出生後の膵臓から分離したか、または由来する、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとを用意すること、インビトロで非内分泌上皮細胞NEECsを培養すること、インビトロで血管内皮細胞VECsを培養すること、及び、インビトロで非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとからなる組織複合体を生成させることを含み、血管内皮細胞VECsの培養は、少なくとも部分的に、非内分泌上皮細胞NEECsの培養とは別個に行われることを特徴とする、インスリン産生細胞IPTsを作成する方法。前記の用意する段階にて、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとは、膵臓から膵島を分離した後に残された残存組織である膵廃棄組織から分離されること、及び前記血管内皮細胞VECsは、前記非内分泌上皮細胞NEECsが分離されたかまたは由来するのと同一のドナー組織に由来するか、または、前記インスリン産生細胞IPTsが移植されるレシピエントからの組織に由来すること、の少なくとも一方であることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記の非内分泌上皮細胞NEECsの培養には、前記膵廃棄組織を、コラーゲンまたはその他の細胞接着性材料でコーティングした培養容器または培養基材に、血清含有培地中にて播種し、これに続いて培養系を静置し、そして最後に浮遊組織片を培養系から除去することにより、非内分泌上皮細胞NEECsを捕集すること、前記捕集の進行中に初期培養を行うこと、及び、径が10~30μmの範囲内である非内分泌上皮細胞NEECsのクローン性コロニーが出現するまで、第2の無血清培地中で培養することにより、初期コロニー増殖を行うことが含まれることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。第2の無血清培地が、ヒトKGFケラチノサイト増殖因子を含むか、または、ヒトKGFと、インスリントランスフェリン亜セレン酸ナトリウムのサプリメントまたは他の増殖因子のサプリメントとを含むことを特徴とする請求項3に記載の方法。前記捕集での血清含有培地について、FGF2または他の線維芽細胞増殖因子、並びに、インスリントランスフェリン亜セレン酸ナトリウムのサプリメント、またはその他の増殖因子サプリメントを含有する第1の無血清培地に交換し、この第1の無血清培地中にて引き続き培養を行うことにより、前記初期コロニー増殖の前で、前記捕集の後に、非内分泌上皮細胞NEECsのコロニーを誘起すること、及び前記初期コロニー増殖の開始時に、第1の無血清培地を、第2の無血清培地に交換することをさらに含むことを特徴とする請求項3または4に記載の方法。前記の非内分泌上皮細胞NEECsを培養する段階は、これら細胞を選択的に増殖するための継代培養を含み、この継代培養には、組織解離酵素溶液で処理して、培養容器または培養基材から非内分泌上皮細胞NEECsを剥離するようにし、また、濾過及び遠心分離の少なくも一方によって、第2の無血清培地から非内分泌上皮細胞NEECsを剥離することにより、前記初期コロニー増殖の際、またはこの後に、培養容器または培養基材から、そして、次いで第2の無血清培地から、非内分泌上皮細胞NEECsを剥離すること、及び、この剥離の後に、非内分泌上皮細胞NEECsを培養することが含まれ、この培養の段階において、非内分泌上皮細胞NEECsが、コラーゲンまたはその他の細胞接着性材料でコーティングした培養容器または培養基材に播種され、非内分泌上皮細胞NEECsが第3の無血清培地中にて培養されることを特徴とする請求項3~5のいずれかに記載の方法。前記剥離の後に非内分泌上皮細胞NEECsを培養するための、コラーゲンまたはその他の細胞接着性材料が、KGF、または、KGF及び抗Notch1抗体を含むか、または、rockRho結合コイルドコイル含有蛋白質キナーゼ阻害剤、または、rock阻害剤及びEGF上皮増殖因子及びHGF肝細胞増殖因子並びにBMP骨形成蛋白質を含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。第3の無血清培地に、アトルバスタチン、シンバスタチンまたはその他のスタチンが添加されることを特徴とする請求項6または7に記載の方法。前記の非内分泌上皮細胞NEECsを剥離する段階の後に、培養容器または培養基材上に残っている上皮細胞としての残存細胞LOCsを、剥離された非内分泌上皮細胞NEECsとは別々に培養すること、及び前記の剥離する段階により得られた非内分泌上皮細胞NEECsについて、残存細胞LOCsにより調整された培地中にて、または、残存細胞LOCs存在下の培地中にて、培養することをさらに含むことを特徴とする請求項6~8のいずれかに記載の方法。前記の非内分泌上皮細胞NEECsを剥離する段階の後に、プロティナーゼ、またはその他の解離酵素を用いて、培養容器または培養基材上に残っている上皮細胞としての残存細胞LOCsを剥離すること、及び前記の剥離する段階により得られた非内分泌上皮細胞NEECsについて、残存細胞LOCsにより調整された培地中にて、または、残存細胞LOCs存在下の培地中にて、培養することをさらに含むことを特徴とする請求項6~9のいずれかに記載の方法。前記の血管内皮細胞VECsを培養する段階は、前記膵廃棄組織そのもの、または、前記の非内分泌上皮細胞NEECsを捕集する段階により剥離された浮遊組織片を、第2の血清含有培地中にて、コラーゲンまたはその他の細胞接着性材料でコーティングした培養容器または培養基材に播種すること、この播種する段階に続いて、血管内皮細胞VECsを増殖させること、培地の交換を行い、この際には、前記の増殖させる段階の後で非接着性の細胞または組織を剥離して、新鮮な血清含有培地と交換すること、及び、抗体を用いて血管内皮細胞VECsを純化し、また、前記の播種する段階、及び、前記の培地の交換を行う段階を繰り返すことにより、純化された血管内皮細胞VECsを増殖させることを含むことを特徴とする請求項3~10のいずれかに記載の方法。前記組織複合体を生成させる段階には、組織解離酵素溶液で処理して非内分泌上皮細胞NEECs及び血管内皮細胞VECsを培養容器または培養基材から剥離し、次いで、遠心分離により、非内分泌上皮細胞NEECs及び血管内皮細胞VECsを培地から剥離することにより、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとを別々に培養するのが完了した際、またはこの後に、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとを、培養容器または培養基材から剥離し、次いで培地から剥離すること、この剥離する段階により得られた非内分泌上皮細胞NEECs及び血管内皮細胞VECsを、血清含有分化培地が入れられた低接着性培養容器中に入れること、組織複合体の初期形成が行われるまで、低接着性培養容器に非水平回転運動を加えること、及び、低接着性培養容器を水平に静置して、前記血清含有分化培地、または同種の培地を交換することにより、前記の組織複合体の初期形成の後における前記インスリン産生細胞IPTsを熟成させることが含まれることを特徴とする請求項1~11のいずれかに記載の方法。前記血清含有分化培地が、アクチビン、他の増殖因子、骨形成蛋白質及びCaCl2を含み、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとの混合比は、これら細胞の合計数に対する血管内皮細胞VECsの数の比率が、3~25であり、前記熟成させる段階において、前記血清含有分化培地から、CaCl2が省かれることを特徴とする請求項12に記載の方法。出生後の膵臓から分離したか、または由来する、血管内皮細胞VECsと自然膵島とを用意すること、細胞単層が形成されるように、インビトロで血管内皮細胞VECsを培養すること、及び、自然膵島を、前記細胞単層上に播種して、この細胞単層上で増殖させることを含むことを特徴とする、インスリン産生細胞IPTsを作成する方法。コラーゲンまたはその他の細胞接着性材料でコーティングした培養容器または培養基材に、血管内皮細胞VECsを播種して、ここで増殖させること、血管内皮細胞VECsを培養容器または培養基材から剥離すること、及び、前記細胞単層を形成するための前記の培養する段階の前に、抗体を用いて血管内皮細胞VECsを純化することをさらに含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。出生後の膵臓から分離したか、または由来する、非内分泌上皮細胞NEECsを用意すすること、インビトロで非内分泌上皮細胞NEECsを、培養容器または培養基材に接着した状態で培養すること、組織解離酵素溶液で処理することで、培養容器または培養基材から非内分泌上皮細胞NEECsを剥離し、これにより、培養容器または培養基材に依然として接着している残存細胞LOCsを残すこと、剥離された非内分泌上皮細胞NEECsと、残存細胞LOCsとを互いに別々に培養すること、及び、非内分泌上皮細胞NEECsについて、残存細胞LOCsにより調整された培地中にて、または、残存細胞LOCs存在下の培地中にて、培養することで細胞クラスターを形成させること、を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞IPTsを作成する方法。解離酵素を用いて培養容器または培養基材から残存細胞LOCsを剥離すること、及び、細胞クラスターを形成させる培養を行う際、またはその前に、剥離した残存細胞LOCsについて、非内分泌上皮細胞NEECsの培地と連通する培地に入れるか、部分的に非内分泌上皮細胞NEECsの培地へと運ばれる培地に入れるか、または、その他の方式により、非内分泌上皮細胞NEECsのための、調整培地を生成するための培地に入れることをさらに含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。非内分泌上皮細胞NEECsが浸漬された培地中に少なくとも部分的に浸漬された、培養容器または培養基材上に、剥離した残存細胞LOCsを配置するか、または、培地に浸漬した多孔性容器中に、剥離した残存細胞LOCsを入れ、残存細胞LOCsが入ったこの容器を、さらに別の細胞容器または細胞基材上に配置し、この際、非内分泌上皮細胞NEECsを、多孔性容器中の培地と連通及び/または連続している培地中にて増殖させることを特徴とする請求項17に記載の方法。前駆細胞の精確な性質は明らかになっていないが、前駆細胞を分離するための種々の方法が試された。それらのうちの1つの方法は、特定の組み合わせの細胞表面マーカーを用いるソーターによる分離である。この方法の欠点は、収集された細胞の量が、往々にして、増殖培養に充分でない。これは、分離ステップにより引き起こされた損傷、及び、細胞表面マーカーから起こり得る偏りのためである。他の一つの方法は、膵廃棄組織膵島分離後の残りをまるごと培養することによる目標細胞の選択的な増殖である。膵廃棄組織は、適切な媒体及び増殖因子を入れた培養容器に播種され、前駆細胞になる見込みのものの増殖を促進するようにする。この方法を採用する際の課題は、どの細胞について、また、どの段階にある細胞について、所定の培養プロトコルによって増殖させる必要があるかを予測することである。移植可能な膵島の不足を埋め合わせる他の方策は、自然膵島細胞を生体外にて増殖させることである。膵島細胞、中でもベータ細胞は、分化を終了した性質を持つと考えられており、そのため、インビトロで増殖を促進するのは、困難であり、このための効率的な方法が求められている。本発明の第1の態様によるインスリン産生組織を作成する方法は、インビトロにて、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとからなる組織複合体を生成することを含む。ここで、非内分泌上皮細胞NEECs及び血管内皮細胞VECsは、いずれも、出生後の膵臓から分離したか、または由来したものである。本発明の第2の態様によるインスリン産生組織を作成する方法は、以下の~を含む。すなわち、出生後の膵臓から分離したか、または由来したものである血管内皮細胞VECs及び自然膵島細胞を用意すること、インビトロで血管内皮細胞VECsについて、細胞単層を形成するように培養すること、及び、この自然膵島細胞を前記血管内皮細胞VECs単層上に播種して増殖させることを含む。本発明の第2の態様によるインスリン産生細胞IPTsを作成する方法は、以下の~を含む。すなわち、出生後の膵臓から分離したか、または由来したものである非内分泌上皮細胞NEECsを用意すること、インビトロで非内分泌上皮細胞NEECsについて、培養容器の表面または培養基材培養基材の語は、これ以降、あらゆる形態の足場材料を含むものとするに接着した状態で培養すること、組織解離酵素で処理することにより、培養容器の表面または培養基材から非内分泌上皮細胞NEECsを剥離し、培養容器の表面または培養基材に依然として接着している残存細胞LOCsを残すこと、剥離した非内分泌上皮細胞NEECsと、残存細胞LOCsとを其々に別々に培養すること、及び非内分泌上皮細胞NEECsについて、残存細胞LOCsが培養された調整培地中にて、または、この残存細胞LOCsの存在下にて培養を行って、細胞クラスターを形成することを含む。本発明は、インスリン産生組織IPTsの形成と内分泌機能を増進させることができる培養法を提供する。特には、膵臓由来の非内分泌上皮細胞NEECsを、同じく膵臓から分離された血管内皮細胞VECsとともに培養することで、インスリン産生組織IPTsの形成を増進させる培養法を提供する。本発明は、また、血管内皮細胞VECsについて、自然膵島の増殖を促進させるという別の用途を提供する。したがって、次のようなことを可能にする具体的な細胞の分離及び培養の方法を提供する。すなわち、非内分泌上皮細胞NEECsのコロニーを増殖させて、膵島様性質が付与されたインスリン産生組織IPTsを生成することを可能にし、また、I型自己免疫性及びII型インスリン抵抗性の糖尿病を治療するための自然膵島の増殖を促進させることを可能にする具体的な細胞の分離及び培養の方法を提供する。