"細胞壁を有する植物細胞に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、細胞壁を有する植物細胞を提供する工程対象とする官能化直鎖核酸カセット分子でナノ粒子を被覆する工程;細胞壁を有する前記植物細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;ならびに細胞壁を含む前記植物細胞に前記ナノ粒子および前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程を含む、方法。ナノ粒子が、前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子と相互作用する官能基を含む、請求項1に記載の方法。ナノ粒子が、ストレプトアビジンQD共役ナノ粒子である、請求項2に記載の方法。さらに、細胞壁を含む前記植物細胞の区画に、前記ナノ粒子の取り込ませる工程を含む、請求項1に記載の方法。さらに蛋白質を標的とする細胞内区画で前記ナノ粒子を被覆する工程を含む、請求項4に記載の方法。前記区画が、細胞質ゾル、核、液胞膜、プラスチド、エチオプラスト、有色体、白色体、脂肪体、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。細胞壁を有する前記植物細胞が、商業作物種から植物細胞である、請求項1に記載の方法。前記植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、菜種、菜種、綿、ヤシ、落花生、ダイズ、イネ属、シロイヌナズナ属、トウゴマ属、およびサトウキビの細胞からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。前記植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根、花、種子、さや、および茎からなる群から選択された組織由来のものである、請求項7に記載の方法。細胞壁を有する前記植物細胞が培養細胞である、請求項1に記載の方法。前記ナノ粒子が、半導体ナノ粒子、量子ドット、正に帯電したナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆されたナノ粒子、多孔質粒子、メソポーラスナノ粒子、シリカナノ粒子、ポリマーナノ粒子、タングステンナノ粒子、ゼラチンナノ粒子、ナノシェル、ナノコアnanocores、ナノスフェア、ナノロッド、および磁性ナノ粒子からなる群から選択される請求項1に記載の方法。前記ナノ粒子が、半導体ナノ粒子である、請求項11に記載の方法。半導体ナノ粒子が、量子ドットである、請求項12に記載の方法。前記ナノ粒子が、金ナノ粒子である、請求項11に記載の方法。さらに、前記ナノ粒子の表面を誘導体化する工程を含む、請求項1に記載の方法。前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、DNA、RNA、RNAi分子、および遺伝子からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1に記載の方法。前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、遺伝子を含む、請求項16に記載の方法。前記遺伝子が、外来タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、請求項17に記載の方法。前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、核酸配列のPCR増幅から得られる、請求項1に記載の方法。核酸配列が、プラスミド、コスミド、人工染色体、酵母人工染色体、および細菌人工染色体からなる群から選択される核酸分子から得られる、請求項19に記載の方法。さらに前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を安定的に組み込んだ細胞を選択する工程を含む、請求項16に記載の方法。前記選択した細胞が、再生可能な細胞である、請求項21に記載の方法。さらに再生可能な細胞から植物細胞を再生する工程を含む、請求項22に記載の方法。植物材料に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、植物細胞、植物組織、植物からなる群から選択される植物材料を提供する工程ナノ粒子を提供する工程対象とする官能化直鎖核酸カセット分子で前記ナノ粒子を被覆する工程;細胞壁を有する前記細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;前記植物材料に前記ナノ粒子および前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程を含む、方法。前記植物材料が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根、花、種子、さや、および茎からなる群から選択される植物組織である、請求項24に記載の方法。植物へ形質を移入するための方法であって、植物細胞を提供する工程官能化直鎖核酸カセット分子と相互作用し得るナノ粒子を提供する工程植物において形質を発現させるための手段でナノ粒子を被覆する工程前記植物細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程前記植物細胞に前記ナノ粒子および前記植物において前記形質を発現させるための手段を取り込ませる工程前記形質転換植物細胞から植物全体を再生させる工程、および前記植物を繁殖させる工程を含む、方法。前記形質が、対象とするタンパク質の発現、雄性不稔、除草剤耐性、害虫抵抗性、細菌性の病害に対する抵抗性、真菌性病害に対する抵抗性、およびウイルス性病害に対する抵抗性からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。Iいくつかの実施形態の概要非侵襲的な遺伝子導入を可能にする本発明の方法は、望ましい形質を有する遺伝子組み換え植物を生成するために非常に役立ち得る。非侵襲的な遺伝子導入は、このような栽培植物に、望ましいインプット、アウトプット、および農業的形質を組み込むなどの分野のために、細胞内の分子部位を特異的に標的化し、編集することを容易にし得る。記載されている方法はまた、現在技術が制限されている、植物の一過性形質転換、木もしくは野菜作物に形質移入し、病害抵抗性を付与するための技術の拡大のための非GMOの選択肢として有用であり得る。最近の特許出願米国特許出願第60978059は、種々のナノ粒子の有効荷重nanoparticlepayloadsを使用して、とりわけ、環状プラスミドDNAを送達する、ナノ粒子に基づくDNA送達の非侵襲的な手段を示し、シロイヌナズナ植物のT1種子における導入遺伝子の安定的な組み込み明確に示す。そこで作製された環状プラスミドDNAを含有するトランスジェニック植物は、所望の除草剤耐性の表現型を示し、少なくとも4回同時にグルホシネートアンモニウムの電磁界レベルを噴霧した場合、高いレベルの耐性を示した。米国特許出願第60978059は、とりわけ、環状プラスミドDNAを用いて正に帯電した金ナノ粒子によるシロイヌナズナの形質転換を実証した。本研究は、とりわけ、植物の安定した遺伝的形質転換のための官能化直鎖核酸カセット分子の使用について記載する。米国特許出願第60978059は、とりわけ、正に帯電したナノ粒子媒介プラスミドDNA送達を記載した。しかし、直鎖プラスミドベースの送達を使用して導入遺伝子の安定したゲノムへの組み込みを実証したことは、現在までに報告されていない。本開示は、植物における安定した形質転換のためのナノ粒子媒介官能化直鎖核酸カセット分子の使用について記載する。分子解析は、本発明の方法によってpat遺伝子およびyfp遺伝子で形質転換されたトランスジェニックT1シロイヌナズナ植物において、YFPと共にPATの発現を示した。T1トランスジェニック植物は繁殖力があり、種子を産生する。これらの種子を増殖させてもよいし、分離分析は、分子およびタンパク質の分析とともに行うことができる。植物における単純なDNA組み込みイベントの生成を可能にする方法が開示され、それによってその後の遺伝子移入の努力を効率化する。官能化直鎖核酸カセット分子の使用は、例えば、プラスミドに比べて遺伝子形質転換での利点を提供する。例えば、官能化直鎖核酸カセット分子は、ベクターバックボーン配列または選択マーカー遺伝子を含んでいなくてもよい。II条件以下説明およびの表では、多くの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む明細書及び特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される:戻し交配:本明細書で使用される戻し交配という用語は、栽培者がハイブリッド後代を両親のいずれかと例えば、F1ハイブリッドの第一世代をF1ハイブリッドの親の遺伝子型のいずれかと繰り返し交配させるプロセスであり得る。胚:本明細書で使用される胚という用語は、成熟した種子の中に含まれている小さな植物を指すことがある。ナノ粒子:本明細書で使用される用語ナノ粒子は、少なくとも1つのナノスケール次元、例えば、100nm未満の微細な粒子を指すことがある。本発明での使用に適したナノ粒子は、1nm~084JAmChemSoc130900612。平均10個のYFPおよびQDあたり名目上50の細胞透過性ペプチドCPPを利用することによって、少なくとも300kDaの分子量および150オングストロームの空間的な広がりを有するタンパク質荷物cargoの細胞内送達を達成し得る。前掲。QDbPEコンジュゲートの送達される荷物は、より大きな範囲のサイズおよび分子量を有し例えば、コンジュゲートあたり平均25ストレプトアビジンbPE、送達されるアセンブリは、潜在的に103kDaを超える分子量および500オングストロームに近い全体寸法を有する。高いbPE価を有するコンジュゲートが使用された場合、分子量およびサイズは大幅に増加し得る。核酸分子:センスおよびアンチセンス鎖の両方のRNA、cDNA、ゲノムDNA、人工染色体ACE、ならびに上記の合成フォームおよび混合ポリマーを含むことができるポリマー形態のヌクレオチド。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変された形態を指す。本明細書で使用される核酸分子は、核酸およびポリヌクレオチドと同義である。特に指定のない限り、核酸分子は、通常、長さが少なくとも10塩基である。この用語は、DNAの一本鎖および二本鎖形態を含む。核酸分子は含めるかまたは天然に存在するヌクレオチド、ならびに天然およびまたは非天然のヌクレオチド結合によって互いに結合された改変ヌクレオチドの両方を含み得る。