"異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体DNA中に組み込み又はプラスミドで保持した放線菌を作製し,次いで,作製した前記放線菌とミコール酸含有微生物とを共培養し,前記放線菌に新たな二次代謝産物を生産させる又は前記二次代謝産物の生産量を増大させることを特徴とする二次代謝産物のスクリーニング方法。前記放線菌がストレプトマイセス属Streptomycesであることを特徴とする請求項1に記載の二次代謝産物のスクリーニング方法。前記ストレプトマイセス属の放線菌がストレプトマイセスリビダンス,コリネバクテリウム属,ロドコッカス属,ゴルドニア属,ダイエットジア属,ノカルジア属,及びマイコバクテリウム属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項に記載の二次代謝産物のスクリーニング方法。異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体DNA中に組み込み又はプラスミドで保持した放線菌を作製し,次いで,作製した前記放線菌とミコール酸含有微生物とを共培養することにより,前記放線菌に培養液中に新たな二次代謝産物を生産させる又は前記二次代謝産物の生産量を増大させることを特徴とする二次代謝産物の製造方法。前記放線菌がストレプトマイセス属Streptomycesであることを特徴とする請求項5に記載の二次代謝産物の製造方法。前記ストレプトマイセス属の放線菌がストレプトマイセスリビダンス,コリネバクテリウム属,ロドコッカス属,ゴルドニア属,ダイエットジア属,ノカルジア属,及びマイコバクテリウム属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする請求項5~7のいずれか1項に記載の二次代謝産物の製造方法。異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体DNA中に組み込み又はプラスミドで保持して作製した少なくとも一種の放線菌と,少なくとも一種のミコール酸含有微生物とを共培養して,培養液中に二次代謝産物を蓄積させたことを特徴とする培養物。前記放線菌がストレプトマイセス属Streptomycesであることを特徴とする請求項9に記載の培養物。前記ストレプトマイセス属の放線菌がストレプトマイセスリビダンス,コリネバクテリウム属,ロドコッカス属,ゴルドニア属,ダイエットジア属,ノカルジア属,及びマイコバクテリウム属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする請求項9~11のいずれか1項に記載の培養物。しかしながら,従来の純粋培養法では,1種あたり30種類以上存在する二次代謝生合成遺伝子クラスターのうち生産が確認されている抗生物質は数種類であり,例えば,エスグリセウスについては生産物が確認できているのは,4種類であり,8割以上の二次代謝産物は生産が確認できていない。そこで,天然物即ち二次代謝産物の探索においては,残りの8割以上の二次代謝産物を効率的に生産させる手法が求められている。また、二次代謝生合成遺伝子全長の異種放線菌への移植による抗生物質の生産においては,しばしば異種放線菌内で移植した二次代謝生合成遺伝子が発現しなかったり,発現したとしても,その生産量が少ないことが多々ある。そのため,異種宿主内で効率的に二次代謝生合成遺伝子を発現させる工夫が求められている。この発明の目的は,予め異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを,放線菌の染色体DNA中に組み込み又はプラスミドで保持させることにより,その放線菌を用いてミコール酸を含有する微生物と共培養して,放線菌の二次代謝能を活性化することにより,放線菌に予め組み込んでおいた異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子を発現誘導させ,新たな二次代謝産物を生産させる又はその生産量を増大させる二次代謝産物のスクリーニング方法,その製造方法,及びその培養物を提供することである。この発明は,異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体DNA中に組み込み又はプラスミドで保持した放線菌を作製し,次いで,作製した前記放線菌とミコール酸含有微生物とを共培養し,前記放線菌に新たな二次代謝産物を生産させる又は前記二次代謝産物の生産量を増大させることを特徴とする二次代謝産物スクリーニング方法に関する。また,この発明は,異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体DNA中に組み込み又はプラスミドで保持した放線菌を作製し,次いで,作製した前記放線菌とミコール酸含有微生物とを共培養することにより,前記放線菌に培養液中に新たな二次代謝産物を生産させる又は前記二次代謝産物の生産量を増大させることを特徴とする二次代謝産物製造方法に関する。