"自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対して、一次又は二次抵抗性を有する悪性細胞の治療において使用するための、自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを含む、医薬組成物。前記悪性細胞が、以下の工程:a感染多重度1にて腫瘍崩壊性麻疹ウイルスで、当該悪性細胞に由来する細胞の集合を感染させた後、72時間、又は好ましくは96時間で当該悪性細胞に由来する細胞の集合において、生細胞の割合を測定することを行うことにより同定され、ここで当該集合における生細胞の40以上、特に50以上、より特別に60以上の割合が、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次抵抗性を有する悪性細胞を指し示す、請求項1に記載の医薬組成物。前記組換え麻疹ウイルスが、麻疹ワクチンSchwarz株に基づく、請求項1又は2に記載の医薬組成物。自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスが、麻疹ワクチンSchwarz株に由良医師、特に配列番号1に記載の配列を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の医薬組成物。前記自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の医薬組成物。前記自殺遺伝子が、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項5に記載の医薬組成物。前記自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼとの融合体を含み、特にここで当該自殺遺伝子が、配列番号2に記載の配列を含む、請求項6に記載の医薬組成物。前記組換え麻疹ウイルスが、配列番号3、配列番号4、配列番号8、又は配列番号9、特に配列番号4に記載のRNA配列を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の医薬組成物。前記悪性腫瘍細胞が、さらに化学療法及び又は放射線療法に対して追加的に非応答性である、請求項1~8のいずれか一項に記載の医薬組成物。前記悪性細胞が、以下のリスト:胆管癌、頭頸部癌、及び肉腫に由来する悪性細胞から選択される、請求項1~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。前記治療が、繰り返し治療、特に毎週、隔週、3週に1回、又は4週に1回の治療である、請求項1~10のいずれか一項に記載の医薬組成物。麻疹ワクチンSchwarz株に基づく組換え麻疹ウイルスであって、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼを含む自殺遺伝子、特に、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子、をコードし、ここで等外自殺遺伝子が、配列番号2に記載の配列を含む、前記麻疹ウイルス。前記組換え麻疹ウイルスが、配列番号3、配列番号8、又は配列番号9、特に配列番号4に記載のRNA配列を含む、請求項12に記載の組換え麻疹ウイルス。以下の工程:ai麻疹ワクチンSchwarz株のゲノム、及びiiシトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼを含む自殺遺伝子、特にシトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子を、RNAポリメラーゼIIの制御下でプラスミドにクローニングする工程を含む、請求項12又は13に記載の組換え麻疹ウイルスを製造する方法。前記自殺遺伝子が、配列番号2に記載の配列を含む、請求項14に記載の方法。b麻疹ウイルスヘルパー遺伝子N、P、及びLを、各々のRNAポリメラーゼIIの制御下で少なくとも1のベクターにクローニングする工程をさらに含む、請求項14又は15に記載の方法。前記ウイルスヘルパー遺伝子N、P及びLが、それぞれ分離したベクター、特にプラスミドベクターにクローニングされる、請求項16に記載の方法。以下の:ba麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Nを、RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、第一ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングし;bb麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Pを、RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、第二ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングし;bc麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Lを、RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、第三ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングする工程を含む、請求項17に記載の方法。工程a及び又はb、或いはa、ba、bb及び又はbcが、前記ゲノム及び又は任意のヘルパー遺伝子由来の推定のスプライシング配列を除去する工程をさらに含む、請求項14から18のいずれか一項に記載の方法。工程aが、配列番号4、配列番号8、又は配列番号9、特に配列番号4に記載の配列を有するプラスミドをもたらす、請求項14~19のいずれか一項に記載方法。工程baからbcが、配列番号5、配列番号6、及び配列番号7に記載の配列を有するプラスミドをもたらす、請求項18又は19に記載の方法。以下の:c宿主細胞を、工程a及びbのプラスミドで感染させるか、又は工程a及びba~bcのプラスミドで感染させる工程をさらに含み、特に宿主細胞はワクチン生産に承認された樹立された細胞株、特にベロ又はMRC-5細胞株由来である、請求項14~21のいずれか一項に記載の方法。以下の:d工程cで形質導入された宿主細胞から組換え麻疹ウイルスをレスキューする工程をさらに含む、請求項22に記載の方法。以下の:ai麻疹ワクチンSchwarz株のゲノムと、iiシトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を、RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で含む自殺遺伝子とを含むプラスミド;特にここで当該自殺遺伝子が、配列番号2に記載の配列を含み、特にここで当該プラスミドが配列番号4、配列番号8、又は配列番号9、より特別に配列番号4に記載の配列を有し;bRNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で単一の遺伝子の形態で、麻疹ウイルスヘルパー遺伝子N、P、及びLを含む少なくとも1のプラスミドを含むキット。前記ウイルスヘルパー遺伝子N、P及びLが、それぞれ分離したプラスミドにクローニングされ、特にここで当該プラスミドが、配列番号5、配列番号6、及び配列番号7に記載の配列を有する、請求項24に記載のキット。その結果、悪性細胞の治療において使用するための組換え麻疹ウイルスを含む改善された医薬組成物や、そのような医薬組成物及び組換え麻疹ウイルスを生成するための改善された方法に対する絶え間ない必要性が残っている。したがって、従来技術の課題を鑑み、本発明の第一の対象は、従来技術の麻疹ウイルスに対して抵抗性である腫瘍に対して腫瘍崩壊活性を伴う組換え麻疹ウイルスを含む、改善された医薬組成物を提供することである。本発明の第二の対象は、樹立された弱毒化生麻疹ウイルスのゲノムに対応するウイルスゲノムを有する組換え麻疹ウイルスを含む改善された医薬組成物である。本発明の第三の対象は、悪性細胞の治療において使用するための組換え麻疹ウイルスを取得するためのより安全かつより安価な方法である。これらの及び他の対象は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次抵抗性primaryorsecondaryresistancesを有する悪性細胞の治療において使用するための自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを含む医薬組成物により解決される。自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次抵抗性を有する悪性細胞の治療において使用するための、自殺遺伝子をコードする組換え麻疹ウイルスの発明は、抗腫瘍効力が失われることなく、少ない数の感染性麻疹ウイルス粒子を使用することを同時に可能にする固体腫瘍のより効果的な治療を可能にする。それにより、ウイルス治療のコストを有意に低下できる。別の態様では、本発明は、シトシンデアミナーゼ、特に酵母のシトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子を含む麻疹ワクチンSchwarz株に基づく組換え麻疹ウイルスであって、特にここで当該自殺遺伝子が、配列番号2の配列を含む、前記ウイルスに関する。