"番号PTA-11008で2010年6月2日にATCCに寄託されたハイブリドーマhCD27.15によって産生されるモノクローナル抗体hCD27.15と同じヒトCD27のエピトープを結合する、結合化合物。-SEQIDNO:5、6、および7からなる群から選択される少なくとも1つのCDR、もしくは前記配列のうちいずれかの変異体を備える抗体重鎖可変領域;ならびに/または-SEQIDNO:8、9、および10からなる群から選択される少なくとも1つのCDR、もしくは前記配列のうちいずれかの変異体を備える抗体軽鎖可変領域を備える、請求項1に記載の結合化合物。-SEQIDNO:3というアミノ酸配列を備える重鎖可変領域と、SEQIDNO:4というアミノ酸配列を備える軽鎖可変領域とを備える、請求項1または2に記載の結合化合物。CD27に結合し、かつ-SEQIDNO:5、6、および7のCDR、もしくは前記配列のうちいずれかの変異体を備える抗体重鎖可変領域;ならびに/または-SEQIDNO:8、9、および10のCDR、もしくは前記配列のうちいずれかの変異体を備える抗体軽鎖可変領域を備える、請求項1または2に記載の結合化合物。前記変異体のいずれかはアミノ酸修飾を3つまで備えてもよい、請求項1-4のいずれか1項に記載の結合化合物。化合物は、ハイブリドーマhCD27.15受託番号PTA-11008またはそのヒト化されたものによって産生されるようなモノクローナル抗体hCD27.15である、請求項1-5のいずれか1項に記載の結合化合物。結合化合物は、-約100nM以下のKDを有するヒトCD27を結合し;かつ-約10nM以下のIC50を有するヒトCD70へのヒトCD27の結合をブロックする、請求項1-6のいずれかに記載の結合化合物。結合化合物であって、ヒトCD27上の結合エピトープについて、請求項1-7の結合化合物のいずれかと競合し、かつ-約100nM以下のKDを有するヒトCD27を結合し;-SEQIDNO:3というアミノ酸配列を備える重鎖とSEQIDNO:4というアミノ酸配列を備える軽鎖とを有する抗体とほぼ同じKDを有するヒトCD27に結合し;-約10nM以下のIC50を有するヒトCD70へのヒトCD27の結合をブロックする、という特性のうち1つ以上を有する、結合化合物。-キメラ抗体もしくはそのフラグメント;-ヒト抗体もしくはそのフラグメント;-ヒト化抗体もしくはそのフラグメント;または-Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、Fab’2、二重特異性mAb、および二重特異性抗体からなる群から選択される抗体フラグメントである、請求項1-8のいずれか1項に記載の結合化合物。請求項1-9のいずれか1項に記載の結合化合物をエンコードする単離されたポリヌクレオチド。hCD27.15の重鎖および軽鎖をエンコードするSEQIDNO1および2を備える、請求項10に記載の単離されたポリヌクレオチド。請求項10または11に記載のポリヌクレオチドを備える発現ベクター。請求項11に記載の発現ベクターまたは請求項10もしくは11に記載のポリヌクレオチドを備える宿主細胞。請求項1-9のいずれか1項に記載の結合化合物を産生する方法であって、a発明の結合化合物をエンコードするポリヌクレオチドを備える発現ベクターを備える宿主細胞を、ポリヌクレオチドが発現される条件下の培地中で好適な調節性配列の制御下で培養し、これにより軽鎖および重鎖可変領域を備えるポリペプチドを産生することと;b宿主細胞または培地からポリペプチドを回収することとを備える、方法。医薬的に許容される担体または希釈液と組合わせた、請求項1-9のいずれか1項に記載の結合化合物を備える組成物。別の活性化合物、特定的には療法的に活性の化合物、より特定的には制がん剤をさらに備える、請求項15に記載の組成物。療法および診断で用いるための、請求項1-9のいずれか1項に記載の結合化合物。療法は、-CD27細胞の増殖および/もしくは生存の刺激;-癌の治療;または-自己免疫疾患の治療、を備える、請求項17に記載の結合化合物。フローサイトメトリ、ウェスタンブロット法、酵素結合免疫吸着検定法ELISA、および免疫組織化学で用いるための、請求項1-9のいずれか1項に記載の結合化合物。このように、発明は、hCD27.15と同じエピトープに結合する結合化合物に関する。hCD27.15を産生するハイブリドーマは、2010年6月2日にATCCに寄託され、受託番号PTA-11008を与えられた。発明は、この特定的なエピトープへの結合がCD27細胞の増殖および/または生存を刺激することが分かったのと同じエピトープを結合するすべての分子に関する。1つの実施形態では、発明は、結合化合物であって、CD27に結合し、かつ-SEQIDNO:5、6、および7からなる群から選択される少なくとも1つのCDR、もしくは当該配列のうちいずれかの変異体を備える抗体重鎖可変領域;ならびに/または-SEQIDNO:8、9、および10からなる群から選択される少なくとも1つのCDR、もしくは当該配列のうちいずれかの変異体を備える抗体軽鎖可変領域を備える、結合化合物に関する。1つの実施形態では、発明は、結合化合物であって、CD27に結合し、かつ-SEQIDNO:5、6、および7、SEQIDNO:5および7、SEQIDNO:6および7、ならびにSEQIDNO:5および6からなる群から選択されるCDRの組合せ、もしくは当該配列のうちいずれかの変異体を備える抗体重鎖可変領域;ならびに/または-SEQIDNO:8、9、および10、SEQIDNO:8および10、SEQIDNO:9および10、ならびにSEQIDNO:8および9からなる群から選択されるCDRの組合せ、もしくは当該配列のうちいずれかの変異体を備える抗体軽鎖可変領域を備える、結合化合物に関する。1つの実施形態では、発明は、以上開示されたCDRの組合せを有する重鎖および軽鎖可変領域の任意の組合せであって、特に-SEQIDNO:8、9、および10とのSEQIDNO:5、6、および7、-SEQIDNO:8および10とのSEQIDNO:5、6、および7、-SEQIDNO:9および10とのSEQIDNO:5、6、および7、-SEQIDNO:8および9とのSEQIDNO:5、6、および7、-SEQIDNO:8、9、および10とのSEQIDNO:5および7、-SEQIDNO:8および10とのSEQIDNO:5および7、-SEQIDNO:9および10とのSEQIDNO:5および7、-SEQIDNO:8および9とのSEQIDNO:5および7、-SEQIDNO:8、9、および10とのSEQIDNO:6および7、-SEQIDNO:8および10とのSEQIDNO:6および7、-SEQIDNO:9および10とのSEQIDNO:6および7、-SEQIDNO:8および9とのSEQIDNO:6および7、-SEQIDNO:8、9、および10とのSEQIDNO:5および6、-SEQIDNO:8および10とのSEQIDNO:5および6、-SEQIDNO:9および10とのSEQIDNO:5および6、-SEQIDNO:8および9とのSEQIDNO:5および6、の組合せに関する。1つの実施形態では、発明は、結合化合物であって、CD27に結合し、かつ-SEQIDNO:5、6、および7のCDR、もしくは当該配列のうちいずれかの変異体を備える抗体重鎖可変領域;ならびに/または-SEQIDNO:8、9、および10のCDR、もしくは当該配列のうちいずれかの変異体を備える抗体軽鎖可変領域を備える、結合化合物に関する。1つの実施形態では、結合分子は、CD27に結合し、かつ-SEQIDNO:3というアミノ酸配列を備える重鎖可変領域と、SEQIDNO:4というアミノ酸配列を備える軽鎖可変領域とを備える。1つの実施形態では、結合化合物は、ハイブリドーマhCD27.15によって産生されるようなモノクローナル抗体hCD27.15受託番号PTA-11008であるかまたはそのヒト化されたものである。1つの実施形態では、結合化合物は、抗体のフラグメント、変異体、または誘導体である。そのさらなる局面に従うと、発明は、発明の結合化合物をエンコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。発明はさらに、当該ポリヌクレオチドを備える発現ベクターおよび発現ベクターを備える宿主細胞に関する。1つの実施形態では、発明は、hCD27.15の重鎖および軽鎖をそれぞれエンコードするSEQIDNO1および2の単離されたポリヌクレオチドに関する。1つの実施形態では、結合化合物は、-約100nM以下のKDを有するヒトCD27を結合し;かつ-約10nM以下のIC50を有するヒトCD70へのヒトCD27の結合をブロックする。1つの実施形態では、発明は、ヒトCD27上の結合エピトープについて、上記結合化合物のいずれかと競合する結合化合物に関し、-約100nM以下のKDを有するヒトCD27を結合し;-SEQIDNO:3というアミノ酸配列を備える重鎖と、SEQIDNO:4というアミノ酸配列を備える軽鎖とを有する抗体とほぼ同じKDを有するヒトCD27に結合し;-約10nM以下のIC50を有するヒトCD70へのヒトヒトCD27の結合をブロックするという特徴のうち1つ以上を有する。結合化合物は、-キメラ抗体もしくはそのフラグメント;-ヒト抗体もしくはそのフラグメント;-ヒト化抗体もしくはそのフラグメント;または-Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、Fab’2、二重特異性mAb、および二重特異性抗体からなる群から選択される抗体フラグメントのうちいずれか1つであり得る。その別の局面に従うと、発明は、発明の結合化合物をエンコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。1つの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、hCD27.15の重鎖および軽鎖をエンコードするSEQIDNO1および2を備える。発明は、ポリヌクレオチドを備える発現ベクター、および発現ベクターまたはポリヌクレオチドを備える宿主細胞にも関する。そのさらなる局面に従うと、発明は、発明の結合化合物を産生する方法であって、a発明の結合化合物をエンコードするポリヌクレオチドを備える発現ベクターを備える宿主細胞を、ポリヌクレオチドが発現される条件下の培地中で好適な調節性配列の制御下で培養し、これにより軽鎖および重鎖可変領域を備えるポリペプチドを産生することと;b宿主細胞または培地からポリペプチドを回収することとを備える方法に関する。発明は、医薬的に許容される担体または希釈液と組合せて結合化合物を備える組成物にさらに関する。そのような組成物は、1つの実施形態では、1つよりも多くの結合化合物を備えてもよい。1つの実施形態では、組成物は、発明の1つ以上の結合化合物に加えて、1つ以上の他の活性化合物を備える。そのような組合せ組成物を、たとえば癌の治療で組合せ療法に用いることができる。その場合、結合化合物は、通常の制がん剤のうち1つ以上と組合される。他の組合せ療法には他の付加的活性化合物を用いる。組合せ療法には、同じ組成物中に2つ以上の活性化合物を有することが義務付けられているわけではない。このように、発明の一部も、結合化合物と他の活性化合物との組合せられたまたはその後の使用であり、ここでは、結合化合物および他の活性化合物は同時にまたは後に投与される。発明は、療法および診断における、ならびに他の非療法的目的のための、結合化合物の使用にさらに関する。1つの実施形態では、療法はCD27細胞の増殖および/または生存の刺激を備える。1つの実施形態では、療法は癌の治療を備える。1つの実施形態では、療法は自己免疫疾患の治療を備える。発明の結合化合物は、非療法的適用例で用いられる場合、たとえば、フローサイトメトリ、ウェスタンブロット法、酵素結合免疫吸着検定法ELISA、および免疫組織化学などの技術に適用可能である。以下では、これらの結合化合物をhCD27.15ベースの結合化合物と称する。この文言は、上述のようなhCD27.15が認識するCD27のエピトープに結合するあらゆる化合物を包含することが意図される。そのような化合物は、hCD27.15、もしくはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体のCDR領域のうち1つ以上を有する抗体、またはモノクローナル抗体hCD27.15もしくはそのヒト化されたもの、またはこのエピトープに結合可能な他の分子であり得る。