更に,この発明は,異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体DNA中に組み込み又はプラスミドで保持して作製した少なくとも一種の放線菌と,少なくとも一種のミコール酸含有微生物とを共培養して,培養液中に二次代謝産物を蓄積させたことを特徴とする培養物に関する。この発明において,前記放線菌はストレプトマイセス属Streptomycesであることが好ましい。更に,前記ストレプトマイセス属の放線菌がストレプトマイセスリビダンスStreptomyceslividansであることが好ましい。また,前記ミコール酸含有微生物は,ツカムレラTsukamurella,コリネバクテリウム属,ロドコッカス属,ゴルドニア属,ダイエットジア属,ノカルジア属,及びマイコバクテリウム属のいずれかに属する微生物であることが好ましい。この発明は,上記のように,純粋培養では発現しない遺伝子を発現させることが可能である複合培養法を異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持した放線菌に適用することにより,ゲノム解析により明らかにされた異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを効率的に生産させることができるようにしたものである。この発明は,特許第4365843号及び特開2009ー207385号公報に記載されている方法,即ち少なくとも1種のミコール酸を含有する微生物及び少なくとも1種の放線菌を同一の培養容器内にて共培養する方法において,予め異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを放線菌の染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持させたものを作製し,次いで,その作製した放線菌とミコール酸含有微生物とを共培養して,その放線菌に新たな天然物即ち二次代謝産物を効率的に生産させる或いはその生産量を増大させることを特徴とする二次代謝産物のスクリーニング方法,その製造方法,及びその培養物に関するものである。ところで,二次代謝生合成遺伝子は,ゲノム上でクラスターを構成しているので,生産が確認できない二次代謝産物の生合成遺伝子全長をクローニングすることが可能である。クローニングした遺伝子を別の放線菌へ形質転換することにより,異種微生物由来の生産が確認できない二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ,又はプラスミドで保持した放線菌を作製することができ,この結果,形質転換した放線菌を宿主として異種微生物由来の二次代謝生産を行わせることが可能である。しかしながら,宿主を替えてもクローニングした遺伝子が宿主内で発現しなかったり,生産量が少ないことが多々ある。そのため,異種宿主内で効率的に二次代謝生合成遺伝子を発現させる工夫が求められている。複合培養は,放線菌に属する微生物とミコール酸を細胞表層に含有する微生物とを共培養する培養法であり,複合培養を行うと放線菌の二次代謝パターンが純粋培養時に比べて変化し,新たな二次代謝産物の生産もしくは二次代謝産物の生産量が増大する。この現象,即ち,複合培養現象は,ミコール酸を細胞表層に含有する微生物が放線菌を外部より刺激し,放線菌がそれに応答して二次代謝生合成遺伝子クラスターの遺伝子発現を活性化することにより生じたものと考えられる。本願発明は,異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持した放線菌を用いて複合培養を行うことにより,外来二次代謝産物の新規生産や生産量を増大させることを特徴とする二次代謝産物のスクリーニング方法,その製造方法,及びその培養物である。まず,本発明者は,それぞれ異なる放線菌由来のスタウロスポリン,レベッカマイシン,又はゴードスポリン生合成遺伝子クラスターをストレプトマイセスリビダンスの染色体DNA中にそれぞれ組み込み,異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ放線菌を参考例に示すとおりに作製した。次いで,作製した放線菌をミコール酸を細胞表層に含有する微生物であるツカムレラプルモニス,ロドコッカスエリスロポリス,又はコリネバクテリウムグルタミカムと共にそれぞれ複合培養を行い,それぞれの培養液からスタウロスポリン,レベッカマイシン,ゴードスポリンを抽出し,その生産量を実施例1に示すように測定した。その結果を,図5,図6,及び図7に示す。