癌形成能が無い細胞が実質的に除去された癌幹細胞の集団であって、癌組織の階層構造を再現する特徴を有する癌幹細胞集団。前記癌幹細胞がヒト腫瘍組織由来であることを特徴とする、請求項1に記載の癌幹細胞集団。前記ヒト腫瘍組織が、上皮癌由来の腫瘍組織であることを特徴とする、請求項2に記載の癌幹細胞集団。前記上皮癌が、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、消化管の癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、肝臓癌、胆管癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、又は、その他の腺組織の癌であることを特徴とする、請求項3に記載の癌幹細胞集団。実質的に均質であることを特徴とする、請求項1~4のいずれかに記載の癌幹細胞集団。ExtremeLimitingDilutionAnalysisにおいて癌幹細胞の頻度が120以上であることを特徴とする、請求項1~5のいずれかに記載の癌幹細胞集団。癌幹細胞を1x104個以上含むことを特徴とする請求項1~6のいずれかに記載の癌幹細胞集団。癌幹細胞を含む細胞群を付着培養する工程を含む方法により作製されることを特徴とする、請求項1~7のいずれかに記載の癌幹細胞集団。下記1~3の工程を含む方法により作製されることを特徴とする、請求項1~8のいずれかに記載の癌幹細胞集団;1癌幹細胞を含む細胞群を、同一又は異なる種に属する非ヒト動物に移植し、癌細胞塊を作製する工程、2作製された癌細胞塊を細分化する工程、及び32の工程により得られた細胞集団を幹細胞培地にて付着培養する工程。前記非ヒト動物が、ヌードマウス、SCIDマウス、NODSCIDマウス、NOGマウス、又はヌードラットのいずれかであることを特徴とする、請求項1~9のいずれかに記載の癌幹細胞集団。癌幹細胞を含む細胞群を付着培養する工程を含む、癌形成能が無い細胞が実質的に除去された癌幹細胞の集団を作製する方法。前記癌幹細胞を含む細胞群が、癌組織の階層構造を再現する細胞群であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。前記癌組織の階層構造を再現する細胞群が非ヒト動物で樹立した癌細胞株、スフェロイド、又は、癌幹細胞マーカーCD24、CD29、CD34、CD44、CD49f、CD56、CD90、CD117、CD133、CD135、CD166、CD184、CD271、CD326、Aldefluor、ABCG2、ABCG5、LGR5、及びMsi1から選択される少なくとも1つ以上のマーカーが陽性の細胞であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。付着培養を行う前に癌幹細胞を含む細胞群を増殖させることを特徴とする、請求項11~13のいずれか一項に記載の方法。スフェロイド培養により癌幹細胞を含む細胞群を増殖させることを特徴とする、請求項14に記載の方法。非ヒト動物に移植し継代することにより細胞群を増殖させることを特徴とする、請求項14に記載の方法。前記癌幹細胞が、ヒト腫瘍組織由来であることを特徴とする、請求項11~16のいずれか一項に記載の方法。前記ヒト腫瘍組織が、上皮癌由来の腫瘍組織であることを特徴とする、請求項17に記載の方法。前記上皮癌が、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、消化管の癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、肝臓癌、胆管癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、その他の腺組織の癌であることを特徴とする、請求項18に記載の方法。前記非ヒト動物が、ヌードマウス、SCIDマウス、NODSCIDマウス、NOGマウス、又はヌードラットのいずれかであることを特徴とする、請求項11~19のいずれか一項に記載の方法。請求項1~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のターゲット分子探索方法。下記1~4に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項21に記載の医薬品のターゲット分子探索方法;1請求項1~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、2該癌幹細胞集団の癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、32において採取した組織片についてDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び4組織片中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物を同定する工程。下記1~3に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項21に記載の医薬品のターゲット分子探索方法;1請求項1~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団をinvitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、2特徴構造を再現した培養細胞の、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び3培養細胞中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNA、タンパク質、ペプチド及び代謝産物を同定する工程。前記医薬品が抗癌剤であることを特徴とする、請求項21~23のいずれか一項に記載の方法。前記ターゲット分子が癌細胞マーカーであることを特徴とする、請求項21~24のいずれか一項に記載の方法。請求項1~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品の評価方法。下記1~5に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項26に記載の医薬品の評価方法;1請求項1~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、2被験物質を1の非ヒト動物モデルに投与する工程、3癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、4組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び5被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。下記1~4に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項26に記載の医薬品の評価方法;1請求項1~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団をinvitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、2被験物質で1の培養細胞を処理する工程、3癌幹細胞から形成される階層構造の変化、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を観察する工程、及び4被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。請求項1~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のスクリーニング方法。下記1~5に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項29に記載の医薬品のスクリーニング方法;1請求項1~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、2被験物質を1の非ヒト動物モデルに投与する工程、3癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、4組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び5特定の癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を阻害する被験物質を同定する工程。下記1~4に記載された工程を含むことを特徴とする、請求項29に記載の医薬品のスクリーニング方法;1請求項1~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団をinvitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、2被験物質で1の培養細胞を処理する工程、3癌幹細胞から形成される階層構造の変化、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を観察する工程、及び4特定の癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を阻害する被験物質を同定する工程。前記医薬品が、抗癌剤であることを特徴とする、請求項26~31のいずれかに記載の方法。前記invitro条件下での培養系が、スフェロイド培養であることを特徴とする、請求項21、23、26、28、29及び31のいずれか一項に記載の方法。本発明は、癌形成能が無い細胞が実質的に除去された癌幹細胞の集団であって、癌組織の階層構造を再現する特徴を有する癌幹細胞集団を提供することを課題とする。また本発明は、癌幹細胞を含む細胞群を付着培養する工程を含む、癌形成能が無い細胞が実質的に除去された癌幹細胞の集団を作製する方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、当該癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル若しくは当該癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系を用いた医薬品のターゲット分子探索方法、医薬品の評価方法、又は、医薬品のスクリーニング方法を提供することを課題とする。本発明者は上記課題を解決するために、鋭意研究を行った。本発明者らは高度免疫不全マウスで癌細胞株を樹立し、その樹立細胞株を用いて、階層構造を持つがんと階層構造を持たないがんを比較解析した。さらに、癌幹細胞モデルに帰属する階層構造を持つがんでは、その癌幹細胞の分離濃縮均質化大量培養の方法が無いため、解析や癌幹細胞を用いた薬剤のスクリーニングなどに支障が生じているため、その問題の解決を試みた。本発明者らは、これまでにヒト癌組織を、機能的なT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞を持たないNODSCIDgammacnullマウス以下、当該マウス及びNSGマウスNODscidIL2Rgnullマウスを本願ではNOGマウスと称するに移植することにより、複数のヒト癌細胞株を樹立した。この株はNOGマウス皮下で継代を重ねても、オリジナルの癌組織と同じ形態を有する癌組織を構築することから、細胞集団の中でヒト癌幹細胞が保存できると考えられる。そのため、NOGマウスで継代可能なヒト癌幹細胞は大変有用な研究ツールである。本発明者らはNOGマウスでヒト癌組織を繰り返し成長させ、癌細胞を分離した後、様々な培養法を比較した。その結果、一般的に用いる浮遊培養法ではなく、血清を含まない幹細胞培地を用いた付着培養法により、均質で、癌形成能がある細胞と無い細胞が実質的に混在しない癌幹細胞組成物を得ることに成功し、これにより本発明を完成するに至った。本方法によって入手した癌幹細胞は、血清を含まない幹細胞培地を用いて付着培養を継代して行うことにより、1ヶ月以上にわたり表現型を変化させることなく安定に維持された。この細胞は、これまで報告されている種々の大腸癌幹細胞マーカーCD133、CD44、EpCAM、CD166、CD24、CD26およびCD29を発現し、かつ、ほぼ100の頻度で癌形成能を示し、元の原発性腫瘍と同じ組織病理学的特性階層構造を有する腫瘍を再構築した。