抑制解除条件下における、野生型AOX1プロモーターと比較して高い発現のための、配列番号1のヌクレオチド694~723の中に少なくとも1つの突然変異を含む、野生型ピキアパストリスAOX1プロモーターの突然変異体ピキアパストリスアルコールオキシダーゼ1プロモーター。配列番号1のヌクレオチド170~235およびまたはヌクレオチド729~763の突然変異およびまたは転写因子結合部位の突然変異およびまたは以下からなる群から選択される少なくとも1つの突然変異:配列番号1のヌクレオチド170~191、ヌクレオチド192~213、ヌクレオチド192~210、ヌクレオチド207~209、ヌクレオチド214~235、ヌクレオチド304~350、ヌクレオチド364~393、ヌクレオチド434~508、ヌクレオチド509~551、ヌクレオチド552~560、ヌクレオチド585~617、ヌクレオチド621~660、ヌクレオチド625~683、ヌクレオチド736~741、ヌクレオチド737~738、ヌクレオチド726~755、ヌクレオチド784~800またはヌクレオチド823~861をさらに含むことを特徴とする、請求項1のプロモーター。突然変異が、欠失、置換、挿入およびまたは逆位であることを特徴とする、請求項1または2のプロモーター。転写因子結合部位が、Hap1、Hsf、Hap234、abaA、Stre、Rap1、Adr1、Mat1MC、Gcr1およびQA1Fからなる群から選択される転写因子の結合部位であり、ここでMat1MCの結合部位は配列番号1のヌクレオチド683~687を含むものであることを特徴とする、請求項2または3のプロモーター。Hap1の結合部位が配列番号1のヌクレオチド54~58を含むものであり、Hsfの結合部位が配列番号1のヌクレオチド142~149および517~524を含むものであり、Hap234の結合部位が配列番号1のヌクレオチド196~200、206~210および668~672を含むものであり、abaAの結合部位が配列番号1のヌクレオチド219~224を含むものであり、Streの結合部位が配列番号1のヌクレオチド281~285を含むものであり、Rap1の結合部位が配列番号1のヌクレオチド335~339を含むものであり、Adr1の結合部位が配列番号1のヌクレオチド371~377を含むものであり、Gcr1の結合部位が配列番号1のヌクレオチド702~706を含むものであり、QA1Fの結合部位が配列番号1のヌクレオチド747~761を含むものであることを特徴とする、請求項4のプロモーター。請求項1~5のいずれかの少なくとも1つの突然変異体ピキアパストリスアルコールオキシダーゼ1プロモーターおよびタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸をコードする少なくとも1種類の核酸を含む核酸分子であって、該プロモーターおよび該核酸が互いに作動可能に連結して1コピーまたは多コピー発現カセットを形成していることを特徴とする核酸分子。請求項1~5のいずれかの突然変異体ピキアパストリスアルコールオキシダーゼ1プロモーターまたは請求項6の核酸分子を含むベクター。請求項1~5のいずれかの少なくとも1つの突然変異体ピキアパストリスアルコールオキシダーゼ1プロモーター、請求項6の核酸分子の少なくとも1つの断片であって請求項1~5のいずれかの少なくとも1つの突然変異体ピキアパストリスアルコールオキシダーゼ1プロモーターおよびタンパク質、ペプチドもしくは機能的核酸をコードする少なくとも1種類の核酸を含む断片、または請求項7の少なくとも1つのベクターを含む細胞。真核生物細胞であることを特徴とする、請求項8の細胞。酵母細胞であることを特徴とする、請求項9の細胞。メチロトローフ酵母細胞であることを特徴とする、請求項10の細胞。該メチロトローフ酵母細胞が、カンジダ、ハンゼヌラ、ピキアおよびトルプロシスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項11の細胞。ピキアパストリス細胞であることを特徴とする、請求項8~12のいずれかの細胞。以下を含む選択されたタンパク質の発現のためのキット:i請求項7のベクター、およびii請求項1~5のいずれかのプロモーターの制御下で該タンパク質を発現することが出来る細胞。該細胞が酵母細胞であることを特徴とする、請求項14のキット。該細胞がメチロトローフ酵母細胞であることを特徴とする、請求項15のキット。該メチロトローフ酵母細胞が、カンジダ、ハンゼヌラ、ピキアおよびトルプロシスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項16のキット。細胞がピキアパストリス細胞であることを特徴とする、請求項14~17のいずれかのキット。以下の工程を含む、細胞において組換えタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸を発現させる方法請求項1~5のいずれかのAOX1プロモーターおよび、タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸をコードする核酸を含み、該プロモーターが該核酸に作動可能に連結している、請求項6の核酸分子または請求項7のベクターを提供する工程、該細胞を該ベクターまたは該核酸分子で形質転換する工程、該形質転換細胞を培地で培養する工程、および該形質転換細胞において発現した該タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸を単離する工程。該タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸の発現を誘導する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項19の方法。該細胞が酵母細胞であることを特徴とする、請求項19または20の方法。該細胞がメチロトローフ酵母細胞であることを特徴とする、請求項21の方法。該メチロトローフ酵母細胞が、カンジダ、ハンゼヌラ、ピキアおよびトルプロシスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項22の方法。細胞がピキアパストリス細胞であることを特徴とする、請求項19~23のいずれかの方法。請求項6の核酸分子、請求項7のベクターまたは請求項8~13のいずれかの細胞の、タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸の発現のための使用。以下の工程を含む、超発現クローンを単離する方法a請求項1~5のいずれかの少なくとも1つの突然変異体ピキアパストリスアルコールオキシダーゼ1プロモーターおよびタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸をコードする少なくとも1種類の核酸およびマーカー耐性遺伝子を含む核酸分子であって、該プロモーターおよび該核酸が互いに作動可能に連結して1コピーまたは多コピー発現カセットを形成している核酸分子、または該核酸分子を含むベクターを、細胞に導入する工程、b工程aの細胞を、抑制解除条件下での超発現クローンの選択的増殖のための、選抜マーカーおよび非抑制性炭素源を含み、かつ、メタノールを含まない培地に移す工程、c工程bからの細胞を該培地上でインキュベートする工程、d工程cから得た細胞のコロニーを単離する工程、および、e該細胞の発現速度を測定することにより、超発現クローンを検出する工程。選抜マーカーが抗生物質であることを特徴とする、請求項26の方法。選抜マーカーがゼオシンまたはジェネテシンであることを特徴とする、請求項27の方法。選抜マーカーがゼオシンであり、マーカー耐性遺伝子がshble遺伝子であることを特徴とする、請求項26~28のいずれかの方法。細胞が酵母細胞であることを特徴とする、請求項26~29のいずれかの方法。細胞がメチロトローフ酵母細胞であることを特徴とする、請求項30の方法。該メチロトローフ酵母細胞が、カンジダ、ハンゼヌラ、ピキアおよびトルプロシスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項31の方法。細胞がピキアパストリス細胞であることを特徴とする、請求項26~32のいずれかの方法。非抑制性炭素源が、アラニン、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、ラクトースおよびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項26~33のいずれかの方法。核酸分子またはベクターが、形質転換により、またはプロトプラスト融合により、または粒子銃により、細胞に導入されることを特徴とする、請求項26~34のいずれかの方法。形質転換がエレクトロポレーションまたは化学的形質転換であることを特徴とする、請求項35の方法。本発明の目的は、タンパク質産生における下流のプロセッシングを容易にし、時間的空間的収率を上昇させ、生成物の質の改良を可能にするために、性質が改善された改良AOX1プロモーターを提供することである。さらなる目的は、部分的または完全にグルコース抑制に打ち勝つベクターまたは宿主株中の強力なAOX1プロモーターを提供することである。高グルコース濃度の存在下で強力な発現を駆動するプロモーターを得ることは有益である。本発明のさらなる目的は、より低量のメタノールを用い、またはメタノールを用いずにタンパク質の産生を可能とするAOX1プロモーターを提供することである。かかるプロモーターは工業的産生工程にかなりの影響を有するであろう。安全性の問題から、メタノールを誘導物質として用いる産生プラントには特別の装置が必要である。これはピキアパストリス適用が多くの特別でない産生プラントでよいことと相反する。さらにメタノールの存在下でのタンパク質安定性はメタノールに基づくタンパク質発現の誘導を妨害しうる。これは堅固な工業用タンパク質の産生にとってはあまり重要ではないが、治療用分泌タンパク質などにとっては重要な問題となる。かかるプロモーターの構築は、いくらか突然変異させた場合、発現挙動に影響を示す野生型ピキアパストリスAOX1プロモーターの特定の部分に関する知識を必要とする。それゆえ本発明の目的はかかる部分を同定し、それゆえ特徴が改良されたAOX1プロモーターを作製するための手段を提供することである。それゆえ本発明は、以下からなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む、野生型ピキアパストリスAOX1プロモーターの突然変異体ピキアパストリスアルコールオキシダーゼ1プロモーターに関するa転写因子結合部位、b配列番号1のヌクレオチド170~235、ヌクレオチド170~191、ヌクレオチド192~213、ヌクレオチド192~210、ヌクレオチド207~209、ヌクレオチド214~235、ヌクレオチド304~350、ヌクレオチド364~393、ヌクレオチド434~508、ヌクレオチド509~551、ヌクレオチド552~560、ヌクレオチド585~617、ヌクレオチド621~660、ヌクレオチド625~683、ヌクレオチド736~741、ヌクレオチド737~738、ヌクレオチド726~755、ヌクレオチド784~800またはヌクレオチド823~861、およびそれらの組合せ。本明細書中、括弧内の数字は、翻訳開始コドンと比較してのプロモーターの対応する位置を反映する。例えば、NxGACTATGNyを含む核酸配列におけるATG中のAは位置1に対応し、ATGのAの前のTは位置1に対応する。本発明によると、突然変異体AOX1プロモーターは転写因子結合部位およびまたは上記核酸配列範囲の1つの中に少なくとも1つの突然変異を含む。AOX1プロモーターの特にこれらの領域はその特徴を変化させるために該プロモーターを改変するのに好適であるということが判明した。もちろん上記の突然変異の組合せを導入してもAOX1プロモーターの特徴を改良することが出来るから選択される2つのTFBS突然変異、aから選択される1つのTFBS突然変異とbから選択される1つの突然変異、aから選択される1つの突然変異とbから選択される2つの突然変異。例えば、TFBSの突然変異は配列番号1のヌクレオチド737~738およびまたはヌクレオチド207~209内の突然変異と組み合わせてもよい。ピキアパストリスにおけるAOX1プロモーターの制御下でのタンパク質の発現は一般的にメタノールの添加により誘導され、培地中のグルコースの存在により阻害される。タンパク質発現に対する該培地添加物の効果を増強または低下させるために、プロモーターは好ましくは上記のプロモーター領域中にて突然変異される。突然変異AOX1プロモーターが目的タンパク質を産生させる有効性は、宿主の染色体に組み込まれたベクターの量に応じて変動する。特に、多コピー株は増強したプロモーター効果を示すことが判明した。