"配列表配列番号11で示されるアミノ酸配列に、78.5以上の同一性を示すアヤメ科植物の2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素。配列表配列番号1、9または12のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有する請求項1に記載の2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素。請求項1または2に記載の2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド。配列表配列番号2、10または13のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなる請求項3に記載のポリヌクレオチド。配列表配列番号2、10または13のいずれかで示されるヌクレオチド配列に対して80以上の同一性を有し、且つ2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードするポリヌクレオチド。アヤメ科植物からクローニングされた請求項4または5に記載のポリヌクレオチド。アヤメ科植物がジャーマンアイリス、キショウブまたはイチハツである請求項6に記載のポリヌクレオチド。請求項3~7のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたベクター。宿主細胞中で、請求項3~7のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを発現しうる発現系を含む組換え体DNAまたはRNA。請求項8に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。宿主細胞が酵母である請求項10に記載の形質転換された宿主細胞。請求項3~7のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたトランスジェニック植物。植物がシロイヌナズナである請求項12に記載のトランスジェニック植物。アヤメ科植物由来の2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる方法。さらに、2-ヒドロキシイソフラバノン脱水酵素をコードする遺伝子を組み合わせて導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる請求項14に記載の方法。形質転換体が酵母を宿主細胞とする形質転換体であり、トランスジェニック植物がシロイヌナズナを宿主植物とするトランスジェニック植物である請求項14または15に記載の方法。アヤメ科植物がジャーマンアイリス、キショウブまたはイチハツである請求項14~16のいずれかに記載の方法。アヤメ科植物由来の2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素が配列表配列番号11で示されるアミノ酸配列に、78.5以上の同一性を示す2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素である請求項14~17のいずれかに記載の方法。アヤメ科植物由来の2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素が配列表配列番号1、9または12のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有する2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素である請求項14~18のいずれかに記載の方法。アヤメ科植物由来の2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードする遺伝子が、配列表配列番号1、9または12のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである請求項14~19のいずれかに記載の方法。アヤメ科植物由来の2-ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードする遺伝子が、配列表配列番号2、10または13のいずれかで示されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである請求項14~18のいずれかに記載の方法。請求項14~21のいずれかに記載の方法により生産されたイソフラボノイド。本発明は、マメ科以外の植物のIFSを単離し、IFSをコードする遺伝子を同定することを課題とする。