"明細書中に記載の発明。従って、出血性疾患を処置するための新しい治療アプローチの必要性が残っている。安全であり、簡便であり、かつ、広範な出血性疾患に有効な単一の医薬品は、臨床診療に有利に影響する。発明の要旨本発明は、凝血原として非抗凝固性の硫酸化多糖NASPを用いて出血性疾患を処置するための方法および組成物を提供する。NASPは、単一の薬剤として、または互いに組み合わせて、または他の止血剤と組み合わせて投与され得る。特に、先天性凝固障害、後天性凝固障害、および外傷に起因する出血状態を含む出血性疾患の処置におけるNASPの使用が記載される。1つの態様において、本発明は、被験体に非抗凝固性の硫酸化多糖NASPを含む組成物の治療有効量を投与する工程を含む、血液凝固の促進が必要な被験体を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、NASPを含む組成物の治療有効量を被験体に投与する工程を含む、出血性疾患を有する被験体を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、NASPは、N-アセチルヘパリンNAH、N-アセチル-脱-O-硫酸化-ヘパリンNA-de-o-SH、脱-N-硫酸化-ヘパリンDe-NSH、脱-N-硫酸化-アセチル化-ヘパリンDe-NSAH、過ヨウ素酸-酸化ヘパリンPOH、化学的硫酸化ラミナリンCSL、化学的硫酸化アルギン酸CSAA、化学的硫酸化ペクチンCSP、硫酸デキストランDXS、ヘパリン誘導オリゴ糖HDO、ペントサンポリサルフェートPPS、およびフコイダンからなる群より選択される。他の実施形態において、NASPは、前述の化合物の低分子量フラグメントからなる群より選択される。好ましい実施形態において、NASPのフラグメントは、dPTアッセイで試験された場合に血液凝固時間を短縮させる。1つの実施形態において、NASPは、dPTアッセイで試験された場合に血液凝固時間を短縮させる、フコイダンのフラグメントである。さらなる実施形態において、NASPは、1以上の異なるNASPと共に、および/または1以上の他の治療薬と組み合わせて、同時投与され得る。特定の実施形態において、NASPは、血友病A、血友病B、フォンヴィレブランド病、突発性血小板減少症、1以上の接触因子例えば、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンHMWK欠乏、臨床的に明らかな出血に関与する1以上の因子例えば、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子低プロトロンビン血症、およびフォンヴィレブランド因子の欠乏、ビタミンK欠乏症、フィブリノーゲンの障害無フィブリノーゲン血症、低フィブリノーゲン血症、および異常フィブリノーゲン血症を含む、α2-アンチプラスミン欠損、ならびに肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温、月経、および妊娠に起因するような過度の出血からなる群より選択される出血性疾患を処置するために被験体に投与される。特定の実施形態において、NASPは、血液因子欠乏に起因する先天性凝固障害または後天性凝固障害を処置するために被験体に投与される。血液因子欠乏は、1以上の因子第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第XI因子、第XII因子、第XIII因子、およびフォンヴィレブランド因子が挙げられるが、これらに限定されないの欠乏によって引き起こされ得る。特定の実施形態において、出血性疾患を有する被験体は、NASPを別の治療薬と組み合わせて含む組成物の治療有効量を投与される。例えば、被験体は、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、第VIIa因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群より選択されるNASPおよび1以上の因子を含む組成物の治療有効量を投与され得る。処置は、トロンビンのような凝血原;内因性凝固経路のアクチベーター第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンが挙げられる;または外因性凝固経路のアクチベーター組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子が挙げられるを投与する工程をさらに包含し得る。出血性疾患を有する被験体を処置するのに用いられる治療薬は、同一または異なる組成物中で投与され得、そしてNASPの投与と同時に、投与前に、または投与後に投与され得る。別の態様において、本発明は、被験体における抗凝血剤の作用を逆転させる方法を提供し、この方法は、非抗凝固性の硫酸化多糖NASPを含む組成物の治療有効量を被験体に投与する工程を包含する。特定の実施形態において、被験体は、ヘパリン、クマリン誘導体例えば、ワルファリンまたはジクマロール、組織因子経路インヒビターTFPI、抗トロンビンIII、ループス抗凝固因子、線虫抗血液凝固ペプチドNAPc2、活性部位をブロックした第VIIa因子第VIIai因子、第IXa因子インヒビター、第Xa因子インヒビターフォンダパリヌクス、イドラパリヌクスidraparinux、DX-9065a、およびラザクサバンrazaxabanDPC906を含む、第Va因子および第VIIIa因子のインヒビター活性化プロテインCAPCおよび可溶性トロンボモジュリンを含む、トロンビンインヒビターヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、およびキシメラガトランを含むが挙げられるがこれらに限定されない、抗凝血剤で処置され得る。特定の実施形態において、被験体における抗凝血剤は、凝固因子第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、第XI因子、第XII因子、フォンヴィレブランド因子、プレカリクレイン、または高分子量キニノーゲンHMWKに結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されないに結合する抗体であってもよい。特定の実施形態において、NASPは、被験体における抗凝血剤の作用を逆転させるために、1以上の異なるNASPと共に、および/または1以上の他の治療薬と組み合わせて、同時投与され得る。例えば、被験体は、NASPならびに第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、第VIIa因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群より選択される1以上の因子を含む組成物の治療有効量を投与され得る。処置は、凝血原、例えば、内因性凝固経路のアクチベーター第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンが挙げられる;または外因性凝固経路のアクチベーター組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子が挙げられるを投与する工程をさらに包含し得る。被験体における抗凝血剤の作用を逆転させるためにNASPと組み合わせて用いられる治療薬は、同一または異なる組成物中で投与され得、そしてNASPの投与と同時に、投与前に、または投与後に投与され得る。別の態様において、本発明は、非抗凝固性の硫酸化多糖NASPを含む組成物の治療有効量を被験体に投与する工程を包含する、血液凝固の改善が所望される外科的または侵襲的手技を受ける被験体を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、NASPは、1以上の異なるNASPと共に、および/または1以上の他の治療薬と組み合わせて、外科的または侵襲的手技を受ける被験体に同時投与され得る。例えば、被験体は、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、第VIIa因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群より選択される1以上の因子の治療有効量を投与され得る。処置は、凝血原、例えば、内因性凝固経路のアクチベーター第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンが挙げられる;または外因性凝固経路のアクチベーター組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子が挙げられるを投与する工程をさらに包含し得る。外科的または侵襲的手技を受ける被験体を処置するのに用いられる治療薬は、同一または異なる組成物中で投与され得、そしてNASPの投与と同時に、投与前に、または投与後に投与され得る。別の態様において、被験体のTFPI活性を阻害する方法を提供し、この方法は、NASPを含む組成物の治療有効量を被験体に投与する工程を包含する。別の態様において、本発明は、生物学的サンプル中のTFPI活性を阻害する方法を提供し、この方法は、生物学的サンプル例えば、血液または血漿を、TFPI活性を阻害するのに十分な量の非抗凝固性の硫酸化多糖NASPと混合する工程を包含する。別の態様において、本発明は、NASPを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、NASPは、N-アセチルヘパリンNAH、N-アセチル-脱-O-硫酸化-ヘパリンNA-de-o-SH、脱-N-硫酸化-ヘパリンDe-NSH、脱-N-硫酸化-アセチル化-ヘパリンDe-NSAH、過ヨウ素-酸酸化ヘパリンPOH、化学的硫酸化ラミナリンCSL、化学的硫酸化アルギン酸CSAA、化学的硫酸化ペクチンCSP、硫酸デキストランDXS、ヘパリン-誘導オリゴ糖HDO、ペントサンポリサルフェートPPS、およびフコイダンからなる群より選択される。他の実施形態において、NASPは、前述の化合物の低分子量フラグメントからなる群より選択される。特定の実施形態において、組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含み得る。特定の実施形態において、組成物は、1以上の異なるNASP、および/または1以上の治療薬、ならびに/あるいは試薬をさらに含み得る。例えば、組成物は、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、およびフォンヴィレブランド因子、組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子からなる群より選択される1以上の因子;および/またはAPTT試薬、トロンボプラスチン、フィブリン、TFPI、ラッセルクサリヘビ蛇毒、微粉化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、およびカオリンからなる群より選択される1以上の試薬をさらに含み得る。別の態様において、本発明は、生物学的サンプル中のNASPによる凝固の加速度を測定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:a生物学的サンプルを、NASPを含む組成物と混合する工程;b生物学的サンプルの凝固時間を測定する工程;c生物学的サンプルの凝固時間を、NASPに曝露されていない対応する生物学的サンプルの凝固時間と比較する工程であって、NASPに曝露された生物学的サンプルの凝固時間の減少が観察される場合、これは、NASPが凝固を促進することを示す、工程。特定の実施形態において、1以上の異なるNASPおよび/または治療薬、ならびに/あるいは試薬は、凝固時間の測定のために生物学的サンプルに添加され得る。例えば、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、およびフォンヴィレブランド因子、組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子が挙げられるがこれらに限定されない、1以上の因子;ならびに/あるいはAPTT試薬、組織因子、トロンボプラスチン、フィブリン、TFPI、ラッセルクサリヘビ蛇毒、微粉化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、およびカオリンが挙げられるがこれらに限定されない、1以上の試薬が添加され得る。本発明は、例えば以下の項目を提供する:項目1血液凝固の促進を必要とする被験体を処置するための組成物の製造における、非抗凝固性の硫酸化多糖NASPの使用。項目2前記NASPが、N-アセチル-ヘパリンNAH、N-アセチル-脱-O-硫酸化-ヘパリンNA-de-o-SH、脱-N-硫酸化-ヘパリンDe-NSH、脱-N-硫酸化-アセチル化-ヘパリンDe-NSAH、過ヨウ素酸-酸化ヘパリンPOH、化学的硫酸化ラミナリンCSL、化学的硫酸化アルギン酸CSAA、化学的硫酸化ペクチンCSP、硫酸デキストランDXS、ヘパリン誘導オリゴ糖HDO、ペントサンポリサルフェートPPS、およびフコイダンからなる群より選択される、項目1に記載の使用。項目3前記NASPがNAHである、項目2に記載の使用。項目4前記NASPがPPSである、項目2に記載の使用。項目5前記NASPがフコイダンである、項目2に記載の使用。項目6前記NASPが、dPTアッセイにおける血液凝固時間を短縮するフコイダンのフラグメントである、項目2に記載の使用。項目7前記NASPが、約0.01mg/kg~約100mg/kgの投薬量で投与される、項目1~6のいずれか1項に記載の使用。