"末端β-ガラクトース残基を有すること及びヒト様糖タンパク質においてフコース残基及びシアル酸残基が本質的に欠失していることを特徴とするヒト様タンパク質を産生する組換え型下等真核宿主細胞。前記宿主細胞がβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を発現する、請求項1に記載の宿主細胞。前記宿主細胞がUDP-ガラクトース輸送活性を発現する、請求項1に記載の宿主細胞。前記宿主細胞がUDP-ガラクトースの上昇したレベルを呈する、請求項1に記載の宿主細胞。β-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をコード化する単離された核酸分子と、UDP-ガラクトース輸送活性、UDP-ガラクトースC4エピメラーゼ活性又はガラクトキナーゼ活性又はガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性をコード化する少なくとも1つの単離された核酸分子とを含む、ヒト様糖タンパク質を産生する組換え型下等真核宿主細胞。前記UDP-ガラクトース輸送活性がSpUGT、hUGT1、hUGT2及びDmUGTからなる群から選択される遺伝子によってコード化されている、請求項3又は請求項5に記載の宿主。前記UDP-ガラクトースC4エピメラーゼ活性がSpGALE、ScGAL10及びhGALEからなる群から選択される遺伝子によってコード化されている、請求項4又は請求項5に記載の宿主。ヒト様糖タンパク質を産生する組換え型下等真核宿主細胞であり、前記宿主細胞は末端GlcNAc残基を含む糖タンパク質のN結合したオリゴ糖分岐鎖へとβ-ガラクトース残基を転移でき、前記N-結合したオリゴ糖分岐鎖は、トリマンノース中心上にあるGlcNAcβ1,2-Manα1,3、GlcNAcβ1,4-Manα1,3、GlcNAcβ1,2-Manα1,6、GlcNAcβ1,4-Manα1,6、及びGlcNAcβ1,6-Manα1,6からなる群から選択される、前記宿主細胞。シアル酸に対する受容体基質である糖タンパク質を産生される、請求項1において生じる組換え型下等真核宿主細胞。前記宿主細胞が、前記糖タンパク質上のグリカンに関して1,6マンノシルトランスフェラーゼ活性を惹起する点において弱められている、請求項1、請求項5又は請求項8のいずれか1項に記載の宿主。前記宿主細胞が、ドリチル-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-ドリチルα-1,3-マンノシルトランスフェラーゼ活性において低下されている又は欠失されている、請求項1、請求項5又は請求項8の何れか1項に記載の宿主。該宿主細胞がα1,2-マンノシダーゼI活性、マンノシダーゼII活性、マンノシダーゼIIx活性及びクラスIIIマンノシダーゼ活性から選択されるマンノシダーゼ活性を発現する、請求項1、請求項5又は請求項8のいずれか1項に記載の宿主。該宿主細胞がGnTI、GnTII、GnTIII、GnTIV、GnTV、GnTVI及びGnTIXからなる群から選択されるGnT活性を発現する、請求項1、請求項5又は請求項8のいずれか1項に記載の宿主。前記宿主細胞が、ピキアパストリスPichiapastoris、ピキアフィンランディカPichiafinlandica、ピキアトレハロフィラPichiatrehalophila、ピキアコクラマエPichiakoclamae、ピキアメンブラナエファシエンスPichiamembranaefaciens、ピキアミニュータPichiaminutaオガタエアミニュータOgataeaminuta、ピキアリンドネリPichialindneri、ピキアオプンティアエPichiaopuntiae、ピキアサーモトレランスPichiathermotolerans、ピキアサリクタリアPichiasalictaria、ピキアグエルキュームPichiaguercuum、ピキアピジュペリPichiapijperi、ピキアスティプティスPichiastiptis、ピキアメタノリカPichiamethanolica、ピキア種Pichiasp.、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、サッカロミセス種Saccharomycessp.、ハンゼヌラポリモルファHansenulapolymorpha、クルイベロミセス種Kluyveromycessp.、クルイベロミセスラクティスKluyveromyceslactis、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、アスペリギルスニドウランスAspergillusnidulans、アスペリギルスニガーAspergillusniger、アスペルギルスオリゼAspergillsoryzae、トリコデルマリーゼイTrichodermareesei、クリソスポリウムラックノウエンスChrysosporiumlucknowense、フサリウム種Fusariumsp.、フザリウムグラミネウムFusariumgramineum、フザリウムベネナツムFusariumvenenatum、フィスコミトレラパテンスPhyscomitrellapatens及びノイロスポラクロッサNeurosporacrossaからなる群から選択される、請求項1、請求項5又は請求項8のいずれか一項に記載の宿主。末端β-ガラクトース残基を有し、前記糖タンパク質上にフコース残基及びシアル酸残基が本質的に欠失していることを特徴とするヒト様糖タンパク質を含む組成物。前記糖タンパク質が、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAc2Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man5GlcNAc2、GalGlcNAc3Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man5GlcNAc2及びGal3GlcNAc3Man5GlcNAc2からなる群から選択されるN結合したオリゴ糖を含む、請求項15に記載の組成物。前記糖タンパク質が、エリスロポエチン、例えば、サイトカイン、インターフェロン-a、インターフェロン-b、インターフェロン-g、インターフェロン-w及び顆粒球-CSF、GM-CSF、例えば、凝固因子、第VIII因子、第IX因子及びヒトタンパク質C、抗トロンビンIII、トロンビン、可溶性IgE受容体a鎖、IgG、IgG断片、IgG融合体、IgM、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、及び尿素トリプシン阻害剤、IGF結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンV融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子-2、骨髄系前駆体阻害因子-1、オステオプロテジェリン、a-1-抗トリプシン、a-胎児タンパク質、DNaseII、ヒトプラスミノーゲンのクリングル3、グルコセレブロシダーゼ、TNF結合タンパク質1、卵胞刺激ホルモン、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4-Ig、膜貫通活性化因子及びカルシウム調節因子及びサイクロフィリンリガンド、可溶性TNF受容体Fc融合体、グルカゴン様タンパク質1、IL-2受容体アゴニストからなる群から選択される、請求項15に記載の組成物。内在性レベルを上回ってUDP-ガラクトースを産生する段階を含む、下等真核宿主細胞におけるヒト様糖タンパク質を産生するための方法。請求項18に記載の方法によって作製された宿主細胞。フコース残基及びシアル酸残基のない状態においてハイブリッド又は複雑な糖タンパク質上にガラクトース残基を転移させる段階を含む、下等真核宿主細胞においてヒト様糖タンパク質組成物を作製するための方法。前記ガラクトース残基が、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2、GlcNAc5Man3GlcNAc2GlcNAc6Man3GlcNAc2、GlcNAcMan4GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAc2Man5GlcNAc2及びGlcNAc3Man5GlcNAc2からなる群から選択される糖タンパク質上へ転移される、請求項20に記載の方法。前記転移段階が、β-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をコード化する遺伝子又はβ-ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒作用活性のある断片を発現させることをさらに含む、請求項20に記載の方法。前記ガラクトシルトランスフェラーゼ活性がヒトGalTI、GalTII、GalTIII、GalTIV、GalTV、GalTVI、GalTVII、ウシGalTI、アフリカツメガエルX.leavisGalT及び線虫C.elegansGalTIIからなる群から選択される、請求項22に記載の方法。前記転移段階が、UDP-ガラクトース輸送活性を発現させることをさらに含む、請求項20に記載の方法。前記UGTがS.ホムベS.pombeUGT、ヒトUGT1、ヒトUGT2、及びキイロショウジョウバエD.melanogasterUGTからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。前記転移段階が、UDP-ガラクトースC4エピメラーゼ活性をコード化する遺伝子を発現させることをさらに含む、請求項20に記載の方法。前記エピメラーゼ活性がS.ポムベS.pombeGalE、S.セレビシエS.cerevisiaeGal10及びヒトGalEからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。少なくとも33ガラクトシル化された糖タンパク質組成物が作製される、請求項20ないし請求項27のいずれか1項に記載の方法。少なくとも60ガラクトシル化された糖タンパク質組成物が作製される、請求項20ないし請求項27のいずれか1項に記載の方法。少なくとも90ガラクトシル化された糖タンパク質組成物が作製される、請求項20ないし請求項27のいずれか1項に記載の方法。請求項20ないし請求項27の何れか1項によって作製された糖タンパク質組成物。前記糖タンパク質組成物がシアル酸に対する受容体基質である、請求項20ないし請求項27の何れか1項によって作製される糖タンパク質組成物。前記糖タンパク質がエリスロポエチン、サイトカイン、例えば、インターフェロン-a、インターフェロン-b、インターフェロン-g、インターフェロン-w及び顆粒球-CSF、GM-CSF、凝固因子、例えば、第VIII因子、第IX因子、及びヒトタンパク質C、抗トロンビンIII、トロンビン、可溶性IgE受容体a鎖、IgG、IgG断片、IgG融合体、IgM、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、及び尿素トリプシン阻害剤、IGF結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンV融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子-2、骨髄系前駆体阻害因子-1、オステオプロテジェリン、a-1-抗トリプシン、a-胎児タンパク質、DNaseII、ヒトプラスミノーゲンのクリングル3、グルコセレブロシダーゼ、TNF結合タンパク質1、卵胞刺激ホルモン、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4-Ig、膜貫通活性化因子及びカルシウム調節因子及びサイクロフィリンリガンド、可溶性TNF受容体Fc融合体、グルカゴン様タンパク質1、IL-2受容体アゴニストからなる群から選択される、請求項31によって作成される糖タンパク質組成物。前記糖タンパク質が、ピキアパストリスPichiapastoris、ピキアフィンランディカPichiafinlandica、ピキアトレハロフィラPichiatrehalophila、ピキアコクラマエPichiakoclamae、ピキアメンブラナエファシエンスPichiamembranaefaciens、ピキアミニュータPichiaminutaオガタエアミニュータOgataeaminuta、ピキアリンドネリPichialindneri、ピキアオプンティアエPichiaopuntiae、ピキアサーモトレランスPichiathermotolerans、ピキアサリクタリアPichiasalictaria、ピキアグエルキュームPichiaguercuum、ピキアピジュペリPichiapijperi、ピキアスティプティスPichiastiptis、ピキアメタノリカPichiamethanolica、ピキア種Pichiasp.、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、サッカロミセス種Saccharomycessp.、ハンゼヌラポリモルファHansenulapolymorpha、クルイベロミセス種Kluyveromycessp.、クルイベロミセスラクティスKluyveromyceslactis、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、アスペリギルスニドウランスAspergillusnidulans、アスペリギルスニガーAspergillusniger、アスペルギルスオリゼAspergillsoryzae、トリコデルマリーゼイTrichodermareesei、クリソスポリウムラックノウエンスChrysosporiumlucknowense、フサリウム種Fusariumsp.、フザリウムグラミネウムFusariumgramineum、フザリウムベネナツムFusariumvenenatum、フィスコミトレラパテンスPhyscomitrellapatens及びノイロスポラクロッサNeurosporacrossaからなる群から選択される宿主細胞から産生される、請求項31において作製される糖タンパク質組成物。GalNAcトランスフェラーゼ活性を発現する組換え型下等真核宿主細胞。異種性UDPase活性をコード化する遺伝子を発現する組換え型下等真核宿主細胞。a配列番号14、b配列番号13のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基と少なくとも約90類似しているもの、c配列番号14と少なくとも92、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99又は少なくとも99.9同一である核酸配列、d配列番号13のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコード化する核酸配列、e配列番号13と少なくとも78、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99又は少なくとも99.9同一のポリペプチドをコード化する核酸配列、fストリンジェントな条件下で配列番号13とハイブリダイズする核酸配列、及びg長さにおいて少なくとも60個の連続したヌクレオチドであるaないしfのうちのいずれか1つの断片を含む核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むか又は前記核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチド。配列番号48ないし配列番号52の保存された領域からなる群から選択される核酸配列を含むか又は前記核酸配列からなり、コード化されたポリペプチドがガラクトシル化した糖タンパク質の産生のためのUDP-グルコース及びUDP-ガラクトースの相互変換を触媒することに関与している、修飾されたポリヌクレオチド。したがって、必要なことは、UDP-ガラクトースの十分なプールから、治療用の糖タンパク質として使用するための好ましい受容体基質へのガラクトース残基の転移を触媒する方法である。本発明は、末端β-ガラクトース残基を有すること及びヒト様糖タンパク質においてフコース残基及びシアル酸残基が本質的に欠失していることを特徴とするヒト様タンパク質を産生する新規の下等真核宿主細胞を提供する。ある実施態様において、本発明は、β-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をコード化する単離された核酸分子と、UDP-ガラクトース輸送活性、UDP-ガラクトースC4エピメラーゼ活性又はガラクトキナーゼ活性又はガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコード化する少なくとも1つの単離された核酸分子とを含む、ヒト様糖タンパク質を産生する組換え型下等真核宿主細胞を提供する。本発明は、末端GlcNAc残基を含む糖タンパク質の、トリマンノース中心上にあるGlcNAcβ1,2-Manα1,3、GlcNAcβ1,4-Manα1,3、GlcNAcβ1,2-Manα1,6、GlcNAcβ1,4-Manα1,6、及びGlcNAcβ1,6-Manα1,6からなる群から選択されるN結合したオリゴ糖分岐鎖へと、β-ガラクトース残基を転移できる、ヒト様糖タンパク質を産生する組換え型下等真核宿主細胞も提供する。別の実施態様において、本発明は、シアル酸転移のための受容体基質である糖タンパク質を産生する組換え型下等真核宿主細胞を提供する。本発明の別の態様において、本明細書は、末端β-ガラクトース残基を有すること及び前記糖タンパク質上にフコース残基及びシアル酸残基が本質的に欠失していることを特徴とするヒト様ヒト様糖タンパク質を含む組成物を提供する。ある実施態様において、前記糖タンパク質はGalGlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAc2Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man5GlcNAc2、GalGlcNAc3Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man5GlcNAc2及びGal3GlcNAc3Man5GlcNAc2からなる群から選択されるN結合したオリゴ糖を含む。別の実施態様において、内在性レベルより高いUDP-ガラクトースを産生する段階を含む、下等真核宿主細胞におけるヒト様糖タンパク質を産生するための方法が提供される。さらに別の実施態様において、フコース残基及びシアル酸残基のない状態においてハイブリッド又は複雑な糖タンパク質上にガラクトース残基を転移させる段階を含む、下等真核宿主細胞においてヒト様糖タンパク質組成物を作製するための方法が提供される。本発明の方法にしたがって、少なくとも10、好ましくは33、より好ましくは60以上のガラクトシル化した糖タンパク質組成物が産生される。本発明はさらに、GalNAcトランスフェラーゼ活性を発現する組換え型下等真核宿主細胞を提供する。本発明は、異種性のUDPase活性をコード化する遺伝子を発現する組換え型下等真核宿主細胞も提供する。さらに、本発明は、a配列番号14、b配列番号13のドナーヌクレオチド結合部位のアミノ酸残基と少なくとも約90類似しているもの、c配列番号14と少なくとも92、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99又は少なくとも99.9同一である核酸配列、d配列番号13のアミノ酸配列を有する保存されたポリペプチドをコード化する核酸配列、e配列番号13と少なくとも78、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99又は少なくとも99.9同一のポリペプチドをコード化する核酸配列、fストリンジェントな条件下で配列番号13とハイブリダイズする核酸配列、及びg長さにおいて少なくとも60個の連続したヌクレオチドであるaないしfのうちのいずれか1つの断片を含む核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むか又は前記核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書には、配列番号48ないし配列番号52の保存された領域からなる群から選択される核酸配列を含むか又は前記核酸配列からなり、前記コード化されたポリペプチドがガラクトシル化した糖タンパク質の産生のためにUDP-グルコース及びUDP-ガラクトースの相互変換を触媒することに関与している、修飾されたポリヌクレオチドも提供される。本明細書に特段の定義がなければ、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は当業者によって共通して理解される意味を有するべきである。さらに、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むべきであり、複数形の用語は単数形を含むべきである。本発明の方法及び技術は、本分野で周知の従来の方法にしたがって一般に実施される。一般に、本発明に関連して使用される学名、及び本明細書に記載される生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションの技術は、本分野で周知のものであり共通して使用される。本発明の方法及び技術は一般に、本分野で周知の従来の方法にしたがって、特段の記載がなければ、本明細書を通じて引用され論議される多様な一般的な及びより特定の参考文献において記載されるように実施される。例えば、SambrookほかMolecularCloning:ALaboratoryManual、第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.1989;Ausubelほか、CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates1992及び、2002年までの補遺;Harlow及びLaneAntibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.1990;IntroductiontoGlycobiology,MaureenE.Taylor,KurtDrickamer,OxfordUniv.Press2003;WorthingtonEnzymeMannual,WorthingtonBiochemicalCorp.Freehold,NJ;HandbookofBiochemistry:SectionAProteins第1巻1976CRCPress;HandbookofBiochemistry:SectionAProteins第2巻1976CRCPress;EssentialsofGlycobiology,ColdSpringHarborLaboratoryPress1999を参照してほしい。本発明に関連して使用される学名、及び本明細書に記載の生化学及び分子生物学の実験室での手段及び技術は、本分野で周知のものであり、共通して使用される。本明細書に記載のすべての刊行物、特許及び他の参考文献は、参照によりここに組み込まれる。特段の記載がなければ、以下の用語は次の意味を有すると理解されるべきである。本明細書で使用されるように、K3という語はヒトプラスミノーゲンのクリングル3ドメインを指す。ここで使用されているように、N-グリカンは、N結合したオリゴ糖を指し、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基へのアスパラギン-N-アセチルグルコサミン結合によって結合されるものである。N-グリカンは、Man3GlcNAc2の共通の五糖類中心を有するManはマンノースを指し、Glcはグルコースを指し、NAcはN-アセチルを指し、GlcNAcはN-アセチルグルコサミンを指す。。N-グリカンは、前記Man3GlcNAc2Man3中心構造へ付加された周辺の糖例、GlcNAc、ガラクトース、フコース及びシアル酸を含む分岐鎖アンテナの数に関して異なる。N-グリカンは、それらの分岐した構成要素にしたがって分類される例、高マンノース、複雑な又はハイブリッド。高マンノース型のN-グリカンは5個以上のマンノース残基を有する。