"メチオニンの生産のための微生物であって、PntABのトランスヒドロゲナーゼ活性を増強するように改変されている、微生物。PntABをコードする遺伝子が過剰発現する、請求項1に記載の微生物。トランスヒドロゲナーゼUdhAの活性を減衰させるように改変されている、請求項1または2に記載の微生物。UdhAをコードする遺伝子が欠失している、請求項3に記載の微生物。一炭素代謝を増加させるように改変されている、請求項1~4のいずれか一項に記載の微生物。下記の活性:a.メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼMetFの活性、b.グリシン開裂複合体GcvTHPおよびLpdの活性、c.セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼGlyAの活性、d.メチルトランスフェラーゼMetHまたはMetEの活性の少なくとも1つが増強される、請求項5に記載の微生物。MetFの活性が、metF遺伝子の過剰発現および/またはその翻訳の最適化によって増強される、請求項6に記載の微生物。metF遺伝子が、Ptrcファミリープロモーターに属する強力なプロモーターの制御下にある、請求項7に記載の微生物。下記の遺伝子:cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysI、cysJ、cysH、cysE、serA、serB、serC、フィードバック感受性が低減されたmetA対立遺伝子、フィードバック感受性が低減されたthrAまたはthrA対立遺伝子の少なくとも一つの発現が増加する、請求項1~8のいずれか一項に記載の微生物。前記遺伝子の少なくとも一つが誘導性プロモーターの制御下にある、請求項9に記載の微生物。ピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現が増強される、請求項1~10のいずれか一項に記載の微生物。微生物の下記の遺伝子:pykA、pykF、purU、yncAまたはmetJの少なくとも一つの発現が減衰される、請求項1~11のいずれか一項に記載の微生物。前記微生物が、腸内細菌科またはコリネバクテリウム科の中から選択される、請求項1~12のいずれか一項に記載の微生物。前記微生物が、エシェリキア属、クレブシェラ属またはコリネバクテリウム属から選択される、請求項13に記載の微生物。下記工程:-炭素源、硫黄源および窒素源を含んでなる適切な培養培地において改変されたメチオニン生産微生物を培養する工程、および-メチオニンまたはその誘導体の一つを培養培地から回収する工程を含んでなり、該微生物が、PntABの増強されたトランスヒドロゲナーゼ活性を示すように改変されている、メチオニンの製造方法。プロトコル幾つかのプロトコルを用いてメチオニン生産株を構築し、下記の実施例に記載する。プロトコル1:相同組換えおよび組換体の選択による染色体改変DatsenkoとWanner2000によって記載された相同組換えによって、特定の染色体上の座における対立遺伝子交換または遺伝子破壊を行った。Flp認識部位によって挟まれたクロラムフェニコールCm耐性cat、カナマイシンKm耐性kan、またはゲンタマイシンGt耐性gm遺伝子を、pKD3またはpKD4あるいはp34S-Gmプラスミドをそれぞれ鋳型として用いることによってPCRによって増幅した。生成するPCR産物を用いて、λRedγ、β、exoリコンビナーゼを発現するプラスミドpKD46を含む宿主大腸菌株を形質転換した。次に、抗生物質耐性の形質転換体を選択して、突然変異した座の染色体構造を表2に示される適切なプライマーを用いるPCR分析によって検証した。pCP20プラスミドを含むクローンをLB上で37°Cで培養した後、抗生物質耐性の喪失を30°Cで試験したことを除き、cat、kanおよびgm耐性遺伝子を、DatsenkoとWanner2000によって記載されたプラスミドpCP20を用いて除去した。次に、抗生物質感受性クローンを、表2に示されるプライマーを用いるPCRによって検証した。プロトコル2:ファージP1の形質導入染色体修飾を、P1形質導入によって所定の大腸菌宿主株に移した。このプロトコルは、i耐性関連染色体修飾を含む供与体株でのファージ溶解液の調製、およびiiこのファージ溶解液による宿主株の感染の2工程から構成されている。ファージ溶解液P1の調製:10mlのLBCm30μg/mlまたはKm50μg/mlまたはGt10μg/mlグルコース0.2CaCl25mMにおいて、対象の染色体修飾を有する株MG1655の一晩培養物100μlを植菌する。振盪しながら37°Cで30分間インキュベートする。準備したP1ファージ溶解液100μlをドナー株MG1655に加える約1×109ファージ/ml細胞が完全に溶解するまで37°Cで30分間振盪する。200μlのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。4500gで遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。上清を無菌試験管に移す。溶解液を4°Cで保存する。形質導入:LB培地中で培養した大腸菌宿主株の一晩培養物5mlを、1500gで10分間遠心分離する。細胞ペレットを2.5mlの10mMMgSO4、5mMCaCl2に懸濁させる。100μlの細胞を、染色体修飾を有するMG1655株のP1ファージ100μlに感染させ供試試験管、対照試験管としてP1ファージを含まない100μl細胞および細胞を含まない100μlのP1ファージを用いる。振盪せずに30°Cで30分間インキュベートする。各試験管に100μlの1Mクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。1mlのLBを加える。振盪しながら37°Cで1時間インキュベートする。試験管を7000rpmで3分間遠心分離する。LBCm30μg/mlまたはKm50μg/mlまたはGt10μg/ml上で培養する。37°Cで一晩インキュベートする。次に、抗生物質耐性形質導入体を選択し、突然変異した座の染色体構造を表2に示されるプライマーを用いるPCR分析によって検証した。I.実施例1:株7、MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-metF::KmPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gtの構築I.1.株1の構築メチオニン生産株1は、特許出願WO2007/077041に記載されており、この出願は、本出願に参考として組込まれる。I.2.株2の構築TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE断片を、二工程で挿入した。最初に、プラスミドpUC18-DmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Kmを構築し、二番目にmalS座に相同性の上流および下流配列を含むTTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Km断片を染色体に導入した。その後、耐性カセットをプロトコル1に従って除去した。以下に示される染色体上の様々な座における組込みは、1対象の座の上流および下流の相同配列、DNA断片および耐性カセットを含む複製ベクターの構築、2対象の染色体修飾を含む最小株MG1655の構築、および3複合株幾つかの修飾を既に含むMG1655への形質導入の同じ方法に従っている。I.2.1.pUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Kmプラスミドの構築プラスミドpUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEは、特許出願PCT/FR2009/052520に記載されているプラスミドpSCB-TTadc-cI857-PλR-35-thrA1-cysEに由来する。簡単に言えば、ApaI/BamHIで消化したTTadc-cI857-PλR-35-thrA1-cysE断片を、pUC18-ΔmalS::MCS-KmのApaIとBamHI部位の間でクローニングさせた。生成するプラスミドは、DNA配列決定法によって確認され、pUC18-ΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Kmと命名した。I.2.2.株MG1655metA11ΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::KmpKD46の構築malS遺伝子をTTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::KmDNA断片によって交換するため、pUC18-DmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::KmをScaIおよびEcoRVによって消化し、malS座に相同性の上流および下流配列を含む残りの消化断片TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Kmをプロトコル1に従って株MG1655metA11pKD46に導入した。カナマイシン耐性組換体を選択し、ΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Km染色体修飾の存在をプライマーOme0826-malS-F配列番号1およびOme0827-malS-R配列番号2表2を用いるPCRおよびDNA配列決定法によって検証した。確認されかつ選択された株を、MG1655metA11pKD46ΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Kmと命名した。I.2.3.ΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Kmの株1への形質導入および耐性カセットの除去ΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Km染色体修飾を、上記の株MG1655metA11pKD46ΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Km由来のP1ファージ溶解液を用いてプロトコル2に従って株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAに形質導入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択し、ΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Km染色体修飾の存在をプライマーOme0826-malS-F配列番号1およびOme0827-malS-R配列番号2表2を用いるPCRによって検証した。生成する株は、遺伝子型MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE::Kmを有する。最後に、上記株のカナマイシン耐性を、プロトコル1に従って除去した。カナマイシン耐性カセットプライマーOme0826-malS-F配列番号1およびOme0827-malS-R配列番号2表2を用いるPCRによって検証した。生成株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEを、株2と命名した。