"キモトリプシンのナンバリングに基づいた30、73、89および155から選択される1つまたはそれ以上の位置に1個以上の突然変異を含み、それにより、該突然変異を含まないプロテアーゼと比較して基質特異性または活性が改変されている修飾セリンプロテアーゼまたはその触媒活性フラグメントであって、該プロテアーゼまたはその触媒活性フラグメントがセリンプロテアーゼのキモトリプシンファミリーのものである、修飾セリンプロテアーゼまたはその触媒活性フラグメント。プロテアーゼが修飾尿中プラスミノーゲンアクティベーターu-PAである、請求項1に記載の修飾プロテアーゼまたはその触媒活性フラグメント。キモトリプシンのナンバリングに基づいた21、24、30、38、39、61A、72、73、75、80、82、84、89、92、132、133、137、138、155、156、158、159、160、187および217の位置のいずれかに対応する位置にアミノ酸置換を含み、それにより、該アミノ酸置換を含まないu-PAポリペプチドと比較して基質特異性または活性が改変されている、飾尿中プラスミノーゲンアクティベーターu-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。アミノ酸置換が、キモトリプシンのナンバリングに基づいたu-PAポリペプチドのF21、I24、F30、V38、T39、Y61A、R72、L73、S75、E80、K82、E84、I89、K92、F132、G133、E137、I138、L155、K156、T158、V159、V160、K187、およびR217から選択されるアミノ酸残基である、請求項3に記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。F21V、I24L、F30I、F30V、F30L、F30T、F30G、F30M、V38D、T39A、Y61AH、R72G、L73A、L73P、S75P、E80G、K82E、E84K、I89V、K92E、F132L、G133D、E137G、I138T、L155P、L155V、L155M、K156Y、T158A、V159A、V160A、K187E、およびR217Cから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項3または4に記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。u-PAポリペプチドが配列番号433に示す野生型u-PAポリペプチドと80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99またはそれ以上の配列同一性を有し;そして該ポリペプチドが1つまたはそれ以上の修飾を有する、請求項2~5のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。アミノ酸修飾が配列番号433に示すu-PAポリペプチドにある、請求項1~5のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。VEGFR-2、またはその配列に対する基質特異性が改変されている、請求項3~7のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。キモトリプシンのナンバリングに基づいたV38D、F30I、F30T、F30L、F30V、F30G、F30M、R72G、L73A、L73P、S75P、I89V、F132L、G133D、E137G、I138T、L155P、L155V、L155M、V160A、およびR217Cから選択されるアミノ酸置換を含む、修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。u-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分がL73A/I89V;S75P/I89V/I138T;R72G/L155P;F132L/V160A;L73A/I89V/F30T;L73A/I89V/F30L;L73A/I89V/F30V;L73A/I89V/F30G;L73A/I89V/L155V;L73A/I89V/F30M;L73A/I89V/L155M;L73A/I89V/F30L/L155M;およびL73A/I89V/F30G/L155Mから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項3~9のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。配列番号434-459のいずれかに示すアミノ酸配列、または突然変異を含み、かつ触媒活性を有する連続アミノ酸のそのフラグメントを有する、請求項3~9のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。t-PA基質、またはその配列に対する基質特異性が改変されている、請求項3~7のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。キモトリプシンのナンバリングに基づいたF21V、I24L、F30V、F30L、T39A、Y61AH、E80G、K82E、E84K、I89V、K92E、K156T、T158A、V159A、およびK187Eから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項12に記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。u-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分がF30V/Y61AH;F30V/K82E;F30V/K156T;F30V/K82E/V159A;F30V/K82E/T39A/V159A;F30V/K82E/T158A/V159A;F30V/Y61AH/K92E;F30V/K82E/V159A/E80G/I89V/K187E;およびF30V/K82E/V159A/E80G/E84K/I89V/K187Eから選択されるアミノ酸置換を有する、請求項3~13のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。配列番号460-472のいずれかに示すアミノ酸配列、または突然変異を含み、かつ触媒活性を有する連続アミノ酸のそのフラグメントを有する、請求項3~14のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。キモトリプシンのナンバリングに基づいた23、52、60g、65、71、93、95、126、129、131、136、143、144、154、164、166、184a、201、209、230、234、および244から選択される位置に対応する位置にアミノ酸置換を含み、それにより、該アミノ酸置換を含まないMT-SP1ポリペプチドと比較して基質特異性または活性が改変されている、修飾マトリックスタイプセリンプロテアーゼIMT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性部分。アミノ酸置換がキモトリプシンのナンバリングに基づいたMT-SP1ポリペプチドのD23、L52、Y60g、T65、H71、F93、N95、A126、V129、P131、I136、H143、T144、I154、N164、T166、F184a、S201、Q209、R230、F234、およびV244から選択されるアミノ酸残基である、請求項16に記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性部分。D23E、L52M、Y60gs、H71R、F93L、N95K、A126T、V129D、P131S、I136T、I136V、H143R、T144I、I154V、N164D、T166A、F184aL、S201I、Q209L、R230W、F234L、およびV244Gから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項16または17に記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。さらにD23E、I41F、I41T、L52M、Y60gs、T65K、H71R、F93L、N95K、F97Y、F97L、T98P、F99L、A126T、V129D、P131S、I136T、I136V、H143R、T144I、I154V、N164D、T166A、L171F、P173S、Q175R、F184aL、Q192H、S201I、Q209L、D217V、Q221aL、R230W、F234L、およびV244Gから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項18に記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性部分がI136T/N164D/T166A/F184AL/D217V;I41F/A126T/V244G;D23E/I41F/T98P/T144I;I41F/L171F/V244G;H143R/Q175R;I41F/I154V/V244G;I141F/L52M/V129D/Q221AL;F97Y/I136V/Q192H/S201I;H71R/P131S/D217V;T65K/F93L/F97Y/D217V;I41T/P173S/Q209LおよびF97L/F234Lから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項16~19のいずれかに記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。キモトリプシンのナンバリングに基づいたT65K、F97Y、F97L、T98P、F99L、L171F、P173S、Q192H、およびQ221aLから選択される1個またはそれ以上のアミノ酸修飾を含み、それにより該突然変異を含まないMT-SP1ポリペプチドと比較して基質特異性または活性が改変されている、修飾マトリックスタイプセリンプロテアーゼIMT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性部分。さらにアミノ酸置換I41F、I41T、Q175RまたはD217Vを含む、請求項21に記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。アミノ酸置換がI41F/L171Fである、請求項22に記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。修飾が、配列番号253に示すアミノ酸配列を有するMT-SP1ポリペプチドにあるか、または配列番号505に示すアミノ酸配列を有するMT-SP1の触媒活性部分にある、請求項16~23のいずれかに記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。修飾がさらにキモトリプシンのナンバリングに基づいた配列番号253に示すMT-SP1ポリペプチドにおけるC122Sの改変に対応する改変を有するMT-SP1ポリペプチドにある、請求項1~24のいずれかに記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。修飾が配列番号507または517に示すアミノ酸配列を有するMT-SP1ポリペプチドにある、請求項25に記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。MT-SP1ポリペプチドが配列番号253に示す野生型MT-SP1ポリペプチドまたは配列番号505に示すその触媒活性部分と80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99またはそれ以上の配列同一性を示し;そして該ポリペプチドが1個またはそれ以上の修飾を含む、請求項16~26のいずれかに記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。修飾がC2補体タンパク質に対する特異性またはC2補体タンパク質に対する活性の一方または両方を高める、請求項16~27のいずれかに記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメント。配列番号568-609のいずれかに示すアミノ酸配列を有する、請求項16~28のいずれかに記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性部分。請求項1~29のいずれかに記載の修飾プロテアーゼまたはその触媒活性フラグメントを含む、医薬組成物。医薬上許容される賦形剤をさらに含む、請求項30に記載の医薬組成物。全身、経口、経鼻、経肺、限局的または局所的投与用に処方されている、請求項30または31に記載の医薬組成物。請求項30~32のいずれかに記載の医薬組成物、該組成物投与装置および所望による投与説明書を含む、キット。請求項1~29のいずれかに記載の修飾プロテアーゼまたはその触媒活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。請求項34に記載の核酸分子を含む、ベクター。請求項33に記載のベクターを含む、細胞。VEGFR-2が介在する疾患または状態の処置に使用するための、請求項8~11のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメントを含む医薬組成物。VEGFR-2が介在する疾患または状態の処置のための、請求項8~11のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメントを含む医薬組成物の使用。処置される疾患または状態が脈管形成疾患である、請求項37または38に記載の医薬組成物または使用。脈管形成疾患が癌、黄斑変性症、炎症、および糖尿病から選択される、請求項39に記載の医薬組成物または使用。さらに他の抗腫瘍剤を含む、請求項37~40のいずれかに記載の医薬組成物または使用。t-PAの投与により処置される疾患または状態の処置に使用するための、請求項12~15のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメントを含む、医薬組成物。t-PAにより処置される疾患または状態の処置のための、請求項12~15のいずれかに記載の修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性フラグメントを含む医薬組成物の使用。疾患または状態が、動脈血栓症、静脈血栓症および血栓性塞栓症、虚血性卒中、後天的凝固障害、汎発性血管内凝固症候群、細菌感染症および歯周炎、および神経学的状態から選択される、請求項42または43に記載の医薬組成物または使用。補体タンパク質C2が介在する疾患または状態の処置に使用するための、請求項16~29のいずれかに記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性部分を含む、医薬組成物。補体タンパク質C2が介在する疾患または状態の処置のための、請求項16~29のいずれかに記載の修飾MT-SP1ポリペプチドまたはその触媒活性部分を含む医薬組成物の使用。疾患または状態が、自己免疫疾患、敗血症、慢性関節リウマチRA、膜性増殖性糸球体腎炎MPGN、多発性硬化症MS、重症筋無力症MG、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体IC性急性炎症性組織損傷、アルツハイマー病AD、虚血-再灌流損傷、移植臓器の拒絶、黄斑変性、およびギラン-バレー症候群から選択される、請求項45または46に記載の医薬組成物または使用。虚血-再灌流損傷が、心筋梗塞MI、卒中、血管形成術、冠動脈バイパス移植、心肺バイパスCPBおよび血液透析から選択される事象または処置により誘発される、請求項47に記載の医薬組成物または使用。改善されたプロテアーゼ活性についてスクリーニングした場合、基質選択性が失われることが多く、逆もまた同様である。最適な治療用プロテアーゼは、標的基質についての高い特異性および高い触媒有効性を呈するべきである。最適化された特異性および最適化された活性を伴うプロテアーゼに関して利用可能な選択方法の有効性は限られているため、これらに代わるプロテアーゼ選択方法の開発が依然として要望されている。したがって、所望の基質特異性および活性をもつプロテアーゼまたは突然変異体プロテアーゼの選択方法を提供することも本発明の目的に含まれる。望ましいかまたは予め定められた基質特異性および活性をもつプロテアーゼまたは突然変異体プロテアーゼまたはその触媒活性部分の選択または同定方法を提供する。特に、本発明は、一標的基質または複数の同基質について改変、改善または最適化または他の点が改変された基質特異性および/または活性を有するプロテアーゼを同定するプロテアーゼスクリーニング方法を提供する。例えば、本発明方法は、疾患または障害の原因に関与する標的基質について改変された基質特異性および活性を有するプロテアーゼのスクリーニングに使用され得る。標的基質について改変、典型的には増強された特異性および/または活性により、本発明方法で同定または選択されたプロテアーゼは、標的基質が関与する疾患または状態の処置における試薬または治療薬としての使用に関する候補である。本発明方法を実践する場合、一コレクションのプロテアーゼまたはその触媒活性部分を、プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させることにより、プロテアーゼトラップポリペプチドとコレクション中のプロテアーゼまたはその触媒活性部分との安定した複合体を形成させる。若干の例では、プロテアーゼトラップポリペプチドに修飾を加えることにより、標的基質、例えば疾患または障害に関与する標的基質についての予め定められた基質特異性および/または活性を有するプロテアーゼにより開裂させる。さらに本方法は、標的基質の開裂配列に関する基質特異性についての複合体のスクリーニングを含み得る。上記の例では、同定または選択されたプロテアーゼは、標的基質に対して改変された活性および/または特異性を有する。一例では、プロテアーゼトラップポリペプチドと選択されたプロテアーゼの共有結合により安定した複合体が形成される。選択されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分は、本発明方法において複合体から同定または選択される。さらに本発明方法は、コレクション中の非複合体化プロテアーゼメンバーからの複合体化プロテアーゼの分離段階を含み得る。一例では、プロテアーゼトラップポリペプチドを検出または分離用に標識し、検出可能なプロテアーゼトラップポリペプチドおよびプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む複合体の捕捉により分離を実施する。懸濁液、溶液中、または固体支持体において捕捉を実施し得る。捕捉が固体支持体による場合、プロテアーゼトラップポリペプチドを固体支持体に結合させるが、この結合は、プロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションの接触前、接触中または接触後に実施され得る。固体支持体は、例えば96ウェルプレートの一ウェルを含み得る。若干の例では、プロテアーゼトラップポリペプチドをビオチンで標識する。他の例では、プロテアーゼトラップポリペプチドをHis標識で標識し得、金属キレート剤、例えば、限定するわけではないが、硫酸ニッケルNiSO4、塩化コバルトCoCl2、硫酸銅CuSO4および塩化銅ZnCl2での捕捉により分離を実施し得る。金属キレート剤は、固体支持体、例えばビーズ、例えばセファロースビーズまたは磁気ビーズにコンジュゲートされ得る。さらに本発明方法は、分離された複合体においてプロテアーゼまたはその触媒活性部分を増幅する段階を含み得る。若干の例では、分離複合体におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分をファージ上で表示し、宿主細胞をファージで感染させることにより増幅を実施する。宿主細胞には、細菌、例えば大腸菌Ecoliが含まれ得る。細菌細胞培地、細菌ペリプラズム、ファージ上清または精製タンパク質からの増幅したプロテアーゼは、標的基質に向かう特異性および/または活性についてスクリーニングされ得る。典型的には、標的基質は、疾患または障害の原因に関与するポリペプチドまたはポリペプチドにおける開裂配列である。本発明では、プロテアーゼのコレクションを複数の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドまたはその修飾形態と接触させる方法で、プロテアーゼトラップポリペプチドが、それぞれ同定可能な形で検出され得るように標識されているマルチプレックス方法を提供する。上記方法では、複数の安定した複合体が形成され得、複数のプロテアーゼが同定されるように少なくとも2種のプロテアーゼトラップポリペプチドが同定可能な形で標識されている。本発明において、本方法はまた、プロテアーゼ選択を最適化するために連続ラウンドのスクリーニングを含み、その方法では、本発明スクリーニング方法の第1ラウンドでの同定または選択後にプロテアーゼを増幅することにより、プロテアーゼまたはその触媒活性部分の第2コレクションを生成する。第2コレクションのプロテアーゼを、プロテアーゼトラップポリペプチド、すなわち第1のと同一または異なるプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させることにより、第2セットの安定複合体を生成する。第2セットの安定複合体におけるプロテアーゼが同定または選択される。本発明方法において、プロテアーゼトラップポリペプチドは、セルピン、アルファマクログロブリンファミリーの一員、またはp35ファミリーの一員である。本明細書記載の方法で使用している上記ポリペプチド分子は、プロテアーゼまたはその触媒活性部分とプロテアーゼトラップポリペプチドの共有結合により安定した複合体を形成する。本発明方法の一態様では、プロテアーゼおよび/またはプロテアーゼのタンパク質分解活性部分の一コレクションをプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させて、プロテアーゼトラップポリペプチドの開裂時にプロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼの安定した複合体を形成させることにより、所望の基質特異性を有するプロテアーゼが同定される。プロテアーゼトラップポリペプチド、またはその修飾形態は、所望の基質特異性を有するプロテアーゼにより開裂されることを目的として本方法で使用するために選択される。上記方法では、プロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を同定することにより、所望の基質特異性を有するプロテアーゼについて選択する。本発明方法で使用するプロテアーゼのコレクションは、プロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションでありさえすればよく、少なくとも、約または5、10、50、100、103、104、105、106と同等のメンバーそれ以上の異なるメンバーを含む。若干の態様では、プロテアーゼは、セリンおよび/またはシステインプロテアーゼである。本発明方法では、プロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションをプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させるために表示する。一例では、プロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を、固体支持体、細胞表面、または微生物の表面上で表示させる。プロテアーゼは、酵母、細菌、ウイルス、ファージ、核酸、mRNA分子、またはリボソーム上で表示され得る。プロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を微生物上で表示させる場合、微生物には、限定するわけではないが、大腸菌Ecoli、サッカロマイシスセレヴィシエScerevisiaeまたはウイルス、例えばM13、fd、またはT7ファージ、またはバキュロウイルスが含まれる。本発明方法では、プロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分はファージディスプレーライブラリー上で表示され、プロテアーゼコレクションはプロテアーゼファージディスプレーライブラリーである。実施態様によっては、プロテアーゼは、コレクションで、例えばディスプレーにより、完全長プロテアーゼのタンパク質加水分解活性部分として与えられる場合もある。若干の例では、プロテアーゼコレクションとプロテアーゼトラップポリペプチドの接触は均一混合物中で行われる。本発明では、少なくとも2種の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドを、コレクションと接触させ、ただしプロテアーゼトラップポリペプチドの1種のみを検出可能な形で標識しているプロテアーゼ選択方法を提供する。検出可能な形で標識されたプロテアーゼトラップポリペプチドは、検出可能なプロテアーゼトラップポリペプチドおよびプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む安定複合体の捕捉を可能にする。本方法の若干の例では、検出可能な形では標識されていない1種またはそれ以上の他のプロテアーゼトラップポリペプチドが、検出可能な形で標識されたプロテアーゼトラップポリペプチドと比べて反応物中に過剰に存在する。本方法において、標識は、それを検出させる標識であればよく、例えば蛍光標識またはエピトープ標識、例えばHis標識である。他の例では、検出可能な標識はビオチンである。本発明方法で選択を行うプロテアーゼのコレクションは、プロテアーゼのいかなるコレクションでもよい。若干の例では、プロテアーゼはセリンまたはシステインプロテアーゼである。プロテアーゼのコレクションは、セリンプロテアーゼのキモトリプシンおよびズブチリシンファミリーのメンバーまたはシステインプロテアーゼのパパインファミリーのカスパーゼからのメンバーであるコレクションを含む。プロテアーゼは表7に示したプロテアーゼまたはその触媒活性部分を全て包含する。若干の例では、プロテアーゼまたはその触媒活性部分は、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子u-PAプロテアーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子t-PAプロテアーゼまたはMT-SP1プロテアーゼのコレクションである。一態様において、本発明方法で使用するプロテアーゼトラップポリペプチドは、セルピン、p35ファミリーメンバー、アルファ-マクログロブリンファミリーメンバー、またはその修飾形態である。本発明方法で使用するプロテアーゼトラップポリペプチドには、限定するわけではないが、プラスミノーゲン阻害剤-1PAI-1、抗トロンビンAT3、またはアルファ2-マクログロブリン、またはその修飾形態がある。本発明方法で使用するプロテアーゼトラップポリペプチドの修飾形態には、アミノ酸置換、欠失、またはプロテアーゼトラップポリペプチドの反応部位での置換を含むものがある。若干の例では、修飾は、標的基質の開裂配列に対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸置換である。標的基質は、疾患または障害の原因に関与するタンパク質であり得る。標的基質の例には、限定するわけではないが、VEGFR、t-PA開裂配列または補体タンパク質がある。例えば、標的基質には、限定するわけではないが、VEGFR2または補体タンパク質C2がある。標的基質の開裂配列には、限定するわけではないが、配列番号389、479および498のいずれかに示したものが含まれる。若干の態様では、プロテアーゼトラップポリペプチドはセルピンであり、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、セルピンポリペプチドの反応部位ループで行われる。反応部位ループRSLにおける1つまたはそれ以上の置換には、P4-P2’位の1つまたはそれ以上におけるものがある。本発明方法で使用する上記セルピンの例は、配列番号497、499、610および611のいずれかに示されている。別の例では、プロテアーゼトラップポリペプチドは、アルファ2マクログロブリンであり、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換はポリペプチドのベイト領域にある。修飾プロテアーゼトラップポリペプチドに対して本発明方法で同定または選択されるプロテアーゼは、非標的基質と比較して標的基質に関して改変された基質特異性についてスクリーニングまたは選択され得る。上記の例では、非標的基質には、対応する鋳型プロテアーゼの基質が含まれる。典型的には、同定または選択されたプロテアーゼの基質特異性は、15倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍またはそれより大きい倍率で増強される。本発明方法は、反復的であるものを含み、所望の基質特異性を有するプロテアーゼについての同定および/または選択方法は、複数回反復または遂行される。上記方法では、複数の異なるプロテアーゼが、本方法の第一反復または第1ラウンドで同定され得る。他の例では、反復の第1ラウンドで選択される同定されたプロテアーゼに基づいた第1反復後に複数のプロテアーゼが生成および製造される。さらに、若干の例では、第1ラウンドまたは反復および/または連続ラウンドで同定される選択されたプロテアーゼのアミノ酸配列を比較することにより、ホットスポットを同定する。ホットスポットは、多ラウンドにおいて改変された座として認識される位置であり、本方法で使用する修飾プロテアーゼのコレクションから、例えば野生型または鋳型プロテアーゼと比較して、例えば少なくとも2、3、4、5またはそれ以上の同定されたプロテアーゼで見られる。また、本発明方法は、一プロテアーゼまたは複数のプロテアーゼを同定した後、プロテアーゼの第2コレクションを調製し、その場合、同定されたプロテアーゼを鋳型として用いて、第2コレクションのメンバーが同定されたプロテアーゼの突然変異およびさらなる突然変異を有するポリペプチドに基づくようにを含むようにプロテアーゼ配列またはその触媒活性部分にさらなる突然変異を導入するものとし、次いで最初の一プロテアーゼまたは複数のプロテアーゼの単離に使用したプロテアーゼトラップと同一または異なるプロテアーゼトラップポリペプチドと第2コレクションを接触させ、その場合、所望の基質特異性を有するプロテアーゼによって開裂されるようにプロテアーゼトラップに修飾を加えるものとし、次いで複合体におけるコレクションからプロテアーゼ複数も可またはプロテアーゼのタンパク質加水分解活性部分複数も可を同定するというさらなる段階を提供するものであり、その結果、同定されたプロテアーゼ複数も可は、最初に同定されたプロテアーゼよりも所望の基質に対して大きな活性または特異性を有することになる。第2コレクションは、同定された鋳型プロテアーゼ複数も可またはプロテアーゼのタンパク質加水分解活性部分のアミノ酸配列と異なりランダムまたはフォーカス突然変異を含み得る。フォーカス突然変異は、例えばホットスポット位置、セリンプロテアーゼ、例えばu-PAにおける、キモトリプシンのナンバリングに基づいた例えば30、73、89および155位を含む。本方法を実践する際、安定した複合体を形成させる反応は、1つまたはそれ以上のパラメーターを制御することによりモジュレーションされ得る。上記パラメーターは、反応の速度または程度または反応の効率を改変するもの、例えば限定するわけではないが、反応時間、温度、pH、イオン強度、ライブラリー濃度およびプロテアーゼトラップポリペプチド濃度である。反応は、プロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分間の反応の競争物質の存在下で実施され、それによって同定されたプロテアーゼ複数も可またはタンパク質加水分解活性部分複数も可の選択性が高められ得る。競争物質には、例えば血清または血漿、例えばヒト血清またはヒト血漿、細胞または組織抽出物、生物学的流体、例えば尿または血液、プロテアーゼトラップの精製または部分精製野生型形態または他の修飾形態がある。上記競争物質の典型例は、プロテアーゼトラップポリペプチドの精製または部分精製野生型形態またはプロテアーゼトラップポリペプチドの1種またはそれ以上の特異的変異型である。本発明は、少なくとも2つの開裂配列についての特異性/選択性および/または活性を有するプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を進化させるかまたは選択または同定する反復方法を提供する。これらの方法は、aプロテアーゼおよび/またはプロテアーゼのタンパク質加水分解活性部分のコレクションを、第1プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させることにより、プロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分によるプロテアーゼトラップポリペプチドの開裂時、コレクションにおけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分を伴うプロテアーゼトラップポリペプチドを含む安定した複合体を形成させ、ただし上記接触は競争物質の存在下で実施されるものとし、b第1プロテアーゼトラップポリペプチドとの複合体を形成するプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を同定または選択し、c第1プロテアーゼトラップポリペプチドとの複合体を形成するプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を、競争物質の存在下で第2プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させ、そしてd第1プロテアーゼトラップポリペプチドとの複合体を形成するプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を同定または選択する段階を含む。2つの開裂配列は、一標的基質にあるか、または2つの異なる標的基質にあり得る。同定、選択または進化させたプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分は、1つまたは2つの異なる標的基質における少なくとも2つの異なる開裂配列についての基質特異性および/または開裂活性を有する。第1および第2プロテアーゼトラップポリペプチドは同一または異なり得る。典型的には、本方法で使用する第1および第2プロテアーゼトラップポリペプチドは異なり、それぞれ異なる標的基質について予め定められた基質特異性を有するプロテアーゼによって開裂されるように修飾が加えられている。さらに本方法は、少なくとも2つの認識配列に対して所望の、または予め定められた基質特異性および開裂活性をもつプロテアーゼが単離されるまで、少なくともさらに1回反復段階aおよびbまたはa-dを含み得る。基質特異性および開裂活性は、典型的には鋳型プロテアーゼと比べて増強されている。本方法で使用する競争物質は、プロテアーゼトラップポリペプチドが相互作用し得る何かを含み、典型的には標的プロテアーゼより安定性は低い。競争物質には、限定するわけではないが、血清、血漿、ヒト血清またはヒト血漿、細胞または組織抽出物、生物学的流体、例えば尿または血液、プロテアーゼトラップの精製または部分精製野生型形態、およびプロテアーゼトラップポリペプチドの1つまたはそれ以上の特異的変異型がある。また、本発明は、aプロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分のコレクションを第1プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させることにより、プロテアーゼトラップポリペプチドの開裂時に、コレクションのプロテアーゼまたはその触媒活性部分とプロテアーゼトラップポリペプチドの共有結合複合体を形成させ、b非複合体形成プロテアーゼトラップポリペプチド複数も可から複合体形成プロテアーゼを分離し、c複合体形成プロテアーゼを単離または選択または同定し、d選択されたプロテアーゼに基づいてプロテアーゼまたはプロテアーゼのタンパク質分解活性部分の第2コレクションを形成し、さらにeプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分の第2コレクションを、第1プロテアーゼトラップポリペプチドとは異なる第2プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させて複合体を形成させ、複合体を分離し、複合体形成プロテアーゼを単離、選択または同定することにより段階a~cを反復する段階を含むプロテアーゼ選択方法を提供する。第1および第2プロテアーゼトラップポリペプチドは、2つの異なる標的基質認識配列を含むように修飾され得、その結果、同定または選択されたプロテアーゼは、少なくとも2つの認識配列に対し特異性および高い開裂活性を有することになる。これらの方法は複数回反復され得る。これらの方法では、プロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分のコレクションを、競争物質上記参照の存在下で第1および/または第2プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させ得る。本明細書に記載しているプロテアーゼ選択方法のいずれかにおいて、コレクションは修飾プロテアーゼを含み得る。プロテアーゼに対する修飾は、ポリペプチドの標的領域にランダムまたは集中して配置され得る。本発明はまた、プロテアーゼおよび/またはそのタンパク質分解活性部分のコレクションおよび少なくとも1つのプロテアーゼトラップポリペプチドを含む組合わせを提供する。成分は、別々に、または混合物として提供され得る。プロテアーゼトラップポリペプチドは、中でもセルピン、p35ファミリーメンバー、アルファ-マクログロブリンファミリーメンバー、それぞれの修飾形態およびその混合物を含む。プロテアーゼおよび/またはその触媒活性部分のコレクションは、溶液または懸濁液中または固相中で提供されるか、または他の形、例えば固体支持体マトリックス材料またはディスプレーライブラリー、例えば、限定するわけではないが、ファージディスプレーライブラリーで表示され得、その場合、メンバーは少なくともプロテアーゼのタンパク質分解活性部分を表示する。本願は、上記組合わせを含むキットを提供する。典型的には、キットは、パッケージされた成分を含み、所望により追加試薬および本方法の実施説明書を含んでいてもよい。また本願は、キモトリプシンのナンバリングに基づいた30、73、89および155から選択される1個またはそれ以上の残基を修飾することによる、セリンプロテアーゼ、例えばu-PAの基質特異性の修飾方法を提供する。また本願は、本発明方法により同定される修飾プロテアーゼを提供する。本発明で提供される修飾プロテアーゼは、同定された修飾により改変された基質特異性および/または活性を呈する。選択方法を用いて同定される本発明による修飾は、野生型プロテアーゼ、その対立遺伝子または種変異型で行われるものもあれば、プロテアーゼの他の変異型で行われるものもあり得る。さらに、本発明はまた、野生型プロテアーゼに対し80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99またはそれ以上の配列同一性を含む修飾プロテアーゼ、またはその対立遺伝子または種変異型を提供するが、ただし本方法で同定された修飾がそこに存在するものとする。上記プロテアーゼには、修飾プロテアーゼ、例えばキモトリプシンファミリーにおける修飾セリンプロテアーゼ、例えばキモトリプシンのナンバリングに基づいた30、73、89および155位から選択されるホットスポット位置に1つまたはそれ以上の突然変異を含むことによって、基質特異性が改変されている尿中プラスミノーゲン活性化因子u-PAポリペプチド、またはその触媒活性フラグメントがある。本発明はまた、疾患または障害の原因に関与する標的基質に向けた高い特異性および/または活性を呈する本発明方法で同定される修飾プラスミノーゲン活性化因子u-PAプロテアーゼを含む。上記標的基質には、限定するわけではないが、VEGFRまたは組織プラスミノーゲン活性化因子t-PA基質がある。したがって、本発明はまた、t-PA基質を開裂する修飾セリンプロテアーゼまたはその触媒活性部分を提供する。特に、上記プロテアーゼには、u-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分が、キモトリプシンのナンバリングに基づいた21、24、30、39、61A、80、82、84、89、92、156、158、159および187位から選択される位置に1つまたはそれ以上の修飾を含む修飾尿中プラスミノーゲン活性化因子u-PAポリペプチドがある。また本発明は、F21V、I24L、F30V、F30L、T39A、Y61AH、E80G、K82E、E84K、I89V、K92E、K156T、T158A、V159AおよびK187Eから選択される1つまたはそれ以上の突然変異を含む上記修飾u-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分を提供する。また本発明は、u-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分が、F30V/Y61aHF30V/K82EF30V/K156TF30V/K82E/V159AF30V/K82E/T39A/V159AF30V/K82E/T158A/V159AF30V/Y61aH/K92EF30V/K82E/V159A/E80G/I89V/K187EおよびF30V/K82E/V159A/E80G/E84K/I89V\K187Eから選択される2つまたはそれ以上の突然変異を含むこれらの修飾u-PAポリペプチドを提供する。また本発明は、VEGFR、特にVEGFR-2を開裂する修飾セリンプロテアーゼまたはその触媒活性部分を提供する。特に、u-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分が、キモトリプシンのナンバリングに基づいた38、72、73、75、132、133、137、138、155、160および217位から選択される位置に1つまたはそれ以上の修飾を含むことにより、VEGFR-2またはその配列に対する基質特異性が改変されている、修飾尿中プラスミノーゲン活性化因子u-PAポリペプチドおよびその触媒活性部分を提供する。また、V38D、R72G、L73A、L73P、S75P、F132L、G133D、E137G、I138T、L155P、L155V、L155M、V160AおよびR217Cから選択される1つまたはそれ以上の突然変異を含む上記ポリペプチドを提供する。さらにこれらのポリペプチドは、キモトリプシンのナンバリングに基づいた30位および/または89位での修飾、例えばF30I、F30T、F30L、F30V、F30G、F30MおよびI89Vから選択される修飾を含み得る。また、L73A/I89VL73PR217CL155PS75P/I89V/I138TE137GR72G/L155PG133DV160AV38DF132L/V160AL73A/I89V/F30TL73A/I89V/F30LL73A/I89V/F30VL73A/I89V/F30GL73A/I89V/L155V;L73A/I89V/F30ML73A/I89V/L155ML73A/I89V/F30L/L155MおよびL73A/I89V/F30G/L155Mから選択される1つまたはそれ以上の突然変異、および場合によっては2つまたはそれ以上の突然変異を含むこれらのu-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分を提供する。また本発明は、u-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分が、F30I、F30T、F30GおよびF30Mから選択される1つまたはそれ以上の突然変異を含む修飾u-PAポリペプチドを提供する。また本発明は、本発明方法により同定される修飾MT-SP1ポリペプチドを提供する。上記修飾ポリペプチドは、配列番号253に示したMT-SP1ポリペプチドにおいて、キモトリプシンのナンバリングに基づいたD23E、I41F、I41T、L52M、Y60gs、T56K、H71R、F93L、N95K、F97Y、F97L、T98P、F99L、A126T、V129D、P131S、I136T、I136V、H143R、T144I、I154V、N164D、T166A、L171F、P173S、F184aL、Q192H、S201I、Q209L、Q221aL、R230W、F234LおよびV244Gから選択される1つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含む。若干の例では、修飾は、配列番号505に示したアミノ酸配列を有するMT-SP1の触媒活性部分に存する。他の例では、修飾は、さらにキモトリプシンのナンバリングに基づく配列番号253に示したMT-SP1ポリペプチドにおけるC122Sの修飾に対応する修飾を含むMT-SP1ポリペプチド、例えば配列番号507または517に示したMT-SP1に存する。特に、本明細書で示した修飾には、I41F、F97Y、L171FおよびV244Gから選択されるものがある。さらに、本発明で提供する修飾MT-SP1ポリペプチドは、配列253に示したMT-SP1ポリペプチドにおけるQ175RまたはD217Vに対応する1つまたはそれ以上の修飾を含み得る。上記修飾には、I136T/N164D/T166A/F184AL/D217VI41FI41F/A126T/V244GD23E/I41F/T98P/T144II41F/L171F/V244GH143R/Q175RI41F/L171FR230WI41F/I154V/V244GI141F/L52M/V129D/Q221ALF99LF97Y/I136V/Q192H/S201IH71R/P131S/D217VD217VT65K/F93L/F97Y/D217VI41T/P173S/Q209LF97L/F234LQ175RN95KおよびY60GSから選択されるものがある。上記修飾MT-SP1ポリペプチドは、いずれもC2補体タンパク質についての特異性またはC2補体タンパク質に対する活性の一方または両方を増強する修飾を呈する。また本発明は、修飾セリンプロテアーゼを含む修飾プロテアーゼ、例えば修飾u-PAポリペプチドまたは修飾MT-SP1ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、医薬上許容される賦形剤を含み、限定するわけではないが、全身、経口、経鼻、経肺、限局的または局所的投与を含む適切な投与経路に対して処方され得る。また、医薬組成物のいずれか、組成物投与装置および所望による投与説明書を含むキットを提供する。本発明は、u-PAプロテアーゼおよびMT-SP1プロテアーゼおよびその触媒活性部分を含む修飾プロテアーゼをコード化する核酸分子を提供する。また、核酸分子を含むベクターおよび核酸分子またはベクターを含む細胞を提供する。本発明は、t-PAの投与により処置される疾患または状態、例えば、限定するわけではないが、動脈血栓症、静脈血栓症および血栓塞栓症、虚血性卒中、後天的凝固疾患、汎発性血管内凝固症候群、細菌感染症および歯周炎、および神経学的状態から選択される疾患または状態を呈する対象の処置方法であって、修飾u-PAプロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分またはそれらをコード化する核酸分子または細胞を含む医薬組成物を投与することによる方法を提供する。本方法は、核酸分子、細胞または医薬組成物を対象に投与することにより実践される。また本発明は、VEGFR、特にVEGFR-2が介在する疾患または状態を呈する対象の処置方法を提供する。上記疾患または状態には、限定するわけではないが、癌、脈管形成疾患、眼病、例えば黄斑変性、炎症性疾患および糖尿病、特にその合併症、例えば糖尿病性網膜症がある。本方法は、VEGFR-2についての非修飾形態と比べて高められた基質特異性を呈する修飾u-PAプロテアーゼを含むかまたはコード化する核酸分子または細胞または組成物を投与することにより行われる。本方法は、所望により疾患または状態を処置するための別の薬剤の投与、例えば疾患が癌である場合抗腫瘍剤の投与を含んでいてもよい。また本発明は、補体タンパク質、特にC2が介在する疾患または状態を呈する対象の処置方法を提供する。上記疾患および状態には、限定するわけではないが、慢性関節リウマチRA、膜性増殖性糸球体腎炎MPGN、多発性硬化症MS、重症筋無力症MG、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体IC性急性炎症性組織損傷、アルツハイマー病AD、虚血-再灌流損傷、およびギラン-バレー症候群がある。若干の例では、虚血-再灌流損傷は、例えば、限定するわけではないが、心筋梗塞MI、卒中、血管形成術、冠動脈バイパス移植、心肺バイパスCPBおよび血液透析といった事象または処置により誘発される。本方法は、C2についての特に非修飾形態と比べて増強された基質特異性を呈する修飾MT-SP1プロテアーゼを含むかまたはコード化する核酸分子または細胞または組成物を投与することにより実施される。場合によっては、疾患または状態が対象の処置により生じることもある。例えば、処置が補体介在虚血-再灌流損傷を誘発し得る。上記処置には、限定するわけではないが、血管形成術または冠動脈バイパス移植がある。上記の例では、修飾MT-SP1プロテアーゼを対象の処置前に投与する。修飾MT-SP1ポリペプチドは、体液または組織試料をインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させることにより投与され得る。本発明はまた、本発明方法で使用する修飾セルピンポリペプチドを提供する。上記修飾セルピンポリペプチドを、標的基質についての開裂配列を伴うP4-P2位に対応する位置でのその反応性部位ループで修飾する。典型的には、標的基質は、疾患または障害の原因に関与している。上記標的基質には、限定するわけではないが、VEGFR、補体タンパク質またはt-PA基質がある。例えば、標的基質は、VEGFR2および補体タンパク質C2を含む。本発明で提供する修飾セルピンの例は、修飾プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1PAI-1および抗トロンビン-3AT3である。典型的な修飾セルピンを、配列番号497、499、610および611のいずれかに示す。詳細な説明概略A.定義B.プロテアーゼのスクリーニング方法C.プロテアーゼトラップポリペプチド1.セルピン:構造、機能および発現2.プロテアーゼ触媒作用、セルピンの阻害性機構、およびアシル酵素中間体の形成a.具体例としてのセルピンiPAI-1ii抗トロンビンAT33.他のプロテアーゼトラップポリペプチドa.p35b.アルファマクログロブリンaM4.プロテアーゼトラップポリペプチド競争物質5.変異型プロテアーゼトラップポリペプチドD.プロテアーゼ1.候補プロテアーゼa.プロテアーゼの分類i.セリンプロテアーゼaウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子u-PAb組織プラスミノーゲン活性化因子t-PAcMT-SP1ii.システインプロテアーゼE.スクリーニング用の修飾プロテアーゼおよびコレクション1.変異型プロテアーゼの生成a.ランダム突然変異誘発b.フォーカス突然変異誘発2.変異型プロテアーゼのキメラ形態3.コンビナトリアルライブラリーおよび他のライブラリーa.ファージディスプレーライブラリーb.細胞表面ディスプレーライブラリーc.他のディスプレーライブラリーF.選択されたプロテアーゼの接触、単離および同定方法1.反復スクリーニング2.具体例としての選択されたプロテアーゼG.プロテアーゼ活性および特異性の評価方法H.プロテアーゼトラップポリペプチドすなわち、セルピンまたはその変異型またはプロテアーゼ/修飾プロテアーゼをコード化する核酸の製造方法1.ベクターおよび細胞2.発現a.原核生物細胞b.酵母細胞c.昆虫細胞d.哺乳類細胞e.植物3.精製技術4.融合タンパク質5.ヌクレオチド配列I.選択されたプロテアーゼポリペプチドの製造、処方および投与1.組成物および送達2.選択されたプロテアーゼのインビボ発現および遺伝子治療a.核酸の送達i.ベクター-エピソームおよび組込みii.人工染色体および他の非ウイルス性ベクター送達方法iii.リポソームおよび他の封入形態および核酸を含む細胞の投与b.インビトロおよびエクスビボ送達c.全身的、限局的および局所的送達2.併用療法3.製品およびキットJ.選択されたプロテアーゼポリペプチドによる具体的処置方法1.tPA標的を開裂する選択されたuPAポリペプチドについての具体的処置方法a.血栓性疾患および状態i.動脈血栓症ii.静脈血栓症および血栓塞栓症a虚血性卒中iii.後天的凝固疾患a汎発性血管内凝固症候群DICb細菌感染症および歯周炎b.他のtPA標的関連状態c.診断方法2.VEGFまたはVEGFR標的を開裂する選択されたプロテアーゼポリペプチドについての具体的処置方法a.脈管形成、癌および他の細胞周期依存的疾患または状態b.VEGFまたはVEGFRを開裂する選択されたプロテアーゼによる併用療法3.補体タンパク質標的を開裂する選択されたMT-SP1ポリペプチドについての具体的処置方法a.免疫介在炎症性疾患b.神経変性疾患c.心臓血管疾患K.実施例A.定義特に断らなければ、本明細書で使用している技術的および科学的用語は、本発明複数も可が属する技術分野の者が一般的に理解しているものと同じ意味を有する。本開示全体を通して引用されている全ての特許、特許出願、公開出願および出版物、Genbank配列、データベース、ウェブサイトおよび他の公的材料については、特に断らなければ、出典明示で援用する。本明細書記載の語について複数の定義がある事象では、この項の記載を優先する。URLまたは他の上記識別名またはアドレスについて言及する場合、上記識別名は変更され得、インターネット上の特定情報はすぐに移り変わり得るが、インターネットを検索することにより同等内容の情報を見出し得るものとする。それを参照すれば、上記情報の有効性および公衆への普及状態が判明する。本明細書で使用しているプロテアーゼトラップまたはプロテアーゼトラップポリペプチドは、プロテアーゼにより開裂される基質であり、プロテアーゼは実際の遷移状態を経て酵素複合体を形成するため、開裂時、プロテアーゼと安定した複合体を形成することによりプロテアーゼを捕え、その結果、プロテアーゼの活性を阻害し、それを捕捉することになる。すなわち、プロテアーゼトラップは、プロテアーゼの阻害剤である。プロテアーゼトラップは、開裂時、安定した複合体が形成されるようにプロテアーゼにより開裂されるアミノ酸残基を含むポリペプチドまたは分子である。複合体は十分安定しているため、未反応トラップまたはプロテアーゼとの相互作用の安定性が劣るトラップから複合体が分離され得る。プロテアーゼトラップは、プロテアーゼにより開裂され、開裂時、プロテアーゼと複合体を形成することにより、未反応トラップから反応したプロテアーゼまたは複合体を分離させ得るものであれば合成、修飾または天然の分子を全て包含する。上記プロテアーゼトラップの具体例は、セルピン、修飾セルピン、セルピンと類似した機構を呈する分子、例えば、p35、およびプロテアーゼにより開裂され、安定した複合体としてプロテアーゼを捕える他の分子、例えば、アルファ2マクログロブリンである。また、プロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分により開裂され、開裂時、プロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分と安定した複合体を形成する合成ポリペプチドもプロテアーゼトラップとして包含される。本明細書で使用しているセルピンは、プロテアーゼによる反応性部位の開裂後にプロテアーゼを阻害することにより、安定したアシル酵素中間体を形成させ、安定した共有結合複合体中にプロテアーゼを捕捉トラップする構造上関連したタンパク質の一群をいう。安定した共有結合複合体を形成することによりセルピン分子がプロテアーゼを阻害する限り、セルピンは対立遺伝子および種変異型および他の変異型を含むものとする。セルピンは、反応性部位ループRSLの少なくとも十分な部分を最小限含むことにより、プロテアーゼ阻害およびプロテアーゼとの安定した共有結合複合体の形成を促す完全長セルピンポリペプチドのアミノ酸の先端切除型または連続フラグメントも包含する。典型的なセルピンは、表2に示されており、そして/または配列番号1~38のいずれか1つに示されたアミノ酸配列、対立遺伝子変異型、またはその先端切除型部分を有する。本明細書で使用している突然変異体または変異型セルピンは、アミノ酸修飾、特にセルピンの反応性部位ループでの修飾を含むセルピンをいう。修飾は、Pn-P15-P14-P13P4-P3-P2-P1-P1-P2-P3Pn位に対応する1個またはそれ以上のアミノ酸の置き換え、欠失または置換であり得る。典型的には、セルピンは、野生型セルピンと比べて反応性部位ループの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。ほぼ通常、置換は、P4-P2位に対応する1個またはそれ以上のアミノ酸に存する。例えば、配列番号11に示した典型的なPAI-1セルピンの場合、配列番号11におけるアミノ酸366~370位に対応するP4-P1位VSARMが修飾され得る。実施例1は、RPVRMまたはPFGRSへのVSARMアミノ酸残基の修飾について記載している。本明細書で使用している容易に開裂できる結合とは、プロテアーゼにより開裂されるポリペプチドにおける結合をいい、基質の開裂配列におけるP1-P1位の間で形成される結合により示される。本明細書で使用している反応性部位とは、プロテアーゼにより開裂される標的基質の配列の部分をいう。典型的には、反応性部位は、容易に開裂できるP1-P1結合配列を含む。本明細書で使用している反応性部位ループRSL;反応性中心ループとも呼ばれる、RCLは、プロテアーゼ認識部位としての役割を果たし、一般にはプロテアーゼ特異性の単独または主要決定基を含むセルピン分子におけるアミノ酸の配列典型的には17~22連続アミノ酸をいう。RSL配列の開裂およびその立体配座変化は、安定した共有結合複合体におけるセルピン分子によるプロテアーゼの捕捉に関与している。本発明の目的の場合、セルピンのRLSループにおける1個またはそれ以上のアミノ酸は、目的標的タンパク質における開裂配列に対応するように修飾され得る。変異型RSL配列を含む上記修飾セルピンまたはその一部分は、基質特異性が改変されたプロテアーゼに関する選択に使用され得る。本明細書で使用している分配することは、セルピンが、安定したセルピン-プロテアーゼ複合体対開裂セルピン間に分配される過程をいう。セルピンにおける分配の理由は、セルピン表面全体に及ぶ開裂された反応性部位ループの大きな転位から生じる、阻害性経路の性質に関係している。プロテアーゼが阻害位置をとる前に解離するすなわち、酵素-セルピン複合体を脱アシル化する時間を有する場合、分配が行われる。したがって、所与のセルピン-プロテアーゼ相互作用の結果は、阻害性k4および基質k5経路間の分配比に左右され例えば図1に描かれている、阻害の化学量論により表わされるSI=1k5/k4。セルピン分子の大部分は複合体形成へ分配され、k5/k4は0に近づくため、良好な阻害剤は1の値を有する。しかしながら、RSLループが十分な速さでプロテアーゼ中に挿入されない場合、分配が起こり、反応は直接開裂産物に進む。本明細書で使用している触媒効率またはkcat/kmは、当業者によく知られている通りプロテアーゼが基質を開裂する際の効率の尺度であり、定常条件下で測定される。本明細書で使用している阻害の二次速度定数は、プロテアーゼと阻害剤の相互作用に関する速度定数をいう。一般的に、プロテアーゼと阻害剤、例えばプロテアーゼトラップ、例えばセルピンの相互作用は、各反応体、阻害剤およびプロテアーゼの濃度の積に比例する二次反応である。堅固な結合または不可逆的阻害剤またはプロテアーゼトラップによるプロテアーゼの阻害に関する二次速度定数は一定であり、酵素濃度と阻害剤濃度を掛けたとき、特定阻害剤による酵素不活化の速度が得られる。各プロテアーゼトラップおよび酵素対についての速度定数は、それらの相互作用を独特に反映する。二次反応として、二次速度定数の増加は、選択された修飾プロテアーゼと阻害剤間の相互作用が、非修飾プロテアーゼと阻害剤の相互作用と比べて速いことを意味する。すなわち、二次速度定数の変化は、反応の成分、プロテアーゼおよび/または阻害剤の間の相互作用の変化を反映している。プロテアーゼについてスクリーニングした場合、二次速度定数の増加は、プロテアーゼにおける選択された修飾が望ましいものであることを反映し得る。本明細書で使用しているアシル酵素中間体は、セリンプロテアーゼの触媒中心典型的には、キモトリプシンのナンバリングに基づいたSer195における基質および必須セリン間の触媒作用における第一段階中に形成される共有結合中間体をいう。この反応は以下の要領で進行する:セリン-OHが基質のP1位のカルボニル炭素を攻撃し、ヒスチジンの窒素がセリンの-OHからの水素を受け入れ、カルボニル酸素の二重結合から一電子対が酸素に移動する。この結果、負に荷電した四面体の中間体が生成される。基質のペプチド結合における窒素と炭素を結ぶ結合が破壊される。この結合を作る共有結合電子が移動してヒスチジンの水素を攻撃することにより、結合を破壊する。カルボニル酸素二重結合から先に移動した電子は、負の酸素から戻ることによって、再び結合を作り、共有結合アシル酵素中間体を形成する。アシル酵素中間体を水で加水分解することにより、脱アシル化が行われ、開裂した基質と遊離酵素が形成される。本明細書で使用しているプロテアーゼのコレクションは、少なくとも10種の異なるプロテアーゼおよび/またはそのタンパク質分解活性部分を含み、一般的には少なくとも50、100、500、1000、104、105またはそれ以上のメンバーを含むコレクションをいう。典型的には、コレクションにプロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分を含ませて、基質特異性についてのスクリーニングにかける。上記コレクションには、天然プロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分および/または修飾プロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分が含まれる。修飾には、プロテアーゼの長さに沿ったランダム突然変異および/またはターゲッティングまたは選択された領域における修飾すなわち、フォーカス突然変異がある。修飾は、組合わせ的であり得、特定の座または全座またはそのサブセットでの全アミノ酸の置換による順列を全て含み得る。上記コレクションは、プロテアーゼドメインのみを含む、完全長またはそれより短いプロテアーゼを含み得る。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼなどのプロテアーゼを全て包含し得る。コレクションのサイズおよび特定のコレクションは、使用者が決定する。他の実施態様では、コレクションが僅か2つのプロテアーゼしか含まない場合もあり得る。本明細書で使用しているコンビナトリアルコレクションまたはコンビナトリアルライブラリーは、出発鋳型プロテアーゼポリペプチド配列の配列に関してその配列中に独特で多様なアミノ酸突然変異を有するプロテアーゼポリペプチドのコレクションをいう。コレクションに表れる突然変異は、ポリペプチドの配列全体に及び得るか、またはポリペプチド配列の特定の一領域または複数領域に存在し得る。突然変異はランダムに誘発され得るか、または構造または機能情報に基づいて経験的または合理的に設計されたターゲット突然変異であり得る。本明細書で使用している鋳型プロテアーゼは、その突然変異誘発に使用されるアミノ酸の配列を有するプロテアーゼをいう。鋳型プロテアーゼは、野生型プロテアーゼ、またはその触媒活性部分の配列であり得るか、または変異型プロテアーゼ、またはその触媒活性部分の配列であり得、さらなる突然変異が導入される。例えば、本発明選択方法で同定される突然変異体プロテアーゼは、さらなる突然変異導入用の出発鋳型として使用され、選択の後続ラウンドで使用され得る。本明細書で使用しているランダム突然変異は、突然変異に関して重要視または偏向を伴わないポリペプチドの配列全体に及ぶ1つまたはそれ以上のアミノ酸変化の導入をいう。ランダム突然変異誘発は、例えばUV照射、化学的方法およびPCR法例、エラープローンPCRを含む当業者に公知の様々な技術により促進され得る。本明細書で使用しているフォーカス突然変異は、ポリペプチドの特定の一領域または複数領域または特定の一位置または複数位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸変化をいう。例えば、プロテアーゼの特異性結合ポケットにおけるアミノ酸のターゲット突然変異が誘発され得る。フォーカス突然変異誘発は、例えば、当業界で公知の標準組換え技術を用いる位置指定突然変異導入または多位置指定突然変異導入により実施され得る。本明細書で使用している、プロテアーゼトラップおよびプロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分間の安定複合体は、プロテアーゼトラップとの複合体を形成しなかったプロテアーゼすなわち、非複合体形成プロテアーゼから分離されるほど十分に安定している複合体をいう。上記複合体は、共有結合、イオン性および疎水性相互作用を含む安定した相互作用を介して形成され得るが、反応条件下で十分に安定しているため、単離するため複合体を分離するのに十分な時間複合体の状態を維持している。典型的には、例えばセルピンおよび開裂プロテアーゼ間における上記相互作用は、共有結合である。本明細書で使用しているホットスポットは、所望の新規基質配列に関して改善された活性および/または選択性を呈するプロテアーゼ選択から生じる多数の変異型において突然変異が導入される位置をいう。1つまたはそれ以上のホットスポットは、プロテアーゼ選択中に同定され得る。このため、上記位置は、プロテアーゼに関する特異性および/または選択性決定因子であることによって基質特異性の一因となるもので、また、他例えばキモトリプシンのナンバリングに基づいた、プロテアーゼファミリー、例えばセリンプロテアーゼファミリーまたは特定のプロテアーゼファミリーの複数メンバーにおいて対応する遺伝子座全体に及ぶ広範な特異性および/または選択性決定因子として発現し得る。本明細書で使用している基質特異性に関する所望の特異性は、予め定められたかまたは予め選択されたかまたは他の形でターゲッティングされる基質についての開裂特異性をいう。本明細書で使用している選択するまたはその文法的変形は、プロテアーゼトラップポリペプチドと複合体を形成しているプロテアーゼを選抜または選択することをいう。このため、本発明における目的の場合、選択するは、プロテアーゼトラップポリペプチドとの安定した複合体におけるその会合状態に基づいてプロテアーゼを抜き出すことである。一般的に、共有結合複合体の捕捉により選択は容易になり得、所望ならば、プロテアーゼを単離し得る。例えば、プロテアーゼトラップポリペプチドを、例えば予め定められたマーカー、標識または他の検出可能な部分で標識することにより、選択は容易となり、安定した複合体におけるその会合状態に基づいてプロテアーゼが同定され得る。本明細書で使用している同定するおよびその文法的変形は、安定した複合体におけるプロテアーゼを認識または識別することである。典型的には、本発明方法では、プロテアーゼは、プロテアーゼトラップポリペプチドとの安定した複合体におけるその会合状態により同定され、この同定は、例えば複合体で結合しているプロテアーゼの増幅すなわち、適切な宿主細胞での増殖、次いでDNA配列決定により達成され得る。本明細書で使用している、検出または分離のための標識は、分子、例えばプロテアーゼトラップポリペプチドが、検出可能な標識、例えば発蛍光団を随伴しているか、または例えば精製または単離または分離を目的として標識または他の部分を随伴していることを意味する。検出可能な形で標識されたは、分子、例えばプロテアーゼトラップポリペプチドが検出または分離するために標識されていることを指す。本明細書で使用している、プロテアーゼまたはプロテアーゼのタンパク質分解活性部分の増幅とは、プロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分の量が、例えば単離およびクローニングおよび発現を通して増大されていることを意味するか、または、プロテアーゼまたはタンパク質分解活性部分が微生物上で表示されている場合、微生物を適切な宿主中に導入し、表示されたプロテアーゼまたはタンパク質分解活性部分がさらに生産されるように生育または培養することを意味する。本明細書で使用している、反応混合物に関して均一なという場合、これは反応体が混合物として、例えば溶液または懸濁液として液相にあることを意味する。本明細書で使用している、プロテアーゼまたはプロテアーゼのタンパク質分解活性部分のコレクションが特定プロテアーゼに基づいているという場合、これは上記コレクションが、例えばランダムまたは位置指定突然変異導入または合理的設計または他の修正スキームまたはプロトコルにより特定プロテアーゼから誘導されてコレクションを形成していることを意味する。