別の態様では、本発明は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次抵抗性を有する悪性細胞の治療方法であって、本発明に記載の自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを、それらを必要とする患者に投与する工程を含む、前記方法に関する。別の態様では、本発明は、本発明に記載の組換え麻疹ウイルスを生成するための方法にであって、ai麻疹ワクチンSchwarz株のゲノム、及びiiシトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子を、RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下でプラスミドにクローニングする工程を含む、方法に関する。さらに別の態様では、本発明は、以下の:ai麻疹ワクチンSchwarz株のゲノム、及びiiシトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子を、RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下に含む、プラスミドであって、特に当該自殺遺伝子が、配列番号2に記載の配列を含み、特に当該プラスミドが、配列番号4、配列番号8、又は配列番号9、より具体的に配列番号4に記載の配列を有する、プラスミド;b単一の遺伝子の形態で、麻疹ウイルスヘルパー遺伝子N、P、及びLを、それぞれRNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で含む少なくとも1のプラスミドを含むキットに関する。本発明は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対して一次又は二次的抵抗性を備えた悪性細胞の治療において使用するための、自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを含む医薬組成物に関する。本発明の意味における含むcomprise及び含んでいるcontainという語句は、特徴が完全に網羅されていない一覧を意味する。同様に、1のという語句は、少なくとも1の意味で理解されたい。本発明の文脈では、自殺遺伝子という語句は、宿主細胞において発現すると、かかる宿主細胞の生存性の低下を引き起こすか、又はもたらす遺伝子を指す。特別な状況では、自殺遺伝子は、アポトーシスを介した細胞による細胞自身の殺傷を引き起す。特定の状況では、自殺遺伝子の発現は、非毒性のプロドラッグから細胞障害性の薬剤の生成を触媒する酵素をもたらす。本発明に記載の医薬組成物の特定の実施態様では、悪性細胞は、以下の工程:a悪性腫瘍に由来する細胞集合を、腫瘍崩壊性麻疹ウイルスで、1の感染多重度で感染後、72時間、又は好ましくは96時間で、当該集合における生細胞の割合を測定すること、を行うことにより同定され、ここで当該集合における40以上、特に50以上、より具体的に60以上の生細胞の割合は、悪性細胞が、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次抵抗性であることを指し示す。特定の実施態様では、組換え麻疹ウイルスは、麻疹ワクチンSchwarz株に基づいている。麻疹ワクチンSchwarz株について、その全長配列を含み、そして他のワクチン株との比較を含む記載は、Tillieuxらにおいて見いだすことができるTillieuxSLHalseybWSSathebGMandVassilevVComprativeanalysisofthecompletenucleotidesequencesofmeaslesmumpsandrubellastraingenomescontainedinPriorixTetraTMandProQuadTMliveattenuatedcombinedvaccinesVaccine27200922652273。特定の実施態様では、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスは、麻疹ワクチンSchwarz株に由来する。より具体的に、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスは、配列番号1に記載の配列を有する図1を参照のこと。本発明の文脈では、配列番号1に記載の配列を有するという用語は、出てきた文脈に依存しており、そして配列番号1に記載されるDNA配列を指すか、又はそのようなcDNA配列を含むベクターからレスキューされたウイルス粒子においてパッケージされて見いだされる対応のRNA配列を指す。本発明に記載の医薬組成物の特定の実施態様において、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼを含む。シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼ、及びガン遺伝子治療におけるプロドラッグ変換酵素としてのその使用は、様々な文献において論じられ、そして試験されてきた例えば、KievitENyatiMKNgEStegmanLDParselsJRossBDRehemtullaALawrenceTSYeastcytosinedeaminaseimprovesradiosensitizationandbystandereffectby5fluorocytosineofhumancolrectalcancerxenograftsCancerRes602000664955。特定の実施態様では、自殺遺伝子は、さらにウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼを含む。シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの同時発現は、5-フルオロシトシンから細胞傷害性代謝産物への酵素変換を改善することが示されたTirabyMCazauxCBaronMDrocourtDReynesJPTirabyGFEMSMicrobiolLett1671998419。より具体的に、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体、いわゆるSCDスーパーCDを含む。シトシンデアミナーゼとウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼを含む融合遺伝子の使用は、アデノウイルスシステムについて記載されたErbsPRegulierEKintzJLeroyPPoitevinYExingerFJundRandMehtaliMInvivocancergenetherapybyadenovirusmediatedtransferofabifunctionalyeastcytosinedeaminaseuracilphosphoriosyltransferasefusiongeneCancerRes602000381322。もっとも具体的に、自殺遺伝子は、配列番号2に記載の配列を含む図2を参照のこと。本発明の文脈では、配列番号に記載の配列を含むという用語は、出てきた文脈に依存し、そして当該配列番号で記載されたDNA配列を指すか、又はそのようなcDNA配列を含むベクターからレスキューされたウイルス粒子においてパッケージされて見いだされる対応のRNA配列を指す。特定の実施態様では、組換え麻疹ウイルスは、配列番号3図3を参照のこと、配列番号4図4を参照のこと、配列番号8図28を参照のこと、又は配列番号9図29を参照のこと、特に配列番号4に対応するRNA配列を含む。本発明に記載の医薬組成物の特定の実施態様では、悪性細胞が、化学療法剤及び又は放射線治療にさらに非応答性である。特定の実施態様では、悪性細胞は、胆管癌、ヒト頭頸部癌、及び肉腫に由来する悪性細胞のリストから選ばれる。特定の実施態様では、医薬組成物は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対して一次又は二次的抵抗性を有する悪性細胞の治療において使用するための自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを使用して、繰り返し治療、具体的に毎週、又は2週間ごと、又は3週間ごと、又は4週間ごと繰り返される治療において使用される。近年、自殺遺伝子活性を伴わない組換え麻疹ウイルスの繰り返し適用4週間ごと、最大6サイクルの臨床レジュメの使用は、ベースライン時と、実験終了時の血清抗麻疹抗体レベルが、血液中及び腹水中の両方において、ベースラインに比較して安定であり、それにより液性免疫応答を有意にブーストすることはないことが示されたGalanisEHartmannLCClibyWALongHJPeethambaramPPBarretteBAKaurJSHaluskaPJJrAdercaIZollmanPJSloanJAKeeneyGAthertonPJPodratzKCDowdySCStanhopeCRWilsonTOFederspielMJPengKWRussellSJCancerRes201070387582。その結果、組換え麻疹ウイルスの繰り返し適用は、癌患者の治療に適していることが見いだされた。