"抗生物質のハイスループットスクリーニング方法であり、aスクリーニングの候補を用意し、b蛍光モエノマイシンと膜貫通ドメインとトランスグリコシラーゼドメインを含むクラスA型ペニシリン結合タンパク質で蛍光異方性測定を実行し、c蛍光異方性値とKD値を計算し、dトランスグリコシラーゼ阻害剤のKI及びIC50値を計算し、e阻害剤の最低阻害濃度を求めることを含み、KDはモエノマイシンとタンパク質との間の解離定数であり、KIは阻害剤とタンパク質との間の解離定数であり、IC50は細菌の増殖を半分に阻害するのに必要な阻害濃度であり、最低阻害濃度とは細胞の増殖を防止する阻害剤の最低濃度である方法。抗生物質がトランスグリコシラーゼ阻害剤である、請求項1に記載の方法。トランスグリコシラーゼ阻害剤がZ-5-4-ブロモフェニル-3-5-ニトロフラン-2-イルメチレンフラン-23H-オン、Z-1,3-ジフェニル-4-2-チアゾール-2-イルヒドラゾノ-1H-ピラゾール-54H-オン、E-4-2-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-2-イルプロプ-1-エニル安息香酸である、請求項2に記載の方法。タンパク質がN末端からC末端に向かって膜貫通、トランスグリコシラーゼ、トランスペプチダーゼの3つのドメインを含む、請求項1に記載の方法。モエノマイシンがペニシリン結合タンパク質に結合する、請求項1に記載の方法。抗生物質が細菌の増殖を阻害し、細菌がEscherichiacoli、Klebsiellapneumoniae、Streptococcuspneumoniae、Shigellaflexneri、Haemophilusinfluenzae、Helicobacterpylori、Citrobacterfreundii、Bordetellapertussi、Staphylococcusaureus、Bacillussubtilis、Pseudomonasaeruginosa、Clostridiumdifficile、Enterococcusfaecium、Enterococcusfaecalis、Salmonellaenterica又はNeisseriagonorrhoeaeである、請求項1に記載の方法。細菌がEfaecalis又はSaureusである、請求項6に記載の方法。前記クラスA型ペニシリン結合タンパク質が以下の手段によって得られることを特徴とする、請求項1記載の方法。a細菌のゲノムDNAから完全長ペニシリン結合タンパク質のDNA配列を増幅させ、bDNA配列をベクターにクローニングし、cホスト細胞内でDNA配列を発現させて完全長ペニシリン結合タンパク質を得て、dタンパク質を界面活性剤で可溶化し、eタンパク質を精製することを含み、界面活性剤がn-デシル-β-D-マルトピラノシド、n-ウンデシル-β-D-マルトピラノシド、n-ドデシル-β-D-マルトピラノシド、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド、n-ノニル-β-D-グルコピラノシド、n-テトラデシルホスホクロリン、n-ドデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシド、3-[3-コラミドプロピル-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート又はα-[4-1,1,3,3-テトラメチルブチルフェニル]-w-ヒドロキシ-ポリオキシ-1,2-エタンジイルである。細菌がEscherichiacoli、Klebsiellapneumoniae、Streptococcuspneumoniae、Shigellaflexneri、Haemophilusinfluenzae、Helicobacterpylori、Citrobacterfreundii、Bordetellapertussi、Staphylococcusaureus、Bacillussubtilis、Pseudomonasaeruginosa、Clostridiumdifficile、Enterococcusfaecium、Enterococcusfaecalis、Salmonellaenterica又はNeisseriagonorrhoeaeである、請求項8に記載の方法。界面活性剤がn-ドデシル-β-D-マルトピラノシドである、請求項8に記載の方法。タンパク質がN末端からC末端に向かって膜貫通、トランスグリコシラーゼ、トランスペプチダーゼの3つのドメインを含む、請求項8に記載の方法。