以下の段階を含む、ヘテロ二量体タンパク質を作出するためのインビトロの方法aFc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンのFc領域を含む第1のホモ二量体タンパク質を提供する段階、bFc領域が第2のCH3領域を含む、免疫グロブリンのFc領域を含む第2のホモ二量体タンパク質を提供する段階、ここで該第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列は異なり、かつ該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、cヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にするのに十分な還元条件の下で、該第1のタンパク質を該第2のタンパク質とともにインキュベートする段階、ならびにd該ヘテロ二量体タンパク質を得る段階。第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質が、Fc領域、抗体、Fc領域を含む融合タンパク質、およびプロドラッグ、ペプチド、薬物もしくは毒素に結合されたFc領域からなる群より選択される、請求項1記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が全長抗体である、請求項1記載のインビトロの方法。第2のホモ二量体タンパク質が全長抗体である、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1および第2のホモ二量体タンパク質がともに抗体であり、異なるエピトープに結合する、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質のFc領域が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプのものであり、かつ第2のホモ二量体タンパク質のFc領域が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプのものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質の両方のFc領域がIgG1アイソタイプのものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。ホモ二量体タンパク質のFc領域の一方がIgG1アイソタイプのものであり、もう一方がIgG4アイソタイプのものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。ホモ二量体相互作用の各々と比較したヘテロ二量体相互作用の強度の増大が、共有結合、システイン残基または荷電残基の導入以外のCH3改変によるものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用が、実施例13に記述した条件の下、05mMGSHでFabアーム交換が起こりえないようなものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用が、実施例14に記述した条件の下、マウスにおいてインビボでFabアーム交換が起こらないようなものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用が、例えば実施例30に記述のように決定した場合、2つのホモ二量体相互作用のうちで最も強いものよりも2倍を超えて強い、例えば3倍を超えて強い、例えば5倍を超えて強い、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列が、実施例30に記述のようにアッセイした場合、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用の解離定数が005マイクロモル未満であるようなものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列が、実施例21に記述のようにアッセイした場合、両方のホモ二量体相互作用の解離定数が001マイクロモルを超える、例えば005マイクロモルを超える、好ましくは001~10マイクロモル、例えば005~10マイクロモル、より好ましくは001~5マイクロモル、例えば005~5マイクロモル、さらにより好ましくは001~1マイクロモル、例えば005~1マイクロモル、001~05マイクロモルまたは001~01マイクロモルであるようなものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列が、同一でない位置にアミノ酸置換を含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。アミノ酸置換が天然アミノ酸または非天然アミノ酸である、請求項15記載のインビトロの方法。野生型CH3領域と比較して、第1のホモ二量体タンパク質がCH3領域中に1つのみアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質がCH3領域中に1つのみアミノ酸置換を有する、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が、366、368、370、399、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が、366、368、370、399、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、ここで該第1のホモ二量体タンパク質および該第2のホモ二量体タンパク質は同じ位置では置換されない、前記請求項1~16のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が、366、368、370、399、405および407からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にPhe以外のアミノ酸を有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にPhe、ArgまたはGly以外のアミノ酸を有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置405にPheを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にPhe以外のアミノ酸および位置409にLysを含む、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置405にPheを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にPhe、ArgまたはGly以外のアミノ酸および位置409にLysを含む、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置405にPheを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にLeuおよび位置409にLysを含む、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置405にPheおよび位置409にArgを含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にPhe、ArgまたはGly以外のアミノ酸および位置409にLysを含む、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置405にPheおよび位置409にArgを含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にLeuおよび位置409にLysを含む、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、位置370にThrおよび位置405にLeuを含む、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置409にArgを含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、位置370にThrおよび位置405にLeuを含む、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置370にLys、位置405にPheおよび位置409にArgを含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、位置370にThrおよび位置405にLeuを含む、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerまたはThr以外のアミノ酸を有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にAla、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、ValまたはTrpを有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にGly、Leu、Met、AsnまたはTrpを有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerまたはThr以外のアミノ酸および位置409にLysを有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にAla、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、ValまたはTrpおよび位置409にLysを有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にGly、Leu、Met、AsnまたはTrpおよび位置409にLysを有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrおよび位置409にArgを有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerまたはThr以外のアミノ酸および位置409にLysを有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrおよび位置409にArgを有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にAla、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、ValまたはTrpおよび位置409にLysを有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrおよび位置409にArgを有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にGly、Leu、Met、AsnまたはTrpおよび位置409にLysを有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置368にPhe、LeuおよびMet以外のアミノ酸、または位置370にTrp、または位置399にAsp、Cys、Pro、GluもしくはGln以外のアミノ酸を有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置409にArg、Ala、HisまたはGlyを有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置368にLys、Gln、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Asn、Arg、Ser、Thr、ValもしくはTrp、または位置370にTrp、または位置399にAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、Trp、Phe、His、Lys、ArgもしくはTyrを有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質が位置409にArgを有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置368にAsp、Glu、Gly、Asn、Arg、Ser、Thr、ValもしくはTrp、または位置370にTrp、または位置399にPhe、His、Lys、ArgもしくはTyrを有する、前記請求項1~18のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1および第2のCH3領域が、指定した変異を除いて、SEQIDNO1に記載される配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質と第2のホモ二量体タンパク質のどちらもヒンジ領域の中にCysProSerCys配列を含まない、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質と第2のホモ二量体タンパク質のどちらもヒンジ領域の中にCysProProCys配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質が、指定した任意の変異を除いて、ヒト抗体である、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質が重鎖抗体である、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1のホモ二量体タンパク質と第2のホモ二量体タンパク質のどちらも軽鎖をさらに含む、前記請求項1~46のいずれか一項記載のインビトロの方法。軽鎖が異なる、請求項47記載のインビトロの方法。第1およびまたは第2のホモ二量体タンパク質が、Asn結合型グリコシル化のアクセプタ部位を取り除く変異を含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。段階aおよびbにおいて提供される第1および第2のホモ二量体タンパク質が精製される、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1およびまたは第2のホモ二量体タンパク質が薬物、プロドラッグもしくは毒素に結合されるか、またはそれらに対するアクセプタ基を含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1およびまたは第2のエピトープが腫瘍細胞上に位置する、前記請求項4~51のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1または第2のエピトープが腫瘍細胞上に位置し、かつ他方のエピトープがエフェクタ細胞上に位置する、前記請求項4~52のいずれか一項記載のインビトロの方法。エピトープが、T細胞上に発現されたCD3上のようにT細胞上に位置する、前記請求項4~53のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1または第2のエピトープが腫瘍細胞上に位置し、かつ他方のエピトープが、ペプチドもしくはハプテンに任意でカップリングもしくは連結されてもよい、放射性同位体、毒素、薬物またはプロドラッグ上に位置する、前記請求項4~52のいずれか一項記載のインビトロの方法。第1または第2のエピトープが腫瘍細胞上に位置し、かつ他方のエピトープが高電子密度ベシクルまたはミニ細胞上に位置する、前記請求項4~52のいずれか一項記載のインビトロの方法。ホモ二量体タンパク質がともに抗体であり、かつ第1の抗体および第2の抗体が同じ腫瘍細胞上の異なるエピトープに結合する、前記請求項1~52のいずれか一項記載のインビトロの方法。ホモ二量体タンパク質がともに抗体であり、かつ第1の抗体が腫瘍細胞上のエピトープに結合し、かつ他方の抗体が、意図した用途に関連するいかなるインビボ結合活性もない無関係なまたは不活性な抗体である、前記請求項1~52のいずれか一項記載のインビトロの方法。段階cにおける還元条件に、還元剤、例えば2メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトールおよびトリスホスフィンまたはその化学的誘導体からなる群より選択される還元剤の添加が含まれる、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。段階cが、150~600mV、例えば250~400mVの酸化還元電位による還元条件の下で行われる、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。段階cが、少なくとも25mMの2メルカプトエチルアミンの存在下にてまたは少なくとも05mMのジチオスレイトールの存在下にて少なくとも20°Cの温度で少なくとも90分間のインキュベーションを含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。段階dが、例えば脱塩による、還元剤の除去を含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。以下の段階を含む、所望の特性を有する二重特異性抗体の選択のための方法a第1セットの抗体が同一の第1のCH3領域を含む、異なる可変領域を有する抗体を含んだホモ二量体抗体の第1セットを提供する段階、b第2セットの抗体が同一の第2のCH3領域を含む、異なる可変領域または同一の可変領域を有する抗体を含んだホモ二量体抗体の第2セットを提供する段階、ここで該第1および第2のCH3領域の配列は異なり、かつ該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、cヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にするのに十分な還元条件の下で、該第1セットのおよび該第2セットの抗体の組み合わせをインキュベートする段階であって、かくして二重特異性抗体のセットを作出する、段階、d任意で条件を非還元条件に戻す段階、e得られた二重特異性抗体のセットを所与の所望の特性についてアッセイする段階、ならびにf所望の特性を有する二重特異性抗体を選択する段階。第2セットのホモ二量体抗体が異なる可変領域を有する、請求項63記載の方法。第2セットのホモ二量体抗体は同一の可変領域を有するが、抗原結合領域外に異なるアミノ酸または構造変化を有する、請求項63記載の方法。以下の段階を含む、ヘテロ二量体タンパク質を産生するための方法a第1のFc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1の核酸構築体を提供する段階、b第2のFc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2の核酸構築体を提供する段階、ここで該第1および第2のCH3領域の配列は異なり、かつ該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、かつここで該第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ該第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、405および407からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、かつまたはここで該第1および第2のCH3領域の配列は、CH3領域の各々のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記述のようにアッセイした場合、001~10マイクロモル、例えば005~10マイクロモル、より好ましくは001~5マイクロモル、例えば005~5マイクロモル、さらにより好ましくは001~1マイクロモル、例えば005~1マイクロモル、001~05マイクロモルまたは001~01マイクロモルであるようなものであり、c宿主細胞において該第1および第2の核酸構築体を共発現させる段階、ならびにd細胞培養物から該ヘテロ二量体タンパク質を得る段階。第1のCH3領域が位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のCH3領域が位置405にPhe、ArgもしくはGly以外などの、位置405にPhe以外のアミノ酸を有し、または第1のCH3領域が位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のCH3領域が位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerもしくはThr以外のアミノ酸を有する、請求項66記載の方法。第1および第2のポリペプチドが、異なるエピトープに結合する2つの抗体の全長重鎖である、請求項66または67記載の方法。段階cが、宿主細胞において軽鎖をコードする1つまたは複数の核酸構築体を共発現させる段階をさらに含む、前記請求項66~68のいずれか一項記載の方法。請求項2~58のいずれか一項または複数項の特徴をさらに含む、前記請求項66~69のいずれか記載の方法。請求項66~70のいずれか一項に特定されている核酸構築体を含む発現ベクター。請求項66~70のいずれか一項に特定されている核酸構築体を含む宿主細胞。前記請求項1~72のいずれか一項記載の方法によって得られたまたは得ることができるヘテロ二量体タンパク質。第1のFc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のポリペプチドと、第2のFc領域が第2のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のポリペプチドとを含むヘテロ二量体タンパク質であって、ここで該第1および第2のCH3領域の配列は異なり、かつ該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、かつここで該第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ該第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、405および407からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、かつまたはここで該第1および第2のCH3領域の配列は、CH3領域の各々のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記述のようにアッセイした場合、001~10マイクロモル、例えば005~10マイクロモル、より好ましくは001~5マイクロモル、例えば005~5マイクロモル、さらにより好ましくは001~1マイクロモル、例えば005~1マイクロモル、001~05マイクロモルまたは001~01マイクロモルであるようなものである、前記ヘテロ二量体タンパク質。第1のCH3領域が位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のCH3領域が位置405にPhe、ArgもしくはGly以外のような、位置405にPhe以外のアミノ酸を有し、または第1のCH3領域が位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のCH3領域が位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerもしくはThr以外のアミノ酸を有する、請求項73記載のヘテロ二量体タンパク質。第1および第2のポリペプチドが、異なるエピトープに結合する2つの抗体の全長重鎖である、請求項74または75記載のヘテロ二量体タンパク質。2つの全長軽鎖をさらに含む、請求項76記載のヘテロ二量体タンパク質。請求項2~58のいずれか一項または複数の項の特徴をさらに含む、前記請求項73~77のいずれか一項記載のヘテロ二量体タンパク質。医薬として用いるための、請求項74~78のいずれか一項記載のヘテロ二量体タンパク質。がんの処置で用いるための、請求項79記載のヘテロ二量体タンパク質。請求項74~78のいずれか一項記載のヘテロ二量体タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。請求項74~78のいずれか一項記載のヘテロ二量体タンパク質の、それを必要としている個体への投与を含む、腫瘍細胞の成長およびもしくは増殖を阻害するための、ならびにまたは腫瘍細胞の死滅化のための方法。発明の詳細な説明定義免疫グロブリンという用語は、2対のポリペプチド鎖、すなわち1対の低分子量軽鎖および1対の重鎖からなる構造的に関連した糖タンパク質のクラスをいい、これら4つは全てジスルフィド結合によって相互に結合している。免疫グロブリンの構造は十分に特徴付けられている。例えば、FundamentalImmunologyCh7を参照されたい。簡潔に説明すると、各重鎖は典型的に、重鎖可変領域および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は典型的に、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3から構成される。重鎖はいわゆるヒンジ領域におけるジスルフィド結合によって相互に結合している。各軽鎖は典型的に、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は典型的に、1つのドメイン、CLから構成される。典型的に、定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、KabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterest5thEdPublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthBethesdaMDに記述されているようにEUインデックスにしたがって行われる。図16は、抗体2F8の異なるアイソタイプ型に対するEUおよびKabat付番の概略を示す。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域と称されるより保存された領域が介在する相補性決定領域とも称される超可変性の領域に、さらに細分されうる。各VHおよびVLは典型的に、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置された、3つのCDRおよび4つのFRから構成されるも参照されたい。本明細書において用いられる場合、Fabアームという用語は1つの重鎖軽鎖対をいう。本明細書において用いられる場合、Fc領域という用語は、少なくともヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む抗体領域をいう。本発明との関連における抗体という用語は、少なくとも約30分、少なくとも約45分、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約8時間、少なくとも約12時間、約24時間もしくはそれ以上、約48時間もしくはそれ以上、約3、4、5、6、7日もしくはそれ以上などといったかなりの期間の、または任意の他の関連する、機能的に規定された期間の半減期を有して、典型的な生理的条件下で抗原に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそれらいずれかの誘導体をいう。