"分岐鎖アミノ酸を有効成分として含有する低アルブミン血症改善用組成物であって、有効成分として、ロイシン及び/又はイソロイシンを含有し、バリンを含有しないことを特徴とする低アルブミン血症改善用組成物。上記分岐鎖アミノ酸として、ロイシン及びイソロイシンを含有する請求項1に記載の低アルブミン血症改善用組成物。上記イソロイシンに対するロイシンの質量比が0.1以上10以下である請求項2に記載の低アルブミン血症改善用組成物。上記分岐鎖アミノ酸として、ロイシン又はイソロイシンのみを含有する請求項1に記載の低アルブミン血症改善用組成物。輸液製剤の形態である請求項1に記載の低アルブミン血症改善用組成物。経口製剤の形態である請求項1に記載の低アルブミン血症改善用組成物。飲食品の形態である請求項1に記載の低アルブミン血症改善用組成物。本発明は、これらの不都合に鑑みてなされたものであり、高いアルブミン産生促進効果を発揮すると共に、副作用を低減させた安全性の高い低アルブミン血症改善用組成物の提供を目的とする。本発明者らは、分岐鎖アミノ酸であるバリン、ロイシン及びイソロイシンのうちバリンが、ヒト肝細胞において、ロイシン及びイソロイシンのアルブミン産生促進作用に対する拮抗作用阻害作用を有すると推察され、その結果、バリンを除外し、ロイシン及び/又はイソロイシンを有効成分とする組成物がヒト肝細胞レベルで格段に高いアルブミン産生促進効果を有するという知見を得た。その結果、上記課題を解決するためになされた発明は、分岐鎖アミノ酸を有効成分として含有する低アルブミン血症改善用組成物であって、有効成分として、ロイシン及び/又はイソロイシンを含有し、バリンを含有しないことを特徴とする。当該低アルブミン血症改善用組成物は、バリンを実質的に含有しないため、他の有効成分であるロイシン及び/又はイソロイシンのアルブミン産生促進作用に対するバリンによる拮抗作用が排除され、その結果、バリン以外の有効成分が生体内において高いアルブミン産生促進作用を効果的に発揮することができる。また、当該低アルブミン血症改善用組成物は、有効成分としてバリンを実質的に含有しないことから、バリンの分だけタンパク量負荷を低減でき、その結果、副作用を低減し、安全性を向上することができる。特に、有効成分量のバリンを含有しない当該低アルブミン血症改善用組成物は、耐糖能異常状態である肝疾患患者への実質上の糖分負荷を大きく低減でき、血糖管理上も有用である。当該低アルブミン血症改善用組成物は、分岐鎖アミノ酸として、ロイシン及びイソロイシンを含有するとよい。このように、当該低アルブミン血症改善用組成物が分岐鎖アミノ酸としてロイシン及びイソロイシンの双方を含有することで、ロイシン及びイソロイシンがそれぞれ有するアルブミンの産生促進作用を相加的に発揮することができる。このように分岐鎖アミノ酸としてロイシン及びイソロイシンを含有する場合、イソロイシンに対するロイシンの質量比としては0.1以上10以下が好ましい。このように、イソロイシンに対するロイシンの質量比を上記範囲とすることで、上述のアルブミン産生促進作用の相加的向上作用を効果的に発揮することができる。また当該低アルブミン血症改善用組成物は、分岐鎖アミノ酸として、ロイシン又はイソロイシンのみを含有してもよい。このように、ロイシン又はイソロイシンのみをそれぞれ単独で含有することで、生体内におけるタンパク量負荷をより一層低減でき、例えば肝疾患の患者の容態に応じて有効性と安全性とのバランスを図ることができる。当該低アルブミン血症改善用組成物は、輸液製剤の形態で好適に用いられる。このように、当該低アルブミン血症改善用組成物を輸液製剤の形態とすることで、血管内を通じて当該低アルブミン血症改善用組成物を迅速かつ効果的に投与することができる。当該低アルブミン血症改善用組成物は、経口製剤の形態でも好適に用いられる。このように、当該低アルブミン血症改善用組成物を経口製剤の形態とすることで、当該低アルブミン血症改善用組成物を、生体に対する侵襲を伴うことなく容易かつ簡便に投与することができる。当該低アルブミン血症改善用組成物は、飲食品の形態でも用いることができる。このように、当該低アルブミン血症改善用組成物を飲食品の形態とすることで、当該低アルブミン血症改善用組成物を上記経口製剤の場合と比較してより一層容易かつ簡便に投与でき、特にQOLQualityOfLifeの向上を図ることができる。