本発明は細菌から完全長クラスA型ペニシリン結合タンパク質を発現及び精製するための方法を提供するものであり、a細菌のゲノムDNAから完全長ペニシリン結合タンパク質のDNA配列を増幅させ、bDNA配列をベクターにクローニングし、cホスト細胞内でDNA配列を発現させて完全長ペニシリン結合タンパク質を得て、dタンパク質を界面活性剤で可溶化し、eタンパク質を精製することを含み、界面活性剤はn-デシル-β-D-マルトピラノシド、n-ウンデシル-β-D-マルトピラノシド、n-ドデシル-β-D-マルトピラノシド、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド、n-ノニル-β-D-グルコピラノシド、n-テトラデシルホスホクロリン、n-ドデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシド、3-[3-コラミドプロピル-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート又はα-[4-1,1,3,3-テトラメチルブチルフェニル]-w-ヒドロキシ-ポリオキシ-1,2-エタンジイルである。ある好ましい実施形態において、細菌はEscherichiacoli、Klebsiellapneumoniae、Streptococcuspneumoniae、Shigellaflexneri、Haemophilusinfluenzae、Helicobacterpylori、Citrobacterfreundii、Bordetellapertussi、Staphylococcusaureus、Bacillussubtilis、Pseudomonasaeruginosa、Clostridiumdifficile、Enterococcusfaecium、Enterococcusfaecalis、Salmonellaenterica又はNeisseriagonorrhoeaeである。好ましくは、完全長クラスA型ペニシリン結合タンパク質の精製に使用する界面活性剤はn-ドデシル-β-D-マルトピラノシドである。加えて、完全長タンパク質は3つのドメインを含み、N末端からC末端に向かって膜貫通ドメイン、トランスグリコシラーゼドメイン、トランスペプチダーゼドメインである。本発明は抗生物質のハイスループットスクリーニング法を更に提供し、この方法はaスクリーニングの候補を用意し、b蛍光モエノマイシンと膜貫通ドメインとトランスグリコシラーゼドメインを含むクラスA型ペニシリン結合タンパク質で蛍光異方性測定を実行し、c蛍光異方性値とKD値を計算し、dトランスグリコシラーゼ阻害剤のKI及びIC50値を計算し、e阻害剤の最低阻害濃度を求めることを含み、KDはモエノマイシンとタンパク質との間の解離定数であり、KIは阻害剤とタンパク質との間の解離定数であり、IC50は細菌の増殖を半分に阻害するのに必要な阻害濃度であり、最低阻害濃度とは細胞の増殖を防止する阻害剤の最低濃度である。ある実施形態において、抗生物質はトランスグリコシラーゼ阻害剤であり、好ましくはZ-5-4-ブロモフェニル-3-5-ニトロフラン-2-イルメチレンフラン-23H-オン、Z-1,3-ジフェニル-4-2-チアゾール-2-イルヒドラゾノ-1H-ピラゾール-54H-オン、E-4-2-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-2-イルプロプ-1-エニル安息香酸である。ある好ましい実施形態において、タンパク質は3つのドメインを含み、N末端からC末端に向かって膜貫通ドメイン、トランスグリコシラーゼドメイン、トランスペプチダーゼドメインである。本発明において、蛍光プローブとして使用するモエノマイシンは、蛍光異方性に基づいたアッセイの実行時にペニシリン結合タンパク質に結合する。その他の好ましい実施形態において、本発明の方法でスクリーニングされたヒット化合物であるところの抗生物質はEscherichiacoli、Klebsiellapneumoniae、Streptococcuspneumoniae、Shigellaflexneri、Haemophilusinfluenzae、Helicobacterpylori、Citrobacterfreundii、Bordetellapertussi、Staphylococcusaureus、Bacillussubtilis、Pseudomonasaeruginosa、Clostridiumdifficile、Enterococcusfaecium、Enterococcusfaecalis、Salmonellaenterica又はNeisseriagonorrhoeaeである細菌の増殖を阻害する。