作動可能に連結された:第1の核酸配列は、第二の核酸配列と機能的な関係にあるとき、第1の核酸配列は、第二の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターがコード配列に作動可能に連結されている。組換えにより産生された場合、同じリーディングフレーム内で2つのタンパク質コード領域を結合するために必要ならば、作動可能に連結された核酸配列は連続していてもよい。しかし、核酸は、作動可能に連結されるために連続している必要はない。PEG化:本明細書で使用される用語PEG化は、ナノ粒子の表面が生体適合性の改善のためにポリエチレングリコールPEGで修飾されているナノ粒子例えば、金ナノ粒子、及び量子ドットを指すことがある。PEG化ナノ粒子は、特定の細胞および組織への強化された送達効率のために、様々なターゲティングリガンド例えば、ペプチド及び抗体でさらに被覆されていてもよい。PEGは、例えば、立体安定化効果を介してタンパク質の非特異的吸着を低減することによってその被覆されたナノ粒子の血液循環時間を延長するために、様々な薬物、リポソーム、および高分子ミセルを有するナノ粒子に結合されてきた。量子ドット:本明細書で使用される用語量子ドットQD時々、ナノクリスタルとしても知られるは、3つの空間方向のすべてにおいて、伝導帯の電子、価電子帯の正孔、または励起子伝導帯の電子および価電子帯の正孔の結合されたペアの動きを閉じ込める半導体ナノ構造を指すことがある。閉じ込めは、例えば、静電ポテンシャル外部電極、ドーピング、歪み、不純物などによって生成される、異なる半導体材料との間のインタフェースの存在例えば、コアシェルナノシステムにおける、半導体表面例えば、半導体ナノ結晶の存在、またはそれらの組み合わせが原因である可能性がある。量子ドットは、量子化された離散的なエネルギースペクトルを有し得る。対応する波動関数は、量子ドット内に空間的に局在化し得るが、結晶格子の多くの周期にわたって延びていてもよい。量子ドットは、小さな有限な数例えば、1~100のオーダーの伝導帯電子、価電子帯ホール、または励起子すなわち、有限の数の電気素量を含む。量子ドットは、IIVI、IIIVI、またはIVV物質の周期群で構成された結晶であり得る半導体材料の特別なクラスである。それらの大きさは、例えば、直径210ナノメートル1050原子の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、量子ドットは、セレン化カドミウム硫化亜鉛コアシェルCdSeZnS製であり得、バルク物質のものから性質的に発散した有用な範囲の電気的および光学的特性を有していてもよい。その高い量子収率、高いモル吸光係数、および退色に対する高い耐性のために、量子ドットナノ粒子は、インビボおよびインビトロでの造影剤として研究されている。グリホサートに対する耐性:グリホサートの投与に対する耐性は、グリホサートのその用量で生き残る植物の能力すなわち、植物は殺され得ないを指す。場合により、耐性植物は、一時的に黄色、またはそうでなければ、いくつかのグリホサート誘発傷害例えば、過剰な分げつおよびまたは増殖阻害を示すが、回復し得る。安定化:本明細書で使用される用語安定化は、同じ種類の近交系植物の第1世代から次の世代に再現性をもって受け継がれる植物の特性を指すことがある。導入遺伝子:本明細書で使用される用語導入遺伝子は、外因性核酸配列を指す場合がある。一例では、導入遺伝子は、遺伝子配列例えば、除草剤抵抗性遺伝子;工業的又は薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子または望ましい農業形質をコードする遺伝子である。さらに別の例では、導入遺伝子は、アンチセンス核酸配列であり、ここでそのアンチセンス核酸配列の発現は、標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、導入遺伝子例えば、プロモーターに作動可能に連結された調節配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子媒介形質転換により導入される対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、導入遺伝子を含む。しかし、他の実施形態では、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、内因性核酸配列但し内因性核酸配列の追加のゲノムコピーが望まれる;または宿主生物における標的核酸分子に対してアンチセンス配向である核酸配列を含む。取り込み:本明細書中で使用される取り込みという用語は、細胞壁や細胞膜を横切る、ナノ粒子例えば、量子ドット、または金ナノ粒子のような粒子の転移を指すことがあり、ここで、転移は、粒子が取り込まれる細胞以外の何かによって粒子に与えられる運動量のみの結果としては発生しない。単に粒子に与えられる運動量の結果として細胞壁または細胞膜を横切って粒子の転移を起こす装置または方法の非限定的な例は、微粒子銃、遺伝子銃、マイクロインジェクション、およびまたはインペールフェクションimpalefection技術である。III植物細胞の安定な形質転換のためのナノ粒子を用いた核酸分子送達A概要本発明は、例えば、遺伝的形質転換および安定したトランスジェニック植物の開発のための官能化直鎖核酸カセット分子のナノ粒子媒介転送を使用して植物を形質転換するための新しい方法を記載する。特定の実施形態に係る方法は、他の形質転換法と比較した場合、トランスジェニック生物の急速な生成だけでなく、所望のゲノム改変のためのいくつかの可能性もまた提供する。本発明の実施形態は、ナノ粒子媒介直鎖化プラスミドDNAの送達を介して生成された最初に報告された安定した形質転換植物につながっている。開示される遺伝子組み換えの方法は、植物の遺伝的形質転換の伝統的な方法から逸脱し、微粒子銃送達に依存せず、そしてトランスジェニック作物を生成するために非常に役立ち得る。トランスジェニック植物は、典型的には、アグロバクテリウム媒介または粒子衝撃形質転換によって生成される。対象とする遺伝子に加えて、トランスジェニック植物は、多くの場合、抗生物質または除草剤に対する耐性を付与する、例えば、ベクターバックボーン配列および選択マーカー遺伝子を必ず含む。選択マーカー遺伝子およびベクターバックボーン配列が、DNA転移手順において余分でありかつ望ましくないので、ベクターフリートランスジェニック植物の生成が有利である。いくつかの実施形態の方法により可能となるベクターバックボーン配列の除去は、相同組換えの量および組み込みプロセスに対する組換えエレメントの影響を制限し得る。本発明の実施形態では、直鎖核酸カセットの非侵襲ナノ粒子媒介送達によるトランスジェニック植物の直接生成が今や、例えば、フローラルディップ法を介して達成され得る。このような方法は、それがなければ当該分野で利用可能であるものよりも、所望の植物の変換を行うための簡単な方法を提供し得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ベクターフリーかつマーカーフリーなトランスジェニック植物を生成するために用いることができる。いくつかの実施形態では、形質転換法は、組織培養とは無関係であるので、性的に植物を再生するためにより便利で実用的であり得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、非侵襲的に非アグロバクテリウム互換性植物およびまたはそれらの組織培養懸濁細胞を形質転換する能力を提供し得る。このような方法は、多大な機会を提供し得る。望ましいインプットおよび農業形質は、同じ形質転換手順で複数の遺伝子送達が必要とし得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、複数の核酸分子の送達を可能にする一方で、もしできるなら煩わしいかもしれない対象とする全ての遺伝子を含む大きなプラスミドを構築する必要性を排除する。B核酸分子特定のタンパク質またはRNA産物例えば、干渉RNARNAiをコードする遺伝子の単離および特徴付けを可能にした分子生物学的手法の出現により、植物生物学の分野で科学者たちは、例えば、特定の方法で細胞の形質を変えるために、外来遺伝子、またはネイティブもしくは内因性遺伝子の追加または改変されたバージョンおそらく異なるプロモーターによって駆動されるを含めるために、細胞のゲノムを操作することに強い興味を抱いてきた。このような外来の追加の遺伝子およびまたは改変された遺伝子は、本明細書中で導入遺伝子と総称される。導入遺伝子は、例えば、対象とするタンパク質をコードし得、またはRNAiに転写され得る。過去15~20年間で、トランスジェニック細胞を産生するためのいくつかの方法が開発されており、特定の実施形態では、本発明は、細胞の形質転換されたバージョン、および細胞壁を有する植物細胞に1以上の官能化直鎖核酸カセット分子を、細胞壁を横切るナノ粒子の取り込みを介して導入することによってそれらを製造する方法に関する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は合成直鎖状DNAカセットに含まれていてもよい。細胞の形質転換は、調節エレメント例えば、プロモーター、エンハンサー、終結配列、またはその組み合わせの制御下にある、または作動可能に連結されている遺伝子を含む核酸分子を含み得る。したがって、核酸分子は、1つ以上のこのような機能的に連結された遺伝子調節エレメントの組み合わせを含み得る。実施形態では、対象とする核酸分子は、官能化直鎖核酸カセット分子であり得る。直鎖核酸カセット分子は、例えば、そこに含まれる発現カセットの切り出しのために、少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼによる環状プラスミドの消化により、生成され得る。制限エンドヌクレアーゼは、プラスミドのヌクレオチド配列内の1つまたは複数の認識部位でプラスミドを切断する。したがって、プラスミドが少なくとも一つの特定の制限エンドヌクレアーゼで消化して、1つ以上の特定の直鎖核酸カセット分子の生成を可能にするように設計し得る。あるいは、与えられたプラスミドのヌクレオチド配列は、1つ以上の特定の直鎖核酸カセット分子の生成を可能にする1つ以上の特定の制限エンドヌクレアーゼの認識部位を探索し得る。環状プラスミドまたは直鎖核酸分子内の特定の場所で開裂する制限部位を選択することにより、得られる直鎖核酸カセット分子が前駆体の核酸分子から1つ以上の配列を欠如するように生成できる。例えば、無関係なextraneous核酸配列例えば、ベクターバックボーン、選択マーカー例えば、細菌選択マーカー、および標的細胞のゲノムDNAと相同である不要な核酸配列を欠いた直鎖核酸カセット分子が生成され得る。