"ブラシカ目Brassicales植物又はその部分におけるグルコシノレートGSL含量を改変するための方法であって、前記植物若しくは前記植物部分の細胞における配列番号2又は配列番号142と少なくとも33の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのグルコシノレート輸送GTRタンパク質の機能活性を改変することを含む、方法。GTRタンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12又は142と少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。GTRタンパク質が、配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128又は130又は144、146、148又は150のいずれか1つと少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の方法。GTRタンパク質が、配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128又は130又は144、146、148又は150から選択されるアミノ酸を含む、請求項1又は2記載の方法。GTRタンパク質が、配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136又は137又は143、145、147又は149のいずれか1つと少なくとも80の配列同一性を有する核酸によってコードされる、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。GTRタンパク質が、配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136又は137又は143、145、147又は149から選択される核酸によってコードされる、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。少なくとも2つのGTRタンパク質の機能活性を改変することを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。第1のGTRタンパク質が、配列番号2又は配列番号142と少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第2のGTRタンパク質が、配列番号4と少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項7記載の方法。前記第1のGTRタンパク質が、配列番号14、16、18、20、22、24、38、40、42、50、52又は54又は144、146、148又は150のいずれか1つと少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のGTRタンパク質が、配列番号26、28、30、32、34、36、44、46、48、56、58、60、120、122、124、126、128又は130のいずれか1つと少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項7記載の方法。前記第1のGTRタンパク質が、配列番号14、16、18、20、22、24、38、40、42、50、52又は54又は又は144、146、148又は150から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第2のGTRタンパク質が、配列番号26、28、30、32、34、36、44、46、48、56、58、60、120、122、124、126、128又は130から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項7記載の方法。前記第1のGTRタンパク質が、配列番号13、15、17、19、21、23、37、39、41、49、51、53又は137又は143、145、147又は149のいずれか1つと少なくとも80の配列同一性を有する核酸によってコードされ、前記第2のGTRタンパク質が、配列番号25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136のいずれかと少なくとも80の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、請求項7記載の方法。前記第1のGTRタンパク質が、配列番号13、15、17、19、21、23、37、39、41、49、51、53又は137又は143、145、147又は149から選択される核酸によってコードされ、前記第2のGTRタンパク質が、配列番号25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項7記載の方法。GSL含量が、植物種子において減少される、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。植物細胞におけるGTR活性を減少させる方法であって、RNA分子を前記植物又は植物部分に導入することを含み、前記RNA分子は、前記GTR遺伝子の発現をダウンレギュレーションできるGTR阻害RNA分子を含む、方法。キメラDNA構築物を前記植物又は植物部分に導入することを含み、前記キメラDNA構築物は、以下の機能的に連結されたDNA領域:a前記植物又は植物部分で作動するプロモーター;b転写されると、前記GTR遺伝子の発現をダウンレギュレーションできるGTR阻害RNA分子を生じる転写DNA領域;c転写終結及びポリアデニル化に関与するDNA領域を含む、請求項14記載の方法。植物細胞におけるGTR活性を減少させる方法であって、内因性GTR遺伝子のヌクレオチド配列を変化させることを含む、方法。GTRタンパク質が、以下:a.22位のSのAへの置換配列番号142の52位b.22位のSのDへの置換配列番号142の52位c.105位のTのAへの置換配列番号142の135位d.105位のTのDへの置換配列番号142の135位e.605位のSのAへの置換配列番号142の635位f.605位のSのDへの置換配列番号142の635位のいずれかを有する配列番号2又は配列番号142のアミノ酸配列を含むタンパク質であるか、又は、GTRタンパク質が、以下:a58位のTのAへの置換b58位のTのDへの置換c117位のTのAへの置換d117位のTのDへの置換e323位のTのAへの置換f323位のTのDへの置換を有する配列番号4のアミノ酸配列を有するタンパク質であるか、又は、GTRタンパク質が、g1241~1243位に終止コドンを含む配列番号25の核酸によってコードされるか、又は、GTRタンパク質が、h929~931位に終止コドンを含むi1145~1147位に終止コドンを含む配列番号31の核酸によってコードされるか、又は、GTRタンパク質が、j870~872位に終止コドンを含むk1380~1382位に終止コドンを含む配列番号27の核酸によってコードされるか、又は、GTRタンパク質が、l780~782位に終止コドンを含む配列番号33の核酸によってコードされるか、又は、GTRタンパク質が、以下の位置:mGly126nGly145oGlu192pTrp229qSer359のいずれかに突然変異を含む配列番号66のアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項16記載の方法。前記植物が、ブラシカBrassica植物である、請求項1~37のいずれか一項に記載の方法。請求項1~17のいずれか一項に記載の方法によって得られる、植物又は植物部分。請求項19記載の植物に由来する、種子。植物又は植物部分において改変されたGSL含量を得るための、GTRをコードする核酸配列の使用。配列番号2、4、6、8、10、12又は142のアミノ酸配列をコードする、単離されたDNA配列。配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128又は130又は144、146、148又は150のアミノ酸配列をコードする、単離されたDNA配列。配列番号25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136又は143、145、147又は149のヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA配列。以下の機能的に連結されたDNAフラグメント:a異種植物発現プロモーター;b配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130又は142又は144、146、148又は150のアミノ酸配列をコードするDNA領域;c植物細胞で機能的な転写終結及びポリアデニル化シグナルを含む、キメラ遺伝子。請求項25記載のキメラ遺伝子を含む、植物。配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130又は142又は144、146、148又は150のアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質。