本明細書で使用している、t-PAに投与により処置される疾患または状態は、当業者がt-PAを投与する疾患または状態をいう。上記状態には、限定されるわけではないが、フィブリン溶解性状態、例えば動脈血栓症、静脈血栓症および血栓塞栓症、虚血性卒中、後天的凝固疾患、汎発性血管内凝固症候群およびその前駆症状、例えば細菌またはウイルス感染症、歯周炎および神経学的状態がある。本明細書で使用している、VEGFR-2が介在する疾患または状態は、病理または病因が複雑である。上記状態には、限定されるわけではないが、炎症性および血管形成状態、例えば癌、糖尿病性網膜症および眼病、例えば黄斑変性がある。本明細書で使用している、プロテアーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼは互換的に使用され、共有ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素を包含する。これらの名称は、チモーゲン形態およびその活性化1本、2本および多鎖形態を包含する。明確にするため、プロテアーゼと言えば、これらの形態を全て包含するものとする。プロテアーゼは、それらの活性部位の触媒活性および標的基質のペプチド結合の開裂機構により、例えばセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルティックプロテアーゼ、トレオニンおよびメタロ-プロテアーゼを包含する。本明細書で使用している、チモーゲンは、成熟開裂を含む、タンパク質加水分解開裂、例えば活性化開裂、および/または他のタンパク質複数も可および/または補因子複数も可との複合体形成により活性化されるプロテアーゼをいう。チモーゲンは、タンパク質分解酵素の不活性前駆体である。上記前駆体は一般に大きいが、活性形態より必ずしも大きいとは限らない。セリンプロテアーゼに関して述べると、チモーゲンは、触媒的および自触的開裂を含む特異的開裂により、または活性酵素を生成する活性化補因子の結合により活性酵素に変換される。すなわち、チモーゲンは、活性化因子の作用によりタンパク質分解酵素に変換される酵素的不活性タンパク質である。開裂は自触的に行われ得る。チモーゲンは、一般的に不活性であり、チモーゲンからのプロ領域の触媒的または自触的開裂により成熟活性ポリペプチドに変換され得る。本明細書で使用している、プロ領域、プロペプチドまたはプロ配列は、開裂されることにより成熟タンパク質を生じる領域またはセグメントをいう。これは、触媒機構を遮断することによって触媒性中間体の形成を阻止することによりすなわち、基質結合部位を化学立体的に閉塞させることにより酵素活性を抑制するべく機能するセグメントを含み得る。プロ領域は、成熟生物学的活性ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列であり、僅か数個のアミノ酸であり得るか、またはマルチドメイン構造であり得る。本明細書で使用している、活性化配列は、活性プロテアーゼを形成するための活性化開裂または成熟開裂に要求される部位であるチモーゲンにおけるアミノ酸配列をいう。活性化配列の開裂は、自触的または活性化パートナーにより触媒され得る。活性化開裂は、活性に必要とされる立体配座変化が起こる成熟開裂の一タイプである。これは古典的活性化経路であり、例えば、セリンプロテアーゼについては、開裂により、触媒機構の保存領域、例えば触媒性残基と相互作用する新たなN-末端が生じ、それにより活性に必要とされる立体配座の変化が誘導される。活性化の結果、プロテアーゼの多鎖形態が生成され得る。場合によっては、プロテアーゼの1本鎖形態が1本鎖としてタンパク質分解活性を呈し得ることもある。本明細書で使用している、ドメインは、分子の他の部分とは構造的および/または機能的に異なり、同定可能である分子、例えばタンパク質またはコード化する核酸の一部分をいう。本明細書で使用している、プロテアーゼドメインは、プロテアーゼの触媒活性部分である。プロテアーゼのプロテアーゼドメインと言えば、これらのタンパク質のいずれかの1本、2本および多鎖形態を指すものとする。タンパク質のプロテアーゼドメインは、例えばその触媒中心などのタンパク質分解活性に必要とされるそのタンパク質の必須特性を全て含む。本明細書で使用している、プロテアーゼの触媒活性部分またはタンパク質分解活性部分は、プロテアーゼドメイン、またはプロテアーゼ活性を保持しているそのフラグメントまたは一部分をいう。重要なことに、少なくともインビトロで、プロテアーゼの1本鎖形態およびその触媒性ドメインまたはタンパク質分解活性部分典型的にはC-末端切頂部分は、プロテアーゼ活性を呈する。本明細書で使用している、プロテアーゼドメインまたはプロテアーゼの触媒活性部分をコード化する核酸は、連続配列としてのプロテアーゼの他の近接部分ではなく、上記1本鎖プロテアーゼドメインまたはその活性部分のみをコード化する核酸をいう。本明細書で使用している、ポリペプチドが本質的にプロテアーゼドメインから成るという表現は、ポリペプチドのその部分のみがプロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分であることを意味する。ポリペプチドは、所望により追加的なアミノ酸の非プロテアーゼ由来の配列を含んでいてもよく、またそれが一般的である。本明細書で使用している、S1~S4は、基質のP1~P4残基についての結合部位を形成するアミノ酸残基をいう例、SchecterおよびBerger1967BiochemBiophysResCommun27:157-162参照。S1~S4はそれぞれ、非連続的であり得る1個、2個またはそれ以上の残基を含む。これらの部位には、容易に開裂できる結合と称される、N-末端認識部位からタンパク質分解部位まで連続番号を付けている。本明細書で使用している、P1~P4およびP1~P4は、S1~S4残基およびS1~S4残基とそれぞれ特異的に相互作用し、プロテアーゼにより開裂される基質ペプチドにおける残基をいう。P1~P4は、開裂部位のN-末端側における残基位置をいう。P1~P4は、開裂部位のC-末端側までの残基位置を指す。アミノ酸残基については、ポリペプチド基質のN末端からC末端まで標識付しているPi、、P3、P2、P1、P1、P2、P3、、Pj。それぞれの結合性サブサイトについても標識付しているSi、、S3、S2、S1、S1、S2、S3、、Sj。開裂は、P1とP1の間で触媒される。本明細書で使用している、結合ポケットは、基質上の特異的な一アミノ酸または複数アミノ酸と相互作用する一残基または複数残基をいう。特異性ポケットは、他よりも多くのエネルギーを与える結合ポケットである最も重要または優勢な結合ポケット。典型的には、結合段階は、触媒過程の誘発に必要な遷移状態の形成に先行する。S1~S4およびS1~S4アミノ酸は、基質配列結合ポケットを構成し、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質基質のそれぞれのP1~P4およびP1~P4アミノ酸との相互作用による基質認識を容易にする。プロテアーゼが基質と相互作用するか否かは、S1~S4およびS1~S4位におけるアミノ酸の相関関係によって決まる。S1、S2、S3、S4、S1、S2、S3およびS4サブサイトのいずれか1つまたはそれ以上におけるアミノ酸が、基質におけるP1、P2、P3、P4、P1、P2、P3およびP4部位のアミノ酸のいずれか1つまたはそれ以上と相互作用するかまたはそれを認識する場合、プロテアーゼは基質を開裂し得る。結合ポケットは、ペプチド結合の触媒作用および基質の開裂が達成されるように標的アミノ酸をプロテアーゼと配置している。例えば、セリンプロテアーゼは、典型的には基質におけるP4-P2部位を認識する。他のプロテアーゼは、P4-P2の範囲を超えて広範に認識し得る。本明細書で使用している、広範な基質特異性の一因となるアミノ酸とは、特異性ポケットに加えて開裂された活性部位における残基をいう。これらのアミノ酸は、プロテアーゼにおけるS1~S4、S1~S4残基を含む。本明細書で使用している、相互作用の二次部位は、開裂された活性部位の外側である。これらは、基質認識および触媒作用の一助となり得る。これらのアミノ酸は、基質との第2および第3殻相互作用の一助となり得るアミノ酸を含む。例えば、S1~S4の周囲のプロテアーゼの構造におけるループ。S1~S4アミノ酸は、基質においてP1~P4、P1~P4アミノ酸を配置させることにより、プロテアーゼの活性部位に容易に開裂できる結合を形成させる上である一定の役割を演じる。本明細書で使用している、プロテアーゼの活性部位は、基質の触媒作用が起こる基質結合部位をいう。活性部位の構造および化学的特性により、基質の認識および結合、それに続く基質における加水分解および容易に開裂できる結合の開裂が行われ得る。プロテアーゼの活性部位は、ペプチド開裂の触媒機構の一端を担うアミノ酸および基質配列認識の一端を担うアミノ酸、例えば広範な基質結合特異性の一助となるアミノ酸を含む。本明細書で使用している、セリンまたはシステインプロテアーゼの触媒性トライアッドまたは活性部位残基とは、セリンまたはシステインプロテアーゼの活性部位にあり、ペプチド開裂の触媒機構の一端を担うアミノ酸、典型的には3個のアミノ酸の組合わせをいう。一般的に、触媒性トライアッドは、セリンプロテアーゼに見出され、活性求核基および酸/塩基触媒を提供する。セリンプロテアーゼの触媒性トライアッドは、キモトリプシンでは、Asp102、His57およびSer195である、3個のアミノ酸を含む。これらの残基は、セリンプロテアーゼの触媒効率にとって決定的なものである。本明細書で使用している、基質認識部位または開裂配列は、プロテアーゼにより開裂される、プロテアーゼの活性部位により認識される配列をいう。典型的には、例えば、セリンプロテアーゼの場合、開裂配列は、基質におけるP1~P4およびP1~P4アミノ酸により構成され、開裂はP1位の後で起こる。典型的には、セリンプロテアーゼに関する開裂配列は、多くのプロテアーゼの広範な基質特異性と適合するように6残基長であるが、プロテアーゼしだいで長い場合も短い場合もあり得る。例えば、自触作用に要求されるMT-SP1の基質認識部位または開裂配列はRQARVVであり、この場合、RはP4位にあり、QはP3位にあり、AはP2位にあり、RはP1位にある。MT-SP1における開裂は、R位の後で起こり、配列VVGGが続く。本明細書で使用している、標的基質とは、プロテアーゼによりその基質認識部位が特異的に開裂される基質をいう。標的基質は、最小限開裂配列を構成するアミノ酸を含む。所望により、標的基質は、開裂配列および他のアミノ酸を含むペプチドを含む。プロテアーゼにより認識される開裂配列を含むものであれば、完全長タンパク質、対立遺伝子、変異型、イソ型またはそのいずれかの一部分は、そのプロテアーゼについての標的基質である。さらに、標的基質は、プロテアーゼによる基質の開裂に影響を及ぼさない追加的部分を含むペプチドまたはタンパク質を含む。例えば、標的基質は、蛍光性部分に化学的に結合された4アミノ酸ペプチドまたは完全長タンパク質を含む。本明細書で使用している、開裂とは、プロテアーゼによるペプチド結合の破壊をいう。プロテアーゼに関する開裂部位モチーフは、N-およびC-末端残基から容易に開裂できる結合までを含む非プライムおよびプライム側は、それぞれ、P3、P2、P1、P1、P2、P3として定義されるプロテアーゼに関する開裂部位を伴い、また開裂はP1とP1残基の間で起こる。典型的には、基質の開裂は、活性化開裂または阻害的開裂である。活性化開裂は、不活性形態から活性形態へのポリペプチドの開裂をいう。これは、例えば、チモーゲンの活性酵素への開裂、および/または前増殖因子から活性増殖因子への開裂を含む。例えば、MT-SP1は、RQARのP1~P4配列で標的基質を開裂することにより自己賦活し得る。活性化開裂もまた、タンパク質が、それ自体活性を有する1つまたはそれ以上のタンパク質に開裂される開裂である。例えば、活性化開裂は、その終結が、炎症を刺激し、抗原食作用を促し、細胞を直接溶解する多くのエフェクター分子の形成をもたらすタンパク質分解的開裂事象の不可逆的カスケードである補体系で起こる。本明細書で使用している、阻害的開裂は、機能的ではない1つまたはそれ以上の分解産物へのタンパク質の開裂である。阻害的開裂の結果、タンパク質の活性は減少または縮小する。典型的には、タンパク質の活性の縮小により、タンパク質が関与する経路または過程も縮小する。一例では、阻害的開裂である、1つまたはそれ以上の標的タンパク質、例えばVEGFRの開裂により、標的基質の1つまたはそれ以上の機能または活性の縮小または阻害が同時に起こる。例えば、VEGFRの開裂の場合、阻害され得る活性には、限定されるわけではないが、リガンド結合、キナーゼ活性または脈管形成活性、例えばインビボまたはインビトロでの脈管形成活性がある。阻害性であるため、開裂は、タンパク質の天然形態と比べて少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、999またはそれを超える割合で活性を低下させる。開裂が阻害性であるために要求されるタンパク質の開裂パーセントは、タンパク質間で変動するが、タンパク質の活性について検定することにより測定され得る。本明細書で使用している、プロテアーゼポリペプチドは、候補プロテアーゼ、または本明細書に記載しているその変異型プロテアーゼのいずれか1つに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本明細書で使用している、修飾プロテアーゼまたは突然変異タンパク質プロテアーゼは、野生型または鋳型プロテアーゼと異なり一次配列に1つまたはそれ以上の修飾を有するプロテアーゼポリペプチドタンパク質をいう。1つまたはそれ以上の突然変異は、1つまたはそれ以上のアミノ酸置き換え置換、挿入、欠失およびそれらの組合わせであり得る。修飾プロテアーゼポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上の修飾位置を有するものを包含する。修飾プロテアーゼは、完全長プロテアーゼであり得るか、または修飾プロテアーゼがタンパク質分解活性を示す限り、修飾完全長プロテアーゼのその触媒活性部分であり得る。一般的に、これらの突然変異は、1つまたはそれ以上の目的または予め定められた標的基質の開裂に関する野生型または鋳型プロテアーゼの特異性および活性を変化させる。プロテアーゼの基質特異性を改変する領域に修飾を含むことに加えて、修飾プロテアーゼはまた、プロテアーゼの基質特異性に必須のものではない領域に他の修飾を含むことを許容し得る。このため、修飾プロテアーゼは、典型的には、野生型またはスカホールドプロテアーゼのアミノ酸の対応する配列と60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99またはそれ以上の配列同一性を有する。修飾完全長プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼのその触媒活性部分は、融合自体がプロテアーゼの基質特異性を改変するものではない限り融合タンパク質であるプロテアーゼも包含し得る。本明細書で使用している、キモトリプシンのナンバリングは、配列番号391の成熟キモトリプシンポリペプチドのアミノ酸のナンバリングをいう。プロテアーゼドメインを含む、キモトリプシンファミリーすなわち、u-PA、t-PA、MT-SP1のプロテアーゼのアラインメントは、キモトリプシンで形成され得る。上記の場合、キモトリプシンのアミノ酸に対応するプロテアーゼのアミノ酸には、キモトリプシンアミノ酸のナンバリングが付されている。対応する位置は、当業者が操作するアラインメントを用いるかまたは多くの利用可能なアラインメントプログラム例えば、BLASTPを用いることによる、上記アラインメントにより決定され得る。対応する位置はまた、例えばタンパク質構造のコンピューターでシミュレーションしたアラインメントを用いることによる、構造アラインメントに基づき得る。ポリペプチドのアミノ酸が開示された配列におけるアミノ酸に対応するということは、標準アラインメントアルゴリズム、例えばGAPアルゴリズムを用いて同一性または相同性が最大となるようにしたこの場合保存されたアミノ酸を整列させる開示された配列とのポリペプチドのアラインメントで同定されたアミノ酸であることを意味する。例えば、成熟キモトリプシンポリペプチドとu-PAのアラインメントでは、配列番号191に示したu-PAの前駆体配列におけるアミノ酸C168が、成熟キモトリプシンポリペプチドのアミノ酸C1と並ぶ。すなわち、u-PAにおけるアミノ酸C168は、キモトリプシンのナンバリングに基づくC1でもある。キモトリプシンのナンバリング標準を用いると、配列番号191に示した前駆体u-PA配列におけるアミノ酸L244は、キモトリプシンのナンバリングに基づくL73と同じであり、I260は、キモトリプシンのナンバリングに基づくI89と同じである。別の例において、成熟キモトリプシンとMT-SP1のセリンプロテアーゼドメイン配列番号253のアミノ酸615~855に対応のアラインメントでは、MT-SP1における615位のVにはV16のキモトリプシンのナンバリングが与えられている。後続のアミノ酸もそれに準じてナンバリングされている。すなわち、完全長MT-SP1配列番号253のアミノ酸708位のFは、キモトリプシンのナンバリングに基づくF99に対応する。残基がプロテアーゼに存在するが、キモトリプシンには存在しない場合、アミノ酸残基には文字表示が付される。例えば、キモトリプシンのナンバリングに基づくアミノ酸60を伴うループの一部であるが、キモトリプシンとは異なりMT-SP1配列に挿入されているキモトリプシンにおける残基は、例えばAsp60bまたはArg60cと称される。本明細書で使用している、標的基質についての特異性とは、非標的基質とも称される別の基質と比べてプロテアーゼによる標的基質の開裂が優先されることをいう。特異性は、プロテアーゼの基質に対するその親和力および酵素の有効性の尺度である、二次速度定数または特異性定数kcat/Kmに反映されている。本明細書で使用している、開裂に関する特異性定数はkcat/Kmであり、式中、Kmはミカエリス-メントン定数半Vmaxでの[S]であり、Kcatは、Vmax/[Eγ]であり、Eγは最終酵素濃度である。パラメーターkcat、Kmおよびkcat/Kmは、基質濃度の逆数対基質開裂速度の逆数をグラフ化し、ラインウェバーバーク等式1/速度=Km/Vmax1/[S]1/Vmax;式中、Vmax=[Eγ]kcatに当てはめることにより計算され得る。様々な濃度の基質の存在下で経時的に開裂の増加速度を測定する方法を用いることにより、特異性定数が計算され得る。例えば、プロテアーゼによる開裂時に放出される蛍光性部分に基質を結合させる。異なる酵素濃度で開裂速度を測定することにより、特定プロテアーゼについてkcatが測定され得る。特異性定数を用いることにより、当業界での標準的方法、例えばポジショナルスキャンコンビナトリアルライブラリーPS-SCLを用いて、基質において同時に存するP1~P4アミノ酸に関するプロテアーゼのS1~S4ポケットの1つまたはそれ以上におけるアミノ酸の部位特異的優先性が測定され得る。さらに、特異性定数を用いることにより、別の基質に対する一標的基質についてのプロテアーゼの優先性も測定され得る。本明細書で使用している、基質特異性比は、特異性定数の比であり、2種またはそれ以上のプロテアーゼまたは2種またはそれ以上の基質に対する一プロテアーゼの特異性を比較するのに使用され得る。例えば、複数基質について競う場合のプロテアーゼまたは一基質について複数プロテアーゼを競わせる場合の基質特異性は、kcat/Kmを比較することにより比べられる。例えば、標的基質について2×106M-1/秒および非標的基質について2×104M-1/秒の特異性定数を有するプロテアーゼは、標的基質についての方の特異性が高い。上記による特異性定数を用いると、プロテアーゼは、標的プロテアーゼについて100の基質特異性を有する。本明細書で使用している、標的基質についての優先性は、基質特異性比として表わされ得る。優先性を反映する比の特定値は、基質と問題のプロテアーゼとの相関的な要素である。1より大きい基質特異性は、標的基質についての優先性を意味し、1未満の基質特異性は非標的基質についての優先性を意味する。一般的に、少なくともまたは約1の比は、プロテアーゼを候補治療薬とみなすのに十分な差異を反映している。本明細書で使用している、改変された特異性とは、出発野生型または鋳型プロテアーゼと比べた場合の修飾または選択されたプロテアーゼの基質特異性の変化をいう。一般的には、特異性の変化は、鋳型プロテアーゼの野生型基質本明細書では非標的基質と称すと比べた場合の標的基質についての修飾プロテアーゼの優先性における変化を反映するものである。典型的には、本明細書記載の修飾プロテアーゼまたは選択されたプロテアーゼは、鋳型プロテアーゼの基質特異性と比べた場合の標的タンパク質の1つまたはそれ以上の予め定められたかまたは目的開裂配列についての基質特異性の増加を呈する。例えば、標的基質対非標的基質に関して100の基質特異性比を有する修飾プロテアーゼまたは選択されたプロテアーゼは、10の基質特異性をもつスカホールドプロテアーゼと比べて10倍高い特異性を呈する。別の例では、01の基質特異性比と比べて1の同比を有する修飾プロテアーゼは、基質特異性の10倍増加を呈する。鋳型プロテアーゼと比べて高い特異性を呈するために、修飾プロテアーゼは、予め定められた標的基質の1つまたはそれ以上について15倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍またはそれより大きい基質特異性を有する。本明細書で使用している、選択性は、競合基質の混合物間から一標的基質を選択および開裂するプロテアーゼの能力についていう場合、特異性と互換的に使用され得る。他の1つまたはそれ以上の標的基質と比べて高い、一標的基質についてのプロテアーゼの選択性は、例えばプロテアーゼによる標的基質開裂の特異性定数を比較することにより測定され得る。例えば、プロテアーゼが標的基質について2×106M-1/秒および他の1つまたはそれ以上の標的基質について2×104M-1/秒の開裂特異性定数を有する場合、プロテアーゼは、前者の標的基質について高い選択性を示す。本明細書で使用している、活性とは、完全長完全タンパク質に随伴するポリペプチドまたはその一部分の機能的な一活性または複数活性をいう。機能的活性には、限定されるわけではないが、生物活性、触媒または酵素活性、抗原性抗ポリペプチド抗体への結合またはそれへの結合についてポリペプチドと競合する能力、免疫原性、マルチマー形成能、およびポリペプチドについての受容体またはリガンドへの特異結合能がある。本明細書で使用している、触媒活性または開裂活性は、選択された基質のタンパク質分解を検出するインビトロタンパク質分解検定法で評価されるプロテアーゼの活性をいう。開裂活性は、プロテアーゼの触媒有効性を評価することにより測定され得る。本明細書で使用している、標的基質に向かう活性とは、開裂活性および/または機能的活性、または標的基質に対するかまたはそれに向かうプロテアーゼの活性を反映する他の測定値をいう。開裂活性は、プロテアーゼの触媒有効性を評価することにより測定され得る。本発明の目的の場合、プロテアーゼが、プロテアーゼの存在しない場合と比べて、高い標的基質のタンパク質分解または開裂を呈するか、そして/または標的基質タンパク質の機能的活性をモジュレーションするすなわち、活性化または阻害する場合、活性は高められている。本明細書で使用している、セリンプロテアーゼまたはセリンエンドペプチダーゼは、酵素の活性中心におけるセリン残基の存在を特徴とする、ペプチダーゼの1種をいう。セリンプロテアーゼは、血液凝固、炎症および原核生物および真核生物での消化酵素を含め、身体における広範囲の機能に関与している。セリンプロテアーゼによる開裂機構は、セリンによる標的ペプチド結合の求核攻撃に基づいている。システイン、トレオニンまたはアスパラギン酸に伴う水分子または金属もまた、この役割を演じ得る。セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸の並んだ側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通する触媒性トライアッドを形成する。セリンプロテアーゼの活性部位はクレフトの形状をしており、そこにポリペプチド基質が結合している。セリンプロテアーゼの例には、配列番号433に示した尿中プラスミノーゲン活性化因子u-PAおよび配列番号253に示したMT-SP1、およびその触媒活性部分、例えば配列番号505に示したMT-SP1プロテアーゼドメインB鎖とも呼ばれるがある。本明細書で使用している、ヒトタンパク質とは、その対立遺伝子変異型およびその同類変異型を全て含む、ヒトゲノムに存在する核酸分子、例えばDNAによりコード化されるものである。修飾がヒトタンパク質の野生型または顕著な配列に基づくものであれば、タンパク質の変異型または修飾形もヒトタンパク質である。本明細書で使用している、天然α-アミノ酸の残基とは、ヒトにおけるその同族体mRNAコドンを伴う負荷tRNA分子の特異的認識によりタンパク質に組み込まれる、天然で見出される20のα-アミノ酸の残基である。本明細書で使用している、非天然アミノ酸とは、遺伝子によりコード化されていないアミノ酸をいう。本明細書で使用している、核酸とは、ペプチド核酸PNAおよびその混合物を含む、DNA、RNAおよびその類似体を包含する。核酸は、1本または2本鎖であり得る。所望により例えば検出可能な標識、例えば蛍光性または放射性標識で標識されていてもよいプローブまたはプライマーについていうとき、1本鎖分子が予測される。上記分子は、典型的にはそれらの標的が、ライブラリーのプローブ探索またはプライミングに際し統計的にユニークであるかまたは低コピー数典型的には5未満、一般的には3未満である長さを有する。一般的には、プローブまたはプライマーは、興味の対象である遺伝子と相補的であるかまたは同一である配列の少なくとも14、16または30の連続ヌクレオチドを含む。プローブおよびプライマーは、10、20、30、50、100またはそれ以上の核酸長であり得る。本明細書で使用している、ペプチドとは、2~40個のアミノ酸長であるポリペプチドをいう。本明細書で使用している、本明細書記載のアミノ酸の様々な配列に現れるアミノ酸は、それらの公知3文字または1文字省略形表1に従って識別される。様々な核酸フラグメントに現れるヌクレオチドは、当業界で常用されている標準1文字名称で示される。本明細書で使用している、アミノ酸とは、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは、2個またはそれ以上のアミノ酸を含む。本発明の目的の場合、アミノ酸は、20の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体すなわち、α炭素が側鎖を有するアミノ酸を包含する。本明細書で使用している、アミノ酸残基とは、そのペプチド結合にあるポリペプチドの化学的消化加水分解時に形成されるアミノ酸をいう。本明細書記載のアミノ酸残基は、L異性体形態であると予測される。D異性体形態であり、そう称される残基は、所望の機能的特性がポリペプチドにより保持されておりさえすれば、いずれのL-アミノ酸残基とも置換され得る。NH2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。COOHは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。JBiolChem、243:3552-35591969記載の標準ポリペプチド命名法、および採択された37CFR§§1821-1822にしたがって、アミノ酸残基に関する省略形を表1に示す。表1-対応表本明細書で式により表わされたアミノ酸残基配列は全て、アミノ末端からカルボキシル末端への慣用的方向で左から右への配向を有するものとする。さらに、アミノ酸残基の語は、対応表表1に列挙したアミノ酸および修飾および特異アミノ酸、例えば37CFR§§1821-1822で示されたもの出典明示で援用するを含むものとして広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始まりおよび終りのダッシュは、1個またはそれ以上のアミノ酸残基のさらなる配列、アミノ末端基、例えばNH2またはカルボキシル末端基、例えばCOOHへのペプチド結合を示すものとする。本明細書で使用している、天然アミノ酸とは、ポリペプチドに現れる20のL-アミノ酸をいう。本明細書で使用している、非天然アミノ酸とは、天然アミノ酸と類似した構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に修飾された有機化合物をいう。すなわち、非天然アミノ酸は、例えば20天然アミノ酸の以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を包含し、限定されるわけではないが、アミノ酸のD-アイソスターを含む。非天然アミノ酸の例は本明細書に記載されており、当業者には公知である。本明細書で使用しているイソキネティック混合物は、アミノ酸のモル比が、それらの記録された反応速度に基づいて調節されたものである例、Ostreshetal1994Biopolymers34:1681参照。本明細書で使用しているDNA構築物とは、天然では見出されない形で組み合わされたかまたは並列されたDNAのセグメントを含む1本または2本鎖、線状または環状DNA分子である。DNA構築物は、人為的操作の結果として存在し、遺伝子操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。本明細書で使用しているDNAセグメントは、特定の属性を有する大きなDNA分子の一部分である。例えば、特定ポリペプチドをコード化するDNAセグメントは、5から3方向に読み取られたとき、特定ポリペプチドのアミノ酸の配列をコード化する長いDNA分子の一部分、例えばプラスミドまたはプラスミドフラグメントである。本明細書で使用しているオーソログの語は、機能的対応物質である一つの種から得られるポリペプチドまたはタンパク質または異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質を意味する。オーソログ間の配列差異は種形成の結果である。本明細書で使用しているポリヌクレオチドの語は、5から3端へと読み取られたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の1本または2本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、RNAおよびDNAを含み、天然供給源から単離されるか、インビトロで合成されるか、または天然および合成分子の組合わせから製造され得る。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書ではヌクレオチド略してntまたは塩基対略してbpにより与えられている。ヌクレオチドの語は、前後関係が許す場合、1本および2本鎖分子に使用される。この語を2本鎖分子に適用するとき、それは長さ全体を示すのに用いられ、塩基対の語と同等内容であるものとする。2本鎖ポリヌクレオチドの2本鎖は、長さが僅かに異なり得、その端部が互い違いに切断され得ることは当業者であれば認めるところである。すなわち、2本鎖ポリヌクレオチド分子内のヌクレオチドが全て対合し得るわけではない。一般に、上記の不対端部が20ヌクレオチド長を超えることはない。本明細書で使用している、2タンパク質または核酸間の類似性とは、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列間の関連性をいう。類似性は、残基の配列およびそこに含まれる残基の同一性および/または相同性の度合いに基づき得る。タンパク質または核酸間の類似性の度合いを評価方法は、当業者には公知である。例えば、配列類似性を評価する一方法では、2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列を、配列間において最大レベルの同一性が得られるように並べる。同一性とは、アミノ酸またはヌクレオチド配列が不変である程度をいう。また、アミノ酸配列、およびある程度までのヌクレオチド配列のアラインメントには、アミノ酸またはヌクレオチドにおける同類差異および/または頻繁な置換が考慮され得る。同類差異は、関与残基の物理化学特性を保存しているものである。アラインメントは、グローバル全残基を含め配列の全長にわたって比較した配列のアラインメントまたはローカル最も類似した一領域または複数領域のみを含む配列の一部分のアラインメントであり得る。同一性それ自体は、当業界で認められた意味を有し、発表された技術を用いて計算され得る。例、ComputationalMolecularBiology,LeskAM編、オックスフォードユニバーシティープレス、ニューヨーク、1988;BiocomputingInformaticsandGenomeProjects、SmithDW編、アカデミックプレス、ニューヨーク、1993;ComputerAnalysisofSequenceData、PartI、GriffinAMおよびGriffinHG編、ヒュマナプレス、ニュージャージー、1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology、vonHeinjeG、アカデミックプレス、1987;およびSequenceAnalysisPrimer、GribskovMおよびDevereuxJ編、Mストックトンプレス、ニューヨーク、1991参照。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定する若干の方法が存在し、同一性の語は当業者には熟知されているCarilloHLiptonD、SIAMJAppliedMath48:10731988。本明細書で使用している相同的核酸および/またはアミノ酸配列に関してとは、25とほぼ同等またはそれを超える配列相同性、典型的には25、40、50、60、70、80、85、90または95と同等またはそれを超える配列相同性を意味する。必要ならば、正確なパーセンテージが明記され得る。本発明での目的の場合、特に断らなければ、相同性および同一性の語は互換的に使用されることが多い。一般に、相同性または同一性パーセンテージを測定するためには、最高次のマッチが得られるように配列を整列させる例、ComputationalMolecularBiology,LeskAM編、オックスフォードユニバーシティープレス、ニューヨーク、1988;BiocomputingInformaticsandGenomeProjects、SmithDW編、アカデミックプレス、ニューヨーク、1993;ComputerAnalysisofSequenceData、PartI、GriffinAMおよびGriffinHG編、ヒュマナプレス、ニュージャージー、1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology、vonHeinjeG、アカデミックプレス、1987;およびSequenceAnalysisPrimer、GribskovMおよびDevereuxJ編、Mストックトンプレス、ニューヨーク、1991;Carilloetal1988SIAMJAppliedMath48:1073参照。配列相同性によって、保存アミノ酸の数は、標準アラインメントアルゴリズムプログラムにより測定され、各供給者により確立されたデフォルトギャップペナルティーにより使用され得る。実質的に相同的な核酸分子は、典型的には興味の対象である核酸の全長に沿って中程度のストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシーでハイブリダイゼーションする。また、ハイブリダイゼーションしている核酸分子におけるコドンの代わりに変性コドンを含む核酸分子も考慮に入れられる。2分子が、少なくとも60、70、80、85、90、95、96、97、98または99の同一性または相同性を示すヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するか否かは、公知コンピューターアルゴリズム、例えば、Pearsonetal1988ProcNatlAcadSciUSA85:2444に示されたデフォルトパラメーターを用いる、FASTAプログラムなど他のプログラムには、GCGプログラムパッケージDevereuxJetal、NucleicAcidsResearch12I:3871984、BLASTP、BLASTN、FASTAAtschulSFetal、JMolecBiol215:4031990がある;GuidetoHugeComputers、MartinJBishop編、アカデミックプレス、サンディエゴ、1994およびCarilloetal1988SIAMJAppliedMath48:1073を用いて測定され得る。例えば、NationalCenterforBiotechnologyInformationデータベースのBLAST機能は、同一性の測定に使用され得る。他の市販または公的に利用可能なプログラムには、DNAStarMegAlignプログラムマディソン、ウィスコンシンおよびtheUniversityofWisconsinGeneticsComputerGroupUWGGapプログラムマディソン、ウィスコンシンがある。タンパク質および/または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えば、GAPコンピュータープログラム例、Needlemanetal1970JMolBiol48:443、SmithおよびWatermanにより改訂1981AdvApplMath2:482を用いて配列情報を比較することにより測定され得る。簡単に述べると、GAPプログラムは、類似している並列された記号すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、2配列の短い方の記号の合計数で割ったものとして類似性を定義する。GAPプログラムに関するデフォルトパラメーターは以下のものを含み得る:1単項比較マトリックス同一性については1および非同一性については0の値を含むおよびGribskovetal1986NuclAcidsRes14:6745の加重比較マトリックス、SchwartzおよびDayhoff編、ATLASOFPROTEINSEQUENCEANDSTRUCTURE、NationalBiomedicalResearchFoundation、353-358頁1979に記載;2各ギャップについて30のペナルティーおよび各ギャップにおける各記号について追加的010ペナルティー、および3エンドギャップについてペナルティー無し。したがって、本明細書で使用している同一性または相同性の語は、試験およびリファレンスポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を表す。本明細書で使用している、少なくとも~と90同一であるの語は、ポリペプチドのリファレンス核酸またはアミノ酸配列に対する90~9999の同一性パーセントをいう。90またはそれを超えるレベルでの同一性は、例証目的を想定すると、100アミノ酸の試験およびリファレンスポリペプチド長が比較されているという事実を示すものである。試験ポリペプチドにおけるアミノ酸の10すなわち、100のうち10以下が、リファレンスポリペプチドのそれとは異なっている。同様の比較が試験およびリファレンスポリヌクレオチド間でも実施され得る。上記差異は、ポリペプチドの全長にわたってランダムに分散した点突然変異として表わされ得るか、またはそれらは、最大許容範囲、例えば10/100アミノ酸差異約90同一性以下の様々な長さの1つまたはそれ以上の場所でクラスターを形成し得る。差異は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約85~90を超える相同性または同一性レベルの場合、結果は当然プログラムおよびギャップパラメーターセットには左右されない。かかる高レベルの同一性は、ソフトウェアに頼らずとも手技によるアラインメントにより容易に評価され得ることが多い。本明細書で使用している、並列された配列とは、相同性類似性および/または同一性を用いて、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列における対応位置を並列させていることをいう。典型的には、50またはそれを超える同一性での関連性を示す2つまたはそれ以上の配列を並列させる。配列の並列セットとは、対応位置で平行に整列させた2つまたはそれ以上の配列をいい、ゲノムDNA配列と並列させた、ESTおよび他のcDNAなどのRNAから誘導される並列配列を含み得る。本明細書で使用している、プライマーとは、適切な緩衝液中および適切な温度で適切な条件下例、4つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合剤、例えばDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在下において鋳型指定DNA合成の開始点として作用し得る核酸分子である。ある種の核酸分子でも、プローブおよびプライマーとしての役割を果たし得るものとする。しかしながら、プライマーは、伸長のための3ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、逆転写酵素RT-PCR、RNAPCR、LCR、マルチプレックスPCR、パンハンドルPCR、捕捉PCR、発現PCR、3および5RACE、insituPCR、ライゲーション伝達PCRおよび他の増幅プロトコルを含む様々な方法で使用され得る。本明細書で使用している、プライマー対とは、増幅例、PCRによるすべき配列の5端とハイブリダイゼーションする5上流プライマーおよび増幅すべき配列の3端の相補部分とハイブリダイゼーションする3下流プライマーを含むプライマーのセットをいう。本明細書で使用している、特異的にハイブリダイゼーションするとは、標的核酸分子への核酸分子例、オリゴヌクレオチドの相補的塩基対合によるアニーリングをいう。当業者であれば、特定分子の長さおよび組成などの特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすインビトロおよびインビボパラメーターを熟知しているはずである。インビトロハイブリダイゼーションと特に関連しているパラメーターには、さらにアニーリングおよび洗浄温度、緩衝液組成および塩濃度がある。高ストリンジェンシーでの非特異的結合核酸分子を除去するための典型的洗浄条件は、01×SSPE、01SDS、65°Cであり、中程度のストリンジェンシーでは、02×SSPE、01SDS、50°Cである。同等内容のストリンジェンシー条件は当業界では公知である。当業者であれば、容易にこれらのパラメーターを調節することにより、特定適用に適切な標的核酸分子への核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを達成できるはずである。本明細書で使用している、生成物と実質的に同一であるとは、興味の対象である特性がほとんど変わっていないため、実質的に同一である生成物がもとの生成物の代わりに用いられ得る程度まで十分に類似していることをいう。また、本明細書で使用している実質的に同一であるまたは類似したの語は、当業者が理解している前後関係により変化するものとする。本明細書で使用している、対立遺伝子変異型または対立遺伝子変異は、同一染色体遺伝子座を占める遺伝子の2つまたはそれ以上のオルターナティブ形態のいずれかをいう。対立遺伝子変異は、突然変異を通して自然発生し、母集団内に表現型多形をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントコード化されたポリペプチドでの変化が無いであり得るか、または改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化し得る。また、対立遺伝子変異型の語は、本明細書では遺伝子の対立遺伝子変異型によりコード化されるタンパク質を示すのに用いている。典型的には、遺伝子のリファレンス形態は、ある種の一母集団または単一リファレンスメンバーからのポリペプチドの野生型形態および/または優勢な形態をコード化する。一般に、種間における変異型を含む対立遺伝子変異型は、典型的には同一種からの野生型および/または優勢な形態と少なくとも80。90またはそれより大きいアミノ酸同一性を有する。同一性の程度は、遺伝子および比較が種間であるのか同一種内であるのかによって異なる。一般的に、同一種内対立遺伝子変異型は、ポリペプチドの野生型および/または優勢な形態との少なくとも約80、85、90または95またはそれを超える同一性、例えば野生型および/または優勢な形態との96、97、98、99またはそれより大きい同一性を有する。本明細書において対立遺伝子変異型といえば、総じて同一種のメンバー間におけるタンパク質の変異をいう。本明細書で使用している、対立遺伝子は、本明細書では対立遺伝子変異型と互換的に使用しており、遺伝子またはその一部分のオルターナティブ形態をいう。対立遺伝子は、同種染色体上の同じ遺伝子座または位置を占める。対象が2つの同一対立遺伝子を有するとき、対象はその遺伝子または対立遺伝子について同型接合であると言われる。対象が2つの異なる対立遺伝子を有するとき、対象は、その遺伝子について異型接合であると言われる。特異的遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチドまたは幾つかのヌクレオチドが互いに異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含み得る。遺伝子の対立遺伝子はまた、突然変異を含む遺伝子の一形態であり得る。本明細書で使用している、種変異型とは、マウスおよびヒトなどの種々の哺乳類種を含む異なる種間でのポリペプチドにおける変異型をいう。本明細書で使用しているスプライス変異型とは、複数タイプのmRNAをもたらすゲノムDNAの一次転写物の差示的プロセッシングにより生成される変異型をいう。本明細書で使用している修飾は、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子におけるヌクレオチドの配列の修飾に関するものであり、アミノ酸およびヌクレオチドのそれぞれの欠失、挿入および置換を含む。ポリペプチドの修飾方法は、例えば組換えDNA方法を用いることによる、当業者には常用的なものである。本明細書で使用しているペプチド模倣物は、特定ペプチドの生物活性形態の立体配座およびある種の立体化学的特徴を模倣する化合物である。一般に、ペプチド模倣物は、生物活性立体配座の喪失および結合破壊を招く可撓性などの化合物の望ましくない特性ではなく、ある種の望ましい特性を模倣するように設計されている。ペプチド模倣物は、望ましくない特性の一因となるある種の基または結合を生物学的等価体と置換することにより生物活性化合物から製造され得る。生物学的等価体は当業者には公知である。例えば、メチレンの生物学的等価体CH2Sは、エンケファリン類似体においてアミド置換基として使用されている例、Spatola1983ChemistryandBiochemistryofAminoAcidsPeptidesandProteins、Weinstein編、7巻、MarcelDekkerニューヨーク、267-357頁参照。経口投与され得るモルヒネは、ペプチドエンドルフィンのペプチド模倣物である化合物である。本発明での目的の場合、環状ペプチドは、1つまたはそれ以上のペプチド結合が模倣物により置換されているポリペプチドであるため、ペプチド模倣物に含まれる。本明細書で使用している、リファレンスポリペプチドで示された特定パーセンテージのアミノ酸を含むポリペプチドとは、そのパーセンテージがポリペプチドおよびリファレンスポリペプチド間で共有されている連続した同一アミノ酸の比率であることを意味する。例えば、147アミノ酸を列挙している配列番号XXに示されたアミノ酸の配列を有するリファレンスポリペプチドに示されたアミノ酸の70を含むイソ型とは、リファレンスポリペプチドが、配列番号XXのアミノ酸配列に示された少なくとも103の連続アミノ酸を含むことを意味する。本明細書で使用しているプロモーターの語は、RNAポリメラーゼの結合および転写の開始を誘導するDNA配列を含む遺伝子の一部分をいう。プロモーター配列は、必ずというわけではないが、普通遺伝子の5非コーディング領域で見出される。本明細書で使用している、単離または精製ポリペプチドまたはタンパク質またはその生物活性部分は、細胞物質またはタンパク質が由来する細胞または組織からの他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または化学的前駆体または化学合成される他の化学物質を実質的に含まない。純度の評価に当業者が使用する標準分析方法、例えば薄層クロマトグラフィーTLC、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーHPLCにより測定したところ容易に検出され得る不純物を含んでいないか、またはそれ以上精製しても酵素および生物活性などの物質の物理および化学特性が検出可能な形では改変されないと予測されるほど十分に純粋であると思われる場合、調製物は実質的に不純物不含有であると判断され得る。実質的化学的純粋化合物を製造するための化合物の精製方法は、当業者には公知である。しかしながら、実質的化学的純粋化合物は、立体異性体の混合物であり得る。そのような場合、さらに精製することにより、化合物の比活性が高められ得る。細胞物質を実質的に含まないの語は、タンパク質が単離されるかまたは組換え技法により生産される細胞の細胞性成分から上記タンパク質が分離されているタンパク質調製物をいう。一実施態様において、細胞物質を実質的に含まないの語は、約30未満乾燥重量にしての非プロテアーゼタンパク質本明細書では混入タンパク質とも称す、一般的には約20未満の非プロテアーゼタンパク質または10の非プロテアーゼタンパク質または約5未満の割合で非プロテアーゼタンパク質を有する調製物を包含する。プロテアーゼタンパク質またはその活性部分を遺伝子組み換え的に製造するとき、それは培養培地も実質的に含まない、すなわち、培養培地は、プロテアーゼタンパク質調製物の体積の約20またはそれ未満、10または5を占める。本明細書で使用している化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないの語は、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質からタンパク質が分離されているプロテアーゼタンパク質の調製物を包含する。この語は、約30乾燥重量にして未満、20、10、5またはそれ未満の割合で化学的前駆体または非プロテアーゼ化学物質または成分を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を包含する。本明細書で使用している、例えば合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関する合成のとは、組換え技法および/または化学合成方法により製造される核酸分子またはポリペプチド分子の場合をいう。本明細書で使用している、組換えDNA方法を用いることによる組換え技法による製造とは、クローン化DNAによりコード化されるタンパク質を発現させる公知分子生物学方法の使用を意味する。本明細書で使用している、ベクターまたはプラスミドは、異種核酸を細胞へ導入してそれを発現または複製させるのに使用される独立要素をいう。ベクターは、典型的にはエピソームのままであるが、ゲノム染色体への遺伝子またはその一部分の組み込みを行うように設計され得る。また、人工染色体、例えば酵母人工染色体および哺乳類人工染色体であるベクターも考えられる。上記ベクターの選択および使用は当業者には公知である。本明細書で使用している、発現ベクターは、DNAフラグメントの発現を実行させ得るプロモーター領域などの調節配列と機能し得るように結合されているDNAを発現させ得るベクターを包含する。上記の追加的セグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含み得、所望により1つまたはそれ以上の複製起点、1つまたはそれ以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般的にプラスミドまたはウイルス性DNAから誘導されるか、または両方の要素を含み得る。すなわち、発現ベクターとは、適切な宿主細胞への導入後、クローン化DNAの発現をもたらす組換えDNAまたはRNA構築物、例えばプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターをいう。適切な発現ベクターは、当業者には公知であり、真核生物細胞および/または原核生物細胞で複製可能なものおよびエピソームのままのものまたは宿主細胞ゲノムへ組み込まれるものを包含する。本明細書で使用しているベクターはまた、ウイルスベクターまたはウイルス性ベクターを包含する。ウイルス性ベクターは、外生遺伝子に機能し得るように結合されることにより、細胞中へ遺伝子をベクターまたはシャトルとして移入する遺伝子工学的ウイルスである。本明細書で使用しているアデノウイルスは、ヒトにおいて結膜炎および上気道感染症を誘発するDNA含有ウイルスの一群のいずれかを指す。本明細書で使用している裸のDNAとは、ワクチンおよび遺伝子治療に使用され得るヒストン不含有DNAをいう。裸のDNAは、形質転換と呼ばれる遺伝子導入過程中に細胞から細胞へ通される遺伝物質である。形質転換では、精製または裸のDNAが受容細胞に取り込まれ、受容細胞に新しい特性または表現型を与える。本明細書で使用している、DNAセグメントについて機能し得るようにまたは作動し得るように結合されているとは、セグメントが意図された目的に調和して機能するように、例えばプロモーターで転写が開始し、コーディングセグメントからターミネーターへと進行するように、それらが配置されていることを意味する。本明細書で使用している、タンパク質結合配列とは、総じて他のタンパク質またはペプチド配列、一群のタンパク質またはペプチド配列または特定タンパク質またはペプチド配列に特異的に結合し得るタンパク質またはペプチド配列をいう。本明細書で使用している、エピトープ標識とは、後続のエピトープ標識タンパク質またはペプチドの生化学的および免疫学的分析をし易くするエピトープに対応するアミノ酸残基の短い伸長部をいう。エピトープ標識は、適切な発現ベクターにおいてエピトープ標識の配列をタンパク質コード化配列に付加することにより達成される。エピトープ標識タンパク質は、標識に対して産生した高特異的抗体を用いてアフィニティー精製され得る。本明細書で使用している、金属結合配列とは、総じて金属イオン、一群の金属イオンまたは特定金属イオンに特異的に結合し得るタンパク質またはペプチド配列をいう。本明細書で使用している、評価することとは、試料中に存在するプロテアーゼまたはそのドメインの活性に関する絶対値を得、活性のレベルを示す指数、割合、パーセンテージ、視覚的または他の値を得るという意味で定量的および定性的測定を包含するものとする。評価は直接的または間接的であり得、実際に検出される化学種は、勿論タンパク質分解産物そのものである必要はないが、例えばその誘導体またはさらに別の物質であり得る。例えばSDS-PAGEおよびクーマシーブルーでのタンパク質染色による、補体タンパク質の開裂産物の検出など。本明細書で使用している、生物活性とは、化合物のインビボ活性または化合物、組成物または他の混合物のインビボ投与時に生じる生理学的応答をいう。すなわち、生物活性は、上記化合物、組成物および混合物の治療効果および医薬活性を包含する。生物活性は、上記活性を試験または使用するように設計されたインビトロ系で観察され得る。すなわち、本発明の目的の場合、プロテアーゼの生物活性は、ポリペプチドが加水分解される際のその触媒活性である。本明細書で使用している、核酸の2配列に関する場合の同等のとは、問題の2配列がアミノ酸または同等内容のタンパク質の同一配列をコード化することをいう。2つのタンパク質またはペプチドに関して同等のを用いるとき、2つのタンパク質またはペプチドが、タンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に改変することのないアミノ酸置換のみを含む、実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。同等のを特性に関して用いるとき、その特性は同程度まで存在する必要はないが例、2つのペプチドは、同じタイプではあるが、異なる速度の酵素活性を呈し得る、活性は通常実質的に同じである。2つのヌクレオチド配列に関して相補的という場合、ヌクレオチドの2配列が、典型的には対向するヌクレオチド間において25未満、15または5の誤対合でハイブリダイゼーションし得ることを意味する。必要ならば、相補性のパーセンテージを特定する。典型的には、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションするように2分子を選択する。本明細書で使用している、タンパク質の活性または遺伝子または核酸の発現をモジュレーションする作用物質とは、タンパク質の活性を減じるかまたは高めるかまたは他の形で改変するか、または何らかの方法で細胞における核酸の発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションまたは他の形で改変するものである。本明細書で使用している医薬効果または治療効果とは、疾患または障害の処置またはその症状の改善を目的とした作用物質の投与時に観察される効果をいう。本明細書で使用しているモジュレーションするおよびモジュレーションまたは改変するとは、分子、例えばタンパク質の活性の変化をさす。活性の例には、限定されるわけではないが、シグナル変換などの生物活性がある。モジュレーションは、活性の増加すなわち、アップレギュレーションまたはアゴニスト活性、活性の減少すなわち、ダウンレギュレーションまたは阻害または活性の他の改変例えば周期性、頻度、持続時間、速度論または他のパラメーターの変化を含み得る。モジュレーションは状況に左右され得、典型的にはモジュレーションは、定められた状態、例えば野生型タンパク質、構成的状態のタンパク質または指定された細胞型または状態で発現されるタンパク質と比較される。本明細書で使用している阻害するおよび阻害とは、阻害されていない活性に対する活性の低下をいう。本明細書で使用している組成物とはあらゆる混合物をいう。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの組合わせであり得る。本明細書で使用している組合わせとは、2つまたはそれ以上のアイテム間での配合をいう。組合わせは、2つまたはそれ以上の個別アイテム、例えば2組成物または2コレクションであり得、その混合物、例えば2つまたはそれ以上のアイテムの単一混合物、またはその変形であり得る。組合わせの成分は、一般的に機能的に結合または関連したものである。キットは、所望によりその組合わせまたは成分の使用説明書を含んでいてもよいパッケージされた組合わせである。本明細書で使用している疾患または障害とは、限定されるわけではないが、感染、後天的状態、遺伝的状態を含む原因または状態から生じ、識別可能な症状を特徴とする、生物体における病理学的状態をいう。本発明において興味の対象である疾患または障害は、補体活性化が介在するものおよび補体活性化が病理または病因においてある一定の役割を演じているものを含む、補体活性化を伴うものである。疾患および障害はまた、免疫不全症などのタンパク質の欠如により誘発されるものも含むが、本発明において興味の対象であるのは、補体タンパク質の欠損故に補体活性化が起こらない障害である。本明細書で使用している、疾患または状態を発現する対象を処置するとは、対象の症状が部分的または全体的に軽減されるか、または処置後に静態のままであることを意味する。このため、処置は、予防、治療および/または治癒を包含する。予防とは、潜在的な疾患の予防および/または症状の悪化または病気の進行の阻止をいう。処置はまた、修飾インターフェロンの医薬的使用およびそれで提供される組成物を包含する。本明細書で使用している治療剤、治療プログラム、放射線防護薬、または化学療法は、ワクチンを含む慣用的薬剤および薬物療法を意味し、当業者には周知である。放射線治療剤は、当業界では周知である。本明細書で使用している処置は、状態、障害または疾患または他の適応症の症状を改善させるかまたは他に有利な形で改変させる方法を意味する。本明細書で使用している治療効果とは、疾患または状態の症状を改変する、典型的には改善または改良するかまたは疾患または状態を治癒させる、対象の処置から生じる効果を意味する。治療有効量とは、対象への投与後に治療効果をもたらす組成物、分子または化合物の量をいう。本明細書で使用している対象の語は、哺乳類、例えばヒトを含む動物をいう。本明細書で使用している患者とは、ヒト対象をいう。本明細書で使用している、処置、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による特定疾患または障害の症状の改善とは、恒久的または一時的、永続的または一過性にせよ、組成物または治療薬の投与に起因するかまたは随伴し得る症状の低減化をいう。本明細書で使用している、防止または予防とは、疾患または状態を発現する危険性を減らす方法をいう。本明細書で使用している有効量は、疾患または状態の症状を予防、治癒、改善、阻止または部分的に止めるのに必要な治療剤の量である。本明細書で使用している、プロテアーゼ、例えば修飾プロテアーゼの投与とは、プロテアーゼをその基質と接触させる方法をいう。投与は、インビボまたはエクスビボまたはインビトロで実施され得る。例えば、エクスビボ投与については、血液などの体液を対象から除去し、体外で修飾非補体プロテアーゼと接触させる。インビボ投与については、例えば限局的、局所的、全身的および/または他の導入経路により修飾プロテアーゼを体内へ導入し得る。インビトロ投与は、細胞培養方法などの方法を包含する。本明細書で使用している、単位用量形態とは、当業界では公知のとおり、ヒトおよび動物対象に適切な物理的に分離された単位をいい、個々にパッケージされている。本明細書で使用している、単用量処方物とは、直接投与用処方物をいう。本明細書で使用している、製品は製造および販売される生成物である。本願全体で使用しているように、この語は、パッケージ製品に含まれた修飾プロテアーゼポリペプチドおよび核酸を包含するものとする。本明細書で使用している、流体とは、流動し得る組成物をいう。すなわち、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他の上記組成物の形態である組成物を包含する。本明細書で使用している、キットは、本明細書記載の修飾プロテアーゼポリペプチドまたは核酸分子、および限定されるわけではないが、投与、診断および生物活性または特性の評価を含む目的に適う別のアイテムの組合わせをいう。キットは、所望により使用説明書を含んでいてもよい。本明細書で使用している細胞抽出物またはライゼートは、溶解または破壊された細胞から調製される調製物または画分をいう。本明細書で使用している動物と言えば、限定されるわけではないが、ヒト、ゴリラおよびサルなどを含む霊長類、マウスおよびラットなどのげっ歯動物、ニワトリなどの家禽、ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物、ヒツジ様動物、例えばブタおよび他の動物を含め、あらゆる動物を包含する。ヒト以外の動物については、考えられる動物としてヒトを除外する。本発明プロテアーゼは、供給源である動物、植物、原核生物および真菌に由来する。ほとんどのプロテアーゼは哺乳類を含む動物由来のものである。本明細書で使用している対照とは、それが試験パラメーターで処理されていないことを除き、試験試料と実質的に同一である試料をいい、またはそれが血漿試料である場合には、興味の対象である状態に冒されていない正常ボランティアから採取され得る。対照はまた、内部対照でもあり得る。本明細書原文で使用している英語の単数形態a、anおよびtheは、特に断らなければ、複数の場合も含むものとする。すなわち、例えば、細胞外ドメインを含む化合物という表現は、1つまたは複数の細胞外ドメインを含む複数化合物を包含する。本明細書で使用している範囲および量は、特定の値または範囲に約を付けて表わされ得る。約という表現は、正確な量も含む。このため、約5塩基は、約5塩基および5塩基の両方を意味する。本明細書で使用している所望によるまたは所望によりは、その後に記載している事象または環境が起こる場合も起こらない場合もあることを意味し、上記事象または環境が起こる場合およびそれが起こらない場合の両方を想定している。例えば、所望により置換されていてもよい基とは、その基が非置換であるか、または置換されていることを意味する。本明細書で使用している保護基、アミノ酸および他の化合物に関する省略形は、特に断らなければ、それらの通常の使用法、公認の省略形またはIUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature1972Biochem11:1726参照に準ずるものとする。B.プロテアーゼのスクリーニング方法本発明は、改変された特性、特に基質特異性および選択性をもつプロテアーゼのスクリーニング方法を提供する。上記方法はまた、実質的に不変であるかまたは治療用としての十分な活性を呈する上記の改変プロテアーゼを提供する。本発明方法は、プロテアーゼ修飾および修飾プロテアーゼの設計方法により使用され得る。上記方法には、ライブラリーの無作為作成方法、既存ライブラリーの使用、および定向進化方法がある。改変された基質特異性/選択性を有するプロテアーゼを同定する様々な選択スキームが使用されているが、どれも制限を有する。本発明方法は上記制限を克服するものである。一般的に、選択スキームは、1プロテアーゼ結合に関して選択するものまたは2プロテアーゼ触媒に関して選択するものを含む。プロテアーゼ結合を利用する戦略の例には、例えば遷移状態類似体TSAの使用および小分子自殺基質を用いるものがある。TSAは、プロテアーゼ:基質反応の遷移状態の電子的および構造的特徴を模倣する安定した化合物である。プロテアーゼと基質間の最強の相互作用は、典型的には反応の遷移状態で行われる。TSAは、高い結合親和力をもつプロテアーゼについて選択するモデル基質として使用される。TSAは、決して真の遷移状態の完璧な模倣物ではなく、それらの合成は難しいBertschingeretal2005、PhagedisplayinBiotechandDrugDiscoverySidhuS編461-491頁。上記戦略は、基質特異性が改変されたプロテアーゼ変異型を同定するが、プロテアーゼ触媒作用に関する必要条件は選択スキームの一部ではないため、上記プロテアーゼは一般に低い活性を呈する。これに代わる別の戦略では、小分子自殺基質機構に基づく阻害剤とも呼ばれるを用いることにより、結合に基づいたプロテアーゼ選択を行う。上記自殺基質は、典型的には酵素の活性部位と共有結合する小分子阻害剤である。これらの自殺基質は、酵素求核基と反応して共有結合を形成する反応性求電子種を含む。プロテアーゼによる天然ペプチド結合の開裂は、この反応には要求されない。典型的には、上記阻害剤は、正確な酵素と結合し、通常の触媒段階を経たときのみ反応性求核基を生成する例、Bertschingeretal2005、PhagedisplayinBiotechandDrugDiscoverySidhuS編461-491頁参照。多くの場合、基質阻害剤は、触媒に関与する最初の遷移状態の立体配座を模倣するが、触媒周期を完了させることはない。その結果、上記阻害剤の使用により、触媒作用の代わりに強い結合が有効に選択され、基質の解離が損なわれた不活性酵素が選択されるDrogeetal2006ChemBioChem、7:149-157。また、それらのサイズおよび基質開裂に関する必要条件の欠如故に、それらは天然タンパク質基質とプロテアーゼの相互作用を繰り返さない。結合ではなく触媒作用について選択するプロテアーゼ選択戦略も試みられてきた例、Heinisetal2001、ProteinEngineering、14:1043-1052。触媒作用の検定における主たる制限の一つは、反応完了後すぐに反応産物が拡散するため、触媒活性酵素の単離が難しいことである。したがって、触媒作用について選択する戦略は、基質および酵素が極めて接近するようにそれらをファージに固定させることにかかっている。例えば、タンパク質カルモジュリンは、固定剤として使用されてきたDemartisJMolBiol、286:617-633。反応基質は、カルモジュリン結合性ペプチド誘導体を用いてカルモジュリン標識ファージ酵素に非共有結合的に固定されている。触媒作用後、抗生成物アフィニティー試薬を用いて、反応生成物を表示するファージを非触媒活性ファージから単離する。しかしながら、基質はファージ粒子に結合されているため、触媒反応は妨害され得る。したがって、これらおよび他のプロテアーゼ選択方法には制限があるため、特異性が改変され、実質的には不変であるが治療適用にとって十分な活性をもつプロテアーゼは同定されない。本発明方法は、これらの制限に取り組むものである。本発明は、基質特異性が改変、最適化または改善されたプロテアーゼおよび/またはプロテアーゼ変異型を同定するためのプロテアーゼ選択方法を提供する。上記プロテアーゼは、所望のタンパク質標的、例えば疾患または障害の病因に関与するタンパク質標的を開裂および不活化または活性化し得る治療用プロテアーゼとして最適化し、使用することを目的として同定される。本発明によるプロテアーゼのスクリーニング方法では、候補プロテアーゼを、プロテアーゼ酵素反応の安定した中間複合体として捕捉し、次いで同定する。安定した中間複合体は、典型的には共有結合複合体または非複合体形成分子からのその分離を可能にする他の複合体である。