第一インヒビターはトランスフォーミング増殖因子βTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、該第二インヒビターはSmallMothersAgainstDecapentaplegicSMADシグナル伝達を低下させることができ、および該第三インヒビターは、ウイングレスWntシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βを低下させることができる、キット。前記第一インヒビターが、SB431542、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である、請求項1に記載のキット。前記第二インヒビターが、LDN193189、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である、請求項1に記載のキット。前記第三インヒビターが、CHIR99021およびその誘導体からなる群より選択される、請求項1に記載のキット。線維芽細胞増殖因子FGF受容体ファミリーシグナル伝達を低下させる第四インヒビターをさらに含む請求項1に記載のキットであって、該FGF受容体ファミリーシグナル伝達が、血管内皮増殖因子VEGF受容体、線維芽細胞増殖因子FGF受容体および血小板由来増殖因子PDGFチロシンキナーゼ受容体を含む、キット。前記第四インヒビターが、SU5402およびその誘導体からなる群より選択される、請求項5に記載のキット。ノッチシグナル伝達を低下させることができる第五インヒビターをさらに含む、請求項1に記載のキット。前記第五インヒビターが、N-[N-3,5-ジフルオロフェナセチル-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステルDAPTおよびその誘導体からなる群より選択される、請求項7に記載のキット。ネスチン、からなる群より選択されるタンパク質の発現の検出のために使用される抗体をさらに含む、請求項1に記載のキット。ネスチン、からなる群より選択される遺伝子のmRNA発現の検出のためのPCRプライマーをさらに含む、請求項1に記載のキット。プロタキキニン-1TAC1、小胞グルタミン酸輸送体2VGLUT2および溶質キャリアファミリー15メンバー3SLC15A3からなる群より選択されるタンパク質の発現の検出のために使用される抗体をさらに含む、請求項1に記載のキット。プロタキキニン-1TAC1、小胞グルタミン酸輸送体2VGLUT2および溶質キャリアファミリー15メンバー3SLC15A3からなる群より選択される遺伝子のmRNA発現の検出のためのPCRプライマーをさらに含む、請求項1に記載のキット。指示書をさらに含む請求項1に記載のキットであって、該指示書が、前記第三インヒビターを添加する2日前に、前記第一インヒビターおよび前記第二インヒビターを添加するための工程を含む、キット。指示書をさらに含む請求項1に記載のキットであって、該指示書が、神経幹細胞前駆体を作製するための工程および侵害受容器細胞を作製するための工程を含む、キット。ヒト幹細胞をさらに含む、請求項1に記載のキット。前記ヒト幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項15に記載のキット。前記ヒト幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、請求項15に記載のキット。前記ヒト幹細胞がトランスジェニックSOX10::GFP細菌人工染色体BACヒト多能性幹細胞hPSCである、請求項13に記載のキット。幹細胞の定方向性分化を誘導するための方法であって、aiヒト幹細胞を含む細胞培養物;およびii第一シグナル伝達インヒビター、第二シグナル伝達インヒビター、および第三シグナル伝達インヒビターであって、ここで、該第一インヒビターはトランスフォーミング増殖因子βTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、該第二インヒビターはSmallMothersAgainstDecapentaplegicSMADシグナル伝達を低下させることができ、および該第三インヒビターは、ウイングレスWntシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βを低下させることができる、第一シグナル伝達インヒビター、第二シグナル伝達インヒビター、および第三シグナル伝達インヒビター;を提供する工程;b該幹細胞を該第一インヒビターおよび該第二インヒビターとインビトロで48時間まで接触させる工程;ならびにc該阻害された幹細胞を、幹細胞の定方向性分化を誘導するために、該第三インヒビターとさらに192時間までさらに接触させる工程を含み、該分化した幹細胞は神経堤幹細胞である、方法。前記第一インヒビターが、SB431542、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である、請求項19に記載の方法。前記第二インヒビターが、LDN193189、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である、請求項19に記載の方法。前記第三インヒビターが、CHIR99021およびその誘導体からなる群より選択される、請求項19に記載の方法。線維芽細胞増殖因子FGF受容体ファミリーシグナル伝達を低下させる第四インヒビターをさらに含む請求項19に記載の方法であって、該FGF受容体ファミリーシグナル伝達が、血管内皮増殖因子VEGF受容体、線維芽細胞増殖因子FGF受容体および血小板由来増殖因子PDGFチロシンキナーゼ受容体を含む、方法。前記第四インヒビターが、SU5402およびその誘導体からなる群より選択される、請求項23に記載の方法。ノッチシグナル伝達を低下させることができる第五インヒビターをさらに含む、請求項19に記載の方法。前記第五インヒビターが、N-[N-3,5-ジフルオロフェナセチル-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステルDAPTおよびその誘導体からなる群より選択される、請求項25に記載の方法。ニューロン系列細胞のペプチド作動性侵害受容器細胞への定方向性分化のために、第四インヒビターおよび第五インヒビターをさらに含む請求項19に記載の方法であって、該第四インヒビターがSU5402およびその誘導体からなる群より選択され、該第五インヒビターがN-[N-3,5-ジフルオロフェナセチル-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステルDAPTおよびその誘導体からなる群より選択される、方法。前記ペプチド作動性侵害受容器細胞が、OCT4、DLK1、PAX6、SOX10、POU4F1BRN3A、ISL1、NEUROG2、NEUROG1、NTRK1、RET、RUNX1、VGLUT2、TAC1およびTRPV1からなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項27に記載の方法。前記ペプチド作動性侵害受容器細胞が、ISL1、POU4F1BRN3A、RET、RUNX1およびNTRK1からなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項27に記載の方法。前記マーカーがタンパク質および核酸からなる群より選択される、請求項27に記載の方法。前記ペプチド作動性侵害受容器細胞が、サブスタンスPおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチドCGRPを共発現する、請求項27に記載の方法。前記ペプチド作動性侵害受容器細胞が外部刺激に応答して活動電位を生じ、該外部刺激が電流である、請求項27に記載の方法。前記分化したペプチド作動性侵害受容器細胞が、前記幹細胞を前記第一インヒビターおよび前記第二インヒビターと接触させた後10~15日以内に、高度に富化されたニューロンの集団内に存在する、請求項27に記載の方法。前記幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項19に記載の方法。前記幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、請求項19に記載の方法。生物学的作用物質をインビトロでスクリーニングする方法であって、ai幹細胞の定方向性分化からインビトロで誘導される侵害受容器細胞;およびii試験化合物を提供する工程;ならびにb該侵害受容器細胞を該試験化合物と接触させて、侵害受容器機能を測定する工程であって、該機能は活動電位の測定値である、工程を含む、方法。前記侵害受容器細胞がヒト幹細胞に由来する、請求項36に記載の方法。したがって、夾雑マウス間質細胞を使用せずに高い純度と収率で胚性または体性幹細胞から直接、末梢感覚ニューロン、特に侵害受容器を生産する方法が当分野において求められている。本発明は、幹細胞生物学の分野、特に、ヒト胚性幹細胞hESC、ヒト誘導多能性幹細胞hiPSC、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的に分化することができる任意の他の細胞を含み得るが、これらに限定されない、多能性または多分化能性幹細胞の系列特異的分化に関する。特に、新規培養条件を用いてhESCおよび/またはhiPSCの系列特異的分化を侵害受容器すなわち侵害受容器細胞へと向かわせる方法を記載する。本発明の方法を用いて作製される侵害受容器は、インビトロでの薬剤発見アッセイにおける使用、疼痛研究における使用、および末梢神経系PNSの疾患または損傷を逆転させる治療薬としての使用を含むが、これらに限定されない、様々な用途に関してさらに考慮される。さらに、疾患モデリングにおける使用のためにヒト多能性幹細胞からメラノサイトを生産するための組成物および方法を提供する。当分野における制約を克服することおよび/または欠陥を軽減することが本発明の1つの目的である。1つの実施形態では、本発明は、i幹細胞例えばhESC、hiPSC、体性幹細胞、がん幹細胞、ヒトまたは哺乳動物多能性細胞等を得ること;ii二重SMADシグナル伝達を阻害する条件下で前記幹細胞を培養すること;ならびにiiiFGFおよびノッチシグナル伝達を阻害し、Wntシグナル伝達を活性化する条件下で前記細胞をさらに培養することを含む、侵害受容器を生産する方法を提供する。本明細書で使用される場合、阻害するまたはブロックするという用語は、化合物すなわちインヒビターでの処理の際に細胞の特定のシグナル伝達経路の活性のレベルが、そのような化合物で処理していないままであるかまたは対照で処理した細胞の前記シグナル伝達経路の活性と比較して低下することを意味する。本明細書で使用される場合、活性化するという用語は、化合物すなわちアクチベーターでの処理の際に細胞の特定のシグナル伝達経路の活性のレベルが、そのような化合物で処理していないままであるかまたは対照で処理した細胞の前記シグナル伝達経路の活性と比較して上昇することを意味する。特定のシグナル伝達経路の何らかのレベルの阻害または活性化は、そのような阻害または活性化が幹細胞の定方向性分化を生じさせる場合、本発明の実施形態とみなされる。1つの実施形態では、培養のための方法は、フィーダーを含まない系のための条件を含む。1つの実施形態では、幹細胞を単層で培養する。好ましい実施形態では、培養のための方法は、化合物SB431542、LDN1933189、SU5402、CHIR99021およびDAPTを含む培地の使用を企図する。1つの実施形態では、分化細胞は、培養細胞の集団の少なくとも10から100までである。1つの実施形態では、分化細胞は、ISL1、BRN3A、RET、RUNX1およびNTRK1を含む群からの1つ以上のマーカーを発現する。1つの実施形態では、前記マーカーの発現は、培養細胞の集団の少なくとも10から100までにおいて発現される。好ましい実施形態では、分化細胞は侵害受容器である。好ましい実施形態では、幹細胞はhESCまたはhiPSCである。1つの実施形態では、本発明は、iSMADシグナル伝達およびTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達TGFβ/Activin-Nodalsignalingの両方をブロックする第一インヒビターまたはインヒビターの組合せ;iiFGFシグナル伝達をブロックする第二インヒビター;iiiノッチシグナル伝達をブロックする第三インヒビター;ならびにivWntシグナル伝達のアクチベーター、を含むキットを提供する。1つの実施形態では、第一インヒビターは、LDN193189およびSB431542、それらの組合せ、それらの混合物を含む群から選択される。1つの実施形態では、第二インヒビターは、SU5402およびその誘導体を含む。1つの実施形態では、第三インヒビターは、DAPTおよびその誘導体を含む。1つの実施形態では、アクチベーターは、CHIR99021およびその誘導体を含む。1つの実施形態では、キットはヒト幹細胞をさらに含む。1つの実施形態では、キットは、本発明を実施するための指示書をさらに提供する。1つの実施形態では、本発明は、iSMADシグナル伝達およびTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の両方をブロックする第一インヒビターまたはインヒビターの組合せ;iiFGFシグナル伝達をブロックする第二インヒビター;iiiノッチシグナル伝達をブロックする第三インヒビター;ならびにivWntシグナル伝達のアクチベーター、を含むキットを提供する。1つの実施形態では、前記第一インヒビターは、SB431542、LDN193189、それらの組合せおよびそれらの混合物を含む群から選択される。1つの実施形態では、前記第二インヒビターは、SU5402およびその誘導体を含む。1つの実施形態では、前記第三インヒビターは、DAPTおよびその誘導体を含む。1つの実施形態では、前記アクチベーターは、CHIR99021およびその誘導体を含む。1つの実施形態では、前記キットは指示書をさらに含む。1つの実施形態では、前記キットはヒト幹細胞をさらに含む。1つの実施形態では、前記ヒト幹細胞はヒト胚性幹細胞である。1つの実施形態では、前記ヒト幹細胞はヒト誘導多能性幹細胞である。本発明は、分化幹細胞の末梢感覚ニューロンサブタイプを評価するための方法をさらに企図する。この方法のある実施形態は、顕微鏡分析、機能アッセイ、特定の系列に関連するマーカーの発現または下方調節の測定を利用することができる。好ましい実施形態では、該方法は、ISL1、BRN3A、RET、RUNX1およびNTRK1を含む群から選択される侵害受容器特異化に関連するマーカーを測定することを含む。1つの実施形態では、本発明は、幹細胞の定方向性分化を誘導するための方法であって、aiヒト幹細胞を含む細胞培養物;iiSMADシグナル伝達およびTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の両方をブロックする第一インヒビターまたはインヒビターの組合せ;iiiFGFシグナル伝達をブロックする第二インヒビター;ivノッチシグナル伝達をブロックする第三インヒビター;ならびにvWntシグナル伝達のアクチベーター、を提供すること、b前記幹細胞を、SMADシグナル伝達およびTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の両方をブロックする前記第一インヒビターまたはインヒビターの組合せと、インビトロで0~48時間より典型的には1~48時間接触させること、ならびにc前記幹細胞を、FGFシグナル伝達をブロックする第二インヒビター;ノッチシグナル伝達をブロックする第三インヒビター;およびWntシグナル伝達のアクチベーターと、さらに192時間までまたはさらには240時間までさらに接触させること、を含む方法を提供する。1つの実施形態では、前記第一インヒビターは、SB431542、LDN193189、それらの組合せおよびそれらの混合物を含む群から選択される。1つの実施形態では、前記第二インヒビターは、SU5402およびその誘導体を含む。1つの実施形態では、前記第三インヒビターは、DAPTおよびその誘導体を含む。1つの実施形態では、前記アクチベーターは、CHIR99021およびその誘導体を含む。1つの実施形態では、前記幹細胞はヒト胚性幹細胞である。1つの実施形態では、前記幹細胞はヒト誘導多能性幹細胞である。1つの実施形態では、前記分化細胞はニューロン細胞である。1つの実施形態では、前記ニューロン細胞は侵害受容器である。1つの実施形態では、前記分化細胞は、ISL1、BRN3A、RET、RUNX1およびNTRK1を含む群からの1つ以上のマーカーを発現する。1つの実施形態では、前記分化細胞は外部刺激に応答する。本発明は、本発明の方法によって生成される侵害受容器の使用をさらに企図する。1つの実施形態では、侵害受容器は、抗疼痛治療薬として使用できる化合物を同定するインビトロアッセイにおいて使用される。1つの実施形態では、侵害受容器は、侵害受容器の機能を検討するために使用される。1つの実施形態では、侵害受容器は、PNSの損傷または疾患に罹患しているかまたはその危険性がある動物におけるインビボでの細胞置換療法として使用される。1つの実施形態では、本発明は、生物学的作用物質をスクリーニングする方法であって、ai侵害受容器;およびii試験化合物、を提供すること;b前記侵害受容器を前記試験化合物と接触させ、侵害受容器機能の活性化または阻害を測定すること、を含む方法を提供する。1つの実施形態では、前記侵害受容器はヒト幹細胞に由来する。1つの実施形態では、本発明は、第一シグナル伝達インヒビター、第二シグナル伝達インヒビターおよび第三シグナル伝達インヒビターを含むキットであって、前記第一インヒビターはトランスフォーミング増殖因子βTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、前記第二インヒビターはSmallMothersAgainstDecapentaplegicSMADシグナル伝達を低下させることができ、そして前記第三インヒビターは、ウイングレスwinglessWntシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βを低下させることができる、キットを提供する。1つの実施形態では、前記第一インヒビターは、SB431542、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である。1つの実施形態では、前記第二インヒビターは、LDN193189、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である。1つの実施形態では、前記第三インヒビターは、CHIR99021およびその誘導体からなる群より選択される。1つの実施形態では、前記キットは、線維芽細胞増殖因子FGF受容体ファミリーシグナル伝達を低下させる第四インヒビターをさらに含み、前記FGF受容体ファミリーシグナル伝達には、血管内皮増殖因子VEGF受容体、線維芽細胞増殖因子FGF受容体および血小板由来増殖因子PDGFチロシンキナーゼ受容体が含まれる。1つの実施形態では、前記第四インヒビターは、SU5402およびその誘導体からなる群より選択される。1つの実施形態では、前記キットは、ノッチシグナル伝達を低下させることができる第五インヒビターをさらに含む。1つの実施形態では、前記第五インヒビターは、N-[N-3,5-ジフルオロフェナセチルdifluorophenacetyl-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステルDAPTおよびその誘導体からなる群より選択される。1つの実施形態では、前記キットは、ネスチン、からなる群より選択されるタンパク質の発現の検出のために使用される抗体をさらに含む。1つの実施形態では、前記キットは、ネスチン、からなる群より選択される遺伝子のmRNA発現の検出のためのPCRプライマーをさらに含む。1つの実施形態では、前記キットは、プロタキキニン-1Protachykinin-1TAC1、小胞グルタミン酸輸送体2VGLUT2および溶質キャリアファミリー15メンバー3solutecarrierfamily15,member3SLC15A3からなる群より選択されるタンパク質の発現の検出のために使用される抗体をさらに含む。1つの実施形態では、前記キットは、プロタキキニン-1TAC1、小胞グルタミン酸輸送体2VGLUT2および溶質キャリアファミリー15メンバー3SLC15A3からなる群より選択される遺伝子のmRNA発現の検出のためのPCRプライマーをさらに含む。1つの実施形態では、前記キットは、第三インヒビターを添加する2日前に第一および第二インヒビターを添加するための工程が含まれる指示書をさらに含む。1つの実施形態では、前記キットは、前記第三インヒビター、前記第四インヒビターおよび前記第五インヒビターの組合せを添加する2日前に第一および第二インヒビターを添加するための工程が含まれる指示書をさらに含む。1つの実施形態では、前記キットは、0~10日目に前記インヒビターを順々に毎日供給するための工程が含まれる指示書をさらに含む。1つの実施形態では、前記キットは、神経幹細胞前駆体を作製するための工程および侵害受容器細胞を作製するための工程が含まれる指示書をさらに含む。1つの実施形態では、前記キットはヒト幹細胞をさらに含む。1つの実施形態では、前記ヒト幹細胞はヒト胚性幹細胞である。1つの実施形態では、前記ヒト幹細胞はヒト誘導多能性幹細胞である。1つの実施形態では、前記ヒト幹細胞はトランスジェニックSOX10::GFP細菌人工染色体BACヒト多能性puripotent幹細胞hPSCである。1つの実施形態では、本発明は、幹細胞の定方向性分化を誘導するための方法であって、aiヒト幹細胞を含む細胞培養物;およびii第一シグナル伝達インヒビター、第二シグナル伝達インヒビターおよび第三シグナル伝達インヒビター但し、前記第一インヒビターはトランスフォーミング増殖因子βTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、前記第二インヒビターはSmallMothersAgainstDecapentaplegicSMADシグナル伝達を低下させることができ、そして前記第三インヒビターは、ウイングレスWntシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βを低下させることができるを提供すること;b前記幹細胞を前記第一インヒビターおよび前記第二インヒビターとインビトロで48時間までまたはさらには96時間まで接触させること;ならびにc幹細胞の定方向性分化を誘導するために前記阻害された幹細胞を前記第三インヒビターとさらに192時間までまたはさらには240時間までさらに接触させること、を含み、前記分化幹細胞が、神経堤幹細胞、神経堤系列細胞およびニューロン系列細胞からなる群より選択される、方法を提供する。1つの実施形態では、前記第一インヒビターは、SB431542、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である。1つの実施形態では、前記第二インヒビターは、LDN193189、その誘導体およびその混合物からなる群より選択される低分子である。1つの実施形態では、前記第三インヒビターは、CHIR99021およびその誘導体からなる群より選択される。1つの実施形態では、前記キットは、線維芽細胞増殖因子FGF受容体ファミリーシグナル伝達を低下させる第四インヒビターをさらに含み、前記FGF受容体ファミリーシグナル伝達には、血管内皮増殖因子VEGF受容体、線維芽細胞増殖因子FGF受容体および血小板由来増殖因子PDGFチロシンキナーゼ受容体が含まれる。1つの実施形態では、前記第四インヒビターは、SU5402およびその誘導体からなる群より選択される。1つの実施形態では、前記キットは、ノッチシグナル伝達を低下させることができる第五インヒビターをさらに含む。1つの実施形態では、前記第五インヒビターは、N-[N-3,5-ジフルオロフェナセチル-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステルDAPTおよびその誘導体からなる群より選択される。1つの実施形態では、前記キットは、ニューロン系列細胞のペプチド作動性侵害受容器細胞への定方向性分化のために、第四インヒビターおよび第五インヒビターをさらに含み、前記第四インヒビターはSU5402およびその誘導体からなる群より選択され、前記第五インヒビターはN-[N-3,5-ジフルオロフェナセチル-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステルDAPTおよびその誘導体からなる群より選択される。1つの実施形態では、前記ペプチド作動性侵害受容器細胞は、OCT4、DLK1、PAX6、SOX10、POU4F1BRN3A、ISL1、NEUROG2、NEUROG1、NTRK1、RET、RUNX1、VGLUT2、TAC1およびTRPV1からなる群より選択されるマーカーを発現する。1つの実施形態では、前記ペプチド作動性侵害受容器細胞は、ISL1、POU4F1BRN3A、RET、RUNX1およびNTRK1からなる群より選択されるマーカーを発現する。1つの実施形態では、前記マーカーは、タンパク質および核酸からなる群より選択される。1つの実施形態では、前記ペプチド作動性侵害受容器細胞は、サブスタンスPおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチドCGRPを共発現する。1つの実施形態では、前記ペプチド作動性侵害受容器細胞は外部刺激に応答して活動電位を生じさせ、前記外部刺激は電流である。1つの実施形態では、前記分化したペプチド作動性侵害受容器細胞は、前記幹細胞を前記第一インヒビターおよび前記第二インヒビターと接触させた後8~18日以内、より典型的には10~15日以内に高度に富化されたニューロンの集団内に存在する。1つの実施形態では、前記幹細胞はヒト胚性幹細胞である。1つの実施形態では、前記幹細胞はヒト誘導多能性幹細胞である。1つの実施形態では、本発明は、生物学的作用物質をインビトロでスクリーニングする方法であって、ai幹細胞の定方向性分化からインビトロで誘導される侵害受容器細胞;およびii試験化合物、を提供すること;ならびにb前記侵害受容器細胞を前記試験化合物と接触させ、侵害受容器機能を測定すること但し、前記機能は活動電位の測定値であるを含む方法を提供する。1つの実施形態では、前記侵害受容器細胞は、ヒト幹細胞に由来する。1つの実施形態では、本発明は、メラノサイトの定方向性分化のためのキットを提供する。1つの実施形態では、本発明は、メラノサイトの定方向性分化のための方法を提供する。1つの実施形態では、本発明は、メラノサイト系列の細胞集団を提供するための方法を提供する。1つの実施形態では、本発明は、成熟メラノサイト細胞集団を提供するための方法を提供する。定義本明細書で使用される場合、キットという用語は、物質を送達するための任意の送達システムを指す。