また、この細胞は、付着培養条件下で高増殖性を示し、細胞表面マーカーであるLgr5が陽性であることでも特徴付けられる。また、高増殖性でLgr5陽性の癌幹細胞は、マウス尾静脈から注射すると肺や肝臓等の臓器で腫瘍塊を形成したことから、癌の転移に重要な役割を担っていることが示された。一方、付着培養条件下で高増殖性を示し、細胞表面マーカーであるLgr5が陽性である癌幹細胞を、浮遊培養するか、イリノテカンや5FU等の抗癌剤で処理することにより、低増殖性でLgr5が陰性である癌幹細胞を単離することができた。この細胞もまた、高い癌形成能を示した。さらに、低増殖性でLgr5が陰性である癌幹細胞を分離して、再び付着培養条件で培養することにより、高増殖性でLgr5が陽性である癌幹細胞に変化することが示された。従って、高増殖性でLgr5陽性の癌幹細胞と、低増殖性でLgr5陰性の癌幹細胞は、相互に変換可能であり、自己交替機能を有することが示された。本発明は、より具体的には以下の1~33を提供するものである。1癌形成能が無い細胞が実質的に除去された癌幹細胞の集団であって、癌組織の階層構造を再現する特徴を有する癌幹細胞集団。2前記癌幹細胞がヒト腫瘍組織由来であることを特徴とする、1に記載の癌幹細胞集団。3前記ヒト腫瘍組織が、上皮癌由来の腫瘍組織であることを特徴とする、2に記載の癌幹細胞集団。4前記上皮癌が、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、消化管の癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、肝臓癌、胆管癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、又は、その他の腺組織の癌であることを特徴とする、3に記載の癌幹細胞集団。5実質的に均質であることを特徴とする、1~4のいずれかに記載の癌幹細胞集団。6ExtremeLimitingDilutionAnalysisにおいて癌幹細胞の頻度が120以上であることを特徴とする、1~5のいずれかに記載の癌幹細胞集団。7癌幹細胞を1x104個以上含むことを特徴とする1~6のいずれかに記載の癌幹細胞集団。8癌幹細胞を含む細胞群を付着培養する工程を含む方法により作製されることを特徴とする、1~7のいずれかに記載の癌幹細胞集団。9下記1~3の工程を含む方法により作製されることを特徴とする、1~8のいずれかに記載の癌幹細胞集団;1癌幹細胞を含む細胞群を、同一又は異なる種に属する非ヒト動物に移植し、癌細胞塊を作製する工程、2作製された癌細胞塊を細分化する工程、及び32の工程により得られた細胞集団を幹細胞培地にて付着培養する工程。10前記非ヒト動物が、ヌードマウス、SCIDマウス、NODSCIDマウス、NOGマウス、又はヌードラットのいずれかであることを特徴とする、1~9のいずれかに記載の癌幹細胞集団。11癌幹細胞を含む細胞群を付着培養する工程を含む、癌形成能が無い細胞が実質的に除去された癌幹細胞の集団を作製する方法。12前記癌幹細胞を含む細胞群が、癌組織の階層構造を再現する細胞群であることを特徴とする、11に記載の方法。13前記癌組織の階層構造を再現する細胞群が非ヒト動物で樹立した癌細胞株、スフェロイド、又は、癌幹細胞マーカーCD24、CD29、CD34、CD44、CD49f、CD56、CD90、CD117、CD133、CD135、CD166、CD184、CD271、CD326、Aldefluor、ABCG2、ABCG5、LGR5、及びMsi1から選択される少なくとも1つ以上のマーカーが陽性の細胞であることを特徴とする、12に記載の方法。14付着培養を行う前に癌幹細胞を含む細胞群を増殖させることを特徴とする、11~13のいずれか一項に記載の方法。15スフェロイド培養により癌幹細胞を含む細胞群を増殖させることを特徴とする、14に記載の方法。16非ヒト動物に移植し継代することにより細胞群を増殖させることを特徴とする、14に記載の方法。17前記癌幹細胞が、ヒト腫瘍組織由来であることを特徴とする、11~16のいずれか一項に記載の方法。18前記ヒト腫瘍組織が、上皮癌由来の腫瘍組織であることを特徴とする、17に記載の方法。19前記上皮癌が、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、消化管の癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、肝臓癌、胆管癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、又は、その他の腺組織の癌であることを特徴とする、18に記載の方法。20前記非ヒト動物が、ヌードマウス、SCIDマウス、NODSCIDマウス、NOGマウス、又はヌードラットのいずれかであることを特徴とする、11~19のいずれか一項に記載の方法。211~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のターゲット分子探索方法。22下記1~4に記載された工程を含むことを特徴とする、21に記載の医薬品のターゲット分子探索方法;11~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、2該癌幹細胞集団の癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、32において採取した組織片についてDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び4組織片中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物を同定する工程。23下記1~3に記載された工程を含むことを特徴とする、21に記載の医薬品のターゲット分子探索方法;11~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団をinvitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、2特徴構造を再現した培養細胞の、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び3培養細胞中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNA、タンパク質、ペプチド及び代謝産物を同定する工程。24前記医薬品が抗癌剤であることを特徴とする、21~23のいずれか一項に記載の方法。25前記ターゲット分子が癌細胞マーカーであることを特徴とする、21~24のいずれか一項に記載の方法。261~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品の評価方法。27下記1~5に記載された工程を含むことを特徴とする、26に記載の医薬品の評価方法;11~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、2被験物質を1の非ヒト動物モデルに投与する工程、3癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、4組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び5被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。28下記1~4に記載された工程を含むことを特徴とする、26に記載の医薬品の評価方法;11~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団をinvitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、2被験物質で1の培養細胞を処理する工程、3癌幹細胞から形成される階層構造の変化、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を観察する工程、及び4被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。291~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は該癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のスクリーニング方法。30下記1~5に記載された工程を含むことを特徴とする、29に記載の医薬品のスクリーニング方法;11~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、2被験物質を1の非ヒト動物モデルに投与する工程、3癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、4組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び5特定の癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を阻害する被験物質を同定する工程。31下記1~4に記載された工程を含むことを特徴とする、29に記載の医薬品のスクリーニング方法;11~10のいずれかに記載の癌幹細胞集団をinvitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、2被験物質で1の培養細胞を処理する工程、3癌幹細胞から形成される階層構造の変化、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を観察する工程、及び4特定の癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を阻害する被験物質を同定する工程。32前記医薬品が、抗癌剤であることを特徴とする、26~31のいずれかに記載の方法。33前記invitro条件下での培養系が、スフェロイド培養であることを特徴とする、21、23、26、28、29及び31のいずれか一項に記載の方法。本発明は、ヒト癌疾患の治療又は予防のための医薬品開発に有効に使用することのできる癌幹細胞集団に関する。具体的には、癌形成能が無い細胞が実質的に除去された、癌幹細胞の集団であって、癌組織の階層構造を再現する特徴を有する癌幹細胞集団に関する。本発明の癌幹細胞集団の由来は特に限定されるものではないが、ヒト腫瘍組織由来であることが好ましい。本発明の第一の側面として、癌形成能が無い細胞が実質的に除去された癌幹細胞の集団であって、癌組織の階層構造を再現する前記集団が提供される。本発明において癌とは、典型的には制御されない細胞増殖により特徴づけられる哺乳動物の生理学的状態を意味し、又はかかる生理学的状態を言う。本発明において、癌の種類は、特に限定されるものではないが、次のものが挙げられる:癌腫上皮癌としては、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、消化管の癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、肝臓癌、胆管癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、又はその他の腺組織の癌が挙げられる。肉腫非上皮癌としては、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、黄紋筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、線維肉腫、悪性末梢神経腫瘍、消化管間質系腫瘍、類腱腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、その他の実質臓器の腫瘍、例えばメラノーマ又は脳腫瘍が挙げられるKumarVAbbasAKFausioNRobbinsandCotranPathologicBasisofDisease7thEdUnitIGeneralPathology7NeoplasiaBiologyoftumorgrowthBenignandmalignantneoplasms2693422005。本発明の癌幹細胞集団は、上記の上皮癌由来の腫瘍組織由来のものであってもよい。本発明において、癌幹細胞とは、以下のi及び/又はiiに記載された能力を有する細胞をいう。