ここで、分岐鎖アミノ酸とは、ロイシン、イソロイシン及びバリンの3種類の必須アミノ酸であり、これらの塩、ペプチド又は誘導体の形態も含む概念である。有効成分とは、単独でアルブミン産生促進作用を奏する程度に含有する成分を意味する。以上説明したように、本発明の低アルブミン血症改善用組成物は、有効成分として分岐鎖アミノ酸を含有するが、この分岐鎖アミノ酸のうちバリンを実質的に含有しないため、製剤等として用いた場合に高いアルブミン産生促進効果を発揮すると共に、副作用の低減により安全性が高く、特に耐糖能異常状態である肝疾患患者への実質上の糖分負荷を大きく低減できることから、上記従来の課題を十分に解決することができる。具体的には、当該低アルブミン血症改善用組成物は、消化不良や栄養失調による栄養素の体外からの摂取の低下、手術後の低栄養状態、肝炎や肝硬変などの肝疾患の場合のタンパク質生成の低下;ネフローゼ症候群、タンパク漏出性胃腸症、熱傷等において見られる生体内タンパク質の体外漏出;重篤な感染症、発熱、甲状腺機能亢進症、悪性腫瘍等の疾患時に見られる生体内タンパク質の異化亢進;多量の胸水や腹水の貯留時、全身浮腫、熱傷の発症などに起因する低アルブミン血症を予防又は改善することができる。さらに、当該低アルブミン血症改善用組成物は、上記低アルブミン状態に起因するこむらがえり、肺水腫、腹水、浮腫等の症状の発症を予防又は改善することができる。以下、本発明の実施の形態を詳細する。低アルブミン血症改善用組成物当該低アルブミン血症改善用組成物は、分岐鎖アミノ酸を有効成分として含有するものであり、有効成分として、ロイシン及び/又はイソロイシンを含有し、バリンを含有しない。このように、当該低アルブミン血症改善用組成物は、有効成分としてバリンを実質的に含有しないことから、メカニズムの詳細は不明であるが、下記A及びBの作用効果を有すると考えられる。Aバリンは、ロイシン等の他の有効成分の阻害要因であり、生体内において、ロイシン等の有効成分が発揮するアルブミン産生促進作用に対する拮抗作用を有していると推定される。従って、当該低アルブミン血症改善用組成物は、有効成分として実質的にバリンを含有しないことで、ロイシン及び/又はイソロイシンのアルブミン産生促進作用に対するバリンによる拮抗作用を完全に排除することができ、その結果、バリン以外のロイシン等の有効成分が生体内において高いアルブミン産生促進作用を効果的に発揮できると考えられる。B当該低アルブミン血症改善用組成物がバリンを実質的に含有しないことで、特に製剤として用いた場合、バリンの分だけタンパク量負荷が低減できるため、3種全ての分岐鎖アミノ酸を含有する従来のアミノ酸製剤を生体内に投与した場合の消化器系症状や腎臓系症状等の副作用を低減し、安全性を向上することができる。特にバリンは、3種類の分岐鎖アミノ酸の中でも服用により血糖値を高める唯一の糖原性アミノ酸である。かかる糖原性アミノ酸であるバリンが配合された従来のアミノ酸製剤を肝疾患患者が服用すると、肝疾患患者は食後の血糖値をさらに上昇させるという副作用を招来するおそれがある。一方、当該低アルブミン血症改善用組成物は、有効成分として実質的にバリンを含有しないことで、耐糖能異常状態である肝疾患患者への実質上の糖分負荷を大きく低減でき、血糖管理上も有用である。上記分岐鎖アミノ酸の異性体としては、特に限定されず、例えばL体、D体、DL体等が挙げられる。これらの中でも、生体内におけるアルブミン蛋白の合成に親和性を示すL体の分岐鎖アミノ酸異性体を使用することが好ましい。上記分岐鎖アミノ酸の形態としては、特に限定されず、例えば遊離形態の純粋結晶状アミノ酸、その塩、ペプチド又は誘導体の形態が挙げられる。この分岐鎖アミノ酸の塩の形態としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩、酢酸塩などの薬理学的に許容される塩の形態が挙げられる。また、分岐鎖アミノ酸のペプチドの形態としては、分岐鎖アミノ酸をジペプチド、トリペプチド等としてペプチド化したものが挙げられる。