タンパク質が固定されているヒドロキシアパタイトを含む固相から該タンパク質を溶出する方法であって、該固相に、約53~約58のpHにおいて約25ppm~約260ppmの濃度のカルシウムイオンおよび約2mM~40mMの濃度のリン酸イオンを含む溶出液を通過させる工程を含む、方法。溶出液がさらに、約30mM~約2000mMの濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項1記載の方法。溶出液が、実質的に塩化ナトリウムを含有しない、請求項1記載の方法。カルシウムイオン濃度が約40ppm~約200ppmである、請求項1記載の方法。カルシウムイオン濃度が約50ppm~約150ppmである、請求項1記載の方法。リン酸イオン濃度が約15mM~約35mMである、請求項1記載の方法。ヒドロキシアパタイトがセラミックヒドロキシアパタイトである、請求項1記載の方法。モノクローナル抗体および高分子量会合体を含む溶液において該会合体から該抗体を抽出する方法であって、該溶液を、ヒドロキシアパタイトを含む固相に適用する工程、および該固相に、約53~約58のpHにおいて、約50ppm~約225ppmの濃度のカルシウムイオン、約5mM~約40mMの濃度のリン酸イオン、約03M~約15Nの濃度のアルカリ金属塩を含む溶出液を通過させて、該モノクローナル抗体を含有する溶出液を得る工程を含む、方法。アルカリ金属塩が、ハロゲン化ナトリウム、ハロゲン化カリウム、硝酸ナトリウム、および硝酸カリウムからなる群より選択される、請求項8記載の方法。アルカリ金属塩が、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムからなる群より選択される、請求項8記載の方法。アルカリ金属塩が塩化ナトリウムである、請求項8記載の方法。ヒドロキシアパタイトからのタンパク質の溶出における使用のための溶出緩衝液であって、約53~約58のpHにおいて約25ppm~約260ppmの濃度のカルシウムイオンおよび約2mM~約40mMの濃度のリン酸イオンを含む水溶液からなる溶出緩衝液。水溶液がさらに、約30mM~約2000mMの濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項12記載の溶出緩衝液。水溶液が実質的に塩化ナトリウムを含有しない、請求項12記載の溶出緩衝液。カルシウムイオン濃度が約40ppm~約200ppmである、請求項12記載の溶出緩衝液。カルシウムイオン濃度が約50ppm~約150ppmである、請求項12記載の溶出緩衝液。リン酸イオン濃度が約15mM~約35mMである、請求項12記載の溶出緩衝液。高分子量会合体からのモノクローナル抗体の抽出における使用のための溶出緩衝液であって、約53~約58のpHにおいて約50ppm~約225ppmの濃度のカルシウムイオン、約5mM~約40mMの濃度のリン酸イオン、約03M~約15Mの濃度のアルカリ金属塩を含む水溶液からなる溶出緩衝液。カルシウムイオン濃度が約50ppm~約100ppmである、請求項18記載の溶出緩衝液。アルカリ金属塩が、約04M~約08Mの濃度の水酸化ナトリウムである、請求項18記載の溶出緩衝液。詳細な説明本明細書において説明される溶出緩衝液に含ませるためのカルシウムイオンは、典型的には水溶液である当該溶出緩衝液に可溶な任意のカルシウム塩であって、当該溶出緩衝液の他の成分、ヒドロキシアパタイト樹脂、および当該樹脂に保持されているタンパク質、ならびに多くの場合、タンパク質の抽出を試みる供給源溶液の残りの成分、に対して不活性であるカルシウム塩によって供給され得る。カルシウムのハロゲン化物塩が、使用にとって好都合であり、塩化カルシウムは特に都合が良い。本明細書の趣旨のある特定の態様において、最も良い結果は、溶出緩衝液中における約25ppm~約260ppmのカルシウムイオン濃度によって達成されるであろう。代替の範囲は、約40ppm~約200ppmであり、さらなる代替の範囲は、約50ppm~約150ppmである。