"ヒトサイトメガロウイルスHCMVのUL79、87又は95遺伝子オープンリーディングフレームORF中に突然変異を生じさせることにより、これらの遺伝子の1つ若しくは複数からの発現が低下又は消失している、弱毒HCMV。前記突然変異が、ORF中への塩基の挿入によるものである、請求項1に記載の弱毒HCMV。前記弱毒HCMVからの感染性ウイルス増殖は野生型ウイルスと比較して低下しているが、ウイルスDNA複製は野生型ウイルスと同等である、請求項1又は2に記載の弱毒HCMV。後期ウイルスmRNAの発現が野生型ウイルスと比較して低下している、請求項1~3のいずれか1項に記載の弱毒HCMV。請求項1~4のいずれか1項に記載の弱毒HCMVを有効成分として含む、HCMV感染の予防又は治療用ワクチン。アジュバントをさらに含む、請求項5に記載のワクチン。請求項1~4のいずれか1項に記載の弱毒HCMV又は請求項5若しくは6に記載のワクチンを非ヒト動物に免疫して抗体を作製するステップ、及び該抗体を回収するステップを含む、抗HCMV抗体の作製方法。前記抗体がヒト抗体である、請求項7に記載の方法。本明細書において、本発明者らは、HCMVのORFであるUL79、87及び95が、後期ウイルスmRNA及び感染性ウイルス産生に必須であるが、ウイルスDNA複製には必須ではないことを示す。UL87タンパク質とUL95タンパク質はウイルスDNA複製の前にウイルスゲノムと組み立てられて、ウイルスのUL44タンパク質及びUL122IE2タンパク質ならびに細胞の転写因子TBPを含む微小フォーカスを形成することが明らかとなった。UL79、87又は95ORFに突然変異を導入することにより、HCMVの弱毒ウイルスを作製することを本発明の目的とする。本発明者らは、ヒトサイトメガロウイルスHCMVのUL79、87及び95タンパク質が、感染性ウイルス増殖には必要とされるが、ウイルスDNA複製には必要とされないこと、真性後期ウイルスmRNAの産生に必須であることを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは、HCMVのUL79、87又は95遺伝子ORFを突然変異させた弱毒HCMVを作製し、本発明を完成させた。具体的には、本発明は、以下の特徴を有する。1ヒトサイトメガロウイルスHCMVのUL79、87又は95遺伝子オープンリーディングフレームORF中に突然変異を生じさせることにより、これらの遺伝子の1つ若しくは複数からの発現が低下又は消失している、弱毒HCMV。2前記突然変異が、ORF中への塩基の挿入によるものである、上記1に記載の弱毒HCMV。3前記弱毒HCMVからの感染性ウイルス増殖は野生型ウイルスと比較して低下しているが、ウイルスDNA複製は野生型ウイルスと同等である、上記1又は2に記載の弱毒HCMV。4後期ウイルスmRNAの発現が野生型ウイルスと比較して低下している、上記1~3のいずれか1つに記載の弱毒HCMV。5上記1~4のいずれか1つに記載の弱毒HCMVを有効成分として含む、HCMV感染の予防又は治療用ワクチン。6アジュバントをさらに含む、上記5に記載のワクチン。7上記1~4のいずれか1つに記載の弱毒HCMV又は上記5若しくは6に記載のワクチンを非ヒト動物に免疫して抗体を作製するステップ、及び該抗体を回収するステップを含む、抗HCMV抗体の作製方法。8前記抗体がヒト抗体である、上記7に記載の方法。本発明によって、ウイルス複製が抑制された弱毒化ヒトサイトメガロウイルスHCMVを提供することができ、該弱毒化ウイルスは、ワクチンとして使用することができる。前述したように、本発明は、HCMVのORFであるUL79、87及び95が、後期ウイルスmRNA及び感染性ウイルス産生に必須であるが、ウイルスDNA複製には必須ではないとの知見に基づく。具体的には、UL79、87若しくは95ORFに突然変異を導入することによりこれらのORFの発現を低下又は消失させることによって、ウイルス複製の抑制、ひいてはHCMVの弱毒化を可能にした。ホルマリンなどの化学物質での処理による弱毒化では、外被エンベロープタンパク質の変性などの問題も生じかねないが、本発明の弱毒化ウイルスは天然ウイルスの構造を保持するという利点を有する。<HCMV>本発明の対象であるヒトサイトメガロウイルスHCMVは、すべてのウイルス株を包含するものとする。HCMVは、ヘルペスウイルス科βヘルペスウイルス亜科に属し、その直径が約180nmで約230kbpの塩基数からなる二本鎖DNAウイルスである。HCMVの株には公知の株が含まれ、例えば、AD169株、Towne株、Major株、BT1943株、Davis株、Merlin株、Toledo株、3157株、6397株、3301株、C87株などが知られているDolan,A.ら,2004,J.Gen。Virol.85:1301-1312;Chee,M.S.ら,1990,Curr.Top.Microbiol.Immunol.154:125-169。上記のHCMV株のゲノム配列は、例えばGenBankNCBI、米国などに蓄積されたデータから入手可能である。例えば、一般によく知られているAD169株及びTowne株のゲノム配列はそれぞれGenBank登録番号FJ527563、AY315197として登録されている。HCMVは、ヒト線維芽細胞、例えばヒト包皮線維芽HFF細胞ATCC-CC2509やヒト胎児線維芽細胞、ヒト内皮細胞、例えばヒト毛細血管内皮細胞HMVECATCCCC-2527やヒト網膜色素内皮細胞RPEATCCC4000-1などのヒト細胞に感染することができる。したがって、これらの細胞に、HCMV又はそのウイルスベクター、例えばHCMVゲノム配列とBAC細菌人工染色体配列から作製されたHCMVBAC、を感染又は導入することによってウイルスDNAを回収することができるDunn,W.ら,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,10024:14223-14228。HCMVのUL79、87及び95ORFは、後期転写のためのウイルストランス作用因子として知られるMHV-68のUL18、24及び34と相同性を有するが、本願以前にはその機能は未知であった。本発明者らは、以下の実施例に示すように、これらのORFが、感染性ウイルス増殖には必要とされるが、ウイルスDNA複製には必要とされないこと、真性後期ウイルスmRNAの産生に必須であることを見出した。例えば、HCMVTowne株GenBank登録番号:AY315197のUL79、87及び95ORF配列は、以下の通りである。他のHCMV株のUL79、87及び95ORF配列も、GenBankなどの公知の遺伝子バンク又は文献などから入手可能である。UL79ORF塩基配列配列番号1:atgatggcccgcgacgaagagaaccccgccgtcccgcgggtccgcacaggcaaattctcctttacttgcgccaatcatctaatattacagattagcgagaagatgtcgcgcggacagccgctgagctcgctgcgtttggaagaactcaaaatcgtacgcctcatctgcgtcctcctctttcaccgcggtctcgaaacgctgctactgcgcgaaactatgaacaacctgggtgtctcggaccacgccgtgcttagccgcaagacgccgcaaccctactggcctcatctgtaccgcgaactgcgccaggccttcccggggctggactttgaggcggccgtgttcgatgaaacacgcgccgcccgtctcagccagcgcctgtgtcacccgcgcttgagcggcggactgctgacgcgctttgtgcagcgccacaccggcctgccggtcgttttccccgaagacctggcgcgcaacggcaacatcctcttctccctaggcacgctctacggacaccgcctgtttcgtctggcggccttcttcacacgccactggggtgccgaagcgtacgaacccttgattcgcatcatctgtcaaaaaatgtggtacttttatctcatcggcaccggcaagatgcgcattacccccgacgccttcgagatccagcggagtcgacacgaaacgggcatttttacctttattatggaagattacagaacgttcgccggcacgctgtcccggcacccgcaccgtccgcacccacaacagcagcagcaccaccaccccggtcccccccatcctcctctttctcaccctgcctcgtcctgtctcaacccagaggccgtactggccgcccgcgcccttcatatgccgacgctggctaacgacgtgtgaUL79ORFアミノ酸配列配列番号2:MMARDEENPAVPRVRTGKFSFTCANHLILQISEKMSRGQPLSSLRLEELKIVRLICVLLFHRGLETLLLRETMNNLGVSDHAVLSRKTPQPYWPHLYRELRQAFPGLDFEAAVFDETRAARLSQRLCHPRLSGGLLTRFVQRHTGLPVVFPEDLARNGNILFSLGTLYGHRLFRLAAFFTRHWGAEAYEPLIRIICQKMWYFYLIGTGKMRITPDAFEIQRSRHETGIFTFIMEDYRTFAGTLSRHPHRPHPQQQQHHHPGPPHPPLSHPASSCLNPEAVLAARALHMPTLANDVUL87ORF塩基配列配列番号3:atggccggcgctgcgccgcgccgcctcggctgcgacgctctaatagtcgtcggcggctccgctacgccgcgccgggttttacacgtccccgtgcacgttcgcgcctgcaacctcacccaagagctatcgacgggcgaggacgcccgcttctgtcgtccgcgacccgttaacgtcgaacgggtacgcgctgttttcgcggctctctaccgtgcctgtcccgtacacgcgaggaccgagtccgagcgtgtcaagctggtactgggtcgtctgttgctgggacccgtggccgtaccctgtttttgcgacggtgaagtggagggccacggcgagcatctggtacccacgacgcagttttgtcgcgggccgctgctctacgtgcaccgacgttgttgttgcggatccgtgaccgccgggcgcgcgctgtcctaccacgttctcgaaaaccacgtggccacgcatgtgttacgcggattgctctcgctgacggaatggaatcgagagttgccgggccttttttgcgactgtcctggcagcggtggcgccttgggaaccgaggaacgctacgccatggcctgcttgccgcgcgacctcagcctgcacctggacgactatccttacctgatggtggaaatcggacgcgtactcagcgtcagcgaggtagacgactacgtaaccgccgtctccggctacctgggcgaggccgcggcgccgcgcattcaggttcactacaagctgctctttggactcaacgtgcgtccgcaagcgccgtgcgcgttggacgctacacgcgacttttttctgctggagctgcaaaagctttggctgggcgttgaatatcaccacgaagtcacgtcggagtttttcggtcgcgtactggctcagctgcatcgcgaccgcgcccgcgtcatgatggcacttcgcttgcccgagcagacggtgtgccacctaagcaccttcgttctcagtcgcttcaagcgacaggtactgtacttcaagttacaggtgagctacggcaagtgccggactggccacgctgacagaagtgggggagggggaaacggtggaagtcagggacaccacaacctactgtgttatcgacgtcttagcgtcacgtttgccgacacggacacggtgtggagaaaccttttctacgtttattatgaactagctcgggatctggggtcccatgggacagaggaccgatccgtaagccgcggttacggtgtttcttgcgctccgaggacgtcgcggctaccaccgtcagaaccgacggtggtttcagccaacggacacgcgctgtcttccaccgcgctcccgacgacgagcgcgggtcacaagctgtcgctgccgcgcgacccggccgcagatcgcgttcgacgttacgtgtgcattatctcgcgtctcatgttcgcccggtatggggagagatggcgtaaacaccgtcgacggcggtcggagacgggagaagaggaggaggaagagacggtggaatcgggggagactgacgccacgccgccatttgactttacggggcagcagctgcgccgggcctatcaggaacaccgacgtcgtaaacatctagccgtgcagcgttacgcgccgtgccgtcgtaagctcatcggcgggatggagtttgccgaggtgacgggcgttagtctggaccgcatcgccgtcaacgctttcaacaccaaccgcgttatcaatatgaaggccgcactctcgtccatcgccgcgtcgggtctcggcgtgcgcgcgccgcggcttcccaagaacatgacccacagttttgtgatgtacaagcacaccttcaaggagcccgcttgcaccgtcagcacttttgtttccaacgacgccgtctacatcaactcgctcaacgtcaatattcgcggttcctatcccgagtttctgtactcgctgggcgtgtaccggctgcacgttaatatcgatcacttctttctgccggccgtggtgtgcaacagcaactcctcgctggacgtgcatgggctggaggaccaggcggtgatccgctcggagcgcagcaaggtgtactggaccaccaactttccgtgcatgatctcgcatactaacaacgtcaacgtgggttggttcaaagcggctacggccattgtgccgcgcgtctcgggcgctgacctggaagccattctgctcaaagaactctcgtgcatcaagaacatgcgcgacgtgtgcatcgattacggtctgcatcgcgttttcacgcaactagagctgcgcaattcgtaccagatccccttcctggccaagcagttggtgctgtttctgcgtgcttgcctgctcaagctgcacggtcgagagaagcggctgcagttggaccgcctagtatttgaggcggcacagcggggtctctttgactacagcaagaacctcacggcgcacaccaagatcaagcacacttgcgcgctcatcggcagtcgtctagccaacaacgtgcccaagatcctggcccggaacaaaaaagtcaaattggatcacctgggccggaacgccaacgtgctgacggtgtgtcggcacgtggaagcccacaagatccctcgcacgcgcctcaaagtgttagtcgaggtgctgggcgcgttgcagagtatcagcggtacgccgcacacgcgtgaagtgatccaccagacgttgtttcgattgtgctcggcggccgcagccacctcgggcctgtgttcatcccctcccccattgtgtgtgtcctcatcttcctccgccccttctgtcccaacctccgtcagcgttgacggcagttctgaacccacgtcgccgcgagcgcggtttgcatcacgatgaUL87ORFアミノ酸配列配列番号4:MMEAAAAAAAAFRPEERPTPGWHDAALLMDDGTVREHAFRNGPLSQLIRRVLPPPPDAEDDVVFASELCFYCSGRFNRRSSVFSIYWQKHSDLVYALTGITHCAKLVVECGQLGSGRLRWRDGDVGGEERRGDDDSRDELYDVPGIYMIRVNDGGSTGPRHVIWPGTSVLWAPDVVITTVQRRISAARALVNTFRQYFFLLERRSHEELVLCPPEMEERLAPLLQSATRGDSDMFDGVVASAYHRLRISNIPRSSARLLEHCVGLAGAKKLLLLDVPRLENYFLCQVCLYELDEDEMGEEMLGMLAGKPEDAAVSGASGGFLLHRKTMKLAACLCLLLNSLHLHQEALEALDPPPPRVEENDLVNVVLRRYYRSHGGVQARTLAAARALLADYAETFSPLGSFTRLGYDRLVSADAGVSRRHLVALLRAUL95ORF塩基配列配列番号5:tgatggcggcggcggtggtgcgagcggaggttaggcggcagcggcgagaggagaggaaaaagatggcggccgcgaggacgacggaggatccacccgaaaaccacgttgttgcggacgtggcttgtgggacgggcgccgtcactcgttcgtcttcgtcgtccctagtggtgtcgtcttcctcggcgtcaggctcggacgaaccttcctccgcctctcctctcagtttccccgtctgctccccctcaactgccgtcaggtctccggggtccgccggggtttcaacgtccctgtgctcggtggaacggatggtcgagctgtcggcgcagtctccggccgccgatttctcggtctccgaggcttggcgcttcgaggaggccgtaaatatggcgctggtggcctgcgaggccgtgtcaccttacgatcgctttcgcctaattgaaacgcccgacgagaatttcttgttggtcaccaacgtaattccgcgcgagtcggccgaggtgccggtgttggatagcagtagcagcggtggcgatagcgggccggaggacaaaaagaaaaacgtcgggaataaaaccgcgggggaaaagaacggcggtgggtctcgggccaaacgccgtcgtagacgacgcgctccgaaaaacgacgccgccacgccgtcttttctacgtcgacacgacgtgctggagcgtttcgcggccgcggctgagcctttgccgtcgctttgtgtgcgtgattatgcgttacgcaatgctgaccgtgttacctacgacggcgaattaatctacggcagttacctgttgtatcgcaaggctcacgtggagctgtcactctccagcaacaaggtgcaacacgtggaagccgtgctgcgacaggtgtacacgccgggcttgttagatcatcacaacgtgtgcgacgtggaggccctgctgtggctgctgtactgcggaccgcgtagcttttgcgcgcgtgacacctgtttcggtcgcgaaaaaaacggttgtcctttccccgcgttgttgcccaaactcttttacgaacccgtgcgggactatatgacctacatgaatctggctgagctgtacgtctttgtttggtatcgcggctacgaattccctgcgccgacgccgcaggcgacgacggcgggtagtggtggcggcggcggggccggcgcttgtgcggtcgagacgagcgcgtcagcaggccgggtcgatgacgccggcgacgaggtgcatttgcctttaaagcccgtctcgctggaccgtctcagagaggtgttgcaggcggtgcgcggccgcttctcggggcgcgaggtgcccgcctggccggcctcgtcgcgcacctgtttgttgtgcgcgctctacagtcagaaccgtctctgtttagatctcgcgcgtgacgaggcgcggaccgtgagttatagccccatcgttatccaagactgcgccgcggctgtcaccgacgtcactttgagccacatcttgcccggccagagcaccgtctcgcttttccccgtctaccacgtcggaaagttgctggacgccctctcgctgaacgacgcgggtctcatcacgttgaatctatgaUL95ORFアミノ酸配列配列番号6:MMAAAVVRAEVRRQRREERKKMAAARTTEDPPENHVVADVACGTGAVTRSSSSSLVVSSSSASGSDEPSSASPLSFPVCSPSTAVRSPGSAGVSTSLCSVERMVELSAQSPAADFSVSEAWRFEEAVNMALVACEAVSPYDRFRLIETPDENFLLVTNVIPRESAEVPVLDSSSSGGDSGPEDKKKNVGNKTAGEKNGGGSRAKRRRRRRAPKNDAATPSFLRRHDVLERFAAAAEPLPSLCVRDYALRNADRVTYDGELIYGSYLLYRKAHVELSLSSNKVQHVEAVLRQVYTPGLLDHHNVCDVEALLWLLYCGPRSFCARDTCFGREKNGCPFPALLPKLFYEPVRDYMTYMNLAELYVFVWYRGYEFPAPTPQATTAGSGGGGGAGACAVETSASAGRVDDAGDEVHLPLKPVSLDRLREVLQAVRGRFSGREVPAWPASSRTCLLCALYSQNRLCLDLARDEARTVSYSPIVIQDCAAAVTDVTLSHILPGQSTVSLFPVYHVGKLLDALSLNDAGLITLNL<弱毒化>本発明では、HCMVのUL79、87又は95ORFを突然変異させることにより不活性化して、HCMVを弱毒化する。本明細書中で使用される弱毒化との用語は、ウイルスの毒性すなわち、感染性及び病原性を減弱させることを意味する。ORFの不活性化は、ORFから最終的に翻訳されるタンパク質の発現を阻害すること、又は機能が抑制されたタンパク質を発現させることを意味する。ORFを不活性化させるための突然変異は、例えばORF配列の一部若しくは全部を別のヌクレオチド配列によって置換すること、又はORFの内部での配列の欠失、付加若しくは挿入によって行なうことができる。好ましくは、ORFの内部への別の配列の挿入により、ORFを不活性化する。しかし、ORFの機能を阻害することができれば、突然変異の程度例えば配列同一性の程度、突然変異の方法などは限定されないものとする。UL79、87又は95ORFが不活性化されることにより、HCMVの複製が抑制される。本発明により、ORFへの突然変異の導入によって、組み換えHCMVの複製能が約1/10以下、1/50以下、好ましくは1/100以下に抑制される。本発明の組み換えHCMVは、HCMVのUL79、87又は95ORFの一部又は全部に突然変異を導入したゲノムDNAを、適切なベクターを利用して作製し、これを適切な宿主細胞、例えば上記のヒト線維芽細胞やヒト内皮細胞に感染させ、組み換えウイルス粒子を回収することを含む手順によって作製することができる。突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発法、相同組み換え法などの公知の方法によって導入することができる。部位特異的突然変異誘発法は、例えば、野生型HCMVのUL79、87又は95配列の一部又は全部に突然変異を導入し、それに隣接する野生型配列と同一の十分な長さの配列を配置したヌクレオチド配列を合成し、クローニングベクターに導入して大腸菌などの細菌中にサブクローニングすること、野生型HCMVゲノムDNAを含む人工染色体ベクター、例えば細菌人工染色体BAC、PACを作製し、次いで、上記ヌクレオチド配列を人工染色体ベクターにアニーリングし、PCRを行い、目的DNAを増幅することなどを含む。具体的な方法として、例えば大腸菌内でバクテリオファージλ組み換えタンパク質exo、beta及びgamを発現するための迅速相同組み換え系Ellis,H.M.ら2001Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98:6742-6746、HCMVのBAC細菌人工染色体DNADunn,W.ら2003Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:14223-14228;Lee,E-C.ら2001Genomics,73:56-65;Borst,E-M.ら1999J.Virol.,7310:8320-8329などを使用して突然変異誘発を行なうことができる。組み換えのためのHCMVの二本鎖DNAは、カナマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子と70bp程度の相同ウイルスDNA配列を含み、この耐性遺伝子には、34bpの最小FRT部位を連結させることができる後述の実施例1参照。UL79、87又は95ORFの突然変異体を作製するために、適切なプライマーを使用してPCRによる増幅を行なう。PCR条件は、例えば、94°C2分の変性を1サイクル、94°C15秒の変性、55°C30秒のアニーリング及び72°C1分の伸長を30サイクル、並びに72°C5分の伸長を1サイクルとするPCRサイクルプログラムからなる。PCR増幅産物をフェノール-クロロホルムで抽出し、95エタノールで沈殿する。残存する鋳型DNAを除去するため、PCR産物を制限酵素を用いて消化したのち、得られたDNA断片を、HCMV-BACDNAを含むコンピテント大腸菌へ、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム法などの手法、好ましくはエレクトロポレーションを用いて形質転換する。