療法1つの実施形態では、発明の療法は、hCD27.15、特にhCD27.15mAbベースの結合化合物を有する、Treg、Th17細胞、またはTh1細胞などのCD27、CD4、またはCD8T細胞サブセットを標的にすることを備える。hCD27.15、特にhCD27.15mAbベースの結合化合物を有するこれらのCD27細胞を標的にすることは、CD4T細胞サイトカイン産生およびCD4T細胞の性質がCD8T細胞応答を助けるように命令し、このことは、癌および自己免疫を含むさまざまな病状を治療するのに有益である。例は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病などのリンパ球由来の腫瘍;膵癌、大腸癌、および前立腺癌のような充実性腫瘍によって形成されるが、これらに制限されるものではない。この目的のため、hCD27.15を、単独でまたは他の制がん剤と組合せて、被験者に直接服用させることができる。自己免疫における使用の例は、関節リウマチ、全身エリテマトーデス、および乾癬を含むが、これらに制限されるものではない。さらに、療法は、ウィルス性および細菌感染などの感染症に向けられてもよい。例は、hCD27.15を、単独でまたは他の抗感染薬剤と組合せて、インフルエンザウィルスまたはCMVウィルスに感染した被験者に投与することを含むが、これに制限されるものではない。1つの実施形態では、hCD27.15、特にhCD27.15mAbベースの結合化合物による免疫系の刺激を用いてワクチン応答を増すことができる。hCD27.15刺激と組合せて用いることができるワクチンの非限定的例は、癌または病原体へのCD8T細胞応答を引き出すように設計される、DNA、細胞ベースの、またはペプチドベースのワクチンを含む。この目的のため、hCD27.15、特にhCD27.15抗体ベースの結合化合物を、予防接種前、予防接種後の適切な時に投与することができるか、またはワクチンの中に処方することができる。現在最新の技術は、CD27細胞の単離および異なる細胞サブセットの単離を可能にする。hCD27.15による、患者の体外のそのような単離された細胞のサブセットの刺激の後、それらを患者または別の患者に後に養子導入することができる。1つの実施形態では、細胞のサブセットは、自己免疫疾患に罹患した患者から単離することができ、優れた抑制特性を実証することが示されているCD27調節性T細胞Tregによって形成される。モノクローナル抗体hCD27.15は、CD27細胞の増殖および/または生存を促進する。最新技術は、広範囲の体液および器官からの細胞のサブセットの単離を用いる。hCD27.15の刺激特性に基づくと、hCD27.15ベースの結合化合物をインビトロ細胞系で用いて、CD27細胞の増殖および/または生存を促進することができる。非限定的な例は、寿命が短いことが実証されているTregを形成する。他の例は、記憶B細胞および活性化されたT細胞を形成する。hCD27.15、特にhCD27.15mAbベースの結合化合物によるCD27細胞の刺激および増殖をこのように用いてTreg母集団をエクスビボで増やすことができ、これを、患者の過度に活性化された免疫系を抑制するように患者に養子移植することができる。このような方策を用いて、活性化された免疫系に苦しむ患者を治療することができる。このように、たとえばこの策を用いて、移植拒絶を防止し、かつ自己免疫および炎症性疾患を治療することができる。別の例は、腫瘍関連のリンパ球の単離である。そのようなリンパ球は、抗腫瘍活性を隠し持っているが、腫瘍およびその環境によって活性化を抑制されている。これらのリンパ球の単離、hCD27.15、特にhCD27.15mAbベースの結合化合物を用いる体外でのその後の活性化および患者への養子導入は、向上した抗腫瘍応答を発することが期待される。hCD27.15、特にhCD27.15抗体ベースの結合化合物をインビボで適用して、CD27腫瘍細胞を標的にすることもできる。hCD27.15、特にhCD27.15抗体ベースの非修飾結合化合物を、たとえば、CD27悪性腫瘍の患者に注射して、抗体依存細胞毒性または他の免疫エフェクタメカニズムを引き出すことができる。hCD27.15、特にhCD27.15抗体ベースの結合化合物を、標的にされたCD27腫瘍細胞を殺すように毒素または他の適切な薬剤とコンジュゲートすることもできる。診断hCD27.15ベースの結合化合物は、たとえば、特異的細胞、組織上の、または血清中のCD27の発現を検出するために、診断アッセイにおいても有用なことがある。診断適用例には、hCD27.15ベースの結合化合物は、典型的に、検出可能な部分で直接にまたは間接的に標識付けされる。ビオチン、蛍光色素、ラジオヌクレオチド、酵素、ヨウ素、および生合成標識というカテゴリに一般的にグループ分け可能な数多くの標識を利用可能である。ある範囲の異なる患者の血清および他の体液中に存在する可溶CD27は、患者の疾患の重さと相関することが示されている。たとえば、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、および非ホジキンリンパ腫に罹患した患者は、可溶CD27の増加した血清レベルを実証した。hCD27.15の実証された結合特性に基づくと、hCD27.15ベースの結合化合物を体液中の可溶CD27を検出する診断ツールとして用いることができる。本発明のhCD27.15ベースの結合化合物を、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ法で用いてもよい。ZolaMonoclonalAntibodiesAManualofTechniquespp147158。hCD27.15ベースの結合化合物をインビボ診断アッセイにも用いてもよい。一般的に、結合化合物は放射性核種で標識付けられるので、抗原またはそれを発現する細胞は、免疫シンチグラフィまたは陽電子放射断層撮影法を用いて局所化することができる。非療法的使用発明の別の局面に従うと、結合化合物は他の非療法的使用を有する。hCD27.15ベースのこれらの結合化合物の非療法的使用は、フローサイトメトリ、ウェスタンブロット法、酵素結合免疫吸着検定法ELISA、および免疫組織化学を含む。この発明のhCD27.15ベースの結合化合物を、たとえば、プロテインA-セファロースカラムへの固定を介して親和性精製試薬として用いてもよい。定義抗体という用語は、その受容体へのリガンドの結合を阻害する、または受容体のリガンド誘導シグナリングを阻害することによってなどして、所望の生物学的活性を呈する抗体の任意の形態を指す。本件では、生物学的活性はCD27に対するアゴニスト活性を備える。このように、抗体はもっとも広い意味で用いられ、具体的には、完全長モノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および多特異的抗体たとえば二重特異性抗体をカバーするが、これらに限定されるものではない。抗体フラグメントおよび抗体結合フラグメントは、典型的には親抗体の抗原結合または可変領域の少なくとも一部たとえば1つ以上のCDRを含む抗体の抗原結合フラグメントおよび類似体を意味する。抗体フラグメントは、親抗体の結合特異性の少なくともいくらかを保持する。典型的には、抗体フラグメントは、親結合活性がモル基準で発現される場合、その活性の少なくとも10を保持する。好ましくは、抗体フラグメントは、標的に対する親抗体の結合親和性の少なくとも20、50、70、80、90、95、または100以上を保持する。抗体フラグメントの例は、Fab、Fab’、Fab’2、およびFvフラグメント;二重特異性抗体;線状抗体;一本鎖抗体分子、たとえばsc-Fv、unibodiesGenmabの技術nanobodiesDomantisの技術;ドメイン抗体Ablynxの技術ならびに抗体フラグメントから形成される多特異的抗体を含むが、これらに限定されるものではない。改変された抗体変異体は、HolligerandHudson2005NatBiotechnol2311261136で検討される。Fabフラグメントは、1本の軽鎖と、1本の重鎖のCH1および可変領域とからなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Fc領域は、抗体のCH1およびCH2ドメインを備える2つの重鎖フラグメントを含有する。2つの重鎖フラグメントは、2つ以上のジスルフィド結合によって、およびCH3ドメインの疎水性相互作用によってともに保持される。Fab’フラグメントは、1本の軽鎖と、VHドメインおよびCH1ドメインならびにCH1ドメインとCH2ドメインとの間の領域も含有する1本の重鎖の部分とを含有し、これにより、2つのFab’フラグメントの2本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成してFab’2分子を形成することができる。Fab’2フラグメントは、2本の軽鎖と、CH1ドメインとCH2ドメインとの間の定常部位の一部を含有する2本の重鎖とを含有し、これにより2本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。このように、Fab’2フラグメントは、2本の重鎖の間のジスルフィド結合によってともに保持される2つのFab’フラグメントからなる。Fv領域は、重鎖および軽鎖の両者からの可変領域を備えるが、定常部位を欠いている。一本鎖Fv抗体またはscFv抗体は、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在する、抗体のVHおよびVLドメインを備える抗体フラグメントを指す。一般的に、Fvポリペプチドは、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成できるようにするVHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに備える。scFvの検討については、Pluckthun1994ThePharmacologyofMonoclonalAntibodiesvol113RosenburgandMooreedsSpringerVerlagNewYorkpp269315を参照。また、国際特許出願公開番号第WO88/01649ならびに米国特許第4,946,778号および第5,260,203号も参照。二重特異性抗体は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントである。フラグメントは、同じポリペプチド鎖VHVLまたはVLVH中の軽鎖可変ドメインVLに接続される重鎖可変ドメインVHを備える。同じ鎖上の2つのドメインの間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは別の鎖の相補ドメインと強制的に対合され、2つの抗原結合部位を作り出す。二重特異性抗体は、たとえば、EP404,097;WO93/11161;およびHolligeretal1993ProcNatlAcadSciUSA9064446448により十分に記載されている。ドメイン抗体フラグメントは、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。いくつかの事例では、2つ以上のVH領域がペプチドリンカーと共有結合して二価ドメイン抗体フラグメントを作り出す。二価ドメイン抗体フラグメントの2つのVH領域は同じまたは異なる抗原を標的にしてもよい。本明細書中で用いられるように、抗体hCD27.15は、重鎖がSEQIDNO:3という可変領域配列を有し、かつIgG1定常部位に結合され、また軽鎖がSEQIDNO:4という可変領域配列を有し、かつκ定常部位に結合されるマウス抗体である。hCD27.15抗体を産生するハイブリドーマは、番号PTA-11008で2010年6月2日にATCCに寄託された。発明の抗体フラグメントは、たとえば通常は重鎖間ジスルフィド結合に係るヒンジシステインのうち少なくとも1つが本明細書中に記載のように変更される、ジスルフィド結合能力が低下した重鎖の二量化または多量化を許すのに十分な定常部位の部分を備えてもよい。別の実施形態では、抗体フラグメント、たとえばFc領域を備えるものは、FcRn結合、抗体半減期変調、ADCC抗体依存性細胞傷害機能、および/または補体結合たとえば、抗体がADCC機能または補体結合に必要な糖化プロファイルを有する場合などの、無傷の抗体中に存在する場合は通常Fc領域と関連付けられる生物学的機能のうち少なくとも1つを保持する。