これらの図において,図5,図6,及び図7において,Tp,Cg,Reは,それぞれツカムレラプルモニスTp,コリネバクテリウムグルタミカムCg,及びロドコッカスエリスロポリスReと複合培養した際の生産量を示す。なお,培養条件は本文中実施例に示す。その結果,図5に示すように,レベッカマイシン生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだエスリビダンスは,純粋培養時には,1mg/Lの生産量であったのに対して,3種の微生物,ツカムレラプルモニス,ロドコッカスエリスロポリス,又はコリネバクテリウムグルタミカムと複合培養した時には,それぞれ,14mg/L,12mg/L,及び28mg/Lと最大28倍程度まで生産量を増大させることができた。同様に,図6に示すように,スタウロスポリン生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだエスリビダンスは,純粋培養時には,19mg/Lの生産量であったのに対して,3種の微生物と複合培養した時には,それぞれ,78mg/L,70mg/L,及び103mg/Lと最大5倍程度まで生産量を増大させることができた。また,図7に示すように,ゴードスポリン生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだエスリビダンスは,純粋培養時には,39mg/Lの生産量であったのに対して,2種の微生物と複合培養した時には,それぞれ,143mg/L,及び82mg/Lと最大3.5倍程度まで生産量を増大させることができた。以上の結果から,異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ放線菌において,複合培養によって,その生産量が増大することが示されるに至った。この発明による新たな二次代謝産物についての説明を記載すると,次のとおりである。新たな二次代謝産物は,ストレプトマイセスエスピーTP-A0274StreptomycesspTPA0274由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターをpTYMcos-Sta7を用いて染色体上に組み込んだ放線菌とミコール酸含有微生物であるツカムレラプルモニスとを複合培養することによって,実施例2に示すような高速液体クロマトグラフィーによる溶出位置と紫外線吸収波形により同定される新たな二次代謝産物の生産を確認した。その結果を,図8に示す。図8及び図9に示すように,ストレプトマイセスエスピーTP-A0274StreptomycesspTPA0274由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターをpTYMcos-Sta7を染色体上に組み込んだエスリビダンスは,純粋培養時には検出できなかった10分,10.5分,13分に溶出されるピークが高速液体クロマトグラフィーにより検出できた。以上の結果から,異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ放線菌において,複合培養によって,放線菌に新たな二次代謝産物を生産させる又はその二次代謝産物の生産量を増大させることが示されるに至った。-天然物即ち二次代謝産物のスクリーニング方法-この発明による二次代謝産物のスクリーニング方法は,まず,異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持した放線菌を作製し,次いで,その作製した放線菌を用いて複合培養を行い,培養液中に二次代謝産物が含まれているかを確認することに特徴を有するものである。二次代謝産物は,例えば,抗菌性抗生物質,制ガン性抗生物質,抗寄生虫物質,酵素阻害剤等になることができる。異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターにおける,由来となる異種微生物は,組換え宿主内で発現可能な遺伝子を有する微生物であることが好ましい。特に,宿主が放線菌であるため,宿主内での遺伝子発現を考慮すると,放線菌であることが好ましい。具体的には,二次代謝産物を生産する主な放線菌としては,アクチノマイセスActinomyces,ノカルディアNocardia,ロドコッカスRhodococcus,ミクロモノスポラMicromonospora,アクチノプラネスActinoplanes,ダクチロスポランギウムDactylosporangium,ノカルディオイデスNocardioides,シュードノカルディアPseudonocardia,アクチノビスポラActinobispora,アミコラトプシスAmycolatopsis,サッカロモノスポラSaccharomonospora,アクチノシネマActinosynnema,アクチノキネオスポラActinokineospora,ストレプトマイセスStreptomyces,キタサトスポラKitasatospora,ストレプトスポランギウムStreptosporangium,ミクロビスポラMicrobispora,ミクロテトラスポラMicrotetraspora,ノノムラエNonomuraea,ノカルディオプシスNocardiopsis,アクチノマデュラActinomadura,キネオコッカスKineococcus,キネオスポリアKineosporia,ルシバリエリアLechevarieria,及びサーモビスポラThermobispora由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターであることが好ましい非特許文献3参照。