デングウイルス血清型1のエンベロープタンパク質またはその断片に結合する、単離された抗体またはその断片であって、該抗体が、中和活性をもつヒト抗体である、前記単離された抗体またはその断片。全免疫グロブリン分子、scFv、Fab断片、F2、およびジスルフィド結合Fvからなる群より選択される、請求項1記載の抗体またはその断片。ヒトIgM定常ドメイン、ヒトIgG1定常ドメイン、ヒトIgG2定常ドメイン、ヒトIgG3定常ドメイン、ヒトIgG4定常ドメイン、およびヒトIgA12定常ドメインからなる群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項1記載の抗体またはその断片。ヒトIgκ定常ドメインおよびヒトIgλ定常ドメインからなる群より選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項1記載の抗体またはその断片。図4に示されるCDR配列の群より選択される少なくとも1つのCDRを含んでいる重鎖を含む、請求項1記載の抗体またはその断片。図4に示されるCDR配列の群より選択される少なくとも1つのCDRを含んでいる軽鎖を含む、請求項1記載の抗体またはその断片。図4に示される3つのCDR配列を含んでいる重鎖を含む、請求項1記載の抗体またはその断片。図4に示される3つのCDR配列を含んでいる軽鎖を含む、請求項1記載の抗体またはその断片。図4に示されるIGHV1202の重鎖フレームワークおよび少なくとも1つのCDR配列を含む、請求項1記載の抗体またはその断片。図4に示されるIGKV32001の軽鎖フレームワークおよび少なくとも1つのCDR配列を含む、請求項1記載の抗体またはその断片。前記抗体が、図4に示される重鎖配列を含む、請求項1記載の抗体またはその断片。前記抗体が、図4に示される軽鎖配列を含む、請求項1記載の抗体またはその断片。前記抗体が14c10クローン8である、請求項1記載の抗体またはその断片。1×108M未満の親和定数で抗原に結合する、請求項1記載の抗体またはその断片。1×109M未満の親和定数で抗原に結合する、請求項1記載の抗体またはその断片。前記抗体が、デングウイルス感染から回復した患者のB細胞に由来する、請求項1記載の抗体またはその断片。前記抗体が、ウイルスの2つのエンベロープタンパク質にまたがって結合する、請求項1記載の抗体またはその断片。2つのエンベロープタンパク質にまたがって結合することが、一方のEタンパク質のDIおよびDIとDIIの間のヒンジに、そして隣接Eタンパク質のDIIIに、結合することを含む、請求項17記載の抗体またはその断片。14c10クローン8の結合特異性を有する、デングウイルスに結合する抗体またはその断片。対象におけるデングウイルス感染を軽減または予防するのに有効な、請求項1~19のいずれか一項記載の抗体またはその断片および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。第2の薬剤をさらに含む、請求項20記載の薬学的組成物。第2の薬剤が抗ウイルス薬または鎮痛薬である、請求項21記載の薬学的組成物。請求項1~19のいずれか一項記載の抗体またはその断片の有効量を対象に投与することを含む、受動免疫方法。デングウイルス感染の治療方法であって、それを必要とする対象に、該疾患を軽減または予防するのに有効な量の請求項1~19のいずれか一項記載の抗体またはその断片を投与することを含む、前記方法。前記抗体が静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、または経口的に投与される、請求項24記載の方法。前記抗体が対象の体重1kgあたり1~100mgの範囲の量で投与される、請求項24記載の方法。第2の薬剤の投与をさらに含む、請求項24記載の方法。第2の薬剤が抗ウイルス薬または鎮痛薬である、請求項27記載の方法。以下の段階を含む、デングウイルスに対する中和抗体を生成する方法:デングウイルス感染から最近回復した個体を同定する段階、該個体からB細胞を取得する段階、段階からのB細胞を不死化する段階、および段階からの不死化B細胞をデングウイルス中和についてアッセイする段階。前記B細胞がCD22である、請求項29記載の方法。前記B細胞がEBVにより不死化される、請求項29記載の方法。請求項1~19のいずれか一項記載の抗体またはその断片をコードする、単離された核酸。請求項32記載の核酸を含む発現ベクター。請求項33記載の発現ベクターを含む宿主細胞。細菌細胞である、請求項34記載の宿主細胞。真核細胞である、請求項34記載の宿主細胞。哺乳動物細胞である、請求項34記載の宿主細胞。詳細な説明本発明は、全体として、脊椎動物対象におけるデングウイルス感染を予防または治療するための組成物および方法に関する。特に、本発明者らは、国立大学病院の感染症部門に入院したデング感染者からCD22B細胞を単離した。こうしたB細胞はインビトロでEBVを用いてポリクローナル細胞株として不死化した。ポリクローナルB細胞活性化剤を、ヒトB細胞増殖因子のインターロイキン2およびインターロイキン4と共に、B細胞不死化の効率を高めるために添加した。ヒトB細胞株は96ウェルの丸底ウェル内で作製した。2週間後、これらのクローンからの上清は、デングウイルスに対する結合中和活性を分析するために、酵素結合免疫吸着アッセイ、プラーク減少中和試験および細胞変性効果アッセイでスクリーニングした。陽性抗体を産生するB細胞株は、抗体重鎖および軽鎖の遺伝子増幅のためのmRNA源として使用した。抗体の重鎖および軽鎖配列はインハウスpCMVベクターにクローニングして、高濃度の組換え抗体を産生するFreestyle293F細胞にトランスフェクトした。この方法を用いて、本発明者らは、極めてデング血清型1に特異的でありかつ種々のデング血清型1遺伝子型に対して広範な特異性を有する組換え抗体をクローニングして発現させた。この抗体はフラビウイルス属の他のウイルスに結合することがなく、そのため、他のフラビウイルスへのマクロファージの感染増強を、デング血清型1に予想されるものを超えて、示すことはほとんどないか、まったくない。インビボでの実験は、デング感染のマウスモデルにおいて顕著な予防および治療効果を示した。したがって、この抗体は、利用可能な最も優れた、現存するデング1感染のための候補治療薬に相当する。定義本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物学的システムに限定されるものではなく、当然、これらはさまざまに変化しうる、ことを理解すべきである。また、本明細書中で用いる用語は、特定の局面のみを説明する目的のためであり、限定することを意図したものではない、ことも理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いるとき、単数形a、anおよびtheは、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数形の照応を含むものである。量、持続時間などの測定可能な値に言及するときに本明細書中で用いる約という用語は、開示された方法を実施するのに適するような、特定された値からの±20または±10、より好ましくは±5、より一層好ましくは±1、さらに好ましくは±01の変動を包含することを意味する。特に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似のまたは同等の方法および材料はどれも、本発明の試験の実施に際して使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載される。脊椎動物、哺乳動物、対象、哺乳動物対象または患者は、交換可能に用いられ、哺乳動物、例えばヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えばウサギ、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヤギおよび他の動物を指す。動物には、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えばマウス、ヒツジ、イヌ、ウシ、鳥類、アヒル、ガチョウ、ブタ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が含まれる。治療するまたは治療は、一般的に、感染もしくは再感染の防止、例えば予防、または関心対象の疾患の症状の軽減もしくは除去、例えば治療、のいずれかを指す。