i自己複製能を保有する。自己複製能とは、分裂した2つの娘細胞のどちらか1つ又は両方の細胞が、細胞系譜上、親細胞と同等の能力及び分化程度を保持している細胞を産出できる能力をいう。ii癌細胞塊を構成する複数種の癌細胞へ分化できる。癌幹細胞から分化した複数種の癌細胞は、正常幹細胞と同様に、細胞系譜上、癌幹細胞を頂点とする階層構造を形成する。癌幹細胞から段階的に多種癌細胞が産出されることにより多様な特徴を有する癌細胞塊が形成される。癌幹細胞とは癌形成能をもち、正常幹細胞と同様に多分化能と自己複製能を持つ癌細胞である。また、癌幹細胞マーカーCD24、CD29、CD34、CD44、CD49f、CD56、CD90、CD117、CD133、CD135、CD166、CD184、CD271、CD326、Aldefluor、ABCG2、ABCG5、LGR5、及びMsi1から選択される少なくとも1つ以上のマーカーが陽性である場合があるが、必ずしも陽性である必要はない。好ましくは、CD326、CD133、CD44、ALDHから選択される少なくとも1つ以上のマーカーが陽性であり、さらに好ましくは、CD326、CD133、CD44、ALDHから選択される少なくとも2つ以上のマーカーが陽性であり、さらに好ましくは、CD326、CD133、CD44、ALDHから選択される少なくとも3つ以上のマーカーが陽性であり、最も好ましくはCD326、CD133、CD44、ALDHすべてが陽性である。また、癌幹細胞が示し得る生物活性である上皮間葉移行の能力も癌幹細胞の有する性質の一つでもあり得る。正常細胞および腫瘍細胞は、invitroおよびinvivoで多様な分化の状態において存在する。これらの分化状態は、少なくとも部分的に、細胞が属する組織微小環境から生じる複雑なシグナルの統合を通して調節される。細胞例えば癌細胞は、多数の遺伝子撹乱geneticperturbationを通して、例えば特定の因子例えばTwist、Snail、TGFベータもしくはMMP類の過剰発現を介して、またはE-カドヘリンなどの接着性接合部タンパク質の阻害により、上皮間葉移行EMTを経験するように誘導され得る。EMTへと誘導された細胞は、用いられた誘導方法に関係なく、類似する表現型の形質およびタンパク質マーカー例えばバイオマーカーを発現し、このことは、EMTが主要な分化プログラムであることを示している。本発明は、EMTへと誘導された細胞が、癌幹細胞に関連する細胞表面マーカーの発現、懸濁培養中での増殖、少ない細胞数でのinvivoでの腫瘍形成、および特定の標準的な化学療法薬に対する耐性を含む、癌幹細胞の特性のうちの多数を共有するという発見に関する。したがって、間葉分化転換または上皮間葉分化転換とも称される上皮間葉移行を経験した細胞により示される分化の状態は、癌幹細胞を特異的に標的とする治療を同定するために利用することができる。本発明の非限定な一態様において、例えば被験細胞を生成する目的等のために上皮間葉移行を誘導する方法が提供される。癌幹細胞は、癌幹細胞を頂点とする階層構造を形成する。癌幹細胞から段階的に多種癌細胞が産出されることにより多様な特徴を有する癌細胞塊が形成される。一方、癌形成細胞とは多分化能をもたない癌細胞であって、癌形成能を持つ癌細胞である。癌形成試験では癌形成能と自己複製能を評価することができ、病理学的な解析や分化マーカーを用いた解析では多分化能を評価できる。癌幹細胞であることを証明するためには、癌形成能だけでなく自己複製能と多分化能も評価しなければならない。癌細胞塊とは、細胞などがヒト腫瘍組織と同様にバラバラでなく相互に接着して形成する塊であり、癌細胞、間質細胞や血球細胞などの癌細胞以外の細胞、コラーゲンやラミニンなどの細胞外基質などで構築される塊をいう。階層構造とは、正常組織に見られる特徴的な固有構造の一部が、当該組織を発生元とする腫瘍構造に病理組織学的に検出されることをいい、一般に高分化型の癌でこの階層構造がより高度に再現し、例えば、腺腔形成臓器の腫瘍の場合、管腔形成や粘液細胞の出現等が見られ、扁平上皮構造を取る腫瘍の場合、上皮の重層構造形成と角化傾向等が見られることを言う。一方で、低分化型の癌ではこの階層構造の再現が不十分で、異型性に富むと言われている。この階層構造は癌の種々の生物反応の結果、再現されたものであると考えられることから、これを再現する非ヒト動物モデルの利用価値は高いものと考えられる。階層構造を再現するとは、移植元の癌患者の癌組織が持っていた特長的な固有構造が、非ヒト動物に移植された際に、同様に観察されることをいう。癌形成能を有するとは、非ヒト動物に移植された細胞、又は細胞集団が癌細胞塊を形成することをいい、好ましくは階層構造を有する癌細胞塊を形成することである。癌形成能がないとは、非ヒト動物に移植された細胞、又は細胞集団が癌細胞塊を形成できないことをいう。癌形成能がない細胞が実質的に除去されたことは、限界希釈した細胞集団を免疫不全動物に移植することにより確認できる。本発明において、癌形成能がない細胞が実質的に除去されたとは、免疫不全動物、好ましくはNOGマウスにスポットあたり10細胞を皮下移植した際に形成される癌細胞塊の形成頻度が60以上であることをいい、好ましく70以上、より好ましくは80以上、さらに好ましくは90以上、最も好ましくは100をいう。また、HuYSmythGKJImmunolMethods2009Aug15347708やIshizawaKRasheedZAetalCellStemCell2010Sep3727982に記載された方法など用いることができる。この方法では、1000細胞、100細胞、10細胞を免疫不全動物に移植し、癌細胞塊が形成される頻度をExtremeLimitingDilutionAnalysis708を用いて解析する。本発明において、癌形成能がない細胞が実質的に除去された均質な癌幹細胞の集団とは、当該解析方法で癌幹細胞の頻度が120以上、好ましくは110以上、より好ましくは15以上、さらに好ましくは13以上、さらに好ましくは12以上、最も好ましくは11であることをいう。ExtremeLimitingDilutionAnalysisELDAは、幹細胞のアッセイの必要性に応じた、制限希釈分析limitingdilutionanalysisLDAのためのソフトウェアアプリケーションである。ELDAは0または100の応答を含むすべてのLDAのデータセット、のために有意義な信頼区間を提供する制限希釈解析ソフトウェアであり、シングルヒット仮説の妥当性のテスト、複数のデータセット間の頻度有意差のためのテスト等を含む。HuらJImmunolMethods3477078によって提唱されたELDAにもとづく解析方法は、上記の非特許文献に記載される方法を適用するほか、httpbioinfwehieduausoftwareeldaにおいて提供される、オンラインの解析ツールを用いることによって当業者は実施することが可能である。本発明を用いれば、癌幹細胞を大量に調製することが可能である。付着培養するフラスコ数を増やすことで原理的には所望の数の癌幹細胞を取得することができる。例えばT150フラスコを用いた場合、コンフルエントまで培養すれば通常4×107個以上の細胞を取得することが可能であり、5つのフラスコを用いて培養すれば2×108個以上の細胞を調整することができる。従って、本発明では所望の細胞数を調製することができる。本発明の癌幹細胞集団は、好ましくは癌形成能が無い細胞が実質的に除去されたており、かつ、該集団には癌幹細胞を1x104個以上含んでいてもよく、より好ましくは1x105個以上、さらに好ましくは1x106個以上、さらに好ましくは1x107個以上、さらに好ましくは1x108個以上、最も好ましくは1x109個以上含んでいてもよい。本発明の第2の側面として、本発明の細胞集団の作製方法が提供される。本発明の細胞集団は、例えば、癌幹細胞を含む細胞群を付着培養することにより、作製することができる。癌幹細胞を含む細胞群としては、SV40などの癌ウイルス遺伝子若しくはRasなどの癌遺伝子を導入した細胞、癌組織から株化した細胞などを用いることができる。癌幹細胞を含む細胞群としては、癌組織の階層構造を再現する細胞群を用いることが好ましく、例えば採取した癌組織を用いることができるが、好ましくは非ヒト動物に癌を移植し継代して作製した樹立癌細胞株で、さらに好ましくは免疫不全動物に癌を移植し継代して作製した樹立癌細胞株で、最も好ましくはNOGマウスに癌組織を移植し継代して作製したNOG樹立癌細胞株を用いることができる。さらに、癌幹細胞を含む細胞群としては、スフェロイド培養により形成されたスフェロイドでもよいし、又は、癌幹細胞マーカーCD24、CD29、CD34、CD44、CD49f、CD56、CD90、CD117、CD133、CD135、CD166、CD184、CD271、CD326、Aldefluor、ABCG2、ABCG5、LGR5、及びMsi1から選択される少なくとも1つ以上のマーカーが陽性である細胞を含む細胞群でもよい。細胞群の由来は特に限定されず、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物等に由来するものを用いることができるが、ヒト由来のものが好ましい。NOG樹立癌細胞株は当業者に知られた方法で作製することができ、例えばFujiiEetalPatholint200858559567に記載された方法などを用いることができ、外科手術で摘出したヒト大腸癌、胃癌、肺癌、乳癌、膵臓癌などをハサミで物理的にミンスし、NOGマウスに皮下移植継代することにより樹立できる。NOG樹立癌細胞株では継代を経てもオリジナルヒト癌組織の特徴が維持される。付着培養工程としては、付着培養であれば使用する培地は特に制限されないが、無血清の幹細胞培地を用いることが好ましい。付着培養とは、付着培養フラスコ、プレート、ディッシュに細胞を播種後、付着した状態で細胞を培養、継代することをいい、浮遊細胞を除いた培養である。コンフルエントに増殖した細胞は、Accutaseを用いて剥がし新しい付着培養フラスコ、プレート、ディシュに継代し培養を続ける。本発明に使用可能な培養液は、癌幹細胞を培養するのに使用できる培養液であれば特に限定されるものではなく、例えばEGF、bFGF、hLIF、HGF、NGF、NSF1、TGFβ、TNFα、Heparin、BSA、insulin、Transferrin、Putrescine、Selenite、Progesterone、Hydrocortisone、DGlucose、SodiumBicarbonate、HEPES、LGlutamine、Nacetylcysteine加えた従来公知の基礎培養液又はこれらの混合物を培養液として用いることができる。EGFの濃度は特に限定されないが、01~100ngmL、好ましくは05~50ngmL、より好ましくは1~20ngmLである。bFGFの濃度は特に限定されないが、01~100ngmL、好ましくは05~50ngmL、より好ましくは1~20ngmLである。hLIFの濃度は特に限定されないが、01~100ngmL、好ましくは05~50ngmL、より好ましくは1~20ngmLである。HGFの濃度は特に限定されないが、01~100ngmL、好ましくは1~50ngmLである。NGFの濃度は特に限定されないが、01~100ngmL、好ましくは1~50ngmLである。NSF1の濃度は特に限定されないが、01~100ngmL、好ましくは1~50ngmLである。TGFβの濃度は特に限定されないが、01~100ngmL、好ましくは1~50ngmLである。TNFαの濃度は特に限定されないが、01~100ngmL、好ましくは1~50ngmLである。Heparinの濃度は特に限定されないが、10ngmL~10μgmL、好ましくは2~5μgmLである。BSAの濃度は特に限定されないが、01~10mgmL、好ましくは1~8mgmLである。Insulinの濃度は特に限定されないが、1~100μgmL、好ましくは10~50μgmLである。Transferrinの濃度は特に限定されないが、10~500μgmL、好ましく50~200μgmLである。Putrescineの濃度は特に限定されないが、1~50μgmL、好ましくは10~20μgmLである。Seleniteの濃度は特に限定されないが、1~50nM、好ましくは20~40nMである。Progesteroneの濃度は特に限定されないが、1~50nM、好ましくは10~30nMである。Hydrocortisoneの濃度は特に限定されないが、10ngmL~10μgmL、好ましくは100ngmL~1μgmLである。