"明細書中に記載の発明。本発明の最も広範な態様では、本発明は、非胚動物細胞または組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な幹細胞にまで及ぶ。特定の態様では、本発明は、生後動物細胞または組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚葉幹細胞にまで及ぶ。さらなる態様では、本発明は、成体動物細胞または組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚葉幹細胞にまで及ぶ。本発明の多能性胚様幹細胞は、非ヒト細胞から単離してもまたはヒト細胞から単離してもよい。本発明の多能性胚様幹細胞は、筋肉、真皮、脂肪、腱、靭帯、軟骨膜、骨膜、心臓、大動脈、心内膜、心筋層、心外膜、大動静脈、肉芽組織、末梢神経、末梢神経節、脊髄、硬膜、軟髄膜、気管、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、膵臓、壁側腹膜、臓側腹膜、壁側胸膜、肺胸膜、膀胱、胆嚢、腎臓、関連結合組織、または骨髄の群より選択される非胚組織から単離することができる。本発明はさらに、細胞、特に、多能性胚様幹細胞から誘導される多能性または始原細胞に関する。細胞は、分化決定された細胞であり得、該細胞は内胚葉、外胚葉または中胚葉系統に決定され得る。例えば、中胚葉系統の分化決定された細胞、例えば、脂肪生成、筋原または軟骨形成始原細胞は、多能性胚様幹細胞から誘導され得る。本発明はまた、多能性間葉幹細胞、多能性内胚葉幹細胞および多能性外胚葉幹細胞を含む多能性胚様幹細胞から誘導される多能性細胞に関する。いずれのそのような多能性細胞も自己再生および分化可能である。さらなる態様において、本発明は、a自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚様幹細胞;およびb前記幹細胞の増殖を支持し得る培地、を含む培養物。を含む培養物に関する。培養物を含有するそのような幹細胞は、増殖因子または分化決定因子をさらに含むことができる。そのような培養物の幹細胞は、非ヒト細胞から単離されてもまたはヒト細胞から単離されてもよい。本発明はさらに、多能性胚様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。a非胚動物供給源から細胞を入手する工程;b-80°Cの最終温度に到達するまで、7.5v/vジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;およびc前記細胞を培養する工程。本発明はさらに、多能性胚様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。a生後動物供給源から細胞を入手する工程;b-80°Cの最終温度に到達するまで、7.5v/vジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;およびc前記細胞を培養する工程。本発明はさらに、多能性胚様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。a成体動物供給源から細胞を入手する工程;b-80°Cの最終温度に到達するまで、7.5v/vジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;およびc前記細胞を培養する工程。本発明はさらに、多能性胚様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。a非胚動物供給源から細胞を入手する工程;b20μmフィルターを介して前記細胞をろ過する工程;c-80°Cの最終温度に到達するまで、7.5v/vジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;およびd前記細胞を培養する工程。さらなる態様において、多能性肺様幹細胞を単離する方法は、それによってそのような幹細胞のクローン集団が単離される方法に関し、ここで、まず、単一の多能性肺様幹細胞が単離され、次いで、クローン集団を作製するために培養および拡張される。単一の多能性胚様幹細胞は、限界希釈かまたは当業者に公知である他の方法によって単離することができる。従って、本発明はまた、そのような方法によって発生されるクローン多能性胚様幹細胞株に関する。特定の態様では、本発明は多能性胚様幹細胞あるいは形質転換またはトランスフェクトされ、それによって目的の遺伝子もしくはタンパク質を含有し発現することができるそのような細胞の集団に関する。従って、本発明は、目的の遺伝子またはタンパク質を発現するように遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を含む。次いで、そのような遺伝子操作された幹細胞が分化決定されるのと同様に、本発明はさらに、遺伝子操作された多能性胚様幹細胞から誘導され、目的の遺伝子またはタンパク質を発現する分化決定された細胞を包含する。分化決定された細胞は内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞であってもよく、多能性間葉幹細胞などの多能性細胞または脂肪生成もしくは筋原細胞などの始原細胞であってもよい。次いで、本発明は、遺伝子的多能性胚様幹細胞を産生する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。a少なくとも1つのマーカー遺伝子または目的の遺伝子を含むDNA構築物で多能性胚様幹細胞をトランスフェクトする工程;b前記多能性胚様幹細胞において前記マーカー遺伝子または目的の遺伝子の発現を選択する工程;c工程bにおいて選択された幹細胞を培養する工程。特定の態様において、本発明は、そのような方法によって産生されたヒトおよび非ヒト細胞を含む遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を包含する。本発明はさらに、分化決定因子である作用物質の存在または活性を検出する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。A.本発明の多能性胚様幹細胞と分化決定因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程;およびB.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程、ここで、前記接触された細胞の系統は、前記サンプルにおける分化決定因子の存在または活性を示す。本発明はまた、作用物質、化合物または因子が分化未決定な細胞の分化決定を変調する能力を試験する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;およびC.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞の増殖または分化決定を変調するのに有効な潜在的作用物質、化合物または薬物のスクリーニングのためのアッセイシステムを含む。さらにそのような態様では、本発明は、分化未決定な細胞の分化決定を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムに関し、該方法は以下の工程を含む。A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;およびC.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。本発明はまた、増幅因子である作用物質の存在または活性を検出する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。A.本発明の多能性胚様幹細胞と増幅因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程;およびB.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程、ここで、分化決定を伴わない前記接触された細胞の増殖は、前記サンプルにおける増殖因子の存在または活性を示す。さらなる態様において、本発明は、作用物質、化合物または因子が分化未決定な細胞の増殖を変調する能力を試験する方法を含み、該方法は以下の工程を含む。A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;およびC.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。本発明はさらに、分化未決定な細胞の増殖を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムに関し、該方法は以下の工程を含む。A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;およびC.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。アッセイシステムは、重要なことに、本発明の多能性胚様幹細胞をinvitroまたはinvivo変調することが可能な薬物もしくは他の実体を同定するために適応し得る。そのようなアッセイは、例えば、増殖または特定の系統もしくは細胞型にを決定するために多能性胚様幹細胞を変調するのに特異的であり得る作用物質、因子または薬物の開発に有用である。例えば、そのような薬物は細胞または組織の移植療法を可能にするのに使用することができる。アッセイシステムは、増殖または分化決定因子をコードするかあるいはそうでなけれは細胞の分化または発生に関与するタンパク質または分子をコードする遺伝子をスクリーニングするか、同定するかあるいは特徴付けするために容易に適応することができる。例えば、特定の系統に沿った分化に関与するかまたは分化中に発現されるタンパク質をコードする遺伝子は、公知の方法例えば、cDNAライブラリー、ディファレンシャルディスプレイなどにより同定することができる。従って、本発明の多能性胚様幹細胞は、特定の系統を生じる条件下で培養することができ、次いでここで発現された遺伝子を特徴付けすることができる。多能性胚様状態における本発明の多能性胚様幹細胞を維持するのに必要な因子およびタンパク質はまた、それらの再生能を維持する条件下で本発明の多能性胚様幹細胞を培養し、遺伝子およびそのようにして発現されるタンパク質または外因から提供される場合に自己再生能を維持するタンパク質を特徴付けることによって、同様に同定および特徴付けすることができる。さらなる実施態様において、本発明は、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚様幹細胞の活性、あるいは増殖因子および分化決定因子を含む作用物質または任意のそのような細胞もしくは組織に作用することが決定付けられた他の薬物に基づく特定の治療方法に関する。1つの例示的治療方法は、特定の系統の細胞の欠乏もしくは不全に原因として関連するかまたは該欠乏もしくは不全から生じる症状の発現の予防または変調に関連し、該方法は、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚様幹細胞を、宿主のそれらの症状の発達または進行を予防するのに十分な量で、個々にあるいは増殖因子または分化決定因子との混合で投与することを含む。さらなるかつ特定の態様において、本発明は、治療から利益が得られえる症状、疾患、障害、細胞衰弱もしくは欠損の治療または緩和における細胞の分化未決定の集団、細胞の分化決定された集団、それから誘導される組織および器官を含む本発明の多能性胚様幹細胞の移植を含む治療方法を含む。これらの方法は、細胞、組織もしくは器官の置換または補充を含む。そのような置換または補充は、本発明の多能性胚洋館細胞の移植または細胞の未分化未決定の集団、細胞の分化決定集団、それから誘導される組織もしくは器官の移植によって達成することができる。従って、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞を宿主に導入する工程を含む、宿主に多能性胚様幹細胞を移植する方法を含む。さらなる態様では、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞を宿主に導入する工程を含む、宿主に精製された多能性胚様幹細胞を提供する方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞に目的のタンパク質もしくは遺伝子を発現するDNAまたはRNAを含むベクターをトランスフェクトする工程を含む、目的のタンパク質もしくは遺伝子をinvivo投与する方法を含む。本発明は、治療有効量の多能性胚様幹細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において組織修復または移植する方法を提供する。本発明は、治療有効量の多能性胚様幹細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の細胞衰弱、障害および/または機能不全および/または他の疾患状態を予防ならびに/あるいは治療する方法を提供する。さらなる態様では、本発明の幹細胞から誘導される治療有効量の内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の細胞衰弱、障害および/または機能不全および/または他の疾患状態を予防ならびに/あるいは治療する方法を提供する。本明細書において一般に言及されている治療方法は、増殖因子もしくは分化決定因子を含む薬学的組成物を単独かあるいは本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞もしくは組織、あるいは他の同様な薬剤、薬物または例えば、本発明のさらなる態様に従って調製および使用される薬物スクリーニングアッセイによって同定される化合物との組み合わせで投与することによって様々な病因あるいは他の細胞機能不全および障害を治療する方法を含む。本発明のさらなる目的は、細胞の分化未決定集団、細胞の分化決定集団、それから誘導される組織および器官を含む本発明の多能性胚様幹細胞を含むかまたは基づく治療方法における使用のための薬学的組成物を、受容可能なキャリアと共に提供することである。薬学的に受容可能なキャリアを伴う、本発明の多能性胚様幹細胞ならびに/またはそれから誘導される細胞、組織および器官に作用するかあるいは変調する増殖因子あるいは分化決定因子を含む薬学的組成物も考慮される。増殖因子あるいは分化決定因子の薬学的組成物は、本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞、組織もしくは器官をさらに含み得る。薬学的組成物は、本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞、組織もしくは器官を、ポリマーキャリアあるいは細胞外マトリックス中に含み得る。本発明はまた、哺乳動物の細胞衰弱、障害および/または機能不全を治療するための薬学的組成物を提供し、該薬学的組成物は以下のものを含む。A.治療有効量の本発明の多能性胚葉幹細胞;およびB.薬学的に受容可能な媒体またはキャリア。本発明の薬学的組成物はまた、本発明の多能性胚様幹細胞から誘導される内胚様、外胚様または中胚葉分化決定された細胞を含む組成物、および薬学的に受容可能な媒体もしくはキャリアを含む。そのような任意の薬学的組成物は、増殖因子または分化決定因子をさらに含むことができる。本発明は、間葉型の細胞へ分化することが可能な多能性幹細胞PPMSCに関し、ここで、そのような細胞は、抗原マーカーCD10、CD13、CD34、CD56、CD90およびMHCクラスIに対して陽性であるかまたはこれらを発現する。本発明のPPMSCは、マーカーCDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CDllb、CDllc、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD31、CD33、CD36、CD38、CD41、CD42b、CD44、CD45、CD49d、CD55、CD57、CD59、CD61、CD62E、CD65、CD66e、CD68、CD69、CD71、CD79、CD83、CD95、CD105、CDl17、CD123、CDl66、グリコホリンA、DRII、FLT3、FMC-7、アネキシン、およびLINに対して陰性である。本発明はさらに、抗原マーカーCDla、CD10、CD41、CD66eおよびアネキシンに対して陽性であるかまたはこれらを発現し、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CDllb、CDllc、CDl3、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD31、CD33、CD34、CD36、CD38、CD42b、CD44、CD45、CD49d、CD55、CD56、CD57、CD59、CD61、CD62E、CD65、CD68、CD69、CD71、CD79、CD83、CD90、CD95、CD105、CDl17、CD123、CDl66、グリコホリンA、DRII、クラスI、FLT3、FMC-7、およびLINに対して陰性であるかまたはこれらを発現しない多能性幹細胞に関する。本発明はまた、抗原マーカーCDla、CD10、CD22およびアネキシンに対して陽性であるかまたはこれらを発現し、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CDllb、CDllc、CDl3、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD23、CD24、CD25、CD31、CD33、CD34、CD36、CD38、CD41、CD42b、CD44、CD45、CD49d、CD55、CD56、CD57、CD59、CD61、CD62E、CD65、CD66e、CD68、CD69、CD71、CD79、CD83、CD90、CD95、CD105、CDl17、CD123、CDl66、グリコホリンA、DRII、クラスI、FLT3、FMC-7、アネキシン、およびLINに対して陰性であるかまたはこれらを発現しない多能性幹細胞を含む。本発明はさらに、抗原マーカーCD10およびCD22に対して陽性であるかまたはこれらを発現し、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CDllb、CDllc、CDl3、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD23、CD24、CD25、CD31、CD33、CD34、CD36、CD38、CD41、CD42b、CD44、CD45、CD49d、CD55、CD56、CD57、CD59、CD61、CD62E、CD65、CD66e、CD68、CD69、CD71、CD79、CD83、CD90、CD95、CD105、CDl17、CD123、CDl66、グリコホリンA、DRII、クラスI、FLT3、FMC-7、アネキシン、およびLINに対して陰性であるかまたはこれらを発現しない多能性幹細胞に関する。本発明はもちろん、本発明において例示されるものを含む本発明の多能性胚様幹細胞の調製および単離のためのいくらかの手段または方法を考慮し、従って、本発明は請求の範囲内でそのような手段または方法を含むことを意図する。本発明はまた、以下の項目を提供する:項目1非胚もしくは生後動物細胞または組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚様幹細胞。項目2ヒト細胞である、項目1に記載の幹細胞。項目3筋肉、真皮、脂肪、腱、靭帯、軟骨膜、骨膜、心臓、大動脈、心内膜、心筋層、心外膜、大動静脈、肉芽組織、末梢神経、末梢神経節、脊髄、硬膜、軟髄膜、気管、食道、髄、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、膵臓、壁側腹膜、臓側腹膜、壁側胸膜、肺胸膜、膀胱、胆嚢、腎臓、関連結合組織、または骨髄の群より選択される非胚組織から単離される、項目1に記載の幹細胞。項目4項目1に記載の幹細胞から誘導される多能性内胚葉幹細胞。項目5項目1に記載の幹細胞から誘導される多能性中胚葉幹細胞。項目6項目1に記載の幹細胞から誘導される多能性外胚葉幹細胞。項目7項目1に記載の幹細胞から誘導される内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定細胞。項目8a生後動物細胞または組織から誘導され、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚様幹細胞;およびb前記幹細胞の増殖を支持し得る培地、を含む培養物。項目9増殖因子または分化決定因子をさらに含む、項目8に記載の培養物。項目10前記幹細胞がヒト細胞である、項目8に記載の培養物。項目11多能性胚様幹細胞を単離する方法であって、a生後動物供給源から細胞を入手する工程と、b80°Cの最終温度に到達するまで、75vvジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程と、c前記細胞を培養する工程と、を含む方法。項目12クローン性多能性胚様幹細胞株を単離する方法であって、a生後動物供給源から細胞を入手する工程と、b80°Cの最終温度に到達するまで、75vvジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程と、c前記細胞を培養する工程と、d前記培養された細胞をクローン密度に希釈する工程と、e前記希釈された細胞を培養する工程と、e単一細胞を有するそれらの培養物を増殖させる工程と、を含む方法。項目13項目12に記載の方法によって発生するクローン性多能性胚様幹細胞株。項目14目的の遺伝子またはタンパク質を発現するために遺伝子操作された項目1に記載の幹細胞。項目15遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を産生する方法であって、a少なくとも1つのマーカー遺伝子または目的の遺伝子を含むDNA構築物で多能性胚様幹細胞をトランスフェクトする工程と、b前記多能性胚様幹細胞において前記マーカー遺伝子または目的の遺伝子の発現について選択する工程と、c工程bにおいて選択された幹細胞を培養する工程と、を含む方法。項目16項目15に記載の方法によって産生される遺伝子操作された多能性胚様幹細胞株。項目17ヒト細胞である、項目16に記載の幹細胞。項目18分化決定因子である作用物質の存在または活性を検出する方法であって、A.項目1に記載の幹細胞と分化決定因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程と、B.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程と、を含み、ここで、前記接触された細胞の系統は、前記サンプルにおける分化決定因子の存在または活性を示す、方法。項目19作用物質、化合物または因子が分化未決定な細胞の分化決定を変調する能力を試験する方法であって、A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において項目1に記載の幹細胞を培養する工程と、B.試験下の前記作用物質、化合物または因子を添加する工程と、C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程と、を含む方法。項目20分化未決定な細胞の分化決定を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムであって、A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において項目1に記載の幹細胞を培養する工程と、B.試験下の前記作用物質、化合物または因子を添加する工程と、C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程と、を含むアッセイシステム。項目21増殖因子である作用物質の存在または活性を検出する方法であって、A.項目1に記載の幹細胞と増殖因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程と、B.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程と、を含み、ここで、分化決定を伴わない前記接触された細胞の増殖は、前記サンプルにおける増殖因子の存在または活性を示す、方法。項目22作用物質、化合物または因子が分化未決定な細胞の増殖を変調する能力を試験する方法であって、A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において項目1に記載の幹細胞を培養する工程と、B.試験下の前記作用物質、化合物または因子を添加する工程と、C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程と、を含む方法。項目23分化未決定な細胞の増殖を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムであって、A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において項目1に記載の幹細胞を培養する工程と、B.試験下の前記作用物質、化合物または因子を添加する工程と、C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程と、を含むアッセイシステム。項目24項目1に記載の幹細胞を、宿主に導入する工程を含む、前記宿主に多能性胚様幹細胞を移植する方法。項目25項目1に記載の多能性胚様幹細胞を、宿主に導入する工程を含む、前記宿主に精製された多能性胚様幹細胞を提供する方法。項目26項目1に記載の多能性胚様幹細胞に目的のタンパク質もしくは遺伝子を発現するDNAもしくはRNAを含むベクターをトランスフェクトする工程を含む、目的のタンパク質または遺伝子をinvivo投与する方法。項目27治療有効量の多能性胚様幹細胞またはそれから誘導される細胞もしくは組織を、哺乳動物に投与する工程を含む、前記哺乳動物の細胞衰弱、障害および/または機能不全および/または他の疾患状態を予防ならびに/あるいは治療する方法。項目28治療有効量の多能性胚様幹細胞またはそれから誘導される細胞もしくは組織を、哺乳動物に投与する工程を含む、前記哺乳動物において組織修復または移植する方法。項目29項目1に記載の幹細胞から誘導される治療有効量の内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞を、哺乳動物に投与する工程を含む、前記哺乳動物の細胞衰弱、障害および/または機能不全および/または他の疾患状態を予防ならびに/あるいは治療する方法。項目30項目1に記載の幹細胞から誘導される治療有効量の内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞を、哺乳動物に投与する工程を含む、前記哺乳動物において組織修復または移植する方法。項目31哺乳動物の細胞衰弱、障害および/または機能不全を治療するための薬学的組成物であって、A.治療有効量の多能性胚葉幹細胞またはそれから誘導される細胞もしくは組織と、B.薬学的に受容可能な媒体またはキャリアと、を含む薬学的組成物。項目32増殖因子または分化決定因子をさらに含む、項目31に記載の薬学的組成物。他の目的および利点は、以下の例示的図面を参照にして、以下の説明を再考することにより当業者には明らかであろう。[詳細な説明]本発明に従えば、用いられる従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術は当業者の範囲内にある。例えば、Sambrookら、MolecularCloning;ALaboratoryManual1989;CurrentProtocolsinMolecularBiologyVolumesI-III[Ausubel,R.M編1994];CellBiology;ALaboratoryHandbookVolumes1-111[J.E.Celis編1994];CurrentProtocolsinImmunologyVolumes1-111[Coligan,J.E編1994];OligonucleotideSynthesisM.J.Gaited.1984;NucleicAcidHybridization[B.D.HamesS.J.Higgins編1985];TranscriptionAndTranslation[B.D.PHamesS.J.Higgins編1984]AnimalCellCulture[R.I.Freshney編1986];ImmobilizedCellsAndEnzymes[IRLPress,1986];B.Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning1984を参照されたい。本明細書において認められる以下の用語は次のように規定されるべきである。用語胚様多能性幹細胞単数および複数、胚様幹細胞、多能性胚様幹細胞、原外胚葉様幹細胞、多能性原外胚葉様幹細胞、PPELSC、PPSCおよび幹細胞ならびに具体的に列挙されていない任意の変異体は、本明細書において交換可能に使用され得、本出願および請求の範囲を通して使用されるに、これらの用語は、これらの細胞単数および複数ならびに/あるいは非胚もしくは生後動物細胞もしくは組織から誘導される上記細胞の培養物、クローンもしくは集団に及び、自己再生可能および内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能である。胚様多能性幹細胞は、本明細書ならびに請求の範囲に記載の能力および特徴のプロフィールを有する。本発明の胚様多能性幹細胞は分化未決定であり、即ち、それらはいずれの特定の胚様、例えば、内胚葉、中胚葉、外胚葉、または脊索にも決定されていない。それらは静止状態を保持することができる。それらはまた、増殖するための特定の成長因子によって刺激され得る。増殖のために活性化される場合、胚様多能性幹細胞は、分化未決定を保持する限り広範な自己再生が可能である。この決定過程には、一般的または特定の分化決定剤の使用が必要である。分化決定は、個々の細胞が、生命体の形成を生じる発生シークエンス中の以後および特定の段階の分化を決定する。用語分化未決定は、細胞が発生シークエンスの分化の以後のいずれの段階例えば、胚様系統または細胞型にも決定されていない細胞の特徴を指す。用語分化決定は、細胞が発生シークエンスの分化の以後の特定の段階例えば、胚様系統または細胞型に決定されている細胞の特徴を指す。例えば、分化決定された細胞は、胚様内の単一の系統、例えば、肝臓、甲状腺内胚葉、筋肉、骨中胚葉、ニューロン、メラニン細胞、表皮外胚葉などに制限された子孫を生じ得るそれらの細胞を含む。