"対象生物の尿路由来非前立腺サンプルから腎臓細胞または膀胱細胞を検知するためのinvitroの方法であって、-尿路由来非前立腺サンプルからRNAを単離し、-PCA3のエクソン3-エクソン4RNAスプライスジャンクションに架かる領域を増幅するためのプライマーペアを用いて該単離したRNAに含まれるPCA3核酸を増幅することによって、増幅産物を採集し、そして-採集した増幅産物の中から、PCA3のイントロン3またはその相補鎖を包含する増幅核酸を検出することを包含し、PCA3のイントロン3またはその相補鎖を包含する該増幅核酸の検出をもって、該尿路由来非前立腺サンプル中の腎臓細胞または膀胱細胞の存在を検知する方法。PCA3マーカーの特異性に関する課題を明らかにし、前立腺癌と関連するPCA3配列を特異的に同定することができる手段を提供することに対する要求が未だに残っている。本発明は、このような要求を、他の要求と共に満足させることを目的とする。進行した前立腺癌が男性人口のかなりの割合において未だに生命を脅かす疾患であるという事実を鑑みると、最も特異的、選択的且つ迅速な前立腺癌検知方法およびキットを提供することに対する要求が未だに残っている。本発明は、このような要求を、他の要求と共に満足させることを目的とする。本発明は、従来技術の診断方法とキットよりも高い特異性と選択性をもって前立腺癌を検知する診断法とキットに関する。本発明の方法は、invitro、exvivoまたはinvivoで行うことができる。本発明の1つの目的は、対象生物の尿路由来非前立腺サンプルから腎臓細胞または膀胱細胞を検出するためのinvitroの方法を開示することである。本発明について説明したので、次に、本発明の好ましい態様を具体的に示す、添付の図面に参照する。1つの特定の態様においては、同定するPCA3核酸は前立腺の悪性状態と関連するが、前立腺の非悪性状態とは関連しない。このような特定な態様の1つにおいては、PCA3核酸はPCA3mRNAである。他の1つの態様においては、サンプルは、核酸の増幅および検知を行うのに十分な量の前立腺細胞または前立腺細胞由来の核酸を含む、患者から得た如何なるサンプルでもよい。特定の態様においては、検知するPCA3核酸は前立腺癌に関連するPCA3mRNAであり、サンプルは尿サンプルである。1つの特定の態様においては、本発明はサンプル例えば、尿サンプル中の、エクソン1とエクソン2の間のイントロン例えば、i1を含有しないPCA3RNAの存在を検知することによって、患者における前立腺癌を評価する方法に関する。他の態様においては、検知するPCA3RNAはエクソン2とエクソン3の間のイントロンi2を欠いたスプライスされたRNAである。本発明の更に他の態様においては、検知するPCA3RNAはエクソン3とエクソン4の間のイントロンi3を欠いたスプライスされたRNAである。本発明の更に別の特定の態様においては、検知するPCA3RNAはエクソン1とエクソン3の間の複数のイントロンを欠いたスプライスされたRNAである。本発明の特に好ましい態様においては、検知するPCA3RNAはエクソン1とエクソン4の間の複数のイントロンを欠いたスプライスされたRNAである。本発明の特に好ましい態様においては、検知するPCA3RNAは少なくとも1つのイントロン例えば、エクソン1とエクソン2の間のi1および/またはエクソン3とエクソン4の間のi3を欠いたスプライスされたRNAである。1つの態様においては、少なくともエクソン1とエクソン2の間の第1イントロンを欠いたPCA3RNAを特異的にターゲティングし、検知する。他の態様においては、検知するPCA3RNAはエクソン3とエクソン4の間のイントロンi3を欠くものである。更に別の特定の態様においては、検知するPCA3配列は全てのイントロンを有していないPCA3RNAである。本発明の1つの特定の態様においては、PCA3遺伝子即ち、RNAのコードする前立腺癌特異的RNAは、サンプル中に含まれる前立腺癌とは関連しなくともよい第2前立腺特異的配列を増幅する増幅法によって検知する。前立腺RNAに対する対照として機能する限り、種々の第2前立腺特異的配列を用いることができる。このような前立腺特異的配列を限定することのない具体例には、PSAこの場合は、前立腺癌と関連することの多い前立腺特異的配列や他のカリクレインファミリーに属する配列が含まれる。前立腺癌特異的PCA3RNA配列の増幅と前立腺特異的配列の増幅は同時に行ってもよい。PCA3の増幅と第2前立腺特異的配列の増幅は、同じまたは異なる反応混合物中で、同時または別々に行うことができる。本発明は、サンプル中の前立腺癌特異的PCA3RNAを検知するための方法を提供する。