"微生物油を含む生成物であって、前記油が約-5°C未満の流動点を有し、及び前記微生物油の脂肪酸組成が、少なくとも50のC18:1及び10未満のC18:2である、生成物。約-10°C~約-40°Cの流動点を有する、請求項1に記載の生成物。前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも60のC18:1である、請求項1又は2に記載の生成物。前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも70のC18:1である、請求項1~3のいずれか一項に記載の生成物。前記微生物油の脂肪酸組成が5未満のC18:2である、請求項1~4のいずれか一項に記載の生成物。前記微生物油の脂肪酸組成が、少なくとも80のC18:1及び5未満のC18:2である、請求項1~5のいずれか一項に記載の生成物。250°C~375°Cの引火点、又は300°C~450°Cの燃焼点を有する、請求項1~6のいずれか一項に記載の生成物。前記微生物油のヨウ素価が25~200である、請求項1~7のいずれか一項に記載の生成物。流動点降下剤をさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の生成物。潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体である、請求項1~9のいずれか一項に記載の生成物。誘電性流体である、請求項1~10のいずれか一項に記載の生成物。前記誘電性流体が20kV~75kVの絶縁破壊電圧を有する、請求項11に記載の誘電性流体。20MV/mRMS~75MV/mRMSの絶縁耐力を有する、請求項11又は12に記載の誘電性流体。抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物をさらに含む、請求項11~13のいずれか一項に記載の誘電性流体。前記微生物油が、1つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌により生成される、請求項1~14のいずれか一項に記載の生成物。前記遺伝子操作された細菌がPrototheca又はChlorellaである、請求項15に記載の生成物。前記遺伝子操作された細菌がProtothecamoriformisである、請求項16に記載の生成物。前記1つ以上の外来遺伝子がショ糖インベルターゼ又は脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする、請求項15~17のいずれか一項に記載の生成物。前記1つ以上の外来遺伝子が2つ以上の脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする、請求項18に記載の生成物。前記1つ以上の外来遺伝子がショ糖インベルターゼ及び1つ以上の脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする、請求項18に記載の生成物。遺伝子操作された細菌により生成された微生物油を含む誘電性流体であって、約-10°C~約-40°Cの流動点を有する誘電性流体。前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも50のC18:1及び10未満のC18:2である、請求項21に記載の誘電性流体。前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも70のC18:1である、請求項21又は22に記載の誘電性流体。前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも70のC18:1及び5未満のC18:2である、請求項21~23のいずれか一項に記載の誘電性流体。前記遺伝子操作された細菌がPrototheca又はChlorellaである、請求項21~24のいずれか一項に記載の誘電性流体。前記細菌がProtothecamoriformisである、請求項25に記載の誘電性流体。請求項21~26のいずれか一項に記載の誘電性流体を含む電気部品。変圧器である、請求項27に記載の電気部品。RBD微生物油を生成する方法であって、前記微生物油が約-5°C未満の流動点を有し、及び前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも50のC18:1及び10未満のC18:2である方法において、a.1つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌を、前記細菌が乾燥重量で少なくとも10の油を有するまで育てることと;b.前記細菌から前記油を分離することと;c.前記油を精製、漂白、脱臭又は脱ガムに供してRBD微生物油を生成することとを含む方法。前記微生物油が約-10°C~約-40°Cの流動点を有する、請求項29に記載の方法。抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物を前記RBD油に添加することをさらに含む、請求項29又は30に記載の方法。前記遺伝子操作された細菌がPrototheca又はChlorellaである、請求項29~31のいずれか一項に記載の方法。前記遺伝子操作された細菌がProtothecamoriformisである、請求項30に記載の方法。前記1つ以上の外来遺伝子がショ糖インベルターゼ又は脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする、請求項29~33のいずれか一項に記載の方法。前記1つ以上の外来遺伝子が2つ以上の脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする、請求項34に記載の方法。前記1つ以上の外来遺伝子がショ糖インベルターゼ及び1つ以上の脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする、請求項34に記載の方法。微生物油を含む生成物を生成する方法であって、前記生成物が約-5°C未満の流動点を有し、及び前記微生物油の脂肪酸組成が少なくとも50のC18:1及び10未満のC18:2である方法において、a.第1の微生物油を精製、漂白、脱臭又は脱ガムに供してRBD油を生成することであって、前記RBD油が初期流動点及び第1の温度によって特徴づけられることと;b.前記RBD油の温度を、前記第1の温度より低い第2の温度に下げることと;c.前記RBD油を前記第2の温度に保持することと;d.前記RBD油を前記第2の温度で濾過して、前記初期流動点より低い第2の流動点であって、約-5°C未満である第2の流動点によって特徴づけられる第2の微生物油を提供することとを含む方法。前記微生物油が約-10°C~約-40°Cの流動点を有する、請求項37に記載の方法。抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物を前記第2の微生物油に添加することをさらに含む、請求項37又は38に記載の方法。a.1つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌を、前記細菌が乾燥重量で少なくとも10の油を有するまで育てることと;b.前記細菌から前記油を分離して前記第1の微生物油を生成することとにより前記第1の微生物油を生成することをさらに含む、請求項37~39のいずれか一項に記載の方法。前記第1の温度が15°C超~約50°Cであり、及び前記第2の温度が約-15°C~約15°Cである、請求項37~40のいずれか一項に記載の方法。前記生成物が、潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体である、請求項37~41のいずれか一項に記載の方法。前記生成物が誘電性流体である、請求項42に記載の方法。前記誘電性流体が、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物をさらに含む、請求項43に記載の方法。ミネラルベースの油に対するバイオベースの油の主な欠点は、バイオベースの油の酸化的な不安定性、バイオベースの油の高い生産コスト、及びミネラルベースの油からバイオベースの油への設備の移行であるSchneider2006、前出を参照。バイオベースの誘電性流体は誘電性流体市場の大きい割合を占めているが、現在のところ、市場ではミネラル油ベースの誘電性流体が優勢である。別の大きい欠点は、このような大豆ベースの油の生産コスト及び重要な食料供給源の非食料用途への転用である。特定の実施形態では、本発明は、流動点が改善された微生物油、そのような油を製造する方法、及びそれから得られる生成物を提供する。流動点は、トリグリセリド油脂の飽和脂肪酸の不飽和脂肪酸に対する相対濃度及び脂肪酸の鎖長との関数である。本発明の方法の実施形態では、ステアリン画分として知られるパルミチン酸及びステアリン酸トリグリセリドを含む飽和画分の相対的な割合を低下させることにより、微生物油の初期流動点を低下させる。これらの方法では、油を画分化することにより、油の飽和トリグリセリド濃度を低下させる。これは、本発明の実施形態において、脱ろうの例示的な実施方法である乾式画分化によって達成することができる。この方法の一実施形態では、微生物例えば、藻類の油は、場合により最初に精製、漂白、脱臭又は脱ガムされ、初期流動点によって特徴づけられるRBD油を生じる。次にRBD油の温度を制御された形で低下させると、やがて結晶核が形成され、その後その最初の結晶化温度に保ってすなわち数時間、結晶を生じさせる。次に濾過により結晶を取り除き、2つの画分:ステアリン画分の一部又はほとんどを含有する固相、及び主としてオレイン画分を含有する液相を生じさせる。この液相は、初期流動点より低い第2の流動点によって特徴づけられ、例えば、第2の流動点は約-10°C~約-40°Cであってもよく、脂肪酸組成は少なくとも50のC18:1及び10未満のC18:2であってもよい。液相は、再び第2のより低い結晶化温度まで画分化に供され、ステアリンのさらなる除去が行われ得る。例示的な実施形態では、第1の結晶化温度は15°C超~約50°Cであり、第2の結晶化温度は約-15°C~約15°Cである。いかなる場合にも、得られる精製された液体画分は、植物油業界で一般的に知られるようなスーパーオレイン油と同等又は実質的に同様であり、天然藻類の油と比べて良好な熱特性を有する。ある実施形態では、それらの特性が化学的な流動点降下剤を加えることでさらに改善され、流動点降下剤は、特定の用途に望ましい場合があるように、流動点をさらに低下させるものである。この方法により提供される微生物油は、食品用途のみならず、潤滑剤、油圧作動液、工業用油industricaloil及び誘電性流体の生産のような工業用途にも使用することができる。工業用途例えば誘電性流体について、微生物油に流動点降下剤に加えて、又はそれに代えて加えることができる1つ以上の添加剤としては、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤又は抗加水分解性化合物が挙げられる。種々の実施形態では、微生物油は、1つ以上の脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼのようなタンパク質をコードする外来遺伝子を発現する組み換え細胞を含め、別個の脂質プロフィールすなわち、別個の脂肪酸プロフィールを有する微細藻類細胞のような油産生微生物から得られる。例示的な実施形態では、微生物油は、1つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌から得られ、及びこの方法は、細菌が乾燥重量で少なくとも10の油を有するようになるまで細菌を育てることと、その細菌から油を分離することとをさらに含み、それにより微生物油が生成され、次にその微生物油が、上述のように、精製、漂白、脱臭され、場合により脱ガムされ得る。酵母、真菌、及びバクテリアを含めた、同様の又は別個の脂質プロフィールを有する他の油産生微生物もまた用いることができる。特定の実施形態では、このように、本発明は、酵母、真菌及びバクテリアを含むそのような微細藻類及び/又は油産生微生物から、脂質及び誘電性流体を含む油ベースの生成物を製造する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、微生物油を含む生成物を提供し、ここで微生物油は約10°C~-約40°Cの流動点を有し、及び微生物油の脂肪酸組成は、少なくとも約50のC18:1及び約10未満のC18:2である。このような実施形態の変形例では、生成物は-10°C~約-40°Cの流動点を有する。生成物中の微生物油は、例えば、少なくとも約60、少なくとも約70、又は少なくとも約80のC18:1を含むことができる。ある場合では、微生物油は、約5未満のC18:2を含むことができる例えば、少なくとも約80のC18:1及び約5未満のC18:2である。特定の実施形態では、生成物中の微生物油microbialoildは、約25~約200のヨウ素価を有する。微生物油は、特定の実施形態では、1つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌によって生成され得る。この目的での例示的な微生物としては、Prototheca属又はChlorella属の種例えば、Protothecamoriformisが挙げられる。このような微生物は、例えば、ショ糖インベルターゼ及び/又は脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする1つ以上の外来遺伝子を発現するように操作することができる。例示的な実施形態では、細菌は、2つ以上の脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼ又はショ糖インベルターゼ及び1つ以上の脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を発現するように操作される。種々の実施形態では、生成物は、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物のような1つ以上の添加剤を含む。例示的な生成物としては、潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体が挙げられる。誘電性流体dielecticfluidは、特に、上記に考察する添加剤の1つ以上を有し得る。ある場合では、微生物油をベースとする生成物は誘電性流体である。ある実施形態では、誘電性流体に使用される微生物油は、以下の属性の1つ以上を有する:i0.4μg/ml未満の総カロチノイド;ii0.001μg/ml未満のリコピン;iii0.02μg/ml未満のβ-カロチン;iv油1kgあたり0.02mg未満のクロロフィル;v油100gあたり0.40~0.60mgのγ-トコフェロール;vi油100gあたり3~9mgのカンペステロール;又はvii油1gあたり0.5mg未満の総トコトリエノール。ある場合では、誘電性流体は、以下の特性の1つ以上を有する:約110cSt未満、例えば、20~30cStの範囲の40°Cでの粘度;b約2~約15cSt、例えば4~8cStの範囲の100°Cでの粘度;c少なくとも35の40°Cでの粘度指数VI、無単位数、限定されないが、35~80のVI、80~110のVI、110~125のVIT、125~160のVI、及びある実施形態では160より大きいVIを含む;d-8~10°C以下の流動点液体が流動し得る最も低い温度、限定されないが、-20~-25°C以下の流動点、及びある実施形態では-30°C、又は-40°C以下の流動点を含む;eASTMD2882に等しい潤滑性;f低揮発性;g300°C以上の引火点を含む、150°C以上の引火点を含めた、高引火点;h150°C以上例えば、300°C超の燃焼点、300°C以上の引火点を含む;i酸及び塩基の存在下での分解抵抗性、良好な熱安定性、酸素との反応に対する低感受性、及び低中和価0.06以下、例えば0.03以下を含めた、低反応性;j高抗乳化度を含めた、良好な混和性;k1以下の25°Cでの力率、限定されないが、0.5以下、0.15以下、0.1以下、及びある実施形態では0.05以下を含む、l1.5以下の100°Cでの力率、限定されないが、1以下、0.3以下、及びある実施形態では0.1以下を含む;m高絶縁耐力;n低損失係数;o低電気伝導度;p高比熱、限定されないが、少なくとも0.39cal/gm/°Cの比熱、及びある実施形態では少なくとも0.45cal/gm/°C以上の比熱を含む;及びq生分解性である、すなわち微生物の存在下で二酸化炭素及び水に分解し、それにより誘電性流体の少なくとも15又はそれ以上が標準的な試験条件下で分解して、28日で生分解し、及びある実施形態では、このような条件下で30以上、又は70以上、又は100生分解する。本発明はまた、上述の誘電性流体を含む電気部品も提供する。特定の実施形態では、電気部品は変圧器である。本発明はさらに、微生物油を含む生成物を生成する方法を提供する。特定の実施形態では、この生成物は約-10°C~約-40°Cの流動点を有し、ここでこの微生物油の脂肪酸組成は少なくとも50のC18:1及び10未満のC18:2である。このような実施形態において、この方法は、1つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌を、その細菌が乾燥重量で少なくとも10の油を有するまで育てることと、次いで細菌から油を分離することとを含む。次いで微生物油が精製、漂白、脱臭、及び場合により脱ガムに供され、RBD油が生成される。この方法は、場合により、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物をRBD油に添加することをさらに含む。例示的な操作された微生物としては、Prototheca属又はChlorella属の種例えば、Protothecamoriformisを挙げることができる。このような微生物は、例えば、ショ糖インベルターゼ及び/又は脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする1つ以上の外来遺伝子を発現するように操作することができる。例示的な実施形態では、細菌は、2つ以上の脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼ又はショ糖インベルターゼ及び1つ以上の脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を発現するように操作される。一実施形態では、本発明は、誘電性流体を製造する方法を提供し、この方法は、a乾燥重量で少なくとも10の脂質である油産生細菌をもたらすように油産生細菌を育てる工程と、b油産生細菌から脂質を分離する工程と、c脂質を、精製、漂白、脱臭、脱ガム、及び結晶化又は乾式画分化による、又は脱ろうによる画分化からなる群から選択される少なくとも1つの処理工程に供する工程とを含む。この方法の特定の実施形態のいくつかでは、油産生細菌は、微細藻類、油産生酵母、油産生真菌及び油産生バクテリアからなる群から選択される。ある場合では、油産生細菌は、Rhodococcusopacusである油産生バクテリアである。ある場合では、油産生細菌は油産生真菌である。ある場合では、油産生真菌は、表3に列挙される種である。ある場合では、油産生細菌は油産生酵母である。ある場合では、油産生酵母は、表2に列挙される種である。ある場合では、油産生細菌は微細藻類である。ある場合では、微細藻類は、表1に列挙される種である。ある場合では、微細藻類はPrototheca属の微細藻類である。ある実施形態では、この方法により生成される誘電性流体は、以下の属性の1つ以上を有する:i0.05~0.244mcg/gの総カロチノイド;ii0.003mcg/g未満のリコピン;iii0.003mcg/g未満のβ-カロチン;iv0.045~0.268mcg/gのクロロフィルA;v38.3~164mcg/gのγ-トコフェロール;vi0.25未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロールstignasterol、又はβ-シトステロール;vii249.6~325.3mcg/gの総トコトリエノール;viii0.003~0.039mcg/gのルテイン;及びix60.8~261.7mcg/gのトコフェロール。ある実施形態では、この方法により生成される誘電性流体は、以下からなる群から選択される特性を有する:a約110cSt未満、例えば20~30cStの範囲の40°Cでの粘度;b約2~約15cSt、例えば4~8cStの範囲の100°Cでの粘度;c少なくとも35の40°Cでの粘度指数;d-15~-25°C以下を含め、-8~-10°C以下の流動点;eASTMD2882に等しい潤滑性;f150°C以上の引火点;g0.06以下の中和価;h1以下の25°Cでの力率;i少なくとも0.39cal/gm/°Cの比熱;及びj誘電性流体の少なくとも15又はそれ以上が、標準的な試験条件下において28日で分解するような生分解性。ある場合では、誘電性流体は、以下の添加剤の1つ以上と混合される:a抗酸化剤;b金属イオンの不活性化剤;c腐食防止剤;d解乳化剤;e耐摩耗添加剤;fマランスチレン共重合体malanstyrenecopolymer;g流動点降下剤、限定されないが、VISCOPLEX登録商標10-310又は1-133Rohmax-EvonikAdditivesGmbH、又はその他の、INFINEUM登録商標V-351InfineumUKlimitied、PMA-D110及びPMADのようなポリアルキルアクリレート類及びポリメチルアクリレート類を含む;又はhカルボジイミド;又はi合成エステル類又はjポリαオレフィンPAO又はkエストライドのエステル。別の実施形態では、本発明は、油産生微生物油を含む誘電性流体を提供し、ここで前記誘電性流体は約10未満のC18:2を含む。ある場合では、誘電性流体は約5未満のC18:2を含む。ある場合では、誘電性流体は約2未満のC18:2を含む。ある場合では、誘電性流体は少なくとも65のC18:1をさらに含む。ある場合では、誘電性流体は30未満のC16:0をさらに含む。ある実施形態では、微生物油が別の油とブレンドされ、それにより本発明の実施形態における誘電性流体が生成される。ある場合では、この他の油は、微生物油ではない。ある場合では、この他の油は、大豆、菜種、キャノーラ、パーム、パーム核、ココナツ、トウモロコシ、野菜くず、ナンキンハゼ、オリーブ、ヒマワリ、綿実、鶏脂、牛脂、豚脂、微細藻類、大型藻類、微生物、クフェア、亜麻、ピーナッツ、上質のホワイトグリース、ラード、カメリナサティバCamellinasativa、カラシの種子、カシューナッツ、オーツ麦、ハウチワマメ、ケナフ、キンセンカ、ヘルプhelp、コーヒー、亜麻仁亜麻、ヘーゼルナッツ、ユーホルビア、カボチャの種、コリアンダー、ツバキ、ゴマ、ベニバナ、イネ、アブラギリ、ココア、コプラ、ケシ、トウゴマの実、ピーカン、ホホバ、マカダミア、ブラジルナッツ、アボカド、油産生酵母、油産生バクテリア、石油、又は先述の油のいずれかの留出画分からなる群から選択される。ある実施形態では、誘電性流体中における他の油の含有量は、30未満である。ある場合では、誘電性流体中における他の油の含有量は、20未満である。ある場合では、誘電性流体中における他の油の含有量は、10未満である。ある実施形態では、誘電性流体中における微生物油の含有量は、50未満である。ある場合では、誘電性流体中における微生物油の含有量は、25未満である。ある場合では、誘電性流体中における微生物油の含有量は、10未満である。別の実施形態では、本発明は、以下の添加剤の1つ以上を含む誘電性流体を提供する:a抗酸化剤、限定されないがBHT及び他のフェノール類を含む;bCu、Znのような金属イオンの不活性化剤、限定されないがベンゾトリアゾールを含む;c腐食防止剤、限定されないがエステル硫酸及びコハク酸エステルを含む;d解乳化剤;e耐摩耗添加剤、限定されないが、ジチオリン酸亜鉛を含む;f流動点を低下させる添加剤、限定されないがマランスチレン共重合体malanstyrenecopolymer、及び限定されないがポリメタクリレート類を含め、ポリアルキルアクリレート類を含む;及びg加水分解から保護する化合物、限定されないがカルボジイミド類を含む。本発明のこれらの及び他の実施形態を、以下の本発明の詳細な説明において説明し、及び以下の例において例証する。上記で及び本出願全体にわたって考察される特徴のいずれも、本発明の種々の実施形態に組み合わせることができる。本発明は、本発明の特定の具体的な実施形態を示す添付の図面と併せて考慮される以下の説明を参照することにより、理解され得る。本発明は、一部には、Prototheca及び他の油産生微生物が、特定の実施形態では、生分解性潤滑剤、特にこれまでは主にミネラル油ベースであったエンジンオイル及び油圧作動液などの他の用途のなかでも、誘電性流体の生成に予想外に有利な特性を有するという発見からもたらされる。微生物油をベースとする潤滑剤は、チェーンソーバーにおける石油潤滑剤、掘削泥及び油、ストレート金属加工油剤、食品工業用潤滑剤、オープンギアオイル、生分解性グリース、油圧作動液、海洋用及び船外機関用潤滑剤、ウォータポンプ及び地下ポンプ用のオイル、レールフランジ用潤滑剤、ショックアブソーバ用潤滑剤、トラクター用オイル、農業機器潤滑剤、エレベータ用オイル、離型油、2サイクルエンジン用潤滑剤及び他の潤滑剤を代用することができる。本発明はまた、一部には、流動点が低下するように微生物油を改変する方法の発見からからもたらされる。脂質のトランスエステル化により長鎖脂肪酸エステルが得られる。他の酵素的及び化学的方法を、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン、及びアルケンが得られるように適合させてもよい。いくつかの用途では、誘電性流体に有用な炭化水素化合物が生成される。読者が読みやすいように、この詳細な説明をいくつかの章に分けている。第I章は、本明細書で用いる用語の定義を提供している。第II章は、本発明の方法の実施形態で有用な培養条件の説明を提供している。第III章は、遺伝子操作の方法及び材料の説明を提供している。第IV章は、Protothecaにより例示されるような微細藻類を具体的に参照して、ショ糖利用を可能にするための微生物の遺伝子操作の説明を提供している。第V章は、脂質生合成を改変するための遺伝子操作の説明を提供している。第VI章は、本発明の実施形態の微生物油及びそれから得られる誘電性流体のような生成物を作る方法を説明している。第VII章は、本発明のさまざまな実施形態を示す例を開示している。I.定義他の意味であると定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び化学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解している意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いられる多くの用語に関する一般的な定義に関する知識を与えるものである。Singletonetal.、DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology第2版、1994;TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnologyWalker編集、1988;TheGlossaryofGenetics、第5版、R.Riegeretal.編集、SpringerVerlag1991;HaleMarham、TheHarperCollinsDictionaryofBiology1991。本明細書で使用される場合、他の意味であると明記されていない限り、以下の用語は、それらに属する以下の意味を有する。微細藻類内で活性は、微細藻類内で機能を発揮する核酸を指す。例えば、トランスジェニック微細藻類に抗生物質耐性を付与するために、抗生物質耐性遺伝子を動かすために用いられるプロモーターは、微細藻類内で活性である。アシルキャリアータンパク質又はACPは、脂肪酸合成中に成長していくアシル鎖に、4’-ホスホパンテテイン部分の末端チオールにおいてチオールエステルとして結合するタンパク質であり、脂肪酸シンターゼ複合体の成分を含む。アシル-CoA分子又はアシル-CoAは、補酵素Aの4’-ホスホパンテテイン部分の末端チオールの位置で、チオールエステル結合によって補酵素Aに共有結合したアシル部分を含む分子である。抗酸化剤は、他の分子の酸化を阻害することが可能な分子である。抗酸化剤は工業製品に添加されることが多い。一般的な使用は、燃料中及び潤滑剤中で酸化を防止するための、並びにガソリン中でエンジン汚損残留物の形成を生じさせる重合を防止するための、安定剤としての使用である。抗酸化剤はまた、ゴム、プラスチック及び接着剤のようなポリマーにおいて、そのような材料の強度及び可撓性を失わせる酸化分解を防止するためにも、広く使用されている。抗加水分解性化合物は、化学的化合物が水と反応して分解するのを阻害する分子である。例えば、カルボジイミドを抗加水分解性化合物として用いることができる。抗加水分解性化合物は、特に、例えばSpecialChemから市販されている。耐摩耗添加剤は、構成部品の耐摩耗性及び耐引掻性を高めて機械寿命を延ばすための、流体例えば、潤滑油に対する添加剤である。耐摩耗添加剤は、機械部品間で油膜が壊れたときに金属同士が直接接触することを防止する。典型的には、添加剤は部品表面上の金属と反応して膜を形成し、この膜が摩擦面に対して摺動し得る。耐摩耗添加剤は、典型的には亜鉛及びリン化合物を含有する。耐摩耗添加剤の例としては、ジチオリン酸亜鉛ZDP、亜鉛ジアルキルジチオリン酸ZDDP、腐食防止剤及び抗酸化剤としても働く、リン酸トリクレシルTCP、高温での動作に使用される、ハロカーボン塩素化パラフィン、極圧での動作用、グリセロールモノオレエート、ステアリン酸150°C未満で可逆吸着過程によって表面に付着する、軽い接触条件に有用が挙げられる。面積百分率は、サンプル中の全ての脂肪酸を、検出前に脂肪酸メチルエステルFAMEに変換し、FAMEGC/FID検出法を用いて観察したピークの面積を指す。例えば、炭素原子14個で、不飽和部のない脂肪酸C14:0について、分離したピークが、任意の他の脂肪酸、例えば、C14:1と比較すると観察される。それぞれの種類のFAMEに対するピーク面積は、混合物中のその組成物における割合と正比例しており、サンプル中に存在する全ピークの合計に基づいて算出されるすなわち、[特定のピークの面積/測定した全ピークの合計面積]×100。本明細書に記載の油及び細胞の脂質脂肪酸プロフィールについて述べる場合、C8~C14が少なくとも4は、細胞中、又は抽出したグリセロ脂質組成物中の総脂肪酸のうち、少なくとも4が、炭素原子が8個、10個、12個又は14個の鎖長を有することを意味している。純培養は、他の生物によって汚染されていない、微生物の培養物を指している。バイオディーゼルは、ディーゼルエンジンの燃料として使用するのに適した、生物によって生成された脂肪酸アルキルエステルである。バイオマスは、細胞の成長及び/又は増殖によって生成する物質である。バイオマスは、細胞及び/又は細胞内成分、並びに、限定されないが、細胞によって分泌された化合物のような細胞外物質を含有していてもよい。バイオリアクターは、細胞を場合により懸濁物の状態で培養する、閉じられた筐体又は部分的に閉じられた筐体である。誘電性流体の絶縁破壊電圧は、誘電性流体がその絶縁特性を失うときの電圧である。触媒は、生成物の一部分とならずに、反応剤の化学反応を容易にするか、又は促進することができる、分子又は高分子複合体のような薬剤である。触媒は、反応速度を高め、その後で、同じ触媒が、生成物を得るための別の反応剤として作用してもよい。触媒は、一般的に、反応に必要な合計活性化エネルギーを小さくするため、反応がすばやく進行するか、又は低い温度で進行する。従って、反応の平衡状態にすばやく達し得る。触媒の例としては、生体触媒である酵素;生体触媒ではない熱;石油精製プロセスで用いる金属が挙げられる。セルロース系材料は、セルロースを消化して得られる物質であり、グルコース及びキシロース、場合により、二糖類、オリゴ糖、リグニン、フルフラール類及び他の化合物のようなさらなる化合物を含む。セルロース系材料の供給源の非限定的な例としては、サトウキビの絞りかす、テンサイパルプ、トウモロコシ茎葉、木片、おがくず、スイッチグラスが挙げられる。共生培養、及び共生生育及び共生発酵などのこの用語の変形は、同じバイオリアクター内に2種類以上の細胞が存在することを指す。2種類以上の細胞は、全てが微細藻類のような微生物であってもよく、異なる細胞種と共に培養された微細藻類細胞であってもよい。培養条件は、2種類以上の細胞の成長及び/又は増殖を進めるような条件であってもよく、又は、2種類以上の細胞のうち1種類、又は部分的な集合の成長及び/又は繁殖を容易にしつつ、残りの細胞の成長を維持する条件であってもよい。補因子は、酵素がその酵素活性を発揮するのに必要な、基質以外の任意の分子である。相補的DNA又はcDNAは、メッセンジャーRNAmRNAの逆転写又は増幅例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCRを介するによって通常得られるmRNAのDNA複写物である。腐食防止剤は、流体に添加されると、その流体と接触している金属又は合金の腐食速度を低下させる分子である。育てられた、及びこの語句の別の言い方である培養された、発酵されたは、選択した条件及び/又は制御された条件を利用することによって、1つ以上の細胞の成長細胞の大きさ、細胞成分が増え、及び/又は細胞活性が高まる及び/又は増殖有糸分裂によって細胞の数が増えるを意図的に進めることを指す。成長と増殖を組み合わせて、繁殖と呼ぶ場合もある。選択した条件及び/又は制御された条件の例としては、十分に定義されている培地pH、イオン強度、炭素源のような既知の特徴を有する、特定の温度、酸素圧、二酸化炭素濃度、バイオリアクター内の成長を用いることが挙げられる。育てることは、微生物の成長又は増殖が自然に起こること、又は人の介入なしに起こることを指さず、例えば、微生物が地中で最終的に化石化し、未精製油を生成するような天然の成長は、育てられたとは言わない。細胞溶解は、低張な環境における細胞の溶解である。細胞溶解は、細胞内側への過剰な浸透作用、又は水の移動によって生じる水分過剰。細胞は、内部の水の浸透圧に耐えられず、爆発する。脱脂した食料及び脱脂した微生物バイオマスは、機械的な力を使ってすなわち、連続圧搾機で圧縮して、又は溶媒抽出を利用して、又は両者を使って油脂質を含むを抽出するか、又は単離した後の微生物バイオマスである。脱脂した食料は、微生物バイオマスから油/脂質を抽出又は単離する前と比較して、油/脂質の量が減っているが、油/脂質はいくらか残っている。解乳化剤は、エマルション通常は液液エマルションを破壊するか、或いはその形成を防止する分子である。解乳化剤は、典型的には以下の化学物質をベースとする:酸触媒フェノールホルムアルデヒド樹脂、塩基触媒フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリアミン、ジエポキシド、ポリオール。これらの分子が通常エトキシ化及び/又はプロポキシ化され、望ましい水/油溶解度をもたらす。エチレンオキシドを添加すると水溶性が高くなり、一方、酸化プロピレンは水溶性を低下させる。市販の解乳化配合剤は、典型的には、キシレン、重質芳香族ナプサHeavyAromaticNapthaHAN、イソプロパノール、メタノール、2-エチルヘキサノール又はディーゼルのような1つ又は複数の担体溶媒中における2~4種の異なる化学物質の混合物である。誘電体又は誘電性流体は、通常の状況下で又はその使用目的の状況下で電流を伝導しない、又は電流の伝導度が極めて低い流体である。誘電性流体は、例えば変圧器及び他の電気装置において、電気絶縁、冷却及び潤滑に使用される。誘電性流体を利用する電気装置には、電源及び配電変圧器、回路遮断器、コンデンサ、開閉装置、X線機器、及び絶縁ケーブルが含まれる。材料例えば、絶縁体の絶縁耐力は、絶縁破壊、すなわちその絶縁特性の不良が生じるのに必要な最大電圧であり、単位厚さあたりのボルトとして表される。材料の絶縁耐力は、標準方法、例えばASTM試験方法D1816、D877、D3300、D117、D2413、D6180、D6181、又はD1310に従い決定することができる。発現ベクター、発現構築物、プラスミド又は組み換えDNA構築物は、例えば、組み換え手段又は直接的な化学合成によって、人の介入によって発生した核酸を指し、一連の特定の核酸エレメントは、宿主細胞内で特定の核酸を転写及び/又は翻訳することができる。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス又は核酸フラグメントの一部分であってもよい。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに動作可能に連結した、転写されるべき核酸を含む。外来遺伝子は、細胞に導入された形質転換されたRNA及び/又はタンパク質を発現するようなコードを有する核酸であり、導入遺伝子とも呼ばれる。形質転換された細胞は、組み換え細胞と呼ばれることもあり、この細胞に、さらなる外来遺伝子が導入されてもよい。外来遺伝子は、形質転換される細胞と異なる種に由来していてもよくつまり、異種、同じ種に由来していてもよいつまり、同種。従って、外来遺伝子は、この細胞のゲノムでは異なる位置にあるような同種遺伝子を含んでいてもよく、内在する遺伝子複製物と比較して、異なる制御下にある同種遺伝子を含んでいてもよい。外来遺伝子は、この細胞の2種類以上の複製物中に存在していてもよい。外来遺伝子は、ゲノムへの挿入物として細胞核又はプラスミド中に維持されてもよく、又はエピソーム分子として細胞中に維持されてもよい。外部から与えられたは、細胞培養物の培地に与えられた分子を指す。連続圧搾機で圧縮するは、大豆や菜種のような原材料から油を抽出する機械的な方法である。連続圧搾機は、スクリュー型の機械であり、ケージで覆われた円筒形の空洞を通すことによって材料を圧縮する。原材料は、圧搾機の片側から入り、ケーキが他方から出ていく間に、ケージ内にあるバーの間から油がしみ出て、集められる。この機械は、スクリューからの摩擦及び連続的な圧力を利用し、原材料を動かし、圧縮する。油は、固形物が通過することができない小さな開口部からしみ出る。原材料が圧縮されていくと、典型的には、摩擦によって熱が発生する。脂肪酸は、長い脂肪族末端鎖を有するカルボン酸である。脂肪酸の脂肪族部分は、完全飽和していても二重結合なし又は分子の1つ以上のさまざまな部分で不飽和であってもよい。ほとんどの天然に存在する脂肪酸は、4~28個の偶数の炭素原子の鎖を有する。脂肪酸は、トリグリセリド又は他の脂質、例えば、リン脂質、スフィンゴ脂質の構成要素であり得る。脂肪酸は脂質価によって特徴づけることができる。脂質価はC:Dの形式をとり、ここでCは脂肪酸中の炭素原子の数であり、Dは脂肪酸中の二重結合の数である。従ってC18:1は、18個の炭素及び1個の二重結合を有する脂肪酸を指し、一方C18:2は、18個の炭素及び2個の二重結合を有する脂肪酸を指す。脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼは、脂質合成中に、アシルキャリアータンパク質ACPから脂肪酸が開裂するのを触媒する酵素である。脂肪酸アシル-CoA/アルデヒド還元酵素は、アシル-CoA分子から一級アルコールへの還元を触媒する酵素である。脂肪酸アシル-CoA還元酵素は、アシル-CoA分子からアルデヒドへの還元を触媒する。脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素は、脂肪族アルデヒドからアルカンへの変換を触媒する酵素である。脂肪族アルデヒド還元酵素は、アルデヒドから一級アルコールへの還元を触媒する酵素である。材料の燃焼点は、裸火で点火後少なくとも5秒間燃焼し続ける温度である。燃焼点は、標準方法、例えばASTM試験方法D92又はD1310に従い決定することができる。引火点は、材料が気化して空中で着火性混合物を形成する最低温度である。引火点では、材料は着火し得るが、点火時に生じる蒸気は、燃焼を持続させるのに十分な速度では生じないこともある。引火点は、標準方法、例えばASTM試験方法D3278、D3828、D56、又はD93に従い決定することができる。固定炭素源は、培地中で、周囲温度及び周囲圧力で固体又は液体の形態として存在し、培地で培養されている微生物が利用することが可能な、炭素を含有する分子、典型的には有機分子である。従属栄養は、それが培養条件に関連するとき、固定炭素源を利用又は代謝する間に実質的に光が存在しない状態で培養することである。ホモジネートは、物理的に破壊されたバイオマスである。油圧作動液は、油圧系の動力伝達媒体として機能する流体である。炭化水素は、水素原子と炭素元素のみを含む分子であり、炭素原子は、直鎖、分枝鎖、環状、又は部分的に環状の骨格になるように共有結合しており、この骨格に水素原子が接続している。炭化水素化合物の分子構造は、最も単純で天然ガスの構成成分であるメタンCH4から、未精製油、石油、ビチューメン中にみられるアスファルテンのようなある種の分子のように、非常に重く、非常に複雑なものまでさまざまである。炭化水素は、気体、液体又は固体の形態であってもよく、これらの形態を任意に組み合わせた形態であってもよく、骨格内の隣接する炭素原子間に1つ以上の二重結合又は三重結合を有していてもよい。従って、この用語には、直鎖、分枝鎖、環状、又は部分的に環状のアルカン、アルケン、脂質、パラフィンが含まれる。例としては、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、オクタン、スクアレンが挙げられる。水素:炭素比は、原子単位であらわした、分子中の水素原子と炭素原子との比率である。この比率は、炭化水素分子中の炭素原子及び水素原子の数を述べるときに用いられ得る。例えば、最も大きな比率を有する炭化水素は、メタンCH4である4:1。疎水性画分は、水系相への溶解度よりも、疎水性相への溶解性が高いような、物質の一部分又は画分である。疎水性画分は、実質的に水には溶解せず、通常は非極性である。脂質収量の増加は、例えば、培養物1リットルあたりの細胞乾燥重量が増加すること、脂質を構築する細胞の割合が増えること、又は、単位時間あたりの培養容積1リットルあたり、脂質の合計量が増えることのような、微生物培養物の脂質生産性の増加を指す。誘発性プロモーターは、特定の刺激に応答し、動作可能に連結した遺伝子の転写に介在するプロモーターである。工業用油は、工業上有用な油である。一般的な工業用油としては、チェーンソーバー潤滑剤、金属加工液、食品級潤滑剤、ギヤオイル、海洋用オイル、エンジン潤滑剤、トラクター用オイル、農業機器潤滑剤、エレベータ用オイル、離型油などが挙げられる。チェーンソーバー潤滑剤は、チェーンソーのバー及びチェーンの外部潤滑に使用される。金属加工液は、金属ピースを有用な物体に成形加工するプロセスを冷却及び/又は潤滑するために使用される流体である。食品級潤滑剤は、食用獣肉、家禽肉及び他の食品を加工する設備、用途及び工場での使用が許容される潤滑剤である。ギヤオイルは、例えば、自動車、トラック、及び他の機械類の、変速装置、トランスファーケース、及び差動装置における、ギヤを潤滑させるのに有用な油である。海洋用オイルは、海洋機器の可動部品を潤滑させるのに有用な油である。エンジン潤滑剤は、さまざまな内燃機関の潤滑に使用される。主要な機能は可動部品を潤滑させることであるが、エンジン潤滑剤はまた、清掃し、腐食を抑制し、封止性を向上させ、及び可動部品から熱を取り除くことによってエンジンを冷却することもできる。トラクター用オイルは、トラクターの可動部品を潤滑させるのに有用な油である。農業機器潤滑剤は、農業機器の可動部品を潤滑させるのに有用な潤滑剤である。エレベータ用オイルは、油圧式エレベータで油圧作動液として使用される油である。離型油は、金型を用いる成形品の作製に有用な油である。離型油は金型からの成形品の離型を促進し、望ましい表面仕上げを提供する表面調整特性を有し得る。動作可能に連結した状態では、制御配列典型的には、プロモーター、連結した配列典型的には、タンパク質をコードする配列、コード配列とも呼ばれるのような、2個の核酸配列間の機能的な連結である。プロモーターは、遺伝子の転写に介在することができる場合、外来遺伝子と動作可能に連結した状態である。系中は、その場で又はその元々の位置でという意味である。ヨウ素価又はヨウ素数は、油の不飽和度の尺度である。これは、油中の不飽和結合により消費されるヨウ素の質量である。例えば、ヨウ素価が50の油は、100gの油が50グラムのヨウ素を消費し得る油である。ヨウ素価は、当該技術分野ではルーチン的に決定されている。ヨウ素価を決定する標準方法には、ASTMD5768-022006及びDIN53241が含まれる。栄養物の制限濃度は、培養している微生物の増殖を制限するような、培養物中の化合物の濃度である。栄養物の非制限濃度は、所与の培養期間中に、最大限の増殖を支援するような濃度である。従って、所与の培養期間中に生成する細胞の数は、栄養物が非制限濃度である場合よりも、制限濃度存在する場合には少なくなる。最大限の増殖を支援する濃度よりも多く栄養物が存在する場合には、培養物中に栄養物が過剰であると言われる。リパーゼは、水に不溶性の脂質基質内のエステル結合を加水分解するのを触媒する水溶性酵素である。リパーゼは、脂質がグリセロール及び脂肪酸に加水分解されるのを触媒する。脂質改変酵素は、脂質の共有構造を変化させる酵素を指す。脂質改変酵素の例としては、リパーゼ、脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼ、ステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼSAD及び脂肪酸アシルデサチュラーゼFADを含むデサチュラーゼ、並びに脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼが挙げられる。脂質経路に関連する酵素は、脂質代謝、すなわち、脂質合成、改変又は変性においてなんらかの役割をはたす任意の酵素であり、脂質を化学的に改変するタンパク質、及びキャリアータンパク質である。脂質は、非極性溶媒例えば、エーテル及びクロロホルムに可溶性であり、水には比較的溶けないか、完全に不溶性の分子種である。脂質分子は、主に、疎水性の性質を有する長い炭化水素鎖かららなるため、これらの性質を有している。脂質の例としては、脂肪酸飽和及び不飽和;グリセリド又はグリセロ脂質例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド又は天然の脂肪、ホスホグリセリド、グリセロリン脂質;グリセリド以外のものスフィンゴ脂質、コレステロール及びステロイドホルモンを含むステロール脂質、テルペノイド、脂肪族アルコール、ワックス、ポリケツドを含むプレノール脂質;複雑な脂質誘導体糖に連結した脂質、又は糖脂質、タンパク質に連結した脂質が挙げられる。脂肪は、トリアシルグリセリドと呼ばれる脂質の下位集団である。潤滑剤は、固体表面間に膜として導入されたときに摩擦、熱、及び/又は摩耗を低減することが可能な物質である。溶解物は、溶解した細胞内容物を含む溶液である。溶解すること又は溶解は、細胞内成分を少なくともいくらか放出させるのに十分な程度まで、生物有機体又は細胞の原形質膜、場合により、細胞壁を分断することである。金属イオン不活性化剤は、金属不活性化剤又は金属不活性剤MDAとしても知られ、金属イオンを不活性化する通常は封鎖することによって流体を安定化させるために用いられる燃料用及び/又は油用の添加剤である。金属イオンは、燃料中の天然に存在する酸及びシステムの金属部品による酸化プロセスによって潤滑剤中に生じた酸の作用により生じ得る。微細藻類は、葉緑体又はプラスチドを含み、場合により、光合成を行うことができる真核性微生物であるか、又は、光合成を行うことができる原核性微生物である。微細藻類には、固定炭素源をエネルギーとして代謝することができない偏性光合成独立栄養生物と、単に固定炭素源がないと生存することができない従属栄養生物とが存在する。微細藻類には、細胞分裂の直後に、妹細胞から分離するChlamydomonasのような単細胞有機体、2種類の別個の細胞型を有する単純な多細胞光合成細菌である、例えば、Volvoxのような細菌が含まれる。微細藻類は、Chlorella、Dunaliella、Protothecaのような細胞を含む。また、微細藻類には、Agmenellum、Anabaena、Pyrobotrysのような、細胞-細胞接着性を示す他の細菌の有機体も含まれる。また、微細藻類は、特定のdinoflagellatealgae種、及びPrototheca属の種のような、光合成を行う能力が失われている偏性従属栄養微生物も指す。微生物及び細菌は、微細な単細胞有機体である。自然に共発現するは、2種類のタンパク質あるいは遺伝子に関する際、例えば、2種類のタンパク質をコードする遺伝子が、共通の制御配列の制御下にあるため、又は、上述の2種類のタンパク質をコードする遺伝子が、同じ刺激に応答して発現するため、そのタンパク質又は遺伝子が、これらが誘導される組織又は有機体で自然に共発現することを意味する。油は、油産生酵母、植物、及び/又は動物を含む有機体により生成される任意のトリアシルグリセリド油脂を指す。脂肪と区別されるときの油は、特に指示されない限り、必ずしもというわけではないが、一般的には平均的な室温及び圧力で液状である脂質を指す。例えば、油には、限定なしに、アボカド、ブラジルナッツ、キンセンカ、カメリナ、カメリナサティバ、キャノーラ、カシューナッツ、トウゴマの実、ココアバターカカオとしても知られる、カカオ豆から得られるトリアシルグリセリド油脂で、典型的な室温及び圧力で固体である、ココナツ、コーヒー、コプラ、コリアンダー、トウモロコシ、綿実、クフェア、ユーホルビア、ヘーゼルナッツ、麻、ジャトロファ、ホホバ、ケナフ、亜麻仁、ハウチワマメ、マカダミア、カラシの種子、オーツ麦、オリーブ、ケシ、パーム、パーム核、ピーナッツ、ピーカン、カボチャの種、菜種、イネ、ベニバナ、ゴマ、大豆、ヒマワリ、及びシナアブラギリ、並びにこれらの組み合わせから得られる油を含めた、植物から得られる植物油又は種子油が含まれる。微生物油は、細菌から得られる油を指す。油産生酵母は、その乾燥細胞重量の20超を脂質として天然に蓄積することができる酵母を意味し、真菌類のDikarya亜界の酵母である。油産生酵母としては、限定されないが、Yarrowialipolytica、Rhodotorulaglutinis、Cryptococcuscurvatus、及びLipomycesstarkeyiのような有機体が挙げられる。浸透圧衝撃は、浸透圧が突然下がることによって、細胞が溶液中で破裂することである。浸透圧衝撃は、時に、誘発されてこのような細胞の細胞成分が溶液内に放出される。多糖分解酵素は、任意の多糖の加水分解又は糖化を触媒することができる任意の酵素である。例えば、セルラーゼは、セルロースの加水分解を触媒する。多糖類又はグリカンは、単糖類がグリコシド結合によって接続したもので構成される炭水化物である。セルロースは、特定の植物細胞壁を構成する多糖である。セルロースは、酵素によって解重合し、キシロース及びグルコースのような単糖類や、これより大きな二糖類及びオリゴ糖を生成し得る。流動点は、特定の一組の条件下で液体が流れる、又は流動する最低温度である。例示的な流動点規格としては、ASTMD97-11、D5853-11、及びD5949-10が挙げられるが、本明細書に記載される方法に関連して流動点の測定を行うにおいては、当業者に公知の、又は当業者が開発する他の規格も用いることができる。流動点降下剤又はPPDは、油又は潤滑剤におけるワックス状結晶の形成を制御するポリマーであり、その結果、流動点が降下し、低温での流動性能が向上する。プロモーターは、核酸の転写に関連する核酸制御配列である。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写開始部位の近くに、必要な核酸配列を含み、例えば、ポリメラーゼII型プロモーターの場合には、TATAエレメントを含む。また、プロモーターは、場合により、遠位エンハンサーエレメント又はリプレッサーエレメントを含み、これらは、転写開始部位から数千塩基対離れた位置にあってもよい。組み換え体は、外来の核酸を導入するか、又は天然の核酸を変えることによって改変された細胞、核酸、タンパク質又はベクターを指す。従って、例えば、組み換え細胞は、この細胞の天然の組み換えされていない形態にはみられない遺伝子を発現するか、又は、組み換えされていない細胞によって発現する遺伝子とは異なる天然遺伝子を発現する。組み換え核酸は、例えば、invitroで、一般的に核酸を操作することによって元々作られている核酸が、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼ、又はそれ以外のものを用いて、天然には通常みられない形態になっているような核酸である。組み換え核酸は、例えば、動作可能に連結した状態にある2種類以上の核酸を配置することによって生成させてもよい。従って、天然では通常は接続していないDNA分子を結合させることによってinvitroで生成した核酸又は発現ベクターの単離物は、両方とも組み換えであると考える。組み換え核酸が作られ、宿主細胞又は有機体に導入されると、宿主細胞の細胞機構を用いてinvivoで複製し得るが、このような核酸は、いったん組み換え状態で産生すると、その後に細胞内で複製されたものであっても、組み換えと考える。同様に、組み換えタンパク質は、組み換え技術によって、すなわち、組み換え核酸の発現によって作られるタンパク質である。RBD油は、精製、漂白、又は脱臭に供された油である。再生可能なディーゼルは、脂質の水素化及び脱酸素によって生成するアルカン混合物例えば、C10:0、C12:0、C14:0、C16:0、C18:0である。糖化は、バイオマス、通常はセルロース系バイオマス又はリグノセルロース系バイオマスを、グルコース及びキシロースのような単糖類に変換するプロセスである。糖化された又は解重合されたセルロース系材料又はバイオマスは、糖化によって単糖類に変換されたセルロース系材料又はバイオマスを指す。音波処理は、音波エネルギーを用いることによって、細胞のような生体材料を破壊する過程である。フルフラール種は、2-フランカルボキサアルデヒド、又は同じ基本構造の特徴を保持した誘導体である。茎葉は、穀物を収穫した後に残る、作物の茎及び葉を乾燥させたものである。ショ糖利用遺伝子は、発現すると、ショ糖をエネルギー源として利用する能力を補助する遺伝子である。ショ糖利用遺伝子によってコードされるタンパク質は、本明細書ではショ糖利用酵素と呼ばれ、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、グルコキナーゼやフルクトキナーゼのようなヘキソキナーゼを含む。変圧器は、誘導結合された導体、典型的には変圧器のコイルを介して、電気的エネルギーをある回路から別の回路に移す装置である。用語脱ろう油又は油の脱ろうは、油からより高い融点の成分を取り除くこと、及び/又は1つ以上の流動点降下剤を添加することを含むプロセスを指す。II.育てること及び培養条件特定の実施形態では、本発明は、一般的に、微生物油脂質を生成するための、Chlorella及びProtothecaの種及び株、並びに酵母、真菌、及びバクテリアの種及び株を含めた、野生型及び組み換え微細藻類のような油産生微生物を育てることに関する。読者が読みやすいように、この章をいくつかの節に分けている。第1節は、Prototheca種及びPrototheca株と、新しいPrototheca種及びPrototheca株並びに関連する微細藻類をゲノムDNA比較によって同定し、さらに本明細書に記載される方法に有用な他の微細藻類、酵母、真菌類、及びバクテリアを同定するやり方とについて記載している。第2節は、育てるのに有用なバイオリアクターについて記載している。第3節は、育てるための培地について記載している。第4節は、本明細書に記載される例示的な育てる方法に従う油脂質の生成について記載している。第5節は、本明細書に記載される方法での使用に適した油産生酵母のタイプ、酵母バイオマスを生じさせるための培養条件、並びに本明細書に記載される例示的な方法に従って調製されたバイオマスの脂質プロフィール及び化学組成について記載している。1.Prototheca種及びPrototheca株並びに他の油産生微生物Protothecaは、高濃度の脂質を産生することができ、特に、誘電性流体及び他の潤滑剤の生成に適した脂質を産生することができるため、脂質の生成に使用するのに卓越した微生物である。Protothecaによって産生される脂質は、他の微細藻類によって生成される脂質よりも飽和度が高い。さらに、Protothecaの脂質は、一般的に、色素を含まずクロロフィル及び特定のカロチノイドが低い乃至検出不能なレベル、いかなる状況でも、他の微細藻類から得られる脂質よりもかなり色素の含有量が低い。さらに、本明細書に記載される方法で用いるために提供される組み換えPrototheca細胞を用い、他の微生物から脂質を生成する場合と比較して、低コストで、高収率及び高効率で脂質を生成させることができる。本明細書に記載される方法で用いる具体的なPrototheca種及びPrototheca株としては、Protothecawickerhamii、ProtothecastagnoraUTEX327を含む、Protothecaportoricensis、ProtothecamoriformisUTEX株1441、1435を含む、及びProtothecazopfiiが挙げられる。Prototheca属の種は、偏性従属栄養生物である。本明細書に記載の方法で使用するProtothecaの種は、ゲノムの特定標的領域を増幅させることによって同定することができる。例えば、特定のPrototheca種又はPrototheca株の同定は、プライマーと、任意のゲノム領域を用いた方法とを用い、例えば、Wuetal.、Bot.Bull.Acad.Sin.200142:115-121IdentificationofChlorellaspp.isolatesusingribosomalDNASequencesに記載されている方法を用いて、核及び/又は葉緑体のDNAを増幅させ、塩基配列を決定することによって行うことができる。Protothecaだけではなく、同様の脂質プロフィール及び産生能を有する他の炭化水素及び脂質を産生する有機体の種を同定するために、リポソームの内部に転写されたスペーサーITS1及びITS2rDNA、23SrRNA、18SrRNA、及び他の保存されたゲノム領域を増幅させ、塩基配列を決定する、当業者によって十分に確率された系統発生解析の方法を用いてもよい。例えば、藻類を同定し、分類する方法は、例えば、Genetics、2005年8月;1704:1601-10及びRNA、2005年4月;114:361-4を参照。従って、ゲノムDNA比較を用い、本明細書に記載の方法で使用すべき微細藻類の適切な種を同定することができる。保存されたゲノムDNA領域、例えば、限定されないが、23SrRNAをコードするDNAを、微細藻類の種から増幅させ、本明細書に記載の方法で使用する好ましい微細藻類に分類学的に関連する微細藻類の種をスクリーニングするために、コンセンサス配列を比較することができる。Prototheca属に含まれる種に対し、このようなDNA配列比較を行った例を以下に示す。ゲノムDNA比較は、株の収集中にうまく同定できなかった微細藻類の種を同定するのにも有用な場合がある。株の収集では、表現型及び形態学的特徴に基づいて、微細藻類の種を同定することが多いだろう。これらの特徴を使用すると、微細藻類の種又は属を間違ってカテゴリー分けしてしまうことがある。ゲノムDNA比較を用いることは、系統発生的関係に基づいて微細藻類種をカテゴリー分けする良好な方法であろう。本明細書に記載の方法で使用する例示的微細藻類は、典型的には、配列番号11~19に列挙されている少なくとも1つの配列に対するヌクレオチド同一性が少なくとも99、少なくとも95、少なくとも90、又は少なくとも85の23SrRNAをコードするゲノムDNA配列を有する。ヌクレオチド同一性又はアミノ酸同一性の割合を決定するために配列を比較する場合、典型的には、ある配列を参照配列として作用させ、これと試験配列とを比較する。配列比較アルゴリズムを用いた場合、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、部分配列の座標を指定し、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定したプログラムパラメーターに基づいて、試験配列を参照配列と比較して配列同一性の割合を算出する。比較のために、例えば、SmithWaterman、Adv.Appl.Math.2:4821981による局地的ホモロジーアルゴリズムによって、NeedlemanWunsch、J.Mol.Biol.48:4431970によるホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、PearsonLipman、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:24441988と同様の方法で検索することによって、これらのアルゴリズムをコンピューター制御によって実施することによってWisconsinGeneticsSoftwarePackage、GeneticsComputerGroup、575ScienceDr.、Madison、WIの、GAP、BESTFIT、FASTA、TFASTA、又は、視覚的な観察一般的に、前出のAusubeletal.を参照によって、配列の最適アラインメントを行うことができる。配列同一性の割合及び配列類似性を決定するのに適した他のアルゴリズムの例は、BLASTアルゴリズムであり、Altschuletal.、J.Mol.Biol.215:403-4101990に記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、NationalCenterforBiotechnologyInformationウェブアドレスはwww.ncbi.nlm.nih.govに公開されている。このアルゴリズムは、検索配列の中で、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列させたときに、ある正の値である閾値Tとマッチするか、又は閾値Tを満足するような長さWの短い文字列を特定することによって、スコアが最も大きくなる配列対HSPをまず特定することを含む。Tは、近隣の文字列スコアの閾値と呼ばれるAltschuletal.、前出。これらの初期の近隣の文字列ヒットが、これらの配列に含まれるもっと長いHSPを見つけるための初期検索の出発点として作用する。この文字列のヒットを、累積アラインメントスコアが増加していく限りは、それぞれの配列に沿って両方向に拡張していく。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターMマッチングした残基対に対するリワードスコア;常に0より大きい及びパラメーターNマッチングしない残基に対するペナルティースコア;常に0より小さいを用いて算出される。アミノ酸配列の場合、スコアの行列を用いて累積スコアを算出する。それぞれの方向への文字列ヒットの拡張は、累積アラインメントスコアが、到達した最大値からXの大きさだけ下がった場合、1つ以上のマイナス値のスコアをもつ残基のアラインメントの累積のため、累積スコアが0又は0未満になった場合、又は、いずれかの配列が末端まできた場合に中止される。核酸又はポリペプチドが本発明の範囲内にあるかどうかを特定するためには、BLASTプログラムのデフォルトパラメーターが適している。BLASTNプログラムヌクレオチド配列の場合は、文字列長W11、期待値E10、M=5、N=-4をデフォルトとして用い、両鎖を比較する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプロフラムを、文字列長W3、期待値E10、BLOSUM62スコア行列をデフォルトとして用いる。TBLATNプログラムヌクレオチド配列のタンパク質配列を用いるは、文字列長W3、期待値E10、BLOSUM62スコア行列をデフォルトとして用いるHenikoffHenikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:109151989を参照。BLASTアルゴリズムは、配列同一性の割合を算出することに加え、2つの配列間の類似性の統計分析も行う例えば、KarlinAltschul、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90:5873-57871993を参照。BLASTアルゴリズムによって与えられる類似性の測定値は、ひとつには最小合計確率PNがあり、この値は、2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列が偶然マッチする確率の指標を与える。例えば、試験核酸と参照核酸とを比較したときの最小合計確率が、0.1未満、より好ましくは、約0.01未満、最も好ましくは、約0.001未満であるときに、この核酸は、参照配列と類似していると考える。Protothecaに加え、さまざまな油産生微生物を、本明細書に記載される方法で用いることができる。例えば、限定されないが、Chlorellaのprotothecoides種の株を含むChlorellaは、本明細書に記載される方法で用いるのに良好な微細藻類である。油、燃料、及び油脂化学品を生成するのに適した脂質又は炭化水素の生成に加え、本明細書に記載される方法で用いるための微生物の選択に影響を及ぼす考慮事項としては、以下の1つ以上を挙げることができる:1細胞重量を基準とした割合で脂質含有量が高いこと;2成長が容易であること;3遺伝子操作が容易であること;及び4バイオマスの処理が容易であること。特定の実施形態では、野生型の微生物又は遺伝子操作された微生物から、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、又は少なくとも70以上が微生物油すなわち脂質及び脂肪酸である細胞が得られる。好ましい有機体は、従属栄養で実質的に光が存在しない状態の糖上で生育する且つ生育される。微細藻類は、一般的に、本明細書に記載される方法で用いるのに良好な微生物である。方法の実施に用いることができる微細藻類の例としては、限定されないが、表1に列挙される以下の藻類が挙げられる。微細藻類に加え、油産生酵母は、その乾燥細胞重量の20超を脂質として蓄積することができ、そのため本明細書に記載される方法において有用である。本発明の一実施形態では、脂質を産生する微生物又は油を抽出する、回収する、若しくは得ることのできる微生物は、油産生酵母である。本明細書に記載される方法で用いることができる油産生酵母の例としては、限定されないが、表2に列挙される油産生酵母が挙げられる。高油含有量を達成するための油産生酵母Yarrowialipolytica及びRhodotorulagraminisを育てる例示的な方法を、以下の例に提供する。本発明の一実施形態では、脂質を産生する微生物、又は脂質を抽出する、回収する、若しくは得ることのできる微生物は、真菌である。本明細書に記載される方法で用いることができる真菌の例としては、限定されないが、表3に列挙される真菌が挙げられる。従って、本発明の一実施形態では、本明細書に記載される方法で用いられる微生物バイオマスの生成に使用される微生物は、真菌である。適した真菌の例例えば、Mortierellaalpine、Mucorcircinelloides、及びAspergillusochraceusには、文献に記載されるように、遺伝子操作に適していることが示されているものが含まれる例えば、Microbiology,Jul;153Pt.7:2013-252007;MolGenetGenomics,Jun;2715:595-6022004;CurrGenet,Mar;213:215-231992;CurrentMicrobiology,302:83-861995;Sakuradani,NISRResearchGrant,StudiesofMetabolicEngineeringofUsefulLipid-producingMicroorganisms2004;及びPCT/JP2004/012021号を参照。本発明の他の実施形態では、脂質を産生する微生物、又は油を抽出する、回収する、若しくは得ることのできる微生物は、油産生バクテリアである。油産生バクテリアは、その乾燥細胞重量の20超を脂質として蓄積することができるバクテリアである。本明細書に記載される方法で用いられる油産生バクテリアの種には、Rhodococcusopacus及びRhodococcussp.のような、Rhodococcus属の種が含まれる。Rhodococcusopacusのような油産生バクテリアを育てる方法は、当該技術分野において公知であるWaltermann,etal.,2000Microbiology,146:1143-1149を参照。高油含有量を達成するためのRhodococcusopacusを育てる例示的な方法を、以下の例に提供する。2.バイオリアクター微生物は、遺伝子操作を行うこと、及び微生物油例えば、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、及びアルカンのような炭化水素を生成することを目的として培養される。前者の種類の培養は、小スケールで、最初は少なくとも原材料微生物が成長可能な条件下で実施される。炭化水素を生成させるための培養は、通常は、バイオリアクターで大規模に行われる例えば、10,000L、40,000L、100,000L又はそれより大きなバイオリアクター。Prototheca種を含む微細藻類、並びに本明細書に記載される他の油産生微生物は、典型的には、バイオリアクター内の液体培地にて、本明細書に記載される方法で培養する。典型的には、バイオリアクターには多量の光を入れず、又はいかなる量の光も入れない。ある実施形態では、微細藻類を含めた、油産生細菌の1つ又は複数の培養工程の全体が、実質的に光が存在しない状態で行われる。バイオリアクター又は発酵槽を用い、生理学的周期の種々の段階を経て、微細藻類細胞を培養する。バイオリアクターは、従属栄養を成長及び増殖させる方法で用いると、多くの利点を与える。本明細書に記載の微細藻類及び他の油産生細菌を、典型的には、液体中で、一例として懸濁培養物中で、大量に発酵させる。鋼鉄製発酵槽のようなバイオリアクターは、非常に大きな容積の培養物を収容する種々の本発明の実施形態では、40,000リットル以上の容量を有するバイオリアクターを用いる。また、バイオリアクターによって、典型的には、温度、pH、酸素圧、二酸化炭素濃度のような培養条件を制御することができる。例えば、バイオリアクターは、典型的には、例えば、酸素又は窒素のような気体成分を液体培養物にバブリングすることが可能な配管に接続したポートを用いて構築することができる。また、培地のpH、微量元素が何であるか及びその濃度、他の培地構成要素のような他の培養パラメーターは、バイオリアクターを用いて簡単に操作することができる。バイオリアクターは、微細藻類が繁殖され、数が増える間、培地がバイオリアクターを流れるような構成であってもよい。ある実施形態では、例えば、播種した後であるが、細胞が所望の密度になる前に、培地をバイオリアクターに注入してもよい。別の状況では、培養開始時にバイオリアクターを培地で満たし、培養物を播種した後は、培地を注入しない。言い換えると、微細藻類の又は他の細菌のバイオマスを、微細藻類が繁殖され、数が増える間、水性媒体中で培養する。しかし、水性培地の量は、この期間全体でバイオリアクターを流れていない。従って、ある実施形態では、水性培地は、播種した後に、バイオリアクターを流れない。スピニングブレード、インペラー、揺動機構、撹拌棒、加圧気体を注入する手段のようなデバイスを備えるバイオリアクターを用い、微細藻類の培養物を混合することができる。混合は、連続的であってもよく、断続的であってもよい。例えば、ある実施形態では、微細藻類が望ましい数に増えるまで微細藻類を繁殖させるために、気体及び培地を入れるのに乱流を用いる形態は維持されない。気体、固体、半固体、液体を、微細藻類を含むバイオリアクターチャンバーに入れるため、又は抽出するために、バイオリアクターポートを用いてもよい。多くのバイオリアクターは、2個以上のポートを備えているが例えば、1つは培地を入れるため、他方はサンプリングのため、1種類の基質だけを1個のポートから入れたり、出したりする必要はない。例えば、バイオリアクターに培地を流し、その後で、サンプリングしたり、ガスを入れたり、ガスを出したり、又は他の目的のために1個のポートを使用してもよい。好ましくは、培養物の純培養性を損なうことなく、サンプリングポートを繰り返し用いることができる。サンプリングポートは、サンプルの流れを止めるか、開始させるか、又は連続的なサンプリング手段を与えるようなバルブ又は他のデバイスを備えるような構成であってもよい。バイオリアクターは、典型的には、培養物を播種することができるような少なくとも1個のポートを備えており、このようなポートを、培地又は気体を入れるような他の目的で用いることもできる。バイオリアクターポートによって、微細藻類の培養物の気体内容物を操作することができる。説明のために、バイオリアクターの容積の一部分は、液体ではなく気体であってもよく、バイオリアクターの気体注入口から、ポンプによって気体をバイオリアクターに入れることができる。ポンプによってバイオリアクターへと有益に入れることが可能な気体としては、空気、空気/CO2混合物、アルゴンのような希ガス、他の気体が挙げられる。バイオリアクターは、典型的には、バイオリアクターにガスを入れる速度をユーザーが制御することができるように取り付けられている。上述のように、バイオリアクターへの気体の流れを増やすことによって、培養物の混合性を高めることができる。気体の流れを増やすことは、培地の濁度にも影響を及ぼす。乱流は、バイオリアクターに入った気体が培地表面でバブリングするように、水性培地の液量より低いところに気体注入ポートを配置することによって起こすことができる。1種類以上の気体がポートを出て行き、気体が外に逃げ、それにより、バイオリアクター中に圧力が蓄積されるのを防ぐ。好ましくは、気体流出ポートは、バイオリアクターに微生物が入り込んで汚染されることを防ぐような一方向バルブにつながっている。3.培地微細藻類及び他の細菌の培地は、典型的には、固定窒素源、固定炭素源、微量元素、場合により、pHを維持するためのバッファー、ホスフェート典型的には、リン酸塩として与えられるのような成分を含有する。他の成分は、特に、海水微細藻類の場合には、塩化ナトリウムのような塩を含んでいてもよい。窒素源としては、有機窒素源及び無機窒素源が挙げられ、例えば、限定されないが、分子状窒素、硝酸エステル、硝酸塩、アンモニア純水なもの、又は塩形態、例えば、NH42SO4及びNH4OH、タンパク質、大豆ミール、コーンスティープリカー、酵母抽出物が挙げられる。微量元素の例としては、例えば、それぞれZnCl2、H3BO3、CoCl26H2O、CuCl22H2O、MnCl24H2O、NH46Mo7O244H2Oのような形態の亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデンが挙げられる。本発明の方法で有用な微生物は、世界中の種々の場所及び環境で発見されている。他の種からの単離、及び得られる進化多様性の結果として、最適な成長、及び脂質及び/又は炭化水素構成要素の最適な発生のための特定の成長培地は、予測することが困難な場合がある。ある場合では、特定の微生物株は、ある種の阻害成分が存在するか、又は、特定の微生物株が必要とするある種の必須栄養分が必要量存在しないために、特定の成長培地上で成長することができない場合がある。固体及び液体の成長培地は、一般的に、さまざまな供給源から入手可能であり、さまざまな微生物株に適した特定の培地を調製する方法の説明は、例えば、オンラインでは、藻類の培養物を収集するためのAustin、1UniversityStationA6700、Austin、Texas、78712-0183のテキサス大学によって運営されているサイトwww.utex.org/で見つけることができるUTEX。例えば、種々の淡水培地及び塩水培地としては、PCT公開番号第2008/151149号に記載されているものが挙げられ、この文献は、参照により組み込まれる。特定の例では、プロテオース培地は、純培養の培地に適しており、培地1リットルpH約6.8は、プロテオースペプトン1gを、BristolMedium1リットルに加えることによって調製することができる。Bristolmediumは、水溶液中に、2.94mMのNaNO3、0.17mMのCaCl22H2O、0.3mMのMgSO47H2O、0.43mM、1.29mMのKH2PO4、1.43mMのNaClを含む。1.5寒天培地の場合、寒天15gを上述の溶液1リットルに加えればよい。この溶液に蓋をし、オートクレーブにかけ、次いで、使用するまで冷蔵温度で保存する。別の例は、Prototheca単離培地PIMであり、10g/Lのフタル酸水素カリウムKHP、0.9g/Lの水酸化ナトリウム、0.1g/Lの硫酸マグネシウム、0.2g/Lのリン酸水素カリウム、0.3g/Lの塩化アンモニウム、10g/Lのグルコース、0.001g/Lの塩酸チアミン、20g/Lの寒天、0.25g/Lの5-フルオロシトシンを含み、pH範囲が5.0~5.2であるPore、1973、App.Microbiology、26:648-649を参照。本明細書に記載の方法と共に用いるのに適した他の培地は、上に特定したURLを閲覧することによって、又はSAG、CCAP又はCCALAのような、微生物の培地を保有している他の機関に助言を求めることによって、簡単に特定することができる。