"HER2に対する結合親和性を有し、かつブドウ球菌のプロテインASPAのドメインに関連するポリペプチドであって、該ポリペプチドの配列は1~約20の置換変異を有する前記SPAドメインの配列に相当する、ポリペプチド。HER2に対する結合親和性を有し、相互作用のKD値が最大で1×106Mであることを特徴とする、請求項1記載のポリペプチド。HER2に対する結合親和性を有し、相互作用のKD値が最大で1×107Mであることを特徴とする、請求項2記載のポリペプチド。配列番号1に示されるSPAプロテインZの配列において1~約20の置換変異を含む配列に相当する配列であることを特徴とする、請求項1~3いずれか一項記載のポリペプチド。4~約20の置換変異を含む、請求項4記載のポリペプチド。第13位、第14位、第28位、第32位および第35位のうちの1以上の位置における置換変異を含む、請求項4又は5記載のポリペプチド。第9位、第10位、第11位、第17位、第18位、第24位、第25位および第27位のうちの1以上の位置における置換変異をさらに含む、請求項6記載のポリペプチド。第13位におけるフェニルアラニンからチロシンへの置換変異を含む、請求項4~7いずれか一項記載のポリペプチド。第14位におけるチロシンからトリプトファンへの置換変異を含む、請求項4~8いずれか一項記載のポリペプチド。第28位における、アスパラギンから、アルギニンおよびヒスチジンから選択されるアミノ酸残基への置換変異を含む、請求項4~9いずれか一項記載のポリペプチド。第28位におけるアスパラギンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項4~10いずれか一項記載のポリペプチド。第32位におけるグルタミンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項4~11いずれか一項記載のポリペプチド。第35位におけるリジンからチロシンへの置換変異を含む、請求項4~12いずれか一項記載のポリペプチド。第10位におけるグルタミンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項4~13いずれか一項記載のポリペプチド。第11位におけるアスパラギンからスレオニンへの置換変異を含む、請求項4~14いずれか一項記載のポリペプチド。第17位におけるロイシンからバリンへの置換変異を含む、請求項4~15いずれか一項記載のポリペプチド。第27位における、アルギニンから、リジンおよびセリンから選択されるアミノ酸残基への置換変異を含む、請求項4~12いずれか一項記載のポリペプチド。配列番号1の配列において突然変異F13Y、Y14W、N28R、Q32RおよびK35Yを少なくとも含む配列に相当するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項4~17いずれか一項記載のポリペプチド。アミノ酸配列が、配列番号2~79のいずれか1つに示される、請求項4~18いずれか一項記載のポリペプチド。アミノ酸配列が、配列番号2又は3に示される、請求項19記載のポリペプチド。関連するブドウ球菌プロテインASPAのドメイン中に存在するアスパラギン残基のうちの少なくとも1つが、別のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。前記ブドウ球菌プロテインASPAのドメインの配列が配列番号1に示されるSPAプロテインZの配列に相当し、かつ該ポリペプチドはN3、N6、N11、N21、N23、N28、N43およびN52から選択される少なくとも1つの位置での置換変異を含む、請求項21記載のポリペプチド。N3A、N6A、N6D、N11S、N23T、N28AおよびN43E、の突然変異のうち少なくとも1つを含む、請求項22記載のポリペプチド。前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドの断片を構成し、該断片はHER2に対する結合親和性を保持していることを特徴とする、ポリペプチド。いずれかの末端に付加的なアミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。前記付加的なアミノ酸残基は、N-またはC末端におけるシステイン残基を含む、請求項25記載のポリペプチド。前記付加的なアミノ酸残基は、好ましくはヘキサヒスチジニルタグ、mycタグおよびFlagタグから選択される、タグを含む、請求項25又は26記載のポリペプチド。前記付加的なアミノ酸残基が少なくとも1つの機能的なポリペプチドドメインを含み、請求項1~24のいずれか一項記載のポリペプチドから成る第一の部分と、少なくとも1つの第二の部分及び任意のさらなる単一又は複数の部分との融合ポリペプチドである、請求項25又は26記載のポリペプチド。前記第二の部分が請求項1~24いずれか一項記載の1又は複数のポリペプチドから構成され、請求項1~24いずれか一項記載の配列が同一でも異なっていてもよい、HER2結合ポリペプチドの多量体である、請求項28記載のポリペプチド。前記第二の部分はHER2以外の標的分子と結合し得る少なくとも1つのポリペプチドドメインを含む、請求項28記載のポリペプチド。前記第二の部分はヒト血清アルブミンと結合し得る少なくとも1つのポリペプチドドメインを含む、請求項30記載のポリペプチド。前記ヒト血清アルブミンと結合し得る少なくとも1つのポリペプチドドメインは連鎖球菌のプロテインGのアルブミン結合ドメインである、請求項31記載のポリペプチド。前記第二の部分がブドウ球菌のプロテインASPAのドメインに関連するポリペプチドを含み、該ポリペプチドの配列は1~約20の置換変異を有する前記SPAドメインの配列に相当する、請求項30記載のポリペプチド。前記第二の部分のポリペプチドの配列が、配列番号1に示されるSPAプロテインZの配列において1~約20の置換変異を有する配列に相当する、請求項33記載のポリペプチド。前記第二の部分が酵素作用を有する、請求項28記載のポリペプチド。前記第二の部分が蛍光作用を有する、請求項28記載のポリペプチド。前記第二の部分が、ファージのコートタンパク質またはその断片である、請求項28記載のポリペプチド。標識基を含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。前記標識基が蛍光標識、ビオチンおよび放射性標識から選択される、請求項38記載のポリペプチド。HER2を過剰発現する細胞に対して活性を有する物質と結合された、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。HER2を過剰発現する細胞に対する活性を有する前記物質が、細胞傷害性物質、放射性物質、ADEPT法に使用される酵素、サイトカインおよび凝血原因子から選択される、請求項40記載のポリペプチド。請求項1~37いずれか一項記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子。請求項42記載の核酸分子を含む発現ベクター。請求項43記載の発現ベクターを含む宿主細胞。請求項1~41いずれか一項記載のポリペプチドの薬剤としての使用。HER2の過剰発現を特徴とする少なくとも一形態の癌の治療のための薬剤の調製における、請求項1~41のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。HER2の過剰発現を特徴とする少なくとも一形態の癌の治療方法であって、請求項1~41いずれか一項記載のポリペプチドを活性物質として含む治療的有効量の組成物を、そのような治療を必要とする患者に投与することを包含する方法。抗癌活性を有する物質と結合された請求項1~41いずれか一項記載のポリペプチドの、HER2を過剰発現する細胞に前記物質を送達するための使用。invivoで、HER2を過剰発現する細胞へ抗癌活性を有する物質を送達する方法であって、前記物質と請求項1~41いずれか一項記載のポリペプチドとの複合体を患者に投与することを包含する方法。試料中のHER2の検出のための請求項1~41いずれか一項記載のポリペプチドの使用。請求項1~41いずれか一項記載のポリペプチドを用いることを特徴とする、試料中のHER2の検出方法。i試験される試料を準備する工程、ii前記試料に対して請求項1~41いずれか一項記載のポリペプチドを、該試料中に存在する任意のHER2との結合が可能な条件下で添加する工程、iii結合していないポリペプチドを除去する工程、およびiv結合したポリペプチドを検出する工程を包含する、請求項51記載の方法。前記試料は生体液試料、好ましくはヒト血漿試料である、請求項52記載の方法。前記試料は組織試料、好ましくはヒト組織試料、さらに好ましくは癌に罹患しているヒトからの生検試料である、請求項52記載の方法。レポーター酵素を融合した請求項1~41いずれか一項記載のポリペプチド、前記レポーター酵素の活性の検出のための試薬、ならびに陽性および陰性対照組織スライドを包含する、組織試料におけるHER2過剰発現の診断のためのキット。キレート剤で標識された請求項1~41いずれか一項記載のポリペプチド、診断用放射性同位体、ならびに取り込み効率の分析のための試薬を包含する、HER2過剰発現をinvivoで診断するためのキット。キレート剤で標識された請求項1~41いずれか一項記載のポリペプチド、治療用放射性同位体、ならびに取り込み効率の分析のための試薬を包含する、請求項49記載の方法を実施するためのキット。HER2との特異的な結合を特徴とするポリペプチドの提供によってこの関心を満足させることが、本発明の一目的である。本発明に関連する目的物は、非特異的結合をほとんどまたは全く示さないHER2結合ポリペプチドである。本発明の別の目的は、融合ポリペプチド中の一部として容易に用いられ得るHER2結合ポリペプチドを提供することである。別の目的は、既存の抗体試薬に関連して経験される既知の問題のうちの1または複数を解決する、HER2結合ポリペプチドの提供である。本発明のさらなる目的は、治療的用途に用い易いHER2結合ポリペプチドを提供することである。関連する目的は、HER2タンパク質の過剰発現により特徴付けられる癌疾患の臨床設定における、治療、抑制および/またはターゲッティングのための新規の方法を見出すことである。低濃度でHER2の検出用試薬として用いることができる分子を提供することも一目的である。これらのおよびその他の目的は、添付の特許請求の範囲で主張されているような本発明の様々な態様により達成される。したがって第一の態様において、本発明は、HER2に対する結合親和性を有し、かつブドウ球菌のプロテインASPAのドメインに関連したポリペプチドであって、該ポリペプチドの配列は1~約20の置換変異を有するSPAドメインの配列に相当する、ポリペプチドを提供する。本発明のこの態様によるポリペプチドの実施の一形態では、HER2に対するその親和性は、相互作用のKD値が最大でも1×106Mであるようなものである。別の実施形態では、HER2に対するポリペプチドの親和性は、相互作用のKD値が最大でも1×107Mであるようなものである。別の実施の形態では、本発明のポリペプチドは、HER2タンパク質の細胞外ドメインであるECDと特異的に結合する。本明細書に記すように、本発明者らは、SPAからのドメインの置換変異によって高親和性HER2結合ポリペプチドが得られるということ、そしてそのようなポリペプチドがHER2と相互作用し得るということを見出した。本発明のポリペプチドは、多様な用途においてHER2に対する抗体の代替物として利用できる。限定的でない例として、該ポリペプチドは、HER2の過剰発現により特徴付けられる癌の治療に、細胞表面上のHER2との結合による細胞シグナル伝達の抑制に、invivoおよびinvitroの両方における癌の診断に、HER2を過剰発現する細胞に対する薬剤のターゲッティングに、HER2を検出するための組織化学的方法に、分離の方法およびその他の用途に有用である。本発明のポリペプチドは、HER2に対する試薬の親和性を利用するあらゆる方法に有用であることが判明するかもしれない。したがって該ポリペプチドは、そのような方法における検出試薬、捕捉試薬または分離試薬としてだけではなく、それ自体で治療薬として、またはHER2タンパク質に対して他の治療薬をターゲッティングするための一手段として用いられ得る。invitroで本発明のポリペプチドを用いる方法は、種々の形式で、例えば微量滴定プレート中で、タンパク質アレイで、バイオセンサー表面上で、組織切片上等において実施され得る。本発明のポリペプチドの種々の修飾および/または該ポリペプチドへの付加は、本発明の範囲を逸脱しない限り、特定の所望の用途に該ポリペプチドを適合させるために実施してもよい。そのような修飾および付加は以下でさらに詳細に記載され、そして同一ポリペプチド鎖中に含まれる付加的アミノ酸、あるいは標識および/または化学的にあるいは別の方法により本発明のポリペプチドに結合される治療薬を包含し得る。さらに本発明は、HER2に結合する能力を有するポリペプチドの断片も包含する。HER2に対する結合親和性とは、例えば表面プラズモン共鳴技法の使用により、例えばビアコア登録商標機器で試験され得るポリペプチドの特性を指す。HER2結合親和性は、HER2を計器のセンサーチップ上に固定し、試験されるポリペプチドを含有する試料を該チップ上に流す実験によって試験することができる。あるいは、試験されるポリペプチドは計器のセンサーチップ上に固定され、HER2を含有する試料は該チップ上を通過させられる。次いで、当業者であれば、得られたセンサグラムを読み取って、HER2に対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的な測定を確立することができる。例えば相互作用に関する信頼できるKD値を確証するための目的で、定量的測定が求められる場合、表面プラズモン共鳴法もまた用いることができる。結合値は、例えばビアコア登録商標2000機器BiacoreABによって決定できる。