"TIP41タンパク質の発現または活性抑制剤を含有する、TRAIL感受性増進用組成物。前記のTIP41タンパク質が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有していることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。前記のTIP41タンパク質の発現抑制剤が、TIP41遺伝子のmRNAに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉RNAshortinterferingRNAおよび低分子ヘアピン型RNAshorthairpinRNAからなる群から選択されたいずれか1つであることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。前記のTIP41タンパク質の活性剤が、TIP41タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体、および天然物からなる群から選択されたいずれか1つであることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。TRAILを用いた癌、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療に使用されることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。前記の癌が、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎臓癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項5に記載の組成物。TIP41タンパク質の発現または活性抑制剤を含有する抗癌補助剤。前記のTIP41タンパク質が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有していることを特徴とする、請求項7に記載の抗癌補助剤。前記のTIP41タンパク質の発現抑制剤が、TIP41遺伝子のmRNAに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉RNAshortinterferingRNAおよび低分子ヘアピン型RNAshorthairpinRNAからなる群から選択されたいずれか1つであることを特徴とする、請求項7に記載の抗癌補助剤。前記のTIP41タンパク質の活性剤が、TIP41タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体および天然物からなる群から選択されたいずれか1つであることを特徴とする、請求項7に記載の抗癌補助剤。前記の癌が、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎臓癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項7に記載の抗癌補助剤。前記のTIP41タンパク質の発現または活性阻害剤が、TRAIL感受性を増進させることを特徴とする、請求項7に記載の抗癌補助剤。請求項7~請求項12のいずれか1項に記載の抗癌補助剤を含む、癌の治療または予防用組成物。1実験群として、癌細胞株に被検物質を処理する工程、2工程1の処理された細胞株でTIP41とPP2AcまたはMKK7タンパク質の結合水準を確認する工程、および3工程2のTIP41とPP2AcまたはMKK7タンパク質の結合水準を対照群と比較して減少させる被検物質を選別する工程を含む、癌の予防または治療剤のスクリーニング方法。癌細胞株が、TRAIL耐性の癌細胞株であることを特徴とする、請求項14に記載の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法。工程2のタンパク質の結合水準が、免疫沈降法immunoprecipitation、酵素免疫分析法ELISA、ウエスタンブロット法WesternBlotting、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGlutathione-S-TransferaseGSTプルダウン分析、タンパク質チップProteinChip、蛍光共鳴エネルギー移動FluorescenceResonanceEnergyTransfer、FRET、蛍光蛋白質再構成法Bimolecularfluorescencecomplementation、BiFCおよび酵母ツーハイブリッドYeasttwo-hybrid、Y2Hからなる群から選択されたいずれか1つで測定することを特徴とする、請求項14に記載の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法。1実験群として、癌細胞株に被検物質を処理する工程、2工程1の処理された細胞株でMKK7タンパク質の活性程度を測定する工程、および3工程2のMKK7タンパク質活性が対照群と比較して増加した被検物質を選別する工程を含む、癌の予防または治療剤のスクリーニング方法。癌細胞株が、TRAIL耐性癌細胞株であることを特徴とする、請求項17に記載の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法。MKK7タンパク質の活性程度が、免疫蛍光法、酵素免疫分析法ELISA、質量分析およびタンパク質チップからなる群から選択されたいずれか1つで測定することを特徴とする、請求項17に記載の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法。1実験群として、癌細胞株に被検物質を処理する工程、2工程1で処理された細胞株でPP2Acタンパク質の発現程度を測定する工程、および3工程2のPP2Acタンパク質の発現量を対照群と比較して減少させた被検物質を選別する工程を含む、癌の予防または治療剤のスクリーニング方法。癌細胞株が、TRAIL耐性癌細胞株であることを特徴とする、請求項20に記載の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法。工程2のPP2Acタンパク質の発現程度が、逆転写重合酵素の連鎖反応ReverseTranscription-PolymerasechainReaction、RT-PCR、酵素免疫分析法ELISAの免疫組織化学、ウエスタンブロット法WesternBlottingおよび流細胞分析法FACSからなる群から選択されたいずれか1つで測定することを特徴とする、請求項20に記載の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法。薬学的に有効な量のTIP41の発現または活性抑制剤を、TRAIL媒介アポトーシスと関連した疾病にかかった個体に投与する工程を含む、TRAILに対する感受性を増進させる方法。前記のTRAIL媒介アポトーシスと関連した疾病が、癌、炎症性疾患または自己免疫疾患であることを特徴とする、請求項23に記載の方法。前記の癌が、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎臓癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項24に記載の方法。前記の炎症性疾患が、皮膚炎、アレルギー、アトピー、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽頭炎、扁桃腺炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症fibromyalgia、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、腱周囲炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎臓炎、シェーグレン症候群sjogrenssyndrome、多発性硬化症、急性および慢性の炎症性疾患からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項24に記載の方法。前記の自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、重度の筋無力症、クレブス病、橋本氏甲状腺炎、アジソン病、白斑症、硬皮症、グッドパスチャー症候群、ベーチェット病、クローン病、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、幼児糖尿病、自己免疫溶血性貧血、クリオグロブリン血症、副腎白質異栄養症および全身性紅斑性狼瘡からなる群から選択されることを特徴とする、請求項24に記載の方法。薬学的に有効な量のTIP41の発現または活性抑制剤を個体に投与する工程を含む、癌の予防方法。薬学的に有効な量のTIP41の発現または活性抑制剤を抗癌補助剤として癌にかかった個体に投与する工程を含む、癌の治療方法。TRAIL媒介アポトーシスと関連した疾病の治療時にTRAIL感受性増進のために使用するための、TIP41の発現または活性抑制剤。抗癌補助剤として使用するためのTIP41の発現または活性抑制剤。本発明の目的は、TIP41タンパク質の発現または活性抑制剤を含有する、TRAIL感受性増進用組成物を提供する。前記の目的を達成するために、本発明は、TIP41タンパク質の発現または活性抑制剤を含有する、TRAIL感受性の増進用組成物を提供する。また、本発明は、TIP41タンパク質の発現や活性抑制剤を含有する、抗癌補助剤補助剤を提供する。また、本発明は、本発明の抗癌補助剤を含む癌の治療または予防用組成物を提供する。また、本発明は、癌の予防や治療剤のスクリーニング方法を提供する。また、本発明は、薬学的に有効な量のTIP41の発現または活性抑制剤をTRAIL媒介アポトーシスと関連した疾病にかかった個体に投与する工程を含む、TRAILに対する感受性を改善する方法を提供する。また、本発明は、薬学的に有効な量のTIP41の発現または活性抑制剤を投与するための工程を含む、癌の予防方法を提供する。また、本発明は、薬学的に有効な量のTIP41の発現または活性抑制剤を抗癌補助として、癌にかかった個体に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。また、本発明は、TRAIL媒介アポトーシスと関連する疾病の治療時にTRAIL感受性増進のために使用するための、TIP41の発現または活性抑制剤を提供する。また、本発明は、抗癌補助剤として使用するためのTIP41の発現または活性抑制剤を提供する。本発明のTRAIL耐性を示す肝癌細胞株にTIP41siRNAを処理し、その発現を抑制した後、TRAILを処理した時、癌細胞株特異的アポトーシスが誘導され、肝癌のみならず、TRAILの耐性を有する肺癌、大腸癌にも効果が観察され、腫瘍を移植したマウスにTIP41siRNAとTRAILを投与した時、腫瘍のサイズが減少して、癌細胞株の死滅を誘導する効果を有するので、TIP41タンパク質の発現または活性抑制剤を含有するTRAIL感受性増進用組成物または抗癌補助剤として有用に用いることができる。以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、TIP41タンパク質の発現または活性抑制剤を含有するTRAIL感受性増進用組成物を提供する。前記のTIP41タンパク質は、配列番号1で表されるアミノ酸配列を特徴とすることが好ましいが、これに限定されない。前記のTIP41タンパク質発現または活性阻害剤は、TRAILセンシタイザーsensitizerであることが好ましいが、これに限定されない。前記のTIP41タンパク質の発現抑制剤は、TIP41遺伝子のmRNAに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉RNAshortinterferingRNAおよび低分子ヘアピン型RNAshorthairpinRNAからなる群から選択されたいずれか1つであることが好ましいが、これに限定されない。前記のTIP41タンパク質の活性剤は、TIP41タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体、および天然物からなる群から選択されるいずれか1つであることを特徴とするが、これに限定されない。前記の組成物は、TRAILを用いた癌、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療時に使用されることが好ましい。前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎臓癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択される1つであることが好ましいが、これに限定されない。また、前記の炎症性疾患は、皮膚炎、アレルギー、アトピー、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽頭炎、扁桃腺炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症fibromyalgia、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、腱周囲炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎臓炎、シェーグレン症候群sjogrenssyndrome、多発性硬化症、急性および慢性の炎症性疾患からなる群から選択される1つであることが好ましいが、これに限定されない。