キメラ抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の部分が特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応の配列と同一であるかまたは同種である一方で、鎖の残余が別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応の配列と同一であるかまたは同種である抗体、ならびにそれらが所望の生物学的活性を呈する限りはそのような抗体のフラグメントを指すたとえば、米国特許第4,816,567号およびMorrisonetal1984ProcNatlAcadSciUSA8168516855を参照。本明細書中で用いられるように、ヒト化抗体という用語は、非ヒトたとえばネズミ抗体およびヒト抗体からの配列を含有する抗体の形態を指す。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する。一般的に、ヒト化抗体は、高可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、かつFR領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のそれに対応する、少なくとも1つおよび典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを備える。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常部位Fcの少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部も備える。げっ歯類抗体のヒト化形態は、本質的に、親げっ歯類抗体の同じCDR配列を備える。もっとも、親和性を増したり、ヒト化抗体の安定性を増したりするために、または他の理由で、あるアミノ酸置換を含んでもよい。しかしながら、CDRループ交換は、起始抗体と同じ結合性を有する抗体という結果を均一にもたらすわけではないので、フレームワーク残基FR、すなわちCDRループ支持に係る残基の変化もヒト化抗体に導入されて、抗原結合親和性を保全することがある。抗体という用語は、完全にヒトの抗体、すなわちヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを備える抗体も含む。完全にヒトの抗体は、マウス中、マウス細胞中、またはマウス細胞に由来するハイブリドーマ中で産生されればネズミ炭水化物鎖を含有することがある。同様に、マウス抗体またはラット抗体は、マウスまたはラット免疫グロブリン配列のみをそれぞれ備える抗体を指す。完全にヒトの抗体は、人間の中で、ヒト免疫グロブリン生殖細胞系配列を有する遺伝形質転換動物の中でファージ提示法または他の分子生物学的方法によって生成されてもよい。また、組換免疫グロブリンも遺伝形質転換マウス中で作られてもよい。Mendezetal1997NatureGenetics15146156を参照。AbgenixandMedarextechnologiesも参照。本発明の結合化合物は、変更されたエフェクタ機能を提供するように修飾されたまたはブロックされたFc領域を有する抗体も含む。たとえば、米国特許第5,624,821号;WO2003/086310;WO2005/120571;WO2006/0057702;Presta2006AdvDrugDeliveryRev58640656を参照。そのような修飾を用いて免疫系のさまざまな反応を向上させるまたは抑制することができ、これには診断および療法における可能な有益な効果が伴う。Fc領域の変更は、アミノ酸変更置換、欠失、および挿入、糖化、または脱グリコシル化、ならびに複数のFcの追加を含む。Fcに対する変更は、療法用抗体中の抗体の半減期を変更することもでき、半減期がより長くなる結果、投薬の頻度が少なくなり、付随して利便性が増大し、かつ材料の使用が少なくなる。Presta2005JAllergyClinImmunol11673435の731を参照。本発明の結合化合物は、完全なエフェクタ機能を提供する無傷のFc領域を有する抗体、たとえば標的にされた細胞中で補体依存性細胞傷害CDCまたは抗体依存性細胞傷害ADCCを誘導するアイソタイプIgG1の抗体も含む。抗体は、保管の間に抗体の安定性を向上させるまたはインビボで抗体の半減期を長くする分子にコンジュゲートたとえば共有結合されてもよい。半減期を長くする分子の例は、アルブミンたとえばヒト血清アルブミンおよびポリエチレングリコールPEGである。抗体のアルブミン結合されたおよびペグ化された誘導体は、当該技術分野で周知の技術を用いて調製可能である。たとえば、Chapman2002AdvDrugDelivRev54531545AndersonandTomasi1988JImmunolMethods1093742Suzukietal1984BiochimBiophysActa788248255およびBrekkeandSandlie2003NatureRev25262を参照。本発明で用いる結合化合物、特に抗体は通常、少なくともKDが約103M、より通常は少なくとも106M、典型的には少なくとも107M、より典型的には少なくとも108M、好ましくは少なくとも約109M、およびより好ましくは少なくとも1010M、およびもっとも好ましくは少なくとも1011Mで結合する。たとえば、Prestaetal2001ThrombHaemost85379389Yangetal2001CritRevOncolHematol381723Carnahanetal2003ClinCancerRes93982s3990sを参照。抗体親和性は、標準的分析を用いて定めてもよい。本明細書中で用いるような高可変領域という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高可変領域は、たとえば軽鎖可変ドメイン中の残基24-34L1、50-56L2、および89-97L3、ならびに重鎖可変ドメイン中の31-35H1、50-65H2、および95-102H3などの、配列整列によって規定される、相補性決定領域もしくはCDRからのアミノ酸残基Kabatetal1991SequencesofproteinsofImmunologicalInterest5thEdPublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthBethesdaMdを参照、ならびに/または、たとえば軽鎖可変ドメイン中の残基26-32L1、50-52L2、および91-96L3、ならびに重鎖可変ドメイン中の26-32H1、53-55H2、および96-101H3などの、構造的に規定されるような高可変ループHVLからの残基ChothiaandLeskl1987JMolBiol196901917を参照を備える。フレームワークまたはFR残基は、本明細書中に定義されるような高可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。単離された抗体は、その自然環境の成分から同定されおよび分離されおよび/または回復されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断または療法的使用を妨げるであろう材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質または非タンパク質溶質を含むことがある。いくつかの実施形態では、抗体は、1ローリー法で定められるような抗体の95重量超まで、およびもっとも好ましくは99重量超まで、2スピンカップシークエネータの使用によるN末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも15個の残基を得るのに十分な程度に、または3クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる還元もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEによる均質性まで、精製される。単離された抗体は、組換細胞内でインサイチューで抗体を含む。というのも、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないであろうからである。しかしながら、普通は、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程で調製される。単離された核酸分子は、少なくとも1つの汚染核酸分子から同定されかつ分離される核酸分子であり、核酸分子は普通、抗体核酸の自然源においてこれと関連付けられる。単離された核酸分子は、それが自然界で見られる形態または設定以外のものである。したがって、単離された核酸分子は、自然細胞中に存在する状態の核酸分子から区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、たとえば、核酸分子が自然細胞とは異なる染色体位置にある抗体を普通は発現する細胞中に含有される核酸分子を含む。本明細書中で用いるようなモノクローナル抗体という用語は、実質的に均質な抗体の母集団から得られる抗体を指す。すなわち、少量存在し得る可能な自然発生する突然変異体を除いて、母集団を備える個別の抗体は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して向けられる高度に特異的なものである。さらに、異なる決定因子エピトープに対して向けられる異なる抗体を典型的には含む従来のポリクローナル抗体調製物に対して、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に向けられる。モノクローナルという修飾語は、抗体の特質が抗体の実質的に均質な母集団から得られるものようなものであることを示し、任意の特定的な方法による抗体の産生を要件とするものとして解釈されるべきではない。たとえば、本発明に従って用いるべきモノクローナル抗体は、Kohleretal1975Nature256495が最初に記載したようなハイブリドーマ法で作られてもよく、または組換DNA法で作られてもよいたとえば米国特許第4,816,567号を参照。モノクローナル抗体は、たとえばClacksonetal1991Nature352624628およびMarksetal1991JMolBiol222581597に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。本明細書中のモノクローナル抗体は、具体的にはキメラ抗体を含む。本明細書中で用いるような免疫細胞という用語は、造血由来であり、かつ免疫応答の役割を果たす細胞を含む。免疫細胞は、B細胞およびT細胞などのリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球などの骨髄性細胞を含む。本明細書中で用いられるように、免疫抱合体は、細菌毒素、細胞毒性薬、または放射性毒素などの療法部分にコンジュゲートする抗CD27抗体またはそのフラグメントを指す。毒性部分は、当該技術分野で利用可能な方法を用いて発明の抗体にコンジュゲート可能である。本明細書中で用いられるように、配列変異体は、1つ以上のアミノ酸残基で開示される配列とは異なるが、結果的に生じる分子の生物学的活性を保持する配列を指す。発明は、hCD27.15ベースの結合化合物の変異体およびhCD27.15の変異体に関する。保存的に修飾された変異体または保存的アミノ酸置換は、この技術分野の当業者には公知のアミノ酸の置換を指し、一般的には結果的に生じる分子の生物学的活性を変更することなく作られ得る。この技術分野の当業者は、一般的にポリペプチドの非必須領域中の単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変更しないことを認識しているたとえば、WatsonetalMolecularBiologyoftheGeneTheBenjaminCummingsPubCop224を参照。そのような例示的な置換は、好ましくは、次のように、以下に述べるものに従ってなされる。本明細書中で用いられるように、約という用語は、値がどのように測定されるかまたは定められるかに部分的に依存する、当業者が定めるような特定の値についての許容可能な誤差範囲内にある値、すなわち測定システムの限界を指す。たとえば、約は、当該技術分野での実践につき1のまたは1を超える標準偏差内を意味する可能性がある。これに代えて、約または本質的に備えるは、20までの範囲を意味する可能性がある。