HER2は計器のセンサーチップ上に固定され、そして親和性が決定されるポリペプチドの試料が連続希釈により調製され、順不同で注入される。次に、その結果から、KD値が、例えば計器メーカーにより提供されるBIAevaluation3.2ソフトウエアの1:1ラングミュア結合モデルを用いて算定され得る。上記のように、本発明のポリペプチドの配列は、上記SPAドメインの1~約20のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたSPAドメイン配列に関連する。しかしながら、導入される置換変異は、ポリペプチドの基本構造に影響を及ぼすべきではない。即ち、本発明のポリペプチドのCα主鎖の全体的な折り畳みは、関連するSPAドメインのものと本質的に同一であり、例えば、二次構造の同一要素を同一順序で有するなどである。したがって、ポリペプチドは、基本的な構造特性、例えば類似のCDスペクトルを生じる特性が共有される場合、SPAと同一の折り畳みを有するという定義に分類されることになる。関係のある他のパラメーターを、当業者は承知している。SPAドメインの基本構造を本質的に保存するというこの要件により、その突然変異時に置換を受け得るドメインの位置は制限される。例えばZタンパク質の既知の構造から出発する場合、Zタンパク質の表面上に位置するアミノ酸残基が置換される一方、Zタンパク質のコア内に埋め込まれたアミノ酸残基3ヘリックス束は分子の構造特性を保存するために不変のまま維持されるべきである、というのが好ましい。同一の推論が、他のSPAドメインおよびその断片に当てはまる。本発明は、上記のHER2結合ポリペプチドが、いずれかの末端に付加的なアミノ酸残基が付加されたHER2結合ドメインとして存在するポリペプチドも包含する。これらの付加的なアミノ酸残基は、該ポリペプチドによるHER2の結合に一役を演じ得るが、しかし、例えばポリペプチドの生産、精製、安定化、カップリングまたは検出のうちの1又は複数に関連したその他の目的にも同様に十分に役立ち得る。このような付加的なアミノ酸残基は、化学的カップリングの目的のために付加された1又は複数のアミノ酸残基を含んでも良い。この一例は、ポリペプチド鎖中の一番初めのまたは後ろの位置での、即ちNまたはC末端でのシステイン残基の付加である。このような付加的なアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のためのタグ、例えばヘキサヒスチジルHis6タグ、あるいはタグに特異的な抗体との相互作用のためのmycタグまたはFlagタグも含み得る。その他の選択肢についても、当業者は承知している。上述の付加的なアミノ酸残基は、任意の所望の機能、例えば最初のHER2結合ドメインと同一の結合機能、または別の結合機能、あるいは酵素的機能、または蛍光的機能、あるいはそれらを複合した機能、を有する1又は複数のポリペプチドドメイン単数または複数を構成してもよい。したがって本発明は、HER2に対する親和性を有するポリペプチドの多量体を包含する。例えば癌の治療のために又はHER2の精製方法において本発明のポリペプチドを用いる場合には、本発明のポリペプチドを1つ用いて可能であるよりもさらに強力なHER2の結合を獲得することは興味深い。この場合、ポリペプチドの多量体、例えば二量体、三量体または四量体の提供は、必要とする親和性作用を提供し得る。多量体は、適切な数の本発明のポリペプチドで構成できる。これらの本発明のポリペプチドドメインは、単量体によりそのような多量体が形成されており、それらの全てが同一のアミノ酸配列を有していてもよいが、しかし、それらが異なるアミノ酸配列を有することも同様に可能である。本発明の多量体中の連結されたポリペプチド単位は、既知の有機化学的方法を用いて共有結合により結合され得るし、あるいはポリペプチドの組換え発現のための系において1又は複数の融合ポリペプチドとして発現され、あるいは任意のその他の方式で、直接的に又はリンカー例えばアミノ酸リンカーを介して、連結され得る。さらに、HER2結合ポリペプチドが第一のドメインまたは第一の部分、ならびにHER2を結合する以外の他の機能を有する第二のおよびさらなる部分を構成する異質性のheterogenic融合ポリペプチドも意図され、それは本発明の範囲内である。融合ポリペプチドの第二のおよびさらなる部分単数または複数は、HER2以外の別の標的分子に対する親和性を有する結合ドメインを含んでも良い。そのような結合ドメインも、SPAドメインの1~約20個の位置における置換変異を通じてSPAドメインに良好に関連し得る。結果的には、少なくとも1つのHER2結合ドメイン、及び上記のその他の標的分子に対する親和性を有する少なくとも1つのドメインを有する融合ポリペプチドであって、両ドメインがSPAドメインに関連する、融合ポリペプチドが得られる。これは、治療薬として、あるいは捕捉、検出または分離試薬として用いられるようないくつかのバイオテクノロジー用途に用いられ得る多特異的な試薬の作製を可能にする。少なくとも1つのポリペプチドドメインがHER2に対する親和性を有する、このようなSPAドメイン関連ポリペプチドの多特異的多量体の調製は、複数のHER2結合単位unitからなる多量体に対しても、上述のように適用し得る。その他の選択肢では、第二の又はさらなる部分単数または複数は、ある標的に対する結合親和性を有する、関連性のない天然または組換えタンパク質あるいは天然または組換えタンパク質の結合能力を維持するその断片を含み得る。ヒト血清アルブミンに対する親和性を有し、かつ本発明のHER2結合SPAドメイン誘導体の融合相手として用いられ得るこのような結合タンパク質の一例は、連鎖球菌のプロテインGSPGのアルブミン結合ドメインであるNygrenPAetalMolRecogn16974。HER2結合SPAドメイン関連ポリペプチドとSPGのアルブミン結合ドメインとの融合ポリペプチドは、したがって、本発明の範囲内に入る。本発明のポリペプチドを、治療薬として、またはターゲッティング剤としてヒト被験体に投与する場合に、該ペプチドを、血清アルブミンを結合する部分と融合させることが有益かもしれないが、それは、このような融合タンパク質のinvivoでの半減期が、単離型のSPAドメイン関連HER2結合部分の半減期と比較した場合、おそらく延長されるだろうと考えられるためであるこの原理は、例えばWO91/01743に記載されている。融合ポリペプチドの作製のためのその他の可能性も意図される。したがって本発明の第一の態様によるHER2結合SPAドメイン関連ポリペプチドは、目的物との結合に加えて、あるいはその代わりに、他の機能を示す第二の又はさらなる単数または複数の部分と共有結合され得る。一例は、1又は複数のHER2結合ポリペプチドと、レポーターまたはエフェクター部分として働く酵素活性を有するポリペプチドとの間の融合である。HER2結合ポリペプチドと結合して融合タンパク質を生成し得るレポーター酵素の例は当業者に既知であり、例としては、β-ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼのような酵素が挙げられる。本発明の融合ポリペプチドの第二の及びさらなる単数または複数の部分に関するその他の選択肢としては、蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよびそれらの変異体が挙げられる。本発明の融合ポリペプチドの第二の及びさらなる単数または複数の部分に関するその他の選択肢としては、治療的用途のための単数または複数の部分が挙げられる。治療的用途では、その他の分子もまた、その他の手段により、本発明のポリペプチドと共有的にまたは非共有的に結合され得る。非限定的な例としては、エフェクター酵素例えばカルボキシペプチダーゼを送達するために本願のポリペプチドを利用する、ADEPT抗体酵素プロドラッグ療法antibodydirectedenzymeprodrugtherapy用途のための酵素、エフェクター細胞および免疫系のその他の構成成分を動員するためのタンパク質、サイトカイン例えばIL-2、IL-12、TNFα、IP-10、凝血原因子例えば組織因子、フォンウィルブラント因子、毒素例えばリシンA、シュードモナス外毒素、カルケアマイシンcalcheamicin、マイタンシノイドmaytansinoid、有毒な小分子例えばアウリスタチンauristatin類似体、ドキソルビシンが挙げられる。さらに、診断用例えば68Ga、76Br、111In、99Tc、124I、125Iまたは治療用例えば90Y、131I、211Atの放射性核種を容易に組入れるために、放射性同位体のためのキレート剤をポリペプチド配列にカップリングすることを目的として、上記で言及した付加的アミノ酸特にヘキサヒスチジンタグ、システインが意図される。本発明は、ポリペプチドであって、該ポリペプチド中で上記のHER2結合ポリペプチドが、例えば該ポリペプチドの検出を目的として標識基例えば少なくとも1つの蛍光体、ビオチンまたは放射性同位体を備えていることを特徴とするポリペプチドを包含する。本発明のHER2結合ポリペプチドを組入れた融合タンパク質についての上記の説明に関しては、第一、第二及びさらなる部分の呼称は、一方のHER2結合部分単数または複数と、他方の他の機能を示す部分とを明白に区別する目的でなされる、ということに留意すべきである。これらの呼称は、融合タンパク質のポリペプチド鎖中における異なるドメインの実際の順序を指すものではない。したがって例えば上記の第一の部分は、制限なしに、融合タンパク質のN末端、中間、またはC末端に出現し得る。本発明のポリペプチドを作製する出発点として用いるためのSPAドメインの一例は、ブドウ球菌のプロテインAのドメインBに由来するプロテインZである。背景技術の節で指摘したように、このタンパク質は、従来、種々の標的と結合し得るAffibody登録商標分子と命名された分子の作製のための足場構造として用いられてきた。非修飾プロテインZZwtと示すの58のアミノ酸配列は配列番号1で示され、図1に例示されている。本発明のポリペプチドの一実施形態では、ポリペプチドはSPAの一ドメインに関連するものであって、該ポリペプチドの配列は4~約20の置換変異を有するSPAドメインの配列に相当する。その他の実施形態は、1~約13の置換変異、あるいは4~約13の置換変異を有し得る。本発明のポリペプチドのさらに具体的な実施形態では、ポリペプチドの配列は、配列番号1に示される配列において1~約20の置換変異、例えば4~約20、1~約13または4~約13の置換変異を有する配列に相当する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、その配列が、配列番号1に示される配列において、第13位、第14位、第28位、第32位および第35位のうちの単数または複数の位置における置換変異を含む配列に相当し得る。さらに本発明のポリペプチドの配列は、第9位、第10位、第11位、第17位、第18位、第24位、第25位および第27位のうちの単数または複数の位置における置換変異を含み得る。本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号1の配列において、第13位でのフェニルアラニンからチロシンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号1の配列において、第14位でのチロシンからトリプトファンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号1の配列において、第28位での、アスパラギンから、アルギニン及びヒスチジンから選択されるアミノ酸残基への、より好ましくはアルギニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号1の配列において、第32位でのグルタミンからアルギニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号1の配列において、第35位でのリジンからチロシンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号1の配列において、第10位でのグルタミンからアルギニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号1の配列において、第11位でのアスパラギンからスレオニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号1の配列において、第17位でのロイシンからバリンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号1の配列において、第27位での、アルギニンから、リジンおよびセリンから選択されるアミノ酸残基への置換変異を少なくとも含む配列に相当する。本発明の好ましいポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、配列番号1の配列において少なくとも以下の突然変異、F13Y、Y14W、N28R、Q32RおよびK35Y、を含む配列に相当する。本発明のポリペプチドの種々の実施形態の具体的な配列の例各々が上記の1又は複数の特定の突然変異を含むは配列番号2~79に記載され、かつ図1に例示されている。これらのポリペプチドのHER2結合特性は、ここでの全般的な本発明の説明の後の実施例に開示される。非修飾SPAドメインの使用に代わるものとして、SPAドメインは、アルカリ性条件下での安定性を増大させるために、突然変異誘発も施され得る。このような安定化は、非修飾配列中に出現する任意のアスパラギン残基を、アルカリ条件に対してより感受性の低いアミノ酸残基に置換する、部位特異的置換を包含する。アフィニティークロマトグラフィーにおけるアフィニティーリガンドとして本発明のポリペプチドを用いる場合、このアルカリに対する低感受性という特性は、以下の利点をもたらす。