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞、および補体活性化の古典的経路の第1成分であるC1qなどの補体系の成分を含む、宿主の組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介しうる。抗体はまた、二重特異性抗体、二特異性抗体、または類似の分子でもよい。二重特異性抗体という用語は、少なくとも2つの異なるエピトープ、典型的には非重複エピトープに対する特異性を有する抗体をいう。上記のように、本明細書における抗体という用語は、特に明記しない限りまたは文脈上明らかに矛盾しない限り、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片を含む。そのような断片は酵素的切断、ペプチド合成および組み換え発現技法のような、任意の公知の技法によって提供することができる。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片、例えばF2断片によって行われうることが示されている。抗体という用語は、特に明記しない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体などの抗体様ポリペプチドを含むこともまた、理解されるべきである。このようにして作出された抗体は、任意のアイソタイプを有しうる。本明細書において用いられる全長抗体という用語は、そのアイソタイプの抗体に通常見られる全ての重鎖および軽鎖の定常ドメインおよび可変ドメインを含む抗体をいう。本明細書において用いられる場合、アイソタイプとは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラスをいう。本明細書において用いられるヒト抗体という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含みうる。しかしながら、本明細書において用いられるヒト抗体という用語は、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含まないことが意図される。本明細書において用いられる場合、重鎖抗体という用語は、2つの重鎖だけからなり、抗体において通常見られる2つの軽鎖を欠く抗体をいう。例えばラクダ科の動物において天然に存在する、重鎖抗体は、VHドメインしか持たないにもかかわらず抗原に結合することができる。エピトープという用語は、抗体に特異的に結合しうるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常はアミノ酸または糖側鎖などの分子の表面基からなり、通常は特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。高次構造的エピトープと非高次構造的エピトープは、前者に対する結合は変性溶媒の存在下で失われるが、後者に対する結合は失われないという点で識別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、および特異的抗原結合ペプチドによって効果的に阻止されるアミノ酸残基のような、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含みうる。本明細書において用いられる場合、所定の抗原に対する抗体の結合との関連における結合という用語は典型的に、例えば、抗原をリガンドとしておよび抗体を分析物として用いて、BIAcore3000装置において表面プラズモン共鳴技術によって決定した場合の、約106Mもしくはそれ以下、例えば約107Mもしくはそれ以下、例えば約108Mもしくはそれ以下、例えば約109Mもしくはそれ以下、約1010Mもしくはそれ以下、または約1011Mもしくはさらにそれ以下のKDに対応する親和性での結合であり、所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的抗原に対する結合の親和性よりも、少なくとも10倍低い、例えば少なくとも100倍低い、例えば少なくとも1000倍低い、例えば少なくとも10000倍低い、例えば少なくとも100000倍低いKDに対応する親和性で、所定の抗原に結合する。親和性がより低い量は抗体のKDに依存し、それゆえ抗体のKDが非常に低い場合、抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性よりも低い量は少なくとも10000倍でありうる。本明細書において用いられるKDという用語は、特定の抗体抗原相互作用の解離平衡定数をいう。本明細書において用いられる場合、第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用という用語は、第1のCH3第2のCH3ヘテロ二量体タンパク質における第1のCH3領域と第2のCH3領域との間の相互作用をいう。本明細書において用いられる場合、第1のCH3領域と第2のCH3領域のホモ二量体相互作用という用語は、第1のCH3第1のCH3ホモ二量体タンパク質における第1のCH3領域と別の第1のCH3領域との間の相互作用、ならびに第2のCH3第2のCH3ホモ二量体タンパク質における第2のCH3領域と別の第2のCH3領域との間の相互作用をいう。本明細書において用いられる単離された抗体は、材料がその本来の環境から取り除かれていることを意味する。抗体が精製された形態であることも好都合である。精製されたという用語は、絶対的な純度を要するのではなく、むしろ、出発材料と比較した場合の、組成物中の夾雑物の濃度に対する抗体濃度の増加を示す、相対的な定義と意図される。本明細書において用いられる宿主細胞という用語は、発現ベクター、例えば本発明の抗体をコードする発現ベクターが導入された細胞をいうように意図される。組み換え宿主細胞は、例えば、CHO細胞、HEK293細胞、NS0細胞、およびリンパ球細胞のような、トランスフェクトーマを含む。本明細書において用いられる場合、2つまたはそれ以上の核酸構築体の共発現という用語は、単一の宿主細胞における2つの構築体の発現をいう。腫瘍細胞タンパク質という用語は、腫瘍細胞の細胞表面に位置するタンパク質をいう。本明細書において用いられる場合、エフェクタ細胞という用語は、免疫応答の認識期および活性化期とは対照的に、免疫応答のエフェクタ期に関与する免疫細胞をいう。例示的な免疫細胞には、骨髄性またはリンパ系起源の細胞、例えばリンパ球を含むT細胞など、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球などの多形核細胞、顆粒球、肥満細胞、および好塩基球が含まれる。一部のエフェクタ細胞は特定のFc受容体を発現し、特定の免疫機能を行う。いくつかの態様において、エフェクタ細胞は、抗体依存性細胞性細胞傷害を誘導しうるナチュラルキラー細胞のように、ADCCを誘導することができる。いくつかの態様において、エフェクタ細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食することができる。還元条件または還元環境という用語は、基質、ここでいう抗体のヒンジ領域内のシステイン残基が、酸化されるより還元された状態になる可能性が高い条件または環境をいう。ジスルフィド結合の異性化という用語は、異なるシステイン間のジスルフィド結合の交換、すなわちジスルフィド結合の再編成をいう。本発明のさらなる局面および態様上記のように、第1の局面において、本発明は、以下の段階を含む、ヘテロ二量体タンパク質を作出するためのインビトロの方法に関するaFc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンのFc領域を含む第1のホモ二量体タンパク質を提供する段階、bFc領域が第2のCH3領域を含む、免疫グロブリンのFc領域を含む第2のホモ二量体タンパク質を提供する段階、ここで該第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列は異なり、該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、cヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にするのに十分な還元条件の下で、該第1のタンパク質を該第2のタンパク質とともにインキュベートする段階、ならびにd該ヘテロ二量体タンパク質を得る段階。二重特異的な形式を多くの方法で用いて、二重特異性抗体の所望の組み合わせを作出することができる。非常に選択的な方法で異なる抗原を標的化する抗体を組み合わせられることに加え、それを使って、同じ抗原を標的化する2つの異なる抗体を組み合わせることにより、所望の特性を変化させる、例えばCDCを増大させることができる。さらに、それを使って、アンタゴニスト抗体の部分的アゴニスト活性を除去することができ、またはその二重特異性抗体を無関係の抗体で作出することによりアゴニスト抗体をアンタゴニスト抗体へ変換することができる。1つの態様において、ホモ二量体タンパク質は、Fc領域、抗体、受容体、サイトカインもしくはホルモンに融合されたFc領域のような、Fc領域を含む融合タンパク質、およびプロドラッグ、ペプチド、薬物もしくは毒素に結合されたFc領域からなる群より選択される。いくつかの態様において、第1およびまたは第2のホモ二量体タンパク質は、Fc領域に加えて、抗体の他の領域、すなわちCH1領域、VH領域、CL領域およびまたはVL領域の1つもしくは複数または全てを含む。したがって、1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は全長抗体である。別の態様において、第2のホモ二量体タンパク質は全長抗体である。重要な態様において、第1および第2のホモ二量体タンパク質はともに抗体であり、好ましくは全長抗体であり、異なるエピトープに結合する。そのような態様において、作出されるヘテロ二量体タンパク質は二重特異性抗体である。該エピトープは異なる抗原上にまたは同じ抗原上に位置することができる。しかしながら、他の態様において、ホモ二量体タンパク質の一方だけが全長抗体であり、もう一方のホモ二量体タンパク質は全長抗体ではない、例えば、受容体、サイトカインもしくはホルモンのような別のタンパク質もしくはペプチド配列とともに発現されるか、またはプロドラッグ、ペプチド、薬物もしくは毒素に結合される、可変領域のないFc領域である。さらなる態様において、ホモ二量体タンパク質のいずれも全長抗体ではない。例えば、どちらのホモ二量体タンパク質も、受容体、サイトカインもしくはホルモンのような別のタンパク質もしくはペプチド配列に融合されるか、またはプロドラッグ、ペプチド、薬物もしくは毒素に結合されるFc領域であることができる。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質のFc領域は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプのものであり、かつ第2のホモ二量体タンパク質のFc領域は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプのものである。好ましい態様において、第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質の両方のFc領域はIgG1アイソタイプのものである。別の好ましい態様において、ホモ二量体タンパク質のFc領域の一方はIgG1アイソタイプのものであり、もう一方はIgG4アイソタイプのものである。後者の態様において、得られるヘテロ二量体はIgG1のFc領域およびIgG4のFc領域を含み、したがってエフェクタ機能の活性化に関して興味深い中間の特性を有することができる。第1およびまたは第2のホモ二量体タンパク質が、Asn結合型グリコシル化のアクセプタ部位を取り除く変異を含むか、またはそうでなければグリコシル化の特性を変化させるように操作されるなら、類似の産物を得ることができる。さらなる態様において、例えばUS2009317869に記述のようにもしくはvanBerkeletalBiotechnolBioeng105350に記述のように、抗体産生中の培地への化合物の添加により、または例えばYamaneOhnukietalBiotechnolBioeng87614に記述のように、FUT8ノックアウト細胞の使用により、フコースを低減させ、したがってADCCを増強させるためにホモ二量体タンパク質の一方または両方を糖遺伝子操作する。あるいは、UmanaetalNatureBiotech17176により記述されている方法を用いてADCCを最適化することができる。さらなる態様において、例えばNatsumeetalCancerSci1002411に記述のように、補体活性化を増強するためにホモ二量体タンパク質の一方または両方を遺伝子操作した。さらなる態様において、新生児Fc受容体への結合を低減または増加させて、ヘテロ二量体タンパク質の血清中半減期を操作するために、ホモ二量体タンパク質の一方または両方を遺伝子操作した。さらなる態様において、ホモ二量体の出発タンパク質の一方がプロテインAに結合しないように遺伝子操作されており、したがって、産物をプロテインAカラムに通すことによって該ホモ二量体の出発タンパク質からヘテロ二量体タンパク質を分離することが可能になる。これは、過剰の一方のホモ二量体タンパク質が出発材料としてのもう一方のホモ二量体タンパク質に対して用いられる態様に特に有用でありうる。そのような態様において、プロテインAに結合する能力を緩めるように過剰にあるホモ二量体タンパク質を遺伝子操作することが有用でありうる。ヘテロ二量体化反応の後に、ヘテロ二量体タンパク質を次に、プロテインAカラムに通すことによって過剰の無交換ホモ二量体タンパク質から分離することができる。さらなる態様において、ホモ二量体タンパク質の一方はFc領域または無関係のエピトープを認識する全長抗体または体細胞超変異を受けておらず、自己抗原に結合しない生殖系列由来配列を含んだ全長抗体である。そのような態様において、ヘテロ二量体タンパク質は一価抗体として機能する。別の態様において、どちらのホモ二量体タンパク質も同じ重鎖を含むが、しかしホモ二量体タンパク質の一方しか、該重鎖と機能的な抗原結合部位を形成する軽鎖を含まず、もう一方のホモ二量体タンパク質は、該重鎖との組み合わせでいずれの抗原にも結合しない、非機能的な軽鎖を含む。そのような態様において、ヘテロ二量体タンパク質は一価抗体として機能する。そのような非機能的な軽鎖は、例えば、体細胞超変異を受けておらず、自己抗原に結合しない生殖系列由来配列であることができる。本発明のホモ二量体出発材料として用いられる抗体は、例えばKohleretalNature256495によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって産生されてもよく、または組み換えDNA法によって産生されてもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、ClacksonetalNature352624628およびMarksetalJMolBiol222581597において記述される技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。モノクローナル抗体は、任意の適当な供給源から得てもよい。このように、例えば、モノクローナル抗体は、関心対象の抗原によって免疫したマウスから得られたネズミ脾臓B細胞から調製されたハイブリドーマから、例として表面上に抗原を発現する細胞の形で、または関心対象の抗原をコードする核酸の形で得てもよい。モノクローナル抗体はまた、免疫したヒト、またはラット、イヌ、霊長類などのような非ヒト哺乳動物の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから得てもよい。本発明のホモ二量体出発材料として用いられる抗体は、例えばキメラ抗体またはヒト化抗体であってよい。別の態様において、任意の特定の変異を除けば、ホモ二量体出発タンパク質の一方または両方がヒト抗体である。ヒトモノクローナル抗体は、マウス免疫系ではなくヒト免疫系の部分を保有している、遺伝子導入マウスまたは染色体導入マウス、例えばHuMAbマウスを用いて作出することができる。HuMAbマウスは、内因性のμおよびκ鎖座を不活化する標的化変異とともに、非再配列ヒト重鎖およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ座を含有する。したがって、マウスはマウスIgMまたはκの発現の低減を示し、免疫に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞変異を受けて、高親和性のヒトIgGκモノクローナル抗体を作出する、前記:LonbergNHandbookofExperimentalPharmacology11349101、LonbergNandHuszarDInternRevImmunolVol136593、およびHardingFandLonbergNAnnNYAcadSci764536546において論評。HuMAbマウスの調製は、TaylorLetalNucleicAcidsResearch2062876295、ChenJetalInternationalImmunology5647656、TuaillonetalJImmunol15229122920、TaylorLetalInternationalImmunology6579591、FishwildDetalNatureBiotechnology14845851において詳細に記述されている。同様にUS5545806、US5569825、US5625126、US5633425、US5789650、US5877397、US5661016、US5814318、US5874299、US5770429、US5545807、WO9824884、WO9425585、WO931227、WO9222645、WO9203918、およびWO0109187を参照されたい。これらの遺伝子導入マウス由来の脾細胞を用いて、周知の技法によりヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作出することができる。さらに、本発明のヒト抗体または他の種由来の本発明の抗体は、当技術分野において周知の技法を用いて、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、哺乳動物ディスプレイ、およびその他の技法を含むがこれらに限定されないディスプレイ型の技術を通じて特定することができ、結果として得られる分子は、成熟の技法が当技術分野において周知であるので、親和性成熟などの、さらなる成熟に供することができる。本発明のさらなる態様において、抗体またはその部分、例えば1つまたは複数のCDRは、WO2010001251を参照されたいが、ラクダ科の種のもの、またはテンジクザメのような、軟骨魚類の種のもの、または重鎖もしくはドメイン抗体である。本発明の方法の1つの態様において、段階aおよびbにおいて提供される第1および第2のホモ二量体タンパク質は精製される。1つの態様において、第1およびまたは第2のホモ二量体タンパク質は薬物、プロドラッグもしくは毒素に結合されるか、またはそれらに対するアクセプタ基を含む。そのようなアクセプタ基は、例えば、非天然アミノ酸であってよい。上記のように、ホモ二量体出発タンパク質の第1および第2のCH3領域の配列は異なり、該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものである。1つの態様において、ホモ二量体相互作用の各々との比較でのヘテロ二量体相互作用の強度の増大は、共有結合、システイン残基または荷電残基の導入以外のCH3改変によるものである。いくつかの態様において、本発明の産物は非常に安定であり、インビトロの穏和な還元条件の下でまたは、重要なことには、ヒトへの投与によりインビボでFabアーム交換を受けない。したがって、1つの態様において、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用は、実施例13に記述した条件の下、05mMGSHでFabアーム交換が起こりえないようなものである。別の態様において、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用は、実施例14に記述した条件の下、マウスにおいてインビボでFabアーム交換が起こらないようなものである。別の態様において、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用は、例えば実施例30に記述のように決定した場合、2つのホモ二量体相互作用のうちで最も強いものよりも2倍を超えて強く、例えば3倍を超えて強く、例えば5倍を超えて強い。さらなる態様において、第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列は、実施例30に記述のようにアッセイした場合、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用の解離定数が005マイクロモル未満であるようなものである。さらなる態様において、第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列は、両方のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記述のようにアッセイした場合、001マイクロモルを超える、例えば005マイクロモルを超える、好ましくは001~10マイクロモル、例えば005~10マイクロモル、より好ましくは001~5マイクロモル、例えば005~5マイクロモル、さらにより好ましくは001~1マイクロモル、例えば005~1マイクロモル、001~05マイクロモルまたは001~01マイクロモルであるようなものである。ホモ二量体出発タンパク質が比較的安定である態様では、大量の出発タンパク質を産生することおよび例えば凝集または誤った折り畳みを回避することがさらに容易であるという利点を有することができる。いくつかの態様において、安定なヘテロ二量体タンパク質は、CH3領域の中にほんの少しの、かなり保存的な、非対称変異を含む2つのホモ二量体出発タンパク質に基づき本発明の方法を用いて高い収量で得ることができる。したがって、1つの態様において、第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列は、同一でない位置にアミノ酸置換を含む。アミノ酸置換は天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってよい。非天然アミノ酸の例は、例えば、XieJandSchultzPGCurrentOpinioninChemicalBiology9548554、およびWangQetalChemistryBiology16323336に開示されている。1つの態様において、アミノ酸は天然アミノ酸である。1つの態様において、野生型CH3領域との比較で、第1のホモ二量体タンパク質はCH3領域の中にたった1つのアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質はCH3領域の中にたった1つのアミノ酸置換を有する。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、その際に該第1のホモ二量体タンパク質および該第2のホモ二量体タンパク質は同じ位置では置換されない。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置366にアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質は、368、370、399、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有する。1つの態様において、位置366のアミノ酸は、Arg、Lys、Asn、Gln、Tyr、GluおよびGlyより選択される。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置368にアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質は、366、370、399、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有する。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置370にアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、399、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有する。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置399にアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有する。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置405にアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有する。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置407にアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、405および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有する。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、405および407からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有する。したがって、1つの態様において、第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列は非対称変異、すなわち2つのCH3領域における異なる位置での変異、例えばCH3領域の一方では位置405での変異およびもう一方のCH3領域における位置409での変異を含む。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、405および407からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有する。1つのそのような態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置405にPhe以外のアミノ酸を有する。このさらなる態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置405にPhe、ArgまたはGly以外のアミノ酸を有する。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置405にPheおよび位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置405にPhe以外のアミノ酸および位置409にLysを含む。このさらなる態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置405にPheおよび位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置405にPhe、ArgまたはGly以外のアミノ酸および位置409にLysを含む。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置405にPheおよび位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置405にLeuおよび位置409にLysを含む。