"1つ以上のN-グリカン構造を含む単離ヒト組換えリソソーム酸リパーゼLALを含む、組成物。前記LALが実質的に配列番号2のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の組成物。前記LALが配列番号2で記載されるアミノ酸配列からなる、請求項2に記載の組成物。前記LALが、配列番号2のAsn15、Asn51、Asn80、Asn140、Asn252およびAsn300からなる群より選択される少なくとも1つの位置においてN-結合グリコシル化されている、請求項3に記載の組成物。前記LALが、配列番号2のAsn15、Asn80、Asn140、Asn252およびAsn300においてN-グリコシル化されている、請求項4に記載の組成物。前記LALが、リン酸化マンノースを含むN-グリカン構造を配列番号2のAsn80、Asn140またはAsn252において含む、請求項5に記載の組成物。前記LALが、リン酸化マンノースを含むN-グリカン構造をAsn80において含む、請求項5に記載の組成物。Asn80に関連したN-グリカン構造の少なくとも30がリン酸化マンノースを有する、請求項5に記載の組成物。Asn80に関連したN-グリカン構造の少なくとも50がリン酸化マンノースを有する、請求項5に記載の組成物。前記LALが、二リン酸化マンノースを含むN-グリカン構造をAsn80において含む、請求項5に記載の組成物。Asn80に関連したN-グリカン構造の少なくとも50が二リン酸化マンノースを含む、請求項5に記載の組成物。前記LALが、リン酸化マンノースM6Pを含むN-グリカン構造をAsn140において含む、請求項5に記載の組成物。Asn140に関連したN-グリカン構造の約10~約50がM6Pを含む、請求項5に記載の組成物。前記LALが、リン酸化マンノースM6Pを含むN-グリカン構造をAsn252において含む、請求項5に記載の組成物。Asn252におけるN-グリカン構造の少なくとも50がM6Pを含む、請求項14に記載の組成物。前記LALが、高マンノース基を含むN-グリカン構造をAsn80またはAsn252において含む、請求項5に記載の組成物。前記高マンノース基が6、7、8、9または10個のマンノースを含む、請求項16に記載の組成物。前記高マンノース基が7、8または9個のマンノースを含む、請求項17に記載の組成物。前記LALが、7、8または9個のマンノースを含むN-グリカン構造をAsn80において含む、請求項18に記載の組成物。Asn80におけるN-グリカン構造の少なくとも80が7、8または9個のマンノースを含む、請求項18に記載の組成物。前記LALが、7、8または9個のマンノースを含むN-グリカン構造をAsn252において含む、請求項18に記載の組成物。Asn252におけるN-グリカン構造の少なくとも70が7、8または9個のマンノースを含む、請求項18に記載の組成物。前記LALが、末端ガラクトースを含むN-グリカン構造をAsn15、Asn140またはAsn300において含む、請求項5に記載の組成物。Asn15に関連したN-グリカン構造の約2~約10が末端ガラクトースを含む、請求項5に記載の組成物。Asn140に関連したN-グリカン構造の5未満が末端ガラクトースを含む、請求項5に記載の組成物。Asn300に関連したN-グリカン構造の100未満が末端ガラクトースを含む、請求項5に記載の組成物。前記LALのAsn51が非グリコシル化または実質的に非グリコシル化である、請求項5に記載の組成物。前記LALが、キシロースを有さないN-グリカン構造を含み、かつ前記N-グリカン構造の15未満がシアル酸を含む、請求項1に記載の組成物。前記LALが、キシロースを有さないN-グリカン構造を含み、かつ前記N-グリカン構造の10未満がシアル酸を含む、請求項1に記載の組成物。前記LALが、キシロースを有さないN-グリカン構造を含み、かつ前記N-グリカン構造の5未満がシアル酸を含む、請求項1に記載の組成物。前記LALが、キシロースを有さないN-グリカン構造を含み、かつ前記N-グリカン構造の1未満がシアル酸を含む、請求項1に記載の組成物。前記LALが、シアル酸およびキシロースを実質的に含まない、請求項1に記載の組成物。前記LALがN-グリカン構造を含み、前記N-グリカン構造の50未満、40未満、30未満、20未満、10未満、5未満または1未満がフコースを含む、請求項1に記載の組成物。前記LALがフコースを含まない、請求項1に記載の組成物。前記LALがN-グリカン構造を含み、前記N-グリカン構造の少なくとも30、50、60、70、80、90および95がリン酸化マンノースM6Pを含む、請求項1に記載の組成物。前記LALがN-グリカン構造を含み、前記N-グリカン構造の少なくとも90がリン酸化マンノースM6Pを含む、請求項1に記載の組成物。前記LALが、以下のN-結合グリコシル化プロファイルを含む、請求項5に記載の組成物:gAsn15において、GlcNAc4Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc4Man3GlcNAc2;hAsn80において、Phos2Man7GlcNAc2;i140において、Phos1Man6GlcNAc2、GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc4Man3GlcNAc2;jAsn252において、Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2、Phos1Man8GlcNAc2またはPhos1Man9GlcNAc2;およびkAsn300において、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2、GlcNAc5Man3GlcNAc2、Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2、GlcNAc6Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc6Man3GlcNAc2式中、Man=マンノース、GlcNAc=N-アセチルグルコサミン、Phos=リン酸、Gal=ガラクトースである。前記LALが、配列番号2のAsn15、Asn51、Asn80、Asn140、Asn252およびAsn300においてN-結合グリコシル化されている、請求項1に記載の組成物。前記LALが、以下の構造から選択されるN-グリカンを含む、請求項1に記載の組成物:式中、四角=N-アセチルグルコサミン黒四角=マンノース-6-リン酸丸=マンノース黒丸=ガラクトース黒三角=フコースである。前記LALが生殖系列トランスジェニックトリにおいて産生される、請求項39に記載の組成物。前記LALが前記生殖系列トランスジェニックトリの輸卵管細胞から産生される、請求項40に記載の組成物。前記オリゴ糖構造がトリ由来である、請求項1に記載の組成物。前記トリがニワトリである、請求項42に記載の組成物。組換えヒトリソソーム酸リパーゼLALの混合物を含み、前記混合物が、配列番号2、配列番号3、配列番号4および配列番号19からなる群より選択される少なくとも2つのヒトLALを含む、組成物。前記ヒトLALの混合物が、以下の構造から選択されるN-グリカンを含む、請求項44に記載の組成物:式中、四角=N-アセチルグルコサミン黒四角=マンノース-6-リン酸丸=マンノース黒丸=ガラクトース黒三角=フコースである。前記LALが、以下のN-結合グリコシル化プロファイルを含む、請求項44に記載の組成物:a配列番号2、3、4および19のそれぞれAsn15、Asn13、Asn10およびAsn9において、GlcNAc4Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc4Man3GlcNAc2;b配列番号2、3、4および19のそれぞれAsn80、Asn78、Asn75およびAsn74において、Phos2Man7GlcNAc2;c配列番号2、3、4および19のそれぞれAsn140、Asn138、Asn135およびAsn134において、Phos1Man6GlcNAc2、GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2GlcNAc3Man3GlcNAc2GlcNAc4Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc4Man3GlcNAc2;d配列番号2、3、4および19のそれぞれAsn252、Asn250、Asn247およびAsn246において、Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2、Phos1Man8GlcNAc2またはPhos1Man9GlcNAc2;およびe配列番号2、3、4および19のそれぞれAsn300、Asn298、Asn295およびAsn294において、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2、GlcNAc5Man3GlcNAc2、Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2、GlcNAc6Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc6Man3GlcNAc2。単離リソソーム酸リパーゼLAL分子を含み、前記LALが、トランスジェニックニワトリの輸卵管細胞内で産生され、前記LALをコードする導入遺伝子を含む前記トランスジェニックニワトリの卵白から単離される、組成物。前記LALがヒトLALである、請求項47に記載の組成物。前記輸卵管細胞が管状腺細胞である、請求項48に記載の組成物。前記単離ヒトLALがニワトリ由来のグリコシル化パターンを含む、請求項49に記載の組成物。LAL欠損症に関連した状態に罹患している患者を治療する方法であって、組換えヒトLALを含む組成物の治療有効量を前記患者に投与することを含む方法。前記組換えヒトLALが請求項1~33のいずれか1項に記載の組成物である、請求項51に記載の方法。前記状態がコレステリルエステル蓄積症CESDである、請求項51に記載の方法。前記状態がウォルマン病である、請求項51に記載の方法。前記患者に約0.35mg/kg~約5.0mg/kgの間の前記LAL組成物を投与する、請求項51に記載の方法。前記患者に約0.35mg/kg~約3.0mg/kgの間の前記LAL組成物を投与する、請求項51に記載の方法。前記患者に7日に1回~45日に1回投与する、請求項51に記載の方法。前記患者に、3日に1回、5日に1回、1週間に1回、2週間に1回、20日に1回、28日に1回、30日に1回または1か月に1回投与する、請求項51に記載の方法。前記患者に約1.0mg/kg~3.0mg/kgの間の有効量を隔週で投与する、請求項51に記載の方法。グリコシル化ヒトリソソーム酸リパーゼLALを作製する方法であって、プロモーターと作動可能に連結されたヒトLALをコードする導入遺伝子を含み、かつ輸卵管細胞内で前記ヒトLALを発現する生殖系列トランスジェニックトリを作製し、前記LALが、前記輸卵管細胞内でグリコシル化され、前記トランスジェニックトリが産む硬殻卵内に蓄積される、方法。グリコシル化ヒトリソソーム酸リパーゼLALを産生する、トランスジェニックトリ。請求項61に記載のトランスジェニックトリが産む卵。請求項61に記載のトランスジェニックトリにより産生されたヒトLALを含有する、卵白。請求項1に記載のヒト組換えリソソーム酸リパーゼをコードする核酸配列を担持する、ベクター。請求項64に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。LAL欠損症に関連した状態に罹患している患者を治療する方法であって、組換えヒトLALを含む組成物の治療有効量を前記患者に投与することと、第二の治療剤を前記患者に投与することとを含む、方法。前記第二の治療剤が、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群より選択されるコレステロール低化剤である、請求項66に記載の方法。前記第二の治療剤が免疫抑制剤である、請求項66に記載の方法。請求項1に記載の組成物を薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤とともに含む、医薬製剤。クエン酸三ナトリウム脱水和物、クエン酸およびヒト血清アルブミンからなる群より選択される少なくとも1つの薬剤を含む、請求項69に記載の医薬製剤。pHが約5.6~約6.2の間に維持された水溶液で提供される、請求項69に記載の医薬製剤。pHが5.7~6.1の間に維持されている、請求項71に記載の医薬製剤。例えばLAL欠損症に関連する状態を治療する治療法での使用に特に適した、LALの組成物が本明細書に開示される。本明細書に記載のLAL分子は、対象、例えばヒト対象に投与した場合に細胞のリソソーム内への効率的かつ迅速な取り込みを生じる、特定のグリカン構造を含む。一態様では、本明細書に開示される組成物はヒトLALを含み、かなりの割合のヒトLALが、例えば肝細胞上に見られる細胞表面上のマンノース-6-リン酸受容体による内部移行のためのリガンドとして働き得る、少なくとも1つのマンノース-6-リン酸グリカン部分を含む。一実施形態では、組成物中に含まれるLALの30以上、例えば、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97または少なくとも99が、少なくとも1つのマンノース-6-リン酸部分を含む。マンノース-6-リン酸部分は、例えば、配列番号2のAsn15、Asn51、Asn80、Asn140、Asn252およびAsn300からなる群より選択される1つ以上の残基に位置するN-グリカン構造上に見ることができる。別の態様では、本明細書に開示される組成物はヒトLALを含み、かなりの割合のヒトLALが、そのN-グリカン構造のいずれにも、細胞内への酵素の内部移行に干渉し得るシアル酸部分を含まない。一実施形態では、組成物中のLALの15以下、例えば、10以下、5以下、2以下、1以下がそのN-グリカン構造にシアル酸部分を含むか、または実質的にすべてのLALがシアル酸部分を含まない。別の態様では、本明細書に開示される組成物はヒトLALを含み、かなりの割合のヒトLALが、そのN-グリカン構造のいずれにもフコース部分を含まない。一実施形態では、組成物中に含まれるLALの50以下、例えば、50以下、40以下、30以下、20以下、10以下、5以下、2以下、1以下がそのN-グリカン構造にフコース部分を含むか、または実質的にすべてのLALがフコース部分を含まない。さらに別の態様では、LAL含有組成物を産生するのに適したベクター、宿主細胞、発現系および関連する方法が記載される。一般に、本明細書で述べられ開示される本発明のLALはヒトLALである。一実施形態では、LALを含む組成物は以下のアミノ酸配列を有する成熟LALを含む:SGGKLTAVDPETNMNVSEIISYWGFPSEEYLVETEDGYILCLNRIPHGRKNHSDKGPKPWFLQHGLLADSSNWVTNLANSSLGFILADAGFDVWMGNSRGNTWSRKHKTLSVSQDEFWAFSYDEMAKYDLPASINFILNKTGQEQVYYVGHSQGTTIGFIAFSQIPELAKRIKMFFALGPVASVAFCTSPMAKLGRLPDHLIKDLFGDKEFLPQSAFLKWLGTHVCTHVILKELCGNLCFLLCGFNERNLNMSRVDVYTTHSPAGTSVQNMLHWSQAVKFQKFQAFDWGSSAKNYFHYNQSYPPTYNVKDMLVPTAVWSGGHDWLADVYDVNILLTQINLVFHESIPEWEHLDFIWGLDAPWRLYNKIINLMRKYQ配列番号2。別の実施形態では、成熟LALは以下のアミノ酸配列を有する:GKLTAVDPETNMNVSEIISYWGFPSEEYLVETEDGYILCLNRIPHGRKNHSDKGPKPWFLQHGLLADSSNWVTNLANSSLGFILADAGFDVWMGNSRGNTWSRKHKTLSVSQDEFWAFSYDEMAKYDLPASINFILNKTGQEQVYYVGHSQGTTIGFIAFSQIPELAKRIKMFFALGPVASVAFCTSPMAKLGRLPDHLIKDLFGDKEFLPQSAFLKWLGTHVCTHVILKELCGNLCFLLCGFNERNLNMSRVDVYTTHSPAGTSVQNMLHWSQAVKFQKFQAFDWGSSAKNYFHYNQSYPPTYNVKDMLVPTAVWSGGHDWLADVYDVNILLTQINLVFHESIPEWEHLDFIWGLDAPWRLYNKIINLMRKYQ配列番号3。別の実施形態では、成熟LALは以下のアミノ酸配列を有する:TAVDPETNMNVSEIISYWGFPSEEYLVETEDGYILCLNRIPHGRKNHSDKGPKPWFLQHGLLADSSNWVTNLANSSLGFILADAGFDVWMGNSRGNTWSRKHKTLSVSQDEFWAFSYDEMAKYDLPASINFILNKTGQEQVYYVGHSQGTTIGFIAFSQIPELAKRIKMFFALGPVASVAFCTSPMAKLGRLPDHLIKDLFGDKEFLPQSAFLKWLGTHVCTHVILKELCGNLCFLLCGFNERNLNMSRVDVYTTHSPAGTSVQNMLHWSQAVKFQKFQAFDWGSSAKNYFHYNQSYPPTYNVKDMLVPTAVWSGGHDWLADVYDVNILLTQITNLVFHESIPEWEHLDFIWGLDAPWRLYNKIINLMRKYQ配列番号4。別の実施形態では、成熟LALは以下のアミノ酸配列を有する:AVDPETNMNVSEIISYWGFPSEEYLVETEDGYILCLNRIPHGRKNHSDKGPKPWFLQHGLLADSSNWVTNLANSSLGFILADAGFDVWMGNSRGNTWSRKHKTLSVSQDEFWAFSYDEMAKYDLPASINFILNKTGQEQVYYVGHSQGTTIGFIAFSQIPELAKRIKMFFALGPVASVAFCTSPMAKLGRLPDHLIKDLFGDKEFLPQSAFLKWLGTHVCTHVILKELCGNLCFLLCGFNERNLNMSRVDVYTTHSPAGTSVQNMLHWSQAVKFQKFQAFDWGSSAKNYFHYNQSYPPTYNVKDMLVPTAVWSGGHDWLADVYDVNILLTQITNLVFHESIPEWEHLDFIWGLDAPWRLYNKIINLMRKYQ配列番号19。別の実施形態では、成熟LALは、配列番号2、配列番号3、配列番号4および配列番号19からなる群より選択される少なくとも2つのポリペプチドの混合物である。また本発明は、本明細書に開示されるタンパク質のような個々の種類の有用なタンパク質分子の、単離された混合物を含有する組成物を提供し、混合物中に含有される1つ以上のタンパク質分子には、特定のオリゴ糖構造、具体的には本明細書に開示されるオリゴ糖構造が結合している。例えば、本発明は、1つ以上の以下の構造A-n~O-nによりグリコシル化されたLAL分子を含有するLAL分子、例えばヒトLAL分子の単離された混合物を提供する:四角=N-アセチルグルコサミン黒四角=マンノース-6-リン酸○=マンノース黒丸=ガラクトース黒三角=フコース。