哺乳類におけるライム病の状態を診断するための方法であって、哺乳類から得られたあるいは派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌細胞表層タンパク質OspA、OspCおよびOspFに対する抗体の有無を決定し、前記抗体の有無に基づいて、前記哺乳類がライム病菌に感染しているか感染していないかを特定することを含む方法。前記哺乳類が馬または犬である、請求項1に記載の方法。前記方法において測定されるライム病菌抗原に対する抗体が、ライム病菌OspA、OspCおよびOspFに対する抗体だけである、請求項1に記載の方法。前記OspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体の非存在の決定によって、前記哺乳類がライム病菌に感染していないことを特定する、請求項3に記載の方法。前記抗体の有無の決定に基づいて、前記動物が初期、中期あるいは慢性のライム病に罹患していることを判定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。前記抗体の有無の決定に基づいて、前記哺乳類がライム病に対するワクチン接種を受けているかどうかを判定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。前記抗体の有無の決定が、側方流装置を使用して決定される、請求項1に記載の方法。前記抗体の有無の決定が、蛍光ビーズベースのマルチプレックス解析を使用して決定される、請求項1に記載の方法。哺乳類におけるライム病の状態を診断するための方法であって、哺乳類から得られたあるいは派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌細胞表層タンパク質OspA、OspCおよびOspFに対する抗体のテストレベルを測定し、前記OspA、OspCおよびOspF抗体のテストレベルと基準の比較に基づいて、前記哺乳類がライム病菌に対するワクチン接種を受けているか及び/又は初期、中期あるいは慢性のライム病に罹患しているかを特定することを含む方法。前記方法において測定されるライム病菌タンパク質に対する抗体が、ライム病菌OspA、OspCおよびOspFに対する抗体だけである、請求項9に記載の方法。OspA、OspCおよびOspFタンパク質に対する抗体の非存在の決定によって、前記哺乳類がライム病菌に感染していないことを特定する、請求項10に記載の方法。前記抗体の有無の決定が、蛍光ビーズベースのマルチプレックス解析を使用して決定される、請求項10に記載の方法。前記基準が、蛍光強度中央値の値域である、請求項10に記載の方法。哺乳類におけるライム病の状態を診断するための方法であって、哺乳類から得られたあるいは派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌細胞表層タンパク質OspA、OspCおよびOspFに特異的な抗体の有無を決定すること、および:iOspAに対する抗体の存在、および、OspCあるいはOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ワクチン接種を受けているが、ライム病菌に感染していないことを特定する;iiOspCに対する抗体の存在、および、OspAおよびOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、初期のライム病を有することを特定する;iiiOspFに対する抗体の存在、および、OspAおよびOspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、慢性のライム病を有することを特定する;ivOspAおよびOspCに対する抗体の存在、および、OspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、初期のライム病を有することを特定する;vOspAおよびOspFに対する抗体の存在、および、OspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、慢性のライム病を有することを特定する;viOspCおよびOspFに対する抗体の存在、および、OspAに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、中期のライム病を有することを特定する;またはviiOspC、OspFおよびOpsAに対する抗体の存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、中期のライム病を有することを特定する;ことを含む方法。配列番号15、配列番号17、配列番号19の配列を含む単離されたタンパク質、あるいは前記タンパク質の組み合わせを含む組成物。配列番号15、配列番号16および配列番号17を含むタンパク質の組み合わせを含む、請求項15に記載の組成物。したがって、哺乳類馬および犬を含むが必ずしもそれらに限定されないにおけるライム病診断の改善された方法に対する継続した且つ満たされていないニーズが存在する。本発明は、これらおよび他のニーズを満たすものである。本発明は、哺乳類においてライム病の状態を診断する方法を提供する。前記方法は、哺乳類から得られたまたは哺乳類から派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌細胞表層タンパク質OspA、OspC、およびOspFに対する抗体の有無を決定し、前記抗体の有無に基づいて、前記哺乳類がライム病菌に感染しているか否かを特定することを含む。前記方法は、前記動物がライム病菌に対するワクチン接種を受けたかどうかを判定することを含む。前記方法は、前記抗体の有無の決定に基づいて、ライム病の様々な段階、すなわち初期、中期あるいは慢性のライム病を判別することを可能にする。一実施形態において、前記哺乳類は、OspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体の非存在の決定によって、ライム病菌に感染していないことが確認される。一実施形態において、前記方法において測定されるライム病菌抗原に対する抗体は、ライム病菌OspA、OspCおよびOspFに対する抗体のみである。前記方法は、適切なシステムまたは装置を使用して、前記抗体の有無を決定するのに適している。様々な実施形態において、前記抗体は、側方流装置または蛍光ビーズベースのマルチプレックス解析を使用して測定される。本発明は、ライム病菌OspA、OspCおよびOspFに対する抗体のテストレベルを測定すること、および前記OspA、OspCおよびOspF抗体のテストレベルと基準との比較に基づき、前記哺乳類がライム病菌に対するワクチン接種を受けたか及び/又は初期、中期あるいは慢性のライム病に罹患しているかを特定することを含む。一実施形態において、前記基準は、蛍光強度中央値の値域である。本発明の特定の態様において、前記方法は以下の工程を含む:iOspAに対する抗体の存在の決定、および、OspCあるいはOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ワクチン接種を受けているが、ライム病菌に感染していないことを確認するiiOspCに対する抗体の存在の決定、および、OspAおよびOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、初期のライム病を有することを確認するiiiOspFに対する抗体の存在の決定、および、OspAおよびOspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、慢性のライム病を有することを確認するivOspAおよびOspCに対する抗体の存在の決定、および、OspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、初期のライム病を有することを確認するvOspAおよびOspFに対する抗体の存在の決定、および、OspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、慢性のライム病を有することを確認するviOspCおよびOspFに対する抗体の存在の決定、および、OspAに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、中期のライム病を有することを確認する、または、viiOspC、OspFおよびOpsAに対する抗体の存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、中期のライム病を有することを確認するライム病タンパク質を含む新規の単離されたタンパク質およびそれらをコードする単離された核酸を含む組成物およびキットも含まれる。本発明は、哺乳類におけるライム病の状態を診断するための方法を提供する。一般に、前記方法は、哺乳類から得られたまたは派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌細胞表層タンパク質OspA、OspC、およびOspFに対する抗体を測定することを含む。OspA、OspCおよびOspF抗体の測定に基づき、前記哺乳類はライム病菌に感染しているか感染していないかを診断されることができる。様々な実施形態において、前記方法は、哺乳類がライム病菌に対するワクチン接種を受けたか及び/又は初期、中期あるいは慢性のライム病を有するかを同定することを提供する。