I.3.株3の構築I.3.1.プラスミドpUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmの構築プラスミドpUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmは、下記のプラスミドpCL1920-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11およびpUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cmに由来する。プラスミドpCL1920-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11の構築プラスミドpCL1920-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11は、特許出願PCT/FR2009/052520に記載のプラスミドpCL1920-TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE-PgapA-metA11に由来する。プラスミドpCL1920-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11を構築するため、プラスミドpCL1920-TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE-PgapA-metA11をプライマーPR-RBS01_F配列番号3およびTTadc-pCL1920_R配列番号4で増幅した。PCR産物をDpnIによって消化して、親DNA鋳型を削除した。残りの粘着性オーバーハングをリン酸化して、大腸菌株に導入し、プラスミドpCL1920-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11を形成させた。TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11インサートおよび特にthrA遺伝子の上流のRBS01配列の存在を、下記のプライマーを用いるDNA配列決定法によって検証した。PR-RBS01_F配列番号3大文字の配列はバクテリオファージPRプロモーターPλR-35に相同性7986。下線を施した大文字の配列は、PsiI制限部位を有するRBS01配列に相当する。太字の大文字の配列は、thrA1-20の5‘末端に相同性。TTadc-pCL1920_R配列番号4大文字の配列は、TTadc転写ターミネーター配列クロストリジウムアセトブチリクム由来のadc遺伝子の転写ターミネーター、pSLO1メガプラスミドの179847~179807に相同性太字の大文字の配列は、pCL1920-TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysE-PgapA-metA11プラスミドに相同性。pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cmプラスミドの構築ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm断片を構築するため、pgaAの上流領域、TT02転写ターミネーター、マルチプルクローニング部位MCSおよびpgaDの下流領域downpgaDをPCRによって連結した。その後、クロラムフェニコールカセットCmを増幅して前記の構築物に添加した。最初に、uppgaA-TT02を、プライマーOme1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F配列番号5およびOme1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R配列番号6を用いてPCRによって大腸菌MG1655ゲノムDNAから増幅した。次に、TT02-MCS-down-pgaD断片を、プライマーOme1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F配列番号7およびOme1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R配列番号8を用いてPCRによって大腸菌MG1655ゲノムDNAから増幅した。プライマーOme1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R配列番号6およびOme1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F配列番号7は、36ヌクレオチド長の領域をオーバーラップするようにデザインされていた。最後に、uppgaA-TT02MCS-downpgaD断片を、プライマーOme1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F配列番号5とOme1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R配列番号8を用いてuppgaA-TT02とTT02-MCS-down-pgaD増幅産物を混合することによって増幅した。生成する融合PCR産物をHpaIによって消化して、大腸菌DNAポリメラーゼIの大KLenow断片によって処理されたpUC18プラスミドのHindIIIとEcoRIの間にクローニングした。生成するプラスミドをDNA配列決定法によって検証し、pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCSと命名した。Ome1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F配列番号5太字の大文字の配列は、HpaIおよびEcoRI制限部位およびエキストラベースについてのもの、大文字の配列は、pgaA遺伝子の上流の配列1092609-1092576,ウェブサイトhttpecogeneorg上のリファレンス配列Ome1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R配列番号6太字の大文字の配列は、BstZ17I制限部位およびエキストラベース、下線を施した大文字の配列は、大腸菌rrnBの転写ターミネーターT1に相当6539大文字の配列は、pgaA遺伝子の上流の配列と相同性1091829-1091851、ウェブサイトhttpecogeneorg上のリファレンス配列Ome1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F配列番号7太字の大文字の配列は、大腸菌rrnBの転写ターミネーターT1の3‘末端配列と相補性6539、下線を施した大文字の配列は、MCSマルチプルクローニング部位BstZ17I、HindIII、PacI、ApaI、BamHIを含む、大文字の配列は、pgaD遺伝子の上流の配列と相同性1085325-1085304、ウェブサイトhttpecogeneorg上のリファレンス配列。Ome1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R配列番号8太字の大文字の配列は、HpaIおよびEcoRI制限部位およびエキストラベースについてのもの、大文字の配列は、pgaD遺伝子の上流の配列と相同性1084714-1084733、ウェブサイトhttpecogeneorg上のリファレンス配列。最後に、プライマーOme1603-K7Cmampl_SmaIBstZ17I_F配列番号9およびOme1604-K7CmamplHindIIIR配列番号10を用いてクロラムフェニコールカセットおよびプラスミドpKD3由来のFRT配列を増幅し、この断片をプラスミドpUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCSのBstZ17IとHindIII部位の間でクローニングした。生成するプラスミドは、DNA配列決定法によって検証し、pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cmと命名した。Ome1603-K7Cmampl_SmaIBstZ17IF配列番号9下線を施した大文字の配列は、BstZ17IとSmaIの制限部位およびエキストラベースについてもの、大文字の配列は、プラスミドpKD3の部位プライマー1に相当する。Ome1604-K7Cmamp1HindIIIR配列番号10下線を施した大文字の配列は、HindIII制限部位およびエキストラベース。大文字の配列は、pKD3プラスミドの部位プライマーに相当。pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmの構築pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmを構築するため、前記のpCL1920-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11から単離したApaI/BamHI断片TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11を前記のプラスミドpUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::CmのApaIおよびBamHI部位でクローニングした。生成するプラスミドは、DNA配列決定法によって検証し、pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmと命名した。I.3.2.株MG1655metA11ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmの構築pgaABCDオペロンをTT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cm領域によって交換するため、pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::CmをSamIおよびAatII制限酵素によって消化し、残りの消化断片ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmをプロトコル1に従って株MG1655metA11pKD46に導入した。クロラムフェニコール耐性組換体を選択し、ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cm染色体修飾の存在をプライマーOme1691-DpgaABCDverifF配列番号11およびOme1692-DpgaABCDverifR配列番号12表2を用いるPCRおよびDNA配列決定法によって検証した。確認されて選択された株を、MG1655metA11ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::CmpKD46と命名した。1.3.3.ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmの株2への形質導入ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cm染色体修飾を、プロトコル2に従って上述の株MG1655metA11pKD46ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cm由来のP1ファージ溶解液を用いて上述の株2表1に形質導入した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cm染色体修飾の存在をOme1691-DpgaABCDverifF配列番号11およびOme1692-DpgaABCDvirifR配列番号12表2を用いるPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmを株3と命名した。I.4.株4の構築I.4.1.pUC18-ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmプラスミドの構築プラスミドpUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Kmを構築するため、ΔuxaCA::TT07-MCS-Km断片を大腸菌MG1655ΔuxaCA::TT07-MCS-KmゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによって得て、pUC18にクローニングした。株MG1655ΔuxaCA::TT07-MCS-KmpKD46の構築uxaCA領域をTT07-MCS-Km断片によって交換するため、プライマーOme1506-DuxaCA-MCS-F配列番号13およびOme1507-DuxaCA-MCS-R配列番号14を用いてpKD4プラスミド由来のカナマイシン耐性カセットを増幅したことを除いて、プロトコル1を用いた。Ome1506-DuxaCA-MCS-F配列番号13大文字の斜体配列は、uxaCA座の上流の配列と相同性である3242797-3242724,ウェブサイトhttpecogeneorg上のリファレンス配列。下線を施した大文字の配列は、ファージT7由来のT7Te転写ターミネーター配列501924、大文字の配列は、プラスミドpKD4のプライマー部位2に相当する。Ome1507-DuxaCA-MCS-R配列番号14大文字の斜体配列は、uxaCA座の下流の配列と相同性である3239830-3239879、ウェブサイトhttpecogeneorg上のリファレンス配列。下線を施した大文字の領域は、制限部位ApaI、BstZ17I、SacII、XhoI、AvaI、BamHI、SmaI、KpnI、SacI、EcoRIの配列を含むMCSについてのもの、大文字は、プラスミドpKD4のプライマー部位1に相当する。カナマイシン耐性組換体を選択し、耐性カセットの挿入は、プライマーOme1612-uxaCAR3配列番号15およびOme1774-DuxaCAF配列番号16表2を用いるPCRおよびDNA配列決定法によって検証した。検証して選択した株を、MG1655ΔuxaCA::TT07-MCS-KmpKD46と命名した。プラスミドpUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS::Kmの構築ΔuxaCA::TT07-MCS-Km領域は、鋳型として上記大腸菌MG1655ΔuxaCA::TT07-MCS-KmゲノムDNAからプライマーOme1515-uxaCA-R2配列番号17およびOme1516-uxaCA-F2配列番号18を用いるPCRによって増幅した。Ome1515-uxaCAR2配列番号17uxaCA座の下流の配列に相同性3239021-3239044Ome1516-uxaCAF2配列番号18下線を施した大文字の配列は、制限部位EcoRVおよびエキストラベースについてのもの、大文字の斜体配列は、uxaCA座の上流の配列に相同性3243425-3243402。次に、生成するPCR産物平滑末端DNAポリメラーゼを用いて得られるを制限酵素EcoRVによって消化し、pUC18のSmaI部位にクローニングした。生成するプラスミドは、DNA配列決定法によって検証し、pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Kmと命名した。pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmの構築pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmを構築するため、上記のpCL1920-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11からのTTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ApaI/BamHI消化断片を、上記pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-KmのApaIおよびBamHI部位にクローニングした。生成するプラスミドは、DNA配列決定法によって検証し、pUC18-ΔuxaCA-TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmと命名した。I.4.2.株MG1655metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11の構築uxaCAオペロンをTT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Km領域に交換するため、pUC18-ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::KmをBamHIおよびAhdIで消化し、残りの消化断片ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmをプロトコル1に従って株MG1655metA11pKD46に導入した。カナマイシン耐性組換体を選択し、ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Km染色体修飾の存在をプライマーOme1612-uxaCAR3配列番号15およびOme1774-DuxaCAF配列番号16表2を用いるPCRおよびDNA配列決定法によって検証した。生成する株は、MG1655metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmと命名した。I.4.3.ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmの株3への形質導入ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Km染色体修飾を、前記の株MG1655metA11pKD46ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::KmからのP1ファージ溶解液を用いてプロトコル2に従って前記の株3表1に形質導入した。ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Km染色体修飾は、Ome1612-uxaCAR3配列番号15およびOme1774-DuxaCAF配列番号16表2を用いるPCRによって検証した。生成する株は、MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::CmΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmと命名した。最後に、前記株のクロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットを、プロトコル1に従って除去した。クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットの喪失は、プライマーOme1691-DpgaABCDverifF配列番号11、Ome1692-DpgaABCDverifR配列番号12、Ome1612-uxaCAR3配列番号15およびOme1774-DuxaCAF配列番号16表2を用いるPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11を、株4と命名した。I.5.株5の構築I.5.1.プラスミドpMA-DCP4-6::TT02TTadc-PgapA-λRthrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmの構築プラスミドpMA-ΔCP4-6::TT02TTadc-PλR-35-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmは、前記のpCL1920-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11および下記のpMA-ΔCP4-6::TT02-MCS::Kmに由来する。プラスミドpMA-ΔCP4-6::TT02-MCS::Kmの構築最初に、GeneArtによってpMA-ΔCP4-6::TT02-MCSを合成した。ΔCP4-6::TT02-MCS断片を、GeneArtからのプラスミドpMAのAscIおよびPacI部位にクローニングし、配列番号19として同定される下記の配列を含んでいる:小文字は、AscI、StuIおよびAvrII制限部位に相当。下線を施した小文字は、CP4-6座の上流の配列と相同性260955-261980,httpecogeneorg、太字の大文字は、大腸菌rrnB遺伝子のT1由来のTT02転写ターミネーター配列に相当6539、斜体大文字の配列は、BstZ17I、HindIII、ApaI、SmaIおよびBamH1制限部位を含むMCSに相当、大文字は、CP4-6座の下流の配列と相同性296511-297581httpecogeneorg下線を施した小文字は、KpnIおよびPacI制限部位に相当。二番目に、プライマーOme1605-K7Kmampl_SmaIBstZ17IF配列番号20およびOme1606-K7Kmamp1HindIIIR配列番号21を用いてプラスミドpKD4由来のカナマイシンカセットを増幅し、これを次にpMA-ΔCP4-6::TT02-MCSのBstZ17IおよびHindIII部位にクローニングした。生成するプラスミドは、DNA配列決定法によって検証し、pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS-Kmと命名した。Ome1605-K7Kmampl_SmaIBstZ17IF配列番号20下線を施した大文字の配列は、BstZ17IおよびSmaI制限部位およびエキストラベースについてのもの、大文字の配列は、プラスミドpKD4の部位プライマー1に相当Ome1606-K7Kmamp1HindIIIR配列番号21下線を施した大文字の配列は、HindIII制限部位およびエキストラベースに対するもの、大文字の配列は、プラスミドpKD4の部位プライマー2に相当。pMA-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmを構築するため、前記のpCL1920-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11からのTTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ApaI/BamHI消化断片を、前記のpMA-ΔCP4-6::TT02-MCS-KmのApaIおよびBamHI部位にクローニングした。生成するプラスミドをDNA配列決定法によって検証し、pMA-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmと命名した。