以下:a22位のSのAへの置換配列番号142の52位b22位のSのDへの置換配列番号142の52位c105位のTのAへの置換配列番号142の135位d105位のTのDへの置換配列番号142の135位e605位のSのAへの置換配列番号142の635位f605位のSのDへの置換配列番号142の635位のいずれか1つを有する配列番号2又は配列番号142と少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むGTRタンパク質、若しくは、以下:g58位のTのAへの置換h58位のTのDへの置換i117位のTのAへの置換j117位のTのDへの置換k323位のTのAへの置換l323位のTのDへの置換を有する配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも80の配列同一性を有するGTRタンパク質をコードする、突然変異GTRアレル、又は、1241~1243位に終止コドンを含む配列番号25の核酸と少なくとも80の配列同一性を有する突然変異GTRアレル、又は、m929~931位に終止コドンを含むn1145~1147位に終止コドンを含む配列番号31の核酸と少なくとも80の配列同一性を有する突然変異GTRアレル、又は、o870~872位に終止コドンを含むp1380~1382位に終止コドンを含む配列番号27の核酸と少なくとも80の配列同一性を有する突然変異GTRアレル、又は、q780~782位に終止コドンを含む配列番号33の核酸と少なくとも80の配列同一性を有する突然変異GTRアレル、又は、以下の位置:rGly126sGly145Glu192tTrp229uSer359のいずれかに突然変異を含む配列番号66のアミノ酸配列と少なくとも80の配列同一性を有するGTRタンパク質をコードする、突然変異GTRアレル。当業者であれば、本明細書における開示を考慮して、過度の負担なく、以下で具体的に記載されていない本発明のあらゆる方法を実施し得る。実施例1:GTRタンパク質の同定及び特性決定ArabidopsisGTR配列の同定及び特性決定最も豊富なArabidopsisGSL4-メチルチオブチルグルコシノレート4-MTBのXenopus卵母細胞への取り込みに関して、全長cDNAとして利用可能なArabidopsisトランスポーターのライブラリーRIKENbioresourcecenter製を、10個の遺伝子のプールで機能的スクリーニングした。構築したライブラリーは、Arabidopsis膜タンパク質ライブラリーデータベースにおいて、有機溶質トランスポーター又は10~14個の膜貫通セグメントを有する機能未知として分類される239個のトランスポーターからなるNourEldinetal2006PlantMethods217。本研究において意図する輸送タンパク質ターゲットは、アポプラストからのインポーターである可能性があったので、Xenopus卵母細胞取り込みアッセイを酸性バッファーpH5で実施した。この手順に従って、At3g47960本明細書においてAtGTR1と名付けられる;配列番号1、2、61及び62及びAt1g18880本明細書においてAtGTR3と名付けられる;配列番号5及び6をGSLトランスポーターとして同定したNourEldin2007、前掲。At3g47960及びAt1g18880は、NRT/PTRトランスポーターファミリーに属しSteineretal1995MolecularMicrobiology16825834Tsayetal2007FEBSletters58122902300、これは、硝酸塩、亜硝酸塩及びペプチドトランスポーターからなることが示されているTsayetal2007FEBSletters58122902300Segonzacetal2007PlantCell1937603777Komarovaetal2008PlantPhysiol148856869。系統発生解析により、これらの2個の遺伝子は、6個のホモログで小さなサブクレードを形成することが示された図1aを参照のこと:At3g47960本明細書においてAtGTR1と名付けられる;配列番号1、2、61及び62、At5g62680本明細書においてAtGTR2と名付けられる;配列番号3、4、63及び64、At1g18880本明細書においてAtGTR3と名付けられる;配列番号5及び6、At1g69860本明細書においてAtGTR4と名付けられる;配列番号7及び8、At1g69870本明細書においてAtGTR5又はNRT1.7と名付けられる;配列番号9及び10、At1g27080本明細書においてAtGTR6又はNRT1.6と名付けられる;配列番号11及び12図1b及び表4は、異なるAtGTR配列の間の配列同一性を示す。Brassica種GTR配列の同定及び特性決定上記で同定したArabidopsisGTR1及びGTR2配列と本質的に類似する配列に関してゲノムデータベースをスクリーニングすることによって、Brassicanapus、Brassicarapa及びBrassicaoleraceaGTR1及びGTR2核酸配列並びにアミノ酸配列をinsilicoで同定した。ArabidopsisGTR1ホモログとの類似性の減少表5a及びbに従って、BrassicaGTR1配列をGTR1-A/C1、2及び3と名付けた配列表の配列番号13~24、配列番号37~42、配列番号49~54及び配列番号61~62を参照のこと。同様に、ArabidopsisGTR2ホモログとの類似性の減少表6a及びbに従って、BrassicaGTR2配列をGTR2-A/C1、2及び3と名付けた配列表の配列番号25~36、配列番号43~48、配列番号55~60及び配列番号63~66を参照のこと。Bjunceaヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を配列番号119~136に提供する。加えて、Bnapus胚トランスクリプトームデータベースにおいて、GTR1及びGTR2配列のタイプ1並びに2の配列すなわち、GTR1-A1、GTR1-C1、GTR1-A2、GTR1-C2、GTR2-A1、GTR2-C1、GTR2-A2及びGTR2-C2配列を同定したところ、これらのタイプのGTR1及びGTR2配列は、Bnapus胚で発現していることが示された。さらに、プライマーBrGTR2-A2-f配列番号67及びBrGTR2-A2-r配列番号68を使用してBrapaecotypepekinensisの葉から単離したcDNAをクローニングすることによって、BrassicarapaGTR2-A2核酸配列及びアミノ酸配列配列表における配列番号65及び66を同定した。実施例2:GTRタンパク質の機能特性決定Arabidopsis及びBrassicaGTRタンパク質の機能特性決定Xenopus卵母細胞における4-MTBの取り込み活性に関して、ArabidopsisNRT/PTRファミリーに由来するAtGTR1~5、BrGTR2-A2及び12個の他のメンバーを個別に試験した。AtGTR1及び2は、AtGTR3に対して5倍高い取り込み活性を示したのに対して、AtGTR4及びAtGTR5は、AtGTR1と比較して、104-MTB取り込み活性を示した。すべての他の試験したNRT/PTRの取り込み活性は、未注射卵母細胞と区別できなかった。BrGTR2-A2を発現する卵母細胞は、卵母細胞1個について1時間あたり約2.5nmol4-MTBを取り込んだ図2のに対して、未注射卵母細胞は、4-MTBの検出可能な取り込みを示さなかった。比較すると、AtGTR2を発現する卵母細胞は、1時間あたり約5nmol4-MTBを取り込んだ図3A。Arabidopsisグルコシノレート輸送タンパク質の生化学的特性決定最も高いGSL取り込み活性を示したAtGTR1及びAtGTR2を、Xenopus卵母細胞で生化学的に特性決定した。両遺伝子に関して、取り込み培地のpHを6から5に下げると、卵母細胞内の4-MTB蓄積が約8倍高くなったのに対して、pH7における取り込みは、pH5における未注射卵母細胞と区別できなかった図3A。これにより、AtGTRがプロトン:GSLシンポーターであることが示された。AtGTR1及びAtGTR2をそれぞれ発現する卵母細胞を100μM4-MTB、pH5及びに曝露し、電圧を-50mVに固定して電流記録を実施すると、30nA範囲の内向き電流が生じた。これは、GSLに曝露した場合のAtGTRを介した陽イオンの純流入を示している。GSL誘発性内向き電流は、30~-120mVの範囲内の過分膜電位を伴って、電圧依存的に増加した図3B及びF。GSLは、1分子あたり負電荷1個を運ぶので、負に帯電した基質を輸送する場合、GSLに対するプロトンの化学量論的組成は、少なくとも2:1でなければならず、これが、一般的には、プロトン依存性オリゴペプチド輸送タンパク質POTの典型的な特性であると思われるDanieletal2006Physiology2193102。-60mVに固定したpH5において、AtGTR1及び2による4-MTBの取り込みは、それぞれ、MichaelisMenten飽和速度に従い、Km=20±1.2μM及びKm=18,7±4,2μMという4-MTBに対するAtGTR1及びATGTR2の高親和性を示した図3C~D。これは、GSLが、inplantaにおけるAtGTRの生理学的基質である可能性があることを示唆している。注目すべきことに、500μM4-MTBにおけるAtGTR2の基質依存性輸送速度は、250μM及び1mMにおいてよりも25低かった。この観察結果も、GSL取り込みの直接LC-MS検出によって測定した基質依存性輸送速度において注目に値するものであった。側鎖を変化させて、GSLに対するAtGTRの基質特異性を調査した。pH5で-50mVに固定したAtGTR1を発現する卵母細胞を、100μMの内因性短鎖メチオニンに由来するGSL4-MTB、4-メチルスルフィニルブチル-GSL及び外因性フェニルアラニンに由来するp-ヒドロキシベンジル-GSLpOHBGで灌流した場合、AtGTR1に関して、30、10及びnAの規模の内向き電流が観察された図3F。同様に、AtGTR2は、卵母細胞抽出物のLC-MS分析によって測定した3個のグルコシノレートすべてを取り込んだデータは示さず。これにより、トランスポーターは、GSL側鎖に関して広範な特異性を有することが示された。