安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を得る方法であって、i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAVITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルスの主鎖を含むハイブリッドベクターを調製するステップ;およびiiプロモーターの調節下にあるAAVrepオープンリードフレームを含有する発現プラスミドを調製するステップiii細胞を発現プラスミドBでトランスフェクトし、続いて細胞をハイブリッドベクターAに感染させるステップiv細胞を選択用の抗生物質の存在のもとで培養するステップv安定してgag、polおよびrevタンパク質を発現する細胞を得るステップvi細胞にenv遺伝子を組み込むステップvii細胞を培養してgag、pol、revおよびenvタンパク質を安定して発現する細胞株を得るステップを含むものである前記方法安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を得る方法であって、i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むアデノ随伴ウイルスAAV逆方向末端反復ITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルスの主鎖を含むハイブリッドベクターを調製するステップ;およびiiプロモーターの調節下にあるAAVrepORFを含有する発現プラスミドを調製するステップiii細胞を発現プラスミドBでトランスフェクトし、続いて細胞をハイブリッドベクターAに感染させるステップiv細胞を選択用の抗生物質の存在のもとで培養するステップv安定してgag、polおよびrevタンパク質を発現する細胞を得るステップviかかる細胞にレンチウイルスtat遺伝子を組み込むステップvii細胞を培養してgag、pol、revおよびtatタンパク質を安定して発現する細胞株を得るステップviiiかかる細胞にenv遺伝子を組み込むステップix細胞を培養して安定してgag、pol、rev、tatおよびenvタンパク質を発現する細胞株を得るステップを含むものである前記方法ハイブリッドベクターの2つの発現カセットがテールツーテール配向でありかつそれぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動される、請求項1または2に記載の方法。プロモーターがCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFV、およびRSVから選択される、請求項3に記載の方法。プロモーターがCMVIEである、請求項4に記載の方法。選択マーカーがハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンまたはゼオマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。選択マーカーがハイグロマイシン耐性遺伝子である、請求項6に記載の方法。選択マーカーがIRES下流にクローニングされる、請求項1または7に記載の方法。AAVRepタンパク質がRep78である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。env遺伝子がMLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体から選択される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。env遺伝子がキメラエンベロープタンパク質RD114TRをコードする遺伝子である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。RD114TRを、5から3末端へCMVプロモーター、その配列中にRREエレメントを含有するβグロビンイントロン、およびRD114TRORFを含有する発現カセットを含むSINレンチウイルスベクターを用いて組み込む、請求項11に記載の方法。i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAVITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピーiienvの少なくとも1つのコピー:を安定してそのゲノム中に組み込んで含有する、安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。細胞が安定してゲノム中に組み込まれたHIV1tat遺伝子をさらに含有する、請求項13に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。細胞がHEK293、HEK293T、HEK293SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株である、請求項13または14に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。組込みカセットの2つの発現カセットがテールツーテール配向でありそれぞれが構成的なプロモーターおよびポリAにより駆動される、請求項13~15のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。プロモーターがCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFV、およびRSVから選択される、請求項13~16のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。選択マーカーがハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンまたはゼオマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項13~17のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。env遺伝子がMLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体から選択される、請求項13~18のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。env遺伝子がキメラエンベロープタンパク質RD114TRをコードする遺伝子である、請求項13~19のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。i請求項13~20に記載のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を培養するステップ;ii安定パッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップを含むレンチウイルスベクターを産生する方法。i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAVITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピーiienvの少なくとも1つのコピー:iii導入ベクターを安定してそのゲノム中に組み込んで含有する、プロデューサー細胞株。細胞がさらに、安定してそのゲノム中に組込まれたレンチウイルスのtat遺伝子の少なくとも1つのコピーを含有する、請求項22に記載のプロデューサー細胞株。細胞がHEK293、HEK293T、HEK293SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株である、請求項22または23に記載のプロデューサー細胞株。ハイブリッドベクターの2つの発現カセットがテールツーテール配向でありそれぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動される、請求項22~24のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株。プロモーターがCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFV、およびRSVから選択される、請求項22~25のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株。選択マーカーがハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンまたはゼオマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項22~26のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株。env遺伝子がMLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体から選択される、請求項22~27のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株。env遺伝子がキメラエンベロープタンパク質RD114TRをコードする遺伝子である、請求項22~28のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株。プロデューサー細胞株を培養するステップを含む、請求項22~30のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターを産生する方法。本発明はレンチウイルスベクターLV産生の分野に関する。いくつかの遺伝子治療の臨床試験がLVを遺伝子送達ビヒクルとして使って進行中である。全てのこれらの試験において、LV産生はまだ一過性プロトコルに基づいている。本発明はHIV1系パッケージング細胞株を作製する新しい戦略を提供する。かかる戦略は、AAVITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルス主鎖を含むハイブリッドベクター、いわゆるバキュロAAVハイブリッド系の、repタンパク質をコードするプラスミドと組み合わせての使用に基づく。