本発明は、新規な単離されたライム病菌タンパク質およびそのフラグメントを含む組成物も提供する。本明細書で使用されるライム病の状態は、ライム病菌OspA、OspCおよびOspFを特異的に認識する抗体に関する哺乳類の抗体プロファイルに言及する。ライム病の状態を判定することは、前記哺乳類が以下のカテゴリーの一つに該当することの判定を含み得る;iライム病菌に対するワクチン接種を受けており、ライム病菌に感染していない;ii初期のライム病を有している;iii慢性のライム病を有している;ivライム病に対するワクチン接種を受けており、初期のライム病を有している;vライム病に対するワクチン接種を受けており、慢性のライム病を有している;vi中期のライム病を有している;viiライム病に対するワクチン接種を受けており、中期のライム病を有している;またはviiiライム病菌に対するワクチン接種を受けておらず、ライム病を有していない。本明細書中で使用される初期感染は、2~6週間の感染を意味する。慢性あるいは後期感染は、5か月以上の感染を意味する。中期の感染は、6週~5か月の感染を意味する。本発明の方法は、哺乳類におけるライム病の状態の決定に有用である。ある特定の実施形態において、前記哺乳類はウマ科の動物、イヌ科の動物あるいはヒトである。ウマ科には、分類学的な科によるウマ科のメンバーが含まれる。ある実施形態において、本発明によって診断されるウマ科の動物は馬である。イヌ科には、分類学的な科によるイヌ科のメンバーが含まれる。ある実施形態によって、本発明によって診断されるイヌ科の動物は飼い犬等の犬である。前記方法においてテストされる生体サンプルは、抗体を含むことが予期される生体サンプルのいずれであってもよい。前記生体サンプルは好ましくは生体液体である。様々な実施形態において、前記生体サンプルは、血液、血清あるいは脳脊髄液を含む。前記生体サンプルは、いずれかの適切な技術を用いて哺乳類から得ることができ、前記抗体の有無の決定に直接使用することができる。あるいは、前記サンプルは、生体サンプルを加工工程にかけることによって生体サンプルから得られたものであってもよい。一般に、ライム病の状態は、表1に示すマトリクスを使用して本発明に従って確認することができる。表中において、は、表示されたOsp抗原を特異的に認識する抗体の存在を意味し、-はそのような抗体の非存在を意味する。以下の記述および実施例からより完全に理解されるように、表1に示されたマトリクスは、多数の馬および犬から得られた非常に多くの生体サンプルをテストし、検証して作成された。表1は、本発明のいくつかの限定されない有用な態様を強調したデータの要約を説明する。例えば、OspA、OspCおよびOspFのそれぞれに対する抗体の有無が、ライム病の状態の最終的な評価を提供するのに重要であることが表1から明確である。特に、OspAのみに対する抗体の存在の決定は、ライム病菌感染に対する偽陽性を提供でき、また、初期および慢性の感染に対する偽陰性の結果も提供できることは明確である。同様に、OspAに対する抗体の非存在およびOspCに対する抗体の非存在のみの決定は、慢性の感染に対する偽陰性の結果をもたらす。さらに、感染していないことおよびワクチン接種されていないことの確定診断は、OspA、OspCおよびOspFのそれぞれに対する抗体の非存在を決定することによって、ライム病の他の抗体または指標を測定しなくても、行うことができる。このように、全3つのOspA、OspCおよびOspF抗原を対象とする抗体の状態を決定するという認識は、本発明の重要な特徴であり、従来の利用可能なテストを超える予期できない利益を提供する。これに関連し、本発明は、OspA、OspCおよびOspFのみに対する抗体を測定することによって、それゆえ他のライム病菌抗原に対する抗体を測定することなく、実施することができる。本発明の一実施形態において、BBK32タンパク質に対する抗体は測定されない。BBK32タンパク質は、米国特許公開公報20060034862号に記述されており、そのBBK32タンパク質の記述およびそのようなタンパク質を対象とする抗体の記述は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、前記方法は、OspA、OspCおよびOspFに特異的な抗体の有無を決定することによって、哺乳類におけるライム病の状態の診断を提供し、以下を含む:iOspAに対する抗体の存在の決定、および、OspCあるいはOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病菌に対するワクチン接種を受けているが、ライム病菌に感染していないことを確認する;iiOspCに対する抗体の存在の決定、および、OspAおよびOspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、初期のライム病を有することを確認する;iiiOspFに対する抗体の存在の決定、および、OspAおよびOspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、慢性のライム病を有することを確認する;ivOspAおよびOspCに対する抗体の存在の決定、および、OspFに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、初期のライム病を有することを確認する;vOspAおよびOspFに対する抗体の存在の決定、および、OspCに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、慢性のライム病を有することを確認する;viOspCおよびOspFに対する抗体の存在の決定、および、OspAに対する抗体の非存在の決定に基づき、前記哺乳類が、中期のライム病を有することを確認する;viiOspC、OspFおよびOpsAに対する抗体の存在の決定に基づき、前記哺乳類が、ライム病に対するワクチン接種を受けており、中期のライム病を有することを確認する;またはviiiOspC、OspFおよびOpsAに対する抗体の非存在に基づき、前記哺乳類が、ライム病菌に対するワクチン接種を受けておらず、ライム病を有していないことを確認する。本発明の様々な態様において、OspA、OspCおよびOspF抗体は、テスト抗体と考えることができる。ライム病の状態の判定のために、哺乳類から得られたまたは派生した生体サンプルから測定されたテスト抗体のレベルは、基準と比較されることができる。一実施形態において、本発明は、哺乳類から得られたまたは派生した生体サンプルにおいて、ライム病菌OspA、OspCおよびOspFに対する抗体のテストレベルを測定すること、および前記OspA、OspCおよびOspF抗体のテストレベルと基準との比較に基づき、前記哺乳類がライム病菌に対するワクチン接種を受けたか及び/又は初期、中期あるいは慢性のライム病を有しているかを同定することを含む、哺乳類のライム病の状態を診断するための方法を提供する。一実施形態において、前記基準は、前記テストサンプルにおける抗体の有無を決定するために使用される。基準は、テスト抗体のレベルを推定するために使用することもできる。前記基準は、テストサンプルと同時に確立されてもよく、あらかじめ確立されても、後で確立されてもよい。一般に、基準値は、関心のあるものの、異なるが既知の量の変数を使用することによって得られ、および当業者に既知の方法によって得ることができる。前記基準は、単一の値または範囲のある値であってもよい。例えば、基準はグラフ上の標準化曲線あるいはエリアであってもよい。ある特定の実施形態において、基準は、サンプル中の抗体が認識すると予期される既知の抗原を使用して得ることができる。前記抗原は好ましくは、テストサンプル中の抗体を測定するために使用される抗原である。一以上のレベルの前記抗原を、一以上のレベルのサンプル中に存在すると予想される抗体に暴露することによって、基準の単一値、値域、グラフ等を確立することができる。一実施形態において、前記基準は、ポジティブコントロールを含むことができる。一実施形態において、前記ポジティブコントロールは、前記テストサンプルのために使用されるのと同じプラットホームの上または中に位置する。例えば、前記ポジティブコントロールは側方流装置上にあってもよく、その上に、異なる位置及び/又はレベルの一以上の異なる抗原も配置される。この配置は、分析されるサンプル中にテスト抗体が存在するかしないかに関係なく、テスト条件下のコントロール基準からのシグナルをもたらし、テストが正しく機能していることの確認を提供できる。前記ポジティブコントロールは、例えばヒトあるいは機械によって知覚できるシグナルを産出できる。本発明の様々な態様において、前記ライム病菌抗原に対するテスト抗体レベルの定性的または定量的な測定を提供するために、前記テスト抗体を基準と比較することができる。いずれにしても、前記基準との比較によって、テスト抗体のレベルは、本発明の方法において分析されるサンプル中に存在している、あるいは存在していないと見なされることができる。基準は、それがシグナルを生成しないように、あるいはそれから生成した何らかのシグナルがバックグラウンドシグナルと見なされるように、構成されてもよい。典型的に、これはネガティブコントロールと見なされ、前記テスト抗体が結合することが予期される特定の抗原を除くすべての反応成分を含む。あるいは、前記ネガティブコントロールは、非特異的タンパク質あるいは抗原も含むことができる。