本発明の組成物を用いて対象を治療することは、デングウイルス、特に血清型1、からの感染のリスクを防止するまたは減少させることができる。治療は、予防的、または疾患の発現後の症状の治療的抑制もしくは緩和であり得る。防止するまたは防止は、本発明の組成物を用いる予防的投与を指す。治療に有効な量または感染を軽減もしくは除去するのに有効な量または有効量は、デングウイルス感染を防止するか、そのような感染に伴う症状の少なくとも1つを緩和するのに十分である、抗体組成物の量を指す。組成物を投与することの利益が不利益を上回る限り、組成物の投与がデング感染の症状を取り除く必要はない。同様に、デング感染に関して用語治療するは、本明細書中で用いるとき、対象が必然的に感染を治癒されること、またはそのすべての臨床兆候が取り除かれることを意味するものではなく、単に対象の症状のいくらかの緩和または改善が組成物の投与によって達成されることを意味するにすぎない。受動免疫は、一般的に、ある個体からの予め生成された抗体の形での能動液性免疫を別の個体に移入することを意味する。したがって、受動免疫は抗体の移入によって達成され得る短期的免疫化の形態であり、こうした抗体はいくつかの可能な形態で投与され、例えば、ヒトもしくは動物の血漿または血清として、静脈内または筋肉内使用のためのプールされた動物もしくはヒト免疫グロブリンとして、免疫された対象由来のまたは疾患から回復しているドナー由来の高力価の動物もしくはヒトIVIGまたはIGとして、およびモノクローナル抗体として投与することができる。受動移入は疾患発症の防止のために予防的に使用されるだけでなく、いくつかのタイプの急性感染の治療にも使用され得る。一般的に、受動免疫化に由来する免疫は、ほんの短い期間だけ持続して、即時的防御を提供するが、その身体は記憶を発達させることはなく、したがって、患者はあとで同じ病原体に感染するリスクがある。抗体本明細書中で用いる抗体という用語は、任意の免疫グロブリンつまりインタクトな分子、ならびに特定のエピトープに結合するその断片を指す。このような抗体には、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、一本鎖、全抗体のFab、Fab、F断片およびまたはF部分、ならびにこれらの変異体が含まれる。IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMを含めて、すべてのアイソタイプがこの用語に包含される。本明細書中で用いる用語抗体断片とは、特に、親抗体の抗原結合機能を保持する抗体の完全配列の不完全な部分または分離された部分を指す。抗体断片の例としては、Fab、Fab、F2、およびFv断片;ダイアボディ;直鎖状抗体;一本鎖抗体;ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。インタクトな抗体は、ジスルフィド結合で相互に接続された少なくとも2本の重鎖と2本の軽鎖を含む。各重鎖は重鎖可変領域と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は3つのドメインCH1、CH2およびCH3から構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は1つのドメインCLから構成される。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域と呼ばれる、より保存された領域が組み込まれている、相補性決定領域と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割することができる。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシル末端へ次の順序で配置された、3つのCDRと4つのFRから構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の各種細胞および古典的補体系の第1成分を含めて、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。抗体という用語には、結合する能力を保持するインタクト抗体の抗原結合部分が含まれる。該結合部分の例としては、以下が挙げられる:VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる1価断片であるFab断片;ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された2つのFab断片を含む2価断片であるF2断片;VHおよびCH1ドメインからなるFd断片;抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片;VHドメインからなるdAb断片;および単離された相補性決定領域。本明細書中で用いる用語一本鎖抗体または一本鎖Fvとは、Fv断片の2つのドメインVLおよびVHの抗体融合分子を指す。Fv断片の2つのドメインVLおよびVHは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、1本のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって連結することが可能であり、そこではVLおよびVH領域が対合して1価の分子を形成するとして知られる;例えば、BirdetalScience242423426およびHustonetalProcNatlAcadSciUSA8558795883を参照されたい。このような一本鎖抗体は用語抗体断片への言及によって包含され、組換え技術またはインタクト抗体の酵素的もしくは化学的切断によって調製することができる。本明細書中で用いる用語ヒト配列抗体には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体が含まれる。本発明のヒト配列抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる。このような抗体は、例えば、PCT出願公開番号WO0114424およびWO0037504に記載されるように、非ヒトトランスジェニック動物において生成することができる。しかしながら、用語ヒト配列抗体は、本明細書中で用いるとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことを意図していない。また、組換え免疫グロブリンを生産することも可能である。Cabillyの米国特許第4816567号;およびQueenetalProcNatlAcadSciUSA861002910033を参照されたい。本明細書中で用いる用語モノクローナル抗体とは、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、用語ヒトモノクローナル抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。一局面において、ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマによって産生され、該ハイブリドーマは、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖トランスジーンおよび軽鎖トランスジーンを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物から得られたB細胞を含む。本明細書中で用いる用語抗原とは、抗体の生成を促し、かつ免疫応答を引き起こすことができる物質を指す。それは本開示では用語免疫原と交換可能に用いることができる。厳密な意味では、免疫原は免疫系から応答を引き出す物質であるのに対し、抗原は特異的抗体に結合する物質として定義される。抗原またはその断片は、特定の抗体に接触する分子であり得る。タンパク質またはタンパク質の断片が宿主動物を免疫するために用いられる場合、該タンパク質の多数の領域は、抗原に特異的に結合する抗体の生成を誘導することができる。本明細書中で用いる用語ヒト化抗体とは、該抗体がヒト抗体によく類似し、かつその元の結合能をまだ保持するように、非抗原結合領域およびまたは抗原結合領域のアミノ酸配列が変更されている少なくとも1つの抗体分子を指す。さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることによる、キメラ抗体;その全体が参照により本明細書に組み入れられるの作製のために開発された技術を使用することができる。