また,対象となる二次代謝生合成遺伝子クラスターは,宿主放線菌で発現可能であれば,ゲノム解析により新たに推定される未知の二次代謝生合成遺伝子クラスター,及び既知の二次代謝生合成遺伝子クラスター等のような二次代謝生合成遺伝子クラスターを用いることができる。その中で,好ましくは,ポリケチド化合物,ペプチド化合物,テルペン化合物,シキミ酸経路由来化合物,アルカロイド化合物,フラボノイド化合物等の生合成遺伝子クラスターを挙げることができる。また,異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持した放線菌における宿主となる放線菌は,複合培養により二次代謝に変化が生じる放線菌であり,特に,特許第4365843号,及び特開2009ー207385号公報に記載の天然物スクリーニング方法に使用されたストレプトマイセス属放線菌が好ましい。特に,ストレプトマイセス属放線菌の中では遺伝子操作系の確立している種である,例えば,エスリビダンス,エスセリカラー,又はエスエバーミチリスなどが特に好ましい。異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持した放線菌において,染色体上に組み込む又はプラスミドで保持する方法は,異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスター全長を組換え宿主で複製可能なコスミドベクター例えば,非特許文献4に記載されているpTOYAMAcosを用いて,定法に従ってクローニングし,定法例えば,プロトプラスト法やプラスミド接合伝達法に従って宿主放線菌に形質転換したものを用いることができる。組換え宿主放線菌と共培養をする微生物は,特許第4365843号,特開2009ー207385号公報,又は非特許文献2に記載されているミコール酸を含有する微生物ならば,どのような微生物を用いてもよい。ミコール酸を含有する細菌のうち,複合培養現象が確認されているものは,コリネバクテリウム属,ロドコッカス属,ゴルドニア属,ダイエットジア属,ノカルジア属,ウィラムジア属,マイコバクテリウム属,及びツカムレラ属であるため,特に,これらのミコール酸を含有する微生物と複合培養することが好ましい。また,培養液中に二次代謝産物が含まれているかの確認は,二次代謝産物の種類に応じて,公知の方法を用いて行うことができる。例えば,公知の方法の一つとしては,培養液を有機溶媒抽出し,その抽出物をHPLC高速液体クロマトグラフィーによって測定することにより確認する方法が考えられる。-天然物即ち二次代謝産物の製造方法-この発明による二次代謝産物の製造方法は,異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ,又はプラスミドで保持した放線菌を作製し,次いで,その作製した放線菌とミコール酸含有微生物とを複合培養を行い,培養液中に産生される二次代謝産物を採取することを特徴とするものである。ここで使用される異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ,又はプラスミドで保持した放線菌は,上記スクリーニング方法で二次代謝産物を生産することが確認された菌であることが適当である。対象となる二次代謝生合成遺伝子クラスターも上記スクリーニング方法で宿主放線菌において遺伝子発現することが確認されたクラスターであることが適当である。二次代謝産物の培養方法,及びその条件も,上記スクリーニング方法で説明したものと同様であるが,所望するターゲットの二次代謝産物の生産量が多くなるように最適化して行われることが好ましい。二次代謝産物の培養方法では,所定量の二次代謝産物が生産され,培養液に蓄積された時点で終了し,培養液から二次代謝産物を採取する。二次代謝産物の採取方法は,二次代謝産物の種類に応じて,公知の方法から適宜選択して行うことができる。-培養物-この発明は,異種微生物由来二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ,又はプラスミドで保持した放線菌を作製した放線菌を用いて複合培養を行い,培養液中に産生される二次代謝産物も含有するものである。