ある実施形態では、前記抗体のレベルは、一以上の値域を含む基準と比較される。非限定的なある実施形態では、第一の基準値範囲に分類されるテスト抗体のレベルは、前記哺乳類のライム病の状態に関し有益なテスト抗体の高いレベルを示す。第二の基準値範囲に分類されるテスト抗体のレベルは、哺乳類のライム病状態に関し同様に有益なテスト抗体の低レベルを示す。第三の基準値範囲に分類されるテスト抗体のレベルは、追加テストを行う必要があることを示してもよい。値域からなる基準は、例えば、初期、慢性あるいは中期のライム病と確認された、あるいはライム病に罹患していないと確認された、及び/又はライム病に対するワクチン接種を受けていないと確認された哺乳類の各グループから得られる抗体の平均レベルを測定することによって、作成できる。何らかの適切な技術、装置、システム及び/又は試薬が、OspA、OspCおよびOspFライム病菌抗体、及び/又はその組み合わせを検出するために使用できる。一般に、抗体を検出する方法は、固体マトリクスと物理的に結合した、OspA、OspCおよびOspFタンパク質またはそのフラグメントを使用することを含む。前記タンパク質のフラグメントは、ライム病菌に対するワクチン接種によってまたはライム病菌の感染によって哺乳類中で製造される抗体によって認識されると予期されるフラグメントである。そのようなフラグメントのアミノ酸組成は、当該技術分野の通常の技術を使用して同定することができる。前記タンパク質及び/又はフラグメントは、ライム病菌から得られ、単離されあるいは誘導されてもよく、またそれらは多種多様の従来法のいずれかを使用して組換え技術によって製造されてもよい。OspA、OspCおよびOspFライム病菌タンパク質あるいはそれらのフラグメントが物理的に結合する前記固体マトリクスは、何らかの適切な固体マトリクスであればよい。前記固体マトリクスは、マルチウェルアッセイプレート、ビーズ、ミクロスフェア、フィルター材、側方流装置あるいはストリップ、あるいは前記タンパク質をある位置に保つのに好適で、それにより哺乳類から得られた生体サンプル中に存在するあるいは由来する抗体を捕獲し検出できる他の何らかのフォームもしくはフォーマット中に存在してもよく及び/又はその一部であってもよい。前記タンパク質は前記固体マトリクスと共有結合または非共有結合してもよい。一実施形態において、前記OspAタンパク質は、以下の配列番号1の配列あるいはそのフラグメントを有する:MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVLVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK一実施形態において、前記OspCタンパク質は、以下の配列番号2の配列あるいはそのフラグメントを有する:MKKNTLSAILMTLFLFISCNNSGKDGNTSANSADESVKGPNLTEISKKITDSNAVLLAVKEVEALLSSIDELAKAIGKKIKNDGSLDNEANRNESLLAGAYTISTLITQKLSKLNGSEGLKEKIAAAKKCSEEFSTKLKDNHAQLGIQGVTDENAKKAILKANAAGKDKGVEELEKLSGSLESLSKAAKEMLANSVKELTSPVVAESPKKP一実施形態において、前記OspFタンパク質は、以下の配列番号3の配列あるいはそのフラグメントを有する:MNKKMFIICAVFALIISCKNYATSKDLEGAVQDLESSEQNVKKTEQEIKKQVEGFLEILETKDLNKLDTKEIEKRIQELKEKIEKLDSKKTSIETYSEYEEKLKQIKEKLKGKADLEDKLKGLEDSLKKKKEERKKALEDAKKKFEEFKGQVGSATGVTTGHRAGNQGSIGAQAWQCANSLGLGVSYSSSTGTDSNELANKVIDDSIKKIDEELKNTIENNGEVKKE本明細書中に示された実施例に記述された分析で使用されたOspタンパク質のアミノ酸配列は新規である。特に、表2Aは、既刊のライム病菌Genbank配列との違いを示す。Genbank受入番号HM756743、HM756744およびHM756745と関連する前記ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本発明の遂行において決定され、2011年1月1日まで公的にアクセス可能にされなかった。このように、様々な実施形態においておよび表2Bで示すように、それらを対象とする抗体を捕獲するために本発明の方法で使用される前記Osp抗原は、本明細書中に記述されるOspAヌクレオチド配列の1~666ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列、及び/又はOspCヌクレオチド配列の52~636ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列、及び/又は本明細書に開示されたOspFヌクレオチド配列の178~684ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む。様々な実施形態において、本発明は、配列番号1、配列番号2または配列番号3の配列を含む単離されたあるいは組換えタンパク質を含む組成物を提供する。これらのタンパク質のフラグメントも提供され、含むフラグメントを含むが、それらに限定されない。前記タンパク質またはそのフラグメントは、本明細書中でさらに記述される組成物及び/又はキットの構成成分として提供されることができる。例えば、それらは、それらを特異的に認識できるライム病菌抗体の有無の決定のために使用できるシステム、装置あるいは組成物の一部として提供されることができる。一実施形態において、前記タンパク質は固体マトリクスと物理的に結合して提供されることができる。一実施形態では、前記固体マトリクスはビーズである。限定されない例において、ライム病菌に対する抗体は、何らかの免疫検出技術、スナップテスト、様々な種類のマルチプレックス抗体検出技術、あるいは関心のある抗体を検出するために適した分析の何らかの変更を含むが、必ずしもそれらに限定されないを使用して検出でき、互いから識別できる。一実施形態において、OspA、OspCおよびOspF抗原は、側方流動ストリップの上にあるいは側方流動ストリップとして構成された固体マトリクスと物理的に結合して別々の位置で提供される。哺乳類から得られたあるいは派生した生体サンプルは、ストリップを使用して分析できる。前記抗原の全てに対する抗体の非存在は、その哺乳類がワクチン接種を受けておらず、ライム病菌に感染していないことを示す。抗体の有無は、一般に表1に示されたマトリクスとの関連で解釈される。一実施形態において、OspA、OspCおよびOspFに対する抗体またはそれらの組み合わせは、蛍光ビーズに結合したOspA、OspCおよびOspF抗原を使用して検出される。前記蛍光ビーズは、適切な蛍光ビーズのいずれであってもよく、その例として、例えばルミネックス社から市販されているものが挙げられる。前記ビーズはそれぞれ、異なったあるいは同じ蛍光検出可能成分で標識されることができる。前記ビーズは、別個の抗原それぞれに結合したビーズが、互いに区別できるようにコード化されることができる。哺乳類から得られたあるいは派生した生体サンプル中に存在する抗体は、各ビーズタイプが結合する抗原によって、抗原結合蛍光ビーズに結合する。検出可能標識に結合された抗種特異的抗体は、OspA、OspCおよびOspF、あるいはそれらの組み合わせに対する抗体の有無を検出するために使用でき、その後、例えば、表1に記述したマトリクスに従ってライム病の状態を診断するために使用できる。本発明にかかる抗体を測定するためのマルチプレックス蛍光ビーズ解析のための説明に役立つ一例を図9に示す。図9から分かるように、組換えライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原が蛍光ビーズに結合され;サンプルが同時に全3つの蛍光ビーズとともにインキュベートされ;ビオチン化抗種特異的免疫グロブリン抗体が前記解析に添加され;ストレプトアビジンフィコエリトリンがレポーター色素として添加される。前記解析は、その後、個々のビーズ解析用の蛍光ビーズコードとレポーター色素を検出するマルチプレックスアナライザーにて測定される。ストレプトアビジンやビオチンやそれらの誘導体等の成分および他のレポーター色素は、マルチプレックス解析において同一または類似する機能を実行できる様々な市販の置換剤のいずれかで置換されることができる。蛍光ベースの抗体検出法から得られた出力データは、当業者に周知の様々な方法で表現されることができる。一実施形態において、蛍光ベースの抗体検出は、蛍光強度中央値として提示されることができる。本発明において、我々はあるMFI値の範囲が、ライム病の状態を決定するために使用できることを特定した。本発明での使用に好適なMFI値は、表3に記述されたものを含む。表3に記述される曖昧という結果は、前記サンプルを陰性または陽性に分類することができるように追加のテストを行うべきことを示している。一実施形態において、前記方法はウマのライム病の状態を判定するために実施される。この実施形態は、ウマから得られたあるいは派生した生体サンプル中で、OspA、OspCおよびOspF抗体の有無を決定することを含む。前記抗体の有無は、なんらかの適切な技術を使用して決定することができる。