多能性内胚様幹細胞は、自己再生または内胚葉内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性内胚葉幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から内胚葉系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の内胚葉分化決定剤の使用が必要である。多能性胚様幹細胞は、上皮裏打ち誘導体、および/または気管の実体、気管支、肺、胃腸管、肝臓、膵臓、膀胱、咽頭、甲状腺、胸腺、上皮小体、鼓室、耳管、扁桃などを含むがこれらに限定されない内胚葉系統内の任意の細胞型を形成することができる。多能性中胚葉幹細胞は、自己再生または中胚様内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性中胚葉幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から中胚葉系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の中胚葉分化決定剤の使用が必要である。多能性中胚葉幹細胞は、骨格筋、平滑筋、心筋、脂肪細胞、褐色細胞、結合組織中隔、疎性結合組織、繊維性器官被膜、腱、靭帯、真皮、骨、硝子軟骨、弾性軟骨繊維軟骨、関節軟骨、成長板軟骨、内皮細胞、髄膜、骨膜、軟骨膜、赤血球、リンパ球、単球、マクロファージ、小膠細胞、形質細胞、肥満細胞、樹状細胞、巨各球、破骨細胞、軟骨吸収細胞、リンパ節、扁桃、脾臓、腎臓、尿管、膀胱、心臓、精巣、卵巣、子宮などを含むがこれらに限定されない中胚葉系統内の任意の細胞型を形成することができる。多能性外胚葉幹細胞は、自己再生または外胚様内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性外胚葉幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から外胚葉系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の外胚葉分化決定剤の使用が必要である。多能性外胚葉幹細胞は、神経外胚葉、神経堤、および/または表面外胚葉系統内の任意の細胞型を形成することができる。多能性神経外胚葉幹細胞は、自己再生または神経外胚様内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性神経外胚葉幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から神経外胚葉系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の神経外胚葉分化決定剤の使用が必要である。多能性神経外胚葉幹細胞は、ニューロン、稀突起膠細胞、星状細胞、上衣細胞、網膜、松果体、脳下垂体後葉などを含むがこれらに限定されない神経外胚様系統内の任意の細胞型を形成することができる。多能性神経堤幹細胞は、自己再生または神経堤内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性神経堤幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から神経堤系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の神経堤分化決定剤の使用が必要である。多能性神経堤幹細胞は、頭側神経節、知覚神経節、自律神経節、末梢神経、シュワン細胞、知覚神経終末、副腎髄質、メラニン細胞、頭部間葉の寄与、頚部間葉への寄与、胸部間葉への寄与、腰部間葉への寄与、仙骨間葉への寄与、尾骨間葉への寄与、心臓弁、心流出路大動脈および肺動脈幹、APUDアミン取り込みデカルボキシラーゼシステム、傍濾胞Cカルシトニン細胞、エンテロクロマフィン細胞などを含むがこれらに限定されない神経堤系統内の任意の細胞型を形成することができる。多能性表面外胚葉幹細胞は、自己再生または表面外胚様内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性表面外胚葉幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から表面外胚葉系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の表面外胚葉分化決定剤の使用が必要である。多能性表面外胚様幹細胞は、表皮、毛髪、爪、汗腺、唾液腺、脂腺、乳腺、脳下垂体前葉、歯のエナメル質、内耳、眼のレンズなどを含むがこれらに限定されない表面外胚葉系統内の任意の細胞型を形成することができる。始原細胞は、分化決定されており、即ち、個々の細胞は、各胚様内の単一の系統、例えば、肝臓、甲状腺内胚葉、筋肉、骨中胚葉、ニューロン、メラニン細胞、表皮外胚葉などに制限された子孫を生じることができる。それらはまた、増殖するための特定の成長因子によって刺激され得る。増殖のために活性化される場合、始原細胞は、プログラム化された細胞老化および死が生じる前に50~70細胞倍加に制限された寿命を有する。クローンまたは細胞のクローン集団は、単一の細胞共通の先祖から有糸分裂によって誘導される細胞の集団である。細胞株は、多くの世代に渡るinvitroでの安定な増殖が可能である初代細胞のクローンである。レプリコンは、invivoでDNA複製の自律単位として機能する任意の遺伝子エレメント例えば、プラスミド、染色体、ウイルスであり、即ち、自身の制御下で複製することが可能である。ベクターは、付着されたセグメントの複製が生じるようにもう1つのDNAセグメントを付着することができるプラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。DNA分子は、デオキシリボヌクレオチドアデニン、グアニン、チミン、またはシトシンの単一形態または二重螺旋でのポリマー形態を指す。この用語は、分子の1次および2次構造のみを指し、該分子を任意の特定の3次形態に限定するものではない。従って、この用語は、特に、線状DNA分子例えば、制限フラグメント、ウイルス、および染色体において見出される2本鎖DNAを含む。特に2本鎖DNA分子の構造について議論する場合、配列は、転写されない鎖のDNA即ち、該鎖はmRNAに相同な配列を有するに沿った5’から3’方向への配列のみを示す通常的な慣例に従って本明細書に記載することができる。複製開始点は、DNA合成に参加するそれらのDNA配列を指す。DNAコード配列は、適切な調節配列の制御下に配置された場合に、転写され、invivoでポリペプチドに翻訳される2本鎖DNA配列であるコード配列の境界は、5’アミノ末端の開始コドンおよび3’カルボキシル末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、原核生物の配列、真核生物のmRNA由来のcDNA型、真核生物例えば、哺乳動物DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列が挙げられるが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列は、通常、コード配列の3’側に配置される。転写および翻訳調節配列は、宿主細胞にコード配列の発現を提供するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのDNA調節配列である。プロモーター配列は、細胞においてRNAポリメラーゼに結合し、下流3’方向のコード配列の転写を開始することが可能なDNA調節領域である。本発明を規定する目的のために、プロモーター配列は、転写開始部位によって3’末端に結合し、上流5’方向に伸張し、最小数の塩基またはバックグランドよりも大きな検出可能なレベルで転写を開始するのに必要なエレメントを含む。プロモーター配列内では、転写開始部位従来、ヌクレアーゼSlによるマッピングによって規定される、およびRNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインコンセンサス配列が認められよう。真核生物のプロモーターは、常にではないがしばしば、TATAボックスおよびCATボックスを含有する。原核生物のプロモーターは、-10および-35コンセンサス配列に加えてシャインダルガノ配列を含有する。発現調節配列は、もう1つのDNA配列の転写および翻訳を制御ならびに調節するDNA配列である。RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、次いで、コード配列によってタンパク質に翻訳される場合、コード配列は細胞中の転写および翻訳調節配列の制御下にある。シグナル配列は、コード配列の前に含まれ得る。この配列は、宿主細胞に連絡してポリペプチドを細胞の表面に方向付けるかまたはポリペプチドを培地に分泌させるシグナルペプチドポリペプチドに対してN末端側をコードし、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物および真核生物に天然に存在する様々なタンパク質に関連して見出すことができる。本発明のプローブについて言及する際に本明細書において使用される用語オリゴヌクレオチドは、2つ以上、好ましくは3つを超えるリボヌクレオチドから成る分子として規定される。その正確なサイズは多くの因子に依存し、順に、最終的な機能およびオリゴヌクレオチドの使用に依存する。本明細書において使用される用語プライマーは、精製された制限消化におけるような天然に存在するかまたは合成により精製されるいずれのオリゴヌクレオチドをも指し、プライマー伸長産物核酸鎖に対して相補的であるの合成が誘導される条件即ち、ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼなどの誘導剤の存在下ならびに適切な温度およびpH下に配置される場合、合成開始点として作用することが可能である。プライマーは単一鎖かまたは2本鎖のいずれか一方であり、誘導剤の存在下で所望される伸長産物の合成をプライムするのに十分な長さでなければ成らない。このプライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源および方法の使用を含む多くの因子に依存する。例えば、診断アプリケーションのために、標的配列の複雑度に依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的に1525以上のヌクレオチドを含有するが、該プライマーはそれより少ないヌクレオチドを含有してもよい。プライマーは、特に標的DNA配列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選択される。このことは、プライマーがそれらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントはプライマーの5’末端に付着することができ、該プライマー配列の残りの部分は鎖に相補的である。あるいは、非相補的塩基またはより長い配列をプライマーに散在させることもできるが、但し、プライマー配列は、鎖の配列とハイブリダイズし、それによって伸長産物の合成のためのテンプレートを形成するのに十分な該鎖の配列との相補性を有する。本明細書で使用される用語制限ヌクレアーゼおよび制限酵素は、特定のヌクレオチド配列またはその付近で2本鎖DNAを切断する微生物の酵素を指す。外来性または異種DNAが細胞の内部に導入されている場合、該細胞は該外来性または異種DNAによって形質転換またはトランスフェクトされている。形質転換またはトランスフェクトDNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAに組み込まれていても組み込まれていなくてもよい。原核生物、例えば、酵母、および哺乳動物細胞では、形質転換またはトランスフェクトDNAは、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持され得る。親核細胞については、安定に形質転換またはトランスフェクトされた細胞は、形質転換またはトランスフェクトDNAが、染色体の複製を介して娘細胞に遺伝するように染色体に組み込まれている細胞である。この安定性は、親核細胞が、形質転換またはトランスフェクトDNAを含有する娘細胞の集団から成る細胞株あるいはクローンを樹立する能力によって決定される。少なくとも約75好ましくは少なくとも約80、最も好ましくは少なくとも約90または95のヌクレオチドが規定された長さのDNA配列に一致する場合、2つのDNA配列は実質的に相同である。実質的に相同である配列は、配列データバンクにおいて利用可能な鎖ソフトウェアを使用して配列を比較するか、または例えば、特定の系について規定されるストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは当業者の範囲内である。例えば、Maniatisら、上掲;DNACloning,Vols.III、上掲;;NucleicAcidHybridization、上掲を参照されたい。DNA構築物の異種領域は、天然におけるより大きな分子との関連において認められないより大きなDNA分子内のDNAの同定可能なセグメントである。従って、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、該遺伝子は、通常、供給源生物のゲノムにおける哺乳動物ゲノムDNAに隣接しないDNAに隣接される。異種コード配列のもう1つの例は、コード配列自体が天然に認められない構築物例えば、ゲノムコード配列がイントロンか、または天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列を含有するcDNAである。対立遺伝子変異体または天然に存在する変異事象は、本明細書に規定されるDNAの異種領域を生じない。発現調節配列がDNA配列の転写および翻訳を制御ならびに調節する場合、該DNA配列は該発現調節配列に作動可能に連結される。用語作動可能に連結されるは、発現させようとするDNA配列の前に適切な開始シグナル例えば、ATGを有し、正確な読み枠を維持して、発現調節配列下のDNA配列の発現およびDNA配列にコードされる所望の産物の産生を可能にすることを含む。組換えDNA分子への挿入を所望する遺伝子が適切な開始シグナルを含有していない場合、そのような開始シグナルを該遺伝子の前に挿入することができる。用語標準的なハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方について5×SSCおよび65°Cに実質的に等価である塩および温度条件を指す。しかし、当業者であれば、そのような標準的なハイブリダイゼーション条件が、緩衝液中のナトリウムおよびマンガンの濃度、ヌクレオチドの配列長および濃度、ミスマッチ、ホルムアミドなどを含む特定の条件に依存することを理解するであろう。2つの配列のハイブリダイズがRNA-RNA、DNA-DNAまたはRNA-DNAであるかどうかも標準的なハイブリダイゼーション条件の決定に重要である。そのようなハイブリダイゼーション条件は、周知の公式ここで、所望であればより高いストリンジェンシーの洗浄によりハイブリダイゼーションは予想されるかまたは決定されるTmよりも典型的に10~20°C低いに従って、当業者によって容易に決定される。本明細書に記載のアミノ酸残基は、L異性体型であるのが好ましい。しかし、免疫グロブリン結合の所望される機能特性がポリペプチドによって保持される限り、D-異性体型の残基を任意のL-アミノ酸残基の代わりに置き換えることができる。NH2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ酸を指す。COOHは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基を指す。標準的なポリペプチド命名方法J.Biol.Chem.,243:3552-591969を見ると、アミノ酸残基の省略記号は以下の対応表表1の通りである。[表1]シンボルアミノ酸1文字3文字YTyrチロシンGGlyグリシンFPheフェニルアラニンMMetメチオニンAAlaアラニンSSerセリンIIleイソロイシンLLeuロイシンTThrトレオニンVValバリンPProプロリンKLysリジンHHisヒスチジンQGlnグルタミンEGluグルタミン酸WTrpトリプトファンRArgアルギニンDAspアスパラギン酸NAsnアスパラギンCCysシステインすべてのアミノ酸残基配列は、左右の方向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式で本明細書において表されることに注意すべきである。さらに、アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュは、1以上のアミノ酸残基のさらなる配列に結合したペプチドを示すことに注意すべきである。上記の表は、3文字命名と本明細書において代替的に出現し得る1文字命名とを相関させるために示されている。同じアミノ酸配列をコードするDNA配列は相互に縮重であり得ることは理解されるべきである。縮重するとは、異なる3文字のコドンが特定のアミノ酸を明確にするために使用されることを意味する。特定の各アミノ酸をコードするために以下のコドンを交換可能に使用することができることは当該分野において周知である。フェニルアラニンPheまたはFUUUまたはUUCロイシンLeuまたはLUUAまたはUUGまたはCUUまたはCUCまたはCUAまたはCUGイソロイシンIleまたはIAUUまたはAUCまたはAUAメチオニンMetまたはMAUGバリンValまたはVGUUまたはGUCofGUAまたはGUGセリンSerまたはSUCUまたはUCCまたはUCAまたはUCGまたはAGUまたはAGCプロリンProまたはPCCUまたはCCCまたはCCAまたはCCGトレオニンThrまたはTACUまたはACCまたはACAまたはACGアラニンAlaまたはAGCUまたはGCGまたはGCAまたはGCGチロシンTyrまたはYUAUまたはUACヒスチジンHisまたはHCAUまたはCACグルタミンGlnまたはQCAAまたはCAGアスパラギンAsnまたはNAAUまたはAACリジンLysまたはKAAAまたはAAGアスパラギン酸AspまたはDGAUまたはGACグルタミン酸GluまたはEGAAまたはGAGシステインCysまたはCUGUまたはUGCアルギニンArgまたはRCGUまたはCGCまたはCGAまたはCGGまたはAGAまたはAGGグリシンGlyまたはGGGUまたはGGCまたはGGAまたはGGGトリプトファンTrpまたはWUGG終止コドンUAAオーカーまたはUAGアンバーまたはUGAオパール上に明記されたコドンはRNA配列に関するものであることを理解すべきである。DNAに対する対応コドンはUの代わりにTを有する。DNAまたはRNA配列の変異または変更は、特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンに変化するように作製され得る。そのような変異は、一般に、可能な限り最も少ないヌクレオチド変化を作製することによって作製され得る。この種類の置換変異を作製して、非保存的方法即ち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸からもう1つの群に属するアミノ酸へコドンを変化させることによってまたは保存的方法即ち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸から同じ群に属するアミノ酸へコドンを変化させることによってで得られるタンパク質のアミノ酸を変化することができる。そのような保存的変化は、一般に得られるタンパク質の構造および機能においてより少ない変化を生じる。非保存的変化は、得られるタンパク質の構造、活性または機能をより変更し易い。本発明は、得られるタンパク質の活性または結合特性を有意に変更しない保存的変化を含有する配列を含むことを考慮すべきである。以下は、様々な群のアミノ酸の1例である。非極性R基を有するアミノ酸。アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン。非変化極性R基を有するアミノ酸。グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン。変化した極性R基を有するアミノ酸pH6.0で陰性に荷電。アスパラギン酸、グルタミン酸。塩基性アミノ酸pH6.0で陽性に荷電。リジン、アルギニン、ヒスチジンpH6.0において。もう1つの群は、フェニル基を有するアミノ酸であり得る。フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン。[表2]もう1つの群は、分子量に従い得る即ち、R基のサイズ。グリシン75アラニン89セリン105プロリン115バリン117トレオニン119システイン121ロイシン131イソロイシン131アスパラギン132アスパラギン酸133グルタミン146リジン146グルタミン酸147メチオニン149ヒスチジンpH6.0で155フェニルアラニン165アルギニン174チロシン181トリプトファン204特に好ましい置換は:陽性荷電が維持され得るようなArgの代わりにLysおよびその逆;陰性荷電が維持され得るようなAspの代わりにGluおよびその逆;遊離の-OHを維持することができるようなThrの代わりにSer;および遊離のNH2を維持することができるようなAsnの代わりにGln。特定の好適な特性を有するアミノ酸を置換するためにアミノ酸置換を導入してもよい。例えば、Cysは、もう1つのCysとのジスルフィド架橋のための潜在的部位に導入することができる。Hisは、特定の触媒部位即ち、Hisは酸または塩基として作用する、生化学触媒において最も一般的なアミノ酸であるとして導入することができるProはタンパク質の構造にβターンを導入する特定の平面構造を有するため、Proを導入することができる。少なくとも約70好ましくは少なくとも約80、最も好ましくは少なくとも約90または95のアミノ酸残基が同一であるか、または保存的置換を示す場合、2つのアミノ酸配列は実質的に相同である。抗体は、抗体および特異的エピトープに結合するそのフラグメントを含む任意の免疫グロブリンである。該用語は、ポリクローナル、モノクローナル、およびキメラ抗体を包含し、最近では米国特許第4,816,397号および同第4,816,567号により詳細に記載されている。抗体結合部位は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖可変ならびに超可変領域から成る抗体分子の構造タンパク質である。本明細書において使用される様々な文法形態における語句抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を考慮する。例示的抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子ならびにFab、Fab’、Fab’2およびFvとして当該分野において公知である部分該部分は本明細書に記載の治療方法における使用に好適であるを含むパラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分である。抗体分子のFabおよびFab’2は、周知の方法により、実質的にインタクトな抗体分子に対するそれぞれパパインおよびペプシンのタンパク質分解反応によって調製される。例えば、米国特許第4,342,566号Theofilopolousらを参照されたい。Fab’抗体分子部分も周知であり、Fab’2部分から、続いてメルカプトエタノールによる2つの重鎖部分を結合するジスルフィド結合の還元、続いてヨードアセタミドなどの試薬による得られたタンパク質メルカプタンのアルキル化により生成される。インタクトな抗体分子を含有する抗体がここでは好ましい。様々な文法形態における語句モノクローナル抗体は、特定の抗原と免疫反応することが可能なただ1つの腫の抗体結合部位を有する抗体を指す。従って、モノクローナル抗体は、典型的に、該抗体が免疫反応する抗原に対する単一の結合親和性を示す。従って、モノクローナル抗体は、異なる抗原に対してそれぞれが免疫特異的である複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば、二特異的キメラモノクローナル抗体を含有し得る。語句薬学的に受容可能は、薬学的に耐性であり、ヒトに投与された場合に典型的にアレルギーまたは胃の不調、めまい感などの同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書において使用される語句治療有効量は、標的細胞隗のS相活性の臨床的に有意な変化または例えば、高血圧、発熱もしくはその存在および活性に伴う白血球数などの病因の他の特徴を予防する、好ましくは少なくとも約30、より好ましくは少なくとも50、最も好ましくは少なくとも90減少するのに十分な量を意味する。その初期の態様において、本発明は、非胚動物細胞または組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚葉幹細胞の同定ならびに単離に関する。本発明は、生後または成体動物細胞もしくは組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚葉幹細胞にまで及ぶ。本発明の多能性胚様幹細胞は、非ヒト細胞から単離してもまたはヒト細胞から単離してもよい。特定の実施態様において、本発明は、任意のヒト多能性胚葉幹細胞およびそのような細胞のクローン集団を含む集団に関する。本発明の多能性胚様幹細胞は、筋肉、真皮、脂肪、腱、靭帯、軟骨膜、骨膜、心臓、大動脈、心内膜、心筋層、心外膜、大動静脈、肉芽組織、末梢神経、末梢神経節、脊髄、硬膜、軟髄膜、気管、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、膵臓、壁側腹膜、臓側腹膜、壁側胸膜、肺胸膜、膀胱、胆嚢、腎臓、関連結合組織、または骨髄の群より選択される非胚生後あるいは成体組織から単離することができる。本発明はさらに、細胞、特に、多能性胚様幹細胞から誘導される多能性または始原細胞に関する。細胞は、分化決定された細胞であり得、該細胞は内胚葉、外胚葉または中胚葉系統に決定され得る。さらなる態様において、本発明は、以下のものを含む培養物に関する。a自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚様幹細胞;およびb前記幹細胞の増殖を支持し得る培地。培養物を含有するそのような幹細胞は、増殖因子または分化決定因子をさらに含むことができる。そのような培養物の幹細胞は、非ヒト細胞から単離されてもまたはヒト細胞から単離されてもよい。本発明はさらに、多能性胚様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。a非胚動物供給源から細胞を入手する工程;b-80°Cの最終温度に到達するまで、7.5v/vジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;およびc前記細胞を培養する工程。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。a生後動物供給源から細胞を入手する工程;b-80°Cの最終温度に到達するまで、7.5v/vジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;およびc前記細胞を培養する工程。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。a成体動物供給源から細胞を入手する工程;b-80°Cの最終温度に到達するまで、7.5v/vジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;およびc前記細胞を培養する工程。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。a非胚動物供給源から細胞を入手する工程;b前記細胞をコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液中でインキュベートする工程;c-80°Cの最終温度に到達するまで、7.5v/vジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記インキュベートした細胞を緩徐に凍結する工程;およびd前記細胞を培養する工程。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。a非胚動物供給源から細胞を入手する工程;b20μmフィルターを介して前記細胞をろ過する工程;c-80°Cの最終温度に到達するまで、7.5v/vジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記ろ過した細胞を緩徐に凍結する工程;およびd前記細胞を培養する工程。さらなる態様において、多能性肺様幹細胞を単離する方法は、それによってそのような幹細胞のクローン集団が単離される方法に関し、ここで、まず、単一の多能性肺様幹細胞が単離され、次いで、クローン集団を作製するために培養および拡張される。単一の多能性胚様幹細胞は、限界希釈かまたは当業者に公知である他の方法によって単離することができる。従って、本発明はまた、そのような方法によって発生されるクローン多能性胚様幹細胞株に関する。特定の態様では、本発明は多能性胚様幹細胞あるいは形質転換またはトランスフェクトされ、それによって目的の遺伝子もしくはタンパク質を含有し発現することができるそのような細胞の集団に関する。従って、本発明は、目的の遺伝子またはタンパク質を発現するように遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を含む。次いで、そのような遺伝子操作された幹細胞が分化決定されるのと同様に、本発明はさらに、遺伝子操作された多能性胚様幹細胞から誘導され、目的の遺伝子またはタンパク質を発現する分化決定された細胞を包含する。分化決定された細胞は内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞であってもよく、多能性間葉幹細胞などの多能性細胞または脂肪生成もしくは筋原細胞などの始原細胞であってもよい。次いで、本発明は、遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を産生する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。a少なくとも1つのマーカー遺伝子または目的の遺伝子を含むDNA構築物で多能性胚様幹細胞をトランスフェクトする工程;b前記多能性胚様幹細胞において前記マーカー遺伝子または目的の遺伝子の発現を選択する工程;c工程bにおいて選択された幹細胞を培養する工程。特定の態様において、本発明は、そのような方法によって産生されたヒトおよび非ヒト細胞を含む遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を包含する。