細胞分化に関連して、キットは、幹細胞と接触させるための物質の組合せを指してもよく、そのような送達システムは、適切な容器例えばチューブ等中での反応試薬例えば化合物、タンパク質、検出試薬PAX6抗体など等および/または支持物質例えば緩衝液、細胞分化を実施するための指示文書等の貯蔵、輸送または送達1つの場所から別の場所へのを可能にするシステムを含む。例えば、キットは、シグナル伝達経路を阻害するための関連反応試薬、例えば、SB431542もしくはSB431542代替物等のようなトランスフォーミング増殖因子βTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達を低下させるためのインヒビター、SMADシグナル伝達を低下させるためのインヒビターである、LDN193189もしくはLDN193189代替物等、CHIR99021もしくはCHIR99021代替物等のような、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βを低下させるためのインヒビター、一例として、β-カテニンのシグナル伝達抑制についての、さもなければWNTシグナル伝達アクチベーターWNTアゴニストとして知られるウイングレスWntもしくはWntsシグナル伝達の活性化のためのインヒビター、SU5402もしくはSU5402代替物等のような、線維芽細胞増殖因子FGF受容体ファミリーシグナル伝達を低下させることを含む、FGF受容体ファミリーシグナル伝達のインヒビター但し、前記FGF受容体ファミリーシグナル伝達には、血管内皮増殖因子VEGF受容体、線維芽細胞増殖因子FGF受容体および血小板由来増殖因子PDGFチロシンキナーゼ受容体シグナル伝達が含まれる、DAPTもしくはDAPT代替物等のような、ノッチシグナル伝達のインヒビター、ならびに/または支持物質を含む、1つ以上の筺体例えば箱もしくはバッグ、試験管、エッペンドルフ管、毛細管、マルチウエルプレート等を含む。1つの実施形態ではキット中の試薬は、溶液中に存在してもよく、凍結されていてもよく、または凍結乾燥されていてもよい。1つの実施形態ではキット中の試薬は、個別の容器中に存在してもよく、またはLSB、3i、CHIR、Mel試薬等の組合せのような特定の組合せとして提供されてもよい。本明細書で使用される場合、シグナル伝達タンパク質に関するシグナル伝達という用語は、膜受容体タンパク質へのリガンド結合または何らかの他の刺激によって活性化されるかまたはさもなければ影響されるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例には、SMAD、β-カテニンを含むWNT複合体タンパク質、ノッチ、トランスフォーミング増殖因子βTGFβ、アクチビン、ノーダルおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βタンパク質が含まれる。多くの細胞表面受容体または細胞内受容体タンパク質に関して、リガンド-受容体相互作用は細胞の応答と直接結びついてはいない。リガンド活性化受容体は、細胞挙動へのリガンドの最終的な生理的作用が生じる前に、最初に細胞の内部で他のタンパク質と相互作用しなければならない。しばしば、いくつかの相互作用性細胞タンパク質の一連の挙動は、受容体の活性化または阻害後に変化する。受容体活性化によって誘導される細胞変化の全体のセットがシグナル伝達機構またはシグナル伝達経路と呼ばれる。本明細書で使用される場合、ノッチという用語は、少なくとも4つのノッチ受容体ノッチ-1、-2、-3および-4と称されるの1つ以上に結合する少なくとも5つのリガンド例えばJagged-1、-2ならびにDelta様Dll-1、-3および-4と称されるによって表されるシグナル伝達経路を指す。ノッチシグナル伝達は、TACETNFα変換酵素および/またはγセクレターゼ/プレセニリン複合体による少なくとも1つのタンパク質分解切断を生じさせる受容体-リガンド相互作用によって開始される。このタンパク質分解切断は、細胞内ドメインタンパク質NIC、ノッチの機能的活性形態の放出を生じさせ、前記タンパク質は核に移行して、DNA結合タンパク質であるCBF-1CSLまたはRBP-Jκとも称されるに結合する。NICのCBF-1への結合は、リプレッサー複合体を移動させ、CBF-1を転写活性化因子に変換するMAML1およびヒストンアセチルトランスフェラーゼなどの核内コアクチベータをリクルートする。CBF-1/ノッチ相互作用は、一例として、Hesヘアリー/エンハンサーオブスプリットHairy/EnhancerofSplit、HeyYRPWと関連するヘアリー/エンハンサーオブスプリットHesR、HRT、HERP、CHFおよびグリッドロックとしても知られる、NF-κBおよびPPARファミリーの転写因子、およびp2lCIP1/WAF1およびサイクリンDなどの細胞周期調節因子を含む、様々な標的遺伝子の発現を生じさせる。HesHes-1を含むおよびHeyHey1およびHey2を含むファミリーメンバーは、ノッチ活性化の直接の下流標的である転写因子の例である。ノッチシグナル伝達経路の複雑さを考慮すると、当然ながらノッチ活性化または阻害の結果を予測することは困難である。多数のノッチ受容体およびリガンド各々が独自の発現パターンを有するが存在するだけでなく、数多くの標的遺伝子およびノッチと他のシグナル伝達カスケードとの間の潜在的クロストークがこのシステムをさらに複雑にする。本明細書で使用される場合、シグナルという用語は、細胞の構造および機能の変化を制御する内部および外部因子を指す。それらは化学的または物理的性質がある。本明細書で使用される場合、リガンドという用語は、受容体Rに結合する分子およびタンパク質を指し、その例には、トランスフォーミング増殖因子β、アクチビン、ノーダル、骨形成タンパク質BMP等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、シグナル伝達分子もしくはシグナル伝達分子の経路を阻害することに関するインヒビターという用語、またはSMADシグナル伝達のインヒビターなどのシグナル伝達インヒビターという用語は、分子または経路のシグナル伝達機能を妨げるすなわち低減するか、または抑制するか、または排除するか、またはブロックする化合物または分子例えば低分子、ペプチド、ペプチドミメティック、天然化合物、siRNA、アンチセンス核酸、アプタマーまたは抗体を指す。言い換えると、インヒビターは、指定されるタンパク質シグナル伝達分子、指定されるシグナル伝達分子に関与する任意の分子、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βなどの指定される関連分子例えば本明細書で述べるシグナル伝達分子を含むが、これらに限定されないの任意の活性を変化させる任意の化合物または分子であって、一例として、SMADシグナル伝達と直接接触すること、SMADmRNAと接触すること、SMADのコンフォメーション変化を生じさせること、SMADタンパク質レベルを低下させること、またはSMADとシグナル伝達パートナー例えば本明細書で述べるものを含むとの相互作用を妨げること、およびSMAD標的遺伝子例えば本明細書で述べるものの発現に影響を及ぼすことを介して、任意の活性を変化させる任意の化合物または分子である。インヒビターはまた、上流のシグナル伝達分子を遮断することによってSMADの生物学的活性を間接的に調節する分子を含む。例えば、シグナル伝達分子および作用の例として、細胞外ドメイン内で、骨形成タンパク質を隔離し、ALK受容体1、2、3および6の活性化を阻害し、したがって下流のSMAD活性化を阻止する、ノギンが挙げられる。同じく、コーディンChordin、サーベラスCerberus、フォリスタチンFollistatinも、同様にSMADシグナル伝達の細胞外アクチベーターを隔離する。膜貫通タンパク質であるBambiも、細胞外TGFβシグナル伝達分子を隔離する偽受容体として働く。アクチビン、ノーダル、TGFβおよびBMPをブロックする抗体は、SMADシグナル伝達の細胞外アクチベーターを中和するための使用等に関して考慮される。したがって1つの実施形態では、本発明のインヒビターは、デフォルト細胞defaultcell型から非デフォルト細胞non-defaultcell型へと分化を誘導する変化させるかまたは改変する。例えば、本発明の方法の1つは、非デフォルト神経前駆細胞を生じさせる少なくとも3つのインヒビターを含む。好ましい実施形態では、本発明のインヒビターは、本発明の侵害受容器細胞を生産するために本明細書で述べるように、非デフォルト細胞型へと細胞分化を向かわせるためにデフォルトシグナル伝達を改変するまたは低下させるまたはブロックする。したがって、本発明のインヒビターは、本発明の侵害受容器細胞を生産するのに役立つシグナル分子活性の上昇または低下のための天然化合物または低分子である。インヒビターは、指定シグナル伝達分子から上流の分子に結合して影響を及ぼすこと次に指定分子の阻害を生じさせることになるによって誘導される阻害に加えて、競合的阻害別の公知の結合化合物の結合を排除または低減するように活性部位に結合するおよびアロステリック阻害化合物がそのタンパク質の活性部位に結合するのを妨げるようにタンパク質のコンフォメーションを変化させるように、タンパク質に結合するの観点から説明される。一部の場合には、インヒビターは、実際にシグナル伝達標的と接触することによってシグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路を阻害することを指す直接インヒビターと称される;例えば、γセクレターゼの直接インヒビターは、γセクレターゼタンパク質に結合するDAPT分子である。例示的な直接インヒビターには、リドカイン、ミリシトリン、慢性カプサイシンchroniccapsaicin、ショウノウ、アミロライド、カプサゼピン、リノピルジン、および全般的な神経機能をブロックする大部分の局所麻酔薬が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、細胞外シグナル伝達の影響という用語は、細胞外シグナル伝達分子例えば、本明細書で述べる低分子などの試験物質、薬学的薬剤、受容体に対するリガンド、サイトカイン、ケモカイン、可溶性因子、接着分子または他のシグナル伝達分子が細胞例えば真核細胞に及ぼす作用を指す。一部の実施形態では、細胞外シグナル伝達は、SMAD活性などのシグナル伝達活性を低減し、SMAD活性化動態を改変し、またはSMAD標的遺伝子の発現パターンを改変する。本明細書で使用される場合、SmaMothersAgainstDecapentaplegicまたはSmallMothersAgainstDecapentaplegicまたはSMADという用語は、シグナル伝達分子を指す。本明細書で使用される場合、アクチベーター、活性化することという用語は、本発明の細胞の定方向性分化を生じさせる分子を活性化するための化合物を指す。例示的なアクチベーターには、有害な熱/低温、機械的刺激、化学的刺激メントール、ピペリン、急性カプサイシン、シンナムアルデヒド、ブラジキニン、ATP、プロスタグランジン、炎症性サイトカイン、酸性生理食塩水、線維芽細胞増殖因子FGF等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、LSBという用語は、細胞においてトランスフォーミング増殖因子βTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達およびSmallMothersAgainstDecapentaplegicSMADシグナル伝達からなるシグナル伝達を低下させるかまたはブロックすることができる2つの化合物LDN-193189およびSB431542の組合せを指す。本明細書で使用される場合、SB431542という用語は、トランスフォーミング増殖因子βTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達を低下させるかまたはブロックすることができる分子であって、CAS番号301836-41-9、分子式C22H18N4O3、および4-[4-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル-5-2-ピリジニル-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミドの名称を有する分子を指し、例えば、以下の構造を参照のこと。本明細書で使用される場合、LDN193189という用語は、C25H22N6の化学式を有する、低分子DM-3189、IUPAC名称4-6-4-ピペラジン-1-イルフェニルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イルキノリンを指す。LDN193189はSMADシグナル伝達インヒビターとして機能することができる。LDN193189はまた、ALK2、ALK3およびALK6、プロテインチロシンキナーゼPTKの極めて強力な低分子インヒビターであり、I型TGFβ受容体のALK1およびALK3ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害し、骨形成タンパク質BMPBMP2、BMP4、BMP6、BMP7およびアクチビンサイトカインシグナルを含む多数の生物学的シグナルの伝達、ならびにその後のSmad1、Smad5およびSmad8のSMADリン酸化の阻害を生じさせる参照により本明細書に組み込まれる、Yuら2008NatMed14:1363-1369;Cunyら2008Bioorg.Med.Chem.Lett.18:4388-4392。本明細書で使用される場合、ドルソモルフィンという用語は、CAS番号866405-64-3、分子式C24H25N5Oおよび6-[4-[2-1-ピペリジニルエトキシ]フェニル]-3-4-ピリジニル-ピラゾロ[1,5-a]ピリミジンジヒドロクロリドの名称を有する分子を指し、例えば、以下の構造を参照のこと。本明細書で使用される場合、LSB/CまたはLSB-Cという用語は、WNTアゴニストとして働くグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βインヒビター、例えばCHIR99021に加えて、細胞のトランスフォーミング増殖因子βTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達およびSmallMothersAgainstDecapentaplegicSMADシグナル伝達からなるシグナル伝達を組合せで低下させるかまたはブロックすることができる、LDN-193189とSB431542などの2つの化合物の組合せを指す。本明細書で使用される場合、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3βインヒビターまたはGSK3βインヒビターという用語は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β酵素を阻害する化合物を指し、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Dobleら、JCellSci.2003;116:1175-1186参照。本発明の目的に関して、GSK3βインヒビターはWNTシグナル伝達経路を活性化することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Cadiganら、JCellSci.2006;119:395-402;Kikuchiら、CellSignalling.2007;19:659-671参照。本明細書で使用される場合、CHIR99021またはアミノピリミジンまたは3-[3-2-カルボキシエチル-4-メチルピロール-2-メチリデニル]-2-インドリノンという用語は、IUPAC名称6-2-4-2,4-ジクロロフェニル-5-4-メチル-1H-イミダゾール-2-イルピリミジン-2-イルアミノエチルアミノニコチノニトリルを指す。CT99021は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βの低分子化学的インヒビター/WNTシグナル伝達経路のアクチベーターの一例であり、高度に選択的であって、関連するキナーゼと無関係なキナーゼのパネルに対して千倍に近い選択性を示し、ヒトGSK3βに対してはIC50=6.7nMおよびげっ歯動物GSK3βホモログに対してはナノモルのIC50値を有する。本明細書で使用される場合、3つのインヒビターまたは3iという用語は、3つの低分子CHIR99021、SU5402およびDAPTの組合せを指す。他の実施形態では、3つのインヒビターは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βの阻害/WNTシグナル伝達のアクチベーターすなわちWNTアゴニスト、ノッチシグナル伝達インヒビター、すなわちノッチシグナル伝達を低下させることができるγセクレターゼインヒビター、および線維芽細胞増殖因子受容体の阻害すなわちインドリノン誘導体は線維芽細胞増殖因子受容体インヒビターの一例であるの組み合わせ阻害ができる、3つの化合物すなわち低分子の組合せを指す。本明細書で使用される場合、ノッチインヒビターまたはノッチシグナル伝達インヒビターという用語は、DAPT、γセクレターゼインヒビターGSI、例えばトリペプチドアルデヒドインヒビター、γセクレターゼインヒビターXIIおよびペプチドミメティックインヒビターLY-411,575などの、ノッチ活性化を阻害する能力を有する任意の化合物を指す。本明細書で使用される場合、γセクレターゼインヒビターまたはGSIという用語は、下流のノッチシグナル伝達の抑制を生じさせる、ノッチ分子の活性ドメインの生成を防ぐ新規クラスの作用物質を指す。本明細書で使用される場合、γセクレターゼインヒビターという用語は、マルチサブユニット膜貫通プロテアーゼであるγセクレターゼを阻害する能力を有する化合物を指す。γセクレターゼの標的すなわち基質の一例は、例えば、ノッチシグナル伝達であり、他のγセクレターゼ基質には、低密度リポタンパク質LDL受容体関連タンパク質、E-カドヘリンおよびErbB-4が含まれる。DAPT、γセクレターゼインヒビターXIIなどのγセクレターゼインヒビターは、それゆえ、ノッチを含むそのようなγセクレターゼ基質のタンパク質分解をブロックする。本明細書で使用される場合、DAPTという用語は、C23H26F2N2O4の化学式を有する、N-[3,5-ジフルオロフェニルアセチル]-L-アラニル-2-フェニル]グリシン-1,1-ジメチルエチルエステル;LY-374973、N-[N-3,5-ジフルオロフェナセチル-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステル;N-[N-3,5-ジフルオロフェナセチル-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステルとしても知られる、ジペプチド性γセクレターゼ特異的インヒビターと表される、ノッチを阻害するγセクレターゼインヒビターの一例を指す。DAPT誘導体の一例は、光活性化可能なDAPT誘導体、DAP-BpBN-[N-3,5-ジフルオロフェナセチル-L-アラニル]-S-フェニルグリシン-4-4-8-ビオチンアミドオクチルアミノベンゾイルベンジルメチルアミドである。本明細書で使用される場合、線維芽細胞増殖因子受容体インヒビターまたはFGFRインヒビターという用語は、SU5402、PD173074等のような低分子を指す。FGFRインヒビターの一例は、インドリノン誘導体SU5402であり、例示的な構造を以下に示す。本明細書で使用される場合、SU5402という用語は、C17H16N2O3の化学式および化学名:2-[1,2-ジヒドロ-2-オキソ-3H-インドール-3-イリデンメチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-プロパン酸を有する低分子を指す参照により本明細書に組み込まれる、Sunら1999Design,synthesisandevaluationsofsubstituted3-[3-or4-carboxyethylpyrrol-2-ylmethylidenyl]indolin-2-onesasinhibitorsofVEGF,FGFandPDGFreceptortyrosinekinases.J.Med.Chem.425120;Patersonら2004Preclinicalstudiesoffibroblastgrowthfactorreceptor3asatherapeutictargetinmultiplemyeloma.Br.J.Haematol.124595;Tanakaら2005FGF-inducedvesicularreleaseofsonichedgehogandretinoicacidinleftwardnodalflowiscriticalforleft-rightdetermination.Nature435:172。本明細書で使用される場合、誘導体という用語は、類似のコア構造を有する化学化合物を指す。本明細書で使用される場合、リガンドに関するWNTまたはウイングレスという用語は、FrizzledおよびLRPDerailed/RYK受容体ファミリーの中の受容体のような、WNT受容体と相互作用することができる分泌タンパク質の群すなわちヒトにおけるInt1integration1を指す。本明細書で使用される場合、シグナル伝達経路に関するWNTまたはウイングレスという用語は、β-カテニンで媒介されるかまたはβ-カテニンを含まない、WntファミリーリガンドおよびWntファミリー受容体FrizzledおよびLRPDerailed/RYK受容体などからなるシグナル経路を指す。本明細書で述べる目的に関して、好ましいWNTシグナル伝達経路は、β-カテニンによる媒介、すなわちWNT/β-カテニンを含む。本明細書で使用される場合、PD173074という用語は、化学名:N-[2-[[4-ジエチルアミノブチル]アミノ]-6-3,5-ジメトキシフェニルピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル]-N’-1,1-ジメチルエチル尿素を有する低分子を指す参照により本明細書に組み込まれる、Bansalら2003SpecificinhibitorofFGFreceptorsignaling:FGF-2-mediatedeffectsonproliferation,differentiation,andMAPKactivationareinhibitedbyPD173074inoligodendrocyte-lineagecells.J.Neurosci.Res.74:486。本明細書で使用される場合、組成物およびこの組成物を使用する方法に関するLSB-3iまたはLSB3iという用語は、侵害受容器を生じさせるニューロン系列細胞の定方向性分化に関して本明細書で述べる例示的な方法において使用されるような、ニューロン系列細胞を産生することができるLSB分子または等価物の組合せおよびニューロン系列細胞の定方向性分化の能力を有する3i分子または等価物を指す。本明細書で使用される場合、骨形成タンパク質またはBMPという用語は、TGFβスーパーファミリーのタンパク質中の、配列相同性に基づきGDF増殖/分化因子を含む、BMPサブファミリーのメンバーであるタンパク質および対応する遺伝子を指す例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Yamashitaら1996Bone19:569参照。BMPの例には、BMP1、BMP2等が含まれる。BMP/GDFは、アミノ酸配列相同性に基づきサブセットに分類される。分類は:1BMP-2およびBMP-4;2BMP-3およびBMP-3b;3BMP-5、BMP-6、BMP-7およびBMP-8;4BMP-9およびBMP-10;5BMP-12、BMP-13およびBMP-14;ならびに6BMP-11およびGDF-8と提案される例えば、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、Yamashitaら1996Bone19:569,Hogan1996GenesDev.10:1580,Mehlerら1997TrendsNeurosci.20:309,Ebendalら1998J.Neurosci.Res.51:139参照。TGFβスーパーファミリーのリガンドには、骨形成タンパク質BMP、増殖および分化因子GDF、抗ミュラーホルモンAMH、アクチビン、ノーダル、TGFβ等のような分子が含まれる。TGFβファミリーには:TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3が含まれる。BMPと同様に、TGFβは胚形成および細胞分化に関与するが、それらはまた、アポトーシスおよび他の機能にも関与する。それらはTGFβ受容体2型TGFBR2に結合する。本明細書で使用される場合、骨形成タンパク質受容体または骨形成タンパク質受容体II型またはBMPR2という用語は、骨形成タンパク質に結合するセリン/トレオニンキナーゼ受容体を指す。本明細書で使用される場合、LSB-Melという用語は、特異的マーカー、すなわちc-kitの発現に基づいて同定され、単離される、メラノサイト前駆細胞メラノサイト前駆体を生産するための、細胞のLSB/C処理とそれに続くBMP4およびエンドセリン-3EDN3との接触を含む、定方向性分化組成物および方法を指す。本明細書で使用される場合、成熟色素性メラノサイトという用語は、色素性メラノソームを産生する色素細胞、例えばBMP4およびcAMPと接触させた本発明のメラノサイト前駆細胞を指す。本明細書で使用される場合、胚性幹細胞という用語は、培養下で長期間分化せずに分裂することができる、着床前段階の胚から誘導され、3つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知である、原始未分化細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、ヒトである胚性幹細胞、例えばWA-09を指す。本明細書で使用される場合、胚性幹細胞系という用語は、数日間、数か月間から数年間まで分化せずに増殖することが可能である、インビトロ条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。本明細書で使用される場合、幹細胞という用語は、培養下で無限に分裂し、特異化した細胞を生じさせる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞は、ヒトである幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、ヒト胚性幹細胞またはhESCという用語は、培養下で長期間分化せずに分裂することができ、3つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知である、初期ヒト胚胚盤胞段階まで、および胚盤胞段階を含むに由来する多能性幹細胞の一種を指す。本明細書で使用される場合、全能性totipotentという用語は、身体のすべての細胞型および胎盤などの胚体外組織を構成するすべての細胞型を生じさせる能力を指す。