基質特異性の調査を拡大して、NRT/PTRトランスポーターファミリーに関して以前に同定した基質、すなわち、ジペプチド及びトリペプチド並びに硝酸塩、を含めた。AtGTR1を発現する卵母細胞を、pH5、133μMのジペプチドala-his、gly-leu、asp-ala及びトリペプチドgly-gly-gly及びmet-ala-serで灌流すると、いかなる検出可能な電流も生じなかった。しかしながら、1mMNO3-で灌流すると電流は生じたが、これらの量は、100μM4-MTBで灌流した場合に測定した電流のわずか1/10になった図3F。これにより、AtGTRは、おそらく二重基質特異性を有することが示された。これをさらに調査するために、AtGTR1及びAtGTR2を発現する卵母細胞を、50x超の非ラベル化4-MTB、NO3-及びジペプチド/トリペプチドの混合物の存在下で40μMC14ラベル化pOHBGに曝露した。50x超の4-MTBのみが、pOHBGの取り込みをバックグラウンドレベルに減少させたのに対して、他の化合物は、有意な阻害効果を有しなかった図3E。まとめると、本発明者らの生化学的分析により、AtGTR1及びAtGTR2は、高親和性、特異的、起電性なプロトン駆動性GSLトランスポーターであり、広範囲のGSLに対して広範な特異性を有することが示された。材料と方法-実施例2:Xenopus卵母細胞におけるトランスポーターcDNAライブラリーの機能的スクリーニング:2箇所改変したが本質的にはNourEldinetalに記載されているように、Xenopus卵母細胞において、239個のArabidopsisトランスポーターのライブラリーの調製及び機能的スクリーニングを実施した。第1に、invitro転写前に、DNA鋳型をプールしなかった。代わりに、各PCR産物を個別にinvitro転写し、次いで、プール1個あたり10個の転写産物にプールした。転写を個別に実施して、プールしたPCRフラグメントの転写効率が変化する可能性により、遺伝子プールがアンバランスになるのを防止した。第2に、ライブラリーを、10個の転写産物をそれぞれ含む23個のプールと、9個の転写産物を含む24番目のプールとに分割した。1mM4-MTBArabidopsis配列の場合又は0.5mM4-MTBBrassica配列の場合を含むKuloripH5中、室温で、取り込みアッセイを実施した。続いて、注射した卵母細胞へのGSL取り込みを媒介した転写産物プールを、個別の転写産物として注射して、GSLトランスポーターを同定した。Xenopus卵母細胞における発現のための構築物:プライマー対AtGTR2f配列番号84及びAtGTR2r配列番号85並びにプライマー対AtGTR5f配列番号94及びAtGTR5r配列番号95NourEldinetal2006NuclAcidsRes34e122をそれぞれ使用して、葉組織に由来するcDNAから、AtGTR2及びAtGTR5のコード配列をクローニングした。第1エクソンに関するプライマー対AtGTR4e1f及びAtGTR4e1r配列番号86及び87、第2エクソンに関するプライマー対AtGTR4e2f及びAtGTR4e2r配列番号88及び89、第3エクソンに関するプライマー対AtGTR4e3f及びAtGTR4e3r配列番号90及び91、並びに、第4エクソンに関するプライマー対AtGTR4e4f及びAtGTR4e4r配列番号92及び93を使用するPCR増幅によって、AtGTR4をクローニングし、続いて、ゲノムDNAに由来するその4個のエクソンを融合した。以前に記載されているようにGeuFloresetal2007NuclAcidsRes35e55、USER融合及びpNB1uへのクローニングを実施した。Brapaecotypepekinensisの葉から単離したcDNAから、BrGTR2-A2のコード配列配列番号65をクローニングした。プライマーBrGTR2-A2-f配列番号67及びBrGTR2-A2-r配列番号68を使用してCDSをクローニングし、Xenopus発現ベクターpNB1uNourEldinetal2006NuclAcidsRes34e122にUSERクローニングした。プライマーT7配列番号96及びpNB1rev配列番号97を使用するPCRによって、invitro転写のための直鎖状鋳型を作製した。以下のように、50μlの反応容量で、cRNAをinvitro転写した:80UT7RNAポリメラーゼFermentas;0,01MDTT;0,1μgμlBSA;60μM3’OMem7GpppGRNACapStructureAnalog;20URibolock商標RNase阻害剤Fermentas;0,01UピロホスファターゼFermentas;1mMrATP、rUTP、rCTP及び0,05mMrGTPLAROVAを含むT7RNAポリメラーゼ転写バッファー中、37°Cで、1~5μgの直鎖状鋳型を30分間インキュベーションした。次いで、rGTPを添加して1mMの最終濃度とし、反応液を3時間インキュベーションした。塩化リチウム沈殿によってRNAを精製し、ヌクレアーゼフリーのH2Oに溶解させて、0,5μgμlの最終濃度とした。Xenopus卵母細胞におけるGSL輸送アッセイ:卵母細胞処置及び注射:以前に記載されているように1998MethodsEnzymol2961752卵母細胞を準備し、50ngのcRNAを注射した。輸送活性をアッセイする前に、卵母細胞を、17°Cで3~4日間インキュベーションした。アッセイ条件:TRISでpH5に調整した生理食塩水バッファーkulori90mMNaCl、1mMKCl、1mMCaCl2、1mMMgCl2、5mMMES中で、アッセイを実施した。kuloriバッファーpH5中で、卵母細胞を5分間プレインキュベーションして細胞内定常状態pHを確保し、続いて、示された濃度の基質を含む500μlのkuloriバッファーpH5に移し、室温で1時間インキュベーションした。氷冷kuloriバッファーpH5で、卵母細胞を4回洗浄した。輸送定量化:放射性ラベル化基質を用いるアッセイの場合、4mlのシンチレーションバイアルに入れた100μlの10SDS中で20~30分間振とうすることによって、単一の卵母細胞を破裂させた。2.5mlのEcoScint商標scintillationfluidと連結したAgilent1100SeriesLCを使用するLC-MS分析によって、脱硫酸化グルコシノレートを含む3μlの上清を分析した。ZorbaxSBC18columnを0,2ml/分の流速で使用し、オーブン温度を35°Cに維持した。移動相を、A、0,1v/vHCOOH及び50μMNaClを含む水;B、0,1v/vHCOOHを含むアセトニトリルとした。勾配プログラムを、0~0,5分、等張2B;0,5~7,5分、直線勾配2~40B;7,5~8,5分、直線勾配40~90B;8,5~11,5分等張90B;11,6~15分、等張2Bとした。11,2~13,5分の合間に、流速を0,3ml/分に増加した。質量分析計をポジティブエレクトロスプレーモードで実行した。実施例3:突然変異GTR遺伝子を有する植物及び植物部分の作製並びに特性決定突然変異GTR遺伝子を有する植物の作製及び特性決定AtGTR1atgtr1-1、AtGTR2atgtr2-1及びAtGTR3atgtr3-1のArabidopsisT-DNA突然変異体を、それぞれ、SALKTDNAcollectionから同定した。insilicoゲノム配列分析により、atgtr1-1は、第1エクソンにT-DNA挿入を含むのに対して、atgtr2-1は、コード領域の第4エクソンにT-DNA挿入を含み、atgtr3-1は、第3エクソンにT-DNA挿入を含むことが示された。遺伝子型決定[atgtr1に関するプライマー対AtGTR1_N879742_RP配列番号98及びAtGTR1_N879742_LP配列番号99、atgtr2に関するAtGTR2_N870210_RP配列番号100及びAtGTR2_N870210_LP配列番号101;並びにatgtr3に関するAtGTR3_N409421_RP配列番号102及びAtGTR3_N409421_LP配列番号103を使用する]、及び、RT-PCR分析[AtGTR1に関するプライマー対AtGTR1_RT_fw配列番号104及びAtGTR1_RT_rev配列番号105、AtGTR2に関するAtGTR2_RT_fw配列番号106及びAtGTR2_RT_rev配列番号107並びにAtGTR3に関するAtGTR3_RT_fw配列番号108及びAtGTR3_RT_rev配列番号109を使用する]により、atgtr1、atgtr2及びatgtr3ホモ接合性突然変異体は、それらの各AtGTRに関するヌル突然変異体であったことが示された。atgtr1突然変異植物とatgtr2突然変異植物を交雑することによって、ダブルノックアウト突然変異体を作製した。野生型、atgtr1、atgtr2及びatgtr1/atgtr2遺伝子型のそれぞれに関して、分離F2集団から、3個のホモ接合性系統を同定した。配列番号65のBrGTR2-A2配列、並びに、tillingプライマーBrGTR2-A2-Till-f配列番号69、BrGTR2-A2-Till-r配列番号70、BrGTR2-A2-Inner-fw配列番号71、BrGTR2-A2-Inner-fw2配列番号72及びBrGTR2-A2-Inner-rv配列番号73を使用するTILLINGによって、突然変異BrapaecotypeR018植物集団RevGenUKにおいて、BrGTR2-A2のBrassicarapa置換突然変異体を同定した。20個の置換突然変異を見出した:7個のサイレント突然変異同じアミノ酸をコードするコドンをもたらす核酸突然変異、8個の重篤でない突然変異同じ機能クラスに属するアミノ酸をコードするコドンをもたらす核酸突然変異、4個の重篤な突然変異異なる機能クラス例えば、大型に対して小型、極性に対して非極性、非脂肪族に対して脂肪族、非芳香族に対して芳香族、極性に対して疎水性、非酸性側鎖に対して酸性側鎖に属するアミノ酸をコードするコドンをもたらす核酸突然変異、及び、1個の終止コドン突然変異。