上記中間体には、例えば、選択されたかまたは予め定められた基質特異性を有するプロテアーゼの捕捉および最終的同定を可能にするアシル酵素中間体がある。プロテアーゼの捕捉捕捉は、プロテアーゼにより開裂され、開裂時に安定した複合体を形成するプロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼのコレクションを接触させることにより行われる。上記プロテアーゼトラップポリペプチドの例は、セルピン、アルファ2マクログロブリン、および他の上記分子である。プロテアーゼトラップポリペプチドは、天然のものであり得るか、そして/または特定標的基質を選択するように修飾され得る。本方法を実施する際、プロテアーゼ、典型的には修飾または突然変異体プロテアーゼのコレクションおよび/または天然プロテアーゼのコレクションを、基質開裂後にプロテアーゼと反応して、捕捉された中間体を含む複合体を形成するプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させる。これらの方法を用いることにより、所望の基質特異性/選択性を有するプロテアーゼを同定し得る。所望の基質特異性/選択性を有するプロテアーゼの同定を達成するため、プロテアーゼトラップポリペプチドにおける容易に開裂できる結合のアミノ酸配列、および/または反応部位の周辺配列、例えば反応性ループ配列または類似配列に修飾を加えることにより、所望の標的基質の基質開裂配列を模倣させ得る。安定した複合体、典型的には共有結合複合体が形成する条件下でプロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼのコレクションを接触させることにより、スクリーニング反応を実施する。複合体は、他の安定性の低い複合体および未反応プロテアーゼトラップポリペプチドからそれらが分離され得るほどの十分な安定性を有している。プロテアーゼトラップポリペプチドには、複合体を同定し易くするため、同定可能標識またはアフィニティー標識が付され得る。例えば、蛍光部分、アフィニティー標識または他の上記ラベル/標識剤などによるプロテアーゼトラップポリペプチドの標識により、プロテアーゼ-阻害剤複合体が単離され易くなり、選択されたプロテアーゼの同定も容易になる。選択されたプロテアーゼを活性について分析することにより、タンパク質分解有効性および基質特異性が評価され得る。また、同定または選択されたプロテアーゼは、例えば配列決定または質量分析法を含む他の同定プロトコルにより、または複合体中の選択されたプロテアーゼを同定するための他の標識方法により同定され得る。本発明方法はまた所望による反復スクリーニング段階を含むため、本方法は、1回実施され得るか、所望の、または予め定められた特異性/選択性および/または開裂活性のプロテアーゼに集中して多ラウンドで実施され得る。例えば、プロテアーゼ選択は、選択されたプロテアーゼの無作為的または経験的または系統的修飾標的領域で、および/または長さに沿って、およびプロテアーゼコレクションを1つまたはそれ以上のプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させる方法の反復1、2、3、4回またはそれ以上のラウンドでを含み得る。本発明方法は、例えば2つまたはそれ以上の差示的標識または差次的に同定可能なプロテアーゼトラップポリペプチドを含ませることにより多重方式で実施され得る。本発明方法では、少なくとも検出可能なパーセンテージ、典型的には少なくとも1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90またはそれ以上の割合で、安定性の低い複合体または未反応プロテアーゼトラップポリペプチドから分離されるかまたは他の形で同定され得る安定した複合体を形成し得る限り、プロテアーゼトラップポリペプチドが複合体形成反応において100または非常に高い有効性を呈することは、必ずしも必要ではない。すなわち、プロテアーゼ触媒反応のプロテアーゼトラップポリペプチドによる100未満の阻害、例えば1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99またはそれ以上の阻害が見られる反応において分配が行われる場合に、プロテアーゼは選択され得る。本発明方法では、例えば反応時間、温度、pH、イオン強度および/またはライブラリーおよび基質濃度を制御することにより、選択のストリンジェンシーおよび他のパラメーターをモジュレーションすることができる。特異性の制約もまた、競合物質、例えば望ましくない基質開裂配列を含む特異的競合物質、または広範なクラスの競合物質、例えばヒト血漿を含ませることにより選択中にモジュレーションされ得る。本発明方法はまた、プロテアーゼのコレクションを一プロテアーゼトラップポリペプチドまたは異なるプロテアーゼトラップポリペプチドの混合物と例えば多重方式により接触させることにより実施され得る。複数の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドを使用する場合、各プロテアーゼトラップポリペプチドに対し個々にかつ明確に標識を付すことにより、それらは同定可能な形で検出され得る。上記方法により、単一反応でプロテアーゼのコレクションから多くのプロテアーゼが単離および同定され得る。本発明方法では、プロテアーゼのコレクションを1度スクリーニングにかけるだけで、所望の、または予め定められた基質特異性を有するものが同定され得る。プロテアーゼのコレクションは、様々な野生型プロテアーゼ、修飾プロテアーゼ、それらの混合物およびそのタンパク質分解活性部分のコレクションを含むプロテアーゼのあらゆるコレクションを包含する。いずれのコレクションでも使用され得る。コレクションはまた、突然変異体プロテアーゼ、または突然変異を含むそのタンパク質分解活性部分のセットとして作成され得る。上記コレクションには、コレクション中のメンバーが様々な突然変異を含むコンビナトリアルコレクションがある。突然変異は、プロテアーゼまたはその触媒活性部分の長さに沿ってランダムに存在し得るか、または特定位置または領域、例えばプロテアーゼの特異性結合ポケットにターゲッティングされ得る。本発明方法では、以前には特異性決定因子として含まれていないとみなされていた非接触残基すなわち、埋没残基が同定または発見され得る。このため、本発明によるプロテアーゼ選択技法を用いることにより、全く新しい特異性および活性をもつプロテアーゼが作られ、既存の先行プロテアーゼの特異性または活性が最適化され得る。C.プロテアーゼトラップポリペプチド本発明方法で使用するプロテアーゼトラップポリペプチドは、プロテアーゼに関する基質としての役割を果たし、開裂時、安定したプロテアーゼ-基質中間複合体を形成させるポリペプチド、または反応性部位を含むポリペプチド部分である。一般的に、上記プロテアーゼトラップポリペプチドは、捕捉された基質-プロテアーゼ複合体を生成させるのにプロテアーゼによる容易に開裂できる結合P1-P1の開裂を必要とするものである。安定した複合体は、典型的には例えば共有結合、イオン結合、疎水性結合、または他の堅固な結合による、プロテアーゼとプロテアーゼトラップポリペプチド間の堅固な相互作用を通じて形成される不可逆性複合体である。一般的に複合体自体は、何時間、何日間、何週間またはそれ以上の間安定しているため、複合体の単離は可能である。一例では、安定した中間複合体は、セリンまたはシステインプロテアーゼとプロテアーゼトラップポリペプチドとの反応時に形成されるアシル酵素中間体であり得る。ほぼ通常、プロテアーゼトラップポリペプチド開裂後、複合体における迅速な立体配座変化によりプロテアーゼはゆがめられ、アシル-酵素複合体の脱アシル化が阻止される。すなわち、プロテアーゼトラップポリペプチドによるプロテアーゼのふるい分けにより、同時にコレクション混合物から容易に単離される非常に堅固なすなわち、共有結合複合体を形成しながら触媒作用すなわち、P1-P1結合の開裂および酵素のアシル化の律速段階について選択が可能となる。典型的には、上記プロテアーゼトラップポリペプチドは、プロテアーゼにより認識される反応性部位配列を含む大きい100を超えるアミノ酸、単一ドメインタンパク質である。一般的に、反応性部位開裂配列は、標的基質となるように可撓性で露出しており、長い大きな反応性ループの一部分であるOtlewskietal2005TheEMBOJ24:1303-1310。しかしながら、プロテアーゼトラップが、プロテアーゼにより開裂され得る反応性部位配列を含み、それによって基質開裂を模倣するものであれば、本発明方法で使用され得る。すなわち、プロテアーゼにより容易に開裂できる結合を含むことにより、長期間持続する安定した複合体中にプロテアーゼを捕捉する大型ポリペプチドまたは合成ポリペプチドは全て、本発明方法で使用され得る。上記プロテアーゼトラップポリペプチドの例は、本明細書記載のものなどのセルピンである。他のプロテアーゼトラップポリペプチド、例えば作用機構がセルピン分子の場合と類似しているものもまた、本発明方法で使用され得る。これらの例には、合成または組換え技法により製造されたセルピン様分子、またはセルピン分子の反応性部位ループの十分な部分を含むセルピン分子の連続フラグメントまたは配列を含むポリペプチドがある。さらに、阻害機構がセルピンの場合と類似している他のプロテアーゼ阻害剤も使用され得、例えばカスパーゼを阻害するバキュロウイルスp35タンパク質があるXuetal2001Nature、410:494-497;Otlewskietal2005TheEMBOJ24:1303-1310。他のプロテアーゼトラップポリペプチドには、限定されるわけではないが、アルファ2マクログロブリンなど、容易に単離され得る安定した複合体にプロテアーゼを捕捉するものがある。1.セルピン:構造、機能および発現セルピンセリンプロテアーゼ阻害剤は、通常は約60未満のアミノ酸である他のセリンプロテアーゼ阻害剤と比べて大きなタンパク質分子約330~500アミノ酸であるプロテアーゼ阻害剤である。セルピンファミリーは、プロテアーゼ阻害剤の中で最大であり、最も広く分布している。1500を超えるセルピンファミリーメンバーが現在までに様々な異なる動物、ポックスウイルス、植物、細菌および古細菌から同定されておりLawetalGenomeBiology、7:216、30を超える種々のヒトセルピンがこれまでに試験されている。大部分のヒトセルピンは、例えば炎症、補体、凝固およびフィブリン溶解カスケードを含む広範囲の調節的役割でそれらが機能している血液から見出されている。セルピンはまた、細胞内で機能することにより、例えば細胞傷害性プロテアーゼの不適切な放出の調節などの細胞防護的役割を演じる。ほとんどのセルピンはプロテアーゼ活性に対して阻害的役割を有するが、中には、限定されるわけではないが、ホルモン輸送、コルチコステロイド結合グロブリン、および血圧調節などの他の非阻害的役割も演じるセルピンもあるSilvermanetal2001JBC、276:33293-33296。非阻害的セルピンには、ステロイド結合グロブリンおよび卵アルブミンがある。典型的には、セルピンはセリンプロテアーゼの作用を阻害するが、パパイン様システインプロテアーゼまたはカスパーゼの阻害剤である幾つかのセルピンも同定されているWhisstocketal2005FEBSJournal、272:4868-4873。セルピンファミリーメンバー間の配列同一性は弱いが、それらの構造は高度に保存されている。例えば、セルピンファミリーのメンバーは、セルピンアルファ1-抗トリプシンと約30のアミノ酸配列相同性を共有しており、保存三次構造を有する。構造的に、セルピンは、3枚のβシートA、BおよびCおよび8~9のα-へリックスA-Iにより構成され、それらは上部β-バレルドメインおよび下部へリックスドメインに組織化されている。2つのドメインは、セルピンの主たる構造的特徴である5本鎖BシートAにより架橋されているHuntingtonetal2003、JThrombosisandHaemostasis、1:1535-1549。セルピンは準安定性タンパク質であるため、それらは活性形態で部分的にのみ安定している。それらは、完全に安定した立体配座をとるのにプロテアーゼを必要とする。反応性部位ループRSLと呼ばれるループは、セルピン分子の改変された立体配座に関与している。RSLは、AおよびCβシート間の領域で分子の上部から突出している約17アミノ酸残基の露出した伸長部分である。RSLは、プロテアーゼ認識部位としての役割を果たし、一般にプロテアーゼ特異性の唯一の決定基を含む。セルピン構造の最も安定した形態は、RSL開裂形態である。プロテアーゼ開裂後、RSLのアミノ末端部分は、βシートAの中心に挿入され、6本鎖βシートの鎖4となる。この立体配座変化は、緊張から弛緩へのまたはSからRへのトランジションと呼ばれる。この形態変換は、5本鎖βシートAから6本鎖抗平行形態への再組織化による分子の熱安定性の増加を特徴とするLawrenceetal2000、JBiolChem、275:5839-5844。言い換えれば、セルピンの天然構造は、プロテアーゼ開裂後にさらに安定した構造へ変換されているだけである潜在的中間体と均等内容であるLawetalGenomeBiology、7:216。典型的には、セルピンは、セリンプロテアーゼをターゲッティングするが、類似した機構を用いてシステインプロテアーゼを阻害するセルピンもある。RSLループは標的プロテアーゼに関する偽基質を提供するため、どのプロテアーゼが阻害についてターゲッティングされるかをそれが決定する。事実、特定セルピンの阻害特異性は、セルピンの中でも最も変化し易い領域であるRSL配列により伝達されるTravisetal1990BiolChemHoppeSeyler、371:3-11。RSLは、プロテアーゼの基質認識配列を模倣することにより、PnP3P2P1P1P2P3Pnとナンバリングされる反応性部位を含み、そこでの反応性部位はP1およびP1間の容易に開裂できる結合である。成熟α1-抗トリプシンの場合、P1-P1結合での開裂はMet358-Ser359結合配列番号1に示したアミノ酸配列のアミノ酸Met382およびSer389に対応で起こる。プロテアーゼ上の残基についての対応結合部位は、SnS3S2S1S1’S2’S3’Sn’である。本発明方法では、下記で詳細に検討しているところによると、RSL配列の修飾は、改変された基質特異性を呈するディスプレーライブラリーからプロテアーゼについて選択するように行われる。2.プロテアーゼ触媒作用、セルピンの阻害機構およびアシル酵素中間体の形成本発明プロテアーゼ選択方法は、基質特異性が改変されたプロテアーゼを同定するため、例えばセルピンにより例証しているように、ポリペプチドのプロテアーゼ捕捉能を利用する。プロテアーゼ触媒作用の機構は、タンパク質分解酵素:セリン、システイン、アスパルティック、トレオニンまたはメタロプロテアーゼのクラス間で微妙に異なる。例えば、セリンペプチダーゼは、活性中心に含まれるセリン残基を有し、アスパルティックは触媒中心に2個のアスパラギン酸を有し、システイン型ペプチダーゼはシステイン残基を有し、トレオニン型ペプチダーゼはトレオニン残基を有し、メタロ-ペプチダーゼは触媒機構で金属イオンを用いている。一般的に、共有結合中間体を形成するそれらのプロテアーゼファミリーは、本発明プロテアーゼ選択方法の標的である。例えば、これらはセリンおよびシステインプロテアーゼファミリーのメンバーを含む。一例として、セリンプロテアーゼの場合、触媒作用の第一段階は、プロテアーゼの触媒中心における基質およびセリン間でのアシル酵素中間体の形成である。この共有結合中間体の形成は、負に荷電した四面体遷移状態中間体を通して続行し、次いで基質のP1-P1ペプチド結合が開裂される。第2段階または脱アシル化中、アシル酵素中間体は水分子により加水分解され、ペプチドを放出し、酵素のSer-ヒドロキシルをもとに戻す。脱アシル化は、四面体遷移状態中間体の形成も伴い、アシル化の逆反応経路を通して続行される。脱アシル化の場合、水分子は、Ser残基に代わる攻撃性求核基である。セリンプロテアーゼの触媒中心におけるHis残基は、一般的塩基を提供し、反応性SerのOH基を受け入れる。セルピンは、上記のSからRへのトランジションを用いてセリンおよびシステイン標的プロテアーゼの両方の触媒反応を阻害する。それらの作用機構は、脱アシル化が進行する前にプロテアーゼの活性部位を破壊するため、アシル酵素中間体の形成後タンパク質分解を不可逆的に妨げることによりプロテアーゼ阻害剤間でも独特なものであるOtlewskietal2005TheEMBOJ24:1303。セルピンとプロテアーゼの反応の速度論モデルは、基質のタンパク質分解のそれと同一である例、図1;Zhouetal2001JBiolChem、276:27541-27547参照。標的プロテアーゼとの相互作用後、セルピンは、まず、容易に開裂できるP1-P1結合の両端に隣接するRSLにおける残基の相互作用を介して非共有結合的ミカエリス様複合体を形成するSilvermanetal2001、JBiolChem、276:33293-33296。プロテアーゼの活性部位におけるセリン残基セリンプロテアーゼの場合はP1-P1結合を攻撃し、ペプチド結合の開裂およびセリン残基とP1残基のバックボーンカルボニル間の共有結合的エステル結合の形成を促す。RSLが開裂された後、RSLはセルピン分子のβシートAに挿入される。最初に挿入される残基はP14すなわち、成熟α1-抗トリプシンにおけるアミノ酸345、配列番号1に示したアミノ酸配列のアミノ酸位置T369に対応するであり、次いでRSLの可撓性ヒンジ領域P15~P9が続くBucketal2005MolBiolEvol、22:1627-1634。RSLの挿入により、それと共に共有結合したプロテアーゼが輸送されるため、歪んだ活性部位を特徴とするプロテアーゼの立体配座に変化がもたらされ図1参照、セルピンの弛緩状態へのトランジションが誘発される。プロテアーゼの立体配座の変化により、P1側鎖がS1ポケットから除去されるように活性部位の触媒性トライアッドが改変される。立体配座の転位の最終的結果として、アシル酵素中間体が捕捉されるSilvermanetal2001、JBiolChem、276:33293-33296。アシル酵素の形成はセルピン相互作用にとって重要であるため、セルピンは、典型的には触媒作用でアシル酵素中間体を有するクラスのプロテアーゼに特異的である。これらのクラスのプロテアーゼの中で、優勢なのはプロテアーゼのキモトリプシンスーパーファミリー中およびズブチリシンスーパーファミリー中のものを含むセリンプロテアーゼファミリーのメンバーであり、これらについては下記で詳細に説明する。さらに、セルピンはまた、例えばセリンプロテアーゼのパパインファミリーおよびカスパーゼファミリー中のものを含むシステインプロテアーゼに対して反応性を示す。典型的には、セルピンは、メタロ-、トレオニンまたはアスパルティックファミリーのプロテアーゼを阻害しない。例えば、セルピンとメタロプロテアーゼの相互作用が、共有結合的に捕捉された中間体をもたらすことはなく、その代わりメタロプロテアーゼが、いかなる複合体も形成せずに阻害剤を開裂するLietal2004CancerRes64:8657-8665。すなわち、ほとんどのセルピンは、キモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼを阻害するが、システインプロテアーゼを阻害する交差クラス的阻害剤も実際に存在する。交差クラス的阻害剤には、両方ともカスパーゼ1を阻害するウイルス性セルピンCrmAおよびPI9SERPINB9およびカテプシンL、KおよびSを含むパパイン様システインプロテアーゼを阻害するSCCA1SERPINB3がある。セリンプロテアーゼのセルピン介在による阻害機構は、システインプロテアーゼにも適合すると思われる。しかしながら、動力学的に捕捉された中間体が、セリンプロテアーゼの場合と同様オキシエステルではなくチオールエステルである点が異なるSilvermanetal2001、JBiolChem、276:33293-33296。安定した共有結合チオールエステル型結合の存在は、SCCA1およびカテプシンS間におけるSDS安定複合体の検出により裏付けられるSilvermanetal2001、JBiolChem、276:33293-33296;Schicketal1998Biochemistry、37:5258-5266。セルピン-プロテアーゼ対は、そのセルピン-プロテアーゼ対によっては何週間から何年間までの間非常に安定しているが、結局は解離が起こり、通常のタンパク質分解産物を生じるすなわち、開裂されたセルピンおよび活性プロテアーゼ;例えば、Zhouetal2001JBiolChem、276:27541-27547参照。さらに、RSLループがプロテアーゼ中に十分な速さでは挿入されない場合、反応は直接開裂産物まで進行する。この現象は分配と呼ばれ、例えば阻害された複合体の形成対非阻害的経路として図1に描かれているように安定した阻害性複合体の形成または基質へのセルピンのターンオーバーのいずれかに至り得る分岐経路の存在を反映するLawrenceetal2000、JBiolChem、275:5839-5844。セルピンの分配は、RSLループ、特にループ挿入を開始するRSLのヒンジ領域すなわち、P14における残基を変えるか、またはセルピンが最適な形で相互作用するプロテアーゼを改変することによりモジュレーションされ得る。例えば、セルピンプラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1PAI-1の阻害活性は、プロテアーゼuPA、tPAおよびトロンビン間で異なり、標的としてはuPAおよびtPAが優先される。さらに、例えば、ヒンジ領域のP14位でのRSLループの変化により、標的とされるPAI-1の優先性が改変される。荷電アミノ酸すなわち、Arg、Lys、Asp、Gluへの突然変異により、uPA、tPAおよびトロンビンのそれぞれに対するPAI-1の阻害活性は低下する。中性アミノ酸すなわち、His、Tyr、Gln、Asnまたは側鎖を欠くGlyへの突然変異により、uPAに対する場合と比べてtPAおよびトロンビンに対するPAI-1の阻害活性は10~100分の1に縮小する。さらに、疎水性アミノ酸への突然変異が、野生型PAI-1の場合と比べてPAI-1の阻害活性を変えることはないLawrenceetal2000、JBiolChem、275:5839-5844。プロテアーゼ触媒作用のセルピン介在による阻害の成功における重要因子はRSLループの長さであり、セルピン本体とプロテアーゼ間にてこ入れすることにより、活性部位から触媒性セリンを除き、プロテアーゼを変形させ得る形で確実にセルピンおよびプロテアーゼが相互作用するためには正確な長さを有していなければならないZhouetal2001JBiolChem、276:27541-27547;Huntingtonetal2000Nature、407:923-926。事実、プロテアーゼは、セルピン本体に対して押し込まれる。ほとんどのセルピンは17残基長であるRSLを有するが、16残基のループをもつものもごく僅か同定されているすなわち、α2-抗プラスミン、C1-阻害剤、およびCrmA。18残基ループを有するα2-抗プラスミン変異型セルピンも出血疾患の患者から同定されているが、この変異型は機能的阻害性セルピンではないZhouetal2001JBiolChem、276:27541-27547。すなわち、セルピン阻害機構は、RSLの延長ではなく、短縮を適応させ得るZhouetal2001JBiolChem、276:27541-27547。セルピンファミリーメンバー間におけるループ長の保存に加えて、セルピンのRSLはまた、一般に保存ヒンジ領域P15~P9組成を保持しており、典型的には荷電または巨大P残基を含まない。a.具体例としてのセルピン類本発明方法で使用するセルピンは、限定されるわけではないが、遺伝子組み換えにより製造されたポリペプチド、合成ポリペプチドおよび細胞、組織および血液から抽出されたセルピンを含め、いかなるセルピンポリペプチドでもよい。セルピンはまた、対立遺伝子変異型および限定されるわけではないが、ヒトおよびヒト以外の起源の動物、ポックスウイルス、植物、細菌および古細菌を含む異なる種からのポリペプチドも包含する。典型的には、セルピンの対立遺伝子または種変異型は、約または少なくとも40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99の割合で天然または野生型セルピンとは異なる。ヒトセルピンは、本明細書例、下記表2で示したセルピン、対立遺伝子変異型イソ型、核酸からの合成分子、ヒト組織、細胞または血液から単離したタンパク質、およびヒトセルピンポリペプチドの修飾形態を包含する。セルピンはまた、プロテアーゼとの相互作用および共有結合アシル酵素中間体の形成を伝達するのに十分なRSLループ部分が存在する限りは切頂型ポリペプチドフラグメントも含む。典型的には、本発明方法で使用するセルピンは、セルピンおよびプロテアーゼ間に共有結合アシル酵素中間体を形成させ得る阻害性セルピンまたはそのフラグメントである。一般的に、上記セルピンを用いることにより、セルピンが通常ターゲッティングするプロテアーゼについて選択を行うが、その場合プロテアーゼのほぼ完全な阻害が起こり、阻害性複合体と開裂セルピン基質間での分配は最小限となる。表3は、セリンプロテアーゼおよびそれらの同族体セルピン阻害剤の例を示す。上記セルピン/プロテアーゼ対は、高い会合定数または二次速度定数を有し、非阻害性複合体への分配は低調または皆無であることが予測される。例えば、t-PAの主たる生理学的阻害剤は、約50kDの糖タンパク質、セルピンPAI-1であるPannekoeketal1986EMBOJ、5:2539-2544;Ginsbergetal1980JClinInvest、78:1673-1680;およびCarrelletal、ProteinaseInhibitors、BarrettAJetal編、Elsevier、アムステルダム、403-420頁1986。また、会合定数が低く、分配が高調である場合でさえ、他のセルピン/プロテアーゼ対も本発明方法で使用され得る。例えば、他のセルピン、例えばC1エステラーゼ阻害剤およびアルファ-2-抗プラスミンとtPAの会合定数は、PAI-1の場合より一桁低いがRanbyetal1982ThromRes、27:175-183;Hekmanetal1988ArchBiochemBiophys、262:199-210、それにも拘らず、これらのセルピンはtPAを阻害しない例、Lucoreetal1988Circ77:660-669参照。すなわち、一般に本発明方法でプロテアーゼの選択に使用するセルピンは反応産物を生じ、その場合反応産物の80、90、93、94、95、96、97、98、99または100は阻害性複合体の形成を占める。しかしながら、本方法で使用するセルピンが最適な形でプロテアーゼをターゲッティングしない場合など、セルピンとプロテアーゼ間で高い分配が起こる場合も本発明方法ではあり得る。すなわち、本発明方法では、セルピンを用いてプロテアーゼを選択するが、その場合、生じる反応物は約20、30、40、50、60、70、75前後およびそれ以上の割合で安定した阻害性複合体に誘導され、残りの生成物は開裂されたセルピン基質である。分配が起こる場合にプロテアーゼ選択に向けて改変され得る因子には、例えば、高いセルピン濃度および長い反応時間がある。場合によっては、下記で検討している他の非阻害性セルピンまたはその突然変異体も、選択用の標的プロテアーゼがセルピン基質と相互作用することにより、捕捉され得る共有結合阻害性複合体を生じさせることができる限りは本発明方法で使用され得る。i.PAI-1プロテアーゼ選択方法で使用するセルピンの具体例は、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1PAI-1またはその変異型である。PAI-1は、プラスミノーゲンの活性化故にフィブリン溶解に関与するプロテアーゼである、組織プラスミノーゲン活性化因子t-PAおよびウロキナーゼまたは尿中プラスミノーゲン活性化因子u-PAの主要阻害剤である。PAI-1は、t-PAおよびu-PAについて約2×107M-1/秒の二次速度定数を有する。PAI-1は、腫瘍浸潤、フィブリン溶解、細胞移動、組織リモデリング、組織退縮、排卵、炎症、栄養膜浸潤および悪性変換に関与するSalonenetal1988JBiolChem、264:6339-6343。PAI-1は、主として内皮により産生されるが、例えば脂肪組織などの他の組織型により分泌されることもある。他の関連プラスミノーゲン活性化因子阻害剤には、PAI-2およびPAI-3がある。例えば、PAI-2もまた、u-PAおよびt-PAの阻害剤であるが、胎盤により分泌され、典型的には妊娠中に大量に存在するのみである。PAI-1は、23アミノ酸シグナル配列を含む、配列番号11に示した前駆体配列を有する単鎖糖タンパク質であり、開裂されると、379アミノ酸成熟配列を生じる。他のセルピンと同様、PAI-1は、Arg346~Met347すなわち、配列番号11に示した前駆体配列のアミノ酸Arg369およびMet370に対応するに位置するそのP1-P1反応性部位がプロテアーゼにより開裂された後、潜在形態から活性形態へとトランジションし、その結果、安定した共有結合複合体の形成および結合プロテアーゼの不活化をもたらす。しかしながら、他のセルピンとは異なり、PAI-1は、自然に潜在トランジションをとるため、不活性の安定性は高いが共有結合的に無傷の形態となり、そこでRSLの残基P15~P4はβ-シートAに挿入されてβ-シートの鎖4すなわちs4Aを形成し、残基P3~P10は、分子の表面に伸長したループを形成するDeTaeyeetal2003JBiolChem、278:23899-23905。すなわち、活性PAI-1は、潜在的立体配座への自然発生的変換前には37°Cで比較的不安定であり、25時間の半減期しか呈しない。しかしながら、この潜在形態は、変性、例えばドデシル硫酸ナトリウム、塩化グアニジウムおよび尿素による変性Declereketal1992JBiolChem、267:11693-11696および加熱Katagirietal1988EurJBiochem、176:81-87により再活性化され得る。PAI-1の活性形態はまた、ビトロネクチンとの相互作用により安定化する。潜在的立体配座への変換を受け入れ得ないため、長時間にわたって高い温度およびpHでさらに安定している突然変異体PAI-1が同定された例、Berkenpasetal1995TheEMBOJ、14:2969-2977。セリンプロテアーゼすなわち、t-PAまたはu-PAおよび/または阻害性セルピンすなわち、PAI-1に対し、例えば野生型プロテアーゼの活性が所望される治療適用で使用するために、阻害の二次速度定数をモジュレーションまたは改変することによりプロテアーゼがそれらの同族体セルピン阻害剤、またはその変異型による阻害に対して耐性となるように修飾を加えている例、米国特許第5866413、5728564、5550042、5486602、5304482号参照ii.抗トロンビンAT3本発明方法で使用する別の典型的セルピンまたはその変異体は抗トロンビンAT3である。AT3はまた、セルピンファミリーの一員であり、例えば、限定されるわけではないが、因子X、因子IX、因子IIトロンビン、因子VII、因子XIおよび因子XIIなどの凝固系からのものを含む酵素の一員を不活化する。典型的には、抗トロンビンは、それが例えばトロンビンの機能を遮断することにより凝固を阻止または阻害する血液から主に見出される。AT3の活性は、1種またはそれ以上の補因子、典型的にはヘパリンの存在により高められる。ヘパリンと相互作用すると、AT3は、セルピン構造からのループ排除およびP1露出を伴う立体配座の転位を経て、露出プロテアーゼに接近し易い立体配座を有するAT3構造となる。さらに、ヘパリンは、プロテアーゼと阻害剤の両方に結合することにより、阻害機構を加速させ得るLawetal2006GenomeBiology、7216:1-11。AT3の遺伝子配列は、配列番号5に示した前駆体タンパク質をコード化する、7エキソンに及ぶDNAをコードする。配列番号5に示した配列のアミノ酸1~32に対応するシグナル配列の開裂により、約58000ダルトンの分子量を有する432アミノ酸の成熟タンパク質が生じる。アミノ酸のうち6個はシステインであり、3つの分子内ジスルフィド結合の形成をもたらす。AT3のRSLにおけるP4-P2位は、配列番号5に示したアミノ酸配列におけるアミノ酸422~427に対応するアミノ酸残基IAGRSL配列番号478を含み、反応性部位P1-P1での開裂がアミノ酸Arg425~Ser426の間で起こる。3.他のプロテアーゼトラップポリペプチドセルピンと類似した阻害機構例、安定した中間体を生成し、プロテアーゼ構造に立体配座の変化をもたらすプロテアーゼによる標的基質の開裂を呈する追加的プロテアーゼトラップポリペプチドは当業界では公知であるか、または同定され得る。上記プロテアーゼトラップポリペプチドについても、本発明方法での使用が考えられる。上記プロテアーゼトラップポリペプチドの例はp35である。さらに、他の分子でも、プロテアーゼにより開裂されて永続性のある安定した複合体中にプロテアーゼを捕捉するものであれば、本発明方法で使用され得る。a.p35例えば、広いスペクトルのカスパーゼ阻害剤である、バキュロウイルスp35タンパク質配列番号473は、この方法でカスパーゼを阻害し得るXuetal2001Nature410:494-497;Xuetal2003JBiolChem、2787:5455-5461。カスパーゼによりp35のP1-P1結合がカスパーゼ開裂部位DQMD87で開裂されると、p35ループのアミノセグメントAsp87とカスパーゼ触媒性トライアッドのシステイン残基カスパーゼ-8におけるCys350間に共有結合チオエステル中間体が生成される。チオエステル結合が形成されると、プロテアーゼにおいて、開裂したループのアミノセグメントをカスパーゼ中へ埋没させ得る立体配座の変化が起こり、2位のCys残基を含むp35のN-末端はカスパーゼ活性部位へ挿入されるため、カスパーゼ-8におけるHis317残基の溶媒接近可能性が遮断される。したがって、加水分解用の水分子に接近できないため、チオエステル結合の後続の加水分解が阻止される。p35に加えて、類似したウイルス性カスパーゼ阻害剤には、限定されるわけではないが、p49配列番号491およびセルピンCrmA牛痘遺伝子配列番号492が含まれる。p49阻害剤は、p49カスパーゼ認識配列TVTD94の開裂時に、カスパーゼの活性部位との安定したチオエステル結合が形成されるという点でp35の場合と類似したカスパーゼ阻害機構を呈する。本発明方法を用いるスクリーニング用の標的基質は、p35、p49またはCrmAポリペプチドなどのウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドを含み得る。本発明で提供するセルピンのRSLループの修飾方法は、ウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドの修飾にも容易に適合し得る。例えば、p35RSLにおける開裂に関する標的部位には、標的基質に関して改変された反応性または特異性を有するプロテアーゼを選択するように修飾が加えられ得る。野生型p35では、カスパーゼ認識はアミノ酸84~87位DQMD87で見出される。したがって、ウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドへの修飾は、開裂配列および/または周囲のアミノ酸残基を改変する修飾を含み得る。例えば、上記修飾カスパーゼ阻害剤ポリペプチド、例えば、p35、p49またはCrmAポリペプチドは、所望の標的基質、例えば、疾患または障害の病因に関与する標的基質の開裂配列を模倣するように設計され得る。ウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドのRSLループ配列における修飾はいずれも本発明方法で行われ得る。本発明方法で使用するp35、p49またはCrmAポリペプチドなどのウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドは、限定されるわけではないが、遺伝子組み換えによるポリペプチド、合成ポリペプチドおよびバキュロウイルス精製方法により製造されるp35またはp49ポリペプチドを含むいずれのウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドでもよい。ウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドはまた、ポリペプチドの対立遺伝子変異型、例えばp35、p49またはCrmAポリペプチド変異型も包含する。b.アルファマクログロブリンaMプロテアーゼのアルファマクログロブリンaMファミリーは、典型的なプロテアーゼ阻害剤アルファ-2-マクログロブリンa2M、配列番号490などのプロテアーゼ阻害剤を含むため、本発明方法でのプロテアーゼトラップとしての使用が考えられる。aM分子は、あらゆるクラスのプロテアーゼを阻害する。aMプロテアーゼトラップは、プロテアーゼによる阻害剤のベイト領域の開裂を含む類似した阻害機構を特徴とする。ベイト領域は、タンパク質分解的開裂を受けやすいセグメントであり、開裂されると、aM分子における立体配座の変化を誘発することにより、プロテアーゼ周囲の構造を崩壊させる。配列番号490に示した典型的a2M配列の場合、ベイト領域はアミノ酸690~728に相当する。生成するaM-プロテアーゼ安定複合体では、プロテアーゼの活性部位は立体的に保護されるため、通常のプロテアーゼ基質への接近は減少する。典型的には、捕捉されたプロテアーゼは、小ペプチド基質に対する活性を保持してはいるが、大型タンパク質基質または阻害剤とのその相互作用能力を喪失している。さらに、aM分子は、チオールエステルとアミンとの反応により阻害受容力を不活化する反応性チオールエステルの存在を特徴とする。さらに、ベイト領域の開裂時に起こる立体配座の変化により、保存されたCOOH-末端受容体結合ドメインRBDは露出する。RBD配列の露出により、循環からaM-プロテアーゼ複合体が除去されやすくなる。4.プロテアーゼトラップ競合物質本発明方法では、標的基質について選択されたプロテアーゼの特異性および選択性制約をモジュレーションするのに競合物質を用い得る。例えばプロテアーゼと所望のプロテアーゼトラップポリペプチドの接触の前または後など、いずれの時点でも、競合物質をプロテアーゼまたはそのコレクションと接触させ得るか、または競合物質および所望のプロテアーゼトラップポリペプチドを同時にプロテアーゼと接触させ得る。競合物質は特異的競合物質または広範な競合物質であり得る。予め定められた非標的基質を模倣することにより、予め定められた潜在的オフターゲット的外れ的存在として作用する特異的競合物質を設計する。典型的には、上記競合物質には標識しないため、形成する安定したプロテアーゼ複合体はそれについて選択されない。さらに、上記競合物質は、選択スキームで使用するように設計されたプロテアーゼトラップポリペプチドよりもかなり過剰に、典型的にはモル過剰で加えられるため、上記競合物質はコレクション中の望ましくないプロテアーゼを捕縛する。特異的競合の一例では、それぞれ異なる基質認識を模倣するように設計された2種の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドを、プロテアーゼのコレクションと接触させるが、その際プロテアーゼトラップポリペプチドの一方のみを検出可能な形で標識する。例えば、競合物質は、その反応性部位が非標的基質の開裂配列を模倣するように設計されたポリペプチドプロテアーゼトラップを含み得る。すなわち、セルピンなどの競合物質は、そのP4-P1RSL残基が予め定められた非標的基質の開裂配列と置き換わるように設計され得る。本発明方法では、競合物質を、プロテアーゼトラップポリペプチド、例えば、そのRSL配列が、所望の、または予め定められた標的基質の開裂配列を模倣するP4-P1位でのアミノ酸を含むように修飾されており、単離され得るように標識された別のセルピンポリペプチドと組み合わせて使用し得る。すなわち、両プロテアーゼトラップポリペプチドとも、標的または非標的開裂配列に対する選択性を呈するプロテアーゼについて選択するが、所望の標的基質特異性を呈し、検出可能な形で標識されている安定したプロテアーゼ複合体のみが反応から単離され得る。特異的競合物質の他の例には、例えば、反応性部位が本発明方法で修飾された天然プロテアーゼトラップポリペプチドがある。実施例6は、血漿精製AT3セルピンを、修飾セルピンAT3SLGR-KIに対する競合物質として用いる戦略を典型的に示している。選択されたプロテアーゼの特異性および選択性を制約する広範な競合物質もまた本発明方法で使用し得る。広範な競合物質の例には、例えば、様々な天然プロテアーゼ阻害剤を含むヒト血漿またはヒト血清がある。別法として、P2、P3またはP4のどの位置も異なるように設定されたプロテアーゼトラップポリペプチドの広範な小分子ライブラリー、例えばAcxxx-チアフィンライブラリーも作成され得る。5.変異型プロテアーゼトラップポリペプチド本発明方法では、改変された開裂配列を有するように反応性部位が修飾されたプロテアーゼトラップポリペプチドも、所望の、または予め定められた標的基質を伴うプロテアーゼについて選択するのに使用し得る。すなわち、プロテアーゼトラップでは、標的基質について改変された反応性または特異性を有するプロテアーゼについて選択できるように、プロテアーゼの認識される開裂部位としての役割を果たすそれらの配列領域に修飾を加える。例えば、セルピンは、RSLループにおいて容易に開裂できる結合またはその付近に改変された開裂配列を有するように修飾され得る。別の例の場合、a2Mでは、改変された開裂配列を有するようにそのベイト領域が修飾され得る。上記修飾プロテアーゼトラップは、所望の標的基質、例えば疾患または障害の病因に関与する標的基質の開裂配列を模倣するように設計され得る。本発明方法では、セルピン分子のRSLループ配列に何らかの修飾が加えられ得る。具体例としての野生型セルピンのRSL配列のアラインメントを下記表4に示す。下表において、P15~P5位を示す番号は、成熟α1-抗トリプシン分子配列番号1に示したアミノ酸配列のアミノ酸367~387に対応するに関するものである。RSLループ配列の同一性は当業界では公知であり、そして/またはアラインメント、例えば下記表4に示したセルピンとのアラインメントにより測定され得る。すなわち、セルピンの反応性部位におけるアミノ酸のいずれか1つまたはそれ以上すなわち、例えば上記表4に示したP15~P5位に対応するアミノ酸のいずれか1つまたはそれ以上に対応するセルピンのRSLループ内のアミノ酸配列が修飾され得る。典型的には、RSLループ配列のヒンジ領域の一部であるアミノ酸は修飾されないすなわち、P15~P9位に対応するアミノ酸。一例では、容易に開裂できる結合の両端に隣接するアミノ酸に対応するP1および/またはP1位における1つまたはそれ以上のアミノ酸が修飾される。別の例では、反応性部位P4~P2位に対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸が修飾される。例えば、PAI-1のP4~P1はVSARM配列番号378であり、RP1とMP1アミノ酸の間で開裂が起こる。VSARM配列のアミノ酸のいずれか1つまたはそれ以上を修飾することにより、改変された特異性をもつプロテアーゼについて選択できるようにPAI-1の開裂配列が修飾され得る。実施例1は、反応性部位ループにおけるVSARM配列をRRARM配列番号379に修飾するPAI-1の修飾を具体的に示している。別の例では、反応性部位ループのVSARM配列を、既知の有効なペプチド基質PFGRS配列番号389に修飾し得る。上記突然変異体PAI-1の具体例を配列番号610および611に示す。別の例では、抗トロンビンIIIAT3のRSLに修飾を加え得る。例えば、AT3のP4-P1はIAGRSL配列番号478であり、RP1とSP1アミノ酸の間で開裂が起こる。IAGRSL配列のアミノ酸のいずれか1つまたはそれ以上を修飾することにより、改変された特異性をもつプロテアーゼについて選択できるようにAT3の開裂配列が修飾され得る。実施例6および7は、反応性部位ループにおけるIAGRSL配列をRRVRKE配列番号498に修飾するAT3の修飾を具体的に示している。別の例では、反応性部位ループのIAGRSLアミノ酸配列を、SLGRKI配列番号479に修飾し得る。アミノ酸配列SKGRSL配列番号501またはアミノ酸配列PRFKII配列番号503によるIAGRSLアミノ酸配列の置換を含む他の修飾AT3ポリペプチドも調製した。上記突然変異体AT3分子の具体例を配列番号497、499、500および502のいずれかに示す。別法として、また必要ならば、いずれか1つまたはそれ以上のアミノ酸P4-P2位における修飾は、同時に1つ、同時に2つ、同時に3つなどの形で行うことも可能であり、生成した修飾セルピンを選択の連続ラウンドで別々に試験することにより、修飾位置のそれぞれで基質特異性および/または選択性を呈するプロテアーゼについて最適化することができる。ほとんどの場合、野生型セルピンまたは別のプロテアーゼトラップにおける類似配列の反応性部位ループにおいてアミノ酸残基を置換しているアミノ酸残基は、所望の標的基質における開裂配列に基づいて選択される。標的基質タンパク質は通常病理に関与しているものであり、所与の基質配列での標的タンパク質の開裂が、病状の処置としての役割を果たす例、米国特許公開第US2004/0146938号、同第US2006/0024289号、同第US2006/0002916号、および仮特許出願第60/729817号参照。例えば、標的タンパク質は、慢性関節リウマチすなわち、TNFR、敗血症すなわち、プロテインC、腫瘍形成性すなわち、増殖因子受容体、例えばVEGFRまたは炎症すなわち補体タンパク質に関与するものであり得る。標的基質はまたウイルス性タンパク質でもあり得るため、ウイルス性タンパク質が開裂すると、ウイルスは細胞に感染し得なくなる。下記表5は、具体的な標的基質を示す。標的タンパク質内の開裂部位は、公知であるかまたは容易に同定され得る。標的タンパク質内の開裂部位は、以下の基準により同定される:1それらはタンパク質の露出表面に位置する、2原子構造予測アルゴリズムでの測定によると、それらは二次構造を欠くすなわち、ヘリックスのPシートではない領域に位置するこれらの領域は、タンパク質表面上のループまたは細胞表面受容体上のストークとなる傾向がある、3それらは、その既知機能に基づくと、タンパク質を不活化または活性化すると思われる部位に位置する。開裂配列は、プロテアーゼの長い基質特異性と適合するために例えば4残基長すなわちP1~P4位であるが、それより長い場合も短い場合もあり得る。例えば、補体因子C2における開裂配列に関するP4-P1アミノ酸残基はSLGR配列番号431であるが、SLGRKI配列番号479のP4-P2配列としても表わされ得、その場合、P1およびP1位間すなわちRK間で開裂が起こる。このため、P4-P1を含む、残基P4-P2のいずれか1つまたはそれ以上を含む、開裂配列内のいずれか1つまたはそれ以上の残基が、例えばセルピンのRSLにおいて、プロテアーゼトラップポリペプチドに導入されることにより、突然変異体プロテアーゼトラップポリペプチドが生成され得る。開裂配列は、当業界で公知の方法により標的基質において同定され得る例、米国特許出願公開第US2004/0146938号参照。一例において、標的基質の開裂は、基質を開裂することが知られているプロテアーゼと標的基質をインキュベーションすることにより測定される。プロテアーゼとのインキュベーション後、標的タンパク質は、SDS-PAGEにより分離され、分解産物は、タンパク質染料、例えばクーマシーブリリアントブルーでの染色により同定され得る。タンパク質分解性フラグメントを配列決定することにより、開裂配列、例えば、6アミノ酸P4-P2開裂配列、および特に4アミノ酸P4-P1開裂配列残基の同一性が測定され得る。表6は、典型的標的基質に関するP4-P1位に対応する開裂配列を示す。セルピンのRSL、または他のプロテアーゼトラップにおける類似配列の修飾は、標的基質の所望の、または予め定められた開裂配列に対して行われ得る。一例において、選択された開裂配列は、t-PAの特に有効な開裂配列であり得る。上記開裂配列は、例えば、PFGRS配列番号389、例えば、Dingetal1995PNAS,92:7627-7631であり得る。すなわち、例えば、プロテアーゼについては、それが有する基質特異性に改変が加えられてt-PAの基質特異性を複製するようにされたものが選択され得る。t-PAはフィブリン溶解疾患の処置に用いられることが多い治療薬であるため、上記の選択されたプロテアーゼは、t-PA治療に伴うことが多い望ましくない副作用すなわち、過度の出血を最小限にしながら代替的t-PA治療薬となるように最適化され得る。別の例において、補体タンパク質に関する開裂配列は、本発明方法を用いることにより、プロテアーゼを選択するため予め定められたかまたは所望の開裂配列としてターゲッティングされ得る。いずれか1つまたはそれ以上の補体タンパク質に対する高い基質特異性を有するように選択されたプロテアーゼは、限定されるわけではないが、例えば慢性関節リウマチおよび狼瘡などの自己免疫疾患、心臓疾患、および他の炎症性疾患、例えば、敗血症および虚血-再灌流損傷などの炎症と関連した障害および疾患を処置するための治療薬候補となる例えば、仮出願第60/729817号参照。実施例6~実施例15は、その天然P4-P2残基IAGRSL配列番号478をC2補体タンパク質の開裂配列すなわち、SLGRKI、配列番号479により置換することにより修飾したAT3セルピン分子に対するMT-SP1プロテアーゼの選択を具体的に示している。SLGRKI開裂配列、またはその中間体、例えば下記のものによるアミノ酸残基の修飾または置換は、所望通りの候補プロテアーゼが選択されるように、プロテアーゼトラップポリペプチド、例えばセルピンポリペプチドで行われ得る。さらなる例において、開裂配列は、開裂配列についての特異性を有するプロテアーゼにより開裂されるとVEGFRが不活化されるように、VEGFR、例えばVEGFRのストーク領域で選択され得る。VEGFRにおける開裂配列の例については、本明細書に記載しており、関連した米国特許出願公開第20060024289号および同第20060002916号に示されている。例えば、セルピンのRSLまたは他のプロテアーゼトラップにおける類似配列、例えばアルファ-2マクログロブリンにおけるベイト領域は、VEGFRの開裂配列により置換されるアミノ酸P4-P2位のいずれか1つまたはそれ以上を有するように修飾され得る。一例において、天然セルピンにおけるアミノ酸残基は、RRVR配列番号489開裂配列に対応するP4-P1位、または全P4-P2配列RRVRKE配列番号498を含むように修飾され得る。上記の修飾セルピンに対して選択されたプロテアーゼは、VEGFR介在疾患、例えば脈管形成疾患を処置するための候補となる。本発明方法では、場合によっては、セルピンRSLのP4-P2位のいずれか1つまたはそれ以上、または他のプロテアーゼトラップにおける類似配列における修飾が、所望の、または予め定められた基質特異性をもつプロテアーゼの選択について最適化するように連続ラウンドで行われ得る。例えば、u-PAおよびt-PAプロテアーゼは両方とも、P2位にある小アミノ酸およびP3およびP4位にある非常に異なるアミノ酸を好む。すなわち、最終標的開裂配列についての中間体である修飾セルピンが生成され得、その場合最初の中間体は、P3およびP4位で特異性を呈するプロテアーゼを選択するようにP3およびP4位のみの修飾により生成される。次いで、選択された一プロテアーゼまたは複数プロテアーゼは、さらにP2位を変えるように修飾された新たなセルピン分子に対する新たなコンビナトリアルライブラリーを作成するための鋳型として使用され得る。すなわち、例えば、VEGFR開裂配列RRVRについての高い基質特異性を呈するu-PAプロテアーゼまたはその変異型の選択では、選択の第一ラウンドは、中間体修飾プロテアーゼトラップポリペプチド、例えばセルピンに対して行われ得、その場合P3およびP4位のみがそれらの位置の天然配列と比べて変更されている。例えば、セルピンPAI-1のRSLループにおける天然P4-P1アミノ酸がVSARMである場合、修飾中間体PAI-1は、P4およびP3VEGFR開裂配列のみの置換により生成され、P4-P1位にRRARM配列番号379を含む中間体セルピン分子を生じ得る。プロテアーゼ選択の後続ラウンドは、さらにP2位が修飾されたPAI-1セルピンに対して行われ得る。セルピンを含むプロテアーゼトラップは、タンパク質修飾技術分野で知られている方法を用いて修飾され得る。上記方法には、単または多位置指定突然変異導入を含む位置指定突然変異導入がある。同様に、変異型プロテアーゼトラップポリペプチドを含むプロテアーゼトラップポリペプチドの発現および精製は、ポリペプチドの発現および精製に関する当業界での標準的方法を用いて遂行され得る。限定されるわけではないが、哺乳類細胞、細菌細胞または昆虫細胞を含む、任意の宿主系が発現に使用され得る。さらに、プロテアーゼトラップポリペプチドは、プロテアーゼトラップポリペプチドの同定および精製で助けとなる追加的配列を含むようにさらに修飾され得る。例えば、ポリペプチドのアフィニティー精製の助けとなるように、エピトープ標識、例えば限定されるわけではないが、His標識またはフラッグ標識が付加され得る。若干の例では、捕捉および/または精製の助けとなるようにプロテアーゼトラップポリペプチドを直接ビオチニル化する。プロテアーゼトラップポリペプチドをビオチニル化する具体的な方法については実施例16に記載している。例えばセルピン分子または他のプロテアーゼトラップの生物学的機能に関する検定法などの検定法は、当業界では公知であり、本発明方法における阻害剤としての修飾プロテアーゼトラップの活性を評価するのに使用され得る。上記検定法は、本発明方法での使用を目的として修飾されたプロテアーゼトラップポリペプチドにより異なる。PAI-1に関する上記検定法の具体例には、例えば、標準トリプシンに対する活性部位滴定または標準トリプシンの滴定、例えば実施例1で具体的に示した方法がある。また、上記検定法の具体例は、当業界では公知のプロテアーゼ阻害検定法であり、その方法では、活性プロテアーゼによる蛍光基質の開裂をプロテアーゼトラップが阻害する能力を、プロテアーゼトラップ活性に関するリードアウトとして使用する。プロテアーゼ阻害検定法の具体例は、マトリプターゼMT-SP1阻害検定法である。上記検定法の一例では、プロテアーゼトラップはセルピンである。ある特定例では、セルピンはAT3または本発明方法により製造された変異型AT3タンパク質であり、蛍光基質はRQAR-ACCである。例えば実施例14Aで具体的に示した要領で、基質の開裂を測定する。トロンビン阻害検定法もまた、AT3または修飾AT3の活性評価に使用され得る。プロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型が通常相互作用する同族体プロテアーゼにより異なる類似検定法も設計され得るかまたは当業者には公知である。さらに、修飾プロテアーゼトラップポリペプチドが、プロテアーゼトラップ活性または機能の通常検定法で野生型プロテアーゼトラップポリペプチドと比べて低い活性を有することは、予測され、またよくあることでもある。D.プロテアーゼ類本発明方法では、典型的には予め定められたか、または所望の基質について改変された基質特異性を呈する候補プロテアーゼを選択する。プロテアーゼ、突然変異体プロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションを、プロテアーゼトラップポリペプチド、例えば、セルピンまたは修飾セルピンを含む本明細書記載のものと接触させることにより、改変された基質特異性を有するプロテアーゼを選択する。プロテアーゼコレクションは、固体支持体または均一混合物中、例えば溶液または懸濁液中で提供され得る。選択されたプロテアーゼは、プロテアーゼトラップポリペプチドとの安定複合体として単離され、同定され得る。選択されたプロテアーゼは、所望の、または予め定められた標的基質に対して高い触媒有効性および反応性を示すため、例えば標的基質が関与する疾患または障害における治療薬としての使用に関する候補である。1.候補プロテアーゼ本発明方法では、疾患または障害に関与する目的基質に関して改変および/または高い特異性を有するプロテアーゼについて選択する。一般的に、プロテアーゼは、他は無傷のままで残しながら標的基質を加水分解する高特異性タンパク質である。天然基質の開裂について、プロテアーゼは、基質開裂には有利であり、非基質開裂には不利となるような高度の選択性を呈するCoombsetal1996JBiolChem、271:4461-4467。所望の標的基質について改変された特異性および選択性を呈するプロテアーゼについて選択することにより、選択的にタンパク質を活性化または不活化することにより疾患または障害を縮小、改善または阻止する治療薬としてのプロテアーゼの使用が可能となる。本発明によるプロテアーゼトラップ選択方法で使用する標的プロテアーゼは、プロテアーゼトラップが相互作用するペプチド結合加水分解能を有する公知クラスのプロテアーゼであり得る。典型的には、セルピンの場合、上記プロテアーゼは、一般的にはセルピンが相互作用して共有結合中間複合体を形成するセリンまたはシステインプロテアーゼである。セリンおよびシステインプロテアーゼの具体例は、下記表7に示したプロテアーゼである。典型的には、本発明方法では修飾プロテアーゼのライブラリーを用いることにより、標的プロテアーゼトラップまたはその変異型、例えばセルピンまたはその変異型について高い特異性または選択性を呈するプロテアーゼ変異型について選択する。本発明選択方法で使用され、そして/または修飾されて使用され得るプロテアーゼの例を記載するが、そこには触媒活性部分を含むその切頂型ポリペプチドが含まれる。候補プロテアーゼの例を表7に列挙し、本項で説明する例えば、wwwmeropssangeracuk参照。例示的な各候補プロテアーゼについてのヌクレオチド配列およびコード化アミノ酸前駆体配列に関する配列表配列番号を表に示す。成熟タンパク質を生じるシグナルペプチドまたはプロペプチド配列に対応するコード化アミノ酸も表に示す。さらに、各プロテアーゼの例えば触媒性トライアッドを構成する活性部位残基であるところのプロテアーゼドメインを示すアミノ酸すなわち、ペプチダーゼユニットについても示す。相互作用は動的であるため、示されたアミノ酸位置は参照および例示のためのものである。示された位置は、2、3、4、5またはそれ以上のアミノ酸の遺伝子座の範囲を反映する。また、対立遺伝子変異型および種変異型間に変形も存在する。当業者であれば、視覚的比較または容易に利用できるアルゴリズムおよびソフトウェアを含む他の比較法により対応する配列を同定できるはずである。選択用の候補プロテアーゼは、典型的には野生型または野生型候補プロテアーゼの修飾または変異型形態、またはその触媒活性部分、例えばいずれかのタンパク質の対立遺伝子変異型およびイソ型などである。候補プロテアーゼは、天然供給源からの単離、細胞、組織および生物体で製造された遺伝子組み換えタンパク質の単離を含む当業界で公知の方法、および遺伝子組換え方法およびインシリコ段階を含む方法、合成方法および当業者に公知の方法により製造または単離され得る。選択用候補プロテアーゼの修飾は、例えば下記に示した方法などの当業者に公知の方法により行われ得る。表7:例示的候補プロテアーゼa.プロテアーゼの分類プロテアーゼプロテイナーゼまたはペプチダーゼとも称すは、標的タンパク質内におけるアミノ酸またはポリペプチド基質の配列を認識するタンパク質分解酵素である。アミノ酸の基質配列を認識すると、プロテアーゼは、標的タンパク質内のペプチド結合の加水分解または開裂を触媒する。標的タンパク質の上記加水分解は、標的配列の完全長配列状況内でのペプチド結合の場所によって異なるが、標的を不活化または場合によっては活性化し得る。プロテアーゼは、それらがタンパク質を攻撃する過程に基づいて、エキソ-またはエンド-プロテアーゼに分類される。プロテイナーゼまたはエンドペプチダーゼは、タンパク質の内側を攻撃して大きなペプチドを生じさせる。ペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼは、タンパク質の端部またはフラグメントを攻撃して、小さなペプチドまたはアミノ酸を生じさせる。ペプチダーゼはそれらの作用パターンに基づいて分類される:アミノペプチダーゼはアミノ末端からアミノ酸を開裂する:カルボキシペプチダーゼは、カルボキシル末端からアミノ酸を開裂し、ジペプチジルペプチダーゼは2つのアミノ酸を開裂する;ジペプチダーゼは、ジペプチドを脱離し、トリペプチダーゼは、トリペプチドからアミノ酸を開裂する。ほとんどのプロテアーゼは、21000~45000ダルトンと小さい。多くのプロテアーゼは、合成され、チモーゲンと呼ばれる不活性形態として分泌され、それに続いてタンパク質分解により活性化される。これにより酵素の活性部位の構造は変化する。プロテアーゼは、幾つかの異なるタイプの触媒機構を用いるBarretetal1994MethEnzymol.244:18-61;Barretetal1994MethEnzymol244:461-486;Barretetal1994MethEnzymol248:105-120;Barretetal1994MethEnzymol248:183-228。それらの触媒機構に基づくと、カルボキシペプチダーゼは、セリン-、メタロおよびシステイン-型カルボキシペプチダーゼに細別され、エンドペプチダーゼは、セリン-、システイン-、アスパルティック-、トレオニン-およびメタロエンドペプチダーゼに細別される。セリンペプチダーゼは、活性中心に含まれるセリン残基を有し、アスパルティックは触媒中心に2個のアスパラギン酸を有し、システイン型ペプチダーゼは、システイン残基を有し、トレオニン型ペプチダーゼは、トレオニン残基を有し、メタロペプチダーゼは、触媒機構で金属イオンを使用する。一般的に、プロテアーゼはそれらの触媒活性に基づいて分類され得るため、プロテアーゼのクラスはセリン、システイン、アスパルティック、トレオニンまたはメタロプロテアーゼを含み得る。プロテアーゼの触媒活性は、標的基質の開裂に必要とされる。このため、プロテアーゼの修飾によるプロテアーゼの触媒活性の改変は、特定基質を開裂するプロテアーゼの能力に影響を及ぼしすなわち、特異性/選択性を修飾し得る。各プロテアーゼは、活性部位ポケットの内側をおおい、基質と直接接触する一連のアミノ酸を有する。ペプチダーゼの結晶学的構造は、活性部位が一般に隣接構造ドメイン間の分子の表面上の溝に位置していることを示しており、基質特異性は、容易に開裂できる結合の加水分解に関与する触媒部位の片側または両側にある溝に沿って配置された結合部位の特性により定められる。したがって、ペプチダーゼの特異性は、各サブサイトが単一アミノ酸残基の側鎖と適応する能力により説明される。触媒部位から基質のN-末端に向かってS1、S2Sn、およびC-末端に向かってS1、S2Snと部位には番号を付す。それらが適応する残基には、それぞれP1、P2Pn、およびP1、P2Pnと番号を付す。標的タンパク質の開裂はP1とP1の間で触媒され、そこではポリペプチド基質のN末端からC末端までのアミノ酸残基がPi、、P3、P2、P1、P1、P2、P3、、Pjと標識されており、プロテアーゼにおけるそれらの対応する結合性認識ポケットがSi、、S3、S2、S1、S1、S2、S3、、Sjと標識されているSchecterおよびBerger1967BiochemBiophysResCommun27:157-162。すなわち、P2はS2と、P1はS1と、P1はS1といった形で相互作用する。したがって、プロテアーゼの基質特異性は、活性部位におけるS1~S4位から生じ、そこではプロテアーゼがペプチド基質配列のP1~P4残基と接触している。中には、活性部位のS1~S4ポケット間で相互作用があるとしてもほとんど起こらない場合もあり、その結果、各ポケットは、他のポケットとは独立してペプチド基質配列における対応する残基を認識し、結合すると思われる。すなわち、特異性決定因子は、他のポケットの特異性に影響することなく一つのポケットで変えられ得る。ファミリーメンバーの多様な構造およびモデリングに基づき、広範な基質特異性および基質との他の二次相互作用の一因となる表面残基は、セリン、システイン、アスパルティック、メタロ-およびトレオニンファミリーのプロテアーゼを含む多くのプロテアーゼについて特定されている例えば、Wangetal2001Biochemistry4034:10038-46;Hopfneretal1999StructureFoldDes78:989-96;Friedrichetal2002JBiolChem2773:2160-8;Waughetal2000NatStructBiol79:762-5;Cameronetal1993JBiolChem268:11711;Cameronetal1994JBiolChem269:11170参照。i.セリンプロテアーゼセリンプロテアーゼSPは、分泌酵素および細胞質貯蔵オルガネラで封鎖された酵素を含み、血液凝固、創傷治癒、消化、免疫応答および腫瘍浸潤および転移を含め様々な生理学的役割を有する。例えば、キモトリプシン、トリプシンおよびエラスターゼは消化管で機能し、因子10、因子11、トロンビンおよびプラスミンは血餅形成および創傷治癒に関与し、C1r、C1sおよびC3変換酵素は、補体活性化においてある一定の役割を演じる。II型貫膜セリンプロテアーゼと命名された細胞表面タンパク質の1種は、細胞外ドメインを伴う膜固定タンパク質であるプロテアーゼである。細胞表面タンパク質として、それらは細胞内シグナル変換および細胞表面タンパク質分解事象の伝達においてある一定の役割を演じる。他のセリンプロテアーゼも膜結合し、類似した形で機能する。他は分泌される。多くのセリンプロテアーゼは、細胞表面受容体へ結合したときにそれらの活性を発揮するため、細胞表面で作用する。細胞表面タンパク質分解は、様々な細胞機能を伝達する生物活性タンパク質を生成する機構である。分泌および貫膜セリンプロテアーゼを含むセリンプロテアーゼは、新生物の発生および発達を含む過程に必然的に伴う。これらのプロテアーゼの正確な役割についてあまり詳述されたことはないが、セリンプロテアーゼおよびその阻害剤は、癌細胞浸潤および転移拡散における分解作用、腫瘍進行に関与する腫瘍の新生血管形成を含む多くの細胞内および細胞外生理学的過程の制御に関与している。プロテアーゼは、細胞外マトリックスECMの分解およびリモデリングに関与し、組織リモデリングの一因となるため、癌浸潤および転移には必要である。若干のプロテアーゼの活性および/または発現は、腫瘍進行および発達と相関関係をなすことが示された。セリンプロテアーゼの20を超えるファミリーS1~S27で示すが同定されており、これらは、構造類似性および他の機能的証拠に基づいて6クランSA、SB、SC、SE、SFおよびSGにグループ分けされるRawlingsNDetal1994MethEnzymol244:19~61。幾つかのセリンプロテアーゼの反応機構には類似性がある。キモトリプシン、ズブチリシンおよびカルボキシペプチダーゼCクランは、セリン、アスパラギン酸およびヒスチジンの触媒性トライアッドを共通して有する:セリンは求核基として、アスパラギン酸は求電子剤として、ヒスチジンは塩基としてそれぞれ作用する。触媒性残基の幾何的配向は、タンパク質折りたたみが異なるにもかかわらずファミリー間で類似している。触媒性残基の直線配列は、一般的にクラン関係を反映している。例えば、キモトリプシンクランSAにおける触媒性トライアッドはHDSとして整列し、ズブチリシンクランSBではDHSおよびカルボキシペプチダーゼクランSCではSDHとして並んでいる。キモトリプシンスーパーファミリーのセリンプロテアーゼの例には、組織型プラスミノーゲン活性化因子tPA、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、ウロキナーゼまたは尿型プラスミノーゲン活性化因子、u-PA、アクロシン、活性化プロテインC、C1エラスターゼ、カテプシンG、キマーゼ、およびカリクレイン、トロンビンおよび因子VIIa、IXa、Xa、XIaおよびXIIaを含む血液凝固カスケードのプロテアーゼがあるBarretAJ、ProteinaseInhibitors、BarrettAJetal編、Elsevier、アムステルダム、3~22頁1986;StrassburgerWetal1983FEBSLett、157:219-223;DayhoffMO、AtlasofProteinSequenceandStructure、第5巻、NationalBiomedicalResearchFoundation、シルバースプリング、メリーランド1972およびRosenbergRDetal1986HospPrac、21:131-137。セリンプロテアーゼファミリーにおけるプロテアーゼの活性は、それらの活性部位を形成する一連のアミノ酸残基により左右される。残基の一つは常にセリンであるため、セリンプロテアーゼと命名されている。例えば、キモトリプシン、トリプシンおよびエラスターゼは、類似構造を共有し、それらの活性セリン残基は、3つ全部において同じ位置Ser-195にある。それらの類似性にもかかわらず、それらは異なる基質特異性を有する。それらはタンパク質消化中に異なるペプチド結合を開裂する。例えば、キモトリプシンは、カルボニル炭素が開裂されるペプチド結合の一部である残基上の芳香族側鎖を好む。トリプシンは、この位置にある正に荷電したLysまたはArg残基を好む。セリンプロテアーゼは、それらの基質認識特性が著しく異なる:高特異性のものがあればすなわち、血液凝固および免疫補体系に関与するプロテアーゼ、部分的にしか特異性を示さないものもありすなわち、哺乳類消化酵素トリプシンおよびキモトリプシン、その他細菌性プロテアーゼであるズブチリシンなどは完全に非特異的である。これらの特異性の差異にもかかわらず、セリンプロテアーゼの触媒機構は十分に保存されている。セリンプロテアーゼによる標的タンパク質の開裂機構は、セリンによるターゲッティングされたペプチド結合の求核的攻撃に基づいている。