"少なくとも36アミノ酸長のポリプロリンIIPPII構造を含んでなる組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列PBISであって、前記PPII構造が、N末端の少なくとも2個のシステインと、C末端の少なくとも2個のシステインとの間に位置し、前記PPII構造中のアミノ酸のうち10以下がリシンまたはアルギニンであり、かつ前記PPII構造が配列PPPVHL6配列番号29を含まない、組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列PBIS。少なくとも36アミノ酸長のプロリンリッチ配列を含んでなる、組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列PBISであって、前記プロリンリッチ配列が、N末端の少なくとも2個のシステインと、C末端の少なくとも2個のシステインとの間に位置し、前記プロリンリッチ配列中のアミノ酸のうち10以下がリシンまたはアルギニンであり、かつ前記プロリンリッチ配列が配列PPPVHL6配列番号29を含まない、組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列PBIS。前記PPII構造またはプロリンリッチ領域が少なくとも5個のプロリンリッチリピートを含んでなる、請求項1または2に記載の組換えPBIS。前記プロリンリッチリピートのそれぞれが、PPPXXX配列番号10、PPXX配列番号6、PX、PPPXX配列番号9、PPPX配列番号5、PPX、およびPPPXPX配列番号11からなる群から独立して選択され、Xは任意のアミノ酸である、請求項3に記載の組換えPBIS。前記PPII構造またはプロリンリッチ領域の長さが約40~60アミノ酸である、請求項1~4のいずれか一項に記載の組換えPBIS。前記PPII構造またはプロリンリッチ領域が、非両親媒性PPII構造、両親媒性負電荷PPII構造、および両親媒性非電荷PPII構造からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の組換えPBIS。前記PPII構造またはプロリンリッチ領域が負電荷両親媒性配列を含んでなる、請求項6に記載の組換えPBIS。前記負電荷両親媒性配列が、PPPVDL配列番号19およびPPPVEL配列番号18からなる群から独立して選択される少なくとも1個のリピートを含んでなる、請求項7に記載の組換えPBIS。前記負電荷両親媒性配列が、配列番号30、配列番号31、配列番号123、および配列番号124からなる群から独立して選択される、請求項8に記載の組換えPBIS。前記PPII構造またはプロリンリッチ領域が非電荷両親媒性配列である、請求項9に記載の組換えPBIS。前記非電荷両親媒性配列が、PPPVNL配列番号21およびPPPVQL配列番号22の群から独立して選択される少なくとも1個のリピートを含んでなる、請求項10に記載の組換えPBIS。前記非電荷両親媒性配列が配列番号32、配列番号33、配列番号34、および配列番号35の群から独立して選択される、請求項11に記載の組換えPBIS。前記PPII構造またはプロリンリッチ領域が非両親媒性配列である、請求項6に記載の組換えPBIS。前記非両親媒性配列が、PPPVAL配列番号16、PPPVTL配列番号20、PPPVSL配列番号36、PPPVVL配列番号37、およびPPPVLL配列番号17からなる群から独立して選択される少なくとも1個のリピートを含んでなる、請求項13に記載の組換えPBIS。前記非両親媒性配列が、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、および配列番号49からなる群から独立して選択される、請求項14に記載の組換えPBIS。前記非両親媒性配列が、プロリンおよびアラニンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる、請求項15に記載の組換えPBIS。前記プロリンおよびアラニンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる配列が、PPPAAA配列番号13、PPPAPA配列番号23、およびPPPPPP配列番号24からなる群から選択される少なくとも1個のリピートを含んでなる、請求項16に記載の組換えPBIS。前記プロリンおよびアラニンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる配列が、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号60、および配列番号61からなる群から独立して選択される、請求項17に記載の組換えPBIS。前記非両親媒性配列が、配列GXYnここで、XおよびYは独立して任意のアミノ酸であり、nは5~20の整数であるから本質的になり、かつ前記GXYnを含んでなる配列が少なくとも30のプロリンを含んでなる、請求項13に記載の組換えPBIS。前記非両親媒性配列が、GenBank受託番号CAA34683.1のアミノ酸135~179と少なくとも70の同一性を示すアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる、請求項19に記載の組換えPBIS。前記非両親媒性配列が、配列番号56および配列番号68からなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる、請求項20に記載の組換えPBIS。前記非両親媒性配列が、表面アドヘシンAgI/IIミュータンス連鎖球菌NG8、GeneBank:GQ456171由来のアミノ酸884~927と少なくとも70の同一性を示すアミノ酸から本質的になる、請求項13に記載の組換えPBIS。前記非両親媒性配列が、配列番号69および配列番号70からなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる、請求項22に記載の組換えPBIS。C末端の2個のシステインの間のアミノ酸の数が0~20の整数であり、かつ/またはN末端の2個のシステインの間のアミノ酸の数が0~20の整数である、請求項1~23のいずれか一項に記載の組換えPBIS。前記PPII構造のN末端のC末端システインとN末端との間、または前記PPII構造のC末端のN末端システインとC末端との間のアミノ酸の数が、約1~30から独立して選択される整数である、請求項1~24のいずれか一項に記載の組換えPBIS。前記N末端の2個のシステインまたは前記C末端の2個のシステインが第2のプロリンリッチ領域内に見られる、請求項1~25のいずれか一項に記載の組換えPBIS。前記第2のプロリンリッチ配列が、配列PXnここで、nは0~20の間の整数であるから本質的になる、請求項26に記載の組換えPBIS。前記第2のプロリンリッチ配列が、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号127からなる群から選択される、請求項27に記載の組換えPBIS。前記PBISが、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号85、配列番号86、配列番号83、配列番号84、配列番号87、配列番号88、配列番号125、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択される、請求項28に記載の組換えPBIS。請求項1~29のいずれか一項に記載の組換えPBISと、異種タンパク質とを含んでなる、融合タンパク質。前記異種タンパク質が組換えPBISに対してC末端にある、請求項30に記載の融合タンパク質。前記異種タンパク質が組換えPBISに対してN末端にある、請求項31に記載の融合タンパク質。前記PBISと、異種タンパク質とがリンカーにより接続される、請求項30~32のいずれか一項に記載の融合タンパク質。前記リンカーが酵素的または化学的タンパク質分解試薬の標的部位を含んでなる、請求項33に記載の融合タンパク質。前記酵素的タンパク質分解試薬の標的部位が、エンテロキナーゼ標的部位、因子Xa標的部位、およびインテインからなる群から選択される、請求項34に記載の融合タンパク質。請求項1~29のいずれか一項に記載の組換えPBISまたは請求項30~35のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする配列を含んでなる、核酸分子。前記PBISまたは融合タンパク質を小胞体へと導くシグナル配列をコードする配列をさらに含んでなり、前記シグナル配列が前記PBISまたは融合タンパク質と同じオープンリーディングフレームにある、請求項36に記載の核酸分子。前記シグナル配列がγゼインシグナルペプチドである、請求項37に記載の核酸分子。プロモーターをさらに含んでなる、請求項36~38のいずれか一項に記載の核酸分子。前記プロモーターが、タバコ細胞、哺乳類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または藻類細胞からなる群から選択される細胞において機能的である、請求項39に記載の核酸分子。請求項37~40のいずれか一項に記載の核酸を含んでなる、ベクター。請求項1~29のいずれか一項に記載の組換えPBISまたは請求項30~33のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含んでなる、RPBLA。請求項1~29のいずれか一項に記載の組換えPBIS、請求項30~35のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項36~40のいずれか一項に記載の核酸、請求項42に記載のRPBLAの請求項41に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。前記細胞が、高等植物細胞、糸状菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、または藻類細胞である、請求項43に記載の宿主。請求項43または44のいずれか一項に記載の細胞を、RPBLAの形成に好適な条件下で培養することを含んでなる、RPBLAの製造方法。i請求項43または44のいずれか一項に記載の細胞をRPBLAの形成に好適な条件下で培養すること、およびii組換えタンパク顆粒を精製することを含んでなる、RPBLAの精製方法。i植物宿主系を請求項36~40のいずれか一項に記載の核酸または請求項41に記載のベクターで形質転換すること、ii前記形質転換植物宿主系から植物体を作出すること、およびiii前記植物体をRPBLAの形成に好適な条件下で栽培することを含んでなる、RPBLの製造方法。