さらに、特に生物系または生物学的プロセスについては、該用語は、値の1桁までまたは値の5倍までを意味する可能性がある。特定の値が出願および請求項で与えられ、特に他に述べられなければ、約または本質的に備えるの意味は、その特定の値についての許容可能な誤差範囲内にあると想定されるべきである。リガンド/受容体、抗体/抗原、または他の結合対を指す際の特異的に結合するは、たとえばタンパク質の異種母集団中のCD27および/または他の生物製剤などのタンパク質の存在を定める結合反応を示す。このように、指定された条件下では、特定されたリガンド/抗原は特定の受容体/抗体に結合し、試料中に存在する他のタンパク質とは有意な量で結合しない。動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、または体液に適用されるような投与、療法、および治療は、動物、ヒト、被験体、細胞、組織、器官、または体液に対する外因性の医薬品、療法薬、診断薬、または組成物の接触を指す。投与、療法、および治療は、たとえば、療法的、薬物動態学的、診断的、研究、および実験的方法を指すことができる。細胞の治療は、流体が細胞と接する場合は、細胞に対する試薬の接触と、流体に対する試薬の接触とを包含する。投与、療法、および治療は、試薬、診断、結合組成物による、または別の細胞による、たとえば細胞のインビトロおよびエクスビボ治療も意味する。モノクローナル抗体モノクローナル抗体は、ヒトCD27抗原を被験体に注射し、次に所望の配列または機能的特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを生成する当該技術分野の知識および技能に従って作ることができる。モノクローナル抗体をエンコードするDNAは、たとえば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をエンコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって容易に単離され、従来の手順で配列される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい源となる。一旦単離されると、DNAを発現ベクターの中に置いてもよく、それらを次に、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得る。抗体の組換産生を以下により詳細に説明する。抗体または抗体フラグメントは、McCaffertyetal1990Nature348552554に記載の技術を用いて生成された抗体ファージライブラリから単離することができる。Clacksonetal1991Nature352624628およびMarksetal1991JMolBiol222581597は、ファージライブラリを用いた、ネズミおよびヒト抗体それぞれの単離を記載する。後続の刊行物は、チェーンシャフリングによる高親和性nM範囲ヒト抗体の産生Marksetal1992BioTechnology10779783、ならびに非常に大きなファージライブラリを構築するための策としての無作為配列感染およびインビボ組換Waterhouseetal1993NucAcidsRes2122652266を記載する。このように、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する有望な代替策である。キメラ抗体抗体DNAも、たとえば、同種ネズミ配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインの代わりにコード配列を用いることによって米国特許第4,816,567号;Morrisonetal1984ProcNatlAcadSciUSA816851、または非免疫グロブリン材料たとえばタンパク質ドメインのためのコード配列のすべてもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、修飾されてもよい。典型的には、そのような非免疫グロブリン材料は、抗体の定常ドメインの代わりに用いられるか、または抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いられて、抗原に対する特異性を有する1つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を備えるキメラ二価抗体を作り出す。ヒト化およびヒト抗体ヒト化抗体は、非ヒトである源からの1つ以上のアミノ酸残基を有する。非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と称され、典型的にはインポート可変ドメインから取られる。ヒト化は、Winterおよび共同研究者の方法に一般的に従って、ヒト抗体の対応の配列に代わりにげっ歯類CDRまたはCDR配列を用いることによって行なうことができるJonesetal1986Nature321522525Riechmannetal1988Nature332323327Verhoeyenetal1988Science23915341536。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に決して無傷ではないヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応の配列によって置換されている抗体である。実際、ヒト化抗体は、いくつかのCDR残基および恐らくはいくつかのFR残基が、非ヒト、たとえばげっ歯類抗体中の類似部位からの残基で置換される典型的にはヒト抗体である。ヒト化抗体を作るのに用いるべき軽および重の両者のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるのに非常に重要である。いわゆる最良適合法に従うと、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、分かっているヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次に、げっ歯類の配列にもっとも近いヒトの配列をヒト化抗体のためのヒトフレームワークFRとして受入れるSimsetal1987JImmunol1512296Chothiaetal1987JMolBiol196901。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の小群のすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に用いてもよいCarteretal1992ProcNatlAcadSciUSA894285Prestaetal1993JImmnol1512623。抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的性質の保持により抗体がヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するため、好ましい方法に従うと、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた、親配列およびさまざまな概念上のヒト化産生物の分析のプロセスによって調製される。一般的に三次元免疫グロブリンモデルを利用可能であり、これは当業者に馴染みがある。選択された候補免疫グロブリン配列の考えられる三次元立体配座構造を図示し、表示するコンピュータプログラムを利用可能である。これらの表示を調べると、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、その抗原を結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このように、FR残基をレシピエントおよびインポート配列から選択して組合せ、これにより標的抗原に対する増大した親和性などの所望の抗体特性が達成される。一般的に、CDR残基は、抗原結合に影響を及ぼすのに直接にかつもっとも実質的に係る。抗体のヒト化は、単純明快なタンパク質工学の課題である。ほぼすべてのネズミ抗体をCDRグラフティングによってヒト化することができ、その結果、抗原結合が保持される。LoBennyKCeditorinAntibodyEngineeringMethodsandProtocolsvolume248HumanaPressNewJersey2004を参照。これに代えて、免疫処置されると、内因性免疫グロブリン産生がなくてもヒト抗体の全レパートリを産生することができる遺伝形質転換動物たとえばマウスを産生することが今や可能である。たとえば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウス中の抗体重鎖結合領域JH遺伝子の同型接合のホモである欠失の結果、内因性抗体産生が完全に阻害されると記載されている。そのような生殖細胞系突然変異マウス中へのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入の結果、抗原チャレンジの際にヒト抗体が産生される。たとえば、Jakobovitsetal1993ProcNatlAcadSciUSA902551Jakobovitsetal1993Nature362255258Bruggermannetal1993YearinImmunology733およびDuchosaletal1992Nature355258を参照。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリに由来する可能性もあるHoogenboometal1991JMolBiol227381MarksetalJMolBiol1991222581597Vaughanetal1996NatureBiotech14309。ヒト化抗CD27抗体のアミノ酸配列変異体は、ヒト化抗CD27抗体のDNAに適切なヌクレオチド変更を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。そのような変異体は、たとえば、ヒト化抗CD27抗体について示されるアミノ酸配列内の残基からの欠失、および/またはその中への挿入、および/またはその置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組合せは、最終構築物が所望の特性を有するならば、最終構築物に到達するようになされる。アミノ酸の変化は、糖化部位の数または位置を変更するなど、ヒト化抗CD27抗体の翻訳後プロセスも変更することがある。突然変異誘発に好ましい場所であるヒト化抗CD27抗体ポリペプチドのある残基または領域の同定のための有用な方法は、CunninghamandWells1989Science24410811085に記載のように、アラニン系統的変異導入法と呼ばれる。ここで、残基または標的残基の群が同定されたとえば、Arg、Asp、His、Lys、およびGluなどの荷電残基、中性のまたは負に荷電したアミノ酸もっとも好ましくはアラニンまたはポリアラニンによって置換えられてCD27抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼす。置換に対する機能感受性を実証するアミノ酸残基は次に、置換部位に、またはその代わりに、さらなるまたは他の変異体を導入することによって洗練される。このように、アミノ酸配列の変形を導入する部位が予め定められる一方で、突然変異体それ自体の性質を予め定める必要はない。たとえば、所与の部位での突然変異体のはたらきを分析するため、Ala置換またはランダム突然変異誘発が標的コドンまたは領域で行なわれ、発現したヒト化抗CD27抗体の変異体が所望の活性についてスクリーニングされる。普通、ヒト化抗CD27抗体のアミノ酸配列変異体は、重鎖または軽鎖のいずれかの元のマウス抗体アミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性を少なくとも75、より好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、およびもっとも好ましくは少なくとも95、98、または99有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性または相同性は、本明細書中では、必要に応じて配列を整列し空隙を導入して最大百分率配列同一性を達成した後に、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、ヒト化残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。