システイン、トレオニンまたはアスパラギン酸に会合した水分子または金属もこの役割を演じ得る。多くの場合、基の求核特性は、アスパラギン酸によりプロトンアクセプター状態に保たれた、ヒスチジンの存在により改善される。セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸の並列側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通した触媒性トライアッドを構築する。例えば、キモトリプシンおよびキモトリプシンと同じファミリーのメンバーであるセリンプロテアーゼの活性部位残基は、Asp102、His57およびSer195である。キモトリプシンスーパーファミリーの全セリンプロテアーゼの触媒性ドメインは、配列相同性および構造相同性の両方を有する。配列相同性は、1特徴的な活性部位残基例、トリプシンの場合におけるSer195、His57およびAsp102;2オキシアニオンホール例、トリプシンの場合におけるGly193、Asp194および3構造中のジスルフィド架橋を形成するシステイン残基の保存性を含むHartleyBS1974SympSocGenMicrobiol、24:152-182。構造相同性は、12つのグリークキー構造を特徴とする共通の折りたたみRichardsonJ1981AdvProtChem、34:167-339、2触媒性残基の共通の配列、および3分子のコア内における構造の細部保存StroudRM1974SciAm、231:24-88を含む。セリンプロテアーゼのキモトリプシンファミリー全体を通じて、基質と酵素間のバックボーン相互作用は完全に保存されているが、側鎖相互作用はかなり変化している。活性部位のS1~S4ポケットを含むアミノ酸の同一性は、その特定ポケットの基質特異性を決定する。一セリンプロテアーゼから同じ折りたたみの別のセリンプロテアーゼへとアミノ酸をグラフトすることにより、一方から他方への特異性の修飾が行われる。典型的には、S1~S4ポケットを含むプロテアーゼのアミノ酸は、基質の4~5オングストローム内に側鎖を有するものである。これらのアミノ酸は直接プロテアーゼ基質と接触するため、それらと基質との相互作用は、一般に第一殻相互作用と呼ばれる。しかしながら、最終的には第一殻アミノ酸を配置させる第二殻および第三殻相互作用もあり得る。第一殻および第二殻基質結合効果は、主としてベータ-バレルドメイン間のループにより決定される。これらのループはタンパク質のコア要素ではないため、新規基質特異性をもつループ変異型が進化過程中に分子レベルでの必要な代謝的または調節的ニッチを満たすように選択され得る間も折りたたみの完全性は維持される。セリンプロテアーゼの場合典型的には、一次配列における以下のアミノ酸が特異性の決定因子である:キモトリプシンのナンバリングに基づくと、195、102、57触媒性トライアッド;189、190、191、192および226S1;57、58と64の間のループ、および99S2;192、217、218S3;Cys168とCys180の間のループ、215、および97~100S4;および41および151S2であり、S1位のアミノ酸はP1特異性に影響を及ぼし、S2位のアミノ酸はP2特異性に影響を及ぼし、S3位のアミノ酸はP3特異性に影響を及ぼし、S4位のアミノ酸はP4特異性に影響を及ぼす。セリンプロテアーゼにおける189位は、S1特異性を決定するポケットの底部に埋没された残基である。様々なセリンプロテアーゼに関する構造決定因子について、成熟キモトリプシンのナンバリングに基づいて番号付しながら表8に列挙しており、示されたプロテアーゼのそれぞれについてのプロテアーゼドメインをキモトリプシンのプロテアーゼドメインのものと並列させている。Cys168~Cys182および60のループの縦列の標題下部の番号は、2つのアミノ酸間のループおよび60のループにおけるアミノ酸の数を示す。Cys191~Cys220の縦欄標題の下の有/無という表示は、ジスルフィド結合がプロテアーゼに存在するか否かを示す。これらの領域は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼのファミリー内において変わり得るものであり、本質的に構造決定因子を表す。S1~S4ポケットにおけるアミノ酸のいずれか1つまたはそれ以上を改変するためのプロテアーゼの修飾は、標的基質に関するプロテアーゼの特異性または選択性に影響を及ぼす。表8:様々なセリンプロテアーゼに関する構造決定因子aウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子u-PAウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子u-PA、尿中プラスミノーゲン活性化因子とも呼ばれるは、本発明方法での選択用候補として使用される典型的プロテアーゼである。u-PAは、配列番号190に示されており、配列番号191に示した前駆体アミノ酸配列をコード化する。u-PAは、尿、血液、精液および多くの癌組織から見出される。それは、プラスミノーゲンからプラスミンへのその変換に関連付けられる様々な生物学的過程に関与しており、それ自体セリンプロテアーゼである。プラスミンは、例えば、細胞移動、およびフィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカンおよびラミニンを含む様々な分子のその開裂を通した組織破壊を含む様々な正常および病理学的過程においてある一定の役割を演じる。u-PAは、創傷治癒中の組織リモデリング、炎症性細胞移動、新生血管形成および腫瘍細胞浸潤にも関与している。u-PAはまた、限定されるわけではないが、肝細胞増殖因子/散乱因子HGF/SF、膜1型マトリックスメタロプロテアーゼMT-SP1の潜在形態などを含む他の基質を開裂および活性化する。u-PAの成熟形態は411残基タンパク質20アミノ酸シグナルペプチドを含む前駆体形態である、配列番号191に示したアミノ酸配列におけるアミノ酸残基21~431に対応するである。u-PAは3つのドメインを含む:セリンプロテアーゼドメイン、クリングルドメインおよび増殖因子ドメイン。ヒトu-PAの成熟形態では、アミノ酸1~158は、増殖因子ドメインアミノ酸1~49、クリングルドメインアミノ酸50~131およびドメイン間リンカー領域アミノ酸132~158を含むN-末端A鎖を表す。アミノ酸159~411は、C-末端セリンプロテアーゼドメインまたはB鎖を表す。u-PAは、1本鎖チモーゲン分子として合成および分泌され、例えば、プラスミン、カリクレイン、カテプシンB、および神経増殖因子-ガンマを含む様々なプロテアーゼにより活性2本鎖u-PAに変換される。2本鎖形態への開裂は、成熟u-PA配列における残基158と159の間で行われる配列番号191におけるアミノ酸残基178および179に対応する。生成した2本の鎖は、ジスルフィド結合によりまとめられて、u-PAの2本鎖形態を形成する。u-PAは、高親和力細胞表面受容体、uPARへの結合により調節される。uPARへのu-PAの結合は、プラスミノーゲン活性化速度を高め、細胞外マトリックス分解および細胞浸潤を促進する。uPARおよびu-PA間で形成されるバイナリー複合体は、膜会合プラスミノーゲンと相互作用することにより、プラスミノーゲン活性化についてのKmすなわち、基質に関するほぼ正確な親和力の速度論的速度定数を低下させる高次活性化複合体を形成するBassetal2002BiochemSocTrans、30:189-194。さらに、uPARへのu-PAの結合により、プロテアーゼは同族体阻害剤、すなわちPAI-1による阻害から防護される。これは、通常血漿に存在する1本鎖u-PAはPAI-1による阻害に感受性を示さないためで、血漿中の活性u-PAはPAI-1により阻害される。受容体結合している活性u-PAは、PAI-1による阻害について十分に有効であるが、PAI-1は、結合した活性分子に接近できないBassetal2002BiochemSocTrans、30:189-194。結果的に、u-PAは、主として細胞表面で機能し、その機能はプラスミン依存的細胞周囲タンパク質分解の活性化と相関関係を示す。u-PAおよびt-PA下記で検討の広範な基質特異性は、両方ともプラスミノーゲンから活性プラスミンへの開裂に関与しているとう事実により類似している。u-PAおよびt-PAは両方とも、P1Arg後の開裂について高い特異性を有し、それらはP2位での小アミノ酸への優先を同様に示す。P3およびP4の両位置は、u-PAおよびt-PAの基質に関する特異性決定因子であり、P3位が特に顕著な役割を担うKeetal1997JBiolChem、272:16603-16609。P3位のアミノ酸が優先されているのは明確であり、2種のプロテアーゼ間における改変された基質の識別に関する主要決定因子である。t-PAは、P3位にある芳香族アミノ酸PheおよびTyrを優先し、u-PAは、小極性アミノ酸ThrおよびSerを優先する例えば、Keetal1997JBiolChem、272:16603-16609;Harrisetal2000PNAS、97:7754-7759参照。b組織プラスミノーゲン活性化因子t-PAまた本発明方法でのプロテアーゼトラップに対する選択用の候補プロテアーゼは、代表的なセリンプロテアーゼ組織プラスミノーゲン活性化因子t-PAおよびその変異型を含む。t-PAは、プラスミノーゲンをプラスミンへ変換するセリンプロテアーゼであり、フィブリン溶解または血餅の形成に関与している。組換えt-PAは、例えば卒中などの血餅を特徴とする疾患での治療薬として使用される。t-PA遺伝子のオルターナティブスプライシングにより3つの転写物が生成される。優勢な転写物は配列番号192に示したもので、20~23のアミノ酸シグナル配列および12~15のアミノ酸プロ配列を含む配列番号193に示した前駆体タンパク質をコード化する。他の転写物は配列番号194および196に示されており、それぞれ配列番号195および197に示したアミノ酸配列を有する前駆体タンパク質をコード化する。t-PAの成熟配列はシグナル配列およびプロペプチド配列を欠いており、527アミノ酸である。t-PAは血管内皮により分泌され、1本鎖形態として血液中で循環する。多くの他のセリンプロテアーゼとは異なり、t-PAの1本鎖またはプロ酵素形態は、高い触媒有効性を有する。t-PAの活性はフィブリンの存在下で高められる。フィブリンが存在しない場合、1本鎖t-PAは、2本鎖t-PAと比べて約8の活性しか示さないが、フィブリンの存在下ではt-PAの1本および2本鎖形態は類似した活性を示す。Strandbergetal1995JBiolChem、270:23444-23449。すなわち、1本鎖t-PAの活性化は、活性化開裂すなわち、チモーゲン開裂により2本鎖形態を生じさせるか、補因子フィブリンに結合することにより達成され得る。活性化開裂は、アミノ酸Arg275~Ile276位配列番号193に示したアミノ酸配列におけるArg310~Ile311に対応するにあるプラスミン、組織カリクレインおよび活性化因子Xによる開裂後に行われ、t-PAの活性2本鎖形態を生じさせる。2本鎖ポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合により連結されたAおよびB鎖を含む。成熟t-PAは、16のジスルフィド架橋を含み、5つの異なるドメインに組織化されるGethingetal1988、TheEMBOJ、7:2731-2740。成熟タンパク質の残基4~50は、フィンガードメインを形成し、残基51~87はEGF様ドメインを形成し、残基88~175および176~263は、3つのドメイン内ジスルフィド結合をそれぞれ含む2つのクリングルドメインを形成し、成熟分子の残基277~527配列番号193に示した前駆体配列のアミノ酸残基311~562に対応するはセリンプロテアーゼドメインを構成する。細胞性受容体結合活性化因子として作用するu-PAとは対照的に、t-PAは、フィブリン依存的循環活性化酵素として機能する。同様に、t-PAの1本および2本鎖形態は、両方ともそれらの同族体阻害剤、例えばPAI-1による阻害を受けやすいが、2本鎖t-PAは、1本鎖t-PAよりも約14倍速くPAI-1により阻害されるTachiasetal1997JBiolChem、272:14580-5。t-PAは、内皮細胞におけるその細胞性結合部位アネキシンIIに結合することにより阻害から防御され得る。すなわち、t-PAおよびu-PAは両方ともプラスミノーゲンを開裂および活性化するが、血中におけるt-PAの作用は、プラスミノーゲンの主たるフィブリン溶解活性化因子としてt-PAを維持し、u-PAはプラスミノーゲンの主たる細胞活性化因子である。cMT-SP1膜型セリンプロテアーゼMT-SP1マトリプターゼ、TADG-15とも呼ばれる、腫瘍形成性サプレッサー14、ST14は、所望の、または予め定められた開裂配列に対して基質特異性が改変された変異型を選択するための本発明方法での選択を目的とする代表的プロテアーゼである。MT-SP1の配列は、配列番号252に示したものであり、配列番号253に示したアミノ酸配列を有する855アミノ酸ポリペプチドをコード化する。それは、C-末端セリンプロテイナーゼドメインをもつマルチドメインプロテイナーゼであるFriedrichetal2002JBiolChem、2773:2160。プロテアーゼの683アミノ酸変異型は単離されたが、このタンパク質は切頂型形態またはエクトドメイン形態であると思われる。MT-SP1は、前立腺、胸部および結腸直腸癌において高度に発現されるかまたは活性を示し、また乳癌および前立腺癌の転移においてある一定の役割を演じ得る。MT-SP1はまた、ヒト消化管および前立腺における高度の活性および/または発現を伴い様々な上皮組織で発現される。MT-SP1の他の種類も公知である。例えば、MT-SP1のマウス相同体が同定されており、エピシンと呼ばれる。MT-SP1は、配列番号253に示された配列におけるアミノ酸615~854または文献中の変形によっては615~855間に貫膜ドメイン、2つのCUBドメイン、4つのLDLR反復、およびセリンプロテアーゼドメインまたはペプチダーゼS1ドメイン、B-鎖とも呼ばれるを含む。プロテアーゼドメインのアミノ酸配列は配列番号505に示されており、配列番号504に示した核酸配列によりコード化される。MT-SP1は、チモーゲンとして合成され、開裂により二重鎖形態に活性化される。さらに、1本鎖タンパク質分解性ドメインのみが触媒活性および機能性を示す。キモトリプシンのナンバリングに基づき、配列番号253または505に示したMT-SP1の野生型配列に対応するC122Sの突然変異を有する、CB469と呼ばれるMT-SP1変異型は、ファージミドベクターで改善されたディスプレーを呈する。上記の変異型MT-SP1は、配列番号515完全長MT-SP1または配列番号507プロテアーゼドメインに示されており、下記の本発明方法で使用され得る。MT-SP1は、キモトリプシンおよびトリプシンも包含するセリンプロテアーゼのペプチダーゼS1ファミリーキモトリプシンファミリーとも称されるに属する。一般的に、キモトリプシンファミリーメンバーは、キモトリプシンと配列および構造相同性を共有する。MT-SP1については、成熟キモトリプシンのナンバリングにしたがって本明細書では番号付しており、そのプロテアーゼドメインをキモトリプシンのプロテアーゼドメインのそれと並列させ、その残基をそれに応じてナンバリングしている。キモトリプシンのナンバリングに基づくと、活性部位残基はAsp102、His57およびSer195配列番号253のAsp711、His656およびSer805に対応するである。線状アミノ酸配列をキモトリプシンの同配列と並列させ、キモトリプシンのβシートにしたがってナンバリングし得る。挿入および欠失は、ベータシート間のループで行われるが、構造的ファミリー全体を通じて、コアシートは保存される。セリンプロテアーゼは、保存ベータシートの形で基質と相互作用する。6個以下の保存水素結合が、基質と酵素の間で行われ得る。キモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼは全て、触媒活性に必要であるプロテアーゼドメインのそれらのN-末端に保存領域を有するすなわち、IIGG、VVGGまたはIVGG、この4つ組における最初のアミノ酸をキモトリプシンのナンバリングに従って番号付し、Ile16の名称を与える。このナンバリングは前駆体配列の長さを反映するものではない。プロテアーゼドメインにおけるMT-SP1の基質特異性は、ポジショナルスキャン合成コンビナトリアルライブラリーおよび基質ファージディスプレーを用いてマッピングされているTakeuchietal2000JBiolChem275:26333。MT-SP1により認識された基質における開裂残基は、P4にArg/LysおよびP3に塩基性残基またはGln、P2に小残基、P1にArgまたはLys、およびP1にAlaを含む。有効な基質は、P4~P1部位にそれぞれLys-Arg-Ser-Argを含む。一般に、MT-SP1についての基質特異性は一つの傾向を見せており、それによると、P3が塩基性である場合P4は非塩基性である傾向があり、P4が塩基性であるならP3は非塩基性である傾向を示す。例えば、プロテイナーゼ活性化受容体-2PAR-2、1本鎖uPAsc-uPA、MT-SP1のプロ形態および肝細胞増殖因子HGFを含むMT-SP1に関する公知基質は、MT-SP1特異基質に関する開裂配列に適合する。MT-SP1は、選択された合成基質をトリプシンと同じくらい有効に開裂するが、トリプシンよりも基質に関して制限された特異性を呈し得る。MT-SP1の触媒性ドメインは、キモトリプシン様セリンプロテアーゼの全体的な構造的折りたたみを有するが、疎水性/酸性S2/S4サブサイトおよび露出した60ループなど独特の特性を示す。同様に、MT-SP1は、接近し易いLysまたはArg残基にあるペプチド基質を無差別に開裂することはないが、容易に開裂できるペプチド結合周囲のさらなる残基の認識を必要とする。広範な一次配列に関する必要条件は、MT-SP1のその基質に関する特異性を強調している。例えば、MT-SP1は、プロテイナーゼ活性化受容体-2PAR-2Ser-Lys-Gly-ArgのP4~P1標的配列を示すを開裂するが、この酵素が、容易に開裂できる結合付近の広範なMT-SP1特異性と適合する標的配列を示さないPAR-1、PAR-3およびPAR-4などこの基質に密接に関連したタンパク質を活性化することはないFriedrichetal2002JBiolChem277:2160参照。MT-SP1のプロテアーゼドメインは、プロ領域および触媒性ドメインにより構成される。このポリペプチドの触媒活性部分は、成熟タンパク質のアミノ酸残基611にある自動活性化部位の後から始まる例えば、RQARにある配列番号253、次いで残基VVGG参照。MT-SP1とトリプシンのS1ポケットは、LysおよびArgP1残基について良好な相補性をもつという点で類似していることから、トリプシンによる基質開裂におけるある程度の類似性も説明される。P1-Lys残基の適応は、側鎖が追加的水素結合アクセプターを提供することにより、埋没したα-アンモニウム基を安定化させるSer190により伝達されるFriedrichetal2002JBiolChem277:2160参照。S2ポケットは、P2アミノ酸の小~中程度の大きさの疎水性側鎖と適応する形状をしており、一般的にP2位での広い範囲のアミノ酸を受け入れる。基質結合時、Phe99ベンジル基の回転により証明されたところによると、S2サブサイトはそれほど堅固ではない。P3位Glnまたは塩基性残基の場合および4位ArgまたはLys残基の場合の基質アミノ酸は、酵素活性部位クレフトに近づくにつれて特異的塩基性ペプチド基質を有利に前配向させ得るAsp-217および/またはAsp-96の酸性側鎖とのS3およびS4ポケットにおける静電気相互作用が介在すると思われる。P3残基の側鎖はまた、Gln192のカルボキサミド基と水素結合を形成し得るか、または別法として、P3側鎖は、S4サブサイト中へ伸長してPhe97と水素結合を形成することにより、Gly216との主鎖間水素結合を弱体化させ得る。いずれの立体配座でも、塩基性P3側鎖は、MT-SP1S4ポケットの負のポテンシャルと有利に相互作用することができる。同じS4部位からの相互電荷補償および排除は、良好なMT-SP1基質においてP3およびP4にArg/Lys残基が同時に存在する確率が低いことを説明している。一般的に、基質結合性に関する拡張した特異性の一因であるMT-SP1のアミノ酸位置キモトリプシンナンバリングに基づくは以下のものを含む:146および151S1;189、190、191、192、216、226S1;57、58、59、60、61、62、63、64、99S2;192、217、218、146S3;96、97、98、99、100、168、169、170、170A、171、172、173、174、175、176、178、179、180、215、217、224S4。iiシステインプロテアーゼシステインプロテアーゼは、システインスルフヒドリル基を含む触媒機構を有する。近接ヒスチジン残基によるシステインスルフヒドリルの脱プロトン化の後、ペプチドカルボニル炭素でシステインの求核攻撃が始まる。新たなカルボキシ末端をシステインチオールに結合するチオエーテルは、反応の中間体セリンプロテアーゼのアシル-酵素中間体に匹敵するである。システインプロテアーゼは、パパイン、カテプシン、カスパーゼおよびカルパインを含む。パパイン様システインプロテアーゼは、パパインとの構造的類似性により関連したチオール依存的エンドペプチダーゼのファミリーである。それらは、RおよびL右および左のことと標識されたドメインとの2ドメインタンパク質を形成し、両ドメインからのループは基質認識クレフトを形成する。それらは、アミノ酸Cys25、His159およびAsn175により構成される触媒性トライアッドを有する。基質のベータシート立体配座に基づいた標的ペプチドを認識し、タンパク質分解するセリンプロテアーゼとは異なり、このファミリーのプロテアーゼは、基質認識について十分に特定されたポケットを有していない。主たる基質認識は、P2アミノ酸で行われるセリンプロテアーゼにおけるP1残基とは異なる。若干のシステインプロテアーゼヒトカテプシンL、V、K、S、F、B、パパインおよびクルザインの基質特異性は、完全多様性ポジショナルスキャン合成コンビナトリアルライブラリーPS-SCLを用いて測定されている。完全ライブラリーはP1、P2、P3およびP4テトラペプチド基質を含み、それらのうち一つの位置が固定されており、他の三つの位置は20の可能なアミノ酸の等モル混合物によりランダムに存在し、~160000のテトラペプチド配列という全体的多様性を与えている。全般的に、P1特異性は、カテプシン間ではほぼ同一であり、ArgおよびLysは非常に有利であり、小脂肪族アミノ酸は許容される。選択性の多くはP2位置から見出され、ヒトカテプシンは疎水性アミノ酸について厳密に選択的である。興味深いことに、疎水性残基についてのP2特異性は、芳香族アミノ酸、例えばPhe、TyrおよびTrpカテプシンL、Vおよび巨大脂肪族アミノ酸、例えばValまたはLeuカテプシンK、S、F間に分割される。P2位と比べると、P3位での選択性は、著しくストリンジェンシーが低い。しかしながら、プロテアーゼの幾つかは、プロリンカテプシンV、Sおよびパパイン、ロイシンカテプシンB、またはアルギニンカテプシンS、クルザインに対して明確な好みを示す。あるアミノ酸が他よりも優先的に選択されることはないため、プロテアーゼはP4位で拡張した特異性を示す。S2ポケットは、プロテアーゼ基質認識部位の中でも最も選択性が高く、十分に特性確認されている。それは、以下の空間的位置にあるアミノ酸により特定されるパパインのナンバリング:66、67、68、133、157、160および205。205位は、特異性を決定するポケットの底部に埋没した残基である、セリンプロテアーゼにおける189位と類似した役割を演じる。他の特異性決定因子には以下のアミノ酸があるパパインによるナンバリング:61および66S3;19、20および158S1。様々なシステインプロテアーゼについての構造決定因子を表9に列挙する。典型的には、例えばパパインプロテアーゼなどのシステインプロテアーゼの修飾による、拡張特異性結合性ポケットまたは他の二次相互作用部位におけるアミノ酸のいずれか1つまたはそれ以上の改変は、補体タンパク質標的基質を含む標的基質に関するプロテアーゼの特異性または選択性に影響を及ぼす。表9:様々なシステインプロテアーゼに関する構造決定因子E.スクリーニングに関する修飾プロテアーゼおよびコレクションプロテアーゼまたはその変異型は、本発明では所望の基質特異性、多くの場合改変、改善または最適化された基質特異性をもつプロテアーゼの同定に使用され得る。本発明方法で使用する修飾プロテアーゼは、当業界で公知の方法を用いてプロテアーゼの1つまたはそれ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより生成され得る米国特許出願公開第2004/0146938号参照。本発明で提供される修飾用プロテアーゼおよび方法は、例えば、完全長野生型プロテアーゼ、プロテアーゼの公知変異型形態、または触媒活性、例えば基質のタンパク質分解に十分なものであるプロテアーゼのフラグメントを含む。上記修飾プロテアーゼは標的プロテアーゼトラップ、例えばセルピンまたは修飾セルピンに対して個々にスクリーニングされ得るか、またはそれらは、例えば、プロテアーゼのディスプレーが、例えばファージディスプレー、細胞表面ディスプレー、ビーズディスプレー、リボソームディスプレーなどにより行われるコンビナトリアルライブラリーを含むディスプレーライブラリーを用いることにより、コレクションとしてスクリーニングされ得る。安定した共有結合阻害性複合体の形成に起因する、プロテアーゼトラップまたはその修飾形態についての特異性および/または選択性を呈するプロテアーゼの選択は、限定されるわけではないが、アフィニティー標識および/または精製、ELISA、色素原検定法、蛍光に基づく検定法例、蛍光クエンチングまたはFRETなどを含む当業者に公知の検出スキームにより容易にされ得る。1.変異型プロテアーゼの生成プロテアーゼ配列に突然変異を導入する方法の例には、配列全体にランダム突然変異を誘発する方法またはプロテアーゼ配列の選択領域またはドメインのフォーカス突然変異を誘発する方法がある。一例では、プロテアーゼに導入される突然変異の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20である。好ましい実施態様では、突然変異複数も可は高い基質特異性をもたらす。プロテアーゼ変異型の活性が、野生型プロテアーゼの活性に対して少なくとも10倍、100倍または1000倍の割合で高められる例もある。関連した態様では、活性の増加は基質特異性に存する。a.ランダム突然変異誘発ランダム突然変異誘発方法には、例えば大腸菌EcoliXL1レッドの使用、UV照射、例えば脱アミノ化、アルキル化または塩基類似体突然変異原による化学的修飾、またはPCR方法、例えばDNAシャッフル、カセット突然変異導入、位置指定ランダム突然変異導入、またはエラープローンPCRがある例、米国特許出願第2006-0115874号参照。上記の例には、限定されるわけではないが、ヒドロキシルアミンによる化学的修飾RuanHetal1997Gene188:35~39、dNTP類似体の使用ZaccoloMetal1996JMolBiol255:589-603、または市販のランダム突然変異導入キット、例えばGeneMorphPCRベースランダム突然変異導入キットStratageneまたはDiversifyランダム突然変異導入キットClontechの使用がある。Diversifyランダム突然変異導入キットは、反応混合物中におけるマンガンMn2およびdGTPの量を変えることにより所与のDNA配列に関する所望の突然変異率2~8突然変異/1000塩基対の選択を可能にする。最初にマンガンレベルを上昇させると突然変異率は増加し、高濃度のdGTPによりさらに突然変異率は増加する。高率の突然変異率でも、追加ラウンドのPCRを実施することにより達成可能である。b.フォーカス突然変異誘発フォーカス突然変異は、遺伝子配列の予め定められた領域、例えば触媒活性を伝達するプロテアーゼドメインの領域に1つまたはそれ以上の突然変異を誘発することにより達成され得る。一例では、標準的単一または多位置指定突然変異導入キット、例えばQuikChangeStratageneを用いることにより、プロテアーゼのいずれか1つまたはそれ以上のアミノ酸に対し突然変異を誘発する。別の例では、飽和突然変異誘発Zhengetal2004NuclAcidsRes、32:115、例えば活性部位残基の突然変異誘発によりプロテアーゼのいずれか1つまたはそれ以上のアミノ酸に対し突然変異を誘発する。この例では、プロテアーゼのS1~S4ポケットを形成しこの場合、プロテアーゼは、ペプチド基質のP1~P4残基と接触している、そして/または特異性の重要な決定因子であることが示された残基は、あらゆる可能なアミノ酸へと単独または組合わせて突然変異誘発される。中には、活性部位のS1~S4ポケット間には相互作用はあったとしてもほとんど存在しない場合もあり、その結果、各ポケットは、他のポケットとは独立してペプチド基質配列上の対応する残基を認識し、結合すると思われる。すなわち、一般的に特異性決定因子は、他のポケットの特異性に影響することなく一ポケットで変えられ得る。一実施態様では、ポケットの内側を覆う残基複数も可を20の可能なアミノ酸のそれぞれに突然変異させる飽和突然変異誘発技術を使用する例えば、KunklemethodCurrentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileySonsInc、MediaPa参照。上記技術では、選択されたアミノ酸複数も可をコード化する所望のコドン複数も可でのヌクレオチドのランダム化を含む変性突然変異原性オリゴヌクレオチドプライマーが合成され得る。ランダム化スキームの例には、NNS-またはNNK-ランダム化があり、この場合Nは任意のヌクレオチドを表し、Sはグアニンまたはシトシンを表し、Kはグアニンまたはチミンを表すものとする。変性突然変異原性プライマーを、1本鎖DNA鋳型にアニーリングし、DNAポリメラーゼを加えることにより、鋳型の相補鎖を合成する。ライゲーション後、増幅させるため二重鎖DNA鋳型を大腸菌Ecoliに形質転換する。本明細書では、典型的プロテアーゼの拡張基質結合性ポケットを形成するアミノ酸について記載する。一般的に、プロテアーゼの基質特異性は、例えば、プロテアーゼおよび基質の複合体の3次元構造に基づいた分子モデリングにより判明している例えば、Wangetal2001Biochemistry4034:10038;Hopfneretal、StructureFoldDes1999、78:989;Friedrichetal2002JBiolChem2773:2160;Waughetal2000NatStructBiol79:762参照。例えば、MT-SP1のフォーカス突然変異は、195102157189190191192216および22657585960616263649914619221721896979899100168169170170A171172173174175176178179180215217224を含む基質特異性の一因となるいずれか1つまたはそれ以上の残基キモトリプシンナンバリングに基づくで誘発され得る。別の例では、パパインファミリープロテアーゼにおけるアミノ酸残基の突然変異は、66~68、133、157、160および/または215を含むP2特異性に影響を及ぼすいずれか1つまたはそれ以上の残基標準パパインナンバリングで誘発され得る。さらに、プロテアーゼ基質と直接接触しないが、接触残基例えば上記で列挙したものの位置および/または立体配座に影響を及ぼす残基についても、突然変異を誘発することによりプロテアーゼスカホールドの特異性を改変させ得る。別の例において、突然変異誘発用に集中させるアミノ酸は、基質特異性が類似した相同性プロテアーゼの配列比較により選択され得る。共通アミノ酸残基は、相同性タンパク質のアミノ配列のアラインメント、例えば基質結合に関与するプロテアーゼ領域のアラインメントにより同定され得る。典型的には、基質特異性が類似したプロテアーゼは、共通アミノ酸を共有しており、例えば基質結合性ポケットのアミノ酸は、比較したプロテアーゼ間において同一または類似したものであり得る。さらに、基質特異性が異なるプロテアーゼのアミノ酸配列を比較することにより、基質認識に関与し得るアミノ酸が同定され得る。これらの方法を、三次元モデリングなどの方法と組み合わせることにより、突然変異誘発についての標的残基が同定され得る。さらなる例において、フォーカス突然変異誘発は、プロテアーゼスクリーニングの初回ラウンドにおいてホットスポットとして同定されるアミノ酸に制限され得る。例えば、ランダム突然変異誘発コンビナトリアルライブラリーからのプロテアーゼの選択後、典型的には幾つかのホットスポットが観察され、これらはスクリーニング方法で何度も選択される。非常に多くの場合、ランダム突然変異誘発はポリペプチド配列を広い範囲で突然変異させるが、各部位にはごく僅かの突然変異しか導入されていないため、さらなる突然変異導入を目的としてホットスポット位置を特異的にターゲッティングするための第2戦略としてフォーカス突然変異誘発法を用いる。ホットスポット位置でのフォーカス突然変異誘発により、ポリペプチド配列のランダム突然変異誘発後に起こる浅い突然変異誘発とは対照的に、特定位置でのさらに多様で根深い突然変異誘発が可能となる。例えば、飽和突然変異誘発は、例えばこれらの位置にNNt/gまたはNNt/cを含むオリゴを用いることにより、ホットスポットの突然変異誘発に使用され得る。一例では、本発明方法を用いることにより、以下のホットスポットが、高い基質特異性の一因になるものとしてu-PAから同定された:キモトリプシンナンバリングに基づく73、80、30および155。これらの位置の突然変異は、例えば、これらの部位の1つまたはそれ以上での野生型または鋳型プロテアーゼ配列の飽和突然変異誘発を用いて達成され、後続のスクリーニングで使用するプロテアーゼ突然変異体のコレクションが作成され得る。2.変異型プロテアーゼのキメラ形態本発明による変異型プロテアーゼは、キメラまたは融合タンパク質を含み得る。一例では、プロテアーゼ融合タンパク質は、プロテアーゼタンパク質の少なくとも1つの触媒活性部分を含む。別の例では、プロテアーゼ融合タンパク質は、プロテアーゼの少なくとも2つまたはそれ以上の触媒活性部分を含む。融合タンパク質内では、非プロテアーゼポリペプチドがプロテアーゼポリペプチドのN-末端またはC-末端に融合され得る。一具体例では、融合タンパク質は、非プロテアーゼポリペプチドからプロテアーゼを分離する、可撓性ペプチドリンカーまたはスペーサーを含み得る。別の具体例では、融合タンパク質は、標識または検出可能なポリペプチドを含み得る。典型的な標識および検出可能なポリペプチドは、当業界では公知であり、例えば、限定されるわけではないが、ヒスチジン標識、血球凝集素標識、mys標識または蛍光性タンパク質が含まれる。さらに別の具体例では、融合タンパク質は、プロテアーゼ配列がGSTグルタチオンS-トランスフェラーゼ配列のN-末端に融合されているGSTプロテアーゼ融合タンパク質である。上記融合タンパク質は、組換えプロテアーゼポリペプチドの精製を容易にし得る。別の具体例では、融合タンパク質は、プロテアーゼ配列が免疫グロブリンGからのFcドメインのN-末端に融合されているFc融合体である。上記融合タンパク質は、インビボで良好な薬物動力学的特性を有し得る。別の具体例では、融合タンパク質は、そのN-末端に異種シグナル配列を含むプロテアーゼタンパク質である。ある種の宿主細胞すなわち哺乳類宿主細胞では、プロテアーゼの発現および/または分泌は、異種シグナル配列の使用を通じて高められ得る。プロテアーゼキメラまたは融合タンパク質は、標準的組換えDNA技術により製造され得る。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントを、慣用的技術にしたがって、例えばライゲーションに適した平滑末端またはスタッガー末端の使用、適切な末端を形成させるための制限酵素消化、適切な場合の粘着末端の補充、アルカリ性ホスファターゼ処理による望ましくない連結の回避、および酵素ライゲーションを用いることにより、枠内でライゲーションさせる。別の具体例では、自動DNA合成装置を含む慣用的技術により、融合遺伝子を合成し得る。別法として、2つの連続した遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用い、後続的に上記フラグメントをアニーリングおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を生成させることにより、遺伝子フラグメントのPCR増幅を実施し得る例えば、Ausubeletal編CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY、JohnWileySons1992参照。さらに、既に融合部分をコード化する多くの発現ベクターが市販されている例、GSTポリペプチド。プロテアーゼをコード化する核酸を上記の発現ベクターにクローン化することにより、融合部分をプロテアーゼタンパク質と枠内で結合させる。3.コンビナトリアルライブラリーおよび他のライブラリースクリーニング検定法用の化合物の供給源は、限定されるわけではないが、コンビナトリアルライブラリーを含むライブラリーなどのコレクションであり得る。コンビナトリアルライブラリーの合成方法および上記コンビナトリアルライブラリーの特徴は、当業界では公知である一般的には、CombinatorialLibrariesSynthesisScreeningandApplicationPotentialCortese編WalterdeGruyterInc、1995;TietzeおよびLieb、CurrOpinChemBiol、23:363-711998;Lam、AnticancerDrugDes、123:145-671997;BlaneyおよびMartin、CurrOpinChemBiol、11:54-91997;およびSchultzおよびSchultz、BiotechnolProg、126:729-431996参照。プロテアーゼまたは酵素ライブラリー、例えばポジショナルスキャン合成コンビナトリアルライブラリーPSSCLを含む多様なライブラリーを作製する方法および戦略は、分子生物学的方法および/または同時化学合成方法を用いて開発されてきた例えば、Georgiouetal1997NatBiotechnol15:29-34;Kimetal2000ApplEnvironMicrobiol66:788793;MacBeathGPetal1998Science279:1958-1961;SoumillionPLetal1994ApplBiochemBiotechnol47:175-189、WangCIetal1996MethodsEnzymol267:52-68、米国特許第6867010号、同第6168919号、米国特許出願第2006-0024289号参照。作製されたコンビナトリアルライブラリーは、選択された活性を呈する化合物を同定するためスクリーニングにかけられ得る非常に多数の化合物を潜在的に含んでいる。一例では、プロテアーゼのコレクションまたはライブラリーの成分を、ポリペプチド部分を表示し得る、限定されるわけではないが、例えばファージ、ウイルスまたは細菌などの複製可能なベクターを含む遺伝子パッケージで表示させ得る。複数の表示されたポリペプチドは、プロテアーゼまたはその触媒活性部分などのポリペプチドを標的ポリペプチドと結合および/または相互作用させ得る方法で遺伝子パッケージにより表示される。遺伝子パッケージの具体例には、限定されるわけではないが、バクテリオファージ例えば、Clacksonetal25a1991MakingAntibodyFragmentsUsingPhageDisplayLibraries、Nature、352:624-628;Glaseretal1992AntibodyEngineeringbyCondonBasedMutagenesisinaFilamentousPhageVectorSystem、Jimmunol、149:39033913;Hoogenboometal1991MultiSubunitProteinontheSurfaceofFilamentousPhageMethodologiesforDisplayingAntibodyHeavyand30LightChains、NucleicAcidsRes、19:4133-41370参照、バキュロウイルス例えば、Boubliketal1995EukaryoticVirusDisplayEngineeringtheMajorSurfaceGlycoproteinoftheAutographaCaliforniaNuclearPolyhedrosisVirusACNPVforthePresentationofForeignProteinsontheVirusSurface、BioTechnology、13:1079-1084参照、細菌および例えばファージ表示プロテアーゼなどのタンパク質表示に適切な他のベクターがある。例えば、興味の対象であるバクテリオファージには、限定されるわけではないが、T4ファージ、M13ファージおよびHIファージがある。所望により、遺伝子パッケージを例えば細菌性宿主で増幅させてもよい。これらの遺伝子パッケージのいずれか、および当業者に公知の他のものも、プロテアーゼまたはその触媒活性部分を表示させるのに本発明方法で使用される。a.ファージディスプレーライブラリースクリーニングを目的とする、変異型プロテアーゼまたはその触媒活性部分のライブラリーは、限定されるわけではないが、M13、fd、f1、T7およびλファージなどのバクテリオファージ表面で発現され得る例えば、Santini1998JMolBiol282:125-135;Rosenbergetal1996Innovations6:1-6;Houshmandetal1999AnalBiochem268:363-370、Zanghietal2005NucAcidRes3318e160:1-8参照。変異型プロテアーゼは、共有結合、非共有結合または非ペプチド結合でバクテリオファージコートタンパク質に融合され得る。例えば、米国特許第5223409号、Cramerietal1993Gene137:69および国際公開第01/05950号参照。変異型プロテアーゼをコード化する核酸を、コートタンパク質をコード化する核酸と融合させてプロテアーゼ-コートタンパク質融合タンパク質を生成させ得、そこで変異型タンパク質がバクテリオファージの表面から発現される。例えば、変異型プロテアーゼをコード化する核酸は、繊維相M13GeneIIIgIIIp;配列番号512のC-末端ドメインをコード化する核酸に融合され得る。若干の例では、ファージ上での改善されたディスプレーを呈する突然変異体プロテアーゼを鋳型として用いることにより、本明細書記載の突然変異体ファージディスプレーライブラリーを作製する。例えば、実施例8の記載によると、キモトリプシンのナンバリングに基づいた野生型MT-SP1の122位に対応する位置におけるセリンからシステインへの突然変異を有する突然変異体MT-SP1は、改善されたファージディスプレーを呈する。このため、上記突然変異体は、ライブラリーでの多様性をもたらす鋳型として使用され得る。さらに、融合タンパク質に可撓性ペプチドリンカーまたはスペーサー、標識または検出可能なポリペプチド、プロテアーゼ部位または追加のアミノ酸修飾を含ませることにより、融合タンパク質の発現および/または有用性が改善され得る。例えば、プロテアーゼ部位の付加により、選択手順後に所望のバクテリオファージが有効に回収され得る。典型的な標識および検出可能なタンパク質は、当業界では公知であり、例えば、限定されるわけではないが、ヒスチジン標識、血球凝集素標識、myc標識または蛍光生タンパク質が含まれる。別の例では、プロテアーゼ-コートタンパク質融合体をコード化する核酸を、リーダー配列と融合させることにより、ポリペプチドの発現性が改善され得る。リーダー配列の例としては、限定されるわけではないが、STIIまたはOmpAがある。ファージディスプレーは、例えば、Ladneretal、米国特許第5223409号;Rodietal2002CurrOpinChemBiol6:92-96;Smith1985Science228:1315-1317;国際公開第92/18610号;国際公開第91/17271号;国際公開第92/20791号;国際公開第92/15679号;国際公開第93/01288号;国際公開第92/01047号;国際公開第92/09690号;国際公開第92/02809号;deHaardetal1999JBiolChem274:18218-30;Hoogenboometal1998Immunotechnology4:1-20;Hoogenboometal2000ImmunolToday2:371-8;Fuchsetal1991BioTechnology9:1370-1372;Hayetal1992HumAntibodHybridomas3:81-85;Huseetal1989Science246:1275-1281;Griffithsetal1993EMBOJ12:725-734;Hawkinsetal1992JMolBiol226:889-896;Clacksonetal1991Nature352:624-628;Grametal1992PNAS89:3576-3580;Garrardetal1991BioTechnology9:1373-1377;Rebaretal1996MethodsEnzymol267:129-49;Hoogenboometal1991NucAcidRes19:4133-4137;およびBarbasetal1991PNAS88:7978-7982に記載されている。ファージディスプレーに適切な核酸、例えばファージベクターは、当業界では公知である例えば、AndrisWidhopfetal2000JImmunolMethods、28:159-81;Armstrongetal1996AcademicPress、Kayetal編、35-53頁;Coreyetal1993Gene1281:129-34;Cwirlaetal1990ProcNatlAcadSciUSA8716:6378-82;Fowlkesetal1992Biotechniques133:422-8;Hoogenboometal1991NucAcidRes1915:4133-7;McCaffertyetal1990Nature3486301:552-4;McConnelletal1994Gene1511-2:115-8;ScottおよびSmith1990Science2494967:386-90参照。プロテアーゼ-コートタンパク質融合タンパク質、典型的には上記要領で生成されるプロテアーゼ変異型をコード化する核酸のライブラリーは、バクテリオファージのゲノムに組み込まれるか、または別法としてファージミドベクターに挿入され得る。ファージミド系では、ディスプレータンパク質をコード化する核酸は、典型的には6000未満のヌクレオチド長のファージミドベクターで提供される。ファージミドベクターはファージ複製起点を含むため、プラスミドをもつ細菌細胞がヘルパーファージ、例えばM13K01またはM13VCSにより感染したとき、プラスミドはバクテリオファージの粒子中へ組み込まれる。しかしながら、ファージミドは十分なファージ遺伝子のセットを欠いているため、感染後に安定したファージ粒子を生産できない。これらのファージ遺伝子は、ヘルパーファージにより提供され得る。典型的には、ヘルパーファージは、遺伝子IIIコートタンパク質およびファージ複製および組立に必要とされる他のファージ遺伝子の無傷のコピーを提供する。ヘルパーファージは欠陥複製起点を有するため、ヘルパーファージゲノムは、野生型起源を有するプラスミドと比べてあまり効果的にはファージ粒子中へ組み込まれない。例えば、米国特許第5821047号参照。ファージミドゲノムは、ライブラリーのメンバーが感染している細胞の選択を目的として選択可能なマーカー遺伝子、例えばAmpsupRまたはKansupRそれぞれ、アンピシリンまたはカナマイシン耐性に関するを含む。ファージディスプレーの別の例では、発現時に感染性ファージ粒子を製造するのに十分な一連のファージ遺伝子、ファージパッケージングシグナルおよび自律複製配列をコード化する核酸をもつベクターが使用され得る。例えば、ベクターは、ディスプレータンパク質をコード化する配列を含むように修飾されたファージゲノムであり得る。さらにファージディスプレーベクターは、外来核酸配列が挿入され得る部位、例えば制限酵素消化部位を含む多クローニング部位を含み得る。例えばファージベクターにおいてディスプレータンパク質をコード化する外来核酸配列は、リボソーム結合部位、シグナル配列例、M13シグナル配列および転写ターミネーター配列に結合され得る。ベクターは、プロテアーゼおよびファージコートタンパク質の一部分を含み、調節可能なプロモーターに機能し得るように結合されたポリペプチドをコード化する配列を含むように標準クローング技術により構築され得る。若干の例では、ファージディスプレーベクターは、ファージコートタンパク質の同じ領域をコード化する2つの核酸配列を含む。例えば、ベクターは、ディスプレータンパク質をコード化する配列に機能し得るように結合させた位置に上記領域をコード化する一配列を、そしてコートタンパク質をコード化する機能的ファージ遺伝子例、野生型ファージ遺伝子の状況において上記領域をコード化するもう一つの配列を含む。野生型および融合コートタンパク質の両方の発現は、一ファージ粒子につき製造される融合タンパク質の量を減らすことにより成熟ファージの生産を助け得る。上記方法は、融合タンパク質に対するファージの耐容性が低い状況において特に有用である。ファージディスプレー系は、典型的には繊維状ファージ、例えばM13、fdおよびf1を利用する。繊維状ファージを用いる若干の例では、ディスプレータンパク質を、ファージコートタンパク質アンカードメインに融合させる。融合タンパク質は、同じアンカードメインを有する別のポリペプチド、例えば野生型またはコートタンパク質の内生コピーと共発現され得る。タンパク質ディスプレーに使用され得るファージコートタンパク質は、i繊維状ファージの小コートタンパク質、例えば遺伝子IIIタンパク質gIIIpおよびii繊維状ファージの主コートタンパク質、例えば遺伝子VIIIタンパク質gVIIIpを含む。遺伝子VIタンパク質、遺伝子VIIタンパク質または遺伝子IXタンパク質などの他のファージコートタンパク質への融合体も使用され得る例、国際公開第00/71694号参照。これらのタンパク質の一部分例、ドメインまたはフラグメントもまた使用され得る。有用な部分はファージ粒子へ安定して組み込まれるドメインを含むため、例えば、融合タンパク質は選択手順全体を通して粒子中に残存する。一例では、gIIIpのアンカードメインを使用する例えば、米国特許第5658727号および下記実施例参照。別の例では、gVIIIpを使用する例えば、米国特許第5223409号参照が、これはディスプレータンパク質に融合させた成熟完全長gVIIIpであり得る。繊維状ファージディスプレー系は、典型的にはタンパク質融合体を用いることにより、異種アミノ酸配列をファージコートタンパク質またはアンカードメインに結合させる。例えば、ファージは、シグナル配列、異種アミノ酸配列およびアンカードメイン、例えばgIIIpアンカードメインをコード化する遺伝子を含み得る。発現された融合タンパク質の価数は、ファージコートタンパク質の選択により制御され得る。例えば、gIIIpタンパク質は、典型的には1ビリオンにつき3~5コピーの割合でファージコートへ組み込まれる。すなわち、変異型プロテアーゼへのgIIIpの融合により、価数は低くなる。これに比べて、gVIIIタンパク質は、典型的には1ビリオンにつき2700コピーの割合でファージコートに組み込まれるMarvin1998CurrOpinStructBiol8:150-158。gVIIIpは価数が高いため、10残基を超えるペプチドの場合、一般的にファージの耐容性は良くない。ファージミド系は、コートタンパク質の野生型コピーを提供して融合タンパク質の価数を減少させることにより、大型ペプチドに対するファージの耐容性を高めるのに使用され得る。さらに、大型ペプチドの発現用に最適化されたgVIIIpの突然変異体も使用され得る。かかる一例として、改善された表面ディスプレー特性をもつgVIIIpについての突然変異誘発スクリーンにおいて突然変異体gVIIpを得たSidhuetal2000JMolBiol296:487-495。調節可能なプロモーターもディスプレータンパク質の価数の制御に使用され得る。調節された発現を利用することにより、ディスプレータンパク質の価数が低いファージが製造され得る。多くの調節可能な例、誘導性および/または抑制性プロモーター配列が知られている。上記配列は、使用者の介入により、例えば環境的パラメーター、例えば温度の操作により、または刺激性分子の添加またはリプレッサー分子の除去により活性が改変または調節され得る調節可能なプロモーターを含む。例えば、内在性化学的化合物を加えることにより、プロモーターによっては転写が調節される場合もあり得る。調節可能なプロモーターは、1つまたはそれ以上の転写アクチベーターまたはリプレッサータンパク質に関する結合部位を含み得る。転写因子結合部位を含む合成プロモーターが構築され得、これらも調節可能なプロモーターとして使用され得る。調節可能なプロモーターの具体例には、環境的パラメーター、例えば温度変化、ホルモン、金属、代謝物、抗生物質または化学的薬剤に応答するプロモーターがある。大腸菌Ecoliでの使用に適した調節可能なプロモーターには、lac、tac、trp、trcおよびtetオペレーター配列またはオペロンからの転写因子結合部位を含むプロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーターpho、アラビノースプロモーター、例えばaraBADプロモーター、ラムノースプロモーター、プロモーターそれ自体、またはその機能性フラグメントがある例えば、Elvinetal1990Gene37:123-126;TaborおよびRichardson1998ProcNatlAcadSciUSA1074-1078;Changetal1986Gene44:121-125;LutzおよびBujard、1997NuclAcidsRes25:1203-1210;DVGoeddeletal1979ProcNatAcadSciUSA、76:106-110;JDWindassetal1982NuclAcidsRes、10:6639-57;RCrowletal1985Gene、38:31-38;Brosius1984Gene27:161-172;AmannaおよびBrosius1985Gene40:183-190;Guzmanetal1992JBacteriol、174:7716-7728;Haldimannetal1998JBacteriol、180:1277-1286参照。例えば、lacプロモーターは、乳糖または構造上関連した分子、例えばイソプロピル-ベータ-D-チオガラクトシドIPTGにより誘導され得、グルコースにより抑制される。誘導性プロモーターには、抑制解除過程、例えばリプレッサー分子の不活化により誘導されるものもある。調節可能なプロモーター配列はまた、間接的に調節され得る。間接的調節用に遺伝子工学的に製造され得るプロモーターの例には、ファージラムダPR、PL、ファージT7、SP6およびT5プロモーターがある。例えば、調節配列は、発現が例えば環境的パラメーターにより調節される因子により抑制または活性化される。上記プロモーターの一例はT7プロモーターである。T7RNAポリメラーゼの発現は、環境応答性プロモーター、例えばlacプロモーターにより調節され得る。例えば、細胞は、T7RNAポリメラーゼをコード化する配列および環境的パラメーターにより調節される調節配列例、lacプロモーターを含む異種核酸を含み得る。またT7RNAポリメラーゼの活性は、RNAポリメラーゼの天然阻害剤、例えばT7リゾチームの存在により調節され得る。別の立体配置では、環境的パラメーターにより調節されるように、ラムダPLに遺伝子操作を加え得る。例えば、細胞は、ラムダリプレッサーの温度感受性変異型をコード化する核酸配列を含み得る。細胞を非許容性温度に上昇させると、PLプロモーターは抑制から解放される。プロモーターまたは転写調節配列の調節特性は、リポータータンパク質または検出可能なタンパク質をコード化する配列にプロモーターまたは配列を機能し得るように結合することにより容易に試験され得る。このプロモーターリポート融合配列を、細菌細胞、典型的にはプラスミドまたはベクターに導入し、リポータータンパク質の存在量を様々な環境条件下で評価する。有用なプロモーターまたは配列は、ある種の条件で選択的に活性化または抑制されるものである。若干の実施態様では、非調節可能プロモーターも使用される。例えば、関連性のある条件下で適切な量の転写を誘導するプロモーターが選択され得る。非調節可能プロモーターの一例はgIIIプロモーターである。b.細胞表面ディスプレーライブラリースクリーニング用の変異型プロテアーゼのライブラリーは、細胞、例えば原核生物または真核生物細胞の表面で発現され得る。細胞表面発現用の典型的細胞には、限定されるわけではないが、細菌、酵母、昆虫細胞、鳥類細胞、植物細胞、および哺乳類細胞があるChenおよびGeorgiouBiotechnolBioeng79:496-503。一例では、発現用の細菌細胞は大腸菌Echerichiacoliである。変異型プロテアーゼは、細胞表面で発現されるタンパク質、例えば膜タンパク質または細胞表面性タンパク質との融合タンパク質として発現され得る。例えば、変異型プロテアーゼは、大腸菌Ecoli外膜タンパク質例、OmpA、主要大腸菌Ecoliリポタンパク質Lppおよび外膜タンパク質OmpAの遺伝子工学的ハイブリッド分子または細胞表面性タンパク質例、線毛および鞭毛サブユニットとの融合タンパク質として大腸菌Ecoliで発現され得る。一般的に、細菌性外膜タンパク質を異種ペプチドまたはタンパク質のディスプレーに使用するとき、それは、担体タンパク質の許容部位への遺伝子挿入を通じて達成される。ペプチドまたはタンパク質は、タンパク質のN-またはC-末端での融合と比べて許容部位への挿入時により束縛されるため、異種ペプチドまたはタンパク質の発現は、挿入されたタンパク質ドメインの構造特性に左右される。融合タンパク質の修飾は、融合タンパク質の発現性を改善するように行われ得るもので、例えば可撓性ペプチドリンカーまたはスペーサー配列の挿入または細菌性タンパク質の修飾例、アミノ酸配列における突然変異誘発、挿入または欠失がある。酵素、例えばβ-ラクタマーゼおよびセルロモナスフィミCellulomonasfimiのCexエキソグルカナーゼは、大腸菌Ecoliの表面でLpp-OmpA融合タンパク質として有効に発現されているFranciscoJAおよびGeorgiouGAnnNYAcadSci745:372-3821994およびGeorgiouGetalProteinEng9:239-2471996。15~514アミノ酸の他のペプチドは、OmpAの表面における第2、第3および第4外側ループでディスプレーされているSamuelsonetal、JBiotechnol96:129-1542002。すなわち、外膜タンパク質は、細菌の外部表面で異種遺伝子産物を担い、ディスプレーし得る。別の例では、変異型プロテアーゼを、エヌゴノロエIgA1プロテアーゼ、セラティアマルセセンスセリンプロテアーゼ、シゲラフレキシネリVirGタンパク質および大腸菌接着AIDA-Iなどのタンパク質のオートトランスポータードメインに融合させ得るKlauseretalEMBOJ19911999ShikataSetalJBiochem114723731SuzukiTetalJBiolChem2703087430880およびMaurerJetalJBacteriol179794804。他のオートトランスポータータンパク質には、グラム陰性菌例、大腸菌Ecoli、サルモネラ血清型ティフィムリウム、およびシゲラフレキシネリに存在するものがある。β-ラクタマーゼなどの酵素は、この系を用いて大腸菌Ecoliの表面で有効に発現されている37263733。細菌に遺伝子組換えを加えることにより、膜融合タンパク質などの融合タンパク質を発現させることができる。変異型プロテアーゼをコード化する核酸は、細胞表面タンパク質、例えば、限定されるわけではないが、細菌性OmpAタンパク質をコード化する核酸に融合され得る。変異型プロテアーゼをコード化する核酸は、膜タンパク質における許容性部位、例えば膜タンパク質の細胞外ループに挿入され得る。さらに、融合タンパク質をコード化する核酸は、標識または検出可能なタンパク質をコード化する核酸に融合され得る。上記の標識および検出可能なタンパク質は当業界では公知であり、例えば、限定されるわけではないが、ヒスチジン標識、血球凝集素標識、myc標識または蛍光性タンパク質がある。融合タンパク質をコード化する核酸は、細菌で発現させるためのプロモーターへ機能し得るように結合され得る。例えば、核酸は、融合タンパク質発現用プロモーターおよび所望による選択用、例えば抗生物質耐性に関する追加的遺伝子を運び得るベクターまたはプラスミドへ挿入され得る。例えば電気穿孔または化学的形質転換法により、細菌は上記プラスミドで形質転換され得る。上記技術は、当業者には公知である。外膜または周辺腔におけるタンパク質は、通常未成熟タンパク質として細胞質で合成され、シグナル配列で開裂されることにより、成熟タンパク質を生じ、これが細胞質外へ輸送される。大腸菌Ecoliに関する組換えタンパク質の分泌的生産に使用される典型的シグナル配列は公知である。興味の対象である遺伝子がシグナル配列と正確に融合されているとき、Met伸長を伴わないN-末端アミノ酸配列は、シグナルペプチダーゼによる開裂後に生成され得る。すなわち、成熟タンパク質は、興味の対象であるタンパク質のアミノ酸配列を変えなくても製造され得るChoiおよびLeeApplMicrobiolBiotechnol64625635。他の細胞表面ディスプレー系は当業界では公知であり、限定されるわけではないが、氷核タンパク質Inpに基づく細菌表面ディスプレー系LebeaultJMNatBiotechnol1657680、酵母ディスプレー例、酵母Aga2p細胞壁タンパク質との融合体;米国特許第6423538号参照、昆虫細胞ディスプレー例、バキュロウイルスディスプレー;ErnstetalNucleicAcidsResearchVol26Issue717181723参照、哺乳類細胞ディスプレー系、および他の真核生物ディスプレー系例えば、5789208号および国際公開第03/029456号参照がある。c.他のディスプレーライブラリーまた、変異型プロテアーゼのライブラリー、例えば、変形が本発明により設計されたものであるライブラリーをスクリーニングするための他のディスプレー方式を用いることも可能である。具体例としての他のディスプレー方式には、核酸-タンパク質融合、リボザイムディスプレー例えば、HanesおよびPluckthunProcNatlAcadSciUSA1349374942参照、ビーズディスプレーLamKSetalNature3548284KSetalNature3548284HoughtenRAetalNature3548486FurkaAetalIntJPeptideProteinRes37487493LamKSetalChemRev97411448米国特許出願公開第20040235054号およびタンパク質アレイ例えば、CahillJImmunolMeth2508191、国際公開第0140803号、国際公開第9951773号、および米国特許出願20020192673A1参照がある。他の特異的な場合では、代わりにプロテアーゼ、変異型プロテアーゼまたは触媒活性部分またはファージライブラリーまたは変異型プロテアーゼを発現する細胞を固体支持体に結合させるのが有利であり得る。例えば、若干の例では、変異型プロテアーゼを発現する細胞をビーズに自然吸着させ得、その結果、ビーズの集団は1ビーズにつき1細胞を含むことになるFreemanetalBiotechnolBioeng86196200。ガラス支持体に固定した後、微細コロニーを成長させ、色素原または蛍光原基質によるスクリーニングにかけ得る。別の例では、変異型プロテアーゼまたはファージライブラリーまたは変異型プロテアーゼを発現する細胞を、タイタープレート中へ配列させ、固定化し得る。F.選択されたプロテアーゼの接触、単離および同定方法プロテアーゼまたはその触媒活性部分をディスプレーする複数のコレクションまたはライブラリーを選択および調製した後、ライブラリーを用いて、標的プロテアーゼトラップポリペプチドをプロテアーゼ成分と接触させる。例えばプロテアーゼトラップポリペプチド、例えば所望の開裂配列を有するようにそのRSLループにおいて突然変異させたセルピンを含む標的基質を、基質特異性が改変されたプロテアーゼの選択用にディスプレーされたプロテアーゼライブラリーと接触させる。プロテアーゼおよびプロテアーゼトラップポリペプチドを、懸濁液、溶液中、または固体支持体を介して接触させ得る。これらの成分を十分な時間、温度または濃度で接触させることにより、相互作用、それに続いて開裂反応が起こり、選択されたプロテアーゼとプロテアーゼトラップポリペプチドの安定した中間複合体が形成され得る。反応を維持させるストリンジェンシーは、反応温度、プロテアーゼトラップポリペプチド阻害剤の濃度、競合物質含まれる場合の濃度、混合物中におけるプロテアーゼコレクションの濃度およびインキュベーションの時間の長さのうちの1つまたはそれ以上のパラメーターを変えることによりモジュレーションされ得る。プロテアーゼトラップポリペプチドと共有結合複合体を形成する選択されたプロテアーゼを捕捉し、単離する。捕捉し易くするため、スクリーニングに用いるプロテアーゼトラップポリペプチドを溶液中、懸濁液中で供給するか、または検定方法に適切な場合固体支持体に結合させ得る。例えば、プロテアーゼトラップポリペプチドを、固体支持体、例えば1個またはそれ以上のビーズまたは粒子、ミクロスフィア、管またはプレートの表面、フィルター膜、および当業界で公知の他の固体支持体に結合させ得る。具体例としての固体支持体系には、限定されるわけではないが、マルチウェルプレートまたは膜を含む、例えばガラス、珪素、金属、ナイロン、セルロース、プラスチックまたは合成物で構築された平坦表面があり、またはシリカゲル、制御型多孔質ガラス、マグネチックDynabeadまたはセルロースビーズなどのビーズ形態であり得る。上記方法は、懸濁液中またはカラム形態での使用にも適合化され得る。標的プロテアーゼトラップポリペプチドは、直接的または間接的に固体支持体、例えばポリアクリルアミドビーズに結合され得る。結合には共有結合または非共有結合的方法を使用し得る。標的化合物の共有結合的結合方法には、化学的架橋方法がある。反応性試薬は、標的分子上の官能基と支持体の間に共有結合を形成させ得る。化学反応し得る官能基の例には、アミノ、チオールおよびカルボキシル基がある。N-エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、N-ヒドロスクシンイミドおよびグルタルアルデヒドは、官能基と反応する試薬の例である。他の例では、標的基質は、例えば、限定されるわけではないが、免疫親和力またはリガンド-受容体相互作用例、ビオチン-ストレプトアビジンまたはグルタチオンS-トランスフェラーゼ-グルタチオンなどの方法により固体支持体に間接的に結合され得る。例えば、プロテアーゼトラップポリペプチドは、ELISAプレートまたは他の類似したアドレス可能なアレイへコーティングされ得る。一例では、プレートのウェルは、プロテアーゼトラップポリペプチドは、と結合し、それを捕捉する親和性捕捉剤でコーティングされ得る。実施例9は、ビオチニル化抗His抗体でストレプトアビジン含有プレートをコーティングすることにより、His標識を含むプロテアーゼトラップポリペプチドの捕捉を容易にする方法を具体的に説明している。固体支持体へのプロテアーゼトラップポリペプチドの結合は、それらが変異型プロテアーゼまたはファージライブラリーまたは変異型プロテアーゼを発現する細胞と接触する前、間または後に実施され得る。例えば、変異型プロテアーゼとのインキュベーション前に、標的基質を固体支持体、例えばクロマトグラフィーカラムに予め吸収させ得る。他の例では、標的基質を変異型プロテアーゼに結合させた後に固体支持体の結合を行う。上記の例では、複合体を形成した基質-プロテアーゼ対を含む固体支持体を洗浄することにより、未結合プロテアーゼを除去し得る。複合体は、当業者に公知の方法により、例えば希酸で処理し、中和するかFuetalJBiolChem2722567825684またはトリエチルアミンChiswelletalTrendsBiotechnol108084で処理することにより固体支持体から回収され得る。この段階を最適化することにより、固体基質からのディスプレー供給源の再生可能で定量的な回収が確実に行われ得る。例えば、固体支持体に結合された標的基質へのディスプレー供給源の結合は、当業者に周知の方法を用いて、例えばファージに対する、例えばM13ファージに対する抗体例、NewEnglandBiolabs、マサチューセッツおよび標準ELISA例えば、AusubeletalCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsニューヨーク参照を用いることにより独立的に監視され得る。基質-プロテアーゼ複合体を捕捉および単離する別の方法は溶液によるものである。典型的には、上記方法では、プロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型を、例えば、少量の適切な結合緩衝液すなわち、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500マイクロリットルまたはそれ以上中でプロテアーゼのコレクションと接触させるが、その液中では、各プロテアーゼトラップポリペプチドは、その同定および単離を目的とする予め定められたマーカー、標識または他の検出可能な部分と会合している。