"水性培地中の生存哺乳類細胞を無菌処理して、細胞密度が少なくとも約500万細胞/mLでありかつ細胞生存率が少なくとも約70である細胞懸濁液を作製するための方法であって、孔径が0.1ミクロンより大きいタンジェンシャルフローフィルターTFFを用いて該培地の容量を減少させる工程を含み、該工程中、膜間差圧TMPが約3psi未満で維持されかつ剪断速度が約4000秒-1未満で維持される、上記方法。細胞生存率が少なくとも約80である、請求項1に記載の方法。細胞生存率が少なくとも約90である、請求項1に記載の方法。剪断速度が約3000秒-1未満で維持される、請求項1に記載の方法。TMPが約1psi未満で維持される、請求項1に記載の方法。TFFの孔径が約0.65ミクロンである、請求項1に記載の方法。。TFFが、少なくとも約0.5ft2の濾過表面積を有する中空糸フィルターである、請求項1に記載の方法。前記フィルターを通る流束が少なくとも約50L/m2hである、請求項7に記載の方法。前記フィルターを通る流束が少なくとも約300L/m2hである、請求項7に記載の方法。前記細胞懸濁液中の細胞の回収率が前記水性培地中の細胞の少なくとも約80であり、この際、該回収率が開始時細胞数と最終細胞数の割合として決定される、請求項1に記載の方法。前記細胞懸濁液が約1000万~約7500万生細胞/mLの間で含有する、請求項1に記載の方法。前記細胞懸濁液が約1000万~約2億の間で生細胞を含有する、請求項1に記載の方法。前記懸濁液中の細胞の生存率が約90~約100の間である、請求項1に記載の方法。TFFを用いて、前記細胞懸濁液の容量の少なくとも約4倍に等しい水性洗浄培地の容量で前記懸濁液の細胞を洗浄するダイアフィルトレーション工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記細胞懸濁液中の望ましくない可溶性成分の残留レベルが前記水性培地中の残留レベルと比べて少なくとも約1000倍低下する、請求項14に記載の方法。前記残留レベルが前記細胞懸濁液の約1ppm未満に低下する、請求項14に記載の方法。センサーを用いて生細胞濃度を測定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。センサーを用いて総細胞生存率を測定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。前記センサーからシグナルを検出することをさらに含み、TFF中のサンプリングが排除される、請求項17に記載の方法。処理段階を決定するために前記シグナルを処理することをさらに含む、請求項18に記載の方法。前記処理が、評価処理するためにフィードバックを提供することをさらに含む、請求項18に記載の方法。前記シグナルがアンプセンサーを通ってヒューマンマシンインターフェースに送られる、請求項13に記載の方法。前記シグナルを可変細胞密度VCDデータに変換することをさらに含む、請求項14に記載の方法。最適の最終細胞密度および/または濃縮係数を決定するために前記VCDデータを解析することをさらに含む、請求項15に記載の方法。治療用組成物に用いる細胞を製造する方法であって、大規模細胞培養を用いて細胞を増殖させる工程;水性培地中の細胞を回収する工程、該水性培地中の細胞の容量を減少させ、請求項11に記載の方法においてTFFを用いて該細胞を洗浄する工程、得られた細胞懸濁液を凍結防止培地中で処方し、細胞生存率の長期維持に好適な条件下で該処方細胞を凍結し保存する工程を含み、該凍結処方細胞が次のパラメーター:少なくとも約80の融解時細胞生存率;約500万細胞/mLより高い生細胞密度;および処方細胞中の望ましくない可溶性成分の残留レベルが約1ppm未満のレベルに低下している、を示す、方法。請求項25に記載の方法によって作製された、製品。本発明は、タンジェンシャルフローフィルトレーションTFF、クロスフローフィルトレーションCFFとしても知られているを用いて生存哺乳類細胞を無菌で濃縮し洗浄するためのプロセスおよび装置を提供する。本発明は、治療製品に用いられる生存哺乳類細胞に、例えば、低温保存用または対象への投与用の処方のためのそのような細胞の懸濁液の容量減少および洗浄などに特に有用である。特に、本発明は、開始時細胞の少なくとも90収率および最終細胞製品の少なくとも90生存率で少なくとも約500万細胞/mLの、医薬処方物に好適な細胞組成を作出するための、数十または数百リットルの回収された哺乳類細胞の容量減少および洗浄が見込まれるTFFの高収率プロセスを提供する。このプロセスからの医薬組成物は、治療的使用に有害な成分例えば、血清成分、トリプシンまたは他の酵素などの回収試薬の残留レベルが開始時レベルと比べて少なくとも約1000~10000倍低下しており、例えば、治療的使用に用いる特定の生物学的製剤では、血清についての要件どおりに1ppmより低い最終レベルへの低下が可能となる連邦規則集第21編第610.15b項。このプロセスは、例えば、シングルユース用装置において剪断速度を最小にし、流束容量/表面積×時間、例えば、L/m2hまたは本明細書ではLMHを最大にする工程、および処理時間を最小限に抑える工程を用いて実行に至った-これらは全てヒト投与に好適な高品質の細胞懸濁液に寄与している。そのプロセスは、フィルター孔径に依存し、フィルターの種類中空糸対フラットシート、フィルター材料およびバッファー処方とは比較的無関係である。他のプロセス変形も使用され、1~3時間の処理時間内に500万~6000万細胞/mLの範囲に及ぶ細胞懸濁液を得るように最適化されている。操作変形は記載されており、操作変形では非常に速い処理時間透過物流束最大化および非常に高い細胞濃度例えば、3000万細胞/mLより高い濃度を得るために利用することができる。