第1の好ましい実施形態において、前記の非内分泌上皮細胞NEECsは、膵島を分離した後の廃棄組織から培養されるものであり、細胞群が、下記の1及び3を含む方法により、好ましくはさらに下記の2をも含む方法により、イニシエートされる。1細胞の捕集:前記の膵廃棄組織を、血清含有培地に播種する。ここで、この血清含有培地に接する培養容器または培養基材は、コラーゲンといった細胞接着材料でコーティングされており、好ましくは、抗cMetHGF受容体抗体及び/または抗Eカドヘリン抗体でコーティングされたものである。播種後、培養系を静置する。例えば、8~56時間、約37°Cにて二酸化炭素富化環境下に静置する。一実施例において、細胞の捕集は、次のように行われる。すなわち、次のようにコーティングした培養容器内にて10体積のウシ胎児血清を含むRPMI1640培地中にて行われる。培養容器は、02mgmlのラット尾由来コラーゲンIでコーティングされたものであり、さらには、抗Eカドヘリン抗体、及び/または、抗cMetHGF受容体抗体で、1100と11000との間の範囲の濃度にてコーティングされたものである。この組織は、約37°Cで5CO2にて24~6時間培養される。2コロニーの誘起:上記の細胞の捕集での血清含有培地について、以下を含有する第1の無血清培地に交換する。すなわち、FGF2または他の線維芽細胞増殖因子、並びに、インスリントランスフェリン亜セレン酸ナトリウムのサプリメント、またはその他の増殖因子サプリメントを含有し、好ましくはさらにLIF白血病阻害因子を含む第1の無血清培地に交換する。そして、この無血清倍地中にて培養を続ける。例えば、少なくとも8時間、約37°Cの二酸化炭素富化環境内にて行う。好ましくは、第1の無血清培地が、線維芽細胞増殖因子を2~40ngml、より好ましくは5~30ngmlの範囲で含有するか、LIFを100~15000Uml、より好ましくは3005000Uml含有するかの、いずれか、または両方である。一実施例において、第1の無血清培地が、1gリットルのITSインスリントランスフェリンセレンのサプリメント。例えば、インスリンが5μgml、トランスフェリンが5μgml、亜セレン酸ナトリウムが5ngml、02のウシ血清アルブミンBSA、20ngmlの組換えヒトFGF2及び1400Umlの組換えヒトLIF白血病抑制因子を、10mMのDグルコースを含有するDMEMHamsF12中に含み、培養が少なくとも24時間行われる。このステップは省略可能であり、細胞捕集ステップ1の後に、直接続けて、下記に示す初期のコロニー増殖のステップ3が行われるのであっても良い。3初期のコロニー増殖:コロニー誘起2での第1の無血清培地について、ヒトKGFケラチノサイト増殖因子を含む第2の無血清培地、または、ヒトKGFケラチノサイト増殖因子と、インスリントランスフェリン亜セレン酸ナトリウムのサプリメントまたは他の増殖因子のサプリメントとを含む第2の無血清培地に交換する。そして、クローン性の非内分泌上皮細胞NEECsであって、細胞の寸法が、直径で10~30μmの範囲内であるものが出現するまで、培養を行う。好ましくは、第2の無血清培地は、1~100ngmlの範囲内のKGF、より好ましくは3~30ngmlの範囲内のKGFを含む。第2の無血清培地は、好ましくは01~10gLの範囲の増殖因子のサプリメントを含む。例えば、第2の無血清培地は、1gLのITSインスリンが5μgml、トランスフェリンが5μgml、亜セレン酸ナトリウムが5ngml、02のウシ血清アルブミンBSA、10mMのニコチンアミド、及び10ngmlの組換えヒトKGFケラチノサイト増殖因子を、7mMのDグルコースを含有するDMEMHamsF12中に含むものである。そして、培養は、例えば、少なくとも2~7日間、約37°Cの二酸化炭素富化環境内で行われる。線維芽細胞様細胞の増殖を軽減させるためには、必要ならば002μMの2メルカプトエタノールを培地に添加することができる。マイコプラズマの感染を防止するためには、マイコプラズマ除去剤を培地に添加することができる。好ましくは、培地交換を、2~3日ごとに行い、寸法が10~30μmである非内分泌上皮細胞NEECsのクローン性コロニーが、相当な数だけ現れるまで行う。第2の好ましい実施形態において、前記の非内分泌上皮細胞NEECsは、下記の4~6の技法による選択的増殖へと、継代される。4第1の細胞剥離:第1の好ましい実施形態の初期コロニー増殖3での非内分泌上皮細胞NEECsを、組織解離酵素溶液で処理することにより、培養容器から剥離する。また、濾過及び/または遠心分離によって、第2の無血清培地から非内分泌上皮細胞NEECsを捕集することにより、細胞剥離を行う。例えば、アキュターゼが剥離に用いられ、剥離された細胞は、40μmのメッシュを通して濾過し、4分未満の間160×G以下で遠心分離する。5第2の細胞剥離または細胞剥離:第1の細胞剥離4における強固に接着された上皮細胞である残存細胞LOCsを、強力な細胞解離剤、または、例えばトリプシンEDTAエチレンジアミン四酢酸といった部分的な蛋白質分解を行う分解剤を添加することにより、培養容器から剥離する。例えば、残存細胞LOCsを約37°Cにて1~15分間処理する。詳細な一実施例においては、残存細胞LOCsの剥離が、005トリプシンEDTAを用いて37°Cで3~5分間行われる。これらの細胞は、無血清培地にて洗浄された後、トランスウェルインサートに移され、後で用いる培地中にて培養される。6第1の細胞剥離で得られた非内分泌上皮細胞NEECsは、第2の細胞剥離で得られた残存細胞LOCsが培養された調整培地中にて培養される。好ましい実施例において、第1の細胞剥離4で得られた剥離細胞は、第1の好ましい実施形態の細胞捕集ステップ1におけると同様に、新たな培養容器に播種されるか、または他の培養容器に播種される。そして、このような培養容器には、第2の細胞剥離で得られた残存細胞LOCsが入れられたトランスウェルインサート例えばミリポア社が装填される。トランスウェルインサートにおける穴の開いた底部を通じて、トランスウェルインサート内の培地は、非内分泌上皮細胞NEECsの培地と同一か、または連通している。好ましくは、第1の細胞剥離4で得られた非内分泌上皮細胞NEECsが、KGFを含むコラーゲン、または、KGF及び抗Notch1抗体を含むコラーゲンでコーティングされている培養容器または培養基材に播種される。そして、非内分泌上皮細胞NEECsは、アトルバスタチンを添加した第3の無血清培地中にて培養される。ここで、KGF、または、KGF及び抗Notch1抗体は、rockRho結合コイルドコイル含有蛋白質キナーゼ阻害剤、または、rock阻害剤、EGF上皮増殖因子及びHGF肝細胞増殖因子並びにBMP4またはBMP7の混合物で置き換えることができる。例えば、培養容器にコーティングするコラーゲン溶液は、10ngmlのKGFを含むように調整され、コーティングされた表面は、さらに、抗Notch1抗体にて、最終濃度が1100~11000となるように処理される。上記に代えて、コラーゲンコーティングがKGFを含まず、抗Notch1抗体によっても処理されず、代わりに、第1の細胞剥離ステップ1の培地中のKGFが、以下によって置き換えられるのであってもよい。すなわち、10ngml15ngmlまたは20ngmlより多く30ngmlまたは20ngmlより少ない例えば20ngmlのHGF肝細胞増殖因子と、10ngml15ngml20ngmlまたは30ngmlより多く50ngmlまたは50ngmlより少ない例えば40ngmlのEGF上皮増殖因子と、2μM4μM8μMまたは14μMより多く25μM20μM14μMまたは8μM少ない例えば4μMのrockRho結合コイルドコイル含有蛋白質キナーゼ阻害剤とによって置き換えられるのであっても良い。細胞剥離4で得られた、剥離された非内分泌上皮細胞NEECsが、培養容器に播種され、場合により、残存細胞LOCsが入れられたトランスウェルインサートが装填されてから、好ましくは、培地に、アトルバスタチンが、001~10μM、より好ましくは003~03μM、例えば01μM添加される。また、この培地には、さらに、10ngmlまたは15ngmlより多く40ngmlまたは30ngmlより少ないBMP7が添加することができる。このようにして、後の分化の際に、内分泌細胞になろうとする傾向を持つ非内分泌上皮細胞NEECsを富化することができる。培地交換は、2~3日ごとに、40調整培地で、非内分泌上皮細胞NEECsのクローン性コロニーが、相当な数だけ現れるまで行う。非内分泌上皮細胞NEECsのクローン性コロニーは、自然に、細胞クラスターを形成するのであり、この細胞クラスターは、分化時における上記の組織複合体を形成する傾向をさらに増大させる、さらなる富化のために、継代培養に供することができるものである。第3の好ましい実施形態において、前記の非内分泌上皮細胞NEECsは、増殖培養または継代時に次のような細胞を含む。すなわち、Hes1、Notchシグナリングの下流ターゲットを示し、かつ、全トランスレチノイン酸およびシクロパミンKAAD3ケトNシクロパミンによる処理でNgn3陽性細胞として同定され、これにより、インスリン産生細胞を生成する能力を備えた前駆細胞の特性を示す細胞を含む。第4の好ましい実施形態において、前記の血管内皮細胞VECsは、膵島を除去した後の廃棄組織から培養され、細胞群のイニシエーションが、下記の7及び8の技法により行われる。7播種:第1の実施の形態の細胞捕集ステップ1で除去された前記廃棄組織そのもの、または浮遊組織を、第2の血清含有培地中、コラーゲンまたはその他の細胞接着材料がコーティングされている培養容器または培養基材に播種する。そして、第2の血清含有培地中にて、培養を行う。好ましくは、この培養には、以下が含まれる。すなわち、前記播種に引き続いて血管内皮細胞VECsを増殖させることと、培地交換することと、抗体及び磁気ビーズを用いて血管内皮細胞VECsを純化することが含まれる。培地交換は、次のように行われる。すなわち、上記の増殖の後で非接着の細胞及び組織片を除去し、例えば、リン酸塩緩衝液といった生理溶液でざっと洗浄してから、新鮮な無血清培地を補充することにより行われる。より好ましくは、新鮮な無血清培地が、ファンギゾン商品名、インビトロジェン社といった抗真菌剤を含む。第2の血清含有培地は、例えば、18mgmlのラット尾由来コラーゲンIをコーティングした培養容器中にあって、655°Cにて60~70分間の熱不活化が施された胎児ウシ血清FCS20体積と、70~100μgmlのECGS内皮細胞増殖サプリメントとを含むRPMI1640培地である。例えば、非接着組織片を18時間の培養後に除去し、接着している細胞及び組織を、素早くリン酸塩緩衝液にて洗浄してから、01体積のファンギゾンを含む新鮮な培地を補充する。8血管内皮細胞VECsの純化:抗体と磁気ビーズによって血管内皮細胞VECsを純化する。好ましくは、抗体結合マイクロビーズといった抗体結合基材であって、抗CD31抗体を有するものなどを用いる。好ましくは、7に記載した、前記の播種及び前記の培地交換を繰り返すことで、純化した血管内皮細胞VECsをさらに増殖させる。第5の好ましい実施形態においては、前記の血管内皮細胞VECsが培養容器に播種され、第4の好ましい実施形態にて具体的に記載された培地中で、ほぼコンフルエントな細胞単層を作り出す。すると、分離され純化された自然膵島から解離された細胞または細胞クラスターが、血管内皮細胞VECsの細胞単層に播種され、膵島の細胞または細胞クラスターの増殖を促す。好ましくは、血管内皮細胞VECsについて、第4の好ましい実施形態における播種及び培養7及び/または純化8を行い、この後に、血管内皮細胞VECsの細胞単層が形成される。第1、第4または第5の好ましい実施形態にしたがう実施形態において、前記血管内皮細胞VECsは、非内分泌上皮細胞NEECsが分離されたと同一のドナー組織に由来するか、または、インスリン産生細胞IPTsまたは自然膵島が移植されるレシピエントの組織に由来する。前述のいずれかの実施形態にしたがう実施形態において、前記のインスリン産生細胞IPTsは、下記の9~11による培養方法を用いて、前記の非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとの組織複合体を形成することにより生成される。9剥離:第2の好ましい実施形態での第1の細胞の剥離4におけると同様にして、前記の非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsを剥離し、低接着性培養容器中にて、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとの組織複合体を生成する。10組織複合体の生成:前記剥離9で得られた前記の非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとの前記組織複合体を、血清含有分化培養液を備える低接着性培養容器中に入れ、この低接着性培養容器に非水平回転運動を、組織複合体の初期形成が行われるまで行う。これら2種類の細胞の混合比は、好ましくは973~7030、より好ましくは973~2575または955~7030、さらに好ましくは9510~7030または955~7525、一層好ましくは9510~7525である。好ましくは、血清含有分化培地が、アクチビン、他の増殖因子、及びCaCl2を含む。より好ましくは、血清含有分化培養培地が、例えば、BMP7またはBMP4などの骨形成タンパク質を含む。さらに好ましくは、血清含有分化培地が、ベータセルリン及びまたはエキセンディン4を含む。好ましい実施例において、アクチビン、ベータセルリン、HGF肝細胞増殖因子、ガストリン、IGFインスリン様増殖因子1、KGF、VEGF血管内皮細胞増殖因子、BMP7、エキセンディン4、アスコルビン酸及びCaCl2を含む。具体的な実施例において、培地は、DMEMHamsF12及び20mMのDグルコースを含み、2体積の胎児ウシ血清FCS、2ngmlのアクチビンA、5ngmlのベータセルリン、20ngmlのHGF、20ngmlのガストリン、20ngmlのBMP7、20ngmlのIGF1、5ngmlのKGF、20ngmlのVEGF、20ngmlのエキセンディン4、10mMのニコチンアミド、01mMのアスコルビン酸、及び、1mMのCaCl2が添加されている。培養容器についての非水平回転運動を、インスリン産生細胞IPTsの球状クラスターがこの培地中に出現するまで行う。好ましくは、10、15または20rpmより小さいスピードで行う。