アフィニティークロマトグラフィーカラムは分離操作の合間に定置洗浄CIPを目的とした厳しいアルカリ処理をしばしば施されるが、このような処理に耐える能力がアフィニティークロマトグラフィーマトリックスの耐用寿命を延長する。一例として、出発点としてプロテインZを使用する場合、本発明のポリペプチドは、HER2結合を付与する置換変異の他に、N3、N6、N11、N21、N23、N28、N43およびN52から選択される少なくとも1つのアスパラギン残基が、アルカリ処理に対して低感受性であるアミノ酸残基で置換されているという修飾を有し得る。このようなポリペプチドの非限定的な例は、以下の組の突然変異Zwtの配列に関してを有するものである。N3A。N6D。N3A、N6DおよびN23T。N3A、N6D、N23TかつN28A。N23T。N23TかつN43E。N28A。N6A。N11S。N11SかつN23T。N6AかつN23T。したがってこれらのSPAドメイン、ならびに安定性の理由のためにアスパラギン突然変異を施されたその他のSPAドメインは全て、本発明のHER2結合ポリペプチドを得るために、アミノ酸残基のさらなる置換変異に付すことができる。あるいは、アスパラギン残基を含む本発明のHER2結合ポリペプチドは、アスパラギン残基を置き換えるためにさらなる突然変異に付してもよい。この後者の選択肢は、そのような分子のHER2結合能力が維持される程度においてのみ可能であることは明らかである。本発明は、上記ポリペプチドの断片の生成を通じて任意の上記ポリペプチドから得られたポリペプチドも包含するが、ここで該ポリペプチド断片はHER2親和性を維持している。該ポリペプチド断片は、その安定性が維持され、かつHER2を結合する特異性を保持するものである。免疫グロブリンGに対する結合特異性を維持した野生型SPAドメインの断片を作製する可能性は、BraistedACandWellsJAetalinProcNatlAcadSciUSA9356885692により示されている。構造ベースの設計およびファージディスプレイ法を用いることにより、59残基からなる3ヘリックス束の結合ドメインは、結果的に33残基からなる2ヘリックス誘導体へと縮小された。これは、異なる領域からの無作為な突然変異の段階的な選択により達成され、それによって、安定性および結合親和性が繰り返し改善された。本発明の第一の態様によるポリペプチドに対すると同一の推論により、当業者は、親HER2ポリペプチドと同一の結合特性を有する最小化HER2結合ポリペプチドを得ることができよう。それゆえ、本発明の上記の態様によるポリペプチドの断片を構成するポリペプチドであって、該断片がHER2に対する結合親和性を保有するポリペプチドは、本発明のさらなる態様である。本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子に関する。本発明のさらなる態様は、前の態様の核酸分子、ならびに核酸分子の発現により本発明のポリペプチドの産生を可能にするその他の核酸要素を含む発現ベクターに関する。本発明のさらに別の態様は、前の態様の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。後半3つの本発明の態様は、本発明のポリペプチドの産生のための手段であり、発現されるべきポリペプチドに関する本明細書中の情報が与えられれば、そしてタンパク質の組換え発現についての当業者の一般的レベルを考えれば、過度の負担をかけることなく、当業者はそれらを生成し得るし、それらを実際に使用し得る。一例として、非修飾プロテインZの発現のためのプラスミド例えばNilssonBetal、上記参照が、出発物質として用いられ得る。所望の置換変異は、既知の技法を用いてこのプラスミド中に導入されて、本発明にのっとった発現ベクターを生成し得る。しかしながら、本発明のポリペプチドは、その他の既知の手段、例えば化学合成、あるいは種々の原核生物または真核生物宿主、例えば植物およびトランスジェニック動物中での発現によっても生成され得る。化学的なポリペプチドの合成を利用する場合、上記のようなポリペプチド中の天然アミノ酸残基のいずれかを、ポリペプチドのHER2結合能力が実質的に弱められることがない限り、任意の対応する非天然アミノ酸残基またはその誘導体によって置換しても良い。少なくとも結合能力は保持されるべきであるが、しかしながら、対応する非天然アミノ酸残基またはその誘導体による置換も、実際には、ポリペプチドのHER2結合能力を改善するのに役立つ可能性がある。さらに、非天然アミノ酸の組入れは、分子例えば標識、エフェクター、キレート剤等の、HER2結合ポリペプチドへの、既存のものに代わる結合部位を提供するために実施され得る。非古典的なアミノ酸または合成アミノ酸類似体としては、普通のアミノ酸のD-異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸designeraminoacids例えばβ-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体全般が挙げられるが、これらに限定されない。さらにアミノ酸残基は、DまたはL形態で存在し得る。本発明は、上記のHER2結合ポリペプチドの使用態様、ならびに該ポリペプチドがその結合特性によって有用なものになっている、治療、診断および検出のための種々の方法にも関する。これらの使用および方法に関する以下の説明においてHER2結合ポリペプチドに言及する場合、この用語はHER2結合ポリペプチドのみを包含することを意図するものではなく、例えばその断片を構成し、および/または融合タンパク質中の一部分としてHER2結合ポリペプチドを組入れるか、および/または標識または治療薬に結合されるか、および/またはタグとしてまたはその他の目的のために付加的アミノ酸残基を備える、このポリペプチドを基礎にした上述の分子もまた全て包含される。上記で説明したように、このような融合タンパク質、誘導体、断片等は、本発明の一部を形成する。したがってこのような一態様では、本発明は、本明細書中に記載されたような薬剤としてのHER2結合ポリペプチドの使用を提供する。さらなる態様において、本発明は、HER2の過剰発現により特徴付けられる癌の少なくとも一形態の治療を目的とした薬剤の調製における、本明細書中に記載されたようなHER2結合ポリペプチドの用途を提供する。HER2の過剰発現により特徴付けられる癌の特定の一形態は、乳癌である。背景技術の節に記載されたように、全ての乳癌患者の約25が、HER2の過剰発現を示すSlamonDJetal、上記を参照。この説に縛られることは望まないが、本明細書中に記載されたポリペプチドは、以下のメカニズムのうちの少なくとも1つを基礎にした治療薬として有用であると考えられる。i化学療法細胞傷害性の増強作用。ここで、ポリペプチドの投与は、現存の及び将来的な化学療法およびホルモン療法と相乗的に機能する。細胞表面のHER2タンパク質の遮断は、DNA傷害薬が作用した後のDNA修復を阻止することが示されているPietrasRJetalOncogene918291838。ii腫瘍細胞の増殖の抑制細胞分裂抑制。この論証は、分子抗体が細胞表面上のHER2タンパク質に結合するといくつかの受容体の細胞内取り込みが生じ、細胞がさらに増殖するためのシグナルを制限する、という観察に基づいているBaselgaJetalCancerRes5828252831SliwkowskiMXetal、上記を参照。本発明の関連態様は、HER2の過剰発現により特徴付けられる癌のうちの少なくとも1つの形態を治療するための方法であって、活性物質として本明細書中に上述されたようなHER2結合ポリペプチドを含む治療的に有効な量の組成物を、このような治療を必要とする被験体に投与することを包含する方法の提供である。本発明のポリペプチドのHER2結合特性は、融合タンパク質および/または標識結合分子の作製に対する該ポリペプチドの適性に加えて、HER2を過剰発現する細胞を含む腫瘍の部位に対して他の活性物質を標的化するためにも該ポリペプチドが有用であり得る、ということを意味する。したがって本発明の別の態様は、抗癌活性を有する物質と結合された本明細書中に記載されるHER2結合ポリペプチドの用途であって、HER2を過剰発現する細胞への上記物質の送達を目的とした用途を提供することである。結合される物質は、被験体の内因性免疫系の応答を引き出すよう機能するものであっても良い。ナチュラルキラーNK細胞または免疫系のその他のエフェクターは、そのようなエフェクターを動員する機能を担う融合部分の提示を通じて、細胞表面上のHER2とHER2結合ポリペプチドとの複合体に引き付けられ得る。細胞が異常であることを検出したNK細胞またはその他のエフェクターは、HER2結合融合タンパク質に結合する。その結果、癌細胞は、NK細胞により食べ尽くされるSliwkowskiMXetal、上記を参照;PegramMDetalProcAmAssocCancerRes38602Abstract4044。このような活性物質は、融合により、または化学的連結により、HER2結合ポリペプチドに結合されるタンパク質、例えばADEPT抗体酵素プロドラッグ療法用途のためにエフェクター酵素の中から選択されるタンパク質;免疫系のエフェクター細胞およびその他の構成成分の動員のためのタンパク質;サイトカイン、例えばIL-2、IL-12、TNFα、IP-10;凝血原因子procoagulantfactors、例えば組織因子、フォンウィルブラント因子;毒素、例えばリシンA、シュードモナス内毒素、カルケアマイシン、マイタンシノイドであり得る。あるいは、該活性物質は、細胞傷害剤、例えばアウリスタチン類似体またはドキソルビシン、あるいは放射性同位体例えば90Y、131I、211Atであり、この同位体は、HER2結合ポリペプチドと直接結合してもよく、あるいはキレート剤、例えば周知のキレート剤であるDOTAまたはDTPAを介して結合しても良い。関連する態様において、本発明は、抗癌活性を有する物質をinvivoでHER2を過剰発現する細胞に対して送達する方法であって、上記活性物質と本明細書中に記載されるHER2結合ポリペプチドとの結合体を患者に投与することを包含する方法も提供する。該結合体は、上記段落に記載されたように適切に調製される。本発明の別の態様は、試料中のHER2の検出を目的とした、本明細書中に記載されているようなHER2結合ポリペプチドの使用である。例えばこのような検出は、HER2の過剰発現により特徴付けられる疾患状態を診断するという目的で実施され得る。試料中のHER2の存在の検出は、invitroまたはinvivoで実施され得る。invivo診断のための好ましい選択肢は、陽電子放射断層撮影PETの使用である。当該試料は、例えば生体液試料または組織試料であり得る。本発明のHER2結合ポリペプチドに対して用いるに適した、HER2に対して作られた抗体に対して今日用いられている一般的な方法は、新鮮な、凍結された、またはホルマリン固定、パラフィン包埋された組織試料中のHER2タンパク質の過剰発現を検証するために用いられる、HER2の存在の組織化学的検出である。HER2検出のために、本発明のポリペプチドは融合タンパク質の一部としても用いられ得るが、ここで、他のドメインはレポーター酵素または蛍光酵素である。あるいは、ポリペプチドは、状況によってはキレート剤を介して、1又は複数の蛍光剤単数または複数および/または放射性同位体単数または複数で標識され得る。適切な放射性同位体としては、68Ga、76Br、111In、99Tc、124Iおよび125Iが挙げられる。本発明のさらに別の態様は、生体液試料中のHER2の検出方法における、本明細書中に記載されたようなHER2結合ポリペプチドの使用により構成される。この方法は、i試験されるべき患者からの生体液試料を準備する工程、ii本明細書中に記載されるようなHER2結合ポリペプチドを、該試料中に存在する任意のHER2と該ポリペプチドとの結合が可能になるような条件下で、該試料に添加する工程、iii結合していないポリペプチドを除去する工程、およびiv結合したポリペプチドを検出する工程、を包含する。検出される結合したポリペプチドの量は、試料中に存在するHER2の量と相関する。工程iiにおいて、試料へのHER2結合ポリペプチドの添加は、任意の適切な形式で実施され、例えば試料が接触する固体支持体上にHER2結合ポリペプチドが固定される状況、ならびにHER2結合ポリペプチドが溶液中に存在する設定を包含する。本発明の別の関連する態様は、試料中のHER2の検出方法であって、iHER2を含有する疑いのある組織試料、例えば組織のクリオスタット切片またはパラフィン包埋切片を準備する工程、ii試料中に存在する任意のHER2とのポリペプチドの結合を実行し得る条件下で、上記試料に本発明のHER2結合ポリペプチドを添加する工程、iii結合していないポリペプチドを除去する工程、およびiv結合したポリペプチドを検出する工程、を包含する方法である。検出される結合したポリペプチドの量は、試料中に存在するHER2の量と相関する。組織試料におけるHER2の過剰発現を診断するためのキットであって、レポーター酵素例えばアルカリ性ホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼと融合した本発明のHER2結合ポリペプチド、酵素活性の検出のための試薬、ならびに陽性および陰性対照組織スライドを包含するキットも、本発明により提供される。組織試料におけるHER2過剰発現の診断のためのキットであって、抗体による検出のためのタグ例えばFlagタグまたはmycタグと融合した本発明のHER2結合ポリペプチド、タグに特異的な一次抗体、一次抗体に特異的で、かつレポーター酵素を結合した二次抗体、酵素活性の検出のための試薬、ならびに陽性および陰性対照組織スライドを包含するキットも、本発明により提供される。診断用途における一領域は、癌細胞またはその集合体のinvivoでの検出である。本発明は、このような診断を実施するためのキットであって、キレート剤で標識された本発明のHER2結合ポリペプチド、診断用放射性同位体非限定的な例は、68Ga、76Br、111In、99Tc、124Iおよび125Iである、ならびに取り込み効率の分析のための試薬を包含するキットを提供する。