例えば、オートインデューサーに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子は、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることができる。キメラ抗体は、マウスmAb由来の可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域をもつような、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。さらに、ヒト化抗体を作製するための技術が開発されている。免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変領域は、相補性決定領域と呼ばれる、3つの超可変領域によって中断されたフレームワーク領域から成る。簡単に述べると、ヒト化抗体は、非ヒト種由来の1つ以上のCDRおよびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である。あるいはまた、一本鎖抗体の作製について記載された技術は、本開示の免疫原性コンジュゲートに対する一本鎖抗体を作製するために適合させることができる。一本鎖抗体は、Fv領域の重鎖断片と軽鎖断片をアミノ酸架橋で連結して、一本鎖ポリペプチドを生じさせることによって形成される。抗体分子のFabおよびF2部分は、周知の方法によって、実質的にインタクトな抗体分子に対する、それぞれパパインおよびペプシンのタンパク質分解反応によって調製することができる。例えば、米国特許第4342566号を参照されたい。Fab抗体分子部分もよく知られており、F2部分の2つの重鎖部分を連結しているジスルフィド結合をメルカプトエタノールなどで還元し、続いて得られたタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドなどの試薬でアルキル化することによって、F2部分から作製される。抗体アッセイ抗体の特異性および親和性を確認するために、そしてその抗体が他のタンパク質と交差反応するかどうかを判定するために、関心対象の抗体をアッセイするための多くのスクリーニングアッセイが当技術分野で知られている。用語特異的結合または特異的に結合するとは、抗原とそれに対応する抗体との相互作用を指す。その相互作用は、結合分子によって認識されるタンパク質の特定の構造の存在に依存する。結合が特異的であるためには、それは、関心対象のエピトープの抗体への結合を含むべきであり、そしてバックグラウンド抗原の結合を含むべきでない。ひとたび抗体が産生されると、それらは、それらが関心対象の抗原に特異的であることを確認するために、そしてそれらが他の抗原との交差反応性を示すかどうかを判定するために、アッセイされる。そのようなアッセイを実施する1つの方法は、米国特許出願公開第20040126829号に記載されるような血清スクリーンアッセイである;その内容は参照により本明細書に明示的に組み入れられる。しかし、品質管理についてアッセイする他の方法は当業者の技能の範囲内であり、したがって、本開示の範囲内でもある。本開示の抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体はまた、抗原に対するそれらの結合親和性の観点から記載するまたは特定することができる。抗原に対する抗体の親和性は、任意の適切な方法を用いて実験的に測定することができるKubyJanisImmunologyWHFreemanandCompanyNewYorkNYおよび本明細書に記載の方法を参照されたい。測定された特定の抗体抗原相互作用の親和性は、異なる条件下で測定する場合にはばらつきがある。それゆえ、親和性および他の抗原結合パラメータの測定は、抗体および抗原の標準液と標準バッファーを用いて行うことが好ましい。親和性結合定数は次式を用いて決定することができる:式中、mAbはフリーの抗原部位の濃度であり、そしてmAgは2つの異なる抗原濃度で測定されたフリーのモノクローナル結合部位の濃度である。抗体に関する用語高親和性とは、少なくとも約1×107リットルモル、または少なくとも約1×108リットルモル、または少なくとも約1×109リットルモル、または少なくとも約1×1010リットルモル、または少なくとも約1×1011リットルモル、または少なくとも約1×1012リットルモル、または少なくとも約1×1013リットルモル、または少なくとも約1×1014リットルモルまたはそれ以上の平衡結合定数を指す。高親和性結合は、抗体アイソタイプごとに異なる可能性がある。平衡解離定数KDは、抗体親和性を記述するためにも用いられる用語であり、Kaffの逆である。平衡解離定数KDは、抗体親和性を記述するためにも用いられる用語であり、Kaffの逆である。KDが用いられる場合、抗体に関する用語高親和性とは、約1×107モルリットル未満、または約1×108モルリットル未満、または約1×109モルリットル未満、または約1×1010モルリットル未満、または約1×1011モルリットル未満、または約1×1012モルリットル未満、または約1×1013モルリットル未満、または約1×1014モルリットル未満もしくはそれよりも低い平衡解離定数を指す。本開示に係る抗体の生成は、生理学的ヒト免疫応答の過程で生成される抗体の特性、すなわちヒト免疫系によってのみ選択され得る抗体特異性、を備えた抗体を提供する。本ケースでは、これはヒト病原体デングウイルス血清型1に対する応答を含む。いくつかの態様では、本開示の抗体は、デングウイルスによる感染への応答の過程で生成されるものの特性を保有する。こうした抗体は適切な製剤化により予防薬または治療薬として使用することができる。特定の病原体に関して、中和抗体、広域中和抗体または中和モノクローナル抗体とは、これらのすべてが本明細書では交換可能に用いられるが、宿主内で感染を開始およびまたは持続させる該病原体の能力を中和することができる抗体のことである。いくつかの態様では、本開示に従って生成されるモノクローナル抗体は、その抗体が109Mまたはそれ以下の濃度で中和することができる場合に、中和活性を有する。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ、クラス、またはサブクラスのものであってよい。いくつかの態様では、抗体は抗原結合性の抗体断片であり、限定するものではないが、Fab、FabおよびF2、Fd、一本鎖Fv、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv、ならびにVLまたはVHドメインのいずれかを含む断片が挙げられる。一本鎖抗体などの抗原結合性の抗体断片は、可変領域を、単独でまたは下記の全体もしくは一部と組み合わせて、含むことができる:ヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH3ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH3ドメインとの任意の組み合わせを含む抗原結合断片も本開示に包含される。B細胞の単離本明細書中で用いる用語B細胞、Bメモリー細胞、Bリンパ球、Bメモリーリンパ球、メモリー細胞、メモリーB細胞、およびこれらの異形は交換可能に使用され、液性免疫応答のB細胞を指す。当技術分野で理解されるように、B細胞は、液性免疫応答の役割を果たすリンパ球である。B細胞の少なくとも1つの機能は、抗原に対する抗体を産生し、抗原提示細胞の役割を果たし、最終的に、抗原相互作用による活性化後にメモリーB細胞へと発達することである。B細胞は適応免疫系の一構成要素である。用語一次B細胞は、いくつかの態様では、生体から直接採取されたB細胞を指すことができる。いくつかの態様では、一次B細胞は、初代細胞培養で培養することができる。一次B細胞は、当業者に知られた任意の方法で対象から由来する、取得する、または採取することができる。いくつかの態様では、一次B細胞は、関心対象の抗原に感染したまたは該抗原を保有する対象から得られる。本開示の方法は、感染体、例えばデングウイルス、に暴露された患者などのドナーから選択されたヒトB細胞により発現されるモノクローナル抗体を同定するために適用され得る。それゆえ、ドナーは、ナイーブである、ワクチン接種されている、1つまたは複数の疾患または感染症に罹っている、特定の治療的処置にすでにさらされているおよびまたは耐性である、特定の臨床指標または臨床状態を提示している、病原体に誤ってさらされている、などであってよい。ドナーの血清は、抗原に対する血清反応陽性の初期判定のためにそのまま使用することができる。