"被検体における前立腺癌を診断する方法であって、a尿、精液、前立腺液、又は前立腺マッサージ後尿から選択される、前記被検体から得た試料における前立腺特異的抗原PSAのタンパク質分解活性のレベルを測定すること;及びb前記活性レベルを前立腺癌の存在と関連付けることを含む、方法。被検体における前立腺癌を診断する方法であって、a尿、精液、前立腺液、又は前立腺マッサージ後尿から選択される、前記被検体から得た試料におけるタンパク質分解活性のレベルを測定し、前記タンパク質分解活性の測定は前立腺癌特異的ペプチドを用いること;及びb前記活性レベルを前立腺癌の存在と関連付けることを含む、方法。前記PSA酵素活性が前立腺癌特異的ペプチドを用いて測定される、請求項1に記載の方法。前記前立腺癌特異的ペプチドがHSSKLQである、請求項2又は3に記載の方法。前記前立腺癌特異的ペプチドがHSSK-Hiv-Qである、請求項2又は3に記載の方法。前記前立腺癌特異的ペプチドがHSSK-Hic-Qである、請求項2又は3に記載の方法。前記ペプチドが標識されている、請求項2、3、4、5又は6のいずれか一項に記載の方法。前記標識が発色性である、請求項7に記載の方法。前記発色性標識が蛍光性である、請求項7に記載の方法。前記標識が電気化学的である、請求項8に記載の方法。前記前立腺癌特異的ペプチドがフィブロネクチンである、請求項2又は3に記載の方法。前記関連付けが、前記試料中の全PSAに対して前記タンパク質分解活性の正規化を用いる、請求項1に記載の方法。前記関連付けが、前記被検体の血清中の全PSAに対して前記タンパク質分解活性の正規化を用いる、請求項1に記載の方法。前記関連付けが、前立腺容量に対して前記タンパク質分解活性の正規化を用いる、請求項1に記載の方法。前記試料を得ることをさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。本発明は、癌の有無を検出し、また癌と良性疾患例えばBPHを区別することができる方法を提供する。この方法は、患者が癌であるか、又は良性疾患であるか、及び/又は臨床的に癌を患っていないかを分類するために、体液中の特異的な酵素活性、例えばPSAのタンパク質分解活性又は前立腺癌特異的ペプチドPCSPの切断などの酵素活性の差異の検出を利用する。したがって、本発明は、被検体における癌、特に前立腺癌の診断方法を提供する。ある場合では、以下に記載するように、正常な患者、すなわち前立腺疾患をまったく患っていない人、癌患者、及びBPHなどの前立腺疾患を持つその他の患者の区別が可能である。ある場合では、本発明の方法を用いて、予後診断を行うことも可能である。一般的に、この文脈における診断とは、前立腺関連疾患、特に前立腺癌の有無を同定するプロセスである。以下に概説するように、これは酵素的測定法を用いて行われる。ある場合では、以下にさらに一般的に概説するように、本明細書に概説するプロテアーゼアッセイの結果は、例えばこれらに限定されないが、前立腺の大きさや容量、グリーソンスコア、血清PSAレベル種々のPSAのアイソフォーム及び遊離PSAを含む、年齢、生活習慣などの前立腺癌ノモグラムにおける一般に認められたリスクファクターを含む他の要素と組み合わせることができる。このように、本発明は、前立腺癌及びその他の前立腺疾患の診断方法を提供する。前立腺癌は、前立腺の悪性疾患で、例えばこれらに限定されないが、腺癌、小細胞型未分化癌、粘液性膠様癌などが含まれる。前立腺癌は、前立腺に局在したまま、すなわち臓器限局性であるか、又は、前立腺の外に転移し得る。前立腺癌を段階付けする体系の1つに、グリーソン分類がある。グリーソン分類は、組織試料中の癌の2つの最も大きな領域にそれぞれ段階を付ける。段階は1~5で、1が最も悪性度が低く、5が最も悪性度が高い。例えば、第3段階では転移はほとんど見られないが、第4又は第5段階では転移がよく見られる。これら2つの段階の合計が、グリーソンスコアとなる。スコア2~4は低段階、5~7は中段階、8~10は高段階である。グリーソンスコアの低い腫瘍は通常、患者の生存期間中に大きな脅威になり得ないほど十分に成長が遅い。癌のほか、前立腺の疾患としては、これらに限定されないが、良性前立腺肥大症BPH、前立腺炎、及び前立腺上皮内腫瘍PINなどが含まれ、本明細書において、これらのいずれか又はすべてを一般的に前立腺疾患という。良性前立腺肥大症BPHは、一般的に、前立腺の臨床的な肥大、又は、刺激性又は閉塞性の排尿パターン、尿閉、及び残尿量の増加を伴う頻尿などを含む下部尿路の症状を表して用いられる。良性前立腺肥大症は、80歳までの男性の80以上で起き、80歳に達する男性の25もの割合で、何らかの治療通常、外科的処置が必要になると報告されているPartinBenignProstaticHyperplasiainProstaticDiseasesWBSaundersPhiladelphiapp95105。BPHの原因は未だ解明されていない。前立腺炎は、前立腺の炎症に関連する任意の種類の疾患を意味し、慢性及び急性の細菌性前立腺炎、並びに慢性の非細菌性前立腺炎を含み、通常、頻尿及び/又は尿意逼迫の症状を伴う。前立腺炎とよく似た症状を示す疾患に、前立腺痛prostadyniaがある。前立腺上皮内腫瘍PINは、これらに限定されないが、高悪性度前立腺上皮内腫瘍及び低悪性度前立腺上皮内腫瘍を含めた、様々な形態及び/又は程度のPINを含む。HGPINは、高悪性度PIN又は高悪性度前立腺上皮内腫瘍を意味し、LGPINは、低悪性度PIN又は低悪性度前立腺上皮内腫瘍を意味する。本発明は、雄の被検体、特にヒトにおける、癌及びBPHを含む前立腺疾患の診断方法を提供する。本方法は、試料のタンパク質分解活性の試験を含む。本明細書において、試料とは、プロテアーゼ活性を含む前立腺疾患に関連する試料を意味し、例えばこれらに限定されないが、尿、精液、前立腺液、精嚢液、前立腺組織試料例えば生検試料例えば均質化組織試料、及び前立腺マッサージ後尿が含まれる。PSAは、管腔細胞から上皮基底膜及び前立腺間質を通過して拡散した後、血清に達し、そこで毛細血管基底膜及び上皮細胞を通過するか、又はリンパ管に入るSokolletal1997。また、PSAは、例えばこれらに限定されないが、精液、精漿、前立腺液、血清、尿、前立腺マッサージ後の尿、及び腹水を含む体液から単離することができる。そのため、いくつかの実施形態では、試料は尿である。ある場合では、初尿又は全試料の標準的な尿を採取している。いくつかの実施形態では、尿試料は、標準的なDRE前立腺マッサージの後に採取し、これは本明細書において前立腺マッサージ後尿という。別の実施形態では、試験試料は精液semen、精液を参照。血清では、全PSAtPSAレベルは、いくつかの遊離アイソフォームfPSAとプロテアーゼ-阻害剤複合体cPSAとの合計濃度を表し、免疫測定法により認識できる。いくつかの実施形態では、血液、血清、及び/又は血漿を用いることができ、いくつかの実施形態では、これらの試料は好ましくない。試料は、調製を行わずにそのまま試験に供するか、又は何らかの調製を行って試験に供することができる。当業者が理解するように、多くの試料調製方法を用いることができ、例えば細胞または非プロテアーゼタンパク質の除去、及び、緩衝剤例えば高濃度塩等の添加、試薬、アッセイ用組成物などの添加が含まれる。本発明は、前立腺疾患に関係する前立腺癌特異的ペプチドPCSPに対するタンパク質分解活性のアッセイにより被検体を診断する方法を提供する。本明細書に記載するように、前立腺癌の存在は、PCSPを切断するアッセイを用いて測定し、ペプチドに対する活性が高いほど癌との関連性がある。本明細書において、ペプチド又は文法上それに対応するものは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチド、誘導体及び類似体を意味し、非天然のアミノ酸及びアミノ酸類似体、並びにペプチド模倣構造を含むタンパク質も含まれる。側鎖は、R又はS配置のどちらでもよい。好適な実施形態では、アミノ酸はS又はL配置である。ペプチドがアッセイ中の基質として用いられる場合例えばPCSP、ペプチドは、PCSPのペプチド模倣残基がペプチドの切断及び/又は活性の診断との相関性を阻害しない限り、天然の構造及びペプチド模倣構造の両方を含むことができる。以下に説明するように、タンパク質を捕獲基質として用いる場合、多くの実施形態では天然のアミノ酸を用いた捕獲ペプチドが利用されるが、一部の実施形態では、試料混入物による分解を抑えるためにタンパク質類似体を用いることが望ましい。驚くことに、本発明は、前立腺癌患者とBPH及び/又は対照患者の間で、前立腺マッサージ後尿などの試料中のPCSPの切断量に相関があり、これにより、前立腺癌の診断、予後及び治療観察に用いることができる。このように、本発明は、PCSPの切断と病態の相関に基づく診断方法を提供する。したがって、本発明は、PCSPである基質ペプチドを提供する。本明細書において、前立腺癌特異的ペプチド若しくはPCSP、前立腺疾患特異的ペプチド、又は文法上それらに対応するものは、試料中の1つ以上のプロテアーゼによる切断が前立腺癌又は前立腺疾患に関連しているペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、以下にさらに詳しく説明するように、PCSPはアッセイにおけるPSAに特異的である。すなわち、ペプチドのプロテアーゼに対する特異性は、ほかにどのようなプロテアーゼが存在するかによって変動することができる;例えば、一般的に、精液は尿に比べてプロテアーゼを多く含み、そのため、尿ではペプチドの絶対的な特異性は低くなり得る。本発明で用いる基質は、標的酵素によって異なる。いくつかの実施形態では、酵素はPSAであり、以下にさらに詳しく説明する。PSAの場合、本発明において特に有用性があるペプチドは、ペプチドHSSKLQ配列番号1であり、グルタミンQの後ろで切断が起こる;DenmeadeetalCancerResearch574924を参照参照によりその全体が本明細書に援用される。以下に概説するように、PCSPは、光蛍光標識や電気化学的標識などを含む標識と結合させ、切断を検出することができる。HSSKLQペプチドのほかにも、本明細書においてさらに説明するように、前立腺特異的抗原PSAセリンプロテアーゼに特異的なペプチドを含む、多くのペプチドがPCSPである。これらのペプチドには、例えばこれらに限定されないが、Denmeadeetalの表1、2及び3に記載されるようなペプチド基質の一部又はすべてが含まれ、例えばこれらに限定されないが、KGISSQY配列番号2、SRKSQQY配列番号3、GQKGQHY配列番号4、EHSSKLQ配列番号5、QNKISYQ配列番号6、ENKISYQ配列番号7、ATKSKQH配列番号8、KGLSSQC配列番号9、LGGSQQL配列番号10、QNKGHYQ配列番号11、TEERQLH配列番号12、GSFSIQH配列番号13、SKLQ、及び類似体などが含まれる。いくつかの実施形態では、好適な類似体としては、これに限定されないが、図1に示す基質があり、本明細書においてAMIDE、HIC、及びHIVと呼ぶ場合がある。当業者が理解するように、本明細書に記載するペプチド配列は、活性が保持されている限り、様々な方法で修飾することができる。例えば、図1のペプチドは、末端ヒスチジンにモルフォリノmor基を有しているが、これは任意選択的である。同様に、図1のペプチドは、蛍光発生脱離基として7-アミノ-4-メチルクマリンAMCを有するが、本明細書に概説するように、その他の多くの標識を用いることができる。さらに、これらのペプチドはグルタミンQの後ろで切断されるが、アッセイの検出系に応じて、この配列又は本明細書に記載する他の配列のN-末端又はC-末端のいずれか又は両方にさらにアミノ酸を加えることも可能である。すなわち、例えば蛍光又はE0のいずれかなど、切断によりシグナルに測定可能な変化がある限り、ペプチドは本発明において有用性がある。本発明において有用性のある他のペプチドとしては、ZhaoetalElectrochemistryCommunications12471に記載されるCHSSLKQK配列番号14;RobertsetalJACS12911353に記載されるCEEEEHSSLKQKKKK配列番号15;NiemelaetalClinicalChemistry481257に記載されるKGISSQY配列番号16;及び、米国特許第6265540号に記載されるいくつかのペプチド具体的には配列表に記載のものなどがあり、これらはすべて参照によりその全体が本明細書に援用される。