また、前記の自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、重度の筋無力症、クレブス病、橋本氏甲状腺炎、アジソン病、白斑症、硬皮症、グッドパスチャー症候群、ベーチェット病、クローン病、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、幼児糖尿病、自己免疫溶血性貧血、クリオグロブリン血症、副腎白質異栄養症および全身性紅斑性狼瘡からなる群から選択される1つであることが好ましいが、これに限定されない。アンチセンスヌクレオチドアンチセンスヌクレオチドは、ワトソンクリック型塩基対で定義されることによって、DNA、未成熟-mRNAまたは成熟したmRNAの相補的塩基配列に結合混成化して、DNAからタンパク質として遺伝子情報の流れを妨げるものである。標的配列に特定性があるアンチセンスヌクレオチドの性質は、それらを例外的に多機能にする。アンチセンスのヌクレオチドは、モノマー単位の長い鎖であるため、これらの標的RNA配列に対して簡単に合成することができる。最近の多くの研究は、標的タンパク質の研究のための生化学的手段としてアンチセンスヌクレオチドの有用性を証明したRothenbergら.,J.Natl.CancerInst,1999年,第81巻,p.1539-1544。オリゴヌクレオチド化学および向上した細胞株吸着、標的結合親和度およびヌクレアーゼ耐性を示すヌクレオチド合成分野で、最近多くの進歩があったため、アンチセンスヌクレオチドの使用は、新しい形の抑制剤として考慮することができる。ペプチドミネティックスPeptideMinetics前記のペプチドミネティックスは、TIP41活性を率いるTIP41タンパク質の結合ドメインを抑制するペプチドまたはペプチドである。非加水分解性ペプチド類似体の重要な残基としては、βターンペプチドコアNagaiら,TetrahedronLett,1985年,第26巻,p.647、ケトメチレンシュードペプチド類Ewensonら,JMedchem,1986年,第29巻,p.295;およびEwensonら,inPeptides:StructureandFunctionProceedingsofthe9thAmeriCanPeptideSymposiumPiercechemiCalco.Rockland,IL,1985年、アゼピンHuffmanら,inPeptides:chemistryandBiology,G.R.Marshalled.,EScOMPublisher:Leiden,Netherlands,1988年、ベンゾジアゼピンFreidingerら,inPeptides;chemistryandBiology,G.R.Marshalled.,EScOMPublisher:Leiden,Netherlands,1988年、βアミノアルコールGordonら,BiochemBiophysRescommun,1985年,第126巻,p.419、および置換されたγ-ラクタム環Garveyら,inPeptides:chemistryandBiology,G.R.,Marshelled.,EScOMPublisher:Leiden,Netherlands,1988年を用いて作成することができる。SiRNA分子センスRNAとアンチセンスRNAが二重鎖RNA分子を形成し、ここで、センスRNAがTIP41mRNA中の一部の連続ヌクレオチドの標的配列と同一な核酸配列を含むsiRNA分子であることが好ましい。前記のsiRNA分子は、TIP41遺伝子の塩基配列内で選択される10~30個の塩基からなるセンス配列および、前記のセンス配列に相補的に結合するアンチセンス配列からなることが好ましいが、これに限られるわけではなく、TIP41遺伝子の塩基配列を対象に相補的に結合できるセンス配列を有する二重鎖RNA分子ならすべて使用可能である。前記のセンス配列は、センス配列と相補的な配列を有していることが最も好ましい。抗体TIP41抗体は、TIP41注入によって製造されたもの、または市販され購入したものなどすべて使用可能である。また、前記の抗体は、多クローン抗体、モノクローナル抗体およびエピトープと結合することのできる断片等を含む。多クローン抗体は、前記TIP41を動物に注入し、その動物から採血して抗体を含む血清を得る従来の方法で生成することができる。このような多クローン抗体は、当業界で知られている任意の方法によって精製することができ、ヤギ、ウサギ、猿、馬、牛、豚、犬などの任意の動物種の宿主から作ることができる。モノクローナル抗体は、継続的な細胞株の培養による抗体分子の生成を提供するいかなる技術を用いても製造することができる。これらの技術は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術およびEBVハイブリドーマ技術が含まるKohlerGら,Nature,1975年,第256巻,p.495-497;KozborDら,JImmunolMethods,1985年,第81巻,p.31-42;coteRJら,ProcNatlACadSci,1983年,第80巻,p.2026-2030;coleSPら,MolcellBiol,1984年,第62巻,p.109-126。また、前記のTIP41に対する特定結合部位を含んだ抗体の断片を製造することができる。たとえば、これらに限定されるものではないが、Fab2断片は、抗体分子をペプシンで分解させて製造することができ、Fab断片は、Fab2断片のジスルフィドブリッジを還元させることにより製造することができる。他の方法として、Fab発現ライブラリを小さくして、所望する特異性を有するモノクローナルFab断片を迅速かつ容易に同定することができるHuseWDら,Science,1989年,第254巻,p1275-1281。前記の抗体は、洗浄や複合体の分離など、それ以降の工程を容易にするために、固形基質solidsubstrateに結合することができる。固形基質は、たとえば、合成樹脂、ニトロセルロース、ガラス基板、金属基板、ガラス繊維、微細球体、微細ビーズなどがある。また、前記の合成樹脂には、ポリエステル、ポリ塩化ビニール、ポリスチレン、ポリプロピレン、PVDFおよびナイロンなどがある。アプタマーAptamerアプタマーは、それ自体で安定した三次構造を有しながら標的分子に高い親和性と特異性で結合することができる特性を有する単一鎖核酸DNA、RNA、または変形核酸である。アプタマーは、SELEXSystematicEvolutionofLigandsbyEXponentialenrichmentと呼ばれるアプタマー発掘技術が最初に開発された後Ellington,ADandSzostak,JW,Nature,1990年,第346巻,p818-822、低分子有機物、ペプチド、膜タンパク質まで、多様な標的分子に結合することができる多くのアプタマーが、継続して発掘された。アプタマーは、固有の高い親和性普通pM水準と特異性で標的分子に結合することができるという特性によって、単一抗体と比較され、特に化学抗体と呼ばれる程、代替抗体としての高い可能性がある。本発明の一実験例では、肝癌組織でTIP41タンパク質が正常組織に比べて過発現されることを、免疫組織染色法とウエスタンブロットを用いて確認した。また、肝癌細胞株でのTIP41発現抑制は、TIP41siRNAをトランスフェクションさせた肝癌細胞株で確認することができた図1を参照。本発明の一実験例では、Huh7肝癌細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションさせて、細胞内TIP41発現量を減少させた後にTRAILを時間別に処理した時、アポトーシスが増加することを、核染色法とFACS分析方法を用いて確認した。また、Huh7肝癌細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションさせた後、TRAILを濃度別に処理してアポトーシスを誘導した後、FACS方法を用いて分析した結果、TIP41siRNAとTRAILを一緒に処理した時、TRAILのみを処理した時よりアポトーシスが大幅に増加していることを確認することができた図2を参照。本発明の一実験例では、Huh7肝癌細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションさせた後、TRAILを時間帯別に処理した時、アポトーシスに関与するタンパク質の発現を観察した結果、カスパーゼ-3、-8、-9およびポリADPリボース重合酵素PolyADPribosepolymelase、PARPが活性化することを確認することができた。また、シトクロムCの発現が細胞質cytosolで確認されたことで、Huh7肝癌細胞株でTIP41タンパク質発現抑制とTRAIL媒介アポトーシスは、外因性経路と内因性経路が混在した形で起こることを確認することができた図3を参照。本発明の一実験例では、Huh7肝癌細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションさせた後、TRAILを時間帯別に処理した時に、c-JunN末端キナーゼJNK伝達経路の活性化を確認することができた、JNK阻害剤を処理した時に、TIP41タンパク質発現の抑制とTRAIL媒介アポトーシスの減少が観察されるので、このようなJNK伝達経路がTIP41タンパク質発現抑制を通じてTRAIL媒介アポトーシスに重要な役割を担っていることを知ることができた図4を参照。本発明の一実験例では、TIP41タンパク質発現抑制とTRAIL処理によって誘導されるアポトーシスが正常細胞株の死滅を誘導せず、癌細胞株に特異的に発生することを確認するために、自己アポトーシス経路に関与するp53タンパク質の影響を確認した結果、p53タンパク質の15と392番セリンにリン酸化が起きることを確認することができた。ただし、p53欠損HCTC同質遺伝子細胞株p53-defecientHCT116isogenicHCCcellにTIP41タンパク質発現を抑制した後にTRAILを処理してアポトーシスを誘導した時、アポトーシスが誘導されることを確認した。これは、TIP41とTRAIL媒介アポトーシスは、p53非依存的経路を通じて起きることを示唆している図5を参照。本発明の一実験例では、細胞株別にTRAIL受容体の発現パターンを確認した結果、肝癌、肺癌細胞株でTRAIL-R2DR5の発現が正常な細胞株よりも、肝癌、肺癌細胞株で過発現することを確認した。また、肝癌細胞株でTIP41タンパク質発現を抑制させた後、肝癌細胞株でTRAIL受容体の発現を確認した結果、TRAIL受容体の発現が類似であることを確認した。これは、TIP41のタンパク質発現の抑制を通じたアポトーシスの増加が、TRAIL受容体発現の変化によるものでないことを示唆する図6を参照。本発明の一実験例では、正常な細胞株のTIP41siRNAとTRAILを処理した後、アポトーシスを観察した結果、TIP41siRNA処理に関係なく、アポトーシスの差異がなく、アポトーシスに関与するタンパク質の活性に差異がないことを確認することができた。したがって、TIP41siRNAをトランスフェクションさせた後、TRAIL媒介アポトーシスは、癌細胞株に特異的に発生することを確認することができた図7を参照。本発明の一実験例では、肝癌以外のTRAILに耐性を有する肺癌、大腸癌細胞株にsiRNAを用いたTIP414ノックダウンknockdownとTRAIL処理による、アポトーシス誘導が確認された図8を参照。本発明の一実験例では、動物実験によるTIP41の機能を確認するために、肝癌細胞株をヌードマウスの背中に移植した後、TIP41siRNAとTRAILを注入して、腫瘍のサイズの減少および癌細胞株の死滅を確認し、アポトーシスに関与するタンパク質の活性が、TRAILのみを注入した時より、TIP41siRNAとTRAILをともに注入したした時に、アポトーシス関連タンパク質の活性化がさらに増加することを確認することができた図9を参照。また、TRAILセンシタイザーとしてTIP41siRNAによって誘導されるアポトーシスの経路を確認するために、TIP41と結合するタンパク質として知られているMKK7とPP2Ac複合体間の相互作用を確認した図10と図11を参照。また、より具体的にTIP41と結合するMKK7の結合部位を確認するために、MKK7の多様な部分を含む断片を作成し、その結合部位を確認した図12と図13を参照。さらに、TIP41発現の抑制とTRAIL処理によって誘導されるアポトーシスの経路が前記TIP41とMKK7間の相互作用のためかどうかを確認するために、Huh7肝癌細胞株でMKK7の発現を抑制した後、アポトーシスを分析した。この場合、アポトーシスが減少する結果を確認することができた。より具体的には、本発明者らは、アポトーシスがMKK7活性によって誘導されるJNKの活性化によって起こるのかどうか実験した時、TIP41の抑制によるMKK7/JNK信号機序活性化が確認された図14を参照。したがって、TRAIL耐性を示す肝癌細胞株にTIP41siRNAとTRAILを処理した時、TRAILに対する耐性がある肝癌、肺癌、大腸癌でもアポトーシスが誘導された。また、腫瘍を移植したマウスにTIP41siRNAとTRAILを注入した時、腫瘍のサイズの減少および癌細胞の死滅誘導が観察された。したがって、TIP41タンパク質発現または活性阻害剤は、TRAIL感受性増進用組成物の有効成分として有用に使用することができる。前記の組成物は、TIP41の発現、または活性阻害剤に同一または類似の機能を示す有効成分を1種以上含むことができる。前記の組成物は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能であり、非経口投与時は、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内注射や胸部内注射で投与することができ、一般的な医薬品製剤の形で使用することができる。前記の組成物は、単独で、または手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法および生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用することができる。