本発明の一態様では、組成物は任意の単離された個々の上記ポリペプチドまたは上記ポリペプチドの組合せを含む。一実施形態では、組成物は医薬組成物、例えば、組成物が、例えば対象例えばヒト、特に、ある状態に罹患しているまたは状態を有すると診断された患者への投与に適するように、薬学的に許容される担体をさらに含む製剤であり得る。組成物は、静脈内投与を含めた様々な方法で投与することができる。別の実施形態では、組成物は第二の薬剤をさらに含むことができる。このような薬剤は、薬物、または対象に投与されたときに生物学的過程に影響を与え得るもしくはそれを調節し得る薬剤であり得る。例えば、第二の薬剤は免疫調節剤であり得る。このような免疫調節剤としては、本明細書に記載の任意のLAL組成物とともに投与された場合すなわち、同時に、または直前もしくは直後に投与された場合に、対象におけるLAL組成物の免疫原性を低減する作用を有し得る任意の薬剤例えば、リツキシマブ、または他の任意のB細胞枯渇抗体を挙げることができる。最後の態様では、LAL欠損症に関連した症状を治療する方法および組成物が開示される。以下の詳細な記載を添付の図面および配列と合わせて再考すれば、本発明のさらなる目的および態様がより明らかになるであろう。定義本明細書において本発明を記載するのに使用される各種用語の意味および範囲を説明および定義するために、ある特定の定義を本明細書にここに記載する。本明細書で使用される製剤、組成物または成分に関する許容されるという用語は、本明細書で使用される場合、治療される対象の全般的健康状態に対して持続的な有害作用を有さないことを意味する。本明細書で使用される投与という用語は、治療を必要とする対象に本発明の組換えヒトリソソーム酸リパーゼを与えることを指す。核酸またはポリヌクレオチド配列は、特に限定されないが、天然のヌクレオシド塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む、真核mRNA、cDNA、ゲノムDNAならびに合成DNAおよびRNA配列を包含する。またこの用語は、1つ以上の修飾塩基を有する配列も包含する。本明細書で使用されるトリという用語は、分類学上のava綱の生物であるあらゆる種、亜種または品種、例えば、特に限定されないがニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ならびにダチョウ、エミューおよびヒクイドリを含めた走禽類などを指す。この用語は、ニワトリGal1usGal1us例えば、白色レグホン、褐色レグホン、横斑ロックBarred-Rock、サセックスSussex、ニューハンプシャーNewHampshire、ロードアイランドRhodeIsland、オーストラロープAustralorp、ミノルカMinorca、アムロックスAmrox、カリフォルニアグレイCaliforniaGray、ならびにシチメンチョウ、キジ、ウズラ、アヒル、ダチョウおよび商業量で一般的に飼育されているその他の家禽の種々の既知の系統を包含する。また、胚および胎仔の段階を含めたすべての発生段階の個々のトリ生物体もこの用語に包含される。治療用タンパク質または医薬タンパク質は、薬物の全体または一部を占めるアミノ酸配列を包含する。コード配列またはオープンリーディングフレームは、適当な調節配列の制御下に置かれた場合に、invitroまたはinvivoで転写されてポリペプチドへ翻訳され得るDNAの場合か、またはポリペプチドへ翻訳され得るmRNAの場合ポリヌクレオチド配列または核酸配列を指す。コード配列の境界は、5’アミノ末端の翻訳開始コドンおよび3’カルボキシ末端の翻訳停止コドンにより定められる。転写終止配列は通常、コード配列の3’側に位置する。コード配列の5’末端および/または3’末端には非翻訳領域が隣接し得る。エクソンは、核転写物へ転写される際に、核スプライシングによるイントロンまたは介在配列の除去後に細胞質mRNA中に発現される遺伝子の部分を指す。核酸制御配列または調節配列は、定められた宿主細胞内の所与のコード配列の転写および翻訳に必要かつ十分なプロモーター配列、翻訳開始および停止コドン、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどを指す。真核細胞に適した制御配列の例は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーである。所望の遺伝子の転写および翻訳に必要かつ十分な制御配列が存在する限り、組換えベクター中にこれらの制御配列がすべて存在しなければならないわけではない。作動可能に連結されているは、所望の機能が遂行されるようにコード配列と制御配列が配置されていることを指す。したがって、コード配列と作動可能に連結されている制御配列は、コード配列の発現をもたらすことができる。DNAポリメラーゼがプロモーター配列と結合して、コードタンパク質に翻訳可能なmRNAへコード配列を転写すれば、そのコード配列は細胞内で転写調節領域と作動可能に連結されている、またはその制御下にあることになる。制御配列がコード配列の発現を指令するように機能する限り、制御配列がコード配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、翻訳されていないが転写されている介在配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在していてもよく、それでもプロモーター配列はコード配列と作動可能に連結されていると見なすことができる。コード配列および制御配列のような核酸配列に関連した異種性および外来性という用語は、組換え構築物の領域もしくは特定の染色体遺伝子座とは通常関連しない、および/または特定の細胞とは通常関連しない配列を表す。したがって、核酸構築物の外来性領域は、天然では一緒には見られない、別の核酸分子内にあるかまたはそれに結合している、特定可能な核酸のセグメントである。例えば、構築物の外来性領域は、天然ではコード配列と一緒には見られない配列が隣接しているコード配列を含み得る。外因性コード配列のもう1つの例は、コード配列自体が天然に見られない例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列構築物である。同様に、宿主細胞内に通常存在しない構築物または核酸により形質転換された宿主細胞は、本発明の目的のために外来性と見なされる。本明細書で使用されるN-グリカン、オリゴ糖、オリゴ糖構造、グリコシル化パターン、グリコシル化プロファイルおよびグリコシル化構造という用語は実質的に同義であり、それぞれ糖残基から形成されグリコシル化タンパク質と結合している1つ以上の構造を指す。本明細書で使用される外来性タンパク質は、特定の組織もしくは細胞中に天然には存在しないタンパク質、外来性発現構築物もしくは導入遺伝子の発現産物であるタンパク質、または特定の組織もしくは細胞中に所与の量で天然には存在しないタンパク質を指す。卵に対して外来性のタンパク質とは、卵中には通常見られないタンパク質のことである。例えば、卵に対して外来性のタンパク質は、その卵を産む動物の導入遺伝子中に存在するコード配列の発現の結果として卵中に存在するタンパク質であり得る。内因性遺伝子は、特定の細胞に通常関連する天然の遺伝子またはそのフラグメントを指す。LALは、ヒトリソソーム酸リパーゼ、SBC-102またはヒトリソソーム酸リパーゼ分子を意味し、これらの用語は本明細書全体を通して互換的に使用される。本明細書に記載の発現産物は、定められた化学構造を有するタンパク質性物質から構成され得る。しかし、詳細な構造は多数の因子、特にタンパク質に共通の化学修飾によって決まる。例えば、すべてのタンパク質はイオン化可能なアミノ基とカルボキシル基とを含んでいるため、タンパク質は酸性または塩基性の塩形態または中性形態をとり得る。一次アミノ酸配列は、糖分子を用いてグリコシル化、または多くの場合は糖類との結合により生じる、例えば脂質、リン酸、アセチル基などとの共有結合もしくはイオン結合を含む他の化学的誘導体化により、誘導体化され得る。これらの修飾はinvitroまたはinvivoで生じ得るが、後者は宿主細胞により翻訳後プロセシング系を通して行われる。このような修飾は分子の生物学的活性を増加または減少させる場合があり、このような化学修飾された分子も本発明の範囲内にあるものとする。クローニング、増幅、発現および精製の代替方法が当業者には明らかであろう。Sambrook,FritschおよびManiatis,MolecularCloning,aLaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratory1989に代表的な方法が開示されている。ベクターは、一本鎖の、二本鎖の、環状の、またはスーパーコイル化されたDNAまたはRNAで構成されるポリヌクレオチドを意味する。典型的なベクターは、機能的な遺伝子発現を可能にする適切な距離で作動可能に連結された以下の要素で構成され得る:複製起点、プロモーター、エンハンサー、5’mRNAリーダー配列、リボソーム結合部位、核酸カセット、終止およびポリアデニル化部位、ならびに選択マーカー配列。特定の用途では上記要素の1つ以上がなくてもよい。核酸カセットは、発現される核酸配列を挿入するための制限部位を含み得る。機能性ベクターでは、核酸カセットは、翻訳開始および終止部位を有する、発現される核酸配列を含む。任意に構築物中に、例えばコード配列の5’側にイントロンが含まれていてもよい。特定のコード配列が適当な調節配列とともにベクター中に配置され、コード配列が制御配列に対して、制御または調節配列の制御下でコード配列が転写される位置および方向であるようにベクターを構築する。このような結果を得るために、特定の目的タンパク質をコードする配列を改変することが望ましい場合がある。例えばいくつかの場合には、適当な方向で制御配列と結合し得るように配列を改変すること、またはリーディングフレームを維持することが必要な場合がある。ベクターに挿入する前に、制御配列および他の調節配列をコード配列と連結させてもよい。あるいは、制御配列と、制御配列を有しその調節制御下にあるリーディングフレーム内にある適当な制限部位とを既に含んでいる発現ベクター中に、コード配列を直接クローニングしてもよい。プロモーターとは、RNAポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始する、DNA上の部位のことである。いくつかの実施形態では、プロモーターを、配列の付加もしくは削除により改変するか、または天然配列および合成配列ならびに合成配列と天然配列の組合せであり得る配列を含めた別の配列に置き換えることができる。多くの真核プロモーターは2種類の認識配列、すなわちTATAボックスおよび上流プロモーター要素を含んでいる。前者は転写開始部位の上流に位置し、RNAポリメラーゼが正確な部位で転写を開始するよう指令することに関与し、後者は転写速度を決定すると考えられ、TATAボックスの上流にある。またエンハンサー要素も、連結したプロモーターからの転写を刺激し得るが、多くのものは特定の細胞型においてのみ機能する。多くのウイルス由来のエンハンサー/プロモーター要素、例えば、SV40プロモーター、サイトメガロウイルスCMVプロモーター、ラウス肉腫ウイルスRSVプロモーターおよびマウス白血病ウイルスMLVプロモーターはすべて広範な細胞型において活性であり、偏在すると呼ばれる。あるいは、マウス乳腺腫瘍ウイルスMMTVプロモーターのような非構成的プロモーターも本発明で使用し得る。クローニング部位に挿入された核酸配列は目的ポリペプチドをコードする任意のオープンリーディングフレームを有し得るが、ただしコード配列が目的ポリペプチドをコードする場合、それは適切なmRNA分子の産生を阻止し得る、および/または異常にスプライスされたもしくは異常なmRNAを産生し得る、潜在的スプライス部位を欠いているべきである。本明細書で使用される医薬組成物という用語は、本明細書に記載の化合物と、他の化学成分、例えば担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤および/または賦形剤などとの混合物を指す。家禽由来またはトリ由来という用語は、家禽により産生される、または家禽から得られる組成物または物質を指す。家禽は、特に限定されないが、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ウズラおよび走禽類を含めた、家畜として飼育され得るトリを指す。例えば、家禽由来はニワトリ由来、シチメンチョウ由来および/またはウズラ由来を指し得る。レトロウイルス粒子または形質導入粒子は、細胞内に非ウイルスのDNAまたはRNAを形質導入することができる複製欠損型または複製型ウイルスを指す。特に有用な一実施形態では、本発明に従ってトランスジェニックトリを作製するために使用するレトロウイルス粒子を、2009年4月28日に発行された米国特許第7,524,626号に開示されている通りに作製する。前述特許の開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。形質転換、形質導入およびトランスフェクションという用語はいずれも、トリ胚盤葉細胞にポリヌクレオチドを導入することを表す。筒部とは、漏斗と峡部の間にあり、卵の卵白タンパク質を合成および分泌する管状腺細胞を含む、輸卵管の部分のことである。導入遺伝子という用語は、本発明に従ってトリゲノム内に挿入された異種性ヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、外来性コード配列、外来性のプロモーターまたは他の調節配列と連結した外来性コード配列、2つのレトロウイルスLTRの間にあるすべてのヌクレオチド配列および/またはレトロウイルスLTR、ならびに導入遺伝子を導入するために使用されるレトロウイルスのLTRの間にあるヌクレオチド配列を特定的に指すことがある。最適化という用語は最適化コード配列という文脈で使用され、ここでは、卵白タンパク質であるオボアルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンに見られる特定の各アミノ酸に最もよく使用されるコドンが、本発明のベクター内に挿入される最適化ヒトインターフェロン-α2bIFN-α2bポリヌクレオチド配列の設計において使用される。より特定的には、最適化ヒトIFN-α2bのためのDNA配列は、雌ニワトリの輸卵管に最適化されたコドン使用頻度に基づくものであり、ニワトリGal1usGal1usのオボアルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンタンパク質から収集されたコドン使用頻度表によってWisconsinPackage、Version9.1のBACKTRANSLATEプログラムGeneticsComputerGroupInc.、Madison、Wis.用いて作製される。例えば、4つの卵白タンパク質におけるアミノ酸アラニンの4つのコドンの使用割合は、GCUが34、GCCが31、GCAが26およびGCGが8である。したがって、最適化コード配列中の大部分のアラニンのコドンとしてGCUを使用する。ヒトタンパク質を最適化するための遺伝子を含んでいるベクターを用いて、トランスジェニック家禽由来のタンパク質を自らの組織および卵内で発現するトランスジェニックトリを作製する。本明細書で使用される対象という用語は、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、特に限定されないが、ヒト、チンパンジー、無尾猿類、有尾猿類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモットなどが挙げられる。本明細書で使用される治療有効量という用語は、その量を服用していない対応する対照と比べて、疾患、障害もしくは副作用の治療、治癒、予防もしくは軽減の向上、または疾患もしくは障害の進行速度の低減をもたらす、化合物の任意の量を指す。また正常な生理機能を増強するのに有効な量も、この用語の範囲内に包含される。治療する、治療することまたは治療という用語は、予防的および/または治療的に、疾患または状態の症状を緩和、寛解もしくは軽減する、さらなる症状を予防する、症状の根本原因を軽減または予防する、疾患もしくは状態を抑制する、疾患もしくは状態の発達を阻止する、疾患もしくは状態を緩和する、疾患もしくは状態を退縮させる、疾患もしくは状態により引き起こされる状態を緩和する、または疾患もしくは状態の症状を停止させる方法を指す。LAL組成物本発明は概略的には、治療、例えばリソソーム蓄積症の治療に有用な酵素を含む組成物に関する。一態様では、本発明は、分子を特定の細胞型による内部移行を受けやすくするグリコシル化パターンを有するLALのようなリソソーム蓄積症酵素に関する。また、単離または精製形態のLALを含む組換えヒトタンパク質も本発明に含まれる。リソソーム蓄積症酵素LALなどの単離は、タンパク質精製の当業者に容易にわかる方法論により行われ得る。一実施形態では、本発明は、限定されないが、本明細書に記載のN-結合グリコシル化パターンを有する、LALを含めたリソソーム蓄積症酵素に関する。一態様では、本明細書に開示される組成物はヒトLALを含み、かなりの割合のヒトLALが、例えば肝細胞上に見られる細胞表面上のマンノース-6-リン酸受容体による内部移行のためのリガンドとして働き得る、マンノース-6-リン酸グリカン部分を含む。一実施形態では、組成物中に含まれるLALの30以上、例えば、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97または少なくとも99が、少なくとも1つのマンノース-6-リン酸部分を含む。マンノース-6-リン酸部分は、例えば、配列番号2のAsn15、Asn51、Asn80、Asn140、Asn252およびAsn300からなる群より選択される1つ以上の残基に位置するN-グリカン構造上に見ることができる。マンノース-6-リン酸部分を含むグリカン構造としては、例えば、図16に示されるG-nおよびH-nが挙げられる本発明による組換えヒトLALは、複数のN-結合炭水化物鎖例えば、約5つまたは6つの炭水化物鎖を含む。5つまたは6つの各部位におけるN-結合グリコシル化構造は、図16に示されるA-n、B-n、C-n、D-n、E-n、F-n、G-n、H-n、I-n、J-n、K-n、L-n、M-n、N-nおよびO-nのうちの1つから選択され得る。また、LAL分子の混合物例えば、配列番号2、3、4および19で記述されるLAL分子のようなLAL分子が混合物中に2つ以上存在し得るも本明細書に記載され、ここではLAL分子のいくつか、またはすべてが、構造A-n、構造B-n、構造C-n、構造D-n、構造E-n、構造F-n、構造G-n、構造H-n、構造I-n、構造J-n、構造K-n、構造L-n、構造M-n、構造N-nおよび構造O-n図16から選択される1つ以上のグリコシル化構造を有する。一実施形態では、リソソーム酸リパーゼ分子の混合物を精製または単離し、例えば、トランスジェニックトリで産生された卵から単離する、またはトランスジェニックトリで産生された卵白から精製もしくは単離する。