よって、本発明の1つの態様は、水性培地中の生存哺乳類細胞を無菌処理して、細胞密度が少なくとも約500万細胞/mLでありかつ細胞生存率が少なくとも約80である細胞懸濁液を作製するための方法を提供する。この方法は、孔径が0.1ミクロンより大きいタンジェンシャルフローフィルターTFFを用いて該培地の容量を減少させる工程を含む。この工程中、望ましい膜透過流束を維持するために、膜間差圧TMPはタンパク質溶液のTFF処理についての先行技術条件と比べて比較的低く維持される。例えば、TMPは約5psi未満で、好ましくは約3psi未満で、より好ましくは1psi未満で維持される。本発明のこの処理工程中、細胞生存率を維持するために、剪断速度もまた、タンパク質溶液についての先行技術条件と比べて比較的低く、例えば、約4000秒-1未満で、好ましくは約3000秒-1未満で、より好ましくは約2000秒-1未満で維持される。本発明のこの方法では、望ましい膜透過流束を得るために、TFFの孔径が少なくとも約0.1ミクロンであり、好ましくは0.1ミクロンより大きく、より好ましくは約0.65ミクロンであることが一般的に有利である。この方法でのTFFは、所望の処理容量に好適な任意の構成、例えば、当技術分野で一般的に公知の中空糸構成またはシート構成などのものであってよい。本発明により約10L~約100Lの細胞を処理するために、TFFは、表面積が約0.5ft2の中空糸フィルターであることが好ましい。本発明によるTFF面積の1平方フィート当たりに処理される細胞の数は、少なくとも7.5億細胞ほど少ない場合も、少なくとも約180億細胞ほど多い場合もあるが、その際、細胞品質および膜透過流束などの所望の操作パラメーターは維持される。驚くべきことに、本発明方法の比較的低い剪断パラメーターおよびTMPパラメーターによりフィルターの目詰まりにはならず、それよりも、非常に望ましい膜透過流束、例えば、少なくとも約50L/m2h、好ましくは少なくとも約100L/m2h、より好ましくは少なくとも約200L/m2h、より好ましくは少なくとも約300~約600L/m2hなどをもたらす。そのような流束は、約10L~約100Lの細胞バッチ容量、あるいは少なくとも約1000Lまでのより大きなバッチでの処理時間を、従来の遠心分離法と比べて大幅に短縮し、それによって生存率を含む高い細胞品質を維持する。さらに、本発明の上記TFFプロセスパラメーターは、驚くべきことに、得られる細胞懸濁液において優れた細胞回収率、例えば、水性培地中の開始時細胞の、少なくとも約80~約85、好ましくは少なくとも約90~約95、より好ましくは少なくとも約97~100を提供する。細胞の種類および用途に応じて、得られる細胞懸濁液は、少なくとも約500万生細胞/mL、1000万生細胞/mL、2500万生細胞/mL、5000万生細胞/mLまたは少なくとも約7500万生細胞/mLを含有し得、場合によっては約1億細胞/mLを超える密度も可能である。いくつかの実施形態では、本発明方法は、TFFを用いて、得られた懸濁液中の細胞を、該細胞懸濁液の容量の少なくとも約2~4倍、好ましくは少なくとも約4~6倍、より好ましくは少なくとも約8~10倍に等しい水性洗浄培地の容量で洗浄するダイアフィルトレーション工程をさらに含む。本発明のダイアフィルトレーション工程は、前記細胞懸濁液中の望ましくない可溶性成分の残留レベルを、細胞を含有する最初の水性培地中の残留レベルと比べて少なくとも約300倍、好ましくは約1000倍、より好ましくは約3000倍低下させ得る。実際には、例えば、この工程は、例えば、治療的使用に用いる特定の生物学的製剤では、要件どおりに、血清タンパク質例えば、BSAまたはHSAなどの培養培地成分の残留レベル、または回収試薬、例えば、トリプシンなどの残留レベルを、最終細胞懸濁液の約1ppm未満に低下させることができる連邦規則集第21編第610.15b項。もう1つの態様では、本発明は、治療用組成物に用いる哺乳類細胞を製造するための全プロセスを提供する。この方法は次の工程を含む:任意の公知の大規模細胞培養方法論、例えば、10段もしくは40段の容器セルファクトリー、または波動揺動バッグまたは攪拌槽型バイオリアクターを用いて細胞を増殖させる工程;水性培地中の細胞を回収する工程;および該水性培地中の細胞の容量を減少させ、フラットシートまたは中空糸のTFF構成で本発明のTFF方法を用いて該細胞を洗浄する工程。本発明のプロセスは、当技術分野で公知の低温保存技術例えば、凍結防止剤としてのジメチルスルホキシドDMSOを必要とするを用いて、得られた細胞懸濁液を凍結防止培地中で処方し、細胞生存率の長期維持に好適な条件下で、該処方細胞を凍結し保存することをさらに含む。凍結防止処方物中の細胞は、そのような目的で知られている任意の従来容器、例えば、プラスチックバッグまたはガラスバイアルなどで凍結し保存し得、短期間の場合には少なくとも約-80°Cの温度で保存し得、または長期保存の場合には、液体窒素の気相もしくは液相中で保存し得る。本発明のこの製造プロセスは、次のパラメーター:少なくとも約80;90または95の融解時細胞生存率;約100万細胞/mL、300万細胞/mLまたは600万細胞/mLより高い生細胞濃度;および望ましくないタンパク質成分の残留レベルが最初の水性培地中の残留レベルと比べて少なくとも約1000倍、約1ppm未満のレベルに低下している、を示す凍結処方細胞を生産する。本発明のさらなる態様は、本発明の細胞処理方法における、例えば、中空糸フィルターHFFを用いる、完全に閉鎖された完全使い捨ての規模拡張可能なタンジェンシャルフローフィルトレーションTFFシステムに関する。このTFFシステムは、高い細胞生存率および機能性を維持しながら、大容量バッチを3時間未満で処理する液体培地から細胞を分離し、清浄化し、回収し、収集することができる。