ナイセリア菌のHsfおよびOpc抗原を含む免疫原性組成物。ナイセリア菌のFHbp抗原をさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。Hsf抗原が髄膜炎菌、特に、血清群Bに由来する、請求項1または2に記載の免疫原性組成物。Hsf抗原が、a配列番号2に記載のアミノ酸配列、b配列番号2と少なくとも80、85、90、95または99の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項1~3のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Hsf抗原が、配列番号2の少なくとも10、15、20、25、30個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドである、請求項1~4のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Hsf抗原、ポリペプチド、アミノ酸配列または免疫原性断片が、配列番号2のポリペプチドに結合することができる、およびまたはその外膜内で配列番号2のポリペプチドを発現する髄膜炎菌に結合することができる抗体を惹起することができる、請求項1~5のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Hsf抗原、ポリペプチド、アミノ酸配列または免疫原性断片が、配列番号2のポリペプチドへのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内で配列番号2のポリペプチドを発現する髄膜炎菌へのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができる抗体を惹起することができる、請求項1~6のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Hsf抗原が、Hsfへのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内でHsfを発現する髄膜炎菌へのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができるヒト宿主における抗体を惹起するのに十分な用量で免疫原性組成物中に存在する、請求項1~7のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Hsf抗原がサブユニット抗原として存在する、請求項1~8のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Hsf抗原が外膜調製物または外膜ベシクル調製物の外膜内に存在する、請求項1~8のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物が、H4476株と同じか、またはそれより高いレベルで外膜中でHsfを発現するナイセリア菌株から作製された、請求項10に記載の免疫原性組成物。Hsf抗原が外膜調製物またはベシクル内で上方調節された、請求項10または11に記載の免疫原性組成物。外膜調製物が、Hsf抗原をコードする1コピーより多いhsf遺伝子を有するか、または異種プロモーターの制御下にhsf遺伝子を有するナイセリア菌株から作製された、請求項12に記載の免疫原性組成物。異種プロモーターが、hsf遺伝子プロモーターより強力なプロモーターである、請求項13に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物がデオキシコレート抽出工程を用いて作製され、用いられるDOCの濃度が0~05、01~04、もしくは02~03、特に、およそまたは正確に0、01、02、03、04もしくは05のDOCである、請求項10~14のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、lgtB、galEまたはlgtEのうちの1つ以上からの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項10~15のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、莢膜多糖を合成することができず、好ましくは、siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synAまたはsynBおよびsynCのうちの1つ以上、好ましくはsiaDからの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項10~16のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、PorAおよびまたはFrpBの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項10~17のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、msbBおよびまたはhtrBからの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項10~18のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Opc抗原が髄膜炎菌、特に、血清群Bに由来する、請求項1~19のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Opc抗原が、a配列番号4に記載のアミノ酸配列、b配列番号4と少なくとも80、85、90、95または99の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項1~20のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Opc抗原が、配列番号4の少なくとも10、15、20、25、30個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドである、請求項1~21のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Opc抗原、ポリペプチド、アミノ酸配列または免疫原性断片が、配列番号4のポリペプチドに結合することができる、およびまたはその外膜内で配列番号4のポリペプチドを発現する髄膜炎菌に結合することができる抗体を惹起することができる、請求項1~22のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Opc抗原、ポリペプチド、アミノ酸配列または免疫原性断片が、配列番号4のポリペプチドへのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内で配列番号4のポリペプチドを発現する髄膜炎菌へのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができる抗体を惹起することができる、請求項1~23のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Opc抗原が、Opcへのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内でOpcを発現する髄膜炎菌へのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができるヒト宿主における抗体を惹起するのに十分な用量で免疫原性組成物中に存在する、請求項1~24のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Opc抗原がサブユニット抗原として存在する、請求項1~25のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。Opc抗原が外膜調製物または外膜ベシクル調製物の外膜内に存在する、請求項1~27のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物が、H4476株またはC751株と同じか、またはそれより高いレベルで外膜中でOpcを発現するナイセリア菌株から作製された、請求項27に記載の免疫原性組成物。Opc抗原が外膜調製物または外膜ベシクル内で上方調節された、請求項27または28に記載の免疫原性組成物。外膜調製物が、Opc抗原をコードする1コピーより多いopc遺伝子を有するか、または異種プロモーターの制御下にopc遺伝子を有するナイセリア菌株から作製された、請求項29に記載の免疫原性組成物。異種プロモーターが、opc遺伝子プロモーターより強力なプロモーターである、請求項30に記載の免疫原性組成物。異種プロモーターがopc遺伝子プロモーターよりも安定にopc遺伝子を発現する、請求項30または31に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物がデオキシコレート抽出工程を用いて作製され、用いられるDOCの濃度が0~05、01~04、もしくは02~03、特に、およそまたは正確に0、01、02、03、04もしくは05のDOCである、請求項27~32のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、lgtB、galEまたはlgtEのうちの1つ以上からの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項27~33のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、莢膜多糖を合成することができず、好ましくは、siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synAまたはsynBおよびsynCのうちの1つ以上、好ましくはsiaDからの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項27~34のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、PorAおよびまたはFrpBの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項27~35のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、msbBおよびまたはhtrBからの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項27~36のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbp抗原が髄膜炎菌、特に、血清群Bに由来する、請求項2~37のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。ファミリーAに由来するFHbpおよびまたはファミリーBに由来するFHbpが免疫原性組成物中に存在する、請求項2~38のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbpファミリーA抗原が、a配列番号5に記載のアミノ酸配列、b配列番号5と少なくとも70、80、85、90、95または99の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項39に記載の免疫原性組成物。FHbpファミリーA抗原が、配列番号5の少なくとも10、15、20、25、30個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドである、請求項39または40に記載の免疫原性組成物。