この系は構造および調節HIV1タンパク質gagpolおよびrevの安定な組込みを得ることを可能にする。本発明の系は、a2つの発現カセット、すなわち、レンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードするものと他のレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードするものを含有することを特徴とするバキュロAAVハイブリッドベクター、および、brepタンパク質をコードするプラスミドを含む。提起した系は、宿主細胞をかかるレンチウイルスタンパク質で安定してかつ効果的に遺伝子操作するために、構造および調節HIV1タンパク質を送達する新しくかつ有利な道を表す。この系を用いて、構造および調節HIV1タンパク質gagpolおよびrevだけを含む第1の中間体を得た、またはこれを出発点として用いて、それぞれ調節タンパク質tatと目的のエンベロープタンパク質を含むかまたはエンベロープタンパク質だけを含む、第2および第3世代パッケージング細胞株、ならびに導入ベクターも含むプロデューサー細胞株を得た。第1中間体はHIV1gagpolおよびrev遺伝子をトリシストロンの立体配置で発現する2コピーの組換えバキュロAAVパッケージング構築物を運ぶ。かかる中間体はPK7と呼ばれて、実施例におけるPK7を意味する。ITR介在型AAVベクター組込みに必要であることが公知のAAVrep78タンパク質の一過性発現により、バキュロAAVパッケージングベクターのゲノム組込みを促進した[14]。かかる第1中間体は1年間の培養に対して驚くべき遺伝安定性を有することを示し、これは残存する遺伝エレメントの一過性トランスフェクション後の機能的LVの連続産生を証明した。さらに、かかる細胞においてサイレンシング現象は観察されなかった。さらに、非コード遺伝子内の転写活性領域中の2つの直列に組み込まれたパッケージングAAVの組込み部位を正確にマッピングすることにより、本発明者らは、そのmRNAがLVにそして究極的には宿主細胞に組み込まれうる危険遺伝子の活性化の可能性に対する安全性の論拠を与えた。第1中間体から、第2および第3世代安定パッケージング細胞株を得ることができる。特に、本発明によれば、第3世代パッケージング細胞株は、第1中間体であるPK7中に目的のエンベロープタンパク質、例えば、MLV4070env、RD114envまたはGALVenvレトロウイルスまたはその誘導体を安定して組み込むことにより得ることができる。安定な組込みはSINLV送達を用いて得ることができるが、他の遺伝子送達ビヒクルを用いてもよい。本発明者らは、実施例においてPK7RDと呼ぶ関連パッケージング細胞株を、ネコ内因性レトロウイルスおよびMLV4070env[15]の細胞質尾部から誘導したエンベロープの細胞外および膜貫通ドメインを含有するキメラエンベロープタンパク質RD114TRを組み込むことにより得た。RD114TRキメラエンベロープタンパク質組込みはSINLV送達により得た。第2および第3世代プロデューサー細胞株を得る目的で、SINTat、SINEnvおよび導入ベクターまたはSINEnvおよび導入ベクターだけをそれぞれ経時的送達により組み込んだ。概念的に、1つのベクターの組込みはその時点では時間がかかるが、相同組換えとそれによるRCL形成のリスクを減ずる。ハイブリッドバキュロAAVベクターの使用に基づく、レンチウイルスgagpolおよびrevを安定発現するために開発されたパッケージング系はMolPackと呼び、その故に、この系で開発されかつエンベロープおよび調節タンパク質としてそれぞれRD114TRおよびtat、ならびに治療遺伝子としてChim3を含有する第2世代プロデューサー細胞株は、実施例においてRD2MolPackChim3と呼ぶ。注目すべきこととして、RD2MolPackChim3クローンから誘導されたLVの力価はHEK293T対照細胞から産生されたLVの力価より2log以上高く、RD2MolPackChim3は一過性プロトコルにより産生された対応するLVより以上に機能的なLVを作製してコスト的に有利でありかつ安全な安定プロデューサー細胞株による産生のさらなる利点を有することを示す。発明の表明本発明の第1の態様によれば、i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAVITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルス主鎖を含むハイブリッドベクター;およびiiプロモーターの調節下にあるAAVRepオープンリードフレームORFを含有する発現プラスミドから成るレンチウイルスの構造および調節タンパク質を安定発現する系が提供される。好ましくは、ハイブリッドベクターの2つの発現カセットはテールツーテールtailtotail配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、プロモーターはCMVIEプロモーターである。本発明の好ましい態様によれば、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、より好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子である。好ましくは、選択マーカーは内部リボソーム侵入部位IRESの下流にクローニングされる。好ましくは、AAVrepタンパク質はrep78またはrep68から選択される。より好ましくはrepタンパク質はrep78である。本発明の他の態様によれば、レンチウイルスのgagpolおよびrevを安定して発現する細胞から成る半安定レンチウイルスパッケージング細胞株であって、かかる細胞はそのゲノム中に安定して組み込まれた少なくとも1コピーのAAVITRに隣接した組込みカセットを含有し、この組込みカセットは第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むことを特徴とする、前記細胞株が提供される。好ましくは、細胞は好ましくはHEK293、HEK293T、HEK293SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株、より好ましくは細胞株はHEK293Tである。好ましくは、2つの発現カセットはテールツーテール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され;、好ましくは、プロモーターはCMVCMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、構成的プロモーターはCMVIEプロモーターである。本発明の好ましい態様によれば、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され;より好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子である。より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。好ましくは、AAVrepタンパク質はrep78またはrep68から選択される。より好ましくはrepタンパク質はrep78である。本発明の他の態様によれば、安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を得る方法であって、i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAVITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルス主鎖を含むハイブリッドベクターを調製するステップ;およびiiプロモーターの調節下にあるAAVrepORFを含有する発現プラスミドを調製するステップiii細胞を発現プラスミドBでトランスフェクトし、続いて細胞をハイブリッドベクターAに感染させるステップiv細胞を選択用の抗生物質の存在のもとで培養するステップv安定してgag、polおよびrevタンパク質を発現する細胞を得るステップvi細胞にenv遺伝子を組み込むステップvii細胞を培養してgag、pol、revおよびenvタンパク質を安定して発現する細胞株を得るステップを含むものである前記方法である。本発明の他の態様によれば、安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を得る方法であって、i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAVITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルス主鎖を含むハイブリッドベクターを調製するステップ;およびiiプロモーターの調節下にあるAAVrepORFを含有する発現プラスミドを調製するステップiii細胞を発現プラスミドBでトランスフェクトし、続いて細胞をハイブリッドベクターAに感染させるステップiv細胞を選択用の抗生物質の存在のもとで培養するステップv安定してgag、polおよびrevタンパク質を発現する細胞を得るステップviかかる細胞にレンチウイルスのtat遺伝子を組み込むステップvii細胞を培養してgag、pol、revおよびtatタンパク質を安定して発現する細胞株を得るステップviiiかかる細胞にenv遺伝子を組み込むステップix細胞を培養してgag、pol、rev、tatおよびenvタンパク質を安定して発現する細胞株を得るステップを含むものである前記方法である。好ましくは、ハイブリッドベクターの2つの発現カセットはテールツーテールtailtotail配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、構成的プロモーターはCMVIEプロモーターである。好ましくはtat遺伝子はHIV1tatである。本発明の好ましい態様によれば、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゼオマイシン耐性遺伝子から選択され;好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは。IRESの下流にクローニングされる。