さらに、該IFSやIFSをコードする遺伝子を用い、イソフラボノイドを生産することを課題とする。本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、Ig、IpまたはIt等の複数のアヤメ科植物からIFSを単離し、これらのIFSをコードする遺伝子を同定することで、本発明を完成するに至った。本発明で同定された遺伝子は、マメ科のダイズやカンゾウ由来のIFSをコードする遺伝子と30程度の同一性しか示さない、新規の特徴を有するものであった。アヤメ科植物の中でも、Ig由来のIFS以下、IgIFSと示すは、酵母やシロイヌナズナを用いてその遺伝子を発現させたところ、マメ科植物由来のIFSを用いた場合と比較してイソフラボノイドの生産量が約100倍であることが確認された。このように、本発明において単離されたIFSは、高い酵素活性を有するものであり、イソフラボノイドの生産に有用なものであった。すなわち、本発明は、次の1~22で示されるIFS、該IFSやIFSをコードする遺伝子を用いるイソフラボノイドを生産させる方法等に関する。1配列表配列番号11で示されるアミノ酸配列に、78.5以上の同一性を示すアヤメ科植物のIFS。2配列表配列番号1、9または12のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有する上記1に記載のIFS。3上記1または2に記載のIFSをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド。4配列表配列番号2、10または13のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなる上記3に記載のポリヌクレオチド。5配列表配列番号2、10または13のいずれかで示されるヌクレオチド配列に対して80以上の同一性を有し、且つIFSをコードするポリヌクレオチド。6アヤメ科植物からクローニングされた上記4または5に記載のポリヌクレオチド。7アヤメ科植物がIg、IpまたはItである上記6に記載のポリヌクレオチド。8上記3~7のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたベクター。9宿主細胞中で、上記3~7のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを発現しうる発現系を含む組換え体DNAまたはRNA。10上記8に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。11宿主細胞が酵母である上記10に記載の形質転換された宿主細胞。12上記3~7のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたトランスジェニック植物。13植物がシロイヌナズナである上記12に記載のトランスジェニック植物。14アヤメ科植物由来のIFSをコードする遺伝子を導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる方法。15さらに、HIDをコードする遺伝子を組み合わせて導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる上記14に記載の方法。16形質転換体が酵母を宿主細胞とする形質転換体であり、トランスジェニック植物がシロイヌナズナを宿主植物とするトランスジェニック植物である上記14または15に記載の方法。17アヤメ科植物がIg、IpまたはItである上記14~16のいずれかに記載の方法。18アヤメ科植物由来のIFSが配列表配列番号11で示されるアミノ酸配列に、78.5以上の同一性を示すIFSである上記14~17のいずれかに記載の方法。19アヤメ科植物由来のIFSが配列表配列番号1、9または12のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有するIFSである上記14~18のいずれかに記載の方法。20アヤメ科植物由来のIFSをコードする遺伝子が、配列表配列番号1、9または12のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである上記14~19のいずれかに記載の方法。21アヤメ科植物由来のIFSをコードする遺伝子が、配列表配列番号2、10または13のいずれかで示されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである上記14~18のいずれかに記載の方法。22上記14~21のいずれかに記載の方法により生産されたイソフラボノイド。