ピキア株の抗生物質耐性は該宿主の染色体に組み込まれた抗生物質耐性カセットの数に依存するので、多コピー株を、選択圧を上げるために選抜寒天プレートの抗生物質濃度10~5000μgml、好ましくは50~3000μgml、特に100~2000μgmlを上昇させることによって作ることが出来るBiotechnology12181184。しかし多数の抗生物質耐性カセットを担持する細胞の成長は抗生物質濃度のみならず時間にも依存するということが見いだされた。それゆえ、多コピー株は同じ濃度の抗生物質を含む培地上で、1コピー株よりも短い時間で検出可能なコロニーにまで増殖することが出来る。この挙動により当業者であれば1コピー株が生育し始める前に多コピー株を検出および単離することが可能である。例えば、1コピーの抗生物質耐性カセットを担持する株は寒天プレートで検出可能なコロニーの大きさまで増殖するのに72時間かかるが、該カセットを2コピー以上担持する同じ株は同じ大きさになるまで増殖するのに24~48時間しかかからない。特にヌクレオチド694~723およびヌクレオチド737~738内に突然変異を有するAOX1プロモーターを担持する多コピー株は驚くべく増強された発現速度を示した。メタノールの存在下で宿主のタンパク質発現効率を上昇させるために、AOX1プロモーターのヌクレオチド170~235を好ましくは突然変異させる。この領域の突然変異はタンパク質発現を野生型AOX1プロモーターと比べて120~130まで上昇させるが、ただし、突然変異体AOX1プロモーターを担持するプラスミドは宿主の染色体ゲノムに1回しか組み込まれていない。しかし、すべてのその他の上記の領域における突然変異はメタノールがタンパク質発現を誘導する有効性を低下させるか影響を与えない。それに対して、野生型AOX1プロモーターのプロモーター領域の突然変異は突然変異に依存して、抑制解除条件下でタンパク質発現を増減させる。しかし、2コピー以上の突然変異AOX1プロモーターを有する組換え株は抑制解除下およびメタノール誘導条件下で増強した活性を有する株となった。詳細に説明すると、配列番号1のヌクレオチド694~723、配列番号1のヌクレオチド694~723、配列番号1のヌクレオチド694~723およびヌクレオチド304~350、TFBS、特にRap1、Gcr1、QA1F、Hsf1、Adr1、Hsf2、Mat1MC、abaAおよびHap2345に突然変異を担持する多コピー株は抑制解除条件下およびまたはメタノール誘導下で野生型AOX1プロモーターの制御下でのタンパク質の発現と比較して発現の上昇を示す。抑制解除条件下でこれら多コピー株のいくつかは野生型プロモーターの制御下での発現と比較して約10倍上昇したタンパク質発現を示す。誘導物質としてのメタノールの存在下では発現効率は本発明によるプロモーターを用いた場合5倍以上増強する。それゆえ、これら突然変異は、特に多コピー形態にて宿主に存在する場合、タンパク質の発現に好ましく用いられる。2以上の上記突然変異の組合せはさらにプロモーター強度を増強させうる。転写因子結合部位は実験的に、または既知の転写因子結合部位との配列比較によって同定することが出来る。該プロモーターの強度および特徴に影響を与えるプロモーター領域の知識を用いて顕著な特性を有するプロモーターを設計することが出来る。さらにこれらの特性はこれらの突然変異体プロモーターが1または複数回宿主のゲノムに組み込まれると増強または変化しうる。しかし、場合によっては、プロモーター活性は上昇ではなく低下させなければならない。特に、制御タンパク質、例えば、キナーゼ、ホスホリラーゼ、および、ヘルパータンパク質、例えば、シャペロン、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、シストランスイソメラーゼ、フォルダーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびプロテアーゼの共発現は、多くの場合、野生型プロモーターまたは本発明による増強したプロモーターの下で細胞によって産生されうる主生成物と比較して低い必要がある。特にの組合せ発現は、主生成物と二次的生成物の発現速度が野生型AOX1プロモーターを使用するよりもより差があるため有利であることが判明した。低下した発現は好ましくは活性化因子結合部位、例えばHSFまたはHAPを欠失させるか、または抑制因子結合部位を野生型AOX1プロモーターに挿入することによって得ることが出来る。したがって、低下した活性を有するAOX1プロモーターの使用は主生成物の収率を低下させるという結果を導きうる細胞のタンパク質発現機構の過剰負荷を妨げる。例えば、BessettePHetal961370313708は、活性ポリペプチドの発現が、チオレドキシンの共発現によってかなり上昇しうることを示している。好ましい態様によると、プロモーターは配列番号1のヌクレオチド694~723およびまたはヌクレオチド729~763にさらに突然変異を含む。上記の突然変異と組合せてのこれらヌクレオチド範囲に影響する突然変異の結果、よりプロモーター活性が上昇しうる。例えば、配列番号1のヌクレオチド694~723およびヌクレオチド737~738に対する二重突然変異は、野生型プロモーターの同じ条件下での発現レベルと比較して抑制解除下および誘導条件下でより高い発現レベルを示すプロモーターを導く。この二重突然変異の効果はプロモーターを含む核酸が細胞に2コピー以上導入されると増強されうる。突然変異は好ましくは、欠失、置換、挿入、逆位およびまたは増幅である。ピキアパストリスの野生型AOX1プロモーターの特徴を改変するために、いくつかの突然変異タイプが可能である。上記領域、配列番号1のヌクレオチド170~235、170~191、192~213、192~210、207~209、214~235、304~350、364~393、434~508、509~551、552~560、585~617、621~660、625~683、694~723、729~763、736~741、737~738、726~755、784~800または823~861を含むプロモーターストレッチを部分的または完全に欠失させ、部分的または完全にその他のヌクレオチドまたは核酸配列と置換し、1ヌクレオチドまたは核酸配列の挿入により破壊し、部分的または完全に逆位させ、または増幅させるとよい。これらすべての突然変異は該突然変異によって構造的特徴およびまたは例えば転写因子の認識結合部位が影響を受けるため、プロモーター活性の変化をもたらす。しかし、これらの変化は野生型プロモーターと比較してプロモーター活性の上昇または低下を導きうる。従来技術において特定の核酸ストレッチの増幅重複がプロモーター活性を上昇させうるとうことは周知である。多くの真核生物プロモーター、特に酵母プロモーターの遺伝子発現の制御は、プロモーターに結合する転写因子の間の複数の相互作用を伴う。複数の部位が非常に小さいシス作用成分の機能にさえも要求されうる。酵母細胞において、上流活性化因子配列は転写に必要である。これらはいずれかの方向で、TATAボックスおよび転写開始部位から様々な距離で機能するが、高等真核生物におけるエンハンサーとは異なり、これらはこれら基本要素の上流になければならない。UASはいくつかの転写活性化因子の標的である。酵母細胞におけるほとんどの抑制現象は、転写因子の不活性化または不在に起因する。しかし、いくつかの負の制御部位も同定可能であった。ピキアパストリスAOX2プロモーターの欠失分析に基づき、3つの調節領域が見いだされ、2つは負に作用する領域、1つは正に作用する領域である3。ハンセヌラポリモルファMOXプロモーターについては2つの上流活性化配列および1つの抑制因子結合部位も記載されている8。対応する配列はAOX1プロモーターおよび725~756にも同定され、AOX2UASとの類似性が示され3、ヌクレオチド622~6568も同様である。これら核酸ストレッチの増幅の結果、強度が増強されたプロモーターが得られる可能性があり、より強力なタンパク質発現が導かれる。それゆえ複数のUAS、好ましくはAOX2およびMOXUASと類似の上記配列領域またはその他の複数の配列ストレッチを含むプロモーターの構築は本発明の枠内に含まれ、好ましい態様であると考えられる。活性化配列は通常プロモーターの数百塩基対内にある。例えば、顕著な活性化配列は増強されるプロモーターの約200~400塩基対内にある。さらに、プロモーターの上流には通常さらなるエンハンサーおよび転写因子結合部位が含まれる。AOX1プロモーターの少なくとも1つの突然変異を当業者に公知の標準的方法により導入するとよい、JSambrookandDRussell、2001、ColdSpringHarborLaboratoryPress。本発明の好ましい態様によると、転写因子結合部位は、Hap1、Hsf、Hap234、abaA、Stre、Rap1、Adr1、Mat1MC、Gcr1およびQA1Fからなる群から選択される。これらTFBSの少なくとも1つの突然変異の結果、様々な特徴の突然変異体プロモーターが生じる。好ましくは、転写因子結合部位Hap1は配列番号1のヌクレオチド54~58、Hsfは配列番号1のヌクレオチド142~149および517~524、Hap234は配列番号1のヌクレオチド196~200、206~210および668~672、abaAは配列番号1のヌクレオチド219~224、Streは配列番号1のヌクレオチド281~285、Rap1は配列番号1のヌクレオチド335~339、Adr1は配列番号1のヌクレオチド371~377、Mat1MCは配列番号1のヌクレオチド683~687、Gcr1は配列番号1のヌクレオチド702~706およびQA1Fは配列番号1のヌクレオチド747~761を含む。これらのTFBSは実験的に同定できるし、その他のプロモーターの既知のTFBSとのコンピュータプログラムを用いた比較によっても同定できる。タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸の発現に対する突然変異体AOX1プロモーターの影響の要約を表2に示す。表2タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸の発現に対する野生型AOX1プロモーターの突然変異体の影響1野生型AOX1プロモーターとの比較における発現速度低下、上昇本発明の別の側面は、本発明による突然変異体ピキアパストリスアルコールオキシダーゼ1プロモーターおよびタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸をコードする核酸を含む核酸分子に関し、ここでプロモーターおよび該核酸は互いに作動可能に連結している。突然変異体AOX1プロモーターは、タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸をコードする遺伝子と連結させることが出来る。その結果得られる核酸断片を用いて、生物、好ましくは酵母、特にピキアパストリス株に導入した場合、例えば、タンパク質を発現させることが出来る。該核酸分子の構築は当業者に周知であり、標準的分子生物学的方法により行うことが出来る、JSambrookandDRussell、2001、ColdSpringHarborLaboratoryPressmanualPichiaExpressionKit、InvitrogenCorp。作動可能に連結しているとは、第一の配列が第二の配列に十分に近くに位置しており、第一の配列が第二の配列または第二の配列の制御下の領域に影響を与えることができることをいう。例えば、プロモーターは遺伝子に作動可能に連結することができ、それによって遺伝子はプロモーターの制御下で発現し、プロモーターは典型的には遺伝子の5にある。通常、コアプロモーターは翻訳開始部位から数百塩基対内にある。そこから約30bp下流では通常下流のプロモーター要素がある。本発明の別の側面は、本発明による突然変異体ピキアパストリスアルコールオキシダーゼ1プロモーターまたは上記の核酸分子を含むベクターに関する。タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸をコードする核酸に作動可能に連結していてもよい突然変異体プロモーターを宿主、好ましくはメチロトローフ酵母株に導入するためには、該プロモーターは該宿主の形質転換に用いることが出来るベクター中に提供されなければならない。例えば、該ベクターは酵母エピソームプラスミド、酵母組込みプラスミドまたは酵母人工染色体でありうる。かかるベクターは通常、複製起点および大腸菌中でのベクターの増殖のための選抜マーカー、酵母における組換えタンパク質発現のためのプロモーターおよびターミネーターおよび酵母のための選抜マーカーを含む。非組込みベクターはさらに自己複製配列を含み、これは細胞におけるベクターの安定性を確実にするGene45299310。AR配列を担持しない組込みベクターは、ゲノム領域と相同的な配列領域を含む。あるいは直線状DNA、例えば、PCR由来のものを形質転換に利用できる。本発明の別の側面は、少なくとも1つの突然変異体ピキアパストリスアルコールオキシダーゼ1プロモーター、上記少なくとも1つの核酸断片または少なくとも1つのベクターを含む細胞に関する。