項目8前記被験体が、慢性または急性出血性疾患、血液因子欠乏に起因する先天性凝固障害、および後天性凝固障害からなる群より選択される出血性疾患を有する、項目1~7に記載の使用。項目9前記血液因子欠乏が、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第XI因子、第XII因子、第XIII因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群より選択される1以上の因子の欠乏である、項目8に記載の使用。項目10前記血液凝固の促進を要する原因が、抗凝血剤の事前投与または手術もしくは他の侵襲的手技である、項目1に記載の使用。項目11前記被験体が、凝血原、内因性凝固経路のアクチベーター、外因性凝固経路のアクチベーター、および第2のNASPからなる群より選択される薬剤を投与することによってさらに処置される、項目1~10のいずれか1項に記載の使用。項目12前記内因性凝固経路のアクチベーターが、第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンからなる群より選択される、項目11に記載の使用。項目13前記外因性凝固経路のアクチベーターが、組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子からなる群より選択される、項目11に記載の使用。項目14前記被験体が、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、第VIIa因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群より選択される、1以上の因子を投与することによってさらに処置される、項目1~13のいずれか1項に記載の使用。項目15前記抗凝血剤は、ヘパリン、クマリン誘導体例えば、ワルファリンまたはジクマロール、組織因子経路インヒビターTFPI、抗トロンビンIII、ループス抗凝固因子、線虫抗血液凝固ペプチドNAPc2、活性部位をブロックした第VIIa因子第VIIai因子、第IXa因子インヒビター、第Xa因子インヒビターフォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、DX-9065a、およびラザクサバンDPC906が挙げられる、第Va因子および第VIIIa因子のインヒビター活性化プロテインCAPCおよび可溶性トロンボモジュリンが挙げられる、トロンビンインヒビターヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、およびキシメラガトランが挙げられる、ならびに凝固因子に結合する抗体からなる群より選択される、項目10に記載の使用。項目16前記抗凝血剤は、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、第XI因子、第XII因子、フォンヴィレブランド因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンHMWKからなる群より選択される凝固因子に結合する抗体である、項目15に記載の使用。項目17被験体におけるTFPI活性を阻害するための組成物の製造における、非抗凝固性の硫酸化多糖NASPの使用。項目18生物学的サンプル中のTFPI活性を阻害するための組成物の製造における、非抗凝固性の硫酸化多糖NASPの使用。項目19非抗凝固性の硫酸化多糖NASP;薬学的に受容可能な賦形剤;ならびに第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、およびフォンヴィレブランド因子、組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子からなる群より選択される1以上の因子を含む組成物。項目20血液凝固の促進を必要とする被験体を処置するための方法であって、該被験体に非抗凝固性の硫酸化多糖NASPを含む組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。項目21被験体におけるTFPI活性を阻害する方法であって、該方法は、該被験体に非抗凝固性の硫酸化多糖NASPを含む組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。項目22生物学的サンプル中のTFPI活性を阻害する方法であって、該方法は、該生物学的サンプルと、該TFPI活性を阻害するのに十分な量の非抗凝固性の硫酸化多糖NASPとを組み合わせる工程を包含する、方法。項目23生物学的サンプルにおける非抗凝固性の硫酸化多糖NASPによる血液凝固の促進を測定する方法であって、該方法は、以下の工程:a該生物学的サンプルと、該NASPを含む組成物とを組み合わせる工程、b該生物学的サンプルの凝固時間を測定する工程、c該生物学的サンプルの凝固時間を、該NASPに曝されていない対応する生物学的サンプルの凝固時間と比較する工程であって、ここで、該NASPに曝露された生物学的サンプルの凝固時間の短縮が、該凝固時間を加速させるNASPであることを示す、工程を包含する、方法。本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮すれば、当業者に容易に想起される。発明の詳細な説明本発明の実施は、他に指示がない限り、当該分野の技術の範囲内にある薬理学、化学、生化学、凝固、組換DNA技術および免疫学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、HandbookofExperimentalImmunology,第I~IV巻D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編,BlackwellScientificPublications;A.L.Lehninger,BiochemistryWorthPublishers,Inc.,現行の追加;Sambrook,etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual第2版,1989;MethodsInEnzymologyS.ColowickおよびN.Kaplan編,AcademicPress,Inc.を参照のこと。I.定義本発明を記載するにあたって、以下の用語が使用され、かつ、以下の用語は以下のとおり定義されることが意図される。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形a、an、およびtheは、その内容が明らかに別のものを指示しない限り、複数の対象を包含することが留意されるべきである。従って、例えば、NASPへの言及は、2以上のこのような因子の混合物を包含する、などである。NASPとは、本明細書中で使用される場合、希釈プロトロンビン時間dPT凝固アッセイまたは活性化部分トロンボプラスチン時間aPTT凝固アッセイにおいて、未分画ヘパリンMW範囲8,000~30,000;平均18,000ダルトンのモル抗凝固凝固時間の統計的に有意な増加活性の3分の1以下、そして好ましくは10分の1未満の抗凝固活性を示す硫酸化多糖をいう。NASPは、自然源例えば、褐藻、樹皮、動物の組織から精製されかつ/または改変されても、あるいはデノボ合成されてもよく、そして100ダルトン~1,000,000ダルトンの分子量の範囲にわたってもよい。NASPは、出血性疾患特に、凝固因子の欠乏に関連する出血性疾患の処置において止血を改善するために、または抗凝血剤の作用を逆転させるために、本発明の方法に用いられ得る。凝固を促進し、出血を減少させるNASPの能力は、種々のインビトロ凝固アッセイ例えば、dPTアッセイおよびaPTTアッセイおよびインビボ出血モデル例えば、血友病のマウスまたはイヌにおける尾部切除、横切断、全血凝固時間、または表皮出血時間測定を用いて容易に決定される。例えば、PDRStaff.Physicians’DeskReference.2004,Andersonetal.1976Thromb.Res.9:575-580;Nordfangetal.1991ThrombHaemost.66:464-467;Welschetal.1991ThrombosisResearch64:213-222;Brozeetal.2001ThrombHaemost85:747-748;Scallanetal.2003Blood.102:2031-2037;Pijnappelsetal.1986Thromb.Haemost.55:70-73;およびGilesetal.1982Blood60:727-730を参照のこと。凝血原とは、本明細書中で使用される場合、血栓形成を開始し得るかまたは促進し得る、任意の因子または試薬をいう。本発明の凝血原としては、内因性または外因性凝固経路の任意のアクチベーター例えば、第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、組織因子、第VIIa因子、および第Va因子からなる群より選択される凝固因子が挙げられる。凝固を促進する他の試薬としては、カリクレイン、APTTイニシエーターすなわち、リン脂質および接触アクチベーターを含む試薬、ラッセルクサリヘビ蛇毒RVV時間、およびトロンボプラスチンdPT用が挙げられる。本発明の方法において凝血原試薬として用いられ得る接触アクチベーターとしては、微粉化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、カオリンなど、当業者に公知のものが挙げられる。凝血原は、単離されかつ実質的に精製された粗製の天然抽出物血液または血漿サンプルに由来しても、合成であっても、または組換えであってもよい。凝血原としては、天然に存在する凝固因子あるいは生物活性を保持するすなわち、凝固を促進するそのフラグメント、改変体または共有結合的に修飾された誘導体が挙げられ得る。凝血原の最適濃度は、当業者によって決定され得る。用語多糖とは、本明細書中で使用される場合、複数すなわち、2以上の共有結合している糖残基を含むポリマーをいう。結合は、天然であっても非天然であってもよい。天然結合としては、例えば、グリコシド結合が挙げられ、一方、非天然結合としては、例えば、エステル結合部分、アミド結合部分、またはオキシム結合部分が挙げられる。多糖は、広範囲の平均分子量MW値のいずれかを有し得るが、一般に、少なくとも約100ダルトンである。例えば、多糖は、少なくとも約500ダルトン、1000ダルトン、2000ダルトン、4000ダルトン、6000ダルトン、8000ダルトン、10,000ダルトン、20,000ダルトン、30,000ダルトン、50,000ダルトン、100,000ダルトン、500,000ダルトンまたはそれよりも大きな分子量を有し得る。多糖は、直鎖または分枝鎖構造を有し得る。多糖は、より大きな多糖の分解例えば、加水分解によって生成した多糖のフラグメントを含み得る。分解は、酸、塩基、熱、または酵素で多糖を処理して分解多糖を生成する工程を包含する、当業者に公知の種々の手段のいずれかによっても達成され得る。多糖は、化学変化されても、修飾を有してもよい硫酸化、多硫化、エステル化、およびメチル化が挙げられるが、これらに限定されない。用語に由来するは、分子の起源を確認するために本明細書中で使用されるが、その分子が作製され得る方法を限定することを意味するものではなく、例えば、化学合成によるものであっても、組換え手段によるものであってもよい。用語改変体、アナログおよび突然変異タンパク質とは、本明細書中に記載される出血性疾患の処置における凝固活性のような所望の活性を保持する、参照分子の生物活性な誘導体をいう。一般に、ポリペプチド例えば、凝固因子に関連する用語改変体およびアナログとは、その改変が生物活性を無効化しない限り、天然の分子と比較して、1つ以上のアミノ酸付加、置換一般には、本質的に保存的であるおよび/または欠乏を有する天然のポリペプチド配列および構造を有する化合物をいい、これは、以下に定義されるような参照分子と実質的に相同である。一般に、このようなアナログのアミノ酸配列は、参照配列に対して、これらの2つの配列を整列させた場合に、高い配列相同性例えば、50よりも高い、一般には60~70よりも高い、特に80~85以上例えば、少なくとも90~95以上のアミノ酸配列相同性を有する。本明細書中に説明されるように、アナログはしばしば、同数のアミノ酸を含むが、置換を含む。用語突然変異タンパク質は、アミノおよび/またはイミノ分子のみから構成される化合物、1つ以上のアミノ酸のアナログ例えば、非天然アミノ酸などが挙げられるを含むポリペプチド、置換結合および当該分野で公知の他の改変を有するポリペプチド、天然に存在する分子および天然に存在しない例えば、合成分子の両方、環化分子、分岐分子などが挙げられるがこれらに限定されない、1つ以上のアミノ酸様分子を有するポリペプチドをさらに包含する。この用語はまた、1つ以上のN置換グリシン残基ペプトイドおよび他の合成アミノ酸またはペプチドを含む分子も包含する。ペプトイドの記載について、例えば、米国特許第5,831,005号;同第5,877,278号;および同第5,977,301号;Nguyenetal.,ChemBiol.20007:463-473;およびSimonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA199289:9367-9371を参照のこと。好ましくは、アナログまたは突然変異タンパク質は、天然の分子と少なくとも同じ凝固活性を有する。ポリペプチドアナログおよび突然変異タンパク質を作製する方法は、当該分野において公知であり、さらに以下に記載される。