BrapaecotypeR018に由来するBrGTR2-A2のゲノムDNA配列において見出された重篤又は終止突然変異コドンのヌクレオチド位置、及び、配列番号66における対応するアミノ酸位置を、表7に示す。Brapaecotypepekinensisに由来するBrGTR2-A2の示したアミノ酸をコードするコドンは、配列番号65における示したアミノ酸位置に見出すことができる。各突然変異に関して、プライマーBrGTR2-A2-Inner-fw配列番号71、BrGTR2-A2-Inner-fw2配列番号72及びBrGTR2-A2-Inner-rv配列番号73を使用し、得られたアンプリコンを配列決定し、表7に示した位置における野生型又は突然変異コドンの存在を決定して、ホモ接合性野生型及び突然変異Brapa植物を同定した。突然変異植物を生育し、異なる植物部分においてGSL含量を測定する。突然変異植物を生育し、異なる植物部分においてGSL含量を測定する。結果を図9にまとめる。Brgtr2ノックアウト突然変異体に由来する種子BrGTR2W229XMut1-9は、真のWTBrapa種子及びBrGTR2SW229XWTSの両方と比較して、グルコシノレート含量が減少していた。各遺伝子型の種子をプールする場合、減少は、BrGTR2W229X-WT植物と比較して、~80である。アミノ酸G145RG145RMut1~4の突然変異をしたBrGTR2を含むBrapa植物は、非常にばらつきのあるグルコシノレート含量を示しているが、これは、種子グルコシノレート含量に影響を与える遺伝子におけるさらなるEMS誘発性点突然変異の分離が、おそらく原因である。突然変異BrassicarapaGTR2-A2タンパク質の機能特性決定Xenopus卵母細胞における4-MTBの取り込み活性に関して、同定した突然変異BrGTR2-A2タンパク質を個別に試験した。以前に記載されているようにGeuFloresetal2007NuclAcidsRes35e55、USER融合によって、BrGTR2-A2に点突然変異を作製した。つまり、コード配列を、所望の突然変異位置に隣接する2個のフラグメントとしてPCR増幅する。各フラグメントは、塩基置換が組み込まれた相補的なテイルを有する。加えて、ウラシル特異的切断試薬USERにより切断されると長い一本鎖オーバーハングこれは、他のフラグメントに由来する相補的なテイルと容易にかつしっかりとアニーリングするを生じるウラシル残基を、各テイルは含む。各フラグメントの末端終結部において、突然変異の上流に位置するフラグメントのためのフォワードプライマーとしてBrGTR2-A2-fプライマーを使用し、突然変異の下流に位置するフラグメントのためのリバースプライマーとしてBrGTR2-A2-rを使用した。ジャンクションにおいて使用したプライマーを、配列番号74及び75表7に示されるアミノ酸126置換のためのフォワード及びリバースプライマー、配列番号76及び77表7に示されるアミノ酸145置換のためのフォワード及びリバースプライマー、配列番号78及び79表7に示されるアミノ酸192置換のためのフォワード及びリバースプライマー、配列番号80及び81表7に示されるアミノ酸229置換のためのフォワード及びリバースプライマー並びに配列番号82及び83表7に示されるアミノ酸359置換のためのフォワード及びリバースプライマーに示す。pNB1uベクターへの挿入後に配列決定することによって各クローンを確認し、上記のようにRNAを作製し、卵母細胞に注射した。各クローンの取り込み活性を図2及び表7に示す。結論としては、終止コドンを含むBrGTR2は非機能的であり、これは、トランケーション型のタンパク質がinplantaで非機能的であることを示しているのに対し、残りの突然変異は様々な輸送活性を示した。これらの様々な輸送活性は、置換を受けるアミノ酸位置が、BrGTR2輸送活性に重要であることを示している。POTタンパク質の提案モデルによれば、膜貫通ヘリックス番号1、2、4、5、7、8、10及び11は、トランスポーターの中心孔を1列に並べ、輸送機構に関与する。残りのヘリックス番号3、6、9及び12は周辺に見られ、構造的安定性を付与し得る。突然変異BrGTR2G126R及びBrGTR2S359Fは、それぞれ膜貫通ヘリックス3及び7に存在する。ヘリックス3は、輸送機構に関与しないはずである;従って、BrGTR2G126Rは、タンパク質の三次構造をひどく破壊し、取り込み活性がほとんどなくなった原因の可能性があるという仮説を立てることができる。ヘリックス7は、輸送が起こる場所である中心孔を1列に並べる;従って、このBrGTR2S359Fに関して見られた取り込み活性の増加は、小さい側鎖セリンから大きい側鎖フェニルアラニンに転移して、孔の拡大が起こったためである可能性がある。さらに、S359F転移の極性の変化は、活性の増加に寄与する可能性がある。突然変異BrGTR2G145Rは、4-MTBの取り込みに有意な変化を引き起こさない。ヘリックス4とヘリックス5の間の細胞質ループにおける突然変異BrGTR2E192Kは、グルコシノレート取り込みの減少を引き起こすようである。負に帯電したグルタミン酸から正に帯電したリシンへのアミノ酸シフトは、非常に劇的であり、おそらくタンパク質構造を破壊する可能性がある。さらに、リン酸化部位は、AtGTR2のペプチド配列ser-glu-ser-gly-lys-arg上に示唆された。AtGTR2とBrGTR2のアライメントは、この配列が保存されていること、及び、当該ペプチドがBrGTR2の残基191~196に対応することを示している。従って、突然変異グルタミン酸E192Kの周囲のセリン191及び193の一方が、正常にリン酸化又は脱リン酸化される場合、これは、リシンへの転移によって防ぐことができる;次いで、これが取り込み活性を減少させ得る。突然変異GTRArabidopsis植物の種子におけるGSL含量の特性決定ヘテロ接合性atgtr1、atgtr2及びatgtr3突然変異体に由来する分離後代のGSL分析により、ホモ接合性atgtr3植物に由来する種子は、野生型レベルの総脂肪族及びインドールGSLを含むことが示された。同様に、atgtr1は、種子1個あたりの総脂肪族及びインドールグルコシノレート含量が有意に減少していなかったのに対して、atgtr2種子は、総脂肪族GSL濃度が約50減少していた図4A~C及び5A。加えて、インドールGSL含量は、atgtr2種子において検出できなかった。植物1個体あたり20個の種子を分析したところ、各ホモ接合性atgtr1/atgtr2系統に由来する種子におけるGSLレベルは、検出限界未満であったが、これは、種子へのGSL輸送においてAtGTR1及びAtGTR2の複合的な活動が果たす重要な役割を示している。野生型及びatgtr1/atgtr2植物に由来する10mgの種子を分析したところ、atgtr1/atgtr2植物に由来する種子において、野生型と比較して250倍低いレベルの微量のグルコシノレートを検出できた。分子相補性に関して、それぞれ、2kbプロモーターと、YFPに融合したゲノム配列と、3’UTRとを含むAtGTR1構築物、及び、2kbプロモーターとそれに続くゲノム配列とからなるAtGTR2構築物を、atgtr1/atgtr2二重突然変異体に導入したところ、種子における脂肪族及びインドールGSL含量の両方を回復させることが示された図4E~F。これにより、atgtr1/atgtr2突然変異体におけるGSLフリーの種子の表現型は、AtGTR1及びAtGTR2輸送タンパク質の欠如が原因であることが実証された。突然変異GTRArabidopsis植物の葉におけるGSL含量の特性決定抽だい前、抽だい後及び老化時のロゼット全体において、GSLレベルを測定した。野生型植物に由来するロゼットにおいて、脂肪族GSL含量を測定したところ、抽だいの前後ではロゼット1個あたりそれぞれ28±13及び68±19nmolであり、老化ロゼットでは8±3nmolであった。対照的に、atgtr1/atgtr2植物に由来するロゼットでは、脂肪族GSL含量は、ロゼット1個あたり抽だい前の27±11nmolから抽だい後の410±78nmolに劇的に増加し、老化時はロゼット1個あたり161±31nmolに保たれていた。atgtr1及びatgtr2単一ノックアウト系統のロゼットは、atgtr1/atgtr2のロゼットと比較して、中間レベルを含んでいた図4B。脂肪族GSLと比較して、インドールGSL含量は、ロゼット組織において、より大きな変動を示した。しかしながら、抽だい後及び老化時において野生型とatgtr1/atgtr2のロゼットを比較すると、atgtr1/atgtr2のロゼットは、平均して2倍高いインドールGSLを含んでいた。まとめると、これらの観察結果は、ロゼット組織が、脂肪族及びインドールGSLの両方を連続的に合成して輸出することを示しており、AtGTR1及びAtGTR2の両方が、野生型植物におけるこの活動に重要であることを実証している。突然変異GTRArabidopsis植物の茎、花、葉、長角果及び長角果壁におけるGSL含量の特性決定抽だい後の植物から、花序長角果及び茎生葉を含まない、茎生葉、すべてのインタクトな長角果種子を含む、及び、単一の切開した長角果最も未成熟及び最も成熟なものに由来する長角果壁において、GSL含量を別々に測定した。加えて、老化時において、単一の長角果壁を分析した。抽だい後の野生型では、花序長角果及び茎生葉を含まないは、花序1個あたり200±46nmolの脂肪族GSLを含んでいたのに対して、atgtr1/atgtr2植物に由来する花序は、61±28nmolを含んでおり、atgtr1及びatgtr2植物の花序は、中間レベルを含んでいた図5C。