本発明の多能性幹細胞の存在および単離によって生じる診断的および治療的両方の可能性については、多能性胚葉幹細胞が非胚生後または成体動物細胞もしくは組織から単離することができ、他方で自己再生ならびに他方で内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞への分化が可能であるという事実から導かれる。従って、任意の内胚葉、外胚葉、および中胚葉系統の細胞は、動物供給源から、成体期に入るかまたは成体期中であっても該供給源から入手可能な細胞の単一な自己再生供給源から提供され得る。本明細書においてはじめに示唆され、さらに詳細に説明したように、本発明は、例えば、薬学的介入、方法および治療、細胞に基づく治療、遺伝子療法、様々な生物学的および細胞アッセイ、増殖または分化決定因子の単離および評価、ならびに発生および細胞分化に関する多様な研究におけるそれから誘導される細胞または組織を含む多能性胚葉幹細胞の使用を考慮する。本明細書において先に記載したように、外傷または疾患により損傷したかもしくは消失したほとんどのヒト組織を再生する能力は、成体では実質的に減少している。毎年数百万人の米国人が組織の消失または終段階の器官不全を患う。組織消失は、ガン、外傷性組織損傷、先天異常、脈管性欠陥、選択術などに関する急性損傷および外科的介入、即ち、切断、組織の挫滅組織切除、および外科摘出術から生じ得る。組織移植および外科的介入などの選択肢は深刻なドナー不足および可能な長期の病的状態のために厳しく制限されている。これらの一般的ストラテジーは、次の新たな組織の作製に適応されている:1.単離された細胞または組織欠損もしくは欠陥の領域に適用される細胞代用物。2.閉鎖または開放系のいずれか一方でマトリックス上もしくは内に配置された細胞。3.組織の再生を生じる増殖の決定されたパターンに特異的な細胞を調節するための増殖因子または分化決定因子を含む成長因子に依存する組織誘導物質、およびこれらの物質をそれらの標的に送達するための方法。広範な移植物、先天異常、選択術、疾患、および遺伝子異常は、それから誘導される細胞もしくは組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞単独あるいは増殖因子、分化決定因子、または目的の遺伝子もしくはタンパク質との組み合わせでの治療に対して可能性を有する。好ましい治療方法は、組織がinvivoで再生され得る場所での移植のために直接細胞を提供するか、失われた組織をinvitroで再生して次いで組織を提供するか、あるいはexvivoもしくはinvivo遺伝子療法のためのトランスフェクションまたは形質転換に適切な十分な数の細胞を提供することを目的とする組織消失の治療を含む。本発明の多能性胚葉幹細胞の重要な有益性は、任意の特定の組織系統内胚葉、外胚葉、中胚葉への決定前に自己再生に対する能力を有し、次いで、一旦決定されたらさらに増殖することである。移植に利用できる適切な細胞および組織の量が制限されている場合、これらの増殖ならびに分化属性は極めて重要かつ有用である。a単離および分類することができる;b多能性を保持する一方で無制限の増殖能を有する;c多数の個別の組織系統へ決定するために操作することができる;d現存する組織への組み入れが可能である;およびe続いてそれぞれ分化された組織型を発現することができる、移植療法のためのさらなる組織供給源としての多能性胚葉幹細胞の単離は、消失した、損傷を受けた、もしくは疾患のある組織の機能的能力および/または寿命を維持あるいは増加する療法に有益性であることが明らかであり得る。さらなる実施態様において、本発明は、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚様幹細胞の活性、あるいは増殖因子および分化決定因子を含む作用物質または任意のそのような細胞もしくは組織に作用することが決定付けられた他の薬物に基づく特定の治療方法に関する。1つの例示的治療方法は、特定の系統の細胞の欠乏もしくは不全に原因として関連するかまたは該欠乏もしくは不全から生じる症状の発現の予防または変調に関連し、該方法は、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚様幹細胞を、宿主のそれらの症状の発達または進行を予防するのに十分な量で、個々にあるいは増殖因子または分化決定因子との混合で投与することを含む。さらなるかつ特定の態様において、本発明は、治療から利益が得られえる症状、疾患、障害、細胞衰弱もしくは欠損の治療または緩和における細胞の分化未決定の集団、細胞の分化決定された集団、それから誘導される組織および器官を含む本発明の多能性胚様幹細胞の移植を含む治療方法を含む。これらの方法は、細胞、組織もしくは器官の置換または補充を含む。そのような置換または補充は、本発明の多能性胚洋館細胞の移植または細胞の未分化未決定の集団、細胞の分化決定集団、それから誘導される組織もしくは器官の移植によって達成することができる。従って、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞を宿主に導入する工程を含む、宿主に多能性胚様幹細胞を移植する方法を含む。さらなる態様では、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞を宿主に導入する工程を含む、宿主に精製された多能性胚様幹細胞を提供する方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞に目的のタンパク質もしくは遺伝子を発現するDNAまたはRNAを含むベクターをトランスフェクトする工程を含む、目的のタンパク質もしくは遺伝子をinvivo投与する方法を含む。本発明は、治療有効量の多能性胚様幹細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の細胞衰弱、障害および/または機能不全および/または他の疾患状態を予防ならびに/あるいは治療する方法を提供する。さらなる態様では、本発明の幹細胞から誘導される治療有効量の内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の細胞衰弱、障害および/または機能不全および/または他の疾患状態を予防ならびに/あるいは治療する方法を提供する。本明細書において一般に言及されている治療方法は、増殖因子もしくは分化決定因子を含む薬学的組成物を単独かあるいは本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞もしくは組織、あるいは他の同様な薬剤、薬物または例えば、本発明のさらなる態様に従って調製および使用される薬物スクリーニングアッセイによって同定される化合物との組み合わせで投与することによって様々な病因あるいは他の細胞機能不全および障害を治療する方法を含む。また、それから誘導される細胞および/または組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞を認識するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む抗体、ならびに細胞および/もしくはそれから誘導される組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞の増殖または決定を変調する作用物質、因子あるいは薬物は、特定の診断または治療アプリケーションを有することができ、例えば、細胞衰弱、細胞欠損などの症状を補正、緩和、検出および/または測定するの利用できる。例えば、それから誘導される細胞および/または組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞を使用し、例えば、マウス脾臓リンパ球と骨髄腫との融合細胞を利用するハイブリドーマ技術などの公知の技術により、様々な細胞培地においてそれらに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を生成してもよい。同様に、例えば、本発明の細胞の増殖または決定を変調する作用物質、因子または薬物を発見、同定または合成することができ、診断および/治療プロトコールに使用することができる。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の一般的作製方法は周知である。発ガンDNAによるBリンパ球の直接形質転換、またはエプスタインバールウイルスによるトランフェクションなどの融合以外の技術によっても、不死の抗体産生細胞株を作製することができる。例えば、M.Schreierら、HybridomaTechniques1980;Hammerlingら、MonoclonalAntibodiesAndTcellHybridomas1981;Kennettら、MonoclonalAntibodies1980を参照されたい。また、米国特許第4,341,761号;同第4,399,121号;同第4,427,783;同第4,444,887;同第4,451,570;同第4,466,917;同第4,472,500;同第4,491,632;同第4,493,890を参照されたい。それから誘導される細胞もしくは組織を含む多能性胚葉幹細胞、またはそれに対して作用する増殖もしくは分化決定因子に対して産生されるモノクローナル抗体のパネルを、様々な特性、即ち、イソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。増殖または分化決定因子の活性を中和するモノクローナル抗体が特に興味深い。そのようなモノクローナル物を、本明細書において考慮または記載した分化決定もしくは増殖アッセイを含む活性アッセイで容易に同定することができる。それ由来の細胞または組織を含む多能性胚葉幹細胞、あるいは増殖または分化決定因子の免疫親和性に基づく精製もしくは単離または同定を求める場合、高親和性抗体も有用である。好ましくは、本発明の診断または治療方法で使用される抗体は、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体である。より好ましくは、抗体はモノクローナル抗体mAbである。さらに、本明細書に記載の抗体分子は、抗体分子全体のFab、Fab’、Fab’2またはFv部分の形態であるのが好ましい。はじめに示唆したように、本発明の診断方法は、例えば、抗胚葉多能性幹細胞抗体、好ましくはアフィニティー精製されたポリクローナル抗体、より好ましくはmAbを含む、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の幹細胞を認識する有効量の抗体を含むアッセイによって、細胞サンプルあるいは培地を検査することを含む。さらに、本明細書に記載の抗体分子は、Fab、Fab’、Fab’2もしくはFv部分または抗体分子全体の形態であるのが好ましい。先に考察したように、本方法により利益を得ることが可能な患者には、細胞衰弱、臓器不全、組織消失、組織損傷、先天異常、ガンまたは他の疾患衰弱を患う患者が含まれる。抗体を単離し、抗体が標的細胞もしくは因子の単離、精製、検査または変調を援助する能力を決定あるいは最適化する方法は、当該分野において周知である。ポリクローナル抗ポリペプチド抗体を産生させる方法は、当該分野において周知である。米国特許第4,493,795号Nestorらを参照されたい。Nimanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:4949-49531983を参照されたい。典型的に、有用な抗体分子のFabおよび/またはFab’2部分を含有するモノクローナル抗体は、Antibodies-ALaboratoryManual,HarlowおよびLane編、ColdSpringHarborLaboratory,NewYork1988該文献は本明細書において参考として援用されるに記載のハイブリドーマ技術を使用して調製することができる。膵臓細胞は、典型的にポリエチレングリコールPEG6000を使用して骨髄腫と融合される。融合したハイブリッドは、HATに対するそれらの感受性によって選択される。本発明の1つの態様を実施するのに有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば、本発明の多能性胚葉幹細胞と免疫反応するそれらの能力によって同定される。本発明のさらなる態様を実施するのに有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば、それから誘導される細胞または組織を含む多能性胚葉幹細胞に対する因子、作用物質もしくは薬物の増殖または分化決定活性を阻害するそれらの能力によって同定される。本発明を実施するのに有用なモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養物を開始することによって、産生させることができる。該培養物は、ハイブリドーマが培地に抗体分子を分泌するのに十分な条件下および期間の間維持される。次いで、抗体含有培地が回収される。次いで、抗体分子は、周知の技術によってさらに単離される。これらの組成物の調製に有用な培地は当該分野において周知でありかつ市販されており、それらには、合成培養培地、近交系マウスなどが含まれる。合成培地の例としては、4.5gm/lグルコース、20mMグルタミン、および20ウシ胎児血清を補充したDulbeccoの最小必須培地DMEM;Dulbeccoら、Virol.8:3961959がある。近交系マウス株の例としては、Balb/cがある。本発明はさらに、本発明の治療方法を実施するのに有用な治療組成物を考慮する。主題組成物は、混合物中に、薬学的に受容可能な賦形剤キャリアまたは媒体およびそれから誘導される細胞または組織を含む1つ以上の本発明の多能性胚葉幹細胞を単独あるいは有効成分として本明細書に記載の増殖因子または分化決定因子との組み合わせで含む単独または増殖因子または分化決定因子と組み合わされたそれから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞は、薬学的組成物中に、適切なキャリアと共に、細胞もしくは組織の消失または欠損を経験している患者に様々な手段で投与するのに有効な強度で調製することができる。本発明のさらなる目的は、細胞の分化未決定集団、細胞の分化決定集団、それから誘導される組織および器官を含む本発明の多能性胚様幹細胞を含むかまたは基づく治療方法における使用のための薬学的組成物を、受容可能なキャリアまたは媒体と共に提供することである。薬学的に受容可能なキャリアまたは媒体を伴う、本発明の多能性胚様幹細胞ならびに/またはそれから誘導される細胞、組織および器官に作用するかあるいは変調する増殖因子あるいは分化決定因子を含む薬学的組成物も考慮される。増殖因子あるいは分化決定因子の薬学的組成物は、本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞、組織もしくは器官をさらに含み得る。本発明の薬学的組成物は、本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞、組織もしくは器官を、単独であるいはポリマーキャリアまたは細胞外マトリックス中に含み得る。適切なポリマーマトリックスは、合成または天然ポリマーから形成される多孔性メッシュまたはスポンジ、およびポリマー溶液を含む。マトリックスの一方の形態はメッシュまたはスポンジであり、他方の形態はポリマーヒドロゲルである。使用可能な天然のポリマーとしては、コラーゲン、アルブミン、およびフィブリンなどのタンパク質;ならびにアルギン酸およびヒアルロン酸のポリマーなどの多糖が挙げられる。合成ポリマーは生物分解性および非生物分解性ポリマーの両方を含む。生物分解性ポリマーの例としては、ポリ乳酸PLA、ポリグリコール酸PGA、およびポリ乳酸-グリコール酸PLGA、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。非生物分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エチレン、酢酸ビニル、およびポリビニルアルコールが挙げられる。可鍛性であるイオンまたは共有架橋されたヒドロゲルを形成することができるポリマーを使用して、細胞をカプセル化する。ヒドロゲルは、有機ポリマー天然または合成が共有、イオン、または水素結合を介して架橋し、ゲルを形成するために水分子を補足する3次元の開放格子構造を作製する場合に形成される物質である。ヒドロゲルを形成するために使用することができる材料の例としては、アルギン酸などの多糖、ポリホスファゼン、ポリアクリレートこれらはイオン架橋する、またはPluronicsもしくはTetronicsなどのブロックコポリマー、ポリエチレン、オキシド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーこれらはそれぞれ温度もしくはpHによって架橋するが挙げられる。他の材料は、フィブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸およびコラーゲンなどのポリマーを含む。一般に、これらのポリマーは、水、緩衝化塩溶液、または荷電した側鎖もしくはその1価のイオン塩を有する水溶性アルコール溶液などの水溶液に部分的に可溶である。カチオンと反応することができる酸性側鎖を有するポリマーの例としては、ポリホスファゼン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ酢酸ビニル、およびスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーが挙げられる。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーもしくはポリマーとの反応によって形成される酸性側鎖を有するコポリマーを使用することもできる。酸性基の例としては、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化好ましくはフッ素化アルコール基、フェノール性OH基、および酸性OH基がある。アニオンと反応することができる塩基性側鎖を有するポリマーの例には、ポリビニルアミン、ポリビニルピリジン、ポリビニルイミダゾール、およびいくつかのイミノ置換ポリホスファゼンがある。ポリマーのアンモニウムまたは第四塩も主鎖の窒素またはイミノ基から形成することができる。塩基性側鎖の例には、アミノおよびイミノ基がある。本発明はまた、哺乳動物の細胞衰弱、障害および/または機能不全を治療するための薬学的組成物を提供し、該薬学的組成物は以下のものを含む。A.治療有効量の本発明の多能性胚葉幹細胞;およびB.薬学的に受容可能な媒体またはキャリア。本発明の薬学的組成物はまた、本発明の多能性胚様幹細胞から誘導される内胚様、外胚様または中胚葉分化決定された細胞を含む組成物、および薬学的に受容可能な媒体もしくはキャリアを含む。そのような任意の薬学的組成物は、増殖因子または分化決定因子をさらに含むことができる。本発明はもちろん、本発明において例示されるものを含む本発明の多能性胚様幹細胞の調製および単離のためのいくらかの手段または方法を考慮し、従って、本発明は請求の範囲内でそのような手段または方法を含むことを意図する。様々な投与技術を利用してもよく、それらのうち、皮下、静脈および腹腔内注入、カテーテル法などの非経口技術も利用される。治療因子含有組成物は、従来、例えば、単位用量の注入によって静脈投与される。幹細胞または細胞の平均量は変動し得るが、特に資格を有する医師または獣医師の推奨および処方に基づくべきである。有効成分などの細胞または組織に基づく治療組成物の調製については、当該分野において十分に理解されている。そのような組成物は、薬学的に受容可能な媒体において処方されえる。細胞は、溶液中にあってもまたはマトリックス中に埋め込まれいてもよい。有効成分として成長、増殖または分化決定因子を含む因子例えば、ヒト成長ホルモンなどを有する治療組成物の調製については、当該分野において十分に理解されている。有効治療成分は、しばしば、薬学的に受容可能であり有効成分に適合性である賦形剤または媒体と混合される。さらに、所望であれば、組成物は、有効成分の有効性を増強する湿潤または乳化剤、pH緩衝剤などの少量の補助物質を含有することができる。因子は、中和された薬学的に受容可能な塩の形態として、治療組成物に処方することができる。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩ポリペプチドまたは抗体分子の遊離のアミノ機によって形成されるおよび例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸が挙げられる。遊離のカルボキシル基から形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄III水酸化物などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも誘導することができる。本発明の治療組成物を参照にして使用される場合の用語単位用量は、ヒトに対する単位の投与量として適切な物理的に区別される単位を指し、それぞれの単位は、要求される希釈剤、即ち、キャリア、媒体、またはビヒクルを伴って、所望の治療効果を生じるために算出された予め決定された量の活性材料を含有する。組成物は、投与処方に適合する方法および治療有効量で投与される。投与しようとする量は、例えば、治療しようとする被験体および衰弱、被験体の器官、細胞および免疫系が有効成分を利用する能力、および細胞または組織治療の性質などに依存する。投与に必要な有効成分の正確な量は、実施者の判断に依存し、各個体に対して特有である。しかし、因子の適切な投与量は、1日あたり個体の体重キログラムあたり約0.1~20、好ましくは約0.5~約10、より好ましくは、1~数ミリグラムの有効成分の範囲であり、投与経路に依存する。初回投与および2回目の投与のための適切なレジメも変動可能であるが、初回投与、それに続く1時間以上の間隔で以後注入または他の投与による反復投与を含むことができる。あるいは、10ナノモル~10マイクロモルの血中濃度を維持するのに十分な連続静脈輸注が考慮される。例えば、有効成分として増殖因子または分化決定因子を有する治療組成物は、有効量の因子および1つ以上の次の有効成分:抗生物質、ステロイドをさらに含んでもよい。例示的処方は以下の通りである。[表3]静脈内処方I成分mg/mlセホタキシム250.0因子10.0デキストロースUSP45.0重亜硫酸ナトリウムUSP3.2エデト酸二ナトリウムUSP0.1注射用水全量1.0mlまで適宜添加する[表4]静脈内処方II成分mg/mlアンピシリン250.0因子10.0重亜硫酸ナトリウムUSP3.2エデト酸二ナトリウムUSP0.1注射用水全量1.0mlまで適宜添加する[表5]静脈内処方III成分mg/mlゲンタマイシン硫酸塩としてチャージする40.0因子10.0重亜硫酸ナトリウムUSP3.2エデト酸二ナトリウムUSP0.1注射用水全量1.0mlまで適宜添加する[表6]静脈内処方IV成分mg/ml因子10.0デキストロースUSP45.0重亜硫酸ナトリウムUSP3.2エデト酸二ナトリウムUSP0.1注射用水全量1.0mlまで適宜添加する本明細書で使用されるpgはピコグラムを意味し、ngはナノグラムを意味し、ugまたはμgはマイクログラムを意味し、mgはミリグラムを意味し、ulまたはμlはマイクロリットルを意味し、mlはミリリットルを意味し、lはリットルを意味する。本発明のもう1つの特徴は、本明細書に記載のものを含む目的の遺伝子またはタンパク質のDNA配列の発現である。当該分野において周知の通り、DNA配列は、それらを、発現ベクター内の発現調節配列に作動可能に連結し、該発現ベクターを用いて適切な単細胞宿主に形質転換することによって発現させることができる。DNA配列の発現調節配列へのそのような作動可能連結は、もちろん、常にDNA配列の一部とは限らない場合、DNA配列の上流の正確な読み枠に開始コドンATGを供給することを含む。広範な宿主/発現ベクターの組み合わせは、DNA配列の発現に用いることができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体のセグメント、非染色体および合成DNA配列から成り得る。適切なベクターは、SV40の誘導体および既知の細菌プラスミド、例えば、E.coliプラスミドcolEl、pCRl、pBR322、pMB9およびそれらの誘導体、RP4などのプラスミド;ファージDNA、例えば、ラムダファージの多くの誘導体、例えば、NM989、ならびに他のファージDNA、例えば、M13および繊維状1本鎖ファージDNA;2μプラスミドなどの酵母プラスミドまたはその誘導体;昆虫もしくは哺乳動物細胞に有用なベクターなどの親核細胞に有用なベクター;ファージDNAもしくは他の発現調節配列を使用するために修飾されているベクターなどのプラスミドとファージDNAとの組み合わせから誘導されるベクターを含む。広範な発現調節配列該発現調節配列に作動可能に連結されたDNA配列の発現を制御する配列のいずれをもこれらのベクターに使用して、DNA配列を発現させることができる。そのような有用な発現調節配列としては、例えば、SV40、CMV、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルスの早期または後期プロモーター、lacシステム、trpシステム、TACシステム、TRCシステム、LTRシステム、ラムダファージの主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーターPho5、酵母α-接合因子のプロモーター、および原核もしくは親核細胞またはそれらの組織の遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにそれらの様々な組み合わせが挙げられる。広範な単細胞宿主細胞はまた、DNA配列の発現に有用である。これらの宿主は、E.coli、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces、酵母などの菌類、ならびにCHO、Rl.l、B-WおよびL-M細胞、AfricanGreenMonkey腎臓細胞例えば、COS1、COS7、BSC1、BSC40、およびBMT10昆虫細胞例えば、Sf9、組織培養物中のヒト細胞および植物細胞などの周知の真核および原核宿主を含み得る。すべてのベクター、発現調節配列および宿主が同等に十分機能してDNA配列を発現させるとは限らないことは理解されよう。また、すべての宿主が、同じ発現系で同等に十分機能するとは限らない。しかし、当業者であれば、過度の実験を伴うことなく、適切なベクター、発現調節配列、および宿主を選択して、本発明の範囲を逸脱することなく所望される発現を達成することが可能である。例えば、ベクターを選択する際、ベクターは宿主内で機能しなければならないため、宿主について考慮しなければならないベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされる他の任意のタンパク質も考慮される。発現調節配列を選択する場合、通常、様々な因子が考慮される。例えば、これらには、システムの相対的強度、その制御能力、および特に潜在的な2次構造に関して、発現させようとする特定のDNA配列または遺伝子との適合性が含まれる。例えば、選択されたベクターとの適合性、分泌特性、タンパク質を正確に折り畳む能力、およびそれらの発酵用件、ならびに発現させようとするDNA配列によってコードされる産物の宿主に対する毒性、および発現産物の精製容易性を考慮することによって、適切な単細胞宿主が選択される。これらおよび他の因子を考慮すれば、当業者は、発酵時または大規模な動物培養物において本発明のDNA配列を発現させる様々なベクター/発現調節配列/宿主の組み合わせを構築することが可能である。DNA配列は、クローン化よりもむしろ合成によって調製することができる。DNA配列は、アミノ酸ハイブリダイゼーションへ津に対する適切なコドンによって設計することができる。一般に、配列を発現のために使用する場合、意図される宿主に適切なコドンが選択される。全配列は、標準的な方法によって重複するオリゴヌクレオチドから組み立てられ、全コード配列に組み立てられる。例えば、Edge,Nature,292:7561981;Nambairら、Science,223:12991984;Jayら、J.Biol.Chem.,259:63111984を参照されたい。合成DNA配列は、類似体または変異タンパク質を発現する遺伝子の簡便な構築を可能にする。あるいは、変異タンパク質をコードするDNAは、天然の遺伝子またはcDNAの部位特異的変異誘発によって作製することができ、変異タンパク質は、従来のポリペプチド合成を使用して直接作製することができる。非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的組み入れのための一般的方法については、ChristopherJ.Noren,SpencerJ.Anthony-Cahill,MichaelC.Griffith,PeterG.Schultz,Science,244:182-188April1989に記載されている。本方法は、非天然アミノ酸を有する類似体を作製すために使用してもよい。本発明はまた、それから誘導される細胞もしくは組織を含む多能性胚葉幹細胞の増殖または特に分化決定因子を誘発する能力を参考にして、増殖因子または特に分化決定因子の存在を検出するための方法を含む様々な診断アプリケーションに関する。本発明の多能性胚葉幹細胞の診断有用性は、それから誘導される細胞もしくは組織を含む多能性胚葉幹細胞の増殖または特に分化決定因子を誘発する能力を参考にして、増殖因子または特に分化決定因子をスクリーニングするためのアッセイにおけるそのような細胞の使用にまで及ぶ。そのようなアッセイは、例えば、核酸および/またはタンパク質配列の単離ならびに決定によって、既知の因子を特徴付けるか、新規の因子を同定するか、または新規もしくは既知の因子をクローン化する場合に使用し得る。上で詳細に記載した通り、それから誘導される細胞または組織を含む多能性胚葉幹細胞に対する抗体は、周知のハイブリドーマ技術を含む標準的な方法によって、産生させ、単離することができる。簡便のために、本明細書では多能性胚葉幹細胞に対する抗体をAb1と呼び、別の種において惹起された抗体をAb2と呼ぶことにする。多能性胚葉幹細胞の存在は、そのような決定に適用可能な通常の免疫学的手順によって確認することができる。多くの有用な手順が公知である。特に有用であるそのような3つの手順は、検出可能な標識で標識された多能性胚葉幹細胞、または検出可能な標識で標識された抗体Ab1、または検出可能な標識で標識された抗体Ab2のいずれかを利用する。該手順は以下の式に要約され得、式中、アスタリスクは粒子が標識されることを示し、幹細胞は、多能性胚葉幹細胞を表す。A.幹細胞Ab1=幹細胞Ab1B.幹細胞Ab1=幹細胞Ab1C.幹細胞Ab1Ab2=幹細胞Ab1Ab2該手順およびそれらのアプリケーションは、当業者によく知られており、従って、本発明の範囲内で利用することができる。