上に説明したとおり、アナログは一般に、本質的に保存的である置換すなわち、それらの側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換を含む。具体的には、アミノ酸は、一般に以下の4つのファミリーに分類される:1酸性--アスパルテートおよびグルタメート;2塩基性--リジン、アルギニン、ヒスチジン;3無極性--アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;および4非荷電極性--グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、しばしば芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの単独置換、アスパルテートのグルタメートでの単独置換、トレオニンのセリンでの単独置換、または構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の類似の保存的置換が、生物活性に対して大きな影響を及ぼさないことは、合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約5~10個までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、あるいは約15~25個までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、あるいは5~25の間の任意の整数個の保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者は、当該分野で周知のHopp/WoodsプロットおよびKyte-Doolittleプロットを参照することによって、変化を許容し得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。誘導体とは、参照分子の所望の生物活性例えば、凝固活性、TFPI活性の阻害が保持される限り、目的の参照分子またはそのアナログの任意の適切な改変例えば、硫酸化、アセチル化、グリコシル化、リン酸化、ポリマー結合体化例えば、ポリエチレングリコールとの、または他の外来部分の付加を意図する。例えば、多糖は、1つ以上の有機基または無機基で誘導体化され得る。例としては、少なくとも1つのヒドロキシル基が、別の部分例えば、硫酸基、カルボキシル基、リン酸基、アミノ基、ニトリル基、ハロ基、シリル基、アミド基、アシル基、脂肪族基、芳香族基、または糖基で置換されたか、あるいは環酸素が、硫黄、窒素、メチレン基などで置換された多糖が挙げられる。多糖は、例えば凝血促進機能を改善するために、化学変化され得る。このような改変としては、硫酸化、多硫化、エステル化、およびメチル化が挙げられ得るが、これらに限定されない。アナログおよび誘導体を作製する方法は、当該分野で一般に利用可能である。フラグメントとは、インタクトな全長配列および構造の一部のみからなる分子を意図する。多糖のフラグメントは、より大きな多糖の分解例えば、加水分解によって生成され得る。多糖の活性フラグメントは、当該フラグメントが生物活性例えば、凝固活性および/またはTFPI活性を阻害する能力を保持するならば、一般に、全長多糖の少なくとも約2~20個の糖単位、好ましくは全長分子の少なくとも約5~10個の糖単位、または2個の糖単位と全長分子の間の任意の整数個の糖単位を含む。ポリペプチドのフラグメントは、天然のポリペプチドのC末端欠乏、N末端欠乏、および/または内部欠乏を含み得る。特定のタンパク質の活性フラグメントは、当該フラグメントが本明細書中で定義されるような生物活性例えば、凝固活性を保持するならば、一般に、全長分子の少なくとも約5~10連続アミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約15~25連続アミノ酸残基、そして最も好ましくは全長分子の少なくとも約20~50連続アミノ酸残基以上であるか、または5アミノ酸と全長配列の間の任意の整数個の連続アミノ酸残基を含む。実質的に精製されたとは、一般に、物質例えば、硫酸化多糖が、この物質が存在するサンプルの主要な割合を占めるような、物質の単離をいう。代表的には、サンプル中において実質的に精製された成分は、サンプルの50、好ましくは80~85、より好ましくは90~95を占める。目的の多糖、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドを精製する技術は、当該分野で周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度勾配沈降が挙げられる。単離されたとは、多糖またはポリペプチドをいう場合、示された分子が、この分子が天然に見出される生物体全体から分離した状態であるか、または同種の他の生物学的高分子が実質的に存在しないところに存在することを意味する。相同性とは、2つのポリヌクレオチド間または2つのポリペプチド部分間の同一性パーセントをいう。2つの核酸配列、または2つのポリペプチド配列は、これらの配列が、それら分子のうちの規定の長さにわたって、少なくとも約50、好ましくは少なくとも約75、より好ましくは少なくとも約80~85、好ましくは少なくとも約90、そして最も好ましくは少なくとも約95~98の配列同一性を示す場合、互いに実質的に相同である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同とはまた、特定の配列に完全な同一性を示す配列もいう。一般に、同一性とは、2つのポリヌクレオチド配列のヌクレオチド対ヌクレオチドの正確な一致、または2つのポリペプチド配列のアミノ酸対アミノ酸の正確な一致をいう。同一性パーセントは、これらの配列を整列させ、この2つの整列した配列間の正確なマッチ数を数え、参照配列の長さで除算し、そしてその結果に100を積算することによって、2つの分子参照配列およびこの参照配列に対する同一性が未知である配列間の配列情報を直接比較することにより決定され得る。容易に入手可能なコンピュータプログラム、例えば、ALIGNDayhoff,M.O.,AtlasofProteinSequenceandStructure,M.O.Dayhoff編,5補遺3:353-358,NationalbiomedicalResearchFoundation,Washington,DCが、分析を補助するのに用いられ得る。ALIGNは、SmithおよびWatermanの局所ホモロジーアルゴリズムAdvancesinAppl.Math.2:482-489,1981をペプチド分析に適応させたものである。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、例えば、WisconsinSequenceAnalysisPackage,Version8GeneticsComputerGroup,Madison,WIから入手可能に同梱されている、BESTFIT、FASTAおよびGAPプログラムこれらもまた、SmithおよびWatermanのアルゴリズムに基づくである。これらのプログラムは、製造者が推奨し、上述のWisconsinSequenceAnalysisPackageに記載されるデフォルトパラメータを用いて、容易に利用される。例えば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対する同一性パーセントは、6つのヌクレオチド位置のギャップペナルティおよびデフォルトスコアリング表を用いた、SmithおよびWatermanの相同性アルゴリズムを用いて決定され得る。本発明に関連して同一性パーセントを算定する別の方法は、UniversityofEdinburghが著作権を有し、JohnF.CollinsおよびShaneS.Sturrokによって開発され、そしてIntelliGenetics,Inc.MountainView,CAによって配布されるプログラムのMPSRCHパッケージを用いることである。この一式のパッケージからのSmith-Watermanアルゴリズムは、デフォルトパラメータがスコアリング表に用いられる場合例えば、12のギャップ開始ペナルティ、1のギャップ伸長ペナルティ、および6のギャップに使用され得る。得られたデータからのマッチ値は、配列同一性を示す。配列間の同一性パーセントまたは類似性を算出する他の適切なプログラムは、当該分野で一般に公知であり、例えば、デフォルトパラメータを用いる別のアルゴリズムプログラムはBLASTである。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用され得る:遺伝コード=標準;フィルター=なし;鎖=両方;カットオフ=60;期待値=10;マトリックス=BLOSUM62;記述=50配列;ソート順序=HIGHSCORE;データベース=重複無しnon-redundant、GenBankEMBLDDBJPDBGenBankCDStranslationsSwissproteinSpupdatePIR。これらのプログラムの詳細は、容易に入手可能である。あるいは、相同性は、相同領域間に安定な2重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、次いで1種以上の1本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、そして消化されたフラグメントをサイズ決定することによって決定され得る。実質的に相同であるDNA配列は、例えば、特定の系のために定義されるようなストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は、当該分野の技術の範囲内にある。例えば、Sambrooketal.,前述;DNACloning前述;NucleicAcidHybridization前述を参照のこと。組換えは、核酸分子について説明するために本明細書中で使用される場合、ゲノム起源、cDNA起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、このポリヌクレオチドは、その起源または操作によって、そのポリヌクレオチドが本来関連するポリヌクレオチドの全部または一部とは関連していない。用語組換えは、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されるポリペプチドを意味する。一般に、目的の遺伝子は、以下にさらに記載されるように、クローニングされ、次いで形質転換された生物体内で発現される。宿主生物体は、発現条件下で外来遺伝子を発現してタンパク質を産生する。脊椎動物被験体とは、ヒトおよび他の霊長類例えば、チンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種のような、非ヒト霊長類を含む;家畜例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ;家庭内哺乳類例えば、イヌおよびネコ;齧歯類を含む実験動物例えば、マウス、ラットおよびモルモット;家庭で飼われている鳥、野鳥および猟鳥を含む鳥類例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、およびアヒル、ガチョウなどのような他の家禽が挙げられるがこれらに限定されない、脊索動物亜門の任意のメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体および新生体の両方が包含されることが意図される。本明細書中に記載される発明は、任意の上記の脊椎動物種における使用を意図するものである。用語患者とは、本発明のNASPの投与によって予防または処置され得る状態に罹患しているかまたはこのような状態になりやすい、ヒトおよび動物の両方を含む生体をいう。本明細書において、生物学的サンプルとは、例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、皮膚、気道、腸管および尿生殖路の外分泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検、ならびにまたインビトロ細胞培養物成分培地中の細胞および組織の成長によって生じる条件培地が挙げられるが、これらに限定されないのサンプル例えば、組換え細胞、および細胞成分も挙げられるがこれらに限定されない、被験体から単離される組織または流体のサンプルをいう。NASP、血液因子、または他の治療薬の治療有効用量または治療有効量とは、本明細書中に記載されるように投与されると、ポジティブな治療応答例えば、出血の減少または凝固時間の短縮を引き起こす量を意図する。用語出血性疾患は、本明細書中で使用される場合、過度の出血と関連している任意の障害例えば、先天性凝固障害、後天性凝固障害、または外傷に起因する出血状態をいう。このような出血性疾患としては、血友病A、血友病B、フォンヴィレブランド病、突発性血小板減少症、1以上の接触因子例えば、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンHMWK欠乏、臨床的に明らかな出血に関与する1以上の因子例えば、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子低プロトロンビン血症、およびフォンヴィレブランド因子の欠乏、ビタミンK欠乏症、フィブリノーゲンの障害無フィブリノーゲン血症、低フィブリノーゲン血症、および異常フィブリノーゲン血症を含む、α2-アンチプラスミン欠損、ならびに肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温、月経、および妊娠に起因するような過度の出血が挙げられるが、これらに限定されない。