上記のように、本発明は、HER2を過剰発現する細胞、例えばある種の癌細胞に活性物質をターゲッティングすることを目的とした、本発明のHER2結合ポリペプチドの使用を包含する。本発明は、この目的のためのキットであって、キレート剤で標識された本発明のHER2結合ポリペプチド、治療用放射性同位体非限定的な例は90Y、131I、211Atである、および取り込み効率の分析のための試薬を包含するキットも提供する。[実施例1]HER2結合ポリペプチドの選択および試験これらの実験では、多数の異なるSPAドメイン関連ポリペプチドのライブラリーから本発明のいくつかのHER2結合ポリペプチドを選択し、その後、特性を明らかにした。ライブラリーのパニング及びクローンの選択NordKetalに記載されたのと本質的に同様に、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを調製した。本試験に用いたこのライブラリーのプールは、第9位、10位、11位、13位、14位、17位、18位、24位、25位、27位、28位、32位および35位に無作為なアミノ酸残基を有するプロテインZAffibody登録商標分子の8.7×108の変異体を含む。標的としてビオチニル化ヒトHER2細胞外ドメインHER2-ECDを用いて、4回のパニングで、抗原結合Affibody登録商標分子を選択した組換えヒト細胞外ドメイン、アミノ酸238~2109、FoxChaseCancerCenterPhiladelphiaUSAにより提供。4回の選択サイクルの結果、91個のクローンをファージELISA用に選択し、それらのHER2結合活性の分析を実施した。HER2結合の分析用のファージELISA4回の選択後に得られたクローンからのファージを96ウエルプレート中で生成させ、HER2結合Affibody登録商標分子を発現するファージをスクリーニングするために、酵素結合免疫吸着検定法ELISAを用いた。シングルコロニーを、深穴96ウエルプレート中で2グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを補充した250μlのTSB培地30.0gのトリプシンダイズブロスMerck、水で最終容積を1lとする。オートクレーブ処理に接種し、37°Cで一晩、振盪器上で増殖させた。5μlの一晩培養物を、新プレート中で、0.1グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを補充した500μlのTSBYE培地30.0gのトリプシンダイズブロスMerck、5.0gの酵母抽出物、水で最終容積を1lとする。オートクレーブ処理に添加した。37°Cで3時間増殖後、0.5μlの5×1012pfu/ml2.5×109pfuのヘルパーファージM13K07NewEnglandBiolabsNO315Sおよび100μlのTSBYE培地を各ウエルに添加し、37°Cで30分間、振盪せずにプレートをインキュベートした。IPTG、カナマイシンおよびアンピシリンを補充した300μlのTSBYEを各ウエルに添加して、最終濃度を1mMのIPTG、25μg/mlのカナマイシンおよび100μg/mlのアンピシリンとして、プレートを30°Cで一晩、振盪器上でインキュベートした。2,500gで15分間の遠心分離により細胞をペレット化し、Affibody登録商標分子を発現するファージを含有する上清をELISAに用いた。PBS2.68mMのKCl、137mMのNaCl、1.47mMのKH2PO4、8.1mMのNa2HPO4、pH7.4中の4μg/mlのHER2の100μlを、微量滴定プレートNunc446612に添加し、4°Cで1ヶ月間インキュベートした。PBS中の2粉末スキムミルクブロッキング緩衝液で、室温で1時間、ウエルをブロッキング処理し、200μlのファージ含有上清および50μlの10ブロッキング緩衝液を添加した。プレートを、室温で2時間インキュベートした。ポリクローナル抗体ウサギ抗M13、Abcamab6188を2ブロッキング緩衝液中で1:1,000に希釈し、150μlを各ウエルに添加した。プレートを、室温で1時間インキュベートした。アルカリ性ホスファターゼと結合したヤギ抗ウサギIgG抗体SigmaA3687を2ブロッキング緩衝液中で1:10,000に希釈し、その後150μlを各ウエルに添加し、室温で1時間インキュベートした。1Mのジエタノールアミン、5mMのMgCl2pH9.8と水の1:1混合物中にSigma-104基質Sigma104105を溶解することにより1錠/5mlの1:1混合物、展開溶液を調製した。その後、180μlの展開溶液を各ウエルに添加した。ウエルをPBS-TPBS0.1Tween-20で2回、PBSで1回洗浄した後、各々の新試薬を添加した。基質を添加してから25分後、ELISA分光光度計BasicSunriseTecanを用い、A405で、プレートを読取った。ELISA値の閾値判定基準A405が0.5より高いを用いて、HER2結合物質をコードするファージを同定した。48のクローンがこの値より高いELISAシグナルを生じ、無作為で選択された、ELISA結果が利用可能でない5クローンとともに、DNA配列分析用に選択された。DNA配列分析上記の手法に従って単離されたクローンからのDNAのシーケンシングを、メーカーの推奨によりABIプリズム登録商標、ビッグダイ商標ターミネーターv2.0レディリアクションサイクルシーケンシングキットAppliedBiosystemsを用いて実施した。プラスミドを調製し、オリゴヌクレオチドRIT-275’-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3’およびビオチン化NOKA-25’-ビオチン-CGGAACCAGAGCCACCACCGG-3’を用いて、Affibody登録商標分子をコードするDNAをシーケンシングした。ABIプリズム登録商標3700遺伝子分析装置AppliedBiosystemsで、配列を分析した。予め選択された53のクローンから、いくつかのクローンが同一アミノ酸配列をコードすることが判明した。これらの縮重を考慮に入れて、ELISA結合検定で選択されたクローンにより発現されるAffibody登録商標分子の4つの配列を図1に示しZHER2AD、かつ配列番号2~5として配列表中で同定した。クローニングおよびタンパク質産生図2で概略的に示されている構築物をコードする発現ベクターを用いて、大腸菌細胞中でZHER2ポリペプチドを発現させた。これにより、該ポリペプチドは、N末端ヘキサヒスチジルタグとの融合体として産生された。融合ポリペプチドHis6-ZHER2AおよびHis6-ZHER2Bを固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMACカラムで精製し、SDS-PAGEで分析した。SDS-PAGE実験の結果を、図3に示す。融合ポリペプチドのバイオセンサー分析前節により産生されたHisタグ化ZHER2変異体とHER2との間の相互作用を、ビアコア登録商標2000システムBiacoreABUppsalaSwedenにより表面プラズモン共鳴を利用して分析した。ヒトHER2、HIV-1gp120ProteinSciencesCorporation、2003MNおよびBB連鎖球菌プロテインG由来のアルブミン結合タンパク質後者2つは対照として用いるを、メーカーの推奨に従って、CM-5チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、異なるフローセル中に固定した。ヒトHER2、HIV-1gp120およびBBの固定化は、それぞれ1900、6290および1000共鳴単位RUを生じた。第四フローセル表面を活性化し、注入を行う間のブランクとして用いるために非活性化した。His6-ZHER2AおよびHis6-ZHER2Bタンパク質をHBS5mMのHEPES、150mMのNaCl、3.4mMのEDTA、0.005界面活性剤P-20pH7.4で希釈して最終濃度を10μMとし、30μl/分の一定流量で、二つ組として、順不同に注入した。精製タンパク質His6-ZHER2A及びHis6-ZHER2BのHER2と相互作用する能力を、それぞれ図4および5のセンサグラムsensorgramに例示したように確認した。さらにHis6-ZHER2AおよびHis6-ZHER2Bに関して、動態試験を実施した。チップに固定された1900RUのヒトHER2を有するCM-5チップを用いた。His6-ZHER2AおよびHis6-ZHER2Bの各々に関して、一連の6つの異なる濃度1μM~40μMのHER2結合ポリペプチドをHBS中に調製し、30μl/分の流量で、二つ組として、順不同に注入した。総注入時間は50秒会合で、その後、6分間洗浄した解離。表面を、20mMのHClで10秒間再生した。参照細胞中で測定された応答活性化/非活性化表面を、固定化HER2を有する細胞中で測定された応答から差し引いた。BIAevaluation3.0.2ソフトウエアBiacoreABの1:1ラングミュア結合モデルを用いて、結合曲線センサグラムを分析した。図6His6-ZHER2Aおよび7His6-ZHER2Bに示された結合曲線から明らかなように、His6-ZHER2Aに関しては10~100nMの、His6-ZHER2Bに関しては200~400nMの表示されたKDを有する会合及び解離曲線により立証されるように、His6-ZHER2AおよびHis6-ZHER2Bはともに、HER2と明瞭に結合する。さらに、試験したHER2結合ポリペプチドのいずれもBB対照抗原およびgp120対照抗原とは結合しないことから図4および図5、該結合は選択的である。第二の動態実験では、His6-ZHER2AおよびHis6-ZHER2B変異体を再び、30μl/分の流量で、異なる濃度0~5μM、最小濃度:His6-ZHER2Aに関しては0.0098μM、His6-ZHER2Bに関しては0.0196μM;HBSで希釈でHER2表面上に注入した。動態分析前に、アミノ酸分析によりタンパク質濃度を確定した。BIAevaluation3.2ソフトウエアBiacoreを用いて、解離平衡定数KD、会合速度定数kaおよび解離速度定数kdを算定し、1対1結合であると推定した。最初の2つのビアコア登録商標分析に関しては、試料は、25°Cで、順不同に2度流し、各回の注入の後には、10mMのHClの注入によりフローセルを再生した。結合曲線図8A~8Bの評価時に、解離平衡定数KDを、His6-ZHER2Aに関しては約50nM、His6-ZHER2Bに関しては約140nMであると確定した。KDの違いの理由は、おそらく、図4のグラフAを図5のグラフAと比較することにより分かるように、解離速度の顕著な差のためである。His6-ZHER2Aに関しては、会合速度定数kaは、約1.8×105M1s1および解離速度定数kdは約9.9×103s1であると算定され、一方、His6-ZHER2Bに関しては、高速な会合および解離動態のため、kaおよびkdは見積もるのが難しかった。したがって、その標的とのより強力な結合を示すHis6-ZHER2AAffibody変異体を、さらなる特徴付けのために選択した。[実施例2]HER2を発現する細胞とのZHER2Aの結合細胞培養約2×106HER2分子/細胞を発現することが知られているヒト乳癌細胞株SKBR-3を、ATCCから購入したATCCHTB-30。10ウシ胎仔血清、2mMのL-グルタミンおよびPEST100IU/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンすべてBiochromKGBerlinGermanyからを補充したRPMI1640培地中で細胞を培養した。細胞を、37°Cで、5CO2を含有する湿潤空気中で培養し、実験の3日前に3cmペトリ皿中に植え付けた。放射性標識OrlovaetalinNuclMedBiol27827835に従って、標識前駆体N-スクシンイミジルp-トリメチル-スタンニルベンゾエートSPMBを調製し、5μgのSPMBを5酢酸溶液中の5MBqの125Iに添加した。反応を開始するために、水溶液中の40μgのクロラミン-TSigmaStLouisMOを添加した。反応混合物を5分間撹拌し、水溶液中の80μgのナトリウム-メタ-ビスルフェートAldrichSteinheimGermanyを添加して、反応を停止した。0.07Mのホウ酸緩衝液pH9.2中の40μgのHis6-ZHER2AまたはHis6-ZHER2Bに、該放射性標識前駆体を添加した。連続的に撹拌しながら、室温で45分間、カップリング反応を実施した。PBSで平衡化したNAP商標-5サイズ排除カラムAmershamBiosciencesを用いて、標識ZHER2変異体を低分子量生成物から分離した。次に放射性標識ZHER2変異体をビアコア登録商標技法を用いて分析して、標識処理がHER2-ECDに対する結合親和性に影響を及ぼさなかったことを確認した。両ZHER2変異体は親和性保持を示したデータは示されていない。細胞試験約100,000個のSKBR-3細胞を有する各培養皿に、14ngの標識His6-ZHER2AまたはHis6-ZHER2Bを含む1mlの培地を添加した。この量は、理論的なリガンド:受容体比である5:1に相当する。細胞に由来しない非特異的結合を測定するために、細胞を含有しない3つの培養皿を同一方法で処理した。この値を、全ての他の値から差し引いた。細胞結合の特異性を分析するために、3つの培養皿を、標識されたZHER2変異体だけでなく、500倍過剰量の標識されていないZHER2変異体でも処理した。37°Cで3時間のインキュベーション後、放射性培地を除去し、培養皿を氷冷無血清培地で3回、迅速に洗浄した。0.5mlのトリプシン/EDTA溶液PBS中0.25/0.02;BiochromKGBerlinGermanyを用いて、37°Cで15分間、細胞をトリプシン処理した。