好ましい実施形態において、細菌はEfaecalis又はSaureusである。以下の実施例は非限定的であり、本発明の多様な態様と特徴を表しているにすぎない。完全長ペニシリン結合タンパク質の発現EcoliのPBP1b変異体の発現と精製EcoliSwiss-Protaccessionnumber:P02919からの完全長PBP1bをゲノムDNAから増幅し、pETベクターEMDSciences社。サンディエゴ、カリフォルニア州にクローニングし、N末端His6タグで発現させた。BL21DE3Ecoliホスト細胞を37°Cで600nmでのODが0.6に達するまで増殖させ、タンパク質発現を1mMのIPTGで3時間に亘って誘発させた。細胞ペレットをpH8.0の20mMのトリス、300mMのNaClに再懸濁させ、マイクロフルイダイザMicrofluidics社、ニュートン、マサチューセッツ州、米国で粉砕した。組み換え完全長膜タンパク質の可溶化と精製を様々な界面活性剤を用いてテストしAnatrace社、マウミー、オハイオ州、米国、n-デシル-β-D-マルトピラノシド、n-ウンデシル-β-D-マルトピラノシド、n-ドデシル-β-D-マルトピラノシド、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド、n-ノニル-β-D-グルコピラノシド、n-テトラデシルホスホクロリン、n-ドデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシド、CHAPS3-[3-コラミドプロピル-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート及びTritonX-100α-[4-1,1,3,3-テトラメチルブチルフェニル]-w-ヒドロキシ-ポリオキシ-1,2-エタンジイルが含まれる。中でも、DDMn-ドデシル-β-D-マルトピラノシドは完全長PBP1bを可溶化し、かつそのモエノマイシン結合活性を維持させることが判明した。従って、完全長PBP1bを20mMのDDMで可溶化させ、1mMのDDMの存在下で製造業者の指示に従ってニッケルキレート化クロマトグラフィで精製した。PBP1bのドメインは膜貫通ドメインTM、残基64-87、トランスグリコシラーゼドメインTG、残基195-409、トランスペプチダーゼTP、残基444-736として定義した。ヌクレオチドプライマはTGTP残基88-844、TMTG残基1-409、TG残基195-409、及びTP残基444-736を含有するそれぞれの変異体を増幅するように設計された。増幅物は発現と精製のためにpETベクターへとクローニングした。変異体TMTGを得るための手順は完全長タンパク質の調製について記載したとおりである。TGTP、TG及びTPの変異体については、13mMのn-テトラデシルホスホクロリンAnatrace社をタンパク質の抽出に、0.25mMのものをニッケルキレート化クロマトグラフィに用いた。界面活性剤を1mMのDDMに交換し、アミコンウルトラフィルターユニットMillipore社、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国を用いて濃縮した。16の細菌株からの組み換え完全長二機能性PBPの発現及び精製完全長二機能性PBPのホモログを、EcoliからのPBP1bタンパク質配列Swiss-Protaccessionnumber:P02919を用いてBLASTでNCBIデータベースでの同定を行ったhttpwwwncbinlmnihgovBLAST。トランスグリコシラーゼモチーフと活性部位の存在を確認するため、Jalviewプログラム4をMUSCLE多重アラインメントアルゴリズム5と共に用いて配列をアラインし、アラインされた出力図2をESPript6を用いて作成した。明確にするため、以下の残基はアライメントから除外した:BpeBpertussis:354-443、NgoNgonorrhoeae:331-416、BsuBsubtilis:615-643、735-787、797-835、及び897-914、及びCdiCdifficile:267-322及び804-842。個々のPBPの発現のために、ゲノムDNAをAmericanTypeCultureCollectionATCC、マナサス、ヴァージニア州、米国から購入した。