"共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子の拡散特性値を測定する方法であって、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する過程と、前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する過程と、前記光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程と、前記検出された発光粒子の光を表す信号のうち、同一の発光粒子に対応する複数の信号を抽出する過程と、前記抽出された信号の発生時間の間隔に於ける前記光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて前記抽出された信号に対応する発光粒子の拡散特性値を算出する過程とを含むことを特徴とする方法。請求項1の方法であって、前記拡散特性値を算出する過程に於いて、前記抽出された信号の発生時間の間隔に於ける前記光検出領域の移動周期からのずれ時間と前記光検出領域の移動速度とから算出される前記抽出された信号に対応する発光粒子の変位に基づいて前記拡散特性値が算出されることを特徴とする方法。請求項1の方法であって、前記抽出された信号の発生時間の間隔が複数の連続した前記抽出された信号のうちのいずれか二つの信号の発生時間の時間差であることを特徴する方法。請求項1の方法であって、前記同一の発光粒子に対応する複数の信号を抽出する過程に於いて、前記検出された発光粒子の光を表す信号のうちの1つの信号の発生時間に前記光検出領域の周期を加算した時間を中心とする前記光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定される時間幅内に発生した信号が前記1つの信号に対応する発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判定されることを特徴とする方法。請求項1の方法であって、前記光強度データ上に於いて複数の発光粒子からの光を表す信号が存在している場合には、前記複数の発光粒子の各々について別々に前記拡散特性値が算出されることを特徴とする方法。請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記拡散特性値が拡散係数であることを特徴とする方法。請求項1乃至6のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置が前記試料溶液中の発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。上記のFCS、FIDA等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカルボリュームの体積は、1fL程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、1nM程度若しくはそれ以上であり、1nMを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカルボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献6~8に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が1nM未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。そこで、本願出願人は、特願2010-044714及びPCT/JP2011/53481に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、FCS、FIDA等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、FCS、FIDA等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域以下、光検出領域と称する。の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術以下、走査分子計数法と称する。によれば、測定に必要な試料がFCS、FIDA等の光分析技術と同様に微量例えば、数十μL程度であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、FCS、FIDA等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。ところで、上記の走査分子計数法に於いて光検出領域で試料溶液内を走査する際、光検出領域は、典型的には、例えば、円形、楕円形の所定の経路を循環するよう移動させられる。その際、光検出領域の移動周期が比較的短いとき或いは発光粒子の拡散並進運動の速度が比較的遅いときには、光検出領域が所定の経路を一周する間に所定の経路上の発光粒子が殆ど移動せず、同一の発光粒子が再度検出されることとなる。実際、動きの遅い分子についての走査分子計数法による測定に於いて、光検出領域の移動周期に略等しい時間間隔にて、周期的な発光粒子の光を表す信号が発生することが観察されている図8A参照。しかしながら、かかる周期的な信号の間隔の長さは、詳細に検査してみると、完全に光検出領域の移動周期には一致せず、また、互いに少しずつずれが生じていることが明らかになった。かかる周期的な信号の間隔の長さのずれは、発光粒子がブラウン運動によりその位置を移動したためであると考えられる。本発明の発明者は、かかる周期的な信号の間隔の長さに於けるずれを解析することによって、粒子のブラウン運動による移動のし易さ、或いは、粒子の拡散係数を見積もることが可能であることを見出した。かくして、本発明の主な課題は、走査分子計数法の発光粒子の検出手法を用いて、発光粒子のブラウン運動による移動のし易さを表す指標値、典型的には、発光粒子の拡散係数を測定する新規な方法を提供することである。また、本発明のもう一つの課題は、FCS等の光分析技術により良好な精度にて計測可能な発光粒子濃度よりも低い濃度の試料溶液中に於ける発光粒子のブラウン運動による移動のし易さを表す指標値又は発光粒子の拡散係数を測定する方法を提供することである。本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子の拡散特性値を測定する方法であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する過程と、光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程と、検出された発光粒子の光を表す信号のうち、同一の発光粒子に対応する複数の信号を抽出する過程と、抽出された信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて抽出された信号に対応する発光粒子の拡散特性値を算出する過程とを含むことを特徴とする方法によって達成される。かかる構成に於いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。。