前記OspA、OspCおよびOspF抗原は、ウマから得られたあるいは派生した生体サンプルと接触させられる。前記抗原に対する抗体が存在すれば、前記抗原に結合し、それによって、抗原蛍光ビーズ複合体に固定化される。検出可能に標識化された抗ウマ特異的抗体が添加され、OspA、OspCおよびOspF抗体それぞれのMFI値を作成するために、蛍光ビーズおよび前記抗ウマ特異的抗体からの検出可能標識を検出するために、マルチプレックスアナライザーが使用される。前記抗体の有無が、表3に示されたウマの値に従って決定され、ライム病の状態が、表1に記述されたマトリクスによって決定される。同じ原理が、イヌから得られたあるいは派生した生体サンプルの分析に適用され、その際、表3に示されたイヌのサンプル用のMFI値が、抗体の有無を決定するために使用され、抗ウマ特異的抗体の代わりに抗イヌ特異的抗体が使用される。このようにして、OspA、OspCおよびOspF抗体のMFI値の測定に基づき、ウマあるいはイヌが、ライム病菌に感染しているか感染していないかが診断でき、さらに、ライム病菌に対するワクチン接種を受けているか、及び/又は初期、中期あるいは慢性のライム病を有しているかが確認できる。様々な実施形態において、本発明は、有形的表現媒体に前記抗体に関する決定を固定することをさらに含む。当該有形的表現媒体は、いかなるタイプの有形的表現媒体であってもよい。本発明は、動物の飼い主、ブリーダー、及び/又は動物のヘルスケア提供者に、ライム病感染を有すると判定された哺乳類の治療のための勧告を展開するために、前記有形的表現媒体を提供することを含む。本発明ではまた、前記抗体を測定するための装置も提供される。一実施形態において、前記装置は、固体マトリクスに物理的に結合したOspA、OspCおよびOspF抗原を含む側方流装置である。一実施形態において、前記OspA、OspCおよびOspFは、前記固体マトリクスに結合して提供される唯一のライム病菌抗原である。一実施形態において、前記装置に備えられた前記OspA、OspCおよびOspF抗原は、本明細書中に開示されたアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる。前記抗体の有無を検出するためのキットも提供される。一実施形態において、前記キットは、固体マトリクスに物理的に結合したOspA、OspCおよびOspF抗原を含む。一実施形態において、前記OspA、OspCおよびOspFは、前記キットに備えられる唯一のライム病菌抗原である。前記キットは、前記固体マトリクスとして蛍光ビーズを含んでも良い。前記キットはさらに、前記抗原及び/又は前記ビーズを一以上の別個のバイアル中に含んでも良い。前記キットは、任意で、前記キットの使用説明書を含んでも良い。以下の実施例は、本発明を具体的に説明することを目的とするものであり、限定を目的としない。本実施例は、イヌにおけるライム病の状態の判定に関し高い有用性を示す方法の一実施形態の説明を提供する。特に、本実施例において、我々はイヌ血清中のライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原に特異的な抗体の同時検出用の蛍光ビーズベースのマルチプレックス解析の開発と検証を記述する。前記検証は、マルチプレックス解析結果を、ライム病診断の推奨確認テストであるウエスタンブロット法と比較することによって行われた。本発明の他の利点の中で、本発明は、OspCが適切な診断マーカーではなかったと教示したイヌの過去の研究に反して、別のことをはっきり示す。特に、本実施例で示したテスト結果は、現在利用できるライム病テスト方法と比べて、イヌのライム病の状態の改良された判定を提供し、OspA、OspCおよびOspFに対する抗体を測定することによって、イヌの現在のワクチン接種および感染の状態のより良い決定を提供することができる。以下の材料および方法が、本実施例で示される結果を得るために使用された。ライム病菌遺伝子のクローニングライム病菌OspA、OspCおよびOspFタンパク質が、Ecoli中で発現され、マルチプレックス解析における抗原として使用された。DNAは、ニューヨークのウエストチェスター郡の森林地帯で採取された感染したシカダニ由来のライム病菌から単離された。完全なOspCおよびOspF遺伝子は、PfuDNAポリメラーゼを使用したPCRによって増幅された。OspCおよびOspFプライマーはそれぞれ、Genbank受入番号NC001903およびL13925からデザインされた。増幅のために使用されたプライマーのポジションが、括弧内に示されるOspCforward5’atgaaaaagaatacattaagtgc3’配列番号10;OspCreverse5’ttaaggtttttttggactttctgccac3’配列番号11;OspFforward5’atgaataaaaaaatgtttattatttgtgc3’配列番号12;およびOspFreverse5’ttattcttttttgacttctcc3’配列番号13。PCRは、前述の通り実施された。PCR産物は、pCR4TopoBluntベクター中でクローン化され、コーネル大学のバイオリソースセンターにてABI自動配列決定装置を使用して配列決定された。OspA遺伝子は、プラスミドOspApRSETから増幅された。前記クローン化した遺伝子の完全な翻訳領域のヌクレオチド配列は、Genbankに提出され、受入番号HM756743、HM756744およびHM756745にて受理された。ライム病菌遺伝子の発現と精製発現クローニングは、表2でも言及した以下のDNA配列に基づいて実施された。OspA、Genbank受入番号HM756743atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaatgttagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaaagttcttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaagcttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaagctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaagttttcaaagaagatggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtcatcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagcagacggaaccagacttgaatacacaggaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaagaggttttaaaaggctatgttcttgaaggaactctaactgctgaaaaaacaacattggtggttaaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagttttagttgaacttaatgacactgacagtagtgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcgggcacttcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaaaacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagttgaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaataa配列番号14MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVLVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTST配列番号15OspC、Genbank受入番号HM756744atgaaaaagaatacattaagtgcaatattaatgactttatttttatttatatcttgtaataattcagggaaagatgggaatacatctgcaaattctgctgatgagtctgttaaagggcctaatcttacagaaataagtaaaaaaattacggattctaatgcggttttacttgctgtgaaagaggttgaagcgttgctgtcatctatagatgagcttgctaaagctattggtaaaaaaataaaaaacgatggtagtttagataatgaagcaaatcgcaacgagtcattgttagcaggagcttatacaatatcaaccttaataacacaaaaattaagtaaattaaacggatcagaaggtttaaaggaaaagattgccgcagctaagaaatgctctgaagagtttagtactaaactaaaagataatcatgcacagcttggtatacagggcgttactgatgaaaatgcaaaaaaagctattttaaaagcaaatgcagcgggtaaagataagggcgttgaagaacttgaaaagttgtccggatcattagaaagcttatcaaaagcagctaaagagatgcttgctaattcagttaaagagcttacaagccctgttgtggcagaaagtccaaaaaaaccttaa配列番号16SCNNSGKDGNTSANSADESVKGPNLTEISKKITDSNAVLLAVKEVEALLSSIDELAKAIGKKIKNDGSLDNEANRNESLLAGAYTISTLITQKLSKLNGSEGLKEKIAAAKKCSEEFSTKLKDNHAQLGIQGVTDENAKKAILKANAAGKDKGVEELEKLSGSLESLSKAAKEMLANSVKELTSPVVAESPKKP配列番号17OspF、Genbank受入番号HM756745atgaataaaaaaatgtttattatttgtgctgtttttgcgttgataatttcttgcaagaattatgcaactagtaaagatttagaaggggcagtgcaagatttagaaagttcagaacaaaatgtaaaaaaaacagaacaagagataaaaaaacaagttgaaggatttttagaaattctagagacgaaagatttgaataaattggatacaaaagagattgaaaaacgaattcaagaattaaaggaaaaaatagaaaaattagattctaaaaaaacttctattgaaacatattctgagtatgaagaaaaactaaaacaaataaaagaaaaattgaaaggaaaggcagatcttgaagataaattaaagggacttgaagatagcttaaaaaagaaaaaagaggaaagaaaaaaagctttagaagatgctaagaagaaatttgaagagtttaaaggacaagttggatccgcgactggagtaactaccgggcatagagctggaaatcaaggtagtattggggcacaagcttggcagtgtgctaatagtttggggttgggtgtaagttattctagtagtactggtactgatagcaatgaattggcaaacaaagttatagatgattcaattaaaaagattgatgaagagcttaaaaatactatagaaaataatggagaagtcaaaaaagaataa配列番号18ETKDLNKLDTKEIEKRIQELKEKIEKLDSKKTSIETYSEYEEKLKQIKEKLKGKADLEDKLKGLEDSLKKKKEERKKALEDAKKKFEEFKGQVGSATGVTTGHRAGNQGSIGAQAWQCANSLGLGVSYSSSTGTDSNELANKVIDDSIKKIDEELKNTIENNGEVKKE配列番号19発現クローニングのために、OspA、OspCおよびOspFは、まずBamHIおよびKpnI制限酵素部位を有するプライマーを使用したPCRによって増幅された。前記遺伝子は、pQE30Xa発現ベクター内でクローン化され、1mMのIPTGの導入後、EcoliSG13009細胞内でHisタグタンパク質として発現された。前記バクテリアは、100mMのリン酸ナトリウム、10mMのトリスおよび8Mの尿素を含む、pH8の緩衝液中で溶解された。溶解物は、40mMのイミダゾール緩衝液で15に希釈され、前記Hisタグタンパク質は、AKTAFPLC機器を使用するHisTrapFFカラムを使用して精製された。タンパク質濃度は、BCAassayによって測定された。SDSPAGEおよびウエスタンブロット法SDSPAGE、ウエスタンブロット法および免疫ブロット法は、記述されているように行われた。手短に説明すれば、2~4μgレーンの組換えライム病菌タンパク質は、還元条件下で15のminigels中で分離された。ゲルが、クーマシーブリリアントブルーで染色されるか、タンパク質が免疫ブロット法用の膜に転写された。転写後、トリス緩衝液Tween20を含む中の5ノンファットドライミルクを使用して、ブロッキングステップが実施された。前記膜は、その後、5のノンファットドライミルクを含むトリス緩衝液で110に希釈されたイヌ血清とともにインキュベートされた。二次ペルオキシダーゼ結合ラビット抗ドッグIgG抗体が検出のために使用された。各抗体のインキュベーション後、膜はトリス緩衝液で三回洗浄され、抗体結合が、ECL化学発光法によって可視化された。さらに、マルチプレックス解析の検証のために使用された血清は全て、前述の通り、全細菌溶解物を使用した従来のライム病菌WBで試験された。蛍光ビーズと組換えライム病菌抗原のカップリング精製された組換えライム病菌タンパク質それぞれ計100μgが、蛍光ビーズにカップリングされた。OspAはビーズ33に、OspCがビーズ34に、OspFはビーズ37にカップリングされた。前記カップリングは、前記ビーズ供給者であるルミネックス社の推奨プロトコルに従って行われた。手短に説明すると、全手順は室温で行われた。全遠心分離ステップは、4分間14000xgで行われた。その後、前記ビーズは20秒間、ボルテックスおよび超音波処理によって再懸濁された。活性化のために、5×106ビーズはH2O中で一度洗浄された。ビーズは、100mMのリン酸ナトリウム緩衝液80μl中で再懸濁された。その後、10μlのSulfoNHSおよび10μ1の1エチル33ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩が添加され、20分間インキュベートされた。前記ビーズは、50mMのpH50の2Nモルホリノエタンスルホン酸で二回洗浄され、MES溶液中に再懸濁された。これらの活性化ビーズは、組換えライム病菌抗原のカップリングのために使用された。前記カップリングは、回転しながら3時間行われた。カップリング後、前記ビーズはブロッキング緩衝液1のBSAと005のアジ化ナトリウムを含むPBS中で再懸濁され、30分間インキュベートされた。前記ビーズは、01のBSA、002のTween20および005のアジ化ナトリウムを含むPBS中で3回洗浄され、カウントされ、2~8°Cの暗所で保管された。ルミネックス解析OspA、OspCおよびOspFと結合したビーズは、それぞれ、超音波処理され、混合され、およびブロッキング緩衝液で1×105ビーズmlの最終濃度に希釈された。前記解析のために、マイクロタイターウェルあたり5×103ビーズ/各々が使用された。全イヌ血清サンプルはブロッキング緩衝液で1600に希釈された。あらかじめテストされた、陰性、低陽性および高陽性のイヌ血清と、ブロッキング緩衝液のみでインキュベートされたビーズが、陽性および陰性コントロールとして各解析プレート上で用いられた。ミリポアマルチスクリーンHTSプレートが、ELx50プレートウォッシャーを使用するPBSTに2分間浸漬された。前記溶液は、前記プレートから吸引され、50μlの各コントロール血清あるいはサンプルが前記プレートに塗布された。その後、50μlのビーズ溶液が各ウェルに添加され、室温にて振盪機上で30分間インキュベートされた。前記プレートはPBSTで洗浄され、ブロッキング緩衝液で15000に希釈された50μlのビオチン化ラビット抗ドッグIgGが各ウェルに添加され、上記のように30分間インキュベートされた。洗浄後、ブロッキング緩衝液で1100に希釈された50μlのストレプトアビジンフィコエリトリンが添加された。プレートは上記のように30分間インキュベートされ、洗浄された。前記ビーズは100μlのブロッキング緩衝液中で再懸濁され、各プレートは、ビーズを再懸濁するために15分間振盪機上に置かれた。前記解析は、LuminexIS100instrumentで解析された。データは、蛍光強度中央値として報告された。血清サンプル全てのイヌ血清サンプルが、コーネル大学の動物健康診断センターに、ライム病菌に対する抗体の血清学的テストのために提出され、ライム病菌に対する抗体を検出するためにキネティックELISAでおよびWBによってテストされた。両方の解析は、ライム病菌の全細胞溶解物を使用しており、前述されている。二セットのイヌ血清サンプルが、この研究のために使用された。まず、ライム病菌に対する抗体のための利用可能なELISAおよびWB結果を有する79の血清サンプルが、各抗原に関するおよびシングルプレックスとマルチプレックス解析の結果の比較に関するビーズベース解析のコンディションを確立するために使用された。これら79のサンプルは、ELISAとWBにより陰性の結果から高陽性の結果にわたる同様の数のサンプルを提供するために選択され、これらの結果によれば、ワクチン接種及び/又は自然感染した犬からの血清を含んだ。第二に、あらかじめテストされなかった計188のイヌ血清サンプルが、さらなるマルチプレックス解析の検証のために使用された。全サンプルは、WBによって、ライム病菌抗原に対する抗体について平行して分析された。ブロット上の31kDa、22kDaおよび29kDaに対する血清抗体の存在あるいは非存在が、マルチプレックス解析結果を知らないオブザーバーによって盲検的に決定された。前記WB結果は、各抗原に対し相対的ゴールドスタンダードを提供し、受信者動作曲線分析のためにおよびマルチプレックス解析におけるライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体の解釈範囲を決定するために使用された。統計解析シングルプレックスおよびマルチプレックス解析フォーマットによって得られた結果の比較のために、全サンプルの対応するMFI値が、スピアマンの順位相関を算出することによって各ライム病菌抗原について比較された。マンホイットニー検定が、WBによってテストされた際それぞれの抗原に対し陰性あるいは陽性のいずれかであったサンプルに対するマルチプレックス解析のMFI値の違いを比較するために実施された。