このように、上記分岐鎖アミノ酸をペプチド化することで、これらのペプチドは生体内のペプチダーゼの作用により遊離アミノ酸に加水分解されて有効に利用され得る。さらに、分岐鎖アミノ酸の誘導体として、N-アセチル-DL-ロイシン、DL-ノルロイシン、N-アセチル-DL-イソロイシン、4-ヒドロキシ-L-イソロイシン、β-メチルノルロイシンなどが挙げられる。これらの誘導体は生体内のアシラーゼなどの作用により遊離アミノ酸となり有効に利用され得る。当該低アルブミン血症改善用組成物は、分岐鎖アミノ酸として、ロイシン及びイソロイシンを共に含有するとよい。このように、分岐鎖アミノ酸としてロイシン及びイソロイシン双方を含有することで、当該低アルブミン血症改善用組成物は、特に製剤として用いた場合に、ロイシン及びイソロイシンが互いのアルブミン産生作用に対する拮抗作用を奏することなく、生体内におけるアルブミンの産生促進効果を相加効果的に向上することができる。当該低アルブミン血症改善用組成物は、分岐鎖アミノ酸として、ロイシン又はイソロイシンのみを単独で含有してもよい。このようにロイシン又はイソロイシンを単独で含有することで、当該低アルブミン血症改善用組成物は、特に製剤として用いた場合、生体内におけるタンパク量負荷をより一層低減させ、副作用を効果的に低減させることができる。従って、当該低アルブミン血症改善用組成物は、例えば肝疾患患者への投与において有効性を重視するのであれば、上述したアルブミン産生促進効果の相加効果的な向上を意図し、ロイシン及びイソロイシンを共に含有するとよい。一方、肝疾患患者への投与において安全性を重視するのであれば、当該低アルブミン血症改善用組成物は、上述したタンパク量負荷の低減による副作用の効果的な低減を意図し、ロイシン又はイソロイシンのみを単独で含有するとよい。つまり、当該低アルブミン血症改善用組成物は、肝疾患の患者の容態に応じて有効性と安全性とのバランスを図ることができる。上記イソロイシンに対するロイシンの質量比としては0.1以上10以下が好ましく、0.5以上3.0以下がより好ましい。このように、イソロイシンに対するロイシンの質量比を上記範囲とすることで、当該低アルブミン血症改善用組成物は、上述したアルブミン産生促進作用の相加的な向上効果を確実に発揮することができる。任意成分等当該低アルブミン血症改善用組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で必要に応じ、上記分岐鎖アミノ酸以外に添加剤を含有することができる。この添加剤としては、薬学的又は食品衛生学的に許容できるアミノ酸、安定化剤、防腐剤、可溶化剤、pH調整剤、増粘剤、酸化防止剤、着色料、香料、人工甘味料等が挙げられる。これらの添加剤の配合量は、上記分岐鎖アミノ酸の配合量に従って適宜設定することができる。製剤の形態当該低アルブミン血症改善用組成物は、製剤の形態で好適に使用される。かかる製剤の形態としては、特に限定されず、例えば輸液製剤、経口製剤、経皮吸収型製剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤、ハップ剤、ローション剤等の形態が挙げられる。特に、当該低アルブミン血症改善用組成物は、輸液製剤の形態で好適に用いられる。このように当該低アルブミン血症改善用組成物を輸液製剤の形態とすることで、当該低アルブミン血症改善用組成物を、血管内を通じて迅速かつ効果的に投与することができ、生体内におけるアルブミン産生促進効果を最も高く発揮させることができる。上記輸液製剤の種類としては、例えば注射剤、点滴剤等が挙げられる。このように、当該低アルブミン血症改善用組成物を注射剤又は点滴剤の形態で使用する場合、これらは殺菌され、かつ血液と等張であるとよい。また、当該低アルブミン血症改善用組成物を注射剤又は点滴剤として調製するに際し、希釈剤として、例えば水、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用することができ、さらに体液と等張な溶液への調整に充分な量の食塩、ブドウ糖又はグリセリンを含有させてもよい。なお、上記輸液製剤は、凍結保存することができ、また凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。