i植物宿主系を請求項36~40のいずれか一項に記載の核酸または請求項41に記載のベクターで形質転換すること、ii前記形質転換植物宿主系から植物体を作出すること、iii前記植物体をRPBLAの形成に好適な条件下で栽培すること、およびiv前記RPBLAを精製することを含んでなる、RPBLAの製造方法。RPBLAの精製が、iv水性細胞ホモジネートを調製すること、v水性細胞ホモジネート中に密度の異なる領域を形成して、高濃度のRPBLAを含有する領域と低濃度のRPBLAを含有する領域を設けること、およびvi比較的高濃度のRPBLAの領域からRPBLA枯渇領域を分離し、それにより、RPBLAを精製することを含んでなる、請求項48に記載の方法。i包膜融合タンパク質を含んでなるRPBLAを準備すること、ここで、前記融合タンパク質は請求項30~35のいずれか一項に記載の融合タンパク質であり、ii前記RPBLAと、膜を解離する量の界面活性剤を含有する水性緩衝液とを接触させること、iii膜を解離させるのに十分な時間および融合タンパク質を変性させない温度で接触を維持して、融合タンパク質から膜を分離すること、およびiv分離した融合タンパク質を回収することを含んでなる、融合タンパク質の精製方法。i包膜融合タンパク質を含んでなるRPBLAを準備すること、ここで、前記融合タンパク質は請求項30~35のいずれか一項に記載の融合タンパク質であり、ii前記RPBLAと、膜を解離する量の界面活性剤を含有する水性緩衝液とを接触させること、iii膜を解離させるのに十分な時間および融合タンパク質を変性させない温度で接触を維持して、融合タンパク質から膜を分離すること、iv分離した融合タンパク質を回収すること、およびv組換えPBISと、異種タンパク質との間の切断部位を切断することを含んでなる、タンパク質の精製方法。治療上有効な量の請求項42に記載のRPBLAを含んでなる、医薬組成物。免疫原性上、有効な量の請求項42に記載のRPBLAを含んでなる、ワクチン。薬学上許容可能な希釈剤をさらに含んでなる、請求項52に記載の医薬組成物または請求項53に記載のワクチン。請求項42に記載のRPBLAを含んでなる、食品。材料および方法植物形質転換のためのプラスミド構築プラスミド構築物は総て、図15aおよび15bに示される融合タンパク質をコードするDNA断片をSalI/BamHI消化により、同じ制限酵素で開環したpC2300ベクターAF234315へクローニングすることによって構築された。植物材料タバコニコチアナベンサミアナ植物を、invitro生育チャンバーにて24~26°C、16時間明期で栽培した。成熟植物を温室にて18~28°Cで栽培した。湿度は55~65の間に維持し、平均明期を16時間とした。浸潤法1112811133、Kapilaetal1997PlantSci122101108のための小植物体を種子から上記のinvitro条件で4~6週間栽培した。真空によるタバコ浸潤法所望の構築物を含むA.ツメファシエンスEHA105株を、カナマイシン50mg/lおよびリファンピシン100mg/lを添加したLB培地トリプトン10g/l、酵母抽出物5g/l、NaCl10g/l上、28°Cで浸透しながら250rpm一晩約18時間増殖させた。次に、カナマイシン50mg/lおよびリファンピシン100mg/lも添加した30mlのLB中にアグロバクテリウムを接種した。一晩約18時間28°Cで培養した後、アグロバクテリウム細胞を3,000xgで10分間の遠心分離により回収、MES4.9g/lおよびスクロース30g/lを含むpH5.8の液体MS培地10ml中に再懸濁させた。この細菌培養物を浸潤法のために最終OD600が0.1となるように調整した。その後、この細胞培養物にアセトシリンゴンを終濃度0.2mMとなるまで添加し、28°Cで90分間インキュベートしたInRecombinantProteinsfromplantsMethodsinMolecularBiologyVol483EdbyGomordVandFayeLSpringerVerlagHumanaPressHeidelberg、pp193208、VoinnetORivasSMestrePandBaulcombeDPlantJ33949956。RX3構築物とHC-Proサイレンシングサプレッサー構築物を担持する個々のアグロバクテリウム培養物を一緒に混合した。これらの植物体を懸濁液で全部覆い、5~6秒間真空100KPaを適用した。懸濁液を除去し、植物体を温室で維持した。植物材料を回収し、全タンパク質抽出物を、適当な抗体を用いた免疫ブロットにより分析した。シリンジによるタバコ浸潤法アグロバクテリウムツメファシエンスEHA105株を、50μg/mLカナマイシンおよび50μg/mLリファンピシンを添加したL-培養液中、28°Cにて静止期まで増殖させた。細菌を5000g、室温で15分の遠心分離により沈降させ、10mMMES緩衝液pH5.6、10mMMgCl2および200μΜアセトシリンゴンに、最終OD600が0.2となるように再懸濁させた。細胞を室温で3時間この培地中に残した。RX3構築物とHC-Proサイレンシングサプレッサー構築物を担持する個々のアグロバクテリウム培養物を一緒に混合し、2~4週齢のニコチアナベンサミアナ植物の葉の背軸面に浸潤させた。タンパク質の抽出および全タンパク質または免疫ブロット分析形質転換葉からの全可溶性タンパク質TSPを、100mMNaCl、0.5SDSおよび200mMDTTを含有する100mMTris-HCl緩衝液pH7.5中、室温で1時間抽出した。得られた抽出液を4°Cにて30分間、10,000xgで遠心分離し、TSPをSDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離した。これらのタンパク質はクーマシーブルー染色もしくは銀染色によるかまたは抗R8抗血清BMCBiology75、大腸菌細胞から発現および精製された組換えGFPもしくhGHタンパク質を注射したウサギで生成した抗GFP、もしくは抗hGH、ならびに市販の抗EGFを用いた免疫ブロットにより検出した。細胞下画分およびRPBLA密度測定浸潤済みのタバコ葉組織を0°Cにて乳鉢で、HBホモジナイゼーション緩衝液Tris10mMpH8.0、0.25Mスクロースおよびプロテアーゼ阻害剤中で摩砕した。このホモジネートを2層のミラクロス22~24マイクロメーター、Calbiochemで濾過して組織残渣を除去した後、4°Cにて5分間、50xgで遠心分離した。得られた種々の組織からの明澄なホモジネートを、HB緩衝液で緩衝させた多段階イオジキサノール密度勾配密度の計算に好ましい段階は、1.11、1.17、1.19、1.21、1.23および1.25g/cm3にのせた。これらの勾配をBeckmanSW40Tiローターにて、4°Cにて2時間、80,000xgで遠心分離した。上清、界面画分およびペレットの等量アリコートをSDS-PAGE、および特異的抗体を用いた免疫ブロットにより分析した。上記で示したように、この技術はRPBLAの密度を決定するのに好適な技術である。下表に、所定のクッション中のイオジキサノールw/vのと相当する密度の間の詳細な比率を示す。免疫組織化学および撮像法:共焦顕微鏡蛍光誘導配列で形質転換したタバコ葉組織の切片を直接的共焦観察のために水で標本化した。共焦点レーザー走査顕微鏡LeicaTCSSPを用いて顕微鏡写真を得た。緑色蛍光画像は、515nmで励起した後、530~630nmの発光域を用いて採取した。青色蛍光画像は、励起458nmおよび発光域470~530nmで採取した。緑色蛍光タンパク質画像は、アルゴンイオンレーザーを用いて、励起488nmおよび495~535nmに設定した発光域を用いて採取した。赤色蛍光画像は、HeNeレーザーを用いて543nmで励起した後、発光域550~600で採取した。光学的切片は厚さ0.5μmとした。デジタル画像および投影図を、共焦顕微鏡ソフトウエアを用いて記録した。顕微鏡像で提供した画像は少なくとも5回の独立した実験の代表例である。共焦顕微鏡によるRPBLAの数およびサイズ時間軸に沿ったPBのサイズ分布相対的パーセントを、各時点2、4、7および10dpiでの500前後のPBの見かけの直径を評価することにより決定した。各時点で3個体の独立した形質転換植物を分析し、ソフトウエアOlympusfluoviewv.1.6aを用いて、FV1000Olympus共焦顕微鏡下で見られた蛍光PBを評価した。PB数の決定については、105μm370×70×20の形質転換組織に相当する共焦投影図を用いた。各時点で8個体の形質転換植物からの40の共焦画像を分析した。これらの結果を、一元配置分散分析ANOVAおよびボンフェローニ多重比較検定により統計学的に分析したp<0.05を有意に異なるとみなした。低速遠心分離でのRPBLAの単離1グラム前後の浸潤済みタバコ葉組織を0°Cにて乳鉢で、5mLのPBP3ホモジナイゼーション緩衝液Tris100mMpH8.0、50mMKCl、6mMMgCl2、10mMEDTAおよび0.5MNaCl中で摩砕した。ホモジネートH0を1層のミラクロス22~24マイクロメーター、Calbiochemで濾過した。明澄化前のホモジネートH1から得られた明澄なホモジネートを低速1,500xgで10分間遠心分離し、得られたペレットおよび上清SNを分析した。低速遠心分離ペレットを穏やかな音波処理サイクル50、出力制御3、10秒、Brandsonsonifier250によって、3~5mLの洗浄緩衝液0.5Triton商標X-100に再懸濁させ、最後に室温で15~60分間インキュベートした。2回目の低速遠心分離の後、等量の得られたペレットwPBおよび上清Wsを分析した。EGFの精製80グラム新鮮重のZeraE-EGFを浸潤させたタバコ植物葉からのwPB画分を上記で示したように可溶化し、37°Cにて2mMCaCl2の存在下、30マイクロリットルのFXaで切断した。3時間後に50mMEDTAを添加することで反応を停止させた。次に、このサンプルを緩衝液Aで5倍に希釈した。EGFを、Amershamからの3mLResource逆相カラムにより精製した。アセトニトリル勾配は、緩衝液A10mM酢酸塩pH4、2mMbMEおよび5アセトニトリルおよび緩衝液B10mM酢酸塩pH4、2mMbMEおよび75アセトニトリルを用いた20カラム容量で行った。アセトニトリル40前後の2画分において純粋なEGFを回収し、3.5kDA透析膜にて、50mMTrispH8、2mMbMEおよび100mMNaClに対して4°Cで一晩透析した。EGFの活性アッセイEGF受容体を過剰発現するヒト上皮癌細胞系統細胞A431をプレートP-35に0.5×105細胞/プレートで播種した。細胞を増殖培地MEM×1、2mMグルタミン、1の非必須アミノ酸および10FBSウシ胎児血清中で48時間インキュベートした。