本発明は、構造A-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造B-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造C-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造D-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造E-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造F-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造G-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造H-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造I-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造J-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造K-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造L-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造M-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造N-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明は、構造O-nを含む個々のLAL分子も含む。本発明によるヒトLALと結合しているN-結合オリゴ糖は、末端シアル酸およびガラクトース残基が不足している。すなわち、少数のN-結合オリゴ糖構造のみが末端でシアル酸化されており、ガラクトース残基も少数しか存在しない。さらに、本明細書に記載のLALのN-結合オリゴ糖構造上に末端N-アセチルグルコサミンGlcNAcが広く存在する。したがって、本発明に従って産生されたLALを単球マクロファージおよびKupffer細胞のような細胞に対して標的化することができる。本発明の一態様では、実質的にシアル酸を有さないLALの組成物が提供される。別の態様では、本明細書に開示される組成物は組換えヒトLALを含み、そのN-グリカン構造のいずれにも、細胞内への酵素の内部移行に干渉し得るシアル酸部分を含まない。一実施形態では、組成物中に含まれるLALの15以下、例えば、10以下、5以下、2以下、1以下がそのN-グリカン構造にシアル酸部分を含むか、または実質的にすべてのLALがシアル酸部分を含まない。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約95以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約90以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約80以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約70以上がシアル酸を含まない。さらに別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在する実質的にすべてのN-結合オリゴ糖構造タイプがシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子と結合していることがわかっているN-結合オリゴ糖構造タイプの約90以上がシアル酸を含まない。例えば、20のオリゴ糖構造タイプが存在すれば、18以上の構造タイプがシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子と結合していることがわかっているN-結合オリゴ糖構造タイプの約80以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子と結合していることがわかっているN-結合オリゴ糖構造タイプの約70以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子と結合していることがわかっているN-結合オリゴ糖構造タイプの約60以上がシアル酸を含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子と結合していることがわかっているN-結合オリゴ糖構造タイプの約50以上がシアル酸を含まない。本発明の一態様によれば、本明細書に記載のLALは高レベルの末端N-アセチルグルコサミンを含む。一態様では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約95以上が末端N-アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約90以上が末端N-アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約80以上が末端N-アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約70以上が末端N-アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約60以上が末端N-アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約50以上が末端N-アセチルグルコサミンを含む。一実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するすべてのN-結合オリゴ糖構造タイプが末端N-アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖構造タイプの約90以上が末端N-アセチルグルコサミンを含む。例えば、20のオリゴ糖構造タイプが存在すれば、18以上のオリゴ糖構造タイプが末端N-アセチルグルコサミンを含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖構造タイプの約80以上が末端N-アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖構造タイプの約70以上が末端N-アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖構造タイプの約60以上が末端N-アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖構造タイプの約50以上が末端N-アセチルグルコサミンを含む。本発明の別の態様では、本明細書に開示される組成物はヒトLALを含み、かなりの割合のヒトLALが、そのN-グリカン構造のいずれにもフコース部分を含まない。一実施形態では、組成物中に含まれるLALの50以下、例えば、50以下、40以下、30以下、20以下、10以下、5以下、2以下、1以下がそのN-グリカン構造にフコース部分を含むか、または実質的にすべてのLALがフコース部分を含まない。一実施形態では、本発明に従って産生されたLALのN-結合オリゴ糖構造上にフコースが実質的に存在しない。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約95以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約90以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約85以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約80以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約70以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明の個々のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約60以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖の約50以上がフコースを含まない。一実施形態では、本発明のLAL分子上に存在する実質的にすべてのN-結合オリゴ糖構造タイプがフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖構造タイプの約95以上がフコースを含まない。例えば、20のオリゴ糖構造タイプが存在すれば、19以上の構造タイプがフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖構造タイプの約90以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖構造タイプの約85以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖構造タイプの約80以上がフコースを含まない。別の実施形態では、本発明のLAL分子上に存在するN-結合オリゴ糖構造タイプの約70以上がフコースを含まない。上で述べたように、本発明に従って産生されたLAL分子中には、ある特定の単糖類が多く存在する。分析される全単糖種としては、フコース、N-アセチルガラクトサミン、N-アセチルグルコサミン、ガラクトース、グルコース、マンノース、マンノース-6-リン酸、N-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルノイラミン酸が挙げられる。フコースは、全単糖類組成の約0~約1の間で存在し得る。N-アセチルガラクトサミンは、全単糖類組成の約0~約1の間で存在し得る。N-アセチルグルコサミンは、全単糖類組成の約35~約50の間で存在し得る。ガラクトースは、全単糖類組成の約1~10の間で存在し得る。グルコースは、全単糖類組成の0で存在し得る。マンノースは、全単糖類組成の約32~約50の間で存在し得る。マンノース-6-リン酸は、全単糖類組成の約1~約11の間で存在し得る。一実施形態では、本発明に従って産生されたLALはキシロースを含まない。さらに、本発明に従って産生されたLAL中にN-アセチルガラクトサミンGalNacが実質的に全く存在しないため、本発明の一態様は、O-結合グリコシル化を有さないLALの組成物を含む。LALは、そのアミノ酸配列中にN-結合グリコシル化のための6つの可能性がある部位、例えば、配列番号1のようにAsn36、Asn72、Asn101、Asn161、Asn273およびAsn321を有する。そのうちの5つ、Asn36、Asn101、Asn161、Asn273およびAsn321はグリコシル化されているが、Asn72は非グリコシル化または実質的に非グリコシル化であり得る実質的に非グリコシル化であるとは、LAL分子の混合物中、Asn36、Asn101、Asn161、Asn273およびAsn321のいずれよりも少ない数のAsn72がグリコシル化されているという意味である図17を参照されたい。したがって、本発明の一態様は、Asn72において非グリコシル化および/または実質的に非グリコシル化であるLALの組成物である。グリコシル化Asn72を有するLALは本発明の範囲内である。本明細書に記載のAsnの位置は、配列番号1で記述されるLALアミノ酸配列に基づくものである。Asnの番号付けすなわち、アスパラギンの位置は個々のLAL分子によって異なり得るものであり、アミノ酸配列が配列番号2、3、4および19で記述されるLAL分子のような他のLAL分子において容易に決定され得ることが、当業者には明らかであろう。本発明に従って産生されるLALは、主要糖としてN-アセチルグルコサミン、マンノースおよびマンノース-6-リン酸M6Pを有する二分岐、三分岐および四分岐構造の混合物を含むN-グリカン構造を含む図16および17。本発明の一態様によれば、少なくともAsn101、Asn161およびAsn273にM6P修飾N-グリカンが存在する。したがって、本発明の一実施形態は、Asn101、Asn161またはAsn273のいずれか1つに存在するM6P修飾N-グリカンを有するLALの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Asn273に存在するM6P修飾N-グリカンを有するLALの組成物を含む。別の実施形態では、本発明は、Asn101、Asn161またはAsn273のいずれか1つに存在する一リン酸化N-グリカンM6Pを有するLALの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Asn161およびAsn273に存在する一リン酸化N-グリカンを有するLALの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Asn101およびAsn273に存在する一リン酸化N-グリカンを有するLALの組成物を含む。特定の一実施形態では、本発明に従って産生されたLALは、Asn101に二リン酸化マンノースビス-M6Pを含み得る。本発明に従って産生されるLALは、減少したレベルのガラクトース例えば、Galを含み得る。本発明の一態様は、Asn36、Asn161またはAsn321のいずれか1つに末端ガラクトースを有するLALの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Asn36およびAsn161に末端ガラクトースを有するLALの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Asn161およびAsn321に末端ガラクトースを有するLALの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Asn36およびAsn321に末端ガラクトースを有するLALの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Asn36、Asn161およびAsn321に末端ガラクトースを有するLALの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、末端ガラクトースを有さないLALの組成物を含む。各種タイプのN-グリカンがLAL中の様々なN-結合グリコシル化部位に見られた。N-グリカン構造は、主要糖としてN-アセチルグルコサミン、マンノースおよびマンノース-6-リン酸M6Pを有する二分岐、三分岐および四分岐構造の混合物を含む。具体的には、本発明の一実施形態では、LALは、第一のN-結合グリコシル化部位例えば、配列番号1におけるAsn36にGlcNAc4Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc4Man3GlcNAc2から選択されるN-グリカン構造を含む。別の実施形態では、LALは、第二のN-結合グリコシル化部位例えば、配列番号1におけるAsn72において、グリコシル化を含まないか、または実質的に非グリコシル化である。さらに別の実施形態では、LALは、その第三のN-結合グリコシル化部位例えば、配列番号1におけるAsn101にPhos2Man7GlcNAc2を含む。さらに別の実施形態では、LALは、その第四のN-結合グリコシル化部位例えば、配列番号1におけるAsn161に、Phos1Man6GlcNAc2、GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc4Man3GlcNAc2から選択されるN-グリカン構造を含む。さらに別の実施形態では、LALは、その第五のN-結合グリコシル化部位例えば、配列番号1におけるAsn273に、Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2、Phos1Man8GlcNAc2またはPhos1Man9GlcNAc2から選択されるN-グリカン構造を含む。さらに別の実施形態では、LALは、その第六のN-結合グリコシル化部位例えば、配列番号1におけるAsn321に、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2、GlcNAc5Man3GlcNAc2、Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2、GlcNAc6Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc6Man3GlcNAc2から選択されるN-グリカン構造を含む。本発明のある特定の態様によれば、LALの組成物は、配列番号1のAsn36、Asn72、Asn101、Asn161、Asn273およびAsn321または配列番号2、3、4および19内の対応するアスパラギン残基においてグリコシル化されたLALを含み、1つのN-グリカンが、以下に示すように指定されたAsn位置にある:aAsn36にGlcNAc4Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc4Man3GlcNAc2があり;bAsn72にグリコシル化がなく;cAsn101にPhos2Man7GlcNAc2があり;dAsn161にPhos1Man6GlcNAc2、GlcNAc1Phos1Man6GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc4Man3GlcNAc2があり;eAsn273にMan7GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2、Phos1Man8GlcNAc2またはPhos1Man9GlcNAc2があり;fAsn321にGlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2、GlcNAc5Man3GlcNAc2、Gal1GlcNAc5Man3GlcNAc2、GlcNAc6Man3GlcNAc2またはGal1GlcNAc6Man3GlcNAc2があり、式中、Man=マンノースGlcNAc=N-アセチルグルコサミンPhos=リン酸エステルGal=ガラクトースである。一実施形態では、本発明に従って産生されたLAL中のAsn36、Asn161またはAsn321のいずれか1つにおいて、Gal1GlcNAc4Man3GlcNAc2がグリカン成分として見られる。特定の一実施形態では、Asn36、Asn161およびAsn321のグリカン成分としてGal1GlcNAc4Man3GlcNAc2が見られる。本発明のLALにおいて、Asn101およびAsn273が、主要成分として約6~約10個のマンノース分子を有する高マンノースタイプ本明細書に記載のMAN6-MAN10を示す。したがって、本発明の一態様は、Asn101またはAsn273において高マンノース構造を有するLALの組成物を含む。別の実施形態では、本発明のLALの組成物は、Asn101またはAsn273に少なくとも6個のマンノースを有するN-グリカン構造を含み得る。