競合手順、手順Aについては、米国特許第3,654,090号および同第3,850,752号に記載されている。手順Cサンドイッチ手順については、米国特許第RE31,006号および同第4,016,043号に記載されている。なお、二重抗体またはDASP手順などの他の手順についても公知である。それぞれの場合、幹細胞は、1つ以上の抗体または結合パートナーと複合体を形成し、複合体のうちの1つのメンバーが検出可能な標識で標識される。複合体が形成され、次いで所望であれば、単離することができ、または標識の検出に適用可能な既知の方法によってその量を決定することができる事実。例えば、蛍光標示式細胞分取のための手順は、当該分野において公知であり、本明細書の実施例において提供されている。予め抗体が結合するかまたは付着しているカラムへの付着によって細胞を単離することもできる。Ab2の特徴的な特性がAblに反応することであることは、上記より明らかであろう。このことは、1つの哺乳動物種において惹起されたAblが、抗体Ab2を惹起する抗原として別の種において使用されているからである。例えば、Ab2は、抗原としてウサギ小唄を使用し、ヤギにおいて惹起され得る。従って、Ab2は、ヤギにおいて惹起される抗ウサギ抗体であり得る。本説明および請求の範囲の目的のために、Ablを第1または抗幹細胞抗体と呼び、Ab2を第2または抗Abl抗体と呼ぶことにする。これらの研究にほぼ一般適に用いられる標識は、放射性元素、酵素、紫外光に暴露された場合に蛍光発光する化学物質、および他の物質である。多くの蛍光材料が公知であり、標識として利用することができる。これらには、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、TexasRed、AMCAブルーおよびLuciferYellowが含まれる。特定の検出材料は、ヤギにおいて調製される抗ウサギ抗体であり、イソチオシアネートを介してフルオレセインと結合する。幹細胞またはその結合パートナーは、放射性元素または酵素で標識することもできる。放射性標識は、任意の現在利用可能な計数手順によって検出することができる。好適なアイソトープは、3H、l4C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、および186Reから選択することができる。同様に、酵素標識も有用であり、任意の現在利用されている発色、分光光度、蛍光光度、電流測定または気体定量技術によって検出することができる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子と反応することによって、選択された粒子に結合される。これらの手順において使用することができる多くの酵素は公知であり、利用することができる。ペルオキシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-D-グルコシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが好適である。交互標識材料および方法の開示内容の例によって、米国特許第3,654,090号;同第3,850,752号;および同第4,016,043号が参照される。本発明は、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚様幹細胞の増殖または分化決定を変調するのに有効な潜在的作用物質、化合物または薬物のスクリーニングのためのアッセイシステムを含む。これらのアッセイはまた、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞に関して活性もしくは能力が既知または推定される因子によって、因子の遺伝子またはポリペプチド配列のクローン化に利用することができるアッセイシステムは、重要なことに、本発明の多能性胚様幹細胞をinvitroまたはinvivo変調することが可能な薬物もしくは他の実体を同定するために適応し得る。そのようなアッセイは、例えば、増殖または特定の系統もしくは細胞型にを決定するために多能性胚様幹細胞を変調するのに特異的であり得る作用物質、因子または薬物の開発に有用である。例えば、そのような薬物は細胞または組織の移植療法を可能にするのに使用することができる。従って、本発明は、分化決定因子である作用物質の存在または活性を検出する方法を考慮し、該方法は以下の工程を含む。A.本発明の多能性胚様幹細胞と分化決定因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程;およびB.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程、ここで、前記接触された細胞の系統は、前記サンプルにおける分化決定因子の存在または活性を示す。本発明はまた、作用物質、化合物または因子が分化未決定な細胞の分化決定を変調する能力を試験する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;およびC.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。さらにそのような態様では、本発明は、分化未決定な細胞の分化決定を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムに関し、該方法は以下の工程を含む。A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;およびC.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。本発明はまた、増幅因子である作用物質の存在または活性を検出する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。A.本発明の多能性胚様幹細胞と増幅因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程;およびB.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程、ここで、分化決定を伴わない前記接触された細胞の増殖は、前記サンプルにおける増殖因子の存在または活性を示す。さらなる態様において、本発明は、作用物質、化合物または因子が分化未決定な細胞の増殖を変調する能力を試験する方法を含み、該方法は以下の工程を含む。A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;およびC.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。本発明はさらに、分化未決定な細胞の増殖を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムに関し、該方法は以下の工程を含む。A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;およびC.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。本発明のさらなる実施態様では、多能性胚様幹細胞あるいは増殖因子または分化決定因子を単離するかもしくはその有無を決定するための医学専門家による使用に適切な市販の試験キットを調製することができる上記の試験技術に従って、そのようなキットの1つのクラスは、少なくとも標識された幹細胞またはその結合パートナー、例えば、該幹細胞に特異的な抗体、および指示書該指示書はもちろん、選択された方法、例えば、競合、サンドイッチ、DASPなどに依存するを含有する。キットはまた、緩衝液、安定剤などの周辺試薬を含有することもできる。従って、多能性胚様幹細胞の単離または該細胞の存在の実証のための試験キットを調製することができ、該試験キットは以下のものを含む。a多能性胚様肝細胞もしくは該細胞への特異的結合パートナーの検出可能な標識への直接的または間接的付着によって得られる予め決定された量の少なくとも1つの標識された免疫組織学的反応成分;b他の試薬;およびc前記キットの使用のための指示書。より具体的には、試験キットは以下のものを含んでもよい。a一般に固相に結合して免疫吸着剤を形成するか、あるいはその代わりに安定なタグ、または複数のそのような終産物などもしくはそれらの結合パートナーにそれぞれに1つ結合する上記のような既知の量の多能性胚様肝細胞;b必要であれば、他の試薬;およびc前記試験キットの使用のための指示書。さらなる改変において、試験キットは、上記の目的のために調製および使用することができ、該試験キットは予め決定されたプロトコール例えば、競合、サンドイッチ、二重抗体などに従って作動し、以下のものを含む。a多能性胚様肝細胞を検出可能な標識を結合することによって得られている標識された成分;b少なくとも1つの試薬がリガンドである1つ以上のさらなる免疫科学的試薬であって、該リガンドは以下のものからなる群より選択される;i標識された成分に結合可能なリガンド;ii標識された成分の結合パートナーに結合可能なリガンド;iii決定しようとする少なくとも1つの成分に結合可能なリガンド;およびiv決定しようとする少なくとも1つの成分の少なくとも1つの結合パートナーに結合可能なリガンド;ならびにc多能性胚葉幹細胞と該細胞に対する特異的結合パートナーとの間の免疫組織反応の1つ以上の成分の検出および/または決定のためのプロトコールの実施のための指示書。本発明は、本発明の例示として提供される以下の非制限的実施例を参考にすることによってさらに理解され得る。以下の実施例は、本発明の好適な実施態様をより十分に例示するために提示されるものであって、決して本発明の広範な範囲を制限するものと解釈されるべきではない。[予備的考慮]提唱された研究は、組織構造および組織機能、例えば、幹細胞、生体活性因子、および生体マトリックスの回復に必要な3部システムならびに組織再生および移植療法のための使用の特定の同定を確かめるように指令された長期間の調査努力の一部である。これらの努力の目的は、ヒト多能性幹細胞を単離し、特定の分化決定に特異的な分子機構を同定することである。この目的は、細胞表面マーカーに対する抗体を使用し、次いで、抗体結合に基づく単離プロトコールを考案することでこれらの細胞を特徴付けることによって達成されるであろう。本発明者らは、先の研究で次のことを示した:a多能性間葉幹細胞のクローン集団は、中胚葉器官の様々な器官および組織から誘導することができる;b多能性間葉幹細胞は、分化能の消失を伴わない実質的に無制限の倍加能を有する;およびc特定の生体活性因子は、細胞速度論、増殖および分化決定、ならびに多能性間葉幹細胞の様々な中胚葉系統、即ち、筋肉、軟骨、骨、脂肪および繊維結合組織への決定を調節することができる。系統発生的分布現在までに、少なくとも5つの種が試験され、間葉幹細胞の系統発生的分布が決定されている表7。試験されたすべての種、例えば、胎児期トリYoungら、1991、1992a,b、1993、1995、1998a;Bowermanら、1991、胎児期マウスKlausmeyerら、1994;RogersVal、1995;Youngら、1998b、胎児期および生後ラットLucasら、1994、1995;Davisら、1995;Warejckaら、1996、生後ウサギPateら、1993、ならびに胎児期および生後ヒトYoungら、1999は、間葉幹細胞の常在性集団を有する。これらの幹細胞は、デキサメタゾンおよび/またはインスリンの存在下でインキュベートする場合、多数の中胚葉表現型を形成する能力を有する。これまで、16種の個別かつ容易に同定可能な細胞/組織表現型が得られている。これらは即ち、骨格筋、平滑筋、心筋、関節軟骨、成長平板軟骨、硝子軟骨、弾性軟骨、繊維軟骨、軟骨内骨化、膜性骨化、瘢痕組織、真皮、脂肪細胞、腱/靭帯、骨膜/軟骨膜、および内皮細胞である。ドナーの年齢移植療法の始原および多能性幹細胞を回収する至適年齢を決定するための研究が行われている。これまで、種あたりに存在する多能性幹細胞の数、増殖能力、または分化能については、ドナーの年齢および性別ヒトのみと比較すると差異が認められていない表7Youngら、1993,1995,1998a,1998b,1999、観察結果は公開されていない;Pateら、1993;Troumら、1993;Lucasら、1994,1995;Rogersら、1995;Warejckaら、1996;Calcuttら、1998。試験した5つのすべての種ニワトリ、マウス、ラット、ウサギおよびヒトでは、種あたりの多能性幹細胞数について年齢に関する差異は認められていない。増殖能または分化能に対する年齢の影響は認められていない。生後では、老年ヒト幹細胞において差異は認められていない。幹細胞の局在位置5つの動物種由来のドナー部位の分析は、うっ血もしくは修復を経験し、結合組織画分を有する任意の組織または器官は、間葉幹細胞の常在性集団を有する。これまでにアッセイされた器官、組織およびそれらの関連結合組織画分は、胚全体、胎児全体、骨格筋、真皮、脂肪、腱、靭帯、軟骨膜、骨膜、心臓、大動脈、心内膜、心筋層、心外膜、大動静脈、肉芽組織、末梢神経、末梢神経節、脊髄、硬膜、軟髄膜、気管、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、膵臓、壁側腹膜、臓側腹膜、壁側胸膜、肺胸膜、膀胱、胆嚢、腎臓、関連結合組織および骨髄Youngら、1993,1995;Pateら、1993;Troumら、1993;Lucasら、1994,1995;Davisら、1995;Rogersら、1995;Warejckaら、1996;Calcuttら、1998;観察結果は公開されていないを含む。特定の組織型の関連結合組織が繊維細胞の必要な補体、組織特異的分化決定された始原幹細胞、および多能性幹細胞を有する一方、該組織は他の組織系統の始原幹細胞も含有することは興味深いYoungら、1993,1995、観察結果は公開されていない。例えば、硝子軟骨周囲の軟骨膜は、幹細胞組成物に基づく3つの区域に区別されることが明らかにされた。内部1/3または骨形成層は、主に軟骨形成始原細胞および少数の多能性細胞を含有し;中間1/3は主に多能性細胞、しかし少数の軟骨形成始原細胞および少数の非軟骨形成始原細胞を含有し;外部1/3は主に非軟骨形成始原細胞例えば、筋原性、脂肪生成、繊維形成、および骨形成始原細胞、繊維細胞、および少数の多能性細胞を含有した。本発明者らは、骨格筋結合組織例えば、筋内膜、筋周膜、筋外膜、骨膜、心内膜、ならびに心外膜における多能性細胞、組織特異的始原細胞、および非組織特異的始原細胞について、局所幹細胞分布の同様の型を見出した。クローン化可能分析間葉幹細胞の同定された集団内の細胞の組成を決定するために、連続限界希釈によるクローン化可能分析を行った。トリYoungら、1993およびマウスRogersら、1995;Youngら、1998b由来の間葉幹細胞のクローン化可能分析は、一貫して幹細胞の2つのカテゴリー、例えば、分化決定された始原幹細胞および分化未決定の多能性幹細胞を明らかにしている。5つの組織系統が、胎児期および生後多能性幹細胞クローン例えば、筋原性、軟骨形成、脂肪生成、繊維形成および骨形成において、全般および系統特異的誘導剤により誘導され、その後、分化された表現型が発現されているGrigoriadisら、1988;Youngら、1993,1998b、本研究;Rogersら、1995。幹細胞の特徴幹細胞、始原細胞および多能性細胞の各カテゴリーは、共通の特徴と自己特有の特徴とを有している。始原および多能性間葉幹細胞の両方は、付着のためのI型コラーゲン下層を選好し、凍結保存法および10血清および7.5DMSOを含有する培地Youngら、1991での-70~-80°Cでの保存を選好する。始原幹細胞即ち、前駆幹細胞、即時型幹細胞、および形成-芽細胞は分化決定されている。それらは、培地中に存在する他の任意の系統に対する誘導剤に係わらず、それぞれの系統内の組織を形成するのみであるYoungら、1998a。それらは静止状態を保持することができるか、または増殖および/または分化するように活性化され得る。それらは密集時に接触阻止を示す。増殖のために活性化される場合、始原幹細胞は、老化前に50~70倍加寿命を有するYoungら、1993,1998b。分化のために活性化される場合、発達因子は表現型発現を刺激する必要があるYoungら、1998a。多能性細胞は分化未決定である。即ち、それらは、任意の特定の中胚葉組織系統に決定されない。それらは静止状態を保持することができるか、または増殖および/または特定の組織系統に決定するように活性化され得る。それらは、それらの寿命の任意の時点で中胚葉株内の任意の組織系統について始原幹細胞を形成するように全般または系統特異的誘導剤によって誘導される能力を有するYoungら、1993,1998a,b、本研究;Rogersら、1995。増殖のために活性化する場合、それらは、分化未決定を維持する限り広範な自己再生が可能である。例えば、胎児期多能性マウス幹細胞クローンは、690細胞倍加を経験した後、多能性を保持したYoungら、1998b。一旦、多能性細胞が、特定の系統を決定するように誘導されると、それらは、系統特異的始原細胞の特徴、即ち、老化前の制限された約50~70倍加寿命、密集時での接触阻止、および表現型発現を刺激するための発達因子の援助を有するとみなされる。例えば、690細胞倍加した胎児期多能性マウス幹細胞クローンYoungら、1998bは、骨格筋、脂肪、軟骨、および骨の表現型発現マーカーを示す形態学を形成する系統特異的始原細胞を形成するように誘導された。発現されたmRNAのノーザン分析本発明者らは、これまでに、多能性細胞におけるMMP誘導性筋形成を試験するための研究においてノーザンブロット分析を使用している。MMPは、胎児期マウス多能性幹細胞Rogersら、1995;Youngら、1998bにおいてミオゲニンおよびMyoD1遺伝子発現のmRNAの転写を誘導した。要約すると、始原および多能性間葉幹細胞は、胎児期および生後動物の両方に存在する。間葉幹細胞は、結合組織成分を有する任意の組織または器官において認めることができる。任意の年齢または性由来の間葉幹細胞において差異は認められない。間葉幹細胞は、分化決定始原幹細胞および分化未決定多能性幹細胞の両方から成る。多能性間葉幹細胞は、多能性を消失することなく、広範に増殖し得る。一旦、特定の組織系統に決定されると、これらの幹細胞はより原始的な分化状態には戻らない。始原幹細胞は、プログラムされた細胞老化前に有限の50~70倍加寿命を有する。特定の生体活性因子内因性または外来から供給されるは、増殖、分化決定、および系統発達を遺伝子的に調節することができる。これらの研究から、本発明者らは、特に、大量の細胞が必要で、供給される移植組織が不足している場合に、中胚葉組織移植、再生、および遺伝子療法のために自家移植多能性間葉幹細胞をHLA一致ドナー組織として使用することができることを提唱する。[材料および方法]細胞の回収および培養ラットの細胞について、CO2吸入を使用して、1日齢Sprague-Dawleyラット児を屠殺した。ラットを2分間、70エタノールに浸漬し、滅菌フードに入れ、皮を剥ぎ、大殿筋、中殿筋、大腿二頭筋、半膜様筋、半腱様筋、縫工筋、大腿四頭筋、ヒラメ筋、および腓腹筋の新鮮筋腹を取り出した。注意深く腱、大きな血管、および神経を除去した。関連する筋内膜、筋周膜、および筋外膜結合組織画分を含む筋組織を10mlの完全培地中に置き、注意深く細かく切り刻んだ。完全培地は、10の予め選択されたウマ血清lot’s17F-0218or49F-0082,SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO、1抗生物質溶液10,000単位/mlペニシリンおよび10,000mg/mlストレプトマイシン、GIBCOを補充したEarle塩を有する89v/vEagle最小必須培地EMEM、pH7.422GIBCO,GrandIsland,NYから成った。細かく切り刻んだ後、組織懸濁液を50×gで20分間、遠心分離した。.上清を捨て、細胞ペレットの容積を見積もった。細胞ペレットを7容積のEMEM、pH7.4および2容積のコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液に再懸濁し、酵素反応により細胞を遊離させたLucasら、1995。コラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液は、100mlディスパーゼ溶液CollaborativeResearch,Bedford,MAに添加された50mlのEMEM中37,500単位のコラゲナーゼCLS-I,WorthingtonBiochemicalCorp.,Freehold,NJから成った。最終濃度は250単位/mlコラゲナーゼおよび33.3単位/mlディスパーゼであったYoungら、1995。得られた懸濁液を37°Cで1時間撹拌し、細胞を分散させて300×gで20分間、遠心分離した。上清を捨て、組織ペレットを20mlのMSC-1培地に再懸濁した。細胞を90mmおよび20mmNitexフィルターTetcoInc.,Elmsford,N.Yで篩い分けし、単一の細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を150×gで10分間、遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを10mlの完全培地に再懸濁した。Trypanブルー排除Youngら、1991により細胞生存度を決定した。1ゼラチン化EMSciences,Gibbstown,NJ100mm培養皿Falcon,Becton-DickinsonLabware,FranklinLakes,NJあたり105細胞で細胞を播種した。細胞培養物を95空気/5CO2湿潤環境、37°Cで密集状態まで増殖させた。密集時に、細胞をトリプシンで遊離させ、凍結保存した。細胞を、7.5v/vジメチルスルホキシドSigmaを含有する完全培地中で、-80°Cの温度が達成されるまで緩徐に凍結1分間あたり1°Cの温度低下したYoungら、1991。種によって起源材料は異なるものの、ヒト、ウサギ、トリおよびマウスの単離についても同様の手順を使用した。クローン化可能分析凍結した細胞のアリコートを融解し、完全培地に再懸濁した。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットを完全培地中に再懸濁した。細胞の生存度をTrypanブルー排除によって決定した。次いで、細胞を、ゼラチン化100mm皿あたり105細胞で播種し、密集状態まで増殖させた。細胞をトリプシンで遊離させ、7.5v/vジメチルスルホキシドDMSO;MortonThiokol,Danvers,MAを含有する完全倍地中で-80°Cまで凍結保存した。前馴化培地胎児期ニワトリYoungら、1993および胎児期マウスRogersら、1995;Youngら、1998bによる先のクローン化研究は、個々の細胞が、同じ親株の高度増殖細胞による前馴化された培地中で増殖した場合、より高いクローン化効率が達成されることを示した。従って、幹細胞が密集状態対数増殖期で回収されるごとに、培養培地をプールし、0.2mmフィルターで2回ろ過し、アリコートに分けて、4°Cで保存した。本研究のクローン化部分の間は、得られた前馴化培地を使用した。50細胞倍加後の増殖胎児期マウスRogersら、1995;Youngら、、1998bにおける先の研究は、クローン化前に、細胞を50細胞倍加後に増殖させる場合、より高いクローン化効率が達成されることを示した。そのような幹細胞をインスリンと共にインキュベートすると、1未満の細胞が、様々な間葉系統の分化された細胞の表現型マーカーを示した。これらの観察は、クローン化前に50を超える細胞倍加で細胞を増殖させることによって、大部分の細胞は集団から取り出されることを示唆した。おそらく、50細胞倍加Hayflickの限界後の細胞の増殖により、分化決定された細胞をプログラムされた細胞老化および死を経験したHayflick,1963,1965;Young,1999a。凍結保存された細胞を融解し、密集度まで培養し、対数増殖期の前馴化培地を回収し、トリプシンで細胞を遊離し、それらを凍結保存に供する標準プロトコールは、幹細胞集団が最低でも50細胞倍加を経験するまで反復した。本研究では、40~50細胞倍加のアポトーシスを経験するために高い細胞質対核比を有するより大きなサイズの細胞を観察した。50細胞倍加後に保持する細胞の大部分は同様のサイズであり、細胞質対核比が小さい。50倍加を超えて増殖させた細胞のアリコートをクローン化のために凍結保存した。クローン化50倍加を超えて増殖させた細胞の凍結アリコートを融解し、密集状態まで増殖させ、トリプシンで遊離させ、遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁し、細胞の生存度を決定した。細胞を、クローン化培地でクローン密度5mlあたり1mlにまで希釈したYoungら、1993,1998b;Rogersら、1995。等容量の完全培地と前馴化培地とを混合することによってクローン化培地を調製した。5ミリリットルの細胞懸濁液を、ゼラチン化した96ウェルの平板Curtain-MathesonScientific,Atlanta,GAの各ウェルの中心に置き、37°Cでインキュベートした。6時間後、200mlのクローン化培地を各ウェルに添加した。最初の播種の18時間後、ウェルあたりの細胞数を決定した。単一の細胞を有するウェルのみをさらに増殖させた。培地を他のすべてのウェルから取り出した。これらのウェルを70v/vエタノールと共に5分間インキュベートし、室内の空気中で乾燥させた。0.03w/vアジ化ナトリウムを含有する200mlの滅菌Dulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水DPBS,GIBCO,pH7.4を添加して、混入菌の増殖を阻止したRogersら、1995;Youngら、1998b。これらのウェルでさらに増殖させるために、10個以上の細胞がウェル内に出現した後に最初のクローン化培地を新鮮クローン化培地と置き換えた。その後のクローン化培地の置き換えは、培養物の密集度の百分率に依存し、給餌間を最大5日間経過させた。培養物を密集状態後も増殖させた。各培養物をトリプシンで遊離させ、ゼラチン化した6ウェルの平板Falconのウェル内に置き、1日おきに完全培地を与え、密集状態後も増殖させた。培養物をトリプシンで遊離し、最低24時間で凍結保存した。クローン化培地の96ウェルの平板においてクローン密度での播種、密集状態を介する増殖、トリプシン遊離、完全培地における6ウェル中の密集度を介する増殖、培養物の選択、トリプシン遊離、および凍結保存の過程を、各単離されたクローンを単一の細胞から誘導することを確実にするために、最初のクローン化後3回反復した。得られたクローンを増幅させ、トリプシンで遊離し、アリコートに分け、凍結保存したYoungら、1993,1998b;Rogersら、1995。表現型発現のためのインスリン-デキサメタゾン分析インスリンおよびデキサメタゾンを使用して、クローンを検査し、それらの同一性、即ち、分化決定された始原細胞かまたは分化未決定の多能性細胞であるかを決定した。インスリンなどの発達因子は始原細胞において表現型発現を加速するが、多能性幹細胞の表現型発現の誘導に対しては効果を示さない。対照的に、デキサメタゾンなどの系統誘導剤は、多能性細胞において分化決定および発現を誘導するが、始原細胞における表現型発現を変更しない。従って、始原細胞のみが培養物中に存在する場合、インスリン中でインキュベートされた培養物について発現された表現型の質または量は、デキサメタゾンと共にインキュベートした培養物と比較して差異は認められない。始原細胞および多能性細胞の療法を含有する培養物を混合する場合、デキサメタゾンで処理した培養物において発現された表現型の質および/または量は、インスリンで処理した培養物と比較してより大きい。培養物が多能性細胞のみを含有する場合、インスリンで処理した培養物において表現型の発現は認められない。デキサメタゾンで処理した同様の培養物は、多数の発現された表現型を示す。このように、デキサメタゾンおよびインスリンによる処理の効果を比較することにより、不明な細胞群内の始原および多能性細胞の特定の型を同定することができるYoungら、1992,1993,1995,1998a,b,1999a-c;Lucasら、1993,1995;Pateら、1993;Rogersら、1995;Warejckaら、1996。凍結保存されたクローンを融解し、完全培地においてゼラチン化24ウェルの平板のウェルあたり5、10、もしくは20×103細胞かまたは標準的なプロトコールに従って96ウェルの平板のウェルあたり0.5もしくは1.0×103細胞で平板固定した。最初の平板固定の24時間後、培地を試験培地TM1~4TM-1、TM-2、TM-3、TM-4または5TM-5に変更した。TM-1~TM-4は、Ultracultureカタログ番号12-725B,lot.nos.OM0455[TM-1],1M1724[TM-2],2M0420[TM-3]、または2M0274[TM-4],Bio-Whittaker,Walkersville,MD、EMEM1、ならびに1v/v抗生物質溶液10,000単位/mlのペニシリン、および10,000mg/mlのストレプトマイシン、GIBCO、pH7.4から成った。TM-5は、98v/vEMEM、1、3、5または10v/vHSHS4、HS7、またはHS9、および1v/v抗生物質溶液、pH7.4から成った。トリ始原細胞および多能性細胞の両方を定常状態の条件で培養物中において最低30日間およ培養物中において120もの長期間維持するUltraculture:EMEM:抗生物質の比を含有する試験培地。それぞれ様々な濃度のUltracultureを含有する4つの試験培地TM’s1-4を、実験手順に記載の通りに使用した。それぞれの試験培地中に存在するUltraculture対EMEM対抗生物質の比を、トリ始原細胞および多能性細胞の両方におけるの定常状態の培養条件を維持する能力に基づいて、それぞれのロットのUltracultureについて経験的に決定した。4つのUltracultureに基づく試験培地は:TM1=15v/vUltracultureロット番号OM0455:84v/vEMEM:1v/v抗生物質;TM2=15v/vUltracultureロット番号1M1724:84v/vEMEM:1v/v抗生物質;TM3=50v/vUltracultureロット番号2M0420:49v/vEMEM:1v/v抗生物質;およびTM4=75v/vUltracultureロット番号2M0274:24v/vEMEM:1v/v抗生物質である。試験培地のみで24時間プレインキュベーションしたものを使用して、完全倍地中の任意の潜在的な相乗的成分を洗浄した。24時間後の試験培地は、以下のうちの1つに変化した。対照については、試験倍のみを使用した。始原細胞のクローンを同定するために、培地を、2μg/mlインスリンSigma、始原細胞において表現型発現マーカーの出現を加速する薬剤を含有する試験培地TM-1~TM-5に置き換えたYoungら、1998a.。