突然変異体AOX1プロモーターを担持する核酸分子の宿主への導入は例えば、エレクトロポレーションによって行うことが出来る。該核酸分子は、1コピーまたは多コピーにて該宿主に導入された後染色体に組み込まれるか、または細胞中に1コピーまたは多コピーの自己複製プラスミドとして存在する。いくつかの突然変異体プロモーターを用いる場合、それらすべてを単一の遺伝子、同一タンパク質または異なるタンパク質に連結することができる。それゆえ本発明の範囲内で、タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸をコードする核酸に作動可能に連結している1コピーのAOX1プロモーターを含む1コピー株および、タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸をコードする核酸に作動可能に連結している2以上、好ましくは少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15または20コピーのAOX1プロモーターを含む多コピー株が好ましくは産生される。本発明の好ましい態様によると、該細胞は真核生物細胞であり、特に酵母細胞、好ましくはメチロトローフ酵母細胞である。好ましくは、メチロトローフ酵母細胞は、カンジダ、ハンゼヌラ、ピキアおよびトルプロシスからなる群から選択され、特にピキアパストリス細胞である。AOX1プロモーターおよびそれに由来する突然変異した変異体は非常に多数の異なる酵母細胞に機能的に導入することができ、例えば、メチロトローフおよび非メチロトローフ細胞が含まれる。プロモーター、特にAOX1およびMOXプロモーターのその他の生物への形質転換能力は当業者に知られている。基質特異性およびいくらかの制御特徴が酵母によって異なっていても、外来プロモーターの認識は示されている。例えば、ハンセヌラポリモルファMOXプロモーターは出芽酵母に認識され、グルコースの存在下で抑制され、炭素源制限下で抑制解除される。同様にAOX1プロモーターはハンセヌラポリモルファで用いることが出来、MOXプロモーターと同様に制御される。AOX1プロモーターと緊密な関係にあるZZA1プロモーターも出芽酵母での使用が成功している。本発明の別の側面は、以下を含む、選択されたタンパク質の発現または機能的RNAへの転写のためのキットに関する:i上記のベクター、および、ii本発明によるプロモーターの制御下で該タンパク質または機能的RNAを発現することが出来る細胞。本発明によるベクターは、選択されたタンパク質の発現または機能的RNAの転写のためのキットにおいて利用できる。本発明の好ましい態様によると、該細胞は酵母細胞、好ましくは、メチロトローフ酵母細胞である。好ましくは、メチロトローフ酵母細胞は、カンジダ、ハンゼヌラ、ピキアおよびトルプロシスからなる群から選択され、特にピキアパストリス細胞である。本発明の別の側面は、以下の工程を含む、細胞において組換えタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸を発現させる方法に関する本発明によるAOX1プロモーターと、タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸をコードする核酸を含むベクターまたは核酸分子であって、該プロモーターが該核酸に作動可能に連結しているベクターまたは核酸分子を提供する工程、該細胞を該ベクターまたは該核酸分子で形質転換する工程、形質転換細胞を好適な培地で培養する工程、所望により、該タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸の発現を誘導する工程、および、該発現したタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸を単離する工程。本発明の好ましい態様によると該細胞は酵母細胞、好ましくはメチロトローフ酵母細胞である。好ましくはメチロトローフ酵母細胞はカンジダ、ハンゼヌラ、ピキアおよびトルプロシスからなる群から選択され、特にピキアパストリス細胞である。本発明の別の側面は、タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸の発現のための本発明による核酸分子、ベクターまたは細胞の使用に関する。本発明による核酸分子、ベクターまたは細胞がタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸の発現に用いられる場合、発現に必要な条件を満たす適当なAOX1プロモーターを選択するのが有益であるまたはメタノール誘導条件下での高または構成的発現。好適な突然変異体AOX1プロモータは表2を参考にして選択することが出来る。本発明の別の側面は、以下の工程を含む、超発現クローンの単離方法に関するaタンパク質または機能的核酸をコードする核酸に作動可能に連結している突然変異させたメタノール誘導性プロモーター、好ましくはAOX1プロモーター、およびマーカー耐性遺伝子を含む核酸分子またはベクターを細胞に導入する工程、b工程aの細胞を、誘導条件下での超発現クローンの選択的増殖のための、適当な選抜マーカー、非抑制性炭素源およびメタノールを含む培地、または、抑制解除条件下での超発現クローンの選択的増殖のための、適当な選抜マーカーおよび非抑制性炭素源を含むがメタノールを含まない培地に移す工程、c工程bからの細胞を該培地上でインキュベートする工程、d工程cから得た細胞のコロニーを単離する工程、および、e該細胞の発現速度の測定によって超発現クローンを検出する工程。突然変異させたメタノール誘導性プロモーターを含むベクターまたは核酸を担持する超または高発現クローンの構築には、当業者がこれらクローンを単離できるようにする方法が必要である。かかる方法を本明細書に提供する。該方法の第一段階はプロモーターを含む核酸の該プロモーターを制御することができる好適な細胞への導入である。プロモーター自体は、遺伝子操作または化学的または物理的突然変異誘発によって突然変異させることができる。さらなる工程において、該突然変異させたプロモーターを担持する細胞を培地、好ましくは固体培地に直接または液体培地を介して移し、該培地は抗生物質および抑制解除条件下での高発現クローンの増殖のためのソルビトールおよびさらにメタノールを含み、高発現クローンであれば誘導条件下で発見できる。メタノールとともに培地にグルコースを含めることによって、グルコース非抑制性およびメタノール誘導性形質転換体が単離できる。好適な培地中または培地上での細胞の培養の後、該細胞を該培地から単離し、さらなる分析に用いるとよい。本発明による方法に用いられる非抑制性炭素源は、例えば、12に開示されており、好ましくは01~10の量、好ましくは02~5の量、より好ましくは03~3の量、特に05~1の量用いる。好ましい非抑制性炭素源は、アラニン、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、ラクトースおよびそれらの組合せからなる群から選択される。好適なマーカー耐性遺伝子の選択は形質転換体の選抜に用いるマーカーに依存する。例えば、ゼオシンをマーカーとして用いる場合、突然変異体AOX1プロモーターの制御下でベクターに導入すべきマーカー耐性遺伝子はShble遺伝子である。核酸がタンパク質またはペプチドをコードする場合、その結果得られる発現したタンパク質は融合タンパク質でありうる。突然変異体AOX1プロモーターの制御下でマーカー耐性遺伝子を提供することは特に有益である。というのは、かかる場合においてマーカー耐性遺伝子産物の発現速度はプロモーター強度および突然変異させたプロモーターの挙動にも依存するからである。例えば、核酸産物の高発現のための強力なプロモーターはマーカー耐性遺伝子産物の発現速度も上昇させるだろう。かかるクローンはプロモーター強度が低下したプロモーターを有するクローンに対して選択的利益を有する。これによって超発現クローンの形質転換細胞からの再生後の直接の選抜が可能となる。発現速度は好ましくは、ゲル電気泳動、抗体結合、定量的PCR、酵素活性などの方法または蛍光定量的に測定することが出来る。他の抑制性のC源の非存在下で発現の上昇を示すプロモーターは非抑制性炭素源を含有する培地中上での形質転換細胞の選択的増殖により選択される。他の抑制性C源の非存在下、誘導物質の存在下で発現の上昇を示すプロモーターは、非抑制性炭素源および誘導物質を含有する培地中上での形質転換細胞の選択的増殖により選択される。誘導物質は非抑制性炭素源であってもよい。超発現クローンは、抗生物質に対するより高い耐性または必須培地成分のより高い産生を導く多コピーと上記の調節的選択とを組み合わせることにより選択される。本発明による方法に用いられる培地組成は直接製造業者または販売元から得ることが出来るし、ピキアパストリスに関するキット、細胞およびベクターから得ることが出来る。培地中のメタノール濃度は、好ましくは005~15、より好ましくは01~10、特に03~5である。科学文献においては異なる培養条件に対する異なるメタノール濃度が記載されている。例えば、振盪フラスコは1以下のメタノールを含んでいてもよくBiotechBioeng56279286、発酵工程は05メタノールを含んでいてもよいProteinExprPurif371826HellwigS、etalBiotechnolBioeng74344352HellwigS、etalBiotechnolApplBiochem30267275。多コピークローンの増強された発現は、細胞中の2コピー以上の突然変異させたプロモーターの存在に依存するのみならず、いくつかの転写因子がないという事実にも依存しうる。というのはかかる因子は該細胞において多数の転写因子結合部位に結合しうるためである。これはメタノール誘導条件下での発現速度と抑制解除条件下での発現速度との比較によって示され、ここで、増強した発現速度は突然変異AOX1プロモーターの細胞中のコピー数の効果だけでないことが見いだされる。例えば、株d6F10はかかる特徴を示す。超発現クローンの単離に用いる培地はさらなる培地成分、例えば、ロイシン、ウラシル、アルギニン、ヒスチジンおよびまたはアデニンを含んでいてもよく、ソルビトールをグルコースと交換して、野生型プロモーター変異体と比較してグルコースの存在下で抑制が低下するプロモーター変異体を同定してもよい。栄養要求性株を用いる場合、細胞をソルビトールを含み、栄養要求性マーカーを用いる抑制解除条件下での超発現クローンの選択的増殖のための個々の培地成分を含む培地に移すとよい。AOX1プロモーターを含むベクターにおいて一般に用いられているPZeo耐性マーカーはゼオシン耐性タンパク質の構成的発現を導き、それゆえより高濃度の抗生物質に対する耐性による多コピークローンの単離が可能となる。記載される新規な方法は、この効果と制御特徴を組み合わせてプロモーターと多コピークローンの検出を可能とし、それによって特定の制御可能調節状況下でのより高い発現を導く。これによって調節特性が変化した新規プロモーター、および、多コピークローンがかかる特定の調節条件下での増強した発現を導くクローンの検出が可能となる。超発現クローンは、野生型プロモーターの制御下でよりも突然変異させたプロモーターの制御下で、より多くのタンパク質または機能的核酸を発現するか、通常に用いられるプロモーター選抜マーカーの組合せ、例えば、PZeoを有するベクターを用いるよりも、より多くのタンパク質または機能的核酸を発現する、発現クローンである。本発明による超発現クローンの発現速度は、野生型プロモーターの制御下での同じタンパク質またはペプチドまたは機能的核酸の発現速度と比較して少なくとも20、好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも100、特に少なくとも500上昇している。超発現クローンは好ましくは2コピー以上の本発明による突然変異させたプロモーターまたは核酸分子を含み得る。あるいは、超発現クローンは高発現クローンとも称される。本発明によるとメタノール誘導性プロモーターはその活性が培地中のメタノールの存在により制御されるプロモーターである。かかるプロモーターは好ましくはAOX1またはMOXプロモーターまたはメチロトローフ酵母由来のいずれかのその他のメタノール誘導性かつグルコース抑制性プロモーター、例えば、FMD、FLD、DASである。本発明の好ましい態様によると、選抜マーカーは抗生物質、好ましくはゼオシンである。培地に用いる選抜マーカーは、細胞の分子の特徴が、突然変異または野生型メタノール誘導性プロモーターを含む核酸またはベクターを担持する細胞と、該核酸またはベクターを担持しない細胞とを区別するのに利用できるという事実に依存する。選抜マーカーはそれゆえ抗生物質であり得る。特定の株の栄養要求性を補償するために、培地中の選抜マーカーは、栄養要求性のタイプに応じて、ロイシン、ウラシル、アルギニン、ヒスチジンおよびアデニンなどの物質であってよい。