このシステムでは、HFFは、システム組立に3箇所の迅速接続とバッチサイズに応じたプラスチックチューブの無菌接合のみ必要であるように取り付けられている無菌クイックコネクターを有する。下記の図1は、チューブ、使い捨てのセンサー図1のP1、P2およびP3および処理貯槽図1のバッグ番号1ならびに使い捨てのフィルター全て市販されているを備えた、完全に閉鎖された完全使い捨ての、本発明の例示的なTFFシステムを示している。本発明のTFFシステムはまた、中空糸フィルターの代わりにフラットシートフィルターも使用し得る。そのようなシステムに好適な蠕動ポンプも市販されている。いくつかの例示的な実施形態のこれらの態様および他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考えれば、よりよく認識され理解されるであろう。しかしながら、以下の説明は、好ましい実施形態およびそれらの非常に多くの具体的な詳細を示しながら、例示として記載しているが限定するものではないことは理解すべきである。実施形態の範囲内でその精神から逸脱することなく多くの変更および修飾を行うことができる。本発明は、特にヒト細胞療法用製品の調製のための、生存哺乳類細胞の濃縮および洗浄のための改良された方法、ならびに関連装置およびシステムを提供する。本発明は、水性培地中の生存哺乳類細胞を無菌処理して、細胞密度が少なくとも約500万細胞/mLでありかつ細胞生存率が少なくとも約70である細胞懸濁液を作製するためのシステムおよび方法に関し、その方法は、孔径が0.1ミクロンより大きいタンジェンシャルフローフィルターTFFを用いて該培地の容量を減少させる工程を含み、該工程中、膜間差圧TMPが約3psi未満で維持されかつ剪断速度が約4000秒-1未満で維持される。本方法を用いた細胞生存率は、少なくとも約70であり、80、90またはそれより高いこともある。前記方法の剪断速度は約3000秒-1未満で維持されかつTMPは約1psi未満で維持される。TFFの孔径は約0.65ミクロンであり、TFFは濾過表面積が少なくとも約0.5ft2の中空糸フィルターである。前記方法のフィルターを通る流束は少なくとも約50L/m2hであり、少なくとも約300L/m2hであることもある。細胞懸濁液中の細胞の回収率が水性培地中の細胞の少なくとも約70である場合、その回収率は開始時細胞数と最終細胞数の割合として決定される。本方法では、細胞懸濁液は約1000万~約7500万生細胞/mLの間または約1000万生細胞~約2億生細胞/mLの間で含有する。加えて、懸濁液中の細胞の生存率は少なくとも約70であり、典型的には少なくとも80、または90以上である。もう1つの実施形態では、前記方法は、TFFを用いて、細胞懸濁液の容量の少なくとも約4倍に等しい水性洗浄培地の容量で懸濁液中の細胞を洗浄するダイアフィルトレーション工程を含む。細胞懸濁液中の望ましくない可溶性成分の残留レベルは、水性培地中の残留レベルと比べて少なくとも約1000倍低下し、細胞懸濁液の約1ppm未満に低下させることができる。本発明のさらにもう1つの実施形態では、前記方法はセンサーを用いて生細胞濃度を測定することを含む。その方法は、TFF処理を制御し、そのプロセス中の特定の工程が終わり別のプロセス工程が始まる例えば、濃縮を終え、ダイアフィルトレーションを始める時期を特定し、確認サンプリングの必要性をなくすためにフィードバック機構を提供し、それによって細胞処理中の汚染の危険性を防ぐ。よって、その方法は、センサーからリアルタイムシグナルを検出することこの際、TFF中のサンプリングが排除される、処理段階を決定するために該シグナルを処理すること、生細胞の目標密度に達した時にTFFプロセス工程を終えるためにフィードバックを提供することを含む。前記方法において用いられるセンサーによって測定されたシグナルは、アンプセンサーを通ってヒューマンマシンインターフェースに送られ、そのシグナルは生細胞密度VCDデータに変換することができる。前記方法は、最適の最終細胞密度および/または濃縮係数を決定するために前記VCDデータを解析することをさらに含む。このVCDデータはまた、プロセス決定することができるもう1つの重大な品質パラメーターである総細胞生存率TCVを計算するために総細胞密度TCDセンサーと組み合わすこともできる。本発明のさらにもう1つの実施形態では、治療用組成物に用いる細胞を製造する方法が提供され、その方法は、大規模細胞培養を用いて細胞を増殖させる工程;水性培地中の細胞を回収する工程、該水性培地中の細胞の容量を減少させ、本明細書に開示するようにTFFを用いて該細胞を洗浄する工程、得られた細胞懸濁液を凍結防止培地中で処方し、細胞生存率の長期維持に好適な条件下で該処方細胞を凍結し保存する工程を含み、該凍結処方細胞は次のパラメーター:少なくとも約80の融解時細胞生存率;約500万細胞/mLより高い生細胞密度;および処方細胞中の望ましくない可溶性成分の残留レベルが約1ppm未満のレベルに低下している、を示す。本発明のもう1つの実施形態は、本明細書に開示する方法を実施するための、セルファクトリー、バイオリアクター、タンクを含んでなる装置を備えたシステムを含む。適当な期間の培養物から回収された細胞の大バッチ例えば、3時間未満で約10~約100Lの処理についての課題に対処するために、本発明者らは、例えば、中空糸フィルターHFFを用いる、完全に閉鎖された、完全使い捨ての規模拡張可能なタンジェンシャルフローフィルトレーションTFFシステムを開発した。このTFFシステムは、高い細胞生存率および機能性を維持しながら、大容量バッチを3時間未満で処理する液体培地から細胞を分離し、清浄化し、回収し、収集することができる。