DGlucoseの濃度は特に限定されないが、1~20mgmL、好ましくは5~10mgmLである。SodiumBicarbonateの濃度は特に限定されないが、01~5mgmL、好ましくは05~2mgmLである。HEPESの濃度は特に限定されないが、01~50mM、好ましくは1~20mMである。LGlutamineの濃度は特に限定されないが、01~10mM、好ましくは1~5mMである。Nacetylcysteineの濃度は特に限定されないが、1~200μgmL、好ましく10~100μgmLである。公知の基礎培養液としては、癌幹細胞のもととなる癌細胞の培養に適したものであれば特に限定されないが、例えばDMEMF12、DMEM、F10、F12、IMDM、EMEM、RPMI1640、MEM、BME、Mocoys5A、MCDB131等が挙げられる。この中では、DMEMF12が好ましい。最も好ましい幹細胞培地として、DMEMF12培地に、最終濃度が20ngmLのEGF、10ngmLのbFGF、4μgmLのHeparin、4mgmLのBSA、25μgmLのinsulin、100μgmLのTransferrin、16μgmLのPutrescine、30nMのSelenite、20nMのProgesterone、29mgmLのDGlucoseを加えた培地が挙げられる。付着培養を行う前に癌幹細胞を含む細胞群を増殖させることが好適である。細胞群を増殖させるとは、例えば、スフェロイド培養や非ヒト動物に移植し継代することにより増殖させることをいうが、特にこれらに限定されるものではない。スフェロイド培養とは、上記の幹細胞を培養できる培地を用いて非付着培養フラスコ、プレート、ディッシュに細胞を播種後、浮遊した状態で細胞を培養することであり、このような浮遊した状態の培養で形成された細胞塊をスフェロイドという。非ヒト動物としては拒絶反応が起こりにくい点で免疫不全動物を用いることができる。免疫不全動物としては、機能的なT細胞を欠損している非ヒト動物、例えばヌードマウスやヌードラット、機能的なT細胞とB細胞とを欠損している非ヒト動物、例えばSCIDマウスやNODSCIDマウスの使用が好適であり、なかでも優れた可移植性を有するT細胞、B細胞、NK細胞とを欠損しているマウス例えば、SCIDマウス、RAG2KOまたはRAG1KOマウスとIL2Rgnullマウスとを組み合わせた高度免疫不全マウス:これにはNODSCIDgammacnullマウス、NODscidIL2RgnullマウスやBALBcRag2nullIL2Rgnullマウスなどが含まれるの使用がより好適である。非ヒト動物の週齢は、例えば無胸腺ヌードマウス、SCIDマウス、NODSCIDマウス、NOGマウスの場合、4~100週齢のものを用いることが好ましい。NOGマウスは、例えばWO2002043477に記載の方法により作製可能であり、財実験動物中央研究所やTheJacksonLaboratoryから入手することも可能である。移植する細胞は細胞塊、組織片、個々に分散した細胞、単離後一旦培養された細胞、他の動物に移植されるという過程を経て再びその動物から単離された細胞など、どのようなものでもよいが、分散した細胞が好ましい。また、移植される細胞数は、106以下の数でよいが、それ以上の数の細胞を移植しても構わない。皮下移植は移植手技が簡便であるという点から好適な移植部位であるではあるが、移植部位は特に制限されるものではなく、使用する動物によって適宜移植部位を選択することが好ましい。なお、NOG樹立癌細胞株の移植操作は、特に制限されず、慣用の移植操作に従って行うことができる。本方法の細胞集団は、例えば患者から採取した癌組織を無血清の幹細胞培地を用い付着培養することで作製することができる。また、付加的に細胞群を増殖させるために、付着培養を行う前にどのような培養を経たかは問われない。例えば、患者から採取した癌組織をスフェロイド培養し、その後無血清の幹細胞培地を用い付着培養することで作製することもできる。また、患者から採取した癌組織を非ヒト動物に移植継代した後に、無血清の幹細胞培地を用い付着培養することで作製することもできる。さらには、患者から採取した癌組織をNOGマウスに移植継代し作製したNOG樹立癌細胞株を、無血清の幹細胞培地を用い付着培養する作製する方法が、効率よく大量の本発明の細胞集団を得ることができる点で最も好ましい。本発明の細胞集団は、医薬品のターゲット分子探索方法、医薬品の評価方法に使用することができる。医薬品の評価方法としては医薬品のスクリーニング方法や抗癌剤のスクリーニングなどが挙げられる。ターゲット分子探索方法として、Genechip解析を用いた癌幹細胞で高発現するDNAやRNAなどの遺伝子例えば、癌幹細胞のマーカーの同定方法、プロテオミクスを用いた癌幹細胞で高発現するタンパク質、ペプチド又は代謝産物の同定方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ターゲット分子探索のスクリーニング方法として、低分子ライブラリー、抗体ライブラリー、マイクロRNAライブラリー、RNAiライブラリーからcellgrowthinhibitionassayで癌幹細胞の増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法などが挙げられる。抑制する物質を取得後、標的を明らかにすることができる。癌幹細胞を免疫し抗体を取得後、ELISAで結合抗体をスクリーニング、又はcellgrowthinhibitionassayで増殖を抑制する抗体をスクリーニングすることもできる。結合抗体、機能抗体取得後、抗原を同定してターゲット分子を明らかにすることができる。本発明の癌幹細胞の集団を用いれば、既存薬剤や開発中の薬剤を用いて癌幹細胞への効果を評価し、新たな薬効を見出すこともできる。均一な癌幹細胞の濃縮により、例えば以下のようなことが可能となる。1.癌幹細胞に特異的に発現する、核酸DNARNA、たんぱく質などを高率に同定し、これらの分子の機能を解明する。2.癌幹細胞に特異的に発現する、核酸DNARNA、たんぱく質などを高率に同定し、これを阻害する薬剤候補の探索スクリーニングを実施する3.濃縮される各癌幹細胞の生物機能解析結果浸潤性、分裂速度などを指標に、癌の予後診断などに用いる4.濃縮される各癌幹細胞の生物機能解析結果浸潤性、分裂速度などを指標に、新たに癌を分類し、この分類ごとの抗癌剤の探索スクリーニングに応用する。5.濃縮された癌幹細胞が、癌組織の大部分を占める分化細胞を輩出する過程を研究し、この過程をおさえこむ抗癌剤癌サイレンサーの探索スクリーニングに使用する。6.癌幹細胞の培養条件酸素分圧、栄養条件、抗癌剤処置等を劣悪な方向に調節することで、癌幹細胞に特徴的な生物反応を検出し、癌幹細胞の耐久性の成因を検討する。7.癌幹細胞の培養条件酸素分圧、栄養条件、抗癌剤処置等を劣悪な方向に調節することで、癌幹細胞に特徴的な生物反応を検出し、癌幹細胞の耐久性を阻害する抗癌剤の探索スクリーニングに使用する。医薬品のターゲット分子探索方法本発明は、本発明の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は本発明の癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のターゲット分子探索方法に関する。本方法において、癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデルを使用する場合には、以下の1~4に記載された工程により、医薬品のターゲット分子探索を行うことができる。1癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、2癌幹細胞集団の癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、32において採取した組織片についてDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び4組織片中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNA、タンパク質、ペプチド又は代謝産物を同定する工程。また、本方法において、癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系を使用する場合には、以下の1~3に記載された工程により、医薬品のターゲット分子探索を行うことができる。1癌幹細胞集団をinvitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、2特徴構造を再現した培養細胞の、DNA、RNA、及びタンパク質、ペプチド又は代謝産物の発現を調べる工程、及び3培養細胞中の癌幹細胞から形成される階層構造、癌肝細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性に依存的に変動するDNA、RNAタンパク質、ペプチド及び代謝産物を同定する工程。本発明において、癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織又は細胞株の構造観察は、AMeX法等の公知の標本作製方法により薄切組織標本を作製した上で、HE染色及び免疫組織化学染色IHCを実施することで行うことができる。被験組織において、上述のヒト腫瘍組織に特異的な階層構造、癌進展プロセス、又はその生物学的特性が確認された場合に、その被験組織を癌関連組織であるものとして、DNA、RNAタンパク質、ペプチド及び代謝産物の発現を確認する。DNA、RNA、タンパク質、ペプチド及び代謝産物の発現確認については、特に制限はされず、慣用の発現確認方法に従って行うことができる。RNAとしては、マイクロRNA、siRNA、tRNA、snRNA、mRNA、又はノンコーディングRNA等が挙げられる。例えば、各遺伝子のmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、又はRTPCR法を実施することによって各遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、各遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。また、各遺伝子からコードされるタンパク質を含む画分を定法に従って回収し、各タンパク質の発現をSDSPAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、各タンパク質に対する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法を実施し、各タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。これらの方法により抗癌剤のターゲット分子の探索を行うことができる。前記の医薬品のターゲット分子の非限定的な一態様として、実施例で挙げられたような本発明の癌幹細胞に特異的に発現している分子であるCD133、CD44、EpCAM、CD166、CD24、CD29またはLGR5等が好適に挙げられる。本発明において、前記医薬品は特に限定されるものではないが、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、血管新生抑制剤、ステロイド剤、酵素阻害剤、抗生物質、抗ヒスタミン剤、抗凝固剤、抗感染剤、鎮痛剤、糖尿病治療剤、関節炎治療剤、抗ぜんそく剤、抗不眠症剤、鎮吐剤、片頭痛治療剤、抗痙攣剤、抗鬱剤、抗精神病剤、解熱剤、パーキンソン病治療剤、アルツハイマー治療剤、交感神経作用剤、不整脈治療剤、降圧剤、利尿剤、抗利尿剤、抗凝固剤、血管拡張剤、鎮静剤などが挙げられるが、抗癌剤が好適である。また、前記医薬品は特に限定されるものではないが、タンパク質薬剤、核酸薬剤、低分子薬剤、細胞性薬剤などが挙げられる。また、本発明において、ターゲット分子は特に限定されるものではないが、膜受容体、酵素、イオンチャネル、転写因子あるいは核内受容体などが挙げられ、癌細胞マーカーが好適である。医薬品の評価方法本発明は、本発明の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品の評価方法に関する。本方法において、本発明の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデルを使用する場合には、以下の1~5に記載された工程により、医薬品の評価を行うことができる。1癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、2被験物質を1の非ヒト動物モデルに投与する工程、3癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、4組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び5被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。また、本方法において、癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系を使用する場合には、以下の1~3に記載された工程により、医薬品の評価を行うことができる。1癌幹細胞集団をinvitro条件下で培養し、癌幹細胞から始まる癌進展プロセスの特徴構造、又は癌幹細胞の生物学的特性を再現する工程、2被験物質で1の培養細胞を処理する工程、3癌幹細胞から形成される階層構造の変化、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を観察する工程、及び4被験物質により阻害された癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を同定する工程。医薬品のスクリーニング方法本発明は、本発明の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデル又は癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系において、癌幹細胞から形成される階層構造、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を指標として評価を行うことを特徴とする、医薬品のスクリーニング方法に関する。本方法において、本発明の癌幹細胞集団が移植された非ヒト動物モデルを使用する場合には、以下の1~5に記載された工程により、医薬品のスクリーニングを行うことができる。1癌幹細胞集団を非ヒト動物に移植することにより非ヒト動物モデルを作製する工程、2被験物質を1の非ヒト動物モデルに投与する工程、3癌幹細胞から始まる癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織構造、又はその生物学的特性を示す組織片を採取する工程、4組織片中の癌幹細胞の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び5特定の癌幹細胞から形成される階層構造形成、癌幹細胞から始まる癌進展プロセス、又は癌幹細胞の生物学的特性を阻害する被験物質を同定する工程。また、本方法において、癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系を使用する場合には、以下の1~4に記載された工程により、医薬品のスクリーニングを行うことができる。1癌幹細胞集団をinvitro条件下で培養し、各癌進展プロセスの特徴構造、又はその生物学的特性を再現する工程、2被験物質で1の培養細胞を処理する工程、3培養細胞中の癌幹細胞の階層構造の経時変化、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を観察する工程、及び4被験物質により阻害された癌幹細胞の階層構造形成、癌進展プロセス、又はその生物学的特性を同定する工程。上記スクリーニング方法により抗癌剤のスクリーニングを行うことができる。本発明の方法における被験物質としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。これらは精製物であっても、また植物、動物又は微生物等の抽出物等のように粗精製物であってもよい。また被験物質の製造方法も特に制限されず、天然物から単離されたものであっても、化学的又は生化学的に合成されたものであっても、また遺伝子工学的に調製されたものであってもよい。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。本方法において、非ヒト動物モデルに対する被験物質の投与方法も特に制限されない。投与する被験物質の種類に応じて、経口投与又は皮下、静脈、局所、経皮若しくは経腸直腸などの非経口投与を適宜選択することができる。本方法において、被験物質で癌幹細胞集団の培養細胞を処理する方法も特に制限されない。当該処理は、細胞の培養液又は該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、癌幹細胞集団へ導入する、又は該ベクターを癌幹細胞集団の細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母又は動物細胞等を用いた2ハイブリッド法を利用することも可能である。被験物質の評価は、その後、当該モデル動物について移植組織癌幹細胞集団が移植された組織を摘出し該移植組織の組織学的特徴を観察したり、又は細胞培養系において組織学的特徴を測定することによって行うことができる。具体的には、被験物質の評価は、非ヒト動物モデル又は癌幹細胞集団のinvitro条件下での培養系において、移植組織又は培養系の癌幹細胞から形成される階層構造を観察し、ヒト癌細胞特有の階層構造を形成しているか確認するか、又はヒト癌疾患に特徴的な癌進展プロセスに対する影響を確認することによって行うことができる。なお、癌進展プロセスにおいて特徴的に認められる組織又は細胞株の構造観察は、AMeX法等の公知の標本作製方法により薄切組織標本を作製した上で、HE染色及び免疫組織化学染色IHCを実施することで行うことができる。上記被験物質の評価は、より具体的には、被験物質を投与しない対照の非ヒト動物モデル又は癌幹細胞集団について同様に、移植組織又は培養系の癌幹細胞の階層構造を観察し、ヒト癌細胞特有の階層構造を形成しているか確認し、被験物質を投与した非ヒト動物モデル又は癌幹細胞集団と上記対照動物とで、癌幹細胞の階層構造を対比することによって行うことができる。この場合、対照動物の場合に比して、被験物質を投与した移植組織又は培養系においてヒト癌細胞特有の階層構造が見られない場合、又はその割合が低下した場合に、それらの被験物質を、ヒト癌疾患の治療又は予防効果を有する有効物質として選択することができる。また、上記被験物質の評価は、より具体的には、被験物質を投与しない対照の非ヒト動物モデル又は癌幹細胞集団について同様に、移植組織又は培養系の癌進展プロセスを観察し、ヒト癌細胞特有の癌進展プロセスが見られるか確認し、被験物質を投与した非ヒト動物モデル又は癌幹細胞集団と上記対照動物とで、癌幹細胞の癌進展プロセスを対比することによって行うことができる。この場合、対照動物の場合に比して、被験物質を投与した移植組織又は培養系においてヒト癌細胞特有の癌進展プロセスが見られない場合に、それらの被験物質を、ヒト癌疾患の治療又は予防効果を有する有効物質として選択することができる。さらに、上記被験物質の評価は、より具体的には、被験物質を投与しない対照の非ヒト動物モデル又は癌幹細胞集団について同様に、移植組織又は培養系の癌幹細胞における生物学的特性を観察し、ヒト癌細胞特有の当該特性が見られるか確認し、被験物質を投与した非ヒト動物モデル又は癌幹細胞集団と上記対照動物とで、癌幹細胞の当該特性を対比することによって行うことができる。この場合、対照動物の場合に比して、被験物質を投与した移植組織又は培養系においてヒト癌細胞特有の当該特性が見られない場合に、それらの被験物質を、ヒト癌疾患の治療又は予防効果を有する有効物質として選択することができる。なお、前述する本発明のスクリーニング方法により、選抜されるヒト癌疾患に対する予防有効物質又は治療有効物質は、必要に応じて、さらに他の薬効試験や安全性試験などを行うことにより、またさらにヒト癌疾患患者への臨床試験を行うことにより、より効果の高い、また実用性の高い予防有効物質又は治療有効物質として選別することができる。このようにして選別される予防有効物質又は治療有効物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生化学的合成発酵又は遺伝子学的操作によって、工業的に製造することもできる。なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例1ヒト癌細胞株を用いた癌幹細胞と癌形成細胞の調製と評価1マウスへ移植した大腸癌株の形態学的評価大腸癌検体は、PharmaLogicalsResearchシンガポールおよびParkwayLaboratoryServicesシンガポールの倫理委員会の承認の下で、同意を得た患者から入手したものである。腫瘍片を剪刀で細かく刻み、NOGマウスの側腹部に移植した。ヒト大腸癌異種移植片は、実験動物中央研究所日本より供与されたNOGマウス中で継代することにより維持した。本実験で使用したマウスは、PharmaLogicalsResearchの動物実験ガイドラインに従って処置した。NOGマウス、又はSCIDマウスで樹立した大腸癌細胞株をNOGマウスへ皮下移植し、癌細胞塊を作成した。癌細胞塊は摘出後、4パラホルムアルデヒドparaformaldehydeにて4°Cで16から24時間の条件で固定し、AMeX法にて包埋して薄切組織標本を作製した。組織標本はHE染色を実施した。図1に結果を示す。NOGマウスへ移植した大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59、大腸癌株PLR325においてヒト組織と同様な形態学的構造が認められ、NOGマウスの影響を受けないことが示された。一方、NOGマウスへ移植した大腸癌株PLR357では形態学的な変化が認められ、NOGマウスへの移植実験に不適切であることが示された。2癌細胞塊から細胞の調製NOGマウスから癌細胞塊を摘出し、ハサミで物理的にミンスした。次に、DPBSで数回懸濁し、CollagenaseDispaseRoche、CatNo10269638001とDNaseIRoche、CatNo11284932001とを含む酵素液に組織を移して、37°Cで3時間撹拌した。さらに、ピペッティングを繰り返し細分化した細胞にLysingbufferBD、CatNo555899を加え、マウス赤血球を除去した。最後に40μmcellstrainerBD、CatNo352340に通し、DPBSで数回懸濁し細胞液を調製した。3癌幹細胞マーカー陽性細胞の検出癌細胞塊から調製した細胞をFACSバッファー2FetalBovineSerumDPBSで懸濁し、RatmAbtomouseMHCclassIAbcam、CatNoab15680を加え、4°Cで30分反応させた。細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後、2次抗体としてPE標識GoatAbtoratIgG2aBioLegend、CatNo405406あるいはAPC標識GoatAbtoratIgG2aBioLegend、CatNo405407、死細胞染色として7AADViabilityDyeBeckmanCoulter、CatNoA07704、癌幹細胞マーカーとしてFITC標識mousemAbtohumanCD326MiltenyiBiotec、CatNo130080301、PE標識mousemAbtohumanCD1331MiltenyiBiotec、CatNo130080801、あるいはPE標識mousemAbtohumanCD44BDPharmingen、CatNo550989をそれぞれ加え、4°Cで30分反応させた。次いで細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後フローサイトメトリー解析に供した。アルデヒドデヒドロゲナーゼALDEHYDEDEHYDROGENASE:ALDH活性はAldeFluorKitStemcellTechnologies、CatNo01700を用いて、メーカー推奨の操作を行うことにより検出した。フローサイトメトリー解析にはEPICSALTRAを用い、mouseMHCclassI陰性かつ7AADViabilityDye陰性の細胞について癌幹細胞マーカーの解析を行った。図2に結果を示す。大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59、大腸癌株PLR325から形成された癌細胞塊において癌幹細胞マーカー陽性の細胞が認められた。