複雑な型のN-グリカンは典型的に、1,3マンノースに結合した少なくとも1つのGlcNAc及びトリマンノース中心の1,6マンノースアームに結合した少なくとも1つのGlcNAcを有する。トリマンノース中心は、Man3構造を有する五糖類中心である。これはしばしばマンノース欠乏paucimannose構造と呼ばれる。複雑なN-グリカンは、場合によりシアル酸又は誘導体NeuAc、Neuはノイラミン酸を指し、Acはアセチルを指す。で修飾されたガラクトースGal残基も有し得る。複雑なN-グリカンは、また二分しているGlcNAc及び中心フコースFucを含む鎖内置換を有し得る。複雑なN-グリカンは、またしばしば多重アンテナ性グリカンと呼ばれる、トリマンノース中心上の複数のアンテナを有し得る。ハイブリッドN-グリカンは、トリマンノース中心の1,3マンノースアームの末端にある少なくとも1つのGlcNAc、及びトリマンノース中心の1,6マンノースアームの0個以上のマンノースを有する。本明細書で使用される略語は、本分野で共通して使用されるものであり、例えば前述の糖の略語を参照してほしい。他の共通の略語には、ペプチドN-グリコシダーゼFEC3.2.2.18を指すPNGase、ガラクトシルトランスフェラーゼを指すGalT、UDP-ガラクトース:β-N-アセチルグルコサミンβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを指すβ1,4GalTが含まれる。さまざまな種からのβ-ガラクトシルトランスフェラーゼは、次のように省略される。すなわち、hGalはヒトβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを指し、bGalTはウシβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを指し、XlGalTはアフリカツメガエルXenopusleauisβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを指し、CeCalTは線虫C.elegansβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを指す。GalNAcTはUDP-GalNAc-GlcNAcβ-1,4-N-アセチルがラクトサミニルトランスフェラーゼを指す。ここで使用されているように、UGTという語はUDP-ガラクトース輸送体を指す。SpGalEはS.ポムベUDP-ガラクトース4-エピメラーゼを指し、hGalEはヒトUDP-ガラクトース4-エピメラーゼを指し、ScGal10はS.セレビシエUDP-ガラクトース4-エピメラーゼを指し、EcGalEは大腸菌E.coliUDP-ガラクトース4-エピメラーゼを指す。本明細書で使用されるように、UDP-Galという語はUDP-ガラクトースを指し、UDP-GalNAcという語はUDP-N-アセチルガラクトサミンを指す。N結合した糖タンパク質は、前記タンパク質にあるアスパラギン残基のアミド窒素へ結合したN-アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質で見つかった優勢な糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、N-アセチルガラクトサミンGalNAc、N-アセチルグルコサミンGlcNAc及びシアル酸例、N-アセチルノイラミン酸NANAである。前記糖群の加工は、小胞体の内腔で同時翻訳的に生じ、N結合した糖タンパク質に向けてゴルジ装置において続行する。ここで使用されているように、ヒト様糖タンパク質という語は、ヒトのN結合したオリゴ糖合成において見つかった糖タンパク質に似たタンパク質に共有結合した修飾されたN-グリカンを指す。複雑なN-グリカン及びハイブリッドN-グリカンは、ヒトグリコシル化で見つかった中間体である。これらの中間体に共通なのは、マンノース欠乏paucimannose中心、五糖類中心、又は単にMan3若しくはMan3とも呼ばれるMan3GlcNAc2中心構造である。それゆえ、ヒト様糖タンパク質は少なくともMan3中心構造を有する。ここで使用されているように、1,6マンノシルトランスフェラーゼ活性を惹起するimitiateという語は、Och1pによってα1,6結合とともに惹起される外側鎖形成におけるトリマンノース中心のManα1,3アームへ典型的に付加された酵母特異的グリカン残基を指す。ポジティブモードにおけるMALDI-TOF-MSによって測定されるN-グリカンへのガラクトース残基の転移モルは、総中性N-グリカンのモルに関するモルガラクトース転移を指す。K及びNaなどの特定の陽イオン付加生成物は通常、個々の付加生成物の分子量だけ前記N-グリカンの重量を増加する溶出されたピークを伴っている。ここで使用されているように、分泌経路という語は、細胞質から小胞体ER及びゴルジ装置の区画への生まれたてのポリペプチド鎖の分子の流れに次ぐ、脂質結合したオリゴ糖前駆体及びN-グリカン基質が連続的に露出される、多様なグリコシル化酵素の組み合せ系を指す。酵素は、この経路に沿って局在化されるといわれる。酵素Yの前の脂質結合したグリカン又はN-グリカンに作用する酵素Xは、酵素Yに対して上流であるか又は上流に作用するといわれ、同様に、酵素Yは酵素Xから下流であるか又は下流に作用する。本明細書で使用されるように、変異という語は、例えばグリコシル化関連酵素の遺伝子産物の核酸配列又はアミノ酸配列におけるいずれかの変化を指す。ポリヌクレオチド又は核酸分子という語は、少なくとも長さ10塩基のヌクレオチドのポリマー形態を指す。前記用語には、DNA分子例、cDNA又はゲノムDNA若しくは合成DNA及びRNA分子例、mRNA又は合成RNA並びに非天然ヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオシド間結合又はその両者を含有するDNA若しくはRNAのアナログが含まれる。前記核酸はトポロジー構造のいずれでもにありうる。例えば、前記核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖、部分的に二本鎖、分岐鎖、ヘアピン状、環状又はパッドロックされた構造でありうる。前記用語には、DNAの一本鎖形態及び二本鎖形態が含まれる。特段の記載がなければ、配列番号Xを含む核酸は、その少なくとも一部がi配列番号Xの配列、又はii配列番号Xと相補的な配列、のいずれかを有する核酸を指す。前記2つの間の選択は文脈によって指図される。例えば、もし前記核酸がプローブとして使用されれば、前記2つの間の選択は、前記プローブが望ましい標的に相補的である必要性によって必然的に決定する。単離された若しくは実質的に純粋な核酸若しくはポリヌクレオチド例、RNA、DNA又は混合されたポリマーは、天然のポリヌクレオチドの宿主細胞において天然のポリヌクレオチドが天然において伴っている他の細胞内成分例えば天然のポリヌクレオチドが天然において伴っているリボソーム、ポリメラーゼ及びゲノム配列から実質的に分離されたものである。前記用語は、1天然にある環境から採取されている、2単離されたポリヌクレオチドが天然においてみられる、ポリヌクレオチドの全部又は一部を伴っていない、3天然において結合していないポリヌクレオチドに機能可能に結合されている、又は4天然において存在しない、核酸又はポリヌクレオチドを包む。単離された又は実質的に純粋なという語は、組換え体又はクローニングされたDNA単離物、化学的に合成されるポリヌクレオチドアナログ、又は異種性の系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログに関しても使用できる。しかしながら、単離されたは、そのように記載された核酸又はポリヌクレオチドがそれ自体、その天然の環境から物理的に採取されたことを必ずしも必要としない。例えば、ある生命体のゲノムにおける内在性核酸配列は、異種性の配列すなわち、この内在性核酸配列に天然において近接していない配列が前記内在性核酸配列近くに置かれ、それによりこの内在性核酸配列の発現が変化する場合、本明細書において単離されたとみなす。例として、非天然プロモーター配列はヒト細胞のゲノムにおける遺伝子の本来のプロモーターと置換でき、それによりこの遺伝子は発現パターンが変化する。この遺伝子は、それに本来隣接する配列の少なくとも一部から分離されたため、いまや単離されたであろう。核酸は、天然において生じていないゲノムにおける対応する核酸へのなんらかの修飾を含有する場合も、単離されたとされる。例えば、内在性のコード化配列が例えばヒト介入によって人工的に導入された挿入、欠失又は点変異を含有する場合、単離されるとされる。単離された核酸には、異種性部位で宿主細胞染色体に組み込まれた核酸、エピソームとして存在する核酸構築物も含まれる。さらに、単離された核酸は、実質的に他の細胞内材料が存在し得ないか、又は組換え技術によって生じる場合、培地が実質的にありえないか、又は化学的に合成される場合、化学的前駆体又は他の化合物が実質的にありえない。本明細書で使用されるように、基準核酸配列の縮重変異体という語句は、標準的な遺伝子コードにしたがって翻訳できて、基準核酸配列から翻訳されるものと同一のアミノ酸配列を提供する核酸配列を包含する。核酸配列の文脈における配列同一性又は同一であるという語は、最大の一致になるよう配列比較して、同一である2つの配列における残基を指す。配列同一性の比較の長さは、少なくとも約9個のヌクレオチドの鎖、通常少なくとも約20個のヌクレオチド、より通常に少なくとも約24個のヌクレオチド、典型的には少なくとも約28個のヌクレオチド、より典型的には少なくとも約32個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約36個以上のヌクレオチドにわたり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに使用できる本分野で公知の多数の異なるアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列はWisconsinPackageVersion10.0,GeneticsComputerGroupGCG,Madison,WisconsinにおけるプログラムであるFASTA、Gap又はBestfitを使用して比較できる。FASTAは、質問配列と検索配列の間の最良の重なりの領域に関する配列比較及び配列同一性を提供するPearson,1990。例えば、核酸配列間の配列同一性は、そのデフォルト因子6の言語サイズ及びスコアリングマトリクスについてのNOPAM因子によるFASTAを使用して、又は本明細書に参照により組み込まれるGCGVersion6.1により提供されるデフォルト因子によるGapを使用して決定できる。核酸又はその断片を指すとき、実質的な相同性又は実質的な類似性という語は、別の核酸又はその相補的な鎖と適切なヌクレオチドの挿入又は欠失と最適に配列比較して、前述のように、FASTA、BLAST又はGapなどの配列同一性のいずれかの周知のアルゴリズムによって測定されるところの、前記ヌクレオチド塩基の少なくとも約50、より好ましくは60、通常前記ヌクレオチド塩基の少なくとも約70、より通常には少なくとも約80、好ましくは少なくとも約90、より好ましくは少なくとも約95、96、97、98又は99におけるヌクレオチド配列同一性があることを指す。あるいは、核酸又はその断片が別の核酸、別の核酸の鎖又はその相補的な鎖と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合、実質的な相同性又は類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及びストリンジェントな洗浄条件は、多くの異なる物理的因子に依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、塩の濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補的領域の長さなどの条件によって影響を受けるであろうし、そのことは当業者によって簡単に正しく認識されるであろう。当業者は、ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェント性に達するためにこれらの因子をいかに変動させるかについて知っている。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、条件の特定のセットの下で、特定のDNAハイブリッドについて融点温度Tmから約25°C低い温度で実施される。ストリンジェントな洗浄は、条件の特定のセットの下で、特定のDNAハイブリッドについてのTmよりも約5°C低い温度で実施される。前記Tmは、完全に符合したプローブへ標的配列の50がハイブリダイズする温度である。本明細書において参照により組み込まれる前述のSambrookほか、9.51ページを参照してほしい。本明細書の目的のため、高いストリンジェント性条件は、6×SSC20×SSCが3.0MNaCl及び0.3Mクエン酸ナトリウムを含有する場合、65°Cで8時間ないし12時間1SDSにおける水性ハイブリダイゼーションすなわち、ホルムアミドなし、その後、65°Cで20分間0.2×SSC、0.1SDSにおける2回洗浄としての溶液相ハイブリダイゼーションについて定義される。65°Cでのハイブリダイゼーションが、ハイブリダイズしている配列の長さ及び同一性を含む多くの因子によって、異なる割合で生じることは当業者によって正しく認識されるであろう。本発明の核酸ポリヌクレオチドとも呼ばれる。は、RNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方、cDNA、ゲノムDNA並びに前述の合成形態及びこれらの混合されたポリマーを含み得る。これらは、当業者により容易に認識されるように、化学的または生化学的に修飾され得、または非天然の又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有し得る。このような修飾には、例えば、ラベル、メチル化、天然に存在するヌクレオチドの一つ以上をアナログと置換、荷電されていない結合例、リン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホールアミデート、カルバメート等、荷電された結合例、ホスホールチオエート、ホスホロジチオエート等、ペンダント部分例、ポリペプチドなどのヌクレオチド間修飾、介入物例、アクリジン、プソラーレン、等、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾された結合例、αアノマー核酸等が含まれる。また、水素結合または他の化学的相互作用を介する指定配列への結合能においてポリヌクレオチドを真似ている合成分子を含む。このような分子は本分野で公知であり、これは例えば前記分子の主鎖におけるリン酸結合をペプチド結合に置換することを含む。核酸配列へ適用される場合、変異されたという語は、核酸配列におけるヌクレオチドが基準核酸配列と比較して挿入され、欠失され、又は荷電され得ることを意味する。単一の変化は座点変異でなされてもよく、又は複数のヌクレオチドが単一の座において挿入され、欠失され、又は荷電されてもよい。さらに、1つ以上の変化が、核酸配列内の遺伝子座のいずれの数でなされてもよい。核酸配列は本分野で公知のいずれかの方法によって変異されてよく、限定を加えるものではないが、エラープローンPCRDNAポリメラーゼのコピー信頼性が低い場合、点変異の高い割合がPCR産物の全長に沿って得られるような条件下でPCRを実施するためのプロセスであり、例えばLeung,D.W.ほか、Technique、1、pp.11-151989並びにCaldwell,R.C.及びJoyceG.F.、PCRMethodsApplic.、2、pp.28-331992を参照してほしい。、及びオリゴヌクレオチド指向型変異誘発興味の対象のいずれかのクローニングしたDNA断片における部位特異的変異の発生を可能にするプロセスであり、例えばReidhaar-Olson,J.F.及びSauer,R.T.ほか、Science、241、pp.53-571988を参照してほしい。などの変異誘発が含まれる。本明細書において使用されるベクターという語は、結合している別の核酸を輸送できる核酸分子を指すよう企図される。ベクターのあるタイプはプラスミドであり、さらなるDNAセグメントが連結され得る環状二本鎖DNAループを指す。他のベクターには、コスミド、バクテリア人工染色体BAC及び酵母人工染色体が含まれる。ベクターの別のタイプはウィルスベクターであり、さらなるDNAセグメントがウィルスゲノムへと連結され得る以下により詳細に論議される。。ある種のベクターは、それが導入されている宿主細胞において自己複製できる例、宿主細胞において機能する複製元を有するベクター。他のベクターは、宿主細胞への導入に際し、前記宿主細胞のゲノムに組込まれ、それにより宿主ゲノムに沿って複製される。さらに、ある種の好ましいベクターは、それらが機能可能に結合された遺伝子の発現を指令できる。このようなベクターは本明細書へ組換え型発現ベクター又は単に発現ベクターとして参照される。機能可能に結合された発現調節配列は、前記発現調節配列が対象の遺伝子に近接して対象の遺伝子を制御する結合を、並びに、トランスで作用してまたは距離をおいて作用して対象の遺伝子を調節する発現調節配列を言う。本明細書で使用される発現調節配列という語は、機能可能に結合されたコード化配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現調節配列は、核酸配列の転写、転写後事象及び翻訳を調節する配列である。発現調節配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列、スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなどの効率よいRNAプロセシングシグナル、細胞質mRNAを安定化させる配列、翻訳効率性を強化する配列例、リボソーム結合部位、タンパク質安定性を強化する配列、及び望む場合、タンパク質分泌を強化する配列が含まれる。このような調節配列の性質は、宿主生命体によって異なっていて、原核生物においては、このような調節配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、転写終結配列を含む。調節配列という語は少なくとも、その存在が発現に不可欠である構成要素全部を含むよう企図され、その存在が有利である更なる構成要素例えばリーダー配列及び融合パートナー配列も含むことができる。本明細書で使用される組換え型下等真核宿主細胞又は単に宿主細胞という語は、組換えベクターが導入される細胞を指すよう企図される。このような用語は特定の対象細胞を指すだけでなく、このような細胞の子孫も指すよう企図される。子孫の世代において、変異または環境の影響によりある種の修飾が起こり得るため、そのような子孫は、実際、親細胞と同一でないこともあり得るが、しかし、本明細書で使用される宿主細胞の範囲内になおも含まれる。組換え宿主細胞は、培養中に生育した、単離された細胞又は細胞系であり得、又は生組織若しくは器官に存在する細胞であり得る。組換え宿主細胞には、酵母、菌、カラーフラゲラータcollar-flagellate、微胞子虫、アルベオラータalveolate例、渦鞭毛藻類、ストラメノパイルstramenopiles例、褐色藻類、原生動物、紅藻植物例、赤色藻類、植物例、緑色藻類、植物細胞、コケ及び他の原生生物が含まれる。本明細書で使用されるペプチドという語は、短いポリペプチドを指し、例えば、典型的には長さ約50アミノ酸未満であるもの、より典型的には長さ約30アミノ酸未満であるものである。本明細書で使用される前記用語は、構造上の機能を模倣し、したがって生物学的機能を模倣するアナログ及び模倣体を包含する。ポリペプチドという語は、天然に存在するタンパク質及び天然に存在しないタンパク質の両者、これらの断片、変異体、誘導体及びアナログを包含する。ポリペプチドは単量体又は重合体であってもよい。さらに、ポリペプチドは、1つ以上の異なる活性を各々有する多数の異なるドメインを含み得る。単離されたタンパク質又は単離されたポリペプチドという語は、その由来又は出所によって、1元の状態において天然に伴っている成分を伴っていない、2純度を他の細胞物質の存在に関して判断して例えば、同じ種からの他のタンパク質がない場合、天然においてあり得ない純度で存在する、3異なる種の細胞によって発現される、又は4天然において存在しない例えば、天然において見られるポリペプチドの断片であるか、又は天然において見られないアミノ酸アナログもしくは誘導体又は標準的なペプチド結合以外の結合を含む。、タンパク質又はポリペプチドである。したがって、化学的に合成されたポリペプチド、またはポリペプチドが天然において存在する細胞とは別の細胞からの細胞システムにより合成されたポリペプチドは、天然において存在している成分から単離されている。ポリペプチド又はタンパク質は、本分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって天然において存在する成分から実質的に単離し得る。このように定義されたように、単離されたは、このように定義されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はオリゴペプチドが天然の環境から物理的に採取されていることを必須として要求しない。本明細書で使用されるポリペプチド断片という語は、全長のポリペプチドと比較してアミノ末端及び/又はカルボキシ末端の除去を有するポリペプチドを指す。好ましい実施態様において、前記ポリペプチド断片は、前記断片のアミノ酸配列がその天然において存在している配列に対応する位置と同じである、連続した配列である。断片は典型的に、少なくとも5、6、7、8、9又は10のアミノ酸長であり、好ましくは少なくとも12、14、16又は18アミノ酸長であり、より好ましくは少なくとも20のアミノ酸長であり、より好ましくは少なくとも25、30、35、40又は45のアミノ酸長であり、さらにより好ましくは少なくとも50又は60のアミノ酸長であり、さらにより好ましくは少なくとも70のアミノ酸長である。修飾された誘導体は、一次構造配列において実質的に相同であるポリペプチド又はその断片を指すが、これらのポリペプチド又はその断片は、例えばインビボもしくはインビトロでの化学的もしくは生化学的修飾を含み、又は天然のポリペプチドにおいて見つかっていないアミノ酸を組み込んでいる。このような修飾には、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種による標識化、および多様な酵素修飾が含まれ、これらは当業者によって容易に認識される。このような目的のために有用な、ポリペプチドを標識するための種々の方法及び種々の置換体又は標識がこの分野で知られていて、これらは、125I、32P、35S、及び3Hなどの放射性同位体、標識された抗リガンド例えば抗体に結合するリガンド、フルオロフォア、化学発光剤、酵素及び標識されたリガンドに対する特異的な結合対因子として機能できる抗リガンドを含む。標識の選択は、必要とされる感度、前記プライマーとの共役の簡便性、安定性の必要条件、及び入手可能な機器に依存している。ポリペプチドを標識するための方法は本分野で周知である。本明細書によって参照により組み込まれるAusubelほか、1992を参照。融合タンパク質という語は、異種性のアミノ酸配列へ結合したポリペプチド又は断片を含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は、それらが2つ以上の異なるタンパク質から2つ以上の望ましい機能要素を含有するよう構築できるため、有用である。融合タンパク質は対象のポリペプチド由来の少なくとも10の連続したアミノ酸を含み、より好ましくは少なくとも20又は30のアミノ酸を、さらにより好ましくは少なくとも40、50又は60のアミノ酸を、なおより好ましくは少なくとも75、100又は125のアミノ酸を含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質又はペプチドをコード化する核酸配列と共にフレーム内においてポリペプチド又はその断片をコード化する核酸配列を構築し、この融合タンパク質を発現させることによって、組換え生産できる。あるいは、融合タンパク質は、前記ポリペプチド又はその断片を別のタンパク質へ架橋させることによって化学的に作製できる。