このさらなる態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置405にPheおよび位置409にArgを含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置405にPhe、ArgまたはGly以外のアミノ酸および位置409にLysを含む。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置405にPheおよび位置409にArgを含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置405にLeuおよび位置409にLysを含む。さらなる態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、位置370にThrおよび位置405にLeuを含む。さらなる態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にArgを含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、位置370にThrおよび位置405にLeuを含む。さらなる態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置370にLys、位置405にPheおよび位置409にArgを含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、位置370にThrおよび位置405にLeuを含む。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置409にLysならびにa位置350にIleおよび位置405にLeu、またはb位置370にThrおよび位置405にLeuを含む。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にArgを含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置409にLysならびにa位置350にIleおよび位置405にLeu、またはb位置370にThrおよび位置405にLeuを含む。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置350にThr、位置370にLys、位置405にPheおよび位置409にArgを含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置409にLysならびにa位置350にIleおよび位置405にLeu、またはb位置370にThrおよび位置405にLeuを含む。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置350にThr、位置370にLys、位置405にPheおよび位置409にArgを含み、第2のホモ二量体タンパク質は位置350にIle、位置370にThr、位置405にLeuおよび位置409にLysを含む。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerまたはThr以外のアミノ酸を有する。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置407にAla、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、ValまたはTrpを有する。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置407にGly、Leu、Met、AsnまたはTrpを有する。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置407にTyrおよび位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerまたはThr以外のアミノ酸および位置409にLysを有する。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置407にTyrおよび位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置407にAla、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、ValまたはTrpおよび位置409にLysを有する。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置407にTyrおよび位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置407にGly、Leu、Met、AsnまたはTrpおよび位置409にLysを有する。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置407にTyrおよび位置409にArgを有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerまたはThr以外のアミノ酸および位置409にLysを有する。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置407にTyrおよび位置409にArgを有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置407にAla、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、ValまたはTrpおよび位置409にLysを有する。別の態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置407にTyrおよび位置409にArgを有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置407にGly、Leu、Met、AsnまたはTrpおよび位置409にLysを有する。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置368にPhe、LeuおよびMet以外のアミノ酸、または位置370にTrp、または位置399にAsp、Cys、Pro、GluもしくはGln以外のアミノ酸を有する。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にArg、Ala、HisまたはGlyを有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置368にLys、Gln、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Asn、Arg、Ser、Thr、ValもしくはTrp、または位置370にTrp、または位置399にAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、Trp、Phe、His、Lys、ArgもしくはTyrを有する。1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質は位置409にArgを有し、第2のホモ二量体タンパク質は位置368にAsp、Glu、Gly、Asn、Arg、Ser、Thr、ValもしくはTrp、または位置370にTrp、または位置399にPhe、His、Lys、ArgもしくはTyrを有する。上で指定したアミノ酸置換に加えて、第1および第2のホモ二量体タンパク質は野生型Fc配列と比べてさらなるアミノ酸置換、欠失または挿入を含むことができる。さらなる態様において、第1および第2のCH3領域は指定した変異を除けば、SEQIDNO1に記載される配列を含む。さらなる態様において、第1および第2のCH3領域は指定した変異を除けば、SEQIDNO2に記載される配列を含む。さらなる態様において、第1および第2のCH3領域は指定した変異を除けば、SEQIDNO3に記載される配列を含む。さらなる態様において、提供されるホモ二量体タンパク質は、LindhoferetalJImmunol15521によって記述されているように、好ましい対形成を示す、ラット抗体およびマウス抗体、または米国特許第5731168号に記述されているように、いわゆるノブインホール変種抗体でありうる。しかしながら、場合によっては、後者のホモ二量体出発タンパク質は、極めて弱いホモ二量体CH3CH3相互作用のため、産生することがより困難でありうる。したがって、位置350、370、405および409に変異を有する本明細書において記述の変種が好ましいこともある。ホモ二量体出発タンパク質のヒンジ領域の配列は変わることもある。しかしながら、得られるヘテロ二量体タンパク質は、ヒンジ領域がIgG4様でないなら、および、好ましくはIgG1様であるなら、ある状況下ではより安定でありうる。したがって、1つの態様において、第1のホモ二量体タンパク質と第2のホモ二量体タンパク質のどちらもヒンジ領域の中にCysProSerCys配列を含まない。さらなる態様において、第1のホモ二量体タンパク質と第2のホモ二量体タンパク質のどちらもヒンジ領域の中にCysProProCys配列を含む。第1および第2のホモ二量体タンパク質が抗体である多くの態様において、抗体は軽鎖をさらに含む。上で説明したように、軽鎖は異なってもよく、すなわち配列が異なり、それぞれが重鎖の一方だけと機能的な抗原結合ドメインを形成してもよい。しかしながら、別の態様において、第1および第2のホモ二量体タンパク質は重鎖抗体であり、これは抗原結合のために軽鎖を必要とせず、例えば、HamersCastermanNature363446を参照されたい。上記のように、本発明の方法の段階cは、ヒンジ領域中のシステインがジスルフィド結合の異性化を受けることを可能とするのに十分な還元条件の下で第1のタンパク質を第2のタンパク質とともにインキュベートする段階を含む。適当な条件の例が本明細書において示される。ヒンジ領域中のシステインがジスルフィド結合の異性化を受けるための最小必要要件は、ホモ二量体出発タンパク質に依って、特に、ヒンジ領域中の的確な配列に依って異なりうる。第1および第2のCH3領域の各ホモ二量体相互作用は、ヒンジ領域中のシステインが所与の条件の下でジスルフィド結合の異性化を受けることを可能とするのに十分に弱いことが重要である。1つの態様において、段階cにおける還元条件には還元剤、例えば2メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、グルタチオン、トリスホスフィン、Lシステインおよびβメルカプトエタノールからなる群より選択される還元剤、好ましくは、2メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトールおよびトリスホスフィンからなる群より選択される還元剤の添加が含まれる。1つの態様において、制御されたFabアーム交換を可能にする還元条件は、必要とされる酸化還元電位という観点から記述されている。トリペプチドグルタチオンは、細胞において主要な低分子量チオールであり、インビボでの通常の酸化還元シグナル伝達に不可欠な、チオールジスルフィド酸化還元状態を制御する。細胞の酸化還元バランスの動態は、還元型GSHおよびその酸化型GSSGのチオール対ジスルフィド状態の維持によって達成される。還元電位の値はRostandRapoportNature201185およびAslundetalJBiolChem2723078030786にあるように測定することができる。1つのGSSGにつき酸化される2つのGSHの化学量論を考慮する酸化還元電位Ehは、酸化還元状態の定量的尺度である。Ehはネルンストの式EhEOlnGSH2によって算出される。Eoは規定のpHでの酸化還元対の標準電位であり、Rは気体定数であり、Tは絶対温度であり、Fはファラデー定数であり、およびnは移動した電子の数である。GSHGSSG対のEhに対するインビボでの推算値は260~200mVの範囲である。最終分化した細胞はその結果、ほぼ200mV程度でEhを維持する一方で、活発に増殖している細胞はおよそ260mVのさらに低減したEhを維持する。DTTの標準的な酸化還元電位は330mVである。TCEPは溶液中でDTTを低減することが示されており、それゆえ、DTTよりも陰性の酸化還元電位を有する。しかしながら、正確な値は報告されていない。制御されたFabアーム交換条件を可能にする還元条件はそれゆえ、必要とされる酸化還元電位Ehという観点で記述することが可能であり、これはインビボの通常の血漿条件の下で達成される値を最適には下回り、ヒンジ領域に位置するかつ重鎖間ジスルフィド結合の形成に関わるもの以外の抗体ジスルフィド結合を低減する酸化還元電位を上回る。したがって、さらなる態様において、段階cは、50mVを下回る、例えば150mVを下回る、好ましくは150~600mV、例えば200~500mV、より好ましくは250~450mV、例えば250~400mV、さらにより好ましくは260~300mVに及ぶ酸化還元電位による還元条件の下で行われる。さらなる態様において、段階cは、少なくとも25mMの2メルカプトエチルアミンの存在下にてまたは少なくとも05mMのジチオスレイトールの存在下にて少なくとも20°Cの温度で少なくとも90分間のインキュベーションを含む。インキュベーションは5~8のpHで、例えばpH70でまたはpH74で行うことができる。さらなる態様において、段階dは、例えば還元剤の除去により、例えば脱塩により、非還元条件または低還元条件になるように条件を戻す段階を含む。いくつかの態様において、本発明の方法は、80超、例えば90超、例えば95超、例えば99超の抗体分子が所望の二重特異性抗体である抗体産物を生じさせる。産生後技術は、共発現に基づく先行技術の方法と比べて、より適応性があり、より制御が容易である。本明細書において開示される還元条件下でのFab交換により二重特異性抗体を作出することの産生後技術の特性によって、これは、二重特異性抗体の発見に向けた特異性の複数の組み合わせのスクリーニングに非常に適した戦略になる。さらに、共発現によって可能とされるよりも高いヘテロ二量体タンパク質の制御、適応性および収量を可能にするインビトロでの工程を研究室で行うことができる。この戦略のさらなる利点は、スクリーニングを最終の治療形式で行え、リード選択時の遺伝子操作の必要性をなくせるということである。上で説明したように、さらなる局面において、本発明の方法は、マトリックススクリーニングのために、すなわち、一方のセットが同一の第1のCH3領域を有し、かつもう一方のセットが同一の第2のCH3領域を有し、該第1および第2のCH3領域の配列は異なり、該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものである、二つのセットの抗体に基づき多数の異なる組み合わせの結合特異性を作出するために用いることができる。したがって、1つの態様において、本発明は、所望の特性を有するヘテロ二量体タンパク質の選択のための方法であって、以下の段階を含む該方法に関するaホモ二量体タンパク質が同一の第1のCH3領域を有する、Fc領域を含んだ第1セットのホモ二量体タンパク質を提供する段階、bホモ二量体タンパク質が同一の第2のCH3領域を有する、Fc領域を含んだ第2セットのホモ二量体タンパク質を提供する段階、ここで該第1および第2のCH3領域の配列は異なり、該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、cヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にするのに十分な還元条件の下で、該第1セットのおよび該第2セットのホモ二量体タンパク質の組み合わせをインキュベートし、かくして二重特異性抗体のセットを作出する段階、d任意で条件を非還元条件に戻す段階、e得られたヘテロ二量体タンパク質のセットを所与の所望の特性についてアッセイする段階、ならびにf所望の特性を有するヘテロ二量体タンパク質を選択する段階。1つの態様において、本発明は、所望の特性を有する二重特異性抗体の選択のための方法であって、以下の段階を含む該方法に関するa第1セットの抗体が同一の第1のCH3領域を含む、異なる可変領域を有する抗体を含んだホモ二量体抗体の第1セットを提供する段階、b第2セットの抗体が同一の第2のCH3領域を含む、異なる可変領域または同一の可変領域を有する抗体を含んだホモ二量体抗体の第2セットを提供する段階、ここで該第1および第2のCH3領域の配列は異なり、該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、cヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にするのに十分な還元条件の下で、該第1セットのおよび該第2セットの抗体の組み合わせをインキュベートし、かくして二重特異性抗体のセットを作出する段階、d任意で条件を非還元条件に戻す段階、e得られた二重特異性抗体のセットを所与の所望の特性についてアッセイする段階、ならびにf所望の特性を有する二重特異性抗体を選択する段階。1つの態様において、第2セットのホモ二量体抗体は異なる可変領域を有する。1つの態様において、第2セットのホモ二量体抗体は同一の可変領域を有するが、抗原結合領域外に異なるアミノ酸または構造変化を有する。2つのセットは必要に応じて多くの異なるやり方で構成することができる。したがって、2つのセットは同じ抗原上の同じエピトープまたは異なるエピトープを標的化してもよい。2つのセットはまた、異なる抗原を標的化してもよく、各セットは、問題の抗原上の同じエピトープまたは異なるエピトープに結合する抗体を含んでもよい。さらに、セットの一方またはセットの両方が、それぞれ、異なる抗原を標的化する抗体を含んでもよい。別の態様において、所望の特性は細胞死滅、細胞溶解、細胞増殖の阻害、または両方の抗原標的を発現する細胞への結合である。スクリーニング戦略にはさまざまな範囲の特異性を含んだ抗体ベクターの2つのパネルが含まれ、ここで1つのパネルは、もう1つのパネルの主鎖との還元条件下でのFabアーム交換に関わることができる主鎖へクローニングされる。例えば、第1のパネルをIgG1F405L主鎖へクローニングし、第2のパネルをIgG1K409R主鎖へクローニングする。抗体ベクターの2つのパネルの各成員を次に、小規模で個別に発現させる。例えば、全ての抗体ベクターをHEK293細胞に一過性にトランスフェクトし、24ウェルプレートに入れた培養物23mL中で発現させる。あるいは、当技術分野において公知の他の適当な産生系を用いることもできる。2つの抗体パネルの発現抗体を次に、等モルの比率にて縦横に対で混合する。例えば、全ての個々の抗体を小規模のプロテインAクロマトグラフィーによって精製し、抗体濃度を280nmの波長での吸光度によって測定する。あるいは、当技術分野において公知のタンパク質濃度を決定するための他の適当な精製方法を用いることもできる。別の態様において、発現培地によって下流の適用に影響がないなら、精製段階を省略することができる。その後、適当な容量に等モル量の両抗体が含まれるように抗体濃度を規準化する。例えば、100μlの64種の混合物に80μgmLの抗体Aおよび80μgmLの抗体Bが含まれるように、F405L主鎖における8種の抗体のパネルをK409R主鎖における8種の抗体と個別に混合する。あるいは、戦略のなかに二重特異性抗体特異的な下流の精製段階が含まれるなら、抗体量を規準化する段階を省略することもできる。抗体の混合物に、適当な量の還元剤を加え、許容温度で適当な時間インキュベートする。例えば、80μgmLの抗体Aおよび80μgmLの抗体Bを含有する100μlに、125mM2MEA25μlを加え、25°Cで終夜インキュベートする。還元剤をその後すぐに、混合物から除去して、ジスルフィド結合の酸化を促進し、スクリーニングアッセイ法における還元剤の妨害を回避する。例えば、ZebaSpin96ウェル脱塩プレートを用いて64種の混合物の緩衝液の交換を行うことにより、2MEAを除去する。あるいは、当技術分野において公知の還元剤を除去するのに適した他の方法を用いることができる。次に二重特異性抗体を生化学的にまたは機能的に特徴付けて、リード候補を特定する。例えば、64種の二重特異性抗体を適当な細胞株の増殖阻害または適当な細胞株への結合についてアッセイする。特定されたリード候補をその後、さらに大規模で産生し、さらに詳細に特徴付ける。共発現による産生本発明のヘテロ二量体タンパク質は、第1および第2のポリペプチドをコードする構築体の単一細胞における共発現によって得ることもできる。したがって、さらなる局面において、本発明は、以下の段階を含む、ヘテロ二量体タンパク質を産生するための方法に関するa第1のFc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1の核酸構築体を提供する段階、b第2のFc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2の核酸構築体を提供する段階、ここで該第1および第2のCH3領域の配列は異なり、該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、かつここで該第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、該第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、405および407からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、かつまたはここで該第1および第2のCH3領域の配列は、CH3領域の各々のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記述のようにアッセイした場合、001~10マイクロモル、例えば005~10マイクロモル、より好ましくは001~5マイクロモル、例えば005~5マイクロモル、さらにより好ましくは001~1マイクロモル、例えば005~1マイクロモル、001~05マイクロモルまたは001~01マイクロモルであるようなものであり、c宿主細胞において該第1および第2の核酸構築体を共発現させる段階、ならびにd細胞培養物から該ヘテロ二量体タンパク質を得る段階。プロモーター、エンハンサーなどを含む適当な発現ベクター、および抗体の産生に適した宿主細胞は当技術分野において周知である。宿主細胞の例としては、CHOまたはHEK細胞のような、酵母細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。この方法の1つの態様において、第1のCH3領域は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、第2のCH3領域は位置405にPhe以外のアミノ酸を有し、かつまたは第1および第2のCH3領域の配列は、CH3領域の各々のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記述のようにアッセイした場合、001~10マイクロモル、例えば005~10マイクロモル、より好ましくは001~5マイクロモル、例えば005~5マイクロモル、さらにより好ましくは001~1マイクロモル、例えば005~1マイクロモル、001~05マイクロモルまたは001~01マイクロモルであるようなものである。この方法の別の態様において第1のCH3領域は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、第2のCH3領域は位置405にPhe、ArgもしくはGly以外のアミノ酸などの、位置405にPhe以外のアミノ酸を有し、または第1のCH3領域は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、第2のCH3領域は位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerもしくはThr以外のアミノ酸を有する。いくつかの態様において、第1および第2のポリペプチドは、異なるエピトープに結合する2つの抗体の全長重鎖であり、かくしてヘテロ二量体タンパク質は二重特異性抗体である。この二重特異性抗体は重鎖抗体であることができ、または宿主細胞は、軽鎖をコードする1つまたは複数の核酸構築体をさらに発現してもよい。1つの軽鎖構築体しか重鎖構築体と共発現されないなら、機能的な二重特異性抗体は、軽鎖配列が重鎖の各々と機能的な抗原結合ドメインを形成できるようなものである場合に形成されるだけである。2つまたは複数の異なる軽鎖構築体が重鎖と共発現されるなら、複数の産物が形成されよう。さらなる態様において、本発明による共発現の方法は、上記のインビトロの方法の下で記述したさらなる特徴のいずれかを含む。さらなる局面において、本発明は、本明細書において上記に指定した第1および第2の核酸構築体を含む発現ベクターに関する。さらなる局面において、本発明は、本明細書において上記に指定した第1および第2の核酸構築体を含む宿主細胞に関する。ヘテロ二量体タンパク質さらなる局面において、本発明は、本発明の方法によって得られたまたは得ることができるヘテロ二量体タンパク質に関する。さらに、本発明の方法は、非対称分子、Fabアームの各々に関してもしくはCH3ドメインの各々に関して異なる特徴を有する分子、または分子全体に異なる改変を有する分子、例えば結合のために非天然アミノ酸置換を有する分子の形成を可能にする。そのような非対称分子は任意の適当な組み合わせで作出することができる。これをいくつかの非限定的な例によって以下でさらに例示する。二重特異性抗体を用いて、腫瘍細胞を含むがこれに限定されない、関心対象の標的細胞を前標的化することができる。標的細胞の前標的化は画像研究のためにまたは免疫治療の目的のために用いることができよう。本発明の方法の1つの態様において、二重特異性分子の第1のFabアームは、本明細書において記載される腫瘍細胞表面タンパク質の1つなどの、腫瘍細胞表面タンパク質または腫瘍細胞表面糖鎖のような、腫瘍細胞に結合し、第2のFabアームは、ペプチドまたはハプテンにカップリングまたは連結された放射標識を含むがこれに限定されない、放射性エフェクタ分子を認識する。そのような放射標識ペプチドの1例は、インジウム標識ジエチレントリアミン5酢酸であるvanSchaijketalClinCancerRes2005117230s7126s。別の例は、例えばテクネチウム99のような放射性核種を保有する重合体ミセルのナノ粒子、リポソームのようなハプテン標識コロイド粒子の使用である。別の態様において、毒素のようなハプテンにカップリングされた別の細胞増殖抑制分子が用いられる。本発明の方法のさらなる態様において、二重特異性分子の第1のFabアームは位置N297でグリコシル化され、二重特異性分子の第2のFabアームはグリコシル化されない。Fc領域における非対称グリコシル化はFcγ受容体との相互作用に影響を与え、C1qのような他のエフェクタ機能分子との相互作用に影響を及ぼすだけでなく、抗体の抗体依存性細胞性細胞傷害にも影響を及ぼす。本発明の方法の別の態様において、二重特異性分子の第1のFabアームは新生児Fc受容体FcRnと相互作用し、第2のFabアームは分子上のFcRn相互作用部位の変異により、例えばH435A変異の作出によりFcRnへの結合が損なわれている。本発明の方法の別の態様において、二重特異性分子の第1のFabアームは、抗体の精製のためによく用いられるブドウ球菌プロテインAおよび連鎖球菌プロテインGと相互作用し、二重特異性分子の第2のFabアームはプロテインAまたはGとの相互作用が損なわれている。結果として、ヘテロ二量体への交換後に残ったプロテインAまたはG結合障害のあるホモ二量体の量の除去は、プロテインAまたはGを用いた二重特異性分子の精製によって容易に得られる。別の態様において、Fcγ受容体またはFcRnのいずれかへの結合が、二重特異性分子の二つのFabアームの一方で改善または低減される。