別の態様では、本発明は、当該麻疹ウイルスは、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子をコードする麻疹ワクチンSchwarz株に基づく組換え麻疹ウイルスに関する。本発明に記載の組換え麻疹ウイルスの特定の実施態様では、自殺遺伝子は配列番号2に記載の配列を含む。特定の実施態様では、組換え麻疹ウイルスは、配列番号3図3を参照のこと、配列番号4図4を参照のこと、配列番号8図28を参照のこと、又は配列番号9図29を参照のこと、特に配列番号4に記載のRNA配列を含む。別の態様では、本発明は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対して一次又は二次抵抗性を有する悪性細胞の治療方法であって、本発明に記載の自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを、それらを必要とする患者に投与する工程を含む、方法に関する。本発明の態様の特定の実施態様では、治療は、胆管癌、頭頸部癌、又は肉腫の治療である。ある実施態様では、治療方法は、繰り返し治療、特に毎週、2週ごと、又は3週ごと、又は4週ごとの繰り返し治療である。別の態様では、本発明は、本発明に記載の組換え麻疹ウイルスを生成する方法に関しており、以下のai麻疹ワクチンSchwarz株のゲノムと、ii自殺遺伝子を、RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下でプラスミド内にクローニングする工程を含む。一本鎖マイナス鎖ウイルスのcDNAからゲノムに相補するantigenomicRNAcRNAを効率的に発現するRNAポリメラーゼIIプロモーターシステムの使用は、ボルナ病ウイルスBDV及び麻疹ウイルスについて示されているMartinAStaeheliPandSchneiderURNAPolymeraseIIControlledExpressionofAntigenomicRNAEnhancestheRescueEfficaciesofTwoDifferentMembersoftheMononegaviralesIndependentlyoftheSiteofViralGenomeReplicationJVirol80200657085715。本発明に記載の方法の特定の実施態様では、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼを含む。別の特定の実施態様では、自殺遺伝子はさらに、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをさらに含む。別の特定の実施態様では、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼとの融合体を含む。本発明に記載の方法の特定の実施態様では、自殺遺伝子が、配列番号2図2を参照のことに記載の配列を含む。特定の実施態様では、本方法は、さらに、以下の:b麻疹ウイルスヘルパー遺伝子N、P、及びLを、それぞれRNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で少なくとも1のベクターにクローニングすることを含む、前記方法。特定の実施態様では、ウイルスヘルパー遺伝子N、P及びLは、各々RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で別々のベクター、特にプラスミドベクターにクローニングされ、i麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Nをコードするプラスミド、ii麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Pをコードするプラスミド、及びiii麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Lをコードするプラスミドをもたらす。こうして、このような実施態様は、以下の工程:bRNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Nを、第一ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングし;cRNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Pを、第二ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングし;dRNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で疹ウイルスヘルパー遺伝子Lを、第三ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングするを含む方法に関する。特定の実施態様では、工程a及び又はb、又はa及び又はb~dは、当該ゲノム及び又は当該ヘルパー遺伝子から推定のスプライシング配列を除去する工程をさらに含む。特定の実施態様では、工程aは、配列番号4図4を参照のこと、配列番号8図28を参照のこと、又は配列番号9図29を参照のこと、特に配列番号4に記載の配列を有するプラスミドをもたらす。特定の実施態様では、工程b~dは、配列番号5、配列番号6、及び配列番号7図5~7を参照のことに記載の配列を有するプラスミドをもたらす。特定の実施態様では、本発明に記載の方法は、さらに、以下の工程:e宿主細胞、特にワクチン生産に承認された認定細胞株、特にベロ又はMRC-5細胞株由来の細胞株に、工程a及びbのプラスミドをトランスフェクトするをさらに含む。生ウイルスワクチンの生産のためのもっとも重要な因子のうちの一つは、その遺伝的安定性である。遺伝的安定性は、ワクチン株のより毒性の形態への潜在的な変換や、潜在的に病原性のウイルスを生産する他のウイルス配列との組換え、そして免疫原性及び効力の低下をもたらしうる任意の遺伝的ドリフトに関する。様々な場合において、ベロ及びMRC-5細胞株における生ワクチン株の伝播が、ワクチン株の遺伝的安定性を維持することが示された例えば、LaassriMMesedaCAWilliamsOMerchlinskyMWeirJPChumakovKMicroarrayassayforevaluationofthegeneticstabilityofmodifiedvacciniavirusAnkaraB5RgeneJMedVirol792007791802特定の実施態様では、本方法はさらに、f工程eにおいてトランスフェクトされた宿主細胞から組換え麻疹ウイルスをレスキューする工程を含む。別の態様では、本発明は、以下の:ai麻疹ワクチンSchwarz株のゲノム、及びiiシトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む、自殺遺伝子をRNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下に含むプラスミドであって、特にここで当該自殺遺伝子が、配列番号2図2を参照のことに記載の配列を含み、特にここでプラスミドが配列番号4図4を参照のこと、配列番号8図28を参照のこと、又は配列番号9図29を参照のこと、より具体的には配列番号4に記載の配列を含む、プラスミド;bRNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下で、単一遺伝子の形態で、麻疹ウイルス遺伝子N、P、及びLを含む少なくとも1のプラスミドを含むキットに関する。本発明に記載の具体的な実施態様では、ウイルスヘルパー遺伝子N、P、及びLが、各々別々のプラスミドに、それぞれRNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下にクローニングされており、ここで当該プラスミドは、配列番号5、配列番号6、及び配列番号7図5~7を参照に記載の配列を有する。本発明は、以下の実施例を参照して記載される。これらの実施例は、例示の目的で提供されており、そして本発明は、これらの実施例に限定されて解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に与えられた教示の結果として明らかとなった任意の及び全ての変更を包含するように解釈すべきである。下記の材料と方法は、それに続く実施例に関して提供されるが、本発明に包含される多様な材料や方法を限定するものではない。実施例1:MeVcDNAプラスミドベクターpc3MerV2ld-Trka配列番号3の調製麻疹ウイルスcDNAベクターの調製は、近年記載されたとおりに基本的に行われたInoueKShojiYKuraneIIijimaTSakaiTMorimotoKJvirolMethods200310722936MartinAStaeheliPSchneiderUJVirol200680570815が、以下の重要な変更を伴った。最初に、i組換え麻疹ウイルスベクターのレスキューや増幅について使用される場合、広く使用されたサイトメガロウイルスCMVRNAポリメラーゼIIPolIIプロモーターのうちどちらの配列部分/断片が、最適か分からず、そしてiiGenBankM60321,M21295に記載される異なるCMVウイルスゲノムのうちどちらが、CMVベースの最小プロモーターの生成に使用されるべきか分からなかった。