というのは、適応免疫応答の特異性および長期維持は、ドナーを選択するのに十分である定性的測定を可能にするからである。採用するスクリーニングアッセイの性質および感度は、最適なドナーを同定する上で重要であり、好ましくは、ドナー血清のスクリーニングに用いられるアッセイは、不死化された抗体分泌B細胞からの上清をスクリーニングするために用いられかつ所望の機能活性をもつ抗体を検出するために設計されたアッセイと同一であるべきである。細胞がそこから精製される組織または器官の選択は、十分な量での適切な細胞の入手可能性によって決定され得る。細胞は、新鮮なもしくは凍結されたサンプルから、およびまたは十分な出発材料を提供するためにプールされた多くの個体由来のサンプルから取得することができる。予備スクリーニングは、抗体分泌細胞を含むサンプルを用いて、候補ドナーのパネルに対して行うことができる。特に、単核細胞は、末梢血単核細胞を単離するための標準的な分離技術、例えば勾配遠心分離を用いて、血液またはリンパ組織から単離することができる。この分離工程の後およびまたは前に、血清、細胞培養上清、または細胞のサンプルは、抗体および抗体分泌細胞の存在を検出するための標準技術を用いて、予備スクリーニングすることができる。当技術分野における例としては、例えば、ワクチン接種されたドナーの免疫応答を特徴づけるためのELISPOTの使用、新たに感染した患者のための診断ツールとしての抗原マイクロアレイの使用、および抗原特異的免疫応答を測定するための他の技術が挙げられる。治療標的に対する抗体応答のこの予備定性解析は、所望の精製抗原、関連抗原の混合物、またはバイオアッセイに向けられた、より高い抗体価を発現するB細胞を有するドナーの同定を可能にすべきである。いったん1または複数のドナーが選択されたら、B細胞の供給源は脾臓、血液、リンパ節、骨髄、腫瘍浸潤リンパ球、慢性感染炎症部位からのリンパ球とすることができる。しかし、通常、ドナーから取得し、保存し、そして一定期間にわたって抗原に対する血清学的応答をモニタリングするには、末梢血のほうが容易である。例えば、5~50mlの末梢血から出発して、約1000万~1億個のPBMCを精製することができ、この細胞数は、本明細書に記載の方法を用いて不死化した後で、抗体分泌細胞の十分に大きな集団をスクリーニングすることを可能にするだろう。生物学的サンプルからPBMCを単離した後で、抗体分泌細胞の特異的選択は、当技術分野で公知の方法を用いて、その表面上の細胞表面マーカーと適宜に他のタンパク質の発現、ならびに細胞の増殖活性、代謝状態およびまたは形態学的状態に基づいて、行うことができる。特に、ヒトサンプルから抗体分泌細胞を精製するためのさまざまな技術は、正または負の選択のためのさまざまな手段および条件を利用する。これらの細胞は、抗体を発現して分泌する細胞に特異的な細胞表面マーカーを発現するものを物理的に分離することによって、効率的に選択することができる。具体的なプロトコルは当技術分野で見いだすことができるOxfordUniversityPress2000pg1731を参照されたい。選択は、これらの細胞表面タンパク質のいずれかに特異的に結合する抗体を用いて行うことができ、該抗体は、固相支持体に連結したり、蛍光活性化セルソーターを用いて検出できる蛍光色素で標識したりすることができる。例えば、ヒトB細胞は、CD19、CD27およびまたはCD22を結合している支持体に対するそれらの親和性に基づいて、あるいはEBV不死化前の特定のアイソタイプに特異的な抗体に対する結合親和性の欠如のために、選択されている。本明細書中に示されるように、CD22は、抗原認識およびB細胞活性化に関連するシグナル伝達経路を制御しているB細胞制限膜貫通タンパク質であって、初期B細胞選択のために使用することができる。CD22陽性集団には異なるアイソタイプおよび特異性を有する抗体を発現する細胞が含まれるので、他の細胞表面マーカーもまた、該細胞を選択するために使用され得る。代替的にまたは付加的に、抗体分泌細胞の特異的濃縮は、CD22ベースの選択に加えて、CD27ベースの選択を利用することによって得ることができる。CD27は、体細胞変異した可変領域遺伝子を有するヒトB細胞のマーカーであることが知られている。CD5、CD24、CD25、CD86、CD38、CD45、CD70、またはCD69などの追加のマーカーは、所望の細胞集団の枯渇または濃縮のために使用することができる。こうして、抗原への暴露のドナーの病歴、抗体価に応じて、全B細胞、CD22濃縮B細胞、またはCD27陽性B細胞などのさらなる濃縮B細胞亜集団を使用することができる。B細胞のEBV形質転換特定のアイソタイプを有する抗体を発現する細胞の、選択されて刺激された集団は、ウイルス不死化剤を用いて不死化することが可能である。さまざまな不死化剤が、不死化された抗体分泌細胞を得るために、抗体分泌細胞に対して使用され得る。ウイルス不死化剤の中で、好ましくは、抗体分泌細胞に感染してそれらを不死化するウイルスが本発明の実施において用いられる。一般的に用いられるウイルスは、ヘルペスウイルスのγクラスに分類されるリンパ球指向性ウイルスである。このウイルス科のメンバーは種特異的にリンパ球に感染し、そしてリンパ増殖性疾患およびいくつかの悪性腫瘍の発症に関連している。EBV、およびHHV8は、ヒトリンパ球に感染して不死化する。MHV68、HVS、RRV、LCV、EHV2、HVA、およびAHV1は、その他の発癌性のリンパ球指向性ヘルペスウイルスであり、それらの間には共通の遺伝的特徴が保存されていて、さまざまな哺乳動物宿主細胞内で同様の病原作用を示す。これらのウイルスは本発明を実施する際に用いることができる。インタクトなウイルスの使用に加えて、特定のウイルスタンパク質を含有する組換えDNA構築物は、B細胞を不死化するために使用されて成功を収めている。ウイルス遺伝子を含有するベクターは、場合によっては、ウイルス様粒子の形成のためにトランスですべての必要な因子を提供するレトロウイルスシステムまたはパッケージング細胞株を利用して、細胞に形質導入することができ、本発明の方法でも使用することができる。EBV媒介性不死化は、EBVによって発現されるタンパク質に起因するB細胞の不死化を含む複雑なプロセスであり、EBVと宿主細胞タンパク質間の相互作用によって調節されている。必要に応じて、不死化プロセスは、特定のEBVタンパク質および転写産物、例えばEBNA2、EBNA1、LMP2、LMP1またはEBERs、の発現を測定することによって、追跡することができる。これらのタンパク質は、PCR、免疫蛍光、ウェスタンブロット、または感染細胞におけるEBVDNAおよびタンパク質の検出を可能にする他の方法によって、検出することができる。形質転換B細胞のスクリーニングおよび単離いくつかの態様において、形質転換されたおよびまたは活性化されたB細胞は、所望の抗原特異性を有するものについてスクリーニングすることができ、その後、個々のB細胞クローンを陽性細胞から生産することができる。スクリーニング段階は、ELISA、組織もしくは細胞の染色、中和アッセイ、およびまたは所望の抗原特異性を同定するための当技術分野で知られた多くの他の方法のいずれかによって、実施することができる。アッセイは単純な抗原認識に基づいて選択するか、または所望の機能にさらに基づいて選択することができる。いくつかの態様において、陽性細胞の混合物から個々のクローンを分離するためのクローニング段階は、限界希釈法、マイクロマニピュレーション、セルソーティングによる単一細胞沈着を用いて、およびまたは当技術分野で知られた任意の他の方法により、行うことができる。いくつかの態様では、クローニングは限界希釈法を用いて行われる。いくつかの態様では、クローン化B細胞は、活性化剤媒介性の増殖シグナルに対する宿主の先天的応答の阻害と結び付いたEBV形質転換を用いて不死化されたB細胞に由来する。いくつかの態様において、本開示は、所望の抗原特異性を有する抗体を産生する不死化B細胞の作製を提供する。このようなB細胞はさまざまな方法で使用することができ、例えば、モノクローナル抗体の供給源として、関心対象のモノクローナル抗体をコードする核酸の供給源として、細胞療法のための対象への送達のために、治療薬または薬剤として使用される。いくつかの態様において、培養中の活性化B細胞からの上清は、当技術分野で知られた公知方法を用いて、関心対象の抗体についてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、関心対象の抗原に結合することができる1つまたは複数のモノクローナル抗体を同定するために行われる。