始原細胞のクローンを同定するために、培地を、10-10~10-6MデキサメタゾンSigma、全般的非特異的系統誘導剤を含有する試験培地TM-1~TM-5に置き換えたYoungら、1993,1998a.。対照および処理した培養物を、1日おきに培地を交換しながらさらに30~45日間増殖させた。1つの濃度ごと、1回の実験ごとに4つの培養物を使用した。0~45日間の期間に、培養物を主観的に1日単位で調査した。表現型発現の変化以下を参照されたいは、処理時間に相関し、インシュリンまたはデキサメタゾン濃度に関連した。次いで、3つのパラメータを利用して実験を繰り返し、確立された免疫化学的および組織化学的手順Youngら、1992a,b,1993,1995,1998a,b,1999を使用して、表現型発現マーカーを客観的に確認した。NikonTMS倒立位相差/光度領域顕微鏡を使用して、細胞を写真撮影した。推定骨格筋細胞内の筋節ミオシンの存在を確認するためのミオシン酵素連結免疫培養物アッセイミオシン-ELICAを使用して、多核系統および自発的に収縮する分岐構造を示す培養物をさらに評価したYoungら、1992a,b,1999。推定脂肪細胞内の中性脂肪の存在を確認するためのSudanブラックBRobozSurgicalCo.,Washington,D.C.染色を使用して、多数の屈折性小胞を示す培養物をさらに評価したYoungら、1993,1995;Young、1999a。推定軟骨細胞周辺の細胞周辺および/または細胞外マトリックスに局在するコンドロイチン硫酸/ケラタン硫酸グリコサミノグリカンの存在を確認するためのコンドロイチナーゼ-ACICNBiomedicals,Cleveland,OH/ケラタナーゼICNBiomedicals消化にpH1.0で結合したAlcianBlueAlcianBlau8GS,Chroma-Gesellschaft,RobozSurgicalCo.を使用して、細胞周辺マトリックスハローを含有する丸型細胞の凝集を示す培養物をさらに評価したYoungら、1989a,1993,1995;Young,1999。推定鉱化骨スピクラ内のリン酸カルシウムの存在を確認するためのEGTAエチレングリコール-ビス-[b-アミノエチルエーテル]N,N,N’,N’-テトラ酢酸、Sigma前処理に結合したvonKossaSilberProtein,Chroma-Gesellschaft染色を使用して、3次元マトリックス内に埋め込まれたおよび/または重層した細胞を示す培養物をさらに評価したYoungら、1989a,1993,1995。推定繊維芽細胞周囲の細胞外コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸グリコサミノグリカンの存在を確認するためのコンドロイチナーゼ-ABCICNBiomedicals消化に結合したAlcianBluepH1.0染色を使用して、顆粒状または繊維状のいずれかの細胞外マトリックス内に埋め込まれた細胞の密集層を示す培養物をさらに評価したYoungら、1989a,1993,1995;Young、1999。生体ラット骨髄由来の多能性間葉幹細胞の集団の単離骨髄支質は、骨芽細胞および軟骨細胞に分化し得る細胞を含有することが知られている。骨髄支質はまた、他の表現型を形成し得る多能性細胞を含有することが仮定されている。本発明者らは、多くの間葉表現型に分化可能である細胞本発明者らはこれを間葉幹細胞MSCと呼んでいるがラット骨格筋細胞から単離することができることを明らかにした。本発明者らは、こららの同じ技術を応用して、MSCが生体ラット骨髄の支質組織に存在するかどうかを決定した。7週齢雄性ラット由来の骨髄を回収し、付着細胞を、EMEM10プレ選択されたウマ血清中で密集状態まで培養し、次いで、トリプシン処理、ろ過し、7.5DMSO中で-80°Cまで緩徐に凍結した。細胞を融解し、上記の培地中で平板固定し、10-10~10-6Mの範囲の濃度のデキサメタゾンで5週間まで処理した。観察された表現型は骨格筋管抗ミオシン、平滑筋抗平滑筋αアクチン、骨VonKossa染色、軟骨Alcecブルー、pH1.0および脂肪SudanブラックBを含んだ。骨髄は骨始原細胞以外の幹細胞を含有する。Friedensteinは骨髄支質中に骨形成幹細胞を発見したFriedenstein,1976最初の人物である。多くの研究室による以後の研究により、骨髄中の決定された骨形成前駆細胞の存在Urist,1989;Beresford,1989;Beresfordら、1994;Johnsonら、1998;Babら、1984および正常位欠損の修復におけるそれらの使用Ohgushiら、1989;Paleyら、1986;Grundelら、1991が確認された。しかし、後にFriedensteinは、骨髄支質における2つの集団の骨形成幹細胞について記載したFriedenstein,1995。1つの集団については、Friedensteinが決定型骨形成前駆細胞DOPCと呼んでおり、第2に集団は誘導型骨形成前駆細胞IOPCである。DOPCは骨芽細胞になることが決定されているが、IOPCはそのようには決定されておらず、骨芽細胞に分化するためのいくつかの外因性シグナルによって誘導されなければならない。骨形成シグナルを供給するための鉱物質除去された骨マトリックスを使用する実験は、骨髄中のIOPCの存在を支持したBleiberg,1985;Burwell,1985;Lindholdら、1982;Lindholm,1980;Greenら、1986;Paleyら、1986;Grundelら、1991;stratesら、1989;Kataokaら、1993;Theisら、1992。Owenらによる骨髄支質細胞の以後のクローン化実験Ashtonら、1984;Owenら、1987;Vitamitjanaら、1993;Gronthosら、1994により、骨髄支質中に繊維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞に分化可能な細胞が存在することが発見された。次いで、Owenは、骨髄が多能性間葉幹細胞を含有することを提供したLocklinら、1995;Owenら、1988;Owen,1988。本発明者らは、ニワトリ胚骨格筋Youngら、1991;Youngら、1992a、新生ラット骨格筋Lucasら、1995、新生ラット心臓および培養物中でいくらかの中胚葉表現型に分化し得る生体ウサギ骨格筋から細胞の集団を単離している:骨格筋、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞。本発明者らは、これらの細胞を多能性間葉幹細胞と呼んでいる。本研究は、類似の集団の細胞が生体ラット骨髄に存在するかどうかを決定するために行った。[材料および方法]細胞培養骨髄全体から細胞を単離するために使用した手順は、Friedensteinが最初に記載した手順Friedenstein,1976と本質的に同一である。6~8週齢のラットから長い骨を取り出し、末端を切断し、Earle塩を有する10予め選択されたウマ血清および1抗生物質Fungizone,GIBCOを補充されたEagle最小必須培地EMEMGIBCO,GrandIsland,NYを18ゲージ針を介してフラッシュした。骨髄細胞は、連続的に小さな針最終的に22ゲージ針に通して粉砕を反復することによって解離した。解離した細胞を20μMNitexフィルターを介してろ過し、単一細胞の調製物を得た。血球計で細胞数を決定し、造血および支質細胞を含む細胞を、100mm培養皿あたり107細胞で平板固定した。皿は、予め1ウシゼラチンで被覆しておいたEMSciences,CherryHillsNJ。培養24時間後、非付着細胞を取り出し、培地を上記の培養培地に取り換えた。ここから先の手順は先に記載の単離およびアッセイと同一である。簡単に説明すると、付着骨髄細胞を密集状態まで培養した。培養物注の細胞を、0.01エチレンジアミンテトラ酢酸EDTAを有するDulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水DPBS中0.025トリプシンで皿から遊離させ、20μmフィルターでろ過した。次いでこれらの細胞を、EMEM10ウシ血清および7.5DMSOSigma中に10細胞を含有する1mlのアリコートで凍結した。凍結チャンバ内FisherScientific,Norcross,GAで凍結保存を実施し、緩徐に-80°Cまで細胞を凍結した。24時間の凍結後、凍結した細胞のアリコートを融解し、EMEM10ウシ血清および抗生物質における24ウェルゼラチン被覆平板培養CorningGlassWorks,Corning,NY中の16mmウェルあたり20,000細胞の密度で平板固定した。これらの細胞を2次培養物とした。いくつかのウェルには同じ培地を維持して対照群のために取っておき、実験用ウェルは、培養開始1日目から10-10~10-6Mの範囲の濃度のデキサメタゾンSigmaで補充した培地で処理した。培養中は1週間の間隔で培養物を固定化し、以下に記載のようにして表現型についてアッセイした。表現型のアッセイ1.鉱化組織。本質的にHumasonHumason,1972に記載の通り、リン酸カルシウムのVonKossa染色により石灰化組織の存在についてアッセイした。簡単に説明すると、培養培地を取り出し、プレートをDPBSで2回濯いだ。細胞を0.5mlの10ホルマリンSigmaで3~5分間固定化し、次いで、蒸留水で4回濯いだ。次いで、0.5mlの新たに調製した2硝酸銀Sigma溶液を添加し、細胞を暗所で10分間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液を取り出し、蒸留水で細胞を5回濯いだ。約0.5mlの蒸留水を各ウェル上に置いた。プレートを、明るい光に15分間暴露した光を反射させるためにプレートのすぐ下に白色背景を置いた。プレートを再度5回蒸留水で濯ぎ、次いで、100エタノールで迅速に脱水した。プレートをグリセリンゼリーで永久保存化したYoungら、1991。リン酸カルシウムの存在の確認は、硝酸銀溶液中でインキュベーションする前に、Ca2、Mg2を含まない緩衝液中に1w/v[エチレンビスオキシエチレンニトリロ]-テトラ酢酸EGTASigmaカルシウム特異的キレーターを有する選択された培養物を1時間前処理することによって実施した。2.軟骨。培養物をAlcianブルーRobozSurgicalInstrument,Rockville,MD、pH1.0で染色した。固定化されたウェルを0.5mlAlcianblue、pH1.0で30分間染色し、次いで、ウェルから取り出した。ウェルを水道水または蒸留水で7回濯ぐことによって、非結合染色物を取り出した。培養物は、グリセリンゼリー化で保存した。3.脂肪。以下の方法で、飽和中性脂肪のSudanブラックBAsbeySurgicalCo.,Washington,DC染色をHumason,1972実施した。培養ウェルからすべての培地をアスピレーと吸引し、それぞれのウェルを1mlのDPBSで2回洗浄した。次いで、0.5mlの70ETOHを添加して細胞膜を破壊した。1分間後、アルコールをアスピレーと吸引し、ウェルをDPBSで2回洗浄した。次いで、細胞を100プロピレン中で5分間、2回インキュベートした。次に、細胞を、1ウェルあたり0.5mlのSudanブラックBで10分間、2回インキュベートした。各溶液が澄明になるまで以下の溶液を各0.5mlで繰り返し細胞を濯ぐことによって、染色を区別した。プロピレン:水90:10、85:15、および70:30。蒸留水を用いて細胞を2回、1分間洗浄し、次いで、グリセリンゼリーで永久保存化した。4.筋肉。YoungらYoungら、1992bの手順を改変して使用し、骨格筋ミオシンに対するMF-20抗体HybridomaBank,Ames,IAで細胞を染色した。断りがない限り、各工程の前にDPBSで2回濯いだ。もう1度濯いだ後、0.5mlの冷エタノール-20°Cを5分間適用し、細胞を固定化した。この後、0.5mlのDPBS中1v/vTritonX100/0.05w/vアジ化ナトリウムと共に5分間インキュベーションし、細胞膜を溶解して、それぞれ内因性ペルオキシダーゼを阻害した。20ヤギ血清の1次ブロッカーを30分間、37°Cインキュベーター中で適用する。次いで、MF-20の1:200希釈の1次IgG0.4ml/ウェルを1時間インキュベートする。0.5mlの20ヤギ血清の2次ブロッカーを30分間適用し、続いて、1:7500希釈のビオチン化ヤギ抗マウスIgGLeinco,St.Louis,MOを0.4ml加え、また37°Cで30分間インキュベートした。20ヤギ血清から成る3次ブロッカーを30分間適用し、取り出し、次いで、1:3750希釈のストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼLeincoを0.4ml添加し、37°Cで30分間インキュベートした。この時点で細胞を濯ぎ、0.5mlのABTSペルオキシダーゼ基質KirkegaardおよびPerryLabs,Gaithersburg,MDを添加して、周囲温度、暗所で30分間インキュベーションした。インキュベーション後、200μlのABTS溶液を細胞から取り出し、10μlの0.03アジ化ナトリウムを含有する96ウェルELISAプレートFalconのウェルで平板固定した。405nmフィルターを使用するTiterTek分光光度計プレートリーダー上で該ELISAプレートを読み取った。ABTS溶液のアリコートを取り出した後、0.5mlのDPBSで2回細胞を濯ぎ、次いで0.5mlの蒸留水で2階濯いだ。染色キットの取扱説明書に従って、以後の写真撮影のために選択されたウェルにChromagenSigmaを添加した。一旦発色したら、25μlの0.05アジ化ナトリウムを各ウェルに添加して、反応を停止した。次いでウェルを濯ぎ、グリセリンゼリーで永久保存化した。残りのウェルからABTSを取り出し、先に記載のように、Johnson-WintおよびHollisのinsituジアミノ安息香酸DABA手順Johnson-WintおよびHollis,1982を使用してDNA含有量を分析した。従って、同じウェル上で、ミオシン含有量およびDNA含有量に対する吸光度を得た。6.平滑筋。Sigma社製キットを使用し、平滑筋a-アクチンに対する抗体による染色によって、平滑筋をアッセイした。7.内皮細胞。VoytaらVoytaら、1984が記載のように、低密度リポタンパク質を取り込む能力によって内皮細胞を同定した。抗生物質を補充したDulbeccoの最小必須培地高グルコースDMEMGIBCOで細胞を5回洗浄した。細胞を、1mlあたり10μgの1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチル-インドカルボシアニン過塩素酸DiI-Acyl-LDLBiomedicalTechnology,Stoughton,MAと共に37°Cで4時間インキュベートした。次いで、ウェルをEMEM10ウマ血清で6回洗浄し、蛍光付着を有するNikonDiaphot上で観察した。[結果]骨髄全体から単離された細胞のほとんどは、培養皿に付着しない造血細胞であった。培地を交換したときの培養1日目に、これらの細胞を取り出した。6日目までの培養物は、星形を伴うほとんどの付着細胞から成った図1AおよびB。小さな丸型で極めて収縮性の細胞が星状細胞胃付着し、この星状細胞がさらに培養皿に付着しているを思われる場合、しばしば細胞の凝集隗が認められる。しかし、培養物の最も際立った特徴は、細胞が直線状に配列することである。このラインの長さの測定値は60mmを超え、100mm培養皿にほとんどまたがっている。コラーゲンは、ブラシで円形状に適用されたため、細胞が乾燥コラーゲンのラインの後を追っているとは考えにくい。直線ライン上にある細胞は、それらに付着する他の細胞を有すると思われた。初代骨髄細胞の培養物の培地では、浮遊細胞が連続的に供給されていることが認められた。これは、最初の付着後では浮遊細胞が認められなかった骨格筋および心臓由来の培養物とは対照的である。トリプシン遊離、ろ過、凍結、融解、および2次培養物への最植え込み後、細胞のラインはもはや認められなかった。平均で80の細胞が、凍結融解で生存したが、これは、骨格筋および心臓から単離された細胞から得られたデータLucasら、1995;Warejeckaら、1996と一致する。デキサメタゾンを添加しなかった2次培養物の細胞は、ほぼ均一な星形細胞である図2A。これらの細胞は、2次培養物中で5週間後でも任意の表現型を示さず、すべての表現型アッセイで陰性であった。しかしながら、デキサメタゾンによる処理により、多くの表現型の発現が引き起こされる。骨格筋および心臓から単離された培養物では、時期に応じて様々なデキサメタゾン濃度で限られたオーダーの表現型の出現が認められる。培養時に自発的に収縮した多核細胞も、10-9~10-6Mの範囲のデキサメタゾン濃度での培養で1~2週間で出現した。多核細胞をミオシンに対する抗体で染色することにより、該多核細胞は筋管と同一であることが確認された図2B。デキサメタゾン処理の4週間までに、繊維を含有するほぼ平行四辺形型の細胞が認められた。これらの細胞は、10-7および10-6Mデキサメタゾンで最も多く認められた。繊維を平滑筋αアクチンに対する抗体で染色したところ、平滑筋細胞と同定された図2C。培養3週間後、10-9~10-6Mデキサメタゾンで処理したウェルでは、収縮性細胞外マトリックスを有する、すべて類似のサイズの極めて丸型の細胞の小集合が出現した。AlcianブルーpH1.0で染色されたこれらの凝集物は、軟骨細胞と同定された図3A~C。いくつかの軟骨節は、位相差下で観察すると極めて暗い領域を示す。これらの暗領域をVonKossa’sで染色したところ、好物の存在が示された。これらの節は、石灰化軟骨を示し得る。約2週間から、10-8~10-6Mデキサメタゾンで処理した培養物は、様々なサイズを有する大きな小胞を伴う細胞を含有し、これらの細胞は、位相差顕微鏡下で収縮型の外見が認められた。これらの細胞をSudanブラックBで染色したところ、飽和型中性脂肪の存在が示され、従って該細胞は脂肪細胞と同定された図4A。これらの細胞は、ミオシンまたは平滑筋αアクチンに対する抗体では染色されなかった。しかし、一般に骨髄培養物の脂肪細胞の数は、骨格筋から単離された培養物よりも少なかった。多角形細胞の細胞凝集物は、培養4週間後に出現した。それらは、10-9~10-10Mデキサメタゾンで処理されたウェルで最も一般的に認められたが、すべてのデキサメタゾン濃度では、少数しか出現しなかった。これらの細胞は、位相差顕微鏡下で相当な暗部を示した稠密な細胞外マトリックスを有し、マトリックスはVonKossa染色で染色された図4B。染色はEGTAによる前処理で防止され得る図4C。これはすべて石灰化細胞外マトリックスを示した。従って、これらの細胞は、骨芽細胞と同定された。また、デキサメタゾンによる処理の4週間までに、10-7および10-6Mデキサメタゾン培養物で多角形であるが細胞外マトリックスが認められない細胞が出現した。これらの細胞は、細胞質小胞にDiI-Acyl-LDLを取り込み図5AおよびB、従って、内皮細胞と同定された。DiI-Acyl-LDLとのインキュベーション期間を4時間に制限したところ、平滑筋細胞は、染色されなかった。最後に、らせん状に増殖し、AlcianブルーpH1.0で軽度に染色された滑面マトリックスを有する星形細胞の領域は、10-10~10-8Mデキサメタゾン処理で出現した。データ示さず形態学および染色パターンに基づいて、細胞は仮定的に繊維芽細胞と同定された。[考察]本発明者らは、骨格筋および心臓から得られる細胞とほぼ同一の方法で、多くの表現型に分化することによってデキサメタゾン処理に応答する骨髄から細胞集団を単離することができた。しかし、初代培養物は、筋および心臓から得られる初代培養物とは同一ではなかった。これは、驚くべきことではない。何故なら、各組織は分化された細胞およびそれらの即時型前駆体の独特な補体を含有するからである。骨格筋由来の初代培養物は分化された多核筋管を含有すし、心臓由来の初代培養物は心筋細胞を含有するLucasら、1995;Warejeckaら、1996。これらの表現型は両方とも初代骨髄培養物には存在しなかった図1。しかし、初代骨髄培養物は、長い直線ラインで細胞が並ぶ独特な特徴を有した。このことは以前に文献で報告されておらず、本発明者らは、これらの培養物の性状についてはあまり説明していない。しかし、それらは、いくらかの独立した調製物において再現性が認められた。プレートには予めコラーゲンが被覆してあるため、乾燥コラーゲンのラインに沿って細胞が配列した可能性もある。しかし、コラーゲンが、円運動で使用されるブラシで適用されたならば、この可能性は低いと思われる。コラーゲンアプリケーションの変化は、細胞の直線ラインの形成に影響を及ぼさないデータ示さず。もう1つの可能性は、ラインが、培養物において造血環境を形成しようとする分化された支質細胞を示すことである。培養条件および予め選択されたウマ血清の使用は、この状況を引き起こし易い。本発明者らは既に、ほとんどのロットの血清が細胞に繊維芽細胞への分化を引き起こさせ、デキサメタゾン処理には感応しないことを明らかにしているLucasら、1995。おそらく、繊維芽細胞分化を防止することにより、より容易に観察するために分化された支質細胞をより明白にそれらの表現型を発現させることが可能である。培地において繰り返し生じる浮遊細胞の再生もまた骨格筋および心臓由来の初代培養物とは異なるが、分化した造血組織とは一致する。ライン内の細胞および浮遊細胞の性質についてはさらに検討する必要がある。初代培養物は骨格筋および心臓から得られる培養物とは異なるが、2次培養物は、他の組織から得られる培養物と同一であるようであり、デキサメタゾンに対して同一に挙動した。対照の2次培養物は、5週間の培養の間、何ら分化を示さない星状細胞から成るデキサメタゾンによる処理により、典型的な時間系列および典型的なデキサメタゾン濃度範囲において十分に分化した表現型が出現する。認識された最初1の十分に分化した表現型は、培養1~2週間で出現する多核筋管であり、続いて、培養3週間で脂肪細胞、次いで4週間で軟骨細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞であった。異なる濃度のデキサメタゾンにより、異なる表現型の分化が生じた。平滑筋細胞および内皮細胞は10-7および10-6Mデキサメタゾンで最も多く、脂肪細胞はl0-8~10-6Mの範囲の濃度のデキサメタゾンで存在し、軟骨細胞および骨格筋管は10-9~10-6Mデキサメタゾンで存在する一方、骨芽細胞はすべての濃度のデキサメタゾンで少量存在した。このことから、1つの培養物にいくらかの表現型が存在することが明らかであり、実際、10-7Mデキサメタゾンで処理された培養物ではすべての表現型が認められるのが普通である。異なる表現型の出現時間および表現型を誘導するために使用されるデキサメタゾンの濃度は両方とも、ラット骨格筋および心臓から単離される2次培養物で得られる結果に対応する。しかし、骨髄細胞の2次培養物に対するデキサメタゾンの効果は先に報告したものとは異なる。ほとんどの場合、骨髄支質細胞のinvitroでのデキサメタゾン処理によって、骨芽細胞が分化するVilamitjana-Amedeeら、1993;Beresfordら、1994;Kleinら、1994;Grontosら、1994;Owenら、1987が、いくつかの研究でも、脂肪細胞の分化が報告されているBeresfordら、1994;Kleinら、1994;Grontosら、1994;Owenら、1987。しかし、骨格金筋管、軟骨細胞、または内皮細胞の分化については何も報告されていない。分散チャンバにおける骨髄支質細胞のいくらかのinvivo研究で該チャンバにおける軟骨の出現が報告されているBabら、1984;Babら、1988;Zipori、1989ことをみれば、invitroで軟骨細胞の分化が認められないのは異例である。先の研究でも決定された先駆細胞の分化能が認められていたかもしれないが、実際には骨形成および脂肪生成に関する研究に当てはまる。しかし、培養条件が差異の原因であるかもしれない。第1に、ここで使用される単離手順は、初代培養で前駆細胞を分化させることによって、該前駆細胞を排除するように設計されている。次いで、好ましくは、分化した細胞は凍結融解中に死滅しYoungら、1991、これは、対照培養物において分化した表現型がまったく認められないことからも実証される。第2に、先の研究では例外なく培養培地にウシ胎児血清が使用されていたことである。本発明者らの経験では、ウシ退治血清は、2次培養物中で未決定細胞を繊維芽細胞に分化させ、デキサメタゾンに対する応答を排除してしまうLucasら、1995。デキサメタゾンの正確な機序については知られていないが、デキサメタゾンは細胞のすべての可能な経路の分化を刺激することは明らかであるLucasら、1995。決定された前駆細胞の場合、これは、表現型の最終分化を生じるが、多能性細胞の場合、デキサメタゾンはそれぞれの可能な表現型の決定および分化を誘導するLucasら、1995。従って、先の研究では、決定された始原細胞即ち、前骨芽細胞を排除しようとせず、培養物中の三毛って衣細胞は血清によって繊維形成系統に決定されたため、骨芽細胞の分化が検出された肉芽組織は、多数の中胚葉表現型に分化し得る細胞を含有する以前に、本発明者らは、新生ラット骨格筋から、デキサメタゾンなどの非特異的分化作用物質で処理すると多くの間葉表現型に分化可能な細胞を単離した。本発明者らは、これらの細胞を間葉幹細胞と呼び、それらは肉芽組織に存在すると仮定している。この仮説を試験するために、肉芽組織から細胞を単離し、それらが多数の中胚葉表現型を形成する能力についてアッセイした。7週齢雄性ラットの皮下にステンレス製創傷チャンバをインプラントした。インプラント7または14日後に該チャンバを取り出し、付着している組織を掻き取った。コラゲナーゼ/ディスパーゼによる消化で細胞を単離し、予め選択されたウマ血清を有する培地においてゼラチン被覆皿中で密集状態まで培養した。細胞をトリプシンで遊離させ、7.5ジメチルスルホキシドDMSO中-80°Cで凍結し、次いで、融解し、10-6~10-10Mデキサメタゾンを補充した同培地中で培養した。両時点での細胞は、培養中同様に挙動した。対照培養は星状形態を有する細胞を含有し、骨格筋から単離された細胞と外観は同様であった。しかし、デキサメタゾンによる処理では、以下のような表現型が観察された。培養時に自発的に収縮し、ミオシンに対する抗体で染色された長型多核細胞骨格筋管、細胞外マトリックスがAlcianブルー、pH1.0で染色された丸型細胞の小節軟骨、細胞外マトリックスが鉱物に対するVonKossa染色で染色された丸型細胞骨、SudanブラックBで染色された大きな小胞を有する丸型細胞脂肪細胞、平滑筋αアクチンに対する抗体で染色された細胞内繊維を有する大細胞平滑筋、アセチル化低ow密度リポタンパク質を取り入れた丸型細胞内皮細胞、および顆粒化されたおよび原繊維の細胞結合組織。これらの結果は、、肉芽組織内における、単なる繊維結合組織瘢痕ではなく多数の中胚葉組織を形成し得る間葉幹細胞の存在を示唆する。これらの細胞をinvivoで適切に操作した場合、瘢痕組織の形成とは異なる実際の組織再生を達成することができる。皮膚創傷の治癒に伴う細胞事象については、広範に研究されている最近の研究については、Clark、1993;Bennett、1993a,1993b;HuntおよびLaVan、1989;Falanga、1993;OrgillおよびDemling、1988;Springfield、1993。第1に、外傷は、毛細血管床の裂傷を生じ、血管周囲組織空間へ血液が放出され、凝固して血腫を形成する。血腫形成の間、血小板が凝集し、脱顆粒し、血塊に多くの成長因子が放出される。血塊の成分および放出された成長因子はマクロファージを引き寄せ、マクロファージは血塊に移動してこれを分解する。マクロファージも多くの成長因子を合成および放出し、これらの因子は損傷を受けていない組織周辺の毛細血管内皮細胞および繊維芽細胞に作用する。いくつかの成長因子、特に、塩基性繊維芽細胞成長因子bFGFは、内皮細胞の増殖および移動を引き起こすFolkmanおよびKlagsbrun、1987;Connollyら、1987。これらの細胞はマクロファージの直ぐ後ろで新たな毛細血管ループを形成し、創傷への循環を回復する。その間、繊維芽細胞は増殖し、これもマクロファージに続いて創傷に移動する。繊維芽細胞は、原則としてI型コラーゲン、プロテオグリカン、およびフィブロネクチンから成る細胞外マトリックスを分泌し始めるこれは結局は極めて稠密なマトリックスとなり、コラーゲン分子が架橋を経験するようなかなり強度なマトリックスとなる。このような繊維芽細胞と関連細胞外マトリックスとの組み合わせは、瘢痕組織を構成する。瘢痕組織は、必然的に、外因性作用物質の非存在下で外傷後の皮下組織で形成するが、鉱物質除去された骨マトリックスおよび外マトリックスから精製されたタンパク質を使用する研究では、皮下部位における軟骨および骨のdenovo誘導が明らかにされているUrist、1989;ReddiおよびHuggins、1972;WeissおよびReddi、1981;Reddi、1981;Lucasら、1990;WeissおよびReddi、1980;ReddiおよびAnderson、1976;ならびにWangら、1990。この誘導の細胞事象については研究されており、血腫の形成、マクロファージ、続いて間葉細胞の浸潤、および新たな毛細血管を生じる組織外傷から成る。間葉細胞は軟骨細胞へ分化し、次いで肥大を生じる。肥大性軟骨細胞は、古典的な軟骨内骨形成によって骨に置き換わるReddi、1981;ReddiおよびAnderson、1976。この一連の早期細胞事象は、繊維芽細胞の代わりに間葉細胞が出現することを除いて、創傷の治癒と同一である。このデータは、創傷内に、繊維形成性瘢痕以外の組織へ分化する能力を有する細胞が存在することを意味する。先の研究では、デキサメタゾン、非特異的分化作用物質によって骨格筋Lucasら、1995周辺の結合組織内に局在する細胞集団の存在が明らかにされており、これらの細胞は繊維芽細胞だけではなく、骨格筋、平滑筋、内皮細胞、軟骨、骨および脂肪などの他の中胚葉表現型に分化する。従って、これらの細胞を間葉幹細胞MSCと命名された。さらなる研究により、MSCは様々な期間の結合組織画分内に存在することが明らかにされたYoungら、1995。これらの細胞は、通常、様々な期間の結合組織内に存在し、従って、組織外傷後の創傷治癒応答に寄与し得るため、本発明者らは、これらの細胞も創傷治癒に関する肉芽組織中に存在するかどうかを決定するための以下の実験を行った。[材料および方法]細胞培養SchillingSchillingら、1959,1969により記載され、GoodsonGoodsonら、1976によって改変されたように、長さ3.5cmのシリンダーに形成されたステンレス製メッシュから創傷チャンバを構築した。ベンゼン、次いでエタノールに浸漬することによって創傷チャンバを清浄し、石鹸水中で洗浄し、次いで徹底的に濯いだ。それらをオートクレイブ中で滅菌した。腹腔内ペントバルビタールにより、7週齢ラットを麻酔した。腹部を剃毛し、ポビドンヨウ素providone-iodine溶液で清浄した。Huntら、Huntら、1966の方法により、創傷チャンバを腹部層に挿入し、ステンレス製創傷クリップで創傷を閉じた。