例えば、37°Cで5CO2にて18~24時間行う。11インスリン産生細胞IPTsの熟成:以下の点を除き前記の生成10におけると同じ手順によりインスリン産生細胞IPTsを熟成する。すなわち、培養容器が水平に、運動することなく配置され、培地が全くCaCl2を含んでいない点を除くと同じ手順で熟成する。好ましい実施例において、培地は、約20日間の全成熟期間中、1~2日ごとに交換される。上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、培地に添加される抗生物質は、50~100Umlのペニシリンと、50~100μgmlのストレプトマイシンであるが、このストレプトマイシンは50~100Umlのゲンタマイシンに置き換えてもよい。上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、培地に添加されるITSインスリントランスフェリンセレン酸ナトリウムサプリメントの原液は、約5μgmlのインスリンと、約5μgmlのトランスフェリンとを含み、亜セレン酸ナトリウムを、好ましくは05~5ngml、より好ましくは075~25ngml、例えば125ngml含む。上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、前記のインスリン産生組織IPTsは、これら実施形態に示される方法によらずに形成される組織に比べて、インスリン産生細胞の割合が、より大きい組織を、より大きい分量で含む。上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、インスリン産生組織IPTsは、これら実施形態に示される方法によらずに形成される組織に比べて、より多くのインスリンを産生する細胞を含む。上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、インスリン産生組織IPTsの機能には、同種の自然膵島により生成するインスリンの5、10、40、60、80または100より少ない分泌が含まれる。上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、インスリン産生組織IPTsの機能には、これら実施形態に示される方法によらずに形成される組織に比べて、インスリン分泌における、より大きいグルコース応答性が含まれる。上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、インスリン産生組織IPTsの機能には、インスリン産生組織IPTsを糖尿病患者のレシピエントに移植した際に、レシピエントのグルコース制御機能を正常化することが含まれる。上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、これら実施形態に示される方法によらずに形成される組織に比べて、自然膵島の増殖が促進する度合いが大きい。これ以降、次のことを可能にするインビトロ培養法に関するさらに具体的な実施形態について述べる。すなわち、出生後の膵臓から得られた非内分泌上皮細胞NEECsによるインスリン産生組織IPTsの生成を可能にする培養法に関するものであり、ここで、このインスリン産生組織IPTsは、自然膵島の10以下のインスリンを分泌する内分泌細胞を含み、また、適切なレベルのグルコース応答性を有するものである。本発明の第一および第三の態様において、以下の、相異なる3つの細胞グループのうち少なくとも2つを用いる培養法を採用する。一つは、膵臓から分離された非内分泌上皮細胞NEECsである。この細胞は、膵管の内部または近傍に存在するか、または、中心腺房細胞として存在する、上皮細胞特性の前駆細胞と定義することができる。最近、これらの細胞は、前駆細胞におけるアルデヒド脱水素酵素の高い酵素活性を利用してAldefluor染色でラベリングされた。以前に考えられていたよりも多量にあるものと推測される。膵島の除去後の膵廃棄組織は、例えばコラゲナーゼ処理などの後、コラーゲンI等でコーティングした培養容器または培養基材に、10FCSを含むRPMI1640培地といった、血清含有培地とともに播種される。初期のインキュベーションは、接着性の細胞や組織が、コーティングされた表面に接着することを可能にし、これにより細胞の捕集を可能にする。捕集される細胞は、大半が非内分泌上皮細胞NEECsである。このような捕集のためには、培養系を、好ましくは8~56時間、より好ましくは12~48時間放置する。好ましくは、約37°Cで富化CO2濃度にて放置する。このような捕集が進行する際に、非内分泌上皮細胞NEECsの初期のインキュベーションまたは培養が行われる。捕集が行われたなら、血清含有培地は、FGF2または類似の増殖因子を含む第1の無血清培地に交換され、好ましくは8~48時間、より好ましくは12~36時間、例えば24時間、増殖を刺激する。この期間の後、培地は、さらに、他の無血清培地、すなわち、第2の無血清培地に交換される。この第2の無血清培地は、好ましくは、KGFまたは類似の増殖因子、及びまたは、線維芽細胞様細胞のための何らかの増殖阻害剤を含む。例えば、この無血清培地は、01nMの2メルカプトエタノール、02のウシ血清アルブミンBSA、1gLのITS、10mMのニコチンアミド及び10ngmlのKGFを含む。好ましくは、培養環境が約37°Cで富化CO2濃度とする。2メルカプトエタノールは、上皮細胞の増殖を妨害する傾向がある線維芽細胞様細胞の増殖を阻害する。無血清培地に添加されるITSの原液は、好ましくは、5μgmlのインスリンと、5μgmlのトランスフェリンと、05ngml、125ngml、25ngml、5ngml、または、より好ましくは125ngmlの亜セレン酸ナトリウムを含む。非内分泌上皮細胞NEECsのクローン性コロニーは、典型的には、7~10日の培養の間、大きさが増加していく。そのため、第2の無血清培地での培養は、好ましくは2~3日で培地交換しつつ、好ましくは3~20日間、より好ましくは5~15日間、好ましくは約37°Cで富化CO2濃度にて行われる。このような初期のコロニー増殖によって、直径10~30μmの大きさを有するNEECsのクローン性コロニーが出現する。上述の、培養に用いる血清含有または無血清のいずれの培地においても、マイコプラズマの感染を防止すべく、必要ならば、マイコプラズマ除去剤を添加することができる。次に、無血清培地には、インスリン産生細胞の自然に生成されるのを防止するために、同じ培地ではあるが、7mM以下のDグルコース濃度といった、より低い糖濃度の培地が、好ましくは2~3日ごとに交換される。好ましい実施形態において、細胞周期をスウィッチオンする重要な信号トランスデューサーとして機能するNotch受容体のマルチレベルの刺激を用いる。充分な数の細胞単層細胞が、コンフルエントの70を超えて増殖した際、これらの細胞を、アキュターゼで培養容器から引き離し、40マイクロメートルのナイロンメッシュを通して濾過し、培養容器に播種する。この培養容器は、KGFを溶解したコラーゲンIでコーティングし、さらに抗NotchI抗体で処理しておいたものである。本発明の継代方法は、2つのNotch活性化刺激を用いる。1つは、上記のような抗Notch1抗体または類似のNotch活性化抗体による、Notch受容体の細胞外刺激を用いるものである。他の1つは、アトルバスタチン、または、Notch経路活性化特性を有する、類似のスタチンによる細胞内刺激を用いるものである。スタチンは、HMGCoA還元酵素阻害剤であり、これらには、特に、アトルバスタチン及びシンバスタチンが含まれる。アトルバスタチンは、潜在的な内分泌前駆細胞の正の誘導因子であるプレセニリン1の発現を促進することが知られている。改変無血清培地におけるアトルバスタチン、シンバスタチン、または他のスタチンの濃度は、好ましくは001~10μMであり、より好ましくは、003~03μM、例えば01μMである。上記に代えて、次のとおりとすることができる。コラーゲンコーティングが、KGFを用いて調製されず、抗Notch1抗体で処理したものでもない。その代わりに、初期のコロニー増殖ステップ3の培養液におけるKGFが、10、15、20及び30ngmlのHGF、より好ましくは20ngmlのHGFと、10、15、20、30、40または50ngmlのEGF、、より好ましくは40ngmlのEGFと、2、4、6、8または10μMのrock阻害剤、より好ましくは4μMのrock阻害剤とにより置きかえられる。培地には、さらに、アトルバスタチンと、10、15、20、または30ngmlのBMP4またはBMP7、より好ましくは20ngmlのBMP4またはBMP7が添加されて、非内分泌上皮細胞NEECsについて、後の分化時に内分泌細胞になる傾向を強めることができる。培養に用いられる別のグループの細胞は、強く付着しあって細胞塊を形成する上皮細胞である。これらの細胞は、これまで記載した培養条件にて急速に増殖するのであり、腺房細胞の前駆細胞、及びまたは、脱分化して、膵管様、または膵管前駆細胞様の表現型を有するのものである。初期の無血清培地の培養系は、かなりの量の、このような上皮細胞塊を含んでおり、この上皮細胞塊が、非内分泌上皮細胞NEECsの増殖を増進させている。この増進は、おそらく、何らかの未同定のパラクリン因子を分泌することによる。この細胞は、アキュターゼ処理といった組織解離酵素を用いた処理によって非内分泌上皮細胞NEECsを分離した後、培養容器に接着したまま残される。そのため、残存細胞LOCsと呼ぶ。この細胞は、プロティナーゼなどの、より強い解離酵素により、培養容器から剥離される。例えば、005トリプシンEDTAを用い、37°Cで3~5分間処理し、無血清培地で洗浄した後、トランスウェルインサートに移す。そして、非内分泌上皮細胞NEECsの増殖を促進させるべく、培地中に配置される。培養に用いられる第3のグループの細胞は、血管内皮細胞VECsであり、非内分泌上皮細胞NEECsを捕集する際に収集される組織片から培養することができるものである。血管内皮細胞VECsは、前述の、接着している細胞や組織を捕集する際の培養液中にある浮遊組織片から、好ましくは6~54時間後、より好ましくは9~36時間後に、収集される。培養された血管内皮細胞VECsは、抗CD31抗体が結合した磁気ビーズを用いて純化される。本発明の一実施形態は、低接着性培養容器中で、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとから組織複合体を生成する方法を提供する。これら2種類の細胞の混合比は、好ましくは973~7525、より好ましくは955~7030である。すなわち、非内分泌上皮細胞NEECsの数と血管内皮細胞VECsの数との合計に対する非内分泌上皮細胞NEECsの数の比率で見た場合、混合比は、好ましくは3~25、より好ましくは5~30の比率である。組織複合体は、低接着性培養容器に非水平回転運動を、好ましくは6~72時間、より好ましくは9~48時間、さらに好ましくは18~24時間、好ましくは約37°Cで富化CO2濃度にて、加えることにより生成される。ここで使用される培地は、好ましくは、アクチビン、ベータセルリン、HGF、ガストリン、IGF1、KGF、VEGF、BMP7、エキセンディン4、アスコルビン酸及びCaCl2を含む。好ましい実施形態において、前記インスリン産生組織IPTsの熟成は、培養容器が水平に静置され培地にCaCl2が含まれないことを除くと、上述と同じ方法が用いられる。培地交換は、約20日間の熟成期間の全期間にわたって、1~2日ごとに行われる。本発明は、いずれも生後の膵臓から得られる非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとの組織複合体をインビトロで生成することにより、インスリン産生組織IPTsの形成及び機能を増進させる新たな方法について記載する。血管内皮細胞VECsが分離される組織源と、血管内皮細胞VECsそのものの生理状態とのいずれもが、本発明において重要である。血管内皮細胞VECsの表現形質の特性は、これら細胞が存在する臓器、組織及び細胞の種類に部分的に依存して、不均一となっているCrivellatoetal2007JAnat211415427。このことから、血管内皮細胞VECsの組織特異性または臓器特異性は、非内分泌上皮細胞NEECsがインスリン産生組織IPTs及び/または膵島へと分化するのを増進させる上で、決定的な因子であるようである。また、非内分泌上皮細胞NEECsとともに組織複合体を生成してからインスリン産生組織IPTsを生成するのに用いられる血管内皮細胞VECsは、膵島中の血管内皮細胞VECsにて通常見られるのと同様に、表現形質において、好ましくは開窓状態となっている。したがって、本発明で用いられる分化培地は、血管内皮細胞VECsについて開窓を形成するように刺激することが知られているVEGFを含む。インスリン産生組織IPTsの形成及び機能を増進させる方法は、2つのステップからなるものとして考案されている。一方のステップは、2種の細胞NEECs及びVECsを分離し増殖させるステップである。もう一方のステップは、これら2種の細胞からの組織複合体の生成である。これら2つのステップは、本願において、実施例の見出しを付けた各セクション、及びまたは、各請求項中に、詳細に説明されている。膵島前駆細胞が含みうる細胞集団を分離するためには、種々の表面マーカーを用いて、サイトメトリーにより、細胞を選り分けることができる。この方法の欠点は、選別された細胞の量が、往々にして前駆細胞の培養増殖にとり不充分であることである。この前駆細胞は、通常、際限なく増殖するのでなく、選り分けのステップで引き起こされる損傷を受ける。もう一つの欠点は、使用される表面マーカーのセットが、個々の細胞のサンプル間のバラツキに起因する選別の偏りを引き起こしうるということである。したがって、得られた細胞が目的とする前駆細胞であるかについては、機能性の分泌細胞を生成した際にはじめて、より厳密に評価することが可能である。この目的のために、本件発明者らは、目的とする前駆細胞の選択的増殖を可能にする細胞培養アプローチを採用する。前駆細胞となる見込みの細胞の増殖を促すとともに、目的としない細胞の増殖をうながさないようにするための、適切な培地及び増殖因子を備えた培養容器に、膵島を除去した後の膵廃棄組織を播種する。従前の研究では、インスリン産生細胞を生成するかもしれない前駆細胞を選択的に増殖させる数多くの方法が考え出すための試みがなされた。