SAGは、ゲッティンゲン大学ドイツ、ゲッティンゲンのCultureCollectionofAlgaeを指し、CCAPは、ScottishAssociationforMarineScience英国、スコットランドによって管理されている藻及び原生動物の培養株保存機関を指し、CCALAは、InstituteofBotanyトシェボニュ、チェコ共和国の藻研究所の培養株保存機関を指す。さらに、米国特許第5,900,370号は、Prototheca種の従属栄養性発酵に適した培地の処方及び条件について記載している。費用効率的な生成について、固定炭素源の費用は、油生成を経済的なものにするには十分低くなければならないため、固定炭素源の選択が重要である。適切な炭素源は、例えば、アセテート、フロリドシド、フルクトース、ガラクトース、グルクロン酸、グルコース、グリセロール、ラクトース、マンノース、N-アセチルグルコサミン、ラムノース、ラフィノース、スタキオース、ショ糖、及び/又はキシロースを含む。本明細書に記載される方法で有用な適切な原材料としては、例えば、黒液、コーンスターチ、解重合されたセルロース系材料、乳清、転化糖グルコース/フルクトース、糖液、ジャガイモ、モロコシ、ショ糖、テンサイ、サトウキビ、濃いサトウキビ汁、イネ、及び小麦が挙げられる。また、炭素源は、混合物として、例えば、ショ糖と解重合されたテンサイパルプの混合物として与えられてもよい。1つ以上の炭素源は、少なくとも約50μM、少なくとも約100μM、少なくとも約500μM、少なくとも約5mM、少なくとも約50mM、及び少なくとも約500mMの濃度の1つ以上の外部から与えられる固定炭素源で供給することができる。発酵原材料として高濃縮の炭素源が好ましく、及び種々の実施形態では、炭素源は、その最大溶解度に近い濃度すなわち、90の溶解度を超える濃度、例えば95以上の、すなわち99溶解度の濃度で原材料中に与えられる。例えば、ある実施形態では、細胞が成長して微生物油脂質を蓄積する間ずっと、高濃縮の固定炭素源が細胞に供給される流加回分式で育てる際、原材料中少なくとも300g/L、少なくとも400g/L、少なくとも500g/L、又は少なくとも600g/L又はそれ以上のグルコース濃度が用いられる。他の実施形態では、流加回分式で育てる際、原材料中少なくとも500g/L、少なくとも600g/L、少なくとも700g/L、少なくとも800g/L又はそれ以上のショ糖濃度が用いられる。高濃縮のショ糖炭素源の非限定的な例としては、濃いサトウキビ汁、サトウキビ汁、テンサイ汁及び糖液が挙げられる。本明細書に記載される方法の目的のための特に興味深い炭素源としては、セルロース解重合形態、グリセロール、ショ糖、及びモロコシが挙げられ、その各々を以下でより詳細に考察する。本明細書に記載の方法によれば、原材料として解重合されたセルロース系バイオマスを用い、微生物を培養してもよい。セルロース系バイオマス例えば、トウモロコシ茎葉のような茎葉は安価であり、入手が容易であるが、この物質を酵母のための原材料として使用する試みは長年失敗している。特定的には、このような原材料は、酵母の成長を阻害することがわかっており、酵母は、セルロース系材料から生成した五炭糖例えば、ヘミセルロースから生成したキシロースを用いることができない。対照的に、微細藻類は、処理したセルロース系材料を用いて成長することができる。セルロース系材料は、一般的に、約40~60のセルロースと;約20~40のヘミセルロースと;10~30のリグニンとを含む。適切なセルロース系材料としては、草及び木のエネルギー作物、及び農業用作物から得られた残渣、すなわち、主要な食品又は繊維製品の分野から除去されなかった植物の一部、主に茎及び葉が挙げられる。例としては、農業廃棄物、例えば、サトウキビの絞りかす、モミ殻、トウモロコシ繊維茎、葉、皮及び穂軸を含む、大豆ミール、麦わら、稲わら、テンサイパルプ、シトラスパルプ、柑橘類の皮;森林の廃棄物、例えば、硬材及び軟材の間伐、伐採作業から得られる硬材及び軟材の残渣;木材廃棄物、例えば、製材工場の廃棄物木片、おがくず、パルプ工場の廃棄物;都市廃棄物、例えば、都市固形廃棄物の紙片、都会の廃材、都市の伐採した草のような、都市の緑廃棄物;木材製造の廃棄物が挙げられる。さらなるセルロース含有材料としては、スイッチグラス、ハイブリッドポプラ材、miscanthus、テンサイ繊維、ソルガム繊維のような専用のセルロース含有作物が挙げられる。このような材料から生成する五炭糖としては、キシロースが挙げられる。細菌が上述の材料を含む糖類を利用することができる効率を高めるために、セルロース系材料を処理する。本明細書に記載される方法は、材料が微生物例えば、微細藻類及び油産生酵母の従属栄養性培養物で用いるのに適するように酸爆発させた後、セルロース系材料を処理するための新規方法を利用して実施することができる。上述のように、リグノセルロース系バイオマスは、セルロース、β1,4結合したグルコース六炭糖の結晶性ポリマー、ヘミセルロース、主にキシロース五炭糖で構成され、少量のマンノース、ガラクトース、アラビノース、リグニンで構成されている、ゆるく会合したポリマー、シナピルアルコール及びその誘導体で構成される複雑な芳香族ポリマー、α1,4結合したポリガラクツロン酸の直鎖であるペクチンのような、種々の画分で構成されている。セルロース及びヘミセルロースがポリマー構造であるため、これらの中に含まれる糖類例えば、単糖類のグルコース及びキシロースは、多くの細菌によって有効に使用する代謝することができるような形態ではない。このような細菌の場合、セルロース系バイオマスをさらに処理し、このポリマーを構成している単糖類を作成することは、セルロース系材料を原材料炭素源として有効に利用するのに非常に役立つ場合がある。セルロース又はセルロース系バイオマスに、爆発と呼ばれるプロセスを行い、このプロセスで、バイオマスは、高温高圧で、希硫酸又は他の酸で処理される。このプロセスは、セルロース系及びヘミセルロース系の画分をグルコースモノマー及びキシロースモノマーにする酵素加水分解を効率よく行うことができるようにバイオマスを調節する。得られた単糖類は、セルロース系糖と呼ばれる。その後に、セルロース系糖が微生物に利用され、種々の代謝物例えば、脂質を産生する。酸爆発工程によって、ヘミセルロース画分が、構成成分である単糖類へと部分的に加水分解する。これらの糖類を、さらなる処理によって、バイオマスから完全に遊離させることができる。ある実施形態では、さらなる処理は、爆発した材料を熱水で洗浄することを含む熱水処理であり、これによって、塩のような混入物質が除去される。この工程は、セルロース系エタノール発酵では、このようなプロセスで用いられる糖の濃度はもっと薄いため、必要ではない。他の実施形態では、さらなる処理は、さらなる酸処理である。さらに他の実施形態では、さらなる処理は、爆発した材料の酵素加水分解である。また、これらの処理を任意の組み合わせで用いてもよい。この種の処理は、遊離する糖の種類例えば、五炭糖対六炭糖、このプロセス中で糖類が遊離する段階に影響を及ぼす場合がある。その結果、五炭糖又は六炭糖のどちらかが主成分の異なる糖の流れを作成することができる。これらの五炭糖又は六炭糖を豊富に含む流れは、異なる炭素利用能を有する特定の微生物用に向けることができる。本明細書に記載の方法は、典型的には、エタノール発酵で達成されるよりも高い細胞密度になるまで発酵することを含む。従属栄養脂質油を生成するための培養物の密度が高いため、固定炭素源例えば、セルロース系から誘導される糖の流れは、好ましくは、濃縮された形態である。解重合されたセルロース系材料のグルコース濃度は、好ましくは、育てる工程の前に、少なくとも300g/L、少なくとも400g/L、少なくとも500g/L、又は少なくとも600g/Lであり、場合により、細胞が成長し、脂質を蓄積する間ずっと、上述の物質を細胞に供給するような流加回分式で育てる。セルロース系糖の流れは、セルロース系エタノールの生成においては、この濃度範囲又はこの濃度範囲付近で用いられない。従って、リグノセルロース系の油を生成している間、非常に高密度の細胞を生成し、維持するために、炭素原材料を、非常に濃縮された形態で従属栄養培養物に運ばなければならない。しかし、油産生微生物の基質ではなく、油産生微生物によって代謝されないような供給物流中の任意の成分は、バイオリアクター中に蓄積し、その成分が、毒性であるか、又は望ましい最終産物を生成するのを阻害する場合には、問題となり得るであろう。リグニン及びリグニンから誘導される副産物、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類のような炭水化物から誘導される副産物、セルロース系材料の生成から誘導される塩爆発プロセス及びその次の中和プロセスの両方で、さらに、代謝されていないペントース/ヘキソース糖ですら、エタノール発酵では問題となり得る場合があり、これらの影響は、初期原材料中のこれらの物質の濃度が高いプロセスでは、顕著に大きくなる。本発明の大量生成する用途に用いることが可能な六炭糖について、セルロース系材料から、300g/L、400g/L、500g/L、又はそれ以上の糖濃度を達成するために、これらの毒性のある物質の濃度を、典型的には、セルロース系バイオマスのエタノール発酵中に存在する濃度の20倍高くすることができる。セルロース系材料の爆発プロセスによる処理は、かなりの量の硫酸、熱、圧力を利用するため、炭水化物の副産物、つまり、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類が遊離する。フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類は、ヘミセルロースの加水分解中に、キシロースを水和してフルフラール及び水にすることによって生成する。本発明のある実施形態では、これらの副産物例えば、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類は、バイオリアクターに入れる前に、糖化されたリグノセルロース系材料から除去される。本発明の特定の実施形態では、炭水化物の副産物を除去するプロセスは、爆発したセルロース系材料の熱水処理である。それに加え、特定の実施形態において、本発明は、リグノセルロース系の油を生成するのに、フルフラール類又はヒドロキシメチルフルフラール類のような化合物に耐え得る株を用いる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、発酵培地中のフルフラール類に耐え得るだけでなく、発酵中に、実際には、これらの副産物を代謝することができる微生物の利用方法も提供する。また、この爆発プロセスは、顕著な量の塩も生じる。例えば、爆発の典型的な条件によって、爆発したセルロース系バイオマスを、水:固形分乾燥重量を10:1の比率で再び懸濁させた場合、5mS/cmを超える導電率が生じ得る。本発明の特定の実施形態では、爆発したバイオマスを希釈したものに対し、酵素による糖化を行い、得られた上澄みを、バイオリアクター中で使用するために最大25倍まで濃縮する。濃縮した糖の流れ中の塩濃度導電率で測定した場合は、許容できないほど高い場合がある最大1.5MNaに相当。同様に、その後の酵素による糖化プロセスのために、爆発した物質を中和すると、さらなる塩が生成する。本明細書に記載の方法により、上のようにして得られる濃縮したセルロース系糖の流れを、脂質を生成するための従属栄養プロセスで使用することができるように、これらの塩を除去することができる。ある実施形態では、これらの塩を除去する方法は、限定されないが、DOWEXMarathonMR3のような樹脂を用いた脱イオン化である。特定の実施形態では、樹脂を用いた脱イオン化工程は、糖の濃縮前に行うか、又は、糖化の前のバイオマスのpH調節及び熱水処理の前に行うか、又はこれらの任意の組み合わせであってもよく、他の実施形態では、この工程は、これらの1つ以上のプロセスの後に行う。他の実施形態では、爆発プロセス自体を、塩が許容されない高濃度で生成するのを避けるように変更する。例えば、セルロース系バイオマスを硫酸又は他の酸で爆発させるのに代わる代替法は、セルロース系バイオマスが酵素加水分解糖化を受けやすくなるような機械的なパルプ化である。さらに他の実施形態では、高濃度の塩に耐性の天然微生物株、又は高濃度の塩に耐性を有するように遺伝子操作された株を用いる。油産生細菌を用いて従属栄養性の微生物油の生成で使用するための、爆発したセルロース系バイオマスを調製するプロセスに好ましい実施形態を以下のように行う。第1の工程では、爆発したセルロース系バイオマスを再懸濁させたもののpHを、5.0~5.3の範囲に調節した後、セルロース系バイオマスを3回洗浄することを含む。この洗浄工程は、脱塩性及びイオン交換性の樹脂、逆浸透膜、熱水処理上述のようなものの使用、又は、脱イオン水に再懸濁させ、遠心分離するのを単に繰り返す、といった種々の手段によって達成することができる。この洗浄工程によって、セルロース系の流れの導電率が100~300μS/cmになり、かなりの量のフルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類が除去される。この洗浄工程からデカンテーションを行い、ヘミセルロース画分から遊離した五炭糖を濃縮するために残しておいてもよい。第2の工程では、洗浄したセルロース系バイオマスを酵素によって糖化することを含む。一実施形態では、AccelleraseGenencorを用いる。第3の工程では、糖化されたバイオマスを遠心分離するか、又はデカンテーションし、次いですすぐことによる、糖の回収を含む。得られたバイオマス固形分は、エネルギー密度が高く、リグニンを豊富に含む成分であり、これを燃料として使用してもよく、廃棄するために送ってもよい。遠心分離/デカンテーション及びすすぎを行うプロセス中で回収された糖の流れを集める。第4の工程では、透過物を回収しつつ、混入している固形物を除去する精密濾過を含む。第5の工程では、濃縮工程を含み、この工程は、減圧エバポレーターを用いることによって達成されてもよい。この工程は、場合により、P’2000Sigma/Flukaのような消泡剤の添加を含んでいてもよく、この作業は、得られる糖原料のタンパク質含有量によっては、時に必要である。本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は、バイオディーゼルのトランスエステル化から得られる、酸性化されたグリセロール及び酸性化されていないグリセロールを含むグリセロールである。一実施形態では、炭素源は、グリセロールと、少なくとも1つの他の炭素源とを含んでいる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも1つの他の固定炭素源の全てが、発酵開始時に微生物に与えられる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも1つの他の固定炭素源が、微生物に対して所定の比率で同時に与えられる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも1つの他の固定炭素源が、発酵している間、所定の速度で細菌に供給される。ある種の微細藻類は、グルコースが存在する状態よりも、グリセロールが存在する状態ですばやく細胞分裂を受けるPCT公開番号第2008/151149号。これらの状況では、細胞に対して、最初に細胞の密度をすばやく上げるためグリセロールを供給し、次いで微生物油脂質を蓄積させるためグルコースを供給するような二段階成長プロセスによって、油が産生する効率を高めることができる。トランスエステル化プロセスのグリセロール副産物を使用すると、微生物油の生成プロセスに戻す場合に経済的に顕著な利点がもたらされる。グリセロール及びグルコースの混合物を固定炭素源として用いる方法のような他の供給方法も同様に提供される。また、このような混合物を供給することによって、同じ経済的な利点が得られる。それに加え、特定の実施形態では、本発明は、ショ糖のような代わりとなる糖をグリセロールとの種々の組み合わせで微細藻類に供給する方法を提供する。本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は転化糖である。転化糖は、ショ糖をその単糖成分フルクトースとグルコースとに分割することにより生成される。転化糖の生成は、当該技術分野において公知のいくつかの方法により達成することができる。そのような方法の一つは、ショ糖の水溶液を加熱することである。多くの場合に、ショ糖の転化糖への変換を加速させる触媒が用いられる。この触媒は生物学的な触媒であり;例えば、インベルターゼ及びスクラーゼのような酵素をショ糖に添加して、転化糖を生成する加水分解反応を加速させることができる。酸は非生物学的触媒の例であり、熱と組み合わせると加水分解反応を加速させ得る。転化糖は、作られた後、ショ糖と比べて結晶化しにくく、従って、保存上の利点、及び微細藻類を含む微生物を従属栄養培養する場合に濃縮炭素源が必要とされる流加回分発酵に対する利点を与える。一実施形態では、炭素源は、好ましくは濃縮された形態の上述のように、用いられる条件下でその最大溶解度の少なくとも90、すなわち、少なくとも800g/リットル、少なくとも900g/リットル、少なくとも1000g/リットル又は少なくとも1100g/リットルの、転化糖である。好ましくは濃縮された形態である転化糖は、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと細胞に供給される。本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は、ショ糖であり、ショ糖を含む複雑な原材料、例えば、サトウキビの処理から得られる濃いサトウキビ汁を含む。上述のように、従属栄養で油を生成するための培養物の密度は高いため、固定炭素源例えば、ショ糖、グルコース等は、濃縮された形態の、すなわち育てる工程の前に少なくとも500g/リットル、少なくとも600g/リットル、少なくとも700g/リットル又は少なくとも800g/リットルである固定炭素源であり、育てる工程は、場合により、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと材料が細胞に供給される流加回分式で育てる。ある場合では、炭素源は、典型的には濃縮された形態の、すなわち、場合により流加回分培養である育てる工程の前に少なくとも固形分60又は約770g/リットル糖、少なくとも固形分70又は約925g/リットル糖、又は少なくとも固形分80又は約1125g/リットル糖である、濃いサトウキビ汁の形態のショ糖である。濃縮された濃いサトウキビ汁は、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと細胞に供給される。一実施形態では、培地は、少なくとも1つのショ糖利用酵素をさらに含む。ある場合では、培地は、ショ糖インベルターゼを含む。一実施形態では、ショ糖インベルターゼ酵素は、微生物の集合が発現する外来のショ糖インベルターゼ遺伝子によってコードされる分泌可能なショ糖インベルターゼ酵素である。従って、いくつかの状況では、以下の第IV章にさらに詳細に記載されるように、本明細書に記載の方法で用いられる細菌は、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、又はフルクトキナーゼのようなショ糖利用酵素を発現するように遺伝子操作されている。ショ糖を含有する複雑な原材料としては、サトウキビの処理から得られる廃棄糖液が挙げられ、サトウキビ処理の価値の低い上述の廃棄生成物によって、炭化水素及び他の油の生成において、顕著に費用を節約することができる。本明細書に記載の方法で有用な、ショ糖を含有する別の複雑な原材料は、ソルガムであり、ソルガムシロップ及び純粋なソルガムを含む。ソルガムシロップは、甘いソルガムの茎の汁から生成する。ソルガムシロップの糖プロフィールは、主に、グルコースデキストロース、フルクトース、ショ糖からなる。4.油の生成本明細書に記載される方法に従って油脂質を生成するには、例えば、光が培養物にあたらないような、きわめて大きな40,000リットル以上の発酵槽を使用する場合のように、細胞を暗い場所で培養することが好ましい。例えば、Prototheca種及び他の微細藻類種は、固定炭素源を含有する培地内で、光が存在しない状態で、油を生成するように成長し、増殖することができる;このような成長は、従属栄養性の成長として知られている。一例として、脂質を生成する微細藻類細胞の播種物質が培地に入れられ、細胞が増殖し始めるまでに遅延期間遅延期が存在する。遅延期間の後、増殖速度は徐々に上がっていき、対数期すなわち指数増殖期に入る。次いで、指数増殖期の後、窒素のような栄養物が少なくなったり、毒性基質が増えたり、菌体数感知機構のために増殖が遅くなる。このように増殖が遅くなった後、増殖が止まり、細胞は、細胞に与えられている特定の環境に依存して、静止期又は安定成長状態に入る。脂質を豊富に含むバイオマスを得るために、培養物は、典型的には、指数増殖期が終わった後に良好に収穫され、指数増殖期は、窒素又は別の鍵となる栄養物炭素以外のものを枯渇させることによって初期に終わらせてもよく、細胞は、過剰に存在する炭素源を脂質に変換する。培養条件のパラメータは、油の総生成量、生成される油中の脂肪酸の組み合わせ、及び/又は特定の脂肪酸及び対応する1つ又は複数の脂質の生成を最適にするように操作することができる。好ましくは、本明細書に記載されている条件及び当該技術分野で既知の他の条件を用いて成長させた微生物は、脂質を少なくとも約20重量、好ましくは、少なくとも約40重量、より好ましくは、少なくとも約50重量、最も好ましくは、少なくとも約60重量含む。プロセスの条件は、特定の用途に適した脂質の収量を高めるように、及び/又は、生成費用を減らすように調節することができる。例えば、特定の実施形態では、微細藻類又は他の油産生細菌を、グルコースのような固定炭素エネルギーを過剰量与えつつ、制限濃度の1つ以上の栄養物、例えば、窒素、リン又は硫黄が存在する状態で培養する。窒素による制限は、窒素が過剰に与えられている培地における微生物脂質収量よりも、微生物脂質収量を増やす傾向がある。特定の実施形態では、脂質収量の増加は、少なくとも約10、約50、約100、約200、又は約500である。全培養期間の一部又は全期間にわたって、制限量の栄養物が存在する状態で細菌を培養してもよい。特定の実施形態では、栄養物の濃度は、全培養期間の間に、制限濃度及び非制限濃度を少なくとも2回繰り返す。過剰量の炭素を与えつつ、窒素量を制限するか、又はまったく窒素を含まない状態で、時間を延長させて培養を続けることによって、細胞の脂質含有量を増やすことができる。別の実施形態では、脂質経路に関連する酵素例えば、脂肪酸合成酵素のための1つ以上の補因子が存在する状態で、脂質を産生する細菌例えば、微細藻類を培養することによって、脂質収量を増やす。一般的に、補因子の濃度は、補因子が存在しない状態での微生物油収量よりも、微生物油例えば、油脂又は脂肪酸の量を増やすのに十分な濃度である。特定の実施形態では、補因子をコードする外来遺伝子を含む細菌例えば、微細藻類を培養物に含むことによって、培養物に補因子を与える。又は、補因子の合成に関与するタンパク質をコードする外来遺伝子を含有する細菌例えば、微細藻類を含むことによって、培養物に補因子を与えてもよい。特定の実施形態では、適切な補因子は、ビオチン及びパントテン酸化合物のような、脂質経路に関連する酵素に必要なビタミンを含む。本明細書に記載の方法で使用するのに適した補因子をコードする遺伝子、又はこのような補因子の合成に関与する遺伝子は、十分に知られており、上述のような構築物及び技術を用い、細菌例えば、微細藻類又は本明細書に記載の他の油産生細菌に導入することができる。本明細書に記載されているバイオリアクター、培養条件、従属栄養性成長及び増殖方法の特定の例を任意の適切な様式で組み合わせ、微生物の成長効率、及び脂質及び/又はタンパク質の生成効率を高めることができる。乾燥重量で、高い割合の油/脂質が蓄積した微細藻類のバイオマスが作成されているPCT公開番号第2008/151149号。本明細書に記載されている培養方法で作成され、本明細書に記載の有用な微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、少なくとも10の微細藻類の油を含む。ある実施形態では、微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、微細藻類の油を少なくとも25、少なくとも50、少なくとも55、又は少なくとも60含む。ある実施形態では、微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、微細藻類の油を10~90、25~75、40~75、又は50~70含む。本明細書に記載されているバイオマスの微細藻類の油、又は本明細書に記載の方法及び組成物で使用するために、バイオマスから抽出された微細藻類の油は、1つ以上の別個の脂肪酸エステル側鎖を有するグリセロ脂質を含む。グリセロ脂質は、1個、2個又は3個の脂肪酸分子でエステル化されたグリセロール分子から成り、脂肪酸分子は、長さはさまざまであってもよく、種々の飽和度を有していてもよい。脂肪酸分子及びそれらを含む微細藻類の油の長さ及び飽和度の特徴によって、以下の第V章にさらに詳細に記載されるように、培養条件又は脂質経路の操作によって、本明細書に記載の微細藻類の油中の脂肪酸分子の性質又は比率を改変するように操作することができる。従って、藻又は他の微生物の油の特定のブレンドは、2種類以上の微細藻類に由来するバイオマス又は藻の油を混合することによって、1種類の藻の中で調製されてもよく、又は、本明細書に記載の藻の油と、大豆、菜種、キャノーラ、パーム、パーム核、ココナツ、トウモロコシ、野菜くず、ナンキンハゼ、オリーブ、ヒマワリ、綿実、鶏脂、牛脂、豚脂、微細藻類、大型藻類、クフェア、亜麻、ピーナッツ、上質のホワイトグリース、ラード、カメリナCamellinaサティバ、カラシの種子、カシューナッツ、オーツ麦、ハウチワマメ、ケナフ、キンセンカ、麻、コーヒー、亜麻仁亜麻、ヘーゼルナッツ、ユーホルビア、カボチャの種、コリアンダー、ツバキ、ゴマ、ベニバナ、イネ、アブラギリ、ココア、コプラ、ケシ、トウゴマの実、ピーカン、ホホバ、ジャトロファ、マカダミア、ブラジルナッツ、アボカド、石油、又は上述のいずれかの油の留分のような他の供給源に由来する油とをブレンドすることによって調製されてもよい。上述のとおり、油の組成、すなわち、グリセロ脂質の脂肪酸構成要素の性質及び比率も、少なくとも2種類の別個の微細藻類に由来するバイオマス又は油を混ぜあわせることによって操作することができる。ある実施形態では、少なくとも2種類の別個の微細藻類は、異なるグリセロ脂質プロフィールを有している。この別個の種類の微細藻類を、好ましくは、それぞれの油を生成するような従属栄養条件下で、本明細書に記載されるように一緒に培養してもよく、又は別個に培養してもよい。異なる種類の微細藻類は、細胞のグリセロ脂質の構成成分である別個の脂肪酸を異なる割合で含有していてもよい。一般的に、Prototheca株は、主要な種としてC16及びC18脂肪酸を有する脂質プロフィールを有する。このようなより長い鎖長の脂肪酸、特に一価飽和C16及びC18脂肪酸すなわち、C16:1及びC18:1は、一般的に、誘電性流体の生成に好ましい例えば、米国特許第6,274,067号を参照。例えば、ProtothecamoriformisUTEX1435、ProtothecastagnoraUTEX327、及びProtothecamoriformisUTEX1441は、12~30のC16脂肪酸及び50~58のC18:1脂肪酸を含有する。ChlorellaprotothecoidesUTEX250は、約73のC18:1脂肪酸を含有し、及び他のChlorellaprotothecoides株は、限定されないが、UTEX25、UTEX249、UTEX256、UTEX264、UTEX411、CCAP211/17、CCAP221/8D及びSAG22110dを含め、7~18のC16脂肪酸及び55~75のC18:1脂肪酸を含有し得る。種々の実施形態では、本明細書に記載される生成物誘電性流体などに有用な微生物油脂質は、少なくとも約50のC18:1、例えば、少なくとも約55、少なくとも約60、少なくとも約65、少なくとも約70、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、及び少なくとも約90のC18:1である。これらの又は他の実施形態では、微生物油脂質は、約10未満のC18:2、例えば、約7.5未満、約5未満、約2.5未満、及び約1未満のC18:2である。微生物油は、合計100又はそれ未満になるC18:1及びC18:2の割合の任意の組み合わせを有し得る。例えば微生物油は、少なくとも50のC18:1及び10未満のC18:2又は少なくとも80のC18:1及び5未満のC18:2を有し得る。また、微細藻類又は他の微生物の油脂質は、微細藻類によって産生されるか、又は培地から微細藻類の油に組み込まれた他の構成要素を含んでもよい。これらの他の構成要素は、培養条件、種、バイオマスから油を回収するのに用いられる抽出方法及び油組成に影響を与え得る他の因子に基づいて、さまざまな量で存在してもよい。このような構成要素の非限定的な例としては、以下が挙げられる:カロチノイド、0.4μg/ml未満の存在量;リコピン、0.001μg/ml未満の存在量;β-カロチン、0.02μg/ml未満の存在量;クロロフィル、油1kgあたり0.02mg未満の存在量;γ-トコフェロール、油100gあたり0.40~0.60mgの存在量;カンペステロール、油100gあたり3~9mgの存在量;及びトコトリエノール、油1gあたり0.5mg未満の存在量。他の構成要素としては、限定されないが、リン脂質、トコフェロール、トコトリエノール、カロチノイド例えば、α-カロチン、β-カロチン、リコピンなど、キサントフィル例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、α-クリプトキサンチン、β-クリプトキサンチン、及び種々の有機化合物又は無機化合物が挙げられる。ある場合では、Prototheca種から抽出した油は、0.003~0.039μgのルテイン/油g、0.003μg未満のリコピン/油g;及び0.003μg未満のβ-カロチン/油gを含む。5.油産生酵母株及び培養条件本発明は、油産生酵母バイオマスから油/脂質を生成する方法を提供する。本発明は、一部には、酵母バイオマスを高油含有量で調製することができ、且つ抽出した油を、誘電性流体及び他の潤滑剤を含めた、さまざまな有用な生成物に変換することができるという発見からもたらされた。飽和脂肪酸と中鎖乃至それより長鎖の脂肪酸例えば、C16及びC18脂肪酸との混合物を含み得る酵母油は、誘電性流体を含む化学品の調製に良好な出発物質を提供する。適した油及び/又は脂質を産生するさまざまな酵母種を、本明細書に記載される方法に従い使用することができるが、高濃度の適した油又は脂質を天然に産生する酵母が好ましい。特定の実施形態では、油産生酵母は、乾燥重量で少なくとも20以上のトリグリセリド油脂である細胞を含む。他の実施形態では、油産生酵母は、乾燥重量で少なくとも25~35以上のトリグリセリド油脂を含有する。一般的に、これらの実施形態では、油産生酵母に含まれる油が多いほど、バイオマスから抽出することのできる油は多くなり、従って、乾燥重量で少なくとも40、少なくとも50、又は少なくとも60以上のトリグリセリド油脂を含有するように培養することができる油産生酵母が、典型的には好ましい。誘電性流体のような化学品には、望ましくない鎖長、飽和レベルがあったり、又は望ましくない混入物質が伴ったりし得るため、それらにおける使用にあらゆる種類の脂質が望ましいわけではない。また、これらの考慮事項は、本明細書に記載される方法で用いられる油産生酵母又は任意の他の細菌の選択にも影響を及ぼす。本明細書に記載される方法で用いるのに適した油産生酵母種としては、限定されないが、Candidaapicola、Candidasp.、Cryptococcuscurvatus、Cryptococcusterricolus、Debaromyceshansenii、Endomycopsisvernalis、Geotrichumcarabidarum、Geotrichumcucujoidarum、Geotrichumhisteridarum、Geotrichumsilvicola、Geotrichumvulgare、Hyphopichiaburtonii、Lipomyceslipofer、Lypomycesorentalis、Lipomycesstarkeyi、Lipomycestetrasporous、Pichiamexicana、Rodosporidiumsphaerocarpum、Rhodosporidiumtoruloides、Rhodotorulaaurantiaca、Rhodotoruladairenensis、Rhodotoruladiffluens、Rhodotorulaglutinus、Rhodotorulaglutinisvar.glutinis、Rhodotorulagracilis、Rhodotorulagraminis、Rhodotorulaminuta、Rhodotorulamucilaginosa、Rhodotorulamucilaginosavar.mucilaginosa、Rhodotorulaterpenoidalis、Rhodotorulatoruloides、Sporobolomycesalborubescens、Starmerellabombicola、Torulasporadelbruekii、Torulasporapretoriensis、Trichosporonbehrend、Trichosporonbrassicae、Trichosporondomesticum、Trichosporonlaibachii、Trichosporonloubieri、Trichosporonloubierivar.loubieri、Trichosporonmontevideense、Trichosporonpullulans、Trichosporonsp.、WickerhamomycesCanadensis、Yarrowialipolytica、及びZygoascusmeyeraeが挙げられる。本明細書に記載される方法で用いる油産生酵母の種は、ゲノムの特定の標的領域を、本明細書で同定される種の同じ領域と比較することによって同定することができる;好ましい種は、本明細書で同定される種と同一性又は少なくとも極めて高度な相同性を示し、且つ本明細書に具体的に記載される株と同程度の量の、及びそれと同様の種類の脂質を生成する種である。例えば、特定の油産生酵母の種又は株の同定は、例えば、KurtzmanandRobnett,AntonievanLeeuwenhoek734:331-3711998,Identificationandphylogenyofascomycetousyeastsfromanalysisofnuclearlargesubunit26SribosomalDNApartialsequencesに記載される方法を用いて、プライマー及び適切なゲノム領域を使用する方法を用いたゲノムDNAの増幅及び配列決定により達成することができる。十分に確立された系統発生解析方法、例えば、核18S及び26S並びにリボソームRNA遺伝子の内部転写スペーサーITS領域及び他の保存領域の増幅及び配列決定を用いて、当業者は、本明細書に開示される方法で用いるのに適した油産生酵母の種を同定することができる。従って、ゲノムDNA比較を用いて、本明細書に記載される方法で使用すべき油産生酵母の適切な種を同定することができる。保存されたゲノムDNAの領域、例えば、限定されないが、真菌18Sの3’領域と真菌26SrRNA遺伝子の5’領域との間の保存されたゲノム配列を、例えば、本明細書に記載される方法で使用する好ましい油産生酵母に分類学的に関連し得る酵母種から増幅させて、好ましい種の対応する領域を比較することができる。次に、本明細書に記載される方法で用いるための高度な類似性を示す種を選択する。実施例6は、油産生酵母株の48株についての保存された真菌18Sの3’領域及び真菌26SrRNAの5’領域のゲノム配列決定について記載している。パーセントヌクレオチド又はアミノ酸同一性を決定する配列比較は、微細藻類/微生物について上記に開示されるものと同じ方法を用いて実施することができる。油産生酵母は、本明細書に記載される方法においては液体培地で培養され、バイオマスを増殖する。本明細書に記載される方法では、油産生酵母種は、固定炭素源及び/又は固定窒素源を含有する培地で、光がない状態で成長させる従属栄養成長。油産生酵母の従属栄養成長は、通常は好気性環境で起こる。例えば、制限窒素条件下で長時間、例えば10~15日間又はそれ以上にわたり従属栄養成長させると、細胞中の軽い脂質/油の含有分が蓄積し得る。油産生酵母培地は、典型的には、固定炭素源以下で考察する、固定窒素源タンパク質、大豆ミール、酵母エキス、コーンスティープリカー、アンモニア純粋の、又は塩形態の、ナイトレート、又は硝酸塩など、微量元素、場合によりpH維持のためのバッファー、及びホスフェート亜リン酸源;他のリン酸塩を使用することができるのような成分を含有する。特定の例において、油産生酵母株の培養に適した培地は、YPD培地である。この培地は一者培養に適しており、10gのバクト酵母、20gのバクトペプトン及び40gのグルコースを蒸留水に添加することにより、1L容量の培地pH約6.8を調製することができる。1.5寒天培地について、1Lの溶液に15gの寒天を添加することができる。この溶液は蓋をしてオートクレーブ処理され、その後、使用時まで冷蔵温度に保存される。乾燥重量の割合として高脂質値を生じるように油産生酵母株を成長及び増殖させる他の方法については、記載がなされている例えば、Lietal.,EnzymeandMicrobialTechnology200741:312-317を参照流加回分発酵を用いてRhodosporidiumtoruloidesを67.5w/wの脂質に培養することを示す。油産生酵母中の高脂質/油含有量は、典型的には、窒素制限下で過剰の炭素源を供給しながら発酵時間を増やすことにより生じ得る。固体及び液体成長培地は、一般的にさまざまな供給源から利用可能であり、油産生酵母のさまざまな株に適した特定の培地の調製についての手引きは、例えば、オンラインでwww.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ_Medium186.pdfに見ることができる。