検出可能な部分は、基質-プロテアーゼ複合体の検出および単離を容易にするものであればいかなる部分でもよい。例えば、上記部分は、標識に特異的な抗体が存在するエピトープ標識であり得るすなわち、myc-標識、His-標識など。抗体を固体支持体、例えばビーズに結合させることにより、安定した複合体の捕捉が容易になり得る。他の類似した戦略も使用され得、例としては、標的基質をビオチンで標識し、磁気ビーズまたはマイクロタイタープレートなどの固体支持体に結合させたストレプトアビジンを用いて捕捉するか、またはポリヒスチジン例、His6-標識で標識し、限定されるわけではないが、硫酸ニッケルNiSO4、塩化コバルトCoCl2、硫酸銅CuSO4または塩化亜鉛ZnCl2などの金属キレート剤を用いて捕捉する方法がある。捕捉剤は、大型ビーズ、例えばセファロースビーズにカップリングされ得、その結果結合ビーズの単離は遠心分離により容易に達成され得る。別法として、捕捉剤は、磁気カラムを用いて容易に単離され得る小型ビーズ、例えば磁気ビーズすなわち、MiltenyiBiotecにカップリングされ得る。さらに、上記部分は蛍光性部分であり得る。例えば、ディスプレー系によっては、例えば、細胞表面ディスプレー系では、蛍光性標識により、蛍光活性化細胞選別法FACS例えば、LevinetalMolecularBioSystems24957参照による選択された複合体の単離が容易になり得る。場合によっては、1つまたはそれ以上の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドを、プロテアーゼのコレクションと接触させることもあり、その場合、プロテアーゼトラップポリペプチドはそれぞれ異なる検出部分と会合しているため、1つまたはそれ以上のプロテアーゼトラップポリペプチド-プロテアーゼ複合体が個々に単離され得る。それぞれ異なる目的RSL開裂配列をもつ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドを単一反応物中に含ませることができれば、同時に何百または何千のうちから10の共有結合複合体を検出および単離することが可能となる。プロテアーゼトラップポリペプチドとの共有結合複合体として捕捉されている、選択されたプロテアーゼは、プロテアーゼのコレクションからの非複合体形成プロテアーゼから分離され得る。次いで、選択されたプロテアーゼを増幅することにより、選択されたプロテアーゼは同定され易くなり得る。プロテアーゼトラップポリペプチドに対し複合体を形成していないプロテアーゼを除去した後、プロテアーゼがディスプレーされている物質の供給源すなわち、ファージ、細胞、ビーズなどを適切な宿主細胞で増幅および発現させる。例えば、プロテアーゼがファージでディスプレーされている場合、一般的にはプロテアーゼトラップポリペプチドとの複合体におけるプロテアーゼ-ファージを、宿主細胞とインキュベーションすることにより、ファージを吸着させ、次いで少量の栄養ブロスを加え、培養物を撹拌することにより、増殖性宿主でのファージプローブDNA複製が促進される。例によっては、ファージの存在下でこれを行うことにより、宿主細胞を確実にファージにより感染させる場合もある。このインキュベーション後、培地に抗生物質および/または誘導物質を補足する。ファージプロテアーゼゲノムはまた、ファージプロテアーゼDNAを維持する細菌細胞の選択的増殖を可能にするために、抗生物質に対する耐性をコード化する遺伝子を含み得る。典型的には、選択されたプロテアーゼを含むファージ上清の供給源としてファージを増幅させる場合、ファージのレスキューがヘルパーファージの使用により要求される。例によっては、レスキュー段階を伴わずに選択されたプロテアーゼの存在について検定することが可能な場合もある。例えば、選択または同定されたプロテアーゼを含む捕捉された複合体と宿主細胞、例えば細菌のインキュベーションおよび選択物質の存在下における増殖後、ペリプラズムまたは細胞培養培地を、選択されたプロテアーゼの供給源として直接サンプリングすることにより、例えば、プロテアーゼ活性を測定することができる。上記手順は実施例17に記載されている。さらに、例えば細菌宿主におけるディスプレー供給源の増幅は、様々な方法で最適化され得る。例えば、マイクロウェルなどにおいて検定材料に加える細菌の量を、結合段階から回収されたファージ供給源よりかなり多くすることにより、ファージゲノムの定量的形質導入が確実に行われ得る。ファージが選択されたとき、所望により形質導入効率を測定してもよい。増幅段階は、ディスプレー供給源のゲノム、例えばファージゲノムを増幅させるため、関連したシグネチャーポリペプチドを過剰発現させ、例えばDNA配列決定によりその同定を行い得る。ふるい分け方法を用いることにより、標的タンパク質、例えばプロテアーゼトラップポリペプチドまたはそのRSL変異型と相互作用するプロテアーゼまたはその触媒活性部分が迅速に選択される。例えば、ファージディスプレーポリペプチド、例えばファージディスプレープロテアーゼのライブラリーを、表面結合または可溶性標的タンパク質とインキュベーションし、未結合ファージを洗い流し、特異的かつ共有結合的に結合したファージを溶離することにより、ふるい分けを行う。次いで、溶離されたファージを例えば宿主感染を介して増幅させ、さらにふるい分けおよび増幅の追加的周期にかけることにより、標的ポリペプチドに関して最高の親和力をもつものについてファージのプールを連続的に強化する。数ラウンドの後、個々のクローンが、例えばDNA配列決定により同定され、それらの活性が例えば下記G項に示した方法により測定され得る。一旦選択されたプロテアーゼが同定されると、それをディスプレー供給源から精製し、活性について試験し得る。一般的に、上記方法は、生化学的および組換えDNA技術を含み、当業者には常用的なものである。一方法では、ポリエチレングリコールPEG沈殿を用いることにより、精製した選択されたファージ上清中に混入している可能性のあるプロテアーゼ活性が除去され得る。上記の例では、ヘルパーファージの存在下でのファージレスキュー後、選択されたプロテアーゼを含むファージ上清をPEGの存在下で沈殿させ得る。当業者であれば、特定の沈殿適用に要求されるPEGのパーセンテージを決定できるはずである。一般的に、プロテアーゼ上清の沈殿について、20PEGを使用する。若干の例では、レスキューファージ上清または細菌細胞ペリプラズムまたは細胞培地ファージレスキューを伴わないからの上清を、本明細書記載の要領でプロテアーゼ活性について検定し得る。別法として、またはさらに、選択されたプロテアーゼは、上清または他の供給源から精製され得る。例えば、選択されたプロテアーゼドメインをコード化するDNAをディスプレー供給源から単離することにより、選択されたタンパク質の精製を行い得る。例えば、上記で示した選択されたファージによる大腸菌Ecoli宿主細胞の感染後、個々のクローンを採取し、当業者に公知の方法を用いてプラスミド精製用に成長させ、必要ならば大量に、例えばMidiPlasmidPurificationKitQiagenを用いて製造し得る。精製したプラスミドをDNA配列決定に使用することにより、変異型プロテアーゼの配列を同定するか、またはこれを用いて発現用の細胞、例えば限定されるわけではないが、哺乳類発現系へトランスフェクションすることが可能である。必要ならば、1または2段階PCRを実施することにより、選択された配列を増幅させ得、これを選択された発現ベクターにサブクローニングし得る。PCRプライマーは、例えば制限酵素部位の付加を含ませることによりサブクローニングを容易にするように設計され得る。実施例4は、完全長u-PA遺伝子の増幅および精製を実施するための2段階PCR手順の具体例を説明しており、選択されたプロテアーゼファージはu-PA遺伝子のプロテアーゼドメインのみを含んでいた。例えば下記で詳述している発現に適切な細胞へのトランスフェクション後、プロテアーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分を含む条件培地を活性検定法で試験するか、またはさらなる精製に使用し得る。さらに、必要ならば、それに応じてプロテアーゼをプロセッシングし、例えば1本鎖形態の開裂により活性プロテアーゼから2本鎖形態を生成させ得る。上記操作は当業者には公知である。例えば、1本鎖u-PAは、本明細書に記載されているプラスミンの開裂に関し活性にされ得る。1.反復スクリーニング本発明方法では、反復スクリーニングを用いてプロテアーゼの修飾を最適化する。すなわち、反復スクリーニング方法では、様々なパラメーターのもと、例えば種々のプロテアーゼトラップポリペプチドまたは競合物質を用いることにより、複数回ふるい分け反応を実施することによりプロテアーゼを進化させ得る。上記の反復スクリーニング方法では、プロテアーゼコレクションは、スクリーニングの連続ラウンドにおいて一定に保たれ得る。別法として、上記ラウンドで同定された選択されたプロテアーゼのみを含ませ、そして/または初回ラウンドで同定された鋳型プロテアーゼと比べてさらなる突然変異が加えられている突然変異体プロテアーゼの新たなコレクションを作製することにより、新たなプロテアーゼコレクションを形成させ得る。一例において、プロテアーゼライブラリーの初回スクリーニングでは、プロテアーゼの特異性を改変する1つまたはそれ以上の突然変異を含む変異型プロテアーゼを同定し得る。次いで、第2ラウンドライブラリー合成を実施し得、そこでは1つまたは複数の突然変異のアミノ酸位置は一定に保たれ、フォーカスまたはランダム突然変異がタンパク質または所望の領域または残基の残りで誘発され得る。追加ラウンドのスクリーニングの後、選択されたプロテアーゼは、ライブラリー合成およびスクリーニングのさらなるラウンドにかけられ得る。例えば、ライブラリー合成およびスクリーニングの2、3、4、5またはそれ以上のラウンドを実施し得る。若干の例では、改変された基質に対する変異型プロテアーゼの特異性を各選択ラウンドによりさらに最適化することもある。反復スクリーニングの別の方法の場合、プロテアーゼコレクションの初回スクリーニングは、中間体プロテアーゼトラップポリペプチドに対するものであり、中間体基質に対するプロテアーゼの特異性を改変する1つまたはそれ以上の突然変異を含む変異型プロテアーゼが同定され得る。選択されたプロテアーゼ複合体を単離し、成長させ、適切な宿主細胞で増幅させ、さらに標的ポリペプチドの完全開裂配列を含むプロテアーゼトラップポリペプチドに対するスクリーニングの第2ラウンドでのプロテアーゼコレクションとして使用し得る。例えば、上記方法は、VEGFR開裂配列についての基質特異性を有するプロテアーゼを選択するのに使用され得、その場合ふるい分けの1回またはそれ以上のラウンドはRRARM中間体開裂配列に対するものであり、ふるい分けの後続ラウンドは、VEGFR2開裂配列RRVRを含むプロテアーゼトラップポリペプチドに対して実施される。反復スクリーニングの追加的な例では、2種またはそれ以上の異なるポリペプチドについての異なる基質認識または開裂配列を含む2つまたはそれ以上のプロテアーゼトラップポリペプチドを、オルターナティブラウンドのふるい分け方法で使用する。上記方法は、2種の異なる基質に関して選択性を有するように最適化されたプロテアーゼを選択するのに有用である。選択された変異型は、典型的には狭い特異性を有するが、2つまたはそれ以上の基質認識配列に対する高い活性を有する。上記方法では、第1の予め定められた基質特異性をもつプロテアーゼを選択するように修飾された、第1プロテアーゼトラップポリペプチドに対するプロテアーゼコレクションの初回スクリーニングでは、プロテアーゼの特異性を改変する1つまたはそれ以上の突然変異を含む変異型プロテアーゼを同定し得る。選択されたプロテアーゼを単離し、成長させ、適切な宿主細胞で増幅させ、さらに第2の予め定められた基質特異性をもつプロテアーゼを選択するように修飾された第2プロテアーゼトラップポリペプチドに対するスクリーニングの第2ラウンドでのプロテアーゼコレクションとして使用し得る。本方法で使用する第1および第2プロテアーゼトラップポリペプチドは同一または異なり得るが、それぞれその反応性部位が、異なる標的基質の基質認識部位すなわち、開裂配列を模倣するように異なる形で修飾されている。例によっては、選択におけるストリンジェンシーが、競合物質、例えば、本明細書記載の厳密または広範な競合物質の存在下で高められることもある。2.選択されるプロテアーゼの具体例本発明は、改変および/または改善された基質特異性を有するものとして本発明方法で同定される変異型u-PAおよびMT-SP1ポリペプチドを提供する。上記変異型u-PAおよびMT-SP1ポリペプチドは、標的タンパク質の選択されたか、または所望の開裂配列に関して高い特異性を有するものとして同定された。上記標的タンパク質の例には、限定されるわけではないが、VEGFRまたは補体タンパク質、例えば、補体タンパク質C2における開裂配列がある。修飾セルピンは、本発明の選択方法で変異型プロテアーゼを同定するのに使用され得る。上記の修飾セルピンの例は、上記で述べたところによると、標的タンパク質、例えば、VEGFRまたはC2に関する開裂配列を含むようにRSLが修飾されたPAI-1またはAT3である。上記の選択された修飾プロテアーゼは、選択された修飾を含まない鋳型または出発プロテアーゼと比べて標的タンパク質における開裂配列について改変された、典型的には改善された基質特異性を呈する。下記によると、特異性は典型的には高く、選択された標的基質対非標的基質に関する野生型または鋳型プロテアーゼの特異性と比較したとき、一般に少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000倍またはそれ以上である。a.変異型u-PAポリペプチド例えば、本発明で提供される変異型u-PAポリペプチドは、天然P4~P1反応性部位アミノ酸を所望の、または選択された標的タンパク質のアミノ酸と置換することによりそのRSL配列が修飾された突然変異体セルピンポリペプチドについて高い反応性を有するように選択された。一例では、修飾PAI-1ポリペプチドの選択に対して変異型u-PAポリペプチドが同定された。本発明によるu-PA選択方法で使用する修飾PAI-1ポリペプチド分子の例には、例えば、その天然P4~P1残基VSARM配列番号378が、中間体VEGFR-2開裂配列RRARM配列番号379についてのアミノ酸残基P4~P1位における所望の開裂配列は、VEGFR-2開裂配列RRVR配列番号489である、または最適t-PA開裂配列PFGRS配列番号389についてのアミノ酸残基により修飾されたPAI-1がある。本発明方法を用いることにより、以下の位置がu-PAポリペプチドの基質特異性の一因になるものとして同定された:キモトリプシンのナンバリングに基づく21、24、30、38、39、61A、72、73、75、80、82、84、89、92、132、133、137、138、155、156、158、159、160、187および217。一アミノ酸置換または同複数置換は、以下の位置のいずれかに対応する1つまたはそれ以上の位置で行われ得る:キモトリプシンのナンバリングに基づいた、u-PAポリペプチド、例えば配列番号433に示したu-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分のF21、I24、F30、V38、T39、Y61A、R72、L73、S75、E80、K82、E84、I89、K92、F132、G133、E137、I138、L155、K156、T158、V159、V160、K187およびR217。高い基質特異性を呈する本発明の修飾u-PAポリペプチドは、キモトリプシンのナンバリングに基づいた、u-PAポリペプチド、例えば配列番号433に示したu-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分のF21V、I24L、F30I、F30V、F30L、F30T、F30G、F30M、V38D、T39A、Y61AH、R72G、L73A、L73P、S75P、E80G、K82E、E84K、I89V、K92E、F132L、G133D、E137G、I138T、L155P、L155V、L155M、K156Y、T158A、V159A、V160A、K187EおよびR217Cのいずれか1つまたはそれ以上の修飾に相当する1つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含み得る。一例では、VEGFR-2開裂配列についての高い基質特異性を有する本発明の修飾u-PAポリペプチドは、キモトリプシンのナンバリングに基づいた、V38D、F30I、F30T、F30L、F30V、F30G、F30M、R72G、L73A、L73P、S75P、I89V、F132L、G133D、E137G、I138T、L155P、L155V、L155M、V160AおよびR217Cのいずれか1つまたはそれ以上の修飾に対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含む。上記ポリペプチドの具体例は、u-PAポリペプチド、例えば配列番号433に示したアミノ酸配列を有するu-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分におけるF30I;L73A/I89V;L73P;R217C;L155P;S75P/I89V/I138T;E137G;R72G/L155P;G133D;V160A;V38D;F132L/V160A;L73A/I89V/F30T;L73A/I89V/F30L;L73A/I89V/F30V;L73A/I89V/F30G;L73A/I89V/L155V;L73A/I89V/F30M;L73A/I89V/L155M;L73A/I89V/F30L/L155MおよびL73A/I89V/F30G/L155Mのいずれかに対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含むu-PAポリペプチドである。上記配列の例は、配列番号434~459のいずれかに示したもの、または突然変異を含み、触媒活性を有する連続アミノ酸のそのフラグメントである。特に、以下のアミノ酸修飾を有する修飾u-PAポリペプチドが提供される:キモトリプシンのナンバリングに基づいた、L73A/I89V;L155P;R72G/L155P;F132L/V160A;L73A/I89V/F30T;L73A/I89V/L155V;L73A/I89V/L155M;およびL73A/I89V/F30L/L155M。別の例では、t-PAにより認識される開裂配列についての高い特異性を有する本発明による修飾u-PAポリペプチドは、キモトリプシンのナンバリングに基づいた、F21V、I24L、F30V、F30L、T39A、Y61AH、E80G、K82E、E84K、I89V、K92E、K156T、T158A、V159AおよびK187Eのいずれか1つまたはそれ以上の修飾に対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含む。上記ポリペプチドの例は、u-PAポリペプチド、例えば配列番号433に示したアミノ酸配列を有するu-PAポリペプチドまたはその触媒活性部分におけるF21V;I24L;F30V;F30L;F30V/Y61AH;F30V/K82E;F30V/K156T;F30V/K82E/V159A;F30V/K82E/T39A/V159A;F30V/K82E/T158A/V159A;F30V/Y61AH/K92E;F30V/K82E/V159A/E80G/I89V/K187EおよびF30V/K82E/V159A/E80G/E84K/I89V/K187Eのいずれかに対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含むu-PAポリペプチドである。上記配列の例は、配列番号460~472のいずれかに示したもの、または突然変異を含み、触媒活性を有する連続アミノ酸のそのフラグメントである。また、本発明は、キモトリプシンのナンバリングに基づき、本発明による変異型u-PAポリペプチドと異なり対応する突然変異を有するキモトリプシンファミリーの変異型プロテアーゼを提供する。例えば、キモトリプシンのナンバリングに基づくと、u-PAにおけるF30位の修飾は、t-PAにおけるQ30位、トリプシンにおけるQ30位およびキモトリプシンにおけるQ30位の修飾に対応するBodeetalCurrentOpinioninStructuralBiology7865872。当業者であれば、限定されるわけではないが、表7に示したプロテアーゼの修飾を含み、配列番号:40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189,193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、242、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、262、264、266、268、270、272のいずれかに示したアミノ酸配列またはその触媒活性フラグメントを有する、他のキモトリプシンファミリーメンバーにおいて対応する突然変異を測定できるはずである。b.変異型MT-SP1ポリペプチド別の例では、本発明による変異型MT-SP1ポリペプチドが、所望の、または選択された標的タンパク質のアミノ酸による天然P4~P2反応性部位アミノ酸の置換によりそのRSL配列が修飾された突然変異体セルピンポリペプチドについての高い反応性を有するものとして選択された。一例では、変異型MT-SP1ポリペプチドが、修飾AT3ポリペプチドの選択に対して同定された。本発明によるMT-SP1選択方法で使用される修飾AT3ポリペプチド分子の例には、例えば、その天然P4~P2残基IAGRSL配列番号478が補体タンパク質C2開裂配列SLGRKI配列番号479についてのアミノ酸残基により修飾されたAT3がある。本発明方法を用いることにより、以下の位置が、MT-SP1ポリペプチドの基質特異性の一因となるものとして同定された:キモトリプシンのナンバリングに基づいた、23、41、52、60g、65、71、93、95、97、98、99、126、129、131、136、143、144、154、164、166、171、173、175、184a、192、201、209、217、221a、230、234および244。一アミノ酸置換または同複数置換は、キモトリプシンのナンバリングに基づいた、MT-SP1ポリペプチド、例えば配列番号253または515に示した完全長MT-SP1ポリペプチドまたは配列番号505または507に示したその触媒活性部分の以下の位置:D23、I41、L52、Y60g、T65、H71、F93、N95、F97、I98、F99、A126、V129、P131、I136、H143、T144、I154、N164、T166、L171、P173、Q175、F184a、Q192、S201、Q209、D217、Q221a、R230、F234およびV244のいずれかに対応するいずれか1つまたはそれ以上の位置で行われ得る。高い基質特異性を呈する本発明の修飾MT-SP1ポリペプチドは、キモトリプシンのナンバリングに基づいた、MT-SP1ポリペプチド、例えば配列番号253または515に示した完全長MT-SP1ポリペプチドまたは配列番号505または507に示したその触媒活性部分のD23E、I41F、I41T、L52M、Y60gs、T65K、H71R、F93L、N95K、F97Y、F97L、T98P、F99L、A126T、V129D、P131S、I136T、I136V、H143R、T144I、I154V、N164D、T166A、L171F、P173S、Q175R、F184aL、Q192H、S201I、Q209L、D217V、Q221aL、R230W、F234LおよびV244Gのいずれか1つまたはそれ以上の修飾に対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含み得る。特に、修飾MT-SP1ポリペプチドは、I41F、F97Y、L171F、Q175R、D217VおよびV244Gのいずれか1つまたはそれ以上の修飾、例えばI41F、F97Y、L171FおよびV244Gのいずれか1つまたはそれ以上の修飾に対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含む。典型的には、上記の修飾MT-SP1ポリペプチドは、補体タンパク質C2についての高い基質特異性を呈する。上記ポリペプチドの例は、MT-SP1ポリペプチド、例えば、配列番号253に示したアミノ酸配列を有するMT-SP1ポリペプチドまたは配列番号505に示したその触媒活性部分におけるI136T/N164D/T166A/F184AL/D217V;I41F;I41F/A126T/V244GD23E/I41F/T98P/T144II41F/L171F/V244GH143R/Q175RI41F/L171FR230WI41F/I154V/V244GI141F/L52M/V129D/Q221ALF99LF97Y/I136V/Q192H/S201IH71R/P131S/D217VD217VT65K/F93L/F97Y/D217VI41T/P173S/Q209LF97L/F234L;Q175RN95KおよびY60GSのいずれかに対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含むMT-SP1ポリペプチドである。上記配列の例は、配列番号589~609のいずれかに示したもの、または例えば、配列番号568~588のいずれかに示した、突然変異を含み、触媒活性を有する連続アミノ酸のそのフラグメントである。若干の例では、本発明による変異型MT-SP1ポリペプチドは、さらにMT-SP1ポリペプチド、例えば配列番号253に示したアミノ酸配列を有するMT-SP1ポリペプチドまたは配列番号505に示したその触媒活性フラグメントにおけるC122Sに対応する修飾を含む。上記変異型MT-SP1ポリペプチドの例は、配列番号537~557のいずれか、または例えば配列番号516~536のいずれかに示した突然変異を含み、触媒活性を有する連続アミノ酸のそのフラグメントに示されている。特に、以下のアミノ酸修飾を有する修飾u-PAポリペプチドが提供される:キモトリプシンのナンバリングに基づいた,L73A/I89V;L155P;R72G/L155P;F132L/V160A;L73A/I89V/F30T;L73A/I89V/L155V;L73A/I89V/L155MおよびL73A/I89V/F30L/L155M。G.プロテアーゼ活性および特異性の評価方法本発明方法で選択されたプロテアーゼを試験することにより、選択後、プロテアーゼが触媒有効性を保持し、所望の基質特異性を呈するか否かを測定し得る。活性評価は、増幅したディスプレー供給源または精製タンパク質からの上清を用いて実施され得る。例えば、上記で検討したところによると、ヘルパーファージによるファージレスキューおよびファージ増幅後にファージ上清が検定され得る。別法として、プロテアーゼ活性は、感染した細菌の細胞培地またはペリプラズムから直接検定され得る。精製された選択されたプロテアーゼのプロテアーゼ活性についても測定し得る。既知プロテアーゼ基質を用いて基質開裂について検定することにより、触媒有効性および/または基質特異性が評価され得る。例えば、プラスミノーゲンの開裂は、t-PAまたはu-PAを本発明選択方法で使用する場合に評価され得る。別の例では、プロテアーゼにより認識されるペプチド基質が使用され得る。例えば、MT-SP1の自律活性化部位であるRQAR配列番号513を用いることにより、選択されたMT-SP1プロテアーゼの活性を評価し得る。一実施態様では、ペプチド基質の蛍光性標識テトラペプチド、例えば、ACC-またはAMC-テトラペプチドが使用され得る。さらに、プロテアーゼを選択する際の所望の標的基質の開裂配列に基づいて設計された蛍光性ペプチド基質を用いることにより、活性が評価され得る。若干の例では、選択されたプロテアーゼが、選択方法で使用される変異型プロテアーゼトラップポリペプチドの存在または非存在下での既知ペプチド基質に対するその活性について評価され得る。典型的には、標的基質の所望の開裂配列を含むプロテアーゼトラップポリペプチドの存在下で阻害されるプロテアーゼについてさらに選択することにより、標的基質について改善された選択性を有する選択されたプロテアーゼを最適化するために上記活性評価を実施する。野生型または鋳型プロテアーゼに対し、そして/または選択方法で同定された他の全プロテアーゼにより阻害の比較を行い得る。選択されたプロテアーゼの天然基質の開裂の速度論分析結果を、所望の標的基質の開裂分析結果と比較することにより、標的配列について選択されたプロテアーゼの特異性が評価され得る。さらに、阻害の二次速度定数kiを評価することにより、本選択方法で使用される基質、例えば、プロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型についての選択されたプロテアーゼの有効性および反応性が監視され得る。実施例5は、本発明方法で同定された突然変異体u-PAポリペプチドの触媒有効性および反応性の評価に使用される様々な検定法について具体的に説明している。実施例10および実施例12は、選択されたMT-SP1ファージ上清の触媒有効性の評価に使用される様々な検定法について具体的に説明している。実施例14は、選択された精製変異型MT-SP1プロテアーゼの触媒有効性および反応性の評価に使用される様々な検定法について具体的に説明している。一例では、選択されたプロテアーゼ、例えば、選択されたu-PAまたはMT-SP1プロテアーゼは、突然変異プロテアーゼトラップポリペプチドの所望の特異性プロフィールと適合するように選択されたものであり、所望の開裂配列に対応する個々の蛍光性ペプチド基質を用いて評価され得る。例えば、標的基質の所望の開裂配列のいずれか1つまたはそれ以上を開裂し得る修飾プロテアーゼについての検定方法は、aプロテアーゼの作用時に蛍光性部分がペプチド基質配列から放出されることにより、蛍光部分を生じさせるように、ペプチド蛍光性試料所望の標的配列を含むをプロテアーゼと接触させ、そしてb試料に蛍光の検出可能な変化が起こっているか否かを観察することを含むもので、この検出可能な変化は、試料中における酵素活性プロテアーゼの存在の指標である。かかる一例では、プロテアーゼを選択する際の所望の開裂配列は、当業界で公知の方法により蛍光性ペプチドへ作製される。一実施態様では、個々のペプチド開裂配列は、蛍光性標識基質、例えば、ACCまたはAMC蛍光性脱離基に結合され得、蛍光性部分の放出がペプチド開裂配列についてのプロテアーゼの特異性の尺度として測定され得る。標的開裂配列の蛍光の増加率は、例えば蛍光分光光度計を用いることにより測定され得る。蛍光の増加率は、時間経過とともに測定され得る。ミカエリス-メントン反応速度定数は、標準速度論的方法により決定され得る。反応速度定数kcat、Kmおよびkcat/Kmは、基質濃度の逆数対基質開裂速度の逆数をグラフ化し、ラインウィーバーバーク等式1/速度=Km/Vmax1/[S]1/Vmax式中、Vmax=[ET]kcatに当てはめることにより計算され得る。二次速度定数または特異性定数kcat/Kmは、基質が特定プロテアーゼによりいかにうまく切断されたかの尺度である。例えば、ACC-またはAMC-テトラペプチド、例えばAc-RRAR-AMC、Ac-SLGR-AMC、Ac-SLGR-ACC、Ac-RQAR-ACCを製造し、本発明方法で選択されたプロテアーゼとインキュベーションすると、蛍光性部分の放出について検定することによりプロテアーゼの活性が評価され得る。テトラペプチドの選択は、検定される所望の開裂配列に左右され、経験的に決定され得る。溶液中のプロテアーゼに関する検定法は、多量のプロテアーゼ貯蔵液を蛍光性プロテアーゼインジケーターペプチドに加え、それに続く蛍光の増加または吸収スペクトルにおける励起バンドの減少を測定するだけでよい。また、溶液および蛍光性インジケーターを合わせて、プロテアーゼの活性を最適化する消化緩衝液中で検定することも可能である。プロテアーゼ活性の検定に適切な緩衝液は、当業者には公知である。一般に、緩衝液は、特定プロテアーゼのpH最適条件に対応するpHにより選択される。例えば、エラスターゼ活性の検定に特に適切な緩衝液は、pH89で50mMのリン酸ナトリウム、1mMのEDTAを含む。測定は、発蛍光団用の励起光源を提供し、それに続いて放出された特定波長の光線を測定する器具である、蛍光計で行うのが最も容易である。プロテアーゼを欠く対照インジケーター溶液との比較により、プロテアーゼ活性の尺度が得られる。既知活性のプロテアーゼ溶液により生じた蛍光の変化率が測定される、プロテアーゼ/インジケーターの組合わせに関する標準曲線を作成することにより、活性レベルは正確に定量化され得る。蛍光性化合物の検出は、蛍光計を用いて達成され得るが、検出は、当業者に公知の様々な他の方法により達成され得る。すなわち、例えば、発蛍光団が可視波長で放出されるとき、検出は光源による励起に応じた蛍光を視覚的に調べるだけで可能である。検出はまた、ディジタル処理装置にインターフェースで連結されたビデオカメラを用いた画像分析システムまたは他の画像捕捉システムによるものであり得る。検出はまた、蛍光顕微鏡のもとでのフィルターを通した視覚化によるものであり得る。顕微鏡は、操作者により簡単に視覚化されるシグナルを提供し得る。別法として、シグナルは、写真フィルムまたはビデオ解析システムを用いて記録され得る。シグナルはまた、画像分析システムまたは光度計を用いて実時間で単純に定量され得る。すなわち、例えば、試料のプロテアーゼ活性に関する基本的検定法では、試料を緩衝液検定されている特定プロテアーゼに最適なpHでに懸濁または溶解し、蛍光性プロテアーゼペプチドインジケーターを緩衝液に加え、例えばHarrisetal1998JBiolChem273:27364に示された要領で分光蛍光計を用いることにより生じた蛍光の変化を監視する。分光蛍光計は、発蛍光団の励起波長で発蛍光団を励起するように設定されている。蛍光性プロテアーゼインジケーターは、プロテアーゼによるインジケーターの開裂に起因する、蛍光を変化させるプロテアーゼの基質配列である。また、選択されたプロテアーゼを検定することにより、完全長タンパク質の状況に置かれたときにそれらが所望の配列を開裂することを確認し得る。一例では、精製標的タンパク質、すなわちVEGFR2または補体タンパク質C2を、選択されたプロテアーゼの存在下または非存在下でインキュベーションし、開裂事象をSDS-PAGE、次いでタンパク質に関するクーマシーブリリアントブルー染色および濃度計を用いた開裂産物の分析によりモニターし得る。プロテアーゼによる完全長タンパク質の開裂の特異性定数を、ゲル濃度計を用いて測定することにより、プロテアーゼの存在下でインキュベーションした完全長標的基質バンドの濃度計での経時変化を評価することができる。さらにまた、所望の標的タンパク質の活性の検定に関する当業界で公知の方法を用いて標的タンパク質の活性を検定することにより、その機能が開裂事象により破壊されたことが証明され得る。実施態様では、選択されたプロテアーゼ、典型的には修飾プロテアーゼの特異性の比較を用いることにより、選択されたプロテアーゼが、野生型または鋳型プロテアーゼと比べて改変された、例えば高い特異性を呈するか否かを測定し得る。標的基質に関するプロテアーゼの特異性は、修飾プロテアーゼが、野生型または鋳型プロテアーゼと比べて所与の活性でいかに多くの本質的に異なる配列を開裂するかを観察することにより測定され得る。修飾プロテアーゼが野生型プロテアーゼよりも開裂する標的基質が少ない場合、修飾プロテアーゼは、それらの標的基質に関して野生型プロテアーゼよりも高い特異性を有することになる。標的基質に関するプロテアーゼの特異性は、非標的基質すなわち、プロテアーゼの天然野生型基質配列と比較した標的基質の開裂の特異性定数から測定され得る。標的基質対非標的基質についての修飾プロテアーゼの特異性定数の比率を出すことにより、プロテアーゼの開裂効率が決定され得る。修飾プロテアーゼおよび野生型または鋳型プロテアーゼ間の開裂効率の比較を用いることにより、標的基質に関する特異性の倍率変化が評価され得る。特異性は、標的基質対非標的基質についての野生型または鋳型プロテアーゼの特異性と比較したとき、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000倍またはそれ以上であり得る。H.プロテアーゼトラップポリペプチドすなわちセルピンまたはその変異型またはプロテアーゼ/修飾プロテアーゼをコード化する核酸の製造方法プロテアーゼトラップポリペプチドまたはプロテアーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分、例えば修飾u-PAポリペプチドまたは修飾MT-SP1ポリペプチドを含む本明細書記載のポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現に関する当業界で公知の方法により得られる。所望の遺伝子をコード化する核酸の同定に関する当業界で公知の任意の方法が使用され得る。当業界で利用可能な方法を用いることにより、例えば細胞または組織供給源から所望のプロテアーゼトラップポリペプチドまたはプロテアーゼタンパク質をコード化する完全長すなわち、全コーディング領域を包含するcDNAまたはゲノムDNAクローンが得られる。修飾ポリペプチド、例えば変異型プロテアーゼトラップポリペプチドまたは選択された変異型プロテアーゼは、本明細書記載の要領で野生型ポリペプチドから例えば位置指定突然変異導入により遺伝子工学的に製造され得る。核酸分子のクローニングおよび単離に関する当業界で公知の利用可能な方法を用いて、ポリペプチドをクローン化または単離し得る。上記方法には、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体に基づくスクリーニングおよび活性に基づくスクリーニングを含む、核酸のPCR増幅およびライブラリーのスクリーニングがある。核酸の増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応PCR方法を用いることにより、所望のポリペプチドをコード化する核酸分子を単離し得る。核酸含有材料を、所望のポリペプチドコード化核酸分子が単離され得る出発材料として用い得る。例えば、DNAおよびmRNA調製物、細胞抽出物、組織抽出物、流体試料例、血液、血清、唾液、健康および/または罹患対象からの試料が増幅方法で使用され得る。核酸ライブラリーもまた、出発材料の供給源として使用され得る。プライマーは、所望のポリペプチドを増幅するように設計され得る。例えば、プライマーは、所望のポリペプチドが生成される発現された配列に基づいて設計され得る。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の復帰翻訳に基づいて設計され得る。増幅により生成された核酸分子の配列決定を行い、所望のポリペプチドをコード化するのを確認し得る。追加的ヌクレオチド配列が、ベクター、例えばタンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コーディングDNA配列の増幅用に設計されたベクターへ合成遺伝子をクローニングするため制限エンドヌクレアーゼ部位を含むリンカー配列を含むポリペプチドコード化核酸分子に連結され得る。さらに、機能的DNA成分を特定する追加的ヌクレオチド配列が、ポリペプチドコード化核酸分子に機能し得るように結合され得る。上記配列の例には、限定されるわけではないが、細胞内タンパク質発現を促すように設計されたプロモーター配列、およびタンパク質分泌を促すように設計された分泌配列がある。タンパク質結合領域を特定する塩基配列などの追加的ヌクレオチド残基配列も、プロテアーゼコード化核酸分子に結合され得る。上記領域には、限定されるわけではないが、特異的標的細胞へのプロテアーゼの取り込みを促すか、または合成遺伝子産物の薬物動態を他の形で改変するタンパク質を促すかまたはコード化する残基の配列がある。さらに、例えばポリペプチドの検出またはアフィニティー精製を助ける標識または他の部分も付加され得る。例えば、エピトープ標識または他の検出可能なマーカーを特定する塩基の配列などの追加的ヌクレオチド残基配列も、プロテアーゼコード化核酸分子またはセルピンコード化核酸分子、またはその変異型に結合され得る。例えば上記配列および核酸配列はHis標識例、6xHis、HHHHH;配列番号496またはフラッグ標識DYKDDDDK;配列番号495をコード化する。次いで、同定および単離された核酸は、適切なクローニングベクターに挿入され得る。当業界で公知の多数のベクター宿主系が使用され得る。可能なベクターには、限定されるわけではないが、プラスミドまたは修飾ウイルスがあるが、ベクター系は使用される宿主細胞と適合するものでなくてはならない。上記ベクターには、限定されるわけではないが、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはプラスミド、例えばpCMV4、pBR322またはpUCプラスミド誘導体またはBluescriptベクターStratagene、ラジョラ、カリフォルニアがある。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的付着末端を有するクローニングベクターへDNAフラグメントをライゲーションすることにより達成され得る。挿入は、TOPOクローニングベクターINVITROGEN、カールスバッド、カリフォルニアを用いて実施され得る。DNAのフラグメント化に使用される相補的制限部位がクローニングベクターに存在しない場合、DNA分子の末端は酵素的に修飾され得る。別法として、ヌクレオチド配列リンカーをDNA末端にライゲーションすることにより、いかなる所望の部位でも作製され得る。これらのリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコード化する特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含み得る。別の方法では、開裂されたベクターとタンパク質遺伝子をホモポリマー末端結合により修飾し得る。組換え分子は、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔およびソノポレーションにより宿主細胞へ導入され得、その結果遺伝子配列の多数のコピーが作成される。実施態様では、単離されたタンパク質遺伝子、cDNAまたは合成DNA配列を組み込んだ組み換えDNA分子による宿主細胞の形質転換により、遺伝子の多数のコピーが作成され得る。すなわち、遺伝子は、形質転換体を成長させ、組換えDNA分子を形質転換体から単離し、必要時には単離された組換えDNAから挿入遺伝子を回収することにより大量に得られる。1.ベクターおよび細胞所望のタンパク質、例えば本明細書記載のものの1つまたはそれ以上を組み換え発現させる場合、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列の全部または一部分を含む核酸を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コーディング配列の転写および翻訳に必要な成分を含むベクターに挿入し得る。必要な転写および翻訳シグナルはまた、プロテアーゼ遺伝子に関する天然プロモーターおよび/またはそれらのフランキング領域により供給され得る。また、本発明は、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼをコード化する核酸を含むベクターを提供する。本発明はまたベクターを含む細胞を提供する。細胞は、真核生物および原核生物細胞を含み、ベクターはそこでの使用に適切なものであればよい。本発明は、ベクターを含む原核生物および真核生物細胞、例えば内皮細胞を提供する。上記細胞には、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞がある。細胞を用いて、コード化されたタンパク質を細胞により発現させる条件下で上記細胞を成長させ、発現されたタンパク質を回収することにより、そのタンパク質を製造する。本発明での目的の場合、例えば、プロテアーゼは培地中へ分泌され得る。一実施態様において、本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコード化、例えば本発明によるu-PA変異型ポリペプチドのいずれかをコード化し、プロテアーゼドメインの全部または一部分、またはその多数のコピーを含むヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。また、本発明は、プロテアーゼドメインおよび完全長およびそれ以下の長さのプロテアーゼタンパク質を含むプロテアーゼタンパク質の追加的ドメインをコード化するヌクレオチド配列およびその多数のコピーを含むベクターを提供する。ベクターは、細胞で修飾プロテアーゼタンパク質またはそのプロテアーゼドメインを発現させるため、またはプロテアーゼタンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択され得る。プロテアーゼドメインを発現させるとき、上記核酸を、分泌シグナルをコード化する核酸、例えば出芽酵母Saccharomycescerevisiae交配因子シグナル配列またはその一部分、または天然シグナル配列に連結する。タンパク質コーディング配列を発現させるのに様々な宿主-ベクター系が使用され得る。これらには、限定されるわけではないが、ウイルス例、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルス感染させた哺乳類細胞系、ウイルス例、バキュロウイルス感染させた昆虫細胞系、微生物、例えば酵母含有酵母ベクターまたはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNAで形質転換した細菌がある。ベクターの発現エレメントは、それらの強度および特異性が変化する。使用する宿主-ベクター系によって、若干の適切な転写および翻訳エレメントのいずれか1つが使用され得る。ベクターへのDNAフラグメントの挿入に関する当業者に公知の方法を用いて、適切な転写/翻訳制御シグナルおよびタンパク質コーディング配列を含むキメラ遺伝子を含む発現ベクターが構築され得る。これらの方法は、インビトロ組換えDNAおよび合成技術およびインビボ組換え体遺伝子組み換えを含み得る。タンパク質、またはそのドメイン、誘導体、フラグメントまたは相同体をコード化する核酸配列の発現は、遺伝子またはそのフラグメントが組み換えDNA分子複数も可により形質転換された宿主において発現されるように第2の核酸配列により調節され得る。例えば、タンパク質の発現は、当業界で公知のプロモーター/エンハンサーにより制御され得る。一実施態様では、プロモーターは、所望のタンパク質に関する遺伝子にとって自然のものではない。使用され得るプロモーターには、限定されるわけではないが、SV40初期プロモーターBernoistおよびChambonNature290304310、ラウス肉腫ウイルスの3長末端反復に含まれるプロモーターYamamotoetalCell22787797、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターWagneretalProcNatlAcadSciUSA7814411445、メタロチオネイン遺伝子の調節配列BrinsteretalNature2963942、原核生物発現ベクター、例えばβ-ラクタマーゼプロモーターJayetalProcNatlAcadSciUSA785543またはtacプロモーターDeBoeretalProcNatlAcadSciUSA802125、またUsefulProteinsfromRecombinantBacteriaScientificAmerican2427994も参照、ノパリンシンテターゼプロモーターHerrarEstrellaetalNature303209213またはカリフラワーモザイクウイルス35SRNAプロモーターGarderetalNucleicAcidsRes92871を含む植物発現ベクター、および光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーターHerreraEstrellaetalNature310115120、酵母および他の真菌からのプロモーターエレメント、例えばGal4プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、および組織特異性を呈し、トランスジェニック動物で使用されている以下の動物転写制御領域:膵腺房細胞で活性を示すエラスターゼI遺伝子制御領域SwiftetalCell38639646OrnitzetalColdSpringHarborSympQuantBiol50399409MacDonaldHepatology7425515、膵臓ベータ細胞で活性を示すインスリン遺伝子制御領域HanahanetalNature315115122、リンパ様細胞で活性を示す免疫グロブリン遺伝子制御領域GrosschedletalCell38647658AdamsetalNature318533538AlexanderetalMolCellBiol714361444、精巣、胸部、リンパ様およびマスト細胞で活性を示すマウス乳癌ウイルス制御領域LederetalCell45485495、肝臓で活性を示すアルブミン遺伝子制御領域PinckertetalGenesandDevel1268276、肝臓で活性を示すアルファ-フェトタンパク質遺伝子制御領域KrumlaufetalMolCellBiol516391648HammeretalScience23553581987、肝臓で活性を示すアルファ-1抗トリプシン遺伝子制御領域KelseyetalGenesandDevel1161171、脊髄細胞で活性を示すベータグロビン遺伝子制御領域MogrametalNature315338340KolliasetalCell468994、脳の稀突起膠細胞で活性を示すミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域ReadheadetalCell48703712、骨格筋で活性を示すミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域SaniNature314283286および視床下部の性腺刺激細胞で活性を示す性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域MasonetalScience23413721378がある。一実施態様では、所望のタンパク質、またはそのドメイン、フラグメント、誘導体または相同体をコード化する核酸に機能し得るように結合されたプロモーター、1つまたはそれ以上の複製起点、および所望による1つまたはそれ以上の選択可能なマーカー例、抗生物質耐性遺伝子を含むベクターが使用される。例えば、プロテアーゼタンパク質のプロテアーゼドメインのベクターおよび発現系は、公知のPichiaベクター例えば、カリフォルニア、サンディエゴのInvitrogenから入手可能、特にコード化されたタンパク質を分泌させるように設計されたものを含む。大腸菌Ecoli細胞の形質転換用の典型的プラスミドベクターには、例えば、pQE発現ベクターカリフォルニア、バレンシアのQiagenから入手可能;また、この系について記載しているQiagenにより出版された文献参照がある。pQEベクターは、大腸菌Ecoliにおいて組換えタンパク質の堅固に調節された高レベル発現を実現させるためのファージT5プロモーター大腸菌EcoliRNAポリメラーゼにより認識されるおよび二重lacオペレーター抑制モジュール、有効な翻訳のための合成リボソーム結合部位RBSII、6XHis標識コーディング配列、t0およびT1転写ターミネーター、ColE1複製起点、およびアンピシリン耐性を付与するためのベータ-ラクタマーゼ遺伝子を有する。pQEベクターでは、組換えタンパク質のN-またはC-末端に6xHis標識を配置させ得る。上記プラスミドにはpQE32、pQE30およびpQE31があり、それらは3読み枠全部についての多クローニング部位を提供し、N-末端6xHis標識タンパク質を発現させる。大腸菌Ecoli細胞を形質転換するための他の典型的なプラスミドベクターには、例えば、pET発現ベクター米国特許第4952496号参照;ウィスコンシン、マディソンのNOVAGENから入手可能;この系について記載しているNOVAGENにより出版された文献参照がある。上記プラスミドには、T7lacプロモーター、T7ターミネーター、誘導性大腸菌Ecolilacオペレーター、およびlacリプレッサー遺伝子を含むpET11a、T7プロモーター、T7ターミネーターおよび大腸菌EcoliompT分泌シグナルを含むpET12a-c、およびHisカラムでの精製で使用されるHisTag登録商標リーダー配列およびカラムでの精製後開裂され得るトロンビン開裂部位、T7-lacプロモーター領域およびT7ターミネーターを含むpET15bおよびpET19bウィスコンシン、マディソンのNOVAGENがある。2.発現タンパク質、例えばプロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型、または選択されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む本明細書に示したタンパク質などは、インビボおよびインビトロ方法を含む当業者に公知の方法により製造され得る。所望のタンパク質は、要求される量および形態のタンパク質、例えば投与および処置に必要とされるものを製造するのに適切な生物体で発現され得る。発現宿主には、原核生物および真核生物、例えば大腸菌Ecoli、酵母、植物、昆虫細胞、ヒトセルラインおよびトランスジェニック動物を含む哺乳類細胞がある。発現宿主は、それらのタンパク質生産レベルおよび発現されたタンパク質に存在する翻訳後修飾のタイプが異なり得る。発現宿主の選択は、これらおよび他の因子、例えば調節性および安全性の考察、製造費用および精製の必要性および方法に基づいて行われ得る。多くの発現ベクターが利用可能で当業者には公知であり、タンパク質の発現に使用され得る。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択に影響される。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび所望によるエンハンサー、翻訳シグナルおよび転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定した形質転換に使用される発現ベクターは、典型的には形質転換細胞を選択および維持し得る選択可能なマーカーを有する。場合によっては、複製起点がベクターのコピー数の増幅に使用され得る。タンパク質、例えば本発明による変異型プロテアーゼまたはプロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型はまた、タンパク質融合体として利用または発現され得る。例えば、プロテアーゼ融合体を生成することにより、プロテアーゼに追加的機能性を付加し得る。プロテアーゼ融合タンパク質の例は、限定されるわけではないが、シグナル配列、例えば局在化の標識、例えばhis6標識またはmyc標識、または精製用標識、例えばGST融合体、およびタンパク質分泌および/または膜会合を指令する配列の融合体を含む。一実施態様では、プロテアーゼは、活性形態で発現され得る。別の実施態様では、プロテアーゼは、不活性チモーゲン形態で発現される。a.原核生物細胞原核生物、特に大腸菌Ecoliは、大量のタンパク質を生産する系を提供する。大腸菌Ecoliの形質転換は、当業者に公知の単純で迅速な技術である。大腸菌Ecoliのための発現ベクターは、誘導性プロモーターを含み得、上記プロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導し、宿主細胞に何らかの毒性を呈するタンパク質を発現させるのに有用である。誘導性プロモーターの例には、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7およびSP6RNAプロモーターおよび温度調節λPLプロモーターがある。タンパク質、例えば本発明によるものは、大腸菌Ecoliの細胞質環境で発現され得る。細胞質は還元的環境であるため、分子によっては、不溶性封入体の形成が誘発される場合もある。還元剤、例えばジチオトレイトールおよびβ-メルカプトエタノールおよび変性剤、例えばグアニジン-HClおよび尿素は、タンパク質を再溶解させるのに使用され得る。これに代わる方法は、酸化環境およびシャペロン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生を誘導し得る細菌の周辺腔におけるタンパク質の発現である。典型的には、リーダー配列を発現させるべきタンパク質に融合することにより、そのタンパク質をペリプラズムに指向させる。次いで、リーダー配列を、ペリプラズム内側のシグナルペプチダーゼにより除去する。ペリプラズム-ターゲッティングリーダー配列の例には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子からのpelBリーダーおよびアルカリ性ホスファターゼ遺伝子から誘導されるリーダーがある。場合によっては、ペリプラズム発現により、発現されたタンパク質が培養培地中へ漏出されることもある。タンパク質の分泌により、培養上清からの迅速かつ簡単な精製が可能となる。分泌されないタンパク質は、浸透溶解によりペリプラズムから得られる。細胞質発現と同様に、場合によってはタンパク質が不溶性になることもあり得るため、変性剤および還元剤を用いることにより、可溶化および再折りたたみを促進し得る。誘導および成長温度もまた、発現レベルおよび溶解度に影響を及ぼし得、典型的には25°C~37°Cの温度が使用される。典型的には、細菌は非グリコシル化タンパク質を生産する。すなわち、タンパク質が機能するのにグリコシル化を必要とする場合、宿主細胞からの精製後にグリコシル化がインビトロで付加され得る。b.酵母細胞出芽酵母Saccharomycescerevisae、分裂酵母Schizosaccharomycespombe、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica、クルイベロマイシスラクチスKluyveromyceslactisおよびピキアパストリスPichiapastorisなどの酵母は、タンパク質、例えば本明細書記載のものの製造に使用され得る公知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターまたは相同的組換えによる安定した染色体組込みにより形質転換され得る。典型的には、誘導性プロモーターを用いて遺伝子発現を調節する。上記プロモーターの例には、GAL1、GAL7およびGAL5およびメタロチオネインプロモーター、例えばCUP1、AOX1または他のピキアPichiaまたは他の酵母プロモーターがある。発現ベクターは、形質転換されたDNAを選択および維持するために選択可能なマーカー、例えばLEU2、TRP1、HIS3およびURA3を含むことが多い。酵母で発現されたタンパク質は多くの場合可溶性である。シャペロン、例えばBipおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現により、発現レベルおよび溶解度は改善され得る。さらに、酵母で発現されたタンパク質は、分泌シグナルペプチド融合体、例えば出芽酵母Saccharomycescerevisaeからの酵母交配型アルファ因子分泌シグナルおよび酵母細胞表面タンパク質、例えばAga2p交配接着受容体またはアルクスラアデニニボランスArxulaadeninivoransグルコアミラーゼとの融合体を用いることにより分泌へ向けて指令され得る。例えばKex-2プロテアーゼに関するプロテアーゼ開裂部位に遺伝子操作を加えることにより、分泌経路を出るとき発現されたポリペプチドから融合配列が除去され得る。酵母はまた、Asn-X-Ser/Thrモチーフでグリコシル化され得る。c.昆虫細胞特にバキュロウイルス発現系を用いる昆虫細胞は、ポリペプチド、例えば修飾プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼトラップポリペプチドの発現に有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物により使用される翻訳後修飾の大部分を行い得る。バキュロウイルスは限定的な宿主範囲を有するため、真核生物発現の安全性は改善され、調節に関する懸念は減じられる。典型的な発現ベクターは、高レベル発現用プロモーター、例えばバキュロウイルスの多角体タンパク質プロモーターを使用する。常用されるバキュロウイルス系には、バキュロウイルス、例えばアウトグラファカリフォルニカAutographacalifornica核多角体病ウイルスAcNPV、およびボンビクスモリbombyxmori核多角体病ウイルスBmNPVおよび昆虫セルライン、例えばスポドプテラフルギペルダSpodopterafrugiperdaから誘導されたSf9、シューダレチアウニプンクタPseudaletiaunipunctaA7SおよびダナウスプレキシプスDanausplexippusDpN1がある。高レベル発現の場合、発現させる分子のヌクレオチド配列を、ウイルスの多角体開始コドンの下流に隣接して融合させる。哺乳類分泌シグナルを昆虫細胞で正確にプロセッシングして用いることにより、発現されたタンパク質は培養培地中へ分泌され得る。さらに、セルライン、シューダレチアウニプンクタPseudaletiaunipunctaA7SおよびダナウスプレキシプスDanausplexippusDpN1は、哺乳類細胞系と類似したグリコシル化パターンをもつタンパク質を生産する。昆虫細胞における別の発現系は、安定して形質転換された細胞の使用である。シュニーダーSchnieder2S2およびKc細胞ドロソフィラメラノガスター、DrosophilamelanogasterおよびC7細胞エデスアルボピクツス、Aedesalbopictusなどのセルラインが、発現に使用され得る。ドロソフィラDrosophilaメタロチオネインプロモーターは、カドミウムまたは銅による重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導するのに使用され得る。発現ベクターは、典型的には選択可能なマーカー、例えばネオマイシンおよびハイグロマイシンの使用により維持される。d.哺乳類細胞哺乳類発現系は、修飾プロテアーゼまたはその触媒活性部分、またはプロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型を含むタンパク質の発現に使用され得る。発現構築物は、アデノウイルスなどのウイルス感染により、またはリポソーム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランなどの直接DNA導入、および物理的手段、例えば電気穿孔および顕微注入により哺乳類細胞へ導入され得る。哺乳類細胞用の発現ベクターは、典型的には、mRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列コザック共通配列およびポリアデニル化エレメントを含む。上記ベクターは、高レベル発現用の転写プロモーター-エンハンサー、例えばSV40プロモーター-エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルスCMVプロモーターおよびラウス肉腫ウイルスRSVの長末端反復を含むことが多い。これらのプロモーター-エンハンサーは、多くの細胞型において活性を示す。組織および細胞型プロモーターおよびエンハンサー領域もまた発現に使用され得る。プロモーター/エンハンサー領域の例には、限定されるわけではないが、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、アルファフェトタンパク質、アルファI抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御域などの遺伝子からの領域がある。選択可能なマーカーは、発現構築物をもつ細胞を選択し、維持するのに使用され得る。選択可能なマーカー遺伝子の例には、限定されるわけではないが、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジンキナーゼがある。TCR-ζおよびFcεRI-γなどの細胞表面シグナリング分子との融合により、細胞表面上で活性状態のタンパク質の発現が指令され得る。マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞を含む哺乳類発現については、多くのセルラインが利用可能である。セルラインの例には、限定されるわけではないが、CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、マウスNS0非分泌性および他のセルライン、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマセルライン、リンパ球、線維芽細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8およびHKB細胞がある。セルラインはまた血清不含有培地に適合させた形で利用され得、細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製が容易になる。上記の一例は、血清不含有EBNA-1セルラインPhametalBiotechnolBioeng8433242である。e.植物トランスジェニック植物細胞および植物は、タンパク質の発現、例えば本明細書記載のタンパク質の発現に使用され得る。発現構築物は、典型的には直接DNA導入、例えばマイクロプロジェクタイル法およびプロトプラストへのPEGを介した導入、およびアグロバクテリウムによる形質転換を用いて植物に導入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、アラビドプシスArabidopsisおよびタバコなどの双子葉植物宿主およびトウモロコシおよびイネなどの単子葉植物宿主に分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターおよびユビキチンおよびUBQ3プロモーターがある。形質転換細胞の選択および維持を容易にするために、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーぜなどの選択可能なマーカーを使用することが多い。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体カルス組織として培養中で維持されるか、または総体植物に再生され得る。トランスジェニック植物細胞はまた、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼを生産するように遺伝子操作が加えられた藻類を含み得る例えば、MayfieldetalPNAS100438442参照。植物は、哺乳類細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するため、このことはこれらの宿主で製造されるタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。3.精製技術宿主細胞からのプロテアーゼポリペプチドまたは他のタンパク質を含むポリペプチドの精製方法は、選択された宿主細胞および発現系により異なる。分泌分子の場合、一般に細胞除去後にタンパク質を培養培地から精製する。細胞内発現の場合、細胞を溶解し、抽出物からタンパク質を精製し得る。トランスジェニック植物および動物などのトランスジェニック生物体を発現に使用するとき、組織または器官を出発材料として用いることにより、溶解細胞抽出物を製造し得る。さらに、トランスジェニック動物生産は、回収され得る乳または卵でのポリペプチドの生産を含み得、必要ならば、当業界での標準的方法を用いてタンパク質を抽出し、さらに精製し得る。一例では、プロテアーゼは、発現および精製されて不活性形態チモーゲン形態をとり得るか、または別法として発現されたプロテアーゼは、自触により活性形態、例えば2本鎖形態に精製されて、プロ領域が除去され得る。典型的には、自己賦活は、例えば室温で24~72時間インキュベーションすることにより、精製過程中に起こる。活性化の速度および程度は、タンパク質濃度および特異的修飾プロテアーゼにより異なり、例えば、高希釈試料は、室温で長期間インキュベーションする必要があり得る。活性化は、SDS-PAGE例、3キロダルトンのシフトおよび酵素活性蛍光性基質の開裂によりモニターされ得る。典型的には、プロテアーゼを精製前に75を超える活性化に到達させる。タンパク質、例えばプロテアーゼまたはプロテアーゼトラップポリペプチドは、当業界で公知の標準タンパク質精製技術、例えば、限定されるわけではないが、SDS-PAGE、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿およびアニオン交換などのイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製され得る。また、調製物の有効性および純度を改良するのにアフィニティー精製技術も利用され得る。例えば、抗体、受容体およびプロテアーゼまたはプロテアーゼトラップポリペプチドと結合する他の分子がアフィニティー精製で使用され得る。また、発現構築物には、mycエピトープ、GST融合体またはHis6などのタンパク質にアフィニティー標識を付加する遺伝子操作が加えられ、myc抗体、グルタチオン樹脂およびNi樹脂によりそれぞれアフィニティー精製され得る。純度は、ゲル電気泳動および染色および分光測光技術を含む当業界で公知の方法により評価され得る。