別の態様において、C1qへの結合が、二重特異性分子の二つのFabアームの一方で改善または低減される。別の態様において、分子の二つのFabアームの一方または両方で補体活性化を増強するようにタンパク質が遺伝子操作されている。別の態様において、二重特異性分子に存在するFabアームの各々が異なるIgGサブクラスに由来する。別の態様において、二重特異性分子に存在するFabアームの各々が異なるアロタイプ変異を保有する。別の態様において、別の部類の非対称免疫治療分子が免疫活性、刺激性または阻害性サイトカインによる二重特異性分子のFabアームの一方のFabの置き換えによって作出される。そのようなサイトカインの非限定的な例はIL2、IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFα、GCSF、GMCSF、IL10、IL4、IL6、IL13である。あるいは、因子またはホルモン刺激剤もしくは阻害剤が分子の中に含まれる。別の態様において、Fabアームの一方のFabが細胞溶解性ペプチド、すなわち、マゲイニン、メリチン、セクロピン、KLAKKLAKおよびその変種のような抗菌ペプチドを含むがこれらに限定されない、腫瘍細胞、細菌、真菌などを溶解できるペプチドまたは陽イオン性の細胞溶解性ペプチドによって置き換えられる。別の態様において、FabアームのFabの一方または両方をサイトカインおよびまたは増殖因子に対する受容体によって置き換え、いわゆるデコイ受容体を作出し、このうち、TNFαを標的化するエンブレルおよびVEGFを標的化するVEGFtrapが周知の例である。これらの二つのデコイ受容体を組み合わせて一つの分子にすることにより、単一のデコイ受容体に比べて優れた活性が示された。別の態様において、別の部類の非対称免疫治療分子が、二重特異性分子に存在するFabアームの一方または両方のN末端またはC末端への免疫活性、刺激性または阻害性サイトカインの融合によって作出される。これは二重特異性分子の抗腫瘍活性にプラスの影響を与えうる。しかしながら、以下のリストに限定されない、そのような分子の例は、IL2、IFNα、IFNβまたはIFNγ、TNFαである。あるいは、例えばGCSF、GMCSF、IL10、IL4、IL6またはIL13のような、サイトカインのN末端またはC末端融合は、二重特異性抗体分子エフェクタ機能にプラスの影響を与えうる。あるいは、因子またはホルモン刺激剤もしくは阻害剤がN末端またはC末端にて分子の中に含まれる。別の態様において、Fabアームの一方または両方での、例えばマゲイニン、メリチン、セクロピン、KLAKKLAKおよびその変種のような抗菌ペプチドなどの、細胞溶解性ペプチドまたは陽イオン性の細胞溶解性ペプチドのN末端またはC末端融合は、分子の活性を増強しうる。別の態様において、別の部類の非対称免疫治療分子は一価抗体、つまり選択の標的と一方のFabアームで相互作用する分子である。そのような分子において、二重特異性分子に存在するFabアームの一方は選択の標的分子に対して作製され、分子のもう一方のFabアームはFabを保有しないかまたはMetMabについて記述されているような非結合性非機能性Fabを有する。あるいは、第VIII因子および第IX因子について記述されているものなどの単量体Fc融合タンパク質を作出することができる。あるいは、上記の非対称分子のいずれかの組み合わせを本発明の方法によって作出することができる。さらなる局面において、本発明は、第1のFc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のポリペプチド、および第2のFc領域が第2のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質に関し、ここで該第1および第2のCH3領域の配列は異なり、該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、かつここで該第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、該第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、405および407からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、かつまたはここで該第1および第2のCH3領域の配列は、CH3領域の各々のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記述のようにアッセイした場合、001~10マイクロモル、例えば005~10マイクロモル、より好ましくは001~5マイクロモル、例えば005~5マイクロモル、さらにより好ましくは001~1マイクロモル、例えば005~1マイクロモル、001~05マイクロモルまたは001~01マイクロモルであるようなものである。1つの態様において、第1のCH3領域は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、第2のCH3領域は位置405にPhe以外のアミノ酸を有し、かつまたは第1および第2のCH3領域の配列は、CH3領域の各々のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記述のようにアッセイした場合、001~10マイクロモル、例えば005~10マイクロモル、より好ましくは001~5マイクロモル、例えば005~5マイクロモル、さらにより好ましくは001~1マイクロモル、例えば005~1マイクロモル、001~05マイクロモルまたは001~01マイクロモルであるようなものである。ヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のCH3領域は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、第2のCH3領域は位置405にPhe、ArgもしくはGly以外のような、位置405にPhe以外のアミノ酸を有し、または第1のCH3領域は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、第2のCH3領域は位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerもしくはThr以外のアミノ酸を有する。さらなる態様において、本発明によるヘテロ二量体タンパク質は産生方法のための上記のさらなる特徴のいずれかを含む。したがって、本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のポリペプチドは抗体、好ましくはヒト抗体の全長重鎖である。本発明のヘテロ二量体タンパク質の別の態様において、第2のポリペプチドは抗体、好ましくはヒト抗体の全長重鎖である。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1および第2のポリペプチドはともに、2つの抗体、好ましくはともに、異なるエピトープに結合するヒト抗体の全長重鎖であり、かくして得られるヘテロ二量体タンパク質は二重特異性抗体である。この二重特異性抗体は重鎖抗体、または重鎖に加えて、同一であってもまたは異なってもよい、2つの全長軽鎖を含む抗体でありうる。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のポリペプチドのFc領域は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプのものであり、第2のポリペプチドのFc領域は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプのものである。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドの両方のFc領域がIgG1アイソタイプのものである。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、ポリペプチドのFc領域の一方がIgG1アイソタイプのものであり、もう一方がIgG4アイソタイプのものである。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、ホモ二量体相互作用の各々との比較でのヘテロ二量体相互作用の強度の増大は、共有結合、システイン残基または荷電残基の導入以外のCH3改変によるものである。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、ヘテロ二量体タンパク質における第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間のヘテロ二量体相互作用は、実施例13に記述した条件の下、05mMGSHでFabアーム交換が起こりえないようなものである。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間のヘテロ二量体相互作用は、実施例14に記述した条件の下、マウスにおいてインビボでFabアーム交換が起こらないようなものである。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のCH3領域は位置405にPheおよび位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、第2のCH3領域は位置405にPhe以外のアミノ酸および位置409にLysを含む。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のCH3領域は位置405にPheおよび位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、第2のCH3領域は位置405にLeuおよび位置409にLysを含む。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のCH3領域は位置405にPheおよび位置409にArgを含み、第2のCH3領域は位置405にLeuおよび位置409にLysを含む。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のCH3領域は位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、第2のCH3領域は位置409にLysならびにa位置350にIleおよび位置405にLeu、またはb位置370にThrおよび位置405にLeuを含む。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のCH3領域は位置409にArgを含み、第2のCH3領域は位置409にLysならびにa位置350にIleおよび位置405にLeu、またはb位置370にThrおよび位置405にLeuを含む。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のCH3領域は位置350にThr、位置370にLys、位置405にPheおよび位置409にArgを含み、第2のCH3領域は位置409にLysならびにa位置350にIleおよび位置405にLeu、またはb位置370にThrおよび位置405にLeuを含む。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のCH3領域は位置350にThr、位置370にLys、位置405にPheおよび位置409にArgを含み、第2のCH3領域は位置350にIle、位置370にThr、位置405にLeuおよび位置409にLysを含む。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドのどちらもヒンジ領域の中にCysProSerCys配列を含まない。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドのどちらもヒンジ領域の中にCysProProCys配列を含む。本発明のヘテロ二量体タンパク質のさらなる態様において、第1およびまたは第2のポリペプチドが、Asn結合型グリコシル化のアクセプタ部位を取り除く変異を含む。標的抗原上で説明したように、本発明の重要な態様において、ヘテロ二量体タンパク質は、結合特異性が異なる、すなわち異なるエピトープに結合する2つの可変領域を含んだ二重特異性抗体である。原理上は、特異性の任意の組み合わせが可能である。上記のように、単一特異性抗体の制約のいくつかを克服するために二重特異性抗体を潜在的に用いることができる。考えられる単一特異性抗体の制約の1つは、抗体結合が望まれない他の細胞種での標的抗原の発現による、所望の標的細胞に対する特異性の欠如である。例えば、腫瘍細胞上に過剰発現される標的抗原が健常組織において発現されることもあり、これによって、その抗原に対して作製された抗体での処置により望ましくない副作用が起こりうる。標的細胞種上に排他的に発現されるタンパク質に対してさらなる特異性を有する二重特異性抗体は、腫瘍細胞への特異的結合を潜在的に改善することができよう。したがって、本発明の1つの態様において、第1および第2のエピトープは同じ細胞、例えば腫瘍細胞上に位置する。腫瘍細胞上の適当な標的は、限定されるものではないが、以下を含むerbB1、erbB2、erbB3、erbB4、MUC1、CD19、CD20、CD4、CD38、CD138、CXCR5、cMet、HERV外被タンパク質、ペリオスチン、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、CD37、EGFrvIII、L1CAM、AXL、組織因子、CD74、EpCAMおよびMRP3。腫瘍細胞標的の可能な組み合わせは、erbB1erbB2、erbB2erbB3、erbB1erbB3、CD19CD20、CD38CD34、CD4CXCR5、CD38RANKL、CD38CXCR4、CD20CXCR4、CD20CCR7、CD20CXCR5、CD20RANKL、erbB2AXL、erbB1cMet、erbB2cMet、erbB2EpCAM、cMetAXL、cMetTF、CD38CD20、CD38CD138を含むが、これらに限定されることはない。さらなる態様において、第1および第2のエピトープは同じ標的抗原上に位置することができ、ここで標的抗原上の二つのエピトープの位置は、一方のエピトープへの抗体の結合がもう一方のエピトープへの抗体の結合を妨害しないようなものである。このさらなる態様において、第1および第2のホモ二量体タンパク質は、同じ標的抗原上に位置する2つの異なるエピトープに結合するが、しかし標的細胞、例えば腫瘍細胞の死滅に対して異なる作用機序を有する抗体である。例えば、1つの態様において、標的抗原はerbB2であり、二重特異性抗体はペルツズマブおよびトラスツズマブの抗原結合部位を組み合わせる。別の態様において、標的抗原はerbB1であり、二重特異性抗体はザルツムマブおよびニモツズマブの抗原結合部位を組み合わせる。二重特異性抗体は、エフェクタ機構を疾患関連組織、例えば腫瘍に再標的化するためのメディエータとして用いることもできる。したがって、さらなる態様において、第1または第2のエピトープは腫瘍細胞タンパク質または腫瘍細胞糖鎖のような、腫瘍細胞上に位置し、他方のエピトープはエフェクタ細胞上に位置する。1つの態様において、エフェクタ細胞はT細胞である。エフェクタ細胞上の可能な標的には以下が含まれる単球およびマクロファージならびに活性化好中球上に発現されるFcgammaRIナチュラルキラーおよびマクロファージ上に発現されるFcgammaRIII循環T細胞上に発現されるCD3PMN、好酸球、単球およびマクロファージ上に発現されるCD89マクロファージ、好中球、好酸球上に発現されるCD32a好塩基球および肥満細胞上に発現されるFcεRI。1つの態様において、エピトープはT細胞上に発現されたCD3上に位置する。別の態様において、第1の抗体は病原微生物に対する結合特異性を有し、第2の抗体はCD3、CD4、CD8、CD40、CD25、CD28、CD16、CD89、CD32、CD64、FcεRIまたはCD1のような、エフェクタ細胞タンパク質に対する結合特異性を有する。さらに、二重特異性抗体を用いて化学療法剤を、薬剤が作用すべき細胞へさらに特異的に標的化することができる。したがって、1つの態様において、ホモ二量体タンパク質の一方は、小さな分子もしくはペプチドを認識するか、または例えばRaderetalPNAS1005396に記述されている原理にしたがい、そのような分子と共有結合を形成できる抗体である。本発明の方法のさらなる態様において、第1の抗体は腫瘍細胞または腫瘍細胞表面タンパク質、例えばerbB1、erbB2、erbB3、erbB4、EGFR3vIII、CEA、MUC1、CD19、CD20、CD4、CD38、EPCAM、cMet、AXL、L1CAM、組織因子、CD74またはCXCR5に対する結合特異性を有し、第2の抗体は毒素、薬物またはプロドラッグのような、化学療法剤に対する結合特異性を有する。二重特異性抗体は毒素、薬物もしくはプロドラッグを含有するベシクル、例えば高電子密度ベシクルまたはミニ細胞を腫瘍へ標的化するために用いることもできる。例えば、MacDiarmidetalNatureBiotech27643を参照されたい。ミニ細胞は、染色体DNAを含有しない、異常な細胞分裂の産物である染色体のない細胞である。したがって、別の態様において、第1または第2のエピトープは腫瘍細胞タンパク質または腫瘍細胞糖鎖のような、腫瘍細胞上に位置し、他方のエピトープは高電子密度ベシクルまたはミニ細胞上に位置する。さらに、二重特異性抗体の中に血清タンパク質に対する結合特異性を含めることによって抗体の血清中半減期を改変することができる。例えば、二重特異性抗体の中に血清アルブミンに対する結合特異性を含めることによって血清中半減期を引き延ばすことができる。したがって、本発明の方法のさらなる態様において、第1の抗体は腫瘍細胞または腫瘍細胞タンパク質、例えばerbB1、erbB2、erbB3、erbB4、MUC1、CD19、CD20、CD4、CD38、CD138、CXCR5、cMet、HERV外被タンパク質、ペリオスチン、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、CD37、EGFrvIII、L1CAM、AXL、組織因子、CD74、EpCAMまたはMRP3、CEAに対する結合特異性を有し、第2の抗体は血中タンパク質、例えば血清アルブミンに対する結合特異性を有する。第2の結合特異性を用いて特定組織、例えば中枢神経系または脳へ抗体を標的化することもできる。したがって、本発明の方法のさらなる態様において、第1の抗体は脳特異的な標的、例えばアミロイドβ、Her2、EGFr、NogoA、TRAIL、αシヌクレイン、Htt、プリオン、西ナイルウイルスタンパク質に対する結合特異性を有し、第2の抗体は血液脳関門タンパク質、例えばトランスフェリン受容体、インスリン受容体、メラノトランスフェリン受容体、ラクトフェリン受容体、アポリポタンパク質E受容体2、LDL受容体関連タンパク質1および2、高度グリコシル化最終産物の受容体、ジフテリア毒素受容体ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子、gp1901325に対する結合特異性を有する。血液脳関門タンパク質に対する結合特異性を用いて、別の非抗体分子を、特定組織、例えば中枢神経系または脳へ標的化することもできる。したがって、さらなる態様において、ホモ二量体タンパク質の一方は、血液脳関門タンパク質またはgp190のようなに対する結合特異性を有する全長抗体であり、もう一方のホモ二量体タンパク質はサイトカイン、可溶性受容体または他のタンパク質、例えばVIP、BDNF、FGF、複数のFGF、EGF、PNA、NGF、ニューロトロフィン3、NT45、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、ニュールツリン、ニューレグリン、インターロイキン、形質転換増殖因子α、TGFβ、エリスロポエチン、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、アルテミン、パーセフィン、ネトリン、カルジオトロフィン1、幹細胞因子、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形態形成タンパク質、サポシン、セマフォリン、白血球阻害因子、αLイズロニダーゼ、イズロン酸2スルファターゼ、Nアセチルガラクトサミン6スルファターゼ、アリールスルファターゼB、酸αグルコシダーゼまたはスフィンゴミエリナーゼのような、別のタンパク質にN末端またはC末端で連結されたFc領域である。さらに、第2の結合特異性を用いて、血液凝固因子を特定の所望の作用部位へ標的化することができる。例えば、腫瘍細胞に対する第1の結合特異性および血液凝固因子に対する第2の結合特異性を有する二重特異性抗体は、血液凝固を腫瘍に向け、かくして腫瘍増殖を停止させることができよう。したがって、本発明の方法のさらなる態様において、第1の抗体は腫瘍細胞または腫瘍細胞タンパク質、例えばerbB1、erbB2、erbB3、erbB4、MUC1、CD19、CD20、CD4またはCXCR5に対する結合特異性を有し、第2の抗体は組織因子のような、血液凝固に関わるタンパク質に対する結合特異性を有する。さらなる特に興味深い結合特異性の組み合わせには、CD3HER2、CD3CD20、IL12IL18、IL1aIL1b、VEGFEGFR、EpCAMCD3、GD2CD3、GD3CD3、HER2CD64、EGFRCD64、CD30CD16、NG2CD28、HER2HER3、CD20CD28、HER2CD16、Bcl2CD3、CD19CD3、CEACD3、EGFRCD3、IgECD3、EphA2CD3、CD33CD3、MCSPCD3、PSMACD3、TFCD3、CD19CD16、CD19CD16a、CD30CD16a、CEAHSG、CD20HSG、MUC1HSG、CD20CD22、HLADRCD79、PDGFRVEGF、IL17aIL23、CD32bCD25、CD20CD38、HER2AXL、CD89HLAクラスII、CD38CD138、TFcMet、Her2EpCAM、HER2HER2、EGFREGFR、EGFRcMet、cMet非結合性アームおよびGタンパク質共役受容体の組み合わせが含まれる。さらなる態様において、本発明による二重特異性抗体を用いて、本質的にはTayloretalJImmunol158842850およびTaylorandFergusonJHematother43573621995に記述されているように赤血球への標的化によって循環血液から病原体、病原性自己抗体または有害化合物、例えば毒液および毒素を除去することができる。第1のエピトープは、赤血球補体受容体1を含むがこれに限定されない、赤血球タンパク質上に位置し、第2のエピトープは、除去の標的とされる化合物または有機物上に位置する。さらなる態様において、第2のFabアームは、自己抗原または結合部位に当たる融合タンパク質を含み、dsDNAのような自己抗原を付着する。本発明の二重特異性抗体による病原体、自己抗体または有害化合物の標的化と、それに続く赤血球を介した除去はかくして、さまざまな疾患および症候群の処置において治療的有用性を持ちうる。結合本発明のさらなる態様において、第1およびまたは第2のホモ二量体タンパク質は、毒素、プロドラッグまたは薬物からなる群より選択される化合物に連結される。そのような化合物は、例えばがん治療において、標的細胞の死滅をさらに効果的にすることができる。得られるヘテロ二量体タンパク質はしたがって、免疫結合体である。化合物はあるいは、得られるヘテロ二量体タンパク質へ、すなわちFabアーム交換が行われた後に、カップリングされてもよい。本発明の免疫結合体を形成させるのに適した化合物は、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、プロカルバジン、マイトマイシンC、シスプラチンおよび他のプラチナ誘導体、例えばカルボプラチン、抗生物質、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン、ジフテリア毒素および関連分子、リシン毒素、コレラ毒素、志賀様毒素、LT毒素、C3毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆BowmanBirkプロテアーゼ阻害剤、緑膿菌外毒素、アロリン、サポリン、モデクシン、ゼラニン、アブリンA鎖、モデクシンA鎖、αサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリス阻害剤、ゼロニン、マイトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ならびにエノマイシン毒素を含む。他の適当な結合分子はリボヌクレアーゼ、DNaseI、ブドウ球菌エンテロトキシンA、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ジフテリン毒素、緑膿菌内毒素、メイタンシノイド、アウリスタチン、カリケアマイシンおよびズオカルマイシン類似体、ドラスタチン10、ドラスタチン15、イリノテカンまたはその活性代謝産物SN38、ピロロベンゾジアゼピンを含む。本発明のさらなる態様において、第1およびまたは第2のホモ二量体タンパク質は、トリウム227、ラジウム223、ビスマス212およびアクチニウム225を含むがこれらに限定されない、α放射体に連結される。本発明のさらなる態様において、第1およびまたは第2のホモ二量体タンパク質は、イオジウム313、イットリウム90、フッ素18、レニウム186、ガリウム68、テクネチウム99、インジウム111、およびルテチウム177を含むがこれらに限定されない、β放射性核種に連結される。別の態様において、結合される化合物は核酸または核酸関連分子を含む。本発明の1つのそのような様相において、結合される核酸は細胞毒性リボヌクレアーゼ、アンチセンス核酸、阻害RNA分子または免疫刺激核酸である。HunteretalNature144945、DavidetalBiochemistry131014、PainetalJImmunolMeth40219およびNygrenJHistochemandCytochem30407によって記述されている方法を含め、結合させるための当技術分野において公知の任意の方法を利用することができる。結合体は、他の成分をタンパク質のN末端側またはC末端側に化学的に結合させることによって作出することができるを参照のこと。そのような結合抗体誘導体は適切な場合、内部の残基または糖での結合によって作出されてもよい。薬剤が本発明のタンパク質に直接的にまたは間接的にカップリングされてもよい。第2の薬剤の間接的なカップリングの1例は、スペーサー部分によるカップリングである。薬物結合体の連結技術が最近、DucryandStumpBioconjugateChem215によって要約されている。組成物および使用さらなる主な局面において、本発明は、本明細書において記述の本発明によるヘテロ二量体タンパク質および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy19thEditionGennaroEdMackPublishingCoEastonPA1995に開示されているものなどの、従来技術にしたがって製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、例えば、希釈剤、増量剤、塩、緩衝液、界面活性剤、安定剤、保存剤、組織固定剤、可溶化剤、およびまたは薬学的組成物の中に含めるのに適した他の材料を含むことができる。薬学的に許容される担体には、本発明の化合物と生理学的に適合する任意のおよび全ての適当な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、抗酸化剤ならびに吸収遅延剤などが含まれる。