本発明のアヤメ科植物由来のIFSおよびIFSをコードする遺伝子を使用することにより、酵母、植物細胞や植物体等を用いてイソフラボノイドを高濃度に生産する技術の確立が可能となる。イソフラボノイドのうち、イソフラボンは特に女性ホルモンであるエストロゲン様の作用を有する。従って、本発明によって、高濃度に生産されたイソフラボノイドは、健康食品や化粧品等、様々な用途に利用され得る。本発明のIFSには、配列表配列番号11で示されるアミノ酸配列に、78.5、より好ましくは80、さらに好ましくは85以上の同一性を示すアヤメ科植物のIFSであればいずれのIFSも含まれる。由来となるアヤメ科植物としては、アヤメ科の植物であればいずれであっても良く、例えば、Ig、IpまたはIt等が挙げられる。このような本発明のIFSとして、例えば配列表配列番号1で示されるアミノ酸配列を実質的に有するIgIFS、配列表配列番号9で示されるアミノ酸配列を実質的に有するIpIFS、または配列表配列番号12で示されるアミノ酸配列を実質的に有するItIFS等が挙げられる。ここで、アミノ酸配列を実質的に有するとは、IFS活性を有する限り、当該アミノ酸配列に欠失、置換、付加、挿入等の変異があるものも含むことを意味する。欠失、置換、付加、挿入されるアミノ酸の数は、例えば、1~100個、好ましくは1~50個、より好ましくは1~10個、特に1~5個であり得る。特に、アミノ酸残基を同様の特性のアミノ酸残基で置換したものであり、典型的なかかる置換は、Ala、Val、LeuおよびIle間、SerおよびThr間、AspおよびGlu間、AsnおよびGln間、LysおよびArg間、PheおよびTyr間の置換である。また、これらのIFSをコードするポリヌクレオチドとして、例えば、配列表配列番号11で示されるアミノ酸配列に78.5、より好ましくは80、さらに好ましくは85以上の同一性を示すアヤメ科植物のIFSをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド等が挙げられる。ここで、ヌクレオチド配列を実質的に有するとは、IFSをコードする配列からなるポリヌクレオチドのほか、該配列と縮重による配列の相違、5末端あるいは3末端又はその両末端に適当な配列が付加されたポリヌクレオチド等も含む意味である。このようなポリヌクレオチドとして、例えば、配列表配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド、配列表配列番号9で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド、または配列表配列番号12で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド等が挙げられる。また、配列表配列番号1、9または13のいずれかで示されるヌクレオチド配列に対して80、より好ましくは85、さらに好ましくは90以上の同一性を有し、且つIFSをコードするポリヌクレオチド等が挙げられる。本発明のベクターとは、大腸菌、酵母等の宿主細胞や、植物に導入することで、発現させたい遺伝子を発現させるためのものを指す。本発明において発現させたい遺伝子としては、上記の配列表配列番号11で示されるアミノ酸配列に78.5、より好ましくは80、さらに好ましくは85以上の同一性を示すアヤメ科植物のIFSをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド等が挙げられる。本発明においてこれらの遺伝子を発現させるベクターとして、従来知られているいずれのベクターも用いることができるが、例えば、酵母発現ベクターであるpYES-DEST52invitrogen社やpESC-LeuStratagene社等を用いることができる。このような発現させたい遺伝子を組み込んだベクターは、酵母や大腸菌等を宿主として導入することができる。これらの宿主は該ベクターによって形質転換できるものであれば何を宿主としても良く、例えば、酵母や大腸菌等を宿主とすることができる。トランスジェニック植物も同様であり、宿主とする植物として例えば、シロイヌナズナ等を挙げることができる。本発明のイソフラボノイドを生産させる方法は、イソフラボノイドの生産にあたり、アヤメ科植物由来のIFSをコードする遺伝子を導入した形質転換体やトランスジェニック植物を用い、これらにイソフラボノイドを生産させる方法であれば良い。さらに、アヤメ科植物由来のIFSをコードする遺伝子の導入に合わせ、HIDをコードする遺伝子を組み合わせて導入した形質転換体またはトランスジェニック植物を用いて、これらにイソフラボノイドを生産させる方法であっても良い。本発明における組換え体DNAまたはRNAとは、これらの形質転換体やトランスジェニック植物におけるDNAまたはRNAのことを指す。