あるいは、無関係な核酸配列を欠いている直鎖核酸カセット分子を合成し得る。直鎖核酸カセット分子は、連続的な熱循環システムを用いて合成し得る。PCT国際公開WO2008045288を参照のこと。連続的サーマルサイクラーは、小さな管を使用するのではなく、異なる温度帯を繰り返し通過する一定のまたは連続した流体の流れを使用して、DNAを増幅する。PCR反応混合物は、PCR反応混合物が非混和性であるキャリア流体に注入され、その後キャリア流体は複数の温度ゾーンを通過し、PCR反応混合物内でのDNAの増幅を促進する。サンプル中に存在する特定のDNA配列は、それが温度帯から周期的に通過する際に、増幅される。PCR産物ゲルろ過カラムで精製し、その後精製し得る。核酸分子は、異なる官能基を有する様々な試薬を用いてナノ粒子に結合させ得る。ナノ粒子への核酸分子の結合体化のための様々な化学反応を表1に示す。対象とする直鎖核酸カセット分子が1または複数の遺伝子を含む実施形態において、その遺伝子単数または複数は優性または劣性対立遺伝子であってもよい。例えば、その遺伝子単数または複数は、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌抵抗性の抵抗性、真菌抵抗性、ウイルス性病害抵抗性、雄の妊性、雄性不稔、栄養価の増大、および産業利用としてこのような形質を与えてもよい。これらの形質および他の形質を付与する遺伝子は、当該技術分野において知られ、任意の遺伝子は、本発明の方法に従って、細胞壁を含む細胞に導入してもよい。直鎖化およびナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクター:マーカー遺伝子直鎖化およびナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクターは、マーカーを含む形質転換細胞がネガティブ選択すなわち、選択可能なマーカー遺伝子を含まない細胞の増殖阻害、またはポジティブ選択すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産物についてのスクリーニングのいずれかによって回収されるようにする例えば調節エレメントに作動可能に連結された少なくとも1つの遺伝子マーカーを任意に含むことができる。形質転換のための多数の選択可能なマーカー遺伝子は、当該技術分野において周知であり、例えば、限定されないが、抗生物質もしくは除草剤であり得る選択的化学物質を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、または阻害剤に非感受性であり得る変化した標的をコードする遺伝子を含む。また、特定のポジティブ選択方法は当該技術分野において知られている。しかしながら、いくつかの実施形態では、直鎖核酸カセット分子は、マーカー遺伝子を含まない。ある種の核酸分子を用いた植物の形質転換に適していてもよい1つの選択可能なマーカー遺伝子は、カナマイシンへの抵抗性を付与する、場合により植物調節シグナルの制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼIInptII遺伝子である。例えばFraleyらProcNatlAcadSciUSA804803を参照されたい。使用してもよい別の選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンへの抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。例えば、VandenElzenらPlantMolBiol5299を参照されたい。本発明の方法に用いてもよい追加的な選択可能なマーカー遺伝子は、細菌起源のもの、例えば、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド-3’-アデニルトランスフェラーゼ、およびブレオマイシンなどの抗生物質に対する抵抗性を付与するものを含む。HayfordらPlantPhysiol861216JonesらMolGenGenet21086SvabらPlantMolBiol14197およびHilleらPlantMolBiol7171を参照されたい。他の選択可能なマーカー遺伝子はグリホセート;グルホシネート;またはブロモキシニルなどの除草剤への抵抗性を付与してもよい。ComaiらNature317741744GordonKammらPlantCell2603618およびStalkerらScience242419423を参照されたい。本発明の方法に用いてもよい他の選択可能なマーカー遺伝子は、細菌起源のものではないものを含む。これらの遺伝子は、例えば、限定されないが、マウスジヒドロ葉酸還元酵素;植物5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素;および植物アセト乳酸合成酵素を含む。EichholtzらSomaticCellMolGenet1367ShahらScience233478およびCharestらPlantCellRep8643を参照されたい。植物の形質転換に適したマーカー遺伝子の他の種類は、抗生物質などの毒性物質への抵抗性についての形質転換細胞の直接的な遺伝的選択よりも形質転換されたと仮定される植物細胞のスクリーニングを必要とする場合がある。これらの遺伝子は、特定の組織における遺伝子発現の空間分布を定量または可視化するために特に有用であり、遺伝子発現の調査のためにそれらが遺伝子または遺伝子制御配列に融合され得るため、しばしばレポーター遺伝子と称される。形質転換細胞をスクリーニングするために通常使用される遺伝子としては、限定されないが、β-グルクロニダーゼGUS;β-ガラクトシダーゼ;ルシフェラーゼ;およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。JeffersonPlantMolBiolRep5387TeeriらEMBOJ8343KonczらProcNatlAcadSciUSA84131およびDeBlockらEMBOJ31681を参照されたい。近年、植物組織の破壊を必要としないGUS活性を可視化するためのこれらのインビボ法が利用可能になっている。MolecularProbespublication2908ImageneGreen14頁およびNalewayらJCellBiol115151a。より最近になって、蛍光タンパク質をコードする遺伝子例えば、GFP、EGFP、EBFP、ECFP、およびYFPが、原核細胞および真核細胞における遺伝子発現のためのマーカーとして利用されている。ChalfieらScience263802を参照されたい。したがって、蛍光タンパク質および蛍光タンパク質の突然変異は、いくつかの実施形態において、スクリーニング可能なマーカーとして使用され得る。ナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクター:プロモーター直鎖核酸カセット分子に含まれる遺伝子は、必要に応じて、調節エレメント、例えばプロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動してもよい。プロモーターのいくつかの種類は、単独またはプロモーターとの組み合わせで使用され得る他の調節エレメントと同様に、形質転換の技術分野において今や周知である。プロモーターは、転写の開始点より上流であってもよく、RNAポリメラーゼおよび/または転写を開始する他のタンパク質の認識および結合に関与してもよいDNAの領域である。植物プロモーターは、植物細胞において転写を開始できるプロモーターであり得る。発生調節下のプロモーターの例としては、葉;根;種子;繊維;木部導管;仮導管;または厚壁組織などのある種の組織において転写を優先的に開始するプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターは、組織優先的と称される。ある種の組織においてだけ転写を開始するプロモーターは、組織特異的と称される。細胞型特異的プロモーターは、1または複数の器官、例えば根または葉における維管束細胞でのある種の細胞型において主に発現を駆動する。誘導可能なプロモーターは、環境制御下にある場合があるプロモーターであり得る。誘導可能なプロモーターによる転写に影響し得る環境条件の例としては、限定されないが、嫌気性条件または光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的、および誘導可能なプロモーターは、非構成的プロモーターの種類を構成する。構成的プロモーターは、大部分の環境条件下で活性であってよいプロモーターである。1.誘導可能なプロモーター誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る。場合により、誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。誘導可能なプロモーターにより、転写速度は誘導剤に反応して増加する。任意の誘導可能なプロモーターは、本発明の実施形態において用いることができる。WardらPlantMolBiol22361366を参照されたい。例示的な誘導可能なプロモーターは、限定されないが、銅に反応するACEI系由来のものMettらProcNatlAcadSciUSA9045674571;ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤に反応するトウモロコシ由来のIn2遺伝子HersheyらMolGenGenetics227229237およびGatzらMolGenGenetics2433238;ならびにTn10由来のTet抑制因子GatzらMolGenGenetics227229237を含む。特に有用な誘導可能なプロモーターは、植物が通常は反応しない誘導剤に反応するプロモーターであってもよい。このような例示的な誘導可能なプロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子由来の誘導可能なプロモーターであり、その転写活性はグルココルチコステロイドホルモンによって誘導され得る。SchenaらProcNatlAcadSciUSA880421。2.構成的プロモーター構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る、または構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。様々な構成的プロモーターを、本発明の実施形態において利用することができる。