別の実施形態では、LALの組成物は、Asn101またはAsn273に7、8または9個のマンノースを有するN-グリカンを含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Asn101およびAsn273に7、8または9個のマンノースを有するLALの組成物を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、Asn101およびAsn273に7、8または9個のマンノースを有し、マンノースの1つがリン酸化されているLALの組成物を含む。上記グリコシル化部位およびAsnに付随する数字が、配列番号1で記述されるLALのアミノ酸配列に基づくものであるということ、また対応するAsnの番号付けはLAL分子によって異なり得るが、配列番号1に関する上記グリコシル化プロファイルが、配列番号2、3、4および19で記述されるLAL分子にも当てはまるということが理解されるべきである。例えば、配列番号1のAsn36は、配列番号2のAsn15、配列番号3のAsn13、配列番号4のAsn10および配列番号19のAsn9に対応する。配列番号1のAsn72は、配列番号2のAsn51、配列番号3のAsn49、配列番号4のAsn46および配列番号19のAsn45に対応する。配列番号1のAsn101は、配列番号2のAsn80、配列番号3のAsn78、配列番号4のAsn75および配列番号19のAsn74に対応する。配列番号1のAsn161は、配列番号2のAsn140、配列番号3のAsn138、配列番号4のAsn135および配列番号19のAsn134に対応する。配列番号1の273は、配列番号2のAsn252、配列番号3のAsn250、配列番号4のAsn247および配列番号19のAsn246に対応する。配列番号1のAsn321は、配列番号2のAsn300、配列番号3のAsn298、配列番号4のAsn295および配列番号19のAsn294に対応する。例えば、一実施形態では、LALは、配列番号2のAsn15、Asn51、Asn80、Asn140、Asn252およびAsn300からなる群より選択される少なくとも1つの位置でN-結合グリコシル化されている。別の実施形態では、LALは、配列番号2のAsn15、Asn80、Asn140、Asn252およびAsn300においてN-結合グリコシル化されている。さらに別の実施形態では、配列番号2のLALのN-グリカン構造はキシロースを有さないが、15、10、5または1未満のN-グリカン構造がシアル酸を含み;50、40、30、20、10、5または1未満のN-グリカン構造がフコースを含み;少なくとも30、50、60、70、80、90および95のN-グリカン構造がリン酸化マンノースM6Pを含む。一実施形態では、LALは、配列番号3のAsn13、Asn49、Asn78、Asn138、Asn250およびAsn298からなる群より選択される少なくとも1つの位置でN-結合グリコシル化されている。別の実施形態では、LALは、配列番号3のAsn13、Asn78、Asn138、Asn250およびAsn298においてN-結合グリコシル化されている。さらに別の実施形態では、配列番号3のLALのN-グリカン構造はキシロースを有さないが、15、10、5または1未満のN-グリカン構造がシアル酸を含み;50、40、30、20、10、5または1未満のN-グリカン構造がフコースを含み;少なくとも30、50、60、70、80、90および95のN-グリカン構造がリン酸化マンノースM6Pを含む。一実施形態では、LALは、配列番号4のAsn10、Asn46、Asn75、Asn135、Asn247およびAsn295からなる群より選択される少なくとも1つの位置でN-結合グリコシル化されている。別の実施形態では、LALは、配列番号4のAsn10、Asn75、Asn135、Asn247およびAsn295においてN-結合グリコシル化されている。さらに別の実施形態では、配列番号4のLALのN-グリカン構造はキシロースを有さないが、15、10、5または1未満のN-グリカン構造がシアル酸を含み;50、40、30、20、10、5または1未満のN-グリカン構造がフコースを含み;少なくとも30、50、60、70、80、90および95のN-グリカン構造がリン酸化マンノースM6Pを含む。一実施形態では、LALは、配列番号19のAsn9、Asn45、Asn74、Asn134、Asn246およびAsn294からなる群より選択される少なくとも1つの位置でN-結合グリコシル化されている。別の実施形態では、LALは、配列番号19のAsn9、Asn74、Asn134、Asn246およびAsn294においてN-結合グリコシル化されている。さらに別の実施形態では、配列番号4のLALのN-グリカン構造はキシロースを有さないが、15、10、5または1未満のN-グリカン構造がシアル酸を含み;50、40、30、20、10、5または1未満のN-グリカン構造がフコースを含み;少なくとも30、50、60、70、80、90および95のN-グリカン構造がリン酸化マンノースM6Pを含む。本発明による組成物は、トランスジェニックトリ、トランスジェニックサカナ、トランスジェニック哺乳動物、例えばトランスジェニックヤギの使用により、またはタバコおよびコウキクサLemnaminorのようなトランスジェニック植物ならびに特定のタイプの培養細胞においてなど、数多くの方法で産生され得る。また本発明はペグ化LALを含む組成物も企図する。本明細書に記載のLAL酵素を、例えば、2007年4月26日に公表された米国特許出願公開第20070092486号に開示されているようにペグ化することができる。上記特許の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、誘導されたグリコシル化パターンを、例えばトリ輸卵管細胞、例えば管状腺細胞由来の発現特化発現系から得る。例えば、本明細書に開示されるグリコシル化パターンは、本発明に従ってニワトリのようなトリの輸卵管細胞中で産生されたリソソーム蓄積症酵素上に存在することが示されている。本発明に従って産生されるタンパク質を、タンパク質精製の当業者に明らかな方法のような任意の有用な方法で卵白から精製することができる。例えば、本発明に従ってトランスジェニックトリで産生されたヒトLALhLALを、タンパク質精製の当業者に明らかな方法により卵白から精製することができる。卵白中に存在するLALのための精製プロトコルの例を実施例に記載する。本発明は、本明細書に開示されるグリコシル化構造を1つ以上含む本発明のリソソーム酸リパーゼ分子を含有する、卵および卵白、ならびに卵を産み、卵白を産生するトリ例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよびウズラを含む。トリでのLAL発現トリゲノム内に外来性核酸配列を安定に導入して、マンノース-6-リン酸の付加が有効である例えば、有効性の増加が得られるタンパク質、例えば、リソソーム酸リパーゼLALおよび本明細書に具体的に開示される他のタンパク質を非限定的に含めたリソソーム酵素などのような所望のタンパク質を発現させるためのベクターおよび方法が本明細書に開示される。具体的には、輸卵管内で外来性配列を発現して、卵内に医薬タンパク質のような外来性タンパク質を蓄積するトランスジェニックトリを作製する。このような外来性タンパク質を含有するトリの卵も本明細書に記載される。また、トランスジェニックトリの輸卵管内で効率的に発現されて、トリの卵内に蓄積される新規な形態のLALも本明細書に開示される。本発明の一態様はLAL、すなわち本発明に従って産生されたLAL分子を含有する組成物に関する。特に有効な実施形態では、LALは精製または単離される。例えば、トランスジェニックトリが産んだ硬殻卵の内容物からLALが取り出されている。特に有効な一実施形態では、LALはヒトLALである。一実施形態では、本発明のLALは、トリの輸卵管細胞内で産生されるLALに由来するグリコシル化パターンを有する。例えば、組成物は、本発明に従ってトリ、例えばニワトリにおいて産生され、卵白から単離されたLAL分子の混合物を含有し得る。有効な一実施形態では、LAL含有組成物は医薬製剤である。一態様では、本発明は単離されたLAL分子、例えばヒトLAL分子を含有する組成物に関するものであり、LALは、LALをコードする導入遺伝子を担持するトリにおいて産生される。一実施形態では、LALはトランスジェニックトリ例えば、トランスジェニックニワトリの輸卵管細胞例えば、管状腺細胞内で産生され、そのLALをトランスジェニックトリの卵白から単離する。一実施形態では、LALはトリ、例えばニワトリの輸卵管細胞例えば、管状腺細胞内でグリコシル化される。別の態様では、リソソーム蓄積症酵素のような外来性タンパク質、例えばLALをトリの特定の組織において産生させる方法が提供される。このような外来性タンパク質は、トリの輸卵管、血液ならびに/または他の細胞および組織において発現され得る。一実施形態では、目的タンパク質が輸卵管筒部の管状腺細胞内で発現され、管腔内に分泌されて硬殻卵の卵白中に蓄積されるように、例えば、X期近くで胚盤葉細胞に導入遺伝子を導入してトランスジェニックトリを作製する。このように作製されたトランスジェニックトリは、その生殖系列中に導入遺伝子を担持して、メンデル方式で外来性導入遺伝子をその子孫に安定に伝達することができる。本発明は、トリ輸卵管内でLALのような外来性タンパク質を産生させる方法を包含する。この方法は、コード配列と、コード配列と作動可能に連結されたプロモーターとを含み、プロモーターがトリ輸卵管内での核酸発現もたらし得る、ベクターを提供する第一の段階を含み得る。トランスジェニック細胞および/または組織を作製することができ、ここでは、ベクターを新たに単離された、培養されている、または胚内にあるトリ胚盤葉細胞に導入して、ベクター配列がトリゲノム内に挿入されるようにする。そのトランスジェニック細胞および/または組織から、輸卵管内でLALのような外来性タンパク質を発現する成熟トランスジェニックトリを得ることができる。本発明の一態様では、レトロウイルスベクターの5’LTRと3’LTRの間に導入遺伝子を担持する複製欠損型または複製型レトロウイルス粒子を用いた胚盤葉細胞の形質導入により、トランスジェニックトリの作製を行う。例えば、プロモーター領域のセグメントの下流に挿入された外来遺伝子を含む改変pNLBプラスミドを含む、トリ白血症ウイルスALVレトロウイルスベクターまたはマウス白血病ウイルスMLVレトロウイルスベクターを用い得る。ウイルス粒子内にパッケージされた改変レトロウイルスベクターのRNAコピーを用いて、トランスジェニックトリになる胚盤葉に感染させることができる。本発明の別の態様では、コード配列とプロモーターとを含み、それらは、コード配列がトリ輸卵管内で発現されるような方向的および位置的関係にある、ベクターが提供される。このようなベクターとしては、トリ白血症ウイルスALVレトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルスMLVレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。さらにベクターは、トリ白血症ウイルスALVレトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルスMLVレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターのLTRを含む核酸配列であってもよい。プロモーターは、トリ輸卵管内でのコード配列の発現をもたらすのに十分なものである。コード配列は、硬殻卵の卵白中に蓄積される外来性タンパク質をコードする。したがって、コード配列は、トランスジェニック家禽由来のタンパク質、例えばトランスジェニック家禽由来のリソソーム酸リパーゼTPDLALなどのような外来性タンパク質をコードする。一実施形態では、本発明の方法で使用するベクターは、特にトリおよびトリの卵内での外来性タンパク質の発現に適したプロモーターを含む。したがって、外来性コード配列の発現は、トランスジェニックトリの輸卵管および血液内ならびにトランスジェニックトリの卵の卵白内で生じ得る。プロモーターとしては、サイトメガロウイルスCMVプロモーター、ラウス肉腫ウイルスRSVプロモーター、β-アクチンプロモーター例えば、ニワトリβ-アクチンプロモーター、マウス白血病ウイルスMLVプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスMMTVプロモーター、オボアルブミンプロモーター、リゾチームプロモーター、コンアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、オボムチンプロモーターおよびオボトランスフェリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。任意に、プロモーターは少なくとも1つのプロモーター領域のセグメント、例えばオボアルブミン、リゾチーム、コンアルブミン、オボムコイド、オボムチンおよびオボトランスフェリンプロモーター領域などのセグメントであってよい。一実施形態では、プロモーターは、例えばオボアルブミン、リゾチーム、コンアルブミン、オボムコイド、オボムチンおよびオボトランスフェリンプロモーターなどのプロモーターの1つ以上の組合せもしくは融合物、または1つ以上のプロモーターの一部分の融合物である。一実施形態では、ベクターはシグナルペプチドコード配列を含み、このコード配列は、細胞内での翻訳の際に、ベクターにより発現されたヒトLALのような外来性タンパク質の、硬殻卵の卵白中への分泌をシグナルペプチドが指令するように、コード配列と作動可能に連結されている。本発明の一態様では、本明細書に開示されるように産生される外来性タンパク質のコード配列が提供され、ここでは、コード配列はトリ、例えばニワトリにおける発現に対してコドン最適化されている。コドン最適化は、トリ細胞例えば、ニワトリ細胞内で発現される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上のタンパク質のコドン使用頻度から決定され得る。例えば、コドン使用頻度は、ニワトリのタンパク質であるオボアルブミン、リゾチーム、オボムチンおよびオボトランスフェリンをコードする核酸配列から決定され得る。例えば、外来性タンパク質のDNAコード配列は、ニワトリGal1usGal1usのオボアルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンタンパク質から収集されたコドン使用頻度表により、WisconsinPackage、Version9.1のBACKTRANSLATE登録商標プログラムGeneticsComputerGroupInc.、Madison、Wis.用いてコドン最適化され得る。本発明の重要な一態様は、特に限定されないがヒトLALを含めた外来性のペプチドまたはタンパク質を含有する、トリ硬殻卵例えば、ニワトリ硬殻卵に関する。ヒトLALのような外来性のペプチドまたはタンパク質は、トランスジェニックトリの導入遺伝子によりコードされ得る。多くの場合、外来性のペプチドまたはタンパク質例えば、LALはグリコシル化されている。タンパク質は任意の有用量で存在し得る。一実施形態では、タンパク質は1硬殻卵当たり約0.01μg~1硬殻卵当たり約1グラムの範囲の量で存在する。別の実施形態では、タンパク質は1硬殻卵当たり約1μg~1硬殻卵当たり約1グラムの範囲の量で存在する。例えば、タンパク質は1硬殻卵当たり約10μg~1硬殻卵当たり約1グラムの範囲例えば、1硬殻卵当たり約10μg~1硬殻卵当たり約400ミリグラムの範囲の量で存在し得る。一実施形態では、本発明の外来性タンパク質は卵の卵白中に存在する。一実施形態では、タンパク質は卵白1ミリリットル当たり約1ng~卵白1ミリリットル当たり約0.2グラムの範囲の量で存在する。例えば、タンパク質は卵白1ミリリットル当たり約0.1μg~卵白1ミリリットル当たり約0.2グラムの範囲の量で存在し得る例えば、タンパク質は卵白1ミリリットル当たり約1μg~卵白1ミリリットル当たり約100ミリグラムの範囲の量で存在し得る。一実施形態では、タンパク質は卵白1ミリリットル当たり約1μg~卵白1ミリリットル当たり約50ミリグラムの範囲の量で存在する。例えば、タンパク質は卵白1ミリリットル当たり約1μg~卵白1ミリリットル当たり約10ミリグラムの範囲の量で存在し得る例えば、タンパク質は卵白1ミリリットル当たり約1μg~卵白1ミリリットル当たり約1ミリグラムの範囲の量で存在し得る。一実施形態では、タンパク質は卵白1ミリリットル当たり0.1μgを上回る量で存在する。一実施形態では、タンパク質は卵白1ミリリットル当たり0.5μgを上回る量で存在する。一実施形態では、タンパク質は卵白1ミリリットル当たり1μgを上回る量で存在する。一実施形態では、タンパク質は卵白1ミリリットル当たり1.5μgを上回る量で存在する。ベクターが導入された胚盤葉細胞から発生した、本明細書に開示される外来性タンパク質例えば、LALを産生する本発明のトリはG0世代であり、創始動物と呼ばれることがある。創始トリは通常、挿入された各導入遺伝子に関してキメラである。つまり、G0トランスジェニックトリの一部の細胞のみが導入遺伝子1つまたは複数を担持する。G0世代は通常、導入遺伝子1つまたは複数に関してヘミ接合性でもある。G0世代を非トランスジェニック動物と交配して、同様に導入遺伝子に関してヘミ接合性であり、かつ実質的にトリの全細胞中に導入遺伝子1つまたは複数を担持するG1トランスジェニック子孫を生じ得る。G1ヘミ接合性子孫を非トランスジェニック動物と交配して、G2ヘミ接合性子孫を生じ、またG1ヘミ接合性子孫同士を交配して、導入遺伝子に関してホモ接合型であるG2子孫を生じ得る。G1子孫に由来する導入遺伝子に関して陽性である実質的にすべてのトリ細胞が導入遺伝子1つまたは複数を担持する。一実施形態では、同じ系統由来のヘミ接合性G2子孫を交配して、導入遺伝子に関してホモ接合型のG3子孫を得ることができる。一実施形態では、ヘミ接合性のG0またはG1個体を、例えば、互いに交配して、個体の各細胞中に2コピーの導入遺伝子1つまたは複数を担持するホモ接合型のG1子孫を産生することができる。これらはある特定の有効な交配方法の例に過ぎず、本発明は、当業者に公知の方法のような任意の有効な交配方法の使用を企図する。一実施形態では、本発明は単離されるLALを提供する。つまり、組成物中に含有されるLALは単離LALであり得る。例えば、LALを卵白から単離し得る。単離LALは、LAL分子内で各種のグリコシル化構造を有するLAL分子であり得る。本発明の方法により、トリ胚盤葉細胞に導入遺伝子を導入して、本発明のタンパク質を産生するために生殖系組織の遺伝物質中に導入遺伝子を担持する、トランスジェニックニワトリ、トランスジェニックシチメンチョウ、トランスジェニックウズラおよび他の種のトリを作製することができる。胚盤葉細胞は通常、VII~XII期の細胞またはそれに相当する細胞であり、一実施形態では、X期近くの細胞である。本発明の方法を実施するのに有用なベクターを本明細書にいくつか記載する。一実施形態では、ベクターのコード配列およびプロモーターはともに、胚盤葉細胞に導入する前に5’LTRと3’LTRの間に位置している。一実施形態では、ベクターはレトロウイルスであり、コード配列およびプロモーターはともに、レトロウイルスベクターの5’LTRと3’LTRの間に位置している。