これらの組換え体DNAまたはRNAは、酵母や植物において、IFSやHID等の遺伝子を発現させインビトロでフラバノン基質をイソフラボノイドへ変換したり、インビボでイソフラボノイドを生産したりするのに用いることができる。ここで生産されるイソフラボノイドとしては、2-ヒドロキシイソフラバノン、イソフラボン等が挙げられる。本発明において導入する遺伝子は、アヤメ科植物由来のIFSをコードする遺伝子であれば上記のような遺伝子を導入することができ、組み合わせて導入する2-ヒドロキシイソフラバノン脱水酵素をコードする遺伝子のHIDの由来は特に問わない。例えばマメ科のダイズやカンゾウ由来であっても良く、アヤメ科のIg、IpまたはIt由来であっても良い。以下に、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。試料1植物材料スクロース30g/l,プロリン250mg/l,トリプトンペプトン200mg/l,α-ナフタレン酢酸1mg/l,ベンジルアデニン0.5mg/lを含むMS培地で暗所,25°Cで培養したIgの不定根カルチャーを用いた参考文献1。寒天9g/lを含む上記培地で3週間不定根を培養後、寒天を含まない液体培地に不定根を移した。通常のアッセイでは、液体培地で培養後5日目の細胞を回収して,酵素アッセイに用いた。また液体培地に植え次ぎ後経時的1日,3日,5日,10日,20日,30日に不定根を回収し-80°Cで保存し、イソフラボノイド合成酵素活性IFS活性の経時変化の解析とRT-PCRに用いた。10スクロースと14mM2-メルカプトエタノールを含む100mMリン酸カリウムバッファーpH7.5中で不定根を破砕し,ガーゼで濾過した。濾過されたホモジネートを遠心分離10,000g,10分間した後、超遠心分離160,000g,90分間でミクロソームを得た。最終的な沈殿物を上記バッファーで懸濁し、Ig抽出液とした1.0mg/mlミクロソームタンパク質。このIg抽出液1mlを1mMNADPH存在下でナリンゲニン10μgと30°Cで60分インキュベートしてイソフラボノイド合成活性IFS活性を調べ、結果を図1に示した。また超遠心分離後の上清に2-ヒドロキシイソフラバノン10μgを加え、30°Cで60分インキュベートしてイソフラボン合成活性HID活性を調べ、結果を図1に示した。参考文献1:Akashi,T.,M.Ishizaki,etal.2005.Isoflavonoidproductionbyadventitious-rootculturesofIrisgermanicaIridaceae.PlantBiotechnology22:207-215.2cDNAライブラリーおよびスクリーニング上記と同様に液体培地で4日間培養したIgの不定根カルチャーから、StaraigtAsmRNAisolationsystemNovagen社を使用してmRNAを単離した。このmRNAからCloneMiner登録商標cDNALiblaryConstructionKitInvitrogen社によりdestinationvectorpDONR222を用いてcDNAライブラリー4×107primaryclonesを構築した。その後、Manufacturersprotocolinvitrogen社に従い、cDNAを酵母発現ベクターpYES-DEST52、invitrogen社のGAL1プロモーターの下にcDNAを組み換えた。P450はシトクロムP450還元酵素CPRと電子伝達系を構成し,P450が活性を示すためにはCPRが必要となることから、マメ科植物ミヤコグサLotusjaponicusから得たCPRcDNALjCPR、配列表配列番号3を酵母発現ベクターpESC-Leu,Stratagene社に組み込み,pESC-LjCPRベクターを作成した。これを酵母BJ2168株ニッポンジーン社,NipponGeneCo.,Ltd.に導入した後、この酵母にさらにpYES-DEST52に組み込んだIgのcDNAライブラリーを導入し、形質転換体を作製した。この形質転換体は、ロイシンとウラシルを含まないsyntheticcompleteSC培地YeastNitrogenbasew/oaminoacids6.7g/l、Difco社,グルコース20g/l、CSMDrop-out-Leu-Ura670mg/l,Formedium社、寒天プレート上で培養した。約500の形質転換体を寒天プレートから取り出し、組換えタンパク質を発現させるために、1mMのσ-aminolevulinicacidsSigma社を加えた10mlのYPG培地yeastextract10g/l,peptone20g/l、galactose20g/lが入ったコニカルチューブ50ml内に接種した。