N末端、C末端、または内部延長、欠失、または抗体配列への挿入のいずれも、配列同一性または相同性に影響すると解釈されてはならない。2つの配列の間の同一性の百分率は、SeqManIIDNAstarIncversion505などのコンピュータアプリケーションを用いて定めることができる。このプログラムを用いて、2つの配列を、SmithandWatermanの最適整列アルゴリズムを用いて整列させることができる。2つの配列の整列後、2つの配列の間の同一のヌクレオチドの数を、整列された配列の長さからすべての空隙の長さを引いたもので除算することによって、百分率同一性を算出することができる。ヒト化抗CD27抗体中で望ましいとして本明細書中で同定される特性を有する抗体を、増大したインビトロ生物活性または好適な結合親和性についてスクリーニングすることができる。ヒトCD27上のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするため、AntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryEdHarlowandDavidLaneに記載のものなどの慣用クロスブロッキングアッセイを行なうことができる。同じエピトープに結合する抗体は、そのようなアッセイにおいてクロスブロックする可能性があるが、すべてのクロスブロッキング抗体が必ずしも正確に同じエピトープで結合するわけではない。というのも、クロスブロッキングは、重なり合うエピトープでの抗体結合、または近隣の重なり合わないエピトープすらによる抗体結合の立体障害の結果として生じることがあるためである。これに代えて、抗体が対象のエピトープに結合するか否かを判断するために、たとえばChampeetal1995JBiolChem27013881394に記載のようなエピトープマッピングを行なうことができる。CunninghamandWells1989Science24410811085に記載のようなアラニン系統的変異導入法またはヒトCD27中のアミノ酸残基の点突然変異誘発の何らかの他の形態も用いて、本発明の抗CD27抗体の機能的エピトープを判断してもよい。本発明の抗体と同じエピトープに結合する付加的な抗体は、たとえば、エピトープへの結合のためのCD27に対して挙げられた抗体のスクリーニングによって、またはエピトープ配列を備えるヒトCD27のフラグメントを備えるペプチドによる動物の免疫処置によって、得られることがある。同じ機能的エピトープに結合する抗体は、ブロッキング受容体結合などの同様の生物学的活性を呈すると予測され得、抗体の機能分析によってそのような活性を確認することができる。標準的な分析を用いて抗体親和性を定めてもよい。たとえばヒト化抗体などの好ましい結合化合物は、約1×107以下;好ましくは約1×108以下;より好ましくは約1×109以下;およびもっとも好ましくは約1×1010以下、または1×1011MすらのKd値を有するヒトCD27を結合するものである。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEを含む免疫グロブリンの任意のクラスから選択可能である。好ましくは、抗体はIgG抗体である。IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含むIgGの任意のアイソタイプを用いることができる。IgGアイソタイプの変異体も企図される。ヒト化抗体は、1つより多くのクラスまたはアイソタイプからの配列を備えてもよい。所望の生物活性を生成する必要な定常ドメイン配列の最適化は、実施例に記載の生物学的アッセイで抗体をスクリーニングすることによって容易に達成される。同様に、いずれかのクラスの軽鎖を本明細書中の組成物および方法で用いることができる。具体的には、カッパ、ラムダ、またはその変異体が本組成物および方法において有用である。発明の抗体および抗体フラグメントは、細胞毒性薬などの細胞毒性ペイロード、または99Tc、90Y、llIn、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th、ならびに40K、157Gd、55Mn、52Tr、および56Feなどのラジオヌクレオチドとコンジュゲートされてもよい。そのような抗体コンジュゲートは、その表面上に標的その抗体の抗原を発現する細胞を選択的に標的にして殺す免疫療法で用いられてもよい。例示的な細胞毒性薬は、リシン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、シュードモナス、外毒素、サポリン、ジフテリア毒素、シスプラチン、ドキソルビシン、アブリン毒素、ゲロニン、およびヨウシュヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質を含む。発明の抗体および抗体フラグメントは、希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアナート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレスカミン、152Eu、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩acridimiumsalt標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン/アビジン、スピン標識、および安定遊離基などの蛍光体を含む蛍光または化学ルミネセンス標識とコンジュゲートされてもよい。Hunteretal1962Nature144945Davidetal1974Biochemistry131014Painetal1981JImmunolMeth40219;およびNygrenJ1982HistochemandCytochem30407に記載の方法を含む、さまざまな部分に発明の抗体分子またはタンパク質分子をコンジュゲートするための当該技術分野で公知の任意の方法を用いてもよい。抗体およびタンパク質をコンジュゲートするための方法は、従来のものであり、かつ当該技術分野で周知である。抗体精製組換技術を用いる際、抗体は、細胞間でペリプラズム間隙で産生可能であるか、または直接に媒質内に分泌可能である。抗体を細胞間で産生する場合、第1の工程として、たとえば遠心分離または限外濾過によって、宿主細胞または溶解されたフラグメントのいずれかである粒子状の残屑を除去する。Carteretal1992BioTechnology10163167は、大腸菌のペリプラズム間隙に分泌される抗体を単離するための手順を記載する。概略的には、細胞ペーストを、酢酸ナトリウムpH3.5、EDTA、およびフッ化フェニルメチルスルホニルPMSFの存在下で約30分に亘って溶かす。遠心分離によって細胞残屑を除去できる。抗体を媒質の中に分泌する場合、一般的に、そのような発現系からの上澄みを、市販のタンパク質濃度フィルタ、たとえば、AmiconまたはMilliporePellicon限外濾過ユニットを用いてまず濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を以上の工程のいずれに含んでタンパク質加水分解を阻害してもよく、偶発的な汚染物の成長を防止するために抗生物質を含んでもよい。細胞から調製される抗体組成物は、たとえば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィを用いて精製可能である。なお、親和性クロマトグラフィが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインAの好適性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンFc領域の種およびアイソタイプに依存する。プロテインAは、ヒトIg.ガンマ1、Ig.ガンマ2、またはIg.ガンマ4重鎖Lindmarketal1983JImmunolMeth62113ベースの抗体を精製するのに用いることができる。プロテインGはすべてのマウスアイソタイプおよびヒト.ガンマ.3Gussetal1986EMBOJ515671575に推奨される。親和性リガンドが付くマトリックスはアガロースであることがもっとも多いが、他のマトリックスを利用可能である。コントロールドポアガラスまたはポリスチレンジビニルベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成できるよりも高い流量および短い処理時間を可能にする。抗体がCH3ドメインを備える場合、BakerbondABX登録商標樹脂JTBakerPhillipsburgNJが精製に有用である。回収すべき抗体に依存して、イオン交換カラム上の分別、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカ上クロマトグラフィ、ヘパリン上クロマトグラフィ、ポリアスパラギン酸カラムなどのアニオンまたはカチオン交換樹脂上HAROSE登録商標クロマトグラフィ、クロマト分画、SDS-PAGE、および硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術も利用可能である。1つの実施形態では、レクチン基質たとえばレクチン親和性カラムへの吸着を用いて糖タンパク質を精製して、フコース含有糖タンパク質を調製物から除去して、これによりフコースを含まない糖タンパク質を富化してもよい。製剤処方発明は、CD27結合化合物の製剤処方を備える。医薬または無菌組成物を調製するため、結合化合物、特に抗体またはそのフラグメントは、医薬的に許容される担体または賦形剤と混ぜられる。たとえば、RemingtonsPharmaceuticalSciencesandUSPharmacopeiaNationalFormularyMackPublishingCompanyEastonPAを参照。療法薬および診断薬の処方は、たとえば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、または懸濁液の形態の生理学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製されてもよいたとえば、Hardmanetal2001GoodmanandGilmansThePharmacologicalBasisofTherapeuticsMcGrawHillNewYorkNYGennaro2000RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacyLippincottWilliamsandWilkinsNewYorkNYAvisetal1993PharmaceuticalDosageFormsParenteralMedicationsMarcelDekkerNYLiebermanetal1990PharmaceuticalDosageFormsTabletsMarcelDekkerNYLiebermanetal1990PharmaceuticalDosageFormsDisperseSystemsMarcelDekkerNYWeinerandKotkoskie2000ExcipientToxicityandSafetyMarcelDekkerIncNewYorkNYを参照。単独でまたは通常の制がん剤などの別の薬と組合せて投与される結合化合物、特に抗体、組成物の毒性および療法的効能は、たとえばLD50母集団の50にとって致死の用量およびED50母集団の50において療法的に有効な用量を判断するための、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順で判断することができる。毒性効果と療法的効果との間の用量比は療法的指標であり、これは、LD50とED50との間の比率として表現することができる。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトでの使用のための調剤範囲の処方に用いることができる。そのような化合物の調剤は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくない、ED50を含む血中濃度の範囲内にある。