多能性および多分化能性も参照のこと。本明細書で使用される場合、多分化能性multipotentという用語は、身体の2つ以上の細胞型へと発生する能力を指す。多能性pluripotentおよび全能性も参照のこと。本明細書で使用される場合、多能性pluripotentという用語は、内胚葉、中胚葉および外胚葉を含む生物の3つの発生胚葉へと発生する能力を指す。本明細書で使用される場合、体性成体幹細胞という用語は、自己再生実験室におけるおよび分化の両方について限られた能力を有する、多くの器官および分化組織で認められる比較的まれな未分化細胞を指す。そのような細胞の分化能力は様々であるが、通常は起源の器官における細胞型に限定される。本明細書で使用される場合、体細胞という用語は、配偶子卵子または精子以外の身体中の任意の細胞を指し、時として成体細胞と称される。本明細書で使用される場合、ニューロン系列細胞という用語は、発生の間または成体において神経系中枢および末梢の両方または神経堤細胞運命に寄与する細胞を指す。神経系には、脳、脊髄および末梢神経系が含まれる。神経堤細胞運命には、脳神経、体幹神経、迷走神経、仙骨神経および心臓神経が含まれ、中外胚葉、頭軟骨、頭蓋骨、胸腺、歯、メラノサイト、虹彩色素細胞、脳神経節、脊髄神経節、交感/副交感神経節、内分泌細胞、腸神経系および心臓の部分を生じさせる。本明細書で使用される場合、誘導多能性幹細胞またはiPSCという用語は、特定の胚性遺伝子OCT4、SOX2およびKLF4導入遺伝子など例えば、参照により本明細書に組み込まれる、TakahashiとYamanaka、Cell126,663-6762006参照が体細胞、例えばC14、C72等に導入されることによって形成される、胚性幹細胞に類似した、多能性幹細胞の一種を指す。本明細書で使用される場合、特異化した細胞という用語は、多細胞生物において特定の機能を果たす細胞の種類を指す。例えば、ニューロンなどの特異化した細胞の群は、協力して神経系などの系を形成する。本明細書で使用される場合、本発明の細胞に関する侵害受容器という用語は、活動電位および有害刺激の知覚疼痛の認知に関与するの能力を有するニューロンを指す。刺激には、温熱性刺激熱および低温、機械的刺激、化学的刺激および炎症が含まれるが、これらに限定されない。侵害受容器は、BRN3A、ISL1、TAC1、VGLUT2、SLC15A3などの、特定の遺伝子およびタンパク質を発現し、軸索様構造に沿った細胞体と2つの別個の突起と表される形態を含む細胞である。本発明の細胞に関する機能的侵害受容器は、本明細書で述べる遺伝子およびタンパク質の発現、本明細書で述べる形態を特徴とし、本明細書で述べるような活動電位を生じさせる能力を有する、定方向性分化から生じる細胞を指す。本明細書で使用される場合、ペプチド作動性ニューロンという用語は、一般に、異なるクラスのイオンチャネルの発現によって同定され、かつタキキニンなどの小さなペプチドの発現によって同定されるニューロンを指す。例えばペプチド作動性侵害受容器は、NTRK1およびタキキニンサブスタンスPを発現する。これに対し非ペプチド作動性ニューロンは、NTRK1またはサブスタンスPを発現しないニューロンを指す。本明細書で使用される場合、神経外胚葉という用語は、ニューロン系列の細胞を生じさせることができる、発生の初期または多能性幹細胞分化の間に認められる細胞または細胞運命を指す。本明細書で使用される場合、細胞増殖のマーカーという用語は、速い周期の細胞に関連する分子の発現を指し、前記分子は、典型的には成熟した遅い周期の細胞または周期がないnoncycling細胞中には存在しないすなわち活発に分裂している細胞には存在するが、長い周期時間を有する細胞または周期がない細胞中には存在しない。そのようなマーカーの例には、細胞増殖のKi67マーカー参照により本明細書に組み込まれる、Gerdesら、IntJCancer31:13-201983および有糸分裂のG2/M期のホスホヒストンH3マーカー参照により本明細書に組み込まれる、Hendzelら、Chromosoma106:348-3601997が含まれる。本明細書で使用される場合、増殖という用語は、細胞数の増加を指す。本明細書で使用される場合、分化という用語は、特異化していない胚細胞が、心臓、肝臓または筋細胞などの特異化した細胞の特徴を獲得する過程を指す。分化は、通常は細胞表面に埋め込まれたタンパク質を含むシグナル伝達経路を通して、細胞の遺伝子と細胞の外側の物理的および化学的条件との相互作用によって制御される。本明細書で使用される場合、定方向性分化という用語は、本発明の侵害受容器細胞などの、特定の例えば所望する細胞型への分化を誘導する幹細胞培養条件の操作を指す。本明細書で使用される場合、幹細胞に関する定方向性分化という用語は、多能性状態からより成熟したかまたは特異化した細胞運命例えば中枢神経系細胞、神経細胞、侵害受容器等への幹細胞の移行を促進するための低分子、増殖因子タンパク質および他の増殖条件の使用を指す。本明細書で使用される場合、細胞に関する分化を誘導するという用語は、デフォルト細胞型遺伝子型および/または表現型を非デフォルト細胞型遺伝子型および/または表現型に変化させることを指す。したがって幹細胞において分化を誘導するとは、細胞を、遺伝子型すなわちマイクロアレイなどの遺伝子分析によって決定される遺伝子発現の変化および/または表現型すなわちPAX6などのタンパク質またはHMB45陽性であるがSOX10については陰性-のようなタンパク質のセットの発現の変化など、幹細胞とは異なる特性を有する子孫細胞に分裂するように誘導することを指す。本明細書で使用される場合、分化転換transdifferentiationという用語は、1つの組織からの幹細胞または成熟細胞が別の組織の細胞へと分化する過程を指す。本明細書で使用される場合、未分化という用語は、まだ特異化した細胞型へと発生していない細胞を指す。本明細書で使用される場合、細胞分化という用語は、特異化していない細胞すなわち幹細胞がより明確な形態および機能を有するように発生または成熟する経路を指す例えば、iPSCが神経堤前駆体へと進行し、ニューロン系列の細胞へ、神経堤細胞へ、ニューロンへ、侵害受容器細胞へ、ペプチド作動性侵害受容器または神経外胚葉へ、中枢神経系の細胞へと進行する。本明細書で使用される場合、分化中の細胞系における細胞に関して使用される分化という用語は、細胞が1つの細胞型例えば多分化能性、全能性または多能性分化可能細胞から、標的分化細胞などの別の細胞型に分化する過程を指す。本明細書で使用される場合、細胞分化経路に関するデフォルトまたは受動という用語は、特異化していない細胞が、特定の化合物で処理されない場合、すなわち通常の細胞培養条件である場合、培養下で特定の分化細胞型になる経路を指す。言い換えると、デフォルト細胞は、細胞が分化細胞型を変化させることができる分子すなわちモルフォゲンと接触しない場合に生じ、例えば本発明のネスチンTUJ1-細胞である。これに対し、細胞に関する非デフォルトは、デフォルト細胞とは異なる細胞型を生じる分化細胞型を指し、すなわち非デフォルト細胞は、TUJ1ネスチン-ニューロン細胞、感覚ニューロン細胞、ペプチド作動性侵害受容器、メラノサイト等を含む、本発明の細胞のような非デフォルト条件から生じる分化細胞型である。デフォルト細胞はまた、後にデフォルト非ペプチド作動性侵害受容器となる非デフォルトTUJ1ネスチン-細胞のように、細胞がモルフォゲンと接触して非デフォルト細胞となった後、続いて形態形成性化合物が存在しなければデフォルト細胞であり得る。本明細書で使用される場合、細胞運命決定のような、細胞に関する運命という用語は、一般に、その子孫細胞がインビボまたはインビトロ培養条件に依存して様々な細胞型または少数の特定細胞型になることができる、遺伝的に決定された系列を有する細胞を指す。言い換えると、細胞の所定の運命は、細胞が別の細胞型ではなくある1つの細胞型になるように特定の分化経路へと運命づけるその環境によって決定され、例えば、神経運命を有する幹細胞の子孫細胞は、筋細胞または皮膚細胞ではなく神経細胞になる。典型的には、細胞の運命は、高度に特異的な条件下を除いて不可逆性である。別の例では、CNS運命は、中枢神経系に関連する細胞になることができる細胞を指す。逆に、神経細胞になることを運命づけられた細胞は、神経前駆細胞と呼ぶことができる。本明細書で使用される場合、神経突起伸長という用語は、細胞からの細胞質の長く伸びた、膜に包まれた突出の観察を指す。本明細書で使用される場合、ドーパミンニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンという用語は、一般に、ドーパミンを発現することができる細胞を指す。中脳ドーパミンニューロンまたはmDAは、前脳構造における推定上のドーパミン発現細胞および前脳構造におけるドーパミン発現細胞を指す。本明細書で使用される場合、神経幹細胞という用語は、ニューロンおよびグリア支持細胞を生じさせることができる、成体神経組織において認められる幹細胞を指す。グリア細胞の例には、星状細胞および希突起神経膠細胞が含まれる。本明細書で使用される場合、ニューロンという用語は、神経系の主要な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは細胞体とその突起-軸索および1つ以上の樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスにおいて神経伝達物質を放出することによって他のニューロンまたは細胞に情報を伝達する。本明細書で使用される場合、細胞培養という用語は、研究または医学的処置のための人工培地におけるインビトロでの細胞の成長を指す。本明細書で使用される場合、培地という用語は、ペトリ皿、マルチウエルプレート等のような培養容器中で細胞を覆う液体を指し、細胞に栄養を与え、支持する栄養分を含む。培地はまた、細胞に所望の変化を生じさせるために添加される増殖因子も含み得る。本明細書で使用される場合、フィーダー層という用語は、多能性幹細胞を維持するために共培養において使用される細胞を指す。ヒト胚性幹細胞培養に関して、典型的なフィーダー層には、培養下で分裂するのを防ぐように処理されたマウス胚性線維芽細胞MEFまたはヒト胚性線維芽細胞が含まれる。本明細書で使用される場合、細胞培養に関する継代という用語は、一連の細胞成長および増殖後に細胞を分離し、洗浄して、新たな培養容器に接種する過程を指す。培養細胞が通過した一連の継代の数は、その年齢および予想される安定性の指標である。本明細書で使用される場合、遺伝子またはタンパク質に関連する発現するという用語は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイ等のようなアッセイを用いて観察することができるmRNAまたはタンパク質が生じることを指す。本明細書で使用される場合、ペアードボックス遺伝子6pairedboxgene6またはPAX6という用語は、非デフォルト神経前駆細胞のマーカーを指す。本明細書で使用される場合、本発明の分化中の細胞に関するTUJ1またはニューロン特異的クラスIIIβチューブリンという用語は、神経前駆細胞などの初期神経ヒト細胞分化のマーカーを指し、PNSおよびCNSのニューロンにおいて発現が認められる。本明細書で使用される場合、本発明の分化中の細胞に関するネスチンという用語は、神経堤幹細胞およびCNS神経幹細胞のマーカーである中間径フィラメント関連タンパク質を指す。本明細書で使用される場合、SMAD分子に関するホモ二量体という用語は、ジスルフィド結合などにより、共に連結されたSMADの少なくとも2つの分子を指す。本明細書で使用される場合、EDN3という用語は、両能性グリア-メラノサイト幹細胞などの神経堤由来細胞系列で一般的に認められる細胞表面受容体EDNRBに結合するエンドセリンファミリーの内皮由来タンパク質からの分泌ペプチドを指す。EDN3アミノ酸配列の一例は:アクセッション番号NP_000105;アクセッションPI14138EDN3HUMANにおけるエンドセリン3配列番号1である:本明細書で使用される場合、ノギンという用語は、骨形成タンパク質4BMP4などの、トランスフォーミング増殖因子βTGFβスーパーファミリーのシグナル伝達タンパク質のメンバーに結合し、それを不活性化する分泌ホモ二量体糖タンパク質を指す。ノギンは、典型的にはグリコシル化されたジスルフィド結合二量体としてヒト細胞において発現される65kDaタンパク質であるGroppeら2002.Nature420,636-642;Xuら2005NatMethods2,185-190;Wangら2005BiochemBiophysResCommun330:934-942。ノギンアミノ酸配列の一例は、アクセッション番号U79163、単一アミノ酸マウスノギン配列番号2である:本明細書で使用される場合、leftyという用語は、EBAFまたは子宮内膜出血関連因子または左右軸決定因子Aとしても知られる、LEFTY1、LEFTY2、LEFTYA等を含むがこれらに限定されない、TGFβを阻害するトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーの新規メンバーを指す。leftyタンパク質は、哺乳動物における器官系の左右非対称性決定のために必要である。本明細書で使用される場合、アクチビンという用語は、アクチビンA、アクチビンB等のような、トランスフォーミング増殖因子βTGFβスーパーファミリーのメンバーを指す。本明細書で使用される場合、トランスフォーミング増殖因子βまたはTGFβという用語は、多様な細胞型の増殖と分化を調節するサイトカインを指す。本明細書で使用される場合、ノーダルという用語は、TGFβファミリーのシグナル伝達分子のメンバーを指す。ノーダルシグナル伝達は、神経外胚葉デフォルト経路に沿ったヒト胚性幹細胞の分化を阻害するVallierら、Dev.Biol.275,403-421。本明細書で使用される場合、ALKまたは未分化リンパ腫キナーゼまたは未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼまたはKi-1という用語は、膜関連チロシンキナーゼ受容体を指す。本明細書で使用される場合、I型セリン/トレオニンキナーゼ受容体に関するALK5という用語は、TGFβ1に結合して、TGFβ1受容体として機能する未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼ5受容体を指す。本明細書で使用される場合、I型セリン/トレオニンキナーゼ受容体に関するALK7という用語は、ノーダルおよびノーダル関連タンパク質に結合して、ノーダルおよびノーダル関連タンパク質受容体として機能する未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼ7受容体を指す。本明細書で使用される場合、細胞を本発明の化合物と接触させるという用語は、接触した細胞を生じさせるために、化合物を、細胞と触れることを可能にする位置に置くことを指す。接触は任意の適切な方法を用いて達成され得る。例えば、1つの実施形態では、接触は、化合物を細胞のチューブに添加することによる。接触はまた、化合物を細胞の培養物に添加することによって達成され得る。本明細書で使用される場合、付着細胞という用語は、培養容器の底部または側面に接着してインビトロで増殖する細胞を指し、付着細胞は、細胞外マトリックス分子等を介して容器と接触してもよく、付着しておらず、培養容器から細胞を取り出すために酵素の使用を必要としない懸濁培養中の細胞と異なり、この細胞を培養皿/容器から分離するためには酵素、すなわちトリプシン、ディスパーゼ等の使用を必要とする。本明細書で使用される場合、マーカーまたは細胞マーカーという用語は、特定の細胞または細胞型を同定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞のマーカーは1つのマーカーに限定されなくてもよく、複数のマーカーは、指定される群のマーカーが1つの細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から同定し得るように、マーカーのパターンを表し得る。例えば、本発明の侵害受容器細胞は、侵害受容器細胞を、あまり分化していない前駆細胞から、すなわちTUJ1陽性およびネスチン陰性侵害受容器を、非侵害受容器細胞または前駆体細胞、すなわちTUJ1陰性およびネスチン陽性細胞から区別する1つ以上のマーカーを発現する。本明細書で使用される場合、染色に関する陽性細胞という用語は、マーカーを発現し、したがってそのマーカーに関して、対照または比較細胞を上回る検出可能な定量的および/または定性的量で染まる細胞を指す。陽性細胞はまた、ネスチン等のような分子に関して染まる細胞も表し得る。本明細書で使用される場合、陰性細胞という用語は、ネスチン抗体検出法等との接触後に染まらない細胞のような、マーカーに関して検出可能なシグナルが存在しない細胞を指す。本明細書で使用される場合、DAPIという用語は、4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール2HCl蛍光染色法を指す。DAPI蛍光染色法は周知であり、数多くの例の1つとして、DAPINucleicAcidStain,2006,MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oregon,97402,USA参照。本明細書で使用される場合、レポーター遺伝子またはレポーター構築物という用語は、発色タンパク質、GFPなどの蛍光タンパク質またはβ-ガラクトシダーゼlacZ遺伝子などの酵素のような、容易に検出可能または容易にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸を含む遺伝的構築物を指す。本明細書で使用される場合、GFPという用語は、標的遺伝子の発現の指示マーカーとして典型的に使用される、細胞内での発現に際して蛍光タンパク質を生成することができる任意の緑色蛍光タンパク質DNA配列を指す。GFPの例としては、Pacificjellyfish、オワンクラゲAequoriaVictoriaなどの腔腸動物から単離されるGFP配列、およびeGFPなどのその合成配列誘導体が含まれる。試料という用語は、その最も広い意味で使用される。1つの意味では、細胞または組織を指すことができる。また別の意味では、任意の供給源から得られる検体または培養物を含むことが意図され、液体、固体および組織を包含する。環境試料には、表面物質、土壌、水および工業試料などの環境物質が含まれる。これらの例は、本発明に適用できる試料の種類を限定すると解釈されるべきではない。本明細書で使用される場合、用語精製された、精製する、精製、単離された、単離する、単離およびその文法的等価物は、試料からの少なくとも1つの汚染物質の量の低減を指す。例えば、所望細胞型は、非ニューロン細胞から単離された分化ニューロン細胞のように、望ましくない細胞型の量の対応する低減によって、少なくとも10、好ましくは少なくとも30、より好ましくは少なくとも50、さらに一層好ましくは少なくとも75、最も好ましくは少なくとも90精製される。言い換えると、精製するおよびその等価物は、試料からの特定の細胞例えば望ましくない細胞の除去を指す。例えば、本発明のTUJ1ニューロン細胞の精製集団を提供するために、TUJ1ネスチン-ニューロン細胞を、本明細書で述べるように、混合細胞集団をフローサイトメトリによってNTRK1とNTRK1-細胞に選別することにより、汚染ネスチンTUJ1-ニューロン細胞の除去によって精製する;ニューロン侵害受容器細胞も、本発明の組成物および方法を含む細胞培養の指定された方法を使用することにより、非侵害受容器細胞デフォルト細胞から精製されるかまたは選択される。非侵害受容器細胞の除去または選択は、試料中の所望侵害受容器細胞の割合の増加を生じさせる。したがって細胞型の精製は、所望細胞、すなわち試料中の侵害受容器の富化、すなわち量の増加をもたらす。物体例えば細胞、組織等および/または化学物質例えばタンパク質、アミノ酸配列、核酸配列、コドン等に適用される場合、本明細書で使用される場合、天然に生じるという用語は、その物体および/または化合物が天然に認められる/認められたことを意味する。例えば、天然に生じる細胞は、胚細胞などの、天然の供給源から単離することができる、生物中に存在する細胞を指し、ここで、前記細胞は実験室においてヒトによって意図的に改変されていない。本明細書で使用される場合、インビトロという用語は、人工環境および人工環境内で起こる過程または反応を指す。インビトロ環境は、試験管および細胞培養物に例示されるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、インビボという用語は、自然環境例えば動物または細胞および胚発生、細胞分化、神経管形成等のような自然環境内で起こる過程または反応を指す。本明細書で開示される任意の細胞に関して行われる場合、から誘導されたまたはから樹立されたまたはから分化されたという用語は、細胞系、組織中の親細胞例えば任意の操作、例えば、限定されることなく、単細胞単離、インビボでの培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染を用いた処理および/または変異誘発、モルフォゲン等のようなDNA配列でのトランスフェクション、培養親細胞中に含まれる任意の細胞の選択連続培養などによるを用いて分離された胚または液体などから得られた例えば単離された、精製された等細胞を指す。誘導された細胞は、増殖因子、サイトカイン、サイトカイン処理の選択進行、接着性、接着性の欠如、選別手順等に対する応答によって混合集団から選択することができる。本明細書で使用される場合、細胞という用語は、単細胞ならびに細胞の集団すなわち2つ以上を指す。集団は、ニューロン細胞の集団または未分化胚細胞の集団などの、1つの細胞型を含む純粋な集団であり得る。あるいは、集団は、2つ以上の細胞型、例えば混合細胞集団を含み得る。集団中の細胞数を限定することは意図されず、例えば細胞の混合集団は少なくとも1つの分化細胞を含み得る。1つの実施形態では、混合集団は少なくとも1つの分化細胞を含み得る。本発明では、細胞集団が含み得る細胞型の数に制限はない。本明細書で使用される場合、高度に富化された集団という用語は、比較集団よりも高いパーセンテージまたは量でマーカーを発現する、培養皿中の細胞の集団などの細胞の集団を指し、例えば、LSBに接触した細胞培養物を2日目にCHIR/SUまたはCHIR/DAPTで処理すると、SU/DAPTでの処理と比較して高度に富化された集団を生じる。細胞生物学cellbiologyまたはcellularbiologyという用語は、細胞の解剖学的構造および機能、例えば細胞の生理的性質、構造、小器官、およびそれらの環境との相互作用、それらの生活環、分裂および死などの、生細胞の研究を指す。関心対象のヌクレオチド配列という用語は、その操作が、当業者により、何らかの理由で例えば疾患を処置する、改善された品質を与える、宿主細胞における関心対象のタンパク質の発現、リボザイムの発現等望ましいと判断され得る任意のヌクレオチド配列例えばRNAまたはDNAを指す。そのようなヌクレオチド配列には、構造遺伝子例えばレポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、がん遺伝子、薬剤耐性遺伝子、増殖因子等のコード配列、mRNAまたはタンパク質産物をコードしない非コード調節配列例えばプロモーター配列、ポリアデニル化配列、終結配列、エンハンサー配列等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、関心対象のタンパク質という用語は、関心対象の核酸によってコードされるタンパク質を指す。遺伝子という用語は、ポリペプチドまたは前駆体例えばプロインスリンの産生のために必要なコード配列を含む核酸例えばDNAまたはRNA配列を指す。ポリペプチドは、完全長コード配列によって、または、完全長もしくはフラグメントの所望活性もしくは機能特性例えば酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等が保持されている限り、コード配列の任意の部分によってコードされ得る。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域を包含し、かつ5’および3’末端の両方においてコード領域に隣接して位置する配列末端上の約1kb以上の距離にわたり、これにより、遺伝子が完全長mRNAの長さに対応するを含む。コード領域の5’側に位置し、mRNA上に存在する配列を5’非翻訳配列と称する。コード領域の3’側または下流に位置し、mRNA上に存在する配列を3’非翻訳配列と称する。遺伝子という用語は、cDNAおよびゲノム形態の遺伝子の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、イントロンまたは介在領域または介在配列と称される非コード配列で分断されたコード領域を含む。イントロンは、核RNAhnRNAに転写される遺伝子のセグメントである;イントロンはエンハンサーなどの調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または一次転写産物から除去されるかまたはスプライシングによって除去される;イントロンは、それゆえ、メッセンジャーRNAmRNA転写産物中には存在しない。mRNAは、翻訳の間、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を指定するように機能する。本明細書で使用される場合、遺伝子発現という用語は、遺伝子内にコードされる遺伝情報を、遺伝子の転写を介してすなわちRNAポリメラーゼの酵素作用によってRNA例えばmRNA、rRNA、tRNAまたはsnRNAに変換する過程、およびタンパク質をコードする遺伝子については、mRNAの翻訳を介してタンパク質に変換する過程を指す。遺伝子発現はこの過程の多くの段階で調節され得る。上方調節または活性化は、遺伝子発現産物すなわちRNAまたはタンパク質の産生を増大させる調節を指し、下方調節または抑制は、産生を減少させる調節を指す。上方調節または下方調節に関与する分子例えば転写因子は、しばしば、それぞれアクチベーターおよびリプレッサーと呼ばれる。本明細書で使用される場合、をコードする核酸分子、をコードするDNA配列、をコードするDNA、をコードするRNA配列およびをコードするRNAという用語は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチドタンパク質鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。DNAまたはRNA配列は、したがって、アミノ酸配列をコードする。単離されたオリゴヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドにおけるように、核酸に関して使用される場合の単離されたという用語は、その天然供給源において通常付随している少なくとも1つの成分または夾雑物から同定され、分離されている核酸配列を指す。単離された核酸は、それが天然で認められるのとは異なる形態または状況で存在する。