このシステムでは、HFFは、システム組立に3箇所の迅速接続とバッチサイズに応じたプラスチックチューブの無菌接合のみ必要であるように取り付けられている無菌クイックコネクターを有する。下の図1は、完全に閉鎖された完全使い捨ての、本発明の例示的なTFFシステムを示している。チューブ、使い捨てのセンサー図1のP1、P2およびP3および処理貯槽図1のバッグ番号1は、注文組立し、ガンマ線によって滅菌した。使い捨てのフィルターは、GE社から供給されたものでありRTPCFP-6-D-4M、RTPCFP-1-E-4MおよびPN:RTPCFP-6-D-5、無菌で組立を行った。この構成または類似した構成で複数回のTFF運転を完了した。加えて、実現可能性の研究によって、本発明のTFFシステムはまた、中空糸フィルターの代わりにフラットシートフィルターも使用し得ることも示された。本発明の典型的なTFFプロセスは2段階:容量減少およびダイアフィルトレーションで構成される。容量減少工程の間に、図1に示した処理バッグ内で所望の細胞濃度に達するまでバルク容量細胞培養培地がフィルターの透過物側から濾去される。容量減少段階に続くダイアフィルトレーション段階では、濃縮された細胞が液体、例えば、バッファーなどで洗浄され、ヒト投与には望まれないまたは許容されない細胞培養培地成分または回収培地成分が除去される。また、ダイアフィルトレーション後にさらなる容量減少を行って、治療製品の処方のために所望の細胞密度に到達させることもできる。本発明のもう1つの実施形態では、図13に示されるように、本明細書に開示する閉鎖された完全使い捨てのTFFシステムは、中空糸フィルターおよび生細胞密度VCD流水式センサーおよび検出FTセンサーをさらに導入している。VCDFTセンサーは、別のラインで接続し得ることが好ましいS1。使い捨てのVCDセンサーの使用によってTFF中の製品サンプリングがなくなり、その結果、リスクが最小限に抑えられ、製品品質および安全性が向上する。VCDFTセンサーからのシグナルはヒューマンマシンインターフェース、例えば、FOGALESEMICONのヒューマンマシンインターフェースを用いて送ることができる。このようにして、VCDデータを用いて、TFF操作中に最適の細胞密度および/または濃縮係数を決定することができる。膜濾過プロセスは、一般的に、膜の孔径に応じて、逆浸透、限外濾過およびマイクロフィルトレーションのカテゴリーに入る。例えば、’294号特許、前掲を参照のこと。通常、限外濾過では分子量がおよそ1~1000kDaの間の溶質の保持に値する膜を使用し、逆浸透では塩および他の低分子量溶質を保持する能力がある膜を使用し、マイクロフィルトレーション、またはマイクロポーラス濾過では、コロイドおよび微生物を保持するために典型的に使用される0.1~10μmミクロン孔径範囲の膜を使用する。同上。TFFでは、供給流を膜の面に対して接線方向に高速で再循環させ、逆拡散の物質移動係数を増加させる。フィルター膜に対して平行な方向に流れる液体は、連続的にフィルター表面を清浄するように働き、濾過できない溶質による目詰まりを防ぐ。同上。TFFでは、膜間差圧TMPと呼ばれる圧力差勾配を膜の長さ方向に適用して、液体および濾過可能な溶質をフィルター通過させる。流束は、経験的に決定することができる特定の最小値より高いTMPには依存しない。同上。最大流束を達成するために、限外濾過システムは、典型的には、この最小値以上の出口圧力で運転される。そのため、TMPは変動するが流束は膜の長さ方向に一定である。驚くべきことに、本発明のTFFプロセスの比較的低い剪断パラメーターおよびTMPパラメーターによりフィルターの目詰まりにはならず、それよりも、非常に望ましい膜透過流束、例えば、少なくとも約100L/m2h、好ましくは少なくとも約200L/m2h、より好ましくは少なくとも約300L/m2hなどをもたらす。そのような流束は、約10L~約100Lの細胞バッチ容量、あるいは約1000Lまでのより大きなバッチでの処理時間を、従来の遠心分離法と比べて大幅に短縮し、それによって生存率を含む高い細胞品質を維持する。さらに、本発明の上記TFFプロセスパラメーターは、驚くべきことに、得られる細胞懸濁液において優れた細胞回収率、例えば、水性培地中の開始時細胞の、少なくとも約80、好ましくは少なくとも約90、より好ましくは少なくとも約95または99を提供する。細胞の種類および用途に応じて、得られる細胞懸濁液は、少なくとも約300万生細胞/mL、600万生細胞/mL、あるいは少なくとも約1000万生細胞/mLを含有し得る。本明細書に記載する方法および応用に対する他の好適な修飾および改変は明らかであり、そのような修飾および改変は本発明またはそのあらゆる実施形態の範囲からも逸脱することなく行うことができることは当業者には明白である。本発明は次の実施例を参照することによってより明確に理解され、それらの実施例は本明細書において例示のためだけに示し、本発明を限定するのもではない。次の実施例におけるこのTFF手法の開発段階で、初代ヒト細胞典型的には、成体間葉系幹細胞またはヒト皮膚繊維芽細胞をセルファクトリーCorningまたはNunc登録商標で培養し、複数のバッグに回収した。実験開始前に、回収した細胞のバッグを、プラスチックチューブの無菌接合または他の無菌接続によって処理バッグ図1のバッグ番号1に接続し、図1に示す供給ポンプMasterflexL/Sを用いて細胞懸濁液を処理バッグに移した。処理バッグには細胞懸濁液がバッグ容量の半分~2/3まで充填した。再循環ポンプWatson-Marlow-323EまたはSpectrumKrosflow図1に示すとおりであるをゆっくり始動させ、目的とする速度まで上げた。次いで、透過ポンプMasterflexL/S図1に示すとおりであるをゆっくり始動させ、目的とする速度に上げた。