"本明細書に記載される発明。発明の概要本発明は、ヒトFcγRIIBに選択的に結合する抗原結合ポリペプチドまたは抗体を提供する。本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、ヒトFcγRIIBに、他のヒトFcγR類に結合するよりも有意に良好な親和性で結合し、いくつかの実施形態においては、ヒトFcγRIIAと本質的に交差反応できない。いくつかの実施形態において、ヒトFcγRIIBに選択的に結合する本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、少なくとも1つまたは複数のCDR配列番号1、2、3、4、5、および6の抗体相補性決定領域を含んでなり、さらなる実施形態において、配列番号1、2、および3の重鎖CDR、および/または配列番号4、5、および6の軽鎖CDRを含む。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、配列番号1、2、3、4、5、および6の1つまたは複数のCDRの改変体である1つまたは複数のCDRを含んでなり、該改変体は、配列番号1、2、3、4、5、および6の1つまたは複数のCDRと、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、少なくとも98、または少なくとも99のアミノ酸配列同一性を有する。さらなる実施形態において、該改変体の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、FcγRIIBに対する抗体5A6の親和性よりも、およそ10倍小さい親和性から、およそ少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍大きな親和性でFcγRIIBに結合するが、ヒトFcγRIIAと本質的に交差反応することはできないままである。さらなる実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、配列番号7の重鎖可変ドメインおよび/または配列番号8の軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体、またはモノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体の断片である。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくは多特異性抗体、またはそれらの断片などの本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、ATCC登録番号PTA-4614を有するハイブリドーマ細胞株から産生された抗体に由来する。本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、治療的抗体または化学療法剤によって処置される疾患または障害の治療方法において、治療的抗体または化学療法剤とともに投与される。本発明は、上記のものなどの、FcγRIIBに選択的に結合する抗体または抗原結合ポリペプチド、およびFcεRIなどの活性化受容体に特異的に結合する第2の抗体または抗原結合ポリペプチドを含む単離二重特異性抗体を提供する。本発明の二重特異性抗体は、例えば、アレルギー、喘息、および炎症に関連した免疫応答阻害およびヒスタミン放出抑制の方法に有用である。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、哺乳動物細胞におけるFcγRIIB受容体と活性化受容体との共凝集による哺乳動物細胞中のFcγRIIB受容体の活性化に有用である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞であり、さらなる実施形態において、ヒト細胞は、T細胞、B細胞、肥満細胞、好塩基球、抗原提示細胞、マクロファージおよび/または単球である。全身ITIMタンパク質媒介阻害を含む実施形態では、このような阻害は典型的に、T細胞、B細胞、肥満細胞、好塩基球、および抗原提示細胞に生じる。阻害が、FcγRIIBに媒介される実施形態では、このような阻害は典型的に、肥満細胞、好塩基球、抗原提示細胞、単球、マクロファージ、およびB細胞に生じる。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、FcγRIIB受容体の活性不活化、阻害または該受容体発現のダウンレギュレーションに有用である。FcεRIが阻害またはダウンレギュレートされる実施形態では、この阻害またはダウンレギュレーションは典型的に、哺乳動物の肥満細胞、好塩基球、および抗原提示細胞に生じる。一態様において、本発明は、薬学的キャリア中に、単離抗huFcγRIIB/抗huFcεRI二重特異性抗体を含む組成物を包含する。他の実施形態において、本発明は、単離抗huFcγRIIB/抗huFcεRI二重特異性抗体および単離抗IgE抗体を含む組成物を包含する。組み合わせ組成物における抗huFcγRIIB/抗huFcεRI二重特異性抗体対抗IgE抗体の有用な比率は、各患者に関して容易に決定される。この比率は、典型的に、およそ0.01:1から100:1の範囲内にある。該組成物の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。他の態様において、本発明は、抗huFcγRIIB/抗huFcεRI二重特異性抗体を投与することにより哺乳動物における免疫障害を治療する治療的方法を包含する。一実施形態において、該哺乳動物は、アレルギー障害、喘息および/または炎症の治療を必要としているヒト患者などのヒト患者である。他の実施形態において、該治療方法はさらに、免疫障害、アレルギー、喘息を経験しているか、またはヒスタミン放出の抑制を必要としている哺乳動物に、本発明の抗huFcγRIIB/抗huFcεRI二重特異性抗体を投与することを含む。さらなる実施形態において、本発明の抗huFcγRIIB/抗huFcεRI二重特異性抗体は、抗IgE抗体と組み合わせて投与され、該投与は、時間を離してなされるか、または連続的になされる。一実施形態において、抗IgE抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる一実施形態において、抗IgE抗体は、Xolair登録商標である。さらなる一実施形態において、該二重特異性抗体は、進行中の免疫障害に対する治療的処置の一部として例えば、同じ治療法の一部として抗IgE抗体と組み合わせて投与され、該二重特異性抗体は、抗IgE抗体とは別に同時ではなく投与される。他の実施形態において、該二重特異性抗体と抗IgE抗体とは同時に投与される。組み合わせ投与における抗huFcγRIIB/抗huFcεRI二重特異性抗体対抗IgE抗体の有用な比率は投与が別々の時間に行われても、同時に行われても、各患者に関して容易に決定される。本発明の目的に関して、この比率は、およそ0.01:1から100:1および患者に対して決定されるその範囲内の任意の比率である。有用な比率は、例えば、0.05:1、0.1:1、0.5:1、1:1、1:0.5、1:0.1、および1:0.05であり得るが、標準的な臨床的方法によって決定され得る有用な比率を排除するものではない。本発明はさらに、該抗体をコードする単離核酸、その核酸を含むベクターまたは宿主細胞、ならびに該宿主細胞の培養を含んでなり、および任意に、該宿主細胞培養物から例えば、宿主細胞培地または宿主細胞培養培地から該抗体を回収することをさらに含む抗体作製方法を提供する。例えば、本発明は以下を提供する:項目1配列番号1、2、3、4、5、および6よりなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含む単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体であって、該抗体はFcγRIIB受容体に選択的に結合する、単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。項目2前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体の重鎖CDRが、配列番号1および/または配列番号2および/または配列番号3を含む、項目1に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。項目3前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体の軽鎖CDRが、配列番号4および/または配列番号5および/または配列番号6を含む、項目1に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。項目4前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、項目1に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。項目5前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、項目1に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。項目6前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号7および8のアミノ酸配列を含む、項目1に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。項目7前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはそれらの断片である、項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体。項目8前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、FcγRIIBに対する抗体Fc領域の結合に拮抗する、項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体。項目9ATCC登録番号PTA-4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の結合特性を有する、項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体。項目10ATCC登録番号PTA-4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の結合特性を有する、単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。項目11ATCC登録番号PTA-4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された、単離抗体またはその抗原結合ポリペプチド断片。項目12FcγRIIBを項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体に結合する工程を包含する、FcγRIIB活性をダウンレギュレートする方法。項目13FcγRIIA活性をダウンレギュレートすることなく、FcγRIIB活性がダウンレギュレートされる、項目12に記載の方法。項目14a治療的抗原結合ポリペプチド、抗体、または化学療法剤を投与する工程;およびb項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体を投与する工程を包含する、哺乳動物における疾患または障害の処置方法。項目15項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の投与を包含する、哺乳動物における疾患または障害の処置方法。項目16a項目1に記載の第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体;およびb活性化受容体に特異的に結合する第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体を含む、単離二重特異性抗体。項目17前記第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体がFcεRIに結合する、項目16に記載の単離二重特異性抗体。項目18前記第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはそれらの断片である、項目16に記載の単離二重特異性抗体。項目19前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の重鎖CDR1、2、および3が、それぞれ、配列番号1、2、および3を含む、項目16に記載の単離二重特異性抗体。項目20前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の軽鎖CDR1、2、および3が、それぞれ、配列番号4、5、および6を含む、項目16に記載の単離二重特異性抗体。項目21前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号7のアミノ酸配列を含む可変ドメイン重鎖を含む、項目16に記載の単離二重特異性抗体。項目22前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号8のアミノ酸配列を含む可変ドメイン軽鎖を含む、項目16に記載の単離二重特異性抗体。項目23前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、ATCC登録番号PTA-4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の結合特性を有する項目16に記載の単離二重特異性抗体。項目24項目16のいずれかの抗体の投与を包含する、哺乳動物における疾患または障害の処置方法。項目25aFcγRIIBに選択的に結合する、ATCC登録番号PTA-4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された第1の抗原結合ポリペプチドもしくは抗体またはその断片、または前記第1の抗体から誘導されたキメラ抗体もしくはヒト化抗体、またはその断片;およびb活性化受容体に特異的に結合する第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体を含む単離二重特異性抗体。項目26前記第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはそれらの断片である、項目25に記載の単離二重特異性抗体。項目27前記第1の抗原結合ポリペプチドもしくは抗体、またはその断片が、ATCC登録番号PTA-4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の重鎖CDRまたは軽鎖CDRを含む、項目25に記載の単離二重特異性抗体。項目28前記第1の抗原結合ポリペプチドもしくは抗体、またはその断片が、ATCC寄託番号PTA-4614のハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の重鎖CDRおよび軽鎖CDRを含む、項目25に記載の単離二重特異性抗体。項目29前記第1の抗体もしくはその断片、または第2の抗体もしくはその断片が、Fab、Fab’、Fab2、Fab’2、Fd、Fd’、scFv、scFv2、dAbよりなる群から選択される抗体断片である、項目25に記載の単離二重特異性抗体。項目30前記活性化受容体がIgE受容体である、項目16に記載の二重特異性抗体。項目31前記IgE受容体がFcεRIである、項目16に記載の二重特異性抗体。項目32前記第1の抗体が前記第2の抗体に共有結合している、項目16に記載の二重特異性抗体。項目33前記第1および第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、少なくとも5つのアミノ酸を含むリンカーによって共有結合している、項目16に記載の二重特異性抗体。項目34前記二重特異性抗体が、重鎖間ジスルフィド結合のできない改変重鎖ヒンジ領域を含む、項目16に記載の二重特異性抗体。項目35前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、ヒトFcγRIIBに結合し、ヒトFcγRIIAには、ほとんどまたは全く結合を示さない、項目16に記載の二重特異性抗体。項目36前記活性化受容体がIgE受容体である、項目25に記載の二重特異性抗体。項目37前記活性化受容体がFcεRIである、項目25に記載の二重特異性抗体。項目38前記第1の抗体が前記第2の抗体に共有結合している、項目25に記載の二重特異性抗体。項目39前記第1および第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、少なくとも5つのアミノ酸を含むリンカーによって共有結合している、項目25に記載の二重特異性抗体。項目40前記二重特異性抗体が、重鎖間ジスルフィド結合のできない改変重鎖ヒンジ領域を含む、項目25に記載の二重特異性抗体。項目41前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、ヒトFcγRIIBに結合し、ヒトFcγRIIAには、ほとんどまたは全く結合を示さない、項目25に記載の二重特異性抗体。項目42項目16に記載の二重特異性抗体を投与する工程を包含する、哺乳動物における免疫応答を阻害する方法。項目43項目16に記載の二重特異性抗体を投与する工程を包含する、哺乳動物における免疫応答に関連するヒスタミン放出を抑える方法。項目44前記ヒスタミン放出が、アレルギー、喘息、または炎症に関連する、項目43に記載の方法。項目45aFcγRIIBを発現する細胞を、項目16に記載の二重特異性抗体に接触させる工程;およびb該FcγRIIBおよび活性化受容体を該二重特異性抗体と共凝集させ、それによって、該FcγRIIBを活性化させる工程を包含する、哺乳動物細胞において、FcγRIIBを活性化させる方法。項目46前記活性化受容体がITAM活性化モチーフを含む、項目45に記載の方法。項目47前記活性化受容体がFcεRIである項目46に記載の方法。項目48FcγRIIBおよびFcεRIの共凝集がFcεRIの発現をダウンレギュレートする項目47に記載の方法。項目49前記細胞がB細胞または肥満細胞である項目48に記載の方法。項目50前記細胞がヒト細胞である項目48に記載の方法。項目51FcεRI受容体およびFcγRIIB受容体を含む細胞に、項目16に記載の二重特異性抗体の有効量を投与することにより、細胞内の該FcεRI受容体の発現を阻害する方法。項目52前記細胞が、該細胞内のFcεRI発現の阻害により軽減される障害にかかっている哺乳動物の細胞である項目45に記載の方法。項目53前記障害が慢性的障害である項目52に記載の方法。項目54前記哺乳動物がヒトである項目53に記載の方法。項目55前記障害が、アテローム硬化症;白血球接着障害;慢性関節リウマチ;全身性エリトマトーデスSLE;真性糖尿病;多発性硬化症;レーノー症候群;自己免疫甲状腺炎;アレルギー性脳脊髄炎;シェーグレン症候群;および若年性糖尿病である項目53に記載の方法。項目56前記方法は、FcεRI活性に関連する慢性的障害の処置を増強する、項目45に記載の方法。項目57cFcγRIIBを発現する細胞を、項目25に記載の二重特異性抗体に接触させる工程;およびd該FcγRIIBおよび活性化受容体を該二重特異性抗体と共凝集させ、それによって、該FcγRIIBを活性化させる工程を包含する、哺乳動物細胞において、FcγRIIBを活性化させる方法。項目58前記活性化受容体がITAM活性化モチーフを含む、項目57に記載の方法。項目59前記活性化受容体がFcεRIである項目57に記載の方法。項目60FcγRIIBおよびFcεRIの共凝集がFcεRIの発現をダウンレギュレートする項目59に記載の方法。項目61前記細胞がB細胞または肥満細胞である項目57に記載の方法。項目62前記細胞がヒト細胞である項目61に記載の方法。項目63FcεRI受容体およびFcγRIIB受容体を含む細胞に、項目25に記載の二重特異性抗体の有効量を投与することにより、細胞内の該FcεRI受容の発現を阻害する方法。項目64前記細胞が、該細胞内のFcεRI発現の阻害により軽減される障害にかかっている哺乳動物の細胞である項目57に記載の方法。項目65前記障害が慢性的障害である項目64に記載の方法。項目66前記哺乳動物がヒトである項目64に記載の方法。項目67前記障害が、アテローム硬化症;白血球接着障害;慢性関節リウマチ;全身性エリトマトーデスSLE;真性糖尿病;多発性硬化症;レーノー症候群;自己免疫甲状腺炎;アレルギー性脳脊髄炎;シェーグレン症候群;および若年性糖尿病である項目64に記載の方法。項目68FcεRI活性に関連する慢性的障害の処置を増強する、項目57に記載の方法。項目69抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドと組み合わせた治療的使用のための、抗FcγRIIB/抗FcεRI二重特異性抗体および薬学的キャリアを含有する組成物。項目70前記抗FcγRIIB結合領域が、配列番号1、2、3、4、5、および6よりなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つfor、5つ、または6つのCDRを含む、項目69に記載の組成物。項目71抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドをさらに含む、項目69に記載の組成物。項目72前記抗IgE抗体がXolair登録商標である項目69に記載の組成物。項目73前記抗IgE抗体がXolair登録商標である項目71に記載の組成物。項目74前記二重特異性抗体が、哺乳動物におけるアレルギー、喘息および/またはまたは炎症の処置のために、抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドと組み合わせて投与するためのものであることを示すラベルをさらに含む、項目69に記載の組成物を含むキット。項目75前記哺乳動物がヒトである項目74に記載のキット。項目76前記二重特異性抗体の投与が、前記抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドとは別個である項目75に記載のキット。項目77前記二重特異性抗体の投与が、前記抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドの投与と同時である項目76に記載のキット。項目78前記抗IgE抗体がXolair登録商標である項目74に記載のキット。項目79前記二重特異性抗体および抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドが、哺乳動物におけるアレルギー、喘息および/またはまたは炎症の処置のためのものであることを示すラベルをさらに含む、項目71に記載の組成物を含むキット。項目80前記哺乳動物がヒトである項目79に記載のキット。項目81前記抗IgE抗体がXolair登録商標である項目80に記載のキット。項目82アレルギー、喘息および炎症よりなる群から選択される障害を経験している哺乳動物に、抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドと組み合わせて、抗FcγRIIB/抗FcεRI二重特異性抗体を投与する工程を包含する処置方法。項目83前記二重特異性抗体および前記抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドの投与は別個である項目82に記載の方法。項目84前記二重特異性抗体および前記抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドの投与が同時である項目82に記載の方法。項目85前記哺乳動物がヒトである項目82に記載の方法。項目86前記抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドがXolair登録商標である項目82に記載の方法。詳細な説明I.定義アレルギーとは、環境抗原に対する免疫応答が、組織の炎症および器官の機能障害を引き起こす一定の疾患を言う。アレルゲンは、アレルギーを引き起こす何らかの抗原である。したがって、それは、抗原性分子自体、または花粉粒、動物のふけ、昆虫毒、もしくは食品などの抗原分子源のいずれかであり得る。IgEは、アレルギー障害において中心的な役割を演じている。IgE高親和性受容体FcεRIは、アレルギー性疾患の症状発現の多くを生み出す炎症伝達物質のさらなる放出を刺激する抗原性標的として働く肥満細胞および好塩基球上に位置している。IgEに媒介された炎症は、肥満細胞上のFcεRI受容体を占拠するIgE抗体に抗原が結合する際に生じる。この結合により、数分以内に肥満細胞の脱顆粒が生じ、一定の遂行伝達物質が放出する。引き続き、この脱顆粒細胞はさらなる伝達物質のデノボ合成および放出を開始する。結果に2つの段階がある。すなわち、血管、平滑筋、および腺分泌に及ぼす最初の即時的作用即時的過敏症、その2、3時間後に続く関係部位の細胞浸潤である。IgE媒介炎症は、アトピー性アレルギー枯草熱、喘息およびアトピー性皮膚炎など、全身性アナフィラキシー反応およびアレルギー性じんま疹蕁麻疹の基礎をなす機構である。それは、急速な血管拡張、抗原接触部位への循環可溶性因子および細胞の進入促進を生じさせるため、通常、免疫防御の第一戦線としての役割を演じる。アレルギー性疾患の最も破壊的起因の多くは、化学遊走したロイコサイトの作用による。用語の抗体と免疫グロブリンとは、最も広義において交換可能に用いられ、モノクローナル抗体例えば、完全長または完全モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体例えば、所望の生物学的活性を示す限りは、二重特異性抗体を含み、また、例えば、抗体の断片であり得る抗原結合ポリペプチドなどの一定の抗体断片本明細書により詳細に記載されているもまた含み得る。一実施形態において、本発明の抗体および免疫グロブリンは、ジスルフィド結合を減少より少なくさせた。一実施形態において、本発明の抗体および免疫グロブリンは、少なくとも1つのシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを不能にされるヒンジ領域を含んでなり、該ジスルフィド結合は、好ましくは分子内にあり、好ましくは重鎖間にある。ヒンジ領域は、限定はしないが、システイン残基の欠失または他のアミノ酸によるシステインの置換など、当業界に公知の種々の好適な方法のいずれかによってジスルフィド結合形成不能にすることができ、それらのいくつかは、本明細書に記載されている。抗体免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依り、種々のクラスに割り当てられている。免疫グロブリンは大きく5つのクラス:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが記載されている。これらをさらに、サブクラスイソタイプ、例えば、IgG-1、IgG-2、IgA-1、IgA2などに分けることができる。各免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、IgA、IgD、IgE、IgGおびIgMに関して、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと称される。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は十分に知られており、一般的に、例えば、Abbasら、2000年、CellularandMol.Immunology、第4版に記載されている。抗体は、該抗体と、1つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有結合により形成されたより大きな融合分子の一部であり得る。用語の完全長抗体、完全抗体および抗体全体は、本明細書において交換可能に用いられ、その実質的に完全な形態にあり、以下に定義される抗体断片ではない抗体を言う。これらの用語は特に、Fc領域を含有する重鎖を有する抗体を言う。本発明の抗体改変体は完全長抗体であり得る。完全長抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、および/または親和性成熟であり得る。親和性成熟抗体は、その1つまたは複数のCDRに1つまたは複数の変化を有し、その結果、それらの変化を有しない親抗体に比較して、抗原に対する抗体の親和性が改善されるものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモルまたはさらにピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、公知の方法で作製される。例えば、可変重鎖VHおよび可変軽鎖VLのドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載しているMarksら、1992年、Biotechnology10:779-783頁を参照されたい。CDRおよび/またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、例えば、Barbasら、1994年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3809-3813頁;Shierら、1995年、Gene169:147-155頁;Yeltonら、1995年、J.Immunol.155:1994-2004頁;Jacksonら、1995年、J.Immunol.1547:3310-9頁;およびHawkinsら、1992年、J.Mol.Biol.226:889-896頁に記載されている。アゴニスト抗体は、受容体などの抗原に結合し、活性化する抗体である。一般に、アゴニスト抗体の受容体活性化能力は、該受容体の天然アゴニストリガンドのそれと、少なくとも質的に同様であるまた本質的に量的に同様であり得る。抗体断片は、完全抗体の部分だけを含んでなり、その部分は、完全抗体に存在する場合に通常その部分に伴う機能の少なくとも1つを保持し、かつ、それらの多くまたは全てを保持し得る。本発明の抗体断片は、例えば、重鎖内ジスルフィド結合に通常は関与するヒンジシステインの少なくとも1つが本明細書に記載されているように変更されている、ジスルフィド結合能力の減少した重鎖の二量体化または多量体化を可能にする定常領域の十分な部分を含み得る。一実施形態において、抗体断片は、完全抗体の抗原結合部位または可変ドメインを含んでなり、したがって、抗原に結合する能力を保持している。他の実施形態において、抗体断片、例えば、Fc領域を含むものは、完全抗体に存在する場合にFc領域に通常伴う、FcRn結合性、抗体半減期モジュレーション、ADCC機能、および/または補体結合性例えば、該抗体がADCC機能または補体結合性に必要なグリコシル化プロフィルを有する場合などの生物学的機能の少なくとも1つを保持する。抗体断片の例としては、線形抗体;単鎖抗体分子;および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。抗体依存性細胞媒介細胞障害性およびADCCとは、FcR類を発現する非特異的細胞障害細胞ナチュラルキラーNK細胞、好中球、およびマクロファージが標的細胞上の結合抗体を認識し、引き続き、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を言う。ADCCを媒介する主要細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、一方、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcR発現は、Ravrtchら、1991年、Annu.Rev.Immunol.9:457-92頁の464頁、表3にまとめられている。対象となっている分子のADCC活性を評価するためには、米国特許第5,500,362号または第5,821,337号に記載されているようなインビトロADCCアッセイが実施できる。このようなアッセイにとって有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞PBMCおよびナチュラルキラーNK細胞が挙げられる。あるいは、または追加して、対象となっている分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynesら、1998年、PNASUSA95:652-656頁に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価できる。抗体免疫アドヘシンキメラは、抗体の少なくとも1つの結合ドメイン本明細書に定義されていると、少なくとも1つの免疫アドヘシン本出願に定義されているとを組み合わせている分子を含む。代表的な抗体-免疫アドヘシンキメラは、Bergら、1991年、PNASUSA88:4723頁およびChamowら、1994年、J.Immunol.153:4268頁に記載されている二重特異性CD4-IgGキメラである。本明細書で用いられる自己免疫疾患は、個体自身の組織から生じ、それに向けられた非悪性疾患である。本明細書に記載された自己免疫疾患では、特に、悪性もしくは癌性の疾患または病態が除外され、具体的に、B細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病ALL、慢性リンパ性白血病CLL、毛様細胞性白血病、および慢性骨髄芽球性白血病が除外される。