例示的な構成的プロモーターは、限定されないが、CaMV由来の35Sプロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーターOdellらNature313810812;イネアクチン遺伝子由来のプロモーターMcElroyらPlantCell2163171;ユビキチンChristensenらPlantMolBiol12619632、およびChristensenらPlantMolBiol18675689pEMULastらTheorApplGenet81581588MASVeltenらEMBOJ327232730;トウモロコシH3ヒストンLepetitらMolGenGenetics231276285、およびAtanassovaらPlantJournal2291300;ならびにALSプロモーター、Xba1/NcoI断片5’からセイヨウアブラナBrassicanapusALS3構造遺伝子または前記Xba1/NcoI断片と類似のヌクレオチド配列を含む。国際PCT公開第WO96/30530号を参照されたい。3.組織特異的または組織優先的プロモーター組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る。場合により、組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。組織特異的プロモーターに作動可能に連結した対象とする遺伝子を用いて形質転換された植物は、特定の組織において導入遺伝子のタンパク質産物を排他的または優先的に産生され得る。任意の組織特異的または組織優先的プロモーターを、本発明の実施形態において利用することができる。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターは、限定されないが、例えば、ファゼオリン遺伝子由来のプロモーターなどの根優先プロモーターMuraiらScience2347682、およびSenguptaGopalanらProcNatlAcadSciUSA8233204;例えばcabまたはrubisco由来のプロモーターなどの葉特異的および光誘導プロモーターSimpsonらEMBOJ427232729、およびTimkoらNature31857982;例えば、LAT52由来のプロモーターなどの葯特異的プロモーターTwellらMolGenGenetics2172405、例えば、Zm13由来のプロモーターなどの花粉特異的プロモーターGuerreroらMolGenGenetics2441618および例えば、apg由来のプロモーターなどの小胞子優先的プロモーターTwellらSexPlantReprod621724を含む。導入遺伝子によって生成されるタンパク質の、葉緑体;空胞;ペルオキシソーム;グリオキシソーム;細胞壁;もしくはミトコンドリアなどの細胞内コンパートメントへの輸送、またはアポプラストへの分泌は、対象とするタンパク質をコードする遺伝子のシグナル配列から5’および/または3’領域をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結することによって達成してもよい。その遺伝子の5’および/または3’末端での標的化配列は、例えば、タンパク質合成およびプロセシング中に、コードされたタンパク質がどこで最終的にコンパートメント化され得るかを決定することができる。代わりに、そのような細胞内コンパートメント標的化タンパク質は、所望の細胞内コンパートメントに対象とする核酸分子で被覆されたナノ粒子を指向するために直接ナノ粒子に連結してもよい。シグナル配列の存在は、細胞内小器官もしくは細胞内コンパートメントのいずれか、またはアポプラストへの分泌にポリペプチドを指向してもよい。多数のシグナル配列が当該技術分野において知られている。例えば、BeckerらPlantMolBiol2049ClosePSMastersThesisIowaStateUniversityKnoxらPlantMolBiol9317LernerらPlantPhysiol911249FontesらPlantCell348396MatsuokaらProcNatlAcadSciUSA88834GouldらJCellBiol1081657CreissenらPlantJ2129KalderonらCell39499509SteifelらPlantCell278593を参照されたい。外来タンパク質遺伝子および農学的遺伝子本発明の実施形態によるトランスジェニック植物は、商業的な量で外来タンパク質を生成し得る。したがって、形質転換された植物の選択および繁殖のための技術は、従来の方法で収穫される複数のトランスジェニック植物を生産する。次に、外来タンパク質は対象とする組織から、またはバイオマス全体から抽出され得る。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、HeneyおよびOrrAnalBiochem114926で検討されている既知の方法によって達成され得る。本発明のいくつかの態様において、外来タンパク質の商業的生産のために提供される植物材料は、植物、植物組織、または植物細胞であってもよい。いくつかの態様において、対象とするバイオマスは植物種子であってよい。より高レベルの発現を示すトランスジェニック植物について、遺伝子地図は、例えば、組み込まれたDNA分子の近似の染色体位置を同定する従来のRFLP、PCRおよびSSR分析を介して作成してもよい。この点に関する例示的な方法について、GlickおよびThompsonMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnologyCRCPressBocaRaton269284を参照されたい。染色体位置に関する地図情報は、例えば対象のトランスジェニック植物の所有権の保護、またはバイオセーフティ評価において有用であり得る。認可されていない繁殖が行われ、他の生殖質との交雑物が作製され得る場合、組み込み領域の地図は、疑われる植物についての同様の地図と、後者が対象の植物と共通の起源を有するかどうかを決定するために比較され得る。地図の比較は、ハイブリダイゼーション、RFLP、PCR、SSRおよび配列決定を含み得、その全ては従来型の技術である。同様に、農業的遺伝子は、形質転換された細胞またはそれらの後代において発現され得る。より具体的には、植物は、農業的目的での種々の表現型を発現するために本発明の方法を介して遺伝子操作され得る。この点において使用され得る例示的な遺伝子として、限定されないが、以下に分類されるものが挙げられる。1.有害生物または病害への抵抗性を付与する遺伝子:A植物の病害抵抗性遺伝子。植物の防御は、植物における病害抵抗性遺伝子Rの産物と病原体中の対応する非病原性Avr遺伝子の産物との間の特定の相互作用によってしばしば活性化される。植物種は、特定の病原体株に抵抗性である植物を操作するためにクローン化された抵抗性遺伝子を用いて形質転換され得る。例えばJonesらScience266789クラドスポリウムフルバムCladosporiumfulvumへの抵抗性のためのトマトCf-9遺伝子のクローニング;MartinらScience2621432シュードモナスシリンゲPseudomonassyringae病原型への抵抗性のためのトマトPto遺伝子。トマトはプロテインキナーゼをコードする;MindrinosらCell781089シュードモナスシリンゲへの抵抗性のためのRSP2遺伝子を参照されたい。B例えばダイズシストセンチュウsoybeancystnematodeなどの有害生物への抵抗性を付与する遺伝子。例えば、国際PCT公開第WO96/30517号;国際PCT公開第WO93/19181号を参照されたい。Cバチルスチューリンゲンシスタンパク質、その誘導体、またはそれをモデル化した合成ポリペプチド。例えば、GeiserらGene48109Btδ-エンドトキシン遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列を参照されたい。さらに、δ-エンドトキシン遺伝子をコードするDNA分子は、例えばATCC受入番号40098;67136;31995;および31998でAmericanTypeCultureCollectionManassas,VAから購入することができる。Dレクチン。例えば、VanDammeらPlantMolecBiol2425いくつかのクンシランCliviaminiataマンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を参照されたい。E例えばアビジンなどのビタミン結合タンパク質。国際PCT公開第US93/06487号害虫に対する殺幼虫剤larvicideとしてのアビジンおよびアビジン相同体の使用を参照されたい。F酵素阻害剤、例えばプロテアーゼもしくはプロテイナーゼ阻害剤、またはアミラーゼ阻害剤。例えば、AbeらJBiolChem26216793イネシステインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列;HuubらPlantMolecBiol21985タバコプロテイナーゼ阻害剤IをコードするcDNAのヌクレオチド配列;SumitaniらBiosciBiotechBiochem571243ストレプトマイセスニトロスポレウスStreptomycesnitrosporeusアルファ-アミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列および米国特許第5,494,813号を参照されたい。G例えばエクジステロイドまたは幼若ホルモン、それらの変異体、それらに基づく模倣物、またはそれらのアンタゴニストもしくはアゴニストなどの昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン。例えば、HammockらNature344458クローン化された幼若ホルモンエステラーゼ、幼若ホルモンの不活性化因子のバキュロウイルス発現を参照されたい。H影響を受けた有害生物の生理機能を発現によって破壊する昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド。例えば、ReganJBiolChem2699発現クローニングは昆虫利尿ホルモン受容体をコードするDNAを産出する;およびPrattらBiochemBiophysResComm1631243アロスタチンはディプロプテラパンタタDiplopterapuntataにおいて同定され得るを参照されたい。米国特許第5,266,317号昆虫特異的な麻痺性神経毒をコードする遺伝子も参照されたい。I天然でヘビ、スズメバチまたは任意の他の生物によって産生される昆虫特異的毒液。例えば、PangらGene116165サソリ昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種性発現を参照されたい。Jモノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質性分子の高度集積に関連する酵素。