本明細書に記載される方法で用いるのに適した他の培地は、上記に特定されるURLを参考にすることにより、又はFungalCultureCollectionsofTheWorldAustrianCenterofBiologicalResourcesandAppliedMycologywww.biotec.boku.ac.at/acbr.html;TheBiomedicalFungiandYeastsCollectionbccm.belspo.be/about/ihem.php;CzechCollectionofMicroorganismssci.muni.cz/ccm/index.html;InstitutPasteurwww.pasteur.fr/ip/easysite/go/03b-000011-08h/;GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultureswww.dsmz.de/;MychotecaUnivesitatisTaurinenesisweb086.unito.it/cgi-bin/bioveg/documenti.pl/Show_id=b522;理研バイオリソースセンターRikenBioresourceCenterJapanCollectionofMicroorganismswww.jcm.riken.jp/JCM/announce.shtml;TheNationalCollectionofYeastCultureswww.ncyc.co.uk/;ATCCwww.atcc.org/;PhaffYeastCultureCollectionwww.phaffcollection.org/のような、油産生酵母の培養物を管理している他の組織を参考にすることにより、容易に同定することができる。本明細書に記載される方法における有用な油産生酵母は、世界中のさまざまな場所及び環境に見出される。他の種からのその分離及び得られる進化的分岐の結果として、任意の特定の細菌種から油及び/又は脂質及び/又はタンパク質を最適に成長及び産生させるための特定の成長培地は、予測することが困難又は不可能であり得るが、当業者は、本明細書の開示をふまえて、ルーチン試験により適切な培地を容易に見つけることができる。ある場合では、特定の微生物株は、何らかの阻害成分が存在したり、又はその特定の微生物株が要求する何らかの必須栄養要件が存在しなかったりするために、特定の成長培地で成長させることができないこともある。以下の例は、乾燥細胞重量の割合として高濃度の脂質を蓄積するようにさまざまな油産生酵母種を培養する例示的な方法を提供する。固定炭素源は培地の主要成分である。本明細書に記載される方法の目的に適した固定炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、ショ糖、ラクトース、ガラクトース、キシロース、マンノース、ラムノース、アラビノース、N-アセチルグルコサミン、グリセロール、グルクロン酸、ラフィノース、スタキオース、及び/又はアセテートが挙げられる。上記の第3節培地には、適した炭素源に関するより詳細な考察が含まれる。プロセスの条件は、細胞のうち脂質油である重量の割合を増加させるように調整することができる。例えば、特定の実施形態では、油産生酵母は、グルコースのような固定炭素源の過剰量を与えながら、制限濃度の1つ以上の栄養物、例えば、窒素、リン酸塩、及び特定の金属イオンの存在下で培養される。窒素制限は、窒素が過剰に与えられる培養物での微生物脂質収率と比べて、微生物脂質収率を増加させる傾向がある。特定の実施形態では、脂質収率は少なくとも約10、50、100、200、又は500増加する。細菌は、全培養期間の一部分にわたり、又は期間全体にわたり、制限された量の栄養物の存在下で培養されてもよい。ある実施形態では、栄養物濃度は、全培養期間の間に制限濃度と非制限濃度とが少なくとも2回繰り返される。安定成長状態では、細胞は油脂質を蓄積するが、細胞分裂は起こさない。本発明の一実施形態では、固定窒素源を除き、元の成長培地のあらゆる成分を細胞に与え続けることにより、成長状態が維持される。長期間細胞に供給することによるなど、固定窒素源を除く、細胞に本来与えられる全ての栄養物を供給することによって油産生酵母を育てると、乾燥細胞重量での脂質の割合が高くなる。他の実施形態では、固定窒素が少なくとも1週間又は2週間など長期間で全て消費された後に固定炭素源を細胞に供給することにより、高脂質バイオマスが生じる。ある実施形態では、細胞には、固定炭素源が存在し、且つ固定窒素源が存在しない状態で、10日間、15日間、又は20日間、油を蓄積させる。本明細書に記載されるか、又は他の当該技術分野において公知の条件を用いた油産生酵母の成長は、乾燥重量で少なくとも約20の脂質を含むことができ、多くの場合に乾燥重量で35、45、55、65、及びさらには75以上の脂質を含むことができる。従って、細胞を成長状態に保つことにより、そこで細胞は炭素を消費して油を蓄積するが、細胞分裂は起こさず、微生物脂質生成における脂質としての乾燥細胞重量の割合が向上し得る。窒素が過剰な条件では、窒素が過剰には与えられない培養での微生物油収率と比べて、微生物のタンパク質収率が増加する傾向がある。油産生酵母に適した窒素供給源は、有機窒素供給源及び/又は無機窒素供給源に由来し得る。有機窒素供給源の非限定的な例は、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、及びコーンスティープ粉末である。好ましい無機窒素供給源の非限定的な例としては、例えば、及び限定なしに、NH42SO4及びNH4OHが挙げられる。一実施形態では、本発明を実施するための培地は、無機窒素供給源のみを含有する。別の実施形態では、本発明を実施するための培地は、有機窒素供給源のみを含有する。さらに別の実施形態では、本発明を実施するための培地は、有機及び無機窒素供給源の混合物を含有する。油産生酵母の成長に用いられる培地配合の例には、以下が含まれる:7g/LKH2PO4;2g/LNa2HPO4;1.5g/LMgSO47H2O;1.5g/L酵母エキス;0.2g/LCaCl26H2O;0.1g/LFeCl36H2O;0.001g/Lビオチン及び0.001g/LZnSO47H2O、HCLでpHレベルを5.5に調整、及び12g/Lグルコース及び30g/LNH4Clを窒素供給源として含む。油産生酵母の成長に用いられる別の培地には、以下が含まれる:20g/Lグルコース;0.5g/L酵母エキス;5g/LNH42SO4;及び1g/LKH2PO4;0.5g/LMgSO47H2O。油産生酵母を発酵槽で成長させるための一つの培地配合は、以下からなる:30g/Lグルコース;20g/Lキシロース;2g/LNH42SO4;1g/LKH2PO4;及び0.5g/LMgSO47H2O。本明細書に記載される方法では、バイオリアクター又は発酵槽を使用して、その生理学的周期のさまざまな期間を通じて油産生酵母細胞が培養される。例として、脂質を生成する油産生酵母細胞の播種物質が培地に導入される;細胞が増殖し始めるまでに遅延期間遅延期が存在する。遅延期間の後、増殖速度は徐々に上がっていき、対数期すなわち指数増殖期に入る。次いで、指数増殖期の後、窒素のような栄養物の減少、毒性基質の増加、及び菌体数感知機構のために増殖が遅くなる。このように増殖が遅くなった後、増殖が止まり、細胞は、細胞に与えられている特定の環境に依存して、静止期又は安定成長状態に入る。脂質を豊富に含むバイオマスを得るために、培養物は、典型的には指数増殖期が終わった後に良好に回収され、指数増殖期は、窒素又は別の鍵となる栄養物炭素以外のものを枯渇させて、強制的に細胞が過剰に存在する炭素源を脂質に変換するようにすることで、初期に終わらせてもよい。培養条件のパラメータは、油の総生成量、生成する脂質種の組み合わせ、及び/又は特定の油の生成を最適にするように操作することができる。高脂質油産生酵母を生成するため、細胞を好ましくは液体中で、例として浮遊培養で、大量に発酵させる。鋼鉄製発酵槽のようなバイオリアクター本発明の種々の実施形態では、5000リットル、10,000リットル、80,000リットル、及びそれ以上の容積が用いられるは、非常に大きい培養物容積を収容することができる。また、バイオリアクターによって、典型的には、温度、pH、酸素圧、及び二酸化炭素濃度のような培養条件を制御することができる。例えば、バイオリアクターは、典型的には、例えば、酸素又は窒素のような気体成分を液体培養物にバブリングすることが可能な配管に接続したポートを用いて構築することができる。バイオリアクターは、油産生酵母が繁殖し、数が増える全期間を通じて、培地がバイオリアクターを流れるような構成であってもよい。ある実施形態では、例えば、播種した後であるが、細胞が望ましい密度になる前に、培地をバイオリアクターに注入してもよい。別の状況では、培養開始時にバイオリアクターを培地で満たし、培養物を播種した後は、それ以上培地を注入しない。言い換えると、油産生酵母バイオマスを、酵母が繁殖し、数が増える全期間を通じて、水性媒体中で培養する;しかし、所定分量の水性培地が全期間を通じてバイオリアクターを流れているのではない。従ってある実施形態では、水性培地は、播種後にはバイオリアクターを流れない。スピニングブレード、インペラー、揺動機構、撹拌棒、加圧気体を注入する手段のようなデバイスを備えるバイオリアクターを用い、油産生酵母培養物を混合に供することができる。混合は、連続的であってもよく、断続的であってもよい。上記で簡潔に述べたように、バイオリアクターは、例えば、培養物の気体内容物の操作を可能にする、さまざまなポートを備えることが多い。説明のために、バイオリアクターの容積の一部分は、液体ではなく気体であってもよく、バイオリアクターの気体注入口から、ポンプによって気体をバイオリアクターに入れることができる。ポンプによってバイオリアクターへと有益に入れることが可能な気体としては、空気、空気/CO2混合物、アルゴンのような希ガス、他の気体が挙げられる。バイオリアクターは、典型的には、バイオリアクターにガスを入れる速度をユーザーが制御することができるように取り付けられている。上述のように、バイオリアクターへの気体の流れを増やすことによって、培養物の混合性を高めることができる。気体の流れを増やすと、培地の濁度にも影響が及ぶ。水性培地の液面より低いところに気体注入ポートを配置し、それによりバイオリアクターに入った気体を培地表面でバブリングさせるすることにより、乱流を起こすことができる。1つ以上の気体流出ポートにより気体が外に逃がされ、それによりバイオリアクター内の圧力の蓄積が防止される。好ましくは、気体流出ポートは、バイオリアクターに微生物が入り込んで汚染されることを防ぐ一方向バルブにつながっている。本明細書に記載されているバイオリアクター、培養条件、従属栄養性成長及び増殖方法の特定の例を任意の適切な様式で組み合わせ、微生物の成長効率、及び脂質及び/又はタンパク質の生成効率を高めることができる。上述の方法によって生じる油産生酵母培養物から、発酵培地中に油産生酵母バイオマスが得られる。油の抽出用にこのバイオマスを調製するため、並びに微細藻類又は他の微生物のバイオマスを調製するため、バイオマスは、典型的には発酵培地から濃縮され、又は回収される。発酵培地から油産生酵母バイオマスを回収する時点では、バイオマスは、主に、水性培地に懸濁されたインタクトな細胞を含む。このバイオマスを濃縮するため、脱水工程を行うことができる。脱水又は濃縮は、発酵ブロス又は他の液体培地からのバイオマスの分離を指し、従って固液分離である。従って、脱水中に、培地がバイオマスから例えば、発酵ブロスを、バイオマスを保持するフィルターを介して排液することにより取り除かれ、又はバイオマスは他の方法で培地から取り除かれる。一般的な脱水方法としては、遠心分離、濾過、及び機械的圧力の使用が挙げられる。これらの方法は、個別にも、又は任意に組み合わせても用いることができる。遠心分離には、遠心力を用いた混合物の分離が含まれる。遠心分離においては、混合物中のより大きい密度の成分が遠心軸から離れ、一方で混合物中の密度が小さい成分は軸に向かって移動する。有効重力を増加させることによりすなわち、遠心分離速度を増加させることにより、固体のように密度が大きい材料が、液体のように密度が小さい材料から分離するため、密度に従い分離される。バイオマス及びブロス又は他の水溶液の遠心分離により、油産生酵母細胞を含む濃縮ペーストが形成される。遠心分離では、多量の細胞内の水は除去されない。実際、遠心分離後にも、バイオマスには相当量の表面水分又は自由水分例えば、70を上回るがなお存在し得るため、遠心分離は乾燥工程とは見なされない。濾過もまた、脱水に用いることができる。本明細書に記載される方法に適した濾過の一例は、クロスフロー濾過としても知られるタンジェント流濾過TFFである。タンジェント流濾過は、膜システム及びフロー力を用いて液体から固体を分離する分離技法である。例示的な適した濾過方法については、MaxCellA/GTechnologies0.45uM中空糸フィルターの使用について記載しているGeresh,Carb.Polym.50;183-1892002を参照。また、例えば、100kD、300kD、1000kD膜カタログ番号P2C01MC01、0.1uM膜カタログ番号P2VVPPV01、0.22uM膜カタログ番号P2GVPPV01、及び0.45uM膜カタログ番号P2HVMPV01とともに使用する、MilliporePellicon登録商標装置も参照。好ましくは、保持液がフィルターを通過する程度は高くなく、保持液中の生成物は、好ましくはフィルター材料に付着しない。またTFFは、中空糸濾過システムを用いて行うこともできる。孔径がなくとも約0.1マイクロメートル、例えば約0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.22、0.45、又は少なくとも約0.65μmであるフィルターが適している。TFFの好ましい孔径は、溶質及び発酵ブロス中の発酵片を通過させるが、微生物細胞は通過させないものである。脱水はまた、バイオマスを脱水するのに十分な、しかし細胞の主な溶解は引き起こすことのない、液体の発酵ブロスを微生物バイオマスから分離させる機械的圧力を、バイオマスに直接加えて生じさせることもできる。微生物バイオマスを脱水させる機械的圧力は、例えばベルトフィルタープレスを使用して加えることができる。ベルトフィルタープレスは、縮径するロールのサーペンタインを介して、2つの張力がかかったベルトの間を通過するスラリー例えば、発酵槽又はバイオリアクターから直接取られた微生物バイオマスに機械的圧力を加える脱水装置である。ベルトフィルタープレスは、実際には3つの区間に分けられ得る:重力区間、ここでは自由に排出する水/液体が重力によって多孔質ベルトを介して排出される;ウェッジ区間、ここでは圧力を加えるための固体が調製される;及び圧力区間、ここでは重力で排出される固体に調整可能な圧力が加えられる。濃縮後、油産生酵母バイオマスは、本明細書において以下に記載されるように処理され、油の抽出用に調製される。乾燥重量で高い割合の油/脂質蓄積を有する油産生酵母バイオマスは、当該技術分野において公知の方法を含む種々の培養方法を用いて生成されている。蓄積された油/脂質の割合が高い油産生酵母は、本明細書に記載される方法で有用である。Candida107は、窒素制限条件下で最大40脂質wt/wtを蓄積可能であることが示されたGilletal.,ApplandEnvironMicrobiology1977pp.231-239。Lietal.は、48w/wの脂質含有量に至る流加回分培養でのRhodosporidiumtoruloids44の生成を実証しているLietal.,EnzymeandMicrobialTechnology200741:312-317。Yarrowialipolyticaは、動物性脂肪ステアリンを炭素源として使用するとき、バイオマス1gあたり0.44~0.54gの脂質を生成可能であることが示されているPanpanikolaouetal.,ApplMicrobiolBiotechnol200258:308-312。本明細書に記載される培養方法により生成され、且つ本明細書に記載される方法において有用なバイオマスは、乾燥重量で少なくとも10の油を含む。ある実施形態では、バイオマスは、乾燥重量で少なくとも25、少なくとも50、少なくとも55、又は少なくとも60の油を含む。ある実施形態では、バイオマスは、乾燥重量で10~90の油、25~75の油、40~75の油、又は50~70の油を含有する。本明細書に記載されるバイオマスの油、又は本明細書に記載される方法及び組成物で用いられるバイオマスから抽出される油は、1つ以上の別個の脂肪酸エステル側鎖を有するグリセロ脂質を含み得る。グリセロ脂質は、1つ、2つ又は3つの脂肪酸分子にエステル化されたグリセロール分子から構成され、このグリセロール分子は長さがさまざまで、さまざまな飽和度を有し得る。油組成物、すなわちグリセロ脂質の脂肪酸構成要素の特性及び比率は、少なくとも2つ別個の油産生酵母種又は油産生酵母株及び別の油産生細菌に由来するバイオマス又は油を組み合わせることによって操作することができる。ある実施形態では、別個の細菌種のうちの少なくとも2つが、異なるグリセロ脂質プロフィールを有する。別個の細菌種は、好ましくは従属栄養条件下で、本明細書に記載されるように共に又は別々に培養することができ、それによりそれぞれの油が産生され得る。異なる細菌種は、細胞のグリセロ脂質中、異なる割合の別個の脂肪酸構成要素を含有し得る。Yarrowialipolyticaは遺伝子操作されている。本発明の実施形態は、脂質改変酵素を含有するYarrowialipolyticaの操作された株を使用して、潤滑剤及び誘電性流体としての使用に適した油を作る。Yarrowiaを操作する例は、米国特許第7,465,565号及び第7,273,746号及び米国特許出願第10/840579号、第11/613420号、第11/714377号及び第11/264737号に記載されている。III.遺伝子操作方法及び材料本明細書に記載される方法は、組み換え微細藻類又は他の組み換え油産生微生物を使用して実施することができる。この章は、限定されないが、組み換えProtothecamoriformis、Protothecazopfii、Protothecakrugani、及びProtothecastagnora宿主細胞を含めた、本明細書に記載される方法に有用な組み換え宿主細胞を作製するための、特にPrototheca細胞により例示される、微細藻類のような油産生微生物を遺伝子改変する方法及び材料について記載する。これらの方法及び材料についての記載は、読者が読みやすいようにいくつかの節に分けている。第1節では、形質転換方法について記載している。第2節では、相同組み換えを用いる遺伝子操作方法について記載している。第3節では、発現ベクター及び構成要素について記載している。1.操作方法-形質転換細胞を、例えば、微粒子銃、エレクトロポレーションMaruyamaetal.2004、BiotechnologyTechniques8:821-826、ガラスビーズによる形質転換、及び炭化ケイ素ウィスカーによる形質転換のような任意の適切な技術によって形質転換することができる。使用可能な別の方法は、プロトプラストを作成し、CaCl2及びポリエチレングリコールPEGを用い、組み換えDNAを微細藻類又は他の微生物細胞に導入することを含むKimetal.2002、Mar.Biotechnol.4:63-73、この論文は、Chorellaellipsoideaを形質転換するために、この方法を用いることを報告している。微細藻類の共形質転換を利用し、2種類の別個のベクター分子を細胞に同時に導入することができる例えば、Protist2004Dec;1554:381-93。微粒子銃による方法例えば、Sanford、TrendsInBiotech.19886:299302、米国特許第4,945,050号;エレクトロポレーションFrommetal.、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA198582:58245828;レーザービーム、マイクロインジェクション、又はDNAを微細藻類に導入することが可能な任意の他の方法の使用を、Prototheca細胞などの油産生細菌を形質転換するために用いることができる。2.操作方法-相同組み換え相同組み換えは、相同性領域を並べて交換する相補的DNA配列の能力に関する。相同組み換えプロセスでは、標的とするゲノム配列テンプレートと相同な、トランスジェニックDNAドナーを含む配列が生物に導入され、次いで、対応するゲノム相同配列の部位においてゲノムへの組み換えが行われる。このプロセスの機構的な工程には、ほとんどの場合に以下が含まれる:1相同DNAセグメントの対形成;2ドナーDNA分子への二本鎖切断の導入;3遊離ドナーDNA末端によるテンプレートDNA分子への侵入と、それに続くDNA合成;及び4組み換え産物をもたらす二本鎖切断修復イベントの回復resolution。宿主又は有機体で相同組み換えを行う能力は、分子の遺伝子レベルで行うことができ、用途に応じた油油脂を産生することができる油産生細菌の生成に有用であるといった多くの実用的意義がある。相同組み換えは、それ自体の本来の性質により、正確な遺伝子標的事象であり、従って、同じ標的配列を用いて作られたほとんどのトランスジェニック系は、表現型の観点では本質的に同一であり、それほど多くの形質転換事象をスクリーニングする必要はない。また、相同組み換えは、遺伝子が宿主の染色体に挿入される事象を標的としており、これにより、遺伝子の選択が存在しない状態であっても、優れた遺伝子安定性が得られる。染色体上の遺伝子座が異なることは、異種プロモーター/UTRに由来するものであっても、遺伝子発現に影響を与えるため、相同組み換えは、よく知られていないゲノム環境にある遺伝子座を検索し、特定のゲノム環境が遺伝子発現に与える影響を評価する方法になり得る。相同組み換えを用いる特に有用な遺伝子操作は、プロモーター/UTRのような選択特異的な宿主制御エレメントが、非常に特異的な様式で異種遺伝子を発現させることである。例えば、選択マーカーをコードする異種遺伝子によるデサチュラーゼ遺伝子/遺伝子ファミリーの除去又はノックアウトを用いて、宿主細胞で生成される飽和脂肪酸の全体的な割合を増加させることができる。実施例4は、Protothecamoriformisで生じさせるそのようなデサチュラーゼ遺伝子除去ノックアウトの相同組み換え標的構築物及び実施例について記載している。内因性遺伝子の発現を低下させる別のアプローチは、限定されないが、RNAi又はアンチセンスアプローチ、並びにdsRNAアプローチを含め、遺伝子発現の下方調節又はサイレンシングをRNAによって誘導する方法を用いることである。アンチセンス、RNAi、dsRNA、及びヘアピンRNAアプローチは、当該技術分野において周知であり、mRNAとして発現するとヘアピンRNAの形成をもたらす発現構築物又はアンチセンス方向に転写される標的遺伝子の一部分を含む発現構築物の導入を含む。これらのアプローチは全て、標的遺伝子の発現の低下をもたらす。また、実施例4は、ヘアピンRNAアプローチによって内在するProtothecamoriformisデルタ12デサチュラーゼ遺伝子FADcを下方調節する発現構築物及び実施例について記載している。相同組み換えは正確な遺伝子標的イベントであるため、十分なフランキング領域が同定されている限り、目的の遺伝子又は領域内の任意のヌクレオチドの正確な改変に用いることができる。従って、相同組み換えは、RNA及び/又はタンパク質の遺伝子発現に影響を及ぼす制御配列を改変する手段として用いることができる。相同組み換えはまた、基質特異性、親和性、及びKmのような酵素活性が改変されるようタンパク質コード領域を改変し、そのようにして宿主細胞の代謝に望ましい変化を生じさせるためにも用いることができる。相同組み換えは、遺伝子ターゲッティング、遺伝子変換、遺伝子欠失、遺伝子重複、及び遺伝子反転を生じさせ、且つプロモーター、エンハンサー及び3’UTRのような遺伝子発現調節エレメントの交換を生じさせる強力な宿主ゲノム操作手段である。相同組み換えは、内在する宿主細胞ゲノム内にある目的の遺伝子又は領域を標的とするために、内在する配列の一部を含む標的構築物を用いることによって行うことができる。このような標的配列は、目的の遺伝子又は領域の5’末端に位置していてもよく、目的の遺伝子/領域の3’末端に位置していてもよく、目的の遺伝子/領域に隣接していてもよい。このような標的構築物を、さらなるベクター骨格を有する超らせん構造のプラスミドDNAとして、ベクター骨格を有さないPCR産物として、又は線状分子として宿主細胞内で形質転換してもよい。ある場合では、まず、制限酵素を用いて、トランスジェニックDNAドナーDNA内にある同種配列にさらすことが有益な場合がある。この工程によって、組み換え効率が増し、望ましくない事象の発生を減らすことができる。組み換え効率を高める他の方法としては、処理されるゲノム配列に対して同種の線状末端を含有する形質転換されたトランスジェニックDNAを作成するためにPCRを用いることが挙げられる。非限定的な例示として、相同組み換えに有用なドナーDNA配列の領域としては、ProtothecamoriformisにおけるDNAのKE858領域が挙げられる。KE858は、タンパク質のトランスファーRNAtRNAファミリーと相同性を共有するタンパク質のコード領域の一部を包含する1.3kbのゲノムフラグメントである。サザンブロットから、KE858配列がProtothecamoriformisUTEX1435ゲノムの単一配列に存在することが示されている。この領域及び相同組み換えの標的化にこの領域を用いる例は、PCT出願番号第PCT/US2009/66142号に記載されている。ドナーDNAの別の有用な領域は6Sゲノム配列である。3.ベクター及びベクター成分微生物の形質転換用ベクターは、本明細書の開示を考慮して、当業者には有名な既知の技術によって調製することができる。ベクターは、典型的には1つ以上の遺伝子を含有し、それぞれの遺伝子は、所望の産物遺伝子産物の発現をコードし、且つ、遺伝子発現を調整し、又は遺伝子産物を組み換え細胞の特定の位置に標的化する1つ以上の制御配列に動作可能に連結されている。読者の助けとなるように、この節をいくつかの節に分けている。第A節は、ベクター上に含まれ得る制御配列について記載している。第B節は、ベクターに典型的に含まれる遺伝子並びにコドン最適化方法及びそれを用いて調製される遺伝子について記載している。A.制御配列制御配列は、コード配列の発現を制御するか、又は遺伝子産物を、細胞内又は細胞外の特定の位置に向かわせる核酸である。発現を制御する制御配列としては、例えば、コード配列の転写を制御するプロモーター、コード配列の転写を止めるターミネーターが挙げられる。別の制御配列は、コード配列の末端に位置する3’非翻訳配列であり、ポリアデニル化シグナルをコードする。遺伝子産物を特定の位置に向かわせる制御配列としては、シグナルペプチドをコードする配列が挙げられ、この配列は、細胞内又は細胞外の特定の位置に、この配列が結合したタンパク質を向かわせる。従って、微細藻類又は他の油産生細菌において外来遺伝子を発現するような例示的なベクターの設計は、望ましい遺伝子産物例えば、選択可能なマーカー、脂質経路改変酵素、又はショ糖利用酵素のためのコード配列を、微細藻類又は他の油産生細菌内で活性なプロモーターと動作可能に連結した状態で含む。又は、ベクターが、目的のコード配列と動作可能に連結した状態でプロモーターを含まない場合、コード配列を、ベクターの組み込み位置で内在するプロモーターに動作可能に連結するように、細胞内で形質転換してもよい。プロモーターを用いずに形質転換する方法は、微細藻類例えば、PlantJournal14:4、1998、pp.441-447又は他の油産生細菌でうまく働くことがわかっている。多くのプロモーターは、微細藻類内で活性であり、形質転換される藻に内在するプロモーター、形質転換される藻に内在しないプロモーターすなわち、他の藻に由来するプロモーター、高等植物に由来するプロモーター、植物ウイルス又は藻ウイルスに由来するプロモーターを含む。微細藻類内で活性な、具体的な外来のプロモーター及び/又は内在するプロモーター微細藻類中で機能する抗生物質耐性のある遺伝子は、PCT公開番号第2008/151149号及びこの明細書に引用されている参考文献に記載されている。外来遺伝子を発現させるために用いられるプロモーターは、その外来遺伝子に天然で連結しているプロモーターであってもよく、又は、異種遺伝子プロモーターであってもよい。ある種のプロモーターは、1つより多い微細藻類において活性である。他のプロモーターは、種に特異的である。具体的なプロモーターとしては、以下の実施例で用いられる、Chlamydomonasreinhardtiiに由来するβ-チューブリンのようなプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスCMV及びクロレラウイルスから由来するプロモーターのような、微細藻類の複数の種の中で活性であることが示されているウイルスプロモーターが挙げられる例えば、PlantCellRep.2005Mar;2310-11:727-35;JMicrobiol.2005Aug;434:361-5;MarBiotechnolNY.2002Jan;41:63-73。Prototheca内で外来遺伝子を発現させるのに適切な別のプロモーターは、Chlorellasorokinianaグルタミン酸脱水素酵素プロモーター/5’UTRである。通常、これらの配列のうち、プロモーターを含有し、少なくとも10、20、30、40、50、又は60ヌクレオチド、又はそれ以上が使用される。Prototheca内で外来遺伝子を発現させるのに有用な代表的なプロモーターは、本明細書の配列表に列挙されており、例えば、ChlorellaHUP1遺伝子のプロモーター配列番号1、Chlorellaellipsoidea硝酸還元酵素プロモーター配列番号2がある。Chlorellaウイルスプロモーターを、Prototheca内で遺伝子を発現させるために用いることもでき、例えば、米国特許第6,395,965号の配列番号1~7が挙げられる。Prototheca内で活性なさらなるプロモーターは、例えば、BiochemBiophysResCommun.1994Oct14;2041:187-94;PlantMolBiol.1994Oct;261:85-93;Virology.2004Aug15;3261:150-9;及び、Virology.2004Jan5;3181:214-23に見いだすことができる。プロモーターは、一般的に、構成的であるか、又は誘発性であると特徴づけることができる。構成的プロモーターは、一般的に、いつでも又は、細胞周期の特定の時期に同じレベルで活性であるか、又は発現を起こすように機能する。誘発性プロモーターは、これとは異なり、刺激に応答したときのみ、活性である又は不活性化するか、又は顕著に上方調節されるか、又は下方調節される。どちらの種類のプロモーターも、本明細書に記載の方法での用途がある。本明細書に記載の方法で有用な誘発性プロモーターとしては、例えば、外から与えられる低分子例えば、配列番号1の場合には、グルコース、温度熱いか、又は冷たい、培地中の窒素不足などの刺激に応答して、動作可能に連結した遺伝子の転写に介在するプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターは、本質的にサイレント遺伝子である遺伝子の転写を活性化させることができるか、又は、低濃度で転写されるような動作可能に連結した遺伝子の転写を上方調節し、好ましくは、かなり上方調節することができる。停止領域の制御配列の包含は任意であり、利用される場合には、停止領域は比較的置き換え可能であるため、その選択は、主に簡便なものである。停止領域は、転写開始領域プロモーターに由来するものであってもよく、目的のDNA配列に由来するものであってもよく、又は、別の供給源から得られるものであってもよい。例えば、ChenandOrozco、NucleicAcidsRes.198816:8411。また、本発明は、制御配列及び組み換え遺伝子、及び目的の遺伝子を区画化して発現するための、これらを含むベクターを提供する。標的とするための細胞小器官は、葉緑体、プラスチド、ミトコンドリア、小胞体である。それに加え、本発明は、制御配列及び組み換え遺伝子、細胞の外側にタンパク質を分泌するための、これらを含むベクターを提供する。Protothecaの核ゲノム内で発現するタンパク質は、プラスチド標的シグナルを用い、プラスチドを標的としてもよい。Chlorellaに内在するプラスチド標的配列は知られており、例えば、プラスチドを標的とするタンパク質をコードする、Chlorella核ゲノム内の遺伝子、例えば、GenBank寄託番号AY646197及びAF499684が挙げられ、一実施形態では、このような制御配列を含むベクターは、Protothecaプラスチドでタンパク質を発現させることを標的とするために、本明細書に記載の方法で使用される。以下の実施例は、宿主細胞の正しい区画に異種タンパク質を向かわせるために、プラスチド標的配列を使用することを記載している。cDNAライブラリーは、Protothecamoriformis細胞及びChlorellaprotothecodies細胞を用いて作られ、PCT出願米国特許出願公開第2009/066142号明細書に記載されている。別の実施形態では、Prototheca又は他の油産生細菌内でのポリペプチドの発現は、小胞体を標的としている。発現ベクター内の適切な保持シグナル又は選別シグナルによって、タンパク質が確実に小胞体ERに保持され、ゴルジ体の下流には行かない。例えば、WageningenUR-PlantResearchInternationalのIMPACTベクター1.3ベクターは、よく知られているKDEL保持シグナル又は選別シグナルを含んでいる。このベクターを用い、ERを保持することは、発現レベルが5倍以上に高まることが報告されているという点で、実益がある。この現象の主な理由は、ERが、細胞質に存在するプロテアーゼより低い濃度のプロテアーゼを含んでいるか、及び/又は、細胞質に存在するプロテアーゼとは異なる、発現したタンパク質の翻訳後の分解に関与するプロテアーゼを含んでいるからだと思われる。緑色微細藻類内で機能するER保持シグナルが知られている。例えば、ProcNatlAcadSciUSA.2005Apr26;10217:6225-30を参照。本発明の別の実施形態では、ポリペプチドは、細胞から出て、培地に分泌することを標的としている。Protothecaなどの他の微細藻類内でも使用することが可能な、Chlorella内で活性なシグナルの分泌については、Hawkinsetal.、CurrentMicrobiologyVol.381999、pp.335-341を参照。B.遺伝子及びコドンの最適化典型的には、遺伝子は、プロモーターと、コード配列と、停止制御配列とを含む。組み換えDNA技術によって組み立てられる場合、遺伝子は、発現カセットと呼ばれることもあり、組み換え遺伝子を宿主細胞に導入するために使用されるベクターに簡便に挿入するために、制限配列に隣接していてもよい。発現カセットは、ゲノム由来のDNA配列、又は相同組み換えにいよって発現カセットをゲノムに安定に組み込みやすくすることを標的とした他の核酸に隣接していてもよい。又は、ベクター及びその発現カセットは、組み込まれないままであってもよく、この場合には、ベクターは、典型的には、異種ベクターDNAを複製するために与えることができるような、複製起源を含んでいてもよい。ベクター上に存在する共通の遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であり、この発現によって、このタンパク質を含有する組み換え細胞が、このタンパク質を発現しない細胞と分化する。このような遺伝子、又はその対応する遺伝子産物は、選択可能なマーカーと呼ばれる。任意のさまざまな選択可能なマーカーを、Prototheca又は本明細書に記載される方法で有用な任意の他の油産生細菌の形質転換に有用なトランス遺伝子構築物に用いることができる。適切な選択可能なマーカーの例としては、G418耐性遺伝子、硝酸還元酵素遺伝子Dawsonetal.1997、CurrentMicrobiology35:356-362を参照、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子HPT;Kimetal.2002、Mar.Biotechnol.4:63-73を参照、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、フレオマイシン対する耐性を付与するble遺伝子Huangetal.2007、Appl.Microbiol.Biotechnol.72:197-205が挙げられる。微細藻類及び他の油産生細菌の抗生物質に対する感度を決める方法はよく知られている。例えば、MolGenGenet.1996Oct16;2525:572-9を参照されたい。抗生物質ベースでない他の選択可能なマーカーもまた、Prototheca種を含め、一般に微細藻類の形質転換に有用なトランス遺伝子構築物に用いることができる。これまで微細藻類が利用できなかった特定の炭素源の利用能を付与する遺伝子もまた、選択可能なマーカーとして使用することができる。例示として、Protothecamoriformis株はショ糖上では、たとえ成長したとしても、典型的には生育が悪い。ショ糖インベルターゼ遺伝子を含む構築物を使用すると、陽性形質転換体が炭素基質としてショ糖上で成長する能力を付与することができる。本明細書に記載される方法の特定の実施形態のために、組み換え宿主細胞を調製するために用いられる発現ベクターは、遺伝子のうちの1つが選択可能なマーカーである場合に、少なくとも2つの遺伝子、及び多くの場合に3つの遺伝子を含み得る。例えば、遺伝子操作されたProtothecaは、選択可能なマーカーに加え、1つ以上の外来遺伝子、例えば、ショ糖インベルターゼ遺伝子又はアシルACP-チオエステラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換することにより作製することができる。1個又は全部の遺伝子が、誘発性プロモーターを用いて発現してもよく、これにより、これらの遺伝子が発現する相対的なタイミングを制御し、脂質収量及び脂肪酸エステルへの変換を高めることができる。2種以上の外来遺伝子の発現は、同じ誘発性プロモーターで制御されていてもよく、異なる誘発性又は構成的プロモーターで制御されていてもよい。後者の状況では、第1の外来遺伝子の発現は、第1の期間に誘発されてもよくこの間に、第2の外来遺伝子の発現が誘発されてもよく、誘発されなくてもよく、第2の外来遺伝子の発現は、第2の期間に誘発されてもよいこの間に、第1の外来遺伝子の発現が誘発されてもよく、誘発されなくてもよい。他の実施形態では、2種以上の外来遺伝子任意の選択可能なマーカーに加えては、脂肪族アシル-ACPチオエステラーゼ及び脂肪酸アシル-CoA/アルデヒド還元酵素、アルコール産物を与えるこれらの組み合わせ作用である。さらに、限定されないが、アルデヒドを生成するための脂肪族アシル-ACPチオエステラーゼ及び脂肪酸アシル-CoA還元酵素のような他の外来遺伝子の組み合わせも提供される。一実施形態では、ベクターは、アルカンを生成するための、脂肪族アシル-ACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシル-CoA還元酵素、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素の組み合わせを与える。これらのそれぞれの実施形態では、1つ以上の外来遺伝子が、誘発性プロモーターを用いて発現してもよい。2種以上の外来遺伝子を発現する、他の代表的なベクターとしては、ショ糖トランスポーター及びショ糖インベルターゼ酵素の両方をコードするベクター、選択可能なマーカーと、分泌されたショ糖インベルターゼとの両方をコードするベクターが挙げられる。