更に、拡散特性値とは、粒子のブラウン運動による移動のし易さを表す任意の指標値であってよく、典型的には、粒子の拡散係数であるが、その他の物理量、例えば、並進拡散時間、任意の拡散係数の関数であってもよい。なお、本明細書に於いて、信号という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。上記の本発明の方法に於いては、走査分子計数法と同様に、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出される。かかる構成に於いて、光検出領域を所定の経路に沿って周期的に移動する場合、光検出領域が或る位置で或る発光粒子を包含した後に所定の経路を周回して前記の発光粒子を包含した位置の付近に到達する間に、その発光粒子が光検出領域の所定の経路から逸脱しないときには、その発光粒子は、再び光検出領域に包含され、その光が検出されることとなる。しかしながら、発光粒子は、光検出領域が所定の経路を一周する間にブラウン運動により、その位置が移動しているので、発光粒子が最初に検出された時間と次に検出された時間との間隔、即ち、発光粒子の信号の発生時間の間隔は、光検出領域の移動周期に完全に一致せず、光検出領域の移動周期からずれることとなり、かかる光検出領域の移動周期からのずれ時間には、発光粒子のブラウン運動による移動のし易さが反映されていることが期待される。そこで、本発明では、上記の如く、光強度データ上に於いて検出された発光粒子の光を表す信号のうちで同一の発光粒子に対応する複数の信号が抽出され、それらの抽出された信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて抽出された信号に対応する発光粒子の拡散特性値が算出される。かかる構成によれば、光検出領域の所定の経路に発光粒子が進入すれば、その拡散特性値を個別に測定できるので、FCS等の光分析技術に於ける蛍光強度のゆらぎの算出のための統計的処理は必要なく、試料溶液中の発光粒子濃度がFCS等で良好な測定結果を得るに必要なレベルよりも低い場合でも、発光粒子の拡散特性値が得られる点で有利である。また、本発明の方法によれば、光強度データ一次元のデータ上に於ける信号の発生時間に基づいて拡散特性値が算出されることから、演算負荷が然程に大きくならない点でも有利である。なお、上記の方法により検出される発光粒子の変位は、光強度データ上で同一の発光粒子の信号として抽出された信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の周期からのずれ時間と光検出領域の移動速度とから算出される。従って、上記の拡散特性値の算出に於いては、かかる発光粒子の変位がまず算出され、その発光粒子の変位に基づいて、発光粒子の拡散特性値が算出されるようになっていてよい。特に、拡散係数Dは、或る時間tに於ける粒子の変位xから<xt>2=2Dt...1ここで、<xt>は、変位の平均により定義されるので、かかる式1の関係を用いて、発光粒子の変位に基づいて算定されてよい。また、光強度データ上で同一の発光粒子の信号として抽出された信号の発生時間の間隔は、必ずしも時間的に隣接する信号の発生時間の差ではなく、複数の連続した前記の抽出された信号のうちのいずれか二つの信号の発生時間の時間差であってよいことは理解されるべきである。例えば、n個の信号が同一の発光粒子の信号として抽出された場合、n個の信号のうちの二つの信号の組合せの全てについて、二つの信号の発生時間の間隔が、拡散特性値又は拡散係数の算出に用いられてよい。即ち、n個の信号が抽出された場合には、nn-1/2個の信号の発生時間の間隔の値が得られ、それらの発生時間間隔の値を用いて拡散特性値又は拡散係数が算出されてよい。かかる手法によれば、隣接する信号の発生時間の差から粒子の変位を逐次計測する場合よりも、少ない測定時間で多くの変位値が得られ、信頼性の高い算出結果が得られる点で有利である。更に、上記の光強度データ上の信号から、同一の発光粒子に対応する複数の信号を抽出する過程に於いては、検出された発光粒子の光を表す信号のうち1つの信号の発生時間に光検出領域の周期を加算した時間から光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定される時間幅内に発生した信号が前記の1つの信号に対応する発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判定されてよい。上記の如く、本発明の方法に於いては、一つの発光粒子を連続的に追跡するのではなく、光検出領域が所定の経路を周回する毎に同一の発光粒子を周期的に検出し、その信号の発生時間の間隔又は変位から拡散特性値又は拡散係数を算出する。従って、光検出領域が周回する時間周期に於いて、発光粒子の平均的な変位が光検出領域の大きさを超えるほど拡散特性値又は拡散係数が大きい場合には、同一の発光粒子の信号を周期的に検出できない可能性がある。即ち、逆に言えば、光検出領域が周回する時間に於ける発光粒子の変位が光検出領域の大きさよりも小さい場合には、その発光粒子の信号の間隔は、光検出領域の周期に、光検出領域の寸法を光検出領域が移動するのに要する時間幅の半分を加算又は減算した値の範囲内となる。そして、光検出領域の寸法を光検出領域が移動するのに要する時間幅は、光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定されるので、結局、或る信号と、その信号が発生した後、光検出領域の周期に光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定される時間幅の半分を加算又は減算した値の範囲内に発生した信号とは、同一の発光粒子の信号であると考えられる。かくして、上記の如く、1つの信号の発生時間に光検出領域の周期を加算した時間を中心とする光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定される時間幅内に発生した信号を前記の1つの信号に対応する発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判定する態様により、同一の発光粒子の信号を抽出することが可能となる。光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定される時間幅ΔTは、具体的には、光検出領域の直径dと移動速度vからΔT=d/v...2により与えられてよい。更にまた、本発明の方法に於いて、光強度データ上に於いて複数の発光粒子からの光を表す信号が存在している場合には、それらの複数の発光粒子の各々について別々に拡散特性値又は拡散係数が算出されてよい。本発明の方法によれば、光検出領域が所定の経路を周回する間に、経路上に複数の発光粒子が存在していれば、それらは、別々に検出される。従って、それらの発光粒子の信号を、発光粒子毎に抽出すれば、それぞれについて拡散特性値又は拡散係数が算出可能である。かかる構成によれば、一つの光強度データ上で、複数の発光粒子の拡散特性値又は拡散係数を得ることができ、少ない測定時間で多くの結果が得られる点で有利である。