調剤は、用いられる調剤形態および利用される投与経路に依存してこの範囲内で異なってもよい。好適な投与経路は、筋肉内、静脈内、または皮下投与などの非経口的投与と、経口投与とを含む。医薬組成物で用いられる、または本発明の方法を実践するための、抗体などの結合化合物の投与は、経口摂食、吸入、局所塗布、または皮膚、皮下、腹腔内、非経口的、動脈内もしくは静脈内注射などのさまざまな従来のやり方で行なうことができる。1つの実施形態では、発明の結合化合物は静脈内投与される。別の実施形態では、発明の結合化合物は皮下投与される。これに代えて、たとえば、作用部位への直接の結合化合物の注射を介してなど、しばしばデポーまたは徐放性製剤で、全身というよりもむしろ局所的な態様で結合化合物を投与してもよい。さらに、標的にされた薬剤送達系に抗体を投与してもよい。抗体、サイトカイン、および小分子の適切な用量を選択する際の手引を利用可能であるたとえば、Wawrzynczak1996AntibodyTherapyBiosScientificPubLtdOxfordshireUKKresina1991MonoclonalAntibodiesCytokinesandArthritisMarcelDekkerNewYorkNYBach1993MonoclonalAntibodiesandPeptideTherapyinAutoimmuneDiseasesMarcelDekkerNewYorkNYBaertetal2003NewEnglJMed348601608Milgrometal1999NewEnglJMed34119661973Slamonetal2001NewEnglJMed344783792Beniaminovitzetal2000NewEnglJMed342613619Ghoshetal2003NewEnglJMed3482432Lipskyetal2000NewEnglJMed34315941602を参照。適切な用量の判断は、たとえば、治療に影響すると当該技術分野で公知であるもしくは疑われている、または治療に影響すると予測される、パラメータまたは因子を用いて臨床医によってなされる。一般的に、用量は、最適用量よりいくぶん少ない量で始まり、その後、任意の好ましくない副作用に対して所望のまたは最適の効果が達成されるまで小さな増分ずつ増やされる。重要な診断尺度は、たとえば、炎症または産生される炎症性サイトカインのレベルの症状の尺度を含む。好ましい用量計画案は、顕著な不所望の副作用を回避する最大用量または用量頻度に係るものである。週単位の用量合計は、一般的に、少なくとも0.05μg/体重kg、より一般的には少なくとも0.2μg/kg、もっとも一般的には少なくとも0.5μg/kg、典型的には少なくとも1μg/kg、より典型的には少なくとも10μg/kg、もっとも典型的には少なくとも100μg/kg、好ましくは少なくとも0.2mg/kg、より好ましくは少なくとも1.0mg/kg、もっとも好ましくは少なくとも2.0mg/kg、最適には少なくとも10mg/kg、より最適には少なくとも25mg/kg、およびもっとも最適には少なくとも50mg/kgであるたとえば、Yangetal2003NewEnglJMed349427434Heroldetal2002NewEnglJMed34616921698Liuetal1999JNeurolNeurosurgPsych67451456Portieljietal2003CancerImmunolImmunother52133144を参照。たとえば、ペプチドミメティック、天然産物、または有機化学物質などの小分子療法の所望の用量は、モル/kgベースの抗体またはポリペプチドについてとほぼ同じである。本明細書中で用いられるように、阻害するまたは治療するまたは治療は、疾患と関連付けられる症状の進行の遅延および/または当該疾患とともに進行するであろうもしくは進行すると予期されるそのような症状の重さの軽減を含む。該用語はさらに、既存の症状を軽減すること、付加的な症状を予防すること、およびそのような症状の元となる原因を軽減するまたは予防することを含む。このように、該用語は、疾患を有する脊椎被験体に有益な結果が与えられることを示す。本明細書中で用いられるように、療法上有効な量または有効な量という用語は、単独でまたは付加的な療法薬と組合せて細胞、組織、または被験体に投与されると、治療すべき疾患または症状を予防するまたは軽減するのに有効な抗CD27抗体またはそのフラグメントの量を指す。療法上有効な用量はさらに、たとえば、関連の病状の治療、治癒、予防、もしくは軽減、またはそのような状態の治療、治癒、予防、もしくは軽減率の上昇などの症状の軽減という結果をもたらすのに十分な化合物のその量を指す。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、療法上有効な用量とはその成分のみを指す。組合せに適用される場合、療法上有効な用量とは、組合せで、連続的に、または同時に投与されても、療法的効果という結果をもたらす活性成分の組合せ量を指す。療法の有効な量は、典型的には少なくとも10だけ;通常は少なくとも20だけ;好ましくは少なくとも約30;より好ましくは少なくとも40、およびもっとも好ましくは少なくとも50だけ、症状を小さくする。第2の療法薬を用いる同時投与または治療のための方法は当該技術分野で周知である。たとえば、Hardmanetal2001GoodmanandGilmansThePharmacologicalBasisofTherapeutics10thedMcGrawHillNewYorkNYPooleandPeterson2001PharmacotherapeuticsforAdvancedPracticeAPracticalApproachLippincottWilliamsWilkinsPhilaPAChabnerandLongo2001CancerChemotherapyandBiotherapyLippincottWilliamsWilkinsPhilaPAを参照。発明の医薬組成物は、細胞毒性剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、抗脈管形成剤、もしくは代謝拮抗剤、腫瘍標的剤、免疫刺激もしくは免疫修飾剤、または細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、もしくはさもなければ毒性剤にコンジュゲートする抗体を含むが、それらに限定されない他の剤も含有してもよい。医薬組成物は、外科手術、化学療法、および放射線療法などの他の療法とともに用いることもできる。[図および表の説明][図1]抗hCD27抗体の特徴付け;A.pCI-neo-hCD27CHO-K1CD27を用いて安定的にトランスフェクトされたCHO-K1へのhCD27.15の結合;抗hCD2757703RDsystemsおよび抗hCD271A4BeckmanCoulterは陽性対照である;抗体はCHO-K1対照細胞データ示さずとは反応しなかった;B.pCI-neo-hCD70CHO-K1.CD70を用いて安定的にトランスフェクトされたCHO-K1細胞への可溶組換hCD27-Fc融合タンパク質の結合に対するhCD27.15の効果;C.CHO-K1CD27への組換hCD70-mCD8融合タンパク質の結合に対するhCD27.15の効果。[図2]hCD27.15は、NF-κB活性化につながるCD27シグナリングを誘導する;ヒト胎児腎臓細胞HEK293Tは、hCD27エンコードベクターまたは対照ベクターでNF-κB-ルシフェラーゼレポータ構築物を発現するように過渡的にトランスフェクトされた;細胞は、hCD27.15mAb10μg/mlの存在または不在下で20時間刺激された;hCD27.15mAbを用いた刺激は、ルシフェラーゼ活性によって読出されるような特異的CD27誘導NF-κB活性化を顕した;AmAbhCD27.15またはアイソタイプ対照mAbを用いたhCD27発現HEK293T細胞の刺激後のルシフェリン生物発光によって読出されるようなルシフェラーゼ活性の絶対値;データは1回の実験SDからの3倍の測定値を表わす;有意性は両側スチューデントt-検定を用いて測定された;BhCD27.15mAbを用いてhCD27または対照ベクターを発現するようにトランスフェクトされたHEK293T細胞の刺激後のルシフェラーゼ活性の倍誘導;データは3回の独立した実験から得られたN=3SD;ChCD27.15は他のhCD27アゴニストよりも優れている;CD27およびNF-κB-ルシフェラーゼレポータを発現するHEK293T細胞は、可溶アゴニスト組換CD70タンパク質Fc-mCD70、2μg/ml、mAbhCD27.1510μg/ml、またはhCD27に向けられた他のmAbの等しい濃度で刺激された;ルシフェラーゼ活性は示された時点で読出された;データは1回の実験SDからの3倍の測定値を表わす;有意性は両側スチューデントt-検定を用いて測定された。[図3]hCD27.15は増殖を誘導し、および/またはCD4CD25T細胞の生存を促進する;CD4CD25T細胞は、ヒトPBMCからMACS陰性選択によって単離され、1×105細胞/ウェルの濃度で96ウェルプレート中で培養された;刺激は図に示すように加えられ、増殖は[3H]チミジン組入れによって判断された。[図4]hCD27.15は増殖を誘導し、および/または未感作CD8T細胞の生存を促進する;未感作CD8T細胞はヒトPBMCから精製され、CFSEで標識付けられ、hCD27.15mAb10μg/mlの存在または不在下で抗CD3および抗CD28mAbで6日間刺激された;hCD27.15mAbは、各分裂周期の細胞の百分率によって特徴づけられるような細胞分裂A、および各分裂周期の細胞の絶対数によって特徴づけられるような合計生細胞収率Bを刺激し;データは4つの健常な個体の細胞を用いた4回の独立した実験から得られたN=4/-SEM。[図5]hCD27.15は、CD8T細胞を刺激して特異的なサイトカインを産生する;未感作CD8T細胞は図3に示すように単離され、hCD27.15mAb10μg/mlの存在または不在下で抗CD3および抗CD28mAbで刺激された;A72時間の培養後、細胞の上澄みを採取し、Luminexassayを用いてサイトカインを測定した;B細胞数は、72時間の培養後に著しく異なることはなく、このことは、あるサイトカインの分泌の定性的な差を示す;A,Bデータは3つの健常な個体の細胞を用いた3回の独立した実験から得られたN=3/-SEM。[図6]hCD27.15の可変領域配列を示す;パネルAおよびBは、hCD27.15の重鎖および軽鎖可変配列のアミノ酸配列をそれぞれ示す。表1hCD27.15および1A4CD27対照のKD、EC50、およびIC50値の概略。表2市販のアゴニスト抗CD27抗体。表3Biacoreを用いてアゴニスト抗体1A4および9F4を含む異なる抗hCD27抗体およびFc-mCD70の結合部位を判断する交差競合アッセイ。まず、異なる抗hCD27抗体をCM5チップ上に固定し固定と称する、rhCD27-Fcキメラ結合RDsystemscatno382CDの結合の後、第2の抗体を注射した遊離と称する。このチェッカーボード分析に基づき、抗体を7つのA-Gエピトープ群に分割した。は同時結合を示す一方で、-は第2の抗体の結合が第1の抗体による捕捉後は不可能であることを示した。ndは判定されずを示す。表4この発明のネズミ抗ヒトhCD27.15抗体の配列ID番号。実施例1免疫処置および抗CD27抗体の選択CD27cDNAを用いたマウスの免疫処置アゴニスト活性を隠し持っているヒトCD27タンパク質に対する抗体を単離するため、リガンド結合部位に結合する抗CD27抗体の組のうちのそのような抗体を見出すと仮説を立てた。抗hCD27抗体を生成するため、hCD27の完全長の開いた読み枠をエンコードするcDNAをpCI-neoベクターPromegaMadisonWIにサブクローン化した。得られたベクターの発現は、CHO-K1細胞AmericanTypeCultureCollectionManassasVA中へのpCI-neo-hCD27の過渡的なトランスフェクションと、10μg/mlのマウス抗hCD27IgG1BDPharmingen555439およびその後のヤギ抗マウスIgG1-FITC1:100SouthernBiotechnologyBirminghamALを用いたフローサイトメトリとによって確認された。製造者の指示に従ってHelios遺伝子銃BioRadHerculesCAおよびDNAcoatedgoldbulletsBioRadを用いた遺伝子銃免疫処置によってマウスを免疫した。