いずれの種類のベクターで形質転換された組み換えPrototheca又は他の微細藻類若しくは微生物の細胞も、サトウキビ及びサトウキビから誘導される糖を炭素源として使用する能力が操作されているため、低い製造コストで脂質を生成する。上述の2種類の外来遺伝子の挿入は、定方向変異誘発法及び/又はランダム変異導入法によって多糖生合成を乱すことと組み合わせることができ、脂質産生へと進む炭素の流れが大きくなる方向に進む。個々に、及び組み合わせて、栄養転換、脂質の産生を変えるような操作、外来の酵素を用いた処理によって、微生物が産生する脂質の組成が変わる。この変化によって、産生する脂質の量、他の脂質種に対する的な1つ以上の脂質油脂種の相対量、及び/又は微生物が産生する脂質種の種類を変えることができる。例えば、微細藻類を、TAGの量及び/又は割合を増やすように操作することができる。組み換えタンパク質の最適な発現のために、形質転換されるべき宿主細胞で優先的に用いられるコドンを用いてmRNAを生成するコード配列を利用することが有益である。従って、トランス遺伝子の適切な発現は、トランス遺伝子のコドンの使用が、トランス遺伝子を発現する有機体の特定のコドンの偏りと適合していることが必要な場合がある。この影響の元になる正確な機構は多くあるが、利用可能なアミノアシル化されたtRNAプールと、細胞内で合成されるタンパク質との適切なバランス、この要求を満たす場合に、トランスジェニックメッセンジャーRNAmRNAをもっと効果的な翻訳との組み合わせを含む。トランス遺伝子内のコドンの使用が最適化されていない場合、利用可能なtRNAプールは、異種mRNAの効率的な翻訳を可能にするのに十分ではなく、その結果、リボソームが失速し、停止し、トランスジェニックmRNAが不安定になる場合がある。Protothecaで組み換えタンパク質が首尾よく発現するのに有用な、コドンが最適化された核酸を本明細書に記載する。Prototheca種のコドン使用を、Protothecamoriformisから単離したcDNA配列を調べることにより分析した。この分析は24,000を超えるコドンの問い合わせに相当し、以下の表4に結果を示している。他の実施形態では、組み換えベクター中の遺伝子は、Prototheca株以外の微細藻類株又は別の微生物株に対してコドンが最適化されている。例えば、微細藻類での発現用に遺伝子を記録する方法が、米国特許第7,135,290号に記載されている。コドン最適化のさらなる情報が、例えばGenBankのコドン使用データベースで利用可能である。本明細書に記載される方法及び材料により、任意の外来遺伝子をPrototheca又は他の微細藻類又は他の油産生微生物に導入することが可能になるが、以下の章で考察するように、ショ糖利用及び脂質経路の改変に関係する遺伝子は、天然でそれを利用することができない微生物にとって、又はその利用が非効率的である微生物にとって、特に興味深い。IV.ショ糖利用実施形態では、組み換えPrototheca又は他の微細藻類細胞又は他の微生物の細胞は、1つ以上の外来性のショ糖利用遺伝子を含む。種々の実施形態では、1つ以上の遺伝子は、フルクトキナーゼ、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ショ糖インベルターゼ、ショ糖トランスポーターからなる群から選択される1つ以上のタンパク質をコードする。例えば、ショ糖トランスポーター及びショ糖インベルターゼが発現することにより、Prototheca又は任意の他の微細藻類細胞又は他の微生物の細胞が培地からショ糖を細胞に運び込み、ショ糖を加水分解してグルコース及びフルクトースを産生することが可能になる。場合により、フルクトースのリン酸化を最大にするのに内在するヘキソキナーゼ活性では不十分な場合、フルクトキナーゼもまた発現させてよい。適したショ糖トランスポーターの例は、GenBank寄託番号CAD91334、CAB92307、及びCAA53390である。適したフルクトキナーゼの例は、GenBank寄託番号P26984、P26420及びCAA43322である。一実施形態では、本明細書に記載される方法は、ショ糖インベルターゼを分泌するPrototheca宿主細胞で実施される。ショ糖インベルターゼの分泌により、ショ糖を細胞に運び込むことができるトランスポーターの発現が不要になる。これは、分泌したインベルターゼがショ糖分子からグルコース分子及びフルクトース分子への変換を触媒し、いずれの分子も、本明細書に記載される方法で有用な微生物によって輸送及び利用され得るためである。例えば、分泌シグナル例えば、配列番号4酵母に由来する、配列番号5高等植物に由来する、配列番号6真核性のコンセンサス分泌シグナルなど、配列番号7高等植物及び真核性のコンセンサスに由来するシグナル配列の組み合わせを用いたショ糖インベルターゼ例えば、配列番号3の発現によって、インベルターゼ活性が細胞外で発生する。このようなタンパク質の発現は、本明細書に開示されている遺伝子操作方法によって可能となるが、それによって細胞外グルコースをエネルギー源としてすでに利用可能な細胞が、ショ糖を細胞外エネルギー源として利用することができる。ショ糖を含有する培地に分泌されるインベルターゼを発現するPrototheca種は、誘電性流体又は他の潤滑剤食用油の生産用、消費者によっては、非組み換え微生物を使用して生産された油を好み得るとして使用される微生物油の生成に好ましい微細藻類の種である。この完全に活性なタンパク質の発現及び細胞外標的化によって、得られた宿主細胞がショ糖で成長することが可能となる一方、対応する非形質転換細胞は成長できない。従って、本明細書に記載される方法の実施では、インベルターゼ活性及びショ糖の加水分解によって評価される場合にインベルターゼ遺伝子が発現するようにゲノムに組み込まれた、限定されないが酵母インベルターゼ遺伝子を含む、コドンが最適化されたインベルターゼ遺伝子を有するPrototheca組み換え細胞が利用されてもよい。インベルターゼ遺伝子は、Prototheca及び他の微細藻類組み換え細胞において選択可能なマーカーとして有用であり、なぜならそのような細胞はショ糖上で成長することができるが、それに対応する非形質転換細胞は成長できないためである;インベルターゼを使用して組み換え宿主細胞を選択する方法は、藻類の分子遺伝学についての強力な選択可能マーカーである。Protothecaでショ糖インベルターゼが首尾よく発現することも、異種組み換えタンパク質が藻類細胞で発現し、且つ細胞の外に出て、完全に活性で機能的な形態で培地に首尾よく移ることができることを示している。従って、微細藻類において広範で多様な一連の異種タンパク質を発現させ、且つそれらを宿主細胞外に分泌させる方法及び試薬が利用可能である。そのようなタンパク質としては、例えば、工業用酵素、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、エステラーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ラクターゼ、イソメラーゼ、及びインベルターゼが挙げられる。適切なショ糖インベルターゼの例としては、Genbank寄託番号CAB95010、NP_012104、CAA06839で特定されるものが挙げられる。適切なインベルターゼの非限定的な例を以下の表5に列挙している。それぞれの列挙したインベルターゼのアミノ酸配列は、以下の配列表に含まれている。ある場合では、本明細書に記載の方法及びベクターで使用するのに適した外来のショ糖利用遺伝子は、表5から選択されるショ糖インベルターゼとのアミノ酸同一性が少なくとも40、50、60、75、又は90、又はそれ以上であるショ糖インベルターゼをコードする。Protothecaによってインベルターゼを培地に分泌させると、細胞は、純粋な試薬グレードのグルコースで成長させるときと同様に、サトウキビ加工から得た廃棄糖液でも成長することができる;サトウキビ加工のこの価値の低い廃棄産物を用いることによって、脂質及び他の油の生成において費用を大幅に節約することができる。従って、本明細書に記載される方法は、Prototheca又は他の微細藻類微生物の集合と、iショ糖及びiiショ糖インベルターゼ酵素を含む培地とを含む微生物培養物の使用を含み得る。種々の実施形態では、培養物中のショ糖は、モロコシ、テンサイ、サトウキビ、糖液、又は解重合されたセルロース系材料場合によりリグニンを含有し得るに由来する。ここで例示される微生物は、ショ糖を利用できるように変えられるが、セルラーゼ、ペクチナーゼ、イソメラーゼなどを分泌する能力を有する操作された宿主細菌がセルロース系のような原材料を利用することができるように、本明細書に記載される方法及び試薬を適用してもよく、その結果、宿主は酵素反応の分解産物に単に耐えるだけでなく、それを炭素源として利用するようになる。V.脂質経路の操作ショ糖を含有する原材料のような原材料をPrototheca又は他の微細藻類細胞又は他の微生物細胞が利用する能力を変えることに加え、生成される脂質の特性及び/又は割合を変えるように改変された組み換えPrototheca又は他の微細藻類細胞又は他微生物の細胞が、本明細書に記載される方法において有用である。それに加えて、又は代えて、脂肪酸経路における脂質及び中間物の酵素処理によって生成されるさまざまな脂質分子の特性及び/又は割合を変えるため、この経路を改変することができる。種々の実施形態では、この組み換え細胞は、形質転換されていない対応する細胞と比較して、単位容積あたり及び/又は単位時間当たりの脂質収量、炭素鎖長例えば工業用化学物質、限定されないが誘電性流体用に、及び脂質原材料を必要とする他の用途のためが増加又は最適化され、二重結合又は三重結合の数が場合によりゼロまで減らされ、及び特定の脂質種脂肪酸の、又は別個の脂質の集合の水素:炭素比が大きくなっている。特定の実施形態では、脂肪酸の合成に対し、代謝における分岐点を制御するような1つ以上の鍵となる酵素を上方調節するか、又は下方調節し、脂質の産生を高める。上方調節は、例えば、転写を増やす強力なプロモーターエレメント及び/又はエンハンサーエレメントを用い、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子が発現するような発現構築物を用いて細胞を形質転換することによって達成することができる。このような構築物は、形質転換体を選択することができるような選択可能なマーカーを含んでいてもよく、これは、構築物の増幅及び付随するコードされた酵素の発現量の増加のために用いることができる。本明細書に記載野の方法に従って上方調節するのに適した酵素の例としては、ピルビン酸をアセチル-CoAに変換する役割を担うピルビン酸脱水素酵素例えば、微細藻類由来のもの、Genbank寄託番号NP_415392;AAA53047;Q1XDM1;CAF05587を含むが挙げられる。ピルビン酸脱水素酵素を上方調節すると、アセチル-CoAの産生量が増え、それによって脂肪酸の合成量が増える。アセチル-CoAカルボキシラーゼは、脂肪酸合成の最初の工程を触媒する。従って、この酵素を上方調節すると、脂肪酸の産生量を増やすことができる例えば、微細藻類由来のもの、Genbank寄託番号BAA94752;AAA75528;AAA81471;YP_537052;YP_536879;NP_045833;BAA57908を含む。また、脂肪酸合成中に、アシル鎖を成長させるアシルキャリアータンパク質ACPを上方調節することによって、脂肪酸産生量を増やすこともできる例えば、微細藻類由来のもの、Genbank寄託番号A0T0F8;P51280;NP_849041;YP_874433を含む。グリセロール-3-ホスフェートアシルトランスフェラーゼは、脂肪酸合成の律速工程を触媒する。この酵素を上方調節すると、脂肪酸の産生量を増やすことができる例えば、微細藻類由来のもの、Genbank寄託番号AAA74319;AAA33122;AAA37647;P44857;ABO94442を含む。遺伝子の上方調節及び/又は下方調節は、脂肪酸の生合成経路に関する遺伝子の発現を制御する包括的な制御因子に適用することができる。従って、脂肪酸合成の1つ以上の包括的な制御因子を、適切な場合に上方調節するか、又は下方調節し、それぞれ、複数の脂肪酸合成遺伝子の発現を阻害するか、又は高め、最終的に、脂質の産生量を増やすことができる。例としては、ステロール制御エレメント結合タンパク質SREBP、例えば、SREBP-1a及びSREBP-1c例えば、Genbank寄託番号NP_035610及びQ9WTN3を参照。本明細書に記載される方法はまた、例えば、脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼ表6を参照、脂肪酸アシル-CoA/アルデヒド還元酵素表8を参照、脂肪酸アシル-CoA還元酵素、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、脂肪族アルデヒド還元酵素、デサチュラーゼステアロイル-ACPデサチュラーゼ及び脂肪酸アシルデサチュラーゼなど及びスクアレンシンターゼGenBank寄託番号AF205791を参照のような脂質改変酵素をコードする1つ以上の外来遺伝子を含むように改変された組み換えPrototheca又は他の微細藻類又は他の微生物の細胞で実施することもできる。ある実施形態では、脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼ及び自然に共発現するアシルキャリアータンパク質をコードする遺伝子が、Prototheca又は他の微細藻類又は他の微生物の細胞に、場合により他の脂質改変酵素をコードする1つ以上の遺伝子とともに形質転換される。他の実施形態では、ACPと脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼとは、それらが特定の組織又は有機体で自然に共発現するか否かにかかわらず、2つが本明細書に記載される微生物及び方法で共に使用されるときに利点を付与するような互いに対する親和性を有してもよい。従って、特定の実施形態では、本発明は、これらの酵素の自然に共発現する対、並びに、ACPから特定の長さの炭素鎖が切断されやすくなるように互いに作用し合うための親和性を共有する対の双方を包含する。さらに他の実施形態では、デサチュラーゼをコードする外来遺伝子を、脂質飽和に関する改変をもたらすように他の脂質改変酵素をコードする1つ以上の遺伝子とともにPrototheca又は他の微細藻類又は他の微生物の細胞に形質転換する。別の実施形態では、内在するデサチュラーゼ遺伝子を、Prototheca又は他の微細藻類又は他の微生物の細胞内で例えば、遺伝子のさらなる複製物の導入によって過剰発現させる。ステアロイル-ACPデサチュラーゼ例えば、GenBank寄託番号AAF15308;ABM45911;及びAAY86086を参照は、例えば、ステアロイル-ACPからオレオイル-ACPへの変換を触媒する。この遺伝子を上方調節すると、細胞が生成する一価不飽和脂肪酸の比率を増やすことができ、一方、下方調節すると、一価不飽和物の比率を減らすことができる。例示として、ステアロイル-ACPデサチュラーゼSADは、C18:0前駆体からのC18:1脂肪酸の合成に関与する。デサチュラーゼの別のファミリーは、デルタ12脂肪酸デサチュラーゼを含む脂肪酸アシルデサチュラーゼFADである。これらのデサチュラーゼは、脂質飽和に関する改変ももたらす。例示として、デルタ12脂肪酸デサチュラーゼは、C18:1前駆体からのC18:2脂肪酸の合成に関与する。同様に、ω-6脂肪酸デサチュラーゼ、ω-3脂肪酸デサチュラーゼ、又はω-6-オレイン酸デサチュラーゼのような1つ以上のグリセロ脂質デサチュラーゼの発現を制御することにより、不飽和脂肪酸の飽和脂肪酸に対する比を変えることができる。ある実施形態では、デサチュラーゼが特定の炭素長の基質又は特定の範囲内の炭素長を有する基質中で位置特異的な改変を設けることができるように、デサチュラーゼは、望ましい炭素鎖長に関して選択され得る。別の実施形態では、望ましい脂肪酸プロフィールが一価不飽和物C16:1及び/又はC18:1などの増加である場合、SADの過剰発現又は異種SADの発現を、脂肪酸アシルデサチュラーゼFADのサイレンシング又は不活性化例えば、内在するデサチュラーゼ遺伝子の突然変異、RNAi、ヘアピンRNA、ノックアウト等によると結び付けることができる。以下の実施例4は、ステアロイル-ACPデサチュラーゼ及びデルタ12脂肪酸デサチュラーゼの標的化した除去又はノックアウトについて記載し、また、内在するデサチュラーゼ遺伝子の発現を低下させるヘアピンRNAアンチセンス構築物の使用についても記載している。従って、特定の実施形態では、本発明の微生物は、アシル-ACPチオエステラーゼ、アシル-CoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル-CoA還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、デサチュラーゼ、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、又は自然に共発現するアシルキャリアータンパク質から選択される1つ以上の外来遺伝子を発現するように遺伝子操作される。適した発現方法は、リパーゼ遺伝子の発現に関して上記に記載されており、他の方法の中でも特に、誘発的発現及び区画化された発現が挙げられる。脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼは、脂質合成中に、アシルキャリアータンパク質ACPから脂肪酸を切断する。次に、さらなる酵素処理によって、切断された脂肪酸が補酵素と組み合わさり、アシル-CoA分子を生じる。このアシル-CoAは、アルデヒドを生じる脂肪酸アシル-CoA還元酵素の、並びにアルコールを生じる脂肪酸アシル-CoA/アルデヒド還元酵素についての酵素活性の基質である。上述のように特定した、脂肪酸アシル-CoA還元酵素の作用によって生成されるアルデヒドは、アルコーを生じる脂肪族アルデヒド還元酵素、又はアルカン若しくはアルケンを生じる脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼのいずれかによるさらなる酵素活性の基質である。ある実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成する脂肪酸、グリセロ脂質、又は対応する一級アルコール、アルデヒド、アルカン、又はアルケンは、16個又は18個の炭素原子を含む。誘電性流体又は対応するアルコール、アルデヒド、アルカン及びアルケンの生成に好ましい脂肪酸は、16~18個の炭素原子を含む。特定の実施形態では、上述の脂肪酸は飽和であり炭素-炭素二重結合又は三重結合を含まない;一価不飽和であり二重結合が1個;多価不飽和であり2個以上の二重結合;及び直鎖である環状でないか又は分枝鎖であるか又はこの2つのタイプの混合であり得る。誘電性流体には、一価不飽和脂肪酸、特にオレイン酸C18:1が好ましい。望ましい鎖長及び/又は飽和度を有する脂質の生成を増加させるため、望ましい鎖長特異性を有するチオエステラーゼが過剰発現するように、より短い鎖長特異性を有するチオエステラーゼの生成がノックアウトされるように、又はそのような遺伝子の発現が低下するように、及び/又は望ましい脂質の飽和度に関与するデサチュラーゼ遺伝子がノックアウトされるように、微細藻類細胞を操作することができる。上述のさまざまな酵素は、典型的には、特定の数の炭素原子を含む基質の加水分解に対し、優先的な特異性を有する。例えば、脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼは、炭素原子を12個含む脂肪酸をACPから優先的に切断し得る。ある実施形態では、ACPと長さ特異的なチオエステラーゼとは互いに親和性を有し得るため、これらは組み合わせとして特に有用であり得る例えば、外来性ACPとチオエステラーゼ遺伝子とは、それらが由来する特定の組織又は有機体で自然に共発現し得る。従って、種々の実施形態では、本発明の組み換えPrototheca又は他の微細藻類又は他の微生物の細胞は、基質に含まれる炭素原子の数に関して酵素活性例えば、ACPからの脂肪酸の切断、アシル-CoAのアルデヒド若しくはアルコールへの還元、又はアルデヒドからアルカンへの変換の触媒に特異性を有してタンパク質をコードする外来遺伝子を含むことができる。酵素特異性は、種々の実施形態では、8~34個の炭素原子及び好ましくは16~18個の炭素原子を有する基質に対するものであり得る。本明細書に記載の細菌及び方法とともに用いるのに適した他の脂肪族アシル-ACPチオエステラーゼとしては、限定されないが、表6に列挙されたものが挙げられる。誘電性流体のようなバイオ油をベースとする化学品は、ヒマワリ油及びキャノーラ油のような天然エステルすなわち、種子油に由来する高オレイン酸C18:1の脂肪酸組成を有する。表7は、一般的な市販の種子油の脂肪酸プロフィールを示す。以下の市販の種子油のデータは全て、USPharmacopeiasFoodandChemicalsCodes,7thEd.2010-2011から編集した。本明細書に記載の細菌及び方法とともに用いるのに適した脂肪酸アシル-CoA/アルデヒド還元酵素としては、限定されないが、表8に列挙したものが挙げられる。アシル-ACPチオエステラーゼは高等植物及びいくつかの微細藻類の種の脂肪酸生合成の終結因子であり、ほとんどの植物種でこれはFatA遺伝子ファミリーのメンバーにより行われ、このメンバーの役割は、C16:0からC18:0への段階で伸長を終結させることである。より短鎖の脂肪酸を合成する種Cuphea、Elaeis、Myristica、又はUmbellulariaなどでは、FatB遺伝子によりコードされる異なるアシル-ACPチオエステラーゼ群がこの終結工程を行う。本明細書に記載される方法での使用に適した他の酵素には、表6及び表8に列挙されるタンパク質のうちの一つと少なくとも70のアミノ酸同一性を有するもの、及び対応する望ましい酵素活性例えば、アシルキャリアータンパク質からの脂肪酸の切断、アシル-CoAのアルデヒド若しくはアルコールへの還元、又はアルデヒドからアルカンへの変換を示すものが含まれる。さらなる実施形態において、酵素活性は、上述の配列のうちの一つと少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、又は少なくとも約99の同一性を有する配列に存在し、これらは全て本明細書によって参照により組み込まれる。発現させる外来遺伝子又は不活性化する内因性遺伝子又はその両方の望ましい組み合わせを選択することにより、細菌により産生される油を用途に応じて調節することができ、次いで、この油を水系バイオマスから抽出してもよい。例えば、細菌は以下を含み得る:i脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする外来遺伝子;ii場合により、自然に共発現するアシルキャリアータンパク質又は脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼに対して親和性を有するアシルキャリアータンパク質;iii変異型の内在するデサチュラーゼ遺伝子、ここでは、デサチュラーゼノックアウトなど、突然変異によりデサチュラーゼ遺伝子又はデサチュラーゼタンパク質が不活性化されている;iv内在するステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼの過剰発現又は異種SADの発現;及びv前述の任意の組み合わせ。脂肪酸アシルACPチオエステラーゼなど、このような酵素をコードする遺伝子は、Chlorellaprotothecoidesのように、多量の脂質生成を示すことが既に知られている細胞から得ることができる。脂質生成で役割を担うことが既に知られている遺伝子、例えば、二重結合を飽和させる酵素をコードする遺伝子を、個々にレシピエント細胞に形質転換することができる。微細藻類中での脂質生成を変化させる向上させることのできる遺伝子を同定する方法については、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2008/151149号に記載されている。従って、特定の実施形態では、本発明の実施において、同じ種の野生型細胞と比較して変化したレベルで脂質経路酵素を発現するように遺伝子操作されたPrototheca細胞又は他の微細藻類又は他の微生物の細胞が利用され得る。ある場合では、上述の細胞は、野生型細胞よりも高いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように遺伝子操作されているか、及び/又は、野生型細胞よりも高いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように選択される。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、ピルビン酸脱水素酵素、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、アシルキャリアータンパク質、グリセロール-3ホスフェートアシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。ある場合では、上述の細胞は、野生型細胞よりも低いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように遺伝子操作されているか、及び/又は、野生型細胞よりも低いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように選択される。細胞が、脂質経路に関連する酵素を低いレベルで発現する一実施形態では、脂質経路に関連する酵素は、クエン酸シンターゼを含む。ある実施形態では、上述の細胞は、野生型細胞と比べ、異なるレベルで脂肪酸合成の包括的な制御因子を発現するように遺伝子操作されているか、及び/又は、異なるレベルで脂肪酸合成の包括的な制御因子を発現するように選択され、それにより、複数の脂肪酸合成遺伝子の発現レベルは、野生型細胞と比べて変化している。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、脂肪酸を改変する酵素を含む。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、ステアロイル-ACPデサチュラーゼ、グリセロ脂質デサチュラーゼから選択される。ある場合では、細胞は、より低レベルの脂質経路酵素を発現するように、又は特定の脂質経路酵素を全く発現しないようにすなわち、ここで脂質経路酵素は外来遺伝子によりノックアウト又は置換されている、遺伝子操作され、及び/又は選択されている。他の実施形態では、本発明の実施において、1つ以上の外来遺伝子及び/又は1つ以上の不活性化された内因性遺伝子を含む油産生細菌が利用され、ここで外来遺伝子又は内因性遺伝子は、脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシル-CoA還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル-CoA/アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、デサチュラーゼ、及びアシルキャリアータンパク質からなる群から選択される1つ又は複数のタンパク質をコードする。別の実施形態では、内在するデサチュラーゼ遺伝子は、上記の外来遺伝子の1つ以上を含む細菌で過剰発現する。一実施形態では、外来遺伝子は、プロモーターと動作可能に連結された状態にあり、プロモーターは刺激に応じた誘導性又は抑制性を有する。ある場合では、刺激は、外部から与えられた小分子、熱、冷温、及び培地中の制限窒素又は無窒素からなる群から選択される。ある場合では、外来遺伝子は細胞内区画で発現し、又は他の方法でそこに標的化される。ある実施形態では、細胞内区画は、葉緑体、プラスチド及びミトコンドリアからなる群から選択される。ある実施形態では、細菌は、Protothecamoriformis、Protothecakrugani、Protothecastagnora又はProtothecazopfiiである。一実施形態では、外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子は、脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする。ある場合では、外来性遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子によりコードされるチオエステラーゼは、アシルキャリアータンパク質ACPからの8~18炭素脂肪酸の切断を触媒する。ある場合では、外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子によりコードされるチオエステラーゼは、ACPからの10~14炭素脂肪酸の切断を触媒する。一実施形態では、外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子によりコードされるチオエステラーゼは、ACPからの12炭素脂肪酸の切断を触媒する。ある実施形態では、外来遺伝子によりコードされるチオエステラーゼは、ACPからの16~18炭素脂肪酸の切断を触媒する。一実施形態では、外来遺伝子は脂肪酸アシル-CoA/アルデヒド還元酵素をコードする。ある場合では、外来遺伝子によりコードされる還元酵素は、8~18炭素脂肪酸アシル-CoAの対応する一級アルコールへの還元を触媒する。ある場合では、外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子によりコードされる還元酵素は、10~14炭素脂肪酸アシル-CoAの対応する一級アルコールへの還元を触媒する。一実施形態では、外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子によりコードされる還元酵素は、12炭素脂肪酸アシル-CoAのドデカノールへの還元を触媒する。本明細書に記載される方法の実施においては、2つの外来遺伝子又は2つの不活性化された内在する遺伝子を含む組み換えPrototheca又は他の微細藻類又は微生物の細胞が利用されてもよく、ここで第1の外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子は脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードし、第2の外来遺伝子又は不活性化された内在する遺伝子は、脂肪酸アシル-CoA還元酵素、脂肪酸アシル-CoA/アルデヒド還元酵素、及びアシルキャリアータンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。ある場合では、2つの外来遺伝子は、それぞれプロモーターと動作可能に連結した状態にあり、プロモーターは刺激に応じた誘導性を有する。ある場合では、各プロモーターは、培地中の制限窒素又は無窒素など、同じ刺激に応じた誘導性を有する。培地中の窒素の制限又は完全な不含は、Prototheca及び他の微細藻類及び他の微生物種のような一部の微生物における油の生成を刺激し、油脂質の生成を高レベルに誘導するための誘因として使用することができる。本明細書に開示される遺伝子操作方法と組み合わせて用いられるとき、乾燥細胞重量の割合としての脂質は、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70及び少なくとも75などの高レベルまで押し上げることができる。本明細書に開示される新規油脂質及びそれから得られる誘電性流体は、ヒマワリ油及びキャノーラ油のようなC16及びC18脂肪酸が高い他の天然に存在する油とは別のものである。一実施形態では、第1の外来遺伝子によりコードされるチオエステラーゼは、ACPからの8~18炭素脂肪酸の切断を触媒する。さらに、より長い鎖長の油が望ましい実施形態では、1つ以上のより短い鎖長すなわちC14未満、例えば、C12、C10、及び/又はC8のTE及び/又は対応するACP遺伝子の発現を低下させその発現を変化させることにより又は消失させる例えば、ノックアウトにより。上述の種々の実施形態では、Prototheca又は他の微細藻類又は他の微生物の細胞は、脂質経路酵素をコードする少なくとも1つの外来遺伝子又は少なくとも1つの不活性化された又は発現が低下するように操作された内在する遺伝子を含み得る。ある場合では、脂質経路酵素は、ステアロイル-ACPデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、グリセロ脂質デサチュラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、アシルキャリアータンパク質、及びグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。他の場合では、Prototheca又は他の細胞は、脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシル-CoA/アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル-CoA還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、及び/又はアシルキャリアータンパク質からなる群から選択される脂質改変酵素を含む。VI.微生物油の生成及びそれから得られる生成物1.微生物油の生成本明細書に記載される方法に従い微生物油を生成するため、微生物細胞により生成された未処理の原料油脂質を任意の好都合な方法で回収し、又は他の方法で集める。油は、例えば全細胞の抽出によって単離することができる。この方法では、まず細胞を破壊し、次いで、上述のような遠心分離を用いるなどして、細胞内の及び細胞膜/細胞壁に関連する脂質及び脂肪酸、並びに細胞外の炭化水素を、細胞塊から分けることができる。微生物で生成される細胞内脂質は、多くの実施形態において、微生物細胞を溶解するプロセスの後又はその最中に抽出される。より具体的には、培養の完了後、微生物は典型的には発酵ブロスから分離される。多くの場合に、この分離は遠心分離によって行われ、これにより微生物バイオマスの濃縮ペーストが生じる。次いで、場合によりバイオマスを洗浄溶液例えば、脱イオン水で洗浄し、発酵ブロス及び発酵片を取り除く。場合により、洗浄した微生物バイオマスを乾燥させてオーブン乾燥、凍結乾燥など、その後細胞を破壊してもよい。あるいは、発酵が完了している場合には、細胞を発酵ブロスの一部又は全部と分離することなく溶解させてもよい。例えば、細胞は、細胞を溶解させるときに、細胞と細胞外の液体とのv:v比が1:1未満であってもよい。脂質を含有する微生物を溶解し、溶解物を作成してもよい。本明細書で詳細に記載するように、微生物を溶解する工程細胞溶解とも呼ばれるは、熱による溶解、塩基を加えること、酸を加えること、プロテアーゼのような酵素、アミラーゼのような多糖分解酵素を用いること、超音波を用いること、機械的な溶解、浸透圧衝撃を用いること、溶解性ウイルスに感染させること、及び/又は1つ以上の溶解遺伝子の発現を含む、任意の簡便な手段によって行うことができる。溶解を行い、微生物によって産生された細胞内分子を放出させる。微生物を溶解させるための、これらのそれぞれの方法を単独の方法として用いてもよく、同時又は連続して、組み合わせとして用いてもよい。細胞の破壊度は、顕微鏡分析によって観察することができる。本明細書に記載した1つ以上の方法を用い、典型的には、70を超える細胞の破壊が観察される。好ましくは、細胞の破壊は、80を超えており、より好ましくは、90を超えており、最も好ましくは、約100である。特定の実施形態では、成長した後に微生物を溶解させ、例えば抽出又はさらなる処理のために、微生物油の露出を増加させる。外来性リパーゼ遺伝子を利用している場合、リパーゼ発現例えば、誘導性プロモーターによる又は細胞溶解のタイミングは、脂質及び/又は炭化水素の収量を最適化するように調節することができる。以下に、いくつかの溶解技術を記載している。これらの技術を個々に用いてもよく、又は組み合わせて用いてもよい。本発明の一実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物を加熱することを含む。この実施形態では、微生物を含む発酵ブロス又は、発酵ブロスから単離した微生物の懸濁物を、微生物、すなわち、微生物の細胞壁及び細胞膜が分解するか、又は破壊するまで加熱する。典型的には、かけられる温度は、少なくとも50°Cである。もっと効率よく細胞を溶解させるために、もっと高い温度、例えば、少なくとも30°C、少なくとも60°C、少なくとも70°C、少なくとも80°C、少なくとも90°C、少なくとも100°C、少なくとも110°C、少なくとも120°C、少なくとも130°C、又はそれ以上の温度を使用する。熱処理によって細胞を溶解することは、微生物を沸騰させることによって行ってもよい。又は、熱処理沸騰させないをオートクレーブ中で行ってもよい。熱処理された溶解物を、さらなる処理のために冷却してもよい。また、細胞の破壊は、蒸気による処理によって、すなわち、加圧した蒸気を加えることによって行ってもよい。細胞を破壊するための微細藻類の蒸気処理は、例えば、米国特許第6,750,048号に記載されている。ある実施形態では、蒸気処理は、蒸気を発酵槽に吹き込み、ブロスを所望の温度に約90分未満、好ましくは約60分未満、より好ましくは約30分未満維持することによって行ってもよい。本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物に塩基を加えることを含む。塩基は、少なくとも、使用した微生物の水系タンパク質化合物の一部分を加水分解するのに十分なほど強いことが必要である。タンパク質を溶解するのに有用な塩基は、化学分野で知られている。本発明の方法の実施形態で有用な、例示的な塩基としては、限定されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、及びこれらの混合物が挙げられる。好ましい塩基はKOHである。細胞を破壊するための微細藻類の塩基処理は、例えば、米国特許第6,750,048号に記載されている。本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物に酸を加えることを含む。酸による溶解は、10~500mNの濃度、又は好ましくは、40~160nMの濃度の酸を用いて行うことができる。酸による溶解は、好ましくは、室温より高い温度例えば、40~160°C、すなわち50~130°Cの温度で行われる。中程度の温度例えば、室温~100°C、特に、室温~65°Cの場合、酸による処理は、有益には、音波処理又は他の細胞破壊方法と組み合わせてもよい。本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、酵素を用いることによって微生物を溶解することを含む。微生物を溶解するのに好ましい酵素は、プロテアーゼ、及びヘミセルラーゼのような多糖分解酵素例えば、Aspergillusnigerに由来するヘミセルラーゼ;SigmaAldrich、セントルイス、モントリオール;H2125、ペクチナーゼ例えば、Rhizopussp.