4.融合タンパク質本発明はまた、本発明による変異型プロテアーゼおよび1つまたはそれ以上の他のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。本発明は、適切な経路による投与用に処方された上記融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。融合タンパク質は、プロテアーゼの精製を容易にし、プロテアーゼを標的細胞または組織に指向させることによりプロテアーゼの薬物動態特性を改変し、そして/またはプロテアーゼの発現または分泌を高めることを目的として修飾プロテアーゼおよび別のポリペプチド、例えば抗体またはそのフラグメント、成長因子、受容体、リガンドおよび他の上記作用物質を何らかの順序で結合することにより形成される。プロテアーゼ融合タンパク質内において、プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼタンパク質の全部またはその触媒活性部分に相当し得る。若干の実施態様では、プロテアーゼまたはその触媒活性部分は修飾プロテアーゼである。本発明による融合タンパク質は、所望の標的基質の1つまたはそれ以上についてのそれらの特異性および/または選択性を実質的に全て保持している。一般的に、プロテアーゼ融合ポリペプチドは、非融合プロテアーゼと比べた場合少なくとも約30、40、50、60、70、80、85、90または95の基質特異性および/または選択性を保持しており、さらに非融合プロテアーゼと比べて96、97、98、99またはそれより大きい基質特異性を保持している場合もある。プロテアーゼポリペプチドおよび別のポリペプチドの結合は、直接的またはリンカーを介して間接的に行われ得る。一例では、結合は、例えばヘテロ二官能性剤を介した化学結合またはチオール結合または他の同様の結合によるものであり得る。プロテアーゼと別のポリペプチドとの融合は、プロテアーゼポリペプチドのN-またはC-末端に対して行われ得る。本発明プロテアーゼとの融合タンパク質で使用され得るポリペプチドの非限定的な例には、例えば、GSTグルタチオンS-トランスフェラーゼポリペプチド、免疫グロブリンからのFcドメイン、または異種シグナル配列がある。融合タンパク質は、さらなる成分、例えば細胞によるタンパク質の取り込みを助ける大腸菌Ecoliマルトース結合タンパク質MBPを含み得る例えば、国際PCT出願第01/32711号参照。プロテアーゼ融合タンパク質は、標準的組換え技術により製造され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントを、慣用的技術にしたがって、例えば連結用に平滑末端またはスタッガー末端を用い、制限酵素消化により適切な末端を形成させ、適宜付着末端を補充し、アルカリ性ホスファターゼ処理により望ましくない結合を回避し、酵素的ライゲーションにより、枠内で連結させ得る。別の実施態様では、融合遺伝子は、自動DNA合成装置を含む慣用的技術により合成され得る。別法として、遺伝子フラグメントのPCR増幅は、2つの連続した遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて実施され得、続いて上記フラグメントはアニーリングおよび再増幅されることによりキメラ遺伝子配列を生じさせ得る例えば、AusubeletalCURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYJohnWileySons1992参照。さらに、既に融合部分例、GSTポリペプチドをコード化している多くの発現ベクターが市販されている。プロテアーゼコード化核酸は、融合部分がプロテアーゼタンパク質と枠内で結合されるように上記発現ベクターにクローン化され得る。5.ヌクレオチド配列本発明は、修飾プロテアーゼをコード化する核酸分子を提供する。核酸分子は、コード化されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分の対立遺伝子変異型またはスプライス変異型を含む。一実施態様では、本発明による核酸分子は、核酸コード化野生型プロテアーゼまたはその触媒活性部分と少なくとも50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95または99の配列同一性を有するか、またはその完全長の少なくとも70に沿って中程度または高度ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションする。別の実施態様では、核酸分子は、プロテアーゼまたはその触媒活性部分のいずれか、例えば本明細書記載のものの変性コドン配列を有するものを含み得る。本発明はまた、プロモーター、例えば哺乳類細胞での発現に関する誘導性プロモーターに機能し得るように結合された核酸分子、または核酸分子の触媒活性部分を含む融合タンパク質を提供する。上記プロモーターには、限定されるわけではないが、CMVおよびSV40プロモーター、アデノウイルスプロモーター、例えばHPVE7腫瘍性タンパク質に反応するE2遺伝子プロモーター、PVプロモーター、例えばPVE2タンパク質に反応するPBVp89プロモーター、およびHIVまたはPVまたは発癌遺伝子により活性化される他のプロモーターがある。本発明による修飾プロテアーゼはまた、遺伝子導入ベクターで細胞に送達され得る。導入ベクターはまた、プロテアーゼが投与される疾患または障害、例えば凝固疾患または癌を処置するための他の追加的治療剤複数も可をコード化し得る。プロテアーゼをコード化する導入ベクターは、対象に核酸を投与することにより全身的に使用され得る。例えば、導入ベクターは、ウイルス性ベクター、例えばアデノウイルスベクターであり得る。プロテアーゼをコード化するベクターはまた、幹細胞に組み込まれ、上記幹細胞は、例えば治療部位に幹細胞を移植または植え付けることにより対象に投与され得る。例えば、間葉幹細胞MSCに対し、プロテアーゼを発現するように遺伝子操作を加え、上記MSCを腫瘍の治療部位に植え付け得る。I.選択されたプロテアーゼポリペプチドの調製、処方および投与1.組成物および送達選択されたプロテアーゼ、例えば選択された突然変異体u-PAポリペプチドの組成物は、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内注射、皮下、硬膜外、経鼻、経口、直腸、局所、吸入、頬側例、舌下および経皮投与または任意の経路を含む当業者に公知の経路による投与用に処方され得る。選択されたプロテアーゼは、慣用的経路により、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層例、口腔粘膜、直腸および腸粘膜等からの吸収により投与され得、連続的、断続的または同一組成物中で他の生物活性剤と共に投与され得る。処置を施す位置によって、限局的、局所的または全身的投与であり得る。処置を必要とする領域への局所投与は、例えば、術中の局部注入、例えば術後の創傷用包帯と連係的させた局所適用、注射、カテーテル手段、坐薬、または移植体手段により行われ得るが、これらに限定されるわけではない。投与法はまた、放出制御型製剤およびポンプ手段などの放出制御装置を含む放出制御系を含み得る。所与の症例で最適な経路は、疾患の性質、疾患の進行状態、疾患の重症度、使用する特定組成物など様々な因子により異なる。様々な送達系が知られており、選択されたプロテアーゼの投与に使用され得、例を挙げると、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルでの封入、化合物を発現し得る組換え細胞、受容体介在によるエンドサイトーシス、および選択されたプロテアーゼをコード化する核酸分子の送達、例えばレトロウイルス送達系があるが、これらに限定されるわけではない。選択されたプロテアーゼを含む医薬組成物が製造され得る。一般的に、医薬上許容される組成物は、動物および人体での使用に関する公認の薬局方に準じて設けられた統制機関または他の機関による承認を考慮して製造される。医薬組成物は、イソ型を投与する際の希釈剤、補助薬、補形薬または賦形剤などの担体を含み得る。上記医薬用担体は、石油、動物性、植物性または合成起源のものを含む無菌の液体、例えば水および油類、例えば、落花生油、大豆油、鉱油およびゴマ油であり得る。医薬組成物を静脈内投与するとき、水は典型的な担体である。食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセリン溶液も、特に注射可能溶液のための液体担体として使用され得る。組成物は、有効成分と一緒に、希釈剤、例えば乳糖、ショ糖、リン酸二カルシウムまたはカルボキシメチルセルロース、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク、および結合剤、例えば澱粉、天然ゴム、例えばアラビアゴム、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に公知の他の同様の結合剤を含み得る。適切な医薬用補形薬には、澱粉、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、稲、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水およびエタノールがある。所望ならば、組成物はまた、少量の湿潤または乳化剤、またはpH緩衝剤、例えば、アセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエート、および他の同様の薬剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤および持効性製剤の形態をとり得る。組成物は、慣用的結合剤および担体、例えばトリグリセリドを用いた坐薬として処方され得る。経口用処方物は、標準担体、例えば医薬グレートのマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム、他の同様の薬剤を含み得る。適切な医薬用担体の例は、EWMartinによるRemingtonsPharmaceuticalSciencesに記載されている。上記組成物は、患者に対し適正な投与を行う形態を提供するために、一般的には純粋形態で、適量の担体と一緒に治療有効量の化合物を含有する。処方物は、投与方式に適合するべきである。処方物は、適量の化合物またはその医薬上許容される誘導体を含有する単位用量形態、例えば錠剤、カプセル剤、丸薬、散剤、顆粒剤、滅菌非経口用溶液または懸濁液、および経口用溶液または懸濁液、および油水エマルジョンでヒトおよび動物への投与用に提供される。医薬的治療活性化合物およびその誘導体は、典型的には単位用量形態または多用量形態で処方および投与される。各単位用量は、所望の治療効果をあげるのに十分な予め定められた量の治療活性化合物を、必要とされる医薬用担体、賦形剤または希釈剤と共に含む。単位用量形態の例には、アンプルおよび注射器および個別にパッケージされた錠剤またはカプセル剤がある。単位用量形態は、分割して、またはまとめて投与され得る。複数用量形態は、単一容器にパッケージされた複数の同一単位用量形態であり、分離した単位用量形態で投与される。複数用量形態の例には、バイアル、錠剤またはカプセル剤の瓶またはパイントまたはガロン単位の瓶がある。このため、複数用量形態は、パッケージ中では分離されていない単位用量の集合体である。0005~100の範囲で有効成分を含有し、残りは非毒性担体から成る用量形態または組成物が製造され得る。経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、医薬上許容される賦形剤、例えば結合剤例、前ゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース、充填剤例、乳糖、微晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム、滑沢剤例、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ、崩壊剤例、ジャガイモ澱粉または澱粉グリコール酸ナトリウムまたは湿潤剤例、ラウリル硫酸ナトリウムによる慣用的手段により製造される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当業界で公知の方法によりコーティングされ得る。医薬調製物はまた、液体形態、例えば溶液、シロップまたは懸濁液であり得るか、または使用前に水または他の適切な賦形剤により再構成される薬剤製品として提供され得る。上記液体調製物は、医薬上許容される添加剤、例えば懸濁剤例、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂、乳化剤例、レシチンまたはアカシア、非水性賦形剤例、扁桃油、油性エステルまたは精製植物油、および保存剤例、メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸を用いた慣用的手段により製造され得る。直腸投与に適切な処方物は、単位用量坐薬として提供され得る。これらは、活性化合物を、1種またはそれ以上の慣用的担体、例えばココアバターと混合し、次いで得られた混合物を成型することにより製造され得る。皮膚または眼への局所適用に適切な処方物には、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エーロゾルおよび油類がある。担体の例には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらの2つまたはそれ以上の組合わせがある。局所用処方物はまた、005~15、20、25重量パーセントの割合で、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアルキレングリコール、ポリ/ヒドロキシアルキル、メタアクリレートまたはポリメタアクリルアミドから選択される増粘剤を含み得る。局所用処方物は、点眼薬または結膜嚢への軟膏として適用されることが多い。それはまた、眼、顔面洞および外耳道の洗浄または潤滑に使用され得る。それはまた、前眼房および他の場所に注射され得る。液体状態の局所用処方物はまた、活性成分が放出されるストリップまたはコンタクトレンズ形態で親水性三次元ポリマーマトリックス中に存在し得る。吸入による投与の場合、本発明で使用する化合物は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用により、加圧パックからのエーロゾル噴霧装置またはネブライザーの形態で送達され得る。加圧エーロゾルの場合、投薬単位はバルブ設けて定量を送達することにより測定され得る。吸入器または注入器で使用される例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物および適切な粉末基剤、例えば乳糖または澱粉の粉末混合物を含むものとして製剤化され得る。頬側舌下投与に適切な処方物には、例えば、調味した基剤、通常ショ糖およびアカシアまたはトラガカントゴム中に活性化合物を含む舐剤およびゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシアなどの不活性基剤中に化合物を含むトローチ剤がある。選択されたプロテアーゼの医薬組成物は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方され得る。注射用処方物は、保存剤を加えた、例えばアンプルまたは複数用量容器中での単位用量形態をとり得る。組成物は、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであり得、懸濁剤、安定剤および/または分散剤などの調剤成分を含み得る。別法として、有効成分は、使用前に適切な賦形剤、例えば無菌で発熱物質不含有の水または他の溶媒による再構成用の粉末形態であり得る。本発明は経皮投与に適切な処方物を提供する。それらは、適切な形式、例えば長期間にわたって受容者の表皮と緊密接触した状態を保つのに適合化された個別パッチで提供され得る。上記パッチは、例えば、活性化合物に関して01~02M濃度の所望により緩衝状態にされていてもよい水溶液中に活性化合物を含む。経皮投与に適切な処方物はまた、イオン導入法例えば、PharmaceuticalResearch3318参照により送達され、典型的には活性化合物の所望により緩衝状態にされていてもよい水溶液の形態をとり得る。医薬組成物はまた放出制御型製剤および/または送達装置により投与され得る例えば、米国特許第3536809359812336302003845770;384777039168994008719;46876104769027505959550735435120548;5354566;559176756394765674533および5733566号参照。ある実施態様では、リポソームおよび/またはナノ粒子も選択されたプロテアーゼの投与に使用され得る。リポソームは、水性媒質に分散され、同時に多重ラメラ同心二分子層小胞多重ラメラ小胞MLVとも呼ばれるを形成するリン脂質から形成される。MLVは、一般に25nm~4μmの直径を有する。MLVを超音波処理すると、コアに水溶液を含む200~500オングストロームの範囲の直径を有する小さい単ラメラ小胞SUVが形成される。リン脂質は、水に分散されると、脂質対水のモル比によって、リポソーム以外の様々な構造を形成し得る。低比では、リポソームが形成される。リポソームの物理的特徴は、pH、イオン強度および二価カチオンの存在に左右される。リポソームは、イオン性および極性基質への低い透過性を示し得るが、高温ではそれらの透過性を著しく改変する相転移が起こる。相転移は、ゲル状態として知られる密に圧縮された規則正しい構造から、流動状態として知られる緩い圧縮状態で、規則正しさの劣る構造への変化を伴う。これは、特徴的な相転移温度で起こり、イオン、糖類および薬物への透過性を高めることになる。リポソームは、種々の機構:マクロファージおよび好中球などの細網内皮細胞系の食細胞によるエンドサイトーシス;非特異的な弱い疎水的または静電的力または細胞表面成分との特異的相互作用による細胞表面への吸着;細胞質へのリポソーム成分の同時放出を伴う、原形質膜へのリポソームの脂質二分子層の挿入による原形質膜との融合;およびリポソーム内容物の会合を伴わない、細胞膜または細胞レベル下の膜へのリポソーム脂質の転移またはその逆により細胞と相互作用する。リポソームの処方を変えると、どの機構が機能的であるかも改変され得るが、同時に複数が機能することも可能である。ナノカプセルは、一般的に安定した再生可能な形で化合物を包括し得る。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するためには、生体内で分解されるポリマーを用いて、このような超微細粒子01μm前後の大きさを設計するべきである。本発明では、これらの必要条件を満たす生体分解性ポリアルキル-シアノアクリレートナノ粒子の使用を考えており、上記粒子は容易に製造され得る。タンパク質分解および抗原性および免疫原性応答による免疫学的介入などの分解的過程への選択されたプロテアーゼの暴露を減らす投与方法が採用され得る。上記方法の例には、治療部位での局所投与がある。治療薬のペギル化は、タンパク質分解に対する抵抗を高め、血中半減期を延長し、抗原性および免疫原性を減らすことが報告されている。ペギル化方法の例は文献により公知である例えば、LuandFelixIntJPeptideProteinRes431271381994LuおよびFelixPeptideRes614261993FelixetalIntJPeptideRes46253641995BenharetalJBiolChem269133984041994BrumeanuetalJImmunol1543088951995、参照また、CalicetietalAdvDrugDelivRev55126177およびMolineuxPharmacotherapy233S8S参照。ペギル化はまた核酸分子のインビボ送達にも使用され得る。例えば、アデノウイルスのペギル化は、安定性および遺伝子導入を高め得る例えば、ChengetalPharmRes20144451参照。望ましい血中レベルは、血漿レベルで確認されるとおり活性成分の連続注入により維持され得る。主治医は、毒性、または骨髄、肝臓または腎臓機能不全により、いつどのように治療を終結、中断または低用量に調節するべきかを承知しているものとする。逆に、主治医はまた、臨床応答が十分なものではない毒性副作用を除外する場合、いつどのように治療を高レベルに調節するかを承知しているはずである。医薬組成物は、例えば、経口、経肺、非経口筋肉内、腹腔内、静脈内IVまたは皮下注射、吸入微細粉末製剤による、経皮、鼻、膣、直腸または舌下投与経路により投与され得、各投与経路に適切な用量形態で処方され得る例えば、国際PCT出願第WO93/25221号および同第WO94/17784号および欧州特許出願第613683号参照。選択されたプロテアーゼは、処置されている患者に対して望ましくない副作用をもたらすことなく治療上有効な効果を発揮するのに十分な量で医薬上許容される担体に含まれる。治療有効濃度は、本明細書記載の検定法など、公知インビトロおよびインビボ系で化合物を試験することにより経験的に決定され得る。組成物中の選択されたプロテアーゼの濃度は、複合体の吸収、不活化および排出速度、複合体の物理化学特性、投薬スケジュール、および投与量並びに当業者に公知の他の因子により異なる。疾患または状態の処置、例えば癌または新脈管形成の処置に関する選択されたプロテアーゼの投与量は、標準的臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロ検定法および動物モデルの使用は、最適な投薬量範囲の確認の助けとなり得る。経験的に決定され得る正確な用量は、投与経路および疾患の重症度により異なり得る。選択されたプロテアーゼは、一度に投与され得るか、または数回の小用量に分割され、時間間隔をおいて投与され得る。選択されたプロテアーゼは、処置の経過にともなって、例えば数時間、数日、数週間または数カ月にわたって1回または複数回の用量で投与され得る。場合によっては、連続投与が有用なこともある。正確な用量および処置の持続時間は、処置されている疾患の相関的要素であり、公知試験プロトコルを用いて経験的に、またはインビボまたはインビトロ試験データから補外することにより決定され得るものとする。濃度および投薬量値はまた緩和すべき状態の重症度により変動し得るものとする。さらに、特定対象についての、特定投薬プログラムは、個体の必要性および組成物投与の管理または監督者の専門的判断に応じて時間経過に伴って調節されるべきであり、本明細書で示した濃度範囲は典型例に過ぎず、それらを含む組成物および組合わせの範囲または使用を制限する意図はないものとする。組成物は、毎時、毎日、毎週、毎月、毎年または1回投与され得る。遺伝子治療のためのポリペプチドを含む組成物および核酸を含む組成物の投与方式には、限定されるわけではないが、病変部内、腹腔内、筋肉内および静脈内投与がある。また、注入、鞘内、皮下、リポソーム型、デポー型投与も含まれる。また、経鼻、経眼、経口、局所的、限局的および経耳送達も含まれる。投与量は経験的に決定され、適応症、投与方式および対象により異なり得る。具体的な用量は、対象の体重に基づいて01、1、10、100、200mg/日/kgおよびそれ以上である。2.選択されたプロテアーゼのインビボ発現および遺伝子治療選択されたプロテアーゼは、核酸分子の発現により細胞および組織へ送達され得る。選択されたプロテアーゼは、エクスビボ技術および直接インビボ発現を含め、選択されたプロテアーゼをコード化する核酸分子として投与され得る。a.核酸の送達核酸は、当業者に公知の方法で細胞および組織へ送達され得る。i.ベクター-エピソームおよび組み込みコード化核酸分子の発現による選択されたプロテアーゼの投与方法には、組換えベクターの投与が含まれる。ベクターは、例えば複製起点の封入によりエピソームのままであるように設計され得るか、または細胞で染色体へ組み込まれるように設計され得る。組換えベクターは、ウイルス性ベクターおよび非ウイルス性ベクターを含み得る。非限定的なウイルス性ベクターには、例えばアデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよび当業者に公知の他のウイルス性ベクターがある。非限定的な非ウイルス性ベクターには、人工染色体またはリポソームまたは他の非ウイルス性ベクターがある。選択されたプロテアーゼはまた、ウイルス性および非ウイルス性ベクターを用いるエクスビボ遺伝子発現療法で使用され得る。例えば、細胞に対し、例えば選択されたプロテアーゼをコード化する核酸を、調節配列と機能し得るように結合させたゲノム位置に組み込むか、または上記核酸をゲノム位置において調節配列に機能し得るように結合させて配置することによる遺伝子操作を加えて選択されたプロテアーゼを発現させ得る。次いで上記細胞は、対象、例えば処置を必要とする患者に局所または全身に投与され得る。選択されたプロテアーゼは、ウイルスにより発現され得、処置を必要とする対象に投与される。遺伝子治療に適切なウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよび上記の他のものがある。例えば、アデノウイルス発現技術は当業界ではよく知られており、アデノウイルス生産および投与方法も熟知されている。アデノウイルス血清型は例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションATCC、ロックビル、メリーランドから入手可能である。アデノウイルスは、エクスビボで使用され得、例えば処置を必要とする患者から細胞を単離し、選択されたプロテアーゼを発現するアデノウイルスベクターにより形質導入する。適切な培養期間後、形質導入された細胞を対象に局所または全身投与する。別法として、選択されたプロテアーゼを発現するアデノウイルス粒子を単離し、対象の疾患または状態を予防、処置または改善することを目的として治療有効量を送達するための医薬上許容される担体中で製剤化する。典型的には、アデノウイルス粒子は、対象体重1キログラム当たり1粒子~1014粒子、一般的には対象体重1キログラム当たり106または108粒子~1012粒子の用量範囲で送達される。状況によっては、細胞をターゲッティングする作用物質、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に関するリガンドと共に核酸供給源を提供することが望ましい場合もある。ii.人工染色体および他の非ウイルス性ベクター送達方法核酸分子は、人工染色体および他の非ウイルス性ベクターへ導入され得る。人工染色体例えば、米国特許第6077697号およびPCT国際PCT出願第WO02/097059号参照には、イソ型をコード化し、発現するように遺伝子操作が加えられ得る。iii.リポソームおよび他の封入形態および核酸を含む細胞の投与核酸は、リポソームなどの伝達体中に封入されるか、または細胞、例えば細菌細胞、特に弱毒化細菌に導入されかまたはウイルス性ベクターに導入され得る。例えば、リポソームを使用するとき、エンドサイトーシスに随伴して細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質がターゲッティングおよび/または取り込みの促進に使用され得、例えば特定細胞型に親和性を示すキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、循環中にインターナリゼーションが行われるタンパク質についての抗体、および細胞内限局化をターゲッティングし、細胞内半減期を高めるタンパク質がある。b.インビトロおよびエクスビボ送達エクスビボおよびインビボ方法の場合、選択されたプロテアーゼをコード化する核酸分子は、適切なドナーまたは処置される対象からの細胞へ導入される。治療目的で核酸が導入され得る細胞には、例えば、処置される疾患または状態に適切な望ましい利用可能な細胞型が含まれ、限定されるわけではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、血液細胞、例えばTリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球、様々な幹または始原細胞、特に造血幹または始原細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓および他の供給源から得られる幹細胞がある。エクスビボ処置の場合、処置される対象と適合し得るドナーからの細胞、または処置される対象からの細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を対象に投与する。処置は、例えば患者の体内に移植される多孔質膜内での封入などによる直接投与を含む例、米国特許第4892538および5283187号参照。インビトロでの哺乳類細胞への核酸の導入に適切な技術には、リポソームおよびカチオン性脂質例、DOTMA、DOPEおよびDC-Cholの使用、電気穿孔、顕微注入、細胞融合、DEAE-デキストランおよびリン酸カルシウム沈殿法がある。DNA送達方法は、選択されたプロテアーゼをインビボで発現させるに使用され得る。上記方法は、核酸のリポソーム送達および裸のDNA送達、例えば電気穿孔を用いる局所および全身的送達、超音波およびリン酸カルシウム送達法を含む。他の技術には、顕微注入、細胞融合、染色体融合遺伝子導入、微小核融合遺伝子導入およびスフェロプラスト融合がある。選択されたプロテアーゼのインビボ発現は、追加分子の発現と連結され得る。例えば、選択されたプロテアーゼの発現は、例えば遺伝子操作されたウイルスにおける細胞傷害性生成物の発現または細胞傷害性ウイルスでの発現と連結され得る。上記ウイルスは、治療効果に関する標的である特定細胞型にターゲッティングされ得る。発現された、選択されたプロテアーゼを用いることにより、ウイルスの細胞傷害性を高めることができる。選択されたプロテアーゼのインビボ発現では、選択されたプロテアーゼをコード化する核酸分子を特異的調節配列、例えば細胞特異的または組織特異的プロモーターと機能し得るように結合させ得る。選択されたプロテアーゼはまた、標的細胞型および/または組織で特異的に感染および/または複製するベクターから発現され得る。誘導性プロモーターを用いて、選択されたプロテアーゼの発現を選択的に調節することができる。c.全身的、限局的および局所的送達裸の核酸として、またはベクター、人工染色体、リポソームおよび他の伝達体での核酸分子は、全身的投与、限局的、局所的および他の投与経路により対象に投与され得る。全身的よびインビボのとき、核酸分子または核酸分子を含む伝達体は、細胞にターゲッティングされ得る。投与はまた、例えば細胞または組織を標的とするベクターまたは細胞の投与による直接的なものであり得る。例えば、腫瘍細胞および増殖性細胞は、選択されたプロテアーゼのインビボ発現に関してターゲッティングされる細胞であり得る。イソ型のインビボ発現に使用される細胞はまた、患者にとってオートロガスである細胞を含む。上記細胞は患者から取り出され、選択されたプロテアーゼを発現させる核酸が導入され、次いで、例えば注射または移植により患者に投与され得る。2.併用療法本明細書記載の選択されたプロテアーゼポリペプチド、および選択されたプロテアーゼポリペプチドをコード化する核酸分子のいずれかは、限定されるわけではないが、他の生物製剤、小分子化合物および手術を含む他の治療剤または処置と併用されるか、それらの前に、それらと断続的に、またはそれらに続いて投与され得る。他の薬剤および処置が利用可能である、上記で例示したもの全てを含むいずれの疾患または状態についても、上記疾患および状態に対して選択されたプロテアーゼポリペプチドは、それらと組み合わせて使用され得る。例えば、増殖性疾患、例えば癌の処置を目的とする本発明の選択されたプロテアーゼポリペプチドは、他の抗癌治療剤、例えば化学療法剤、放射性核種、放射線療法、サイトカイン類、成長因子、感光剤、毒素、代謝拮抗物質、シグナリングモジュレーター、抗癌性抗生物質、抗癌性抗体、新脈管形成阻害剤またはそれらの組合わせと併用されるか、それらの前に、それらと断続的に、またはそれらに続いて投与され得る。特異的な例では、血栓性疾患の処置を目的とする本発明の選択されたプロテアーゼポリペプチドは、他の抗凝血剤、例えば、限定されるわけではないが、血小板阻害剤、血管拡張剤、フィブリン溶解性活性化因子または他の抗凝血薬と併用されるか、それらの前に、それらと断続的に、またはそれらに続いて投与され得る。例示的な抗凝血薬には、ヘパリン、クマリン、ヒルジン、アスピリン、ナプロキセン、メクロフェナミン酸、イブプロフェン、インドメタシン、フェニルブタザールphenylbutazare、チクロピジン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび組織プラスミノーゲン活性化因子がある。3.製品およびキット選択されたプロテアーゼポリペプチドまたは選択されたプロテアーゼポリペプチドをコード化する核酸、またはその誘導体または生物活性部分の医薬化合物は、包装材料、疾患または障害の処置に有効な医薬組成物および選択されたプロテアーゼポリペプチドまたは核酸分子が疾患または障害の処置に使用されることを示すラベルを含む製品として包装され得る。本明細書による製品は包装材料を含む。医薬製品を包装するのに使用される包装材料は、当業者には周知である。例えば、米国特許第5323907、5052558および5033252号参照、これらについては出典明示で援用する。医薬用包装材料の例には、限定されるわけではないが、ブリスターパック、瓶、チューブ、吸入器、ポンプ、袋、バイアル、容器、注射器、瓶および選択された処方物および意図された投与および処置方式に適切な包装材料がある。本発明による化合物および組成物の広範な一連の処方物は、標的が介在する疾患または障害についての様々な処置法であるものとしてみなされる。選択されたプロテアーゼポリペプチドおよび核酸分子はまた、キットとして提供され得る。キットは、本明細書記載の医薬組成物および投与用のアイテムを含み得る。例えば、選択されたプロテアーゼは、投与装置、例えば、注射器、吸入器、服用カップ、スポイトまたはアプリケーターにより供給され得る。キットは、所望により、投薬量、服用法を含む使用説明書および投与方法に関する指示書を含んでいてもよい。キットはまた、本明細書記載の医薬組成物および診断用アイテムを含み得る。例えば、上記キットは、対象において選択されたプロテアーゼの濃度、量または活性を測定するアイテムを含み得る。J.選択されたプロテアーゼポリペプチドによる典型的処置方法特定標的を開裂する本発明による選択されたプロテアーゼポリペプチドおよび本発明による選択されたプロテアーゼをコード化する核酸は、標的配列を含むタンパク質に関連するか、または標的配列を開裂するプロテアーゼが使用される疾患または状態の処置に使用され得る。例えば、tPA標的基質、例えばプラスミノーゲンを開裂するように遺伝子操作が加えられた、選択されたuPAポリペプチドは、tPA標的基質に関連するかまたはtPAポリペプチドが使用される疾患または状態の処置に使用され得る。tPA標的基質に関連した疾患の例には血栓性疾患があり、本発明による選択されたプロテアーゼによる処置により、プラスミノーゲンからその活性プロテアーゼ形態プラスミンへの開裂が促進され、血餅の溶解が誘導され得る。選択されたプロテアーゼポリペプチドは、単独または他の薬剤と組み合わせた形で治療活性を呈する。本発明による選択されたプロテアーゼは、競合する結合タンパク質に対して改善された特性を呈するように設計されている。上記特性は、例えば、ポリペプチドの治療有効性を改善し得る。この項では、その典型的な使用および投与方法を説明する。ここに記載した治療法は典型例であって、選択されたプロテアーゼポリペプチドの適用を制限するものではない。本発明による選択されたプロテアーゼポリペプチドは、標的配列を含むタンパク質と関連した様々な治療および診断方法で使用され得る。上記方法は、下記に記載および列挙した生理学的および医学的状態の処置方法を含むが、これらに限定されるわけではない。本発明による選択されたプロテアーゼポリペプチドは、競合する結合タンパク質または特定標的を開裂するプロテアーゼよりも改善されたインビボ活性および治療効果を呈し得、例えば低用量でも投与および処置において同じ効果、さらに持続性のある治療効果および他の改善をもたらし得る。選択されたプロテアーゼポリペプチドの使用による治療上の改善例には、限定されるわけではないが、標的組織浸透性例、腫瘍浸透性の改良、有効性の向上、投薬量の低減化、投与頻度の減少および/または低下、副作用の減少および治療効果の増強がある。特に、選択されたプロテアーゼは多数の標的基質を開裂および不活化し得るため、選択されたプロテアーゼにより実質的に治療範囲は拡大される。特に、選択されたプロテアーゼポリペプチドは、特定標的を開裂するプロテアーゼが既に処置に使用されている治療方法での使用が意図されたものである。上記方法には、限定されるわけではないが、疾患および障害、例えば、限定されるわけではないが、凝血性障害、例えば血栓性障害および汎発性血管内凝固症候群、心臓血管疾患、神経学的障害、増殖性疾患、例えば癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染症、細菌感染症、呼吸器疾患、胃腸障害および代謝性疾患の処置方法がある。選択されたプロテアーゼポリペプチドによる疾患および状態の処置は、限定されるわけではないが、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内注射、皮下、硬膜外、経鼻、経口、直腸、局所、吸入、頬側例、舌下および経皮投与を含む本明細書記載の適切な処方物を用いた適切な投与経路により実施され得る。必要ならば、特定の投薬量および持続期間および処置プロトコルは、経験的に決定されるかまたは補外され得る。例えば、類似配列を開裂する野生型プロテアーゼポリペプチドの典型的用量は、適切な投薬量を決定する際の出発点として使用され得る。例えば、組換えtPAポリペプチドの用量は、tPA標的を開裂する選択されたuPAポリペプチドの用量を決定する際の指針として使用され得る。投薬量レベルおよびプログラムは、既知の投薬量およびプログラムに基づいて決定され得、必要ならば、選択されたプロテアーゼポリペプチドの特性の変化に基づいて補外され、そして/または様々な因子に基づいて経験的に決定され得る。他の類似プロテアーゼとの比較における選択されたプロテアーゼポリペプチドの活性レベルおよび半減期などの因子は、上記決定を下すのに使用され得る。特定の投薬量およびプログラムが経験的に決定され得る。上記の他の因子には、個体の体重、全般的健康状態、年齢、使用される特異的化合物の活性、性別、食事療法、投与時間、排出速度、薬剤の組合わせ、疾患の重症度および経過、および疾患に対する患者の素因および主治医の判断がある。有効成分、選択されたプロテアーゼポリペプチドは、典型的には医薬上有効な担体と組み合わされる。担体材料との組み合わせにより、単一用量形態または複数用量形態を形成する有効成分の量は、処置される宿主および特定の投与方式により変化し得る。疾患の処置または疾患の症状の改善に対する選択されたプロテアーゼポリペプチドの効果は、処置されている特定疾患について当業界で公知の診断試験を用いてモニターされ得る。患者の状態が改善されると、維持用量の化合物または組成物が投与され得、必要ならば、投薬量、投薬形態または投与頻度またはそれらの組合わせが修正され得る。場合によっては、病状の再発時または予定された投薬法に基づいて、対象が長期間体制で断続的処置を必要とすることもあり得る。他に、出血、外傷または外科的措置などの急性事象に応じて追加的投与が要求される場合もあり得る。例によっては、プロテアーゼアゴニストすなわち、模倣物質またはプロテアーゼアンタゴニストとして機能する選択されたプロテアーゼタンパク質の変異型を使用する場合もある。選択されたプロテアーゼポリペプチドの変異型は、突然変異誘発例、プロテアーゼタンパク質の独立した点突然変異または先端切除により生成され得る。選択されたプロテアーゼポリペプチドのアゴニストは、選択されたプロテアーゼポリペプチドの天然形態の生物活性と実質的に同じ活性かまたはそれらの一部分を保持し得る。選択されたプロテアーゼポリペプチドのアンタゴニストは、選択されたプロテアーゼポリペプチドの天然形態の活性の1つまたはそれ以上を、例えば選択されたプロテアーゼポリペプチドと同じ標的タンパク質を開裂することにより阻害し得る。すなわち、限定された機能をもつ変異型で処置することにより、特異的生物作用が誘発され得る。一実施態様では、選択されたプロテアーゼポリペプチドの天然形態の生物活性の一部を有する変異型で対象を処置すると、選択されたプロテアーゼポリペプチドの天然形態で処置した場合と比べて対象における副作用は少なくなる。以下、選択されたプロテアーゼが単独の治療剤として、または他の薬剤と組合わせた形で使用され得る若干の典型的な疾患または状態を示す。プロテアーゼの選択に関する具体例としての標的は、説明を目的としているのであり、本発明方法で使用される可能な標的の範囲を限定するものではない。1.tPA標的を開裂する選択されたuPAポリペプチドに関する典型的処置方法tPA標的を開裂する選択されたuPAポリペプチドは、急性および慢性状態の両方を含む血栓性障害の改善に使用される治療適用法に有用である。急性状態には特に心臓発作および卒中があり、慢性状況には動脈および深静脈血栓症および再狭窄の状態がある。選択されたuPAポリペプチドは、上記状態の症状を改善するための血栓崩壊性治療薬として使用され得る。治療用組成物は、ポリペプチド、cDNA分子を単独で、またはウイルス性ベクター送達系またはリポソーム送達系などで示された他のベクターに基づく遺伝子発現送達系の一部を含む。血栓崩壊性治療薬として使用される組成物は、一般に医薬上適切な賦形剤中における選択されたuPAポリペプチドの生理学的有効量である。投与方式および処置される状態によって、血栓崩壊性治療薬は単一または複数投薬法で投与される。当業者であれば、投薬法の変化は処置される状態によって異なることは容易に理解できるはずである。凝血に対し阻害または拮抗作用を示す本発明による選択されたuPAポリペプチドは、虚血性障害、例えば末梢血管障害、肺塞栓、静脈血栓症、深静脈血栓症DVT、表在性血栓静脈炎SVT、動脈血栓症、心筋梗塞、一過性虚血発作、不安定狭心症、可逆性虚血性神経障害、付随性血栓崩壊活性、過度の血液凝固状態、再灌流損傷、鎌状赤血球貧血または卒中障害についての抗凝血処置方法で使用され得る。術中におけるDVTまたはSVTなどの過度の血液凝固の危険性が高い患者の場合、本発明によるプロテアーゼ不活性の選択されたuPAポリペプチドが、限定されるわけではないが、心臓手術、血管形成術、肺手術、腹部手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、または心臓、肺、膵臓または肝臓の移植を含む臓器移植手術などの手術中における過度の血液凝固を予防するために投与され得る。選択されたuPAポリペプチドのみで処置を行う場合もある。また、選択されたuPAポリペプチドを、処置される状態または疾患に必要であるならば追加的抗凝固因子と連係的に投与する場合もある。tPAは、食品医薬品局FDAにより認可された、急性血栓塞栓性卒中に関する唯一の治療薬である。tPAおよびその変異型は、市販されており、様々な状態に関して人体への投与が認められている。例えば、アルテプラーゼActivase登録商標、カリフォルニア、サウスサンフランシスコ、Genentechは組換えヒトtPAである。レテプラーゼRetavase登録商標、Rapilysin登録商標BoehringerMannheim、RocheCentororは、もとのタンパク質の527アミノ酸のうち355アミノ酸を含むように分子に遺伝子操作が加えられたヒトtPAの組換え非グリコシル化形態である。テネクテプラーゼTNKase登録商標、Genentechは、3個のアミノ酸置換を有する点が天然ヒトtPAとは異なるヒトtPAの527アミノ酸糖タンパク質誘導体である。これらの置換により、血漿クリアランスは減少し、フィブリン結合は増加しそれによりフィブリン特異性は増加する、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1PAI-1への抵抗性は高まる。アニストレプラーゼEminase登録商標、SmithKlineBeechamは、さらに別の市販されているヒトtPAである。tPA標的に対する特異性をもつ本発明による選択されたuPAポリペプチドも同様に修飾され、tPAで処置可能な治療法に関して処方され得る。a.血栓性疾患および状態血栓性疾患は、凝固能亢進、または血液凝固に有利な血流遮断の調節不全を特徴とする。血栓性疾患および状態の例には、動脈血栓症、静脈血栓症、静脈血栓塞栓症、肺塞栓症、深静脈血栓症、卒中、虚血性卒中、心筋梗塞、不安定狭心症、心房細動、腎損傷、経皮的経管的冠動脈形成術、汎発性血管内凝固症候群、敗血症、人工臓器、シャントまたはプロテーゼ、および下記で検討している他の後天的血栓性疾患がある。血栓性疾患に関する典型的治療法は、凝血カスケードの阻止を含む抗凝血治療を必然的に伴う。本発明による選択されたuPAポリペプチドおよび本発明による選択されたuPAポリペプチドをコード化する核酸は、血管内凝固を伴う状態の処置を含む、血栓性疾患および状態に関する抗凝血治療で使用され得る。血液凝固を阻害し得る本発明による選択されたuPAポリペプチドは、例えば、血栓形成を制御、溶解または阻止するのに使用され得る。ある実施態様では、本発明による選択されたuPAポリペプチドおよび選択されたuPAポリペプチドをコード化する核酸は、動脈血栓性疾患の処置に使用され得る。別の実施態様では、本発明による選択されたuPAポリペプチドおよび選択された修飾uPAポリペプチドをコード化する核酸は、深静脈血栓症などの静脈血栓障害の処置に使用され得る。ある実施態様では、本発明による選択されたuPAポリペプチドおよび選択されたuPAポリペプチドをコード化する核酸は、卒中などの虚血性障害の処置に使用され得る。選択されたuPAポリペプチドの使用による治療上の改善例としては、例えば、投薬量の低下、投与頻度の減少および/または低下、副作用の減少および治療効果の向上があるが、これらに限定はされない。選択されたuPAポリペプチドは、例えば、動物モデルの使用により治療有効性について試験され得る。例えば、虚血性卒中のマウスモデル、または血栓性疾患または状態に関する他の公知疾患モデルは、選択されたuPAポリペプチドにより処置され得るDoddsAnnNYAcadSci516631635。病状の進行および表現型をモニターすることにより、選択されたuPAポリペプチドの効果が評価される。また選択されたuPAポリペプチドを、動物モデルおよび臨床試験などにおける対象に投与することにより、プラセボ対照と比較したインビボ有効性が評価され得る。i.動脈血栓症動脈血栓は、動脈血管壁の破裂の結果として形成される。多くの場合、この破裂はアテローム性動脈硬化症などの血管疾患を患う患者で起こる。動脈血栓は、通常妨害された血流領域およびアテローム性動脈硬化症のプラークに起因する破裂部位で形成され、この破裂によりトロンボゲン形成性内皮下層が血小板および凝血性タンパク質に暴露され、次いで凝血カスケードを活性化する。プラーク破裂はまた、プラークへの出血に起因する血管のさらなる狭窄をもたらし得る。非閉塞性血栓は血管壁に組み込まれ、アテローム性動脈硬化のプラーク成長を加速させ得る。動脈血栓の形成は、血流を閉塞させるかまたは遠位微細循環系への塞栓により虚血状態を誘発し得る。抗凝血薬および血小板機能および凝血カスケードを抑制する薬剤は、動脈血栓症の予防および処置に有効であり得る。上記種類の薬剤は、動脈血栓症の処置に有効である。動脈血栓症は、不安定狭心症および急性心筋梗塞状態に至り得る。凝血を阻害する本発明による選択されたuPAポリペプチドは、不安定狭心症および急性心筋梗塞などの動脈血栓症および状態の処置および/または予防に使用され得る。ii.静脈血栓症および血栓塞栓症静脈血栓症は、特に静脈系を通る血流が低い場合における血液凝固対血餅溶解に関するシグナルの不均衡により血餅が静脈に形成されている状態である。血栓形成の結果としては、静脈および静脈弁の損傷があり得るが、血管壁は典型的には無傷のままである。血餅は、多くの場合塞栓を形成するかまたは破裂し、血流を通過し得、そこで臓器領域、例えば肺肺塞栓症、脳虚血性脳卒中、一過性虚血性発作、心臓心臓発作/心筋梗塞、不安定狭心症、皮膚電撃性紫斑病および副腎に留まり得る。血流妨害により死亡する場合もあり得る。静脈血栓塞栓症の再発傾向がある患者は、血栓形成傾向を有することを特徴としている。血栓塞栓性疾患発現に関する危険因子には、外傷、固定化、悪性疾患、心不全、肥満、高レベルのエストロゲン、下肢麻痺、心筋梗塞、拡張蛇行静脈、癌、脱水症、喫煙、経口避妊薬および妊娠がある。血栓形成傾向を有する家族の遺伝的研究は、FVIII、FIXおよびFXIを含む、遺伝的な高レベルの凝固因子を立証しているLavigneetalJThrombHaemost121342130。深静脈血栓症DVTは、深下肢静脈における静脈血栓の形成をいう。DVTの一因となる3つの主因子は、静脈管壁の損傷、高い血液凝固傾向および血流鬱滞である。これらの因子は、まとめてウィルヒョウーの3要素と呼ばれる。静脈は、外傷または手術中、または病的状態、例えばバーガー病またはDICまたは別の血液凝固の結果として傷つき得る。DVT発現の一因となる他の因子は、上記で検討した一般的な血栓塞栓性疾患の場合と類似している。DVTで形成される血餅は、微細な炎症しか誘発しないため、容易に血流中へ放出され得る。血栓は、多くの場合下肢筋肉の微細な収縮により破裂し得る。一旦血栓が塞栓になると、それは肺の血管内に留まり得るため、肺梗塞を誘発し得る。血流中の活性FIXレベルが高い患者は、深静脈血栓症を発症する危険性が高いWeltermannetalJThrombHaemost11618。血栓塞栓性疾患は遺伝性であり得、血液凝固因子の遺伝的異常により病気が誘発されるため、血流遮断での不均衡がもたらされる。幾つかの先天的欠損には、抗トロンビンIII、プロテインC、プロテインSまたはプラスミノーゲンが含まれる。他の因子には、活性化プロテインCに対する抵抗APC抵抗性または第V因子ライデン効果とも呼ばれ、第V因子における突然変異により、プロテインCによる分解に対して抵抗を示すものになる、プロトロンビンの突然変異、異常フィブリノゲン血症突然変異によりフィブリン溶解に対する抵抗性が付与されるおよび高ホモシステイン血症がある。若年患者における血栓塞栓性疾患の発現は、上記の先天的欠損に起因することが多く、若年性栓友病と呼ばれる。静脈血栓塞栓性疾患およびDVTの処置は、典型的には抗凝血治療を含み、その場合経口用量のへパリンおよびワルファリンを投与する。通常、ヘパリンを患者に注入することにより急性事象を制御した後、長期間ワルファリンによる経口抗凝血治療を行うことにより、将来的な症状の発現を制御する。他の治療法には、直接的トロンビン阻害剤、血小板機能阻害剤、例えばアスピリンおよびデキストラン、および弾力性ストッキングおよび空気圧迫装置を含む静脈鬱血を打ち消す治療がある。凝血を阻止する本発明による選択されたuPAポリペプチドは、血栓塞栓性疾患および/またはDVTの抗凝血治療で使用され得る。若干の実施態様において、凝血を阻止する本発明による選択されたuPAポリペプチドは、血栓塞栓性疾患および/またはDVTに関する危険因子を呈する患者における血栓塞栓性疾患および/またはDVTの予防的治療法で使用され得る。a虚血性卒中脳への血流が中断されたとき、虚血性卒中が起こり、脳の一領域への循環が突然失われるため、それに応じて神経学的機能も失われる。脳内出血を特徴とする出血性卒中とは対照的に、虚血性卒中は、通常血栓症または塞栓症により誘発される。虚血性卒中は、全卒中の約80を占める。上記で検討した血栓塞栓症発現に関する原因および危険因子に加えて、脳動脈切開の原因となる過程例、外傷、胸部大動脈切開、動脈炎が血栓性卒中を誘発し得る。他の原因としては、狭窄または閉塞した動脈に対し遠位での低灌流または2つの脳動脈テリトリー間の脆弱な分水界領域の低灌流がある。虚血性卒中の処置は、その状態を予防および処置するための抗凝血治療を含む。凝血を阻止する本発明による選択されたuPAポリペプチドは、虚血性卒中の処置および/または予防またはその危険性の低減化に使用され得る。iii.後天的凝固障害後天的凝固障害は、ビタミンK欠損症、肝臓病、汎発性血管内凝固症候群DICまたは循環抗凝固薬の発現などの状態または疾患の結果である。血液凝固の欠損は、上記状態または疾患により誘発される血液凝固因子の二次的欠乏の結果である。例えば、肝臓が病的状態であるとき、肝臓からの凝固因子の生成は損なわれることが多い。凝固因子の合成の減少に伴って、フィブリン溶解が増し、血小板減少症血小板の欠乏が増大する。また、肝臓による凝固因子の生産減少は、劇症肝炎または急性妊娠脂肪肝により誘発され得る。上記の状態は、利用可能な凝固因子を消費する血管内血液凝固を促進する。本発明による選択されたuPAポリペプチドは、血液凝固因子の欠乏を緩和するために後天的凝固障害の処置で使用され得る。a汎発性血管内凝固症候群DIC汎発性血管内凝固症候群DICは、広範囲に及び継続している凝固の活性化を特徴とする障害である。DICでは、凝固のトロンビン活性化と血栓のプラスミン分解間の均衡が失われる。血管または微細血管フィブリン沈着は、結果的に様々な臓器への血液供給に障害を生じさせ得、それが臓器不全の一因となり得る。亜急性または慢性DICでは、患者は凝固能亢進表現型を呈し、過度のトロンビン形成による血栓が生じ、静脈血栓症の症状および徴候が存在し得る。急性DICとは対照的に、亜急性または慢性DICは、ヘパリン、抗トロンビンIIIおよび活性化プロテインC処置を含む、高血栓症の緩和方法により処置される。本発明による選択されたuPAポリペプチドおよび本発明による選択されたuPAポリペプチドをコード化する核酸は、亜急性または慢性DICに対する治療で使用され得る。一実施態様では、亜急性または慢性DICについて、本発明によるポリペプチド、および選択されたuPAポリペプチドをコード化する核酸は、他の抗凝固治療と組み合わせて使用され得る。選択されたuPAポリペプチドは、例えば動物モデルを用いることにより、治療有効性に関して試験され得る。病状の進行および表現型をモニターすることにより、選択されたuPAポリペプチドの効果を評価する。また、選択されたuPAポリペプチドを、動物モデルおよび例えば臨床試験での対象に投与することにより、プラセボ対照と比較したインビボ有効性が評価され得る。b細菌感染症および歯周炎細菌などの微生物による全身的感染症は、一般にDICに随伴する。凝固経路のアップレギュレーションは、炎症応答を誘発する微生物の細胞膜成分リポ多糖類または内毒素または細菌性内毒素例、ブドウ球菌アルファ毒素により部分的に伝達され、高レベルのサイトカインを誘導し得る。次いで、サイトカインは凝固の誘導に影響を及ぼし得る。細菌性病原体、例えばポルフィルスギンギバリスPorphyrusgingivalisは、成人歯周病の病原体としてよく知られている。ポルフィルスギンギバリスPorphyrusgingivalis菌は、病原性因子として機能するアルギニン特異的システインプロテイナーゼを生じるGrenieretalJClinMicrobiol25738740SmalleyetalOralMicrobiolImmunol4178181MarshetalFEMSMicrobiol59181185およびPotempaetalJBiolChem2732164821657。ポルフィルスギンギバリスPorphyrusgingivalisからは、50kDaおよび95kDaのギンギパインRそれぞれRgpBおよびHRgpAと称される2種のプロテイナーゼが生成された。プロテアーゼは、凝固因子をタンパク質分解的に開裂することにより活性化し得る。細菌感染中には、血流中へギンギパインRが放出されることにより、凝固カスケードの活性化が制御不能になり、トロンビンの過剰生産をもたらすため、汎発性血管内凝固症候群DIC誘発の可能性が増大し得る。さらにトロンビン濃度の多大な増加は、歯周炎部位での破骨細胞による歯槽骨吸収の一因となり得る。血液凝固を阻害する本発明による選択されたuPAポリペプチド、および選択されたuPAポリペプチドをコード化する核酸は、歯周炎の処置に使用され得る。選択されたuPAポリペプチドは、歯周炎モデルにおける気道応答性に関する治療有効性について試験され得る。上記モデルとしては、動物、例えばヒト以外の霊長類、イヌ、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットが利用可能であるWeinbergおよびBralJofPeriodontology26335340。また選択されたuPAポリペプチドを、動物モデルおよび例えば臨床試験での対象に投与することにより、プラセボ対照と比較したインビボ有効性が評価され得る。b.他のtPA標的関連状態本発明による選択されたuPAポリペプチドはまた、tPAが関与する神経障害の処置にも使用され得る。tPAは、細胞外マトリックスタンパク質および他の基質に対する加水分解能を有することから組織モデリングおよび可塑性を含む生理学的過程を調節すると考えられているGravanisおよびTsirskaGlia49177183。卒中または負傷例、事故または手術によるなどの事象を経験した患者は、本発明による選択されたuPAポリペプチドで処置され得る神経損傷を患っていることが多い。本発明による選択されたuPAポリペプチドは、限定されるわけではないが、神経変性疾患、例えば多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、亜急性硬化性汎脳炎、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋ジストロフィー、および栄養失調または毒素例、神経毒、乱用性医薬により誘発される状態を含む様々な神経学的疾患および状態に罹患している対象の処置に有用であり得る。さらに、選択されたuPAポリペプチドは、認知機能を向上させ、そして/または認知機能低下、例えば、良性老人性健忘症、老年性記憶障害、老年性認知機能低下などPetersenetalJImmunologicalMeth257107116およびアルツハイマー病を処置するのに有用であり得る。選択されたuPAポリペプチドは、神経系への損傷に関する様々な動物モデルのいずれかを用いて試験され得る。使用され得るモデルには、限定されるわけではないが、血栓塞栓性卒中KruegerおよびBusch、InvestRadiol376008GuptaおよびBriyal、IndianJPhysiolPharmacol4837994に関するげっ歯動物、ウサギ、ネコ、イヌまたは霊長類モデル、脊椎損傷モデルWebbetalVetRec15522530などがある。本方法および組成物はヒトでも試験され得る。標準化された試験および評点システムを含む様々な異なる方法が、動物およびヒトにおける運動、感覚、行動および/または認知機能の回復を評価するのに利用可能である。適切な方法であれば使用され得る。一例では、ヒトにおける感覚機能の回復を測定する主基準となった、アメリカ脊髄障害協会ASIA評点基準が使用され得る。例えば、様々な評点システムおよび方法の例についてはMartinezArizalaJRehabilResDev40359ThomasおよびNoga、JRehabilResDev402533KesslakおよびKeirstead、JSpinalCordMed263238参照。ヒトでの使用に好ましい用量範囲は、薬剤複数も可の効力および観察された毒性を考慮しながら組織培養系および動物モデルで薬剤複数も可を試験することにより確立され得る。c.診断方法本発明による選択されたuPAポリペプチドは、限定されるわけではないが、フィブリンおよび活性が改変されたフィブリン分解産物を検出する診断検定法を含む診断方法で使用され得る。したがって、これらの検定法は血栓状態で指示される。他の診断的適用法は、選択されたuPAポリペプチドに対する抗体を含むキットを含み、これらは当業者には周知のものである。2.VEGFまたはVEGFR標的を開裂する選択されたプロテアーゼポリペプチドに関する典型的処置方法血管内皮増殖因子VEGFは、特異的細胞表面受容体VEGFRと結合し、それを通してシグナリングすることにより、新たな血管が既存の脈管構造から形成される過程である新血管形成を調節するサイトカインである。病的な新血管形成は、疾患に随伴した血管新生の増加を示し、固体腫瘍の増大McMahonOncologist5補遺11310、黄斑変性および糖尿病などの事象を含む。癌の場合、固体腫瘍は、増殖および転移するため血液供給の絶えざる増加を必要とする。低酸素または発癌遺伝子突然変異により、腫瘍および周辺ストロマ細胞におけるVEGFおよびVEGFRmRNAのレベルが増加するため、既存の血管が伸長し、新たな脈管網が形成される。滲出型黄斑変性では、異常な血管増殖が黄斑下方に形成される。これらの血管から血液および流体が黄斑中へ漏れることにより光受容細胞が損なわれる。糖尿病では、眼への血液供給が欠如するため失明に至り得る。目の周囲における毛細血管の成長をVEGFが刺激することにより、正しく機能しない不規則な脈管となる。VEGFの3種のチロシンキナーゼファミリー受容体VEGF-R-1/Flt-1、VEGF-R-2/Flk-1/KDR、VEGF-R-3/Flt-4が同定されている。KDRマウス相同体はFlk-1は、内皮細胞で排他的に発現される400~800pMのKdをもつVEGFの高親和力受容体WaltenbergerJBiolChem2692698895である。VEGFおよびKDRの組合わせは、病的新脈管形成に必要とされる主要な内皮細胞特異的シグナリング経路として確認されているKimNature3628414MillauerNature3675769YoshijiHepatology30117986。リガンド結合時に受容体が二量体化すると、細胞質ドメインの自動リン酸化、および細胞質全域および核にシグナルを伝達する結合パートナーの漸増が誘発されることにより、細胞増殖プログラムが変更される。可溶性VEGF-R2による腫瘍の処置により、腫瘍の増殖は阻害されLinCellGrowthDiffer94958、リン酸化の化学的阻害により腫瘍細胞はアポトーシスに至り得るShaheenCancerRes5954126。血管内皮増殖因子VEGFおよびその受容体によるシグナリングは、病的新脈管形成および癌における腫瘍脈管構造の急速な発達に関与している。このシグナリング経路を遮断する薬剤は、腫瘍の血液供給の増大および維持を阻止し、腫瘍を系統的な死に至らしめる。転移性腸癌患者における抗VEGF抗体AVASTIN登録商標の近年の成果は、VEGFが癌の抗脈管形成療法における標的であることを証明した。これらの有望な結果にもかかわらず、腫瘍の進行は抗VEGF処置にもかかわらず依然として起こっている。VEGF機能に影響する抗体の機構および抗体がどのように腫瘍増大を妨げるのかは未知である。ノックダウン実験は、VEGF機能の遮断により新脈管形成が遮断されることを示している。すなわち、VEGFR-2を通じた脈管形成シグナリングの阻害は、新規ターゲッティングを伴う遺伝子操作されたプロテアーゼの開発に理想的であるまだ十分には開発されていない治療領域を代表している。VEGF受容体およびFlk-1/KDRを特異的にターゲッティングする治療は、単独および細胞傷害性治療JClinInvest105R1524と組み合わせた形で、ヒトおよびマウス固体腫瘍の多数のマウスモデルにおいて病的な新脈管形成を阻害し、腫瘍の大きさの縮小を示したPrewettCancerRes59520918FongNeoplasia13141ErratumNeoplasia1183。小分子阻害剤および抗体による試験は、強力な抗新脈管形成標的であるとしてVEGF受容体ファミリーを確認しているが、さらに有効な治療法が依然として要望されている。VEGFRは、7つの免疫グロブリンIg様ドメインの細胞外領域、貫膜領域および2つの細胞質チロシンキナーゼドメインにより構成される。最初の3つのIg様ドメインは、リガンド結合を調節することが示されており、ドメイン4~7は正しい二量体化の阻害およびリガンドの非存在下でのシグナリングにおいてある一定の役割を有する。遺伝子操作されたプロテアーゼによる選択的タンパク質分解における標的として、それは以下の有望な標的としての特徴を有する:タンパク質分解に接近可能なアミノ酸の不安定領域;ヒト、ラットおよびマウス種間における高い配列同一性;開裂時のシグナリングのダウンレギュレーション;およびリガンドと非生産的に結合し得る可溶性受容体のタンパク質分解的生成。VEGF-R2の幾つかの領域は、Ig様ドメイン間における貫膜領域および未構築ループ前のストーク領域を含め特異的タンパク質分解に利用可能である。一例では、本発明によるセリン様プロテアーゼには、貫膜およびサイトカインまたは増殖因子結合ドメイン間の特異的標的受容体例、VEGFRを開裂するように遺伝子操作が加えられ得る。それによりタンパク質受容体を細胞表面またはループ領域につなぐように機能するストーク領域は、ポリペプチド鎖における球状ドメインから分離される。a.新脈管形成、癌および他の細胞周期依存的疾患または状態本発明による典型的な選択されたプロテアーゼは、新脈管形成のモジュレーションに関与するVEGFまたはVEGFRを開裂する。細胞表面分子が腫瘍新脈管形成でシグナリングするVEGFRである場合、開裂は癌の拡散を阻止する。例えば、VEGFR分子から細胞表面ドメインが開裂されると、その細胞外シグナル、特に細胞増殖シグナルを伝達する能力は不活化され得る。腫瘍に養分を与える新脈管形成が無ければ、癌細胞は増殖し得ないことが多い。したがって、一実施態様において、本発明による選択されたプロテアーゼは癌治療に使用される。また、VEGFRの開裂は、黄斑変性、炎症および糖尿病などの他の病状における新脈管形成のモジュレーションに使用され得る。一実施態様では、細胞周期の進行に関与する標的VEGFまたはVEGFRタンパク質を開裂することにより、細胞周期を前進させるタンパク質の能力が不活化される。細胞周期の進行が無ければ、癌細胞は増殖できない。したがって、本発明による選択されたプロテアーゼは、VEGFまたはVEGFRを開裂することから、癌および他の細胞周期依存的病状の処置に使用される。また本発明による選択されたプロテアーゼは、腫瘍形成性に関与する可溶性タンパク質を開裂し得る。VEGFポリペプチドの開裂により、VEGF受容体によるシグナリングが阻止され、新脈管形成が減少するため、例えば癌、黄斑変性、炎症および糖尿病などの新脈管形成が一定の役割を演じる疾患が縮小される。さらに、VEGFシグナリングは、ある種の細胞型における細胞周期のモジュレーションに関与する。したがって、本発明による選択されたプロテアーゼは、VEGFを開裂することから、癌および他の細胞周期依存的病状の処置に有用である。b.VEGFまたはVEGFRを開裂する選択されたプロテアーゼによる併用療法一実施態様において、癌などの病状の処置では、処置を必要とする対象に、例えば少なくとも1種の抗癌剤と組合わせて、特異的に開裂することにより、VEGF/VEGFR-2複合体のシグナリングを不活化するプロテアーゼの治療有効量を投与する。抗新脈管形成療法は、固体癌および血液悪性疾患の両方に対して有効であることが判明した例えば、RibattietalJHematotherStemCellRes121122参照。したがって、抗新脈管形成治療としての本発明による組成物は、血液および固体組織悪性疾患の両方の処置を容易にし得る。本発明による組成物および処置方法は、単独または当業者に公知の他の適切な抗癌治療法と組合わせて使用され得る。例えば、本発明による選択されたプロテアーゼは、AVASTIN登録商標投与が治療上の恩恵をもたらす治療においてAVASTIN登録商標と併用して、またはその代わりに投与され得る。一実施態様では、抗癌剤は少なくとも1種の化学療法剤である。関連した実施態様では、プロテアーゼの投与を少なくとも1種の放射性療法と組み合わせる。併用療法を施行すると、脈管形成シグナルが弱められ、遊離VEGFレベルを低下させる可溶性受容体のプールができる。一実施態様では、本発明による選択されたプロテアーゼは、6アミノ酸領域にわたる受容体の決定的領域、Flk-1/KDRストークと適合するインビトロ特異性を有する。本発明による選択されたプロテアーゼポリペプチドは、複数の治療剤を含む組成物中で投与され得る。治療剤は、同一または異なり得、例えば治療用放射性核種、薬物、ホルモン、ホルモン拮抗物質、受容体拮抗物質、別の作用物質により活性化された酵素またはプロ酵素、オートクリン、サイトカインまたは当業者に公知の適切な抗癌剤であり得る。一実施態様では、選択されたプロテアーゼポリペプチドと共投与される抗癌剤はAVASTIN登録商標である。本発明方法で有用な他の治療剤には、毒素、抗DNA、抗RNA、放射性標識オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗タンパク質および抗クロマチン細胞傷害性または抗菌剤がある。他の治療剤も当業者には知られており、本発明方法による他の同様の治療剤の使用も具体的に考えられる。抗腫瘍剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、ホルモン性剤、抗生物質、抗体、抗癌生物製剤、グリベック、コルチシン、ビンカアルカロイド、L-アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、ニトロソ尿素またはイミダゾールカルホキサミドなどの多数の化学療法剤の一つであり得る。適切な薬剤は、チューブリンの脱分極を促進するかまたは腫瘍細胞増殖を阻止する薬剤である。考えられる化学療法剤には、限定されるわけではないが、食品医薬品局および米国保健福祉省により編集された、OrangeBookofApprovedDrugProductsWithTherapeuticEquivalenceEvaluationsに列挙された抗癌剤がある。上記化学療法剤に加えて、本発明によるセリンプロテアーゼ様プロテアーゼも放射線治療処置と一緒に投与され得る。