インプラント後7または14日目のいずれかに創傷チャンバを取り出し、間葉幹細胞の単離のための先に記載された2工程手順Lucasら、1995を使用して、推定幹細胞を単離した。まず、滅菌条件下で、付着しているすべての組織を創傷チャンバから取り出した。次いで、チャンバを開放し、チャンバ内の組織の容積を目視で見積もり、電磁撹拌棒を含有する100ml培地ボトルにチャンバを移した。7容積の250単位/mlコラゲナーゼCLS-IWorthingtonBiochemicals,Freehold,NJ、33.3単位/mlディスパーゼCollaborativeResearch,Bedford,MAを含有するEarle塩を有するEagle最小必須培地EMEMGIBCO,GrandIsland,NYを添加し、創傷チャンバ中の組織が消化されるまで、混合物を37°Cで1時間半撹拌した。混合物を遠心分離管に移し、300×gで20分間、遠心分離した。上清を捨て、10予め選択されたウマ血清およびペニシリン-ストレプトマイシンを補充したEMEM、pH7.4を20ml添加し、細胞を、20μmのフィルターを介してろ過し、単一細胞懸濁液を得た。さらに、細胞を150×gで10分間、遠心分離し、上清を捨て、10mlのEMEM10ウマ血清を添加した。血球計で細胞を計数し、1ウシゼラチンで被覆した100mm培養皿EMSciences,CherryHills,NJあたり100,000細胞で平板固定した。培養物を、10予め選択されたウマ血清および抗生物質を補充したEMEM中に維持した。約8日後、細胞は密集状態に達し、培養物は少数の多核筋管を伴う単核細胞から成った。0.05トリプシンで細胞を遊離させ、筋管を除去し、単核細胞を残す20μmフィルターを介して細胞をろ過した。次いで、細胞を、EMEM10ウマ血清7.5DMSO中-80°Cで凍結した。.細胞のアリコートを融解し、24ウェルゼラチン被覆培養プレートCorningGlassWorks,Corning,NY中16mmウェルあたり5,000細胞の密度で平板固定した。対照では同じ培地で培養物を維持したが、実験用皿は10-10M~10-6Mの範囲の濃度でデキサメタゾンを含有する培地で処理した。4または5週間目に、培養物を固定化し、以下に記載のようにして表現型についてアッセイした。表現型のアッセイ:1.筋肉。骨格筋筋管を、培養物中で自発的に収縮した多核線状および分岐構造として形態学的に観察したYoungら、1992a。YoungらYoungら、1992bの手順を改変して使用し、支質ミオシンに対するMF-20抗体HybridomaBank,Ames,IAで細胞を染色することによって、組織化学的に骨格筋表現型を確認した。断りがない限り、各工程の前にDPBSで2回濯いだ。DPBSで細胞層を濯いだ後、0.5mlの冷エタノール-20°Cを5分間適用し、細胞を固定化した。この後、0.5mlのDPBS中1v/vTritonX100/0.05w/vアジ化ナトリウムと共に5分間インキュベーションし、細胞膜を溶解して、それぞれ内因性ペルオキシダーゼを阻害した。20ヤギ血清の1次ブロッカーを30分間、37°Cインキュベーター中で適用する。次いで、MF-20の1:200希釈の1次IgG0.4ml/ウェルを1時間インキュベートす。0.5mlの20ヤギ血清の2次ブロッカーを30分間適用し、続いて、1:7500希釈のビオチン化ヤギ抗マウスIgGLeinco,St.Louis,MOを0.4ml加え、また37°Cで30分間インキュベートした。20ヤギ血清から成る3次ブロッカーを30分間適用し、取り出し、次いで、1:3750希釈のストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼLeincoを0.4ml添加し、37°Cで30分間インキュベートした。この時点で、細胞を0.5mlDPBSで2回、次いで、0.5mlの蒸留水で2濯いだ。染色キットの取扱説明書に従って、以後の写真撮影のために選択されたウェルにChromagenSigmaを添加した。一旦発色したら、25μlの0.05アジ化ナトリウムを各ウェルに添加して、反応を停止した。次いでウェルを濯ぎ、グリセリンゼリーで永久保存化した。2.軟骨。培養物をAlcianブルーRobozSurgicalInstrument,Rockville,MD、pH1.0で染色した。細胞を10ホルマリン中で固定化し、次いで0.5mlAlcianブルー、pH1.0で30分間染色し、次いで、ウェルから取り出した。ウェルを水道水または蒸留水で7回濯ぐことによって、非結合染色物を取り出した。培養物は、グリセリンゼリー化で保存した。3.鉱化組織。鉱化可能な組織は、極めて稠密な多角形細胞の凝集物として区別されうる。HumasonHumason、1972により記載のVonKossa手順を使用するリン酸カルシウムに対する組織化学的染色によって、細胞外マトリックスの石灰化性質の確認を行った。簡単に説明すると、培養培地を取り出し、プレートをDPBSで2回濯いだ。細胞を5mlの10ホルマリンSigmaで3~5分間固定化し、次いで、蒸留水で4回濯いだ。次いで、0.5mlの新たに調製した2硝酸銀Sigma溶液を添加し、細胞を暗所で10分間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液を取り出し、蒸留水で細胞を5回濯いだ。約0.5mlの蒸留水を各ウェル上に置いた。プレートを、明るい白色白熱光に15分間暴露した光を反射させるためにプレートのすぐ下に白色背景を置いた。プレートを再度5回蒸留水で濯ぎ、次いで、100エタノールで迅速に脱水した。プレートをグリセリンゼリーで永久保存化した。リン酸カルシウムの存在の確認は、硝酸銀溶液中でインキュベーションする前に、Ca2、Mg2を含まない緩衝液中に1w/v[エチレンビスオキシエチレンニトリロ]-テトラ酢酸EGTASigmaカルシウム特異的キレーターを有する選択された培養物を1時間前処理することによって実施したHumason,1972。4.脂肪。以下の方法で、飽和中性脂肪のSudanブラックBAsbeySurgicalCo.,Washington,DC染色をHumason,1972実施した。培養ウェルからすべての培地をアスピレーと吸引し、それぞれのウェルを1mlのDPBSで2回洗浄した。次いで、0.5mlの70エタノールを添加して細胞膜を破壊した。1分間後、アルコールをアスピレーと吸引し、ウェルをDPBSで2回洗浄した。次いで、細胞を100プロピレン中で5分間、2回インキュベートした。次に、細胞を、1ウェルあたり0.5mlのSudanブラックBで10分間、2回インキュベートした。各溶液が澄明になるまで以下の溶液を各0.5mlで繰り返し細胞を濯ぐことによって、染色を区別した。プロピレン:水90:10、85:15、および70:30。蒸留水を用いて細胞を2回、1分間洗浄し、次いで、グリセリンゼリーで永久保存化した。5.平滑筋。Sigma社製キットを使用し、平滑筋a-アクチンに対する抗体による染色によって、平滑筋をアッセイした。6.内皮細胞。VoytaらVoyta、1984が記載のように、低密度リポタンパク質を取り込む能力によって内皮細胞を同定した。抗生物質を補充したDulbeccoの最小必須培地高グルコースDMEMGIBCOで細胞を5回洗浄した。細胞を、1mlあたり10μgの1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチル-インドカルボシアニン過塩素酸DiI-Acyl-LDLBiomedicalTechnology,Stoughton,MAと共に37°Cで4時間インキュベートした。次いで、ウェルをEMEM10ウマ血清で6回洗浄し、蛍光付着を有するNikonDiaphot上で観察した。[結果]初代培養物により、密集状態に達するまで単核星形細胞が増殖した図6AおよびB。トリプシンで細胞を遊離させ、ろ過し、凍結保存した後も平板固定時には細胞は星形を保持した。4週間目に、対照培養部は星形細胞から成った図7A。しかし、デキサメタゾンで処理した培養物は、7種の形態を示した。約1週間の培養を始めたところ、自発的に収縮した線状および分岐した両方の多核細胞がすべてのデキサメタゾン濃度で出現したが、10-8および10-7Mデキサメタゾンの方がより多く出現した図7B。これらの細胞を骨格支質ミオシンに対する抗体で染色した図7Cところ、骨格筋筋管と同定された。10-9~10-6Mデキサメタゾンで処理した培養物は、位相差顕微鏡での観察では収縮性細胞周辺マトリックスを有する丸型細胞の小節を含有していた。これらの小節の2種の形態を同定した。1つの形態は、明白な境界を伴わない膨れ上がった細胞凝集物を有し、該細胞凝集物は星形細胞層と合流していた図8A。第2の形態は、星形細胞層との鮮明な境界を含有する盛り上がった細胞凝集物から成った図8B。両小節の形態の細胞周辺マトリックスはAlcianブルー、pH1.0によって染色され、硫酸化グリコサミノグリカンの存在を示す。特定の細胞形態学および組織学的染色パターンに基づき、これらの細胞を軟骨小節中の軟骨細胞と同定した。培養4週間後に多角形細胞の細胞凝集物が出現した。それらは、10-9~10-10Mデキサメタゾンで処理されたウェルで最も一般的に認められたが、すべてのデキサメタゾン濃度では、少数しか出現しなかった。これらの細胞は、位相差顕微鏡下で相当な暗部を示した稠密な細胞外マトリックスを有し、マトリックスはVonKossa染色で染色された図8C。染色はEGTAによる前処理で防止され得ることが見出されたデータ示さず。これはすべて石灰化細胞外マトリックスを示した。従って、これらの細胞は、仮に骨芽細胞と同定された。10-8~10-6Mデキサメタゾンで処理した培養物は、2週間の培養で最初に出現した細胞内小胞を含んだ。細胞内小胞は、SudanブラックBで染色され、中性脂肪の存在を示した図9A。特定の形態学および組織化学染色パターンに基づいて、これらの細胞は脂肪細胞と同定された。図9Aでは、軟骨小節付近に特徴的な細胞内小胞/脂質小滴を有する脂肪細胞を認めることができる。このことは、培養系の2つの特徴を強調している:1デキサメタゾンは非特異的に多数の中胚葉表現型を誘導することができ、2タスの表現型は、それぞれの培養ウェルにおいてぞれぞれのデキサメタゾン濃度で出現した。10-7および10-6Mのデキサメタゾン濃度および培養3週間後、極めて大きな星状または四辺形の形状である細胞が出現し、区別可能な細胞内繊維を含有した。これらの細胞は平滑筋αアクチンに対する抗体で染色された図9B。染色は細胞内繊維で特に強度に認められた。従って、本発明者らは、これらの細胞を平滑筋細胞と同定した。同じデキサメタゾン濃度10-7および10-6Mおよびまた培養3ヵ月後に、個々の非凝集性多角形から丸型の単核細胞が出現した。これらの細胞は、蛍光標識アシル低密度リポタンパク質を細胞質内に取り入れた図10AおよびB。染色は核周辺に認められ、いくらかの細胞では核で顕著であった。従って、本発明者らは、これらの細胞を内皮細胞と同定した。10-9~10-7M濃度のデキサメタゾンで、非収縮性粒状細胞外マトリックスを有する螺旋パターンの密集な紡錘状細胞の凝集を3週間後に認識した。これらの細胞のこれらの細胞外マトリックスは、繊維芽細胞を示唆するパターンで、Alcianブルー、pH1.0で染色された。従って、本発明者らは、これらの細胞を仮定的に繊維芽細胞と同定した。インプラント後7日目に取り出した創傷チャンバとインプラント後14日目に取り出した創傷チャンバとの間には、ごく僅かな差異しか認められなかった。両時点から得られた培養物から、同じデキサメタゾン濃度で同じ表現型が明らかにされた。[考察]本発明者らの研究室の先の研究では、いくらかの中胚葉表現型に分化可能なニワトリ、ラットおよびウサギの骨格筋において単離された細胞集団の存在が明らかにされているLucasら、19995;Youngら、1992a;Pateら、1993。ニワトリ胚Youngら、1995および新生ラット心臓Warejcka、1996のいくらかの結合組織において同様の細胞集団が見出されている。Owenの用語Owen、1987に従って、本発明者らは、明らかな非制限的増殖能Lucasら、1995;Youngら、1993および中胚葉間葉発生系統の細胞へ分化する能力について、これらの細胞を間葉幹細胞と命名した。本研究において、本発明者らは、7週齢ラットの皮下に7または14日間インプラントされたHuntSchilling創傷チャンバから得られる肉芽組織に同じ単離および試験手順を適用した。本研究における細胞の単離手順は、ラット筋肉および心臓で使用される手順と同一であったLucasら、1995;Warejcka、1996。チャンバのメッシュまたは内部のいずれかに増殖した肉芽組織のみを使用するために、創傷チャンバから注意深く、付着している組織を掻き取った。任意の混入始原細胞を表現型で認識可能な形態まで分化させるために、単離した細胞を初代培養物で密集状態まで培養させた。これらの初代培養物では、僅かな筋管のみが出現し、他の分化した表現型は認められなかった。次いで、初代培養物をトリプシンで遊離させ、7.5DMSO中で-80°Cまで緩徐に凍結し、融解し、2次培養物中においた。凍結融解工程は分化した表現型を排除し、間葉幹細胞の生存を可能にするために設計される。培地のみで増殖させる場合、2次培養物は星状形態を維持し、分化しない図7A。分化は、外因性作用物質で刺激されなければならず、デキサメタゾンを使用すればこれが達成される。この系では、デキサメタゾンは非特異的分化剤として作用する。その正確な作用機序については不明であるが、デキサメタゾンは幹細胞の分化を刺激するための多くの培養系で使用されているBallおよびSanwal、1980;OwenおよびJoyner、1987;Bellowsら、1990;Greenberger、1979;Hounerら、1987;SchiwekおよびLoffler、1987;BernierおよびGoltzman、1993;ZimmermanおよびCristae、1993;Grigoriadisら、1989;ならびにGuerrieroおよびFlorin、1980。デキサメタゾンで処理した2次培養物中の細胞は、骨格筋筋管、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、および繊維芽細胞を示すいくらかの形態へ分化した。特に分化された細胞について特に表現型発現マーカーを同定するために設計された免疫組織学、組織化学、または機能的LDL取り込み技術によって表現型を確認した。本研究においてこれらの応答を誘発するのに使用される特定の表現型の出現のタイミングおよびデキサメタゾンの特定の濃度は、ニワトリ胚Youngら、1992a、ラット胚骨膜Grigoriadisら、1988、新生期ラット骨格筋Lucasら、1995、新生期ラット心臓Warejckaら、1996、および生体ウサギ骨格筋Pateら、1993から単離される間葉幹細胞の条件に同一である。本研究においてラット肉芽鎖組織から単離された細胞は、培養物において他の結合組織に存在するMSCの集団と同一に挙動するようである。従って、本発明における細胞は、MSCの集団であるようである。理論的に、MSCのこの集団は、2つのサブ集団:1観察された表現型のそれぞれの始原幹細胞および/または2分化決定多能性幹細胞から成り得る。分化決定された始原幹細胞集団の存在に関する先の例は、骨格筋の単能性始原筋付随体幹細胞Mauro、1961;Snow、1978;Grounds、1990,1991、それぞれ軟骨膜および骨膜の単能性始原軟骨形成および骨形成幹細胞BloomおよびFawcett、1994、ならびに骨髄の二能性始原軟骨形成、骨形成幹細胞Owen、1988;Beresford、1989を含む。分化未決定多能性MSCの存在は、クローン単離された幹細胞の結果に基づく。ラット胚骨膜Grigoriadis,1988およびニワトリ胚骨格筋、真皮、および心臓Youngら、1993から誘導される個々のクローン細胞株は、デキサメタゾンで処理した場合、多数の表現型を示しており、このことから、これらの組織における分化未決定の多能性幹細胞の存在が示唆されている。さらに、新生期ラット骨格筋から単離された細胞から作製されるクローン細胞株の予備データはまた、多数の中胚葉表現型に分化することができる個々のクローンを明らかにしておりDavisら、1995、このことから、多能性幹細胞の分娩後生存への存続が示唆される。本研究では、培養培地は、初代培養物における分化決定された始原細胞の分化を可能にし、ここで、骨格筋筋管が認められた。しかし、同じ培地で培養された第2の細胞は、アッセイされた中胚葉表現型への分化を示さなかった図8A。表皮は、軟骨細胞または骨芽細胞のための分化決定された始原細胞を含有しないようである。従って、肉芽組織から得られる2次培養物中の少なくともいくつかの細胞は分化未決定の多能性MSCであるか能性があるようである。さらに、創傷チャンバから単離したMSCの潜在的起源および試験した動物の年齢は、本研究について興味深い。方法のセクションに記載のように、創傷チャンバ内のみの細胞を分析に使用した。このことは、間葉幹細胞の移動能力を示唆し、それらが創傷チャンバ周辺の組織に由来することを示唆する。MSCは、明らかに創傷に移動し、同時に創傷治癒に記載の他の細胞型、繊維芽細胞および脈管細胞を伴う。本研究において使用した動物は創傷チャンバインプラント時で7週齢であった。肉芽組織におけるMSCの存在は、MSCが成体期生存まで存続することを示すPateら、1993。7または14日間インプラントされていた創傷チャンバから単離される間葉幹細胞は、デキサメタゾン処理に対して同一の応答を示した。先の研究は、肉芽組織が7日目に創傷チャンバに存在し、14日目に最大に達することを示しているSchillingら、1969。14日後、肉芽組織は徐々に改造され、結合組織瘢痕を形成する。現在の結果は、間葉幹細胞が創傷治癒の肉芽相全体に存在し、従って、創傷治癒応答に参加し得ることを示す。しかし、創傷チャンバに存在する間葉幹細胞の絶対数を予測することは不可能である。初代培養物の単離手順、それに続く凍結融解および2次培養物での増殖は、本来の組織に存在する間葉幹細胞の数を比較することはできない。さらに、幹細胞の両サブ集団分化決定および多能性の増殖能は、そのような算出を困難にしている。先の研究は、分化決定された始原細胞がプログラムされた細胞老化の前に約50細胞倍加の寿命を有するHayflick,1965が、多能性MSCは、それらが特定の系統に未決定であり続ける限り、本質的に不死的に増殖するLucasら、1995;Youngら、1993ことを示している。肉芽細胞内の比較的多量のMSCを比較することは、間葉幹細胞のマーカーが利用できるまで待たなければならない。肉芽組織における間葉細胞の存在は創傷治癒に対する現在の捕らえ方に異論を提示している。この見方は、創傷に移動する細胞は脈幹細胞平滑筋および内皮細胞ならびに繊維芽細胞であると述べている。繊維結合組織瘢痕の形成は必然であるという考えも認められる。我々らの研究に基づいて、本研究者らは創傷部位に移動する細胞の少なくとも一部は、多数の中胚葉表現型を形成する能力を有する間葉幹細胞である。示されているように、MSCは周辺の結合組織に存在し、肉芽組織に寄与している他の細胞と共同して移動することができ、繊維芽細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞を含む多くの中胚葉表現型に分化する能力を有する先の研究では、全層関節軟骨欠損に配置されたMSCは、局所内因性因子の影響下で軟骨および骨に分化することが明らかにされている。従って、本発明者らは、創傷部位に存在する1つ以上の局所因子は決定および以後のMSCの結合組織瘢痕、即ち、繊維芽細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞において観察された表現型への分化に影響する能力を有する血小板、マクロファージ、リンパ球を脱顆粒することによって放出され、創傷治癒中に全身の循環に存在する多くの成長因子は同定されており、分化決定された始原細胞に関するそれらの機能は特徴付けされているClark、1993;Bennett、1993a,1993b;HuntおよびLaVan、1989;Falanga、1993;OrgillおよびDemling、1988;Springfield、1993;Adolphら、1993。しかし、多くの未知因子は、同定、特徴付け、ならびに始原幹細胞および多能性間葉幹細胞の両方に対するそれらの影響についての機能分析が行われていない。この見解は、螺旋パターンを形成する紡錘形細胞繊維芽細胞へのMSCのinvitro分化を引き起こす活性がほとんどのロットの血清に存在するLucasら、1995ことからも支持される。本発明者らは、局所環境が変化する場合、創傷部位に存在する常在性MSCは繊維結合組織瘢痕以外の組織を形成し得ると仮定している。この見解は、骨形態が骨外性皮下創傷部位に配置される研究によって支持される。これにより、最初に軟骨が出現し、その後該軟骨が軟骨内骨化を生じて骨を形成するUrist、1989;ReddiおよびHuggins、1972;Reddi、1981;Wangら、1990。別の研究で、応答性細胞がインプラント部位に存在することが示されているWeintroubら、1990。皮下部位に別の形態形成タンパク質、筋形態形成タンパク質をインプラントすると、皮膚組織の骨格筋管の分化が生じるLucasら、1996。最終的に、皮膚創傷を治癒するためのTGF-β1に対する抗体の添加、または外来性TGF-β3の添加によっても、トランスフォーミング成長因子-βTGF-βのレベルが調製されているFerguson、1994;Shahら、1992,1994,1995。これらの研究により、TGF-β1に対する抗体または外来性TGF-β3は瘢痕形成を抑制し、それにより正常な表皮が出現することが示された。本発明者らは、創傷部位でTGF-βイソ型のレベルが変化すると、瘢痕繊維芽細胞から正常繊維芽細胞へMSCの分化が偏り、正常な表皮が出現すると推測している。肉芽組織に間葉幹細胞の集団が存在すると、瘢痕組織の形成に対して真の組織再生の可能性が生じる再生には、間葉幹細胞が適切かつ特異的に操作されて所望の組織に分化することが必要である。本発明者らは、現在、1繊維形成を阻害し、2特異的表現型を刺激する能力について生体活性因子を試験している。生体ヒト骨格筋から単離された間葉幹細胞創傷の治癒は損傷に対する応答であるが、非機能的瘢痕組織を生じる。より好ましい結果は組織の再生であろう。本発明者らは、肢骨、筋肉、脂肪、表皮などに正常に認められる組織へ分化可能な間葉幹細胞の存在を仮定し、胎児および成体ラット骨格筋においてそのような細胞集団を見出した。成体ヒト組織からこれらの細胞を単離するために、これらの実験を設計した。75歳糖尿病雌および35歳雄の切断された脚から骨格筋を回収した。単核細胞を酵素的に単離し、10予め選択されたウマ血清を補充したEarle塩を有する最小必須培地EMEM中で培養した。この調製物は、筋管へ分化される決定された筋原細胞を含有する。次いで、培養物をトリプシン処理し、ろ過し、7.5DMSO中、-80°Cで凍結し、融解し、平板固定し、ここで、2~6週間の間、10-10~10-6Mデキサメタゾン非特異的分化因子を補充した上記の同じ培地でそれらを培養した。対照培養は、間葉幹細胞に典型的な正常形態を示した。デキサメタゾンで処理された培養物は、以下の表現型を含有した:ミオシンに対する抗体で染色された長形単核細胞骨格筋、SudanブラックBで染色された脂質小滴を有する丸型細胞脂肪細胞、Alcianブルー、pH1.0で染色された細胞外マトリックスを有する丸型細胞軟骨、平滑筋a-アクチンに対する抗体で染色された細胞平滑筋、アセチル化低密度リポタンパク質を取り入れた細胞内皮細胞、および鉱物に対するVonKossa染色で染色された細胞外マトリックス骨芽細胞。実験により、間葉表現型に分化する能力を有するヒト間葉幹細胞の存在が確立される。これにより、細胞を操作して、損傷を受けた患者の間葉組織の適切な再生を達成する可能性が生じる。間葉細胞は、結合組織、筋肉、骨、脂肪、軟骨、および血液細胞を含む多くの異なる組織を生じる。間葉から誘導された身体の組織に対する損傷は珍しいことではない。しばしば、組織に対する損傷は外傷、磨耗および断裂と呼ばれる病因学的破損、または先天的欠損によって生じる。骨折、変形性関節症、または骨格筋損傷に関与する病因学的過程ではこれは特に正しい。身体は、損傷を受けたまたは消失した間葉組織の修復の機序を有するが、正常な機能を有する組織の再生は不十分であるかまたは不適切であるようである。その代わり、治癒は、通常、主に非機能的繊維瘢痕組織から成る領域を残す。損傷が生じると、創傷治癒の過程が開始する。第1の段階は血腫の形成、続いて、炎症応答および以後の肉芽組織の損傷による欠損への移動に関与する。創傷が治癒すると、リモデリングおよび繊維瘢痕が生じる。これは、通常、細胞の空隙を修復するのに適切であるが、成体の身体が同一に一致する機能的至適細胞を再生する能力は制限されている。タンパク質および成長因子の流入は細胞が損傷の視域に移動するためのシグナルであるPostelthwaiteら、1976,1978,1981;Seppaら、1982;Grotendorstら、1982;Dueulら、1982。このことは正しいかもしれないが、広範囲の損傷の再生は、細胞の創傷への移動のみでは簡単に説明することができない。従って、結合組織マトリックスに存在する多能性細胞の常在性集団が存在するという仮説が提案された。成長因子は、これらの常在性間葉幹細胞による可能な再生について、開始および複製のための重要なシグナルであるようである。これらの間葉幹細胞の多能性特性に関する分化の方向は、特定のシグナルによって変化することができるが、再生を開始させて、非機能的瘢痕組織を回避することができる。瘢痕形成は損傷を安定化しようとするが、それは機能的には最適ではない。治癒される損傷の視域が瘢痕を伴い得るという多くの問題がある。腱、筋肉および軟骨損傷などの間葉組織の領域における瘢痕組織は、特に弾力性、収縮、伸張性および剪断力に関する機能性が顕著に減少する。例えば、非機能的瘢痕形成による問題は、骨折後の骨の癒着不能または骨折変形治癒、瘢痕視域における再損傷素因を有する腱、関節軟骨表面の変化による関節炎、および皮膚結合組織における過形成性瘢痕による問題である。間葉細胞は、治癒過程において極めて重要であり、創傷に存在する多くの間葉組織に分化する特性についてその特徴が知られている。幹細胞は、無制限の増殖能を有する細胞と規定されており、従って、細胞倍加数が制限されるHayflick理論には結びつかないHayflick、1965。これらの細胞は、身体において多数の組織型を構成している細胞系統へ分化することができる娘細胞子孫を産生することができるHallWatt、1989。発生中の哺乳動物胚には、娘細胞が生物の骨格組織を生じる多能性細胞である間葉幹細胞が存在するGilbert、1997。これらの細胞から誘導される骨格組織は、骨、筋肉、軟骨、結合組織、および骨髄支質を含む。成体では、胚の間葉幹細胞に類似の多能性を有する細胞は、表皮、胃腸管上皮、および骨髄の造血画分においても同定されているという証拠も存在する。多能性細胞は、成体組織の修復および維持に重要であると思われる。造血画分から誘導される幹細胞についてはほとんど研究されている。造血幹細胞と呼ばれる細胞は、多くの様々な表現型に分化する能力を有することに注目したLemischkaら、1986;Sachsなど。もう1つの類似ではあるがまったく異なる細胞集団が仮定され、その後、間葉幹細胞MSCと呼ばれる成体骨髄において見出された。MSCについても広範に研究されたが、これは、骨および軟骨Owen、Beresford、Caplan、腱Caplan、筋肉Wakatani,Saito、脂肪Dennisならびに造血を支持し得る骨髄支質結合組織などの様々な組織表現型を生じることが明らかにされている。これらの特性も、鉱物質除去された骨マトリックスインプラントに関与する研究中に観察されている。インプラント、またはそれから誘導されるタンパク質は、異所性視域、即ち筋肉において軟骨および骨形成のdenovo誘導を示したUrist、1965;ReddiおよびAnderson、1976;Wangら、1990;Uristら、1978;Lucasら、1988。これは、骨髄マトリックス内のタンパク質シグナルに応答する成体ヒトにおける結合組織マトリックス内の多能性細胞の集団が存在し得る。最近の研究では、トリ胚骨格筋周囲の結合組織には多くの間葉表現型に分化することができる細胞集団が存在することが先に明らかにされているYoungら、1992a。異なる濃度のデキサメタゾンでインキュベートする場合、MSCは、骨、軟骨、骨格筋、脂肪、および内皮組織を含む様々な表現型に分化することが明らかにされているYoungら、1995。これらの細胞の集団も、最近、成体ラットの心筋Lucasら、1995、新生ラット、成体ラットの骨格筋Warejeckaら、1996、および成体ウサギPateら、1993に存在することが明らかにされている。これらの単離された細胞は、間葉幹細胞MSCと呼ばれている。現在の目的は、上記の間葉幹細胞に類似の細胞集団が存在し、ヒト成体の骨格筋から単離することができるかどうかを決定することである。[材料および方法]表現型のアッセイ:1.鉱化組織。本質的にHumasonHumason,1972に記載の通り、リン酸カルシウムのVonKossa染色により石灰化組織の存在についてアッセイした。簡単に説明すると、培養培地を取り出し、プレートをDPBSで2回濯いだ。細胞を0.5mlの10ホルマリンSigmaで3~5分間固定化し、次いで、蒸留水で4回濯いだ。次いで、0.5mlの新たに調製した2硝酸銀Sigma溶液を添加し、細胞を暗所で10分間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液を取り出し、蒸留水で細胞を5回濯いだ。約0.5mlの蒸留水を各ウェル上に置いた。プレートを、明るい光に15分間暴露した光を反射させるためにプレートのすぐ下に白色背景を置いた。プレートを再度5回蒸留水で濯ぎ、次いで、100エタノールで迅速に脱水した。プレートをグリセリンゼリーで永久保存化したYoungら、1991。リン酸カルシウムの存在の確認は、硝酸銀溶液中でインキュベーションする前に、Ca2、Mg2を含まない緩衝液中に1w/v[エチレンビスオキシエチレンニトリロ]-テトラ酢酸EGTASigmaカルシウム特異的キレーターを有する選択された培養物を1時間前処理することによって実施したHumason,1972。2.軟骨。培養物をAlcianブルーRobozSurgicalInstrument,Rockville,MD,pH1.0で染色した。固定化されたウェルを0.5mlAlcianブルー、pH1.0で30分間染色し、次いで、ウェルから取り出した。ウェルを水道水または蒸留水で7回濯ぐことによって、非結合染色物を取り出した。培養物は、グリセリンゼリー化で保存した。3.脂肪。以下の方法で、飽和中性脂肪のSudanブラックBAsbeySurgicalCo.,Washington,DC染色をHumason,1972実施した。培養ウェルからすべての培地をアスピレーと吸引し、それぞれのウェルを1mlのDPBSで2回洗浄した。次いで、0.5mlの70ETOHを添加して細胞膜を破壊した。1分間後、アルコールをアスピレーと吸引し、ウェルをDPBSで2回洗浄した。