K生物学的に活性な分子、例えば天然または合成での、解糖系酵素;タンパク質分解酵素;脂肪分解酵素;ヌクレアーゼ;シクラーゼ;トランスアミナーゼ;エステラーゼ;ヒドロラーゼ;ホスファターゼ;キナーゼ;ホスホリラーゼ;ポリメラーゼ;エラスターゼ;キチナーゼ;またはグルカナーゼの翻訳後修飾を含む修飾に関与する酵素。国際PCT公開第WO93/02197号カルラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を参照されたい。キチナーゼをコードする配列を含むDNA分子は、例えばATCCから受入番号39637および67152で得ることができる。KramerらInsectBiochemMolecBiol23691タバコイモムシキチナーゼをコードするcDNAのヌクレオチド配列;およびKawalleckらPlantMolecBiol21673パセリubi4-2ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列も参照されたい。Lシグナル伝達を刺激する分子。例えば、BotellaらPlantMolecBiol24757リョクトウカルモジュリンcDNAクローンについてのヌクレオチド配列;およびGriessらPlantPhysiol1041467トウモロコシカルモジュリンcDNAクローンのヌクレオチド配列を参照されたい。M疎水性モーメントペプチド。例えば、国際PCT公開第WO95/16776号真菌性植物病原体を抑制するタキプレシンのペプチド誘導体;および国際PCT公開第WO95/18855号病害抵抗性を付与する合成抗菌性ペプチドを参照されたい。N膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤。例えば、JaynesらPlantSci8943青枯病菌Pseudomonassolanacearumに抵抗性のトランスジェニックタバコ植物を提供するセクロピン-β溶解性ペプチド類似物の異種性発現を参照されたい。Oウイルス性侵襲性タンパク質またはそれら由来の複合毒素。例えば、形質転換された植物細胞におけるウイルス被覆タンパク質の蓄積は、被覆タンパク質遺伝子が由来し得るウイルスによって、および関連するウイルスによってもたらされるウイルス感染および/または病害の進行への抵抗性を与える。BeachyらAnnrevPhytopathol28451を参照されたい。被覆タンパク質媒介抵抗性は形質転換植物に、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイルスX、ジャガイモウイルスY、タバコエッチウイルス、タバコ茎壊疽ウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対して与えられている。同文献。P昆虫特異的抗体またはそれら由来の免疫毒素。したがって、昆虫の消化管において重要な代謝機能を標的とする抗体は、影響される酵素を不活性化し、昆虫を死滅させてもよい。TaylorらAbstract497SeventhIntlSymposiumonMolecularPlantMicrobeInteractions一本鎖抗体断片の生成を介するトランスジェニックタバコにおける酵素の不活性化を参照。Qウイルス特異的抗体。例えば、TavladorakiらNature366469組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物はウイルス攻撃から防御されるを参照されたい。R病原体または寄生生物によって天然で生成される発生停止タンパク質。例えば、真菌エンドα-1,4-D-ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ-α-1,4-D-ガラクツロナーゼを可溶化することによって真菌のコロニー形成および植物栄養素の放出を促進する。LambらBioTechnology101436を参照されたい。ToubartらPlantJ2367マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特徴付けも参照されたい。S植物によって天然で生成される発生停止タンパク質。例えば、LogemannらBioTechnology10305オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェニック植物は真菌性病害への抵抗性が増大しているを参照されたい。2.除草剤への抵抗性を付与する遺伝子A成長点または分裂組織を阻害する、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素などの除草剤。この分類の例示的な遺伝子は、例えば、LeeらEMBOJ71241、およびMikiらTheorApplGenet80449によってそれぞれ記載される突然変異体ALSおよびAHAS酵素をコードする。B例えば、突然変異体5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素EPSP遺伝子組換え核酸の導入および/または種々の形態の天然EPSP遺伝子のインビボ突然変異誘発を介して;それぞれaroA遺伝子およびグリホセートアセチルトランスフェラーゼGAT遺伝子;他のホスホノ化合物、例えば、ストレプトマイセスハイグロスコピカスStreptomyceshygroscopicusおよびストレプトマイセスビリジクロモゲネスStreptomycesviridichromogenesを含むストレプトマイセス種由来のグルホシネートホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPAT遺伝子;およびピリジノキシまたはフェノキシプロプリオン酸ならびにシクロヘキソン類ACCase阻害剤をコードする遺伝子によって付与されるグリホセート抵抗性。例えば、米国特許第4,940,835号および米国特許第6,248,876号植物にグリホセート抵抗性を付与し得るEPSPの形態のヌクレオチド配列を参照されたい。突然変異体aroA遺伝子をコードするDNA分子は、ATCC受入番号39256で得ることができる。米国特許第4,769,061号突然変異体aroA遺伝子のヌクレオチド配列も参照されたい。欧州特許出願第0333033号および米国特許第4,975,374号は、L-ホスフィノトリシンなどの除草剤への抵抗性を付与し得るグルタミン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。例示的なPAT遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州出願第0242246号、およびDeGreefらBioTechnology761PAT活性をコードするキメラbar遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生成において提供される。フェノキシプロプリオン酸、ならびにセトキシジムおよびハロキシホップなどのシクロヘキソン類への抵抗性を付与する遺伝子の例は、MarshallらTheorApplGenet83435によって記載されているAcc1-S1、Acc1-S2およびAcc1-S3遺伝子を含む。グリホセート抵抗性を付与できるGAT遺伝子は、例えば、WO2005012515に記載されている。2,4-D,フェノキシプロピオン酸およびピリジロキシオーキシン除草剤への抵抗性を付与する遺伝子は、例えばWO2005107437に記載されている。CトリアジンpsbAおよびgs遺伝子またはベンゾニトリルニトリラーゼ遺伝子などの光合成を阻害する除草剤。例えばPrzibilaらPlantCell3169突然変異体psbA遺伝子をコードするプラスミドでのクラミドモナスの形質転換を参照されたい。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第4,810,648号に開示され、これらの遺伝子を含むDNA分子はATCC受入番号53435;67441;および67442で入手可能である。HayesらBiochemJ285173グルタチオンS-トランスフェラーゼをコードするDNAのクローニングおよび発現も参照されたい。3.次のような付加価値のある形質を付与するまたはそれに寄与する遺伝子A例えば、植物のステアリン酸含有量を増加させるためにステアリルACP不飽和化酵素のアンチセンス遺伝子を用いて植物を形質転換することによる、修飾された脂肪酸代謝。KnultzonらProcNatlAcadSciUSA892624を参照されたい。Bフィチン酸塩含有量の減少。フィターゼをコードする遺伝子の導入は、フィチン酸塩の分解を増強し、形質転換された植物により多くの遊離リン酸塩を増やしてもよい。例えば、VanHartingsveldtらGene12787クロコウジカビAspergillusnigerフィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を参照されたい。フィチン酸塩含有量を減らす遺伝子を導入してもよい。例えばトウモロコシにおいて、これはクローニング、および続く、フィチン酸の低レベルによって特徴付けられるトウモロコシ突然変異体に関与し得る単一対立遺伝子に関連するDNAの再導入によって達成され得る。RaboyらMaydica35383を参照されたい。C例えば、デンプンの分枝様式を変化させる酵素をコードする遺伝子を用いて植物を形質転換することによって生じた修飾された炭水化物組成物。例えば、ShirozaらJBacteol170810連鎖球菌突然変異体フルクトース転移酵素遺伝子のヌクレオチド配列;SteinmetzらMolGenGenet20220レバンスクラーゼ遺伝子;PenらBioTechnology10292α-アミラーゼ;ElliotらPlantMolecBiol21515トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列;SogaardらJBiolChem26822480オオムギα-アミラーゼ遺伝子;およびFisherらPlantPhysiol1021045トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素IIを参照されたい。C.ナノ粒子本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞壁を含む植物細胞に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方法は、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を用いて被覆させたナノ粒子を細胞と接触させて配置し、細胞壁を通したナノ粒子の取り込みを可能にすることを含んでもよい。