次に細胞を1mlの培地中に再懸濁し、0.5mlの細胞懸濁液を細胞計数のために用い、残り1mlを自動ガンマーカウンターでの放射能測定のために用いた。図9に示したように、His6-ZHER2Aは、2×106のHER2受容体/細胞を発現することが知られているSKBR-3細胞との特異的な結合を示した遮断なしバー。放射性標識His6-ZHER2Aの結合は、過剰量の非標識His6-ZHER2Aの添加により完全に遮断することができた遮断ありバー。しかしながら、SKBR-3細胞とのHis6-ZHER2Bの結合は、おそらくはこのZHER2変異体に関するより迅速な解離速度の結果上記参照として、検出限界より低かったデータは示されていない。[実施例3]HER2結合ポリペプチド二量体の発現および特徴付けDNA構築およびタンパク質産生HER2受容体に対する親和性を有する新規のAffibodyリガンドHis6-ZHER2Aと名づけられているの選抜を、上に記した。ZHER2Aポリペプチドをコードする遺伝子断片をHis6-ZHER2Aのための発現ベクター中にサブクローニングすることにより、二量体ZHER2変異体を構築した。DNAシーケンサーABIプリズム登録商標3700アナライザーAppliedBiosystemsFosterCityCAによるDNAシーケンシングにより、ZHER2A断片の導入を確認した。大腸菌RRIΔM15菌株RutherNucleicAcidsRes1057655772を、クローニングを行う間、細菌宿主として用いた。その結果得られたベクターは、T7プロモーターの制御下でStudieretalMethodsEnzymol1856089、N末端ヘキサヒスチジンHis6タグと融合した二量体ZHER2変異体ZHER2A2をコードし、これにより固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMACによる精製が可能になる。二量体ZHER2変異体を、大腸菌BL21DE3菌株中でHis6-タグ化融合タンパク質として発現させて、実施例1において単量体ポリペプチドに関して記載されたように、変性条件下で、タロンTalon金属アフィニティー樹脂8901-2、BDBiosciencesCAカラムによるIMAC精製により回収した。メーカーのプロトコルAmershamBiosciencesに従って、PBS10mMのリン酸塩、154mMのNaClpH7.1で平衡化したPD-10カラムを用い、ゲル濾過により、精製His6-ZHER2A2融合タンパク質の再生を実施した。適切な吸光係数30440M1cm1を用いて、280nmでの吸光度測定値からタンパク質濃度を算定し、アミノ酸分析AminosyraanalyscentralenUppsalaSwedenによっても確認した。NovexシステムNovexCAUSAを用いて、トリス-グリシン16均質ゲル上でのSDS-PAGEにより、精製タンパク質をさらに分析した。クマシーブリリアントブルー染色により、タンパク質帯域を可視化した。SDS-PAGE分析により、該タンパク質は、予測分子量15.6kDの明確な帯域として観察された図10、挿入図のレーン2。280nmでの吸光度測定値からの概算により、培養細胞lリットルあたり約200mgの発現レベルが実証された。バイオセンサー分析リアルタイム生体特異的相互作用分析BIAのために、ビアコア登録商標2000機器BiacoreABを用いた。10mMのNaAcpH4.5で希釈したHER2の組換え細胞外ドメインHER2-ECDを、メーカーの使用説明書に従って、アミンカップリングによりCM5センサーチップ研究等級BR-1000-14、BiacoreABの一方のフローセル表面のカルボキシル化デキストラン層上に固定した約2200RU。他方のフローセル表面を活性化及び非活性化して、参照用の表面として供した。ZHER2試料に関しては、メーカーのプロトコルAmershamBiosciencesに従って、NAP商標-10カラムを用いて、ゲル濾過により、緩衝液をHBS5mMのHEPES、150mMのNaCl、3.4mMのEDTA、0.005界面活性剤P20pH7.4へと変更し、その後試料を濾過した0.45μm;MilliporeBillericaMA。結合分析を25°Cで実施し、HBSをランニングバッファーとして用いた。全てのビアコア登録商標分析に関して;試料は順不同に2度繰り返して流し、各回の注入の後に、10mMのHClの注入により、フローセルを復元させた。第一の実験では、HER2-ECDとの結合における、単量体と二量体ZHER2タンパク質実施例1のHis6-ZHER2A及びHis6-ZHER2A2との差を、5μl/分の流量でのHER2-ECD表面上への5μMの各タンパク質の注入により検定した。図10から分かるように、His6-ZHER2A2に関してより遅い解離速度offrateが観察されたが、これは、HER-ECDとHis6-ZHER2A2との結合が、His6-ZHER2Aと比較してより強力であることを示す。第二の実験では、His6-ZHER2A2を動態分析に付したが、ここでは、30μl/分の流量で、異なる濃度0~5μM、最小濃度として0.0049μM;HBS中に希釈でHER2-ECD表面上にタンパク質を注入した。動態分析前に、アミノ酸分析によりタンパク質濃度を確定した。BIAevaluation3.2ソフトウエアBiacoreABを用いて、解離平衡定数KD、会合速度定数kaおよび解離速度定数kdを算定し、1対1結合であると推定した。結合曲線の評価時に、解離平衡定数KDを、約3nMであると確定し、会合速度定数kaを、約2.5×105M1s1及び解離速度定数kdを約7.6×104s1であると算定した。これらの値を、実施例1の単量体His6-ZHER2Aに関して得られた動態定数と比較して、二量体His6-ZHER2A2のより強力な結合を確認することができる。二量体構築物に関する親和性作用による、このような向上した明白な高親和性は、他のAffibody登録商標分子に関してはより早期に既に実証されているGunneriussonEetalProteinEng12873878。[実施例4]SKOV-3異種移植片を有するヌードマウスにおける、ZHER2A2の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング本実施例を構成する実験では、実施例3のHis6タグ化二量体ZHER2A2ポリペプチドを125Iで放射性標識し、HER2の過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。標識されたポリペプチドの局在化を調べるため、ペプチドを注入されたマウスの画像処理と同様に、該ポリペプチドの生体内分布の検査も実施した。TaqDNAポリメラーゼに対する結合親和性を有する標識されたZドメイン誘導体を、HER2に対する特異性を有さない対照として用いたZTaq;GunneriussonEetal上記参照に記載され、その中ではZTaqS11として言及されている。材料および方法ZHER2A2の間接的放射性ヨウ素標識2.3μlの容量の125I10MBqに相当するNa[125I]、AmershamBiosciencesUppsalaSwedenを、シリコン処理した微量遠心分離管に加えた。10μlの酢酸水に0.1、5μlのN-スクシンイミジルp-トリメチル-スタンニル-ベンゾエートの5酢酸メタノール中で1mg/mlKoziorowskiJetalApplRadiatIsot49955959に従って調製、ならびに10μlのクロラミン-T4mg/ml水溶液CH3C6H4SO2NClNaH2O、SigmaStLouisMOUSAを添加した。多少混合しながら、5分間反応させた。次に、10μlのメタ亜硫酸水素ナトリウム8mg/ml水溶液Na2S2O5、SigmaStLouisMOUSAで、反応を終わらせた。40μlの容量のZHER2A2二量体0.07Mのホウ酸緩衝液pH9.2ホウ酸ナトリウムNa2B4H710H2OSigmaStLouisMOUSAおよび塩酸HClMerckDarmstadtGermany中、0.25mg/mlを、反応試験管に添加した。別の40μlのホウ酸緩衝液を、pHを約9に上げるために、各試験管に添加した。連続振盪しながら45分間反応させた後、メーカーのプロトコルに従って、PBSで平衡化したNAP-5サイズ排除カラムAmershamBiosciencesUppsalaSweden上で、反応成分を分離した。反応試験管、素通り画分、高MW画分、低MW画分およびカラムを、標識収率を算定するために、小型γ検出器MiniinstrumentsLtdEssexUKを用いて60cm125Iで測定した。後日使用するまで、20°Cで、シリコン処理微量遠心分離管中に高分子量画分を貯蔵した。得られた収率は、25~30であった。ZTaqの間接的放射性ヨウ素標識[125I]-NaIのストック溶液を、0.1酢酸水溶液10μl、5μlのN-スクシンイミジルp-トリメチル-スタンニル-ベンゾエート溶液5酢酸メタノール中で1mg/ml、および10μlのクロラミン-Tの水溶液4mg/mlと混合した。反応混合物を激しく撹拌し、振盪しながら室温で5分間、インキュベートした。10μlのメタ亜硫酸水素ナトリウムの水溶液8mg/mlで、反応を終了させた。PBS中のZTaq2.4mg/mlの溶液21μlを粗反応混合物に添加した。ホウ酸緩衝液0.1M、pH9.15の添加により、反応混合物のpHを約9に調整した。振盪しながら30分間、室温で反応混合物をインキュベートし、溶離液としてPBSを用いて、PBS中の5アルブミンウシ、分画V、SigmaStLouisMOUSAで予備平衡化したNAP-5カラムを用い、高分子量画分標識ZTaqおよび低分子量画分に分離した。得られた放射性物質の収率は、75~80であった。具体的な放射能は、100kBq/μgであった。動物の準備MBからの雌非近交系nu/nubalbマウス到着時に10~12週齢を、C181/1承認下で用いた。異種移植片を該マウスに移植する前の1週間、ルドベック研究所UppsalaSwedenの動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。第一の実験の2ヶ月前に、5×106個のSKOV-3ヒト卵巣癌細胞ATCCHTB-77を33匹のマウスの右後足に皮下注射した。このグループをA組と名づけた。第二の実験の3週間前に、107個のSKOV-3細胞を32匹のマウスの両後足に皮下注射した。このグループをB組と名づけた。画像処理試験のために、大型の腫瘍を有する2匹のマウス下記参照をA組から取り出し、そして他の全てをB組から取り出した。実験時までに、腫瘍は全マウスにおいて定着していたが、サイズおよび状態はかなり小さく且つ異なった被包性および侵潤、血管新生の段階。使用時に、全マウスの体重は22~27gであった。生体内分布実験IA組からのマウス20匹を、各グループ4匹で5つのグループI~Vに無作為に分けた。大型腫瘍を有するA組からの2匹は、画像処理試験に用いるために除外した。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム1に従った。PBS50μl中の125I100kBq/マウスで間接標識したZHER2A20.5μgをマウスの尾部に静脈注射した。IIグループ遮断グループのマウスに対しては、PBS200μl中の0.05mgの非標識ZHER2A2を皮下に予備注射した45分後に、標識ZHER2A2を注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。屠殺の5分前に、致死用量のケタラール/ロンプン溶液20μl/体重1g、ケタラール10mg/mlPfizerNewYorkUSA、ロンプン1mg/mlBayerLeverkusenGermanyをマウスに腹腔内注射した。希釈ヘパリン5000IE/ml、LeoPharmaCopenhagenDenmarkで洗浄した1ml注射器を用いて、心臓穿刺により、屠殺時に血液を採取した。血液と、尿、筋肉、骨、大腸、小腸、心臓、膀胱、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、胃、唾液腺および甲状腺、脳、腫瘍および尾の試料を解剖し、重さを測った20mlプラスチックボトル中に回収した。B組からの数匹のマウスにおける複数の腫瘍の場合、全ての腫瘍を別個のボトル中に回収した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器3インチNaIT1検出器を伴う自動γ計数器である1480WallacWIZARDで測定した。生体内分布実験IIB組からのマウス24匹を、各グループ4匹で6つのグループに無作為に分けた。大型腫瘍を有するB組からの8匹は、画像処理試験に用いるために選択した。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム2に従った。PBS50μl中の125I100kBq/マウスで間接標識したZHER2A20.5μgを、IおよびグループIV~VIのマウスの尾部に静脈注射した。グループIIのマウスを、同量の放射性ヨウ素標識ZHER2A2を用いて、今回は尾の皮下に注射した。グループIIIのマウスの尾に、PBS50μl中の125I100kBq/マウスで間接標識したZTaq1.07μgを静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。生体内分布実験Iに関して上記したのと同様に、屠殺および試料の採取を実施した。この第二の実験では、胴体carcassも回収し、その放射能含量を測定した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器で測定した。放射能の測定125Iの測定に関する標準プロトコルを用いた。バックグラウンドレベルを用いて補正した計数/分を、評価のために用いた。ID/g組織1gあたりの、注射された線量に対する百分率として表される組織取込み値を、以下のように算出した。