"以下のa又はbのタンパク質。aフォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ、ルシオララテラリス、ホタリアパロウラ、ピロフォラスプラギオフタラマス、ラムピリスノクチルカ又はフォティナスペンシランヴァニカの1つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの232位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの234位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの234位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの234位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、baのタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの232位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの234位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの234位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの234位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。以下のa又はbのタンパク質。aフォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ、ルシオララテラリス、ホタリアパロウラ、ピロフォラスプラギオフタラマス、ラムピリスノクチルカ又はフォティナスペンシランヴァニカの1つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの295位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの297位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの297位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの297位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、baのタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの295位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの297位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの297位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの297位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。以下のa又はbのタンパク質。aフォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ、ルシオララテラリス、ホタリアパロウラ、ピロフォラスプラギオフタラマス、ラムピリスノクチルカ又はフォティナスペンシランヴァニカの1つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの14位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの16位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの17位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの17位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、baのタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの14位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの16位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの17位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの17位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。以下のa又はbのタンパク質。aフォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ、ルシオララテラリス、ホタリアパロウラ、ピロフォラスプラギオフタラマス、ラムピリスノクチルカ又はフォティナスペンシランヴァニカの1つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの35位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの37位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの38位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの38位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、baのタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの35位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの37位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの38位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの38位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。以下のa又はbのタンパク質。aフォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ、ルシオララテラリス、ホタリアパロウラ、ピロフォラスプラギオフタラマス、ラムピリスノクチルカ又はフォティナスペンシランヴァニカの1つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの105位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの106位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの107位、ルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの107位又はルシオララテラリス遺伝子に由来する野生型ルシフェラーゼの108位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、baのタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの105位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの106位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの107位、ルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの107位又はルシオララテラリス遺伝子に由来する野生型ルシフェラーゼの108位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。以下のa又はbのタンパク質。aフォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ、ルシオララテラリス、ホタリアパロウラ、ピロフォラスプラギオフタラマス、ラムピリスノクチルカ又はフォティナスペンシランヴァニカの1つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの234位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの236位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの236位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの236位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、baのタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの234位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの236位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの236位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの236位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。以下のa又はbのタンパク質。aフォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ、ルシオララテラリス、ホタリアパロウラ、ピロフォラスプラギオフタラマス、ラムピリスノクチルカ又はフォティナスペンシランヴァニカの1つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの420位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの422位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの422位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの422位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、baのタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの420位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの422位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの422位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの422位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。以下のa又はbのタンパク質。aフォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ、ルシオララテラリス、ホタリアパロウラ、ピロフォラスプラギオフタラマス、ラムピリスノクチルカ又はフォティナスペンシランヴァニカの1つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの310位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの312位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの312位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの312位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、baのタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、フォティナスピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの310位、ルシオラミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの312位、ルシオラクルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの312位又はルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの312位のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。フォティナスピラリス由来の野生型ルシフェラーゼに由来する、請求項1~8のいずれか1項に記載のタンパク質。請求項9に記載のタンパク質であって、フォティナスピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも60の類似性を有する、タンパク質。請求項9に記載のタンパク質であって、フォティナスピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも70の類似性を有する、タンパク質。請求項9に記載のタンパク質であって、フォティナスピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも80の類似性を有する、タンパク質。請求項9に記載のタンパク質であって、フォティナスピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも90の類似性を有する、タンパク質。フォティナスピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの354位、又はルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの356位のアミノ酸に対応するアミノ酸がグルタメート以外のアミノ酸に変異している、請求項1~8のいずれかに記載のタンパク質。フォティナスピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの354位、又はルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの356位のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジン又はアルギニンに変異している、請求項14に記載のタンパク質。フォティナスピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの215位、又はルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの217位のアミノ酸に対応するアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異している、請求項1~8のいずれかに記載のタンパク質。フォティナスピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの215位、又はルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの217位のアミノ酸に対応するアミノ酸がイソロイシン、ロイシン又はバリンに変異している、請求項16に記載のタンパク質。請求項1~17のいずれかに記載のルシフェラーゼをコードする核酸。請求項18に記載の核酸を含むベクター。請求項19に記載のベクターで形質転換した細胞。原核細胞である、請求項20に記載の細胞。請求項1~17のいずれかに記載のタンパク質の生物発光アッセイにおける使用。請求項1~17のいずれかに記載のタンパク質を含むキット。本件出願人は、増加した熱安定性をもたらし、かつ当該技術分野において既知の変異体を補完する更なる変異体を見いだした。