1つの態様において本発明は、患者から前立腺癌特異的なPCA3RNAを検知することを包含する、患者における前立腺癌の診断または予知を行うための方法およびそれを実施するためのキット;キットを構成する特定の成分については下記を参照であり、この方法およびキットにおいては、PCA3RNAが、患者における前立腺癌の存在または前立腺癌素因と関連するものか否かを検知する。1つの特定の態様においては、PCA3RNAは少なくとも1つのイントロンを欠くものである。核酸を検知するための数々の高感度の方法が知られており、これらはサンプルの種類、検知方法の感度、PCA3核酸の量などに基づいて本発明に適合させることができる。1つの特定の態様においては、検知は、本明細書で開示する配列から設計したプローブを用いて行う。1つの特定の態様においては、プローブはPCA3RNAのエクソン-エクソンジャンクションに架かるものである。更に他の態様においては、PCA3核酸の増幅を更に行うことで、本発明の方法およびそれを実施するためのキットの感度を向上させる。種々の増幅方法を用いることができる。その多くが本明細書に記載されている。1つの特定の態様においては、PCA3核酸、好ましくはPCA3RNAを、そのエクソン配列にハイブリダイズするプライマーを用いて増幅する。更なる別の態様においては、PCA3RNAの検知は、1つを超えるイントロンを欠いたRNAの検知である。通常は行うが必ずしも増幅の後に行うわけではない更なる態様においては、PCA3を検知するための1つまたはそれ以上のプローブは、エクソン-エクソンジャンクションを標的とする。これらの方法を実施するためのキットも本発明の範囲に含まれる。プライミングに係る種々のエクソンジャンクションの変更、1つまたはそれ以上のエクソンジャンクションに対するプロービングの変更、あるいは特定のまたは1つ以上のイントロンを欠いたPCA3RNAの検知などについては、感度を向上する方法や核酸を捕捉する方法などと共に、本明細書において教示または例示する。本発明は、サンプル中の前立腺癌特異的PCA3RNAの存在を検知するためのキットも提供する。1つの態様において本発明は、上記前立腺癌特異的PCA3核酸例えば、RNAを増幅可能な一対のプライマーの入った第1容器を少なくとも包含する診断キットを提供する。他の態様において本発明は、上記前立腺癌特異的PCA3RNAを増幅可能な一対のプライマーの入った第1容器と、上記第2前立腺特異的配列を増幅可能な一対のプライマーの入った第2容器とを包含する診断キットを提供する。他の態様においては、PCA3増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブの入った第3容器を更に包含する。本発明の特定の態様においては、プローブはPCA3の選ばれたエクソン-エクソンジャンクションに特異的にハイブリダイズすることによって本発明の方法の特異性を更に向上させる。更に他の態様においては、PCA3の他の領域および/または第2前立腺特異的配列に対するプローブの入った第4容器を更に包含する。更なる別の態様においては、キットは検知感度を増幅するための試薬を包含する。1つの態様においては、キットはリアルタイムの増幅と検知を可能にする試薬も含有する。更に本発明は、患者における前立腺癌の存在または前立腺癌を発生する素因を診断するための方法を提供する。別の態様においては、PCA3遺伝子のコードするRNAは、患者の排泄した尿から得た尿サンプルに含まれる細胞から得たものである。本発明の1つの態様においては、RNA増幅方法を用いてRNAを検知する。このような態様の1つにおいては、RNA増幅法は蛍光特異的プローブを用いた、増幅産物のリアルタイム検知法と組み合わされている。更なる別の態様においては、増幅方法はPCRである。更なる態様においては、PCRはリアルタイムPCRまたはそれに類似した、増幅産物のリアルタイムの検知を可能とする方法である。1つの態様においては、丁寧な直腸指診DREの後に尿サンプルを得る。増幅方法および/または検知方法が標的マーカーPCA3と、所望により第2マーカーを検知するのに十分な感度を有する時には、当然のことながら、本発明の方法およびキットは、直腸指診を行わずに得た尿サンプル、精子や、精子と尿の混合物射精に続く最初の尿のサンプルなどの他の種類のサンプルに対しても使用可能であることを理解されたい。本発明の方法およびキットがこのようなサンプルでも実施可能であることは実験によって示されている。使用できる他のサンプルには、血液や血清が含まれる。1つの態様においては、尿サンプルから回収した細胞を集め、総核酸抽出を実施する。