抽だい後の野生型植物に由来する茎生葉では、脂肪族GSL含量は、茎生葉合計で59±15nmolの量であったのに対して、atgtr1/atgtr2突然変異体は、それらの茎生葉において181±20nmolを含んでいた図5C。脂肪族GSLの含量の増加は、長角果壁においても観察され、抽だい後のatgtr1/atgtr2植物における濃度は、長角果壁1個あたり8.8±3nmolであったのに対して、野生型植物では、長角果壁1個あたり2.9±0,8nmolであった。老化時において、野生型に由来する長角果壁におけるGSLレベルは、長角果壁1個あたり0.3±0,13nmolに減少したのに対して、atgtr1/atgtr2の長角果壁は、3±0,78nmolに保たれていた図5D。まとめると、これらの観察結果は、この発生段階において、ロゼット組織に加えて茎生葉及び長角果壁が、GSL源として機能するのに対して、花序全体又はその一部は、AtGTR1及びAtGTR2媒介性GSL輸送のシンクを構成するようであることを示している。長角果を分析した際の2つのさらなる観察結果は、注目に値する。第1に、抽だい後の野生型又はatgrt1/atgtr2突然変異体に由来するインタクトな長角果を分析した際に、GSL含量に有意差は観察されず図5C、これは、この発生段階において、インタクトな長角果のGSL含量が、AtGTR1及びAtGTR2の活性にもっぱら依存していないことを示している図5D。第2に、他の組織とは対照的に、抽だい後のatgtr1及びatgtr2単一突然変異体は、atgtr1/atgtr2と比較して中間の表現型を示さず、反対に、atgtr1及びatgtr2は両方とも野生型と似ていたが、これはおそらく、両方のトランスポーターを突然変異させることの興味深い相乗効果を示している図5D。抽だい後の植物の様々な組織における総脂肪族GSL含量のバランスを計算すると、atgtr1/atgtr2植物は、ロゼット及び茎生葉において、野生型と比較して、約460nmolの過剰分を含むことが見られる。この増加は、atgtr1/atgtr2植物の茎及びインタクトな長角果における約160nmolの減少によってのみ達成されるので、これは、野生型と比較して、atgtr1/atgtr2植物の地上部合計で総脂肪族GSL含量の約300nmolの増加をもたらす表8。突然変異GTRArabidopsis植物の根におけるGSL含量の特性決定抽だい前後の水耕栽培植物に由来する根、ロゼット及び花序において、GSL濃度を測定した。抽だい前では、野生型の根における脂肪族グルコシノレート含量は、1,75±0.28nmolmg生重量であったのに対して、atgtr1/atgtr2の根に含まれるのは、20倍少なかった0,08±0,06nmolmg。抽だい後では、野生型植物に由来する根は、0,8±0,14nmolmgの脂肪族グルコシノレートを含んでいたのに対して、atgtr1/atgtr2植物に由来する根は、0.2±0.06nmolmgすなわち、4倍未満を含んでいた図6A。土壌栽培植物とは対照的に、抽だい前の水耕栽培植物に由来する対応するロゼットにおける脂肪族グルコシノレート含量は、atgtr1/atgtr2植物1,33±0,11nm/mgでは、野生型0,64±0,1nmolmgと比較して、2倍超であった図6B。抽だい後では、野生型とatgtr1/atgtr2植物に由来するロゼットの間の倍差は、より顕著になり、野生型植物は、0.35±0,13nmolmgを含んでいたのに対して、atgtr1/atgtr2のロゼットは、1.44±0,16nmolmgすなわち、4倍超の濃度を含んでいた図6B。最後に、野生型とatgtr1/atgtr2植物に由来する花序の間の脂肪族グルコシノレート濃度に、有意差は見られなかった図6B。まとめると、これらの観察結果は、atgtr1/atgtr2の地上組織におけるグルコシノレート蓄積の大幅な増加が、根に輸送されるはずであった量によって説明できることを示している。従って、根は、グルコシノレート輸送に関する、まだ同定されていない強力なシンクを構成する。Arabidopsis植物におけるAtGTR1及び2の組織、細胞並びに細胞内局在の特性決定β-D-グルクロニダーゼbeta-D-glucoronidaseGUSの発現を駆動するのに、2kbの各プロモーターを使用した。抽だい前は、pGTR1::GUS活性は、排水組織の周囲の明確なスポットに限定されていた。対照的に、抽だい後は、ロゼット葉の維管束組織、葉肉及び表皮を含む葉全体にわたって、pGTR1::GUS活性を検出した。発生中の花では、pGTR1::GUS活性は、萼片の表皮の個々の細胞において見られたのに対して、発生中の長角果は、表皮及び珠柄において活性を示した。この発現パターンにより、AtGTR1は、抽だい後の葉全体にわたって、細胞間のグルコシノレート輸送において普遍的な役割を果たす可能性があることが示された。表皮への局在により、グルコシノレートは、葉の外周に輸送される可能性があることが示された。pGTR2::NLS-GFP-GUSトランスジェニック植物では、GUS活性は、発生を通じて維管束組織において強くかつ主に検出され、いくらかの活性が、葉の表皮においても検出された。さらに、GUS活性は、萼片の維管束構造、花弁及び発生中の花の花糸において検出された。発現は、長角果壁の維管束組織及び発生中の種子の珠柄においても検出された。比較すると、GUS活性は、いかなる発生段階の非トランスフォーメーション植物のいかなる組織においても検出できなかった。AtGTR2が維管束組織において明らかに限定的かつ構成的に発現していることにより、維管束組織におけるバリアを越えてグルコシノレートを輸送して、シンクへの長距離輸送を可能にする主な役割が示された。材料と方法-実施例3:植物材料及び生育条件:地上組織におけるGSL分析及び発現局在研究に関して、20°C、16時間明期700μEm2s1のグロースチャンバーにおいて、4cmの植木鉢に入れた土壌で、Arabidopsis植物ecotypeColumbia0を栽培した。根におけるGSL分析に関して、Lehmannetal2009MolPlant2390406に記載されている水耕システムにおいて、植物を生育した。つまり、空のピペット-チップボックス内に保持した0.5mlのマイクロチューブに入れた0.5植物寒天/50Gibeaut’s栄養溶液Gibeautetal1997PlantPhysiol115317319上で、種子を発芽させた。発芽後約1週間にチューブの底を切り取り、ボックスを100栄養溶液で満たした。約2週間後に植物をより大きなコンテナに移し、20°C、16時間:8時間光周期の下で生育した。栄養溶液を毎週交換し、遺伝子型を別々のコンテナで生育した。土壌栽培植物に関して記載したように、グルコシノレート分析のための個々の組織の回収を実施した。植物組織からのGSL抽出及び分析:atgtr1-1×atgtr2-1の交雑から生じた各遺伝子型の各系統それぞれに関して同定した3つにおいて、3つの時点でGSLレベルを分析した。1抽だい前:花序の出現前の10~14枚の葉を有する完全に形成されたロゼットを特徴とする3週齢植物成長段階1.10~1.12、2抽だい後:全長が最低である長角果、及び、少なくとも7~10個の発生中の長角果が存在することを特徴とする5週齢植物成長段階6.10~6.30、3老化:老化して乾燥した緑色組織、及び、発生した長角果すべてが成熟種子を含むことを特徴とする8~9週齢植物成長段階9.7。成長段階の定義は、以前に記載されている通りであるBoyesetal2001Plantcell1314991510。各遺伝子型の各系統において、抽だい前後の水耕栽培植物のロゼット、根及び花序におけるGSLレベルも分析した。土壌栽培又は水耕栽培した抽だい前後の植物で実施した分析に関して、新鮮組織を採取し、ホモジナイズした。具体的には、抽だい後の長角果壁の分析に関して、長角果壁及び未成熟種子に切開する前に、インタクトな長角果を凍結乾燥した。老化植物の分析に関して、乾燥組織を採取し、ホモジナイズした。成熟種子の分析に関して、20個の種子を分析した。GSLを抽出し、以前に記載されているようにHansenetal2007PlantJ50902910、C18reversedphasecolumnSupelcosilLC18DB、25cm×4.6mm、5μm粒径、SupelcoBellefontePAUSAを備えるHP1200SeriesHPLCAgilent製を用いて、1ml分-1の流速注入量45μlで水溶媒A-アセトニトリル溶媒B勾配を使用することにより、脱硫酸化GSLとして分析した。勾配を以下のようにした:1.5~7B5分、7~256分、25~804分、80B3分、80-35B2分、35~1.5B2分及び1.5B3分。200~400nm2nm間隔のダイオードアレイ検出によって、溶出液をモニタリングした。公知の基準のものReicheltetal2002との保持時間及びUV吸収スペクトルの比較に基づいて、脱硫酸化GSLを同定した。応答係数Brownetal2003FiebigandArens1992に対して計算したnmolとして、結果を示す。レポーター及び相補構築物の構築:すべてのクローニングにEcoli株DH10Bを使用した。AtGTR1及びAtGTR2プロモーター:レポーター構築物に関して、AtGTR1プロモーター用のプライマーAtGTR1pf配列番号110及びAtGTR1pr配列番号111、並びに、AtGTR2プロモーター用のプライマーAtGTR2pf配列番号112及びAtGTR2pr配列番号113を使用して、ArabidopsisCol0ゲノムDNAから、プロモーターを増幅した。pCambia3300u-NLS-GPF-GUS、すなわちβ-D-グルクロニダーゼに融合したGFPが後ろにある核局在シグナルの上流Chytilovaetal1999AnnBot83645654に、プロモーターフラグメントをUSERクローニングした。