このような凍結乾燥により保存された上記輸液製剤は、使用時に注射用蒸留水、滅菌水等を加え、再度溶解して使用することができる。当該低アルブミン血症改善用組成物は、経口製剤の形態でも好適に用いられる。このように当該低アルブミン血症改善用組成物を経口製剤の形態とすることで、当該低アルブミン血症改善用組成物を、生体に対する侵襲を伴うことなく、容易かつ簡便に投与でき、生体内におけるアルブミン産生促進効果を十分に発揮させることができる。上記経口製剤の種類としては、特に限定されず、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、チュワブル剤、シロップ剤等が挙げられる。この錠剤として使用する場合、低アルブミン血症改善分野で公知の各種担体が使用される。この担体としては、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤;水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤;乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤;白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤;第4級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤;グリセリン、デンプン等の保湿剤;デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤;精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等が挙げられる。また、かかる錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。また、丸剤として使用する場合、低アルブミン血症改善分野で公知の各種担体が使用される。この担体としては、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤;アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤;ラミナラン、カンテン等が挙げられる。上記経口製剤には、さらに添加剤を含有することができる。かかる添加剤としては、例えば界面活性剤、吸収促進剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩などが挙げられ、経口製剤の投与単位形態に応じて適宜選択し使用することができる。飲食品の形態当該低アルブミン血症改善用組成物は、飲食品の形態としても好適に使用される。このように当該低アルブミン血症改善用組成物を飲食品の形態として用いることで、上記経口製剤の場合と比較してより一層容易かつ簡便に投与でき、生体内におけるアルブミン産生促進効果を十分に発揮させることができる。さらに、当該低アルブミン血症改善用組成物を飲食品の形態とすることで、日常生活の中で特に容易かつ簡便に摂取できることから、QOLQualityOfLifeの向上を図ることができる。上記飲食品としては、特に限定されず、例えばサプリメント、栄養機能食品、特定保健用食品、病者用食品等が挙げられる。また、上記飲食品の形態としては、例えば粉末、顆粒、ドリンク剤等の飲料、カプセル、チュアブル剤等を含む錠剤、可食性フィルム等が挙げられる。なお、これらの飲食品の製造方法としては、本発明の効果を損なわなければ特に限定されず、各用途で当業者が使用されている方法を使用することができる。上記飲食品のうち顆粒状食品の場合、かかる粒度としては、20μm以上2000μm以下が好ましく、100μm以上1500μm以下程度がより好ましく、500μm以上1000μm以下程度が特に好ましい。かかる顆粒状食品は、顆粒状態で水、お茶、ジュース等の飲料と共に摂取することができ、また飲料に溶かして摂取することもできる。なお、本発明の低アルブミン血症改善用組成物は上記実施形態に限定されるものではない。