II.発明の実施のための形態本発明を詳細に記載する前に、本発明が特定の処方物またはプロセスパラメータに限定されるものではなく、当然変動し得るものと理解されるべきである。本明細書中で使用される技術用語は、単に本発明の特定の実施形態を記載する目的であり、限定を意図するものではない。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な多数の方法および材料も、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書中に記載されている。A.総括血友病HemAおよびHemB、重症フォンヴィレブランド病svWD、ならびに重症第VII因子FVII欠乏を含む血液凝固障害は、代表的には、因子補充例えば、HemAおよびsvWDに対して第VIII因子、HemBに対して第IX因子、FVII欠乏などに対して第VIIa因子によって処置されているBishopetal.2004Nat.Rev.DrugDiscov.3:684-694;Carcaoetal.2004BloodRev.18:101-113;Robertsetal.2004Anesthesiology100:722-730;およびLee2004Int.Anesthesiol.Clin.42:59-76に最近概説された。このような治療は多くの場合有効であるが、高いコスト、不便さすなわち、静脈内投与、および中和抗体産生を含む、有用性を制限する特徴があるBishopetal.,前述;Carcaoetal.,前述;Robertsetal.,前述;Lee,前述;およびBohnetal.,2004Haemophilia10追補1:2-8。FVIIaは、種々の出血性疾患においてますます利用されているがRobertsetal.,前述、前述の制約がなく、かつ、広い用途を有する代替の単一化合物の凝血原療法は、重要である。出血性疾患の個体において止血を改善する1つの一般的なアプローチは、血液凝固の外因性経路をアップレギュレートすることにより凝結の開始を改善することである。内因性および外因性の凝固経路が、トロンビン生成およびフィブリンクロット凝固形成に寄与する一方でDavieetal.1991Biochemistry30:10363-10370、外因性経路または組織因子TF媒介性経路はインビボにおける凝固の開始に重要であり、かつ、伝播に寄与するMann2003Chest1243追補:lS-3S;Rapaportetal.1995Thromb.Haemost.74:7-17。外因性経路活性をアップレギュレートするための1つの潜在的機序は、組織因子経路インヒビターTFPIの減弱である。TFPIは、外因性経路の活性化の持続性ダウンレギュレーションをもたらす、FVIIa/TFのKunitz型プロテイナーゼインヒビターであるBroze1992Semin.Hematol.29:159-169;Broze2003J.Thromb.Haemost.1:1671-1675;およびJohnsonetal.1998Coron.ArteryDis.92-3:83-87総説を参照のこと。実際に、マウスにおけるヘテロ接合性のTFPI欠乏は、血栓形成の悪化を引き起こし得Westricketal.2001Circulation103:3044-3046、そしてTFPI遺伝子突然変異は、ヒトにおける血栓症の危険因子であるKleesieketal.1999Thromb.Haemost.82:1-5。TFPIのターゲティングによって血友病における凝固を調節することは、Nordfangetal.およびWunetal.によって記載され、彼らは、抗TFPI抗体が血友病血漿の凝固時間を短縮し得ることNordfangetal.1991Thromb.Haemost.66:464-467;Welschetal.1991Thromb.Res.64:213-222、および、抗TFPIIgGが第VIII因子欠乏のウサギの出血時間を改善することErhardtsenetal.1995BloodCoagul.Fibrinolysis6:388-394を示した。1つの分類として、硫酸化多糖は、動物およびヒトにおいてしばしば有利な耐容性プロフィールを有する過剰の生物活性を特徴とする。これらのポリアニオン分子は、多くの場合、植物および動物の組織に由来し、ヘパリン、グリコサミノグリカン、フコイダン、カラギーナン、ペントサンポリサルフェート、およびデルマタン硫酸または硫酸デキストランを含む広範囲のサブクラスを包含するToidaetal.2003TrendsinGlycoscienceandGlycotechnology15:29-46。低分子量かつ低不均質性の化学的に合成された硫酸化多糖が報告されており、薬物開発の各段階に達しているSinay1999Nature398:377-378;Batesetal.1998Coron.ArteryDis.9:65-74;Orgueiraetal.2003Chemistry9:140-169;McAuliffe1997ChemicalIndustryMagazine3:170-174;Williamsetal.1998Gen.Pharmacol.30:337-341。ヘパリン様硫酸化多糖は、抗トロンビンIIIおよび/またはヘパリン補助因子IIの相互作用によって媒介される特異な抗凝固活性を示すToidaetal.前述。特に、天然起源であるかまたは化学的に改変された特定の化合物は、抗凝固活性が十分でない濃度または用量では、他の生物活性を示すWilliamsetal.1998Gen.Pharmacol.30:337-341;Wanetal.2002Inflamm.Res.51:435-443;Bourinetal.1993Biochem.J.289Pt2:313-330;McCaffreyetal.1992Biochem.Biophys.Res.Commun.184:773-781;Luytetal.2003J.Pharmacol.Exp.Ther.305:24-30。さらに、硫酸ヘパリンは、TFPIと強い相互作用を示すことが示されているBroze1992Semin.Hematol.29:159-169;Broze2003J.Thromb.Haemost.1:1671-1675;Johnsonetal.1998Coron.ArteryDis.9:83-87;Novotnyetal.1991Blood;782:394-400。本明細書中に記載されるように、特定の硫酸化多糖は、TFPIと相互作用して、抗凝固に関与する濃度よりも低い濃度でその活性を阻害する。このような分子は、凝固形成に障害が起きた場合に役立ち得る。B.凝固促進因子としてのNASP本発明は、非抗凝固性の硫酸化多糖NASPが、出血性疾患の患者の処置において、凝血原として用いられ得るという発見に基づいている。凝固を促進するためにヘパリン様硫酸化多糖のような硫酸化多糖を逆説的に利用する、止血を調節するための新規アプローチが、本発明者らによって発見された。本明細書中に記載される選択された硫酸化多糖は、抗凝固活性をほとんど有さないか、または抗凝固活性を示す濃度よりも顕著に低い濃度で抗凝固促進を示し、従って非抗凝固性の硫酸化多糖を示す。実施例4~6に示されるように、希釈プロトロンビン時間dPT凝固アッセイおよび活性化部分トロンボプラスチン時間aPTT凝固アッセイによれば、NASPは、血友病AHem-Aまたは血友病BHem-Bを有する被験体由来の血漿の凝固を促進する。さらに、NASPは、傷害後の血友病Aマウスモデルおよび血友病Bマウスモデルにおける出血時間を短縮する実施例7。本明細書中に開示される実験において、特定の候補NASPは、ヘパリンと比較して少なくとも1/10低い抗凝固活性を示すことが、凝固アッセイで示される。さらに、NASPのサブセットペントサンポリサルフェートPPSおよびフコイダンが挙げられるは、組織因子経路インヒビターTFPIを阻害し、かつ、希釈プロトロンビン時間dPTアッセイにおいて4~500nMの範囲の濃度で試験した場合に、FVII濃度の低いヒト血友病Aおよび血友病Bの血漿複数または単数の凝固時間を改善したすなわち、加速させた。インビボでの止血の改善は、血友病Aマウスまたは血友病Bマウスにおいて、PPSまたはフコイダン、あるいはNASPと因子補充の組み合わせを低用量で皮下投与した後に観察された。因子欠乏マウスの出血惹起後の生存の増加もまた観察された。これらの結果は、選択されたNASPの全身投与が、出血性疾患における止血を調節するためのユニークなアプローチになり得ることを示す。従って、本発明は、先天性凝固障害、後天性凝固障害、および外傷に起因する出血状態を含む、出血性疾患の被験体における止血を制御するためのNASPの使用に関する。C.NASP本発明の方法に用いるNASPは、凝血促進活性を有する硫酸化多糖である。潜在的なNASPの非凝固性は、希釈プロトロンビン時間dPT凝固アッセイまたは活性化部分トロンボプラスチン時間aPTT凝固アッセイを用いて決定される。非凝固性の硫酸化多糖は、未分画ヘパリンMW範囲8,000~30,000;平均18,000ダルトンの3分の1以下、好ましくは10分の1未満の抗凝固活性を示す凝固時間の統計的に有意な増加によって測定される。潜在的なNASP活性を有する硫酸化多糖としては、グリコサミノグリカンGAG、N-アセチルヘパリンSigma-Aldrich,St.Louis,MOおよびN-脱硫酸化ヘパリンSigma-Aldrichを含むヘパリン様分子、スルファトイドsulfatoid、多硫酸化オリゴ糖Karstetal.2003Curr.Med.Chem.10:1993-2031;Kuszmannetal.2004Pharmazie.59:344-348、コンドロイチン硫酸Sigma-Aldrich、デルマタン硫酸CelsusLaboratoriesCincinnati,OH、フコイダンSigma-Aldrich、ペントサンポリサルフェートPPSOrtho-McNeilPharmaceuticals,Raritan,NJ、フコピラノンサルフェートfucopyranonsulfateKatzmanetal.1973J.Biol.Chem.248:50-55、および新規スルファトイド、例えばGM1474Williamsetal.1998GeneralPharmacology30:337およびSR80258ABurgetal.1997LaboratoryInvestigation76:505、および新規ヘパリノイド、およびそのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。NASPは、天然源例えば、褐藻、樹皮、動物の組織から精製および/または改変され得るか、あるいはデノボ合成され得、そして分子量は100ダルトン~1,000,000ダルトンの範囲であり得る。潜在的なNASP活性を有するさらなる化合物としては、過ヨウ素酸-酸化ヘパリンPOHNeoparin,Inc.,SanLeandro,CA、化学的硫酸化ラミナリンCSLSigma-Aldrich、化学的硫酸化アルギン酸CSAASigma-Aldrich、化学的硫酸化ペクチンCSPSigma-Aldrich、硫酸デキストランDXSSigma-Aldrich、ヘパリン誘導オリゴ糖HDONeoparin,Inc.,SanLeandro,CAが挙げられ得る。原則として、複合糖質の単糖成分上の任意の遊離ヒドロキシル基は、本発明の実施においてNASPとして潜在的に使用される硫酸化複合糖質を生成するために、硫酸化によって改変され得る。例えば、このような硫酸化複合糖質としては、限定しないが、硫酸化ムコ多糖D-グルコサミン残基およびD-グルコロン酸残基、カードランカルボキシメチルエーテル、硫酸水素塩、カルボキシメチル化カードランSigma-Aldrich、硫酸化シゾフィランItohetal.1990Int.J.Immunopharmacol.12:225-223;Hirataetal.1994Pharm.Bull.17:739-741、硫酸化グリコサミノグリカン、硫酸化多糖-ペプチドグリカン複合体、硫酸化アルキルマルトオリゴ糖Katsurayaetal.1994CarbohydrRes.260:51-61、硫酸アミロペクチン、N-アセチルヘパリンNAHSigma-Aldrich、N-アセチル-脱-O-硫酸化ヘパリンNA-de-o-SHSigma-Aldrich、脱-N-硫酸化-ヘパリンDe-NSHSigma-Aldrich、および脱-N-硫酸化-アセチル化-ヘパリンDe-NSAHSigma-Aldrichが挙げられる。凝固を促進し、出血を減少させるNASPの能力は、種々のインビトロ凝固アッセイ例えば、dPTアッセイおよびaPTTアッセイおよびインビボ出血モデル例えば、血友病のマウスまたはイヌにおける尾部切除または表皮出血時間測定を用いて容易に決定される。例えば、PDRStaff.Physicians’DeskReference.2004,Andersonetal.1976Thromb.Res.9:575-580;Nordfangetal.1991ThrombHaemost.66:464-467;Welschetal.1991ThrombosisResearch64:213-222;Brozeetal.2001ThrombHaemost85:747-748;Scallanetal.2003Blood.102:2031-2037;Pijnappelsetal.1986Thromb.Haemost.55:70-73;およびGilesetal.1982Blood60:727-730を参照のこと。凝固アッセイは、NASPおよび1以上の血液因子、凝血原、または他の試薬の存在下で行われ得る。