自己免疫疾患または自己免疫障害の例としては、限定はしないが、乾癬や皮膚炎例えばアトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患;全身性強皮症および硬化症;炎症性腸疾患に関連する応答クローン病や潰瘍性大腸炎など;呼吸窮迫症候群成人呼吸窮迫症候群:ARDSなど;髄膜炎;脳炎;ブドウ膜炎;大腸炎;腎炎;湿疹や喘息およびT細胞の浸潤に関与する他の病態ならびに慢性炎症性応答などのアレルギー性病態;アテローム硬化症;白血球接着不全;慢性関節リウマチ;全身性エリトマトーデスSLE;真性糖尿病例えば、I型真性糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病;多発性硬化症;レーノーReynaud’s症候群;自己免疫甲状腺炎;アレルギー性脳脊髄炎;シェーグレンSjorgen’s症候群;若年発症糖尿病;ならびに、結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症および血管炎に典型的に見られるサイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅発性過敏症に関連する免疫応答;悪性貧血アジソン病;白血球漏出に関与する疾患;中枢神経系CNS炎症性障害;多臓器障害症候群;溶血性貧血限定はしないが、クリオグロビネミアcryoglobinemiaまたはクームズ陽性貧血など;筋無力症;抗原-抗体複合体媒介疾患;抗糸球体基底膜疾患;抗リン脂質症候群;アレルギー性神経炎;グレーブス病;ランバートイートン筋無力症候群;天疱瘡状水疱;天疱瘡;自己免疫多腺性内分泌障害;ライター病;スティッフマン症候群;ベーチェット病;巨細胞動脈炎;免疫複合体腎炎;IgA腎症;IgM多発性神経障害;免疫血小板減少性紫斑病ITP;または自己免疫血小板減少症が挙げられる。生物学的に活性なまたは機能的な免疫グロブリンは、構造的、調節的、生化学的または生物物理的事象において、天然活性の1つまたは複数を発揮することのできる免疫グロブリンである。例えば、生物学的に活性な抗体は、抗原に特異的に結合する能力を有することができ、その結合により、シグナル伝達または酵素活性などの細胞事象または分子事象を誘発または変更することができる。また、生物学的に活性な抗体は、受容体のリガンド活性化を阻害するか、またはアゴニスト抗体として作用することもできる。天然活性の1つまたは複数を発揮する抗体の能力は、ポリペプチド鎖の適切なフォールディングおよび組み立てなどのいくつかの因子に依存している。結合親和性とは一般に、分子例えば抗体の単一結合部位とその結合相手例えば抗原またはFcRn受容体との間の非共有的相互作用の合計の強さを言う。分子Xのその相手Yに対する親和性は、一般に、解離定数Kdによって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されたものを含めて、当業界に公知の一般的方法によって測定することができる。低親和性抗体は、抗原またはFcRn受容体に対する結合が弱く、解離し易い傾向があり、一方、高親和性抗体は、抗原またはFcRn受容体に対する結合がより緊密で、より長く結合状態を保つ。阻害抗体またはアンタゴニスト抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害するか、または減少させる抗体である。このような阻害は、任意の手段により、例えば、受容体へのリガンド結合、受容体複合体の形成、受容体複合体におけるチロシンキナーゼ受容体のチロシンキナーゼ活性および/または受容体におけるまたは受容体によるチロシンキナーゼ残基のリン酸化、を妨害することによって生じ得る。例えば、FcγRIIBアンタゴニスト抗体は、FcγRIIBに結合し、FcγRIIBに結合するIgGの能力を抑制し、そのことによって免疫エフェクター応答を抑制する。好ましい阻害抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に、または完全に抑制する。用語の癌および癌性とは、哺乳動物における、無調節な細胞増殖を典型的に特徴とする生理学的病態を称するか、または記述する。癌の例としては、限定はしないが、癌腫、リンパ腫、芽球腫、肉腫、および白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、および種々のタイプの頭部ならびに頚部の癌が挙げられる。用語のキメラ抗体とは、重鎖および/または軽鎖の一部が、ある特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、もしくは相同であり、一方、該鎖の残部が、他の種に由来するか、または他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、もしくは相同である抗体を言い、ならびに、所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片を言う例えば、米国特許第4,816,567号およびMorrisonら、1984年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855頁を参照。本明細書に用いられる語句の細胞、細胞株、および細胞培養物は交換可能に用いられ、このような呼称は全て、後代を含む。したがって、形質転換体および形質転換細胞という語は、移しの数に関係なく、第一次対象細胞およびそれに由来する培養物を含む。また、当然のことながら、故意の、または偶発的な変異のため、全ての後代が正確に同一でない可能性もある。もとの形質転換細胞においてスクリーンされたものと同じ機能または生物活性を有する変異後代が含まれる。異なる呼称が意図される場合は、文脈から明らかであろう。語句の制御配列とは、作動可能に結合したコード配列の、特定の宿主生物における発現にとって必要なDNA配列を言う。原核生物にとって好適な制御配列としては、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用していることが知られている。障害は、治療的抗体による治療から利益を得ると考えられる任意の病態である。これには、哺乳動物に問題の障害への素因を与える病態などの慢性および急性の障害または疾患が含まれる。一実施形態において、この障害は、癌または自己免疫疾患である。細胞外ドメインは、本明細書において、細胞の外部にあるFcRなどの膜貫通ポリペプチドの領域と定義される。用語のFc受容体またはFcRは、抗体のFc領域に結合する受容体を記述するために用いられる。好ましいFcRは、天然配列ヒトFcRである。また、好ましいFcRは、IgG抗体ガンマ受容体に結合するものであり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の突然変異体、あるいはスプライスされた形体も含む。本明細書のFcRには、将来同定されるものを含めて他のFcRも包含される。この用語はまた、胎児への母親のIgG移行を担っている新生子受容体、FcRnも含むGuyerら、1976年、J.Imunol.117-587頁およびKimら、1994年、J.Imunol.24:249頁を参照。用語のFc領域は、免疫グロブリン重鎖のC末端領域の定義に用いられる。Fc領域は、天然配列のFc領域でも改変体のFc領域でもよい。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変化し得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Cys226位、またはPro230のアミノ酸残基から、そのカルボキシ末端までの延伸部と定義される。免疫グロブリンのFc領域は、図1に示されるように、一般に、2つの定常ドメイン、CH2およびCH3を含む。機能的Fc領域は、天然配列Fc領域のエフェクター機能を有する。代表的なエフェクター機能としては、C1q結合;補体依存性細胞障害性;Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介細胞障害性ADCC;食作用;細胞表面受容体例えばB細胞受容体;BCRのダウンレギュレーションなどが挙げられる。このようなエフェクター機能には、一般に、Fc領域が結合ドメイン例えば、抗体可変ドメインと組み合わされることが必要であり、例えば、本明細書に開示されているものなどの種々のアッセイを用いて評価できる。天然配列Fc領域は、天然で見られるFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトFc領域は、図3に示されており、天然配列ヒトIgG1Fc領域非AおよびAアロタイプ;天然配列ヒトIgG2Fc領域;天然配列ヒトIgG3Fc領域;および天然配列ヒトIgG4Fc領域、ならびにそれらの天然改変体が挙げられる。改変Fc領域は、本明細書に定義された少なくとも1つのアミノ酸修飾の点で、天然配列Fc領域と異なるアミノ酸配列を含む。改変Fc領域は、天然配列Fc領域、または親抗体のFc領域に比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換を有し得、例えば、天然配列Fc領域、または親抗体のFc領域に、約1つから約10のアミノ酸置換、または約1つから約5つのアミノ酸置換を有し得る。改変Fc領域は、天然配列Fc領域、および/または親抗体のFc領域と、少なくともや80の同一性を有し得、それと少なくともや90の同一性を有し得るか、または少なくとも約95の同一性を有し得る。用語のFcγRIIAは、別に指示されない限り、ヒトFcγRIIa遺伝子によってコードされるポリペプチドであるヒトFcγRIIAhuFcγRIIAを言い、限定はしないが、FcγRIIA1およびFcγRIIA2、ならびにそれらの対立形質改変体が挙げられる。ヒトFcγRIIAは、活性化FcRであり、その細胞質ドメイン内に、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフITAMを含有する。最も好ましいヒトFcγRIIAは、配列番号9またはその高レスポンダーHRおよび低レスポンダーLR対立形質改変体などの、その対立形質改変体を含むヒトFcγRIIA1である。用語のFcγRIIBは、別に指示されない限り、ヒトFcγRIIB遺伝子によってコードされるポリペプチドを言い、限定はしないが、FcγRIIB1およびFcγRIIB2、FcγRIIB3ならびにそれらの対立形質改変体が挙げられる。好ましいFcγRIIBは、その細胞質ドメイン内に、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフITIMを含有する抑制性FcR受容体I/V/LxYxxL/VであるSathishら、2001年、J.Immunol.166、1763。好ましいヒトFcγRIIBは、それぞれ配列番号10または配列番号11のアミノ酸配列を有するヒトFcγRIIB2huFcγRIIB2またはFcγRIIB1huFcγRIIB1、ならびにその対立形質改変体である。FcγRIIB1配列とFcγRIIB2配列とは、FcγRIIB1の細胞質ドメイン内に、19のアミノ酸配列、LPGYPECREMGETLPEKPA配列番号29の挿入で、互いに異なっている。本明細書に用いられるFcR依存性病態としては、II型炎症、IgE媒介アレルギー、喘息、アナフィラキー、自己免疫疾患、IgG媒介細胞毒作用、または発疹が挙げられる。本明細書に用いられるヒンジ領域およびその変型は、例えば、Janewayら、1999年、ImminoBiology:TheImmuneSysteminHealthandDisease、ElsevierScience社、ニューヨーク、第4版;Bloomら、1997年、ProteinScience、6:407-415頁;Humphreysら、1997年、J.Immunol.Methods、209:193-202頁に示されている、当業界に公知の意味を含む。相同性は、配列のアラインメントをし、最大の相同性パーセントを得るために、必要ならばギャップを導入した後の、アミノ酸配列改変体における同一な残基のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは当業界に十分に知られている。そのようなコンピュータプログラムの1つは、1991年12月10日にGenentech社により製作されたAlign2であり、theUnitedStatesCopyrightOffice、ワシントンDC20559に、利用者文書と共に保管されている。本明細書に用いられる用語の宿主細胞または組換え宿主細胞とは、組換えプラスミドまたはベクターなどの外来ポリヌクレオチドの導入により、遺伝的に変化させたか、または遺伝的に変化させることができる細胞を言う。当然のことながら、このような用語により、特定の対象細胞だけではなく、このような細胞の後代も称されることが意図されている。突然変異または環境的影響によって、後続世代において一定の改変が生じ得るため、このような後代は、実際、親細胞と同一でない場合があるが、それでも、本明細書に用いられる宿主細胞という用語の範囲内に含まれる。ヒトエフェクター細胞は、1つまたは複数のFcRを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。該細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を発揮することが好ましい。ADCCを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞PBMC、ナチュラルキラーNK細胞、単球、細胞障害性T細胞、および好中球が挙げられるが、PBMC類およびNK細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本明細書の記載されているとおり、天然源から、例えば、血液またはPBMC末梢血単核細胞から単離できる。非ヒト例えばマウス抗体のヒト化形体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少配列を含有するキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種ドナー抗体の高頻度可変領域の残基によって置換されているヒト免疫グロブリンレシピエント抗体である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域FR残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、高頻度可変ループの全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのそれに相当し、FR領域の全部または実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列のそれらである少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域Fcの少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含む。さらなる詳細に関しては、Jonesら、Nature321:522-525頁1986;Riechmannら、Nature332:323-329頁1988;およびPresta、Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596頁1992を参照されたい。ヒト抗体は、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有し、および/または本明細書に開示されたヒト抗体を作製するための方法のいずれかを用いて作製された抗体である。この定義により、具体的に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は除外される。本明細書に用いられる用語の高血糖障害とは、I型およびII型糖尿病などのインスリン抵抗性から生じる糖尿病および障害、ならびに重篤なインスリン抵抗性、高インスリン血症、および高脂血症、例えば、肥満対象、およびメンデンホール症候群Mendenhall’sSyndrome、ウェルナー症候群、妖精症、脂肪萎縮性糖尿病、および他の脂肪組織萎縮などのインスリン抵抗性糖尿病の全ての形態を言う。本明細書に開示された具体的な高血糖障害は、特に、I型およびII型糖尿病である。糖尿病自体は、インスリンの不十分な産生または利用に関係する炭水化物代謝の進行性疾患を言い、高血糖および糖尿を特徴とする。本明細書に用いられる用語の高頻度可変領域とは、抗原結合を担っている抗体のアミノ酸残基を言う。高頻度可変領域は、配列アラインメントによって確定された相補性決定領域またはCDRのアミノ酸残基、例えば、軽鎖可変領域の残基24~34L1、50~56L2、および89~97L3ならびに重鎖可変領域における31~35H1、50~65H2および95~102H3;Kabatら、1991年、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、第5版、PublicHealthService、NationalInstitutesofHealth、Bethesda、メリーラmmド州を参照、および/または構造的に確定された高頻度可変ループHVLの残基、例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基26~32L1、50~52L2および91~96L3ならびに重鎖可変ドメインにおける26~32H1、53~55H2および96~101H3;ChothiaおよびLeskl、1987年、J.Mol.Biol.196:901-917頁を参照、を含む。フレームワークまたはFR残基は、本明細書で確定された高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。免疫疾患ならびに炎症性疾患としては:慢性関節リウマチ、骨関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症強皮症、特発性炎症性筋障害皮膚筋炎、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫溶血性貧血免疫汎血球減少症、PNH、自己免疫血小板減少症特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症、甲状腺炎グレーブ病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎、自己免疫炎症性疾患例えば、アレルギー性脳脊髄炎、多発性硬化症、インスリン依存性真性糖尿病、自己免疫ブドウ膜網膜炎、甲状腺機能亢進症、自己免疫甲状腺疾患、悪性貧血、自己移植片拒絶、真性糖尿病、ならびに免疫媒介腎疾患糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎、多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害またはギラン-バレ症候群などの中枢および末梢神経系の脱髄性疾患、ならびに慢性炎症性脱髄性多発神経障害;感染性肝炎A、B、C、D、E型肝炎ウィルスおよび他の非肝向性ウィルスなどの肝胆道疾患、自己免疫活動性慢性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎、グルテン性腸疾患、およびウィップル病;水疱性皮膚疾患、多形紅斑および接触皮膚炎、乾癬などの自己免疫または免疫媒介皮膚疾患;喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季結膜炎、湿疹、食物過敏症および蕁麻疹などのアレルギー性疾患;好酸性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性間質性肺炎などの肺の免疫疾患;移植片拒絶および移植片対宿主疾患などの移植関連疾患が挙げられる。本明細書に用いられる用語の免疫アドヘシンとは、異種アドヘシンタンパク質例えば、受容体、リガンド、または酵素の結合ドメインと免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせている抗体様分子を言う。構造的に、免疫アドヘシンは、抗原認識以外の所望の結合特異性および抗体すなわち異種の結合部位抗原結合部位を有するアドヘシンアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。免疫アドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、γ1、γ2、またはγ4重鎖に由来することが好ましい。これらの領域を含む免疫アドヘシンは、タンパク質Aクロマトグラフィーによって精製できるからである。例えば、Lindmarkら、1983年、J.Immunol.Meth.62:1-13頁を参照されたい。単離抗体は、その天然環境の成分から、同定され、分離され、および/または回収された抗体である。その天然環境の混入成分は、該抗体に関する診断的または治療的使用を妨害すると考えられる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質溶質を含み得る。いくつかの実施形態において、該抗体は、1ローリー法によって測定して、抗体の95重量超に、最も好ましくは、99重量超に、2スピニングカップシークエネーターの使用により、N末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得る上で十分な程度に、または3クーマシーブルーまたは好ましくは、銀染色を用いて、還元または非還元条件下、SDS-PAGEによる均一性に、精製される。単離抗体には、該抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイチュー抗体が含まれる。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも1つの精製段階によって調製される。単離核酸分子は、該抗体核酸の天然源に通常結合している少なくとも1つの混入核酸分子から、同定され、分離されている核酸分子である。単離核酸は、天然に見られる形態または設定以外においてある。したがって、単離核酸は、天然細胞に存在する核酸分子から区別される。しかし、単離核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にある抗体を、通常、発現する細胞内に含有される核酸分子が含まれる。用語の哺乳動物としては、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、およびネコなどの、哺乳動物として分類されている任意の動物が挙げられる。本発明の一実施形態において、哺乳動物はヒトである。本明細書に用いられる用語のモノクローナル抗体とは、天然に生じる可能性のある、微量に存在し得る突然変異を除いて実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち、同一な集団を含む個々の抗体を言う。モノクローナル抗体は、高特異性であり、単一の抗原性部位に特異的である。また、典型的には、種々の決定基エピトープに特異的な種々の抗体を含む従来のポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に特異的である。修飾因子モノクローナルは、該抗体の特徴が、実質的に均一な抗体集団から得られており、何らかの特定の方法による抗体の作製が必要とは考えられていないことを示している。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら、1975年、Nature256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製できるか、または組換えDNA法例えば、米国特許第4,816,567号を参照によって作製できる。また、モノクローナル抗体は、例えば、Clacksonら、1991年、Nature352:624-628頁およびMarksら、1991年、J.Mol.Biol.222:581-597頁に記載された方法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離できる。本明細書におけるモノクローナル抗体には、具体的に、重鎖および/または軽鎖の一部が、ある特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、もしくは相同であり、一方、該鎖の残部が、他の種に由来するか、または他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、もしくは相同であるキメラ抗体、ならびに、所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片が含まれる米国特許第4,816,567号;およびMorrisonら、1984年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855頁。本明細書で用いられる核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、作動可能に結合されている。例えば、シグナルペプチドまたは分泌リーダーに関するDNAが、抗体の分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、抗体のDNAに作動可能に結合されているか;プロモーターまたはエンハンサーが、該配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に結合されているか;またはリボソーム結合部位が、翻訳を促進するために置かれている場合、それは、コード配列に作動可能に結合されている。一般に、作動可能に結合されているという意味は、結合されているDNAが近接しており、分泌リーダーの場合は、近接しており、かつリーディング段階にあるということである。しかし、エンハンサーは、近接している必要がないと考えられる。結合は、都合のよい制限部位における結合によって達成される。このような部位が存在しない場合は、従来の方法にしたがって、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが用いられる。本明細書の目的に関して、薬学的組成物は、哺乳動物、特にヒトへの投与に適合させていて、好適なものである。したがって該組成物は、哺乳動物における疾患または障害を治療するために使用することができる。さらに、その治療的使用を妨害する可能性のある混入物が、それから分離したことになるように、該組成物中の該タンパク質は、1つまたは複数の精製工程または単離工程に供された。一般に、薬学的組成物は、治療的タンパク質および薬学的に許容できるキャリアまたは希釈剤を含む。該組成物は、通常、滅菌してあり、凍結乾燥状態であり得る。薬学的処方物は、下記により詳細に記載されている。本明細書において交換可能に用いられるポリヌクレオチドまたは核酸とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを言い、DNAおよびRNAが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および/またはそれらの類縁体、または、DNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼにより、または合成反応により、ポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類縁体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造に対する修飾が存在する場合、それが行われるのは、ポリマー組み立ての前でも後でもよい。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド成分による割り込みがあり得る。ポリヌクレオチドは、合成後に、標識との結合などによってさらに修飾できる。他のタイプの修飾としては、例えば、キャップ、類縁体による天然ヌクレオチドの1つまたは複数の置換、例えば、非電荷結合によるもの例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど、および電荷結合によるもの例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど、例えば、タンパク質例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、プライLリジンなどなどのペンダント部分を含有するもの、割り込み記号を有するもの例えば、アクリジン、ソラレンなど、キレーターを含有するもの例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属など、アルキレーターを含有するもの、修飾結合を有するもの例えば、アルファアノマー核酸などなどのヌクレオチド間修飾、ならびにポリヌクレオチドの未修飾形態が挙げられる。通常、糖に存在するヒドロキシル基のいずれかが、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換できるか、標準的保護基によって保護できるか、もしくは活性化して、さらなるヌクレオチドへのさらなる結合を調製できるか、または、固体または半固体の支持体に結合できる。5’端および3’端OHは、リン酸化できるか、1から20の炭素原子のアミンまたは有機キャッピング基部分によって置換できる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基へと誘導体化できる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、2’-O-メチル、2’-O-アリル、2’-フルオロまたは2’-アジドリボース、炭素環式糖類縁体、アルファアノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類縁体、およびメチルリボシドなどのアベイシックヌクレオシド類縁体など、当業界で一パン的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類縁体も含有できる。1つまたは複数のホスホジエステル結合を、代替の結合基によって置換できる。これらの代替結合基としては、限定はしないが、各RまたはR’が独立してHまたは置換または非置換アルキル1~20CであるPOSチオエート、PSSジチオエート、ONR2アミデート、POR、POR’、COまたはCH2ホルムアセタールによって置換されている実施形態が挙げられる。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。前述の事項は、RNAおよびDNAを含む、本明細書に挙げられた全てのポリヌクレオチドに当てはまる。本明細書に用いられるオリゴヌクレオチドとは、一般的に、短い、一般に一本鎖、一般に語でポリヌクレオチドであり、これらは一般に、約200ヌクレオチド長未満であるが、必ずしもそうであるとは限らない。用語のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する前述の事項は、オリゴヌクレオチドにも等しく、完全に当てはめることができる。分泌シグナル配列またはシグナル配列とは、細胞膜、通常は、原核生物の内膜または内膜および外膜を通して、新たに合成された対象タンパク質を方向づけるために使用できる短いシグナルペプチドをコードする核酸配列を言う。したがって、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖ポリペプチドなどの対象タンパク質は、原核細胞宿主細胞の細胞膜周辺内に、または培養培地中に分泌される。分泌シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、宿主細胞にとって内因性であってもよいし、発現されるポリペプチドに固有のシグナルペプチドを含めて、外因性であってもよい。分泌シグナル配列は、典型的には、発現されるポリペプチドのアミノ末端に存在し、典型的には、生合成と、細胞質からの該ポリペプチド分泌との間に、酵素的に除去される。したがって、シグナルペプチドは、成熟タンパク質産物内には、通常存在しない。用語の受容体結合ドメインは、受容体に対する、細胞接着分子などの任意の天然リガンド、または対応する天然リガンドの少なくとも質的受容体結合能力を保持している天然リガンドの任意の領域または誘導体を称するために用いられる。この定義は、とりわけ、前述の受容体に対するリガンドの結合配列を特に含む。本明細書に用いられる治療的抗体は、ある疾患または障害に罹っているか、または罹り易くなっている哺乳動物における該疾患または障害の治療に有効な抗体である。