非ペプチドアナログという語は、基準ポリペプチドのものと類似である特性を有する化合物を指す。非ペプチド性化合物は、ペプチド擬態体又はペプチド模倣体とも呼び得る。例えば、Jones1992AminoAcidandPeptideSynthesis,OxfordUniversityPress;Jung1997CombinatorialPeptideandNonpeptideLibraries:AHandbookJohnWiley;Bodanszkyほか、1993PeptideChemistry―APracticalTextbook,SpringerVerlag;SyntheticPeptides:AUsersGuide、G.A.Grant編、W.H.FreemanandCo.、1992;EvansほかJ.Med.Chem.30:12291987;Fauchere、J.Adv.DrugRes.15:291986;Veber及びFreidingerTINSp.3921985;及び上記文献の各々に引用されている参考文献。これらは本明細書において参照により組み込まれる。このような化合物はしばしば、コンピューター化した分子モデリングの援助で開発される。本発明の有用なペプチドと構造上類似したペプチド模倣体は、等価の効果を生じるよう使用され得、それゆえ、本発明の一部であると構想される。ポリペプチド変異体又は変異体タンパク質は、その配列が元の又は野生型のタンパク質のアミノ酸配列と比較して1つ以上のアミノ酸の挿入、複製、欠失、再編成又は置換を含有するポリペプチドを指す。変異タンパク質は、それぞれ天然に存在するタンパク質の配列に置いて、1つ又はそれ以上の点置換ある位置の単一のアミノ酸が別のアミノ酸に変更されている。、1つ又はそれ以上の挿入及び/又は削除1つ又はそれ以上のアミノ酸が挿入され又は削除されている。、及び/又はアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれか又は両者におけるアミノ酸配列の切断を有し得る。変異タンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較して、同一の生物活性を有し得るが、好ましくは異なる生物活性を有する。変異タンパク質は、その野生型対応物と少なくとも70の全体的な配列相同性を有する。さらにより好ましくは、野生型タンパク質と80、85又は90の全体的な配列相同性を有する変異タンパク質である。さらにより好ましい実施態様において、変異タンパク質は95の配列同一性を示し、さらにより好ましくは97、さらにより好ましくは98及びさらにより好ましくは99、99.5又は99.9の全体的な配列同一性を示す。配列相同性は、Gap又はBestfitなどのいずれかの共通配列分析アルゴリズムによって測定し得る。好ましいアミノ酸置換は、1タンパク質分解に対する敏感性を低下させ、2酸化に対する敏感性を低下させ、3タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させ、4結合親和性又は酵素活性を変化させ、及び5このようなアナログの他の物理化学的特性又は機能的特性を付与又は修飾するものである。本明細書で使用されているように、20個の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用に従う。本明細書に参照によって組み込まれる、Immunology-ASynthesis第2版、E.S.Golub及びD.R.Gren編、SinauerAssociates、Sunderland,Mass.1991を参照してほしい。前記20個の従来のアミノ酸、α,α-二置換したアミノ酸などの非天然アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、及び他の非従来型アミノ酸の立体異性体例、D型アミノ酸も本発明のポリペプチドのための適切な構成要素であり得る。非従来型アミノ酸の例には、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸塩、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、s-N-メチルアルギニン、及び他の類似したアミノ酸及びイミノ酸例、4-ヒドロキシプロリンが含まれる。本明細書で使用されるポリペプチドの表示法において、標準的な使用及び慣習にしたがって、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。タンパク質は、前記タンパク質をコード化する核酸配列が第二タンパク質をコード化する核酸配列と類似した配列を有する場合、前記第二タンパク質の相同性を有し、又は相同的である。あるいは、前記2つのタンパク質が類似したアミノ酸配列を有する場合、タンパク質は第二タンパク質との相同性を有するしたがって、相同性タンパク質という語は前記2つのタンパク質が類似したアミノ酸配列を有することを意味するよう定義される。。好ましい実施態様において、相同的なタンパク質はその野生型タンパク質に対して60の配列相同性を呈するものであり、より好ましくは70の配列相同性である。さらにより好ましくは前記野生型タンパク質に対して80、85又は90の配列相同性を呈する相同的なタンパク質である。本明細書で使用されるように、特に推定される構造類似性に関するアミノ酸配列の2つの領域間の相同性は、機能の上での類似性を包含するものと解釈される。相同的ながタンパク質又はペプチドに関して使用される場合、同一でない残基位置が、しばしば保存されたアミノ酸置換によって異なっていることが認識される。保存的なアミノ酸置換は、似た化学特性例えば電荷又は疎水性を備えた側鎖R基を有する別のアミノ酸残基によってアミノ酸残基が置換されているものである。一般に、保存的なアミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。2つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的な置換だけで互いに異なっている場合、配列同一性又は相同性の程度は、前記置換の保存的な性質を補償するよう上向きに調整され得る。この調整をなすための手段は当業者に周知である例、本明細書に参照によって組み込まれるPearsonほか、1994を参照してほしい。。次の6つの群は各々、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含有する。すなわち、1セリンS、スレオニンT;2アスパラギン酸D、グルタミン酸E;3アスパラギンN、グルタミンQ;4アルギニンR、リジンK;5イソロイシンI、ロイシンL、メチオニンM、アラニンA、バリンV、及び6フェニルアラニンF、チロシンY、トリプトファンWである。配列同一性とも呼ばれるポリペプチドについての配列相同性は、配列分析ソフトウェアを使用して典型的に測定される。例えば、遺伝学コンピューターグループtheGeneticsComputerGroupGCGの配列分析ソフトウェアパッケージtheSequenceAnalysisSoftwarePackage、UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter,910UniversityAvenue,Madison,Wisconsin53705を参照してほしい。タンパク質分析ソフトウェアは、多様な置換、欠失及び保存的なアミノ酸置換を含む他の修飾に割り当てられた相同性の測定を使用して、似た配列と比較する。例えば、GCGは、生物体の異なる種由来の相同的なポリペプチド又は野生型タンパク質及びその変異タンパク質の間での相同的なポリペプチドなどの密接に関連したポリペプチド間の配列相同性又は配列同一性を決定するために、デフォルトパラメータを使用できるGap及びBestfitなどのプログラムを含む。例えば、GCG第6.1版を参照してほしい。阻害分子配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合、好ましいアルゴリズムはコンピュータプログラムBLASTAltschul,S.F.ほか1990J.Mol.Biol.215:403-410;Gish及びStates1993NatureGenet.3:266-272;Madden,T.L.ほか1996Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul,S.F.ほか1997NucleicAcidsRes.25:3389-3402;Zhang,J.及びMadden,T.L.1997GenomeRes.7:649-656であり、特にblastp又はtblastnAltschulほか、1997である。BLASTpについての好ましい因子は、期待値:10初期設定;フィルター:seg初期設定;間隙を開くためのコスト:11初期設定;間隙を伸長するためのコスト:1初期設定;最大配列比較:100初期設定;言語サイズ:11初期設定;記載の番号:100初期設定;罰則マトリクス:BLOWSUM62である。相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般に少なくとも約16個のアミノ酸残基、通常少なくとも約20残基、より通常少なくとも約24残基、典型的には少なくとも約28残基、及び好ましくは約35残基超である。大きな数の、異なる生物由来の配列を含有するデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を使用するデータベース検索は、本分野で公知のblastp以外のアルゴリズムによって測定できる。例えば、ポリペプチド配列は、GCG第6.1版におけるプログラムであるFASTAを使用して比較できる。FASTAは、質問配列と検索配列との最良の重なりの領域の配列比較及び配列同一性を提供する本明細書で参照によって組み込まれるPearson,1990。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性は、そのデフォルトパラメータ言語サイズ2及びPAM250のスコアリングマトリクスを備えたFASTAを使用して決定でき、これは本明細書に参照によって組み込まれるGCG第6.1版において提供されている。本明細書で使用されるドメインという語は、生体分子の公知の機能又は予測される機能へ関与する生体分子の構造を指す。ドメインは、領域又はその一部と同一の広がりを有し得、ドメインは、生体分子の異なる非連続的な領域も含み得る。タンパク質ドメインの例には、これらに制限されるものではないが、Igドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインが含まれる。本明細書で使用されているように、分子という語は、以下に限定するものではないが、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質等を含むいずれかの化合物を意味し、このような化合物は天然化合物又は合成化合物でありうる。本明細書及びその実施態様を通じて、含むという語又は含有するもしくは含んでいるなどの変形は、記載されている整数又は整数の群を包含するが、いずれかの他の整数又は整数の群を排除しないことを指すものと理解される。特段の定義がなければ、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明の関する分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。典型的な方法及び材料は以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと同様の又は等価の方法及び材料も本発明の実施において使用でき、当業者に明らかである。本明細書に記載されたすべての刊行物及び他の参考文献は、参照によってその全部が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が調節する。前記材料、方法、及び実施例は実例となるのみであり、限定を加えるよう意図されてはいない。ヒト様ガラクトシル化した糖タンパク質を産生するための宿主の設計本発明は、ヒト様糖タンパク質が末端β-ガラクトース残基を有し、フコース及びシアル酸を本質的に欠失することを特徴とする、前記糖タンパク質を産生する組換え型下等真核宿主細胞を提供する。ある実施態様において、本発明は、UDP-ガラクトース輸送体をコード化する少なくとも第二の単離された核酸分子、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼをコード化する単離された核酸又はガラクトキナーゼ若しくはガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコード化する単離された核酸との組み合わせでUDP-ガラクトース:β-N-アセチルグルコサミンβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼβ1,4GalTをコード化する単離された核酸分子を含む下等真核宿主細胞を提供する。別の実施態様において、β1,4GalTは、UDP-ガラクトース輸送体をコード化する単離された核酸分子及びUDP-ガラクトース4-エピメラーゼをコード化する単離された核酸分子との組み合わせで発現する。前述の酵素をコード化する前記核酸配列の変異体及び断片、組換えDNA分子、及び形質転換向けの前記酵素をコード化する核酸配列も提供される。本発明のある態様において、方法は、下等真核宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生するために提供され、UDP-ガラクトースからβ結合における受容体基質へのβ1,4GalT活性の発現による転移を触媒する段階と、宿主へUDP-ガラクトース4-エピメラーゼ活性、ガラクトキナーゼ活性、ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性又はUDP-ガラクトース輸送活性を導入する段階とを含む。受容体基質は好ましくは、トリマンノース中心上の末端GlcNAc残基、例えばGlcNAcβ1,2-Manα1,3;GlcNAcβ1,4-Manα1,3;GlcNAcβ1,2-Manα1,6;GlcNAcβ1,4-Manα1,6;又はGlcNAcβ1,6-Manα1,6分岐を含むオリゴ糖組成物である。受容体基質は、より好ましくは対象のタンパク質に共有結合されるN結合される複雑なグリカン例、GlcNAc2Man3GlcNAc2、ハイブリッドグリカン例、GlcNAcMan5GlcNAc2又は複数のアンテナ性グリカン例、GlcNAc4Man3GlcNAc2である。前記β-ガラクトース残基は、β-グリコシド結合を形成する2-アセトアミド-2-デオキシ-D-グルコースGlcNAcの炭素4でヒドロキシ基を含む受容体基質へと転移される。ガラクトース残基を受容できる末端GlcNAc残基を含むN結合した受容体基質には、GlcNAcMAn3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2、GlcNAc5Man3GlcNAc2GlcNAc6Man3GlcNAc2、GlcMAcMan4GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAc2Man5GlcNAc2及びGlcNAc3Man5GlcNAc2が含まれるが、これらに限定されない。β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニングヒトb-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼI遺伝子hGalTI、GenbankAH003575を、プライマーRCD192配列番号1及びRCD186配列番号2を使用して、ヒト腎cDNAマラソンレディcDNA、ClontechからPCR増幅した。このPCR産物を、クローニングし配列決定したpCR2.1Invitrogen中にクローニングした。このクローンから、PCR重複変異誘発を実施した。前記遺伝子のNotI部位までの5’末端を、プライマーRCD198配列番号3及びRCD201配列番号4を使用して増幅し、前記3’末端を、プライマーRCD200配列番号5及びRCD199配列番号6を使用して増幅した。前記産物をプライマーRCD198配列番号3及びRCD199配列番号6と互いに重ねて、前記NotI部位を除去しながら43個のアミノ酸のN末端欠失を除く前記野生型アミノ酸配列を用いて前記ORFを再合成した。前記新たな切断したhGalTIPCR産物をpCR2.1中にクローニングし、配列決定した。次に、導入したAscI/PacI部位を使用して、前記断片を、pRCD260を作製するPpURA3/HYGRロールインベクターであるプラスミドpRCD259図1へとサブクローニングした図1実施例4。同一の戦略を、ヒトβ1,4GalTII及びヒトβ1,4GalTIIIをクローニングする上で適用した。実施例4は、PCRによってヒトβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼII及びIII遺伝子を増幅させるために遺伝子特異的プライマーを使用し、次にそれをベクターへとクローニングすることを記載する。下等真核生物におけるβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼの発現β1,4GalT活性をコード化する遺伝子又はβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をコード化する組換え型核酸分子、β1,4GalT活性をコード化する遺伝子融合体例、pXB53図1又はβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼをコード化する核酸分子GenbankAH003575からの発現を下等真核宿主細胞例、P.パストリスpastorisへ導入して発現させ、ガラクトシル化した糖タンパク質を産生した。あるいは、β-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の活性化によって、下等真核宿主細胞を遺伝子工学的に改変し、ガラクトシル化した糖形態を産生する。触媒活性のあるβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼドメイン又はその一部は、UDP-ガラクトースから、β1,4-Galグリコシド結合を形成するオリゴ糖受容体基質例、GlcNAc2Man3GlcNAc2の末端GlcNAc残基へのガラクトース残基の転移を触媒する。本発明に従って産生される複雑なガラクトシル化したN-グリカンはフコース及びシアル酸を本質的に欠失している例、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。ガラクトシル化し、脱フコシル化し、脱シアル酸付加したこのような糖タンパク質組成物は、治療剤として有用である。前記新規に形成された基質は、下等真核宿主において産生されるシアル酸付加した糖タンパク質の形成における好ましい前駆体でもある。本発明はしたがって、ヒト様糖タンパク質が下等真核生物におけるシアル酸転移のための受容体基質である末端ガラクトース残基を有することを特徴とする、前記糖タンパク質を産生するための方法を提供する。β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼのコンビナトリアルDNAライブラリ本発明に関連する態様において、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ及び酵母指向性配列膜貫通ドメインのコンビナトリアルDNAライブラリを作製し、WO02/00879において記載されるていように下等真核宿主細胞において発現させる。したがって、WO02/00879に記載されているように、長さが短、中、長の指向性ペプチドのサブライブラリへと融合されたhGalTI例、Genbank受入番号X55415のサブライブラリが作成される。指向性ペプチドサブライブラリには、小胞体、ゴルジ体、又はトランスゴルジネットワーク内の特定の位置へのタンパク質の局在化を生じる指向性シグナルぺプチドをコード化する核酸配列が含まれる。これらの指向性ペプチドは、遺伝子工学的に改変された宿主生物体から、他の関連した又は関連していない生物体からと同様、選択され得る。一般に、このような配列は3つのカテゴリーへと分類される。すなわち1ゴルジ体の内膜内腔膜へタンパク質を互いにまたは個々につなぐサイトゾル尾部ct、膜貫通ドメインtmd及びステム領域srの一部又は全部をコード化するN末端配列、2HDEL又はKDELテトラペプチドなどのC末端で一般にみられる修復シグナル、及び3ゴルジ体において局在化することが公知の多様なタンパク質、例えばヌクレオチド糖輸送体からの膜架橋領域、である。指向性ペプチドは本明細書において、II型膜タンパク質の一部に対して短s、中m、長lと示される。短sと示される指向性ペプチド配列は、膜結合タンパク質の膜貫通ドメインtmdに対応する。長lと示される指向性ペプチド配列は、膜貫通ドメインtmd及びステム領域srの長さに対応する。中mと示される指向性ペプチド配列は、膜貫通ドメインtmd及び、ステム領域srの長さのほぼ半分に対応する。触媒作用のあるドメイン領域は本明細書において、その野生型グリコシル化酵素に関してヌクレオチド欠失の数によって示される。ある実施態様において、前記ライブラリをP.パストリスpastorisへと形質転換し、前記形質転換体を、ハイグロマイシンを含有する最小培地上で選抜した。以下に記載されるような多様なリーダー配列へ融合したβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼIの活性を、ポジティブモードにおいてMALDI-TOFMSを使用する読み取りとしてのガラクトシル化したN-グリカンの産生を介して分析した。□-ガラクトシルトランスフェラーゼ融合構築物48個のリーダー配列WO02/00879からなる単離された酵母指向性配列膜貫通ドメインのライブラリを、hGalTI遺伝子の上流にあるpRCD260上のNotI/AscI部位に連結し、プラスミドpXB20-pXB67を作製した各プラスミドは1つのリーダー配列を有する。。本発明のコンビナトリアルDNAライブラリ由来のGalT融合構築物の代表例はpXB53図1であり、ヒトβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼIGenbankAH003575の43N末端アミノ酸欠失へフレーム内連結した、切断したS.セレビシエMnn2s指向性ペプチドGenbankNP_009571由来のMNN2の1ないし108ヌクレオチドである。したがって、本明細書で使用される命名法は、グリコシル化酵素の指向性ペプチド/触媒作用ドメイン領域を、S.セレビシエMnn2s/hGalTIΔ43とする。しかしながら、コード化した融合タンパク質単独では、図9Aに示される主としてガラクトシル化したグリカンを有するN-グリカンを生じるのには不十分である。N-グリカンGalGlcNAc2Man3GlcNAc2[B]の集団と一致するピークが、P.パストリスにおけるhGalTIの導入で示されているが、前記試料のその後の切断によって、このピークがb-1,4-ガラクトシダーゼに不応性であることが示される実施例7。さらに、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性は、対象の特定のタンパク質に対して特異的であってもよい。したがって、対象の糖タンパク質に関する適切なグリコシル化を生じさせるために、指向性ペプチド/ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒作用ドメイン融合構築物が必ずしもすべて等しく十分に機能するのではないということは、さらに理解されるべきである。したがって、対象のタンパク質は、前記タンパク質に最適なガラクトシルトランスフェラーゼ活性を発現する1つ以上の融合構築物を特定するために、コンビナトリアルDNAライブラリで形質転換した宿主細胞へと導入され得る。当業者は、本明細書に記載のコンビナトリアルDNAライブラリアプローチを使用して最適な融合構築物を作成及び選抜できるであろう。さらに、局在化した活性のあるガラクトシルトランスフェラーゼ触媒作用ドメイン又はより一般には、いずれかの酵素のドメインを呈する他のこのような融合構築物が本明細書に記載の技術を使用して作製され得ることは明白である。