上記の本発明の構成に於ける光検出領域の位置を移動する過程に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、1つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、1つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。更に、上記の光検出領域の位置を移動する過程に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、発光粒子の拡散移動速度ブラウン運動による粒子の平均の移動速度よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の方法では、光検出領域が包含した1つの発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、1つの発光粒子から複数回、その存在を表す信号が検出されてしまう可能性があり、検出された信号と1つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、光検出領域が所定の経路を一周する間に於いて1つの発光粒子を、1つの信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性特に、拡散特性値又は拡散係数に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動経路は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。なお、本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、試料溶液中の発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなくアーティファクトの無い状態で安定した状態にて、光の計測が可能である例えば、試料に流れを発生させる場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の発光粒子又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。また、流れのある液体中の粒子の変位からのその拡散係数の算出は複雑である。。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、FCS等の場合と同様に微量1~数十μL程度の試料溶液にて計測及び分析が可能である。本発明の方法は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなどの溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。総じて、本発明の方法によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡に於いて、その光検出領域により試料溶液中を走査することにより、発光粒子の存在を個別に検出すると共に、その発光粒子の拡散特性値又は拡散係数が測定できることとなる。そして、拡散特性値又は拡散係数は、粒子の大きさ及び形状を反映した値であるので、本発明の方法による測定によって、粒子の同定、粒子の大きさ及び形状、それらの変化の検出、或いは、粒子の結合解離反応又は分散凝集といった種々の現象の検出及び分析が可能となる。上記の本発明の方法に於ける拡散特性値又は拡散係数の測定は、新規な原理によるものであり、従前の拡散係数の測定又は推定方法とは異なるいくつかの特徴を有している。例えば、FCSによれば、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子の並進拡散時間が算出され、その並進拡散時間から発光粒子の拡散係数を見積もることが可能であるが、FCSの並進拡散時間は、測定時間中の蛍光強度の自己相関関数を先ず演算し、かかる自己相関関数から得られる値であり、そこから算定される拡散係数は、試料溶液中の多数の発光粒子の平均の値である。従って、試料溶液中に種類の異なる発光粒子が存在している場合、演算処理が複雑となるので、例えば、観測対象となる粒子に発光プローブを付加して、かかる粒子について、FCSによる測定をする場合には、観測対象粒子に結合していない発光プローブを除去するための精製処理が必要となり得る。また、既に述べた如く、FCSで良好な精度にて蛍光強度の自己相関関数を演算するには、試料溶液中の発光粒子濃度が、測定時間中、常に1つ以上の発光粒子が存在するレベルである必要がある。これに対し、本発明の方法によれば、発光粒子の存在及びその位置を個別に検出して、各粒子の個別の拡散特性値又は拡散係数を算出することが可能である。従って、測定を良好な精度にて実行可能な試料溶液中の発光粒子濃度は、FCSの場合よりも大幅に低くてもよく、また、信号の特性等によって発光粒子の種類が見分けられる場合には、試料溶液中に種類の異なる発光粒子が存在しているか否かは、拡散特性値又は拡散係数の算出の難易度にあまり影響しないので、発光プローブが付加された粒子について測定する場合にも、発光プローブの除去は必須ではなくなるといった利点が得られる。また、従来技術の粒子の拡散係数を算出可能な別の例として、SMTSingleMoleculetrackingやRICSRasterImagingCorrelationSpectroscopy非特許文献5によれば、光学顕微鏡下で撮影された画像に於いて、溶液中の発光粒子のブラウン運動を追跡し、その二次元の粒子の運動から拡散係数を見積もることが可能であるが、これらの場合、二次元データ画像データの解析を要し、また、発光粒子の速い動きを捉えることが困難である粒子の変位の時間分解能は、例えば、ビデオレートにより制約を受ける。。これに対し、本発明の方法に於いては、拡散特性値又は拡散係数は、一次元データ時系列の光強度データを用いて算出されるため、画像データの解析演算に比して、演算負荷が軽く、また、光検出領域の移動速度及び/又は経路の長さを適宜調節することによって、SMT、RICSの場合に比して動きの速い粒子の拡散係数を発光粒子毎に個別に測定可能である。かくして、本発明の方法に従って、発光粒子を個別に検出し、その拡散特性値又は拡散係数を個別に算出する手法によれば、上記の如く、従前の拡散特性値又は拡散係数の測定又は推定方法にはない幾つかの利点が得られる。特に、本発明では、発光粒子を個別に検出するようになっていることから、試料溶液中で相対的に濃度が低い発光粒子であって、その光が従前の方法ではその他の発光粒子からの光に埋没してしまう発光粒子であっても、検出可能であり、その拡散特性値又は拡散係数が測定可能となる。本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。