この発明で得られる培養物は,この発明の製造方法において,所定量の二次代謝産物が産生され,培養液に蓄積された時点で,培養を終了して得られる培養液であることができる。又は,この培養液を更に加工や処理を施して,二次代謝産物含有物として利用することができる。次に,この発明を,実施例により更に詳細に説明をすると,次に記載する事項を参考にすることができる。ストレプトマイセスリビダンスへの異種放線菌由来の抗生物質生合成遺伝子クラスターの導入1.レベッカマイシン生合成遺伝子クラスターを含むシャトルベクターの作製1-1:材料試薬pTOYAMAcosの染色体DNA1-2:プラスミドの作製レベッカマイシン生産菌であるレチェバリエリアアエロコロニジェンの染色体をSau3AIにて部分消化し,pTOYAMAcosのマルチクローニングサイト内のBamHIへ挿入し,染色体コスミドライブラリーを作製した図1。Ngt遺伝子をプローブとし定法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い,レベッカマイシン生合成遺伝子クラスターを取得し,pTYMcos-rebをクローニングした図2,DDBJAccessionNumberAB071405。2.スタウロスポリン生合成遺伝子クラスターを含むシャトルベクターの作製2-1:材料試薬pTOYAMAcosストレプトマイセスエスピーTP-A0274の染色体DNA2-2:プラスミドの作製スタウロスポリン生産菌であるストレプトマイセスエスピーTP-A0274を前述のとおり部分消化し,コスミドライブラリーを作製した。rebD遺伝子をプローブとし,定法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い,スタウロスポリン生合成遺伝子クラスター全長図3を含むpTYMcos-Sta10及び未知の二次代謝生合成遺伝子クラスターを含むpTYMcos-Sta7をクローニングした図3,DDBJAccessionNumberAB071406。3.ゴードスポリン生合成遺伝子を含むシャトルベクターの作製3-1:材料試薬pTOYAMAcosストレプトマイセスエスピーTP-A0584の染色体DNA3-2:プラスミドの作製ゴードスポリン生産菌であるストレプトマイセスエスピーTP-A0584の染色体をSau3AIにて部分消化し,図1に示すpTOYAMAcosのマルチクローニングサイト内のBamHIへ挿入し,染色体コスミドライブラリーを作製した。godA遺伝子をプローブとして,定法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い,ゴードスポリン生合成遺伝子クラスターをを含むpGSBc1を構築した図4,DDBJAccessionNumberAB025012,非特許文献4参照。4遺伝子導入構築したプラスミドpTYMcos-reb,pTYMcos-Sta10,pTYMcos-Sta7,pGSBclを,プラスミド接合伝達性大腸菌エッシェリキアコリS17-1を用いてストレプトマイセスリビダンスの染色体上に組み込ませ,形質転換体を取得した大腸菌の形質転換,放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい。5異種放線菌由来の抗生物質生合成クラスター遺伝子による形質転換体を用いた複合誘導による抗生物質生産の増大異種放線菌由来の抗生物質生合成クラスター遺伝子を形質転換したストレプトマイセスリビダンスをV-22液体培地で30°C2日間振とう培養した。ツカムレラプルモニスTsukamurellapulmonis,ロドコッカスエリスロポリスRhodococcuserythropolisを培養した場合は,V-22液体培地0.1澱粉,0.5グルコース,0.3NZ-case,0.2酵母抽出物,0.5トリペプトン,0.3K2HPO4,0.5MgSO47H2O,0.3CaCO3,pH7.0で30°C,それぞれ2日間,一方,コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumを培養した場合は,V-22液体培地で30°C,1日間振とう培養した。A-3M培地0.5グルコース,2.0グリセロール,2.0澱粉,1.5ファーマメディア,0.3酵母抽出物,1.0HP-20,pH7.0に形質転換ストレプトマイセスリビダンスを3,ツカムレラプルモニスTsukamurellapulmonis,ロドコッカスエリスロポリスRhodococcuserythropolis,又はコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumはそれぞれ1植菌し,7日間30°Cで振とう培養した。培養液を等量のブタノールで抽出し,ブタノール層をロータリーエバポレータにて濃縮後,ジメチルスルホキシドにて溶解し,高速液体クロマトグラフィーにて解析を行った。