その結果、異なる最小CMV由来プロモーター構築物についての秩序立った分析を最初に行う必要があった。この研究結果により、301~11が転写開始部位として規定されるのCMVプロモーターヌクレオチドと、追加的に1位の後に挿入された3のヌクレオチドTGGを包含するプロモーターバリアント構築物pc3が、ウイルスレスキューとウイルス増幅の両者において最適な収率を与えたことが明らかになった。301と3のヌクレオチドntにより表されるサイトメガロウイルス由来のかなり短いバージョンのプロモーターは、組換え麻疹ウイルスベクターゲノムを含む全長プラスミドを短くするさらなる利点を提供するものであり、これによりプラスミド複製の効率が高まる。さらに、最小pc3CMVプロモーター301nt3ntにおけるイントロン配列の欠如により、mRNAが核から輸送される前のスプライシング機構へのmRNAの提供が妨げられ;それにより低下されたスプライシング効率は、麻疹ウイルスレスキューと増幅の両者を改善する。さらに、3’に配置されたデルタ肝炎ウイルスHDVリボザイムを意図的に取り込むことにより、3’末端の全ての転写産物が正確に処理された。pc3MerV2ld―Trka図1を参照の配列は、ヌクレオチドntの位置を参照して以下の通りに記載される;UTR非翻訳領域;ORFオープンリーディングフレーム:nt155:MeVリーダー配列nt5666:導入遺伝子転写のための遺伝子開始部位MeVN遺伝子から得られた遺伝子開始配列nt67103:5’UTRMeVN遺伝子から得られた5’UTR配列nt103-108:制限エンドヌクレアーゼXhoIC’TCGAGの認識部位を提示するクローニング部位nt109-114:制限エンドヌクレアーゼPauIG’CGCGC又はAscIGG’CGCGCCの認識部位を提示するクローニング部位;両方の認識部位は、完全なベクター配列において一回のみ存在する固有部位を表すnt115-126:MeVN遺伝子由来の3’-UTRnt127-136:導入遺伝子のための遺伝子末端MeVN遺伝子から得られるnt140-150:MeVNの遺伝子開始部位nt192-1769:NORF1578nt=525aaストップコドンnt1891-3414:PORF1524nt=507aaストップコドンnt2036-2043:制限エンドヌクレアーゼSdaICCTGCA’GGの認識部位を提示する3’-クローニング部位、固有部位は、完全なベクター配列において一回のみ存在するnt1913-2473:CORF非-構造遺伝子;561nt=186aaストップコドンnt2575-2582:A5G3編集ボックス;nt2580の後に単一のヌクレオチドGが挿入されているnt1891-2789:mRNA編集非構造遺伝子;900nt=299aaストップコドン後のVトランス-フレームORFnt3522-4529:MORF1008nt=335aaストップコドンnt5533-7194:FORF1662nt=553aaストップコドンnt7355-9208:HORF1854nt=617aaストップコドンnt9318-15869:LORF6552nt=2138aaストップコドンnt15942-15978:MeVトレーラー配列37nt実施例2:MeVld-SCDld-SCDプラスミドベクターpc3MerV2ld-SCD配列番号4の調製組換えMeVld-SCDld-SCD麻疹ウイルスベクターの生成のために、SCD自殺融合遺伝子をコードするプラスミドpUS-SCDを、制限エンドヌクレアーゼMluIで分解し、そしてSCD自殺融合遺伝子のオープンリーディングフレームを含む断片を、制限エンドヌクレアーゼAscIで直線化された基礎ベクターpc3MerV2ld-Trka最適化短くかつ改変されたCMVRNAポリメラーゼIIPolIIプロモーターを包含する親ベクターpc3の誘導体にライゲーションされた。断片の正確な結合を、制限酵素やシーケンシングにより確かめた。続いてレスキュー工程により感染性のウイルス粒子を、うまく生成した。pc3MerV2ld-SCD配列番号4。pc3MerV2ld-SCDの配列図2を参照を、ntの位置を参照して以下の通り記載することができる:nt1-55:MeVリーダー配列nt56-66:導入遺伝子転写のための遺伝子開始部位MeVN遺伝子から得られた遺伝子開始配列nt67-103:5’UTRMeVN遺伝子から得られた5’UTR配列nt103-108:制限エンドヌクレアーゼXhoIC’TCGAGの認識部位を提示するクローニング部位nt109-114:制限エンドヌクレアーゼPauIG’CGCGC又はAscIGG’CGCGCCの認識部位を提示するクローニング部位;両方の認識部位は、完全なベクター配列において一回のみ存在する固有部位を表すnt121-1242:SCDORF1122nt=373aaストップコドンnt1243-1248:制限エンドヌクレアーゼMluIA’CGCGTPauIA’CGCGC認識部位を提示するクローニング部位nt1249-1260:3’-UTRnt1262-1270:導入遺伝子のための遺伝子末端MeVN遺伝子から得られるnt1274-1284:MeVNの遺伝子開始部位nt1326-2903:NORF1578nt=525aaストップコドンnt3025-4548:PORF1524nt=507aaストップコドンnt3047-3607:CORF非構造遺伝子;561nt=186aaストップコドンnt3709-3716:A5G3編集ボックス;nt2580の後に単一のヌクレオチドGが挿入されているnt3025-3923:mRNA編集非構造遺伝子;900nt=299aaストップコドン後のVトランス-フレームORFnt4656-5663:MORF1008nt=335aaストップコドンnt6667-8328:FORF1662nt=553aaストップコドンnt8489-10342:HORF1854nt=617aaストップコドンnt10452-17003:LORF6552nt=2183aaストップコドンnt17076-17112:MeVトレーラー配列37nt実施例3:ヘルパープラスミド配列番号5~7の調製N、P又はLの遺伝子をそれぞれ有するヘルパープラスミドの調製を、近年記載された通りに本質的に行ったMartinAStaeheliPSchneiderUJVirol200680570815が、以下の重要な変更を伴った。異なる最小CMV由来のプロモーター構築物の秩序立った分析の結果として、ウイルスレスキューとウイルス増幅の両者において最適な収率を与えると見いだされているプロモーターバリアント構築物pc3は、ヘルパープラスミド生成のために使用された。最小pc3CMVプロモーター301nt3ntにおけるイントロン配列の欠如により、mRNAが核から輸送される前のスプライシング機構へのmRNAの提供が妨げられ;それにより低下されたスプライシング効率は、麻疹ウイルスレスキューと増幅の両者を改善する。さらに、3’に配置されたデルタ肝炎ウイルスHDVリボザイムの意図的な取り込みを使用して、3’末端の全ての転写産物を正確に処理した。最後に、このプロモーターバリアントpc3は、麻疹ウイルスのN、P、及びL遺伝子の効果的なPolII依存的転写を可能にするためにのみ見いだしたものではなく、麻疹ウイルスのN、P及びL遺伝子の転写産物は、曖昧なスプライシング部位を大量にスプライシングすることなく核から効率的に輸送される。実施例4:MeVld-SCDld-SCDベクターから麻疹ウイルス粒子のレスキュー0日目に、ベロ細胞ATCCCCL-81を、4×105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種した。1日目に、以下のトランスフェクション条件を用いて、ベロ細胞をトランスフェクトした。200μlのDMEM培地をピペットで1.5mlチューブに入れた。次に、以下の量のプラスミドDNAを加えた:混合後、混合物をスピンダウンし、そして18.6μlのFuGeneHDRocheつまり3μlFuGene1μgDNAを直接液体に加えた。ボルテックス後に、混合物をスピンダウンした。反応混合液を25分間室温でインキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄した。1.8mlのDMEM2FCSPSを加えた後に、トランスフェクション混合物を滴下して細胞に加え、そしてプレートを旋回させた。細胞培養物を37°C及び5CO2でインキュベートした。2日目及び3日目に、培地を交換した1mlDMEM2FCSPS。合胞体が出芽した際に約4日目、ベロ細胞を10cmのディッシュ中に播種した1のコンフルエントT75、10ml、1ディッシュあたり0.5mlで蒔いた。次の日、培地中でレスキュー細胞をスクレイピングし、ピペットして取得し、ベロ細胞に滴下することにより、重層を行った。合胞体が出現した場合に重層後約1日、3×105ベロ細胞を、6ウェルプレート中に撒き、継代0のウイルスとしたP0。次の日、合胞体を拾いあげた構築物あたり2~3。培地を10cmディッシュから除き、そして5~10μl培地を直接ピペットで合胞体に加えた。ピペットで出し入れし、そしてスクレイピングすることにより、合胞体を除去し、そして6ウェルプレートの新たなベロ細胞にピペットで加えた。合胞体が現れた際に、細胞を掻き取って培地に入れ、そして-80°Cで貯蔵した=P.0。