その一部を1つのプールとして、合計10個の独立したプールを得た。スクリーニングの第二段階のために、それぞれのプールから取り出した少量のカルチャーを上記と同様の寒天プレートの上においた。ナリンゲニン0.5mgを残ったプールにいれ、形質転換体を30°Cで24時間培養した。カルチャーを酢酸エチルで抽出し溶媒を溜去した。抽出物をエタノールに溶解し、HPLCによって解析した後、スクリーニングの次の段階のために10プールのうちポジティブなプールを小分けした約50clones/pool。ポジティブなプールのアッセイを繰り返し、イソフラボノイドを生産するクローンを単離した。イソフラボノイド2-ヒドロキシイソフラバノン及びイソフラボンの生産は次の条件でHPLCを行い確認した。最終的に、イソフラボノイドを生産する単一酵母コロニーをIgIFS/LjCPRを発現している形質転換体として同定した。この形質転換体からプラスミドを抽出して,IgIFSのアミノ酸配列配列表配列番号1を特定するとともに、IgIFSをコードする遺伝子cDNA配列表配列番号2を同定した。このスクリーニング方法の概要およびIgIFS/LjCPRを発現している形質転換体におけるイソフラボノイドの生産を図2に示した。HPLC条件:CAPCELLPAKC18MGcolumn4.6x150mm;Shiseido社、40°C、流量:0.8ml/min、30~80v/vのメタノール溶媒使用、25分間直線濃度勾配lineargradientelution3酵素活性の測定invitro上記によって得られた本発明の形質転換体と、コントロールとして、pESC-Leuストラタジーン社およびpYES2インビトロゲン社を酵母BJ2168株に導入して得た形質転換体を用いた。また、比較として、マメ科カンゾウのIFSCYP93C2、配列表配列番号4を組み込んだ発現ベクターpYES-CYP93C2を上記と同様に作成し参考文献2、CYP93C2/LjCPRを発現している形質転換体を得て、これを比較として用いた。参考文献2:Akashi,T.,T.Aoki,etal.1999.CloningandfunctionalexpressionofacytochromeP450cDNAencoding2-hydroxyisoflavanonesynthaseinvolvedinbiosynthesisoftheisoflavonoidskeletoninlicorice.PlantPhysiology1213:821-828.IgIFSまたはマメ科カンゾウのIFSCYP93C2の発現は、参考文献3に従って行った。即ち、酵母を10スクロースと14mM2-メルカプトエタノールを含む100mMリン酸カリウムバッファーpH7.5に懸濁し,ガラスビーズを用いて細胞を破砕した.酵母ホモジネートを遠心分離10,000g,10分間した後、超遠心分離160,000g,90分間でミクロソームを得た。最終的な沈殿物を上記バッファーで懸濁した1.0mg/mlミクロソームタンパク質。上記形質転換体のミクロソーム0.3mgミクロソームタンパク質を0.1mMRS-ナリンゲニンSigma社と1mMNADPH和光純薬工業とともに全容量1ml、30°Cで15分間インキュベートした。反応ミクスチャーのエタノール抽出物を上記と同じ条件でHPLCを行い解析した。HPLCによる溶出物eluteは、multiwavelengthdetectorMD-2010,JASCO社によってモニターした。その結果、図3,図4A.に示すようにIgIFSを発現している形質転換体酵母ミクロソームではナリンゲニンからイソフラボノイド2-ヒドロキシイソフラバノン図3、4A.:2HIとイソフラボン図3、4A.:Genisteinと共に少量の3-ヒドロキシナリンゲニン3-OHNaringenin、図3、4A.:3HFとフラボンアピゲニン図3,4A.:Apigeninを生成することが示された。従って,このタンパク質がイソフラボノイドの生成に関わっていることが確認された。また、比較として用いたマメ科カンゾウのIFSCYP93C2を発現している形質転換体酵母ミクロソームでは図3に示したように、2-ヒドロキシイソフラバノン図3:2HIを88、イソフラボン図3:Genisteinを5、と共に少量の3-ヒドロキシナリンゲニン図3:3HFを7生成することが示された。反応の立体選択性stereoselectivityを決定するために、30°Cで60分間インキュベートし、残った基質を、TLCKieselgelF254,Merck,Darmstadt,Germany;chroloform:methanol[98:2,v/v]から回収し、chiralcolumn参考文献4、ChiralcelOD-RHcolumn4.6x150mm;Daicel社、40°C、流量:0.4ml/min、30アセトニトリル溶媒使用において、上記と同じ条件でHPLCを行い解析した。