その際,クロマトグラムのそれぞれの生産物ピーク面積を標品と比較して定量を行った。用いた評品はスタウロスポリン,レベッカマイシン,及び/又はゴードスポリンである。スタウロスポリン,レベッカマイシンは,ジメチルスルホキシドで10mg/mlの濃度に溶解し,HPLCにインジェクトした。スタウロスポリン,レベッカマイシンは市販品を使用した。ゴードスポリンは,非特許文献4に示す方法で精製した評品を,25mg/mlの濃度にジメチルスルホキシドで溶解し,HPLCにインジェクトした。HPLCHP1100,Agilentは,C18ReininカラムΦ4.6×100mmを使用し,カラム温度30°C,移動相には0.1H3PO4バッファーpH35およびアセトニトリルを用い,流速1.2ml/minで溶出した。溶出は0から3分まで15,3分から6分まで40までの勾配,6分から12分まで40,12分から19分まで55までの勾配,19分から22分まで85の勾配になるようにアセトニトリル濃度を調整して行った。スタウロスポリン及びレベッカマイシンの存在は290nmのUV吸収で検出し,ゴードスポリンの存在は230nmのUV吸収で検出した。高速液体クロマトグラフィー解析の結果,レベッカマイシン生合成遺伝子クラスターを組み込んだエスリビダンスは純粋培養時には1mg/Lの生産量であったのに対して,ツカムレラプルモニスTsukamurellapulmonis,ロドコッカスエリスロポリスRhodococcuserythropolisもしくはコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumと複合培養した時はそれぞれ,14mg/L,12mg/L,28mg/Lと最大28倍程度まで生産量が増大した。スタウロスポリン生産においてはスタウロスポリン生合成遺伝子クラスターpTYMcos-Sta10を組み込んだエスリビダンスは純粋培養時には19mg/Lの生産量であったのに対して,ツカムレラプルモニスTsukamurellapulmonis,ロドコッカスエリスロポリスRhodococcuserythropolis,又はコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumと複合培養した時はそれぞれ,78mg/L,70mg/L,103mg/Lと最大5倍程度まで生産量が増大した。ゴードスポリン生産においてはゴードスポリン生合成遺伝子クラスターを組み込んだエスリビダンスは純粋培養時には39mg/Lの生産量であったのに対して,ツカムレラプルモニスTsukamurellapulmonisもしくはロドコッカスエリスロポリスRhodococcuserythropolisと複合培養した時はそれぞれ,143mg/L,82mg/Lと最大3.5倍程度まで生産量が増大した。1異種放線菌由来の抗生物質生合成クラスター遺伝子による形質転換体を用いた複合誘導による新たな二次代謝産物の生産異種放線菌由来の抗生物質生合成クラスター遺伝子pTYMcos-Sta7を形質転換したストレプトマイセスリビダンスをV-22液体培地で30°Cで2日間振とう培養した。ツカムレラプルモニスは,V-22液体培地で30°Cで,それぞれ2日間振とう培養した。A-3M培地に形質転換ストレプトマイセスリビダンスを3,ツカムレラプルモニスを1植菌し,7日間にわたって30°Cで振とう培養した。培養液を等量のブタノールで抽出し,ブタノール層をロータリーエバポレータにて濃縮後,ジメチルスルホキシドにて溶解し,高速液体クロマトグラフィーにて解析を行った。その際,クロマトグラムのそれぞれの生産物ピークを形質転換ストレプトマイセスリビダンスの純粋培養時のピークと比較して定量を行った。HPLCHP1100,Agilentは,C18ReininカラムΦ4.6×100mmを使用し,カラム温度30°C,移動相には0.1H3PO4バッファーpH35およびアセトニトリルを用い,流速1.2ml/minで溶出した。溶出は,0分から3分まで15,3分から6分まで40までの勾配,6分から12分まで40,12分から19分まで55までの勾配,及び19分から22分まで85の勾配になるように,アセトニトリル濃度を調整して行った。二次代謝産物の存在は290nmのUV吸収で検出した。高速液体クロマトグラフィー解析の結果,図8に示すように,pTYMcos-Sta7を組み込んだエスリビダンスとツカムレラプルモニスと複合培養した時には10分,10.5分,13分にpTYMcos-Sta7を組み込んだエスリビダンスのみの純粋培養時には検出できなかったピークが検出できた。また,10分,10.5分,13分のピークに該当するUVスペクトルは図9に示してある。以上の3つのピークはUV吸収スペクトルよりpTYMcos-Sta7を組み込んだエスリビダンスとツカムレラプルモニスとを共培養した時にのみ新たに生産が確認できる二次代謝産物である。"