FHbpファミリーA抗原、ポリペプチド、アミノ酸配列または免疫原性断片が、配列番号5のポリペプチドに結合することができる、およびまたはその外膜内で配列番号5のポリペプチドを発現する髄膜炎菌に結合することができる抗体を惹起することができる、請求項39~41のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbpファミリーA抗原、ポリペプチド、アミノ酸配列または免疫原性断片が、配列番号5のポリペプチドへのヒトH因子の結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内で配列番号5のポリペプチドを発現する髄膜炎菌へのヒトH因子の結合を阻害することができる抗体を惹起することができる、請求項39~42のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbpファミリーA抗原が、FHbpファミリーAへのヒトH因子の結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内でFHbpファミリーAを発現する髄膜炎菌へのヒトH因子の結合を阻害することができるヒト宿主における抗体を惹起するのに十分な用量で免疫原性組成物中に存在する、請求項39~43のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbpファミリーB抗原が、a配列番号6に記載のアミノ酸配列、b配列番号6と少なくとも70、80、85、90、95または99の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項39~44のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbpファミリーB抗原が、配列番号6の少なくとも10、15、20、25、30個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドである、請求項39~45のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbpファミリーB抗原、ポリペプチド、アミノ酸配列または免疫原性断片が、配列番号6のポリペプチドに結合することができる、およびまたはその外膜内で配列番号6のポリペプチドを発現する髄膜炎菌に結合することができる抗体を惹起することができる、請求項39~46のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbpファミリーB抗原、ポリペプチド、アミノ酸配列または免疫原性断片が、配列番号6のポリペプチドへのH因子の結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内で配列番号6のポリペプチドを発現する髄膜炎菌へのヒトH因子の結合を阻害することができる抗体を惹起することができる、請求項39~47のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbpファミリーB抗原が、FHbpファミリーBへのヒトH因子の結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内でFHbpファミリーBを発現する髄膜炎菌へのヒトH因子の結合を阻害することができるヒト宿主における抗体を惹起するのに十分な用量で免疫原性組成物中に存在する、請求項39~48のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbp抗原がサブユニット抗原として存在する、請求項2~49のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbp抗原が1種以上の外膜調製物または外膜ベシクル調製物の外膜内に存在する、請求項2~50のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物が、8047株またはMC58株と同じか、またはそれより高いレベルで外膜中でFHbpを発現するナイセリア菌株から作製された、請求項2~51のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。FHbp抗原が外膜調製物または外膜ベシクル内で上方調節された、請求項51または52に記載の免疫原性組成物。外膜調製物が、FHbp抗原をコードする1コピーより多いfhbp遺伝子を有するか、または異種プロモーターの制御下にfhbp遺伝子を有するナイセリア菌株から作製された、請求項53に記載の免疫原性組成物。異種プロモーターが、fhbp遺伝子プロモーターより強力なプロモーターである、請求項54に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物がデオキシコレート抽出工程を用いて作製され、用いられるDOCの濃度が0~05、01~04、もしくは02~03、特に、およそまたは正確に0、01、02、03、04もしくは05のDOC、特に、03、02または01までのDOCである、請求項51~55のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、lgtB、galEまたはlgtEのうちの1つ以上からの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項51~56のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、莢膜多糖を合成することができず、好ましくは、siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synAまたはsynBおよびsynCのうちの1つ以上、好ましくはsiaDからの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項51~57のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、PorAおよびまたはFrpBの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項51~58のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。外膜調製物または外膜ベシクル調製物が誘導される宿主細胞が、msbBおよびまたはhtrBからの発現を下方調節するように遺伝子操作された、請求項51~59のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。髄膜炎菌のNspAおよびまたはPilCをさらに含む、請求項1~60のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。1種以上の細菌莢膜多糖またはオリゴ糖をさらに含む、請求項1~61のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。莢膜多糖またはオリゴ糖が、髄膜炎菌血清群A、C、YおよびW135、インフルエンザ菌b、肺炎連鎖球菌、A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌からなる群より選択される細菌から誘導される、請求項62に記載の免疫原性組成物。莢膜多糖またはオリゴ糖がタンパク質にコンジュゲートされる、請求項62または63に記載の免疫原性組成物。アジュバントを含む、請求項1~64のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。アルミニウム塩、水酸化アルミニウム、またはリン酸アルミニウムを含む、請求項65に記載の免疫原性組成物。3DMPLを含む、請求項65または66に記載の免疫原性組成物。請求項1~67のいずれか1項に記載の免疫原性組成物および製薬上許容し得る担体を含むワクチン。請求項68に記載のワクチンの保護用量を、それを必要とする宿主に投与することを含む、ナイセリア菌疾患の治療または予防のための方法。髄膜炎菌およびまたは淋菌感染を予防または治療する、請求項69に記載の方法。ナイセリア菌感染の治療または予防のための医薬の調製における請求項68に記載のワクチンの使用。髄膜炎菌およびまたは淋菌感染を予防または治療する、請求項71に記載の使用。ナイセリア菌感染の治療または予防における使用のための請求項1~68のいずれか1項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。髄膜炎菌およびまたは淋菌感染の治療または予防における使用のための請求項73に記載の免疫原性組成物またはワクチン。内皮細胞へのナイセリア菌の付着の防止のため、または該防止における使用のための請求項1~68、73、74のいずれか1項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。髄膜炎菌性髄膜炎の予防のため、または該予防における使用のための請求項1~68、73~75のいずれか1項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。ナイセリア菌の補体媒介性殺傷耐性の低下のため、または該低下における使用のための請求項1~68、73~76のいずれか1項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。髄膜炎菌または淋菌病原体へのヒトビトロネクチン結合の防止のため、または該防止における使用のための請求項1~68、73~77のいずれか1項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。髄膜炎菌または淋菌病原体へのヒトH因子結合の防止のため、または該防止における使用のための請求項1~68、73~78のいずれか1項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。HsfおよびOpc抗原を一緒に混合する工程を含む、請求項1~68、73~79のいずれか1項に記載の免疫原性組成物またはワクチンを作製する方法。HsfおよびまたはOpc抗原を含む外膜調製物または外膜ベシクルを単離する工程を含む、請求項1~68、73~79のいずれか1項に記載の免疫原性組成物またはワクチンを作製する方法。Hsf抗原を含む単離された外膜調製物または単離された外膜ベシクルを、Opc抗原を含む単離された外膜調製物または単離された外膜ベシクルと混合する工程を含む、請求項81に記載の方法。請求項1~68、73~79のいずれか1項に記載の免疫原性組成物またはワクチンのHsfおよびOpc抗原に対して特異的な抗体を含む医薬組成物。請求項73~79のいずれか1項に記載の使用による使用のための請求項83に記載の医薬組成物。本発明者らは、ナイセリア菌Hsf抗原が宿主のビトロネクチンに結合すること、およびこの抗原がナイセリア菌のビトロネクチンに基づく補体媒介性殺傷耐性の原因となり得ることを見出した。かくして、これらの2つの主要な耐性因子を含み、これらの因子を標的とする宿主抗体を誘導して、これらの系を不活化し、宿主におけるナイセリア病原体の補体媒介性殺傷を促進することができるワクチンが提唱される。さらなる公知のナイセリア菌耐性因子は、H因子に結合し、補体媒介性殺傷耐性にも寄与するH因子結合タンパク質である。かくして、一般的にこれらの因子を標的とし、ビトロネクチンおよびH因子に基づく系の両方を不活化し、宿主におけるナイセリア病原体の補体媒介性殺傷を促進する宿主抗体を誘導するためにFHbpをさらに含む一般的なワクチンがさらに提唱される。従って、ナイセリア菌HsfおよびOpc抗原、ならびに必要に応じて、ナイセリア菌FHbp抗原を含む免疫原性組成物が提供される。Hsf抗原は、髄膜炎菌、特に、血清群Bに由来するものであってよい。Hsf抗原は、a配列番号2のアミノ酸配列、b配列番号2との少なくとも80、85、90、95もしくは99の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはc配列番号2の少なくとも10、15、20、25、30個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドであってよい。本発明のHsf抗原は、配列番号2のポリペプチドへのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内で配列番号2のポリペプチドを発現する髄膜炎菌へのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができる抗体を惹起することができる。Hsf抗原は、Hsfへのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができるおよびまたはその外膜内でHsfを発現する髄膜炎菌へのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができるヒト宿主中で抗体を惹起するのに十分な用量で免疫原性組成物中に存在してもよい。これに関連して、本発明の組成物により生成された血清ヒト、または任意の好適な動物モデル源に由来するを用いて結合の阻害を見ることにより、血清をinvitro試験において試験することができる。Opc抗原は、髄膜炎菌、特に、血清群Bに由来するものであってよい。Opc抗原は、a配列番号4のアミノ酸配列、b配列番号4との少なくとも80、85、90、95もしくは99の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはc配列番号4の少なくとも10、15、20、25、30個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドであってよい。本発明のOpc抗原は、配列番号4のポリペプチドへのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内で配列番号4のポリペプチドを発現する髄膜炎菌へのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができる抗体を惹起することができる。Opc抗原は、Opcへのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができるおよびまたはその外膜内でOpcを発現する髄膜炎菌へのヒトビトロネクチンの結合を阻害することができるヒト宿主中で抗体を惹起するのに十分な用量で免疫原性組成物中に存在してもよい。これに関連して、本発明の組成物により生成された血清ヒト、または任意の好適な動物モデル源に由来するを用いて結合の阻害を見ることにより、血清をinvitro試験において試験することができる。FHbp抗原は、髄膜炎菌、特に、血清群Bに由来するものであってよい。それは公知のファミリーA型もしくはファミリーB型に関連してもよく、または本発明の組成物は両方のファミリーに由来するFHbpを含んでもよい。ファミリーの分類は、JournalofInfectiousDiseases2009vo200No3pp379389に一般的に記載されている。本発明のFHbpファミリーA抗原は、a配列番号5のアミノ酸配列、b配列番号5との少なくとも70、80、85、90、95もしくは99の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはc配列番号5の少なくとも10、15、20、25、30個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドであってよい。本発明のFHbpファミリーB抗原は、a配列番号6のアミノ酸配列、b配列番号6との少なくとも70、80、85、90、95もしくは99の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはc配列番号6の少なくとも10、15、20、25、30個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドであってよい。本発明のFHbpファミリーA抗原は、配列番号5のポリペプチドへのヒトH因子の結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内で配列番号5のポリペプチドを発現する髄膜炎菌へのヒトH因子の結合を阻害することができる抗体を惹起することができる。FHbpファミリーB抗原は、配列番号6のポリペプチドへのヒトH因子の結合を阻害することができる、およびまたはその外膜内で配列番号6のポリペプチドを発現する髄膜炎菌へのヒトH因子の結合を阻害することができる抗体を惹起することができる。本発明のFHbpファミリーA抗原は、FHbpファミリーAへのヒトH因子の結合を阻害することができるおよびまたはその外膜内でFHbpファミリーAを発現する髄膜炎菌へのヒトH因子の結合を阻害することができるヒト宿主中で抗体を惹起するのに十分な用量で免疫原性組成物中に存在してもよい。本発明のFHbpファミリーB抗原は、FHbpファミリーBへのヒトH因子の結合を阻害することができるおよびまたはその外膜内でFHbpファミリーBを発現する髄膜炎菌へのヒトH因子の結合を阻害することができるヒト宿主中で抗体を惹起するのに十分な用量で免疫原性組成物中に存在してもよい。これに関連して、本発明の組成物により生成された血清ヒト、または任意の好適な動物モデル源に由来するを用いて結合の阻害を見ることにより、血清をinvitro試験において試験することができる。本発明の抗原は、精製されたサブユニット抗原として、または外膜ベシクル調製物の外膜内に存在してもよい。外膜調製物内のHsf抗原を、H4476株と同じか、またはそれより高いレベルで外膜中でHsfを発現するナイセリア菌株から作製することができる。外膜調製物を、Hsf抗原をコードする1コピーより多いhsf遺伝子を有するか、または異種プロモーターの制御下でhsf遺伝子を有するナイセリア菌株から作製することができる。好ましくは、異種プロモーターは、hsf遺伝子プロモーターよりも強力なプロモーターである。外膜調製物内のOpc抗原を、H4476株またはC751株と同じか、またはそれより高いレベルで外膜中でOpcを発現するナイセリア菌株から作製することができる。Opcの発現は髄膜炎菌中では自然に下方調節され得るが、Opcを発現する株は、鼻咽頭から単離される傾向がある。さらに、本発明において用いることができるOpcを発現する株細胞を、公知のコロニーブロッティング技術を用いて容易に見出すことができる。本発明のOpc抗原を、外膜ベシクル内で上方調節することができる。本発明の外膜調製物を、Opc抗原をコードする1コピーより多いopc遺伝子を有するか、または異種プロモーターの制御下でopc遺伝子を有するナイセリア菌株から作製することができる。異種プロモーターはまた、野生型プロモーターよりも安定であるという潜在的な利点も有する。好ましくは、異種プロモーターは、opc遺伝子プロモーターより強力なプロモーターである。本発明の外膜調製物を、8047株またはMC58株と同じか、またはそれより高いレベルで外膜中でFHbpを発現するナイセリア菌株から作製することができる。FHbp抗原を、外膜ベシクル内で上方調節することができる。本発明の外膜調製物を、FHbp抗原をコードする1コピーより多いfhbp遺伝子を有するか、または異種プロモーター、好ましくは、fhbp遺伝子プロモーターより強力なプロモーターの制御下でfhbp遺伝子を有する、ナイセリア菌株から作製することができる。本発明の外膜ベシクル調製物を、細菌により自然に剥離したOMVを回収することにより作製するか、または界面活性剤、典型的には、デオキシコレートにより抽出することができる。用いられる界面活性剤の濃度は、0~05、01~04、または02~03、特に、およそもしくは正確に0、01、02、03、04または05のDOCであってよい。より高いレベルでは反応性であり得るブレブからLOSを除去する。より低レベルではより大量のFHbpなどのリポタンパク質を保持する。好ましくは、OMV調製物は、莢膜多糖を作ることができない株から作製する。さらに、好ましくは、免疫優勢可変抗原、例えば、PorAおよびまたはFrpBをOMVから除去して、免疫応答を改善する。本発明のOMV内のLOSを、OMV産生株中でのmsbBおよびまたはhtrB遺伝子の機能的発現を欠失させることにより解毒することができる。本発明の免疫原性組成物は、ナイセリア菌のNspAおよびまたはPilCをさらに含んでもよいWO0109350、WO2004014418。これらのタンパク質はまた、ナイセリア菌の補体媒介性殺傷耐性を補うことができる結合因子中に含有させることもできる。本発明の免疫原性組成物は、1種以上の細菌莢膜多糖またはオリゴ糖、特に、髄膜炎菌血清群A、C、YおよびW135、インフルエンザ菌b、肺炎連鎖球菌、A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌からなる群より選択される細菌から誘導されるものをさらに含んでもよい。これらのものをタンパク質担体にコンジュゲートすることができる。本発明の免疫原性組成物を用いるヒト宿主におけるナイセリア菌の治療または予防のさらなる方法が本発明により提供される。ビトロネクチンおよびH因子が、ヒト内皮細胞に付着し、身体の様々な区分に通過するナイセリア病原体により用いられることを考慮すると、本発明の免疫原性組成物を、そのような付着の防止における使用のため、およびまたは髄膜炎菌による髄膜炎の防止のために用いることができる。また、明らかに、本発明の組成物を、ナイセリア菌の補体媒介性殺傷耐性を低下させるために、ならびにナイセリア病原体の補体媒介性殺傷の改善のために用いることもできる。また、医学的治療もしくは予防または本明細書に記載の他の使用のために用いることができる、本発明のHsfおよびOpc抗原に特異的な抗体を含む医薬組成物も提供される。あるタンパク質が本明細書で具体的に記載される場合、それは天然の、完全長タンパク質、およびその天然の変異体に対する参照であるのが好ましいが、それはその抗原性断片を包含してもよい。これらのものは、タンパク質のアミノ酸配列から連続的に取った、少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは20個のアミノ酸、より好ましくは30個のアミノ酸、より好ましくは40個のアミノ酸または最も好ましくは50個のアミノ酸を含有するか、または含む断片である。さらに、抗原性断片は、ナイセリア菌の完全長タンパク質に対して生成された抗体またはナイセリア菌による哺乳動物宿主の感染により生成されたと免疫学的に反応する断片を指す。抗原性断片はまた、有効用量で投与した場合、ナイセリア菌感染に対して防御免疫応答を惹起する断片を含み、より好ましくは、それは髄膜炎菌およびまたは淋菌に対して防御的であり、最も好ましくは、それは髄膜炎菌血清群B感染に対して防御的である。また、本発明のナイセリア菌タンパク質の組換え融合タンパク質、またはその断片も本発明に含まれる。これらのものは、同じポリペプチド中で異なるナイセリア菌タンパク質またはその断片を組合わせてもよい。あるいは、本発明はまた、T細胞エピトープの提供因子または精製タグ、例えば、βガラクトシダーゼ、グルタチオンSトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、FLAG、mycタグ、ポリヒスチジンなどのエピトープタグ、またはインフルエンザウイルスヘマグルチニン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197などのウイルス表面タンパク質などの異種配列との融合タンパク質として、ナイセリア菌タンパク質またはその断片の個々の融合タンパク質を含む。NMB参照は、wwwneisseriaorgからアクセスすることができる配列に対する参照番号を指す。NspAはWO9629412に記載されている。PilCはMolMicrobiol199723879892に記載されている。Hsfは、自己輸送因子タンパク質に共通の構造シグナル配列、パッセンジャードメインおよび外膜への付着のための固定化ドメインを有する。例えば、髄膜炎菌H4476株に由来するHsfは、アミノ酸1~51から構成されるシグナル配列、表面に露出され、可変領域を含む成熟タンパク質のアミノ末端の頭部領域、首部領域、疎水性αへリックス領域および4つの膜貫通鎖が外膜に広がる固定化ドメインからなる。完全長Hsfを本発明の免疫原性組成物中で用いることができるが、様々なHsfトランケートおよび欠失物も、ワクチンの種類に応じて有利に用いることができる。Hsfをサブユニットワクチン中で用いる場合、可溶性パッセンジャードメインの一部を用いるのが好ましい例えば、アミノ酸52~479の完全なドメイン、最も好ましくは、その保存された部分、例えば、特に有利には、アミノ酸134~479の配列を用いる。WO0155182に開示されたタンパク質の可変領域を欠失するように、好ましい形態のHsfをトランケートすることができる。好ましい変異体は、WO0155182に定義された1、2、3、4または5つの可変領域の欠失を含む。上記配列および以下に記載の配列は、NまたはC末端のいずれか、または両方で最大で1、3、5、7、10または15個のアミノ酸により伸長またはトランケートすることができる。従って、Hsfの好ましい断片は、好ましくはアミノ酸52~473を含有する、Hsfの全ヘッド領域を含む。Hsfのさらに好ましい断片は、以下のアミノ酸配列;52~62、76~93、116~134、147~157、157~175、199~211、230~252、252~270、284~306、328~338、362~391、408~418、430~440および469~479のうちの一つ以上を含む頭部の表面に露出した領域を含む。Hsfが外膜ベシクル調製物中に存在する場合、それを完全長タンパク質として、または好ましくは、アミノ酸1~51および134~591の融合タンパク質から構成される有利な変異体として発現させることができる。好ましい形態のHsfを、WO0155182に開示されたタンパク質の可変領域を欠失させるためにトランケートすることができる。好ましい変異体としては、WO0155182に定義された1、2、3、4、または5つの可変領域の欠失を含む。好ましくは、第1および第2の可変領域を欠失させる。好ましい変異体は、アミノ酸配列52から237または54から237の間に由来する残基を欠失させ、より好ましくは、アミノ酸52から133または55から133の間の残基を欠失させる。成熟タンパク質は、シグナルペプチドを欠く。従って、本発明の好ましいプロセスは、1~5のスクロース中、pH70~pH90のpHでEDACNHSの存在下で、および必要に応じて、NaClを実質的に含まない条件下で、ブレブをコンジュゲートさせる工程、ならびに反応混合物からコンジュゲートされたブレブを単離する工程を含む、ブレブ内でコンジュゲートされたLOSを製造するプロセスである。反応の後、抗LOSmAbを用いる反応混合物のウェスタンゲル分離を行って、反応時間が進むにつれて、LOS分子量が増加し、ブレブ中のLOSの割合がより高くなることを示すことができる。収率99のブレブをそのような技術から回収することができる。EDACは、LOSのT依存的免疫原性の改善にとって十分にLOSをOMPに架橋させるが、乏しい濾過性、凝集性およびブレブ間架橋などの問題が生じるそのような高い程度でそれを架橋しない点で、優れたブレブ内架橋剤であることがわかった。生成されるブレブの形状は、非コンジュゲート化ブレブのものと同様である。さらに、上記プロトコルは、過度に高い架橋が起こるのを回避した。FHbpタンパク質は、本明細書では2つのファミリーに定義される。一態様においては、ファミリーの分類は、SequenceDiversityoftheFactorHBindingProteinVaccineCandidateinEpidemiologicallyRelevantStrainsofSerogroupBNeisseriameningitidesTheJournalofinfectiousdiseases2009vol200no3pp379389に開示されている。一態様においては、ファミリーの同一性は、成熟配列の領域136~254にわたって評価される。一態様においては、同じファミリー中のタンパク質は、C末端に対して成熟タンパク質のアミノ酸136から出発するfHbpの配列に基づいて80を超える同一性を有する。一態様においては、異なるファミリー中のタンパク質は、C末端に対して成熟タンパク質のアミノ酸136から出発するfHbpの配列に基づいて50~75の同一性を有する。一態様においては、ファミリーの同一性は、成熟配列の領域113~135にわたって評価される。一態様においては、同じファミリー中のタンパク質は、fHbpの成熟アミノ酸配列の領域113~135に基づいて69を超える同一性を有する。一態様においては、異なるファミリー中のタンパク質は、fHbpの成熟アミノ酸配列の領域113~135に基づいて20未満の同一性を有する。