同様に、溶出緩衝液に含ませるためのリン酸イオンは、やはり典型的には水溶液である溶出緩衝液に可溶な任意のリン酸塩であって、当該緩衝液の他の成分、樹脂、タンパク質、および供給源溶液の残りの成分に対して不活性であるリン酸塩から供給され得る。アルカリ金属またはアルカリ土類金属のリン酸塩は、好都合であり、例として、リン酸ナトリウムが挙げられる。本明細書における趣旨のある特定の態様において、最良の結果は、溶出緩衝液中における約2mM~約40mMのリン酸イオン濃度において達成され、ある特定のタンパク質に対しては、最適な範囲は約15mM~約35mMである。上記において述べたように、溶出緩衝液の最適な組成は、タンパク質をヒドロキシアパタイトに結合させている相互作用のタイプによって変わり得る。当該相互作用が、カチオン交換である場合、例えば、特に高濃度、例えば、約30mM~約2000mMの範囲内の濃度において塩化ナトリウムを含ませることは有益であろう。当該相互作用が、例えばキレート化化学などによるカルシウム配位錯体の形成を伴う場合、低塩化ナトリウム濃度の緩衝液、または場合によって塩化ナトリウムを含有していない緩衝液が、最も効果的に使用することができる。この段落およびこれ以前の段落におけるガイドラインにより、任意の特定のタンパク質またはタンパク質の組み合わせのための最適な溶出緩衝液の組成は、通常の実験によって容易に特定される。高分子量会合体からのモノクローナル抗体の精製での使用のための溶出緩衝液は、好ましくは、約50ppm~約225ppmの濃度のカルシウムイオン、約5mM~約40mMの濃度のリン酸イオン、および約03M~約15Mの濃度のアルカリ金属塩を含む。さらに好ましい範囲は、カルシウムイオン濃度については約50ppm~約100ppm、アルカリ金属塩については約04M~約08Mである。好ましいアルカリ金属塩は、ナトリウムおよびカリウム塩、あるいはアルカリ金属のハロゲン化物および硝酸塩である。塩化ナトリウムおよび塩化カリウムは、特に好ましい。本明細書におけるすべての溶出および精製のための溶出緩衝液は、pHが約53~約58の範囲内であるほとんどの用途において、最適な結果を提供するであろう。pHは、従来の緩衝液、例えば、エチレンジアミン四酢酸、コハク酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン酸、マレイン酸塩、カコジル酸塩、2--エタンスルホン酸、N--2-アミノエタンスルホン酸、ピペラジン-NN-2-エタンスルホン酸、2--2-ヒドロキシ-プロパンスルホン酸、NN-ビス--2-アミノエタンスルホン酸、3--プロパンスルホン酸、N-2-ヒドロキシエチル-ピペラジン-N-2-エタンスルホン酸、3-メチルアミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、3--2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、N-ピペラジン-N-、4--1-ピペラジンプロパンスルホン酸、N-トリス-メチルグリシン、NN-ビスグリシン、エチルアミノ-1-プロパンスルホン酸、N--3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、トリスアミノメタン、およびビス2-ヒドロキシエチルイミノトリス-ヒドロキシメチルメタンである。当技術分野において公知の他の緩衝液も使用することができる。任意のそのような緩衝液の量および所望の値へのpHの調節方法は、周知であり、または当業者には容易に明かとなるであろう。本明細書において説明される溶出緩衝液の使用によって恩恵を受けるであろうヒドロキシアパタイトの形態としては、水和ヒドロキシアパタイトゲル、例えば、Bio-GelHTゲル、Bio-GelHTPゲル、およびDNAグレードのBio-GelHTPなど、ならびにセラミックヒドロキシアパタイトが挙げられ、これらはすべて、BioRadLaboratoriesIncから入手可能である。