これに対し、単離されていない核酸は、天然で存在する状態で認められるDNAおよびRNAなどの核酸である。例えば、所与のDNA配列例えば遺伝子は、宿主細胞の染色体上で隣接遺伝子の近傍に認められ;特定のタンパク質をコードする特定のmRNA配列などのRNA配列は、多数のタンパク質をコードする数多くの他のmRNAとの混合物として細胞内で認められる。しかし、所与のタンパク質をコードする単離された核酸は、一例として、所与のタンパク質を通常発現する細胞内の核酸であって、核酸が天然の細胞とは異なる染色体位置にあるか、または天然で認められるものとは異なる核酸配列が隣接している、核酸を含む。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは最小限でもセンス鎖またはコード鎖を含むがすなわちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であり得る、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み得るすなわちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であり得る。本明細書で使用される場合、本発明の細胞に関するメラノサイトという用語は、一般に、PSCに由来する細胞を指し、例えば、初期メラノサイトが挙げられ、これは、Sox10、HMB45、c-kit、必須のメラノサイト転写因子MITF-MまたはMITFM、小眼球症関連転写因子MITFのアイソフォーム、メラノサイトにおいて発現される塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスロイシンジッパー転写因子ファミリーのメンバー、チロシナーゼTYR、チロシナーゼ関連タンパク質1TYR-1、TYR関連タンパク質2/ドーパクロムトートメラーゼDCT等を含むマーカーの群を発現し、プレメラノソームpremelosomeおよび/またはメラノソームを含有し、明らかな色素肉眼でまたは顕微鏡検査によって観察されるを伴うかまたは伴わない。成熟メラノサイトは、典型的には色素性メラノソームを含み、チロシナーゼ陽性であり、チロシナーゼ関連タンパク質1TRP1等のようなメラノサイトタンパク質を発現する。本明細書で使用される場合、本発明の細胞に関する初期メラノサイトまたはメラニン芽細胞またはメラノサイト前駆体またはメラノサイト前駆細胞という用語は、成熟メラノサイトへとさらに分化することができる、Sox10::GFPおよびMITFならびにc-kitを共発現する細胞を指す。1つの実施形態では、Sox10::GFPは推定上のメラノサイト前駆体のマーカーである。別の実施形態では、c-kitは推定上のメラノサイト前駆体のマーカーである。さらなる実施形態では、Sox10::GFP/c-kit二重陽性細胞は、推定上のメラノサイト前駆体細胞である。本明細書で使用される場合、本発明の細胞に関するHMB45という用語は、初期段階メラノサイトすなわち未熟メラノサイト、網膜色素上皮の色素細胞に分化することができる細胞、未熟メラノソームを含む成熟メラノサイトなどの、プレメラノソーム糖タンパク質、すなわちヒトPmel17参照により本明細書に組み込まれる、Theosら、PigmentCellRes.2005.185:322-36を発現する細胞を指す。本明細書で使用される場合、疾患モデリングという用語は、障害の結果としてヒトにおいて認められる特定の徴候または症状を模倣するために実験生物またはインビトロ細胞培養物を使用する過程を指す。1つの実施形態では、神経障害を生じさせる遺伝子変異を有するヒトに由来するヒト多能性幹細胞を増殖させ、そのヒトにおいて認められるのと類似の欠陥を保持する神経細胞へと分化させることができる。発明の詳細な説明本発明は、幹細胞生物学の分野、特に、ヒト胚性幹細胞hESC、ヒト誘導多能性幹細胞hiPSC、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的に分化することができる任意の他の細胞を含み得るが、これらに限定されない、多能性または多分化能性幹細胞の系列特異的分化に関する。特に、新規培養条件を用いてhESCおよび/またはhiPSCの系列特異的分化を侵害受容器すなわち侵害受容器細胞へと向かわせる方法を述べる。本発明の方法を用いて作製される侵害受容器は、インビトロでの薬剤発見アッセイにおける使用、疼痛研究における使用、および末梢神経系PNSの疾患または損傷を逆転させる治療薬としての使用を含むが、これらに限定されない、様々な用途に関してさらに考慮される。さらに、疾患モデリングにおける使用のためにヒト多能性幹細胞からメラノサイトを生産するための組成物および方法を提供する。本明細書に含まれる説明から、当業者は、本発明の本質的特性を容易に確認することができ、またその精神および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用途および条件に適合させ、本発明を最大限に利用するために本発明に変更および修正を加えることができる。以下で述べる実施形態および実施例は、単に例示と解釈されるべきであり、いかなる意味においても本発明の範囲の限定と解釈されるべきではない。発明者は以前に、幹細胞の分化を神経細胞集団へと向かわせる二重SMAD阻害の使用を開示しており、CNSと神経堤子孫の比率は処置開始の時点での細胞の集密度に依存し;高い平板培養密度、すなわち高い集密度はCNS子孫を生じ、一方低い平板培養密度、すなわち低い集密度は神経堤子孫を生じることを開示した。発明者はさらに、分化したCNSニューロン子孫の機能的ドーパミン作動性ニューロンへのパターン形成が達成できることを開示した。本明細書で述べる本発明は、神経堤由来細胞系列である機能的侵害受容器を、連続的な、SMADシグナル伝達の阻害、次いでFGFおよびノッチシグナル伝達の阻害ならびにWntシグナル伝達の活性化により、高密度平板培養された胚性または体性幹細胞から約10日間で直接分化させることができ、そしてそのような機能的侵害受容器をインビトロで7日間以上維持することができるという予想外の新規観察を開示する。特に、ヒト多能性幹細胞の定方向性分化において使用する化合物を発見するためにコンビナトリアル低分子スクリーニングを行った。このスクリーニングの間に、PSCを有糸分裂後ニューロンに変換する低分子が見出された。具体的には、経路インヒビターである5つの低分子、すなわちSB431542、LDN-193189、CHIR99021、SU5402およびDAPTの組合せが、本明細書で述べる特定の試験条件下で、いかなる組換え増殖因子も存在せずに、10日以内の分化でhPSCから>75の効率でニューロンを生成するのに十分であることが発見された。したがって、本発明の組成物キットを含むおよび方法の使用は、hPSCからペプチド作動性侵害受容器の少なくとも50の収率、または少なくとも60、または少なくとも70、または少なくとも75の効率をもたらす。生じたこれらのヒトニューロンは、NTRK1、BRN3A、ISL1、NEUROG1、サブスタンスPおよびCGRPを含む侵害受容感覚ニューロン運命の標準的なマーカーを発現した。この低分子に基づくニューロン運命獲得の加速は、通常のインビボ発生と比較して3~5倍速い時間枠内で起こり参照により本明細書に組み込まれる、Bystronら、NatNeurosci9:880-8862006、特定のシグナル伝達経路の阻害がヒトニューロン細胞発生の時期を加速するのに十分であることを示した。ペプチド作動性侵害受容器のこの迅速で潜在的に拡大可能なすなわち多数の成熟感覚ペプチド作動性侵害受容器ニューロンを生産するためのバッチ処理、高い効率の誘導は、ヒト疼痛知覚の研究における使用のための医学的に適切な細胞型を生産するためのこの新規方法への前例のないアクセスを可能にした。コンビナトリアル低分子スクリーニングは、hPSC生物学における新しい世代の定方向性分化戦略のための強力な方法ツールである。10日以内の成熟感覚ペプチド作動性侵害受容器ニューロンのインビトロ生産のための組成物および方法のこの発見は、成熟感覚ニューロンを生産するために現在の方法よりも有意に少ない時間を示す。この発見以前には、hPSCからの有糸分裂後ニューロンのインビトロ誘導は、典型的には30日間以上続く長い培養期間を必要とした参照により本明細書に組み込まれる、Zhangら、MethodsMolBiol584:355-3662010;Elkabetzら、GenesDev22:152-1652008。この時間のかかるhPSCのインビトロ分化は、インビボでのヒト発生の時系列を反映すると考えられたPerrier,ProcNatlAcadSciUSA101:12543-125482004。そこで、1つの実施形態では、成熟ペプチド作動性侵害受容器ニューロンを生産するための組成物および方法は、5つの化合物の少なくとも1つ、すなわちSB431542、LDN-19318または等価物との初期接触後30日未満の培養を含む。したがって、ペプチド作動性侵害受容器は、5つの化合物の少なくとも1つとの初期接触後29日未満、25日未満、20日未満、15日未満、12日未満、および10日未満で入手され得る。ヒト発生の遅い速度を克服するインビトロ戦略を同定することは、基礎生物学およびヒト疾患モデリングにおいてhPSCの最大の可能性を実現するための重要な課題である参照により本明細書に組み込まれる、Saha,CellStemCell5,584-5952009。発明者は本明細書において、多能性細胞を成熟ニューロンに変化させるための低分子に基づく新規方法の発見を述べる。そこで1つの実施形態では、多能性細胞を成熟侵害受容器細胞への分化に向かわせる。さらに、発明者は、様々な形態および高い数で成熟ニューロン、すなわち侵害受容器細胞を生産するための物質および方法を述べる。I.ニューロン前駆体系列細胞を誘導するための細胞培養法:ヒト多能性幹細胞をSB431542およびLDN-193189と接触させることにより、ニューロン系列細胞が生産された。以下の実施例は、本発明の開発の間に使用するニューロン系列の細胞を提供するための例示的な方法を述べる。二重SMAD阻害は、以前にhPSCからある1種のニューロン系列細胞を誘導するための迅速で極めて有効な方法として使用された参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、NatBiotechnol272009。ノギンを含む分子によって誘導されたこれらのニューロン系列細胞は、中枢神経系細胞、すなわち神経細胞運命への発生を可能にするデフォルト経路を有していた。補足試験は、ノギンの代わりに低分子ドルソモルフィンDMを使用することにより、少なくとも一部には類似の細胞が生産されるが、培養物の一貫性consistencyに差があることを報告した参照により本明細書に組み込まれる、Kimら、RobustenhancementofneuraldifferentiationfromhumanESandiPScellsregardlessoftheirinnatedifferenceindifferentiationpropensity.StemCellRev6,270-2812010;Zhouら、High-EfficiencyInductionofNeuralConversioninhESCsandhiPSCswithaSingleChemicalInhibitorofTGF-betaSuperfamilyReceptors.StemCells,5042010。発明者は、LDN処理細胞と同じ発生段階、同じマーカーの大部分の発現、および様々なニューロン系列を作製する類似の発生可能性の能力を示すにも関わらずノギンを用いて生成された細胞は、LDNを用いて誘導された神経細胞と比較して、前後軸において前方であることすなわちより前脳、より多くの細胞がFOXG1を発現する等などの相違も示すことを認めた。そこで、数あるシグナル伝達経路の中でも特にBMPを阻害するためにノギンの代わりにLDNを使用したが、ノギンとLDNは、BMPを阻害すること以外に、異なる他の種類の活性を有すると考えられる。一部にはノギンを使用することの高コストのゆえに、発明者は、BMPインヒビターの使用が神経細胞運命の細胞を生産する際にノギンの代わりになり得ると考えた。そのため、hPSCから原始神経外胚葉、神経細胞運命を有する細胞、すなわちCNS細胞を生成するために、SB431542と組み合わせて、低分子BMPインヒビター、LDN-193189参照により本明細書に組み込まれる、Yuら、NatMed14,1363-13692008を使用し、本発明の開発の間にノギンに取って代わることを認めた図2A。この組合せ処理を、これら2つのインヒビターLDN-193189とSB431542の組合せに関してLSBと称した。一般に、細胞分化は、SMADシグナル伝達の二重阻害で高集密度単層のhESまたはhiPSを処理することによって開始された。好ましい実施形態は、50~100の集密度パーセンテージを利用し、最も好ましい実施形態は70~80の集密度を利用する。本発明の好ましい集密度を達成するために必要な初期平板培養密度が、細胞型、大きさ、平板培養効率、生存率、接着および当業者の側に過度の実験を課すことなく経験的に決定することができる他のパラメータに依存することは当業者に明らかである。SMADの二重阻害は、ノギン、SB431542、LDN193189、ドルソモルフィン、またはTGFβ、BMPおよびアクチビン/ノーダルシグナル伝達をブロックする他の分子を含む様々な化合物を用いて達成できる。好ましい実施形態は、SB431542およびLDN193189集合的にLSBを、0.1μM~250μM、より好ましくは1~25μM、最も好ましくは10μMのSB431542および10~5000nM、最も好ましくは100~500nMのLDN193189の濃度で含む組成物を利用する。II.定方向性分化における使用のための化合物:本発明のニューロン系列細胞を使用して低分子をスクリーニングすることにより、定方向性分化における使用のための低いPAX6および高いTUJ1ニューロン細胞を生じる化合物がもたらされた。以下の実施例は、定方向性分化における使用のための低分子候補化合物をスクリーニングするために実施例IIからのニューロン系列の例示的細胞を使用することを述べる。具体的には、二重SMAD阻害LSBに関連して、すなわちヒトES細胞を、約400の条件下で候補化合物すなわち低分子をスクリーニングするためにヒトES細胞から出発する有糸分裂後ニューロンマーカーの獲得を加速し得る低分子の組合せを見出すため、最初にLSBLDN-193189およびSB431542で処理した。CNSに発生することができる細胞を決定するために細胞運命を決定するために、発生試験において重要であることが公知であり、しばしば使用される細胞シグナル伝達経路例えばFGF、ノッチ、WNT、SHHソニックヘッジホッグ等のようなシグナル伝達経路を標的とする変化させる分子から候補化合物を選択した。一例として、4種のインヒビターすなわちSU/DAPT/CHIR/シクロパミンをLSB処理からの異なる日に異なる組合せで試験した細胞培地中の細胞に供給した。各々の処理を、次に、10日目にTUJ1/PAX6発現に関してスクリーニングした。処理条件の一例として、LSBを毎日供給し、4日目から10日目まで毎日CHIRおよびSUを培地に添加して細胞に供給した。一般に、スクリーニング処理の結果は、死細胞を含む多数の培養物を生じさせた。言い換えると、このスクリーニングにおける生存可能な培養条件は、非生存可能条件すなわち細胞死よりもはるかに低い頻度であることが分かった例えばSU/DAPTを初期培養物に、すなわち2日目より前に添加した場合。発明者は、CNS幹細胞は生存のためにFGFシグナル伝達およびγセクレターゼ活性/ノッチシグナル伝達に依存し、そのためCHIRが存在しない場合、SU/DAPTが細胞をCNSから神経堤に切り替わるように誘導したとき、切り替わるのではなく、細胞が死亡したと考えた。LSBの添加後10日目に、スクリーニングの間生存した細胞をヒト神経外胚葉マーカーPAX6参照により本明細書に組み込まれる、Zhangら、CellStemCell7,90-1002010の喪失およびTUJ1発現によるニューロン分化の開始参照により本明細書に組み込まれる、Leeら、CellMotilCytoskeleton17,118-1321990に関して観察した。細胞を、免疫蛍光immunoFにより、ニューロンTUJ1に関して染色し、PX6のC末端に結合する抗体を使用して神経外胚葉の喪失より少ないPAX6細胞の観察に関して染色した。このスクリーニングをインヒビターの数多くの組合せ例えばSU、SU/DAPT、SU/DAPT/CHIR、DAPT/CHIR、SU/CHIR、SU/シクロパミン等で実施し、それらを組合せの日例えば0~10日目、1~10日目、2~10日目、3~10日目等に様々な毎日の供給物に添加した。一般に、最も高い量のTUJ1/PAX6-染色を示す条件および化合物を、さらなる分析のための細胞を提供することについての成功として選択するために、各々の処理によって生成された細胞のTUJ1/PAX6-染色の相対的な量を観察することによって結果を決定した。細胞の免疫染色によりTUJ1/PAX6-である細胞を生産するためのスクリーニング試験において失敗とみなされた低分子の一例はシクロパミンであった。シクロパミンは、それをいつ添加した場合でも、TUJ1/PAX6染色を生じさせることに関して細胞に影響を及ぼさないと思われた。言い換えると、細胞形態は、免疫蛍光により10日目にLSB単独で処理した細胞と同様のままであったすなわち>90PAX6および<10TUJ1。しかし、スクリーニングの間に、発明者は、LSB処理の2日目に添加した3つの低分子の特定の組合せSU5402、CHIR99021およびDAPT;3つのインヒビターについて3iと称するが図6AおよびB、分化の10日目にhPSCにおいてPAX6発現を無くし、TUJ1を誘導することを発見した図2AおよびB。LSB処理の2日目において処理細胞はまだ、神経細胞運命を有することまたは神経細胞運命へと発生する能力を有することに関して不明であったので、これは驚くべき発見であった。その代わりに、3i処理は細胞を神経細胞運命から離れて神経堤細胞へと向かわせ、それらは本発明の侵害受容器細胞へとさらに分化した。次に、いずれのシグナル伝達経路がPAX6TUJ1-ヒトES細胞集団をPAX6-TUJ1集団に変換することに関与すると考えられるかを見出すために、これらの低分子の各々に関する機能を検討した。最初に、SU5402は、VEGF、FGFおよびPDGFチロシンキナーゼシグナル伝達の強力なインヒビターと報告された参照により本明細書に組み込まれる、Sunら、JMedChem42,5120-51301999。そこで一般に、低分子の少なくとも1つはFGFRシグナル伝達経路を阻害することに関与すると考えられた。第二に、CHIR99021は、GSK-3βの選択的阻害β-カテニンを安定化するによるWNTアゴニストと報告された参照により本明細書に組み込まれる、Bennettら、JBiolChem277,30998-310042002。そこで一般に、低分子の少なくとも1つはグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3βを阻害することに関与すると考えられた。1つの実施形態では、この低分子は選択的に、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3β阻害などを介して、WNTシグナル伝達経路の少なくとも1つを活性化することができる。そして第三に、DAPTは、ノッチシグナル伝達をブロックすることができるγセクレターゼインヒビターと報告された参照により本明細書に組み込まれる、Doveyら、JNeurochem76,173-1812001。そこで一般に、低分子の少なくとも1つは少なくとも1つのノッチシグナル伝達経路を阻害することに関与すると考えられた。そこで1つの実施形態では、低分子の1つは非選択的または汎ノッチインヒビターpan-Notchinhibitorと考えられた。別の実施形態では、インヒビターの1つは、少なくとも1つのノッチシグナル伝達経路をブロックすることができる、γセクレターゼ分子のインヒビターである。それゆえ、1つの例示的な実施形態では、インヒビターの組合せは、本発明のPAX6-TUJ1ヒトニューロン細胞を生産するために、FGFRシグナル伝達経路を阻害することに関与する少なくとも1つの低分子、少なくとも1つのノッチシグナル伝達経路を阻害することに関与する少なくとも1つの低分子、およびWNTシグナル伝達経路の少なくとも1つを活性化しつつGSK3βを阻害することに関与する少なくとも1つの低分子を含む。さらなる実施形態では、インヒビターの1つは、ノッチシグナル伝達経路中の少なくとも1つのγセクレターゼ分子をブロックすることができた。A.LSB-3i:FGFおよびノッチシグナル伝達の2つのインヒビターとWntシグナル伝達のアクチベーターとの組合せはTUJ1ニューロン細胞を生産した。FGFおよびノッチシグナル伝達のインヒビターおよびWntシグナル伝達のアクチベーターを、LSB処理の開始の約2、3、4、5、6または7日後に添加した。FGFシグナル伝達の阻害は、SU5402、PD-161570、PD-173074、スラミンまたはFGFシグナル伝達経路をブロックする他の分子を含む様々な化合物を用いて達成することができる。ノッチシグナル伝達の阻害は、DAPT、L-685,458、化合物E、MK0752またはノッチシグナル伝達経路をブロックする他の分子を含む様々な化合物を用いて達成できる。Wntシグナル伝達の活性化は、CHIR99021、LiCl、TDZD-8、組換えWntまたはWntシグナル伝達経路を活性化する他の分子を含む様々な化合物を用いて達成できる。好ましい実施形態は、CHIR99021、DAPTおよびSU5402集合的に3iを、0.3~100μM、より好ましくは3~10μM、最も好ましくは3μMのCHIR99021;1~100μM、最も好ましくは10μMのDAPT;および0.5~200μM、より好ましくは5~20μM、最も好ましくは10μMのSU5402の濃度で含む組成物を利用する。LSBと3iの組合せで処理した幹細胞を11日目に固定し、生存率とニューロンマーカーTUJ1の発現に関して検査した。LSB処理の2日目に3iで処理しておいた集団は、最も高い生存率ならびにニューロンマーカーTUJ1の高発現を生じたが、LSB処理の5日後に3iで処理しておいた集団は、細胞毒性および細胞死を示した図6A。驚くべきことに、LSB処理後2日目に、細胞集団は、Oct4の発現が高いのでまだ前駆体様のままである図6B。LSB処理後6日目になってから、神経拘束neuralcommitmentマーカーPax6が発現される;しかし3iでの6日目の処理は細胞毒性をもたらし、それによりLSBと3i処理の組合せによって誘導されたニューロン集団は多能性幹細胞から直接分化しており、ニューロン中間体からではないことを指示する。それゆえ、3iでの処理の好ましい実施形態はLSB処理後1~4日目の間であり、3iでの処理の最も好ましい実施形態はLSB処理後2日目である。加えて、3i組成物の3つの成分すべてが分化ニューロンの最大収率のために必要である図2E。TUJ1ニューロン細胞は細胞増殖マーカーの発現の喪失を示す。以下の実施例は、TUJ1ニューロン細胞の成熟細胞周期段階を決定するための例示的な方法を述べる。成熟後、培養下で生産されたニューロンは有糸分裂を受けることを停止し、それぞれ細胞増殖参照により本明細書に組み込まれる、Gerdesら、IntJCancer31,13-201983および有糸分裂のG2/M期参照により本明細書に組み込まれる、Hendzelら、Chromosoma106,348-3601997のマーカーであるKi67およびホスホヒストンH3PHH3を喪失した。それゆえ、3iと組み合わせたLSBすなわちLSB3iを使用して生産された細胞をより低い密度、約10~100,000細胞/cm2に継代し、個々の細胞において、発現をより良好に評価するために固定した後、細胞増殖マーカーKi67およびホスホヒストンH3PHH3に関して試験した。特に、Ki67の発現は増殖の良好な予測因子であることが公知であった。そこで、3i化合物を伴わないLSB中で培養した細胞と比較して、12日後に、3iの存在下で培養された細胞では、より少ない細胞それぞれ50および16がKi67およびpHH3細胞を示した図2C~F。LSB/CHIRCHIR99021:C、SU/DAPTSU5402/DAPT、SU/CHIRSU5402/CHIR99021、DAPT、SUSU5402、CHIRに加えて、対照としてLSB単独と比較して、LSB3iを使用したニューロン分化の効率パーセンテージを定量化するため、神経前駆体のマーカーであるネスチンおよびニューロン分化のマーカーであるβ3-チューブリンTUJ1についての細胞間FACSintercellularFACS染色を実施した図2G。LSB、SU/DAPT、DAPT、SUおよびCHIRの存在下では、大部分の細胞がネスチンを発現した。特に、LSB細胞集団の>95がネスチンであった。数多くの細胞が二重SMAD阻害後にネスチン染色を示したが定量化されず、一方より長期間、すなわち19日間培養した細胞はTUJ1ニューロンを示し、これらの細胞の大部分が、チロシンヒドロキシラーゼTHを共発現し、このことは、潜在的なドーパミン作動性ニューロンを同定する参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、NatBiotechnol272009。逆に、LSBに接触した細胞を2日後に3i化合物と接触させた場合、10日後に約25の細胞がネスチンを発現し、約75の細胞がTUJ1を発現して、短期間、すなわち19日未満の細胞培養後のニューロン細胞運命への効率的な変換を明らかにした。驚くべきことに、LSB処理、次いで2日後に細胞をCHIR99021およびDAPTまたはSUのいずれか1つと接触させることにより、細胞集団の50をTUJ1細胞へと分化させた。3つのインヒビターの各々をLSB処理後に単独で使用した場合、20以下の細胞がTUJ1であった。それゆえ、CHIR99021は、この細胞集団のTUJ1ニューロン細胞への定方向性分化の鍵となる寄与因子であることが発見された。発明者は、ネスチンTUJ1-細胞のネスチン-TUJ1ニューロン細胞への定方向性分化が、FGF受容体経路またはノッチシグナル伝達経路内のγセクレターゼのいずれかを阻害することに加えて、WNTシグナル伝達経路の少なくとも1つを活性化しつつGSK3βを阻害することに依存すると考えた。さらに、3i化合物の添加は、さらに25のネスチン-TUJ1ニューロン細胞の変換を生じさせた。図2G参照。要約すると、LSB処理の2日後に3i処理する好ましい実施形態から誘導されるニューロン集団をさらに検討した。この集団は、LSB単独で処理した細胞と比較してニューロンマーカーTUJ1の高発現図2A、BならびにKi67の喪失図2C、Dを示した。Ki67の喪失は、有糸分裂後分化ニューロンの特徴である細胞周期中の細胞の減少を示す。加えて、FACS分析は、LSBと3iからなる好ましい組成物で処理した細胞集団の75超がTUJ1を発現し、これに対してLSB単独で処理した集団の99が前駆体マーカーであるネスチンを発現することを明らかにした図2G。