光分析装置の構成本発明による方法は、基本的な構成に於いて、図1Aに模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図1Aを参照して、光分析装置1は、光学系2~17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光Exが、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1~数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域励起領域が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光Emは、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1Bに模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図1Bに例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1~10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカルボリュームと称される。コンフォーカルボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール13を通過した光は、ダイクロイックミラー14aを経て、バリアフィルター14を透過してここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。、マルチモードファイバー15に導入されて、対応する光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、1つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。また、上記の光分析装置の光学系に於いて、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図1Cに模式的に例示されている如く、反射ミラー7の向きを変更するミラー偏向器17が採用されてよい。かかるミラー偏向器17は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器17は、コンピュータ18の制御の下、光検出器16による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動経路は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよいコンピュータ18に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。。なお、図示していないが、対物レンズ8を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。なお、追加的な構成として、顕微鏡のステージ図示せずには、観察するウェル10を変更するべく、マイクロプレート9の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置17aが設けられていてよい。ステージ位置変更装置17aの作動は、コンピュータ18により制御されてよい。発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域光検出領域のみで光の放出があるので、ピンホール13は、除去されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。また、発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系2~5が省略されてよい。更に、光分析装置1に於いては、図示の如く、複数の励起光源2が設けられていてよく、発光粒子を励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器16も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。本発明の方法の原理発明の概要の欄に記載されている如く、本発明の方法によれば、端的に述べれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域の位置を試料溶液内にて所定の経路に沿って周期的に移動しながら、試料溶液中にて分散する発光粒子が光検出領域内に包含される際に放出する光を検出して発光粒子の存在を個別に検知する走査分子計数法に於いて、光検出領域が所定の経路を周回する間の発光粒子の位置のずれが反映される発光粒子の信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいてその発光粒子の移動し易さ、即ち、発光粒子の拡散特性値又は拡散係数が算出される。かかる構成によれば、試料溶液中の発光粒子の各々を個別に検出し、その拡散特性値又は拡散係数が個別に測定されることになるので、試料溶液中の発光粒子濃度がFCS等の蛍光ゆらぎの大きさの算出のための統計的処理を要する分光分析技術で良好に測定可能な濃度よりも低い場合でも、発光粒子の拡散特性値又は拡散係数の測定が可能となる。以下、走査分子計数法及び本発明による拡散特性値又は拡散係数の測定方法の原理について説明する。1走査分子計数法の原理FCS等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FCS等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図10Aに模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度フォトンカウントが検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図10Bに描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号フォトンカウントが、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。そこで、本願出願人は、特願2010-044714及びPCT/JP2011/53481に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きFCS、FIDA等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく走査分子計数法を提案した。走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構ミラー偏向器17を駆動して光路を変更し、図2にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域CVの位置を移動しながら、即ち、光検出領域CVにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図2Aの如く、光検出領域CVが移動する間図中、時間to~t2に於いて1つの発光粒子の存在する領域を通過する際t1には、発光粒子から光が放出され、図2Bに描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度Emのパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域CVの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図2Bに例示されている如きパルス状の信号有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、発光粒子の特性に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、FCS、FIDA等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の特性に関する情報が取得可能である。