これらのペプチド、及び、配列内に置換、修飾、非天然又は天然のアミノ酸を含むペプチドやアミノ末端又はカルボキシ末端が修飾されているペプチドを含む、他の酵素切断可能なペプチドは、それらの構成成分であるアミノ酸から、通常の技術者によく知られた各種の方法により、容易に入手可能な材料と機器を用いて作製される例えば、ThePracticeofPeptideSynthesisMBodanskzyandABodanskzySpringerVerlagNewYorkNYを参照;その内容は参照により本明細書に援用される。これらは、例えば限定されないが、Fmoc法を用いた固相合成を含む例えば、ChangeandMeieinhoferIntJPeptProteinRes112469を参照。ペプチド合成について記載している他の文献としては、例えば限定されないが、MiklosBodanskyPeptideChemistryAPracticalTextbook1988SpringerVerlagNYPeptideSynthesisProtocolsMichaelWPenningtonandBenMDunneditors1994HumanaPressTotowaNJなどがある。上記のように、酵素切断可能なペプチドは、ペプチドを切断可能なペプチダーゼの認識部位となるアミノ酸配列を含む。酵素切断可能なペプチドを構成するアミノ酸は、天然、修飾又は非天然アミノ酸を含むことができ、天然、修飾又は非天然アミノ酸は、D型又はL型のいずれでもよい。天然アミノ酸は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンを含む。また、酵素切断可能なペプチドは、本発明の酵素切断可能なペプチドへの置換に適した様々な非天然又は修飾アミノ酸を含むことができる。非天然アミノ酸の明確なリストは、RobertsandVellaccioThePeptidesVol5341449AcademicPressNewYorkに開示されており、その目的のために参照により本明細書に援用される。本明細書において用いられる非天然又は修飾アミノ酸の例としては、これらに限定されないが、以下のものがある:α-アミノ酸、2-アミノアジピン酸2-アミノヘキサン二酸、α-アスパラギン、2-アミノブタン酸又は2-アミノ酪酸、γ4-アミノ酪酸、2-アミノカプリン酸2-アミノデカン酸、6-アミノカプロン酸、α-グルタミン、2-アミノヘプタン酸、6-アミノヘキサン酸、α-アミノイソ酪酸2-アミノアラニン、3-アミノイソ酪酸、β-アラニン、アロ-ヒドロキシリジン、アロ-イソロイシン、4-アミノ-7-メチルヘプタン酸、4-アミノ-5-フェニルペンタン酸、2-アミノピメリン酸2-アミノヘプタン二酸、γ-アミノ-β-ヒドロキシベンゼンペンタン酸、2-アミノスベリン酸2-アミノオクタン二酸、2-カルボキシアゼチジン、β-アラニン、β-アスパラギン酸、ビフェニルアラニン、3,6-ジアミノヘキサン酸β-リジン、ブタン酸、4-アミノ-3-ヒドロキシブタン酸、γ-アミノ-β-ヒドロキシシクロヘキサンペンタン酸、シクロブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、N5-アミノカルボニルオルニチン、シクロペンチルアラニン、シクロプロピルアラニン、3-スルホアラニン又はシステイン酸、2,4-ジアミノブタン酸、ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノブタン酸、ジフェニルアラニン、N,N-ジメチルグリシン、ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロパン酸又は2,3-ジアミノプロピオン酸、S-エチルチオシステイン、N-エチルアスパラギン、N-エチルグリシン、4-アザ-フェニルアラニン、4-フルオロ-フェニルアラニン、γ-グルタミン酸又はγ-E又はγ-GluGlaγ-カルボキシグルタミン酸、ヒドロキシ酢酸グリコール酸、ピログルタミン酸、ホモアルギニン、ホモシステイン酸、ホモシステイン、ホモヒスチジン、2-ヒドロキシイソバレリアン酸、ホモフェニルアラニン、ホモロイシン又はホモ-Lホモプロリン又はホモ-Pホモセリン、ホモセリン、2-ヒドロキシペンタン酸、5-ヒドロキシリジン、4-ヒドロキシプロリン、2-カルボキシオクタヒドロインドール、3-カルボキシイソキノリン、イソバリン、2-ヒドロキシプロパン酸乳酸、メルカプト酢酸、メルカプトブタン酸、N-メチルグリシン又はサルコシン、4-メチル-3-ヒドロキシプロリン、メルカプトプロパン酸、ノルロイシン、ニペコ酸、ノルチロシン、ノルバリン、ω-アミノ酸、オルニチン、ペニシラミン3-メルカプトバリン、2-フェニルグリシン、2-カルボキシピぺリジン、サルコシンN-メチルグリシン、2-アミノ-3-4-スルホフェニルプロピオン酸、1-アミノ-1-カルボキシシクロペンタン、スタチン4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、3-チエニルアラニン、ε-N-トリメチルリジン、3-チアゾリルアラニン、チアゾリジン4-カルボン酸α-アミノ-2,4-ジオキソピリミジンプロパン酸、及び2-ナフチルアラニン。また、酵素切断可能なペプチドは、様々な修飾アミノ酸を含んでいてもよく、アミノ酸のアミン基又はヒドロキシ基は、アルキル基、アルケニル基、フェニル基、フェニルアルキル基、複素環基、複素環式アルキル基、炭素環基、又は炭素環式アルキル基によって化学的に修飾されている。化学修飾置換基の例としては、これらに限らないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アリル、フェニル、ベンジル、ピリジル、ピリジルメチル、及びイミダゾリルがある。ThePeptidesVol3388では、アミノ酸を修飾するための適切な側鎖官能基が多数開示されており、その目的のために本明細書に援用される。修飾アミノ酸の例としては、これらに限定されないが、N-メチル化アミノ酸、N-メチルグリシン、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、Ν,Ν-ジメチルリジン、N’-2-イミダゾリルリジン、O-メチルチロシン、O-ベンジルチロシン、O-ピリジルチロシン、O-ピリジルメチルチロシン、O-メチルセリン、O-t-ブチルセリン、O-アリルセリン、O-ベンジルセリン、O-メチルスレオニン、O-t-ブチルスレオニン、O-ベンジルスレオニン、O-メチルアスパラギン酸、O-t-ブチルアスパラギン酸、O-ベンジルアスパラギン酸、O-メチルグルタミン酸、O-t-ブチルグルタミン酸、及びO-ベンジルグルタミン酸がある。また、酵素切断可能なペプチドは、4-アザヒドロキシフェニルアラニン4-アザHof又はアザHof、4-アミノメチルアラニン、4-ピリジルアラニン、4-アザフェニルアラニン、モルホリニルプロピルグリシン、ピペラジニルプロピルグリシン、N-メチルピペラジニルプロピルグリシン、4-ニトロ-ヒドロキシフェニルアラニン、4-ヒドロキシフェニルグリシン、又は2-4,6-ジメチルピリミジニルリジンである修飾アミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、蛍光性fluorogenicPCSPが用いられる。当技術分野で周知のように、プロテアーゼの切断の測定に用いられる多くの蛍光発生基があり、限定されないが、AMC7-アミノ-4-メチルクマリン;MCA7-メトキシクマリン-4-イルアセチル、p-ニトロアニリドpNAなどがある。切断によって活性化される単一の発蛍光団を利用する蛍光発生基質のほかに、蛍光共鳴エネルギー移動FRET系を用いることもできる。これらの実施形態では、発蛍光団レポーター及びクエンチャーquencherが用いられ、これらの間にプロテアーゼ切断部位が位置する。具体的な例の1つとして、クエンチング部分は、FRETの周知の現象非放射エネルギー移動又はForsterエネルギー移動としても知られるによりシグナル発蛍光団の蛍光発光を消光させるquenchことができる色素分子であってもよい。FRETでは、励起した発蛍光団供与体色素;この場合ではシグナル発蛍光団は、その励起エネルギーを別の発色団受容体色素;この場合ではクエンチャーに転移する。このようなFRET受容体又はクエンチャーは、それ自身が発色体であって、転移されたエネルギーを蛍光発光で放射してもよく、又は、非蛍光発光であって、転移されたエネルギーを他の崩壊機構により放出してもよい暗型のFRETクエンチャー又は受容体。効率的なエネルギー移動は、FRET供与体の放出スペクトルとFRETクエンチャー又は受容体の吸収スペクトルの重なり、及び、FRET供与体と受容体との間の距離に直接的に依存する。切断の前にレポーターとクエンチャーが近接していれば消光が起こり、ここでは、レポーターの最大励起での励起により、レポーターがクエンチャーの励起波長で発光し、それがクエンチャー分子に吸収され、その結果レポーターの発光スペクトルは容易に検出できない。しかし、切断により、レポーターとクエンチャーは空間的に近接しなくなり、消光の効果は失われる。FRETの色素の対であるシグナルとクエンチャーの標識の例は、当技術分野で周知である。例えば、Marrasetal2002NucleicAcidsRes30e122;Wittweretal1997Biotechniques22130138LayandWittwer1997ClinChem4322622267;Bernardetal1998AnalBiochem255101107;米国特許第6,427,156号;第6,140,054号、及び第6,592,847号を参照これらの内容は、参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、シグナルプローブのシグナル標識は発蛍光団であり、クエンチャープローブのクエンチャー標識は、シグナル発蛍光団の蛍光シグナルを消光することができる部分である。発蛍光団は当技術分野で公知である。蛍光シグナルを消光することができる部分の例としては、ダブサイルDabcyl、ダブシルdabsylBHQ-1、TMR、QSY-7、BHQ-2、ブラックホールクエンチャー登録商標Biosearch、及び、ニトロ又はアゾ基を有する芳香族化合物が含まれる。別の具体的な例では、消光部分は、FRETではない機構によってシグナル発蛍光団の蛍光発光を消光することができる分子又は発色団であってもよい。衝突又は直接的接触による消光では、シグナル発蛍光団と消光発色団の間にスペクトルの重なりは必要ないが、シグナル発蛍光団と消光発色団が互いに衝突できるような近い距離になければならない。また、当業者によって容易に理解されるように、上述のような蛍光発光に基づく検出系は、液相アッセイとして行うことができる。あるいは、蛍光発光を利用するPSA酵素活性試験は固体支持体アッセイとして行うこともできる。したがって、例えば、上記のような単一の発蛍光団で標識したペプチド、又は二重に標識したFRETペプチドのいずれかを固体支持体に結合させ、試験試料を加えて蛍光発光を観察することができる。同様に、本明細書に記載するように、電気化学的検出のために別のアミノ酸を組み入れることもできる。例えば、本明細書における電気化学的研究では、表面にペプチドを結合させるために、グルタミンの後ろにシステインを用いている。当技術分野において理解されるように、ペプチドは、ペプチド結合でRAMに直接結合するか、又は、PSA酵素が基質を切断してシグナルを生じさせ続ける限り例えば、E0の変化又は蛍光発光の変化、アミノ酸類似体を含む追加の/異なるアミノ酸を含ませることができる。したがって、他のペプチドも、本明細書に記載するアッセイ系に用いる捕獲基質例えば、PSAペプチドとして用いることができる。例えば、PSAは、例えばキモトリプシンに比べて、ある程度の特異性をもってHSSKLQペプチドを切断する。試験試料に応じて、より特異性の低いペプチドを用いることができる。当業者が理解するように、ペプチドベースの基質で利用できる多くの光学的例えば蛍光発光に基づくアッセイが存在する。一般的に、上記に概説するように、これらは切断によって生じる光学的変化、例えば蛍光発光を利用している。その他のPSA基質としては、セメノゲリンsemenogelinI、セメノゲリンII、フィブロネクチン、ラミニン、インスリン様成長因子結合タンパク質、一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、及び副甲状腺ホルモン関連タンパク質などの天然基質が含まれる。一般的に、これらのPCSPの切断は、試料中の特定のプロテアーゼの存在と関連がある。プロテアーゼは、ペプチド結合を触媒的に加水分解するタンパク質分解酵素の多数のファミリーを表す。本明細書において、プロテアーゼ又はプロテイナーゼとは、アミノ酸を連結しているペプチドアミド結合の加水分解によってタンパク質を加水分解することができる酵素を意味する。