本発明は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス、ホタリアパロウラHotariaparoula、ピロフォラスプラギオフタラマスPyrophorusplagiophthalamus、ラムピリスノクチルカ、ピロコエリアナヤコPyrocoelianayako、フォティナスペンシランヴァニカPhotinuspennsylanvanica又はフィリキソシックス由来のルシフェラーゼと少なくとも60の類似性を有するタンパク質であって、前記酵素の配列において、aフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基214又はルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基216に対応するアミノ酸残基、bフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基232又はルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基234に対応するアミノ酸残基、cフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基295又はルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基297に対応するアミノ酸残基、dフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基14、ルシオラミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基16、又はルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基17に対応するアミノ酸残基、eフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基35、ルシオラミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基37、又はルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基38に対応するアミノ酸残基、fフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基105、ルシオラミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基106、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基107、又はルシオララテラリス遺伝子由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基108に対応するアミノ酸残基、gフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基234又はルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基236に対応するアミノ酸残基、hフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基420又はルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基422に対応するアミノ酸残基、iフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基310又はルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリスのアミノ酸残基312に対応するアミノ酸残基、のなかの少なくとも1つが対応の野生型配列において現れるアミノ酸とは異なるものであり、かつ、前記ルシフェラーゼ酵素は、当該部位に特定種の対応野生型ルシフェラーゼのアミノ酸を有する酵素と比較して増加した熱安定性を有することを特徴とする酵素を提供する。好ましくは、前記タンパク質はルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス、ホタリアパロウラ、ピロフォラスプラギオフタラマス、ラムピリスノクチルカ、ピロコエリアナヤコ又はフォティナスペンシランヴァニカ由来のルシフェラーゼと少なくとも60の類似性を有している。特に、前記タンパク質は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、野生型ルシフェラーゼの配列、例えばフォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス、ホタリアパロウラ、ピロフォラスプラギオフタラマスグリーン-LucGR、ピロフォラスプラギオフタラマスイエローグリーンLucYG、ピロフォラスプラギオフタラマスイエロー-LucYE、ピロフォラスプラギオフタラマスオレンジ-LucOR、ラムピリスノクチルカ、ピロコエリアナヤコ、フォティナスペンシランヴァニカLY、フォティナスペンシランヴァニカKW、フォティナスペンシランヴァニカJ19又はフィリキソシックスグリーンPvGR若しくはレッドPhREの配列を実質的に有する。但し、前記タンパク質は、野生型酵素のアミノ酸とは異なるように操作された1以上、例えば100までのアミノ酸残基、好ましくはせいぜい50、より好ましくはせいぜい30のアミノ酸を含んでいてもよい。特に、基質D-ルシフェリン4,5-ジヒドロ-2-[6-ヒドロキシ-2-ベンゾチアゾリル]-4-チアゾールカルボン酸を使用して光放射を生じることができる種に由来する生物発光酵素は、本発明の変異体酵素の基礎を形成するだろう。実施例によると、本発明のルシフェラーゼは、フォティナスピラリスのルシフェラーゼ配列を実質的に有し、かつ、以下の変化のうちの少なくとも1つを有している。aフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基214に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外のアミノ酸残基に変化している、bフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基232に対応するアミノ酸残基がイソロイシン以外に変化している、cフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基295に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外に変化している、dフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基14に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外に変化している、eフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基35に対応するアミノ酸残基がロイシン以外に変化している、fフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基105に対応するアミノ酸残基がアラニン以外に変化している、gフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基234に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸以外に変化している、hフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基420に対応するアミノ酸残基がセリン以外に変化している、iフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基310に対応するアミノ酸残基がヒスチジン以外に変化している。本発明のタンパク質がルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来酵素の配列を実質的に有する場合、以下の変化のうちの少なくとも1つを有する。aルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基216に対応するアミノ酸残基が、ルシオラミングレリカを基礎とする配列ではグリシン以外であり、又は、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリスを基礎とする配列ではアスパラギン以外である。bルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基234に対応するアミノ酸残基がセリン以外である。cルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基297に対応するアミノ酸残基がロイシン以外である。dルシオラミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基16又はルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基17に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外である。eルシオラミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基37又はルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基38に対応するアミノ酸残基がリジン以外である。fルシオラミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基106に対応するアミノ酸残基、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基107に対応するアミノ酸残基、又は、ルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基108に対応するアミノ酸残基がグリシン以外である。gルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基236に対応するアミノ酸残基がグリシン以外である。hルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基422に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外である。iルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基312に対応するアミノ酸残基が、ルシオラミングレリカを基本とする配列ではスレオニン以外であり、又は、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリスを基本とする配列ではバリン以外である。熱安定性を増強させる全ての場合における特定の置換アミノ酸は、以下に説明されるようなルーチンの方法により決定することができる。それぞれの場合において、異なる置換が熱安定性の増強を引き起こすだろう。当業者に理解されるように、置換は、天然又は適切な変異体タンパク質をコードするDNAの部位特異的突然変異誘発により行うことができるだろう。この場合において本発明は熱安定性と関連するタンパク質の同定と関連する。しかしながら、一般的には、野生型のアミノ酸とは異なる性質を有するアミノ酸で置換することを考慮することが好ましい。したがって、ある場合においては、親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基逆も又同様で好ましく置換するだろう。同様に、酸性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基で置換するだろう。例えば、本発明のタンパク質は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来のルシフェラーゼ酵素と少なくとも60の類似性を有し、その配列内に以下の変化のうち少なくとも1つを有し、野生型ルシフェラーゼ酵素と比較して増加した熱安定性を有している。aフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基214に対応するアミノ酸残基及びルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基216に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼの場合はスレオニン以外である。bフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基232に対応するアミノ酸残基及びルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基234に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼの場合はイソロイシン以外である。cフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基295に対応するアミノ酸残基及びルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基297に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、例えば、フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼの場合、フェニルアラニン以外である。種々のルシフェラーゼの全ての配列は、高度に保存されて、これら酵素間で有意な程度の類似性を有していることを示す。このことは、配列を調査して最も類似している領域を検出することにより酵素配列間の対応領域が容易に決定可能であることを示している。必要ならば、種々の配列間対応領域又は特定のアミノ酸を決定するために市販のソフト例えば、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループのBestfit、Devereuxら1984NucleicAcidResearch12387395を参照のことを使用することができる。代替又は追加として、対応の酸を、文献:LYeらBiochimBiophysActa13393952により決定することができる。前記文献で使用する番号方式numberingsystemは、本件出願で使用した番号方式の基礎を形成する。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基214に対応するアミノ酸残基の可能な変化について、極性アミノ酸スレオニンは、非極性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインなどにより適切に置換される。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基214に対応するスレオニン残基の特に好ましい置換はアラニンによるものである。より好ましい置換はシステインによるものである。しかしながら、この部位における異なる極性残基、例えばアスパラギンも、当該部位にスレオニンを有する対応の酵素の熱安定性を増強するだろう。野生型ルシフェラーゼ酵素においてこの部位に現れるその他のアミノ酸には、グリシンルシオラミングレリカ、ホタリアパロウラ、アスパラギンピロフォラスプラギオフタラマス、GR、YC、YE及びOR、ルシオラクルシアタ、ルシオララテラリス、ラムピリスノクチルカ、ピロセリアナヤコ、フォティナスペンシランヴァニカLY、KW、J19及びセリンフィリキソシックスルシフェラーゼの部位211が含まれる。非極性又は異なる非極性側鎖、例えばアラニン及びシステインで置換することは有利であろう。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基232に対応するアミノ酸残基の可能性のある変化について、非極性アミノ酸であるイソロイシンは、異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインなどで適切に置換される。野生型の配列においてこの部位に現れるその他のアミノ酸には、セリン及びアスパラギンそれぞれ、フィトシックスグリーンPhritothixgreen及びレッドPhritothixredにおける対応の229番目の部位におけるバリン又はアラニンと同じが含まれる。