前記の組成物の一日の投与量は、約0.0001~100mg/kgで、好ましくは0.001~10mg/kgであり、1日1回ないし数回に分けて投与することが好ましいが、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明の組成物は、実際の臨床投与時に非経口の多様な剤形で投与することができ、製剤化する場合は、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤や賦形剤を用いて調剤する。非経口投与のための製剤には、殺菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。座薬の基剤としては、ハードファットウィテップゾールwitepsol、マクロゴール、ツイーン61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。また、本発明は、TIP41タンパク質の発現や活性抑制剤を含有する抗癌補助剤を提供する。前記のTIP41タンパク質は、配列番号1で表されるアミノ酸を有していることが好ましいか、これに限定されない。前記のTIP41タンパク質発現または活性阻害剤は、TRAILセンシタイザーsensitizerであることが好ましいが、これに限定されない。前記のTIP41タンパク質の発現の抑制剤は、TIP41遺伝子のmRNAに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉RNAshortinterferingRNAおよび低分子ヘアピン型RNAshorthairpinRNAからなる群から選択されたいずれか1つであることが好ましいか、これに限定されない。前記のTIP41タンパク質の活性抑制剤は、TIP41タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体、および天然物からなる群から選択されたいずれか1つであることが好ましいか、これに限定されない。前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、癌、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、肝癌、肺癌または大腸癌であることがさらに好ましいがこれに限定されず、TRAILに対する耐性を有する癌はすべて含むことが好ましいが、これに限定されない。また、前記の抗癌補助剤において、TIP41タンパク質の発現または活性阻害剤は、TRAIL感受性を増進することが好ましいが、これに限定されない。本発明の実験例では、TIP41のタンパク質が肝癌組織で過発現し図1を参照、Huh7肝癌細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションさせた後、TRAILを時間帯別に処理した場合、アポトーシスがTRAILのみ処理した特よりもさらに増加した図2を参照。また、TIP41siRNAとTRAIL媒介アポトーシス経路を調べるためにカスパーゼ-3、-8、-9およびポリADPリボース重合酵素活性と、JNK伝達経路関連タンパク質およびp53タンパク質を観察した結果、アポトーシスはTIP41siRNAとTRAILをともに処理した時にTRAILを単独で処理した時よりも、アポトーシスがさらに増加しており、これは癌細胞株特異的アポトーシスであることを確認することができた図3、図4、図5および図7を参照。また、TIP41タンパク質の発現を抑制した場合、TRAIL受容体の発現は変化がないことを確認した図6を参照。また、肝癌以外のTRAILに耐性を有する他の細胞株にTIP41siRNAとTRAILを処理し、アポトーシスが誘導されることを確認した図8を参照。さらに、ヌードマウスの背中に移植した腫瘍のサイズが、TIP41siRNAとTRAILを注入した時に、TIP41、TRAILsiRNAを単独注入した時よりも減少し、腫瘍組織から分離した、癌細胞株のアポトーシスとアポトーシスに関与するタンパク質の活性化が、TIP41siRNAとTRAILを注入した時に最も多く観察された。したがって、TRAIL耐性を示す肝癌細胞株にTIP41siRNAとTRAILを処理した時、癌細胞株特異的アポトーシスTRAILに対する耐性を有する肝癌、肺癌、大腸癌でもアポトーシスが誘導され、腫瘍を移植したマウスでもTIP41siRNAとTRAILを注入した時、腫瘍のサイズの減少および癌細胞株の死滅を誘導する効果を有するので、TIP41タンパク質の発現または活性抑制剤を含有する抗癌補助剤として有用に使用できる。前記の抗癌補助剤は、TIP41の発現または活性阻害剤にさらに同一または類似の機能を示す有効成分を1種以上含むことができる。前記の抗癌補助剤は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能であり、非経口投与時は、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内注射や胸部内注射で投与することができ、一般的な医薬品製剤の形で使用することができる。前記の抗癌補助剤は、単独で、または手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法および生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用することができる。前記の抗癌補助剤の一日の投与量は、約0.0001~100mg/kgで、好ましくは0.001~10mg/kgであり、1日1回ないし数回に分けて投与することが好ましいが、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明の抗癌補助剤は、実際の臨床投与時に非経口の多様な剤形で投与することができ、製剤化する場合は、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤や賦形剤を用いて調剤する。非経口投与のための製剤には、殺菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。座薬の基剤としては、ハードファット、マクロゴール、ツイーン61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。また、本発明は、本発明の抗癌補助剤を含む癌の治療または予防用組成物を提供する。本発明の実施例では、本発明のTIP41の発現または活性抑制剤をTRAILとともに処理した時、TRAILに耐性を有する多様な肝癌、肺癌、大腸癌細胞株の癌特異的なアポトーシスが増加した。また、本発明のTIP41の発現または活性抑制剤の癌特異的アポトーシスの生体内invivo効果が、腫瘍を移植したヌードモデルで観察された。したがって、本発明のTIP41の発現または活性抑制剤を含有する抗癌補助剤は、癌の治療または予防用組成物の有効成分として有用に使用できる。前記の癌の治療または予防用組成物は、TIP41の発現または活性阻害剤に同一または類似の機能を有する有効成分を1種以上を含むことができる。前記の癌の治療または予防用組成物は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能であり、非経口投与時は、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内注射や胸部内注射で投与することができ、一般的な医薬品製剤の形で使用することができる。前記の癌の治療または予防用組成物は、単独で、または手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法および生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用することができる。前記の癌の治療または予防用組成物の一日の投与量は、約0.0001~100mg/kgで、好ましくは0.001~10mg/kgであり、1日1回ないし数回に分けて投与することが好ましいが、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明の癌の治療または予防用組成物は、実際の臨床投与時に非経口の多様な剤形で投与することができ、製剤化する場合は、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤や賦形剤を用いて調剤する。非経口投与のための製剤には、殺菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。座薬の基剤としては、ハードファット、マクロゴール、ツイーン61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。また、本発明は、癌の予防や治療剤のスクリーニング方法を提供する。本発明の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法は、下記の工程を含む方法であることが好ましいが、これに限定されない。1実験群として、癌細胞株に被検物質を処理する工程、2工程1の処理された細胞でTIP41とPP2Acタンパク質間の結合水準またはTIP41とMKK7タンパク質間の結合水準を確認する工程、および3工程2のTIP41とPP2Acタンパク質間の結合水準またはTIP41とMKK7タンパク質間の結合水準を対照群と比較して減少させる被険物質を選別する工程。前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、癌、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌や膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、肝癌、肺癌または大腸癌であることがさらに好ましいがこれに限定されず、TRAILに対する耐性を有する癌はすべて含むことが好ましいが、これに限定されない。本発明の癌の予防や治療剤のスクリーニング方法において、請求項第16項において、工程2のタンパク質の結合水準は、免疫沈降法immunoprecipitation、酵素免疫分析法ELISA、ウエスタンブロット法WesternBlotting、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGlutathione-S-TransferaseGSTプルダウン分析、タンパク質チップProteinChip、蛍光共鳴エネルギー移動FluorescenceResonanceEnergyTransfer、FRET、蛍光蛋白質再構成法Bimolecularfluorescencecomplementation、BiFCおよび酵母ツーハイブリッドYeasttwo-hybrid、Y2Hからなる群から選択されたいずれか1つで測定することが好ましいが、これに限定されない。また、本発明は、癌の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する。本発明の癌の予防や治療剤のスクリーニング方法は、下記の工程を含む方法であることが好ましいが、これに限定されない。1実験群として、癌細胞株に被検物質を処理する工程、2工程1で処理された細胞株でMKK7タンパク質の活性程度を測定する工程、および3工程2のMKK7タンパク質の活性を対照群と比較して増加した被険物質を選別する工程を含む、癌の予防または治療剤のスクリーニング方法。前記の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法において、MMK7タンパク質の活性程度は、免疫蛍光法、酵素免疫分析法ELISA、質量分析およびタンパク質チップからなる群から選択されたいずれか1つで測定することが好ましいが、これに限定されない。また、本発明は、癌の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する。本発明の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法は、下記の工程を含む方法であることが好ましいが、これに限定されない。1実験群として、癌細胞株に被検物質を処理する工程、2工程1で処理された細胞株でPP2Acタンパク質の発現程度を測定する工程、および3工程2のPP2Acタンパク質の発現量を対照群と比較して減少させた被検物質を選別する工程。前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、癌、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌や膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、肝癌、肺癌または大腸癌であることがさらに好ましいがこれに限定されず、TRAILに対する耐性を有する癌はすべて含むことが好ましいが、これに限定されない。本発明の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法において、工程2のPP2Acタンパク質の発現程度は、逆転写重合酵素の連鎖反応ReverseTranscription-PolymerasechainReaction、RT-PCR、酵素免疫分析法ELISA、免疫組織化学、ウエスタンブロットWesternBlottingおよび流細胞分析法FACSからなる群から選択されたいずれか1つで測定することが好ましいが、これに限定されない。また、本発明は、薬学的に有効な量のTIP41の発現または活性抑制剤をTRAIL媒介アポトーシスと関連した疾病にかかった個体に投与する工程を含む、TRAILへの感受性を増進させる方法を提供する。