I.5.2.株MG1655metA11DCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::KmpKD46の構築CP4-6オペロンをTT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Km断片に交換するため、プラスミドpMA-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::KmをKpnIおよびAvrIIで消化し、残りの消化断片ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmをプロトコル1に従って株MG1655metA11pKD46に導入した。カナマイシン耐性組換体を選択して、ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Km染色体修飾の存在を、プライマーOme1775-DCP4-6verifF配列番号22およびOme1776-DCP4-6verifR配列番号23表2を用いるPCRおよびDNA配列決定法によって検証した。生成する株を、MG1655metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::KmpKD46と命名した。1.5.3.ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmの株4への形質導入および耐性カセットの除去ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Km染色体修飾を、前記の株MG1655metA11pKD46ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::KmからのP1ファージ溶解液を用いてプロトコル2に従って前記の株4表1に形質導入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択して、ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Km染色体修飾の存在をOme1775-DCP4-6verifF配列番号22およびOme1776-DCP4-6verifR配列番号22表2を用いるPCRによって検証した。生成する株を、MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Kmと命名した。最後に、前記株のカナマイシン耐性カセットを、プロトコル1を用いて除去した。カナマイシン耐性カセットの喪失は、プライマーOme1775-DCP4-6verifF配列番号22およびOme1776-DCP4-6verifR配列番号23表2を用いることによりPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11を、株5と命名した。I.6.株6の構築treBC座でそれぞれ大腸菌ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼおよびホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするTT02-serA-serC領域を挿入するため、二工程法を用いた。最初に、プラスミドpMA-ΔtreBC::TT02serA-serC::Gtを構築し、二番目に、treBC座に相同性の上流および下流領域を含むΔtreBC::TT02serA-serC::Gt断片を、プロトコル1に従って染色体に組み換えた。I.6.1.プラスミドpMA-ΔtreBC::TT02serA-serC::Gtの構築プラスミドpMA-ΔtreBC::TT02serA-serC::Gtは、下記のpMA-ΔtreBC::TT02-MCS::Gt、p34S-Gm、および特許出願PCT/FR2009/052520に記載のpUC18-serA-serCから誘導される。最初に、プラスミドpMA-ΔtreBC::TT02-MCSを、GeneArtによって合成した。ΔtreBC::TT02-MCS断片を、GeneArtから得られかつ配列番号24として同定された下記の配列を含むプラスミドpMAのAscIおよびPacI部位にクローニングした。小文字は、AscI制限部位に相当、下線を施した大文字は、treBC座4460477-4461034の上流の配列と相同性、太字の大文字は、大腸菌rrnB遺伝子のT1ターミネーター由来のTT02転写ターミネーター配列に相当6539、斜体大文字は、BstZ17I、HindIII、ApaI、SmaIおよびBamH1制限部位を含むマルチプルクローニング部位に相当、大文字は、treBC座の下流の配列に相当4464294-4464787、斜体の小文字は、PacI制限部位に相当。プラスミドpMA-ΔtreBC::TT02-MCS::Gtを構築するため、FRT-Gt-FRT耐性カセットを、p34S-Gmを鋳型として用い、プライマーBstZ17I-FRT-Gt-F配列番号25およびHindIII-FRT-Gt-R配列番号26を用いるPCRによって増幅した。BstZ17I-FRT-Gt-F配列番号25下線を施した大文字の配列は、SmaIおよびBstZ17I制限部位およびエキストラベースに対するもの、太字の大文字の配列は、FRT配列に相当、大文字の配列は、p34S-Gmに配置されたゲンタマイシン遺伝子の配列に相同性。HindIII-FRT-Gt-R配列番号26下線を施した大文字の配列は、HindIII制限部位およびエキストラベースに対するもの、太字の大文字の配列は、FRT配列に相当、大文字の配列は、p34S-Gmに配置されたゲンタマイシン遺伝子の配列に相同性。FRT-Gt-FRTPCR産物を、pMA-ΔtreB::TT02-MCSのBstZ17IおよびHindIII部位の間にクローニングした。生成するプラスミドは、DNA配列決定法によって検証し、pMA-ΔtreBC::TT02-MCS-Gtと命名した。最終的なプラスミドpMA-ΔtreBC::TT02serA-serC::Gtを構築するため、pUC18-serA-serCをHindIIIによって消化し、serA-serC消化断片をHindIIIによってリニアライズしたpMA-ΔtreBC::TT02-MCS-Gtにクローニングした。生成するプラスミドを、消化およびDNA配列決定法によって検証し、pMA-ΔtreBC::TT02serA-serC::Gtと命名した。I.6.2.株MG1655metA11pKD46ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gtの構築treBC遺伝子をTT02-serA-serC::Gt断片に交換するため、pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::GtをApaIおよびSalIによって消化し、残りの消化断片ΔtreBC::TT02serA-serC::Gtを株MG1655metA11pKD46にプロトコル1に従って導入した。ゲンタマイシン耐性組換体を選択し、ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt断片の存在を、プライマーOme1595-DtreBverifF配列番号27およびOme1596-DtreBverifR配列番号28表2を用いるPCRおよびDNA配列決定法によって検証した。生成する株を、MG1655metA11pKD46ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gtと命名した。I.6.3.ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gtの株5への形質導入ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt染色体修飾を、次にプロトコル2に従って前記の株MG1655metA11pKD46ΔtreBC::TT02-serA-serC::GtからのP1ファージ溶解液を用いて、株5表1に形質導入した。ゲンタマイシン耐性形質導入体を選択し、DtreBC::TT02-serA-serC::Gt染色体修飾の存在をOme1595-DtreBverifF配列番号27およびOme1596-DtreBverifR配列番号28表2を用いるPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gtを株6と命名した。I.7.Ptrc36-metF::Kmの株6への形質導入による株7の構築metF座で染色体、株MG1655metA11ΔmetJPtrc36-metF::Kmに組込まれた人工プロモーター由来のmetF遺伝子の過剰発現は、特許出願WO2007/077041に記載されている。Ptrc36-metF::Kmプロモーター構築物を、株MG1655metA11ΔmetJPtrc36-metF::KmからのP1ファージ溶解液を用いてプロトコル2に従って株6表1に形質導入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択し、Ptrc36-metF::Kmプロモーター構築物をプライマーOme0726-PtrcmetF-F配列番号29およびOme0727-PtrcmetF-R配列番号30表2を用いるPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serC::GtPtrc36-metF::Kmを株7と命名した。II.実施例2:株9MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11DtreBC::TT02-serA-serC::GtPtrc01-pntAB::CmΔudhA::Kmの構築II.1.株8の構築II.1.1.カナマイシン耐性カセットの除去によるMG1655metA11ΔmetJPtrc36-metFの構築特許出願WO2007/077041に記載の株MG1655metA11ΔmetJPtrc36-metF::Kmのカナマイシン耐性をプロトコル1に従って除去した。カナマイシン耐性カセットの喪失は、プライマーOme0726-PtrcmetF-F配列番号29およびOme0727-PtrcmetF-R配列番号30表2を用いることによってPCRによって検証した。生成する株を、MG1655metA11ΔmetJPtrc36-metFと命名した。II.1.2.MG1655metA11ΔmetJPtrc36-metFΔudhA::KmpKD46の構築株MG1655metA11ΔmetJPtrc36-metFにおけるudhA遺伝子を欠失するため、プライマーOme0032-DUdhAF配列番号31およびOme0034-DUdhAR配列番号32を用いてカナマイシン耐性カセットをプラスミドpKD4から増幅させることを除き、プロトコル1を用いた。カナマイシン耐性組換体を選択した。耐性カセットの挿入は、プライマーOag0055-udhAF2配列番号33およびOag0056-udhAR2配列番号34表2を用いるPCRとDNA配列決定法によって検証した。生成する株は、MG1655metA11ΔmetJPtrc36-metFΔudhA::KmpKD46と命名した。Ome0032-DUdhAF配列番号31大文字の配列udhA遺伝子の上流の配列と相同性4158729-4158650、ウェブサイトhttpecogeneorgの対照配列、下線を施した大文字の配列は、プラスミドpKD4のプライマー部位1に相当。