LSB処理の2日後に3i処理する好ましい実施形態から誘導されるニューロン集団をさらに検討した。この集団は、LSB単独で処理した細胞と比較してニューロンマーカーTUJ1の高発現図2A、BならびにKi67の喪失図2C、Dを示した。Ki67の喪失は、有糸分裂後分化ニューロンの特徴である細胞周期中の細胞の減少を示す。加えて、FACS分析は、LSBと3iからなる好ましい組成物で処理した細胞集団の75超がTUJ1を発現し、これに対してLSB単独で処理した集団の99が前駆体マーカーであるネスチンを発現することを明らかにした図2E。B.TUJ1ニューロン細胞はCNS細胞マーカーではなくPNS細胞マーカーを発現した。以下の実施例は、本発明の開発の間に生産されるTUJ1陽性ニューロンの種類を同定するための例示的な方法を述べる。LSB処理の2日後に3i処理する好ましい実施形態から得られるニューロンのサブタイプをさらに特性づけるため、TUJ1陽性集団を様々なニューロンサブタイプのマーカーに関して染色した。具体的には、二重SMAD阻害プロトコールは、FOXG1フォークヘッドボックスタンパク質G1を発現する前脳前部正体anteriorforebrainidentityに偏ったPAX6神経上皮細胞を生成することが公知であった参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、NatBiotechnol272009。それゆえ、LSB3i処理後のニューロンサブタイプ正体を決定するために、細胞を10日目により低い密度、約10~100,000細胞/cm2に継代し、12日目に一連のマーカー発現に関して評価した。予想されるニューロン型はCNS運命であったので、試験した初期マーカーの大部分はCNS型細胞の同定のためのものであった。実際に、LSB細胞はこのサブタイプPAX6、FOXG1陽性がデフォルトであるので、CNS前脳ニューロンが予想された。驚くべきことに、PNS細胞のマーカーであるISL1の染色が見出される前に、CNSマーカーについて少なくとも12の陰性結果例示的な10を以下に示すが得られた。ISL1は、運動ニューロンおよび末梢感覚ニューロンによって発現される。BRN3A発現を試験し、LSB/3i細胞によって発現することを認めた。それゆえ、発明者は、末梢感覚ニューロンの発生を示すBRN3A/ISL1ニューロンを発見した。以下の表A参照。表A:以下の遺伝子/タンパク質のリストは、本明細書で述べるLDN/3i誘導分化を使用して、細胞に関して陽性である発現されると予想された数多くのCNS運命分子を示す。しかし、これらの結果は例示的なCNSマーカーの欠如を示し、前記結果は、PNS系列に関する潜在的マーカー、すなわちISL1およびBRN3Aのその後の観察によって支持された。驚くべきことに、ISL1およびBRN3Aの均一な発現赤色/細胞内のより暗い領域図3AおよびBが本発明のTUJ1細胞緑色/赤色染色に比べてより明るい細胞体で認められた。ISL1およびBRN3Aは感覚ニューロンについての鍵となるマーカーであるそのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、ISL1:Sunら、NatNeurosci11,1283-12932008;BRN3A:Gerreroら、ProcNatlAcadSciUSA90,10841-108451993。この発見は、LSB3i処理から生じるニューロンがCNS細胞ではなくPNSであることを示した。これらの結果は、CNS前脳ニューロンサブタイプPAX6、FOXG1陽性がデフォルトであるLSB細胞と対照的であった。先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の高い集密度はCNS由来ニューロン集団を生じさせるはずであるので、これは極めて予想外の観察である。しかし、侵害受容器は神経堤細胞集団に由来し、神経堤細胞集団は、先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の低い集密度に由来する。言い換えると、予想は、LSB処理の開始の時点で>20,000細胞/cm2の多能性幹細胞という高い初期平板培養密度は拘束CNSニューロン集団を生じさせるというものであった。これに対し、神経堤細胞を生じさせるには約10,000細胞/cm2という低い初期平板培養密度が必要であることは公知であったその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、NatureBiotech,2009図4の下半分参照。LSB処理の2日後に3i処理する好ましい実施形態から得られるニューロンのサブタイプをさらに特性づけるため、TUJ1陽性集団を様々なニューロンサブタイプのマーカーに関して染色した。この集団は、ISL1、BRN3A、RETおよびRUNX1の発現に関して陽性であった図3A~D。FACS分析は、これらのニューロンの60超がNTRK1に関して陽性であることを明らかにした図3E。これらのマーカーは集合的に、ニューロン集団が末梢感覚ニューロン、特に侵害受容器であることを示す。先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の高い集密度はCNS由来ニューロン集団を生じさせるはずであるので、これは極めて予想外の観察である。しかし、侵害受容器は神経堤細胞集団に由来し、神経堤細胞集団は、先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の低い集密度に由来する。それゆえ、2日目の3i処理とLSBの組合せの好ましい実施形態は、神経堤由来集団、すなわち侵害受容器の予想外の形成を生じさせる。本発明の一般性を確立するため、発明者は、hiPSCを幹細胞の供給源として使用して、LSB処理の2日後に3i処理を組み合わせる本発明の好ましい実施形態を反復した。現行技術はhiPSCを生産する多くの方法を述べており、当業者に公知である。LSB、次いで2日目に3iで処理した、高集密度で平板培養したhiPSC細胞は、侵害受容器マーカーISL1、BRN3A、RETおよびRUNX1に関して陽性のニューロン細胞の形成をもたらす図4A~D。C.PNSTUJ1ニューロン細胞は侵害受容器-ペプチド作動性細胞マーカーを発現した。以下の実施例は、本明細書で述べる方法を用いていずれの型の末梢神経系PNSニューロンが生産されたかを決定するための例示的な方法の使用を述べる。本明細書で述べる方法によっていずれの型のPNSニューロンが生産されるかは、感覚ニューロンおよび運動ニューロンなどのいくつかの種類の候補ニューロンが存在し、さらに固有受容器細胞、機械的受容器mechanoceptor細胞および侵害受容器細胞を含むPNS中の公知の感覚ニューロンの少なくとも3つの主要なサブセットが存在するので、不明であった。発生の間、初期段階の侵害受容器はペプチド作動性および非ペプチド作動性の両方であり、独自にNTRK1、RUNX1を発現し、次いでRETを発現したRETに関する情報の例については、参照により本明細書に組み込まれる、Woolfら、Neuron55,353-3642007参照。TUJ1ニューロンを含む2連の初期段階LSB3i培養物をRET発現に関して試験し図3C、このマーカーに関して陽性であることが見出されTUJ1染色緑色/RET染色と比較してより明るい細胞体および挿入されたRETの箱内のより明るい染色領域と比較して、赤色/大きい方の箱の細胞内のより暗い領域図3D、また10日目にFACSによって測定した場合、培養下のすべての細胞の60超がNTRK1を発現した図3E。要約すると、この集団はISL1、BRN3A、RETおよびRUNX1の発現に関して陽性であり図3A~D、初期段階侵害受容器ペプチド作動性および非ペプチド作動性の両方の産生を指示した。FACS分析は、これらのニューロンの60超がNTRK1に関して陽性であることを明らかにした図3E。これらのマーカーは集合的に、ニューロン集団が末梢感覚ニューロン、特に侵害受容器であることを示す。それゆえ、2日目の3i処理とLSBの組合せの好ましい実施形態は、神経堤由来集団、すなわち侵害受容器の予想外の形成を生じさせる。さらに、発明者は、LSB/3i処理によって得られた細胞が神経堤へと移行し、CNS運命に分化する代わりにニューロゲニン1NEUROG1を一過性に発現するという本明細書で述べた観察に加えて、初期免疫蛍光結果、すなわちBRN3A、ISL1、アレイデータ、すなわちTAC1サブスタンスP発現を含む、いくつかの試験からの情報を組み合わせ、次にNTRK1マーカーを選択し、NTRK1細胞を見出した。そこで、発明者は、生じるPNS細胞がおそらくペプチド作動性侵害受容器である可能性が高いと考えた。D.LSB3iはPNSTUJ1侵害受容器-ペプチド作動性ニューロン細胞を再現可能に誘導した。以下の実施例は、再現性を決定するために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。本発明の一般性を確立するため、発明者は、hiPSCを幹細胞の供給源として使用して、LSB処理の2日後に3i処理を組み合わせる本発明の好ましい実施形態を反復した。LSB3i処理の再現性を、誘導多能性幹細胞hiPSC系を含むさらなるhPSC系にわたって評価した。現行技術はhiPSCを生産する多くの方法を述べており、当業者に公知である。特に、Oct4オクタマー結合転写因子4、Sox2SRY性決定領域Yボックス2、Klf4クルッペル様因子4およびc-Myc転写因子p64などの遺伝子を挿入することによって作製される2つのhiPSC系C14およびC72を使用して、効率的に神経化できるneuralizeことが示された参照により本明細書に組み込まれる、Papapetrouら、ProcNatlAcadSci.,USA1062009参照。次にPAX6発現をImmunoFによって検査した。C14およびC72細胞系のLSBおよびLSB3i処理は、図3A~Dに示すヒト細胞系と比較した場合、類似のニューロン染色結果を示した。上記で述べたように、ISL1、BRN3A、RET、RUNX1およびTUJ1に関して、例示的なC14染色結果を図4A~Dに示し、例示的なC72染色結果を図8A~Dに示す。C14およびC72細胞系のLSB処理はネスチン陽性細胞を均一に生じさせ処理細胞集団の>95、FACSによって測定されるようにLSB3iの組合せで処理したときTUJ1細胞を形成することができたC14については40およびC72については33;図4E。これらの結果を、図4EにおいてLSBおよびLSB3i結果に関して示される、LSBおよびLSB3iで処理したH9細胞系すなわちhESC系と比較した。さらに一層高いニューロン収率がFACSによって測定された40および33から、NTRK1に関して選別した場合核染色の>90がニューロンである、NTRK1神経栄養因子チロシンキナーゼ受容体1型マーカー発現に関して選別した後バルク培養物を、N2培地を含むMatrigel商標でコートした培養容器に継代したとき、これら2つのhiPSC系において得られた。細胞をアキュターゼで解離させ、N2に再懸濁して、APC結合NTRK1抗体RDと共に氷上で15分間インキュベートし、洗浄して、FACSのためにN2に再懸濁した。選別後、細胞をN2培地で24時間培養し、適切に固定した。細胞を収集し、BRN3A、ISL1、TUJ1およびDAPIに関して染色した。特に、代表的なNTRK1LSB3i処理細胞集団におけるわずかなネスチン細胞と比較して、LSB3i処理細胞からはC14およびC72両方のNTRK1-細胞に関して数多くのネスチン細胞赤色/暗染色が示される図9。さらに、わずかなC14NTRK1-細胞がTUJ1細胞系を発現したが、C27はより高い数のNTRK1-TUJ1緑色;鮮やかな染色を示した。両細胞系は、DAPI青色;明るい核染色によって同定される細胞体と比較して認められるように、高い数のネスチン-TUJ1細胞を示した。要約すると、LSB、次いで2日目に3iで処理し、高集密度で平板培養したhiPSC細胞は、侵害受容器マーカーISL1、BRN3A、RETおよびRUNX1に関して陽性のニューロン細胞の形成を生じさせた図4A~D、図8A~Dおよび図9。この低分子組合せアプローチを用いて、安定な成熟ニューロン細胞運命がhPSCから分化することができる速度は図4、最も驚くべき観察である。成熟ニューロン表現型の生成のための10~15日間という時間枠は、ヒト発生の間の侵害受容器出現の推定30~50日間参照により本明細書に組み込まれる、Kitaoら、JCompNeurol371,249-2571996と比較してはるかに加速されている。ISL1およびBRN3Aの上方調節は、5日目から7日目の間に始まる、SOX10の発現と共存する。3iを添加する最適時点は二重SMAD阻害の2日目であり、2日目のソニックヘッジホッグでの処理がFOXA2発現およびヒト底板分化を促進するうえで最も有効であるという発明者の研究室からの以前の観察を反映する参照により本明細書に組み込まれる、Fasanoら、CellStemCell6,336-3472010。これは、神経パターン形成がOCT4タンパク質発現の喪失に先だって起こり得ること、およびOCT4タンパク質の存在は前パターン形成事象を制限しないと思われることを示唆する。神経堤由来感覚ニューロンの誘導におけるCHIR99021の重要な役割は、おそらく、初期神経堤特異化において必須であることが公知であり参照により本明細書に組み込まれる、Dorskyら、Nature396,370-3731998、ナイーブ神経堤前駆体を感覚ニューロン系列へと指示することができる参照により本明細書に組み込まれる、Leeら、Science303,1020-10232004、標準的なWNTシグナル伝達の活性化に関連する。マウス細胞の転写因子に基づく系列再プログラム化は、線維芽細胞から直接ニューロンを誘導する手段としてそれに値する注目を集めており参照により本明細書に組み込まれる、Vierbuchenら、Nature463,1035-10412010、いつかはこの方法がヒト細胞で使用されるかもしれない。本明細書で示すデータは、LSB3iがヒト有糸分裂後ニューロンを速やかに誘導できることを明らかにした。LSB3iを含む方法を使用することの重要な利点の一部は、ヒト前駆体細胞、すなわちPSCからのヒト有糸分裂後ニューロンの生産の速度と効率であった。さらに、このプロトコールは、遺伝子操作または継代などの機械的介入処置を必要とせず、単一培養工程で10日以内に高度に富化されたニューロンの集団を生じさせた。LSB3iはまた、hPSCにおける系列特異化を駆動するためのコンビナトリアル低分子スクリーニングの使用の最初の例の1つである。発生決定点で繰り返し使用される発生経路の限られた数を考慮すると参照により本明細書に組み込まれる、Brivanlouら、Science295,813-8182002、本明細書で述べるアプローチはヒト多能性系列を特異化するために一般的に適用できるはずである。LSB3iで使用される5つの低分子の大部分は公知のシグナル伝達経路インヒビターであり、内因性シグナル伝達経路の抑制がhPSC運命を指示するうえで特に有効であることを示す。低分子を使用する場合、低分子がしばしば意図されないかまたは予想外の結果を生じさせる、オフターゲット効果は重要な考慮すべき事項であるが、本発明の開発の間に得られたデータは、この特定の発明において、内因性シグナル伝達経路の低分子組合せ阻害が、hPSC細胞運命を調節するための効率的で、非遺伝的なDNAコード配列の変化なし、種を超える、コスト効果的で、迅速な、かつ可逆的な手段を提供することを明らかにした。III.LSB-C:CHIR99021はLSB3i侵害受容器の生成のために必要であり、分化を神経堤幹細胞へと向かわせることが発見された。本発明の開発の間に、発明者は、LSB接触細胞が、LSB処理後2日目にCHR/SUまたはCHR/DAPTと接触した場合、高い数で侵害受容器へと分化するように指示され得るが、SU/DAPTではそれが起こらないことを発見した。さらに検討したとき、発明者は、驚くべきことにLSB-C、CHIRと接触したLSB処理細胞が神経堤幹細胞集団を生じさせることを発見した。A.CHIR99021CはLSB培養細胞すなわちLSB-Cからニューロン分化を誘導するための鍵となる因子である。以下の実施例は、定方向性ニューロン分化を誘導するための各々の化合物の効果を試験するために例示的方法を使用することを述べる。実施例IIIのTUJ1細胞の誘導に関連することが認められた各々の化合物の充足度に関する機構的な洞察を得るために、3i化合物の特定の組合せを、細胞間FACSを用いて測定されるネスチンおよびTUJ1の細胞発現を誘導することに関して試験した図1Gに示す。ネスチンをLSBニューロン系列細胞のマーカーとして使用し、下流のすなわちより分化したニューロン細胞を同定するためにTUJ1を使用した。個々の因子のいずれもが高い数60超のTUJ1ニューロンを生じなかったが、その他の2つのシグナル阻害因子のいずれか1つと組み合わせたCHIR99021は、中等度の数のTUJ1ニューロンDAPTに関しては53およびSU5402に関しては58を生成することができた。これらのデータは、本明細書で使用した試験条件下で、CHIR99021がニューロン分化を加速するための鍵となる因子であり、SU5402およびDAPTは重要な、しかし付加的な刺激を提供したことを示す。加えて、3i組成物の3つの成分すべてが分化ニューロンの最大収率のために必要である図2G。B.CHIRとさらに接触したD2LSB接触細胞D0から神経堤幹細胞が誘導された。発明者は、これらのそれぞれのインヒビターの早期回収を使用した実験を介して、BMPシグナル伝達およびTGFβシグナル伝達が神経堤誘導のために最適化されることを認めた。次に、低分子GSK3βインヒビターCHIR99021を使用して、GSK3β阻害と共にWntシグナル伝達が活性化された。そこで発明者は、狭いウインドウ2日目のWntシグナル伝達が二重SMAD阻害プロトコールに関連して神経堤誘導を支配することを認めた。これら3つの経路についての最適化シグナル伝達を組み合わせた修正二重SMAD阻害プロトコールLSB-Cは、集団の65までにおいてSox10::GFPを発現する神経堤の誘導を増強した。IV.LSB3iおよびLSB-C誘導の人工SOX10細胞は侵害受容器細胞を生産することができる。以下の実施例は、操作されたSox10GFP発現ヒト細胞の定方向性分化のために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。侵害受容器細胞は、ヒト発生の間に2種類の細胞中間体から生じると考えられる:具体的には、SOX10ニワトリ胚神経堤細胞は脊髄に隣接する体幹侵害受容器細胞を生成できることが認められた参照により本明細書に組み込まれる、Georgeら、NatNeurosci10:1287-12932007。加えて、アフリカツメガエルXenopuslaevisの頭部プラコード組織は、顔面組織中の三叉神経侵害受容器細胞集団に寄与した参照により本明細書に組み込まれる、Schlosserら、JCompNeurol418:121-1462000;Schlosserら、DevBiol294:303-3512006。そこで、ヒト細胞においてSOX10によって示される神経堤中間体細胞運命参照により本明細書に組み込まれる、Aokiら、DevBiol259,19-332003;Leeら、NatBiotechnol25,1468-14752007が、トランスジェニックSOX10::GFP細菌人工染色体BAChPSC系を使用して分化の間に認められるかどうかを決定するために、以前に報告された方法参照により本明細書に組み込まれる、Placantonakisら、StemCells27:521-5322009を用いて、GFP遺伝子と共発現する富化された神経堤遺伝子マーカーを伴った、このSOX10::GFPBAC細胞系を生成した。SOX10:GFP細胞系はH9hESC系のサブクローンであった。細胞を解離させ、Amaxaからの試薬溶液V、プロトコールB-16および装置を用いて遺伝子送達を実施した。ヌクレオフェクトしたnucleofected核にトランスフェクトしたDNAは、GeneExpressionNervousSystemAtlas[GENSAT]アクセッション番号:GENSAT1-BX1086から入手した、挿入されたGFPとSOX10遺伝子を含む細菌人工染色体BACであった。次にBACを、pL452プラスミドから切り出した選択カセットからGENSATBACへのcre/LoxP組換えを使用して、選択のためにネオマイシン耐性遺伝子を含むように改変した参照により本明細書に組み込まれる、Tomishimaら、Stemcells251:39-45.Epub2006Sep212007参照。遺伝子送達後、hESCを、ネオマイシン耐性選択のためにG418の存在下で単細胞として接種し、クローンを手操作で採取して、分化後にGFPの存在に関してスクリーニングした。qRT-PCRによりGFP細胞を選別してSOX10および他の神経堤マーカーの発現を確認した。2つの付加的な2連の試料を各々LSBの1つと接触させ、次にCHIR99021LSB/CまたはLSBと3iに接触させて、LSBで分化を開始させた後4、8、12および16日目に、GFP発現をFACS同定およびSOX10::GFP細胞の選別によって測定した。CHIR99021が存在した場合は、培養下でこれらの処理細胞の70超が、培養条件に応じて分化の12日目までにSOX10::GFPになったLSB/Cについては70およびLSB3iについては80;図5DおよびE。この結果は、細胞の大部分が神経堤正体を発現することを示し、CHIR99021がLSB3i侵害受容器細胞の生成のために必要であるという発明者の観察を支持した。したがって、LSB3i処理細胞はLSB/C処理したhPSCと比較してより迅速に神経堤運命を獲得したので図5DおよびE、SU5402およびDAPTと接触させることに加えて、チロシン受容体キナーゼ受容体およびノッチシグナル伝達を阻害するこれらの低分子による組合せ阻害は、それぞれ、神経堤細胞運命を加速した。発明者は、CHIRは神経堤および感覚ニューロンを誘導し、SUは神経堤マーカー発現およびニューロン分化を加速すると考えた。最後に、発明者は、CHIRおよびSUと組み合わせたDAPTはニューロン分化を加速すると考えた。さらに、LSBと組み合わせたCHIR99021の使用、すなわちLSB/Cは、操作されたSOX::GFP細胞を読み出しとして使用した場合、12日から16日目までの間にLSB3iと比較して、60超のネスチン-TUJlニューロン細胞の遅い変換速度を生じさせた。V.本明細書で述べる方法によって生産されたNTRK1ヒト侵害受容器細胞はインサイチューラット侵害受容器細胞に類似した電気生理学的応答を示した。以下の実施例は、本明細書で述べる方法によって生産された侵害受容器細胞の機能的能力を決定するために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。LSB3i由来ニューロンが本物の侵害受容器ニューロン細胞であることを確認するために、LSB3i処理細胞を機能、成熟段階および挙動に関して検査した。侵害受容器細胞を生じさせる多能性幹細胞のLSB3i処理が得られた後、10~100,000細胞/cm2の平板培養密度から長期培養物を樹立し、ヒトβNGF、BDNFおよびGDNFを添加したN2培地での培養下で10日目、30日目に継代したさらなる詳細については実施例I参照。より長期の培養条件下でのこれらの細胞の生存率は、NTRK1侵害受容器状態と対応して、NGF依存性であることが認められた。LSB3i侵害受容器は、グルタミン酸図7Cに加えて、先に示したように高レベルのTUJ1、ISL1、BRN3A図7A~Cを発現した。グルタミン酸産生は、興奮性グルタミン酸作動性ニューロン、すなわちグルタミン酸を放出する侵害受容求心性線維、および有害刺激についての重要なイオンチャネルであるカプサイシン受容体TRPV1図7Dと一致した。培養下で15日目に2つの別個の成長突起を各々のニューロンについて同定することができた図7E、図12。樹状突起マーカーMAP2は、主として、極性を有する形式polarizedfashionにおいて、2つの突起の一方において発現された図7F。ニューロンの双極性は、末梢神経節における感覚ニューロンの役割と一致し、細胞体は背根神経節に位置し、脊髄と末梢の両方に向けて突起を突き出す参照により本明細書に組み込まれる、Woolfら、Neuron55,353-3642007;Georgeら、NatNeurosci10,1287-12932007。神経成長因子NGFの存在下で、ニューロンを長期間培養した例えば、細胞を10日目に継代し、30日目まで培養した。LSBを5日目に細胞から回収し、10日目に3iを回収して、その日にNGF/GDNF/BDNFを培地に添加した。10日目から30日目までニューロンにNGF/GDNF/BDNFを供給した。初期LSB処理からの日数で30日目に、ニューロンは神経節様構造へと自己組織化し始めたことが認められた。このタイプの形態は末梢感覚ニューロンに共通する参照により本明細書に組み込まれる、Marmigereら、NatRevNeurosci8,114-1272007図7G、HおよびI。成熟侵害受容器は、典型的には、ペプチド作動性感覚ニューロンによって発現されるカルシトニン遺伝子関連ペプチドCGRPおよびサブスタンスP神経ペプチドなどの神経ペプチドの発現に依存して、ペプチド作動性または非ペプチド作動性のいずれかである参照により本明細書に組み込まれる、Woolfら、Neuron55,353-3642007。これに対し、非ペプチド作動性ニューロンはCGRPもサブスタンスPも発現せず、レクチンIB4への結合などの他のマーカーを有する。それゆえ、LSB3i誘導ニューロンを、FACSを用いて、NTRK1発現に関して上記で述べた方法参照、NTRK1およびNTRK1-集団に選別した選別細胞の例については図7G参照。NTRK1細胞はサブスタンスPおよびCGRPの両方に関して陽性であり、主としてペプチド作動性侵害受容器表現型を示した図7HおよびI;分化の30日目。感覚ニューロン正体の主要な機能的特徴すなわち機能は、それらの電気生理学的特性である参照により本明細書に組み込まれる、Fangら、JPhysiol565,927-9432005。NTRK1選別ニューロンを、培養ニューロンについての標準的な電気生理学技術によっても試験したその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Placantonakisら、StemCells.2009,Figure5に一例が示されている。NTRK1細胞は、電気生理学的特徴である、特徴的な単一活動電位AP、発火パターンを示し、平均膜静止電位は初期LSB3i処理後21日目までに67±4mVであった。LSB3iヒトニューロンにおいて生じるAPのタイミングおよび活動曲線の形状を図7J太い赤線参照および以下の表1に示す。これらの結果は、以前に一次麻酔成体ラット侵害受容器の電気生理学的報告において述べられたものと同様であった参照により本明細書に組み込まれる、Fangら、JPhysiol565,927-9432005。VI.包括的な遺伝子発現分析は遺伝子発現の例示的な時期を示す。以下の実施例は、本明細書で述べる方法によって生産される侵害受容器細胞および他の細胞型の包括的な遺伝子発現を決定するための例示的な方法の使用を述べる。