例えば、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、およびフォンヴィレブランド因子、組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子;ならびに/あるいは1以上の試薬APTT試薬、トロンボプラスチン、フィブリン、TFPI、ラッセルクサリヘビ蛇毒、微粉化シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、およびカオリンが挙げられるが、これらに限定されないが挙げられるがこれらに限定されない、1以上の因子が添加され得る。実施例3~4および図2~3は、本明細書中でNASPと呼ばれる薬剤が、本当に非抗凝血剤であるすなわち、検討された濃度の範囲にわたって、凝固時間を有意に増加させないことを確認する。このような化合物は、これらの化合物が示し得るいかなる抗凝固活性も、これらの化合物が凝血促進活性を示す濃度よりも有意に高い濃度でしか示さないならば、本発明の方法および組成物に用いられ得る。所望の凝血促進活性が生じる濃度に対する、所望されない抗凝血性が生じる濃度の比率は、当該NASPの治療係数と呼ばれる。本発明のNASPの治療係数は、5、10、30、100、300、1000またはそれ以上であってもよい。D.薬学的組成物必要に応じて、本発明のNASP組成物は、薬学的組成物を提供するために1以上の薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含み得る。例示的な賦形剤としては、限定されないが、炭水化物、無機塩類、抗菌剤、酸化防止剤、界面活性剤、緩衝液、酸、塩基、およびそれらの組み合わせが挙げられる。注射可能組成物に適した賦形剤としては、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質、および界面活性剤が挙げられる。糖、アルジトールのような誘導体化糖、アルドン酸、エステル化糖、および/または糖ポリマーのような炭水化物は、賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤としては、例えば、以下が挙げられる:フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Dマンノース、ソルボースなどのような単糖;ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどのような二糖類;ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどのような多糖;およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトールグルシトール、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなどのようなアルジトール。賦形剤としてはまた、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせのような、無機塩類または緩衝液も挙げられる。本発明の組成物はまた、微生物増殖の予防または防止のための抗菌剤を含み得る。本発明に適した抗菌剤の非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサールthimersol、およびそれらの組み合わせが挙げられる。酸化防止剤も、同様に組成物中に存在し得る。酸化防止剤は、酸化を防止するために用いられ、それによって、NASPまたは調製物の他の成分の変質を防止する。本発明で用いられる適切な酸化防止剤としては、例えば、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせが挙げられる。界面活性剤は、賦形剤として存在し得る。例示的な界面活性剤としては、以下が挙げられる:ポリソルベート例えば、Tween20およびTween80、ならびにプルロニック例えば、F68およびF88BASF,MountOlive,NewJersey;ソルビタンエステル;脂質、例えば、レシチンのようなリン脂質および他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンただし、好ましくはリポソームの形態でない、脂肪酸および脂肪酸エステル;コレステロールのようなステロイド;EDTAのようなキレート剤;ならびに亜鉛および他のこのような適切なカチオン。酸または塩基は、組成物中に賦形剤として存在し得る。用いられ得る酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される酸が挙げられる。適切な塩基の例としては、限定されないが、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウムpotassiumfumerate、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される塩基が挙げられる。組成物中のNASPの量例えば、薬物送達系に含まれる場合は、多くの因子によって変動するが、組成物が単位投薬形態であるかまたは容器例えば、バイアル中にある場合、その量は最適には治療有効用量である。治療有効用量は、臨床的に望ましいエンドポイントを生じる量を決定するために、組成物の量を増加させて連続投与することによって、実験的に決定され得る。組成物中の任意の個々の賦形剤の量は、賦形剤の性質および機能ならびに組成物の特定のニーズによって変動する。代表的には、任意の個々の賦形剤の最適量は、慣用的な実験によって決定され、すなわち、種々の量の賦形剤少量から多量までの範囲わたるを含む組成物を調製し、安定性および他のパラメータを検査し、次いで、有意な悪影響を及ぼすことなく最適性能を達成する範囲を決定することによって決定される。しかしながら、一般に賦形剤単数または複数は、約1重量~約99重量、好ましくは約5重量~約98重量、より好ましくは約15重量~約95重量の賦形剤30重量未満の濃度が最も好ましいの量で組成物中に存在する。これらの前述の薬学的賦形剤は、他の賦形剤とともに、Remington:TheSciencePracticeofPharmacy、第19版、WilliamsWilliams,1995,Physician’sDeskReference、第52版、MedicalEconomics,Montvale,NJ1998、およびKibbe,A.H.,HandbookofPharmaceuticalExcipients、第3版、AmericanPharmaceuticalAssociation,Washington,D.C.,2000に記載される。組成物は、すべてのタイプの処方物、特に、注射に適した処方物例えば、使用前に溶媒で再構成され得る粉末剤または凍結乾燥物、ならびに注射可能な状態の溶液または懸濁液、使用前にビヒクルと混合される乾燥した不溶性の組成物、および投与前に希釈される乳剤および液体濃縮物を包含する。注射前に固形組成物を再構成するのに適した希釈剤の例としては、注射用静菌水、5デキストロース水溶液、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、およびそれらの組み合わせが挙げられる。液体の薬学的組成物について、溶液および懸濁液が想定される。さらなる好ましい組成物としては、経口送達、眼送達、または局在送達のための組成物が挙げられる。本明細書中の製剤はまた、意図される送達様式および使用様式に応じて、シリンジ、埋め込みデバイスなどに収容され得る。好ましくは、本明細書中に記載されるNASP組成物は、あらかじめ測定されたか、あらかじめパッケージされた形態の、単回投与に適した本発明の結合体または組成物の量を意味する、単位投薬形態である。本明細書中のNASP組成物は、必要に応じて1以上の追加の薬剤例えば、止血剤、血液因子、または状態もしくは疾患について被験体を処置するのに用いられる他の薬剤を含み得る。特に、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、第VIIa因子、およびフォンヴィレブランド因子のような1以上の血液因子を含む、合成調製物が好ましい。NASP組成物はまた、内因性凝固経路のアクチベーター第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンが挙げられるが、これらに限定されない;またはならびに外因性凝固経路のアクチベーター組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子が挙げられるが、これらに限定されないのような、他の凝血原も含み得る。NASP組成物は、天然に存在する凝固因子、合成凝固因子、または組換え凝固因子、あるいは生物活性を保持するすなわち、凝固を促進するそのフラグメント、改変体または共有結合的に修飾された誘導体を含み得る。あるいは、このような薬剤は、NASPとは別個の組成物中に含まれ得、そして本発明のNASP組成物と同時に、前に、または後に、併用投与され得る。E.投与NASPを用いた少なくとも1つの治療上有効な治療サイクルが、被験体に投与される。治療上有効な治療サイクルとは、投与されると、個体の出血性疾患の処置に関してポジティブな治療応答を引き起こす治療サイクルを意図する。止血を改善するNASPを用いた治療サイクルが、特に重要である。ポジティブな治療応答とは、本発明に従って処置を受ける個体が、出血性疾患の1つ以上の症状の改善血液凝固時間の短縮および出血の減少および/または因子補充療法の必要性の低下のような改善を含むを示すことを意図する。特定の実施形態において、1以上のNASPおよび/または他の治療薬例えば、止血剤、血液因子、または他の薬剤を含む、複数の治療有効用量の組成物が投与される。本発明の組成物は、必ずしもその必要はないが、代表的には、経口的に投与されるか、注射によって皮下に、静脈内にまたは筋肉内に投与されるか、注入によって投与されるか、または局所的に投与される。製剤は、投与の直前に溶液または懸濁液の形態であってもよいが、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、カプセル、粉末、ゲル、マトリックス、坐薬などのような別の形態をとってもよい。さらなる投与様式としては、例えば、肺、直腸、経皮、経粘膜、髄腔内、心膜、動脈内、大脳内、眼内、腹腔内なども企図される。NASPおよび他の薬剤を含む薬学的組成物は、当該分野で公知の任意の医学的に受容可能な方法に従って、同じ投与経路かまたは異なる投与経路を用いて投与され得る。特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えば、病変、傷害、または手術の結果としての出血の処置については、NASPの局所送達に用いられる。本発明による調製物はまた、局所療法にも適している。例えば、NASPは、出血の部位に注射によって投与され得るか、または固体、液体もしくは軟膏の形態で、好ましくは接着テープまたは創傷カバーによって投与され得る。坐剤、カプセル剤特に、胃液耐性カプセル剤、ドロップまたはスプレーもまた用いられ得る。出血の部位を標的化するために、特定の調製物および適切な投与方法が選択される。別の実施形態において、NASPおよび/または他の薬剤を含む薬学的組成物は、例えば計画的手術の前に、予防的に投与される。このような予防的用途は、既知の血液凝固障害を既に有する被験体にとって特に価値がある。本発明の別の実施形態において、NASPおよび/または他の薬剤を含む薬学的組成物は、徐放性処方物の状態であるか、または徐放性デバイスを用いて投与される処方物の状態である。このようなデバイスは、当該分野において周知であり、例えば、経皮パッチ、および非徐放性の薬学的組成物を用いて徐放作用を達成するために、種々の用量で連続的な定常様式で経時的に薬物送達を提供し得る、小型埋め込みポンプが挙げられる。本発明はまた、結合体または組成物中に含まれるNASPを用いた処置に応答性の状態を患う患者に、本明細書中に提供されるようなNASPを含む結合体を投与する方法を提供する。この方法は、本明細書中に記載される任意の様式によって、治療有効量の結合体または薬物送達系好ましくは、薬学的組成物の一部として提供されるを投与する工程を包含する。この投与方法は、NASPを用いた処置に応答性の任意の状態を処置するために用いられてもよい。より具体的には、本明細書中の組成物は、血友病A、血友病B、フォンヴィレブランド病、突発性血小板減少症、1以上の接触因子例えば、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンHMWK欠乏、臨床的に明らかな出血に関与する1以上の因子例えば、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子低プロトロンビン血症、およびフォンヴィレブランド因子の欠乏、ビタミンK欠乏症、フィブリノーゲンの障害無フィブリノーゲン血症、低フィブリノーゲン血症、および異常フィブリノーゲン血症を含む、α2-アンチプラスミン欠損、ならびに肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温、月経、および妊娠に起因するような過度の出血を含む、出血性疾患を処置するのに有効である。特定のNASPが効率的に処置される条件は、当業者であれば理解する。投与される実際の用量は、被験体の年齢、体重、および全身状態、ならびに処置される状態の重症度、ヘルスケアの専門家の判断、および投与される結合体によって変化する。治療有効量は、当業者によって決定され得、各特定の症例の特定の要件に適合される。一般に、治療有効量は、1日にNASP約0.01mg/kg~200mg/kg、より好ましくは、1日に約0.01mg/kg~20mg/kg、さらにより好ましくは、1日に約0.02mg/kg~2mg/kgの範囲である。