代表的な治療的抗体としては、本発明の5A6抗FcγRIIB抗体および本発明の二重特異性抗FcγRIIB/抗FcεRI抗体、ならびに、rhuMAb4D5HERCEPTIN登録商標Carterら、1992年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285-4289頁、米国特許第5,725,856号9;米国特許第5,736,137号におけるキメラ抗CD20C2B8RITUXAN登録商標、米国特許第5,721,108B1号における2H7抗体のキメラ改変体またはヒト化改変体またはトシツモマブBEXXAR登録商標;抗IL-8StJohnら、1993年、Chest103:932頁、および国際公開第95/23865号;ヒト化抗VEGF抗体huA4.6.1AVASTIN商標Kimら、1992年、GrowthFactors7:53-64頁、1998年10月15日発行の国際公開第96/30046号、および第98/45331号などのヒト化および/または親和性成熟抗VEGF抗体などの抗VEGF抗体;抗PSCA抗体国際公開第01/40309号;S2C6およびそのヒト化改変体国際公開第00/75348号などの抗CD40抗体;抗CD11a米国特許第5,622,700号、国際公開第98/23761号、Steppeら、1991年、TransplantIntl.4:3-7頁、およびHourmantら、1994年、Transplantaion58:377-380頁;抗IgEPrestaら、1993年、J.Immunol.151:2623-2632頁、および国際公開第95/19181号;抗CD181997年4月22日発行の米国特許第5,622,700号、または1997年7月31日発行の国際公開第97/26912号;抗IgE1998年2月3日発行の米国特許第5,714,338号,または1992年2月25日発行の米国特許第5,091,313号、1993年3月4日発行の国際公開第93/04173号、または1998年6月30日出願の国際出願PCT/US98/13410号、米国特許第5,714,338号;抗Apo-2受容体抗体1998年11月19日発行の国際公開第98/51793号;cA2REMICADE登録商標、CDP571およびMAK-195などの抗TNF-α抗体1997年9月30日発行の米国特許第5,672,347号,Lorenzら、1996年、J.Immunol.1564:1646-1653頁、およびDhainautら、1995年、Crit.CareMed.239:1461-1469頁を参照;抗組織因子TF1994年11月9日付与の欧州特許第0420937B1号;抗ヒトα4~β7インテグリン1998年2月19日発行の国際公開第98/06248号;抗EGFR1996年12月19日発行の国際公開第96/40210号におけるキメラ化またはヒト化225抗体OKT3などの抗CD3抗体1985年5月7日発行の米国特許第4,515,893号;CHI-621SIMULECT登録商標およびZENAPAX登録商標などの抗CD25または抗tac抗体1997年12月2日発行の米国特許第5,693,762号を参照;cM-7412抗体などの抗CD4抗体Choyら、1996年、ArthritisRheum391:52-56頁;CAMPATH-1Hなどの抗CD52抗体Riechmannら、1988年、Nature332:323-337頁;Grazianoら、1995年、J.Immunol.15510:4996-5002頁におけるような、FcγRIに特異的なM22抗体などの抗Fc受容体抗体;hMN-14などの抗癌胎児性抗原CEA抗体Sharkeyら、1995年、CancerRes.5523Suppl:5935s-5945s;huBrE-3、hu-Mc3およびCHL6などの乳房上皮細胞に特異的な抗体Cerianiら、1995年、CancerRes.5523:5852s-5856s;およびRichmanら、1995年、CancerRes.5523Supp:5916s-5920s;C242などの大腸癌細胞に結合する抗体Littonら、1996年、Eur.J.Immunol.261:1-9頁;抗CD38抗体、例えば、AT13/5Ellisら、1995年、J.Immunol.1552:925-937頁;HuM195などの抗CD33抗体Jurcicら、1995年、CancerRes5523Suppl:5908s-5910sおよびCMA-676またはCDP771;LL2またはLymphoCideなどの抗CD22抗体Juweidら、1995年、CancerRes5523Suppl:5899s-5907s;17-1Aなどの抗EpCAM抗体PANOREX登録商標;アブシキシマブまたはc7E3FabREOPRO登録商標などの抗GpIIb/IIIa抗体;MEDI-493SYNAGIS登録商標などの抗RSV抗体;PROTOVIR登録商標などの抗CMV抗体;PRO542などの抗HIV抗体;抗HepB抗体OSTAVIR登録商標などの抗肝炎抗体;抗CA125抗体OvaRex;抗イディオタイプGD3エピトープ抗体BEC2;抗αvβ3抗体VITAXIN登録商標;ch-G250などの抗ヒト腎臓細胞癌抗体;ING-1;抗ヒト17-1A抗体3622W94;抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体A33;GD3ガングリオシドに特異的な抗ヒト黒色腫抗体R24;抗ヒト扁平上皮細胞癌SF-25;およびSmartID10および抗HLADR抗体OncolymLym-1などの抗ヒト白血球抗原HLA抗体などの抗体が挙げられる。用語の治療的有効量とは、対象または哺乳動物における疾患または障害を軽減するまたは治療する上で有効な本発明の組成物の量を言う。一実施形態において、治療すべき免疫疾患がB細胞媒介疾患である場合、治療的有効量は、哺乳動物におけるB細胞数の減少B細胞減損をもたらす量である。治療とは、対象または哺乳動物における疾患または障害の治療にとって、または治療する上で有効な本発明の使用を言う。一般に、疾患または障害の治療は、該疾患または障害に関連した1つまたは複数の症状または医療的問題を減少させることを含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体および組成物は、対象または哺乳動物における疾患または障害の発現または再発を防ぐために使用できる。例えば、自己免疫疾患に罹っている対象において、本発明の抗体を、突発を防ぐか、または治療するために使用できる。連続的な治療もしくは投与とは、治療において1日以上の間隔を空けない、少なくとも毎日ベースの治療を言う。間欠的な治療もしくは投与、または間欠的様式における治療または投与とは、連続的ではなく、実際、周期的な治療を言う。本明細書における治療法は、連続的であっても間欠的であってもよい。本明細書に用いられる改変体または変化した重鎖とは、ジスルフィド結合能力が減少した、例えば、少なくとも1つのシステイン残基をジスルフィド結合形成不能にさせた重鎖を一般に言う。前記少なくとも1つのシステインは、重鎖のヒンジ領域にあることが好ましい。本明細書に用いられる用語のベクターは、それが結合した他の核酸分子を輸送することができる核酸分子を称することが意図されている。ベクターの1つのタイプは、追加DNAのセグメントが結合できる環状の二本鎖DNAループであるプラスミドである。ベクターの他のタイプは、ファージベクターである。ベクターの他のタイプは、追加DNAセグメントがウィルスのゲノムに結合できるウィルスベクターである。一定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製できる例えば、細菌の複製起点およびエピソーム哺乳動物ベクターを有する細菌ベクター。他のベクター例えば、非エピソーム哺乳動物ベクターは、宿主細胞導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、そのことによって、宿主のゲノムと共に複製される。さらに、一定のベクターは、それらが作動可能に結合した遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において、組換え発現ベクターまたは単に、組換えベクターと称される。一般に、組換えDNA法において利用される発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドがベクターの最も一般的な使用形態であるため、本明細書において、プラスミドとベクターは交換可能に使用できる。ヒトFcγRIIBに選択的に結合する抗体は、他のヒトFcγR類に対する結合よりも有意に良好な親和性で、ヒトFcγRIIBに結合する。いくつかの実施形態において、ヒトFcγRIIBに選択的に結合する抗体は、FcγRIIB1とFcγRIIB2の双方に結合し、FcγRIIA、FcγRIおよびFcγRIII、ならびにそれらの対立形質改変体に対する結合はほとんど示さないか、または全く示さない。相対的結合性および/または結合親和性は、限定はしないが、酵素結合免疫吸着アッセイELISAおよび蛍光活性化細胞選別FACSなどの、当業界に認められた種々の方法で実証できる。一般に、これは、本発明の抗体が、ELISAで測定した場合、FcγRIIAに結合するよりも、少なくとも約1ログ高濃度の反応性でFcγRIIBに結合することを意味する。ヒトFcγRIIAよりもヒトFcγRIIBに選択的に結合する抗体は、ヒトFcγRIIAと本質的に交差反応できないことが好ましい。本明細書に用いられるヒトFcγRIIBと本質的に交差反応できない抗体は、ヒトFcγRIIAに対する結合の程度が、蛍光活性化細胞選別FACS分析または放射免疫沈降アッセイRIAによって判定した時、ヒトFcγRIIB結合のレベルの10未満、あるいはヒトFcγRIIBに対する結合に比較して、ヒトFcγRIIAに対して、8未満、あるいは6未満、あるいは4未満、あるいは2未満、あるいは1未満の結合性である抗体である。本明細書に用いられるヒトFcγRIIBに対するFc領域の結合に拮抗する抗体は、ヒトFcγRIIBに対するFc領域例えば、IgGなどの抗体のFc領域、または免疫アドヘシン、または他のFc含有構築体の結合を阻害または妨害する。このような拮抗活性は、例えばELISAによって判定できる。II.本発明を実施する様式A.抗FcγRIIB抗体の作製iFcγRIIB抗原任意に他の分子に結合させた可溶性ヒトFcγRIIBまたはその断片を、抗体作製のための免疫原として使用できる。免疫原の例としては、キャリアタンパク質またはGSTまたはHis6などの親和性タグを有するFcγRIIB1またはFcγRIIB2の細胞外ドメインを含む融合タンパク質が挙げられる。あるいは、またはそれに追加して、ヒトFcγRIIBを発現する細胞を免疫原として使用できる。このような細胞は、天然源から誘導できるか、またはヒトFcγRIIBを発現させるために組換え法によって形質転換させた細胞であり得る。抗体の調製に有用なヒトFcγRIIBの他の形態は当業者に明らかであろう。iiポリクローナル抗体ポリクローナル抗体は、関連抗原およびアジュバントの複数回皮下scまたは腹腔内ip注射により、動物内で増加させることが好ましい。二機能性試剤または誘導体化試剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステルシステイン残基を介した結合、N-ヒドロキシスクシンイミドリジン残基を介して、グルタールアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはRとR1が異なるアルキル基であるR1N=C=NRを用いて、免疫化される種における免疫原性のタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、関連抗原を結合させることが有用であり得る。例えば、100μgまたは5μgのタンパク質または複合体それぞれウサギまたはマウスにと、3容量のフロインドアジュバントとを組み合わせ、その溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫複合体、または誘導体に対して、動物を免疫化する。およそ1ヵ月後、フロインド完全アジュバント中、元の量の1/5から1/10のペプチドまたは複合体を複数部位に皮下注射することによって、該動物に増強を行う。7日から14日後、該動物から採血し、血清を抗体滴定に関してアッセイする。滴定プラトーまで、動物に増強を行う。動物は、同じ抗原の複合体によって増強することが好ましいが、異なるタンパク質と結合させ、および/または異なる交差結合剤によっても増強が行われる。複合体はまた、タンパク質融合体として、組換え細胞培養においても作製できる。また、免疫応答を高めるために、ミョウバンなどの凝集剤が好適に使用される。iiiモノクローナル抗体モノクローナル抗体は、Kohlerら、1975年、Nature、256:495頁に最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製できるか、または組換えDNA法例えば、米国特許第4,816,567号参照によって作製できる。ハイブリドーマ法においては、マウス、またはハムスターもしくはマカクザルなどの他の適切な宿主動物を、本明細書に上記されたとおり免疫化し、免疫化に用いられたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生する能力のあるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化できる。次いで、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成するGoding、1986年、MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice、59-103頁AcademicPress。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄細胞の増殖または生存を阻害する1つまたは複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地中に播種し増殖させる。例えば、親骨髄細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼHGPRTまたはHPRTを欠失している場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的に、HGPRT欠失細胞の増殖を防ぐ物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンHAT培地を含む。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞によって抗体の安定な高レベル産生を支持し、HAT培地などの培地に感受性であるものである。これらの中でも好ましい骨髄腫細胞株は、theSalkInstituteCellDistributionCenter、サンジエゴ、カリフォルニア州、USAから入手できるMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍に由来するもの、およびAmericanTypeCultureCollection、ロックビル、メリーランド州、USAから入手できるSP-2またはX63-Ag8-653細胞などのマウス骨髄腫系である。ヒトモノクローナル抗体産生のために、ヒト骨髄腫およびマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株もまた記載されているKozbor、1984年、J.Immunol.、133:3001頁;Brodeurら、1987年、MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandAplications、51-63頁MarcelDekker社、ニュウヨーク。ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、該抗原に特異的なモノクローナル抗体の産生に関してアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、または放射免疫アッセイRIAもしくは酵素結合免疫吸着アッセイELISAなどのインビトロ結合アッセイによって判定する。所望の特異性、親和性、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマを確認したら、希釈法を制限することによってクローンをサブクローン化でき、標準的方法によって増殖させるGoding、上記。この目的に好適な細胞培地としては、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地が挙げられる。また、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍として、インビボで増殖できる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質A-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNAは、常法を用いて例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて、容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はこのようなDNAの好ましい供給源として働く。DNAを単離したら、発現ベクター内に入れることができ、次いでこれを、他の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクトする。抗体の組換え製造は、下記でより詳細に記載する。さらなる実施形態において、抗体または抗体断片は、McCaffertyら、1990年、Nature、348:552-554頁に記載されている方法を用いて作出された抗体ファージライブラリーから単離できる。Clacksonら、1991年、Nature、352:624-628頁、およびMarksら、1991年、J.Mol.Biol.222:581-597頁は、ファージライブラリーを用いて、それぞれマウスおよびヒトの抗体の単離を記載している。引き続く刊行物では、鎖シャッフリングによる高親和性nM範囲ヒト抗体の作製Marksら、1992年、Bio/Technology,10:779-783頁、ならびに極めて大規模なファージライブラリーを構築する戦略として、組み合わせ感染およびインビボ組換えWaterhouseら、1993年、Nuc.Acids。Res.21:2265-2266頁が記載されている。したがってこれらの方法を、モノクローナル抗体の単離に関する従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ法の代わりに実施できる。またDNAは、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに関するコード配列を、相同なマウス配列の代わりに置換することによって米国特許第4,816,567号;Morrisonら、1984年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851頁、または免疫グロブリン配列を、非免疫グロブリン材料例えば蛋白質ドメインに関するコード配列の全部または一部と共有結合させることによって改変することもできる。典型的に、このような非免疫グロブリン材料を、抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、または抗体の抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換して、ある抗原に対して特異性を有するある抗原結合部位および異なる抗原に対して特異性を有する他の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体が創製される。ivヒト化抗体およびヒト抗体ヒト化抗体は、非ヒトである出所源からの1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と称され、典型的には、インポート可変ドメインから取られる。ヒト化は一般に、齧歯類の1つまたは複数のCDR配列を、ヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することにより、一般に、Winterおよび共同研究者の方法Jonesら、1986年、Nature321:522-525頁;Riechmannら、1988年、Nature332:323-327頁;Vrhoeyenら、1988年、Science239:1534-1536頁にしたがって、実施できる。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全ヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である米国特許第4,816,567号。実際、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのCDR残基、および可能性として、いくつかのFR残基が、非ヒト、例えば、齧歯類抗体における類似部位の残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体の作製に使用される軽重双方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減少させる上で極めて重要である。いわゆる最良適合法により、齧歯類抗体可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーンする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワークFRとして受け入れられるSimsら、1987年、J.Immunol.151:2296頁;Chothiaら、1987年、J.Mol.Biol.196:901頁。他の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークが用いられる。いくつかの異なるヒト化抗体に、同じフレームワークを使用できるCarterら、1992年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285頁;Prestaら、1993年、J.Immunol.151:2623頁。さらに、抗体が、抗原に対する高親和性および他の有利な生物学的性質を保持したままヒト化されることが重要である。この目標を達成するために、好ましい方法にしたがって、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用い、親配列および種々の構想的ヒト化産物を分析する方法によって、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配置構造を描き、表示するコンピュータプログラムが入手できる。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における該残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。この方法において、標的抗原に対する親和性増加などの所望の抗体特性が達成されるように、レシピエントおよびインポート配列のFR残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、CDR残基が、直接的におよび最も実質的に、抗原結合性に対する影響に関与している。あるいは、免疫化されると、内因性免疫グロブリン産生の不在下で、ヒト抗体の完全レパートリーを産生することができる遺伝子組換え動物例えば、マウスを作製することが現在可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞株変異マウスにおける抗体重鎖結合領域JH遺伝子のホモ接合欠失が、内因性抗体産生の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞株変異マウスにおけるヒト生殖細胞株免疫グロブリン遺伝子アレイの転移により、抗原誘発時に、ヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Jakobovitsら、1993年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551頁;Jakobovitsら、1993年、Nature、362:255-258頁;Bruggermanら、1993年、YearinImmuno.7:33頁;およびDuchosalら、1992年、Nature355:258頁を参照されたい。ヒト抗体はまた、ファージ表示ライブラリーに由来し得るHoogenboomら、1991年、J.Mol.Biol.277:381頁;Marksら、J.Mol.Biol.1991年、222:581-597頁Vaughanら、1996年、NatureBiotech14:309頁を参照されたい。v多重特異性抗体多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して抗原特異性を有する。このような分子は、通常、2つの抗原に結合するだけだがすなわち、二重特異性抗体、BsAbs、本明細書に用いられる場合、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体が、この語句に包含される。BsAbsの例としては、FcγRIIBに特異的な1つの抗原結合部位および、例えば:B細胞受容体BCR、CD79αおよび/またはCD79β、腫瘍細胞上に発現した抗原、IgE受容体FcεR、肥満細胞および/または好塩基球上などのIgERに結合したIgE、NKおよび単球ならびにマクロファージ上などのIgG受容体RIFcγRIおよびRIIIFcγRIII、受容体チロシンキナーゼc-キットに特異的な他の抗原結合部位を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、BsAbsは、FcγRIIBに対する第1の結合特異性、および細胞質ITAMモチーフを有する活性化受容体に対する第の結合特異性を含む。ITAMモチーフ構造は、9~11のアミノ酸スペーサーによって分離した2つのチロシンを有する。一般的なコンセンサス配列は、YxxL/Ix6~8YxxLであるIsakov、N.、1997年、J.Leukoc.Biol.61:6-16頁。代表的な活性化受容体としては、FcεRI、FcγRIII、FcγRI、FcγRIIA、およびFcγRIICが挙げられる。他の活性化受容体としては、例えば、CD3、CD2、CD10、CD161、DAP-12、KAR、KARAP、FcεRII、Trem-1、Trem-2、CD28、p44、p46、B細胞受容体、LMP2A、STAM、STAM-2、GPVI、およびCD40が挙げられる例えば、Azzoniら、1998年、J.Immunol.161:3493頁;Kitaら、1999年、J.Immunol.162:6901頁;Merchantら、2000年、J.Biol.Chem.74:9115頁;Pandeyら、2000年、J.Biol.Chem.275:38633頁;Zhengら、2001年、J.Biol.Chem.276:12999頁;Propstら、2000年、J.Immunol.165:2214頁を参照。一実施形態において、BsAbは、FcγRIIBに対する第1の結合特異性およびFcεRIに対する第2の結合特異性を含む。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製できる例えば、Fab’2二重特異性抗体。二重特異性抗体は、ホール内ノブ抗体またはヒンジレス抗体として調製できる。二重特異性抗体は、Segalら、2001年、J.Immunol.Methods248:1-6頁に概説されている。二重特異性抗体を作製する方法は当業界に知られている。完全長二重特異性抗体の従来の作製法は、2つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現に基づいており、これら2つの鎖は、このような特異性を有しているMillsteinら、1983年、Nature305:537-539頁。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのため、これらのハイブリドーマクアドローマは、10の異なる抗体分子の混合物を生じる可能性があり、これらのうち、1つだけが正しい二重特異性の構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー処置によって行われる正しい分子の精製は、かなり厄介であり、産物の収量は低い。同様な方法は、国際公開第93/08829号、およびTraunneckerら、1991年、EMBOJ.10:3655-3659頁に開示されている。異なる方法により、所望の結合特異性抗体-抗原結合部位を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。この融合は、ヒンジ、CH2、およびCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合であり得る。融合体の少なくとも1つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第1の重鎖定常領域CH1を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および所望の場合は、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別個の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物内に同時トランスフェクトする。これによって、構築に用いられた3種の抗体鎖の不等比率が最適収量を与える場合、実施形態における3種の抗体断片の相互比率の調整には大きな柔軟性が与えられる。しかし、等しい比率にある少なくとも2種の抗体鎖の発現が高収量をもたらす場合、またはこれらの比率が特に重要ではない場合、ある発現ベクターにおける2種または3種全ての抗体鎖がコード配列を挿入することは可能である。この方法の他の実施形態において、二重特異性抗体は、一方のアームにおける第1の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対第2の結合特異性を提供するからなる。二重特異性分子の片方の部分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することで、容易な分離方法が提供されるため、この非対称構造により、所望の二重特異性化合物を、不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することが促進される。この方法は、国際公開第94/04690号に開示されている。二重特異性抗体の作出のさらなる詳細に関しては、例えば、Sureshら、1986年、MethodsinEnzymology121:210頁を参照されたい。国際公開第96/27011号に記載された他の方法によると、抗体分子対間の界面を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大化するために操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第1の抗体分子の界面からの1つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖例えば、チロシンまたはトリプトファンによって置換される。大きなアミノ酸側鎖を、より小さなもの例えば、アラニンまたはトレオニンで置換することにより、大きな側鎖と同じか、または類似のサイズの代償的な空洞が、第2の抗体分子の界面に生み出される。これによって、ホモ二量体などの不要な最終産物よりもヘテロ二量体の収量を増加させる機構が提供される。二重特異性抗体としては、交差結合またはヘテロ複合体が挙げられる。例えば、ヘテロ複合体における抗体の一方をアビジンに、他方をビオチンに結合することができる。このような抗体は、例えば、不要な細胞細胞に免疫系を標的化するために米国特許第4,676,980号、およびHIV感染の治療のために国際公開第91/00360号、国際公開第92/200373号、および欧州特許第4,676,980号提案されている。ヘテロ複合体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製できる。好適な交差結合剤は当業界に十分知られており、例えば、米国特許第4,676,980号に、多数の交差結合法と共に開示されている。2超の結合価を有する抗体もまた考慮されている。例えば、Tuttら、1991年、J.Immunol.147:60に従って、三重特異性抗体を調製することができる。vi改変ヒンジ領域を有する抗体本発明の抗体は、例えば、2003年10月30日出願の出願第10/697,995号に記載されているような改変重鎖もまた含み得る。改変重鎖を含む抗体は、システイン残基がジスルフィド結合を形成できないような、少なくとも1つのジスルフィド形成システイン残基の変化を含む。一態様において、前記システインは、重鎖のヒンジ領域のものであるしたがって、このようなヒンジ領域は、本明細書において、改変ヒンジ領域と称され、さらに、ヒンジなしと称される。いくつかの態様において、このような免疫グロブリンは、分子間で2本の重鎖間でのようにまたは分子内でポリペプチド単鎖内の2つのシステイン残基間でのように、通常はジスルフィド結合を形成することができる重鎖システイン残基の完全レパートリーを欠いている。一般に、および好ましくは、変化させるシステイン残基すなわち、ジスルフィド結合形成不能にされるによって形成されたジスルフィド結合は、抗体内に存在していない場合、免疫グロブリンの通常の物理化学的および/または生物学的特徴の実質的な損失をもたらさないものである。ジスルフィド結合形成不能にされるシステイン残基は、重鎖ヒンジ領域のシステインであることが好ましいが、必ずしもそうである必要はない。改変重鎖または改変ヒンジ領域を有する抗体は、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または2つと11との間の重鎖間ジスルフィド結合が除かれている抗体を、宿主細胞内に発現させ、宿主細胞から前記抗体を回収することによって、一般に作製される。前記抗体は、ジスルフィド結合能力の減少した改変重鎖を含む抗体をコードするポリヌクレオチドから発現させることができ、引き続き、該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞から前記抗体を回収する。好ましくは、前記重鎖は、免疫グロブリン重鎖の改変ヒンジ領域を含んでなり、前記改変ヒンジ領域の少なくとも1つのシステインはジスルフィド結合形成不能になっている。免疫グロブリン重鎖の任意のシステインが、本明細書に記載されたヒンジシステインと同様にジスルフィド結合形成不能にできることは、このような変化が免疫グロブリンの生物学的機能を実質的に減少させないという条件で、さらに予想される。