好ましくは、核酸分子、ベクターおよび細胞は本発明による核酸、ベクターおよび細胞である。本発明の好ましい態様によると、核酸分子またはベクターは当業者に知られた標準的方法、好ましくはエレクトロポレーション、化学的形質転換、プロトプラスト融合による形質転換または粒子銃によって細胞に導入される、JSambrookandDRussell、2001、ColdSpringHarborLaboratoryPress参照。本発明をさらに以下の図面および実施例によって説明するが、これらに制限されない。図1は、マイクロスケールでのメタノールによる誘導前および誘導の24時間後および72時間後のGFPZeoを発現するピキアパストリス株のSDSPAGEを示す。サンプルは実施例1hに記載のように調製した。レーン1はX33、レーン24はX33GFPZeo株MutSA9、D2およびE2、レーン5はX33d6F10である。42kDaの強いバンドがすべてのGFPZeoクローンに存在する。図2は、AOX1プロモーター領域およびいくらかの転写因子結合部位内の配列欠失の概要を示す。領域デルタ19を重複伸長PCRにより欠失させた。図3は、AOX1プロモーター変異体のマイクロスケールでの抑制解除後の蛍光強度の棒グラフを示す。細胞を1グルコースでマイクロスケールで培養した。データは4独立実験の平均±SDを表す。RFU相対蛍光単位WT野生型AOX1プロモーターの制御下でGFPZeoを有するピキアパストリス株GFPZeoD2D1D9GFPZeo遺伝子の前の欠失コンストラクトAOX1Δ1Δ9を有するピキアパストリス株EX励起波長EM発光波長。図4は、マイクロスケールでのメタノール誘導後のAOX1プロモーター変異体の蛍光強度の棒グラフを示す。細胞は1グルコースでマイクロスケールで培養した。データは4独立実験の平均±SDを表す。RFU相対蛍光単位WT野生型AOX1プロモーターの制御下でGFPZeoを有するピキアパストリス株GFPZeoD2D1D9GFPZeo遺伝子の前に欠失コンストラクトAOX1Δ1Δ9を有するピキアパストリス株EX励起波長EM発光波長。図5は、選択したAOX1プロモーター変異体のマイクロスケールでの蛍光強度の棒グラフを示す。野生型およびΔ6プロモーター変異体を有する1コピー株および多コピー株の抑制解除および誘導条件下での発現レベルを示す。データは4独立実験の平均±SDを表す。WT野生型AOX1プロモーターを有する1コピーGFPZeo株、D61コピーAOX1Δ6クローンWTE2野生型AOX1プロモーターを有する多コピーGFPZeoクローンD6F10多コピーAOX1Δ6クローン。図6は、異なるゼオシン商標濃度を有するMDおよびMDM寒天プレート上でのピキアパストリス株のドロップ試験の結果を示す。細胞をBMD培地でOD595が15になるまで培養し、10倍ずつ希釈して最終希釈率105とし、48ピンレプリケータを用いて寒天プレートに移した。図の上の数は希釈係数を示し、これはすべてのプレートで同一である。MD培地は上記のように調製した。MDMZeoプレート中のメタノールは終濃度約05にて添加した。ゼオシン商標はそれぞれ終濃度100、200および500μgmlになるように添加した。X33ピキアパストリスX33、A9ピキアパストリスGFPZeoMutSA9、D2ピキアパストリスGFPZeoD2、E2ピキアパストリスGFPZeoE2。図7は、参照株と比較してのいくつかの多コピー株の発現レベルを示すa抑制解除条件下での活性bメタノール誘導後の活性。図8は、参照株と比較しての抑制解除および誘導条件下でのΔ6多コピー株の発現レベルを示す。実施例1材料および方法aDNA調製精製キットいくつかの市販のDNA調製および精製キットを提供されたマニュアルにしたがって用いた。表3DNA調製および精製キットbTOPO登録商標クローニングTOPO登録商標クローニングは提供されたマニュアルにしたがって行った。常に4μlのPCR産物をクローニングに用いた。2および4μlの各クローニング反応をOneShot登録商標化学的コンピテント大腸菌TOP10F細胞に上記プロトコールにしたがって形質転換した。c大腸菌形質転換ライゲーション反応およびプラスミドの大腸菌への形質転換はSEMプロトコールによって行った16。化学的コンピテント大腸菌TOP10F細胞を形質転換に用いた。dピキアパストリス形質転換コンピテントピキアパストリス細胞の調製所望のピキアパストリス宿主株のシングルコロニーを用いて、300mlバッフル付き広首三角フラスコ中の50mlYPDに接種した。30°C、一晩、60湿度、130rpmでのインキュベーションの後、特定の体積のこの前培養物を用いて2lバッフル付き広首三角フラスコ中の200mlのYPDに接種し、595nmでの吸光度を約01とした。培養物を前培養物と同じ条件下で培養して吸光度10~15とした。細胞を4°C、4000rpmで10分間ペレットとし、200ml氷冷滅菌水に再懸濁した。この手順を3回繰り返し、細胞をそれぞれ100ml水、10ml1Mソルビトールおよび05ml1Mソルビトールに再懸濁した。10μgの所望のプラスミドを最終体積300μl中にてBglIIおよびNotIで一晩直鎖化した。制限消化後、DNAを標準的プロトコールにしたがってEtOHおよび03M酢酸ナトリウム中に沈殿させた16。DNAを11μl滅菌ddH2Oに溶解し、MFMillipore商標MembraneFilterを用いて約12時間脱塩した。PCR産物を形質転換に用いる場合、約45μgDNAをEtOH沈殿から出発して上記のように処理した。各形質転換について80μlの調製した細胞を上記のように10μgDNAと混合し、氷上で5分間インキュベートした。混合物を氷冷電気形質転換キュベットに入れ、200Ω、25μFおよび25kVでパルスした。1mlの氷冷1Mソルビトールをすぐに添加した。懸濁液を滅菌12mlPPチューブに移し、2時間30°Cで振盪せずにインキュベートした。この再生相の後、アリコットを選抜プレートに播いた。誘導条件下で高発現する形質転換体の選抜のために、細胞をソルビトール、メタノールおよびゼオシンを含む最少培地を含むMSMZeoプレートに播いた。抑制解除条件下で高発現を示すクローンの選抜のために、細胞をメタノールを含まない最少ソルビトールzeoプレート上に播いてもよい。グルコースをメタノール含有選抜プレートに含めることにより、グルコース非抑制性発現クローンおよびそのプロモーターの検出が可能となる。eコロニーPCR所望のピキア株のシングルコロニーを100μlマイクロチューブ中の100μlddH2Oに再懸濁し、95°Cで5~10分間加熱した。13200rpmで1分間の遠心分離の後、10μlの上清をPCR反応の鋳型として用いた。5μlのこの第一PCRラウンドを第二PCRラウンドの鋳型として用いた。5μlの第二PCRラウンドを対照ゲルのために用いた。PCR反応には10pmolの各プライマー、200μMの各dNTPおよび25ユニットのHotStarTaq登録商標DNAポリメラーゼまたはTaqDNAポリメラーゼが最終体積50μlにて提供されたマニュアルにしたがったバッファー条件下で含めた。配列決定のために、第二PCR産物をQIAquick登録商標PCRPurificationKitを用いて精製した。表4コロニーPCRのための温度プログラムfピキアパストリスゲノムDNA単離所望のピキアパストリス株を一晩、回転容器上の滅菌12mlPPチューブ中の5mlYPDで30°Cで最終OD595が510となるまで培養した。15mlの培養液を使用して、EasyDNA商標Kitを用いて提供されたプロトコールにしたがってDNAを単離した。gタンパク質アッセイ溶液中のタンパク質濃度の測定は生化学で長く用いられてきた。その主な用途の一つは、酸素消費速度についてこの例で行われているように総タンパク質量に対して多数の生化学的方法を規準化することである。もっとも一般的に用いられているタンパク質濃度の測定方法はBradford法、Lowry法およびBCA商標法である。これらの方法は感受性、ダイナミックレンジおよび特定の試薬に対する適合性の面で明確な限界を有する。これら3つのアッセイのなかでは、Bradford法およびLowry法がBCA商標と比べてより信頼でき、再現性が高い。一方Lowry法およびBradford法は界面活性剤およびまたは還元剤が存在する場合に深刻な限界を有し、その場合、ブランクの値が高くなる。したがってBCA商標アッセイが化学的溶解の後に選択すべき方法である。タンパク質濃度をYPer登録商標による化学的細胞溶解後にBCA商標アッセイを用いて、BSAを標準として指示マニュアルにしたがって測定したので、主な工程のみを以下に簡単に記載する。200μlの培養液を4000rpmで4°Cで5分間遠心分離した。上清を捨てた後、ペレットをピペッティング操作により100μlYPer登録商標に再懸濁した。懸濁液をThermomixer中で室温で600rpmで20分間15mlマイクロチューブ中でインキュベートした。細胞細片を13200rpmで室温で10分間ペレットとした後、上清を新しいマイクロチューブに移し、4°CでBCA商標アッセイまたはSDSPAGEのために保存した。25μlサンプルをマイクロプレートウェル中で200μlBCA商標ワーキング試薬と混合し、徹底的に30秒撹拌し、プレートシーラーで密封した。37°Cでの30分間のインキュベーションおよび室温への冷却後、562nmでの吸収をSpectramaxPlus384プレートリーダーを用いて測定した。必要な場合、サンプルをddH2Oで希釈した後、BCAアッセイに用いた。hSDSPAGESDSPAGE用のサンプルを上記のセクションで記載したように試薬としてYPer登録商標を用いて化学的細胞溶解により調製した。10μlの溶解液を10μl2xSSBと混合し、95°Cで510分間インキュベートし、15μlのこの混合物をタンパク質ゲルにロードした。電気泳動は180Vで約1時間行い、タンパク質バンドはクーマシー商標ブルー染色を用いて検出した。表5SDSPAGE用のゲル調製iグルコースアッセイグルコース濃度は除タンパクを行わずにグルコースUVヘキソキナーゼ法を用いて測定した。50μlのピキア培養液をPCRマイクロプレートに移し、4000rpmで5分間遠心分離した。10μlの上清をUVStarマイクロプレート中の190μlのヘキソキナーゼ試薬に添加し、室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後、340nmでの吸光度をSpectramaxPlus384プレートリーダーを用いて測定した。jドロップ試験ピキアパストリス株をBMD中で最終OD595が15となるまで培養し、10倍ずつ希釈して最終希釈率105とした。寒天プレートに48ピンレプリケータを用いて移した。プレートをコロニーが現れるまで30°Cでインキュベートした。k配列アラインメントすべての配列アラインメントはINRAホームページのMultAlin17またはEuropeanBioinformaticsInstituteのClustalW18を用いて行った。MultAlinによる配列比較のために常にDNA配列類似性マトリックスを比較のために用いた。メタノール利用経路の遺伝子およびほとんどのペルオキシソーム遺伝子は、グルコース抑制、炭素飢餓での抑制解除およびメタノールによる誘導に関して同様に制御されている。所定のセットの転写因子による同様の転写制御がこの制御パターンの原因であるはずである。これらプロモーター領域内の転写因子結合部位はいくらかの保存領域を示すはずである。共制御される遺伝子のプロモーター領域間の複数配列アラインメントにより、これらの遺伝子の制御に関与する転写因子の保存された結合部位が明らかとなるはずである。メチロトローフ酵母であるピキアパストリス、ハンセヌラポリモルファおよびカンジダボイジニのいくつかの遺伝子は共制御されていることが報告され、それらのプロモーター配列を単離した。表6メチロトローフ酵母であるピキアパストリス、ハンセヌラポリモルファおよびカンジダボイジニからのメタノール利用経路またはペルオキシソーム遺伝子の共制御される遺伝子l転写因子分析転写因子分析をGenomatixSoftwareGmbHサーバーのGenomatixSuite161におけるMatInspectorReleaseprofessional61Jan200315を用いて行った。pPICZB由来のPAOX1配列を用いてMatrixFamilyLibraryVersion311April2003groupALLfungilibを用いて転写因子結合部位を検索した。mプライマー表7記載した実施例に用いたプライマーのリストTm:Equation2を用いて計算実施例11レポーターコンストラクトのクローニングGFPZeoをAOX1プロモーター変異体により駆動される遺伝子発現のためのレポーターとして用いた。ATG開始コドンの周囲の配列を酵母において高度に発現される遺伝子についてのKozakコンセンサス配列の最少必要条件を満たすよう構築した。GFPZeo遺伝子のまえのプロモーター領域を変更するため、EcoRI制限部位を重複伸長PCRにより挿入した。