有用な一実施形態では、LTRまたはレトロウイルスベクターは、トリ白血症ウイルスALV、マウス白血病ウイルスMLVまたはレンチウイルス由来である。一実施形態では、胚盤葉細胞をトランスフェクトして、トリゲノム内への安定な挿入をもたらすために使用されるベクターは、コード配列とプロモーターとを、トリ輸卵管筒部の管状腺細胞内でコード配列が発現されるような方向的および位置的関係で含み、ここでは、リソソーム酵素例えば、LALのような外来性タンパク質が硬殻卵の卵白中に蓄積される。プロモーターは任意選択で、管状腺細胞内でのコード配列の発現を指令するのに十分な大きさであるオボアルブミンプロモーター領域のセグメントであってよい。オボアルブミンプロモーターを切り詰めることおよび/またはオボアルブミンプロモーターの重要な調節要素を集約して、プロモーターが輸卵管筒部の管状腺細胞内での発現に必要な配列を保持し、かつベクターへ容易に組み込まれ得るように十分に小型であるようにさせることは、本発明の範囲内に含まれる。一実施形態では、オボアルブミンプロモーター領域のセグメントを使用し得る。このセグメントはオボアルブミン遺伝子の5’隣接領域を含む。またプロモーターは、リゾチームプロモーターのような全部ではないが大部分が筒部に特異的なプロモーターであってもよい。またプロモーターはマウス乳腺腫瘍ウイルスMMTVプロモーターであってもよい。あるいは、プロモーターは構成的プロモーター例えば、サイトメガロウイルスCMVプロモーター、ラウス肉腫ウイルスRSVプロモーター、マウス白血病ウイルスMLVプロモーターなどであってもよい。一実施形態では、プロモーターはサイトメガロウイルスCMVプロモーター、MDOTプロモーター、ラウス肉腫ウイルスRSVプロモーター、マウス白血病ウイルスMLVプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスMMTVプロモーター、オボアルブミンプロモーター、リゾチームプロモーター、コンアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、オボムチンプロモーターおよび/またはオボトランスフェリンプロモーターである。任意に、プロモーターはプロモーター領域の少なくとも1つのセグメント、例えばオボアルブミン、リゾチーム、コンアルブミン、オボムコイド、オボムチンおよびオボトランスフェリンプロモーター領域のセグメントなどであってよい。胚盤葉細胞をトランスフェクトする1つの方法では、トリゲノム内に組み込まれるように、パッケージされたレトロウイルス系ベクターを用いて胚盤葉細胞内にベクターを送達する。トリゲノム内に導入遺伝子を無作為に導入するのに有用なレトロウイルスは、複製欠損型トリ白血症ウイルスALV、複製欠損型マウス白血病ウイルスMLVまたはレンチウイルスである。一実施形態では、レトロウイルスゲノムの5’および3’の長い末端反復配列LTRの間にオボアルブミンプロモーターと1つ以上の外来性遺伝子とを挿入することにより、pNLBベクターを改変する。本発明は、管状腺細胞内で活性なプロモーターの下流にある任意のコード配列が管状腺細胞内で発現され得ることを企図する。例えば、オボアルブミンプロモーターは、オボアルブミンタンパク質の発現を駆動し、輸卵管の管状腺細胞内で活性であるため、輸卵管筒部の管状腺細胞内で発現され得る。また本明細書に記載の任意のベクターは、ベクターのコード配列により発現されたタンパク質の、輸卵管の管状腺細胞からの分泌を指令するシグナルペプチドをコードするコード配列を任意に含み得る。本態様は、本明細書に記載の方法を用いてトリの卵内に蓄積され得る外来性タンパク質の範囲を効果的に拡大する。外来性タンパク質がそれ無しは分泌されないであろう場所で、コード配列を含むベクターを改変して、リゾチーム遺伝子由来のシグナルペプチドをコードする約60bpを含むDNA配列を含ませる。シグナルペプチドをコードするDNA配列が、DNAによりコードされているタンパク質のN末端にそれが位置するようにベクターに挿入される。本発明の別の態様は、本発明の任意のベクターにおいて、ジシストロニックまたはポリシストロニックなmRNAからの2種類以上のタンパク質の翻訳を可能にする配列内リボソーム進入部位IRES要素を使用することを含む。IRES単位を1つ以上の追加のコード配列の5’末端に融合し、次いでこれをベクター内の元のコード配列の末端に挿入することにより、コード配列がIRESにより互いに分離されるようになる。一実施形態では、IRESを使用すると、他のコード配列の産生物を修飾することが可能な酵素を1つのコード配列がコードすることができるため、産生物の翻訳後修飾が容易になる。例えば、第一のコード配列がコラーゲンをコードし、このコラーゲンが第二のコード配列によりコードされている酵素によりヒドロキシル化され活性化され得るが、ここでは当該技術分野において理解されている通りにIRESを使用する。別の態様では、本発明のいずれの方法で使用するベクターのコード配列にも3’非翻訳領域3’UTRを加えて、産生されるRNAを安定にする。3’UTRをレトロウイルスベクターに付加する場合、3’UTRの付加が完全長ゲノムRNAの転写に干渉しないように、構築物中でのプロモーター、遺伝子Xおよび3’UTRの方向を逆にしなければならない。一実施形態では、3’UTRは、オボアルブミンもしくはリゾチーム遺伝子の3’UTR、または筒部細胞内で機能する任意の3’UTR、すなわちSV40後期領域であり得る。一実施形態では、構成的プロモーターを用いて、導入遺伝子のコード配列をトリにおいて発現させる。この場合、発現は筒部に限定されず、トリ内の他の組織例えば、血液中でも生じる。構成的プロモーターとコード配列とを含むこのような導入遺伝子の使用は、輸卵管内でのタンパク質発現と、それに続く卵内へのタンパク質の分泌を生じさせるまたは駆動することに特に適している。形質を導入するための粒子すなわち、形質導入粒子をベクター用に作製して力価を測定し、胚に注入するために使用することができる適切な濃度を決定する。Speksnijderの手順米国特許第5,897,998号、この開示はその内容全体が参照により本明細書に組み込まれるに従ってトリの卵に孔を開け、卵に形質導入粒子を注入する。注入の約21日後に卵が孵化し、交配用に雄のトリを選別する。精子に導入遺伝子を含むG0雄ニワトリをスクリーニングするために、雄ニワトリ精子の試料からDNAを抽出する。精子試料中に導入遺伝子を最も高レベルで含むG0雄ニワトリを、人工授精により非トランスジェニック雌ニワトリと交配させる。血液DNA試料を導入遺伝子の有無に関してスクリーニングする。外来性タンパク質の有無に関してトランスジェニック雄ニワトリの血清を試験する。外来性タンパク質が確認されれば、そのトランスジェニック雄ニワトリの精子を非トランスジェニック雌ニワトリの人工授精に使用する。その結果、特定の割合の子孫が導入遺伝子を担持する例えば、50を上回る。本発明に従って産生された卵内に外来性タンパク質が存在すれば、そのタンパク質を単離してよい。またそのタンパク質の生物学的活性を試験してもよい。トリ輸卵管内での外来性タンパク質の産生および外来性タンパク質を含有する卵の産生を提供する本発明の方法は、適当なベクターを提供し、胚盤葉細胞にベクターを導入することに続いて、そのベクターがトリゲノム内に組み込まれるように、さらなる段階を含む。次の段階は、前段階で作製されたトランスジェニック胚盤葉細胞から成熟トランスジェニックトリを得ることである。成熟トランスジェニックトリは、胚内にベクターが直接トランスフェクトまたは形質導入された胚盤葉胚の細胞から得ることができる。得られた胚を成長させ、ニワトリを成熟させる。胚盤葉細胞から作製されたトランスジェニックトリは、創始動物として知られる。創始動物の一部は、輸卵管筒部の管状腺細胞内に導入遺伝子を担持している。これらのトリは、導入遺伝子によりコードされた外来性タンパク質を輸卵管内で発現する。また外来性タンパク質は、輸卵管に加えて他の組織例えば、血液でも発現され得る。外来性タンパク質が適当なシグナル配列1つまたは複数を含んでいれば、そのタンパク質は輸卵管の管腔内に、そして卵の卵白中に分泌される。創始動物の中には生殖系列の創始動物がある。生殖系列の創始動物とは、生殖系列組織の遺伝物質中に導入遺伝子を担持し、また外来性タンパク質を発現する輸卵管筒部管状腺細胞内にも導入遺伝子を担持し得る創始動物のことである。したがって、本発明に従うと、トランスジェニックトリは外来性タンパク質を発現する管状腺細胞を有し得、またそのトランスジェニックトリの子孫も外来性タンパク質を発現する輸卵管筒部管状腺細胞を有し得る。あるいは、その子孫は、トリの特定組織1つまたは複数内での外来性遺伝子の発現により決定される表現型を発現する。一実施形態では、トランスジェニックトリはニワトリまたはシチメンチョウである。医薬組成物および治療法本明細書に記載の通りに産生された治療用タンパク質を、未加工の形態で投与して治療に使用することも可能であるが、治療用タンパク質を医薬製剤の一部として投与することが好ましい。したがって、家禽由来のLALのようなグリコシル化治療用タンパク質またはその薬学的に許容される誘導体を、1つ以上の薬学的に許容される担体と、任意に他の治療および/または予防成分とを一緒に含む医薬製剤、ならびにこのような医薬製剤の投与方法がさらに提供される。担体1つまたは複数は、製剤の他の成分と適合性があり、かつその被投与者に有害でないという意味で許容されるものでなければならない。本発明の医薬組成物を用いた患者の治療法例えば、投与する医薬タンパク質の量、投与の頻度、および治療期間の長さは、当業者である医師に公知の標準的な方法を用いて決定することができる。複合分子を含めた担体を含む組成物を、その教示が参照により本明細書に組み込まれる公知の従来の方法例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences,第14版,MackPublishingCo.,Easton,Pa.を参照されたいにより製剤化する。担体は希釈剤を含み得る。一実施形態では、医薬担体は液体であり得、組換えヒトLALは溶液の形態であり得る。医薬担体はロウ、脂肪またはアルコールであり得る。一実施形態では、ロウまたは脂肪ベースの担体はエステルを含有しない。別の実施形態では、薬学的に許容される担体は、粉末、凍結乾燥粉末または錠剤形態の固体であり得る。一実施形態では、担体はリポソームまたはマイクロカプセルを含み得る。医薬製剤には、筋肉内、皮下および静脈内投与を含めた注射による投与に適したものが含まれる。医薬製剤には、経口、経直腸、経鼻、局所バッカルおよび舌下を含む、経膣または非経口に適したものが含まれる。また医薬製剤には、吸入または吹送による投与に適したものも含まれる。製剤は、必要に応じて、都合よく個別の投与単位で提供することができ、製薬分野で公知の任意の方法により調製し得る。医薬製剤の製造方法は通常、治療用タンパク質を液体担体もしくは微粉化した固体担体、またはその両方と混ぜ、次いで必要に応じて、製品を所望の製剤に成形する段階を含む。経口投与に適した医薬製剤は、それぞれが所定量の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤または錠剤のような個別の単位;粉末もしくは顆粒剤;液剤;懸濁剤;または乳剤として好都合に提供し得る。活性成分を大形丸剤、舐剤またはペースト剤として提供し得る。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、従来の添加剤、例えば結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤または湿潤剤を含有し得る。錠剤を当該技術分野で公知の方法によりコーティングし得る。経口液体製剤は、例えば水性もしくは油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であり得、また使用前に水もしくは他の適当な溶剤で構成する乾燥製品として提供し得る。このような液体製剤は、従来の添加剤、例えば懸濁化剤、乳化剤、非水性溶剤食用油を含み得るまたは保存剤など含有し得る。またLALを非経口投与例えば、注射、例えばボーラス注射または持続注入による用に調製してもよく、アンプル、予め充填したシリンジ、少量の注入物中の単位用量形態で、または保存剤を添加した多回用量容器中で提供し得る。治療用タンパク質を、例えば、皮下注射、筋肉内注射および静脈内注入または注射により注射することができる。LALは、油性または水性溶剤による懸濁剤、液剤または乳剤の形態であり得、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤のような製剤用剤を含有し得る。治療用タンパク質が、無菌固体からの無菌単離または溶液からの凍結乾燥によりによる得られる、使用前に適当な溶剤、例えば無菌無発熱物質水で構成するための粉末形態であり得るということも企図される。静脈内注入または注射用には、本発明に従って産生されたLALを水性懸濁剤または液剤として製剤することができる。静脈内注入または注射用の製剤に適した添加剤は、クエン酸三ナトリウム脱水和物、クエン酸およびヒト血清アルブミンのうちの1つを含み得る。また医薬製剤は、リソソーム蓄積障害用の他の製品に使用される当該技術分野で公知の他の適当な添加剤も含み得る。本発明に従って産生されたLALのpHを約5.6~約6.2の間に維持する。好ましくは、LAL製剤のpHを5.9±0.2に維持する。皮膚への局所投与用には、本発明に従って産生された本発明の治療用タンパク質を、軟膏剤、クリーム剤もしくはローション剤として、または経皮パッチとして製剤化し得る。軟膏剤およびクリーム剤は、例えば、適当な増粘剤および/またはゲル化剤を加えて水性または油性基剤で製剤化し得る。ローション剤は、水性または油性基剤で製剤化することができ、また1つ以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤または着色剤を含有し得る。口腔内の局所投与に適した製剤としては、風味を加えた基剤、通常はスクロースとアラビアゴムまたはトラガカントに活性成分を含むトローチ剤;ゼラチンとグリセリンまたはスクロースとアラビアゴムのような不活性な基剤に活性成分を含む香錠剤;および適当な液体担体中に活性成分を含む口腔洗浄剤が挙げられる。担体が固体である経直腸投与に適した医薬製剤は、単位用量の坐剤であることが最も好ましい。適当な担体としては、カカオバターおよび当該技術分野において一般に使用される他の材料が挙げられ、また坐剤は、活性化合物を軟化または溶解させた担体1つまたは複数と混合した後、鋳型に入れて冷却し成形して形成することが好都合であり得る。経膣投与に適した製剤は、活性成分に加えて、適切であることが当該技術分野で公知である担体を含有する、膣坐剤、タンポン剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、泡状剤またはスプレー剤として提供され得る。鼻腔内投与用には、本発明の治療用タンパク質を液体スプレーもしくは分散粉末として、または滴剤の形態で使用し得る。滴剤は、1つ以上の分散剤、可溶化剤または懸濁化剤も含む水性または非水性基剤で製剤化し得る。液体スプレー剤は、加圧パックから送達するのが好都合である。吸入による投与用には、本発明による治療用タンパク質を吹入器、噴霧器もしくは加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達するのに都合のよい他の手段から都合よく送達することができる。加圧パックは適当な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスなどを含み得る。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するための弁を備え付けることにより決定され得る。吸入または吹送による投与用には、本発明による治療用タンパク質は、乾燥粉末組成物、例えば、化合物とラクトースまたはデンプンのような適当な粉末基剤との混合粉末の形態をとり得る。粉末組成物を、例えば、カプセルもしくは薬包中の、または例えば、吸入器もしくは吹入器により粉末が投与され得るゼラチンもしくはブリスターパック中の単位投与剤形で提供し得る。必要に応じて、活性成分を徐放することに適合させた上記製剤を使用し得る。また本明細書に記載の医薬組成物は、抗菌剤または保存剤のような他の活性成分も含有し得る。さらに、本明細書に開示される治療用タンパク質を他の治療剤と併用し得ることが企図される。例えば、本発明は、潜在的な注入関連のアナフィラキシー反応を最小化または予防するための薬学的に有効量の抗ヒスタミン剤による前処置の方法を提供する。例えば、抗ヒスタミン剤は、本明細書に開示されるおよび当該技術分野で公知である任意の薬学的に許容される抗ヒスタミン剤例えば、ジフェンヒドラミンであり得る。一実施形態では、抗ヒスタミン剤を体重1kg当たり約1mg~約10mgの間の用量で投与する。例えば、抗ヒスタミン剤を体重1kg当たり約5mgの用量で投与し得る。一実施形態では、血管アクセスポートと接続された携帯型システムを用いて、抗ヒスタミン剤を、リソソーム酸リパーゼの投与前の約10分~約90分の間、例えば約30分~約60分の間に投与する。一実施形態では、ジフェンヒドラミンの投与により潜在的アナフィラキシー性の注入反応を効果的に抑える。患者がアナフィラキシー反応または有害な免疫応答を経験する場合、LAL投与の前、間または後に免疫抑制剤、例えば抗ヒスタミン剤、副腎皮質ステロイド剤、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、メトトレキサート、IL-2受容体に対する抗体、T細胞受容体に対する抗体、TNF-αに対する抗体または融合タンパク質インフリキシマブ、エタネルセプトまたはアダリムマブ、CTLA4-Ig例えば、アバタセプト、抗-OX-40抗体なども投与することもできる。また本発明は、1つ以上のコレステロール低化剤例えば、HMG-CoA還元酵素阻害剤を併用するLAL含有組成物の投与を含む治療法も企図する。このような薬剤の非限定的な例としては、アトルバスタチンLipitor登録商標およびTorvast登録商標、フルバスタチンLescol登録商標、ロバスタチンMevacor登録商標、Altocor登録商標、Altoprev登録商標、ピタバスタチンLivalo登録商標、Pitava登録商標、プラバスタチンPravachol登録商標、Selektine登録商標、Lipostat登録商標、ロスバスタチンCrestor登録商標およびシンバスタチンZocor登録商標、Lipex登録商標が挙げられる。本明細書に記載の組成物またはタンパク質を用いて各種状態を治療することができる。例えば、その治療法が当業者である医師に公知の状態がある。本発明は、トリ系で産生され、家禽由来のグリコシル化パターンを含有する治療用タンパク質例えば、LALを使用して、このような状態を治療し得ることを企図する。つまり、従来の方法で作製された治療用タンパク質により治療可能であることが知られている状態を、本明細書に記載の通りに産生された治療用タンパク質により治療することも企図される。