特定の実施形態において、ナノ粒子は、可逆的にまたは不可逆的に、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を含み、それで被覆され、またはその他の方法でそれに結合および/または担持してもよい。これらおよびさらなる実施形態において、ナノ粒子は、対象となる官能化核酸カセット分子上の基と反応する基で官能化され、対象となる官能化直鎖核酸カセット分子に結合したナノ粒子を生成し得る。特定のの実施形態において、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、細胞壁を有する植物細胞との接触前にナノ粒子に導入され、または細胞壁を有する植物細胞にナノ粒子の導入と同時であってもよい。本発明の実施形態において使用され得るナノ粒子の例は、限定されないが、量子ドット;他の半導体ナノ粒子;正に帯電したナノ粒子;金ナノ粒子;金被覆ナノ粒子;多孔性ナノ粒子;メソ多孔性ナノ粒子;シリカナノ粒子;ポリマーナノ粒子例えばデンドリマー;タングステンナノ粒子;ゼラチンナノ粒子;ナノシェル;ナノコア;ナノスフェア;ナノロッド;および磁気ナノ粒子含む。本発明の特定の実施形態では、ナノ粒子の表面は官能化されてもよく、それは、例えば、ナノ粒子の表面への他の物質の標的化された取り込み、または可逆的もしくは不可逆的な結合を可能し得る。非限定的な例として、ナノ粒子例えば、量子ドットの表面は、例えば、アルカンチオレートalkanethiolateの自己組織化単分子膜で官能化され得、これはさらに官能化または誘導体化し得る。さらに非限定的な例では、ナノ粒子の表面は、それ自体が、例えば、ストレプトアビジンさらに官能化または誘導体化され得るリンカーで誘導体化し得る。一つの実施形態では、ナノ粒子は、PEG化し得る。他の実施形態では、ナノ粒子は、1つ以上のコア活性または不活性、立体コート活性または不活性、開裂可能な結合、およびまたは標的分子またはリガンドを含み得るか、またはこれらで多官能化され得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ストレプトアビジンQDコンジュゲートであり得る。ストレプトアビジンQDコンジュゲートは、半導体材料CdSeのナノメートルスケールの結晶これは、その材料の光学的特性を改善するために、さらなる半導体シェルZnSで被覆されているから作られている。それは、605nm付近に発光極大を有する狭い、対称的な発光スペクトルを有する。コアシェル素材はさらに、材料が生体分子に結合させること、およびその光学特性を保持することを可能にするポリマーシェルで被覆されている。このポリマーシェルが直接ストレプトアビジンに結合されている。ストレプトアビジンQDコンジュゲートは、大きい高分子または蛋白質約15~20nmのサイズである。表面は、様々な水性緩衝液中のサンプルとともにインキュベートされた場合、低い非特異的シグナルを有するように調製される。量子ドットを活性エステルカップリング反応を介して直接ストレプトアビジンに結合し得る。これは、高特異的生物学的活性を有するストレプトアビジン量子ドット複合体を生じる表面典型的には、5~10個のストレプトアビジン量子ドット複合体上に共有結合により結合されたストレプトアビジンを有する材料が得られる。本発明の実施形態によれば、細胞壁を有する植物細胞は、損傷を受けていない細胞壁全体を含む任意の植物細胞であってもよい。細胞壁を有する細胞の例は、限定されないが、藻類;タバコ;ニンジン;トウモロコシ;キャノーラ;ナタネ;綿;パーム;ピーナッツ;大豆;サトウキビ;オリザ種Oryzasp;シロイヌナズナ種Arabidopsissp;およびトウゴマ種Ricinusspを含む。本発明の実施形態は、任意の組織、または、限定されないが、胚;分裂組織細胞;カルス;花粉、例えば、半数体および2倍半数体の小胞体;葉;葯;根;根端;花;種子;鞘;茎;および組織培養物を含めて、その中に見出されるあらゆる箇所由来の細胞壁を含む細胞を含んでもよい。本発明の特定の実施形態において、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、本発明に係る細胞壁を有する植物細胞に送達され得る任意の官能化直鎖核酸カセット分子であってもよい。対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、限定されないが、DNA;RNA;RNAi分子;遺伝子;プラスミド;コスミド;YAC;およびBACの核酸配列を含んでもよい。対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、細胞壁を有する植物細胞に、例えば、限定されないが、ポリペプチド;酵素;ホルモン;糖ペプチド;糖類;脂肪;シグナル伝達ペプチド;抗体;ビタミン;メッセンジャー;セカンドメッセンジャー;アミノ酸;cAMP;薬剤;除草剤;殺菌剤;抗生物質;および/またはそれらの組み合わせと同時に導入してもよい。量子ドットのようなナノ粒子は、Dubertretら2002Science2981759のプロトコルを使用して、または当業者の裁量によりそこから修正されたプロトコルによって、PEGで官能化し得る。例えば、TOPOトリオクチルホスフィンオキシドで被覆されたCdSeZnS量子ドットは、クロロホルム中のPEGPEで懸濁し、続いて溶剤の蒸発及び得られるPEG化量子ドットの水での可溶化をさせ得る。本発明の態様において、ナノ粒子は、細胞の様々な部分に取り込まれ得る。ナノ粒子が取り込まれ得る位置の例は、限定されないが、細胞質ゾル;核;液胞膜;色素体;エチオプラスト;有色体;白色体;脂肪体;タンパク質プラスト;アミロプラスト;葉緑体;および二重膜の管腔を含む。他の実施形態では、細胞壁を含む細胞へのナノ粒子の取り込みは、シンプラスト的またはアポプラスト的経路を介して行ってもよい。D.安定に形質転換された植物細胞本発明に係る安定に形質転換された植物細胞は、ナノ粒子を媒介した形質転換によって、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を用いて形質転換され得る任意の植物細胞であってもよい。したがって、植物細胞は、双子葉植物または単子葉植物から単離し、またはそこから培養してもよい。また、植物細胞は、植物組織または植物全体に存在してもよい。本発明に係る双子葉植物由来の安定に形質転換された植物細胞の非制限的な例は、アルファルファ;豆類;ブロッコリ;キャベツ;ニンジン;カリフラワー;セロリ;白菜;綿;キュウリ;ナス;レタス;メロン;エンドウ;コショウ;ピーナッツ;ジャガイモ;カボチャ;ダイコン;ナタネ;ホウレンソウ;大豆;スカッシュ;サトウダイコン;ヒマワリ;タバコ;トマト;およびスイカを含む。本発明に係る単子葉植物由来の安定に形質転換された植物細胞の非制限的な例は、コーン;タマネギ;イネ;ソルガム;小麦;ライ麦;キビ;サトウキビ;オートムギ;ライ小麦;スイッチグラスおよび芝草を含む。除草剤グルホシネートアンモニウムGLAは、グルホシネート耐性遺伝子を発現するトランスジェニック植物をスクリーニングするために、フィールドレベルの濃度で噴霧し得る。本発明の方法を用いて生成したシロイヌナズナのT1苗は、グルホシネートのフィールドレベルの用量の5つの連続した適用例えば、発芽後7日を開始日として一日おきにに対して、除草剤耐性を示している。これらのトランスジェニック植物からのゲノムDNAをPCRによりpatおよびyfpの存在について分析し、その結果は、patおよびyfp標的DNA配列を示している。PCR産物の配列決定の結果は、本発明の方法を用いて生成されたT1シロイヌナズナ中でのpatおよびyfp導入遺伝子の正確な配列を明らかにした。本発明に係るトランスジェニック植物は、本発明の方法によって産生された安定に形質転換された植物細胞から再生し得る。このような植物は、任意の方法で使用または栽培することができ、ここで、対象とする核酸分子の存在が望ましい。従って、トランスジェニック植物は、ナノ粒子媒介形質転換を介して官能化直鎖核酸カセット分子で形質転換し、そして当業者に公知の任意の方法によってトリミングされ、栽培されることにより、とりわけ、1または複数の所望の特性を有するように操作し得る。以下の実施例は、ある特定の特徴およびまたは実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、例示される特定の特徴または実施形態に本発明を限定するものと解釈されるべきではない。実施例1:植物細胞の形質転換のためのナノ粒子の調製DNA;プラスミドDNAの調製pDAB3831プラスミドDNA図1を単離し、直鎖DNAストレプトアビジン被覆量子ドットによる植物の形質転換のために調製した。このプラスミドは、シロイヌナズナユビキチン10プロモーターAtUbi10によって駆動されるPAT選択マーカー遺伝子およびキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターCsVMVによって駆動されるフィラジウム黄色蛍光タンパク質遺伝子PhiYFPを含む。形質転換実験を、直鎖化DNAを用いて試験した。pDAB3831を直鎖化するために、PCR反応を完了させた。pDAB3831を、連続サーマルサイクリングシステムを用いてPCR増幅した。PCT国際公開WO2008045288。サンプルを以下を含むように調製した:12MgCl225mM、033TaqDNAポリメラーゼ5単位μL、20dNTPアデノシン三リン酸dATP、デオキシシチジン三リン酸dCTP、デオキシグアノシン三リン酸dGTP、およびデオキシチミジンdeothythimidine三リン酸dTTP、80テンプレート2μgmL、6166プルロニックF108溶液15溶液、4フォワードプライマー、4リバースプライマー、及び8の反応緩衝液10倍濃度。システムの隣接セクタを、それぞれ解離、アニーリング、および伸長のために、95°C、59°C、および72°Cの温度に設定した。PCR反応混合物を20psiで加圧容器を使用して、システムを介してポンピングした。反応混合物を温度制御本体に供給した後、鉱物油を使用して、チューブの長さ全体を通してサンプルをプッシュした。反応混合物の流速を流量弁で025mL分に制御した。サンプル中に存在する特定のDNA配列を、温度帯を通して周期的に渡すに従って増幅した。30サイクル後、内容物を採取した。PCR産物をゲルろ過カラムで精製し、続いてエタノール沈殿させた。精製した産物のサンプルを、AgilentBioanalyzer商標上で、ならびにアガロースゲル電気泳動上で分析し、PCR産物のサイズおよび濃度を確認した。上記のPCRに使用したテンプレートは、DASプラスミドpDAB3831であった。フォワードプライマー配列番号:1およびリバースプライマー配列番号:2を合成して、遺伝子およびそれらのプロモーターの両方を含む46kbpの完全な発現カセットすなわち、直鎖化されたDNAを増幅した。