適切には、これらの極性残基は、非極性残基、例えば前記にて概略を述べたものにより置換される。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基232に対応する残基及びルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリスの残基234に対応する残基の特に好ましい置換はアラニンによるものである。このことは、野生型配列に対するアミノ酸の変化を示している。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基295に対応するアミノ酸残基及びルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基297に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろうこれは、フィリキソシックスルシフェラーゼの残基292に対応する。一般的に、この部位におけるアミノ酸は非極性アミノ酸であるフェニルアラニン又はロイシンである。これらは異なる非極性アミノ酸で改変される。例えば、フォティナスピラリスでは、非極性アミノ酸フェニルアラニンは、異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン又はシステインにより適切に置換される。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基214に対応するフェニルアラニン残基についての特に好ましい置換はロイシンによるものである。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基14に対応するアミノ酸残基又はルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基16フィリキソシックス由来ルシフェラーゼではアミノ酸残基13に対応するアミノ酸残基における変異も可能である。このアミノ酸残基通常はフェニルアラニンであるが、ロイシン、セリン、アルギニン又はある場合ではチロシンであってもよいは、異なるアミノ酸、特に異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファン、好ましくはアラニンへ適切に改変するだろう。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基35又はルシオラミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基37に対応するアミノ酸残基その他のルシオラ種及びフィリキソシックスにおけるアミノ酸38に対応するにおける変異も有効であろう。このアミノ酸は野生型酵素間で変化し、この部位におけるロイシンフォティナスピラリスだけでなく、リジン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、グルタミン及びアスパラギン酸も含まれるだろう。適切には、この部位におけるアミノ酸残基は、非極性アミノ酸残基又は異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、フェニルアラニン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファンにより適切に置換される。この部位における好ましいアミノ酸はアラニンであり、これは野生型酵素とは異なるものである。フォティナスピラリス由来配列の部位14に対応するアミノ酸における変異及び/又はフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基35に対応するアミノ酸残基における変異は、好ましくはこの酵素における唯一の変異ではない。これらの変異は、前記で定義したその他の変異、特にフォティナスピラリス由来ルシフェラーゼの部位214、395又は232に対応する部位における変異を適切に伴う。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼにおける残基105に対応するアミノ酸残基及びルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基106に対応するアミノ酸残基フィリキソシックスにおける残基102の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的に、この部位におけるアミノ酸は非極性アミノ酸であるアラニン又はグリシンであり、フィリキソシックスではセリンであろう。これらのアミノ酸は異なる非極性アミノ酸により適切に改変される。例えば、フォティナスピラリスにおいて、非極性アミノ酸アラニンは、異なる非極性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファン等により適切に置換される。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼの残基105に対応するアラニン残基についての特に好ましい置換はバリンによるものである。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基234に対応するアミノ酸残基及びルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基236フィリキソシックスにおける残基231に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的にこの部位におけるアミノ酸はアスパラギン酸又はグリシンであり、ある場合においてはグルタミン又はスレオニンである。これらは、非極性アミノ酸又は異なる非極性アミノ酸により適切に置換される。例えば、フォティナスピラリスにおいて、アミノ酸残基アスパラギン酸は、非極性アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファンにより適切に置換される。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基234に対応するフェニルアラニン残基の置換に特に好ましいのはグリシンによるものである。非極性アミノ酸残基、例えばグリシンが例えば、ルシオラ由来ルシフェラーゼにおいてこの部位に存在する場合、グリシンは異なる非極性アミノ酸により適切に置換されるだろう。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基420に対応するアミノ酸残基及びルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基422フィリキソシックスグリーンにおける残基417及びフィリキソシックスレッドにおける残基418に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的にこの部位におけるアミノ酸は無電荷極性アミノ酸であるセリン又はスレオリン又はグリシンである。これらは、異なる無電荷極性アミノ酸により適切に置換される。例えば、フォティナスピラリスにおいて、セリンは、アスパラギン、グルタミン、スレオニン又はチロシン、特にスレオニンにより適切に置換される。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基310に対応するアミノ酸残基及びルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ若しくはルシオララテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基312に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。この部位におけるアミノ酸は既知のルシフェラーゼタンパク質の間で変化し、フォティナスピラリス、ピロセリアナヤコ、ラムピリスノクチルカ及びある形態のフォティナスペンシランヴァニカ由来ルシフェラーゼではヒスチジンであり、ルシオラミングレリカ、ホタリアパロウラ及びフィリキソシックスアミノ酸残基307由来ルシフェラーゼではスレオニンであり、ルシオラクルシアタ及びルシオララテラリスではバリンであり、あるピロフォラスプラギオフタラマス由来ルシフェラーゼではアスパラギンである。