好ましくは、env遺伝子は宿主細胞に、AAVベクター、レトロウイルスベクター、安定なプラスミド組込みまたは相同性組換えを用いて組み込まれる。より好ましい態様によれば、env遺伝子はSINレンチウイルスベクターを用いて組み込まれる。好ましくは、env遺伝子はMLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体から選択され;より好ましくは、env遺伝子はキメラエンベロープタンパク質RD114TRをコードする遺伝子である。好ましい実施形態においては、キメラエンベロープタンパク質RD114TRの安定な組込みのために、5から3末端へCMVプロモーター、その配列中にRREエレメントを含有するβグロビンイントロン、およびRD114TRORFを含有する発現カセットを含むSINレンチウイルスベクターを提供する。好ましくは、AAVrepタンパク質はrep78またはrep68から選択される。より好ましくは、repタンパク質はrep78である。本発明の他の態様によれば、i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAVITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピーiienvの少なくとも1つのコピー:を安定してそのゲノム中に組み込んで含有する、安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を提供する。本発明の同じ態様によれば、上記の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株はさらに、安定してそのゲノム中に組み込まれたHIV1tat遺伝子の少なくとも1つのコピーを含む。好ましくは、細胞はヒト細胞株、好ましくは、細胞株はHEK293、HEK293SF、HEK293T、TE671、HT1080またはHeLaから選択され、より好ましくは、細胞株はHEK293Tである。好ましくは、組込みカセットの2つの発現カセットはテールツーテール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、プロモーターはCMVIEプロモーターである。本発明の好ましい態様によれば、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。好ましくは、env遺伝子は宿主細胞に、AAVベクター、レトロウイルスベクター、安定なプラスミド組込みまたは相同性組換えを用いて組み込まれる。より好ましい態様によれば、env遺伝子はSINレンチウイルスベクターを用いて組み込まれる。好ましくは、env遺伝子はMLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体から選択され;より好ましくは、env遺伝子はキメラエンベロープタンパク質RD114TRをコードする遺伝子である。本発明の他の態様によれば、レンチウイルスベクターを産生する方法であって、i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAVITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピー;およびenvの少なくとも1つのコピーを安定して含有する安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を培養するステップ;iiその安定なパッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップを含む前記方法が提供される。好ましくは、2つの発現カセットはテールツーテール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMVCMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、プロモーターはCMVIEプロモーターである。好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、より好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。好ましくは、env遺伝子はVSVGenv、MLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体から選択され;より好ましくは、env遺伝子はキメラエンベロープタンパク質RD114TRをコードする遺伝子である。本発明の他の態様によれば、i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAVITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピーiienvの少なくとも1つのコピー:iii導入ベクターを安定してそのゲノム中に組み込んで含有する、プロデューサー細胞株が提供される。本発明の同じ態様によれば、上記のプロデューサー細胞株はさらに、安定してそのゲノム中に組み込まれたレンチウイルスのtat遺伝子を含む。好ましくは、細胞はヒト細胞株、好ましくは、細胞株はHEK293、HEK293T、HEK293SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択され、より好ましくは、細胞株はHEK293Tである。好ましくは、組込みカセットの2つの発現カセットはテールツーテール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、プロモーターはCMVIEプロモーターである。本発明の好ましい態様によれば、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、より好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。好ましくは、env遺伝子は宿主細胞に、AAVベクター、レトロウイルスベクター、安定なプラスミド組込みまたは相同性組換えを用いて組み込まれる。より好ましい態様によれば、env遺伝子はSINレンチウイルスベクターを用いて組み込まれる。好ましくは、env遺伝子はMLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体から選択され;より好ましくは、env遺伝子はキメラエンベロープタンパク質RD114TRをコードする遺伝子である。他の態様によれば、レンチウイルスベクターを産生する方法であって、i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAVITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピーiienvの少なくとも1つのコピー:iii目的の遺伝子をコードする導入ベクターの少なくとも1つのコピーを安定してそのゲノム中に組み込んで含有する、プロデューサー細胞株を培養するステップを含むものである前記方法が提供される。好ましくは、2つの発現カセットはテールツーテール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、プロモーターはCMVIEプロモーターである。好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、より好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。好ましくは、env遺伝子はVSVGenv、MLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体から選択され;より好ましくは、env遺伝子はキメラエンベロープタンパク質RD114TRをコードする遺伝子である。発明の詳細な説明本発明の好ましい特徴および実施形態の詳細な説明を非限定の例を用いて説明しよう。当業者は、特に断らない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の通常の技法を使うことにより本発明を実施に移すことができる。全てのかかる技法は、出版されている文献に開示されかつ説明されている。例えば、JSambrookEFFritschandTManiatis1989MolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionBooks13ColdSpringHarborLaboratoryPress;AusubelFMetal;CurrentProtocolsinImmunologych12JohnWileySonsNewYorkNY;BRoeJCrabtreeandAKahn1996DNAIsolationandSequencingEssentialTechniquesJohnWileySonsJMPolakandJamesODMcGee1990InSituHybridizationPrinciplesandPracticeOxfordUniversityPress;MJGait1984OligonucleotideSynthesisAPracticalApproachIrIPress;および、DMJLilleyandJEDahlberg1992MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymologyAcademicPressを参照されたい。全てのこれらの出版物は参照により組み込まれる。バキュロAAVハイブリッド系本発明はHIV1に基づくパッケージング細胞株を作製する新しい戦略を提供する。LV用の産生系の最適化は、LV技法に基づく遺伝子治療薬開発のために解決を要する重要な課題である。この技法を用いる臨床試験数が増加するにも関わらず、LVはかかる試験においてなお一過性トランスフェクションプロトコルを用いて作製されている。この方法では、LVの作製は未だに非常に高価でありかつ多数の患者向けには不満足である。この理由で、LV用の安定パッケージング細胞株を開発する多くの努力がなされてきた。安定なレンチウイルスパッケージング細胞株の開発における重要な課題の1つは宿主細胞を遺伝子操作するための正しいビヒクルの選定である。