供給ポンプおよび透過ポンプを同じサイズのチューブ3/16インチまたは1/4インチIDを用いて同じ速度で運転して、本プロセスの容量減少工程中、処理バッグ内で一定の液体容量を維持した。再循環ポンプには、1/4インチまたは3/8インチIDのチューブを典型的に用い、一定の速度で運転して望ましい入口流量を得た。細胞懸濁液サンプルを定期的に収集して、Nucleocounterまたは他の細胞計数技術を用いて細胞密度および生存率を測定した。典型的には、バルク容量を所望の細胞濃度に応じて約100~800mLの範囲内に減少させたら、バッファーバッグを処理バッグに接続することによってダイアフィルトレーションを開始させた。ダイアフィルトレーションバッファーの8~10容量の同等物で細胞を洗浄して、残留する培養成分および回収成分の減少を達成させた。次いで、処理バッグ内の容量を上記のように濾過によってさらに減少させて、処方のために所望の細胞濃度を達成してもよい。所望の細胞濃度を達成したら、全てのポンプを停止させ、フィルターおよびチューブの細胞懸濁液を重力によって処理バッグ中に排出した。細胞計数のために処理バッグの最終サンプルを得、低温保存のために細胞懸濁液を処方し、バイアルに充填した。回収した細胞懸濁液10~100Lでの細胞療法プロセスの重大な品質パラメーターには:細胞を1000万細胞/mLより高く濃縮する際の少なくとも90の細胞生存率および高い細胞機能性の維持;少なくとも約85の全体細胞回収率入細胞-出細胞/入細胞として定義されるの取得;ウシ血清アルブミンBSAなどの培養培地残留物の1ug/mL未満への低下例えば、連邦規則集第21編第610.15項を参照のこと;および細胞死を制限する細胞処理時間、例えば、約3時間未満の維持、が含まれる。実施例1.剪断速度の影響高剪断速度は、フィルターの汚れを最小限に抑えるのに役立ちフィルター材料への細胞の吸着を防ぎ、そうすることによって流束を最大にし、処理時間を最小限に抑えるため、TFFプロセスでは一般的である。この一連の実験の目的は、最終細胞懸濁液の重大な品質パラメーターを維持しながら剪断速度を最適化することであった。TFFプロセス性能および製品品質に対する剪断速度の影響を調査するために、上記の典型的なTFF手順に従って小規模3~5L実験を行った。剪断速度は、=~式中、rは剪断速度単位=秒-1であり、qは繊維ルーメンを通るフィルター入口流量単位=m3/秒であり、Rは繊維半径単位mであるとして計算した。明記したフィルターおよびチューブを含む任意の装置では、フィルター入口流量すなわち、図1の供給ポンプの流量によって剪断速度を制御した。2~3のセルファクトリー40段Nuncからおよそ20億~30億のヒト皮膚繊維芽細胞を回収し、0.5ft2サイズのフィルターGE社製PN:RTPCFP-6-D-4Mを用いて処理した。実験開始時の細胞濃度は2.5×105~5×105細胞/mLの範囲に及び、典型的なTFFプロセスに従って容量を62±9分間濃縮した。中空糸フィルターで処理を行い、場合によっては過大な剪断速度ダイアフィルトレーションを行わなかった。表1のデータは、高剪断速度が細胞生存率に悪影響を及ぼしたことを示している。数回の実験に関する剪断速度の傾向解析によって最終濃縮細胞製品の生存率に対する剪断力の影響を示し図2、この場合、生存率の低下は、Nucleocounterアッセイによって測定されるTFF前およびTFF後の細胞生存率の差異として定義される。結論:この一連の研究によって、最終細胞生存率が本プロセスの液体剪断速度に依存し、その剪断速度は約3000秒-1より低く維持されることが好ましいはずであることが示される。実施例2.細胞懸濁液の品質パラメーターに対するTMPの影響膜間差圧TMPはTFFの重大な処理変数である。透過制御のないプロセス例えば、上記の’669号特許の場合などの間、TMPは透過流の主な推進力であり、流束を制御する。よって、高TMPは高流束および低処理時間に至らせる。そのため、我々は、明記した装置を用いて処理した細胞の品質パラメーターに対するTMPの影響を判定することに着手した。本実験では、セルファクトリー40段Nuncからおよそ29億のヒト皮膚繊維芽細胞hDFを回収し、0.5ft2サイズの中空糸フィルターGE社製PN:RTPCFP-6-D-4Mを用いて3500~3900秒-1の比較的高剪断速度で処理した。この高剪断速度は、細胞生存率を最大にしながらフィルターの汚れを最小限に抑えるために選択した。TMPは、TMP=P2P2P3式中、P1はフィルター入口圧力であり、P2はフィルター出口圧力であり、P3は透過圧力であるとして計算した。所定の装置では、図1に示す再循環ポンプおよび透過ポンプのポンプ流量の制御を通じてP1、P2および/またはP3を変えることによってTMPを制御した。実験開始時の細胞濃度は4.2×105細胞/mLであり、上記の典型的なプロセスに本質的に従って細胞を濃縮した。図3aおよび図3bは、TFFプロセス性能および製品品質に対する中度のTMPレベル5~10psiの影響を示している。処理中、TMPはフィルターの目詰まりから5psiを超えるまでに上昇したため、生存率および細胞回収率の両方に影響を及ぼした。容量減少工程中に細胞生存率は90より低く低下しダイアフィルトレーションを行う他の実験によって、処理が続く場合には生存率が80未満に低下し得ることが立証されている、これは処理中の剪断速度によるものであった可能性がある。しかしながら、高膜間差圧から処理中にほぼ90の細胞が消失したことが重要であり、この高膜間差圧によってフィルターの汚れが進み、流束がほぼゼロに減少した。結論:本実験中に細胞生存率は90より低く低下し容量減少工程だけの間、プロセス性能の不良からダイアフィルトレーションを行うことができなかった、細胞製品のかなりの部分88が消失した。