さらに、ナノ粒子の表面に直線二本鎖DNAの結合を容易にするために、ビオチンTEGCEホスホラミダイトを使用してプライマーのリン酸基にビオチン分子を化学的に結合させた。このホスホラミダイトは、トリエチレングリコールリンカーに基づく伸長した15原子混合極性スペーサーアームを有する。オリゴの残りの部分からビオチン機能を分離する伸長スペーサーアームの利点は、ストレプトアビジン分子に結合する時にすべての可能な立体障害の影響を低減することである。フォワードプライマーを標識したときに、ビオチンは、DNAの先頭にある。リバースプライマーを標識したときに、ビオチンはDNA断片の終端にある。したがって、ビオチン化両方向DNA断片は、ストレプトアビジンで被覆されたナノ粒子に結合させることができる。ビオチン化オリゴおよび連続熱循環システムを使用して、約20mgの直鎖状DNA断片を生成した。直鎖DNAナノ粒子の複合体化ストレプトアビジン被覆量子ドットは、EvidentTechnologyトロイ、ニューヨーク州から入手した。1mLのストレプトアビジン被覆量子ドット4nmolを05mgのビオチン化した直鎖化プラスミドDNAとともに30分間室温でインキュベートし、直鎖状DNAQD複合体を形成した。実施例2:シロイヌナズナの花芽の形質転換植物体形質転換のための植物材料種子の同期された発芽は、T0植物における花発生の均質性を確実するために重要である。シロイヌナズナAthalianacv.コロンビア種子は、0.1w/v寒天溶液中に懸濁され、4°Cにて48時間インキュベートし、層別化を完了した。60mgの種子を計量し、15mLチューブに移した。13mLの0.1w/v寒天溶液を添加し、種子が均一に分散するまでボルテックスを行った。これは、4.6mg種子/1mLの0.1w/v寒天溶液または約230種子/mLの種子溶液濃度を作製する。6本のチューブ72mL溶液を調製し、各トレイに1831/2インチポットを含む4平面に植え付けた。種子溶液を4°Cにて48時間インキュベートし、層別化を完了した。各ポットは、個別に、ポットあたり1.0mLの層状化種子溶液で植え付けられた。全てのポットを植え付けたとき、繁殖ドームをトレイに配置し、土壌水分を保持した。ドームを植え付け日後の5日に除いた。種子を発芽させ、植物を長日条件下16時間明/8時間暗、120~150μmol/m2秒の光度にて、一定の温度22°Cおよび湿度40~50下でConviron登録商標モデルCMP4030およびCMP3244、ControlledEnvironmentsLimited,Winnipeg,Manitoba,Canadaにおいて生育した。植物は、植物を植え付けた後の10~14日間、Hoagland溶液、続いてDI水で水を与え、湿らせてはないが、土壌水分を保持した。植え付けの日から4週間後、花を摘み、二番花のより均等な生育を生じさせた。植え付け後の第5週で、形質転換プロセスのために植物を調製した。植物体形質転換シロイヌナズナAthalianacv.コロンビアの直鎖DNA/QDを媒介した形質転換は、CloughおよびBentの変更したプロトコルを用いて完了した。CloughおよびBentPlantJ1673543。20mLの懸濁液は、0.5mgの直鎖DNAおよび4nMのPQDの濃度で直鎖DNA/QD複合体溶液を用いて作製され、シロイヌナズナ植物大部分は、いくつかの受精した長角果fertilizedsiliqueを有する未成熟な花房の処置に使用された。植物を浸漬する前に、0.05v/v250μL/500mL~0.005の濃度にしたSilwetL-77を直鎖DNA/PQD溶液に添加し、十分に混合した。植物の上記地上部分は、穏やかに撹拌しながら、直鎖DNA/PQD溶液に30秒間浸漬された。処理された植物は、それらの側に30分間、暗くして22~24°Cにて置かれた。植物は、上述される条件下、Convironに移され、成熟するまで生育させ、種子を回収した。選択トレイ10.5’’×21’’×1’’トレイを用いて、バルク回収種子をT0植物からスクリーニングし、各トレイでは約10,000個の種子があった。2つの対照を用いて、選択噴霧が正しく行われたことを確認した;Col-0負の形質転換体対照、および正の形質転換体対照としてPATホスピノトリシンアセチルトランスフェラーゼ選択可能なマーカーのために同型の種子でスパイクされたコロンビアCol-0野生型。同期を達成するために、種子は、植え付け前の48時間、0.1w/v寒天溶液に層状化された。選択トレイあたり10,000個の種子を与えるために、200mgの種子を0.1w/v寒天溶液に添加し、種子が均一に懸濁されるまでボルテックスした。次に、層状化された種子は、SunshineミックスLP5で満たされた選択トレイ上に植え付けられ、Hoagland溶液を用いて地下潅漑された。有効である選択噴霧について、40mLの懸濁された種子が選択トレイに均一に植え付けられることは重要である。植え付け後、繁殖ドームを各選択トレイ上に配置し、植物を選択のために生育した。繁殖ドームは、植え付け後の約5日で除かれた。実施例3:形質転換されたシロイヌナズナの分析形質転換された植物の選択新たに回収されたT1種子は、室温にて7日間乾燥させた。T1種子は26.5×51cmの発芽トレイに植え付けられ、各々は、予め40mLの0.1w/vアガロース溶液に懸濁され、4°Cにて2日間保存され、休眠要件を完了し、同期された種子発芽を確認された、層状化されたT1種子の200mgアリコート約10,000個の種子を受け入れた。SunshineMixLP5は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでHoagland溶液で地下潅漑され、次に重力排水された。層状化された種子の各40mLアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライトに均一に植え付けられ、4~5日間、湿式ドームで覆われた。ドームは、グルホシネートの発芽後噴霧を用いて、初期の形質転換体の選択前1日に取り除かれた。植え付け後の7日DAPに、T1植物それぞれ子葉および2-4-lf段階は、1塗布あたり280gae/haグルホシネートの有効速度で送達するために、DeVilbiss圧縮された空気噴霧チップを用いて、10mL/トレイ703L/haの噴霧体積で、Liberty除草剤200gae/Lグルホシネート、BayerCropSciences,KansasCity,MOの0.2w/v溶液を用いて5日以内に連続して5回噴霧された。生き残ったもの活性に生育している植物は、最終噴霧後の4~7日に同定され、鉢植え媒体MetroMix360を用いて調製された3インチのポットに個別に移された。移された植物は、3~4日間、湿式ドームで覆われ、以前の通り22°Cの生育チャンバーに置かれ、または温室に直接移された。ドームは、その後、取り出され、植物は、温室22±5°C、50±30RH、14時間明:10時間暗、最小500μE/m2s1自然追加の光内で生育された。導入遺伝子のゲノム組み込みのための分子分析および証拠シロイヌナズナAthalianaトランスジェニック植物由来のゲノムDNAは、製造業者の指示書に従って、植物DNAZOL商標Invitrogenを用いて、6週齢の植物の葉材料から抽出された。PCRプライマーは、YFPおよびPAT導入遺伝子を検出するために設計された。YFPプライマーは配列番号1および配列番号2として示される。PATプライマーは配列番号5および配列番号6として示される。導入遺伝子のgDNAPCR増幅PATおよびYFPについてのPCR増幅反応は、TaKaRaExTaq商標キットTakara,Otsu,Shiga,Japanを用いて完了された。遺伝子産物は、50μLの全反応体積において増幅された。PCR反応は、100ngゲノムDNA鋳型、1×ExTaq反応緩衝液、0.2mMのdNTP、10pMolの各プライマー、および0.025単位/μLのExTaqを含んだ。以下のPCR条件を用いた:96°Cで5分間の1サイクル、および以下の条件:94°Cで15秒間、65°Cで30秒間、72°Cで1分間、および最終伸長72°Cで7分間の31サイクル。PCR増幅産物は、0.8TAEアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色によって視覚化された。DNA断片は、QIAEX商標IIゲル精製キットQiagen,Valencia,CAを用いて、アガロースゲルから精製された。PCR断片は、高度なSanger配列決定技術MWGBiotech,Huntsville,ALを用いて、PATフォワードプライマー配列番号5とYFPフォワードプライマー配列番号3により配列決定された。配列データは、Sequencherソフトウェアを用いて分析された。PATおよびYFPのPCRアンプリコンの配列決定結果は、これらの遺伝子について予期されたヌクレオチド配列と合致していた。これらの結果は、pDAB3831からのPAT配列およびYFP配列は、ナノ粒子および直鎖DNAカセット形質転換プロトコルを用いて、シロイヌナズナのgDNAに安定に組み込まれたことを明示する。本結果は、PATおよびYFP配列が実施例1における正に帯電したナノ粒子を媒介した直鎖化DNA送達を通じて送達され、したがって、シロイヌナズナ植物のゲノムDNAにおける導入遺伝子の安定なゲノム組み込みの証拠を与えることを示す。実施例4:培養植物細胞への官能化直鎖核酸カセット分子のナノ粒子を媒介した送達単一細胞植物材料を調製する。例えば、BY2細胞およびNT1細胞の両方を用いる。BY2細胞は、緑色でない、増殖が速いタバコ細胞株である。NT1細胞は、タバコから単離された光独立栄養細胞である。形質転換の3から4日前、1週齢の懸濁培養は、250mLフラスコに50nMのDAS-PMTI-1微小管阻害剤および0.5~0.1v/vのDMSOを含む40mlのNT1BまたはLSBY2培地に、2mlのNT1またはBY2培養物を移すことによって、新鮮な培地に継代培養される。単一細胞は、微小管阻害剤処理後の4日または7日のいずれかで回収される。使用されるBY2単一細胞は、生存細胞をカウントするために、Beckmanフローサイトメータにより処理される。細胞は、単一細胞が細胞の細胞質を通じて分布した大多数の色素体アミロプラストを含むことを決定するために、共焦点画像システムに接続された微分干渉コントラストDIC顕微鏡を用いて調べられる。細胞は、3.0OD600の懸濁液1mLを移すことによって、14日ごとに一度継代培養される。形質転換の標的細胞として培養細胞が用いられる。ナノ粒子調製および細胞の処理プラスミドDNAは、直鎖DNA/量子ドットQDを媒介した植物形質転換のために単離および調製される。