プロテアーゼの主なグループとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、及びメタロプロテアーゼが含まれる。前立腺に見られるセリンプロテアーゼは、前立腺癌の浸潤及び転移の原因となるタンパク質分解カスケード反応に関与している可能性がある。2つのそのようなタンパク質は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子u-PAとPSAである。ウロキナーゼプロテアーゼの合成の増加は、多くの癌における転移能力の上昇と関連がある。ウロキナーゼは、細胞外空間に遍在するプラスミノーゲンからプラスミンを活性化し、その活性化により、転移性の腫瘍細胞が浸潤する細胞外マトリックス中のタンパク質の分解が引き起される。また、プラスミンはコラゲナーゼを活性化することができ、これにより毛細血管やリンパ系を取り囲む基底膜中のコラーゲンの分解を促進し、その結果、腫瘍細胞が標的組織に浸潤できるようになるDanoetalAdvCancerRes44139。本発明は、試料中のプロテアーゼ、特に前立腺特異的抗原PSAセリンプロテアーゼの測定法を提供する。すなわち、いくつかの実施形態では、前立腺マッサージ後尿などの試料におけるPSAの活性は、PSAによって切断され、かつ特定の試料中に存在する他のプロテアーゼにより切断されない基質を用いて測定する。前立腺特異的抗原PSAは、通常15~60μMすなわち、0.5~2mg/mlの濃度で存在し、前立腺液において最も多く存在するセリンプロテアーゼである。前立腺特異的抗原PSAは、約33kDaの糖タンパク質であり、これは腺性カリクレイン様プロテイナーゼと非常によく似た構造を有する。しかし、他のカリクレインに一般的に見られるトリプシン様活性とは対照的に、PSAはキモトリプシン様活性を示す。ヒトPSAの配列は、GENBANK:AAD14185であり;前立腺特異的抗原アイソフォーム1プレプロタンパク質ヒトは、NCBIリファレンス配列:NP_001639であり、また、前立腺特異的抗原アイソフォーム3プレプロタンパク質ヒトは、NCBIリファレンス配列:NP_001025218である。PSAは、タンパク質分解において、主にプロテアーゼとして独立して作用し、u-PAのようにプラスミンを介さないことが示唆されている。PSAは導管上皮及び前立腺腺房で合成され、エキソサイトーシスにより前立腺管の管腔に分泌される。PSAは、前立腺管の管腔から、前立腺を通過して精液に入る。精液中には、精嚢で作られるセメノゲリンI及びII、並びにフィブロネクチンを主としたゲル形成タンパク質が存在する。これらのタンパク質は、射精時に形成され、かつ精子を捕捉する働きを持つ精液凝塊の主要な成分である。PSAは凝塊を液化し、ゲル形成タンパク質のタンパク質分解により精液塊をより小さくかつより溶解性の高い断片に分解し、これにより精子が解放される。その他の基質が確認されており、これは活性なPSAアイソフォームを前立腺癌の発生に関与させ、例えばこれらに限定されないが、フィブロネクチン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、インスリン様成長因子結合タンパク質、潜在型形質転換増殖因子β、及び副甲状腺ホルモン関連タンパク質が含まれる。PSAは、いくつかの遊離アイソフォームで存在し、異なる体液中のプロテアーゼ阻害剤と錯体を形成している。異なるPSAアイソフォームの測定により、選択した集団における前立腺癌検出の特異性が向上されている。CatalonaetalJAmMedAssoc27915421547及びJansenetalEurUrol55563574。現在、米国で前立腺癌の検出に最も広く用いられているものには、Hybritech全PSA及び遊離PSAテストキットBeckmanCoulterと、AxSYM登録商標PSAアッセイAbbottLaboratoriesがある。しかし、活性PSAのタンパク質分解作用は、通常の免疫測定では定量化できない。そのため、PSA酵素活性に特異的なアッセイは、良性疾患と悪性疾患を判別するためのこの重要なパラメーターの臨床的有用性を確認するための既存の試験の補助手段として望ましい。NiemelaetalClinChem4812571264、WuetalClinChem50125129、及びZhuetalBiolChem387769772。そのため、本発明では、潜在的な癌の同定を容易にし、最終的には、リスクの高い患者に生検が妥当であることを知らせるための診断のノモグラムに加えるための、PSA活性に特異的な診断アッセイの利用について述べる。本発明は、試料中で、PSAによって引き起こされるペプチド切断事象を特異的に検出するあらゆるアッセイプラットフォームすなわち、光学的、電気化学的なものを包含する。本明細書に概説する発明は、臨床尿試料中のPSA活性が、癌であると確認された生検結果に有意な相関があることを示す。そのため、いくつかの実施形態では、本発明は、前立腺癌治療例えば、これらに限定されないが、化学療法的治療、並びに、近接照射療法、体外照射療法、及びその他の種類の放射線又はビーム療法を含む放射線治療の経過を診断、予測、又は観察する方法を提供する。前記方法は、患者の試料におけるPSAの酵素活性を測定することを含む。一般的に、診断は、得られた結果を正常な患者のPSA活性レベルと比較することで行うことができ、PSA活性の上昇が前立腺癌の存在のマーカーとなる。治療の観察は、処置を受けている患者のPSAレベルを時間の経過とともに繰り返し測定して観察することにより行うことができ、酵素活性の減少レベルが腫瘍量の減少、存在、又は悪性度に相関する。経時的変化が見られない場合、結果に従い、医師が治療の変更又は増強を行うこともできる。当業者が理解するように、上述の光学的標識に加えて、以下に概説する電気化学的標識を用いることもできる。本明細書に概説するように、光学的例えば、蛍光発光アッセイは、既知のどのようなフォーマットを用いて行ってもよい。試料は、単独又はバッチで測定してもよく、自動システム等を含むどのようなシステムを用いてもよい。一態様では、本発明は、電気化学的アッセイを用いて試験試料中のPSAなどの酵素を検出する方法を提供する。一般的なシステムは、米国特許出願第60/980,733号;第12/253,828号;第61/087,094号;第12/253,875号;及び、第61/087,102号に記載されている;これらすべては、参照によりその全体、及び特に発明の構成要素が、明示的に本明細書に援用される。当業者が理解するように、本明細書に記載するアッセイ系の構成要素は、最終的な系においてそれぞれ独立して包含及び除外することができ、本発明の構成要素の異なる組み合わせを用いることができる。電気化学的アッセイでは、これらに限定されないが、自己組織化単分子膜SAM及び共有結合で結合した電気活性な活性部位EAM、又は本明細書において酸化還元活性分子ReAMとも呼ぶを含む電極を含みうる。電極とは、電子装置に接続したときに、電流又は電荷を感知して信号に変換することができる組成物を意味する。好適な電極は当技術分野で周知であり、例えばこれらに限定されないが、以下のものが含まれる:金、白金、パラジウム、ケイ素、アルミニウムを含むある種の金属及びその酸化物;酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、酸化インジウムスズ、酸化パラジウム、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化モリブデンMo2O6、酸化タングステンWO3、及び酸化ルテニウムを含む金属酸化物電極;及び炭素ガラス状炭素電極、グラファイト、及びカーボンペーストを含む。好適な電極としては、金、ケイ素、炭素、金属酸化物電極が含まれ、金が特に好適である。EAMは、第1のE0を有する遷移金属錯体を含む。また、電極には、標的酵素の複数の酵素基質捕捉基質、本明細書において、標的酵素がPSAである場合、PSA基質又はPSAペプチドとも呼ばれる。が結合されている。したがって、この方法では、試験試料が電極に付加され、標的酵素と標的酵素の基質とが複数の反応物を形成する。酵素の存在は、EAMの環境の変化により生じるE0の変化を測定することで判定する。一態様では、本発明は、電極に結合したリガンド構造を提供する。いくつかの実施形態では、捕捉基質は配位原子を提供する。他の実施形態では、ReAMCは電極に結合した単一分子であるが、捕捉基質は配位原子を提供しない。その他の実施形態では、ReAMCは含まれない;EAMと捕捉基質が別々に電極に結合している。以下にさらに述べるように、本発明では、いくつかの異なる構造を用いることができる。ある実施形態では、EAMは捕捉基質も含み、本明細書において酸化還元活性部分複合体又はReAMCと呼ぶものを形成する。本明細書に記載する電極は平面で表されるが、これは電極の可能な構造の1つに過ぎず、単に模式的に示すためのものである。電極の構造は、用いる検出方法によって異なる。例えば、平面状の電極は、光学的検出方法に対して好ましい場合があり、又は、ペプチドアレイを作製する際には、合成と検出の両方のためのアドレス可能な部位が必要になる。あるいは、単一プローブ分析では、電極はチューブ状でもよく、SAM、EAM及び捕捉リガンドなどの系の構成成分は内表面に結合される。これにより、核酸を含む表面を少量の試料に最大限接触させることができる。本発明の電極は、通常、バイオチップカートリッジに組み込まれ、様々な構成が可能で、また、作用電極及び基準電極、相互接続子相互接続子を含む、及び微小流体素子を組み込むことができる。例えば、米国特許第7,312,087号を参照参照によりその全体が本明細書に援用される。バイオチップカートリッジには、生体分子のアレイを含む基板が組み込まれ、様々な構成が可能である。例えば、チップは、試薬の導入及び除去のための入口と出口とを備えた反応室を含むことができる。また、カートリッジは、微小流体素子を備えたキャップ又は蓋を含むことができ、これにより試料を導入し、試薬を添加し、反応を行い、その後、検出用アレイを含む反応室に試料を加えることができる。ある好適な実施形態では、バイオチップは、複数のアレイ位置を有する基板を含む。本明細書において、基板若しくは固体支持体、又は文法上それに対応するものは、捕捉リガンドの付加又は結合に適した別個の個々の部位を含むように変更することができる材料を意味する。適当な基板としては、金などの金属表面、以下に定義する電極、ガラス及び修飾又は官能性ガラス、繊維ガラス、テフロン登録商標、セラミックス、マイカ、プラスチックアクリル、ポリスチレン及びスチレンと他の物質との共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン登録商標、及びそれらの誘導体などを含む、GETEKポリプロピレンオキシドと繊維ガラスの混合物等、ポリサッカライド、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、シリカ又はシリコンや修飾シリコンを含むシリカ系物質、炭素、金属、無機ガラス、及びその他の様々なポリマーが含まれ、プリント基板PCBとポリエチレンテレフタラートPETの物質が特に好適である。本システムでは、アドレス可能な検出電極の形成基板が存在するアレイフォーマットに特に有用性が見出される本明細書では、一般的に、パッド、アドレス又は微細部位という。本明細書において、アレイとは、あるアレイフォーマットにおける複数の捕捉リガンドを意味する;アレイの大きさはその組成と最終用途によって異なる。約2つの異なる捕捉基質から数千のものを含むアレイを作製することができる。ある好適な実施形態では、検出電極は基板上に形成される。また、本明細書の記述は、概して金電極の利用に関するが、当業者が理解するように、他の電極も用いることができる。本明細書及び引用文献に概説されるように、基板は様々な物質を含むことができる。一般的に、好適な物質には、プリント基板が含まれる。回路基板材料は、導電膜でコーティングされ、かつリソグラフィー技術、特にフォトリソグラフィー技術を用いて処理され、電極及び相互接続子当技術分野で相互結線interconnection又はリード線と呼ばれる場合があるのパターンを形成する絶縁基板を含むものである。絶縁基板は、すべてではないが通常、ポリマーである。当技術分野で周知のように、1つ又は複数の層を用いて、二次元例えば、平面内のすべての電極及び相互結線又は三次元電極が1つの面にあり、かつ相互接続子が反対側に向けて基板を貫通でき、又は電極が複数の面にあるの基板を作ることができる。三次元系では、ドリル加工又はエッチングを用いることが多く、その後、銅などの金属で電気メッキを行い、基板貫通相互結線が作られる。回路基板材料は、銅箔などの箔が基板にあらかじめ付着されたものが多く、必要に応じて、例えば電気メッキにより、追加の銅を加える例えば相互結線のため。