カナマイシン耐性遺伝子を欠失させるために、組み換えHCMV-BACDNAを大腸菌に形質転換する。また、リコンビナーゼを発現するプラスミドpCP20Hahn,W.ら2003Virology,307:164-177を、組み換えHCMV-BACDNAを含む大腸菌DH10Bに形質転換する。カナマイシン耐性遺伝子を含まないHCMVBACDNAを、アンピシリン及びクロラムフェニコール含有LBプレート上で選択する。HFF細胞などの細胞を、リン酸カルシウム沈殿法によって、プラスミドpSVpp71の存在中、上記の各組み換えBACでトランスフェクションする。約10日後にウイルスプラークが出現し、100細胞変性作用CPEの7日後に、細胞外液を回収し、約1:10に希釈したものと未希釈のものを調製し、HFF細胞などの細胞に感染させ、組み換えウイルスを回収する。このとき、ウイルスの選択は、ORFに所望の突然変異が導入されていることを配列決定によって確認すること、及びHFF細胞などの細胞に導入又は感染させてウイルス複製が抑制されていることを確認し、また、野生型の表現型と同一又は本質的に同一であることを確認することによって行なうことができる。<ワクチン>本発明はさらに、弱毒化HCMVを含むことを特徴とする、HCMV感染症を治療又は予防するためのワクチンを提供する。ワクチンは、一般に生ワクチンと不活性化ワクチンに大別される。特に生ワクチンは安価に製造可能であることや接種回数が少なくても高い効果が期待できるなどの利点を有するが、同時に毒性復帰にリスクを有する。本発明の弱毒化HCMVは、顕著にウイルス複製が抑制されたウイルスであるため、安全性の高い生ワクチンとして使用可能であると考えられる。本発明のワクチンは、AIDS患者、臓器移植患者などの免疫抑制患者、胎児、乳幼児、高齢者、重症患者などの抵抗性が低下したヒトに対し、肺炎、肝炎、網膜炎、胃腸炎などを含む広範な疾患を引き起こす可能性のあるHCMV感染の予防及び治療のために使用可能である。HCMVは、血液、尿、唾液などを介して感染するウイルスであり、上記のヒトに感染すると重症化する場合がある。そのような感染を抑制するために、本発明のワクチンは有効である。本発明のワクチンは、適切な賦形剤、特に希釈剤、例えば滅菌水、生理食塩水、リンゲル液、緩衝液などとともに処方することができる。また、ブドウ糖、トレハロース、エタノール、グリセリンなどの添加剤を含有させることができる。さらにまた、免疫応答を増強させるためのアジュバント、例えば水酸化アルミニウムalum、ムラミルジペプチド、サポニン類、リポ多糖、リポゾーム、消化性ポリマーGupta,R.K.etal.,Vaccine13:1263-12761995などをその有効量で含有させてもよい。さらにまた、安定化剤を添加することも可能であり、安定化剤としては、ゼラチン、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、ポリソルベートなどの界面活性剤、スクロース、トレハロースなどの糖類、メチオニン、リジンなどのアミノ酸類などが挙げられる。投与方法は、例えば皮下、筋肉内又は皮内注射、鼻腔内などの粘膜投与を含む。鼻腔内投与の場合、噴霧器による投与が望ましい。投与量は、例えば103~1011PFUウイルス/kg体重、又は1回あたり10μg~10mgの用量であるが、この範囲に制限されない。ワクチンの投与量は、患者などの被験体の状態、年齢、体重、性別、重症度などを考慮に入れて、医師の裁量で判断されるべきである。被験体は、1回又は2回以上の投薬を受容でき、複数回投与の場合、1週間~1ヵ月以上の間隔、例えば2、3、5、12、18又は24ヵ月間隔で投与することができる。<抗体の作製>本発明はさらに、上記弱毒化HCMVを非ヒト動物に免疫して抗体を生成させ、該抗体を回収することを含む、抗HCMV抗体の作製方法を提供する。抗体は、IgA、IgG、IgD、IgE、IgMのいずれのクラスでもよいし、またIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2などのいずれのサブクラスでもよい。さらにまた、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、組み換え抗体のいずれでもよい。組み換え抗体には、例えば単鎖Fv抗体scFv、単鎖ダイアボディscDbなどが含まれる浅野竜太郎、生化学、7712:1497-15002005。抗体フラグメントには、例えばFab、Fab’2、Fvなどがある。また、抗体には、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体なども包含され、好ましい抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。抗体の作製は、慣用の方法で行なうことができる。ポリクローナル抗体は、弱毒化HCMV粒子を動物に免疫し、抗血清、さらにIgG画分を回収することによって作製できる。モノクローナル抗体は、弱毒化HCMV粒子を免疫した動物例えばマウス、ラットなどから脾臓を取り出し、脾臓細胞又はリンパ球とミエローマ細胞とを融合させ、該HCMV粒子抗原と特異的に免疫反応する抗体をスクリーニングすることによって作製できる。ヒト抗体は、ヒト抗体産生非ヒト動物例えばKMマウス、XenoMouseを用いて作製することができる。あるいは、弱毒化HCMV粒子を免疫した動物のゲノムから抗体遺伝子を回収し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各CDR1~CDR3コード配列を決定し、ヒト抗体遺伝子の本来のCDR1~CDR3コード配列を前記CDR1~CDR3コード配列と置換することを含む遺伝子組み換え技術を用いてヒト化抗体を作製することができる。上記の抗体は、ポリエチレングリコールなどの分子によって化学修飾することもできる。上記のようにして得られた抗体は、HCMV感染症の治療及び予防のために使用することができ、或いはHCMVの検出のために使用することもできる。ここで、HCMVの検出のために、抗原-抗体反応を利用する手法のいずれを使用することもできる。そのような手法には、例えば均質法、固相法例えばサンドイッチ法などが含まれる。以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、該実施例によって制限されないものとする。実施例1突然変異型若しくはエピトープタグ付けされたUL79、87、又は95ORFを有する組み換えウイルスの構築ウイルスDNA複製及び後期mRNAに対するHCMVUL79、87、又は95の影響を調べるために、UL79、87又は95のORFを中断する突然変異を有する組み換えウイルスを構築した。<材料と方法>細胞及びウイルス初代ヒト包皮線維芽HFF細胞を、以前に報告されているように43、10ウシ胎児血清Sigma,St.Louis,Mo、ペニシリン100U/mL及びストレプトマイシン100μg/mLを添加したイーグルの最小必須培地中で、37°C、5CO2で維持した。ウイルスDNA複製を阻害するために、ホスホノ酢酸PAA,Sigma,St.Louis,MO200μg/mL、又は9-[1,3-ジヒドロキシ-2-プロピルメチル]グアニンガンシクロビル[GCV],Calbiochem,Darmstad,Germany450μMを、感染時及び感染して維持する間、培地に添加した。HCMVUL79、87又は95ORFを発現するHFF細胞を作製するために、Nolan博士の研究室から入手したプロトコールに従いレトロウイルス系を使用したhttp://www.stanford.edu/group/nolan/protocols/pro_helper_dep.html。UL79及び95ORFは、それぞれ、XhoIUL79ORFF及びHindIIIUL79ORFR、並びにXhoIUL95ORFF及びHindIIIUL95ORFRのプライマーペアを用いて、HCMVTowneのBACDNAからPCRにより増幅した。PCRプライマーの配列は表1に示してある。PCR産物を制限エンドヌクレアーゼXhoI及びHindIIIで消化し、pLBC2スタンフォード大学Nolan博士の許可を得て、FredHunchinsonCancerResearchCenterのKiem博士から供与されたにクローニングし、その結果、ORFのC末端にmcherry京都大学医学系研究科、松田博士より供与されたが融合された。pLBCは、EBVゲノムのEBNA1ORF及びOriP配列を有する、組み換えレトロウイルスの構築のためのシャトルベクターである。UL97ORF配列はATG開始コドンから815ヌクレオチドn.t.に制限エンドヌクレアーゼHindIII部位を含む。