2.本発明による発光粒子の拡散特性値の測定の原理上記の走査分子計数法に於いて、図3Aに模式的に描かれている如く、光検出領域CVは、試料溶液中で、所定の経路例えば、半径Rの円環を通過するよう循環される。かかる光検出領域の移動の間、発光粒子は、ブラウン運動により、位置が移動するところ、一度検出された発光粒子一度光検出領域に包含された発光粒子が、光検出領域が所定の経路を周回する間に、光検出領域の通過する空間領域から逸脱しない場合には、その発光粒子は再び検出されることとなる。特に、発光粒子のブラウン運動の速度が比較的低いときには、一度検出された発光粒子は、しばらくの間、光検出領域の周回毎に光検出領域に包含されることとなるので、光強度データ上に於いて、発光粒子の光を表す信号が、図3Bに模式的に例示されている如く、概ね、光検出領域が所定の経路を一周する時間移動周期tcycle毎に周期的に検出される。しかしながら、かかる周期的に検出される信号の発生時間の間隔は、光検出領域の移動周期に完全には一致しておらず、光検出領域が所定の経路を周回する時間に於ける発光粒子のブラウン運動による位置の移動に依存して光検出領域の移動周期に対して増減する、即ち、移動周期からのずれ時間が生ずることとなる。そこで、本発明に於いては、上記の周期的に検出される信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて、発光粒子のブラウン運動による移動のし易さ、即ち、拡散特性値の算出が試みられる。なお、以下、拡散特性値として、拡散係数を算出する例について説明されるが、その他の拡散特性値についても信号の発生時間の間隔に於ける移動周期からのずれ時間に基づいて適宜算出できることは理解されるべきであり、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。周期的に検出される発光粒子の信号の発生時間と発光粒子の拡散係数は、具体的には、以下の如く関係づけられる。まず、図3Cの左に示されている如く、時刻t=toに或る発光粒子が光検出領域に包含され、その発光粒子の信号が発生した後、光検出領域が移動周期tcycleにて所定の経路を、k回kは、正の整数、周回して同一の発光粒子を包含してその信号が検出されるとき、図3Cの右に示されている如く、発光粒子は位置を移動しているので、信号の発生時間t=tkは、t=tk=toktcycleΔt...3により与えられる。ここで、Δtは、発光粒子の位置の移動による発光粒子が光検出領域に包含される時刻のずれ、即ち、二つの信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間であるΔtは、正又は負で有り得る。。従って、ktcyclek周期に於ける光検出領域の移動方向に沿った発光粒子の位置の変位xktcycleは、光検出領域の移動速度vを用いて、x=vΔt...4により与えられる。ところで、粒子の拡散係数Dと時間tに於ける粒子の一次元の変位xtの関係は、アインシュタイン-スモルコフスキーの式より、<xt>2=2Dt...5により与えられる。かくして、式3、4を用いて、周期的に検出される信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間から発光粒子の位置の変位xを算出し、それらの変位を用いて、式5により、拡散係数Dを算定することが可能となる。ところで、或る光検出領域の移動周期tcycleに於ける発光粒子の平均的な変位が光検出領域の大きさを超えるほど拡散係数が大きい場合には、同一の発光粒子の信号を光検出領域の周回毎に捉えることが困難となる。なぜなら、光検出領域により一度包含された発光粒子は、その移動方向が、偶然、光検出領域の通過領域所定の経路に沿っていれば、光検出領域の周回後に再度光検出領域により包含されるが、発光粒子はランダムな方向に運動するので、光検出領域の一周期に於ける発光粒子の平均的な変位が光検出領域の大きさを超えるほど大きいときには、発光粒子は、光検出領域により一度包含された後、光検出領域の通過領域から逸脱し、光検出領域の周回後に再度光検出領域により包含されなくなる可能性が高いためである。従って、上記の拡散係数Dの算定を確実に達成するべく周期的な信号を捉えるためには、図3Dに例示されている如く、光検出領域の移動周期tcycleに於ける発光粒子の3次元の変位lが光検出領域の直径2rを超えないように、光検出領域の移動周期tcycleが調整されることが好ましい。即ち、本発明の方法により拡散係数の測定をする場合には、好適には、光検出領域の移動周期tcycleは、2r2>2δDtcycle...6ここで、δは、次元であり、ここでは、δ=3である。を満たすよう調整される。なお、実際の測定に於いては、検査されるべき発光粒子の予想される拡散係数に於いて、上記の式6の条件が成立するよう光検出領域の移動周期tcycleが調整されてよい。処理操作過程図1Aに例示の光分析装置1を用いた本発明の方法による発光粒子の拡散係数の測定方法の実施形態に於いては、具体的には、1発光粒子を含む試料溶液の調製過程、2試料溶液の光強度の測定処理過程、及び3測定された光強度の分析処理過程が実行される。図4は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。1試料溶液の調製本発明の方法に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識蛍光分子、りん光分子、化学生物発光分子が任意の態様にて付加された粒子であってよい。2試料溶液の光強度の測定本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器17を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動試料溶液内の走査を行いながら、光強度の測定が為される図4-ステップ100。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、記憶装置図示せずに記憶されたプログラム試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、光源2から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器17がミラー7ガルバノミラーを駆動して、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎BINTIMEに、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、一般的には、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図5Aに模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化発光粒子からの光を表す信号を特定することが困難となる。