1つの特定の態様においては、BOOMetalの発表した、シリカビーズ上で行う固相バンド法solidphasebandmethodを用いて総核酸抽出を行う。当然のことながら、種々の核酸抽出法が存在するので、本発明に従って他の方法を用いることができる点を理解されたい。本発明を限定することのない1つの具体例としては、フェノール/クロロホルム抽出法が挙げられる。他の方法も本明細書で参照する教科書に記載されている。更なる1つの態様においては、PCA3遺伝子のコードするRNAは、核酸増幅法NASBA法と呼ばれるinvitroRNA増幅法によって検知する。当然のことながら、他のRNA増幅法も知られており、本発明の方法とキットはNASBA法に限定されるものではない。本発明を限定することのないRNA増幅法の具体例としては、ポリメラーゼ連鎖反応法PCR法、転写媒介性増幅法TMA法およびリガーゼ連鎖反応法LCR法が挙げられる。1つの態様においては、ビーコン手法によって、蛍光プローブを用いて均質相で増幅産物を検知する。他の態様においては、蛍光検出法または比色検出法を用いて増幅産物を固相上で検知する。標的RNAの検知および/または定量には、種々の蛍光検出法、比色検出法または酵素検出法を本発明に従って使用できることを理解されたい。このような蛍光検出法、比色検出法または酵素検出法は、当業界では広く知られている。当業者であれば、試験結果が陽性か陰性かを決定するために、本発明に関連して数々の統計方法を使用することができることを理解されたい。本発明の他の目的およびその利点については、以下の明細書の記載より明らかとなる。用語の定義以下の記載においては、DNA工学で使用する種々の用語を広範にわたって使用する。本明細書と請求の範囲、並びにこのような用語によって含まれる範囲の理解を明瞭且つ一貫したものとするために、以下の定義を提供する。特に定義のない限り、本明細書で使用する科学用語と技術用語および命名は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般に理解される定義と同一であるものとする。分子生物学用語の一般に理解されている定義は、例えば、以下の教科書に記載されている:DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology微生物学および分子生物学辞典第2版Singletonetal著、1994年、JohnWileySons、ニューヨーク州、ニューヨーク;TheHarperCollinsDictionaryofBiologyハーパーコリンズの生物学辞典に記載の方法によって合成した。核酸プライマーを転写媒介性増幅法TMAで使用するために設計した。TMA法は既に詳細に報告されている方法である例えば、Kacianetal、米国特許第5399491号と第5480784号。TMAは、逆転写酵素とRNAポリメラーゼを用いて標的配列のコピー数を10億倍以上にする等温増幅手法である。簡単に説明すると、TMAにおいては、一対の増幅用オリゴヌクレオチドそのうちの1つは5’RNAポリメラーゼプロモーター配列を有するの存在下で、一本鎖標的配列を用いて逆転写酵素によって二本鎖DNA中間体を合成する。DNA中間体は、RNAポリメラーゼによって認識され、標的配列の転写即ち、数百コピーのRNAを誘導する二本鎖プロモーター配列を含んでいる。次に各RNA転写産物を二本鎖DNA中間体に変換し、それを更なるRNAの産生に使用するので、その結果、反応が指数関数的に進行する。以下の配列を有するプライマーを合成した:CAGGAAGCACAAAAGGAAGC配列番号3およびAATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGCTCATCGATGACCCAAGATGG配列番号36。2番目のプライマープロモータープライマーとも呼ばれるの下線で示した5’部位はTMA手法で用いるT7プロモーター配列AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA、配列番号37であるが、当業者は、3’標的特異的配列GGCTCATCGATGACCCAAGATGG、配列番号38またはその相補的配列からなるプライマーも、T7RNAポリメラーゼによる転写の関与しない増幅反応では同等に使用できる点を理解している。これらプライマーは、PCA3mRNAのエクソン3と4の間のスプライスジャンクションに架かる領域を増幅するように設計したものである。エクソン3-エクソン4スプライスジャンクションに架かるプローブGGAAGCACAGAGATCCCTGG、配列番号8を使用した。