以下の:a麻疹ワクチンSchwarz株のゲノム、及び酵母シトシンデアミナーゼと酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子、b麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Nc麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Pd麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Lをコードし、その各々が、RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下に存在するプラスミドを使用した本発明者らの結果として、最大で16.000感染スポット合胞体を、第1継代P.1で達成することができた。この結果は、P.1において最大で8800感染スポット合胞体しか生じさせないバクテリオファージT7RNAポリメラーゼの制御下の導入遺伝子及び同ゲノムを発現する結果と比較して、ずっと高かった。こうして、CMV由来RNAポリメラーゼIIプロモーターシステムの使用により、感染性組換え麻疹ウイルス粒子の高度に効率的に生産されることが示された。実施例5:HuCCT1、RBE、及びTFK-1細胞のSRB増殖アッセイ図8は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeVld-SCDウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされたHuCCT1、RBE、及びTFK-1細胞のSRB増幅アッセイの結果を示す。一般的に、SRB増幅アッセイでは、細胞を0日目に播種し、そして24時間後に、0.001、0.01、0.1、1又は10MOIのウイルス粒子で感染させ個々の実験及び又は添付の図面を参照、そしてプロドラッグ処理の場合、5-FCを感染の3時間後に加えた。SRBアッセイを感染の96時間後に行った。RBE又はTFK-1細胞を、感染多重度1MOI1でMeVld-SCDで感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養した場合、96時間後における細胞質量の低下は、非感染対照細胞細胞質量100とするに比較して、58RBE又は86TFK-1の範囲であるとそれぞれ計算されるグラフの左側に配置した長方形により囲まれた値。MeVld-SCDMOI1で感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養されたHUCCT1細胞は、96時間後に、非感染対照細胞細胞質量を100とするに比較して、42の範囲の細胞質量の低下を示した。それにより、HuCCT1細胞は、従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能を使用していないに対して一次抵抗性を示した。しかしながら、MeVld-SCDMOI1感染HuCCT1細胞が、104~100mMの範囲のプロドラッグ5-FCを添加して培養された場合、96時間後における細胞質量の低下が、非感染対照細胞細胞質量を100とするに比較して、最大で99の範囲で示された。こうして、追加の自殺遺伝子機能を使用していない従来技術の麻疹ウイルスに対するHuCCT1細胞の一次抵抗性が、非毒性プロドラッグ5-FCから細胞傷害性薬剤5-FU及び誘導体への生成を触媒するSCD自殺遺伝子機能の使用により克服されうるということが示された。実施例6:HuCCT1、RBE、及びTFK-1細胞のLDH放出アッセイ図9は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeVld-SCDウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされたHuCCT1、RBE、及びTFK-1細胞ヒト胆管癌細胞のLDH放出アッセイの結果を示す。RBE又はTFK-1細胞を、MOI1にてMeVld-SCDで感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCの添加を伴わずに培養された場合に、LDH放出アッセイにより計測されば場合に96時間後LDH酵素の放出ここで、細胞完全性が失われることについての代替的パラメーターとして使用されるが、界面活性剤TritonX-100での処理により完全に溶解された非感染対照細胞に比較してLDH放出を100とする、70RBE又は85TFK-1の範囲であると計算された。対照的に、MeVld-SCDMOI1を感染させ、そしてプロドラッグ5-FCを添加せずに培養されたHuCCT1細胞は、96時間後に、非感染対照細胞に比較して、31の範囲のLDH酵素の放出を示した。これにより、HuCCT1細胞が、追加の自殺遺伝子機能を使用していない従来技術の麻疹ウイルスに対して一次抵抗性を示すことが再び示された。しかしながら、MeVld-SCDMOI1感染HuCCT1細胞を、プロドラッグ5-FC104~100mMの範囲を添加して培養した場合に、非感染対照細胞細胞質量を100とするに比較して、96時間後のLDH酵素の放出における有意に高い増加が、最大で82の範囲で示された。こうして、HuCCT1細胞における、追加の自殺遺伝子機能の使用していない従来技術の麻疹ウイルスの一次抵抗性が、SCD自殺遺伝子機能を使用することにより克服されうることが再び示された。実施例7:SAS及びHTB-43FaDu細胞におけるSRB増殖アッセイ図10は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeVld-SCDウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされたSAS及びHTB-43FaDu細胞ヒト頭頸部HN癌細胞の結果を示す。HTB-43FaDu細胞をMOI1にてMeVld-SCDで感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養した場合に、96時間後の細胞質量の低下は、非感染対照細胞に比較して66の範囲であると計算された数値は、グラフの左側に配置された長方形により囲まれている。対照的に、MeVld-SCDMOI1で感染され、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養したSAS細胞は、96時間後において、非感染対照に比較してまったく細胞質量は低下を示さなかった0。これによりSAS細胞は、従来技術の麻疹ウイルスに対して一次抵抗性を示す追加の自殺遺伝子機能の不使用。しかしながら、MeVld-SCDMOI1感染SAS細胞を、プロドラッグ5-FC104~100mMの範囲を添加して培養した場合に、それぞれ非感染対照細胞に比較して、96時間後において最大で83の範囲の細胞質量の低下が示された。こうして、従来技術の麻疹ウイルスに対するSAS細胞の一次抵抗性が、SCD自殺遺伝子機能の使用により克服できることが示された。実施例8:SAS及びHTB-43FaDu細胞のLDH放出アッセイ図11は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeVld-SCDウイルス粒子で処理し、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされたSAS及びHTB-43FaDu細胞におけるLDH放出アッセイの結果を示す。HTB-43FaDu細胞をMeVld-SCDで、MOI1にて感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養した場合、96時間後の酵素LDHの放出は、界面活性剤TritonX-100での処理により完全に溶解された非感染対照細胞に比較して、16の範囲であると計算されたグラフの左側に配置された長方形により囲まれた数値。MeVld-SCDMOI1で感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養されたSAS細胞は、それぞれ非感染対照細胞に比較して、96時間後において、18の範囲の酵素LDHの放出しか示さなかった。しかしながら、MeVld-SCDMOI1感染SAS細胞をプロドラッグ5-FC10E-4~10E0を添加して培養した場合、96時間後において、非感染対照細胞細胞質量を100とするに比較して、最大38の範囲で、酵素LDHの放出を強力に増加することが、示された。こうして、従来技術の麻疹ウイルスに対するSAS細胞の一次抵抗性が、SCD自殺遺伝子機能の使用により克服されうることが再び示された。実施例9:A673、BRZ及びSRH細胞のSRB増殖アッセイ図12は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeVld-SCDウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされたA673、BRZ、及びSRH細胞ヒト肉腫細胞のSRB増殖アッセイの結果を示す。A673又はBRZ細胞を、MeVld-SCDで、MOI1にて感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養した場合、96時間後における細胞質量の低下は、それぞれ非感染対照細胞に比較して、それぞれ96又は75の範囲であると計算されたグラフの左手側に配置された長方形により囲まれている数値。対照的に、MeVld-SCDMOI1で感染され、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養されたSRH細胞は、96時間後に、非感染対照細胞に比較して10範囲の細胞質量の低下しか示さなかった。これにより、SRH細胞は、従来技術の麻疹ウイルスに対して一次抵抗性を示す追加の自殺遺伝子機能を使用なし。しかしながら、MeVld-SCD感染SRH細胞MOI1をプロドラッグ5-FC104~100mMの範囲を添加して培養した場合に、非感染対照細胞に比較して96時間後で最大で55の範囲の細胞質量の低下が示された。こうして、従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子の使用なしに対するSAS細胞の一次抵抗性は、有意に改善されたが、選択された条件MOI1の元では、SCD自殺遺伝子機能を克服できなかったことが示された。実施例10:A673及びSRH細胞のLDH放出アッセイ図13は、pc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeVld-SCDウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされたA673及びSRH細胞のLDH放出アッセイの結果を示す。A673細胞を、MeVld-SCDで、MOI1にて感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養した場合に、96時間後における酵素LDHの放出は、界面活性剤TritonX-100での処理により完全に溶解された非感染対照細胞に比較して、54の範囲であると計算された。MeVld-SCDMOI1で感染され、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養されたSRH細胞は、非感染対照細胞に比較して、96時間後において23の範囲の酵素LDHの放出を示した。注目すべきは、MeVld-SCDMOI1感染SRH細胞を、プロドラッグ5-FC104~100mMの範囲を添加して培養した場合に、感染対照細胞細胞質量を100とするに比較して、96時間後において31の酵素LDHの放出の増加が示された。こうして、従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用なしに対するSRH細胞一次抵抗性が、選択された条件MOI1下では、SCD自殺遺伝子機能の使用により十分に克服されないことが示された実施例11:SRH細胞におけるSRB増殖アッセイ図14は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeV2ld-SCDで、強化したMOI10通常はMOI1を使用する;ここでウイルスロードの増加は、プロドラッグ5-FCの存在下にてMOI1にて観察された抵抗性の現象を克服するために使用されたにて処理したSRH細胞のSRB増殖アッセイの結果を示す。MOI10にてMeVld-SCDで感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養したSRH細胞は、96時間後に非感染対照細胞に比較して、68の範囲の細胞質量の低下を示し、非感染対照細胞に比較して28の細胞質量の低下しか示さないMOI1にて得られた結果と比較して有意に改善された。さらに、MeVld-SCDMOI10感染SRH細胞を、プロドラッグ5-FC104~100mMの範囲を添加して培養した場合、96時間後の細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較して最大で89の範囲で示された。こうして、従来技術の麻疹ウイルスに対するSRH細胞の一次抵抗性が、選択された条件下MOI10で、SCD自殺遺伝子機能の追加的使用により、克服されうることが示された。実施例12:肉腫腫瘍細胞細胞株CCSLMのSRB増殖アッセイ図15は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされた肉腫腫瘍細胞細胞株CCSLMのSRB増殖アッセイの結果を示す。ベクターMeVld-SCDで、MOI1にて感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養したCCS又はLM細胞は、96時間後に、非感染対照細胞に比較してそれぞれ5又は25の範囲の細胞質量の低下を示したグラフの左手側に配置された長方形により囲まれた数値。こうして、CCS及びLM細胞の両者は、従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用無しに対する一次抵抗性を示す。しかしながら、MeVld-SCD感染CCS又はLM細胞MOI2を、プロドラッグ5-FC104~100mMの範囲を添加して培養した場合に、非感染対照細胞に比較して96時間後の細胞質量の低下が、それぞれ79又は94の範囲で示された。こうして、従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用なしに対するCCSおよびLM細胞の一次抵抗性が、選択された条件下MOI10で、大幅に改善でき、そしてLM細胞の場合、選択された条件下においてSSCD自殺遺伝子機能の使用により、ほぼ完全に克服されうることが示された。実施例13:肉腫腫瘍細胞細胞株STO、ZAF、KDのSRB増殖アッセイ図16は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeVld-SCDウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされた肉腫腫瘍細胞細胞株STO、ZAF、KDのSRB増殖アッセイの結果を示す。STO、ZAF、又はKD細胞を、MeVld-SCDで、MOI1にて感染させ、次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養した場合に、非感染対照細胞に比較して、96時間後の細胞質量において、それぞれ76、87、又は94の範囲の低下が計算されたグラフの左手側に配置された長方形により囲まれた数値。こうして、STO、ZAF、又はKD細胞は、従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用なしに対する一次抵抗性を示さなかった。MeVld-SCDで感染されたSTO、ZAF、又はKD細胞MOI1を、プロドラッグ5-FC104~100mMの範囲で添加して培養した場合、96時間後における細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較して、それぞれ94、99、又は98の範囲で示された。実施例14:肉腫腫瘍細胞細胞株CCS、LMのSRB増殖アッセイ図17は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeVld-SCDウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされたグリア芽腫細胞細胞株LNT229、LNT229CTS-1のSRB増殖アッセイの結果を示す。MeVld-SCDで、MOI1にて感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCの添加をせずに培養されたLNT229又はLNT229CTS-1細胞は、96時間後の細胞質量において、それぞれ56又は27の低下を示したグラフの左手側に配置された長方形により囲まれた数値。こうして、LNT229又はLNT229CTS-1細胞の両者が、従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用なしに対して一次抵抗性を示した。しかしながら、MeVld-SCD感染されたLNT229又はLNT229CTS-1細胞MOI1を、プロドラッグ5-FC104~100mMの範囲を添加して培養した場合に、96時間後の細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較してそれぞれ最大で97又は96の範囲で示された。こうして、LNT229又はLNT229CTS-1細胞の従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用なしに対する一次抵抗性は、SCD自殺遺伝子機能の使用により、選択された条件下MOI1でほぼ完全に克服されたことが示された。実施例15:グリア芽種細胞細胞株LN18、LN18アポトーシス抵抗性のSRB増殖アッセイ図18は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeVld-SCDウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされたグリア芽腫細胞細胞株LN18、LN18アポトーシス抵抗性のSRB増幅アッセイの結果を示す。MeVld-SCDで、MOI1にて感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養されたLN18又はLN18アポトーシス抵抗性細胞は、非感染対照細胞に比較して、96時間後の細胞質量において、それぞれ33又は22の低下を示したグラフの左手側に配置された長方形により囲まれた数値。