その後、それらを、FBSを含まない増殖培地で一晩飢餓状態にした。次に、Promegaからの標準EGF0~100ngEGF/mLと相当するサンプル可溶化済みRX3E-EGFおよびEGFを同じ濃度範囲で加え、細胞を9分間インキュベートした。その後、これらの細胞を冷PBSで2回洗浄し、液体N2中で凍結させて細胞代謝を停止させた。EGF受容体のリン酸化を分析するために、これらの細胞を破砕し、等量の全タンパク質を、PathScan商標Phospho-EGF受容体Tyr1068サンドイッチELISAキットにより、本質的に製造者が記載しているように分析した。実施例1:形質転換タバコ植物体のRPBLAにおけるRX3-GFP、RX3R-GFP、RX3K-ECFP、RX3A-GFPおよびRX3L-GFPの蓄積RX3のリピートドメインの両親媒性が自己集合およびRPBLAの形成において不可欠であることが記載されている3277234、KoganetalJMolBiol312907913。RPBLA誘導能に対する両親媒性の重要性を特徴付けるために、リポーター蛍光タンパク質GFPまたはECFPに融合されたRX3タグセットを分析した図1A:ヒスチジンを有する天然RX3PPPVHL8配列番号62[RX3]、両親媒性が増強された2つのRX3変異体、すなわち、ヒスチジンをアルギニンで置換することにより得られるPPPVRL8配列番号63[RX3R]およびリシンで置換することにより得られるPPPVKL8配列番号64[RX3K]、ならびに完全疎水性RDを有する2つのRX3変異体、すなわち、ヒスチジンがアラニンで置換されたPPPVAL8配列番号66[RX3A]およびロイシンで置換されたPPPVLL8配列番号67[RX3L]。予測されたように、RX3-GFPで形質転換されたタバコ植物は、細胞内に直径約1マイクロメーターの丸い形状の蛍光RPBLAを多数蓄積した。驚くことに、両親媒性RDが存在しないにもかかわらず、融合タンパク質RX3A-GFPおよびRX3L-GFPもまた、細胞の小胞体ER内に留まり、RPBLAを形成した図1C。RX3A-GFP融合タンパク質は大きなRPBLA内に蓄積したが、これはRX3-GFPの発現から得られたRPBLAよりもやや大きかった。これらのRX3L-GFPRPBLAは約0.5マイクロメーターであると測定された。細胞の表面に蛍光は見られず、該タンパク質はRPBLA内に効率的に蓄積され、分泌されなかったことを示す。これらの研究はまた、完全疎水性RDを有するRX3タグが集合して、植物においてRPBLAの形成を誘導し得ることを示す。疎水性RDを含有するRX3タグで得られた驚くべき結果に基づき、総てのヒスチジンがアルギニンで置換された[RX3R]またはリシン[RX3K]で置換された両親媒性RX3の蓄積を分析することにより、RX3タグのRD両親媒性の重要性をさらに特徴付けることにした。アルギニンおよびリシンは、ヒスチジンに比べて高いpKaそれぞれ12および10.5を有する。従って、これらの置換は、小胞体のpH値においてより高い正の正味電荷を有するRD、そのRDの高い正味正電荷および高い両親媒性をもたらす。驚くことに、共焦顕微鏡分析は、これらの構築物を用いた場合に極めて低い蛍光を示した。他のRX3変異体に用いたものと同じ条件をRX3R-GFPおよびRX3K-ECFPに適用したところ、有意なシグナルは見られなかった。同様に、RX3R-GFPおよびRX3K-ECFP融合タンパク質の低い蓄積が、抗GFP抗体を用いたウエスタンブロットにより見られた。図1Bに示されるように、RX3R-GFPはRX3-GFPに比べて蓄積が少なく、RX3K-ECFP融合タンパク質は見られなかった。興味深いことに、RX3K-ECFPを発現するホモジネートでは、抗GFP抗体と免疫反応性がある、より移動度の高いバンドのみが見られた。このバンドはおそらく部分的に分解されたECFPに相当する図1B、レーン4、黒い矢印の先。pRX3R-GFPまたはpRX3K-ECFPを浸潤させたタバコ葉の長時間露光画像は、このタンパク質がER由来RPBLA中に効率的に保持されないことを示した。RX3R-GFPの発現は、大部分の融合タンパク質の分泌をもたらし、細胞内に蓄積されたRPBLAは少なく、かつ極めて小さいものでしかなかった図1C。RX3K-ECFPに関しては、RPBLAが見られず、蛍光が葉緑体および分泌物に伴っていたことから図1C、四角の中これらの結果はいっそう驚くべきものであった。この実験およびほとんどの融合タンパク質が分解されると思われるという事実に基づけば、葉緑体に伴う蛍光は部分的に分解されたECFPによるものである可能性がある。RX3K-ECFPがこのオルガネラに選別されるとは考えにくい。これらの結果を考え合わせると、文献で示唆されていることとは対照的に、RX3の両親媒性はタンパク質集合およびRPBLA誘導に必要な重要な要素ではない。さらに、ヒスチジンをアルギニンまたはリシンで置換することによるRDの両親媒性の増強は、これらのペプチドのRPBLA形成誘導能を有意に低下させる。実施例2:タバコ植物においてRX3-GFP、RX3A-GFPおよびRX3L-GFPにより誘導されたRPBLAの密度の特性決定RPBLAの1つの特徴はそれらの高密度であり、ステップ密度勾配により決定することができる。本研究において、Optiprep商標勾配は、濾過した植物ホモジネートを下記のOptiprep商標ステップクッション下に置くことによって行った。画分f18のミクロソームER、ゴルジなどは、18のOptiprep商標を含む低密度クッションの上の界面に沈降する。一般に、RPBLAはミクロソームよりも高密度であり、26~28のOptiprep商標よりも高密度の画分から回収される。図2に示されるように、融合タンパク質RX3-GFPを発現するタバコ植物のホモジネートを所定のステップ密度勾配で超遠心分離にかけると、予測されたように、ほとんどのタンパク質が密度画分f34およびf38において回収された。この結果は、融合タンパク質がER内に稠密に集合し、高密度のRPBLAを形成することを示す。一部のRX3-GFPはミクロソームに相当する低密度画分f18に見られるが、これはおそらく、高密度構造にまだ完全に集合してない新たに合成された融合タンパク質に相当する。上述のように、分析した2つの構築物は完全疎水性RDRX3A-GFPおよびRX3L-GFPを有しており、双方とも細胞内でRPBLAの形成を誘導した。RX3A-GFPを密度勾配により分析したところ、ほとんどの融合タンパク質が高密度画分f30およびf34に蓄積したが、これにより、RX3A-GFPが高密度RPBLA内に蓄積することが確認される。RX3L-GFPで形質転換したタバコ葉からの明澄化したホモジネートを分析した際にも同様の結果が得られた。この場合、RPBLAはRX3A-GFPの発現により誘導されたものよりも低密度であったとしても、それらの主要な画分は高密度画分に回収された図2B、f30およびf34。これらのデータは、両親媒性RDが存在しないにもかかわらず、RX3A-GFPおよびある程度まではRX3L-GFPは、RPBLA内に効率的に自己集合することができ、これらはほとんどの細胞夾雑物から単離されるに十分な密度である。RX3A-GFPホモジネートをのせた密度勾配から回収された等容量の画分のクーマシーブルー染色による分析を図2Bに示す。ほとんどの細胞夾雑物は画分Sおよびf18に回収されたが、f30およびf34は極めて純粋なRX3A-GFP画分を含んでいたことを見て取れる。実施例3:低速遠心分離によるタバコ植物体からのRPBLA単離の下流手順密度勾配遠心分離はRPBLA密度の決定に適当な分析手法であるが、これらのオルガネラの大規模精製には好適でない。明澄なRPBLA画分の回収を可能とする簡単な低速遠心分離と回収した沈降物の数回の洗浄工程に基づく下流プロセス実験手順参照が開発されている。この簡単な下流プロセスをRX3-GFPおよびRX3A-GFPで形質転換したタバコ植物に適用し、このプロセスの種々の段階の等量をウエスタンおよびクーマシーブルーで染色したSDS-PAGEにより分析した。図3Aに示されるように、対応するホモジネートH0中に存在する融合タンパク質のほとんど総てがRPBLA画分wPBに回収された。両場合とも収量は同等であり、上清SNおよび洗浄工程Wsにおいて融合タンパク質の損失はないことから極めて高かった。この所見はウエスタンブロットにより確認された。処理した同量のバイオマスからRX3-GFPよりも多くのRX3A-GFP融合タンパク質が回収されるという事実は図3A、wPB画分を比較、より良好な回収率を反映するものではなく、タバコ葉におけるRX3A-GFPの蓄積率が高いことを反映している。RX3A-GFPRPBLAがRX3-GFPよりも低密度であることを考えれば、この効率的な回収は極めて驚くべき結果である。このプロセスにおいて達成された富化も著しく高い。ホモジネートH0中に存在するほとんどの夾雑物はこのプロセスで除去され、洗浄済みRPBLAに相当する画分wPBはほぼ排他的に融合タンパク質を含んでいた。wPB画分にはいくつかのバンドが確認されたが、それらは同じ融合タンパク質のいくつかのオリゴマー化状態に相当するものであって、タンパク質の不純物ではない。RX3L-GFPのRPBLAの下流回収は、この融合タンパク質を含有する小型で低密度のオルガネラをより効率的に回収するために相当するホモジネートをより高速4,000~5,000xgで遠心分離することにより適合させた図2。驚くことに、RX3L-GFPでさえも、この収率は極めて効率的であり、図3B右のパネルに見られるように、ほとんどの融合タンパク質がRPBLA画分wPBに回収された。RX3L-GFP含有RPBLAを回収するためにより高速を必要とするという事実は、クーマシーブルーにより染色したSDS-PAGEゲルにより示されたように図3B、左のパネル、このプロセスの富化に有意な影響を及ぼさない。これらの結果により、完全疎水性RDを有するRX3タグがRPBLAの単離によるタンパク質生産および精製に好適であることが確認される。実施例4:RX3融合タンパク質の可溶化RPBLA画分からのRX3に基づく融合タンパク質の可溶化は、RPBLA下流プロセシングにおける重要な工程の1つである。本質的に実施例3に示されるように低速遠心分離により回収されたRPBLA画分を用いて、RX3-GFPおよびRX3A-GFPの溶解度を比較した。RDのヒスチジンをアラニンで置換すると、そのタンパク質の全体的な極性が小さくなることから水溶液中の融合タンパク質の溶解度が低下すると予想されたが、驚くことに、RX3A-GFPは試験した各条件ではるかに高い可溶性であった。一例として、図3Aにおいて、明澄化したRPBLA画分wPBを穏和な緩衝液50mMTrispH8、5mMTCEPおよび10mM2bME中で4時間インキュベートした後、可溶化画分sPBを非可溶化uPB画分と比較する。