例えば、特定の宿主細胞へと導入される特定の発現ベクターにおける融合構築物のライブラリからのGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2産生を最適化するために本発明のコンビナトリアルDNAライブラリを作製及び使用することは、当業者にとって決まりきった実験法の一内容である。遺伝子改変のP.パストリスにおけるガラクトシル化したN-グリカンの産生本発明の方法にしたがって産生されるヒト様ガラクトシル化糖タンパク質には、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAc2Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man5GlcNAc2、GalGlcNacMan5GlcNAc2、GalGlcNAc2Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man5GlcNAc2、GalGlcNAc3Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man5GlcNAc2及びGal3GlcNAc3Man5GlcNAc2が含まれる。本発明のある実施態様において、MNN2s/hGalTIを含むプラスミドpXB53を用いて、GlcNAc2Man3GlcNAc2を産生する宿主であるP.パストリスRDP30-10を形質転換した実施例5。触媒活性のあるβ-ガラクトシルトランスフェラーゼドメインは、末端GlcNAc残基例、GlcNAc2Man3GlcNAc2を有する受容体基質へガラクトース残基を転移するのを触媒し、ガラクトシル化した糖形態を生じる。MALDI-TOFMSを使用して、P.パストリスRDP37由来のリポータータンパク質から放出されたN-グリカンは、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2[B]の質量に対応する1505m/zでピークを示した図8B。GalGlcNAc2Man3GlcNAc2を生じた受容体基質GlcNAc2Man3GlcNAc2への、ヒトサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeMnn2s/β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを含む融合構築物によるガラクトース残基の転移は、約10ないし20であることを示した。図8Bは、1662m/z[C]でのGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2の対応する質量を示す。それゆえ、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2を生じるGlcNAc2Man3GlcNAc2への2つのガラクトース残基の転移は明白であった。したがって、本発明の宿主は、ヒト様N-グリカン上のガラクトシル部分の少なくとも10モルを呈する。GalTIが宿主の産生する複雑な例、二アンテナ性グリカンにおける第二末端GlcNAc残基を有する受容体基質へ第二ガラクトース残基を転移できることが認識される。例えば、グリカンGlcNAc2Man3GlcNAc2のGlcNAcβ1,2Manα1,3アーム上のガラクトース残基で末端GlcNAcをキャッピングできるMann2s/hGalTI融合は、末端GlcNAc残基例、GlcNAcβ1,2Manα1,6とともに露出されたその他のアーム上での少なくとも1つのさらなるβ-グリコシド結合を形成でき、それにより、その後ガラクトシルトランスフェラーゼを発現させずにガラクトシル化した糖形態を生じる。図12は、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2に対応する1663m/z[C]でのピークを呈するMALDI-TOFMSを示す。本結果は、特定のβ1,4-GalTに対する基質特異性が前記グリカンの指定されたアームのみにあるガラクトース残基の転移を触媒するよう制限されてはおらず、それゆえ第二ガラクトシルトランスフェラーゼが不要になるかもしれないことを示す。したがって、本発明のある実施態様において、たった1つのβ1,4-GalT活性が一本、二本、三本又は四本のアンテナ性のガラクトシル化した糖形態を生じうる。このような実施態様において、前記ガラクトース残基と前記グリカン上のGlcNAc残基の間のグリコシド結合はすべて同一であろう。例えば、二アンテナ性グリカンを産生する宿主におけるhGalT1の発現は2つの末端Galβ1,4-GlcNAcβ1,2結合を呈するであろう。あるいは、異なるβ-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性例、hGalTII又はその触媒活性部分を下等真核宿主細胞において発現させる。ある実施態様において、MNN2s/hGalTII及びSpGALEを含むベクターpRCD440、及びDmUGTを含むベクターpSH263図3Bを宿主P.パストリスYSH-44図12Bに形質転換した。前記形質転換体のN-グリカン分析によって、hGalTIIが前記受容体基質上へ両ガラクトース残基を転移させたことを示すGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2の糖形態の産生が示された図12B。二ガラクトシル化構造Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2が支配的である。中性グリカンに関するガラクトシル部分の転移は約75であった。さらに別の実施態様において、hGalTIIIをコード化する配列を下等真核宿主細胞において発現させる。図12Cは、前記組み合わせた一ガラクトシル化したグリカン及び二ガラクトシル化したグリカンへのガラクトース転移が約50モルないし60モルであることを示す。hGalTI、hGalTII及びhGalTIIIの比較は、ガラクトース転移の多様なレベルを示す図12Aないし図12C。P.パストリスRDP71由来のN-グリカンプロファイルは、hGalTIの発現によるガラクトース残基の転移がK3受容体タンパク質に対して最適である約80モルことを示す。さらなるβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼの発現別の実施態様において、hGalTI及びhGalTIIは、順次に局在化し、中期ゴルジ体指向性配列及び後期ゴルジ体指向性配列をそれぞれ使用して発現される。例えば、前記hGalTIは、中期ゴルジ体において局在化するのに対し、前記hGalTIIは後期ゴルジ体において局在化する。あるいは、別の実施態様においてマンノシダーゼIIとの基質競合を回避するため、後期ゴルジ体リーダーをβ-ガラクトシルトランスフェラーゼについて使用する。ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の発現は通常、一ガラクトシル化したグリカン及び二ガラクトシル化したグリカンの両者を生じる。一ガラクトシル化した糖形態に加えて複数アンテナ性のガラクトシル化した糖形態が、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を発現する宿主細胞において一般に生産される。ガラクトシルトランスフェラーゼ活性及び、組換え型宿主細胞における多様なプロモーター及び多様な発現ベクターを使用することによって前記タンパク質をコード化する遺伝子の発現を最適化することは当業者にとって決まりきった実験法の事項である。N-グリカンの産生における目的に合わせたガラクトシル化したグリコシド結合本発明の別の特徴において、異なるGalTを使用する複数のアンテナ性のガラクトシル化した糖タンパク質の産生は、異なるβ-グリコシド結合を生じる。ある実施態様において、好ましい所望のβ-グリコシド結合が、下等真核宿主細胞において作成される。例えば、β1,4GalTファミリーのいずれか1つ例、hGalTI、hGalT2、hGalT3、hGalT4、hGalT5、hGalT6、hGalT7、bGalTI、XlCalT、CeGalTIIを、β1,4Galグリコシド結合を有することを特徴とするガラクトシル化した糖タンパク質の産生のために発現させる。あるいは、β1,3GalT活性又はβ1,6GalT活性などの他のガラクトシルトランスフェラーゼ酵素、ホモログ、変異体、誘導体及び触媒活性のあるそれらの断片を下等真核宿主細胞例、P.パストリスにおいて発現させることによって、特に望ましいβGalグリコシド結合を形成する中間的なオリゴ糖受容体基質へとガラクトース残基を転移させる。多様な末端ガラクトース結合例、β1,3、β1,4、又はβ1,6を望ましいβ-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の発現の結果として形成する。下等真核生物におけるGalNAcT発現GalNAcによりキャップしたグリカンは、ヒトにおける特定のタンパク質で観察されてきた。本発明の別の態様において、GalNAcトランスフェラーゼGalNAcTをコード化する遺伝子を下等真核宿主細胞において発現させ、それが末端GlcNAc残基を有する基質へとGalNAcを転移させる。ある実施態様において、線虫GalNAcTをコード化する遺伝子GenbankANNP_490872は、宿主細胞において産生されるグリカンのオリゴ糖分岐鎖を伸長する末端GlcNAc残基を有する基質へのGAlNAc残基の転移を触媒する。強化したガラクトシル転移図12に示されるhGalTI発現の比較は、β-ガラクトシルトランスフェラーゼ発現単独では下等真核生物における受容体基質上でのβGal-グリコシド結合の形成に十分ではあり得ないことを示す。ガラクトース残基の転移は、エピメラーゼもしくはガラクトキナーゼ、ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、及び/又はUGTをコード化する遺伝子の追加によって強化される。ガラクトシル化した糖形態例、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2の十分量が治療用糖タンパク質として望ましい。したがって、輸送活性の追加の発現によってグリカンへのガラクトシル転移を強化し、及び/又は内在性UDP-ガラクトースレベルを上昇させることは、本発明の特徴である。ある実施態様において、UDP-ガラクトースレベルを強化させるため、宿主細胞にエピメラーゼ活性を導入する。別の実施態様において、UDP-ガラクトースレベルの強化は、ガラクトキナーゼ又はガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性によって仲介される。本発明はそれゆえ、UDP-GAl輸送活性を使用して及び/又は、エピメラーゼ又はガラクトキナーゼ又はガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼを介する内在性UDP-ガラクトースレベルを上昇させることによってのいずれかとの組み合わせでβ-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を導入及び発現させることによって、ガラクトシル転移を強化する方法を提供する。ヒト様糖タンパク質の産生における下等真核生物宿主でのUDP-ガラクトース輸送体UGTのクローニング及び発現本明細書には、ヒト様ガラクトシル化糖タンパク質の産生のための下等真核細胞例、P.パストリスにおけるUDP-ガラクトース輸送体をコード化する遺伝子を導入及び発現する方法も開示される。S.ポムベUDP-ガラクトース輸送体のクローニング及び発現遺伝子特異的プライマーをS.ポムベUDP-ガラクトース輸送体遺伝子GenbankAL022598の相同性領域を補完するようデザインし、S.ポムベゲノムDNAATCC24843からPCR増幅し、単一イントロンを排除した。前記遺伝子の5’の96塩基対を増幅するために、プライマーRCD164配列番号7及びRCD177配列番号8を使用した。前記3’の966塩基対を増幅するために、プライマーRCD176配列番号9及びRCD165配列番号10を使用した。前記末端で導入されるNotI部位及びPacI部位を有する1つの連続したオープンリーディングフレームを含有する単一PCR断片へと前記2つの増幅した産物を重ねるために、プライマーRCD164配列番号7及びRCD165配列番号10を使用した。前記PCR産物をpCR2.1TAInvitrogenへとクローニングし、配列決定した。前記遺伝子産物を、P.パストリスGAPDHプロモーターを含有するプラスミドpJN335へとサブクローニングした実施例2。したがって、ある実施態様において、S.ポムベUDP-ガラクトース輸送体をコード化するプラスミドpRCD257GenbankAB023425を構築し、宿主において発現させ、末端GlcNAc残基P.パストリスRDP-27例、GlcNAcMan3GlcNAc2を産生する。多様なUDP-ガラクトース輸送体のクローニング及び発現好ましい実施態様において、キイロショウジョウバエD.melanogasterUDP-ガラクトース輸送体をコード化する遺伝子を下等真核宿主細胞において導入及び発現させる。キイロショウジョウバエUGTをキイロショウジョウバエcDNAライブラリUCBerkeleyキイロショウジョウバエゲノムプロジェクト、卵巣λ-ZAPライブラリGMからPCR増幅し、pCR2.1PCRクローニングベクターへとクローニングし、配列決定した。NotI部位及びPacI部位を導入する遺伝子を増幅するため、プライマーDmUGT-5’配列番号11及びDmUGT-3’配列番号12を使用した。pSH263をつくるpRCD393における前記NotI部位及びPacI部位でPpOCH1プロモーターの下流へ融合したこの遺伝子を増幅するため、前記NotI部位及びPacI部位を使用した図3B。実施例2は、多様な他のUDPガラクトース輸送体のクローニングを示す。図11は、ガラクトース転移の強化についての比較におけるUDP-輸送体活性を示す。本発明の最良のモードとして、キイロショウジョウバエから単離されたUDP-ガラクトース輸送体をP.パストリスにおいて発現させる。キイロショウジョウバエUDP-ガラクトース輸送体と同時発現するヒトGalTI遺伝子融合体の活性を図11Eに示す。驚くべきことに、キイロショウジョウバエUGTを発現する宿主細胞は、主としてガラクトシル化した糖形態を産生するのに対し、S.ポムベ図11B、ヒトI図11C及びヒトII図11D由来のUGTは最適な転移を下回ることを示した。二ガラクトシル化し、脱フコシル化し、脱シアル酸付加した糖形態Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2の産生における有意な強化が生じる。1664m/z[C]での単一形態のピークは、グリカンGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2の質量に対応する。DmUGTを発現する宿主細胞例、P.パストリスpastorisは、他のUDP-ガラクトース輸送体と比較して少なくとも90モルのガラクトース転移を呈する。UDP-ガラクトース輸送体ポリペプチド本発明は、下等真核宿主細胞例、P.パストリスにおいて発現する輸送体-トランスフェラーゼ融合体の多様な組み合わせを提供する。したがって、ある実施態様において、本発明は、触媒活性のあるβ-ガラクトシルトランスフェラーゼドメインへフレーム内に融合したUDP-ガラクトース輸送体を含む下等真核宿主を提供する。別の実施態様において、ヒト様等タンパク質を産生する宿主細胞は、hGalTI触媒ドメインへフレーム内に融合したS.ポムベ及びS.セレビシエMnn2s指向性ペプチドから単離されるUDP-ガラクトース輸送体を含む。ヒト様糖タンパク質の産生における下等真核宿主におけるUDP-ガラクトース4-エピメラーゼの発現本発明の別の態様において、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性及び少なくともUDP-ガラクトース4-エピメラーゼ活性酵素、ホモログ、変異体、誘導体及び触媒活性のあるそれらの断片を発現させることによって下等真核生物例、P.パストリスpastorisにおいてヒト様糖タンパク質を産生するための方法が提供される。エピメラーゼは、UDP-ガラクトース及びUDP-グルコースの相互変換を触媒する酵素である。本分野で周知の技術を使用して、エピメラーゼ遺伝子例、ScGAL10、SpGALE、hGALEの相同性領域を補完するよう遺伝子特異的プライマーをデザインし、PCR増幅する実施例3。ある実施態様において、S.セレビシエGal10活性をコード化する遺伝子、又はエピメラーゼをコード化する組換え型核酸分子、又はエピメラーゼ活性をコード化する核酸分子からの発現を下等真核宿主細胞例、P.パストリスにおいて導入及び発現させ、末端β-ガラクトース残基を有することを特徴とするヒト様糖タンパク質を産生させる。あるいは、エピメラーゼ活性の活性化によって、宿主細胞を遺伝子工学的に改変し、ガラクトシル化した糖形態のレベルを上昇させる。複雑なN-グリカンの産生におけるUDP-ガラクトース4-エピメラーゼの発現ある実施態様において、UDP-グルコースをUDP-ガラクトースへ変換するためにエピメラーゼ活性をコード化する遺伝子を発現させ、宿主細胞におけるガラクトシル転移のためにUDP-ガラクトースのレベルを上昇させる。β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性に加えてエピメラーゼ活性の発現は、ガラクトシル化したN-グリカンの産生を強化する。図9Bは、ScCal10をコード化するプラスミドであるpRCD395と組み合わせたMnn2s/hGalTI融合体で形質転換した複雑なグリカンを産生する酵母系例、P.パストリスYSH-44を示す。ScGal10エピメラーゼの付加は、ガラクトース転移のための入手可能なUDP-ガラクトースを上昇させる。1501m/z[B]でのピークは、グリカンGlcNAc2Man3GlcNAc2上の1つのガラクトース残基の転移に対応し、1663m/z[C]でのピークは、グリカンGlcNAc2Man3GlcNAc2上の2つのガラクトース残基の転移に対応する。好ましくはガラクトースの少なくとも60モルが中性グリカン全体のに関して転移する。したがって、ある実施態様において、エピメラーゼ活性との組み合わせでのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が、宿主細胞において発現され、ガラクトシル化した糖タンパク質を産生する実施例7。ハイブリッドN-グリカンの産生におけるUDP-ガラクトース4-エピメラーゼの発現別の実施態様において、ScGAL10の導入及び発現は、下等真核生物におけるハイブリッド糖タンパク質に関するガラクトース転移を強化する実施例6。図10Aは、ハイブリッドガラクトシル化N-グリカンを生成するScGal10エピメラーゼと組み合わせてMnn2m/hGalTI融合体を発現するP.パストリス株RDP39-6を示す。前記N-グリカン分析によって、1つのガラクトース残基の転移を確立するグリカンGalGlcNAcMAn5GlcNAc2の質量に対応する1622m/z[K]でのピーク、及びハイブリッドグリカンGlcNAcMan5GlcNAc2の質量に対応する1460m/z[H]でのピークが示される。その後のβ1,4-ガラクトシダーゼ切断によって単一ガラクトース残基の存在が確立される図10B。好ましくはガラクトース転移の少なくとも70モルが中性グリカン全体のに関して検出される。ガラクトース転移を強化するため、さらに他のエピメラーゼを宿主細胞において発現させる。実施例3は、エピメラーゼ構築物の構築を示し、図13は、ヒト様N-グリカンの生成における種々のエピメラーゼの活性を示す。図13AにおけるMnn2s/hGalTI及びDmUGTに沿ったScGal10の発現は、優勢な二ガラクトシル化した糖形態Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2を示す。同様に、いずれかのオーダーにおけるSpGalE、Mnn2s/hGalTI、前記DmUGTの形質転換は、二ガラクトシル化した糖形態の産生を生じる図13B及び図13C。hGalEの付加は同一の効果を有する図13D。好ましくは、前記エピメラーゼは、S.セレビシエUDP-ガラクトース4-エピメラーゼ、S.ポムベUDP-ガラクトース4-エピメラーゼ、大腸菌E.coliUDP-ガラクトース4-エピメラーゼ、ヒトUDP-ガラクトース4-エピメラーゼからなる群から選択される。制限を加えることなく、他のエピメラーゼは同様に選択できかつ宿主細胞において発現できる。SpGALEをコード化する核酸配列本発明はさらに、S.ポムベ由来のGALE遺伝子及びその変異体を含む単離された核酸分子を提供する。酵素UDP-ガラクトース4-エピメラーゼをコード化するこの遺伝子についての全長の核酸配列はすでに配列決定されており、GenbankNC_003423に示されるように同定されている。S.ポムベゲノムdNAからSpGALEを増幅するのに使用されるプライマーは、除去された175塩基対のイントロンを明らかにした実施例3。前記クローニングしたゲノム配列内に含まれるのは、S.ポムベUDP-ガラクトース4-エピメラーゼについてのコード化配列である。前記コード化したアミノ酸配列は配列番号13にも示される。前記SpGALE遺伝子は、宿主細胞におけるN-グリカンへのガラクトース転移のためのUDP-ガラクトースの十分なプールを生じる上で特に有用である。下等真核生物におけるSpGALE遺伝子の発現は、N結合したオリゴ糖合成における強化された及び効率のよいガラクトース転移を提供する。ある実施態様において、本発明は、配列番号14に示されるSpGALEコード化配列を含むか又はそれからなる核酸配列並びにそのホモログ、変異体及び誘導体を有する単離された核酸分子を提供する。更なる実施態様において、本発明は、野生型遺伝子と少なくとも53の同一性を有するSpGALE遺伝子の変異体である配列を含むか又はそれからなる核酸分子を提供する。核酸配列は野生型遺伝子と少なくとも70、75又は80の同一性を有しうる。さらにより好ましくは、前記核酸配列は、野生型遺伝子に対して85、90、95、98、99、99.9又はさらにより高い同一性を有しうる。別の実施態様において、本発明の核酸分子は配列番号13のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する。配列番号13と少なくとも60同一であるポリペプチド配列をコード化する核酸分子も提供される。典型的に、本発明の核酸分子は、配列番号13との少なくとも70、75又は80の同一性のポリペプチド配列をコード化する。好ましくは、前記コード化したポリペプチドは、配列番号13と85、90又は95同一であり、前記同一性はさらにより好ましくは98、99、99.9又はさらにより高くありうる。ガラクトシル化した糖タンパク質の産生のためのUDP-グルコース及びUDP-ガラクトースの相互変換に関与するエピメラーゼの保存された領域S.ポムベ、ヒト、大腸菌由来のエピメラーゼと、S.セレビシエの最初の362個のアミノ酸残基との配列比較は、いくつものモチーフ及び潜在的な活性部位の存在を示す非常に保存された領域を示す図7実施例11。ある実施態様において、本発明は、潜在的なUDP-ガラクトース又はUDP-グルコース結合モチーフを以下の箇所で有する配列番号13のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。すなわち、9-VLVTGGXGYIGSHT-22配列番号48、83-VIHFAGLKAVGESXQXPLXYY-103配列番号49、127-FSSSATVYGX-136配列番号50、184-LRYFNPXGAHXSGXXGEDPXGIPNNLXPYXXQVAXGRX-221配列番号51、又は224-LXXFGXDYXXXDGTXXRDYIHVXDLAXXHXXAX-256配列番号52である。