表8本実施例で用いたAOX1配列とピキアパストリス株NRRLY11430のAOX1配列の間の翻訳開始部位および周囲の配列の比較。EcoRI制限部位に下線を引き、位置3および4のKozak最少要求条件を太字で示す。レポーター系成分PのPCRに基づく産生は10ngのベクターpPICZBARS1を鋳型として用いて増幅した。反応には適当なバッファー条件中に10pmolの各プライマーforwおよびPrev、200μMの各dNTPおよび25USynergy商標ポリメラーゼも含め、最終体積を50μlとした。AOX1TTはAOX1プロモーターと同様に増幅した。AOX1TTforwおよびAOX1TTrevをこの反応においてプライマーとして用いた。両方のPCR反応をサーマルサイクラーで30サイクル行い、最初の変性工程を5分95°C、最終伸長工程を10分68°Cとした。2μlの第一PCRラウンドを上記と同じ条件下での第二ラウンドの増幅に用いた。唯一の相違は伸長温度を72°Cに上昇させたことであった。GFPZeo19を鋳型として25ngのベクターpTracer商標CMV2を用いて増幅した。反応には適当なバッファー条件中で10pmolの各プライマー、200μMの各dNTPおよび25USynergy商標ポリメラーゼも含め最終体積を50μlとした。PCRをサーマルサイクラーで30サイクル行い、最初の変性工程を5分95°Cとし、最終伸長工程を10分72°Cとした。すべてのPCR産物をアガロースゲル電気泳動により精製した後、重複伸長PCRに供した。反応には適当なバッファー条件中に10ngP、5ngAOX1TTおよび鋳型として上記のように調製した50ngGFPZeo、200μMの各dNTPおよび25USynergy商標ポリメラーゼを含め最終体積は50μlとした。PCRをサーマルサイクラーで30サイクル行い、最初の変性工程を5分95°Cとし、最終伸長工程を10分68°Cとした。10サイクルの後、適当なバッファー条件中の10pmolの外側プライマーPforwおよびAOX1TTrev、200μMの各dNTPおよび25USynergy商標ポリメラーゼを含む10μlの混合物を添加した。この添加の後、PCRをプログラムの通り続けた。所望のサイズである約24kbの得られたPCR産物をアガロースゲルで精製した。精製した産物をpCR登録商標4BluntTOPO登録商標ベクターにクローニングし、配列決定した。配列決定によりレポーターコンストラクト中に4つの突然変異と1つの欠失が明らかとなった。塩基対欠失部位は元のプロモーター配列の位置15にみられた。この位置はすべてのpPICZベクターのマルチクローニングサイト内にあったため、この欠失はプロモーター活性には影響を与えないはずであり、それゆえ修正しなかった。第一の突然変異はプロモーター領域中位置828にみられた。その他の3つの突然変異はGFPZeoコード配列内の位置122、507および1075にそれぞれみられた。位置122のGA変換はGlyのGGAコドンをGAAコドンに変化させる結果、G41Aアミノ酸変化が生じる。507のTC変換はサイレント突然変異でありR169のコドンを変化させるのみである。位置1075の最後の突然変異はTGA終止コドンをアルギニンコドンCGAに変化させる。突然変異828、122および1075はpAOXベクターの構築後QuikChange登録商標複数部位特異的突然変異誘発キットを用いて修復した。位置507のサイレント突然変異およびポリリンカー中の突然変異はレアコドンを導入しなかったため変化させなかった。pAOXはpCR登録商標4BluntTOPO登録商標ベクターからPAOX1GFPZeoAOX1TT断片をKpnIおよびNotIにより切り出し、それをpBlueScript登録商標SKベクターのKpnIおよびNotI部位の間に挿入することによって構築した。AOX1プロモーターおよびGFPZeo配列にみられた突然変異はQuikChange登録商標複数部位特異的突然変異誘発キットを用いて修正した。PCR反応は提供されたマニュアルにしたがって行い、適当なバッファー条件中に100ngpAOX、100ngの突然変異誘発プライマーおよび1μlQuikChange登録商標複数酵素ブレンドを含んでおり最終体積を25μlとし、サーマルサイクラーで30サイクル行い、最初の変性工程は1分95°Cとした。DpnI消化および大腸菌XL10GOLD登録商標細胞への化学的形質転換は提供されたマニュアルにしたがって行った。3つのすべての突然変異の修正は配列決定により確証した。実施例12AOX1プロモーター欠失の構築AOX1プロモーターの左腕をフォワードプライマーとしてPforwおよびリバースプライマーとしてAOXnrevを用いて合成した。右腕はフォワードプライマーとして10pmolのAOXnforwおよびリバースプライマーとしてPrevを用いて合成した。すべての腕は鋳型として12ngのベクターpAOXおよび10pgの各プライマーを用いて合成した。反応には適当なバッファー条件中10pmolの各プライマー、200μMの各dNTPおよび06UPwoDNAポリメラーゼを含め最終体積を50μlとした。PCRをサーマルサイクラーで30サイクル行い、最初の変性工程を5分95°Cとし、最終伸長工程を10分68°Cとした。すべての腕はアガロースゲルで精製した後、重複伸長PCRの鋳型として用いた。表9プロモーター欠失のためのオーバーラッププライマー対および腕の長さ反応には適当なバッファー条件中に鋳型として上記のように調製した10ngの各腕、200μMの各dNTPおよび06UPwoDNAポリメラーゼを含め、最終体積を50μlとした。PCRをサーマルサイクラーで30サイクル行い、最初の変性工程を5分95°Cとし、最終伸長工程を10分68°Cとした。10サイクルの後、適当なバッファー条件中に10pmolの外側プライマーPforwおよびPrev、200μMの各dNTPおよび06UPwoDNAポリメラーゼを含む20μlの混合物を添加した。PCRは混合物の添加の後、プログラムした通り続けた。所望のサイズの約898947bpである得られたPCR産物をアガロースゲルで精製し、pCR登録商標4BluntTOPO登録商標またはpCR登録商標BluntIITOPO登録商標ベクターにクローニングし、配列決定した。pAOXΔベクターは、PAOX1Δ断片をTOPO登録商標ベクターからBglIIおよびEcoRIにより切り出し、それを野生型AOX1プロモーターの代わりにpAOXベクターのBglIIとEcoRI部位との間に挿入することによって構築した。その結果得られたベクターは配列決定により確証した。実施例13ピキアパストリス形質転換および形質転換体の分析ピキアパストリス形質転換は以前に記載のようにして行った。PAOX1GFPZeoAOX1TTの組込みの選抜はアリコット中の形質転換された再生したピキア細胞をMSMZeo寒天プレートに播くことにより行った。ピキアパストリス株をウェル当たり300μlのBMDを含むディープウェルプレートで28°Cで、320rpm、80湿度で60時間室温で培養した。この期間の後、50μlを採取してGFP蛍光を測定した。誘導を250μlBMM2ウェルを添加することにより行い、次いでさらに72時間インキュベーションした。メタノールを10、24および48時間後に50μlBMM10を添加することにより補充した。メタノール誘導の72時間後にGFP蛍光を再度測定した。レポーター酵素発現の分析ピキアパストリス中でのGFPZeoの発現をSpectramaxGeminiXSプレートリーダー中で、395nmでの励起および507nmでの発光によるGFPの蛍光検出により分析した。上記のようにディープウェルプレートで培養した50μlのピキアパストリス培養液をFIAマイクロタイタープレート中でddH2Oにより13に希釈した。サンプル量が限られていたため一度の測定のみを行った。得られたすべての平均±標準偏差を少なくとも3種類の培養液から算出した。組込みカセットがAOX1遺伝子を置換することなくAOX1座に組み込まれている場合、組換えピキア株は野生型の速度でメタノール上で生育できるが、二重乗換えによるAOX1遺伝子の置換は、メタノール上でのより遅い成長速度をもたらす。これら2つの成長表現型はメタノール利用およびメタノール利用遅延型とそれぞれ称される。メタノール利用表現型の分析のために、ピキアパストリスマイクロスケール培養を96ピンレプリケータを用いてMMおよびMD寒天プレートに移し、30°Cで2日間インキュベートした。2日後、コロニーがピキア株がMut表現型を有する場合には両方のプレートに現れたが、MutS表現型株ではMDプレート上でのみコロニーが現れた。pAOXまたはpAOXΔプラスミドのいずれかの形質転換由来のすべてのピキア株をコロニーPCRにより分析し、欠失コンストラクトも配列決定により分析してレポーター遺伝子の前のプロモーター配列を確認した。実施例14AOX1プロモーターの定向進化遺伝子のコード領域のPCR突然変異誘発はよく開発され確立されているが、プロモーター領域の突然変異誘発に関しては全く知られていない。知識がないため、いくつかの突然変異誘発条件を行った突然変異範囲における偏りを最少にするために、TaqDNAポリメラーゼとMutazyme登録商標DNAポリメラーゼとの2種類のポリメラーゼを用いた。プロモーター配列の進化のための突然変異頻度に関する知識が完全にないという事実により、いくつかの突然変異頻度を試験した。HotStarTaq登録商標DNAポリメラーゼを用いる突然変異誘発変異原性PCRをプロモーター配列に対して20にしたがって100μl反応体積にて行った。反応には、12ngpAOX、40pmolの各プライマー、forwおよびPrev、dNTPおよび5UHotStarTaq登録商標DNAポリメラーゼを適当なバッファー条件中に含めた。MgCl2濃度を7mMに上げてポリメラーゼのエラー率を変化させた。PCRをサーマルサイクラーで30サイクル行い、最初の変性工程を15分95°Cとし、最終伸長工程を10分72°Cとした。GeneMorph登録商標ランダム突然変異誘発キットを提供されたマニュアルにしたがって最終体積50μlにてプロモーター配列に対して実施した。鋳型として様々な量のベクターpAOXを用いた。125pmolの各プライマー、PforwおよびPrevを用いた。PCR反応をサーマルサイクラーで30サイクル行い、最初の変性工程を1分95°Cとし、最終伸長工程を10分68°Cとした。表10GeneMorph登録商標PCR反応に用いた鋳型の量上記条件による第一ラウンドの突然変異誘発を行った。より高い突然変異頻度を達成するためにGeneMorph登録商標反応3を第二PCRラウンドの鋳型として用いた。TaqおよびGeneMorph登録商標2および3条件を用いた。ピキアパストリスX33GFPZeoMutSA9細胞への形質転換の前に、以前に記載のようにしてすべてのPCR反応を沈殿させて脱塩した。標準的形質転換および再生手順を用いた。グルコース培地中で誘導されたプロモーターの選抜を150μlアリコットの形質転換細胞懸濁液を100500μgmlゼオシン商標を含むMD寒天プレートに播き、30°Cで2日間インキュベーションすることによって行った。実施例15結果および考察Iレポーター系の特徴決定今日まで、多数のGFP変異体が分子生物学において用いられている。数個の点突然変異においてのみしか変わらないのに、それらの特徴は大幅に異なる。フォールディング特性の改善の他に、それらの蛍光スペクトルおよび量子収率も異なり、それゆえ強度もかなり異なる。緑色蛍光タンパク質はその励起極大に応じて2つの主な群に分けられる励起極大が395nmでありより小さい極大が470nmである野生型GFP変異体、および、励起極大が480490nmである赤方にシフトしたGFP変異体。そのアミノ酸配列にしたがって、サイクル3GFPは野生型GFP変異体の群に属し、励起極大が395nmである。ピキアパストリスで発現した場合のスペクトル特性を制御するために、蛍光スペクトルを測定した。GFPZeoにおけるサイクル3GFPの総励起極大は395nmであり、478nmの第二極大は一過性であるスペクトルと重なる領域にて放出される光子が吸収されうる。より低い蛍光強度が、自己吸収が起こると観察される。これによりプロモーター活性の過小評価が起こる。インナーフィルター効果が無ければ、蛍光強度はフルオロフォアが増加すると線形に上昇する。したがって様々な体積のGFPZeoを発現するピキアパストリス細胞をその蛍光活性について試験した。3000RFUまで、発光インナーフィルター効果は細胞レベルで検出不可能であった。GFPの蓄積により起こる細胞内での自己吸収は、評価できなかった。蛍光の線形の上昇が全部で72時間の誘導相にわたって検出された。そのため、細胞内でのインナーフィルター効果はないようである。したがって核内でのGFPZeoの蓄積はその定量に問題はない。インナーフィルター効果は本研究で測定した1コピーのプロモーター活性の範囲内では起こらない。自己吸収がないため、プロモーター活性の過小評価は起こらないようである。その他によって観察されるインナーフィルター効果はおそらくより小さいストロークシフトを有するために重なる励起および発光スペクトルを有する異なるGFP変異体の使用により起こるようである。