可溶化工程の直後に、サンプルを16,000gで10分間遠心分離し、sPBを上清として回収した。uPBはペレットとして回収した。予測されたように、RX3-GFPは、部分的に可溶化されたに過ぎなかった。単量体形態のほとんどの融合タンパク質は所定の条件で可溶化されるが図3A、sPBとuPBを比較、矢印の先、強固に凝集した多量体型の融合タンパク質が多量に非可溶化画分に残存する図3A、アスタリスク。これに対して、同じ可溶化条件で、事実上総てのRX3A-GFPタンパク質が、その凝集形態とは無関係に可溶化された。洗浄済みのRPBLAからの融合タンパク質の回収において極めて高収率を可能とするというこの驚くべき結果は、以下に示すような数種のタンパク質と融合された広範囲の完全疎水性アセンブラーペプチドで確認された。実施例5:形質転換タバコ植物のRPBLAにおけるRX3A3-ECFPの蓄積従前の実験において、新たなRX3変異体は総て、RDに中に存在するヒスチジンの単一の突然変異からなったので、ヒスチジンの前後のバリンおよびロイシン残基はまだ分析されていなかった。これを行うため、新たなRX3非両親媒性変異体RX3A3においてRD上に存在するバリン、ヒスチジンおよびロイシン残基を総てアラニンで置換した図4A。タバコ葉を、ECFPに融合されたRX3A3ペプチドを発現するベクターで形質転換させ、浸潤の3日および6日後dpiに共焦顕微鏡によりRPBLAの形成を分析した。第1の浸潤後日数3dpiでさえ、多数の小型RPBLAの存在が確認され、RX3A3変異体が極めて有効であったことが示唆される。この所見は、6dpiにおいて、クラスター内に組織化された極めて多数の大型RPBLAの存在により確認され図4B、この新たなアセンブラーペプチドが予期しないことに野生型RX3よりも有効であることを示す。この植物におけるRX3A3-ECFP発現の分析は、RD中に存在するバリンおよびロイシン残基がタンパク質の集合およびRPBLAの形成に必要ではないことを示す。この結論の明確な帰結は、RD中に存在するバリン、ヒスチジンおよびロイシンが、そのRD構造が折り畳まれない限り、他の任意の疎水性アミノ酸で置換可能であるということである。次の実験は、これらの残基が極性非電荷および負電荷アミノ酸でも置換可能であることを示す。実施例6:形質転換タバコ植物体のRPBLAにおけるRX3E-GFPおよびRX3D-ECFPの蓄積上述のように、RDのヒスチジン残基をリシンまたはアルギニンで置換すると正味電荷が増し、その結果、このドメインの両親媒性が増す。驚くことに、それはまた、RPBLAの形成および全体的なタンパク質蓄積に関するアセンブラーペプチドの効率を劇的に低下させる。これらの結果に基づけば、ヒスチジンをアスパラギン酸およびグルタミン酸で置換しても、これらの残基の付加もRDの正味電荷を増し、従って、その両親媒性を増すことから、RPBLAにおける蓄積が低下することになると予測された。しかしながら、図5Bに示されるように、RX3E-GFP、RX3D-ECFPおよび対応する対照それぞれRX3-GFPおよびRX3-ECFPで形質転換したタバコ植物体からの全タンパク質抽出物のウエスタンブロットは、酸性アミノ酸を有する融合タンパク質は対照よりもやや良好に蓄積した。RX3E-GFPおよびRX3D-ECFPの低い移動度は、これまでに他のタンパク質に関して報告されているように、酸性アミノ酸の含量が高いことで説明することができる。さらに、RX3E-GFPおよびRX3D-ECFPで形質転換したタバコ植物体は、クラスター内に組織化された多数の大型で丸い形状の蛍光RPBLAの形成を誘導した図5C。実際に、1~2マイクロメーターの大型のRPBLAは形質転換細胞のほとんどに高頻度で存在する。興味深いことに、これらのRPBLAの平均サイズは、RX3と融合されたGFPまたはECFPの発現によって誘導されたものよりも有意に大きかった。実施例7:タバコ植物体のRPBLAにおけるRX3T-ECFP、RX3N-ECFPおよびRX3Q-ECFPの蓄積上記の結果は、ヒスチジンを疎水性または酸性アミノ酸で置換すると、アセンブラーペプチドのRPBLA誘導能が増強されたことを示す。さらに、ヒスチジンを塩基性アミノ酸で置換することによるRDの正電荷を増すことの負の影響が見られた。しかしながら、アセンブラーペプチドの機能性に対する極性非電荷アミノ酸の影響はまだ知られていない。従って、RDのヒスチジンをトレオニン、アスパラギンおよびグルタミン残基で置換し、ECFPと融合させた3つの新たな構築物それぞれRX3T-ECFP、RX3N-ECFP、およびRX3Q-ECFPを作出した。これらのアミノ酸の付加は、両親媒性であるが正味電荷を持たないRDをもたらす図6A。これらの構築物を総て発現するタバコ葉を、浸潤3日および6日後dpiに共焦顕微鏡により分析した。3dpiでは、多数の小型RPBLAが見られ、これらのRX3変異体は総て極めて有効であったことを示唆する。この所見は6dpiにおいて、クラスター内に組織化された多数の大型RPBLAの存在により確認された図4B。これらの結果は、植物体における極性非電荷アミノ酸を有するRX3変異体の発現はRPBLAの形成をもたらすことを示す。実施例8:形質転換タバコ植物体のRPBLAにおけるPP-ECFPおよびPA-ECFPの蓄積RX3の2つの主要なドメインRDおよびPXは双方とも、一般にPPII構造を採るプロリンリッチ配列である。合成RDの円偏光二色性による研究により、水溶液中でのこのドメインにPPIIヘリックスが存在することが確認されたpp67756782。PPIIドメインを有するタンパク質は植物および他の生物に豊富に存在する。しかしながら、それらは一般にRPBLA形成誘導能を有さない。例えば、コラーゲン、α-カゼイン乳汁タンパク質、およびPKAは、PPIIヘリックスを有するが、RPBLA誘導能を有さないタンパク質の例である。結果として、PPII構造配列に加え、RX3の他のエレメントもRPBLA形成誘導に必要であると思われた。RX3配列上のこのようなエレメントを特定するために、RDおよびPXドメインを、RX3と相同でないプロリンに基づく配列で置換した。PPII構造を維持し、システイン残基の数および相対的位置は変更しなかったPP、図7A。さらに、RDおよびPXドメインを、その配列の全域にリピートを有するヘキサペプチドPPPAPAで置換した、類似であるがより疎水性のペプチドを合成したPA、図7A。これらの2つのペプチドはRX3と本質的に同じPPII構造を有するが、高プロリン含量とシステインの数および位置以外の主要な相同性は有さない。RX3-ECFP、PP-ECFPまたはPA-ECFPを過剰発現するタバコ葉のウエスタンブロットによる分析は、驚くことに、ECFPと融合されたこれらの2つの合成ペプチドが天然RX3よりも高い効率で蓄積したことを示した図7B、レーン1および2と3を比較。PP-ECFP、および程度は低いがPA-ECFPは、3つの融合タンパク質が総て同数のアミノ酸を有していても、SDS-PAGEゲルにおいてRX3-ECFPよりも低い移動度を示した。これは、PPおよびPAが、ウエスタンブロット条件であっても、RX3よりも安定なPPII延長ヘリックスを呈することを示唆する。結果として、これらの合成ペプチドの集合は好都合であり、ウエスタンブロットにより判定した際に、このタンパク質は蓄積の増加を示すことになろう。この仮説は、RX3-、PP-およびPA-ECFP融合タンパク質を発現するベクターでの形質転換から6日後の、共焦顕微鏡によるタバコ葉の観察により確認された。図7Cは、PP-ECFPおよびPA-ECFPで形質転換した葉の共焦画像を示し、RX3-ECFPを発現する葉に比べて多数のRPBLAを呈した。さらに、PP-およびPA-ECFP発現により誘導されたRPBLAの平均サイズはRX3-ECFPRPBLAの平均サイズよりも2倍大きかった。これらの3つのタンパク顆粒誘導配列の配列を比較すると図7A、それらの唯一の相同性領域はシグナルペプチドの後の最初の10個のアミノ酸THTSGGCGCQ配列番号25であることが明らかである。この配列がタンパク質集合において特別な役割を果たさないことを確認するために、この配列をプロリンに基づく合成配列THPPPPCPCP配列番号26で置換した。プロリンに基づく配列は、PA-ECFP構築物に関してシステインの位置を維持していた。この構築物NPA-ECFPは、RPBLA誘導においてPA-ECFPと同等に有効であった。さらに、RX3由来のγ-ゼインのシグナルペプチドも、PR-Sとしても知られるPR10シグナルペプチドで置換した。得られた構築物をGFPと融合させたRX3PR10-GFP。このシグナルペプチドは、タンパク質がERに入る際に同時翻訳的に切断されることから、RPBLAの形成に影響を及ぼすとは考えにくく、予測されたように、RPBLAの蓄積速度および誘導は用いるシグナルペプチドとは完全に無関係であった。PP、PA、NPPおよびNPAペプチドがRX3との主要な配列相同性を有さないという事実は、予期しないことに、RPBLA集合および誘導能がRX3の配列に依存せず、その三次元構造に依存することを示す。RX3、PP、PAペプチド、およびそれらの変異体に存在する延長されたPPIIヘリックスは、RPBLA誘導を担う重要な特徴である。クローニング上の理由から、PPおよびPAペプチドはRX3リピートドメインの最後のリピートの部分を維持する。RD由来のこの最後のRX3リピート単位がRPBLAの形成に必要とされるということを棄却するために、このリピートが存在しない構築物の新たなセット:PP3およびPA2を作出した。これらの2つの構築物はRPBLA形成能を維持している。実施例9:形質転換タバコ植物体におけるRPBLAの誘導または安定化に関与するRX3のシステイン残基の決定ここで示される研究は、その多量体形成およびRPBLA形成を可能とするRX3の特異な形質に重要な洞察を与える。関連があるが、独特ではない形質として、RX3分子間のジスルフィド結合に関与し得るシステイン残基の存在がある。6つのシステインのそれぞれの点突然変異を、RX3重合におけるジスルフィド結合の役割を決定するための直接的方法として用いた。C7またはC9を欠くRX3-ECFPRX3C7G-ECFPおよびRX3C9G-ECFPの過剰発現は明らかに融合タンパク質の多量体形成プロセスを妨げ、両突然変異体は旺盛に分泌された図8C~D。実際に、個々のC7またはC9突然変異体で形質転換した表皮細胞の細胞ごとの画像解析において、融合タンパク質は主として分泌され、数個の強い蛍光の単細胞だけが蛍光RPBLA様のスポットを示した。この所見は、ERにおける組換えタンパク質の高い発現率が凝集効率の増大をもたらすことを示唆し、このことは、野生型RX3に比べてタンパク質凝集により高い臨界タンパク質濃度が必要とされることを示す図8C~D、四角の中。