中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59においてはマーカー陽性細胞とマーカー陰性細胞が混在し、ヘテロな細胞集団であった。一方、低分化型の大腸癌株PLR325においては、すべての細胞がEpCAM、AC133、ALDH活性が陽性、またすべての細胞がCD44が陰性という均質な特徴を示す細胞集団であった。4細胞液からマウス細胞の除去癌細胞塊から調製した細胞をFACSバッファーで懸濁し、RatmAbtomouseMHCclassIを加え、4°Cで15分反応させた。細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後、2次抗体としてPE標識GoatAbtoratIgG2aを加え、4°Cで15分反応させた。さらに細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後、EPICSALTRAによるセルソーティング、又は、EasySepMousePEPositiveselectionKitStemcellTechnologies、CatNo18554を用いてメーカー推奨の操作を行うことによりマウス細胞を除去した。細胞の純度はEPICSALTRAを用いて解析した。図3に結果を示す。大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59、大腸癌株PLR325から形成された癌細胞塊において、マウス細胞除去後、95以上の細胞がmouseMHCclassI陰性であることが示された。5大腸癌株の癌形成試験上記2で調製した細胞液からマウス細胞を除去したのち、癌細胞を顕微鏡下で単一細胞であることを確認し、細胞数をカウントした。HanksBalancedSaltSolutionInvitrogen、CatNo24020117で50に希釈したMatrigelBasementMembraneMatrixBD、CatNo354234を用いて、10000cellsmL、1000cellsmL、100cellsmLの細胞液を調製した。それぞれの細胞液を100μLspot、すなわち1000cellsspot、100cellsspot、10cellsspotでNOGマウスへ皮下移植し、形成される腫瘍数を評価した。表1に結果を示す。中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59において100cellsspot以上の移植において癌の形成が認められ、低分化型の大腸癌株PLR325において10cellsspot以上の移植において癌の形成が認められた。また、癌形成能を有する細胞の頻度をExtremeLimitingDilutionAnalysisを用いて解析した。大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59、大腸癌株PLR325においてそれぞれ1161、1195、114の頻度で癌形成能を有する細胞が含まれていることが示された。6大腸癌株における階層構造形成の組織学的評価100細胞、10細胞から形成された癌細胞塊は摘出後、4パラホルムアルデヒドparaformaldehydeにて4°Cで16から24時間の条件で固定し、AMeX法にて包埋して薄切組織標本を作製した。組織標本はHE染色を実施した。図4に結果を示す。中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59において階層構造が認められ、大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59は癌幹細胞であることが示された。一方、低分化型の大腸癌株PLR325において、階層構造は認められず、大腸癌株PLR325は癌形成細胞であることが示された。7正常腸管幹細胞マーカーLGR5タンパク質の検出上記2で調製した細胞液からマウス細胞を除去したのち、RIPAバッファーSigma、CatNoR0278を用いて大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59、大腸癌株PLR325の細胞ライゼートを作成し、SDSPAGEを行った後、ウエスタンブロッティングを行った。LGR5タンパク質を検出するためにrabbitmAbtohumanGPR49Abcam、CatNoab75850、陽性コントロールのためにmousemAbtohumanGAPDHSantaCruz、CatNoSc69778を用いた。図5に結果を示す。中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59においてLGR5タンパク質が検出され、正常腸管幹細胞マーカー陽性の細胞が存在することが示された。一方、低分化型の大腸癌株PLR325において、LGR5タンパク質は検出されなかった。実施例2市販invitro癌細胞株の特徴解析1市販invitro癌細胞株の培養市販invitro癌細胞株の培養は一般的な方法例えば、37°C、5CO2存在下を基本とし、ATCChttpwwwatccorg推奨の培地を用いて行った。なお、全ての培地中のFetalBovineSerumは、56°Cで30min以上保温する処理を行うことにより、非働化したものを用いた。2癌幹細胞マーカー陽性細胞の検出invitro培養した癌細胞をAccutaseでフラスコから剥がし、FACSバッファーで懸濁し、死細胞染色として7AADViabilityDyeBeckmanCoulterCatNoA07704、癌幹細胞マーカーとしてFITC標識mousemAbtohumanCD326、PE標識mousemAbtohumanCD1331、あるいはPE標識mousemAbtohumanCD44をそれぞれ加え、4°Cで30分反応させた。次いで細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後フローサイトメトリー解析に供した。アルデヒドデヒドロゲナーゼALDEHYDEDEHYDROGENASE:ALDH活性はAldeFluorKitを用いて、メーカー推奨の操作を行うことにより検出した。フローサイトメトリー解析にはEPICSALTRAを用い、7AADViabilityDye陰性の細胞について癌幹細胞マーカーの解析を行った。図6に結果を示す。HCT116において、ほとんどの細胞が幹細胞マーカー陽性という均質な特徴を示す細胞集団であった。3市販invitro細胞株の癌形成試験invitro培養した癌細胞をAccutaseでフラスコから剥がし、癌細胞を顕微鏡下で単一細胞であることを確認し、細胞数をカウントした。HanksBalancedSaltSolutionで50に希釈したMatrigelBasementMembraneMatrixを用いて、10000cellsmL、1000cellsmL、100cellsmLの細胞液を調製した。それぞれの細胞液を100μLspot、すなわち1000cellsspot、100cellsspot、10cellsspotでNOGマウスへ皮下移植し、形成される腫瘍数を評価した。表2に結果を示す。HCT116において10cellsspot以上の移植において癌の形成が認められた。また、癌形成能を有する細胞の頻度をExtremeLimitingDilutionAnalysisを用いて解析した。HCT116において19の頻度で癌形成能を有する細胞が含まれていることが示された。4市販invitro細胞株における階層構造形成の組織学的評価10細胞から形成された癌細胞塊は摘出後、4パラホルムアルデヒドparaformaldehydeにて4°Cで16から24時間の条件で固定し、AMeX法にて包埋して薄切組織標本を作製した。組織標本はHE染色を実施した。図7に結果を示す。HCT116において階層構造は認められず、HCT116は癌形成細胞であることが示された。5正常腸管幹細胞マーカーLGR5タンパク質の検出RIPAバッファーを用いてHCT116の細胞ライゼートを作成し、SDSPAGEを行った後、ウエスタンブロッティングを行った。LGR5タンパク質を検出するためにrabbitmAbtohumanGPR49、陽性コントロールのためにmousemAbtohumanGAPDHを用いた。図8に結果を示す。HCT116において、LGR5タンパク質が検出されなかった。6正常腸管幹細胞マーカーLGR5陽性細胞の検出HCT116を5000cellswellでLabTekChamberSlidesThermoScientific、CatNo177402に蒔き込み培養した。約24時間後、insituハイブリダイゼーションに使用した。insituハイブリダイゼーションはQuantiGeneViewRNAPlateBasedAssayKitPanomics、CatNoQVP0010、QuantiGeneViewRNAPlateBasedSignalAmplificationKitPanomics、CatNoQVP0200、QuantaGeneViewRNAGPR49LGR5ProbesetPanomics、CatNoVA110587を用いてメーカー推奨の操作を行うことにより解析した。また、核染色にDAPIInvitrogen、CatNoD21490を用いた。図9に結果を示す。HCT116においてLGR5probeに対して陽性である細胞は認められなかった。実施例3癌幹細胞のinvitro株化1癌幹細胞のinvitro付着培養細胞の培養は一般的な方法例えば、37°C、5CO2存在下を基本とし、以下の幹細胞培地を用いて行った。幹細胞培地はDMEMF12Invitrogen、CatNo11330057培地に、最終濃度が1xのN2supplementInvitrogen、CatNo17502014、20ngmLのRecombinantHumanEGFInvitrogen、CatNo11330032、10ngmLのFibroblastGrowthFactorbasicHumanRecombinantSigmaCat、NoF0291、4μgmLのHeparinSodiumSaltSigma、CatNoH3149、4mgmLのAlbuMaxLipidRichBSAInvitrogen、CatNo11010021、20μgmLのinsulinHumanRecombinantZincsolutionInvitrogen、CatNo12585014、29mgmLのDGlucoseSolutionSigma、CatNoG8769、1xのAntibioticAntimycoticInvitrogen、CatNo15240062となるようにそれぞれ加えて作製した。癌幹細胞を含む癌細胞は幹細胞培地を用いて付着培養用の6wellプレートBD、CatNo353046で培養した。数日後、プレートに付着した細胞と浮遊した細胞が認められたが、浮遊細胞は除き、付着細胞のみを培養した。コンフルエントに増殖した付着細胞はAccutaseを用いて剥がし、新しい付着培養用の6wellプレート、あるいは付着培養用のT25フラスコBD、CatNo353109、T75フラスコBD、CatNo356485、T150フラスコBD、CatNo355001を用いて培養した。以下の2に示す方法ですべての付着細胞が癌幹細胞マーカー陽性になるまで継代を続け、一部の細胞は細胞保存液であるバンバンカーWako、CatNo30214681で懸濁し、80°C以下で保存した。図10にinvitro培養した中分化型の大腸癌株PLR123の形態を示す。浮遊状態においてのみ、スフェロイドと呼ばれる細胞塊の形成が認められた。2癌幹細胞マーカー陽性細胞の検出幹細胞培地でinvitro付着培養した癌細胞をAccutaseでフラスコから剥がし、FACSバッファーで懸濁し、死細胞染色として7AADViabilityDye、癌幹細胞マーカーとしてFITC標識mousemAbtohumanCD326、あるいはPE標識mousemAbtohumanCD44をそれぞれ加え、4°Cで30分反応させた。次いで細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後フローサイトメトリー解析に供した。アルデヒドデヒドロゲナーゼALDEHYDEDEHYDROGENASE:ALDH活性はAldeFluorKitを用いて、メーカー推奨の操作を行うことにより検出した。