相補構築物AtGTR2プロモーター-ATGTR2ゲノム遺伝子に関して、プライマープライマーAtGTR2pf配列番号112及びAtGTR2pr配列番号113を使用して、フラグメントをPCR増幅し、pCambia1300uにUSERクローニングした。相補構築物AGTR1プロモーター-AtGTR1ゲノム遺伝子-YFP-3’UTRに関して、プロモーター-ゲノム遺伝子フラグメント用のプライマーAtGTR1pf配列番号110及びAtGTR1r-YFP配列番号114、YFPフラグメント用のプライマーYFPf-AtGTR1-融合配列番号115及びYFPr-pot13’UTRfusion配列番号116、並びに、3’UTRフラグメント用のプライマーAtGTR13’UTRf-YFP融合配列番号117及びAtGTR13’UTRr配列番号118を使用して、各フラグメントをPCR増幅した。pCambia1300uベクターにフラグメントをUSER融合した。植物発現プラスミドを、安定的ArabidopsisトランスフォーメーションのためのAgrobacteriumGV3101をトランスフォーメーションするのに使用した。GUS活性に関するトランスジェニックArabidopsis植物の染色:1mMX-GIc、0.5TritonX-100、20v/vメタノール、100mMTris-HClpH7.5及び10mMアスコルビン酸塩を含む溶液に、X週齢ArabidopsisGTR1prom-GFP-GUS及びGTR2prom-GFP-GUS植物を浸し、37°Cで16時間インキュベーションした。染色後に洗浄し、70エタノール中でインキュベーションすることによって、クロロフィルを除去した。実施例4:突然変異BrassicaGTR遺伝子及びそれを含む植物及び植物部分の作製並びに特性決定Brassica植物に由来する種子M0種子をEMSに曝露する。突然変異を起こした種子M1種子からM1植物を生育し、自家受粉させてM2種子を作製する。M2植物を生育し、植物サンプルからDNAサンプルを調製する。GTR遺伝子のタンパク質コード領域における終止コドンの導入、GTRタンパク質におけるアミノ酸の置換、又は、スプライス部位突然変異を引き起こすGTR遺伝子における点突然変異の存在に関して、DNAサンプルを、上記GTR特異的プライマーを用いて直接配列決定し、点突然変異の存在に関して配列を分析することによってスクリーニングする。M2植物のDNAサンプルにおいて同定した各突然変異GTR遺伝子に関して、GTR突然変異を含むM2植物と同じM1植物に由来するM2植物を生育し、各M2植物個体の植物サンプルから、DNAサンプルを調製する。同定したGTR点突然変異の存在に関して、DNAサンプルをスクリーニングする。Bnapusにおいて以下の突然変異アレルを単離し、M3湿潤種子において総グルコシノレート含量を試験した:a.GTR2-C2-ems02b.GTR2-C1-ems05c.GTR2-C1-ems01d.GTR2-A2-ems09e.GTR2-A2-ems03f.GTR2-A1-ems01突然変異アレルに関するさらなる詳細は、表3a及び3bを参照のこと。結果を図10にまとめる。観察された総グルコシノレートの最大減少は、単一遺伝子ノックアウトによる51であった。試験した各遺伝子コピーは、類似の効果をもたらした。高レベルのばらつきは、戻し交雑していない材料における多数の無関係なバックグラウンド突然変異に関係している可能性がある。このようにして、突然変異GTRアレルを作製し、単離する。また、このような突然変異アレルを含む植物を、以下のように、植物例えば、Brassica育種系統における選択した突然変異体及び/又は野生型アレルを組み合わせるのに使用できる:突然変異GTR遺伝子を含むBrassica植物ドナー植物系統を、突然変異GTR遺伝子を持たないBrassica植物アクセプター植物系統と交雑する。以下の遺伝子移入スキームを使用する突然変異GTR遺伝子をgtrと略すのに対して、野生型をGTRと示す:初回交雑:gtr/gtrドナー植物×GTR/GTRアクセプター植物、例えば、育種系統F1植物:GTR/gtrBC1交雑:GTR/gtr×GTR/GTRアクセプター植物BC1植物:50GTR/gtr及び50GTR/GTR突然変異GTRアレルgtrに関する分子マーカー例えば、AFLP、PCR、Invader商標などを使用して、50GTR/gtrを選択する。BC2交雑:GTR/gtrBC1植物×GTR/GTRアクセプター植物BC2植物:50GTR/gtr及び50GTR/GTR突然変異GTRアレルgtrに関する分子マーカーを使用して、50GTR/gtrを選択する。戻し交雑をBC3~BC6まで繰り返すBC3~6植物:50GTR/gtr及び50GTR/GTR突然変異GTRアレルgtrに関する分子マーカーを使用して、50GTR/gtrを選択する。戻し交雑の回数を減らすために例えば、BC6の代わりにBC3まで、アクセプター植物系統の遺伝的背景に特異的な分子マーカーを使用できる。BC3~6S1交雑:GTR/gtr×GTR/gtrBC3~6S1植物:25GTR/GTR及び50GTR/gtr及び25gtr/gtr突然変異GTRアレルgtrに関する分子マーカーを使用して、gtrを含む植物を選択する。突然変異及び野生型GTRアレルに関する分子マーカーを使用して、突然変異GTRアレルgtr/gtrに関してホモ接合性であるBC3~6S1植物個体を選択する。次いで、これらの植物を種子生産に使用する。突然変異GTRBrassica植物の部分におけるGSL含量の特性決定突然変異GTRArabidopsis植物に関して上記に記載したように、突然変異GTRBrassica植物において、種子、茎、花、葉、根、長角果及び長角果壁のGSL含量を分析する。さらなる育種、種子生産又は作物栽培のために、特定の植物部分において特定のGSL含量をもたらす突然変異GTR遺伝子の特定の組み合わせを含むBrassica植物を選択する。ecotypeR018Brassicarapa亜種trilocularisの近交系統のWT及び突然変異ゲノム内ターゲット誘発性局所損傷TargetingInducedLocalLesionsINGenomes、TILLINGによるBrassicarapa種子を、ReverseGeneticsUKから購入した。種子を植物基質上に播種し、Bactimosと水を与えた;播種後に、種子を4°Cで2日間冷却層積して、一定の高発芽率を得た。最後に、発芽中の種子を、16時間日長及び温度20°Cのグロースチャンバーに移した。分析に使用したBrapa植物は、2.5月齢であった;それらは、緑色の未成熟種子を含む緑色の長角果を有していた。実験において使用した反復植物の数は、n=5植物であった。Brapaの葉及び他の組織の重量を量り、モルタル葉及び根又はブレンダー茎及び長角果のいずれかを使用して、液体N2中でホモジナイズした。内部標準としてp-ヒドロキシベンジルグルコシノレートpOHBを含む85メタノール中で、ホモジナイズした氷冷植物材料から、グルコシノレートを抽出した。45μlDEAEsephadex商標A-25カラム材料でロードした96ウェルフィルタープレートに、上清の一部を移した。グルコシノレートはカラム材料に結合させたが、サンプルは、簡単な真空処理を行うことによってフィルタープレートから吸い出した。その後、カラムを70メタノール及び水で洗浄した。スルファターゼ溶液2mgmlをカラムに添加し、室温で一晩インキュベーションした。100μlの水をカラムに注入し、ショートスピンにより、脱硫酸化グルコシノレートを96ウェルフォーマットプレートに溶出した。サンプルをAgilenttechnologies1200seriesHPLCDADシステムで分析し、ZorbaxSBAQカラムで分離した。wt及びノックアウトBrapaの異なる組織におけるグルコシノレート濃度を図12にまとめ、これらの組織の重量を図13にまとめる。実施例5:リン酸化/脱リン酸化状態が変化した突然変異GTR1及びGTR2アレルの作製並びに特性決定httpphosphatmpimpgolmmpgdeホスホプロテオミクスデータを収集しているデータベースで検索可能な実験的に確認されたリン酸化部位に基づいて、構成的リン酸化又は脱リン酸化を模倣するArabidopsisthalianaGTR1及びGTR2アレルを構築した。リン酸化部位候補のアミノ酸S又はTをアスパラギン酸で置換することによって、リン酸化を模倣した。アラニンに置換することによって、脱リン酸化を模倣した。以下の構築物を作製した:以下:a.22位のSのAへの置換b.22位のSのDへの置換c.105位のTのAへの置換d.105位のTのDへの置換e.605位のSのAへの置換f.605位のSのDへの置換を有する配列番号2のアミノ酸配列これは、以下:g.52位のSのAへの置換h.52位のSのDへの置換i.135位のTのAへの置換j.135位のTのDへの置換k.635位のSのAへの置換l.635位のSのDへの置換を有する配列番号142のアミノ酸配列に対応するを有するGTR1タンパク質をコードする構築物、又は、以下:m.58位のTのAへの置換n.58位のTのDへの置換o.117位のTのAへの置換p.117位のTのDへの置換q.323位のTのAへの置換r.323位のTのDへの置換を有する配列番号4のアミノ酸配列を有するGTR2タンパク質をコードする構築物。また、492又は522位のプロリンをロイシンで置換したGTR1又はGTR2をコードする構築物も試験した。100μMの濃度のグルコシノレート4-MTB4-メチルスルフィニルブチルグルコシノレートのプロトン依存性取り込みに関して、リン酸化/脱リン酸化構築物をアッセイした。構築物100ngμlの1つのcRNAを5個の卵母細胞に注射4回反復し、17°Cで5日間維持した。