本明細書の実施例において用いられるセラミックヒドロキシアパタイトは、高温で焼結された化学的に純粋な形態のヒドロキシアパタイトである。セラミックヒドロキシアパタイトは、球状であり、約10ミクロン~約100ミクロンの範囲の粒径を有し、典型的には、20ミクロン、40ミクロン、および80ミクロンの公称直径において入手可能である。セラミックヒドロキシアパタイトは、マクロ多孔性であり、2つのタイプ:中程度の有孔率および比較的高い結合能力を有するタイプI、ならびにより大きい有孔率および低い結合能力を有するタイプII、が入手可能である。いずれかの有孔率を使用することができ、任意の特定のタンパク質の分離または精製にとって最適な有孔率は、タンパク質または供給源混合物の組成によって変わるであろう。いずれの形態のヒドロキシアパタイトも、他の分離媒体または支持体との混合物ではなく、単独で使用することができ、ならびに、天然であるかまたは水和されているかに関係なく、非官能化形態において使用することができる。本明細書において開示される溶出緩衝液による連続的なタンパク質分離においてヒドロキシアパタイト樹脂が使用される場合、当該樹脂は、各分離の後に、従来の方法により、残留タンパク質および不純物質の樹脂を清浄化し、樹脂をタンパク質の保持および溶出のために使用される状態へと平衡化させることによって、再生することができる。したがって、多くの場合、再生は、例えば、適切な塩基性溶液による樹脂の中和、それに続く中性pHへの再生、続いて今度は、タンパク質保持にとって最も適合する範囲内であるわずかに酸性のpHへの、および塩が含まれる場合には塩濃度への平衡化、を含むであろう。一般的に、ヒドロキシアパタイト樹脂は、樹脂の無欠陥性および機能を失うことなく、10回以上、しばしば25回以上、しばしば50回以上のタンパク質分離および溶出に使用することができる。実施例1およそ12グラムの40μm粒子のヒドロキシアパタイトを充填したカラムにおいて、pH65において5mMのリン酸イオンおよび100MのNaClを含有する適用緩衝液を使用してオボアルブミンをセラミックヒドロキシアパタイトI型に固定した。次いで、当該固定されたオボアルブミンを、pH56において、30mMの塩化カルシウム、30mMのリン酸塩、および20mMのMES-エタンスルホン酸を含有する溶出緩衝液を適用することにより、溶出させた。溶出プロファイルを図1A、1B、および1Cに示しており、図1Aは、時間に対する光学濃度を示しており、図1Bは時間に対するpHを示しており、図1Cは時間に対する導電率を示している。12分にカラムの衛生化、36分にpH調節、および108分にタンパク質の負荷を実施した。154分に溶出が始まり、続いて、240分に中和を、および252分に再生を開始した。108分に始まる光学濃度における低い上昇は、カラムに固定されずに通過する少量のタンパク質を示しており、154分に始まる光学濃度のピークは、カラムからのオボアルブミンの溶出を表しており、中和段階に始まる光学濃度のピークは、オボアルブミン中の不純物質の溶出を表している。この実施例は、使用した条件においてオボアルブミンがヒドロキシアパタイトから溶出し得ることを示している。実施例2この実施例は、低濃度リン酸塩、高濃度塩の溶出緩衝液において実施した以外、実施例1の繰り返しである。溶出緩衝液は、30mMの代わりに11mMのリン酸塩を用い、さらに550mMのNaClを含有しており、他のすべての成分および操作条件は同じである。溶出プロファイルを図2A、2B、および2Cに示しており、それぞれ、時間に対する光学濃度、時間に対するpH、および時間に対する導電率を表している。108分に始まる光学濃度の低い上昇は、図1Aと同様に、カラムに固定されずに通過する少量のタンパク質を示しており、中和段階に始まる光学濃度のピークは、やはり、オボアルブミン中の不純物質を表している。光学濃度の軌跡は、この溶出緩衝液ではオボアルブミンはカラムから溶出しないことを示している。