別の好ましい実施態様において、第一配列の位置15にあるアミノ酸残基は、S及びAからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第二配列の位置96にあるアミノ酸残基は、T及びVからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第二配列の位置98にあるアミノ酸残基は、V、K及びIからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第二配列の位置101にあるアミノ酸残基は、S、D、E及びRからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第三配列の位置136にあるアミノ酸残基は、D及びNからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第四配列の位置190にあるアミノ酸残基は、G、T、V及びIからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第四配列の位置194にあるアミノ酸残基は、P及びAからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第四配列の位置197にあるアミノ酸残基は、E、C、D及びLからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第四配列の位置198にあるアミノ酸残基は、L、I及びMからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第四配列の位置203にあるアミノ酸残基は、L及びQからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第四配列の位置210にあるアミノ酸残基は、L及びMからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第四配列の位置213にあるアミノ酸残基は、I、V及びMからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第四配列の位置214にあるアミノ酸残基は、A及びSからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第四配列の位置218にあるアミノ酸残基は、V及びIからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第四配列の位置221にあるアミノ酸残基は、L及びRからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置225にあるアミノ酸残基は、N、A及びYからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置226にあるアミノ酸残基は、V及びIからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置229にあるアミノ酸残基は、D及びNからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置232にあるアミノ酸残基は、P及びDからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置233にあるアミノ酸残基は、T及びSからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置234にあるアミノ酸残基は、S、E及びRからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置238にあるアミノ酸残基は、P及びGからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置239にあるアミノ酸残基は、I及びVからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置246にあるアミノ酸残基は、C、V及びMからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置250にあるアミノ酸残基は、E、K及びDからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置251にあるアミノ酸残基は、A及びGからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置253にあるアミノ酸残基は、V及びIからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置254にあるアミノ酸残基は、A及びVからなる群から選択される。別の好ましい実施態様において、第五配列の位置256にあるアミノ酸残基は、L及びMからなる群から選択される。単離されたポリペプチド本発明の別の態様にしたがって、本発明の核酸分子によってコード化される変異タンパク質、対立形質、変異体、断片、誘導体、及びアナログを含む単離されたポリペプチドが提供される。ある実施態様において、前記単離されたポリペプチドは、配列番号13に対応するポリペプチド配列を含む。本発明のある代替的な実施態様において、前記単離されたポリペプチドは配列番号13と少なくとも60同一のポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明の前記単離されたポリペプチドは配列番号13との少なくとも70、75又は80同一性を有する。より好ましくは、前記同一性は85、90又は95であるが、配列番号13との同一性は98、99、99.9又はさらにより高くありうる。本発明の他の実施態様にしたがって、前述のポリペプチド針悦の断片を含む単離されたポリペプチドが提供される。これらの断片には好ましくは少なくとも20個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個又はさらにより多くの連続したアミノ酸が含まれる。本発明のポリペプチドは、前述のポリペプチド配列と異種性のポリペプチドとの間の融合も含む。前記異種性の配列は、例えば組換えで発現されるタンパク質の精製及び/又は可視化を容易にするようデザインされた異種性の配列を含むことができる。タンパク質融合の他の制限のない例には、ファージ又は細胞の表面上でコード化されたタンパク質を表しうるもの、緑色蛍光タンパク質GFPなどの本質的に蛍光性のタンパク質への融合、及びIgGFc領域への融合が含まれる。UDP-ガラクトース4-エピメラーゼ/β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ融合ポリペプチド本発明の更なる態様において、エピメラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼ活性を含むポリペプチドをコード化する遺伝子融合が生成される。ある実施態様において、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼ及びβ1,4-GalTIを含む融合ポリペプチドが生成され、宿主細胞に導入される。より好ましい実施態様において、前記融合ポリペプチドはさらに、リーダー配列を含む。例えば、指向性ペプチドをコード化するリーダー配列のライブラリが、SpGalE/hGalTI融合にフレーム内に連結される。さらにより好ましい実施態様において、前記融合ポリペプチドは、ScMnn2sリーダー、SpGalEエピメラーゼ及びhGalTIを含む。前記融合ポリペプチドは、HYGマーカーを含む酵母組み込みプラスミドに挿入される。pRCD461と命名されるエピメラーゼ-ガラクトシルトランスフェラーゼ組み込みプラスミドの例は図5に示されている実施例8。前記エピメラーゼ-ガラクトシルトランスフェラーゼ融合形質転換体は、約70ガラクトシル化したヒト様糖タンパク質Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2を生成する図15B。B1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼ、UDP-ガラクトース輸送体ポリペプチド本発明の別の態様において、β-ガラクトシルトランスフェラーゼ、エピメラーゼ及びUDP-ガラクトース輸送体の活性を含むポリペプチドをコード化する単一構築物が生成される。ある実施態様において、ヒトβ1,4-GalT、SpGalE及びDmUGT三重を含むプラスミドを構築する実施例9。好ましい実施態様において、前記トランスフェラーゼポリペプチドはさらに、リーダー配列、例えばhGalTIへフレーム内に凍結されたScMnn2sを含む。3つのポリペプチドはすべて、好ましくは自らのプロモーター及び終結因子とともにKANRマーカーを含有する酵母組み込みプラスミドへと挿入される。pRCD465と命名されるこの三重組み込みプラスミドの例は図4に示されている。ある実施態様において、前記融合ポリペプチドを含む三重組み込みプラスミドが、宿主細胞において導入及び発現され、末端GlcNAc残基を産生する。P.パストリスYSH-44を前記三重組み込みプラスミドで形質転換し、RDP80と命名した。RDP80系において産生されるN-グリカンが、推定したGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2種であるかどうかを査定するため、RDP80から分泌され、精製したK3を、CMP-NANAの存在下において試験管内でシアリルトランスフェラーゼとインキュベートし、生じたN-グリカンが放出された。前記N-グリカンのMALDI-TOFMS分析は、最終的にシアル酸付加したN-グリカンNANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2である複雑なものの質量に対応する2227m/z[X]での優勢なピークを示した図14C。UDP-Galの代替的な生産前述のように、ガラクトース残基のN-グリカンへの転移は、活性化されたガラクトースUDP-Galのプールを要する。下等真核生物における内在性レベルを上回るこのようなプールを形成するある方法は、UDP-ガラクトース4エピメラーゼの発現である。代替的な経路には、3つの個別の遺伝子UDP-ガラクトース4エピメラーゼのない状態での形質膜ガラクトースパーミアーゼ、ガラクトキナーゼ、及びガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼの発現が含まれる。前記UDP-ガラクトース4エピメラーゼのない状態で、ガラクトースの外来源を有するルロワLeLoir経路のその他の3つの遺伝子の発現は、UDP-ガラクトースの内在性レベルを上昇するのに機能するであろうRossほか、2004。さらに、本実施態様において、前記生じたUDP-ガラクトースがN-グリカンなどの基質への添加と離れては代謝できないため、UDP-ガラクトース4エピメラーゼのないことによってUDP-ガラクトースのレベルは、ガラクトースの外来性濃縮を調節することで調節できるようになる。ガラクトースパーミアーゼは、形質膜ヘキソース輸送体であり、外来源からガラクトースを取り込む。ある実施態様において、S.セレビシエガラクトースパーミーゼ遺伝子、GAL2Genbank:M81879、又はガラクトースを取り込むことのできる形質膜ヘキソース輸送体をコード化するいずれかの遺伝子を使用する。ガラクトキナーゼは、ガラクトース代謝の第一段階、すなわちガラクトースのガラクトース-1-リン酸へのリン酸化を触媒する酵素である。別の実施態様において、S.セレビシエ由来のGAL1遺伝子Genbank:X76078を使用する。ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼは、UDP-ガラクトース及びガラクトース-1-リン酸のUDP-ガラクトース及びグルコース-1-リン酸への変換である、ガラクトース代謝の第二段階を触媒する。別の実施態様において、ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性をコード化するいずれかの遺伝子を使用でき、これにはS.セレビシエGAL7Genbank:M12348が含まれる。好ましい実施態様において、UDP-ガラクトース4エピメラーゼをコード化する遺伝子は、ルロワLeLoir経路を介してガラクトースを代謝できる下等真核生物から削除される。より好ましい実施態様において、ガラクトースパーミアーゼ、ガラクトキナーゼ及びガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコード化する遺伝子を、gal-でありルロワLeLoir経路の遺伝子を内在的に発現しない下等真核宿主細胞において発現させるHittingerほか、2004。この代替実施態様の利点は、生育阻害濃度を下回るレベルでの外部ガラクトースの調節により、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼのないことで内部UDP-ガラクトース濃度の特異的な調節が可能になることである。遺伝学的に変化した酵母細胞におけるガラクトシル化したN-グリカン産生の増加酵母及び菌の宿主におけるヒト様N-グリカンを産生する方法は、WO00200879A3及びWO03056914A1において提供され、本明細書に組み込まれる。当業者は、前述の方法と組み合わせて本明細書で開示された手段の決まりきった改変が対象の糖タンパク質の産生における改善された結果を提供し得ることを認識する。本発明の方法にしたがって、少なくともβ-ガラクトシルトランスフェラーゼ融合構築物pXB53で形質転換したP.パストリス実施例4図12は、検出可能な部分において複雑によりガラクトシル化されたグリカンを生成する。ガラクトース残基の少なくとも10は宿主細胞において糖タンパク質へと転移される。エピメラーゼの発現は、ガラクトース転移のレベルも増加する図13。好ましくは、ガラクトース残基の少なくとも60が宿主細胞における糖タンパク質へと転移される。UGTなどの別の異種性グリコシル化酵素の発現は、望ましいガラクトシル化した糖タンパク質の細胞内産生をさらに強化する。驚くべきことに、このような輸送体の一つであるDmUGTの発現はガラクトース転移を劇的に増加させる図11。本実施態様の最良のモードにおいて、DmUGTで形質転換した宿主細胞は、少なくとも90以上のガラクトース転移を示す。好ましくは、前記酵母宿主細胞の温度は、前記酵素の至適温度と符合させるため37°Cに維持される。さらに、前記方法にはこれらの糖タンパク質を単離することも含まれる。UDPase活性の発現WO02/00879に記載されているように、ヒトにおいて、ヌクレオチド糖前駆体例えばUDP-N-アセチルグルコサミン、UDP-N-アセチルガラクトサミン、CMP-N-アセチルノイラミン酸、UDP-ガラクトース等は、一般にサイトゾル中で合成され、ゴルジ体へと輸送され、そこでヌクレオチド糖前駆体はグリコシルトランスフェラーゼによって中心オリゴ糖に結合する。このプロセスを下等真核生物において複製するため、糖ヌクレオシド特異的輸送体が、ヌクレオシド糖前駆体の適切なレベルを確実にするため、ゴルジ体において発現されなければならないSommers,1981;Sommers,1982;Perez,1987。糖のN-グリカンへの転移の副産物は、ヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸のいずれかである。一リン酸塩がアンチポートメカニズムによってヌクレオシド三リン酸糖との交換において直接放出されることができる一方で、二リン酸ヌクレオシド例えばGDPは、放出される前に、リン酸分解酵素例、GDPaseによって開裂され、ヌクレオシド一リン酸及び無機リン酸が産生されなければならない。この反応は、S.セレビシエ由来のGDPaseがマンノシル化に必要であることがわかっているため、効率のよいグリコシル化に重要であるように見える。しかしながら、前記酵素はUDPに対して活性が10しかないBerninsone,1994。下等真核生物は、ゴルジ体において糖タンパク質合成のためのUDP-糖前駆体を利用しないため、ゴルジ体においてUDP特異的ジホスファターゼ活性をしばしば有していない。遺伝子工学的に改変された酵母の系は、基質としてUDP-GlcNAc又はUDP-ガラクトースを利用する複数のトランスフェラーゼ酵素を含有する。このことは、殆んどの種においてこれらの基質を含有しない酵母ゴルジ体において、適切な基質プールの遺伝子工学的改変を要する。しかしながら、UDP-GlcNAc又はUDP-ガラクトースを利用するトランスフェラーゼ反応の最終生成物には遊離UDPが含まれる。このUDPは、これらの糖ヌクレオチドを利用する殆んどのトランスフェラーゼの強い阻害剤として作用する。S.セレビシエは、ヌクレオシドジホスファターゼ活性を有する2つのゴルジ体タンパク質を発現する。1つはScGDA1であり、GDPに対して非常に特異的であるAbeijonほか、1993。二番目はScYND1というアピラーゼであり、したがってヌクレオシド二リン酸と同様、ヌクレオシド三リン酸も加水分解でき、ADP/ATP、GDP/GTP及びUDP/UTPに対して等しく特異的であるGaoほか、1999。しかしながら、野生型ゴルジ体におけるUDPに結合した糖の欠失、及びUDPを最終生成物として生成するトランスフェラーゼ酵素の同時欠失のため、遺伝子工学的に改変された酵母の系におけるUDPの蓄積の起こりうる上昇が重大な関心事である。サイトゾルからゴルジ体へのガラクトース残基の転移がUDPaseの欠失によって阻害され得るので、UDPaseを発現させるための遺伝子操作が下等真核宿主細胞において効率よいガラクトース転移のために必要であろう。したがって、本発明の別の態様において、UDPaseをコード化する遺伝子を発現させる、好ましくは過剰発現させる方法が提供される。UDPase活性をコード化する遺伝子の過剰発現により、ゴルジ体における受容体基質へのガラクトースの転移に必要な糖ヌクレオチドUDP-ガラクトースの利用可能性を増加させることが意図される。酵母のゴルジ体におけるUDPase活性のレベルを上昇させるためにはいくつかの可能性が存在する。ある実施態様において、UDPase活性をコード化する遺伝子、例えばUDPに対していくらかの活性約10のあるScGDA1NP_010872が過剰発現される。別の実施態様において、ヌクレオシドジホスファターゼ活性をコード化する遺伝子、例えばGDPと比較してUDPに対してより高い活性を有するScYND1NP_010920これは、しかし、ヌクレオチド二リン酸に特異的ではない。が過剰発現される。さらに、別の実施態様において、P.パストリスにおけるより高いUPDase活性を得るという目標を達成するために、S.セレビシエGDA1又はYND1が過剰発現される。又は、これらの遺伝子のP.パストリスのホモログこれはBLAST相同性検索を介して簡単に同定可能である。が過剰発現される。さらに、これらの糖ヌクレオチドを利用する生物は、これら糖ヌクレオチドをUMPへ、UDPに特異的なヌクレオチドジホスファターゼの作用を介して変換することができる。一例は、Wang及びGuidottiAF016032によって特定されたヒトウリジンジホスファターゼUDPaseである。しかしながら、このタンパク質は2つの推定膜貫通ドメインを含有し、1つはC末端に、1つはN末端にある。したがって、酵母ゴルジ体におけるこのタンパク質の局在化のためには、このタンパク質の触媒ドメインを酵母指向性ドメインと融合させる必要がある。K.ラクティス及びS.セレビシエを含む他の酵母は、それらのゴルジ体においてUDP-糖を利用し、GlcNAc及びガラクトースをそれぞれそれらのN-グリカンへと付加する。K.ラクティスもS.ポムベも、KlGDA1Lopez-Avalosほか、2001;CAC21576及びSpgdaID’Alessioほか、2003;NP_593447とそれぞれ命名され、UDPase活性も有する、ScGDA1の相同体を発現する。UDPが遺伝子工学的に改変された酵母の系において蓄積し、前記遺伝子工学的に改変されたトランスフェラーゼに対して有害であることが示される場合、これらのいずれかのタンパク質又はより多くのタンパク質の発現はUDPase活性を許容可能なレベルまで押し上げるよう機能する。アシアロ糖タンパク質受容体ASGRに対する結合親和性本発明の別の特徴は、脱シアル酸付加した糖タンパク質を除去し、循環器系における治療タンパク質の半減期を低下させることがわかっているASGRに対する結合親和性の低下を提供する。先行研究により、二アンテナ性構造を有するグリカンは、三アンテナ性又は四アンテナ性構造を有するグリカンよりもあまり迅速には除去されないことが示されているStockert、PhysiolRev.1995年7月号;753:591-609。本発明のある態様において、末端ガラクトース残基を有することを特徴とする単一糖形態例えば二アンテナ性構造を有する対象のタンパク質上のグリカンを提供する。このような二アンテナ性構造は、三アンテナ性及び四アンテナ性分岐反応を触媒する他のGnTのため、哺乳類細胞において容易に生成されない。ガラクトース残基を備えた末端GlcNAc残基を有する基質をキャッピングすることによって、ガラクトシル化した基質へのGlcNAcの転移を触媒する他のGnT例、GnTIV、GnTVは存在しない。したがって、本発明は、哺乳類宿主において産生される前記糖タンパク質と比較して、ASGRに対する結合親和性がほとんどない脱シアル酸した糖タンパク質を生成するための方法を提供する。より好ましい実施態様において、脱シアル酸した糖タンパク質は、哺乳類において産生される異種性の糖タンパク質と比較して、増加した体内における循環上の半減期及び生物活性によって特徴付けられる。組み込み部位例えば1,3マンノシルトランスフェラーゼ例えばS.セレビシエにおけるMNN1Graham,1991、1,2マンノシルトランスフェラーゼ例えばS.セレビシエ由来のKTR/KREファミリー、1,6マンノシルトランスフェラーゼS.セレビシエ又はP.パストリス由来のOCH1、マンノシルリン酸トランスフェラーゼ及びその制御因子S.セレビシエ由来のMNN4、PNO1及びMNN6、細胞内プロテアーゼAPEP4、細胞内プロテアーゼBPRB1GPIにより固定されたアスパラギン酸プロテアーゼYPS1、及び異常で、免疫原性の即ち、ヒト以外でのグリコシル化反応に関与する他の酵素などのマンノシルトランスフェラーゼに対応する遺伝子座においてUGT、エピメラーゼ及びβ1,4GalTをコード化する核酸を組み込むことが好ましい。破壊された遺伝子座を有する変異体は、酵素活性の低下した又は酵素活性が完全に排除された生存可能な表現型を生じる。好ましくは、惹起initiatingするα-1,6マンノシルトランスフェラーゼ活性をコード化する遺伝子座は、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコード化する遺伝子の初期組み込みのための適した標的である。同じようにして、前記遺伝子座における遺伝子破壊事象に基づいて、1よりヒト様の様式でグリコシル化する細胞の能力を改善する、2タンパク質を分泌する細胞の能力を改善する、3外来タンパク質のタンパク質分解を低下させる、及び4精製を容易にするプロセス又は発酵プロセス自体の他の特徴を改善する、ことが期待される他の染色体の組み込み部位の範囲を選択できる。特に好ましい実施態様において、ライブラリDNAは宿主染色体における望ましくない遺伝子の部位へ組み込まれ、前記遺伝子を破壊し又は除去される。例えば、OCH1、MNN1又はMNN4遺伝子の部位への組み込みによって、望ましいライブラリDNAの発現が可能になる一方、酵母における糖タンパク質の過マンノシル化に関与する酵素の発現を防止する。他の実施態様において、ライブラリDNAは、核酸分子、プラスミド、ベクター例えばウィルスベクター又はレトロウィルスベクター、染色体を介して宿主へと導入されてもよく、自立性核酸分子として、又は宿主ゲノムへの相同的又は無作為に組み込まれてもよい。いずれの場合においても、安定的に形質転換された宿主生物を容易に選別することを可能にするために、少なくとも1つの選択可能なマーカー遺伝子を各ライブラリDNA構築物に含むことが一般に望ましい。選択できるURA5などの再利用可能なマーカー遺伝子Yeast,2003年11月号;2015:1279-1290が特に適している。更なる配列多様性の作成本実施態様の方法は、核酸、例えば宿主へ形質転換されるDNAライブラリが多様な配列を含有するとき最も効果的であり、それにより少なくとも1つの形質転換体が望ましい表現型を呈する確率を増大させる。例えば、単一のアミノ酸突然変異が、糖タンパク質加工酵素の活性を劇的に変更させ得るRomeroほか、2000。