その後、銅表面は、接着層を取り付けるため、エッチングなどによる粗面化が必要になる場合がある。したがって、ある好適な実施形態では、本発明は、複数の電極、好適には金電極を含む基板を含むバイオチップ本明細書において、チップと呼ぶ場合があるを提供する。電極の数は、アレイについて概説する通りである。各電極は、好適には、本明細書に概説する自己組織化単分子膜を含む。ある好適な実施形態では、単分子膜形成種の1つは、本明細書に概説する捕捉リガンドを含む。また、各電極は、電極に一端が結合され、電極を制御することができる機器に最終的に結合される相互結線を有する。すなわち、各電極は独立してアドレス可能である。最後に、本発明の構成物は、微小流体要素や自動装置要素などの様々な追加の要素例えば、米国特許第6,942,771号及び第7,312,087号、並びに関連する件を参照;両文献は参照によりその全体が本明細書に援用される、及び、信号処理技術を用いたコンピュータを含む検出システム例えば、米国特許第6,740,518号を参照;参照によりその全体が本明細書に援用されるを含むことができる。自己組織化単分子膜スペーサーいくつかの実施形態では、電極はさらにSAMを含んでいてもよい。本明細書において、単分子膜又は自己組織化単分子膜又はSAMとは、表面に自然に化学吸着した分子の比較的整列した集合体であって、分子は互いに略平行で、面に対してほぼ垂直に配置されているものを意味する。各分子は、面に結合する官能基と、単分子膜中の隣接する分子と相互作用して比較的整列したアレイを形成するための部分とを有する。混合単分子膜は異種単分子膜を含んでおり、すなわち、少なくとも2つの異なる分子が単分子膜を構成している。本明細書において概説するように、単分子膜を用いることで、表面への生体分子の非特異的結合の量を減らし、また、核酸の場合、オリゴヌクレオチドの電極からの距離によって、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの効率を高めることができる。このように、単分子膜により、標的酵素を電極表面から離しておくことが容易になる。また、単分子膜は、電荷キャリアを電極表面から遠ざけておくことにも役立つ。そのため、この膜は、溶媒中で電極とReAM又は電極と荷電種との電気的接触を妨げることに寄与する。このような接触は、直接的な短絡、又は試料中に存在する可能性のある荷電種を介した間接的な短絡を引き起こす可能性がある。したがって、単分子膜は、電極表面の均一な層に密にパッキングされ、最小限のホールが存在することが好ましい。このように、単分子膜は、溶媒が電極に到達することを妨げる物理的なバリアとして働く。いくつかの実施形態では、単分子膜は伝導性オリゴマーを含む。本明細書において、伝導性オリゴマーとは、好適には直鎖状である、実質的に伝導性のオリゴマーを意味し、そのいくつかの実施形態は、文字通り分子ワイヤーと呼ばれる。本明細書において、実質的に伝導性とは、オリゴマーが100Hzで電子を移動させ得ることを意味する。一般的に、伝導性オリゴマーは、実質的に重なり合うπ軌道、すなわち共役π軌道を伝導性オリゴマーの単量体ユニット間に有するが、伝導性オリゴマーは、1つ以上のσ結合を含んでいてもよい。加えて、伝導性オリゴマーは、関連するEAMに電子を導入し、又はそれから電子を受け取ることができる能力によって機能的に定義することもできる。さらに、伝導性オリゴマーは、本明細書に定義する絶縁体よりも伝導性が高い。また、本発明の伝導性オリゴマーは、それ自身が電子を供与又は受け取る電気活性ポリマーとは区別される。伝導性オリゴマーのさらに詳細な説明は、国際公開第1999/57317号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に援用される。具体的には、国際公開第1999/57317号の14~21ページにある構造1~9に示される伝導性オリゴマーは、本発明で有用である。いくつかの実施形態では、伝導性オリゴマーは以下の構造を有する:さらに、単分子膜中の少なくとも一部の伝導性オリゴマーの末端は、電子的に露出している。本明細書において、電子的に露出しているとは、EAMを末端に非常に近接させ、かつ、適切なシグナルで惹起した後に、EAMの存在に依存したシグナルが検出され得ることを意味する。伝導性オリゴマーは、末端基を有しても、有していなくてもよい。そのため、好適な実施形態では、付加的な末端基はなく、伝導性オリゴマーは、例えばアセチレン結合などの末端基で終端する。あるいは、いくつかの実施形態では末端基が付加され、本明細書においてQで表す場合がある。末端基はいくつかの理由で用いられる場合がある;例えば、EAMの検出のための伝導性オリゴマーの電子的な利用可能性に寄与する、又は、他の理由のためにSAMの表面を変化させる;例えば、非特異的な結合を防ぐなど。例えば、負の電荷を持つ表面を形成するために負の電荷を持つ基が末端にあってもよく、標的検体が本明細書に定義するペプチドであった場合、プロテアーゼPSAの結合が可能になり、それによりペプチドの特異的切断が起きる。好適な末端基としては、-NH2、-OH、-COOH、及び-CH3などのアルキル基、さらにポリエチレングリコールなどのポリアルキルオキシドなどが含まれ、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2O2H、-OCH2CH2O3H、及び-OCH2CH2O4Hが好ましい。ある実施形態では、異なる種類の末端基を有する伝導性オリゴマーの混合物を用いることができる。したがって、例えば、一部の末端基は検出を促進し、一部のものは非特異的結合を防ぐことができる。いくつかの実施形態では、電極は、好適には電極表面上の単分子膜の形で、不動態化剤passivationagentをさらに含む。一部の検体では、検体結合すなわち、プロテアーゼの一時的な結合とそれに続く切断の効率は、結合リガンドが電極から離れている際に増加し得る。さらに、単分子膜の存在により、表面への非特異的結合を減少させることができるこれは、末端基を用いることでさらに促進される。不動態化剤の層は、結合リガンド及び/又は検体を電極表面から遠ざけておくことを容易にする。さらに、不動態化剤は電荷キャリアを電極表面から遠ざけておくことに役立つ。そのため、この層は、溶媒中で電極と電子伝達部分との電気的接触、又は電極と荷電種との電気的接触を妨げることに役立つ。このような接触は、直接的な短絡、又は試料中に存在し得る荷電種を介した間接的な短絡を引き起こす恐れがある。したがって、不動態化剤の単分子膜は、電極表面の均一な層に密にパッキングされ、最小限のホールが存在することが好ましい。あるいは、不動態化剤は単分子膜の形でなくてもよく、伝導性オリゴマーのパッキングや他の特性を促進するために存在することができる。このように、不動態化剤は、溶媒が電極に到達することを妨げる物理的なバリアとして働く。そのため、不動態化剤はそれ自体が実際に、1伝導性、又は2非伝導性、すなわち絶縁性の分子である。したがって、ある実施形態では、本明細書に述べるように、不動態化剤は、電極への電荷の移動を阻害又は減少させる末端基を有する又は有しない伝導性オリゴマーである。伝導性であり得る他の不動態化剤としては、--CF2n--、--CHFn--、及び--CFRn--のオリゴマーが含まれる。ある好適な実施形態では、不動態化剤は絶縁体部分である。いくつかの実施形態では、単分子膜は絶縁体を含む。絶縁体とは、実質的に非伝導性のオリゴマーであり、好適には直鎖状である。本明細書において、実質的に非伝導性とは、絶縁体を介した電子の移動速度が、伝導性オリゴマーを介した電子の移動速度よりも遅いことを意味する。別に言うと、絶縁体の電気抵抗は、伝導性オリゴマーの電気抵抗よりも高い。しかし、--CH216分子などのように、一般的に絶縁体と考えられているオリゴマーであっても、速度は遅いが電子を移動し得ることに注意が必要である。いくつかの実施形態では、絶縁体の伝導率Sはおよそ10-7Ω-1cm-1以下で、およそ10-8Ω-1cm-1未満が好ましい。GardneretalSensorsandActuatorsA515766参照により本明細書に援用される。一般的に、絶縁体は、σ結合を有するアルキル又はヘテロアルキルのオリゴマー又は部分であり、任意の特定の絶縁体分子は芳香族基又は1つ以上の共役結合を含んでいてもよい。本明細書において、ヘテロアルキルとは、少なくとも1つのヘテロ原子、すなわち窒素、酸素、硫黄、リン、ケイ素、又はホウ素を鎖内に含むアルキル基を意味する。あるいは、絶縁体は、電子の移動を好ましくは大きく阻害する又は遅くすることに寄与する1つ以上のヘテロ原子又は結合が付加された伝導性オリゴマーに非常に類似していてもよい。いくつかの実施形態では、絶縁体はC6-C16アルキルを含む。絶縁体を含む不動態化剤は、電極上の部分又は伝導性オリゴマーのパッキングや、絶縁体の親水性又は疎水性、及び絶縁体の可動性、すなわち、回転、ねじれ、又は長軸方向の可動性を変化させるために、本明細書に記載するR基で置換されていてもよい。例えば、分枝状アルキル基を用いることができる。また、絶縁体を含む不動態化剤の末端は、単分子膜の露出表面に作用するための追加の基を含んでいてもよく、本明細書において末端基TGと呼ぶ場合がある。例えば、試料からの非特異的な結合を阻害し、又は検体等の結合の動態に作用するために、電荷を帯びた基、中性の基、又は疎水性の基を付加することができる。例えば、電荷を帯びた表面を形成して、特定の標的検体の結合を促進又は阻害し、あるいは表面上に横たわるのを退ける又は防止するために、電荷を帯びた基が末端に存在していてもよい。不動態化剤の長さは必要に応じて変わる。一般的に、不動態化剤の長さは、上述する伝導性オリゴマーの長さと同程度である。また、伝導性オリゴマーは、基本的に不動態化剤と同じ長さであるか又はより長くてもよく、その結果、結合リガンドが溶媒により到達しやすくなる。単分子膜は、絶縁体を含む不動態化剤を単一種類含むか、又は異なる種類を含んでいてもよい。適当な絶縁体は当技術分野で周知であり、例えばこれらに限定されないが、--CH2n--、--CRHn--、及び--CR2n--、エチレングリコール、又は酸素の代わりに他のヘテロ原子を用いる誘導体すなわち窒素又は硫黄電極が金である場合、硫黄誘導体は好ましくないを含む。いくつかの実施形態では、絶縁体はC6~C16アルキルを含む。いくつかの実施形態では、電極は金属表面であり、相互接続子又は電気化学反応を行う能力を必ずしも有する必要はない。アンカー基本発明は、アンカー基を含む化合物を提供する。本明細書において、アンカー又はアンカー基とは、本発明の化合物を電極に結合する化学基を意味する。当業者が理解するように、アンカー基の組成は、それが結合する表面の組成に応じて異なる。金電極の場合、ピリジニルアンカー基及びチオール系アンカー基の両方が特に有用である。伝導性オリゴマーの共有結合は、使用する電極および伝導性オリゴマーに応じて、様々な方法で達成することができる。一般的に、構造1中のAで示されるようなある種のリンカーが用いられ、ここで、Xは伝導性オリゴマーを示し、斜線面は電極を示す:構造1この実施形態では、Aはリンカー又は原子である。Aの選択は、電極の特性に部分的に依存する。そのため、例えば、金電極が用いられる場合、Aは硫黄部分であってもよい。あるいは、金属酸化物電極が用いられる場合、Aは、酸化物の酸素に結合したケイ素シラン部分であってもよい例えば、ChenetalLangmuir1033323337;LenhardetalJElectroanalChem78195201を参照;これらは参照により明示的に本明細書に援用される。炭素系電極が用いられる場合、Aはアミノ部分であってもよい好適には第一級アミン;例えば、DeinhammeretalLangmuir1013061313を参照。このように、好適なA部分としては、これらに限定されないが、シラン部分、硫黄部分アルキル硫黄部分を含む、及びアミノ部分が含まれる。いくつかの実施形態では、電極は炭素電極、すなわちガラス状炭素電極であり、結合はアミン基の窒素を介して行われる。代表的な構造は、米国特許出願第20080248592号の構造15に示されており、参照によりその全体、特にそれに記載される構造、異なるアンカー基に関する説明、及び付属する文章が本明細書に援用される。また、追加の原子が存在してもよいすなわち、リンカー及び/又は末端基。米国特許出願第20080248592号の構造16上記のように参照により本明細書に援用されるでは、酸素原子は、金属酸化物電極の酸化物に由来する。Si原子は他の原子を含んでいてもよく、すなわち、置換基を含むケイ素部分であってもよい。SAMを他の電極に結合するその他のものについては、当技術分野で周知である;例えば、酸化インジウムスズ電極への結合に関するNapieretalLangmuir1997、及び、酸化インジウムスズ電極へのリン酸塩の化学吸着HHoldenThorpeCHIconferenceMay451998の発表を参照。