例えば、Todorovら2006Pancreas32130138は、コラーゲンIでコーティングしたフラスコ中、血清含有培地で、ヒトの膵廃棄組織を用いて、Pdx1発現性の上皮細胞を増殖させた。この方法が、本発明のベースとなっており、培地及び増殖因子の選択において、種々の改変がなされた。本件発明者らは、BonnerWeirら及びKatdareらが選択的増殖に用いたのと同様に、熱不活性化ウシ胎児血清FCSを10添加したRPMI1640を用いることで、コラーゲンIでコーティングされた表面への選択的な細胞接着を促すようにした。BonnerWeirやKatdareの研究では、培地が、インスリントランスフェリンセレンITSと、5~10Mmのニコチンアミドと、10ngmlのKGFFGF7を含む無血清培地に切り替えられた。ニコチンアミドは、上皮細胞の増殖を促進すると言われている。Katdareら2004は、また、線維芽細胞様細胞の増殖を抑えるために2メルカプトエタノールを用いた。本件発明者らは、BonnerWeirやKatdareの方法に対して、クローン性コロニーを誘発する他の中間のステップを追加するという改変を行った。ここで、FGF2及びLIFを添加することで、24時間、接着した細胞の増殖を無差別に促進するようにした。この後、培地について、2メルカプトエタノール、ニコチンアミド及びKGFを添加した他の無血清培地に変更した。この培地は、さらなる細胞増殖を可能にするものである。引き続く2~7日の期間内に、直径が10から30マイクロメートルの範囲のサイズを有する上皮細胞のクローン性コロニーが、かなりの数、出現した。これらの細胞が、少なくとも初期増殖段階においては、密接に隣接し合った上皮シートを形成せず、緩やかに隣接しあった単一細胞のクラスターのままとなっている。本件発明者らは、このような細胞を非内分泌上皮細胞NEECsと命名した。これは、未だ内分泌機能を達成していない前駆細胞を含む、上皮細胞の大きいカテゴリ内における、不均一な細胞のグループであることを示す。内分泌細胞が未熟な状態で生成するのを防止すべく、無血清培地中のグルコース濃度は、非内分泌上皮細胞NEECsを培養する残りの期間全体にわたって7mM以下に維持される。この初期培養ステップでは、接着している上皮細胞を非内分泌上皮細胞NEECsとともに増殖させる。この理由は、接着している上皮細胞が、非内分泌上皮細胞NEECsの増殖を促進する未同定の増殖因子を分泌している可能性があるからである。本件発明者らは、このように接着している上皮細胞を残存細胞LOCと命名した。この残存細胞LOCは、上述のアキュターゼ処理によって非内分泌上皮細胞NEECsを剥離した後に、培養容器に接着したままとなっている。残存細胞LOCは、後にトリプシン処理により剥離される。コラーゲンでコーティングした培養容器、ウェルプレートまたは培養皿について、非内分泌上皮細胞NEECsの接着性を高めるべく、表面特性を改変した。この改変は、コラーゲンでコーティングした容器について、抗Eカドヘリン抗体及び抗CMET抗体のリン酸塩緩衝液PBSであって濃度が1100と11000との間の範囲にあるものを用いて、1時間室温25°C付近で処理することにより行った。この抗体処理は、上皮細胞が他の種類の細胞に接着する確率を増大させる。上皮細胞は、他の種類の細胞の間にあって、Eカドヘリンを発現する。Eカドヘリンは、細胞間接着分子であって、膵内分泌前駆細胞によっても発現される。そのため、上皮細胞は、抗Eカドヘリン抗体でコーティングした表面に接着すると予測される。cMetと同義であるHGF受容体は、膵島内分泌細胞になる能力を有する細胞が含まれた前駆細胞を特徴づける細胞表面分子の一つである。実際、抗体処理は、コーティングされた表面あたりの上皮細胞図2Aの収率を増大させた。興味深いことに、上記の2つの抗体を組み合わせた場合、一方だけの場合より、細胞の収率が少し低くなった。成人の膵臓から分離した前駆細胞の細胞集団は、継代培養時に、多分に増殖を停止する可能性があるSeabergetal2004NatureBiotechnology2211151124。TAら2006StemCells2417381749は、BMP4でもって上皮間葉移行EMTを誘起することにより、この増殖停滞を克服した。TAらの研究によると、上皮間葉移行後の線維状の細胞が急速に増殖した。そして、培養系が充分な量の細胞を生み出した際に、膵島様組織を生成する前に、逆のプロセス、すなわち間葉上皮移行METにより、上皮細胞の特性を回復させた。このような移行培養方法の1つの欠点は、結果として得られる膵島様組織が分泌するインスリンの量が貧弱であるということであった。このことは、移行培養方法が、得られた組織により機能的に成果を出すことを妨げているという可能性を示唆する。これとは対照的に、BonnerWeirら2000やKatdareら2004によるもののような、上皮細胞から生成した膵島様組織は、より多くのインスリンを産生した。BonnerWeirら2000やKatdareら2004の研究は、継代培養について具体的な方法を示すものでないが、本件発明者は、これらの研究の基本的な培養技術のいくつかについて、継代時における上皮細胞の均一性を向上させるべく、上皮間葉移行EMTを誘起することなくシミュレートした。継代後における非内分泌上皮細胞NEECsの増殖を促進させるべく、本件発明者らは、細胞周期をスウィッチオンする重要な信号トランスデューサーである、Notchシグナリングの2つの方法の刺激を用いた。一つの方法は、抗Notch1抗体を用いたNotch受容体の細胞外の刺激によるものであり、他の方法は、アトルバスタチンを用いた細胞内の刺激によるものである。初代培養で充分な数の細胞単層細胞が増殖して50、60、70、80、90より大きいコンフルエンス、または100のコンフルエンスとなった際、より好ましくは70のコンフルエンスとなった際、非内分泌上皮細胞NEECsは、アキュターゼにより、個々ばらばらの細胞または小さな細胞塊として剥離される。特には残存細胞LOCsといった、より大きな細胞塊の除外は、ナイロンメッシュなどの濾布またはその他のフィルター材を通して細胞浮遊液を濾過することにより保証されている。フィルター材の目開きの寸法は、およそ、10、20、30、40、50、70または100μm、より好ましくは40μmである。KGFを埋め込んだコラーゲンIでコーティングした上に抗Notch1抗体にて11000ミリポア社の希釈率で処理した培養容器に、濾過後の非内分泌上皮細胞NEECsを、本来の細胞密度の、およそ、2334または45の細胞密度、より好ましくは34の細胞密度で播種する。特定のグループの抗Notch1抗体が、筋肉細胞の再生におけるNotch受容体の活性化を誘起することが知られている。この後、非内分泌上皮細胞NEECsを、01μMのアトルバスタチンを添加した改変無血清培地中にて増殖させた。この培地は、積極的に潜在的な内分泌前駆細胞を選択することが知られている。CRASMeneurら2009GenesDevelopment2320882101は、トランスジェニックマウスモデルを用いて次のことを示した。すなわち、γセクレターゼの触媒コアにおけるプレセニリン1及び2が、Notchシグナリングと、Ngn3陽性前駆細胞による内分泌特性の獲得とに必須であることを示した。プレセニリン1は、脳卒中後の神経細胞の再生中に、アトルバスタチンによりアップレギュレートされることが知られているChenetal2008Stroke39220226。したがって、本件発明者らは、内分泌前駆細胞を増加させるのに、上皮細胞のプール内にて、アトルバスタチンを用いた。但し、他のスタチンが同様の効果を生み出す可能性がある。非内分泌上皮細胞NEECsの培養にあたり、上記の無血清培地は、さらに、KGFについて、次の~のいずれか、または任意の組み合わせにより置き代えることができる。すなわち、10、15、20及びまたは30ngmlを含む濃度範囲のHGF、より好ましくは20ngmlのHGF、15、20、30、40及びまたは50ngmlを含む濃度範囲のEGF、より好ましくは40ngmlのEGF、及びまたは、2、4、6、8及びまたは10μMのrock阻害剤、より好ましくは4μMのrock阻害剤、により置き代えることができる。非内分泌上皮細胞NEECsの培養にあたり、上記の無血清培地には、さらに、次の及びの少なくとも一方を添加するで、非内分泌上皮細胞NEECsについて、後の分化時に内分泌細胞になる傾向を高めることができる。すなわち、001~10μM、より好ましくは003~03μM、例えば01μMのアトルバスタチン、及びまたは、10、15、20及びまたは30gmlのBMP、より好ましくは約20ngmlのBMP4またはBMP7を添加することで内分泌細胞になる傾向を高めることができる。解離した非内分泌上皮細胞NEECsを新たな培養容器に播種した後、残存細胞LOCsが入れられたトランスウェルインサートを、この培養容器の上方に配置することで、残存細胞LOCsから分泌される増殖促進性のパラクリン因子により、非内分泌上皮細胞NEECsの増殖が促進する。これらの培養系のいずれにおいても、培地は、非内分泌上皮細胞NEECsクローン性コロニーがかなりの数に増殖するまで、2~3日ごとに、約10、約20、約30、約40、約50または約60の調整培地で交換される。より好ましくは約40の調整培地で交換される。これらのクローンのコロニーが形成する細胞塊は、さらに富化を行うべく、採取して継代培養することができるものであり、このようにして、分化の際に組織複合体を生成する傾向を強めることができる。膵島内分泌細胞の成体前駆細胞の正確な分化系列については争いがあるDoretal2004Nature4294146Inadaetal2008PNAS1051991519919Xuetal2008Cell132197207。本件発明者らは、本発明に記載された培養条件のような一定のストレス状況下にて膵島内分泌細胞を生成することができる、成体前駆細胞が存在するとの見解を有している。いくつかの研究は、出生後の膵臓中における膵島前駆細胞と、外部ストレスを加えることによる生体中での内分泌細胞の再生とを示している。例えば、アロキサンまたはストレプトゾトシンなどの毒を投与したり、膵切除などの外科的処置を膵臓に施したり、膵管結さつ結紮と呼ばれる膵管を縛って止めることを行ったり、という外部ストレスを加える。最近、管結さつが、強力な膵臓の炎症及び細胞のアポトーシスを引き起こし、これに続いて、膵島前駆細胞集団の増殖が行われることが知られたXuetal2008。成体の膵臓中における前駆細胞の正確な組織位置の特定について、未だ解明がなされていないが、多くの研究は、前駆細胞細胞、膵管中及び/または腺房中心細胞中に存在する証拠を見出している。また、いくつかの他の研究は、前駆細胞が膵島中にも存在することを示している。最近、このような前駆細胞の特定のグループが、アルデヒドデヒドロゲナーゼの高い酵素活性を用いたaldefluorStemCellTechnologiesによりラベリングされ、従前に考えられていたよりも多量にあることが知られた。インスリン産生組織IPTsの生成に用いる他のグループの細胞は、血管内皮細胞VECsであり、これは、通常、膵島と膵臓の間葉組織との両方を、分岐する枝のように貫いている。この血管内皮細胞VECsも、接着性の細胞または組織を捕集するために膵廃棄組織を12~48時間浮遊培養した後に、収集した膵廃棄組織から分離することができる。血管内皮細胞VECsを含む細胞を短期間だけ増殖させた後、血管内皮細胞VECsを培養容器から剥離し、抗CD31抗体が結合した磁気ビーズMyltenyBiolgyIncを用いて純化する。純化した血管内皮細胞VECsについて、内皮細胞増殖サプリメントECGS、シグマアルドリッチ社を添加した血清含有培地中で、さらに増殖を行う。このような分離と培養の手法は、様々な組織や臓器の供給源からの血管内皮細胞VECsの培養を可能にする技術分野にて知られている。非内分泌上皮細胞NEECs及び血管内皮細胞VECsは、まず、インビトロで相異なる培地中にて別々に増殖させてから、球状組織の生成を促すカルシウムイオン1mMの存在下に非水平回転運動を加えて混ぜ合わせる。過剰量の細胞外カルシウムイオンは、隣接する細胞間の表面における、Eカドヘリン分子のホモタイプな結合を誘起し、これにより、球状の組織を形成することが知られている。カドヘリンといった細胞表面分子によるホモタイプな結合のみならず、ヘテロタイプな細胞間相互作用も、膵島の器官形成に決定的な役割を果たすことが知られている。非内分泌上皮細胞NEECsの役割、特には、膵島の初期の発生段階における役割について、注目すべきであるYoshitomiZaret2004Development131807817Lammertetal2001Science294564567。血管内皮細胞VECsが、隣接する細胞との相互作用に関連して果たす役割は、実に多面的であり、他の種類の細胞のためのニッチ専門用語では血管ニッチを形成するNikolovaetal2007TrendsinCellBiology171925。血管内皮細胞VECsは、接着、増殖及び諸機能を含む、隣接する細胞の生態作用についてサポートするための、細胞外マトリクスを分泌する。実際のところ、膵島の形態形成の期間中、膵内分泌前駆細胞は、特定の組み合わせのインテグリンによって、細胞外マトリクスに接着して移動するCirullietal2000JournalofCellBiology15014451458。β細胞が、成熟時にも自らの細胞外マトリクスを有しないため、複数のβ細胞の物理的な一体性は、隣接する血管内皮細胞VECsから分泌される細胞外マトリックスに依存していると推測される。膵島内分泌細胞は、成熟後、血管内皮細胞VECsと相互作用を行うが、この機構は、ガス及び/または栄養の交換以外のものであり得る。例えば、Johanssonら2006Endocrinology14723152324は、次のことを見出した。成熟した膵島細胞と、隣接する血管内皮細胞VECsとが、相互に増進作用を及ぼしあうのであり、血管内皮細胞VECsがHGFを分泌してベータ細胞の増殖と維持を促し、ベータ細胞がVEGFを分泌して血管内皮細胞VECsをサポートする。これらの研究は、いずれも、異なるタイプの細胞間における相互作用の重要性を示すものの、膵臓組織から分離した血管内皮細胞VECsが、成体膵前駆細胞についてインビトロでインスリン産生細胞へと分化するのを促進することは示していない。