例えば本発明の低アルブミン血症改善用組成物の形態が経口製剤又は飲食品である場合、必要に応じて糊料増粘剤、ゲル化剤を添加し、ゲル状又はゼリー状に調製することもできる。このように、本発明の低アルブミン血症改善用組成物をゲル状又はゼリー状に調整することで、経口投与が容易となり、胃腸内における吸収も良好になる。この糊料の種類としては、特に限定されず、例えば寒天、ゼラチン、カラギーナン、アラビアガム、グァーガム、ローカストビーンガム、タラガム、ジェランガム、カードラン、キサンタンガム、プルラン、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、その他糊料として通常使用し得る多糖類等が挙げられ、これらを1種単独又は2種以上を併用して使用することができる。なお、かかる糊料の配合割合としては、ゲル状又はゼリー状に調製した低アルブミン血症改善用組成物100質量部に対して5質量部以下の割合が好ましい。以下、実施例に基づき本発明を詳述するが、この実施例の記載に基づいて本発明が限定的に解釈されるものではない。<ヒト培養肝細胞のアルブミンmRNA発現及びアルブミン分泌量への影響>この試験はヒト初代培養肝細胞系において、各被験液で培養することによるアルブミンmRNAの発現能の変化と分泌されるアルブミン量の変化を調べたものであり、以下の通り実施した。<測定項目>1アルブミンmRNA及びhypoxanthinephosphoribosyltransferase1以下HPRT1と略すmRNAアルブミンmRNA及びHPRT1mRNAを測定した。アルブミンとHPRT1の塩基配列は、以下の通りGenBankに登録されており、それらの各塩基配列は登録された配列に従うものである。アルブミン;GenBankaccessionnumberXM031322HPRT1;GenBankaccessionnumberNM000194なお、HPRT1は対照としてのハウスキーピング遺伝子として同一試験で測定した。アルブミンの測定に用いた各プライマーとプローブの配列は、Nishimura,M.,Yoshitsugu,H.,Yokoi,T.,Tateno,C.,Kataoka,M.,Horie,T.,Yoshizato,K.andNaito,S.:EvaluationofmRNAexpressionofhumandrug-metabolizingenzymesandtransportersinchimericmousewithhumanizedliver.Xenobiotica,35:877-8902005に公開されている。また、HPRT1の測定に用いた各プライマーとプローブの配列はNishimura,M.,Naito,S.andYokoi,T.:Tissue-specificmRNAexpressionprofilesofhumannuclearreceptorsubfamilies.DrugMetab.Pharmacokinet.,19:135-1492004において公開されている。2培地中のアルブミン濃度培地中のアルブミン濃度は、HumanAlbuminEIAKitタカラバイオ株式会社製により測定した。<供試験用物質>以下の物質を利用した。イソロイシンIle:MW131.17ロイシンLeu:MW131.17バリンVal:MW117.15<供試肝細胞>肝細胞としては、ヒト正常肝細胞HumanNormalHepatocytes,Lot.100、LMP、ONQ及びVUA,InVitroTechnologies,Inc.社製を利用した。<試薬>以下の試薬及び器機を利用した。正常肝細胞専用培地キット:Cambrex社タカラバイオ株式会社Hank’sBalancedSaltsolutionModified:シグマ社、500mLHEPESBuffer1M:100mLSodiumPyrvateSolution100mM:100mLAcrodiscSyringeFilters:PallCorpration、製品番号4187、50個入りRneasyMiniKit50:キアゲン株式会社QIAshredder50:キアゲン株式会社YeasttRNA:GIBCOBRLTaqManOne-StepRT-PCRMasterMixReagentsKit:AppliedBiosystemsFast96-WellReactionPlate0.1mL:AppliedBiosystemsOpticalAdhesiveCovers:AppliedBiosystems24ウエル平底プレートコラーゲンタイプIコート:旭テクノグラス株式会社15mLConicalTube:FalconTrypanblue:FlowLaboratoriesLTD.