GFP発現実験の結果を比較する場合には注意が必要である。至適化されたコドン使用を有し、それゆえ異なる発現宿主では非常に異なる発現レベルを導く異なるスペクトル特性を有するいくつかのGFP変異体の使用は、異なる研究室の結果の比較を複雑にする。IIマイクロスケールでのAOX1プロモーター活性微生物細胞のスモールスケール培養は通常振盪フラスコ培養で行われる。振盪フラスコ中の大きい微生物ライブラリーの接種および培養は労力と時間がかかり、コストが高くなる。近年、深ウェルマイクロタイタープレートを用いるマイクロスケール培養系が替わりとして開発された。例えば、96または384株培養の並行操作および必要材料が少ないことのために、マイクロタイター系は労力、時間そしてコストの点で振盪フラスコよりも優れている。いくつかの理由のため、マイクロタイター系の主な欠点である、サンプル体積が少なく、通気効率が低いことは、さほど問題ではない分析系における技術的進歩により多数の化合物の検出限界が低くなった結果、非常に小さいサンプル体積しか必要ではない深ウェルマイクロタイタープレートでの増殖方法および装置も改善された。いくつかの研究において、マイクロタイタープレートでの通気速度およびそれゆえ培養条件は振盪フラスコと同様であることが示された。出芽酵母におけるサイクル3GFPをレポータータンパク質として用いるGAL1プロモーターのリアルタイム研究が振盪フラスコ研究と一致することが示された。AOX1プロモーターに駆動されるGFPZeo発現を上記のように深ウェルマイクロタイタープレートで研究した。グルコース上での細胞培養後、炭素およびエネルギー源としてのメタノールによる誘導相を行った。PAOX1GFPZeoAOX1TT発現カセットを有するピキアパストリス細胞におけるメタノールによるAOX1プロモーターの誘導により、GFP蛍光の迅速な上昇が導かれた。72時間までGFP蛍光は線形に上昇した。GFPZeoの発現はメタノールを添加すると続く。そうでなければ、24時間以内にメタノールは蒸発と消費により枯渇し、GFPZeo発現は抑制解除レベルまで低下する。GFPZeo蛍光の上昇はSDSPAGEによって示されるようにGFPZeoタンパク質にもしたがった。メタノール誘導により、約42kDaのタンパク質バンドがみられ、このバンドは蛍光が上昇するとより強力となった。42kDaの強いバンドがすべてのGFPZeoクローンでみられたが、陰性対照ではバンドはみられなかった。X33d6F10のサンプルにおいてもメタノール誘導の72時間後に強いバンドがみられた。規準化してはいないが、42kDaバンドの強度と適当な蛍光レベルの間の明らかな相関が評価できる。III転写因子結合部位以前に記載のように、いくつかの転写因子の結合部位についてのコンセンサス配列は知られている。AOX1プロモーター配列の配列分析により、いくつかの推定転写因子結合部位が明らかとなり、特に興味深いいくつかのヒットがあった。熱ショック因子およびストレス応答要素モチーフのなかで、一般的にグルコース制御に関与していることが知られているいくつかの転写因子の結合部位がみられた。もっとも興味深い結合部位を表11および図2に要約した。表11AOX1プロモーター配列内にみられた転写因子結合部位。大文字の塩基対はコア配列を示し、下線を施した塩基対は情報含量が高いことを示す。GFPZeo遺伝子の翻訳開始点と比較しての与えられた位置を示す推定転写因子結合部位のコア配列を大文字で示す。cは相補鎖との相同性を示す。IVメタノールに制御される遺伝子における制御配列いくつかの配列がメタノール誘導性遺伝子の制御に関与していることが文献に記載されている。ピキアパストリスAOX2プロモーターの欠失分析に基づいて3つの調節領域が記載され、2つは負に作用する領域であり、1つは正に作用する領域である3。ハンセヌラポリモルファMOXプロモーターについて、2つの上流活性化配列および1つの抑制因子結合部位が同様に記載されている8。VAOX1プロモーターの欠失コンストラクト転写因子分析および複数配列アラインメントに基づき、9つのプロモーター領域が先に記載のようにして重複伸長PCRの欠失のために選択された。AOX1プロモーター欠失コンストラクトをpAOXベクターにクローニングしてレポーター遺伝子GFPZeoの5側の野生型AOX1プロモーターを置換した。プラスミドを直鎖化し、ピキアパストリスゲノムに組み込んだ。表12AOX1プロモーターコンストラクトにおいて欠失させた配列所与の位置は配列番号1に対して示されている。組み込み体を上記のようにGFPZeo発現およびGFPZeo遺伝子の前の正しいプロモーター配列の組込みについて分析した。1コピー組み込み体をマイクロスケールでの異なる炭素源でのそのGFPZeo発現レベルについて更に分析した。すべてのコンストラクトにおいて、グルコースまたはグリセロールが培地中に存在する限りGFP蛍光は検出できなかった。抑制解除条件を表す炭素飢餓の際、GFP蛍光のわずかな上昇が検出された。野生型と比較していくつかのプロモーター変異体は顕著な相違を示した。抑制解除条件下で有意に低いプロモーター活性が6つのコンストラクトでみられた。Δ1は野生型活性を有していたが、コンストラクトΔ2およびΔ6は有意に高いGFPZeo発現をもたらした。後者の発現レベルは野生型レベルより顕著に高かった。メタノール誘導の際、1つを除いてすべての変異体は有意に低いプロモーター活性を示したΔ1は野生型と比較して約20高い活性をもたらした。その他の全ての変異体の活性の低下は図4にみられるように非常に顕著であった。メタノール誘導性野生型活性に対して規準化したすべての変異体および野生型コンストラクトのプロモーター活性を表13に要約する。表13マイクロスケールでのAOX1プロモーター変異体の蛍光強度。データは4つの独立実験の平均±SDを表す。WTプロモーターのメタノール誘導の72時間後の蛍光強度は987±81である。グルコースが培地に存在する限り、蛍光は検出不可能であった。コンストラクトΔ8におけるTATAボックスの欠失の結果、プロモーターが広範に破壊され、抑制解除および誘導条件でそれぞれ約90および80の深刻な活性の低下が伴った。転写開始部位の実験的に測定した除去によっては511111121、かかる強力な発現レベルへの効果は観察されなかった。それはメタノール誘導後の最良の欠失コンストラクトの1つである。予測されたように、TATAボックスは転写レベルに深刻な影響を有していた。一方、転写開始部位はTATAボックスほど重要ではないようである。TATAボックスから規定された距離の別の領域は元のものの欠失後、転写開始として作用しうる。mRNAの5末端は欠失により変化したため、発現プロセスのいくつかの段階に対するこの欠失の効果を推測することができる。Δ2およびΔ6の2つのコンストラクトのみが、抑制解除後に有意に高い発現レベルを示す。Rap1pおよびGcr1pの推定転写因子結合部位は欠失配列に含まれている。さらにQA1Fの推定転写因子結合部位はΔ6の欠失配列に非常に近い。注目すべきことに、Rap1pおよびGcr1p結合部位はプロモーター配列に存在する場合相乗的に作用することが知られている21。包括的転写因子Rap1pはその結合部位および適当な転写因子との配列の関係に応じて様々な細胞機能を有する2224。上記のように、Gcr1pは解糖遺伝子の制御と協調に主要なものであり、出芽酵母における高レベル発現に絶対的に必要である。Rap1pおよびGcr1pの結合部位は解糖遺伝子の上流活性化配列のコア領域の非常に近くに見いだされており、Gcr1p結合はDNAをRap1pにより曲げることにより弱まる。一方、隣接Rap1p結合部位は遺伝子のGcr1p依存的活性化の必要条件ではない。Gcr1pは、より多数のCTボックスが存在する場合、その結合部位への結合を促進しうるようである。Rap1pとGcr1pならびにGcr1pとGcr1pとの明らかな相互作用が記載されているのに、いくらかのその他の因子がGcr1pおよびまたはRap1pと相互作用して複合体の活性を調節すると示唆されている。誘導機構に関する広範な知識が最近の30年間で得られた。上記の機能的UASにおけるGcr1pおよびRap1p結合部位の上記のような必須の近接がAOX1プロモーター配列にはみられなかった。そうではなく、この2つの結合部位は367bp離れている。推定Gcr1p結合部位のなかで、そのコア配列CTTCCが2回AOX1プロモーター配列に存在するが、Rap1p結合部位またはその他のCTTCCモチーフにいずれもすぐに隣接していない。それゆえ多くの解糖遺伝子にみられるようなこれら2つの結合部位の相乗作用はないようである。Rap1pおよびGcr1pの推定される役割は抑制解除条件下でのAOX1の抑制因子タンパク質であるという事実により、この推定される新規な細胞機能には2つのタンパク質の新しい作用様式が存在しうる。Δ6欠失の炭素飢餓の際の抑制における関与は、メタノール誘導無しで非常に高いGFPZeo発現を示す多コピー株の観察により強調される。ピキアパストリスX33d6F10と称される、Δ1Δ9群の最良のクローンのGFPZeo発現を図5に示す。GFPZeo発現は抑制解除後のこのΔ6多コピー株において、メタノール誘導後の1コピー野生型プロモーター株よりも約10高い。メタノール誘導後のピキアパストリスX33d6F10の発現レベルはまた、野生型プロモーターを有する多コピー株よりも非常に高い。ピキアパストリスAOX1およびDAS1およびハンセヌラポリモルファMOXプロモーター領域は出芽酵母においてレポーター酵素であるベータガラクトシダーゼの発現を促進する9。出芽酵母におけるこれら遺伝子の制御パターンはその天然の宿主と類似しているグルコースは遺伝子発現を抑制する。炭素飢餓条件において発現はわずかに抑制解除され、炭素源としてのグリセロールが発現を誘導する。出芽酵母においてAOX1およびDAS1調節領域の制御下で発現するベータガラクトシダーゼレベルは出芽酵母の強力なCYC1およびGAL2プロモーターにより得られるレベルと匹敵する9。MOXプロモーターにより駆動される発現は出芽酵母においてエタノール、メタノールおよびオレイン酸によっても誘導されることが示された。さらなる非常に重要な知見はAdr1pのプロモーターの抑制解除誘導への関与である。出芽酵母におけるADH2およびいくつかのペルオキシソームタンパク質の陽性エフェクターであるAdr1pは25、グルコースが培地に存在しない場合、MOXプロモーターの陽性エフェクターでもある。上記のようにAOX1およびMOX遺伝子の制御パターンは、グリセロールが存在する場合、MOXの抑制解除によりそれらの天然の宿主において有意に異なる。ハンセヌラポリモルファにおけるAOX1プロモーター領域の使用により、AOX1プロモーターは異種宿主においてグリセロールによって抑制されないことが明らかとなった26。したがって、異種AOX1プロモーターは、相同的MOXプロモーターのように制御されるようである。この結果、ピキアパストリスおよびハンセヌラポリモルファの間の制御パターンにおける有意差は、これら2つの酵母における異なる炭素源に対する全体的転写応答に起因することが示唆される。即ち、グリセロールおよびグルコース抑制機構は、ピキアパストリスにおいて同一であるが、ハンセヌラポリモルファにおいてはと同様に状況が異なり、グリセロールがグルコース抑制機構を使用しない。AOX1プロモーター配列にみられた3つの推定HAP2345結合部位のうち2つはΔ1欠失コンストラクト内にあり、もう1つはΔ5にある。Δ1の配列欠失の結果、メタノール誘導によりプロモーター活性が上昇するが、抑制解除によってはプロモーターレベルに対する効果は観察されなかった。一方、Δ5の欠失の結果、抑制解除および誘導条件下でプロモーター活性がかなり低下した。Δ1欠失において、推定偽巣性コウジ菌abaA結合部位がみられた。abaA遺伝子産物は転写活性化因子であり、偽巣性コウジ菌における分生子柄の発達に関与している27。すべての推定結合部位は活性化因子配列である可能性があるので27、その欠失はΔ5コンストラクトにみられるように発現レベルに対する負の効果を有しうる。両方の欠失が非常に長いという事実により、別の結合部位が観察された効果の原因である可能性がある。Δ1の欠失は発現レベルに逆の効果をもたらすという事実は、推定結合部位の1つが抑制因子モチーフであるか、あるいはもう一つの結合部位が存在し、推定HAPおよびabaA結合部位の欠失の効果を超えて発現レベルを上昇させているということを示す。にもかかわらず、HAP複合体は、出芽酵母において呼吸およびエネルギー代謝に関与している遺伝子の上方制御の原因であることが知られている。呼吸の制御は酸素レベルおよび培地に存在する炭素源によってコントロールされており、その両方がHap複合体に媒介されている。発酵酵母である出芽酵母において、いくつかの遺伝子およびそれゆえ呼吸鎖ならびにクエン酸回路の機能がグルコースによって抑制される。呼吸のグルコース抑制は部分的にはHap複合体によって媒介され、即ちグルコースが存在する限りHap4pの不在によって媒介される。