したがって、一般的に、この部位におけるアミノ酸は親水性アミノ酸であり、これを異なるアミノ酸残基に換えて、酵素の熱安定性を増加させてもよい。フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基310に対応するヒスチジン残基に対する特に好ましい置換はアルギニンによるものである。酵素内にその他の変異が存在していてもよい。例えば、好ましい態様では、タンパク質は、フォティナスピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸354に対応する部位ルシオラ由来ルシフェラーゼにおける部位356及びフィリキソシックス由来ルシフェラーゼの部位351にグルタミンから、特にグリシン、プロリン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変化したアミノ酸を有する。適切には、この部位におけるアミノ酸はトリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びアスパラギンであり、特に好ましくはリジン又はアルギニンである。この変異はWO9525798に記載されている。代替の好ましい態様では、EPA052448に記載されるように、タンパク質は、ルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基217に対応する部位が、疎水性アミノ酸、特にイソロイシン、ロイシン又はバリンに換わったアミノ酸を有している。タンパク質は、当該タンパク質のルシフェラーゼ活性が過度に妥協しないことを条件に配列内に更に変異を含んでいてもよい。その変異は酵素の特性を適切に増強するか、又は、ある場合においては意図する目的により適するようにする。このことは、更なる変異が熱安定性及び/又はカラーシフト特性及び/又はATPに対する酵素のKmの増強を引き起こすことを意味する。カラーシフトを引き起こす変異の例はWO9518853に記載されている。Km値に影響する変異は例えばWO9622376及び国際特許出願第PCTGB9801026号に記載されている。これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明のタンパク質は、1つより多い変異、好ましくは前記の変異の3つすべてを適切に有している。本発明のタンパク質には野生型及び組換え型ルシフェラーゼ酵素の両方が含まれる。本発明のタンパク質は、前記のとおり野生型酵素に存在するアミノ酸の少なくとも60が本発明のタンパク質に存在するという意味で、フォティナスピラリス、ルシオラミングレリカ、ルシオラクルシアタ又はルシオララテラリス由来ルシフェラーゼの配列又はその他のルシフェラーゼ酵素の配列と少なくとも60の類似性を有する。本発明のタンパク質は前記の野生型酵素に対し、より高い程度類似性、特に少なくとも70、より好ましくは少なくとも80、特に好ましくは少なくとも90の類似性を有することができる。このタイプの類似のタンパク質には、対立遺伝子変異体、その他の昆虫種由来のタンパク質及び組換えにより生成した酵素が含まれる。本発明のタンパク質は、野生型酵素をコードする配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるという点で同定されるだろう。前記の条件は当業者に周知であり、例えばSambrookら1989MolecularCloningColdSpringHarborLaboratoryPressに例示されている。一般的には、低ストリンジェント条件は約周囲温度~約65°Cにおける3×SSCとして定義され、高ストリンジェント条件は約65°Cにおける0.1×SSCとして定義される。SSCは0.15MNaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウムからなる緩衝液の名称である。3×SSCは3回の同じ強さのSSCのことである。特に、本発明の配列と特定の配列との類似性は、Lipman及びPearsonLipmanDJPearsonWR1985RapidandSensitiveProteinSimilaritySearchesSciencevol227ppl4351441に記載される多重整列化multiplealignment法を使用して評価されるだろう。最適化された百分率のスコアは、LipmanPearsonアルゴリズムについての以下のパラメーター:ktup=1、ギャップペナルティーgappenalty=4及びギャップペナルティー長さgappenaltylength=12を用いて計算されるべきである。類似性を評価する配列は試験配列として使用されるべきである。このことは、比較のための塩基配列、例えばフォティナスピラリスの配列若しくはYeら、前出に記録された前記のその他の配列又はフィリキソシックスの場合はBiochemistry19993882718279に記載される配列は、参照配列として使用されることを意味する。本発明の特定の例は、前記の変異を有する野生型ルシフェラーゼ配列である。このタンパク質は少なくとも1つ、好ましくは1つより多くの前記の変位を有している。更に本発明は前記のルシフェラーゼをコードする核酸を提供する。適切には、前記核酸は当業者に周知の野生型配列に基づくものである。アミノ酸配列に所望の変異を起こす適切な突然変異は、遺伝子コードの知識に基づき容易に明らかになるだろう。本発明の核酸は、発現ベクター、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの制御要素の制御下にあるプラスミドへ適切に組み込まれる。これらのベクターを用いて宿主細胞、例えば原核細胞又は真核細胞、例えば植物又は動物細胞、特に原核細胞、例えば大腸菌Ecoliを形質転換し、当該細胞に所望のルシフェラーゼ酵素を発現させることができる。当該技術分野で周知の条件を使用して、得られた形質転換細胞の培養にルシフェラーゼ酵素を産生させ、次いで培養培地からルシフェラーゼ酵素を分離することができる。細胞が動物又は植物細胞の場合、当該細胞から植物又は動物を繁殖させてもよい。その後、当該植物からタンパク質を抽出してもよい。トランスジェニック動物の場合、タンパク質を乳汁から回収してもよい。ベクター、形質転換細胞、トランスジェニック植物及び動物並びに前記細胞の培養による酵素の生産方法の全ては本発明の更なる側面を形成する。フォティナスピラリスT214A変異ルシフェラーゼを、以下のランダム突然変異誘発により作成した。T214A単一点変異体は野生型ルシフェラーゼよりも高い熱安定性を有している。2つの新規な三重変異ルシフェラーゼ:E354KT214AA215L及びE354KT214AI232Aを作成したところ、これらも高い熱安定性を示した。本発明の範囲内にあるフォティナスピラリス変異体酵素の特定の例には以下のものが含まれる。I232AE354KT214AI232AE354KA215LI232AE354KT214AI232AE354KA215LI232AE354KT214AF295LI232AE354KT214AF295LF14AL35AI232AE354KT214AF295LFl4AL35AA215LA105VT214AT214CT214NT295LI232AF14AL35AD234GS420TH31OR又はその他の種のルシフェラーゼに由来するときは、それらのすべての等価物。三重変異体作成のための変異を、プラスミドpET23上のルシフェラーゼ遺伝子へ、部位特異的突然変異PCRにより導入した。関連する変異を起こすためにPCR反応へ添加したオリゴヌクレオチドは以下の実施例で与えられたものである。部位354及び215における点変異の効果は相加的であることが既に示されている。本発明はより高い熱安定性を与えるために3又はそれより多い変異を組み合わせる可能性を提供する。本発明の熱安定性ルシフェラーゼは、シグナル伝達手段としてルシフェラーゼ/ルシフェリン反応を利用する全ての生物発光アッセイにおいて有利に使用されるだろう。文献において非常に多数のアッセイが知られている。それゆえ、本発明のタンパク質は、前記のアッセイの実行を鑑みて調製されるキット中に、適宜ルシフェリン及び特定のアッセイを行うのに必要なその他の試薬と共に含まれるだろう。本発明は添付図面を参照した実施例により詳述されるだろう。"