一態様においては、ファミリーAおよびBを、1個以上の下記アミノ酸の存在により識別することができる:一態様においては、ファミリーAおよびBは、領域113~135に由来する以下のコンセンサス配列を含む:AKINNPDKDSLINRSFLVSGLG、BQQDESMVAKRFIGDI。ファミリーBの配列の一例は、MC58株である。ファミリーB種の他の例としては、H4476株、M982株、M060240006株、03s0408株が挙げられ、他の例は当業者には周知である。ファミリーAの配列の一例は、8047株である。ファミリーA種の他の例としては、M1239株、M981株、M08240117株、M97252153株が上げられ、他の例は当業者には周知である。Opcは、5個の表面露出したループを有し、ビトロネクチンに結合するβバレルファミリーの膜貫通タンパク質である。このタンパク質は、天然では塩基性であり、突出表面ループ2を有する。本発明の組成物中で用いることができるOpcの免疫原性断片は、これらの5個の表面露出ループの1個以上を含み、特にループ2はビトロネクチンの結合に関与する。同時に、Opcの表面ループは、負に荷電した分子を収容することができる正に荷電した隙間を形成することができる。Opcは、invitroでヒト上皮細胞上のヘパリン様分子およびヘパリン硫酸プロテオグリカンの後ろにあることが示されている。ビトロネクチンは、ヒトにおいて200~400μgmlで循環するより豊富な血漿タンパク質の1つであり、全血漿タンパク質の02~05を占める。免疫原性組成物は、宿主に投与した場合に免疫応答を生成することができる本発明の少なくともHsfおよびOpc抗原を含む組成物である。好ましくは、そのような免疫原性調製物は、ナイセリア菌、好ましくは、髄膜炎菌または淋菌感染に対する防御免疫応答を生成することができる。本発明の免疫原性組成物は、サブユニット組成物であってもよい調製物との混合物であってもよい。サブユニット組成物は、成分を混合して抗原性組成物を形成させる前に、成分が単離され、少なくとも50、好ましくは少なくとも60、70、80、90純粋まで精製された組成物である。サブユニット組成物は、水溶性タンパク質の水性溶液であってもよい。それらは、抗原の疎水性部分を可溶化するための界面活性剤、好ましくは、非イオン、両性イオンまたはイオン界面活性剤を含んでもよい。それらは、リポソーム構造が形成され、脂質膜に広がる構造を有する抗原の提示を可能にするような脂質を含んでもよい。髄膜炎菌血清群Bは、工業規模でのその製造を可能にするのに十分な量の外膜ブレブを排出する。また、外膜ベシクルを、細菌細胞の界面活性剤抽出のプロセスを介して調製することもできる。本発明の免疫原性組成物はまた、好ましくは組換え的に上方調節された本発明の1つ以上の抗原を有する外膜ベシクル調製物も含んでもよい。そのような調製物はまた、必要に応じて、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3の一方または両方を含んでもよい。ナイセリア菌株に由来するブレブ調製物の製造は、当業者には周知の方法のいずれかによって達成することができる。好ましくは、EP301992、米国特許第5597572号、EP11243もしくは米国特許第4271147号、Frederiksonら、Zollingerら、Saundersら、DrabickらまたはWO0109350に開示された方法を用いる。一般に、OMVは界面活性剤、好ましくは、デオキシコレートを用いて抽出し、核酸は、必要に応じて、酵素的に除去する。精製は、超遠心分離、次いで、必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィーにより達成する。本発明の2つ以上の異なるブレブが含まれる場合、それらを単一の容器中で混合して、本発明の多価調製物を形成することができる。OMV調製物は通常、02μmのフィルターを介する濾過により滅菌し、好ましくは、ブレブ調製物を安定化することが知られるスクロース溶液中で保存する。外膜ベシクル調製物内のタンパク質の上方調節を、OMV調製物が誘導されたナイセリア菌株に余分のコピーの遺伝子を挿入することにより達成することができる。あるいは、遺伝子のプロモーターを、OMV調製物が誘導されるナイセリア菌株中でより強力なプロモーターに交換することができる。そのような技術は、WO0109350に記載されている。タンパク質の上方調節は、非改変髄膜炎菌から誘導されるOMV中に存在するタンパク質のレベルと比較して、OMV中に存在するより高いレベルのタンパク質をもたらす。好ましくは、そのレベルは、15、2、3、4、5、7、10または20倍高い。LPSがOMV中のさらなる抗原であることが意図される場合、好ましくは、低濃度の抽出界面活性剤を用いるプロトコルをOMV調製方法において用いて、特に毒性の弱く結合したLPSを除去しながら、高レベルの結合したLPSを保存することができる。用いられるDOCの濃度は、好ましくは、0~05のDOC、002~04のDOC、004~03のDOC、より好ましくは、006~02のDOCまたは008~015のDOC、最も好ましくは、およそまたは正確に01のDOCである。LPSを除去するためには、05のDOCを用いるべきである。より強力なプロモーター配列とは、目的の抗原をコードする遺伝子の転写を増加させる調節制御エレメントを指す。発現の上方調節とは、非改変ブレブのものと比較して、目的の抗原の発現を増強させるために任意の手段を指す。上方調節の量は、目的の特定の抗原に応じて変化するが、ブレブの膜完全性を破壊しない量を超えないことが理解される。抗原の上方調節は、非改変ブレブのものよりも少なくとも10高い発現を指す。好ましくは、それは少なくとも50より高い。より好ましくは、それは少なくとも100より高い。最も好ましくは、それは3、4、5、7、10、20倍より高い。再度明確にするために、用語少ない前記抗原を産生するように細菌株を遺伝子操作することまたは下方調節とは、好ましくは、発現が非改変ブレブのものよりも少なくとも10低くなるように、欠失により、非改変のものと比較して、目的の抗原の発現を低下させる任意の手段を指す。好ましくは、それは少なくとも50低く、最も好ましくは完全に存在しない。下方調節されるタンパク質が酵素または機能的タンパク質である場合、下方調節は、酵素活性または機能的活性の10、20、50、80または好ましくは100の手かをもたらす1個以上の突然変異を導入することにより達成することができる。ナイセリア菌タンパク質の発現を調節するのに必要な遺伝子操作工程を、当業者には公知の様々な方法で実行することができる。例えば、配列を挿入し、プロモーター遺伝子をトランスポゾン挿入の技術によって破壊することができる。例えば、遺伝子の発現を上方調節するために、強力なプロモーターを、遺伝子の開始コドンの2kb上流にトランスポゾンを介して挿入することができる。点突然変異または欠失を用いることもできる。しかしながら、そのような方法は、非常に不安定であるか、または不確実であり、従って、相同組換え事象を介して遺伝子操作工程を実施するのが好ましい。好ましくは、その事象は細菌染色体上の少なくとも30ヌクレオチドの配列と、株内に形質転換されたベクター上の少なくとも30ヌクレオチドの配列との間で起こる。好ましくは、前記領域は40~1000ヌクレオチド、より好ましくは、100~800ヌクレオチド、最も好ましくは、500ヌクレオチドである。これらの組換え誘導領域は、それらが高度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることができるように十分に類似しているべきである。本明細書に記載の遺伝子改変事象を実行するのに用いられる方法は、WO0109350に記載されている。ナイセリア菌に組込むことができる典型的な強力なプロモーターは、porA、porB、lgtF、Opa、p110、lst、およびhpuABである。PorAおよびPorBが、構成的な強力なプロモーターとして好ましい。PorBプロモーター活性はporBの開始コドンの上流のヌクレオチド1~250に対応する断片中に含まれることが確立されている。多くの表面抗原は細菌株間で可変性であり、結果として、限られたセットの密接に関連する株に対してのみ防御的である。本発明の一態様は、他のタンパク質の発現が低下したか、または好ましくは可変表面タンパク質をコードする遺伝子が欠失した本発明の外膜ベシクルを包含する。そのような欠失は、ワクチン中で投与した場合、ワクチン被接種者の免疫系に対する保存的タンパク質により示されるより高い影響に起因して、様々な株に対して交叉反応するより強い能力を有するブレブを産生する細菌株をもたらす。本発明のブレブ免疫原性組成物中で下方調節することができるナイセリア菌におけるそのような可変抗原の例としては、PorA、PorB、Opaが挙げられる。例えば、これらの可変遺伝子または非防御遺伝子の発現を下方調節するか、または最終的にそのスイッチを切ることができる。これは、ブレブの外側表面上に少量で存在するより良好な抗原に免疫系を集中させる利点を有する。また、下方調節とは、上記の外膜タンパク質の表面に露出した可変性免疫優勢ループを変化または欠失させて、得られる外膜タンパク質の免疫優勢性をより低くすることができることも意味する。発現を下方調節するための方法は、WO0109350に開示されている。本発明のブレブ免疫原性組成物中で下方調節される好ましいタンパク質の組合せとしては、PorAおよびOpA;PorAおよびFrpB;OpAおよびFrpB;PorAおよびOpAおよびFrpBが挙げられる。4つの異なるOpa遺伝子が髄膜炎菌ゲノム中に存在することが知られ、従って、Opaの発現が下方調節されると言う場合、それは好ましくは髄膜炎菌中に存在する1、2、3または4つ全部の遺伝子がそのように下方調節されることを意味する。そのような下方調節は、WO0109350に記載のように遺伝的に実施するか、またはOpa遺伝子座からの発現がないか、もしくは少ない、容易に認められる天然の安定な髄膜炎菌株を探すことにより実施することができる。そのような株を、Opaである細胞が、プレート上または顕微鏡下での細胞の出現を見ることにより見出すことができるOpaを発現する細胞にとって異なる表現型を有する場合、Poolmanらに記載の技術を用いて見出すことができる。一度見出されたら、Opaの欠如を確立するための発酵の実行後に細胞含量に対してウェスタンブロットを実施することにより、その株が安定的にOpaであることを示すことができる。外膜ベシクル中のいくつかの抗原の上方調節を鉄制限条件下での増殖により達成する場合、可変タンパク質FrpBJBacteriol18128952901を上方調節することもできる。本発明者らは、WO0109350に記載のように全タンパク質の発現を下方調節するか、またはFrpBの可変領域を欠失させることにより、これらの環境下でFrpBの発現を下方調節することが有利であることを見出した。これは、前記免疫原性組成物により惹起される免疫応答が、様々な株に存在する抗原に対するものであることを確保する。本発明の代替的な実施形態においては、FrpBを、鉄制限条件下で増殖させないナイセリア菌株から調製された外膜ベシクル中で下方調節する。本発明の免疫原性組成物中のブレブを、WO0109350に開示されたLPSの解毒のための方法により解毒することができる。特に、本発明のLPSの解毒のための方法は、WO0109350に開示されたhtrBおよびまたはmsbB酵素の下方調節欠失を含む。ナイセリア菌のmsbBおよびhtrB遺伝子は、それぞれ、lpxL1およびlpxL2とも呼ばれ、これらの遺伝子の欠失突然変異は、表現型的には、一方の二次アシル鎖を失うmsbB突然変異LOS、および両方の二次アシル鎖を失うhtrB突然変異LOSを特徴とする。WO9314155およびWO9503327は、本発明の組成物中で用いることができるポリミキシンBの非毒性的ペプチド機能的等価物を記載している。そのような方法を、低レベルのDOC、好ましくは、0~03のDOC、より好ましくは005~02のDOC、最も好ましくは、およそまたは正確に01のDOCを含むブレブ抽出の方法と組合わせるのが好ましい。反応性多糖被包性グラム陰性細菌からの細菌外膜ブレブの単離は、莢膜多糖の同時精製をもたらすことが多い。いくつかの場合、この夾雑材料は、多糖が他のブレブ成分により付与される免疫応答を増強することができるため、有用であることがわかっている。しかしながら、他の場合、細菌ブレブ調製物中の夾雑多糖材料の存在は、ワクチン中でのブレブの使用にとって有害であることがわかっている。例えば、血清群Bの莢膜多糖が防御免疫を付与せず、ヒトにおける有害な自己免疫応答を誘導しやすいことが、少なくとも髄膜炎菌の場合に示されている。結果として、本発明の外膜ベシクルを、莢膜多糖を含まないように遺伝子操作されたブレブ生産のための細菌株から単離することができる。そして、ブレブはヒトにおける使用にとって好適になる。そのようなブレブ調製物の特に好ましい例は、莢膜多糖を含まない髄膜炎菌血清群Bに由来するものである。莢膜生合成およびまたは輸送にとって必要な遺伝子が損傷した改変ブレブ産生株を用いることにより、これを達成することができる。莢膜多糖生合成または輸送をコードする遺伝子の不活化を、制御領域、コード領域もしくはその両方を突然変異することにより、またはそのような遺伝子の酵素機能を低下させる任意の他の方法により達成することができる。さらに、莢膜生合成遺伝子の不活化を、アンチセンス過剰発現またはトランスポゾン突然変異誘発によって達成することもできる。好ましい方法は、多糖生合成および輸送にとって必要な髄膜炎菌cps遺伝子のいくらかまたは全部の欠失である。この目的のために、置換プラスミドpMF121を用いて、cpsCAD遺伝子クラスターを欠失する突然変異を送達することができる。ヒトスフィンゴ糖脂質中に存在するラクトNネオトレハロースオリゴ糖基と類似する構造の存在のため、L3またはL2LPSに対して生じた抗体の安全性には疑問があった。