例えば、本明細書に記載の通りに産生されたLALを用いて、LAL欠損症または不全症合わせてLAL欠損症と呼ぶを原因とするまたはこれと関連する状態、例えばウォルマン病およびコレステリルエステル蓄積症CESDなどを治療することができる。本明細書に記載のLAL欠損症では、LALの発現が、体内で産生されるLALの減少または欠損を生じる状態例えば、遺伝子突然変異、生理的因子または環境因子により減少している状態も考慮される。本明細書に記載の通りに産生されたLALを用いて、他の状態、例えばアテローム性動脈硬化症、脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎NASHおよび肝硬変なども治療することができる。また本明細書に記載の通りに産生されたLALを用いて、2005年2月1日に発行された米国特許第6,849,257号この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる;2009年12月3日に公開された米国特許出願公開第2009/0297496号;2004年11月11日に公開された米国特許出願公開第2004/0223960号;2009年11月15日に公開された米国特許出願公開第2007/0264249号これらの開示すなわち、上記4つの各特許公開は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるに開示されている状態のような他の状態も治療することができる。本明細書に開示される通りに産生されたLALを用いて、膵炎、例えば慢性膵炎および/または急性膵炎、ならびにアルコール性膵炎のようなアルコールによる膵臓損傷を含めた特定の状態を治療し得ることも企図される。本明細書に開示される方法のような任意の有用な方法により作製されたLALを用いて、特に限定されないが、体組織、例えば、特に限定されないが肝臓、脾臓、消化管および心血管組織などに脂質エステルの蓄積を生じるアルコールによる細胞損傷を含めたアルコールによる細胞損傷が原因の疾患を治療することが企図される。また本発明は、LAL投与による吸収不良の治療も企図する。本発明の一態様は、本明細書に記載の組換えヒトLALを含む治療有効量の組成物を患者に投与することを含む、患者を治療する方法に関する。患者は、LAL欠損症に関連した状態を含めたあらゆる状態に罹患しているか、またはそのような状態に罹患し得る。一実施形態では、治療有効量とは、患者の赤血球数を所望の量だけ増加させる量のことである。本発明に従って産生されたLALを用いて、例えば、組織がリソソーム酸リパーゼの産生を維持することができない慢性腎疾患を治療し得ることが企図される。また任意の有効な方法により作製されたLALが、タンジール病および家族性低アルファリポタンパク血症を有する患者の治療に有用であり得ることも企図される。タンジール病/家族性低アルファリポタンパク血症は、マクロファージ内でのコレステロールエステルの蓄積に関連し、肝脾腫大および/またはリンパ節腫脹とともに、LALの投与により治療可能な高密度リポタンパク質HDLの低下を伴う。例えば、本発明が特定の作用理論または作用機序に限定されることを望むものではないが、LAL活性の障害によりABCA1発現が減少し、逆に、タンジール病/家族性低アルファリポタンパク血症の患者へのLALの投与により得られたLAL活性の増加によりABCA1発現が増加し、多型性により機能活性が低下したABCA1遺伝子の影響が克服されると考えられる。一般に状態の治療では、投与量は既知の要因、例えば被投与者の年齢、健康状態、体重、併用する治療の種類、治療頻度などによって異なり得る。通常、活性成分の用量は体重1kg当たり約0.0001~約10ミリグラムの間であり得る。正確な用量、投与頻度および治療期間は、各治療用タンパク質投与の分野において熟練した医師により決定され得る。さらに、LAL欠損症の治療では1mg/kg以下が有効であり得ることが見出されている。本発明は、治療有効量のリソソーム酸リパーゼを5日に1回から25日に1回の間、例えば、7日に1回から14日に1回の間で哺乳動物例えば、患者、好ましくはヒト患者に投与することを含む、状態の治療法を提供する。一実施形態では、投与するリソソーム酸リパーゼの用量は、体重1kg当たり約0.1mg~約50mgの間であり、例えば、用量は1kg当たり約1mg~5mgの間であり得る。特に有用な一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の投薬計画のような任意の治療的に有効な投薬計画に従って、体重1kg当たり約0.1mg~1.0mgの間の用量のリソソーム酸リパーゼを投与することによる、状態の治療法を提供する。本発明は、治療有効量のLALの投与が有用であり得るLAL欠損症の任意の合併症を治療する方法を提供する。一実施形態では、本明細書に記載の方法により吸収不良および成長不全を治療し得る。別の実施形態では、本明細書で提供される方法を用いて、特に限定されないが肝腫大および肝障害を含めた、LAL欠損症患者で見られる合併症を治療し得る。本発明は、当該技術分野において理解されているような任意の有効なタンパク質発現系、例えば、トランスジェニック哺乳動物およびトランスジェニックトリにより産生され得る組換えLAL例えば、組換えヒトLALによる治療を提供する。他のタンパク質発現系としては、細胞培養系、細菌系および植物系を挙げ得るが、これらに限定されない。本発明は、組換えLALを薬学的に許容される組成物の一部として、当該技術分野において熟練した医師により判定される意図した治療効果を達成し得る任意の経路で投与することを包含する。例えば、血管アクセスポート例えば、留置ポートと接続された携帯型注入ポンプにより注入が容易になり得る。また本発明は、哺乳動物例えば、ヒト患者における状態、例えばウォルマン病およびCESDの臨床的および病理学的発症の監視も含む。一実施形態では、評価は、特に限定されないが脂質分析、胸部X線、肝機能検査、大便チャートstoolchart、血漿メバロン酸、免疫原性、血漿リソソーム酸リパーゼ、キトトリオシダーゼ、PARC、門脈圧亢進、身体計測、例えば画像技術を用いた肝臓、膵臓および消化管の体積および特徴付けで構成される。例えば、上記画像技術は、超音波、磁気共鳴画像法および核磁気共鳴分光測定で構成され得る。本発明を以下の実施例によりさらに例示する。実施例は単なる例示を目的とするものであり、いかなる形でも本発明を限定する意図はなく、また限定するものであると解釈されるべきではない。実施例1組換えヒトリソソーム酸リパーゼrhLALコード配列を担持するベクターpALVIN-OVR1-I-hLAL-dSAの構築pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSAベクター中のhLAL遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトリソソーム酸リパーゼ遺伝子GenBankアクセション番号:NP_000226により産生されるタンパク質のアミノ酸配列と同一のタンパク質をコードする図1。この配列の転写と、それに続く得られたmRNAの翻訳により399アミノ酸の前駆体タンパク質が産生され、これがプロセシングされて、配列番号1で記述されるヒトLALGenBankアクセション番号:NP_000226図1と同一の成熟した378アミノ酸タンパク質になる。本実施例のhLAL遺伝子cDNA配列に関する図2を参照の発現は、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、ならびに5’および3’非翻訳配列を含むオボアルブミン遺伝子由来の非コード要素により制御される。オボアルブミン遺伝子は、卵白の主要なタンパク質成分であるオボアルブミンを産生する。ニワトリオボアルブミンプロモーターの活性は、卵白を産生するニワトリ輸卵管内の細胞に極めて特異的であり、他の組織での発現は極めて少ない。プラスミドベクターpALVIN-0VR1-I-hLAL-dSA図3A;ヌクレオチド配列は図4に示されているを用いて、創始動物XLL109のゲノム内にhLAL導入遺伝子を安定に組み込む複製欠損型レトロウイルスRDRを作製した。このプラスミドベクターは、ウイルスRNAのパッケージング、逆転写および組込みに必要なレトロウイルスヌクレオチド配列を含むが、ウイルスのgag、polおよびenv遺伝子のためのインタクトな配列は含まない。レトロウイルスベクターを作製するために用いる方法およびそれに続く遺伝子導入手順でのその使用を本明細書に記載する。pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSAのレトロウイルス部分はALVベクターであるpNLBに基づく。LTRが自己不活性となるようにpNLBを改変したSIN図3B。これを達成するために、U3領域のエンハンサーおよびCAATボックスを含む273bpの3’LTRを削除した。レトロウイルス配列の3’末端の不活性化されたU3領域は、組み込まれたプロウイルスの5’末端に存在する新たなU3領域の鋳型として働くため、5’LTRも通常は不活性化される。SIN構築物中にあるLTR配列の削除により、内部プロモーターに対するLTRからのプロモーターの干渉が低下し、配列組換えによる複製型レトロウイルスの形成の可能性が最小限になる。新たなベクターを、ALV不活性化ベクターにちなんでpALVINと命名する。5’LTRの下流は、pNLBベクターから引き継がれた部分的gagおよびenvコード配列である。pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA中には、gagタンパク質前駆体配列の小さな一部12が残りp19成熟ペプチド配列の55、またRAV2のenv前駆体配列の小さな一部1.7が残っているGenBankアクセション番号:AF033808。これらの切り詰められたgagおよびenv領域は、複製型レトロウイルスを生じるのに必要な機能性タンパク質を産生することができないCosset、1991。ニワトリオボアルブミン遺伝子の転写制御要素および翻訳制御要素をpALVINに挿入して、pALVIN-OV-1.1-I配列は図6に示されている;配列番号8を作製した。pALVIN-OV-1.1-Iの第一の部分は、1.1kbの近位プロモーター領域、第一エクソン、第一イントロンおよび第二エクソンの一部を含むニワトリオボアルブミン遺伝子の連続した部分で構成されている。次の部分は、オボアルブミンタンパク質コード配列の代わりとなるスタッファー挿入フラグメントである。スタッファーの後には、ポリアデニル化を含めたmRNAの適切なプロセシングを促進する配列を含む、ニワトリオボアルブミン遺伝子の3’非翻訳領域UTRが続いている。一般にスタッファーフラグメントは、所望のタンパク質、この場合はhLALをコードするDNAフラグメントに置き換えられる。その結果、トランスジェニックニワトリ輸卵管内でのmRNAの制御された転写発現および翻訳を促進する特定の要素を有し、内因性オボアルブミンmRNAの調節を忠実に模倣し、卵白での目的タンパク質の高度な発現を可能にするベクターが得られる。pALVIN-OV-1.1-Iベクターはオボアルブミン遺伝子の第一イントロンを含む。イントロンはレトロウイルスRNAゲノムの生成およびパッケージングの間にスプライシングを受けやすいため、本発明者らはLTRに対して逆方向に発現カセットを挿入した。このようにして、イントロンはレトロウイルスRNA内で認識されなくなり、スプライシングされずにパッケージされる。便宜上、本明細書のすべてのマップは、LTRを反対方向にし、発現カセットを正方向または時計回りの方向にして描いてある。pALVIN-OV-1.1-Iを基本ベクターにして、そこにhLALのコード配列CDSを挿入した。hLALCDSおよびpALVIN-OV-1.1-Iとの適合性のために必要とされる配列を構成するhLALアダプターおよびSynhLALの2つのDNAフラグメントをIntegratedDNATechnologiesCoralville、Iowaにおいて合成した図7および8を参照されたい;配列番号9および10。hLALアダプターの229bpのHpal/BamHIフラグメントおよびSynhLALの1113bpのBamHI/BstBIフラグメントをpALVIN-OV-1.1-Iの7882Hpal/BstBIフラグメントに挿入することによりスタッファー領域をhLALCDSに置き換えて、pALVIN-OV-1.1-I-hLALを作製した。インタクトなレトロウイルスRNAのパッケージングを妨げる不可解なスプライス部位がhLALCDSのアンチセンス鎖内に存在するということが明らかになった。この不可解なスプライス部位を、hLALのアミノ酸配列を変化させずにDNA配列を改変することにより取り除いた。この改変をプライマー5’-AGAAACTGAGAGTGTCTTAT-3’配列番号12およびプライマー5’-TGACAGCTGTGGATCCAGAAACAAACATG-3’配列番号13を用いたpALVIN-OV-1.1-I-hLALの領域232~534のポリメラーゼ鎖増幅により行い、329bpのアンプリコンが作製された。このアンプリコンをBamHIおよびSexAIで消化し、pALVIN-OV-1.1-I-hLALの8940bpのBamHI/SexAIフラグメントに連結して、pALVIN-OV-1.1-I-hLAL-dSAを作製した。ニワトリオボアルブミン遺伝子のDNアーゼ高感受性部位IIIDHSIIIを含む推定プロモーターエンハンサーOVプロモーター開始部位から-3819~-2169の位置Kaye、Bellardら,1984をpALVIN-0V-1.1-I-hLAL-dSAに挿入して、pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSAを作製した。これは以下のように行った。DHSIIIエンハンサーと1.1kbのOVR1プロモーターと呼ばれる近位OVプロモーターとを含むDNAフラグメント図9を参照されたい;配列は配列番号11をXhoIおよびBlpIでの消化により単離した。サブクローニングを容易にするために、プライマー5’-GCCGCTCGAGCGAGGAATATAAAAAAATT-3’配列番号14および5’-TCCGCGCACATTTCCCCGAA-3’配列番号15を用いたpALVIN-OV-1.1-Iの領域6752~7974のPCR増幅、次いでNgoMIおよびXhoIでの消化により、アダプターフラグメントであるpSIN-OV-1.1-IのPCRを作製した。OVR1プロモーターの2772bpのXhoI/BlpIフラグメントおよびpSIN-OV-1.1-IのPCRの1067bpのNgoMI/XhoIフラグメントをpALVIN-OV-1.1-I-hLAL-dSAの7043bpのNgoMI/BlpIフラグメントに挿入して、pALVIN-0VR1-I-hLAL-dSAを作製したpALVIN-0VR1-I-hLAL-dSAの構築の略図に関する図10を参照されたい。pALVINと呼ばれるpAVIJCR-A395.22.3.1-KMまたはpALV-SINとしても知られるベクターのレトロウイルスベクターセグメントの構築は、米国特許出願第2008/0064862号に記載されている。さらに、2008年3月13日に公開された米国特許出願公開第2008/0064862号この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるに開示されているプロモーターおよび/またはベクターを用いた、本発明によるLALの産生が含まれる。実施例2ウイルス粒子作製レトロウイルス遺伝子導入法を以下のように用いて、G0創始動物である、hLAL導入遺伝子をゲノム中に担持するトランスジェニック雄のXLL109を作製した。不死化したニワトリ線維芽細胞系の一過性トランスフェクションにより、pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSAベクターを担持する複製欠損型ウイルス粒子を作製した。これらのニワトリ線維芽細胞を、pALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA、pCMV-gag-polおよびpCMV-VSV-Gの3つのプラスミドで同時にトランスフェクトした。pCMV-gag-polはトリ白血症ウイルスのRAVI株のgagおよびpol遺伝子を発現する。pCMV-VSV-Gは水疱性口内炎ウイルスのエンベロープタンパク質を発現する。トランスフェクションの4時間後に、培地を、10のウシ胎仔血清、100単位/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシンを添加したDMEMに置き換えた。トランスフェクションの48時間後に培地を回収し、0.45ミクロンのフィルターMilliporeでろ過し、超遠心分離により濃縮した。濃縮したALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA導入遺伝子を担持するレトロウイルスを収集し、初期段階の胚の形質導入に使用した。pはプラスミド型のベクターの記号であるため、導入遺伝子が一度、パッケージされたベクターまたは組み込まれた導入遺伝子の形態になれば、その導入遺伝子の名称にはpが付かないことに留意されたい。実施例3胚への遺伝子導入胚ゲノム内へのALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA発現カセットの組込みを、初期段階の胚の形質導入により行ったSpeksnijderおよびIvarie,2000。産んだばかりの白色レグホンの受精した卵を繁殖コロニーから入手した。胚に接触できるように殻に孔を開けた。上記ALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA発現カセットを担持する濃縮された複製欠損型レトロウイルス粒子を胚の胚下腔に7マイクロリットル注入した。熱接着剤で卵を密封し、次いで標準条件下でインキュベートして孵化させた。識別し追跡できるように、上記注入により作製された子孫に個体識別マーカーを孵化時に付けた。子孫の血液試料を、hLALコード配列に特異的なPCRプライマーを用いたリアルタイムPCRによりhLAL導入遺伝子を解析したところ、これらは導入遺伝子に関して陽性であった以下に記載する。これにより、遺伝子導入手順が成功したことが示された。hLAL導入遺伝子のリアルタイムPCRアッセイでは、Taqman登録商標化学AppliedBiosystemsを用いる。順方向および逆方向プライマーは、それぞれ5’-ACGACTGGCTTGCAGATGTCT-3’配列番号16および5’-CCCCAAATGAAGTCAAGATGCT-3’配列番号17であった。Taqman登録商標プローブ配列は5’-CCGGAATGCTCTCATGGAACACCAA-3’配列番号18であり、5’末端がFAMでエミッターとして、3’末端がIowaBlackでクエンチャーとして標識されていた。プライマー、プローブおよび1μlの抽出DNAを30μlのTaqman登録商標UniversalMasterMixAppliedBiosystemsに加えた。対照反応には、hLAL配列と野生型ニワトリ由来DNAとを有するプラスミドの各種希釈物が含まれていたデータ不掲載。AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystemに標準的なサイクリングパラメータを用いた。