したがって、形質転換の前に、DNAライブラリ又はサブライブラリ成分は、更なる配列多様性を作成するための1つ以上の技術へ供され得る。例えば、遺伝子シャフリング、エラープロンPCR、試験管内変異誘発又は配列多様性を作成するための他の方法が、融合構築物のプール内で配列のより大きな多様性を得るために実施し得る。コドン最適化本発明の核酸が、保存的なアミノ酸置換、付加、欠失又はその組み合わせなどの一次アミノ酸配列における1つ以上の変化を生じるようにコドンの最適化がされてもよいことも意図される。発現調節配列各ライブラリ構築物を、前述のオープンリーディングフレーム配列に加えて、例えばプロモーター、転写終結因子、エンハンサー、リボソーム結合部位、及び宿主生物体への融合構築物の形質転換に際し融合タンパク質の効果的な転写及び翻訳を確実にするのに必要であり得る他の機能的配列などの発現調節配列と共に提供することが一般に好ましい。適切なベクター構成成分例えば、選択可能なマーカー、発現調節配列例、プロモーター、エンハンサー、終結因子等及び必要に応じて宿主細胞における自律複製に必要な配列は、選択された特定の宿主細胞の機能として選択される。特定の哺乳類宿主細胞又は下等真核宿主細胞に使用のための適切なベクター構成成分の選抜基準は日常的なものである。本発明の好ましい下等真核宿主細胞には、ピキアパストリスPichiapastoris、ピキアフィンランディカPichiafinlandica、ピキアトレハロフィラPichiatrehalophila、ピキアコクラマエPichiakoclamae、ピキアメンブラナエファシエンスPichiamembranaefaciens、ピキアミニュータPichiaminutaオガタエアミニュータOgataeaminuta、ピキアリンドネリPichialindneri、ピキアオプンティアエPichiaopuntiae、ピキアサーモトレランスPichiathermotolerans、ピキアサリクタリアPichiasalictaria、ピキアグエルキュームPichiaguercuum、ピキアピジュペリPichiapijperi、ピキアスティプティスPichiastiptis、ピキアメタノリカPichiamethanolica、ピキア種Pichiasp.、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、サッカロミセス種Saccharomycessp.、ハンゼヌラポリモルファHansenulapolymorpha、クルイベロミセス種Kluyveromycessp.、クルイベロミセスラクティスKluyveromyceslactis、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、アスペリギルスニドウランスAspergillusnidulans、アスペリギルスニガーAspergillusniger、アスペルギルスオリゼAspergillsoryzae、トリコデルマリーゼイTrichodermareesei、クリソスポリウムラックノウエンスChrysosporiumlucknowense、フサリウム種Fusariumsp.、フザリウムグラミネウムFusariumgramineum、フザリウムベネナツムFusariumvenenatum、フィスコミトレラパテンスPhyscomitrellapatens及びノイロスポラクロッサNeurosporacrossaが含まれる。宿主がピキアパストリスの場合、適切なプロモーターは、例えばAOX1、AOX2、GAPDH、OCH1、SEC4、D2及びP40のプロモーターを含む。選択可能なマーカー薬物耐性を付与し又は宿主の代謝上の破壊された部分を補完するための遺伝子などの、少なくとも1つの選択可能なマーカーを各構築物に提供することがまた好ましい。前記マーカーの存在は、形質転換体のその後の選択において有用であり、例えば酵母においては、URA5、URA3、HIS4、SUC2、G418、BLA又はSHBLEといった遺伝子が使用され得る。選択可能なマーカーの多くは公知であり、酵母、菌、植物、昆虫、哺乳類及びその他の真核宿主細胞において使用するために利用可能である。形質転換酵母において、電気穿孔法、塩化リチウム法又はスフェロプラスト法などのDNA導入法のいずれかの従来の方法を使用し得る。糸状菌及び植物細胞において、従来の方法は、粒子照射、電気穿孔法及びアグロバクテリウムにより仲介される形質転換を含む。高密度培養例えば酵母における発酵に適した安定した株を作製するため、宿主染色体へ融合構築物に組み込むことが望ましい。好ましい実施態様において、組み込みは本分野で周知の技術を使用して相同的組換えを介して行われる。好ましくは、P.パストリスの安定した遺伝的修飾は、二重のクロスオーバー事象を介して行われるNettほか、Yeast、2003年11月号;2015:1279-1290。例えば、異種性の酵素活性は宿主生物の配列と相同的な側面配列によって提供され、次いで、単一マーカーを拾いだすことにより形質転換が行われる。このような方法により、組み込みが、再利用可能なマーカーを使用する宿主ゲノムの特定の部位において行われる。スクリーニングプロセス及び選択プロセス宿主株を異種性の酵素で形質転換した後、望ましいグリコシル化表現型を示す形質転換体が選択される。選択は、単一段階において又は多様なアッセイ又は検出方法のいずれかを使用する一連の表現型の濃縮段階及び/又は枯渇段階によって実施され得る。表現型の特徴付けは、手動で又は自動化した高処理量のスクリーニング装置を使用して実施し得る。共通して、宿主微生物は、細胞表面上にタンパク質N-グリカンを示し、それにより細胞表面上に多様な糖タンパク質が局在する。例えば、細胞表面上の末端GlcNAcの最大濃度を有する細胞について、又は最大の末端GlcNAc含有量でタンパク質を分泌する細胞について、スクリーニングし得る。このようなスクリーニングは、染色手順、特定の末端GlcNAcに結合する、抗体又はマーカーに結合したレクチンこのようなレクチンはE.Y.Laboratories社、SanMateo,CAから入手可能である。の結合能力、末端マンノース残基へ結合する特異的レクチンの低下した能力、インビボでの放射性標識した糖を組み込む能力、染色剤への又は荷電した表面への変化した結合のような可視化方法に基づき得、又はフルオロフォア標識したレクチン又は抗体と組み合わせたFluorescenceAssitedSortingFACSを使用することによって達成し得るGuillen,1998。したがって、無傷細胞が、この細胞を望ましいN-グリカンへ特異的に結合するレクチン又は抗体に曝すことによって望ましいグリコシル化表現型についてスクリーニングされ得る。多様なオリゴ糖特異的レクチン例えばEYLaboratories,SanMateo,CAからが商業的に入手可能である。あるいは、ヒト又は動物N-グリカンに対して特異的な抗体は、商業的に入手可能であり、又は標準的な技術を使用して作製し得る。適切なレクチン又は抗体は、発色団、フルオロフォア、放射性同位体、又は色素生産性基質を有する酵素などのリポーター分子へ結合させ得るGuillenほか、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA9514:7888-7892。次いで、スクリーニングは、分光測定、蛍光測定、蛍光標示式細胞分取、又はシンチレーション計数などの分析方法を使用して実施し得る。他の場合において、形質転換した細胞から単離した糖タンパク質又はN-グリカンを分析する必要があり得る。タンパク質の単離は、本分野で公知の技術によって実施し得る。好ましい実施態様において、リポータータンパク質は、培地へと分泌され、アフィニティークロマトグラフィー例、Ni-アフィニティ又はグルタチオン-S-トランスフェラーゼアフィニティクロマトグラフィーにより精製される。単離されたN-グリカンが好ましい場合、エンド-b-N-アセチルグルコサミニダーゼGenzyme社、Boston,MA;NewEnglandBiolabs,Beverly,MAなどの酵素を使用して糖タンパク質から前記N-グリカンを切断してもよい。単離されたタンパク質又はN-グリカンは、次いで、液体クロマトグラフィー例、HPLC、質量分析又は他の適切な手段によって分析され得る。米国特許第5,595,900号は、望ましい細胞外炭水化物構造を有する細胞を特定し得るいくつかの方法を教示している。好ましい実施態様において、MALDI-TOF質量分析が前記切断したN-グリカンを分析するのに使用される。望ましい形質転換体の選抜の前に、望ましくない表現型を有する細胞の形質転換した集団を枯渇させることが望ましいこともあり得る。例えば、前記方法を使用して、機能的マンノシダーゼ活性を細胞へと遺伝子工学的に改変させるとき、望ましい形質転換体は、細胞内糖タンパク質において比較的低レベルのマンノースを有する。形質転換した手段を培地中のマンノースの致死量放射性同位体へ暴露することで、望ましくない表現型、つまり高レベルの組み込まれたマンノースを有する形質転換体の集団を枯渇させるHuffakerTC及びRobbinsPW.,ProcNatlAcadSciUSA.1983年12月号;8024:7466-7470。あるいは、望ましくないN-グリカンに対して指向する細胞毒性レクチン又は抗体が、望ましくない表現型の形質転換した集団を枯渇させるのに使用し得る例、StanleyP及びSiminovitchL.SomaticCellGenet1977年7月号;34:391-405。米国特許第5,595,900号は望ましい細胞外炭水化物構造を有する細胞を特定し得るいくつかの方法を教示している。この戦略を繰り返して実施することによって、下等真核生物におけるさらにより複雑なグリカンを順次行うことによって遺伝子工学的に改変できる。宿主細胞の表面上にヒト様N-グリカン中間体Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2の高い程度を有する前記細胞を検出するために、例えばインビトロ細胞アッセイにおいてGalTによるUDP-ガラクトースからのガラクトースへの最も効率的な転移を可能にする形質転換体を選択し得る。このスクリーニングは、アガープレート上で選択的な圧力の下で形質転換したライブラリを有する細胞を生育させ、個々のコロニーを96穴マイクロタイタープレートへと転移することによって実施し得る。前記細胞を生育させた後、前記細胞を遠心分離し、緩衝液中に再懸濁し、UDP-ガラクトース及びGalTの添加後のUDPの放出をHPLC又はUDPについての酵素結合アッセイのいずれかによって測定する。あるいは、放射性標識したUDP-ガラクトース及びGalTを使用し、前記細胞を洗浄した後、β-ガラクトシダーゼによる放射性ガラクトースの放出について観察してもよい。このことはすべて、手動で実施してもよく又は高処理量のスクリーニング装置の使用を通じて自動化されてもよい。第一アッセイにおいてより多くのUDPを放出する形質転換体、又は第二アッセイにおいてより放射性標識されたガラクトースを放出する形質転換体は、前記形質転換体の表面上にGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2のより高い程度を有すると期待され、したがって望ましい表現型を構成すると期待される。同様のアッセイが、同様に分泌されたタンパク質上のN-グリカンを観察するのに適応させ得る。あるいは、形質転換した細胞の表面上のグリコシル化パターンの変化を示すことのできるレクチン結合アッセイなどのその他の適切なスクリーニングを使用してもよい。この場合、末端マンノースに特異的なレクチンの結合の低下は、適切な選抜ツールであり得る。スノードロップGalantusnivalisレクチンは、十分なマンノシダーゼII活性がゴルジ体に存在する場合低下すると期待される末端a-1,3マンノースへ特異的に結合する。又、高い末端マンノース含有量を有する細胞の除去を可能にするクロマトグラフィー分離段階を実施することによって、望ましい形質転換体を濃縮し得る。この分離段階は低い末端マンノース含有量を有する細胞を上回る、高い末端マンノース含有量を有する細胞に特異的に結合するレクチンカラムを使用して実施されるであろう例、アガロースへ結合したスノードロップレクチン、Sigma,St.Louis,MO。宿主細胞本発明はP.パストリスを宿主生物体として使用して例示するが、酵母宿主及び菌宿主の他の種を含む他の真核宿主細胞に、ヒト様糖タンパク質を産生するために、本明細書に記載されるように替えることができることが当業者によって理解される。このような宿主には、好ましくはピキアフィンランディカPichiafinlandica、ピキアトレハロフィラPichiatrehalophila、ピキアコクラマエPichiakoclamae、ピキアメンブラナエファシエンスPichiamembranaefaciens、ピキアミニュータPichiaminutaオガタエアミニュータOgataeaminuta、ピキアリンドネリPichialindneri、ピキアオプンティアエPichiaopuntiae、ピキアサーモトレランスPichiathermotolerans、ピキアサリクタリアPichiasalictaria、ピキアグエルキュームPichiaguercuum、ピキアピジュペリPichiapijperi、ピキアスティプティスPichiastiptis、ピキアメタノリカPichiamethanolica、ピキア種Pichiasp.、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、サッカロミセス種Saccharomycessp.、ハンゼヌラポリモルファHansenulapolymorpha、クルイベロミセス種Kluyveromycessp.、クルイベロミセスラクティスKluyveromyceslactis、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、アスペリギルスニドウランスAspergillusnidulans、アスペリギルスニガーAspergillusniger、アスペルギルスオリゼAspergillsoryzae、トリコデルマリーゼイTrichodermareesei、クリソスポリウムラックノウエンスChrysosporiumlucknowense、フサリウム種Fusariumsp.、フザリウムグラミネウムFusariumgramineum、フザリウムベネナツムFusariumvenenatum、フィスコミトレラパテンスPhyscomitrellapatens及びノイロスポラクロッサNeurosporacrossaが含まれる。望ましくない宿主細胞グリコシル化遺伝子、例えばOCH1の同定及び破壊のために本明細書に記載された技術は、他の酵母系及び菌系などの他の真核宿主細胞における望ましくない宿主細胞グリコシル化遺伝子及び/又他の相同の若しくは機能的に関連した遺伝子に適用可能であると理解されるWO02/00879参照。さらに、他の好ましい宿主細胞は、Dol-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-Dolマンノシルトランスフェラーゼ活性についてコード化するAlg3pにおいて欠乏している。好ましい宿主細胞は、酵母宿主及び糸状菌宿主であり、これらはβ1,4-ガラクトース結合、フコース及び末端シアル酸を本質的に欠失している。哺乳類糖タンパク質のN-グリカンとは異なり、これらの糖は酵母及び糸状菌において産生される糖タンパク質に関して通常見つかっていない。本発明は、糖タンパク質上にガラクトース残基を産生し、前記糖タンパク質上にフコース残基およびシアル酸残基を本質的に欠失する宿主細胞を遺伝子工学的に改変するための方法を提供する。別の実施態様において、フコース又はシアル酸を産生する該宿主細胞は、フコシルトランスフェラーゼ活性又はシアリルトランスフェラーゼ活性を低下させるか又は排除するよう修飾できる。本発明の宿主から産生される糖タンパク質組成物はそれゆえ、フコース残基及びシアル酸残基を本質的に欠失している。本発明の有意な利点は、前記宿主細胞がフコシダーゼ及びシアリダーゼ処理による生体外修飾をせずにガラクトシル化した、フコースのない、及びシアル酸のない糖タンパク質を産生することである。他の好ましい宿主細胞には、グリカンに関してマンノシルリン酸化を欠失する菌宿主が含まれるUSSN11/020,808。さらに他の好ましい宿主細胞には、グリカンに関してβ-マンノシル化を欠失する菌宿主が含まれるUSSN60/566,736。したがって、本発明の別の態様は、ヒト細胞によって作られるものと類似した修飾されたN-グリカンを含む糖タンパク質を発現するヒト以外の真核宿主系に関する。酵母細胞及び菌細胞以外の種において本発明の方法を実施することはしたがって、本発明により意図され包含される。本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリがいずれかの真核宿主細胞系におけるグリコシル化経路を修飾する構築物を選択するために使用し得る。例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリは、宿主細胞分泌経路に沿って望ましい位置においてグリコシル化酵素又はその触媒作用ドメインを含むタンパク質を局在化させるために、植物、藻類及び昆虫において、並びに哺乳類細胞及びヒト細胞を含む他の真核宿主細胞においても使用し得る。好ましくは、グリコシル化酵素又は触媒作用ドメイン及びその類似体は、これらが機能でき、好ましくはこれらが最も効率よく機能するようデザインされ又は選択される宿主細胞分泌経路に沿って、細胞内の位置へと向かわされる。本発明のこの実施態様にしたがった方法を使用して影響を及ぼしうるグリコシル化への修飾の例は、1Man8GlcNAc2からマンノース残基を切断してMan5GlcNAc2N-グリカンを生じるよう真核宿主細胞を遺伝子工学的に改変すること、2N-アセチルグルコサミンGlcNAc残基をGlcNAcトランスフェラーゼIの作用によりMan5GlcNAc2へ付加するよう真核宿主細胞を遺伝子工学的に改変すること、3N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼGnTI、GnTII、GnTIII、GnTIV、GnTV、GnTVI、GnTIX、マンノシダーゼII、フコシルトランスフェラーゼFT、ガラクトシルトランスフェラーゼGalT又はシアリルトランスフェラーゼSTなどの酵素を機能的に発現するよう真核宿主細胞を遺伝子工学的に改変すること、である。前記方法を繰り返すことによって、ますます複雑なグリコシル化経路が下等真核微生物などの標的宿主へと遺伝子工学的に改変できる。ある好ましい実施態様において、前記宿主生物体は、グリコシル化活性をコード化する配列を含むDNAライブラリと2回以上形質変換される。望ましい表現型の選択は、形質転換の各ラウンド後、又はそれに替わるものとして何回もの形質転換が生じた後に実施され得る。複雑なグリコシル化経路はこの方法で迅速に遺伝子工学的に改変できる。指向性糖タンパク質本明細書に記載の方法は、糖タンパク質、特にヒトにおいて治療上使用される糖タンパク質を産生するのに有用である。特異的糖形態を有する糖タンパク質は、例えば、治療用タンパク質の指向性において特に有用であり得る。例えば、マンノース-6-リン酸は、リソソームへタンパク質を指向することが示されており、マンノース-6-リン酸は、少しだけ述べれば、ゴーシェ病、ハンター病、ハーラー病、シャイエ病、ファブリー病及びテイサックス病などのリソソーム貯蔵疾患に関連したいくつもの酵素の適切な機能に不可欠であり得る。同様に、グリカン側鎖への1つ以上のシアル酸残基の付加は、投与後の生体内治療用糖タンパク質の寿命を延長させ得る。したがって、宿主細胞例、下等真核細胞又は哺乳類細胞は、前記細胞において発現される糖タンパク質中の末端シアル酸の程度を増大するよう遺伝子工学的に改変され得る。あるいは、シアル酸は、シアル酸トランスフェラーゼ及び適切な基質を使用する投与の前に、インビトロで対象のタンパク質に結合させてもよい。生育培地組成物の変化が、ヒトの形態をより密接に模倣する糖タンパク質を産生するために、ヒト様グリコシル化に関与する酵素活性の発現に加えて、採用されてもよいS.Weikertほか、NatureBiotechnology,1999,17,1116-1121;Werner,Noeほか1998Arzneimittelforschung488:870-880;Weikert,Papacほか、1999;Andersen及びGoochee1994Cur.Opin.Biotechnol.5:546-549;Yang及びButler2000Biotechnol.Bioengin.684:370-380。モノクローナル抗体に特異的なグリカンの修飾例、二分するGlcNAcの付加は、抗体依存性細胞の細胞毒性を改善することが示されておりUmanaP.ほか、1999、このことは抗体又は他の治療用タンパク質の産生のために望ましいことであり得る。治療用タンパク質は、典型的には注入、経口的、肺経由、又は他の手段によって投与される。本発明にしたがって産生し得る適切な標的糖タンパク質の例には、以下に制限を加えるものではないが、エリスロポエチン、インターフェロン-a、インターフェロン-b、インターフェロン-g、インターフェロン-w、及び顆粒球-CSF、GM-CSFなどのサイトカイン、第VIII因子、第IX因子、及びヒトタンパク質C、抗トロンビンIII、トロンビンなどの凝固因子、可溶性IgE受容体a鎖、IgG、IgG断片、IgG融合体、IgM、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、及び尿素トリプシン阻害剤、IGF結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンV融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子-2、骨髄系前駆体阻害因子-1、オステオプロテジェリン、a-1-抗トリプシン、a-胎児タンパク質、DNaseII、ヒトプラスミノーゲンのクリングル3、グルコセレブロシダーゼ、TNF結合タンパク質1、卵胞刺激ホルモン、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4-Ig、膜貫通活性化因子及びカルシウム調節因子及びサイクロフィリンリガンド、可溶性TNF受容体Fc融合体、グルカゴン様タンパク質1、IL-2受容体アゴニストが含まれる。分泌シグナル配列分泌シグナルをコード化する核酸配列を、糖タンパク質をコード化する対象の配列と結合させることがまた好ましい。分泌シグナル配列という語は、より大きなポリペプチドの構成成分として、合成された細胞の分泌経路を通じてより大きなポリペプチドを向わせるポリペプチド分泌ペプチドをコード化するDNA配列を示す。前記より大きなポリペプチドは、分泌経路を通じての移行の間、前記分泌ペプチドを除去するよう共通して開裂される。宿主細胞の分泌経路へとポリペプチドを向わせるため、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても公知の分泌シグナル配列が発現ベクターにおいて提供される。前記分泌シグナル配列は、制限を加えることなく、糖タンパク質に関連した野生型配列、S.セレビシエSuc2シグナル配列をコード化する配列、ピキアPho2シグナル配列をコード化する配列、ピキアPrc1シグナル配列をコード化する配列、S.セレビシエα接合因子αMFシグナル配列をコード化する配列、ウシリゾチームCシグナル配列をコード化する配列の分泌シグナル配列であり得る。前記分泌シグナル配列は、核酸配列へ機能できるよう結合され、すなわち、前記2つの配列は正確な読み枠において接続され、新規に合成されるポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へと向わせるよう置かれ得る。分泌シグナル配列は、興味の対象のポリペプチドをコード化するDNA配列に対して5’にどれも置かれるが、特定の分泌シグナル配列は、対象のDNA配列におけるほかのどこかに置かれてもよい例、Welchほか、米国特許第5,037,743号;Hollandほか、米国特許第5,143,830号。あるいは、本発明のポリペプチド中に含有される分泌シグナル配列は、分泌経路へと他のポリペプチドを向わせるのに使用される。本発明はこのような融合ポリペプチドについて提供する。本発明の融合ポリペプチドに含有される分泌シグナル配列は好ましくは、分泌経路へと更なるペプチドを向わせるために、更なるペプチドへアミノ末端で融合される。