実施例3この実施例は、溶出緩衝液のリン酸濃度を34mMに増加させ、他のすべての材料および条件は同じにおいて、実施例2を繰り返した。溶出プロファイルを図3A、3B、および3Cに示しており、それぞれ、時間に対する光学濃度、時間に対するpH、および時間に対する導電率を表している。オボアルブミンによるカラムへの過負荷に起因するオボアルブミンの破過点が、144分に認められるが、180分のピークは、高濃度リン酸溶出緩衝液によってカラムからのオボアルブミンの脱着が回復したことを示している。実施例4この実施例は、pH56での、220mMのカルシウムイオン、229mMのリン酸塩、20mMのMES、および055MのNaClを含有する溶出緩衝液に対する繰り返し曝露におけるセラミックヒドロキシアパタイトの安定性を示している。上記の実施例と同様に、40ミクロンの粒径のセラミックヒドロキシアパタイトI型およそ12グラムを含有するカラムを使用した。実験は、以下の一連の材料を当該カラムに34回通過させることによって実施した。セラミックヒドロキシアパタイトの処理プロトコル34回のサイクルの後、樹脂をカラムから取り出し、清浄化し、秤量した。最終重量は1336gであり、139gの増量を表していた。細孔容積における小さな減少が認められたが、粒子はマクロ多孔性であるため、この減少は、当該粒子のタンパク質結合能力に影響を及ぼさないであろう。溶出液のカルシウムイオン含有量は、120~125ppmの範囲、または入力値225ppmより約95ppm低かった。上記の実施例は、オボアルブミンの保持および溶出を対象としているが、それに匹敵する結果が、他のタンパク質おいても達成可能である。これらのタンパク質の例は、等電点が増加する順に、α-ラクトアルブミン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、カタラーゼ、コンアルブミン、ミオグロビン、リボヌクレアーゼA、α-キモトリプシノーゲンA、リゾチーム、およびシトクロムcである。58以上の等電点を有するタンパク質は、典型的には、イオン交換によってヒドロキシアパタイトに結合し、かつ溶出され、これらのタンパク質の溶出は、溶出緩衝液中の塩化ナトリウムの高い濃度から恩恵を受ける。58未満の等電点を有するタンパク質は、典型的には、カルシウム配位錯体の形成によってヒドロキシアパタイトに結合し、脱錯体化によるこれらのタンパク質の溶出は、溶出緩衝液中のリン酸塩濃度が低い場合に最も良く達成される。実施例5この実施例は、ヒドロキシアパタイトカラムにおいて高分子量会合体からモノクローナル抗体を精製するための、本発明の範囲内の溶出緩衝液の使用を示している。長さ22cm、内径22cmのカラムに、40ミクロン粒径のセラミックヒドロキシアパタイトI型4970gを入れた。結果として得られる充填されたカラムは、175cm時間または1109mL分の流量であった。5の高分子量会合体を含有するモノクローナル抗体溶液を、出発材料として使用した。カラムを通過させた一連の材料は、以下の通りであった。モノクローナル抗体の精製プロトコルカラムから溶出するMAb中の高分子量会合体の含有量は、06重量未満まで減少した。本明細書に添付の請求の範囲において、用語1つのは、1または複数を意味することが意図される。用語含むおよびその変形、例えば、含むおよび含むことなどは、工程または要素の列挙の前にある場合、さらなる工程または要素の追加が、任意でありかつ排除されないことを意味することが意図される。本願明細書中に引用された全ての特許、特許出願、その他公開された参考資料は、参照によりその全体が本願明細書に組み入れられる。本明細書において引用された任意の参考資料または一般的な任意の先行技術と、本明細書の明確な教示との間の任意の矛盾は、本明細書における教示を優先して解消することが意図される。これは、単語または句について当技術分野において理解される定義と、当該単語または句に対して本明細書において明確に提供される定義との間におけるあらゆる矛盾も包含する。