予測されたように、両方のシステイン残基を同時に突然変異させた場合には図8I、RX3C7,9G-ECFP、RPBLAの蓄積は見られなかった。これらの結果は、RX3ドメインのN末端付近の2個のシステイン残基の存在が、RPBLAの形成を誘導するためのERにおけるタンパク質の保持に必要であることを示す。しかしながら、最初の2個のシステインをもっぱら維持する多重突然変異体RX3C64,82,84,92G-ECFPは、C7とC9は融合タンパク質をER内に保持し、それにRPBLAを形成させるのに十分でないことを示した図8K。従って、RX3ペプチド中に存在する他のいくつかのシステインが、その適正なタンパク質集合に役割を果たしている。RX3ドメインの中央に位置するシステイン残基の突然変異C64オリゴマー化プロセスに有意な影響はなく、タンパク質はRPBLAに蓄積した図8E、RX3C64G-ECFP。さらに、RX3のC末端に位置するこれらの3個のシステイン残基の個々の突然変異C82、C84またはC92は、RPBLAにおける蓄積能に有意な影響はなかった図8F~H、それぞれRX3C82G-ECFP、RX3C84G-ECFPまたはRX3C92G-ECFP。これらの単一突然変異体の通常の凝集能は、これらの残基の中に、それ自体、RPBLAの誘導および安定化に必要とされるものはないという仮説を裏付ける。しかしながら、多重C末端Cys突然変異体図8J、RX3C82,84,92G-ECFPはRPBLAの生合成とともに進行不能であり、RX3はRPBLAの形成にC末端付近の少なくとも2個のシステイン残基もまた必要とすることが明らかである。さらに、タンパク質濃度は、自己集合ペプチドの凝集を制御する重要なパラメーターであることが知られているInMethodsinEnzymologyvol309AcademicPressSanDiegoCalifornia。しかしながら、RX3-ECFPおよびRX3Cys突然変異体の発現はSDS-PAGEクーマシーブルー染色ゲルにおいて明らかに視認され、RPBLAを形成したタンパク質と分泌され、凝集しなかったタンパク質との間にタンパク質レベルの有意な差は見られなかった図8B。従って、供試したRX3突然変異体のタンパク質の多量体形成における違いは、凝集能に影響を及ぼすそれらの固有の特性の違いに関連する。RX3配列の改変はオリゴマー化に必要なタンパク質濃度閾を引き上げるかのいずれかの可能性がある。RPBLAの有効な誘導を可能とするためにアセンブラーペプチドに必要とされるシステインの最小数の決定は重要である。まず、アセンブラーペプチドにおけるシステイン残基は、主としてこのタンパク質もシステイン残基を含む場合に、目的タンパク質の適正な折り畳み、従ってその活性に負の影響を及ぼし得る。しかしながら、アセンブラーペプチドにおけるシステインの存在は、ジスルフィド結合の形成による融合タンパク質の架橋を保証する。この架橋は、RPBLAの安定化およびロバスト性をもたらす。これらの特徴は、このオルガネラの容易な単離を可能とするので望ましい。さらに、RPBLAオルガネラが用いられる産業上の利用はいずれもジスルフィド結合の形成による架橋に依存する。緒論に記載したように、プロラミン以外のPBISは、タンパク質のC末端にKDEL配列を付加することによりRPBLAの形成を誘導することができる。このアプローチがRPBLAの形成を可能とするにしても、これらのオルガネラの単離はそれらの低い安定性のために困難であろう。実施例10:システイン残基の配向は、形質転換タバコ植物体におけるRPBLAへのPPペプチド蓄積能に影響を及ぼさないタンパク質集合およびRPBLA誘導におけるシステイン残基の重要性は、実施例9におけるこれらの残基の単一および多重突然変異によって実証された。しかしながら、これらの残基の配向の影響はまだ探求されていない。これを行うために、新たなアセンブラーペプチドPP2を合成した。PP2は、いくつかのシステイン残基の位置以外はPPと相同である図9A、C9→10、C84→85およびC92→91。プロリンが極めて豊富なペプチドは、図9Bに示されるように、1ターン当たり3アミノ酸を有することを特徴とするPPIIヘリックスを形成する。天然RX3では、システイン残基はヘリックスの3つの面のそれぞれに向かって配向する。この配向は、天然およびRPBLAを、ジスルフィド架橋によって集合および安定化されたタンパク質が詰まった通常、大きな最大3マイクロメーター丸い形状のオルガネラへと形成することを可能とする、3方向総てにおける集合および安定化を促進するのに重要であり得るという仮説が立てられた。従って、PP2は、システイン残基が総てヘリックスの同じ面に配向されるように設計された。予期しないことに、GFPと融合されたPP2は、PP-GFPと同等に蓄積することができ、いっそう驚くことに、大きなRPBLAの形成を誘導することができた図9C。実施例11:形質転換タバコ植物のRPBLAにおけるR84C-ECFP、R74C-ECFP、R64C-ECFPおよびR44C-ECFPの蓄積RPBLAの生合成に必要なPPIIの最小長も決定した。これを行うため、最小RX3-ECFP由来のタンパク質R8C4-ECFPを、RX3のPX配列を削除し、付加的な最小配列を付加することによって作出した。従って、R8C4-ECFPはC82、C84およびC92を欠き、鎖内ジスルフィド架橋を強化するために2個のプロリンによってC64と連結された付加的な新たなシステイン残基を含む図10A。N.ベンサミアナ葉において発現された場合のR8C4-ECFPタンパク質の分布パターンは、高倍率で小型のRPBLAであると見て取れる明白な球状蛍光スポットに蓄積した図10C。RX3-ECFPにより誘導されたRPBLAは4dpiにおいて平均直径1.4μmに達し、7dpiにおいて最大2μmに達するまで徐々に増大したが、R8C4-ECFPにより誘導された蛍光スポットは7dpiにおいて直径1μmに達することは稀であった下表参照。従って、従前に示唆されたように、PPIIヘリックスR8C4に関してはRDの各面のシステイン対はRPBLAへと発達するタンパク質凝集体の核を形成するのに十分である。RX3-ECFPがR8C4-ECFPよりも、大きなRPBLAを形成する強い傾向を有するという所見は、RX3-ECFPオリゴマーがその6個のシステイン残基により鎖内架橋を増やすことによってより大きな成長見込みを有するという事実によるものであり得る。従って、重合がPPIIの長さに関連する程度も検討した。これらの実験はRDを徐々に短縮することによって行った。R8C4-ECFPからさらに3つの構築物を作出した。リピートドメインを7、6および4PPPVHL単位に短縮した図10A。図10Cに示されるように、6または4リピート単位を含む過剰発現タンパク質それぞれR6C4-ECFPおよびR4C4-ECFPはなお小さな凝集体を形成することができたが、リピートドメインの短縮に伴い分泌が高まる図10Bの挿入。R7C4-EGFもR8C4-EGFと同様の結果をもたらした。RX3末端切断型タンパク質を過剰発現する葉から抽出された全タンパク質のクーマシーブルー染色分析図10Bは、組換えタンパク質の濃度がどの場合でも同等であったことを示した。これは、各融合タンパク質が安定であること、および良好な発現レベルがRPBLAが効率的に形成される証明にはならないことを示す。言い換えれば、突然変異体の低い凝集効率はタンパク質発現レベルに関するものではなかった。これらの結果は、最適なRX3ペプチド相互作用に都合のよい、また、PB形成の効率を決定する臨界サイズが存在することを示唆する。他の構築物に比べてR4C4-ECFPの融合タンパク質分泌の有意な増強に基づけば、R4C4は、有効なアセンブラーペプチドの最小長を示す。これらの結果は、PPIIヘリックスを採り、各末端において1対のシステイン残基により挟み込まれた24アミノ酸R4C4リピートドメインの長さより長いペプチドであれば、ERに保持され、RPBLA形成を誘導するのに十分であることを示す。実施例12:形質転換タバコ植物体のRPBLAにおけるRX3A-mCherryRX3E-mCherryの蓄積蛍光タンパク質mCherryは、RX3と融合させた場合、著しく可溶性となり、RPBLAに蓄積しにくくなる。RX3-mCherry発現するベクターで形質転換したタバコ葉の共焦顕微鏡分析は、図11Aに示されるような明確な分泌パターンを示し、見られる赤色蛍光の大部分が細胞の末梢に位置した。興味深いことに、タバコ葉をRX3A-mCherryで形質転換した場合には、蛍光の大部分が細胞内に見られ、融合タンパク質が細胞内に効率的に保持されたことを示す。さらに、明確な粒子パターンが見られ図11Bおよび11B’、融合タンパク質がRPBLAに蓄積したことを示唆する。これらの組換えタンパク顆粒のサイズ直径約1マイクロメーターは、いくつかの融合タンパク質で形質転換した植物体において従前に同定されたRPBLAと一致する米国特許第7,575,898号および米国特許出願公開第20060123509号、同第20060121573号および同第20070243198号参照。この結果は少なくとも2つの理由で予期されないものであった。第一に、mCherryをRX3Aと融合させた場合には、天然型リピートドメインを含む非改変型プロラミン由来RX3に比べてRPBLAの形成効率が高まった。さらに、RX3のリピートドメインの両親媒性がタンパク顆粒の形成に重要であると記載されており、完全疎水性リピートドメインを有するようにRX3Aを変異させた実施例1参照。上記で示したように、mCherryの高い溶解度は、mCherryの天然型RX3と融合してRPBLAを形成する能力を低下させる主要な要因の1つであり得る。RX3Aのより高い性能が単にRDの疎水性含量の増加ヒスチジン正電荷アミノ酸を疎水性アラニンへ置換によるものかどうかを判定するために、mCherryとRX3Eの融合物を発現させた。図11Cに示されるように、RX3E-mCherryは細胞内に効率的に保持され、さらに、それはRX3A-mCherryの発現のより誘導されたものよりもはるかに大きいRPBLAに蓄積した。両親媒性電荷RDを有するRX3Eもまた、mCherryと融合させた場合にRPBLAの形成を誘導し得るという事実は、RX3に比べてのRX3Aの性能の向上がそのペプチドの疎水性特徴の非特異的増大によるものではなく、これらの2つの合成RX3由来ペプチドの集合能、従ってタンパク顆粒誘導能の増大によるものであることを示唆する。実施例13:形質転換タバコ植物体におけるRX3、RX3A、RX3E、PPおよびPAアセンブラーペプチドと融合されたEGFの蓄積タバコ浸潤植物におけるRX3と融合された上皮細胞増殖因子EGFの生産および精製は従前に報告されているWO2006/056484号公報。