その結果、図4B.に示すように,S-ナリンゲニンのみ減少し,この酵素はS-体のみを基質にすることが確認された.また、上記の反応ミクスチャーにRS-naringeninの代わりに表1に示した基質0.1mMをそれぞれ加え、基質特異性を調べた。その結果、表1に示すようにIgIFSは、カンゾウIFSCYP93C2と比べてナリンゲニン対する活性が最も高く,リクイリチゲニンに対する活性は低かった。さらに、様々な濃度のS-naringenin0.2,0,5,1.0,1.5,5.0,10,20および50μMとNADPH500μMを組換え酵母ミクロソームとともに全量4ml、30°Cで15分間インキュベートし、Km値およびVmax値をLineweaver-Burkplotにより調べ、結果を表2に示した。参考比較として、F3Hnaringenin,IFSlicoriceliquiritigeninまたはIFSsoybeannaringeninのKm,Kcat値を参考文献5~7より引用して示した。参考文献3:Ayabe,S.,T.Akashi,etal.2002.CloningofcDNAsencodingP450sintheflavonoid/isoflavonoidpathwayfromelicitedleguminouscellcultures.MethodsinEnzymology357:360-369.参考文献4:Shimada,N.,T.Aoki,etal.2003.Aclusterofgenesencodesthetwotypesofchalconeisomeraseinvolvedinthebiosynthesisofgeneralflavonoidsandlegume-specific5-deoxyisoflavonoidsinLotusjaponicus.PlantPhysiol.131:941-951参考文献5:Halbwirth,H.,Fischer,T.C.,Schlangen,K.,Rademacher,W.,Schleifer,K-J.Forkmann,G.andStich,K2006Screeningforinhibitorsof2-oxoglutarate-dependentdioxygenases:Flavanone3β-hydroxylaseandflavonolsynthasePlantscience171:194-205.参考文献6:Akashi,T.,Aoki,T.andAyabe,S.1999.CloningandfunctionalexpressionofacytochromeP450cDNAencoding2-hydroxyisoflavanonesynthaseinvolvedinbiosynthesisoftheisoflavonoidskeletoninlicorice.PlantPhysiology121:821-828.参考文献7:Kochs,G.andH.Grisebach1986.Enzymicsynthesisofisoflavones.Eur.J.Biochem.155:311-318.4生体内変換invivoinvivoで,IgIFSとマメ科カンゾウのIFSCYP93C2のイソフラボノイド生産能を比較した。即ち、上記で作成したIgIFS/LjCPRまたはCYP93C2/LjCPRを発現している形質転換体をそれぞれ用い、寒天を含まないSC培地5mlに接種し、28°Cで24時間おいた。その後、細胞を遠心分離3,000xg,5minによって分離し、この細胞を1mM-aminolevulinicacid、4mgRS-naringeninequivalentof0.75mMS-naringeninおよび0.5v/vTween80が添加された10mlYPG培地yeastextract10g/l,peptone20g/l、galactose20g/lOD600=0.5で24時間、48時間または72時間培養した。培地の一部1mlを採取し、酢酸エチルで抽出したものを、上記と同じ条件でHPLCを行い解析した。この結果を図5および表3に示した。図5および表3に示したように、72時間培養した場合に、IgIFSをコードする遺伝子を導入した組換え酵母細胞では、イソフラボノイド2HIgenisteinの生産量が550μmol/lであったのに対し、CYP93C2/LjCPRを発現している組換え酵母細胞ではわずかに5.5μmol/lであった。従って、この結果より、従来のマメ科由来のIFSを用いた場合と比較して、本発明のIgIFSを用いた場合では、イソフラボノイドの生産量が約100倍に向上することが示された。5系統解析PhylogeneticanalysisMEGA4softwarehttp://www.megasoftware.net/よりダウンロードを用いて系統解析を行った。