プラスミドは、シロイヌナズナユビキチン10プロモーターAtUbi10によって駆動されるPAT選択可能なマーカー遺伝子、およびカッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターCsVMVによって駆動されるフィラジウム黄色蛍光タンパク質遺伝子PhiYFPを含む。プラスミドを含む大腸菌Escherichiacoli株は植菌され、37°Cにてアンピシリンを含むLuria-Bertaniブロス中で濁るまで増殖される。DNAは、QiagenPlasmidMidi-PrepキットQiagen,Valencia,CAを用いて単離される。プラスミドDNAを直鎖化するために、PCR反応を、連続熱サイクリングシステムを使用して完了する。PCT国際公開WO2008045288。サンプルは以下を含むように調製される:12MgCl225mM、033TaqDNAポリメラーゼ5単位μL、20dNTPアデノシン三リン酸dATP、デオキシシチジン三リン酸dCTP、デオキシグアノシン三リン酸dGTP、およびデオキシチミジンdeothythimidine三リン酸dTTP、80テンプレート2μgmL、6166プルロニックF108溶液15溶液、4フォワードプライマー、4リバースプライマー、及び8の反応緩衝液10倍濃度。システムの隣接セクタを、それぞれ解離、アニーリング、および伸長のために、95°C、59°C、および72°Cの温度に設定した。PCR反応混合物を20psiで加圧容器を使用して、システムを介してポンピングした。反応混合物を温度制御本体に供給した後、鉱物油を使用して、チューブの長さ全体を通してサンプルをプッシュした。反応混合物の流速を流量弁で025mL分に制御した。サンプル中に存在する特定のDNA配列を、温度帯を通して周期的に渡すに従って増幅した。30サイクル後、内容物を採取した。PCR産物をゲルろ過カラムで精製し、続いてエタノール沈殿させた。精製した産物のサンプルを、AgilentBioanalyzer商標上で、ならびにアガロースゲル電気泳動上で分析し、PCR産物のサイズおよび濃度を確認した。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを合成して、遺伝子およびそれらのプロモーターの両方を含む完全な発現カセットすなわち、直鎖化されたDNAを増幅する。さらに、ナノ粒子の表面への直鎖二本鎖DNAの結合を容易にするために、ビオチンTEGCEホスホラミダイトを使用してプライマーのリン酸基にビオチン分子を化学的に結合させる。したがって、ビオチン化両方向DNA断片は、ストレプトアビジン被覆されたナノ粒子に結合させることができる。ビオチン化オリゴおよび連続熱循環システムを使用して、直鎖状DNA断片がミリグラム量で生成される。直鎖DNAナノ粒子の複合体化ストレプトアビジン被覆量子ドットは、EvidentTechnologyトロイ、ニューヨーク州から取得される。1mLのストレプトアビジン被覆量子ドット4nmolを05mgのビオチン化直鎖化プラスミドDNA共に30分間室温でインキュベートして、直鎖DNAQD複合体を形成する。1~3μL/mLの直鎖DNA結合ナノ粒子の濃度は、24ウェルマイクロタイタープレート中の500μLの細胞に添加され、20分間、暗所で振とう機上で穏やかに回転させる。ナノ粒子は細胞壁を通じて運搬される。実施例5:多官能化されたナノ粒子を媒介したシロイヌナズナの植物体形質転換シロイヌナズナについての植物体形質転換は、CloughおよびBentから修飾されたものを用いて行うことができる。多官能化されたナノ粒子上のDNA、ならびにホーミングタンパク質形質導入ドメインPTDおよびNLS単位の分子の濃度は、形質転換効率の増加を達成するために最適化される。植物材料:健康なシロイヌナズナ植物は、開花するまで土壌において、ポットに入れて長日下で生育される。第1の束は刈り取られ、多数の第2の束の増殖を促す。植物は、刈り取られた後のおよそ4~6日で準備される。シロイヌナズナArabidopsisthalianaコロンビアCol-0生態型は、花の植物体形質転換のためにバックグラウンドT0植物として選択される。種子の同調された発芽は、T0植物における花芽発生の均質性を確実にするために重要である。野生型種子は、0.1寒天溶液に懸濁され、4°Cにて48時間インキュベートし、層別化を完了する。薬包紙上で60mgの種子を計量し、15mLチューブに移す。13mLの0.1寒天溶液を添加し、種子が均一に分散するまでボルテックスを行う。これは、4.6mg種子/1mL溶液または約230種子/mLの濃度を作製する。6本のチューブ72mL溶液を調製し、各トレイに1831/2インチポットを含む4平面に植え付け、全2ポットを植え付ける。溶液を4°Cにて48時間インキュベートし、層別化を完了する。各ポットは、個別に、ポットあたり1.0mLの層状化種子溶液で植え付けられる。全てのポットを植え付けたとき、繁殖ドームをトレイに配置し、土壌水分を保持する。ドームを植え付け日後の5日に除く。種子を発芽させ、植物を長日条件下16時間明/8時間暗、120~150μmol/m2秒の光度にて、一定の温度22°Cおよび湿度40~50下でConviron登録商標モデルCMP4030およびCMP3244、ControlledEnvironmentsLimited,Winnipeg,Manitoba,Canadaにおいて生育する。植物は、植物を植え付けた後の10~14日間、Hoagland溶液、続いてDI水で水を与え、湿らせてはないが、土壌水分を保持する。植え付けの日から4週間後、花を摘み、二番花のより均等な生育を生じさせる。植え付け後の第5週で、形質転換プロセスのために植物を調製する。花の処理のためのナノコンジュゲート調製:2~120nmサイズ範囲のナノ粒子は処置のために選択され、Derufusらに従って、直鎖DNAカセットおよびホーミングペプチド単位を用いて多官能化される。655または705nmの発光極大を有し、ストレプトアビジンおよびアミノ基を用いて修飾された量子ドットを得る。QD濃度は、供給者によって提供される減衰係数を用いて、595nmでの光学的吸収によって測定される。使用される架橋剤は、スルホ-LC-SPDPスルホスクシンイミジル6-3’-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミドヘキサノエートPierceおよびスルホ-SMCCスルホスクシンイミジル4-N-マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレートSigmaである。アミノ修飾されたストレプトアビジンQDは、架橋剤を用いて、ビオチン結合直鎖DNAカセットおよびホーミングペプチドにコンジュゲートされる。QDは、AmiconUltra-4100kDaカットオフフィルターを用いて、50mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH7.2に再懸濁される。架橋剤1000倍過剰をQDに添加し、1時間反応させる。サンプルは、10mMのEDTAを補足された類似の緩衝液にNAP-5重力カラム過剰の架橋剤を除去するため上で濾過される。ペプチドは、典型的には、凍結乾燥粉末から使用される。ペプチドおよび直鎖化DNAカセットは、濾過されたQDに添加され、一晩4°Cにて反応させる。3つのAmiconフィルターを用いて、生成物は、Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水PBSで2回、高塩緩衝液1.0M塩化ナトリウム、100mMクエン酸ナトリウム、pH7.2で2回、PBSでさらに2回濾過される。高塩洗浄は、PBS洗浄だけでは取り除かれない、静電的に結合されたDNAおよびペプチドを除くために必要とされる。スルホ-SMCCは、1つの末端に、アミド結合を形成するために、アミノ修飾されたQDと反応するN-ヒドロキシスクシンイミドNHSエステルを有する。また、スルホ-LC-SPDPは、任意の1級アミン含有分子と急速に反応して、安定なアミド結合を形成するアミン反応性N-ヒドロキシスクシンイミドNHSエステルを含む。植物体形質転換およびT1抵抗性植物のスクリーニング:最終体積が250~500mLの懸濁液は、ナノ粒子、ホーミングペプチドおよび直鎖DNAカセットNHDコンジュゲート溶液を用いて作製され、次にシロイヌナズナ植物大部分は、いくつかの受精した長角果を有する未成熟な花房を処置に用いる。植物を浸漬する前に、0.05250ul/500ml~0.005の濃度にしたSilwetL-77をNHpDコンジュゲート溶液に添加し、十分に混合する。植物の上記地上部分は、穏やかに撹拌しながら、NHpDコンジュゲート溶液に2~30秒間浸漬される。処理された植物は、16~24時間、22~24°Cにてドームまたはカバー下に保持される。植物は、Convironに移され、成熟するまで生育させ、種子を回収する。選択トレイ10.5’’×21’’×1’’トレイを用いて、バルク回収種子をT0植物からスクリーニングし、各トレイでは約10,000個の種子がある。2つの対照を用いて、選択噴霧が正しく行われたことを確認する、Col-0負の形質転換体対照、および正の形質転換体対照としてPATホスピノトリシンアセチルトランスフェラーゼ選択可能なマーカーのために同型の種子でスパイクされたコロンビアCol-0野生型。同期を達成するために、種子は、植え付け前の48時間、0.1寒天溶液に層状化される。選択トレイあたり10,000個の種子を与えるために、200mgの種子を0.1w/v寒天溶液に添加し、種子が均一に懸濁されるまでボルテックスする。次に、層状化された種子は、SunshineミックスLP5で満たされた選択トレイ上に植え付けられ、Hoagland溶液を用いて地下潅漑される。有効である選択噴霧について、40mLの懸濁された種子が選択トレイに均一に植え付けられることは重要である。植え付け後、繁殖ドームを各選択トレイ上に配置し、先に言及した条件を用いた選択のために、種子を生育する。繁殖ドームは、植え付け後の約5日で除かれる。苗木は、植え付け後の5日、さらに植え付け、苗木噴霧後の10日に、1塗布あたり280g/haグルホシネートの有効速度で送達するために、DeVilbiss圧縮された空気噴霧チップを用いて、10mL/トレイ703L/haの噴霧体積中のグルホシネートアンモニウムBayerCropSciencesからのLIBERTY登録商標除草剤の0.2v/v溶液20μl/10mldH2Oを用いて噴霧される。調製するためのLiberty登録商標の量は以下のように計算される:703L/ha噴霧体積=280GPA。280gai/ha×1ha/703L×1L/200gaiグルホシネート=0.20溶液または20μL/10mL。10mLの溶液は、噴霧されるべき各トレイのために20mLシンチレーションバイアルにピペットで入れる。噴霧は、水平および垂直の塗布パターンを用いて送達される。第2の噴霧後の4~7日に、除草剤抵抗性植物を同定する。"