Escherichiacoli、Klebsiellapneumoniae、Streptococcuspneumoniae、Shigellaflexneri、Haemophilusinfluenzae、Helicobacterpylori、Citrobacterfreundii、Bordetellapertussi、Staphylococcusaureus、Bacillussubtilis、Pseudomonasaeruginosa、Clostridiumdifficile、Enterococcusfaecium、Enterococcusfaecalis、Salmonellaenterica及びNeisseriagonorrhoeaeを含む16の細菌からの完全長遺伝子の組み換えタンパク質を完全長EcoliのPBP1bについて記載したものと同じプロトコルを用いて調製した。その殆どは80より高い純度で得ることができ図3、結合実験のために使用可能である。抗生物質のハイスループット検出材料及び方法表面プラズモン共鳴検出精製したPBP及びその変異体をCM3チップGEhealthcare社、ウプサラ、スウェーデン上に約1500~2000RUまでアミン結合法を用いて固定化した。次にチップを異なる濃度のモエノマイシンA0-2000nMに通した。固定化及びデータ収集をBIAcoreT100GEHealthcare社、ウプサラ、スウェーデンを用いて25°Cで行った。蛍光異方性測定蛍光異方性測定を488nmレーザを備えたレーザ蛍光分析装置IsoCyte、BlueshiftBiotech社、サニーヴェール、カリフォルニア州、米国を用いて384ウェルプレートのウェルで3回行った。各種バッファ、塩、pH値、及び二価陽イオンCa、Mg、Coを蛍光異方性測定にむけて最適化した。KD及びKIは100mMのNaCl、pH8.0の10mMのトリスにおいて求めた。走査の焦点は、検出の障害とならないようにプレート底部の上方であった。データ分析はプロプライエタリソフトウェアであるBlueImageBlueshiftBiotech社を用いて行った。蛍光異方性値Aは方程式:A=/I平行2GI垂直を用いて計算し、I平行は励起光に平行な放射光の蛍光強度であり、I垂直は励起光に対して垂直な放射光の蛍光強度であり、Gは機器バイアスを修正するためのゲーティングファクタである。Gファクタは各回ごとにプローブだけのウェルを基準異方性として用いて実験的に求めた。直接結合アッセイからのKD値の測定直接結合アッセイにおいて、初期条件にはpH8.0、10mMのトリス、100mMのNaCl中の40μlの100nMのF-Moeが含まれた。少量のPBP原液を添加した後、5分間の平衡後に異方性の変化を測定した。直接滴定はリガンドLとレセプタRとの単純な結合平衡に沿うものとみなすRLS⇔RLSでKD=RLS/RLS。データをPrismGraphPadSoftware社、サンディエゴ、カリフォルニア州を用いて[方程式1KD]にフィットさせ、KD3を求めた。A測定-A最低/A最高-A最低=KDLSTRT-[KDLSTRT]2-4LSTRT]1/2[方程式1]であり、A測定は観察された異方性、A最低は最低異方性、A最高は最高異方性、LSTはF-Moeの総濃度、RTはPBPの総濃度、KDはリガンドF-MoeとレセプタPBPとの間の解離定数である。報告値は4回の平均である。KI及びIC50値の競合置換アッセイによる測定競合置換において、初期条件にはpH8.0、10mMのトリス、100mMのNaCll中の40μlの100nMのF-Moe、10μg/mlのHpyloriのPBP1aが含まれた。化合物原液のアリコートを添加し、5分間の平衡の後、異方性をモニタした。置換アッセイによって得られたデータを用いて、完全競合結合モデルRLLS⇔KLRLSL⇔KDRLSL3を用いて阻害剤の阻害定数KIとIC50値を計算した。KI値は総阻害剤濃度Cを結合/遊離F-Moeのモル比に対してプロットし、得られた曲線を[方程式2]にフィットさせることで求めた。C=[KI/KDX1][RT-LSTX/X1-KDX][方程式2]X=結合/遊離=A測定-A最低/A最高-A測定ここでA測定は化合物の特定濃度Cで観察された異方性、A最低は最低異方性、A最高は最高異方性、LSTはF-Moeの総濃度、RTはPBP1aの総濃度、KDはリガンドF-MoeとレセプタPBPとの間の解離定数、KIは阻害剤とPBP1aとの間の解離定数である。報告値は4回の平均である。IC50を求めるために、結合蛍光プローブの割合を競合物濃度Cの対数値に対してプロットする。得られたS次型曲線を[方程式3]を用いてフィットさせると、IC50値が得られる。A測定-A最低/A最高-A最低=1/110^C-logIC50傾き[方程式3]ここでA測定は化合物の特定濃度Cで観察された異方性であり、A最低は最低異方性、A最高は最高異方性である。