残留量のL3LPSを含有するデオキシコレート抽出ベシクルワクチンを用いて多数の人々が安全にワクチン接種されていたとしても33810931096GVGSierraら、NIPHann14195210、LOS糖の末端部分の欠失が、ヒト組織の表面に存在する構造物との交叉反応を防止するのに有用である。好ましい実施形態においては、lgtB遺伝子の不活化は、末端ガラクトース残基およびシアル酸が存在しない中間体LPS構造をもたらす。そのような中間体はL3およびL2LPS株中で得ることができる。lgtE遺伝子を止めることにより、代替的な、およびあまり好ましくない型のLPSを得ることができる。lgtA遺伝子を止めることにより、さらなる代替的な、およびあまり好ましくない型のLPSを得ることができる。そのようなlgtA突然変異を選択する場合、lgtC発現も止めて、非免疫原性L1免疫型が形成されるのを防止するのが好ましい。本発明者らは、lgtB突然変異体が、殺菌抗体応答を依然として誘導することができるLPS防御オリゴ糖エピトープを依然として保持しながら、安全性の問題を解決するための最適なトランケーションであることを見出したため、これが最も好ましい。従って、一般に、L2またはL3調製物または髄膜炎菌ブレブ調製物をさらに含む本発明の免疫原性組成物は、lgtB、lgtA、galEまたはlgtE遺伝子に由来する機能的遺伝子産物の発現を、好ましくは該遺伝子のスイッチを切ることにより、最も好ましくは該遺伝子のプロモーターおよびもしくはオープンリーディングフレームの全部もしくは一部を欠失させることによって永久に下方調節するように遺伝子操作されたナイセリア菌株から有利に誘導される。本発明の上記免疫原性組成物が髄膜炎菌B株から誘導される場合、莢膜多糖も除去するのがさらに好ましい。これを達成するために多くの遺伝子のスイッチを切ることができるが、本発明者らは、ブレブ産生株を遺伝子操作して、siaD遺伝子に由来する機能的遺伝子産物の発現を、好ましくは該遺伝子のスイッチを切ることにより、最も好ましくは該遺伝子のプロモーターおよびもしくはオープンリーディングフレームの全部もしくは一部を欠失させることにより、永久に下方調節するのが好ましいことを有利に示した。そのような不活化はWO0109350に記載されている。siaD突然変異は、莢膜多糖からのヒトに類似するエピトープの除去をもたらし得る多くの突然変異のうち、最も有利なものである、何故なら、それはLOSの防御的エピトープの生合成に対する効果を有さない唯一の突然変異の1つであり、かくして、防御抗原としてLOSを最終的に用いることを目的とし、細菌の増殖に対する最小の効果を有するプロセスにおいて有利であるからである。従って、本発明の好ましい態様は、lgtEsiaD、lgtAsiaDまたは好ましくはlgtBsiaD髄膜炎菌B突然変異株から誘導される上記のブレブ免疫原性調製物である。上記の理由から、siaD突然変異が好ましいが、髄膜炎菌B莢膜多糖合成のスイッチを切る他の突然変異を用いることができる。かくして、ブレブ産生株を遺伝子操作して、下記遺伝子ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA、synBまたはsynC遺伝子の1つ以上からの機能的遺伝子産物の発現を、好ましくは、該遺伝子のスイッチを切ることにより、最も好ましくは、該遺伝子のプロモーターおよびまたはオープンリーディングフレームの全部または一部を欠失させることにより、永久に下方調節することができる。lgtE突然変異を、これらの突然変異の1つ以上と組合わせることができる。好ましくは、lgtB突然変異をこれらの突然変異の1つ以上と組合わせる。従って、本発明のさらなる態様は、髄膜炎菌Bのそのような組合わせた突然変異株に由来する上記のブレブ免疫原性調製物である。その株自体は本発明のさらなる態様である。lgtBおよびlgtEなどの様々なlgt遺伝子を含むナイセリア菌遺伝子座、ならびにその配列が当業界で公知である。最終生成物中で完全長LOSを用いようとする場合、LOSはシアル化されていないのが望ましい。そのような場合、synA、synBまたはsynC遺伝子が欠失した莢膜陰性株を用いるのが有利であり、そのようなものとして、突然変異はまた、menBLOSをシアル化することができなくする。ブレブ調製物、特に、低濃度のDOCで抽出された調製物においては、LPSを本発明の免疫原性組成物における抗原として用いることができる。しかしながら、ヒト様ラクトNネオテトラオース構造を除去するために、lgtE、lgtA、または好ましくは、lgtB遺伝子遺伝子産物の酵素機能を下方調節欠失不活化することが有利である。LPSオリゴ糖構造の生合成のためのlgt遺伝子を含むナイセリア菌遺伝子座は当業界で公知である。lgtBの下方調節欠失は、LPS防御エピトープを無傷のままにするため、好ましい。本発明の髄膜炎菌血清群Bブレブ調製物においては、siaDおよびlgtBの両方の下方調節欠失が好ましく、synBまたはsynCのいずれかとの組合せを用いることもできる、最適な安全性を有し、LPS防御エピトープが保持されたブレブ調製物をもたらす。従って、本発明のさらなる態様は、髄膜炎菌Bのそのような組合わせた突然変異株から誘導される上記のブレブ免疫原性調製物である。その株自身は本発明のさらなる態様である。本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1、2、3、4または5つの異なる外膜ベシクル調製物を含んでもよい。2つ以上のOMV調製物が含まれる場合、本発明の少なくとも1つの抗原がそれぞれのOMV中で上方調節される。そのようなOMV調製物を、同じ種および血清群のナイセリア菌株または好ましくは異なるクラス、血清群、血清型、亜血清型もしくは免疫型のナイセリア菌株から誘導することができる。例えば、免疫原性組成物は、免疫型L2のLPSを含む1つ以上の外膜ベシクル調製物および免疫型L3のLPSを含む1つ以上の外膜ベシクル調製物を含んでもよい。L2またはL3のOMV調製物を、好ましくは、LPSオリゴ糖合成遺伝子座中に最小の相変動性を有する安定な株から誘導する。本発明の免疫原性組成物はまた、サブユニット組成物と外膜ベシクルとの両方を含んでもよい。その可溶性に起因してサブユニット組成物中への含有にとって特に好適であるいくつかの抗原がある。そのようなタンパク質の例としては、本発明のFHbp抗原またはHsfパッセンジャードメインが挙げられる。外膜ベシクル調製物は、本発明のHsf、NspA、PilC、Opc抗原などの内在性膜タンパク質を担持させるのに理想的である。FHbpはまた、リポタンパク質の脂質尾部を介してOMVにより担持することもできる。本発明の免疫原性組成物は、髄膜炎菌血清群A、B、C、Y、W135または淋菌から誘導された抗原を含んでもよい。本発明の免疫原性組成物はさらに、細菌莢膜多糖またはオリゴ糖を含んでもよい。莢膜多糖またはオリゴ糖は、髄膜炎菌血清群A、C、YおよびまたはW135、インフルエンザ菌b、肺炎連鎖球菌、A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌ならびに表皮ブドウ球菌のうちの1つ以上から誘導することができる。本発明のさらなる態様は、本発明の抗原組成物と、ウイルスまたはグラム陽性細菌と関連するものなどの特定の疾患状態に対して有利に用いられる他の抗原とのワクチン組合せ物である。1つの好ましい組合せにおいては、本発明の抗原組成物は、プレーンであるか、またはタンパク質担体にコンジュゲートされていてもよい以下の髄膜炎菌莢膜多糖またはオリゴ糖:A、C、YもしくはW135のうちの1、2、3または好ましくは4つ全部と共に製剤化される。好ましくは、本発明の免疫原性組成物を、AおよびC;またはC;またはCおよびYと共に製剤化する。髄膜炎菌、好ましくは、血清群Bに由来するタンパク質を含有するそのようなワクチンを、広範囲の髄膜炎ワクチンとして有利に用いることができる。さらに好ましい実施形態においては、好ましくは、プレーンな、またはコンジュゲート化髄膜炎菌莢膜多糖もしくはオリゴ糖A、C、YもしくはY135の1、2、3または4つ全部と共に製剤化された、本発明の抗原組成物を、コンジュゲート化インフルエンザ菌b莢膜多糖もしくはオリゴ糖、およびまたは1つ以上のプレーンな、もしくはコンジュゲート化肺炎球菌莢膜多糖もしくはオリゴ糖と共に製剤化する。必要に応じて、前記ワクチンはまた、肺炎連鎖球菌感染に対して宿主を防御することができる1つ以上のタンパク質抗原を含んでもよい。そのようなワクチンを、広範囲の髄膜炎ワクチンとして有利に用いることができる。さらに好ましい実施形態においては、本発明の免疫原性組成物を、髄膜炎菌、インフルエンザ菌b、肺炎連鎖球菌、A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌の1つ以上から誘導された莢膜多糖またはオリゴ糖と共に製剤化する。肺炎球菌莢膜多糖抗原は、好ましくは、血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fから選択される。さらに好ましい実施形態は、インフルエンザ菌のPRP莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、黄色ブドウ球菌の5型、8型または336莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、表皮ブドウ球菌のI型、II型またはIII型莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、B群連鎖球菌のIa型、Ic型、II型またはIII型莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、好ましくは、少なくとも1つのMタンパク質およびより好ましくは複数の型のMタンパク質をさらに含む、A群連鎖球菌の莢膜多糖を含む。本発明のそのような莢膜多糖は、コンジュゲートされていないか、または破傷風トキソイド、破傷風トキソイド断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリシン、Dタンパク質などの担体タンパク質にコンジュゲートしてもよい。多糖コンジュゲートを、任意の公知のカップリング技術により調製することができる。例えば、多糖を、チオエーテル結合を介してカップリングすることができる。このコンジュゲーション方法は、シアネートエステルを形成する、多糖の1シアノ4ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレートによる活性化に依存する。かくして、活性化された多糖を直接またはスペーサー基を介して担体タンパク質上のアミノ基にカップリングすることができる。好ましくは、シアネートエステルを、ヘキサンジアミンとカップリングし、アミノ誘導体化多糖を、チオエーテル結合の形成を含むヘテロライゲーション化学を用いて担体タンパク質にコンジュゲートする。そのようなコンジュゲートは、PCT公開出願第WO9315760号に記載されている。コンジュゲートはまた、US4365170およびUS4673574に記載の直接還元的アミノ化方法により調製することもできる。他の方法は、EP0161188、EP208375およびEP0477508に記載されている。さらなる方法は、カルボジイミド縮合による、アジピンサンヒドラジドで誘導体化されたシアノゲンブロミド活性化多糖の、タンパク質担体へのカップリングを含む。オリゴ糖を含有させる場合、それらをコンジュゲートするのが好ましい。好ましい肺炎球菌タンパク質抗原は、肺炎球菌の外表面に露出した肺炎球菌タンパク質、または肺炎球菌によって分泌もしくは放出されるタンパク質である。最も好ましくは、前記タンパク質は、毒素、付着因子、2成分シグナル伝達物質、もしくは肺炎連鎖球菌のリポタンパク質、またはその断片である。特に好ましいタンパク質としては、限定されるものではないが、ニューモリシンMitchellら、NucleicAcidsRes1990Jul11184010ComparisonofpneumolysingenesandproteinsfromStreptococcuspneumoniaetypes1and2、Mitchellら、BiochimBiophysActa1989Jan2310076772ExpressionofthepneumolysingeneinEscherichiacolirapidpurificationandbiologicalproperties、WO9605859、WO9006951、WO9903884PspAおよびその膜貫通欠失変異体PspCおよびその膜貫通欠失変異体PsaAおよびその膜貫通欠失変異体525562SequenceheterogeneityofPsaAa37kilodaltonputativeadhesinessentialforvirulenceofStreptococcuspneumoniae肺炎球菌コリン結合タンパク質およびその膜貫通欠失変異体CbpAおよびその膜貫通欠失変異体グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼHSP70PcpAM様タンパク質および付着因子18627が挙げられる。さらに好ましい肺炎球菌タンパク質抗原は、WO9818931に開示されたもの、特に、WO9818930およびPCTUS9930390で選択されたものである。本発明の免疫原性組成物ワクチンはまた、必要に応じて、ジフテリア菌、破傷風菌および百日咳菌感染のうちの1つ以上に対する防御を提供する抗原を含んでもよい。百日咳成分は、殺傷された全細胞百日咳またはPT、FHAおよび69kDaペルタクチンに由来する少なくとも1つの抗原を含む無細胞百日咳であってもよい。