さらに、>10M/mLの処方用細胞懸濁液の取得は、フィルターの汚れおよび細胞回収率の不良から達成できなかった終濃度はたった0.5M細胞/mLであった。従って、本実験によって、5psiより高いTMPが細胞生存率、最終細胞濃度および細胞回収率に悪影響を及ぼすことが示される。これは、治療用細胞製品の品質特性を維持するために処理時間流束によると他の処理パラメーターとのバランスをとることの重要性の基礎となる。さらなる研究によって、許容される少なくとも90回収率が約1psi以下のTMPを用いて得られるのに対し、約1psiより高く5psiまでのTMPは細胞回収率に対して中度の影響を及ぼし、5psiを超えるTMPは細胞回収率に対して重大な悪影響を及ぼすことが示された。図3cは、複数回のTFF実験のTMP運転中の平均、細胞回収率および細胞生存率についての傾向チャートである。実施例3.流束に対する孔径の影響TFFプロセス性能および製品品質に対するフィルター孔径の影響を調査するために、小規模3~5L実験を行った。セルファクトリー40段Nuncからおよそ30億のヒト皮膚繊維芽細胞を回収し、0.65ミクロン孔GE社製PN:RTPCFP-6-D-4Mまたは0.1ミクロン孔RTPCFP-1-E-4Mの0.5ft2サイズの中空糸フィルターを用いて処理した。実験開始時の細胞濃度は、4×105~5×105細胞/mLの範囲に及び、上記の典型的なプロセスに本質的に従って濃縮した。下記の表2は、試験したフィルター孔径の範囲および対応する製品品質パラメーターおよびプロセス性能パラメーターを示している。0.1ミクロン孔フィルターを用いた実験は透過流量流束の不良から完了することができなかった。そのため、細胞回収率および処理時間のデータは適用しないN/A図4は、TFFプロセス性能に対するフィルター孔径の影響を調査するために行った実験の流束およびTMPを示している。結論:この一連の研究によって、0.65ミクロンから0.1ミクロンへの孔径の減少はフィルターの汚れにつながり、流束は減少し、TMPは上昇し、これは最終的には最終細胞製品の重大な品質パラメーターに対して悪影響を及ぼし、多くの場合には製品欠陥生存率<80に至ることが示される。実施例4.高流束の影響TFFプロセス性能および製品品質に対する高流束の影響を調査するために、小規模3~5L実験を行った。セルファクトリー40段Nuncからおよそ30億のヒト皮膚繊維芽細胞を回収し、0.5ft2サイズの中空糸フィルターGE社製PN:RTPCFP-6-D-4Mを用いて処理した。実験開始時の細胞濃度は、2.5×105~5×105細胞/mLの範囲に及び、上記の典型的なプロセスに本質的に従って濃縮した。流束は、再循環速度を維持しながら透過流量を増加させることによって制御した。下記の表3は、達成した流束の範囲および対応する製品品質パラメーターを示している。流束は、150~350LMHの範囲に及び、剪断速度は、2000~3000秒-1の範囲に及んだ。結論:この一連の研究によって、流束単位LMHは、剪断速度およびTMPを最小限に抑え、少なくとも90の細胞生存率および少なくとも90の細胞回収率を維持しながら透過流量の制御を用いて150~350LMHの範囲で達成することができることが示される。大容量の場合にはこの高流束により処理時間の最小化が見込まれ、この最小化は製品品質に対して全体的な良い影響を及ぼす。実施例5.ヒト間葉系幹細胞hMSCの大規模バイオプロセス上記の典型的な手順および図1のTFFシステムを用い、複数のNuncまたはCorningの40段の培養容器を用いてヒト間葉系幹細胞Lonza社BioscienceのMSCを増殖させ、2~4×105細胞/mL~4×107細胞/mLまでの回収濃度から濃縮し、その際、約95の細胞生存率を維持し、本プロセスから本質的に全ての細胞を回収した。図5を参照のこと。濃縮および8~10ダイアフィルトレーション容量のヒト血清アルブミンHSA含有生理食塩水を用いたダイアフィルトレーションの後、濃縮した細胞の最終BSA残留レベルは100ng/mL未満に低下していた図6。次いで、規模拡張可能なシングルユース用システムを用いてそれらの細胞をさらに処理した。容量減少および洗浄後に、Nucleocounterを用いてhMSCを計数して、濃度および生存率を確認し、TFF処理収率を確認し、さらに処方の指針とした。約8~12M細胞/mLでProFreeze商標中7.5ジメチルスルホキシドDMSOの最終溶液を得るために細胞を処方した。処方されたhMSCを、Flexicon登録商標ポンプおよび処方バッグに接続されたシングルユース用チューブセットを用いて20mLバイアルに分注した。バイアルは、大量に大規模凍結をシミュレーションするために約200のバイアル速度制御付きフリーザーで凍結し、気相液体窒素に入れて7~14日間保存した。最終容器中で、融解時、細胞生存率図7および生細胞回収率は90をはるかに超えて維持された。TFFプロセスが処理細胞の全体的健康および生存率に対して何らかの影響を及ぼしたかどうかを評価するために、処理細胞および未処理細胞を96ウェルプレートに1ウェル当たり30,000細胞で播種し、Vialight登録商標細胞代謝生存率アッセイを用いて24時間生存率および細胞機能性をモニタリングした。重要なことには、TFFプロセスは大規模40段培養プラットフォームから回収された細胞に対してほとんど~全く影響を及ぼしていなかった図8。この一連の研究によって、増殖させ大規模培養容器に回収した臨床的に関連のある細胞すなわち、ヒトMSCを本発明のTFFプロセスを用いてうまく濃縮し洗浄することができ、残留タンパク質が除去されるのと同時に、低温保存後でも生存率および最終細胞製品の収率などの重大な品質パラメーターが維持されることが示される。