Ome0034-DUdhAR配列番号32大文字の配列は、udhA遺伝子の下流の配列と相同性4157588-4157667、ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列、下線を施した大文字の配列は、プラスミドpKD4のプライマー部位2に相当。II.1.3.Ptrc36-metFΔudhA::Kmの株6への同時形質導入遺伝子udhAおよびmetFは、大腸菌染色体上でそれぞれ89.61分および89.03分と近接しており、ファージP1は大腸菌染色体の2分をパッケージすることができるので、遺伝子udhAおよびmetFは同時形質導入することができる。そのため、前記のPtrc36-metFプロモーター修飾およびΔudhA::Km欠失を、前記の株MG1655metA11ΔmetJPtrc36-metFΔudhA::KmpKD46からのP1ファージ溶解液を用いることによってプロトコル2に従って株6表1に同時形質導入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択した。Ptrc36-metFプロモーター修飾の存在を、プライマーOme0726-PtrcmetF-F配列番号29およびOme0727-PtrcmetF-R配列番号30を用いるPCRによって検証した後、DNA配列決定法によって検証した。DudhA::Km欠失の存在を、プライマーOag0055-udhAF2配列番号33およびOag0056-udhAR2配列番号34表2を用いるPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykFΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serC::GtΔudhA::Kmを、株8と命名した。II.2.株9の構築II.2.1.株MG1655metA11pKD46Ptrc01-pntAB::Cmの構築ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼαおよびβサブユニットPntAおよびPntBの発現レベルを増加させるため、構成的人工trc01プロモーターを、プライマーOme1149-Ptrc-pntAF配列番号35およびOme1150-Ptrc-pntAR配列番号36を用いてプラスミドpKD3由来のクロラムフェニコール耐性カセットを増幅したことを除き、プロトコル1に従って株MG1655metA11pKD46中にpntABオペロンの上流に加えた。クロラムフェニコール耐性組換体を選択した。人工プロモーターPtrc01の存在および耐性カセットの挿入は、プライマーOme1151-pntAF配列番号37およびOme1152-pntAR配列番号38表2を用いるPCRによっておよびDNA配列決定法によって検証した。生成する株を、MG1655metA11pKD46Ptrc01-pntAB::Cmと命名した。Ome1149-Ptrc-pntAF配列番号35大文字の配列は、pntA遺伝子の上流の配列と相同性1676002-167594、ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列、下線を施した大文字の配列は、ファージT7由来のT7Te転写ターミネーター配列501924、斜体大文字の配列は、プラスミドpKD3のプライマー部位1に相当。Ome1150-Ptrc-pntAR配列番号36大文字の配列は、配列upstreamofthepntA遺伝子の上流の配列と相同性1675875-1675940,ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列下線を施した大文字の配列は、trcプロモーター配列についてのもの、斜体大文字の配列は、プラスミドpKD3のプライマー部位2に相当。II.2.2.Ptrc01-pntAB::Cmの株8への形質導入Ptrc01-pntAB::Cmプロモーター修飾を、プロトコル2に従って、前記の株MG1655metA11pKD46Ptrc01-pntAB::Cm由来のP1ファージ溶解液を用いることによって株8表1に形質導入した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、Ptrc01-pntAB::Cm染色体修飾の存在を、Ome1151-pntAF配列番号37およびOme1152-pntAR配列番号38表2を用いてPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykFΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serC::GtPtrc01-pntAB::CmΔudhA::Kmを、株9と命名した。III.実施例3:株10MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykFΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCの構築III.1.プラスミドpUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmの構築プラスミドpUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmは、前記のプラスミドpCL1920-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11および前記のプラスミドpUC18-ΔwcaM::TT02-MCS::Cmから誘導される。III.1.1.プラスミドpUC18-ΔwcaM::TT02-MCS::Cmの構築DwcaM::TT02-MCS::Cm断片を構築するため、wcaMupwcaMの上流領域、TT02転写ターミネーター、マルチプルクローニング部位MCSおよびwcaMdownwcaMの下流領域の間のオーバーラップPCRを行い、その後、クロラムフェニコールカセットCmを増幅してクローニングした。最初に、断片upwcaM-TT02を、プライマーOme1703-DwcaM-HpaI-EcoRI-F配列番号39およびOme1704-DwcaM-TT02-BstZ17I-R配列番号40を用いてPCRによって大腸菌MG1655ゲノムDNAから増幅した。次いで、TT02-MCS-downwcaM断片を、プライマーOme1705-DwcaMMCS-BstZ17I-F配列番号41およびOme1706-DwcaMEcoRI-R配列番号42を用いてPCRによって大腸菌MG1655ゲノムDNAから増幅した。プライマーOme1704-DwcaM-TT02-BstZ17I-R配列番号40およびOme1705-DwcaM-MCS-BstZ17I-F配列番号41は、36ヌクレオチド長の領域をオーバーラップするようにデザインされていた。最後に、upwcaM-TT02MCS-downwcaM断片を、upwcaM-TT02とTT02-MCS-downwcaMアンプリコンを混合して、プライマーOme1703-DwcaM-HpaI-EcoRI-F配列番号39およびOme1706-DwcaM-EcoRI-R配列番号42を用いることによって増幅した。生成する融合PCR産物をHpaIによって消化し、大腸菌DNAポリメラーゼIの大KLenow断片によって処理されたpUC18プラスミドのHindIIIとEcoRI部位の間にクローニングした。生成するプラスミドをDNA配列決定法によって検証し、pUC18-ΔwcaM::TT02-MCSと命名した。Ome1703-DwcaM-HpaI-EcoRI-F配列番号39下線を施した大文字の配列は、HpaIおよびEcoRI制限部位およびエキストラベースについてのもの、大文字の配列は、wcaM遺伝子の下流の配列に相同性2114909-2114938、ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列。Ome1704-DwcaM-TT02BstZ17I-R配列番号40太字の大文字の配列は、BstZ17I制限部位およびエキストラベースについてのもの、下線を施した大文字の配列は、大腸菌rrnBの転写ターミネーターT1に相当6539大文字の配列は、wcaM遺伝子の下流の配列と相同性2113921-2113950、ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列。Ome1705DwcaM-MCS-BstZ17I-F配列番号41太字の大文字の配列は、大腸菌rrnBの転写ターミネーターT1の3‘末端配列に相補性6539、下線を施した大文字の配列は、マルチプルクローニング部位BstZ17I、HindIII、PacI、ApaI、BamHIを含む、大文字の配列は、wcaM遺伝子の上流の配列と相同性2112496-2112525、ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列。Ome1706DwcaM-EcoRI-R配列番号42太字の大文字の配列は、HpaIおよびEcoRI制限部位およびエキストラベースについてのもの、大文字の配列は、wcaM遺伝子の上流の配列と相同性2111497-2111527、ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列。最後に、前記のプライマーOme1603-K7CmamplSmaIBstZ17IF配列番号9およびOme1604-K7Cmamp1HindIIIR配列番号10を用いて、プラスミドpKD3からのクロラムフェニコールカセットを増幅した。このカセットを、次にプラスミドpUC18-ΔwcaM::TT02-MCSのBstZ17IおよびHindIII部位の間にクローニングした。生成するプラスミドをDNA配列決定法によって検証し、pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS-Cmと命名した。III.1.2.プラスミドpUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmの構築pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmを構築するため、前記のpCL1920-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11からのTTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ApaI/BamHI消化断片を、pUC18-ΔwcaM::TT02-MCS-CmのApaIおよびBamHI部位の間にクローニングした。得られたプラスミドを、DNA配列決定法によって検証し、pUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmと命名した。III.2.株MG1655metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::CmpKD46の構築wcaM遺伝子をTT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cm領域に交換するため、プラスミドpUC18-ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::CmをBspHIによって消化し、残りの消化断片ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmをプロトコル1に従って株MG1655metA11pKD46に導入した。