本発明の薬学的組成物において利用されうる適当な水性および非水性担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオールが挙げられる。薬学的に許容される担体には、無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用の無菌の水溶液または分散液および無菌の粉末が含まれる。例えば、レシチンなどの、コーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および表面活性剤の使用によって適切な流動性を維持してもよい。本発明の薬学的組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウムなどのような、水溶性抗酸化剤パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、レシチン、プロピルガレート、αトコフェロールなどのような、油溶性抗酸化剤ならびにクエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような、金属キレート剤を含んでもよい。本発明の薬学的組成物はまた、糖、マンニトール、ソルビトール、グリセロールなどのポリアルコールまたは塩化ナトリウムのような、等張剤を組成物の中に含んでもよい。本発明の薬学的組成物はまた、薬学的組成物の有効期限または有効性を増強しうる、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、保存剤または緩衝液のような選択の投与経路に適した1つまたは複数のアジュバントを含むこともできる。本発明の化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤のような、化合物の速やかな放出を防ぐ担体で調製されてもよい。そのような担体は、ゼラチン、モノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリン、単独のもしくはロウと一緒のエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生体分解性で、生体適合性の重合体、または当技術分野において周知の他の材料を含むことができる。そのような製剤の調製のための方法は通常、当業者に公知である。無菌の注射可能な溶液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に、必要に応じて、例えば上に列挙した、1つの成分または複数の成分の組み合わせとともに組み入れ、引き続き精密ろ過滅菌することによって調製することができる。薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者にとって有毒ではないようにして、特定の患者、組成物、および投与様式に望まれる治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、利用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、利用される特定の化合物の排泄速度、処置の継続時間、利用される特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物およびまたは材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態および過去の病歴、ならびに医学分野において周知の同様な要因を含む、種々の薬物動態要因に依るであろう。薬学的組成物は任意の適当な経路および様式によって投与することができる。1つの態様において、本発明の薬学的組成物は非経口的に投与される。本明細書において用いられる非経口的に投与されるは、経腸および局所投与以外の、普通は注射による投与様式を意味し、これは表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含む。1つの態様において、薬学的組成物は、静脈内もしくは皮下注射または点滴により投与される。主な局面において、本発明は、医薬として用いるための、本発明による二重特異性抗体のような、本発明によるヘテロ二量体タンパク質に関する。本発明のヘテロ二量体タンパク質はいくつかの目的のために用いることができる。特に、上で説明したように、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、転移性がんおよび難治性がんを含む、さまざまな形態のがんの処置のために用いることができる。したがって、1つの局面において、本発明は、本明細書において記述の本発明によるヘテロ二量体タンパク質の、それを必要としている個体への投与を含む、腫瘍細胞の成長およびもしくは増殖を阻害するための、ならびにまたは腫瘍細胞の死滅化のための方法に関する。別の態様において、本発明のヘテロ二量体タンパク質は免疫疾患および自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、心血管疾患、CNSならびに筋骨格疾患の処置のために用いられる。上記の処置および使用の方法における投与量計画は、最適な所望の応答を提供するように調整される。例えば、単一の巨丸薬が投与されてもよく、時間をかけていくつかの分割用量が投与されてもよく、または治療状況の危急によって示されるように用量が比例的に低減もしくは増大されてもよい。ヘテロ二量体タンパク質に効率的な投与量および投与量計画は、処置される疾患または状態に依り、当業者によって判定されうる。本発明の二重特異性抗体の治療的有効量の例示的な、限定するものではない範囲は、約01~100mgkg、例えば約01~50mgkg、例えば約01~20mgkg、例えば約01~10mgkg、例えば約05mgkg、例えば約03mgkg、約1mgkg、約3mgkg、約5mgkg、または約8mgkgである。当技術分野における通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に判定および処方することができる。例えば、医師または獣医師は、薬学的組成物において利用されるヘテロ二量体タンパク質の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルから始めて、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができよう。一般に、本発明の組成物の適当な日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最小の用量である化合物の量であろう。投与は、例えば、静脈内、筋肉内または皮下のような、非経口の投与であってよい。本発明のヘテロ二量体タンパク質はまた、がんのような、疾患を発症するリスクを低減するために、疾患進行における事象の発生の始まりを遅延させるために、およびまたはがんのような疾患が寛解期にある場合には再発のリスクを低減するために予防的に投与することもできる。本発明の、二重特異性抗体のような、ヘテロ二量体タンパク質はまた、併用療法において投与することもでき、すなわち、処置される疾患または状態に適している他の治療剤と組み合わせることもできる。したがって、1つの態様において、ヘテロ二量体タンパク質を含有する医薬は、細胞毒性剤、化学療法剤または血管新生阻害剤のような、1つまたは複数のさらなる治療剤との組み合わせに向けられる。そのような併用投与は同時、別々または逐次であってよい。さらなる態様において、本発明は、がんのような、疾患を処置または予防するための方法であって、放射線治療およびまたは外科手術との組み合わせでの、本発明の二重特異性抗体のような、ヘテロ二量体タンパク質の治療的有効量の、それを必要としている対象への投与を含む該方法を提供する。本発明の、二重特異性抗体のような、ヘテロ二量体タンパク質はまた、診断目的で用いることもできる。実施例1ヒトIgG12F8およびIgG17D8の発現のための発現ベクターHuMab2F8およびHuMab7D8のVHおよびVLコード領域を、ヒトIgG1重鎖の産生のために発現ベクターpConG1fおよびκ軽鎖の産生のためにpConKappaにクローニングした。IgG4抗体の場合、VH領域をpTomG4ベクターに挿入した。あるいは、構築体の追跡的検討において、pEE124ベクターの中に重鎖またはpEE64ベクターの中にHuMab2F8もしくはHuMab7D8のヒトκ軽鎖の完全にコドン最適化されたコード領域を含有するベクターを用いた。実施例2ヒンジ欠失IgG12F8、ならびに特異的変異を含有するヒトIgG1およびIgG4CH2CH3断片の発現のための発現ベクター抗体重鎖のヒンジ領域およびCH3領域に変異を導入するために、Quickchange部位特異的突然変異誘発キットを製造元の推奨にしたがって用いた。あるいは、構築体を完全に合成し、またはVH領域を、特異的アミノ酸をコードする置換を既に含んだベクターにクローニングした。CH2およびCH3断片をコードする構築体を、PCRまたは完全合成により構築し、コドン最適化した。これらの構築体はN末端シグナルペプチドおよび6アミノ酸のHisタグを有し、ヒトIgG14定常領域のアミノ酸番号341447を含んだ。構築体をpEE124にクローニングした。ヒンジ欠失IgG1分子を構築するために、EGFR特異性を有するヒトIgG1アイソタイプのUniG1形式をコードする合成DNA構築体を作出した。この構築体において、天然のヒンジ領域を欠失させた。IgG1構築体において位置158でのSerからCysへの追加の変異を作出して、このサブタイプにおけるHC鎖とLC鎖との間のCys結合を利用した。タンパク質配列を以下に示す。構築体をpEE64ベクターに挿入し、pHG12F8と名付けた。実施例3アカゲザルIgG42F8およびIgG47D8の発現のための発現ベクター中国アカゲザルのIgG4重鎖およびκ軽鎖ならびにHumab2F8および7D8のVHおよびVL領域のコード領域を含有するベクターを合成し、完全にコドン最適化し、pEE124およびpEE64に挿入した。使われた重鎖定常領域の配列は、以下であった。使用したアカゲザルの軽鎖定常領域配列は以下であった。実施例4HEK293F細胞での一過性発現による抗体産生293fectinを製造元の使用説明書にしたがって用い、HEK293F細胞において関連する重鎖および軽鎖発現ベクターを同時にトランスフェクトすることにより、無血清条件の下で、抗体を産生した。実施例5IgG1およびIgG4抗体の精製IgG1およびIgG4抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。細胞培養上清を020μMのデッドエンドフィルタ上でろ過し、引き続いて5mLのプロテインAカラムに対する負荷および01Mクエン酸NaOHpH3によるIgGの溶出を行った。溶出液を2MTrisHClpH9ですぐに中和し、126mMリン酸ナトリウム140mMNaClpH74に対して終夜透析した。透析後、サンプルを020μMのデッドエンドフィルタ上で滅菌ろ過した。精製されたIgGの濃度を比濁法および280nmでの吸光度によって判定した。精製タンパク質をSDSPAGE、IEF、質量分析および糖分析によって分析した。実施例6CH2CH3断片の精製Hisタグ付きCH2CH3タンパク質を固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、PBSで平衡化されたPD10カラムを用いて脱塩し、02μMのデッドエンドフィルタ上でろ過滅菌した。精製タンパク質の濃度を280nmでの吸光度によって判定した。精製タンパク質の質をSDSPAGEによって分析した。実施例7ヒトIgG4抗体とアカゲザルIgG4抗体との間のGSH誘導性Fabアーム交換による二重特異性抗体の作出上記のように、WO2008119353では、二重特異性抗体が還元条件下でのインキュベーションにより2つの単一特異性IgG4抗体またはIgG4様抗体間のFabアームまたは半分子交換によって形成される、二重特異性抗体を産生するためのインビトロの方法が記述されている。このFabアーム交換反応は、単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖間ジスルフィド結合が還元され、結果として生じる遊離システインが、異なる特異性を有する別の抗体分子のシステイン残基と新しい重鎖間ジスルフィド結合を形成する、ジスルフィド結合の異性化反応の結果である。結果として生じる産物は、異なる配列を有する2つのFabアームを持つ二重特異性抗体である。ヒトIgG4抗体とアカゲザルIgG4抗体との間のFabアーム交換について試験するために、ヒトIgG42F8、ヒトIgG47D8、アカゲザルIgG42F8およびアカゲザルIgG47D8を用いて、二抗体の可能な全ての組み合わせを作出した。インビトロでのFabアーム交換のため、05mMの還元型グルタチオンを含むPBS05mL中4μgmLの終濃度で各抗体を含有する抗体混合物を37°Cで24時間インキュベートした。還元反応を停止させるために、PBS005Tween2005mLを反応混合物に加えた。サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ法を用いた二重特異性結合の判定により、二重特異性抗体の存在について試験した。ELISAプレートを4°CにてPBS中2μgmLのEGFRの組み換え細胞外ドメインで終夜コーティングした。プレートをPBSTで1回洗浄した。PBST02BSA中の抗体サンプルの希釈系列をコーティング済のELISAプレートに移入し、プレート振盪機にて、室温で60分間インキュベートした。サンプルを捨て、プレートをPBS005Tween20で1回洗浄した。次に、プレートをプレート振盪機上にて、PBTB中2μgmLのマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体2F2SAB11とともに60分間インキュベートした。プレートをPBS005Tween20で1回洗浄した。次に、プレートをプレート振盪機上にて、PBSTB中のHRP結合ヤギ抗マウスIgGとともにRTで60分間インキュベートした。プレートをPBS005Tween20で1回洗浄した。ABTSを加え、RTで30分間遮光してインキュベートした。反応を2シュウ酸で停止させた。RTで10分の後、405nmでの吸光度をELISAプレート読取機の中で測定した。図1は、ヒトおよびアカゲザルIgG4の組み合わせがその同じ種のIgG4分子の組み合わせの各々と比べてさらに高い二重特異性の結合を生じたことを示す。これらのデータは、Fabアーム交換がヒトIgG4とアカゲザルIgG4との間で行われることを示す。さらに、より高い二重特異性の結合は、ヒトIgG4半分子がアカゲザルIgG4半分子との選択的な二量体化を示し、50ヘテロ二量体と50ホモ二量体との確率的な交換に代えて二重特異性ヘテロ二量体の方へ移行するFabアーム交換反応の平衡をもたらすことを示唆している。実施例8ヒトおよびアカゲザルIgG4の配列分析抗体がFabアーム交換に関与する能力には、活性化されるのに還元環境しか必要とされない、いわゆる許容的なヒンジ領域に加えて第3の定常ドメインを要することが記述されている。ヒト抗体の場合、Fabアーム交換は、CH3ドメインにおける位置409のアルギニンおよび許容的なヒンジによって特徴付けられる、IgG4に固有の特徴であることが分かったを参照のこと。対照的に、Fabアーム交換に関与しないヒトIgG1は、位置409にリジンおよび安定なヒンジを有する。同じ種のIgG4分子間のFabアーム交換と比べてヒトIgG4とアカゲザルIgG4との間のFabアーム交換が高いことを解明しようとして、ヒトおよびアカゲザル抗体のコアヒンジおよびCH3CH3界面アミノ酸を分析したBiochemistry379266を参照のこと。図2は、中国アカゲザルIgG4におけるコアヒンジ配列が226CPAC229であること、およびCH3ドメインが位置409にリジンを含むことを示す。さらに、配列アライメントにより、アカゲザルIgG4がヒトIgG4と比べてCH3CH3界面におけるさらに3つのアミノ酸置換アカゲザルでは位置350にイソロイシンに対してヒトではスレオニンアカゲザルでは位置370にスレオニンに対してヒトではリジンおよびアカゲザルでは位置405にロイシンに対してヒトではフェニルアラニンにより特徴付けられることが示された。実施例9ヒトIgG4とアカゲザルIgG4CH3配列を含有するヒトIgG1との間のGSH誘導性Fabアーム交換を用いた二重特異性抗体の作出IgG1分子においてFabアーム交換を行わせるため、P228S置換によりIgG1コアヒンジ配列をヒトIgG4配列と交換することは影響がなかったこと、しかしFabアーム交換活性にはCH3をIgG4様の配列に変異させることが必要であったことがヒト抗体について記述されている。実施例7に記述されているヒトIgG4とアカゲザルIgG4との間のFabアーム交換に基づき、中国アカゲザルのIgG4CH3配列がヒトIgG1をFabアーム交換に関与させうるかどうか分析した。それゆえ、ヒンジ配列CPSCをもたらすP228S変異に加え、三重変異T350IK370TF405LをヒトIgG12F8に導入した。インビトロでのGSH誘導性Fabアーム交換のためにヒトIgG12F8変異体をヒトIgG47D8と組み合わせた。05mMGSHを有するPBS05mL中4μgmLの終濃度で各抗体を含有する抗体混合物を、37°Cで0~3~6~24時間インキュベートした。還元反応を停止させるために、PBS005Tween2005mLを反応混合物に加えた。ELISAにおける二重特異性結合の測定を実施例7に記述されているように行った。図3から、CPSCヒンジのみの導入では、ヒトIgG47D8と組み合わせた場合のGSH誘導性Fabアーム交換にヒトIgG12F8を関与させないことが確認される。また、アカゲザルIgG4特異的CH3界面アミノ酸のヒトIgG12F8への導入では、野生型IgG1ヒンジを保っていたとはいえ、これらの条件の下でヒトIgG47D8と組み合わせた場合のFabアーム交換への関与を生じなかった。対照的に、ヒンジ中のCPSC配列もアカゲザルIgG4特異的CH3界面アミノ酸もともに持つ変種ヒトIgG12F8主鎖配列は、2つのヒトIgG4抗体と比べてヒトIgG47D8とのGSH誘導性Fabアーム交換後に二重特異性結合の増大を示した。これらのデータは、CPSCを含んだヒンジが、位置350、370および405に、それぞれ、I、TおよびLを含んだCH3ドメインとの組み合わせで、ヒトIgG1をGSH誘導性Fabアーム交換に関与させるのに十分であること、ならびに交換反応の平衡がヒトIgG4と組み合わせた場合に、交換された二重特異性産物の方へ移行することを示す。実施例10ヒトIgG4とIgG1またはIgG4変異体との間のインビボでのFabアーム交換による二重特異性抗体の作出Fabアーム交換への関与に必要な特徴をさらに特定するために、ヒトIgG4およびIgG1変種をインビボで分析した。1群あたり4匹の雌性SCIDマウスに、300μLの総容量中600μgの抗体を含有する抗体混合物をiv注射した。注射から3、24、48および72時間後に伏在静脈から血液サンプルを採血した。血液をヘパリン含有バイアル中に集め、10000gで5分間遠心分離して細胞から血漿を分離した。実施例7に記述されているようにPBSTB中で連続希釈された血漿サンプルを用いELISAにてCD20およびEGFR二重特異性反応を評価することにより、二重特異性抗体の作出を追跡した。参照基準としてインビトロで交換された抗体混合物を用い、非線形回帰曲線適合により血漿サンプル中の二重特異性抗体を定量化した。図4は、ヒンジ配列またはCH3配列のどちらかがその対応するヒトIgG1配列に変換されているヒトIgG42F8が、インビボでもはやFabアーム交換に関与しないことを示す。逆に、ヒンジ領域もCH3界面配列もともにその対応するヒトIgG4配列に変換されているヒトIgG1は、インビボでFabアーム交換に関与することができる。これらのデータは、CPSCを含んだヒンジが位置409にアルギニンを含んだCH3ドメインとの組み合わせで、インビボでのヒトIgG1によるFabアーム交換を可能とするのに十分であることを示す。実施例112MEA誘導性Fabアーム交換安定化ヒンジの迂回破壊による二重特異性抗体の作出2メルカプトエチルアミンHClは、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を保ちながらも、抗体のヒンジ領域中のジスルフィド結合を選択的に切断することが記述されている温和な還元剤である。それゆえ、2MEAの濃度系列を、それが、CPSCまたはCPPCヒンジ領域を含んだ2つの抗体間のFabアーム交換による二重特異性抗体の作出を誘導する能力について試験した。05mgmLの終濃度で各抗体を含有する抗体混合物を、TE100μLの総容量中の2MEAの濃度系列とともに37°Cで90分間インキュベートした。還元反応を停止させるため、製造元の推奨にしたがいスピンカラムを用いてサンプルを脱塩することにより還元剤2MEAを除去した。実施例7に記述されているようにELISAにて二重特異性結合を測定した。2MEA誘導性Fabアーム交換を、CPSCヒンジ領域を含んだ、かつGSH誘導性Fabアーム交換に関与することが分かった、組み合わせIgG42F8×IgG47D8について、および安定化されたヒンジ領域によってGSH誘導性Fabアーム交換に関与しなかった組み合わせIgG12F8ITL×IgG47D8CPPCについて試験した。驚いたことに、2MEAは非還元SDSPAGEによって判定した場合に重鎖からの軽鎖の分離を誘導することが分かった。それにもかかわらず、図5に示されるように機能的な二重特異性抗体が作出された。野生型ヒトIgG42F8とIgG47D8との間のFabアーム交換後の二重特異性結合の最大レベルは、20mM2MEAの濃度で達成され、実施例9に記述されているように05mMGSHで達成されたレベルに匹敵していた。しかしながら、2MEAは用量依存的にヒト抗体IgG12F8ITLとIgG47D8CPPCとの間のFabアーム交換を誘導することができた。おそらく両抗体のヒンジ領域におけるCPPC配列の存在により、低い2MEA濃度では二重特異性抗体がほとんどまたは全く形成されなかったものの、より高い2MEA濃度では二重特異性抗体の作出は非常に効率的であった。最大の二重特異性結合は25mM2MEAで達成され、2つの野生型IgG4抗体間のFabアーム交換後の最大結合を超えた。これらの最大結合レベルは、CPSCヒンジを有する対応抗体のGSH処理について実施例9に記述されているものに匹敵していた。IgG12F8ITLおよびIgG47D8CPPCはともにCPPCヒンジを含むので、これらのデータは、2MEAがインビトロでのFabアーム交換のためのCPSCヒンジの要件を回避できたことを示唆する。実施例122MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性抗体の作出を追跡するための質量分析2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性抗体の作出は実施例11に記述されており、そこではELISAによって二重特異性結合が示された。二重特異性抗体が形成されることを確認するために、サンプルをエレクトロスプレイイオン化質量分析により分析して、分子量を決定した。最初に、PBS180μL中0005UのNグリカナーゼとともに37°Cで終夜、抗体200μgをインキュベートすることによりサンプルを脱グリコシル化した。サンプルを、BEH300C1817μm21×50mmのカラムの付いたAquityUPLCにて60°Cで脱塩し、005のギ酸を含有する、MQ水およびLCMS等級のアセトニトリルの混合液の勾配で溶出させた。飛行時間エレクトロスプレイイオン化質量スペクトルをmicrOTOF質量分析計に、陽イオンモードで動作させ、オンラインで記録した。分析の前に、500~4000mzのスケールをESチューニングミックスで較正した。DataAnalysisソフトウェアv34が備えられたMaximalEntropyを用いることにより、質量スペクトルをデコンボリュートした。この実験においてFabアーム交換に使われた抗体の分子量に基づき、二重特異性抗体を元の抗体と識別することができた。二重特異性抗体のピークについては、曲線下の面積を決定し、曲線下の総面積で除して、各サンプルにおける二重特異性抗体の割合を算出した。図6Aは、0mM2MEA、7mM2MEA、ならびに40mM2MEAでのIgG12F8ITLとIgG47D8CPPCとの間のFabアーム交換反応の代表的な3つの質量分析プロファイルを示す。二重特異性産物の均一なピークから、細分されたピークを生じたはずの、軽鎖の誤対合は起こらなかったことが示唆される。定量化されたデータは図6Bに提示されており、IgG12F8ITLとIgG47D8CPPCとの間のFabアーム交換がほぼ100の二重特異性抗体を生じたことを示す。対照的に、野生型IgG4抗体間のFabアーム交換は50未満の二重特異性産物を生じた。これらのデータは、実施例11に記述した二重特異性結合ELISAの結果を確認するものである。実施例132MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体の安定性2MEA誘導性のインビトロでのFabアーム交換により作出された二重特異性抗体の安定性を試験した。それゆえ、70mM2MEAでIgG12F8ITLおよびIgG47D8CPPCから作出された二重特異性サンプル2μgを、二重特異性試験サンプル2μgと比べて0倍、1倍、10倍、50倍過剰のIgG4MGに相当する、濃度系列の無関係なIgG4の存在下でGSH誘導性Fabアーム交換反応に用いた。この反応におけるFabアーム交換は二重特異性EGFRCD20結合の喪失を引き起こすであろう。GSH還元反応の条件は、実施例7に記述したのと同じであった。還元反応を停止させるために、PBSTB05mLを反応混合物に加えた。実施例7に記述されているようにELISAにて二重特異性結合を測定した。GSH還元反応後の二重特異性結合を、100に設定した、出発材料において測定された二重特異性結合と比べて提示する。図7Aは、IgG12F8ITL×IgG47D8CPPC由来の二重特異性サンプルについて、無関係なIgG4の存在下においてGSH誘導性Fabアーム交換の後にEGFRCD20二重特異性結合は著しく変化しないことを示す。これは、二重特異性産物が安定である、すなわち、GSH誘導性Fabアーム交換に関与しないことを示唆している。対照として、図7Bから、IgG42F8×IgG47D8由来のサンプルは無関係なIgG4の存在下においてGSH誘導性Fabアーム交換の後にEGFRCD20二重特異性結合の低下を示すことが示され、この産物が安定ではないことが示唆される。これらのデータから、CH3ドメインの中に三重変異T350IK370TF405Lを含んだヒトIgG1重鎖、および安定化されたヒンジを生ずるS228P置換を含んだヒトIgG4重鎖からなるヘテロ二量体が安定であることが示される。実施例142MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体の薬物動態および安定性のインビボ分析IgG12F8ITL×IgG47D8CPPC間のインビトロでの2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体をSCIDマウスに注射して、その安定性および薬物動態特性を親抗体のIgG12F8ITLおよびIgG47D8CPPCとの比較で分析した。3群のマウスの尾静脈に精製抗体200μL二重特異性抗体100μg二重特異性抗体100μg無関係なIgG41000μgIgG12F8ITL50μgIgG47D8CPPC50μgを静脈内注射した。血液サンプルを抗体投与後の所定の時間間隔で頬部穿刺により集めた。血液をヘパリン含有バイアル中に集め、14000gで10分間遠心分離した。血漿をさらなる分析の前に20°Cで保存した。血漿サンプル中の総IgG濃度をELISAによってアッセイした。続く段階のアッセイ条件は実施例7に記述したELISAの場合と同じであった。総IgG測定に用いた特定化合物は以下であった2μgmLのマウス抗ヒトIgGでコーティング血清サンプル希釈ならびに結合体HRP結合ヤギ抗ヒトIgG。