これらの細胞は、未処理細胞と比べて、培養下で生物学的機能性を維持し、高濃度で低温保存することができ、処理後に優れた回収率を示す。要約すれば、これらのデータは、TFFが大規模細胞療法製造のための容量減少および洗浄についての信頼性のある方法であることを示している。実施例6.大規模25L処理運転大規模25LでTFFプロセス性能および製品品質を評価するために、本実験を行った。本実験では、複数の振盪フラスコCorning登録商標からおよそ180億のCHO細胞を回収し、1.7ft2サイズの中空糸フィルターGE社製PN:RTPCFP-6-D-5を用いて処理した。実験開始時の細胞濃度は、2.5×105~5×105細胞/mLの範囲に及び、上記の典型的なプロセスに従って、表4に示すTMPパラメーターおよび流束パラメーターを用いて濃縮し、表4には、製品品質パラメーターおよびプロセス性能パラメーターも示している。図9は、大規模25LでのTFFプロセス性能および製品品質を評価するために行った実験の流束およびTMPを示している。図10は、大規模25LでのTFFプロセス性能および製品品質を評価するために行った実験の細胞生存率および回収率を示している。結論:この研究によって、最終細胞製品の重大な品質パラメーターを維持しながらの、本プロセスの商業規模への規模拡張性が示される。実施例7.中空糸フィルター型および平面フィルター型の比較細胞処理へのフラットシートフィルター使用の実現可能性を調査するために、小規模実験を行った。これらの実験では、8~12の10段のセルファクトリーまたは1~3の40段のセルファクトリーからおよそ10億~30億の間葉系幹細胞またはヒト皮膚繊維芽細胞を回収し、中空糸フィルター0.5ft2または1ft2サイズのフィルターGE社製PN:RTPCFP-6-D-4MまたはSartorius社およびPall社製の0.1~0.65pmのフラットシートフィルターのいずれかを用いて処理した。実験開始時の細胞濃度は、4.5×105~5×105細胞/mLの範囲に及んだ。実施例1のプロセスに本質的に従って細胞を濃縮した。図11はフラットシート運転の例を示し、図12は中空糸フィルター運転の例を示している。結論:この一連の研究によって、TFFプラットフォームの種類、すなわち、中空糸またはフラットシートが、本システムの重大な品質パラメーターに実質的に影響を与えず、そして、TFFプラットフォームに関係なく、本発明によって細胞生存率および細胞回収率を達成することができることが示される。実施例8.最終細胞濃度TFFプロセスを用いての高細胞濃度達成の実現可能性を調査するために、小規模3~5L実験を行った。4~5のセルファクトリー40段Nuncからおよそ50億のヒト皮膚繊維芽細胞を回収し、0.5ft2サイズの中空糸フィルターGE社製PN:RTPCFP-6-D-4Mを用いて処理した。第2の実験では、複数の振盪フラスコからおよそ100億のチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞を回収し、全く同じ0.5ft2サイズの中空糸フィルターを用いて処理した。実験開始時の細胞密度は、約4×105~5×105細胞/mLの範囲に及び、上記の典型的なプロセスに本質的に従って細胞を濃縮した。図13は、CHO実験の過程において達成された総細胞密度TCDを時間の関数として示し、表5には、両実験についての達成された最終TCDおよび対応する製品品質パラメーターを示している。結論:この一連の研究によって、細胞生存率および回収率を維持しながら、少なくとも、5000万/mLより高い密度に細胞を濃縮し得ることが示される。他の類似実験では、本発明の方法によって1億細胞/mLを超えるTCDが達成されている。実施例9.フィルター充填容量これらの研究では、1~2のセルファクトリー40段NuncからhMSC細胞を、複数の振盪フラスコからCHO細胞を回収した。0.5ft2中空糸フィルターGE社製PN:RTPCFP-6-D-4Mを用いてhMSC細胞を処理し、1.7ft2中空糸フィルターGE社製PN:RTPCFP-6-D-5を用いてCHO細胞を処理した。実験開始時の細胞濃度は、2.5×105~5.6×105細胞/mLの範囲に及び、実施例1のプロセスに従って濃縮した。下記の表6には、フィルターの面積当たりの処理細胞の範囲および対応する製品品質パラメーターを示している。結論:この一連の研究によって、許容される細胞生存率および回収率を維持しながら、14億細胞/ft2ほど低くも、86億細胞/ft2ほど高くもフィルターに充填し得ることが示される。加えて、理論的には、フィルター充填量は少なくとも7.5億細胞/ft2ほど少なくてもよく、その際には、許容されるプロセス性能パラメーターが維持される。本発明の実施形態を記載してきたが、それらの実施形態は本発明の原理の応用の一部の例示であることは理解されるであろう。当業者ならば、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく非常に多くの修飾を行うことができる。実施例10.FTセンサーを備えたTFFシステム図13は、Lonza社で設計された、中空糸フィルターおよび生細胞密度VCD流水式センサー/検出器FTセンサーを備えた、完全に閉鎖された完全使い捨てのTFFシステムを示している。チューブ、使い捨てのセンサー図13のP1、P2、P3およびS1VCDセンサーを含むおよび処理貯槽図1のバッグ番号1は、注文組立し、ガンマ線によって滅菌した。使い捨てのVCDセンサーの使用によってTFF中の製品サンプリングがなくなり、その結果、リスクが最小限に抑えられ、製品品質および安全性が向上する。使い捨てのフィルターは、GE社から供給されたものでありRTPCFP-6-D-4M、RTPCFP-1-E-4MおよびPN:RTPCFP-6-D-5、無菌で組立を行った。