例えば、IgMおよびIgEはヒンジ領域を欠いているが、各々が余分の重鎖ドメインを含有し;本発明の方法において、重鎖および/または重鎖を含む抗体の生物学的機能を実質的に減少させない限り、該重鎖システインの少なくとも1ついくつかの実施形態においては全てを、ジスルフィド結合形成不能にすることができる。例えば、Kabat、1991年、Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest、上記に記載されているような重鎖ヒンジシステインは当業界に十分に知られている。当業界で知られているように、ヒンジシステインの数は、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスに依って変わる。例えば、Janeway、1999年、Immunobiology、第4版、GarlandPublishing、ニューヨークを参照されたい。例えば、ヒトIgGI類においては、2つのヒンジ領域が2つのプロリンによって分離しており、これらは通常、分子間ジスルフィド結合において、隣接した重鎖の相手側と対になっている。他の例としては、4つのヒンジシステインを含有するヒトIgG2、11のヒンジシステインを含有するIgG3、および2つのヒンジシステインを含有するIgG4が挙げられる。したがって、本発明の方法は、改変ヒンジ領域の少なくとも1つのシステインがジスルフィド結合形成不能になっている改変ヒンジ領域を含む免疫グロブリン重鎖を宿主細胞内に発現させること、該重鎖を軽鎖と複合体化させて、生物学的に活性な抗体を形成すること、および宿主細胞から抗体を回収することを含む。代替の実施形態は、少なくとも2つ、3つ、または4つのシステインがジスルフィド結合形成不能になっているもの;約2つから約11のシステインが不能になっているもの;および改変ヒンジ領域の全てのシステインが不能になっているものを含む。本発明の方法によって作製された本発明の抗体を構成する軽鎖および重鎖は、単一のポリヌクレオチドによって、または別々のポリヌクレオチドによってコードされ得る。通常、ジスルフィド結合形成に関与するシステインは、当業界に公知の種々の方法のうちのいずれか、または本明細書に記載された基準を考慮して、当業者に明らかであると考えられる方法によって、ジスルフィド結合形成不能にすることができる。例えば、ヒンジシステインを、ジスルフィド結合のできないセリンなどの他のアミノ酸によって置換することができる。改変するヒンジ領域をコードする核酸配列の部位特異的変異誘発などの標準的な分子生物学的方法によってアミノ酸置換を達成することができる。好適な方法としては、Sambrookら、1989年、MolecularCloning:ALaboratoryManual、第2版に記載されたものが挙げられる。改変ヒンジ領域を有する免疫グロブリンを作出するたの方法としては、ヒンジ領域をコードするオリゴヌクレオチドの合成が挙げられ、置換されるシステインのコドンが、置換アミノ酸のコドンと置き換わる。次いで、このオリゴヌクレオチドを、適宜、可変領域およびFc配列などの他の適切な抗体配列を含むベクター主鎖内に結合することができる。他の実施形態において、ヒンジシステインを欠失できる。アミノ酸欠失は、改変するヒンジ領域をコードする核酸配列の部位特異的変異誘発などの標準的な分子生物学的方法によって達成できる。好適な方法としては、Sambrookら、上記に記載されたものが挙げられる。改変ヒンジ領域を有する免疫グロブリンを作出する他の方法としては、改変するシステインのコドンが欠失しているヒンジ領域をコードする配列を含むオリゴヌクレオチドの合成が挙げられる。次いで、このオリゴヌクレオチドを、適宜、可変領域およびFc配列などの他の適切な抗体配列を含むベクター主鎖内に結合することができる。viiキャビティー内突起戦略を用いて形成される二重特異性抗体いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、ヘテロオリゴマー化のために、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間の界面を操作するのに役立つキャビティー内突起戦略を用いて形成され、これはホール内ノブとも称される。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。Fc配列のCH3ドメインにおけるホール内ノブ変異は、ホモ二量体の形成を大幅に減少させるという報告がある例えば、Merchantら、1998年、NatureBiotechnology16:677-681頁を参照。突起は、第1のポリペプチド界面の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖例えば、チロシンまたはトリプトファンによって置換することにより構築される。その突起と同じか、または同様なサイズの補償的キャビティーは、第2のポリペプチドの界面に、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖によって置換することにより任意に創製される。第1または第2のポリペプチドの界面いずれかに、好適に配置され、大きさを定めた突起またはキャビティーが存在する場合、隣接する界面に、それぞれ対応するキャビティーまたは突起を操作するだけでよい。該突起およびキャビティーは、ポリペプチドをコードする核酸の変化などの合成的手段により、またはペプチド合成により作製することができる。ホール内ノブのさらなる説明に関しては、米国特許第5,731,168号、第5,807,706号、第5,821,333号を参照されたい。いくつかの実施形態において、ホール内ノブ法は、ヘテロ二量体化を促進して、完全長二重特異性抗FcγRIIBおよび抗活性化受容体例えばIgER抗体を作出するために用いられる。一実施形態において、ノブ変異T366WをFc領域に導入することにより、抗FcγRIIB成分例えばp5A6.11ノブのための、また、ホール変異T366S、L368A、Y407Vを導入することにより、抗IgER成分のための構築体が調製された。他の実施形態において、本明細書に開示された方法、またはMerchantら、1988、上記、または米国特許第5,731,168号;第5,807,706号;第5,821,333号に開示された方法などにより、ホール変異をそのFc領域に導入することによって、抗FcγRIIB成分例えばp5A6.11ホールのための、また、ノブ変異をそのFc領域に導入することによって、抗IgER成分例えばp22E7.11ノブのための構築体が調製される。キャビティー内突起法を用いてヘテロ多量体を調製する一般的方法は、1種または数種の宿主細胞に、突起をコードするように元のポリヌクレオチドから変化させた、第1のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびキャビティーをコードするように元のポリヌクレオチドから変化させた、第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを発現させることを含む。該ポリペプチドは、共通の宿主細胞に発現させて、宿主細胞培養物からヘテロ多量体を回収するか、別々の宿主細胞に発現させて、回収し、精製した後、ヘテロ多量体を形成するかのいずれかである。いくつかの実施形態において、形成されたヘテロ多量体は、多量体抗体、例えば二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ホール内ノブ法と改変ヒンジ領域構築体とを組み合わせて、ヒンジなし二重特異性抗体が作製される。B.ベクター、宿主細胞および組換え法また本発明は、本明細書に開示された抗体をコードする単離ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞、ならびに該抗体を作製するための組換え法を提供する。該抗体の組換え作製のために、該抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニングDNAの増幅のため、または発現のために、複製可能なベクターに挿入する。該抗体をコードするDNAは、従来の方法を用いて、例えば、該抗体をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクターの構成要素としては、限定はしないが、一般に、以下の1つまたは複数が挙げられる:シグナル配列、複製起点、1つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。iシグナル配列要素本発明の抗体は、直接的にのみならず、異種抗体との融合抗体としても組換え作製できる。一実施形態において、異種抗体は、シグナル配列、または成熟タンパク質または抗体のN末端に特定の開裂部位を有する他の抗体である。選択されることが好ましい異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、処理されるすなわち、シグナルペプチダーゼにより開裂されるものである。天然抗体のシグナル配列を認識、処理しない原核生物宿主細胞に関しては、そのシグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列によって置換する。酵母分泌のためには、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼ、α因子リーダーサッカロミセスおよびKluyveromycesのα因子リーダーを含む、または酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンスグルコアミラーゼリーダー、または国際公開第90/13646号に記載されたシグナルによって置換できる。哺乳動物細胞の発現には、哺乳動物シグナル配列ならびにウィルス分泌リーダー、例えば、単純疱疹gDシグナルが入手できる。このような前駆体領域のDNAを、リーディングフレーム内で、該抗体をコードするDNAに結合する。他の実施形態において、抗体の産生は、宿主細胞の細胞質内で生じ得、したがって、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在を必要としない。これに考慮して、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、細胞質内で、発現し、折りたたまれ、組み立てられて、機能的免疫グロブリンが形成される。一定の宿主株例えば、大腸菌trxB株は、ジスルフィド結合形成に有利な細胞質条件を提供し、それによって、発現されたタンパク質サブユニットの適切な折りたたみと組み立てが可能となるProbaおよびPlukthun、1995年、Gene159:203。ii複製起点成分発現ベクターとクローニングベクターの双方が、1種または複数種の宿主細胞内でベクターが複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般にクローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主の染色体DNAと独立して複製することを可能にする配列であり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウィルスに関して、十分に知られている。プラスミドpBR322の複製起点は、多くのグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド源は、酵母に好適であり、種々のウィルス源SV40、ポリオーマ、アデノウィルス、VSV、またはBPVは、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点成分は、哺乳動物の発現ベクターにとって必要ではないSV40源は、初期プロモーターを含有するという理由だけで、典型的に使用できる。iii選択遺伝子成分発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択性マーカーとも称される選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、a抗体または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与える、b栄養要求欠失を補足する、またはc複合培地から入手できない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。例えば、桿菌では、Dアラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。選択方式の一例では、宿主細胞の増殖を阻害する薬剤が利用される。異種遺伝子によって首尾よく形質転換されている細胞は、薬物耐性を与えて選択処置に生き残るタンパク質を産生する。このような優占的選択の例では、薬物のネオマイシン、ミコフェノール酸およびヒグロマイシンが用いられる。哺乳動物細胞にとって好適な選択性マーカーの例は、DHFR、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン-Iおよび-II、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの、抗体核酸を有する能力のある細胞の同定を可能にするものである。例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換した細胞は、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトレキサートMtxを含有する培養培地で、全ての形質転換体を培養することによって、先ず同定される。野生型のDHFRが用いられる場合の適切な宿主細胞は、DHFR活性の欠失したチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞株である。あるいは、抗体、野生型DHFRタンパク質、およびアミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼAPHなどの他の選択性マーカーをコードするDNA配列によって形質転換されたか、または同時形質転換された宿主細胞特に、内因性DHFRを含有する野生型宿主が、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはG418などの選択性マーカーに関する選択物質を含有する培地中での細胞増殖によって選択できる。米国特許第4,965,199号参照されたい。酵母に用いられる好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子であるStinchcombら、1979年、Nature282:39頁。trp1遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の欠損株、例えばATCC番号44076またはPEP4-1に関する選択マーカーを提供する。Jones、1977年、Genetics85:12頁。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるtrp1障害の存在により、トリプトファン不在下での増殖により形質転換を検出するために効果的な環境が提供される。同様に、Leu2欠失酵母株例えば、ATCC番号20,622または38,626を有する株は、Leu2遺伝子を担持する公知のプラスミドによって補足される。また、1.6μmの環状プラスミドpKD1由来のベクターを、Kluyveromyces酵母の形質転換に使用できる。あるいは、組換えウシキモシンの大規模製造に関する発現系が、K.lactisに関して報告されている。VandenBerg、1990年、Bio/Technology8:135頁を参照されたい。Kluyveromycesの産業用株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌に関する安定な多コピー発現ベクターもまた開示されちる。Fleerら、1991年、Bio/Technology9:968-975頁を参照されたい。ivプロモーター成分発現ベクターおよびクローニングベクターは、宿主生物によって認識され、抗体核酸に作動可能に結合したプロモーターを、通常は含有する。原核生物宿主と共に使用する上で好適なプロモーターとしては、phoAプロモーター、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファンtrpプロモーター系、およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターも好適である。細菌系に使用されるプロモーターは、該抗体をコードするDNAに作動可能に結合したシネ-ダルガルノS.D.配列もまた含有する。真核生物に関するプロモーター配列が知られている。実際、真核生物の全ての遺伝子が、転写が開始される部位からおよそ25から30塩基上流に位置するATの多い領域を有している。多くの遺伝子の転写開始から、70から80塩基上流に見られる他の配列は、CNCAAT領域であり、ここでNは任意のヌクレオチドである。多くの真核生物遺伝子の3’端には、コード配列の3’端にポリA尾部を付加するシグナルであり得るAATAAAがある。これらの配列は全て、真核生物発現ベクター内に好適に挿入される。酵母宿主と共に用いる好適なプロモート配列の例としては、3-ホスホグリセラートキナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベ-トデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素に関するプロモーターが挙げられる。増殖条件によって制御される転写というさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担っている酵素に関するプロモーター領域である。酵母の発現に用いられる公的なベクターおよびプロモーターは、欧州特許第73,657号にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターと共に有利に用いられる。哺乳動物宿主細胞において、ベクターからの抗体転写は、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルスアデノウィルス2など、ウシパピローマウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス、最も好ましくは、シミアンウィルス40SV40などのウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにより、このようなプロモーターが、宿主細胞株に適合性であるという条件で、制御される。SV40ウィルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウィルスの複製起点もまた含有するSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガウィルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。ウシパピローマウィルスをベクターとして用いて哺乳動物宿主にDNAを発現する系は、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第4,601,978号に記載されている。単純疱疹ウィルスのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ-インターフェロンcDNAの発現については、Reyesら、1982年、Nature297:598-601頁もまた参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウィルスの長末端反復がプロモーターとして使用できる。vエンハンサー要素成分高級真核生物による、本発明の抗体をコードするDNAの転写は、該ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによって増加させることが多い。哺乳動物遺伝子グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-胎児タンパク質、およびインスリンの多数のエンハンサー配列が、現在知られている。しかし、典型的には、真核生物細胞ウィルスのエンハンサーが用いられる。例としては、複製起点bp100~270の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウィルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化に関するエンハンス要素については、Yaniv、1982年、Nature297:17-18頁もまた参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列に対して、5’位または3’位でベクター内にスプライスされ得るが、プロモーターの5’位に位置することが好ましい。vi転写終結成分真核生物宿主細胞酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物の有核細胞に用いられる発現ベクターは、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列もまた含有する。このような配列は一般に、真核生物またはウィルスDNAまたはcDNAの5’、および時には3’未翻訳領域から入手できる。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの未翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。有用な転写終結成分の一つは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号およびそれに開示されている発現ベクターを参照されたい。vii翻訳強度の調節分泌され、適切に組み立てられた完全長抗体の収量を最大化するために、本発明の免疫グロブリンを、発現される軽鎖と重鎖の量比が調節できる発現系から発現させることもできる。このような調節は、軽鎖と重鎖の翻訳強度を同時に調節することによって達成される。翻訳強度を調節する1つの方法は、Simmonsら、米国特許第5,840,523号およびSimmonsら、2002年、J.Immunol.Methods263:13-147頁に開示されている。それは、シストロン内の翻訳開始領域TIRの改変体を利用する。所与のTIRに関する一連のアミノ酸配列または核酸配列の改変体が、翻訳強度の範囲で創製され、そのことによって、特定の鎖の所望の発現レベルにこの因子を調節する簡便な手段が提供される。TIR改変体は、アミノ酸配列を変化させ得るコドン変化をもたらす従来の変異誘発法によって作出できるが、ヌクレオチド配列のサイレント変化が好ましい。TIRの変化としては、例えば、シグナリング配列における変化と共に、シネ-ダルガルノ配列の数または間隔の変化を挙げることができる。変異シグナル配列を作出する1つの好ましい方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させないすなわち、変化がサイレントである、コード配列の始めにおけるコドンバンクの作出である。これは、各コドンの第3のヌクレオチド位置を変化させることによって達成でき、;さらに、ロイシン、セリン、およびアルギニンなどのいくつかのアミノ酸は、バンク作製に複雑さを付加し得る複数の1位および2位を有する。変異誘発のこの方法は、Yansuraら、1992年、METHODS:ACompaniontoMethodsinEnzymol.4:151-158頁に、詳述されている。内部の各シストロンに関してあるTIR強度範囲を有する一組のベクターが作出されることが好ましい。この限定された組により、各鎖の発現レベルならびに種々のTIR強度の組み合わせにおける完全長産物の収量の比較が提供される。TIR強度は、Simmonsら、米国特許第5,840,523号およびSimmonsら、2002年、J.Immunol.Methods263:133-147頁に詳細に記載されているレポーター遺伝子の発現レベルの定量化によって判定することができる。本発明の目的に関して、ベクター内のTIRの特定の対に関する翻訳強度の組み合わせは、N-軽、M-重によって表されここで、Nは、軽鎖の相対的TIR強度であり、Mは、重鎖の相対的TIR強度である。例えば、3-軽、7-重は、ベクターが、軽鎖発現に関しては約3の相対的TIR強度、重鎖発現に関しては約7の相対的TIR強度を提供することを意味する。翻訳強度の比較に基づき、本発明の発現ベクター構築体に組み合わせるべき所望の個々のTIRが選択される。vii宿主細胞の選択および形質転換本明細書のベクターにおけるDNAのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高級真核生物の細胞である。この目的のための好適な原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性細菌などの古細菌および真性細菌、例えば、エシェリキア属、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシェラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、サルモネラ菌、セラチア属、例えば、霊菌、志賀菌属、ならびに枯草菌およびリケニホルミス菌などの桿菌例えば、1989年4月12日発行のDD266,710に開示されたリケニホルミス菌41P、緑膿菌などのシュードモナス属、およびストレプトマイセス属が挙げられる。好ましい大腸菌クローニング宿主の1つは、大腸菌294ATCC27,325であるが、大腸菌B、大腸菌X1776ATCC31,537および大腸菌W3110ATCC27,325も好適である。これらの例は、限定ではなくて例示的なものである。また、宿主細胞が最少量のタンパク質分解酵素を分泌することが好ましく、追加のプロテアーゼ阻害剤が細胞培養物中に組み込まれることが望ましい場合がある。また、原核生物宿主細胞は、チオレドキシン経路および/またはグルタチオン経路における変異を含み得る。原核生物に加えて、糸状菌、真菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターにとって好適なクローニング宿主または発現宿主である。低級真核生物宿主微生物の中では、酵母、または一般的なパン酵母が最も一般的に用いられる。しかし、Schizosaccharomycespombe;例えば、K.lactis、K.fragilisATCC12,424、K.bulgaricusATCC16,045、K.wickeramiiATCC24,178、K.waltiiATCC56,500、K.drosophilarumATCC36,906、K.thermotolerans、およびK.marxianus欧州特許第402,226号などのKluyveromyces宿主;Pichiapastoris欧州特許第183,070号;カンジダ属;Trichodermareesia欧州特許第244,234号;Neurosporacrassa;SchwanniomycesoccidentalisなどのSchwanniomyces;および例えば、アカパンカビ属、アオカビ属、Tolypocladiumなどの糸状菌およびA.nidulansおよびA.nigerなどのアスペルギルス属宿主などの他の多数の属、種および株が一般的に入手でき、本明細書において有用である。グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎生物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウィルス株および改変体ならびに対応する、Spodopterafrugiperda毛虫、ネッタイシマカ蚊、セスジヤブカ蚊、キイロショウジョウバエショウジョウバエ、およびカイコガなどの宿主の許容的昆虫宿主細胞が確認されている。トランスフェクション用に、例えば、オートグラファカリフォルニア核多汗症ウィルスのL-1改変体およびカイコガ核多汗症ウィルスのBm5株などの種々のウィルス株が公共的に入手でき、このようなウィルスは、本発明により、本明細書におけるウィルスとして、特に、Spodopterafrugiperda細胞のトランスフェクションのために使用できる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ツクバネアサガオ、トマト、およびタバコの植物細胞培養物もまた宿主として利用できる。脊椎動物宿主細胞は広く用いられており、培養液中での脊椎動物細胞の増殖組織培養はルーチン法となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1系COS-7、ATCCCRL1651;ヒト胎児腎臓系293細胞または懸濁培養にて増殖用にサブクローン化した293細胞、Grahamら、J.Gen.Virol.36:591977、ハムスター仔腎臓細胞BHK、ATCCCCL10;チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFRCHO、Urlaubら、1980年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216頁;マウスセルトリ細胞TM4、Mather、1980年、Biol.Reprod.23:243-251頁;サル腎臓細胞CV1ATCCCCL70;アフリカミドリザル腎臓細胞VERO-76、ATCCCRL-1587;ヒト子宮頚癌細胞HELA、ATCCCRL1442;ヒト肺細胞W138、ATCCCCL75;ヒト肝臓細胞HepG2、HB8065;マウス乳腺腫瘍MMT060562、ATCCCCL51;TRI細胞Matherら、1982年、AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68頁;MRC5細胞;FS4細胞;NSO例えば、RCB0213、1992年、Bio/Technology10:169およびSP2/0細胞例えば、SP2/0-Ag14細胞、ATCCCRL1581などのマウス骨髄腫細胞;YB2/0細胞例えば、YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞、ATCCCRL1662などのラット骨髄腫細胞;およびヒト肝癌系HepG2である。CHO細胞は、本発明の実施に好ましい細胞株であり、CHO-K1、DUK-B11、CHO-DP12、CHO-DG44SomaticCellandMolecularGenetics12:5551986、およびLec13は代表的な宿主細胞株である。CHO-K1、DUK-B11、DG44またはCHO-DP12宿主細胞の場合、これらは、そこで発現されたタンパク質をフコシル化する能力を欠失するように変化させることができる。本発明はハイブリドーマ細胞にも適用できる。用語のハイブリドーマは、免疫源の不死細胞株と抗体産生細胞との融合によって作製されたハイブリッド細胞株を言う。この用語は、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞株との融合、引き続いて、プラズマ細胞との融合の結果である、一般にトリオーマ細胞株として知られている異種ハイブリッド骨髄腫融合体の後代を包含する。さらに、該用語は、例えば、抗体を産生するクアドローマなどの任意の不死化ハイブリッド細胞株を含むことが意図されている例えば、Milsteinら、1983年、Nature537:3053頁を参照。ハイブリッド細胞株は、ヒトやマウスなど、任意の種のものであり得る。最も好ましい一実施形態において、哺乳動物細胞は、対象となっている抗体をコードする外来性単離核酸によって形質転換された非ハイブリドーマ哺乳動物細胞である。外来性核酸または異種核酸は、該細胞にとって外来であるか、または該細胞と同種ではあるが、宿主細胞核酸内で該核酸が通常では見られない位置にある核酸配列を意味する。viii宿主細胞の培養宿主細胞は、抗体産生のために、上記の発現ベクターまたはクローニングベクターによって形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、適宜修飾した従来の栄養培地中で培養する。本発明の抗体の産生に用いられる宿主細胞は、種々の培地中で培養できる。ハムのF10Sigma、最少必須培地MEMSigma、RPMI-1640Sigma、およびダルベッコー修飾イーグル培地DMEMなどの市販の培地が宿主細胞の培養に好適である。また、Hamら、1979年、Meth.Enz.58:44頁、Barnesら、1980年、Anal.Biochem.102:255頁、米国特許第4,767,704号;第4,657,866号;第4,927,762号;第4,560,655号;または第5,122,469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;または米国特許Re第30,985号に記載された培地のいずれかを、宿主細胞の培養培地として使用できる。これらの培地にはいずれも、必要な場合は、ホルモンおよび/または他の成長因子インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など、塩類塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など、緩衝剤HEPESなど、ヌクレオチドアデノシンおよびチミジンなど、抗生物質GENTAMYCIN商標剤など、微量元素マイクロモル範囲で最終濃度に通常存在する無機化合物として規定された、およびグルコースまたは等価エネルギー源を添加できる。任意の他の必要添加物を、当業者に公知であると思われる適切な濃度において含めることもできる。温度、pHなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に用いられたものであり、当業者には明らかであろう。