即ち、スプライスされたmRNAから誘導したアンプリコンのみを特異的に検知し、エクソン3-イントロン3-エクソン4未スプライス型を検知しないようにプローブを設計した。プローブは非ヌクレオチドリンカーArnoldetal、米国特許第5585481号と第5639604号を参照を含むようにinvitroで合成し、化学発光性のアクリジニウムエステルArnoldetal、米国特許第5185439号を参照で標識した。増幅反応の標的RNAは、PCA3mRNAのエクソン1-エクソン3-エクソン4スプライス型の配列を含有するinvitro転写産物だった。当業者は、その他の標準的な方法、例えば、標的の精製を含む、RNAse活性を阻害する界面活性剤含有緩衝化溶液を用いた細胞の化学融解例えば、米国特許第6110678号でWeisburgetalの発表した方法、によっても標的を産生可能であることを理解するであろう。試験した各標的濃度、即ち、1回の反応当たりの標的が0~10,000コピー表4を参照、について3本のサンプル用チューブを使用したn=3。各反応チューブに、各プライマーそれぞれ15pmolを含有する増幅用試薬を加えた増幅用試薬は、26.7mMのrATP、5.0mMのrCTP、33.3mMのrGTP、5.0mMのrUTP、125mMのHEPES、8w/vの二水和トレハロース、1.33mMのdATP、1.33mMのdCTP、1.33mMのdGTP、1.33mMのdTTP、33mMのKCl、30.6mMのMgCl2、0.10w/vのメチルパラベン、0.02w/vのプロピルパラベンと0.003のフェノールレッドを含有する75μlの溶液pH7.5である。次にチューブに標的RNA転写産物を含有する水を10μl加えて混合し、更に200μlのシリコンオイルペンシルバニア州、ブリストル、UnitedChemicalTechnologiesInc製を反応チューブに加えてふたをし、ボルテックスに約10秒間付した後に初期のアニーリング工程として62°Cの恒温槽で約10分間インキュベートした。ここでプロモーター/プライマーの標的核酸への結合が生じた。反応チューブを次に42°Cで約5分間インキュベートし、その後、25μlの酵素試薬を各反応チューブに加えて穏やかに混合し、42°Cで約60分間インキュベートした酵素試薬は、50mMのHEPES、125mMのN-アセチル-L-システイン、120mMのKCl、1mMのEDTA、20v/vのグリセリン、10.2v/vのTRITONX100、0.2Mのトレハロース、0.90U/mlのマロニーマウス白血病ウイルスMMLV逆転写酵素RTと0.20U/mlのT7RNAポリメラーゼを含有、pH7.0;ここでは、1UのMMLV-RTのRT活性を、37°Cで15分間に合成し放出するcDNAが5.75fmolと定義し、1UのT7RNAポリメラーゼ活性を、37°Cで20分間に産生するRNA転写産物が5.0fmolと定義した。PCA3増幅産物を検知するために、反応チューブを室温に戻し、100fmolの標識した検知用プローブと400pmolの未標識プローブとを含む100μlのハイブリダイゼーション試薬100mMのコハク酸、2w/vのラウリル硫酸リチウム、100mMの水酸化リチウム、15mMのアルドリチオール-2、1.2MのLiCl、20mMのEDTAと3.0v/vのエタノール、pH4.7を各反応チューブに加えた。標識した検知用プローブは、10番と11番ヌクレオチドの間に位置する非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結したアクリジニウムエステル標識を有し、未標識のプローブは同じ核酸配列であるが標識されていないオリゴマーである。反応チューブにふたをし、ボルテックスに約10秒間付し、検知用プローブの増幅産物へのハイブリダイゼーションを実施するために、62°Cで約20分間インキュベートした。反応チューブを室温で約5分間冷却し、各チューブに250μlの選択用試薬600mMのホウ酸、182.5mMのNaOHと1v/vのTRITONX100、pH8.5を加えた。反応チューブにふたをし、ボルテックスに約10秒間付し、そしてハイブリダイズしていない標識プローブに結合したアクリジニウムエステル標識を加水分解するために、62°Cで約10分間インキュベートした。反応チューブを約15分間で約18~28°Cまで冷却し、相対光単位またはRLUとして表す化学発光性シグナルを発光測定機LEADER7450hまたはLEADER7HCLuminometer;カリフォルニア州、サンディエゴ、GenprobeInc製を用いて検知した。