多くの場合、宿主細胞はプラスミドを用いて遺伝子操作で作られてきたが、かかる場合、ゲノム不安定性および遺伝子サイレンシング現象も観察されている。他の2例ではgagpolおよびrev遺伝子を安定して組み込むために、レトロウイルスベクターが使われている。今まで開発された安定パッケージング細胞株はいずれも臨床試験に用いられていない。本発明の戦略は、レンチウイルスの構造および調節タンパク質を安定して発現する系であって、第1の発現カセットはレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットはレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAVITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルスの主鎖を含むハイブリッドベクターと一緒に、プロモーターの調節下にあるAAVrepORFを含有する発現プラスミドから成る前記系の使用に基づくものである。バキュロウイルスの主鎖の存在は、いくつかの異なるタンパク質をコードする2つの発現カセットを含む大きくかつ複雑な組込みカセットの宿主であることを可能にする。得られるバキュロAAVパッケージングベクターは、わずか1回の感染処置を介して安定かつ効果的にLVを産生するために必要とするgagpolおよびrevタンパク質を用いて宿主細胞を遺伝子操作することを可能にする。バキュロAAVパッケージングベクターのゲノム組込みはAAVrepタンパク質の一過性発現により得た。この系により、非コード域の遺伝子間転写活性領域におけるAAVベクターの組込みが得られ、従って、そのmRNAがLVに、究極的には、宿主標的細胞に組込まれうる危険遺伝子の活性化を排除することができる。提示した系は、構造および調節レンチウイルスタンパク質を用いて宿主細胞を安定してかつ効果的に遺伝子操作するために構造HIV1タンパク質を送達する新しいかつ先進的な方法である。好ましい実施形態において、バキュロAAVパッケージング構築物に含まれる2つの発現カセットはテールツーテール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、プロモーターはCMVIEプロモーターである。本発明の好ましい態様によれば、AAVパッケージングに含まれる選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、好ましくは、マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。バキュロAAVパッケージングベクターのゲノム組込みは、ITR介在型AAVベクター組込み用のAAVrepタンパク質の一過性発現により得た。好ましい実施形態においては、repタンパク質はrep78またはrep68から選択される。より好ましくは、タンパク質はrep78である。この系を用いて、HIV1タンパク質gagpolおよびrevを安定して発現するように遺伝子操作された細胞を得ることが可能であった、そして本発明者らはこれを半安定パッケージング細胞と呼んだ。特に、本発明は、かかる遺伝子操作された細胞および、構造および調節タンパク質を含むそれらの第2および第3世代パッケージング細胞株、ならびに導入ベクターを含むプロデューサー細胞株を得るための使用、ならびに安定パッケージング細胞株を作製する方法を開示しかつ請求の範囲とする。半安定パッケージング細胞株本発明の半安定パッケージング細胞株は、HIV1gagpolおよびrev遺伝子を発現する組換えバキュロAAVパッケージング構築物の少なくとも1つのコピーを運ぶ宿主細胞から成る。バキュロAAVパッケージングベクターのゲノム組込みは、ITR介在型AAVベクター組込みを得る目的でAAVrepタンパク質の一過性発現により得ている。好ましくは、2つの発現カセットはテールツーテール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され;、好ましくは、プロモーターはCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択される。より好ましくは、構成的プロモーターはCMVIEプロモーターである。本発明の好ましい態様によれば、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され;好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。好ましくは、AAVrepタンパク質はrep78またはrep68から選択される。より好ましくはrepタンパク質はrep78である。半安定パッケージング細胞株を得るために遺伝子操作することができる宿主細胞は、HEK293、HEK293T、HEK293SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株であり、より好ましくは細胞株はHEK293Tである。かかる半安定なパッケージング細胞株は、半安定産生系において色々なenvおよび色々な導入ベクターを用いて潜在的に多様なLVを産出するのに好適である。これは、コスト削減を可能にするので、レンチウイルスベクターのより有効な産生に大きい利点を表し、これはgagpolおよびrevをコードするGMPグレードのプラスミドDNAを用いる必要がなく、一過性トランスフェクション中のプラスミド間の組換え事象に二次的に付随するRCL形成のリスクを減ずる。本発明の半安定なパッケージング細胞株は、1年間の培養に対して驚くべき遺伝安定性を有することを示し、これは残りの遺伝エレメントの一過性トランスフェクション後の機能的LVの連続産生を証明した。さらに、非サイレンシング現象が実際に観察され、この中間体を用いて得たレンチウイルス粒子の力価と感染性の両方が1年間影響されないで残った。かかるデータは選択圧力の存在または非存在の両方で確認された。注目すべきこととして、文献においてAAVITR介在型カセットの組込み安定性に関する比較しうるデータは見当たらない。唯一の関連情報は、野生型AAV血清2型AAV2で感染したヒト骨髄由来の繊維芽細胞様細胞株RuddlesDetroit6細胞は潜伏状態で少なくとも47および118継代の間、ウイルス配列を維持したことである[1617]。実施例に示したように、本発明の半安定なパッケージング細胞株は少なくとも102継代の間、生存した。安定パッケージング細胞株本発明は、安定レンチウイルスパッケージング細胞株を得る方法を提供する。かかる方法は、2つの発現カセットすなわち、レンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードする発現カセットとレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする第2の発現カセットを含有する組込みカセットの少なくとも1つのコピーを安定に組み込むバキュロAAVパッケージング構築物の使用に基づく。このカセットの安定な組込みは、宿主細胞におけるITR介在型の安定な組込みを可能にするrepタンパク質の共トランスフェクションによって得ることができる。このように遺伝子操作した宿主細胞を次いで抗生物質の存在のもとで培養し次いでクローニングする。得られる半安定パッケージング細胞株は第2および第3世代レンチウイルスパッケージング細胞を作製するための出発点である。特に第3世代安定パッケージング細胞株はさらに所望のenvタンパク質を組み込むことによって得られる。第2世代安定パッケージング細胞株は最初にHIV1Tatタンパク質、次いで所望のエンベロープを組込むことによって得られる。エンベロープタンパク質とHIV1tatは、AAVベクター、レトロウイルスベクター、安定なプラスミド組込みまたは相同性組換えを用いて、宿主細胞に安定して組み込むことができる。好ましくはエンベロープタンパク質とHIV1tatをHIVSINベクターを用いて宿主細胞に組み込む。いくつかの種類のエンベロープタンパク質を用いることができ、例えば、MLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体が挙げられる。より好ましくは、前記env遺伝子はキメラエンベロープタンパク質RD114TRをコードする遺伝子である。RD114TRエンベロープタンパク質を安定して組み込むため、最初にCMVプロモーター調節下のRD114TRORFを運ぶpCMVRD114TRプラスミド由来のBamHIBamHI断片を含有するSIN構築物を開発した。この構築物はRD114TRタンパク質を作製しなかった。SINRD114TRLV構築中の思いがけない発見によって、CMVプロモーターとRD114TRORFの間に必ずβグロビンイントロンを含まねばならないことが判った。一般に、SINLVの関係に包含される細胞およびウイルスの遺伝子発現カセットの大多数は、ベクターのSDとイントロンのSAの間のスプライシングおよびその結果としての発現カセットに含有されるプロモーター切除のリスクの故に、イントロンエレメントを欠く。この落とし穴を回避するために、2つのRREエレメントSDとSA配列の間の正準SINLV立体配置におけるものとβグロビンイントロン内のものを運ぶ新しいSINLVを作製した。この発見に基づいて、RD114TR産生を得るための思いがけないβグロビンイントロンの必要性は、RD114TRORF中の、またはSINRD114TR構築物中に存在するRD114TR停止コドンおよび3BamHI制限酵素部位からの領域を包含する328bp断片中の不安定性もしくはネガティブ断片の存在を反映しうることを論じた。GENEARTAGRegensburg、Germanyが実施したGeneOptimizer支援による配列分析は、RD114TR遺伝子および328bp断片全体にわたって悪いコドン使用を持つコドンを確認し、本発明者らの仮定を理由付けた。さらに、コドン最適化分析は、コドン適合指数CAIが065から098へ改善したことを示したここで、CAI=1は最適を意味する。それ故に、原理的に、RD114TRをRDMolPackに組み込むための、MLVに基づくもしくはHIVに基づくSINベクターを用いる代わりのかつより簡単な手法は再コードしたRD114TRを用いることであろう。そこで、コドン最適化配列を含有する構築物を調製しかつ試験した。対照的に、コドン最適化は、βグロビンイントロンの非存在においてもRD114TR前駆体タンパク質PR翻訳を可能にすることを見出したが、意外にも、高レベルのPRはSUおよびTMサブユニット中のフーリンfurinによってプロセシングされなかった。