クロラムフェニコール耐性組換体を選択し、ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cm染色体修飾の存在をプライマーOme1707-DwcaMverifF配列番号43およびOme1708-DwcaMverifR配列番号44表2を用いるPCRおよびDNA配列決定法によって検証した。検証し選択した株を、MG1655metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmと命名した。III.3.DwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmの株6への形質導入および耐性カセットの除去ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cm染色体修飾を、前記の株MG1655metA11pKD46ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::CmからのP1ファージ溶解液を用いてプロトコル2に従って株6表1に形質導入した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cm染色体修飾の存在をOme1707-DwcaMverifF配列番号43およびOme1708-DwcaMverifR配列番号44表2を用いるPCRによって検証した。生成する株を、MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serC::GtΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11::Cmと命名した。前記株のゲンタマイシンおよびクロラムフェニコールカセットを、次にプロトコル1に従って除去した。ゲンタマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットを、それぞれプライマーOme1595-DtreBverifF配列番号27およびOme1596-DtreBverifR配列番号28、およびプライマーOme1707-DwcaMverifF配列番号43およびOme1708-DwcaMverifR配列番号44表2を用いてPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCを、株10と命名した。IV.実施例4:株12,MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11DtreBC::TT02-serA-serCPtrc01-pntAB::CmpCL1920-PgapA-pycre-TT07の構築IV.1.Ptrc01-pntAB::Cmの株10への形質導入による株11の構築前記のPtrc01-pntAB::Cmプロモーター修飾を、前記の株MG1655metA11pKD46Ptrc01-pntAB::CmからのP1ファージ溶解液を用いることによって株10表1に形質導入した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、Ptrc01-pntAB::Cm染色体修飾を、プライマーOme1151-pntAF配列番号37およびOme1152-pntAR配列番号38表2を用いるPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCPtrc01-pntAB::Cmを、株11と命名した。IV.2.pCL1920-PgapA-pycRe-TT07の構築および株11への導入リゾビウムエトリのピルベートカルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現させるために、プラスミドpCL1920から誘導されるプラスミドpCL1920-PgapA-pycRe-TT07を構築した。PgapA-pycRe-TT07インサートを構築するため、gapAプロモーター、そのリボソーム結合部位RBSおよびリゾビウムエトリのpycRe遺伝子の間のオーバーラップPCRを用いた。最初に、gapAプロモーターとRBS領域gapA開始コドンの上流の-156~-1領域に相当を、プライマーPgapA-SalI-F配列番号45とPgapA-pycRe-R配列番号46を用いるPCRによって大腸菌MG1655ゲノムDNAから増幅した。次に、pycRe遺伝子を、プライマーPgapA-pycReF配列番号47およびpycRe-TT07-SmaI-R配列番号48を用いてリゾビウムエトリCFN42ゲノムDNAから増幅した。プライマーPgapA-pycRe-R配列番号46およびPgapA-pycReF配列番号47は、42ヌクレオチド長の領域をオーバーラップするようにデザインされている。最後に、PgapA-RBSgapA-pycRe-TT07断片を、プライマーPgapA-SalI-F配列番号45およびpycRe-TT07-SmaI-R配列番号48を用いてgapAプロモーター-RBSとpycReアンプリコンを混合することによって増幅した。生成する融合PCR産物を、プラスミドpCL1920のSalIとSmaI部位の間でクローニングした。生成するプラスミドを、DNA配列決定法によって検証し、pCL1920-PgapA-pycRe-TT07と命名した。PgapA-SalI-F配列番号45下線を施した大文字の配列は、SalI、ClaI、HindIIIおよびPmeI制限部位およびエキストラベースについてのもの、太字の大文字の配列は、gapAプロモーター配列と相同性1860640-1860658、ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列。PgapA-pycRe-R配列番号46太字の大文字の配列は、gapA遺伝子のプロモーターと相同性1860772-1860791、httpecogeneorg上の対照配列、大文字の配列は、pycRe遺伝子のGTG開始コドンをATGに交換したことを除き、pycRe遺伝子と相同性4236889-4236906、ウェブサイトhttpwwwncbinlmnihgov上の対照配列。PgapA-pycReF配列番号47太字の大文字の配列は、gapA遺伝子のプロモーターと相同性1860772-1860791、ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列。大文字の配列は、pycRe遺伝子のGTG開始コドンをATGに交換したことを除き、pycRe遺伝子と相同性4236889-4236906、ウェブサイトhttpwwwncbinlmnihgov上の対照配列。pycRe-TT07-SmaI-R配列番号48下線を施した大文字の配列は、SmaI、BamHI、EcoRI制限部位およびエキストラベースについてのもの、大文字の配列は、T7ファージ由来のT7Te転写ターミネーター配列に相当501924、斜体大文字の配列は、XhoI制限部位およびエキストラベースについてのもの、太字の大文字の配列は、pycRe遺伝子の下流の配列と相同性4240332-4240388、ウェブサイトhttpwwwncbinlmnihgov上の対照配列。次に、pCL1920-PgapA-pycRe-TT07を、株11表1にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドpCL1920-PgapA-pycRe-TT07の存在を検証し、生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCPtrc01-pntAB::CmpCL1920-PgapA-pycRe-TT07を、株12と命名した。V.実施例5:株13、MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11DtreBC::TT02-serA-serCPtrc01-pntAB::CmΔudhA::Kmの構築前記のΔudhA::Km欠失を、前記の株MG1655metA11ΔmetJPtrc36-metFΔudhA::KmpKD46からのP1ファージ溶解液を用いることによってプロトコル2に従って株11表1に形質導入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択した。Ptrc36-ARNmst17-metFプロモーター修飾の存在を、プライマーOme0726-PtrcmetF-F配列番号29およびOme0727-PtrcmetF-R配列番号30を用いるPCRに続いてDNA配列決定法によって検証し、ΔudhA::Km欠失の存在は、プライマーOag0055-udhAF2配列番号33およびOag0056-udhAR2配列番号34表2を用いるPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCPtrc01-pntAB::CmΔudhA::Kmを、株13と命名した。VI.実施例6:株14MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCPtrc01-pntAB::CmΔudhA::Kmの構築遺伝子udhAおよびmetFは大腸菌染色体上でそれぞれ89.61分および89.03分と近接しており、ファージP1は大腸菌染色体の2分をパッケージすることができるので、遺伝子udhAおよびmetFは同時形質導入することができる。そのため、前記のPtrc36-metFプロモーター修飾およびΔudhA::Km欠失を、前記の株MG1655metA11ΔmetJPtrc36-metFΔudhA::KmpKD46からのP1ファージ溶解液を用いることによってプロトコル2に従って株11表1に同時形質導入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択した。Ptrc36-metFプロモーター修飾の存在を、プライマーOme0726-PtrcmetF-F配列番号29およびOme0727-PtrcmetF-R配列番号30を用いるPCRによって検証した後、DNA配列決定法によって検証した。DudhA::Km欠失の存在を、プライマーOag0055-udhAF2配列番号33およびOag0056-udhAR2配列番号34表2を用いるPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykFΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serC::GtΔudhA::Kmを、株14と命名した。VII.実施例7:株15、MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11DtreBC::TT02-serA-serCPtrc01-pntAB::CmΔudhA::KmpCL1920-PgapA-pycre-TT07の構築前記のpCL1920-PgapA-pycRe-TT07を、株13表1にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドpCL1920-PgapA-pycRe-TT07の存在を検証し、生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCPtrc01-pntAB::CmΔudhA::KmpCL1920-PgapA-pycre-TT07を、株15と命名した。