典型的には、ジフテリア菌および破傷風菌に対する防御を提供する抗原は、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドである。これらのトキソイドは、化学的に不活化された毒素または点突然変異の導入により不活化された毒素であってよい。本発明の好ましい実施形態は、製薬上許容し得る賦形剤または担体をも含んでもよいワクチン中の本発明の免疫原性組成物の製剤である。上記の改変株のいずれかからの外膜ベシクル調製物の製造を、当業者には周知の方法のいずれかにより達成することができる。好ましくは、EP301992、US5597572、EP11243またはUS4271147に開示された方法を用いる。最も好ましくは、WO0109350に記載の方法を用いる。ワクチン調製物は、一般にVaccineDesignPlenumPressNewYorkに記載されている。本発明の抗原組成物を、本発明のワクチン製剤中でアジュバント化することができる。好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲルもしくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化チロシン、もしくはアシル化糖、陽イオンもしくは陰イオン的に誘導体化された多糖の不溶性懸濁液、またはポリホスファゼンであってもよい。用いることができる好適なTh1アジュバント系としては、モノホスホリルリピドA、特に、3デOアシル化モノホスホリルリピドA、およびモノホスホリルリピドA、特に、3デOアシル化モノホスホリルリピドAとアルミニウム塩との組合せが挙げられる。増強された系は、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体との組合せ、特に、WO9400153に開示されたQS21と3DMPLとの組合せ、またはQS21がWO9633739に開示されたようにコレステロールでクエンチされた低反応性組成物を含む。市中油乳濁液中にQS213DMPLおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤がWO9517210に記載されており、好ましい製剤である。ワクチンは、サポニン、より好ましくは、QS21を含んでもよい。それはまた、水中油乳濁液およびトコフェロールを含んでもよい。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドもまた、TH1応答の選択的誘導因子であり、本発明における使用にとって好適である。本発明のワクチン調製物を用いて、全身経路または粘膜経路を介して前記ワクチンを投与することにより、感染が疑われる哺乳動物を防御または治療することができる。これらの投与としては、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路を介する注射;または口腔消化管、気道、尿生殖路への粘膜投与が挙げられる。かくして、本発明の一態様は、グラム陰性細菌の感染により引き起こされる疾患に対してヒト宿主を免疫する方法であって、本発明のOMV調製物の免疫防御用量を宿主に投与することを含む前記方法である。それぞれのワクチン用量中の抗原の量は、典型的なワクチン被接種者において有意な、有害な副作用なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は、用いられる特定の免疫原およびそれが提示される方法に応じて変化する。一般に、それぞれの用量は1~100μg、好ましくは5~50μg、および最も典型的には、5~25μgの範囲のタンパク質抗原またはOMV調製物を含むと予想される。特定のワクチンのための最適量を、被験体における好適な免疫応答の観察を含む標準的な試験によって確認することができる。初回ワクチン接種の後、被験体は十分に間隔を空けた1回または数回の追加免疫を受けてもよい。本発明のワクチンは、好ましくは免疫防御的および非毒性的であり、小児科での使用または青年期の使用にとって好適である。小児科での使用とは、4歳未満の幼児における使用を意味する。本発明の別の態様は、防御用量の本発明のワクチンを、それを必要とする宿主に投与することを含むナイセリア菌疾患の治療または予防のための方法を含む。髄膜炎菌血清群A、B、C、YもしくはW135およびまたは淋菌感染を、有利に予防または治療することができる。本発明はまた、ナイセリア菌感染の治療または予防のための医薬の調製における本発明のワクチンの使用も含む。また、ナイセリア菌感染は、髄膜炎菌血清群A、B、C、Y、W135およびまたは淋菌による感染を包含する。本発明の別の態様は、本発明の外膜ベシクルを誘導することができる遺伝子操作されたナイセリア菌株である。そのようなナイセリア菌株は、髄膜炎菌または淋菌であってよい。本発明のさらなる態様は、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを作製する方法である。これらのものは、本発明のナイセリア菌株から誘導されたブレブの形態で存在してもよい、ナイセリア菌に由来する本発明の少なくとも2つの単離された抗原またはタンパク質を一緒に混合して、本発明の免疫原性組成物を作製する工程を含む方法、および本発明の免疫原性組成物と製薬上許容し得る担体とを混合する工程を含む本発明のワクチンを作製する方法を含む。また、ナイセリア菌培養物から本発明の外膜ベシクルを単離する工程を含む本発明の免疫原性組成物を作製する方法も本発明に含まれる。そのような方法は、好ましくは、少なくとも1つの外膜ベシクル調製物が免疫型L2のLPSを含有し、少なくとも1つの外膜ベシクル調製物が免疫型L3のLPSを含有する、少なくとも2つの外膜ベシクル調製物を混合するさらなる工程を含んでもよい。本発明はまた、0~05の濃度のDOCで抽出することにより外膜ベシクルを単離するそのような方法も含む。LPS含量を最小化するためには、03~05のDOC濃度を用いる。LPSを抗原として保存しようとするOMV調製物においては、抽出のために0~03、好ましくは、005~02、最も好ましくは約01のDOC濃度を用いる。本発明者らは、ブレブ調製物およびワクチンに対する上記改善を、ゴーストまたは殺傷全細胞調製物およびワクチンにも容易に拡張することができると予想する。ブレブ調製物が作製される本発明の改変グラム陰性株を用いて、ゴーストおよび殺傷全細胞調製物を作製することもできる。グラム陰性株からゴースト調製物を作製する方法は、当業界で周知である。ワクチンにおける使用のための不活化細胞調製物を作製するために全細胞を殺傷する方法も周知である。本明細書を通して記載される用語ブレブまたはOMV調製物およびブレブまたはOMVワクチンならびにプロセスは従って、本発明の目的のために、それぞれ、用語ゴースト調製物およびゴーストワクチンならびに殺傷全細胞調製物および殺傷全細胞ワクチンにも適用可能である。同様に、本発明の外膜ベシクルOMV調製物またはブレブ調製物に関する本明細書に記載の実施形態も、任意の外膜調製物本発明の外膜調製物に対して本明細書に記載のあらゆる例において等しく適用可能である。そのような外膜調製物を、宿主の細菌DNAおよび多くの他の細胞の細胞質成分から精製する。かくして、本発明の外膜調製物は、ブレブ、OMV、ゴースト、または外膜複合体などの任意の公知の型の膜調製物であってもよい。本発明の外膜調製物における使用のためのOMPCを作製する方法は当業界で周知であり、例えば、以下のZollingerらに記載の方法がある。必要に応じて、本発明のブレブOMVは、ブレブのLOS含量が、標準物として精製されたLOSを用いるSDSPAGE電気泳動後の銀染色によって測定される通り、3~30、5~25、15~22のLOS含量であるように調製されたものである142533に記載の方法を参照されたい。髄膜炎菌ブレブ中の20のLOSを、01の低DOC抽出を用いて達成することができ、緩く保持されたLOS分子を除去するが、大部分の抗原は保存することができる。05のDOC抽出は、調製物中で約5のLOSをもたらすことができる。必要に応じて、本発明のOMPCは、OMPCのLOS含量が、3、2、1、075、05、または025より下であるように調製されたものである。好ましくは、LOS含量は1より下である。本発明の別の態様は、レシピエントを本発明のワクチンで免疫する工程およびレシピエントから免疫グロブリンを単離する工程を含む、ナイセリア菌感染の予防または治療における使用のための抗体または免疫グロブリンを調製する方法である。本発明により調製される免疫グロブリンは、本発明のさらなる態様である。本発明の免疫グロブリンおよび製薬上許容し得る担体を含む医薬組成物は、本発明のさらなる態様であり、ナイセリア菌疾患の治療または予防のための医薬の製造において用いることができる。有効量の本発明の医薬調製物を患者に投与する工程を含むナイセリア菌感染の治療または予防のための方法は、本発明のさらなる態様である。ポリクローナル抗体産生のための接種材料は、典型的には、ヒトでの使用にとって好適な塩水または他のアジュバントなどの生理的に許容し得る希釈剤中に抗原組成物を分散させて、水性組成物を形成させることにより調製される。免疫刺激量の摂取材料を哺乳動物に投与し、次いで、接種された哺乳動物を、抗原組成物が防御抗体を誘導するのに十分な時間にわたって維持する。アフィニティクロマトグラフィーなどの周知の技術により、望ましい程度まで抗体を単離することができる。抗体は、様々な一般的に用いられる動物、例えば、ヤギ、霊長類、ロバ、ブタ、ウマ、モルモット、ラットまたはヒトに由来する抗血清調製物を含んでもよい。動物を出血させ、血清を回収する。本発明に従って産生される免疫グロブリンは、全抗体、抗体断片またはサブ断片を含んでもよい。抗体は、任意のクラスの全免疫グロブリン、例えば、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、本発明の2つ以上の抗原に対する二重の特異性を有するキメラ抗体またはハイブリッド抗体であってよい。それらはまた、断片、例えば、ハイブリッド断片を含むF2、Fab、Fab、Fvなどであってもよい。免疫グロブリンはまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する天然の、合成の、または遺伝子操作されたタンパク質を含んでもよい。本発明のワクチンを、後に特異的ワクチンからのチャレンジに応答して産生される免疫グロブリンの供給源として働くレシピエントに投与することができる。このように治療された被験体は、従来の血漿分画法により高力価免疫グロブリンが得られる血漿を提供する。高力価免疫グロブリンを別の被験体に投与して、ナイセリア菌感染に対する耐性を付与するか、またはそれを治療することができる。本発明の高力価免疫グロブリンは、幼児、免疫不全個体における、または治療を必要とする場合および個体がワクチン接種に応答して抗体を産生する時間がない場合のナイセリア菌疾患の治療または予防にとって特に有用である。本発明のさらなる態様は、グラム陰性細菌、好ましくは、ナイセリア菌、より好ましくは、髄膜炎菌または淋菌、および最も好ましくは、髄膜炎菌血清群Bによる感染を治療または予防するのに用いることができる、本発明の免疫原性組成物の少なくとも2つの構成要素に対して反応する2つ以上のモノクローナル抗体を含む医薬組成物である。そのような医薬組成物は、任意のクラスの全免疫グロブリン、例えば、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgEであってよいモノクローナル抗体、本発明の2つ以上の抗原に対する特異性を有するキメラ抗体またはハイブリッド抗体を含む。それらはまた、断片、例えば、ハイブリッド断片を含むF2、Fab、Fab、Fvなどであってもよい。モノクローナル抗体を作製する方法は当業界で周知であり、脾臓細胞とミエローマ細胞との融合が挙げられる。あるいは、モノクローナルFv断片を、好適なファージ展示ライブラリーをスクリーニングすることにより取得することができる。モノクローナル抗体は、公知の方法によりヒト化または一部ヒト化することができる。本特許明細書内で引用された全ての参考文献または特許出願は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。本明細書における用語含む、含むおよび含むは、必要に応じて、例毎に、それぞれ用語からなる、からなる、およびからなると置換可能であることが本発明者らによって意図される。以下の実施例は、別途詳細に記載される場合を除いて、当業者には周知であり、日常的である標準的な技術を用いて実行される。実施例は例示的なものであるが、本発明を限定するものではない。WO0109350およびWO2004014418は、外膜ベシクルを調製し、外膜ベシクルが誘導される細菌株を操作するための詳細な一般的方法を提供する。抗原または遺伝子の下方調節、莢膜多糖の除去、抗原の上方調節のための方法が開示される。はヒトビトロネクチンと直接相互作用する:宿主細胞接着および血清耐性における髄膜炎菌HsfおよびOpcの間の相互作用最近、本発明者らは、血清耐性を誘導する補体調節分子の隔離ならびに鼻咽頭において、および血管境界面で細胞受容体がヒト細胞障壁を通過することを可能にする細胞受容体への結合という髄膜炎菌外膜タンパク質の2つの鍵となる機能を調査してきた。この研究において、本発明者らは、髄膜炎菌Hsfが細菌にビトロネクチン結合特性を付与することを観察した。さらに、OpcおよびMsfは、正常なヒト血清中でビトロネクチンを用いて、補体機能ならびに排除機能を達成する。合成Vnペプチドを用いて、本発明者らはビトロネクチンのMsf結合領域を詳述してきた。