誘導分化過程の間の事象すなわちマーカー発現の時期をさらに特性づけるため、LSBおよびLSB3i処理した両方のhPSCに関して、包括的な遺伝子発現分析を精密時間分解能finetemporalresolutionで実施した2、3、5、7、9および15日目、NCBIGeneExpressionOmnibusGEOアクセッション番号GSE26867。神経外胚葉、神経堤、ニューロンおよび侵害受容器に関する選択マーカーを分析した場合以下の表2参照、各々について分化の異なる段階を認めることができた図10。この遺伝子発現分析図10B、Cおよび上記表2は免疫蛍光結果の大部分と一致した。例えば、遺伝子分析は、成熟中のニューロンにおいて、ISL1、POU4F1BRN3A、SOX10、TAC1サブスタンスPのプロペプチド、NTRK1およびグルタミン酸小胞輸送体VGLUT2遺伝子がすべて上方調節されるすなわち培養下の多くの細胞が経時的にこれらのマーカーの発現を増加させることを示した。同時にこれらのマーカーは誘導細胞で増加することが認められたが、hESC由来の原始神経外胚葉についてのマーカー、特にDLK1、LHX2、OTX2、LEFTY2、PAX6およびHES5は下方調節されるすなわち培養下のより少数の細胞で発現されることが認められた。しかし、成熟侵害受容器で発現されると予想される、ソマトスタチンSSTおよびSOX10の発現が、15日目にLSB3i処理細胞培養物で認められた。しかし、SSTはまた、発生中の感覚ニューロンにおいても発現されることが示された。それゆえ、発明者は、このマーカーが15日目の未熟細胞の存在を示していると考えた。いくぶん下方調節されているが、SOX10の発現はまた、大部分の細胞がニューロンであると思われる時点でも観察された。SOX10は細胞がニューロンに分化するとともに下方調節されると予想されたので、この観察は意外であった。15日目の培養物の細胞におけるSSTおよびSOX10発現というこの予想外の発見から、すべての細胞が侵害受容器細胞になるわけではなく、約20~30であると考えられた。これは、他の成熟細胞型シュヴァン細胞などがSOX10を発現し続けることを示した。二重SMAD阻害によって生産されるhESC由来の原始神経外胚葉細胞培養物は各々が参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、NatBiotechnol272009;Fasanoら、CellStemCell6,336-3472010、DLK1、LHX2、OTX2、LEFTY2、PAX6およびHES5遺伝子の高発現を示した。同様に、hESC由来の原始神経外胚葉細胞培養物がLSBを用いた二重SMAD阻害によって生産された場合も、これらの遺伝子について類似の高発現が観察された図10B、Cおよび以下の表3参照。これらの遺伝子は、LSB3i処理の間は低減し、この間、本発明の開発において侵害受容器が生産された。加えて、時間的トランスクリプトーム分析は、機械的受容器細胞mechanoceptorおよび固有受容器細胞とは異なる、侵害受容器中間体細胞運命についてのさらなる証拠を提供した。ニューロゲニン塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質は、マウス発生の間に背根神経節における神経発生の2つの逐次的な波を媒介する参照により本明細書に組み込まれる、Marmigereら、NatRevNeurosci8,114-1272007;Maら、GenesDev13,1717-17281999。NEUROG2ニューロゲニン2によって示される最初の波は機械的受容器細胞および固有受容器細胞を生じさせ、NEUROG1ニューロゲニン1によって示される2番目の波は侵害受容器細胞を生じさせる。hPSCをLSBで処理した場合、NEUROG2発現は7日目までに強力に誘導される図10Cおよび以下の表4。これに対し、LSB3iで処理したhPSCは、7日目までにあまり顕著ではないNEUROG2の誘導を示すが、9日目までにNEUROG1の選択的誘導を示す図10C。VII.例示的な侵害受容器細胞を提供するために本発明の組成物および方法を用いて企図される大規模培養。以下の企図される説明は、本明細書で述べる方法によって生産される侵害受容器細胞の大規模生産のための例示的な方法および使用を示す。LSB3iを使用する、拡大可能な生成すなわち比較的少数の細胞、例えば実施例、前出で述べるような48穴プレートの1.5×104細胞/穴、および企図される96穴プレートでの5×103細胞/穴を含む両培養物から、hPSC由来侵害受容器の大規模バッチ培養例えば1815cm皿のバッチで1×107~1×108細胞約5.5×107細胞まで、侵害受容器細胞を生成するための成功をおさめると考えられる方法。これらの方法は、基礎生物学試験における使用のため、ならびにヒトおよび動物における医学適用に適用できる薬剤発見のために、化合物を試験する際に使用するためのhPSC由来侵害受容器細胞を提供することが企図される。特に、発明者は、ヒトおよび動物における急性および慢性疼痛を軽減する処置のために本発明の組成物および方法を使用することを企図する。特に、例示的な侵害受容器細胞、例えばペプチド作動性侵害受容器細胞を、7×107~7×108の例示的な非限定的範囲で70の効率の侵害受容器細胞収集が企図される提供するために、本明細書で述べる培地および例示的化合物を使用して、例示的な1×108~1×109hPSC細胞をバッチ胚様体培養物において増殖させる大規模バッチ培養が企図される。例示的な侵害受容器細胞は、TAC1、VGLUT2およびSLC15A3などの侵害受容器細胞を同定する遺伝子すなわちmRNAおよびタンパク質を発現すると考えられる。例示的な侵害受容器細胞は、ISL1、BRN3A、RET、RUNX1、サブスタンスP、CGRP等のような同定マーカーを発現すると考えられる。要約すると、発明者は、基礎生物学ならびにヒトおよび動物において侵害受容器細胞に関連する状態、特に疼痛の試験および処置のための薬剤発見における、新規プラットフォームを提供するために本発明の組成物および方法を使用することを企図する。VIII.ヒト多能性幹細胞からのメラノサイトの誘導:LSB-Mel、LDN-193189、SB431542、CHIR99021、EDNR3およびBMP。メラノサイトは、主として表皮で認められる色素産生細胞であり、メラノサイトは表皮においてUV照射が誘導するDNA損傷に対する光防護バリアを確立する。メラノサイト生物学の欠損は、白皮症、白斑およびまだら症を含む多くの色素沈着障害に関連する。メラノサイトは悪性黒色腫の起源細胞である。しかし、これらの障害の理解/処置は、インビトロでのヒトメラノサイトの試験に適した実験系の欠如により限られている。本発明の開発の間に、ヒト多能性細胞の神経細胞前駆体および神経堤NC前駆体の両方への迅速で極めて効率的な分化を生じさせるプロトコールが発見された。皮膚メラノサイトは神経堤細胞前駆体に由来するので、発明者は、成熟メラノサイトへのメラノサイト系列に沿った分化を指示するためにLSB-C由来の神経堤細胞系列細胞を使用する方法を発見した。言い換えると、多能性ESC胚性幹細胞を神経堤前駆体細胞になるように誘導しLSB-C、それをメラノサイト前駆体になるように誘導して、次に分化メラノサイトになるように誘導した。この行程は、多能性ESCが神経堤前駆体を経て、より拘束されたメラノサイト前駆体に向かい、その後最終的に分化状態を確立する、メラノサイト系列に沿った連続的特異化progressivespecificationとしてモデル化された図16の、これらの段階の各々についての例示的なマーカーを示す概略図参照。発明者は、メラノサイト発生の分子機構を同定するための新規アッセイにおけるこれらの定方向性分化メラノサイトの使用を企図する。特に、発明者は、患者特異的誘導多能性幹細胞iPSCを誘導するための最近確立されたアプローチと組み合わせて、これらの定方向性分化メラノサイトを使用するアッセイを企図する。この新規定方向性分化メラノサイトは、白皮症、白斑、まだら症、黒色腫および悪性黒色腫等を含む、ヒト疾患のメラノサイト関連モデルについてのアッセイを生み出すことが企図される。A.ヒトESCからの神経堤の誘導メラノサイトを生産するための定方向性分化における第一工程。メラノサイトは、神経外胚葉と非神経外胚葉との間の境界で原腸形成の間に生じる神経堤NCとして知られる、脊椎動物に特有の細胞の一過性遊走集団から生じる。多分化能性神経堤は、一部には、NC細胞の解剖学的位置軸レベルによって決定される広範囲の誘導体に分化する。文献中の多大の証拠が、Wnt、BMPおよびTGFβシグナル伝達を早期神経堤特異化における重要要件として同定した。これらのうちで、後の2つの経路は二重SMAD阻害プロトコールの低分子処理によって能動的に阻害される。本明細書で述べるように、発明者は、BMPおよびTGFβシグナル伝達が、それらのそれぞれのインヒビターの早期回収を介して神経堤誘導のために最適化されることを発見した。さらに、本明細書で述べるように、後でWntシグナル伝達を活性化する、低分子GSK3βインヒビターCHIR99021の使用は、処理の2日目にLSB処理細胞に添加された場合、神経堤幹細胞マーカーを発現する集団を生産することが見出された。そこで、3つの経路すべてについて最適化されたシグナル伝達を組み合わせる修正二重SMAD阻害プロトコールをSox10::GFP細胞系に関して使用し、Sox10::GFPを発現する神経堤の誘導を集団の65に増強することを認めたLSB-C処理。B.神経堤由来のメラニン芽細胞の系列特異化と単離。LSB-Cで誘導したSox10::GFPを発現するNCを、次に、メラノサイト系列に沿って分化する能力に関して試験した。Sox10::GFPおよび、メラノサイト系列において発現されるがメラノサイト系列に特有というわけではないマーカーである、MITFを共発現する細胞の同定を介して、推定上のメラノサイト前駆体の存在が修正分化プロトコールLSB-Cの11日目に確認された図13A。これらの細胞集団の誘導をさらに最適化し、その後特定の型のメラノサイト前駆体を単離または精製するために、メラノサイト系列の同定を可能にする細胞表面マーカーが必要であった。文献の調査後、c-kitを推定上のメラノサイト前駆体についての候補マーカーとして同定した。Sox10::GFP細胞において試験したc-kitのマーカーは、早期メラノサイトマーカーの発現が大きく富化された図13C、Sox10::GFP/c-kit共発現細胞の低いパーセンテージ約9の存在を確認した図13B。分化プロトコールのさらなる最適化は、Sox10::GFP/c-kit二重陽性細胞の存在度abundanceが、メラノサイト特異化に関与する2つの因子、BMP4およびエンドセリン3での付加的な処理LSB-Mel、図13D~Eを介してほぼ4倍に増加したことを明らかにした。C.メラノサイトの増殖と成熟。発明者は、推定上のメラノサイト前駆体が選別後の培養下でわずか6日間の付加的な日数後に色素沈着状態に成熟できることを発見した図14A~B。驚くべきことに、発明者は、Sox10::GFP/c-kit二重陽性集団および2つのマーカーの各々についての単一陽性の集団の両方が、動態は異なるが、色素細胞を生じさせることを認め図14C、3つの集団の間の系列階層を示したcKit/SOX10-、cKit-/SOX10、cKit/SOX10。これら3つのメラノサイト系列細胞の同定は、メラノサイト系列に沿った分化中間体の単離を可能にすると考えられた。これらのメラノサイト前駆体細胞の使用により、成熟メラノサイト表現型を有する細胞を誘導し、支持することができる最適成熟条件が、そのような成熟を支持すると考えられる数多くの化合物を使用して同定された。評価したメラノサイトの特性には、紡錘形態、色素沈着およびメラノソーム形成の誘導が含まれた。発明者は、BMP4およびcAMPの培地への添加が成熟紡錘様形態および色素沈着を促進することを発見した図14D。成熟メラノサイトマーカーMITF、SOX10、Tyrp1およびHMB45の発現に基づき、SCF、EDN3、FGF、WntCHIR、BMP4およびcAMPを含む培地で細胞を8週間長期増殖させた場合、メラノサイトの純粋な培養物が得られた図15A。色素濃度を評価するために長期LSB-MEL細胞を遠心分離したとき、暗色ペレットが認められた図15B。成熟メラノサイトの電子顕微鏡超微細構造特性付けは、様々な発生段階において図15D、LSB-Mel由来メラノサイトの細胞質において多数の暗く色素沈着したメラノソームの存在を明らかにした図15C。D.メラノサイトはヒト多能性幹細胞から誘導される:LSB-メラノサイトLSB-Mel。以下は、関連疾患モデリングにおける使用のためのメラノサイトを提供するための例示的な組成物および方法を述べる。SOX10::GFP細菌人工染色体BACヒト胚性幹細胞hESCレポーター系を作製した。このことは、この細胞系が低分子との接触に応答する際のインビトロでの神経堤細胞誘導の観察を可能にした。Sox10は、多分化能性神経堤幹細胞の最も堅調な早期マーカーであり、メラノサイト前駆体を含む一部の神経堤誘導体においても発現されることが認められた。これまでの成熟スキームで得られるよりも高い純度と数でメラノサイト培養物を生産するために、このレポーター系を使用して、定方向性分化スキームの開発において神経堤集団を将来を見越してprospectively同定し、単離した図14、LSB-C。二重SMAD阻害プロトコール参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、Nat.Biotech.2009において、SMADシグナル伝達を阻害する2つの低分子で処理したヒト多能性幹細胞hPSCは、CNS神経組織を効率的に生産した。加えてhESCをより低い密度で平板培養した場合、低レベルの自発的神経堤細胞誘導が認められた例えば、約3のSoxl0::GFP神経堤型細胞が認められた。しかし、研究における使用のためおよび医学的試験のためには、より多くの神経堤型細胞が必要であった。さらに、メラノサイト研究のためには、低レベルの自発的分化では提供されない、より多数の細胞を有するより純粋な集団が必要であった。本発明の開発の間に、発明者は、メラノサイト前駆体、成熟中のメラノサイトおよび成熟メラノサイトの高度に純粋な産物を生産するように、神経堤誘導のための二重SMAD阻害プロトコールを最適化する方法を発見した。具体的には、本発明のメラノサイトを生産する、以下の時系列の培養条件を開発した:0および1日目にLDNおよびSB3iを含む方法におけるLDNおよびSBと同じ濃度範囲を使用するを供給する;2日目にLDN、SB、CHIR本明細書で述べる3iを含む方法におけるLDN、SBおよびCHIRと同じ濃度範囲を使用するを供給する;1つの実施形態では、3日目にSB、CHIR本明細書で述べる3iを含む方法におけるSBおよびCHIRと同じ濃度範囲を使用するを供給し、別の実施形態では、3日目にLDN、SB、CHIR本明細書で述べる3iを含む方法におけるLDN、SBおよびCHIRと同じ濃度範囲を使用するを供給する;4日目および5日目にCHIR本明細書で述べる3iを含む方法におけるCHIRと同じ濃度範囲を使用するを供給する;6日目から11日目までCHIR、BMP4およびEDN3本明細書で述べる3iを含む方法におけるCHIRと同じ濃度範囲を使用し、BMP4およびEDN3については以下の濃度範囲参照を供給する。11日目に細胞を継代し、8週間までMEL培地CHIRを含むを供給した。MEL培地は、メラノサイトに関して富化され、これにより、8週間までに細胞培養物は100までの純粋な集団を示した。したがってこのLSB-MEL法/プロトコールは、メラノサイト生産の高い効率を有していた。発明者はまた、メラノサイトの発生の間、リノール酸がMEL培地中の少なくとも1つの必要成分であることを発見した図16参照。メラノサイトの発生の間に、多数の前駆体段階が以下の順序で認められた:神経堤幹細胞、胚性グリア-メラニン芽幹細胞、成体メラノサイト幹細胞、メラノサイト。図13の例示的な概略図参照。図13メラノサイト前駆体/メラニン芽細胞の特異化と単離。11日目のLSB-Cプロトコールは、Soxl0::GFP、MITFを共発現するメラノサイト前駆体の誘導を支持したA、右のパネル。MITF単一陽性集団も認められたA、左のパネル。c-Kitはメラノサイト前駆体の潜在的マーカーとして同定された。LSB-C分化後に低いパーセンテージのSox10::GFP、c-kit共発現細胞が認められたB、橙色集団。qRT-PCR分析により、二重陽性集団においてメラノサイトマーカーMITFM塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスロイシンジッパータンパク質およびDctドーパクロムトートメラーゼドーパクロムδイソメラーゼ、チロシン関連タンパク質2の富化が確認されたC。BMP4およびEDN3での処理LSB-Melは、Sox10::GFP、c-kit二重陽性の推定上のメラノサイト前駆体集団の誘導を増強したD。LSB-Mel処理後に単離されたSox10::GFP、c-kit二重陽性細胞は、有意により高いレベルのメラノサイトマーカーMITFMおよびDctを示したE。誤差バーはs.e.m.を示す。p<0.05。図14メラノサイト前駆体の増殖と成熟。分化条件の要約A。BMP4およびEDN3を伴うLSB-CLSB-Mel条件での特異化後、細胞を11日目に選別し、再接種した。選別後PS細胞を、c-kitリガンドSCF、エンドセリン3EDN3、線維芽細胞増殖因子FGFおよびWntアクチベーターを含む成熟培地に維持した。PS6日目に明視野顕微鏡検査によって認められた色素細胞は、メラノサイトマーカーMITFに関して陽性であったが、Sox10::GFPレポーターが下方調節されていると思われたB。Sox10::GFP、c-kit二重陰性を除くすべての集団が、最終的にMITF発現細胞および肉眼で見える色素クラスターを生じさせたが、その割合は異なっていたC。BMP4およびcAMPでの処理は、メラノサイトに特有の紡錘様形態を示す色素細胞への分化を増強したD。図15成熟メラノサイトの特性付け。LSB-Melプロトコールで誘導した成熟メラノサイトの純粋な集団は、培養下で8週間超後にMITF、Sox10、Tyrp1チロシナーゼ関連タンパク質1およびHMB45を含む一般的なメラノサイトマーカーの発現を維持するA。メラノサイトは、継代の数週間にわたってそれらの暗く色素沈着した表現型を保持するB。色素沈着レベルを評価するために1×106細胞をペレット化し、写真撮影した。成熟メラノサイトの電子顕微鏡超微細構造特性付けC、D。LSB-Mel由来メラノサイトの細胞質中の数多くの暗く色素沈着したメラノソームの存在がTEMによって観察されたC。メラノソーム小胞の段階IからIVへの成熟に伴うメラニン色素の存在および進行性沈着に注目されたいD。それゆえ、発明者は、二重SMAD阻害プロトコール、LSBが、ヒト胚性幹細胞からSoxl0::GFPを発現する神経堤集団を迅速かつ効率的に生成することを明らかにした。この修正プロトコールは、c-kit発現によって、将来を見越して同定され、単離される、低レベルのメラノサイト前駆体の誘導を支持した。これらの細胞の誘導は、BMP4およびEDN3での処理を介してさらに増強された。メラノサイト前駆体は、その後、BMP4およびcAMPの存在下でインビトロでさらに培養した後、色素沈着状態へと成熟した。RDからのBMP4についての濃度範囲は10ng/ml~100ng/ml1つの実施形態では25ng/mlを使用し、AmericanPeptideCompanyからのEDNは25~300nM1つの実施形態では100nMを使用する。図16メラノサイトの増殖のためにリノール酸を必要とする、例示的なLSB-MEL培地処方物を示す。顕微鏡像の上に示す培地成分は、処方物から除外された培地成分である;Ph=位相差;BF=明視野。例示的な概略図は、本発明の細胞を同定するために使用したメラノサイト前駆体マーカーを示す。したがって発明者は、インビトロでの神経堤の誘導ための迅速で明確なプロトコールを発見し、開発した。さらに、発明者は、これらの細胞のメラノサイトへの定方向性分化のための組成物および方法を開発するために、インビトロでの神経堤細胞の誘導のためのこの迅速で明確なプロトコールを使用した。これらのメラノサイトは、長期培養およびユーメラニンの持続的生産のそれらの能力において独特であった。それゆえ、ヒト胚性幹細胞hESCからのメラノサイトの誘導は、メラノサイト疾患生物学のさらなる探求のための有益なツールを提供すると考えられる。実験以下の実施例は、本発明の特定の実施形態および態様を説明するための助けとなるものであり、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。以下の実験の開示では、以下の略語を適用する:N規定度;Mモル濃度;mMミリモル濃度;μMマイクロモル濃度;molモル;mmolミリモル;μmolマイクロモル;nmolナノモル;pmolピコモル;gグラム;mgミリグラム;μgマイクログラム;ngナノグラム;pgピコグラム;Lリットル;mlミリリットル;μlマイクロリットル;cmセンチメートル;mmミリメートル;μmマイクロメートル;nmナノメートル;U単位;min分;sおよびsec秒;deg度;penペニシリン、strepストレプトマイシンならびに°C10セ氏温度/セルシウス度。以下の処方物は、本発明の実施形態を開発する際に使用するための例示的な細胞培養培地を述べる。維持のためのhESC培地1リットル:800mLのDMEM/F12、200mLのノックアウト血清代替物、5mLの200mML-グルタミン、5mLのPen/Strep、10mLの10mMMEM最小非必須15アミノ酸溶液、55μMの13-メルカプトエタノールおよびbFGF最終濃度は4ng/mLである。hESC分化のためのKSR培地1リットル:820mLのノックアウトDMEM、150mLのノックアウト血清代替物、10mLの200mML-グルタミン、10mLのPen/Strep、10mLの10mMMEMおよび55μMの13-メルカプトエタノール。hESC分化のためのN2培地1リットル:985mlの蒸留H2OとDMEM/F12粉末、1.55gのグルコースSigma、カタログ番号G7021、2.00gの重炭酸ナトリウムSigma、カタログ番号S5761、プトレシン100mLの蒸留水に溶解した1.61gの100μLアリコート;Sigma、カタログ番号P5780、プロゲステロン100mLの100エタノールに溶解した0.032gの20μLアリコート;Sigma、カタログ番号P8783、亜セレン酸ナトリウム蒸留水中の0.5mM溶液の60μLアリコート;BioshopCanada、カタログ番号SEL888、および100mgのトランスフェリンCelliance/Millipore、カタログ番号4452-01、および10mLの5mMNaOH中の25mgのインスリンSigma、カタログ番号16634。PMEF初代マウス胚性線維芽細胞PMEFフィーダー細胞を調製するための10FBSを含むダルベッコ改変イーグル培地DMEM1リットル:885mLのDMEM、100mLのFBS、10mLのPen/Strepおよび5mLのL-グルタミン。MS-5フィーダー細胞培地を調製するための10FBSを含むα最小必須培地MEM1リットル:890mLのαMEM、100mLのFBS、10mLのPen/Strepゼラチン溶液500ml:0.5gのゼラチンを500mlの温かい50~60°CMilli-Q水に溶解する。室温に冷却する。実施例I実験材料および方法以下の実施例は、本発明の開発の間に使用される例示的な材料および方法を述べる。細胞および培養条件。ヒト胚性幹細胞hESC細胞WA-09;32~50継代およびhiPSC系C14、C72;10~20継代を、12~15,000細胞/cm2で事前にプレートに入れておいたpre-plateマウス胚性線維芽細胞MEF、Globalstem,Rockville,StateofMaryland,UnitedStatesofAmericaUSAと共に培養した。ヒト誘導多能性幹細胞hiPSC系を、報告されているように参照により本明細書に組み込まれる、Papapetrouら、ProcNatlAcadSciUSA1062009生成した。ダルベッコ改変イーグル培地DMEM/F12、20ノックアウト血清代替物、1mML-グルタミンInvitrogen,Carlsbad,StateofCalifornia,USA、100μMMEM非必須アミノ酸Invitrogenおよび0.1mMβ-メルカプトエタノールInvitrogenを含む培地を作製した。6ng/mlの線維芽細胞増殖因子2FGF-2、RDSystems,Minneapolis,StateofMinnesotaを滅菌ろ過後に添加し、細胞に毎日供給して、6U/mLディスパーゼWorthingtonBiochemical,Lakewood,StateofNewJersey,USAを使用して週1回継代した。SOX10::GFP細菌人工染色体細胞系を、報告されているように参照により本明細書に組み込まれる、Placantonakisら、StemCells27,521-5322009生成した。神経および侵害受容器誘導。先に報告されているように参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、NatBiotechnol272009神経誘導を実施した。簡単に述べると、細胞を収集し、次にACCUTASESigma-AldrichCorp.St.Louis,Missouri,USAを使用して単細胞懸濁液にして、30分間ゼラチン上に置き、マウス胚性線維芽細胞MEFフィーダー細胞MEFMEFはゼラチンコートプレートに接着するを除去した。非接着細胞を収集し、10ng/mlFGF-2および10μMY-27632rhoキナーゼインヒビター-TocrisBioscienceを含むMEF馴化hESC培地の存在下で、20~40,000細胞/cm2の密度でマトリゲル処理した皿に入れた。820mlのノックアウトDMEM、150mlのノックアウト血清代替物、1mML-グルタミン、100μMMEM非必須アミノ酸および0.1mMβ-メルカプトエタノールを含むノックアウト血清代替物KSR培地を使用して細胞が集密になったときに神経分化を開始させた。SMADシグナル伝達を阻害するため、100nMLDN-193189および10μMSB431542を0日目SMADシグナル伝達インヒビターLSBを添加した日から5日目まで毎日添加した。細胞に毎日供給しすなわちインヒビターの6回の供給、D0、D1、D2、D3、D4およびD5、4日目から開始して1日おきに25の漸増量で増加させて、N2培地を初期培地に添加した10日目の100N2まで。2日目から10日目まで毎日、3つのインヒビター特に指示されない限りを3μMCHIR99021、10μMSU5402および10μMDAPTで添加することによって侵害受容器誘導を開始させた。10日目以後、長期培養培地は、10~100ng/mlヒトβ神経増殖因子NGF、10~100ng/ml脳由来神経栄養因子BDNFおよび10~100ng/mlグリア細胞由来神経栄養因子GDNFを含むN2培地からなった。顕微鏡検査、抗体およびフローサイトメトリFACS。