そこで、好適には、図5Bに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略同様となり粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。図6A上段参照。、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度拡散移動速度よりも速く設定される。具体的には、拡散係数Dを有する発光粒子がブラウン運動によって半径rの光検出領域コンフォーカルボリュームを通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式2r2=6DΔτ...7から、Δτ=2r2/6D...8となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度拡散移動速度Vdifは、概ね、Vdif=2r/Δτ=3D/r...9となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、D=2.0×10-10m2/s程度であると予想される場合には、rが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10-3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の15mm/sと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル典型的には、励起光強度分布と略同様となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。更に、本発明の方法に於いては、既に述べた如く、光検出領域の移動周期tcycleは、好適には、検査されるべき発光粒子の拡散係数Dに対して、式6の条件が成立するよう設定される。例えば、図3Aに例示されている如く、光検出領域の移動経路が円形であるときには、光検出領域の移動周期tcycle、移動速度v及び移動経路の半径Rの関係は、2πR=vtcycle...10により与えられるので、式6から、光検出領域の移動速度vは、v>3πR/r2D...11も成立するよう設定される。3光強度の分析上記の処理により試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出、同一の発光粒子の信号の抽出、拡散係数の算出が実行される。i発光粒子に対応する信号の検出時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図5Bに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する図8B参照。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布:I=Aexp-2t2/a2...12であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイルバックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイルに対して式12をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ図6A、最上段検出結果未処理に対して、スムージング平滑化処理が為される図4-ステップ110、図6A中上段スムージング。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度走査速度、BINTIMEに応じて適宜設定されてよい。次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号以下、パルス信号と称する。が存在する時間領域パルス存在領域を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算されるステップ120。時系列光強度データの時間微分値は、図6A中下段時間微分に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定されるステップ130。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ図6A下段釣鐘型関数フィッティング、釣鐘型関数のパルスのピーク最大値の強度Ipeak、パルス幅半値全幅Wpeak、フィッティングに於ける最小二乗法の相関係数等のパラメータが算出されるステップ140。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定されるステップ150。かくして、図6B左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図6B右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。上記のステップ130~150の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよいステップ160。また、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。ii同一の発光粒子の信号の抽出図4-ステップ170時系列光強度データ上に於ける発光粒子のパルス信号の検出が為されると、それらのパルス信号のうちから、同一の発光粒子の信号の抽出が為される。上記までの説明から理解される如く、同一の発光粒子の信号は、光検出領域の移動周期に完全に一致しないが概ね等しい周期にて連続的に出現する。そこで、同一の発光粒子の信号の抽出は、光検出領域の移動周期に概ね等しい周期にて連続的に出現する信号を任意の手法又はアルゴリズムにより選択することにより為されてよい。例えば、最も単純には、実験者が時系列光強度データ上に於いて光検出領域の移動周期に概ね等しい周期にて連続的に出現する信号を目視によって特定することにより、同一の発光粒子の信号が抽出されてよい。また、既に触れたように、本発明の方法では、有意に発光粒子の拡散係数が算出できるよう周期的な信号を捕捉可能にすべく、好適には、観測対象の発光粒子の光検出領域の周回毎の平均的な変位が光検出領域の大きさを超えない程度となるよう光検出領域の移動周期が調整される式6参照。その場合、一旦検出された発光粒子の光検出領域の周回後に於ける位置は、光検出領域の範囲内にあることが期待される。即ち、或る一つの発光粒子の信号が検出された後、光検出領域の一周期が経過する時間を中心として、光検出領域がその移動方向の大きさ直径dを移動する時間に相当する時間幅、ΔT=d/v...2の範囲内に発生した信号は、前記の一つの発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判断できる。