VIII.実施例8:株18、MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11DtreBC::TT02-serA-serCPtrc30-pntAB::CmΔudhApCL1920-PgapA-pycRe-TT07の構築VIII.1.株13の耐性カセットの除去による株16の構築前記の株13のカナマイシンおよびクロラムフェニコールの耐性カセットを、プロトコル1に従って除去した。カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットの喪失は、プライマーOag0055-udhAF2配列番号33、Oag0056-udhAR2配列番号34、Ome1151-pntAF配列番号37およびOme1152-pntAR配列番号38表2を用いるPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11DtreBC::TT02-serA-serCPtrc01-pntABΔudhApCL1920-PgapA-pycRe-TT07を株16と命名した。VIII.2.株MG1655metA11pKD46Ptrc30-pntAB::Cmの構築ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼαおよびβサブユニットPntAおよびPntBの発現レベルを増加させるため、構成的人工trc30プロモーターを、プライマーOme2104Ptrc30-pntAR配列番号49およびOme1150-Ptrc-pntAF配列番号36を用いてプラスミドpKD3由来のクロラムフェニコール耐性カセットを増幅したことを除き、プロトコル1に従って株MG1655metA11pKD46中にpntA-pntBオペロンの上流に加えた。クロラムフェニコール耐性組換体を選択した。人工プロモーターtrc30の存在および耐性カセットの挿入は、プライマーOme1151-pntAF配列番号37およびOme1152-pntAR配列番号38表2を用いるPCRによっておよびDNA配列決定法によって検証した。生成する株を、MG1655metA11pKD46Ptrc30-pntAB::Cmと命名した。Ome2104Ptrc30-pntAR配列番号49大文字の配列は、pntA遺伝子の上流の配列と相同性1675875-1675940、ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列、下線を施した大文字の配列は、trc30プロモーター配列斜体大文字の配列は、pKD3プラスミドのプライマー部位に相当VIII.3.株16へのPtrc30-pntAB::Cmの形質導入による株17の構築Ptrc30-pntAB::Cmプロモーター修飾を、前記の株MG1655metA11pKD46Ptrc30-pntAB::CmからのP1ファージ溶解液を用いてプロトコル2に従って株16に形質導入した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、Ptrc01-pntAB::Cm染色体修飾を、プライマーOme1151-pntAF配列番号37およびOme1152-pntAR配列番号38表2を用いるPCRによって検証した。検証し選択した株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCPtrc30-pntAB::Cmを、株17と命名した。VIII.4.株17へのpCL1920-PgapA-pycre-TT07の形質導入による株18の構築前記のpCL1920-PgapA-pycRe-TT07を、株17表1にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドpCL1920-PgapA-pycRe-TT07の存在を検証し、生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCPtrc30-pntAB::CmΔudhA::KmpCL1920-PgapA-pycre-TT07を、株18と命名した。IX.実施例9:株20、MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11DtreBC::TT02-serA-serCPtrc97-pntAB::CmΔudhApCL1920-PgapA-pycRe-TT07の構築IX.1.株MG1655metA11pKD46Ptrc97-pntAB::Cmの構築ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼαおよびβサブユニットPntAおよびPntBの発現レベルを増加させるため、構成的人工trc97プロモーターを、プライマーOme2105Ptrc97-pntAR配列番号50およびOme1150-Ptrc-pntAF配列番号36を用いてプラスミドpKD3由来のクロラムフェニコール耐性カセットを増幅したことを除き、プロトコル1に従って株MG1655metA11pKD46中にpntA-pntBオペロンの上流に加えた。クロラムフェニコール耐性組換体を選択した。人工プロモーターtrc97の存在および耐性カセットの挿入は、プライマーOme1151-pntAF配列番号37およびOme1152-pntAR配列番号38表2を用いるPCRによっておよびDNA配列決定法によって検証した。生成する株を、MG1655metA11pKD46Ptrc97-pntAB::Cmと命名した。Ome2105Ptrc97-pntAR配列番号50大文字の配列は、pntA遺伝子の上流の配列と相同性1675875-1675940、ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列、下線を施した大文字の配列は、trc97プロモーター配列斜体大文字の配列は、pKD3プラスミドのプライマー部位2に相当IX.2.Ptrc97-pntAB::Cmの株16への形質導入による株19の構築Ptrc97-pntAB::Cmプロモーター修飾を、前記の株MG1655metA11pKD46Ptrc97-pntAB::Cm由来のP1ファージ溶解液を用いることによってプロトコル2に従って株16表1に導入した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、Ptrc97-pntAB::Cm染色体修飾の存在を、Ome1151-pntAF配列番号37およびOme1152-pntAR配列番号38表2を用いるPCRによって検証した。検証して選択した株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykFΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serC::GtPtrc97-pntAB::CmΔudhAを株19と命名した。IX.3.pCL1920-PgapA-pycre-TT07の株19への導入による株20の構築前記のpCL1920-PgapA-pycRe-TT07を、株19表1にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドpCL1920-PgapA-pycRe-TT07の存在を検証し、生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCPtrc97-pntAB::CmΔudhA::KmpCL1920-PgapA-pycre-TT07を、株20と命名した。X.実施例10:株22,MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11DtreBC::TT02-serA-serCPtrc55-pntAB::CmΔudhApCL1920-PgapA-pycRe-TT07の構築X.1.株MG1655metA11pKD46Ptrc55-pntAB::Cmの構築ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼαおよびβサブユニットPntAおよびPntBの発現レベルを増加させるため、構成的人工trc55プロモーターを、プライマーOag0699-Ptrc55-pntABR配列番号51およびOme1150-Ptrc-pntAF配列番号36を用いてプラスミドpKD3由来のクロラムフェニコール耐性カセットを増幅したことを除き、プロトコル1に従って株MG1655metA11pKD46中にpntA-pntBオペロンの上流に加えた。クロラムフェニコール耐性組換体を選択した。人工プロモーターtrc55の存在および耐性カセットの挿入は、プライマーOme1151-pntAF配列番号37およびOme1152-pntAR配列番号38表2を用いるPCRによっておよびDNA配列決定法によって検証した。検証し選択した株を、MG1655metA11pKD46Ptrc55-pntAB::Cmと命名した。Oag0699-Ptrc55-pntAR配列番号51大文字の配列は、pntA遺伝子の上流の配列と相同性1675875-1675940、ウェブサイトhttpecogeneorg上の対照配列、下線を施した大文字の配列は、trc55プロモーター配列斜体大文字の配列は、pKD3プラスミドのプライマー部位2に相当X.2.Ptrc55-pntAB::Cm株16への形質導入Ptrc97-pntAB::Cmプロモーター修飾を、前記の株MG1655metA11pKD46Ptrc55-pntAB::Cm由来のP1ファージ溶解液を用いることによってプロトコル2に従って株16表1に導入した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、Ptrc55-pntAB::Cm染色体修飾の存在を、Ome1151-pntAF配列番号37およびOme1152-pntAR配列番号38表2を用いるPCRによって検証した。検証して選択した株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykFΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serC::GtPtrc55-pntAB::CmΔudhAを株21と命名した。X.3.pCL1920-PgapA-pycre-TT07の株21への導入による株22の構築前記のpCL1920-PgapA-pycRe-TT07を、株21表1にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドpCL1920-PgapA-pycRe-TT07の存在を検証し、生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCPtrc55-pntAB::CmΔudhA::KmpCL1920-PgapA-pycre-TT07を、株22と命名した。XI.実施例11:株24,MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11DtreBC::TT02-serA-serCΔudhA::KmpCL1920-PgapA-pycRe-TT07の構築XI.1.ΔudhA::Kmの株10への形質導入による株23の構築前記のΔudhA::Km欠失を、前記の株MG1655metA11ΔmetJPtrc36-metFΔudhA::KmpKD46からのP1ファージ溶解液を用いることによってプロトコル2に従って株10表1に形質導入した。