前記のTIP41タンパク質の発現または活性阻害剤は、TRAILセンシタイザーであることが好ましいが、これに限定されない。前記のTIP41タンパク質の発現の抑制剤は、TIP41遺伝子のmRNAに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉RNAおよび低分子ヘアピン型RNAからなる群から選択されるいずれか1つであることが好ましいが、これに限定されない。前記のTIP41タンパク質の活性剤は、TIP41タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体、および天然物から選択されるいずれか1つであることを特徴とするが、これに限定されない。前記のTRAIL媒介アポトーシスと関連する疾病は、癌、炎症性疾患や自己免疫疾患であることが好ましいが、これに限定されない。前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択される1つであることが好ましいが、これに限定されない。また、前記の炎症性疾患は、皮膚炎、アレルギー、アトピー、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽頭炎、扁桃腺炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、腱周囲炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎臓炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、急性および慢性の炎症性疾患からなる群から選択される1つであることが好ましいが、これに限定されない。また、前記の自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、重度の筋無力症、クレブス病、橋本氏甲状腺炎、アジソン病、白斑症、硬皮症、グッドパスチャー症候群、ベーチェット病、クローン病、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、幼児糖尿病、自己免疫溶血性貧血、クリオグロブリン血症、副腎白質異栄養症および全身性紅斑性狼瘡からなる群から選択される1つであることが好ましいが、これに限定されない。本発明の一実施例では、本発明のTIP41の発現または活性抑制剤をTRAILとともに処理した時、TRAILに耐性を有する多様な肝癌、肺癌、大腸癌細胞株の癌特異的なアポトーシスが増加した。また、本発明のTIP41発現または活性抑制剤の癌特異的アポトーシスの生体内インビボ効果が腫瘍を移植したヌードモデルで観察された。したがって、本発明のTIP41の発現または活性阻害剤は、TRAILに対する感受性を増進させる手段として有用に用いることができる。また、本発明は、薬学的に有効な量のTIP41の発現または活性抑制剤を個体に投与する工程を含む、癌の予防方法を提供する。また、本発明は、薬学的に有効な量のTIP41の発現または活性抑制剤を抗癌補助剤として、癌にかかった個体に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。前記の個体は、脊椎動物、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは、ラット、ウサギ、ギニアピッグ、ハムスター、犬、猫などの実験動物で、最も好ましいのは、チンパンジー、ゴリラのような類人猿動物である。前記のTIP41の発現または活性抑制剤の治療学的に有効な量は、いくつかの要素は、例えば投与方法、目的部位、患者の状態によって異なり得る。したがって、人体に使用時の投与量は、安全性と効率性を考慮して適正な量に決定する必要がある。動物実験によって決定された有効な量からヒトに使用される量を推定することも可能である。有効な量の決定時に考慮する事項は、例えば、HardmanandLimbird,eds.,GoodmanandGilmansThePharmacologicalBasisofTherapeutics,10thed.2001年,PergamonPress;およびE.W.Martined.,RemingtonsPharmaceuticalSciences,18thed.1990年,MackPublishingCo.に記述されている。本発明のTIP41発現または活性阻害剤は、生物学的製剤に通常使用される担体、希釈剤、賦形剤、またはこれらを二つ以上組み合わせたものを含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、TIP41の発現または活性抑制剤を生体内に伝達するのに適合したものなら特別に制限されず、例えば、MerckIndex,13thed.,MerckCo.Inc.に記載されている化合物、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分中、1成分以上を混合して使用でき、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法で、またはRemingtonsPharmaceuticalScienceMackPublishingCompany,EastonPA,18th,1990年に開示されている方法を用いて、それぞれの疾患や成分によって好ましく製剤化することができる。本発明のTIP41発現または活性阻害剤にさらに同一または類似の機能を有する有効成分を1種以上含むことができる。本発明の組成物は、組成物の総重量に対して前記のタンパク質を0.0001ないし10重量、好ましくは0.001~1重量含む。本発明のTIP41発現または活性阻害剤は、目的とする方法によって非経口投与たとえば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用したり経口投与したりでき、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与、投与方法、排泄率と疾患の重症度によってその範囲が多様である。本発明の組成物の一日の投与量は、0.001μg~10mg/kgで、好ましくは0.01μg~10mg/kgであり、1回ないし数回に分けて投与することが好ましい。また、本発明は、TRAIL媒介アポトーシスと関連する疾病治療時のTRAIL感受性を増進するために使用するためのTIP41の発現または活性抑制剤を提供する。さらに、本発明は、抗癌補助剤として使用するためのTIP41の発現または活性抑制剤を提供する。前記のTIP41タンパク質は、配列番号1で表されるアミノ酸配列を特徴とすることが好ましいが、これに限定されない。前記のTIP41タンパク質発現または活性阻害剤は、TRAILセンシタイザーであることが好ましいが、これに限定されない。前記のTIP41タンパク質の発現の抑制剤は、TIP41遺伝子のmRNAに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉RNAおよび低分子ヘアピン型RNAからなる群から選択されたいずれか1つであることが好ましいが、これに限定されない。また、前記のTIP41タンパク質の活性剤は、TIP41タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体、および天然物から選択されるいずれか1つであることを特徴とするが、これに限定されない。前記のTRAIL媒介アポトーシスと関連する疾病は、癌、炎症性疾患または自己免疫疾患であることが好ましいが、これに限定されない。前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択される1つであることが好ましいが、これに限定されない。また、前記の炎症性疾患は、皮膚炎、アレルギー、アトピー、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽頭炎、扁桃腺炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、腱周囲炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎臓炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、急性および慢性の炎症性疾患からなる群から選択される1つであることが好ましいが、これに限定されない。また、前記の自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、重度の筋無力症、クレブス病、橋本氏甲状腺炎、アジソン病、白斑症、硬皮症、グッドパスチャー症候群、ベーチェット病、クローン病、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、幼児糖尿病、自己免疫溶血性貧血、クリオグロブリン血症、副腎白質異栄養症および全身性紅斑性狼瘡からなる群から選択される1つであることが好ましいが、これに限定されない。以下、本発明を実験例と製造例によって詳しく説明する。ただし、下記の実験例と製造例は、本発明を説明するだけのもので、本発明の内容が下記の実験例と製造例によって限定されるものではない。<実験例1>肝癌および肺癌組織でのTIP41タンパク質発現の確認<1-1>免疫染色方法を用いたTIP41発現の確認患者の肝癌組織忠南大学校医科大学キムジンマン教授チームを10中性バッファーホルマリン溶液で固定して、パラフィンを添加した後、5μm厚に切断した。切断されたセクションsectionを10mMのクエン酸バッファーpH6.0で、4分間処理した後、3過酸化水素H2O2が含まれている0.1MTris緩衝食塩水TBS、pH7.4に30分間置いた。前記のセクションをProteinBlockSolutionDAKOで、常温で20分間処理した後、アンチTIP41抗体と30分間反応させた。0.1MTBST0.01ツイーン20を含む0.1MTBSで洗浄し、セクションをエヌビジョンアンチウサギポリマーnVisionanti-rabbitpolymerDAKOと30分間反応させた。ペルオキシダーゼが結合した抗体を3,3-ジアミノベンジジン色原体基質溶液3,3-diaminobenzidineDABchromogensubstratesolutionDAKOと反応させて、可視化した。顕微鏡下で観察して、適切に染色された時、0.1MTBSで洗浄して反応を終了させた後、オリンパスBX51顕微鏡オリンパス、日本を用いて観察し、オリンパスDP70カメラオリンパス、日本でイメージを得た。その結果、一般の肝臓組織に比べて肝癌組織でTIP41が過発現することを確認することができた図1のA。また、肝癌、肺癌患者の周辺正常組織に比べて、TIP41タンパク質がこれらの患者の癌組織で過発現した表1および表2。TIP41発現と癌段階間の関係分析は、TIP41陽性発現がNSCLC、肺癌の高い段階と顕著に関連していることを示しP=0.045、これはTIP41の発現とNSCLC進行との間の関係を示す表2。このデータは、TIP41発現がHCCおよびNSCLC細胞で過発現することを示す。表1肝癌HCC臨床組織でのTIP41の発現量IHC方法表2肺癌非小細胞性肺癌、NSCLCの臨床組織での、TIP41の発現量IHC方法<1-2>ウエスタンブロットを用いたTIP41発現の確認B型肝炎ウイルスHBVによって発病した肝癌患者7人とそうでない肝癌患者7人の肝癌組織および隣接正常組織忠南大学校医科大学から抽出されたタンパク質を用いて、TIP41タンパク質発現量をウエスタンブロット方法を用いて確認した。組織を溶解バッファーlysisbuffer[20mMHEPES4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸pH7.5、150mM塩化ナトリウムNacl、1mMエチレンジアミン四酢酸EDTA、2mMエチレングリコール四酢酸EGTA、1トリトンX-100、10のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルI/II]に組織を溶解させた後、15,000rpmで10分間遠心分離して細胞の残骸celldebrisを削除し、タンパク質を得た。タンパク質は、SDS-PAGEを通じて分子量によって分離し、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜でトランスファーさせた後、5のスキムミルクで1時間の非特異的反応を防ぐためにブロックした。1時間後、ニトロセルロース膜は1:2,000TIP41BetylLaboratories,米国および1:5,000GAPDHAbforntier,韓国で4°Cで12時間以上の反応後、0.1のTBSTTris-BufferedSalineツイーン-20で10分ずつ3回洗浄した後、抗マウスPierce,米国および抗ウサギPierce,米国二次抗体を常温で1時間反応させた。それを、0.1のTBSTで10分ずつ3回洗浄して、化学発光試薬を用いて発現を確認した。各組織の定量的対照群にハウスキーピング遺伝子のGAPDHグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼを用いた。その結果、B型肝炎ウイルスHBVによって発病した肝癌患者7人とそうでない肝癌患者7人の肝癌組織でTIP41が過発現されていることを確認することができた図1のB。<1-3>肝癌細胞株の培養韓国の細胞株銀行から分譲されたヒトのHuh7肝癌細胞株は、10の牛胎児血清を含んだダルベッコの改変イーグル培地DulbeccosmodifiedeaglesmediumDMEMで37°C、5CO2で培養した。SiRNAをトランスフェクションさせるためにHuh7肝癌細胞株1×106細胞/100mm皿に植えて24時間培養し、その後、トランスフェクションを行なった。