従ってRD114TRは、CMVプロモーターとRD114TRORFの間の構築物中にβグロビンイントロンを含むHIVに基づくSINベクターを用いて、首尾よくパッケージング細胞株に組み込まれた。好ましい実施形態においては、5から3末端に向けて、CMVプロモーター、配列中にRREエレメントを含有するβグロビンイントロンおよびRD114TRORFを含有する発現カセットを含むSINLVが提供される。本発明は、i上記の安定パッケージング細胞株を培養するステップii半安定パッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップを含む、LVを産生する方法を提供する。現在臨床試験で使われているLVの産生はまだ全ての必要なタンパク質の一過性トランスフェクションに基づいている。対照的に、本発明の方法およびパッケージング細胞株は安定な産生を可能にする。特に、本発明の方法に用いるバキュロAAVハイブリッド発現系は有利なことに、わずか1回のトランスフェクション/感染とクローニングで、構造gagpolおよび調節revHIVタンパク質の安定かつ安全な導入を可能にする。かかる発現系を用いて得た中間体はサイレンシング現象を示さず、そして、LV産生用の迅速かつ効果的なプロトコルを開発するための非常に重要なツールである第2および第3世代パッケージング細胞株の開発を可能にする。本発明の安定なパッケージング細胞株を用いてコスト効果的かつより安全な産生が可能である。実際、全体のトランスフェクションが存在しないことは、コスト削減を可能にしかつ潜在的にRCLの形成に導く組換え事象の可能性を減ずるものである。さらに、本発明の方法で得られる安定なパッケージング細胞株は、一過性プロトコルで産生したLVに少なくとも比較しうるかまたはそれより高い力価をもつLVを産生することができる。プロデューサー細胞株プロデューサー細胞株は、目的の遺伝子GOIをコードする導入ベクターを安定して組み込むことにより達成することができる。本発明はさらに、かかるプロデューサー細胞株を培養するステップを含む、LVを産生する方法を提供する。注目すべきこととして、第2世代安定パッケージング細胞株実施例では、RD2MolPackChim3クローンと呼ばれるから産生されるLVの平均力価と感染能力は、HEK293T対照細胞から産生されるLVのそれより2対数以上高く、RD2MolPackChim3は一過性プロトコルにより産生される等価のLVよりも機能的なLVを作製することを示す。興味深いこととして、クローンRD2MolPackChim314は懸濁液中で自発的に増殖しかつその産生するLVの力価は、SupT1細胞で10×106TUmlであり、そしてCD34HSCで05×106TUmlである。実施例一般的方法プラスミド野生型HIV1gag、polおよびrev遺伝子を、pCG719pKLgagpol以後、簡略化のためにCMVGPRと呼ぶ図1a、模式図13およびpCG720pKrev以後、CMVRevと呼ぶ図1a、模式図9プラスミドからそれぞれMluINarIおよびMluINotI消化により切除した27。そのウイルス遺伝子を2つの異なる発現カセット各カセットはCMVIEプロモーターにより駆動され、polyA配列を運ぶに入れて、GatewaypENTRTM4シャトルベクターInvitrogen、Co、Carlsbad、CA中にテールツーテール配向で挿入した。第1のカセットはgagとpol遺伝子を発現するが、第2のカセットはrev遺伝子と選択マーカーハイグロマイシン耐性hygro遺伝子を発現し;hygroはIRESの下流にクローニングしてバイシストロンbicistronic翻訳を可能にした。2つの発現ユニットを感染性AAVゲノムを運ぶ組換えpSUB201プラスミドのXbaI部位中に導入した18。得られる5ITRCMVGagPolpolyApolyAhygroIRESRevCMVITR3カセットを次いで切除し、GatewaypENTRTM4シャトルベクター中に挿入した。組換えハイブリッドバキュロAAVパッケージングベクターバキュロAAVGPR図1a、模式図1を、2つのカセットを含有するpENTRTM4シャトルエントリーベクターとBaculoDirect直鎖DNABaculoDirectTMバキュロウイルス発現系InvitrogenCoとの間のバクテリオファージλ部位特異的組換え系を用いて得た。相同組換え中に、BaculoDNAのポリヘドリン遺伝子はその際、GPR二重カセットで置換えられた。pABCMVRep78発現プラスミドCMVAAVRep78は、Recchiaetal200419に記載の発現ベクターpABS43のCMVIEプロモーター下のAAVrep78ORFをクローニングすることにより得た図1a、模式図8。pMDGプラスミドCMVVSVG20は小胞性口内炎エンベロープ糖タンパク質VSVGをコードする図1a、模式図10。第3世代導入ベクター、pCCLsinPPThPGKeGFPWPREAmpSINeGFP21は構成的プロモーターhPGK下のeGFP遺伝子図1a、模式図6を発現する。抗HIV1Chim3トランスジーンを発現する第2世代PΔNChim3導入ベクターはPorcelliniら200920102324に記載されている図1a、模式図7。SINRD114TRベクター図1a、模式図3~5は次の異なる戦略に従って、ネコ内因性レトロウイルスRD114エンベロープの細胞外および膜貫通ドメインから作られたキメラRD114TRエンベロープおよびAMLVenv4070Aの細胞質テールTRをコードするpCMVRD114TRCMVRD114TR図1a、模式図11プラスミドから切除したRD114TRORFを用いることにより構築した22。概略を述べると、CMVRD114TR、CMVRD114TRINおよびCMVRD114TRINRREカセットをそれぞれSINpolyMluIベクターSINeGFPベクターの改変バージョンであって、hPGKeGFPカセットが除去され、EcoRVMluISmaIMluINotISacIBglIIBamHISalIポリリンカーで置換されたのMluI部位中にクローニングした。SINRD114TRINおよびRD114TRINRRE構築物それぞれ、図1a、模式図4および5はCMVRD114TRベクター図1a、模式図11中に存在するウサギβグロビンイントロンを含有する。SINRD114TRINRREにおいて、PCR分析の節で記載したPCRで増幅した230bpRREエレメントをβグロビンイントロンエレメントのScaI部位中に組み込んだ。第2世代パッケージングpCMVΔR874CMVGPRT構築物図1a、模式図12はHIV1gag、pol、revおよびtat遺伝子をコードする25。SINTatベクター図1a、模式図2は、CMVGPRTプラスミド図1a、模式図12由来のtat遺伝子をpIRESpuro3ClontechLaboratoriesIncaTakaraBioCompanyMountainViewCAのEcoRI部位中に挿入することにより、次いでバイシストロンのCMVTatIRESpuroカセットをSINpolyMluIベクターのMluI中にクローニングすることにより構築した。細胞SpodopterafrugiperdaSf9昆虫細胞InvitrogenCoは10FCSEuroCloneLtd、UKおよびペニシリンストレプトマイシンとグルタミンPSGの組み合わせを補充したTC100培地InvitrogenCoの懸濁液中で27°CにてCO2の非存在のもとで増殖した。ヒト胎児腎293THEK293T細胞およびその誘導体クローンPK7およびPK7誘導体は10FCSおよびPSGを補充したDulbecco改変Eagle培地DMEMで増殖した。CEMA301およびSupT1T細胞は10FCSおよびPSGを補充したRPMI1640中で増殖した。CD34造血幹細胞HSCおよび新生児白血球は臍帯血UCBからFicollHypaque勾配遠心分離LymphoprepNycomedPharmaASOsloNorwayで精製した。勾配分離の後、回収したUCB単核細胞環から、CD34マイクロビーズキットおよびMiniMACS分離カラムMiltenyiBiotecSunnyvaleCAを用いてポジティブ選択により、CD34HSCを単離した。CD34細胞純度92はFACS分析FACSCaliburBDBioscienceSanJoseCAおよびFlowJoソフトウエアTreeStarIncAshlandORにより、抗CD34PEAbBDPharmingenTMSanDiegoCAを用いて確立した。CD34細胞はヒト幹細胞因子hSCF100ngmlRDSystemsMinneapolisMN、hFlt3L100ngmlPeprotechRockyHillNJ、hIL620ngmlRDSystemsおよびヒトトロンボポエチンhTpo20ngmlPeprotechを含有する20血清Iscove改変Dulbecco培地IMDMで24時間、前刺激し、形質導入の間、同じ培地中で維持した。新生児白血球は48時間、RPMI中の可溶性抗ヒトCD330ngmlOrthocloneOKT3JanssenCilagUKおよび組換えヒトIL2rhIL250UmlChironEmeryvilleCAで刺激し、次いで、10FCS、PSG、およびrhIL2を補充したRPMI中に保った。RD2MolPackChim314クローンは25FCSを含有するDulbecco培地DMEMで増殖するように次の通り適合させた:すなわち、細胞を回転振とう器上の125ml振とうフラスコ内で120rpm、37°Cにて5CO2加湿大気中で増殖し、15×106細胞mlの密度とした。生存率は≧70に維持され、細胞は05×106細胞mlで分裂し、そして培地を毎日変えた。複数の継代にわたってFCSは10から5へ25へ減少した;各血清の変更は少なくとも2回の培養継代後に実施した。バキュロウイルス産生とHEK293T細胞のバキュロGPR感染組換えハイブリッドバキュロAAVGPRDNAゲノムを運ぶバキュロウイルスをGateway登録商標適合化バキュロウイルスDNAシステムInvitrogen、Coを用いてBaculoDirect法に従い作製した。組換えバキュロウイルス力価をプラークアッセイにより評価すると、Sf9細胞中の3継代のウイルス増幅後に1×1011pfumlに対応した。