血漿サンプル中の二重特異性抗体の存在を、実施例10に記述したようにELISAでのCD20およびEGFRの二重特異反応性によってアッセイし、定量化した。図8Aは総抗体血漿濃度を示す。血漿クリアランス曲線の形状は全ての群において同一であり、二重特異性抗体の血漿クリアランスが、分析した時間間隔にわたって親抗体IgG12F8ITLおよびIgG47D8CPPCの場合と同じであったことが示唆された。図8Bは経時的な二重特異性抗体の血漿濃度を示す。二重特異性抗体への10倍過剰の無関係なIgG4の添加は、二重特異性抗体濃度に影響を与えず、インビボでFabアーム交換が行われなかったことが示唆された。親抗体の注射後、二重特異性抗体は血漿中に検出できず、これらの抗体がインビボでFabアーム交換に関与しないことが確認された。これらのデータは、IgG12F8ITL×IgG47D8CPPC間のインビトロでの2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された、二重特異性抗体産物は、インビボにおいて安定であり、親の一価抗体と同程度の薬物動態特性を示したことを示唆している。実施例152つの抗体間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体の純度ヒトIgG12F8ITL×IgG47D8CPPC間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体のバッチをPD10脱塩カラムにて精製した。次に、二重特異性産物の純度をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、高性能サイズ排除クロマトグラフィーおよび質量分析によって分析した。作出された二重特異性抗体の機能性をELISAでの二重特異性結合によって確認した。改変したLaemliの方法6805を用い、サンプルを中性pHで泳動させ、4~12NuPAGEBisTrisゲルにて還元条件および非還元条件の下でSDSPAGEを行った。SDSPAGEゲルをクマシーで染色し、GeneGeniusを用いてデジタル処理画像を取得した。図9Aは、非還元ゲル上にて検出できる半分子がわずかであり、Fabアーム交換後の抗体サンプルがインタクトなIgGからなることを示す。HPSEC分画を、TSKHPSECカラムおよびWaters2487デュアルλ吸光度検出器に接続されたWatersAlliance2695分離装置を用いて行った。サンプルを1mL分で泳動させた。結果を、Empowerソフトウェア2002年版を用いて処理し、ピークごとに全ピーク高さの割合として表した。図9Bは、凝集体が実質的に形成されず、98超のサンプルがインタクトなIgGからなることを示す。実施例12に記述されているように質量分析を行った。図9Cは、出発材料IgG12F8ITLおよびIgG47D8CPPCならびにIgG12F8ITL×IgG47D8CPPC間のFabアーム交換により作出された二重特異性産物の質量分析プロファイルを示す。Fabアーム交換サンプルにおける産物は145901kDaであり、これは、IgG12F8ITLIgG47D8CPPCに由来する二重特異性産物と完全に適合する。さらに、二重特異性抗体産物は均一なピークを示し、細分されたピークを生じたはずの、軽鎖の誤対合は起こらなかったことを示唆していた。これらのデータは、Fabアーム交換が100の二重特異性抗体を生じたことを示す。IgG47D8CPPCおよび二重特異性サンプルの主要なピークに加えて検出された小さなピークは、1つまたは2つのC末端リジンの存在に起因しうる。これらのデータは、約100の機能的な二重特異性抗体サンプルがIgG12F8ITL×IgG47D8CPPC間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出されたことを示す。実施例16ヒトIgG1のFabアーム交換の関与のためのT350I、K370TおよびF405L置換の要件の解明IgG1がFabアーム交換に関与するために必要とされるIgG1CH3ドメインにおける決定基をさらに特定するために、三重変異T350IK370TF405Lを含むIgG1を、二重変異体T350IK370T、T350IF405LおよびK370TF405Lと比較した。また、単一変異体F405Lを試験した。2MEAを還元剤として用い、インビトロでのFabアーム交換を誘導した。単一変異体F405L抗体の場合、一過性トランスフェクションの上清由来の未精製抗体を、AmiconUltra遠心分離器具を用いてPBSへの緩衝液交換後に用いた。還元反応を停止させるため、実施例11に記述されているようにスピンカラムを用いてサンプルを脱塩することにより、還元剤2MEAを除去した。二重特異性抗体の作出は、実施例7に記述されているようにELISAにて測定された二重特異性結合により判定した。三重変異、二重変異ならびに単一変異をIgG12F8に導入した。これらの変異体を、37°Cで90分間25mM2MEAを用いたFabアーム交換のため、CPSCヒンジを含有するIgG47D8、または安定化されたヒンジを含有するIgG47D8と組み合わせた。図10A~Bは、IgG12F8IL変異体およびIgG12F8TL変異体が、組み合わされたIgG47D8に関係なく、三重変異体ITLと同じレベルまでFabアーム交換を示したことを示す。対照的に、IgG12F8IT変異体との組み合わせでは二重特異性結合が見られなかった。図10Cは、同様にIgG12F8F405L変異体が、組み合わされたIgG47D8に関係なく、Fabアーム交換を示したことを示す。これらのデータは、上記の条件の下でFabアーム交換にヒトIgG1を関与させるのにF405L変異で十分なことを示唆する。実施例17異なる温度での2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性抗体の作出2つの異なる抗体間のFabアーム交換による二重特異性抗体の作出を誘導する2MEAの能力を異なる温度で試験した。0°C、20°Cまたは37°CのいずれかでPBS25mM2MEA320μl中にてIgG47D8CPPC160μgとともにヒトIgG12F8ITL160μgをインキュベートすることにより、Fabアーム交換反応を開始した。これらの反応から、サンプル20μLをさまざまな時点で採取した。Zeba96ウェルスピン脱塩プレートを製造元の推奨にしたがって用いサンプルを脱塩することによって還元剤2MEAを除去する前にPBS20μlを各サンプルに加えた。NanodropND1000分光光度計を用い280nmの波長で吸光度を測定することにより、総抗体濃度を決定した。抗体サンプルの希釈系列を、実施例7に記述されているようにELISAにて用い、二重特異性結合を測定した。図11は、ヒトIgG12F8ITLとIgG47D8CPPCとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性抗体の作出が、45分後に最大の二重特異性結合に到達し、37°Cで最も効率的であることが分かったことを示す。室温で、二重特異性抗体の作出はいっそう低く、240分後に最大の二重特異性結合に到達した。0°Cで、分析した時間的経過の間に二重特異性結合の作出は認められなかった。実施例18さまざまな還元剤がインビトロでのFabアーム交換による二重特異性抗体の作出を誘導する能力の分析05mMGSHはインビトロでのFabアーム交換をヒトIgG4とIgG1CPSCITLとの間で誘導できるが、ヒトIgG4と安定なヒンジを含んだIgG1ITLとの間では誘導できないことが上記で示された。さらに、2MEAはIgG1ITL×IgG4CPPCのような、安定化されたヒンジ領域を有する抗体間のFabアーム交換を誘導できることが分かった。他の濃度のGSHもしくは2MEAまたは他の還元剤が2つの異なる抗体間のインビトロでのFabアーム交換を誘導できるかどうか試験するために、2MEA、GSHおよびDTTの濃度系列を試験した。それゆえ、PBS20μl中でヒトIgG12F8ITL10μgおよびIgG47D8CPPC10μgの組み合わせを、異なる還元剤の濃度系列とともに37°Cでインキュベートした。90分後、PBS20μlを各サンプルに加え、実施例17に記述されているようにスピン脱塩プレートを用いてサンプルを脱塩することにより還元剤を除去した。総抗体濃度を実施例17に記述されているように決定した。抗体サンプルの希釈系列を、実施例7に記述されているようにELISAにて用い、二重特異性結合を測定した。図12から、2MEAは25mM2MEAの濃度で最大の二重特異性結合を誘導することが確認される。DTTは、25mMDTTで最大の二重特異性結合に到達し、二重特異性抗体の作出において非常に有効であることが分かった。0~5mM範囲のGSH濃度では、安定化されたヒンジ領域をともに含んだ、IgG1ITL抗体とIgG4CPPC抗体との間のFabアーム交換による二重特異性抗体の作出を誘導することができなかった。より高いGSH濃度では、非還元SDSPAGEによって判定した場合に、抗体凝集体の形成が引き起こされた。それゆえ、これらのサンプルは分析から除外された。これらのデータは、2つの異なる抗体間のFabアーム交換による二重特異性抗体の作出をさまざまな還元剤によって誘導できることを示す。実施例19IgG1ITLとの組み合わせでの2MEA誘導性Fabアーム交換における関与のためのIgG1409位の決定基2MEAは実施例11に記述されているように、ヒトIgG1ITLとIgG4CPPCとの間のFabアーム交換を誘導することができる。ヒトIgG1およびIgG4のCH3界面残基は、位置409でだけ異なるIgG1ではリジンおよびIgG4ではアルギニン。それゆえ、位置409でのアルギニンまたは他の任意のアミノ酸によるリジンの置換が、IgG1をIgG1ITLとの2MEA誘導性Fabアーム交換に関与させられるかどうかについて試験した。PBS25mM2MEA20μl中でヒトIgG12F8ITL10μgおよびIgG17D8K409X10μgの組み合わせを、37°Cで90分間インキュベートした。一過性トランスフェクションの上清由来の未精製抗体を、AmiconUltra遠心分離器具を用いてPBSへの緩衝液交換後に用いた。Fabアーム交換反応の後に、PBS20μlを各サンプルに加え、実施例17に記述されているようにスピン脱塩プレートを用いてサンプルを脱塩することにより還元剤を除去した。抗体サンプルの希釈系列を、実施例7に記述されているようにELISAにて用い、二重特異性結合を測定した。図13Aは、IgG12F8ITL×IgG17D8K409X間の2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性結合の結果を示す。図13Bにおいては、交換が、100に設定した、IgG12F8ITLおよびIgG47D8CPPC間の2MEA誘導性Fabアーム交換に由来する二重特異性抗体の精製バッチに対しての二重特異性結合として提示されている。これらのデータをまた、表1に提示されているように、Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換または高いFabアーム交換としてスコア化した。IgG17D8における409位がK、LまたはMであった場合に、Fabアーム交換はないと認められた。Fabアーム交換は、IgG17D8における409位がF、I、NまたはYであった場合には中等であることが分かり、IgG17D8における409位がA、D、E、G、H、Q、R、S、T、VまたはWであった場合には高いことが分かった。表1IgG12F8ITL変異体とIgG17D8K409X変異体との間の2MEA誘導性Fabアーム交換IgG12F8ITL変異体とIgG17D8K409X変異体との間の2MEA誘導性のインビトロでのFabアーム交換後の二重特異性抗体の作出をサンドイッチELISAによって判定した。Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換、高いFabアーム交換。実施例20抗体脱グリコシル化は2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性抗体の作出に影響を与えないPBS180μL中0005UのNグリカナーゼとともに37°Cで終夜、抗体200μgをインキュベートすることによってIgG47D8およびIgG47D8CPPCサンプルを脱グリコシル化した。これらのサンプルをFabアーム交換反応において直接用いた。Fabアーム交換は、37°Cで90分間PBS25mM2MEA100μl中にて各抗体50μgをインキュベートすることにより行われた。実施例11に記述されているようにスピンカラムを用いてサンプルを脱塩することにより、還元剤2MEAを除去した。抗体サンプルの希釈系列を、実施例7に記述されているようにサンドイッチELISAにて用い、二重特異性結合を測定した。質量分析から、脱グリコシル化反応が100の脱グリコシル化抗体産物を生じることが示された。図14は、脱グリコシル化抗体を伴うFabアーム交換が、対応するグリコシル化抗体とのFabアーム交換とは異ならなかったことを示す。これらのデータは、脱グリコシル化が2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性抗体の作出に影響を与えなかったことを示唆する。実施例21非共有結合性CH3CH3相互作用の定量化CH3界面での相互作用の強度は、親抗体における両方の重鎖がFabアーム交換反応において解離すること、およびそれらがその後、ヘテロ二量体化反応において会合することが可能なようなものであるはずである。それゆえ、Fabアーム交換に関与する能力と非共有結合性CH3CH3相互作用の強度との間の相関関係を分析した。GSH誘導性Fabアーム交換を以下のヒト抗体の組み合わせについて実施例9に記述したように行った二重特異性抗体の作出を、実施例7に記述されているようにサンドイッチELISAでの二重特異性結合の判定により測定した。図15ABCは、Fabアーム交換反応後の二重特異性結合の結果を示す。上記のCH3変異がCH3CH3相互作用の強度に及ぼす影響を測定するために、CH2CH3ドメインのみから構成される断片を作出した。これらの断片におけるヒンジ領域の欠如により、共有結合性の重鎖間ジスルフィド結合が阻止された。断片を非変性質量分析によって分析した。10kDaMWCOのスピンフィルタカラムを用いて、サンプルを100mM酢酸アンモニウムpH7へ緩衝液交換した。連続希釈サンプルのアリコットをLCT質量分析計での分析のために金めっきのホウケイ酸キャピラリへ負荷した。単量体シグナルMsは、スペクトルにおける全ピーク面積の割合としての単量体ピーク面積、式中Ds二量体シグナルと定義した。平衡にある単量体の濃度Meqは、MSM0と定義し、式中M0は単量体を単位としての全タンパク質濃度である。平衡にある二量体濃度Deqは、2と定義した。次いでKDを、DeqvsMeq2のプロットの勾配から抽出した。非共有結合性のCH3CH3相互作用のKDを、表2に提示する。Fabアーム交換に関与する能力と非共有結合性CH3CH3相互作用の強度との間の相関関係を分析した。図15DEは、対応するCH2CH3断片の測定KDに対してプロットされたFabアーム交換後の二重特異性結合の割合を示す。これらのデータから、試験した条件の下で、効率的なFabアーム交換を可能にするCH3CH3相互作用の見掛け上のKD値の特定範囲があることが示唆される。表2非共有結合性CH3CH3相互作用のKD野生型IgG1またはIgG4の対応するCH2CH3断片と比較した実施例22さまざまな還元剤がIgG12F8F405LとIgG17D8K409Rとの間のインビトロでのFabアーム交換による二重特異性抗体の作出を誘導する能力についての分析2MEAおよびDTTは、ヒトIgG1ITLとIgG4CPPCとの間のインビトロでのFabアーム交換を誘導することが分かった。これらの還元剤が同様に、ヒトIgG12F8F405LとIgG17D8K409Rとの間のインビトロでのFabアーム交換を誘導できるかどうか試験した。2MEA、DTT、GSHおよびTCEPホスフィンの濃度系列を試験した。Fabアーム交換を実施例18に記述したように行った。試験した濃度系列のさまざまな還元剤は、次の通りであった00、004、01、02、05、10、50、250、500mMの2MEA、GSH、DTTまたはTCEP。図17から、2MEAが25mM2MEAの濃度で最大のFabアーム交換を誘導することが確認され、これはさらに高い500mM2MEAの濃度で持続した。DTTは、05mMDDTで最大のFabアーム交換に到達し、二重特異性抗体の作出において非常に有効であることが分かり、これもさらに高いDTT濃度にわたって持続した。同様に、TCEPは、05mMで最大のFabアーム交換に到達し、二重特異性抗体の作出において非常に有効であることが分かった。250mM以上の濃度で、TCEPによるFabアーム交換は妨害された。00~50mM範囲のGSH濃度では、Fabアーム交換による二重特異性抗体の作出を誘導することができなかった。さらに高いGSH濃度では、抗体凝集体の形成が引き起こされた。それゆえ、これらのサンプルは分析から除外された。これらのデータは、2つの異なる抗体間のFabアーム交換による二重特異性抗体の作出をさまざまな還元剤によって誘導できることを示す。実施例23IgG12F8F405LとIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性抗体の作出ヒトIgG12F8F405LとIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性抗体の形成を確認するために、2MEAの濃度系列によるFabアーム交換反応からのサンプルの分子量をESIMSによって決定した。試験した濃度系列は、次の通りであった00、05、10、20、50、70、100、150、250および400mMの2MEA。Fabアーム交換およびサンドイッチELISAを実施例11に記述したように行った。ESIMSは実施例12に記述したように行った。図18Aは、用量依存的にIgG12F8F405LとIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換が二重特異性抗体の作出を効率的にもたらし、150mM2MEAの濃度で二重特異性結合のレベルが最大になることを示す。定量化されたESIMSデータは、図18Bに提示されており、IgG12F8F405LとIgG17D8K409Rとの間のFabアーム交換がほぼ100の二重特異性抗体を生じたことを示し、二重特異性結合ELISAの結果を確認するものであった。実施例24ヒトIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体の純度ヒトIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換によって作出された、二重特異性抗体のバッチを、PD10脱塩カラムを用いて精製した。次に、二重特異性産物の純度を実施例12に記述したように質量分析によって分析した。図19は、出発材料IgG12F8F405LおよびIgG17D8K409RならびにIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間のFabアーム交換により作出された二重特異性産物の質量分析プロファイルを示す。Fabアーム交換サンプルにおける産物は1461607kDaであり、これは、IgG12F8F405L×IgG17D8K409Rに由来する二重特異性産物1464594kDaと適合する。さらに、二重特異性抗体産物は均一なピークを示し、細分されたピークを生じたはずの、軽鎖の誤対合は起こらなかったことを示唆していた。これらのデータは、Fabアーム交換がおよそ100の二重特異性抗体を生じたことを示す。実施例252MEA誘導性Fabアーム交換によりIgG12F8F405L×IgG17D8K409Rから作出された二重特異性抗体の安定性および薬物動態のインビボでの分析IgG12F8F405L×IgG17D8K409R間のインビトロでの2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体をSCIDマウスに注射して、実施例14に記述したようにその安定性および薬物動態特性を分析した。2群のマウスを分析した二重特異性抗体100μg二重特異性抗体100μg無関係なIgG41000μg。この例で、HRP結合ヤギ抗ヒトIgGを検出用の結合体として用いたことを除いては、実施例14に記述したようにELISAによって血漿サンプル中の総IgG濃度をアッセイした。血漿サンプル中の二重特異性抗体の存在を、実施例14に記述したようにサンドイッチELISAでのCD20およびEGFRの二重特異反応性によってアッセイし、定量化した。図20Aは経時的な総抗体血漿濃度を示す。血漿クリアランス曲線の形状は両群において同一であった。図20Bは経時的な二重特異性抗体の血漿濃度を示す。二重特異性抗体への10倍過剰の無関係なIgG4の添加は、二重特異性抗体濃度に影響を与えず、インビボでFabアーム交換が行われなかったことが示唆された。これらのデータは、IgG12F8F405L×IgG17D8K409R間のインビトロでの2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された、二重特異性抗体産物が、インビボにおいて安定であったことを示唆している。実施例26ヒトIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体によるCDC媒介性の細胞死滅CD20抗体IgG17D8は、補体依存性細胞傷害によってCD20発現細胞を効率的に死滅させることができる。対照的に、EGFR抗体IgG12F8は、EGFRを発現している標的細胞に対するCDCを媒介しない。変異体IgG17D8K409RおよびIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体が依然として、CD20発現細胞に対してCDCを誘導できるかどうか試験した。105個のDaudi細胞またはRaji細胞を、01BSAを補充したRPMI培地80μL中の抗体の濃度系列とともに室温にて振盪機中で15分間プレインキュベートした。正常ヒト血清20μLを補体の供給源として加え、37°Cで45分間インキュベートした。01BSAを補充した氷冷RPMI培地30μLを加えて、CDC反応を停止させた。10μgmLのヨウ化プロピジウム10μLを加え、FACS分析によって死細胞および生細胞を識別した。図21は、IgG17D8によるCD20発現Daudi細胞およびCD20発現Raji細胞のCDC媒介性の細胞死滅がK409R変異の導入によって影響を受けなかったことを示す。Daudi細胞もRaji細胞もEGFRを発現せず、IgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体の一価結合を引き起こす。それにもかかわらず、二重特異性抗体は依然として、CD20発現細胞のCDC媒介性の細胞死滅を誘導した。これらのデータから、親抗体のCDC能力が二重特異性の形式で維持されたことが示唆される。実施例27ヒトIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体によるADCC媒介性の細胞死滅EGFR抗体IgG12F8は抗体依存性細胞傷害により、A431のような、EGFR発現細胞を死滅させることができる。A431細胞はCD20を発現せず、それゆえ、CD20抗体IgG17D8はこれらの細胞に対してADCCを誘導しない。変異体IgG12F8F405LおよびIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体が依然として、A431細胞に対してADCCを誘導できるかどうか試験した。エフェクタ細胞の単離のため、Leucosep試験管を製造元の推奨にしたがって用い健常ドナーの全血から末梢血単核細胞を単離した。01BSAを補充したRPMI培地1mL中5×106個のA431細胞に100μCi51Crを加え、37°Cの振盪水浴中で60分間インキュベートすることによって、標的細胞を標識化した。標識細胞を洗浄し、01BSAを補充したRPMIに再懸濁した。01BSAを補充したRPMI中5×104個の標識された標的細胞を100μL中、抗体濃度系列とともに室温で15分間プレインキュベートした。ADCCアッセイ法は、エフェクタ細胞50μLをET比1001で加えることによって始めた。37°Cで4時間後、三つ組の実験からの51Cr放出をシンチレーションカウンタにてカウント毎分として測定した。以下の式特異的溶解の割合×100を用いて細胞毒性の割合を計算した。5TritonX10050μLを標的細胞50μLに加えることによって最大の51Cr放出を決定し、感作抗体およびエフェクタ細胞の非存在下において基礎放出を測定した。図22は、CD20特異抗体IgG17D8がCD20陰性A431細胞に対してADCCを誘導しなかったことを示す。IgG12F8も変異体IgG12F8F405LもともにA431細胞に対してADCCを誘導することが可能であり、IgG12F8におけるF405L変異の導入がそのADCCエフェクタ機能に影響を与えないことを示唆していた。また、IgG12F8F405L×IgG17D8K409Rに由来する二重特異性抗体はA431細胞に対してADCCを用量依存的に誘導し、ADCCエフェクタ機能が二重特異性の形式で維持されたことを示唆していた。実施例28IgG1K409Rとの組み合わせでの2MEA誘導性Fabアーム交換における関与のためのIgG1405位の決定基実施例16において、F405L変異はIgG47D8と組み合わせた場合、ヒトIgG1をFabアーム交換に関与させることを可能とするのに十分であることを記述した。ヒトIgG1K409Rとの組み合わせでの2MEA誘導性Fabアーム交換における関与のためのIgG1405位の決定基をさらに調べるために、可能な全てのIgG12F8F405X変異体をIgG17D8K409Rと組み合わせた。手順は実施例19に記述したように精製抗体で行った。図23は、IgG12F8F405X×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性結合の結果を示す。これらのデータをまた、表3に提示されているように、Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換または高いFabアーム交換としてスコア化した。IgG12F8における405位がFであった場合に、Fabアーム交換はないと認められた。Fabアーム交換は、IgG12F8における405位がGまたはRであった場合には低いことが分かった。Fabアーム交換は、IgG12F8における405位がA、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、WまたはYであった場合には高いことが分かった。これらのデータから、IgG1K409Rと組み合わせた場合にIgG1405位の特定の変異が、2MEA誘導性Fabアーム交換にIgG1を関与させることが示唆される。表3IgG12F8F405X変異体とIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換IgG12F8F405X変異体とIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性のインビトロでのFabアーム交換後の二重特異性抗体の作出をサンドイッチELISAによって判定した。Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換、高いFabアーム交換。実施例29IgG1K409Rとの組み合わせでの2MEA誘導性Fabアーム交換における関与のためのIgG1407位の決定基実施例28において、位置F405でのある種の単一の変異はIgG1K409Rと組み合わせた場合、ヒトIgG1をFabアーム交換に関与させることを可能とするのに十分であることを記述した。