一方、酸素依存的制御はHap1pにより制御されているようである28。Hap複合体遺伝子のホモログが呼吸酵母であるクルイヴェロマイセスラクティスにおいて単離された。呼吸に関与する遺伝子は、呼吸酵母において、グルコースの存在下であっても構成的に発現する。今日まで、ほとんどすべての呼吸鎖遺伝子がHap複合体とは独立に制御されることが示されている29。Hap複合体の役割は出芽酵母30および偽巣性コウジ菌29においてみられるように炭素および窒素同化作用を協調させることであるようである。ピキアパストリスにおいてAOX1遺伝子産物により主に触媒されるメタノール利用経路の第一段階は、酸素消費である。エネルギー代謝に関与するほとんどの遺伝子および酸素消費酵素をコードするほとんどすべての遺伝子は酸素によって主にHap1pおよびまたはHap2345pを介して制御されている28。唯一のエネルギーおよび炭素源としてメタノール上で培養した場合、メタノール利用経路は、炭素同化作用およびエネルギー産生をもたらす。AOX1プロモーターの制御におけるHap複合体認識モチーフTTCCAAの関与は明らかである。第二の推定HSF結合部位を含むΔ4コンストラクトは、抑制解除および誘導後、プロモーター活性の30の低下をもたらす。それゆえHSFは、抑制解除および誘導条件下でのAOX1遺伝子発現の包括的エンハンサーである。出芽酵母において、いくつかのストレス条件、例えば、熱ショック、酸化ストレスおよびグルコース飢餓により、HSFの活性化が導かれる。代謝マスタースイッチの一つであるタンパク質キナーゼSnf1pが、炭素飢餓の際のHSFのリン酸化およびそれゆえ活性化に関与していることも示された31。したがってHSFのグルコース飢餓の際のAOX1の完全な活性化における関与が起こる。切断型および欠失配列を有する変異体を用いるAOX1プロモーターに関する発現研究が従来技術に開示されている32、33。表14Inanetal32、33によるプロモーター研究の結果誘導は炭素源としての05メタノールで行い、抑制は05メタノールおよび05エタノールで行った開始位置は翻訳開始点に対するAOX1プロモーターにおける配列の5’末端を示す。153にて開始するコンストラクトInanBCDEFは、153の上流の少なくとも1つ活性化因子タンパク質の結合部位を明らかにした。この活性化因子結合部位の候補はMatInspectorによってみられる相補鎖上でのHap1pおよびHSFの結合部位である。SacI制限部位での切断の結果、野生型プロモーター活性にほぼ達するプロモーターが生じた。SacI切断プロモーターコンストラクトにより野生型プロモーターレベルに達するために、抑制因子タンパク質の第二の結合部位は210の上流に存在し得、その欠失はプロモーター活性に同じ影響を有するが反対の方向である。Δ1コンストラクト~234は抑制因子結合部位を含むため、抑制因子タンパク質の位置は169と210の間である。Δ1の欠失の結果、プロモーター活性が20上昇し、これは活性化因子タンパク質結合部位の欠失による低下の範囲内である。Δ4~550との比較により、抑制因子結合部位の位置はさらに433と508との間の配列に絞られる。というのは、Δ4欠失は正に活性化する転写因子である、HSFを516~536に含むからである。正に活性化するHSFが提案された領域内に位置する場合、433と508との間の抑制因子結合部位のより強力な効果が示唆されうる。HSFの結合部位が508と536との間の領域に位置する場合、さらなる活性化因子結合部位が536と560との間に位置している。そうでなければそれはおそらく同一の結合部位であろう。野生型活性の16にすぎないInanABCDF変異体と同様に、Δ5コンストラクトの結果、野生型レベルの約70の低下が起こる。予測されたように、InanB断片の全長プロモーターからの欠失は、InanBCDEFからの欠失と同様により長い断片のそれぞれ63および64の低下をもたらす。一方、全長プロモーターからのC断片の欠失はプロモーター活性を約10上昇させ、切断型InanCDEF断片からの欠失は49~14の低下をもたらす。その説明は転写因子のその結合部位との関係に依存する協力的な結合である。713と760の間に、最後の活性化因子タンパク質結合部位が位置する。さらにΔ7コンストラクトにより、活性化因子の位置は729まで下流に絞られる。結論づけると、AOX1プロモーターの発現レベルに強力な影響を有するいくつかの領域が見いだされた。本明細書に提供する実施例からの制御部位とその他のすべての既知の制御部位とを組み合わせると、TATAボックスと転写開始部位を含む領域を除き、少なくとも10の制御部位がPAOX1プロモーター配列に存在する。得られたデータにより、AOX1プロモーターの組織化された制御が明らかとなった最大発現レベルのためにはいくつかの因子がDNAに結合することが必要である。誘導条件下において、いくつかの正に作用する転写因子がDNAに結合するが、ほとんどの抑制因子タンパク質は結合しなかった結果、高発現レベルとなった。抑制解除されると、プロモーター活性は誘導レベルのわずかなパーセンテージにしか達しなかった。これはおそらくプロモーター領域に結合する活性化因子がより少なく抑制因子タンパク質がより多いことによる。抑制条件下では、活性化因子はDNAに結合せず、いくつかの抑制因子がDNAに結合し、抑制条件下ではさらに抑制因子活性化因子比が上昇すると予測できる。グルコースに抑制された出芽酵母のADH2プロモーターについて、ヌクレオソームにすぐに隣接している活性化因子タンパク質の結合が、抑制解除の際にクロマチンの不安定化、それゆえ再編成を導くことが示された。再編成はTATAボックスおよび転写開始部位の領域において起こり、それゆえそれらとの接近可能性が上昇する。接近可能性が高くなることにより、安定な前開始複合体の形成が起こり、それゆえプロモーター活性が基底レベルにまで上昇する。PAOX1に駆動される発現を促進するいくつかの転写因子の結合において、少なくとも抑制解除については類似の機構が推測できる。すべてのデータおよび推測をまとめると、AOX1プロモーターの制御は高度に複雑であり、いくつかの転写因子の推定結合部位は高度に協調した機構であることが判明し、これによりAOX1プロモーターの制御のための多数のシグナルを統合することが可能である。VIAOX1プロモーターのPCR突然変異誘発このたび、転写因子結合部位のコア配列内の特異的突然変異の結果、そのエフェクター能力が有意に変化することが示された。おそらくいくつかの活性化因子および抑制因子タンパク質がAOX1プロモーターに作用する結果、その非常に強力な制御が導かれる。それゆえAOX1プロモーターのランダム突然変異誘発の結果、抑制因子結合部位活性が破壊または低下したいくつかのプロモーター変異体が生じるはずである。様々な突然変異率の一連のPCR反応を行った。その結果得られるプロモーター変異体をAOX1遺伝子がGFPZeo株によって置換されているピキアパストリスGFPZeoMutSA9株に形質転換した。野生型AOX1プロモーターの突然変異誘発したプロモーター変異体による置換が特定の率で起こるはずである。グルコースが培地に存在する場合により高い発現速度を示すプロモーター変異体のスクリーニングをMDZeo寒天プレートで行った。100μgmlゼオシン商標を含有するMD寒天プレートに播種した結果、ピキアパストリス細胞によりプレートに斑点が生じたが、シングルコロニーは現れなかった。選択圧が野生型株の成長を抑制するのに十分ではなかったようである。グルコースが存在する場合ピキアパストリスGFPZeoMutSA9株において蛍光は検出できなかったが、いくつかのGFPZeoタンパク質が細胞中で発現してゼオシン商標耐性を付与しているようであった。GFPZeoMutSA9株の成長阻害のためのより高いゼオシン商標濃度を試験するために、以前に記載のようにしてドロップ試験を行った。図6から明らかなように、200μgmlまでの上昇によっては、AOX1プロモーターの制御下でGFPZeo遺伝子を担持するピキアパストリス株の細胞生存度は低下しなかったが、500μgmlまで上昇させると細胞生存度は低下した。プロモーターの突然変異誘発の結果、わずかに発現レベルが上昇するはずであると推定され、それゆえ500μgmlゼオシン商標の選択圧は高すぎるようである。最終的に350μgmlを突然変異誘発プロモーター変異体のすべてのさらなるスクリーニングのために選択した。多くのプロモーター領域が関与している非常に複雑な転写制御により、高い突然変異誘発率を用いるランダム突然変異誘発アプローチが有益である。実施例2プロモーター欠失の作製実施例1の結果に基づき、第二世代の欠失変異体を作製した。第一の群と異なり、これら新しい欠失コンストラクトにおいては、推定転写因子結合部位の短い特定の配列ストレッチのみを欠失させた。表15抑制解除およびメタノール誘導の際の発現レベルに対する特定の転写因子結合部位の欠失の効果。突然変異Δ1Δ9および単一突然変異の組合せも示す。すべての数値は同じ条件下での野生型プロモーター活性と比較しての相対的プロモーター活性である。材料および方法a突然変異誘発すべての欠失はWangetal34にしたがって2段階部位特異的突然変異誘発プロトコールを用いて導入した。第一段階において2つの別の反応を評価した。25μlのこれら2つのPCR反応を合わせ、第二のPCR反応工程を行った。1μlのDpnI制限酵素を30μlの第二PCR反応工程に添加し、1時間37°Cでインキュベートした。15μlのDpnI消化PCR反応を電気コンピテント大腸菌細胞に形質転換し16、1時間のSOC培地での再生時間の後LBAmpプレートに播いた。表16転写因子結合部位欠失の部位特異的突然変異誘発のためのプライマーbピキアパストリス形質転換およびクローンの特徴決定上記のように構築したプラスミドを調製し、実施例1に記載のようにピキアパストリスに形質転換した。結果および考察発現レベルに対する強力な効果が、すべての突然変異が有意な正または負のプロモーター活性に対する効果を有していた実施例1のより大きい欠失について既に記載したように、実施例2の短い突然変異によって観察された。特定の転写因子結合部位の短い欠失はプロモーター活性に強力な効果を有し、個々の制御部位の調節特性に関するより正確な情報を与える。Gcr1は、その結合部位がΔ6欠失に含まれるため特に興味深い。pAOXΔ6欠失突然変異体のプロモーター領域およびピキアパストリスクローンのゲノムDNAのコロニーPCR産物の配列決定により、プロモーター領域におけるさらなる欠失が明らかとなったの欠失。このプロモーター変異体はプロモーター活性の上昇を導く結果、抑制解除条件下においてより高い発現速度が達成されるという事実により、このさらなる突然変異を本発明によるプロモーターに導入するとかかる条件下でタンパク質発現を上昇させることが出来る。さらなる欠失の欠失を有するQA1Fクローンのプロモーター活性は、このさらなる欠失を有さないΔQA1Fプロモーターと比較して有意差がある活性は野生型活性の30および100から140および70までそれぞれ変化した。これら6ヌクレオチドのさらなる欠失はプロモーター活性に劇的に影響を与えるようである。したがって、この突然変異を担持する新しいプロモーター変異体を上記のように部位特異的突然変異誘発プロトコールによって導入した。この領域における偶発的かつ独立に2倍となる両方の突然変異の結果、抑制解除条件下でプロモーター活性が上昇した。両方のコンストラクトにおいて第二のそしておそらくは負に影響する突然変異が存在するのに、プロモーター活性が上昇することは注目に値する。Δ2とΔ6の組合せを単一欠失と同様に重複伸長PCRによって作製した。両方の断片の欠失の結果、抑制解除条件下および誘導条件下でプロモーター活性の非常に強力な低下が起こることが表17から明らかである。上記のようにΔ6コンストラクトと比較してこのコンストラクトにもさらなるTA欠失は存在しないので、この結果は、偶発的に生じたさらなる突然変異により炭素飢餓の際にプロモーター活性が上昇するという推測を支持する。いくつかの欠失の結果、プロモーター活性の劇的な低下が起こった。これら推定結合部位は配列重複の魅力的な標的であり、プロモーター活性の上昇を導くはずである。興味深いことに、部位特異的突然変異誘発により作製したΔ736741変異体の4つのクローンのうち2つにおいて、位置552~560の9ヌクレオチドの新しい欠失が見いだされた。欠失が異なる領域にみられたという効果は、ΔHsf2コンストラクトにおいてもみられた。かかる効果は部分的配列相同性に起因すると考えられる。したがってかかるさらに欠失した領域および近隣の配列も推定転写因子結合部位であり、それゆえ欠失および重複のための非常に興味深い標的である。欠失変異体Δ73641の結果、メタノール誘導条件下での発現レベルがさらに低下した。多コピー株ほとんどの場合において多コピー株の作製の結果、GFPZeo超発現株が生じた。多くの場合、これらの株は主にメタノール誘導条件下でd6F10株より高い発現レベルを有する。