、0.4solutionin0.85salineβ-メルカプトエタノール:シグマ社HumanAlbuminEIAKit:タカラバイオ株式会社また、mRNAの定量は、下記表1に示す各配列のプライマー対及びプローブ開始コドンの位置は、登録された各塩基配列に従うものであるを用いて、RT-PCRReal-timequantitativereversetranscription-polymerasereactionにより実施した。各プライマー及びプローブは、自動DNA合成機を用いて作成した。<溶液の調製>150μg/mLのYeasttRNA液の調製YeasttRNAは、RNaseフリーの水で希釈し、50μg/mLとした。2各種被験物質を含む被験液の調製2-1BufferABufferAとして、Hank’sBalancedSaltsolutionModified:HEPESBuffer1M:SodiumPyrvateSolution100mMを100:1:2の比率で混合した。2-2BufferBBufferBとして、BufferA:培地を9:1の比率で混合した。2-3リーバクト組成の被験液リーバクト組成の被験液として、Ile、Leu、Valの混合後の濃度がそれぞれ13.8mM、27.7mM、18.5mMリーバクト組成の被験液の濃度として60mMとなるように溶解した。なお、溶解の手順はBufferAに溶解後、BufferAの1/10量の培地を添加した。2-4Ile、Leu又はVal溶液Ile、Leu又はVal溶液として、Ile、Leu又はValの濃度が60mMとなるように溶解した。なお、溶解の手順はBufferAに溶解後、BufferAの1/10量の培地を添加した。2-5調整2-3で調製したリーバクト組成の被験液及び2-4で調整したIle、Leu又はVal溶液を、BufferBを用いて3倍希釈し、20mMの溶液とした。<ヒト正常肝細胞の初代培養>Nishimuraらの方法Nishimura,M.,Yoshitsugu,H.,Naito,S.andHiraoka,I.:Evaluationofgeneinductionofdrug-metabolizingenzymesandtransportersinprimarycultureofhumanhepatocytesusinghigh-sensitivityreal-timereversetranscriptionPCR.YakugakuZasshi,122:339-3612002に従い、24wellのプレートに1×105cells/400μL/wellずつ分注し、CO2インキュベーターで培養し、3時間後に培地交換をした。その21時間後播種開始時点から24時間後に培地交換した。以後、24時間毎に培地交換を行った。なお、交換する培地の液量は、400μL/wellとした。また、各被験液への交換は、48時間後の培地交換時点で行った。<実験1>ヒト肝細胞を播種1×105viablecells/0.4mL/wellした後、播種開始時点から3時間後及び24時間後に培地交換を行った。なお、かかる播種時における生存率は90.4Lot100であった。次いで、播種開始から48時間後に供試験用物質を添加し、この試験物質の添加開始から24時間後にTotalRNAを抽出しRneasyMiniKit使用、リアルタイムRT-PCRによりアルブミン及びHPRT1のmRNAの定量を行った。なお、HPRT1は、ハウスキーピング遺伝子であり、内部標準として用いた。<実験2>ヒト肝細胞を播種1×105viablecells/0.4mL/wellした後、播種開始時点から3時間後及び24時間後に培地交換を行った。なお、かかる播種時における生存率は93.6Lot100、84.2LotLMP、90.0LotQNQ、84.3LotVUAであった。