CH3ドメインにおけるFcFc界面の位置に関与する他の決定基が同様に、Fabアーム交換機構を媒介しえたかどうか調べるために、IgG1407位での突然変異誘発を行い、この変異体をヒトIgG1K409Rとの組み合わせでの2MEA誘導性Fabアーム交換における関与について調べた。可能な全てのIgG12F8Y407X変異体をIgG17D8K409Rと組み合わせた。手順は実施例19に記述したように精製抗体で行った。図24は、IgG12F8Y407X×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性結合の結果を示す。これらのデータをまた、表4に提示されているように、Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換または高いFabアーム交換としてスコア化した。IgG12F8における407位がY、E、K、QまたはRであった場合に、Fabアーム交換はないと認められた。Fabアーム交換は、IgG12F8における407位がD、F、I、SまたはTであった場合には低く、IgG12F8における407位がA、H、NまたはVであった場合には中等で、IgG12F8における407位がG、L、MまたはWであった場合には高いことが分かった。これらのデータから、IgG1K409Rと組み合わせた場合にIgG1407位の特定の単一の変異が、2MEA誘導性Fabアーム交換にIgG1を関与させることが示唆される。表4IgG12F8Y407X変異体とIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換IgG12F8Y407X変異体とIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性のインビトロでのFabアーム交換後の二重特異性抗体の作出をサンドイッチELISAによって判定した。Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換、高いFabアーム交換。実施例30IgG1ヘテロ二量体における非共有結合性のCH3CH3相互作用の定量化効率的なFabアーム交換を可能にするCH3CH3ホモ二量体の相互作用の強度には特定の範囲があることを実施例21において記述した。CH3界面での相互作用の強度は、親抗体における両方の重鎖がFabアーム交換反応において解離すること、およびそれらがその後、ヘテロ二量体化反応において会合することが可能であるようなものでなければならない。安定なヘテロ二量体を作出するためには、ヘテロ二量体相互作用の強度は、ホモ二量体相互作用の強度よりも高くなければならず、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化に有利に働くようなものでなければならない。これを確認するために、ヘテロ二量体におけるCH3CH3相互作用の強度を測定し、ホモ二量体における強度と比較した。IgG1K409R、IgG1F405LおよびIgG1ITLホモ二量体に由来するCH2CH3断片のKDを実施例21に記述したように測定した。ヘテロ二量体におけるKDの決定のため、CH2CH3ドメイン断片を、ヒンジを除く全ての抗体ドメインを含むIgG17D8K409RのIgG1Δヒンジ断片と混合した。両方の断片におけるヒンジ領域の欠如によって、共有結合性の重鎖間ジスルフィド結合が阻止された。断片を混合し、実施例21に記述したように非変性質量分析によって24時間後に分析した。表示されているCH2CH3断片またはIgG1Δヒンジを有するCH2CH3断片の混合物における非共有結合性のCH3CH3相互作用のKD値を表5に提示する。これらのデータから、試験した条件の下で、ヘテロ二量体相互作用の強度は、対応するホモ二量体相互作用よりも高いであることが示唆される。表5実施例312MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体の生化学分析ヒトIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体のバッチをPD10脱塩カラムにて精製した。次に、二重特異性産物の純度をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、高性能サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、HPLC陽イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー等電点分画によって分析した。SDSPAGEは実施例15に記述したように非還元条件および還元条件の下で行った。図25Aは、非還元ゲル上にて検出できる半分子がわずかであり、2MEA誘導性Fabアーム交換後の抗体サンプルがインタクトなIgGからなることを示す。HPSECは実施例15に記述したように行った。図26および図26は、それぞれ、出発材料IgG12F8F405LおよびIgG17D8K409RのHPSECプロファイルを示す。両抗体の混合物およびIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性産物を、それぞれ、図26Cおよび図26Dに示す。さらに、図26Dは、凝集体が実質的に形成されず、99超のサンプルがインタクトなIgGからなることを示す。実施例12に記述されているように質量分析を行った。図27および図27は、それぞれ、出発材料IgG12F8F405LおよびIgG17D8K409Rの質量分析プロファイルを示す。両抗体の混合物およびIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性産物を、それぞれ、図27Cおよび図27Dに示す。2MEA誘導性Fabアーム交換サンプルにおける産物は1461597kDaであり、これは、IgG12F8F405L×IgG17D8K409Rに由来する二重特異性産物と完全に適合する。さらに、二重特異性抗体産物は均一なピークを示し、細分されたピークを生じたはずの、軽鎖の誤対合は起こらなかったことを示唆していた。これらのデータは、2MEA誘導性Fabアーム交換が二重特異性IgGを生じたことを示す。で示される小さなピークは、分析の前の不完全な脱グリコシル化から生じた。これらのデータは、二重特異性抗体サンプルがIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出されたことを示す。キャピラリー等電点分画はiCE280分析機を用いて行った。図28Aおよび図28Bは、それぞれ、出発材料IgG12F8F405LおよびIgG17D8K409RのcIEFプロファイルを示す。両抗体の混合物およびIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間のFabアーム交換により作出された二重特異性産物を、それぞれ、図28Cおよび図28Dに示す。全てのサンプルを使用の前に脱塩した。アッセイ混合物における終濃度は03mgmLIgGであった。等電点分画を3000Vで7分間行い、全キャピラリー吸収像を電荷結合素子カメラによって捕捉した。ピークプロファイルの較正の後、データをEZChromソフトウェアによって解析した。pIマーカーをで示す。これらのデータは、二重特異性抗体サンプルがIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出されたことを示す。モノクローナル抗体の荷電アイソフォームを調べるための別の技術は、高圧液体クロマトグラフィー陽イオン交換である。図29Aおよび図29Bは、それぞれ、出発材料IgG12F8F405LおよびIgG17D8K409RのHPLCCIEXプロファイルを示す。両抗体の混合物およびIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性産物を、それぞれ、図29Cおよび図29Dに示す。サンプルをHPLCに注入するために、移動相A中で1mgmLに希釈した。ProPacWCX104mm×250mmの分析カラムを1mL分の流速で用いることにより、差次的に荷電されたIgG分子を分離した。移動相Aから移動相Bの勾配で溶出を行い、280nmで検出を行った。これらのデータは、二重特異性抗体サンプルがIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出されたことを示す。陽イオン交換がヘテロ二量体から残りのホモ二量体を分離するための強力なツールであることも示す。陽イオン交換クロマトグラフィーの別の用途はそれゆえ、二重特異性ヘテロ二量体の最終精製、すなわち、交換後に残存する任意のホモ二量体を精製除去することである。実施例32両ホモ二量体の同時共発現によるヘテロ二量体の組み換え発現2つのホモ二量体が組み換えによって共発現される場合にヘテロ二量体形成も行われることを例証するために、IgG17D8K409RおよびIgG12F8F405の重鎖および軽鎖をコードする4つの発現ベクターを1111の比率でHEK293F細胞に同時にトランスフェクトした。抗体を実施例4に記述したように無血清条件の下で一過性に産生させた。次に、IgGを実施例5に記述したようにプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。精製したIgGを脱グリコシル化し、その後、実施例12に記述したようにエレクトロスプレイイオン化質量分析によって分析した。IgG17D8K409RおよびIgG12F8F405の重鎖および軽鎖の理論的質量を表6に示す。表6IgG17D8K409RおよびIgG12F8F405の重鎖および軽鎖の理論的質量これらの質量に基づいて、以下のIgG分子を理論的に検出することができた。測定した質量を最終列に示す。表7IgG17D8K409RおよびIgG12F8F40の重鎖および軽鎖の理論的検出146345Daおよび146159Daの2つの最も豊富なピークは、それぞれ、片方の軽鎖または両方の軽鎖が組み入れられたヘテロ二量体に相当していた。IgG17D8K409RまたはIgG12F8F405の両重鎖のホモ二量体が検出されたが、少量でしかなかった。これらのデータは、2つのホモ二量体が共発現される場合にもヘテロ二量体化が起こることを示す。実施例332MEA誘導性Fabアーム交換の動態のモニタリングおよびHPLCCIEXの使用による交換後に残存するホモ二量体の定量化2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性抗体の作出を実施例11に記述した。この実施例においては、交換反応中のさまざまな時点で高圧液体クロマトグラフィー陽イオン交換を行うことによって交換反応をモニタリングした。ホモ二量体IgG12F8F405LおよびIgG17D8K409Rを、各1mgmLの濃度でモル比11にて混合した。25mM2MEAの添加後、サンプルを、25°Cで予め加温された、HPLCオートサンプラの中に置いた。図31A~31Hは2MEA添加後の、それぞれ、t0分~t450分に及ぶHPLCCIEXにより得られた異なる時間間隔での8つの連続注入を示す。このデータから、二重特異性IgGがかなり迅速に形成され、ホモ二量体の大部分が135分後に交換されたことが示される。45分後に現れている不均一なヘテロ二量体ピークは、およそ180分後にいっそう均一なピークに分解し、異なる相で交換が行われていることを示唆していた。さらに、図32Aは、およそ3の残存ホモ二量体がCIEX法で検出されたことを示す。示したように、この方法は、交換反応がほぼ完了した時点で残存しているホモ二量体の含量を定量化するのに適している。実施例34さまざまな2MEA濃度、温度およびインキュベーション時間で、高い抗体濃度での2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性抗体の作出2MEA誘導性Fabアーム交換を高いIgG濃度で行った。交換の量に及ぼす2MEA濃度、インキュベーション温度および時間の影響について調べた。IgG17D8K409R×IgG12F8F405Lの組み合わせを用いて交換過程を行った。プロテインAを用いたアフィニティークロマトグラフィーで両材料を精製した。材料を20mgmL超にまで濃縮した後に、HiPrepQFF1610を用いて連続的な陰イオン交換段階を行った。最終精製した材料をPBSへ緩衝液交換した。二重特異性交換をPBS中20mgmLおよび10mgmLの最終IgG濃度で調べた。10、25、50および100mMの終濃度で2MEAを含む両方のIgG濃度用に別個の混合物を調製した。混合物をエッペンドルフ試験管中、100μlのアリコットに分け、15、25および37°Cで保存した。各温度で90分、5時間および24時間の異なるインキュベーション時間用に別個の試験管を用いた。また、混合物を両方のIgG濃度用に2MEAなしで調製し、未処理対照として4°Cで保存した。適切なインキュベーション時間の後、90分および5時間のサンプルを脱塩用に収集して、2MEAを除去した。Zeba96ウェル脱塩プレートを用いてサンプルを脱塩した。24時間のサンプルは24時間のインキュベーション後に別個に脱塩した。抗体サンプルの連続希釈液をサンドイッチELISAにて用い、実施例7に記述したように二重特異性結合を測定した。プレートごとに、IgG12F8ITLとIgG47D8CPPCとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換に由来する二重特異性抗体の精製バッチの対照を含めた。図34~は、個々のELISAプレートにおいて測定された二重特異性結合の結果を示す。最も高いOD405値を用い、100に任意設定された、対照との比較で二重特異性結合を計算した。これにより、各2MEA濃度に対して図34~に示されているように対照と比べて制御されたFabアーム交換の割合が得られた。データから、二重特異性結合の最大レベルに、全ての温度時間条件で両方のIgG濃度に対して100mM2MEAの濃度で到達したことが示される。50mM2MEAで、最大の結合に、25°Cおよび37°Cで、ならびにまた24時間のインキュベーション後には15°Cで到達した。25mMおよび10mM2MEAのさらに低い濃度の場合、交換は、より高い温度でより効率的であって、インキュベーション時間の延長で増大し、25mM2MEAの24時間のインキュベーションによって37°Cで最大の交換に至った。10mM2MEAで試験した条件のどれでも100の二重特異性産物は作出されなかった。交換過程は20mgmLの総IgGと比べて10mgmLのIgG濃度でわずかに速かった。二重特異性抗体が形成されたことを確認するために、および二重特異性産物をより詳細に調べるために、サンプルを陽イオン交換分析で分析した。5時間および24時間のインキュベーション後20mgmLのIgG濃度ならびに全ての2MEA濃度でサンプルに対して実施例31に記述したようにHPLCCIEX分析を行った。図35~中のCIEXクロマトグラムは、二重特異性産物の最も高い収量が50および100mM2MEAで得られたことを示し、二重特異性ELISAの結果を確認するものであった。しかしながら、少量の残存ホモ二量体が依然として、50および100mM2MEAで検出された。より高い濃度、より長いインキュベーション時間および漸増2MEA濃度での交換は、CIEXプロファイルにおいて22~24分でのさらなるピークの出現をもたらす。交換が5時間以内で完了した場合には最少量のさらなるピークが得られた。これらのピークの性質を特定するために、SDSPAGE分析およびHPSEC分析を行った。HPSECから、凝集体の量は全ての条件について1未満であったことが示され、さらなるピークが凝集体に相当しないことが示唆された。しかしながら、非還元SDSPAGEから、追加のピークが、1つまたは2つの軽鎖を欠いているヘテロ二量体に相当しうることが示唆された。少量の半分子が同様に検出された。実験から、交換反応が高いホモ二量体濃度で行われ、これがこの過程を商業規模で魅力的にすること、ならびに二重特異性抗体の収量が2MEA濃度、温度およびインキュベーション時間に依ることが示される。実施例35IgG1K409Rとの組み合わせでの2MEA誘導性Fabアーム交換における関与のためのIgG1368位の決定基実施例28および29では、位置F405およびY407でのある種の単一の変異はIgG1K409Rと組み合わせた場合、ヒトIgG1をFabアーム交換に関与させることを可能とするのに十分であることを示す。本実施例において例証されるように、CH3ドメインにおけるFcFc界面の位置に関与するさらなる決定基が同様に、Fabアーム交換機構を媒介しうる。この趣旨で、IgG1368位での突然変異誘発を行い、この変異体をヒトIgG1K409Rとの組み合わせでの2MEA誘導性Fabアーム交換における関与について調べた。可能な全てのIgG12F8L368X変異体をIgG17D8K409Rと組み合わせた。手順は実施例19に記述したように精製抗体で行った。図36は、IgG12F8L368X×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性結合の結果を示す。これらのデータをまた、表8に提示されているように、Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換または高いFabアーム交換としてスコア化した。IgG12F8における368位がL、FまたはMであった場合に、Fabアーム交換はないと認められた。Fabアーム交換は、IgG12F8における368位がYであった場合には低いことが分かった。Fabアーム交換は、IgG12F8における368位がKであった場合には中等で、IgG12F8における368位がA、D、E、G、H、I、N、Q、R、S、T、VまたはWであった場合には高いことが分かった。これらのデータから、IgG1K409Rと組み合わせた場合にIgG1368位の特定の変異が、2MEA誘導性Fabアーム交換にIgG1を関与させることが示唆される。表8IgG12F8L368X変異体とIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換IgG12F8L368X変異体とIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性のインビトロでのFabアーム交換後の二重特異性抗体の作出をサンドイッチELISAによって判定した。Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換、高いFabアーム交換。実施例36IgG1K409Rとの組み合わせでの2MEA誘導性Fabアーム交換における関与のためのIgG1370位の決定基実施例28、29および35では、位置F405、Y407またはL368でのある種の単一の変異はIgG1K409Rと組み合わせた場合、ヒトIgG1をFabアーム交換に関与させることを可能とするのに十分であることを示す。本実施例において例証されるように、CH3ドメインにおけるFcFc界面の位置に関与するさらなる決定基が同様に、Fabアーム交換機構を媒介しうる。この趣旨で、IgG1370位での突然変異誘発を行い、この変異体をヒトIgG1K409Rとの組み合わせでの2MEA誘導性Fabアーム交換における関与について調べた。可能な全てのIgG12F8K370X変異体をIgG17D8K409Rと組み合わせた。手順は実施例19に記述したように精製抗体で行った。図37は、IgG12F8K370X×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性結合の結果を示す。これらのデータをまた、表9に提示されているように、Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換または高いFabアーム交換としてスコア化した。IgG12F8における370位がK、A、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、VまたはYであった場合に、Fabアーム交換はないと認められた。K370をWで置換するだけで中等のFabアーム交換が起きた。これらのデータから、IgG1K409Rと組み合わせた場合にIgG1370位の1つの変異だけで2MEA誘導性Fabアーム交換にIgG1を関与させられることが示唆される。表9IgG12F8K370X変異体とIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換IgG12F8K370X変異体とIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性のインビトロでのFabアーム交換後の二重特異性抗体の作出をサンドイッチELISAによって判定した。Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換、高いFabアーム交換。実施例37IgG1K409Rとの組み合わせでの2MEA誘導性Fabアーム交換における関与のためのIgG1399位の決定基実施例28、29、35および36では、位置F405、Y407、L368またはK370でのある種の単一の変異はIgG1K409Rと組み合わせた場合、ヒトIgG1をFabアーム交換に関与させることを可能とするのに十分であることを示す。本実施例において例証されるように、CH3ドメインにおけるFcFc界面の位置に関与するさらなる決定基が同様に、Fabアーム交換機構を媒介しうる。この趣旨で、IgG1399位での突然変異誘発を行い、この変異体をヒトIgG1K409Rとの組み合わせでの2MEA誘導性Fabアーム交換における関与について調べた。可能な全てのIgG12F8D399X変異体をIgG17D8K409Rと組み合わせた。手順は実施例19に記述したように精製抗体で行った。図38は、IgG12F8D399X×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換による二重特異性結合の結果を示す。これらのデータをまた、表10に提示されているように、Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換または高いFabアーム交換としてスコア化した。IgG12F8における399位がD、EおよびQであった場合に、Fabアーム交換はないと認められた。Fabアーム交換は、IgG12F8における399位がVであった場合には低く、IgG12F8における399位がG、I、L、M、N、S、TまたはWであった場合には中等であることが分かった。Fabアーム交換は、IgG12F8における399位がA、F、H、K、RまたはYであった場合には高いことが分かった。これらのデータから、IgG1K409Rと組み合わせた場合にIgG1399位の特定の変異が、2MEA誘導性Fabアーム交換にIgG1を関与させることが示唆される。表10IgG12F8D399X変異体とIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換IgG12F8D399X変異体とIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性のインビトロでのFabアーム交換後の二重特異性抗体の作出をサンドイッチELISAによって判定した。Fabアーム交換なし、低いFabアーム交換、中等のFabアーム交換、高いFabアーム交換。実施例382MEA誘導性Fabアーム交換が最適下限に行われて高効率IgG1変異体を識別する、条件範囲の決定2MEA誘導性Fabアーム交換の過程は、25mM2MEAを用いる場合、37°Cで効率的に行われる。これらの条件の下で、許容的なIgG1変異体の大部分は、高いレベルの2MEA誘導性Fabアーム交換を示す。最も高い効率を有するIgG1変異体間の識別を可能にしうる実験条件を特定するため、4つの異なる変異体の組み合わせに対する2MEA誘導性Fabアーム交換を、それぞれ、15°Cおよび20°Cで経時的に調べた。温度、期間および抗体希釈の変化は別として、手順は実施例19に記述したように行った。20°Cで、4つの変異体の組み合わせの2MEA誘導性Fabアーム交換は、最大の交換と比べてさまざまな割合で行われた。105分のインキュベーション後、IgG12F8L368R×IgG17D8K409Hは最大の交換レベルに到達し、その一方でIgG12F8F405S×IgG17D8K409A、IgG12F8D399R×IgG17D8K409GおよびIgG12F8F405L×IgG17D8K409Rは200分後に、それぞれ、最大90、85および85に到達した。15°Cでの異なるIgG1変異体の組み合わせのインキュベーションにより、交換率の最も顕著な差異が示された。60分および105分のインキュベーションの後、2MEA誘導性Fabアーム交換、4つの変異体の組み合わせの間の差異は最も極端であった。200分のインキュベーション後のFabアーム交換により、陽性対照と比べて100の効率、85の効率または65の効率が示された。実施例39最適以下の条件での変異体の2MEA誘導性Fabアーム交換効率の分析2MEA誘導性Fabアーム交換の過程は、25mM2MEAを用いる場合、37°Cで効率的に行われる。これらの条件の下で、許容的なIgG1変異体の大部分は、高いレベルの2MEA誘導性Fabアーム交換を示す。実施例38で、2MEA誘導性Fabアーム交換効率の差異はいわゆる最適下限の条件での、すなわち60~105分間15°Cでのインキュベーション後に最も顕著であることを記述した。IgG17D8K409Rと90超の2MEA誘導性Fabアーム交換を示すL368、D399、F405およびY407での全部で24種のIgG12F8変異体を選択し、IgG17D8K409A、G、HまたはRでのFabアーム交換分析に供した。二重特異性抗体を作出する効率によってこれらの変異体の組み合わせを分類するために、2MEA誘導性Fabアーム交換を90分間15°Cで行った。IgG17DK409Rとのインキュベーション後に弱い2MEA誘導性Fabアーム交換を示した2つのIgG12F8変異体Y407QおよびD399Qを、さらなる陰性対照として取り入れ、使用して、K409位での別のアミノ酸とのインキュベーションが異なる結果をもたらすかどうか調べた。温度の変化および抗体希釈の変化は別として、手順は実施例19に記述したように行った。90分間15°Cでの異なる全てのIgG1変異体の組み合わせのインキュベーションによって、異なる2MEA誘導性Fabアーム交換効率の範囲が示された。20μgmLの抗体濃度での二重特異性結合の結果を表11に示す。下記表11の説明文に明記されているように、結果を4つの部類に分類したゼロの、低い、中等のおよび高い二重特異性結合効率。これらの結果から、最適下限の条件の下で、IgG1分子におけるアミノ酸変異のいくつかの組み合わせは2MEA誘導性Fabアーム交換に有利に働くことが明らかになる。表1190分間15°Cでの許容的なIgG1変異体間の二重特異性結合試験した変異IgG12F8分子から、6つを二次分析のために選択して、先に得られた結果を確認した。いくつかの変異体をその高い2MEA誘導性Fabアーム交換効率ならびに中等の2MEA誘導性Fabアーム交換効率のために選択した。また、二度目にIgG12F8Y407Qを分析した。というのは、これが、IgG17D8K409Hと予想外の、陽性の2MEA誘導性Fabアーム交換反応を示したからである。概して、図40に提示されたこれらの結果から、一次分析が確認され、IgG17D8K409Hとの変異IgG12F8分子の2MEA誘導性Fabアーム交換反応が最も高い効率を示したことが示される。さらに、実施例28、29および35~37において陰性と報告されているIgG17D8K409Rとの変異IgG12F8分子間の2MEA誘導性Fabアーム交換反応はそれでも、IgG1の2MEA誘導性Fabアーム交換を潜在的に促進するので、興味深い。実施例40アンタゴニストcMet抗体の望ましくないアゴニスト活性を取り除いて、それらを一価の、二重特異性の形式へ変換するための二重特異性の形式の使用モノクローナル抗体療法用に開発されたいくつかの二価抗体は、その標的への結合によって望ましくないアゴニスト活性を示す。