5日目に、卵母細胞をKuloripH5中で5分間プレインキュベーションし、次いで、アッセイ培地100μMの濃度の4-MTBを含むKuloripH5に移した。1時間後に、4-MTBを含む培地から卵母細胞を取り出し、100メタノール中で抽出する前に、4回洗浄した。4-MTBの取り込みを検出するためのLC-MS分析を行い、結果を図11に示す。位置S22S52におけるGTR1の構成的脱リン酸化は、輸送を完全に止めることが観察できた。同様に、同じ残基のリン酸化は、取り込みをインタクトな状態に維持することが観察できた。さらに、GTR2T58の脱リン酸化は、輸送活性をインタクトな状態に維持するのに対して、同じ残基のリン酸化は、輸送を不活性化することが観察できた。GTR1のT105T135及びGTR2のT117の構成的リン酸化並びに脱リン酸化は両方とも、輸送活性を遮断する。GTR1P492P522及びGTR3P492のロイシンへの突然変異は、輸送活性を不活性化することも観察できた。つまり、特定の残基におけるリン酸化/脱リン酸化は、GTR1及びGTR2媒介性グルコシノレート輸送をレギュレーションするという結論を出すことができる。によって示したアミノ酸位置は、30AAのN末端延長を含むロングバージョンのGTR1に関するものである実施例6:dsRNA構築物を使用した、Brassica種におけるGTR1及び/又はGTR2発現のダウンレギュレーション標準リコンビナントDNA技術を使用して、以下の機能的に連結されたDNAフラグメントを含むリコンビナント遺伝子をコードするdsRNAを構築する。aGTR1をダウンレギュレーションするリコンビナント遺伝子i.植物発現プロモーター例えば、CaMV35Sii.配列番号138のヌクレオチド配列を含むDNA領域iii.転写終結及びポリアデニル化領域例えば、3’nos領域bGTR2をダウンレギュレーションするリコンビナント遺伝子i.植物発現プロモーター例えば、CaMV35Sii.配列番号139のヌクレオチド配列を含むDNA領域iii.転写終結及びポリアデニル化領域例えば、3’nos領域cGTR1/GTR2をダウンレギュレーションするリコンビナント遺伝子i.植物発現プロモーター例えば、CaMV35Sii.配列番号140のヌクレオチド配列を含むDNA領域iii.転写終結及びポリアデニル化領域例えば、3’nos領域リコンビナント遺伝子をコードするこれらのdsRNAを、選択可能マーカー遺伝子例えば、リン酸化アセチルトランスフェラーゼをコードする選択可能マーカー遺伝子と共に、T-DNAベクターの境界の間に別々に導入する。従来の方法を使用して、T-DNAベクターを、ヘルパーTiプラスミドを含むAgrobacterium株に導入する。本質的にはDeBlocketalPlantPhysiol91694に記載されているように、Brassicanapusの胚軸外植片を入手し、培養し、トランスフォーメーションして、キメラ遺伝子をBrassicanapus植物に移動させる。トランスジェニックBrassicanapus植物を同定し、葉及び種子におけるグルコシノレート含量に関して分析する。従って、本発明は、以下の段落に記載される実施態様を含む。段落1.Brassicales植物又はその部分におけるグルコシノレートGSL含量を改変するための方法であって、前記植物若しくは前記植物部分の細胞における配列番号2又は配列番号142と少なくとも33の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのグルコシノレート輸送GTRタンパク質の機能活性を改変することを含む、方法。段落2.GTRタンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12又は142と少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落1記載の方法。段落3.GTRタンパク質が、配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130、144、146、148又は150のいずれか1つと少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落1又は2記載の方法。段落4.GTRタンパク質が、配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130、144、146、148又は150から選択されるアミノ酸を含む、段落1又は2記載の方法。段落5.GTRタンパク質が、配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136、137、143、145、147又は149のいずれかと少なくとも80の配列同一性を有する核酸によってコードされる、段落1~4のいずれか1つに記載の方法。段落6.GTRタンパク質が、配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136、137、143、145、147又は149から選択される核酸によってコードされる、段落1~5のいずれか1つに記載の方法。段落7.少なくとも2つのGTRタンパク質の機能活性を改変することを含む、段落1~6のいずれか1つに記載の方法。段落8.第1のGTRタンパク質が、配列番号2又は配列番号142と少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第2のGTRタンパク質が、配列番号4と少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落7記載の方法。段落9.前記第1のGTRタンパク質が、配列番号14、16、18、20、22、24、38、40、42、50、52、54又は144、146、148又は150のいずれか1つと少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のGTRタンパク質が、配列番号26、28、30、32、34、36、44、46、48、56、58、60、120、122、124、126、128又は130のいずれか1つと少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落7記載の方法。段落10.前記第1のGTRタンパク質が、配列番号14、16、18、20、22、24、38、40、42、50、52又は54又は144、146、148、150から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第2のGTRタンパク質が、配列番号26、28、30、32、34、36、44、46、48、56、58、60、120、122、124、126、128又は130から選択されるアミノ酸配列を含む、段落7記載の方法。段落11.前記第1のGTRタンパク質が、配列番号13、15、17、19、21、23、37、39、41、49、51、53又は137又は143、145、147、149のいずれか1つと少なくとも80の配列同一性を有する核酸によってコードされ、前記第2のGTRタンパク質が、配列番号25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136のいずれか1つと少なくとも80の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、段落7記載の方法。段落12.前記第1のGTRタンパク質が、配列番号13、15、17、19、21、23、37、39、41、49、51、53又は137又は143、145、147、149から選択される核酸によってコードされ、前記第2のGTRタンパク質が、配列番号25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、段落7記載の方法。段落13.前記植物又は植物部分の細胞における機能性GTR活性を減少させることを含む、段落1~12のいずれか1つに記載の方法。段落14.GSL含量が、植物種子において減少される、段落13記載の方法。段落15.GSL含量が、緑色植物組織において増加される、段落13記載の方法。段落16.機能性GTR活性の前記減少が、GTR遺伝子発現のダウンレギュレーションを含む、段落9~12のいずれか1つに記載の方法。段落17.機能性GTR活性の前記減少が、GTRタンパク質活性のダウンレギュレーションを含む、段落1~16のいずれか1つに記載の方法。段落18.RNA分子を前記植物又は植物部分に導入することを含み、前記RNA分子は、前記GTR遺伝子の発現をダウンレギュレーションできるGTR阻害RNA分子を含む、段落17記載の方法。段落19.キメラDNA構築物を前記植物又は植物部分に導入することを含み、前記キメラDNA構築物は、以下の機能的に連結されたDNA領域:a前記植物又は植物部分で作動するプロモーター;b転写されると、前記GTR遺伝子の発現をダウンレギュレーションできるGTR阻害RNA分子を生じる転写DNA領域;c転写終結及びポリアデニル化に関与するDNA領域を含む、段落18記載の方法。段落20.前記転写DNA領域が、センスRNA分子をコードし、前記DNA領域が、前記GTR遺伝子のDNA鎖と少なくとも95の同一性を有する少なくとも20個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、段落19記載の方法。段落21.前記転写DNA領域が、アンチセンスRNA分子をコードし、前記DNA領域が、前記GTR遺伝子のDNA鎖の相補体と少なくとも95の同一性を有する少なくとも20個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、段落19記載の方法。段落22.