好ましくは、このような用量は、0.01~50mg/kgを1日4回QID、0.01~10mg/kgQID、0.01~2mg/kgQID、0.01~0.2mg/kgQID、0.01~50mg/kgを1日3回TID、0.01~10mg/kgTID、0.01~2mg/kgTID、0.01~0.2mg/kgTID、0.01~100mg/kgを1日2回BID、0.01~10mg/kgBID、0.01~2mg/kgBID、または0.01~0.2mg/kgBIDの範囲である。投与される化合物の量は、特定のNASPの効力および所望の大きさまたは凝血促進作用および投与経路に依存する。NASP先と同様に、好ましくは製剤の一部として提供されるは、単独で、あるいは他のNASPまたは治療薬例えば、止血剤、血液因子、または特定の状態もしくは疾患を処置するのに用いられる他の薬剤と組み合わせて、臨床医の判断や患者の要求などに依存する種々の投薬スケジュールに従って、投与され得る。具体的な投薬スケジュールは、当業者に公知であるか、または慣用的な方法を用いて実験的に決定され得る。例示的な投薬スケジュールとしては、限定されないが、1日5回投与、1日4回投与、1日3回投与、1日2回投与、1日1回投与、週3回投与、週2回投与、週1回投与、月2回投与、月1回投与、およびその任意の組み合わせが挙げられる。好ましい組成物は、1日1回よりも多くの投与を必要としない組成物である。NASPは、他の薬剤の前に、他の薬剤と同時に、または他の薬剤に続いて投与され得る。他の薬剤と同時に投与される場合、NASPは、同じかまたは異なる組成物中に提供され得る。従って、NASPおよび他の薬剤は、併用療法として個体に与えられ得る。併用療法とは、物質の併用による治療効果が治療を受ける被験体にもたらされるような、被験体への投与を意図する。例えば、併用療法は、NASPを含むある用量の薬学的組成物と、止血剤または凝固因子例えば、FVIIIまたはFIXのような少なくとも1つの他の薬剤を含むある用量の薬学的組成物とを、特定の投薬レジメンに従って、治療有効量を含むように組み合わせて投与することによって達成され得る。同様に、1つ以上のNASPおよび治療薬は、少なくとも1つの治療用量で投与され得る。別々の薬学的組成物の投与は、これらの物質の併用の治療効果が治療を受ける被験体にもたらされる限り、同時にかまたは別々にすなわち、連続的にか、いずれかの順序でか、同日にか、または他日に行われ得る。F.適用1つの態様において、NASPは、出血性疾患特に、凝固因子の欠乏に関連する出血性疾患の処置において止血を改善するために、または被験体における抗凝血剤の作用を逆転させるために、本発明の方法に用いられ得る。NASPは、先天性凝固障害、後天性凝固障害、および外傷に起因する出血状態を含む出血性疾患を処置するために、被験体に投与され得る。NASPで処置され得る出血性疾患の例としては、血友病A、血友病B、フォンヴィレブランド病、突発性血小板減少症、1以上の接触因子例えば、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンHMWK欠乏、臨床的に明らかな出血に関与する1以上の因子例えば、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子低プロトロンビン血症、およびフォンヴィレブランド因子の欠乏、ビタミンK欠乏症、フィブリノーゲンの障害無フィブリノーゲン血症、低フィブリノーゲン血症、および異常フィブリノーゲン血症を含む、α2-アンチプラスミン欠損、ならびに肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、手術、外傷、低体温、月経、および妊娠に起因するような過度の出血が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、NASPは、血友病A、血友病Bおよびフォンヴィレブランド疾患を含む先天性凝固障害を処置するために用いられる。他の実施形態において、NASPは、第VIII因子、フォンヴィレブランド因子、第IX因子、第V因子、第XI因子、第XII因子および第XIII因子の欠乏、特に、血液凝固因子に対するインヒビターまたは自己免疫に起因する障害、あるいは凝固因子の合成の低下を引き起こす疾患または状態に起因する止血障害を含む、後天性凝固障害を処置するために用いられる。患者の要求は、処置される特定の出血性疾患によって異なる。例えば、NASPは、慢性症状例えば、先天性または後天性凝固因子欠乏症を処置するために、複数用量で長期間にわたって投与され得る。あるいは、NASPは、急性状態例えば、手術または外傷に起因する出血、あるいは凝固因子補充療法を受けている被験体における因子インヒビター/自己免疫症状の発現を処置するために、単回または複数用量で比較的短期間例えば、1~2週間投与されてもよい。さらに、NASP治療は、他の止血剤、血液因子、および医薬品と組み合わせて用いられ得る。例えば、被験体は、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、第VIIa因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群より選択される1以上の因子の治療有効量を投与され得る。処置は、凝血原、例えば、内因性凝固経路のアクチベーター第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンが挙げられる;または外因性凝固経路のアクチベーター組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子が挙げられるを投与する工程をさらに包含し得る。さらに、血液製剤の輸液は、過度の出血が起きている被験体における失血を補充するのに必要であり得、そして傷害の場合、外科的修復は、止血するのに適し得る。本発明はまた、被験体における抗凝血剤の作用を逆転させる方法NASPを含む組成物の治療有効量を被験体に投与する工程を包含する方法を提供する。特定の実施形態において、被験体は、ヘパリン、クマリン誘導体例えば、ワルファリンまたはジクマロール、TFPI、ATIII、ループス抗凝固因子、線虫抗血液凝固ペプチドNAPc2、活性部位をブロックした第VIIa因子第VIIai因子、第IXa因子インヒビター、第Xa因子インヒビターフォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、DX-9065a、およびラザクサバンDPC906を含む、第Va因子および第VIIIa因子のインヒビター活性化プロテインCAPCおよび可溶性トロンボモジュリンを含む、トロンビンインヒビターヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、およびキシメラガトランを含むが挙げられるがこれらに限定されない、抗凝血剤で処置され得る。特定の実施形態において、被験体における抗凝血剤は、凝固因子に結合する抗体第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、第XI因子、第XII因子、フォンヴィレブランド因子、プレカリクレイン、または高分子量キニノーゲンHMWKに結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されないであってもよい。特定の実施形態において、NASPは、単独で投与され得るか、または1以上の異なるNASPとともに、かつ/または被験体における抗凝血剤の作用を逆転させるために1以上の他の治療薬と組み合わせて、併用投与され得る。例えば、被験体は、NASPならびに第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、第VIIa因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群より選択される1以上の因子を含む組成物の治療有効量を投与され得る。処置は、凝血原、例えば、内因性凝固経路のアクチベーター第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンが挙げられる;または外因性凝固経路のアクチベーター組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子が挙げられるを投与する工程をさらに包含し得る。別の態様において、本発明は、外科的または侵襲的手技を受ける被験体における凝固を改善する方法を提供し、この方法は、非抗凝固性の硫酸化多糖NASPを含む組成物の治療有効量を被験体に投与する工程を包含する。特定の実施形態において、NASPは、単独で投与され得るか、または1以上の異なるNASPとともに、かつ/または1以上の他の治療薬と組み合わせて、外科的または侵襲的手技を受ける被験体に併用投与され得る。例えば、被験体は、第XI因子、第XII因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲンHMWK、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第II因子、第VIIa因子、およびフォンヴィレブランド因子からなる群より選択される、1以上の因子の治療有効量を投与され得る。処置は、凝血原、例えば、内因性凝固経路のアクチベーター第Xa因子、第IXa因子、第XIa因子、第XIIa因子、および第VIIIa因子、プレカリクレイン、および高分子量キニノーゲンが挙げられる;または外因性凝固経路のアクチベーター組織因子、第VIIa因子、第Va因子、および第Xa因子が挙げられるを投与する工程をさらに包含し得る。別の態様において、本発明は、TFPIを含む組成物を、TFPI活性を阻害するのに十分な量のNASPと混合する工程を包含する、TFPI活性を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、TFPI活性は、NASPを含む組成物の治療有効量を被験体に投与する工程を包含する方法によって、被験体において阻害される。特定の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のTFPI活性を阻害する方法を提供し、この方法は、生物学的サンプル例えば、血液または血漿を、TFPI活性を阻害するのに十分な量のNASPと混合する工程を包含する。III.実験下記は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの実施例は、単に例示の目的で挙げられるものであり、本発明の範囲を何ら限定することを意図するものではない。使用される数例えば、量、温度などに関して正確を期すための努力がなされているが、多少の実験誤差および偏差は、当然容認されるべきである。実施例1材料および方法A.試薬ヘパリンおよび修飾ヘパリン、ならびにフコイダンは、SigmaSt.Louis,MOから購入した。ペントサンポリサルフェートナトリウムPPSの供給源は、Ortho-McNeilPharmaceuticalsRaritan,NJから入手した処方薬Elmironであった。ヒト血漿は、GeorgeKingBiomedicalOverlandPark,KSから入手した。第VIIa因子およびヒト組換えTFPIは、AmericanDiagnosticaStamford,CTからであり、第VIII因子は、WyethPharmaceuticalsMadison,NJから入手した処方薬ReFacto登録商標であった。SIMPLASTINEXCELおよびAPTT試薬は、bioMerieuxDurham,NCまたはOrganonTeknikaRoseland,NewJerseyから入手した。B.動物Hem-Aマウスエクソン16FVIIIノックアウト対立遺伝子のホモ接合体は、JohnHopkinsUniversityから使用許諾され、Hem-Bマウスエクソン1-3FIXノックアウトのホモ接合体は、ChapelHillのUniversityofNorthCarolinaから使用許諾された。全ての動物手順は、GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals実験動物の管理と使用に関する指針NationalResearchCouncil.Guideforthecareanduseoflaboratoryanimals.Washington,D.C.:NationalAcademyPress;1996に従って行い、そして全ての手順は、所内動物実験委員会によって慎重に検討され、認可された。C.凝固アッセイ活性化部分トロンボプラスチン時間aPTTアッセイaPTTアッセイは、改変を加えて、以前に記載されたように行ったPDRStaff.Physicians’DeskReference.2004,AndersonLo,Barrowcliffe,T.W.,Hohmer,E.,Johnson,E.A.,Sims,G.E.C.Thromb.Res.1976;9:575-580。25mMのCaCl2およびフィブリンカップfibrincupsFisherを37°Cに予熱した。解凍した正常のまたは出血性のヒト血漿0.1mlを、温めた試験管に添加した。5μlの生理食塩水例えば、Sigmaまたは5μlの生理食塩水中に溶解した試験薬剤例えば、NASPを、95μlの血漿とともに室温で30分間インキュベートした。APTT試薬例えば、OrganonTeknikaを3mlの蒸留水中で再構成し、そしてAPTT試薬を含む再構成溶液0.1mlを各試験管に添加した。試験薬剤または生理食塩水コントロールおよびaPTT試薬を含む血漿0.2mlを、試験管から予熱したフィブリンカップに移し、2~3分間インキュベートした。