培養培地は全て、以下のカテゴリーの1つまたは複数のうちの少なくとも1つの成分を典型的に提供する:1通常はグルコースなどの炭水化物の形態におけるエネルギー源;2全必須アミノ酸、通常は20のアミノ酸の基本セットプラスシスチン;3ビタミン類および/または低濃度で必要とされる他の有機化合物;4遊離脂肪酸;および5微量元素、ここで微量元素は、通常マイクロモル範囲の極めて低濃度で典型的に必要とされる無機化合物または天然元素として定義される。培養培地は、無血清であることが好ましく、例えば、約5未満、好ましくは、1未満、より好ましくは、0から0.1の血清および他の動物由来タンパク質である。しかし、それらは所望ならば使用できる。本発明の好ましい一実施形態において、細胞培養培地は過剰のアミノ酸を含む。過剰に提供されるアミノ酸は、例えば、Asn、Asp、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびValから選択できる。Asn、Asp、Lys、Met、Ser、およびTrpが過剰に提供されることが好ましい。例えば、欧州特許第307,247号または米国特許第6,180,401号に指定された範囲の1倍または2倍で、アミノ酸、ビタミン類、微量元素および他の培地成分を使用できる。これら2つの文書は、参照として本明細書に組み込まれている。所望のタンパク質を発現し、特定の位置に所望の炭水化物を付加することのできる哺乳動物細胞の培養のために、培養される宿主細胞に特に注意を払って、多数の培養条件が使用できる。哺乳動物細胞のための好適な培養条件は、当業界に十分に知られているW.LouisClevelandら、1983年、J.Immunol.Methods56:221-234頁か、または当業者により容易に決定でき例えば、AnimalCellCulture:APracticalApproach第2版、Rickwood,D.およびHames,B.D.編、OxfordUniversityPress、ニューヨーク1992を参照、選択された具体的な宿主細胞によって変わる。ix抗体の精製組換え法を用いる場合、抗体は、細胞内に、もしくは細胞周辺腔に産生できるか、または直接、培地に分泌され得る。第1段階として、抗体が細胞内に産生される場合、宿主細胞または溶解断片の破片は、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去される。Carterら、1992年、Bio/Technology10:163-167頁は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離する方法を記載している。手短に述べると、酢酸ナトリウムpH3.5、EDTA、およびフェニルメチルスルホニルフルオライドPMSFの存在下、細胞ペーストを約30分にわたって解かす。細胞破片は遠心分離によって除去する。抗体が培地に分泌される場合、このような発現系の上澄み液は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMilliporePellicon限外ろ過ユニットを用いて、一般的には先ず濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を、前述のいずれかの段階に含めることができ、また、外来性汚染物の増殖を防ぐために、抗生物質を含めることができる。細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製法である。親和性リガンドとしてのタンパク質Aの好適性は、種および抗体内に存在する免疫グロブリンFc領域のイソタイプに依存する。タンパク質Aは、ヒトγ1、γ2、またはγ4重鎖に基づく抗体の精製に用いることができるLindmarkら、1983年、J.Immunol.Meth.62:1-13頁。タンパク質Gは、全てのマウスイソタイプおよびヒトγ3に対して推薦されているGussら、1986年、EMBOJ.5:15671575。親和性リガンドが結合する基質は、多くの場合アガロースであるが、他の基質も利用できる。制御ポアガラスまたはポリスチレンジビニルべんゼンなどの機械的に安定な基質によって、アガロースで達成できるよりも、速い流速および短い処理時間が可能になる。抗体がCH3ドメインを含む場合、精製には、BakerbondABX商標樹脂J.T.Baker、フィリップスバーグ、ニュージャージー州が有用である。イオン交換カラム上での分画エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカ上クロマトグラフィー、ヘパリンHAROSE商標クロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂上クロマトグラフィーポリアスパラギン酸カラムなど、等電点クロマトグラフィー、SDS-PAGE、および硫酸アンモニウム沈殿などの、タンパク質精製のための他の方法もまた、回収する抗体に依って利用できる。一実施形態において、糖タンパク質は、調製物からフコース含有糖タンパク質を除去するために、レクチン基質上への吸着を用いて精製でき、それによって、フコースのない糖タンパク質を高濃度化できる。x抗体活性アッセイ本発明の免疫グロブリンは、当業界に公知の種々のアッセイによって、それらの物理的/化学的性質および生物学的機能に関して特性化できる。本発明の一態様において、免疫原に対する本発明の抗体の選択性を他の結合標的に対するものと比較することは重要である。特に、選択的にFcγRIIBに結合する抗体は、他のFcγR類、特にFcγRIIAと結合しないか、または低い結合親和性を示すことが好ましい。本発明の一定の実施形態において、本明細書で産生される免疫グロブリンは、それらの生物学的活性に関して分析される。いくつかの実施形態において、本発明の免疫グロブリンは、それらの抗原結合活性に関して試験される。当業界に公知であり、本明細書に使用できる抗原結合アッセイとしては、限定はしないが、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ELISA酵素結合免疫吸着アッセイ、サンドイッチ免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイ、およびタンパク質A免疫アッセイなどの方法を用いた任意の直接的または競合的結合アッセイが挙げられる。例示的抗原結合アッセイは、下記の実施例の節に提供されている。精製免疫グロブリンは、限定はしないが、N末端配列決定、アミノ酸分析、非変性ゲルろ過高速液体クロマトグラフィーHPLC、質量分析法、イオン交換クロマトグラフィー、およびパパイン消化などの一連のアッセイによってさらに特性化できる。タンパク質定量化の方法は当業界に十分知られている。例えば、発現したタンパク質のサンプルを、それらの量的強度に関して、クーマシー染色SDS-PAGE上で比較できる。あるいは、対象となっている特異的バンド例えば完全長バンドを、例えば、ウェスタンブロットゲル分析および/またはAME5-RPアッセイによって検出できる。C.薬学的処方物該抗体の治療的処方物は、所望の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容できるキャリア、賦形剤または安定化剤と混合することによってRemingston’sPharmaceuticalSciences第16版、Osol,A.編1980、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で調製できる。許容できるキャリア、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤;保存剤オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾールなど;低分子量約10残基未満抗体;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖、二糖、および他の炭水化物;EDTAなどのキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体例えばZn-タンパク質錯体;および/またはTWEEN商標、PLURONICS商標またはポリエチレングリコールPEGなどの非イオン界面活性剤が挙げられる。また、本明細書における処方物は、治療される具体的な徴候に関して、必要ならば、1つ超の活性化合物、好ましくは、互いに有害作用を及ぼさない相補的活性を有するものを含有できる。例えば、該処方物は、他の抗体または化学療法剤をさらに含み得る。このような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わされて好適に存在する。また、該活性成分は、コロイド状薬物送達系例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセルにおいて、またはマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション法によって、または界面ポリマー化によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルならびにポリ-メチルメタクリレートマイクロカプセルに閉じ込めることもできる。このような方法は、Remington’sPharmaceuticalSciences第6版、Osol,A.編1980に開示されている。インビボ投与に用いられる処方物は滅菌してある必要がある。これは、滅菌ろ過膜によって容易に達成される。持続放出処方物を調製できる。持続放出処方物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過基質が挙げられ、該基質は、形状化製品、例えば、薄膜、またはマイクロカプセルの形態にある。持続放出基質の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル例えば、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、またはポリビニルアルコール、ポリラクチド米国特許第3,773,919号、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレンビニルアセテート、LUPRONDEPOT商標乳酸-グリコール酸コポリマーおよびロイプロライドアセテートからなる注射用ミクロスフェアなどの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、およびポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレンビニルアセテートおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーは、100日間にわたって分子放出を可能にするが、一定のヒドロゲルがタンパク質を放出する時間はより短い。カプセル化抗体が体内で長時間残留すると、37°Cで水分に晒される結果、変性または凝集して、生物活性の損失および場合によっては、免疫原性の変化を生じ得る。関与する機構に依って、安定化のための合理的な戦略が考案できる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間S-S結合形成であることが分かれば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマー基質組成物の開発によって安定化が達成できる。D.抗体の非治療的使用法本発明の抗体はアフィニティー精製剤として使用できる。この方法においては、当業界に周知の方法を用いて、Sephadex商標樹脂またはろ紙などの固相上に抗体を固定する。固定化した抗体を、精製する抗原を含有するサンプルに接触させ、その後、サンプル中の精製する抗原以外の実質的に全ての物質を除去する好適な溶媒で支持体を洗浄し、これを固定化抗体に結合させる。最後に、抗体から抗原を遊離させるグリシン緩衝液、pH5.0などの他の好適な溶媒で支持体を洗浄する。また抗体は、例えば、特定の細胞、組織、または血清中の対象となっている抗原の発現を検出するための診断的アッセイにも有用である。診断適用では、抗体は典型的に、検出可能部分によって標識化される。多数の標識が入手でき、一般に以下のカテゴリーに分類される:a35S、14C、125I、3H、および131Iなどの放射性アイソトープ。抗体は、例えば、CurrentProtocolsinImmunology、第1巻および第2巻、Coligenら編、Wiley-Interscience、ニューヨーク、NewYorkPubs1991に記載された方法を用いて、放射性アイソトープによって標識化でき、放射性は、シンチレーションカウントによって測定できる。b希土キレート類ユーロピウムキレート類またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン、およびテキサスレッドなどの蛍光標識が入手できる。蛍光標識は、例えば、CurrentProtocolsinImmunology、上記に開示された方法を用いて抗体に結合できる。蛍光は蛍光計を用いて定量化できる。c種々の酵素-基質標識が入手でき、米国特許第4,275,149号は、これらのいくつかのレビューを提供している。酵素は、種々の方法を用いて測定できる色素産生基質の化学変化を一般に触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒でき、これは吸光分析で測定できる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量化する方法は、上記に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に興奮し、次いで、測定できる例えば化学発光計を用いて光を発し得るか、または蛍光受容体にエネルギーを供与できる。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ類例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ;米国特許第4,737,456号、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン類、マレートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼHRPOなどのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ類例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ複素環式オキシダーゼウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど、ァクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素を結合する方法は、O’Sullivanら、MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay,inMethodsinEnzym.J.LangoneおよびH.VanVunakis編、Academicpress、ニューヨーク、73:147-166頁1981に記載されている。酵素-基質の組み合わせの例としては、例えば、1セイヨウワサビペルオキシダーゼHRPOは、過酸化水素を利用して色素前駆体を酸化する例えば、オルトフェニレンジアミンOPDまたは塩酸3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンTMB;2アルカリホスファターゼAPと、色素産生基質としてのパラニトロフェニルホスフェート;および3β-D-ガラクトシダーゼβ-D-Galと色素産生基質例えば、p-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼまたは蛍光原基質の4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼが挙げられる。多数の他の酵素-基質の組み合わせが当業者に入手できる。これらの一般的なレビューに関しては、米国特許第4,275,149号および第4,318,980号を参照されたい。時には、標識を間接的に抗体に結合させる。これを達成するための種々の方法を、当業者は認識されるであろう。例えば、抗体をビオチンに結合させ、上記の標識の3つの広範なカテゴリーのいずれかをアビジンに結合できるか、またはその逆ができる。ビオチンは選択的にアビジンに結合し、したがって、標識をこの間接的な方式で抗体に結合できる。あるいは、標識と抗体との間接的結合を達成するために、抗体を小型のハプテン例えばジゴキシンに結合させ、上記の種々のタイプの標識のいずれか1つを、抗ハプテン抗体例えば抗ジゴキシン抗体に結合させる。このようにして、標識と抗体との間接的結合を達成できる。本発明の他の実施形態において、抗体は標識化する必要はなく、その存在は、その抗体に結合する標識抗体を用いて検出できる。本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ法で使用できる。Zola、MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques、147-158頁CRCPress社、1987年。該抗体は、インビボ診断的アッセイにも使用できる。一般に、抗原またはそれを発現する細胞が局在化できるように、該抗体は、免疫シンチオグラフィーを用いて、放射性核種111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32Pまたは35Sなどによって標識される。E.抗体のインビボ使用法iFcγRIIBCD32Bの抑制活性の減少:抗体Fc結合の妨害他の実施形態において、治療薬の機能を高めるために、抗FcγRIIB抗体が治療薬と同時投与される。例えば、FcγRIIBに対するIgG結合を阻害するために、哺乳動物に抗FcγRIIBを投与し、そのことによって、免疫応答のFcγRIIB媒介抑制を防ぐ。これにより、IgG治療的抗体の細胞障害性が増強される。例えば、治療的抗体が腫瘍抗原に特異的である場合、本発明の抗FcγRIIを、抗腫瘍抗原抗体と同時投与することにより、抗腫瘍抗原抗体の細胞障害性が増強する。治療的抗体の多くは、上記に記載されているが、それらは、癌などの種々の疾患の治療に開発され、承認されている。例えば、RITUXAN登録商標リツキシマブIDECPharm/Genentech社は、B細胞リンパ腫の治療に使用され、AVASTIN商標ベバシツマブGenentech社は、転移大腸癌の治療に使用され、HERCEPTIN登録商標トラスツマブGenentech社は、転移乳癌の治療に使用されるヒト化抗HER2モノクローナル抗体である。このような治療のために開発された全てのモノクローナル抗体による癌治療の機構は、完全には理解されていないかも知れないが、少なくともいくつかの場合、抗体療法の有効性の一部は、免疫エフェクター機能の動員が原因であると考えることができる。Houghtonら、2000年、NatureMedicine6:373-374頁;Clynesら、2000年、NatureMedicine6:433-446頁。XOLAIR登録商標オマリツマブGenentech社は、アレルギーの治療に使用される抗IgE抗体である。FcγRIIBは、リンパ系および骨髄系の細胞に発現するが、ナチュラルキラー細胞には発現せず、抑制受容体である。FcγRIIBは、活性化されると、例えば、そうでない場合には、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞および肥満細胞を活性化するFcγRIIBシグナル伝達を抑制する。FcγRIIBの抑制例えば、FcγRIIBに対するFc結合の阻害により、免疫エフェクター機能に及ぼすその抑制作用が減弱化し、そのことによってMAb療法が補助される。Ravetch,j.国際公開第01/79299号は、FcγRIIBに対するFc領域の親和性減少により、細胞障害性を増強し、そのことによって細胞活性化のSHIP媒介抑制を制限する方法を記載している。一実施形態において、FcγRIIBに選択的に結合する抗体が、抗腫瘍抗体と共に、このような治療を必要としている哺乳動物に投与される。FcγRIIAなどの他のFcγR類による免疫エフェクター応答の活性化が損なわれないように、FcγRIIBに対する選択性が望まれる。FcγRIIAとの交差反応ができないことで、FcγRIIBの抑制機能はより効果的に阻害され、そのことによって、同時治療薬の効果が増強される。一実施形態において、IgG抗体の結合を阻害し、そのことによって、FcγRIIBの抑制効果を阻害し、例えば、B細胞増殖を高めるために、本発明の抗FcγRIIB抗体を哺乳動物に投与する。iiFcγRIIBの抑制活性の増強:活性化受容体との共凝集インビボで、FcγRIIBは、非限定例として、B細胞抗原受容体BCR、IgEに対する高親和性受容体IgERまたはFcεRI、FcγRIIA、およびc-kit受容体FcγRIIIなどの種々の活性化受容体と共凝集され得る。非限定例としての活性化受容体は、免疫エフェクター応答に関して活性化活性を有する膜貫通タンパク質であり、ITAM活性化モチーフを含む。FcγRIIBは、FcγRIIBと活性化受容体との共凝集によって活性化し、活性化受容体を介して伝達されるシグナルを減弱させる。現在までとところ、FcγRIIBは、自己凝集またはホモ二量体化によってリン酸化されることは示されていない。FcγRIIB受容体は、リン酸化ITAM活性化モチーフを発現している他の受容体と実験的にヘテロ二量体化または共凝集または共結合しており、タンパク質チロシンキナーゼ類PTK類との間接的結合によって、FcγRIIBITAMがリン酸化され得る。リン酸化FcγRIIBITAMは、ホスファターゼSHIPイノシトールホスフェート5’-ホスファターゼを含有するSH2ドメインを動員し、ITAMが引き金となるカルシウム動員および細胞増殖を抑制するDaeronら、1995年、Immunity3、635;Malbecら、1998年、J.Immunol.169、1647頁;Onoら、1996年、Nature、383、23。正味の効果は、カルシウム流入の阻害および持続的カルシウムシグナル伝達の防止であり、これによって、脱顆粒、食作用、ADCC、およびサイトカイン放出が防止されるRavetchら、2000年、Science290:84-89頁が、いくつかのFcγRIIB媒介シグナル伝達阻害は、カルシウムと独立でもあり得る。B細胞における増殖阻害は、ITIM経路にも依存的である。FcγRIIB抑制活性の活性化は、FcγRIIBに特異的なモノクローナル抗体と結合活性化受容体との間接的交差結合によって達成されている。間接的交差結合剤としては、ビオチン化モノクローナル体、マウスモノクローナルIgGのFc部分に特異的なポリクローナル抗体、および抑制剤と活性化受容体との双方に結合する免疫複合体を形成する多価抗原に対して、アビジンが挙げられる。多くの実験的モデルでは、マウスB細胞または肥満細胞およびマウスFcγRIIとFcγRIII受容体の双方と交差反応するモノクローナル抗体ラットG4.2の使用が記載されている。本発明により、モノクローナル抗ヒトFcγRIIBFabおよび活性化受容体に特異的なモノクローナルFabを含む異種二重機能性抗体が、当業界に周知の化学的または遺伝子工学的方法によって調製される。このような二重機能性抗体に関する治療可能性としては、炎症およびアレルギーに関与するシグナルの減弱が挙げられよう。IgEおよびアレルゲンによって活性化されるとFcεRを介して、肥満細胞および好塩基球は、血管細胞および筋肉細胞に作用して炎症細胞を動員する炎症メディエーターおよびサイトカインを分泌する。次いで炎症細胞は炎症メディエーターを分泌し、長期継続性の炎症をもたらす連続的過程で炎症細胞を動員する。したがって、IgE誘導肥満細胞の活性化を制御する手段は、炎症応答の開始を妨害することにより、アレルギー疾患治療への治療方法を提供する。上記のとおり、FcγRIIBに選択的に結合する抗体またはその断片をさらに含み、また、例えば、FcεRIまたはIgEに結合したFcεRに結合する抗体またはその断片を含む二機能性抗体は、FcγRIIBの抑制活性によりIgE媒介活性化を減弱させる。さらなる二重機能性抗体例えば二重特異性抗体の例は、FcγRIIBに選択的に結合する抗体またはその断片と以下に関与する活性化受容体に結合する第2の抗体またはその断片との組み合わせを含む:喘息モノクローナルヒト抗体およびFcεRI、IgEに結合したFcεRI、またはCD23に特異的なモノクローナルFab、慢性関節リウマチおよび全身性紅斑性狼蒼モノクローナル抗ヒトFcγRIIBFabおよびFcγRIに特異的なモノクローナルFab、乾癬モノクローナル抗ヒトFcγRIIBFabおよびCD11aに特異的なモノクローナルFab、免疫媒介血小板減少症、慢性関節リウマチおよび全身性紅斑性狼蒼モノクローナル抗ヒトFcγRIIBFabおよびFcγRIIICD16またはCD4に特異的なモノクローナルFab、クローン病および潰瘍性大腸炎モノクローナル抗ヒトFcγRIIBFab、およびアルファ4ベータ7インテグリンサブユニット、またはアルファ4インテグリンサブユニットに特異的なモノクローナルFab、またはこれらのモノクローナル抗体の結合部分、および肥満細胞、好塩基球、B細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球および樹状細胞が活動的に関係している他の自己免疫疾患。上記の定義の節に、種々の免疫疾患が記載されている。該抗体はまた、疾患に関連する重要な免疫複合体成分が存在する免疫疾患の治療にも使用できる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、活性化受容体によって媒介される炎症前シグナルおよび/またはB細胞活性化を抑制する目的で、該抗体により治療されている哺乳動物における抑制性FcγRIIB受容体を活性化するために使用される。したがって、該抗体は、上記で特定されたものなどの炎症性障害および/または自己免疫疾患を治療するために使用される。FcγRIIB抑制機能の活性化は、FcγRIIBと直接的に交差結合する本発明の二重特異性抗体および活性化受容体によって、またはFcγRIIBに間接的に交差結合する抗体および活性化受容体によって達成される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、活性化に関連した脱顆粒化を抑制する。活性化に関連した脱顆粒化は、ヒスタミン放出抑制によって測定できる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、全ヒスタミンに比較して、少なくともヒスタミン放出を70抑制する。さらなる実施形態において、ヒスタミン放出の抑制は、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95であり、各々、70から100の連続した整数を含み、ヒスタミン放出の100減少は、バックグラウンドのヒスタミン放出に等しい。疾患の予防または治療のための抗体の適切な投与量は、治療する疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、該抗体の投与が予防のためかまたは治療のためか、先行療法、患者の臨床暦および抗体への応答性、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体は、患者に、1回、または一連の処置にわたって投与される。疾患のタイプおよび重症度に依って、例えば、1回または複数の別々の投与によっても、連続的注入によっても、約1μg/kgから15mg/kg例えば、0.1~20mg/kgの抗体が、患者に投与する初回の候補投与量である。典型的な1日の投与量は、上記の因子に依り、約1μg/kgから100mg/kg以上の範囲であり得る。数日間またはそれ以上にわたる反復投与では、病態に依って、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療が持続される。しかし、他の投与法も有用であり得る。この療法の進行は、従来の方法およびアッセイによって容易にモニターされる。該抗体組成物は、適切な医療行為に矛盾しない様式で処方され、用量化され、投与されることが必要である。この文脈において考慮すべき因子としては、治療する具体的疾患、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療行為者に公知の他の因子が挙げられる。投与する抗体の治療的有効量は、このような考慮事項によって調節され、疾患または障害を予防、寛解、または治療する上で必要な最少量である。該抗体は、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている1つまたは複数の薬剤と共に任意に処方されるが、それが必ずしも必要というわけではない。このような他の薬剤の有効量は、処方物に存在する抗体の量、障害または治療のタイプ、および上記で考察した他の因子に依存する。これらは一般に、先に用いられたのと同じ用量ならびに投与経路で、またはこれまで用いられた用量の約1から99で用いられる。治療的抗体組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアル内に入れられる。本発明はさらに、例えば、癌の治療に有用な材料を含有する製造品およびキットを提供する。該製造品は、ラベルを有する容器を含む。好適な容器としては、例えば、ビン、バイアル、および試験管が挙げられる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成できる。該容器は、本明細書に記載された抗体を含む組成物を保持する。該組成物中の活性剤は特定の抗体である。該容器上のラベルは、該組成物が特定の疾患または障害の治療または予防に使用されることことを示し、また、上記のものなどのインビボに関する指示もまた示し得る。本発明のキットは、上記の容器および緩衝液を含む第2の容器を含む。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書付きの添付文書などの商業的および使用者の立場から望ましい他の材料をさらに含み得る。例えば、慢性関節リウマチおよび狼蒼などの、炎症細胞例えば白血球接着、移動および活性化の関与がある自己免疫疾患の治療のために、本明細書における抗体は、例えば、抗LFA-1抗体抗CD11a抗体または抗CD18抗体または抗ICAM-1、-2、または-3などの抗ICAM抗体と共に同時投与できる。本明細書における抗体と組み合わせる、慢性関節リウマチ治療のためのさらなる薬剤としては、Enbrel商標、DMARDS、例えば、メトトレキサート、およびNSAID類非ステロイド抗炎症薬が挙げられる。本明細書における抗体以外の1種超のこのような他の抗体もまた使用できる。さらに、インスリンを糖尿病の治療に、抗IgEを喘息に、抗CD11aを乾癬に、抗アルファ4ベータ7および成長ホルモンGHを炎症性腸疾患に使用できる。さらに、該処方物は、有効量の血糖降下薬と共に好適に投与される。本明細書の目的に関し、用語の血糖降下薬は、グルコース代謝の調節に有用な化合物、好ましくは、経口薬を言う。本明細書において、ヒトへの使用により好ましいものは、インスリン、および膵臓によるインスリンの分泌を生じさせるスルホニル尿素クラスの経口血糖降下薬である。例としては、グリブリド、グリピジド、およびグリクラジドが挙げられる。さらに、ビグアニド類メトホルミンおよびフェンホルミンなどおよびREZULINTM商標トログリタゾン商標インスリン増感剤などのインスリン感受性を高めるか、またはインスリン増感性の薬剤、ならびにPPAR-ガンマ核受容体に結合する他の化合物がこの定義内に入り、また好ましい。血糖降下薬は、非経口、鼻腔内、経口などの任意の好適な方法により、または任意の他の有効な経路により、哺乳動物に投与される。投与は経口経路によることが最も好ましい。例えば、1.25mg、2.5mg、および5mg錠剤濃度において、Upjohnにより市販されているMICRONASE商標錠グリブリドが経口投与に好適である。この療法で設定されるII型糖尿病に対する通常の維持用量は一般に、1日当たり、約1.25mgから20mgの範囲であり、これを、単回投与として、または1日の間に適切であると考えられるような分割で投与できる。医薬品集、2563-2565頁1995。処方に入手できるグリブリドベースの錠剤の他の例としては、GLYNASE商標商標薬UpjohnおよびDIABETA商標商標薬Hoechst-Rousselが挙げられる。GLUCOTROL商標Prattは、5mgと10mgの双方の力価で入手できるグリピジド1-シクロヘキシル-3-p-2-5-メチルピラジンカルボキサミドエチルフェニルスルホニル尿素錠の商標であり、食事管理後の血糖降下療法を必要とするII型糖尿病患者、または他のスルホニル尿素に対する応答がなくなった患者に、やはり処方される。医薬品集、1902-1903頁1995。ビグアナイド類例えば、メトホルミンおよびフェンホルミンもしくはチアジリジンジオン類例えばトログリトゾン、またはインスリン作用に影響を与える他の薬剤などのスルホニル尿素以外の他の血糖降下薬もまた使用できる。チアジリジンジオンがペプチドと共に用いられる場合、それは、現在使用されている濃度と同じ濃度、またはいくらか低い濃度で使用され、ペプチド単独で、またはジオンと共に見られる効果に関して適合させることができる。トログリタゾンREZULINTM商標単独で用いられる典型的な用量は、1日当たり、約100mg~1000mg、より好ましくは、200mg/日~800mg/日であり、この範囲が本明細書において適用できる。例えば、Ghazziら、Diabetes46:433-439頁1997を参照されたい。トログリタゾンよりも強力なインスリン増感剤である他のチアジリジンジオンは、より低用量で使用されると考えられる。F.