ある好適な実施形態では、酸化インジウムスズITOが電極に用いられ、アンカー基はホスホン酸含有種である。硫黄アンカー基構造1では単一の部分として示しているが、伝導性オリゴマーは、2つ以上のA部分により電極と結合していてもよい。A部分は同一でも異なっていてもよい。したがって、例えば、以下の構造2、3及び4に一般的に示すように、電極が金電極であって、Aが硫黄原子又は部分である場合、電極への伝導性オリゴマーの結合に複数の硫黄原子が用いられていてもよい。当業者が理解するように、他のこのような構造も作ることができる。構造2、3及び4では、A部分は単純な硫黄原子であるが、置換された硫黄部分を用いることもできる。したがって、例えば、以下の構造6に一般的に示すように、電極が金電極であって、Aが硫黄原子又は部分である場合、以下の構造2、3及び4に一般的に示すように、電極への伝導性オリゴマーの結合に複数の硫黄原子が用いられていてもよい。当業者が理解するように、他のこのような構造も作ることができる。構造2、3及び4では、A部分は単純な硫黄原子であるが、置換された硫黄部分を用いることもできる。構造2構造3構造4構造4と同様に、単一の炭素原子で終端し、3つの硫黄部分が電極に結合している伝導性オリゴマーを有し得ることにも注意が必要である。別の態様では、本発明は、共役チオールを含むアンカーを提供する。いくつかの典型的な錯体は、共役チオールアンカーとの錯体である。いくつかの実施形態では、アンカーはアルキルチオール基を含む。2つの化合物は、それぞれカルベンおよび4-ピリジルアラニンをベースとしている。別の態様では、本発明は、金電極などの電極上で検体を検出するための電気活性部分の構築物においてアンカー基として働く共役多足性multipodalチオ含有化合物を提供する。すなわち、スペーサー基EAM、ReAMC、又は空の単分子膜形成種に結合することができるが2つ以上の硫黄原子を用いて結合されている。これらの多足性アンカー基は、本明細書に記載するように、直鎖状又は環状である。いくつかの実施形態では、アンカー基は、金表面に結合する2つの硫黄原子を含む二足性であり、直鎖状であるが、一部の場合には、他の多足性例えば、三足性の系を含むことが可能である。このような多足性のアンカー基は、高い安定性を示し、及び/又は、立体的な制約がある頭部基を持つチオール含有アンカーからSAMを調製するうえでより大きなフットプリントが可能である。いくつかの実施形態では、アンカーは環状ジスルフィド二足を含む。一部の場合では、他の多足性例えば、三足性を有する環系アンカー基を含むことができる。環の原子の数はさまざまで、例えば5~10であり、以下に述べる多環アンカー基も含まれる。いくつかの実施形態では、アンカー基は、以下に示すような、7員環で頂点apex窒素原子および分子内ジスルフィド結合を有する[1,2,5]-ジチアゼパン単位を含む:構造IIIaでは、環の炭素原子はさらに置換されていてもよい。当業者が理解するように、異なる員の環も含まれる。さらに、多環構造も用いることができ、環状ヘテロアルカン、例えば上記の[1,2,5]-ジチアゼパンが他の環状アルカン環状ヘテロアルカンを含むで置換されたもの、またはや芳香環構造が含まれる。いくつかの実施形態では、アンカー基及びスペーサーの一部は、以下の構造を有する。ここで、R基は、任意の置換基でもよく、EAMの遷移金属成分のための末端配位リガンドを有する共役オリゴフェニルエチニレン単位を含む。アンカーは二足性中間体I式IIIの化合物で、R=Iから合成され、これはLietalOrgLett436313634に記載されている参照により本明細書に援用される。また、WeietalJOrgChem6914611469も参照参照により本明細書に援用される。硫黄原子の数は、本明細書に概説するように変動することができ、特定の実施形態では、スペーサー当たり1個、2個、又は3個である。電気活性部分アンカー基に加えて、本発明は、電気活性部分を含む化合物を提供する。本明細書において、電気活性部分EAM、遷移金属錯体、酸化還元活性分子、又は電子遷移部分ETMとは、1つ以上の電子を可逆的又は半可逆的に移動することができる金属含有化合物を意味する。電子供与体と受容体の能力とは相関的である。すなわち、特定の実験条件において電子を失うことができる分子は、異なる実験条件において電子を受容することが可能となる。可能な遷移金属錯体の数は非常に多く、電子遷移化合物分野の当業者であれば、本発明において多くの化合物を用いることができる。本明細書において、遷移金属とは、原子が一部の又は完全な電子殻を有する金属を意味する。本発明での使用に好適な遷移金属としては、これらに限定されないが、カドミウムCd、銅Cu、コバルトCo、パラジウムPd、亜鉛Zn、鉄Fe、ルテニウムRu、ロジウムRh、オスミウムOs、レニウムRe、白金Pt、スカンジウムSc、チタンTi、バナジウムV、クロムCr、マンガンMn、ニッケルNi、モリブデンMo、テクネチウムTc、タングステンW、及びイリジウムIrが含まれる。すなわち、遷移金属の第一系列、白金族Ru、Rh、Pd、Os、Ir及びPtが、Fe、Re、W、Mo及びTcと共に、本発明において特に有用である。特に好適なものは、酸化状態の変化によって配位部位の数が変わらない金属であり、ルテニウム、オスミウム、鉄、白金及びパラジウムが含まれ、オスミウム、ルテニウム及び鉄が特に好ましく、多くの実施形態でオスミウムが特に有用である。いくつかの実施形態では、鉄は好ましくない。一般的に、遷移金属は、本発明においてTM又はMで示される。遷移金属と配位リガンドとが、金属錯体を形成する。本明細書において、リガンド又は配位リガンドとは本明細書において、図中でLで示す、1つ以上の中心原子又はイオンに対して、通常、配位共有結合によりそれ自身の1つ以上の電子を供与する、又は、共有結合によりそれ自身の電子を共有する、原子、イオン、分子、又は官能基を意味する。金属のその他の配位部位は、遷移金属錯体を捕捉リガンドに直接に又はリンカーを用いて間接的に結合するか、又は電極に結合するスペーサーが用いられる場合が多く、以下により詳しく述べるか、あるいはその両方に用いられる。このため、例えば、遷移金属錯体が結合リガンドに直接結合する場合、金属イオンの1つ、2つ又はそれ以上の配位部位が、結合リガンド間接的結合の場合はリンカーによって供給される配位原子によって占有され得る。さらに、又はその代りに、金属イオンの1つ以上の配位部位は、遷移金属錯体を電極に結合するために用いるスペーサーにより占有され得る。例えば、以下により詳しく述べるように、遷移金属錯体が結合リガンドとは別に電極に結合する場合、金属の配位部位nは、1つを除いてすべてn-1、極性リガンドを含む可能性がある。本明細書により詳しく述べるように、本明細書において通常Lで表される好適な小分子極性リガンドは、大きく2つに分類される。ある実施形態では、小分子極性リガンドは、一般的に脱離基としての性質が低い又はσ供与体として優れているというその特質や金属の特性から、金属イオンに効果的に不可逆的に結合される。これらのリガンドは、置換不活性と呼ばれることがある。あるいは、以下により詳しく述べるように、小分子極性リガンドは金属イオンに可逆的に結合する場合があり、標的検体が結合した際に、脱離基として優れている又はσ供与体としての性質が低いというその特性から、検体が1つ以上の配位原子を金属に提供することができ、事実上小分子極性リガンドを置換する。これらのリガンドは、置換易動性と呼ばれることがある。リガンドは双極子を形成することが好ましいが、それは、これが高い溶媒再構築エネルギーに寄与するからである。いくつかの遷移金属錯体の構造を以下に示す。Lは共リガンドであり、金属イオンの結合に配位原子を提供する。当業者が理解するように、共リガンドの数と種類は、金属イオンの配位数によって決まる。単座、二座、又は多座の共リガンドは、任意の位置で用いることができる。このため、例えば、金属の配位数が6である場合、伝導性オリゴマーの末端からのLと、核酸から与えられるLと、rとの合計が6になる。したがって、金属の配位数が6である場合、共リガンドがすべて単座であれば、rは0すべての配位原子が他の2つのリガンドから提供される場合から4となる。したがって、一般的に、金属イオンの配位数と他のリガンドの選択に応じて、rは0から8となる。ある実施形態では、金属イオンの配位数は6であり、伝導性オリゴマーに結合したリガンドと核酸に結合したリガンドは、ともに少なくとも二座である;すなわち、rは好適には0、1すなわち、残りの共リガンドは二座、又は22つの単座共リガンドが用いられるである。当技術分野において理解されるように、共リガンドは同一でも異なっていてもよい。好適なリガンドは2つに分類される:配位原子として、窒素、酸素、硫黄、炭素、又はリン原子金属イオンによって決まるを用いるリガンド一般的に、文字通りσ供与体と呼ばれる、及び、メタロセンリガンドなどの有機金属リガンド一般的に、文字通りπ供与体と呼ばれ、本明細書においてLmで表す。好適当な窒素供与リガンドは、当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、以下のものを含む:シアノC≡N、NH2;NHR;NRR’;ピリジン;ピラジン;イソニコチンアミド;イミダゾール;ビピリジン及びビピリジンの置換誘導体;ターピリジン及び置換誘導体;フェナントロリン、特に1,10-フェナントロリン略記phen、及びフェナントロリンの置換誘導体、例えば4,7-ジメチルフェナントロリン及びジピリドール[3,2-a:2’,3’-c]フェナジン略記dppz;ジピリドフェナジン;1,4,5,8,9,12-ヘキサアザトリフェニレン略記hat;9,10-フェナントレンキノンジイミン略記phi;1,4,5,8-テトラアザフェナントレン略記tap;1,4,8,11-テトラ-アザシクロテトラデカン略記cyclam及びイソシアニド。縮合誘導体を含む置換誘導体も用いることができる。いくつかの実施形態では、ポルフィリン及びポルフィリンファミリーの置換誘導体を用いることができる。例えば、ComprehensiveCoordinationChemistryEdWilkinsonetalPergammonPress1987Chapters132211及び213を参照これらはすべて、参照により明示的に本明細書に援用される。当技術分野において理解されるように、本発明では、供与体1-架橋-供与体2のリガンドここで、供与体1は金属に結合し、供与体2は周囲の媒体溶媒、タンパク質などとの相互作用に用いられる、特にシアノのように供与体1及び供与体2がπ系を介して共役するものシアノでは、Cが供与体1、Nが供与体2、π系がCNの三重結合を用いることができる。1つの例はビピリミジンであり、ビピリジンとよく似ているが、媒体との相互作用のためのN供与体を裏面に有している。その他の共リガンドとしては、これらに限定されないが、シアネート、イソシアネート-N=C=O、チオシアネート、イソニトリル、N2、O2、カルボニル、ハロゲン化物、アルコキシド、チオラート、アミド、リン化物、及び含硫黄化合物例えば、スルフィノ、スルホニル、スルホアミノ、及びスルファモイルが含まれる。いくつかの実施形態では、異なる金属との錯体形成の共リガンドとして、複数のシアノを用いることができる。例えば、7個のシアノがReIIIに結合する;8個のシアノがMoIV及びWIVに結合する。したがって、本発明では、ReIIIにおいて6個以下のシアノと1つ以上のL、若しくは、MoIV又はWIVにおいて7個以下のシアノと1つ以上のLを用いることができる。WIV系をもつEAMは、より不活性で、より作製が容易で、より好ましい還元電位を持つことから、他のものに対して非常に有利である。一般的に、CN/L比が大きい方ほど移動が大きくなる。炭素、酸素、硫黄、及びリンを用いた好適なσ供与リガンドは、当技術分野で既知である。例えば、適当なσ炭素供与体は、CottonandWilkensonAdvancedOrganicChemistry5lhEditionJohnWileySons1988などに見出される参照により本明細書に援用される;例えば38ページを参照。同様に、適当な酸素リガンドとしては、クラウンエーテル、水、及びその他の当技術分野において既知のものが含まれる。ホスフィン及び置換ホスフィンも同様に好適である;CottonandWilkensonの38ページを参照。酸素、硫黄、リン、及び窒素供与リガンドは、ヘテロ原子が配位原子として働くことができるように結合される。いくつかの実施形態では、有機金属リガンドが用いられる。