0.1mlの予熱した25mMCaCl2を添加して凝固を開始させ、血漿凝固の時間をBBLFIBROSYSTEMフィブロメータを用いて測定した。希釈プロトロンビン時間dPTアッセイ使用したdPTアッセイは、改変した標準臨床PTアッセイであったNordfangetal.1991ThrombHaemost66:464-467;Welschetal.1991ThrombosisResearch64:213-222。SIMPLASTINEXCELトロンボプラスチン試薬OrganonTeknikaを製造業者の希釈剤で再構成し、さらに0.9生理食塩水中で1:100に希釈した。トロンボプラスチン試薬、25mMのCaCl2、および血漿サンプルを、アッセイを開始する前に37°Cに予熱した。解凍した血漿100μlをマイクロ遠心分離管に等分した。TFPI活性の阻害を測定するために、5μlの生理食塩水例えば、Sigmaまたは5μlの試験薬剤例えば、硫酸化多糖を95μlの血漿に添加し、室温で約30分間インキュベートした。100μlの希釈トロンボプラスチン試薬および100μlの25mMCaCl2を、37°Cに予熱したフィブリンカップFisherに添加した。試験薬剤または生理食塩水コントロールを含む100μlの正常または血友病血漿を、トロンボプラスチン試薬およびCaCl2を含むフィブリンカップに添加して、凝固を開始させた。血漿凝固時間をBBLFIBROSYSTEMフィブロメータを用いて測定した。動物出血時間アッセイ出血時間アッセイは、試験薬剤例えば、ビヒクルコントロールまたはNASPの投与後に、正常な齧歯類または血友病のFVIII欠乏もしくはFIX欠乏もしくはvWF欠乏齧歯類における止血機能の変化を測定するのに用いられ得る。試験薬剤例えば、ビヒクルコントロールまたはNASPは、1日1回または2回、経口的に、非経口的に、または持続注入によって投与される。例えば、0.1ml/10g体重肩甲下筋の試験薬剤を0.1~10mg/kgの範囲の用量で、小さなゲージの注射針を用いて1日2回、少なくとも1日間、および好ましくは3日間より長く、投与され得る。出血時間をアッセイする日に、齧歯類をケタミン/キシラジンまたはイソフルランで麻酔する。齧歯類を、尾の浸漬のために生理食塩水のペトリ皿と一体化した滅菌パッド上に並べる。EMLAクリームを齧歯類の尾の意図した切断部位に塗布する。マウスについては、尾の極めて先端を切り取り、この尾を生理食塩水皿の中に置き、計数を開始する。ラットについては、ラットの尾の背部に長さ8mm×深さ1mmの切開を行い、次いでこれを生理食塩水中に移す。生理食塩水中への目に見える出血の停止にかかる時間を記録する。齧歯類について、出血時間は、正常なコントロールマウスでは約10分であり、正常なコントロールラットでは6分である。出血時間アッセイの終了後、この齧歯類の尾を滅菌ゲージで乾燥させ、止血を確認し、そして齧歯類をケージに戻した。必要であれば硝酸銀を切断部位に塗布してもよい。あるいは、出血時間は、マウスBrozeetal.2001Thromb.Haemost.85:747-748またはイヌScallanetal.2003Blood102:2031-2037;Pijnappelsetal.1986Thromb.Haemost.55:70-73において、他の方法によって測定され得る。代替のまたはさらなる薬力学的エンドポイントとしては、直接分析または血漿単離のためのNASP処置被験体からの血液のサンプリング、ならびにエキソビボ凝固時間例えば、全血凝固時間および/またはPTおよび/またはAPTTまたは凝固因子レベルの測定が挙げられ得る。全血凝固時間WBCTアッセイWBCTアッセイを以下のように行った。マウスをイソフルランチェンバー中で短時間麻酔した。次いで、これらのマウスを後眼窩静脈叢から出血させて、プラスチック採血管中に採血した例えば、150μl。これらの採血管を37°Cの水浴中に入れ、ストップウォッチを用いて凝固時間を測定した。この期間中、採血管を1分間隔で反転させた。血液凝固完全な/部分的ではない凝固に要する時間を測定した。統計分析凝固アッセイについては、スチューデントt検定を用いて、NASP処置サンプルとビヒクルコントロールとの間の有意性を検討した。マウス出血試験のデータを、片側のχ2乗検定によって、ビヒクルコントロールまたは下の表に示されるような他の群との有意性について検討した。ほぼ同一の結果がフィッシャーの直接確率検定によって得られた。実施例2TFPIはdPTアッセイにおける凝固時間を増加させる以下の実験は、TFPIがdPTアッセイにおける凝固時間を増加させることを示すために、そしてその後のNASP実験で用いるTFPI濃度を決定するために行った。100μg/mLのTFPIストック溶液AmericanDiagnostica,Stamford,CTを生理食塩水中に連続的に希釈して、以下の濃度のTFPI溶液を作製した:20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、6μg/mLおよび2μg/mL。5μlのこれらのTFPI希釈物を95μlのFVIII欠乏血漿と混合し、室温で30分間インキュベートした。dPTアッセイを以下のように行った:SIMPLASTINトロンボプラスチンを生理食塩水で1:100に希釈し、37°Cに予熱した。25mMCaCl2およびTFPIを含む試験血漿100μlを37°Cに予熱した。100μlのSIMPLASTINトロンボプラスチンと100μlのCaCl2を混合し、BBLフィブロメータを用いて凝固時間を測定した。その結果を表1に要約する。TFPIは、Hem-A血漿の凝固時間を一次の用量応答で増加させた図1を参照。これらのデータに基づいて、0.5μg/mlのTFPIの濃度を、NASPの凝血促進機能のアッセイに選択した。実施例3NASPのスクリーニング修飾ヘパリン、ペントサンポリサルフェート、およびフコイダンを含む硫酸化多糖化合物を抗凝固活性について試験し、ヘパリンと比較して、これらの化合物が非抗凝血剤とみなされるか否かを決定した。試験した化合物を表2に列挙する。試験化合物を、100μM、10μM、2μMおよび200nMに希釈した。各試験化合物について、その試験化合物を含む12.5μlの希釈溶液を237.5μlのHem-A血漿に添加し、室温でインキュベートした。試験化合物を含む100μlの血漿を、実施例2に記載されるような血漿凝固時間のdPTアッセイのために採取した。その結果を表3に要約する。示した値は、選択した多糖についての凝固時間秒である。NASPの非存在下でのHem-A血漿の凝固時間は、41.5秒である。表3および図2に示されるように、ヘパリンは、10nMよりも高い濃度で顕著に抗凝血性であったが、N-アセチルヘパリンNAH、N-アセチル-脱-O-硫酸化ヘパリンNA-de-O-SH、脱-N-硫酸化ヘパリンDe-N-SHは、5000nMよりも高い濃度でも凝固時間の延長をほとんど示さなかった。同様に、フコイダンおよびPPSは、ヘパリンよりもそれぞれ約10倍~100倍高い濃度で50の凝固時間の延長を示す、ごく弱い抗凝血剤であったので、非抗凝血剤と示される。ほとんど同一のプロフィールが正常ヒト血漿を用いて観察されたデータは示さず。実施例4aPTTアッセイによるヒト血漿の凝固に対するNASPの影響血漿の凝固時間に対するNASPの影響はまた、aPTTアッセイを用いて測定し、これらの化合物が非抗凝血剤とみなされるか否かを決定した。正常なヒト標準血漿であるFACTGeorgeKingBiomedicalをヒトHem-A血漿中で希釈して、0.31~100の正常血漿濃度の血漿を生成した。次いで、aPTTアッセイを以下のように行った:100μlのFACT-Hem-A血漿混合物と100μlのaPTT試薬を混合し、37°Cで3分間インキュベートした。100μlのCaCl2を添加し、そしてBBLフィブロメータを用いて血漿凝固にかかる時間を測定した。その結果を表4に示す。このデータに基づいて、1.25のFACT濃度を、凝血促進活性についてNASPをスクリーニングするアッセイに選択した。血漿の凝固時間に対するNASPの影響は、以下のように決定した:5μlのNASPを、ヒトHem-A血漿で希釈した95μlの1.25FACTに添加し、室温で30分間インキュベートした。aPTTアッセイを行って、実施例1に記載されるように血漿凝固時間を決定した。その結果を表5に示す。NASP活性のさらなる確認は、Hem-A血漿を用いたAPTT凝固アッセイにおいて3種の化合物を評価することによって実証した。凝固時間に約50の延長を生じる濃度は、フコイダン、PPS、およびNAHについて、ヘパリンについてよりもそれぞれ10倍または100倍または500倍よりも高かった図3を参照。実施例5NASPによるTFPI活性の阻害A.血漿に添加する前のTFPIとNASPのプレインキュベーションNASPによるTFPI活性の阻害を、正常血漿または血友病血漿を用いたdPT凝固アッセイで評価し、そして組換えTFPIを添加した。希釈した組換えTFPIを、血漿を添加する前にNASPとともに室温で5分間プレインキュベートした。血漿の添加後、この混合物をさらに25分間インキュベートし、続いてdPTイニシエーションを行った。Hem-A血漿中で行ったアッセイの結果を、表6および図4に示す。Hem-A血漿単独の凝固時間は44秒である。Hem-A血漿TFPIの凝固時間は151秒である。TFPIは、約0.5μg/mlの最終濃度で、実験およびヒト血漿の供給源に依存して、血漿の凝固時間を約40秒から100~200秒に延長した。TFPI活性が硫酸化多糖によって阻害されるならば、NASPの存在下で凝固時間の短縮が観察されるはずであるNordfangetal.1991Thromb.Haemost.664:464-467を参照。図4に示されるように、フコイダンおよびPPSを1nMよりも高い濃度で添加すると、TFPIを含むHem-A血漿の凝固を有意に促進した。対照的に、NAHは、凝固時間を短縮するのに約100nMの濃度が必要であり、そしてヘパリン図示せずは、凝固時間を延長するのみであった。重要なことには、PPSまたはフコイダンの最適濃度では、凝固時間は、TFPIなしか、またはビヒクルコントロールレベルか、またはわずかに低い程度まで短縮され、そしてTFPI作用の中和の幅は、少なくとも100倍の範囲例えば、5~500nMに及んだ。TFPIの存在下でのNASPによる血漿凝固の促進もまた、Hem-B血漿および正常血漿中で試験した。Hem-B血漿中で行ったアッセイの結果を、表7および図5に示した。Hem-B単独、TFPIなしの凝固時間:46秒Hem-BTFPIの凝固時間:101秒。NASPによる血漿凝固の促進おそらくTFPI活性の阻害によるは、HemB血漿表7および図5および正常ヒト血漿データは示さずにおいて同様に実証された。NASP間の効力の序列は、Hem-A血漿を用いた研究と同じであり、かつ、濃度応答プロフィールは、ほぼ同じであった。B.TFPIとNASPのプレインキュベーションなしでのTFPI活性の阻害実験を、血漿への曝露前に硫酸化多糖とTFPIをプレインキュベーションすることなく繰り返した。TFPI活性のNASP阻害試験のストリンジェンシーを高めるために、NASPを添加する前にTFPIを血漿に添加した。その結果を表8および図6に示す。HemATFPI:183秒Hem-A単独、TFPIなし:45秒。図6に示すように、NASPは、プレインキュベーション研究図4とほぼ同じ用量反応プロフィールで、Hem-A血漿において同じ凝固時間促進の特性を明確に実証した。興味深いことには、フコイダンが最も強力であり、顕著な凝固促進についての濃度域は100倍よりも大きかった。従って、これらの研究により、PPSおよびフコイダンのような特定のNASPがTFPI中和活性を示し得ること、および、正味の抗凝固が認められない非常に広範囲の濃度にわたってこのような効力が実証されることが明らかになった。実施例6TFPI補充のない状態でのNASPによる血友病血漿凝固における改善NASPがTFPI補充なしで因子欠乏血漿の凝固を促進する能力もまた、dPTアッセイにおいて試験した。凝血促進応答が観察される場合、これは内因性のTFPI活性ヒト血漿中に約100ng/mlで存在しNordfangetal.,前述、主にリポタンパク質または血小板に関与するBrozeetal.1992Semin.Hematol.29:159-169;Brozeetal.2003J.Thromb.Haemost.1:1671-1675の中和と関連し得る。A.外因性TFPIの非存在下でのHem-A血漿における凝固の促進外因性TFPIの非存在下でHem-A血漿の凝固を促進するNASPの能力を試験した。フコイダンまたはPPSをHem-A血漿中に漸増させ、そしてdPTアッセイを行った。さらに、外因性経路活性を増幅させる陽性コントロールとして、第VIIa因子に対する用量反応を分析した。その結果を図7および表9に示す。Hem-A単独、NASPなしの凝固時間:69秒。フコイダンおよびPPSのいずれも、用量依存的な様式で凝固時間を有意に加速し、フコイダンは、最高の有効性および最大の効力を示した。他の研究と同様に、凝血促進作用の濃度域は、フコイダンの場合には、約5nMから100nMを上回る範囲であった。図7において、フコイダンの濃度が100nMよりも高いと応答曲線が上方に偏向し始めるが、凝固は依然としてビヒクルコントロールと比較して促進されるので、フコイダンは凝血促進性であることに留意すべきである。20nMのフコイダンで凝固時間が約70秒から55秒に短縮されることは、大きな差ではないにもかかわらず、NAHは活性を有さなかった。このような促進は、FVIIaおよびトロンビンのような凝血促進因子で以前に観察された。従って、FVIIaを20nMになるように添加すると、凝固時間が約20秒加速され、これはフコイダン図7の加速よりも大きかった。