Opcに関しては、この相互作用は、C9重合およびMsf含有細菌膜中への終末補体複合体挿入を阻害することにより、NHS中での髄膜炎菌の生存を延長する。かくして、表現型の混合物をNHSに曝露した場合、Vn結合タンパク質を発現するものは、その発現を欠くものと比較して殺傷に抵抗する著しい能力を示す。しかしながら、MsfおよびOpcは細胞接着およびVnへの結合を介する侵襲においては同等に効率的であるわけではない。このデータは、ビトロネクチン結合が、細菌がいくつかの異なる接着機構を進化させたinvivoでの環境において病原体の生存のための重要な特性であり得ることを暗示する。この提示の目的は、分子レベルでの新規の相互作用機構および外膜タンパク質の機能的特性ならびに生存および障壁貫通を可能にするように操作された宿主成分を説明することである。ナイセリアメニンギティディスは、ヒトに特異的な細菌である。それはかなりの能力の生着菌および病原体としてのその成功への鍵である、その宿主の先天性および後天性免疫機構に対する耐性のいくつかの機構を進化させてきた。ヒト抗体および補体は、多くの個体において、細菌が呼吸器粘膜に限定されたままになるように、病原体の拡散の制御において重要な役割を果たしている。しかしながら、この環境においても、細菌はヒト抗体、補体因子および他の血清タンパク質に遭遇し得る。髄膜炎菌が抗体および補体媒介性殺傷に対する耐性を獲得することができる1つの機構は、H因子、補体成分C4結合タンパク質またはビトロネクチンなどの補体制御因子の隔離による。前者の2つの機構は、髄膜炎菌について記載されているが、後者は未知のままであった。本発明者らは最近、Nmが補体機能の制御のためにもこの経路を利用することができることを見出した。ビトロネクチンは、重要な補体調節機能を有する多機能血漿糖タンパク質である。Vnの機能は、クラステリンと重複しており、Vnと同様、Clnは細胞溶解を防止するために細胞膜への終末補体複合体または膜攻撃複合体の挿入を遮断することができる。それらはMACと複合体化することがわかった。Brandtzaegおよび同僚は、重篤な髄膜炎菌疾患中にビトロネクチンおよびクラステリンのレベルを試験し、髄膜炎菌疾患の急性期においてはそのレベルが低く、生存患者においては徐々に正常化することを見出した。彼らの研究において、特に、低レベルのVnは、疾患の重篤度ならびに凝固、線維素溶解および補体系の活性化と相関した。ビトロネクチンは、凝固経路においていくつかの重要な役割を果たす。例えば、それはプラスミノゲン活性化因子阻害因子1型に結合し、その機能的寿命を増加させることにより、線維素溶解を阻害する。Vnはまた、抗トロンビンIII活性に対するその効果により、凝血促進的役割を果たす。ビトロネクチンの機能の多くは、生理的リガンド結合時に起こるビトロネクチンの活性化または展開を必要とする。活性化されたビトロネクチンのレベルは凝固の間に増加し得るが、活性化されたビトロネクチンはそのリガンドとの複合体中に迅速に消費され、消失する。かくして、ビトロネクチンの全体のプールは敗血症の間に減少する。しかしながら、そのようなビトロネクチンの持続的活性化はまた、活性化されたか、または展開されたビトロネクチンが髄膜炎菌による敗血症の間に正常レベルよりも高いレベルで存在することを意味する。ビトロネクチンはまた、細胞付着を促進し、そのRGDモチーフを介してインテグリンに結合する。興味深いことに、天然の折畳まれたVnは、ヘパリン結合に関与するものなどの多くの潜在部位または部分的に露出した部位ならびにOpc相互作用において重要であると本発明者らが発見した、2つの硫酸化チロシン残基を含む;以下を参照されたい。Opcおよびビトロネクチンに関する本発明者らの研究:数年前、本発明者らは、ビトロネクチンがNmOpcタンパク質に結合し、細胞接着および侵襲のためのOpcを発現する単離物の能力を増加させることを記載した。本発明者らの最近の研究は、Opcとビトロネクチンとの相互作用機構を調査し、様々な髄膜炎菌単離物による血清の吸着、活性化された展開された、および天然の折畳まれた形態のビトロネクチンの使用ならびに活性化されたビトロネクチンへの結合を阻害する抗体の使用、ビトロネクチンの合成チロシン硫酸化ペプチドならびに高親和性ヘパリン結合ドメインを含有するペプチドの使用などのいくつかの技術を用いて、ビトロネクチンのOpc標的化の正確な機構を評価した。本発明者らは、ビトロネクチンがその接続領域中の硫酸化チロシン残基を介してOpcを発現するNmに直接結合することができることを示した。さらに、Opcを発現するNmはまた、ヘパリンを含むサンドイッチ機構によってC末端ヘパリン結合ドメインにより少ない程度で結合することができる。ビトロネクチンへのOpcのそのような結合は、脳の微小血管内皮細胞などのヒト内皮細胞に細菌を付着、侵襲させることができる。さらに、ビトロネクチン結合は、Opcを発現する細胞が、補体媒介性殺傷に対してより耐性になるようにすることができる;この可能性は、本発明者らの最近の研究以前には、髄膜炎菌については以前に調査されていなかった。ビトロネクチン標的化を介する血清耐性のOpc依存的獲得に加えて、本発明者らは、初期にはNhhAHsfと呼ばれた髄膜炎菌タンパク質Msfもビトロネクチンに結合することができるという新しい発見を行った。これは、Opcと同様、髄膜炎菌の血清耐性の増加に寄与する。これはMsfにより得られた血清耐性の機構を定義づける初めての研究であり、本発明者らの観察を以下で簡単に説明する。大腸菌の付着因子AIDAIの相同体として、Nm株MC58においてnhhAと命名された遺伝子が同定された。その後、それがインフルエンザ菌のHiaおよびHsf付着因子とより密接に関連することがわかった。この遺伝子は試験したNmの全ての株上に存在し、ウェスタンブロット分析により、試験した大部分の株において発現されるが、発現のレベルは変化することが示された。nhhAは髄膜炎菌中では生じるが、淋菌中では生じないと考えられる。さらに、それはHsf、インフルエンザ菌表面フィブリルと最も類似するため、本発明者らは、用語Msfを使用することが好ましかった。いくつかの研究は、組換えMsfが免疫原性であり、殺菌抗体を惹起すること、回復期の血清が抗Msf抗体を示した。2008年7月に、本発明者の研究室で、本発明者らは、Msfの潜在的機能に関する調査を開始した。本発明者らは、ヒト細胞外マトリックスおよび血清タンパク質への結合におけるMsfの潜在的な役割を研究した。初期の研究において、本発明者らは、血清耐性はビトロネクチンなどの血清タンパク質の結合を介して獲得され得る1つの特性であるため、Msfを発現する髄膜炎菌が、より血清耐性であるかどうかを評価した。Msfが発達した、およびMsfを欠損するNmを用い、平行してOpc単離物を分析することにより、本発明者らは、MsfOpc髄膜炎菌と比較したMsfOpcの血清耐性の増加を観察することができた。MC58株は検出可能なレベルのMsfを発現するが、これらのものはMsfを過剰発現するように遺伝子操作されたH4476単離物中で認められるレベルに達しない。さらに、MC58株のMsf突然変異体を用いることにより、本発明者らは、正常なヒト血清の殺菌特性に対する耐性の増加におけるMsfとOpcの両方の役割を示すことができた。これらの観察は、Msfによる血清ビトロネクチンの潜在的標的化を試験するように本発明者らを導いた。以下の結果は、aMsfを発現する髄膜炎菌の無莢膜および莢膜単離物によるビトロネクチンの結合、bMsfにより標的化され得るビトロネクチンの領域、c活性化形態のヒトVnへの結合により獲得された血清耐性およびdVn標的化を介する血清耐性の機構が補体因子C9重合および溶解孔形成の阻害を含むことを示すために記載される。かくして、MsfまたはOpcによるビトロネクチン標的化は、補体作用の最終的な重要な段階を制御することによって全ての主要な補体経路活性を阻害することができる。の結合の証明Vnは発生期タンパク質として主に閉じたコンフォメーションで血中に循環するため、本発明者らは、より豊富な天然のVnおよびあまり豊富ではない展開された活性化形態のVnの両方がMsfを発現するNmに結合する能力を試験した。保存時にコンフォメーション変化を自発的に受けることができる天然のVn調製物が、Msfを発現するNmならびにOpcを発現するNmに低レベルで結合することが、初期の試験から明らかであった8E6の使用によりモニターすることができる。本発明者らは以前に、Opc相互作用のための活性化形態のVnに関する絶対要件を確立したため、この観察は、Opc結合と同様の機構もMsfを発現するNmによって用いることができることを示唆していた。これらの研究において、本発明者らは、本発明者らが用いたnVn調製物が約25の展開されたmAb8E6結合成分を含有することを確立することができた。結果として、このnVn調製物へのOpcまたはMsf発現細菌の結合は、Vnの完全に活性化された調製物について認められるものの約30であった。かくして、Msfはコンフォメーション的に活性化された形態のVnに選択的に結合すると結論付けることができる。OpcおよびMsf発現が発達したか、または欠損したNm誘導体を用いて、本発明者らは、aVnに結合するその能力を試験した。ELISAにおいて、無莢膜H4476誘導体の全細胞懸濁液を、固定されたaVn上に重ねた場合、付着因子がないものと比較していずれかの付着因子が発達した髄膜炎菌の結合の有意な増加がすぐに明らかとなった。さらに、二重発現因子は最も高い程度でaVnに結合したが、MsfOpcの結合レベルは、MsfOpcおよびOpcMsf表現型により示され、実験設定に依存した結合レベルを常に付加するものではなかった。の結合ビトロネクチン構造は高度に保存されており、ヒト、マウス、ウサギおよびウシに由来する血清タンパク質は広範囲の構造類似性を有する。動物起源に由来するタンパク質がヒトVnと同様に認識されるかどうかを試験するために、ビトロネクチンのヘパリンアフィニティ精製された調製物をELISAプレート上に固定し、細菌結合を評価した。それぞれの場合、Msfを発現するNmは固定された活性化ビトロネクチンに結合した。これらの観察は、感染の動物モデルにおいて、または動物血清を実験手順において用いる場合、ビトロネクチンのこれらの異なる供給源が、ヒト血清と同様に効率的に特定の髄膜炎菌表現型によって隔離され得ることを示唆している。タンパク質の領域が2つのタンパク質によって標的化され得ることを評価するために、いくつかの合成ビトロネクチンペプチドを用いた。以前に、OpcはVnのチロシン硫酸化領域に結合することが示された。残基V43~A68に広がるペプチド、その硫酸化誘導体VA26Sおよびそのリン酸化ペプチドVA26Pの使用は、VA26またはVA26Pではなく、VA26SによるaVnへのOpc結合の特異的阻害を示した。これらのペプチドを現在の試験において用いて、ペプチドの任意の領域がMsfにより認識され得るかどうかを評価した。直接結合試験において、3つ全部の固定されたビオチン化ペプチドへのMsf発現誘導体の有意な結合が認められた。対照的に、以前に観察されたようにOpcを発現するMsfNmのみがVA26Sに有意に結合した。MsfおよびOpcの両方へのVA26Sの特異的結合が、固定されたペプチドVA26SならびにVnとの配列類似性を有さない2つの無関係のペプチドSY30およびGS22を用いるELISAにおいて示された。いずれの対照ペプチドの結合も認められなかった。Msf対OpcのVnへの結合に関与するビトロネクチンの領域を確認するために、MsfおよびOpc結合を阻害するVA26SペプチドおよびOpc結合を阻害することが知られる8E6mAbを用いて細菌結合を評価した。実際、VnへのOpcの直接結合はチロシン硫酸化領域でのみ起こるので、VA26Sおよび8E6は予想された通りaVnへのOpc結合を無効化した。しかしながら、VA26Sを用いた場合、Msf結合の30の低下が観察され、mAb8E6を用いた場合はさらに少なかった。MsfOpc表現型の場合、前記ペプチドおよび8E6は両方とも、MsfOpc誘導体よりも有効であった。全体として、データは、iMsfおよびOpcは両方とも、これらのタンパク質を同時に発現する表現型においてaVnに結合すること、iiMsf結合領域がヒトビトロネクチンのV43A68領域内に部分的に位置し得ること、ならびにiiiVA26Sペプチドのみだと、aVnへのMsf結合を無効化するのに十分ではないことを示唆する。かくして、VnはVA26Sと比較してより完全な、もしくはより天然のエピトープを提供することが可能であり、およびまたはモノマーペプチドは多量体化した活性化Vnとうまく競合することができない。さらに、aVn上の他の部位はまた、Msfによって直接標的化することもできる。株MO1240101およびB16B6のMsfタンパク質は、公知のMsfタンパク質間でH4476と構造的に最も類似していない。合成VA26ペプチドに結合するその能力を評価するために、これらのタンパク質を過剰発現するNm誘導体に由来する全細胞細菌溶解物をELISAにおいて用いた。VA26への結合のレベルは、Msfタンパク質間の小さい構造的相違よりもむしろ、発現されるMsfのレベルの相違と相関した。いくつかの細菌は、ヒトVnの塩基性ヘパリン結合ドメインに直接または間接に結合する。本発明者らは、Opcがヘパリンを介して架橋することによってaVnHBDに結合することができることを示した。直接的または間接的相互作用がMsfを介して生じるかどうかを調査するために、本発明者らは、主要なヘパリン結合部位であるVnのC末端領域のVn残基A360~R395に広がる合成ビオチン化ペプチドAR36を使用し、無莢膜H4476単離物の結合を試験した。Opcとは対照的に、MsfはHBDペプチドに直接結合した。MsfとaVnとの相互作用を直接評価するために、Msfの組換えHisタグ付パッセンジャードメインを大腸菌中で発現させ、自然条件下でその精製を実行した。