<1-4>siRNAのトランスフェクションTIP41のTRAILセンシタイザーとしての機能を確認するためにsiRNADharmaconRNAiTechnologies,米国を選別して効果的にTIP41タンパク質の発現を抑制する配列を構築した。前記の<1-3>で培養された2×105肝癌細胞株を60mm培養皿に植えてリポフェクタミンRNAimaxinvitrogenを用いて、製造元の指示に従って、siRNASmallinterferingRNAをトランスフェクションした。72時間後に、トランスフェクションさせた細胞はTRAIL100ng/mlを0、0.5、1、2、3、4、6時間処理した後、細胞株をそれぞれの時間帯に溶解バッファーを用いて、細胞株からタンパク質を得てウエスタンブロットした。溶解バッファー[20mMHEPESpH7.5、150mM塩化ナトリウム、1mMエチレンジアミン四酢酸EDTA、2mMエチレングリコール四酢酸EGTA、1トリトンX-100、10のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルI/II]で細胞を溶解させた後、15,000rpmで10分間遠心分離して細胞の残骸を削除して、タンパク質を得た。タンパク質は、SDS-PAGEによって分子量によって分離した後、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜でトランスファーさせた後、5のスキムミルクで1時間非特異的反応を防ぐためにブロックした。1時間後、ニトロセルロース膜は1:2,000TIP41BethylLaboratories、米国および1:5,000チューブリンSigmaaldrich、米国で4°Cで12時間以上の反応後、0.1のTBSTで10分ずつ3回洗浄した後、抗マウスPierce、米国および抗ウサギPierce、米国の二次抗体を常温で1時間反応させた。それを、0.1のTBSTで10分ずつ3回洗浄し、化学発光試薬を用いて発現を確認した。各組織の定量的対照群にハウスキーピング遺伝子であるGAPDHを用いた。使用されたTIP41siRNA配列は、5-CCTAATGAAATATCCCAGTAT-3配列番号2だった。その結果、TRAIL処理の有無に関係なく、TIP41siRNAを処理した後、TIP41タンパク質の発現が完全に抑制されることを確認することができた図1のC。<実験例2>TIP41タンパク質発現の抑制とTRAL処理によるアポトーシス誘導<2-1>核染色法を用いたTIP41タンパク質発現抑制で誘導されるアポトーシス分析6ウェルプレートで前記実験例<1-1>の方法で培養されたTIP41発現抑制された細胞株を2×105細胞/ウェルずつ分注した。24時間後、TRAILを100ng/mlで各々0、2、4、6、8時間処理した後、Hoechst33342を5μg/mlで30分間室温で染色した。Hoechst33342で核を染色した後、蛍光顕微鏡で死滅した細胞数をカウントして、アポトーシスを測定した。その結果、Huh7肝癌細胞株にTIP41siRNAとTRAILを同時に処理した時、TRAILのみを処理した時よりアポトーシスが増加した。TRAILを処理する時間が長くなるほど、アポトーシスが増加し、TIP41siRNAを処理した群では、対照群にsiRNAを処理時より約30程度のアポトーシスの増加が観察された。これにより、Huh7肝癌細胞株でTIP41siRNAの処理は、TRAIL抵抗を減少させることを確認することができた図2のA。<2-2>FACSを用いたTIP41タンパク質発現抑制で誘導されるアポトーシスの分析前記の実験例<1-1>の方法で培養したHuh7肝癌細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションさせて、細胞内TIP41発現量を減少させた後、TRAILを100ng/mlで処理した後、0、2、4、6、8時間帯にアポトーシスをアネキシンV-FITc/PI染色法で死滅した細胞株と正常細胞株を区別して染色した後、FACS蛍光活性化セルソーターを用いてアポトーシスを測定した。アポトーシスを測定するために、トリプシンEDTAを用いて細胞株を得た後、FITc融合したアネキシンV50μg/mlとPIヨウ化プロピジウム50ng/mlで20分間染色後、FACSCaliburBDを用いて細胞株を分離し、アネキシンV-FITc/PI染色された細胞株の比率を分析した。その結果、TRAILを時間別に処理した後、アポトーシスが起こることをFACS分析を通じて確認することができた図2のB、同一の実験方法で、TRAILを0、25、50、100、200ng/ml濃度別に4時間処理した時、処理濃度によってアポトーシスが増加することを確認することができた図2のC。<実験例3>TIP41タンパク質発現の抑制およびTRAIL処理によって誘導されたアポトーシス経路確認<3-1>カスパーゼの活性化TIP41siRNAとTRAILを処理した後に誘導されるアポトーシスの経路を確認するために、TIP41siRNAをトランスフェクションさせた72時間後、TRAILを100ng/mlで0、0.5、1、2、4、6時間処理した後、カスパーゼ-3、-9、-9およびポリADPリボース重合酵素PARPの発現をウエスタンブロットを用いて測定した。前記の実験例<1-1>で培養した細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションさせた72時間後、TRAILを100ng/mlで時間帯別に処理した。溶解バッファー[20mMHEPESpH7.5、150mM塩化ナトリウム、1mMエチレンジアミン四酢酸EDTA、2mMエチレングリコール四酢酸EGTA、1トリトンX-100、10のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルI/II]で細胞を溶解させた後、15,000rpmで10分間遠心分離して細胞の残骸を削除してタンパク質を得た。タンパク質はSDS-PAGEを通じて分子量によって分離した後、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜でトランスファーさせた後、5のスキムミルクで1時間非特異的反応を防ぐためにブロックした。1時間後、ニトロセルロース膜は1:1,000カスパーゼ-3、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9および1:2,000PARPcellsignalingtechnology、米国で4°Cで12時間以上の反応させた後、0.1のTBSTで10分ずつ3回洗浄した後、抗マウスPierce、米国および抗ウサギPierce、米国の二次抗体を常温で1時間反応させた。これを、0.1のTBSTで10分ずつ3回洗浄し、化学発光試薬を用いて発現を確認した。その結果、TIP41タンパク質の発現が抑制された後、TRAILの時間別処理によってカスパーゼ-9、-8、-3とPARPが活性化していることを確認することができた図3のA。これから、TIP41のタンパク質発現抑制によるアポトーシスがTRAILの濃度および時間に依存的に増加することを確認することができた。<3-2>ミトコンドリアのシトクロムCの細胞質への放出アポトーシスの経路を確認するために、ミトコンドリアmitochondriaのシトクロムCCytochromeCが細胞質に放出されるかどうかを確認するために、細胞分画subcellularfractionationおよびウエスタンブロットを用いた。前記の実験例<1-1>の方法で培養したHuh7肝癌細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションさせて、細胞内TIP41発現量を減少させた後、60mm皿にTIP41の発現が抑制された細胞株を2×106細胞/皿に分注した。24時間後、TRAILを100ng/mlで、各々0、1、2、4時間処理した後、細胞分画を行なった。細胞分画は、SubcellularProteomeExtractionkitCalbiochem社を用いて行ない、キットkitは、4種類のバッファーで構成され、各バッファーの使用に応じて細胞質、ミトコンドリア、核および細胞骨格タンパク質の順で細胞分画が分離された。溶出バッファー1extractionbuffer1500μlを各々の細胞株に添加して、4°Cで10分間撹拌した後、遠心分離して細胞質分画を得、溶出バッファー2500μlを4°Cで30分間撹拌した後、遠心分離してミトコンドリアの分画を得た。分画された細胞質とミトコンドリアにウエスタンブロットを用いた。前記の実験例<1-1>の培養細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションさせた72時間後、TRAILを0、2、4、6時間に処理した。溶解バッファーlysisバッファー[20mMHEPESpH7.5、150mM塩化ナトリウム、1mMエチレンジアミン四酢酸、2mMエチレングリコール四酢酸、1トリトンX-100、10のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルI/II]で細胞を溶解させた後、15,000rpmで10分間遠心分離して細胞の残骸を削除してタンパク質を得た。タンパク質はSDS-PAGEを通じて分子量によって分離した後、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーさせた後、5のスキムミルクで1時間非特異的反応を防ぐためにブロックした。細胞質分画マーカーには、チューブリンを用いて、ミトコンドリアはペルオキシレドキシンIIIを用いた。1時間後、ニトロセルロース膜は1:1,000シトクロムCBD、米国、1:5,000チューブリンSigmaaldrich,米国および1:2,000ペルオキシレドキシン3Abfrontier、韓国で4°Cで12時間以上反応させた後、0.1のTBSTで10分ずつ3回洗浄した後、抗マウスPierce、米国および抗ウサギPierce,米国の二次抗体を1:2,000の比率で常温で1時間反応させた。これを、0.1のTBSTで10分ずつ3回洗浄し、化学発光試薬を用いて発現を確認した。その結果、TIP41siRNAを処理した後、シトクロムCが細胞質に放出されることを確認することができた図3のB。つまり、カスパーゼ-8と-9が活性化して、ミトコンドリオンmitochondrionからの細胞質にシトクロムCが放出されることを確認した。これらの結果は、Huh7肝癌細胞株でTIP41タンパク質発現抑制とTRAIL処理によって誘導されるアポトーシスがカスパーゼ/ミトコンドリア依存性アポトーシス経路と密接に関連していることを示す。<実験例4>TIP41タンパク質発現抑制およびTRAIL処理で誘導されるJNK伝達経路の活性<4-1>TIP41タンパク質発現抑制およびTRAIL処理で誘導されるJNK伝達経路のタンパク質活性自己アポトーシスの場合、JNKリン酸化による経路が多くの論文で報告されており、p38の活性化もまたアポトーシスを誘導する可能性があるという報告があった。JNKおよびp38の活性がアポトーシスを誘導すると報告されている。これにより、前記の<実験例>で確認されたTIP41タンパク質発現抑制とTRAIL処理で誘導されるアポトーシスとミトゲン活性化プロテインキナーゼMitogen-ActivatedProtein,MAP伝達経路、特にJNKとp38との関連性を確認するために、Huh7肝癌細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションさせた後、TRAIL100ng/mlを、0、1、2、4時間処理した。その後、ウエスタンブロットを用いて、TIP41タンパク質発現抑制とTRAIL処理で誘導されるアポトーシスとJNKとp38との関連性を確認した。前記の実験例<1-1>の培養細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションした72時間後、TRAILを前記の時間帯別に処理した。溶解バッファー[20mMHEPESpH7.5、150mM塩化ナトリウム、1mMエチレンジアミン四酢酸、2mMエチレングリコール四酢酸、1トリトンX-100、10のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルI/II]で細胞を溶解させた後、15,000rpmで10分間遠心分離して細胞の残骸を削除してタンパク質を得た。タンパク質は、SDS-PAGEを通じて分子量によって分離した後、分離したタンパク質をニトロセルロース膜でトランスファーさせた後、5のスキムミルクで1時間非特異的反応を防ぐためにブロックした。1時間後、ニトロセルロース膜は1:1,000の比率でp-MKK7cSTInc.,米国とp-p38cSTInc.,米国を用い、1:1,000の比率でp-JNKcSTInc.,米国を用い、1:5,000の割合でチューブリンSigmaaldrich,米国を用いて4°Cで12時間以上の反応させた後、0.1のTBSTで10分ずつ3回洗浄し、抗マウスPierce,米国および抗ウサギPierce,米国の二次抗体を1:2,000の比率で常温で1時間反応させた。それを、0.1のTBSTで10分ずつ3回洗浄し、化学発光試薬を用いて発現を確認した。その結果、図4のAに示すように、RNAiによるTIP1の下方調整は、TRAILによって誘導されるMKK7/JNK活性を延長するために十分であることが分かった図4のA。<4-2>JNK阻害剤処理によるアポトーシスの減少JNK伝達経路とTIP41抑制とTRAIL処理で誘導されるアポトーシス間の関連性を確認するために、実験例<4-1>と同一な方法で細胞株を培養し、TIP41siRNAを処理した後、JNK阻害剤であるSP60012510μg/mlを1時間処理してJNK伝達経路を遮断した。TRAIL刺激で誘導されるアポトーシスをアネキシンV-FITc/PI染色法を用いたFACS分析法を用いて測定した。