IgIFSを含む植物P450のアミノ酸配列をClastalWhttp://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.htmlを用いて整列することでアライメントを調べ図6、neighbor-joiningmethod近隣結合法参考文献8を用いて系統樹を構築した。アライメントを調べることにより、IgIFSはCYP93ファミリーとは30程度の同一性を有し、CYP75BF3Hと最も同一性が高い約40ことが示された。また、IgIFSにおけるI-helix中央の保存された残基はThrであり、CYP93C2のL371とK375に相当するアミノ酸残基はそれぞれ,Leu,Ileであることが示された。P450の世代の分岐AgeofdivergenceはMEGA4softwareのmanufacturesprotocolに従って,P450の核酸配列を用いて算出した。構築した系統樹を図7に示した。参考文献8:Saitou,N.andM.Nei1987.Theneighbor-joiningmethod:anewmethodforreconstructingphylogenetictrees.MolBiolEvol44:406-25.6RT-PCR解析上記のIg由来の不定根カルチャーからmRNAを抽出し,cDNAを合成した。ExTaqDNApolymeraseTakara社、IgIFS特異的プライマーIgIFS1-F配列表配列番号5、IgIFS1-R配列表配列番号6Sigma社で受託合成を用いてRT-PCRを行った。RT-PCRは、94°C1分で変性させた後、94°C,1分;55°C,1分;72°C,1分の3ステップを30サイクル行った。1.2w/vのアガロースゲルで電気泳動した後、増幅物をエチジウムブロマイドで染色した。PCRのための鋳型の濃度はアクチンcDNAと同様に増幅されるよう調整して用いた。その結果、ジャーマンアイリスでのイソフラボノイド生合成酵素の活性の変化図8、上図とIgIFS遺伝子の発現が対応していることが示され図8、下図、IgIFSが植物でイソフラボノイドの生産に関わっている事が強く示唆された.キショウブIrispseudacorusからIpIFSを取得した。即ち、スクロース30g/l,プロリン250mg/l,トリプトンペプトン200mg/l,α-ナフタレン酢酸1mg/l,ベンジルアデニン0.5mg/lを含むMS培地でキショウブIrispseudacorusのカルスを培養した。キショウブカルスからStaraigtAsmRNAisolationsystemNovagen社を使用してmRNAを抽出し,SuperscriptIIIInvitrogen社を用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、ExTaqDNApolymeraseTakara社、プライマーIFS-F配列表配列番号7、IFS-R配列表配列番号8ともにSigma社で受託合成を用いてRT-PCRを行った。RT-PCRは、94°C1分で変性させた後、94°C,1分;55°C,1分;72°C,1分の3ステップを30サイクル行った。1.2w/vのアガロースゲルで電気泳動した後、増幅物をエチジウムブロマイドで染色した。この増幅産物をアガロースゲルから切り出し、pT7BlueT-vectorNovagen社に導入後、DNAシーケンサーABI3100,アプライドバイオシステム社で解析した。得られた配列は、配列解析ソフトウェアGenetyx-MacVer15,ゼネティックス社で解析し、IpIFSのアミノ酸配列を配列表配列番号9に、IpIFSをコードする塩基配列を配列表配列番号10にそれぞれ示した。IpIFSのアミノ酸配列のうち、IgIFSの一部配列表配列番号11:配列表配列番号1の241番目から442番目のアミノ酸配列に対するアライメントを調べ、図9に示した。IpIFSとIgIFSとの同一性アミノ酸配列は78.5であった。また、実施例1、5系統解析Phylogeneticanalysisの記載に従い、MEGA4softwareを用いて系統解析を行った。アヤメ科植物のIFSとマメ科植物のIFSのアミノ酸配列を、ClastalWを用いて整列することでアライメントを調べ、neighbor-joiningmethod近隣結合法を用いて系統樹を構築した。その結果、図10に示すようにアヤメ科植物のIFSとマメ科植物のIFSは別のクレードに属し、IgIFSとIpIFSは近縁であることが確認された。イチハツIristectorumからItIFSを取得した。