15×106HEK293T細胞を4μgのAAVrep78発現プラスミドでトランスフェクトし、24時間後に組換えバキュロAAVGPRに1000のMOIにて感染することによりPK7クローンを得た。細胞をハイグロマイシン無しで4日間維持し、次いで5×105細胞を、ハイグロマイシン100μgmlの連続希釈濃度の存在する22枚の10cmディッシュに播いた。22枚のディッシュをELISAによるp24gag産生についてスクリーニングした。細胞を37×104細胞ディッシュで播いたわずか1枚のディッシュが上清中に十分なp24gagを放出した。このディッシュは40コロニーを含有し、それらを全て拾い上げてスクリーニングした。そのうちの、p24Gag産生に対してポジティブの評価を得た3コロニーをさらに特徴付けた。LV産生と力価測定HEK293T細胞から産生される偽型LVは、次のプラスミド:パッケージング構築物CMVGPR第3世代またはCMVGPRT第2世代、VSVGまたはRD114TRエンベロープ構築物、および第3世代SINeGFP26または第2世代PΔNChim323もしくはPΔNeGFP導入ベクターの一過性共トランスフェクションにより得た。パッケージング:エンベロープ:導入ベクターの比は、特に断らない限り、65:35:10μgDNAであった。PK7クローンからのLVはenv発現プラスミドと導入ベクターを共トランスフェクトすることにより作製したが、PK7RDおよびPK7Tat7RDクローンから産生したLVは適当な導入ベクターだけをトランスフェクトすることにより得た。一過性トランスフェクションは標準Caリン酸法またはFugene6登録商標系を用いて製造業者の取扱説明書RocheDiagnosticsCorporationIndianapolisINに従って実施し、類似の結果を得た。上清をトランスフェクション後48時間に収穫し、045μmフィルターを通して濾過した。力価を、SupT1、CEMA301、一次活性化末梢血液単核細胞PBMCおよび臍帯血由来のCD34HSCについて、実験の型に応じて計算した。概要を説明すると、SupT1と一次活性化末梢血液単核細胞細胞はポリブレン8μgmlSigmaAldrichStLouisMOの存在のもとで2サイクルのスピノキュレーション1240×g、1時間により形質導入し、一晩静置して相を分離し;CD34HSCは24時間レトロネクチンをコーティングしたプレートTakaraBio、Otsu、Japan上でポリブレン無しで形質導入した。形質導入効率はeGFP発現SINeGFPのフローサイトメトリー分析FACSCaliburBDBioscienceSanJoseCAまたはPorcellinietal2009および20102324に記載のFlowJoソフトウエアTreeStarIncAshlandORを用いるΔLNFGR発現PΔNChim3によってモニターした。5~20ポジティブ細胞の範囲の形質導入値だけを用いて、次式:TU細胞数×GFP100volsupmlでに従って各LV調製物の力価を計算した。力価に基づくクローンスクリーニングのプロトコル選択を促進するために、本発明者らは全てのPK7誘導体サブクローンをその上清のLV力価を計算することによりスクリーニングした。本発明者らは、LVを作製するためのCaリン酸に基づく小規模の1または2プラスミドの共トランスフェクションを設定し、その効力を次いで小規模形質導入プロトコルによるSupT1細胞について計算した。概略を説明すると、6×104ウエルPK7誘導体細胞を48ウエルプレートに播いて、24時間後、機能的LVを得るために必要な残りのプラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、200μlの培養上清を用いて、75×104mlの濃度で播いた3×104ウエルSupT1細胞を形質導入した。力価閾値スコアは≧1×102TUmlを課した。ノーザンおよびサザンブロットアッセイノーザンアッセイ全RNAをTrizol試薬LifeTechnologiesTMIncGaithersburgMDにより製造業者の取扱説明書に従って抽出した。5μgサンプルを08アガロースホルムアルデヒドゲル上に流し、キャピラリートランスファーによりHybondN膜上に移し、最後にPerfectHybPLUSハイブリダイゼーションバッファー中の1×106dpmmlの32P標識550bpRD114TRプローブSigmaChemicalCorpStLouisMOで探索した。徹底的に洗浄した後、メンブランをX線フィルムに70°Cにて曝した。サザンブロットアッセイゲノムDNAgDNAをQIAampMiniキットQIAGENGmbH、Germanyにより製造業者の取扱説明書に従って単離した。バキュロウイルスDNAをウイルス粒子からQIAampDNAマイクロキットQIAGENにより抽出した。示した制限酵素を用いて一晩消化後、10μgのgDNAを08アガロースゲルに流し、サザンキャピラリートランスファーによりナイロン膜上にブロットしDuralonStratageneTXUSA、次いでPerfectHybPLUSハイブリダイゼーションバッファー中の1×106dpmmlの32Pランダムプライムド標識した600bpCMVまたは11kbGPRカセット、250bptat、600bpChim3、および500bpRD114TR特異的プローブとハイブリダイズさせた。徹底的に洗浄した後、メンブランをX線フィルムに70°CにてまたはホスホイメージャーMolecularDynamicsSunnyvaleCAに曝した。分析用PCR分析1ngSINeGFPベクターをDNAテンプレートとして、およびプライマーのセット:RREフォワード:5AGTACTGGAGCTTTGTTCCTTGGG3;RREリバース:5AGTACTAAATCCCCAGGAGCTG3を、次のPCR条件:98°Cにて7分間、30サイクルの94°Cにて30秒間、50°Cにて30秒間、および72°Cにて30秒間で用いることにより、230bpRREアンプリコンを得た。AAVRep78プラスミドの残りの組込みのスクリーニングに対するPCR分析を300ngのゲノムDNAについて、プライマーのセット:AAVRep78フォワード:5CGGGCTGCTGGCCCACCAGG3;AAVRep78リバース:5ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTG3を次のPCR条件:98°Cにて7分間、30サイクルの94°Cにて30秒間、66°Cにて30秒間、および72°Cにて15分間で用いることにより、実施した。2つのGPRカセットの配向を確立するためにPCR分析を300nggDNAについて、プライマーのセット:revフォワード:5CTTGAGGAGGTCTTCGTCGC3;βグロビンリバース:5CCCTGTTACTTCTCCCCTTCC3;revネスト化フォワード:5TGTCTCCGCTTCTTCCTGCC3;βグロビンネスト化リバース:5TTAACCATAGAAAAGAAGGGG3を次の条件:98°Cにて2分間、35サイクルの94°Cにて30秒間、52°Cにて30秒間、および72°Cにて15分間で用いることにより実施した。p24gagELISA培養上清中の物理的LV産生をAllianceHIV1p24抗原ELISAキットPerkinElmerLifeandAnalyticalSciencesIncWalthamMAにより製造業者取扱説明書に従い、1pgp24gagが1×104物理的粒子に対応すると仮定して測定した。ウェスタンブロット分析PK7細胞から誘導した全細胞および核抽出物ならびに単離された細胞を含まないVLPまたはLV由来のウイルスタンパク質を先に記載のように調製した2324。タンパク質をSDSPAGEによりサイズ分画し、HybondECLニトロセルロース膜GEHealthcare、LifeSciences、UKLtd、UKにエレクトロブロットした。膜を5低脂肪ドライミルクでブロックし、次いで適当な一次Abとインキュベートした。AIDS患者から得た抗HIV1血清を1:2000希釈で用い;タンパク質の外部ドメイン中の2つの15量体ペプチドaa95109、QNRRGLDLLTAEQGGおよびaa6579、SGIVRNKIRTLQEELを認識する抗RD114TRウサギ血清22を1:500希釈で用い;そしてHIV1revMoAbRev6sc69730およびアフィニティ精製したウサギポリクローナル抗YY1AbC20sc281SCruzBiotechnologyIncSCruzCAおよびマウス抗p24gagAcrisAntibodiesGermanyをそれぞれ1:200、1:1000および1:500希釈で用いた。Ab結合を強化化学発光系ECLECLAmershamにより、製造業者の取扱説明書に従って可視化した。リアルタイムTaqManPCRによるベクターコピー数VCN定量組み込まれたベクターのベクターコピー数VCNをABIPrism7900FAST計器AppliedBiosystems、FosterCity、CAを用いる定量TaqManPCRにより確認し、SDS23ソフトウエアAppliedBiosystemsにより分析した。PCR条件は次の通りである:50°Cにて2分間および95°Cにて5分間、次いで40サイクルの95°Cにて15秒間および60°CGAG標的配列については01°Cサイクルの増分でにて15秒間。gDNAは次のプライマーとプローブを用いて増幅した。ライゲーション介在型LMPCR6ゲノムDNAをPK7細胞からQIAampDNAMiniキットQIAGENにより製造業者の取扱説明書に従って抽出し、そしてBglIIおよびBamHIを用いて37°Cにて一晩消化した。5GATC3粘着末端と適合しうるアダプター76bpオリゴヌクレオチドリンカーのライゲーションを標準条件で実施した。LMPCRは次のネスト化プライマーのカップルを用いて行った:ITRフォワード:16s:5GTAGCATGGCGGGTTAATCA3、および17sロングネスト化:5TTAACTACAAGGAACCCCタグTGATGG3;リンカーリバースプライマー:リンカー1:5GTAATACGACTCACTATAGGGC3およびリンカー2ネスト化:5AGGGCTCCGCTTAAGGGAC3。リンカー配列は5GATCGTCCCTTAAGCGGAGCCCTAタグTGAGTCGTATTACCAGGGAATTCGCCTCGGGATATCACTCAGCATAATG3に対応する。