材料の寄託以下のハイブリドーマ細胞株は、AmericanTypeCultureCollection、10801University大通り、マナサス、バージニア州20110-2209米国ATCCに寄託されている:ハイブリドーマ/抗体名ATCC番号寄託月日FcγRIIB5A6.2.1PTA-46142002年8月28日この寄託は、特許手続きを目的とする微生物寄託の国際公認についてのブタペスト条約の条項およびそれに従う規定ブタペスト条約の下でなされた。これは、寄託日から30年間、生存可能な培養維持を保証している。細胞株は、ブタペスト条約の条項の下で、ATCCにより入手でき、Genentech社およびATCC間の合意に供され、これによって、a特許出願の係属中、37CFR§1.14および35USC§122にしたがって、長官により権利が与えられると判定された者に培養物へのアクセスが利用できること、およびbこのように寄託された培養物の公共への利用可能性に対する制限は、特許付与時に取消し不能で除去されることが保証される。本発明の譲受人は、寄託培養物が好適な条件下で、死滅または損失または破壊された場合は、通告に基づいて、同じ培養物の生存可能な試料と直ちに交換されることに合意している。寄託細胞株の入手可能性は、任意の政府の権限下でその特許法にしたがって付与された権利に違反して本発明を実施する許可として考えられるべきではない。前述の明細書は、当業者に本発明の実施を可能にさせる上で十分であると考えられる。寄託された実施形態は、本発明の一態様の一つの実例として意図されているため、本発明は寄託培養物によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に等価な任意の培養物が本発明の範囲内にある。本明細書における材料の寄託は、本明細書に含まれた説明が、その最良の様式を含めて、本発明の任意の態様の実施を可能にする上で不十分であるとの容認を定めるものではなく、また、請求項の範囲をそれが表示している特定の実例に限定していると解釈すべきでもない。実際、本明細書に示され記載されたものの他に、本発明の種々の修飾が、前述の説明から当業者に明らかになるであろうし、また添付の請求項の範囲に入る。本発明は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。しかし、それらを、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。本明細書に挙げられた全ての文献および特許引用文は、参照として、特に組み込まれている。III.実施例機能的には反対であるが、ヒトFcγRIIA活性化受容体とヒトFcγRIIB抑制性受容体は、相同性の高いタンパク質であり相同性領域は、図2Aの囲み部分である、IgG1における約9つのアミノ酸および3つの結合ドメインに違いがある。市販のモノクローナル抗体は、ヒトFcγRIIAとFcγRIIBの双方に結合する。FcγRIIBに特異的に結合するモノクローナル抗体が有用であると考えられ、IgG結合を阻害するさらなる能力もまた望ましい。実施例および補助図において、FcγRIIBは、ヒトFcγRIIBであり、特に記述されない限り、一般にヒトFcγRIIB1を言う。FcγRIIBは、交換可能に、FcgRIIB、FcGRIIb、huFcγRIIB、huFcGRIIb、hFcγRIIB、Fcγ-RIIb、FcγR2B、FcγR2b、またはIgGRと称し得る。特定の対立遺伝子改変体は、数字の1、2、または3を付けて、例えば、huFcGRIIb1と称される。FcεRIは、ヒトFcεRIであり、ヒトFcεRIαと称される。FcεRIは、交換可能に、FceRI、FceRIa、FcERI、IgER、IgE-R、FcεRIα、Fcε-RIまたはFcεRIaと称し得る。上記タンパク質のいずれかの抗体は、名称によるか、または一般的に、関連タンパク質の前に抗を付けて、例えば、抗FcγRIIB、抗IgERなどと称される。タンパク質の細胞外ドメインは、タンパク質名にECDを付けて、例えば、FcγRIIBECDと称される。対象となっているタンパク質を発現している細胞は、その細胞株のタンパク質名の変型を含むように記述的に命名でき、細胞と称される。実施例1.0材料および方法1.1材料PerkinElmerLifeScienceのGeneAmp商標、pGEX-4T2プラスミド、タンパク質Aカラムおよび試薬、ならびにタンパク質GFcγRIIIを用いて逆転写PCRを実施し、カラムおよび試薬は、AmershamPharmaciaBiotechから入手した。Ni-NTAカラムおよび試薬は、Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州から入手した。Centriprep-30コンセントレーターは、Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ州から、SDS-ポリアクリルアミドゲルおよびポリビニリデンジフルオリド膜は、NOVEX、サンジエゴ、カリフォルニア州から入手し、FuGENE登録商標は、Rocheから入手した。ヒトFcγRIIACD32A;His131アロタイプ、FcγRIIBCD32B、およびFcγRIIIACD16A;Val158アロタイプの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするcDNA;およびFcγRIIBおよびFcγRIIAのグルコース-6-ホスフェートイソメラーゼGPIイソ体は、Dr.J.Ravetchロックフェラー大学、ニューヨークにより提供された。FcγRIIA-Arg131アロタイプおよびFcγRIIIA-Phe158アロタイプは、部位特異的変異誘発31によって作出した。FcγRIIB1配列番号11に関する配列情報は、登録番号:NP003992で;FcγRIIB2配列番号10および登録番号:NP001002273で;FcγRIIA配列番号9および登録番号:NP067674で、およびFcγRIII2つのイソ体は、登録番号:NP000560およびNP000561で入手できる。抗体AT10は、BiosourceInternational、カミリロ、カリフォルニア州から入手した。抗体mopc21は、BDPharmagenから入手した。マウスモノクローナル抗体は、以下の供給源から入手した:Medarex、アナンデール、ニュージャージー州から、32.2抗FcγRI、IV.3抗FcγRII、および3G8抗FcγRIII;およびBeckmanCoulter、パロアルト、カリフォルニア州から、B1G6抗b2ミクログロブリン。抗GST抗体は、ZymedLaboratories社から、抗GSTビオチンは、Genentechクローン15H4.1.1JW8.5.13は、Serotec社、ラレイ、ノースカロライナ州から入手した。ELISAプレート、例えば、Nunc登録商標maxisorbプレートは、Nalge-Nunc、ネイパービル、イリノイ州から入手した。組織培養プレートは、例えば、LinbroまたはFisherから入手できる。ウシ血清アルブミンBSA、ツウィーン20登録商標、TritonX-100、EMEMイーグル最少必須培地、イオノマイシン、硫酸プロタミンおよびo-フェニレンジアミンジヒドロクロライドOPD、ヨウ化プロピジウムは、Sigmaセントルイス、ミズーリ州から、ストレプトアビジンおよびカゼインブロッカーProd37528は、Pierceロックフォード、イリノイ州から、セイヨウワサビペルオキシダーゼウサギ抗マウスIgG抗体結合体、およびヤギ抗ヒトFab’2-特異的IgGのペルオキシダーゼ結合Fab’2断片は、JacksonImmunoResearchLaboratories、ウェストグローブ、ペンシルベニア州から入手した。ペルオキシダーゼ結合タンパク質Gは、BioRadから、ストレプトアビジン-HRPは、BoehringerMannheimまたはZymedから、TMB基質ProdTMBW-0100-01および停止液ProdBSTP-0100-01は、BioFxLaboratoryから、ヤギ抗マウスIgG-フルオレセインは、AmericanQualexLabsから入手した。NP-11-OVAおよびTNP-11-OVAは、BiosearchTechnologies社、ノバド、カリフォルニア州から入手した。ストレプトアビジン-PEおよびラット抗マウスIgG-PEまたはフルオレセイン結合体は、BDPharmagen、フランクリン、レイクス、ニュージャージー州から入手した。フローサイトメトリーは、FACScan商標上で実施するか、またはFACSCalibur商標フローサイトメーターをBD、フランクリンレイクス、ニュージャージー州から入手した。吸光度は、MolecularDevices、マウンテンビュー、カリフォルニア州のVmaxプレートリーダーを用いて読み取った。ヒスタミンELISAは、RDI社ニュージャージー州により配給された、IBLImmunobiologicalLabsハンブルク、ドイツ国から入手のHistamineELISAKitを用いて実施した。1.2GST-Fc受容体融合タンパク質の作製FcγRICD64のcDNAは、α鎖細胞外ドメインをコードする断片を作出するプライマーを用いて、U937細胞のオリゴdT-プライムドRNAの逆転写PCRによって単離した。全ての受容体のコード領域を、前述のpRK哺乳動物細胞発現ベクター内にサブクローン化したEaton,D.ら、1986年、Biochemistry25:8343-8347頁。全てのFcγRpRKプラスミドに関して、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを、Gly-His6タグおよびヒトグルタチオンSトランスフェラーゼGSTをコードするDNAで置換した。5’端と3’端に、それぞれNheI制限部位とXbaI制限部位を有するpGEX-4T2プラスミドから、PCRによって234のアミノ酸GST配列を得た。したがって、発現タンパク質は、以下のアミノ酸位置において、カルボキシル末端でGly/His6/GSTに融合したα鎖の細胞外ドメインを含有する:FcγRI、His292;FcγRIIA、Met216;FcγRIIB、Met195;FcγRIIIA、Gln191残基数はシグナルペプチドを含む。プラスミドは、リン酸カルシウム沈降によってアデノウィルス形質転換ヒト胚体腎臓細胞株293にトランスフェクトしたGormanら、1990年、DNAProthyA遺伝子.Eng.Tech.2:3-10頁。10mg/リットルの組換えウシインスリン、1mg/リットルのヒトトランスフェリン、および微量元素を添加した無血清PSO4倍地に変換72時間後、上澄み液を採集した。タンパク質を、ニッケル-ニトリロ三酢酸Ni-NTAクロマトグラフィーによって精製し、Centriprep-30コンセントレーターを用いて、緩衝液をリン酸化緩衝生理食塩水PBSに交換した。タンパク質を4~20SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分析し、ポリビニリデンジフルオライド膜に移し、それらのアミノ末端を配列決定して適切なシグナル配列開裂を確認した。マウスモノクローナル32.2抗FcγRI、IV.3抗FcγRII、3G8抗FcγRIII、およびB1G6抗b2-ミクログロブリンを用いて、ELISAにより受容体のコンホメーションを評価した。アミノ酸組成分析によって誘導した吸光係数を用いて、280nmにおける吸光度を測定した。1.3FcγRIIB抗体の作製受容体によるIgGFc結合w阻害するヒトFcγRIIB特異的抗体を、FcγRIIB-His6-GSTに対して作出した。BALB/cマウスを、足裏に2μgのhuFcγRIIB-His6-GSTにより免疫化した。免疫化マウスの脾臓細胞SelectedMethdsincellularimmunologyMishellBB、ShiigiSM編、351-372頁、サンフランシスコ:FreemanにおけるOiVT、ハーゼンバーグ、ルイジアナ州、1981年、Immunoglobulinproducinghybridcelllinesに記載された細胞を、P3X63Ag8U1骨髄腫細胞に融合し、およそ900のハイブリドーマを得た。ELISAは一般に、以下のとおり実施される:PBS、pH7.4中、およそ1.5mg/mlで、受容体融合タンパク質をELISAプレートに塗布し、4°Cで18時間置いた。プレートを、アッセイ緩衝液により、25°Cで1時間ブロックした。スクリーンする抗体の連続3倍希釈液および対照抗体10.0~0.0045mg/mlをプレートに加え、2時間インキュベートした。アッセイ緩衝液でプレートを洗浄後、ヤギ抗ヒトFab’2特異的IgGのペルオキシダーゼ結合Fab’2断片により、該受容体に結合したIgGを検出した。使用された基質は、o-フェニレンジアミンジヒドロクロライドであった。Vmaxプレートリーダーにより、490nmにおける吸光度を読み取った。1.4FcγRIIB特異的抗体に関する一次スクリーン一次スクリーンにおいて、ハイブリドーマサブクローンから発現させた抗体を含有する上澄み液を、FcγRIIB-His6-GSTに対する陽性結合に関してスクリーンした。ELISAによりFcγRIIB-His6-GSTに反応性の抗体を、FcγRIIB-His6-GSTに対する結合およびFcγRIIAR131改変体-His6-GSTおよびFcγRIIIF158改変体-His6-GSTに対する陰性結合に関して再スクリーンした。この一次スクリーンから、およそ50の抗体がさらなる分析のために選択された。1.5FcγRIIB特異的抗体に関する二次スクリーン二次スクリーンにおいて、受容体特異性に関して、該抗体をELISAにより再スクリーンし、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼGPI結合FcγRIIB、およびFcγRIIAを発現するCHO細胞株を用いて細胞結合アッセイを行った。ELISAを実施し、上記に記載し、結果は図4に示した。図4において、棒グラフは、GST-huFcγRIIAおよびGST-huFcγRIII融合タンパク質と比較して、GST-huFcγRIIBに対する抗体の相対的結合を示している。抗体1D1、5A6、5H11および6A5は、GST-huFcγRIIAおよびGST-huFcγRIII融合タンパク質よりもGST-huFcγRIIBに選択的に結合する。抗体5B9は、GST-huFcγRIIIよりもGST-huFcγRIIBとGST-huFcγRIIAの双方に選択的に結合する。図5は、GPI-huFcγRIIAを発現するCHO細胞に比較して、GPI-huFcγRIIBを発現するCHO細胞に対する抗体の免疫蛍光結合による結合特異性を示している。CHO細胞の分離アリコートを、mIgG1イソタイプ対照mopc21,または抗ヒトFcγRIIBモノクローナル抗体、1D1、5A6、5H11および6A5のいずれかによって染色した。フルオロセイン結合Fab’2ヤギ抗マウスIgGFab’2特異的抗体による第2のインキュベーションによって、結合を間接的に検出した。抗体5A6は、GPI-huFcγRIIAを発現するCHO細胞に比較して、GPI-huFcγRIIBを発現するCHO細胞に優先的に結合する。結果は、GST構築体に対する結合と同様である。さらなるELISA結合データを、図6~9に示す。図6~9は、GST-huFcγRIIB、GST-huFcγRIIAH131、またはGST-huFcγRIIAR131に対する種々の抗FcγRIICD32MAb類の結合に関する結合親和性曲線を示す。AT10は、FcγRIIAに特異的なmIgGであり、mopc21は、mIgGイソタイプ対照である。5A6mIgG1は、図6に示されたGST-huFcγRIIBに対する結合に関して、0.06nMのEC50測定値を有する。対照的に、GST-huFcγRIIAH131に対する結合に関する5A6mIgG1のEC50は、50μg/ml超であり図9、GST-huFcγRIIAR131に対する結合に関しては、2.5μg/mlである図8。1.6抗体の発現および精製抗体5A6.2.1本明細書において、5A6.2.1または5A6と交換可能に称されるを腹水に関して選択し、タンパク質GクロマトグラフィーAmershamPharmaciaBiotechを用いて精製した。5A6.2.1をコードするDNAを常法を用いて単離し、配列決定した。重鎖配列番号7および軽鎖配列番号8のアミノ酸配列およびCDRを図10に示す。重鎖CDRは:DAWMD配列番号1、EIPSKPNNHATYYAESVKG配列番号2、およびFDY配列番号3である。軽鎖CDRは:RASQEISGYLS配列番号4、AASALDS配列番号5、およびLQYVSYPL配列番号6である。5A6モノクローナル抗体に対する推定上の結合エピトープとしては、アミノ酸残基K158~V161およびF174~N180が挙げられ、ナンバリングは、図2AにおけるFcγRIIB2に示されているFcγRIIB2、配列番号10。FcγRIIB1およびFcγRIIB2受容体は、図2Aおよび2Bに残基T43~P123におけるIgG様ドメイン1として、および残基W132~P217におけるIgG様ドメイン3として示された構造ドメインを有するFcγRIIB2により例示。ITIMモチーフは、図2Aに、FcγRIIB2に関して示されており、残基N269~M277を含む。図2AにおいてFSRLDPT配列番号39として示されたFcγRIIAのアミノ酸配列F165~T171は、FSHLDPT配列番号40であり得、それにより、FcγRIIAとFcγRIIBとの間には、抗体5A6に対するFcγRIIBの推定結合エピトープにおける大きな配列の相違が示されていることが、最近報告されている図2および登録番号:NP067674、配列番号30を参照。このアミノ酸配列は、FcγRIIAのN末端位における残基の変化も含む。1.7E27:IgE複合体との競合このアッセイは、FcγRIIAおよびFcγRIIBに対するIgG1の結合を妨害する5A6MAbの能力をスクリーンする。FcγRII類は、単量体IgG1に対する親和性が弱く、したがって、IgG1結合は、3種のIgEおよび3種の抗IgE分子、例えば、IgEに結合するヒト化IgG1抗体であるE27の安定な六量体複合体を用いてアッセイするShields,R.L.ら、J.Biol.Chem.276:6591-6604頁2001。ヒトFcγRIIAおよびFcγRIIBに対するE27-IgE六量体複合体の結合に競合する抗体の能力を評価することによるIgG結合中和に関して、5A6MAbがスクリーンされた。この競合アッセイは以下のとおり実施され、結果は図11および12に示されている。PBS、pH7.4中、1mg/mlのFcγRIIBおよびFcγRIIA融合タンパク質を、ELISAプレートに塗布し、4°Cで48時間置いた。25°Cで1時間、トリス緩衝生理食塩水、0.5ウシ血清アルブミン、0.05ポリソルベート-20、2mMEDTA、pH7.45アッセイ緩衝液でプレートをブロックした。25°Cで1時間、E27およびヒト骨髄腫IgEの等モル量を混合することにより、アッセイ緩衝液中でE27-IgE六量体複合体を調製したNilsson,K.,Bennich,H.,Johansson,S.G.O.,およびPonten,J.,1970Clin.Exp.Immunol.7:477-489頁。E27-IgEアッセイ緩衝液中10.0mg/mlをプレートに加え、2時間インキュベートした。該プレートを洗浄して、非結合E27-IgEを除去した。5A6MAb、5A6Fab2、5A6Fab、mIgG1対照、および5B9抗FcγRIIA/Bを、0.01nMから100nMの種々の濃度でアッセイ緩衝液中で調製した。個々のウェルに抗体を加え、1時間インキュベートした。アッセイ緩衝液でプレートを洗浄後、競合抗体の存在下、FcγRIIAまたはFcγRIIBに結合したままのE27-IgE六量体複合体の検出を行った。検出は、E27のIgG1部分への、ヤギ抗ヒトFab’2特異的IgGの結合を含んだ。使用された検出可能なペルオキシダーゼ基質は、o-フェニレンジアミンジヒドロクロライドであった。490nmにおける吸光度を、Vmaxプレートリーダーを用いて読み取った。図11は、競合的抗体5A6MAb、5A6Fab2、5A6Fab、mIgG1、および5B9の濃度の増加と共に、FcγRIIAに対するE27-IgE六量体の結合の継続によって示されるように、5A6がhuFcγRIIAに対するE27-IgE六量体結合を妨害していないことを示している。FcγRIIAとFcγRIIBの双方に結合することが知られている抗体5B9図4および図5を参照のみが、E27-IgE六量体結合と競合することができた。図12は、5A6抗体、FabまたはFab2の増加と共に、E27-IgE六量体結合の減少によって示されるように、5A6がFcγRIIBに対するE27-IgE六量体結合に競合することを示している。予測どおり、対照のIgG1抗体は競合しなかった。huFcγRIIBに対する抗体5A6、5A5、5H11.1および5A6Fab’2、およびFcγRIIB、FcγRIIAR131、またはFcγRIIAH131に対するIgG1E27-IgE六量体の結合がさらに、図13~図16に示されている。図14では、抗体5A6.2.1および6A5の存在下で、FcγRIIBに対するIgGの結合が阻害されたことが示されているが、図13では、FcγRIIAR131に対するIgGの結合、図15では、FcγRIIAH131に対するIgGの結合が阻害されないことが示されている。1.8免疫蛍光結合アッセイK562赤白血病細胞ATCC番号CCL-243に発現させた天然FcγRIIAR131に対する5A6MAbの間接的免疫蛍光結合アッセイを図16に示す。K562細胞の個別のアリコートを、mIgG1イソタイプ対照mopc21、5A6抗ヒトFcγRIIBモノクローナル抗体またはMedarex4.3MAb抗ヒトFcγRIIA/Bモノクローナル抗体のいずれかによって染色した。フルオレセイン結合Fab’2ヤギ抗マウスIgGFab’2特異的抗体と共に、第2のインキュベーションにより間接的に検出し、フローサイトメトリーによって分析した。Medarex4.3MAbは、図16に示されるように、huFcγRIIACD32Aに結合し、5A6、抗huFcγRIIB抗CD32B抗体は、huFcγRIIACD32Aに結合せず、図4における点線で示されたように、イソタイプ対照、mopc抗体が、huFcγRIIACD32Aにやはり結合しなかったことと両立した。実施例2.0抗FcγRIIB抗体の性質2.1材料抗FcεRIMAb、22E7MAbは、受容体に結合したIgEを有する、または有さないFcεRIに結合する。22E7MAbは、Hoffman-LaRoche細胞株IGE4R:22E7.2D2.1D11から精製したRisek,F.,ら、1991年、J.Biol.Chem.266:11245-11251頁。22E7MAbを発現するHoffman-LaRoche細胞は、10×FBS、1×Pen-Strep、および1×グルタミンと共に、アイエムディーエム中で増殖させた。22E7MAbを、タンパク質Aおよびタンパク質Gクロマトグラフィーを用いて精製した。22E7抽出物をプールし、FcεRIに対する親和性を検証した。2.2RBL細胞株親ラット肥満細胞株RBL-2H3ATCC番号CRL-2256由来のRBL48細胞株は、高親和性ヒトIgE受容体FcεRIのαサブユニットを発現するGilfillianA.M.ら、1992年、Immunology、149、2445-2451頁。RBL48細胞株を、電気穿孔法により、ヒトFcγRIIB1の完全長αサブユニットのcDNAクローンにトランスフェクトしMutaT.ら、1994年、Nature368:70-73頁、これを、プロマイシン選択性発現ベクター内にサブクローン化したMorgenstern,J.P.ら、1990年、NucleicAcidResearch18:3587-3596頁。クローンを、1μMのプロマイシン中で選択し、抗ヒトFcγRIIBモノクローナル抗体、5A6.2.1による免疫蛍光染色により、FcγRIIB細胞表面発現に関して分析した。選択されたサブクローンを、RBL48.C.4と称した。2.3ヒスタミン放出活性化受容体におけるFcγRIIB交差結合本明細書において、共架橋、共凝集、または共結合として、交換可能に称されるの効果を、アレルゲン感作RBL48.C.4細胞からのヒスタミン放出を阻害する該抗体の能力に基づいて定量的に測定した。アッセイ法は下記に記載され、結果はさらに、図17に示されている。2μg/mlの抗FcεRIMAb22E7および0.002μg/mlから2μg/mlの種々の濃度におけるmIgG1イソタイプ対照mopc21または5A6MAbのいずれかを用い、2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMの非必須アミノ酸、1.5g/Lの炭酸水素ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、15のウシ胎仔血清を有するアッセイ緩衝液EMEMアールBSSを有するイーグル最少必須培地中、RBL48.C.4クローンを96ウェルの平底マイクロタイタープレートにインキュベートした。細胞をアッセイ緩衝液中、2回洗浄し、Fab’2ヤギ抗マウスFc特異的交差結合抗体と共に、37°Cで30分間インキュベートした。上澄み液を採集し、ヒスタミンELISAキットを用いて、上記で一般的に記載されたとおり、ELISAによりヒスタミン含量に関してアッセイした。ヒスタミン放出値は、三通りのウェルからの平均およびSEMとして表し、図5にグラフで示した。ヒスタミン放出の抑制には、交差結合抗体と共に、5A6と22E7の双方が必要であった。ヒスタミン放出は、FcγRIIBに対する5A6の結合およびFcεRIに対する22E7の結合によって抑制され、5A6および22E7は、ヤギ抗マウスFc特異的交差結合抗体によっても交差結合されている。ヒスタミン放出抑制には、5A6対22E7の1:1の比率が最も効果的であり、1:10、1:100、および1:1000の比率でも抑制が認められた。実施例3.0二重特異性抗体の作製本実施例は、ジスルフィド形成システイン残基を欠くヒンジなし可変ヒンジ領域を有する二重特異性抗体の構築および精製を記載する。野生型ヒンジ配列を有する二重特異性抗体の構築もまた記載する;これらの抗体は、種々の種の抗体複合体を得る効率性を評価するために使用できる。3.1発現ベクターの構築完全長抗体の発現に関するプラスミドは全て、重鎖および軽鎖の転写に関する別個のphoAプロモーターAPKikuchiら、1981年、NucleicAcidsRes.9:5671-5678頁、それに続く、翻訳開始のためのtrpシャインダルガーノ配列に依存する別個のシストロン系Simmonsら、2002年、J,Immunol.Methods263:133-147頁;Simmonsら、米国特許第5,840,523号基づいたYanofskyら、1981年、NucleicAcidsRes9:6647-6668頁およびChangら、1987年、Gene55:189-196頁。また、重鎖および軽鎖の細胞周辺腔分泌には、熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列STIIPickenら、1983年、Infect.Immun.42:269-275頁およびLeeら、1983年、Infect.Immun.42:264-268頁を用いた。双方の鎖の良好な制御は、翻訳開始領域TIRに沈黙コドン変化SimmonsおよびYansura、1996年、NatureBiotechnol.14:629-634頁およびSimmonsら、上記を含む相対的翻訳強度を測定した前述のSTIIシグナル配列改変体によって達成された。本発明の目的に関して、ベクター内の特定のTIR対に関する翻訳強度の組み合わせは、N-軽、M-重によって表され、Nは軽鎖の相対的TIR強度、およびMは重鎖の相対的TIR強度である。最後に、λt0転写ターミネーターSchlosstissekおよびGrosse、1997年、NucleicAcidsRes.15:3185頁を、双方の鎖のコード配列の下流に配置した。プラスミドには全てpBR322ベースのベクター系のフレームワークが用いられたSutcliffe、1978年、ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.43:77-90頁。二重特異性ポリペプチド鎖の結合を増強させるために、ノブおよびホール変異を二量体領域に導入した。当然のことではあるが、どちらかの鎖がノブ変異を含んでなり得、他方の鎖がホール変異を含む。本発明は双方の実施形態を含む。例示的な本実施例では、二重特異性抗体の5A6アームは、ノブ変異を含むように構築され、二重特異性抗体の22E7アームは、相補的なホール変異を含むように構築される。iプラスミドp5A6.11.ノブ.Hg-所望のp5A6.11.ノブ.Hg-プラスミドを作出するために、2種の中間体プラスミドが必要とされる。5A6抗FcγRIIBキメラ軽鎖の可変ドメインを先ずpVG11.VNERKノブプラスミドに転移させて、中間体プラスミドp5A6.1.L.VG.1.H.ノブを作出する。次いで、5A6キメラ重鎖の可変ドメインをp5A6.1.L.VG.1.H.ノブプラスミドに転移させて、中間体プラスミドp5A6.11.ノブプラスミドを作出する。以下に、これらの中間体プラスミドp5A6.1.LC.VG.1.HC.ノブおよびp5A6.11.ノブの調製、引き続いて、p5A6.11.ノブ.Hg-p5A6.1.L.VG.1.H.ノブの構築を記載する。このプラスミドは、完全長抗体重鎖-軽鎖H/L単量体抗体の作出に適合したプラスミドに、5A6抗体のマウス軽可変ドメインを転移するために構築した。このプラスミドの構築は、2つのDNA断片の結合を含んだ。第1のものは、小さなEcoRI-PacI断片が除去されたpVG11.VNERKノブベクターであった。プラスミドpVG11.VNERKノブは、軽および重可変ドメインが、ノブ変異T366WMerchantら、1998年、NatureBiotechnology16:677-681頁および上記の全ての制御要素を有する抗VEGF抗体VNERKに変化した、1-軽および1-重の相対的TIR強度Simmonsら、2002年、上記を有する別個のシストロンベクターの誘導体である。結合の第2の部分は、上記のEcoRI-PacI消化pVG11.VNERKノブベクターへの、図25配列番号35で示された配列の結合を含んだ。該配列は、アルカリホスファターゼプロモーターphoA、STIIシグナル配列および5A6抗体.p5A6.11.ノブの軽鎖全体可変ドメインおよび定常ドメインをコードする。このプラスミドは、ヒト重鎖フレームワークに、5A6抗体のマウス重可変ドメインを導入して、キメラ完全長重鎖/軽鎖H/L単量体抗体を作出するために構築された。p5A6.11.ノブの構築は、2つのDNA断片の結合を含んだ。第1の断片は、小さなMluI-PspOMI断片が除去された上記のp5A6.1.L.VG.1.H.ノブベクターであった。第2の断片は、MluI-PspOMI消化p5A6.1.L.VG.1.H.ノブベクターへの、図27に示された配列配列番号37の結合を含んだ。該配列は、STIIシグナル配列の最後の3つのアミノ酸および5A6抗体のマウス重可変ドメインのおよそ119のアミノ酸をコードする。p5A6.11.ノブ.Hg-完全長キメラ5A6ヒンジなしノブ重/軽H/L鎖単量体抗体を発現させるために、p5A6.11.ノブ.Hg-プラスミドを構築した。該プラスミドの構築は、2つのDNA断片の結合を含む。第1の断片は、小さなPspOMI-SacII断片が除去された上記のp5A6.11.ノブベクターであった。第2の断片は、2つのヒンジシステインがセリンに変換したヒト重鎖のおよそ171のアミノ酸をコードするp4D5.22.Hg-からのおよそ514の塩基対PspOMI-SacII断片であったSequencesofproteinsofImmunologicalinterest、第5版、第1巻、NIH、ベセスダ、メリーランド州におけるC226S、C229S、EUnumberingschemeofKabat,E.A.ら編集、1991年、671頁。プラスミドp4D5.22Hg-は、軽および重可変ドメインが、抗HER2抗体に変化し、2つのヒンジシステインがセリンに変換したC226S、C229S、2-軽および2-重の相対TIR強度Simmonsら、J.Immunol.Methods263:133-147頁2002を有する別個のシストロンベクターの誘導体である。iiプラスミドp5A6.22.ノブ.Hg-所望のp5A6.22.ノブ.Hg-プラスミドを作製するためには、1種の中間体プラスミドが必要とされた。phoAプロモーターおよびSTIIシグナル配列軽鎖の相対TIR強度は2を先ずp5A6.11.ノブ.Hg-プラスミドに転移させて、中間体プラスミドp5A6.21.ノブ.Hg-を作出する。以下に、中間体プラスミドp5A6.21.ノブ.Hg-の調製、引き続いて、p5A6.22.ノブ.Hg-の構築を記載する。p5A6.21.ノブ.Hg-このプラスミドは、軽鎖にSTIIシグナル配列相対TIR強度は2を導入するために構築した。p5A6.21.ノブ.Hg-の構築は、3つのDNA断片の結合を含んだ。第1の断片は、小さなEcoRI-PacI断片が除去されたp5A6.11.ノブ.Hg-ベクターであった。第2の断片は、キメラ5A6抗体の軽鎖をコードするp5A6.11.ノブ.Hg-プラスミドからのおよそ658の塩基対NsiI-PacI断片であった。結合の第3の部分は、以下のプライマーを用いて、p1H1.22.Hg-プラスミドから作出されたおよそ489塩基対EcoRI-NsiIPCR断片であった:5’-AAAGGGAAAGAATTCAACTTCTCCAGACTTTGGATAAGG配列番号275’-AAAGGGAAAATGCATTTGTAGCAATAGAAAAAACGAA配列番号28プラスミドp1H1.22.Hg-は、軽および重可変ドメインが、ラット抗組織因子抗体に変化し、2つのヒンジシステインがセリンに変換したC226S、C229S、2-軽および2-重の相対TIR強度Simmonsら、J.Immunol.Methods263:133-147頁2002を有する別個のシストロンベクターの誘導体である。p5A6.22.ノブ.Hg-このプラスミドは、重鎖に2の相対TIR強度を有するSTIIシグナル配列を導入するために構築された。p5A6.22.ノブ.