こうして、LN18又はLN18アポトーシス抵抗性細胞の両者が、従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用なしに対して一次抵抗性を示した。しかしながら、MeVld-SCD感染されたLNT18又はLN18アポトーシス抵抗性細胞MOI1を、プロドラッグ5-FC104~100mMの範囲を添加して培養した場合に、96時間後の細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較してそれぞれ最大で97又は83の範囲で示された。こうして、LN18又はLN18アポトーシス抵抗性細胞の従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用なしに対する一次抵抗性は、かなり改善され、そしてLN18細胞の場合、選択された条件下MOI1でSCD自殺遺伝子機能の使用により、ほぼ完全に克服されたことが示された。実施例16:腎臓細胞癌ACHN、肺腺ガンHOP-62、及びメラノーマM14腫瘍細胞のSRB増殖アッセイ図19は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeVld-SCDウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされた腎細胞癌ACHN、肺腺ガンHOP-62、及びメラノーマM14腫瘍細胞のSRB増殖アッセイの結果を示す。MeVld-SCDで、MOI1にて感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養したACHN、HOP-62、又はM14細胞は、非感染対照細胞に比較して、96時間後の細胞質量において、それぞれ20、16、又は16の範囲の低下を示した。こうして、ACHN、HOP-62、及びM14細胞は、従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用なしに対して一次抵抗性を示した。しかしながら、MeVld-SCD感染されたACHN、HOP-62、又はM14細胞MOI1を、1mMのプロドラッグ5-FCを添加して培養した場合に、96時間後の細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較してそれぞれ最大で85、86又は76の範囲で示された。こうして、ACHN、HOP-62、及びM14細胞の従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用なしに対する一次抵抗性は、SCD自殺遺伝子機能の使用により、選択された条件MOI1でかなり改善されたことが示された。実施例17:結腸腺ガン腫瘍細胞細胞株KM-12,HCT-15のSRB増殖アッセイ図20は、プラスミドpc3MerV2ld-SCDld-SCDからレスキューされたMeVld-SCDウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ5-FCとインキュベートされた結腸腺ガン腫瘍細胞細胞株K-12、HCT-15のSRB増殖アッセイの結果を示す。MeVld-SCDベクターで、MOI1にて感染させ、そして次にプロドラッグ5-FCを添加せずに培養したKM-12又はHCT-15細胞は、非感染対照細胞に比較して、96時間後の細胞質量において、それぞれ13又は2の範囲の低下を示した。こうして、KM-12及びHCT-15細胞の両者は、従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用なしに対して一次抵抗性を示した。しかしながら、MeVld-SCD感染されたKM-12又はHCT-15細胞MOI1を、1mMのプロドラッグ5-FCを添加して培養した場合に、96時間後の細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較してそれぞれ最大で85、86又は76の範囲で示された。こうして、KM-12又はHCT-15細胞の従来技術の麻疹ウイルス追加の自殺遺伝子機能の使用なしに対する一次抵抗性は、SCD自殺遺伝子機能の使用により、選択された条件MOI1でほとんど完全に克服されたことが示されたことが示された。実施例18:代替ウイルスベクターの構築i麻疹ウイルスゲノム内の配置、及びiiSCD遺伝子発現のコンテクストここで、融合遺伝子のコンテクスト;すなわち、融合タンパク質を拡散するタンパク質の機能を媒介する1型単純ヘルペスウイルスHSV-1テグメントタンパク質VP22を伴っているに関する自殺遺伝子アレイにおいて異なっている3つのベクターを構築した図27を参照。導入遺伝子が麻疹ウイルスゲノムに挿入されたゲノムの位置が、ウイルス複製や導入遺伝子発現に影響するので、スーパーシトシンデアミナーゼSCD導入遺伝子の位置を2つのバージョンで比較した。ベクターpc3MerV2ld-SCDにおけるSCDについてのゲノム第一位置、ベクターpMerV2P-SCDにおけるSCDについてのゲノム第三位置。さらに、第三ベクター、ベクターpc3MerV2ld-VP22SCD、を構築し、そしてほかの2つのベクターと比較した。ゲノム第一位置において、このベクターpc3MerV2ld-VP22SCDは、1型単純ヘルペスウイルスHSV-1テグメントタンパク質VP22遺伝子とSCD導入遺伝子との融合体を発現する。テグメントタンパク質VP22遺伝子は、融合タンパク質ここで:VP22SCDを発現細胞から、ベクターpc3MerV2ld-VP22SCDからレスキューされたMeVld-VP22SCDウイルス粒子でこれまで感染されていない隣接細胞へと拡散させるタンパク質の機能を媒介し、こうして、第一ベクターの不十分な形質導入効率を補うための有望なツールにする。pc3MerV2ld-VP22SCDの構築の詳細:第三強化麻疹ワクチンウイルスathirdarmedmeaslesvaccinevirusMeVld-VP22SCDを新たに生成するために、プラスミドpc3MerV2ld-Trkaを開始基礎プラスミドとして用いた。このプラスミドは、ワクチン株Schwarzと100同一性を有するウイルスcDNAをコードし、そしてリーダー配列とN-遺伝子とのあいだに、空の追加転写ユニットATU又はTrka、転写カセットを含む。この追加の転写ユニットは、ウイルスゲノムからの導入遺伝子の発現に必要とされる制御配列の全てを含む。遺伝子開始配列及び遺伝子集結配列、並びに非翻訳領域は、N遺伝子由来の配列と同一である。導入遺伝子は、制限酵素部位XhoI又はPauIを介して挿入するすることができる。VP22SCDのオープンリーディングフレームORFは、プラスミドpUC29-VP22SCD由来であった。このORFは、2つのSalI制限酵素部位を含み、そしてMeV全長コンストラクトにおいてさらなるクローニング工程が、SalIを介して行われる可能性が最も高いので、これらの制限酵素部位は、最初に部位特異的突然変異誘導により取り除かれるべきであった。ORFが、PauIにより生成される末端と同一の末端を生成するMluI部位にすでに繋がっていたので、そしてこのプラスミドから生じるMluI-MluI断片が、すでに、ルール6にしたがってMeVゲノムを生成するための正確な数のヌクレオチドを含んでいたので、さらに変更することなく、SalI部位を除去した後でこの断片をMeVcDNAに挿入することができた。こうして、クローニング戦略は、以下の3工程から構成された:部位特異的突然変異誘導によるSalI部位の除去;VP22SCDをpc3MerV2ld-Trkaの挿入;ウイルスのレスキューSalI部位の除去:2回の単一部位突然変異誘発を行った。1回目において、制限酵素分析により示される通り802位のSalI部位の除去に成功した。生成したプラスミドを、次にDpnIにより切断し、そしてXL-1ブルースーパーコンピテント細菌中で増幅し、そして第二回の突然変異誘導用のテンプレートとして用いた。ここで制限酵素分析により再び示される通り、1127位の部位を取り除いた。両方の部位の除去、並びにORFの正確な配列をシーケンスにより確認した。得られたプラスミドをpUC29-VP22SCD_woSalIと名付けた。VP22SCDのpc3MerV2ld-Trkaへの挿入:レシピエントプラスミドpc3MerV2ld-Trkaを、PaulIで切断した。約20kbプラスミドの機械的切断を避けるために、直線化プラスミドをゲル精製しなかった。制限酵素を、熱で不活性化し、そしてDNA断片を脱リン酸化し、そして直接ライゲーションに供した。pUC29-VP22SCD_wOSalIをMluIで切断し、ゲル精製を行い、そしてライゲーションに供した。導入遺伝子の挿入の成功を、HindIII-切断により、さらにシーケンスにより示した。得られたプラスミドをpc3MerV2ld-VP22SCDと名付けた。実施例19:代替のウイルスベクターの比較実施例18に記載されるように合成された3の異なるウイルスベクターを、もっとも有効な1つを同定することを目的として比較した図21~23を参照。図21は、ウイルス粒子MeVld-SCD、MeVld-VP22SCD、及びMevP-SCDの、Hep3Bヒト肝細胞癌細胞に対する効果を示す。Hep3B細胞を、0.001又は0.01のMOIで、pc3MerV2ld-SCD、pMerV2P-SCD、及びpc3MerV2ld-VP22SCDからレスキューされたウイルス粒子で感染させ、そして腫瘍細胞質量を、試験時間のあいだ1mMの5-FCの存在下又は非存在下で測定した。