酸化還元部分として用いるための純粋な有機化合物や、供与原子が複素環置換基又は環外置換基であるδ結合した有機リガンドを有する種々の遷移金属配位錯体に加えて、π結合した有機リガンドを有する様々な遷移金属有機金属化合物を用いることができるAdvancedInorganicChemistry5lhEdCottonWilkinsonJohnWileySons1988chapter26;OrganometallicsAConciseIntroductionElschenbroichetal2ndEd1992VCH;及びComprehensiveOrganometallicChemistryIIAReviewoftheLiterature19821994AbeletalEdVol7chapters781011PergamonPressを参照;参照により本明細書に明示的に援用する。このような有機金属リガンドには、シクロペンタジエニドイオン[C5H5-1]などの環状芳香族化合物、及び、インデニリド-1イオンなどの様々な環置換及び環縮合誘導体が含まれ、ビスシクロペンタジエニル金属化合物すなわちメタロセンのクラスを形成する;例えば、RobinsetalJAmChemSoc10418821893;及びGassmanetalJAmChemSoc10842284229を参照参照により本明細書に援用される。このうち、フェロセン[C5H52Fe]及びその誘導体は典型的な例であり、様々な化学的ConnellyetalChemRev96877910、参照により本明細書に援用される及び電気化学的GeigeretalAdvancesinOrganometallicChemistry23193;及びGeigeretalAdvancesinOrganometallicChemistry2487、参照により本明細書に援用される電子移動又は酸化還元反応に用いられている。様々な第一、第二、及び第三遷移金属のメタロセン誘導体は、核酸のリボース環又はヌクレオシド塩基に共有結合する酸化還元部分として可能性のある候補である。その他の可能性のある好適な有機金属リガンドとしては、ベンゼンなどの環状アレーンが含まれ、ビスアレーン金属化合物、並びにその環置換及び環縮合誘導体を形成し、ビスベンゼンクロムが典型的な例である。その他の非環式のπ結合したリガンド、例えばアリル-1イオン又はブタジエンは、可能性のある好適な有機金属リガンドを与え、これらのリガンドはすべて、他のπ結合及びδ結合したリガンドとの伝導において、金属-炭素結合を有する有機金属化合物の一般的なクラスを構成している。架橋有機リガンドを持つ化合物及び追加の非架橋リガンドを持つ化合物、並びに金属-金属結合を持つ又は持たない化合物の種々のダイマー及びオリゴマーの電気化学的研究は、核酸分析において、可能性のある酸化還元部分の候補である。共リガンドの1つ以上が有機金属リガンドである場合、通常、リガンドは有機金属リガンドの炭素原子の1つを介して結合するが、複素環リガンドでは他の原子を介して結合してもよい。好適な有機金属リガンドとしてはメタロセンリガンドが含まれ、これは置換誘導体及びメタロセンオファンmetalloceneophanesを含む前掲のCottonandWilkenson、1174ページを参照。例えば、メチルシクロペンタジエニルなどのメタロセンリガンドの誘導体ペンタメチルシクロペンタジエニルなどの複数のメチル基を有するものが好ましいを、メタロセンの安定性を高めるために用いることができる。ある好適な実施形態では、メタロセンの2つのメタロセンリガンドの一方だけが誘導体化される。本明細書に記載するように、リガンドは任意に組み合わせて用いることができる。好適な組み合わせには、aすべてのリガンドが窒素供与リガンドである;bすべてのリガンドが有機金属リガンドである;及びc伝導性オリゴマーの末端のリガンドがメタロセンリガンドであり、核酸が提供するリガンドが窒素供与リガンドであり、必要に応じてその他のリガンドが窒素供与リガンド又は有機金属リガンド、若しくはその混合物であるものが含まれる。一般的に、非大環状キレート剤を含むEAMは、金属イオンに結合して非大環状キレート化合物を形成するが、その理由は、金属の存在によって、複数のプロリガンドが互いに結合し、多くの酸化状態が作られるからである。いくつかの実施形態では、窒素供与プロリガンドが用いられる。好適な窒素供与プロリガンドは当技術分野において周知であり、例えばこれらに限定されないが、以下のものが含まれる:NH2;NHR;NRR’;ピリジン;ピラジン;イソニコチンアミド;イミダゾール;ビピリジン及びビピリジンの置換誘導体;ターピリジン及び置換誘導体;フェナントロリン、特に1,10-フェナントロリン略記phen、及びフェナントロリンの置換誘導体、例えば4,7-ジメチルフェナントロリン及びジピリドール[3,2-a:2’,3’-c]フェナジン略記dppz;ジピリドフェナジン;1,4,5,8,9,12-ヘキサアザトリフェニレン略記hat;9,10-フェナントレンキノンジイミン略記phi;1,4,5,8-テトラアザフェナントレン略記tap;1,4,8,11-テトラ-アザシクロテトラデカン略記cyclam及びイソシアニド。縮合誘導体を含む置換誘導体を用いることもできる。金属イオンを配位的に飽和させず、また別のプロリガンドを加えることが必要な大環状リガンドは、本用途では、非大環状と見なされる。当業者が理解するように、複数の非大環状リガンドを共有結合させて、配位的に飽和された化合物を形成することができるが、これには環状骨格がない。いくつかの実施形態では、単座例えば、少なくとも1つのシアノリガンド、二座、三座、及び多座のリガンド飽和するまでの混合物をEAMの構築に用いることができる。一般的に、遷移金属錯体が溶媒にアクセス可能であるsolventaccessibleかどうかは、リガンドの組成又は特性によって決まる。本明細書において、溶媒にアクセス可能な遷移金属錯体又は文法上それに対応するものは、少なくとも1つ、好適には2つ、より好適には3つ、4つ又はそれ以上の小分子極性リガンドを有する遷移金属錯体を意味する。極性リガンドの実際の数は、金属イオンの配位数nによって決まる。極性リガンドの好適な数は、n-1及びn-2である。例えば、以下により詳しく述べるように、Fe、Ru、Osなどの配位数が6の金属では、溶媒にアクセス可能な遷移金属錯体は、他の部位の条件に応じて、1~5個、好適には2~5個、特に好適には3~5個の小分子極性リガンドを有することが好ましい。PtやPdなどの配位数が4の金属は、1個、2個、又は3個の小分子極性リガンドを有することが好ましい。溶媒にアクセス可能及び溶媒阻害は関連する用語である。すなわち、加えられたエネルギーが高ければ、溶媒にアクセス可能な遷移金属錯体であっても、電子の移動が引き起こされる場合がある。溶媒にアクセス可能な金属、及び対応するEAMは、米国特許出願公開第2011/0033869号、第2010/0003710号、及び第2009/0253149号に記載されており、これらすべては、その全体、及び特に記載される図及び定義が、明示的に本明細書に援用される。EAMのいくつかの例を本明細書に記載する。シアノ系cyanobased錯体一態様では、本発明は、遷移金属及び少なくとも1つのシアノ-C≡Nリガンドを有するEAMを提供する。金属の価数及び系の構成例えば、捕捉リガンドが配位原子を提供するなどに応じて、1、2、3、4、又は5個のシアノリガンドを用いることができる。一般的には、最も多いシアノリガンドを用いる実施形態が好ましい;この場合も、系の構成によって決まる。捕捉リガンドとは別に結合された、オスミウムなどの六座の金属を用いるEAMは、5個のシアノリガンドを用いることができ、6番目の配位部位は結合リンカーの末端で占有される。六座の金属が、配位原子を提供する結合リンカーと捕捉リガンドとを両方持つ場合、4個のシアノリガンドが存在し得る。いくつかの実施形態では、結合リンカー及び/又は捕捉リガンドは、1より大きい数の配位原子を提供することができる。したがって、例えば、結合リンカーは、2つの配位原子を提供するビピリジンを含む。いくつかの実施形態では、シアノリガンド以外のリガンドを、少なくとも1つのシアノリガンドと組み合わせて用いることができる。Ru-N系錯体一態様では、本発明は、配位が単座、二座、三座、又は多座である、Ru-N系錯体の新たな構造を提供する。したがって、配位リガンドLアンカー及び捕捉リガンドに共有結合するものの数は、1、2、3、又は4個であり得る。電荷中和リガンドは、当技術分野で周知の任意の好適なリガンドであってよく、本明細書に述べるように、例えば、ジチオカルバメート、ベンゼンジチオレート、又はシッフ塩基が含まれる。捕捉リガンド及びアンカーは、同一のフレームワークに又は別々に存在し得る。本発明の別の態様では、EAMリガンド構造の各成分は、Ruの配位化学ではなく、共有結合により結合されている。本明細書に記載する構造の構築は、最新の合成有機化学的方法論に従う。設計で考慮すべき重要な点としては、アンカー及び捕捉リガンド成分中と配位リガンド成分中に存在する官能基の必須の直交的反応が含まれる。好適には、化合物全体が合成でき、合成の最終工程の付近で、酸化還元活性遷移金属をリガンドに配位する。本明細書に記載する配位リガンドは、確立されたルテニウムペンタアミン前駆体の無機方法論に従う。GerhardtandWeekJOrgChem7163366341;SizovaetalInorgChimActa357354360;及び、ScottandNolanEurJInorgChem18151828を参照参照によりこれらすべてが本明細書に援用される。当業者が理解するように、本明細書に記載する化合物のアンカー成分は、アルキルと多足性チオールとの間で交換可能である。フェロセン系EAMいくつかの実施形態では、EAMは置換フェロセンを含む。フェロセンは空気中で安定である。フェロセンは、捕捉リガンド及びアンカー基の両方によって容易に置換される。標的タンパク質がフェロセン上の捕捉リガンドに結合すると、フェロセンの周囲の環境を変化させるだけでなく、シクロペンタジエニル環の回転を阻害し、それによりエネルギーを約4kJ/mol変化させる。国際公開第1998/57159号;HeinzeandSchlenkerEurJInorgChem29742988;HeinzeandSchlenkerEurJInorgChem6671;及び、HollemanWibergInorganicChemistryAcademicPress34thEdat1620、参照によりこれらすべてが本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、アンカー及び捕捉リガンドは、より簡単な合成のために、同一のリガンドに結合される。いくつかの実施形態では、アンカー及び捕捉リガンドは異なるリガンドに結合される。本明細書に開示する新たな構造の構築に用いることができる多くのリガンドが存在する。例えば、これらに限定されないが、カルボン酸塩、アミン、チオレート、ホスフィン、イミダゾール、ピリジン、ビピリジン、ターピリジン、tacn1,4,7-トリアザシクロノナン、サレンN,N’-ビスサリチリデンエチレンジアミン、アカセンN,N’-エチレンビスアセチルアセトンイミネート-、EDTAエチレンジアミン四酢酸、DTPAジエチレントリアミン五酢酸、Cpシクロペンタジエニル、ピンサー型pincerリガンド、及びスコルピオネートが含まれる。いくつかの実施形態では、好適なリガンドはペンタアミンである。ピンサー型リガンドは、特殊な種類のキレートリガンドである。ピンサー型リガンドは、それ自身で金属中心のまわりを包み、金属の両側及びその間に結合を形成する。金属核電子に対するピンサー型リガンドの化学作用の効果は、アミン、ホスフィン、及び混合供与体リガンドと似ている。これは、金属の活性を目的に合わせて作ることができる独特な化学的状態を作る。例えば、ピンサー型リガンドを適応させるには、錯体の立体構造に対する高い要求があるため、金属が関与できる反応は制限され、選択的である。スコルピオネートリガンドは、facの形で金属に結合する三座リガンドを意味する。スコルピオネートの最も一般的なクラスは、トリスピラゾリルヒドロホウ酸塩又はTpリガンドである。CpリガンドはTpに対してアイソローバルisolobalである。いくつかの実施形態では、以下の制限が望ましい:金属錯体が、溶媒と密接することを可能にする小分子極性リガンドを有する。電荷中和リガンド別の態様では、本発明は、荷電リガンドを含む金属錯体を有する組成物を提供する。中性から荷電に変化させる系の再構築エネルギー例えば、M<->M0;M-<->M0は、極性化していない環境への変化、又はその環境からの変化に適応するために水分子がさらに再構築されることで単純に電荷が変化する系のもの例えば、M2<->M3よりも大きい場合がある。いくつかの実施形態では、アンカー及び捕捉リガンドを金属中心に結合するために、荷電リガンドの陰イオン性化合物を用いることができる。