当業界で公知の追加的処置も包含される。治療剤は化学療法剤であり得る。化学療法剤は当業界では公知であり、少なくともタキサン類、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカアルカロイド、抗生物質、酵素、白金配位錯体、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤または拮抗物質が含まれる。さらに具体的には、化学療法剤は、ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲンまたはアンドロゲンの非限定的な群から選択される1種またはそれ以上の薬剤であり得る。さらに特定すれば、化学療法剤は、アザリビン、ブレオマイシン、ブリオスタチン-1、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、CPT-11、シクロホスファミド、シタラビン、デカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、ヒドロキシプロゲステロン、カプロエート、ヒドロキシ尿素、L-アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、フェニルブチレート、プレドニゾン、プロカルバジン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タキソール、テストステロンプロピオネート、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビンブラスチンまたはビンクリスチンであり得る。化学療法剤の組合わせの使用も包含される。化学療法剤の投与は、セリンプロテアーゼ様ムテインポリペプチドの投与の前、最中または後であり得る。本発明による選択されたプロテアーゼポリペプチドと併用または共投与される他の適切な治療剤は、放射性同位元素、ホウ素アデンド、免疫モジュレーター、毒素、光活性剤または染料、癌化学療法剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗細菌剤、抗原生動物剤および化学増感剤から成る群から選択される米国特許第4925648および4932412号参照。適切な化学療法剤は、例えば、REMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCES、19版およびGoodmanおよびGilman、THEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICSに記載されている。他の適切な化学療法剤は、例えば、実験用薬物は、当業者には公知である。さらに、適切な治療用放射性同位元素は、ax-エミッター、β-エミッター、γ-エミッター、オージェ電子エミッター、α-粒子を放出する中性子捕捉剤および電子捕捉により崩壊する放射性同位元素から成る群から選択される。好ましくは、放射性同位元素は、225Ac、198Au、32P、131I、131I、90Y、186Re、188Re、67Cu、177Lu、213Bi、10Bおよび211Atから成る群から選択される。複数の治療剤を本発明による選択されたプロテアーゼと組み合わせて使用する場合、それらは同じ種類またはタイプに属するものであり得るか、または異なる種類またはタイプのものであり得る。例えば、治療剤は、異なる放射性核種、または一薬物および一放射性核種を含み得る。別の実施態様では、個々のエネルギー放出の結果として異なる距離にわたって有効である種々の同位体が、本発明プロテアーゼとの組み合わせにおける第1および第2治療剤として使用される。上記薬剤の使用により、腫瘍のさらに有効な処置が達成され得ることから、通常の臨床環境におけるように、大きさが異なる多数の腫瘍を呈する患者に対しても有用である。極小腫瘍沈殿物および単細胞の処置に有用である利用可能な同位体は僅かしかない。これらの状況では、薬物または毒素が本発明によるプロテアーゼとの同時投与に関して有用な治療剤であり得る。したがって、若干の態様では、同位体は、薬物、毒素および中性子捕捉剤などの非同位体種と組み合わせて使用され、本発明によるプロテアーゼと同時投与される。細胞に対する細胞傷害作用を有する多くの薬物および毒素が知られており、本発明によるプロテアーゼと組み合わせて使用され得る。それらは、薬物および毒素の総目録、例えばMerckIndex、GoodmanおよびGilmanなど、および上記で引用した参考文献に載せられている。細胞内タンパク質合成を妨げる薬剤もまた、本発明治療方法においてプロテアーゼと併用され得る。上記薬剤は、当業者には公知であり、例としてはプロマイシン、シクロヘキシミドおよびリボヌクレアーゼがある。本発明による治療方法は、癌治療に使用され得る。放射性同位元素、薬物および毒素を、癌細胞により、またはそれに付随して生じるマーカーと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントにコンジュゲートし得ること、および上記抗体コンジュゲートを用いて、放射性同位元素、薬物または毒素を腫瘍部位にターゲッティングさせることにより、それらの治療効力を高め、副作用を最小限に抑え得ることはよく知られている。これらの薬剤および方法の例は、WawrzynczakおよびThorpe、ImmunoconjugatesAntibodyConjugatesinRadioimagingandTherapyofCancer、DillmanRO、Pastanetal、VitettaetalおよびBradyetalにおいて検討されている。癌に関する免疫コンジュゲートの他の使用例および他の治療形態の例は、特に、米国特許第4331647、4348376、4361544、4468457、4444744、4460459、4460561、4624846、4818709、4046722、4671958、4046784、5332567、5443953、5541297、5601825、5635603、5637288、5677427、5686578、5698178、5789554、5922302、6187287および6319500号に開示されている。さらに、本発明による処置方法は、ある種の細胞傷害性薬剤の副作用を阻止、軽減または打ち消すために、本発明による選択されたプロテアーゼを他の化合物または技術と組み合わせて使用する方法を含む。上記の組合わせの例には、例えば米国特許第4624846号に記載されている、例えば迅速なクリアランスのための抗体とIL-1の同時投与がある。上記投与は、抗癌剤と例えば、細胞傷害性成分として放射性同位元素、薬物または毒素と組み合わせたグランザイムBムテインまたはMT-SP1ムテインによる一次治療的処置施与の3~72時間後に実施され得る。この方法を用いることにより、循環からのコンジュゲート、薬物または毒素のクリアランスを向上させ、治療剤により誘発される骨髄性および他の造血性毒性を軽減または打ち消し得る。別の例では、また上記のとおり、癌治療は、複数の殺腫瘍性剤、例えば薬物および放射性同位元素、または中性子活性化療法の場合には放射性同位元素およびボロン10剤、または薬物および生物応答修飾因子、または融合分子コンジュゲートおよび生物応答修飾因子の組み合わせを含み得る。サイトカインは、その各成分の効力を最大限発揮させるように上記治療プログラムに組み込まれ得る。同様に、βまたはα-エミッターである放射性同位元素とコンジュゲートしたある種の抗白血病および抗リンパ腫抗体は、これらの薬剤を腫瘍細胞に指向させているだけではないとき、骨髄性および他の造血性副作用を誘発し得る。特に腫瘍細胞が循環系および血液形成臓器にあるとき、これが観察される。少なくとも1種の造血性サイトカイン例、成長因子、例えばコロニー刺激因子、例えばG-CSFおよびGM-CSFを同時および/または後続投与することが、抗癌効果を高めながら、造血系副作用を低減化または改善するのに好ましい。様々な放射性核種治療方法が、例えばHarbert、NuclearMedicineTherapy、ニューヨーク、ThiemeMedicalPublishers1087、1~340頁に記載されているとおり、癌および他の病的状態の処置に使用され得ることは、当業界ではよく知られている。これらの手順で経験を積んだ臨床医であれば、容易に上記手順に本明細書記載のサイトカインアジュバント療法を適合させて、その造血系副作用を軽減することができるはずである。同様に、プロテアーゼムテインと同時投与される、細胞傷害性薬剤による治療は、例えば癌、感染性または自己免疫疾患の処置または臓器拒絶治療に使用され得る。上記処置には、同位体または放射性標識抗体による放射性同位体療法と類似した原則が適用される。すなわち、当業者であれば、サイトカイン使用形態を適合させて、一次抗癌治療の前、間および/または後にサイトカインを投与することにより骨髄抑制および他の造血系副作用を軽減できるはずである。3.補体タンパク質標的を開裂する選択されたMT-SP1ポリペプチドについての典型的処置方法本発明によるプロテアーゼポリペプチドおよび核酸分子は、補体経路の活性化が関与する状態、特に急性炎症状態を含む炎症状態、例えば敗血症ショックおよび慢性炎症状態、例えば慢性関節リウマチRAの処置に使用され得る。急性および炎症性状態は、免疫介在性疾患、例えば自己免疫疾患または免疫複合体介在性炎症により誘発される組織損傷として発現され得る。補体介在性炎症状態はまた、炎症性成分を有する神経変性または心臓血管疾患として発現され得る。この項では、プロテアーゼの具体例としての使用、投与方法について記載する。これらの記載された治療法は、典型例であって、プロテアーゼの適用を制限するものではない。上記方法は、限定されるわけではないが、下記に記載および列挙した生理学的および医学的状態の処置方法を含む。上記方法には、限定されるわけではないが、敗血症、慢性関節リウマチRA、膜性増殖性糸球体腎炎MPGN、全身エリテマトーデス、多発性硬化症MS、重症筋無力症MG、喘息、炎症性腸疾患、呼吸窮迫症候群、免疫複合体IM介在性急性炎症性組織損傷、多臓器不全、アルツハイマー病AD、例えば心筋梗塞MI、卒中、心肺バイパスCPBまたは冠動脈バイパス移植、血管形成術、または血液透析などの事象または処置により誘発される虚血-再灌流損傷またはギラン-バレー症候群の処置方法がある。プロテアーゼによる疾患および状態の処置は、限定されるわけではないが、皮下注射、経口および経皮投与を含む本明細書記載の適切な処方物を用いた適切な投与経路により実施され得る。必要ならば、特定の投薬量および持続期間および処置プロトコルは、経験的に決定されるかまたは補外され得る。例えば、組換えおよび天然プロテアーゼポリペプチドの典型的用量は、適切な投薬量を決定するための出発点として使用され得る。野生型またはスカホールドプロテアーゼと比べて高い特異性および/または選択性を有する修飾プロテアーゼは、低い投薬量および/または頻度でも有効であり得る。用量レベルは、例えば個体の体重、全般的健康状態、年齢、使用する特定化合物の活性、性別、食事療法、投与時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度および経過、および疾患に対する患者の素因および主治医の判断などの様々な因子に基づいて決定され得る。担体材料と組合わせて単一用量形態を生成させ得る有効成分の量は、処置される宿主および特定投与方式により異なる。患者の状態が改善すると、必要ならば、維持用量の化合物または組成物が投与され得、さらに投薬量、用量形態または投与頻度またはその組合わせも修正され得る。場合によっては、病状再発時に対象が長期体制での断続的処置を必要とすることもあり得る。a.免疫介在性炎症性疾患本明細書記載の方法で選択されるプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、限定されるわけではないが、本発明による変異型MT-SP1プロテアーゼを含め、炎症性疾患の処置に使用され得る。プロテアーゼで処置され得る炎症性疾患には、急性および慢性炎症性疾患がある。炎症性疾患の例としては、中枢神経系疾患CNS、自己免疫疾患、例えば喘息における気道過敏状態、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、および免疫複合体IC介在急性炎症性組織損傷がある。実験的自己免疫脳脊髄炎EAEは、多発性硬化症MSに関するモデルとしての役割を果たし得るPiddlesdenetalJImmunol1525477。EAEは、ミエリンおよびミエリン成分、例えばミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質およびミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質MOGによる免疫化により若干の遺伝的感受性種で誘発され得る。例えば、MOG誘導EAEは、慢性的、再発性臨床病状経過、炎症の組織病理学的3要素、反応性神経膠症および大きな融合性脱髄プラークの形成を含むヒトMSの本質的特徴を再現する。プロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、EAE動物モデルで評価され得る。プロテアーゼを例えば毎日腹腔内注射により投与し、症状の経過および進行を対照動物と比較しながらモニターする。また病気を増悪させ得る炎症性補体成分のレベルは、溶血検定法において血清補体活性を検定することにより、また補体成分、例えばC1、C3およびC9の沈着について検定することにより測定され得る。補体活性化は、慢性関節リウマチRAなどの疾患において炎症をモジュレーションするWangetalPNAS928955。プロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、本発明による変異型MT-SP1プロテアーゼを含め、RAの処置に使用され得る。例えば、プロテアーゼは、局所的または全身的に注射され得る。プロテアーゼは、毎日または毎週投与され得る。ペギル化プロテアーゼは、免疫原性を低下させるのに使用され得る。一例として、II型コラーゲン誘発関節炎CIAは、炎症性滑膜炎、パンヌス形成および軟骨および骨の侵食を特徴とするRAと組織学的に類似している自己免疫炎症性関節疾患のモデルとしてマウスで誘発され得る。CIAを誘発するため、完全フロイントアジュバントの存在下におけるウシII型コラーゲンB-CIIを、尾の付け根に皮内注射する。21日後、同一プロトコルを用いてマウスを再免疫化する。MT-SP1ポリペプチドを含むプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの効果を調べるため、B-IIによる初回攻撃の3週間後、プロテアーゼまたは対照を3週間にわたって週に2回腹腔内投与する。初回免疫化の7週間後組織分析用にマウスを殺す。確立された疾患に対するプロテアーゼの治療効果を評価するため、プロテアーゼは、1本またはそれ以上の下肢における臨床的関節炎の開始後合計10日間毎日投与され得る。最初に罹患した関節の腫脹の程度は、カリパスを用いて足の厚みを測定することによりモニターされ得る。両モデルにおいて、溶血検定法および補体活性化マーカー、例えばC5aおよびC5b-9の測定用にマウスから血清を採取し得る。別の例として、霊長類モデルがRA処置に関して利用可能である。プロテアーゼポリペプチドで処置された対象および対照において柔らかい腫脹した関節の応答をモニターすることにより、プロテアーゼ処置が評価され得る。プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼは、限定されるわけではないが、本発明による変異型MT-SP1ポリペプチドを含め、免疫複合体IC介在性急性炎症性組織損傷の処置に使用され得る。IC介在性損傷は、組織におけるIC沈着に対する局所炎症応答により誘発される。後続の炎症性応答は、浮腫、好中球増加、出血および最終的には組織壊死を特徴とする。IC介在性組織損傷は、インビボアルツスRPA反応で試験され得る。簡単に述べると、アルツス反応では、過剰の抗体例えばウサギIgG抗ニワトリ卵アルブミンを、対応する抗原すなわち、ニワトリ卵アルブミンを予め静脈内注入しておいた動物、例えばラットまたはモルモットの皮膚に注射するSzalaietalJImmunol164463。RPA反応での開始直前、プロテアーゼまたはボーラス対照を、右大腿静脈への静脈内注射により対応する抗原と同時に投与する。別法として、プロテアーゼは、RPA反応の最初の1時間、抗原注射の直後から始まり抗体の皮内注射の直前までに投与され得る。補体依存的IC介在性組織損傷の発生に対するプロテアーゼの効果は、採血して血清溶血活性を測定し、皮膚の感染領域を採取して病変の大きさを計量することにより、RPA開始後の様々な時点で評価され得る。治療用プロテアーゼ、例えば本発明による変異型MT-SP1ポリペプチドを含む本明細書記載のものは、敗血症および致命的ショックを誘発し得る重症の敗血症の処置に使用され得る。補体介在性致命的ショックのモデルは、治療剤としてのプロテアーゼの効果を試験するのに使用され得る。かかる一例では、痕跡量のリポ多糖類LPSでラットを感作し、次いで補体の膜阻害剤に対するモノクローナル抗体抗Crryを投与するMizunoMetalIntArchAllergyImmunol12755。プロテアーゼまたは対照は、致命的ショックの開始経過中におけるいずれの時点でも、例えばLPS感作前、LPS感作後または抗Crry投与後に投与され得、致命的ショックからのラットのレスキューが評価され得る。b.神経変性疾患補体活性化は、アルツハイマー病ADの進行を増悪させ、AD脳の神経突起喪失の一因となる。本発明によるプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、限定されるわけではないが、本発明による変異型MT-SP1ポリペプチドを含め、ADの処置に使用され得る。ADの神経病理学的および行動的特徴をある程度模倣するマウスモデルが、プロテアーゼの治療効果を評価するのに使用され得る。トランスジェニックマウスモデルの例では、攻撃的プロモーターの制御下で、発病性突然変異をもつヒトアミロイド前駆体タンパク質APPまたはプレセニリン1PS1タンパク質をマウスに導入する。これらのマウスには、ベータ-アミロイド斑および異栄養性神経突起の増加を含むADの特徴が現れる。APPおよびPS1突然変異体タンパク質についての二重トランスジェニックマウスは、多数の原線維ベータ-アミロイド斑を発現し、活性化グリアおよび斑に随伴した補体因子を示す。プロテアーゼは、例えば毎日腹腔内または静脈内注射により投与され得、症状の経過および進行については対照動物と比較しながらモニターする。c.心臓血管疾患本発明によるプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、限定されるわけではないが、本発明による変異型MT-SP1ポリペプチドを含め、心臓血管疾患の処置に使用され得る。プロテアーゼは、卒中、心筋梗塞、心肺バイパス、冠動脈バイパス移植、血管形成術または血液透析により誘発される虚血再灌流損傷を含む心臓血管疾患の処置で使用され得る。プロテアーゼはまた、組織損傷の一因となり得る心肺バイパスに伴う炎症性応答の処置に使用され得る。一般的に、プロテアーゼは、補体介在性虚血再灌流損傷を誘発する処置または事象の前、それと同時またはそれに後続して投与され得る。一例では、プロテアーゼは、例えば冠動脈バイパス移植血管形成術などの補体介在性虚血損傷誘発事象による対象の処置の前に対象に投与され得る。虚血再灌流損傷の処置に対するプロテアーゼの効果は、損傷の動物モデルで評価され得る。上記の一モデルでは、前部心膜に切り目を入れておいたウサギにおいて左前下行LAD冠動脈のその起点から5~8mm付近のところに3-0絹糸で縫合術を施し、血管が完全に閉塞されるように結紮糸を締めることにより心筋虚血を誘発するBuerkeetalJImmunol1675375。プロテアーゼ、例えば本発明による変異型MT-SP1ポリペプチド、または食塩水などの対照賦形剤を、冠動脈閉塞の55分後すなわち再灌流の5分前ボーラスとして増加用量で静脈内投与し得る。5分後すなわち合計60分の虚血後LAD結紮をほどき、虚血心筋を3時間再灌流させ得る。再灌流期間の最後に、LAD周囲の結紮を締める。虚血損傷に対するプロテアーゼの効果は、心筋壊死、血漿クレアチンキナーゼレベルおよび好中球活性化のマーカー、例えばミエロペルオキシダーゼ活性およびスーパーオキシドラジカル放出に対する効果を評価することにより分析され得る。6ヒト血漿を含むクレブス-ヘンゼライト緩衝液での摘出マウス心臓の灌流後に持続される補体介在性心筋損傷の別のモデルでは、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼによる処置は、組織損傷を心臓に制限するのに使用され得る。かかる一例では、心臓の灌流に使用する緩衝液に様々な用量のプロテアーゼ、例えば限定されるわけではないが、本発明によるMT-SP1ポリペプチドを含む変異型プロテアーゼが補われ得る。灌流された心臓は、ヒトC3およびC5b-9の沈着、冠動脈灌流圧、最終拡張期圧および心拍数について検定され得る。プロテアーゼおよび修飾プロテアーゼ、例えば本発明による変異型MT-SP1ポリペプチドは、心肺バイパスCPBまたは冠動脈バイパス移植の前またはその後に、バイパス後に起こりがちであり、組織損傷の一因となり得る炎症性免疫応答を阻害する治療薬として使用され得る。体外バイパス回路における全血のインビトロ再循環を用いることにより、CPBが誘発する血小板および白血球の変化および補体活性化を刺激し得るRinderetalJClinInvest961564。上記モデルでは、様々な用量のプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼまたは対照緩衝液を、体外回路に血液を加える直前、健康なドナーからの血液およびブタヘパリンを既に含むトランスファーパックに加え得る。血液試料を、再循環の5、15、30、45、60、75および90分後に採取し、補体試験、例えば溶血検定法および/またはC5a、C3aおよび/またはsC5b-9について測定する補体活性化検定法にかけ得る。体外回路への添加前に採取した処置前血液試料を対照として使用し得る。血液試料のフローサイトメトリーを実施することにより、血中で循環している白血球すなわち、好中球の集団における接着分子のレベル、例えばCD11bおよびP-セレクチンレベルが測定され得る。K.実施例以下の実施例は、説明を目的としているのに過ぎず、本発明の範囲を制限する意図はない。実施例1突然変異体PAI-1阻害剤A.突然変異体PAI-1阻害剤の発現および精製ヒトPAI-1のcDNA配列番号396に示したN-末端Metを含む成熟PAI-1をコード化するをもつ組換えプラスミド、pPAIST7HSを鋳型として用いることにより、PAI-1反応性中心ループのアミノ酸配列に修飾を導入した。プラスミドpPAISTHSは、ヌクレオチド対1でのHindIII部位およびヌクレオチド対2106でのSalI部位を欠くプラスミドpPAIST7の誘導体である。プラスミドpPAIST7は報告された要領で生成されたFrankeetalBiochimicetBiophysicaActa10371623。簡単に述べると、PAI-1cDNAクローンpPAI-11RBを、制限エンドヌクレアーゼApaLIおよびPflMIで開裂し、PAI-1の残基1に関する2bpのコドンおよび379残基タンパク質の残基2~376に関する完全コーディング配列を含むPAI-1の1127bpフラグメントを、ゲル電気泳動により精製した。合成リンカーを構築して、PAI-1cDNAコーディング配列の両端を再構築し、成熟PAI-1の第1残基をコード化するトリプレットの直前にATGタンパク質合成開始コドンを導入することにより、配列番号396に示したアミノ酸配列を有する成熟PAI-1を生成した。さらに、cDNAコーディング領域をプラスミドpBR322へ挿入し易くするため、PAI-1cDNAフラグメントの5および3末端にそれぞれEcoRIおよびHindIII制限エンドヌクレアーゼ部位を生じるようにリンカーを設計した。合成リンカーは次のとおりである:N-末端、5AATTCTATGG-3’配列番号392および5-TGCACCATAG-3配列番号393;C-末端、5-ATGGAACCCTGAA-3配列番号394および5-AGCTTCAGGGTTCCATCAC-3配列番号395。リンカーを使用前にポリヌクレオチドキナーゼで処理した。次いで、合成リンカー5末端にある10bpおよび3末端にある13bpを、1127bpのApaLI-PflMIDNAフラグメントでライゲーションし、EcoRIおよびHindIIIで消化し、1146bpのEcoRI-HindIIIフラグメントをゲル電気泳動により単離し、EcoRIおよびHindIII開裂pBR322配列番号377へクローン化した。pPAIST-7発現プラスミドの構築を開始するため、pBR322ベクターにおけるサブクローンを、EcoRIで開裂し、細菌性アルカリ性ホスファターゼを用いて線状プラスミドを脱リン酸化した。trpプロモーターおよびリボソーむ結合部位を含むpC5A-48からの360bpのEcoRIDNAフラグメントを用いて、標準ライゲーション後にpPAIST-7を作製した。pPAIST7HS原核生物発現ベクターShubeitaetalJBiolChem2651837918385を作製するため、pPAIST7をHindIIIで部分消化してプラスミドを線状にし、大腸菌EcoliDNAポリメラーゼIのクレノウ断片で平滑末端にし、ライゲーションすることにより、上流HindIII部位を排除した。HindIIIとSalI部位間のPAI-1コーディング配列のpPAIST7下流における配列の欠失およびSalI部位の排除は、連続的部分SalI消化、完全HindIII消化、大腸菌EcoliDNAポリメラーゼIのクレノウ断片による平滑末端形成およびライゲーションにより達成された。供給者により明記された条件にしたがって、Multi位置指定突然変異導入キットStratageneを用いることにより、突然変異誘発反応を実施した。アミノ酸VSARM配列番号378に対応する反応性中心ループにおけるP4~P1位置で野生型PAI-1におけるアミノ酸の突然変異を誘発した。P4からP1位までのPAI-1反応性中心ループにおけるRRARM配列番号379配列による野生型アミノ酸配列VSARMの置換を含む突然変異体PAI-1を作製したPAI-1/RRAR。RRARM突然変異誘発性プライマーの配列は、5-CCACAGCTGTCATAAGGAGGGCCAGAATGGCCCCCGAGGAGATC-3配列番号380であった。P4からP1位までのPAI-1反応性中心ループにおけるPFGRS配列番号389配列による野生型アミノ酸配列VSARMの置換を含む第2の突然変異体PAI-1を作製したPAI-1/69。PFGRS突然変異誘発性プライマーの配列は、5CCACAGCTGTCATACCCTTCGGCAGAAGCGCCCCCGAGGAGATC-3配列番号390であった。突然変異誘発後、形質転換体から単離したDNAを完全に配列決定することにより、目的とする突然変異が存在し、追加的突然変異が存在しないことを確認した。pPAIST7HSベクターに存在するN-末端ポリヒスチジン残基を利用することにより、突然変異体PAI-1/RRARおよびPAI-1/69を融合タンパク質として発現させた。突然変異体PAI-1すなわち、PAI-1/RRARおよびPAI-1/69の発現および精製は、Keetal記載の方法に基づくものであった。突然変異体PAI-1をコード化するpPAIST7HSベクターの01μgDNAを、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシドの存在下でT7RNAポリメラーゼを合成する大腸菌Ecoli株BL21[DE3]pLyssへ形質転換することにより、PAI-1の野生型および突然変異型の発現を達成した。細菌培養物を37°Cで激しく振とうしながら11~13の吸光度A595まで成長させ、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシドを最終濃度1mMになるまで加えることにより、T7RNAポリメラーゼの合成およびPAI-1タンパク質の生成を誘導した。培養物を37°Cでさらに1~2時間成長させ、次いで2~6時間30°Cにシフトした。細胞を4°Cで20分間8000×gの遠心分離にかけることにより沈殿させ、冷出発緩衝液20mMの酢酸ナトリウム、200mMのNaClおよび001トゥイーン20、pH5640mlに再懸濁した。細胞懸濁液をFrenchプレスセルAminco中で破砕し、細胞屑を32000×gで25分間の超遠心分離により除去した。PAI-1/RRARまたはPAI-1/69の可溶性形態を含む大腸菌Ecoliのライゼートを、CM-50セファデックスPharmacia、例えば、SanchoetalEurJBiochem224125134参照を充填したXK-26カラムPharmaciaBiotechIncに注入することにより、可溶性、活性突然変異体PAI-1の精製を実施した。カラムを5カラム容量の出発緩衝液20mMの酢酸ナトリウム、200mMのNaClおよび001トゥイーン20、pH56で洗浄し、同緩衝液中NaClの02~18Mの直線勾配を用いてPAI-1タンパク質を溶離した。ピーク画分を集め、プールし、セントリプラス30濃縮装置Amiconを用いて濃縮した。濃縮した画分を活性測定用に使用した。B.PAI-1活性測定1.標準トリプシンに対する活性部位滴定PAI-1/RRARおよびPAI-1/69の活性濃度を、Olsonetalにより記載された要領で、標準トリプシンに対する活性部位滴定により測定した。簡単に述べると、濃縮した阻害剤05~60μMを、1μMのβ-トリプシンSigmaおよび10μMのp-アミノベンズアミジンプローブSigmaの溶液に連続的に加えた。阻害剤の結合による酵素活性部位からの結合プローブの排除に伴う蛍光の減少から結合をモニターした。各濃縮阻害剤を添加後、1~2分の平衡時間をおいた後、それぞれ325nmおよび345nmの励起および放出波長での蛍光の変化を評価し、結合および遊離プローブ蛍光間の差異を最大化した。トリプシン酵素の非存在下における阻害剤とプローブのみの対照滴定を実施することにより、バックグラウンド蛍光について補正した。阻害剤-酵素滴定結果を、一次回帰分析に適合させた。2.標準化t-PA調製物の滴定また、突然変異体PAI-1を、標準化t-PA調製物に対して滴定することにより活性を評価した。tPAAmericanDiagnosticsInc、100U/μgおよび色素原性tPA基質H-D-Ile-Pro-Arg-パラ-ニトロアニリン基質S-2288、Chromogenixを用いる直接色素原検定法により、野生型PAI-1または突然変異体PAI-1の阻害活性を測定した。系列希釈したPAI-101~40μgを、室温で一定時間典型的には20~60分間マイクロタイタープレートにおいてt-PAとインキュベーションし、色素原基質S-2288を05mMの最終濃度になるまで添加することにより、tPAの残留活性を測定した。増加濃度の阻害剤とのインキュベーション後のt-PAの残留活性を、405nmでの吸光度の測定により評価した。実施例2u-PA変異型のファージディスプレーライブラリーの構築A.ファージミドへの野生型u-PAのクローニングファージでのu-PAのプロテアーゼドメインの機能的ディスプレーを立証するため、プライマー496および497、PfuDNAポリメラーゼ、および鋳型として完全長u-PA遺伝子配列番号474のc-DNAを含むpCMV4プラスミド配列番号373を用いて、高忠実度PCRを実施した。PCR増幅で使用したプライマーは次の通りであった:496、5-ACGTGGCCCAGGCGGCCTTTCAGTGTGGCCAAAAG-3配列番号374、497、5-TCCTGGCCGGCCTGGCCGAGCAGGCCATTCTC-3配列番号375。両プライマーとも、5末端にSfiI酵素についての制限部位下線部分をもつ。精製およびSfiI消化後、PCR産物をSfiI消化ファージミドベクター、pComb3H配列番号376AndrisWidhopfetalJImmunolMethods2815981にライゲーションした。野生型または突然変異体u-PAの1価ディスプレーにファージミドを使用した下記参照。この構築物は、fdファージのgIIIp遺伝子のC-末端領域をコード化する配列を含む。2つの異なる認識配列をもつベクターにおける2つのSfiI制限部位の存在は、上述のプライマーを設計するのに利用された。プライマー496および497を用いて増幅したPCR産物により、ファージミドへのu-PAプロテアーゼドメインcDNA配列番号475の定方向性クローニングが可能となったライゲーション条件については下記参照。最終構築物において、u-PAプロテアーゼドメインの配列を含むPCR産物を、OmpAおよびgIIIp配列の中間でクローン化することにより、野生型または突然変異体u-PAをN-末端融合体としてディスプレーした。B.突然変異体u-PAの構築および突然変異体u-PAのファージディスプレーライブラリーu-PAファージディスプレーライブラリーを構築するため、PCRDiversify突然変異誘発キットClontechで供給される試薬を用いて100μlの反応混合物中で25サイクル間、上記で示した通り、鋳型としてuPA遺伝子のcDNAを含むpCMV4/u-PAプラスミドを用いることにより、エラープローンPCR増幅を実施した。適切なPCR条件にしたがって3種の異なるPCR反応を設定し、製造業者により記載されたとおりマンガンMN2またはdGTPの量を変えることにより上記のプライマー496および497を用いてuPA遺伝子配列番号475のプロテアーゼドメインのみを増幅させ、cDNAへの突然変異率02、05または09の組み込みを達成した。PCR精製キットQiagen、次いでSfiI酵素消化を用いることにより、増幅したPCR産物805bp、配列番号475を精製した。各突然変異誘発反応からのSfiI消化PCR産物を用いて、3つの異なるライブラリーを作製した。ライブラリーを構築するため、pComb3Hベクター配列番号376をSfiI酵素で消化し、この反応からの大きい方のDNAフラグメントを、ゲルスライスキットQiagenを用いてゲル精製した。3つの別々のライゲーション反応を実施することにより、02、05および09突然変異率を含むPCR産物で3種のライブラリーを構築した。少なくとも1μgのゲル精製ベクターを、SfiI消化PCR産物1:2比と混合し、ライゲーション混合物を一晩18°Cでインキュベーションした。次に、ライゲーション混合物を、Qiagenミニ溶離キットQiagenを用いて精製し、最後にDNAを60μlのMilliQ精製水中へ溶離した。精製したDNAを、400μlの大腸菌EcoliXLBlue1エレクトロポレーション能力細胞Stratagene中へ遺伝子のパルサーBioRadを用いてエレクトロポレーションした。次いで、細胞を10mlのSOC培地Invitrogenへ移し、振とう器中37°Cで1時間インキュベーションした後、カルベニシリン75μg/mLを補った大型LB寒天プレート245mm×245mmで平板培養した。30°Cでのプレートの一晩インキュベーション後、細胞スクレーパーを用いて形質転換体をこすり取り、得られた培養物を、37°Cで振とうしながら2時間カルベニシリン75μg/mlを補った2XYT培地で培養した。培養物を、ライブラリー増幅のため5のMOI感染多重度でヘルパーファージVCSM13により感染させた。37°Cで振とうしながら1時間培養後、培養物にカナマイシンを3μg/mLの最終濃度になるまで補い、一晩37°Cで振とうしながら培養した。細胞を採取し、PEG-NaCl溶液を用いて上清に存在するファージ粒子を沈殿させた。同時に、各ライブラリーの多様性を計算するため、電気穿孔した細胞のアリコートを、カルベニシリン100μg/mlを補ったLB寒天プレートで平板培養し、一晩37°Cでインキュベーション後コロニーを計数した。同じ方法を用いることにより、PAI-1/RRAR阻害剤に対して同定されたu-PA変異型のさらなる改良のため連続世代のu-PAファージディスプレーライブラリーを作製した。以前のライブラリーから同定されたu-PA変異型のDNAを、次世代ライブラリー構築用の鋳型として用いた。ランダム突然変異誘発を用いて作製した野生型またはu-PAファージライブラリーの触媒有効性を、間接的プラスミノーゲン活性化検定法を用いて分析した。簡単に述べると、合計100μlの容量中に、5μlのu-PAファージ典型的には~5×1012cfu、02μMのLys-プラスミノーゲンAmericanDiagnosticおよび062mMのSpectrozymePLAmericanDiagnosticを存在させた。マイクロタイタープレートで検定を実施し、405nmでの光学密度を、MolecularDevicesThermomaxを用いて30秒ごとに1時間読み取った。反応を37°Cで実施した。u-PAまたはu-PA変異型ファージの阻害についても評価した。簡単に述べると、u-PAファージ5μl典型的には~5×1012cfuを、wt-PAI-101μMまたは突然変異体PAI-1/RRAR阻害剤10μMと混合し、室温で30分間インキュベーションし、次いで062mMのSpectrozymePL、02μMのLys-プラスミノーゲンAmericanDiagnosticsIncを加えた。検定結果を上記要領で読み取った。実施例3突然変異体阻害剤に対するu-PAファージライブラリーからの変異体u-PAの選択A.u-PAファージ/突然変異体PAI-1複合体の選択突然変異体PAI-1/RRAR阻害剤またはPAI-1/69を、ふるい分け実験におけるベイト基質として用いることにより、上記実施例2に記載した大きなコンビナトリアルu-PAファージディスプレーライブラリーからの突然変異体基質配列に対して改善された反応性を示す改変されたu-PAファージ複数も可を単離した。簡単に述べると、3つの全u-PAファージライブラリー02、05および09突然変異誘発頻度からの同等呈示量のu-PAファージを含む、5μl~2×1012~1×1013のu-PAファージを、合計容量100μlすなわち、反応物は80μlのH2Oを含んだ中で5μlのベイト基質01~10μMのPAI-1/RRARまたはPAI-1/69および10μlの10×間接的緩衝液pH7405Mのトリス、10MのNaCl、10mMのEDTA、01トゥイーン80と混合した。反応物を室温で様々な時間インキュベーションした典型的には1時間、しかしながら、インキュベーション時間を調節して溶液のストリンジェンシーを制御した。CuSO4活性化セファロースを用いて、u-PAファージ-PAI-1阻害剤複合体を捕捉した。CuSO4100mMで処理することにより、キレート化セファロース200μl;Pharmaciaの前活性化を達成した。CuSO4活性化セファロースを、室温で1時間PBS緩衝液中の05BSAにより遮断した。BSA遮断セファロースビーズ100μlを、結合緩衝液05MのNaCl、20mMのトリス、20mMのイミドゾール、pH74800μlの存在下、上記ふるい分け混合反応物100μlに加えることにより、His標識PAI-1阻害剤-u-PAファージ複合体を捕捉した。インキュベーションをさらに1時間室温で続行した。次に、ふるい分け混合物を2000rpmで1分間遠心分離し、結合u-PAファージ-PAI-1阻害剤複合体を含むセファロースビーズを、結合緩衝液1mlで洗浄することにより、未結合ファージを除去した。洗浄段階を5~10回反復し、各洗浄後結合複合体を含むビーズを新しい管に移すことにより、非特異的ファージの潜在的キャリーオーバー持ち越しを回避した。結合u-PAファージ-PAI-1/RRAR複合体を、溶離緩衝液05MのEDTA100μlで溶離した。溶離したファージの95μlアリコートを用いて、1mlのXL1Blue大腸菌Ecoli細胞を感染させる06ODことにより、ライブラリーのアウトプットを計算した選択後に得られたファージの数を示す。感染した細菌を、カルベニシリン75μg/mlを含む大型プレート245mm×245mmで培養することにより、次のラウンドの選択用にライブラリーを作製した。最後に、残りのアウトプットライブラリーすなわち、選択されたファージを用いて、次のラウンドの選択用に新しいライブラリーをスクリーニングおよび/または作製するため個々のファージクローンを調製した。選択で使用するベイト基質の濃度およびライブラリーとベイト基質のインキュベーション時間を、所望のストリンジェンシーレベルにしたがって調節した。例えば、条件は、1未満、2、5、10または10を超える率でライブラリーのu-PA活性が、ベイト基質配列を含むベイトPAI-1により阻害されるように選択され得る。典型的には、高い例、05μM濃度のベイトPAI-1を用いて選択の初回ラウンドを実施し、選択の後続ラウンドについては、ベイトセルピン濃度およびライブラリーとのインキュベーション時間を減らした。さらに、多重ストリンジェンシーを各選択ラウンドで並行して使用することもできる。アウトプット例、一対/-ベイトセルピン選択におけるファージアウトプットのシグナル対ノイズ比下記参照の質、および機能性分析に基づいた結果のヒットの質に基づいて、これらの選択の1つまたはそれ以上からのファージアウトプットが選択の次回ラウンド複数も可に向けて実施され得る。並行して、ベイト基質を含まないu-PAライブラリーからのファージの選択に関する上記条件を用いて対照実験を実施し、この対照実験からのファージを、ベイトセルピン基質の存在下におけるライブラリー選択のアウトプットと比較した。ベイト基質の存在下で選択されたライブラリーのアウトプットからのcfuは、通常対照選択から得られたアウトプットより104~105高い範囲であった。高いバックグラウンドが対照選択で観察された場合、インキュベーション時間を減らす、反応体ライブラリー、ベイト基質またはビーズの濃度を増す、およびキレート化セファロースに結合した選択されたファージの洗浄回数および時間を増やす10倍またはそれ以上までなどストリンジェンシーの高い条件を用いてふるい分けを反復した。B.新しい基質配列に対して高い反応性および触媒有効性をもつu-PAファージのスクリーニング溶離u-PAファージのアリコート5μlを、感染させるためXL1Blue大腸菌Ecoli細胞100μlと混合し、37°Cで1時間インキュベーションした。次いで、感染した大腸菌Ecoli細胞を、カルベニシリン100μg/mlを補ったLB寒天プレートで平板培養した。一晩37°Cでインキュベーション後、個々のコロニーをファージ調製用に採取した。カルベニシリン100μg/mlおよびテトラサイクリン100μg/mlを補った2×YT2ml中で細胞を増殖させ、報告された要領SambrookJetalMolecularCloningAlaboratorymanualColdspringHarborlaboratoryでファージ調製を実施した。同定されたファージを以下の検定法で試験することにより、活性を評価した。個々のファージ調製物を間接的プラスミノーゲン活性化検定法で使用することにより、活性ファージを同定し、活性ファージ調製物を阻害検定法に用いた。1.間接的プラスミノーゲン活性化検定法個々のファージ調製物を間接的プラスミノーゲン活性化検定法で使用することにより、活性u-PAファージを同定した。簡単に述べると、100μlの合計容量中に、5μlのu-PAファージ典型的には~5×1012cfu、02μMのLys-プラスミノーゲンAmericanDiagnosticおよび062mMのSpectrozymePLを存在させた。検定法をマイクロタイタープレートで実施し、405nmでの光学密度を、MolecularDevicesThermomaxにおいて30秒ごとに1時間読み取った。反応を37°Cで実施した。2.突然変異体PAI-1/RRARによるu-PAファージの阻害間接的プラスミノーゲン活性検定法で活性として確認されたファージを、突然変異体PAI-1/RRARによる阻害についてさらに試験した。簡単に述べると、阻害検定については、5μlの活性u-PAファージ典型的には~5×1012cfuを、マイクロタイタープレートのデュプリケイトウェルに加え、次いで一定濃度の突然変異体PAI-1例、10μMを一方のウェルに加え、リン酸緩衝食塩水PBSをデュプリケイトの他方のウェルに加えた。混合した後、反応を一定時間例、30分室温で続行させ、次いで062mMのSpectrozymePL、02μMのLys-プラスミノーゲンAmericanDiagnosticIncを添加した。対照実験については、野生型u-PAファージを同一条件下で評価した。プレートを2時間分光光度計において405nmで読み取った。野生型u-PAファージと比べてPAI-1/RRARまたはPAI-169に対して改善された感受性を呈する選択されたu-PAファージを、さらなる分析用に選択し、DNA配列決定にかけた。3.ペプチド基質スクリーニングさらに、改善された触媒有効性を呈するu-PAファージの変異型を同定するため、個々のファージクローンを、Ac-RRAR-AMC基質に対するスクリーニングにかけた。検定法については、一定容量のファージ上清例、35μlを、総容量100μlで1X間接検定緩衝液50mMのトリス、100mMのNaCl、1mMのEDTA、001トゥイーン80中において75μMのAc-RRAR-AMC基質と混合した。96ウェルまたは384ウェルの黒色検定プレートCorningで検定を実施し、分光光度計MolecularDevices読取装置により2時間380~450nmで読み取った。それらの改善を確認するため、阻害剤およびペプチド基質スクリーニング後に確認された陽性u-PAファージを、上記検定法を用いて再度スクリーニングにかけた。C.選択されたu-PA突然変異体の同定および同定された突然変異体の最適化陽性ファージクローンを、上記と同様、感染させるためXL1Blue大腸菌Ecoli細胞と混合し、培養物を37°Cで振とうしながら一晩発育させた。プラスミド調製キットQiagenを用いて、プラスミドDNAを一晩培養物から精製した。DNAを次のプライマー:535-5-CAGCTATCGCGATTGCAG-3配列番号381;5542-5GTGCGCAGCCATCCCGG-3配列番号382を用いるカスタムシーケンシングに送った。配列決定データの解析後に突然変異体u-PA遺伝子で改変されたアミノ酸残基が同定された。下表10は、PAI-1/RRAR突然変異体阻害剤に対するu-PAファージライブラリーからの変異型u-PAの選択から同定されたu-PAの変異型を示している。下表10に示した突然変異は、キモトリプシンのナンバリングによるものである。カッコ内の数は、突然変異体がファージ選択方法で同定された回数を示す。活性検定法からの結果に基づいて、u-PAファージの最良の変異型を下線により強調している。示された突然変異を含む成熟u-PAプレプロタンパク質配列番号433のアミノ酸配列は、配列番号434~445のいずれかに示されている。表10PAI-1/69阻害剤に対する選択後にPAI-1/69阻害剤に対して高い感受性を呈する突然変異体u-PA遺伝子において改変されたアミノ酸残基が、上記で示した配列決定データの解析後に同定された。第一世代プロテアーゼファージディスプレーライブラリーIから同定された突然変異体を下表11に示す。PCRDiversify突然変異誘発キットおよびプライマー496および497を用いる上記実施例2Bで示した方法を用いることにより、後続世代のプロテアーゼファージディスプレーライブラリーを作製した。第2世代ファージディスプレーライブラリーについては、キモトリプシンのナンバリングに基づいたF30Vに対応する突然変異を含むu-PA突然変異体u-PA/Icを、突然変異誘発反応用の鋳型として使用した。第2世代プロテアーゼファージディスプレーライブラリーIIから同定された突然変異体を、下表11に示す。第3世代ファージディスプレーライブラリーについては、キモトリプシンのナンバリングに基づいたF30V/Y61AHまたはF30V/K82Eにそれぞれ対応する突然変異を含むu-PA突然変異体u-PA-IIbまたはu-PA-IIb突然変異体を、突然変異誘発反応用の鋳型として使用した。第3世代プロテアーゼファージディスプレーライブラリーIIIから同定された突然変異体を、下表11に示す。第4世代ファージディスプレーライブラリーについては、キモトリプシンのナンバリングに基づいたF30V/K82E/V159Aに対応する突然変異を含むu-PA突然変異体u-PA/IIIaを、突然変異誘発反応用の鋳型として使用した。第4世代プロテアーゼファージディスプレーライブラリーIVから同定された突然変異体を、下表11に示す。カッコ内の数は、u-PAファージが同じ突然変異を有するものについて選択された回数を示す。下線は、突然変異体により獲得された新しい突然変異を示す。示された突然変異を含む成熟u-PAプレプロタンパク質配列番号433のアミノ酸配列は、配列番号460~472のいずれかに示されている。表111.PAI-1/RRAR阻害剤に対するフォーカスファージディスプレーライブラリーにおけるアミノ酸残基30および155の最適化および組換えPAI-1/RRAR阻害剤に対するu-PA変異型の感受性を増強するため、キモトリプシンのナンバリングに基づいたアミノ酸30およびアミノ酸155上記表10に示された初回選択でホットスポットとして確認されているを、次のプライマーをそれぞれ用いてランダム化および組換えについてターゲッティングした:TC30-5GCCCTGGNNSGCGGCCATC-3配列番号383TC155-5GGAGCAGNNSAAAATGACTG-3配列番号384製造業者が記載した条件にしたがって、QuickChange多位置指定突然変異導入キットStratageneを用いることにより突然変異誘発を実施した。簡単に述べると、製造業者が記載した条件にしたがって、T4ポリヌクレオチドキナーゼNewEnglandBiolabsを用いたプライマーのリン酸化の後、残基30および155のランダム化について3種の異なる反応を実施した:1個々に30、2個々に155、および同時に30と155の両方。対応する野生型u-PAプロテアーゼドメイン配列と異なり残基L73AおよびI89Vに突然変異をもつDNA構築物、pComb3H/u-PA変異型pARF81を、30位および155位のそれぞれのランダム化にプライマーTC30配列番号383およびTC155配列番号384をそれぞれ用いる突然変異誘発反応において鋳型として用いた。別の反応では、これら2種のプライマーを用いることにより、pARF81変異型DNAで30および155位を一緒にランダム化した。製造業者が明記した条件にしたがって、Multi位置指定突然変異導入キットStratageneを用いることにより突然変異誘発を実施した。突然変異導入後、反応産物をXL1Blue大腸菌Ecoli細胞へライブラリー構築用に形質転換した上記実施例2参照。増幅したu-PAファージライブラリーを、上記実施例3Aおよび3Bに示した改良されたu-PA変異型の選択に使用した。下表12は、全変異型がキモトリプシンのナンバリングに基づいたアミノ酸残基L73AおよびI89Vにバックグラウンド突然変異を有するフォーカスu-PAファージライブラリーからの変異型u-PAのPAI-1/RRAR突然変異体阻害剤に対する選択から同定されたu-PAの変異型を示している。下表12に示した突然変異は、キモトリプシンのナンバリングによるものである。カッコ内の数は、突然変異体がファージ選択方法で同定された回数を示す。活性検定法からの結果に基づいて、u-PAファージの最良の変異型を下線により強調している。示された突然変異を含む成熟u-PAプレプロタンパク質配列番号433のアミノ酸配列は、配列番号446~459のいずれかに示されている。表12実施例4COS細胞の一過性トランスフェクションによる修飾u-PA酵素の発現哺乳類発現系で変異型u-PA酵素を発現させるため、ファージディスプレー結果から同定された陽性クローンを、選択されたu-PA変異型遺伝子をコード化するcDNAのPCR増幅用の鋳型突然変異体u-PAプロテアーゼドメイン配列をもつpComb3Hとして用いた。次のプライマーを用いて、オーバーラップ伸長PCRHoSetalGene775159を実施した。717-5-TTTCAGTGTGGCCAAAAG-3配列番号385;718、5-CAGAGTCTTTTGGCCACA-3配列番号386;850、5GGGGTACCGCCACCATGAGAGCCCTGCTGGCGCGC-3配列番号387;851、5GCTCTAGATCATCAGAGGGCCAGGCCATTCTCT-3配列番号388。プライマー850および851は、それぞれKpnIおよびXbaI制限酵素下線についての配列をもつ。2段階でPCRを実施することにより、下記の要領で突然変異cDNAu-PA遺伝子の完全長増幅を達成した。第1段階では、PCRを100μl反応物中で実施し、PfuDNAポリメラーゼ、プライマー850、718および鋳型として完全長uPA遺伝子を含むpCMV4配列番号474を用いることにより500bp産物u-PAのEGFおよびクリングルドメインに対応するを増幅した。同様に、別のPCRを実施し、プライマー851および717、および鋳型として適切な突然変異体u-PA-pComb3Hを用いることにより突然変異体u-PAプロテアーゼドメイン800bp、すなわち配列番号475で示した野生型配列と異なる突然変異体配列に対応するを増幅した。これら2種のPCR産物をゲル精製し、PCR増幅の次なるラウンドで使用した。第2段階では、ゲル精製したPCR産物各5μlを、プライマー850および851を含めた100μl反応混合物中で鋳型として使用した。プライマー717および718は、第2段階PCRで完全長u-PAcDNA13kbを増幅させ得るオーバーラップ相補的配列を有する。PCR精製キットQiagenを用いてPCR産物を精製し、次いでKpnIおよびXbaI制限酵素により消化した。QIAquickカラムQiagenを用いて精製後、完全長p-UA遺伝子を、KpnIおよびXbaIで予め消化しておいたpCMV4哺乳類発現ベクター配列番号373とライゲーションした。ライゲーション混合物を、大腸菌EcoliXL1Blue細胞へ電気穿孔し、カルベニシリン100μg/mlを補ったLBプレートで平板培養した。37°Cでプレートを一晩インキュベーション後、個々のコロニーを採取し、プラスミド精製用に2mlのLB培地で培養した。次の配列決定用プライマーを用いた全u-PA遺伝子の配列決定にこれらのプラスミドを使用した。UPAF1-5ATGAGAGCCCTGCTGGCGCGCC-3配列番号476およびUPAF2-5GGAAAAGAGAATTCTACCG-3配列番号477。正確な突然変異をもち、追加の突然変異複数ありは一切もたない突然変異体u-PAクローンを、Midiプラスミド調製キットQiagenを用いて大量生産し、BioRadGenePulserを用いるCOS-1細胞への電気穿孔に使用した。cDNA20μg、担体DNA100μg、および約107のCOS-1細胞を、04cmのキュベットに入れ、電気穿孔を320V、960マイクロファラッド、およびΩ=∞で実施したTachiasetalJBiolChem2701831918322。電気穿孔後、トランスフェクションされた細胞を、10胎児ウシ血清および5mMの酪酸ナトリウムを含むDMEM培地IrvineScientific中37°Cで一晩インキュベーションした。次いで、細胞を血清不含有培地で洗浄し、DMEM中37°Cで48時間インキュベーションした。血清不含有培地とインキュベーション後、条件培地を集め、さらなる特性確認に使用した。実施例5精製突然変異体u-PAの特性確認A.酵素濃度の測定条件培地中の突然変異体u-PA酵素の1本鎖形態を、プラスミン-セファロースCalbiochemで処理することにより対応する2本鎖酵素に変換した。これらの培地における活性u-PAの濃度を、上記実施例1記載の要領でトリプシン一次標準に対して予め滴定しておいた標準PAI-1阻害剤調製物での活性部位滴定により測定した。実験マニュアル、HarlowetalUsingAntibodiesColdSpringHarborLaboratoryのプロトコルにしたがって酵素結合イムノソルベント検定法により、全酵素濃度を測定した。これらの濃度比により、各培地で活性を示すu-PA変異型のフラクションを得た。B.u-PAの直接的色素原検定法u-PA活性の直接検定法では、基質カルボベンズオキシ-L-γ-グルタミルα-t-ブトキシ-グリシル-アルギニン-p-ニトロアニリド一酢酸塩Cbo-L--Glu-Gly-Arg-pNAAcOHSpectrozyme登録商標uPA。Americandiagnosticaを利用したMadisonetalJBiolChem27075587562。405nmの吸光度で単位時間あたりに生じた遊離pNAの吸光度の増加を測定することにより、酵素活性を測定した。6~8nM間の酵素濃度を用いて、動的検定を経時的に実施した。Spectrozyme登録商標uPAの濃度を、2本鎖u-pAの検定では25から150μMに、またu-PAのプロテアーゼドメインの検定では25から200μMに変えた。反応を96ウェルのマイクロタイタープレートで実施し、SpectromaxM2またはM5プレート読取装置を用いて30秒ごとに405nmでの吸光度測定により、2時間までの間反応速度を評価した。基質濃度の逆数対OD405での吸光度の速度の逆数をグラフ化し、ラインウィーバーバーク等式1/速度=Km/Vmax1/[S]1/Vmax式中、Vmax=Ekactに当てはめることにより、反応速度定数kcat、Kmおよびkcat/Km特異性定数を計算した。下表13は、u-PA酵素活性の直接検定法でPAI-1/69阻害剤に対して高い感受性を呈するものとして同定された、u-PAの突然変異体の動的検定の結果を示す。これらの結果は、Spectrozyme登録商標uPA基質の開裂に関する特異性定数kcat/Kmの測定結果から測定されたところによると、同定された突然変異体u-PAのそれぞれが、野生型u-PAと比べて低い酵素活性を有することを示している。表において、試験した変異型は、u-PAファージディスプレーライブラリーの後続世代第1~第4からの選択後における上記表11に示されたものである。C.蛍光性基質を用いたu-PA変異型の動的検定RRAR標的基質配列に対するu-PA変異型の活性を測定する直接的検定法を、Ac-RRAR-AMC基質を利用して実施した。7-アミノ-4-メチルクマリンAMC蛍光性ペプチド基質の使用は、プロテアーゼ特異性の常用的測定方法であるZimmermanetalAnalBiochem784751HarrisetalPNAS9777547759。アニリド結合の特異的開裂により、蛍光性AMC脱離基が遊離することから、これは個々の基質に関する開裂速度を測定する有効な手段を提供する。基質を005から120mMまで系列希釈し、Costarの96ウェル黒色半面積検定プレートにおいてプロテアーゼ9~25nMの存在下でインキュベーションした。遊離AMC脱離基からの蛍光を、AMC標準に関して励起波長380nmおよび放出波長450nmで蛍光分光光度計MolecularDevicesGeminiXPSにより測定した。蛍光の増加速度を、30秒間隔で読み取ることにより30分にわたって測定した。基質濃度の逆数対基質開裂速度の逆数をグラフ化し、ラインウィーバーバーク等式1/速度=Km/Vmax1/[S]1/Vmax式中、Vmax=Ekactに当てはめることにより、反応速度定数kcat、Kmおよびkcat/Km特異性定数を計算した。下表14は、Ac-RRAR-AMC基質に対するu-PA変異型ARF2およびARF36の動的検定の結果を示す。これらの結果は、選択されたu-PAプロテアーゼ変異型に関するRRAR基質についての特異性定数が野生型u-PAと比べて約10倍またはそれ以上の割合で高いことを示している。D.間接的色素原検定法を用いたプラスミノーゲン活性化の動的検定間接的色素原検定法を実施することにより、精製タンパク質調製物として製造した野生型および突然変異体u-PAの活性を測定したMadisonetalNature339721724MadisonetalJBiolChem2652142321426。この検定法では、遊離p-ニトロアニリンを、プラスミノーゲンに対するu-PAの作用により産生したプラスミンの作用により色素原性基質SpectrozymePLH-D-ノルロイシルヘキサヒドロチロシル-リシン-p-ニトロアニリド二酢酸塩、AmericanDiagnosticsIncから放出させる。遊離p-ニトロアニリンの放出を、OD405nmでの分光光度計により測定した。この検定法については、試験すべきuPA酵素025~1ng、062mMのSpectrozymePL、02μMのLys-プラスミノーゲンAmericanDiagnosticsIncを含む反応混合物100μlを、50mMのトリス-HClpH75、01MのNaCl、10mMのEDTAおよび001v/vトゥイーン80を含む緩衝液中で合わせた。反応物を37°Cで96ウェルの平底マイクロタイタープレートCostarInc中においてインキュベーションし、405nmでの光学密度OD405を、MolecularDevicesThermomaxにおいて30秒ごとに1時間読み取った。反応速度定数kcat、Kmおよびkcat/Km特異性定数を先の記載MadisonELNature339721724要領で計算した。下表15は、u-PA酵素活性の間接的検定法において、PAI-1/69阻害剤に対して高い感受性を呈するものとして同定された、突然変異体u-PAの動的検定の結果を示す。結果は、Spectrozyme登録商標PL基質の開裂に関する開裂特異性定数kcat/Kmの間接的測定結果から測定されたところによると、同定された突然変異体u-PAがそれぞれ野生型u-PAと比べて低い酵素活性を有することを示している。表において、試験した変異型は、u-PAファージディスプレーライブラリーの後続世代第1~第4からの選択後における上記表11に示されたものである。E.野生型PAI-1および突然変異体PAI-1による突然変異体u-PA酵素の阻害の動的検定突然変異体および野生型u-PA陽性対照の阻害に関する2次速度定数kiを、偽1次速度定数ki<2×106または2次速度定数ki>2×106条件を用いて測定した。各酵素については、残留酵素活性が初期活性の20~80の範囲で変化する幾つかのデータポイントが得られるように、酵素および阻害剤突然変異体PAI-1の濃度を選択した。野生型および突然変異体u-PAと野生型および突然変異体u-PAの相互作用速度に関する動的検定を、01mMのEDTAおよび01v/vトゥイーン20を含む01Mのトリス-HCl緩衝液pH74中24°Cで実施した。上記D項記載の間接的色素原検定法を用いて、時間の関数として存在する残留酵素活性を測定した。PAI-1による野生型および突然変異体u-PAに阻害に関する速度定数は、以前に記載された例えば、HolmesetalBiochemistry2651335140BeattyetalJBiolChem25539313934MadisonetalPNAS8735303533MadisonetalMethodsEnzymol223249271参照u-PAに対し過剰のPAI-1に関する偽1次速度定数条件下のものであった。簡単に述べると、精製野生型または突然変異体u-PA3~50fmolを、室温で0~120分間野生型または突然変異体PAI-135~1330fmolとインキュベーションした。インキュベーション後、混合物を希釈し、残留酵素活性を上記D項記載の標準色素原検定法で測定した。ln残留活性/初期活性対時間をプロットし、得られた直線の傾きを決定することにより、データを分析した。次いで、反応における阻害剤の濃度で傾きを割ることにより、偽1次速度定数を誘導した。2次反応については、等モル濃度の野生型または突然変異体u-PAおよび野生型または突然変異体PAI-1を、マイクロタイタープレートウェルで直接混合し、0~30分の時間範囲の様々な期間室温で前インキュベーションした。インキュベーション後、混合物を過剰の中和性抗PAI抗体でクエンチングし、残留酵素活性を間接的色素原検定法で測定した。間接的色素原検定結果を、PAI-1を含まないか、または前インキュベーションおよび反応混合物への抗PAI-1抗体、プラスミノーゲンおよびSpectrozymePLの添加後にPAI-1を加える対照反応と比較した。ln残留活性/初期活性対時間をプロットし、得られた直線の傾きを決定することにより、データを分析した。次いで、反応における阻害剤の濃度で傾きを割ることにより、2次速度定数を誘導した。下表16は、PAI-1/RRAR阻害剤によるu-PA変異型の阻害に関する2次速度定数を示す。結果は、野生型u-PAと比べて阻害に関するki速度定数が高いと評価されている通り、変異型ARF2およびARF36が、PAI-1/RRAR阻害剤基質に関する特異性について約20倍の改善を呈することを示す。下表17および18は、PAI-1/69阻害剤に対して選択された野生型u-PAまたはu-PA変異型による野生型表17または突然変異体PAI-1/69阻害剤表18に関する阻害の2次速度定数の結果である。表17および18のそれぞれに示した変異体u-PAは、上記表11で示されているu-PAファージライブラリー選択の1I~4IV連続ラウンドから同定されたものである。表17における結果は、突然変異体u-PAの中にはすなわち、u-PA/IIIa、u-PA/IIIbおよびu-PA/IVa、野生型u-PAと比べて阻害に関する2次速度定数が微増しているものがあり、突然変異体u-PA/Ic、u-PA/IIbおよびu-PA/IVbは、野生型u-PAと比べて阻害に関する2次速度定数が低いことを示している。表18における結果は、阻害に関する2次速度定数が、突然変異体PAI-1/69阻害剤による阻害について選択されたu-PA変異型のそれぞれについて劇的に増加していることを示す。これらの結果は、選択された変異型のそれぞれが、PAI-1/69阻害剤基質に関する特異性に関して13倍を超える改善を呈しており、変異型u-PA/IIIb、u-PA/IVaおよびu-PA/IVbが、それぞれ特異性に関して40倍近く、またはそれを超える改善を呈することを示す。実施例6突然変異体AT3阻害剤に対するMT-SP1ファージライブラリーからの変異型MT-SP1の選択アミノ酸残基IAGRSL配列番号478に対応する野生型AT3の反応性部位ループRSL残基P4-P3-P2-P1-P1-P2にヘキサペプチド配列を含む突然変異体抗トロンビンIIIAT3阻害剤配列番号5に対し、これらの残基において、補体C2開裂配列のアミノ酸残基に対応するSLGRKI配列番号479への置換を含むように突然変異を導入した。突然変異体AT3SLGR-K1をプロテアーゼ選択実験におけるベイト基質として用いることにより、大きなコンビナトリアルMT-SP1ファージディスプレーライブラリーから突然変異体基質配列に対する反応性が改善されたファージを単離した。簡単に述べると、第1世代選択分析については、酵素活性を有する低突然変異頻度すなわち、02~05の突然変異誘発頻度ライブラリーである1:100SM1~3X1013MT-SP1ファージライブラリー5μlを、同等呈示量で高い突然変異誘発頻度すなわち、09を含む1:100SM2~3X1012MT-SP1ファージライブラリー5μlと合わせた。ファージライブラリーを、50μlの総容量すなわち、20μlのH2Oを含むで5μl18μMの野生型血漿精製AT3および5μlの10XMTSP活性緩衝液05MのトリスHCl、pH8、03MのNaCl、01トゥイーン30の存在下、5μlのヘパリン5ng/μl、ブタ腸粘膜のストックから、5μlのベイトAT3SLGR-K1基質0すなわち、5μlのH2O~0018μM、018μM、18μMまたは18μMの濃度範囲と混合した。反応物を37°Cで45時間インキュベーションした。CuSO4活性化セファロースを用いて、MTSP-1ファージ-AT3阻害剤複合体を捕捉した。キレート化セファロースPharmacia200μlを、CuSO4100mMにより前活性化した。CuSO4活性化セファロース100μlを、室温で1時間PBS緩衝液中05のBSA2mlにより遮断した。ビーズを6500rpmで60秒間の遠心分離による沈降により遮断溶液から採取し、次いで450μlの結合緩衝液05MのNaCl、100MのトリスpH8、10mMのイミダゾール、01のトゥイーン20に再懸濁した。上記ふるい分け反応混合物50μlを、CuSO4活性化セファロースビーズに加えることにより、His標識AT3阻害剤-MTSP1ファージ複合体を捕捉した。インキュベーションを室温でさらに1時間続行した。次に、ふるい分け混合物を2000rpmで1分間の遠心分離にかけ、結合AT3ファージ-MTSP-1阻害剤複合体を含むセファロースビーズを、結合緩衝液500μlで洗浄することにより未結合ファージを除去した。洗浄工程を5回反復し、結合複合体を含むビーズを各洗浄後に新しい管へ移すことにより、非特異性ファージの潜在的キャリーオーバーを回避した。結合MT-SP1ファージ-AT3SLGR-K1複合体を、溶離緩衝液05MのEDTA、pH80100μlに溶離した。溶離したファージの50μlアリコートを用いて、37°Cで20分間活発に増殖しているTG1大腸菌Ecoli細胞A600=05;05OD=~15X108コロニー/ml3mlを感染させた。感染細菌を、カルベニシリン75μg/mlを含む大型プレート245mmX245mmで平板培養し、30°Cで一晩インキュベーションした。翌朝、プレートを採取した。各プレートにおけるコロニーを計数し、AT3SLGR-K1阻害剤を含まないバックグラウンドプレートと比較した。コロニー計数の結果を表19に示す。プレートを2時間冷室に置いて寒天を固まらせた後、AT3SLGR-K1含有プレートからのコロニーを、カルベニシリン~100μg/mlを補った25mlの2YT中へかき出した。2YT細菌含有培地20mlを、カルベニシリン含有2YT500mlに加え、A600を測定したところ013であった。細菌をOD=~05まで増殖させ、次いで~1X1010~26X1013cfu/mlのヘルパーファージVSM13をライブラリー増幅用に加えた~150μl~200μlで。37°Cで振とうしながら1時間増殖後、培養物にカナマイシンを加えて最終濃度3μg/mLとし、一晩30°Cで振とうしながら増殖させた。細胞を採取し、PEG-NaCl溶液を用いて上清に存在するファージ粒子を沈殿させた。