このようなスクリーニングは培養上清およびまたは精製抗体に対して実施することができる。あるいは、スクリーニングは活性化およびまたは不死化B細胞からの培養上清およびまたは精製抗体を用いて行うことができる。さらに、交差反応性の抗体が関心対象である場合には、2つまたはそれよりも多い異なる抗原と交差反応するモノクローナル抗体の能力が検討される。さらに、いくつかの態様では、特定の機能特性をもつ抗体をスクリーニングすることが望ましい。本開示によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は、例えば、イムノアッセイで、例えば免疫沈降または他のインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイなどによって、測定することができる。採用することができるスクリーニング方法の代表的な一般的クラスとしては、限定するものではないが、抗体捕捉アッセイ;抗原捕捉アッセイ;および機能スクリーニングが挙げられる。抗体捕捉アッセイでは、抗原を固相に結合させ、該抗原に試験されるモノクローナル抗体を結合させることができる。未結合の抗体を洗浄により除去した後で、結合した抗体が、例えば該抗体を特異的に認識する標識抗体などの二次試薬によって、検出される。抗原捕捉アッセイの場合には、抗原を直接標識することができる。一態様では、試験されるモノクローナル抗体を固相に結合させ、次いで、任意に標識された抗原と反応させることができる。あるいは、試験されるモノクローナル抗体を固相に結合させる前に、抗体抗原複合体を免疫沈降によって形成させてもよい。抗体抗原複合体を固相に結合させたら、未結合の抗原を洗浄によって除去し、結合した抗原を検出することによって陽性を同定することができる。さまざまな機能スクリーニングは、所望の活性を有するモノクローナル抗体を同定するために存在する。本開示において、そのような1つのスクリーニングは、実施例に記載されるように、中和アッセイである。組換え発現本開示の方法はまた、選択されたB細胞クローンからの抗体のための核酸の取得およびまたは配列決定、ならびに関心対象の抗体を発現することができる宿主細胞を作製するための該核酸の利用を提供する。いくつかの態様において、所望の抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列決定した後、293細胞またはCHO細胞などの異種発現系で使用することができる。いくつかの態様では、抗体は、関心対象の抗体をコードするB細胞クローンから1つまたは複数の核酸を取得し、宿主細胞内での関心対象の抗体の発現を可能にするために該核酸を宿主細胞内に挿入することによって、組換えにより発現させることができる。組換えDNA法を用いる抗体の生産は、例えば米国特許第4816567号に記載されている。抗体の組換え生産では、それをコードする核酸が単離されて、さらなるクローニングのために、または発現のために、複製可能なベクターに挿入される。モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手法を用いて容易に単離され、配列決定される。一般的に使用できるベクターは、限定するものではないが、次の1つまたは複数を含む:シグナル配列、複製起点、1つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。このような発現系の構成要素の例は、例えば米国特許第5739277号に、記載されている。本明細書においてベクター中のDNAのクローニングまたは発現に適する宿主細胞は、原核生物、酵母、または高等真核生物の細胞である。薬学的組成物本明細書に開示される主題は、本開示に従って産生される抗体を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様では、形質転換されたおよびまたは活性化されたB細胞を含む薬学的組成物が提供される。いくつかの態様では、薬学的組成物は本明細書に開示される方法を用いて産生された1つまたは複数のモノクローナル抗体を含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に開示される主題のモノクローナル抗体と形質転換およびまたは活性化B細胞の両方を薬学的組成物中に含めることができる。いくつかの態様では、本開示に従って産生されたモノクローナル抗体のパネルを薬学的組成物中に含めることができる。いくつかの態様では、本開示に従って産生されたモノクローナル抗体およびまたはB細胞は、1つまたは複数の追加の薬剤、例えば抗ウイルス薬または鎮痛薬、と一緒に含めることができる。いくつかの態様において、薬学的組成物はまた、薬学的に許容される担体または抗体の投与のためのアジュバントを含むことができる。いくつかの態様では、担体はヒトに使用するために薬学的に許容可能である。担体またはアジュバントそれ自体は、組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生を誘導してはならず、かつ毒性であってはならない。適切な担体は大きな、ゆっくり代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子であり得る。薬学的に許容される塩を使用することができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などの鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩などの有機酸塩が使用され得る。治療用組成物中の薬学的に許容される担体はさらに、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含有することができる。さらに、湿潤剤、乳化剤またはpH緩衝物質などの補助物質もこのような組成物中に存在させることができる。こうした担体は、患者による摂取のために薬学的組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁液剤として製剤化することを可能にする。本明細書に開示される主題の組成物はさらに、組成物の調製および投与を容易にするための担体を含むことができる。適切な送達ビヒクルまたは担体はどれも使用することができ、限定するものではないが、以下が挙げられる:マイクロカプセル、例えばミクロスフェアまたはナノスフェアCancerRes5454085413SaltzmanFungAdvDrugDelivRev26209230、グリコサミノグリカン、脂肪酸、脂肪乳剤、脂質または脂質誘導体、コラーゲン、多糖またはその誘導体、ナノ懸濁液、高分子ミセルまたはコンジュゲートCancerRes5714471451および米国特許第4551482号、第5714166号、第5510103号、第5490840号、および第5855900号、およびポリソーム。抗体配列は、当技術分野で公知の方法を用いて、活性物質または担体に連結することができ、こうした方法として、限定するものではないが、以下が挙げられる:カルボジイミドコンジュゲーション、エステル化、過ヨウ素酸ナトリウム酸化とその後の還元的アルキル化、およびグルタルアルデヒド架橋CancerRes5714471451ChengHumGeneTher7275282NerietalNatBiotechnol1512711275NabelVectorsforGeneTherapyCurrentProtocolsinHumanGeneticsJohnWileySonsNewYorkParketalAdvPharmacol40399435PasqualinietalNatBiotechnol15542546BaumingerWilchekMethEnzymol70151159米国特許第6071890号および欧州特許第0439095号。本発明の治療用組成物は、いくつかの態様では、薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物を含む。適切な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質、および意図されたレシピエントの体液と製剤を等張にする溶質を含むことができる水性および非水性無菌注射液;ならびに懸濁化剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は単位用量または複数回用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供することができ、そして使用直前に無菌液状担体の添加のみを必要とする凍結または凍結乾燥状態で保存することができる。