細胞を4パラホルムアルデヒドで20分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄して、PBS中の0.5TritonXを用いて透過処理し、リン酸緩衝生理食塩水PBS中の1BSAウシ血清アルブミンを使用してブロックした。グルタミン酸染色のために、0.05グルタルアルデヒドを固定液に添加した。顕微鏡検査のために使用した一次抗体は、PAX6;ペアードボックス遺伝子6無虹彩症、角膜炎Covance,Princeton,NewJersey,USA、TUJ1;ニューロン特異的クラスIIIβ-チューブリンCovance,Princeton,NewJersey,USA、Ki67;抗原KI-67;MKI67Sigma-AldrichCorp.St.Louis,Missouri,USA、ISL1DevelopmentalStudiesHybridomaBank;DSHB、BRN3A;脳特異的ホメオボックス/POUドメインタンパク質3AChemicon,Billerica,Massachusetts,USA、RET;がん原遺伝子チロシンプロテインキナーゼ受容体RD、RUNX1;Runt関連転写因子1Sigma-AldrichCorp.St.Louis,Missouri,USA、MAP2;微小管関連タンパク質2Sigma-AldrichCorp.St.Louis,Missouri,UnitedStatesofAmerica、TRPV1;一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーVメンバー1NeuromicsInc.,Minneapolis,UnitedStatesofAmerica、サブスタンスPNeuromicsInc.,Minneapolis,UnitedStatesofAmerica、CGRP;カルシトニン遺伝子関連ペプチドNeuromicsInc.,Minneapolis,UnitedStatesofAmericaを含んだ。フローサイトメトリのために、BDCytofix/CytopermKitBDBiosciencesPharmingenを用いて細胞を固定し、1つの実施形態では、細胞を4パラホルムアルデヒド中にさらに固定した。フローサイトメトリ用の一次結合抗体はNTRK1神経栄養チロシンキナーゼ受容体、1型-APCRDSystems,Inc.,Minneapolis,Minnesota,USA、ネスチン-Alexa647BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,California,USA、TUJl-Alexa488BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,California,USAであった。電気生理学。神経栄養チロシンキナーゼ受容体、1型NTRK1選別細胞を10~12日目にポリオルニチン/ラミニン/フィブロネクチン処理したカバーガラススリップ上に置き、長期培養培地中でさらに3週間成熟させた。カバースリップを、以下を含むmM人工脳脊髄液に移した:125NaCl、2.5KC1、1.25KH2PO4、1MgCl2、2CaCl2、25NaHCO3、1.3アスコルビン酸、2.4ピルビン酸および25グルコース95O2および5CO2で通気、室温。落射蛍光照射、電荷結合素子カメラおよび2つの水浸レンズ×10および×60を備えた赤外線微分干渉DIC顕微鏡Olympusを使用して細胞を視覚化し、記録用電極を細胞に標的化した。ガラス製記録用電極7~9MΩ抵抗に、130mMグルコン酸カリウム、16mMKCl、2mMMgCl2、0.2mMEGTA、10mMHEPES、4mMNa2ATP、0.4mMNa3GTPおよび0.2Alexa-568からなる細胞内溶液mM、pH7.25を満たした。閾値電流での活動電位特性を、一連の漸増25pA300ms電流ステップの適用後に細胞記録から決定した。記録を収集し、Axopatch700B増幅器およびpCLAMP10ソフトウエアMolecularDevices,Sunnyvale,California,UnitedStatesを用いて分析した。遺伝子発現プロファイリング。TrizolLSを使用してLSBまたはLSB3i処理したhPSCの分化の2、3、5、7、9および15日目に全RNAを単離した。試料をMemorialSloan-KetteringCancerCenterMSKCCGenomicsCoreFacilityによって処理し、IlluminaHumanHT-12v4ExpressionBeadChipにハイブリダイズした。Bioconductorprojectwww.bioconductor.orgからのIllumina分析パッケージLUMIを統計プログラミング言語Rhttp://cran.r-project.org/と共に使用して標準化およびモデルに基づく発現測定値を計算した。発現値は倍数変化のlog2である。多重検定の補正p値が<0.05である場合、ペアワイズ比較のカットオフは有意であった。定量的リアルタイムPCR。RNeasyキットQiagenを使用して全RNAを抽出した。各々の試料について、1ugの全RNAをDNA汚染に関して処理し、QuantitectRTキットQiagenを使用して逆転写した。増幅した物質を、MastercyclerRealPlex2EppendorfでQuantitectSYBR緑色プローブおよびPCRキットQiagenを使用して検出した。すべての結果をHPRT対照に標準化しており、それらは、各々のデータ点において2~3の独立した生物学的試料の4~6の技術的複製物からの結果である。実施例IIヒト多能性幹細胞をSB431542およびLDN-193189LSBと接触させることによりニューロン系列細胞が生産された。以下の実施例は、本発明の開発の間に使用するニューロン系列の細胞を提供するための例示的な方法を述べる。二重SMAD阻害は、以前にhPSCからある1種のニューロン系列細胞を誘導するための迅速で極めて有効な方法として使用された参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、NatBiotechnol272009。ノギンを含む分子によって誘導されたこれらのニューロン系列細胞は、中枢神経系細胞、すなわち神経細胞運命への発生を可能にするデフォルト経路を有していた。補足試験は、ノギンの代わりに低分子ドルソモルフィンDMを使用することにより、少なくとも一部には類似の細胞が生産されるが、培養物の一貫性consistencyに差があることを報告した参照により本明細書に組み込まれる、Kimら、RobustenhancementofneuraldifferentiationfromhumanESandiPScellsregardlessoftheirinnatedifferenceindifferentiationpropensity.StemCellRev6,270-2812010;Zhouら、High-EfficiencyInductionofNeuralConversioninhESCsandhiPSCswithaSingleChemicalInhibitorofTGF-betaSuperfamilyReceptors.StemCells,5042010。発明者は、LDN処理細胞と同じ発生段階、同じマーカーの大部分の発現、および様々なニューロン系列を作製する類似の発生可能性の能力を示すにも関わらずノギンを用いて生成された細胞は、LDNを用いて誘導された神経細胞と比較して、前後軸において前方であることすなわちより前脳、より多くの細胞がFOXG1を発現する等などの相違も示すことを認めた。そこで、数あるシグナル伝達経路の中でも特にBMPを阻害するためにノギンの代わりにLDNを使用したが、ノギンとLDNは、BMPを阻害すること以外に、異なる他の種類の活性を有すると考えられる。一部にはノギンを使用することの高コストのゆえに、発明者は、BMPインヒビターの使用が神経細胞運命の細胞を生産する際にノギンの代わりになり得ると考えた。そのため、hPSCから原始神経外胚葉、神経細胞運命を有する細胞、すなわちCNS細胞を生成するために、SB431542と組み合わせて、低分子BMPインヒビター、LDN-193189参照により本明細書に組み込まれる、Yuら、NatMed14,1363-13692008を使用し、本発明の開発の間にノギンに取って代わることを認めた図2A。この組合せ処理を、これら2つのインヒビターLDN-193189とSB431542の組合せに関してLSBと称した。実施例III本発明のニューロン系列細胞を使用して低分子をスクリーニングすることにより、低いPAX6および高いTUJ1ニューロン細胞を生じる化合物がもたらされた。以下の実施例は、定方向性分化における使用のための低分子候補化合物をスクリーニングするために実施例IIからのニューロン系列の例示的細胞を使用することを述べる。具体的には、二重SMAD阻害LSBに関連して、すなわちヒトES細胞を、約400の条件下で候補化合物すなわち低分子をスクリーニングするためにヒトES細胞から出発する有糸分裂後ニューロンマーカーの獲得を加速し得る低分子の組合せを見出すため、最初にLSBLDN-193189およびSB431542で処理した。CNSに発生することができる細胞を決定するために細胞運命を決定するために、発生試験において重要であることが公知であり、しばしば使用される細胞シグナル伝達経路例えばFGF、ノッチ、WNT、SHHソニックヘッジホッグ等のようなシグナル伝達経路を標的とする変化させる分子から候補化合物を選択した。一例として、4種のインヒビターすなわちSU/DAPT/CHIR/シクロパミンをLSB処理からの異なる日に異なる組合せで試験した細胞培地中の細胞に供給した。各々の処理を、次に、10日目にTUJ1/PAX6発現に関してスクリーニングした。処理条件の一例として、LSBを毎日供給し、4日目から10日目まで毎日CHIRおよびSUを培地に添加して細胞に供給した。一般に、スクリーニング処理の結果は、死細胞を含む多数の培養物を生じさせた。言い換えると、このスクリーニングにおける生存可能な培養条件は、非生存可能条件すなわち細胞死よりもはるかに低い頻度であることが分かった例えばSU/DAPTを初期培養物に、すなわち2日目より前に添加した場合。発明者は、CNS幹細胞は生存のためにFGFシグナル伝達およびγセクレターゼ活性/ノッチシグナル伝達に依存し、そのためCHIRが存在しない場合、SU/DAPTが細胞をCNSから神経堤に切り替わるように誘導したとき、切り替わるのではなく、細胞が死亡したと考えた。LSBの添加後10日目に、スクリーニングの間生存した細胞をヒト神経外胚葉マーカーPAX6参照により本明細書に組み込まれる、Zhangら、CellStemCell7,90-1002010の喪失およびTUJ1発現によるニューロン分化の開始参照により本明細書に組み込まれる、Leeら、CellMotilCytoskeleton17,118-1321990に関して観察した。細胞を、免疫蛍光immunoFにより、ニューロンTUJ1に関して染色し、PX6のC末端に結合する抗体を使用して神経外胚葉の喪失より少ないPAX6細胞の観察に関して染色した。このスクリーニングをインヒビターの数多くの組合せ例えばSU、SU/DAPT、SU/DAPT/CHIR、DAPT/CHIR、SU/CHIR、SU/シクロパミン等で実施し、それらを組合せの日例えば0~10日目、1~10日目、2~10日目、3~10日目等に様々な毎日の供給物に添加した。一般に、最も高い量のTUJ1/PAX6-染色を示す条件および化合物を、さらなる分析のための細胞を提供することについての成功として選択するために、各々の処理によって生成された細胞のTUJ1/PAX6-染色の相対的な量を観察することによって結果を決定した。細胞の免疫染色によりTUJ1/PAX6-である細胞を生産するためのスクリーニング試験において失敗とみなされた低分子の一例はシクロパミンであった。シクロパミンは、それをいつ添加した場合でも、TUJ1/PAX6染色を生じさせることに関して細胞に影響を及ぼさないと思われた。言い換えると、細胞形態は、免疫蛍光により10日目にLSB単独で処理した細胞と同様のままであったすなわち>90PAX6および<10TUJ1。しかし、スクリーニングの間に、発明者は、LSB処理の2日目に添加した3つの低分子の特定の組合せSU5402、CHIR99021およびDAPT;3つのインヒビターについて3iと称するが図6AおよびB、分化の10日目にhPSCにおいてPAX6発現を無くし、TUJ1を誘導することを発見した図2AおよびB。LSB処理の2日目において処理細胞はまだ、神経細胞運命を有することまたは神経細胞運命へと発生する能力を有することに関して不明であったので、これは驚くべき発見であった。その代わりに、3i処理は細胞を神経細胞運命から離れて神経堤細胞へと向かわせ、それらは本発明の侵害受容器細胞へとさらに分化した。次に、いずれのシグナル伝達経路がPAX6TUJ1-ヒトES細胞集団をPAX6-TUJ1集団に変換することに関与すると考えられるかを見出すために、これらの低分子の各々に関する機能を検討した。最初に、SU5402は、VEGF、FGFおよびPDGFチロシンキナーゼシグナル伝達の強力なインヒビターと報告された参照により本明細書に組み込まれる、Sunら、JMedChem42,5120-51301999。そこで一般に、低分子の少なくとも1つはFGFRシグナル伝達経路を阻害することに関与すると考えられた。第二に、CHIR99021は、GSK-3βの選択的阻害β-カテニンを安定化するによるWNTアゴニストと報告された参照により本明細書に組み込まれる、Bennettら、JBiolChem277,30998-310042002。そこで一般に、低分子の少なくとも1つは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3βGSK3β阻害を介して、WNTシグナル伝達経路の少なくとも1つを活性化することに関与すると考えられた。そして第三に、DAPTは、ノッチシグナル伝達をブロックすることができるγセクレターゼインヒビターと報告された参照により本明細書に組み込まれる、Doveyら、JNeurochem76,173-1812001。そこで一般に、低分子の少なくとも1つは少なくとも1つのノッチシグナル伝達経路を阻害することに関与すると考えられた。そこで1つの実施形態では、低分子の1つは非選択的または汎ノッチインヒビターpan-Notchinhibitorと考えられた。別の実施形態では、インヒビターの1つは、少なくとも1つのノッチシグナル伝達経路をブロックすることができる、γセクレターゼ分子のインヒビターである。それゆえ、1つの例示的な実施形態では、インヒビターの組合せは、本発明のPAX6-TUJ1ヒトニューロン細胞を生産するために、FGFRシグナル伝達経路を阻害することに関与する少なくとも1つの低分子、少なくとも1つのノッチシグナル伝達経路を阻害することに関与する少なくとも1つの低分子、およびWNTシグナル伝達経路の少なくとも1つを活性化しつつGSK3βを阻害することに関与する少なくとも1つの低分子を含む。さらなる実施形態では、インヒビターの1つは、ノッチシグナル伝達経路中の少なくとも1つのγセクレターゼ分子をブロックすることができた。実施例IVTUJ1ニューロン細胞は細胞増殖マーカーの発現の喪失を示す。以下の実施例は、TUJ1ニューロン細胞の成熟細胞周期段階を決定するための例示的な方法を述べる。成熟後、培養下で生産されたニューロンは有糸分裂を受けることを停止し、それぞれ細胞増殖参照により本明細書に組み込まれる、Gerdesら、IntJCancer31,13-201983および有糸分裂のG2/M期参照により本明細書に組み込まれる、Hendzelら、Chromosoma106,348-3601997のマーカーであるKi67およびホスホヒストンH3PHH3を喪失した。それゆえ、3iと組み合わせたLSBすなわちLSB3iを使用して生産された細胞をより低い密度、約10~100,000細胞/cm2に継代し、個々の細胞において、発現をより良好に評価するために固定した後、細胞増殖マーカーKi67およびホスホヒストンH3PHH3に関して試験した。特に、Ki67の発現は増殖の良好な予測因子であることが公知であった。そこで、3i化合物を伴わないLSB中で培養した細胞と比較して、12日後に、3iの存在下で培養された細胞では、より少ない細胞それぞれ50および16がKi67およびpHH3細胞を示した図2C~F。LSB/CHIRCHIR99021:C、SU/DAPTSU5402/DAPT、SU/CHIRSU5402/CHIR99021、DAPT、SUSU5402、CHIRに加えて、対照としてLSB単独と比較して、LSB3iを使用したニューロン分化の効率パーセンテージを定量化するため、神経前駆体のマーカーであるネスチンおよびニューロン分化のマーカーであるβ3-チューブリンTUJ1についての細胞間FACSintercellularFACS染色を実施した図2G。LSB、SU/DAPT、DAPT、SUおよびCHIRの存在下では、大部分の細胞がネスチンを発現した。特に、LSB細胞集団の>95がネスチンであった。数多くの細胞が二重SMAD阻害後にネスチン染色を示したが定量化されず、一方より長期間、すなわち19日間培養した細胞はTUJ1ニューロンを示し、これらの細胞の大部分が、チロシンヒドロキシラーゼTHを共発現し、このことは、潜在的なドーパミン作動性ニューロンを同定する参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、NatBiotechnol272009。逆に、LSBに接触した細胞を2日後に3i化合物と接触させた場合、10日後に約25の細胞がネスチンを発現し、約75の細胞がTUJ1を発現して、短期間、すなわち19日未満の細胞培養後のニューロン細胞運命への効率的な変換を明らかにした。驚くべきことに、LSB処理、次いで2日後に細胞をCHIR99021およびDAPTまたはSUのいずれか1つと接触させることにより、細胞集団の50をTUJ1細胞へと分化させた。3つのインヒビターの各々をLSB処理後に単独で使用した場合、20以下の細胞がTUJ1であった。それゆえ、CHIR99021は、この細胞集団のTUJ1ニューロン細胞への定方向性分化の鍵となる寄与因子であることが発見された。発明者は、ネスチンTUJ1-細胞のネスチン-TUJ1ニューロン細胞への定方向性分化が、FGF受容体経路またはノッチシグナル伝達経路内のγセクレターゼのいずれかを阻害することに加えて、WNTシグナル伝達経路の少なくとも1つを活性化しつつGSK3βを阻害することに依存すると考えた。さらに、3i化合物の添加は、さらに25のネスチン-TUJ1ニューロン細胞の変換を生じさせた。図2G参照。要約すると、LSB処理の2日後に3i処理する好ましい実施形態から誘導されるニューロン集団をさらに検討した。この集団は、LSB単独で処理した細胞と比較してニューロンマーカーTUJ1の高発現図2A、BならびにKi67の喪失図2C、Dを示した。Ki67の喪失は、有糸分裂後分化ニューロンの特徴である細胞周期中の細胞の減少を示す。加えて、FACS分析は、LSBと3iからなる好ましい組成物で処理した細胞集団の75超がTUJ1を発現し、これに対してLSB単独で処理した集団の99が前駆体マーカーであるネスチンを発現することを明らかにした図2G。実施例VTUJ1ニューロンは、驚くべきことに、予想された中枢神経系CNS細胞ではなく末梢神経系PNS細胞であった。以下の実施例は、本発明の開発の間に生産されるTUJ1陽性ニューロンの種類を同定するための例示的な方法を述べる。LSB処理の2日後に3i処理する好ましい実施形態から得られるニューロンのサブタイプをさらに特性づけるため、TUJ1陽性集団を様々なニューロンサブタイプのマーカーに関して染色した。具体的には、二重SMAD阻害プロトコールは、FOXG1フォークヘッドボックスタンパク質G1を発現する前脳前部正体anteriorforebrainidentityに偏ったPAX6神経上皮細胞を生成することが公知であった参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、NatBiotechnol272009。それゆえ、LSB3i処理後のニューロンサブタイプ正体を決定するために、細胞を10日目により低い密度、約10~100,000細胞/cm2に継代し、12日目に一連のマーカー発現に関して評価した。予想されるニューロン型はCNS運命であったので、試験した初期マーカーの大部分はCNS型細胞の同定のためのものであった。実際に、LSB細胞はこのサブタイプPAX6、FOXG1陽性がデフォルトであるので、CNS前脳ニューロンが予想された。驚くべきことに、PNS細胞のマーカーであるISL1の染色が見出される前に、CNSマーカーについて少なくとも12の陰性結果例示的な10を以下に示すが得られた。ISL1は、運動ニューロンおよび末梢感覚ニューロンによって発現される。BRN3A発現を試験し、LSB/3i細胞によって発現することを認めた。それゆえ、発明者は、末梢感覚ニューロンの発生を示すBRN3A/ISL1ニューロンを発見した。以下の表A参照。表A:以下の遺伝子/タンパク質のリストは、本明細書で述べるLDN/3i誘導分化を使用して、細胞に関して陽性である発現されると予想された数多くのCNS運命分子を示す。しかし、これらの結果は例示的なCNSマーカーの欠如を示し、前記結果は、PNS系列に関する潜在的マーカー、すなわちISL1およびBRN3Aのその後の観察によって支持された。驚くべきことに、ISL1およびBRN3Aの均一な発現赤色/細胞内のより暗い領域図3AおよびBが本発明のTUJ1細胞緑色/赤色染色に比べてより明るい細胞体で認められた。ISL1およびBRN3Aは感覚ニューロンについての鍵となるマーカーであるそのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、ISL1:Sunら、NatNeurosci11,1283-12932008;BRN3A:Gerreroら、ProcNatlAcadSciUSA90,10841-108451993。この発見は、LSB3i処理から生じるニューロンがCNS細胞ではなくPNSであることを示した。これらの結果は、CNS前脳ニューロンサブタイプPAX6、FOXG1陽性がデフォルトであるLSB細胞と対照的であった。先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の高い集密度はCNS由来ニューロン集団を生じさせるはずであるので、これは極めて予想外の観察である。しかし、侵害受容器は神経堤細胞集団に由来し、神経堤細胞集団は、先行技術の教示によれば、平板培養密度によって示される、処理の開始の際の幹細胞の低い集密度に由来する。言い換えると、予想は、LSB処理の開始の時点で>20,000細胞/cm2の多能性幹細胞という高い初期平板培養密度は拘束CNSニューロン集団を生じさせるというものであった。これに対し、神経堤細胞を生じさせるには約10,000細胞/cm2という低い初期平板培養密度が必要であることは公知であったその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、NatureBiotech,2009図4の下半分参照。実施例VI末梢神経系PNSニューロンは初期段階侵害受容器細胞であることが見出された。以下の実施例は、本明細書で述べる方法を用いていずれの型の末梢神経系PNSニューロンが生産されたかを決定するための例示的な方法の使用を述べる。本明細書で述べる方法によっていずれの型のPNSニューロンが生産されるかは、感覚ニューロンおよび運動ニューロンなどのいくつかの種類の候補ニューロンが存在し、さらに固有受容器細胞、機械的受容器mechanoceptor細胞および侵害受容器細胞を含むPNS中の公知の感覚ニューロンの少なくとも3つの主要なサブセットが存在するので、不明であった。発生の間、初期段階の侵害受容器はペプチド作動性および非ペプチド作動性の両方であり、独自にNTRK1、RUNX1を発現し、次いでRETを発現したRETに関する情報の例については、参照により本明細書に組み込まれる、Woolfら、Neuron55,353-3642007参照。TUJ1ニューロンを含む2連の初期段階LSB3i培養物をRET発現に関して試験し図3C、このマーカーに関して陽性であることが見出されTUJ1染色緑色/RET染色と比較してより明るい細胞体および挿入されたRETの箱内のより明るい染色領域と比較して、赤色/大きい方の箱の細胞内のより暗い領域図3D、また10日目にFACSによって測定した場合、培養下のすべての細胞の60超がNTRK1を発現した図3E。要約すると、この集団はISL1、BRN3A、RETおよびRUNX1の発現に関して陽性であり図3A~D、初期段階侵害受容器ペプチド作動性および非ペプチド作動性の両方の産生を指示した。FACS分析は、これらのニューロンの60超がNTRK1に関して陽性であることを明らかにした図3E。これらのマーカーは集合的に、ニューロン集団が末梢感覚ニューロン、特に侵害受容器であることを示す。それゆえ、2日目の3i処理とLSBの組合せの好ましい実施形態は、神経堤由来集団、すなわち侵害受容器の予想外の形成を生じさせる。さらに、発明者は、LSB/3i処理によって得られた細胞が神経堤へと移行し、CNS運命に分化する代わりにニューロゲニン1NEUROG1を一過性に発現するという本明細書で述べた観察に加えて、初期免疫蛍光結果、すなわちBRN3A、ISL1、アレイデータ、すなわちTAC1サブスタンスP発現を含む、いくつかの試験からの情報を組み合わせ、次にNTRK1マーカーを選択し、NTRK1細胞を見出した。そこで、発明者は、生じるPNS細胞がおそらくペプチド作動性侵害受容器である可能性が高いと考えた。実施例VIILSB3i処理は再現可能である。以下の実施例は、再現性を決定するために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。本発明の一般性を確立するため、発明者は、hiPSCを幹細胞の供給源として使用して、LSB処理の2日後に3i処理を組み合わせる本発明の好ましい実施形態を反復した。LSB3i処理の再現性を、誘導多能性幹細胞hiPSC系を含むさらなるhPSC系にわたって評価した。現行技術はhiPSCを生産する多くの方法を述べており、当業者に公知である。特に、Oct4オクタマー結合転写因子4、Sox2SRY性決定領域Yボックス2、Klf4クルッペル様因子4およびc-Myc転写因子p64などの遺伝子を挿入することによって作製される2つのhiPSC系C14およびC72を使用して、効率的に神経化できるneuralizeことが示された参照により本明細書に組み込まれる、Papapetrouら、ProcNatlAcadSci.,USA1062009参照。次にPAX6発現をImmunoFによって検査した。C14およびC72細胞系のLSBおよびLSB3i処理は、図3A~Dに示すヒト細胞系と比較した場合、類似のニューロン染色結果を示した。上記で述べたように、ISL1、BRN3A、RET、RUNX1およびTUJ1に関して、例示的なC14染色結果を図4A~Dに示し、例示的なC72染色結果を図8A~Dに示す。