マンホイットニー検定は、ガウス近似、両側、95信頼区間および有意性カットオフとしてp<005を使用して実行された。マルチプレックス解析フォーマットにおける各ビーズ解析の感度および特異度を判定するために、各血清サンプルのWB結果および相対的ゴールドスタンダードとしての対応するタンパク質を使用して、マルチプレックス解析の使用によりそのサンプルおよび組換え抗原について得られたMFI値と比べることによって、ROC曲線が作成された。解釈範囲と、マルチプレックス解析における診断の感度および特異度を規定するために、尤度比解析が行われた。ROC曲線および尤度解析は、各抗原に対し別々に行われた。スピアマンの順位相関およびマンホイットニー検定は、GraphPadPrismprogramversion501を使用して行われた。ROC曲線は、MedCalcprogramversion112002010Fを使用して作成された。尤度解析は、Statistix902008を使用して行われた。結果ライム病菌抗原の発現ライム病菌OspA、OspCおよびOspFタンパク質の細胞外部分が、Ecoliで発現され、それぞれ333、194および169のアミノ酸サイズであった。結果として生じたrOspAタンパク質は、30kDaの計算分子量を有していた。30kDaでの対応する主タンパク質に加えて、22と42kDaの2つのより弱いタンパク質が、精製後に観察され、これはrOspAのアフィニティー精製の間に他のタンパク質が微量に混入したことを示唆する。計算分子量は、rOspCが175kDa、rOspFが152kDaであった。SDSPAGEによって見つけられたタンパク質は、rOspCが29kDa、rOspFが27kDaであり、両方のタンパク質の二量体形成を示唆する。蛍光ビーズベース解析の開発組換えライム病菌OspA、OspCおよびOspFタンパク質が蛍光ビーズにカップリングされた。プレテストされたイヌの血清サンプルが、各ビーズベース解析のコンディションを確立するために使用された。陽性と陰性コントロールが同定され、各解析プレートに含まれた。計79の血清は、その後個々の抗原を有するシングルプレックス解析と3つ全ての抗原を同時に使用するマルチプレックス解析で測定された。シングルプレックスとマルチプレックス解析の間のスピアマン順位相関は、093、088および096であった。マルチプレックス解析の平均バックグラウンド値は、血清無しの40ランで決定され、OspAとOspCの解析について10MFI未満、OspFについて80MFIであった。OspA、OspCおよびOspFのWBおよびマルチプレックス解析結果の比較188のイヌ血清から得られたWBおよびマルチプレックス解析結果が各タンパク質のために比較された。図3は、感染、ワクチン接種および非感染非ワクチン接種の犬血清から得られた従来法のWB結果を示す。OspAのマルチプレックスの結果が、WBの31kDaタンパク質の発生と比較され、OspCが22kDaタンパク質と、OspFが29kDaタンパク質と比較された。WB結果は、3つの抗原それぞれについて別々に陰性または陽性として分類された。WBによって、188の血清のうち、107が31kDaOspA抗原を検出し、39が22kDaOspCを検出し、82が29kDaOspFタンパク質を確認した。有意に高いMFI値が、陰性WB結果のものと比べてWB陽性血清を使用した3つ全てのライム病菌タンパク質のマルチプレックス解析において得られた。さらに、ライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原のためのROC曲線が、相対的ゴールドスタンダードとして188の血清のWB結果を使用して作成された。前記ROC曲線は、OspA、OspCおよびOspFについてマルチプレックス解析とWB結果の間の高い一致を示した。マルチプレックス解析結果の解釈マルチプレックス解析におけるライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原の解釈範囲を決定するために、尤度解析が実施された。前記解析は、血清学的解析は大抵、ゴールドスタンダードと比較した際、いくらの偽陽性および偽陰性の結果をもたらすということを考慮した。これは、高い非特異的結合を示すある種の血清の性質によって、準最適なゴールドスタンダードによって、あるいは比較される解析の分析感度の違いによって、引き起こされる可能性がある。このようにして、陰性、曖昧および陽性の解釈範囲が各抗原について決定された。表5は、解釈範囲、陽性テストの尤度比およびイヌ血清におけるライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原のそれぞれに対する抗体のマルチプレックス解析の診断感度と特異度を示す。マルチプレックスフォーマットにおけるOspA、OspCおよびOspF解析の診断特異度は、それぞれ90、89および86であった。診断感度は、83、62および82であった。前述したことから明らかなように、本実施例において、我々はライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原に対する血清抗体を同時に検出するため、新しいマルチプレックス解析の開発と検証を実証する。前記マルチプレックス解析は、ELISAとWBの現在のテスト手順を一つのテストにまとめ、且つ、ワクチン接種または感染のためのマーカーとして個々のライム病菌抗原を区別する。ELISAとその後に続くWBは、今なお、ライム病菌に対する抗体を検出するためのゴールドスタンダードであると考えられている。ライム病菌の全細胞溶解物について行われるELISAは、高い診断感度を有するが、かなり低い診断特異度を有していた。全細胞溶解物を使用する偽陽性のELISA結果は、血清抗体と、他のバクテリアの対応するタンパク質と高い相同性を共有するスピロヘータタンパク質との反応によって引き起こされた。本願で開発されたマルチプレックス解析が、ライム病菌の新規の組換えタンパク質を使用したことは、新しい解析における交差反応の可能性を減少させた。ここで、我々は、特異的ライム病菌抗原に対するWB結果と、対応するOspA、OspCおよびOspF抗原に対するマルチプレックス結果を比較した。前記ROC曲線解析は、2つのテストの間の非常に良好な関連性を示した。しかしながら、WBとマルチプレックス解析の間の不一致が観察された。この不一致について考えられる説明として、WBは一般的に、特異的なバンドが存在するか否かの観察者の主観的な解釈に依存するということが挙げられる。WBの解釈は、ブロット展開における日差変動によっても影響され得る。WBの分析感度は、ELISAのそれより低く、マルチプレックス解析の分析感度よりはるかに低い。したがって、低濃度のライム病菌に対する抗体を含む様々な血清は、WBによって検出されなかったが、マルチプレックス解析によって識別されたと考えられる。WBと比較したマルチプレックス解析の分析感度の増加に加えて、ブロット上のいくつかのバンドも誤解釈される可能性がある。例えば、ライム病菌は、WB上で22kDa付近に現れる2つのタンパク質である、OspCと22kDaのさらなるタンパク質を発現する。一般に、ライム病菌の粗製調製物がWBのために使用されるため、OspCに対する抗体の分析は、サンプル中の22kDaタンパク質に対する抗体の存在によって複雑になり得る。結果的に、WBによって同定される22kDaのバンドは、OspCに対する抗体と常に対応しているわけではない可能性がある。これは、我々がビーズベースOspC解析とWB結果の間で観察した低い一致を説明できる。したがって、OspCマルチプレックス解析の真の診断特異度と感度は、WBによって検出される22kDaのタンパク質との比較によって計算されるものより高いと思われる。全体的に見て、我々は、WBはライム病菌に対する抗体を検出する他の解析を検証するための相対的ゴールドスタンダードであり得るだけであると結論を出した。188のイヌ血清サンプルからなるセットを使用して、我々は、OspCおよびOspFに関するWB陽性サンプルの総数について、高い相違を観察した。これは、ライム病菌抗原の差次的発現および結果として生じる上述のホスト抗体応答に一致している。前記サンプルは、診断分野の提出に由来するものであり、したがって、これらの犬の感染及び/又はワクチン接種の時期は知られていなかった。我々は、前記血清サンプルに応じて、OspCもしくはOspFのいずれか又は両方に対する抗体がマルチプレックス解析によって検出できることを観察し、このことは、これらの細胞表層タンパク質検出パターンがライム病菌による感染の異なる段階の指標となることを示唆する。このように、OspCとOspF抗原に対する異なった抗体パターンは、前記犬においてライム病菌への暴露が生じた時期の指標となる。このような改良された感染段階の判定は、治療法の決定および治療成功の予測に役立つと思われる。このように、ライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体の検出のために本実施例において記述されたマルチプレックス解析は、ライム病菌への感染及び/又はワクチン接種の結果生じた抗体の指標となるイヌ血清中の抗体を測定するための、定量的、経済的および鋭敏な代替手段を提供する。本実施例は、ウマにおいてライム病の状態を判定するための高い有用性を実証する方法の一実施形態に関する説明を提供する。馬のためのマルチプレックス解析は、実施例1のイヌのライム解析について前述したように、ワクチン接種及び/又は初期もしくは慢性の感染のマーカーとして、OspA、OspCおよびOspFを使用する。