この構成または非常に類似した構成で複数回のTFF運転を完了した。加えて、TFFシステムは、中空糸フィルターの代わりにフラットシートフィルターも使用し得る。フラットシートフィルターを用いて実現可能性の研究を行った。典型的なTFFプロセスは2工程-容量減少およびダイアフィルトレーション、で構成される。容量減少工程の間に、図13に示した処理バッグ内で所望の細胞濃度に達するまでバルク容量細胞培養培地がフィルターの透過物側から濾去される。容量減少工程の後にダイアフィルトレーション工程が続く。ダイアフィルトレーションの間に、濃縮された細胞がバッファーで洗浄され、不純物が除去される。典型的なTFF実験では、初代ヒト細胞ほとんどの場合、間葉系幹細胞またはヒト皮膚繊維芽細胞をセルファクトリーCorningまたはNunc登録商標で培養し、複数のバッグに回収する。TFF実験開始前に、回収した細胞のバッグを、無菌接合または他の無菌接続によって処理バッグ図13のバッグ番号1に接続し、図13に示す供給ポンプMasterflexL/Sを用いて細胞懸濁液をそのバッグに移す。VCDFTセンサーからのシグナルはアンプケーブルを通ってFogale社製のヒューマンマシンインターフェースHMIに送られる。そのシグナルはVCD基準に変換され、HMIに表示される。このVCDデータを用いて、TFF操作中に最適の最終細胞密度および/または濃縮係数が決定される。処理バッグには細胞懸濁液がバッグ容量の半分~2/3まで充填される。再循環ポンプWatson-Marlow-323EまたはSpectrumKrosFlow図1に示すとおりであるをゆっくり始動させ、目的とする速度まで上げる。次いで、透過ポンプMasterflexL/S図13に示すとおりであるをゆっくり始動させ、目的とする速度に上げる。供給ポンプおよび透過ポンプを同じサイズのチューブ3/16インチ、1/4インチまたは3/8インチIDを用いて同じ速度で運転して、本プロセスの容量減少工程中、処理バッグ内で一定の液体容量を維持する。再循環ポンプには、1/4インチまたは3/8インチIDのチューブを典型的に用い、一定の速度で運転して望ましい入口流量を得る。細胞懸濁液サンプルを定期的に収集して、NucleocounterNCまたは他の細胞計数技術を用いて細胞密度および生存率を測定し得る。典型的には、一度、バルク容量をVCDFTセンサーからのVCDデータに基づいて100~800mLの範囲内に減少させたら、バッファーバッグを処理バッグに接続することによってダイアフィルトレーション工程を開始させる。ダイアフィルトレーションバッファーの8~10容量の同等物で細胞を洗浄して、残留する培養試薬および回収試薬の減少を達成させる。処理バッグ内の容量をさらに減少させて、処方のためにVCDFTセンサーからのVCDデータに基づいて所望の細胞濃度を達成してもよい。一度、所望の細胞濃度が達成されたら、全てのポンプを停止させる。フィルターおよびチューブの細胞懸濁液を重力によって処理バッグ中に排出する。細胞計数のために処理バッグの最終サンプルを得、低温保存のために細胞懸濁液を処方し、バイアルに充填する。細胞療法プロセスの重大な品質パラメーターでは、細胞を5M細胞/mLより高く濃縮しながら細胞生存率>90を維持しなければならず、細胞機能性も維持しなければならない。この一連の構造によって、間葉系幹細胞は2~4×105から.3x107細胞/mLまで濃縮することができ、VCDセンサーシグナル誘電率がNucleocounterによる方法を用いて測定されるVCDの増加と相関することが示される図13。重要なことには、このプロセスは完全使い捨てのシングルユース用構成で行い得る。いくつかの具体的な実施形態についての前述の説明は、他者が、現在の知識を適用することによって、包括的概念から逸脱することなくそのような具体的な実施形態を様々な用途に向けて容易に修飾しまたは改変することができる十分な情報を提供しており、それゆえ、そのような改変および修飾は、開示した実施形態の均等物の意味および範囲内に包含されるべきであり、そうであることが意図されている。本明細書において使用した表現または用語は、説明を目的としており、限定するものではないことを理解されたい。図面および説明では、例示的な実施形態を開示しており、特有語を使用したが、それらは、特に断りのない限り、一般的かつ記述的な意味でのみ使用しており、限定するものではなく、それゆえ、特許請求の範囲の範囲はそのように限定されない。さらに、本明細書において論じた方法の特定の工程は別の順序で並べることができ、または工程を組み合わせることもできることは当業者ならば分かるであろう。よって、添付の特許請求の範囲は本明細書に開示した特定の実施形態に限定されないことが意図される。本明細書に引用した出願および特許の各々、ならびに出願および特許の各々において引用された各文書または参照文献各発行済み特許の審査中のものを包含する;出願引用文献、およびこれらの出願および特許のいずれかに対応するおよび/またはその優先権を主張するPCTおよび外国出願または特許の各々、および出願引用文献の各々において引用されたまたは参照された文書の各々は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。より一般には、文書または参照文献は、本明細書末尾の参照文献リスト;または本明細書自体のいずれか;において引用されており、そして、これらの文書または参照文献の各々本明細書引用参照文献、ならびに本明細書引用参照文献の各々において引用された各文書または参照文献製造業者の仕様書、使用説明書などのいずれもを包含するは、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。"