血管内皮細胞VECsが分泌する細胞外マトリクスに関連して、血管内皮細胞VECsとベータ細胞との間の細胞間相互作用が果たす役割を記載した研究報告が多数あり、いくつかの研究は、そのような細胞間相互作用が、膵島細胞の機能を向上させるのに用いうることを見出した。例えば、Powersら2005年、US20050048040A1は、一度解離した血管内皮細胞VECsを膵島と再結合させることで血管新生を増進させ、成熟したヒト膵島細胞の機能を増進させようと試みた。増殖因子及び細胞外マトリクスによる、成熟膵島細胞の機能の増進は、しばしば文献に記載されているが、成体膵前駆細胞がインスリン産生細胞にインビトロで分化するのを増進させることにつき、血管内皮細胞VECsとの細胞間相互作用と関連して示されたことはない。本発明においてインスリン産生組織IPTsをインビトロで生成させるにあたり、いくつかの他の研究において用いられていた浮遊培養方法を用いたOgataetal2004EndocrineJournal51381386Todorovetal2006。そして、得られた膵島様組織は、周囲の培地へと、より多量のインスリンを分泌した。また、本発明は、非水平回転運動培養法を用いて、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとの直接の接触を促進することで、効率的にインスリン産生組織IPTsを生成すべく、ホモタイプのみならずヘテロタイプの細胞間相互作用を増進させる。増殖または継代培養された非内分泌上皮細胞NEECsは、まず、培養容器から、細胞剥離酵素の1つであるアキュターゼInnovativeCellTechnologiesIncで処理することで剥離される。アキュターゼは、哺乳類の細胞に対する損傷が最小限であるものとして知られているものである。細胞を、リン酸塩緩衝液PBSで洗浄し、アキュターゼでオーバーフローさせ、室温で310分間インキュベートし、培地で希釈し、穏やかにピペッティングし、4分未満の間160ラGで遠心分離することで沈渣を得た。上澄みが除去され、細胞沈渣は、集められて、再度、インスリン産生組織IPTsを培養する培地に浮遊される。この培地は、20mMDグルコースを含むDMEMHamsF12に、2体積のウシ胎児血清FCSと、10mMのニコチンアミドと、01mMのアスコルビン酸と、表1に挙げられている成長因子及び増殖因子が添加されている。一方、血管内皮細胞VECsが、同様の方法により培養容器から剥離されるが、10~15分間インキュベートされ、5分間300ラGで遠心分離される。この後、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとが、浮遊状態で混ぜ合わされる。これらの割合は、それぞれ、959080または70と、51020または30であり、より好ましくは70と30である。浮遊液中の典型的な細胞密度は、01X10505X10510X10550X105及び100X105細胞mlのうちの任意の2つの値の間であり、より好ましくは50X105細胞mlである。超低接着性の6ウェルプレートCorningIncの各ウェルには、およそ0507510または15mlの上記浮遊液、特に好ましくは10mlの上記浮遊液が仕込まれる。細胞混合液が入れられたプレートには、さらに、1mMのCaCl2が添加される。そして、オービタルシェーカーに設置されて、101520または25回転/分より小さい回転スピードの非水平回転運動、好ましくは20回転/分の非水平回転運動が、37OC及び5CO2にて、18~24時間加えられる。この非水平回転運動によるインキュベーション期間の経過後、上記の細胞は、典型的には、直径100~200μmの球状組織を形成する。球状組織を形成したなら、CaCl2を含まない培地に完全に交換して、水平に静置する。培地は、約20日間の熟成期間の全期間にわたって、1~2日ごとに交換される。このような最後のインキュベーションステップの間に、このような球状の組織、すなわちインスリン産生組織IPTsのあるものは、融合してより大きな組織塊となり、これらの組織塊から、より小さな半透明の組織の芽が出てくる。このように形成された球状組織は、非内分泌上皮細胞NEECsのみより作られた球状組織に比べて、相当に、より平滑な表面テクスチャーを有し、また、組織の外側の膜が、より明確な境界を有している。非内分泌上皮細胞NEECsのみの培地は、球状組織から解離したと思われる小さな細胞塊によって汚染されやすい傾向にある。そのため、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとから作られた組織複合体は、物理的な一体性を維持しやすいが、非内分泌上皮細胞NEECsのみから作られた組織複合体は、より壊れやすい。これは、血管内皮細胞VECs、及び/または、これより分泌される細胞マトリクスが、組織複合体の物理的一体性を向上させているようである。非内分泌上皮細胞NEECs及び血管内皮細胞VECsのキャラクタリゼーションは、次のような方法で、ルーチン的に行われる。すなわち、RTPCR、免疫細胞化学的もしくは免疫組織化学的検査、及び、インビトロでのインスリン分泌の能力に関して、インスリンもしくはCペプチドELISA、などの方法によって行われる。Cペプチドの評価は、用いた培地がインスリンを基質として含み、このインスリンにより新しく分泌されたインスリンの定量化が難しい場合に行われる。理論的には、一つのインスリン産生細胞から、等モル量のCペプチドとインスリンとが生成されるのであるが、ELISAによる定量化によると、必ずしも、これら二つのタンパク質についての推定量は対応するものとならない。RTPCRによる遺伝子発現解析が、以下の方法で行われる。非内分泌上皮細胞NEECs及び血管内皮細胞VECsを培地から剥離してリン酸塩緩衝液PBSで洗浄し、回収した細胞または組織を、細胞溶解緩衝液中にて、1秒間に3~4回のパルスによって超音波処理する。全RNAは、RNeasyMiniKitQiagenIncにより抽出し、さらに、RNaseフリーのDNaseIセットQiagenIncにより精製して、存在しうるDNAのコンタミネーションを除去する。20ngの精製したRNAをテンプレートとして用いて、SuperScriptIIIInvitrogenInc及びランダムヘキサマーInvitrogenIncを用いたcDNAの合成を行う。得られたcDNAは、RNaseHで処理することで、存在しうるRNAのコンタミネーションを除去する。半定量的PCRを、HotStartTaqPCR反応混合物AmbionIncと、20ngのcDNAを用い、表2に示すプライマー、アニーリング温度、及びサイクル数にて行った。PCR生成物は、内部コントロールに対する指定生成物の分子サイズに関連した、DNAバンドの強度により定量する。免疫細胞化学的検査は、以下の方法で実行される。非内分泌上皮細胞NEECsは、各段の培地を用いて、コラーゲンIでコーティングしたスライドチャンバー上にて継代培養される。コラーゲンIでコーティングしたスライドチャンバーは、使用する前に、成長因子または抗体で前処理されている。細胞は、適切な密度に増殖すると、リン酸塩緩衝液PBSで3回洗浄し、冷メタノール中10分間の固定処理、または70エタノール中室温で30分間の固定処理を行い、空気乾燥させ、リン酸塩緩衝液PBSで洗浄し、ブロッキング溶液DakoIncでブロッキングした。この細胞を、一次抗体で染色し、01BSA、01Tween20及びリン酸塩緩衝液PBSを含む洗浄バッファーで洗浄し、二次抗体とともにインキュベートした。この後、ブロッキング溶液でDAPI染色し、VectraShieldを用いてマウントし、倒立蛍光顕微鏡で観察した。Ngn3を検出するための免疫細胞化学的検査のためには、培養した細胞を、4パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液中、室温10分間で固定処理し、固定処理を01グリシン溶液でクエンチする。02トリプシン溶液で細胞を処理することにより免疫学的エピトープを腑活化し、さらに、ブロッキング溶液と抗Ngn3抗体で処理する。生成されたインスリン産生組織IPTsのグルコース反応をテストするための静的なインキュベーションを行うには、約20膵島当量のインスリン産生組織IPTsまたは膵島1膵島イクイヴァレンツは、200μmの直径のインスリン産生組織を、U字型の底96ウェルプレートの各ウェルに、5mMグルコース入りのクレブス緩衝液200μLと共に仕込む。緩衝液を注意深くピペッティングにより新たなものに交換し、1時間、37°C、5CO2でキュベーションプレインキュベーションを行う。次いで、インスリン産生組織IPTsを、同様に、5mMグルコース入りのクレブス緩衝液200μLで洗浄し、2時間のインキュベーション低グルコースインキュベーションを行う。このインキュベーションの後、20mMグルコース入りの同様の緩衝液で数回洗浄し、2時間のインキュベーション高グルコースインキュベーションを行う。このインキュベーションの後、クレブス緩衝液を集め、分析までの間、30°Cで保存する。ELISAは、メーカーのプロトコルに従って行われる。20日間の熟成後に、生成したインスリン産生組織IPTsは、典型的には、自然膵島により産生させるインスリンの10までのインスリンを分泌し、また、適切な程度のグルコース反応性を有する。上記のような本発明の対象、及びその他の対象は、後述の実施形態の1つまたは複数により与えられる。本発明の一実施形態は、インビトロで非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとからなる組織複合体を生成することにより、インスリン産生組織IPTsの生成及び内分泌機能を増進させる方法を提供する。この方法は、所与の細胞源から、より多い量のインスリン産生組織IPTsを得ることを可能にするとともに、インスリン分泌に関する内分泌機能を増大させることを可能にする。インスリン産生組織IPTsの生成及び内分泌機能を増進させる他の一実施形態において、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとは、同一の、哺乳類の出生後の膵臓から分離したものでありうる。また、血管内皮細胞VECsは、他の体細胞種のものでありうる。非内分泌上皮細胞NEECsは、膵管及びまたは中心腺房細胞に属するが、インスリンその他の内分泌ホルモンを分泌しない細胞である。インスリン産生組織IPTsの生成及び内分泌機能を増進させる他の一実施形態において、非内分泌上皮細胞NEECsを、膵廃棄組織から、すなわち、膵臓を酵素的に分解してから膵島を取り出した残りの組織から得ることができる。本発明の一実施形態は、前記非内分泌上皮細胞NEECsをインビトロで培養する方法を与えるものであり、この方法には、02mgmlのラット尾由来コラーゲンIでコーティングし、1100と11000との間の範囲の濃度の抗Eカドヘリン抗体及び抗cMetHGF受容体抗体でコーティングした培養容器に、前記膵廃棄組織を、10体積のウシ胎児血清FCSが含まれるRPMI1640中にて、播種する細胞捕集ステップが含まれる。この膵廃棄組織は、好ましくは、24~36時間、約37°Cで約5CO2にて培養される。本発明の他の一実施形態は、前記非内分泌上皮細胞NEECsをインビトロで培養する方法を与えるものであり、この方法には、細胞捕集ステップでの培地について、以下のような無血清培地に交換して培養を行う、コロニー誘起ステップが含まれる。すなわち、1gLのITS5μgmlのインスリン、5μgmlのトランスフェリン、5ngmlの亜セレン酸ナトリウムと、20ngmlの組換えヒトFGF2と、1400Umlの組換えヒトLIFとを、7mMのDグルコース入りのDMEMHamsF12中に含む無血清培地に交換して、少なくとも24時間培養を行う。本発明のさらなる一実施形態、前記非内分泌上皮細胞NEECsをインビトロで培養する方法を与えるものであり、この方法には、コロニー誘起ステップでの培地について、以下のような別の無血清培地に交換して培養を行う、コロニー増殖ステップが含まれる。すなわち、1gLのITSと、02ウシ血清アルブミンBSAと、10mMのニコチンアミドと、10ngmlの組換えヒトKGFとを、7mMのDグルコース入りのDMEMHamsF12中に含む無血清培地に交換して、少なくとも5~7日間培養を行う。この培地には、好ましくは、培養の後の段階で、非内分泌上皮細胞NEECsの増殖を阻害しうる線維芽細胞の増殖を防ぐための002μMの2メルカプトエタノールと、起こりうるマイコプラズマ感染を防ぐためのマイコプラズマ除去剤とを含む。培地は、直径10~30マイクロメートルの範囲のサイズを有するNEECsのクローン性コロニーが、かなりの数出現するまで2~3日ごとに交換される。本発明の一実施形態は、非内分泌上皮細胞NEECsについて選択的増殖を行うべく継代培養する方法を与えるものであり、この方法には、組織消化酵素であるアキュターゼで処理することにより、培養容器から非内分泌上皮細胞NEECsを剥離する細胞剥離ステップが含まれる。剥離された細胞について、160×G以下にて、4分未満の間、遠心分離を行う。本発明の他の一実施形態は、非内分泌上皮細胞NEECsについて選択的増殖を行うべく継代培養する方法を与えるものであり、この方法には、先のステップにて剥離された細胞を、下記のような培養容器及び培地に播種して培養する培養ステップが含まれる。すなわち、1100~11000の最終濃度の抗Notch1抗体で前処理した他は先のステップと同一である培養容器に、01μMのアトルバスタチンを含む他は先のステップと同一である倍地中にて播種し、培養を行う。培地は、かなりの数の、非内分泌上皮細胞NEECsのクローン性コロニーが増殖するまで交換される。他の一実施形態においては、上記に代えて、コラーゲンコーティングがKGFまたは抗Notch1抗体を含まずに調製され、初期のコロニー増殖ステップ3の培地中のKGFが、10、15、20及び30ngmlのHGF、より好ましくは20ngmlのHGFと、10、15、20、30、40及び50ngmlのEGF、より好ましくは40ngmlのEGFと、2、4、8、14、20及び25μMのrock阻害剤、より好ましくは4μMのrock阻害剤とにより置きかえられる。