C14およびC72細胞系のLSB処理はネスチン陽性細胞を均一に生じさせ処理細胞集団の>95、FACSによって測定されるようにLSB3iの組合せで処理したときTUJ1細胞を形成することができたC14については40およびC72については33;図4E。これらの結果を、図4EにおいてLSBおよびLSB3i結果に関して示される、LSBおよびLSB3iで処理したH9細胞系すなわちhESC系と比較した。さらに一層高いニューロン収率がFACSによって測定された40および33から、NTRK1に関して選別した場合核染色の>90がニューロンである、NTRK1神経栄養因子チロシンキナーゼ受容体1型マーカー発現に関して選別した後バルク培養物を、N2培地を含むMatrigel商標でコートした培養容器に継代したとき、これら2つのhiPSC系において得られた。細胞をアキュターゼで解離させ、N2に再懸濁して、APC結合NTRK1抗体RDと共に氷上で15分間インキュベートし、洗浄して、FACSのためにN2に再懸濁した。選別後、細胞をN2培地で24時間培養し、適切に固定した。細胞を収集し、BRN3A、ISL1、TUJ1およびDAPIに関して染色した。特に、代表的なNTRK1LSB3i処理細胞集団におけるわずかなネスチン細胞と比較して、LSB3i処理細胞からはC14およびC72両方のNTRK1-細胞に関して数多くのネスチン細胞赤色/暗染色が示される図9。さらに、わずかなC14NTRK1-細胞がTUJ1細胞系を発現したが、C27はより高い数のNTRK1-TUJ1緑色;鮮やかな染色を示した。両細胞系は、DAPI青色;明るい核染色によって同定される細胞体と比較して認められるように、高い数のネスチン-TUJ1細胞を示した。要約すると、LSB、次いで2日目に3iで処理し、高集密度で平板培養したhiPSC細胞は、侵害受容器マーカーISL1、BRN3A、RETおよびRUNX1に関して陽性のニューロン細胞の形成を生じさせた図4A~D、図8A~Dおよび図9。実施例VIIICHIR99021CはLSB培養細胞すなわちLSB-Cからニューロン分化を誘導するための鍵となる因子である。以下の実施例は、定方向性ニューロン分化を誘導するための各々の化合物の効果を試験するために例示的方法を使用することを述べる。実施例IIIのTUJ1細胞の誘導に関連することが認められた各々の化合物の充足度に関する機構的な洞察を得るために、3i化合物の特定の組合せを、細胞間FACSを用いて測定されるネスチンおよびTUJ1の細胞発現を誘導することに関して試験した図1Gに示す。ネスチンをLSBニューロン系列細胞のマーカーとして使用し、下流のすなわちより分化したニューロン細胞を同定するためにTUJ1を使用した。個々の因子のいずれもが高い数60超のTUJ1ニューロンを生じなかったが、その他の2つのシグナル阻害因子のいずれか1つと組み合わせたCHIR99021は、中等度の数のTUJ1ニューロンDAPTに関しては53およびSU5402に関しては58を生成することができた。これらのデータは、本明細書で使用した試験条件下で、CHIR99021がニューロン分化を加速するための鍵となる因子であり、SU5402およびDAPTは重要な、しかし付加的な刺激を提供したことを示す。加えて、3i組成物の3つの成分すべてが分化ニューロンの最大収率のために必要である図2G。実施例IX人工SOX10細胞は侵害受容器細胞を生産することができる。以下の実施例は、操作されたSox10GFP発現ヒト細胞の定方向性分化のために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。侵害受容器細胞は、ヒト発生の間に2種類の細胞中間体から生じると考えられる:具体的には、SOX10ニワトリ胚神経堤細胞は脊髄に隣接する体幹侵害受容器細胞を生成できることが認められた参照により本明細書に組み込まれる、Georgeら、NatNeurosci10:1287-12932007。加えて、アフリカツメガエルXenopuslaevisの頭部プラコード組織は、顔面組織中の三叉神経侵害受容器細胞集団に寄与した参照により本明細書に組み込まれる、Schlosserら、JCompNeurol418:121-1462000;Schlosserら、DevBiol294:303-3512006。そこで、ヒト細胞においてSOX10によって示される神経堤中間体細胞運命参照により本明細書に組み込まれる、Aokiら、DevBiol259,19-332003;Leeら、NatBiotechnol25,1468-14752007が、トランスジェニックSOX10::GFP細菌人工染色体BAChPSC系を使用して分化の間に認められるかどうかを決定するために、以前に報告された方法参照により本明細書に組み込まれる、Placantonakisら、StemCells27:521-5322009を用いて、GFP遺伝子と共発現する富化された神経堤遺伝子マーカーを伴った、このSOX10::GFPBAC細胞系を生成した。SOX10:GFP細胞系はH9hESC系のサブクローンであった。細胞を解離させ、Amaxaからの試薬溶液V、プロトコールB-16および装置を用いて遺伝子送達を実施した。ヌクレオフェクトしたnucleofected核にトランスフェクトしたDNAは、GeneExpressionNervousSystemAtlas[GENSAT]アクセッション番号:GENSAT1-BX1086から入手した、挿入されたGFPとSOX10遺伝子を含む細菌人工染色体BACであった。次にBACを、pL452プラスミドから切り出した選択カセットからGENSATBACへのcre/LoxP組換えを使用して、選択のためにネオマイシン耐性遺伝子を含むように改変した参照により本明細書に組み込まれる、Tomishimaら、Stemcells251:39-45.Epub2006Sep212007参照。遺伝子送達後、hESCを、ネオマイシン耐性選択のためにG418の存在下で単細胞として接種し、クローンを手操作で採取して、分化後にGFPの存在に関してスクリーニングした。qRT-PCRによりGFP細胞を選別してSOX10および他の神経堤マーカーの発現を確認した。2つの付加的な2連の試料を各々LSBの1つと接触させ、次にCHIR99021LSB/CまたはLSBと3iに接触させて、LSBで分化を開始させた後4、8、12および16日目に、GFP発現をFACS同定およびSOX10::GFP細胞の選別によって測定した。CHIR99021が存在した場合は、培養下でこれらの処理細胞の70超が、培養条件に応じて分化の12日目までにSOX10::GFPになったLSB/Cについては70およびLSB3iについては80;図5DおよびE。この結果は、細胞の大部分が神経堤正体を発現することを示し、CHIR99021がLSB3i侵害受容器細胞の生成のために必要であるという発明者の観察を支持した。したがって、LSB3i処理細胞はLSB/C処理したhPSCと比較してより迅速に神経堤運命を獲得したので図5DおよびE、SU5402およびDAPTと接触させることに加えて、チロシン受容体キナーゼ受容体およびノッチシグナル伝達を阻害するこれらの低分子による組合せ阻害は、それぞれ、神経堤細胞運命を加速した。発明者は、CHIRは神経堤および感覚ニューロンを誘導し、SUは神経堤マーカー発現およびニューロン分化を加速すると考えた。最後に、発明者は、CHIRおよびSUと組み合わせたDAPTはニューロン分化を加速すると考えた。さらに、LSBと組み合わせたCHIR99021の使用、すなわちLSB/Cは、操作されたSOX::GFP細胞を読み出しとして使用した場合、12日から16日目までの間にLSB3iと比較して、60超のネスチン-TUJlニューロン細胞の遅い変換速度を生じさせた。実施例X本明細書で述べる方法によって生産されたNTRK1ヒト侵害受容器細胞は、ペプチド作動性細胞と一致する遺伝子発現、およびインサイチューラット侵害受容器細胞に類似した電気生理学的応答を示した。以下の実施例は、本明細書で述べる方法によって生産された侵害受容器細胞の機能的能力を決定するために本発明の例示的な方法を使用することを述べる。LSB3i由来ニューロンが本物の侵害受容器ニューロン細胞であることを確認するために、LSB3i処理細胞を機能、成熟段階および挙動に関して検査した。侵害受容器細胞を生じさせる多能性幹細胞のLSB3i処理が得られた後、10~100,000細胞/cm2の平板培養密度から長期培養物を樹立し、ヒトβNGF、BDNFおよびGDNFを添加したN2培地での培養下で10日目、30日目に継代したさらなる詳細については実施例I参照。より長期の培養条件下でのこれらの細胞の生存率は、NTRK1侵害受容器状態と対応して、NGF依存性であることが認められた。LSB3i侵害受容器は、グルタミン酸図7Cに加えて、先に示したように高レベルのTUJ1、ISL1、BRN3A図7A~Cを発現した。グルタミン酸産生は、興奮性グルタミン酸作動性ニューロン、すなわちグルタミン酸を放出する侵害受容求心性線維、および有害刺激についての重要なイオンチャネルであるカプサイシン受容体TRPV1図7Dと一致した。培養下で15日目に2つの別個の成長突起を各々のニューロンについて同定することができた図7E、図12。樹状突起マーカーMAP2は、主として、極性を有する形式polarizedfashionにおいて、2つの突起の一方において発現された図7F。ニューロンの双極性は、末梢神経節における感覚ニューロンの役割と一致し、細胞体は背根神経節に位置し、脊髄と末梢の両方に向けて突起を突き出す参照により本明細書に組み込まれる、Woolfら、Neuron55,353-3642007;Georgeら、NatNeurosci10,1287-12932007。神経成長因子NGFの存在下で、ニューロンを長期間培養した例えば、細胞を10日目に継代し、30日目まで培養した。LSBを5日目に細胞から回収し、10日目に3iを回収して、その日にNGF/GDNF/BDNFを培地に添加した。10日目から30日目までニューロンにNGF/GDNF/BDNFを供給した。初期LSB処理からの日数で30日目に、ニューロンは神経節様構造へと自己組織化し始めたことが認められた。このタイプの形態は末梢感覚ニューロンに共通する参照により本明細書に組み込まれる、Marmigereら、NatRevNeurosci8,114-1272007図7G、HおよびI。成熟侵害受容器は、典型的には、ペプチド作動性感覚ニューロンによって発現されるカルシトニン遺伝子関連ペプチドCGRPおよびサブスタンスP神経ペプチドなどの神経ペプチドの発現に依存して、ペプチド作動性または非ペプチド作動性のいずれかである参照により本明細書に組み込まれる、Woolfら、Neuron55,353-3642007。これに対し、非ペプチド作動性ニューロンはCGRPもサブスタンスPも発現せず、レクチンIB4への結合などの他のマーカーを有する。それゆえ、LSB3i誘導ニューロンを、FACSを用いて、NTRK1発現に関して上記で述べた方法参照、NTRK1およびNTRK1-集団に選別した選別細胞の例については図7G参照。NTRK1細胞はサブスタンスPおよびCGRPの両方に関して陽性であり、主としてペプチド作動性侵害受容器表現型を示した図7HおよびI;分化の30日目。感覚ニューロン正体の主要な機能的特徴すなわち機能は、それらの電気生理学的特性である参照により本明細書に組み込まれる、Fangら、JPhysiol565,927-9432005。NTRK1選別ニューロンを、培養ニューロンについての標準的な電気生理学技術によっても試験したその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Placantonakisら、StemCells.2009,Figure5に一例が示されている。NTRK1細胞は、電気生理学的特徴である、特徴的な単一活動電位AP、発火パターンを示し、平均膜静止電位は初期LSB3i処理後21日目までに67±4mVであった。LSB3iヒトニューロンにおいて生じるAPのタイミングおよび活動曲線の形状を図7J太い赤線参照および以下の表1に示す。これらの結果は、以前に一次麻酔成体ラット侵害受容器の電気生理学的報告において述べられたものと同様であった参照により本明細書に組み込まれる、Fangら、JPhysiol565,927-9432005。実施例XI本明細書で述べる組成物および方法によって生産される細胞の遺伝子発現。以下の実施例は、本明細書で述べる方法によって生産される侵害受容器細胞および他の細胞型の包括的な遺伝子発現を決定するための例示的な方法の使用を述べる。誘導分化過程の間の事象すなわちマーカー発現の時期をさらに特性づけるため、LSBおよびLSB3i処理した両方のhPSCに関して、包括的な遺伝子発現分析を精密時間分解能finetemporalresolutionで実施した2、3、5、7、9および15日目、NCBIGeneExpressionOmnibusGEOアクセッション番号GSE26867。神経外胚葉、神経堤、ニューロンおよび侵害受容器に関する選択マーカーを分析した場合以下の表2参照、各々について分化の異なる段階を認めることができた図10。この遺伝子発現分析図10B、Cおよび上記表2は免疫蛍光結果の大部分と一致した。例えば、遺伝子分析は、成熟中のニューロンにおいて、ISL1、POU4F1BRN3A、SOX10、TAC1サブスタンスPのプロペプチド、NTRK1およびグルタミン酸小胞輸送体VGLUT2遺伝子がすべて上方調節されるすなわち培養下の多くの細胞が経時的にこれらのマーカーの発現を増加させることを示した。同時にこれらのマーカーは誘導細胞で増加することが認められたが、hESC由来の原始神経外胚葉についてのマーカー、特にDLK1、LHX2、OTX2、LEFTY2、PAX6およびHES5は下方調節されるすなわち培養下のより少数の細胞で発現されることが認められた。しかし、成熟侵害受容器で発現されると予想される、ソマトスタチンSSTおよびSOX10の発現が、15日目にLSB3i処理細胞培養物で認められた。しかし、SSTはまた、発生中の感覚ニューロンにおいても発現されることが示された。それゆえ、発明者は、このマーカーが15日目の未熟細胞の存在を示していると考えた。いくぶん下方調節されているが、SOX10の発現はまた、大部分の細胞がニューロンであると思われる時点でも観察された。SOX10は細胞がニューロンに分化するとともに下方調節されると予想されたので、この観察は意外であった。15日目の培養物の細胞におけるSSTおよびSOX10発現というこの予想外の発見から、すべての細胞が侵害受容器細胞になるわけではなく、約20~30であると考えられた。これは、他の成熟細胞型シュヴァン細胞などがSOX10を発現し続けることを示した。二重SMAD阻害によって生産されるhESC由来の原始神経外胚葉細胞培養物は各々が参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、NatBiotechnol272009;Fasanoら、CellStemCell6,336-3472010、DLK1、LHX2、OTX2、LEFTY2、PAX6およびHES5遺伝子の高発現を示した。同様に、hESC由来の原始神経外胚葉細胞培養物がLSBを用いた二重SMAD阻害によって生産された場合も、これらの遺伝子について類似の高発現が観察された図10B、Cおよび以下の表3参照。これらの遺伝子は、LSB3i処理の間は低減し、この間、本発明の開発において侵害受容器が生産された。加えて、時間的トランスクリプトーム分析は、機械的受容器細胞mechanoceptorおよび固有受容器細胞とは異なる、侵害受容器中間体細胞運命についてのさらなる証拠を提供した。ニューロゲニン塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質は、マウス発生の間に背根神経節における神経発生の2つの逐次的な波を媒介する参照により本明細書に組み込まれる、Marmigereら、NatRevNeurosci8,114-1272007;Maら、GenesDev13,1717-17281999。NEUROG2ニューロゲニン2によって示される最初の波は機械的受容器細胞および固有受容器細胞を生じさせ、NEUROG1ニューロゲニン1によって示される2番目の波は侵害受容器細胞を生じさせる。hPSCをLSBで処理した場合、NEUROG2発現は7日目までに強力に誘導される図10Cおよび以下の表4。これに対し、LSB3iで処理したhPSCは、7日目までにあまり顕著ではないNEUROG2の誘導を示すが、9日目までにNEUROG1の選択的誘導を示す図10C。実施例XII例示的な侵害受容器細胞を提供するために本発明の組成物および方法を用いて企図される大規模培養。以下の企図される説明は、本明細書で述べる方法によって生産される侵害受容器細胞の大規模生産のための例示的な方法および使用を示す。LSB3iを使用する、拡大可能な生成すなわち比較的少数の細胞、例えば実施例、前出で述べるような48穴プレートの1.5×104細胞/穴、および企図される96穴プレートでの5×103細胞/穴を含む両培養物から、hPSC由来侵害受容器の大規模バッチ培養例えば1815cm皿のバッチで1×107~1×108細胞約5.5×107細胞まで、侵害受容器細胞を生成するための成功をおさめると考えられる方法。これらの方法は、基礎生物学試験における使用のため、ならびにヒトおよび動物における医学適用に適用できる薬剤発見のために、化合物を試験する際に使用するためのhPSC由来侵害受容器細胞を提供することが企図される。特に、発明者は、ヒトおよび動物における急性および慢性疼痛を軽減する処置のために本発明の組成物および方法を使用することを企図する。特に、例示的な侵害受容器細胞、例えばペプチド作動性侵害受容器細胞を、7×107~7×108の例示的な非限定的範囲で70の効率の侵害受容器細胞収集が企図される提供するために、本明細書で述べる培地および例示的化合物を使用して、例示的な1×108~1×109hPSC細胞をバッチ胚様体培養物において増殖させる大規模バッチ培養が企図される。例示的な侵害受容器細胞は、TAC1、VGLUT2およびSLC15A3などの侵害受容器細胞を同定する遺伝子すなわちmRNAおよびタンパク質を発現すると考えられる。例示的な侵害受容器細胞は、ISL1、BRN3A、RET、RUNX1、サブスタンスP、CGRP等のような同定マーカーを発現すると考えられる。要約すると、発明者は、基礎生物学ならびにヒトおよび動物において侵害受容器細胞に関連する状態、特に疼痛の試験および処置のための薬剤発見における、新規プラットフォームを提供するために本発明の組成物および方法を使用することを企図する。以下の参考文献はそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施例XIIIメラノサイトはヒト多能性幹細胞から誘導される:LSB-メラノサイトLSB-Mel。以下は、関連疾患モデリングにおける使用のためのメラノサイトを提供するための例示的な組成物および方法を述べる。SOX10::GFP細菌人工染色体BACヒト胚性幹細胞hESCレポーター系を作製した。このことは、この細胞系が低分子との接触に応答する際のインビトロでの神経堤細胞誘導の観察を可能にした。Sox10は、多分化能性神経堤幹細胞の最も堅調な早期マーカーであり、メラノサイト前駆体を含む一部の神経堤誘導体においても発現されることが認められた。これまでの成熟スキームで得られるよりも高い純度と数でメラノサイト培養物を生産するために、このレポーター系を使用して、定方向性分化スキームの開発において神経堤集団を将来を見越してprospectively同定し、単離した図14、LSB-C。二重SMAD阻害プロトコール参照により本明細書に組み込まれる、Chambersら、Nat.Biotech.2009において、SMADシグナル伝達を阻害する2つの低分子で処理したヒト多能性幹細胞hPSCは、CNS神経組織を効率的に生産した。加えてhESCをより低い密度で平板培養した場合、低レベルの自発的神経堤細胞誘導が認められた例えば、約3のSoxl0::GFP神経堤型細胞が認められた。しかし、研究における使用のためおよび医学的試験のためには、より多くの神経堤型細胞が必要であった。さらに、メラノサイト研究のためには、低レベルの自発的分化では提供されない、より多数の細胞を有するより純粋な集団が必要であった。本発明の開発の間に、発明者は、メラノサイト前駆体、成熟中のメラノサイトおよび成熟メラノサイトの高度に純粋な産物を生産するように、神経堤誘導のための二重SMAD阻害プロトコールを最適化する方法を発見した。具体的には、本発明のメラノサイトを生産する、以下の時系列の培養条件を開発した:0および1日目にLDNおよびSB3iを含む方法におけるLDNおよびSBと同じ濃度範囲を使用するを供給する;2日目にLDN、SB、CHIR本明細書で述べる3iを含む方法におけるLDN、SBおよびCHIRと同じ濃度範囲を使用するを供給する;1つの実施形態では、3日目にSB、CHIR本明細書で述べる3iを含む方法におけるSBおよびCHIRと同じ濃度範囲を使用するを供給し、別の実施形態では、3日目にLDN、SB、CHIR本明細書で述べる3iを含む方法におけるLDN、SBおよびCHIRと同じ濃度範囲を使用するを供給する;4日目および5日目にCHIR本明細書で述べる3iを含む方法におけるCHIRと同じ濃度範囲を使用するを供給する;6日目から11日目までCHIR、BMP4およびEDN3本明細書で述べる3iを含む方法におけるCHIRと同じ濃度範囲を使用し、BMP4およびEDN3については以下の濃度範囲参照を供給する。11日目に細胞を継代し、8週間までMEL培地CHIRを含むを供給した。MEL培地は、メラノサイトに関して富化され、これにより、8週間までに細胞培養物は100までの純粋な集団を示した。したがってこのLSB-MEL法/プロトコールは、メラノサイト生産の高い効率を有していた。発明者はまた、メラノサイトの発生の間、リノール酸がMEL培地中の少なくとも1つの必要成分であることを発見した図16参照。メラノサイトの発生の間に、多数の前駆体段階が以下の順序で認められた:神経堤幹細胞、胚性グリア-メラニン芽幹細胞、成体メラノサイト幹細胞、メラノサイト。図13の例示的な概略図参照。図13メラノサイト前駆体/メラニン芽細胞の特異化と単離。11日目のLSB-Cプロトコールは、Soxl0::GFP、MITFを共発現するメラノサイト前駆体の誘導を支持したA、右のパネル。MITF単一陽性集団も認められたA、左のパネル。c-Kitはメラノサイト前駆体の潜在的マーカーとして同定された。LSB-C分化後に低いパーセンテージのSox10::GFP、c-kit共発現細胞が認められたB、橙色集団。qRT-PCR分析により、二重陽性集団においてメラノサイトマーカーMITFM塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスロイシンジッパータンパク質およびDctドーパクロムトートメラーゼドーパクロムδイソメラーゼ、チロシン関連タンパク質2の富化が確認されたC。BMP4およびEDN3での処理LSB-Melは、Sox10::GFP、c-kit二重陽性の推定上のメラノサイト前駆体集団の誘導を増強したD。LSB-Mel処理後に単離されたSox10::GFP、c-kit二重陽性細胞は、有意により高いレベルのメラノサイトマーカーMITFMおよびDctを示したE。誤差バーはs.e.m.を示す。p<0.05。図14メラノサイト前駆体の増殖と成熟。分化条件の要約A。BMP4およびEDN3を伴うLSB-CLSB-Mel条件での特異化後、細胞を11日目に選別し、再接種した。選別後PS細胞を、c-kitリガンドSCF、エンドセリン3EDN3、線維芽細胞増殖因子FGFおよびWntアクチベーターを含む成熟培地に維持した。PS6日目に明視野顕微鏡検査によって認められた色素細胞は、メラノサイトマーカーMITFに関して陽性であったが、Sox10::GFPレポーターが下方調節されていると思われたB。Sox10::GFP、c-kit二重陰性を除くすべての集団が、最終的にMITF発現細胞および肉眼で見える色素クラスターを生じさせたが、その割合は異なっていたC。BMP4およびcAMPでの処理は、メラノサイトに特有の紡錘様形態を示す色素細胞への分化を増強したD。図15成熟メラノサイトの特性付け。LSB-Melプロトコールで誘導した成熟メラノサイトの純粋な集団は、培養下で8週間超後にMITF、Sox10、Tyrp1チロシナーゼ関連タンパク質1およびHMB45を含む一般的なメラノサイトマーカーの発現を維持するA。メラノサイトは、継代の数週間にわたってそれらの暗く色素沈着した表現型を保持するB。色素沈着レベルを評価するために1×106細胞をペレット化し、写真撮影した。成熟メラノサイトの電子顕微鏡超微細構造特性付けC、D。LSB-Mel由来メラノサイトの細胞質中の数多くの暗く色素沈着したメラノソームの存在がTEMによって観察されたC。メラノソーム小胞の段階IからIVへの成熟に伴うメラニン色素の存在および進行性沈着に注目されたいD。それゆえ、発明者は、二重SMAD阻害プロトコール、LSBが、ヒト胚性幹細胞からSoxl0::GFPを発現する神経堤集団を迅速かつ効率的に生成することを明らかにした。この修正プロトコールは、c-kit発現によって、将来を見越して同定され、単離される、低レベルのメラノサイト前駆体の誘導を支持した。これらの細胞の誘導は、BMP4およびEDN3での処理を介してさらに増強された。メラノサイト前駆体は、その後、BMP4およびcAMPの存在下でインビトロでさらに培養した後、色素沈着状態へと成熟した。RDからのBMP4についての濃度範囲は10ng/ml~100ng/ml1つの実施形態では25ng/mlを使用し、AmericanPeptideCompanyからのEDNは25~300nM1つの実施形態では100nMを使用する。図16メラノサイトの増殖のためにリノール酸を必要とする、例示的なLSB-MEL培地処方物を示す。顕微鏡像の上に示す培地成分は、処方物から除外された培地成分である;Ph=位相差;BF=明視野。例示的な概略図は、本発明の細胞を同定するために使用したメラノサイト前駆体マーカーを示す。したがって発明者は、インビトロでの神経堤の誘導ための迅速で明確なプロトコールを発見し、開発した。さらに、発明者は、これらの細胞のメラノサイトへの定方向性分化のための組成物および方法を開発するために、インビトロでの神経堤細胞の誘導のためのこの迅速で明確なプロトコールを使用した。これらのメラノサイトは、長期培養およびユーメラニンの持続的生産のそれらの能力において独特であった。上記明細書において言及したすべての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。記述した本発明の方法およびシステムの様々な修正および変法が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求に記載の本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが了解されるべきである。実際に、細胞生物学、神経生物学、がん細胞生物学、分子生物学、生化学、化学、有機合成または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記述した方法の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。"