HindIII部位はpLBCへのORFのクローニングに必要である。UL87の1~814n.t.の領域をまずプライマーXhoIUL87ORFF及びUL87HindIII815Rを用いるPCRにより増幅し、pLBCの対応する制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングし、DNA配列決定した愛知県がんセンター中央研究所。続いて、815~2826n.t.の領域を、UL87815HindIIIF及びHindIIIUL87ORFRのプライマーペアを用いるPCRにより増幅し、UL87の1~814n.t.の領域を有するpLBCのHindIII部位にクローニングし、DNA配列決定した。各ORFを含有するシャトルベクターをパッケージング細胞株であるPhoenix-GALV17Nolan博士の許可を得て、Kiem博士から供与されたにトランスフェクションすることにより、レトロウイルスストックを調製した。HFF細胞を組み換えレトロウイルスに感染させ、ピューロマイシン選択下でpUL79-mcherry、pUL87-mcherry又はpUL95-mcherry発現細胞集団を作製した。野生型wtHCMVTowne、RHAUL95UL87myc、RUL95HAUL87myc、RdlUL79、RdlUL87、又はRdlUL95のウイルス力価は、HFF細胞又はpUL79、87若しくは95-mcherry発現HFF細胞に対する標準的なプラークアッセイにより、以前に記載されているように決定した34。ウイルス力価は、段階希釈で感染させた単層HFF細胞でのGFP蛍光フォーカスによっても決定した。感染後の種々の時点で細胞及び上清を回収し、3回の凍結融解サイクルに供した。ウイルス力価を、HFF細胞又はpUL79、87若しくは95-mcherry発現HFF細胞での50組織培養感染用量TCID50アッセイにより決定した。TCID50を算出するために、Reed-Muench法を用いた。野生型ウイルス及び組み換えウイルスは、置き換え可能な10kbUS1-US12領域US:ユニークショートをGFP遺伝子で置換されている。ウイルスDNA複製3MOIでの感染後、2、3及び4d.p.i.で回収した。3個の35mmプレート中の細胞を、50μg/mLプロテアーゼKを含有する溶解バッファー50mMTris-HCl,pH8,10mMEDTA,1SDS及び20μg/mLRNaseA中に懸濁した。複製したウイルスDNAをHCMVgBプライマー及び以前に記載されたプローブ20、23を用いるリアルタイムPCRにより測定した。AppliedBiosystemsFosterCity,CAから購入した18Sプライマー及びプローブを用いるリアルタイムPCRは、入力DNAの内部対照としても機能した。データは3回の独立した実験の平均である。HCMABACDNAの突然変異誘発バクテリオファージλ組み換えタンパク質exo、beta及びgamを発現する大腸菌NIHのCourt博士から供与されたでの迅速相同組み換えシステムを、以前に記載されているように用いた10。HCMVTowne株のBACDNAはLiu博士カリフォルニア大学から供与された9。ORFを欠損した組み換えHCMVBACDNAの構築に際して、ORFの中央にFRT配列を挿入し、隣接する遺伝子への34bp配列の影響を最小限に抑えた。さらに、隣接遺伝子の調節領域が除去される可能性を除外するために、ヌクレオチドを欠失させることはしなかった。BACdlUL79KanFRT、BACdlUL87KanFRT及びBACdlUL95KanFRT図1a参照の組み換えHCMVBACDNAを作製するために、組み換えのための二本鎖DNAを、プラスミドpACYC177NEBを鋳型として、BACdlUL79FRTFKanF及びBACdlUL79FRTRKanR、BACdlUL87FRTFKanF及びBACdlUL87FRTRKanR、並びにBACdlUL95FRTFKanF及びBACdlUL95FRTRKanRのプライマーペアをそれぞれ用いるPCRにより増幅した。プライマー配列は表2に示してある。BACUL95NneoSt及びBACUL95neoStを作製するために、プラスミドpRpsL-neoGeneBridges,Dresden,Germanyを鋳型として、BACUL95NneoStF及びBACUL95NneoStR、並びにBACUL95CneoStF及びBACUL95CneoStRのプライマーペアをそれぞれ用いるPCRにより二本鎖DNAを増幅した。プライマー配列は表2に示してある。プラスミドpACYC177又はpRpsL-neoGeneBridgesは、カナマイシン耐性KanR又はKanR及びストレプトマイシン耐性遺伝子をそれぞれ含有する。組み換えのために増幅された二本鎖DNAは、最小FRT部位5’-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3’15、又はRpsLneo遺伝子GeneBridgesに連結されたKanR遺伝子、及び70bpの相同ウイルスDNA配列を含有していた。DpnIでの37°C、1.5時間の消化の後に、PCR産物をゲル精製し、親HCMVBACDNAを含有するDY-380に形質転換した。相同組み換え後、KanR及びFRT配列、又はRpsL-neo遺伝子を含有する突然変異型BACDNAはカナマイシンに対して耐性であった図1を参照。FRT配列を含む突然変異型HCMVBACDNAからKanR配列を切り出すために、FRTを介した組み換えを、以前に記載されているように用いた23。プラスミドpCP20MaxvonPettenkoferInstitute,Munich,GemanyのHuhn博士から供与されたを組み換えHCMVBACDNAを含むDH10Bに形質転換した。カナマイシンを含まないHCMVBACDNAを、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有するLBプレート上で選択した。UL79、87又は95ORFの欠失を有する組み換えBACDNAを選択するために、UL79detectF及びUL79detectR、UL87BACdetectF及びUL87BACdetectR、並びにUL95BACdetectF及びUL95BACdetectRのプライマーペアをそれぞれ用いてPCR分析を行なった。プライマー配列は表1に示してある。PCR産物をDNA配列決定し、組み換えを確認した愛知県がんセンター中央研究所。逆選択を、以前に記載されているように行なった21、50。RpsLはストレプトマイシン感受性遺伝子を付与するので、突然変異型BACDNAを、CounterSelectionModificationKitGeneBridgesを用いて増大したストレプトマイシン耐性に基づいて選択した。BACHAUL95又はBACUL95HAを構築するために、オリゴヌクレオチドBAColigoHAUL95又はBACUL95Coligoを用いてそれぞれ逆選択した図1b参照。オリゴ配列は表2に示してある。組み換えBACHAUL95UL87myc又はBACUL95HAUL87myc図1b参照を構築するために、BACHAUL95又はBACUL95HAの構築後に、逆の手順を繰り返した。BACUL87CneoStF及びBACUL87CneoStRのプライマーペアを用いるPCRにより、二本鎖DNAを増幅し、BACHAUL95又はBACUL95HAを含有するDY-380に形質転換した。プライマー配列は表2に示してある。BACHAUL95neoSt又はBACUL95HAneoStを、カナマイシン含有プレート上で選択した。BACUL87oligoのオリゴヌクレオチドを用いる逆選択を行なった後、BACHAUL95UL87myc又はBACUL95HAUL87mycを上記のように増大したストレプトマイシン耐性に基づいて選択した図1参照。HA-UL95、UL95-HA及びUL87-mycを含む組み換えBACDNAを選択するために、UL95NdetectF及びUL95NdetectR、UL95CdetectF及びUL95CdetectR、並びにUL87CdetectF及びUL87CdetectRのプライマーペアをそれぞれ用いてPCR分析を行なった。プライマー配列は表2に示してある。PCR産物は、組み換え及び切り出しを確認するために配列決定した愛知県がんセンター中央研究所。抗体HA又はmcherryでタグ付けした融合タンパク質を検出するために、ラット又はウサギポリクローナル抗体3F10,Roche又はPM005,MBL,名古屋をそれぞれ用いた。mycエピトープを含む融合タンパク質を検出するために、マウスモノクローナル抗体9B11、又はウサギポリクローナル抗体7D10CellSignaling,Boston,MAを用いた。