次いで、播種開始から48時間後に供試験用物質を添加し、この試験物質の添加開始から24時間後に培地を採取し、分泌されたアルブミン量を定量した。<TotalRNAの調製>培地を吸引後、QIAshredder及びRneasyMiniKitを用いてTotalRNAを抽出した。以下に、このKitを用いた調製方法を記述する。培養開始後3、24、48及び72時間時点において、24wellのプレートの各wellから培地を吸引除去した。ただし、培養開始0時間時点については15mLのConicalTubeに2×105cells/tubeとなるように肝細胞を分取し、遠心後、培地を吸引除去した。次に、β-メルカプトエタノールを含むRLT溶液RLT溶液:β-メルカプトエタノール=1:100を400μLずつ添加し、ピペッティング後、QIAshreddercolumnに全量を添加し、15,000rpmで2分間遠心した。溶出液350μLを分取し、等量の70エタノール溶液を添加した。10秒間の攪拌を3回行った後、RneasyMinispincolumnに全量を添加し、12,000rpmで30秒間遠心し、Collectiontube内の溶出液を吸引除去した。700μLのRW1溶液を添加し、12,000rpmで30秒間遠心後、Collectiontubeを取りかえた。500μLのRPE溶液を添加し、12,000rpmで30秒間遠心後、Collectiontube内の溶出液を吸引除去した。500μLのRPE溶液を添加し、15,000rpmで2分間遠心後、1.5mLのCollectiontubeに交換し、50μLのRnasefreewaterを添加し、10,000rpmで1分間遠心によりtotalRNAを溶出させた。溶出液は50μg/mLのYeasttRNA液を用いて5倍希釈して測定用TotalRNA溶液とした。なお、抽出操作は全て室温で行なった。また、50μg/mLのYeasttRNA液は、YeasttRNAをRNaseフリーの蒸留水で希釈して調製した。<mRNAの測定>AppliedBiosystems7500FastSequenceDetectionSystemAppliedBiosystemsを利用してハウスキーピング遺伝子HPRT1及びアルブミンのmRNAを、以下の通り定量した。RT-PCRは、300nMForwardPrimer、900nMReversePrimer及び200nMTaqManProbeを含むTaqManOne-StepRT-PCRMasterMixReagentsKitを用い、20μL/tubeの系で行った。TotalRNA溶液は3μLを使用した。RT-PCRの条件としては、48°Cで30分間、その後95°Cで10分間保温した後、95°Cで15秒間、60°Cで1分間のサイクルを40回行うことを条件とした。サイクルごとに蛍光強度を測定した。なお、反応容器はFast96-WellReactionPlate0.1mLを、カバーはOpticalAdhesiveCoversを用いた。<アルブミン分泌量の定量>培地中のアルブミン濃度はHumanAlbuminEIAKitタカラバイオ株式会社により測定した。<結果の計算方法および統計処理>1mRNAの定量HPRT1のmRNAを内在性コントロールとした。各mRNAの定量値は、ΔCt法Nishimura,M.,Yaguri,H.,Yoshitsugu,H.,Naito,S.Satoh,T.,2003YakugakuZasshi,123,369-375にて算出し、試験はtriplicateで行った。アルブミンmRNAの発現量は、HPRT1mRNAの発現量を1とした時の比で表し、その平均値mean±標準偏差SDを表2及び図1に示した。<アルブミン分泌量の定量>結果はLot別の値及び平均値mean±標準偏差SDで表示した。<結果及び考察>得られた結果を表2、表3及び図1に示す。各表及び表2の結果を示す図1のグラフから次のことが判る。即ち、表2及び図1に示されるとおり、ヒトの肝細胞を用いて、アルブミンのmRNA発現量の増加を指標に、Ile、Leu、Val単体での効果、IleとLeu、IleとVal及びLeuとValを組み合わせた場合に、相加、相乗効果があるのか、或いは拮抗しあうのかの検討を行った。