多コピー株の作製はいくつかのコンストラクト、特にΔ6コンストラクト、二重欠失d2d6、コンストラクト、例えばΔ1、Δ2およびΔ6欠失ならびに例えば、Gcr1、Rap1、abaA、Hap23451、また例えば、QA1F、Adr1、Hsf2Mat1MCおよびHsf2Hap23451により達成可能である。これらの株において誘導条件下でd6F10株と比較してより高い発現速度がみられる。一方、d6F10株は既知の抑制解除条件下まで、作製したいずれかのその他の株よりも多くのGFPZeoを産生することが出来た。Δ6コンストラクトのピキアパストリスへの形質転換の繰り返しの結果、多数の多コピー株が生じ、これらは特に抑制解除条件下でd6F10株と匹敵する活性であった。野生型プロモーターコンストラクトを用いると、プロモーター変異体を用いる場合より低頻度の多コピー株が観察された。24倍多くの形質転換体を分析したが、最良の形質転換体E2の発現レベルは1コピー形質転換体の2倍にすぎなかった。結論づけると、プロモーター変異体の形質転換の結果、より高頻度の多コピー株が得られ、これらの株は多コピー野生型プロモーター株よりも多重により生産性である。実施例3代替のレポータータンパク質すべてのGFPZeoの結果のその他の基本的によく発現する工業的に関連するタンパク質への適用可能性を試験するために、いくつかのプロモーター変異体をかかるレポーター酵素の前にクローニングした。クローニングプロモーター変異体をベクターpPICZαBHRPWT35およびpGAPZAPaHNL5αにクローニングした。pPICZαBHRPWTにおけるプロモーター交換のために、NdeI制限部位を部位特異的突然変異誘発によりプロモーターの5’末端に挿入した。その結果得られたベクターをpPICZαBNdeIHRPWTと称した。表18pPICZαBHRPWTにおけるNdeI制限部位の導入およびプロモーター交換のための部位特異的突然変異誘発用プライマーpGAPZAPaHNL5α発現クローンのために、PaHNL5α遺伝子をまずpHILD2ベクターからpGAPZAベクターにクローニングし、その結果、プラスミドpGAPZAPaHNL5αを得た。プロモーター変異体のpGAPZAPaHNL5αへのクローニングは、pGAPZAPaHNL5αおよびpAOXΔプラスミドのEcoRIBglII消化の後に直接行うことが出来た。pPICZαBNdeIHRPWTにおける交換のために、プロモーター変異体をプライマーAOX1NDE1およびAOX1revを用いてPCRにより増幅した。PCR産物およびpPICZαBNdeIHRPWTプラスミドをNdeIHindIII制限部位を用いてクローニングした。形質転換、培養および酵素アッセイピキアパストリス形質転換のために、すべてのHRPベクターをNdeIで直鎖化し、すべてのPaHNL5αプラスミドをBglIIで直鎖化した。形質転換は実施例1に記載のようにして行った。ピキアパストリス株の培養も実施例1に記載のようにして行ったが、わずかにそれを改変した。最初のBMDの量を350μlに増やし、60時間後100μlの培養液をとって遠心分離した。メタノール誘導は実施例1とまったく同様にして行った。50μlまたは10μlの遠心分離からの上清を取ってHNLアッセイに供し、両方の条件の15μlをHRPアッセイに供した。HRPアッセイ15μlの上清をPSマイクロタイタープレート中の50mMNaOAcバッファーpH45中の150μl1mMABTS29mMH2O2に添加した。吸収は5分間405nmでSpectramaxPlus384プレートリーダーで測定した。HNLアッセイ50μlまたは10μlの上清をUVStarマイクロタイタープレート中の100または140μl005Mリン酸クエン酸バッファーpH50に添加した。反応を50μlの006Mマンデロニトリル溶液の添加により開始させ、5分間280nmでSpectramaxPlus384プレートリーダーで測定した。結果および考察代替のレポータータンパク質であるPaHNL5αおよびHRPを用いた結果は、明らかにGFPZeoを用いて検出されたプロモーター活性の転換能力を示す。HRPアッセイの感受性が低いために、抑制解除条件での発現レベルは検出限界未満であった。したがってHRP発現は抑制解除条件下では測定できなかった。表17代替のレポーター酵素を有するいくつかのAOX1プロモーター変異体のプロモーター活性。多コピー選抜を代替のレポーター系に移すため、AOX1プロモーター変異体を適当なHRPおよびPaHNL5αプラスミド中のゼオシン耐性遺伝子の前にクローニングすることによって、TEF1プロモーターを置換した。実施例4代替のレポータータンパク質GFPGFPを有するプロモーター変異体を試験するために、実施例1および2に記載のプロモーター変異体をサイクル3GFP遺伝子の前にクローニングしした。クローニングベクターpAOXにおけるサイクル3GFP中の内部BamHIおよびXhoI制限部位をプライマーBamdelfおよびXhodelfおよび鋳型として100ngベクターを用いる部位特異的突然変異誘発によって欠失させた。GFP断片をその結果得られたプラスミドからプライマーGFPZeoforwおよびwtGFPXhoIrおよびPhusion商標ポリメラーゼを用いる適当な条件下でのPCRにより増幅した。その結果得られたPCR産物をEcoRIXhoI制限切断およびT4DNAリガーゼを用いるライゲーションの実施によってベクターpPICZBにクローニングした。その結果得られたプラスミドをpPICZGFPと称した。すべてのプロモーター変異体のpPICZGFPへのクローニングは、pPICZGFPおよびpAOXΔプラスミドのBglIIEcoRI消化後直接行うことが出来た。表19ベクターpAOXにおけるサイクル3GFPの部位特異的突然変異誘発およびそのGFP断片の増幅用のプライマー形質転換、培養およびGFP検出ピキアパストリス形質転換のためにすべてのプラスミドをBglIIによって直鎖化した。形質転換を実施例1に記載のように行った。形質転換および2時間の再生相の後、細胞を、100μgmlゼオシンを含有するYPDZeo寒天プレートに播いた。ピキアパストリスの培養、メタノール誘導およびGFP蛍光の測定は実施例1の記載と同様にして行った。結果および考察この場合も、GFPをレポーター系として用いる結果は、GFPZeoを用いて検出されるプロモーター活性の転換能力を示す。多コピー株実施例1および2に記載のように、ゼオシンを選抜マーカーとして用いる多コピー株の発生は非常に一般的である。多コピー株の頻度は、選抜プレート上のゼオシン濃度をそれぞれ500および1000μgmlに上昇させることによって劇的に上昇させることが出来た。表20GFPおよびGFPZeoをレポーター遺伝子として有するいくつかのAOX1プロモーター変異体の同じ条件下での野生型プロモーターと比較しての相対プロモーター活性。実施例5GFPを用いる十分な群ほとんどすべての転写因子結合部位を有さない系におけるAOX1プロモーターの小部分を試験するために、AOX1プロモーターを、位置176および194においてTATAボックスの前の数塩基対を切断して、基本プロモーター要素AOX176およびAOX194を得た。基本プロモーター断片の前のプロモーター要素のクローニングならびに基本プロモーターのクローニングを可能とするために、BspTIおよびEcoRI制限部位をそれぞれ5および3’末端に挿入した。表21基本AOX1プロモーター要素AOX176およびAOX194ならびに基本プロモーター変異体の前に付加されるプロモーター断片737および201214の配列。制限部位BspTIおよびEcoRIを下線で示す。クローニング基本AOX1要素をpAOXから、プライマーAOX1basalrvおよびAOXbasalfwnおよびAOX176fwをそれぞれ用いて増幅した。PCRはPhusion商標ポリメラーゼを用いて適当な条件で総体積50μlにて行った。プロモーター変異体AOX176737は上記のようにプライマーAOX1basalrvおよび73738AOX176を用いてPCRにより増幅した。プロモーター変異体AOX176201214を上記のようにプライマーAOX1basalrvおよび201214AOX176を用いてPCRにより増幅した。その結果得られたPCR産物をBglIIEcoRI制限切断およびT4DNAリガーゼを用いたライゲーションを行ってベクターpPICZGFPにクローニングすることにより、野生型AOX1プロモーターを置換した。4つのオリゴヌクレオチド、Leu2basal1f、Leu2basal2f、Leu2basal1rおよびLeu2basal2rを総体積20μlとして混合し、95°Cで2分間加熱し、室温までゆっくりと冷却した。3μlの混合物を159ngのpPICZGFPBglIIEcoRI断片と6時間16°Cでライゲーションした。大腸菌への形質転換後、その結果得られたベクターをpLeu2basalGFPと称した。プロモーター変異体Leu2737をプライマーsLEU2basalrvおよび73738Leu2そして鋳型としてpLeu2basalGFPを用いて上記のようにPCRにより増幅した。その結果得られたPCR産物をBglIIEcoRI制限切断およびT4DNAリガーゼを用いるライゲーションを行ってベクターpPICZGFPにクローニングし、それにより野生型AOX1プロモーターを置換した。その結果得られたプラスミドをpLeu2GFP737と称した。表22基本プロモーター要素および十分なコンストラクトの作製用プライマー形質転換、培養およびGFP検出ピキアパストリス形質転換のために、すべてのプラスミドをBamHIにより直鎖化した。形質転換を実施例1に記載のように行った。形質転換および2時間の再生相の後、細胞を100μgmlゼオシンを含有するYPDZeo寒天プレートに播いた。ピキアパストリスの培養、メタノール誘導およびGFP蛍光の測定は実施例1の記載と同様に行った。結果および考察この実験は、実施例1および2にて同定した小さい要素の付加が、AOX1プロモーターまたは出芽酵母LEU2プロモーター由来の基本プロモーター要素のプロモーター強度の上昇に利用できることを示す。多コピー株形質転換後にみられる多コピー株の発生および頻度は実施例4に記載のものとまったく同様であった。プラスミド内の直鎖化の部位が異なることは、多コピー株の作製に影響を与えなかった。表23制御因子結合部位として作用すると推定される小さいAOX1プロモーター断片を含まない、およびかかる断片の付加後の基本プロモーター要素のプロモーター活性。GFPをレポータータンパク質として用いた。1コピー株および多コピー株を示す。参考文献1NakagawaTetalYeast151223302KoutzPetalYeast5167773OhiHetalMolGenGenet243489994CreggJMetalMolCellBiol91316235NakagawaTetalYeast191067736SakaiYetalJBacteriol180588558907GenuVetalEurJBiochem270246724758GoedeckeSetalGene13935429TschoppJFetalNucleicAcidsRes1538597610ParpinelloGetalJBacteriol18029586711AlamaeTetalYeast1014596612InanMetalJBiosciBioeng9258558913SreekrishnaKetalGene190556214RomanosMetalMethodsMolBiol103NucleicAcidsRes2348788416AusubelFMetalCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileyandSonsNewYork200317CorpetFNucleicAcidsRes16108819018ChennaRetalNucleicAcidsRes31349750019BennettRPetalBioTechniques244788220FarinasETetalAdvSynthCatal34360160621HuieMAetalYeast123071722LopezMCetalPNASUSA9514112723ZengXetalGenetics14749350524DelVescovoVetalJMolBiol3388779325SimonMetalYeast8303926RaschkeWCetalGene177163727AndrianopoulosAetalMolCellBiol1425031528KwastKEetalJExpBiol201MolMicrobiol3112051530DangVDetalJBacteriol1781842931HahnJSetalJBiolChem27951697632WO0208165033US669969134WangWetalBiotechniques26680235MorawskiBetalProteinEng133778436WeisRetalFEMSYeastRes5179189配列表配列番号1ピキアパストリスのAOX1プロモーター