そこで、同一の発光粒子の信号の抽出方法の一つとして、時系列光強度データ上に於いて、1つの発光粒子の信号の発生時間に光検出領域の周期を加算した時間を中心とする時間幅ΔTの範囲内に発生した信号が、前記の1つの信号に対応する発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判定するアルゴリズムが採用されてよい。より具体的には、図7Aに模式的に例示されている如く、例えば、或る発光粒子の信号αiを選択した後、その選択された信号αiの発生時刻ピーク時であってよい。から光検出領域の一周期が経過する時間を中心として、時間幅ΔTの範囲内に信号αiiが存在する場合には、その信号αiiが信号αiと同一の発光粒子の信号として選択される。しかる後、更に、選択された信号αiiの発生時刻から光検出領域の一周期が経過する時間tcycleを中心として、時間幅ΔTの範囲内に信号αiiiが存在する場合には、その信号αiiiが既に選択された信号αi、αiiと同一の発光粒子の信号として選択される。かくして、新たに信号が選択される毎に、その選択された信号の発生時刻から光検出領域の一周期が経過する時間を中心として時間幅ΔTの範囲内に存在する信号を選択する処理を順に反復して実行することにより、時系列光強度データ上に於いて、同一の発光粒子の一連の信号信号群を抽出することが可能となる。なお、最初に選択された信号の発生時刻を基準として、光検出領域の移動周期tcycleが経過する毎に、各周期が終了する時間を中心として、時間幅ΔTの範囲内に存在する信号が最初に選択された信号と同一の発光粒子の信号として選択されるようになっていてもよい。また、光検出領域の通過領域に複数の発光粒子が進入する場合には、図7Aに例示されている如く、或る周期的に出現する信号の群αの間に、別の周期的に出現する信号の群βが出現することとなる。その場合には、その別の周期的に出現する信号の群についても上記と同様のアルゴリズムに従って、信号が逐次的に抽出されるようになっていてよい。即ち、一つの時系列光強度データ上に於いて、複数の周期的に出現する信号の群が存在する場合には、それらの信号群は、それぞれ、個別に抽出されてよい。実際の抽出処理に於いては、例えば、時系列光強度データに於いて、最初に或る一つの信号αiを選択して、その一つの信号を基準として、上記の如き態様にて一群の周期的な信号が抽出された後、抽出された信号群に選択されなかった一つの信号βiを基準として、上記の如く一つの周期的な信号の群βii,...が抽出される。かかる処理を繰り返して、一つの時系列光強度データ上にて、複数の信号群が抽出されてよい。上記の信号抽出方法は、特に、時系列光強度データ上に多数の発光粒子の信号が検出されている場合、コンピュータによって自動的に信号を抽出する際に有利に用いられる。iii発光粒子の変位の算出図4-ステップ180上記の如く発光粒子毎に同一の発光粒子の信号群が抽出されると、各信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて発光粒子の変位が見積もられる。既に触れたように、光検出領域が所定の経路をk周する時間ktcycleの発光粒子の変位は、k回の光検出領域の周回に於ける最初の信号の発生時間toと最後の信号の発生時間tkとの間に於けるk周期に相当する時間ktcycleからのずれ時間Δt=tk-to-ktcycle...13を用いて、式4にて算出される。従って、発光粒子の変位の算出に於いては、典型的には、抽出された信号群に於ける信号のうちから二つの信号の組合せの全てについて、式13により、ずれ時間Δtが算出され、算出されたΔtに光検出領域の移動速度vが乗ぜられて式4により、各信号の発生時間の間隔に於ける発光粒子の変位xが算出されてよい。例えば、図7Bの如く、5個の信号が略周期的な信号が検出されているとすると、光検出領域の移動の1周期、2周期、3周期及び4周期に相当する時間に於けるずれ時間粒子の変位を与える信号の組合せ数は、それぞれ、4組1、5、8、10、3組2、6、9、2組3、7及び1組4となり、全部で、10個のずれ時間及び粒子の変位のデータが算出されることとなる。そして、発光粒子の信号群の信号数がn個であるときには、1~n-1周期に相当する時間の各々に対して、ずれ時間及び粒子の変位のデータが得られ、データの総数は、nn-1/2個となる。iv拡散係数の算出図4-ステップ190かくして、上記のステップ180に於ける処理により、一つの発光粒子の、光検出領域の移動時間周回数×移動周期の各々に於ける粒子の変位が算出されると、式5の関係を用いて、その発光粒子の拡散係数Dが算出される。例えば、一つの態様に於いては、図7Cに模式的に例示されている如く、時間周回数×移動周期に対するステップ180で得られた粒子の変位の二乗値x2のプロットに対して、最小二乗法等により直線をフィッティングし、その直線の傾き=2Dから、拡散係数Dが算出されてよい直線のフィッティングに於いては、粒子の変位の二乗値x2図中、×に対して直線をフィッティングが為されるか、周期毎の粒子の変位の二乗値x2の平均値図中、●に対して直線をフィッティングが為されてよい。。また、それぞれの粒子の変位xについて、D=x2/2ktcycle...14を算出し、算出されたDの平均値をその発光粒子の拡散係数としてもよい。かくして、上記の本発明の方法によれば、光検出領域により試料溶液中にて走査して発光粒子を個別に検出する走査分子計数法に於いて、発光粒子の拡散係数を測定することが可能となる。既に述べた如く、拡散係数は、粒子の大きさや形状を反映した物理量であるので、本発明によれば、任意の観測したい粒子に発光標識を付与することによって発光粒子とし、かかる発光粒子の拡散係数を測定することによって、観測したい粒子の大きさ、構造又はそれらの変化、或いは、種々の分子間相互作用に関する情報を得ることが可能となる。特に、本発明に於いては、光検出領域の移動周期を調整することにより、測定可能な拡散係数の大きさが可変となるので、比較的広範囲の種類の粒子の拡散係数を測定可能であることが期待される。実際の測定に於いては、光検出領域の移動周期は、観測対象粒子の周期的な信号が得られるよう予備実験を通じて、適切な値に調整されてよい。上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。発光粒子の拡散係数の測定本発明の方法により発光粒子の拡散係数が測定されることを検証した。試料溶液として、SYTOXOrangeインビトロジェン社、CatNoS11368を10nMにて含むリン酸緩衝液0.05Tween20を含む中に、観測対象粒子として、プラスミドpBR322、タカラバイオ株式会社、CatNo3035を、その濃度が1pMとなるように溶解した溶液を調製した。なお、SYTOXOrangeは、DNAプラスミドに結合すると、蛍光強度が約500倍増大する蛍光色素である。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた1分子蛍光測定装置MF20オリンパス株式会社を用い、上記の2試料溶液の光強度の測定にて説明した態様に従って、上記の試料溶液について、時系列光強度データフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、633nmのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、660-710nmの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域は、10m秒の移動周期及び15mm/秒の移動速度にて、円形半径約23.9μmの経路を循環させた。