TG阻害剤のハイスループットスクリーニングFAアッセイを購入した50000個の小分子ChemBridge社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国と我々が所有するコレクションのうちの7000個に対してのスクリーニングに使用した。化合物を96ウェルプレートFreedomEvo、TecanSchweizAG社、マネドルフ、スイスに、次に384ウェルプレートへとマルチディスペンサLabcyte社、サニーヴェール、カリフォルニア州、米国を用いて移し、スクリーニング用の化合物のプレートを準備した。最終容量40μl、pH8.0の100nMのF-Moe、10mMのトリス、100mMのNaCl中のHpyloriのPBP1a10μg/mlを384ウェルプレートに加えたFreedomEvo150、Tecan社。2mM化合物原液の1μlをマルチディスペンサLabcyte社を用いてウェルに加えた。各プレートの最後2つのカラムはコントロールである10μMのモエノマイシンと2.5のDMSOにそれぞれ用いた。30分の培養後、蛍光異方性における変化をIsocyteBlueshiftBiotech社を用いて求めた。コントロールの異方性値と比較して75より高い低下を示したヒット化合物を更に調べるために選択した。最低阻害濃度minimalinhibitoryconcentrationMICの測定試験化合物の最低阻害濃度MICをNCCLS基準に従って求めた。実験は血液を加えたStreptococcuspneumonia又は加えていないBacillussubtilis、Enterococcusfaecalis、Staphylococcusaureusミュラーヒルトン培養液での二倍希釈を用いて96ウェルマイクロタイタープレートで行った。5x105細胞/mlで指数関数的に増殖する細胞を様々な濃度の試験化合物で培養した。18~24時間に亘る37°Cでの培養後、細菌の増殖を防止する化合物の最低濃度としてMICを求めた。結果クラスA型ペニシリン結合タンパク質へのモエノマイシン結合のドメイン要件二機能性トランスグリコシラーゼEcoliからのPBP1bの異なるドメインを含むタンパク質構築物を、表面プラズモン共鳴SPRを用いたモエノマイシン結合活性測定用に発現、適した界面活性剤を用いて精製した実施例1。5つのEcoliのPBP1b変異体を発現、精製した:膜貫通ドメイン、トランスグリコシラーゼドメイン及びトランスペプチダーゼドメインを含む完全長タンパク質TMTGTP、2TGTP、3TMTG、4TG及び5TP図1B。ターゲットタンパク質をセンサーチップ上に固定化した後、異なる濃度のモエノマイシンを表面に通し、結合親和性を求めた。図1Bに図示されるように、膜貫通ドメインを有していないPBPTGTPのモエノマイシン結合活性は完全長PBP1bの結合活性と比較すると約5倍低かった。その一方で、TMTGの結合活性は完全長タンパク質の結合活性と同様である。結果は、膜貫通ドメインがモエノマイシン結合において重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。完全長タンパク質のモエノマイシン結合親和性は4.4x10-7Mと求められており、TG反応についての阻害能と同様であったStemberaKVogelSBuchynskyyAAyalaJAWelzelPChembiochem3559565。我々は、SPR分析でのモエノマイシンAのC25脂質の非特異的な結合を憂慮していたが、TP変異体をコントロール用のタンパク質として用い、求められたモエノマイシンのPBP1b変異体に対しての結合親和性が顕著であり特異的なものであることが確認された。切断PBP1b変異体を使用した結合実験は、TMPG変異体の結合親和性が完全長タンパク質の結合親和性と同様であることを更に示した。MoeA結合におけるTMドメインの役割が、TGTP変異体の結合能が完全長PBP1bのものと比較して5倍も低下したという観察結果から示された図1B。モエノマイシンのPBP結合活性と最低阻害濃度MICの相関関係膜貫通ドメインはモエノマイシン結合に大きく関与することから、モエノマイシン結合の研究のために16のグラム陰性及びグラム陽性細菌表1からの完全長PBPの準備に着手した。クラスA型PBPの遺伝子はNCBIデータベースhttpwwwncbinlmnihgovBLASTを用いて同定し、この全てがTG及びTPモチーフを有していることが確認されたBarrettDSChenLLittermanNKWalkerSBiochemistry4312375DiGuilmiAMDessenADidebergOVernetTJBacteriol18516501658図2。