一般に、マルチプレックス解析は、生体サンプルにおける可溶性分析物の同時検出の原理を使用する。それらは、前記解析のマトリクスを提供する個々の抗原と結合した蛍光ビーズをベースとする。ELISAはngml濃度、WBはμgml濃度を検出するのに対し、マルチプレックス解析は、典型的にはpgml範囲の抗体を検出する。このように、馬のための新しいライムマルチプレックス解析は、ライム病菌による感染あるいはライム病菌に対するワクチン接種に関する特異的マーカータンパク質に基づいており、また、抗体の濃度が低い状況において有利であると思われる。以下の材料および方法が、本実施例に示す結果を得るために使用された。組換えライム病菌タンパク質および蛍光ビーズへのカップリングライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原は、Ecoli中で発現され、実施例1で説明したように、蛍光ビーズにカップリングされた。OspAはビーズ33に、OspCはビーズ34に、OspFはビーズ37にカップリングされた。前記カップリングは、ビーズ提供者の推奨プロトコルに従って実施された。マルチプレックス解析マルチプレックス解析は、以下の変更を伴い、実施例1のイヌ血清サンプルについて前述した通りに行われた:ウマ血清サンプルは、1400に希釈された。血清抗体の検出のために、ビオチン化ヤギ抗ウマIgH抗体が13000の希釈にて使用された。全ての他の試薬、緩衝液およびインキュベーション工程は、先に述べた手順と同一である。当該解析は、LuminexIS100instrumentで分析された。データは蛍光強度中央値として報告された。馬の血清全てのウマ血清サンプルは、コーネル大学の動物健康診断センターに、血清学的なライムテストのために提出され、ライム病菌に対する抗体を検出するためにキネティックELISAそしてそれに続くWBによってテストされた。両方の解析は、ライム病菌の全細胞溶解物を使用し、前述したように行われた。二セットのウマ血清サンプルがこのアプローチのために分析された:まず、ライム病菌に対する抗体のための利用可能なELISAおよびWB結果を有する81のウマ血清サンプルが、各抗原のためのおよびシングルプレックスとマルチプレックス解析を比較するための、ビーズベース解析のコンディションを確立するために使用された。これら81のサンプルは、ELISAとWBによって同定される陰性から高陽性の解釈範囲内の同様の数のサンプルを提供するために選択され、ワクチン接種及び/又は自然感染した馬の血清を含んだ。第二に、前もってテストされなかった計562のウマ血清サンプルが、さらなるマルチプレックス解析の検証のために評価された。これらのサンプルは、2008年7月と2009年6月の間にコーネル大学の動物健康診断センターに提出された。全てのサンプルは、ライム病菌抗原に対する抗体についてもWBによって分析された。ブロット上の31kDa、22kDaおよび29kDaに対する血清抗体の存在あるいは非存在が、マルチプレックス解析結果を知らないオブザーバーによって盲検的に判定された。統計解析第一セットの血清サンプルから得られたMFI値が、シングルプレックスとマルチプレックス解析フォーマットによって分析され、スピアマンの順位相関を算出することによって各ライム病菌抗原について比較された。マンホイットニー検定が、WBによってテストされた際それぞれの抗原に対し陰性あるいは陽性のいずれかであったサンプルに関するマルチプレックス解析のMFI値における違いを比較するために実施された。マンホイットニー検定は、ガウス近似、両側、95信頼区間および有意性カットオフとしてp<005を使用して実行された。スピアマンの順位相関およびマンホイットニー検定は、GraphPadPrismprogramversion501を使用して行われた。第二の血清サンプルセットのために、前記WB結果が、受信者動作特性曲線解析における相対的ゴールドスタンダードとして使用され、マルチプレックスMFI値と比較された。この解析は、WBが本当に真のゴールドスタンダードであると想定した。尤度比解析は、ライム病菌OspA、OspCおよびOspF抗原に対する抗体の解釈範囲およびマルチプレックス解析の診断感度と特異度を規定するために行われた。ROC曲線と尤度解析は、各抗原について別々に行われた。ROC曲線は、MedCalcprogramversion112002010を使用して作成された。尤度解析は、Statistix902008を使用して行われた。第二の血清サンプルセットは、真のゴールドスタンダードが利用できない場合に分析性能の解析のために使用できるベイズ統計アプローチのためにも使用された。その乏しい分析感度および特異的なバンドが存在するか否かの分析におけるその主観的な構成要素のため、ライム抗体検査において、WBは相対的ゴールドスタンダードとして考慮されることができるのみである。前記データは、新しいライムマルチプレックス解析およびWBの両方のテストに対する診断特異度、感度および陽性カットオフ値を特定するためにベイズモデルを使用して分析された。ベイズ的アプローチは、異なる有病率の疾患指標を有する2つのグループを必要とした。さもないとパラメーターを推定するために使用されたベイズモデルは同定不可能になる。したがって、血清サンプルは、人為的に2つのグループに分けられた。2008年7月と12月の間に収集された全サンプルは、グループ1に割り当てられ、2009年1月と6月の間に収集された全サンプルは、グループ2とされた。この分類は、ライム病の指標としてのライム病菌に対する抗体の保有率が、年の最初の6か月の期間より7月から12月により高いという前提に基づいた。前記解析は、この前提が、OspCとOspFに対する抗体について真実であることを示したため、前記解析が行われた。OspAについては、前記2グループ間の保有率は同様に低く、ベイズ的アプローチはOspA解析のために使用できなかった。結果ライム病菌に対する抗体を検出するためのウマのマルチプレックス解析の開発ライム病菌に対する抗体を含むあるいは含まない計81のプレテストされたウマ血清が、蛍光ビーズベース解析のコンディションを確立するために使用された。ビーズは、ライム病菌の組換えOspA、OspCあるいはOspF抗原と結合された。これらの抗原に対する血清抗体の測定値は、個々のビーズについての解析を行うことによっておよびマルチプレックス解析によっても比較された。ライム病菌に対する抗体のマルチプレックスおよびシングルプレックス解析結果は、高度に相関した。個々の抗原比較用のスピアマンランク値は、OspA、OspCおよびOspFについて、それぞれ077、083および096であった。マルチプレックス解析のためのバックグラウンド値は、OspAとOspCについて10MFI未満であり、OspFについて100MFI未満であった。前記81の血清サンプルは、OspAについて347~21650、OspCについて75~3842、およびOspFについて192~23209の間のMFI値をもたらし、ライムマルチプレックス解析の広いダイナミックレンジが確認された。ウマのライムマルチプレックス解析の検証OspA、OspCおよびOspFに対する抗体のマルチプレックス解析の検証が、計562の馬の血清に対する、マルチプレックスの結果と、WBによって得られた対応する結果を比較することによって行われた。WBによって、OspCとOspFに対する抗体が、ダニ咬傷後ライム病菌に感染した馬において検出できる。OspAに対する抗体は、ライム病に対するワクチン接種後に発生すると考えられる。マルチプレックス解析によって得られたMFI値は、WB陰性および陽性の血清サンプルと比較された。これは、個々の抗体それぞれについて、WB陰性サンプルよりもWB陽性サンプルにおいて明確に高いMFI値を示した。全MFI値におけるこれらの明確な差にもかかわらず、前記解析は、WB陰性および陽性サンプルのMFI値間の重複も示し、これは様々な統計アプローチによるマルチプレックス解析のカットオフ値のさらなる評価を要求した。相対的ゴールドスタンダードとしてWBを使用する解析WBは、その相対的に乏しい分析感度およびWB評価に含まれる主観的な構成要素のため、相対的ゴールドスタンダードとして考慮されることができるのみである。それにもかかわらず、ROC曲線が、個々のOspA、OspCあるいはOspF解析に対するマルチプレックス解析結果を、WB上の対応するバンドの存在または非存在と比較することによって作成された。ROC曲線下のエリアは、OspAで0765、OspCで0773およびOspFで0738であった。WB陰性およびWB陽性サンプルの量複するMFI値のために、我々は各ビーズベース解析について、3つの解釈範囲を確立するために尤度比解析も実施した。診断感度と特異度の値は、尤度解析の陽性カットオフ値に基づいても計算された。ベイズモデルを使用する真のゴールドスタンダードが無い場合の解析の妥当性WBは、複数の解釈の間違いをもたらす可能性も非常に高いということを考慮し、我々は、比較される両方のテストについて診断感度と特異度を推定するベイズ的アプローチを使用してもう一つの解析を行った。前記解析は、異なる罹患率を有する二つの実験群を必要とした。前記データは、1年の間に提出されたサンプルから得られ、それらは人為的に7月~12月の間に提出された血清および1月~6月の間に提出されたサンプルに分類された。前記解析は、グループ1で、ライム病菌に対する抗体の保有率が、2つの感染マーカーOspCとOspFについてはより高いが、ワクチン接種マーカーOspAについてはそうではないことを確認した。