その結果、JNK阻害剤を処理してJNK伝達経路を遮断した後、TRAILを処理した実験で、アポトーシスが減少した。これにより、JNK伝達経路がTIP41タンパク質発現抑制とTRAIL処理で誘導されるアポトーシスに重要な役割を遂行していることが分かった図4のB。<実験例5>TIP41タンパク質発現抑制とp53非依存的アポトーシス経路の確認<5-1>肝癌細胞でp53非依存的アポトーシス経路の確認現在使用されている抗癌剤の最も大きな問題点は、正常細胞株と癌細胞株を区別できず、正常細胞株を殺すという副作用を有しており、このような正常細胞の死滅機序は、p53経路の活性化を通して起きることが報告された。P53依存的アポトーシスを誘導する抗癌剤は、癌細胞株のみならず、正常細胞株にも影響を与えるので、TIP41siRNAを処理した後、TRAILによって誘導されるアポトーシスがp53を通じて行なわれるのかどうかを確認した。TIP41siRNAをHuh7肝癌細胞株にトランスフェクションした72時間後、100ng/mlのTRAILを0、2、4、および6時間処理した。ホスホp53phospho-p53抗体を用いたウエスタンブロット方法を実行して、アポトーシスがp53伝達経路を経由して行われるかどうかを確認するために、p53のリン酸化を確認する抗体を用いた。P-p53Ser6、p-p53Ser9、p-p53Ser15、p-p53Ser20、p-p53Ser37、p-p53Ser46およびp-p53Ser392を用いて、p53のセリン6、9、15、20、37、46、392番のリン酸化を確認した。溶解バッファー[20mMHEPESpH7.5、150mM塩化ナトリウム、1mMエチレンジアミン四酢酸、2mMエチレングリコール四酢酸、1トリトンX-100、10のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルI/II]に細胞を溶解させた後、15,000rpmで10分間遠心分離して細胞の残骸を削除してタンパク質を得た。タンパク質は、SDS-PAGEを通じて分子量によって分離した後、分離したタンパク質をニトロセルロース膜でトランスファーさせた後、5のスキムミルクで1時間非特異的反応を防ぐためにブロックした。1時間後、ニトロセルロース膜はすべて1:1,000の比率でp-p53Ser6、p-p53Ser9、p-p53Ser15、p-p53Ser20、p-p53Ser37、p-p53Ser46とp-p53Ser392cSTInc,米国で4°Cで12時間以上の反応させた後、0.1のTBSTで10分ずつ3回洗浄し、抗マウスPierce、米国および抗ウサギPierce,米国の二次抗体を1:2,000の比率で常温で1時間反応させた。それを、0.1のTBSTで10分ずつ3回洗浄し、化学発光試薬を用いて発現を確認した。その結果、細胞にTIP41siRNAとTRAIL処理した時、p53タンパク質の15番と392番セリンにリン酸化が起きることを確認することができた図5のA。セリン15番のリン酸化は、DNA損傷などによるアポトーシスに関与するATMAtaxiatelangiectasiamutated/ATRATMandRAD3-related経路の活性化またはDNA依存性プロテインキナーゼDNA-dependentproteinkinase,DNA-PKによって起きるようになり、アポトーシスとの関連が報告されていて、Ser392番のリン酸化は、核内でp53タンパク質がDNA配列に結合するのに関与することが知られている。したがって、TIP41タンパク質発現抑制を通じたTRAILによって誘導されるアポトーシスがp53依存的である可能性があるが、JNK伝達経路で活性化されるセリンが発現されない結果を考慮する時、p53の非依存的である可能性も排除することができなかった。<5-2>p53欠損細胞の培養HCT116細胞株は、正常的にp53タンパク質を作る大腸癌細胞株であり、TRAIL耐性細胞株にTRAIL単一処理によってアポトーシスが頻繁に発生しないことが知られている。HCT116p53欠如細胞は、Dr.B.Vogelsteinによって1998年に確立された細胞株で、p53遺伝子が欠損しているVogelstein,B.,Science,1998年。前記の細胞株の分譲を受けて実験に用い、細胞株は10牛胎児血清、100mg/ml、ストレプトマイシン、そして100IU/mlアンピシリンを含んだDMEMHyclone,米国培地に、安定な抗生剤マーカーG418を100μg/ml添加して、3日周期で継代培養した。<5-3>p53欠損細胞株でp53非依存的アポトーシス経路の確認P53非依存的である可能性を確認するために、前記の実験例<5-2>制作したHCT116p53欠損細胞株にTIP41siRNAをHuh7肝癌細胞株の場合と同じ実験方法でトランスフェクションした後、同一な条件でTRAILを処理して、アポトーシスを誘導した後、アネキシンV-FITc/PI染色法を用いたFACS分析法を行なった。その結果、TIP41siRNAをトランスフェクションさせた後にTRAILを処理した時、Huh7肝癌細胞株と同様にHCT116p53欠損細胞株でもアポトーシスが良く誘導されており、これはTIP41のタンパク質発現抑制によるアポトーシスは、p53非依存的経路を通じてアポトーシスが誘導されることを意味する。したがって、図5のAに示されたp53セリン15番の活性化は、TIP41タンパク質発現抑制によるTRAILによって誘導されるアポトーシスに及ぼす影響は微々であり、p53が核に移動して、転写活性を高めることを推定することができた図5のB。<実験例6>TRAIL受容体の発現様相の測定<6-1>細胞毎週TRAIL受容体の発現の確認TRAIL抵抗性を克服させて、癌細胞株特異的な治療剤としての効能を高めるために、癌細胞株のアポトーシスを増加させる方法として、TRAIL受容体の発現を増加させる研究結果が報告された。このような研究と関連してTIP41遺伝子の発現抑制を通じたアポトーシスとTRAIL受容体との相関関係を確認するために、正常細胞株と肝癌および肺癌細胞株でTRAIL受容体の発現様相を確認した。TRAIL受容体は4種類に区分され、TRAIL-R1DR4、TRAIL-R2DR5、TRAIL-R3DcR1およびTRAIL-R4DcR2で、R1とR2は、細胞死受容体に作用してTRAILが結合すると、細胞株を自己アポトーシスが起きるように誘導するが、R3とR4はデコイ受容体で、TRAILがR1とR2に結合することを阻害してTRAILによるアポトーシスを阻害すると報告されている。定量的リアルタイムPCRqPCRは、Huh7肝癌細胞株、HAEC正常細胞株Humanaorticendothelialcell,clonetics社、A549肺癌細胞株韓国細胞株銀行をトリゾールを用いてRNAを抽出した後、抽出したRNA1μgの逆転写酵素superscriptIIinvitrogenを用いてcDNAを合成し、それを鋳型に、TIP41、TRAIL-R1DeathreceptorDR4、TRAIL-R2DR5、TRAIL-R3DcR1およびTRAIL-R4DcR2遺伝子のプライマーを用いて、定量的リアルタイムPCRを行なった。PCRの結果は、2-DDct比較法2-DDctcomparativemethodを通じて各遺伝子の相対的な発現量を確認した。TIP41正方向プライマー配列番号3:5-attgaaagccagagaacaga-3とTIP41逆方向プライマー配列番号4:5-tctcgtgtcattcattctga-3、DR4正方向プライマー配列番号5:5-ctcagcggaatcaatcagctgtg-3、DR4逆方向プライマー配列番号6:5-agaggaacacgacaatcagccttag-3、DR5正方向プライマー配列番号7:5-atcaagcggccccctttttttcac-3、DR5逆方向プライマー配列番号8:5-ctcattgtcacactcctcgacagc-3、DcR1正方向プライマー配列番号9:5-tccccaagaccctaaagttc-3、DcR1逆方向プライマー配列番号10:5-ggcaccaaattcttcaacac-3、DcR2正方向プライマー配列番号11:5-gcacagagggtgtggattac-3、およびDcR2逆方向プライマー配列番号12:5-gagcagatgcctttgaggta-3を用いて、定量的リアルタイムPCRを行なった。ここで、定量的対照群としてベータ-2-マイクログロブリンbeta-2-microglobulin,B2Mの正方向プライマー配列番号13:5-ctcgctccgtggccttag-3および逆方向プライマー配列番号14:5-caaatgcggcatcttcaa-3で表されるプライマー対を用いて、定量的リアルタイムPCRを行った。前記のPCRの条件は、95°Cで10分間で変性させた後、95°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで1分の条件で40サイクル反復した後、72°Cで8分間伸長させた後、常温まで冷やした。定量的リアルタイムPCRの結果は、各試料別のTRAIL受容体発現量をB2M発現量に補正する2-DDct比較方法で分析した後、正常肝臓組織でのTRAIL受容体発現量に対する肝癌組織での発現量の倍数を図6に示した。その結果、TRAIL耐性癌細胞株の肝癌および肺癌細胞株でTRAIL-R3DcR1は、正常細胞株より低く発現し、TRAIL-R4DcR2は、正常細胞株と類似の水準で発現した。TRAIL-R1DR4の場合は、正常細胞株に比べて肝癌、肺癌細胞株で発現量が少し高いが全体の発現量は低く、TRAIL-R2DR5は、正常細胞株に比べて、肝癌、肺癌細胞株で過量に発現することを確認した。したがって、一般的に知られているように、細胞死受容体が肝癌、肺癌細胞株で多く発現し、このことからTRAIL耐性が受容体の発現とは関係がないことを確認することができた図6のA。<6-2>TIP41タンパク質発現抑制とTRAILを処理後、TRAIL受容体の発現確認TIP41タンパク質のノックダウンknockdownで誘導されたアポトーシスとTRAIL受容体との相関関係を確認するために、TRAILおよびTIP41siRNAで処理されたHuh7肝癌細胞株でのTRAIL受容体の発現水準を測定した。TIP41siRNAをHuh7肝癌細胞株にトランスフェクション72時間後、100ng/mlのTRAILを4時間および6時間処理した。TRAILを処理した後、定量的リアルタイムPCRを行なうためにHuh7肝癌細胞株をトリゾールを用いてRNAを抽出した後、抽出したRNA1μgの逆転写酵素superscriptIIinvitrogenを用いてcDNAを合成し、それを鋳型に、TIP41、TRAIL-R1DeathreceptorDR4、TRAIL-R2DR5、TRAIL-R3DcR1およびTRAIL-R4DcR2遺伝子のプライマーを用いて、定量的リアルタイムPCRを行なった。PCRの結果は、2-DDct比較法を用いて、各遺伝子の相対的発現量を測定した。その結果、図6のBに示されているように、TIP41siRNAをトランスフェクションさせた群と対照群とを比較してみると、TIP41タンパク質発現抑制後、TRAIL受容体TRAIL-R1、-R2、-R3および-R4の発現の差異は、ほとんど表れないことを確認することができた図6のB。<6-3>肝癌細胞組織別TRAIL受容体の発現確認肝癌組織とそれに隣接する組織で、TRAIL受容体の発現様相をリアルタイム逆転写重合反応ReverseTranscriptase-PCR法で測定した。実験に使用した組織は、エドモンソンEdmondson及びステイナーSteiner分類法によってIn=5、IIn=5、IIIn=5およびIVn=4に分類した、各肝癌段階にある患者の肝癌組織hepatocellularCarcinoma、HCCと周辺の正常組織を含む19の組織を、カトリック医大CatholicUniversityofMedicineinSeoul,韓国で外科手術前の患者の同意の下で採取した。リアルタイム逆転写PCRは、トリゾールを用いて肝癌組織からRNAを抽出した後、抽出したRNA1μgを逆転写酵素superscriptIIinvitrogenを用いてcDNAを合成し、それを鋳型にTRAIL-R1DeathreceptorDR4、TRAIL-R2DR5、TRAIL-R3DcR1およびTRAIL-R4DcR2遺伝子のプライマーを用いて、リアルタイムPCRを行なった。PCRの結果は、2-DDct比較法によって各遺伝子の相対的発現量を確認した。その結果、TRAIL-R1DR4の発現量が正常組織と比較して、肝癌組織で有意な増加を肝癌1段階で最も多く観察され、その次に、肝癌3段階の組織、肝癌2段階および4段階で、発現量の差異が有意に観察された。TRAIL-R2DR5の場合は、肝癌1段階と肝癌5段階で、正常組織に比べて肝癌組織で発現が有意に増加することが確認されたが、TRAIL-R3DcR1は、ほぼすべての段階で発現量が少なく、正常組織と肝癌組織間の差異が観察されなかった。また、TRAIL-R4DcR2は、肝癌の2段階でのみ正常組織に比べて肝癌組織で有意に増加することが観察され、それ以外の場合は、正常な組織と同じか、むしろ、正常組織で発現が増加することを確認することができた図6のC。<実験例7>正常細胞株でアポトーシスを確認<7-1>FACS分析によるTIP41発現の抑制とTRAIL処理による正常細胞株でのアポトーシス分析TIP41は、癌細胞株に特異的に発現するが、正常細胞株でも発現するため、TIP41の発現を抑制した時、癌細胞株のように正常細胞株のアポトーシスが誘導される可能性があるため、TIP41タンパク質の発現抑制とTRAIL処理で誘導されるアポトーシスが癌細胞株特異的な反活性であることを確認するために、正常細胞株であるHAECにTIP41タンパク質発現抑制とTRAIL処理によってアポトーシスを誘導した。正常細胞株であるHAECにTIP41siRNAをトランスフェクションさせた後72時間が経過した後、TRAILを100ng/mlで0、2、4時間処理し、アポトーシスを誘導した。