これは、受容体チロシンキナーゼcMetを標的化する大部分のIgG1に基づく抗体の事例にもある。これらのアゴニスト抗体は受容体の二量体化を誘導し、その後にいくつかの下流のシグナル伝達経路の活性化が行われる。結果として、細胞の増殖および分化が誘導される。一価抗体の形式を用いることで、受容体の二量体化の誘導を阻止することができる。抗cMet抗体Fabアームと無関係の抗体のFabアームとの組み合わせによって、機能的に一価の、それゆえ、完全に拮抗性の二重特異性抗体が得られる。ここで、本発明者らは、二重特異性抗体において一部または全部のアゴニスト抗体を、IgG1b1210241027において最初に記述されていると組み合わせた。IgG1b12は、ウイルスタンパク質に対して作製されているため、無関係の非結合抗体と見なされた。本実施例において用いた抗cMet抗体は、遺伝子導入マウスにおいて作出された完全にヒトのモノクローナル抗体である。IgG1058およびIgG1069はcMet上の異なるエピトープに結合する。用いた2つの抗cMet抗体は、さらに開示されるように、Fc領域が改変されているIgG1κ抗体である。それらは以下の重鎖および軽鎖可変配列を有する。受容体リン酸化一価の二重特異性cMet抗体を、25mM2MEAを用いて実施例23に記述したようにIgG1058F405LまたはIgG1069F405LおよびIgG1b12K409RとのFabアーム交換反応によって作出した。cMetリン酸化に及ぼす二重特異性抗体の効果を評価した。天然リガンドHGFによるまたはアゴニスト二価抗体による2つの隣接したcMet受容体の二量体化で、cMetの細胞内ドメインにおける3つのチロシン残基は交差リン酸化される。これは、cMetの細胞内ドメインにおけるいくつかの他のアミノ酸のリン酸化およびいくつかのシグナル伝達カスケードの活性化をもたらす。cMetの二量体化および活性化は、抗cMet抗体の潜在的な受容体活性化作用に対する読み出しとして機能する、これらの位置でリン酸化された受容体に特異的な抗体を用いることによりモニタリングすることができる。A549細胞、つまりATCCから入手したCCL185を、70の集密度に達するまで、血清を含有するDMEM培地中で増殖させた。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、血清を含有する培地中にて細胞110e6個ウェルで6ウェル培養プレートにプレーティングした。終夜のインキュベーション後、細胞をHGFまたは抗体のパネルで処理し、37°Cで15分間インキュベートした。細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した溶解用緩衝液で溶解した。細胞溶解物サンプルを80°Cで保存した。受容体活性化を、ホスホcMet特異抗体を用いウエスタンブロットでのcMetリン酸化の検出により判定した。細胞溶解物中に存在するタンパク質を、4~12SDSPAGEゲルにて分離し、ニトロセルロース膜へ転写し、これをその後、リン酸化されたcMetに特異的な抗体で染色した。ゲル負荷の対照として、抗cMet抗体および抗βアクチン抗体を用いて総βアクチンおよびcMetレベルを判定した。ウエスタンブロットの結果を図41に示す。組織培地対照ならびに抗体5D5の一価の形式UniBodyで処理された細胞は、少しもcMet受容体リン酸化を示さなかった。本明細書において用いられる一価UniBodyの形式は、ヒンジ領域が欠失された、かつCH3領域が位置405および407で変異された、IgG4である。対照的に、陽性対照HGFまたはアゴニスト抗体IgG1058で処理された細胞のウエスタンブロット分析から、リン酸化cMetの、予想された高さに明瞭なバンドが示された。部分的アゴニスト抗体IgG1069は、より低い、しかし検出可能な受容体リン酸化を示し、受容体のいくらかの架橋結合が起きることを示唆していた。しかしながら、二重特異性IgG1058b12抗体も二重特異性069b12抗体もともに、cMetリン酸化を全く誘導せず、親抗体と関連するアゴニスト活性が完全に欠けていることを示していた。インビトロでのNCIH441の増殖に及ぼすcMet抗体の効果cMet抗体の潜在的な増殖性のアゴニスト活性を肺腺がん細胞株NCIH441においてインビトロで試験した。この細胞株は高レベルのcMetを発現するが、そのリガンドHGFを産生しない。NCIH441細胞を血清不含RPMI中で、96ウェル組織培養プレートに播種した。抗cMet抗体を血清不含RPMI中で667nMに希釈し、細胞に添加した。37°C5CO2で7日のインキュベーションの後、生細胞の量をアラマーブルーにより、製造元の使用説明書にしたがって定量化した。EnVision2101Multilabel読取機を標準的なアラマーブルーの設定で用いて、蛍光をモニタリングした。IgG1069とは反対に、図42に示されるように、二重特異性IgG1069b12とのNCIH441細胞のインキュベーションにより増殖は誘導されなかった。また、UniBody069対照では増殖が誘導されず、これは処理なしまたはIgG1b12処理に匹敵していた。実施例41ヒトIgG12F8F405LまたはIgG17D8F405LとIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体によるCDC媒介性の細胞死滅CD20抗体IgG17D8は、補体依存性細胞傷害によってCD20発現細胞を効率的に死滅させることができる。対照的に、EGFR抗体IgG12F8は、EGFRを発現している標的細胞に対するCDCを媒介しない。IgG17D8K409RもIgG12F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体もともに、CD20発現細胞に対してCDCを誘導することができる。IgG17D8F405LおよびIgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体が同様に、CD20発現細胞に対してCDCを誘導できるかどうか試験した。105個のDaudi細胞またはRaji細胞を、01BSAを補充したRPMI培地100μL中の抗体の濃度系列とともに室温にて振盪機中で15分間プレインキュベートした。正常ヒト血清25μLを補体の供給源として加え、37°Cで45分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを氷上に置いて、CDC反応を停止させた。10μgmLのヨウ化プロピジウム10μLを加え、FACS分析によって死細胞および生細胞を識別した。図43は、IgG17D8およびIgG17D8F405LとIgG17D8K409Rとの間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性産物が、CD20発現DaudiおよびCD20発現RajiのCDC媒介性の細胞死滅を誘導する同じ効力を有することを示す。Daudi細胞もRaji細胞もEGFRを発現せず、IgG22F8F405L×IgG17D8K409R間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出された二重特異性抗体の一価結合を引き起こす。この二重特異性産物はまた、わずかに低い効率であったが、CDC媒介性の細胞死滅を誘導した。これらのデータから、親抗体のCDC能力が二重特異性の形式で維持されたことが示唆される。二価の二重特異性産物によるCDC媒介性の細胞死滅の誘導は、一価の二重特異性産物と比べてわずかに高い効率であった。CD20を標的化する11B8抗体は、CDC媒介性の細胞死滅を誘導することができず、陰性対照として機能する。実施例42インビトロでのκを標的としたETA死滅アッセイ法で試験したHER2×HER2二重特異性抗体実施例から、HER2×HER2二重特異性抗体が、κを標的とした緑膿菌外毒素Aを用いた汎用のインビトロでの細胞に基づく死滅アッセイ法で内部移行後に腫瘍細胞へ細胞毒性剤を送達できることが示される。このアッセイ法では、緑膿菌外毒素Aの切断型に結合された高親和性抗κドメイン抗体を利用する。抗体結合タンパク質およびジフテリア毒素または緑膿菌外毒素Aの類似の融合タンパク質が既述されているKuoSRetal2009BioconjugateChem20092019751982。これらの分子は抗κETAとは対照的に、完全な抗体のFc部分を結合した。内部移行およびエンドサイトーシスの選別によって、抗κETAドメイン抗体はタンパク質分解およびジスルフィド結合の還元を起こし、触媒ドメインを結合ドメインから分離する。触媒ドメインは次いで、KDEL保持モチーフによりゴルジから小胞体へ輸送され、その後、細胞質ゾルへ移動され、そこで、タンパク質合成を阻害して、アポトーシスを誘導する。本実施例および以下の実施例43~45において用いた抗HER2抗体は、遺伝子導入マウスにおいて作出された完全にヒトのモノクローナル抗体である。それらはHER2上の異なるエピトープに結合する。それらは全て、さらに開示されるように、そのFc領域が改変されているIgG1κ抗体である。それらは以下の重鎖および軽鎖可変配列を有する。HER2×HER2二重特異性抗体をA431細胞とのインキュベーションの前に抗κETAとプレインキュベートした。A431細胞は、細胞1個につきおよそ15000個のHER2抗体を発現し、裸のHER2抗体による処理に感受性がない。初めに、各細胞株について抗κETAの最適濃度、すなわち、非特異的な細胞死の誘導をもたらさない最大耐用量を判定した。A431細胞を96ウェル組織培養プレート中の正常細胞培地に播種し、少なくとも4時間接着させた。これらの細胞を正常細胞培地中で抗κETAの希釈系列100、10、1、01、001、0001および0μgmLとともにインキュベートした。3日後、生細胞の量をアラマーブルーにより、製造元の使用説明書にしたがって定量化した。EnVision2101Multilabel読取機を標準的なアラマーブルーの設定で用いて、蛍光をモニタリングした。抗κETAのみで細胞を死滅させなかった抗κETAの最大濃度を以下の実験に用いた。次に、抗κETAとともにプレインキュベートされたHER2×HER2二重特異性抗体およびHER2単一特異性抗体の効果を、細胞死滅を誘導するその能力について試験した。A431細胞を上記のように播種した。HER2特異抗体の希釈系列を作出し、所定の濃度の抗κETAとともに30分間プレインキュベートした後に、それらを細胞に加えた。37°Cで3日のインキュベーションの後、生細胞の量を上記のように定量化した。抗体とともにプレインキュベートされた抗κETAで処理した細胞のアラマーブルーシグナルを、抗体処理なしの処理細胞と比べてプロットした。GraphPadPrism5ソフトウェアを用いてEC50値および最大の細胞死を計算した。スタウロスポリンを細胞死滅の陽性対照として用いた。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。図44は、全ての抗κETAプレインキュベートHER2二重特異性抗体が用量依存的にA431細胞を死滅できたことを示す。これらの結果は、試験した大部分のHER2二重特異性抗体が、この抗κETAアッセイ法において組み合わせの中に含まれる単一特異性抗体よりも有効であったことを実証する。さらに、二重特異性抗体005X169、025X169および153X169の効力から、このインビトロでのκを標的としたETA死滅アッセイ法において活性を欠く単一特異性抗体、つまりHER2特異抗体169の効力を、別のHER2特異抗体との二重特異性の組み合わせを通じて増大できることが示された。実施例43異なるHER2エピトープを標的化する二重特異性抗体とのインキュベーションによるHER2受容体の抑制的調節HER2×HER2二重特異性抗体は、2つの空間的に異なるHER2受容体上の2つの異なるエピトープを結合することができる。これによって、他のHER2×HER2二重特異性抗体を、これらの受容体上の残りのエピトープに結合させることができる。これにより、多価受容体架橋結合を引き起こすことができ、その結果、受容体の抑制的調節を増強することができた。HER2×HER2二重特異性抗体がHER2の抑制的調節の増強を誘導するかどうか調べるために、AU565細胞を抗体および二重特異性抗体とともに3日間インキュベートした。全体のHER2レベルおよび抗体結合HER2レベルを判定した。AU565細胞を正常細胞培地中で24ウェル組織培養プレートに播種し、10μgmLのHER2抗体またはHER2×HER2二重特異性抗体の存在下にて37°Cで3日間培養した。PBSで洗浄した後に、SurefireLysis緩衝液25μLとともに室温で30分間細胞をインキュベートすることによって細胞を溶解した。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ試薬を製造元のプロトコルにしたがって用い、総タンパク質レベルを定量化した。HER2特異的なサンドイッチELISAを用いて溶解物中のHER2タンパク質レベルを分析した。ウサギ抗ヒトHER2細胞内ドメイン抗体を用いてHER2を捕捉し、ビオチン化ヤギ抗ヒトHER2ポリクローナル抗体、引き続きストレプトアビジンポリHRPを用いて、結合したHER2を検出した。反応を22アジノビス3エチルベンゾチアゾリン6スルホン酸によって可視化させ、シュウ酸で停止させた。405nmでの蛍光をマイクロタイタープレート読取機にて測定し、HER2の量を未処理細胞に対する割合として表した。結果を図45に示す。図から、試験した全てのHER2×HER2二重特異性抗体が40以上のHER2の抑制的調節を誘導したことが実証される。興味深いことに、全てのHER2×HER2二重特異性抗体がその単一特異性の対応物の両方と比べてHER2の抑制的調節の増大を実証した。実施例44共焦点顕微鏡検査により分析されたHER2×HER2二重特異性抗体とリソソームマーカーLAMP1との共局在化実施例43に記述したようにHER2抑制的調節アッセイから、HER2×HER2二重特異性抗体がHER2のリソソーム分解を増大できることが示唆された。これらの所見を確認するために、共焦点顕微鏡検査技術を適用した。AU565細胞を37°Cで3日間標準的な組織培地中で、ガラスカバースリップにて増殖させた。細胞をロイペプチンとともに1時間プレインキュベートしてリソソーム活性をブロックし、その後、10ugmLのHER2単一特異性抗体またはHER2×HER2二重特異性抗体を加えた。細胞を37°Cでさらに3時間または18時間インキュベートした。その後、それらをPBSで洗浄し、4ホルムアルデヒドとともに室温で30分間インキュベートした。スライドをブロッキング用緩衝液で洗浄し、20mMNH4Clを含有するブロッキング用緩衝液とともに20分間インキュベートして、ホルムアルデヒドをクエンチした。スライドを再び、ブロッキング用緩衝液で洗浄し、マウス抗ヒトCD107aとともに室温で45分間インキュベートしてリソソームを染色した。ブロッキング用緩衝液で洗浄した後に、スライドを二次抗体のカクテルヤギ抗マウスIgGCy5およびヤギ抗ヒトIgGFITCとともに室温で30分インキュベートした。スライドを再び、ブロッキング用緩衝液で洗浄し、封入剤20μLを用いて顕微鏡スライド上に終夜マウントした。スライドを、63×13206油浸対物レンズおよびLASAFソフトウェアを備えたLeicaSPEII共焦点顕微鏡で撮像した。重複するピクセル強度の定量化を可能とするために、ピクセルの飽和を回避するべきである。それゆえ、FITCレーザー強度を10に減少させ、スマートゲインを830Vに設定し、スマートオフセットを948に設定した。これらの設定を用いることにより、二重特異性抗体はピクセル飽和なく明瞭に可視化されたが、単一特異性抗体は検出することが困難なこともあった。単一特異性抗体と二重特異性抗体との間でリソソーム共局在化を比較するために、これらの設定を、分析する全ての共焦点スライドについて同じに保った。MetaMorphソフトウェアを用い共局在化について12ビット画像を分析した。FITCおよびCy5画像をスタックとして取り込み、バックグラウンドを差し引いた。全てのFITC画像および全てのCy5画像について同一の閾値設定を用いた。共局在化を重複領域におけるFITCのピクセル強度として描写した。ここで、ROIは全てのCy5陽性領域から構成される。いくつかのHER2抗体またはHER2×HER2二重特異性抗体で染色された異なるスライドを比較するために、Cy5のピクセル強度を用いて画像を規準化した。ヤギ抗マウスIgGCy5を用いて、リソソームマーカーLAMP1を染色した。LAMP1のピクセル強度は、試験した種々のHER2抗体またはHER2×HER2二重特異性抗体の間で異ならないはずである。FITCおよびCy5の共局在化に対する規準化値=100×200000TPICy5この式において、TPIは総ピクセル強度を表す。上式はさまざまな単一特異性HER2抗体およびHER2×HER2二重特異性抗体に対して、Cy5と重複しているFITCピクセル強度により測定したときの、生細胞の割合を表す。描写される抗体または二重特異性分子ごとに、異なる3つの画像を、およそ1、3または5個を超える細胞を含有する1枚のスライドから分析した。各スライド内の異なる画像の間で顕著な差異が認められた。しかしながら、全てのHER2×HER2二重特異性抗体が、その単一特異性の対応物と比較した場合に、リソソームマーカーLAMP1との共局在化の増大を示すことが明らかであった。これらの結果は、HER2×HER2二重特異性抗体が、内部移行されたら、リソソーム区画の方へ効率的に局在化され、それらが、二重特異性抗体薬結合体による手法に適することを示唆している。実施例45HER2単一特異性抗体またはHER2×HER2二重特異性抗体とのインキュベーションによるAU565細胞の増殖の阻害HER2二重特異性抗体を、インビトロでAU565細胞の増殖を阻害するその能力について試験した。AU565細胞上の高いHER2発現レベルにより、HER2はこれらの細胞において構成的に活性であり、かくして、リガンド誘導性のヘテロ二量体化に依存しない。96ウェル組織培養プレートの中に、無血清細胞培地中10μgmLのHER2抗体またはHER2×HER2二重特異性抗体の存在下で1ウェルあたり9000個のAU565細胞を播種した。対照として、抗体または二重特異性抗体なしの無血清培地中に細胞を播種した。3日後、アラマーブルーを製造元の使用説明書にしたがい用いて生細胞の量を定量化した。EnVision2101Multilabel読取機を標準的なアラマーブルーの設定で用いて、蛍光をモニタリングした。抗体処理細胞のアラマーブルーシグナルを未処理細胞に対する割合としてプロットした。図47は、HER2抗体およびHER2×HER2二重特異性抗体とのインキュベーション後のAU565細胞のアラマーブルーの蛍光強度を描く。ハーセプチンは陽性対照として含まれ、JuntillaTTetalCancerCell200915429440によって記述されているように増殖の阻害を実証した。全てのHER2×HER2二重特異性抗体がAU565細胞の増殖を阻害することができた。二重特異性抗体IgG1005ITL×IgG1169K409RおよびIgG1025ITL×IgG1005K409Rはこのアッセイ法において、その単一特異性抗体の対応物と比べて有効であった。実施例46Fc領域において1つまたは2つのFcRn部位を含んだヒンジ欠失IgG1二重特異性抗体および二重特異性IgG1抗体によるFcRn結合のインビトロおよびインビボでの分析本実施例では、非対称二重特異性分子、すなわち、本発明による各Fabアームにおいて異なる特徴を有する分子の作出を例証する。新生児Fc受容体は、IgGを分解から保護することによりIgGの長い血漿中半減期に関与する。抗体の内部移行後、FcRnはエンドソームにおいて抗体Fc領域に結合し、そこでは弱酸性の環境において相互作用が安定である。環境が中性である、原形質膜への再利用により、内部移行が失われ、抗体は循環血液中にもう一度放出される。抗体のFc領域は、CH2CH3界面にある各重鎖に1つの、FcRn結合部位2つを含む。抗体のFc領域におけるH435A変異は、FcRnへの結合を抑止し、また、ヒンジ領域はFcRn結合に影響を与えるものと考えられる。さらに、FcRnへの一価抗体の結合を上回る二価抗体の結合の役割が効率的な再利用において示唆されている。本実施例では、単一のFcRn結合部位を含む、非対称二重特異性IgG1分子によってFcRn結合価の影響について評価する。非対称二重特異性ヒンジ欠失IgG1分子によってヒンジ領域のさらなる寄与について評価する。ゼロ、1または2個のFcRn結合部位を含む二重特異性IgG1分子またはヒンジ欠失IgG1分子のFcRn結合をヒトおよびマウスFcRnELISAによって測定した。抗体IgG12F8ITL、IgG17D8K409RおよびIgG17D8K409RH435A単一特異性分子は、実施例2、3、4および5に記述したように作出した。ヒンジ欠失IgG1分子UniG12F8ITL、UniG17D8K409RおよびUniG17D8K409RH435A単一特異性分子は、実施例11に記述したように作出した。二重特異性IgG1分子はIgG12F8ITL分子およびIgG17D8K409R分子またはIgG17D8K409RH435A分子間の2MEA誘導性Fabアーム交換により作出した。二重特異性ヒンジ欠失IgG1分子はUniG12F8ITLとUniG17D8K409RまたはUniG17D8K409RH435Aとのインキュベーションによって作出した。3倍希釈系列の単一特異性および二重特異性IgG1分子およびヒンジ欠失IgG1分子を、ストレプトアビジンでコーティングされたelisaプレート上に捕捉されたビオチン化ヒトまたはマウスFcRnに加え、その後、1時間pH60および74でのインキュベーションを行った。結合した抗体およびヒンジ欠失IgG1分子を、コンジュゲートとして西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト2および基質としてABTSを用い可視化した。EL808Elisa読取機を用い405nmの波長での光学密度として結果を測定した。図48は、pH60およびpH74でのヒトFcRnおよびマウスFcRnへの単一特異性または二重特異性IgG1分子およびヒンジ欠失IgG1分子の結合結果を示す。予想通り、試験した全ての抗体、つまりIgG1分子もヒンジ欠失IgG1分子も、pH74でFcRnに効率的に結合しない。弱酸性の条件で、単一特異性IgG12F8ITLならびにIgG12F8ITLおよびIgG17D8K409Rから作出された二重特異性IgG1は、マウスFcRnの場合にはヒトと比べて3倍高いとはいえ、FcRnへの二価の結合効率を示し、これはFcRn結合に対する陽性対照を再現している。これは、ITL変異およびK409RがFcRnへの結合を妨害しないことを示唆している。ヒトおよびマウスFcRnへのIgG1分子の結合をpH60で比較した場合、FcRn相互作用部位2個vs1個vs0個の明らかな影響を認めることができる。IgG12F8ITL、IgG17D8K409RおよびIgG12F8ITLIgG17D8K409Rは対照と同等に結合する。FcRn結合部位が0個の分子IgG17D8K409RH435Aは、結合を全く示さない。FcRn結合部位が1個の分子IgG12F8ITLIgG17D8K409RH435Aは、FcRn結合部位が2個の分子と比べた場合、中等の結合を示す。図48pH60右パネルはヒンジ欠失IgG1分子のヒトFcRnへの結合を示す。全てのヒンジ欠失分子は、対照IgG1分子と比べた場合、ヒトFcRnとのその相互作用が損なわれており、FcRn結合ELISAにおいて評価した場合にヒンジが、実際、FcRnとの相互作用に影響することを示唆している。FcRn相互作用部位2個vs1個vs0個の明らかな影響は、pH60でのヒトFcRnへの結合がこれらのヒンジ欠失分子から構成される場合、認めることができない。しかしながら、マウスFcRnへのヒトIgGの結合は、より強力なため、pH60でのマウスFcRnへのこれらのヒンジ欠失IgG分子の結合を比較した場合、FcRn相互作用部位2個vs1個vs0個の明らかな影響を認めることができるpH60右パネル。UniG17D8K409RH435AUniG12F8ITLの結合は、UniG12F8ITL、UniG17D8409RおよびUniG12F8ITLUniG17D8K409R、ならびにUniG12F8ITLH435Aの結合と比較した場合、中等である。実施例47インビトロ細胞毒性アッセイ法において試験したHer2×CD3二重特異性抗体CD3は、成熟T細胞上に発現されるT細胞受容体複合体における共受容体である。二重特異性抗体におけるCD3特異抗体Fabアームと腫瘍抗原特異抗体Fabアームとの組み合わせによって、腫瘍細胞へのT細胞の特異的な標的化が起こり、T細胞媒介性の腫瘍細胞溶解に至るであろう。同様に、CD3陽性T細胞を体内の他の脱線細胞へ、感染細胞へまたは直接病原体へ標的化することができよう。Her2×CD3二重特異性抗体を作出した。Her2特異的Fabアームの重鎖および軽鎖の可変領域配列は、実施例42において抗体153および169の場合に示した通りであった。CD3特異的Fabアームに対する以下の重鎖および軽鎖の可変領域配列を用いたYTH125271725により記述されている配列。huCLBT3474963により記述されている配列。わずかなアミノ酸置換を導入して、配列を、最も近いヒト生殖細胞系列に似させた。全ての抗体は、以下に記述されるように、そのFc領域が改変されているIgG1κとして発現されたIgG1Her2153K409RおよびIgG1Her2153N297QK409R、IgG1Her2169K409R、IgG1huCLBT34F405LおよびIgG1huCLBT34N297QF405L、IgG1YTH125F405LおよびIgG1YTH125N297QF405L。これらのHer2およびCD3特異抗体由来の二重特異性抗体を、実施例11に記述したように作出し、AU565細胞を用いてインビトロ細胞毒性アッセイ法において試験した。AU565細胞をほぼ集密まで培養した。細胞をPBSで2回洗浄し、37°Cで5分間トリプシン処理した。培地12mLを加えてトリプシンを不活化し、細胞を800rpmで5分間遠心沈殿した。細胞を培地10mLに再懸濁し、細胞ろ過器に細胞を通すことによって単個細胞懸濁液を作出した。細胞5×105個mLの懸濁液100μLを96ウェル培養プレートの各ウェルに加え、細胞を37°C、5CO2で少なくとも3時間インキュベートして、プレートに接着させた。Leucosep30mL試験管を製造元のプロトコルにしたがって用い、末梢血単核細胞を健常ボランティアの血液から単離した。UntouchedHumanTcellsDynabeadキットを用いて陰性選択によりPBMC調製物からT細胞を単離した。単離細胞を細胞7×106個mLの終濃度まで培地に再懸濁した。培地を接着AU565細胞から除去し、50μlウェルの2×濃縮抗体希釈液および50μlウェルのT細胞7×106個mLと交換した。プレートを37°C、5CO2で3日間インキュベートした。上清を除去し、プレートをPBSで2回洗浄した。各ウェルに培地150μLおよびアラマーブルー15μLを加えた。プレートを37°C、5CO2で4時間インキュベートし、吸光度を測定した。図49から、対照抗体はT細胞媒介性の細胞傷害を誘導しなかったが、二重特異性のHer2×CD3抗体huCLBHer2153、huCLBHer2169、YTH125Her2153およびYTH125Her2169はAU565細胞の用量依存的なT細胞媒介性の細胞傷害を誘導したことが示される。Her2169を含んだ二重特異性抗体は、Her2153を含んだものよりも強力であった。グリコシル化部位を除去するためにN297Q変異を含んだIgG1huCLBT34、IgG1YTH125およびHer2153の変異体を作出したこの部位でのグリコシル化はIgGFcγ受容体相互作用に重要である。図49は、Her2×CD3二重特異性抗体YTH125Her2153およびhuCLBHer2153のN297Q変異、それゆえ、Fcグリコシル化の欠如が、AU565細胞の用量依存的なT細胞媒介性の細胞傷害を誘導する潜在性に影響を与えなかったことを示す。