IE1及びIE2タンパク質、IE2、UL44、UL57、TBP又は細胞内GAPDHを検出するための抗体は、NEA-9221PerkinElmer,Boston,MA、12E2VancouverBiotech,Ltd.,Vancouver,CA、CA006EastCoastBio,NorthBerwick,ME、CH167SantaCruz,SantaCruz,CA、sc-273SantaCruz、及びMAB374Chemicon,Temucula,CAをそれぞれ用いた。ウエスタンブロット分析細胞を感染後の示した時点で回収し、PBSで洗浄し、以前に記載されているように溶解バッファーで処理した19、20。20μgのタンパク質のアリコートを、ドデシル硫酸ナトリウムSDS-10ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEのために各レーンにロードし、PVDFメンブレンにトランスファーした。増強化学発光検出試薬GEHealthcareUKLtd.,Buckinghamshire,UK及び二次西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス、ウサギ、又はラットIgG抗体Zymed,SanFrancisco,CAを製造業者の取扱説明書に従って用いた。<結果>C末端に蛍光タンパク質mcherryをインフレームで融合させたUL79、87又は95を安定的に発現するHFF細胞を、組み換えレトロウイルスを用いて単離した。これらの細胞を、組み換えHCMVを増殖させるために用いた。組み換えBACDNAを親BACDNAから選択するために薬剤耐性遺伝子が必要であったので、34bpの最小FRT部位に連結されたKanRを有する組み換えBACDNAをまず構築し、続いてFRT-FLP組み換えによりKanRを切り出した。図1aを参照されたい。隣接遺伝子への影響を最小限にするために、FRTはORFの中央に挿入した。本発明者らはまた、UL87又はUL95ORFのN末端又はC末端に融合されたHA又はmycエピトープを有する組み換えウイルスも構築した。以前に報告されているようにUL98遺伝子は必須であり9、56、UL95ORFはUL89と重複しているので、UL95のN末端へのHAエピトープの挿入はUL89タンパク質の機能に障害を与える可能性がある。したがって、本発明者らは、UL95ORFのN末端又はC末端に融合されたHAエピトープを有する組み換えウイルスを構築した。UL86は必須であり10、59、UL87とは逆方向に転写されるので、mycエピトープをUL87ORFのC末端に挿入した。UL87ORFのTGA停止コドンとUL88のATG開始コドンは重複しているので、mycエピトープはUL87ORFのTGA停止コドンの前に挿入した。ORFのN末端又はC末端にエピトープを挿入するために、逆の手順を行なった。図1bに示されているように、マーカーカセットをRpsL遺伝子GeneBridgesで置き換え、ストレプトマイシンに対する感受性を増大させた。中間体BACクローンは、カナマイシンに対する耐性に基づいて選択した。これらのクローンの完全性はHindIIIでの消化によりチェックし、正しい位置でのマーカーカセットの挿入はPCRにより確認した。相同組み換えの第2ラウンドでは、マーカーカセット全体をカウンター選択によりエピトープを含む配列と置き換えた。組み換え構築物を、以前に記載されているように50ストレプトマイシンに対する増大した耐性に基づいて単離し、エピトープが挿入された組み換えBACをPCRにより選択した。PCR分析により、組み換えBACDNA中へのエピトープの挿入が確認された図1c。DNA配列決定により組み換えを確認しデータは示していない、突然変異型BACの完全性をHindIIIによる消化によってチェックしたデータは示していない。3の高MOIで、これら組み換えウイルスの増殖を親ウイルスwtと比較した。RUL95HAUL87mycは感染4及び5日後d.p.i.で野生型と比較して1/2対数ほど遅く複製したが、7d.p.i.までに感染力価は同等となった。RHAUL95UL87mycは、4、5及び7d.p.i.で野生型と同等に複製した図8。実施例2UL79、87及び95はHCMVの増殖には必要であるが、DNA複製には必要でないHCMVUL79、87又は95タンパク質がウイルス増殖又はDNA複製に必要であるかを決定するために、補充ウイルスタンパク質を発現するか発現しないHFF細胞に組み換えウイルスを3MOIで感染させた。ウイルス力価を1、4、5、7及び9d.p.i.でアッセイし、同数の感染細胞からのDNAを2、3及び4d.p.i.で回収した。突然変異させたUL79、87又は95ORFを含む組み換えウイルスは、補充ウイルスタンパク質の発現なしではHFF細胞で感染ウイルスを産生しなかったそれぞれ、図2a、b及びc。対照的に、ウイルスDNAは両方のHFF細胞で同等であった図2d、e及びf。これらの結果は、UL79、87及び95がウイルス増殖に必要とされるが、ウイルスDNA複製には必要でないことを示している。実施例3UL79、87及び95タンパク質は真性後期γ2ウイルスmRNAに必要とされる<材料と方法>ノザンブロット分析以前に記載されたように、感染後1、2及び3日で細胞質RNAを単離した5、16。20μgの細胞質RNAを2.2Mホルムアルデヒドを含有する1アガロースゲルでの電気泳動に供し、最大強度のHybondNGEHealthcareUKLtd.にトランスファーした。IE1、UL75又はUL99DNAプローブを用いるノザンブロット分析を以前に記載されているように実施した20、22、23。放射標識プローブは32P-dCTPでの標識により以前に記載されているように作製した23。RNase保護アッセイ32P標識アンチセンスUL44RNAプローブを以前に記載されているように構築した23。以前に記載されているように19、26、20μgのRNAを32P標識アンチセンスUL44プロモータープローブに37°Cで一晩ハイブリダイズさせ、その後、RNaseT1100Uで消化した。保護されたRNA断片を変性6ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に供し、続いてHyperfilmMPGEHealthcareUKLtd.でのオートラジオグラフィーに供した。<結果>UL79、87又は95タンパク質が真性後期γ2mRNAに必要とされるかを決定するために、補充ウイルスタンパク質を発現するか発現しないHFF細胞を、PAAの存在下又は非存在下で、組み換えウイルスに3MOIで感染させた。1、2及び3d.p.i.で細胞質RNAを回収し、IE1、UL75gH又はUL99pp28DNAプローブのいずれかを用いてノザンブロット分析によって分析した。IE1RNAは、予想される通り、組み換えウイルスを感染させた両方の細胞タイプで1d.p.i.に検出された図3a~c、左パネル。UL75プローブを用いると、UL75、76、77及び78mRNAに対応する3種類のサイズのmRNAが検出された図3a~c、中央パネル。これらのウイルスmRNAは以前に報告されているように異なる開始部位を有する48。UL75の転写方向はUL76、77及び78とは逆方向である52。初期/後期UL76~78転写産物はPAAの存在下では著明に減少した図3b及びc。UL75転写産物は後期転写産物であり、PAAの存在下又は補充タンパク質の発現なしにはHFF細胞で検出されなかった図3a~c、中央パネル。UL99ORFは一連の3’共同末端転写産物内のウイルスゲノムの複合領域に位置する51。すべての転写産物はUL99ORFの共通のポリアデニル化部位下流配列を用いる51。pp28テグメントタンパク質は1.6kbのmRNAから翻訳される1。以前に報告されているように1、UL99プローブを用いるノザンブロット分析は、PAAの存在下で、UL99プロモーターからの1.6kbのmRNAが検出されないこと、したがってUL99は真性後期遺伝子であることを示した図3b及びc、右パネル。以前の報告と合致して51、PAA処理RNAの分析から、この領域内の可能性があるORFのそれぞれの上流から開始されるmRNAが遅延初期転写産物を含むことが示された図3b及びC、右パネル。PAAの存在下、又は補充タンパク質の発現なしには、1.6kbmRNAはHFF細胞で検出されなかった図3a~c、右パネル。これらのことから、HCMVUL79、87及び95は真性後期ウイルスmRNAのために必須であると結論づけられる。HCMVUL44転写ユニットは3つの異なる部位で開始され、それぞれは約50塩基により隔てられ、生産性感染時に別々に調節される。