RX3-EGF融合タンパク質の低速遠心分離、可溶化および切断、ならびにその後の逆相RFFPLCによるEGFの精製によるRPBLA単離のプロセスはWO2007/096192号公報において開発されている。新たなアセンブラーペプチドの有効性を試験するために、EGFをRX3AおよびRX3Eと融合させ、同じ下流プロセスを行った。RX3A-EGFおよびRX3E-EGFの発現によって誘導されたRPBLAは、RX3-EGFの発現によって誘導された対照と同程度効率的に低速遠心分離のより回収された図12A。3つの場合の総てにおいて、融合タンパク質のほとんど総てがwPB画分に回収され図12A、レーン4、上清図12A、レーン2および洗浄工程図12A、レーン3においては有意でない損失が見られたに過ぎなかった。これらの結果から、ほとんど総ての融合タンパク質がRPBLA内で強固に集合し、オルガネラはwPB画分において容易に回収されることが明らかである。下流における重要なポイントは、RPBLAからの融合タンパク質の可溶化である。RX3-EGFRPBLAを穏和な条件50mMホウ酸緩衝液pH10および10mMのbME、25°Cで4時間で可溶化した後には、低いパーセンテージの融合タンパク質が可溶化されたに過ぎなかった。実際に、可溶化されたのはRX3-EGF単量体の50に過ぎなかった図12B、レーン3sPBとレーン6iPBを比較。驚くことに、RX3A-EGFまたはRX3E-EGFを含有するRPBLAの可溶化ははるかに効率的であった。単量体形態のRX3A-EGFはほとんど総て可溶化され、用いた条件で不溶性のままであると思われるRX3A-EGFはほとんどなかった図12B、レーン1sPBとレーン4iPBを比較。下流プロセシングに対するPP-EGFおよびPA-EGFの影響もまた検討した。図12Cは、これらの2つの融合タンパク質がタバコ浸潤葉においてRX3-EGFおよびRX3E-EGFと同様のレベルで蓄積することを示す。さらに、低速遠心分離によるRPBLA回収の後、PP-EGFおよびPA-EGFは上記の穏和な条件においてRX3E-EGFと同様に極めて効率的に可溶化された図12D。上述のように、これらの総ての融合タンパク質間での電気泳動移動度の違いは、タンパク質サイズの違いに関するものではなく、SDS-PAGE条件下であってもタンパク質コンフォメーションのわずかな違いによるものである。予期しないことに、新たなアセンブラーペプチドRX3A、RX3E、PPおよびPAは総て、それらの集合し、RPBLAの形成を誘導する能力に影響を及ぼさずに融合タンパク質の溶解度を大きく高める。この目立った結果は、それがプロセスの総収量を劇的に高めるRX3Aに関しては少なくとも2倍、RX3E、PPおよびPAに関しては10倍を超えることから、RPBLAの下流プロセシングにおいて主として重要である。これらの新たなアセンブラーペプチドによって生産されたEGFのコンフォメーションを評価するために、可溶化されたRX3E-EGF、ならびにこの融合タンパク質からFXaにより切断され、RF-FPLCにより精製されたEGFの活性を試験した。図13Aは非明澄化ホモジネートから切断工程までの総ての下流工程を伴う場合の銀染色ゲルを示す。部位特異的プロテアーゼFXaで切断した後、遊離したEGFを材料および方法に記載のようにRF-FPLCにより精製した。EGFタンパク質は、図13Bにおいて矢印で示される鋭いピークに相当する2つの画分でのみ30のアセトニトリルで回収された。回収された2つの画分図13Cの混合物の純度は、HPLCにより92を越えると評価された。EGF活性は、invitroにおいて、漸増量のRX3E-EGFおよびEGFとともにインキュベートしたA431細胞のEGF受容体リン酸化の分析により測定した。陰性対照として、これらの細胞を並行してRX3とともにインキュベートした。3回の独立した実験は、RX3E-EGFおよびEGFがPromegaから市販されているEGFGS02Aに比べて、それぞれ50および100の活性があったことを示した。実施例14:形質転換タバコ植物体におけるRX3およびRX3Aアセンブラーペプチドと融合されたhGHの蓄積ヒト成長ホルモンをRX3変異体の下流プロセス増強能を確認するためのさらなる例として選択した。RX3A-hGH融合タンパク質を発現するタバコ植物体をホモジナイズし、誘導されたRPBLAを低速遠心分離により単離した。図14A左パネルに示されるように、ホモジネートH0からRPBLAの極めて純粋な画分wPBが得られた。クーマシー染色により分析したところ、その種々のオリゴマー形態の融合タンパク質RX3A-hGHがこの画分に見られる唯一のタンパク質である。興味深いことに、このプロセスの収量をウエスタンブロットにより分析したところ、ほとんどの融合タンパク質が安定な強固に集合したRPBLAに蓄積しており、これは遠心分離により回収することができ、対応する上清中の損失は少量だけである図14A、左パネル。RX3A-hGHを含有するRPBLAがこの簡単な遠心分離法によってひと度得られたら、それらを穏和な可溶化緩衝液50mMホウ酸pH10、10mMβ-メルカプトエタノールbME室温中で3時間インキュベートした。参照として、RX3-hGHを含有する等量のRPBLAを同じ条件でインキュベートし、抗hGH抗体を用いるウエスタンブロットにより並行して分析した。RPBLAの回収が高収量であることが、これらの2つの融合タンパク質のうちいずれか一方の発現により誘導されたオルガネラが双方とも安定で、強固に集合していることを示唆するとしても、驚くことに、RX3A-hGH融合タンパク質はRX3-hGHよりもはるかに可溶であった。この水溶解度の上昇は驚くことに、RX3ヒスチジン残基をRX3aのアラニンで置換すると、アセンブラーペプチドの疎水性が高まるという事実を与える。実施例15:形質転換タバコ植物体における高密度RPBLA生合成におけるCys残基の依存性上述のように、高密度RPBLA形成におけるPBISの必須要素の1つが、ポリプロリンII型ドメインの各末端における少なくとも2個のシステイン残基の存在である。しかしながらやはり、ER内に保持され、ジスルフィド架橋形成の不在下であっても、KDEL配列と融合された際に小胞様構造に蓄積する他のアセンブラーペプチド例えば、ヒドロホビン、ELPも存在する。ある特定のアセンブラータンパク質のC末端におけるKDELの存在は、その分子をER内に保持するのに十分であり、このタンパク質のアセンブラー能は小胞構造の形成をもたらす。RX3アセンブラーペプチドの末端におけるER保持配列の付加がCys残基の必要を補填できるかどうかを判定するために、RX3変異体RX3ΔCys64,82,84,92-ECFP実施例9に示されるように、RPBLAを誘導できず、分泌されたを、KDELを有するECFPと融合させたRX3ΔCys64,82,84,92-ECFP-KDEL。RX3-ECFPおよびRX3ΔCys64,82,84,92-ECFP-KDELを過剰発現するタバコ葉のクーマシー染色およびウエスタンブロットによる分析図16Aは、これら2つのRX3に基づく融合タンパク質が同等のレベルで蓄積したことを示した。RX3ΔCys64,82,84,92-ECFP-KDELがRPBLAに蓄積するかどうかを判定するために、この融合タンパク質を発現する葉を浸潤3日および7日後dpiに共焦顕微鏡のより分析した。従前にRX3-ECFP発現タバコ葉で見られたように、RX3ΔCys64,82,84,92-ECFP-KDELの発現により誘導された1マイクロメーター前後の丸い形状の小胞がわずか3dpiでも見られた図16B。この所見は、ECFPのC末端と結合されたKDEL配列が細胞内の融合タンパク質の有効な保持を可能とすることを示す。さらにまた、この所見は、RX3に基づくペプチドのアセンブラー能が自己集合および小胞構造の誘導を可能にすることも示す。これらの小胞構造は3dpi後も成長を維持し、興味深いことに、7dpiでは、5マイクロメーターを越えるものもある不規則な大型の小胞構造が見られた図16B。このサイズのRPBLAは、対照RX3-ECFP融合タンパク質を過剰発現するタバコ葉では見られず、このことはRPBLA中へのRX3-ECFPの自己集合がRX3ΔCys64,82,84,92-ECFP-KDEL小胞の集合機構と同じでないことを示唆する。小胞構造内での融合タンパク質集合の強固さを間接的に特徴付ける技術的アプローチは、ステップクッションOptiprep商標勾配による小胞構造の密度の測定である。従って、タバコ植物体においてRX3ΔCys64,82,84,92-ECFP-KDELまたはRX3-ECFP発現により誘導された小胞構造は、濾過した植物ホモジネートを下記のOptiprep商標ステップクッションの上にのせることによって決定した。各ステップクッションの密度は上記の表4に定義する通りである。RX3-ECFP勾配により例示されるように、高密度RPBLA1.2g/mL前後の密度を有する画分から回収され図16C、左、レーン5および6、これには内因性タンパク質はほとんど含まれない。実際に、RPBLAの密度および堅牢性は、米国特許出願公開第2006/0123509号にすでに記載されているように、RPBLA単離において大いに注目される点である。RX3ΔCys64,82,84,92-ECFP-KDEL小胞構造を同じ手段により分析したところ、驚くことに、ほとんど総ての融合タンパク質が上清画分に回収された図16.C、右。この結果は明らかに、RX3ΔCys64,82,84,92-ECFP-KDEL融合タンパク質が、真のRPBLAとはみなすことができない小胞様構造に蓄積することを示す。ERまたはゴルジ体に由来する細胞内オルガネラ、例えば、一般にOptiprepクッションの18~30の間の沈降物であるが、組織ホモジナイゼーションプロセスの際に、ミクロソームの管腔に存在する大きな割合の可溶性タンパク質が遊離し、上清中に回収されることになる。従って、RX3ΔCys64,82,84,92-ECFP-KDEL融合タンパク質がER内に保持されるが、集合しないか、または弱く集合するに過ぎず、高密度RPBLAが形成されないと結論付けることができる。実施例16:形質転換タバコ植物のRPBLAにおけるZAdh-GFP、ZAdhPx-Gfp、ZCol-Gfp、ZColPx-Gfpの蓄積RX3と低い配列相同性を有するPBISはRPBLAを生じ得ることが示されている。PPおよびPAはRX3配列と、C9~C64残基の間に60未満の同一性を有する。他方、PPおよびPA配列は高いパーセントのプロリンを有しそれぞれ96.2および67.9、これは野生型RX354.7よりも有意に高いことを指摘しておくことが重要である。PPII構造を採る他のタンパク質配列のRPBLA誘導能を評価した。これらの配列は以下の判定基準を満たした:iRX3に対して40未満、およびiiプロリン含量40未満。