実施例4G0創始動物の同定性成熟した雄から精液を採取してDNAを抽出し、hLALリアルタイムPCRアッセイを用いてアッセイした。負の対照の精液DNAと混合した既知の基準物質hLAL遺伝子を有するプラスミドを用いて、各試料中の導入遺伝子コピー数を推定した。リアルタイムPCRによる推定では、雄XLL109の導入遺伝子カセットDNAの含有量は、その子孫に導入遺伝子を伝達することが可能なレベルであった。このXLL109雄をG0トランスジェニック創始動物とし、非トランスジェニックニワトリと交配させて、G1ヘミ接合性トランスジェニックニワトリを産ませた。実施例5ヘミ接合性G1ヘトリの繁殖および特徴付けトランスジェニック創始動物XLL109を親として産まれた子孫を、血液細胞DNA中の導入遺伝子の有無に関して、hLALリアルタイムPCRアッセイを用いて試験した。1~2週齢の子孫から血液を採取し、ハイスループット技術を用いてDNAを抽出したHarveyら,2002。ハイスループットスクリーニングを容易にするために、Taqmanアッセイの前にDNA溶液を定量化しなかった。通常、1μlのDNA溶液には、陽性増幅シグナルを生じるのに十分な50~400ngのDNAが含まれる。XLL109を親とする合計1,322羽のニワトリを試験し、陽性子孫から再び採血して確認のための試験を行った。PCRの結果から、22羽の子孫がALVIN-OVR1-I-hLAL-dSA導入遺伝子に関して陽性であった。Taqmanの結果の例を図11に示す。実施例6高発現系統の同定および特徴付けG1ニワトリの1羽である1LL7466が、卵白中に他のG1ニワトリに比べて有意に高いレベルのrhLALタンパク質を含む卵を産んだ。1LL7466および同胞のG1雄に関してサザンブロット解析を行って、高発現ニワトリと同じ組込み部位を有する同胞雄を同定した。導入遺伝子内で1回だけ切断する制限酵素BlpIにより消化を行い、サザンブロットをオボアルブミンプロモーターのセグメントまたはhLALコード配列でプローブした図12A~12D。第二制限部位の位置は隣接ゲノム領域内にあり、組み込みの部位によって異なる。したがって、OVプローブまたはhLALプローブにより検出されるBlpIバンドのサイズは、生じた各系統に固有のものである。OVプローブにより、野生型ニワトリ由来のBlpI消化DNAにおいて4.1kbの単一バンドが検出され、これはニワトリゲノムの内因性オボアルブミン遺伝子のBlpIセグメントの予測サイズに相当するものであった図12Bおよび12D。ニワトリ1LL7466で4.3kbの第二のバンドが検出され、これは導入遺伝子バンドに相当するものであった。3羽の追加の雌同胞1LL10409、1LL10686および1LL12058、ならびに3羽の追加の雄同胞1LL8922、1LL9330およびILL11217が4.3kbのバンドを示したが、このことは、これらの同胞が同じ系統であり得ることを示している図12Bおよび12D。ニワトリリソソーム酸リパーゼ遺伝子のDNA配列および組換えヒトリソソーム酸リパーゼのコード配列が、上記サザンアッセイで使用する条件下でハイブリダイゼーションが起こらないように十分に分化しているため、予想どおり、野生型ニワトリ由来のDNAではhLALプローブによりバンドが検出されなかった図12C。OVプローブにより検出された4.3kbバンドに関して陽性であった同じニワトリ由来のBlpI消化ゲノムDNAにおいて、hLALプローブにより約10.6kbの単一バンドが検出されたが、このことは、これら7羽のG1ニワトリが同じ組込み部位を有し、したがって同じ系統であることを示している。他のバンドが検出されなかったので、1LL7466、1LL10409、1LL10686、1LL12058、1LL8922、1LL9330および1LL11217はすべて単一の組込み部位を有することが示された。OVおよびhLALプローブにより検出されたバンドはサイズが異なり、また単独の導入遺伝子由来のバンドよりもサイズが大きいことから、導入遺伝子が組み込まれたということもサザン解析により示された。隣接ゲノム領域内での組込み導入遺伝子の予想される構造およびBlpI部位の位置を表すマップを図12Aに示す。導入遺伝子がインタクトであることを、2つの段階を踏んで確認した。最初に、PCRによりhLALコード配列を1LL7466から単離した。PCR産物の両鎖に関して、hLAL開始コドンから停止コドンまで配列決定を行った。DNA配列は全く予想どおりであり、このことは導入遺伝子内のコード領域のDNA配列が全く変化していないことを示していた。次に、インタクトな導入遺伝子を2つのセグメントである3.6kbおよび3.8kbに消化する制限酵素ApaLIを用いて、サザンブロット解析を行った図13A。G1由来のApaLI消化ゲノムDNAにおいて3.6kbおよび3.8kbのバンドがともに検出され、これにより、導入遺伝子が完全にインタクトな形で組み込まれたことが示された図13B。実施例7G2の繁殖および特徴付け単一のG0創始動物XLL109に由来するhLALG2の系統を図14に示す。G1の段階では、コピー数、整合性、hLAL配列および組込み部位に関して導入遺伝子の特徴付けを行い、7羽のG1トランスジェニックが同定され特徴付けされた4羽のニワトリおよび3羽の雄ニワトリ。G1雄親1LL8922、1LL9330および1LL11217から採取した精液で非トランスジェニックニワトリを人工授精してG2の繁殖を行った図14。受精させた各ニワトリ、その卵および次の子孫を他の子孫と隔離して飼育した。孵化した子孫を、hLAL導入遺伝子の有無に関してhLALリアルタイムPCRアッセイを用いて試験した。G1創始動物は導入遺伝子に関してヘミ接合性であるため、子孫の半数がトランスジェニックG2であることが予想された。これまでに解析した610羽のG2子孫のうち、330羽すなわち54がトランスジェニックであった。実施例8hLALトリの遺伝子解析各G2ニワトリを血液DNAのhLALリアルタイムPCRアッセイにより同定した後、産生系統に対して以下の遺伝子アッセイを行った:血液DNAからhLAL遺伝子をPCR増幅して配列決定を行い、ヒト配列との100同一性を確認し;上記のように組込み部位PCRにより導入遺伝子組込み部位を確認した。PCR配列決定および組込み部位解析を以下のニワトリに対して行った:10羽未満のニワトリ産生系統の各ニワトリ;11~100羽のニワトリ産生系統の10のニワトリ最低10羽;101~1000羽のニワトリ産生系統の5のニワトリ最低10羽;1001~10,000羽のニワトリ産生系統の1のニワトリ最低50羽;10,001を超えるニワトリ産生系統の0.1のニワトリ最低100羽。成長および産生の段階ごとに詳細な記録を続けた。実施例9卵白からのhLALの精製LALを含有する卵白EWをpH6で一晩可溶化し、0.2μmろ過を用いた遠心分離または深層ろ過により清澄化した。EWを1MNaOAc緩衝液pH4でpH6に調整した。清澄化したEWを、20mMリン酸/137mMNaCl緩衝液pH6で平衡化したフェニル-HICカラムEW:カラムサイズ=2:1に負荷した。負荷完了後、平衡化緩衝液および5mMリン酸緩衝液pH6でカラムを洗浄した。5mMトリス緩衝液pH7.2を含む30プロピレングリコールでLALを溶出させた。溶出したLAL画分を1Mの酸でpH5に調整した後、GigaCapSカラムEW:カラムサイズ=10:1に負荷した。カラムを50mMNaOAc緩衝液pH5で平衡化した。負荷完了後、平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。50mMNaOAc/60mMNaClpH5でLALを溶出させた。GigaCapSカラムからのLAL画分を1Mトリス緩衝液でpH6に調整した後、ブチル-HICカラムEW:カラムサイズ=10:1に負荷した。20mMリン酸/137mMNaCl緩衝液pH6でカラムを平衡化した。負荷完了後、平衡化緩衝液および5mMリン酸緩衝液pH6でカラムを洗浄した。5mMトリス緩衝液pH7.2を含む50プロピレングリコールで純粋なLALを溶出させた。卵白からのhLALの精製段階を図15に図示する。実施例10トランスジェニックトリ由来hLALの炭水化物分析当業者に公知の以下の分析技術を用いて、トリ由来ヒトLALのオリゴ糖構造を決定した。200マイクログラムを、1mMCaCl2を含有する0.1Mトリス-HClpH8.2中、37°Cで18時間、トリプシンおよびキモトリプシンにより消化した。C18カートリッジカラムにより、消化産物を濃縮し夾雑物を除去した。濃縮後、グリコペプチドを50μlの20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5中、37°Cで18時間、2μlのPNGアーゼF7.5単位/mlにより消化した。解離したオリゴ糖をSep-PakC18カートリッジカラムに通してペプチドおよび酵素から分離した。グリカン画分をジメチルスルホキシドに溶解させた後、AnumulaおよびTaylorの方法によりペルメチル化したAnumulaおよびTaylor,1992。水を加えて反応を停止させ、ジクロロメタンでペル-O-メチル化炭水化物を抽出した。ペル-O-メチル化グリカンを窒素流下で乾燥させた。MALDI/TOF-MSマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を、マトリックスとしてα-ジヒドロキシ安息香酸DHBA、50メタノール:水に溶かした20mg/mL溶液を用いて、反射装置陽イオンモードで行った。MicroflexLRFBrukerを用いて全スペクトルを得た。ペプチド主鎖からの解離および精製の後、オリゴ糖に関してMALDI-TOF-MS分析およびESIMS/MSエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析を当該技術分野において理解されている通りに行った。また個々の多糖種の試料を特定の酵素で消化し、消化産物を当該技術分野において理解されている通りにHPLCで分析した。ヒトLAL上には約6個のN-結合グリコシル化部位が存在すると考えられている。Zschenkerら2005J.Biochem.,Vol137,p387-394を参照されたいこの開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。またこの参照文献は、ヒトLAL上にはO-結合グリコシル化部位が存在し得るということも示唆している。同定されたN-結合オリゴ糖構造を図16に示す。多くのまたはすべてのこれらの構造が、本発明に従って産生されたLALにおいてはN-結合グリコシル化構造として見られるということが、データから明らかになった図16。例えば、本発明に従って産生されたLALにはA-nが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたLALにはO-nが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたLALには、B-n、C-nおよびD-nのうちの少なくとも1つが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたLALには、E-nおよびF-nのうちの少なくとも1つが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたLALには、I-nおよびJ-nのうちの少なくとも1つが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたLALには、K-nおよびL-nのうちの少なくとも1つが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたLALには、M-nおよびN-nのうちの少なくとも1つが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたLALにはG-nが結合していることが見出される。例えば、本発明に従って産生されたLALにはH-nが結合していることが見出される。実施例11トランスジェニックトリ由来LALのN-グリカン種トランスジェニックトリ由来hLALの精製試料600μg/試料を、Tube-O-Dialyzer4.0kDaカットオフ膜;GBiosciencesを用いて4°Cで約24時間、超純水nanopurewaterに対して透析し、塩およびその他の夾雑物を除去した。全透析時間の間に超純水を4回交換した。透析後、各試料を3つのアリコートに、すなわち、試料重量の約1/4を中性およびアミノ糖分析用に、試料重量の約1/4をマンノース-6-リン酸分析用に、試料重量の約1/2をオリゴ糖プロファイリング用に分けた。中性およびアミノ糖分析用のアリコートを100°Cで4時間、2Nトリフルオロ酢酸TFAにより加水分解し、マンノース-6-リン酸分析用のアリコートを100°Cで1.5時間、6.75NTFAにより加水分解した。次いで、加水分解物をN2下で乾燥させ、50μLのH20に再び溶解させ、氷中で7分間超音波処理し、注入バイアルに移した。ただし、中性およびアミノ糖試料は、元の溶解加水分解物から得られたピークが大き過ぎたため、希釈を2回行った。中性およびアミノ糖用の標準品とマンノース-6-リン酸用の標準品との既知のモル数の混合物を、試料と同じ方法で同じ時間だけ加水分解した。4種類の濃度の中性およびアミノ糖標準品混合物10μl当たり0.2、0.4、0.8および1.6ナノモルのFucとGalNAc;10μl当たり0.5、1.0、2.0および4.0ナノモルのGlcNAc;10μl当たり0.3、0.6、1.2および2.4ナノモルのGalとMan;ならびに10μl当たり0.1、0.2、0.4および0.8ナノモルのGlcならびにマンノース-6-リン酸l0μl当たり640、1280、2560、5120ピコモルを調製し、較正方程式を確立した。試料中の各糖のモル数を直線補間により較正方程式から定量化した。中性およびアミノ糖ならびにマンノース-6-リン酸を、グラジエントポンプと、電気化学検出器と、オートサンプラーとを備えたDionexICS3000システムを用いて、HPAECにより分析した。アミノトラップを有するDionexCarboPacPA203×150mm分析カラムにより、個々の中性およびアミノ糖ならびにマンノース-6-リン酸を分離した。グラジエントプログラムには、中性およびアミノ糖に溶離液A脱気したナノピュア水と溶離液B200mMNaOH、マンノース-6-リン酸に溶離液C100mMNaOHと溶離液D100mMNaOH中1Mの酢酸ナトリウムを用いた。注入10μL/注入を中性およびアミノ糖測定では40分毎に、マンノース-6-リン酸測定では35分毎に行った。すべての方法は、HardyおよびTownsendHardy,M.R.およびTownsend,R.R.,High-pHanion-exchangechromatographyofglycoprotein-derivedcarbohydrates,1994,MethodsEnzymol.230:208-225により記載されているプロトコルを基にした。機器制御およびデータ収集はDionexchromeleonソフトウェアを用いて行った。結果を下の表1に示す。対照試料はEWから精製したオボムコイドである。LALの構造的特徴LALは、そのアミノ酸配列中にN-結合グリコシル化のための6つの可能性のある部位、すなわちAsn36、Asn72、Asn101、Asn161、Asn273およびAsn321を有する。このうちの5つ、すなわちAsn36、Asn101、Asn161、Asn273およびAsn321がグリコシル化されているのに対し、Asn72は非グリコシル化または実質的に非グリコシル化である実質的に非グリコシル化であるとは、LAL分子の混合物中、Asn36、Asn101、Asn161、Asn273およびAsn321のいずれよりも少ないAsn72がグリコシル化されているという意味であることがわかった。したがって、本発明の一態様は、Asn72において非グリコシル化および/または実質的に非グリコシル化であるLAL例えば、ヒトLAL、ならびにそのようなLALの産生および使用である。ただし、グリコシル化Asn72を有するLALは本発明の範囲内にある。N-グリカン構造は主として、主要糖としてN-アセチルグルコサミン、マンノースおよびマンノース-6-リン酸M6Pを有する二分岐、三分岐および四分岐構造の混合物で構成されている。各部位は、本発明の一態様である有利な一式の構造表2および図17を有すると思われる。例えば、M6P修飾N-グリカンは、Asn101、Asn161およびAsn273に存在する。非リン酸化構造は、内因性卵白タンパク質に見られるN-グリカンの典型である。N-アセチルガラクトサミンGalNacがないことから判断されるように、O-結合グリカンは検出されなかった。シアル酸は検出されず、これは、本発明に従って産生された他の内因性および外来性タンパク質のすでに決定されているN-グリカン構造と一致する。本発明は、1つ以上の本明細書に開示されるオリゴ糖構造でグリコシル化されたLALを含む。方法中性糖、アミノ糖およびM6Pを含めた単糖組成を、高pH陰イオン交換クロマトグラフィー-パルスアンペロメトリック検出HPAEC-PADを用いて定性的および定量的に決定した。いくつかの質量分析法MALDI-TOF、NSI-MS/MSおよびグリコペプチドLC-MSのデータを用いて優勢なグリカンの構造を決定した。MALDI-TOFは中性N-グリカンの決定に有効であり、リン酸化N-グリカンを検出することができた図18。NSI-MS/MSを用いてMALDI-TOFスペクトル中の微小ピークの性質を決定したが、そのうちのいくつかはリン酸化N-グリカンによるものであった図19。MALDI-TOFのリン酸化N-グリカン検出能力を向上させる努力は実らなかった。グリコペプチドのLC/MSでは、中性およびリン酸化構造を決定することができ、またLALのアミノ酸配列中での特定の構造の位置を決定することができた図17および表2にデータをまとめる。HPAEC-PADクロマトグラムのどのピークがリン酸化N-グリカンによるものかを決定するために、LALをホスファターゼで処理して分析した図3。グループCおよびDのピークは曲線下面積AUCが減少したのに対し、グループAのピークはより顕著になった。グループBのピークは他のピークに比べて変化がなかった。保持時間が荷電リン酸化またはシアリル化によるものの程度に比例するという知識に基づけば、グループCは1つのリン酸を有するN-グリカンモノM6Pで構成され、グループDは2つのリン酸を有するN-グリカンビス-M6Pで構成されていると考えられる。また保持時間は、中性およびアミノ単糖の組成および相対的な構造上の位置にも影響された。このような例としては、ガラクトースの存在、二分岐GlcNacの存在およびGlcNac置換の程度が挙げられる。このような要素はHPAEC-PADクロマトグラムにおけるピークの多様性の一因となる。実施例12卵白中のトランスジェニックトリ由来hLALのinvitro酵素活性解析卵白中のリソソーム酸リパーゼの活性を、基本的にはYanら2006,AmericanJournalofPathology,Vol.169,No.3,p916-926この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるに記載されている通りに蛍光発生基質4-メチルウンベリフェリルオレアートアッセイを用いて決定した。