前記転写DNA領域が、a前記GTR遺伝子と少なくとも95の同一性を有する少なくとも20の連続ヌクレオチドを含むセンスRNA領域;b前記センスRNA領域と相補的な少なくとも20個のヌクレオチドを含むアンチセンスRNA領域;を含む二本鎖RNA分子をコードし、前記センス及びアンチセンスRNA領域が、二本鎖RNA領域を形成でき、前記二本鎖RNA分子が、前記GTR遺伝子の発現をダウンレギュレーションできる、段落19記載の方法。段落23.前記転写DNA領域が、配列番号138、139又は140のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、段落22記載の方法。段落24.前記転写DNA領域が、前記GTR遺伝子から転写されるmRNAの切断を誘導できるmiRNAにプロセシングされるmiRNA前駆体分子をコードする、段落19記載の方法。段落25.前記プロモーターが、組織特異的又は誘導性プロモーターである、段落19~24のいずれか1つに記載の方法。段落26.前記プロモーターが、種子特異的プロモーターである、段落25記載の方法。段落27.内因性GTR遺伝子のヌクレオチド配列を変化させることを含む、段落16又は17記載の方法。段落28.GTRタンパク質が、以下:a22位のSのAへの置換b22位のSのDへの置換c105位のTのAへの置換d105位のTのDへの置換e605位のSのAへの置換f605位のSのDへの置換のいずれかを有する配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質であるか、又は、GTRタンパク質が、以下:g52位のSのAへの置換h52位のSのDへの置換i135位のTのAへの置換j135位のTのDへの置換k635位のSのAへの置換l635位のSのDへの置換のいずれかを有する配列番号142のアミノ酸配列を含むタンパク質である、段落27記載の方法。段落29.GTRタンパク質が、以下:a58位のTのAへの置換b58位のTのDへの置換c117位のTのAへの置換d117位のTのDへの置換e323位のTのAへの置換f323位のTのDへの置換を有する配列番号4のアミノ酸配列を有するタンパク質である、段落27記載の方法。段落30.GTRタンパク質が、a1241~1243位に終止コドンを含む配列番号25の核酸によってコードされる、段落27記載の方法。段落31.GTRタンパク質が、a929~931位に終止コドンを含むb1145~1147位に終止コドンを含む配列番号31の核酸によってコードされる、段落27記載の方法。段落32.GTRタンパク質が、a870~872位に終止コドンを含むb1380~1382位に終止コドンを含む配列番号27の核酸によってコードされる、段落27記載の方法。段落33.GTRタンパク質が、a780~782位に終止コドンを含む配列番号33の核酸によってコードされる、段落27記載の方法。段落34.GTRタンパク質が、以下の位置:aGly126bGly145cGlu192dTrp229eSer359のいずれかに突然変異を含む配列番号66のアミノ酸配列を有するタンパク質である、段落27記載の方法。段落35.前記植物が、Brassica植物である、段落1~34のいずれか1つに記載の方法。段落36.段落1~34のいずれか1つに記載の方法によって得られる、植物又は植物部分。段落37.段落36記載の植物に由来する、種子。段落38.段落37記載の種子に由来する、種子ミール。段落39.段落36記載の植物に由来する、緑色植物組織。段落40.段落35記載の植物又は段落37記載の種子に由来する、油。段落41.動物飼料における、段落36記載の植物又は植物部分の使用。段落42.害虫管理、特に生物燻蒸における、段落36記載の植物又は植物部分の使用。段落43.ガン予防における、段落36記載の植物又は植物部分の使用。段落44.植物又は植物部分において改変されたGSL含量を得るための、GTRをコードする核酸配列の使用。段落45.種子又は種子ミールを製造するための方法であって、減少された機能性GTR活性を有する植物を生育すること、及び、前記植物から種子を回収することを含む、方法。段落46.段落19~32のいずれか1つに記載される、キメラDNA構築物。段落47.突然変異GTRタンパク質をコードする核酸であって、対応する野生型GTRタンパク質が、配列番号2又は配列番号142と少なくとも33の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸。段落48.野生型GTRタンパク質が、配列番号2、4、6、8、10又は12又は配列番号142と少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落33記載の核酸。段落49.段落47又は48記載の核酸によってコードされる、突然変異GTRタンパク質。段落50.生物学的サンプルにおける段落47又は48記載の核酸を同定するための方法であって、サンプルの核酸における突然変異DNA領域の存在を決定することを含み、前記突然変異DNA領域が、対応する野生型GTRタンパク質をコードする核酸と比較して、突然変異GTR核酸における少なくとも1つの欠失、挿入又は置換されたヌクレオチドを含む、方法。段落51.生物学的サンプルにおける段落45又は46記載の核酸を同定するためのキットであって、プライマー又はプローブのセットを含み、前記セットが、-プライマー又はプローブの一方が、突然変異DNA領域の5’側に隣接するDNA領域を特異的に認識し、プライマー又はプローブの他方が、突然変異DNA領域の3’側に隣接するDNA領域を特異的に認識する、プライマー又はプローブのセット、-プライマー又はプローブの一方が、突然変異DNA領域の5’又は3’側に隣接するDNA領域を特異的に認識し、プライマー又はプローブの他方が、突然変異DNA領域を特異的に認識する、プライマー又はプローブのセット、-それぞれ、プライマー又はプローブの一方が、突然変異DNA領域の5’又は3’側に隣接するDNA領域を特異的に認識し、プライマー又はプローブの他方が、3’又は5’隣接領域と突然変異DNA領域の間の連結領域を特異的に認識する、プライマー又はプローブのセット、-突然変異DNA領域の5’又は3’側に隣接するDNA領域と、突然変異DNA領域の間の連結領域を特異的に認識する、プローブからなる群より選択される、キット。段落52.配列番号2、4、6、8、10又は12又は142のアミノ酸配列をコードする、単離されたDNA配列。段落53.配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130又は144、146、148又は150のアミノ酸配列をコードする、単離されたDNA配列。段落54.配列番号25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136又は143、145、147又は149のヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA配列。段落55.以下の機能的に連結されたDNAフラグメントa異種植物発現プロモーターb配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130又は142又は144、146、148又は150のアミノ酸配列をコードするDNA領域c植物細胞で機能的な転写終結及びポリアデニル化シグナルを含む、キメラ遺伝子。段落56.段落55記載のキメラ遺伝子を含む、植物。段落57.配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130又は142又は144、146、148又は150のアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質。段落58.以下:a22位のSのAへの置換b22位のSのDへの置換c105位のTのAへの置換d105位のTのDへの置換e605位のSのAへの置換f605位のSのDへの置換のいずれかを有する配列番号2と少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するGTRタンパク質をコードするか、又は、以下:g52位のSのAへの置換h52位のSのDへの置換i135位のTのAへの置換j135位のTのDへの置換k635位のSのAへの置換l635位のSのDへの置換のいずれかを有する配列番号142と少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するGTRタンパク質をコードする、突然変異GTRアレル。段落59.以下:a58位のTのAへの置換b58位のTのDへの置換c117位のTのAへの置換d117位のTのDへの置換e323位のTのAへの置換f323位のTのDへの置換を有する配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも80の配列同一性を有するGTRタンパク質をコードする、突然変異GTRアレル。段落60.a1241~1243位に終止コドンを含む配列番号25の核酸と少なくとも80の配列同一性を有する突然変異GTRアレル。段落61.a929~931位に終止コドンを含むb1145~1147位に終止コドンを含む配列番号31の核酸と少なくとも80の配列同一性を有する突然変異GTRアレル。段落62.a870~872位に終止コドンを含むb1380~1382位に終止コドンを含む配列番号27の核酸と少なくとも80の配列同一性を有する突然変異GTRアレル。段落63.a780~782位に終止コドンを含む配列番号33の核酸と少なくとも80の配列同一性を有する突然変異GTRアレル。段落64.以下の位置:aGly126bGly145cGlu192dTrp229eSer359のいずれかに突然変異を含む配列番号66のアミノ酸配列と少なくとも80の配列同一性を有するGTRタンパク質をコードする、突然変異GTRアレル。"