カナマイシン耐性形質導入体を選択した。Ptrc36-ARNmst17-metFプロモーター修飾の存在を、プライマーOme0726-PtrcmetF-F配列番号29およびOme0727-PtrcmetF-R配列番号30を用いるPCRに続いてDNA配列決定法によって検証し、ΔudhA::Km欠失の存在は、プライマーOag0055-udhAF2配列番号33およびOag0056-udhAR2配列番号34表2を用いるPCRによって検証した。生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCΔudhA::Kmを、株23と命名した。XI.2.株24:pCL1920-PgapA-pycre-TT07の株23への導入前記のpCL1920-PgapA-pycRe-TT07を、株23表1にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドpCL1920-PgapA-pycRe-TT07の存在を検証し、生成する株MG1655metA11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metFPtrc07-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PλR-35-thrA1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔwcaM::TT02-TTadc-PλR-35-RBS01-thrA1-cysE-PgapA-metA11ΔtreBC::TT02-serA-serCΔudhA::KmpCL1920-PgapA-pycre-TT07を、株24と命名した。XII.実施例12:振盪フラスコでの発酵によるL-メチオニンの生産生産株を小型の三角フラスコ中で評価した。5.5mlの前培養物を、混合培地2.5g/lグルコースおよび90最少培地PC1を含む10LB培地LBブロス,ミラー25g/lで30°Cで21時間増殖させた。これを用いて、PC1培地の50ml培養をOD600が0.2となるまで植菌した。必要であれば、抗生物質を、カナマイシンおよびスペクチノマイシンについては50mg/l、クロラムフェニコールについては30mg/l、およびゲンタマイシンについては10mg/lの濃度で加えた。培養の温度は、37°Cに2時間、42°Cに2時間、および次に37°Cに培養の終了まで維持した。培養物のOD600が5~7に達したところで、細胞外アミノ酸をOPA/Fmoc誘導体化の後にHPLCにより定量し、他の関連の代謝産物を、屈折率測定検出を用いたHPLC有機酸およびグルコースおよびシリル化後のGC-MSを用いて分析した。それぞれの株について、数回反復した。細胞外メチオニン濃度は、OPA/HPLC誘導体化の後にHPLCによって定量した。残留グルコース濃度は、屈折率測定検出を用いたHPLCを用いて分析した。メチオニン収率は、下記のように表された:表4に見られるように、メチオニングルコース収率Ymetは、pntAB過剰発現および/またはudhA欠失によって増加する株7に比較して株9および14、および株10に比較して株12、13、15および24。収率の向上は、metF遺伝子の過剰発現が強いときには更に良好である。metF遺伝子の前にmRNA安定化配列とpntAB過剰発現およびudhA欠失とを両方とも含む株13は、C1経路の強力な過剰発現のない株14より高い収率を示す。XIII.実施例13:トランスヒドロゲナーゼおよび5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性実施例12の表4に記載の結果を、それぞれPntABおよびMetF表5によって行ったトランスヒドロゲナーゼおよび5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性の分析によって確かめる。小型の三角フラスコでの培養では、いずれの活性も過剰発現によって増加する。酵素活性のインビトロ測定のために、大腸菌株を前記の最少培地で培養した。抽出法に先立って、細胞を遠心分離によって培養液から回収した。ペレットを低温の20mMリン酸カリウム緩衝液pH7.2に再懸濁し、細胞をPrecellysBertinTechnologies5000rpmで2x10秒間、2つの工程の間に氷上に2分間を用いるビーズ破砕によってリーシスした後、12000g4°Cで30分間遠心分離した。上清を脱塩し、分析に用いた。タンパク質濃度を、Bradford分析試薬を用いて測定した。トランスヒドロゲナーゼ活性THは、前記したように分析した。サイクリックトランスヒドロゲナーゼ活性は、50mMMES-KOH緩衝液pH6.0、0.2mMNADH、10μMNADPHを含むまたは含まない0.2mMAcPyAD、および6μgの粗細胞抽出物を含む37°C反応混合物で375nmで30分間分光光度法により分析した。総ての結果は、少なくとも3回の測定の平均値である。5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性MTHFRは、幾らかの改変を加えた前記の方法で分析した。この方法は、式1に示されている。メチル-THFメナジオン→メチレン-THFメナジオールメチル-THFは基質として用いられ、メチレン-THFの形成は、ホルムアルデヒドを生成するメチレン-THFの酸分解によって測定される。生成したホルムアルデヒドは指示薬NBDHと反応して、530nmでの蛍光性の強いヒドラゾン誘導体を形成する。5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性は、wasassayedfor30minutesat37°Cinareactionmixturecontaining50mMリン酸カリウム緩衝液pH6.7、0.3mMEDTA、0.2w/vウシ血清アルブミン、20メタノール/80H2O中のメナジオンの飽和溶液、および粗細胞抽出物20μgを含む反応混合物中で37°Cで30分間分析を行った。インキュベーションの後、反応を、酢酸ナトリウム緩衝液pH4.7を加え、試験管を100°Cのヒーターブロックに2分間置くことによって終結させる。10000gで5分間遠心分離を行った後、生成したホルムアルデヒドを、95エタノール/6リン酸中0.001NBDHを加えることによって、FLx800蛍光マイクロプレートリーダーを用いて分析する。XIV.実施例14:バイオリアクターでの発酵によるL-メチオニンの生産実質的量の対象の代謝物を生産した株を、次にフェドバッチ法を用いて2.5L発酵装置中で生産条件下にて試験した。簡単に言えば、2.5g/lのグルコースを加えた10mlLB配置で増殖した24時間培養物を用いて、最少培地B1aに24時間前培養を植菌した。これらのインキュベーションは、回転式振盪機200RPM中50mlの最少培地を含む500mlジャマ板付きフラスコで行った。最初の前培養は30°Cの温度で行い、第二の前培養は34°Cの温度で行った。第三の前培養工程は、1.2g/lのバイオマス濃度に5mlの濃縮前培養を植菌した200mlの最少培地B1bを満たしたバイオリアクターで行った。前培養温度は34°Cの一定に維持し、pHは10NH4OH溶液を用いて6.8の値に自動的に調整した。溶存酸素濃度は、空気供給および/または撹拌により30の値の空気分圧飽和に連続的に調整した。バッチ培地からグルコースが枯渇した後、フェドバッチを初期流速0.7ml/時で開始し、約18g/lの最終細胞濃度を得るため、0.13/時の増殖速度で24時間指数的に増加させた。次に、2.5L発酵装置に600mlの最少培地B2を満たし、2.1g/lのバイオマス濃度に55~70mlの前培養容積を植菌した。培養温度は37°Cの一定に維持し、pHはNH4OH溶液10NH4OHを9時間、および28NH4OHを培養終了までの自動添加によって作業値に維持した。初期撹拌速度は、バッチ期中は200RPMに設定し、フェドバッチ期中は1000RPMまで増加させた。初期気流速度は、バッチ期は40NL/時に設定し、フェドバッチ期の開始時には100NL/時まで増加させた。溶存酸素濃度は、20~40、好適には撹拌を増加させることによって30の値に維持した。細胞質量が5g/l付近の濃度に到達したときに、フェドバッチを5ml/時の初期流速で開始した。供給溶液を、増殖の26時間後に24ml/時に達した増加流速と共にシグモイド曲線に従って注入した。正確な供給条件は、式:式中、Qtは、バッチ容積600mlについてml/時での供給流速であり、p1=1.80、p2=22.40、p3=0.270、p4=6.5であるに従って計算した。26時間後、フェドバッチ供給溶液ポンプを停止し、培養をグルコースの枯渇後に終了した。細胞外アミノ酸は、OPA/Fmoc誘導体化の後に定量し、他の関連代謝物は、屈折率測定検出有機酸およびグルコースを用いるHPLCおよびシリル化後にGC-MSを用いて分析した。株10および13は、それぞれ49.1および55.5g/lのチオ硫酸アンモニウム、およびフェドバッチ培地ではチオ硫酸マグネシウムの代わりに5g/lの硫酸マグネシウムを用いて培養した。バッチ培地は、この2つの株についてチオ硫酸マグネシウムの代わりに1g/lの硫酸マグネシウムを含んでいた。フラスコ実験で前記したように、同様にバイオリアクターでは、メチオニン/グルコース収率Ymetmaxは、pntAB過剰発現および/またはudhA欠失によって増加する表10の株10および13を比較されたい。更に、本発明者らは、pntAB過剰発現のファインテューンドレギュレーションが、上表10の株12、15、18、20および22で見られるようにメチオニン生産を向上させたことを示している。メチオニン生産は、pntAB遺伝子の発現レベルによって調節され、本発明者らは、それがpntABの中位の過剰発現で一層良好であることを示している。発酵槽容積は、初期容積に、pHを調節しかつ培養物を供給するために加えた溶液の量を加え、試料採取に用いおよび蒸発によって失われた容積を差し引くことによって計算した。フェドバッチ容積に続いて、供給ストックの計量を行った。次いで、注入したグルコースの量を、注入重量、溶液の密度およびBrixの方法によって測定したグルコース濃度に基づいて計算した[グルコース]。メチオニン収率は、下記のように表された培養中に得られた最大収率を、ここではそれぞれの株について示した。メチオニン0およびメチオニンtについては、それぞれ、初期および最終メチオニン濃度であり、V0およびVtは初期およびt時点での容積である。消費されたグルコースは、下記のようにして計算した注入したグルコースtフェド容積tグルコース消費されたグルコースtグルコース0V0注入したグルコースグルコース残留Vtグルコース0、グルコース、グルコース残留は、それぞれ初期、フェドおよび残留グルコース濃度である。XV.実施例15:トランスヒドロゲナーゼ活性実施例14の表10に記載の結果は、PntAB表11によって行ったトランスヒドロゲナーゼ活性の分析によって確かめられる。フラスコ実験で以前に観察されたように、トランスヒドロゲナーゼ活性はpntABの過剰発現によって増加する表11の株10および13参照。更に、pntAB過剰発現のファインテューンドレギュレーションは、表11の株18で見ることができるようにトランスヒドロゲナーゼ活性を約10倍減少させた。トランスヒドロゲナーゼ活性THは、実施例13で前記した方法で分析した。総ての結果は、少なくとも3回の測定の平均値である。参考文献"