したがって、前記モデルは、OspCとOspFに対する抗体のための結果について実行されることができただけであり、2つの独立したテストとしてビーズベース解析とWBを比較した。OspCに対する抗体について、ビーズベース解析は80の診断感度と79の診断特異度をもたらした。OspCWBは、わずか72の感度と92の特異度を有した。OspFに対する抗体については、ビーズベース解析の感度は86であり、特異度は69であった。OspFWBは、80の感度と77の特異度を有した。前記ベイズ解析は、より多数の偽陰性が、マルチプレックス解析よりもWBによって得られることを示した。WBのより高い特異度の値は、このテストによって検出された偽陽性の数の低さを示していた。OspCとOspFのビーズベース解析のためのカットオフ値は、それぞれ、813と1270MFIであり、これは尤度解析によって規定される曖昧あるいは非常に低い陽性解釈範囲に該当する。前述したことから明らかなように、本実施例において、我々は、ライム病の指標となる抗体を検出するための新しいマルチプレックス解析を開発するために、Ecoliによって発現されたライム病菌のOspA、OspCおよびOspF抗原を使用した。新マルチプレックス解析の検証における大きな課題は、カットオフ値、解釈範囲、および診断の感度と特異度の値を確立するための真のゴールドスタンダードが存在しないことであった。ライム病菌に対する抗体の検出について、WBは、確認テストおよび、血清学的ライム病診断のための最も優れた利用可能なスタンダードと考えられる。テスト検証のためのゴールドスタンダードとしてWBを使用することは、この方法についての100の診断感度と特異度を前提とする。この事実に基づけば、新しいテストが、従来のゴールドスタンダード法を使用する既存のテストより優れていることはありえない。しかしながら、WBは定性的なテストであり、分析感度、ブロット展開における日差変動、および、経験豊かな評価者によってさえバンドの誤解をもたらし得るその主観的な評価に関し、限界を有する。WB結果の解釈は、非常に高い抗体価を有するサンプルについては、あるいは、実験的に感染させた隔離されたウマでは単純であるが、感染歴が不明な臨床的状況では及び/又はライム病菌に対する抗体レベルの低い血清については、より困難である。WBとマルチプレックステクノロジー間の分析感度の予想される違いとともに、WB評価のこれらの特徴は、新ライムマルチプレックス解析を検証するための異なる統計アプローチを我々に探索させた。従来のROC曲線と尤度比解析は、WBが真のゴールドスタンダード、すなわち100正確であるという前提の下で行われた。ベイズモデルアプローチは、ゴールドスタンダード不在の中で診断解析を分析でき2006年、Wang他;2007年、Wang他且つWBとマルチプレックス解析を同等のテストとして比較できる。それゆえ、前記分析は、両方の解析に対し診断の感度と特異度のデータをもたらした。2つのテストがそれらの分析感度の点で明らかに広範囲において異なるので、これら全ての前提は必ずしも正しくないかもしれないが、ベイズ解析は、WBが真のゴールドスタンダードではない、すなわち100正確ではないということを考慮することによって、より正確に新マルチプレックス解析の診断感度と特異度を推定することを可能にした。その結果として、前記ライムマルチプレックス解析の診断感度および特異度の値は、相対的ゴールドスタンダードアプローチよりも、前記ベイズ法においてより高かった。従来のゴールドスタンダード分析は、OspCおよびOspFビーズベース解析の感度として56と72、特異度として86と67の値をそれぞれ示した。上記のWBに関する議論に基づいて、これらの値は前記マルチプレックス解析の真の特異度および感度を過小評価した可能性がある。前記ベイズモデルは、WBに関する後者の記載を確認し、OspCおよびOspFビーズベース解析と比較べてWBのより低い診断感度とより高い診断特異度を算出した。前記ベイズ解析は、マルチプレックス解析においてOspCについて80、OspFについて86の診断感度をもたらした。前記マルチプレックス解析の診断感度の値は、従来のゴールドスタンダードアプローチと比べて明らかに改善され、且つ、WBと比べたマルチプレックス解析による抗体検出の改善した分析感度のため、実際の診断感度の値をより反映する。ベイズ解析を使用するマルチプレックス解析の診断特異度は、OspCについて79、OspFについて69であったが、これは計算に基づくゴールドスタンダードと比べてOspFについて改善され、OspCについてはわずかに低い。OspC解析の特異度の値が違う理由は、ベイズ的アプローチの計算におけるOspCに対するより低いカットオフ値を適用する2つの統計的手法によるOspCのカットオフ値がより大きく違うためである。ゴールドスタンダードおよびベイズ解析は、OspCおよびOspFに対する抗体のカットオフ値を確立するためにも使用された。OspCに関し、尤度比解析は、>1000MFIの陽性カットオフ値を示し、ベイズ的アプローチは、813MFIといったさらに低いカットオフ値さえ確認した。OspFに関し、尤度解析は、ベイズ的アプローチでの1270MFIカットオフとほぼ同一の最適陽性カットオフとして>1250MFIを見出した。我々のサンプルセットに関し、OspCについて約10000およびOspFについて>25000のMFI値をもたらしたマルチプレックス解析の広いダイナミックレンジを考慮すると、示されたカットオフ値はウマ血清におけるライム病菌に対する抗体の詳細な定量分析を可能にするこのテストの広いダイナミックレンジを裏付けた。広い動的定量範囲は、かなり狭い線形の定量範囲を有するELISA等の現存する定量テストに比べて、前記マルチプレックスアプローチの重要な利点である。我々の経験では、増加した線形のダイナミックレンジの最も重要な利点は、血清が、マルチプレックス解析において単一の希釈で使用でき、および結果がほとんどの場合、前記解析の線形の定量範囲に属することである。現在の従来型ライムELISAは、ほぼ全ライム病菌溶解物に基づいており、感染とワクチン接種とを区別しない。これらの解析は、溶解混合物中の共通の細菌成分に対する非特異的交差反応性のリスクを負った。したがって陽性の場合、これらの解析は、定性的WB等の第二の確認テストを必要とする。抗体の定量が要求される状況では、テストは通常2つのテスト;第一に、抗体の減少を確認するための定量的ELISA、および、第二に、その現象がライム病の指標となる抗体に特異的であることを確認するためのWBテストを要求する。他のオンサイドまたはELISAに基づくテストは、ライム病原体を有する馬の感染とよく相関することが発見された。しかしながら、C6に対する抗体が早期に検出される、または、従来のライム病菌ELISAによって検出される抗体と比べてより急速に低下するようには見えなかった。WBと新マルチプレックスライム解析の両方が、ライム病菌による自然感染から生じた抗体と、ワクチン接種後に発生した抗体とを区別できる。後者の応答は、ヒト、実験齧歯動物、イヌについておよび馬についても頻繁に記述されているように、ライム病菌のOspA抗原に対する抗体の高い値を特徴とする。馬に使用するための認可されたライムワクチンは現在存在していない。それゆえ、イヌ用のワクチンが時々、ライム病が風土病の地域において小屋で飼われている馬のために使用されている。認可ワクチンが存在しないことは、我々のサンプルセットにおけるOspA陽性のウマ血清が全体的に低い数であることを説明する。2つのグループ間でOspAに対する抗体の保有率が同様であったため、ベイズモデルは、OspAに対する抗体のためのこのデータセットについて実行できなかった。ワクチン接種がいつでも実施でき、環境中の感染ダニの発生に依存するライム病菌感染のように必ずしも季節的なピークに追随しないので、これは当然のことである。風土病地域の小屋で飼われたワクチン接種済みの馬に対し、ワクチン接種力価の定量的な評価は、これらの馬についてライム病を防止するためにワクチンを再接種するか否かの決定を方向付けることができる重要な情報である。新マルチプレックス解析は、ワクチン接種マーカーOspAに対する抗体反応を定量化する初めての利用可能なテストであり、ワクチン接種に対する宿主応答と感染に対する宿主応答を区別することもできる。ワクチン応答は、使用したワクチンによって、OspAのみに対する、あるいはOspAとOspCに対する抗体によって特徴づけられることができる。OspFは、現在利用できるワクチンには含まれておらず、それゆえ、たとえその馬がワクチン接種を受けていたとしても感染用マーカーのままである。要約すれば、ウマのための新ライムマルチプレックス解析を検証するための2つの統計アプローチの使用は、感染マーカーOspCおよびOspFに対して、よく似たカットオフおよび診断感度と特異度の値をもたらした。前記分析は、WBの最初の診断感度と特異度の評価、ライム病菌に対する抗体分析用の伝統的なゴールドスタンダードももたらした。マルチプレックス解析の総合的性能は、それがWBに比べて、期待できる向上した分析および診断に関する感度を有する有益なテストであることを示した。馬のための新ライムマルチプレックス解析は、ウマにおけるライム病感染及び/又はライム病に対するワクチン接種の指標となる抗体を検出するための、有益で、素早く、鋭敏でかつ定量的なツールを提供する。本発明は、実例となる実施例を通して説明されてきたが、当業者に明らかな通常の変更は、本発明の範囲内であることが意図される。