いくつかの代表的な成分は、ある態様では01~10mgmlの範囲内の、ある態様では約20mgmlのSDS;およびまたは、ある態様では10~100mgmlの範囲内の、ある態様では約30mgmlのマンニトールまたは別の糖;およびまたはリン酸緩衝生理食塩水である。問題の製剤のタイプを考慮して、当技術分野で慣用の他のどのような作用剤も使用することができる。いくつかの態様では、担体は薬学的に許容可能である。いくつかの態様では、担体はヒトに使用するために薬学的に許容可能である。本開示の薬学的組成物は55~85のpH、好ましくは6~8、さらに好ましくは約7のpHであり得る。pHは緩衝剤の使用によって維持することができる。本組成物は滅菌およびまたは発熱物質不含とすることができる。本組成物はヒトに対して等張であり得る。本明細書に開示される主題の薬学的組成物は、密閉容器に入れて供給することができる。薬学的組成物は、本明細書に記載される1つまたは複数の抗体の有効量を含むことができる。いくつかの態様では、薬学的組成物は、目的の疾患もしくは症状を治療する、改善するまたは予防するのに十分であるか、検出可能な治療効果を示すのに十分である量を含むことができる。治療効果には、身体症状の軽減も含まれる。ある対象のための正確な有効量は、対象のサイズおよび健康状態、症状の性質および程度、投与のために選択された治療薬または治療薬の組み合わせに依存するだろう。所与の状況のための有効量は、当業者によって実施されるルーチン実験により決定される。治療レジメン:薬物動態本発明の薬学的組成物は、投与方法に応じて、さまざまな単位剤形で投与することができる。典型的な抗体の薬学的組成物の投与量は当業者によく知られている。そのような投与量は一般的に勧告されるものであり、そして特定の治療状況または患者の耐容性に応じて調整される。それを達成するのに十分な抗体の量は治療有効用量として規定される。投与計画およびその使用に有効な量、すなわち投薬レジメンは、疾患または症状の病期、疾患または症状の重症度、患者の一般的な健康状態、患者の身体状況、年齢、活性薬剤の製剤処方および濃度などを含めて、さまざまな要因に左右されるだろう。患者に対する投薬レジメンを計算する際には、投与方法もまた考慮される。投薬レジメンはまた、薬物動態、すなわち、薬学的組成物の吸収率、生物学的利用能、代謝、クリアランスなどを考慮に入れる必要がある。例えば、最新のRemingtonsEgletonPeptides18143114391997LangerScience249152715331990を参照されたい。本発明の目的のために、抗体を含む組成物の治療有効量は、約005~1500μgのタンパク質、好ましくは約10~1000μgのタンパク質、さらに好ましくは約30~500μg、最も好ましくは約40~300pg、またはこれらの値の間の任意の整数値を含有する。例えば、本発明の抗体は対象に約01μg~約200mg、例えば約01μg~約5μg、約5μg~約10μg、約10μg~約25μg、約25μg~約50μg、約50μg~約100μg、約100μg~約500μg、約500μg~約1mg、約1mg~約2mgの用量で投与することができ、任意の追加免疫が例えば1週間、2週間、3週間、4週間、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月およびまたは1年後に与えられる。当然のことながら、ある患者に対する特定の用量レベルは、使用される特定の抗体の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時期、投与経路、排泄速度、複合薬、および治療を受ける特定の疾患の重症度を含めて、さまざまな要因に依存する。投与経路としては、限定するものではないが、経口、局所、皮下、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、経皮、および真皮下が挙げられる。投与経路に応じて、1回の投与量あたりの容量は、好ましくは約0001~10ml、さらに好ましくは約001~5ml、最も好ましくは約01~3mlである。組成物は単回投与療法で投与されるか、または対象の年齢、体重および症状、使用される特定の抗体製剤、ならびに投与経路に適した計画に基づいて、適切な期間にわたり、複数回投与療法で投与される。キット本発明は、例えば、上述した治療用途のために使用することができる、本開示に従って産生された抗体を含むキットを提供する。その製品はラベルの付いた容器を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、および試験管が挙げられる。容器はガラスまたはプラスチックなどの各種材料から形成することができる。容器は、上述したような治療用途に有効である活性薬剤を含む組成物を保持する。組成物中の活性薬剤は抗体を含むことができる。容器上のラベルは、その組成物が特定の治療または非治療用途に使用されることを示し、また上述したような、インビボまたはインビトロでの使用の指示を示すことができる。本発明を実施するための特定の局面の以下の実施例は、説明のみを目的として提供され、いかなる場合にも本発明の範囲を限定するものではない。方法および材料倫理上の声明インフォームドコンセントを得て、すべての手順を国立大学治験審査委員会から承認されたプロトコルの下で行った。細胞およびウイルスC636細胞およびBHK21細胞は、以前に記載されたように培養した。EHIおよびPVP159株を除くすべてのデング株は、シンガポールのノバルティス熱帯病研究所から得た。EHI株はシンガポールの環境衛生研究所から入手し、PVP159はEDEN患者コホートから入手した。B細胞のクローニングB細胞の単離および不死化は、以前に記載されたように実施した。15日間の培養後、上清をELISAおよびPRNTでDENV特異的抗体についてスクリーニングした。ELISA結合アッセイ96ウェル平底プレートにマウス4G2抗体を5μgmlで一晩コーティングした。プレートをPBSTween20001で3回洗浄した。異なるDENV株をウェルあたり50μl中1×105pfuで添加し、さらに2時間インキュベートした。プレートをPBSTween20001で3回洗浄した。HM14C10をプレートに加えて、さらに1時間インキュベートした。プレートをPBSTween20001で3回洗浄した。抗ヒトIgG結合HRPを添加して1時間インキュベートした。TMB基質を添加し、01M硫酸を用いて反応を停止させた。組換えHM14c10の生産RNA抽出キットを用いて、B細胞からRNAを抽出した。組換え抗体のクローニングおよび発現は、以前に記載されたとおりに行った。抗体依存性増強アッセイデングウイルスを培地、個々のモノクローナル抗体またはHM14c10モノクローナル抗体のサブクラスと一緒にプレインキュベートし、次に105個のK562細胞に添加した。1時間後、細胞をPBSで十分に洗浄して、未結合のウイルスとモノクローナル抗体を除去した。さらに48時間後、上清を回収して、ウイルス力価をBHK21細胞でのプラークアッセイにより測定した。インビボでのマウス実験AG129マウスはIFNαβおよびγ受容体が欠損している。マウスは動物実験委員会の勧告に従って取り扱った。HM14c10対PBS処理対照の予防的および治療的適用を詳述した略図を図21に提供する。マウスを犠牲にして、確立されたプラークアッセイによりウイルス血症を定量した。タイムラプス共焦点生細胞イメージングすべてのタイムラプス生細胞顕微鏡法は、PlanApochromat100X14開口数レンズを用いて倒立A1Rsi共焦点顕微鏡で行った。生細胞イメージングは、チャンバーホルダーに取り付けた25mmガラス製カバースリップ上で成育させた未固定の生存BHK細胞を用いて行った。実験の1日前に細胞を4×104個ウェルの密度で播種し、10FCSを添加したRPMI1640中で培養した。AlexaFluor488標識抗体とAlexaFluor647標識DEN1ウイルスの同時検出のために、488nmラインのアルゴンイオンレーザーと633nmのヘリウムネオンレーザーの光をHFTUV488633ビームスプリッターに向けて、AlexaFluor488検出用の505530バンドパスフィルターとAlexaFluor647検出用の650ロングパスフィルターを組み合わせたNFT545ビームスプリッターを用いて蛍光を検出した。画像は30秒間隔で1フレーム毎秒にて30~60分間撮影した。すべての生細胞イメージング実験は、5CO2顕微鏡用ケージインキュベーターシステム内37°Cでインキュベートした細胞を用いて行った。