アミノ酸135~179を含んでなるヒトコラーゲンCOL2A1AccN:CAA34683の断片、および表面アドヘシンAgI/IIミュータンス連鎖球菌株NG8、GeneBank:GQ456171.AccN:ACV69919由来の884~927断片を選択した。図17Aに示されるように、このような配列を用いてR8C4ZAdhおよびZColまたはRX3ZAdhPxおよびZColPxアセンブラーペプチドのRDを置換した。GFPに融合されたこれらのアセンブラーペプチドはタバコ葉に高レベルで蓄積し、これらの葉からの明澄化前のホモジネートにおいて、クーマシーで染色された主要なバンドとして現れた図17B。ZAdh-GfpおよびZAdhPx-Gfpそれぞれ推定分子量37.7kDaおよび34.6kDaは、SDS-PAGEゲルにおいて低い移動度を有する。上記のPPII構造を採るほとんどのアセンブラーペプチド例えば、PP、RX3Eなどでも見られたこの移動のシフトは、この二次構造の強い安定性に帰することができる。ZAdh-GFP、ZAdhPx-GFP、ZCol-GFPおよびZColPx-GFPを発現するタバコ植物体の共焦顕微鏡による分析は、これらの融合タンパク質が細胞内の直径約1マイクロメーターの丸い形状の蛍光RPBLAに蓄積したことを示した。RX3との低い相同性パーセンテージおよび低プロリン含量にもかかわらず、これらの融合タンパク質も小胞体ER内に保持され、それらの集合は効率的にRPBLAの形成を誘導した図17C。ELP、ヒドロホビンまたはRX3ΔCys64,82,84,92-ECFP-KDELにより生産された顆粒とは異なり、RPBLAの重要な特徴は高密度オルガネラ内のタンパク質の稠密な充填である。この特徴は遠心分離によるRPBLA単離を可能とする。従って、ZAdh-GFP、ZAdhPx-GFP、ZCol-GFPおよびZColPx-GFPが1500xgでの遠心分離の後にペレットRPBLA画分に回収されるという所見図17Dは、これらの融合タンパク質が高密度RPBLAの形成を誘導することを示す。Pxドメインの存在、従って、Cys残基数の増加4~6、また、プロリンリッチ配列によるアセンブラーペプチドの拡張は、集合の強固さの有意な増大およびより高い効率のRPBLA回収をもたらす図17においてZAdh-GFPとZAdhPx-GFPおよびZCol-GFPとZColPx-GFPを比較。密度勾配およびFRAP実験がこのデータを裏付ける。ZAdh-GFP、ZAdhPx-GFP、ZCol-GFPおよびZColPx-GFPの配列比較から見て取れるように図17A、RX3リピートドメインの最後のリピートは、総ての場合でクローニング上の理由から維持された。AdhおよびColPPIIがRPBLAを形成するためにRD由来のこの最後のRX3リピート単位を必要とするということを棄却するために、このリピートが存在しない構築物の新たなセット:ZAdh2-GFP、ZAdh2Px-GFP、ZCol2-GFPおよびZCol2Px-GFPを作出した。これらの新たな構築物は総て、RPBLA誘導能を維持していた。実施例17:形質転換タバコ植物体におけるRX3-Xyl、RX3L-Xyl、RX3E-Xyl、RX3A-XylPP-XylおよびPA-Xylの発現により誘導されたRPBLA上のキシラナーゼ活性の測定従前に記載されているようにWO2007/096192A1号公報、野生型RX3由来融合タンパク質の発現により誘導されたRPBLAは、このようなPBISと融合された目的タンパク質POIの活性を維持する能力を有する。本明細書に記載のアセンブラーペプチドがそれらに融合されたタンパク質の活性にどのような影響を及ぼすか決定するために、非両親媒性PP、PA、RX3AおよびRX3Lおよび負電荷両親媒性RX3Eアセンブラーペプチドを検討した。キシラナーゼ酵素DQ465452をリポーターPOIとして選択し、これらの総てのアセンブラーペプチドならびに参照としての野生型RX3と、5個のグリシンを含んでなるリンカーを介して融合させた。PP-Xyl、PA-Xyl、RX3E-Xyl、RX3L-Xyl、RX3A-XylおよびRX3-Xylを過剰発現するタバコ葉を浸潤法の6日後に、矛盾および変動をなくすために壊死組織を避けて採取した。各構築物に低速遠心分離による下流プロセシングを行い、富化RPBLA画分をSDS-PAGEにてクーマシーブルー染色により分析した。総ての場合で、RPBLA画分は融合タンパク質が著しく富化されており、画分にタンパク質が最も豊富であった。タンパク質含量はEZQタンパク質定量キットにより測定し、各サンプルに伴うキシラナーゼ活性は合成基質DiFMUX2を用い、対応する蛍光産物を2分おきに測定する波長:励起360/40nm、発光460/40nmことで定量した。予期しないことに、分析した総てのサンプルのうち、最低の比活性11.7nmols/分タンパク質マイクログラムを有するRPBLA画分がRX3-Xyl融合タンパク質に相当した。この融合タンパク質を参照として、RX3A-Xylはほぼ2倍の比活性を示し、RX3E-XylおよびRX3L-Xylは約3倍の増強を示し、PP-XylおよびPA-Xylは参照の7倍を超える比活性を有した表4参照。この活性は同量の融合タンパク質を用いて測定したので、RX3と比較した場合のこれらのアセンブラーペプチドの比活性の増大は、RPBLA特性の違いに関連づけることができる。高い比活性は酵素適用における有用な属性であることを考えれば、この所見は極めて重要である。実施例18:タバコ植物のRPBLA誘導能におけるシステイン残基に対する、および目的ポリペプチドに対するRX3リピートドメインの配向の独立性野生型RX3由来の繰り返しドメインRDには、それぞれN末端およびC末端に位置する2個および4個のシステイン残基が隣接している。この非対称分布は、集合能および/またはRPBLA誘導の効率に関して何らかの重要性を持つ可能性がある。これを試験するために、このRDの隣接領域が交換され、逆配向でクローニングされるように新たな構築物をiRX3作出した図18A。タバコ葉に、ECFPと融合させた逆配向のRX3アセンブラーペプチドiRX3-ECFPをコードする構築物を浸潤させたところ、大型の丸い形状のRPBLAが見られた。驚くことに、誘導されたRPBLAのサイズは、参照として用いたRX3-ECFP融合タンパク質の発現により得られた対応するRPBLAよりも有意に大きかった図18B。RX3-ECFPおよびiRX3-ECFPの平均サイズはそれぞれ約1および2.5マイクロメーターであった。RPBLAの高い密度と強固さは、遠心分離による、残りの細胞オルガネラおよび可溶性タンパク質からの効率的な単離を可能とすることから米国特許出願公開第2006/0123509号、iRX3-ECFPRPBLAの密度を多段階Optiprep密度勾配により測定した。iRX3-ECFPおよびRX3-ECFPの発現により誘導された密度勾配によるRPBLA分布を比較したところ、有意な違いは示されなかった。どちらの場合も、大多数のRPBLAが浸潤6日後に生じ、1.175~1.26g/cm3の範囲の高密度画分から回収された図18C、レーン4~7。これらの画分もまた、内因性の細胞タンパク質をほとんど含んでない。目的タンパク質ECFPに対するアセンブラーペプチドRX3およびiRX3の相対的位置の重要性も分析した。ECFPのC末端にRX3またはiRX3アセンブラーペプチドをクローニングすることにより、さらに2つの構築物を作出した図18、ECFP-RX3およびECFP-iRX3。これらの融合タンパク質を発現するタバコ葉はRPBLAを誘導することができたが、対応するN末端融合タンパク質RX3-ECFPおよびiRX3-ECFPよりも有効性が低かった。図18Bにおいて、共焦画像は、ECFP-RX3およびECFP-iRX3が多数の小型のRPBLAを誘導することを示し、それらのほとんどは0.5マイクロメーター前後であった。興味深いことに、サイズは小さくなったものの、RPBLAは、密度画分1.175および1.21g/cm3で回収した場合図18C、レーン4および5、細胞夾雑物をほとんど含んでいない。低密度画分におけるいくらかの融合タンパク質の存在図18C、レーン2および3は、おそらく集合速度が遅かったために完全なRPBLAに集合しなかった融合タンパク質に相当する。また、目的タンパク質のC末端に連結されたアセンブラーペプチドを有する融合タンパク質の発現により誘導されたRPBLAが遠心分離により単離可能であると結論付けることもできる。実施例19:CHO細胞のhGH-I-RX3、DsRED-I-RX3およびEK-RX3におけるRPBLAの蓄積POIのC末端に融合されたPBISがCHO細胞においてRPBLAの形成をし得ることを証明するために、以下の融合タンパク質:ihGH-I-RX3、iiEK-RX3、およびiiiDsRED-I-RX3を発現する3つの構築物を作出した図19参照。3つの場合の総てで、CHO細胞のトランスフェクション後、細胞内スポットの特徴的なパターンを観察したところ、対応する融合タンパク質が細胞内のRPBLAに保持されたことが証明された図19AおよびB。図19Aにおいて明らかに見て取れるRPBLAサイズの不均一性は、RPBLA形成段階の違い、またはトランスフェクション効率の違いおよびその結果としての融合タンパク質発現レベルの違いに関連するものであり得る。タンパク顆粒内の融合タンパク質集合の強固さを間接的に特徴付けるための技術的アプローチは、ステップクッションスクロース勾配によるRPBLA密度の決定である。従って、CHO細胞においてhGH-I-RX3の発現により誘導されたRPBLAを、以下のスクロースステップクッション勾配の上にのせた。密度勾配から回収された等容量の種々の画分をウエスタンブロットにより分析したところ、添加した融合タンパク質図19A、レーンHの大部分が高密度画分に回収されたことが示された図19A、レーンF42およびF56。集合していない少量の融合タンパク質も、おそらく集合速度が遅かったために、SおよびF27画分に見られた。高密度RPBLAは一般に1.2g/mL前後の密度を有する画分から回収されるので、RPBLAはタンパク質のC末端にRX3ドメインを有する融合タンパク質によって誘導され得ると結論付けることができる。実施例20:SF9昆虫細胞におけるhGH-I-RX3のRPBLAにおける蓄積タンパク質のC末端にRX3アセンブラーペプチドを有する融合タンパク質は昆虫細においてRPBLAを誘導することができるという証明をhGH-I-RX3を用いて行った。hGH-I-RX3を発現するpBacPAK8組換えウイルスに感染させた昆虫細胞は、RPBLA蓄積の特徴的な免疫蛍光パターンを示した図19C。細胞に均一に分布したスポットはRPBLAに相当し、融合タンパク質がERに効率的に保持されることを示した。hGH-I-RX3を発現するSF9細胞をホモジネートし、低速で遠心分離し3000xg、大きな割合の融合タンパク質がRPBLA画分に回収された図19C、右のパネル、レーン3。