の構築は、2つのDNA断片の結合を含んだ。第1のものは、小さなPacI-MIuI断片が除去されたp5A6.21.ノブ.Hg-ベクターであった。結合の第2の部分は、軽鎖のλt0転写ターミネーター、phoAプロモーター、およびSTIIシグナル配列重鎖の相対TIR強度は2をコードするp1H1.22.Hg-プラスミドからのおよそ503の塩基対PacI-MIuI断片であった。iiiプラスミドp22E7.11.ホール.Hg-所望のp22E7.11.ホール.Hg-プラスミドを作製するためには、2種の中間体プラスミドが必要とされた。22E7抗FcεRIキメラ軽鎖の可変ドメインを先ずpVGG11.VNERK.ホールプラスミドに転移させて、中間体プラスミドp22E7.1.L.VG.1.H.ホールを作出した。次いで、22E7キメラ重鎖の可変ドメインを、p22E7.1.L.VG.1.H.ホールプラスミドに転移させて、中間体プラスミドp22E7.11ホールプラスミドを作出した。以下に、これらのプラスミドp22E7.1.L.VG.1.H.ホールおよびp22E7.11.ホールの調製、引き続いて、p22E7.11.ホールHg-の構築を記載する。p22E7.1.L.VG.1.H.ホールこのプラスミドは、完全長重鎖/軽鎖H/L単量体抗体の作出に適合したプラスミドに、22E7抗体のマウス軽可変ドメインを転移させるために構築した。このプラスミドの構築は、2つのDNA断片の結合を含んだ。第1の断片は、小さなEco-RI-PacI断片が除去されたpVGG11.VNERK.ホールベクターであった。プラスミドpVGG11.VNERK.ホールは、軽および重可変ドメインが、ホール変異T366S、L368A、Y407VMerchantら、NatureBiotechnology16:677-681頁および上記の全ての制御要素を有する抗VEGF抗体VNERKに変化した、1-軽および1-重の相対TIR強度Simmonsら、J.Immunol.Methods263:133-147頁2002を有する別個のシストロンベクターの誘導体である。結合の第2の部分は、上記のEcoRI-PacI消化pVG11.VNERK.ホールベクターへの、図26配列番号36で示された配列の結合を含んだ。該配列は、アルカリホスファターゼプロモーターphoA、STIIシグナル配列および22E7抗体の軽鎖全体可変ドメインおよび定常ドメインをコードする。p22E7.11.ホールこのプラスミドは、22E7抗体のマウス重可変ドメインを、ヒト重鎖フレームワークに導入して、キメラ完全長重鎖/軽鎖H/L単量体抗体を作出するために構築した。p22E7.11.ノブの構築は、2つのDNA断片の結合を含んだ。第1のものは、小さなMIuI-PspOMI断片が除去されたp22E7.1.L.VG.1.H.ホールベクターであった。結合の第2の部分は、MIuI-PspOMI消化p22E7.1.L.VG.1.H.ホールベクターへの、図28配列番号38で示された配列の結合を含んだ。該配列は、STIIシグナル配列の最後の3つのアミノ酸および22E7抗体のマウス重可変ドメインのおよそ123のアミノ酸をコードする。p22E7.11.ホール.Hg-p22E7.11.ホール.Hg-プラスミドは、完全長キメラ22E7ヒンジなしホール重鎖/軽鎖H/L単量体抗体を発現させるために構築した。該プラスミドの構築は、2つのDNA断片の結合を含んだ。第1のものは、小さなPspOMI-SacII断片が除去されたp22E7.11.ホールベクターであった。結合の第2の部分は、2つのヒンジシステインがセリンに変換したC226S、C229S、ヒト重鎖のおよそ171のアミノ酸をコードするp4D5.22.Hg-からの514の塩基対PspOMI-SacII断片であった。ivプラスミドp22E7.22.ホール.Hg-所望のp22E7.22.ホール.Hg-プラスミドを作製するためには、1種の中間体プラスミドが必要とされた。軽鎖のphoAプロモーターおよびSTIIシグナル配列相対TIR強度は2を先ずp22E7.11.ホール.Hg-プラスミドに転移させて、中間体プラスミドp22E7.21.ホール.Hg-を作出した。以下に、中間体プラスミドp22E7.21.ホール.Hg-の調製、引き続いて、p22E7.22.ホール.Hg-の構築を記載する。p22E7.21.ホール.Hg-このプラスミドは、軽鎖のSTIIシグナル配列相対TIR強度は2を導入するために構築した。p22E7.21.ホール.Hg-の構築は、3つのDNA断片の結合を含んだ。第1の断片は、小さいEcoRI-PacI断片が除去されたp22E7.11.ホール.Hg-ベクターであった。第2の断片は、キメラ22E7抗体の軽鎖をコードするp22E7.11.ホール.Hg-プラスミドからのおよそ647塩基対EcoRI-PacI断片であった。第3の断片は、アルカリホスファターゼプロモーターphoAおよびSTIIシグナル配列をコードするp1H1.22.Hg-プラスミドからのおよそ500塩基対EcoRI-EcoRV断片であった。p22E7.22.ホール.Hg-このプラスミドは、重鎖のSTIIシグナル配列相対TIR強度は2を導入するために構築した。p22E7.22.ホール.Hg-の構築は、3つのDNA断片の結合を含んだ。第1の断片は、小さいEcoRI-M1uI断片が除去されたp22E7.21.ホール.Hg-であった。第2の断片は、アルカリホスファターゼプロモーター、STIIシグナル配列、およびキメラ22E7抗体の軽鎖をコードするp22E7.21.ホール.Hg-プラスミドからのおよそ1141塩基対EcoRI-PacI断片であった。第3の断片は、軽鎖のλt0転写ターミネーターおよび重鎖のSTIIシグナル配列相対TIR強度は2をコードするp1H1.22.Hg-プラスミドからのおよそ503塩基対PacI-M1uI断片であった。3.2抗体発現..5A6ノブおよび22E7ホール抗FcγRIIB5A6/抗FcεRI22E7抗体の作出におけるヘテロ二量体化を促進するために、ホール内ノブ技法を利用して、完全長二重特異性抗体を形成した。Fc配列のCH3ドメインにおけるホール内ノブ変異により、二量体の形成が大いに減少することが報告されているMerchantら、NatureBiotechnology16:677-681頁1998。ノブ変異T366WをFc領域に導入することにより、抗FcγRIIB成分のための構築体、およびホール変異T366S、L368A、Y407Vを導入することにより、抗FcεRI成分p22E7.11.ホールのための構築体を調製したMerchant、1998年、上記。ノブ抗FcγRIIB単量体抗体産生のために、プラスミドp5A6.11.ノブを、およびホール抗FcεRI単量体抗体のために、p22E7.11.ホールを用いて、抗体の小規模合成を実施した。プラスミドの各々は、軽鎖と重鎖の双方に関して、1の相対TIR強度を有した。各構築体の小規模発現には、宿主細胞として、大腸菌株33D3W3110ΔfhuAΔtonAptr3lacIqlacL8ΔompTΔnmpc-fepEdegP41kanRを用いた。形質転換後、カルベニシリン50μg/mLを添加した5mLのLB培地に、選択された形質転換体を播種し、培養ウィール上、30°Cで一晩増殖させた。次いで、各培養物を、C.R.A.P.リン酸制限培地に希釈1:100したSimmomsら、J.Immunol.Methods263:133-147頁2002。次いで、誘導培養物に、カルベニシリンを50μg/mLの濃度で添加し、培養ウィール上、該培養物を30°Cでおよそ24時間増殖させた。別に記述しない限り、振とうフラスコ誘導は全て、5mL容量で実施した。誘導培養物からの非還元細胞全体のライセートは、以下のとおり調製した:11OD600-mLの誘導サンプルを、マイクロチューブで遠心分離した;2各ペレットを、90μLのTE10mMのトリスpH7.6、1mMのEDTA中に再懸濁した;3遊離システインを抑え、ジスルフィドシャッフリングを防ぐために、各サンプルに、10μLの100mMヨード酢酸SigmaI-2512を加えた;420μLの10SDSを、各サンプルに加えた。サンプルに渦を巻かせ、約90°Cで3分間加熱し、次いで、再び渦を巻かせた。サンプルが室温まで冷却した後、750μLのアセトンを加えて、タンパク質を沈殿させた。サンプルに渦を巻かせ、約15分間、室温に置いた。マオクロ遠心分離で5分間の遠心分離後、各サンプルの上澄み液を吸引により除去し、各タンパク質ペレットを、50μLのdH2Oプラス50μLの2×NOVEXSDSサンプル緩衝液中に再懸濁した。次いで、サンプルを約90°Cで4分間加熱し、渦を巻かせ、室温まで冷却させた。5分間の最終遠心分離を実施し、上澄み液を清浄な管に移した。誘導培養物からの還元細胞全体のライセートは、以下のとおり調製した:11OD600-mLの誘導サンプルを、マイクロチューブで遠心分離した;2各ペレットを、90μLのTE10mMのトリスpH7.6、1mMのEDTA中に再懸濁した;3ジスルフィド結合を還元させるため、各サンプルに、10μLの1MジチオスレイトールSigmaD-5545を加えた;420μLの10SDSを、各サンプルに加えた。サンプルに渦を巻かせ、約90°Cで3分間加熱し、次いで、再び渦を巻かせた。サンプルが室温まで冷却した後、750μLのアセトンを加えて、タンパク質を沈殿させた。サンプルに渦を巻かせ、約15分間、室温に置いた。マオクロ遠心分離で5分間の遠心分離後、各サンプルの上澄み液を吸引により除去し、各タンパク質ペレットを、10μLの1Mジチオスレイトールプラス40μLのdH20プラス50μLの2×NOVEXSDSサンプル緩衝液中に再懸濁した。次いで、サンプルを約90°Cで4分間加熱し、渦を巻かせ、室温まで冷却させた。5分間の最終遠心分離を実施し、上澄み液を清浄な管に移した。調製後、各サンプルの5μLから8μLを10ウェル、1.0mm12トリス-グリシンSDS-PAGENOVEX上に乗せ、約120ボルトで1.5~2時間、電気泳動を行った。次いで、生じたゲルを、クーマシーブルーで染色するか、ウェスタンブロット分析に用いた。ウェスタンブロット分析では、10mMのCAPS緩衝液、pH113メタノール中、ニトロセルロース膜NOVEX上に、該SDS-PAGEゲルを電気ブロットした。1×NET150mMのNaCl、5mMのEDTA、50mMのトリスpH7.4、0.05のTritonX-100プラス0.5ゼラチンの溶液を用い、室温でおよそ30分~1時間揺動させて、該膜をブロックした。ブロッキング処置後の抗Fabウェスタンブロット分析では、1×NET/0.5ゼラチン/抗Fab抗体ヒトIgGFabに対するペルオキシダーゼ結合ヤギIgGフラクション;CAPPEL番号55223の溶液中に、該膜を置いた。抗Fab抗体の希釈は、抗体のロットに依って、1:50,000から1:1,000,000の範囲であった。あるいは、抗Fcウェスタンブロット分析では、1×NET/0.5ゼラチン/抗Fc抗体ヒトFc断片に対するペルオキシダーゼ結合ヤギIgGフラクション;BETHYL番号A80-104P-41の溶液中に、該膜を置いた。抗Fc抗体の希釈は、抗体のロットに依って、1:50,000から1:250,000の範囲であった。各々の場合において、該膜は、抗体溶液中、揺動させながら室温で一晩置いた。翌朝、該膜を、1×NET/0.5ゼラチン中、最低3×10分洗浄し、次いでTBS20mMのトリスpH7.5、500mMのNaCl中、1×15分間洗浄した。抗Fab抗体および抗Fc抗体に結合したタンパク質バンドを、AmershamPharmaciaBiotechECL検出キットを用い、引き続き、X線フィルムに曝露して可視化した。p5A6.11.ノブノブ抗FcγRIIB抗体およびp22E7.11.ホールホール抗FcεRI抗体の発現に関する抗Fabウェスタンブロットの結果を図18に示す。それらは、レーン1におけるノブ抗FcγRIIB抗体、ならびにレーン2におけるホール抗FcεRI抗体に関する完全に折りたたまれ、組み立てられた重軽HL鎖種の発現を明らかにしている。抗Fab抗体は、軽鎖の異なる可変ドメインが異なる親和性を有する。非還元サンプルにおいては、各抗体の発現により、重軽鎖種が検出されることになる。特に、ホール抗FcεRI抗体に関して、完全長抗体ホモ二量体種が検出可能であるが、それは、完全に折りたたまれ、組み立てられた抗体種全体のうちの小さい比率にすぎない。抗FcγRIIB抗体に関してはノブ変異、および抗FcεRI抗体に関してはホール変異を含む結果、完全長抗体ホモ二量体種の折りたたみおよび組み立てに都合がよくない。還元サンプルでは、ノブ抗FcγRIIB抗体およびホール抗FcεRI抗体に関して、軽鎖が検出される。同様に、抗Fcウェスタンブロットの結果が図19に示されており、それらは、レーン1におけるノブ抗FcγRIIB抗体、ならびにレーン2におけるホール抗FcεRI抗体に関する完全に折りたたまれ、組み立てられた重軽HL鎖種の発現を、やはり明らかにしている。抗Fc抗体は軽鎖に結合できず、したがって、軽鎖は検出されない。非還元サンプルに関して、各抗体の発現により、重軽鎖種が検出されることになるが、完全長抗体ホモ二量体種は検出されない。還元サンプルに関しては、ノブ抗FcγRIIB抗体およびホール抗FcεRI抗体に関して、同様な量の重鎖が検出される。3.35A6ノブヒンジ改変抗体および22E7ホールヒンジ改変抗体p5A6.11.ノブ構築体およびp22E7.11.ホール構築体の発現から得られた一次抗体種は、完全に折りたたまれ、組み立てられた重軽HL鎖種であった。しかし、二重特異性抗FcγRIIB/FcεRI5A6/22E7抗体に関する、本明細書に記載した調製法を促進するために、2つのヒンジシステインをセリンに置換するC226S、C229S、Kabat,E.A.らのEUナンバリング方式、上記ことによって、2つの重鎖のヒンジ配列を修飾した。ヒンジ改変体は、下記でヒンジなしとも称される。ノブ抗FcγRIIb5A6抗体およびホール抗FcεRI22E7抗体に関して、C226S、C229S置換を有するヒンジ改変体を含むプラスミド構築体を調製した。各抗体に関して2つのプラスミド構築体を調製した。1つの構築体は、軽鎖と重鎖双方に関して、1の相対TIR強度を有し、第2の構築体は、軽鎖と重鎖双方に関して、2の相対TIR強度を有した。次いで、ノブ抗FcγRIIB抗体p5A6.11.ノブプラスミドから、ホール抗FcεRI抗体p22E7.11.ホールノブヒンジなし抗FcγRIIb抗体p5A6.11.ノブ.Hg-およびp5A6.22.ノブ.Hg-,およびホールヒンジなし抗FcεRI抗体p22E7.11.ホール.Hg-およびp22E7.22.ホール.Hg-を本明細書の上記に記載されたそれらのそれぞれのプラスミドから発現させた。細胞全体のライセートを調製し、SDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロースに移し、上記のヤギ抗ヒトFab結合抗体およびヤギ抗ヒトFc結合抗体によって検出した。抗Fabウェスタンブロットの結果は、図20に示されており、それらは、レーン2におけるノブヒンジなし抗FcγRIIB単量体抗体相対TIR強度-軽鎖で1および重鎖で1ならびにレーン5におけるホールヒンジなし抗FcεRI単量体抗体相対TIR強度-軽鎖で1および重鎖で1に関する重-軽HL鎖種の折りたたみおよび組み立てにおけるかなりの改善を示している。また、抗Fabウェスタンブロットの結果は、軽鎖および重鎖の相対TIR強度が1から2に増加すると、単量体HLノブヒンジなし抗FcγRIIB抗体レーン3および単量体HLホールヒンジなし抗FcεRI抗体レーン6に関する重-軽HL鎖種の折りたたみおよび組み立てが増加することを示している。抗Fab抗体は、軽鎖の異なる可変ドメインが異なる親和性を有し、一般に重鎖は親和性が低い。非還元サンプルに関して、各抗体の発現により、重軽鎖種が検出されることになるが、完全長抗体種は、ヒンジシステインがセリンに変換する結果、検出されない。2つのヒンジシステインがセリンに変換される場合、またやはり、軽鎖および重鎖の相対TIR強度が1から2に増加する場合、ノブヒンジなし抗FcγRIIb抗体およびホールヒンジなし抗FcεRI抗体の各々で、重-軽HL鎖種の折りたたみおよび組み立てにかなりの改善がある。還元サンプルでは、種々の抗FcγRIIb抗体および抗FcεRI抗体に関して、重鎖ならびに軽鎖が検出される。相対TIR強度が1から2に増加すると、重鎖および軽鎖の量の増加が検出される。同様に、図21における抗Fcウェスタンブロットの結果は、2つの重鎖HCヒンジシステインがセリンに変換される場合、またやはり、軽鎖および重鎖の相対TIR強度が1から2に増加する場合、ノブヒンジなし抗FcγRIIB抗体およびホールヒンジなし抗FcεRI抗体の双方で、重-軽HL鎖単量体種の折りたたみおよび組み立てにかなりの改善があることを示している。抗Fc抗体は軽鎖に結合できず、したがって、軽鎖は検出されない。還元サンプルに関して、種々の抗FcγRIIb抗体および抗FcεRI抗体に関して、重鎖が検出される。相対TIR強度が1から2に増加すると、重鎖の量の増加が検出される。3.4二重特異性抗体成分の精製上記の可変ヒンジ領域を有する抗体の文脈で、精製された機能的二重特異性抗体を得る容易さおよび効率をさらに評価した。1.大腸菌ペーストからの抽出凍結大腸菌ペーストを解凍し、HClでpH5に調整した5容量v/wの蒸留水に懸濁させ、遠心分離し、上澄み液を捨てた。この不溶性ペレットを、ポリトロンBrinkmanを用いて、pH9で5~10容量の緩衝液中に再懸濁し、遠心分離後、上澄み液を保持した。この処理をもう一度繰り返した。次いで、不溶性ペレットを同じ緩衝液の5~10容量に再懸濁し、マイクロフリューダイザーMicrofluidicsにより継代分裂させた。遠心分離後、上澄み液を保持した。該上澄み液を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEおよびウェスタンブロットにより評価し、単一アーム抗体すなわち、単一の重鎖プラス軽鎖の分子量に相当するバンドを含有するものをプールした。2.タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィープールした上澄み液を、pH8に調整し、ProSep商標-AビーズMilliporeを加えた10リットル当たりおよそ250mlのビーズ。該混合物を4°Cで24~72時間攪拌し、ビーズを沈降させ、上澄み液を流し捨てた。ビーズをクロマトグラフィーカラムAmershamBiosciencesXK50商標に移し、10mMのトリス緩衝液pH7.5で洗浄した。次いでこのカラムを、50mMのクエン酸、0.1MのNaCl緩衝液中、pH勾配を用いて溶出させた。出発緩衝液は、pH6に調整し、勾配は、pH2の緩衝液を用いて直線希釈によって作成した。フラクションを、8M尿素およびトリス塩基の添加により、pH5、および2M尿素に調整し、次いで、SDS-PAGEにより評価し、プールした。3.カチオン交換クロマトグラフィーS-SepharoseFastFlow商標カラムAmershamBiosciencesを、2M尿素、25mMのMESpH5.5により平衡化した。ProSep商標-A溶出液プールを等量の平衡化緩衝液で希釈し、カラムに装填した。平衡化緩衝液、次いで25mMのMES、pH5.5で洗浄後、カラムを、25mMのMES、pH5.5中、0M~1MNaClの直線勾配で展開した。フラクションを、SDS-PAGE分析に基づいてプールした。4.疎水性相互作用クロマトグラフィーHI-Propyl商標カラムJ.T.Bakerを、0.5Mの硫酸ナトリウム、25mMのMES、pH6で平衡化した。S-FastFlow商標溶出物を、0.5Mの硫酸ナトリウム、pH6に調整し、カラムに装填し、このカラムを、25mMのMES、pH6中、0.5M~0M硫酸ナトリウムの勾配により展開した。フラクションを、SDS-PAGE分析に基づいてプールした。5.サイズ排除クロマトグラフィーCentriPrep商標YM10コンセントレーターAmiconを用いて、HI-Propyl商標溶出液プールを濃縮し、Superdex商標SX200カラムAmershamBiosciencesに装填し、0.1MのNaCl、pH6中、10mMのコハク酸または10mMのヒスチジンで平衡化し、2.5ml/分でカラムを展開した。フラクションを、SDS-PAGE分析に基づいてプールした。3.5二重特異性抗体抗体作出のための抗体アニーリング2つの類似した同じではないアニーリング法を下記に記載する。これらは双方とも二重特異性抗体を良好な収量で生じた。下記の抗体および抗体成分の重鎖は、上記の可変ヒンジ領域を含有する。ヒンジ改変5A6ノブおよびヒンジ改変22E7ホールのアニーリング-方法125mMのMESpH5.5、0.5MのNaCl中、精製した5A6ノブおよび22E7ホールの重鎖/軽鎖単量体抗体を、それらの濃度に基づき、等モル比で混合した。次いで、この混合物を50°Cで、5分間から1時間加熱した。このアニーリング温度は、これらのCH3改変体に関して、以前記載された融解曲線Atwell,S.ら、1997年、J.Mol.Biol.270:26-35頁から誘導した。次いで、アニールした抗体をその二重特異性を判定するための分析に供した。二重特異性の分析1等電点電気泳動アニールした抗体を、サンプルに等電点電気泳動分析を実施することにより、二重特異性について検証した。5A6ノブ抗体は、7.13のpIを有し、一方、22E7ホールは、9.14のpIを有する。5A6ノブ/22E7ホール抗体は、8.67のpIを有する。図22は、クーマシーブルーによる染色後、等電点電気泳動ゲル上の、5A6ノブ、22E7ホールおよび二重特異性5A6ノブ/22E7ホール加熱の前および後抗体の動きを示している。室温での混合時に、いくらかのアニーリングが存在するが、50°Cへの加熱は、この方法の達成を促進するようである。5A6ノブと22E7ホールの間のpIを有する新たなタンパク質バンドの出現は、二重特異性抗体の形成を検証している。2アフィニティーカラム分析5A6ノブ、22E7ホールおよび二重特異性5A6ノブ/22E7ホール抗体の挙動を、FcγRIIBアフィニティーカラム上で観察した。製造元の使用説明書に従って、小型カラムにおける固体支持体に、ヒトFcγRIIB細胞外ドメイン-GST融合タンパク質を結合したPierce、UltraLink商標ImmobilizationKit46500。PBS137mMのNaCl、2.7mMのKCl、8mMのNa2HPO4、1.5mMのKH2PO4、pH7.2中の5A6ノブ、22E7ホールおよび二重特異性5A6ノブ/22E7ホール抗体を、3つの別個のFcγRIIBアフィニティーカラムに、各カラムの理論的結合能力のおよそ10~20で装填した。次いで、カラムを16カラム容量のPBSで洗浄した。装填および洗浄のカラム流出物を回収し、合わせて、Centricon商標マイクロコンセントレーターAmicon内で、およそ10倍に濃縮した。次いで、同容量の各濃縮体を2×SDSサンプル緩衝液で2倍に希釈し、SDS-PAGEInvitrogen、NovexTris-Glycineによって分析した。タンパク質バンドを、20mMのNa2HPO4pH6.5中、電気ブロッティングによってニトロセルロースへ移し、抗ヒトIgGFabペルオキシダーゼ結合抗体CAPPELL番号55223を用いて探索した。次いで、AmershamPはrまたはシスチン-d-アラビノフラノシドBiotechECL商標キットを用い、製造元の使用説明書に従って、抗体バンドを検出した。この分析の結果を図23に示す。FcγRIIBアフィニティーカラムは、5A6ノブ抗体および5A6ノブ/22E7ホール二重特異性抗体を保持するはずである。図23に示されるように、22E7ホール抗体は、流出するはずである。5A6ノブ/22E7ホール二重特異性レーンに抗体が検出されなかったことにより、二重特異性が示された。5A6ノブ、22E7ホールおよび二重特異性5A6ノブ/22E7ホール抗体の挙動は、FcεRIアフィニティーカラム上でも観察できる。FcγRIIBアフィニティーカラムのために、上記のとおり、IgE融合アフィニティーカラムを調製し、利用できる。FcεRIアフィニティーカラムは、22E7ホール抗体および5A6ノブ/22E7ホール抗体を保持するはずである。5A6ノブ抗体は流出するはずである。5A6ノブ/22E7ホール抗体レーンに抗体が検出されなかったことにより、二重特異性が示された。ヒンジ改変5A6ノブおよびヒンジ改変22E7ホールのアニーリング-方法2抗体成分単一アーム5A6ノブおよび22E7ホールを上記のとおり精製した。わずかに過剰モルの5A6を用いた50°Cでのアニーリングにより、ヘテロ二量体が見られた。次いで、カチオン交換カラム上で精製した。5A6ノブ5mgおよび22E7ホール4.5mgH/L単量体抗体を、20mMトリス、pH7.5に調整した全量10mlの8mMコハク酸、80mMNaCl緩衝液に合わせた。該混合物を、水浴中、50°Cに10分間加熱することによって、単量体抗体をアニールし、次いで4°Cに冷却して、二重特異性抗体を形成した。二重特異性の分析1.等電点電気泳動等電点電気泳動ゲルCambrex、pH7~11上での分析により、アニーリング混合物中、pI約8.5に、二重特異性抗体に相当する単一バンド計算pIは8.67の形成が示された。図24を参照されたい。2.カチオン交換カラム上での精製5mlのCM-高速カラムHiTrap、AmershamBiosciencesを、pH5.5における緩衝液30mMのMES、20mMのhepes、20mMのイミダゾール、20mMのトリス、25mMのNaClによって平衡化した。アニールしたプールを、等量の平衡化緩衝液で希釈し、pH5.5に調整し、カラムに装填し、平衡化緩衝液で洗浄した。該カラムを、同じ緩衝液中、pH5.5からpH9.0の勾配を用い、1ml/分で30分かけて展開した。フラクションをIEFによって分析すると、5A6が、ヘテロ二量体の前に溶出されることが分かった。ヘテロ二量体を含有するプールフラクションの光散乱による分析で、単量体は無いことが分かった。実施例4.05A6/22E7ホール内ノブ二重特異性抗体の特性化本実施例の目的は、5A6または22E7単独ではなく、5A6/22E7が二重特異性抗体であることの実証である。5A6/22E7は、サンドイッチElisaアッセイにおいて、ヒトFcγRIIB-His6-GSTおよびFcεRI-ECD-Fcに対して二重の結合特異性を有する。結果を図29および図30に示す。5A6Aおよび5A6Bは、5A6の2種のタンパク質調製物を称する。下記の5A6/22E7二重特異性抗体は、野生型ヒンジを有するか、または有さないホール内ノブヘテロ二量体抗体である。二重特異性抗体は、交換可能にBsAbと称される。huFcγRIIB-His6-GSTおよびhuFcεRI-ECD-FcIgE受容体融合体は、ELISAによって実証され、結果は図29に示されている。PBS、pH7.4中、FcγRIIB-His6-GSTの1μg/ml溶液の100μlにより、ELISAプレートを、4°Cで一晩コーティングした。該プレートを、PBSで洗浄し、PBS中1カゼインブロッカーでブロックした。該ウェルを、PBS/0.05TWEEN登録商標で3回洗浄した。ElisaDiluent緩衝液50mMのトリス-HCl、pH7.5、150mMのNaCl、0.05ツウィーン20、0.5BSA、2mMのEDTA中、10μg/mlのCD4-IgGを調製し、以下の各試験抗体のFc部分に対するFcεRI-ECD-Fc:5A6A/22E7ホール内ノブ、野生型ヒンジ、二重特異性抗体;5A6B/22E7ホール内ノブ、野生型ヒンジ、BsAb;5A6/22E7ホール内ノブ、ヒンジなしBsAb;5A6MAb;および22E7MAb。該プレートをPBS/0.05TWEEN登録商標で3回洗浄後、5A6A/22E7、5A6MAb、および22E7MAbの3種の連続希釈液をELISADiluent緩衝液中で調製し、各希釈液を、100μl/ウェルでウェルに加えた。該プレートを室温で1時間インキュベートした。該プレートを、PBS/0.05TWEEN登録商標で3回洗浄後、各ウェルに、1μg/mlhuFcεRI-ECD-Fcの100μlを加え、該プレートを室温で1時間インキュベートした。該プレートを、PBS/0.05TWEEN登録商標で3回洗浄後、各ウェルに、1μg/mlIgE-ビオチンを加え、室温で1時間インキュベートした。該プレートを、PBS/0.05TWEEN登録商標で洗浄し、ELISA希釈緩衝液中1:2000ストレプトアビジン-HRPの100μl/ウェルと共に、30分間インキュベートした。PBS/0.05TWEEN登録商標で洗浄後、該プレートを、100μlのTMB基質と共に5分間インキュベートした。100μl/ウェルの停止溶液により反応をクウェンチし、該プレートを、96ウェルプレートデンシトメーターMolecularDevices上、630nmにおいて読み取った。結果は、5A6/22E7二重特異性抗体を含有するウェルにおけるIgE結合を示している。二重特異性抗体:5A6A22E7BsAb、5A6B22E7BsAb、および5A622E7ヒンジなしノブ-ホールBsAbは、FcγRIIB-GSTおよびIgE-ビオチンに首尾よく結合した。図29を参照されたい。補足的ELISA実験を以下のとおり実施し、結果は図30に示した。PBS、pH7.4中、FcεRI-ECD-Fcの1μg/ml溶液の100μlにより、ELISAプレートを、4°Cで一晩コーティングした。該プレートを、PBSで洗浄し、PBS中1カゼインブロッカーでブロックした。該ウェルを、PBS/0.05TWEEN登録商標で3回洗浄した。ElisaDiluent緩衝液中、5A6/22E7二重特異性抗体、5A6抗体、または22E7抗体の連続希釈液を調製し、各希釈液を、100μl/ウェルでウェルに加えた。該プレートを、室温で1時間インキュベートした。該プレートを、PBS/0.05TWEEN登録商標で3回洗浄後、試験抗体、huFcεRI-ECD-FcのFc部分および第2の抗体抗GSTビオチンに対するFcγRIIB-His6-GST結合を阻害するために、10μg/mlのCD4-IgGの存在下、FcγRIIB-His6-GSTを、1μg/mlの100μlで各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。該プレートを、PBS/0.05TWEEN登録商標で3回洗浄後、1μg/ml抗GST-ビオチンの100μlを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。該プレートを、PBS/0.05TWEEN登録商標で洗浄し、ELISA希釈緩衝液中1:2000ストレプトアビジン-HRPの100μl/ウェルと共に、30分間インキュベートした。PBS/0.05TWEEN登録商標で洗浄後、該プレートを、100μlのTMB基質と共に5分間インキュベートした。100μl/ウェルの停止溶液により反応をクウェンチし、該プレートを、630nmにおいて読み取った。結果は、5A6/22E7二重特異性抗体を含有するウェルにおける抗GSTビオチン結合を示している。二重特異性抗体:5A6A22E7および5A6B22E7ヒンジなし二重特異性抗体、および5A622E7ノブ-ホール二重特異性抗体は、huFcεRI-ECD-FcおよびFcγRIIB-GSTに首尾よく結合した。図30を参照されたい。両実験に関する曲線のグラフを、図29および図30に示す。FcγRIIB-GSTおよびhuFcεRI-ECD-Fcに対する結合成功は、5A6A22E7および5A6B22E7ヒンジなし二重特異性抗体によってのみ実証された。、図29および図30に示された結果に関するIC50値を表1に提供する。実施例5.05A6/22E7ヒンジなし、ホール内ノブ、二重特異性抗体の性質5.1材料先の実施例において、FcγRIIBは、3つのヒトFcγRIIBスプライス改変体の1つであるhuFcγRIIB1であった。残りの実施例において、FcγRIIB1およびさらなるスプライス改変体、FcγRIIB2が利用され、そのように称されている。JW8.5.13は、NPニトロフェノール、抗原に特異的なマウス可変領域およびヒトIgEFc領域からなるキメラ抗体である。JW8.5.13IgEの可変領域は、NPに特異的であり、TNPと交差反応しない。JW8.5.13のヒトIgE部分は、huFcεRIに特異的に結合し、RBL誘導細胞株における内因性ラットFcεRIに結合しない。huFcεRIに対するJW8.5.13の結合は、その発現をアップレギュレートし、それを抗原特異的IgEで満たす。高親和性ヒトIgE受容体FcεRIのαサブユニットであるFcεRIαを発現するRBL-2H3ATCC番号CRL-2256細胞Gilfillanら1995IntArchAllergyImmunol.1071-3:66-68頁に、huFcγRIIB1および/またはhuFcγRIIB2の組み合わせすなわち、有無をトランスフェクトして、RBL誘導細胞株を作出した。RBL-2H3細胞株改変体は、BD-Clontechから入手可能なpQCXIRRetro-XQベクターに類似した、ワシントン大学、ミズーリ州から入手したレトロウィルス発現ベクターを用いて、RBL-2H3細胞への、ヒトFcγRIIB1またはFcγRIIB2のレトロウィルスによる形質導入によって作出した。完全長ヒト遺伝子のcDNAを、単独で、またはIRESInternalRibosomalEntrySequenceと組み合わせて、レトロウィルスベクターにサブクローン化し、2つの遺伝子の二シストロン同時トランスフェクションおよび同時発現を可能にした。レトロウィルス形質導入法のさらなる説明を下記に提供する。PG13パッケージ細胞ATCCCRL-10686を、1プレート当たり2×106細胞で、10cmの組織培養プレートDMEM高グルコース、10FCS、ペニシリン、ストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン上に播種し24時間置いた。FuGENE6を用いて、pMSCVDNA構築体を細胞にトランスフェクトし、37°C、5CO2で2日間培養した。レトロウィルス粒子を含有する細胞培養上澄み液を採取し、0.4ミクロンフィルターを通してろ過した。滅菌硫酸プロタミンを、10μg/mlの最終濃度まで添加し、4mlの上澄み液を用いて、およそ1×106RBL細胞に、32°Cで90分間、スピン感染によって感染させ、引き続き、レトロウィルス上澄み液中、37°C、5CO2で3~4時間、連続培養した。