4TritonX-100中2.5mMの4-MUOからなる4-メチルウンベリフェリルオレアート4-MUOのストック溶液を調製した。各ウェルが0.01Tween80中0.2Mのクエン酸ナトリウムpH5.562.5μl、12.5μlの卵白試料および25μlの2.5mM4-MUOを含むマイクロタイタープレートでアッセイを行った。Bio-TekSynergyHT蛍光測定マイクロプレートリーダー励起360nmおよび発光460nmを用いて37°Cで30分間、蛍光の変化をモニターした。アッセイ前に、hLALを含有する卵白を、直線的に少なくとも30分間続く反応を生じる酵素濃度になるまで希釈した。50μlの0.75MトリスHClpH8.0により反応を停止させ、上で使用したものと同じプレートリーダー励起360nmおよび発光460nmでエンドポイント蛍光シグナルを測定した。標準として4-メチルウンベリフェリルを用いて活性単位を決定した。1単位Uは、上記アッセイ条件下で1分間当たり1μmolの4-メチルウンベリフェリルの形成を生じる酵素量と定義される。hLALを含有しない卵白を負の対照として使用した。hLALに関して陽性の卵白試料は、卵白1mL当たり1U~100Uの間の活性を有していた。21羽のG1ニワトリの卵白を解析した。10羽のニワトリの卵白が、hLAL活性の試験で陽性であった。実施例13トランスジェニックトリ由来LALのinvitro解析トランスジェニックトリの輸卵管細胞内で産生されたLAL本明細書ではSBC-102、トリ由来LAL、LALまたはhLALと呼ぶが細胞と結合する能力およびリソソーム区画へ内部移行する能力を、マクロファージおよび線維芽細胞を用いてinvitroで調べた。マクロファージ細胞とインキュベートした場合、蛍光標識されたSBC-102がリソソームに局在していた。この作用はマンノース多糖競合物を用いて弱めることができたが、このことは、認識機序としてのN-アセチルグルコサミン/マンノースGlcNAc/マンノース受容体およびこれらの細胞による取込みを示唆している。SBC-102はinvitroにおいて、インキュベーション後にLAL欠損ヒト線維芽細胞および正常マウス線維芽細胞の細胞結合型LAL活性を増加させたが、このことは、SBC-102への曝露が、欠損した酵素活性の実質的な置き換えを生じ得ることを示している。マンノース-6-リン酸M6Pは、遍在するM6P受容体を介した多種多様な細胞型へのリソソーム酵素送達に関与することが示されているSBC-102のオリゴ糖構造内に存在する。LALを雌ニワトリトランスジェニックの卵白から精製した。OregonGreenNHSをInvitrogen商標0-10241から入手した。ラット肺胞マクロファージ系NR8383およびマウス線維芽細胞系NIH-3T3をATCCから入手した。LAL欠損Wolman病線維芽細胞をCoriellInstituteforMedicalResearchから入手し、LysoTracker登録商標RedをInvitrogen商標から入手した。酵素標識:PBS中の4mgのトランスジェニックトリ由来LALを、製造者の推奨に従ってOregonGreenで標識し、次いで反応物をPBSに対して透析した後、濃縮した。マクロファージによる取込み:蛍光標識したトランスジェニックトリ由来LAL5μg/mLおよびLysoTracker登録商標RedをNR8383細胞とともに2時間インキュベートした。細胞を共焦点蛍光顕微鏡により、488nm、次いで514nmにおいて連続スキャンモードを用いて調べた。マンナンによる競合阻害:蛍光標識したSBC-1025μg/mLおよびマンナンをNR8383細胞とともに2時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、エンドポイントとして中央値の蛍光強度を用いた蛍光標示式細胞分取法により、LAL取込みを測定した。トランスジェニックトリ由来LALが取り込まれた後、標的細胞のリソソーム内に取り込まれる能力を、マクロファージ細胞系NR8383を用いて調べた。蛍光標識したトランスジェニックトリ由来LALおよびリソソームマーカーLysoTracker登録商標RedInvitrogen商標を細胞とともに2時間インキュベートした。次いで、連続スキャンモードを用いた共焦点蛍光顕微鏡により、上記細胞のリソソーム内でのトランスジェニックトリ由来LALとリソソームマーカーの共局在を調べた図20。LALはリソソームへの局在を示したが、このことは、各種入手源由来のrhLALを用いた同様のinvitro実験と一致する。GlcNAc/マンノース受容体に対するトランスジェニックトリ由来LALの結合特異性を、マクロファージ細胞系NR8383を用いた競合結合アッセイにより評価した図21。5μg/mLの蛍光標識したOregonGreenトランスジェニックトリ由来LALおよび各種濃度のマンノース含有オリゴ糖であるマンナンを細胞とともに2時間、共インキュベートした。無マンナン対照と比較した、トランスジェニックトリ由来LAL取込みのマンナンによる相対的阻害を、エンドポイントとして中央値の蛍光強度を用いた蛍光標示式細胞分取解析により定量化した。トランスジェニックトリ由来LALの結合/取込みにおけるマンノース用量依存的な阻害が観察されたが、このことは、トランスジェニックトリ由来LAL:GlcNAcR相互作用と一致する。さらに、マンノース-6-リン酸を用いた競合実験により、線維芽細胞でのマンノース-6-リン酸仲介による取り込みが示された結果は不掲載。トランスジェニックトリ由来LALへの曝露が細胞内のLAL活性を増加させる能力を、正常細胞およびLAL欠損細胞の両方を用いてvitroで調べた。Wolman病患者から分離された線維芽細胞および正常マウス線維芽細胞NIH-3T3を、0、0.16または0.5μg/mLの濃度のトランスジェニックトリ由来LALの存在下で5時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して非特異的シグナルを除去し、4-MUO基質を用いて、細胞溶解物をLAL活性に関してアッセイした。内因性の細胞結合型LAL活性は、NIH-3T3に比べてWolman病線維芽細胞で低く、またトランスジェニックトリ由来LALとのインキュベーション後に、両細胞型で活性の用量依存的増加が見られた図22。実施例14トランスジェニックトリ由来LALのinvivo解析LAL欠損Yoshidaラットすなわち、ホモ接合型Kuriyamaら1990,JournalofLipidResearch,vol.31,p1605-1611;Nakagawaら1995,JournalofLipidResearch,vol.36,p2212-2218;ならびにYoshidaおよびKuriyama1990,LaboratoryAnimalScience,vol.40,p486-489を参照されたいを、4週齢から始めて週1回で4週間、SBC-1025mg/kg、IVまたはプラセボで処置した。各投与では、SBC-102を30分おきに2つの等しい用量2.5mg/kgでラット尾静脈内に注射した。最終投与の1週間後にラットおよび同齢野生型対照を調べた。三重反復で解析を行った。SBC-102処置個体の肉眼的病理検査では、臓器サイズの減少に加えて、肝臓の色の正常化が示された。SBC-102処置ラットは、泡沫状のマクロファージがかなり蓄積している溶剤処置ラットとは極めて対照的に、実質的に正常な肝臓組織増を示した。LAL-/-ラットにおいて上昇する血中アラニントランスフェラーゼおよびアスパラギン酸トランスフェラーゼレベルもSBC-102処置ラットでは減少していた不掲載。各ラットの内部臓器および組織の質量を決定した。そのデータを図23に示す。臓器サイズは、LAL-/-ラットおよびLAL/ラットにおいて、溶剤またはSBC-102を5mg/kgで週1回、4週間投与した後に、8週齢で決定された体重のパーセントとして表されている。図24に示すように、SBC-102処置または溶剤処置Yoshidaラットの体重を野生型ラットのものと比較した。LAL-/-ラットには、SBC-1025mg/kgまたは溶剤を単回用量または分割用量4時間以内に投与として、IV注射により投与した。LAL/ラットは同齢の同腹子対照である。実施例15トリグリセリド解析野生型、ホモ接合型プラセボ処置およびホモ接合型SBC-102処置のラットの肝臓および脾臓組織に関してトリグリセリド解析を行った。トリグリセリド解析は標準的な方法すなわち、MBLInternational社のTriglycerideQuantificationKit、カタログ番号JM-K622-100を用いて、三重反復で行った。肝臓の基質レベル図25は、WTおよびLAL欠損ラットにおいて、溶剤またはSBC-102を5mgkg-1で週1回、4週間投与した後に8週齢で決定された、肝臓のコレステロール、コレステリルエステルおよびトリグリセリドレベルを示している。実施例16用量反応実験上で行った研究に基づき、LALSBC-102の用量範囲および投与計画週1回および隔週の薬力学的PD効果をLAL-/-ラットで調べた。これらの実験では、SBC-102を0.2、1、3および5mg/kgで隔週または0.35、1および5mg/kgで週1回の用量で、4週齢から始めて1か月間、IV注射により投与した。結果は、体重BW増加図26、臓器肥大図27および組織基質レベル図28の改善を示した。血中トランスアミナーゼレベルもSBC-102用量の増加に伴って減少し、高用量ではそのレベルは実質的に野生型のレベルに達した。実施例17ラットモデルにおける組換えLALの投与体重、組織中トリグリセリドおよびコレステロール、肝腫大、脾腫、リンパ節腫脹、腸重量、ならびに他のパラメーターに対する組換えヒトリソソーム酸リパーゼLAL反復投与の効果を、YoshidaおよびKuriyama1990,LaboratoryAnimalScience,vol.40,p486-489に記載されているLAL欠損DonryuラットKuriyamaら1990JournalofLipidResearch,vol.31,p1605-1611;Nakagawaら1995,JournalofLipidResearch,vol.36,p2212-2218も参照されたいこの開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるにおいて評価した。LAL欠失に関してホモ接合型LAL-/-の4週齢のDonryuラットを、トランスジェニックニワトリ輸卵管系で産生された組換えヒトLALまたは生理食塩水プラセボを投与する群に振り分けた。野生型で同齢の同腹子ラットを対照として用いた。LALLAL-/-ラットには、週1回で4週間合計で4用量または隔週で4週間合計で2用量、単回用量として、または30分おきに投与する2つの等しい用量で尾静脈注射により投与した。LALの用量は1mg/kgまたは5mg/kgであった。投与計画を表4に示す。潜在的なアナフィラキシー反応を抑えるために、リソソーム蓄積症治療のための酵素置換療法の動物モデルにおける以前の実験Shullら1994,ProceedingsoftheNationalAcademyofScience,vol.91,p.12937;Bielickiら1999,TheJournalofBiologicalChemistry,274,p.36335;Voglerら1999,PediatricResearch,45,p.838この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるに基づく手順で、ラットにジフェンヒドラミン5mg/kgを前処置した。図29は、1週間当たり1mg/kgのLAL、1週間当たり5mg/kgのLALまたは2週間当たり5mg/kgのLALを投与したラットの毎日の体重増加の経過を示している。図では、2つの用量サイズおよび頻度の間で治療効果にほとんどまたは全く差がないことがわかる。組換えLALで処置したLAL-/-ラットの病理学検査実施例1に記載されている実験の終わりに、実験動物を人道的に安楽死させて剖検を行い、肉眼的病理、組織病理および臨床化学の検査を行った。肉眼的剖検には、体の外表面、すべての開口部、ならびに頭蓋腔、胸腔、腹腔およびそれらの内容物の検査が含まれていた。ラットの内部臓器および組織の質量を決定し、臓器および組織を採取して、10中性緩衝ホルマリンで固定した。固定後、組織を処理してヘマトキシリン/エオシン染色切片のスライドを作製し、評価した。分析した処置個体の肉眼的病理検査では、図30の解剖で見られるように、肝臓のサイズおよび色がかなり正常化しているが示された。器官対体重の重量比を決定し、これにより、プラセボ処置ラットに比べて、治療が成功した解剖個体の肝臓、脾臓、腸間膜組織、十二指腸、空腸および回腸の相対的な臓器サイズの減少が示された図23。分析した処置ラットのLALの肝臓組織の組織病理は、基本的に正常な肝臓組織像を示し、泡沫状のマクロファージがかなり蓄積しているプラセボ処置ラットとは極めて対照的であることを示している図30。実施例18組換えLAL投与によるウォルマン病WDの治療生後の体重増加が困難で発育が悪いため、女児患者を生後7週間で入院させる。最初の身体検査で、患者は体重が3.6kg出生時体重が3.7kgで痩せており、弛緩性皮膚によるしわが見られる。腹部は膨張し、6cmの硬い肝腫大および約4cmの硬い脾腫大が見られる。鼠径部にリンパ節肥大が認められ、筋肉活動が弱い。最初のヘモグロビンレベルが9.2gm、血小板数が506,000および白血球が11,550である。尿検査は正常であり、骨髄塗抹標本では空胞のあるリンパ球および多数の泡状細胞が見られる。血化学測定値は、総脂質が834mg/100ml、リン脂質が176mg/100ml、トリグリセリドが141mg/100ml、コレステロールが129mg/100ml、ビリルビンが0.3mg/100ml、アルカリホスファターゼが9.0BU、SGOTが90単位、SGPTが50単位、コリンエステラーゼが20単位、尿素窒素が8.3mg、空腹時血糖が45mg/100mlである。腹部CTスキャンでは、肝脾腫大および石灰化を伴った左右相称の副腎肥大が見られる。患者に投薬用の静脈アクセスポートを外科手術により埋め込む。ポートを携帯型注入機に接続した後、発生し得るなアナフィラキシー性の注入反応を抑えるために、LAL注入の20分前に患者を1mg/kgのジフェンヒドラミンで前処置する。次いで、静脈内注入によりLALを1mg/kgで5時間にわたって患者に投与する。この治療法を7日に1回、無期限で繰り返す。最初のLAL投与の2週間以内に、患者は体重増加および超音波により判定される重要な腹部臓器のサイズの正常化における著しい改善を経験する。検査結果は、LALの注入により、患者のリソソーム酸リパーゼ活性が回復し、関連する異常が修正されたことを示す。実施例19組換えLAL投与によるコレステリルエステル蓄積症CESDの治療そう痒性の腹部発疹を有する3歳男児をかかりつけの小児科医が検査する。腹部の検査では、医師により肝腫大が認められ、超音波により確認される。この時点で診断は下されず、患者は定期的にモニターされる。8歳で患者は胃腸炎で入院する。肝生検の光学顕微鏡検査では、肝細胞の細胞質内グリコーゲンおよび小脂肪滴の増加が見られる。電子顕微鏡検査では、小型で高電子密度の顆粒を有する、膜で囲まれた脂肪滴が見られる。III型グリコーゲン蓄積症脱分枝酵素欠損症の作業診断workingdiagnosisが下されるが、皮膚線維芽細胞の脱分枝酵素活性は正常である。10歳で肝腫大は続き、2回目の肝生検を行う。光学顕微鏡検査では肝臓実質の小葉構造の変化が見られ、肝細胞が細胞質顆粒および空胞を含んで腫脹し、軽度の門脈周囲線維症を伴っている。線維芽細胞の酸リパーゼ活性は正常の7であることがわかり、CESDの診断が確定される。総コレステロールTC、トリグリセリドTG、低密度リポタンパク質コレステロールLDL-Cの各血漿中濃度はそれぞれ7.51、3.24および5.58mmol/Lで、その年齢性別の95パーセンタイルを上回り、また血漿中高密度リポタンパク質コレステロールHDL-Cは0.47mmol/Lで5パーセンタイルを下回っており、患者は複合型の高脂血症高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低アルファリポタンパク血症および高ベータリポタンパク血症である。患者に投薬用の静脈アクセスポートを外科手術により埋め込む。ポートを携帯型注入機に接続した後、発生し得るアナフィラキシー性の注入反応を抑えるために、LAL注入の20分前に患者を5mg/kgのジフェンヒドラミンで前処置する。次いで、静脈内注入によりLALを5mg/kgで5時間にわたって患者に投与する。この治療法を14日に1回、無期限で繰り返す。最初のLAL投与の2週間以内に、患者は体重増加および超音波により判定される重要な腹部臓器のサイズの正常化における著しい改善を経験する。検査結果は、LALの注入により、患者のリソソーム酸リパーゼ活性が回復し、関連する異常が修正されることを示す。実施例20医薬品の説明および組成本明細書に記載のLALSBC-102の原薬は、トランスジェニックニワトリにより産生された卵白から精製された組換えヒトリソソーム酸リパーゼrhLALである。SBC-102で使用される添加剤は、現在市販されているリソソーム蓄積障害LSD用の他の製品で使用されているものと同様であり、製剤の安定性を維持するように選択されている。SBC-102は無色透明で無菌の液体であり、FluroTec登録商標でコーティングした非天然ラテックスブチル製ストッパーとアルミニウム製クリンプシールとを備えた透明なI型ホウケイ酸ガラスバイアルに入れて提供される。SBC-102は、SBC-1022mg/mL、クエン酸三ナトリウム二水和物13.7mg/mL、USP、クエン酸一水和物1.57mg/mL、USP、ヒト血清アルブミン10mg/mL、USPおよび注射用水最終体積分、USPで構成される水溶液として提供される。SBC-102のpHは5.9±0.2である。SBC-102は保存剤を含まず、バイアルは単回使用が意図される。製剤の成分上記明細書の各例は本発明を説明するために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。実際、本発明の範囲または趣旨を逸脱することなく、本発明におおける種々の修正、組合せ、追加、削除および変更が可能であることが、当業者には明らかであろう。例えば、1つの実施形態の一部として説明または記載されている特徴を別の実施形態で用いて、さらなる実施形態をもたらすことが可能である。本発明は、このような修正、組合せ、追加、削除および変更を包含するものとする。上記明細書に引用されている文献例えば、米国特許、米国特許出願、刊行物はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の種々の修正および変更は、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、その例となる実施形態に触れながら具体的に示され、記載されているが、当業者は、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本発明において形態および詳細の種々の変更を行い得るということを理解するであろう。"