これらの開始部位のうち2つ、遠位及び近位が初期に活性であり、中央開始部位は後期まで不活性である28。後期開始部位からの発現はウイルスDNA複製に依存し、後期ウイルス遺伝子発現に影響を有する22。本発明者らは、UL44転写に対するUL79タンパク質の影響も調べた。異なる開始部位に由来するすべての転写産物を検出するために、RNase保護アッセイを行なった。以前の報告と合致して21、22、28、離れた開始部位から開始される3種類の主要な転写産物が補充細胞では検出された図3d、レーン3、5及び7。対照的に、中央の開始部位からの転写産物はRdlUL79感染HFF細胞では検出されず、他の2種類の初期転写産物は検出された図3d、レーン2、4及び6。これらのことから、UL44の中央の後期開始部位からの転写産物はUL79ウイルスタンパク質を必要とすることが結論づけられる。実施例4UL87及び95ORFは初期ウイルスタンパク質であるHCMVORF79、87及び95はMHV-68ORF18、24及び34と機能の上で似通っているので、これらの発現時期及びHCMVUL44との共局在について調べた。図1bに示されるエピトープタグ付けされたUL87及びUL95ORFを含む組み換えウイルスを構築した。UL79ORFに融合したエピトープを含む組み換えウイルスは構築しなかった。UL87及びUL95融合タンパク質の発現動態を調べるために、PAA若しくはGCVの存在下又は非存在下で、HFF細胞をRUL95HAUL87myc又はRHAUL95UL87mycに3MOIで感染させた。感染細胞を1、2及び3d.p.i.で回収し、IE1若しくはUL44タンパク質に対する抗体、又はHA若しくはmycエピトープに対する抗体を用いるウエスタンブロット分析によりアッセイした。タグ付けされた融合タンパク質は、1~3d.p.i.で、またPAA若しくはGCVの存在下又は非存在下で2d.p.i.で検出された図4A及びB。UL87及びUL95融合タンパク質の発現動態は、UL44遺伝子の初期ウイルスタンパク質と似通っていた図4C。これらの結果は、UL87及びUL95が感染の初期に発現されることを示している。実施例5UL79、87及び95ウイルスタンパク質は複製コンパートメントRCに動員される<材料と方法>共焦点顕微鏡観察前のタンパク質のinsitu抽出24ウェルプレート中のコンフルエントのHFF細胞に3MOIで組み換えウイルスを感染させた。以前に記載されているように55、感染後の種々の時点で、カバーガラス上で増殖した細胞を50μg/mLのジチオビススクシンイミジルプロピオネートDSP、Thermo,Rockford,ILホモ二官能性NHSエステル架橋剤で4°Cにて10分間固定した。マトリックスに結合していないタンパク質を核又は細胞質から除去するために、細胞をTNEバッファー10mMTris-HCl,pH7.8,1NP40及び0.15MNaClで処理し、2パラホルムアルデヒドで4°Cにて60分間固定した。顕微鏡観察細胞を高塩濃度TPBS0.001Mリン酸ナトリウム[pH7.3],0.5MNaCl,0.1Tween20,及び0.1TritonX-100で3回洗浄し、示した一次抗体と共に4°Cにて一晩インキュベートした。室温でのTPBSでの3回の洗浄後、細胞をAlexaFluor594若しくは680標識二次抗マウスIgGMolecularProbes、AlexaFluor594若しくは680標識抗ウサギIgGMolecularProbes、又はAlexaFluor594標識ラットIgG抗体MolecularProbesと共に37°Cで30分間インキュベートした。感染細胞においてHA又はmyc融合タンパク質を検出する場合には、SignalimmunostainTOYOBO,大阪を用いて特異的シグナルの強度を増強した。スライドを、4’,6’-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPIを含むProLongGoldアンチフェード試薬MolecularProbesでマウントした。画像取得は、PlainApo63又は100×1.4NA油浸対物レンズを装着したCarlZeissMeta共焦点レーザー走査顕微鏡CarlZeissMicroImaging,Inc.を用いて行なった。LSM510Meta共焦点顕微鏡にはAlexaFluor594及び680蛍光団を励起するためのHeNeレーザーを装着した。細胞をいずれかの抗原に関して染色した場合、まずタンパク質の局在を調べ、次に同じ条件で別のフィルターを用いて免疫蛍光が検出されないことを確認した。<結果>HCMV複製タンパク質UL44は約2d.p.i.でRCに局在化する。BrdUをこれらのコンパートメント中のウイルスDNAに取り込ませると、子孫ウイルスで検出される36、38。本発明者らは、RdlUL79、RdlUL87又はRdlUL95での感染後の細胞内でその局在を調べるために、HFF細胞で安定に発現させたmcherry蛍光融合ウイルスタンパク質を用いた。3MOIでの感染2日後に細胞を固定し、UL44に対する抗体とインキュベートした。組み換えウイルスはGFPタンパク質を含有しているので、AlexaFluor680標識二次抗マウスIgGを用いてUL44の細胞内局在を検出した。図5A、a~cに示されているように、UL79、87及び95-mcherry融合ウイルスタンパク質はUL44タンパク質と核で共局在していた。これらの結果は、mcherryと融合させた補充タンパク質UL79、87又は95が、それぞれRdlUL79、RdlUL87又はRdlUL95での組み換えウイルス感染後にRCに動員されることを示している。実施例6組み換えウイルスから発現させたUL87及び95タンパク質は複製コンパートメントに動員されるウイルスから発現させたUL87及び95タンパク質も互いに共局在することを示すために、HFF細胞を3MOIでRUL95HAUL87mycに感染させた。1~3d.p.i.において、細胞を固定し、HAエピトープに対するラットポリクローナル抗体またはmycエピトープに対するマウスモノクローナル抗体と共にインキュベートした。AlexaFluor594標識二次抗ラットIgG及びAlexaFluor680標識抗マウスIgGをそれぞれ用いた。共焦点顕微鏡観察は、1、2及び3d.p.i.でのUL87融合タンパク質とUL95融合タンパク質との共局在を証明した図5B、a~c。共焦点顕微鏡観察はまた、2d.p.i.でのUL95融合タンパク質とUL44タンパク質との共局在も実証した図5d。さらに、UL44タンパク質は新規に合成されたウイルスDNAとも共局在していた図5e。これらの結果は、UL87及びUL95ウイルスタンパク質が共局在し、UL95がRCに動員されたことを示している。実施例7UL87及びUL95タンパク質はウイルスDNA複製前にUL44の微小フォーカスに動員される<材料及び方法>FISHアッセイHCMVBACDNAを、ニックトランスレーションキットAbbottMolecular,AbbottPark,Illinoisを製造業者の取扱説明書に従って用いてSpectrumOrangeで標識した。FISH分析は多少の改変を加えて、基本的に以前に記載された方法に基づいて行なった24。カバーガラス上で増殖させた細胞を、insitu細胞抽出後に2パラホルムアルデヒドで4°Cにて60分間固定し、RNase100μg/mLを含有するブロッキングバッファー2.5BSA,0.2Mグリシン,及び0.1TritonX-100で1時間透過化し、その後ハイブリダイゼーションに用いた。各カバーガラスを、5μLのハイブリダイゼーションバッファー2×SSC,10硫酸デキストラン及び50ホルムアミド及びDNAプローブと共にスライドガラス上に逆にふせて置いた。ハイブリダイゼーションバッグ中に密封した後、スライドを85°Cの水浴中に5分間浸漬し、続いて37°Cで一晩インキュベートした。FISH分析後、抗UL44抗体を用いてUL44抗原を検出した。カバーガラスを、50ホルムアミドを含有する2×SSCで50°Cにて3分間ずつ3回洗浄し、2×SSCで50°Cにて3分間ずつ3回洗浄し、0.1×SSCで60°Cにて10分間、1回洗浄した。SpectrumOrange蛍光団は560nmの吸収極大と588nmの蛍光発光極大を有し、HeNeレーザーで励起したhttp://www.zeiss.de/C12567BE0045ACF1/Contents-Frame/5CDD62C92B112413C1256A140040C831。<結果>UL87及びUL95がウイルスDNA複製前にUL44と共局在するかを調べるために、PAA又はGCVの存在下でHFF細胞を3MOIでRUL95HAUL87mycに感染させた。