イチハツの根からStaraigtA’smRNAisolationsystemNovagen社を使用してmRNAを抽出し,SuperscriptIIIInvitrogen社を用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、ExTaqDNApolymeraseTakara社、プライマーIFS-F配列表配列番号7、IFS-R配列表配列番号8ともにSigma社で受託合成を用いてRT-PCRを行った。RT-PCRは、94°C1分で変性させた後、94°C,1分;55°C,1分;72°C,1分の3ステップを35サイクル行った。1.0w/vのアガロースゲルで電気泳動した後、増幅物をエチジウムブロマイドで染色した。この増幅産物をアガロースゲルから切り出し、pT7BlueT-vectorNovagen社に導入後、DNAシーケンサーABI3100,アプライドバイオシステム社で解析した。得られた配列は、配列解析ソフトウェアGenetyx-MacVer15,ゼネティックス社で解析した。ItIFSのアミノ酸配列を配列表配列番号12に、ItIFSをコードする塩基配列を配列表配列番号13にそれぞれ示した。IgIFS、IpIFS、ItIFSの全アミノ酸配列のアライメントを配列解析ソフトウェアGenetyx-MacVer15を用いて調べ、図11に示した。ItIFSとIgIFSとのアミノ酸配列の同一性は91であり、ItIFSとIpIFSとのアミノ酸配列の同一性は82であった。IgIFS、IpIFS、ItIFSは互いに高い相同性を示し、アヤメ属では類似タンパク質がイソフラボン生合成に関わっていることが示唆された。モデル植物シロイヌナズナArabidopsisthalianaでのイソフラボノイド生産植物形質転換用ベクターはpRI909タカラバイオ社を用いた。pRI909のカリフラワーモザイクウイルス35SプロモータCAMV35Sの下流にジャーマンアイリスのIgIFScDNAを組み込んだ発現ベクターpRI909IgIFSを作成した図12。また、マメ科IFSと生産量を比較するためにpRI909のCAMV35Sの下流にマメ科カンゾウCYP93C2cDNAを組み込んだ発現ベクターpRI909CYP93C2も作成した。pRI909IgIFS、pRI909CYP93C2およびコントロールとしてpRI909をAgrobacteriumtumefaciensLBA4404、タカラバイオ社にエレクトロポレーション法で導入した。形質転換株はカナマイシン50mgLを含むLB寒天培地で28°C2日間培養した。生じたコロニーを、カナマイシン50mgLを含むLB液体培地で、28°Cで一晩前培養をした後、28°Cで一晩本培養を行った。シロイヌナズナの形質転換は花序浸し法によって行った。得られたT0種子を表面殺菌し、カナマイシン50mgL、カルベニシリン50mgLを含むMS培地に播種し選抜した。発芽した組換え個体を培養土に移し、T1種子を回収してホモ個体を選抜した。得られたホモ個体IgIFS導入株1個体,CYP93C2導入株2個体、pRI909導入株1個体を恒温恒湿室コイトトロン,18~25°C,明期14時間で栽培した。栽培によって20cm以上に成長した各個体の茎頂から5cmを採取し、重量を計測し、サンプルとした。各サンプルを液体窒素で凍結粉砕し、10mLの特級メタノールを加え、1晩静置した。濾過した抽出液を濃縮し、特級エタノール、純水に溶解させてガラスバイアルマルエム社に移した。移したサンプルを吹き付け濃縮AIRPUMPSPP-6GA、高槻電気工業株式会社し、1N塩酸メタノールで90°C、1時間酸処理して配糖体の酸加水分解を行った。酸処理したサンプルを再度吹き付け濃縮し、IgIFS導入株とpRI909導入株はサンプルの生重量1gにつき2mL、CYP93C2導入株は3倍の濃度になるように75メタノールで溶解させ、エキクロディスクMillex登録商標-LH、ミリポア社でろ過した。これらをHPLCTSK-gelODS-Tm東ソー社;流速、1mL/min;カラム温度、40°C;20分でメタノール濃度40から80のグラジエント分析で分析した。何も導入していないシロイヌナズナコントロール株はフラボノルのkaempferolとquercetinを含むが、IgIFS導入株では両物質はほとんど検出されず、genisteinのみが検出された図13。CYP93C2導入株ではフラボノール量はコントロール株とほとんど変わらなかったが、少量のgenisteinが新たに検出された。IgIFS導入株とCYP93C2導入株でのgenistein生産量はそれぞれ38.2μg/gF.W.,2.1μg/gF.W.であり、IgIFS導入株の方がCYP93C2導入株よりgenistein生産量は約18倍高かった。従ってこの結果より、アイリスのIFS遺伝子を用いた組換え植物でのイソフラボノイド生産が有効であることが示された。"