概略的には、1μmの金粒子を、2:1:1の比率で、pCI-neo-hCD27cDNA、ならびにマウスFlt3LおよびマウスGM-CSFのための市販の発現ベクター両者ともAldevronFargoNDからで被覆した。合計1μgのプラスミドDNAを用いて500μgの金粒子を被覆した。具体的に、7-8週齢のメスのBALB/Cマウスを遺伝子銃で耳に免疫し、両耳に1発を3周期受けた。2つのDNA免疫処置後のマウス血清中の細胞-ELISAによって約1:4,000の抗hCD27タイターを検出した。細胞-ELISAでは、すべてのインキュベーション工程の後にPBST0.01のTween20を含むPBSでの洗浄工程を行なった。組織培養プレートに親CHO-K1またはCHO-K1hCD27細胞を接種し40,000細胞/ウェル、37°Cで一晩インキュベートした。翌日、培地を除去し、細胞をマウス血清の希釈液で37°Cで1時間インキュベートした。次に、PBSTで細胞を洗浄し、1:1,000のヤギ抗マウスIgG-HRPSouthernBiotechnology103005で37°Cで1時間インキュベートした。その後、PBSTで細胞を6回洗浄し、100μlのOptiEIATMB基質BDBiosciencesFranklinLakeNJで抗hCD27免疫活性を視覚化した。100μlの0.5MのH2SO4で反応を止め、460および620nmで吸光度を読取った。hCD27に対する反応性を実証したマウスに、最終の4回目の免疫をし、4日後に殺処分した。赤血球欠損脾臓細胞母集団を前述のように調製しSteenbakkersetal1992JImmunolMeth1526977Steenbakkersetal1994MolBiolRep19125134、-140°Cで凍結した。B細胞を産生する抗hCD27抗体の選択抗hCD27抗体を産生するB細胞クローンを選択するため、1.5×107個の赤血球欠損脾細胞をモノサイトの代わりに欠損させた。T25-フラスコ中の密集度まで成長した、照射された3,000RADCHO-K1hCD27遺伝形質転換体への結合によってhCD27特異性B細胞を選択した。非特異的B細胞を欠損させるための広範な洗浄の後、製造者の指示に従うトリプシン処理によって、結合したB細胞を集めたInvitrogencatno25200056。次に、Steenbakkersetal1994MolBiolRep19125134に記載のようにB細胞を培養した。概略的に、選択されたB細胞を、7.5v/vT細胞上澄み、および96ウェル平底組織培養プレート中200μlのDMEMF12/P/S/10BCSの最終容積中で、50,000個の照射された2,500RADEL-4B5栄養細胞と混合した。8日目に、上述のような細胞-ELISAによってhCD27反応性について上澄みをスクリーニングした。13のhCD27-反応性上澄みを同定し、hCD27とhCD70との間の相互作用を抑制するそれらの能力について試験した。細胞-ELISAでは、すべてのインキュベーション工程の後にPBST0.01のTween20を含むPBSを用いた洗浄工程を行なった。親CHO-K1またはCHO-K1hCD27細胞を組織培養プレートに接種し40,000細胞/ウェル、37°Cで一晩インキュベートした。翌日、培地を除去し、細胞をマウス血清の希釈液で37°Cで1時間インキュベートした。次に、PBSTで細胞を洗浄し、1:1,000のヤギ抗マウスIgG-HRPSouthernBiotechnology103005で37°Cで1時間インキュベートした。その後、PBSTで6回細胞を洗浄し、100μlのTMBStabilizedChromagenInvitrogencatnoSB02で抗hCD27免疫反応性を視覚化した。100μlの0.5MのH2SO4で反応を止め、460および620nmで吸光度を読取った。さらに、2つの競合アッセイを用いて上澄みのブロッキング性を研究した。CHO-K1CD27アッセイは以下の原則に従って働く:CHO-K1CD27細胞を96ウェルプレートに接種し40,000細胞/ウェル、37°Cで一晩インキュベートした。媒質除去の後、50μlの組換hCD70CD70h-muCD8融合タンパク質AncellcatnoANC5370.5μg/mlおよび50μlの抗hCD27抗体含有上澄みを加えた。室温での1時間のインキュベーションの後、PBSTでウェルを3回洗浄した。次に、100μl/ウェルのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートBDPharmingencatno5540661:5,000を加え、37°Cで1時間細胞をインキュベートした。6回のPBSTでの最終洗浄の後、以上で概要を述べたようにELISAを展開した。陽性対照:抗hCD27、クローン57703RDsystemscatnoMAB382、および抗hCD27、クローン1A4BeckmanCoultercatnoIM2034。CHO-K1.CD70アッセイは以下の原則に従って働く:CHO-K1.CD70細胞を40,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。300μlの媒質/ウェルを加えることによって同じ量のプレートをブロックし、すべてのプレートを37°Cで一晩インキュベートした。翌日、プレートをさっとはたくことによって、媒質のみを含有するプレートを空にし、50μl/ウェルの組換可溶hCD27-Fc融合タンパク質rhCD27/Fcキメラ0.5μg/mlRDsystemscatno382CDを加えた。これらのプレートに50μlの抗体含有媒質/血清または媒質を加えた。1時間の室温でのインキュベーションの後、100μlのrhCD27-Fc/抗体混合物を、媒質除去済みのCHO-K1/CD70プレートに移した。これらのプレートを室温で1時間インキュベートし、次にPBSTで3回洗浄した。100μlの抗ヒトIgHL-HRPコンジュゲート1:2,500をすべてのウェルに加えPromegacatnoW4031、細胞を37ICで1時間インキュベートした。6回のPBSTでの最終洗浄の後、以上で概要を述べたようにELISAを展開した。陽性対照:抗hCD27、クローン57703RDsystemscatnoMAB382、および抗hCD27、クローン1A4BeckmanCoultercatnoIM2034。すべての上澄みは、hCD27とhCD70との間の相互作用をブロックした抗体を含有することを実証した。その後、公開された手順に従って、hCD27反応性上澄みからのB細胞クローンを小規模電気融合によって固定したSteenbakkersetal1992JImmunolMeth1526977Steenbakkersetal1994MolBiolRep1912534。具体的に、B細胞を106個のSp2/0-Ag14骨髄腫細胞と混合し、DMEMF12媒質で洗浄することによって血清を除去した。プロナーゼ溶液Calbiochemcatno4308070536で3分間細胞を処理し、ElectrofusionIsomolarバッファEppendorfcatno53702で洗浄した。30s、2MHz、400V/cmの交番電界によって50μlの融合チャンバ中で電気融合を行ない、その後に10μs、3kV/cmの方形高電界パルスと、再び30s、2MHz、400V/cmの交番電界とを与えた。チャンバの中身をハイブリドーマ選択的媒質に移し、限定的な希釈条件下で96ウェルプレートで培養基培養した。融合に続く12日目に、上述のようなhCD27反応性およびhCD70ブロッキング活性についてハイブリドーマ上澄みをスクリーニングした。hCD27を認識し、ブロッキング活性を実証した上澄み中の抗体を分泌する7つのハイブリドーマを単離し、それらの完全性を保護するために限定された希釈によってサブクローン化した。より一層の分析のために抗体hCD27.15を選択した。実施例2抗hCD27抗体の精製および特徴付けハイブリドーマを産生する抗hCD27の安定化および抗hCD27抗体の精製2周の限定的な希釈により、hCD27.15ハイブリドーマについてクローン細胞母集団を得た。安定したハイブリドーマを、血清を含まない媒質中で7-10日間培養した;上澄みを採取し、0.22μMのニトロセルロース膜を通して濾過した。製造者の指示に従ってProsepAスピンカラムMilliporecatnoLSK2ABA60を用いて抗体を精製した。PD-10ゲル濾過カラムGEHealthcareを用いてバッファをPBSと交換した。AmiconUltra15遠心分離フィルタユニットMilliporeBillericaMAを用いて抗体を濃縮し、分光測定法を用いて定量化した。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングテストキットRoche11493027001を用いて、すべてのhCD27抗体のサブ-アイソタイプがIgG1、カッパであると判定した。結合分析精製されたhCD27抗体を用いる細胞ベースのELISA実験を行なって、細胞的に発現されたhCD27へのhCD27の結合活性を判断した。この細胞-ELISAでは、すべてのインキュベーション工程の後にPBST0.01のTween20を含むPBSでの洗浄工程を行なった。組織培養プレートにCHO-K1hCD27細胞を接種し40,000細胞/ウェル、37°Cで一晩インキュベートした。次の日、培地を除去し、精製された抗体の希釈液で細胞を37°Cで1時間インキュベートした。次に、PBSTで細胞を洗浄し、1:1,000のヤギ抗マウスIgG-HRPSouthernBiotechnology103005で37°Cで1時間インキュベートした。その後、PBSTで細胞を6回洗浄し、100μlのTMBStabilizedChromagenInvitrogencatnoSB02で抗hCD27免疫反応性を視覚化した。100μlの0.5MのH2SO4で反応を止め、460および620nmで吸光度を読取った。図1Aに示するように、異なるhCD27抗体hCD27.15および対照は、異なる結合強さでhCD27に結合した。合計結合シグナルの50が観察される濃度を表わす、算出したEC50を表1に表す。精製された抗体のブロッキング性を、2つの競合アッセイを用いて研究した。CHO-K1CD70アッセイは以下の原則に従って働く:CHO-K1.CD70細胞を40,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。300μlの媒質/ウェルを加えることによって同じ量のプレートをブロックし、すべてのプレートを37°Cで一晩インキュベートした。翌日、プレートをさっとはたくことによって、媒質のみを含有するプレートを空にし、50μl/ウェルのrhCD27-Fcキメラ0.5μg/mlRDsystemscatno382CDを加えた。これらのプレートに、精製されたhCD27.15抗体の50μlの異なる希釈液を加えた。1時間の室温でのインキュベーションの後、100μlのrhCD27Fc/抗体混合物を媒質除去済みのCHO-K1/CD70プレートに移した。これらのプレートを室温で1時間インキュベートし、PBSTで3回洗浄した。100μlの抗ヒトIgHL-HRPコンジュゲート1:2,500をすべてのウェルに加えPromegacatnoW4031、プレートを37°Cで1時間インキュベートした。6回のPBSTでの最終洗浄の後、TMBStabilizedChromagenInvitrogencatnoSB02100μl/ウェルを加え、以上で概要を述べたようにELISAを読出した。陽性対照:抗hCD27、クローン57703RDsystemscatnoMAB382、および抗hCD27、クローン1A4BeckmanCoultercatnoIM2034。図1Bに示すように、精製されたhCD27.15抗体は、CHO-K1.CD70細胞へのrhCD27Fcキメラの結合をブロックした。抑制の半分が観察される濃度を表わす、hCD27.15および陽性対照1A4の算出したIC50値を表1に提示する。CHO-K1CD27アッセイは以下の原則に従って働く:CHO-K1CD27細胞を96ウェルプレートに接種し40,000細胞/ウェル、37°Cで一晩インキュベートした。媒質除去の後、50μlの組換マウスCD70融合タンパク質Fc-mCD700.5μg/mlおよび精製された抗hCD27抗体の50μlの異なる希釈液を加えた。Fc-mCD70は、ヒトIgG1の二量化ドメインのC末端で融合されるネズミCD70aa41195融合タンパク質である。