細胞を固定し、HA又はmycエピトープに対するポリクローナル抗体、及びUL44タンパク質に対するモノクローナル抗体で処理した。AlexaFluor594標識二次抗ラット又はウサギIgG及びAlexaFluor680標識抗マウスIgGを用いた。ウイルスDNAを検出するためのFISH分析後に、細胞をUL44タンパク質に対するモノクローナル抗体とインキュベートし、続いてAlexaFluor680標識二次抗マウスIgGとインキュベートした。予想された通り、UL44はウイルスDNA合成阻害剤の存在下でウイルスDNAと共局在した図6a及びb。UL87及びUL95はPAA又はGCVの存在下でUL44と共局在した図6c~f。これらの結果は、UL87及び95タンパク質がウイルスDNA複製前にUL44と共局在することを示している。UL87とUL44との共局在の特異性を調べるために、UL57及びUL44の局在を調べた。HCMVでは、UL44タンパク質はウイルスDNA合成前にはUL57タンパク質含有小フォーカスには伴われないことが報告されている36。細胞を固定し、UL87と融合したmycエピトープに対する抗体及びUL57タンパク質に対する抗体で処理した。AlexaFluor594標識二次抗ウサギIgG又はAlexaFluor680標識抗マウスIgGをそれぞれ用いた。以前に報告されている通り38、PAAの存在下では、UL87融合タンパク質はUL57タンパク質と共局在しなかった図6g。UL57タンパク質はウイルスDNA複製開始後にはUL44タンパク質と共局在するようである。併せて考えると、HCMVUL87及び95タンパク質は、ウイルスDNA複製前にはUL44と共局在する。実施例8IE2タンパク質はウイルスDNA複製前にUL87と共局在するSourvinosらによるinsituハイブリダイゼーション分析42により、IE2タンパク質は12時間p.i.で直接的なDNAとの接触により親ウイルスゲノムに伴われていることが示されている。IEタンパク質は点状構造を形成することができ、これがRCへと発達する。IE2はPAAの存在下でウイルスDNA複製と関連するため、本発明者らは、HCMV後期トランス因子がウイルスDNA複製前にIE2と共局在するかを調べた。細胞を3MOIでRUL95HAUL87mycに感染させ、固定し、IE2、myc、UL44及びTBPに対する抗体で処理した。AlexaFluor594標識抗マウスIgG及びAlexaFluor680標識抗ウサギIgGの二次抗体を用いた。UL87タンパク質はPAA若しくはGCVの存在下又は非存在下でIE2フォーカスと共局在した図7a~c。TATA結合タンパク質TBPはIE2タンパク質と直接的に相互作用するので14、TBPに対するポリクローナル抗体及びUL44タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて、PAA若しくはGCVの存在下又は非存在下でTBPがUL44微小フォーカスに動員されるかを調べた。図7d~fに示される通り、PAA若しくはGCVの存在下又は非存在下で、TBPはUL44と共局在し、したがって、予想されたように、RC前駆体に動員された。これらの結果から、UL87タンパク質は、IE2タンパク質及びTBPと同様に、ウイルスDNA複製前にウイルスRC前駆体に動員されると結論づけられる。<考察>MHV-68のUL18、24及び34は後期転写のためのウイルストランス作用因子である。これらのMHV-68ORFは初期に発現されるが、ウイルスDNA複製には必要とされない。これらのMHV-68ウイルスタンパク質はインジケーター遺伝子の発現を駆動する後期ウイルスプロモーターを活性化させるので、後期ウイルストランス活性化因子であると考えられている。後期ウイルストランス活性化因子がどのようにして後期ウイルスプロモーターを特異的に活性化するのかは未だ明らかになっていない。後期ウイルスプロモーターの活性化についての理解は、ユニークな抗ウイルス剤のための新規なアプローチに寄与するものと思われる。HCMVは深刻な病原ウイルスであり、現在利用可能な抗ウイルス剤は限定された有効性及び副作用を有するので、HCMV後期転写因子の解析は新規な抗ウイルス剤の開発のために重要であろう。したがって、本発明者らは、MHV-68後期ウイルストランス活性化因子に相同なHCMV遺伝子が真性後期γ2HCMV遺伝子の転写に影響を及ぼすかを調べた。HCMVでは、プロモーターは単純であり、それらは上流又は下流配列を必要としないコアエレメントを含む8、25、31。UL44初期ウイルスプロモーターはカノニカルなTATA配列を有する。対照的に、UL44後期ウイルスプロモーターはノンカノニカルなTATA配列を有する図3dを参照されたい。本発明者らは、このノンカノニカルなTATA配列が後期ウイルス遺伝子発現に重要であることを報告している21。Serioら39もまた、EBVのBcLF1後期プロモーターからの発現が変異型TATAエレメントのみに依存することを報告している。ノンカノニカルなTATA配列へのTBPの弱い結合親和性は、感染後の初期での転写の欠如を部分的に説明するものかもしれない。TBPの後期プロモーターへの結合親和性が、後期遺伝子特異的トランス活性化因子の動員及びウイルスDNA複製中の二重らせんの開放後に強まる可能性はある。これらの後期遺伝子トランス活性化因子が、IE2トランス活性化因子と共に、TBP及びRNAポリメラーゼIIの後期プロモーターへの結合を安定化させるということも考えられる。HCMVでは、初期/後期ウイルス遺伝子発現に影響を与えるIE2遺伝子にはいくつかのアイソマーがある。感染初期には、ウイルスIE2-p86タンパク質が初期ウイルス遺伝子発現に必須である。感染後期には、IE2アイソマーであるIE2-p60及びIE2-p40が後期ウイルス遺伝子発現に多大な影響を及ぼす49、50。ウイルスDNAとウイルスIE2トランス活性化因子との複合体は、ウイルスDNAが複製し始める時点で検出され、RCの発達を引き起こす42。本発明者らはHCMVUL87がウイルスRCでIE2タンパク質と共局在することを示したが、現状ではこれら2つのウイルスタンパク質が相互作用するという証拠はない。なぜ後期ウイルス遺伝子の転写がウイルスDNA複製を必要とするのかは分かっていない。本発明者らのデータは、HCMVUL79、87及び95がUL75gH及びUL99pp28後期mRNAに必要であることを示している。これらのウイルスタンパク質はウイルスDNA複製の前に発現され、ウイルスRCに組み込まれる。RCは、部分的にはウイルスDNA鋳型を濃縮することにより、ウイルス遺伝子発現のためのフォーカスとして機能する。UL44タンパク質は、ウイルスDNA複製前にIE蓄積部位に組み込まれた。IE2タンパク質は後期遺伝子転写に十分ではないので、UL44がUL79、87及び95と共にIE2フォーカスに動員されることにより後期遺伝子転写に適した環境を提供したとは考えにくい。UL44タンパク質がUL79、87及び95のタンパク質と直接的に相互作用するという証拠はない。UL44は構造的に真核生物の増殖細胞細胞核抗原ProliferatingCellNuclearAntigen;PCNAと相同であり、PCNAは複数のタンパク質と相互作用する30。近年のプロテオーム解析により、UL44タンパク質がウイルス複製関連タンパク質以外の転写因子を含む広範なタンパク質と相互作用することが実証された13、44~46。したがって、UL44タンパク質が後期遺伝子転写のタイミングを最適化していると考えられる。HCMVRCはまた、ヘルペスウイルス複製タンパク質すなわち、HSVICP8、UL9、及びヘテロ三量体ヘリカーゼ-プライマーゼ複合体UL5-UL8-UL52に相同な5種類のウイルスタンパク質も含有する。これらのヘルペスウイルス複製タンパク質がまずウイルスの複製前駆体微小フォーカスに組み込まれ、続いてこれらのフォーカスにポリメラーゼ及びポリメラーゼアクセサリータンパク質が動員される4。しかしながら、培地にPAAを添加した場合、HCMVUL87タンパク質はSSBUL57タンパク質と共局在しなかった。HCMVでは、HCMVUL57の微小フォーカスは後期遺伝子転写を実現するための足場としては機能しないように思われるが、ウイルスDNA複製の開始後には重要な役割を果たすようである。本願では、UL79、87及び95タンパク質が後期ウイルスmRNAに必要であり、したがってウイルス増殖に必要とされることが示された。UL79、87若しくは95ORFに突然変異を導入することによりこれらのORFの発現を低下又は消失させることによって、ウイルス複製を抑制し、弱毒化したHCMVは、ワクチンとして使用する上で、天然ウイルスの構造を保持するという利点を有する。"