発光測定機は、検知用試薬11mMの硝酸と32mMの過酸化水素の自動注入と、それに続く検知用試薬2pHをほぼ中性に調整するための1.5MのNaOHの自動注入を行うための装置を装備していた。この実験における負の結果のカットオフ値は50,000RLUである、即ち、陽性サンプルは50,000RLUを超えるシグナルを発した。表4に示した結果は、PCA3アッセイの検知するPCA3RNA転写産物の最小コピー数が10であることを示す。標的のコピー10個を使用して得られたシグナルRLUは、負のサンプルコピー数0を使用して得たシグナルの約15倍も大きかった。検知したRLUシグナルはサンプルに存在した標的の相対量と正の相関を示し、これはPCA3アッセイ系の定量的性質を現している。男性および女性の尿由来の細胞ペレットにおけるPCA3mRNAの増幅この実施例は、尿由来細胞ペレットにおけるPCA3エクソン3-エクソン4スプライス変異体mRNAの検知について開示する。特に記載しない限り、試薬は実施例4と同じである。細胞ペレットは、正常な男性3人と正常な女性1人から得た200μlの尿を遠心分離1500RCFで15分に付すことで得た。各対象から5つのサンプルを調製し分析した。尿の上澄みをデカンテーションした後、チューブから水分を抜いた。標的核酸を放出するために各細胞ペレットを400μlの融解緩衝液15mMのリン酸一ナトリウム、15mMのリン酸二ナトリウム、1.0mMのEDTA、1.0mMのEGTA、110mMのラウリル硫酸リチウムを含有、pH6.7、62°Cで10分間インキュベートしたものの中で融解し、その後、室温で約5分間冷却した。PCA3mRNA標的核酸をサンプルチューブに存在する他の成分から分離するために、サンプルチューブの内容物をきれいなチューブに移し、1.5pmolの標的キャプチャープローブAUCUGUUUUCCUGCCCAUCCUUUAAGTTT30、配列番号39を含有する100μlの標的キャプチャー試薬を添加した標的キャプチャー試薬は、250mMのHEPES、310mMのLiOH、1.88MのLiClと100mMのEDTAを含有するpH6.4の溶液に、1ミクロンの磁気粒子SeraMagTMMGCMCarboxylateModified;インディアナ州、インディアナポリス、SeradynInc製に14オリゴマーを共有結合させたもの250μg/mlを加えたものである。このキャプチャープローブは、5’標的結合領域AUCUGUUUUCCUGCCCAUCCUUUAAG、配列番号40と3’固定化プローブ結合領域TTT30、配列番号41を有する。チューブにふたをして手で振り、キャプチャープローブの標的結合領域が標的核酸にハイブリダイズするように62°Cで約30分間インキュベートし、磁気粒子に結合した14に相補的なキャプチャープローブの固定化プローブ結合領域の30配列のハイブリダイゼーションのために室温で約30分間冷却した。次に、チューブの外側から磁場を約5分間あてて核酸の結合した磁気粒子を単離し、その後サンプル溶液をチューブから吸引した。各チューブ内の核酸の結合した粒子を1mlの洗浄溶液で洗浄し即ち、150mMのNaCl、10mMのHEPES、6.5mMのNaOH、1mMのEDTA、0.3v/vのエタノール、0.1w/vのSDS、0.02w/vのメチルパラベンと0.01w/vのプロピルパラベンを含有するpH7.5の溶液中で、ボルテックスに10~20秒付し、粒子から洗浄溶液を吸引で取り除く前に、磁場約5分を用いて再度粒子を分離した。標的キャプチャー工程に続いて、実施例4で使用したプライマーを含有する増幅用試薬75μlを各反応チューブに加え、増幅反応、プローブのハイブリダイゼーションそして検知を実施例4と同様に行った。表5に示した結果は、PCA3アッセイは男性尿由来細胞ペレットからPCA3誘導核酸を増幅して検知するが、女性尿由来細胞ペレットからは増幅も検知もしないことを示した。3人の正常男性から得たRLU値の範囲にはばらつきがあり、これはPCA3を発現する細胞の回収率の違いまたはPCA3mRNA発現の違いを表している。女性尿由来細胞ペレットから得たRLU値はバックグラウンド値と同等であり、これは検知可能なPCA3mRNAが存在しないことを意味する。表5のCVは変異係数の略語であり、データの平均値に対する各データの標準偏差を百分率で表したものである。本明細書に記載した全ての出版物の内容が、ここで参照することによって組み込まれているものとする。本発明について好ましい実施態様を用いて上で説明したが、当業者は、添付の請求の範囲によって定義された本発明の精神とその本質から逸脱することなく、実施態様に変更を加えることが可能である点を理解するであろう。"