MT-SP1ファージ選択の第2世代の分析については、ベイトAT3SLGR-K1基質に対する反応が、選択のストリンジェンシーを高めるのに45時間ではなく27分だけであること以外、条件は第1世代と類似していた。上記の結合MT-SP1ファージ-AT3SLGR-K1複合体の溶離後、溶離したファージの50μlアリコートを用いて、37°Cで20分間活発に増殖しているTG1大腸菌Ecoli細胞A600=05;05OD=~15X108コロニー/ml3mlを感染させた。感染細菌を、カルベニシリン75μg/mlを含む大型プレート245mmX245mmで平板培養し、30°Cで一晩インキュベーションした。翌朝、プレートを採取した。各プレートにおけるコロニーを計数し、AT3SLGR-K1阻害剤を含まないバックグラウンドプレートと比較した。コロニー計数の結果を表20に示す。さらなる特性検定用にコロニーを採取した。カルベニシリン100μg/mlおよびテトラサイクリン10μg/mlを補った2xYT2ml中で細胞を培養し、報告された要領SambrookJetalMolecularCloningAlaboratorymanualColdspringHarborlaboratoryでファージ調製を実施した。選択されたファージを、Ac-SLGR-ACC基質に対する酵素活性について試験した。さらに、選択されたファージを、野生型AT3または血漿により不活化に対する抵抗性について選択した。実施例7突然変異体AT3阻害剤の発現および精製A.変異体AT3の生成鋳型としてヒト抗トロンビンIIIAT3遺伝子配列番号612;OrigeneTechnologiesから購入、カタログTC110831のコーディング領域を用いてAT3反応性中心ループRCLのアミノ酸配列に修飾を加えることにより、プロテアーゼトラップベイト基質として使用する突然変異体AT3タンパク質を作製した。AT3cDNAを、配列番号626に示した核酸配列:スタッファー配列太字で示す、BAMH1部位イタリック体で示す、およびAT3遺伝子とハイブリダイゼーションする部分平文字で示すを含むを有するフォワードプライマー、および配列番号628に示した核酸配列:GTAGCCAACCCTTGTGTTAAGGGAGGCGGAAGCCATCACCACCATCACCACTAAGAATTCを有するリバースプライマーを用いるPCRにより増幅した。増幅後、cDNAを、制限部位BamおよびEcoRIを用いてpAcGP67bバキュロウイルストランスファーベクターBDBiosciences配列番号494へサブクローニングした。このサブクローニング段階中にC-末端6xHis標識配列番号496またはC-末端FLAG標識DYKDDDDK;配列番号495を付加することにより、AT3突然変異体は後でアフィニティー精製により単離され得る。4アミノ酸GGGSリンカー配列番号620を用いて6xHis標識と融合したAT3を含む、クローン化AT3融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号613および614に示す。様々な特異性をもつ標的プロテアーゼを単離するための突然変異体AT3ベイト基質を製造するため、製造業者が明記した条件にしたがってQuikchange登録商標位置指定突然変異導入キットStratageneを用いて突然変異誘発反応を実施することにより、野生型AT3反応性中心ループRCL配列IAGRSL配列番号478の代わりに標的開裂配列のアミノ酸残基を導入した配列番号に示した前駆体AT3ポリペプチド配列のアミノ酸残基422~427、および配列番号493に示した成熟AT3ポリペプチド配列のアミノ酸残基390~395。野生型IAGRSLアミノ酸配列のアミノ酸残基を、ターゲッティングされたVEGFR2開裂配列からのアミノ酸残基RRVRKE配列番号498で置換することにより、上記の一突然変異体、AT3AT3/RRVR-KE配列番号497を作製した。野生型IAGRSLアミノ酸配列を、ターゲッティングされた補体C2タンパク質開裂配列からのアミノ酸残基SLGRKI配列番号479で置換することにより、別の突然変異体、AT3AT3/SLGR-KI配列番号499を作製した。Quikchange登録商標PCRについては、野生型AT3RCLプライマーは、配列番号630に示された次の核酸配列を有していた:GCTGCAAGTACCGCTGTTGTGATTGCTGGCCGTTCGCTAAACCCCAACAGGGTGACTTTC。補体C2標的配列プライマーは、配列番号632に示された次の核酸配列を有していた:GCTGCAAGTACCGCTGTTGTGTCGTTAGGCCGTAAAATTAACCCCAACAGGGTGACTTTC。VEGFR2標的配列プライマーは、配列番号634に示された次の核酸配列を有していた:GCTGCAAGTACCGCTGTTGTGCGCCGTGTGCGCAAAGAAAACCCCAACAGGGTGACTTTC。野生型AT3cDNAを含むベクターおよび突然変異体AT3cDNAを含むベクターを、それぞれ形質転換し、XL1Blue超形質転換能生細胞Stratageneで増幅した。QiagenPlasmidMaxiキットQuiagenを用いて、供給者が明記した条件にしたがってプラスミドDNAを細胞から精製した。B.AT3突然変異体の発現Sf9昆虫細胞を用いて、上記のAT3含有pAcGP67bトランスファーベクターを用いることにより、His標識およびFLAG標識野生型および突然変異体AT3タンパク質の両方を発現および精製した。Sf9細胞を、SF900II血清不含有培地Invitrogenでの成長に適合させ、35mmの皿で培養飽和密度の85~90まで培養した。供給者が明記した条件およびプロトコルにしたがって、FlashBac登録商標バキュロウイルス発現系OxfordExpressionTechnologiesを用いることにより、細胞をトランスフェクションした。AT3トランスファーベクター500ngおよびFlashBac登録商標組換えベクター500ngを、抗生物質を含まないSF900II血清不含有培地1ml中で20分間Cellfectin登録商標トランスフェクション試薬Invitrogen5μlとプレインキュベーションし、次いで細胞に滴下適用した。トランスフェクションの5時間後、細胞を遠心分離にかけ、抗生物質抗生物質/抗真菌溶液;Cellgroを含むSF900II血清不含有培地2mLに再懸濁し、28°Cで4日間インキュベーションした。プラーク検定法で測定されたように、ウイルスをSf9細胞において1×106pfu/mLの最大力価まで拡大させた。次いで、HighFive登録商標BTITN5B14昆虫セルラインInvitrogenおよびExcell登録商標405血清不含有培地JRHBiosciencesを用いることにより、組換えAT3を発現させた。細胞を、01~1の感染多重度MOIで感染させ、オービタルシェーカープラットフォームにおいて125RPMで振とうしながら、4~5日間1Lエルレンマイヤーフラスコにおいて300mL培養量で培養した。C.野生型および突然変異体AT3タンパク質のアフィニティー精製His標識AT3タンパク質のアフィニティー精製については、実施例7Bからの培養物の上清を、遠心分離にかけ、045μMフィルターでの濾過により澄明にし、50mMのリン酸ナトリウムpH75、300mMのNaClを含む緩衝液中へ透析した。BioLogicDuoflow登録商標クロマトグラフィー装置BioRadおよび10mLのTALON登録商標コバルト金属アフィニティー樹脂Clontechを用いるカラムクロマトグラフィーによりタンパク質を精製した。樹脂結合His標識タンパク質を、50mMのリン酸ナトリウムpH75、300mMのNaClおよび50mMのリン酸ナトリウムpH65、300mMのNaCl、150mMのイミダゾールの一次勾配で溶離した。タンパク質含有画分を合わせ、AT3貯蔵緩衝液50mMのリン酸ナトリウムpH65、300mMのNaCl、5グリセリン中へ透析した。精製AT3調製物が活性タンパク質を含むことを立証するため、本明細書の下記実施例14に記載のMT-SP1阻害活性部位滴定検定法を実施することにより、透析されたAT3がMT-SP1の基質開裂能を阻害する能力を測定した。このMT-SP1阻害検定法からの反応混合物を、SpectraMax登録商標M5SpectraMax登録商標M5マイクロプレートリーダー、MolecularDevicesMolecularDevicesIncでの04mMのAc-RQAR-ACCアセチル-Arg-Gln-Ala-Arg-ACC基質カスタム合成の開裂について速度論的に評価した。この基質の名称におけるACCは、7-アミノ-4-カルバモイルメチルクマリン脱離基を指す。ACC脱離基は、励起Ex=380、放出Em=450およびカットオフc/o=435の波長で検出された。精製His標識AT3タンパク質の全収量は、約1~3mg/Lであった。FLAG標識AT3タンパク質のアフィニティー精製については、培養物からの上清を上記と同様遠心分離および濾過により澄明化した。澄明化した上清をトリス緩衝食塩水TBSpH74中へ透析し、総容量300mLで新しい1Lエルレンマイヤーフラスコに加えた。予め平衡にした抗FLAGM2アフィニティーゲルSigma2mLを加え、全容量を、4°Cで3時間、125RPMでのオービタルシェーカープラットフォームでインキュベーションした。樹脂結合FLAG標識AT3タンパク質を、フリットの20mLクロマトグラフィーカラムBioRadを用いて重力により集めた。樹脂を1度目はTBS5mL、TBST01トゥイーン20を含むTBSで1回、そして2度目はTBS5mLで洗浄した。次いで、02mg/mLのFLAGペプチドSigmaを含むTBS10mL加えることにより、AT3タンパク質を溶離した。溶離液を濃縮し、AT3貯蔵緩衝液50mMのリン酸ナトリウムpH65、300mMのNaCl、5グリセリン中へ透析し、上記および下記実施例14A記載のマトリプターゼMT-SP1阻害活性部位滴定検定法を用いて活性を上記要領で検定した。精製FLAG標識AT3タンパク質の全収量は、約05~1mg/Lであった。これらの精製FLAG-およびHis-標識AT3タンパク質を、例えば、以下の実施例に記載した方法において、特定標的部位配列を認識するプロテアーゼを同定するためのプロテアーゼトラップとして用いた。実施例8プロテアーゼ変異型のファージディスプレーライブラリーの構築A.pMal-C2ファージミドディスプレーベクターへの野生型およびC122SMT-SP1プロテアーゼドメインB鎖のクローニング配列番号253に示した完全長MT-SP1タンパク質のアミノ酸615~854を含む、成熟MT-SP1プロテアーゼドメインMT-SP1B鎖配列番号505をコード化するcDNA配列番号504を、制限部位NdeIおよびHindIIIを用いて、分泌を促すSTIIリーダー配列TGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTATGCA配列番号636、および繊維状ファージM13GeneIII配列番号616のC-末端ドメインをコード化する核酸を含む、pMal-C2ベクター配列番号615NewEnglandBiolabsへクローン化した。MT-SP1プロテアーゼドメインcDNAを、リーダー配列とGeneIIIドメインの間に挿入した結果、最終構築物は、MT-SP1N-末端GeneIII融合タンパク質をコード化する配列番号510に示した核酸の配列を含んでいた。この融合タンパク質のコード化されたアミノ酸配列配列番号506は下記のとおりであり、STIIリーダー配列配列番号511は平文字、成熟MT-SP1ドメインは太字、C-末端GeneIII配列番号512ドメインはイタリック体で示す。は、タンパク質をコード化する核酸配列における停止コドンの存在を示す。配列番号506:野生型MT-SP1B鎖融合タンパク質に加えて、MT-SP1B鎖変異型CB469-GeneIII融合タンパク質を上記方法により作製した。上記配列でイタリック体で示され、配列番号505に示されている、野生型MT-SP1プロテアーゼドメイン配列の122位キモトリプシンのナンバリングに基づくのシステインをセリンと置換することにより、配列番号507に示したCB469変異型アミノ酸配列を作製した。上記要領で、このCB469配列をpMal-C2ベクターにクローン化した。改善されたディスプレーにするため、この変異型MT-SP1融合タンパク質をコード化する核酸を含むファージミドベクターを用いることにより、下記実施例8B記載のMT-SP1突然変異体ファージディスプレーライブラリーを作製した。B.突然変異体ファージディスプレーライブラリーの作製を目的とするプロテアーゼドメインの突然変異誘発突然変異したプロテアーゼドメインを含むファージディスプレーライブラリーの作製については、以下に具体例を示している当業界で公知MatsumuraetalMethodsMolBiol200218225967CirinoetalMethodsMolBiol200323139の標準的エラープローンPCR突然変異誘発プロトコルを用いて行った。1.B鎖MT-SP1融合タンパク質の突然変異誘発突然変異体MT-SP1含有融合タンパク質の構築については、Diversify登録商標PCRランダム突然変異誘発キットBDBiosciencesClonetechを用い、供給者が示した条件に従ったエラープローンPCRにより、MT-SP1CB469cDNAをpMal-C2ベクターから増幅し、1キロ塩基あたり5つの突然変異を得た。配列番号508に示した核酸配列:を有する、このPCRで使用されるMT-SP1フォワードプライマーは、STIIリーダー配列内でイタリック体で示した残基とハイブリダイゼーションするように設計されており、Nde制限部位配列太字で示したを含んでいた。配列番号509に示した核酸配列:を有するMT-SP1リバースプライマーは、MT-SP1プロテアーゼドメインをコード化する配列の3部分内でイタリック体で示した残基とハイブリダイゼーションするように設計されており、SacI制限部位配列太字で示すを含んでいた。2.突然変異誘発産物の精製Taqポリメラーゼは、DNAと堅固に結合するため、QiagenPCR精製キットを用いても完全には除去されず、その存在はPCR産物の下流制限消化を妨げ得るCroweetalNucleicAcidsRes1991年1月11日19184WybranietzetalBiotechniques24578580。すなわち、実施例8B1からの増幅された野生型および突然変異体PCR産物からTaqポリメラーゼを除去するため、それらの精製前に、以下のものを反応に加えた:5mMのEDTA、05SDS、50ng/μlのプロテイナーゼK。Taqポリメラーゼを排除するため、混合物を65°Cで15分間インキュベーションした。確実に下記選択方法を妨害する可能性がある野生型鋳型が残存しないようにするため、PCR産物を精製することにより鋳型DNAを除去した。PCR産物からベクターを分離するため、試料を、PCR産物またはラダーと共移動することのない10XオレンジGゲルローディングバファーNewEnglandBiolabsの存在下で1アガロースゲルにローディングした。外科用メスを用いてPCR産物をゲルから削り取った。供給者が明記した条件に従ってQIAquick登録商標ゲル抽出キットプロトコルQiagenまたはZymoclean登録商標ゲル抽出キットZymocleanCA、カタログD4001を用いて、削り取ったPCR産物を精製した。Qiagenゲル抽出キットについては、削り取ったゲル断片をQG緩衝液中で可溶化し、それぞれ約5~10μgの結合受容量を有し、2mLより多い量を保持することのない、QiagenQGカラムにゆっくりと通した。十分な数のカラムを用いることにより、完全容量の出発材料を適応させた。カラムをコレクターチューブ中14000rpmでの遠心分離にかけることにより、残留バファーQGを全て除去した。07mLのバファーPEを各カラムに添加し、試料を2~5分間インキュベーションした。次いで、カラムを2回、それぞれさらに1分間13000rpmでの遠心分離にかけることにより、残留PE緩衝液を全て除去した。試料を新しい15mL微細遠心分離管に移し、50μLのH20を加え、2分間インキュベーションした。結合DNAを7000rpmでの遠心分離により溶離した。典型的収率は、試料の出発量の30~60であった。Zymoclean登録商標ゲル抽出キットについては、出発材料の量によって、1本またはそれ以上のZymoclean登録商標ゲル抽出キットカラムそれぞれ5μgの最大結合受容量を有する、またはZymoclean登録商標DNACleanConcentrator登録商標キットからの1本またはそれ以上のカラムそれぞれ25μgの受容量を有するを使用した。このキットを用いて、削り取ったDNA断片を15ml微細遠心分離管に移し、次いでゲルから削り取ったアガロースの各量に3容量のADBBuffer登録商標を加えた。ゲル薄片が完全溶解するまで、試料を37~55°Cで5~10分間インキュベーションした。溶解したアガロース溶液を、コレクションチューブにおけるZymoSpinI登録商標カラムに移し、少なくとも10000rpmで30~60秒間遠心分離にかけた。カラムから流れ出た溶液を廃棄した。200μLの洗浄緩衝液をカラムに加え、30秒間少なくとも10000rpmでの遠心分離にかけた。流れ出た溶液を廃棄し、洗浄工程を繰り返した。みず50μLをカラムマトリックスに直接加えた。最小限の溶離量は、Zymoclean登録商標ゲル抽出カラムの場合10μLであり、DNACleanConcentrator登録商標カラムの場合35mLであった。カラムを15ml管中に入れ、30~60秒間少なくとも10000rpmでの遠心分離にかけることにより、DNAを溶離した。これら2方法の一法を用いた溶離の後、試料をプールし、蛍光分光光度計を用いて、70μLのUVキュベット中260nmで試料の吸光度を測定することにより、DNA濃度を評価した。次の等式:1A260=50ng/μldsDNAにしたがってDNA濃度を計算した。C.pMal-C2ファージミドベクターを用いたプロテアーゼ突然変異体ファージライブラリーの構築突然変異体プロテアーゼドメインを発現するファージディスプレーライブラリーの構築については、消化されたPCR産物、例えば上記実施例8AおよびB記載のプロテアーゼPCR突然変異誘発および精製から得られたものを、上記pMal-C2ファージミドベクターにライゲーションした。この過程の場合、Nde1およびSac1を用いてベクターを消化し、生成物をゲル精製し、ライゲーション反応下記で精製制限消化PCR産物と合わせた。Nde1/Sac1消化ゲル精製pSTII-g3pMal-C2ファージミドの分子量MWは5835塩基対bpである。Nde1/Sac1消化MT-SP1PCR産物のMWは806bpである。典型的には、2mLのライゲーション反応の場合、758μgの切断ベクターは約1nMのベクターであり、314μgの切断MT-SP1生成物は約3nMの挿入産物であった。MT-SP1生成物のライゲーションについては、消化精製生成物40μl3nM、314μgを、消化精製ベクター40μl1nM、758μg、1510μlのH2O、400μlの5XT4DNAリガーゼ緩衝液Gibcoおよび10μl10単位のT4DNAリガーゼNewEnglandBiolabsと混合した。ライゲーション反応を、2mL容量で、16°Cで一晩または室温で4時間実施した。ライゲーション後、ライゲーション反応混合物を65°Cで15分間インキュベーションすることによりDNAリガーゼを加熱不活化し、4mLのZymoResearchDNA結合緩衝液を加えた。次いで、この試料を、25μgのZymoResearchカラムへ一度に800μl加えた。カラムを600μlのZymoResearch洗浄緩衝液で2回洗浄し、予め42°Cに温めておいた50μLの水で溶離した。蛍光分光光度計を用いて260nmで希釈溶離試料70μlのH2O中3μlの溶離液の吸光度を測定することにより、DNA回収パーセントを評価した。例えば、上記の3mLライゲーションについては、A260が012=140ng/μlに対応する場合、総収量は約7μgライゲーションからのDNAの約70収率であるであると測定された。ライゲーション産物を、電気穿孔により約500ng/μlと適応し得るXL-1blue細胞への電気穿孔にかけた。200μlのXL1Blue細胞Stratageneに対し140ng/μlライゲーション産物75μlを加えた。細胞を02cmギャップキュベットに加え、次の条件:電圧V=2500、電気容量=25uF、抵抗=200オームを用いてジーンパルサーBioRadCAでの電気穿孔にかけた。電気穿孔の直後、1mLのSOC培地Invitrogenをキュベットに加えた。次いで、細胞を25mLのSOC培地に移し、37°Cで20分間インキュベーションした。このインキュベーション後、5つの小アリコート100マイクロリットルの系列100倍細胞希釈液を調製し、小さな2YTカルベニシリン寒天プレートで平板培養し、コロニーの数電気穿孔により作製されたライブラリーからのクローンの数を表すを数えるため37°Cで一晩インキュベーションした。一方法では、残存する大量の細胞を遠心分離にかけて細胞を沈降させ、次いで12mLのSOC緩衝液に再懸濁し、カルベニシリン75μg/mlを補った大型寒天プレート245mm×245mmで培養し、30°Cで一晩増殖させた。別法として、ライブラリーからファージストックを調製するため、1×1010CFU/mLのM13KO7ヘルパーファージと共にカルベニシリン75μg/mlを補った500mLの2YT培地に細胞を直接加え、37°Cで一晩増殖させた。実施例9突然変異体AT3プロテアーゼトラップを用いるプロテアーゼドメインファージライブラリーからの変異型プロテアーゼドメインの選択A.MT-SP1ファージ/突然変異体AT3複合体の選択およびELISAに基づくリードアウト検定法この実施例では、上記実施例7に記載の補体C2標的開裂配列SLGRKIを含む突然変異体AT3阻害剤を、標的開裂配列に対する反応性が改善された突然変異体MT-SP1担持ファージを単離し、かつその存在についてのリードアウトを提供するように設計されたふるい分け実験においてベイト基質として用いた。以下の手順を用いて上記実施例8A、8Bおよび8C記載の要領で製造した大型コンビナトリアルMT-SP1ファージディスプレーライブラリーからファージを単離した。1.突然変異体MT-SP1担持ファージとのAT3変異型の相互作用およびそれによる開裂まず、ファージライブラリーからのファージ結合MT-SP1突然変異体を、次の要領で標的開裂部位を有する突然変異体AT3を用いて選択した。各開裂反応については、37°Cで60分間、96ウェルのポリスチレンプレートNuncMaxysorpのデュプリケイトウェルにおいて以下の反応成分を70μl容量でインキュベーションすることにより実施した:314E12CFU/mlでのMT-SP1ライブラリーファージ35μl、7μLの10XMT-SP1活性緩衝液05Mのトリス-HCl、pH74、1MのNaCl、1トゥイーン20、7μLの10μM低分子量へパリンBDBiosciences、14μLのH2O、および7μLのHis標識突然変異体AT3-SLGRKI。次の異なるAT3-SLGRKI濃度で、個々の開裂反応を実施した:100nM、33nM、11nM、33nM、11nMおよび033M。100mg/mlのプロテアーゼ阻害剤4-2-アミノエチル-ベンゼンスルホニルフルオリドPefablocRocheDiagnostics2μLを加えることにより、各反応を終結させた。次いで、055BSA、0275トゥイーン20溶液40μLを加え、上下にピペット操作しながら十分に混合した。2.抗His抗体を用いたMT-SP1ファージ-AT3複合体の捕捉一方、別の96ウェルポリスチレンプレートNuncMaxysorpのウェルを、02Mの炭酸緩衝液pH9、Pierce中の5ng/μlストレプトアビジンPierce100μLにより室温で振とうしながら1時間コーティングした。次いで、ウェルを250μLのPBSTで3回洗浄し、室温2時間PBS中の02BSA200μLにより遮断し、室温で1時間5ng/μlのビオチニル化抗6HIS抗体100μlとインキュベーションすることにより、His標識AT3突然変異体を捕捉し、PBSTで十分に洗浄した。次いで、実施例9A1におけるAT3開裂反応からの各突然変異体MT-SP1ファージ試料を、コーティングした96ウェルプレートにデュプリケイトで加え、室温で1時間インキュベーションした。次いで、プレートを250μLのPBSTで14回洗浄した。3.MT-SP1ファージ-AT3複合体を選択するためのELISAに基づくリードアウト洗浄後、マイクロタイタープレートにおける2列の第1列を用いて、ELISA酵素結合免疫検定法に基づく検定法を実施することにより、ファージ捕捉についてのリードアウトを得た。この列の各ウェルに、HRPコンジュゲート抗M13ファージ抗体GEHealthcareの1:5000希釈物100μLを加え、1時間結合させた。次いで、この列におけるウェルを、Skanwasherプレート洗浄機MolecularDevicesを用いて8回洗浄し、次いでTMB/ペルオキシド基質溶液Pierce100μLを加え、室温で5分間インキュベーションした。この反応を2MのH2SO4100μlでクエンチングし、450nMでの吸光度についてSpectraMax登録商標プレート読取装置MolecularDevicesで検定した。このリードアウトを、ファージ-AT3複合体の存在に関するサロゲートとして使用した。この検定法では、吸光度の濃度依存的増加が観察された実施例9A1での開裂反応で使用したAT3-SLGRKIベイトの濃度増加に基づく。さらに、本明細書に記載した連続ラウンドのふるい分けを用いてこの方法を実施するとき、各ラウンドの後に吸光度の増加が観察されたことから、このふるい分け方法はファージプールを標的開裂部位親和力について有効に濃厚化し得ることがわかった。これらのデータは、この方法を用いることにより、ファージライブラリーから、特定標的配列に親和力を有する突然変異体プロテアーゼドメイン融合タンパク質を選択することができることを示唆している。ELISA検定法は、下記実施例9A4記載のアフィニティーに基づく捕捉および後続の溶離に用いたのと同じ96ウェルプレートを用いることによる、この選択および濃厚化についてのリードアウトを得る方法を提供した。4.選択されたMT-SP1ファージの溶離次いで、実施例9A2からのマイクロタイタープレートのデュプリケイトの2列の第2列を用いることにより、後続の精製およびスクリーニングに使用するための特異結合ファージを溶離した。この列の各ウェルに、100mMのHCL100μLを加え、5分間インキュベーションすることにより、特異結合ファージを溶離した。得られたファージ溶出液を、感染前に酸で中和するため33μLの1MトリスpH8を含む別々のウェルに加えた。次いで、中和したファージ混合物133μLを、05のOD600で増殖しているXL-1Blue細胞1mlに加え、次いで37°Cで20分間インキュベーションし、カルベニシリンを補った2xYT寒天プレート245mm×245mmで平板培養した。これらの細胞を、下記実施例に記載した後続のスクリーニング、配列決定および精製方法で使用した。また、この選択およびELISAに基づく検定方法を、例えば上記実施例2および3に記載したものなどのuPAライブラリーからのuPA突然変異体を選択および評価するのに使用した。B.選択されたプロテアーゼドメイン担持ファージの精製この実施例では、ベイト阻害剤を用いて選択されたファージ上清の単離方法について記載する。上記実施例9Aで回収されたものなどの選択されたファージの力価cfu/mLを測定した。ファージストックをPBSで希釈し、05のOD600または約21×108細胞/mLで増殖している大腸菌EcoliXL-1Blue細胞の感染に使用した。所望の感染力範囲は、1プレート当たり1000~2000コロニーであった。感染した細胞を、245mm×245mm平方のポリスチレンBioAssayCorning皿において100μg/mLのカルベニシリンを補った2YT寒天上で平板培養し、16~20時間またはコロニーサイズが直径ほぼ2mmになるまで増殖させた。自動コロニーピッカーを用いることにより、個々のコロニーを採取し、それぞれ100μg/mLのカルベニシリンおよび12μg/mLのテトラサイクリンを補った2YT培地150~170μLを含む、96ウェルポリプロピレンプレートのウェルに分配した。鋳型ファージ突然変異誘発用の鋳型として使用されたプロテアーゼドメインを有するファージまたは不活性プロテアーゼ変異型を含む融合タンパク質を含むファージで感染させた細胞を対照ウェルに接種した。接種したプレートを空気透過性膜で密閉し、HiGroGeneMachinesインキュベーター中に入れ、37°Cで14~20時間、400rpmで振とうした。インキュベーション後、対数期細胞を得るため、各ウェルからの100μLを用いて、100μg/mLのカルベニシリンおよび12μg/mLのテトラサイクリンを補った2YT培地1mLを含む深型ウェル96ウェルプレートのウェルに接種した。次いで、深型ウェルプレートを、空気透過性膜で密閉し、細胞密度が04~06間のOD600に達するまで酸素曝気して37°C、400rpmで振とうしながら、HiGro登録商標インキュベーター中に置いた。典型的インキュベーション期間は、4~5時間の間であった。インキュベーション後、ヘルパーファージストック100μLを各ウェルに加え、プレートを密閉し、37°Cで5~10分間、400rpmで再び振とうした。5~10分間振とうした後、プレートを37°Cで30~45分間、振とうせずに静止状態でインキュベーションした。次いで、振とうを37°Cで15~30分間、400rpmで再開した。振とう後、100μLのカナマイシン溶液400μg/mLを各ウェルに加えることにより、各ウェルにおいて333μg/mLの最終濃度とした。プレートを再密閉し、37°Cで12~16時間、400rpmで振とうした。次いで、細胞を沈降させるため、プレートを、4°Cで20分間、3500~4500rpmでの遠心分離にかけた。遠心分離後、単離されたファージを含む上清を、そのまま下記実施例記載のスクリーニングに使用するか、またはまず4°Cで貯蔵した。C.プロテアーゼドメインファージ上清のポリエチレングリコールPEG沈殿この実施例では、ポリエチレングリコール沈殿を用いることによる、選択された精製ファージ上清に混入する可能性のあるバックグラウンドプロテアーゼ活性下記の特性確認検定法の中にはこれに感受性を示すものもあるの除去方法を記載する。この方法では、一晩12~16時間MT-SP1担持ファージ上清例えば実施例9Aで選択および溶離されたものをヘルパーファージでレスキュー後、試料を4°Cで20分間、3500~4500rpmでの遠心分離にかけ、1000μLの上清を各ウェルから除去し、別の96ウェル深型ウェルプレートのウェルに移した。沈殿させるため、25MのNaCl中20PEG体積にしてを含む溶液250μLを各ウェルに加えた。プレートを密閉し、激しく反転させながら混合し、次いで氷水浴中に置き、1~2時間放置した。次いで、プレートを、4500rpmで60分間または3500rpmで90分間の遠心分離にかけた。各ウェルからの上清溶液を傾瀉し、プレートを軽くたたいて乾かし、20~30分間水切りした。生じた沈殿物を、もとのファージ上清体積200μLの20に等しい最終体積でPBSを用いて再懸濁することにより、5倍濃縮液を得た。この物質については、そのまま下記検定法で使用するか、または試験準備するまで4°Cで貯蔵した。実施例10標的基質配列に対する高い反応性および触媒有効性を有するプロテアーゼドメイン担持ファージのスクリーニング例えば実施例9Bおよび9C記載のものなどの個々のファージ調製物を様々な検定法で用いることにより、それらの特異性および/または活性を測定した。A.ベイトタンパク質による蛍光性ペプチド加水分解の阻害をモニターすることによるプロテアーゼドメイン変異型を発現するファージの分析突然変異体プロテアーゼ担持ファージクローンを評価する一方法として、選択された変異体プロテアーゼドメインの活性を阻害する阻害剤ベイトセルピンの能力を、ファージミドライブラリー構築で最初に使用した鋳型プロテアーゼドメインすなわち、親プロテアーゼの活性を阻害するその能力と比較する生化学的阻害検定法が実施され得る。この方法によると、例えば上記実施例9で回収されたものなどの突然変異体プロテアーゼ担持ファージが、標的基質配列を含む蛍光性基質を開裂する能力を、所定濃度のベイト阻害剤の存在下または非存在下で評価し、同ベイト阻害剤の存在下で同配列を開裂する鋳型プロテアーゼドメインの能力と比較した。蛍光性ペプチド基質の使用は、プロテアーゼ特異性測定に関する常用方法であるZimmermanetalAnalBiochem784751HarrisetalPNAS9777547759。MT-SP1B鎖鋳型実施例8B1での突然変異誘発に使用の阻害と比較したMT-SP1B鎖突然変異体の阻害の分析については、変異型AT3所望の標的配列を伴うが阻害剤として使用され得、Ac-RQAR-ACCが基質として使用され得る。この基質では、アニリド結合の特異的開裂により、蛍光性ACC脱離基が遊離することから、個々の基質に関する開裂速度の有効な測定手段が提供される。上記検定法の一例では、例えば上記実施例3で回収されたものなどのuPAプロテアーゼ担持ファージが蛍光性基質Ac-AGR-AMC配列番号617を開裂する能力を、所定濃度のPAIベイトの存在下および非存在下で評価した。上記のとおり、かかる7-アミノ-4-メチルクマリンAMC蛍光性ペプチド基質の使用は、プロテアーゼ特異性測定に関する常用方法である。この例では、35μLのファージ上清例えば、実施例3A記載の要領で得られたものを、384ウェルのポリプロピレンプレートCoStar、3658における指定検定ウェルおよび指定対照ウェルの両方に移した。選択に使用したものと同じPAIベイトを含む2x間接検定緩衝液35μLを検定ウェルに加えた。ベイトの濃度は選択に使用した濃度と同じであった。2x間接検定緩衝液阻害剤含まず35μLw、対応する対照ウェルに加えた。プレートを37°Cで60分間インキュベーションした。ファージを阻害剤または対照緩衝液と混合した後、間接検定緩衝液中で60μMの最終検定濃度に希釈した、AGR-AMC蛍光性ペプチド基質10μLをウェルに加えた。1時間動的読取モードを用いて、380nmでの励起、460nmでの放出によりMolecularDevicesSpectraMax登録商標プレート読取装置を用いて、蛍光を測定した。鋳型プロテアーゼに関して高い標的基質阻害を示すクローンをさらに分析した。B.蛍光性ペプチド基質を用いた変異体プロテアーゼ活性の分析MT-SP1突然変異体の活性および特異性を直接評価するため、蛍光性ペプチド基質Ac-RQAR-ACC野生型MT-SP1により認識される天然自触開裂配列を有するおよびC2標的部位開裂配列を有するAc-SLGR-ACCアセチル-Ser-Leu-Gly-Arg-ACCを用いて検定法を実施した。上記で示したとおり、これらの基質の名称におけるACCは、蛍光性脱離基である7-アミノ-4-カルバモイルメチルクマリンを表す。また、上記で示したとおり、蛍光性ペプチド基質の使用は、プロテアーゼ特異性測定に関する常用方法であるZimmermanetalAnalBiochem784751HarrisetalPNAS9777547759。この例では、アニリド結合の特異的開裂により、蛍光性ACC脱離基が遊離することから、個々の基質に関する開裂速度の有効な測定手段が提供される。この方法では、35μLの2x間接検定緩衝液を全試験ウェルに加えた。35μLのファージ上清実施例9B記載の要領で単離または再懸濁PEG沈殿ファージ実施例9C記載の要領で単離を、各指定ウェルに加えた。ファージを加えた後、プレートを1分間2000rpmで遠心分離することにより、気泡を除去した。ペプチド基質Ac-SLGR-ACC最終検定濃度=125μMおよびAc-RQAR-ACC最終検定濃度=60μMのそれぞれ10μLを、1X間接検定緩衝液で希釈し、次いで適切なウェルに個々に加えた。基質開裂の指標である相対蛍光単位/秒RFU/秒として測定した加水分解速度ROHを、動的読取モードを用いて、SpectraMax登録商標M5マイクロプレート読取装置MolecularDevicesを用いることにより経時的にモニターした。実施例11MT-SP1突然変異体の調製、選択、評価および同定A.ファージミドライブラリーからのB鎖MT-SP1突然変異体の蛍光検定法この実施例では、実施例8記載の要領で製造されたライブラリーを用いて製造されたMT-SP1プロテアーゼドメイン担持ファージの活性および特異性を分析するのに実施された蛍光検定法について記載する。鋳型としてキモトリプシンのナンバリングに基づき122位にあるシステインの代わりにセリンを有するMT-SP1の天然B鎖配列番号507を用いることにより、MT-SP1ライブラリーを上記実施例8記載の要領で製造した。供給者が勧めるpMal-C2ベクターおよびエラープローンPCR条件を用いて、ライブラリーを上記要領で調製することにより、約05突然変異誘発率を達成した。この突然変異誘発反応からの収量は、4×109組換え体であった。実施例7の記載と同様、天然RCLの代わりに標的基質配列を含む変異型AT3との相互作用およびその開裂の速度に基づいたファージの選択を、ポリプロピレン96ウェルフォーマットを用いて、実施例9A記載の要領で実施した。この選択については、1x1012組換えファージを、30分間SLGRKIRCL配列を有する33nMの変異型AT3と混合した。洗浄後、ファージを上記実施例9A記載の要領で溶離し、実施例9B記載の要領でXL-1Blue細胞を感染させるのに使用した。本明細書記載の本発明方法を用いて、連続ラウンドの選択を実施することにより、標的基質配列との迅速な相互作用およびその開裂について増強した。例えば、第1ラウンドで選択されたクローンを、実施例9A3の記載と同様1時間33、11および033nMのAT3を用いて、本明細書記載の要領で選択の第2ラウンドにかけた。第1ラウンドの選択後、選択されたクローンからのPEG沈殿を用いて実施例9Cと同様にファージ上清を調製した。蛍光性基質としてAc-SLGR-ACCC2標的開裂部位配列を含むおよびAc-RQAR-ACC天然MT-SP1に関する天然開裂配列を含むを用いることにより、上記実施例10Bの方法を用いて、ファージクローンをスクリーニングした。各クローンについて、Ac-SLGR-ACC検定法から測定された蛍光速度ROFを、天然基質配列に対する各突然変異MT-SP1プロテアーゼドメインの活性を、標的基質配列に対するその活性と比較する手段としてAc-RQAR-ACC検定法から測定されたROFと比較した。また、突然変異体MT-SP1検定法におけるROFを、鋳型C122SMT-SP1検定法におけるROFと比較した。個々のクローンにより得られた結果を下表21に示しており、その表ではクローン番号を列挙し、RFU/秒1秒あたりの相対蛍光単位として蛍光速度を列挙している。表21:AT3-SLGRKIの開裂速度について選択された突然変異体MT-SP1プロテアーゼドメイン担持ファージのスクリーニングB.DNA配列決定による選択されたMT-SP1突然変異体ファージの同定この実施例では、先行実施例記載の要領で製造され、例えば上記実施例10B記載の検定法などの蛍光性検定法からの結果に基づいて選択された陽性ファージクローンの同定に使用した方法について記載している。この方法については、個々のクローンを、感染させるためXL-1Blue大腸菌Ecoli細胞と混合し、培養物を37°Cで振とうしながら一晩培養した。プラスミド調製キットQiagenを用いて、プラスミドDNAを一晩培養物から精製し、DNAを突然変異体同定のための配列決定に送った。この方法の一例では、上記実施例11Aからの選択されたB鎖MT-SP1突然変異体のアミノ酸配列を、上記で概説した段階を用いて同定した。これらのクローンの同定に使用した配列決定プライマーは、配列番号618:5GGTGTTTTCACGAGCACTTC3に示されている。配列決定データの解析により得られた結果を下表22に示す。この表は、複数の分離体で突然変異していることが見出された残基をもつ突然変異体のみを列挙している。表22は、配列決定データの解析により測定された、野生型MT-SP1B鎖配列配列番号505と比較した各クローンに関するアミノ酸突然変異/位置を列挙している。アミノ酸ナンバリングは、キモトリプシンのナンバリングに準拠している。また配列番号は、示されたアミノ酸突然変異を含むMT-SP1プロテアーゼドメインB鎖をコード化するアミノ酸残基の配列および同じ突然変異を有する完全長MT-SP1タンパク質をコード化するアミノ酸残基の配列の両方について列挙されている。表22:選択されたMT-SP1突然変異体実施例12選択されたファージ結合MT-SP1プロテアーゼの大量生産および特性確認A.MT-SP1ファージの大規模製造この実施例では、選択されたプロテアーゼドメインの分析およびそれに続く下流方法、例えばMT-SP1プロテアーゼ全体でのインビトロ翻訳における使用を目的とする、選択されたMT-SP1プロテアーゼドメイン担持ファージの大量生産について記載する。この実施例については、上記実施例11と同様に選択された単ファージ担持コロニーを、一晩小型滅菌CorningOrangeCappedエルレンマイヤーフラスコにおいて、最終濃度50μg/mLのカルベニシリンおよび最終濃度12μg/mLのテトラサイクリンを補った2YT培地中で一晩培養した。グリセリン貯蔵液を調製するため、60グリセリン85μLを、各培養物500μlに加え、次いで-80°Cで貯蔵した。各培養物の残存量を、カルベニシリンおよびテトラサイクリンを補った2YT培地500mlを含む2Lの広口バッフル付きフラスコに加えた。別法として、この段階を50mL容量で500mLフラスコ中において実施した。05のOD600に達するまで培養物を増殖させた。M13KO7ヘルパーファージを培養物に加えることにより、1E10CFU/mlを得、培養物を37°Cで1時間インキュベーションした。カナマイシンを加えて最終濃度30μg/mLとした。培養物をヘルパーファージと37°Cで一晩インキュベーションすることによりレスキューした。一晩培養後、試料を15分間6000rpmでの遠心分離にかけた。5体積の培養物に対し1体積のPEG/NaCl20PEG8K/15MNaCl溶液を加えた。次いで、試料を4°Cで20分間撹拌した。試料を20分間10000rpmでの遠心分離にかけ、上清を除去した。10000rpmでの2度目の遠心分離工程後、ペレットを5mL最初の体積が500mLの場合または1mL最初の体積が50mLの場合のPBSに再懸濁した。再懸濁されずに沈殿している細胞を、2分間14000rpmでの短い遠心分離により除去した。再懸濁された細胞を含む上清に、グリセリンを10体積の割合で加えた。細胞を-80°Cで冷凍した。B.ACCおよびQF基質を用いる調製されたファージの検定法この実施例では、実施例12Aで調製されたファージの活性および特異性を評価するのに使用される蛍光検定法について記載する。実施例12A記載の要領で50mL容量の培養物を用いて調製した、PEG-沈殿突然変異体MT-SP1担持ファージクローンを、1E13粒子/mlに正規化した。次いで、ACC蛍光原性およびQFQuenchedFluorescence基質を用いることにより、次の要領でファージを酵素検定した。5μLのファージ1E13粒子/mlでを、5μLの10XMT-SP1検定緩衝液、35μLのH2Oおよび5μLの基質と一緒に50μLの総容量で黒色CostarポリプロピレンハーフウェルマイクロタイタープレートCorningの各ウェルに加えた。個々のウェルで使用した基質は、Ac-SLGR-ACC120μM最終濃度、Ac-RQAR-ACC60μM最終濃度、または次の消光蛍光基質:SLGR-KIおよびRQAR-SA両方をも0625μM最終濃度で使用であった。Ac-SLGR-ACC基質は、標的補体C2開裂配列の突然変異体MT-SP1クローンによる開裂の評価に使用され、Ac-RQAR-ACC基質は、MT-SP1に関する天然標的開裂配列の開裂の評価に使用された。同様に、SLGR-KI基質は、標的補体C2開裂配列の開裂の評価に使用され、RQAR-SA基質は、MT-SP1に関する天然標的開裂配列の開裂の評価に使用された。これら2つの開裂速度比は、ターゲッティングされた新たな開裂配列についての選択されたプロテアーゼの特異性の一つの定量的尺度であった。選択された変異型および対応する本来のスカホードすなわち、親プロテアーゼに関するこれらの比率を比較すると、選択されたプロテアーゼが、ターゲッティングされた新たな開裂配列に対し高い選択性を呈するか否かが示された。ACCリードアウトについては、SpectraMax登録商標プレート読取装置を380nMでの励起に設定し、435nMカットオフで、460nMでの放出を検出するようにした。QFリードアウトについては、SpectraMax登録商標プレート読取装置を490nMでの励起に設定し、515nMのカットオフで、520nMでの放出を検出するようにした。この検定法の結果を下表23に示す。上記と同様、配列番号は、上記実施例11B記載の要領で、配列決定により測定された、示されたアミノ酸突然変異を含むMT-SP1プロテアーゼドメインB鎖をコード化するアミノ酸残基の配列および同じ突然変異を有する完全長MT-SP1タンパク質をコード化するアミノ酸残基の配列の両方について列挙されている。RFU相対蛍光単位番号は、各基質について37°Cでの60分反応で観察された加水分解速度に対応している。表23:選択されたMT-SP1プロテアーゼドメイン担持ファージクローンの動的検定法RFU/秒=相対蛍光単位/秒加水分解速度実施例13インビトロ翻訳を用いた選択されたMT-SP1突然変異体タンパク質の発現この実施例では、遺伝子III融合タンパク質の一部ではない、上記実施例で選択およびスクリーニングされたMT-SP1プロテアーゼドメインの発現について記載する。A.修飾IVEXベクターへのMT-SP1配列のサブクローニング遺伝子III融合タンパク質としては合成されていない、上記実施例記載のとおりファージで選択されたMT-SP1プロテアーゼドメインを発現させるため、N-末端活性化配列およびC-末端6xHis標識を含むMT-SP1プロテアーゼドメインについてのコーディング領域を、NdeIおよびXhoI制限部位を用いてpIVEX23dRTSインビトロ翻訳ベクターRoches、配列番号559にクローン化した。RQAR開裂部位に先行するpIVEX23dMT-SP1の完全N-末端アミノ酸配列は、配列番号558:MEKTRHHHHHHSGSDCGLRSFTRQARで示される。上記要領でファージミドライブラリーを用いて選択され、実施例10Bおよび11A記載の要領で蛍光スクリーニング方法を用いて検定され、実施例11B記載の要領で配列決定された、MT-SP1B鎖タンパク質をコード化する残基を、内部SphIおよびBsrGI制限部位を用いてpIVEX23dMT-SP1ベクターにサブクローニングした。これらの内部部位の外側であるMT-SP1配列に突然変異を有するファージミドのセレクタントを、PCR突然変異誘発によりこの方法で使用するために作製した。B.インビトロ翻訳によるMT-SP1の発現インビトロ翻訳キット、RTS100大腸菌EcoliジスルフィドキットRocheAppliedScienceを用いたMT-SP1プロテアーゼドメインの発現を、次の最適化による供給者が明記した条件にしたがって実施した。50μlの反応液の成分については、5μlの1MヘペスpH8緩衝液、25μlの12nMのトゥイーン-20、25μlのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼPDIおよび6μlのシャペロンRTSGroEサプリメントRocheAppliedScienceを加えて12μlのアミノ酸混合物、10μlの反応混合物、12μlのライゼートを含むように修正した。また、1mLのフィード混合物についても、168μlのアミノ酸混合物、24μlのメチオニン、608μlのフィード混合物、100μlの1MヘペスpH8、50μlの12nMのトゥイーン-20および50μlの水を含むように修正を加えた。インビトロ翻訳IVT反応物を、30°Cで18時間、プレートシェーカーでインキュベーションした。C.His標識MT-SP1の精製インビトロ翻訳IVT反応後、不溶性タンパク質を遠心分離により澄明化し、新しい管に移した。澄明上清約45μlの容量を、50mMのリン酸ナトリウムpH75、300mMのNaCl中で1mLの最終容量にした。溶液を、2mLフリット付きクロマトグラフィーカラムClontechにおいて予め平衡させておいたTALON登録商標樹脂300μlに適用し、重力により流出させた。50mMのリン酸ナトリウムpH7、300mMのNaClおよび75mMのイミダゾールを含む溶液3mLによりカラムを洗浄し、50mMのリン酸ナトリウムpH65、300mMのNaClおよび75mMのイミダゾールを含む溶液600μlで溶離した。溶出液を、01トゥイーン-20含有リン酸緩衝食塩水PBST中に透析し、20μLに濃縮した。典型的には、精製プロテアーゼの収率は約70であった。実施例14突然変異MT-SP1プロテアーゼドメインの特性検定この実施例では、上記実施例13の要領で調製した突然変異体MT-SP1プロテアーゼドメインの特性検定について記載する。A.IVT反応の活性部位滴定プロテアーゼ活性を評価するため、報告された要領TakeuchietalPNAS961105411061で、インビトロ翻訳突然変異体MT-SP1プロテアーゼドメインの活性部位滴定を、MT-SP1阻害剤M84Rエコチンにより澄明上清において実施した。この検定法については、IVTタンパク質を、1XMT-SP1活性緩衝液中で1:10000の最終濃度に希釈し、30°Cで1時間1:25系列希釈での15nMエコチンとインキュベーションした。反応を、SpectraMax登録商標M5マイクロプレート読取装置MolecularDevicesIncにおける04mMのAc-RQAR-ACC基質の開裂について動的に検定した。ACC脱離基が、励起Ex=380、放出Em=450およびカットオフc/o=435の波長で検出された。20~80非阻害活性間の活性分率を示す検定点を、活性対エコチン濃度のグラフでプロットし、点をつないで線をプロットした。その線のx切片を用いて、IVTプロテアーゼの活性濃度を確立した。曲線の線部分はIVTプロテアーゼの活性濃度を示すものとして反応をグラフ化した。すなわち、活性部位滴定法を用いて活性部位濃度下表24に幾つかの突然変異体について示す;活性部位濃度を測定した。B.ACCおよびQF基質によるIVTMT-SP1プロテアーゼドメイン突然変異体の検定法幾つかのIVT産生MT-SP1ファージセレクタントを、消光蛍光QF動的酵素検定法により天然RQARMT-SP1開裂部位よりも突然変異体RCL開裂部位についての方が高い特異性について評価した。上記実施例13C記載の要領で澄明化されたIVT上清を、1XMT-SP1活性緩衝液中で1:10000に希釈し、天然RQAR-SLQF基質または突然変異体RCLC2開裂基質SLGR-KIのいずれか625μMとインキュベーションした。Ex=490、Em=520およびc/o=515の波長でSpectraMax登録商標M5マイクロプレート読取装置MolecularDevicesを用いて開裂を評価した。天然配列の場合に対するRCL標的配列についてのIVT産生プロテアーゼの相対特異性を、SLGR-KIおよびRQAR-SLについてのRFU/秒1秒あたりの相対蛍光単位の比率を用いて計算した。結果を下表24に示す。配列番号と表示された列では、示されたアミノ酸突然変異を含むプロテアーゼドメインのアミノ酸配列を示す配列番号を最初に列挙し、示されたアミノ酸突然変異を含む完全長MT-SP1をコード化するアミノ酸残基の配列を示す配列番号を内に示している。RFU数は、各基質に関して測定された相対蛍光単位加水分解速度を示す。表24:突然変異体MT-SP1プロテアーゼドメインの動的検定法実施例15精製タンパク質としての選択されたMT-SP1突然変異体タンパク質の発現A.MT-SP1プロテアーゼドメインのpQEベクターへの導入先行実施例で検定されたMT-SP1プロテアーゼドメイン担持ファージクローンのサブセットを、野生型MT-SP1プロテアーゼドメインの発現用に予め修飾しておいたpQE30発現ベクターへのMT-SP1プロテアーゼドメイン配列の導入用に選択した。InFusionDryDownPCRクローニングキットClonetechを用いることにより、供給者が明記し、BenoitetalProteinExpressionPurification45:66-71に記載された条件下で選択されたクローンをpQE30-MT-SP1配列番号624へ導入した。この過程については、MT-SP1プロテアーゼドメインをコード化するファージクローンDNAの一部分を、それぞれ非アニーリング5テイルをもつ、pQE-InsertF2フォワードプライマー:およびpQE-Insert-R3リバースプライマー:によるポリメラーゼ連鎖反応PCRにより増幅した。MT-SP1のプロテアーゼドメインを伴わないプラスミドpQE30-MT-SP1を、フォワードプライマー:pQE-Linear-F2:およびリバースプライマー:pQE-Linear-R1:によるPCRを用いて線状化し、次いでドナーおよびアクセプターの両PCR産物をDpnI酵素で処理した。上記で示したそれぞれの線状化プライマー配列については、18ヌクレオチド長相同性領域、非アニーリング5プライマーテイルを太字で示している。次いで、アクセプターおよびドナーの両DNAを混合し、供給者が明記した条件を用いて10μL容量でInFusion反応を行った。2μLの反応混合物を、50μLの大腸菌EcoliTOP10F形質転換能生細胞Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニアへ形質転換した。100ppmのカルベニシリンを補ったLB寒天プレートでコロニーを選択した。プラスミドDNAを選択されたクローンから単離し、フォワードプライマー:MT-SP1-5F:GGAGAAACCGGCAGAGTAC配列番号564およびリバースプライマー:MT-SP1-5R:GGTTCTCGCAGGTGGTCTG配列番号565を用いて配列決定することにより、正確な導入であることを証明した。これらのプライマーは完全にアニーリングしている。B.突然変異MT-SP1プロテアーゼドメインの発現、再生および精製上記実施例15B記載のpQE30ベクターQiagenにおけるMT-SP1変異型のプロテアーゼドメインをコード化するプラスミドを、BL21GoldDE3大腸菌Ecoli細胞Stratageneへ形質転換した。100μg/mLのカルベニシリンを補った1mLのLBを含む小出発培養物をコロニーから接種し、37°Cで8~10時間インキュベーションした。この培養物100μLを用いて、100μg/mLのカルベニシリンを補った2xYT培地50mLに接種し、一晩培養した。50mL円錐管Corningにおいて、細胞を遠心分離により採取し、次いで溶解した。供給者が明記した条件を用いてBugBuster登録商標試薬Novagenにより封入体IBを単離した。100mMのトリスpH8、6MのGdmHCLおよび20mMのDTTを含む変性溶液1mLにより、IBペレットを可溶化した。不溶性物質があれば、微細遠心管20000×g、10分間での遠心分離により全て除去した後、50mL円錐管Corning中に15Mのアルギニン、100mMのトリスpH8、150mMのNaCl、5mMの還元グルタチオンおよび50μMの酸化グルタチオンを含む40mLの再生溶液中へ上清を希釈した。管を4°Cで3~4日間NutatorプラットフォームFisherScientific上に水平に置いた。次いで、まだ活性化されていない、再生されたMT-SP1変異型を、室温で3~4日間25mMのトリスpH8、25mMのNaClに対し十分に透析した。透析中にアルギニンを除去した後、MT-SP1プロテアーゼドメイン変異型は活性化することができた。次いで、活性化MT-SP1プロテアーゼドメイン変異型の粗調製物を、1ラウンドにつき7つまでの変異型の処理を可能にする自動モードで稼働するAKTAシステムに結合した5mLのHiTrap登録商標QHPカラムGEHealthcareでのクロマトグラフィーにかけた。泳動緩衝液は25mMのビス-トリスpH65であり、精製MT-SP1を350mMのNaClへの50mL勾配内で溶離した。活性画分をプールし、次いで緩衝液をPBS20mMベンズアミジンに交換し、MWCOが10kDaであるAmiconUltra15装置Milliporeを用いて05~10mg/mLに濃縮した。最後に、アリコートを液体窒素中で急速冷凍し、-80°Cで貯蔵した。実施例16ビオチニル化突然変異体PAI阻害剤ベイトの調製この実施例では、uPAライブラリーからの変異型uPAプロテアーゼの選択に使用される、ストレプトアビジンでコーティングした表面を捕捉のためビオチンにより標識した突然変異体PAI阻害剤タンパク質を発現および精製するのに使用した方法について記載する。これらの突然変異体PAI阻害剤はまた、MT-SP1変異型およびPAIで使用するRCL配列に左右される、MT-SP1ライブラリーからの変異型MT-SP1プロテアーゼの選択にも有用である。A.6xHis-PAI-1のN-末端ビオチニル化6xHis-PAI-1またはその反応性中心ループ変異型のビオチニル化については、本明細書実施例1記載の要領で、野生型His標識PAI-1配列番号625およびHis標識PAI-1変異型を、Rosetta-2DE3pLys宿主株Novagenへ形質転換した。発現は、次の修飾を加えながら、本質的には報告された要領BlouseGEPerronMJThompsonJHDayDELinkCAおよびShoreJDBiochemistry411199712009で実施された。3時間30°Cで、02グルコース、100μg/mLのカルベニシリンおよび10μg/mLのクロラムフェニコールCmを補った2XYT培地中において誘導を実施した。次いで、6xHis-PAI-1の活性画分を、報告された要領BlouseGEPerronMJKvassmanJOYunusSThompsonJHBettsRLLutterLCおよびShoreJDBiochemistry421226012272KvassmanJOおよびShoreJDFibrinolysis9215221で細胞ライゼートから精製した。ジスルフィド開裂性試薬EZLinkNHS-SS-PEO4-ビオチンPIERCE、ロックフォード、イリノイ、21442を用いて、6xHis-PAI-1変異型をN-末端のところで優先的にビオチニル化した。氷上4°Cで4時間、50mMのNaPi/300mMのNaCl/1mMのEDTAを含む緩衝液中pH62で実施した。DMSOに溶かした5倍モル過剰のビオチニル化試薬を加えることにより、反応を開始させた。反応物中のDMSOの最終濃度を1未満に維持した。05Mのトリス/10のNaCl/10mMのEDTA、pH74を加えて20mMの最終トリス濃度にすることにより、ビオチニル化反応をクエンチングした。過剰のビオチニル化試薬を、50mMのNaPi/300mMのNaCl/1mMのEDTA、pH62を含む貯蔵緩衝液に対する十分な透析により除去した。生成した溶液におけるPAI-1の濃度を、093mLmg1-cm-1の吸光係数を用いて確認したKvassmanJOおよびShoreJDFibrinolysis9215221参照。供給者が明記した条件にしたがって、EZ-QuantHABA/アビジンキットPIERCE、ロックフォード、イリノイ、28005を用いてビオチニル化の範囲を測定したところ、典型的にはPAI-1変異型1モルあたり10~12モルのビオチンであった。B.PAIのインビボビオチニル化:BRS-TEV-OptiPAI-1stabのインビボビオチニル化:この実施例では、PAIのインビボビオチニル化に使用した方法について記載する。この実施例では、ベイト分子をコード化する遺伝子に適切な認識配列を組み込むことにより、ベイトのビオチン標識を、精製ベイトによりインビトロで実施するのではなく成長中の細胞で達成することができた。N150H、K154T、Q319LおよびM354I突然変異を有する、安定したPAI-1タンパク質PAI-1stab、配列番号567に示したアミノ酸残基配列を有するをコード化する遺伝子についてBerkenpasMBLawrenceDAおよびGinsburgDEMBOJ1429692977、大腸菌Ecoliコドンを最適化する形で、次の領域を次の順序で含むように設計した:1開始コドン、2ビオチン認識配列BRS、3タバコエッチウイルスプロテアーゼ配列TEV4PAIコーディング配列、5停止コドン。この合成PAI-1stab遺伝子を、XbaIおよびHindIII制限酵素を用いて市販の発現ベクターpET21-aマディソン、ウィスコンシン配列番号566へクローン化することにより、T7発現系を用いて最適化PAI-1OptiPAI-1;配列番号621に示したアミノ酸配列によりコード化される;この場合、アミノ酸残基3~17位および20~26位はそれぞれBRSおよびTEV部位に対応するで発現されるプラスミドpCAT0002配列番号619を得た。次いで、プラスミドpCAT0002を、大腸菌Ecoliビオチンリガーゼ、BirAを過剰発現するプラスミドpBirAAsaietalJBiolChem2742007920078に記載をもつ大腸菌EcoliBL21-GoldDE3形質転換能細胞Stratagene、サンディエゴ、カリフォルニアへ共形質転換した。100μg/mLのカルベニシリンおよび10μg/mLのクロラムフェニコールCmを補ったルリア-ベルターニLB寒天プレートで形質転換体を選択した。BRS-TEV-OptiPAI-1stab配列番号621およびその反応性中心ループの発現を、次の修正を加えながらも本質的には報告された要領BlouseGEPerronMJThompsonJHDayDELinkCAおよびShoreJDBiochemistry411199712009で実施した。3時間30°Cで、02グルコース、100μg/mLのカルベニシリンおよび10μg/mLのクロラムフェニコールCmを補った2XYT培地中において、01mMのIPTGおよび01mMのD-ビオチンを加えることにより誘導を開始させた。それに続いて、BRS-TEV-OptiPAI-1stabの活性画分を、報告された要領BlouseGEPerronMJKvassmanJOYunusSThompsonJHBettsRLLutterLCおよびShoreJDBiochemistry421226012272およびKvassmanJOおよびShoreJDFibrinolysis9215221参照で、または供給者が明記した条件にしたがって単量体アビジンPIERCE、ロックフォード、イリノイ、20227でのクロマトグラフィーによる選択により、次の修正を加えながら細胞ライゼートから精製した。結合緩衝液は、50mMのトリス/100mMのNaCl/1mMのEDTA/001トゥイーン-80を含み、pHは74であった。使用した競合的溶離緩衝液は、この結合緩衝液に加えて2mMのD-ビオチンを含んでいた。競合的溶離段階からのビオチンを、50mMのNaPi/300mMのNaCl/1mMのEDTA、pH62を含む貯蔵緩衝液に対する十分な透析により除去した。PAI-1濃度を、報告された要領で093mLmg1-cm-1の吸光係数を用いて確認したKvassmanJOおよびShoreJDFibrinolysis9215221。C.V1COptiPAI-1stabのインビトロビオチニル化この実施例は、PAI変異型のN-末端ビオチニル化方法を示す。この実施例に記載した方法を実施して、PAIベイト分子をコード化する遺伝子に適切な反応基を組み込むことにより、タンパク質の精製後にビオチンによるベイトの標識が達成され得、ベイトが位置特異的に標識され得る。この実施例において、天然PAIはシステイン残基を含まないため、PAI遺伝子をコード化するDNAにシステインコドンを付加することにより、Cys含有PAIを作製し、次いでこれをCys反応性ビオチニル化試薬と反応させ得た。上記プラスミドpCAT0002におけるOptiPAI-1のN-末端BRS-TEV配列を、供給者の仕様書に従って、QuikChangeXL突然変異導入キットStratagene、サンディエゴ、カリフォルニアを用いてV1C突然変異を同時導入することにより欠失させ、V1COptiPAI-1stabタンパク質配列番号622を発現するプラスミドpCAT0051配列番号623を得た。プラスミドpCAT0051を大腸菌EcoliBL21DE3pLysS形質転換能細胞Stratagene、サンディエゴ、カリフォルニアへ形質転換した。100μg/mLのカルベニシリンおよび10μg/mLのクロラムフェニコールCmを補ったルリア-ベルターニLB寒天プレートで形質転換体を選択した。V1C-OptiPAI-1stabタンパク質およびその反応性中心ループの発現を、次の修正を加えながらも本質的には報告された要領BlouseGEPerronMJThompsonJHDayDELinkCAおよびShoreJDBiochemistry411199712009で実施した。3時間30°Cで、02グルコース、100μg/mLのカルベニシリンおよび10μg/mLのクロラムフェニコールを補った2XYT培地中において、01mMのIPTGを加えることにより誘導を開始させた。V1COptiPAI-1stabまたはその変異型の活性画分を、報告された要領BlouseGEPerronMJKvassmanJOYunusSThompsonJHBettsRLLutterLCおよびShoreJDBiochemistry421226012272およびKvassmanJOおよびShoreJDFibrinolysis9215221で細胞ライゼートから精製した。チオール反応性および可逆性ビオチニル化試薬、EZ-Linkビオチン-HPDPN-6-ビオチンアミドヘキシル-3-2-ピリジルジチオ-プロピオンアミドPIERCE、ロックフォード、イリノイ、21341を用いることにより、V1COptiPAI-1タンパク質および変異型を、遺伝子操作を加えたN-末端システイン残基のところでビオチニル化した。供給者の仕様書に従って次の要領で若干の修正を加えながらビオチンのコンジュゲーションを達成した。ビオチン-HPDPの保存溶液を、無水DMF93mM中5mg/mLで調製した。V1C-OptiPAI-1stabをG-25ゲル濾過カラムで迅速に脱塩し、50mMのNaPi/150mMのNaCl/1mMのEDTA/001トゥイーン-80、pH74を含むコンジュゲーション緩衝液中へ溶離した。10倍モル過剰のビオチン-HPDP保存液を加えることにより、ビオチニル化反応を開始させた。ジメチルホルムアミドDMFの最終濃度を2~3未満に維持した。反応を25°Cで4時間実施し、343nmでのピリジン-2-チオン脱離基の放出を用いて反応の進行を追跡した。過剰のビオチニル化試薬を、50mMのNaPi/300mMのNaCl/1mMのEDTA、pH62を含む貯蔵緩衝液に対する十分な透析により除去した。PAI-1濃度を、報告された要領で093mLmg1-cm-1の吸光係数を用いて確認したKvassmanJOおよびShoreJDFibrinolysis9215221。EZ-QuantHABA/アビジンキットおよびピリジン-2-チオンの放出PIERCE、ロックフォード、イリノイ、28005を用いたところ、ビオチニル化の範囲は、典型的にはPAI-1変異型1モルあたり10~12モルであった。実施例17大腸菌Ecoli培養物上清およびペリプラズム抽出物からのMT-SP1変異型のスクリーニングこの実施例では、大腸菌Ecoli周辺腔からのタンパク質または大腸菌Ecoli細胞培養培地からのタンパク質を検定することによりファージでのMT-SP1変異型の活性をスクリーニングするための別法として使用される2方法について記載する。両方法について、1mL培養物を次の要領で調製した。100μg/mLのカルベニシリンおよび12μg/mLのテトラサイクリンを補った2YT培地1mLを、96ウェル深型ウェルプレートの各ウェルに分配し、96ウェルマスタープレートからの上記実施例14記載の要領で一晩MT-SP1プロテアーゼドメイン担持ファージで感染させておいたXL-1Blue細胞10μLを接種した。深型ウェルプレートを空気透過性膜で密閉し、細胞密度が04~06OD600に達するまで通常4~5時間の振とう、酸素曝気しながら37°C、400rpmで振とうするHiGroシェーカーインキュベーター中に置いた。その時点で、IPTGを加えて05mMの最終濃度とし、振とうしながら一晩増殖を続行させた。翌日、プレートを20分間3600rpmでの遠心分離にかけて細胞を沈降させた。A.ペリプラズム調製物からのMT-SP1変異型のスクリーニングこの実施例での方法を用いることにより、大腸菌Ecoli周辺腔中へ輸送しておいた、完全長MT-SP1-遺伝子III融合タンパク質、および融合タンパク質の酵素活性開裂産物を検定した。3600rpmで遠心分離後、培養上清を廃棄し、細胞ペレットを用いることにより、次の条件のいずれかを用いてペリプラズムタンパク質を放出させた:条件1:細胞ペレットを150μLの冷リン酸緩衝食塩水PBSに再懸濁し、懸濁液を96ウェルPCRプレートに移し、次いで1段階冷凍解凍処理-80°Cで20分/室温水浴で10分を行った:または条件2:細胞ペレットを150μLの3BugBusterタンパク質抽出試薬Novagenに再懸濁し、懸濁液を96ウェルPCRプレートに移し、懸濁液を室温で30分間インキュベーションした。次に、細胞懸濁液を4°Cで20分間、3600rpmでの遠心分離にかけ、ペレットを乱すことなく、ペリプラズムタンパク質を含む上清を注意深く除去した。さらに、ペリプラズム抽出物を用いることにより、実施例10B項記載の要領で適切な基質を用いてMT-SP1変異型の酵素活性を測定した。B.上清調製物からのMT-SP1変異型のスクリーニングこの実施例での方法を用いることにより、ペリプラズムから細菌細胞培養培地へ拡散させておいた、完全長MT-SP1-遺伝子III融合タンパク質、および融合タンパク質の酵素活性フラグメントを検定した。この実施例では、1mL培養物中で遠心分離後、培養上清10μLを除去し、さらに25μLの検定緩衝液を反応に加えること以外は、実施例10、B項記載のプロテアーゼ検定法を用いて検定した。当業者であれば、修正については容易に想到できるはずであるため、本発明は、添付の請求の範囲でのみ制限されるものとする。"