2ラウンドのLMPCRをAmpliTaqGoldDNAポリメラーゼAppliedBiosystemsを用いて行い、それぞれ30サイクルから成った95°Cにて30秒間、52°Cにて30秒間、72°Cにて2分間。PCRアンプリコンをTOPO登録商標クローニングキットInvitrogen、Coを用いてクローニングし、そしておよそ100~200bpのインサートを運ぶプラスミドコロニーを選択し、配列決定を行った。配列相同性はBLASTサーチ、NCBIにより同定した。蛍光insituハイブリダイゼーションFISH分裂中期染色体はPK7細胞をコルヒチン10μgmlSigmaC9754で37°Cにて2時間処理することによって得た。リン酸バッファー生理食塩水PBSで洗浄した後、細胞を低浸透圧溶液75mMKCl中に室温にて6分間保持し、メタノール/酢酸3:1で4回洗浄して固定し、次いで清浄なガラススライド上に延ばした。細胞遺伝子サンプルを70ホルムアミド溶液中で2分間72°Cにて変性し、冷温の70、85、および95エタノールの連続洗浄により脱水し次いで空気乾燥した。特異的プローブを次の通り調製した:GPRカセットを含有する13kbプラスミドDNAはランダムプライムドDNA標識キットRocheAppliedScience、Indianapolis、INを用いてSpectrumOrangeTMdUTPVysis、Inc、DownersGrove、ILで標識したが、ヒトhox4遺伝子を含有する対照30kbコスミドDNAはFISHBrightTM核酸標識キットKreatechBiotechnology、Amsterdam、TheNetherlandsを用いて標識した。ハイブリダイゼーションは、5ngμlの各プローブを含む250μlの50ホルムアミド、2×SSC、および10硫酸デキストランおよび50ngμlのヒトC0T1DNAハイブリダイゼーションバッファーInvitrogenをインキュベートすることにより実施した。サンプルを変性したプローブで10分間75°Cにてコートし、Parafilm登録商標Mで覆い、そして一晩37°Cにて加湿室でインキュベートした。サンプルを1回、04×SSC中で、pH=7、72°Cにて2分間;1回、4×00025Tween20を含有するSSC中で、pH=7、RTにて30秒間;ならびに2回、PBS1×RTにて1分間洗浄した。スライドを002μgμlの496ジアミジノ2フェニルインドールDAPISigmaで対比染色した。可視化と写真撮影はNikon80i正立顕微鏡NikonInstrumentsSpA、Italyで、FITCおよびスペクトルオレンジ色スペクトルオレンジ色フィルター照明を用いて行った。画像はGenikonソフトウエアNikonで処理した。第1中間体PK7クローンの作製第2または第3世代LVの連続産生用のRDMolPackパッケージング細胞株を得るために、いくつかのHEK293T由来の中間体クローンを開発した。最初のものは、PK7と名付けられ、組換えハイブリッドバキュロAAVベクターrhバキュロAAVGPR図1a、模式図1を使ってHIV1gag、polおよびrev遺伝子を安定して組み込むことにより得た。この送達系は、一過性で与えられるAAVrep78タンパク質のインテグラーゼ活性を利用し、AAVITR隣接組込みカセットを切除してヒト染色体中に組み込む図1b。rhバキュロAAVベクターはBaculoDirectLinearDNAとITR隣接GPRカセットを含有するGateway登録商標pENTRTM4エントリープラスミドの間の相同組換えにより作製した図1a、模式図1。Sf9昆虫細胞における3サイクルp3の組換えバキュロウイルス増幅の後、ハイブリッドバキュロAAVDNAの力価と潜在的組換え事象をプラークアッセイおよびウイルスのゲノムDNAサザンブロットによりそれぞれチェックした。p3における力価は6×1010pfumlに対応し、サザンブロット分析は単一の鋭いバンドを現し、ウイルス増幅プロセス中に組換え事象が無いことを示した図5。次に、AAVRep78プラスミドトランスフェクションおよびrhバキュロAAV感染の用量および時間ならびに感染したHEK293T細胞のクローニング条件を注意深く規定した図1c。実際、これらの実験設定の選択は結果的に重要であった。このように広範囲の条件を試験した後に、最終的に確立したのは、単一用量のAAVrep78プラスミドDNAをトランスフェクトしてから24時間後における1000のMOIでのバキュロAAV感染が最良の実験設計に対応することであった。さらに、22枚の90mmペトリディッシュに配給した合計5×105細胞の播種、すなわち、各ディッシュに異なる濃度で播いてかつ播種から4日後にハイグロマイシン100μgmlを加えて播くことが最大数の細胞クローンを得る最良の条件であった。数えた360クローンのうちわずかに3クローン、PK7、PK17およびPK18が100pgmlの設定閾値を上回った。クローンのサザンブロット分析は、各クローンが2コピーの正しいサイズのベクターを含有することを明らかにした図2a。残りのAAVRep78プラスミドDNAの組込みの可能性を排除するためにrep78特異的PCRをPK7gDNAについて行い、ポジティブシグナルを検出しなかった図5b。GPRカセットから発現されたHIV1タンパク質発現パターンを3つのPKクローンおよび培地に放出されるそれらに整合するウイルス様粒子VLPのウェスタンブロットによりモニターした。全てのウイルスタンパク質は適当に処理され、サイズが正しく、そして正しい相対比率であった図2b。SupT1細胞について、VSVGプラスミドおよび第3世代導入ベクターSINeGFP表1で共トランスフェクトした後の3つのクローンから産生したLVの効力を計算することにより、将来役立つPKクローンを選択した。注目すべきは、一過性トランスフェクションにより産生された対照HEK293TLVの力価はPK7およびPK18LVより5倍以上高かったが、その感染性はPKLVとほとんど同一であり、PKクローンは、品質の視点で通常の方法により産生したものと比較しうることである表1。PK7とPK18LVの効力は類似しているが、形態学、増殖、生存率およびp24Gag産生値の評点がPK18クローンより優れているPK7クローンをさらなる遺伝子操作の対象に選定した表1。次に、PK7クローン中のITR隣接カセットの組込みを定量LMPCR、TaqManPCR図2cおよびFISH技法図2dにより徹底的に特徴付けた。組込み部位を正確にマッピングするために、染色体2、2q321図2cにおける分断点にスポットライトを当てたLMPCR研究を行った。この結果を、アーム長とセントロメア位置に基づいて染色体2中に単一スポットを当てた特異的GPRプローブとのinsituハイブリダイゼーションにより確認した図2d。この位置付けを確認するために、染色体2q312中にマッピングすることが公知であるHox4プローブを用いた。HEK293T細胞は三倍体であり、Hox4は正しく全ての3つの染色体2中に検出された図2d。最後に、定量TaqManPCRによって2つのコピーが組込まれたこと、および、適当なプライマーの設計をしたネスト化PCRによって2つのコピーが縦列配向、テールツーヘッドであることが確認された。テールツーヘッド配向は、野生型AAVおよびほとんどのrAAVベクターコンカタマーの宿主細胞ゲノム中への組込みに対して観察される自然な立体配置である17。テールツーヘッド接合点を包含するアンプリコンの配列分析は、303bpの第1カセットの3CMVプロモーターと共に第1および第2カセットのITRおよび第2カセットの全5CMVプロモーターが喪失したことを明らかにした図2e、赤色ボックス。このベクター-細胞の組換え事象の大部分は実際にはベクターのITR配列内で起こる。この再配列はPK7細胞に第2カセットのgagpol遺伝子の転写欠如および恐らく第1カセットのrevおよびhygro遺伝子の転写欠如を生じさせる。しかし、記載に値するのは、欠失されたCMVプロモーターの残された285bp領域模式図の中央の灰色三角形はなお、1つもしくは2つのrevおよびhygro遺伝子の転写を駆動するのに十分なTATAボックスを含有しうることである。結論として、PK7は2つの組込まれたカセットを含有し、これらが共同で1つのgagpol遺伝子および1つもしくは2つのrevおよびhygro遺伝子を転写する。PK7クローンの長期にわたる安定性を実証するために、細胞をハイグロマイシンの存在または非存在で420細胞倍加に対応する350日間培養し、そして細胞当たり基準でのp24Gag産生を測定した表2。ハイグロマイシンの存在のもとでの平均産生は1534±847SDngp24Gag1×106細胞に対応するが、抗生物質の非存在のもとでは670±351SDngp24Gag1×106細胞である表2。この相違はおそらくハイグロマイシン薬物圧がhygro耐性遺伝子およびそれによりクロマチンの転写も同様にonに保つという事から導かれるようである。これはgagpol遺伝子のより高い転写を好都合にしうる。PK7クローンから作製されるVLPが100の倍加後にでも機能的であるかどうかを評価するために、PK7細胞にp60およびp102にてVSVGエンベロープとSINeGFP導入ベクターを共トランスフェクトし、そしてLV効力を計算した。注目すべきは、選択薬物の存在および非存在共に、産生されたLVの力価と感染性はかかる時間の延長後でもなお通常のレベルを維持した表1。これらのデータは薬物圧の存在または非存在に関わらず、GPRカセットの遺伝子不安定性を実証し、将来の特徴付け試験におけるハイグロマイシンの使用を回避することを容認した。AAVITR介在型カセットの組込み安定性に関する比較しうるデータは文献に見当たらない。唯一の関連情報は、野生型AAV血清2型AVV2に感染したヒト骨髄由来の繊維芽細胞様細胞株RuddlesDetroit6細胞が少なくとも47継代および118継代の間、潜伏状態でウイルス配列を維持したことである。注目すべきこととして、PK7細胞は少なくとも102継代の間生存した。第2世代RD2MolPack用の第2中間体PK7Tat7クローンの開発第2世代RDMolPack図1cの開発に向けた次のステップは、SINLV送達を用いる、HIV1調節因子TatのPK7細胞中への安定な組込みにある図1、模式図2。細胞を2サイクルのスピノキュレーションにより形質導入し次いでピューロマイシン選択後の限定希釈によりクローニングした。