フローサイトメトリー解析にはEPICSALTRAを用い、7AADViabilityDye陰性の細胞について癌幹細胞マーカーの解析を行った。図11に結果を示す。invitroで付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59において、すべての細胞が癌幹細胞マーカー陽性で、均質な細胞集団あることが示された。3正常腸管幹細胞マーカーLGR5タンパク質の検出細胞液からマウス細胞を除去したのち、RIPAバッファーを用いて、中分化型の大腸癌株PLR123、中分化型の大腸癌株PLR59、幹細胞培地でinvitro付着培養した大腸癌株PLR123、幹細胞培地でinvitro付着培養した大腸癌株PLR59各々の細胞ライゼートを作成し、SDSPAGEを行った後、ウエスタンブロッティングを行った。LGR5タンパク質を検出するためにrabbitmAbtohumanGPR49、陽性コントロールのためにmousemAbtohumanGAPDHを用いた。図12に結果を示す。幹細胞培地でinvitro付着培養した大腸癌株においてLGR5タンパク質の増加が検出された。幹細胞培地でinvitro培養することにより正常腸管幹細胞マーカー陽性の細胞が濃縮されることが示唆された。4正常腸管幹細胞マーカーLGR5陽性細胞の検出幹細胞培地でinvitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123を50000cellswellでLabTekChamberSlidesに蒔き込み培養した。約24時間後、insituハイブリダイゼーションに使用した。insituハイブリダイゼーションはQuantiGeneViewRNAPlateBasedAssayKit、QuantiGeneViewRNAPlateBasedSignalAmplificationKit、QuantaGeneViewRNAGPR49LGR5Probesetを用いてメーカー推奨の操作を行うことにより解析した。また、核染色にDAPIを用いた。図13に結果を示す。幹細胞培地でinvitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123はすべてがLGR5probeに陽性であることが認められた。幹細胞培地でinvitro培養することにより正常腸管幹細胞マーカー陽性の細胞が濃縮されることが示され、すべての細胞が正常腸管幹細胞マーカーLGR5陽性の均質な細胞であることが示された。5invitro付着培養した細胞の癌形成試験invitro付着培養した癌細胞をAccutaseでフラスコから剥がし、DPBSで数回懸濁した。細胞液は40μmcellstrainerに通し、顕微鏡下で単一細胞であることを確認し、細胞数をカウントした。HanksBalancedSaltSolutionで50に希釈したMatrigelBasementMembraneMatrixを用いて、10000cellsmL、1000cellsmL、100cellsmLの細胞液を調製した。それぞれの細胞液を100μLspot、すなわち1000cellsspot、100cellsspot、10cellsspotでNOGマウスへ皮下移植し、形成される腫瘍数を評価した。表3に結果を示す。invitroで付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59において、すべての移植で癌の形成が認められた。invitroで付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59はいずれも、すべてが癌形成能を有する細胞であることが示された。6癌幹細胞のinvitro株化の評価invitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123をさらに1ヶ月以上培養し、癌形成能力の比較を行った。invitro付着培養した細胞をAccutaseでフラスコから剥がし、DPBSで数回懸濁した。細胞液は40μmcellstrainerに通し、顕微鏡下で単一細胞であることを確認し、細胞数をカウントした。HanksBalancedSaltSolutionで50に希釈したMatrigelBasementMembraneMatrixを用いて、10000cellsmL、1000cellsmL、100cellsmLの細胞液を調製した。それぞれの細胞液を100μLspot、すなわち1000cellsspot、100cellsspot、10cellsspotでNOGマウスへ皮下移植し、形成される腫瘍数を評価した。表4に結果を示す。1ヶ月以上培養した中分化型の大腸癌株PLR123はすべての移植で癌の形成が認められた。invitro培養による癌形成能力は100に保たれ、invitro株化に成功したことが示された。710細胞のinvitro付着培養癌細胞から形成された癌細胞塊における階層構造形成の組織学的評価10細胞のinvitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59から形成された癌細胞塊を摘出して、4パラホルムアルデヒドparaformaldehydeにて4°Cで、16から24時間の条件で固定後、AMeX法にて包埋して薄切組織標本を作製した。組織標本はHE染色を実施した。図14に結果を示す。10細胞のinvitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59から形成された癌細胞塊において、ヒト組織及び樹立癌細胞株と同様な階層構造が認められた。また、1ヵ月以上培養したinvitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123から形成された癌細胞塊においても、ヒト組織及びNOG樹立癌細胞株と同様な階層構造が認められた。invitroで付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59はいずれも、すべてが多分化能を持つ癌幹細胞であることが示された。810細胞のinvitro付着培養癌細胞から形成されたヒト癌細胞塊より調製した細胞における癌幹細胞マーカーの解析10細胞のinvitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59から形成された癌細胞塊より調製した細胞をFACSバッファーで懸濁し、RatmAbtomouseMHCclassIを加え、4°Cで30分反応させた。細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後、2次抗体としてPE標識GoatAbtoratIgG2aあるいはAPC標識GoatAbtoratIgG2a、死細胞染色として7AADViabilityDye、癌幹細胞マーカーとしてFITC標識mousemAbtohumanCD326、PE標識mousemAbtohumanCD1331、あるいはPE標識mousemAbtohumanCD44をそれぞれ加え、4°Cで30分反応させた。次いで細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後フローサイトメトリー解析に供した。アルデヒドデヒドロゲナーゼALDEHYDEDEHYDROGENASE:ALDH活性はAldeFluorKitを用いて、メーカー推奨の操作を行うことにより検出した。フローサイトメトリー解析にはEPICSALTRAを用い、mouseMHCclassI陰性かつ7AADViabilityDye陰性の細胞について癌幹細胞マーカーの解析を行った。図15に結果を示す。10細胞のinvitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123、大腸癌株PLR59から形成された癌細胞塊において、癌幹細胞マーカー陰性の細胞が認められ、癌幹細胞マーカー陽性細胞から癌幹細胞マーカー陰性細胞が産出されたことが示された。910細胞のinvitro付着培養癌細胞から形成されたヒト癌細胞塊1世代目より調製した細胞の癌形成試験2世代目10細胞のinvitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123から形成された癌細胞塊1世代目より調製した細胞液からマウス細胞を除去したのち、ヒト癌細胞を顕微鏡下で単一細胞であることを確認し、細胞数をカウントした。HanksBalancedSaltSolutionで50に希釈したMatrigelBasementMembraneMatrixを用いて、10000cellsmL、1000cellsmL、100cellsmLの細胞液を調製した。それぞれの細胞液を100μLspot、すなわち1000cellsspot、100cellsspot、10cellsspotでNOGマウスへ皮下移植し、形成される腫瘍数及び形態を評価した。表5に結果を示す。10箇所以上で階層構造を有する癌の形成が認められたことから、癌細胞塊に含まれる細胞が癌幹細胞としての自己複製能を有することが示された。また、癌細胞塊に含まれる癌幹細胞の頻度は、195であったことから、invitro付着培養した癌幹細胞から癌形成能を持たない分化した細胞が産出されたことが示された。10invitro付着培養癌細胞から形成された2世代目の癌細胞塊における階層構造形成の組織学的評価invitro付着培養癌細胞から形成された2世代目の癌細胞塊を摘出して、4パラホルムアルデヒドparaformaldehydeにて4°Cで、16から24時間の条件で固定後、AMeX法にて包埋して薄切組織標本を作製した。組織標本はHE染色を実施した。図16に結果を示す。invitro付着培養した中分化型の大腸癌株PLR123から形成された2世代目の癌細胞塊において、ヒト組織及びNOG樹立癌細胞株と同様な階層構造が認められた。参考実施例1Lgr5タンパク質発現解析1全長ヒトLgr4、Lgr5、およびLgr6を発現する細胞の樹立NM018490Lgr4、NM001017403Lgr5、およびNM003667Lgr6の配列に基づくPCRによって、全長ヒトLgr4、Lgr5、およびLgr6cDNAをクローニングした。クローニングした遺伝子のN末端にHAタグを付加または付加せずに、発現させた。GenePulserBioRadを用いて、チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHODG44Invitrogenに発現プラスミドをトランスフェクトした。G418を用いて、安定な細胞株であるHALgr4DG、HALgr5DG、およびHALgr6DGを選択した。2可溶性Lgr5Fcタンパク質の調製可溶性のLgr5アミノ酸1~555タンパク質を、CHODG44のマウスIgG2aのFc部分との融合タンパク質として発現させた。ヤギ抗マウスIgG2aBethyllabotratoriesおよびHRPラット抗マウスIgG2amAbSerotecを用いるサンドイッチELISAにより、トランスフェクタントをスクリーニングした。sLgr5Fcを最も豊富に生じたクローンを2D3と命名した。2D3培養上清を回収し、Lgr5Fcタンパク質をプロテインAセファロースカラムによってアフィニティ精製したPharmacia。Lgr5Fcはタンパク質免疫化およびELISAスクリーニングのための抗原として働いた。3Lgr5Fcタンパク質免疫化による抗Lgr5モノクローナル抗体の生成WO2009063970完全フロイントアジュバント中に乳化させた50μgのLgr5Fcを用いて、BalbcマウスCharlesRiverJapanを皮下免疫した。2週間後、フロイント不完全アジュバント中の同量を用いて2週間にわたり週1回の注射を繰り返した。細胞融合の3日前、マウスに25μgのLgr5Fcを静脈注射した。免疫化マウスに由来する脾臓リンパ球を、従来法MethodsMolBiol239243260により、P3X63Ag8U1マウスミエローマ細胞ATCCと融合させた。ELISAを用いて、sLgr5Fcとの反応性を有する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングした。Lgr5特異的マウスmAb2T15E2および2U2E2を樹立した。培養細胞および異種移植組織に関する免疫蛍光染色免疫蛍光細胞化学のために、4パラホルムアルデヒドおよびメタノールで固定した細胞を、マウス抗ヒトEカドヘリン抗体Abcam、ウサギ抗ヒトSnail抗体Abcam、またはウサギ抗ヒトβカテニン抗体Sigmaと共にインキュベーションし、その後、それぞれAlexaFluor488で標識したヤギ抗マウスIgG抗体またはヤギ抗ウサギIgG抗体を用いて可視化した。