ターゲット遺伝子を個々の細菌種のそれぞれのゲノムDNAから増幅して発現ベクターにクローニングし、Ecoliホストを用いて組み換えタンパク質を産生させた。精製したタンパク質の酵素活性は脂質II重合によって確認されデータ提示せず、モエノマイシン結合はSPRで測定した。表1に示されるように、異なる種から得たPBP間には様々な定常状態親和性KD値が見えられたが、測定されたKD値は全て10-7Mの範囲内に収まり、トランスグリコシル化プロセスについて報告された阻害濃度に近いStemberaKVogelSBuchynskyyAAyalaJAWelzelPChembiochem3559565。興味深いことに、テストしたグラム陽性細菌の中でも、EfaecalisとSaureusのPBPのKD値はMIC値と相関関係にあり、PBPのモエノマイシン結合部位がこれらの種に対しての抗生物質の開発にとってよいターゲットとなり得ることを示唆している。表116の細菌株についての抗菌活性とモエノマイシンのPBP結合親和性との相関関係1異なる細菌種に対してのモエノマイシンのMIC。2文献から得たモエノマイシンのMIC値。3個々の細菌株から得たクラスA型PBP遺伝子の配列ID。クラスA型PBPのホモログをBLASTを用いてNCBIデータベースで同定した。4SPRを用いてのPBPホモログとモエノマイシンのKD。平均値を示す。5本発明のFAに基づいたアッセイを用いて得たPBPホモログとモエノマイシンとのKD。トランスグリコシラーゼ阻害剤についての蛍光異方性に基づいたアッセイの開発完全長タンパク質をモエノマイシン結合研究に使用できるとの結論に基づいて、蛍光異方性FAに基づいたアッセイを設計し、TGに対しての小分子の結合親和性をモニタした。複雑な結晶構造LoveringALdeCastroLHDLimDStrynadkaNCScience31514021405及び構造活性関係WelzelPChemRev10546104660についての従来の研究は、化合物1から2への変性図4Aは結合と抗菌性を劇的に低下させることはないことを示唆した。更に、2のアミノ部分により、結合研究用のモエノマイシン型のプローブとしてのいずれのフルオロフォアとの共役が可能となるBuchynskyyAKempinUVogelSHennigLFindeisenMMullerDGiesaSKnollHWelzelPEurJOrgChem711491162DonnerstagAMarzianSMullerDWelzelPTetrahedron5119311940。実際、化合物2は基本条件下で即座にフルオレセイン6-カルボキシフルオレセインN-ヒドロキシスクシンイミドエステルに結合して蛍光プローブ3を生成したF-Moe、図4B。FAアッセイで使用の蛍光プローブについての主な懸念の1つはプローブそれ自体、つまりフルオロフォア又は構造変性のいずれかがターゲットタンパク質と小分子との結合を阻害することである。従って、MoeAのPBP結合親和性及び蛍光プローブをSPRを用いて比較した。求めた定常状態親和性KD値はMoeA及びF-Moeについて同様であった4.4x10-7対5.2x10-7M図4C及び4D。この結果によりF-MoeがFAに基づいたPBP結合アッセイに有用な有効蛍光プローブであることが確認された。F-Moeの異方性はEcoliのPBP1bとの培養により著しく上昇し、これはF-Moe-PBP1b複合体の形成によるものと思われる図5A。対照的に、F-Moeの異方性は、100μMまで、ウシ血清アルブミンとの培養では変化しなかったデータ提示せず。タンパク質濃縮物を、異方性変化の用量依存性を確立するために更に滴定に供した。F-Moeについての推定解離定数KDはEcoliのPBP1bにおいてはサブミクロモル範囲にあった図5A。しかしながら、EcoliのPBP1bを用いたFAアッセイの信号対雑音比は不十分であり、最高異方性は0.120である。従って、異なるクラスA型PBPをスクリーニングしてアッセイを改良した。試験したホモログ全てにおいて、HelicobacterpyloriのPBP1aを用いたFAアッセイが25/-14nMの最適な信号対雑音比を出し、異方性はF-Moeへの結合時に0.018から0.2へと上昇した図5B。阻害剤スクリーニング用のアッセイを開発するために、F-MoeをHpyloriのPBP1aと予備培養し、次に様々な濃度の無標識のMoeAとの競合に供した。MoeAの濃度が上昇するにつれて異方性の低下が観察され、KI阻害定数とIC50値はそれぞれ0.47/-0.10μMと0.36μMとなった図5C。この結果により、FAアッセイがPBPのモエノマイシン結合ポケットからプローブを競合的に置換する阻害剤をスクリーニングすることが実証された。