死滅した細胞を前記で記載された方法と同一にアネキシンV-FITc/PI染色で分析した。その結果、TRAILを処理した後、TIP41siRNAの処理の有無に関係なく、アポトーシスする程度に差異がないことを確認することができた。したがって、癌細胞株特異的に過発現するTIP41siRNAをトランスフェクションさせた後、TRAILを処理して誘導されるアポトーシスが癌細胞株特異的に発生することを確認することができた図7のA。<7-2>TIP41発現抑制とTRAIL処理による正常細胞株のアポトーシスタンパク質分析TIP41siRNAを前記と同一な実験方法で正常細胞株にトランスフェクションさせた後、カスパーゼ-8、-3、JNK、PARPタンパク質の活性化を確認した。正常細胞株に100ng/TRAILを0、2、4時間処理し、その後、アポトーシス促進性タンパク質の発現および活性を前記で記載したウエスタンブロット方法を用いて確認した。その結果、TIP41siRNAをトランスフェクションさせた後、TIP41タンパクの発現が抑制さることを確認することができたが、その他のアポトーシス伝達経路に関与する、カスパーゼ-8、カスパーゼ-3、JNK、pJNKリン酸化したJNK、phosphorylationJNKの変化が観察されなかった。また、これらのタンパク質が活性化されないことを確認することにより、TIP41siRNAとTRAILによるアポトーシスが癌細胞株特異的な反応であることを確認することができた図7のB。<実験例8>癌細胞株でTRAIL発現抑制を通じたTIP41媒介アポトーシス<8-1>肺癌細胞株でTIP41タンパク質発現抑制を通じたTIP41媒介アポトーシス<8-1-1>ウエスタンブロット方法によるTIP41タンパク質発現抑制で誘導される肺癌細胞株のアポトーシスの確認前記の<実験例>で用いた肝癌細胞株以外のTRAIL耐性癌細胞株でTIP41タンパク質発現抑制によるTRAILの耐性克服するセンシタイザーとしての機能を検証するために、肺癌細胞株のA549細胞株で肝癌細胞の場合と同じ方法でTIP41siRNAをトランスフェクションさせた後、72時間経過後に100ng/mlのTRAILを0、1、2、3、4時間処理した後、アポトーシスに関連したタンパク質の活性化をウエスタンブロット方法を用いて確認した。その結果、肝癌の場合と同様に、JNKおよびカスパーゼ-8、PARPなどが活性化してアポトーシスが起きることを確認することができた図8AのA。<8-1-2>核染色法によるTIP41のタンパク質発現抑制で誘導される肺癌細胞株のアポトーシスの確認肺癌細胞株のA549細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションさせて、細胞内TIP41発現量を減少させた後、TRAILを100ng/mlで処理した後、0、1、2、4、6時間帯にアポトーシスを核染色法を用いて測定した。アポトーシスの測定は、Hoechst33342で核を染色した後、蛍光顕微鏡で観察して死滅した細胞株を計数した。6ウェルプレートにTIP41発現抑制された細胞株を2×105細胞/ウェルずつ分注した。24時間後、前記の細胞に100ng/mlのTRAILを各々0、1、2、4、6時間処理した後、Hoechst33342を5μg/mlで30分間室温で染色した。核が染色された細胞株を蛍光顕微鏡で死滅した細胞株を計数して、アポトーシスを測定した。その結果、図8BのAに示すように、A549肺癌細胞株にTIP41siRNAとTRAILを処理した時、TRAILのみを処理した時よりアポトーシスが増加した。TRAILを処理する時間が長くなるほど、アポトーシスが増加し、TIP41siRNAを処理した群では、対照群にsiRNAを処理時より約30程度のアポトーシスの増加が観察された。したがって、A549肺癌細胞株でTIP41siRNAがTRAIL抵抗を減少させることを確認することができた図8BのA。<8-1-3>FACS分析方法を用いて肺癌細胞でTIP41タンパク質発現抑制を通じたTRAIL媒介アポトーシスの確認細胞内TIP41発現量を減少させるために、A549細胞株にTIP41siRNAをトランスフェクションして、TRAILを100ng/mlで処理した後、0、1、2、4、6時間帯にアポトーシスをアネキシンV-FITc/PI染色法で死滅した細胞株と正常細胞株を区別して染色した後、FACSを用いてアポトーシスを測定した。アポトーシスを測定するために、細胞株をトリプシンEDTAを用いて細胞株を得た後、FITc融合したアネキシンVannexinv50μg/mlとPI50ng/mlで20分間染色した後、アネキシンV-FITc/PI染色された細胞株の比率を分析するためにFACSCaliburBDを用いて、分析した。その結果、対照群のsiRNAを肺癌細胞株のA549細胞株に処理したものに比べて、本発明のTIP41siRNAを処理した時、A549細胞株のアポトーシスが顕著に増加することを確認することができた図8BのB。また、図8BのCに示すように、TRAIL濃度を0、25、50、100および200ng/mlで処理し、4時間処理してアポトーシスを観察した結果、TRAIL処理濃度が高い程、TRAILとTIP41siRNAを一緒に処理した時、アポトーシスが増加することを確認することができた図8BのC。これらの結果を通じて、本発明のTIP41siRNAは、TRAILの耐性を有する肺癌細胞株のTRAIL耐性を減少させ、癌特異的アポトーシスを誘発する効果を有していることを確認することができた。<8-2>TIP41発現抑制による大腸癌細胞株でのTRAIL媒介アポトーシスHCT116大腸癌細胞での場合と同一な方法で、TIP41siRNAをトランスフェクションさせた後、72時間経過後、TRAILを0、50、100ng/mlで処理し、ビヒクルvehicleには、0.3DMSOを処理した後、アポトーシスを誘導する実験を行った。死滅した細胞株を前記記載の方法と同一にアネキシンV-FITc/PI染色した後、アポトーシスを測定するためにFACS分析法を用いた。その結果、TRAILの処理濃度が高くなる程アポトーシスが増加することを確認することができ、TIP41siRNAをトランスフェクションさせた群で、対照群と比較してアポトーシスが増加することを確認することができた。つまり、大腸癌細胞株でも肝癌細胞株の場合と同様に、アポトーシスが誘導されることを確認することにより、TIP41遺伝子はTRAIL耐性を有する癌のTRAILセンシタイザーとして使用が可能であることを確認した図8AのB。<8-3>TIP41発現抑制を通じた肝癌細胞株でのTRAIL媒介アポトーシス前記の<実験例>で用いたHuh肝癌細胞株以外のTRAIL耐性癌細胞株でTIP41タンパク質発現抑制によるTRAILの耐性を克服するセンシタイザーとしての機能を検証するために、HepG2肝臓肝細胞の細胞liverhepatocellularcell細胞とSK-Hep1細胞にTIP41siRNAをトランスフェクションさせた後、72時間経過後、100ng/mlのTRAILを0、1、2、4、6時間処理した後、アポトーシスに関連したタンパク質の活性化をウエスタンブロット方法を用いて測定した。その結果、図8CのAおよびBに示すように、HepG2およびSK-Hep1細胞でTIP41siRNAによってカスパーゼ-8とPARPが活性化してアポトーシスが起きることを確認することができた図8CのAおよびB。<実験例9>動物実験によるTIP41機能検証<9-1>Huh7肝癌細胞株をヌードマウスに移植ヌードマウスの右側の背部分に肝癌細胞株のHuh7肝癌細胞株を2×106程度移植した後、腫瘍を一定のサイズ50~100mm3に成長させた。実験は、個体群ごとに7匹ずつn=7、総28匹のヌードマウスをJapanSLcInc.から購入して行なった。<9-2>TIP41発現抑制とTRAIL処理による腫瘍サイズの変化の測定実験例<9-1>に記載した方法でHuh7肝癌細胞株をヌードマウスの背に移植して、腫瘍を形成した後、12日間、0、4、6、8日に対照siRNAcontrolsiRNAとTIP41siRNAをヌードマウスの背に形成した腫瘍に注入し、2、5、7、9、10、11日にTRAILを注入した後、12日にマウスを犠牲にした。50nMの濃度でリポフェクタミンRNAiMax試薬を用いて混合物を作成し、形成された腫瘍に注入し、2、5、7、9、10、11日にTRAILを2.5μg/kgずつ注入した後、4つのグループcontrolsiRNAvehicle、controlsiRNATRAIL、TIP41siRNAvehicle、TIP41siRNATRAILに分け、TIP41siRNAとTRAIL処理による腫瘍のサイズを確認した。その結果、TIP41siRNAを注入した群でcontrolsiRNAを注入した群と比較して、腫瘍のサイズが減少することを確認することができ、TRAILを注入した時、controlsiRNAに比べてTIP41siRNAを処理した後、さらに減少する腫瘍サイズを確認することができた図9A。<9-3>癌組織でアポトーシスの観察SiRNAを処理していないヌードマウスと、controlsiRNA、TIP41siRNAを処理したヌードマウスにTRAILを処理した群と、処理しない群に分けて、6群で生成された腫瘍を採取してホルマリンに固定した後、パラフィンに包埋した。5μmの厚さに切片をつくり、キシレンを用いてパラフィンを除去した後、エタノール濃度による再水和rehydrationさせた。4パラホルムアルデヒド溶液を処理して、組織切片を固定し、プロテイナーゼK溶液を処理して、組織を透過可能にした後、4パラホルムアルデヒド溶液に再度固定した後、TUNELstainingkitpromega,米国を用いて、実験を行なった。平衡バッファーを用いて組織切片を平衡化させ、その間にrTdT反応溶液を準備して平衡化した部位にそれを処理した。最後に、ストレプトアビジンHRP溶液を処理してDAB混合物を用いて発色反応させた後、光学顕微鏡で観察した。その結果、siTIPRNAをトランスフェクションさせた群でアポトーシスが明確に増加していることを確認することができた図6のB。<9-4>腫瘍のアポトーシス測定4つのグループcontrolsiRNAvehicle、controlsiRNATRAIL、TIP41siRNAvehicle、TIP41siRNATRAILから採取した腫瘍を溶解させてタンパク質を抽出した後、アポトーシスの標識因子であるカスパーゼ-8抗体を用いて、ウエスタンブロット方法でアポトーシスを確認した。その結果、TIP41タンパク質の発現量の減少でTIP41siRNAの効果を確認することができ、TRAIL処理によって増加しなかったカスパーゼ-8の活性がTIP41siRNAトランスフェクションさせた後、発現が明確に増加していることを確認することができた。これにより、TIP41siRNAが生体内でも作用することができ、TRAILに耐性を有する癌に対して効果的にアポトーシスを誘導することにより、TRAIL耐性克服の効果を有する化学剤として使用できることを確認した図9C。<実験例10>TIP41とPP2Acとの相互結合測定<10-1>発現ベクターの構成TIP41、PP2Ac、MKK7、αalpha4およびPR65遺伝子を発現するベクターを製造するために、前記の肝癌細胞株からRNAを分離して、発現ベクターにクローニングした。逆向RNAreservedRNAを鋳型に用いて、個々の遺伝子に該当するプライマーを用いてPCRを行なった。TIP41正方向プライマー配列番号15:5-cgggtaccaaatgatgatccacggcttc-3とTIP41逆方向プライマー配列番号16:5-cccggatccttattccacttgtgtact-3、PP2Ac正方向プライマー配列番号17:5-cgggatccatggacgagaaggtgttc-3、PP2Ac逆方向プライマー配列番号18:5-atagtttagcggccgcttacaggaagtagtctgg-3、MKK7正方向プライマー配列番号19:5-ccgctcgagatggcggcgtcctccctg-3、MKK7逆方向プライマー配列番号20:5-ggggtacccctgaagaagggcaggtg-3、α4正方向プライマー配列番号21:5-cgggatccatggctgctgaggacgag-3、α4逆方向プライマー配列番号22:5-atagtttagcggccgctcagcccatgttctgtcg-3、PR65正方向プライマー配列番号23:5-cgggatccatggcggcggccgacggc-3、およびPR65逆方向プライマー配列番号24:5-atagtttagcggccgctcaggcgagagacagaac-3を用いてPCRを行なった。前記のPCRの条件は、95°Cで3分間で変性させた後、95°Cで1分、58°Cで1分、72°Cで1分30秒の条件で30サイクル反復した後、72°Cで10分間伸長した後、4°Cに冷やした。TIP41に対するベクターの場合は、抽出されたPCR産物をKpnIとBamHI制限酵素で切断し、その後、pHAベクターpcDNA3.1;Invitrogen社のベクターにHAタグHAtagを挿入製造したベクターに挿入した。使用したプライマーには、KpnIとBamHI制限部位が含まれていた。PP2Ac、PR65、MKK7、α4の場合、BamHIとNotI制限酵素認知部位を含むプライマーを用いて増幅させた後、生成されたPCR産物を精製した後、BamHIとNotI制限酵素でカットした後、pGSTベクターpEBGベクターMayerら,CurrentBiology,1995年,第53巻,p.296-305、また組換えタンパク質を製造するために、前述と同一のプライマーを用いてPCRを行った。MKK7およびPP2Acに対するPCR産物をE.coli発現ベクターであるpET21aNovagen社ベクターに各々挿入し、TIP41に対するPCR産物は、pGEX4T-1GEhelthcare社ベクターに挿入した。