この融合タンパク質をエンコードするcDNA構築物は、RowleyandAlShamkhani2004JImmunol15172603946が記載するように構築され、293Tヒト胎児腎臓細胞中でFc-mCD70タンパク質を産生するのにこれを用いた。タンパク質は、プロテインASepharoseGEHealthCareに対する親和性クロマトグラフィによって精製された。室温での1時間のインキュベーションの後、PBSTで3回ウェルを洗浄した。次に、100μl/ウェルのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートBDPharmingencatno5540661:5,000を加え、細胞を37°Cで1時間インキュベートした。6回のPBSTでの最終洗浄の後、TMBStabilizedChromagenInvitrogencatnoSB02100μl/ウェルを加えた。100μlの0.5MのH2SO4の添加で反応を止めた。460および620nmで吸光度を読取った。陽性対照:抗hCD27、クローン57703RDsystemscatnoMAB382、および抗hCD27、クローン1A4BeckmanCoultercatnoIM2034。図1Cに示すように、hCD27.15抗体は、組換ヒトCD70とCHO-K1CD27細胞との間の相互作用をブロックした。算出したIC50値を表1に提示する。標識なし表面プラズマ共鳴Biacoreによる速度論的分析hCD27.15抗体の結合性を、Biacore2000equipmentを用いる標識なし表面プラズマ共鳴を用いてより詳細に特徴付けた。pH=4.5でのアミン結合を用いてCM5センサチップに少量の抗体を結合し、ここでRmaxは100RUを超えない。これは、高いフローレベル30μl/分と組合せると、1:1ラングミュア結合モデルに対する良好な適合を生じるであろう。0.016nMから1nMの範囲に亘るrhCD27Fcキメラの濃度系列を30μl/分で1分間注射した。解離を5分間モニタした。ランニングバッファは、3mMのEDTAおよび0.005のP20HPB-EP、pH7.4を含むHEPESバッファサリンである。組合せプロットは、BIAeval32を用いて、ブランクフロー細胞で得られるシグナルの減算によってなされた。1:1ラングミュア結合モデルにセンサグラムをフィッティングした。抗体hCD27.15は速い会合および解離を示し、その結果、程よい親和性が得られた。算出したKD値を表1に提示する。種交差反応性ヒトCD27またはマウスCD27をエンコードする完全長cDNAを安定して発現するようにレトロウィルス的に形質導入されたMCF-7乳がん細胞を用いて、マウスCD27へのhCD27抗体の結合を判断した。空のベクター-形質導入細胞が対照となった。抗体の結合は、有効化されたアゴニスト抗hCD27抗体1A4およびCLBCD27/1ならびに陽性対照としての抗マウスCD27LG.3A10Gravesteinetal1995IntImmunol7:5517を用いたフローサイトメトリ分析によって試験した。アゴニスト活性を隠し持っていると報告されているこれらの市販の抗hCD27抗体を、表2に記載のように得た。hCD27.15抗体はヒトCD27に結合したが、MCF-7細胞上に発現されるマウスCD27には結合しなかった。hCD27.15抗体の結合部位を、交差競合Biacoreアッセイを用いて特徴付け、かつ市販のアゴニスト抗体9F4および1A4と比較した。pH4.5での一般的なアミン結合を用いて、フロー細胞を、25μg/mlの各々の抗体に高固定レベルに固定した。次に、5μl/分の速度での1nMのrhCD27FcキメラRDsystemscatno382CDの複数回のフロー細胞注射の後に、10nMの第2の抗体を注射した。発明の抗hCD27抗体hCD27.15および2つの公知のアゴニスト抗体1A4および9F4を一次固定または二次遊離抗体として用いた。バッファ中のBSAの存在のために、アゴニスト抗CD27抗体1A4を第2の抗体としてのみ用い、固定しなかった。Fc-mCD70は、ヒトIgG1の二量化ドメインのC末端で融合されるネズミCD70aa41195の融合タンパク質である。この融合タンパク質をエンコードするcDNA構築物は、RowleyandAlShamkhani2004JImmunol15172603946が記載するように構築され、293Tヒト胎児腎臓細胞中でFc-mCD70タンパク質を産生するようにこれを用いた。タンパク質は、プロテインASepharoseGEHealthCareに対する親和性クロマトグラフィによって精製された。すべてのフロー細胞を、50μl/分で10mMのHClの6秒注射によって再生成した。第2の抗体の注射によるシグナルの増大は、第2の抗体が依然として結合可能であり、かつ一次および二次が異なる結合部位に結合することを意味する。そうでない場合は、そのことは、両方の抗体がhCD27の同じエピトープを認識し、重なり合うエピトープを有するか、または立体障害のために同時に結合できないことを示唆する。表3に示するように、hCD27.15および対照抗体を異なる結合群に分割可能である。実施例3マウス抗ヒトCD27抗体の機能プロファイリングhCD27.15はNF-κB活性化につながるCD27シグナリングを誘導する完全長ヒトCD27cDNAをpcDNA3発現ベクターにクローン化し、FuGENE6トランスフェクション試薬Rocheを用いて、HEK293Tヒト胎児腎臓細胞HEK293Tへのトランスフェクションによって過渡的に発現させた。この構築物からのCD27発現をフローサイトメトリによって有効化した。hCD27.15mAbの結合に応答するhCD27シグナリングを読出すため、HEK293細胞を、hCD27pcDNAベクターまたは空の対照ベクター、および最小限のNF-κB-応答プロモータBonehilletal2008MolTher16117080によって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子をエンコードするNF-κB-ルシフェラーゼレポータ構築物とともに、過渡的に同時トランスフェクションした。トランスフェクションの20時間後、hCD27.15mAb10μg/ml、表2に記載の10μg/mlの他のCD27抗体、またはFcCD702μg/mlの存在または不在下で、4、8、20、または24時間細胞を刺激した。刺激の後、氷のように冷たいPBSで細胞を洗浄し、CellCultureLysisバッファPromegaLuciferaseassaysystemcatalognumberE1500で溶解した。製造者の計画案に従って基質を細胞溶解物に加えた後にルシフェラーゼ活性を測定したLuminometerCentroXS3LB960BertholdTechnologies。Mikrowin2000ソフトウェアを用いてデータを分析した。図2は、hCD27.15が他のhCD27抗体およびFcCD70よりも強力にCD27を活性化することを図示する。hCD27.15は、ヒトCD4CD25T細胞を同時刺激する未感作ヒトCD4CD25T細胞に対する、hCD27.15抗体を用いたCD27活性化の効果を、以下のように判定した。製造者の指示に従ってFicoll勾配遠心分離FicollPaque登録商標PluscatNumber17144003を用いてBuffycoatからPBMCを単離した。製造者の指示に従ってCD4T細胞単離キットIIMiltenyicatNo130091155およびCD25マイクロビーズIIMiltenyicatNo130092983を用いたMACSベースの陰性選択により、手つかずのCD4CD25T細胞をこれらのPBMCから単離した。精製されたCD4CD25細胞を1×105細胞/ウェルの濃度で96ウェルプレートに接種した。培養の前に、フローサイトメトリによってCD4CD25細胞を純度についてチェックした。図3について示すような、抗CD3OKT-3、抗CD281μg/mlclone15E8Sanquin、Fc-CD702μg/ml、アイソタイプ対照MOPC-21、10μg/ml、およびhCD27.1510μg/mlの異なる組合せで、細胞をインキュベートした。次の日、[3H]チミジン組入れによって増殖を検出した。hCD27.15は、最適以下の刺激条件下でヒトCD4CD25細胞の増殖を刺激した。hCD27.15は、ヒトCD8T細胞を同時刺激する未感作ヒトCD8T細胞に対する、hCD27.15抗体によるCD27活性化の効果を以下のように調査した。Ficoll勾配遠心分離を用いてbuffycoatからPBMCを単離した。製造者の指示に従ってBDIMag登録商標ヒト未感作CD8T細胞富化キットBDcatnumber558569を用いたMACSベースの陰性選択によって、手つかずのCD8T細胞をこれらのPBMCから単離した。抗CD8および抗CD45RA抗体を用いたフローサイトメトリによって、選択されたCD8T細胞を純度および未感作性についてチェックし、製造者の計画案に従ってInvitrogen、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルCFSE、5μmで標識付けた。次に、それらを1.0×105細胞/ウェルの濃度で96ウェルプレートに接種した。10μg/mlのhCD27.15またはアイソタイプ対照の存在下で、10μg/mlの可溶抗CD3mAbCLB-T3/4EPeliclusterハイブリドーマ培養のs/nを用いた、0.02μg/mlの抗CD28mAbCLB-CD28/1Peliclusterで細胞を刺激した。示した日数の培養後、CASY細胞カウンタScharfeSystemGmbHを用いて細胞を計数し、ヨウ化プロピジウムPIを用いることによって生存度を判断し、T細胞が経た細胞分裂の数をCFSE蛍光強度のフローサイトメトリ分析FACSCaliburによって評価した。図4は、hCD27.15がCD8細胞の生存および増殖を促進もしていることを図示する。hCD27.15は、CD8T細胞を刺激して特異的サイトカインを産生するヒト未感作CD8T細胞を、以上で示したように精製し、刺激した。72時間の培養後に培養上澄みを取り、製造者の指示に従って27PlexLuminexBioradcatno171A11127によってサイトカイン分泌について分析した。図5Aに示すように、hCD27.15は、TNF-α、IL-2、IFN-γ、CXCL10、IL-13、およびGM-CSFの分泌を誘導した。さらに、細胞を用いて、IL-2およびIFNγの細胞間染色を行なった。72時間の培養の後、PMAconcおよびイオノマイシンconcで、GolgiPlug1μg/ml:BDBiosciencesの存在下で4時間細胞を培養した。CD8細胞の合計数はhCD27.15と非none刺激細胞との間で劇的に異ならず、このことは、サイトカインの増大した分泌が細胞あたりのサイトカインの定性的増加によって生じるにすぎないことを示す図5B。実施例4hCD27.15抗体配列免疫グロブリンcDNAのクローニング変性プライマPCRベースの方法を用いて、ハイブリドーマhCD27.15によって発現されるマウス抗体のための可変領域をエンコードするDNA配列を判定した。TRIZOLInvitrogenを用いて5×106個のハイブリドーマ細胞から合計RNAを単離し、製造者の指示に従って、M-MLV逆転写酵素であるRNaseHMinus、点突然変異体キットPromegacatnoM368Cを用いて重鎖および軽鎖のための遺伝子特異的cDNAを合成した。NovagenベースのIg-プライマセットNovagenSanDiegoCAおよびTaqポリメラーゼInvitrogenを用いてVHおよびVL遺伝子をPCR増幅した。500bpの予期された単位複製配列サイズに一致したすべてのPCR産生物をpCR4TOPOベクターInvitrogenにクローン化し、構築物を、製造者の指示に従って、OneShotCompetentToplO大腸菌Invitrogenに形質転換した。ユニバーサルM13順方向および逆方向プライマを用いるコロニーPCRによってクローンをスクリーニングし、各反応からの少なくとも2つのクローンをDNA配列分析のために選択した。Kabat規則に従ってCDRを同定したKabatetal1991SequncesofProteinsofImmunologicalInterestFifthEditionNIHPublicationNo913242。質量分析法によってアミノ酸配列を確認した。配列を添付の図6の配列リストに開示し、表4に列挙する。"