トランスグリコシラーゼ阻害剤のハイスループットスクリーニング幾つかのモエノマイシン類似体2、4、5を調製してFAに基づいたアッセイの信頼性を評価した。表2に示されるように、これらのモエノマイシン類似体のFAに基づいたアッセイで求めた異なる結合親和性IC50値は、発表された論文のものに類似しているMarzianSHappelMWagnerUMullerDWelzelPFehlhaberHWStarkASchutzHJMarkusALimbertMvanHeijenoortYvanHeijenoortJTetrahedron5052995308。モエノマイシンAから2への変性によりTG結合親和性は若干低下した。8炭素スペーサを介した2の二量体化により、PBP結合能と抗菌性の双方が2より2倍上昇した4が得られたが、4はそれでもMoeA1よりも強度が低い。より顕著には、C25脂質部分を有していない化合物5はF-Moeプローブ3を置換することがほとんどできず、これはモエノマイシンの疎水性部分が完全長PBP1bへの結合に不可欠であることを示している。阻害能の順序がMIC値の順序と一致していることは注目に値する表2。表2選択されたヒット化合物のTG活性の阻害と抗菌性測定1化合物2、4、5はモエノマイシン誘導体である。化合物6~8はハイスループットスクリーニングでスクリーニングされたヒット化合物である。2IC50値は図5Aで図示の蛍光異方性アッセイを用いて求められた。3異なる細菌種に対してのモエノマイシンのMICを材料と方法で記載したように求めた。ATCCはアメリカンタイプカルチャーコレクションの略。モエノマイシン及びその類似体はグラム陽性細菌に対してよく効くものの、その薬物動態特性の悪さによりTG阻害剤開発において新たなリード化合物が必要とされている。HTSフォーマットでの効率的かつ経済的なTGアッセイは、新規のTG阻害剤の同定に役立つと思われる。FAアッセイを用いて50μMでMoeA誘導体図6と共に57000個の小分子のコレクションをスクリーニングした。モエノマイシン1μMでのアッセイをハイコントロール、2.5DMSOでのアッセイをローコントロールとした。ウシ血清アルブミン等のその他のタンパク質もコントロールとして含めることで、異方性の上昇が非特異的な結合によるものでないことを確認した。ハイスループットスクリーニングのロバスト性を評価するための0から1の範囲の統計パラメータであるZ ́値ZhangJHChungTDOldenburgKRJBiomolScreen46773を100を越える個々の実験から0.895と求めた。スクリーニングでヒットした11の少なくとも75の阻害を示した化合物を、PBP結合に関して抗菌性アッセイとIC50値の測定を含め更に研究するため選び出した図7A。中でも、2つのモエノマイシン類似体2及び4及び3つの小分子化合物6、7及び8が抗菌性とTG結合阻害活性の双方を有していると確認された表2。化合物6、7、8はそれぞれZ-5-4-ブロモフェニル-3-5-ニトロフラン-2-イルメチレンフラン-23H-オンZ-1,3-ジフェニル-4-2-チアゾール-2-イルヒドラゾノ-1H-ピラゾール-5-4H-オン;E-4-2-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン―2―イルプロプ-1-エニル安息香酸である。本発明のFAに基づいたアッセイを用いて、0.895のZ ́値で0.02のヒット率が得られ、これはこのアッセイを膨大な化合物ライブラリから可能性のあるヒット化合物を迅速に同定するためのロバストな一次スクリーニングとして使用可能なことを示唆している。選択したヒット化合物を抗菌性アッセイ又は脂質II重合活性分析を用いて更にスクリーニングし、リード化合物を同定する。全ての蛍光を利用したアッセイと同様に、本発明のFAに基づいたアッセイは蛍光化合物についてTG阻害活性を求めるのに使用することはできない。しかしながら、FAに基づいたPBP結合アッセイは新規の抗菌剤の発見に非常に強力なHTSアッセイであることが実証された。本発明を当業者がそれを実践するのに十分な詳細さでもって説明、例示してきたが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく様々な代替、改変、改良が可能であることは明白である。本発明が目的を達成し、本来備えているもののみならず、記載の結果と利点を得るに十分に適合されていることを当業者は容易に理解するものである。その改変及びその他の使用は他の当業者の想定内である。これらの改変は本発明の精神の範囲に含まれ、請求項の範囲によって定められる。"