免疫蛍光組織化学のために、上記異種移植腫瘍のパラフィンブロック由来の薄片をマウス抗ヒトLgr5抗体2U2E2またはウサギ抗ヒトSnail抗体Abcamと共にインキュベーションした。一次抗体とインキュベーションした後、Lgr5タンパク質を、ポリマーHRPと結合したヤギ抗マウス抗体によって検出し、AlexaFluor488標識チラミドtyramideInvitrogenによって可視化した。ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体VECTORによってSnailタンパク質を検出し、AlexaFluor568標識ストレプトアビジンInvitrogenによって可視化した。これらの細胞および検体も、DAPIInvitrogenで染色した。5フローサイトメトリー解析CSCを標識抗体でインキュベーションし、EPICSALTRABeckmanCoulterおよびFACSCaliburBectonDickinsonを用いて解析した。使用した抗体は、PE標識マウス抗ヒトCD133抗体MiltenyiBiotec、PE標識マウス抗ヒトCD44抗体BDPharmingen、FITC標識マウス抗ヒトCD326EpCAM抗体MiltenyiBiotec、PE標識マウス抗ヒトCD166抗体RDSystems、PE標識マウス抗ヒトCD24抗体BDPharmingen、PE標識マウス抗ヒトCD26抗体BDPharmingen、およびPE標識マウス抗ヒトCD29抗体BDPharmingenであった。Lgr5を染色するために、CSCを、マウス抗ヒトLgr5抗体2T15E2と、次にPR標識ラット抗マウスIgG抗体Invitrogenと、インキュベーションした。アルデヒドデヒドロゲナーゼの活性は、AldeFluorKitStemcellTechnologiesを用いて測定した。抗マウスMHCクラスI抗体AbcamおよびPEまたはAPC標識したヤギ抗ヒトIgG2a抗体BioLegendで染色することによって、マウス細胞とヒトCSCを区別した。死細胞も、7AADViabilityDyeBeckmanCoulterによって除去した。これらの抗体はLgr5に高度に特異的であったが、Lgr5に対して両方とも高い相同性を有するLgr4およびLgr6に対しては交差反応しなかった図18、19。これらの抗体を用いることにより、本発明者らは、付着性の癌幹細胞にLgr5が発現することを立証した。参考実施例2Lgr5陽性およびLgr5陰性の大腸CSCの腫瘍再構築能力大腸癌の幹細胞群の特徴がWntシグナル伝達であるならば、インビボではLgr5陽性の付着細胞しか腫瘍を形成することができない。これが本当なのかどうか確かめるため、本発明者らは、Lgr5陽性の付着細胞およびLgr5陰性の浮遊細胞の腫瘍形成能を調べた。結果、腫瘍形成活性は、Lgr5陰性の浮遊細胞よりもLgr5陽性の付着細胞において強力であったが、Lgr5陽性細胞およびLgr5陰性細胞のどちらもNOGマウスにおける腫瘍形成能を保持していた。Lgr5陽性細胞10個の皮下注射により全ての注射部位6箇所のうち6箇所で腫瘍が生じたが、Lgr5陰性細胞では注射部位6箇所のうち2箇所PLR123由来細胞または1箇所PLR59由来細胞で腫瘍が形成された表6。なお、Lgr5陽性細胞は、接種部位あたりたった1個の細胞を注射した場合でさえ、注射部位12箇所のうち2箇所PLR123由来細胞または1箇所PLR59由来細胞で腫瘍が再構築され図20、Lgr5陽性細胞およびLgr5陰性細胞に由来する腫瘍の組織病理学的形態は、元の腫瘍とほぼ同じであった図21。さらに細胞表面マーカーの発現およびLgr5陽性CSCの腫瘍形成活性は、1ヶ月の継代培養を経た後でさえ変化しなかった図22、23。これらの結果により、PLR59およびPLR123に由来するLgr5陽性細胞およびLgr5陰性細胞は高純度の大腸CSCであること、および、Lgr5陽性およびLgr5陰性細胞は大腸癌における2種類の別個の状態のCSCを意味することが実証された。参考実施例3TCFおよびβカテニンの効果ウエスタンブロット解析は以下の方法によって実施された。CompleteMiniプロテアーゼインヒビターカクテルRocheを添加したRIPAバッファーSigmaを用いて、タンパク質を抽出した。タンパク質をNuPAGEゲルInvitrogenで分画し、PVDF膜に転写した。1スキムミルク含有PBSでブロッキングした後、膜を、ウサギ抗ヒトβカテニン抗体、ウサギ抗ヒトホスホcJUN抗体、ウサギ抗ヒトTCF1抗体、ウサギ抗ヒトTCF3抗体、ウサギ抗ヒトTCF4抗体、ウサギ抗ヒトLgr5抗体、マウス抗ヒトEカドヘリン抗体、ウサギ抗ヒトSnail抗体、および、マウス抗ヒトGAPDH抗体でプローブした。BCIPNBT基質KPLを用いて反応性のバンドを検出した。Lgr5の発現と一致して、Lgr5陽性細胞ではβカテニン、TCF1、TCF3、およびTCF4タンパク質のレベルがアップレギュレーションされたが、Lgr5陰性細胞では認められなかった図20および図24。一方、cJunのN末端領域のリン酸化は、Lgr5陰性癌幹細胞と比べてLgr5陽性癌幹細胞では検出されなかった図20および図24。Wntシグナル伝達が大腸癌幹細胞の増殖を駆動するかどうかとの疑問を解決するため、本発明者らは、βカテニンTCFインヒビターであるFH535、およびWntβカテニンインヒビターであるカルダモニンβカテニンの分解を誘発するが大腸癌幹細胞の増殖に与える効果を調べた。細胞増殖は以下の方法により評価された。浮遊癌幹細胞および付着癌幹細胞を、それぞれウェルあたり浮遊癌幹細胞約100個および付着細胞1×104個で、96ウェルプレートに播種した。0および3日目に、製造元のプロトコールに従って、CellCountingKit8アッセイDoujindoにより生細胞数を測定した。0日目の平均吸光度を100と表した。化学感受性分析のため、浮遊癌幹細胞および付着癌幹細胞を、それぞれウェルあたり浮遊癌幹細胞約100個および付着細胞1×104個で、96ウェルプレートに播種し、24時間インキュベーションした後、10μgmLの5FU、10μgmLのイリノテカン、50mMのTCFインヒビターFH535、および50mMのβカテニンインヒビターであるカルダモニンを添加した。薬物存在下で3日間培養した後、CellCountingKit8を細胞に加えた。DMSOまたは培地のみに曝露した細胞の平均吸光度を100と表した。実験はすべて3回ずつ行った。結果、50μMのFH535はLgr5陽性の大腸癌幹細胞の増殖を有意に低下させたが、Lgr5陰性の大腸癌幹細胞の増殖には影響を与えなかった図25および図26。一方、50μMのカルダモニンはLgr5陽性の大腸癌幹細胞において生細胞数を70まで減少させ、Lgr5陰性の大腸癌幹細胞において約50まで減少させた図25および図26。この結果は、TCFがLgr5陽性細胞の増殖を仲介すること、およびβカテニンが大腸癌幹細胞の生存に関与することを示唆するものである。興味深いことに、Lgr5陽性細胞はEGFおよびFGFの供給が無くても増殖し図27および28、このことは、大腸癌幹細胞が、その増殖に関してWntシグナル伝達を活性化するための内因的自己分泌機序を包含していることを示すものである。参考実施例4大腸癌幹細胞のLgr5陽性状態からLgr5陰性状態への交替能力癌幹細胞の特徴の1つは、化学療法剤に対する抵抗性であるため、本発明者らは、5FUおよびイリノテカンに対する大腸癌幹細胞の感受性を調べた。前述のように、Lgr5陽性細胞は倍加時間約25日で増殖したが、Lgr5陰性癌幹細胞は増殖という観点からは静止状態であった。5FU10microgmlおよびイリノテカン10microgmlで処理した場合、いずれの場合もLgr5陽性の大腸癌幹細胞の増殖は有意に阻害したが、Lgr5陰性の大腸癌幹細胞の増殖および生存には影響を与えなかった図29および図30。Lgr5陽性の大腸癌幹細胞を5FU10microgmlまたはイリノテカン10microgmlに3日間曝露した後、これらの化学療法剤に対して抵抗性を有する細胞が現れた。驚くべきことに、該薬物抵抗性細胞はLgr5陰性であり、かつその形態が変化しており図31、図32、および図33、これは、Lgr5陽性状態からLgr5陰性状態へ変化したことが示された。本発明者らは、Lgr5陰性の大腸癌幹細胞がLgr5陽性状態に変化するのかどうか確認するため、イリノテカン処理により調製したLgr5陰性の大腸癌幹細胞を再度無血清の幹細胞培養液で付着培養したところ、Lgr5陽性となり、間葉細胞様形態を示すとともに図34および図35、細胞増殖を開始した。一方、Lgr5陽性の付着大腸癌幹細胞を超低接着プレートで培養したところ、本発明者らは細胞のいくつかが増殖を停止し、スフェロイド様構造を形成し、非常に低レベルのLgr5mRNAを示したことを観察した図34および図35。なお、Lgr5のmRNAは、下記の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって評価された。すなわち、RNeasyMiniKitincludingDNAasetreatmentQiagenを用いて単離された全RNAを鋳型としてcDNAが、FirstStrandcDNASynthesisKitSABiosciencesを用いて合成された。定量的リアルタイムPCRQRTPCR解析は、Mx3005PRealTimePCRSystemStratageneにおいて、SYBRGreenRoxqPCRSABiosciencesを用いて実施した。誘導倍率の値は、2ΔΔCt法を用いて算出した。GAPDHおよびACTBを参照として用いた。実験はすべて3回ずつ行った。定量的リアルタイムPCR解析のためのプライマーとして以下のプライマーを、反応性の転写産物を増幅するために用いた。Lgr5フォワードプライマー5AGTTTATCCTTCTGGTGGTAGTCC3配列番号:1、リバースプライマー5CAAGATGTAGAGAAGGGGATTGA3配列番号:2、GAPDHフォワードプライマー5CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC3配列番号:3、リバースプライマー5ACGACCAAATCCGTTGACTC3配列番号:4、ACTB:フォワードプライマー5AAGTCCCTTGCCATCCTAAAA3配列番号:5、リバースプライマー5ATGCTATCACCTCCCCTGTG3配列番号:6前記の結果より、本発明者らは、大腸癌幹細胞はLgr5陽性状態とLgr5陰性状態の間を交替し、そのような変化は外因的な要素およびニッチ環境を必要としないと結論づけた。参考実施例5Lgr5陽性の大腸癌幹細胞のインビトロおよびインビボにおけるEMT核βカテニンを発現している間葉様細胞は、EMTを受ける、移動性癌幹細胞および転移形成癌幹細胞であると考えられるBrabletzTJungASpadernaSHlubekFKirchnerTOpinionmigratingcancerstemcellsanintegratedconceptofmalignanttumourprogressionNatRevCancer5744749。Lgr5陽性の大腸癌幹細胞の形態が間葉細胞に似ているため、本発明者らはLgr5陽性の大腸癌幹細胞は移動性癌幹細胞に相当するかどうか試験した。ウエスタンブロット分析によって、Lgr5陽性の大腸癌幹細胞における、低レベルの細胞表面Eカドヘリン、高レベルのSnail、および核局在βカテニンの発現これはEMTの特徴であるが明らかになった図36、図37、および図38。これに対して、Lgr5陰性の大腸癌幹細胞はいかなるEMTの兆候も示さず、すなわち、細胞表面Eカドヘリンが高発現し、Snailが低発現し、かつβカテニンの核局在は認められなかった。さらに、異種移植腫瘍組織で、出芽性領域でEMTを受けている細胞における、SnailとLgr5の同時発現が観察され図39、これは、Lgr5陽性の大腸癌幹細胞が移動性幹細胞に相当するとの見解を支持するものである。さらに、本発明者らは、Lgr5陽性の大腸癌幹細胞は、肺、肝臓、リンパ節、および皮下を含む複数の組織において腫瘍を形成することを示した。興味深いことに、腫瘍細胞の静脈注射から少なくとも40日後までに、肝臓、リンパ節、および皮下においては上皮管構造をもつ腫瘍が再構成されたが、肺では再構成されなかった図40、41。