簡単に述べると、細菌を収穫し、Trisバッファー中に再懸濁し、超音波処理し、細胞デブリを遠心分離により除去した。次いで、上清をNiNTAアガロースと混合し、カラムに充填し、洗浄し、rMsfをイミダゾール含有Trisバッファーで溶出し、一晩透析した。そのようなMsfの調製は、一般的に、機能的に活性であり、図5に示されるように活性化ヒトビトロネクチンに結合することがわかった。数ヶ月間保存したいくつかのMsf調製物は活性を失っており、そのような調製物を対照として用いた。Msfを発現するNmがヒト血清に由来するVnに結合したかどうかを評価するために、細菌を血清と共にインキュベートし、洗浄し、aVn、フィブロネクチンまたはクラステリンの結合を、ヒトタンパク質に対する特異的抗体を用いて評価した。図6Aに示されるように、Msfを発現するNmは、血清に由来するaVnに有意に結合したが、フィブロネクチンまたはクラステリンには結合しなかった。さらに、aVnがMsfを発現するNmの血清耐性を増加させたかどうかを評価するために、H4476のいくつかの表現型を血清に曝露し、10血清または10μgmlのaVnを補給した10血清を用いて細菌の生存を試験したにおいて、髄膜炎菌疾患の既往歴のない4人の個人からプールされた正常ヒト血清を用いた;SBAのための方法は別表2に記載される。興味深いことに、MsfまたはOpc発現は、該タンパク質を発現しないものと比較してMsfOpcを発現する表現型の血清耐性の増加をもたらし、これらの実験においては相加効果はなかった。しかしながら、および重要なことに、MsfまたはOpc発現は、血清耐性におけるaVn依存的増加にとって必要であった。血清耐性における変異体B16B6Msfの役割を証明し、莢膜表現型におけるその効果を評価するために、異種B16B6Msfを発現するH4476莢膜誘導体もSBAにおいて用いた。活性化Vnは、この表現型の血清耐性をも増加させた。aVnとMsfを発現する表現型の血清耐性の増加との関係のさらなる証明が、一定範囲のaVn濃度で実行されたSBAにおいて得られた。これらの実験は、MsfおよびMsfH4476無莢膜誘導体を用いた。その鋭い血清感度のため、これらの実験においては5NHSを用いた。そのような限られた抗体状況では、aVnは16μgmlで存在する場合に血清殺傷を半減させた。正常ヒト血清におけるMsfまたはOpc発現表現型の生存利益を例示するために、初期集団が70の非発現菌から30の単一または二重の発現菌を等しい比率で含むように、H4476株誘導体を混合した。10PHSに10min曝露した後、生存菌を塗布し、コロニー形成単位を決定した。第1に、aVnを添加したPHS中の全生存菌は、PHSのみにおける生存菌を6~7倍超えた。第2に、10分以内に、ビトロネクチン結合タンパク質の一方または両方を発現する表現型は、一緒になって、PHSまたはaVnを補給したPHS中で全集団の90以上を占めるように優勢になった。集団構造の試験は、MsfOpcを発現する表現型の比OpcMsfOpcMsfが111から約41835に増加したことを示した。それぞれの表現型の生存は遮断抗体を含んでもよい血清の抗体組成にも依存するため、無作為に選択されたドナーに由来する血清を用いて、髄膜炎菌の血清耐性の増加における2つのタンパク質の優れた効果を証明することができることは注目すべきことである。生存集団の最終的なプロフィールの類似性はまた、補給されていないPHSおよびaVnを補給したPHSにおける生存機構の類似性を反映する。活性化Vnは、C5b7およびC5b9終末補体複合体などのその生理的リガンドと結合する。C5b9の形成中のC9成分へのその結合は、C9の重合を阻害し、標的膜へのC9溶解孔の形成を防止し、かくして細胞溶解を防止する。C9の重合の間に、C9上の新抗原が示される。C9新抗原に対するモノクローナル抗体ならびにMAC複合体においてC9を認識するポリクローナル抗体を用いて、PHSへのaVn付加後に細菌膜と結合したC9のレベルを評価した。aVnを補給されたPHS中の血清殺菌活性の観察される増加が、補体経路の終末段階の阻害に主に起因するかどうかを評価するために、細菌上でのC3の蓄積に対する添加されたVnの効果も、ポリクローナル抗C3抗体を用いて評価した。図9に示されるデータは、aVnを添加したMAC蓄積の特異的制御を示す。さらなる試験において、異なるMsfタンパク質を含む無莢膜および莢膜誘導体上でのMAC蓄積を、その対応するMsfタンパク質を発現する莢膜株MC58および無莢膜H4476ならびに異種B16B6Msfを発現する莢膜H4476誘導体を用いて決定した。第1に、SBAにおける異なるMC58およびH4476表現型の比較は、MsfOpc誘導体と比較してOpcおよびまたはMsfが発現される場合、非常により低いMAC蓄積を示した。さらなる実験において、莢膜G74誘導体と結合したC9を試験したところ、再び、aVnを補給したPHS中でのC9の結合の減少を示した。図2に提示される試験から明らかである通り、ビトロネクチン残基V43~A68に広がる合成ペプチドは、aVnとのMsf相互作用を有意に阻害する。細菌上でのMAC蓄積の修復におけるそのようなペプチドの効果を評価するために、対照ペプチドであるMV14も含むMAC蓄積アッセイにおいてVA26を用いた。MsfとのaVn相互作用の阻害におけるその役割と一致して、対照ペプチドMV14ではなく、VA26がMAC蓄積を修復した。本発明者らは、ビトロネクチンがNm上のOpcと内皮細胞インテグリンとの間で架橋を形成して、細菌細胞の接着および侵襲を増加させることができることを示した。しかしながら、本発明者らの現在の研究では、本発明者らは、Msfを発現するNmによる同様の細胞標的化を観察していない。MsfOpc二重発現表現型において、MsfがOpc媒介性細胞相互作用を阻害することができるとの証拠はない。Msfにより標的化されるVnの領域は、チロシン硫酸化Opc結合部位の上流にあり、VnのRGD細胞結合領域と重複してもよいと考えられる。これは、Msfを発現する表現型の内皮細胞結合の欠如を説明することができる。さらに、ビトロネクチン上のその結合部位に非常に近いため、Opc依存的細胞接着もMsfによって妨害することができる。補体耐性は、粘膜および粘膜下環境の定着の成功のための必須の特性であり、ヒト鼻咽頭の頻繁な生着菌である髄膜炎菌は、この目的のためにいくつかの戦略を進化させてきた。これらのものは、そのうちのいくらかは分子擬態を含む複合体機構を介して抗体および補体回避を補助する髄膜炎菌に共通する表面シアル酸の同化を含む。別の共通する戦略は、不透明タンパク質Opc、GNA1870またはH因子結合タンパク質として知られるタンパク質、ナイセリア表面タンパク質Aおよびポリンタンパク質PorAなどのいくつかの外膜タンパク質を介して宿主補体回避タンパク質の隔離を伴う。これらのタンパク質は、ビトロネクチン、H因子ならびにC4bpなどの異なる宿主分子に結合するが、後者の結合は生理的塩濃度では起こらないことが示された。Vn、fHおよびC4BPは補体経路の異なる段階を制御する:fHはC3転換酵素の形成を遅延させ、予め形成された解離させることにより、補体第二経路を下方調節する;C4BPは古典的経路のC4転換酵素と同様の効果を有する;一方、ビトロネクチンは、細胞膜中への終末C5b9膜攻撃複合体挿入を阻害することにより、全ての補体経路が収束する補体蓄積の終末段階でその効果を発揮する。かくして、髄膜炎菌によるVnへの結合は、免疫宿主においても細菌に対するかなりの利益を提供することができる。本発明者らは、Msfが、Opcと同様、補体攻撃に抵抗する能力を有するビトロネクチン結合タンパク質であることを示した。そうすることにおいて、この研究は、補体耐性全体の新規で重要な機構を同定した。Msfは宿主細胞接触時に上方調節され得る。さらに、いくつかの研究が、組換えMsfが免疫原性であり、殺菌抗体を惹起すること、および回復期の血清が抗Msf抗体を含有することを示した。免疫原性タンパク質は感染中に特殊な機能を有し得るため、定着および疾患における該タンパク質の能力を確立することが重要である。抗体および補体は、髄膜炎菌に対する防御、感染の間のMsfタンパク質の上方調節において重要な役割を果たし、全ての補体経路の作用に抵抗するその能力は、それを徹底的に調査するための重要な標的分子にする。ビトロネクチンなどのその宿主標的およびこれらの相互作用にとって必要なその特徴の同定は、以下の観点から有益である。遮断抗体を惹起し得る、Msfなどのワクチン候補の構造的特徴の保持は、これらの抗体が、ビトロネクチン隔離を阻害することによって、細菌に対する全ての抗体の効果を増加させ、それ自身、殺菌抗体として働くことができるため、特に有益であり得る。さらに、低レベル中間レベルのOpcは別表3に記載の血清耐性を補助することができるため、ワクチン調製物と共にOpcおよびMsfは、広範囲の毒性の強い髄膜炎菌株の拡散を制御するのに役立ち得る。参考文献HogasenKTEMollnesらLowlevelsofvitronectinandclusterininacutemeningococcaldiseasearecloselyassociatedwithformationoftheterminalcomplementcomplexandthevitronectinthrombinantithrombincomplexInfectImmun62487480PeakIRYSrikhantaらIdentificationandcharacterisationofanovelconservedoutermembraneproteinfromNeisseriameningitidisFEMSImmunolMedMicrobiol2832934SaECunhaCNJGriffithsらNeisseriameningitidisOpcinvasinbindstothesulphatedtyrosinesofactivatedvitronectintoattachtoandinvadehumanbrainendothelialcellsPLoSPathog6e1000911SjolinderHJErikssonらMeningococcaloutermembraneproteinNhhAisessentialforcolonizationanddiseasebypreventingphagocytosisandcomplementattackInfectImmun76541220VirjiMKMakepeaceらDistinctMechanismsofInteractionsofOpcExpressingMeningococciatApicalandBasolateralSurfacesofHumanEndothelialCellstheRoleofIntegrinsinApicalInteractionsMolecularMicrobiology14173184VirjiMKMakepeaceらOpcandpilusdependentinteractionsofmeningococciwithhumanendothelialcellsmolecularmechanismsandmodulationbysurfacepolysaccharidesMolMicrobiol18741754HartmanGVirjiMおよびHeydermanRDifferentialexpressionofNMB1856andtheautotransporterhomologuesNMB1985andNMB0992byNeisseriameningitidisduringearlyinteractionswithhumanepithelialcellsThirteenthInternationalPathogenicNeisseriaConferenceNorwegianInstituteofPublicHealthOsloNorwayNorwaySept162002注記:NMB0992NhhAMsf。別表2血清殺菌アッセイ細菌懸濁液をDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水中で調製し、計数し、新鮮に解凍されたヒト血清の必要な希釈液を100μl容量中の103個の細菌にすぐに添加した。CO2インキュベータ中、37°Cでインキュベートした後、細菌懸濁液の希釈液を寒天上に塗布して、生存細菌数を決定した。次いで、同様の様式で脱補体化された血清に曝露した細菌数との比較により、殺傷率を算出した。3莢膜および無莢膜Msf発現表現型の血清耐性に対するOpcレベルの変化の効果に関するさらなる研究Opcレベルはinvivoで変化し、粘膜単離物中のタンパク質のレベルは高いが、血液単離物中ではそれらは低い傾向があることが示唆される。血清耐性に対するOpcレベルの効果を評価するために、2つのシリーズの誘導体を用いて、invivoでの定着および疾患表現型を表現した。¢2シリーズのMC58無莢膜誘導体は、過剰発現するH4476誘導体中で発現されるレベルの約30である、Msfのレベルを発現する。注目すべきことに、H4476およびMC58のMsfは同一であり、Opcタンパク質は全ての髄膜炎菌において大部分は不変である。両方の株において、様々な発現レベルのOpc誘導体を、以下の図面に示されるように選択した。低い中程度のMsf発現を有するMC58においては、Msf単独で血清耐性を増加させる。両シリーズの単離物において、Opcレベルの増加は、PHSにおいては中程度に、およびaVnを補給したPHSにおいては非常により劇的に、血清耐性に役立つ。また、無莢膜および莢膜バックグラウンドの両方において、最大未満のレベルのOpcが血清耐性をかなり増加させるのに十分であることが明らかである。4様々な髄膜炎菌株のOpcおよびMsf関連性を示す表