に由来するペクチナーゼ;SigmaAldrich、セントルイス、モントリオール;P2401、Mannaway4.0LNovozymes、セルラーゼ例えば、Trichodermavirideに由来するセルロース;SigmaAldrich、セントルイス、モントリオール;C9422、ドリセラーゼ例えば、Basidiomycetessp.に由来するドリセラーゼ;SigmaAldrich、セントルイス、モントリオール;D9515である。本発明の他の実施形態では、溶解は、例えば、多糖分解酵素のようなセルラーゼ、場合により、Chlorella又はChlorellaウイルスに由来するもの、及び/又は、プロテアーゼ、例えば、Streptomycesgriseusプロテアーゼ、キモトリプシン、プロテイナーゼK、DegradationofPolylactidebyCommercialProteases、OdaYetal.、JournalofPolymersandtheEnvironment、第8巻、Number1、2000年1月、pp.29-324、Alcalase2.4FGNovozymes、に列挙されているプロテアーゼ、Flavourzyme100LNovozymesのような酵素によって行われる。先に示したプロテアーゼ及び多糖分解酵素の任意の組み合わせを含む、プロテアーゼと多糖分解酵素の任意の組み合わせを用いてもよい。別の実施形態では、溶解は、連続圧搾機を用いて行うことができる。このプロセスでは、バイオマスに、高圧状態で、スクリュー型デバイスを用いて力を加え、細胞を溶解させ、細胞内脂質を放出させ、細胞内のタンパク質及び繊維及び他の成分と分離させる。本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、超音波を用いて、すなわち、音波処理によって行われる。従って、高周波数の音を用いて細胞を溶解させることができる。音は、電子的に発生させ、適切に濃縮した細胞懸濁物に対し、金属片を介して伝搬させてもよい。この音波処理又は超音波処理は、細胞懸濁物中に空洞を作り出すことに基づいて、細胞の一体性を破壊する。本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、機械的な溶解によって行われる。細胞は、機械的に溶解されてもよく、場合により、炭化水素例えば、脂質を集めやすいように均質化してもよい。例えば、加圧による破壊を利用し、細胞を含有するスラリーを制水型オリフィス弁にポンプで圧送してもよい。高圧1500barまでをかけ、その後、出口ノズルを通して瞬間的に拡散させてもよい。細胞の破壊は、弁での衝撃、オリフィス内での大きな液体剪断力、放出による急な圧力低下といった3種類の異なる機構によって行われ、これにより、細胞が爆発する。この方法によって、細胞内の分子が放出される。又は、ボールミルを用いてもよい。ボールミルの場合、ビーズのような小さな研磨粒子を含む懸濁物中で細胞を撹拌する。細胞は、剪断力、ビーズ間で研磨されること、ビーズと衝突することによって破壊される。ビーズは、細胞を破壊して、細胞内容物を放出させる。また、細胞は、細胞を破壊するためのブレンド例えば、例として高速ブレンダー又はWaringブレンダーを用いるか、フレンチプレスを用いるか、又は細胞壁が弱い場合には、遠心分離を用い、剪断力によって破壊されてもよい。本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、浸透圧衝撃を与えるすなわち、低張液中に微生物細胞を懸濁することによって行われる。本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を溶解性ウイルスに感染させることを含む。本明細書に記載の方法で用いるのに微生物を溶解するのに適したさまざまなウイルスが知られており、特定の微生物に特定の溶解性ウイルスを選択し、使用することは、当業者の知識の範囲内である。例えば、parameciumbursariachlorellaウイルスPBCV-1は、特定の単細胞性の、真核性のクロレラに似た緑色の藻の中で複製し、溶解させる、大きな20面体のプラークを形成する二本鎖DNAウイルスのグループPhycodnaviridae科、クロロウイルス属の原型である。従って、培養物を任意の適切なクロレラウイルスに感染させることによって、任意の感染しやすい微細藻類を溶解させることができる。Chlorella種を、クロレラウイルスを用いて感染させる方法は知られている。例えば、Adv.VirusRes.2006;66:293-336;Virology、1999年4月25日;2571:15-23;Virology、2004年1月5日;3181:214-23;NucleicAcidsSymp.Ser.2000;44:161-2;J.Virol.2006年3月;805:2437-44;Annu.Rev.Microbiol.1999;53:447-94を参照。本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、自己消化を含む。この実施形態では、微生物を、微生物を溶解する溶解性タンパク質を生成するように遺伝子操作する。この溶解遺伝子を、誘発性プロモーターを用いて発現させ、まず、細胞は、発酵槽内で望ましい密度まで成長し、その後、プロモーターの誘発によって、細胞を溶解させる溶解遺伝子が発現する。一実施形態では、溶解遺伝子は、多糖分解酵素をコードしている。特定の他の実施形態では、溶解遺伝子は、溶解性ウイルスに由来する遺伝子である。従って、例えば、Chlorellaウイルスに由来する溶解遺伝子を、藻の細胞中で発現させてもよい。Virology260、308-3151999;FEMSMicrobiologyLetters180199945-53;Virology263、376-3871999;Virology230、361-3681997を参照。溶解遺伝子の発現は、好ましくは、誘発性プロモーター、例えば、低分子、光、熱及び他の刺激の存在のような刺激によって誘発される、微細藻類内で活性なプロモーターを用いてなされる。上述の方法によって生成した細胞溶解物から脂質を分離するための種々の方法が利用可能である。例えば、脂質及び脂質誘導体、例えば、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルコール、アルカンのような炭化水素を、疎水性溶媒、例えば、ヘキサンで抽出してもよいFrenzetal.1989、EnzymeMicrob.Technol.、11:717を参照。また、脂質及び脂質誘導体を、液化によって抽出してもよく例えば、Sawayamaetal.1999、BiomassandBioenergy17:33-39、及びInoueetal.1993、BiomassBioenergy64:269-274を参照;油の液化によって抽出してもよく例えばMinowaetal.1995、Fuel7412:1735-1738を参照;超臨界CO2抽出によって抽出してもよい例えば、Mendesetal.2003、InorganicaChimicaActa356:328-334を参照。Miao及びWuは、Chlorellaprototheocoidesの培養物から、微細藻類の脂質を回収するプロトコルを記載しており、このプロトコルでは、細胞を遠心分離処理によって集め、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥によって乾燥させた。得られた細胞粉末を乳鉢で細かく粉砕し、次いで、n-ヘキサンで抽出した。Miao及びWu、BiosourceTechnology200697:841-846。従って、本明細書に記載の微生物によって生成した脂質、脂質誘導体、炭化水素を、有機溶媒を用いた抽出によって回収することができる。ある場合では、好ましい有機溶媒は、ヘキサンである。典型的には、事前に溶解物成分を分離させることなく、溶解物に有機溶媒を直接加える。一実施形態では、上述の1つ以上の方法によって生成した溶解物を、脂質及び/又は炭化水素成分が有機溶媒と溶液を形成するのに十分な時間、有機溶媒と接触させる。ある場合では、溶液をその後にさらに精製し、特定の望ましい脂質成分又は炭化水素成分を回収する。ヘキサンによる抽出方法は、当該技術分野でよく知られている。微生物から脂質を抽出する他の方法は、参照により本明細書に組み込まれるPCT出願米国特許第10/031108号に記載される。本明細書に記載されるように、細胞によって産生される脂質及び脂質誘導体、例えば、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルコール、アルカンのような炭化水素を、上述のように、リパーゼのような1つ以上の酵素を用いて改変してもよい。炭化水素が、細胞の外の環境に存在する場合、1つ以上の酵素を、この酵素が炭化水素を改変しするか、又は炭化水素前駆体からの合成を完結させるような条件下で、この環境に加えてもよい。又は、炭化水素を、細胞材料から部分的又は完全に単離してから、酵素のような1つ以上の触媒を加えてもよい。このような触媒は、外から加えられ、触媒の活性は、細胞の外で生じるか、又はinvitroで生じる。2.微生物油のさらなる処理従って、invivoで細胞によって産生されるか、又は、invitroで酵素によって改変される脂質及び炭化水素は、本明細書に記載されるように、従来の手段によってさらに処理されてもよい。処理は、クラッキングして、炭化水素分子を小さくし、水素:炭素比を大きくすることを含んでいてもよい。触媒によるクラッキング方法及び熱によるクラッキング方法は、炭化水素及びトリグリセリド油脂の処理において通常用いられる。触媒による方法は、固体酸触媒のような触媒の使用を含む。触媒は、シリカ-アルミナ又はゼオライトであってもよく、この触媒により、炭素-炭素結合が不均衡又は非対称に破壊され、カルボカチオンとヒドリドアニオンが生じる。これらの反応性中間体は、次いで、転移するか、又は別の炭化水素にヒドリドが移動する。このように、この反応によって、中間体が再生し、自己連鎖的な機構を生じ得る。また、炭化水素を処理し、炭化水素中の炭素-炭素二重結合又は三重結合を減らしてもよく、場合によりゼロにしてもよい。また、炭化水素を処理し、炭化水素中の環又は環状構造を除去するか、又は取り除いてもよい。また、水素:炭素比が大きくなるように、炭化水素を処理してもよい。この処理は、水素添加水素化及び/又は炭化水素を小さな炭化水素にするクラッキングを含んでいてもよい。脂質の抽出後、本明細書に記載される方法によれば、脂質を1つ以上の処理工程にかけることができる。これらの処理工程は、燃料の生成時に未精製油例えば、石油及び他の供給源に対して行われる精製工程とは別個のものである。これらの処理工程は、いくつかの態様では、人の食用に生成する間に種子油に対して行われるものと同等である。ある実施形態では、抽出した脂質は脱ガムされ、レシチン及び他のリン脂質が抽出される。他の実施形態では、抽出した脂質は、塩基又はアルカリ金属を使用して精製される。さらに他の実施形態では、抽出した脂質は漂白クレイ、通常は酸性クレイに通される。他の実施形態では、抽出した脂質は脱臭され、アルデヒド及びケトンのような揮発性の不純物が除去又は低減される。さらに他の実施形態では、抽出した脂質は脱ろうされ、ワックス又は飽和脂肪が除去又は低減される。前述の処理工程は、所望の生成物の特徴に応じて、抽出した脂質に関するいかなる組み合わせで行われてもよい。精製され例えば、塩基又はアルカリ金属による、漂白され例えば、漂白クレイによる及び/又は脱臭された抽出脂質は、通常RBD油と呼ばれる。本明細書に記載される微細藻類及び/又は油産生酵母に由来する抽出脂質から生成されたRBD油は、誘電性流体の生成を含め、さまざまな工業用途に有用である。ある実施形態では、脱ガムが実施され、リン脂質のような混入物質が油から除去される。本発明のある実施形態では、抽出した油の脱ガムは、精製、漂白及び脱臭すなわちRBDの一部である。RBDプロセスにより、抽出した油の臭い、色、及び/又は味が除去又は低減される。ある実施形態では、精製プロセスは、通常、脱ガム及び中和工程の2工程からなり、中和工程では、油中の遊離脂肪酸FFAが水酸化ナトリウムによる苛性アルカリストリッピングによって取り除かれる。漂白工程には、油をさまざまな漂白クレイと混合して色、微量金属及び硫黄化合物を吸着させることが含まれ得る。脱臭工程は、低圧及び高温で行われる蒸留プロセスであってもよい。例示的な蒸留プロセスでは、油が真空下に置かれ、蒸気で加熱することにより、任意の残留する味及び臭い並びにFFAが取り除かれる。また、脱臭は、活性炭による処理によっても達成することができる。上記に列挙される工程は、流動点を低下させる働きをし得る。種々の実施形態では、微生物油脂質の流動点は、約-10°C、約-15°C、約-20°C、約-25°C、約30°C、約-35°C、又は約-40°Cまで低下され得る。さらに、微生物油の流動点は、これらの値のいずれかを境界とする任意の範囲内、例えば、約-10°C~-40°C又は約-15°C~約-35°C等にあってもよい。流動点の低下は、ステアリン画分として知られる主としてパルミチン酸及びステアリン酸トリグリセリドからなる飽和画分の相対的な割合が、これらの工程によって低下するために起こり得る。油を画分化すると、油の飽和トリグリセリド濃度が低下する。画分化は、植物油業界で公知の脱ろうプロセスのような、乾式画分化により達成されてもよい。このプロセスでは、まず、微生物例えば、藻類の油が、植物油業界で用いられるものと同様の方法によって精製、漂白及び脱臭される。それにより、-5~-10°Cの範囲、例えば-8°Cの流動点を有する油が得られる。次いで、結晶核が形成されるまで、RBD油の温度を制御された方法で下げることができる。次いで、油をその結晶化温度に数時間維持して、結晶の成長を促進し得る。次いで、結晶を濾過により取り出すと、2つの画分が得られる:ステアリン画分の一部又はほとんどを含有する固相、及び主としてオレイン画分を含有する液相。これにより、-8~-15°Cの範囲、例えば-11°Cの流動点を有する油が得られる。液相は、より低い結晶化温度まで再び画分化に供することで、ステアリンのさらなる除去を生じさせることができる。得られる精製された液体画分は、植物油業界で一般的に知られるとおりのスーパーオレインに相当するもので、天然の微生物油と比べてより良好な熱的特性を有する。例えば、2回目の画分化により、-15°C~-25°Cの範囲、例えば-20°Cの流動点を有する油を得ることができる。得られた油は、重要なことに食品用途を含めた、さまざまな用途に極めて有用であり、食品用途では微生物油を、割安で、且つ多くの場合により健康的な、動物油及び植物油の代替品として、全面的に又は部分的に用いることができる。3.微生物油から得られる生成物また、本明細書に記載される微生物油を使用して、潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体のような生成物を生成することもできる。一般的な工業用油としては、チェーンソーバー潤滑剤、金属加工液、食品級潤滑剤、ギヤオイル、海洋用オイル、エンジン潤滑剤、トラクター用オイル、農業機器潤滑剤、エレベータ用オイル、離型油などが挙げられる。誘電性流体dielecticfluidは、典型的には、電気部品特に高電圧の電気出力分布機器のもの、例えば、オートリクローザ、コンデンサ、回路遮断器、高電圧流体で満たされたトランスミッションケーブル、配電部品、スイッチングギヤ例えば、高電圧負荷開閉器、例えば米国特許第6,797,909号に記載されるもの、変圧器、変速装置部品、及び電圧調整器の冷却及び/又は電気的絶縁に使用される。従来の誘電性流体はミネラル油ベースの潤滑剤を含む。それらには、グループ1、グループII、及びグループIIベースオイルが含まれ、従来どおり精製され又は軽く水素化処理されていて、且つ120未満の粘度指数VIを有する石油ベースの油である。これにはまた、高度に精製された従来の油生成物であるグループIIIベースオイル米国での合成モータオイルを含むも含まれる。グループIIIベースオイルは、グループ1又はグループII/IIベースオイルを水素化処理ハイドロクラッキング及び/又は水素異性化することによって作ることができ、グループI、II、又はIIベースオイルと比べて含有する飽和物、硫黄、及び窒素が少なく、120より大きいVIを有する。AmericanSocietyofTestingandMaterialsASTMは、誘電性流体及び他の炭化水素組成物ディーゼル燃料ASTMD975、ジェット燃料ASTMD1655、及びバイオディーゼルASTMD6751などについて、沸点、セタン価、曇り点、引火点、粘度、アニリン点、硫黄含有量、含水量、灰分、銅板腐食、及び炭素残渣のようないくつかの要素のうちのいずれかに従う仕様を確立している。バイオベースの誘電性流体は、さまざまなプロセスにより調製することができる。例えば、一つのプロセスは、未精製の植物油から出発して、脱ガム、アルカリ精製、漂白、脱臭、水素化、脱ろうRBD植物油を生じさせるため、クレイ処理による微量の極性化合物及び酸性物質の除去米国特許第6,274,067号を参照、及び添加剤との混合を含み、それによりバイオベースの誘電性流体が生成される。誘電性流体の主要な特性には、粘度、可燃性、反応性、混和性、電気絶縁能力、生分解性、及び製造費用が含まれる。これらの及び他の特性を以下で考察するが、読者は、本発明の特定の実施形態の利点のいくつかについて、ミネラル油ベースの誘電性流体に対する従来のバイオベースの誘電性流体の利点及び欠点のいくつかを理解することにより、より良く理解することができる。粘度については、バイオベースの誘電性流体は一般的により高い粘度及び流動点を有し、従ってミネラル油ベースの誘電性流体と比べて劣った低温特性を有する。しかしながら、ミネラル油はさまざまな供給源間で一貫性がなく、且つ供給源の化合物が複雑であるため、ミネラル油ベースの誘電性流体の粘度はロット毎に異なり得る。バイオベースの誘電性流体は、一般的にミネラル油ベースの誘電性流体と比べて引火点及び燃焼点が高い少なくとも2倍高い。バイオベースの誘電性流体は、一般的にミネラル油ベースの誘電性流体と比べて加水分解、熱、及び酸化に関する安定性が劣り、酸価が約2倍高い。バイオベースの誘電性流体は、一般的にミネラル油ベースの誘電性流体と比べて高い生分解性を有し、毒性が低く、再生不能なものと対比される再生可能な資源から生産される。バイオベースの誘電性流体は、一般的にミネラル油ベースの誘電性流体と比べて生成にかかる費用が高く、より多くの添加剤が必要である。本発明の方法は新規の誘電性流体を提供し、これは、特定の実施形態では、従来のバイオベースの誘電性流体の利点を全て有し、欠点が少なく、ある実施形態では欠点がない。本方法のこれらの及び他の利点は、誘電性流体の一般的特性についての以下の考察を考慮すると、より良く理解することができる。理想的には、誘電性流体の粘度は、温度に伴う変化が可能な限り小さくなければならない。粘度は、流れ又は剪断に対する流体の抵抗性の尺度濃さであり、動粘性kv及び絶対値動的で測られる40°C及び100°CにおけるcSt又はmm2/sASTMD2270-04;ASTMD445;ASTMD88。一般的に、2つの動く表面を適切に離れさせる最小粘性の潤滑剤が望ましい。粘度は、ときに油圧作動液の最も重要な特性と考えられる。粘度が高過ぎる場合、摩擦、圧力降下、パワー消費、及び発熱が増加する。粘度が低過ぎる場合、高い動作温度で内部漏れの増加が起こり得る。可動部品の過剰な摩耗又は起こり得る焼付きを防ぐには、油膜は不十分であり得る。さまざまな供給源から得られる誘電性流体の例示的な粘度cSt単位は以下である:ミネラル油由来:40°Cで20及び100°Cで4;大豆油由来:40°Cで30及び100°Cで7.6;ヒマワリ油由来:40°Cで40及び100°Cで8.7;及び菜種キャノーラ油由来:40°Cで33Siniawskietal.;J.SyntheticLubrication;24,101-1102007;Schneider;J.Sci.FoodAgric.,86,1769-17802006。本発明の方法は、特定の実施形態では、前述の供給源から得られる誘電性流体の粘度と同様の粘度を有する誘電性流体を提供し得る。例示的な実施形態では、誘電性流体は、40°Cで約110cSt未満、例えば20~30cStの範囲の粘度、及び/又は100°Cで約2~約15cSt、例えば4~8cStの範囲の粘度を有する。粘度指数VI、無単位数は、温度の変動に伴う粘度の変動の計測値である。VIについては、40°Cでの油のkvが2つのVIが0及び100の基準油と比較され、ここで全ての油は100°Cで同じkvを有するASTMD2270。VI値は、一般的に可能な限り高くなければならない。高いVI値は、温度に伴う油の粘度の変化が小さいことを示す。一般に:低いVIは35未満であり;中程度のVIは35~80であり;高いVIは80~110であり;極めて高いVIは110~125であり;極度のVIは125~160であり;及び極度に高いVIは160以上である。さまざまな出発物質から得られる誘電性流体のVIには、以下が含まれる:ミネラル油由来:103;大豆油由来:246;及びヒマワリ油由来:206Siniawskietal.;J.SyntheticLubrication;24,101-1102007。本発明の方法は、特定の実施形態では、前述の供給源から得られる誘電性流体のVIと同様のVIを有する誘電性流体を提供し得る。流動点は、液体が流れ、又は流動する最低温度°CであるASTMD97。流動点は、誘電性流体が使用されるときの予想される最低周囲温度より少なくとも10°C低くなければならない。さまざまな出発物質から得られる誘電性流体の流動点には、以下が含まれる:ミネラル油由来:-50°C;大豆油由来:-9°C;ヒマワリ油由来:-12°C;及び菜種キャノーラ油由来:-21°CSiniawskietal.;J.SyntheticLubrication;24,101-1102007。本発明の方法は、特定の実施形態では、前述の供給源から得られる誘電性流体の流動点と同様の流動点を有する誘電性流体を提供し得る。種々の実施形態では、微生物油ベースの誘電性流体の流動点は、約-10°C、約-15°C、約-20°C、約-25°C、約30°C、約-35°C、又は約-40°Cであり得る。さらに、微生物油ベースの誘電性流体の流動点は、これらの値のいずれかを境界とする任意の範囲内、例えば、約-10°C~-40°C又は約-15°C~約-35°C等にあってもよい。例えば、及び上述のように、本明細書に記載される方法に従い生成されるRBD油は、約-8°C以下の流動点で容易に生成することができる。この流動点は、RBD油を流動点降下剤と混合することによりさらに下げることができ、油に添加される流動点降下剤の量に基づき-15~-20°C以下の範囲の流動点を有する油が実現される。一回の画分化からのオレイン画分が、約-11°Cの流動点を有する油を容易に生成し、この流動点は、オレイン画分を流動点降下剤と混合することによりさらに下げることができ、油に添加される流動点降下剤の量に基づき-16~-20°C以下の範囲の流動点を有する油が実現される。2回目の画分化からのオレイン画分スーパーオレインは、約-20°Cの流動点を有する油を容易に生成し、この流動点は、スーパーオレイン画分を流動点降下剤と混合することによりさらに下げることができ、油に添加される流動点降下剤の量に基づき-20°C未満、すなわち-26°C以下の流動点を有する油が実現される。さまざまな流動点降下剤が、Chevron、Oronite、Infineum、GeneralElectric、RohmMaxEvonikなどから市販されている。本明細書に記載される微生物油脂質で用いられる例示的な流動点降下剤としては、VISCOPLEX登録商標10-310又は1-133Rohmax-EvonikAdditivesGmbH、又は他のポリアルキルアクリレート及びポリメチルアクリレート、例えばINFINEUM登録商標V-351InfineumUKlimitied、PMA-D110及びPMA-Dが挙げられる。流体粘度が不十分で流体膜が表面接触を防止しない場合にはASTMD2882、早期に摩耗が起こるため、誘電性流体の潤滑性耐摩耗特性は重要である。ある実施形態では、本発明の方法は、良好なASTMD2882と同等か、又はそれより良好な潤滑性を有する誘電性流体を提供する。誘電性流体にとって、揮発性、すなわち油の気化しやすさ蒸気atm対°Cもまた重要である。一般的に、揮発性は低いほど好ましい。ある実施形態では、本発明の方法は、ミネラル油ベースの誘電性流体及び従来のバイオベースの誘電性流体と同程度に低く、さらにはそれより低い揮発性を有する誘電性流体を提供し得る。誘電性流体の可燃性は重要である。一般的に、可燃性は低いほど好ましいBio-BasedLubricants:AMarketOpportunityStudyUpdateUnitedSoybeanBoard,Nov.2008,OmniTechInternational,Ltd.,www.soynewuses.org/downloads/reports/BioBasedLubricantsMarketStudy.pdfを参照。本発明の方法は、特定の実施形態では、ミネラル油ベースの誘電性流体及び従来のバイオベースの誘電性流体と同程度に低く、さらにはそれより低い可燃性を有する誘電性流体を提供し得る。引火点は、油が気化して着火性混合気を形成する最低温度°Cである。ASTMD3278、D3828、D56、及びD93に、誘電性流体に適した引火点仕様が記載されている。油の発火を防ぐため、引火点は一般的に可能な限り高くなければならない。さまざまな供給源から得られる誘電性流体の引火点には、以下が含まれる:ミネラル油由来:147°C;及びTAG由来典型的:324°CNewSafetyDielectricCoolantsforDistributionandPowerTransformers,www.cooperpower.com/Library/pdf/00048.pdf。ある実施形態では、本発明の方法は、前述の供給源から得られる誘電性流体の引火点と同様の、及びASTMD1310及びASTMD92仕様以上の引火点を有する誘電性流体を提供し得る。燃焼点は、裸火で着火後、油が少なくとも5秒燃焼し続け得る最低温度°Cである。ASTMD1310及びASTMD92に、誘電性流体に適した燃焼点仕様が記載されている。油の発火を防ぐため、燃焼点は可能な限り高くなければならない。さまざまな供給源から得られる誘電性流体の燃焼点には、以下が含まれる:ミネラル油由来:165°C;及びTAG由来典型的:360°CNewSafetyDielectricCoolantsforDistributionandPowerTransformers,www.cooperpower.com/Library/pdf/00048.pdf。ある実施形態では、本発明の方法は、前述の供給源から得られる誘電性流体の燃焼点と同様の、及びASTMD1310及びASTMD92仕様以上の燃焼点を有する誘電性流体を提供し得る。ある実施形態では、燃焼点は300°Cを上回り、例えば300°C~450°Cである。誘電性流体の反応性は重要である;誘電性流体は、酸/塩基、熱、及び空気と反応してはならない又は低反応性を呈しなければならない。加水分解反応性は、酸又は塩基の存在下における流体の分解に対する感受性を指す。ASTMD2619及びASTMD943に、誘電性流体に適した加水分解反応性が記載されている。TAGでは、感受性を有する官能基はエステル及び酸/塩基感受性官能基である。本発明の方法は、特定の実施形態では、低い加水分解反応性を有するASTMD2619及び/又はASTMD943と同等か、又はそれより良好な誘電性流体を提供し得る。熱安定性は、誘電性流体の熱分解に対する感受性を指す。バイオ油由来の誘電性流体では、熱的不安定性は、典型的には、最終的に脱離生成物をもたらすグリセロール上のβ-水素に起因する。本発明の方法は、特定の実施形態では、高い熱安定性を有する従来のバイオ油由来の誘電性流体の熱安定性と等しいか、又はそれより高い誘電性流体を提供し得る。酸化感受性は、酸化生成物を形成する酸素との反応に対する誘電性流体の感受性を指す。ASTMD943及びASTMD2272に、誘電性流体に適した酸化安定性が記載されている。酸化に対しては低感受性が望ましい;値が高いほど、より酸化しやすい潤滑剤を指す。特定の実施形態では、本発明の方法は、特定の実施形態において、低酸化感受性を有する例えば、ASTMD943又はASTMD2272誘電性流体を提供し得る。中和価酸価/酸化指数は、油又は誘電性流体中の酸の量の尺度である。酸は、油又は誘電性流体が経年及び修理点検に伴い酸化すると形成される。酸は、バイオベースの潤滑剤では、酸化、エステル熱分解、又は酸/塩基加水分解によって生じる。ASTMD947、ASTMD3487、及びASTMD6871に、誘電性流体に適した中和価が記載されている。一般的に、酸価は可能な限り低くなければならない。酸価は、標準的なミネラル油について0.03であり、バイオベースの油について0.06であるEsterTransformerFluids,IEEE/PESTransformerCommitteeMeeting,October7,2003,www.transformerscommittee.org/info/F03/F03-EsterFluids.pdf。本発明の方法は、特定の実施形態では、低い酸価を有する例えば、ASTMD947、ASTMD3487、又はASTMD6871誘電性流体を提供し得る。混和性は、流体が他の流体と混合する能力を指す。理想的には、誘電性流体は他の潤滑剤、流体、及び添加剤と良好に混合しなければならないが、水とは良好に混合してはならない。抗乳化度は、油圧作動液が水との混合にどの程度抵抗するかを指す。抗乳化度は、誘電性流体において最適である。望ましい潤滑剤及び添加剤との混和性は、誘電性流体において最適である。特定の実施形態では、本発明の方法は、特定の実施形態において、良好な混和性及び抗乳化度を有する誘電性流体を提供し得る。誘電性流体は、良好な電気絶縁特性を有しなければならず、すなわち電流の散逸を防止しなければならない。変圧器に関して絶縁力率試験が行われ、誘電損失が計測されるで計測。この値は変圧器の状態-湿潤度、乾燥度、絶縁性の低下、巻線の、バリアの、タップ切換器の、ブッシングの及び油の状態-を報告する。誘電性流体に関連する力率の値は、可能な限り低くなければならず、典型的には0.5以下でなければならない。例えば、精油所から出荷された新しい油の力率は、25°Cで0.05以下及び100°Cで0.3以下でなければならないwww.nttworldwide.com/tech2209.htmに引用されるとおりのIEEE指針C57、106-1991。69kV以下で動作する新しい機器の新しい油については、力率は25°Cで0.15以下及び100°Cで1.5以下でなければならない;69kVから288kV以下で動作するものについては、力率は25°Cで0.10以下及び100°Cで1.0以下でなければならない;345kV以上で動作するものについては、力率は25°Cで0.05以下及び100°Cで0.3以下でなければならない。回路遮断器用の新しい油は、25°Cで0.05以下及び100°Cで0.3以下の力率を有しなければならない。回路遮断器で用いられる油は、25°Cで1.0を上回る力率を有してはならない。本発明の方法の特定の実施形態は、望ましい力率要件を備える誘電性流体を提供する。絶縁耐力は、誘電性流体電気絶縁体が壊れずに抵抗することのできる最大電界強度を指す。絶縁耐力はMV/mの単位で計測され相対誘電率、ASTMD877が誘電性流体に適した仕様を提供している。電気絶縁体としての使用には、潤滑剤の絶縁耐力は可能な限り高くなければならない。本発明の方法は、特定の実施形態では、ASTMD877によって規定される絶縁耐力と同等の、又はそれより優れた絶縁耐力を有する誘電性流体を提供し得る。損失係数は、電気絶縁体として使用するときの誘電性流体に起因する電気損失の尺度であり、25°Cにおける単位で計測される。ASTMD924に、誘電性流体に適した仕様が提供されている。電気絶縁体としては、損失係数の値は可能な限り低くなければならない。特定の実施形態では、本発明の方法は、ASTMD924によって規定される損失係数と同等の、又はそれより優れた損失係数を有する誘電性流体を提供する。電気伝導度は、電気絶縁体として使用するときの、誘電性流体の電流を伝導する能力の尺度であり、Sm-1の単位で計測される。ASTMD2624に、誘電性流体に適した仕様が提供されている。絶縁体としては、誘電性流体の電気伝導度の値は可能な限り低くなければならない。本発明の方法の実施形態は、ASTMD2624によって規定される電気伝導度と比較して望ましい電気伝導度を有する誘電性流体を提供する。電気変圧器での使用及び他の用途には、誘電性流体の熱的特性は、熱が効率的に伝達されるものでなければならない。比熱は物質の熱容量を指し、cal/gm/°Cの単位で計測される。ASTMD-2766に、誘電性流体に適した仕様が提供されている。比熱の値が高いほど、より効率的な熱伝達及び冷却が可能になる。比熱の値は、ミネラル油由来の誘電性流体について一般的に約0.39であり、TAG由来の誘電性流体について約0.45であるSafetyDielectricCoolantsforDistributionandPowerTransformers,www.cooperpower.com/Library/pdf/00048.pdf。本発明の実施形態における方法は、0.39以上の、及び/又はASTMD2624仕様を満たす比熱値を有する誘電性流体を提供し得る。誘電性流体の環境特性は重要である。一般的に、流出又は他の事故の環境影響を軽減するように選択された誘電性流体が用いられなければならない。生分解性は、環境中で二酸化炭素と水に分解する誘電性流体の特性を指し、一般的に28日あたりのの単位で計測される。OECD301B及びASTMD-6046に、誘電性流体に適した生分解性仕様が提供されている。易生分解性の生分解性値は、一般的に約100であり;本質的に生分解性の生分解性値は、一般的に20~70であり;及び非生分解性の生分解性値は、一般的に無視し得るほど僅か乃至0である。ミネラル油由来の誘電性流体は、一般的に15~35の範囲の生分解性値を有し、バイオ油由来の誘電性流体は、一般的に70~100の範囲の生分解性値を有する。本発明の方法の特定の実施形態は、70~100の範囲の生分解性値を有する誘電性流体を提供し得るRenewableLubricantsManual:BiobasedOils,Fluids,Greaseswww.renewablelubricants.com/RenewableLubricantsManual_Biodegradable.htmlIntroductionを参照。ヨウ素価又はヨウ素数は、油に関する不飽和度の尺度である。より具体的には、ヨウ素価は、油中の不飽和結合により消費されるヨウ素の質量である。乾性油は約175以上の比較的高いヨウ素価を有する。大豆油は約130であり、オリーブ油は約80のヨウ素価を有する。ヨウ素価は、当該技術分野ではルーチン的に決定されている。ヨウ素価を決定する標準方法には、ASTMD5768-022006及びDIN53241が含まれる。種々の実施形態では、微生物油をベースとする生成物、例えば誘電性流体中の微生物油は、約25~約200、例えば、約50、約75、約100、約125、約150、又は約175のヨウ素価を有し得る。さらに、ヨウ素価は、これらの値のいずれかを境界とする任意の範囲内、例えば、約25~約175、約50~約200、約50~約175等にあってもよい。脂肪酸不飽和もまた変化させることができる。不飽和を増加させると、凝固点/流動点が低下する。高オレイン酸バイオ潤滑剤に見られるような一価不飽和が現在最適であり、流動点と酸化反応性との均衡に相当する。一価不飽和油は空気と反応するが、多価不飽和FA又はPUFAと比べるとはるかに緩徐である。PUFAの例としては、アラキドン酸ARA、エイコサペンタエン酸EPA、及びドコサヘキサエン酸DHAが挙げられる。二価及び多価不飽和FAは酸化に対する感受性が高く、電気的な用途には不適である。植物油から得られる誘電性流体の一つの問題は、多価不飽和FA例えば、リノール酸及びリノレン酸の存在である。本発明の一部の実施形態の誘電性流体の一つの利点は、それが含む又はそれが由来する微生物油が二価及び多価不飽和FAを、他のバイオ油から得られる誘電性流体が含有するものと比べて、ほとんど、及びある実施形態では全く含有しないことである。誘電性流体の脂質プロフィールは、通常は原材料油の脂質プロフィールと極めて類似している。より長い鎖C16~C18の一価不飽和脂肪酸の量が多いことは、誘電性流体としての使用に好ましい。多価不飽和脂肪酸C18:2、C18:3、ARA、EPA及びDHAなどは、酸化及び酸化生成物の生成から、好ましくない。飽和脂肪酸は、高い凝固点を有する固体又は液体である傾向を有し、従って飽和脂肪酸が誘電性流体中に多量にあるのは望ましくない。種々の実施形態では、誘電性流体に有用な微生物油脂質は、少なくとも約50のC18:1、例えば、少なくとも約55、少なくとも約60、少なくとも約65、少なくとも約70、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、及び少なくとも約90のC18:1である。これらの又は他の実施形態では、微生物油脂質は約10未満のC18:2、例えば、約7.5未満、約5未満、約2.5未満、及び約1未満のC18:2である。微生物油は、合計100以下になるC18:1及びC18:2の割合の任意の組み合わせを有することができる。例えば微生物油は、少なくとも50のC18:1及び10未満のC18:2又は少なくとも80のC18:1及び5未満のC18:2を有することができる。例示を目的として、本明細書には、ヒマワリ油の20~75及び大豆油の48~65と比較して2未満のC18:2を含有する油産生微生物由来のTAG油が提供される実施例4を参照。また、大豆油の5~10と比較して0.5未満のC18:3を有するTAG油も提供される。誘電性流体のこれらの及び他の特性は、任意の用途に適した、潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体のような生成物が提供されるように、本明細書に記載される方法に従い実現し、操作し、及び/又は変化させることができる。例えば、油産生微生物の遺伝子操作は、上述のように、脂質中のさまざまな脂肪酸の鎖長、飽和、及び/又は組成を変えるように行うことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載されるような有用な微生物油は、1つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌によって生成される。例えば、遺伝子操作された細菌は、Prototheca例えば、Protothecamoriformis又はChlorellaであってもよい。例示的な外来遺伝子には、ショ糖インベルターゼ及び/又は脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードするものが含まれる。