001~10μM、より好ましくは003~03μM、例えば、01μMのアトルバスタチンと、10、15、20及び30ngml、より好ましくは20ngmlのBMP4またはBMP7とにより、非内分泌上皮細胞NEECsが、後の分化時に内分泌細胞になる傾向が高められている。本発明のさらなる一実施形態において、アキュターゼ処理により非内分泌上皮細胞NEECsが剥離された後に、培養容器に接着して残っている上皮細胞塊は、このことから残存細胞LOCsと呼ぶが、培養容器から、005トリプシンEDTAを用いた37°C5分間の処理で剥離され、無血清培地で洗浄され、トランスウェルに移され、そして、非内分泌上皮細胞NEECsの増殖をさせるために、培地に入れられる。本発明のさらなる一実施形態において、トランスウェル内の残存細胞LOCsと共に培養された非内分泌上皮細胞NEECsが、細胞クラスターを形成する。この細胞クラスターは、さらなる富化のために継代培養を行って、分化の際に組織複合体を形成する傾向を高めることができる。本発明の一実施形態において、培養された非内分泌上皮細胞NEECsは、次のような細胞により特徴付けられる。すなわち、オールトランス型レチノイン酸及びシクロパミンKAADで処理した際に、転写因子であるHes1と、Notchシグナルの下流ターゲットと、Ngn3とを発現し、これによって、インスリン産生細胞を生成可能な前駆細胞としての特長を示す細胞により特徴付けられる。血管内皮細胞VECsを分離して培養する方法の一実施形態は、血管内皮細胞VECsを、膵廃棄組織から分離するか、または、膵廃棄組織の培養系から収集した浮遊組織片から分離するステップを含む。この方法は、膵廃棄組織または浮遊組織片を、次のような培地及び培養容器に播種するものである。すなわち、655°Cで60~70分間の熱不活化を行った20体積のウシ胎児血清FCSと70~100μgmlのECGS内皮細胞増殖サプリメントとを含むRPMI1640中、18mgmlのラット尾由来コラーゲンIでコーティングした培養容器に播種するものである。非接着性の細胞及び組織を含む、この培地は、18時間の培養後に、新鮮な培地で交換される。血管内皮細胞VECsを分離して培養する方法の一実施形態において、血管内皮細胞VECsは、抗体結合マイクロビーズと、抗CD31抗体とを用いて純化することができ、その後、先のステップについて説明した手順により増殖させることができる。血管内皮細胞VECsを分離して培養する方法のさらなる一実施形態において、管内皮細胞VECsは、起こりうる免疫拒絶を減弱させる目的で、前記インスリン産生組織IPTsの移植を受けるレシピエントの組織に由来するか、または、非内分泌上皮細胞NEECsを分離したのと同一のドナー組織に由来する。本発明の一実施形態は、低接着性培養容器内にて、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとの組織複合体を生成する方法を提供する。ここで、これら2種類の細胞の混合比は、細胞数でそれぞれ、好ましくは、95、90、80または70と、5、10、20または30とになっている。組織複合体は、培養容器にゆっくりとした非水平回転運動を加えることで生成する。好ましくは、10、15、20、または25rpmより少ない回転数で、約37°Cで、5CO2などといったCO2富化条件下に、18~24時間、非水平回転運動を加えることで生成する。本発明の他の一実施形態は、次のような培地中で組織複合体を生成する方法を提供する。すなわち、DMEMHamsF12及び20mMのDグルコースを含む培地であって、2体積の胎児ウシ血清FCS、2ngmlのアクチビンA、5ngmlのベータセルリン、20ngmlのHGF、20ngmlのガストリン、20ngmlのIGF1、5ngmlのKGF、20ngmlのVEGF、20ngmlのBMP7、20ngmlのエキセンディン4、10mMのニコチンアミド、01mMのアスコルビン酸、及び、1mMのCaCl2が添加されている培地中にて、組織複合体を生成させるのであり、培養容器についての非水平回転運動を行う間に、インスリン産生細胞IPTsの球状クラスターが、この培地中に出現するまで、組織複合体を生成させる。本発明のさらなる一実施形態は、下記の点を除き同一の方法で組織複合体を熟成させる方法を提供する。すなわち、培養容器が水平に、運動することなく配置され、培地がCaCl2を含んでいない点を除くと同一の方法で熟成する。培地は、約20日間の全成熟期間中、1~2日ごとに交換される。本発明のさらなる一実施形態は、次の及びを含む方法を提供する。血管内皮細胞VECsが、培養容器に播種され、第4の好ましい実施形態に記載された培地中、ほぼコンフルエントな細胞単層を生成する。次いで、分離され純化された自然膵島から解離された細胞または細胞クラスターが、血管内皮細胞VECsの細胞単層の上に播種されて、膵島の細胞または細胞クラスターが増殖するのを促進させる。インスリン産生細胞IPTsを生成する方法についての本発明の一実施形態において、このようにして生成されたインスリン産生組織IPTsは、この方法を用いない場合よりも、より多数の組織を含む。インスリン産生細胞IPTsを生成する方法についての本発明の他の一実施形態において、このようにして生成されたインスリン産生組織IPTsは、この方法を用いない場合よりも、より多くのインスリンを産生する細胞を含む。インスリン産生細胞IPTsを生成する方法についての本発明の他の一実施形態において、このようにして生成されたインスリン産生組織IPTsの機能は、同種の自然膵島により産生されるインスリンの、5、10、40、60、80または100より少なく、例えば約10を分泌することを含む。インスリン産生細胞IPTsを生成する方法についての本発明の他の一実施形態において、このようにして生成されたインスリン産生組織IPTsの機能は、この方法を用いない場合よりも、インスリン分泌における、より高いグルコース応答性を含む。本発明のさらなる一実施形態において、分離されて純化された自然膵島から解離され、血管内皮細胞VECsの細胞単層の上に播種された細胞または細胞クラスターは、血管内皮細胞VECsを有しない基材に播種された場合に比べて、増殖が促進される。本発明のさらなる一実施形態において、培地に添加される抗生物質は、50~100Umlのペニシリン及び50~100μgmlのストレプトマイシンである。または、ストレプトマイシンを、50~100Umlのゲンタマイシンで置き換えてもよい。<定義>膵臓または膵の用語は、本技術分野において、哺乳類生物の腹腔内における脾臓と十二指腸の間に位置して内分泌及び外分泌の両方の器官として認識され、またそのような器官を指す。本願で用いられているように、膵島は、膵臓にある小さな組織塊であって、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド及びグレリンといった内分泌ホルモンを分泌するものを指す。本願で用いられているように、膵廃棄組織は、膵臓から膵島を除去した後に残った膵臓の組織を指す。臨床的な膵島移植において、膵島を収集すべく、ドナーの膵臓組織が、コラゲナーゼ分解、及び、これに続く一連の純化ステップによって処理され、膨大な量の膵廃棄組織が副産物として生み出される。この膵廃棄組織中に存在する膵島前駆細胞が糖尿病を治療するための細胞療法に用いうるのではないかということが、言われており、また試されている。本願で用いられているように、非内分泌上皮細胞NEECsは、出生後の哺乳動物の膵臓から分離された細胞であって、未だ内分泌機能を獲得していない前駆細胞を含む上皮細胞の大きなカテゴリ内の異種の細胞から構成されているものを指す。そのため、非内分泌上皮細胞NEECsは、インビトロでインスリン産生組織IPTを増殖させて生成することが可能な細胞を含む。非内分泌上皮細胞NEECsは、次の及びの少なくともいずれかである。膵臓の膵管に存在する可能性がある、かつ/または、Aldefluor陽性細胞として同定される中心腺房細胞と同義でありうる。本願で用いられているように、残存細胞LOCsは、しっかりと接着し合った細胞クラスターを形成する上皮細胞であって、非内分泌上皮細胞NEECsを継代培養のために培養容器から最初に剥離した後も残存する細胞のことをいう。これらの細胞は、本願記載の培養条件下で急速に増殖する。また、これらの細胞は、次の~の少なくともいずれかである。すなわち、中心腺房細胞の前駆細胞である、膵管細胞の前駆細胞である、かつ/または、脱分化して、膵管様、または膵管前駆細胞様の表現形質を有する。これらの細胞が、おそらくは何らかの未同定のパラクリン因子を分泌することによって、非内分泌上皮細胞NEECsの増殖を促進する。本願で用いられているように、血管内皮細胞VECsは、出生後の哺乳動物の膵臓から単離された血管内皮細胞を指す。血管内皮細胞VECsは、また、骨髄細胞または末梢血のいずれかから分離することができる。血管内皮細胞VECsは、非内分泌上皮細胞NEECsが分離されるのと同じドナーに由来するか、または、より好ましくはインスリン産生組織IPTsが移植される予定のレシピエントに由来する。本願で用いられているように、インスリン産生組織IPTsは、球状の組織複合体を形成する一群の細胞群であって、インビトロで生成可能な組織であり、インスリンを分泌可能であってその他の内分泌ホルモンも分泌可能でありうる内分泌組織として熟成することができるものを指す。本願で用いられているように、生成または生成するは、非内分泌上皮細胞NEECsとして分類されうる細胞が、インスリン産生組織IPTsの定義を満たすことができる組織複合体となる変化であるところの組織形成プロセスを指す。本願で用いられているように、前駆細胞は、本願に記載の条件下に、膵廃棄組織から選択的に培養されて、増殖及び継代培養を可能にしたものであり、膵内分泌細胞になる能力を有するものとして特徴づけられるとともに、オールトランス型レチノイン酸及びシクロパミンKAADでの処理により、Ngn3陽性細胞として同定しうるものを指す。本願で用いられているように、培養は、細胞、細胞のクラスター、組織複合体または自然膵島について、細胞の増殖または機能性組織の生成を可能にする環境条件にてインキュベーションを行うことにより、増殖または生育させることを指す。培養には、適切な増殖因子、マイトジェン、及びまたは分化因子を含む培地が必要である。これらは、培養を行う、細胞、細胞のクラスター、組織複合体または自然膵島について、一般に、増殖及びまたは熟成を向上させる。本願で用いられているように、組織複合体は、インスリン産生組織IPTsを生成する目的で得られた2つのグループの細胞の配合体である。組織複合体は、これら2つのグループの細胞を、所与の混合比で低接着性培養容器中に入れて、ゆっくりとした非水平回転運動を加えることで、形成される。組織複合体は、1mMのCaCl2を添加した本願記載の無血清培地中にて、インキュベーションを行うことができる。培地中のカルシウムイオンは、隣接する細胞間でカドヘリン分子を活性化し、これにより細胞間接着を促し、このようにして組織複合体を形成する。本発明の実際的な応用には、特にことわらない限り、当業者の技能の範囲内における、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学及び組換えDNAについての従来の技術を用いる。これらの技術は、文献に記載されており、例えば、以下に記載されている。BasicManualsforMolecularBiologyBook3TrulyAmplifyingPCR、CultureofAnimalCellsImmunocytochemicalMethodsandProtocolsVol115inMethodsinMolecularBiology、TheELISAGuidebookbyCrowther、MethodsinCellBiologyVol41FlowCytometry2ndEdedByDarzynkiewiczRobinsonandCrissman<実施例>以下の分析の結果を得るのに用いた実験手順の詳細は、対応する実施例に記載されている。グラフに示されているエラーバーは、下記の図の標準偏差を表す。図面の各写真画像は、カラー画像をグレースケール画像に変換したもの、またはRGB色を分離し、赤、緑、青のいずれかの色分解画像としたものである。<膵廃棄組織の収集>マウスの膵臓C57Bl6の摘出を、膵管内へと、20~25ml、01のコラゲナーゼS1新田ゼラチン社のHBSS溶液を投与した直後に行った。これらの膵臓について、HBSS中にて37°Cで20分間のインキュベーションを行い、氷上で冷却し、添加物を加えることなくRPMI1640インビトロジェン社10mlを加えて20秒間激しく振盪した。コラゲナーゼで分解した膵臓組織を、10mmのスチールメッシュに通すことで、大部分が脂肪と結合組織である、大きな廃棄組織塊を除去した。この除去の後、膵臓の溶出液は、50mlのRPMI1640を用い、4°Cで2分間250×Gで遠心することにより、3回洗浄した。得られた約1mlの沈殿組織について、MKyoto液大塚製薬株式会社とOptiprepAxisShieldPoCASOsloNorwayとの、密度を11gmlに調製した混合液15mlにより、50mlコニカルチューブ中にて再浮遊した。次いで、この浮遊液の上に、密度を1077gmlに調製した別の混合液15mlを静かに注いで層をなすようにし、さらに、5mlのRPMI1640を静かに注いで層をなすようにした。複数の層をなす浮遊液を、4°Cで20分間、400×Gで遠心分離した。大部分の膵島を含む中間の不透明な浮遊層を、慎重なピペット操作により除去し、実施例14における自然膵島細胞の増殖試験に用いた。残りの浮遊する細胞及び組織と、底部の組織片とについて、まとめて、膵廃棄組織と捉えて、細胞捕集ステップに供した。<非内分泌上皮細胞NEECsについての細胞捕集>膵廃棄組織について、50mlのRPMI1640を用い4°Cで2分間、250×Gで遠心分離することにより、2回洗浄を行った。そして、各膵廃棄組織を次のように播種した。すなわち、10の熱不活化ウシ胎児血清FCSHyCloneLaboratoriesIncとPenStrepとを含むRPMI1640中、6ウェルプレートまたは10cmディッシュGreinersIncに播種した。上記に代わる手順では、膵廃棄組織の組織塊について、アキュターゼInnovativeCellTechnologiesIncを用いて室温にて10分間で、さらに解離させる。ほぼ1つの膵臓からの膵消化組織塊を、各プレートまたはディッシュに播種した。