このような構築物は本分野で公知の数多くの適用を有する。例えば、これらの新規の分泌シグナル配列融合構築物は、受容体などの通常分泌されないタンパク質の活性部分の分泌を指示できる。このような融合物は、前記分泌経路を通じてペプチドを向わせるようインビボ又はインビトロで使用し得る。本発明の方法によって生産される糖タンパク質は、本分野で周知の技術によって単離できる。望ましい糖タンパク質は、分画、イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー及びアフィニティクロマトグラフィーなどの方法によって精製及び分離される。以下は、本発明の組成物及び方法を説明する例である。これらの例は制限を加えるものとして解釈されるべきではなく、前記例は、説明の目的のみのために含まれる。プロモーターカセット及び発現ベクターの構築PpOCH1遺伝子についての800塩基対プロモーターを、プライマーRCD48配列番号155’-TATGCGGCCGCGGCTGATGATATTTGCTACGA-3’及びプライマーRCD134配列番号165’-CCTCTCGAGTGGACACAGGAGACTCAGAAACAG-3’を使用して増幅し、PpSEC4遺伝子についての400塩基対プロモーターを、プライマーRCD156配列番号175’-CTTCTCGAGGAAGTAAAGTTGGCGAAACTT-3’及びプライマーRCD157配列番号185’-CTTAGCGGCCGCGATTGTTCGTTTGAGTAGTTT-3’を使用して増幅した。前記PCR産物をpCR2.1クローニングベクターInvitrogenへとクローニングし、配列決定した。次に、プラスミドpRCD360及びプラスミドpRCD362をそれぞれ作製するために導入されたXhoI/NotI制限部位を使用してGAPDHプロモーターの替わりにベクターpJN261Nettほか、Yeast、2003年11月号;2015:1279-1290へとOCH1プロモーター及びSEC4プロモーターをサブクローニングした。PpHIS3プロモーターを、プライマーRCD152配列番号195’-CTTCTCGAGGGCATTCAAAGAAGCCTTGGG-3’及びプライマーRCD153配列番号205’-CTTAGCGGCCGCTGAGTGGTCATGTGGGAACTT-3’を使用してPCR増幅し、プラスミドpCR2.1へとクローニングし、配列決定した。次に、PpPMA1強力プロモーターをより弱いPpHISプロモーターと置換して、PpHIS3プロモーターへと延びているNATRプラスミドであるプラスミドpRCD351を作製するため、前記PpHIS3プロモーターをプラスミドpTA18へとサブクローニングするようXhoI/NotI部位を使用した。前記PpHIS3の一部を、プライマーRCD301配列番号215’-CCTGGATCCAACAGACTACAATGACAGGAG-3’及びプライマーRCD302配列番号225’-CCTGCATGCCTCGAGCTTGCCGGCGTCTAAATAGCCGTTGAAG-3’を使用して増幅し、プラスミドpRCD391を作製するため、BamHI/SphI制限部位を使用してpUC19へと挿入した。このベクターは、プライマーRCD302配列番号22へと遺伝子工学的に改変されるXhoI部位及びNgoMIV部位と同様、PpHIS座の1.2Kb部分を含有する。pRCD392を作製するため、G418R遺伝子をBglII/SacI断片としてpUG6Wachほか、1994からpRCD391のBamHI/SacI部位へと挿入した。PpTRP1の1.2Kb部分を、プライマーRCD307配列番号235’-CCTGTCGACGCTGCCGGCAAGCTCGAGTTTAAGCGGTGCTGC-3’及びプライマーRCD308配列番号245’-CCTGGATCCTTTGGCAAAAACCAGCCCTGGTGAG-3’を使用してP.パストリスゲノムDNAから増幅した。プラスミドpRCD399を作製するため、BamHI/SalI部位を使用して、前記増幅した断片をpUC19へと挿入した。フォスフィノスリシンに対する耐性を付与するPAT遺伝子を、BglII/SacIを使用してプラスミドpAG29Goldstein及びMcCusker、1999から放出させ、プラスミドpRCD401へ延びているPpTRP1/PATを作製するため、BamHI/SacIで切断したpRCD399へと挿入した。ガラクトース輸送体のクローニングS.ポムベUDPガラクトース輸送体単一イントロンを除去するために、SpUGTと呼ばれるUDPガラクトース輸送体をコード化するS.ポムベ遺伝子SpGMS1、GenbankAL022598を、S.ポムベゲノムDNAATCC24843から2つのピースへとPCR増幅した。前記遺伝子の5’の96塩基対を増幅するために、プライマーRCD164配列番号75’-CCTTGCGGCCGCATGGCTGTCAAGGGCGACGATGTCAAA-3’及びプライマーRCD177配列番号85’-ATTCGAGAATAGTTAAGTGTCAAAATCAATGCACTATTTT-3’を使用し、3’の966塩基対を増幅するために、プライマーRCD176配列番号95’-AAAATAGTGCATTGATTTTGACACTTAACTATTCTCGAAT-3’及びプライマーRCD165配列番号105’-CCTTTTAATTAATTAATGCTTATGATCAACGTCCTTAGC-3’を使用した。その後、プライマーRCD164配列番号7及びプライマー165配列番号10を使用して、これら2つの増幅した産物を重ね合わせ、1つの連続したオープンリーディングフレームを含み、末端に導入されたでNotI部位及びPacI部位を有する単一のPCR断片とした。このPCR産物をpCR2.1ベクターInvitrogenへとクローニングし、配列決定した。次に、NotI部位及びPacI部位を使用して、この遺伝子を、P.パストリスGAPDHプロモーターの下流の遺伝子を融合しているカセットを含有するプラスミドpJN335へとサブクローニングした。次に、400塩基対のPpOCH1転写終結因子を、プライマーRCD202配列番号255’-TCCTTAATTAAAGAAAGCTAGAGTAAAATAGAT-3’及びプライマーRCD203配列番号265’-TCCCTCGAGGATCATGTTGATCAACTGAGACCG-3’を使用してPCR増幅し、pCR2.1へとクローニングした。その後、プラスミドpRCD257を作製するために、前記GAPDHプロモーター/SpUGT遺伝子融合体をXhoI/PacI断片として、及びPpOCH1-TTをPacI/XhoI断片としてプラスミドpTA18における単一XhoI部位へと挿入するよう、三重ライゲーションを実施した。前記新規のプラスミドpRCD257はNATRであり、このNATRはGAPDH-SpGALE-OCH1TT融合体を、PpPMAIプロモーターによって駆動されるScVAN1膜貫通ドメインへ融合されたヒトGnTII遺伝子の切断バージョンを含有する第二カセットに沿って含有するベクターを含有している。プラスミドpRCD385及びプラスミドpRCD387をそれぞれ作製するため、OCH1プロモーターを有するpRCD360の、及びSEC4プロモーターを有するpRCD362のNot/PacI部位へとSpUGT遺伝子も挿入した。P.パストリスHIS3/G418Rロールイン型の発現プラスミドpRCD393及び発現プラスミドpRCD394をそれぞれ作製するため、XhoI/NgoMIVを使用して、pRCD385由来のPOCH1-SpUGT-PpCYC1TTカセット及びpRCD387由来のPSEC4-SpUGT-PpCYC1TTカセットを、pRCD392HIS3/G418Rロールインベクターへと挿入した。キイロショウジョウバエUDPガラクトース輸送体DmUGTと呼ばれるUDPガラクトース輸送体をコード化するキイロショウジョウバエ遺伝子GenbankBAB62747を、キイロショウジョウバエcDNAライブラリUCBerkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト、卵巣1-ZAPライブラリGMからPCR増幅し、pCR2.1PCRクローニングベクターへとクローニングし、配列決定した。5’末端及び3’末端でそれぞれNotI部位及びPacI部位を導入した前記遺伝子を増幅するため、プライマーDmUGT-5’配列番号115’-GGCTCGAGCGGCCGCCACCATGAATAGCATACACATGAACGCCAATACG-3’及びプライマーDmUGT-3’配列番号125’-CCCTCGAGTTAATTAACTAGACGCGCGGCAGCAGCTTCTCCTCATCG-3’を使用した。次に、プラスミドpSH263を作製するため、pRCD393においてNotI/PacI部位でPpOCH1及びプロモーターの下流へ融合した前記遺伝子をサブクローニングするため、NotI部位及びPacI部位を使用した。ヒトUDPガラクトース輸送体hUGT1及びhUGT2とそれぞれ呼ばれるUDPガラクトース輸送体1をコード化するヒト遺伝子GenbankBAA95615番及びUDPガラクトース輸送体2をコード化するヒト遺伝子GenbankBAA95614番をヒト前立腺cDNAマラソンレディdDNA、Clontechから増幅した。前記UGT1遺伝子を、プライマーhUGT1-5’配列番号275’-GGCTCGAGCGGCCGCCACCATGGCAGCGGTTGGGGCTGGTGGTTC-3’及びhUGT1-3’配列番号285’-CCCTCGAGTTAATTAATCACTTCACCAGCACTGACTTTGGCAG-3’を使用して増幅し、hUGT2遺伝子を、プライマーhUGT2-5’配列番号295’-GGCTCGAGCGGCCGCCACCATGGCAGCGGTTGGGGCTGGTGGTTC及びプライマーhUGT2-3’配列番号305’-CCCTCGAGTTAATTAACTAGGAACCCTTCACCTTGGTGAGCAAC-3’を使用して増幅した。前記PCR産物をpCR2.1ベクターInvitrogen,Carlsbad,CAへとクローニングし、配列決定した。その後、プラスミドpSH264及びプラスミドpSH262をそれぞれ作製するため、NotI/PacIを使用するPpOCH1プロモーターの下流のpRCD393へと前記hUGT1遺伝子及びhUGT2遺伝子を挿入した。UDP-ガラクトース-4-エピメラーゼ遺伝子のクローニングS.セレビシエUDP-ガラクトース4-エピメラーゼUDP-ガラクトース4-エピメラーゼをコード化するS.セレビシエ遺伝子ScGAL10を、プライマーRCD270配列番号315’-TAGCGGCCGCATGACAGCTCAGTTACAAAGTGAAAG-3’及びRCD271配列番号325’-CGTTAATTAATCAGGAAAATCTGTAGACAATCTTGG-3’を使用してS.セレビシエゲノムDNAからPCR増幅した。生じたPCR産物をpCR2.1へとクローニングし、配列決定した。次に、プラスイドpRCD395及びプラスミドpRCD396をそれぞれ作製するため、NotI/PacI部位を使用して前記ScGAL10をプラスミドpRCD393及びpRCD394へとサブクローニングし、又、プラスミドpRCD404及びプラスミドpRCD405を作製するため、プラスミドpRCD402及びプラスミドpRCD403へとサブクローニングした。プラスミドpRCD402及びプラスミドpRCD403は、P.パストリスOCH1プロモーター及びSEC4プロモーターをそれぞれ含有し、並びにPpCYC1終結因子及び簡便な制限部位この制限部位はエピメラーゼとこれらのプロモーターと融合させ、別のプラスミドへと一体にして移動させ得るカセットを作製するために使用された。を含有する発現ベクターである。ヒトUDP-ガラクトース4-エピメラーゼhGALEと呼ばれるUDP-ガラクトース4-エピメラーゼをコード化するヒト遺伝子Thodenほか、2001JBC,276巻1815131-15136を、それぞれNotI部位及びPacI部位を有するプライマーGD7配列番号33及びプライマーGD8配列番号34を使用して、ヒト腎cDNAマラソンレディcDNA、ClontechからPCR増幅した。次に、プラスミドpRCD427及びプラスミドpRCD428をそれぞれ作製するため、NotI/PAcI部位を使用してプラスミドpRCD406及びプラスミドpRCD407へとhGALE遺伝子をサブクローニングした。S.ポムベUDP-ガラクトース4-エピメラーゼS.ポムベATCC24843ゲノムDNA由来のSpGALE遺伝子を増幅するため、プライマーGALE2-L配列番号35及びプライマーGALE2-R配列番号36を使用した。前記増幅した産物をpCR2.1へとクローニングし、配列決定した。配列決定は、66の位置でのイントロン175塩基対の存在を明らかにした。前記イントロンを除去するため、上流のプライマーGD1配列番号3794塩基対をデザインした。これはイントロンの66塩基上流にNotI部位を有し、前記イントロンの先の20塩基が続く。GD2配列番号38は下流のプライマーであり、PacI部位を有する。pCR2.1サブクローンからSpGALE無イントロン遺伝子を増幅するため、プライマーGD1配列番号37及びプライマーGD2配列番号38を使用し、前記産物を再度pCR2.1へとクローニングし、配列決定した。b-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニングヒトb-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼIヒトb-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼI遺伝子hGalTI、GenbankAH003575を、プライマーRCD192配列番号15’-GCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCCCAAC-3’及びプライマーRCD186配列番号25’-CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCA-3’を使用してヒト腎cDNAマラソンレディcDNA、ClontechからPCR増幅した。このPCR産物をpCR2.1ベクターInvitrogen,Carlsbad,CAへとクローニングし、配列決定した。このクローンから、PCR重複変異誘発を次の3つの目的のために実施した。すなわち、1野生型タンパク質配列を維持しながらオープンリーティングフレーム内のNotI部位を除去するため、2内在性膜貫通ドメインのすぐ下流のタンパク質を切断するため、及び3モジュールクローニングのために5’末端及び3’末端にAscI部位及びPacI部位を導入するため、である。これを実施するため、前記NotI部位までの前記遺伝子の5’末端を、プライマーRCD198配列番号35’-CTTAGGCGCGCCGGCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCC-3’及びプライマーRCD201配列番号45’-GGGGCATATCTGCCGCCCATC-3’を使用して増幅し、前記3’末端を、プライマーRCD200配列番号55’-GATGGGCGGCAGATATGCCCC-3’及びプライマーRCD199配列番号65’-CTTCTTAATTAACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3’を使用して増幅した。前記NotI部位を除去しながら、前記オープンリーディングフレームを野生型アミノ酸配列で再合成するために、前記産物をプライマー198及びプライマー199を用いて重ね合せた。前記新規の切断したhGalTIPCR産物をpCR2.1ベクターInvitrogen,Carlsbad,CAへとクローニングし、配列決定した。次に、pRCD260を作製するため、PpURA3/HYGRロールインベクターであるプラスミドpRCD259へと前記断片をサブクローニングするため、前記導入したAscI/PacI部位を使用した。プラスミドpXB20-pXB67を作製するため、参照によって組み込まれるWO02/00879に記載の酵母指向性配列膜貫通ドメインのライブラリを、hGalTI遺伝子の上流にあるNotI/AscI部位に連結した。ヒトb-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼIIヒトb-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼII遺伝子hGalTII、GenbankAF038660の切断した形態を、プライマーRCD292配列番号395’-CTTAGGCGCGCCCAGCACCTGGCCTTCTTCAGC-3’及びプライマーRCD293配列番号405’-CTTGTTAATTAATCAGCCCCGAGGGGGCCACGACGG-3’を使用してヒト腎cDNAマラソンレディcDNA、ClontechからPCR増幅し、プラスミドpCR2.1へとクローニングし、配列決定した。プラスミドpRCD378を作製するため、N末端膜貫通ドメインをコード化する遺伝子の一部を除去したこの切断したクローンを、hGalTIの替わりにベクターpXB53へと導入されたAscI/PacI部位を使用してサブクローニングした。切断したhGalTIIと、S.セレビシエMNN2遺伝子の膜貫通ドメイン/リーダー配列をコード化する部分との遺伝子融合物を含有する、このプラスミドは、PpGAPDHプロモーターにより駆動される。ヒトb-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼIIIヒトb-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼIII遺伝子hGalTIII、GenbankAF038661の切断した形態を、プライマーRCD294配列番号415’-CTTAGGCGCGCCCGAAGTCTCAGTGCCCTATTTGGC-3’及びRCD295配列番号425’-CTTGTTAATTAATCAGTGTGAACCTCGGAGGGCTGT-3’を使用してヒト腎cDNAマラソンレディcDNA、ClontechからPCR増幅し、プラスミドpCR2.1へとクローニングし、配列決定した。プラスミドpRCD381を作製するため、hGalTIの替わりにベクターpXB53へと導入されたAscI/PacI部位を使用して、N末端膜貫通ドメインをコード化する遺伝子の一部を除去したこの切断したクローンをサブクローニングした。このプラスミドはいまや、前記切断したhGalTIIIと、PpGGAPDHプロモーターによって駆動されるS.セレビシエMNN2遺伝子の膜貫通ドメイン/リーダー配列をコード化する部分との遺伝子融合を含有する。複雑なN-グリカンを産生するにおけるSpUGTを有するhGalTIの発現ヒトGnTII遺伝子及びSpGMS1遺伝子SpUGTを含有するpRCD257プラスミドをRDP27株に導入した。RDP27は、P.パストリスの変異株であり、och1及びalg3の欠失を有していて、プラスミドpSH49及びプラスミドpPB104で形質転換されたものである。プラスミドpSH49及びプラスミドpPB104は、それぞれマウスマンノシダーゼIBとびヒトGnTIとの活性ある融合構築物を含有し、またプラスミドpPB103を含有する。プラスミドpPB103は、K.ラクティスUPD-GlcNAcトランスポーターを含有し及びリポータータンパク質K3Choiほか、2003を含有するプラスミドpBK64を含有する。ナーセオスリシンnourseothricin上での選択後、16個の形質転換体を選抜し、発現されたリポータータンパク質K13のグリコシル化を測定した。これら形質転換株のうち2つにおいて、期待される複雑なヒトグリコシル化構造GlcNAc2Man3GlcNAc2を観察し、これらの株をRDP30-10図8A及びRDP30-13と命名した。hGalTI遺伝子/リーダー融合プラスミドライブラリの一部を、RDP30-10株へと形質転換し、ハイグロマイシンを含有する最小培地上で形質転換株を選択した。生じた株によって分泌されたK3から放出されたN-グリカンをMALDI-TOFMSで分析した。1個のガラクトース糖の追加に一致する質量における分子レベルのシフトを、2つの異なるリーダー構築物pXB53及びpXB65の形質転換株由来のN-グリカンに関して観察した。第一のpXB53は、ScMnn2sリーダーへ融合させた本明細書でScMnn2s/hGalTIと呼ばれるhGalTIからなり、もう一方はScMnn1mリーダーとの融合体であった。MALDI-TOFによる、RDP37pXB53で形質転換したRDP30-10からのK3から放出されたN-グリカンの分析は、約10ないし20のGlcNAc2Man3GlcNAc2がGalGlcNAc2Man3GlcNAc2へ変換され、より少量1ないし2がGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2pXB53,図8Bへ変換されることを示した。GalGlcNAc2Man3GlcNAc2への変換のより少量3ないし5がしかしGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2はできなかった。第二融合体pXB65で観察された。ハイブリッドN-グリカンを産生する株におけるhGalTI及びScGAL10の発現NotI/PacIを用いて、hGnTIIに替えて、NATRベクターpTA18及びpRCD351へ、UDP-ガラクトース4-エピメラーゼをコード化するScGAL10遺伝子をサブクローニングした。これにより、強力なPMAIプロモーター及びより弱いPpHIS3プロモーターの前にエピメラーゼ遺伝子が挿入され、プラスミドpRCD331PPMAI-ScGAL10及びpRCD352PHIS3-ScGAL10がそれぞれ作製される。前記プラスミドを直鎖状にしPpPMA1プロモーターにおいてSacIを有するpRCD331及びPpHIS3プロモーターにおいてBglIIを有するpRCD352、PBP-3米国特許出願第20040018590号へと形質転換した。PBP-3株はP.パストリスの変異株である。この変異株は、Och1の欠失を有しており、プラスミドpSH49及びプラスミドpPB104で形質転換されている。プラスミドpSH49及びプラスミドpPB104は、それぞれマウスマンノシダーゼIBとヒトGnTIとの活性融合構築物を含有し、またプラスミドpPB103を含有している。pPB103は、K.ラクティスUDP-GlcNAcトランスポーターを含有し、リポータータンパク質K3Choiほかを含有するプラスミドpBK64を含有している。この株は、分泌されたタンパク質上の構造GlcNAcMan5GlcNAc2のハイブリッドN-グリカンを産生する。ナーセオスリシンを含有するYPD培地上で選択された、得られた形質転換株を、プライマーRCD285配列番号435’-TACGAGATTCCCAAATATGATTCC-3’及びプライマーRCD286配列番号445’-ATAGTGTCTCCATATGGCTTGTTC-3’を使用するPCRによって、及び前記リポータータンパク質K3を発現させ、放出されたN-グリカンを分析して、前記株がハイブリッドGlcNAcMan5GlcNAc2グリカン構造を維持していることを確認することによって、分析した。pRCD352PHIS3-ScGAL10構築物によって形質転換したある株をRDP38-18と命名した。この株をプラスミドpXB53Mnn2shGalTI融合構築物並びにHYGR遺伝子及びPpURA3遺伝子を含有する。により、SalIPpURA3にある。で直鎖状にした後、形質転換した。形質変換株を、ハイグロマイシンを有するYPD培地上で選択し、K3を発現させ、N-グリカンのサイズを決定することによってスクリーニングした。RDP39-6株図10Aから精製され、K3から放出されたN-グリカンの大部分~2/3は、主としてGlcNAcMan5GlcNAc2であるRDP38-38由来のものと比較して、1個の追加のヘキソースHexGlcNAcMan5GlcNAc2を含有していた。さらに、前記追加のヘキソース残基は、可溶性b-1,4-ガラクトシダーゼとのしかし、a-1,3-ガラクトシダーゼまたはa-1,2-マンノしダーゼとではない。その後のインキュベーションにより除去でき、このことは、特異的結合b-1,4による、末端GlcNAcへの単一ガラクトースの付加はこの株のhGalTIによって触媒されたことを示している。