Ile、Leu、Val単体、IleとLeu、LeuとVal、IleとVal、リーバクト組成Ile:Leu:Val=1:2:1.35、20mM、60mMでの比較を行い、Ile、Leuの単体とIleとLeuの組み合わせにアルブミンmRNAの発現量の増加作用を確認し、IleとLeuの組み合わせのアルブミンmRNAの発現量に相加効果があることが分かった。また、Valとの組み合わせではアルブミンmRNAの発現量の増加作用が打ち消されることが分かった。また、実験2はヒトの肝細胞4ロットでの結果であり、実験1と同様、Valを含むと分泌量は低下した表3参照。以上の通り、当該低アルブミン血症改善用組成物を利用すれば、アルブミン合成能を上昇させることに有効であることが分かる。<低アルブミン血症マウスにおける血漿中アルブミン濃度上昇効果の検討>この試験は、低アルブミン血症を発症したマウスの血漿中アルブミン濃度に対する各試験物質の効果を調べたものであり、以下の通り実施した。<実験3>BALB/c、雌性マウスを3日間絶食させ、低アルブミン血症を誘発させた後、各試験物質を7日間経口投与し血漿中アルブミン濃度を測定した。以下に、本実験の詳細を示す。<試験物質の調製>Val:0.214gに秤量したL-ロイシン、0.107gに秤量したL-イソロイシン及び0.129gに秤量したL-バリン以上、ペプチド研究所と注射用蒸留水大塚製薬の適量を15mLコニカルチューブ日本ベクトンディッキンソン社に入れ、混和した。完全に溶解させて15mLとした。Val-:0.214gに秤量したL-ロイシン及び0.107gに秤量したL-イソロイシン以上、ペプチド研究所と注射用蒸留水大塚製薬の適量を15mLコニカルチューブ日本ベクトンディッキンソン社に入れ、混和した。完全に溶解させて15mLとした。<使用動物>本実験には、マウス、BALB/cCrSlc、雌性、7週齢入荷時体重18g~20g日本エスエルシー社を用いた。<投与方法>上記マウスに対して、下記の3群を設けた。下記バリン群及びVal-群に対しては、3日間の絶食後、上記調製した各試験物質を10mL/kg/日の投与量で7日間連続して経口投与した。なお、Val群及びVal-群に対しては、各試験物質の投与期間中は摂餌を行った。また、対照群に対しては、全試験期間中、摂餌のみを行った。Val群3日間の絶食後、Valを経口投与させる群、n=3イソロイシン:0.071g/kg/日、ロイシン:0.143g/kg/日、バリン:0.086g/kg/日Val-群3日間の絶食後、Val-を経口投与させる群、n=5イソロイシン:0.071g/kg/日、ロイシン:0.143g/kg/日対照群試験期間中摂餌させる群、n=5<試料採取>上記マウスに対して、絶食開始3日目、試験物質投与開始1、3、7日目に、無麻酔下で眼底をヘパリン処理したテルモヘマトクリット毛細管テルモ社で傷つけ、約20μL採血を行った。採血した血液は氷冷し、12000rpm、10分間の遠心分離により血漿を分離し、血漿中アルブミン測定に供した。<血漿中アルブミンの測定方法>血漿中アルブミン濃度は、富士ドライケムスライドALB-P富士フイルムメディカル社を用いて自動分析装置DRI-CHEM7000富士フイルムメディカル社にて測定した。試験物質投与後7日目までのマウス血漿中アルブミン濃度を表4に示した。<解析方法>各測定項目の値について、各群の平均値mean±標準偏差S.D.を求めた。また、統計解析は、Val群及びVal-群間で、Studentのt-検定及び経時型分散分析により行った。なお、検定の有意水準は両側5とした。データ集計は、MicrosoftExcel2003マイクロソフト社で行った。統計解析ソフトは、EXSAS7.6アームシステックス社を使用した。<結果及び考察>表4に示す通り、本条件下で7日間、絶食後のマウスに試験物質を与えたところ、7日目では、Val群に比してVal-群のアルブミン上昇傾向p=0.0531を認めた。また、補足として経時型分散分析を行ったところ、群と時間で有意差を認め、Val-がValに比して経時的に血漿中アルブミン濃度を上昇させる可能性が示唆された。本試験の結果より、Valを除くことVal-で、現在臨床で使用されているリーバクト登録商標等のBCAA製剤Valを凌駕する血中アルブミン濃度上昇効果が期待できると考えられた。"