しかしながら、20nMフコイダンが5nMの薬理学的濃度のFVIIaと同等に機能することに留意することは興味深い。B.外因性TFPIの非存在下でのHem-B血漿およびFVII欠乏血漿における凝固の促進NASPの視覚的な凝血促進活性の評価を、HemB血漿およびFVII欠乏血漿中のNASP活性を試験することによって、他のヒト出血性疾患にまで広げた。Hem-A血漿について示した結果と同様の結果が、Hem-B血漿について観察されたデータは示さず。第VII因子欠乏血漿における凝固の調節はまた、dPTアッセイでも評価した。予想通り、FVII欠乏血漿は、FVIIa再構成なしでは300秒以内に凝固しなかった。FVIIaを約0.1nMになるように添加すると、凝固時間が約150秒に回復したデータは示さず。dPTアッセイに見られるこのような凝固時間の変化は、ヒト第VII因子欠乏症のある種の形態に類似している。フコイダンおよびPPSをFVII欠乏血漿中に漸増させると、凝固時間は加速された。その結果を図8および表10に示す。NASPなし、FVIIaなしでの凝固時間:>300秒NASPなし、0.1nMFVIIaでの凝固時間:173秒。図8に示すように、フコイダンおよびPPSの漸増により、第VII因子欠乏血漿の凝固が促進され、そしてHemA血漿で観察されたように、フコイダンはPPSよりも有意に強力かつ有効であった。今回も、治療濃度域は広かった;フコイダンの場合、実質的な凝固促進は、約10nM~500nMの範囲の濃度で観察された。実施例7NASP処置マウスの止血の改善インビボにおける止血の潜在的な改善を評価するために、HemAマウスまたはHemBマウスをPPSおよびフコイダンで処置した。頻回の投薬は血友病マウスにおいて適度に良好な耐容性を示し、種々の硫酸化多糖の皮下経路によるバイオアベイラビリティーは以前に確立されているのでMacGregoretal.1985Thromb.Haemost.53:411-414;Milletetal.1999Thromb.Haemost.81:391-395、NASPを皮下注射した。PPSおよびフコイダンの半減期は、1~2時間程度の短さでもよい。従って、1日2回の投薬レジメンを採用した。初期試験により、数日間の投薬は、1~2日間にわたることが好ましいことを示した。処置したマウスにおける凝固調節に対するNASP処置の効果は、dPTアッセイのための血漿単離、全血凝固時間WBCTアッセイのための血液採取、酷い出血の時間、および尾部切除後または横切開後の長期的生存Brozeetal.2001Thromb.Haemost.85:747-748を含む、いくつかの可能性のあるエンドポイントに基づいて評価した。PPSおよびフコイダンを用いた5日間のインビボ研究の結果を、表11~13に要約する。A.Hem-AマウスおよびHem-BマウスにおけるPPSの効力Hem-AマウスおよびHem-Bマウスにおける凝固を改善する、PPSの効力を試験した。Hem-AおよびHem-Bの雄性マウスまたは雌性マウスに、0.02mg/kg、0.06mg/kgまたは0.2mg/kgの用量のPPSあるいは生理食塩水ビヒクルを、1日2回、5日間、皮下に投与した。投薬後5日目の朝に、尾部を先端から1cm切断し、行動および生存を次の20~24時間モニターした。その結果を表11に示す。マウスを無作為に選択し、示した薬剤を1日2回、4.5日間、皮下投与した後に、尾部切断を行ったt=0。ビヒクルに対してP=0.07。Hem-Aマウスを0.06mg/kgのPPSで処置すると、生存がほぼ2倍に改善されるが、結果は統計学的に有意ではなかった0.05<p<0.1表11。治療的有用性は、処置群を知らされていない技術スタッフの目視観察により、中用量および高用量のマウスにおいて、ビヒクルコントロールと比較してより正常な行動不活発な状態および体を丸めた状態がより少ないおよびより少ない出血が観察されたことによって、さらに支持された。同様に、引き続いてHem-Bマウスを0.06mg/kgのより有効な用量で1日2回、皮下投与で処置することにより、FVIII欠乏マウスにおいて観察された結果と同一の結果が得られた。Hem-Bマウスにおける凝固を改善するPPSの効力を、dPTアッセイでさらに試験した。全てのマウスを研究前に出血させて、ベースライン予備試験凝固時間を確立した。マウス14週齢にPPSを以下の用量で1日2回、4.5日間、皮下投与した:250μlの容量で、2mg/kg、0.3mg/kgおよび0.06mg/kg。4.5日後にマウスを出血させ、採取した血液サンプルから凝固時間を決定した。その結果を表12に示す。未処置のHem-Bは、44~50秒の範囲のdPTを有する。B.Hem-Aマウスにおけるフコイダンの効力上記の凝固アッセイの一部において、PPSと比較してフコイダンの有効性および効力の大きさが改善されることを考慮して、Hem-Aマウスにおいてフコイダンを用いてさらに研究を行った。フコイダンを用いた第1の研究では、PPSについて記載したレジメンと用量レベルはわずかに異なるがほぼ同じレジメンを採用した。Hem-A雄性マウスに、0.1mg/kgまたは1.0mg/kgの用量でフコイダンを、あるいは生理食塩水を、1日2回、4日間、皮下に投与した。5日目の朝に、出血試験の前に2倍用量のフコイダンをマウスに投与した。生存および動物行動を、フコイダンで処置したマウスについてビヒクルコントロールと比較して評価した。フコイダンを用いた第2の研究において、第VIII因子との併用療法の可能性を評価した。本研究は、5日目の朝に53mU/マウスのFVIIIFVIIIの正常レベルの約1.25の静脈内ボーラス投与をマウスの身体に近い上方の尾静脈に投与した以外は、上記のように行った。以前ように、動脈ではなく側部尾静脈を、2時間後に直径約2.7mmに相当する領域で横切開した。これらのフコイダン研究において、尾静脈横切開の改変により、止血およびその調節がより正確に評価されることが分かっているのでBrozeetal.2001Thromb.Haemost.85:747-748、これを利用した。生存および臨床観察を20~24時間記録した。その結果を表13に示す。マウスを無作為に選択し、ビヒクルまたはNASPを1日2回、4.5日間皮下投与した後に、尾静脈切断を行ったt=0。示した場合、FVIIIを尾部切断の2時間前に投与した。なお、これらのマウスにおいて、FVIII再構成率1では生存率が約10となるが、一方、FVIII再構成率2では生存率が約100となることに留意されたい。ビヒクルに対してP<0.05ビヒクルに対してP=0.06フコイダンに対してP=0.06。第1の研究において、用量0.1mg/kgのフコイダンを用いたマウスの処置は、用量1.0mg/kgを用いた処置よりも有効であるようであった約10時間での生存は、ビヒクルで1/6、0.1mg/kgで4/6、そして1.0mg/kgで3/6であった。従って、第2の研究は、用量0.1mg/kgのフコイダンを用いて行った。表13の上2列に示されるように、HemAマウスのフコイダン処置により、出血の生存が有意に改善された。動物行動は、上記のように、切開後の最初の8~10時間の間、すべてのフコイダン処置マウスにおいてより正常であり、ほぼ半数の動物において長期にわたって明らかに改善された。併用療法の可能性を、FVIII/-フコイダンでマウスを処置することによって予備的に評価した表13。HemAマウスに尾部切開の2時間前にFVIII投与のみを行う予備的な用量誘導研究では、生存に対して極めて急勾配の用量反応関係を示した。正常率1へのReFacto登録商標投与により生存率が約10となったが、一方、正常率2への投与により生存率が約100となったデータは示さず。従って、FVIII再構成率1.25の用量を、約50の生存を得るために選択した。特に、フコイダンFVIII処置群の生存率は、フコイダンまたはFVIIIのいずれか単独よりも一貫して高かった。従って、PPSおよびフコイダン研究の結果より、選択されたNASPを投与後に血友病の動物モデルにおいて止血が改善されることを示した。結論一連の研究は、エキソビボおよびインビボの血友病モデルにおける凝固の改善についてNASPを試験するために行った。硫酸化多糖は、ヘパリンと比較して抗凝血性を実質的に低下させることが確認された。これらのNASPのサブセット、すなわちフコイダンおよびPPSは、血液凝固の外因性経路の主なダウンレギュレーターであるTFPIの活性を強力に阻害することが示された。フコイダンおよびPPSは、第VII因子、第VIII因子、または第IX因子が欠乏しているヒト血漿の希釈プロトロンビン凝固時間を改善した。インビボでのフコイダン処置またはPPS処置の治療的有用性は、血友病マウスの出血試験により明らかであった。PPSおよびフコイダンのいずれも、ヘパリンコファクターII相互作用の結果Churchetal.1989J.Biol.Chem.264:3618-3623;Giedrojcetal.1999J.Cardiovasc.Pharmacol.34:340-345と同様に、より高濃度で抗凝固活性を示し得る。ラットに皮下投与されるPPSは、凝固を延長するためには5mg/kgよりも高い用量が必要でありGiedrojcetal.前述、フコイダンは、ウサギでは10mg/kgで静脈内投与しても耐容性が良好なようであるGranertetal.1999Infect.Immun.67:2071-2074。従って、本結果は、血友病の齧歯類において0.1mg/kg以下の用量で止血が改善されることを示す。インビボで止血を改善した用量レベルは、他の報告された作用を引き起こす用量レベルよりも低かったToidaetal.2003TrendsinGlycoscienceandGlycotechnology15:29-46;Luytetal.2003J.Pharmacol.Exp.Ther.305:24-30;Berteauetal.2003Glycobiology13:29R-40R;Granertetal.,前述;およびSweeneyetal.2002Blood99:44-51。特定の理論にとらわれずに、TFPIのNASP阻害は、エキソビボおよびインビボにおいて観察された凝固の改善に対する部分的な説明となり得る。抗体によるTFPIの中和は、ウサギHemAモデルにおける止血を改善し、かつヒト血友病血漿の凝固を促進することが示されているNordfangetal.,前述;Welschetal.,前述;およびErhardtsenetal1995BloodCoagul.Fibrinolysis6:388-394。本研究では、TFPI活性を阻害する化合物だけが、血友病血漿のdPTアッセイにおける凝固時間も減少した。さらに、フコイダンは、自然環境を最も良く模倣するためにTFPIを最初に血漿中に混合した場合、dPT凝固試験においてPPSと比較してより強力な、かつおそらくより大きな最大作用を示した。同様に、未決定の関連する薬物動態が出血結果に影響を与えるにもかかわらず、マウスのフコイダン処置はPPSよりも幾分良好な有効性を示した。このような挙動が、試験したすべてのNASPで現れたわけではないことは、注目に値するものである。例えば、NAHは、TFPIの添加なしでは弱いTFPI中和活性しか示さず図4~6、かつ、血友病血漿の凝固時間を加速しなかったデータは示さず。さらに、5000nMまでの濃度で固有の抗凝固活性を示さない3種のNASP図2;De-N-S-AH、De-N-SH、およびNA-De-O-SHは、TFPI中和活性を全く示さず、さらにHemA血漿の凝固時間を加速しなかったデータは示さず。NASPを用いて観察された止血の改善の大きさは、臨床的に関連するようである。最適なフコイダン濃度でのHemA血漿の凝固時間の改善は、約5nMでのFVIIa補充に匹敵し実施例6、これは、患者の止血を正常化するのに有効であることが証明されているBishopetal.2004Nat.Rev.DrugDiscov.3:684-694;Carcaoetal.2004BloodRev.18:101-113;Robertsetal.2004Anesthesiology100:722-730;Leeetal.2004Int.Anesthesiol.Clin.42:59-76;およびBrummeletal.2004J.Thromb.Haemost.2:1735-1744。さらに、マウスにおけるNASP処置による延命効果は有意であった実施例7。dPTアッセイにおけるフコイダンによる凝固の促進は、マウス血漿よりもヒト血友病血漿で、より延長されるデータは示さず。出血性疾患のための可能性のあるNASPの臨床開発に関する明白な検討材料は、治療指数である。具体的には、止血の改善と抗凝固への移行との間の指数である。ヒト血漿におけるPPSまたはフコイダンのような化合物についての凝固アッセイの結果から、抗TFPIまたはdPT凝固促進活性と、このような効力の喪失と、正味の抗凝固の開始との間の差は、50倍以上であるようである。マウス研究用について上に記載したように、この指数は、マウスにおいて少なくとも10倍であるようである。さらに、分類としては、ヘパリン様硫酸化多糖は一般に耐容性が良好である。要約すると、選択したNASPの全身投与は、出血性疾患における止血を調節するためのユニークなアプローチを示し得る。特に、ペントサンポリサルフェートおよびフコイダンは、TFPI活性を阻害し、ヒト第VII因子欠乏血漿、第VIII因子欠乏血漿、および第IX因子欠乏血漿の凝固を改善した。従って、NASP処置は止血を改善し、現在の凝固因子治療に対して、比較的低価格の、安全な、かつ便利な代替または補充を示し得る。本発明の好ましい実施形態が例示され、かつ記載されてきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の変更がなされ得ることが理解される。"