ID/g=[組織の放射能/注射された放射能/組織重量]×100ここで、静脈注射に関しては、注射された放射能=対照の注射器の平均放射能-使用した注射器の放射能-尾の放射能であり、皮下注射に関しては:注射された放射能=対照の注射器の平均放射能-使用した注射器の放射能である。画像処理試験画像処理のために、全てのグループがA組からの大型腫瘍を有する1匹のマウスを含むということを考慮に入れつつ、各グループ5匹で2つのグループにマウスを分けた。B組からのマウスを無作為に抽出した。2グループのマウスに、PBS90μl中の125I2.9MBq/マウスで間接標識したZHER2A22.3μgを、それぞれ画像処理の6時間または8時間前に注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全ての注射が良好に耐容されたと判断した。放射性複合体の注射後pi6時間および8時間目に、マウスの全身画像処理を実施した。マウスを強制排尿させて、致死量のケタラール/ロンプンの腹腔内注射により麻酔して、頚椎脱臼により殺害した。マウス各グループ5匹をe.CAMγカメラSiemensGermany中に置いて、各時点において10分間の画像を得た。大型腫瘍を有する2匹のマウス各グループから1匹を、露出時間を20分とした、同一カメラでの特別な画像を撮るために選択した。99ウインドウサイズ、35keVエネルギーウインドウで、低エネルギー、高分解能絞りを用いて、256×256ビットマトリックスで画像を得た。NuclearDiagnosticsKentUKからのHermesソフトウエアを用いて、画像を評価した。結果遮断実験腫瘍中へのZHER2A2の取込みが特異的で且つ受容体調節性であるか否かをはっきりさせるために、生体内分布実験Iにおける遮断実験を実施した。放射性ヨウ素標識二量体の主要静脈注射の前に、スキーム1のグループIIのマウスに、0.05mgの非標識ZHER2A2を皮下注射した。グループIおよびグループIIにおける注射後1時間での放射能の取込みを比較した。マウスの2つのグループに関する腫瘍対血液比は、0.72グループI平均および0.25グループII平均であった図11。しかしながら、取込みの差は有意でなかったp=0.16。腫瘍を除く全ての器官において、放射能取込みは遮断ありおよび遮断なし、の動物の両方に関して同一であった。遮断なしマウスの場合における比較的低い腫瘍対血液比は、この実験では早い時点注射後1時間が選択されたことにより説明できる。取込みの特異性生体内分布実験IIにおいて、グループIIIのマウスに、他のグループのマウスに注射したZHER2A2の量に相当する量のZTaqを注射した。ZHER2A2に関すると同一の間接的な方法を用いて、放射性ヨウ素でZTaqを標識しておいた。ZTaqは、HER2受容体に対して非特異的である。グループIおよびグループIIIにおける注射後4時間での放射能の取込みを比較した。この実験の結果図12は、非特異的ZTaq分子が特異的ZHER2A2分子より低い腫瘍取り込みを有する、ということを示した。この実験における腫瘍対血液比は、1.43グループI、特異的ZHER2A2および0.15グループIII、非特異的ZTaqであった。統計学的分析により、差が有意であるp=0.009ことが示された。他の器官すべてにおいて、放射能取込みは、両Z分子に関して同一レベルであった。遮断実験と比較した場合、ZHER2A2に対する高い腫瘍対血液比が、この実験で観察された。これは、実験の時点がより遅い注射後4時間ためであると考えられた。生体内分布標識されたZHER2A2を静脈注射しておいた生体内分布実験IおよびIIにおけるマウスのグループからの結果を、腫瘍を保持するマウスの器官および組織中の放射性ヨウ素の生体内分布の分析と併せた。結果を図13~図16に示す。図13および図14を参照すると、腫瘍中の125Iの濃度はほとんどの正常器官中の濃度より高く、このことは、ZHER2A2ポリペプチドがHER2を保有する腫瘍細胞を標的とすることができることを示す。正常器官および組織中の放射能濃度は、腎臓全時点、甲状腺全時点および肝臓早期時点を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した。実験は、血液および正常器官からの放射性ヨウ素の迅速なクリアランスを示した。正常器官からのクリアランスは、放射性ヨウ素の蓄積が見出された甲状腺を除いて、主に血中クリアランスに次ぐものであった。遊離ヨウ素の甲状腺取込み増大は、間接的標識法に関してさえ既知であり、ある程度まで、非アイソトープすなわち非放射性ヨウ素で防止され得るLarsenRHetalNuclMedBiol25351357。高濃度の放射性ヨウ素はマウスの腎臓においても見出されたが、これも腎臓がこのような小タンパク質および異化代謝産物のための主要排泄経路であるためと予測された。図15Aおよび図15Bは、血中および腫瘍中の放射性ヨウ素濃度の長時間にわたる経過を示す。注射後4時間から始めると、腫瘍放射能は、血液放射能より高かった。図15Aに示したような実験データを用いて、血液および腫瘍中の放射性ヨウ素の半減期を、GraphPadPrismcv3.0GraphPadSoftware社製を用いて算定した。2相の指数関数的な崩壊に関する非線形回帰をモデルとして用い、得られたグラフを図15Bに示す。腫瘍に対するT12α0.36時間は、血液に対するもの0.76時間より短かったが、T12βは長かった腫瘍では87.5時間に対し、血液では4.3時間が、これは得られた結果と良好に一致する。比較のために、腫瘍を保有しない正常なマウスからの生体内分布データを用いて同一モデルで算定された標識二量体に対する血液中のT12αは、0.3時間であったデータは示されていない。放射能濃度の腫瘍対血液比図16は、注射後少なくとも12時間の間、時間に伴って増大した。この比は、放射能画像処理における主バックグラウンドが血液中の放射能からのものであるため、画像のコントラストを見積もるのに好都合な因子である。腫瘍対血液比および腫瘍の放射能濃度を考慮に入れると、注射後6時間及び8時間が画像化のための最適時点であり得る、と結論づけられた。良好なコントラストを有する画像に対しては、腫瘍対非腫瘍の放射能濃度比は、2未満であるべきである。ガンマ画像画像処理のために選択された各々5匹から成る2グループの各々から、ガンマ画像を撮影したそれぞれ注射後6時間および8時間。両時点での全てのマウスにおいて、鮮明な構造を有する腎臓を同定することができた。いくつかのさらなる構造おそらくは肝臓が、注射後6時間のマウスの画像に、腎臓に重なって、全身血液プールからのバックグラウンド増大に加えて、認められる。いくつかの動物はそれらの膀胱中に多少の尿を有したが、これも直接観察される。注射後8時間のマウスに関する画像では、頚部領域のさらなる構造が同定され得るが、これはおそらく甲状腺である。各画像セッションにおける5匹の動物から、1つの大型侵潤腫瘍SKOV-3注射の第一バッチからが視覚化された。他の腫瘍の局在化は明白ではなかった。2匹の当該動物を付加的な画像処理セッションのために選択した。結果を図17に示す。要約SKOV-3卵巣癌細胞株腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素125Iで間接的に標識された二量体ポリペプチドZHER2A2の生体内分布は、正常マウスにおける該二量体ポリペプチドの正常な生体内分布と良好な一致を示した。125I-ベンゾエート-ZHER2A2として注射される放射性ヨウ素の腫瘍への取込みが達成された。腫瘍への取込みは、高濃度の非標識ZHER2A2分子の予備注射を用いた遮断実験により、且つ非特異的な、標識されたZ変異体ZTaqの注射により示されるように、受容体介在性かつ特異的であった。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度が注射後4時間の血中の放射能濃度より高く、且つ腎臓および甲状腺を除いて、注射後6時間における大多数の正常器官および組織中より高い、ということが示された。SKOV-3異種移植腫瘍を保有するマウスのガンマ画像を、注射後6および8時間で得た。良好な分解能が達成された。両時点で、大きい侵潤腫瘍を明瞭に同定できた。[実施例5]SKOV-3異種移植片を保有するヌードマウスにおけるHis6-ZHER2A単量体の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング本実施例を構成する実験では、実施例1および2の単量体ZHER2Aポリペプチドを125Iで放射性標識し、HER2の過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。該ポリペプチドの生体内分布の検査を、その局在化を調べるために実施した。材料および方法ZHER2Aの間接的放射性ヨウ素標識125Iで標識するために、40μlの単量体His6-ZHER2Aを、実施例4における二量体ポリペプチド構築物と同様の処理に付した。動物の準備MBからの雌の非近交系nu/nubalbマウス到着時、10~12週齢を、C66/4承認下で用いた。異種移植片をマウス中に移植する前の1週間、ルドベック研究所UppsalaSwedenの動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の3週間前に、5×107個のSKOV-3ヒト卵巣癌細胞ATCCHTB-77を16匹のマウスの右後足に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全てのマウスにおいて定着しており、全てのマウスの体重は22~27gであった。放射能の測定実施例4に記載されたように125I測定を実施し、ID/gを算出した。生体内分布実験マウス16匹を、各グループ4匹で4つのグループI~IVに無作為に分けた。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム3に従った。PBS50μl中の125I100kBq/マウスで間接標識したZHER2A0.5μgをマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。実施例4の第一の生体内分布試験に記載したように、マウスを屠殺し、試料を採取した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器3インチNaIT1検出器を伴う自動γ計数器である1480WallacWIZARDで測定した。結果標識されたZHER2Aを皮下注射しておいたマウスのグループからの結果を、マウスの器官および組織中の放射性ヨウ素の分布を確証するために分析した。結果を図18~図20に示す。図18および図19を参照すると、腫瘍中の125Iの濃度は、4時間および24時間で大多数の正常器官中での濃度より高く、このことはZHER2AポリペプチドがHER2を保有する腫瘍細胞を標的にすることができる、ということを示す。正常な器官および組織中の放射能濃度は、腎臓全時点および甲状腺全時点を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した。実験は、血液および正常器官からの放射性ヨウ素の迅速なクリアランスを示した。正常器官からのクリアランスは、放射性ヨウ素の蓄積が見出された甲状腺を除いて、大抵の場合は血中クリアランスに次ぐものであった。高濃度の放射性ヨウ素はマウスの腎臓においても見出された。図20は、血中および腫瘍中の放射性ヨウ素濃度の長時間にわたる経過を示す。注射後4時間から始めると、腫瘍の放射能は、血液の放射能より6倍高かった。放射能濃度の腫瘍対血液比図21は、注射後少なくとも8時間の間この時点での該比の値は10対1であった、時間に伴って増大した。要約SKOV-3卵巣癌細胞株腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素125Iで間接的に標識された単量体ポリペプチドZHER2Aの生体内分布は、正常マウスにおける該ポリペプチドの正常な生体内分布と良好な一致を示した。125I-ベンゾエート-ZHER2Aとして注射される放射性ヨウ素の腫瘍取込みが達成された。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度が注射後4時間の血中の放射能濃度より高く、二量体の形態ZHER2A2と比較した場合、腎臓および甲状腺を除いて、注射後4時間においてすでに大多数の正常器官および組織中より高い、ということが示された。[実施例6]SKOV-3異種移植片を保有するヌードマウスにおけるABDZHER2A2の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング本実施例を構成する実験では、ABDZHER2A2と名づけられたポリペプチドを生成するために、実施例3の二量体ZHER2A2ポリペプチドを、そのN末端で、連鎖球菌プロテインG由来のアルブミン結合ドメインABDと遺伝子操作によって融合した図22。ABDは、ヒトおよびマウス血清アルブミンに高い親和性で結合するMJohanssonetalJBiolChem27781148120。アルブミンは、緩徐な血漿クリアランスを有する血中に豊富なタンパク質である。アルブミンとの高親和性の結合は、アルブミンタンパク質それ自体と同様に、該結合剤に緩徐な動態を付与する。動物における腫瘍ターゲッティングリガンドの循環時間が延長されると、理論上、腫瘍に送達される用量は増加する。これを試験するために、ABDZHER2A2ポリペプチドを125Iで放射性標識し、HER2過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。ポリペプチドの生体内分布の検査を、その局在化を調べるために実行した。材料および方法DNA構築およびタンパク質産生His6-ZHER2Aと名づけた、HER2受容体に対する親和性を有する新規のAffibodyリガンドの選択は、実施例1および2に記されている。