複雑なN-グリカンを産生する系におけるhGalTI及びScGAL10の発現GlcNAc2Man3GlcNAc2構造を有する複雑なN-グリカンを表示するP.パストリスYSH-44株を構築した。YSH-44は、P.パストリスの変異株であり、och1を欠失していて、プラスミドpSH49、pPB104、pKD53及びpTC53で形質転換される。プラスミドpSH49、pPB104、pKD53及びpTC53は、それぞれマウスマンノシダーゼIB、ヒトGnTI、キイロショウジョウバエマンノシダーゼII及びヒトGnTIIの活性融合構築物を含有し、またpPB103を含有する。pPB103は、K.ラクティスlactisUDP-GlcNAcトランスポーターを含有し、およびリポータータンパク質K3Hamiltonほか、Science2003年8月29日号;3015637:1244-1246を含有するプラスミドpBK64を含有している。この株を、Mnn2s/hGalTI融合構築物を含有するpXB53プラスミドで形質転換し、形質転換体を、ハイグロマイシンを有するYPD培地上で選択した。K3を精製し、MALDI-TOFMSによって、放出されたN-グリカンを分析することによって、いくつかの形質転換株を分析した。分析した形質変換株のそれぞれは、GlcNAc2Man3GlcNAc2構造を有するN-グリカンの主要部分及び単一ヘキソース追加と一致した少数部分~5YSH-71を与えた。しかしながら、このピークは常にhGAlTIの導入と相関していたが、b-1,4-ガラクトシダーゼに対して完全に不応性であった。次いで、これらの株のいくつかを、プラスミドpRCD395及びプラスミドpRCD396POCH1-ScGAL10及びPSEC4-ScGAL10をそれぞれ含有するPpHIS3/G418Rプラスミドで、BglIIで直鎖状にした後、形質転換し、G418上で選択した、得られた株をそれぞれYSH-83及びYSH-84と命名した。分泌されたK3から放出されたN-グリカンをMALDI-TOFMSにより分析した。得られた形質転換体を、G418を含有するYPD培地上で選択した。これらの株から分泌され精製されたK3から放出されたN-グリカンをMALDI-TOFMSにより分析した。これらの形質転換体由来N-グリカンの大部分は、3つの構造、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2~0ないし25又はGalGlcNAc2Man3GlcNAc2~40ないし50からなり、残りのN-グリカンは、親YSH-44株により表示されるGlcNAcMan3GlcNAc2構造を保持していた。N-グリカンの相対的な量は、前記ScGAL10エピメラーゼ遺伝子をPpOCH1プロモーターYSH-83又はPpSEC4プロモーターYSH-84によって駆動したかどうかとは無関係に変化しないままであった。図9Bは、YSH-84から放出されたN-グリカンのMALDI-TOFMSを示す。エピメラーゼ/トランスフェラーゼ融合構築物の構築SpGALE遺伝子を、プライマーRCD326配列番号455’-CTTGGCGCGCCATGACTGGTGTTCATGAAGGGACT及びプライマーRCD329配列番号465’-CCTGGATCCCTTATATGTCTTGGTATGGGTCAG-3’を使用して増幅し、pCR2.1ベクターInvitrogenへとクローニングし、配列決定した。最初の43個のアミノ酸を除去するhGalTI遺伝子の切断した部分hGalTIΔ43を、プライマーRCD328配列番号475’-CTTGGATCCGGTGGTGGCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCC-3’及びプライマーRCD199配列番号485’-CTTCTTAATTAACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3’を使用して増幅し、pCR2.1ベクターInvitrogenへとクローニングし、配列決定した。次に、SpGALEクローンをAscI/BamHIで切断し、hGalTIクローンをBamHI/PacIで切断し、両者を、AscI/PacIで切断したpRCD452へと挿入した。プラスミドpRCD452は、G418耐性マーカー、及びScMNN2S/hGalTI融合体を有するGAPDH/CYC1カセットを含有している。AscI/BamHISpGALE断片及びBamHI/PacIhGalTIΔ43断片を、AscI/PacIにより放出されたhGalTIに置き換えて連結し、pRCD461を作製した。この新規プラスミドpRCD461は、ScMNN2s/SpGALE/hGalTI融合体を含有していて、SpGalEタンパク質及びhGalTIタンパク質は、BamHI部位を含有する4つのアミノ酸GSGGリンカーによって分離されていて、PpGAPDHプロモーターによって駆動される単一のポリペプチドにおいてコード化されている。複雑なN-グリカンを産生する系におけるガラクトシルトランスフェラーゼ、エピメラーゼ及びトランスポーターの発現活性のあるhGalTI-53遺伝子融合体を含有するプラスミドpXB53、及びhGalTII-53融合体を含有するpRCD378を、HYGRマーカー近くのXhoIで直鎖状にし、T4DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabs,Beverly,MAで平滑末端化した。hGalTIII-53遺伝子融合体を含有するプラスミドpRCD381をURA3遺伝子近くのHindIIIで直鎖状にし、T4ポリメラーゼで平滑末端化した。次に、3つのエピメラーゼ遺伝子ScGAL10、SpGALE及びhGALEをプラスミドpRCD404、pRCD406、及びpRCD427からそれぞれXhoI/SphIで切断し、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化し、前記3つの直鎖状にしたトランスフェラーゼプラスミドへと挿入した。これにより9つの新規二重トランスフェラーゼ/エピメラーゼHYGRプラスミドが生じた。すなわち、hGalTI-53及びScGAL10を有するpRCD424、hGalTI-53及びSpGALEを有するpRCD425、hGalTI-53及びhGALEを有するpRCD438、hGalTII-53及びScGAL10を有するpRCD439、hGalTII-53及びSpGALEを有するpRCD440、hGalTII53及びhGALEを有するpRCD441、hGalTIII-53及びScGAL10を有するpRCD442、hGalTIII-53及びSpGALEを有するpRCD443並びにhGalTIII-53及びhGALEを有するpRCD447である。その後、YSH44系を、これらのXbaIで直鎖状にした二重HYGRプラスミド、及びAgeIで直鎖状にしたSpUGT、hUGT2、DmUGT及びhUGT1UDP-Galトランスポーターコード化遺伝子をそれぞれ含有するG418RプラスミドpRCD393、pSH262、pSH263及びpSH264で順次形質転換した。このように、一連の株は、それぞれがトランスフェラーゼ、エピメラーゼ及びトランスポーターの異なる組み合わせを含有するよう作製された。第一に、異なるUDP-Galトランスポーターを、hGalTI-53及びSpGALEを含有する株において比較した。DmUGT遺伝子の導入は、2つの末端ガラクトース残基Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2を有する複雑なグリカンをすべて実質的に生じたのに対し、その他の3つのトランスポーターは、前記トランスフェラーゼ及びエピメラーゼのみで得られたものと実質的に同一の複雑なグリカンの特性を生じた図11Aないし図11E。第二に、前記エピメラーゼ遺伝子を、pRCD424、pRCD425又はpRCD438と共にpSH263を株に導入することによって、hGalTI-53融合体及び活性のあるDmUGT遺伝子を有する株において比較した。前記3つのそれぞれのエピメラーゼ遺伝子とGal遺伝子との組み合わせは、分泌されたK3に関してGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2の複雑なN-グリカンを生じる上で等価であった。最後に、前記3つのヒトトランスフェラーゼ融合構築物hGalTI-53、hGalTII-53及びhGalTIII-53を、pSH263で形質転換した株へpRCD425、pRCD440及びpRCD443を導入することによって、DmUGT及びSpGAKEを有する株において比較した。ここで、hGalTII-53は、Galを転移させる上でわずかに効率がよくなく、hGalTI053を有する株における複雑なN-グリカンの約10であり、単一のがラクトースGalGlcNAc2Man3GlcNAc2のみを有していた一方、他の観察可能な、hGalTII-53を有する株における複雑なN-グリカンは二ガラクトシル化したGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2であった図12Aないし図12B。さらに、hGalTIII-53は、前記複雑なN-グリカンの60ないし70が0個ないし1個のガラクトース残基GlcNAc2Man3GlcNAc2又はGalGlcNAc2Man3GlcNAc2を含有するのに対し、30ないし40はGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2であり、hGalTI-53又はhGalTII-53のいずれかよりも有意に効率が劣っていた図12Aないし図12C。単一プラスミド構築物を使用するガラクトシルトランスフェラーゼ、エピメラーゼ及びトランスポーターの発現POCH1-DmUGTを含有するG418RプラスミドであるpSH263を、SacIで切断することによって直鎖状にした後、T4DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsで平滑末端化した。PSEC4-SpGALE遺伝子をプラスミドpRCD405からXhoI/SphI切り出し、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化した。次に、平滑末端化したSpGALEをpSH263の平滑末端化したSacI部位へと挿入し、二重トランスポーター/エピメラーゼG418RプラスミドであるプラスミドpRCD446を作製した。次に、pRCD446をEcoRIで直鎖状にし、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化した。PGAPDHScMNN2s/hGalTI融合コンストラクトをpXB53からBglII/BamHIにより放出させ、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化した。次に、平滑末端化したScMNN2s/hGalTIをpRCD446の平滑末端化したEcoRI部位へと挿入し、ScMNN2s/hGalTI、SpGALE及びDmUGTを含有する三重G418RプラスミドであるプラスミドpRCD465を作製した。pRCD465で形質転換したP.パストリスYSH-44をRDP80と命名した。N-グリカン特性はGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2[C]の質量に対応する1663m/zで単一のピークを示した図14A。hGalTI-53及びSpGALEを含有するHYGRプラスミドであるpRCD425をAflIIで直鎖状にし、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化した。DmUGT遺伝子をpSH263からNotI/PacIで切り出し、NotI/PacIで切断したプラスミドpRCD405へ挿入し、pRCD468を作製した。pRCD468は、単一カセットとして放出されることができるPSEC4-DmUGT-CYC1-TT融合体を含有する。pRCD468をXhoI/SalIで切断し、前記DmUGTカセットを放出させ、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化した。前記平滑末端化したDmUGTをpRCD425の前記平滑末端化したAflII部位へと挿入し、hGalTI-53、SpGALE及びDmUGTを有するHYGR三重プラスミドであるプラスミドpRCD466を作製した。hGalTI-53及びhGALEを含有するHYGRプラスミドであるpRCD438をAflIIで直鎖状にし、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化した。pRCD468をXhoI/SalIで切断し、DmUGTカセットを放出させ、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化した。平滑末端化したDmUGTをpRCD438の平滑末端化したAflII部位へと挿入し、hGalTI-53、hGALE及びDmUGTを有するHYGR三重プラスミドであるプラスミドpRCD467を作製した。インビトロb-ガラクトシダーゼ切断P.パストリスRDP80株由来のN-グリカン2μgを、50mMNH4HCO3pH6.0中の3mUβ1,4ガラクトシダーゼQAbio,SanMateo,CAとともに37°Cで16時間ないし20時間インキュベートした。図14BにおけるN-グリカン分析は、N-グリカンGlcNAc2Man3GlcNAc2の質量に対応する1430m/z[A]での優勢なピークを示し、図14Aにおいてガラクトース転移を確認する。インビトロシアリルトランスフェラーゼ反応RDP80株から精製したK3200μgを、50mMNH4HCO3pH6.0中の50mgCMP-シアル酸及び15mUラット組換え型a□2,6--N-シアリルトランスフェラーゼCalbiochemとともに、37°Cで16時間ないし20時間インキュベートした。次に、N-グリカンをPNGaseF切断によって放出させ、MALDI-TOFMSで検出した。前記グリカンのスペクトルは、RDP80由来のもの図14Aと比較したとき、シアリルトランスフェラーゼ処置後の質量における増加を示した図14C。図14Cに示されるスペクトルは、N-グリカンNANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2の質量に対応する2227m/z[X]での優勢なピークを示し、RDP80株によって産生されたN-グリカンがヒト型Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2であることを確認する。エピメラーゼ配列比較エピメラーゼの配列比較を、CLUSTALを使用して実施した。GenBank、SwissProt、BLOCKS及びPimaIIのデータベースにおける配列を問い合わせるため、配列リストのヌクレオチド配列及び/又はアミノ酸配列を使用した。すでに同定され注釈のついた配列を含有するこれらのデータベースを、BLASTBasicLocalAlignmentSearchToolを使用して相同性の領域について検索した例、Altschul,S.F.1993J.Mol.Evol36:290-300及びAltschulほか1990J.Mol.Biol.215:403-410を参照してほしい。。BLASTは、配列類似性を決定するためにヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の両者の配列比較を生じた。一次配列パターン及び二次構造間隙罰則を取り扱う場合、他のアルゴリズムを使用できた例、Smith,Tほか1992ProteinEngineering5:35-51を参照してほしい。。材料MOPS、カコジル酸ナトリウム、塩化マンガン、UDP-ガラクトース及びCMP-N-アセチルノイラミン酸はSigma社製であった。TFAはAldrich社製であった。ウシ乳由来のb1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼはCalbiochem社製であった。タンパク質N-グリコシダーゼF、マンノシダーゼ、及びオリゴ糖はGlyko社SanRafael,CA製であった。DEAEトヨパール樹脂はTosoHaas社製であった。金属キレートHisBind樹脂はNovagen社Madison,WI製であった。タンパク質結合96穴プレートはMillipore社Bedford,MA製であった。塩及び緩衝剤はSigma社St.Louis,MO製であった。MALDIマトリクスはAldrich社Milwaukee,WI製であった。振盪フラスコ培養単一コロニーを、興味の対象の系を含有するYPDプレート2週齢未満から拾い上げ、50mlファルコン遠心チューブの中のBMGY培地の10mlへと接種した。前記培養物を24°Cで飽和するまで生育させた約48時間。種培養物を、BMGY培地の150mlを含有する500mlの調節されたメスフラスコへと移し、24°Cで5±2のOD600になるまで生育させた約18時間。前記細胞の生育速度を、時間に対するOD600の自然対数のプロットの傾斜として決定した。前記細胞を、3000gで10分間遠心分離することによって前記生育培地BMGYから回収し、BMMYで洗浄し、250mlの調節したメスフラスコ中のBMMYの15ml中に懸濁した。24時間後、前記発現培地フラスコを遠心分離3000gで10分間することによって回収し、前記上清をK3産生について分析した。バイオリアクター培養BMGY培地の150mlの入った500mlの調節されたメスフラスコを種培養物フラスコ培養参照の1mlで接種した。前記接種体を24°Cで4ないし6のOD600になるよう生育させた約18時間。次に、前記接種培養物由来の細胞を遠心分離し、発酵培地培地1lあたり:CaSO42H2O0.30g、K2SO46.00g、MgSO47H2O5.00g、グリセロール40.0g、PTM1塩2.0ml、ビオチン4×10-3g、H3PO48530ml、1lあたりのPTM1塩:CuSO4H2O6.00、NaI0.08g、MnSO47H2O3.00g、NaMoO42H2O0.20g、H3BO30.02g、CoCl26H2O0.50g、ZnCl220.0g、FeSO47H2O65.0g、ビオチン0.20g、H2SO4985.00mlの50mlへと再懸濁した。発酵を3lのくぼんだ底1.5lの初期負荷容積のApplikonバイオリアクターで実施した。前記発酵槽を24°Cの温度において流加培養モードで稼動させ、30水酸化アンモニウムを使用してpHを4.5±0.1に調節した。溶解した酸素を1気圧の空気による飽和に対して40を上回るよう、撹拌速度450rpmないし900rpm及び純酸素供給を調整することによって維持した。気流速度を1vvmに維持した。DOの増加によって示される、バッチ相における初期グリセロール40g/lが枯渇するとき、PTM1塩の12ml/lを含有する50グリセロール溶液を、望ましいバイオマス濃度に到達するまで12ml/l/時の供給速度で供給した。飢餓相の30分後、メタノール供給12ml/lPTM1を有する100メタノールを開始する。メタノール供給速度を使用して、発酵槽におけるメタノール濃度を0.2ないし0.5に調節する。メタノール濃度をオンラインで、前記発酵槽からの気体流出口にあるTGSガスセンサーFigaroEngineering社製TGS822を使用して測定する。発酵槽から8時間ごとに試料採取し、バイオマスOD600、細胞湿重量及び細胞計数、残余炭素源レベルAminex87Hを使用するHPLCによるグリセロール及びメタノール、及びSDS-PAGE及びBio-Radタンパク質アッセイによる細胞外タンパク質含有量について分析した。リポータータンパク質の発現、精製、及びN結合したグリカンの放出アルコールオキシダーゼ1AOX1プロモーターの調節下でのK3ドメインをモデルタンパク質として使用し、6×ヒスチジンタグを使用してすでに報告されているように精製したChoiほか、ProcNatlAcadSciUSA2003年4月29日号;1009:5022-5027。グリカンを糖タンパク質から、すでに報告された方法の修正によって放出させ及び分離したPapac及びBriggs1998。前記タンパク質を還元及びカルボキシメチル化した後、膜をブロッキングし、ウェルを水で3回洗浄した。前記タンパク質を、N-グリカナーゼGlykoの1ミリ単位を含有する10mMNH4HCO3、pH8.3の30mlの添加によって脱グリコシルした。37°Cで16時間後、グリカンを含有する溶液を遠心分離によって除去し、乾燥させるために蒸発させた。タンパク質精製BeckmanBioMek2000試料取り扱いロボットBeckman/CoulterRanchCucamonga,CAで96穴フォーマットを使用してクリングル3を精製した。C末端6-ヒスチジンタグを使用してクリングル3を発現培地から精製した。ロボット精製は、NovagenのHisBind樹脂についてのNovagenによって提供されるプロトコールの応用である。簡潔に説明すれば、樹脂の150μlμlに設定された容積を96穴細胞溶解液結合プレートのウェルへと注入し、水の3容積で洗浄し、50mMNiSO4の5容積を負荷し、結合緩衝液5mMイミダゾール、0.5MNaCl、20mMトリス-HCl、pH7.9の3容積で洗浄する。タンパク質発現培地を3:2の培地:PBS60mMPO4、16mMKCl、822mMNaCl、pH7.4に希釈し、カラムへ負荷する。排水後、前記カラムを結合緩衝液の10容積及び洗浄緩衝液30mMイミダゾール、0.5MNaCl、20mMトリス-HCl、pH7.9の6容積で洗浄し、前記タンパク質を溶出緩衝液1Mイミダゾール、0.5MNaCl、20mMトリス-HCl、pH7.9の6容積で溶出する。前記溶出した糖タンパク質を凍結乾燥により乾燥するまで蒸発させる。N結合したグリカンの放出グリカンをすでに報告された方法Papacほか、A.J.S.1998Glycobiology8、445-454の修正によって糖タンパク質から放出させ及び分離する。96穴MultiScreenIPImmobilonP膜プレートMilliporeのウェルをメタノールの100μlで湿らせ、水の3×150μl及びRCM緩衝液8M尿素、360mMトリス、3.2mMEDTA、pH8.6の50μlで洗浄し、各添加後にゆるく真空にしながら排水する。前記乾燥したタンパク質試料をRCM緩衝液の30μlに溶解し、RCM緩衝液の10μlを含有するウェルへと移す。前記ウェルを排水し、RCM緩衝液で2回洗浄する。前記タンパク質をRCM緩衝液中の0.1MDTTの60μlの37°Cでの1時間の添加によって還元する。前記ウェルを水の300μlで3回洗浄し、0.1Mヨード酢酸の60μlの暗所における室温での30分間の添加によってカルボキシメチル化する。前記ウェルを水で再度3回洗浄し、膜を水中の1PVP360の100μlの室温での1時間の添加によってブロッキングする。前記ウェルを排水し、水の300μlで3回洗浄し、N-グリカナーゼGlykoの1ミリ単位を含有する10mMNH4HCO3、pH8.3の30μlの添加によって脱グリコシルした。37°Cで16時間後、前記グリカンを含有する溶液を遠心分離により除去し、乾燥するまで蒸発させた。種々:タンパク質をLaemmliLaemmli1970にしたがってSDS-PAGEにより分離した。飛行時間型質量分析法のマトリクス支援レーザー脱離イオン化時間前記グリカンの分子量を、抽出の遅延を使用するVoyagerDEPRO線形MALDI-TOFAppliedBiosciences質量分析法を使用して決定した。各ウェル由来の乾燥したグリカンを水の15μlに溶解し、0.5μlをステンレス鋼試料プレート上に点状に置き、S-DHBマトリクスジヒドロキシ安息香酸の9mg/ml、水とアセトニトリル0.1TFAの1:1中の5-メトキシサリチル酸の1mg/mlの0.5μlと混合し、乾燥させた。イオンを4ナノ秒のパルス時間でパルス化された窒素レーザー337nmによる照射によって発生させた。機器を125ナノ秒の遅延及び20kVの加速電位での抽出遅延モードにおいて稼動させた。格子電位は93.00であり、誘導ワイヤ電位は0.10であり、内部圧力は5×10-7トルであり、低質量ゲートは875Daであった。スペクトルを100ないし200のレーザーパルスの合計から生じ、2GHzのデジタイザーで獲得した。外部分子量標準物質としてMan5GlcNAc2オリゴ糖を使用した。スペクトルはすべて陽イオンモードにおいて前記機器で生じた。前記スペクトルの概算された質量の精度は0.5であった。"