さらに、微細藻類又は油産生酵母から抽出された脂質は、誘電性流体に望ましい特性を実現するため、さまざまな化学的な改変に供することができる。典型的な改変には、脂肪酸FA鎖長を変化させることが含まれる。鎖が短いFAほど低い流動点を有する。化学的な改変はまた、本発明の方法の実施形態において、不飽和を低減するためにも用いることができ、アルキル化、ラジカル付加、アシル化、エン反応、ヒドロホルミル化、選択的水素化、オリゴマー形成、ヒドロアミノメチル化、アシルオキシ化、及びエポキシ化が挙げられる。それに加えて、又は代えて、望ましい特性、例えば流動点を実現するため、流動点降下剤のような添加剤を処理済みの微生物油と混合することができる。例示的な添加剤については、以下でさらに詳細に考察する。上記に考察したとおり、特定の実施形態では、油産生細菌から抽出した原料微生物油は、典型的には本発明の生成物に取り込まれる前に濃縮される。例えば、微生物脂質には、堆積物として溶液から結晶化し、及び/又は沈殿し、析出し得る混入物質が存在し得る。堆積物の形成は、誘電性流体が低温で使用される場合に特に問題である。堆積物又は沈殿物は、流動の低下、詰まりなどの問題引き起こし得る。当該技術分野では、より高い品質の生成物を生成するための、このような混入物質及び堆積物の除去に特別に対処する方法がよく知られている。そのような方法の例としては、限定されないが、リン脂質及び遊離脂肪酸のような混入物質を除去する油の前処理例えば、ガム状物質の除去、苛性ソーダによる精製、シリカ吸着剤による濾過が挙げられる。脱ろうは、本発明の方法の実施形態において、微生物油を濃縮するために用いることができる。本発明の実施形態に従い誘電性流体を脱ろうするアプローチは、いくつかある。一つのアプローチは、流体を他の誘電性流体とブレンドすることである。別のアプローチは、凝固点を下げることのできる添加剤を使用することである。乾式画分化もまた、飽和画分ステアリン画分の相対的な割合を減らすために用いることができる。油を冷却することにより、飽和物を結晶化させ、次いで結晶を濾別することができる。画分化は、流体を個々の成分又は画分に選択的に分離し、特定の画分を除去するか、又は含むようにすることができる。他の画分化方法は、尿素による画分化、溶媒による画分化、及び熱による蒸留が挙げられる。次いで、珪藻土又は漂白クレイのような他の濾過材料を冷却した液体に加えてスラリーを形成し、次いで、これを葉状圧力フィルター又は他の種類のフィルターで濾過し、粒状物を除去し得る。次いで、濾過した液体を研磨フィルターに通し、残った任意の堆積物及び珪藻土を除去して、最終生成物を生成し得る。それに代えて、又は加えて、この生成物、又は前述のプロセス工程のいずれかの終わりに生成される微生物油を、流動点降下剤と混合して、本発明の生成物、例えば誘電性流体を生成することができる。本発明の一実施形態では、潤滑油又は誘電性流体を生成する方法が提供され、この方法は、a本明細書に開示される方法を用いて脂質を含有する微生物を育てることと、b脂質を含有する微生物を溶解して溶解物を生成することと、c溶解した微生物から脂質組成物を単離することと、d単離した脂質組成物を濃縮することとを含み、これにより潤滑油又は誘電性流体が生成される。典型的には、工程dは、1つ以上の精製、漂白、及び/又は脱臭工程及び1つ以上の画分化工程を含み、それによりパルミチン酸及び/又はステアリン酸トリグリセリドを除去して飽和画分の相対的な割合が低減され得る。さらなる実施形態において、工程dから得られる潤滑油又は誘電性流体は、流動点降下剤と混合される。場合により、単離された脂質の酸化安定性を増加させる他の添加剤を、これらの方法により生成される微生物油、潤滑剤、又は誘電性流体と混合することができる。そのような添加剤の例としては、抗酸化剤、例えばトコフェロールビタミンE、例えば、α-、β-及び/又はδ-トコフェロール、アスコルビン酸ビタミンCが挙げられる。適した抗酸化剤は市販されている。BASF社は、IRGANOX登録商標の商標で、一連の適したフェノールベース及びアミンベースの抗酸化剤を販売している。IRGANOXL109、IRGANOXL64、IRGANOXL57、他のIRGANOX抗酸化剤、並びに他のフェノールベース及びアミンベースの化合物が、油及び誘電性流体を含む生成物に対する抗酸化添加剤として適している。抗酸化剤の他の非限定的な例としては、ブチル化ヒドロキシアニソールBHA、ブチル化ヒドロキシトルエンBHT、モノ第三ブチルヒドロキノンTBHQ、ブチル化ヒドロアニソール、テトラヒドロブチロフェノンtetrahydrobutrophenone、パルミチン酸アスコルビル、及び没食子酸プロピルが挙げられる。特定の実施形態では、微生物油をベースとする生成物、例えば誘電性流体は、重量で0.1~5、好ましくは0.5~2の抗酸化剤をさらに含む。誘電性流体のような生成物として使用するために場合により単離された脂質に添加され得る他の添加剤は、金属イオンの不活性化剤、腐食防止剤、耐摩耗添加剤、及び/又は加水分解防止剤である。誘電性流体に広く用いられている添加剤のいくつかが、Schneider,2006,JScienceFoodandAgriculture;86:1769-1780に記載されている。金属イオン不活性化剤は、2つの主要な機能を有する。これは金属の表面に対する化学的攻撃を抑制し、また、金属表面を不動態化して、ラジカル不対電子形成の触媒として作用し得るあらゆる残基を抑制する。金属不活性化剤は市販されている。例えば、BASF社は、IRGAMET登録商標ラインの金属不活性化剤を含む一連の金属不活性化剤を提供している。RTVANDERBILT社は、CUVAN登録商標ラインの金属不活性化剤を販売している。金属不活性化剤の他の例としては、1-ジイソオクチルアミノメチル-1,2,4-トリアゾール、1-2-メトキシプロプ-2-イルトリルトリアゾール、1-1-シクロヘキシルオキシプロピルトリルトリアゾール、1-1-シクロヘキシルオキシヘプチルトリルトリアゾール、1-1-シクロヘキシルオキシブチルトリルトリアゾール、1-[bis2-エチルヘキシルアミノメチル-4-メチルベンゾトリアゾールを含む誘導体化トリアゾール、ホウ酸トリエチル、ホウ酸トリプロピル、ホウ酸トリイソプロピル、ホウ酸トリブチル、ホウ酸トリペンチル、ホウ酸トリヘキシル、ホウ酸トリシクロヘキシル、ホウ酸トリオクチル、ホウ酸トリイソオクチルを含む誘導体化ホウ素、及び他の誘導体化ヒドラジン金属不活性化剤、例えば、2’,3-bis[[3-[3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシフェニル]プロピオニル]]プロポニオヒドラジンproponiohydrazineなどが挙げられる。特定の実施形態では、微生物油をベースとする生成物、例えば誘電性流体は、重量で0.1~5、好ましくは0.5~2の1つ以上の金属不活性化剤をさらに含む。従って、本明細書に記載される方法に従い調製された誘電性流体は、複数の添加剤を含有することができ、限定されないが、以下の添加剤の1つ以上が含まれる:a抗酸化剤、限定されないがBHT及び他のフェノール類を含む;bCu、Znなどの金属イオンの不活性化剤、限定されないがベンゾトリアゾールを含む;c腐食防止剤、限定されないがエステル硫酸及びコハク酸エステルを含む;d解乳化剤;e耐摩耗添加剤、限定されないがジチオリン酸亜鉛を含む;f流動点を降下させる添加剤、限定されないがマランスチレン共重合体malanstyrenecopolymer、限定されないがポリメタクリレートを含むポリアルキルアクリレートを含む;及びg加水分解を防ぐ化合物、限定されないがカルボジイミドを含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、約-10°C~約-40°Cの流動点を有する微生物油を含む生成物を生成し、ここで微生物油の脂肪酸組成は、少なくとも50のC18:1及び10未満のC18:2である。この方法は、1つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌を、その細菌が乾燥重量で少なくとも10の油を有するようになるまで育てることを含む。例示的な遺伝子操作された微生物としては、Prototheca例えば、Protothecamoriformis又はChlorellaが挙げられる。例示的な外来遺伝子としては、ショ糖インベルターゼ及び/又は脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードするものが挙げられる。ある実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、ショ糖インベルターゼ及び脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードするか、2つの異なる脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードするか、又はショ糖インベルターゼ及び2つの異なる脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼをコードする、少なくとも2つの外来遺伝子を発現する。細菌が乾燥重量で少なくとも10の油を有するようになると、油が細菌から分離され、精製、漂白、脱臭又は脱ガムに供されて、RBD油が生成される。場合により、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、及び/又は抗加水分解性化合物をRBD油に添加して、望ましい生成物を生成することができる。特定の実施形態では、本発明の画分化方法は、約-10°C~約-40°Cの流動点を有する生成物例えば、誘電性流体dielecticfluidへの組み込みに適した微生物油を生成し、ここで微生物油の脂肪酸組成は、少なくとも50のC18:1及び10未満のC18:2である。この方法は、出発すなわち第1の微生物油を精製、漂白、脱臭又は脱ガムに供して、初期流動点及び第1の温度によって特徴づけられるRBD油を生成することと、RBD油の温度を第2の温度に下げることと、RBD油を第2の温度で濾過して、初期流動点より低い第2の流動点であって、約-10°C~約-40°Cである第2の流動点によって特徴づけられる第2の微生物油を提供することとを含み、ここで第2の微生物油の脂肪酸組成は、少なくとも50のC18:1及び10未満のC18:2である。例示的な第1の温度は15°C~約50°Cであり、例示的な第2の温度は約-15°C~約15°Cである。場合により、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、及び/又は抗加水分解性化合物を第2の微生物油に添加して、望ましい生成物を生成することができる。これらの実施形態の変形例において、第1の微生物油は、1つ以上の外来遺伝子を発現するように操作された遺伝子操作された細菌を、その細菌が乾燥重量で少なくとも10の油を有するようになるまで育てることと、次いで、細菌から油を分離して第1の微生物油を生成することとにより生成される。この方法を用いて、例えば、潤滑剤、油圧作動液、工業用油、又は誘電性流体を生成することができる。特定の実施形態では、生成物が誘電性流体dielecticfluidである場合、流体は、抗酸化剤、金属イオン不活性化剤、腐食防止剤、解乳化剤、耐摩耗添加剤、流動点降下剤、又は抗加水分解性化合物のうちの1つ以上を含む。本発明の一実施形態では、誘電性流体は、油産生微生物から得られる油及び/又は誘電性流体を既存の油又は誘電性流体とブレンドすることにより生成される。既存の油及び誘電性流体は、植物又は動物又はその双方、すなわち石油を起源とするのものであってよい。従って、本発明は、油産生微生物からの脂質が誘電性流体並びにさまざまな工業的及び他の用途に有用な他の生成物を生じるように企図されるさまざまな方法を含む。本明細書に開示される方法により生成される油の改変方法の例としては、限定されないが、油の加水分解、油の水素化、及び油のエステル化が挙げられる。微細藻類脂質の他の化学的な改変としては、限定なしに、エポキシ化、酸化、加水分解、硫酸化、スルホン化、エトキシ化、プロポキシル化、アミド化、及び鹸化が挙げられる。微細藻類の油の改変により基本的な油脂化学品が生成され、これは、望ましい機能のため、選択された誘導体油脂化学品にさらに改変することができる。燃料生成方法に関する上記の記載と同様にして、これらの化学的な改変を、本明細書に記載される微生物培養物から産生された油に対して行うこともできる。特定の実施形態では、本明細書に記載される誘電性流体は、変圧器コア/コイル組立体を収容するタンクここでは誘電性流体がコア/コイル組立体を取り囲むを含めた、変圧器のような電気システムで用いられる。このような実施形態の変形例において、タンクは酸素吸収材料も含み、この材料はタンク内のガスと接触しているが、誘電性絶縁流体からは接触しないよう隔離されている。適した酸素吸収材料は、タンク内部で誘電性流体を取り囲む大気中の遊離酸素濃度を低減することが可能で、ひいては流体それ自体にある溶存酸素の存在量を低減するものである。そのような化合物は、酸素除去化合物と呼ばれ得る。有用な酸素除去化合物には、食品包装業界で一般的に用いられているものが含まれる。本発明の実施において有用な酸素除去化合物の代表的なものには、以下が含まれる:亜硫酸ナトリウム;硫酸銅五水和物;炭素と活性鉄粉との組み合わせ;ハイドロサルファイト、水酸化カルシウム、重炭酸ナトリウム及び活性炭の混合物;金属粉末の表面にコーティングされた金属ハロゲン化物粉末;及び水酸化カルシウムのようなアルカリ化合物と炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウムとの組み合わせ。上記の組成物の1つ以上の混合物及び組み合わせもまた有用と考えられる。また、酸素除去化合物としては、亜硫酸塩と、水和硫酸銅、塩化第一スズ、又は酸化コバルトのような促進剤との混合物を含む、酸素を取り除く組成物を含めた、参照により組み込まれる米国特許第2,825,651号により提供される組成物も有用である。別の有用な酸素除去化合物クラスには、同様に参照によって組み込まれる米国特許第4,384,972号に開示されるような、マンガン、鉄、コバルト又はニッケルの塩、アルカリ化合物、及び亜硫酸塩又は潮解性化合物を含む組成物が含まれる。好ましい酸素除去化合物は、酸化鉄IIのような少なくとも1つの基本酸化鉄を含み又はその基本成分として含み、又は酸化鉄材料の混合物から構成される。有用な酸化鉄含有組成物は、例えば、Agelessの商標名でDuncan,SouthCarolinaのMitsubishiGasChemicalCompanyから、及びFreshmaxの商標名でBuffalo,N.Y.のMultisorbTechnologies,Inc.から市販されている。また、第一鉄塩及び酸化改質剤及び/又は金属亜硫酸塩又は硫酸塩化合物の混合物を含む酸素吸収剤も有用である。本発明について上に詳細に説明し、以下の実施例で例示するが、これらは説明のために与えられたものであり、特許請求の範囲に書かれた発明を限定するために与えられているのではない。VII.実施例実施例1:Protothecaを培養する方法細胞乾燥重量で高い割合の油を得るようにPrototheca株を育てた。凍結保存した細胞を室温で解凍し、細胞500μlを、2グルコースを含む培地4.5ml4.2g/LK2HPO4、3.1g/LNaH2PO4、0.24g/LMgSO47H2O、0.25g/Lクエン酸一水和物、0.025g/LCaCl22H2O、2g/L酵母抽出物に入れ、6ウェルプレートで撹拌しつつ200rpm、28°Cで7日間成長させた。細胞乾燥重量は、あらかじめ秤量しておいたエッペンドルフ管中、培養物1mlを14,000rpmで5分間遠心分離することによって決定した。培養物の上澄みを棄て、得られた細胞ペレットを脱イオン水1mlで洗浄した。培養物を再び遠心分離処理し、上澄みを棄て、細胞ペレットを凍結するまで-80°Cに置いた。次いで、サンプルを24時間凍結乾燥し、細胞乾燥重量を算出した。培養物中の総脂質を決定するために、培養物3mlを取り出し、AnkomシステムAnkomInc.、Macedon、NYを用い、製造業者のプロトコルに従って分析した。サンプルを、AmkomXT10抽出機を用い、製造業者のプロトコルに従って、溶媒抽出した。酸によって加水分解して乾燥させたサンプルと、溶媒抽出して乾燥させたサンプルとの質量差として、総脂質を決定した。細胞乾燥重量での油の割合を測定した値を表9に示す。Prototheca属の複数の株に由来する微細藻類サンプルの遺伝子型を解析した。藻類のバイオマスからゲノムDNAを以下のように単離した。液体培養物から、細胞約200mgを14,000×gで5分間遠心分離処理した。次いで、細胞を滅菌蒸留水に再び懸濁させ、14,000×gで5分間遠心分離処理し、上澄みを棄てた。このバイオマスに、直径約2mmの1個のガラスビーズを加え、この管を-80°Cで少なくとも15分間置いた。サンプルを取り出し、研磨バッファー1Sarkosyl、0.25Mショ糖、50mMNaCl、20mMEDTA、100mMTris-HCl、pH8.0、RNaseA0.5ug/μl150μlを加えた。ペレットを短時間ボルテックスすることによって再び懸濁させた後、5MNaCl40μlを加えた。サンプルを簡単にボルテックスした後、5CTABセチルトリメチルアンモニウムブロミド66μlを加え、最後に短時間ボルテックスした。次いで、サンプルを65°Cで10分間インキュベートした後、14,000×gで10分間遠心分離処理した。新しい管に上澄みを移し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール12:12:1300μlで1回抽出し、次いで、14,000×gで5分間遠心分離処理した。0.7体積部のイソプロパノール約190μlを含む新たな管に、得られた水相を移し、ひっくり返すことによって混合し、室温で30分間インキュベートするか、又は4°Cで一晩インキュベートした。14,000×gで10分間遠心分離処理することによってDNAを回収した。次いで、得られたペレットを70エタノールで2回洗浄した後、100エタノールで最後に洗浄した。ペレットを室温で20~30分風乾した後、10mMTrisCl、1mMEDTApH8.050μlで再び懸濁させた。上述のように調製した藻の全DNA5μlを、これを10mMTris、pH8.0で1:50に希釈した。最終容積が20μlのPCR反応を以下のように設定した。2×iProofHFマスターミックスBIO-RAD10μlを、0.4μlのプライマーSZ0261310mMストック濃度の5’-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3’配列番号9に加えた。このプライマー配列は、GenBank寄託番号L43357の位置567~588であり、高等植物及び藻のプラスチドゲノムにおいて高度に保存されている。次いで、これに0.4μlのプライマーSZ0261510mMストック濃度の5’-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3’配列番号10を加えた。このプライマー配列は、GenBank寄託番号L43357の位置1112~1093と相補性であり、高等植物及び藻のプラスチドゲノムにおいて高度に保存されている。次いで、希釈した全DNA5μl及びdH2O3.2μlを加えた。PCR反応を以下のように行った。98°C、45秒;98°C、8秒;53°C、12秒;72°C、20秒を35サイクル繰り返した後、72°Cで1分、25°Cで保持。PCR産物を精製するために、核反応物に10mMTris、pH8.020μlを加えた後、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール12:12:140μlで抽出し、ボルテックスし、14,000×gで5分間遠心分離処理した。PCR反応物をS-400カラムGEHealthcareに入れ、3,000×gで2分間遠心分離処理した。次いで、精製したPCR産物を、PCR8/GW/TOPOへとTOPOクローン化し、LB/Specプレートで陽性クローンを選択した。精製したプラスミドDNAについて、M13の順プライマー及び逆プライマーを用い、両方向で配列を決定した。23SrRNADNAの配列が決定された全部で12種類のPrototheca株を選択し、これらの配列を、配列表に列挙している。株及び配列表の番号のまとめは、以下にある。UTEX1435配列番号15配列との全体的な違いについて、配列を分析した。最も違う配列として、2対があらわれたUTEX329/UTEX1533及びUTEX329/UTEX1440。これら両者の場合で、ペアワイズアラインメントから、一対の配列同一性が75.0であった。UTEX1435の配列同一性の割合も、以下に示している。上に列挙した株の部分集合から得られた脂質サンプルについて、HPLCを用いて脂質プロフィールを分析した。結果を以下の表10に示す。ProtothecamoriformisUTEX1435から抽出した油溶媒抽出によるか、又は連続圧搾機を用いる、について、カロチノイド、クロロフィル、トコフェロール、他のステロール及びトコトリエノールを分析した。結果を以下の表11にまとめる。4つの別個のロットからの、Protothecamoriformisから抽出した油を、標準的な植物油の処理方法を用いて精製し、漂白した。簡潔に言えば、Protothecamoriformisから抽出した未精製油を水平デカンターで透明にし、そこで油から固形分を分離した。次いで透明にした油をクエン酸及び水とともにタンクに移し、約24時間静置しておいた。24時間後、タンク内の混合物が2つの別個の層を形成した。下層は水及びガムから構成され、次いでガムをデカンテーションにより除去してから、その脱ガム油を漂白タンクに移した。次いで油を別の一添加量のクエン酸とともに加熱した。次いで漂白クレイを漂白タンクに加え、混合物を真空下でさらに加熱することで、存在した水を全て蒸発させた。次いで混合物を葉状濾過器でポンピングして、漂白クレイを除去した。次いで濾過した油を最終的な5μm仕上げフィルターに通し、次いで、回収して、使用時まで保存した。次いで精製及び漂白したRB油について、カロチノイド、クロロフィル、ステロール、トコトリエノール及びトコフェロールを分析した。これらの分析の結果を以下の表12にまとめる。ndは、検出されなかったことを示し、検出感度は以下に掲載する:検出感度カロチノイドmcg/gnd=<0.003mcg/gクロロフィルIImcg/gnd=<0.03mcg/gステロールnd=0.25トコフェロールmcg/g;nd=3mcg/gProtothecamoriformis油の同じ4つのロットを、微量元素についても分析した。結果を以下の表13にまとめる。実施例2:微粒子銃によってProtothecaを形質転換する一般的な方法Seashell製の金マイクロキャリア550ナノメートルを製造業者のプロトコルに従って調製した。プラスミド20μgを、結合バッファー50μl及びS550d金担体60μl30mgと混合し、氷中、1分間インキュベートした。沈殿バッファー100μlを加え、この混合物を氷中でさらに1分間インキュベートした。ボルテックスした後、DNAでコーティングされた粒子を、エッペンドルフ5415C微量遠心器で10,000rpmで10秒間回転させることによって、ペレット状にした。この金ペレットを冷たい100エタノール500μlで1回洗浄し、微量遠心器で軽く回転させることによってペレット状にし、氷冷したエタノール50μlで再び懸濁させた。軽く1~2秒音波処理した後、10μlのDNAコーティングされた粒子を、すぐにキャリア膜に移した。Prototheca株を、2グルコースを含むプロテオース培地2g/L酵母エキス、2.94mMNaNO3、0.17mMCaCl22H2O、0.3mMMgSO47H2O、0.4mMK2HPO4、1.28mMKH2PO4、0.43mMNaCl中、旋回シェーカー上で、細胞密度が2×106細胞/mlになるまで成長させた。この細胞を収穫し、滅菌蒸留水で1回洗浄し、培地50μlに再び懸濁させた。非選択的なプロテオース培地プレートの中央の1/3に1×107細胞を広げた。この細胞を、PDS-1000/HeBiolisticParticleDeliveryシステムBio-Radで撃った。破裂ディスク1350psiを用い、プレートはスクリーン/マクロキャリアの集合体から6cm下に置いた。細胞を25°Cで12~24時間回復させた。回復したら、ゴム製スパチュラで細胞をプレートから掻き取り、培地100μlと混合し、適切に選別した抗生物質を含むプレートに広げた。25°Cでインキュベーションして7~10日経過後、プレート上に形質転換された細胞を示すコロニーが目視で確認された。コロニーを取り出し、2回目の選択ラウンドのために選択的な抗生物質あるいは炭素源のいずれか寒天プレートにスポットとして乗せた。実施例3:微細藻類細胞での異種脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼ遺伝子の発現Prototheca種を含む微細藻類細胞で異種チオエステラーゼ遺伝子を発現させる方法及びその結果が、以前に、本明細書によって参照により組み込まれるPCT出願番号第PCT/US2009/66412号に記載されている。本実施例では、高等植物種に由来する他のチオエステラーゼ遺伝子/遺伝子産物を使用した結果について記載する。Ricinuscommunisに由来する脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼを、ProtothecamoriformisUTEX1435の遺伝的背景に導入した。コドンが最適化されたcDNA配列配列番号87及びアミノ酸配列GenBank寄託番号ABS30422.1に由来配列番号88は配列表に列挙している。発現構築物は、核ゲノムに組み込むための、6Sゲノム領域に対する5’配列番号100及び3’配列番号101相同組み換え標的配列構築物に隣接すると、C.reinhardtiiβ-チューブリンプロモーター/5’UTR及びChlorellavulgaris硝酸還元酵素3’UTRの制御下にあるS.cerevisiaesuc2ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このS.cerevisiaesuc2発現カセットは配列番号78として列挙され、選択マーカーとして機能した。R.communisコード領域は、ProtothecamoriformisAmt03プロモーター/5’UTR配列番号84及びC.vulgaris硝酸還元酵素3’UTR配列番号85の制御下にあった。また、Ricinuscommunis天然トランジットペプチドは、C.protothecoidesステアロイルデサチュラーゼ配列番号86に由来するトランジットペプチドによって置き換えた。置き換えられたトランジットペプチドを有するチオエステラーゼのcDNA配列は、配列番号87として列挙される。Ricinuscommunis発現カセットの全体をpSZ1375と命名し、Protothecamoriformisの遺伝的背景に形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化法を用いて脂質脂肪酸プロフィールを決定した。選択されたクローンの脂肪酸プロフィールを、以下の表14にまとめている。結果は、Ricinuscommunisチオエステラーゼトランス遺伝子を有する形質転換体は、野生型株と比べてC16:0脂肪酸のレベルが変化し、及びそれより程度は少ないがC18:0脂肪酸のレベルも変化したことを示している。また、野生型レベルと比較したとき、C18:1脂肪酸濃度の増加も同時に起こった。実施例4:微細藻類Protothecamoriformisにおける飽和脂肪酸濃度の改変A.遺伝子ノックアウトアプローチによるステアロイルACPデサチュラーゼdesaturease及びデルタ12脂肪酸デサチュラーゼ発現の低減ProtothecamoriformisUTEX1435に由来するゲノムDNAのcDNA、Illumiaトランスクリプトーム及びRoche454シーケンシングに基づくバイオインフォマティクスベースのアプローチを用いたゲノムスクリーンの一部として、脂肪酸不飽和化に関わる2つの特定の遺伝子群を同定した:ステアロイルACPデサチュラーゼSAD及びデルタ12脂肪酸デサチュラーゼΔ12FAD。ステアロイルACPデサチュラーゼ酵素は脂質合成経路の一部であり、脂肪酸アシル鎖に二重結合を導入する働きをし、例えば、C18:0脂肪酸からC18:1脂肪酸を合成する。デルタ12脂肪酸デサチュラーゼもまた脂質合成経路の一部であり、既に不飽和の脂肪酸に二重結合を導入する働きをし、例えば、C18:1脂肪酸からC18:2脂肪酸を合成する。バイオインフォマティクスを試みる間に同定されたこれらの2つの脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子クラスに基づくプローブを使用したサザンブロット分析から、デサチュラーゼ遺伝子の各クラスが複数のファミリーメンバーから構成されている可能性が高いことが示された。さらに、ステアロイルACPデサチュラーゼをコードする遺伝子は、2つの別個のファミリーに分類された。これらの結果に基づき、デサチュラーゼ酵素の各ファミリー内でより高度に保存されたコード領域を標的とすることにより複数の遺伝子ファミリーメンバーを破壊する3つの遺伝子破壊構築物を設計した。3つの相同組み換え標的構築物は、以下を用いて設計した:1デルタ12脂肪酸デサチュラーゼd12FADファミリーメンバーのコード配列の高度に保存された部分及び22つの別個のSADファミリーの各々を標的化する2つの構築物、各々が各ファミリーからのコード配列の保存領域を有する。この戦略は、相同組み換えにより標的遺伝子のフランキング領域を標的とし得る古典的な遺伝子置換戦略ではなく、選択可能なマーカー遺伝子ショ糖を加水分解する能力を付与するS.cerevisiaeに由来するsuc2ショ糖インベルターゼカセットをこれらの高度に保存されたコード領域複数のファミリーメンバーを標的とするに埋め込むように設計される。全ての構築物は、上述の方法を用いた微粒子銃形質転換により細胞に導入し、構築物は線状化してから細胞に撃ち込んだ。形質転換体はショ糖含有プレート/培地で選択し、脂肪酸プロフィールの変化は上述の方法を用いて分析した。3つの標的構築物の各々からの関連する配列を以下に列挙する。構築物の各々による形質転換からの代表的な陽性クローンを取り出し、それらのクローンの脂肪酸プロフィールを決定して面積で表されている、以下の表15にまとめた。構築物の各々は、望ましい脂肪酸クラスに対して計測可能な影響を有し、3つのケース全てにおいて、特に2つのSADノックアウトで、C18:0濃度が著しく上昇した。SADノックアウトからの複数のクローンをさらに比較すると、SAD2Bノックアウト系統が、SAD2Aノックアウト系統で観察されるC18:1脂肪酸濃度と比べて、C18:1脂肪酸の著しく大きい低下を有したことが示された。上述の方法を用いてProtothecamoriformisUTEX1435の背景にさらなるΔ12脂肪酸デサチュラーゼFADノックアウトを生じさせた。Δ12FADの潜在的な相同性を同定するため、以下のプライマーを使用して、推定FADをコードするゲノム領域を増幅した:プライマー15’-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3’配列番号74プライマー25’-GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3’配列番号75上記プライマーを用いたProtothecamoriformisゲノムDNAのゲノム増幅から得られた配列は、高度な類似性を示したが、ProtothecamoriformisにΔ12FADの複数の遺伝子又は対立遺伝子が存在することが示された。この結果に基づき、1つ以上のΔ12FAD遺伝子を除去する2つの遺伝子破壊構築物を設計した。この戦略は、古典的な遺伝子置換戦略を用いるのではなく、ショ糖インベルターゼS.cerevisiaeに由来するsuc2カセットを高度に保存されたコード領域に埋め込み、ひいては選択可能なマーカーとしてショ糖を加水分解する能力を付与することであった。pSZ1124と命名された第1の構築物は、5’及び3’ゲノム標的配列を含み、それに、S.cerevisiaesuc2遺伝子の発現を駆動するC.reinhardtiiβ-チューブリンプロモーターと、Chlorellavulgaris硝酸還元酵素3’UTRとが隣接したS.cerevisiaesuc2カセット。pSZ1125と命名された第2の構築物は、5’及び3’ゲノム標的配列を含み、それに、S.cerevisiaesuc2遺伝子の発現を駆動するC.reinhardtiiβ-チューブリンプロモーターと、Chlorellavulgaris硝酸還元酵素3’UTRとが隣接した。構築物の関連する配列は、配列表に列挙する:pSZ1124及びpSZ1125を、それぞれProtothecamoriformisの背景に導入し、ショ糖を加水分解する能力に基づき陽性クローンを選択した。表16は、pSZ1124及びpSZ1125を標的とするベクターを利用した2つのトランスジェニック系で得られた脂肪酸プロフィール面積、上述の方法を用いて作成をまとめている。FAD2BpSZ1124構築物を含むトランスジェニックから、脂質プロフィールに極めて興味深い、且つ予想外の結果がもたらされ、すなわち低下することを予想し得たC18:2濃度が、約1面積しか低下しなかった。しかしながら、C18:1脂肪酸濃度は著しく増加し、ほぼ例外なくC16:0濃度がその代償となり、C16:0濃度は著しく低下した。FAD2CpSZ1125構築物を含むトランスジェニックからも、脂肪酸プロフィールの変化がもたらされた:C18:2の濃度が著しく低下し、これには対応するC18:1濃度の増加が伴う。B.Prototheca細胞においてデルタ12デサチュラーゼFADcを下方調節するRNAヘアピンアプローチヘアピンRNAによりFADcデルタ12デサチュラーゼ遺伝子の遺伝子発現を下方調節するベクターを、ProtothecamoriformisUTEX1435の遺伝的背景に導入した。唯一の炭素源としてショ糖で成長する能力を陽性クローンに付与するSaccharomycescerevisiaesuc2ショ糖インベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカーとして利用し、2つのタイプの構築物を使用した。第1のタイプの構築物は、FADcコード領域の第1エクソンがシスでその第1のイントロンに連結し、その後に逆方向の第1エクソンの反復単位が続く部分を利用した。このタイプの構築物は、mRNAとして発現したときにヘアピンを形成するように設計された。この第1のタイプの構築物を2つ作製し、1つはProtothecamoriformisAmt03プロモーター配列番号84により駆動されるもので、pSZ1468と命名され、2つ目は、Chlamydomomasreinhardtiiβ-チューブリンプロモーター配列番号89により駆動されるもので、pSZ1469と命名された。第2のタイプの構築物は、アンチセンス方向の大きいFADcエクソン2を利用し、ProtothecamoriformisAmt03プロモーター配列番号84により駆動されるかpSZ1470と命名された、又はChlamydomomasreinhardtiiβ-チューブリンプロモーターpromter配列番号89により駆動されたpSZ1471と命名された。4つの構築物はいずれも、S.cerevisiaesuc2ショ糖インベルターゼカセット配列番号78と、核ゲノムに組み込むための、6Sゲノム領域に対する5’配列番号100及び3’配列番号101相同組み換え標的配列構築物に隣接するとを有した。各ヘアピンRNA構築物のFADc部分の配列を、各構築物の関連する部分とともに、以下のとおり配列表に列挙する:4つの構築物のそれぞれを、Protothecamoriformisの背景に形質転換し、ショ糖を唯一の炭素源として含むプレートを使用して陽性クローンをスクリーニングした。各形質転換から陽性クローンを取り出し、一部を選択して、脂肪酸プロフィールに対するpSZ1468、pSZ1469、pSZ1470及びpSZ1471に含まれたヘアピン及びアンチセンスカセットの影響を決定した。各形質転換から選択されたクローンを脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化法を用いて脂肪酸プロフィールを決定した。形質転換のそれぞれからの代表的な脂肪酸プロフィールを、以下の表17にまとめている。野生型1及び2細胞は、陰性対照として形質転換体のそれぞれと共に実行した非形質転換Protothecamoriformis細胞であった。上記の結果は、ヘアピン構築物pSZ1468及びpSZ1469が予想された表現型:それぞれ野生型1及び野生型2と比較したときのC18:2脂肪酸濃度の低下及びC18:1脂肪酸濃度の増加を示したことを示している。アンチセンス構築物pSZ1470及びpSZ1471は、C18:2脂肪酸濃度の低下はもたらさず、それぞれ野生型1及び野生型2と比較したときには僅かな増加を示し、及びC16:0脂肪酸濃度の僅かな低下を示した。C.外来性ステアロイル-ACPデサチュラーゼの発現Oleaeuropaeaステアロイル-ACPデサチュラーゼGenBank寄託番号AAB67840.1を、ProtothecamoriformisUTEX1435の遺伝的背景に導入した。この発現構築物は、核ゲノムに組み込むための、6Sゲノム領域に対する5’配列番号100及び3’配列番号101相同組み換え標的配列構築物に隣接すると、C.reinhardtiiβ-チューブリンプロモーター/5’UTR及びChlorellavulgaris硝酸還元酵素3’UTRの制御下にあるS.cerevisiaesuc2ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このS.cerevisiaesuc2発現カセットは配列番号78として列挙され、選択マーカーとして機能した。Oleaeuropaeaステアロイル-ACPデサチュラーゼコード領域は、ProtothecamoriformisAmt03プロモーター/5’UTR配列番号84及びC.vulgaris硝酸還元酵素3’UTRの制御下にあり、天然トランジットペプチドがChlorellaprotothecoidesステアロイル-ACPデサチュラーゼトランジットペプチド配列番号86に置き換えられた。コドンが最適化されたcDNA配列及びアミノ酸配列置き換えられたトランジットペプチドを含むを、配列表にそれぞれ配列番号98及び配列番号99として列挙する。O.europaeaSAD発現カセットの全体をpSZ1377と命名し、Protothecamoriformisの遺伝的背景に形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化法を用いて脂肪酸プロフィールを決定した。選択されたクローンの脂肪酸プロフィールを、以下の表18にまとめている。上記の結果は、異種デサチュラーゼ、この場合、Oleaeuropaeaに由来するステアロイル-ACPデサチュラーゼを導入することにより、より高濃度のC18:1脂肪酸及びそれに伴うC18:0及びC16:0脂肪酸濃度の低下がもたらされ得ることを示している。