また、BINTIMEを10μ秒とし、測定時間は、2秒間とした。光強度の測定後、上記の3i発光粒子に対応する信号の検出に記載された処理手順に従って、試料溶液について取得された時系列光強度データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小二乗法によりフィッティングして、ガウス関数に於けるピーク強度、パルス幅半値全幅、相関係数を決定した。そして、下記の条件20μ秒<パルス幅<400μ秒ピーク強度>1.0[pc/10μs]...A相関係数>0.95を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視した。図8Aは、上記の2秒間の測定により得られた光強度データのうちの1.5~1.6秒に於けるデータに於いて、光検出領域の移動周期である約10m秒にて周期的に出現した発光粒子の光を表す信号1~5の例を示している。いずれの信号も、時間方向について拡大した図を観察すると、図8Bに示されている如く、概ね、釣鐘状のパルス状の信号であった。上記の各信号のピーク時刻は、以下の通りであった単位は、m秒。信号11510.741信号21520.726信号31530.738信号41540.767信号51550.825これらの一連の信号の周期は、光検出領域の移動周期に略等しく、同一の発光粒子の信号であると考えられる。そこで、上記の信号のピーク時刻を用いて、iii発光粒子の変位の算出に記載されている要領にて、5つの信号のうちの二つの信号の組合せの全てについて、式13により、信号の発生時間の間隔に於ける移動周期に相当する時間周期数×移動周期からのずれ時間Δtを算出し、更に、式4により発光粒子の変位xを算出した。図8Cは、かくして算出された変位xの二乗値x2を時間周期数×移動周期に対してプロットした図である各点は、各時間に於ける変位xの二乗値の平均値である。。図から理解される如く、変位xの二乗値x2の平均値は、時間に対して略比例した。このことは、変位xの二乗値x2の平均値と時間との間に式5にて表される関係が成立しており、上記の信号の発生時間の間隔に於ける移動周期に相当する時間からのずれ時間Δtに基づいて、ブラウン運動による発光粒子の変位xが算定できることを示している。なお、図8Cのプロットに対して、最小二乗法により直線をフィッティングして得られた直線の傾き=2Dから得られた拡散係数Dは、3.89×10-11[m2/s]であった。更に、上記の2秒間の測定により得られた光強度データの全体図9に於ける発光粒子の信号から、同一の発光粒子に対応する信号の組の全てを別々に抽出し、発光粒子毎に拡散係数を算定した。信号の抽出に於いては、ii同一の発光粒子の信号の抽出に於いて述べた如く、光強度データ上で、最初に一つの発光粒子の信号を選択した後、その選択された信号のピーク発生時刻から光検出領域の移動周期tcycleが経過する時間を中心として、式2で与えられる時間ΔTの範囲内に存在する信号を最初に選択された信号と同一の発光粒子の信号として選択し、更に、新たに選択された信号のピーク発生時刻から光検出領域の移動周期tcycleが経過する時間を中心として、式2で与えられる時間ΔTの範囲内に存在する信号を選択する処理を繰り返して、一群の信号を抽出した。次いで、前の信号群に選択されなかった一つの信号を基準として、上記の如く一つの周期的な信号の群を抽出する処理を繰り返して、一つの時系列光強度データ上にて、複数の信号群を抽出した。図9の例では、式2で与えられる時間ΔTは、ΔT=53μ秒に設定したd=0.8μm、v=15mm/秒を用いて演算。。その結果、図9の光強度データ上で発光粒子の信号の総数は、7188個であったところ、光検出領域の移動周期毎に2回以上周期的に発生した信号の組の数は、1708組であった周期的に発生した信号の総数は、4156個であった。。かかる信号の組の数は、発光粒子の数に対応するので、本実施例の場合、2秒間の測定による一つの光強度データに於いて、1708個の発光粒子の拡散係数の値が得られることとなる。かくして、検出された1708組の信号群の各々について、式13に従って、信号の発生時間の間隔に於ける移動周期に相当する時間からのずれ時間Δtを算出した後、式4に従ってΔtから算出される変位xの二乗値x2と光検出領域の移動時間周回数×移動周期とから、式5の関係を用いて、拡散係数を算出したところ、拡散係数は、平均9.9×10-12[m2/s]であった。上記の観測対象粒子プラスミドpbr322を10nMにて含む溶液についてFCSによる測定1分子蛍光測定装置MF-20を使用を行って得られた観測対象粒子の拡散係数は、4.0×10-12[m2/s]であった。また、観測対象粒子の比容を1.0cm3/gとして、観測対象粒子が球状であると仮定した場合に、ストークスアインシュタインの式D=κBT/6πηrより、理論的に算定される拡散係数は、2.2×10-11[m2/s]となり、観測対象粒子が棒状であると仮定した場合直径4nm、長さ680nmと仮定の理論的に算定される拡散係数は、4.2×10-12[m2/s]となる非特許文献6の式8による補正を用いた。。かくして、上記の本実施例に於ける拡散係数の結果値は、FCSによる方法及び理論値とオーダーが略一致しており、このことは、本発明の方法により、粒子の拡散係数の測定が可能であることを示している。かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、上記の本発明の方法によれば、走査分子計数法に於いて発光粒子の拡散係数の測定が可能となる。特に、本発明の方法は、光強度データ上に於ける周期的に発生する発光粒子の信号を個別に検出して、その信号の発生時刻に基づいて拡散係数を算出するよう構成されているので、本発明の方法によれば、試料溶液中の発光粒子濃度が、FCS等の光分析技術で要求される濃度域よりも低くても、発光粒子の拡散係数の測定が可能であり、かかる特徴は、医学生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合に有利であろう。また、本発明の方法では、拡散係数が一次元の光強度データ上に於ける周期的に発生する発光粒子の信号の発生時刻に基づいて算出されるので、演算負荷は比較的低く、一つの発光粒子の拡散係数の算出に要する演算量又は時間は、SMT等の画像処理を用いる方法に比して軽減されることが期待される。なお、上記に於いては、走査分子計数法を用いて拡散係数を測定する例について詳細に説明されているが、信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて拡散係数以外の拡散特性値が算出可能であることは理解されるべきであり、そのような場合も本発明の範囲に属する。例えば、信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて算出される時間に対する粒子の変位の二乗値のプロットの傾き、並進拡散時間が算出され、粒子の大きさ又は構造変化や分子間相互作用の評価に用いられても良い。"