前記のプロセスによって、pET21-MKK7、pET21-PP2Ac、およびpEGX4T-TIP41を製造した。<10-2>HEK293T細胞株の培養韓国細胞株銀行から分譲されたHEK293T細胞株に10の牛胎児血清を含んだダルベッコの改変イーグル培地DMEMで37°C、5CO2で培養した。SiRNAをトランスフェクションするためにHEK293T細胞株を1×106細胞/100mm皿に植えて24時間培養し、その後、トランスフェクションを行なった。<10-3>TIP41とPP2Acとの相互結合確認本発明者らは、前記の実験を通じて、TIP41発現抑制およびTRAIL処理によるアポトーシスの原因が、JNKの継続的な活性化の結果であることを解明したが、それは、TIP41の発現抑制がJNK活性化作用機序を誘導するということを意味する。TIP41と結合することが知られているタンパク質によってJNK活性が調整されるかどうかを確認するために、最近の報告で、TIP41と結合することが知られたタンパク質ホスファターゼ2AcProteinphosphatase2Ac、PP2Acを発現させる発現ベクターを、前記の実験例<10-1>で製造した。PP2Acタンパク質は、セリン/スレオニンホスファターゼで、いくつかのタンパク質のSer/Thrアミノ酸にリン酸化phosphorylationしているリン酸塩を除去する機能を実行する。PP2Acタンパク質の基質としてFoxo1、NF-κBp65、AMPK、MKK4などが知られている。まず、TIP41と結合することが知られているPP2Acとの結合を確認するために、HEK293T細胞株を2×105で100mmの培養皿に分注した後、前記の細胞株にリポフェクタミンLTX試薬を用いて実験例<10-1>で製造したPP2Ac発現ベクターを細胞にトランスフェクションさせてPP2Acを過発現させた。トランスフェクションした細胞から細胞溶解物を抽出して、GSTプルダウン分析を行なった。GSTプルダウン分析は、細胞溶解物1mg/mlにGSH-ビーズ40μlを添加した後、4°Cで12時間注意深く撹拌した後、PBST[0.1のツイーン20を含むPBS]バッファーを1mlずつ入れて洗浄し、それを6回反復した。その後、洗浄されたビーズに1×サンプルバッファーウエスタンブロット用を100μlずつ添加した後、95°Cヒーティングブロックで5分間沸かした後、氷で2分間冷却した。その後、各々の抗体を用いて、前記記載と同一な条件で、ウエスタンブロットを行なった。その結果、図10のAに示すように、TIP41は陽性対照群として提供されたα4と同様に、PP2Acと結合することを確認することができた。また、GSTプルダウン前、全体細胞溶解物WcLを通じて各発現ベクターの発現量も確認した図10のA。<10-4>TIP41とPP2Ac複合体の相互作用確認TIP41とJNKキナーゼとして知られているPP2Acとの結合を確認するために、実験例<10-1>で製造された発現ベクターをHEK293T細胞株に前記と同一な方法でトランスフェクションさせた後、GSTプルダウンしてウエスタンブロットを行なった。その結果、図10のBに示すように、TIP41とPP2Ac複合体の結合すなわち、PP2Ac、PR65とα4の結合を確認できた図10のB。<実験例11>TIP41とMKK7間の相互作用確認<11-1>MKK7過発現後、TIP41とMKK7間の相互作用確認TIP41とJNKキナーゼとして知られているMKK7との間の結合を確認するために、前記の<実験例10>で製造したMKK7発現ベクターをHEK293T細胞にトランスフェクションさせて過発現させた後、<実験例10>と同一な方法でGSTプルダウン分析を行なった。その結果、図11のAに示すように、TIP41とMKK7の結合を確認することができた図11のA。<11-2>免疫沈降法を用いたTIP41とMKK7の相互作用確認TIP41とMKK7間の相互作用を確認するために、各々の抗体を用いて、免疫沈降法を行なった後、ウエスタンブロットを行なってTIP41とMKK7間の結合を確認した。免疫沈降法は、沈降させたタンパク質の抗体を細胞溶解物1mgに2μgずつ入れて、4°Cで2時間反応させた後、プロテインGセファロースビーズ30μlずつ入れて、4°Cで12時間反応させる。その後、PBST[0.1のツイーン20を含むPBS]バッファーを1mlずつ入れて洗浄し、それを4回反復した。その後、洗浄されたビーズに1×サンプルバッファーウエスタンブロット用100μlずつ添加した後、95°Cヒーティングブロックで5分間沸かした後、氷で2分間冷却した。その後、MKK7、TIP41の抗体を用いて、ウエスタンブロットを行なった。その結果、図11のBに示すように、TIP41がMKK7と結合することを確認することができた図11のB。<実験例12>TIP41とPP2AcまたはTIP41とMKK7間の相互作用確認TIP41とPP2AcおよびMKK7間の相互作用をより正確に確認するために、細胞内でTIP41とMKK7の相互作用ではない、E.coliで組換えタンパク質を合成し、合成されたタンパク質を1:1の反応率に反応させるGSTプルダウン分析を行なった。組換えタンパク質は、前記の実験例<10-1>で製造されたE.coli用発現ベクターをBL21E.coli菌株に形質転換させて製造した。誘導は、形質転換したE.coliをLB培地に接種して、O.D値が0.4~0.6の間になるように培養した後、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGを最終濃度が1mMになるように添加した後、2時間30°Cで培養した。その後、超音波破砕を用いて溶解物を得てGSTプルダウンに用いた。その結果、図11のCに示すように、TIP41とMKK7が直接的に相互結合することを確認することができ、また、TIP41とPP2Acが直接的に相互結合することを確認した図11のC。また、TIP41とPP2AcおよびMKK7間の相互作用は、実験例<10-4>と同様に、行なった結果でも確認された図10のB。<実験例13>MKK7と結合するTIP41の結合部位の確認MKK7と結合するTIP41の結合部位を確認するために、TIP41の断片発現ベクターを前記<実験例10>に記載されている方法でクローニングした。図12のAに示すように、全長TIP41をD1~D6の六つの断片に分離し、それぞれに対応する下記のプライマーを用いて増幅させた後、pHA発現ベクターに挿入した。TIP41-D1正方向プライマー配列番号15とTIP41-D1逆方向プライマー配列番号25:5-cgggatcccaggcttgaaactccatg-3、TIP41-D2正方向プライマー配列番号15、TIP41-D2逆方向プライマー配列番号26:5-cgggatccggaaggtggaacatgcatc-3、TIP41-D3正方向プライマー配列番号27:5-ggggtaccatgcttaaagtggcctgtg-3、TIP41-D3逆方向プライマー配列番号16、TIP41-D4正方向プライマー配列番号28:5-cgggatccatgcttaaagtggcctgt-3、TIP41-D4逆方向プライマー配列番号29:5-ccgctcgagcaggcttgaaactccatg-3、TIP41-D5正方向プライマー配列番号15およびTIP41-D5逆方向プライマー配列番号30:5-cgggatccgtgttcaccctccgtcct-3、TIP41-D6正方向プライマー配列番号31:5-cgggatccaaattgaaagccagagaac-3およびTIP41-D6逆方向プライマー配列番号16を用いてPCRを行った。D1~D6のTIP41断片を発現するベクターを過発現させるために、HEK293T3×106細胞株を100mm培養皿に植えた後、リポフェクタミンLTX試薬を用いて、クローニングされたTIP41D1~D6断片発現ベクターを細胞株に各々トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞から細胞溶解物を抽出し、GSTプルダウン分析を行なった。GSTプルダウン分析は、前記と同一な方法で実行した。その結果、図12のBに示すように、MKK7と結合する断片は、全長TIP41タンパク質と断片D3とD6だった。したがって、MKK7は、記載されたTIP41タンパク質配列番号1のN末端から、230番~272番部位に結合することを確認することができた図12。<実験例14>TIP41と結合するMKK7の結合部位確認TIP41と結合するMKK7の結合部位を確認するために、MKK7断片発現ベクターを前記<実験例10>に記載されている方法でクローニングした。MKK7-D1正方向プライマー配列番号32:5-cgggatcccgcagcatggagagcatt-3とMKK7-D1逆方向プライマー配列番号20、MKK7-D5正方向プライマー配列番号33:5-cgggatccgccggctgtgccgcctac-3、MKK7-D5逆方向プライマー配列番号20、MKK7-D6正方向プライマー配列番号19、MKK7-D6逆方向プライマー配列番号34:5-atagtttagcggccgctaaatgcgctcggggatggg-3を用いてPCRを行なった。図13のAに示すように、全長MKK7をD1、D5およびD6の3つの断片に分けて、それぞれに該当する前記のプライマーを用いて増幅させた後、pGST発現ベクターに挿入した。D1、D5およびD6のMKK7断片を発現するベクターを過発現させるために、HEK293T3×106細胞株を100mm培養皿に植えた後、リポフェクタミンLTX試薬を用いて、クローニングされたMKK7D1、D5およびD6断片発現ベクターを細胞株に各々トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞から細胞溶解物を抽出し、GSTプルダウン分析を行なった。GSTプルダウン分析は、前記と同一な方法で行なった。その結果、図13のBに示すように、TIP41に対するMKK7の結合断片は、全長MKK7タンパク質と断片D6だった。したがって、TIP41は、MKK7配列番号35のアミノ酸配列でN末端1番~85番部位に結合することが分かった図13のB。<実験例15>MKK7/JNK経路によって媒介されたアポトーシス<15-1>MKK7発現抑制によるアポトーシスの減少アポトーシス耐性がMKK7とTIP41間の相互作用によって媒介されることを確認するために、MKK7に対するsiRNAによるアポトーシス耐性の減少を調べた。Huh7肝癌細胞株にTIP41siRNA、MKK7siRNA各々および混合して導入した後、TRAILを100ng/mlの濃度で0、3、6時間刺激を与えた後に、アポトーシスをアネキシンV-FITc/PI染色法を用いたFACS分析法を用いて測定した。その結果、図14のAに示すように、MKK7発現抑制によってアポトーシスが減少することを確認することができた。これにより、TIP41タンパク質発現抑制とTRAIL処理で誘導されるアポトーシスは、MKK7の役割が重要であることを確認することができた図14のA。<15-2>TIP41発現抑制によるMKK7/JNK経路活性化実際にTIP41発現抑制が直接的にMKK7の活性化に関与して、それによってMKK7下部信号伝達に与える影響を確認するために、試験管内invitro共免疫キナーゼimmuno-co-kinase分析を行なった。共免疫キナーゼの分析は、免疫沈降法の一種で、MKK7を沈降させた後、それを分離して試験管内invitro状態で人為的にMKK7の基質およびMKK7の下部信号伝達に関与する基質を同時に定量的に添加して、リン酸化される程度を確認する実験方法である。前記のような方法でMKK7抗体を用いて免疫沈降をさせ、MKK7タンパク質に結合しているプロテインGビーズを得た後、キナーゼバッファーにMKK7の基質である組換えGST-JNK1とJNK1の基質であるGST-c-Junおよび標識因子して同位元素-32Pを入れて、37°Cで30分間反応させた。その後、1×タンパク質ローディングダイproteinloadingdyeを添加した後、95°Cで5分間沸かした。10のSDS-PAGEゲルに電気泳動した後、ゲルドライヤー機でゲルを乾燥させた後、BASリーダー放射線測定機器、富士通、日本で感光した。その結果、図14のBに示すように、TIP41発現抑制によってMKK7が活性化し、MKK7の基質であるGST-JNK1をリン酸化させ、また活性化したJNK1はJNKの下部経路の基質GST-c-junタンパク質をリン酸化させた。したがって、TIP41タンパク質発現抑制とTRAIL処理でMKK7が活性化され、それによりJNK伝達経路が活性化されることを証明した図14のB。下記に本発明の組成物のための製造例を提示する。<製造例1>薬学的製剤の製造<1-1>散剤の製造TIP41タンパク質発現または活性阻害剤2g乳糖1g前記の成分を混合し、気密包に充填して散剤を製造した。<1-2>錠剤の製造TIP41タンパク質発現または活性阻害剤100mgトウモロコシ澱粉100mg乳糖100mgステアリン酸マグネシウム2mg前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって、打錠して錠剤を製造した。<1-3>カプセル剤の製造TIP41タンパク質発現または活性阻害剤100mgトウモロコシ澱粉100mg乳糖100mgステアリン酸マグネシウム2mg前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法によって、ゼラチンカプセルに充填して、カプセル剤を製造した。<1-4>丸薬の製造TIP41タンパク質発現または活性阻害剤1g乳糖1.5gグリセリン1gキシリトール0.5g前記の成分を混合した後、通常の方法によって1丸薬当り4gになるように製造した。<1-5>顆粒製造TIP41タンパク質発現または活性阻害剤150mg大豆エキス50mgブドウ糖200mg澱粉600mg前記の原料を混合し、30のエタノール100mgを追加して、60°Cで乾燥して顆粒形成した後、包に充填した。"