ZHER2Aポリペプチドをコードする遺伝子断片をHis6-ZHER2A用の発現ベクター中にサブクローニングすることにより構築される二量体ZHER2変異体は、実施例3に記載された。ABDポリペプチドをコードする遺伝子断片をHis6-ZHER2A用の発現ベクター中にサブクローニングし、ヘキサヒスチジンタグをABDポリペプチドで置換することにより、この二量体ZHER2A変異体のABD融合タンパク質を構築した。さらに、エクステンションPCRを利用して、C末端システイン残基を融合タンパク質に付加した。DNAシーケンサーABIプリズム登録商標3700アナライザーAppliedBiosystemsFosterCityCAでのDNAシーケンシングにより、導入されたABD断片を確認した。大腸菌RRIΔM15菌株RutherNucleicAcidsRes1057655772を、クローニングの間、細菌宿主として用いた。得られたベクターは、T7プロモーターの制御下でStudieretalMethEnzymol1856089、ABDと融合した二量体ZHER2変異体ABDZHER2A2をコードしており、これはC末端がシステイン残基と融合されていることにより部位特異的な化学的修飾が可能である図22。二量体ZHER2変異体を、大腸菌BL21DE3菌株中でABDとの融合体として発現させて、メーカーのプロトコルAmershamBiosciencesに従って調製されたアルブミンセファロースアフィニティーカラム上でのアフィニティークロマトグラフィー精製により、回収した。適切な吸光係数を用いて、280nmでの吸光度測定値からタンパク質濃度を算定した。NovexシステムNovexCAUSAを用いて、トリス-グリシン16均質ゲル上でのSDS-PAGEにより、精製タンパク質をさらに分析した。クマシーブリリアントブルー染色により、タンパク質帯域を可視化した。SDS-PAGE分析により、該タンパク質は、予測された分子量の明確な帯域として観察された。ABDZHER2A2の間接的放射性ヨウ素標識125Iで標識するために、40μlのABDZHER2A2を、実施例4における二量体ポリペプチド構築物と同一の処理に付した。動物の準備MBからの雌非近交系nu/nubalbマウス到着時、10~12週齢を、C66/4承認下で用いた。異種移植片を該マウスに移植する前の1週間、ルドベック研究所UppsalaSwedenの動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の3週間前に、5×107個のSKOV-3ヒト卵巣癌細胞ATCCHTB-77を16匹のマウスの右後足に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全マウスにおいて定着しており、全マウスの体重は22~27gであった。放射能の測定実施例4に記載されたように、125I測定を実施し、ID/gを算定した。生体分布実験マウス16匹を、各グループ4匹の4つのグループI~IVに無作為に分けた。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム4に従った。50μlのPBS中の125I100kBq/マウスで間接標識した0.5μgのABDZHER2A2をマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。実施例4の第一の生体内分布試験に記載したように、マウスを屠殺し、試料を採取した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器3インチNaIT1検出器を伴う自動γ計数器である1480WallacWIZARDで測定した。結果結果を図23~図24に示す。図23を参照すると、腫瘍中の125Iの濃度は、12時間腫瘍2.4ID/gおよび24時間腫瘍2.2ID/gでは、ほとんどの正常器官中の濃度より高く、このことは、ABDZHER2A2ポリペプチドがHER2を保有する腫瘍細胞を標的にし得る、ということを示す。正常な器官および組織中の放射能濃度は、腎臓全時点、24時間で3.5ID/g、甲状腺全時点、24時間で5.2ID/gおよび血液全時点、24時間で3.9ID/gを除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した。肺での値は、腫瘍での値とほとんど等価であるが、これは、肺中の血液含量が高いためかもしれない。実験は、血液からの放射性ヨウ素の非常に遅いクリアランスを示した。これは、ABDZHER2A2のABD部分が、緩徐な動態を有する血中に豊富なタンパク質である血清アルブミンと高親和性で結合するため、予測できることである。正常器官からのクリアランスは、放射性ヨウ素の蓄積が見出された甲状腺を除いて、血中クリアランスより迅速であった。高濃度の放射性ヨウ素はマウスの腎臓においても見出された。図24は、実施例4および5におけるZHER2Aの単量体および二量体構築物に関して作成された結果と比較した場合の、腫瘍中のABDZHER2A2に関連した放射性ヨウ素濃度の長時間にわたる経過を示す。注射後24時間で、ABDZHER2A2を用いた際の腫瘍の放射活性は、単量体または二量体の場合より13倍高かったが、これは、標的部分の体内での残留時間の延長が実際に腫瘍上での線量を増大するために利用され得る、ということを示す。このデータによりZHER2A2部分をアルブミン結合ドメインに機能的に結合できる、ということも裏付けられる。要約SKOV-3卵巣癌細胞株腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素125Iで間接的に標識された融合ポリペプチドABDZHER2A2の生体内分布は、予測されたアルブミン結合ポリペプチドの特性と良好な一致を示した。125I-ABDZHER2A2として注射された放射性ヨウ素の腫瘍への取込みが達成され、腫瘍での線量はZHER2Aポリペプチドの二量体または単量体バージョンでのものより高かった。得られたデータの分析により、肺、腎臓、甲状腺および血液中の放射能は依然として高かったものの、腫瘍中の放射能濃度は注射後12時間でのほとんどの他の器官中の放射能濃度よりは高いことが示された。[実施例7]テクネチウム標識二量体99mTc-ZHER2A2の生体内分布本実施例を構成する実験では、実施例3による二量体His6-ZHER2A2ポリペプチドを、診断用画像処理核種99m-テクネチウムで標識し、正常マウス及びHER2過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウス中に注射した。99mテクネチウム99mTcは、invivo診断のための理想に近い特性を有する放射性核種である。さらにこれは安価で且つ容易に入手可能であり、このことが99mテクネチウムを、病院における医学的画像処理のための望ましい候補にしている。該ポリペプチドの生体内分布の試験を実行して、その局在化を調べた。材料および方法His6-ZHER2A2のテクネチウム標識His6-ZHER2A2タンパク質上のヘキサヒスチジンタグへ99mTc核種を送達する市販のIsoLink商標キットMallinckrodtNetherlandsを用いて、メーカーの使用説明書に従って、His6-ZHER2A2ポリペプチドを標識した。IsoLink商標キット試薬はテクネチウム陽イオン[99mTcCO3H2O3]を生じ、これは次に、ヘキサヒスチジンタグにより安定的に配位結合されて、His6-ZHER2A2ポリペプチドのHis6タグを特異的に標識するための手段を提供する。簡単に述べると、ウプサラ大学病院で発生器から溶離された99mTcストック溶液0.5~0.6mlを、水浴中で、100°Cで20分間、IsoLink商標カルボニル標識剤DRN4335、Mallinckrodtの内容物とともにインキュベートした。このようにして得られたテクネチウム陽イオン[99mTcCO3H2O3]40μlを、PBS中のHis6-ZHER2A21.2mg/ml40μlと混合し、50°Cで1時間インキュベートした。5kDの排除分子量を有するNAP-5サイズ排除カラムPharmaciaUppsala上での分離により、生成物を精製した。生成物の純度は、薄層クロマトグラフィーをすぐに行って確認したところ、97であった。動物の準備MBからの雌非近交系nu/nubalbマウス到着時、10~12週齢を、C66/4承認下で用いた。異種移植片をマウス中に移植する前の1週間、標準的な食餌、寝床および環境を用い、ルドベック研究所UppsalaSwedenの動物施設でマウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の3週間前に、5×107個のSKOV-3ヒト卵巣癌細胞ATCCHTB-77を4匹のマウスの右後足に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全マウスにおいて定着しており、全マウスの体重は22~27gであった。放射能の測定実施例4において125Iに関して記載したと同様に、99mTcの測定を実施し、ID/gを算出した。生体内分布実験4匹のマウスを有する1つのグループを実験に用いた。注射および屠殺の時間は、スキーム5に従った。50μlのPBS中の99mTc100kBq/マウスで標識した0.5μgのHis6-ZHER2A2をマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。実施例4の第一の生体内分布試験に記載したように、マウスを屠殺し、試料を採取した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器3インチNaIT1検出器を有する自動γ計数器。1480WallacWIZARD、WallacOYで測定した。結果結合体99mTc-His6-ZHER2A2は、invitroで高い安定性を有したPBS、血漿、システインおよび過剰量の遊離ヒスチジンで攻撃。99mTc-His6-ZHER2A2のinvivoでの生体内分布実験からの結果を、図25~図27に示す。図25を参照すると、総腫瘍線量は、125I標識された単量体構築物である125I-ベンゾエート-ZHER2A注射後8時間で1.1ID/gまたは二量体構築物である125I-ベンゾエート-ZHER2A2注射後8時間で1.06ID/gと比較した場合、99mTc-His6-ZHER2A2注射後8時間で、3.3ID/gを用いた場合は3倍高かった。99mTcは、125Iより良好な残留性物質であるということが既知であり、これは、99mTcでは送達された用量が残存する一方、ヨウ素では用量は代謝され、腫瘍細胞から放出されることを意味する。図26を参照すると、腫瘍中の99mTcの濃度は、注射後8時間においてはほとんどの正常器官より高かった腫瘍3.3ID/gが、これは、99mTc-His6-ZHER2A2ポリペプチドがHER2を保有する腫瘍細胞を標的にし得る、ということを示す。正常器官および組織中の放射能濃度は、腎臓8時間で27ID/g、腫瘍線量の36倍および肝臓8時間で11.4ID/g、腫瘍線量の3倍を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した図27。99mTc-His6-ZHER2A2は腎臓を介して除去されるため、腎臓での高い値が予測された。腎臓中の高レベルのトレーサーは毒性の問題を示さないが、これは、注射された総線量は診断目的であって非常に低いからである。甲状腺中の放射能の量は、予測どおり、125Iを用いた場合実施例4ほど高いことは全くなかった8時間で1ID/g。正常器官からのクリアランスは、1時間をピークとする99mテクネチウムの蓄積が観察された腎臓を除き、主として血中クリアランスに次ぐものであった。レベルはその後低下し、1時間の間注射後2時間までに急速排除期、その後、緩徐排除期が続き、24時間後においても腎臓中には依然としてかなりの線量70ID/gが認められた。注射後8時間での該テクネチウム結合体に関する腫瘍対血液比は4であり、総腫瘍線量は3.3ID/gであった。これは、99mテクネチウムがinvivo診断用途に用いられ得る、ということを示した。比較としては、同じ時点で、125I-ベンゾエート-ZHER2A2および125I-ベンゾエート-ZHER2Aの腫瘍線量は約1であったが、腫瘍対血液比は約11であった。要約SKOV-3卵巣癌細胞株腫瘍を保有するマウスにおける、99mTc標識ポリペプチド99mTc-His6-ZHER2A2の生体内分布は、医療用画像処理目的にとって相対的に良好な分布特性を示した。99mTc-His6-ZHER2A2として注射されたテクネチウムの腫瘍への取込みが達成され、腫瘍での線量は、ZHER2Aポリペプチドの125I標識二量体または単量体バージョンに対するものより高かった。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度は、実質的に腫瘍より高い取込みが肝臓および腎臓で認められるものの、注射後8時間ではほとんどの他の器官および血液中の放射能濃度よりは高いことが示された。[実施例8]211Atを用いたinvitro標識および特徴付け本実施例を構成する実験においては、実施例3による二量体His6-ZHER2A2ポリペプチドを、125Iを用いた標識に関して上記したと同様の化学的手法を用いて、治療用放射性核種である211アスタチン211Atで標識した。放射性核種の腫瘍へのターゲッティングの一目的は、放射線療法である。これは、標的細胞を根絶することができる高エネルギー粒子、例えばα粒子および高エネルギーβ粒子を放射する核種を要する。α放出放射性ハロゲン211AtT12=7.2時間は、ごく少数の細胞の直径程度の飛程rangeを有しており、これは、細胞の根絶が高精度で起こり得ることを意味する。211At標識ポリペプチドのinvitroでの殺細胞能力の試験を実行した。材料および方法2日前に、HER2過剰発現により特徴付けられる100,000個のSKBR-3細胞を、3cm培養皿に植え付けた。