図に示すとおり、pc3MerV2ld-SCDからレスキューされたウイルス粒子は、MOI0.01の場合において、5-FCが存在しない場合でさえ、劇的に高い腫瘍溶解力を示し、そしてMOI0.001の場合でさえ、5-FCの存在下で、6日後に腫瘍細胞のほぼ完全な低下をもたらした。図22は、ベクターpc3MerV2ld-SCD、pMerV2p-SCD、及びpc3MerV2ld-VP22SCDからレスキューされたウイルス粒子の、HepG2ヒト肝細胞癌細胞に対する効果を示す。HepG2細胞をMOI0.001又は0.01にて、pc3MerV2ld-SCD、pMerV2P-SCD及びpc3MerV2ld-VP22SCDからレスキューされたウイルス粒子で感染させ、そして腫瘍細胞質量を、試験時間のあいだ1mMの5-FCの存在下で、又は非存在下で測定した。図に示すとおり、MeVld-SCDウイルス粒子は、MOI0.01の場合において、5-FCが存在しない場合でさえ、実質的に高い腫瘍崩壊力を示し、そしてMOI0.001の場合でさえ、5-FCの存在下で、6日後に腫瘍細胞の実質的にかなりの低下をもたらした。図23は、ベクターpc3MerV2ld-SCD、pMerV2p-SCD、及びpc3MerV2ld-VP22SCDからレスキューされたウイルス粒子の、PLC/PRF/5ヒト肝細胞癌細胞に対する効果を示す。PLC/PRF/5細胞をMOI0.001又は0.01にて、pc3MerV2ld-SCD、pMerV2P-SCD及びpc3MerV2ld-VP22SCDからレスキューされたウイルスで感染させ、そして腫瘍細胞質量を、試験時間のあいだ1mMの5-FCの存在下で、又は非存在下で測定した。図に示すとおり、ベクターpc3MerV2ld-SCDからレスキューされたウイルス粒子は、MOI0.01の場合において、5-FCが存在しない場合でさえ、実質的に高い腫瘍崩壊力を示し、そしてMOI0.001の場合でさえ、5-FCの存在下で、6日後に腫瘍細胞の実質的にかなりの低下をもたらした。こうして、驚くべきことに、麻疹ウイルスゲノム内のSCD自殺遺伝子の配置、並びにSCD遺伝子のコンテクストは、ウイルス粒子の腫瘍崩壊活性について強力な影響を有しており、さらにベクターpc3MerV2ld-SCDから得られた粒子は、pMerV2P-SCD及びpc3MerV2ld-VP22SCDからレスキューされた粒子よりも優れていた。実施例20:異種移植動物腫瘍モデルにおける強化ベクターarmedvectorinvivo特徴決定強化ベクターpc3MerV2ld-SCD、pMerV2P-SCD、及びpc3MerV2ld-VP22SCDをinvivoで試験するために、ヒトHCCを移植したマウス異種移植片モデルを用いた。麻疹ウイルスはマウス細胞に感染しないので、ベクターを試験するために、表面糖タンパク質を特別に改変することをせずに、同系腫瘍を患うマウスモデルを用いることはできなかった。強化ベクターを比較するために、皮下で成長したHep3B腫瘍のマウスモデルを選択した。この決定は、以下のiHep3Bが、MeVにより効率的に感染され、そして高いレベルのMeV複製を支持し、iiHep3Bにおいて、5-FCの5-FUへの変換が迅速かつ効率的であり、そしてiiiプロドラッグの感染細胞への投与後1~4日間のインキュベーションにわたり、ウイルスのみでの治療と、コンビネーション治療とのあいだのギャップの増大が観察されたという事実に基づいた。さらに、Hep3Bのマウスモデルは、すでに記載されておりBlechaczBSplinterPLGreinerSMyersRPengKWFederspielMJRussellSJLaRussoNFHepatology2006Dec446146577、高い生着率を示した80、私信、BorisBlechaczMayoClinicRochesterMNUSA。対照的に、この率は、PLCPRF5でずっと低く60、そしてHepG2においても低かった。両方とも、本発明者らの研究室にて行われた。このinvivo実験では、6週齢のヌードマウスに、106Hep3B細胞をPBS中に含む100μlの細胞懸濁液を皮下注射した。予期されるように、マウスの80において移植された細胞は、腫瘍細胞の移植と、腫瘍の出現の間の期間にもかかわらず、完全に異種性であると見いだされた。腫瘍は、血管を新生しており、そしてマウスのヌード皮膚を介して青色に見えた。腫瘍が約5mmの直径に成長した後に、それぞれのウイルスMeVld-SCD、MeVld-VP22SCD、又はVeVP-SCDを腫瘍内に5回、1回あたり2×106pfuで毎日1回の注射を行った合計用量:107pfu。対照群には培地のみを注射した。続いて7日目に、500mgkg体重の5-FCをPBSに溶かしたものをマウスに腹腔内注射した。マウスの腫瘍体積及び体重を週に3回測定した。上記の治療スケジュールが毒性にならないことを保証するために、マウスを毎日モニターし、そして体重を週に3回測定した。組み合わせ治療MeVSCD5-FCでは、動物の行動における目に見える変化を導かなかったし、触られることに対する敏感さの増大などの反応も示さなかった。マウスの皮膚は健康に見え、活動や摂食行動について変化が見られず、体重も安定的であった。自殺遺伝子治療を受けた腫瘍を有するマウスの治療では、腫瘍体積を有意に低下させ、そして生存を有意に延長させた。invivo試験の結果として、いずれかのウイルスの強力な腫瘍崩壊効果が記載されている。期待されたとおりに、プロドラッグのみの投与は効果がなく、ウイルス治療されたマウスにおいて5-FC注射が、ウイルス単独での治療に比較して、変更された結果を導かなかったが、重要なことに、ウイルス複製の初期停止によるウイルス媒介性の効果についても阻害しなかった。さらに、顕著な腫瘍崩壊性の差異が3つのベクターの間において観察されることはなかった。この実験設定では、腫瘍崩壊性麻疹ワクチンウイルスが、特に有効であり、その結果さらに5-FCを適用することにより、高い腫瘍崩壊性や、生存についての利得を導かれなかった。対照治療マウスの生存中央値は35日であり、そして5-FCで治療されたマウスは32日に過ぎなかった図24を参照。これらの群の全てのマウスを、50日の前に屠殺した。対照的に、治療群における生存の中央値は、49日MevP-SCD単独及び82.5日MeVld-SCD単独であった図24を参照。MevP-SCDで治療された両方の群のマウスは、100日の前に屠殺し、一方他の処理群由来の6匹のマウスには腫瘍がなく、150日超生存した1のマウスがMeVld-SCD単独及びMeVld-VP22SCD5-FC;二匹のマウスが、MeVld-SCD5-FC、でありそしてMeVld-VP22SCD単独であった。異なる治療群由来の何匹かのマウスが、腹膜腔の内部に目に見えかつ触診できる二次腫瘍を発達させた。これは治療失敗と考えられたので、これらのマウスは、統計分析から除外はしなかった。全ての治療群において、異なる増殖挙動を有する腫瘍を観察した。いくつかの腫瘍がかなり早く成長し、そして治療の開始後30日で、規定の終点2000mm3超に達し、これは対照治療マウスに似ていた。いくつかの他のマウスは、遅延された腫瘍増殖を有しており、治療開始後、最初の週において腫瘍体積は低かったが、最終的に、その腫瘍は成長を再開し、終点の体積に到達した。いくつかの他の腫瘍は完全に消滅し、そしてマウスは195日超のあいだ腫瘍を伴わなかった。この異なる挙動は、MeVld-SCD治療群の両方において見られた。いくつかの腫瘍が、振動成長挙動を有し、これはおそらくウイルス複製による腫瘍体積の低下と、それに続いて残りの腫瘍細胞の増殖し、ウイルスに対し複製のための新たな基礎を提供し、再び腫瘍崩壊と腫瘍の低下を導くことのため生じている。この腫瘍の収縮と成長は、腫瘍の血管新生の低下と回復を伴っており、マウスの皮膚を介した青色揺らぎにより検出される。ここで示された実施例では、腫瘍は最終的に91日目で消滅した。この振動増殖は、腫瘍における長期間のウイルス複製の最初の兆しとして考えられた。同様の結果が、追加の異種移植動物モデルで観察されたHepG2ヒト肝細胞癌腫細胞、及びPLC/PRF/5ヒト肝細胞癌腫細胞:図25及び26をそれぞれ参照のこと。配列表:配列番号1:麻疹ワクチンSchwarz株の遺伝配列図1を参照配列番号2:酵母シトシンデアミナーゼと酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体の遺伝子配列リンカー配列を伴う図2を参照配列番号3:任意の導入遺伝子を伴わず、挿入カセットを含む基礎組換え麻疹ウイルスの遺伝子配列図3を参照配列番号4:ベクターpc3MerV2ld-SCDの遺伝子配列図4を参照配列番号5:N遺伝子の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列図5を参照配列番号6:P遺伝子の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列図6を参照配列番号7:L遺伝子の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列図7を参照配列番号8:ベクターpMerV2P-SCDの遺伝子配列図28を参照配列番号9:ベクターpc3MerV2ld-VP22SCDの遺伝子配列図29を参照"