11個の増殖クローンを拾い上げ、p24gag産生に基づく第1スクリーニング後に、Tat発現を、≧5ngp24gag1×106細胞価を示す5個のクローンから得た核抽出物を用いてウェスタンブロットにより確立した。PK7Tat5とPK7Tat7クローンだけが高レベルのtat図3aおよびp24gag図3bを提示した。従って、これらの2つのクローンだけを、TaqManPCRにより確立することにより、PK7Tat5は12個のおよびPK7Tat7は6個の遺伝子を含有することを特徴付けた;LV効力も残るVSVGエンベローププラスミドおよびPΔNeGFP第2世代導入ベクターを共トランスフェクトすることにより測定した。両方のクローンの力価は対照細胞より2対数値低かったが、感染性は1対数値だけ低かった表3。これに基づいて、PK7Tat7を中間体クローンとして選択し、続いてこのクローンにRD114TRエンベロープを組込んだ。SINRD114TRINRREベクターの構築RD114TRエンベロープをSINLV送達によりPK7およびPK7Tat7クローン中に加える数多くの試みのうちの第1は、SINRD114TRベクター図1a、模式図3の構築であった。この目的のために、SINeGFPベクター図1a、模式図6のPGKeGFPカセットをCMVRD114TRカセットで置換したが、このカセットは元来のCMVRD114TRプラスミド図1a、模式図11中に存在するβグロビンイントロンを含有しなかった。SINベクターのパッケージングシグナル上流に位置する強いスプライスドナーSDのcPPTエレメント上流に位置するスプライスアクセプターSAとだけでなくさらにβグロビンイントロンのSAとにより駆動される多重スプライシング事象を恐れて、βグロビンイントロンを最初に構築物から排除したのである。後者の場合、実際、スプライシングはCMVプロモーターをベクター図1、模式図6のゲノムDNAから除去しうる。驚いたことに、このSINベクターおよび同じ発現カセット立体配置をもつ全ての中間体プラスミドはRD114TRタンパク質を産生しなかった。実際、SINRD114TRを用いてトランスフェクションTFまたは形質導入TDした細胞から得た細胞抽出物をウェスタンブロットにより分析すると、RD114TRタンパク質のレベルはCMVRD114TR対照プラスミドから得たものと比較して、不検出であった図4a、レーン1~3。ノーザンブロット分析は、プラスミドのPK7細胞中へのトランスフェクション後に作製されるSINRD114TR特異的転写物は全長FLおよび単一スプライス転写物に対応するが、内部CMVRD114TRカセットのそれに対応しないことを示し図6、レーン1および2、効率的なRD114TR転写物蓄積にはβグロビンイントロンが必要である可能性を示唆した。これらの発見に基づいて、予期しなかったRD114TR産生を得るためのβグロビンイントロンの必要性はRD114TRORF中の不安定性またはネガティブ配列の存在を反映しうることを論じた。GENEARTAGRegensburg、Germanyが実施したGeneOptimizer登録商標を用いた配列分析は、悪いコドン利用がRD114TR遺伝子全体に広がることを確認し、本発明者らの仮定を理由付けた。さらに、コドン最適化分析は、コドン適合指数CAIを065から098に改善することを示したここで、CAI=1が最適である。それ故に、βグロビンイントロンをベクター設計に含ませる必要を避けるために、全RD114TRORFを介してコドン最適化を行った。コドン最適化はβグロビンイントロンの非存在においてもRD114TRPR翻訳を可能にすることを見出した、しかし、意外にも、高レベルの前駆体タンパク質PRは、当然のはずのSUおよびTMサブユニット中のフーリンfurinによるプロセシングがなされないことがわかった図4a、レーン7。非常に低い量のプラスミドDNA10pgDNA106細胞トランスフェクション後ですらタンパク質分解切断は記載されてないので、大量の無処理PRの蓄積が基質過剰の二次的なものである可能性は除外された。それ故に、1以上のサイレントな突然変異がタンパク質の転写/翻訳の比率を改変し、そのために、正しいフォールディングおよびおそらくはフーリン依存性切断着手の可能性に支障を来したのであろうと結論した。そこで、βグロビンイントロンを含有するWTRD114TRを発現する他の2つのベクター、SINRD114TRINおよびSINRD114TRINRRE配列図1a、それぞれ模式図4および5を作製した;後者では、βグロビンイントロン内に余分なRREを埋め込んでスプライシングを保護した。SINRD114TRINベクターはトランスフェクション後に大量のタンパク質を産生する図4a、レーン6、しかしSINRD114TRINを形質導入された細胞中にタンパク質は存在しない図4a、レーン7。この発見はノーザンブロット分析により支持され、不検出の全長ゲノムRNAを示し、800bpβグロビンイントロンの存在によってSINRD114TRのそれより遅く移動すると予想された図6、レーン3および4、ExpFL、全長。対照的に、大量のスプライスされたRNAがβイントロンのSDおよびSAの作用により誘導された図6、レーン3および4。注目すべきは、SINRD114TRINRREベクター中のRREは、トランスフェクションおよび形質導入されるPK7細胞図4a、レーン8および9およびそれぞれのVLP図4a、レーン10および11の両方におけるエンベロープ発現を可能にするために必要かつ十分であることが観察された。VLP中に組込まれたRD114TRは正常にプロセシングされ、高レベルの膜貫通サブユニットTMおよびTMを示した後者はSandrinetal200422が示したようにTMサブユニットのウイルスのプロテアーゼによる切断から得られる。PR分子と共移動するはずのRD114TRSUサブユニットは本発明者らが用いた特異的抗RD114TRにより検出されない。次に、本発明者らはSINRD114TRCOINRREベクターを作製し、タンパク質産生およびプロセシングについて試験した。今までのところ、このベクターから産生されるタンパク質は適当に産生されずかつプロセシングされなかった図4a、レーン13。この結果から、RD114TRの正しい産生のために唯一の利用可能な構築物はSINRD114TRINRREであると結論した。RD2MolPackを得るためのPK7Tat7RD19クローンおよびRD3MolPackを得るためのPK7RD32クローンの開発以上提示した結果に基づいて、RD114TRエンベロープをPK7Tat7およびPK7クローンの両方に、VSVG偽型SINRD114TRINRRELV送達により安定して組込んだ。PK7Tat7細胞をスピノキュレートし、限定希釈によりクローニングした。次に、第2世代PΔNeGFP導入ベクター表4の形質導入後に産生したLVの力価を計算することにより、9つのクローンをスクリーニングした;RD114TRのレベルはウェスタンブロットにより調節しそしてTaqManPCRだけによりこれらのクローン、すなわち、PK7Tat7RD3、PK7Tat7RD12、およびPK7Tat7RD19クローン図4bに組み込まれたコピー数は力価≧1×105TUmlを示した。PK7Tat7RD19クローンを選択したが、その理由は、これが最高の力価およびSINRD114TRINRRELV組込みコピー数図4b、括弧内の数字について良い量のRD114TRを産生したからである。次いで、PK7Tat7RDクローンを作製するために採用したのと同じ形質導入、選択、クローニングおよびスクリーニングプロトコルを続けて、RD114TRをPK7細胞中に組込んだ表5。選んだPK7RD26、PK7RD28およびPK7RD32細胞をウェスタンブロットおよびTaqManPCR技法により試験した図4c。PK7RD26クローンを選んだが、その理由は、これが低い力価のLVを産生するという事実にも関わらず、他の選択したクローンと比較しておよび祖先PK7クローンと比較してもなお最高レベルのp24gagを産生するからであった表7。興味深いことに、PK7RD28とPK7RD32クローンの間のRD114TRコピー数の顕著な差異図4c、括弧内の数字にも関わらず、RD114TRTMサブユニットのレベルは両者で等価であり、SINRD114TRINRREベクターの一部はPK7RD32クローンにおいて機能的で無いに違いないことを示唆した。そこで、PK7RD26クローン中の高レベルのp24gag産生と恐らく高レベルのRD114TRタンパク質を組み合わせるために、さらに2サイクルのSINRD114TRINRRE組込み、選択およびクローニングを行い、第1サイクルからサブクローンPK7RD2672を、および第2サイクルからサブクローンRD267210を得て、RD114TRの数を2から11および次いで22へ、そして力価を70×102から11×104および最終的に27×105へそれぞれ増加した図4d、括弧内数字。第2世代RDMolPackChim3安定なプロデューサー細胞株の開発最後の第2世代RDMolPackパッケージング細胞を得るために、抗HIVAIDS遺伝子治療の関係で詳しく特徴付けられている治療遺伝子Chim3の導入ベクターPΔNChim3[23、24]図1a、模式図7をPK7Tat7RD19細胞に組込んだ。標準スクリーニングプロトコルの後に、3つのクローンPK7Tat7RD19Chim32、PK7Tat7RD19Chim33およびPK7Tat7RD19Chim314表6を選んでさらに特徴付けを行った。懸濁液中で自発的に増殖するので、PK7Tat7RD19Chim314クローン以後、RD2MolPackChim314と呼ぶを選択した。このクローンは2か月近くの間、培養で生存し、力価をSupT1細胞で測定すると3TU細胞日であることを実証した。さらに、RD2MolPackChim314細胞は5FCSを含有するDMEM培地で正常に生存しうるが、25FCSを含有するDMEM培地で増殖するように適合させると、その生存度は減少した図3d。その増殖特性はバイオリアクターにおける大規模培養の可能性にとって重要である。組込まれたChim3LVの高コピー数にも関わらず、サザンブロット分析を用いて観察したウイルス遺伝子の再配列は観察されず、組み込まれたベクターの遺伝的安定性を与えることも実証した図3c。全く、RD2MolPackChim314クローンから産生されたLVの力価は、SupT1またはCD34細胞のいずれかについて計算すると、残りのプラスミドで一過的にトランスフェクトしたPK7およびHEK293T対照細胞から産生されたLVのそれより高かった表6。参考文献