次いで、細胞を100プロピレン中で5分間、2回インキュベートした。次に、細胞を、1ウェルあたり0.5mlのSudanブラックBで10分間、2回インキュベートした。各溶液が澄明になるまで以下の溶液を各0.5mlで繰り返し細胞を濯ぐことによって、染色を区別した。プロピレン:水90:10、85:15、および70:30。蒸留水を用いて細胞を2回、1分間洗浄し、次いで、グリセリンゼリーで永久保存化した。4.筋肉。YoungらYoungら、1992bの手順を改変して使用し、支質ミオシンに対するMF-20抗体HybridomaBank,Ames,IAで細胞を染色した。断りがない限り、各工程の前にDPBSで2回濯いだ。もう1度濯いだ後、0.5mlの冷エタノール-20°Cを5分間適用し、細胞を固定化した。この後、0.5mlのDPBS中1v/vTritonX100/0.05w/vアジ化ナトリウムと共に5分間インキュベーションし、細胞膜を溶解して、それぞれ内因性ペルオキシダーゼを阻害した。20ヤギ血清の1次ブロッカーを30分間、37°Cインキュベーター中で適用する。次いで、MF-20の1:200希釈の1次IgG0.4ml/ウェルを1時間インキュベートする。0.5mlの20ヤギ血清の2次ブロッカーを30分間適用し、続いて、1:7500希釈のビオチン化ヤギ抗マウスIgGLeinco,St.Louis,MOを0.4ml加え、また37°Cで30分間インキュベートした。20ヤギ血清から成る3次ブロッカーを30分間適用し、取り出し、次いで、1:3750希釈のストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼLeincoを0.4ml添加し、37°Cで30分間インキュベートした。この時点で細胞を濯ぎ、0.5mlのABTSペルオキシダーゼ基質KirkegaardおよびPerryLabs,Gaithersburg,MDを添加して、周囲温度、暗所で30分間インキュベーションした。インキュベーション後、200μlのABTS溶液を細胞から取り出し、10μlの0.03アジ化ナトリウムを含有する96ウェルELISAプレートFalconのウェルで平板固定した。405nmフィルターを使用するTiterTek分光光度計プレートリーダー上で該ELISAプレートを読み取った。ABTS溶液のアリコートを取り出した後、0.5mlのDPBSで2回細胞を濯ぎ、次いで0.5mlの蒸留水で2階濯いだ。染色キットの取扱説明書に従って、以後の写真撮影のために選択されたウェルにChromagenSigmaを添加した。一旦発色したら、25μlの0.05アジ化ナトリウムを各ウェルに添加して、反応を停止した。次いでウェルを濯ぎ、グリセリンゼリーで永久保存化した。残りのウェルからABTSを取り出し、先に記載のように、Johnson-WintおよびHollisのinsituジアミノ安息香酸DABA手順Johnson-Wintら、1982を使用してDNA含有量を分析した。従って、同じウェル上で、ミオシン含有量およびDNA含有量に対する吸光度を得た。5.平滑筋。Sigma社製キットを使用し、平滑筋a-アクチンに対する抗体による染色によって、平滑筋をアッセイした。6.内皮細胞。VoytaらYoytaら、1984が記載のように、低密度リポタンパク質を取り込む能力によって内皮細胞を同定した。抗生物質を補充したDulbeccoの最小必須培地高グルコースDMEMGIBCOで細胞を5回洗浄した。細胞を、1mlあたり10μgの1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチル-インドカルボシアニン過塩素酸DiI-Acyl-LDLBiomedicalTechnology,Stoughton,MAと共に37°Cで4時間インキュベートした。次いで、ウェルをEMEM10ウマ血清で6回洗浄し、蛍光付着を有するNikonDiaphot上で観察した。7.造血細胞。CD-34に対するマーカーの存在によって造血細胞を同定した。培養皿中の細胞をDPBS-Ca-Mgで2回洗浄した。次に、DPBS-Ca2Mg2およびEDTA溶液を添加した。40分後、サンプルを緩徐に粉砕して細胞を取り出した。次いで、外れた細胞を取り出し、15ml遠心分離管に移した。次いで、EMEM10HS-3を培養さらに添加し、サンプルを再インキュベートした。細胞懸濁物を150gで12分間、遠心分離した。上清をアスピレーターで吸引し、ペレットを1.95mlのDPBS-Ca2-Mg2培地に再懸濁した。次いで、細胞を血球計を使用して計数した。次に、細胞をDPBS-Ca2-Mg2で洗浄した。次いで、本発明者らは、5mlの1次IgGをEMEM10HS-3中4°Cでインキュベートした。IgGは40μl/106細胞CD-34Aアイソトープであった。2本のマイクロ遠心管中、20μl/106細胞CD-34Bアイソトープであった。次いで、サンプルをマイクロ遠心管中、4分間、150gで遠心分離した。上清をアスピレーターで吸引し、ペレットを再懸濁し、DPBSで洗浄した。次いで、サンプルを再度遠心分離し、1BSA、0.5TW中で20分間ブロックした。次いで、サンプルを再度遠心分離した。次いで、2次IgGを添加し、20分間インキュベートした。次いで、サンプルをスピード3で4分間、遠心分離した。上清をアスピレーター吸引し、ペレットを0.5ml培地で洗浄した。溶液を再度遠心分離し、上清をアスピレーターで吸引した。100mlの媒体PBSをペレットに添加し、次いで、スライドあたり10μlを利用してサンプルを平板固定した。サンプルをアセトン、ETOH、加熱およびホルマリンで固定化した。次いで、サンプルを、ブルーフィルターを有する蛍光顕微鏡下で観察した。[結果および考察]77歳雌および37歳雄の外科サンプルから得られた骨格筋から間葉幹細胞を単離した。初代培養物は、単核星形細胞推定多能性間葉幹細胞および筋芽細胞を示した図11A、11B。トリプシンで細胞を遊離させ、ろ過し、凍結保存した後も平板固定時には2次培養物中の細胞は星形を保持した図11C。デキサメタゾンで処理した2次培養物は、脂肪細胞、軟骨および骨を含むいくらかの形態を示した13B~D;図14A~C。これらの培養物中の細胞をミオシンに対する抗体で染色した図12A~Bところ、骨格筋筋管と同定された。他の細胞は、それらの形態学および蛍光標識アシル低密度リポタンパク質を細胞質に取り入れるそれらの能力によって内皮細胞と同定された図15A~B。平滑筋αアクチンに対する抗体による細胞染色も同定された図14。2次培養物も、CD34の発現について評価し、固定化された細胞はCD34に対する抗体で陽性染色であることが明らかにされた図16A~B。これらの結果は、培養物において、平滑筋、脂肪細胞、軟骨、骨および内皮細胞に分化可能である多能性間葉幹細胞を、成体、老齢77歳でもよいヒト骨格筋から単離することができることを示す。3T3細胞はinvitroで多能性表現型に分化する結合組織は、繊維芽細胞のみから成ると考えられる。3T3細胞は、繊維芽細胞を出現させると思われるマウス胚組織から誘導される細胞株である。本発明者らは、プロトコールに従って3T3細胞を培養した。本発明者らは、ラット組織から多数の表現型に分化することができる細胞を単離することを開発した。Swiss3T3細胞AmericanTypeCultureCollectionを、Earle塩を有する最小必須培地EMEM10予め選択されたウマ血清中で培養した。細胞を、非特異的分化剤、10-l0~10-6Mの範囲の濃度のデキサメタゾンで、4~8週間処理した。対照にはデキサメタゾンを添加しなかった。いくらかの間葉表現型は培養物中で発生した:脂肪細胞SudanブラックB染色;軟骨細胞Alcianブルー染色、pH1.0、骨芽細胞鉱物質に対するVonKossa染色、平滑筋細胞a-平滑筋アクチンに対する抗体、内皮細胞アシル低密度リポタンパク質の取り込み、および骨格筋筋管線状多核細胞および支質ミオシンに対する抗体。いくつかの細胞はまた、イソプロテレノール処理で拍動数が増加し、プロプラノロールpropanolol処理で減少する2核拍動細胞を示した。本発明者らは、この細胞を仮定的に心筋細胞と同定した。3T3は、幹細胞の特徴を有するが、繊維芽細胞の特徴を有さない多数の間葉から誘導された表現型に分化することが可能である。従って、それらは、幹細胞の細胞生物学を診査し、成長および分化因子によって方向付けられる特定の組織型を研究するための簡単、簡便なアッセイを提供するのに極めて貴重な道具であり得る。特異的に細胞分化を指令する能力は、組織の修復において非常に大きな可能性を付与する。Swiss-3T3細胞は、本来、Swissマウス胚から、長期培養方法を使用して、TodaroらTodaroおよびGreen、1963;Todaraら、1964により作製された細胞株は、培養物中明らかな不死後、密集上での細胞増殖の接触阻害を対象に選択された。これは、約50細胞倍加後の細胞老化について、Hayflick数Hayflick、1965への一致が失われることによる。細胞株は繊維芽細胞様細胞を出現させ、これはSwiss-3T3細胞と命名された。それらの由来3T3細胞およびその誘導体は、13,000以上の研究において使用され、ウイルス形質転換Denhardtら、1991;GreenおよびOlaniyi、1974、細胞表面レポーターEldarら、1990;Friedmanら、1990;Maher、1993;Satohら、1990成長因子調節campbellら、1993;CorpsおよびBrown、1991;Powisら、1990;Satohら、1990;Yatesら、1993細胞生理学CorpsおよびBrown、1992;DominおよびRozengurt、1993;Pangら、1993、ならびに因子調節分化Evansら、1993;Sparksら、1993を含む細胞制御の態様に関する様々な態様が検討されている。分子生物学技術の出現に伴い、Swiss-3T3細胞は、遺伝子調節機構を研究するために利用されているBatteyら、1991;Linderら、1991;Miyazawaら、1993;yanおよびHung、1993;Yangら、1993。3T3細胞のサブ集団は、培養中にグルココルチコイドで処理すると脂肪細胞に分化することが明らかにされているGreenおよびMeuth、1974;Kuri-Harcuch、1978;NixonおよびGreen、1984;Morikauaら、1982;Ringoldら、1991;WierおよびScott、1986。3T3のクローンである3T3-10Tl/2細胞は、5’-アザシチジンで処理すると脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、および筋管に分化することが明らかにされているTaylorおよびJones、1979。最近Youngら、1995、分化決定された始原間葉幹細胞および分化未決定の多能性間葉幹細胞の両方は、多数の器官およびニワトリ胚における器官系に関連する結合組織画分内に局在することが見出された。LucasらLucasら、1995は、胎児および新生児ラット骨格筋から間葉幹細胞を単離した。これらの細胞は、骨格筋、軟骨、骨、平滑筋、内皮細胞、および繊維芽細胞に分化することが可能であった。WarejckaらWarejckaら、1996は、3~5日齢ラット心臓から幹細胞集団を単離した。デキサメタゾンによる処理後、これらもまた、骨格筋、平滑筋、脂肪細胞、骨および軟骨に発生することが認められた。本研究では、本発明者らは、Swiss-3T3細胞が培養物中において多数の表現型を形成する能力を評価した。[材料および方法]細胞培養125継代時のSwiss-3T3細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクションAmericanTypeCulture’CollectionBethesda,MDより入手した。到着時、細胞を融解し、最初に、Earl塩を有する89Eagle最小必須培地EMEMGIBCO,GrandIsland,NY、10予め選択されたウマ血清、および1ペニシリン/ストレプトマイシン10,000μペニシリン/10,000マイクログラムのストレプトマイシン硫酸、GIBCOを含有する培地pH7.4において皿あたり100,000細胞で、予めウシゼラチンEMSciences,CherryHills,NJを被覆した100mm皿に播種した。培養物を、湿潤95空気/5C02を含有するインキュベーター、37°C中に、細胞が密集状態になるまで配置した。細胞は、約8日目に密集状態に達し、0.025トリプシンおよびCa、Mgを含まないリン酸緩衝化生理食塩水PBSの溶液でプレートから遊離させ、20μmのNitexフィルターを介して、7.5ジメチルスルホキシドSigma,Salom,MOを含有するEMEM10ウマ血清中1×106細胞/mlに希釈し、凍結チャンバFisherScientific,Norcross,GA内で-80°Cまで緩徐に凍結した。次いで、凍結した3T3細胞を融解し、PBS中0.4トリパンブルーを使用し、血球計Denhardtら、1991;DominおよびRozengurt、1993で細胞生存度を決定し、細胞を、1ゼラチンで予め被覆した24ウェルプレートCorningGlassworks,Corning,N.Y.中に、5000細胞/ウェルの密度で配置した。細胞を、10ウマ血清および様々な濃度のデキサメタゾンSigma,Salom,MOを含有するEMEM中で培養した。4つのウェルを対照とし、デキサメタゾンを添加しなかった。4つのウェルは、それぞれ、10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6Mデキサメタゾンを含有する培地を添加した。培地を1日おきにチャージし、培養物を、異なる表現型の出現について、位相差顕微鏡下で試験した。表現型のアッセイ:骨-Humasonに記載の通り、リン酸カルシウムのVonKossa染色により石灰化組織の存在についてアッセイした。簡単に説明すると、培養培地を取り出し、プレートをDPBSで2回濯いだ。細胞を0.5mlの10ホルマリンで3~5分間固定化し、次いで、蒸留水で4回濯いだ。次いで、1.5mlの新たに調製した2硝酸銀溶液を添加し、細胞を暗所で10分間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液を取り出し、蒸留水で細胞を5回濯いだ。約0.5mlの蒸留水を各ウェル上に置いた。プレートを明るい光に、光を反射させるための白色背景に対して15分間暴露した。プレートを再度5回蒸留水で濯ぎ、100エタノールで迅速に脱水した。プレートをグリセリンゼリーで永久保存化した。リン酸カルシウムの存在の確認は、硝酸銀溶液中でインキュベーションする前に、Ca、Mgを含まない緩衝液中に1重量/容積[エチレンビスオキシエチレンニトリロ]-テトラ酢酸カルシウム特異的キレーターを有する選択された培養物を1時間前処理することによって実施した。筋肉-Youngら、1992bの手順を改変して、支質ミオシンに対するMF-20抗体HybridomaBank,AmesIowaで細胞を染色した。断りがない限り、各工程の前にDPBSで2回濯いだ。もう1度濯いだ後、0.5mlの冷エタノール-20°Cを5分間適用し、細胞を固定化した。この手順の後、0.5mlのDPBS中1v/vTritonX100/0.05w/vアジ化ナトリウムSigmaと共に5分間インキュベーションし、細胞膜を溶解して、それぞれ内因性ペルオキシダーゼを阻害した。20ヤギ血清Sigmaの1次ブロッカーを30分間、37°Cインキュベーター中で適用する。次いで、MF-20の1:200希釈の1次IgG0.4ml/ウェルを1時間インキュベートする。0.5mlの20ヤギ血清の2次ブロッカーを30分間適用し、続いて、1:7500希釈のビオチン化ヤギ抗マウスIgGLeinco,St.Louis,MOを0.4ml加え、また37°Cで30分間インキュベートした。これを30分間、37°Cでインキュベートした。20ヤギ血清から成る3次ブロッカーを30分間適用し、取り出した。次に、1:3750希釈のストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼLeincoを0.4ml添加し、30°Cで30分間インキュベートした。細胞を0.5mlの蒸留水で2階濯いだ。染色キットの取扱説明書に従って、以後の写真撮影のために選択されたウェルにChromagenSigmaを添加した。一旦発色したら、25マイクロリットルの0.05アジ化ナトリウムを各ウェルに添加して、反応を停止した。次いでウェルを濯ぎ、グリセリンゼリーで永久保存化した。軟骨-培養物をAlcianブルーRobozSurgicalInstrument,Rockville,MD、pH1.0で染色した。固定化されたウェルを0.5mlAlcianブルー溶液、pH1.0で30分間染色し、次いで、ウェルから取り出した。ウェルを水道水または蒸留水で7回濯ぐことによって、非結合染色物を取り出した。培養物は、グリセリンゼリー化で保存した。平滑筋-平滑筋αアクチンに対する抗体で染色することによって、細胞を同定しSigma,St.Louis,MO。内皮細胞-VoytaらVoytaら、1984が記載のように、低密度リポタンパク質を取り込む能力によって内皮細胞を同定した。抗生物質を補充したDulbeccoの最小必須培地高グルコースGIBCOで細胞を5回洗浄した。細胞を、1mlあたり10μgの1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチル-インドカルボシアニン過塩素酸DiI-Acyl-LDLBiomedicalTechnology,Stoughton,MAと共に37°Cで4時間インキュベートした。次いで、ウェルをEMEM10ウマ血清で6回洗浄し、蛍光付着を有するNikonDiaphot上で観察した。心筋-大型2核化された核ならびに変力薬および変時性薬に対する反応に基づいて、心筋細胞を同定した。[結果]3T3細胞をATCCより入手し、解凍し、培養したところ、ほとんどが正常または3角形形態を有した。約1週間~10日間の培養で密集状態に達した。細胞を凍結し、融解し、記載のように反復した。デキサメタゾンを伴わない対照培養物は、培養期間中を通して、継続して均一な星状形態を示した図17A。デキサメタゾンで処理した培養物は、多数の表現型を示した。invitro分化について試験するために、デキサメタゾンを非特異的誘導剤として使用したGrig.,aubin,Heersche。デキサメタゾン処理の2週間後に出現した1つの表現型は、位相差で収縮性であった丸型小滴を有する細胞を含有した図17B。これらの細胞をSudanブラックBで染色したところ図17C、脂肪細胞と同定された。これらの脂肪細胞のほとんどは、10-8~10-6デキサメタゾン濃度で出現した。14日目に、10-9~10-6Mデキサメタゾンの濃度で、いくらかの核を含有する細長い細胞が出現した図18A。これらの細胞は培養物中で自発的に収縮し、支質ミオシンに対するモノクローナル抗体で染色された図18B。従って、これらの細胞は、筋管と同定された。培養4週間目に、10-7~10-6Mデキサメタゾンの濃度で、若干の2核細胞が出現した。これらの細胞は、1分間に約65拍動で、培地中で規則的に拍動した表8。細胞を10-6Mのイソプロテノールで処理した場合、拍動数は1分間あたり85拍動まで増加した。イソプロテレノールは、心筋に対する陽性の変力および変時性効果を有する強力な選択的βアドレナリン作用アゴニストであるGoodmanおよびGilman、1996。対照的に、プロプラノロールは心拍数を遅くするβアドレナリン作用アンタゴニストである。細胞を10-6Mプロプラノロールで前処理し、次いで、イソプロテノールに暴露した場合、細胞は拍動数を維持する。これらの基準、イソプロテノールに対する陽性変時性反応およびプロプラノロールに対する陰性反応に基づいて、本発明者らは、仮定的にこれらの細胞を心筋細胞と同定した。表8.心筋および対照細胞のイソプロテノールおよびプロプラノロールへの暴露ならびに拍動数の変化の比較培養35日目に、10-7~10-9Mデキサメタゾンの濃度で、小節中で増殖し、収縮性細胞外マトリックスを有する丸型細胞が出現した図19AおよびB。細胞外マトリックスをAlcianブルーpH1.0で染色した。これらの小節は軟骨と同定された。2つの異なる形態が観察された。一方では、軟骨小節は不規則な境界を有し、ここで、該細胞は周辺星状細胞に結合していた図19C。他方は、背景の星状細胞とは極めて明確に規定される境界を有する小節から成った図19B。培養28日後、すべてのデキサメタゾン濃度で、少数の多角形細胞が出現した図19。これらの細胞は、VonKossa染色で染色された稠密な細胞外マトリックスを形成した図19。EGTAで培養物を前処理した場合、VonKossa染色による染色が防止されたデータ示さず。石灰化マトリックスを作製する細胞の能力に基づき、これらの細胞は骨芽細胞と同定された。デキサメタゾン処理の35日目に、繊維を含有する平行四辺形型の細胞が認められた。これらの細胞は、10-7および10-6Mデキサメタゾン濃度で最も多く認められた。これらの繊維は平滑筋αアクチンに対する抗体で染色された。従って、細胞は平滑筋細胞と同定された図20。認識可能な細胞外マトリックスを伴わない多角形細胞は、35日目に10-7および10-6Mデキサメタゾン濃度で出現した。細胞はDil-AcylLDLを細胞質小胞に取り入れ、内皮細胞と同定された図21。[考察]培養物における組織の増殖は、後にinvivoでの使用のための生物学的組織の開発に転換することができる細胞生物学を理解するための非常に重要な有望性を有している。一般にSwiss3T3細胞は、文献上繊維芽細胞と呼ばれているEldarら、1990;Linderら、1991。しかし、3T3を、間葉幹細胞を単離するために開発されたプロトコールに従って培養した場合、3T3細胞は、デキサメタゾンで処理するといくらかの中胚葉表現型に発生する。本研究では、10-8Mデキサメタゾンの濃度で、処理2週間の培養物は、位相差で収縮性である丸型小滴を有する細胞を示した。これらの細胞をSudanブラックBで染色したところ、脂肪細胞と同定された。14日目に、10-9~108Mデキサメタゾンの濃度で、培養中に自発的に収縮した細長い多核細胞が出現した。これらは、支質ミオシンに対するモノクローナル抗体による染色に基づき、筋管と同定された。10-7~10-6Mデキサメタゾン濃度で、28日目に、培養物中で規則的に拍動する2核細胞が認められた。これらの細胞は、選択的βアゴニストおよびアンタゴニストに暴露される場合、心筋細胞として挙動する。培養35日目、10-9~10-7Mデキサメタゾン濃度で、2つの異なる形態で軟骨細胞が出現し、一方は不規則な境界を有し、他方は背景の星状細胞から明確に規定される境界を有した。培養28日後、すべてのデキサメタゾン濃度において、多角形細胞が出現した。石灰化マトリックスを作製する細胞の能力に基づき、これらの細胞は骨芽細胞と同定された。デキサメタゾン処理の35日目、10-6Mデキサメタゾン濃度で平行四辺形型細胞が観察された。これらの細胞は、平滑筋αアクチンに対する抗体によるそれらの染色に基づき、平滑筋細胞と同定された。35日目、10-7Mデキサメタゾンの濃度で、Dil-Acyl-LDLを細胞質小胞に取り入れる細胞外マトリックスを伴わない多角形細胞が内皮細胞と同定された。3T3が分化する能力について考察している報告はほとんどないが、文献的にいくらかの研究では、該細胞が他の表現型に分化することが示されている。マウス繊維芽間葉細胞C3H10T1/23T3のクローンは、BMP2および4による永久トランスフェクション後に本来の繊維芽細胞の性質を消失したAhernsら、1993。これらの細胞は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、および脂肪細胞に類似の3種の異なる表現型に分化することが明らかにされた。TaylorおよびJonesTaylorおよびJones、1979は、5’-アザシチジン5-AZA-CRがマウス胚細胞株において生化学的に分化された機能的横紋筋、脂肪細胞および軟骨細胞の形成を誘導することを示した。1982年において、同グループは、初期S期中に細胞が処理されると、筋肉および脂肪細胞表現型は最大であることを示したTaylorおよびJones、1982。幹細胞の2つの異なる特徴は、無制限な分可能、およびそれらの休止状態である能力である。本研究における3T3細胞は、125形態または625細胞倍加でATCCより入手した。これは、決定化された細胞の50細胞倍加のHayflick限界を超えているHayflick,1965。研究中に、本発明者らは、少なくとも5を超える細胞倍加を観察した。対照研究では、3T3細胞が静止状態であり、刺激を受けるまで未分化であることが明らかにされている。SparksおよびScottSparksら、1991は、3T3細胞に対するTGFBの効果について検討した。彼らは、TGFBが3T3細胞の脂肪細胞への分化の特異的阻害剤であることを認めた。しかし、増殖は影響を受けなかった。従って、分化した脂肪細胞表現型の発現前は、3T3幹細胞は、まず、細胞周期の異なる段階で増殖を停止する。さらに、分化は、増殖停止を防止する高度の分裂促進剤によって非特異的に開始することができる。幹細胞の分化に関するもう1つの研究ScottおよびMaercklein1984では、低線量のUV照射は、成長因子の欠損または栄養欠損培養条件における細胞増殖を調節する能力を変更することなく、前脂肪細胞の分化を安定かつ選択的に阻害することが見出された。この効果は、発ガン阻害の初期の事象であり得る。照射された細胞はまた、非照射細胞よりも形質転換しやすい。TodaroおよびGreenによる本来の単離は、意図的な形質転換に関与しない。しばしば、3T3細胞は、自発的に形質転換されることが主張されており、これは該細胞の無制限増殖能の原因である。しかし、Scottらの研究では、UV照射への暴露にもかかわらず細胞増殖が生じないことが示されている。さらに、ウイルストランスフェクションによって3T3を形質転換する研究では、トランスフェクトされていない細胞は腫瘍を形成しないSparksら、1991。従って、3T3細胞にHayflick数を超える能力があるのは、それらが幹細胞であるのがその理由である可能性がある。中胚葉胚由来の組織は、体肢骨格および筋背側中胚葉dosralmesoderm、結合組織ならびに血管および心臓の内皮臓側板、ならびに他の器官中間中胚葉を生じる。本研究で観察される表現型は、背側中胚葉および臓側板から誘導される。将来の研究では、中間中胚葉由来の表現型が注目されるであろう。BMPおよびCDMPは、これらの様々な組織の分化を指令することが認められている作用物質である。BMPは、アザシチジンの存在下で、C3HlOTl/2の脂肪細胞、軟骨細胞および骨芽細胞への分化を誘導したAhernsら、1993。関節細胞由来の抽出物は、ラットの皮下にインプラントされる場合、軟骨および骨形成を誘導することが見出されているChangら、1994。これらの軟骨誘導性形態学的タンパク質CDMPは、軟骨細胞の分化および長骨の成長に役割を果たしていると考えられる。従って、3T3細胞は多能性分化能を示し、幹細胞として挙動している。このことにより、3T3細胞は、分化の遺伝的段階を研究するための潜在的アッセイ系になる。造血サイトカインは、ヒト多能性幹細胞における造血発現を誘導するヒト多能性幹細胞老齢、回収後150細胞倍加でのPAL3細胞株を、10HSおよび1抗生物質/抗カビ剤を含有するOpti-MEM中1ゼラチン化T-25フラスコあたり75×103細胞で播種した。24時間後、培地を、対照同培地または実験造血サイトカイン:2.5U/mlエリトロポイエチン、10ng/ml顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、10ng/ml顆粒球コロニー刺激因子、10ng/mlマクロファージコロニー刺激因子、50ng/mlインターロイキン-3、50ng/mlインターロイキン-6、50ng/ml幹細胞因子、および2μg/mlインスリンを含有する同培地で置き換えた。培養物は、それぞれの培地において2週間ごとに給餌した。対照と比較して、3週間の実験処理により、ノーザンRNA/cDNA分析により示されるように、GM-CSFレポーターの発現が誘導された。ヒト間葉幹細胞は、細胞表面クラスター分化マーカーCD10、CD13、CD56およびMHCクラスIを提示する毎年数百万人の人が組織の消失または終段階の器官不全を患う。同種療法は数えきれないほどの生命を救い、改善するが、それらは完全に解決しているわけではない。これらの療法は、深刻なドナーの不足、長期罹患率、および死亡率によって制限される。広範な移植、先天異常、選択術、および遺伝子異常は、HLAが一致したドナー組織の供給源として、自己由来の幹細胞による治療の能力を有する。本発明者らの現在の調査は、ヒト始原および多能性間葉幹細胞における細胞表面クラスター分化CDマーカーを特徴付けて、これらの細胞の比較的精製された集団の単離に役立てることをることを目的としている。本研究では、15CDマーカーが存在するか能性について、胎児、成熟、および老齢個体から単離されたヒト多能性および始原細胞を試験した。インスリンおよびデキサメタゾンに対する応答は、細胞単離物が分化決定された始原細胞および分化未決定の多能性細胞から成ることを示した。フローサイトメトリーは、CD10、CD13、CD56、およびMHCクラスIマーカーに対して陽性ならびにCD3、CD5、CD7、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD45、およびCD65マーカーに対して陰性である細胞集団を示した。ノーザン分析は、細胞回収時のCD13およびCD56が有効に転写されたことを示す。本発明者らは、まず、これらのヒト間葉幹細胞上のCD10、CD13、CD56、およびMHCクラスI表面抗原の同定について報告する。多くの研究により、多くの動物の結合組織画分に広範に分布する間葉幹細胞の存在が示されている。これらの細胞は、個体の生涯を通して、組織の継続的な維持および修復を提供している。これらの細胞の例としては、筋肉の単能性始原筋付随体幹細胞Mauro、1961;Campion、1984;Groundsら、1992;脂肪組織の単能性脂肪芽細胞Aihaudら、1992;それぞれ軟骨膜および骨膜の単能性軟骨形成および骨形成幹細胞Cruess、1982;Youngら、1995;脂肪組織の二能性脂肪繊維芽細胞Vierckら、1996;骨髄の軟骨形成/骨形成幹細胞Owen、1988;Beresford、1989;Caplanら、1997;ならびに骨髄および末梢血の多能性造血幹細胞PalisおよびSegel、1998;McGuire、1998;Ratajczakら、1998が挙げられる。連続希釈クローン可能分析Youngら、1993,1998a,b;Rogersら、1995は、間葉幹細胞が2つの特有に異なるカテゴリーの細胞:様々な系統に決定された始原細胞上記を参照されたい、および何ら特定の系統に決定されていない多能性細胞から成ることを示している。さらなる分析Youngら、1993,1995は、多能性系統特異的始原細胞および多能性細胞は、様々な組織の結合組織画分にも存在することを示した。