画像は、ニコン画像統合ソフトウェアエレメンツCソフトウェアニコン、日本で解析し、処理した。細胞内蛍光の定量DENV1のエンドサイトーシスに対する抗体の効果は、生存細胞内の蛍光の相対レベルを測定することによって評価した。個別の抗体で処理した後、少なくとも100個の細胞の画像を、3つの独立した実験からA1Rsi共焦点顕微鏡を用いてランダムに取得した。その後、細胞の細胞内領域を、NISElementsソフトウェアの関心領域regionofinterestROI機能を用いて個別に手動で画定し、そして各細胞内のAlexaFluor488の相対蛍光レベルを該ソフトウェアのROI統計機能を用いて測定した。平均値、標準偏差およびスチューデントのt検定は、MicrosoftExcelを用いて各細胞集団について計算した。未処理のDEN1感染細胞集団からの蛍光を100に正規化して、抗体で処理した感染細胞との比較に使用した。低温電子顕微鏡法デングウイルスを以前に記載されたとおりに調製した。ウイルスをFabHM14c10と1:1のモル比で混合し、37°Cで30分、次に4°Cで2時間インキュベートした。その後、複合体を、連続したカーボンの薄層でコーティングされたレーシーカーボングリッド上で液体エタンにて急速凍結した。ウイルス粒子は300kVFEITitanKriosを用いて以下の条件で撮影した:電子線量16eÅ2、倍率47000、デフォーカス範囲1μm~3μm。画像は1ピクセルあたり19Åのピクセルサイズをもたらす4K×4KGatanCCDカメラにより記録した。合計5566個の粒子がボックス化され、EMANプログラムスイートで、それぞれプログラムboxerおよびctfitを用いることにより、コントラスト伝達関数パラメータを測定した。粒子の配向は、マルチパスシミュレーテッドアニーリングプロトコルを用いて測定した。西ナイルウイルスを初期モデルとして使用した。EMANでプログラムmake3dを用いることによって三次元マップを作成した。最終的なマップの分解能は、05のフーリエシェル係数カットオフで測定して、7Åの分解能であることが分かった。DENV1融合後Eタンパク質の結晶構造は、剛体としてcryoEM密度マップにうまくフィットせず、したがってEタンパク質のドメイン類を分割してから個別にフィットさせた。cryoEMマップへの分子のフィットはその後、Chimeraのフィットインマップ機能を用いて最適化した。HM14c10可変領域のホモロジーモデルを作成するために、最高の配列一致を有する構造が選択され、そしてホモロジーモデルがModellerを用いて作成された。ホモロジーモデルの重鎖および軽鎖は、Fabの2つの可能な配向でcryoEMマップに別々にフィットさせた。実施例1:回復期DENV1感染者からの強く中和するDENV1特異的抗体14c10の単離DENV1に対する血清型特異的な結合および中和活性を有する抗体を分泌するBリンパ球細胞株の一群を同定し、サブクローニングし、そして増殖させた。これらの細胞株のうちの1つ、BCL14c10は、他のものより著しく強い結合および中和活性を有するIgGを産生した。この細胞株は、組換えヒトIgG1のPCR増幅および発現のための免疫グロブリン遺伝子テンプレートの供給源として使用した。1つの組換えヒト抗体14c10は、親BCL14c10と同等のDENV1への結合活性をもっていた。HM14c10は、DENV1に結合して中和したが、DENV2、3または4には結合せず、インビトロにおいて0328μgmlのPRNT50で強い中和活性を示した。DHFおよびDSSの発症と関連があるADE活性は、中和濃度以下の抗体とDENVがFc受容体保有細胞に結合する複合体を形成するときに発生することが提案されている。これは、ウイルスの取り込みならびに炎症性サイトカインおよびケモカインの分泌の増加につながる。本発明者らは、FcγRを発現する骨髄単核細胞株K562を使用する確立されたインビトロアッセイを用いて、HM14c10のADE活性をヒト化抗フラビウイルスモノクローナル抗体HM4G2と比較した。HM4G2は、血清型交差結合活性を有して、DENV1~4上のEDIIの保存された融合ループを標的とする。本発明者らは、HM14c10が中和濃度以下でDENV1感染の若干の同型増強を示すが、それが結合しないDENV2、3または4には増強活性を示さない、ことを観察した。対照的に、HM4G2は中和濃度以下で4つすべての血清型の増強を媒介する。HM14c10の観察された同型ADE活性へのK562FcγRの寄与を検証するために、本発明者らは、該抗体をFab断片として発現させるか、または297位のアスパラギン残基からグルタミンへの置換を介してヒトIgG1上のグリコシル化部位を取り除くことによってFcγR結合を低下させた。HM14c10FabとN297Q変異体はどちらも、全IgG1対照に比して、それらの同型ADE活性の低下を示した。本発明者らは次に、ADE活性に対するIgGサブクラスの影響を比較し、そしてK562上のFcγRIIAについて報告された結合活性との部分相関を観察した。ADE活性は次のようにランク付けすることができる:IgG3が最高で、IgG4が最低であって、IgG3>IgG1>IgG2>IgG4。したがって、この中和抗DENV抗体のADE活性は、FcγR結合に依存しているようだが、これらの実験ではウイルス中和に対する高親和性FcγR1および補体成分の影響が取り上げられていないことに留意すべきである。DENVのさらなる複雑さは、単一の血清型内の複数の遺伝子型の存在である。DENV1遺伝子型はそれらのアミノ酸組成において最大3異なっており、そしてマウス抗DENV抗体の以前の報告は、防御活性が遺伝子型間で変化し得ることを示唆した。本発明者らは、2つの異なるDENV1遺伝子型に相当するいくつかのDENV1臨床分離株に対するHM14c10の結合活性をHM4G2と比較した。HM14c10とHM4G2の両方は試験した遺伝子型に対して結合活性を示したが、HM4G2はすべてのケースでより良好な結合特性を示した。対照的に、HM14c10は、試験した分離株遺伝子型のすべてに対して、HM4G2と比べて優れた中和活性を示した。実施例2:HM14c10は四次構造依存性エピトープに結合する所与の抗体とDENV間の相互作用の正確な性質は、中和を説明するための鍵を握っているに違いない。それを究明するために、FabHM14c10:DENV1複合体の低温電子顕微鏡構造を7Åの分解能で解いた。完全占有では、120コピーのFabHM14c10がウイルス表面上のEタンパク質の利用可能な180コピーのすべてに結合する。Eタンパク質上のHM14c10のフットプリントを同定するために、DENV1Eタンパク質の結晶構造をcryoEM密度マップにフィットさせた。7Å分解能のcryoEMマップは、HM14c10FabとEタンパク質の間の明確な密度接続を示して、相互作用界面でのEタンパク質残基の同定を可能にした。HM14c10によって認識されるエピトープはウイルスの四次構造に依存する。HM14c10の2つのFabはウイルス非対称単位内の3つのEタンパク質に結合する。各抗体は、2つの隣接するEタンパク質にまたがって、EDIII上のエピトープの半分と、隣接Eタンパク質のEDIおよびEDIEDIIヒンジ上のあとの半分に結合する。Eタンパク質とFabの相互作用を理解するために、HM14c10の可変領域のホモロジーモデルを、基準ヒト抗体構造に基づいてModellerを用いて作成した。次にホモロジーモデルの軽鎖および重鎖の可変領域をcryoEM密度にフィットさせた。両鎖の構造は類似しているが、密度へのより良好な相関を与える際立ったフィットが存在する。FabEタンパク質界面の解析は、重鎖および軽鎖のすべての相補性決定領域がこの相互作用に係っていることを示唆する。表1HM14c10:DENV1cryoEM密度へのDENV1Eタンパク質ドメインのフィッティングaEタンパク質の位置の指定については図12を参照のこと。bデング1Eタンパク質ドメインは最初に成熟デング2ウイルスのcryoEM構造のEタンパク質位置に重ね合わせた。cデング1Eタンパク質ドメインのHM14c10:DENV1cryoEMマップへのフィットは、Chimeraのフィットインマップ機能を用いて最適化した。非対称単位内の2つのHM14c10Fabの結合フットプリントは同一でなく、12個のアミノ酸は両界面に共通しているが、4個はユニークである。異なるDENV1分離株間のエピトープ残基の配列比較は、ほとんどの残基が保存されていることを示して、観察されたHM14c10の中和活性と一致する。