N末端RX3融合タンパク質で見られたように米国特許出願公開第2006/0123509号公報、RX3:RX3相互作用によって誘導された高密度オルガネラRPBLAにおける強固な集合は、RPBLAに著しく富化された画分の効率的な回収を可能とする。実施例21:哺乳類細胞におけるRPBLAの蓄積以下のタンパク質をコードする配列を、キシラナーゼをコードする配列と融合させ、哺乳類細胞で発現させるためにベクターpcDNA3.1にクローニングした:RX3、RX3A、RX3L、RX3A3、RX3E、RX3D、RX3T、RX3N、RX3Q、PP、PA、RX3C64G、RX3C82G、RX3C84G、RX3C92G、PP2、R8C4、R7C4、R6C4、R4C4、ZAdh、ZAdhPx、ZCol、ZColPxおよびiRX3。得られたベクターを、リポフェクタミンに基づくトランスフェクション法を用いて293T、Cos1およびCHO細胞に導入した。トランスフェクト細胞のウエスタンブロットは、総ての融合タンパク質の蓄積を示す。さらに、免疫細胞化学による融合タンパク質の局在は、融合タンパク質が直径約0.5~約3ミクロンの球形RPBLAに蓄積することを示す。RPBLAの密度は、スクロースステップクッションにのせることによって測定し、約1.1~約1.4g/mLである。これらのRPBLAを、低速遠心分離約5000xg未満を用いて精製し、回収されたRPBLAは少なくとも約95の純度であった。RPBLAは、穏和な緩衝液50mMTrispH8、5mMTCEPおよび10mM2bME中で約4時間インキュベートした後、約16,000gで約10分間遠心分離を行うことによって可溶化する。可溶化部分のタンパク質は高収量で回収される。キシラナーゼ活性は合成基質DiFMUX2を用いて測定し、高い活性レベルが見られる。実施例22:昆虫細胞におけるRPBLAの蓄積以下のタンパク質をコードする配列を、キシラナーゼをコードする配列と融合させ、pFastBAckバキュロウイルス発現ベクター系にクローニングする:RX3、RX3A、RX3L、RX3A3、RX3E、RX3D、RX3T、RX3N、RX3Q、PP、PA、RX3C64G、RX3C82G、RX3C84G、RX3C92G、PP2、R8C4、R7C4、R6C4、R4C4、ZAdh、ZAdhPx、ZCol、ZColPxおよびiRX3。組換えウイルスを、BaculoGoldトランスフェクションキットPharMingenSanDiegoCaliforniaUSAを用いて生産する。Sf9細胞を培養ディッシュの底に接着させ、15分~1時間のインキュベーションの後、これらの培養物にウイルス原液を添加し、加湿空気中、27°Cで約30~約36時間維持する。感染細胞のウエスタンブロットは、総ての融合タンパク質の蓄積を示す。さらに、免疫細胞化学による融合タンパク質の局在は、それらの融合タンパク質が直径約0.5~約3ミクロンの球形RPBLAに蓄積することを示す。RPBLAの密度は、スクロースステップクッションにのせることによって測定し、約1.1~約1.4g/mLである。これらのRPBLAを、低速遠心分離約5000xg未満を用いて精製し、回収されたRPBLAは少なくとも約95の純度である。RPBLAは、穏和な緩衝液50mMTrispH8、5mMTCEPおよび10mM2bME中で約4時間インキュベートした後、約16,000gで約10分間遠心分離を行うことによって可溶化する。可溶化部分のタンパク質は高収量で回収される。キシラナーゼ活性は合成基質DiFMUX2を用いて測定し、高い活性レベルが見られる。実施例23:糸状菌細胞におけるRPBLAの蓄積以下のタンパク質をコードする配列を、キシラナーゼをコードする配列と融合させ、トリコデルマリーゼイ発現ベクターにクローニングし、T.リーゼイRutC-30株MontenecourtBSEveleighDESelectivescreeningmethodsfortheisolationofhighyieldingcellulasemutantsofTrichodermareeseiAdvChemSer1979181289301に、本質的に記載のとおりにPenttilaMNevalainenHRattoMSalminenEKnowlesJAversatiletransformationsystemforthecellulolyticfilamentousfungusTrichodermareeseiGene198761155164導入した:RX3、RX3A、RX3L、RX3A3、RX3E、RX3D、RX3T、RX3N、RX3Q、PP、PA、RX3C64G、RX3C82G、RX3C84G、RX3C92G、PP2、R8C4、R7C4、R6C4、R4C4、ZAdh、ZAdhPx、ZCol、ZColPxおよびiRX3。形質転換体は125μg/mlのハイグロマイシンBを含有するプレートで選択する。これらの形質転換体を、誘導発現のためにラクトースを含有する選択培地に画線塗布し、蛍光顕微鏡によりスクリーニングする。最高量の融合タンパク質を産生する形質転換体からの菌糸を濾過により採取する。形質転換菌糸細胞のウエスタンブロットは、総ての融合タンパク質の蓄積を示す。さらに、免疫細胞化学による融合タンパク質の局在は、それらの融合タンパク質が直径約0.5~約3ミクロンの球形RPBLAに蓄積することを示す。RPBLAの密度は、Optiprepステップクッションにのせることによって測定し、約1.1~約1.4g/mLである。これらのRPBLAを、低速遠心分離約5000xg未満を用いて精製し、回収されたRPBLAは少なくとも約95の純度である。RPBLAは、穏和な緩衝液50mMTrispH8、5mMTCEPおよび10mM2bME中で約4時間インキュベートした後、約16,000gで約10分間遠心分離を行うことによって可溶化する。可溶化部分のタンパク質は高収量で回収される。キシラナーゼ活性は合成基質DiFMUX2を用いて測定し、高い活性レベルが見られる。実施例24:本発明によるPBISを用いて得られたRPBLAの特性の概要RX3、RX3E、RX3D、RX3Q、RX3N、RX3T、RX3A、RX3A3、RX3L、PA、PPおよびiRX3PBISおよびECFPiRX3PBISを用いる場合には、融合タンパク質をECFPに対して両配向のPBISを用いて構築したの融合タンパク質を発現する対応する構築物を浸潤させたタバコ植物体から調製したRPBLAの直径および密度を上記で説明した通りに測定した。結果を表9に示す。実施例25:非アレルゲン性PBISの構築プロラミンタンパク質およびプロラミン由来のペプチドはアレルゲン性であり得る。興味深いことに、RX3ペプチドの推定アレルゲン性を、TheFoodAllergyResearchandResourceProgramFARRPによって開発された、アレルゲンオンラインデータベースバージョン10.0、2010年1月、httpwwwallergenonlinecomによって分析したところ、アレルゲン性ペプチドと35を越える同一性を有する10件が見つかった。この結果は、野生型RX3がアレルゲン能を有することを示唆する。このペプチドの低アレルゲン性または非アレルゲン性バージョンはいくつかの適用すなわち、栄養用途に有用である。従って、本出願に記載されるRX3ペプチドの種々の変異体を用いて同じ分析を行ったところ、それらの結果は、PAおよびRX3A3が野生型RX3よりも有意にアレルゲン性が低いことを示した。アレルゲンオンラインデータベースでのPAおよびRX3A3の配列分析は、アレルゲン性ペプチドと35を超える同一性を有するヒットをそれぞれ3つおよび2つだけ示した。これらの所見に基づき、RX3アセンブラーペプチドのいくつかの新たな非アレルゲン性バージョンを合成した:RX3LA1配列番号110およびRX3LA2配列番号111。これらの2つのペプチドに、アレルゲン性ペプチドと35を超える同一性を有するヒットはなく、それらにアレルゲン性がないことを示唆する。RX3LA1およびRX3LA2とGFPおよびECFPとの融合タンパク質をタバコ葉で発現させたが、それらのRPBLA誘導能に影響はない。RX3-LA1配列番号60RX3-LA2配列番号61特に、R84Cにはアレルゲン性ペプチドと35を越える同一性を有するヒットはなく、それらに全くアレルゲン性がないことを示唆する。この結果は、RX3のアレルゲン性が主としてPro-Xドメインのアミノ酸配列によることを示唆する。アセンブラーペプチドにおいて推定されるアレルゲン性作用を避けるために、いくつかの非アレルゲン性R84C変異体を合成したところ、タバコ植物体におけるRPBLA誘導を首尾よく試験することができた。詳細な説明の節は特許請求の範囲を説明するために用いられることが意図されるが、概要および要約の節はそうではないと理解すべきである。概要および要約の節は、本発明者らが検討する本発明の1以上の例示的実施形態を示し得るが、総てを示すものではなく、従って、本発明および添付の特許請求の範囲を何ら限定するものではない。本発明は、特定の機能およびその関連する実施形態を例示する機能的構成ブロックを活用して上記に記載した。これらの機能的構成ブロックの境界は、記載に便利なように本明細書において任意に規定した。特定の機能およびその関係が適宜遂行される限り、別の境界を規定することができる。上記の特定の実施形態の記載は本発明の一般的性質を十分に明らかにしているので、他者は当業者の範囲内の知識を適用することで、本発明の一般的概念から逸脱することなく、過度な実験を行わずに、このような特定の実施形態の種々の適用に合わせて容易に改変し、かつ/または適合させることができる。従って、このような適合および改変も、本明細書に示される教示および指針に基づき、開示されている実施形態の均等物の意味および範囲内にあるものとする。本明細書の術語または用語は限定ではなく説明を目的とするものであり、従って、本明細書の用語または術語は教示および指針を鑑みて当業者により解釈されるべきであると理解される。本発明の広さおよび範囲は上記の例示的実施形態のいずれかによって限定されるものではなく、下記の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ規定されるべきである。本出願の特許請求の範囲は、親出願または他の関連出願の特許請求の範囲とは異なる。従って、本出願人らは本出願に関する親出願またはいずれかの前権利者出願においてなされた特許請求の範囲のいずれの放棄も無効にする。従って、審査官から、放棄およびそれを回避するためになされた参考文献の引用を再検討する必要があるのではないかという助言があった。さらに、審査官は、本出願においてなされたいずれの放棄も親出願に読み込まれる、または読み取られるべきではないことについても気づかせている。"