実施例5:油産生酵母を育てることこの実施例及び続く実施例で使用した油産生酵母株は、DeutscheSammlungvonMikroorganismenunZellkulturenGmbHDSMZ、所在地Inhoffenstrabe7B、38124Braunschweig、ドイツ、又はCentraalbureauvoorSchimmelsculturesCBSFungalBiodiversityCentre、所在地P.O.Box85167,3508Utrecht、オランダのいずれかから入手した。185個の油産生酵母株を、成長率及び脂質生成についてスクリーニングした。YPD寒天以下に記載するようなYPD培地、2寒天添加プレートに単一コロニーを線状に塗ることにより、全ての株を純培養にした。各株のYPDプレートからの単一コロニーを取り出し、YPD培地10gバクト酵母エキス、20gバクトペプトン及び20gグルコース/蒸留水中1Lの最終容積中、ロータリーシェーカーにおいて200rpm、30°Cで後期対数期まで成長させた。脂質生産性を評価するため、50mLの風袋重量を測ったバイオリアクターチューブMidSci,Inc.に2mLのYPD培地を添加し、各株の凍結ストックから播種した。次いで、チューブを30°Cのインキュベーターに置き、200rpmで振とうしながら24時間成長させて、種培養物を生じさせた。24時間後、0.1Mフタル酸バッファー、pH5.0を含有する8mLのY1培地アミノ酸不含酵母窒素原基礎、Difcoを添加し、穏やかにピペッティングすることにより十分に混合した。得られた培養物を、第2の風袋重量を測ったバイオリアクターチューブに等分した。次いで、得られた2回分の各5mLの培養物を、200rpmでの撹拌を伴う30°Cのインキュベーターに5日間置いた。次いで、脂質生産性及び脂質プロフィール用に細胞を収穫した。3mLの培養物を使用して乾燥細胞重量及び総脂質含有量脂質生産性を決定し、1mLを使用して脂肪酸プロフィールを決定した。いずれの場合にも、培養物はチューブに入れ、3500rpmで10分間遠心分離処理することにより細胞をペレット状にした。上澄みをデカンテーションした後、各チューブに2mLの脱イオン水を加え、それを用いて得られた細胞ペレットを洗浄した。チューブを再び3500rpmで10分間回転させ、洗浄した細胞をペレット状にし、次いで、上澄みをデカンテーションし、細胞ペレットを-70°Cのフリーザーに30分間置いた。次いで、チューブを凍結乾燥器に一晩移して乾燥させた。翌日、円錐形チューブ3mL培養物から得られた乾燥バイオマスの重量を記録し、得られた細胞ペレットを、AnkomAcidHydrolysisシステムを使用して製造者の指示に従い全脂質抽出に供し、総脂質含有量を決定した。スクリーニングした185株のなかから、成長率及び脂質生産性に基づき30株を選択した。これらの30株の脂質生産性乾燥細胞重量のパーセント脂質として表されるを以下で表19にまとめている。1mL培養物から得られた細胞ペレットを直接的なトランスエステル化に供し、GCにより分析して脂肪酸プロフィールを決定した。上記の酵母株のうち17個の脂肪酸プロフィールの要約を、以下の表20にまとめている。さらなる油産生酵母株に対して脂肪酸プロフィール分析を行い、TorulasporadelbruekiiCBS2924を含むいくつかの株は、高い割合のC16:1脂肪酸を生成することが分かった。この油産生酵母株は、DCWの割合として約40脂質の脂質生産性、及びC12:00.36;C14:01.36;C15:00.16;C16:010.82;C16:142.9;C17:00.11;C18:02.1;C18:135.81;C18:24.62の脂肪酸プロフィールを有した。この株は、脂肪酸プロフィールの一部として特に高い割合のC16:1パルミトオレイン酸を有することが分かった。高い割合の16:1を生成するものとして、4つのさらなる株を同定した:YarrowialipolyticaCBS601210.10;YarrowialipolyticaCBS633114.80、YarrowialipolyticaCBS1014412.90及びYarrowialipolyticaCBS558914.20。実施例6:油産生酵母株の遺伝子型決定48個の異なる油産生酵母株の遺伝子型決定を行った。以下のような油産生酵母バイオマスの48個の異なる株の各々から、ゲノムDNAを単離した。液体培養物から、細胞約200mgを14,000×gで5分間遠心分離処理した。次いで、細胞を滅菌蒸留水に再び懸濁させ、14,000×gで5分間遠心分離処理し、上澄みを棄てた。このバイオマスに、直径約2mmの1個のガラスビーズを加え、この管を-80°Cで少なくとも15分間置いた。サンプルを取り出し、研磨バッファー1Sarkosyl、0.25Mショ糖、50mMNaCl、20mMEDTA、100mMTris-HCl、pH8.0、RNaseA0.5ug/ul150μlを加えた。ペレットを短時間ボルテックスすることによって再び懸濁させた後、5MNaCl40μlを加えた。サンプルを短時間ボルテックスした後、5CTAB臭化セチルトリメチルアンモニウム66μlを加え、最後に短時間ボルテックスした。次いで、サンプルを65°Cで10分間インキュベートした後、14,000×gで10分間遠心分離処理した。新しい管に上澄みを移し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール12:12:1300μlで1回抽出し、次いで、14,000×gで5分間遠心分離処理した。0.7体積部のイソプロパノール約190μlを含む新たな管に、得られた水相を移し、ひっくり返すことによって混合し、室温で30分間インキュベートするか、又は4°Cで一晩インキュベートした。14,000×gで10分間遠心分離処理することによってDNAを回収した。次いで、得られたペレットを70エタノールで2回洗浄した後、100エタノールで最後に洗浄した。ペレットを室温で20~30分風乾した後、10mMTrisCl、1mMEDTApH8.050μlで再び懸濁させた。上述のように調製した藻類の全DNA5μlを、10mMTris、pH8.0で1:50に希釈した。最終容積が20μlのPCR反応を以下のように設定した。2×iProofHFマスターミックスBIO-RAD10μlを、0.4μlのプライマーSZ5434順プライマー10mMストック濃度の5’-GTCCCTGCCCTTTGTACACAC-3’配列番号39及び0.4μlのプライマーSZ5435逆プライマー10mMストック濃度の5’-TTGATATGCTTAAGTTCAGCGGG-3’配列番号40に加えた。これらのプライマーは、18Sの3つのプライム領域と真菌26SrRNA遺伝子の5つのプライム領域との間の配列保存に基づき選択した。順プライマーはGenbank寄託番号AY550243のヌクレオチド1632~1652と同じであり、逆プライマーはGenbank寄託番号NC_001144のヌクレオチド464271~464293と同じである。次に、5μlの希釈した全DNA及び3.2μlのdH2Oを加えた。PCR反応を以下のように行った:98°C、45秒;98°C、8秒;53°C、12秒;72°C、20秒を35サイクル繰り返した後、72°Cで1分、25°Cで保持。PCR産物を精製するために、各反応物に10mMTris、pH8.020μlを加えた後、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール12:12:140μlで抽出し、ボルテックスし、14,000×gで5分間遠心分離処理した。PCR反応物をS-400カラムGEHealthcareに入れ、3,000×gで2分間遠心分離処理した。得られた精製後のPCR産物をクローン化し、ZeroBluntPCR4Blunt-TOPOベクターキットInvitrogenを製造者の指示に従い使用して、大腸菌E.coliに形質転換した。配列決定反応は、アンピシリン耐性コロニーで直接実行した。精製したプラスミドDNAについて、M13の順プライマー及び逆プライマーを用い、両方向で配列を決定した。次いで、精製したPCR産物を、PCR8/GW/TOPOへとTOPOクローン化し、LB/Specプレートで陽性クローンを選択した。精製したプラスミドDNAについて、M13順プライマー及び逆プライマーを用い、両方向で配列を決定した。遺伝子型を解析した48株の油産生酵母のリストは、対応する配列番号と共に、表21にある。実施例7:高油含有量を達成するRhodococcusopacusを育てること250mlバッフルフラスコ内において、4ショ糖を含有する50mlのMSM培地Schlegel,etal.,1961ArchMikrobiol38,209-22を参照に播種した2mlの凍結保存ストックを使用して、RhodococcusopacusPD630DSM44193、DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkuttwenGmbHの種培養物を産生した。この種培養物を、それが600nmで1.16の光学密度に達するまで、30°Cで、200rpmで撹拌しながら成長させた。2つの異なる窒素条件下:10mMNH4Cl及び18.7mMNH4Clそれぞれ2回ずつで脂質を生成させるため、10mlの種フラスコ培養物を使用して培養物を播種した。成長培養物を、30°C、200rpmで撹拌しながら6日間成長させた。10mMNH4Cl条件での細胞成長は、6日間の培養後、DCWで最高57.2の平均脂質に達した。18.7mMNH4Cl条件での細胞成長は、5日間の培養後、DCWで最高51.8の平均脂質に達した。Rhodococcusopacusバイオマスのサンプルを直接的なトランスエステル化に供し、脂肪酸プロフィールについてGC/FIDにより分析した。結果は以下であった:C14:02.33;C15:09.08;C16:024.56;C16:111.07;C17:010.50;2二重結合当量2DBEC17種19.90;C18:02.49;C18:117.41;C18:20.05;C19:00.75及び2DBEC19種1.87。実施例8:微生物からの油の抽出A.連続圧搾機及び圧縮助剤を用いた微細藻類からの油の抽出ドラム乾燥機を用い、DCWで38の油を含む微細藻類バイオマスを乾燥させ、得られた含水量は5~5.5であった。バイオマスをFrenchL250プレスに供給した。バイオマス30.4kg67lbsをプレスに供給したが、油は回収されなかった。同じ乾燥させた微生物バイオマスに、種々の割合のスイッチグラスを圧縮助剤として組み合わせ、プレスに供給した。乾燥微生物バイオマス及び20w/wスイッチグラスを組み合わせると、最も良好な油の総回収率が得られた。次いで、圧縮したケーキをヘキサンで抽出し、スイッチグラスが20の条件で、最終収率は、61.6の利用可能な油重量によって算出の総量であった。細胞乾燥重量の50を超える油を有するバイオマスは、油を抽出するために、スイッチグラスのような圧縮助剤を使う必要はなかった。連続圧搾機を用いた微細藻類からの油の他の抽出方法は、参照により本明細書に組み込まれるPCT出願番号第PCT/US2010/31108号に記載されている。B.連続圧搾機を用いた油産生酵母からの油の抽出酵母株RhodotorulaglutinisDSMZ-DSM70398を、DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbHGermanCollectionofMicroorganismandCellCulture,Inhoffenstrasse7B,38124Braunschweig、ドイツから入手した。凍結保存した細胞を解凍し、1×DASビタミン溶液1000×:9g/Lトリシン;0.67g/LチアミンHCl;0.01g/Ld-ビオチン;0.008シアノコバラミン;0.02パントテン酸カルシウム;及び0.04g/Lp-アミノ安息香酸を含有する50mLYPD培地上記に加え、30°Cで、200rpmで撹拌しながら18~24時間、ODの読みが5ODA600を超えるまで成長させた。次いで、培養物を7L発酵槽に移し、1×DASビタミン溶液を含有するYP1培地アミノ酸及び硫酸アンモニウム不含の8.5g/LDifco酵母窒素原基礎、3g/L硫酸アンモニウム、4g/L酵母エキスに切り換えた。培養物のサンプルを1日2回採取し、ODA600、乾燥細胞重量DCW及び脂質濃度についてアッセイした。培養物が50g/LDCW超に達したとき、培養物を収穫した。乾燥細胞重量を基準として、酵母バイオマスは約50の油を含んだ。2つの酵母バイオマスサンプルを直接的なトランスエステル化に供し、脂肪酸プロフィールについてGC/FIDにより分析した。結果は面積パーセントで表し、以下の表22に示す。収穫した酵母ブロスを、比較のため3つの異なる方法を用いて乾燥させた:1強制空気オーブン内において75°Cで一晩トレイ乾燥した;2濃縮なしにドラム乾燥機で乾燥させた;及び3酵母ブロスを固形分22まで濃縮し、次いでスラリーをドラム乾燥機で乾燥させた。3つの異なる乾燥条件のそれぞれからの材料を加熱調湿し、スクリュープレスに送り込んで油を抽出した。プレス温度は150°Fであり、調湿した乾燥酵母バイオマスは、プレスに送る準備ができるまで約190°Fに保持した。トレイ乾燥した酵母の含水量は1.45であり、次いで、この乾燥した酵母を90°Cのオーブン内で10分間調湿した。調湿後の含水量は0.9であった。次いで、調湿したトレイ乾燥材料を卓上Tabyスクリュープレス2.2Hpモータ及び70mmスクリュー直径を備えるTabyPressenType70オイルプレスに送り込み、油を抽出した。この材料からは多量の油は得られず、プレスで重厚な堆積物footingが観察された。濃縮なしにドラム乾燥した酵母ブロスの含水量は5.4であり、次いで、このドラム乾燥した酵母を90°Cのオーブン内で20分間調湿した。調湿後の含水量は1.4であった。次いで、調湿したドラム乾燥酵母を卓上Tabyスクリュープレスに送り込み、油を抽出した。この材料からは良好に油が得られ、堆積物は最小限であった。ドラム乾燥して濃縮した酵母ブロスの含水量は2.1であり、次いで、このドラム乾燥して濃縮した酵母を90°Cのオーブン内で20分間調湿した。調湿後の含水量は1.0であった。次いで、調湿したドラム乾燥濃縮酵母を卓上Tabyスクリュープレスに送り込み、油を抽出した。この材料からは良好に油が得られ、堆積物は最小限であった。C.乾燥及び油産生バクテリアからの油の抽出油産生菌種RhodococcusopacusPD630DSMZ-DSM44193を本明細書に提供される方法に従い培養し、DCWで約32の脂質を含む油産生バクテリアバイオマスを生成した。収穫したRhodococcusopacusブロスを遠心分離を用いて濃縮し、次いで、脱イオン水で洗浄し、1.8Lの脱イオン水中に懸濁させた。50グラムの精製セルロースPB20-Pre-co-Floc,EPMinerals,Nevadaを懸濁させたバイオマスに加え、脱イオン水で合計固形分を20に調整した。次いで、Rhodococcusバイオマスをドラム乾燥機で乾燥させ、ドラム乾燥後のRhodococcusの含水量は約3であった。次いで、ドラム乾燥した材料を、130°Cのオーブンで30分間加熱調湿すると、含水量が約1.2になった。次いで、加熱調湿したバイオマスを卓上Tabyプレススクリュープレスに送り込み、油を抽出した。プレス温度は209°Fであり、調湿した乾燥酵母バイオマスは、プレスに送る準備ができるまで約240°Fに保持した。油の回収には、重い堆積物が伴った。実施例9:抽出した油の処理;流動点を降下させるまとめ前述の例に従い調製される微生物油は、食品及び潤滑剤での使用向けにその特性を向上させるため、本明細書に記載される方法に従い処理することができる。上記の例に記載される微生物に加え、微細藻類Chlorellaprotothecoidesが、微生物油の優れた生成体である。Chlorellaの種及び株を培養して高油量を得て、そこから油を抽出する方法については、参照により本明細書に組み込まれるPCT公開番号第2008/151149号、第2010/120939号、及び第2010/138,620号を参照のこと。飽和画分の相対的な割合を低下させることにより、Chlorellaprotothecoidesから得られる油の流動点を低下させた。飽和画分は、商業的にはステアリン画分として知られるパルミチン酸及びステアリン酸トリグリセリドから主になっている。これは、油を画分化して油の飽和トリグリセリド濃度を低下させることにより達成した。これは、植物油業界で公知の脱ろうプロセスと同様の、結晶化又は乾式画分化により行った。まず、藻類油を、上述の方法により植物油業界で用いられるものと同様の方法もまた用いることができた精製、漂白及び脱臭し、RBD油を生成した。結晶核が形成されるまで、RBD油の温度を制御された方法で降下させた。次いで、油をその結晶化温度に数時間保持し、結晶の成長を促進した。次いで、結晶を濾過によって取り除くと、2つの画分が得られた:ステアリン画分の一部又はほとんどを含有する固相、及び主としてオレイン画分を含有する液相。液相を再び画分化に供して結晶化温度を下げ、ステアリンのさらなる除去を生じさせた。得られる精製された液体画分は、植物油業界で一般的に知られるようなスーパーオレインと同等のものであり、天然藻類の油と比べて良好な熱特性を有する。材料及び方法材料藻類油精製、漂白、及び脱臭されたものが、Solazyme,IncSouthSanFrancisco、CAによって生成された。表23は、本研究に使用した油の特性をまとめている。約50w/wの菜種油担体を含有するポリアルキルメタクリレート共重合体ベースの流動点降下剤PPDVISCOPLEX登録商標10-310及び精製ミネラル油担体を含有するVISCOPLEX登録商標1-133は、RohmMaxEvonikHorsham、PAにより供給された。方法A.乾式画分化:結晶化約2.5kgの藻類油を、生成物を加熱及び冷却するように働く温度制御式循環水浴に接続された、3Lジャケット付き容器に入れたCrystallizationDegumming、Charleroi、ベルギー。リアクターには変速撹拌機を装着した。冷却は、油の温度及びリアクターの二重壁の間を循環する水の温度をモニタリングすることにより制御した。冷却終了時に、リアクターから結晶懸濁液の液滴サンプルを棒で取り、カバーグラスに載せて結晶形成を観察した。サンプルは、結晶が期せずして溶解する前に、直ちに顕微鏡下に分析した。全体的な冷却パターンは図1に示される。撹拌機速度は、第1段階の間30rpm、及び冷却プログラムの終わりまで15rpmであった。B.乾式画分化:濾過結晶化が終わると、1L膜加圧フィルターChoquenetSA、Chauny、フランスを使用して結晶懸濁液を濾過した。濾過は、最終冷却温度に保たれたチャンバ内で実行した。濾過時間は20分間であり、濾過供給圧力は4bargであった。分離工程が終わると、ステアリン画分及びオレイン画分を秤量し、画分収率を計算し、各画分のサンプルをさらなる分析のために取っておいた。藻類スーパーオレイン1は、第1の画分化からのオレインを処理し、図2に示される冷却プログラムの後、上述の結晶化及び濾過プロセスを繰り返すことにより生成した。藻類スーパーオレイン2及び3は、脱臭油の第1の画分化、及び図2に示されるものと同様の冷却プログラムを用いて結晶化及び濾過プロセスを繰り返すことにより生成した。C.流動点PP流動点降下剤0.5及び1.0グラムをフラスコに秤量した。各フラスコに、藻類油、オレイン及びスーパーオレイン画分100gを加えた。混合物を十分に混合した。D97ASTMTheAmericanSocietyforTestingandMaterialsの標準方法に従い、各サンプルを試験した。サンプルを試験管に流し込み、温度を48.0°Cに設定した水浴中、撹拌なしに加熱し、サンプルは、それが46.0°Cに達するまで加熱した。加熱後、サンプルを25.0°Cに冷却水浴中した。次いで、サンプルをメタノール浴中の金属製シリンダーに入れた。メタノール浴の温度は、サンプルの温度が10.0°Cに達するまで、-1.0°C~-2.0°Cに設定した。次いで、サンプルの温度が-7.0°Cに達するまで、メタノール浴の温度を-17.0°Cに下げた。サンプルの温度が予想流動点を約11.0°C上回るとき、3.0°C下がる毎にメタノール浴からサンプルを取り出し、流動能力を確認した。サンプルの流動点は、メタノール浴から取り出したときに試験管内のサンプルが流動しなくなったときの温度として決定した。記録する温度には3.0°Cを加え、サンプルの実際の流動点の値を提供した。各工程で生成される油の特性は、本明細書に記載される方法において、流動点をさらに低下させる化学的な流動点降下剤を添加することにより、さらに改善することができた。この例に用いた流動点降下剤は、いずれもEvonikにより生産されるVISCOPLEX登録商標10-310及び1-133であったが、任意の標準的な流動点降下剤を使用しても同様の結果を得ることができた。結果を、以下の表24、及び図3に示す。実施例10:操作された微細藻類から生成される油の流動点ProthecamoriformisUTEX1435を、実施例2の方法を用いて、以下の表25のプラスミド構築物のうちの1つで形質転換した。構築物の各々は、核ゲノムに組み込むための領域と、C.reinhardtiiβ-チューブリンプロモーター/5’UTR及びChlorellavulgaris硝酸還元酵素3’UTRの制御下にあるS.cerevisiaesuc2ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このS.cerevisiaesuc2発現カセットは配列番号78として列挙され、選択マーカーとして機能した。核ゲノムの組み込みに使用した標的領域の関連する配列を以下に示す。ショ糖を選択可能なマーカーに加え、4つの構築物のうちの3つはまた、タンパク質又はRNAのいずれかを発現させるための別のさらなる配列を含んだ。表26は、示される構築物のDNA配列によりコードされる重要な酵素又はヘアピンRNAカセットを列挙している。全てのタンパク質コード領域は、ProtothecamoriformisUTEX1435表2を参照の核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。使用した構築物についてのアミノ酸配列及びcDNA配列の両方を、配列表に列挙する。CarthamustinctoriusACPチオエステラーゼ構築物3のCtOTE及びCupheawrightiiFatB2チオエステラーゼ構築物4のCwTE2の双方のコード領域とも、ProtothecamoriformisAmt03プロモーター/5’UTR配列番号84及びC.vulgaris硝酸還元酵素3’UTR配列番号85の制御下にあった。C.tinctoriusACPチオエステラーゼの天然トランジットペプチドは、Chlorellaprotothecoidesステアロイル-ACPデサチュラーゼトランジットペプチド配列番号86に置き換えた。C.tinctoriusACPチオエステラーゼのコドンが最適化されたcDNA配列及びアミノ酸配列置き換えたトランジットペプチドを含むを、配列表にそれぞれ配列番号106及び配列番号104として列挙する。CupheawrightiiFatB2チオエステラーゼのコドンが最適化されたcDNA配列及びアミノ酸配列を、配列表にそれぞれ配列番号107及び配列番号105として列挙する。FADcヘアピンRNAを含む構築物1については、実施例4に記載される。各構築物をProtothecamoriformisの遺伝的背景に形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させた。野生型UTEX1435はグルコースを使用して成長させ、一方、他のトランスジェニック系は全て、ショ糖で育てた。各構築物について、形質転換体を成長させ、油を単離した。単離した油を脂肪酸プロフィールについて分析し、本明細書に記載されるように流動点を決定した。流動点は、流動点評価に関するASTMD97標準試験方法を用いて決定した。トランスジェニック株についての油の脂肪酸プロフィール及び流動点を、以下の表27に示す。表27は、遺伝子操作された微細藻類によって生成された油の流動点の首尾よく行われた操作についてのデータを開示する。構築物3で形質転換した油の流動点は、-10.5°Cから-19.5°Cに低下した。実施例11:改変された脂肪酸プロフィールを有する操作された微細藻類上述のように、Prototheca種の特定の内在する脂質経路酵素をノックアウト又はノックダウンする異種遺伝子の組み込みにより、脂肪酸プロフィールを変えることができる。内在する脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼは、脂質合成中におけるアシルキャリアータンパク質からの脂肪酸の切断を触媒するため、宿主生物の脂質プロフィールを構築する際に重要な脂質経路酵素である。内在する脂肪酸アシル-ACPチオエステラーゼ遺伝子FATA1をノックアウト又はノックダウンする結果として、宿主細胞の脂質プロフィールが影響を受け得るかどうかを評価するため、プラスミド構築物を作製した。A.内在するProtothecamoriformisチオエステラーゼ遺伝子をノックアウトすることによる脂肪酸プロフィールの改変ProthecamoriformisUTEX1435、S1920の古典的に変異を誘発した誘導体を、実施例2の方法を用いて、以下の表28のプラスミド構築物のうちの1つで形質転換した。各構築物は、内在するFATA1遺伝子を分断するように核ゲノムに組み込むための領域と、C.reinhardtiiβ-チューブリンプロモーター/5’UTR及びChlorellavulgaris硝酸還元酵素3’UTRの制御下にあるS.cerevisiaesuc2ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このS.cerevisiaesuc2発現カセットは配列番号78として列挙され、選択マーカーとして機能した。全てのタンパク質コード領域は、ProtothecamoriformisUTEX1435表2を参照の核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。核ゲノムの組み込みに使用したFATA1遺伝子の標的領域の関連する配列を、以下に示す。構築物FATA1-CrbTub_yInv_nr-FATA1における関連する制限部位は、以下の配列中、小文字、太字及び下線で示し、5’-3’にそれぞれBspQ1、KpnI、AscI、MfeI、SacI、BspQIである。BspQI部位が形質転換DNAの5’末端及び3’末端を区切る。太字で小文字の配列は、FATA1遺伝子座での相同組み換えによる標的化した組み込みを可能にするS1920に由来するゲノムDNAを表す。5’から3’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子ショ糖を代謝するS1920の能力を付与するの発現を駆動するC.reinhardtiiβ-チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターATG及びターミネーターTGAを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Chlorellavulgaris硝酸還元酵素3’UTRを小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるS190FATA1ゲノム領域が続く。CupheawrightiiACP-チオエステラーゼ2CwFatB2遺伝子寄託番号U56104をS1920のFATA1遺伝子座に導入するため、ProtothecamoriformisAmt03プロモーター/5’UTR配列番号84及びC.vulgaris硝酸還元酵素3’UTR配列番号85の制御下でCwFatB2遺伝子のタンパク質コード領域を発現する構築物を作成した。S1920で発現させた構築物は、FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1と書くことができる。構築物FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1における関連する制限部位は、以下の配列中、小文字、太字且つ下線で示され、5’-3’にそれぞれBspQ1、KpnI、AscI、MfeI、BamHI、EcoRI、SpeI、AscI、PacI、SacI、BspQIである。BspQI部位が形質転換DNAの5’末端及び3’末端を区切る。太字で小文字の配列は、FATA1遺伝子座での相同組み換えによる標的化した組み込みを可能にするS1920に由来するゲノムDNAを表す。5’から3’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子ショ糖を代謝するS1920の能力を付与するの発現を駆動するC.reinhardtiiβ-チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターATG及びターミネーターTGAを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Chlorellavulgaris硝酸還元酵素3’UTRを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるProtothecamoriformisの内在するamt03プロモーターが続く。C.wrightiiACP-チオエステラーゼのイニシエーターATG及びターミネーターTGAコドンを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのACP-チオエステラーゼコード領域を太字のイタリックにより示す。C.vulgaris硝酸還元酵素3’UTRはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるS1920FATA1ゲノム領域が続く。CupheawrightiiFatB2チオエステラーゼのコドンが最適化されたcDNA配列及びアミノ酸配列を、配列表にそれぞれ配列番号107及び配列番号105として列挙する。FATA1-CrbTub_yInv_nr-FATA1をS1920に形質転換した後、一次形質転換体をクローン精製し、実施例1に開示される条件と同様のpH5.0の標準的な脂質生成条件下で成長させた。標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー炎イオン化FAMEGC/FID検出方法を用いて、脂肪酸プロフィールを分析した。以下の表29は、いくつかの形質転換体の脂肪酸プロフィールを提供する。これらの結果は、宿主の内在するFATA1対立遺伝子を除去することにより、操作された微細藻類の脂質プロフィールが変わることを示している。選択可能なマーカーを内在するFATA1対立遺伝子に標的化させる影響は、C16:0脂肪酸産生の明らかな減少と、それに伴うC18:1脂肪酸産生の増加である。FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1をS1920に形質転換した後、一次形質転換体をクローン精製し、40g/Lの総濃度となるように提供される種々の炭素源で、標準的な脂質生成条件下にpH7.0で成長させた。ショ糖濃度は40g/Lであった。グルコースのみを炭素源として使用した場合、グルコースは40g/Lで提供した。グルコース及びフルクトースを炭素源として使用した場合、グルコースは20g/Lで提供し、及びフルクトースは20g/Lで提供した。脂肪酸プロフィールをGC-FIDにより評価した。得られた脂肪酸プロフィールを表30に列挙する。選択可能なマーカーが単独で宿主のFATA1対立遺伝子を標的化することと一致して、選択可能なマーカーを外来性チオエステラーゼと共に組み込むと、操作された微細藻類の脂質プロフィールが変化する。上記のように、外来遺伝子をFATA1対立遺伝子に標的化させると、C16:0脂肪酸産生の明らかな減少が生じる。FATA1遺伝子座におけるCwTE2チオエステラーゼのさらなる発現はまた、中鎖脂肪酸及びC18:1脂肪酸産生にも影響を与え、影響の程度は、分析される形質転換体に存在する外来性チオエステラーゼ活性のレベルに依存する。FATA1-CrbTub_yInv_nr::amt03_CwTE2_nr-FATA1のような構築物中でC.vulgaris硝酸還元酵素3’UTRのように反復単位が隣接する遺伝子は、宿主ゲノムに組み込むと、増幅することができる。標的組み込み部位で増幅されるトランス遺伝子の複製物の数とチオエステラーゼ濃度との間には、脂肪酸プロフィール又はウエスタンブロッティングにより評価されるときの組み換えタンパク質蓄積のいずれに対する影響によっても明らかなように、良好な一致がある。CwTE2遺伝子が増幅を起こしたトランスジェニック系は、中鎖C10:0~C14:0脂肪酸の著しい増加及び同時に起こるC18:1脂肪酸の減少を示す。対照的に、CwTE2が増幅をほとんど又は全く起こさなかった形質転換体おそらく1~2個の複製物は、外来性チオエステラーゼのより低い発現と一致し、中鎖脂肪酸の僅かな増加及びC18:1脂肪酸の増加に対するはるかに大きい影響をもたらす。まとめて、これらのデータは、宿主の内在するFATA1対立遺伝子を除去すると、操作された微細藻類の脂質プロフィールが変化することを示している。B.内在するProtothecamoriformisチオエステラーゼ遺伝子をノックダウンすることによる脂質プロフィールの改変ヘアピンRNAによりProtothecamoriformisFATA1遺伝子の発現を下方調節する構築物pSZ1773を、ProtothecamoriformisUTEX1435S1920の遺伝的背景に導入した。Saccharomycescerevisiaesuc2ショ糖インベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカーとして利用し、唯一の炭素源としてショ糖で成長する能力を付与した。ヘアピンRNAをコードする構築物部分には、FatA1コード領域の第1エクソンと、それに続く内在するイントロン、及び逆方向の第1エクソンの反復単位を利用した。ヘアピン構築物を核ゲノムに組み込むため、それぞれ配列番号100及び101として列挙される6Sゲノム領域に対する5’及び3’相同組み換え標的配列構築物に隣接するが含まれた。この構築物は、6S::β-Tub:suc2:nr::β-tub:ヘアピンFatA:nr::6Sと命名される。6S::β-Tub:suc2:nr::β-tub:ヘアピンFatA:nr::6Sにおける関連する制限部位は、以下の配列中、小文字、太字且つ下線で示され、5’-3’にそれぞれBspQ1、KpnI、MfeI、BamHI、EcoRI、SpeI、XhoI、SacI、BspQIである。BspQI部位が形質転換DNAの5’末端及び3’末端を区切る。太字で小文字の配列は、6S遺伝子座での相同組み換えによる標的化した組み込みを可能にするS1920由来のゲノムDNAを表す。5’から3’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子ショ糖を代謝するS1920の能力を付与するの発現を駆動するC.reinhardtiiβ-チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターATG及びターミネーターTGAを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Chlorellavulgaris硝酸還元酵素3’UTRを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるヘアピンFatA1の発現を駆動する第2のC.reinhardtiiβ-チューブリンプロモーターが続く。FatA1のイニシエーターATGコドンは、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、FatA1コード領域の残りの第1エクソンは大文字により示す。FatA遺伝子のイントロンは下線の大文字として示し、及び下線の大文字、太字のイタリックで示されるリンカー領域をFatA1イントロン/逆向きの第1エクソンジャンクションに作製して、これらのベクターにおけるRNAスプライシングを促進した。FatA1の逆の第1エクソンは大文字により示す。C.vulgaris硝酸還元酵素3’UTRはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示されるS19206Sゲノム領域が続く。このRNAi構築物のFATA部分の配列は、配列番号110として列挙される。6S::β-Tub:suc2:nr::β-tub:ヘアピンFatA:nr::6Sの発現は、標的FatA遺伝子をサイレンシングするヘアピンRNAの形成をもたらす。S1920へのその形質転換後、一次形質転換体をクローン精製し、pH5.0の標準的な脂質生成条件下で成長させた。代表的な形質転換体クローンから得られたプロフィールを、表31に列挙する。上記の結果は、FATAヘアピン構築物から、予想された表現型:野生型の非形質転換対照と比較したときのC16脂肪酸濃度の低下及びC18:1脂肪酸濃度の増加が得られたことを示している。本発明を、特定の実施形態と関連させて記載してきたが、さらなる改変ができることは理解されるであろう。本明細書は、本発明の原理に一般的に従い、本発明のいかなる変更、応用又は適応をも包含することを意図しており、それらは、本発明が属する技術分野の範囲内にある知られているあるいは慣例の実践範囲内で行われ、また本明細書に記載する本質的な特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む。本明細書に引用されている全ての参考文献は、特許、特許明細書、刊行物を含め、GenBank寄託番号も含め、その内容がすでに具体的に組み込まれているか否かにかかわらず、その全体が本明細書によって参照により組み込まれる。本明細書で述べられている刊行物は、本発明と組み合わせて使用することが可能な試薬、方法及び概念を記載し、開示する目的で引用されている。本明細書におけるいかなる記載も、これらの引用文献が本明細書に記載した本発明との関連で従来技術であることを認めたものと解釈されるべきではない。特に、以下の特許明細書は、あらゆる目的のために、その内容全体が本明細書によって参照により組み込まれる:PCT出願番号第2009年11月30日に出願したPCT出願番号第PCT/US2009/066142号、名称ProductionofTailoredOilsinHeterotrophicMicroorganisms;2009年11月30日に出願したPCT出願番号第PCT/US2009/066141号、名称ProductionofTailoredOilsinHeterotrophicMicroorganisms;及び2010年4月14日に出願したPCT出願番号第PCT/US2010/31108号、名称MethodsofMicrobialOilExtractionandSeparation。配列表"