60μgのHis6-ZHER2A2ポリペプチドを、コペンハーゲン大学病院のScanditronixMC32サイクロトロン中で生成した211Atで標識して、JorgenCarlssonウプサラ大学の研究室で精製した。約1:1および5:1モル比の211At-ZHER2A2分子/細胞受容体を、3つの培養皿の各々に添加した。さらに3つの別の培養皿には、5:1濃度の211At-ZHER2A2に加えて、結合部位を遮断することにより非特異的な放射の影響を概算することを目的として、500倍過剰量の非標識His6-ZHER2A2を供給した。細胞を、37°Cで24時間、211At-ZHER2A2とともにインキュベートした。24時間のインキュベーション後、全細胞を洗浄し、新しい新鮮な培地を補給した。次に、約2ヶ月間、週に1回、それらの増殖をモニタリングした。並行して、上記の細胞殺滅検定に用いたのと同一方法で調製した一組の培養皿に、同じ211At-ZHER2A2溶液を供給した。培養皿中の全グループに関する取込み曲線を確立するために、これらの細胞を異なる時点で採取し、細胞数を計数し、放射能含量を測定した。これらの曲線を用いて、細胞殺滅実験で用いた24時間に亘る、細胞当たりの崩壊量を算出した。結果HER-2を過剰発現するヒト乳癌細胞株SKBR-3からの細胞を、2つの異なる用量の211At-ZHER2A2に24時間曝露した。第一の用量では、添加した211At-ZHER2A2分子は、細胞上のHER2標的受容体の数と等しかった。第二の用量では、211At-標識分子を5倍過剰量で添加した。24時間のインキュベーション後、週に1回、2ヶ月にわたって細胞をモニタリング、計数し、生存画分を確定した。図28で観察されるように、応答は、投与された用量に関連した。等モル量の211At-ZHER2A2を投与された細胞は、放射能がターゲッティング剤を伴わずに添加される対照と比較して、いかなる特異的な増殖の遅延も示さなかった。非特異的な放射線傷害により短期間の増殖遅延が認められたが、しかし細胞は増殖を停止しなかった。これに対比して、211At-ZHER2A2を5倍過剰量で添加した場合、細胞増殖の抑制は目覚ましいものであった。実験終了時、高用量投与グループは未だ正常な状態に回復していなかったが、一方、低用量および対照グループは106倍に増殖していた。生存細胞が実験前とほぼ同一の増殖率を照射後にも維持していると考えると、5:1グループ中の全細胞が根絶されたことになる。取込み曲線は、遮断処理された5:1グループも、おそらくは遮断が不十分であったために、細胞に対してかなりの量の照射を受けていた、ということを明示した。細胞あたりの崩壊数DPCを、統合した取込み曲線から概算した。増殖曲線から、指数増殖曲線の勾配として倍加時間を算出し、かつ、遅延した増殖の曝露時間への外挿により、生存画分を算定した。第1表に結果を示す。要約211At-ZHER2A2は、invitroでHER2過剰発現SKBR-3細胞との特異的な結合を示した。誘導された細胞死は、蓄積された線量と良好に相関した。100未満の崩壊数/細胞は、単一の細胞を殺傷して完全に細胞を根絶するのに十分であることを示した。[実施例9]付加的なHER2結合ポリペプチドの同定および特徴付け実施例1に記載した選択から得られるHER2結合Z変異体の親和性を増大させるために、第二のライブラリーの構築GunneriussonetalProteinEng12873878NordetalEurJBiochem268426977と、その後のHER2に対する再選択とを包含する親和性の成熟戦略を適用した。第一世代のポリペプチド変異体ZHER2A、B、CおよびDのアラインメントは、第13位、14位、28位、32位および35位での同一性とは別に、ZHER2AおよびZHER2B間に、第10位におけるRおよびKへの、そして第11位におけるQおよびTへの集中convergenceが認められる、ということを示した。したがって第二世代のライブラリーは、5つの固定された位置、すなわち第13位、14位、28位、32位および35位、ならびに2つの部分的に固定された位置、すなわち第10位縮重コドンとしてcgc/aaaおよび第11位縮重コドンとしてcaa/accを含有する一方、残りの第9位、17位、18位、24位、25位および27位は、NNG/T縮重コドンを用いて再び無作為化された。形質転換後、3×108クローンのライブラリーを得た。標的としてヒトHER2HER2-ECDのビオチニル化細胞外ドメイン組換えヒトHER2細胞外ドメイン、アミノ酸238~2109、FoxChaseCancerCenterPhiladelphiaUSAによる提供を用い、その濃度を低下させながら、抗原結合分子に対して5回の選択を施した。それぞれ4回および5回目に得られた80および260コロニーのクローンを、それらのHER2結合活性の分析を実施するために選別した。HER2結合の分析のためのABASELISA4回および5回の選択から無作為に選択されるクローンを、96ウエルプレートNunc中で生成させた。ABASELISAと呼ばれるELISAスクリーニング手法を用いて、高親和性HER2結合Z変異体を同定した。単一コロニーを、深穴96ウエルプレート中で1mMのIPTGおよび100μg/mlのアンピシリンを補充した1mlのTSB-YE培地30.0gのトリプシンダイズブロスMerckおよび5.0gの酵母抽出物Merck、水で最終容積を1lとするに接種し、37°Cで一晩、振盪器上で増殖させた。3,000gで10分間の遠心分離により細胞をペレット化した。ペレットを300μlのPBS-T中に再懸濁し、-80°Cで少なくとも30分間凍結させた。プレートをぬるま湯中で解凍し、3,500gで20分間遠心分離した。100μlの上清を微量滴定ウエル9018Costar登録商標に入れて、これを4°Cで一晩、15mMのNa2CO3および35mMのNaHCO3pH9.6中の6μg/mlのヒト血清アルブミンHSAと共にインキュベートし、室温で1時間、PBS-T中の2粉末スキムミルクでブロッキングしておいた。プレートを4回洗浄した後、1μg/mlのビオチニル化HER2/ウエル100μlを添加し、1.5時間インキュベートした。ウエルを4回洗浄した後、ストレプトアビジン-HRP1:5,000P0397Dakoを添加し、1時間インキュベートした。ウエルを4回洗浄し、最終洗浄後、100μlの展開溶液ImmunoPureTMB34021Pierceを各ウエルに添加した。20~30分後、100μlの停止溶液2MのH2SO4を、各ウエルに添加した。450nmでの吸光度をELISA読取器Tecanで測定した。ABASELISAからの結果を図29に示す。図29Aおよび図29BのグラフのX軸は、該96ウエルプレートのウエルの番号に対応する。したがって図29Aは第一の96ウエルプレートに関するELISA結果を示し、一方、図29Bは第二のプレートに関する結果を示す。DNA配列分析ABAS-ELISAで分析したZHER2変異体をコードするDNAのシーケンシングを、ビオチニル化オリゴヌクレオチドAFFI-725’-ビオチン-CGGAACCAGAGCCACCACCGGを用いて、製造者の推奨に従って、ABIプリズム登録商標、dGTP、ビッグダイ商標ターミネーターv3.0レディリアクションサイクルシーケンシングキットAppliedBiosystemsを用いて実施した。ABIプリズム登録商標3100遺伝子分析器AppliedBiosystemsで、配列を分析した。配列分析は、130の独特の配列を生じた。ネガティブ対照の値より少なくとも2倍高い吸光度値により立証されるような、ABASELISA実験で結合を示したZHER2変異体かに由来する配列は図1に示されており、配列番号6~76として配列表で同定される。これらのHER2結合Z変異体の命名法は、以下の通りである。ELISA実験の第一のプレートから単離された変異体図29Aは、ZHER21NNと呼ばれ、この場合、NNはその特定のポリペプチド変異体が分析された第一のプレート中のウエルの番号に対応する。ELISA実験の第二のプレートから単離された変異体図29Bは、ZHER22NNと呼ばれ、この場合、NNはその特定のポリペプチド変異体が分析された第二のプレート中のウエルの番号に対応する。クローニングおよびタンパク質産生図30で模式的に示されている構築物をコードする発現ベクターを用いて、大腸菌細胞中で、選定したHER2結合ポリペプチドを発現させた。N末端ヘキサヒスチジルタグとの融合体として、該ポリペプチドを生成させた。His6-タグ化ポリペプチドZHER2101、ZHER2107、ZHER2149、ZHER2202、ZHER2205、ZHER2207、ZHER2209、ZHER2222、ZHER2225およびZHER2229、ならびにZHER2Aを、変性条件下で、BioRobot3000QiagenおよびNI-NTASuperflow96BioRobot手法を用いて精製した。精製されたHis6-タグ化タンパク質を、PBS2.68mMのKCl、137mMのNaCl、1.47mMのKH2PO4、8.1mMのNa2HPO4、pH7.4中で透析した。試料のタンパク質濃度を、280nmでの測定吸光度値およびそれぞれのタンパク質の理論的吸光係数から算出した。His6-タグ化ZHER2変異体のバイオセンサー分析前節により産生されたHisタグ化ZHER2変異体とHER2との間の相互作用を、ビアコア登録商標2000システムBiacoreABUppsalaSwedenでの表面プラズモン共鳴を用いて分析した。ヒトHER2およびIgG免疫グロブリンGを、製造者の推奨に従って、CM-5チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、別個のフローセル中に固定した。ヒトHER2およびIgGの固定化は、それぞれ4,600および5,100共鳴単位RUを生じた。第三のフローセル表面を活性化し、及び注入の間のブランクとして用いるために不活性化した。融合ポリペプチドZHER2101、ZHER2107、ZHER2149、ZHER2202、ZHER2205、ZHER2207、ZHER2209、ZHER2222、ZHER2225およびZHER2229を、1×HBS-EP5mMのHEPES、150mMのNaCl、3.4mMのEDTA、0.005界面活性剤P-20、pH7.4により希釈して、最終濃度を50nMとし、10μl/分の一定流量で注入した。総注入時間は2分会合で、その後3分間洗浄した解離。表面を、25mMのHClの2回の注入により再生した30秒/注入。参照細胞中で測定された応答活性化/不活性化表面を、固定化されたHER2を有する細胞中で測定された応答から差し引いた。HER2と相互作用する精製タンパク質の能力を、図31のセンサグラムにより例示されるように、確認した。[実施例10]付加的なHER2結合ポリペプチドの同定および特徴付け実施例1に記載した選択の3回目および4回目に得られるクローンの包括的な配列分析を実施した。製造者の推奨に従って、ABIプリズム登録商標、dGTP、ビッグダイ商標ターミネーターv3.0レディリアクションサイクルシーケンシングキットAppliedBiosystemsを、そしてABIプリズム登録商標3100遺伝子分析器AppliedBiosystemsを用いて、DNAをシーケンシングした。ビオチニル化オリゴヌクレオチドAFFI-725’-ビオチン-CGGAACCAGAGCCACCACCGGを、プライマーとして用いた。配列分析は、11の新規のポリペプチド配列、即ち実施例1に記載した試験において見出されなかったクローンを明示した。図30に模式的に例示される構築物をコードする発現ベクターを用いて、大腸菌細胞中でこれらのZ変異体を発現させることを決定した。その結果、N末端ヘキサヒスチジルタグとの融合体として、ポリペプチドが生成された。変性条件下で、BioRobot3000QiagenおよびNI-NTASuperflow96BioRobot手法を用いて、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMACにより、該ポリペプチドを精製した。溶離したタンパク質を、SDS-PAGE上で分析した。精製His6-タグ化タンパク質の緩衝液を、製造者の推奨に従って、PD-10カラムAmershamBiosciencesを用いて、5mMのNH4Acに交換した。その後、タンパク質を凍結乾燥し、HBS-EP5mMのHEPES、150mMのNaCl、3.4mMのEDTA、0.005界面活性剤P-20、pH7.4中に溶解した。試料のタンパク質濃度を、280nmでの測定吸光度値、ならびにそれぞれのタンパク質の理論的吸光係数から算定した。His6-タグ化ZHER2変異体のバイオセンサー分析His6タグ化ZHER2変異体とHER2との間の結合活性を、ビアコア登録商標2000BiacoreABUppsalaSwedenを用いて分析した。ヒトHER2およびHIV-1gp120ProteinSciencesCorporation、2003-MNを、製造者の推奨に従って、CM-5チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、別個のフローセル中に固定した。ヒトHER2およびHIV-1gp120の固定化は、それぞれ2631および3138共鳴単位RUを生じた。第三のフローセル表面を活性化し、及び注入を行う間のブランクとして用いるために不活性化した。ZHER2変異体を、1×HBS-EP5mMのHEPES、150mMのNaCl、3.4mMのEDTA、0.005界面活性剤P-20、pH7.4中に希釈して、最終濃度を1μMとし、10μl/分の一定流量で注入した。総注入時間は1分会合で、その後3分間洗浄した解離。表面を、10mMのHClの30秒間の注入により再生した。参照細胞中で測定された応答活性化/不活性化表面を、固定化HER2を有する細胞中で測定された応答から差し引いた。3つの精製タンパク質ZHER23035、ZHER20434およびZHER20024は、図32のセンサグラムにより例示されるように、HER2と特異的に結合した。これらのZHER2変異体の配列は図1に示されており、配列番号77~79として配列表で同定される。"