非内分泌上皮細胞NEECsを捕集するためには、プレートまたはディッシュについて、予め、02~025mgmlのラット尾由来コラーゲンIBDBiosciencesを用いて室温で1時間コーティングしておき、さらに、抗マウスEカドヘリン抗体Clone36ECadherinBDBiosciences、及び/または、抗cMet抗体をすなわち、これら及びの少なくとも一方を、1100と11000との間の濃度範囲にて用い、室温で1時間コーティングを行った。組織の培養を、37°Cで5CO2にて、24~36時間行った。培養期間中、浮遊組織片を一度、培地と共に除去し、新鮮な血清含有培地を加えた。図1Aに示す顕微鏡写真は、このように得られた細胞であって、コラーゲンIでコーティングされたディッシュ表面に接着したままとなっている細胞について示す。これは、抗cMet抗体のみを、ディッシュ表面をコーティングする抗体として用いた場合のものである。図2Aは、このようにして得られた表面に接着している細胞の数についてのグラフである。これは、非内分泌上皮細胞NEECsの培養を、18~36時間、EカドヘリンEcad及びまたは抗cMetはcMet抗体の存在下、または、非存在下で行った場合のものである。二元配置分散分析TwowayANOVAによると、抗体処理間の効果は、F116n6groupp00003であり、18時間培養と36時間培養との間の効果は、F877n6groupp00001であった。<非内分泌上皮細胞NEECsのコロニー誘起>細胞捕集ステップの後、培地は、コーティングされた表面から、いくぶん大きい細胞塊が脱落することを可能にする非水平回転運動をプレートに加えてから、除去した。非内分泌上皮細胞NEECsのコロニー増殖を誘起すべく、培養系には、次のような無血清培地を加えた。すなわち、1gmlのITS最終濃度:インスリンが5μgml、トランスフェリンが5μgml、亜セレン酸ナトリウムが5ngml、02のウシ血清アルブミンBSASigmaAldrichCo、20ngmlの組換えヒトFGF2、及び1400Umlの組換えヒトLIF白血病抑制因子、10mMのDグルコースWakoChemicalsCo、PenStrep及びサイクリンB1RochePharmaceuticalIncを含有するDMEMHamsF12中に含まれる無血清培地を加えた。そして、組織の培養を、37°Cで5CO2にて、少なくとも24時間行った。図1Bは、このように誘起された細胞コロニーの顕微鏡画像を示す。比較のために、実施例1及び2と同様の処理手順、及び、上記誘起ステップを、同一の膵臓の膵管のみから得られた組織Ductaltissuesに対して行った。すなわち、比較のために、実施例1のように膵臓の全部分から得られた組織Alltissuesを用いる代わりに、このように行った。また、誘起ステップにてヒトFGF2を用いない他は同一である処理手順も行った。結果を図2Bに示す。二元配置分散分析TwowayANOVAによると、FGF2処理と非処理との間の効果は、F759n6groupp00001であり、膵管組織と全組織との間の効果は、F3380n6groupp00001であった。無血清培地を用いる、この誘起ステップにてFGF2を含む培地を用いる場合は、FGF2を含まない培地を用いる場合に比べて、より多くの非内分泌上皮細胞NEECsを産生した。また、膵廃棄組織の全体を用いる場合、播種前にピペット操作で選び取った膵管組織を用いる場合に比べて、より多くの非内分泌上皮細胞NEECsを産生した。<初期コロニー増殖>非内分泌上皮細胞NEECsのコロニーを増殖させるには、コロニーの誘起ステップ実施例3の後、無血清培地を、次のような別の無血清培地に置き換える。すなわち、1gLのITSインスリンが5μgml、トランスフェリンが5μgml、亜セレン酸ナトリウムが5ngml、02のウシ血清アルブミンBSA、10mMのニコチンアミド、及び10ngmlの組換えヒトKGFケラチノサイト増殖因子が、7mMのDグルコース、PenStrep、002μMの2メルカプトエタノール及びサイクリンB1を含有するDMEMHamsF1211混合物中に含まれる無血清培地に置き換え、2日間培養する図1C。次いで、培地には、サイクリンB1を含まず40が調整培地である培地による交換を、非内分泌上皮細胞NEECsのクローン性コロニーであって10~30μmの径範囲の大きさを有するものが、かなりの数だけ増殖するまで、2~7日間行った図1D。<非内分泌上皮細胞NEECsの継代培養と選択的増殖>実施例4の初期増殖ステップの後の非内分泌上皮細胞NEECsを、リン酸塩緩衝液PBSで2回洗浄し、室温で5分間アキュターゼ処理することにより、プレートから剥離した。剥離した細胞は、40μmのナイロンメッシュを通して濾過し、160×G以下で4分未満の間、遠心分離した。プレートに残っている細胞クラスター、すなわち残存細胞LOCsについては、別個の容器中にて同一の無血清培地でインキュベーションを続け、後に、実施例6におけるトランスウェルの培養系に用いた。細胞の沈殿について、01μMのアトルバスタチンLKTLaboratories社を添加した他は実施例4と同一である無血清培地を用いて再浮遊した。細胞及びこの浮遊培地を、実施例2と同様にラット尾由来コラーゲンIでコーティングされた、6ウェルプレート、10cmのディッシュ、または4ウェルのスライドチャンバーBiocoatCellwareBDLabwareに播種した。但し、プレートをコーティングするコーティング液は、10ngmlのKGFを含み、コーティングされた表面について、抗マウスNotch1抗体Clone8G10Milliporeで1100~11000の最終濃度にて、さらに処理したのであった。培地交換は、2~3日ごとに、40調整培地で、非内分泌上皮細胞NEECsのクローン性コロニーが、相当な数だけ現れるまで行った。比較実験は、抗マウスNotch1抗体を省いた点を除き、実施例1から、この直前の箇所にまで記載したのと同じ処理手順により行った。図2C独立t検定:n5group、P00001は、抗Notch1抗体で処理したコラーゲンIコーティング済みの培養容器に継代培養した場合AntiNotch1、及び、抗体処理していないコラーゲンIコーティング済みの培養容器に継代培養した場合Untreatedにおける、ブロモデオキシウリジン陽性Brdu細胞の割合を示す。免疫細胞化学的検査を、実施例4と同じ方法により行った。図4に示すように、増殖を示すBrdu陽性細胞の割合は、AntiNotch1で、Untreatedの約2倍となった。<改変無血清培地、及び、トランスウェルによる残存細胞LOCsを用いた非内分泌上皮細胞NEECsの培養>実施例5の選択的増殖の後の非内分泌上皮細胞NEECsを、コラーゲンIでコーティングした12ウェルトランスウェルプレートMillipore社へと、下記を含有する無血清培地中にて継代培養した。すなわち、10mMのDグルコースWakoChemicalsCo、PenStrep及び002μMの2メルカプトエタノールを含有するDMEMHamsF12中に、1gmlのITSインスリンが5μgml、トランスフェリンが5μgml、亜セレン酸ナトリウムが125ngmlと、02のウシ血清アルブミンBSAと、10mMのニコチンアミドと、20ngmlのHGFと、40ngmlのEGFと、20ngmlのBMP7と、4μMのrock阻害剤とが含まれる無血清培地中にて、残存細胞LOCsの塊を配置したトランスウェルインサートを吊り下げた状態で、3日間のインキュベーションを行った。トランスウェルインサートは、多孔性の底部を有する一種の容器であり、この底部が、トランスウェルプレートの底部の培養系を覆い、かつ離間されるように配置されたものである。次いで、顕微鏡画像を取得した。図31Aには、培養容器のコーティングされた表面上、すなわち、トランスウェルプレートの底部上下側コンパートメントにある非内分泌上皮細胞NEECsの顕微鏡画像を示す。また、図31Bには、トランスウェルインサート中、すなわち、トランスウェルインサートの底部上上側コンパートメントにある残存細胞LOCsの顕微鏡画像を示す。このように増殖した非内分泌上皮細胞NEECsが往々にして細胞クラスター図31A、矢印を形成し、この細胞クラスターは、1週間の期間で増殖して大きさが増加した図31C。図31A及び図31B中に矢印で示すように、下側コンパートメント中にある非内分泌上皮細胞NEECsのクラスターの位置と、上側のトランスウェルインサート中にある残存細胞LOCsのクラスター位置とが、ほぼ一致している。このことは、残存細胞LOCsにより分泌される何らかのパラクリン因子が、生理学的に、及び/または、細胞生物学的に、近傍にある非内分泌上皮細胞NEECsに影響を与えていることを示唆する。非内分泌上皮細胞NEECsを、このように残存細胞LOCsとともに増殖させると、残存細胞LOCsなしのコントロールに比べて、非内分泌上皮細胞NEECsクラスターの数が、顕著に増大した図32、独立t検定、n3groupstreatmentt00021。図33は、半定量的RTPCRにより評価した、これらの細胞からの、Pdx1及びIns1のmRNA発現を示す。残存細胞LOCsが、自然膵島よりも、さらに強度の大きい、Pdx1の強いシグナルを示した。一方、非内分泌上皮細胞NEECsは、せいぜい中程度のシグナルを示した。これとは対照的に、分化の際、残存細胞LOCsは、非内分泌上皮細胞NEECsと異なり、Ins1のシグナルを示さなかった。なお、インサート中の残存細胞LOCsとともに培養した非内分泌上皮細胞NEECsNEECsLOCは、残存細胞LOCsなしに培養した非内分泌上皮細胞NEECsNEECsLOCに比べて、強度の大きいIns1のシグナル示した。<インスリン産生細胞に分化する前駆細胞について富化した非内分泌上皮細胞NEECsの培養>実施例5の選択的増殖の後の非内分泌上皮細胞NEECsは、コラーゲンIでコーティングしたスライドチャンバーBiocoatCellwareBDLabware上へと継代培養し、01μMのアトルバスタチンATSを含む他は実施例4と同一の無血清培地中にて、5日間インキュベーションを行った。Controlコントロールでは、アトルバスタチンATSを省いたので、実施例4と全く同一の培地を用いた。次いで、これらの細胞は、次のような培地に交換することで、3日間、分化を誘起した。すなわち、DMEMHamsF12に、20mMのDグルコース、2体積のウシ胎児血清FCS、2ngmlのアクチビンA、5ngmlのベータセルリン、20ngmlのHGF、20ngmlのガストリン、20ngmlのIGF1、5ngmlのKGF、20ngmlのBMP7、20ngmlのVEGF、20ngmlのエキセンディン4、10mMのニコチンアミド及び01mMアスコルビン酸を含む培地に交換して分化を誘起した。免疫細胞化学的検査のために、細胞を冷メタノールで固定し、室温で1時間ブロッキング溶液DakoASのペルオキシダーゼブロッキング試薬、過酸化水素及び15mMアジ化ナトリウムを含む。でブロッキングした。そして、抗インスリン抗体MilliporeInternationalIncLinco401101F1400により室温で30分間処理し、ブロッキング溶液で洗浄し、Cy3結合二次抗体抗モルモットIgG1800で処理した。核をDAPIで染色し、スライドをVectraShieldVectorLaboratoriesの退色防止剤溶液の商品名を用いてマウントし、蛍光顕微鏡で観察した図4A。インスリン陽性細胞の割合は、所与の観測フィールド内にて、細胞のトータルの数を表すDAPI染色核の数を基準に算出した図4B。図4Bに示すように、インスリン陽性細胞の割合は、アトルバスタチンATSで処理した細胞の場合に、処理しなかった場合よりも、著しく大きかった独立t検定n7groupp00001。<非内分泌上皮細胞NEECsについての、インスリン産生組織IPTsを生成可能な前駆細胞としての特定>実施例7の富化及び分化の後の非内分泌上皮細胞NEECsを、コラーゲンIでコーティングしたスライドチャンバーBiocoatCellwareBDLabware中へと継代培養し、少なくとも24時間のインキュベーションを行った。この際、2μMのオールトランスレチノイン酸和光ケミカルと025μMのシクロパミンKAADMerkLtdとを培地中に含む条件、及び含まない条件にて行った。また、培地には、KGFもアトルバスタチンも含まない他は実施例4で用いたと同じ無血清培地を用いた。インキュベーション後、非内分泌上皮細胞NEECsを、免疫細胞化学的な分析に供した。非内分泌上皮細胞NEECsを、pH74のリン酸塩緩衝液PBSに溶かした4パラホルムアルデヒド和光ケミカルでもって、室温にて30分間で固定した。そして、固定剤を、リン酸塩緩衝液PBSに溶かした100mMグリシンでクエンチした。免疫エピトープは、005のトリプシンを溶かした1塩化カルシウム溶液にて、37°Cで10分間処理することにより、明らかにした。スライド上の細胞を、ブロッキング溶液DakoIncのペルオキシダーゼブロッキング試薬と、抗Ngn3抗体MilliporeInternationalIncAB56844001と、FITCフルオレセインイソチオシアネート標識二次抗体で処理した8001。次いで、蛍光顕微鏡により観察した図5A。免疫細胞化学的画像は、AdobePhotoshopバージョン6での色変換により分析し、任意に選ばれた閾値レベルを超える色彩強度を示す細胞につきNgn3陽性であるとした。このようにして得られた、非内分泌上皮細胞NEECs中におけるNgn3陽性の細胞の割合を図5Bに示す。オールトランス型レチノイン酸及びシクロパミンKAADCyclKRAで処理された非内分泌上皮細胞NEECsは、これらによる処理を行わなかったものContrrolに比べて、Ngn3陽性細胞の割合が著しく高かったn3、p00001独立t検定。<遺伝子発現解析>C57Bl6マウスから分離した自然膵島並びに膵島内分泌前駆細胞及びインスリン産生組織IPTsに関連したmRNA発現につきキャラクタリゼーションを行うべく、半定量的RTPCRを行ったNgn3Pdx1NeuroDPtf1aNotch1Hes1HNF6Nkx61Ins1及びIns2。全RNAは、10×105個の細胞から、RNeasyMiniKitQiagenIncにより抽出した。存在しうるDNAコンタミネーションは、RNasefreeDNaseISetにより除去した。