ハロゲン化物イオンXを錯体内圏に有する金属錯体は、これらに限定されないが以下のものを含む荷電リガンドと反応する:チオールR-SH、チオレートRS-E;E=脱離基、すなわち、トリメチルシリル基、炭酸、ジチオール、炭酸塩、アセチルアセトネート、サリチル酸塩、システイン、3-メルカプト-2-メルカプトメチルプロパン酸。この反応の原動力はHX又はEXの形成である。陰イオンリガンドが捕捉リガンド及びアンカーの両方を含む場合、1つの置換反応が必要であり、そのため、反応する金属錯体は内圏に1つのハロゲンリガンドを有する必要がある。アンカー及び捕捉リガンドが別々に導入される場合、出発物質は一般的に配位内圏に2つのハロゲン化物を含む必要がある。SeideletalInorgChem3765876596;KathariandBuschInorgaChem822762280;IsiedandKuehnJAmChemSoc10067526754;及び、VolkersetalEurJInorgChem47934799、参照によりこれらすべてが本明細書に援用される。好適な金属錯体の例は以下である以下に示す構造は、複数の単座リガンドを表し、多座リガンドは、シアノリガンドなどの単座リガンドの代用とすることができ、又はそれと組み合わせることができる:いくつかの実施形態では、以下の例のように、電荷中和リガンドとしてジチオカルバメートが用いられる。いくつかの実施形態では、以下の例のように、電荷中和リガンドとしてベンゼンジチオレートが用いられる。上記の構造において、Lnは配位リガンドを示し、n=0又は1である。いくつかの実施形態では、EAMはシッフ塩基系の錯体を含む。本明細書において、シッフ塩基又はアゾメチンとは、窒素原子がアリール又はアルキル基に結合しているが、水素に結合していない炭素-窒素二重結合を含む官能基を意味する。シッフ塩基は一般式R1R2C=N-R3で表され、R3はシッフ塩基を安定なイミンにするフェニル又はアルキル基である。シッフ塩基は、芳香族アミンとカルボニル化合物から求核付加によりヘミアミナールを形成し、続いて脱水によりイミンを生成することで合成できる。アカセンacacenは、小さい平面状の四座リガンドで、その窒素原子と酸素原子を介して周囲の水分子と水素結合を形成することができ、これにより再構築エネルギー効果が高まる。アカセンは多くの官能基で修飾でき、例えば、これらに限定されないが、カルボン酸及びハロゲン化物が含まれ、これらはアカセンリガンドを捕捉リガンド及びアンカー基に結合させるために用いることができる。これにより、EAMにおいて様々な異なる金属中心を用いることができる。このリガンドは2つの酸素原子および2つの窒素原子によって結合するため、4つの配位部位だけが占有されている。そのため、金属中心によっては、さらに2つの配位部位が空いている。これらの配位部位は、様々な有機及び無機リガンドで占有することができる。これらの追加的な空いた部位は、内圏の置換例えば、不安定なH2O又はNH3をタンパク質結合により置換できる、又は外圏の作用例えば、H結合にCO、CNに利用し、捕捉リガンドが標的に結合した際の電位のシフトを最適化することができる。国際公開第1998/057158号、国際公開第1997/21431号、LouieetalPNAS9566636668、及び、BottcheretalInorgChem3624982504、参照によりこれらすべてが本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、サレン錯体も用いられる。SyamaletalReactiveandFunctionalPolymers392735。いくつかのアカセン系錯体及びサレン系錯体の構造を以下に示す。捕捉リガンド及び/又はアンカーによる官能化に適したリガンド上の位置は、アスタリスクで示している。アカセンをリガンドとして用いてコバルト錯体を形成する1つの例を以下に示す:式中、A及びBは置換基を示し、Lnは配位リガンドを示し、n=0又は1である。スルファトsulfatoリガンドいくつかの実施形態では、EAMはスルファト錯体を含み、例えばこれらに限定されないが、[L-RuIIINH34SO4]及び[L-RuIIINH34SO2]2が含まれる。SO4-RuIII錯体は空気中で安定である。リガンドLは捕捉リガンド及びアンカーを含む。硫酸塩リガンドは、アミンよりも極性が高く、負に荷電されている。そのため、表面の錯体は、[L-RuNH35-L’]及び[L-RuNH35]2よりも多くの水分子によって囲まれる。IsiedandTaubeInorgChem1315451551、参照により本明細書に援用される。スペーサー基いくつかの実施形態では、EAM又はReAMCは、結合リンカーと電極との結合を可能にする官能基部分を通常さらに含む結合リンカー又はスペーサースペーサー1を介して、アンカー基電極に結合しているに共有結合している。例えば、米国特許第7,384,749号を参照のことその全体、及び特に結合リンカーについての記述が、参照により本明細書に援用される。金電極の場合、硫黄原子を官能基として用いることができる本発明の目的のため、この結合は共有結合と考えられる。本明細書において、スペーサー又は結合リンカーとは、酸化還元活性錯体を電極の表面から離した状態とする部分を意味する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、本明細書に概説するように伝導性オリゴマーであるが、好適なスペーサー部分には、以下に概説するように不動態化剤及び絶縁体が含まれる。いくつかの場合では、スペーサー分子はSAM形成種である。スペーサー部分は、実質的に非伝導性であってもよいが、好適には必須ではないが、酸化還元活性分子と電極HABの間の電子結合は、電子移動の律速段階とはならない。また、ReAMCを用いる場合、結合リンカーは、捕捉リガンドの配位原子と捕捉リガンド自体との間に用いることができる。同様に、結合リンカーは分枝状であってもよい。さらに、結合リンカーは、ReAMCに関与していない場合、捕捉リガンドを電極に結合させるために用いることができる。結合リンカーの一端はEAM/ReAMC/捕捉リガンドに結合し、他端しかし、当業者が理解するように、どちらも厳密な末端である必要はないは、電極に結合している。酸化還元活性分子を含む伝導性オリゴマーの共有結合及び、他のスペーサー分子の結合は、使用する電極と伝導性オリゴマーに応じて、様々な方法で達成される。例えば、米国特許出願公開第20020009810号の構造12~19及び付随する文章を参照参照によりその全体が本明細書に援用される。一般的に、スペーサーの長さは、米国特許第6,013,459号、第6,013,170号及び第6,248,229号、並びに第7,384,749号において伝導性オリゴマー及び不動態化剤について概説される通りであるこれらはすべて、参照によりその全体が本明細書に援用される。当業者が理解するように、スペーサーが長くなりすぎると、酸化還元活性分子と電極との間の電子結合は急激に減少する。作製方法別の態様では、本発明は、本明細書に記載する組成物の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、米国特許第6,013,459号、第6,248,229号、第7,018,523号、第7,267,939号、米国特許出願第09/096593号及び第60/980,733号、2008年8月7日に提出された米国仮出願番号第61/087,102号これらは、すべての目的のためにその全体が本明細書に援用されるに開示される方法に従って作製される。ある実施形態では、以下に示す化合物1末端フェロセン基及びマレイミド基を有する非対称ジアルキルジスルフィドを、実施例に詳細に示すように、合成して金電極上に沈着させた。診断本発明は、試料中のPCSPに対する酵素活性、具体的には試料中のPSAの酵素活性に基づく前立腺疾患の診断法を提供する。いくつかの実施形態では、受信者動作特性ROC曲線分析により、選択したバイオマーカーの異なる切断点での感度及び特異性を評価する。ROC曲線上の各点は、選択したバイオマーカーの値の特定の決定しきい値正規化したもの、又はしていないものに対応する感度/特異性の対を表す。当技術分野で周知のように、ROC曲線は診断試験評価の基本ツールである。ROC曲線では、有病正診率感度を無病誤診率100-特異性の関数中に、1つ又は複数のパラメーターの異なる切断点でプロットする。ROC曲線上の各点は、特定の決定しきい値に対応する感度/特異性の対を表す。ROC曲線の下側の領域は、パラメーターが2つの診断グループ疾患/正常をどれだけ区別できるかを示す指標となる。そのため、ROC曲線分析は、疾患のケースと正常なケースとを判別する試験の診断能力の評価、又は試験の精度を評価するために実施されるMetz1978ZweigandCampbell1993。また、ROC曲線は、2つ以上の試験所又は診断テストの診断能力の比較にも用いることができるGrineretal1981。本発明では、ROC曲線は、以下に述べる1つのパラメーター又はパラメーターの組み合わせを用いて、確立した試料例えば、予め確認された独立した診断試料により、前記の対象を疾患グループと非疾患グループの2つの異なるグループに分類する盲検試験によって作成される。本発明では、ROC曲線は、単一のパラメーター、例えば、本明細書に定義する試料中のPCSPに対する酵素活性又はPSA酵素活性を用いて作成される。あるいは、ROC曲線は、これらに限定されないが、以下を含むリストから任意に独立して選択される1つ以上のパラメーターを用いて作成される:a試料中の酵素活性;b前立腺容量;cグリーソンスコア;c血清中の全PSA、遊離PSA、及び、又は、遊離PSA/全PSAの比率;d活性を試験した試料中の全PSA;f前立腺液の量当技術分野で既知のように一般的に亜鉛濃度を用いて正規化される;g尿の量一般的にクレアチニンの量を用いて正規化される;hHGPin、及びiPIN。いくつかの実施形態では、酵素活性と上記リストの任意の他のパラメーターとを組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、ROC曲線は2つのパラメーターを用いて作成され、例えばこれらに限定されないが、以下のものが含まれる:a試料中の酵素活性と前立腺容量;b試料中の酵素活性と全PSA試料中で活性なもの及び非活性なもの例えば結合したものを含む;c試料中の酵素活性と全PSA患者の血清中で活性なもの及び非活性なもの例えば結合したものを含む;d試料中の酵素活性とグリーソンスコア。いくつかの実施形態では、ROC曲線は3つのパラメーターを用いて作成され、例えばこれらに限定されないが、以下のものが含まれる:a試料中の酵素活性、試料中の全PSA量、及び前立腺容量、並びに、b試料中の酵素活性、血清中の全PSA量、及び前立腺容量。当業者が理解するように、多重パラメーター分析は、除法例えば、試料中の酵素活性を前立腺容量で割る、乗法、又は定数を作るその他の方法で行うことができる。一度作成すれば特定の値が得られ、これにより、確立されたROC曲線によって決定されるしきい値と比較することで新たな臨床試料の診断が可能になる。さらに、又はあるいは、単一又は多重パラメーター分析は、既存の前立腺癌及び前立腺疾患のリスクノモグラムと組み合わせることができる。当技術分野において周知のように、ノモグラムは様々な要素を用いて作成され、試料のPCSPに対する酵素活性及び/又はPSA酵素活性もそれに加えることができる。さらに、又はあるいは、ROC曲線は、2以上の正常な例えば疾患を持たない患者、前立腺癌の患者、及び/又は癌ではない前立腺疾患例えばBPHの患者から得た試料を用いて作成することができる。これらのROC曲線は、以下の要素の1つ以上に対して正規化した試料中の酵素活性を用いて作成することができる:a前立腺容量;bグリーソンスコア;c血清中の全PSA、遊離PSA、及び、又は、遊離PSA/全PSAの比率;d活性を試験した試料中の全PSA;e前立腺液の量当技術分野で既知のように一般的に亜鉛濃度を用いて正規化される;f尿の量一般的にクレアチンレベルを用いて正規化される;gHGPin、及びhPIN。別の実施形態では、ザイモグラフィーを用いて、PCSPに対する試料中のプロテアーゼの酵素活性を測定する。ザイモグラフィーは、一般的に、基質を含むゲル中で又は電気泳動ゲル試験後のオーバーレイを用いて天然の条件下で例えば、還元剤や界面活性剤の非存在下試料を泳動する電気泳動技術である。Webberetalに記載されるように、プロテアーゼの細胞外マトリクス分解能を評価するための手法であるPSA-SDS-PAGEザイモグラフィーにより、PSAはゼラチン分解プロテアーゼ活性を示している。