感染RBL細胞を回収し、RBL培地に移し、選別のために増加させた。トランスフェクト陽性細胞を、22E7抗体および/または5A6抗体を用いてFACSにより同定し、ヒトFcεRIAおよびヒトFcγRIIBをそれぞれ検出した。得られた細胞株は以下のとおり命名した:RBLヒトFcεRI細胞表面発現ヒトFcεRIα;RBLhuFcγRIIB細胞表面発現ヒトFcγRIIB1、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞表面発現ヒトFcεRIαおよびヒトFcγRIIB1;ならびにRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞表面発現ヒトFcεRIαおよびヒトFcγRIIB2。20×モル過剰のEZ-link商標NHS-PEO4-ビオチンPierce、ロックフォード、イリノイ州をPBS中、二重特異性抗体に結合させることによって、ビオチン化5A6/22E7二重特異性抗体ホール内ノブ、ヒンジなしを調製した。バキュロウィルス発現系にサブクローン化することによって、huFcεRIα細胞外ドメインhuFcεRIαECDを作製し、CNBr-セファロース結合カラムおよびセファデックスゲルろ過カラムを用いて精製した。huFcγRIIB細胞外ドメインhuFcγRIIBECDは、C末端His6タグを有するフレームにサブクローン化し、続いて、バキュロウィルス発現系に発現させて作製した。huFcγRIIBECDは、NiNTA樹脂によって精製した。5.2ヒスタミン放出アッセイ5A6/22E7二重特異性抗体が、細胞表面上のhuFcγRIIB1またはhuFcγRIIB2またはhuFcεRIに架橋する能力を、以下のアッセイによるヒスタミン放出の選択的阻害によって実証した。以下の説明は、さらに図31~33によって裏づけられる。5CO2の加湿インキュベーター内の標準的組織培養フラスコにおいて、2mMのL-グルタミン、0.1mMの非必須アミノ酸、1.5g/Lの炭酸水素ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、15胎仔ウシ血清を添加したEMEMアールBSS添加イーグル最少必須培地中、トランスフェクトしたRBL48細胞上記を、37°Cで増殖させた。PBS/0.05トリプシン/0.53mMEDTAの4mL溶液に37°Cで2分間曝露することによって細胞を採取した後、遠心分離し400×g、10分、新鮮EMEMに再懸濁させた。懸濁液中の細胞を、血球計数器Reichert-Jungでカウントし、密度を、およそ105から106細胞/mlに調整した。上記のトランスフェクトしたRBL細胞、RBLhuFcεRI、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞およびRBLRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞を96ウェル、平底組織培養プレートに、200μlのEMEM中、105細胞/ウェルで播種した。該細胞を、1mg/mlのJW8.5.13NP特異的ヒトIgEと共に、またはそれなしで、24時間、37°Cでインキュベートした。次いで、該細胞を新鮮培地で3回洗浄し、非結合のNP特異的ヒトIgEを除去した。いくつかの細胞は、抗原による活性化前に、飽和条件下、1~5μg/mlの二重特異性抗体によって処理し、37°Cで1時間インキュベートした。ニトロフェノールNP結合オバルブミンNP11-OVA、JW8.5.13に結合する抗原、IgE、またはTNP11-OVA、無関連抗原と共に、37°Cで1時間インキュベートした。NP11-OVAおよびTNPにより、二重特異性抗体と共に、またはそれなしで、RBLhuFcεRI、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞およびRBLRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞の活性化関連脱顆粒ヒスタミン放出を、0.0001μg/mlから10μg/mlの抗原濃度の範囲で試験した。インキュベーション後、細胞上澄み液細胞培養培地中のヒスタミン濃度を上記のELISAにより測定した。また、TritonX-100による細胞溶解によるか、またはイオノマイシンを用いた刺激によりヒスタミン放出を引き起こすことによって、活性化と独立した陽性対照として働く、該細胞に関する総ヒスタミン濃度も得た。また、RBL細胞によるバックグラウンドヒスタミン放出も得た。ヒスタミン放出濃度は、HistamineELISAキットKMI、Diagnostics、ミネアポリス、ミネソタ州を用いて定量化した。ヒスタミン放出アッセイの結果を、図31~33に示す。ヒスタミン放出は、特に阻害されない限り、hIgEJW8.5.13およびNP11-OVA抗原NPの存在下で増加することが予想される。図31は、TNPまたはNP11-OVAの種々の濃度でのRBLhuFcεRI細胞におけるヒスタミン放出データを示している。RBLhuFcεRI細胞において、ヒスタミン放出は、NPおよびhIgEによって引き起こされる。予想どおり、二重特異性抗体は、huFcγRIIBの不在下ではヒスタミン放出に影響すなわち、抑制または阻害を及ぼさない図31、グラフAの各サンプルの一番右の暗灰色の棒、hIgENP二重特異性を参照。図32は、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞におけるヒスタミン放出データを示しており、図33は、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞におけるヒスタミン放出データを示している。RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞ならびにRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞において、二重特異性抗体はヒスタミン放出を抑制する図32のグラフA、および図33のグラフAにおける明灰色棒のhIgENPを、暗灰色のhIgENP二重特異性と比較されたい。全てのRBL細胞株におけるヒスタミン放出の活性化は、ヒトFcεRIに結合したヒトIgEによる用量依存的様式で、抗原特異的である。細胞は、ヒトIgEの不在下では活性化されなかったし、また、非関連抗原すなわちTNPによって引き起こされた場合でも活性化されなかった。5A6/22E7二重特異性抗体を加えることにより、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞ならびにRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞において、ヒスタミン放出を抑制するバックグラウンド濃度に比較してが、RBLhuFcεRI細胞においては抑制せず、抑制機能にとってFcγRIIBの存在が必要であることを示している。huFcεRI存在下のFcγRIIB1およびFcγRIIB2の双方によっても、同様な結果が見られる。本発明の二重特異性抗体は、主要なヒト好塩基球における抗IgE誘導ヒスタミン放出もまた抑制する。主要好塩基球は、インフォームドコンセントを得た6人の正常なヒト血液ドナーから単離された。好塩基球は、デキストラン沈降プロトコルを用いて、ヒト血液から濃縮化された。簡単に述べると、沈降させるドナー血液の各40mlを、50mlの円錐管内で、375mgのデキストロース、5.0mlの0.1MEDTAおよび12.5mlの6臨床用デキストランと混合する。この混合物を50mlの円錐管2本に分け、円錐管1本当たり、20mlの血液を加える。該血液を、60~90分間、沈降させ、その間、血漿層を取り出し、4°Cで8分間、110×gで遠心分離し、ペレット化細胞を保持し、再懸濁させ、PAGデキストロース1g/L;1×PIPES、pH7.3;0.003ヒト血清アルブミンで洗浄し、PAGに再懸濁させる。細胞を、デキストラン濃縮調製物として、または引き続いてミルテニー磁気ビーズ分離MiltenyiBiotec、オーバーン、カリフォルニア州;例えば、Kepley,C.ら、J.AllergyClin.Immunol.102:304-315頁1998を参照を用いた精製後、37°Cで1時間インキュベートしてから、遠心分離して細胞をペレット化して、抗IgE抗体で刺激した。上澄み液を分析用に保持した。好塩基球は、Kepley,C.L.ら、J.AllergyClin.Immunol.1062:337-348頁2000に記載されているような標準的方法により単離できる。濃縮された好塩基球は、磁気ビーズ分離MiltenyiBiotec、オーバーン、カリフォルニア州;Kepley,C.ら、J.AllergyClin.Immunol.102:304-315頁1998により、および/またはフローサイトメトリー選別Kepley,C.ら1994、上記によってさらに精製できる。ヤギ抗ヒトIgEは、CaltagCaltagLaboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国から入手した。単離好塩基球、同時発現のhuFcγRIIBおよびhuFcεRIを、抗IgEヤギ抗ヒトIgECaltagLaboratoriesと共に、または5A6/22E7二重特異性抗体をさらに添加して、37°Cで1時間インキュベートした。ヤギ抗IgEの1:100希釈容量で液を用いて、試験溶液中、0ng/mlから20000ng/mlの範囲の5A6/22E7二重特異性抗体の存在下、好塩基球を刺激した。ヒスタミン放出は、本明細書に上記で開示したとおりにアッセイした。図62の棒グラフは、抗ヒトIgEの存在下、ヒスタミン放出が誘導されたことを示している。5A6/22E7二重特異性抗体の添加により、おおよそ用量依存様式でヒスタミン放出が抑制された。抗体の不在で、または5A6/22E7二重特異性抗体単独での存在下で、バックグラウンドヒスタミン放出は制限された。6人の正常なヒト血液ドナーからの好塩基球サンプルの分析に基づくと、5A6/22E7二重特異性抗体によるヒスタミン放出の平均抑制は、67±9であった。Xolair登録商標患者の好塩基球からの平均ヒスタミン放出は、FcεRI発現のダウンレギュレーションに基づき、90日後におよそ50に抑制されたことが報告されているMacGlashan,D.W.ら、J.Immunol.158:1438-1445頁1997。これらの結果は、抗huFcγRIIB/抗huFcεRI二重特異性抗体は、FcγRIIBとの交差結合によって、FcεRIの活性を抑制することにより、ヒト患者の免疫反応好塩基球におけるヒスタミン放出などを速やかに抑制するための治療的分子として有用であることを実証している。また、抗huFcγRIIB/抗huFcεRI二重特異性抗体は、抗IgE抗体との併用療法にも有用である。併用療法を用いることによって、抗huFcγRIIB/抗huFcεRI二重特異性抗体は、FcγRIIBとの交差結合によって、ヒスタミン放出を速やかに抑制する作用をし、続いて、抗IgE抗体Xolair登録商標抗IgE抗体、Genentech社などによりFcεRI発現のダウンレギュレーションが行われる。5.3二重特異性抗体によるhuFcεRIおよびhuFcγRIIBの交差結合本実施例の目的は、5A6/22E7二重特異性抗体による、細胞表面上でのヒトFcεRIとヒトFcγRIIBの交差結合に対するヒスタミン抑制の依存性を示すことである。このアッセイ法は、以下に記載されており、結果は、さらに図34~41に示されている。RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞ならびにRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞を、5μg/mlのNP特異的ヒトIgEと共に、37°Cで24時間、インキュベートし、続いて新鮮培地EMEMで3回洗浄して、非結合のNP特異的ヒトIgEを除去した。RBL細胞に加える前に、5A6/22E7二重特異性抗体を、種々のモル比で、精製huFcεRIαECDおよびhuFcγRIIBECDと共に30分間、プレインキュベートした。プレインキュベートした5A6/22E7二重特異性抗体を、5A6/22E7二重特異性抗体の最終濃度、5μg/mlで、RBL細胞培養培地に加え、37°Cで1時間、さらにインキュベートした。細胞を、NP結合オバルブミンと共に、37°Cで1時間インキュベーションすることによって活性化した。活性化に関連した脱顆粒を、上記で一般的に記載したELISA法を用いて、細胞培養培地へのヒスタミン放出を定量化することによって測定した。本発明の二重特異性抗体によるヒトFcεRIとヒトFcγRIIBの同時交差結合に対するヒスタミン放出抑制の依存性を、図34にRBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞に関しておよび図36にRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞に関して示してある。RBL誘導細胞に対する二重特異性抗体の結合は、フローサイトメトリーを用いて、huFcεRIαECDおよびhuFcγRIIBECDの存在下でも評価された。細胞および材料は上記のとおりである。該細胞を採取し、105~106細胞のアリコートに選別する。該細胞を洗浄し、FACS緩衝液2のFCSを有するPBS中に再懸濁させた。2回目の細胞洗浄を行い、10のラット血清、2μg/mlのヒトIgGおよび1μg/mlのビオチン化二重特異性抗体を添加したFACS緩衝液に再懸濁させた。該細胞を、氷上で30秒間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン-PEを有するFACS緩衝液中に再懸濁させた。氷上でさらに30秒間のインキュベーション後、混合物を冷FACS緩衝液で洗浄し、遠心沈殿させ、0.1ヨウ化プロピジウムを有するFACS緩衝液中に再懸濁させた。サンプルをフローサイトメトリーで分析し、結果を相対蛍光単位RFUとして表した。これらの結合試験の結果は、図35および図37~41に示してあり、ECD対二重特異性抗体の比率が示されている。図35および図37は、huFcεRIECDおよびhuFcγRIIBECDの存在下、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞図35またはRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞図37のいずれかに対する5A6/22E7二重特異性抗体の結合に関するフローサイトメトリーデータのグラフを含んでいる。予想どおり、高比率のECD対二重特異性抗体は、細胞に対する二重特異性抗体の結合を減少させる。明色ピークECDの存在下、BsAbにより結合した細胞対暗色ピーク陽性対照-ECDの不在下、BsAbにより結合した細胞を比較されたい。図38~41では、huFcεRIECD、huFcγRIIBECDまたはhuFcεRIECDとhuFcγRIIBECDとの双方の存在下、種々のRBL誘導細胞に対する5A6/22E7二重特異性抗体の結合を分析するために、フローサイトメトリーを用いている。図38~41において、黒色ピークは、ECDの存在下での5A6/22E7の細胞表面受容体結合である。明灰色ピークBsAbによって結合されていない細胞および暗灰色ピークECDの不在下、BsAbによって結合されている細胞と比較されたい。予想どおり、huFcγRIIBECDではなく、huFcεRIECDの濃度増加により、RBLhuFcεRI細胞に対する5A6/22E7結合図38を参照が阻害され、双方のECDの阻害は、huFcεRIECDに対して同様な結果となる。RBLhuFcγRIIB細胞に対する5A6/22E7結合図39w参照は、huFcεRIECDによって影響されず、huFcγRIIBECDによって阻害される。RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞図40およびRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞図41においては、同様な結合結果が見られる。予想どおり、5A6/22E7の結合は、huFcεRIECDまたはhuFcγRIIBECDいずれかの10:1比によって減少し、双方のECDの10:1比飽和濃度においてのみ、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1または2細胞に対する5A6/22E7の完全阻害がある。10倍モル過剰のhuFcεRIαおよびhuFcγRIIB細胞外ドメインと共に、5A6/22E7二重特異性抗体のプレインキュベーションの際には、ヒスタミン応答の抑制が見られなかったことから、これらの実験は、ヒスタミン放出の抑制が、細胞表面FcεRIとFcγRIIBの同時交差結合に依存していることを実証している。これらの条件下で、細胞表面に対する5A6/22E7二重特異性抗体の結合は、フローサイトメトリーによって評価されるとおり、完全に阻害された。低モル比のhuFcεRIECDおよびhuFcγRIIBECD2:2:1、1:1:1、または0.1:0.1:1のhuFcεRI:huFcγRIIB:二重特異性でのプレインキュベーションは、RBL細胞に対する5A6/22E7二重特異性結合の不完全阻害ならびにヒスタミン放出の不完全抑制に至った。したがって、肥満細胞におけるヒスタミン放出の抑制には、細胞表面FcεRIαとFcγRIIBの交差結合が必要である。飽和下濃度での5A6/22E7二重特異性抗体による抑制は、所望の抑制を達成するために受容体の完全占拠は必要ないことを示唆している。5.4飽和下濃度における二重特異性抗体による抑制5A6/22E7二重特異性抗体のヒスタミン放出抑制およびRBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞の結合を、以下の方法により、結合飽和下濃度で測定し、結果を図42~46に示した。RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞またはRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞を、5μg/mlのNP特異的ヒトIgEと共に、37°Cで24時間インキュベートし、続いて新鮮培地で3回洗浄し、非結合のNP特異的ヒトIgEを除去した。抗原による活性化前に、濃度を変化させた5A6/22E7二重特異性抗体と共に、細胞を37°Cで1時間、さらにインキュベートした。フローサイトメトリーによる分析またはヒスタミン発現のために、細胞を分けた。二重特異性抗体結合の程度を、上記のとおり、フローサイトメトリーにより評価した。フローサイトメトリーは、ストレプトアビジン-PEで検出されたビオチン化二重特異性抗体の比較可能な濃度を用いて実施した。上記のプレインキュベートした細胞を、0.1μg/mlまたは1μg/mlのNP結合オバルブミンのいずれかと共に、37°Cで1時間インキュベーションすることにより活性化した。活性化に関連した脱顆粒を、上記のとおり、細胞培養培地に放出されたヒスタミン濃度を定量化することによって測定した。ヒスタミン放出データならびにRBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞に対する5A6/22E7二重特異性抗体結合は、それぞれ、図42と図43に示し、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞に対する5A6/22E7二重特異性抗体結合は、それぞれ、図44と図45に示している。バックグラウンド濃度に対するヒスタミン放出の抑制は、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞とRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞の双方において、0.0025μg/mL超の二重特異性抗体濃度において示される。RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞およびRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞に対する二重特異性抗体結合のフローサイトメトリー試験により、結合飽和は、およそ2.5μg/mlの二重特異性抗体で達成されることが示された。図46は、4つのRBL誘導細胞株、RBLhuFcεRI細胞、RBLhuFcγRIIB細胞、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞、およびRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞にわたって、0.1μg/mlから2.5μg/mlの二重特異性抗体のフローサイトメトリーによる滴定を示している。中実ピークは、ビオチン化二重特異性抗体に結合した細胞に対応する。RBL誘導細胞株に対する二重特異性抗体結合の滴定により、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞、ならびにRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞に対する二重特異性抗体の結合は、低濃度の二重特異性抗体では低下し、0.0025μg/ml未満では検出不可能であることが示される。図42および図44に示されるように、NP抗原刺激の異なる2種の濃度を用い、二重特異性抗体のRBLヒスタミン放出抑制は、二重特異性抗体の結合飽和下濃度で維持された。5.5FcεRIα表面発現レベルに及ぼす二重特異性の効果肥満細胞および好塩基球上のFcεRI発現レベルのダウンレギュレーションは、抗原誘導活性化に対する肥満細胞および好塩基球の感受性を減少させる一つの手段であり、治療薬が喘息またはアレルギーに有益な効果を有し得る一つの機構である。FcεRIの表面発現レベルを調節する二重特異性抗体の能力は、以下の方法を用い、二重特異性抗体の存在下または不在下で、IgE誘導FcεRIのアップレギュレーションおよびダウンレギュレーション実験を実施することによって評価した。2μg/mlの二重特異性抗体の存在下または不在下、RBLhuFceRIhuFcγRIIB1細胞、およびRBLhuFceRIhuFcγRIIB2細胞を、1μg/mlのU266IgEATCCTIB196と共に、1、2、3、または7日間インキュベートした。図47および図48は、5A6/22E7二重特異性抗体およびIgEの濃度は、検出用ヒトIgG1およびIgEを用いてELISAによって検出した際、7日間の時間経過の間に変化しないままだったことを示しており、該試薬が細胞培養培地から減損されなかったことを示している。細胞表面ヒトFcεRIの総レベルは、全てのFcεRI受容体を氷上でU266IgEによって飽和させた後、ヒトIgECaltagLaboratoriesに対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって測定した。FcεRIアップレギュレーションに関するフローサイトメトリーデータを、図49~54に示す。図49および50に示されるとおり、RBLhuFcεRI細胞の2つのサンプル、ならびに図51および52に示されるとおり、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞の2つのサンプルにおけるFcεRI表面発現レベルのIgE誘導アップレギュレーションに対し、二重特異性抗体は効果を及ぼさない。しかし、図53および54に示されたRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞の2つのサンプルにおけるhuFceRIおよびhuFcγRIIB2の同時交差結合の際には、二重特異性抗体は、FcεRIのアップレギュレーションの程度を低下させた。また、IgE除去後のFcεRIαのダウンレギュレーションに及ぼす二重特異性抗体の効果も測定し、結果は図55~57に示されている。RBL細胞上のFcεRIαは、1μg/mlのU266IgEによって7日間アップレギュレートした。次いで。IgEを細胞培養培地から洗い出し、IgE除去後、1、2、3、および7日目に、二重特異性抗体の存在下または不在下で、FcεRIαのダウンレギュレーションをフローサイトメトリーによって観察した。図55および56に示されるとおり、RBLhuFcεRI細胞およびRBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞におけるFcεRIαのダウンレギュレーションに、二重特異性抗体は効果を及ぼさなかった。しかし、図57に示されるとおり、RBLhu5A6/22E7二重特異性抗体huFcγRIIB2細胞において、FcεRIαのダウンレギュレーションの割合は二重特異性抗体によって増加した。RBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞を用いる実験を繰り返した。ただし、IgE存在下、0、3または4日目に、5A6/22E7二重特異性抗体を加えた図63を参照。結果は、二重特異性抗体が、これらの細胞において、FcεRIのIgE誘導発現を低下させることを示している。また、これらの試験により、FcγRIIB1イソ体はhuFcεRI発現をダウンレギュレートしないことが分かった。二重特異性抗体は、FcεRIとFcγRIIB2イソ体との同時交差結合の際に、肥満細胞および好塩基球上のFcεRIの表面発現レベルを低下させ得ることが、これらの試験によって示された。肥満細胞におけるhuFcεRIα、FcγRIIB1、FcγRIIB2、huRPL19対照、およびラットFcεRIα、mRNA発現;RBLFcεRIhuFcERIaと称される、RBLhuFcεRIhuFcγRIIB1細胞huFcGRIIb1と称される、およびRBLhuFcεRIhuFcγRIIB2細胞huFcGRIIb2と称される;および3人の異なるドナーのヒト好塩基球上のRT-PCRデータ。3人の異なるヒトドナーの精製末梢血好塩基球から調製したmRNAに対して、FcγRIIB1イソ体およびFcγRIIB2イソ体のリアルタイムRT-PCR同定を実施した。ヒト血液の好塩基球は、磁気ビーズ精製法MACsヒト好塩基球単離キット、Miltenyiを用いて、100mlの血液から単離した。106好塩基球からのmRNAは、RNeasy商標ミニキットQiagenを用いて精製した。リアルタイムRT-PCR分析に用いられる以下のプライマー/プローブセットを表2に挙げてある。RNAは、製造元の推奨プロトコルに従って、TaqMan登録商標One-StepRT-PCRMasterMixAppliedBiosystemsを用い、ABIPRISM登録商標7700配列検出システムで分析した。図58~61に示されるとおり、FcγRIIBのB1イソ体とB2イソ体の双方がヒト好塩基球に発現し、細胞内のFcγRIIB2と同時架橋する際に、FcεRI表面発現レベルをダウンモジュレートする二重特異性抗体の能力が実証されたことにより、FcεRIの抑制および/またはダウンレギュレーションが疾患の軽減を提供するような疾患を経験している患者の治療にとって、本発明の抗FcγRIIB-抗FcεRI二重特異性抗体を用いる方法は特に有用になる。5.6二重特異性抗体は、RBL細胞株においてサイトカイン放出を抑制する以下のアッセイによって実証されるとおり、抗FcγRIIB-抗FcεRI二重特異性抗体5A6/22E7の存在下で、サイトカインMCP-1単球走化性タンパク質-1、IL-4インターロイキン4、およびTNF-α腫瘍壊死因子αの放出が抑制された。RBL細胞に、huFcγRIIB2またはhuFcγRIIB1およびhuFcεRIをコードするcDNAをトランスフェクトし、上記の本実施例5に記載された方法に従って培養した。ヒスタミン放出アッセイに関して本実施例5に記載されたとおり、ニトロフェノールNP結合オバルブミンNP11-OVAおよびIgE抗NPヒトIgEに曝露することによって細胞を刺激し、サイトカインを放出させた。5A6/22E7二重特異性抗体を、5μg/mlの濃度でテキストサンプルに加えた。対象となっているサイトカインに関して、以下のとおり、対象となっているサイトカイン各々の検出および定量化を行った。MCP-1およびIL-4は、BeadlyteRatMulti-cytokineBeadmasterキットカタログ48-200、Upstate、シャーロッテズビル、バージニア州、米国を用いて検出した。ラットTNFアルファは、製造元の使用説明書に従い、抗ラットTNFアルファELISAキットを用いて検出した。アッセイを、製造元の使用説明書に従って実施した。図64は、FcγRIIB2およびFcεRIをトランスフェクトしたRBL細胞におけるサイトカイン放出の結果を示しているが、その結果は、FcγRIIB1およびFcεRIをトランスフェクトしたRBL細胞に関するものと同じであった。ラット肥満細胞のサイトカイン放出は、5A6/22E7二重特異性抗体の存在下で抑制されたが、他方、細胞培養中では5時間にわたり、サイトカイン放出は抑制されず、増加した暗色棒。5.7二重特異性抗体は、RBL細胞株において、アラキドン酸代謝物の合成および放出を抑制する。アレルゲンの存在は、肥満細胞からのヒスタミンなどのいわゆる前形成炎症伝達物質の放出、アラキドン酸の産生およびプロスタグランジンなどのいわゆるエイコサノイド伝達物質へのアラキドン酸の変換、およびサイトカイン類およびケモカイン類の産生および放出など、複数の免疫応答を開始させる。前形成伝達物質は、曝露の際に直ちに放出されるが、エイコサノイド伝達物質は、およそ30分から2時間遅れ、サイトカイン類およびケモカイン類は、およそ5時間から24時間遅れる。アラキドン酸カスケードと呼ばれる身体の防御機構の1つは、あらたに形成される3種の炎症性伝達物質-プロスタグランジン類、トロンボキサン類およびロイコトリエン類を産生し、これらは集合的に、エイコサノイドとして知られている。アレルゲンへの曝露のこの下流作用を抑制する5A6/22E7二重特異性抗体の能力を試験するために、アラキドン酸代謝物の放出をモニターした。huFcγRIIB1またはhuFcγRIIB2およびhuFcεRIをコードするcDNAを、RBL細胞にトランスフェクトし、上記の本実施例5に記載されたとおり培養した。ヒスタミン放出アッセイに関して本実施例5に記載されたとおり、IgE抗NPヒトIgEと組み合わせて、抗原としてのニトロフェノールNP結合オバルブミンNP11-OVAに曝露することによってアラキドン酸カスケードを刺激した。代謝物、ロイコトリエンC4LTC4の定量化を、EIAキットカタログ番号212011CaymanChemicalCompany、上記を用い、製造元の使用説明書に従って実施した。代謝物、プロスタグランジンD2PGD2の定量化を、MOXEIAキットカタログ番号212011CaymanChemicalCompany、上記を用い、製造元の使用説明書に従って実施した。図65の結果は、huFcγRIIB1およびFcεRIを発現するRBL細胞において、LTC4およびPGD2の産生によって立証されるように、アラキドン酸代謝物は、IgEプラス抗原の存在下では時間と共に増加し、非関連抗原TNP11-OVAの存在下では増加しなかったことを示している。5μg/mlの5A6/22E7二重特異性抗体の存在下で、アラキドン酸代謝は抑制された。huFcγRIIB2およびFcεRIを発現するRBL細胞を用いても同じ結果が得られたデータは示していない。これらの結果は、抗FcγRIIB-抗FcεRI二重特異性抗体によって、重要な免疫経路が抑制されることを実証している。5.8二重特異性抗体はIgE誘導肥満細胞の生存を阻害するIgE。5A6/22E7二重特異性抗体がこのような生存を阻害したかどうかを試験するために、以下のアッセイを実施できる。ヒト造血前駆体幹細胞CD34を、Allcellsカタログ番号ABM012、Allcells、LLC、バーケリー、カリフォルニア州、米国から入手した。IL-330ng/mlで、IL-6200ng/mlでおよび幹細胞因子SCF、100ng/mlでを含有するStemPro-34登録商標無血清培地GibcoCellCultureSystems、Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国中で、3人のドナー各々からの細胞を2週間培養した。以下の試験条件下で、肥満細胞の生存を、Annexin/7-AAD7-アミノアクチオマイシンD染色BD/ファーミンゲンフローサイトメトリーキット、BectonDickensonCompany、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国によって評価した:1StemPro登録商標培地単独、2StemPro登録商標培地30ng/mlのIL-3、200ng/mlのIL-6、および100ng/mlのSCF、3StemPro登録商標培地5μg/mlのSPE-7マウスIgE抗DNPモノクローナル抗体SPE-7、Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国、4StemPro登録商標培地5μg/mlの煮沸、変性SPE-7、および5StemPro登録商標培地5μg/mlのSPE-75μg/mlの5A6/22E7二重特異性抗体。最初の2週間の培養期間の後の10日間、細胞の生存をモニターした。両段階とも、細胞は37°C、5CO2に維持した。試験培養開始後、4日から7日の間に時期に、細胞の生存を判定した。3人のドナーの細胞サンプルに関する細胞生存の平均阻害パーセントは、65±9であった。これらの結果は、抗FcγRIIB-抗FcεRI二重特異性抗体を用いた、FcγRIIB受容体との架橋によるFcεRI受容体活性の抑制は、ヒト骨髄由来肥満細胞のマウスIgE誘導生存を阻害することを示している。上記の明細書、実施例およびデータは、本発明の組成物の製造ならびに使用法についての完全な説明を提供している。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの実施形態を行い得るため、本発明は、以下の添付の請求項のもとにある。"