逆転写を、20ngのRNAでSuperScriptIIIInvitrogenInc及びランダムプライマーInvitrogenIncを用いて行い、合成されたcDNAは、RNaseHWakoChemicalsCoで処理して、RNAコンタミネーションを除去した。PCRを、20ngのcDNAでHotStartTaqMasterMixを用い、表2に挙げた所定のプライマーのペア、アニーリング温度及びサイクル数にて行った。増幅したPCR生成物を、2アガロースゲル及び0001エチジウムブロマイドを用いたゲル電気泳動により分析した図6A、6B、9A9C。図6a~6B中、1~4の番号は、分析に用いた組織または細胞培養のサンプルを示す。1は、実施例1の膵廃棄組織である。2は、実施例7における、アトルバスタチンATSで5日間、無血清培地で培養した後の非内分泌上皮細胞NEECsである。3は、この後、オールトランス型レチノイン酸及びシクロパミン実施例8におけるKAADを含む培地で24時間培養した、実施例8の非内分泌上皮細胞NEECsである図5A~5BのCYCLKRA。4は、3の培養系のコントロール、すなわち、実施例8及び図5A~5BのControlコントロールとしての非内分泌上皮細胞NEECsである。図6A~6B中の矢印は、Ngn3とHes1の発現が、見かけ上、同時となっていることを強調して示す。このことは、継代培養された細胞集団が、内分泌前駆細胞を生成するにあたり、わずかに異なる時間経過を取ることを示す。<血管内皮細胞VECs>実施例2における膵廃棄組織の培養系から除去された浮遊組織片を、18mgmlのラット尾由来コラーゲンIをコーティングした24ウェルプレートに、100μgmlのECGS内皮細胞増殖サプリメントと、655°Cにて60~70分間の熱不活化が施された胎児ウシ血清FCS20体積とを含むRPMI1640培地とともに、播種した。18時間培養後の非接着性の組織片を除去し、リン酸塩緩衝液PBSでざっと洗浄してから、01体積のファンギゾンSigmaAldrichCoを含む新鮮な培地で交換し、7~10日間培養した。次いで、細胞をアキュターゼ処理によって剥離し、浮遊する細胞を、抗体結合磁性マイクロビーズMiltenyiBiotecInc及び抗CD31抗体PharmingenCoにより純化した。細胞溶出液は、細胞が直前に記載のごとく剥離したのと同一の培地にて、コラーゲンIをコーティングしたT25フラスコCorningInc中にて培養した。このように得られた細胞VECsの浮遊液の画像を図71Aに示す。<組織複合体の生成>実施例7の富化及び分化の後の非内分泌上皮細胞NEECsと、実施例10の培養の後の血管内皮細胞VECsとを、それぞれの培養容器の表面からアキュターゼ処理によって剥離し、細胞数での比率が、それぞれ、955、9010、8020及び7030となるように、混合した。図71B~71D及び72は、混合比を8020とした場合の結果を示す。この混合比は、組織複合体の機能を増大させるとともに、非内分泌上皮細胞NEECsの比率をあまり下げないという観点から、最適であるように思われる。細胞混合物浮遊液を、超低接着性6ウェルプレートCostar3471CorningIncに、組織生成培地とともに播種した図71B。この培地は、DMEMHamsF12と、20mMのDグルコースと、2体積のウシ胎児血清FCSと、2ngmlのアクチビンAと、5ngmlのベータセルリンと、20ngmlのHGFと、20ngmlのガストリンと、20ngmlのIGF1と、5ngmlのKGFと、20ngmlのBMP7と、20ngmlのVEGFと、20ngmlのエキセンディン4と、10mMのニコチンアミドと、01mMアスコルビン酸と、1mMのCaCl2を含む。細胞混合物の浮遊液には、ゆっくりとした非水平回転運動が約20回転分にて、37°C、5CO2で、18~24時間、インスリン産生組織IPTsの球状のクラスターが生成される図71Cまで加えられた。インスリン産生組織IPTsの熟成を、培地にCaCl2が含まれず、培養容器を動かさずに水平に置く点を除き、上記球状クラスターの生成と同一の方法で行った。培地は、約20日間の熟成の全期間にわたって、1~2日ごとに交換した図71D。図71の画像C及びDから知られるように、インスリン産生組織IPTsの熟成が進むにともない、一部のインスリン産生組織IPTsは融合して、より大きな組織塊を形成するとともに、より小さな組織部分が出芽している。比較のためには、実施例7の富化及び分化の後の非内分泌上皮細胞NEECsについて、血管内皮細胞VECsと混合することなく、上記の培養に供した。非内分泌上皮細胞NEECsのみ、または、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとの組織複合体から生成した、100~200μmの径のインスリン産生組織IPTsの数を計測し、図72に示す独立t検定n3p00001。図72から知られるように、組織複合体から生成したインスリン産生組織IPTsの数は、非内分泌上皮細胞NEECsのみから生成した場合の3倍より多かった。<インスリン産生組織IPTsのキャラクタリゼーション>実施例11の熟成期間後のインスリン産生組織IPTsについて、計数及び径の測定を行い、これにより膵島イクイヴァレンツIEQsを算出することで、組織の生産性を評価した。1膵島イクイヴァレンツIEQは、約200μmの径の球状の組織IPTに相当する。この計算は、インスリン産生組織IPTsの体積に基づいており、この体積は、得られたインスリン産生組織IPTsの数を表す膵島イクイヴァレンツIEQsに置き換えて捉えられる図72。組織の評価は、標準的な免疫組織化学的手法により、インスリン陽性細胞の相対的な比率についても行った。インスリン産生組織IPTsの固定を、リン酸緩衝液に溶かした4パラホルムアルデヒド液により4°Cで18時間行った。固定されたインスリン産生組織IPTsを、リン酸緩衝液中4°Cで18時間洗浄し、2アガロース中に埋め込み、一連のアルコール液で脱水し、キシレンで置換し、パラフィン中に埋め込んだ。4μmのパラフィン切片について、ガラススライド上にてワックス除去を行い、一連のアルコール液及びリン酸緩衝液で、再度含水状態とした。インスリン産生組織IPTsの切片について、ブロッキング溶液で室温にて1時間ブロッキングを行い、抗インスリン抗体MilliporeInternationalIncLinco401101F1400で処理し、ブロッキング溶液で洗浄し、Cy3結合二次抗体AntiGuineaPigIgG1800で処理した。核をDAPIで染色し、スライドをVectraShieldでマウントし、倒立蛍光顕微鏡で観察した図81。インスリン産生組織IPTsの4μmパラフィン切片を、抗インスリン抗体及びCy3標識二次抗体で染色した。図81のサイズバーは30μmを表す。インスリン陽性細胞の割合について、所与の観測領域でのトータルの細胞数を示す、DAPIで染色された核の数に対する割合として算出した図82。図82に示すように、組織複合体から生成したインスリン産生組織IPTsは、非内分泌上皮細胞NEECsのみから生成したものに比べて、より多くのインスリン陽性細胞を含んでいたn5独立t検定p0001。組織複合体から生成したインスリン産生組織IPTsと、非内分泌上皮細胞NEECsのみから生成したインスリン産生組織IPTsとをさらに比較するために、半定量的PCRにより増幅したインスリンmRNA発現について測定した。図9Aはこのようにして得られた画像を示す。この図で、MはDNAサイズマーカーを表し、自然膵島のパターンも示されている。図9Bは、Insulin1Ins1の相対発現強度を示すペアt検定Ins1n5p00001。また、図9Cは、Insulin2Ins2についての同様の相対発現強度を示すペアt検定Ins2n4p00001。図9B及び9Cから知られるように、組織複合体から生成したインスリン産生組織IPTsは、非内分泌上皮細胞NEECsのみから生成したものに比べて、insulin1Ins1及びinsulin2Ins2のいずれについても、より大きい相対発現強度を示した。<インスリン分泌機能の評価>インスリン分泌機能をグルコース刺激法で評価した。実施例11で得られた20日間の熟成後のインスリン産生組織IPTsにおける約20膵島イクイヴァレンツIEQsを、次のようにプレインキュベートした。すなわち、01のウシ血清アルブミンBSA、10mMのHepes、PenStrep及び5mMのDグルコースを添加した低濃度グルコース溶液とした200μLのクレブスリンゲル液を用い、U字形底の96ウェルプレートNalgeneNuncInternationalKK中にて、37°Cで5CO2にて2時間プレインキュベートした。20膵島イクイヴァレンツIEQsの自然膵島BALBcマウスについてもプレインキュベートしたが、実験条件に順応させるべく、グルコース刺激の前に一晩18時間プレインキュベート。クレブスリンゲル液を注意深く除去し、2~3回洗浄し、同量の新鮮な溶液を仕込んでから、37°Cで5CO2にて2時間インキュベートした。インキュベーション後、150μLの低グルコース溶液をウェルから採取し、後の分析のために、30°Cで保存した。そして、インスリン産生組織IPTsについて、2~3回洗浄し、20mMのDグルコースを含む点を除き上記のとおりの同量の新鮮なリンゲル液高濃度グルコース溶液を仕込み、37°Cで5CO2にて2時間インキュベートした。次いで、150μLの高濃度グルコース溶液をウェルから採取し、後の分析のために、30°Cで保存した。採取したリンゲル液を、解凍し、ざっと遠心分離することで各サンプルから50μLを取り、機器メーカーの指示にしたがい、ELISAによるCペプチドアッセイ図10A、または、ELISAによるインスリンアッセイ図10Bを行った。この組織について、実施例9と同様にRTPCRを行うことで、Ins1及びIns2の検査を行った。この検査は、自然膵島について、熟成及び機能の状態を評価するのにルーチン的に用いられるものである。図10Aに示すように、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとの組織複合体から生成したインスリン産生組織IPTsは、グルコース濃度が増大した際に、Cペプチドの分泌において、より高いグルコース応答性を示した二元配置分散分析:効果NEEC単独vsNEECsVECsF197n5p00004。効果低グルコース濃度vs高グルコース濃度F57n5p00295。さらに、図10Bに示すように、非内分泌上皮細胞NEECsと血管内皮細胞VECsとの組織複合体から生成したインスリン産生組織IPTsは、自然膵島BALBcマウスが分泌するインスリン量の、110~12のインスリンを分泌したが、少なくとも実験を行った条件において、グルコース応答性が、自然膵島よりも高かった二元配置分散分析:効果IPTsvs自然膵島F117978n4グループn3グループp00001。効果低グルコース濃度vs高グルコース濃度F12232p00001。<血管内皮細胞VECsの細胞単層上での膵島細胞の培養>実施例1に記載したようにC57Bl6マウスから自然膵島を分離し、自然膵島を、アキュターゼ存在下に室温で10分間のインキュベーションを行うことにより、解離させた。これらの細胞を、02mgmlの増殖因子低減マトリゲルBDBiosciencesでコーティングしたスライドチャンバー、または、実施例10で得られた血管内皮細胞VECsが培養されて細胞単層が形成されたスライドチャンバーに播種した。膵島細胞を、10のウシ胎児血清FCS及びPenStrep5050を含むRPMI1640中にて2日間培養し図111、培養の最後の30分間には10μMのブロモデオキシウリジンBrduで刺激を加えた。免疫細胞化学的検査のために、70エタノールで室温にて30分間で固定処理を行った後、実施例7と同様のインスリン染色の操作手順を行った図112。リン酸塩緩衝液で洗浄した後、細胞の染色を、抗Brduの一次抗体CloneIIB5SantaCruzBiotechnologyInc及び二次抗体goatantimouseIgGFITCSantaCruzBiotechnologyIncを用いて、それぞれ1200及び1400の希釈率にて行った。実施例7におけると同様に蛍光画像を観察した図112。図112に示す一連の免疫細胞化学的画像は、チャンバースライド上の血管内皮細胞VECs膵島の細胞単層の上に播種した膵島A、B及びC、及び、チャンバースライドのコーティングされた表面の上に播種した膵島D、E及びFについてのものである。図112において、A及びDはDAPI、B及びEは抗インスリンCy3、C及びFは抗BrdUFITCのものである。図113のグラフは、膵島を血管内皮細胞VECs上で増殖させた場合に、マトリゲルを用いた場合よりも、ブロモデオキシウリジン陽性細胞BrdU細胞が著しく多いことを示す独立スチューデント検定:t657n8グループp00001。<インスリン産生組織IPTsのインビボでの機能評価>生後9~14週の同性で同一系統のマウスを、実施例11の熟成後のインスリン産生細胞IPTsを移植するレシピエントに用いた一晩絶食させたマウスに、ストレプトゾトシン110~150mgkg体重を腹腔内に注入することによって、糖尿病にさせ、血糖値の測定を、注射後4日目、及び、その後の2~5日ごとに行った。血糖値が2日間連続で400mgdlを超えた場合に、糖尿病であると考えた。麻酔中の糖尿病マウスの腹側部腹膜を外科的に切開し、一方の腎被膜下に700~1000膵島イクイヴァレンツIEQsのインスリン産生細胞IPTsを移植した。もう一方の腎臓は、処置を行わず、そのままとした。切開口は、マウスの麻酔を解除する前に、二重閉鎖技法により閉鎖した。手術を行ったマウスについての経過の追跡を、AccuChekActiveRocheDiagnosticsIncによる血糖値の測定及び体重測定により50日間行った図12A。図12Aは、700膵島イクイヴァレンツIEQsのインスリン産生細胞IPTsを移植した糖尿病マウスについて測定された血糖値の変化を示す。ここで、インスリン産生細胞IPTsは、同一系統のドナーマウスの膵組織から生成されたものであり、腎被膜下に移植した。日数0は移植の日を示す。400mgdlを超える血糖値は高血糖性糖尿病性であり、200mgdlより低い血糖値は正常血糖性非糖尿病性であって正常である。移植を受けたマウスは、最初の2週間で血糖値の低下を示した。インスリン産生細胞IPTsが移植された腎臓について、インスリン陽性細胞局在を免疫組織化学的に実施例12で検査したところ、インスリン陽性細胞クラスターが腎被膜下に明瞭に視認可能であった。