Webberetalでは、精液中のセメノゲリン及びフィブロネクチンに対するプロテアーゼの生理活性によるフィブロネクチン及びラミニンの分解を用いたPSA活性の測定について述べている。WebberetalClinCancerRes11089参照により本明細書に援用される。このため、本明細書に概説するように、ある実施形態では、基質はゲルに組み込まれ、この基質はフィブロネクチン様基質であってよく、測定は、一般的に、酵素が存在するゲルの不透明度の変化に基づくか、又は光学的ペプチド基質の使用による発色シグナルの発生によって行う。基質をゲルに組み込む方法に代えて、電気泳動の終わりに、さらなるゲル又はゲルに加える発光基質を含む溶液によるオーバーレイゲルを用いることもできる。一般的に、校正は、濃度計又は光学式読み取り装置蛍光発生基質の場合は、蛍光光度計を含むによって行う。前立腺癌における前立腺特異的抗原PSAの役割は明らかになっていない。前立腺癌のバイオマーカーとして用いられているが、癌との相互関係は必ずしも直接的ではない。本発明は、前立腺癌の存在又は非存在に関連し、正常と良性疾患例えば良性前立腺肥大症BPHとを区別することができる簡易検定法を提供する。実施例1UrologicalResearchFoundationから30個の臨床尿試料を入手した。匿名化したこれらの尿試料は、血清tPSAが高い患者からDRE前立腺マッサージ後に採取した。試料には、生検で確認され、グリーソンスコアが6以上である陽性の前立腺癌患者の試料が15個、及び前立腺の生検は正常だがBPHを持つ陰性患者の試料が15個含まれる。市販の蛍光性ペプチドHSSKLQ-AMCを用いて、前述のように蛍光発光切断アッセイfluorescencecleavageassayを盲検的に実施した。DenmeadeetalCanRes5749244930。結果を図2に示す。陰性対照試料の大部分は最小限のPSA活性を示し、一方、癌が確認された群ではPSA活性レベルの中央値は高く、これは、血清t-PSAレベルの結果とは全く逆となっている。この活性の一因となる他の数値があるかどうかを示すため、広範囲な統計分析を実施した。調査した臨床的数値を下記の表に示す過去の数値は最大7回まで収集した。これにより、患者の前立腺容量が偽陽性及び偽陰性の一因となっている可能性が見出された。したがって、活性データは前立腺容量で正規化し例えば、ペプチド活性を患者の前立腺容量で割る、これにより2つの集団に対する統計的に異なる数値が得られた。また、尿試料中の全PSA量の活性の正規化によって、同様のより良い相関が得られた。実施例2別の47個の試料一式を採取した。前回同様の活性が確認されている。これら一式について、試料自体についても試験し、尿の自己蛍光を活性曲線から引き、より良い結果が得られた。この工程は、先の30試料を用いた分析では行っていない。これらのデータについても、市販の血清t-PSA値は一切相関が見られないだけでなく、事実上負のバイオマーカーであり、癌の平均はBPH患者のものより低い直観に反する。しかし、PSA活性については、癌患者の平均はBPHの患者より高く、先の分析の結果と一致する。下記のグラフにより明らかなように、活性データを全PSAの存在と前立腺容量とで正規化することで、同様により良く区別される。再び、本明細書に述べるすべての関連するバイオマーカーについて、同様のROC曲線分析を行ったが、図中の曲線下面積AUC値の増加及びp値の減少に見られるように、活性は血清t-PSAよりも優れたバイオマーカーであることが明らかである。実施例3同様にPSAにより切断され、AMIDEペプチドに類似した別の基質であるHIC及びHIVが、試料中の別の酵素、特にエステラーゼによって加水分解され得るかどうかを試験するため、対照実験を実施した。この切断の事象は蛍光定量的に検出することはできないが、これは、グルタミンQアミノ酸が発蛍光団AMCに結合したままとなり、蛍光シグナルの発生を阻害するためである。さらに、試料中のPSAはこの配列Q-AMCを認識せず、そのため偽陰性の結果をもたらす。この試験は、尿試料ペプチド基質;0.4mMと犠牲エステルアラニンメチルエステル;40mMの有無により行った。試料中にエステラーゼが存在すれば、比較的高い濃度のエステルを加えることでペプチド基質の切断が阻害され、その結果、基質の転換turnoverがより高まると考えられる。1回の実験を行った結果では、エステルの有無により違いが見られないことが示されている。そのため、考えられる選択肢は以下である:aエステラーゼがこの特定の試料中に存在しない;bエステラーゼが存在した場合、ペプチド基質は切断せず、犠牲エステルを切断する、及びcエステラーゼが存在した場合、犠牲エステルは切断せず、ペプチド基質を切断する。この活性アッセイで考慮すべき別の要素は、陽性シグナルを発生しうる尿中の別のプロテアーゼPSA以外、又はPSAの別のアイソフォームの可能性である。ペプチド基質に作用するプロテアーゼがPSAだけであることを実証するため、PSAに対して抗触媒活性を持つことが示されているモノクローナル抗体Dako社より入手可能、mAb0750、クローンER-PR8の有無により試料を試験した。両方の試料について、活性の減少が見られたが、シグナルが完全に失われることはなかった。可能性としては以下が含まれる:a活性で基質を切断する他のプロテアーゼが試料中に存在する、及びbPSA活性を完全に抑えるにはより高い濃度のmAbが必要。実験PSA酵素活性を測定するための光学的検定法試薬:バッファーA:50mMトリスHCl、1.5MNaCl、2mg/mLBSA、pH=7.5、Mor-HSSKLQ-AMC;PeptidesInt.ロット919961;MW=956.03g/mol;バッファーA中0.4mM。Mor-HSSK-Hic-Q-AMC;PeptidesInt.ロット000111C;MW=970.06g/mol;バッファーA中0.4mM。Mor-HSSK-Hiv-Q-AMC;PeptidesInt.ロット922391;MW=955.44g/mol;バッファーA中0.4mM。PSA;ScrippsLaboratories、1アリコート2ug/20uL;ロット2364501;MW=33,000;586uLのバッファーAを添加=100nM。7-アミノ-4-メチルクマリンAMC;Aldrich、MW=175.18g/mol、DMSO中22.2mM。抗触媒mAbM0750;Dako;ロット00060404;66mg/mL、α-キモトリプシン;SigmaC3142;ロット026K7695;MW=25,000;バッファーA中100nM、トリプシン-タイプ1;SigmaT8003;ロット037K7015;MW=23,800;バッファーA中100nM、トシルフェニルアラニンクロロメチルケトンTPCK;Acros、99、ロット227800010、MW=351.84g/mol、DMSO中21mM、フッ化フェニルメタンスルホニルPMSF;Sigma、98.5、ロット080M1169U、174.19g/mol、DMSO中21mM、ZnCl2;Aldrich、136.3g/mol;バッファーA中220nmBSA含まず。試料:D1~D47臨床尿試料をノースウェスタン大学のWilliamCatalona博士より入手した。各500uLの試料を10個に分注し、使用時まで-80°Cで保管した。匿名の研究ボランティアから得た男性尿コントロール。匿名の研究ボランティアから得た女性尿コントロール。機器:BiotekSynergy登録商標4マルチプレートリーダー;蛍光モード380nm励起/450nm発光;Costar96ウェルマイクロプレートCorning、3603実験の概要:線形蛍光範囲を決定するためのAMC試薬6の段階希釈PSA試薬5の段階希釈基質Mor-HSSKLQ-AMC試薬2Mor-HSSK-Hic-Q-AMC試薬3Mor-HSSK-Hiv-Q-AMC試薬4α-キモトリプシン試薬8の段階希釈基質Mor-HSSKLQ-AMC試薬2Mor-HSSK-Hic-Q-AMC試薬3Mor-HSSK-Hiv-Q-AMC試薬4トリプシン-タイプ1試薬9の段階希釈基質Mor-HSSKLQ-AMC試薬2Mor-HSSK-Hic-Q-AMC試薬3Mor-HSSK-Hiv-Q-AMC試薬4TPCK試薬10及びPMSF試薬11を用いたPSA及びキモトリプシン活性の阻害a.基質としてMor-HSSKLQ-AMC試薬2b.基質としてMor-HSSK-Hiv-Q-AMC試薬4D1~D47臨床試料二重;50uL150uL基質2D1~D47臨床試料一重;50uL150uL基質2D1~D47臨床試料一重;50uL150uL基質2原臨床試料D5、D6、D21、D22、D27、D29、臨床試料一重;50uL基質3原試料抗触媒活性mAb基質試薬2D39又はD40マイクロプレート実験の一般的手順所望の臨床尿試料を室温で解凍し、穏やかにボルテックスし、短時間遠心分離して<20秒、チューブの底に試料を堆積させた。試料を50uLずつピペットで96ウェルマイクロプレートに移した。PSA標準物質20uLを調製し、同様に入れた。マルチチャンネルピペットを用いて、基質150uLを一度に1列ずつ移し、開始時間を記録した。プレート全体の充填を終えた後、マイクロプレートリーダーに挿入し、10分ごとに2~12時間分析した。タンパク質希釈の一般的手順:7個の低結合性マイクロ遠心チューブを並べ、190μLのタンパク質保存液をチューブ1に加え、残りのチューブには130μLのバッファーAを加えた。チューブ1から2に60μLを移し、ボルテックスし、短時間遠心分離した。チューブ2から60μLを取り、チューブ3に加え、ボルテックスし、遠心分離した。最終的な濃度は、25.0nM-0.25nMとなった。実験の詳細:線形蛍光範囲を決定するためのAMC試薬6の段階希釈:試薬635.9uLを2.0mLのバッファーAに希釈し、0.4mMの濃度とした。1:2希釈を行い、最終濃度範囲は0.4mM~0.024uMとなった。これを96ウェルマイクロプレートに2ウェルずつ入れ、スキャンを1回行った。PSA試薬5の段階希釈基質:20uLの各PSA標準物質の標準溶液上記タンパク質希釈の一般的手順を参照を96ウェルマイクロプレートに2ウェルずつ入れ、次にペプチド基質のバッファーA溶液150uLを加え上記一般的手順を参照、少なくとも3時間、スキャンを行った。α-キモトリプシン試薬8の段階希釈基質:試薬8を用いたこと以外は実験2と同じ。トリプシン-タイプ1試薬9の段階希釈基質:試薬9を用いたこと以外は実験2と同じ。TPCK、PMSF、及び亜鉛を用いたPSA及びキモトリプシン活性の阻害。96ウェルマイクロプレートに、20uLの酵素溶液133.3nMのバッファーA溶液;下記プレートマップを参照を入れた。190uLの試薬2及び試薬4を8~12列に入れた。マルチチャンネルピペットを用いて、各基質溶液を180uLずつ移し、反応を開始させた7から1;8から2;9から3;10から4;11から5;12から6。プレートは10分ごとにスキャンしながら77分間読み取り、その後、それぞれの阻害剤10uLを対応するウェルに加えた。プレートはさらに123分間読み取った。D1~D47臨床試料二重;50uL150uL基質2臨床試料D1~D47を96ウェルマイクロプレートに入れ上記手順参照、PSAの標準希釈物を加えた2ウェルずつ。150uLの試薬2を各列に加えて反応を開始し、プレートを10分ごとに12時間スキャンした。D1~D47臨床試料一重;50uL150uL基質2臨床試料D1~D47を96ウェルマイクロプレートに入れ上記手順参照、PSAの標準希釈物を加えた2ウェルずつ。150uLの試薬2を各列に加えて反応を開始し、プレートを10分ごとに12時間スキャンした。D1~D47臨床試料一重;50uL150uL基質2原臨床試料臨床試料D1~D47を96ウェルマイクロプレートに2ウェルずつ入れ上記手順参照、PSAの標準希釈物を加えた2ウェルずつ。150uLの試薬2を臨床試料の第1のセットとPSAの希釈系列の各列に加えた。臨床試料の別のセットは150uLのバッファーAで希釈した尿の自己蛍光を差し引くため。プレートを10分ごとに8時間スキャンした。D5、D6、D21、D22、D27、D29臨床試料一重;50uL基質3原試料臨床試料を96ウェルマイクロプレートに2ウェルずつ入れた。試薬3150uLを第1のセットに加え、150uLのバッファーAを第2のセットに加えた。プレートを10分ごとに4時間スキャンした。抗触媒活性mAb基質試薬2D39又はD40データ解析:純粋なバッファー中で試験した試料から得られたデータは、蛍光対時間でプロットした。尿中で試験した試料臨床試料又はコントロールは、原尿試料基質を含まないと並べて試験し、バックグラウンドの自己蛍光を試料基質のデータから差し引いた。その後、これを蛍光対時間でプロットした。傾き活性を測定するため、100分~200分の時間のデータで線形回帰分析を行い、最良適合線から傾きを得た。R2の値が0.9より小さいデータは除外し、個別に検討した。"