対照的に、これらの残基は他のDENV血清型または西ナイルウイルスでは保存されていない。表2DENV1Eタンパク質上のFabHM14c10エピトープFabHM14c10およびHM14c10によって結合された両エピトープにおいて共通する残基は太字で示される。実施例3:タイムラプス共焦点顕微鏡法はHM14c10の中和メカニズムを明らかにする抗体は、エンドソーム膜へのウイルスの付着もしくは融合の阻害、またはウイルスによって誘起される表面糖タンパク質のコンフォメーション変化のブロックを介してなど、多様なメカニズムによってウイルス感染を中和することができる。DENV1のHM14c10中和のメカニズムを理解するために、タイムラプス共焦点顕微鏡法を用いて、蛍光タグ付けした生存DENVによる細胞の感染を追跡した。BHK細胞をDENV1およびアイソタイプ対照Mabと一緒にインキュベートしたとき、ウイルスは、複数の、主に核周囲の、細胞内コンパートメント内で合体した。中和濃度のHM4G2は細胞外空間でのウイルス凝集体の形成を誘導したが、これらもまた、うまく内在化され、HM4G2がウイルスの付着内在化を阻害しないことが確認された。対照的に、HM14c10はより小さい凝集体の形成を誘導したが、効率的にウイルスの付着をブロックし、小さいウイルス粒子のほとんどは1時間後に細胞外空間に残存していた。HM4G2は、アイソタイプ対照に比べて、細胞内ウイルスの蓄積を遅らせた。HM14c10:DENV1複合体は細胞に入ることができなかったが、その表面から外れた状態で見ることができた。3つすべての条件下で内在化された蛍光DENV1の程度が定量化された。これらのデータから、HM14c10によるDENV1の阻害の主な様式は、宿主細胞へのウイルス付着の妨害によるものであることが示唆される。実施例4:HM14c10はインビボで高い予防および治療活性を示すDENVは、免疫応答性げっ歯類の天然の病原体ではないが、タイプIIIIFNの受容体が欠損しているAG129マウスにおいて用量依存性のウイルス血症を誘発することが可能である。本発明者らは、これらのマウスに未変性DENV1を皮下または腹腔内に注射してから、それぞれ3~4日後にウイルス血症を定量化した。異なる遺伝子型を表す2つのDENV1臨床分離株を利用して、HM14c10のインビボ有効性を判定した。両方のモデルにおいて、HM14c10は、DENV1感染の24時間前にマウスに与えたとき、または感染の48時間後に与えたとき、疾患を防いだ。ウイルス血症の顕著な減少が観察されたHM14c10の最低濃度はマウスあたり06μgであり、これは報告された他の抗DENV治療製剤のいずれによっても達成されていないインビボ効力に相当する。考察DENV感染で生じる体液性応答に関する最近のレポートでは、主にDENV血清型交差反応性であって弱い中和活性を有する抗体が支配的であることを示唆している。ヒト血清レパートリーでは稀であるが、EDIII抗体はDENV感染を防ぐことが提案されており、これはDENVへのマウス抗体応答に関する研究と一致している。特性評価されたヒト抗体は、基本的にはウイルスEタンパク質のDIおよびDIIに特異的であった。特性評価された抗体の少数は、ウイルス全体に結合するものの、組換えEタンパク質には結合しないことが観察され、これは四次構造依存性エピトープに対する特異性を示唆している。この研究において、本発明者らは、DENV血清型1に対する強力な中和抗体を単離して、徹底的に特性評価した。この抗体はインビトロ系とインビボ系の両方において高度に中和する。それは、DENV1のみに結合するので、他のDENV血清型による骨髄単核細胞の感染増強を引き起こすことがない。DENV1と複合体化されたFabHM14c10の7Å分解能のcryoEM構造は、FabとEタンパク質との結合の詳細を明らかにした。このレベルの詳細は、抗体フラビウイルス複合体の以前のcryoEM構造では観察されていない。HM14c10のフットプリントはEDIIIおよび隣接Eタンパク質からのEDI:EDIIにわたって広がっている。WNVに特異的なヒト抗体CR4354に関するレポートもまた、免疫のターゲットとしてこの領域を暗示している。FabCR4354と複合体化されたWNVのcryoEM構造は、より低い分解能で解かれるが、FabCR4354結晶構造のフィッティングは疑似原子分解能構造をもたらす。これは相互作用残基の同定を可能にした。WNVのCR4354エピトープとDENV1のHM14c10エピトープの比較は、CR4354がフットプリントの大きな割合をEDIII上に有するのに対して、HM14c10は相互作用残基のほとんどがEDI上にあることを示した。これらのエピトープの配列比較は、CR4354エピトープの20ほどがHM14c10エピトープとオーバーラップするにすぎず、そしてオーバーラップする残基は主に非保存的であることを示した。CR4354とHM14c10のエピトープは同一ではないが、これらの抗体の結合は近隣のEタンパク質を一緒に保持し、それによってウイルス構造をロックし、かつ増殖性感染、すなわち宿主受容体へのウイルス付着および宿主細胞のエンドサイトーシス経路内での融合、に不可欠なコンフォメーション変化を妨げるはずである。タイムラプスライブイメージング共焦点顕微鏡法は、HM14c10が宿主細胞へのDENVの付着を阻害することを示す。これに対して、CR4354はWNV融合を優先的に阻害することが示されたが、このことは、抗体によるこの領域のターゲッティングは結果的に複数の阻害メカニズムにつながることを示唆している。DENVの表面タンパク質は、ブリージングと呼ばれる生理的条件で、一定の変化を受けることが示唆されている。ブリージングは、細胞へのウイルスの付着を容易にする上で役割を果たしている可能性がある。HM14c10は表面Eタンパク質同士を架橋するので、それはその後、表面タンパク質がブリージングを受けるのを妨げることによって、付着を阻害することができる。あるいは、EDIIIは宿主細胞への付着にとって重要であることが示されており、したがって、EDIIIへのHM14c10の結合はこのプロセスを立体的に妨害することができる。HMAbCR4354は、HM14c10と同様の領域に結合するが、WNV付着を阻害しない。これは、脳炎を引き起こすWNVと熱性疾患を引き起こすDENVが同一の受容体結合決定基を共有しないことを意味している。HMAbCR4354は、エンドソーム膜へのウイルスの融合を低pHで妨げることが示された。HM14c10もまた近隣のEタンパク質にまたがって結合するので、HM14c10が融合時に二量体Eの三量体構造への再配列を阻害する可能性は排除できない。受容体結合と融合の両方を阻害する潜在能力は、HM14c10の並外れたインビボ有効性を説明することができる。ほとんどのフラビウイルスEタンパク質は、WNVおよびDENVのcryoEM構造間の高度の類似性に基づくと、同様の四次構造をもっている。したがって、すべてのフラビウイルス表面Eタンパク質は、その感染サイクルの間に同様の構造再配列を受ける可能性がある。そのため、他のフラビウイルスにおいてHM14c10またはCR4354と同様の領域をターゲットとする抗体は防御的であり得る。HM14c10およびCR4354抗体は、この結合活性により特性評価されたたった2つの抗体であり、かつ両方ともヒト源に由来するので、このタイプのエピトープはおそらく全身性のフラビウイルス免疫のための決定基であることが示される。このことは今後のワクチンの設計と評価に重要な意味を持っている。最後に、HM14c10はほとんどの臨床DENV1分離株に対する強い中和プロファイルおよび優れたインビボ有効性を備えていることを考えると、この抗体はDENV1感染者を治療するための良好な治療薬候補を表している。参考文献本発明の特定の局面を説明し例示してきたが、そのような局面は、単に本発明の例示と見なされるべきであって、添付の特許請求の範囲に従って解釈される本発明を限定するものと見なされるべきでない。本明細書中で引用したすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願がすべての目的のために参考として援用されるために具体的にかつ個別に示されているように、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。前述の本発明は、理解を明確にするために、図面および実施例を用いてある程度詳しく説明してきたが、特定の変更および修飾が添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなされ得ることが、本発明の教示に照らして、当業者には容易に明らかであろう。