例えば、骨格筋の結合組織は、筋付随体細胞骨格筋の前駆細胞および繊維芽細胞結合組織の前駆細胞だけではなく、脂肪芽細胞脂肪の前駆細胞、軟骨形成始原細胞軟骨の前駆細胞、骨形成細胞骨の前駆細胞、および分化未決定の多能性幹細胞を含有する。分化決定された始原細胞は、Hayflick限界Hayflick,1965に順応し、プログラム化された細胞老化および死が生じる前に50~70細胞倍加に制限された寿命を有する。始原細胞は、それらが決定されている系統に制限された細胞型に分化する上記を参照されたい。対照的に、多能性幹細胞は、該細胞が分化未決定を保持する限り、Hayflick限界を超えて広範な自己再生のための能力を有する多能性幹細胞は、胚性中胚葉株内の任意の組織系統に決定することができる。一旦、特定の系統に決定されれば、これらの細胞は始原細胞のすべての帰属物であるとみなされる。本発明者らは、始原および多能性細胞が、ドナー組織の供給が不足している移植および/または遺伝子療法に価値があり得ることを提唱する。実際、Grandeら1995は、ウサギ全層軟骨欠損モデルにおいてウサギ多能性細胞を使用した。関節軟骨の再表面化resurfacingならびに隣接する肋軟骨下骨および海面質trabecularboneの再構築において劇的な結果が報告された。先の研究Youngら、1993,1998;Rogersら、1995では、始原および多能性細胞を、限界連続希釈クローン可能分析18~24箇月またはHayflick限界超増殖5~9箇月によって始原細胞および多能性細胞を単離および区別するためには、長期間が必要である。これらの細胞が臨床施設で有用であるためには、単離の容易性および分化決定の誘導を改善しなければ成らない。しかし、本発明者らの現在の調査は、単離および区別に必要な時間を短縮するために、ヒト始原および多能性細胞のヒト表面抗原を特徴付けることを目的としている。造血細胞上の細胞表面抗原を特徴付けるために、フローサイトメトリーと組み合わせて、細胞表面クラスター分化CDに対する抗体が使用されている。現在までに、造血細胞系統の特徴を識別するために、180を超えるCDマーカーが使用されているKishimotoら、1997。本文献において報告された実験は、胎児、成体、および老齢ドナーから単離されたヒト雄性ならびに雌性始原および多能性幹細胞上の15種の細胞表面CDマーカーを特徴付けることに関与した。本発明者らは、まず、ヒト始原および多能性間葉幹細胞上のCD10、CD13、CD56、およびMHCクラスI表面抗原の同定について報告する。CD3、CD7、CDllb、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD45、およびCD65抗原については陰性の結果が得られた。細胞からRNAを抽出し、電気泳動し、ノーザン分析を使用して、CD10、CD13およびCD56に対する32P-標識cDNAをプローブとして検出した。細胞回収時のCD13およびCD56が有効に転写されていた。[材料および方法]材料および方法は、以下に記載のものは例外として、上記の実施例1に記載のとおりである。ヒト間葉幹細胞成体雌性、胎児雄性および雌性、および老齢雄性および雌性の5種のヒト細胞集団を、本研究に使用した。成体雌性細胞を、25歳ヒト皮膚繊維芽細胞[NHDF,catalogCC-0252,lot6F0600,Clonetics,SanDiego,CA]のサブ密集培養物として購入した。胎児雄性細胞を、大腿筋から誘導した22歳胎児骨格筋細胞[CM-SkM,catalogCC-0231,lot6F0604,Clonetics]のサブ密集培養物として購入した。胎児雌性細胞を、三頭筋から誘導した25週齢胎児骨格筋細胞[CF-SkM,catalogCC-2561,lot14722,Clonetics]のサブ密集培養物として購入した。到着時に、細胞を平板培地-APM-Aに移した。PM-Aは、Earle塩、10v/v予め選択されたウマ血清[ロット番号17F-0218HS7or49F-0082HS4,SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO]、および1v/vペニシリン/ストレプトマイシン[10,000単位/mlペニシリンおよび10,000mg/mlストレプトマイシン、GIBCO]を有する89v/vEagle最小必須培地[EMEM,GIBCOBRL,GrandIsland,NY]、pH7.4から成った。細胞を37°Cで95空気/5CO2湿潤環境でインキュベートした。増殖後、0.0744w/vエチレンジアミンテトラ酢酸[EDTA、Sigma]を含有するCa2、Mg2を含まないDulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水[GIBCO]中0.05w/vトリプシン[DIFCO,Detroit,MI]で細胞を遊離させ、100×gで20分間、遠心分離し、上清をアスピレーターで吸引した。細胞ペレットをPM-Aに再懸濁し、細胞懸濁物を、7.5v/vジメチルスルホキシド[DMSO,MortonThiokol,Danvers,MA]を含有するPM-A中で-70~80°Cで緩徐に凍結保存したYoungら、1991。間葉幹細胞の単離のための標準プロトコールYoungら、1995;Lucasら、1995に従って、67歳雄性患者および77歳雌性患者から得た骨格筋の標本から老齢細胞を単離した。雄性細胞をPAL3と呼び、雌性細胞をPAL2と呼んだ。簡単に説明すると、コラゲナーゼ[CLS-1,WorthingtonBiochemicalCorp.,Freehold,NJ]およびディスパーゼ[catalog40235,CollaborativeResearchInc.,Bedford,MA]で骨格筋の結合組織画分から細胞を遊離させた。90mmおよび20mmNitex[TetcoInc.,Elmsford,NY]を介する.連続ろ過によって、単一の細胞懸濁液を得た。細胞を105細胞/1w/vゼラチン被覆[EMSciences,Gibbstown,NJ]T-75フラスコ[Falcon,Becton-DickinsonLabware,FranklinLakes,NJ]でPM-Aに播種し、凍結保存前に増殖および分化させた。細胞を37°Cで95空気/5CO2湿潤環境でインキュベートした。増殖後、トリプシンで細胞を遊離させ、上記のように篩い分けして分化した表現型即ち、多核筋管、脂肪細胞コロニー、軟骨小節、骨小節から単核細胞を区別し、7.5v/vDMSOを含有するPM-A中、-70~-80°Cで凍結保存した。上記で該述した手順を使用して、それぞれの以後の工程では、幹細胞調製物から98を超える混入繊維芽細胞および分化した表現型を除去するYoungら、1991。平板培地-BPM-Bを有する1ゼラチン被覆フラスコを利用する多数の増殖および凍結保存工程によって、始原および多能性細胞をさらに精製した。PM-Bは、0.01mMWβ-メルカプトエタノール[Sigma]、10v/vウマ血清[HS3,ロット番号3M0338,BioWhittaker,Walkersville,MD]、および1v/v抗生物質-抗カビ剤溶液[GIBCO]を含有する89v/vOpti-MEMに基づく培地[catalog22600-050,GIBCO]から成った。次いで、細胞を30倍加まで増殖させ、トリプシンで遊離させ、インスリン/デキサメタゾン分析、フローサイトメトリーおよび分子分析のためにアリコートに分けた。始原および多能性細胞を同定するためのインスリン/デキサメタゾン分析CM-SkM、CF-SkM、NHDF、PAL3、およびPAL2細胞のアリコートを融解し、PM-Bを利用する1ゼラチン被覆24ウェルの平板[Corning,Corning,NY]中ウェルあたり10,000細胞で個別に平板固定した。24時間後、PM-Bを取り出し、対照培地、インシュリン試験培地、またはデキサメタゾン試験培地のいずれかと置き換えた。対照培地は、0.01mMβメルカプトエタノール、1v/vHS3、および1v/v抗生物質-抗カビ剤溶液を含有する98v/vOpti-MEMから成った。インスリン試験培地は、2μg/mlインスリン[Sigma]を含有する対照培地から成った。デキサメタゾン試験培地は、98Opti-MEM、0.01mMβメルカプトエタノール、1血清[HS3,HS9ウマ血清、ロット番号90H-0701,SigmaまたはFBSウシ胎児血清、ロット番号3000L,AtlantaBiologicals,Norcross,GA]、および1v/v抗生物質-抗カビ剤溶液から成った。この溶液では、デキサメタゾン[Sigma]を10-10、10-9、10-8、10-7MとしたYoungら、1995;Young、1999;Youngら、1998。6週間の間に、培地を1週間あたり3回交換した。表現型の変化について1週間あたり2回培地を観察し、写真撮影した。細胞の表現型発現の明白な変化について形態学的にアッセイした。これらの形態学的組織細胞型は、インスリンまたはデキサメタゾンと共にインキュベートされたトリおよびマウス間葉幹細胞において先に認められ、組織化学的および免疫科学的手順によって広範に分析されたYoungら、1995;Rogersら、1995;Youngら、1993;Young、1999;Youngら、1998細胞型と同一であった。1週間目に細長い多核構造が出現し、筋原構造を同定した図22A。2週間目には、脂肪生成細胞を多数の細胞な収縮性小胞を含有する多核細胞と同定した図22B。4週間目には、軟骨形成細胞を丸型細胞の凝集物としてシート状または離散した小節として同定した図22C。6週目に、骨形成細胞を、細胞凝集物の重層する3次元の細胞外マトリックスとして同定した図22D。フローサイトメトリーCM-SkM、CF-SkM、NHDF、PAL3、およびPAL2細胞のアリコートを融解し、105細胞/1ゼラチン被覆T-75フラスコでPM-Bに播種し、37°Cで95空気/5CO2湿潤環境で増殖させた。増殖後、トリプシンで細胞を遊離させ、PM-Bに再懸濁した。次いで、細胞を遠心分離し、1×106細胞/mlの濃度で洗浄緩衝液に再懸諾した。洗浄緩衝液は、1w/vFBSおよび1w/vアジ化ナトリウム、NaN3[Sigma]を補充したリン酸緩衝液から成った。トリパンブルー[GIBCO]染料除外技術Yongら、1993;Yongら、1991により細胞生存度は>95であった。100マイクロリットルの細胞調製物1×105細胞を、飽和濃度のフルオレセインイソチオシアネートFITC、フィコエリトリンPE、またはペルジニンクロロフィルタンパク質PerCP結合CD3、CD5、CD7、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD45、CD56、CD65、MHCクラスIまたはイソタイプ一致対照[Becton-Dickinson,Inc.,SanJose,CA]で染色した。簡単に説明すると、細胞を暗所で30分間、4°Cでインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄緩衝液で3回洗浄し、フローサイトメトリー上での分析のために0.5mlの洗浄緩衝液に再懸濁した。FACScan商標Becton-Dickinson上でフローサイトメトリーを実施した。光散乱によって細胞を同定した。10,000ゲート制御事象における蛍光の対数を評価した4十進計、1024チャンネルスケール。LYSYSII商標ソフトウェアBecton-Dickinsonを使用して分析を実施し、適切なイソタイプ対照と比較してそれぞれの抗原の有無を決定した。蛍光がイソタイプ対照よりも25を超えて大きい場合は抗原事象をゲート制御した。5種の間葉幹細胞株から得られたプールされたフローサイトメトリーデータについて、統計解析を実施した。従って、それぞれのCDマーカーに対して5種のサンプルサイズを使用した。10,000ゲート制御事象あたりの細胞の絶対数を表10に示す。平均値が1000細胞を超えたら任意のCDマーカーについて陽性とみなした。分子分析CM-SkM、NHDF、およびPAL3細胞のアリコートを融解し、105細胞/1ゼラチン被覆T-75フラスコでPM-Bに播種し、37°Cで95空気/5CO2湿潤環境で増殖させた。培養後、細胞をトリプシンで遊離させ、凍結保存した。得られた上清をアスピレーターで吸引し、細胞ペレットを凍結し、-80°Cで保存した。細胞ペレットを氷上で融解し、製造者の取扱説明書に従い、QiagenQIAシュレッダー[catalog79654,Qiagen,Chatsworth,CA]およびRNeasy総RNAキット[catalog74104,Qiagen]を使用して、総RNAをCF-SkM、NHDF、およびPAL3細胞から抽出した。.CD10、CD13、CD56およびβアクチンそれぞれI.M.A.G.E.ConsortiumCloneID:701606、713961、468885、および586736、ResearchGenetics,Huntsville,AlのI.M.A.G.E.ConsortiumLLNLcDNAクローンLennonら、1996を得た。制限消化によって、プラスミドからcDNA挿入物を切り出し、標準的な手順Sambrookら、1989に従ってアガロースゲル電気泳動により分離した。製造者の取扱説明書に従い、QiaexIIゲル抽出キット[catalog20021,Qiagen]を使用して、cDNAのバンドを使用した。Prime-Itランダムプライマー標識キットKit[catalog300385,Stratagene,LaJolla,CA]を使用して、3,000Ci/mMα[32P]-dCTP[catalognumberAA0005,Amersham,ArlingtonHeights,IL]の取り込みによりcDNAを標識した。ノーザン分析:ホルムアルデヒド/アガロースゲル[ホルムアミド、catalogF79-500、およびアガロース、catalogBP164-100,Fisher,Norcross,GA]を介して総RNA30μg/レーン/細胞株を電気泳動し、標準的な手順Sambrookら、1989に従ってナイロン膜[catalogNJ0HYB0010Magnagraph,Fisher]に移した。ローラーボトルにおいて、68°Cで1晩、QuikHybハイブリダイゼーション溶液[catalog201220,Stratagene]中でハイブリダイゼーションを行った。洗浄は製造者の取扱説明書に従って行った。増感スクリーンを使用して、-70°C~-80°Cでオートラジオグラフィー[Fujifilm,catalog04-441-95,Fisher]を行った。[結果]細胞の同定分析にインスリンおよびデキサメタゾンを使用して、ヒト胎児、成熟、および老齢細胞集団内に存在する細胞の正体を試験した。5種すべてのヒト細胞集団において、骨格筋筋管、脂肪細胞、軟骨小節、および骨小節に一致する形態学がインスリンまたはデキサメタゾンによる処理で生成された。しかし、インスリンよりもデキサメタゾンの方が、誘導される形態の百分率が高かった表9、図22A~D。データは、始原細胞インスリンにより加速された形態および多能性細胞デキサメタゾンにより加速された形態の両方が25歳雌性表皮、22週齢胎児雄性および25週齢胎児雌性生前骨格筋結合組織、ならびに67歳雄性および77歳雌性骨格筋結合組織に存在することを示唆する。フローサイトメトリー分析ヒト始原細胞および多能性細胞によって発現される細胞表面抗原については不明であるため、本発明者らは、フローサイトメトリーと組み合わせた免疫化学によりCD3、CD5、CD7、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD45、CD56、CD65、およびMHCクラスIの存在について5種の細胞集団を分析した。この強力な技術により、本発明者らは多量の細胞を比較的迅速かつ容易に試験することができた。試験したすべてのヒト細胞集団は、CD10、CD13、CD56、およびMHCクラスIの細胞表面発現について陽性であり、CD3、CD5、CD7、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD45、およびCD65については陰性であった表10、図23および24。データは、CD10中性脂肪、CD13アミノペプチダーゼ、CD56神経細胞接着分子、140kDaイソ型、ならびに胎児雄および雌、成体雌、および老齢雄および雌年齢におけるこれらのヒト細胞の細胞表面に位置する腫瘍組織適合性クラスI抗原を示した。CD10、CD13、およびCD56の分子分析CD10中性脂肪、CD13アミノペプチダーゼ、およびCD56神経細胞接着分子、140kDaイソ型が回収時の細胞によって転写されるかどうかを決定するために、CF-SkM、NHDF、およびPAL3サンプル由来の総RNAを、ヒトCD10、CD13、およびCD5632P標識cDNAをプローブとして使用するノーザンブロット技術によって分析した。細胞回収時のCDマーカーの転写において様々なパターンが観察された表10、図28。3種のすべての細胞株においてCD56-mRNAへの強力なcDNA結合が観察され、3種のすべての細胞株において神経細胞接着分子イソ型の有効な転写が示唆された。CD13-mRNAへのcDNAは弱いCF-SkM、強いNHDF、または存在しないPAL3かのいずれかであり、異なる細胞株内のアミノペプチダーゼの転写にばらつきがあることが示唆された。CD10mRNAへのcDNA結合は、試験した3種のいずれの細胞株においても認められなかった。この所見は、2つの可能性を示唆している:CD10のmRNAは、細胞回収時に転写されなかったか、またはCD10のmRNAの量がアッセイの検出限界未満であったかのいずれかである。[考察]毎年数百万人の人々が組織の消失または終段階の器官不全を患うLangerおよびVacanti、1993。これらの患者のための米国の国民医療費の合計は、1年あたり4千億ドルを超えている。現在、米国では、これらの障害を治療するために年間8百万を超える外科手順が実施されており、4千万~9千万の病院日数が必要である。これらの外科手順は数えきれないほどの生命を救い、改善するが、それらは完全に解決しているわけではない。組織移植および外科的介入などの選択肢は深刻なドナー不足および長期の病的状態、および死亡のために厳しく制限されている。ドナー不足は毎年悪化し、必要な臓器の待機リストに掲載されながら死亡する患者の数が増加している。広範な移植、先天異常、選択術、疾患、および遺伝子異常は、ドナー組織の供給源として、自己由来の幹細胞単独または他の薬剤との組み合わせでの治療の能力を有する。好ましい治療は、組織消失の治療であり、ここで、目的は移植に利用可能な細胞数を増加し、それによって失われた組織を置換するかまたはexvivo遺伝子療法のための十分な細胞数を提供することである。自己由来の細胞を使用すれば、同一のHLA一致が得られ、同種異系移植および免疫抑制治療に伴う病態および死亡が妨げられるはずである。先の研究では、ヒトYoungら、1992a;Youngら、1995;Lucasら、1993;Lucasら、1995;Pateetら、1993;Rogersら、1995;Warejckaら、1996を含む多くの動物種の結合組織マトリックス内に位置する中胚葉幹細胞の存在が明らかにされている。これらの細胞には2つのカテゴリーが存在することが、連続制限希釈クローン可能分析によって明らかにされているYoungら、1993,1986;Rogersら、1995;Young、1999。分化決定された始原細胞は、筋原、繊維形成、脂肪生成、軟骨形成または骨形成系統などの単一の系統の組織を形成する単能性、軟骨-骨形成または脂肪繊維系統などの2つの系統の組織を形成する二能性、または造血系統などの同じ系統内で多数の組織もしくは細胞を形成する多能性のいずれかである。分化決定された始原細胞は自己複製が可能であるが、プログラムされた細胞の老化が生じる前に約50~70細胞倍加までの制限された寿命を有する。始原細胞の個々のクローンは、個別の系統の子孫例えば、筋原、繊維形成、脂肪生成、軟骨形成、および骨形成を生じることによって、系統制限を示す。始原細胞の1つの独特な特徴は、インスリン、インスリン様成長因子-IIGF-I、またはインスリン様成長因子-IIIGF-IIなどの発達因子で処理することによってそれらの表現型発現を加速することができることであるYoung、1999;Youngら、1998b。対照的に、多能性細胞は広範な自己再生が可能であり、単一の細胞から様々な分化決定された始原細胞を作製する能力を有する。例えば、生後多能性マウスクローンは、長期間のデキサメタゾン処理によって、690を超える細胞倍加後に骨格筋、脂肪、軟骨、および骨の特徴を有する形態学的かつ表現型発現を示す分化決定された始原細胞を形成するように誘導されるYoungら、1998b。デキサメタゾン、骨形態形成タンパク質BMP、筋形態形成タンパク質MMPなどの分化誘導因子で分化決定を誘導する必要があるYoung、1999;Youngら、1998a。インスリン、IGF-I、またはIGF-IIなどの発達因子は、多能性細胞に影響を及ぼさないYoung、1999。一旦、PPMSCが特定の組織系統に決定される即ち、分化決定された始原細胞になると、理論的に、それらの複製能は、プログラムされた細胞老化が生じる前の約50~70細胞倍加に制限される。これらの新たに作製された始原幹細胞は、血小板誘導性成長因子などの増幅因子の影響下で最大で50~70細胞倍加で増幅することができる。それらはまた、発達因子の影響下で個別の中胚葉株に沿ってさらに分化することもできるRogersら、1995;Youngら、1993,1998a,1998b。これらの細胞には増殖および分化能の両方があるため、本発明者らは、それらが、ドナー組織の供給が不足している様々な移植および/または遺伝子療法において重要な価値があり得ることを提唱する。実際に、哺乳動物多能性細胞を単離するための本発明者らのプロトコールLucasら、1995;Pateら、1993を利用して、GrandeらGrandeら、1995は関節軟骨ならびにラットの全層関節軟骨欠損の治療における肋軟骨下骨および海面質trabecularboneの再構築において劇的な結果を示している。多能性細胞の単離、発達、および分化決定の誘導に必要な時間は、細胞が取り出され、処理され、患者の身体に再導入される多くの臨床状況で使用されるべきこれらの細胞にしては相対的に短い。哺乳動物多能性細胞の単離は、代替的方法によって達成することができる。多能性細胞は、先に記載Youngら、1991;Youngら、1995;Lucasら、1995のように7.5v/VDMSOを含有する培地における-70~-80°Cでの冷凍保存の手段によって得ることができる。あるいは、精製された多能性細胞集団は、Hayflick限界50~70細胞倍加Hayflick、1965を超えた1次回収物から単離された細胞を発達させることによって、得ることができる。この手順は5~9箇月を要する。さらなる手順は、連続希釈クローン可能分析によって多能性および始原細胞の個々のクローンを単離することである。この手順は18~24箇月を要する。本発明者らは、これらの細胞を単離するための時間を最小限にしたいと考えている。本発明者らの現在の調査の1つの態様は、ヒト始原および多能性細胞上の細胞表面抗原を特徴付けすることを目的とする。この知識は、より高度に精製されたこれらの細胞集団を単離するのに必要な時間および操作を減少することを意図する。これは、ヒト始原および多能性間葉幹細胞についての中性エンドペプチダーゼCD10、アミノペプチダーゼCD13、神経細胞接着分子、140kDa、イソ型CD56、およびMHCクラスIの細胞表面局在化を実証するための最初の研究である。本発明者らは、これらの細胞表面CD抗体は、最初の細胞回収物からより精製されたヒトの細胞集団を単離するための最初の工程として、フローサイトメトリーおよび蛍光標示式細胞分取または磁気ビーズ技術と共同で使用することができることを示唆する。これらの自家細胞で富化された集団で開始することは、培養時間ならびに様々な移植および/または遺伝子治療のための適切な数の始原および多能性細胞を得るために必要な費用を有意に減少する。ヒト中胚葉細胞におけるCDマーカーの陽性染色本研究において利用されるヒト胎児、成体、および老齢細胞によって発現される特定の細胞表面部分CD10、CD13、CD56、およびMHCクラスIの機能的重要性については、現在のところまだ不明である。しかし、CD10、CD13、およびCD56は、造血系内の分化された細胞および早期幹細胞の両方において発現されることは既知であるKishimotoら、1997。細胞表面中性エンドペプチダーゼCD10は、汎急性リンパ性白血病CALLA細胞、早期リンパ球始原細胞、成熟顆粒球、および好中球を同定する方法としてクラスター分化CDマーカーに対する抗体およびフローサイトメトリーと共に利用されているKishimotoら、1997。この膜関連亜鉛金属ペプチダーゼは、エンケファリン、化学走性ペプチド、サブスタンスP、ニューロテンシン、オキシトシン、ブラジキニン、ならびにアンジオテンシンIおよびIIを含む広範な調節ペプチドホルモンを不活化することが明らかにされているShippら、1989;Shippら、1991a;Llorens-Cortesら、1992;Casaleら、1994。細胞表面アミノペプチダーゼCD13は、顆粒球および単球CFU-GMの早期決定された始原細胞を同定するためにフローサイトメトリーと共に利用されている。これらの系統のすべての細胞は成熟しているので、CD13は、それらによって発現されるKishimotoら、1997。CD13はまた大きな顆粒リンパ球の小部分上で発現されるが、他のリンパ球では発現されないKishimotoら、1997。CD13は、アミノペプチダーゼNEC3.4.11.2、膜結合性亜鉛結合金属プロテアーゼに構造上同一であるLookら、1989;Larsenら、1996。この酵素は、多様な細胞型によって産生される調節ペプチドからのNH2末端アミノ酸の除去を触媒するLarsenら、1996;Weberら、1996。これらの幹細胞における細胞表面酵素、中性エンドペプチダーゼCD10およびアミノペプチダーゼCD13の1つの可能な機能は、それらが、好ましくはオートクリン、パラクリン、および/またはエンドクリン調節ペプチド例えば、分化決定作用物質、発達因子、および増殖作用物質を分解することによって、分化過程を調節する役割をし得ることである。YoungらYoungら、1998aは、様々なパラクリンおよびエンドクリン調節ペプチドが増殖、分化決定、および始原および多能性幹細胞における系統発達を変更する能力を実証した。.これらの化合物は、増殖血小板誘導性成長因子-AAおよび-BB、系統誘導デキサメタゾン、BMPおよびMMP、ならびに発達インスリン、IGF-IおよびIGF-IIに影響する化合物を含んだ。それらの研究は、分化は、分化未決定の多能性幹細胞から分化決定された始原幹細胞へ促進するため、幹細胞が特定の調節ペプチドに応答する能力がより厳密に制御されることを示唆した。神経細胞接着分子NCAM,CD56の140kDaイソ型は、ナチュラルキラーNK細胞およびCD4/CD8T細胞を同定するための始原型マーカーとしてフローサイトメトリーと共に利用されているKishimotoら、.,1997。その機能は、造血細胞によっては納得できるほどには明らかにされていないが、C2-setIg領域ならびに細胞外ドメイン内のフィブロネクチン領域のために、NKおよびT細胞へのホモフィリックな接着に関与することが示唆されているLanierら、1989;Lanierら、1991。NCAMによる非造血組織、ホモフィリックおよびヘテロフィリックな接着について、細胞-細胞間および細胞-マトリックス間の相互作用の両方を調節することが提唱されている。このことは、一部、細胞外マトリックス細胞の接着および移動に重要なエレメントであるに関連するI型コラーゲンと相互作用する能力に原因があり得るMeyerら、1995。NCAMは、早期胚細胞に出現し、細胞集合体および形態形成部位の境界の形成に重要であるRutishauser、1992。発生の後半では、様々な分化組織においてNCAMが認められる。先の研究Youngら、1995;Lucasら、1995;Youngら、1993;Young、1999で、間葉幹細胞が、骨格筋、心筋、平滑筋、および骨骨芽細胞などの中胚葉由来の組織を形成する能力が明らかにされた。これらの特定の分化された細胞型は、分化を生じる細胞-細胞間および細胞-マトリックス間相互作用のためにNCAMを利用することを明らかにしているKnudsenら、1990;PeckおよびWalsh、1993;Byeonら、1994;Lyonsら、1992;Romanskaら、1996;LeeおよびChuong、1992。CD56を示している5種の細胞株内の間葉幹細胞の百分率が特に興味深い表10。CD56を示す細胞数の差異は、暦年齢または回収時の細胞の機能能力を反映し得る。また、各細胞株におけるCD56を示す細胞の百分率は、それぞれの集団内の始原対多能性幹細胞の絶対数を反映し得る。細胞表面NCAMは、正常な胚発達中に、それぞれの組織系統経路に沿った間葉幹細胞のさらなる分化のための調製に必要な細胞-細胞間および細胞-マトリックス間相互作用を調節するように機能する。それはまた、成体においても同様の機能を有する。細胞表面主要組織適合遺伝子複合体MHCクラスI分子は、すべての脊椎動物種に存在し、身体内のほとんどすべての有核細胞上で発現されることが示されているBenjaminiら、1996。MHCクラスI分子は、抗原のプロセシングおよび提示の現象に中心的な役割を果たしBenjaminiら、1996;Abbasら、1997、それらはまた、自己および非自己を区別する免疫応答の機序を理解するために広範に研究されている。間葉幹細胞は、組織工学のための細胞の供給源として、移植のためのドナーまたは遺伝子治療のための送達ビヒクルのいずれかとして提唱されているYoungら、1998a,b。示されているように表10、胎児、成体、および老齢個体から単離された幹細胞の集団内の80を超える細胞は、MHCクラスI抗原を発現する。このことは、それらの特定のクラスI抗原発現細胞が、MHCミスマッチ免疫応答性個体において外来として認識されるため、従って、それらは自己または同系移植にのみ使用すべきであることを示す。対照的に、約5の胎児性および成体幹細胞ならびに15の老齢幹細胞がMHCクラスI抗原を発現しないことが認められている。このようにMHCクラスI抗原発現が明らかに減少するのは、細胞表面クラスI抗原の量が、利用される免疫組織学的/フローサイトメトリー手順による検出限界を下回ること、または幹細胞の特定の部分集合由来のこれらの分子がまったく存在しないことによるようである。この所見の重要性についてはこの時点では知られていない。これらの幹細胞上の細胞表面クラスI分子の有無は、特定の細胞の分化状態、即ち、MHCクラスI抗原を示すより分化した始原幹細胞およびこれらの特定の細胞表面抗原を発現しないより原始的な多能性幹細胞を表し得る。あるいは、特定の幹細胞の分化状態は、細胞表面上のMHCクラスI抗原の発現に関係し得ない。この例では、免疫系から本質的に隠れているMHCクラスI抗原を有さない幹細胞の部分集合が存在し得、従って、普遍的組織移植物の候補であり得る。そのような特定の部分集合の細胞は、同系異種移植手順に有用であり得る。この領域は、現在研究中である。ヒト間葉幹細胞におけるCDマーカーの陰性染色上記の4種の陽性染色細胞表面抗原とは対照的に、以下の11種の抗原は、胎児、成体、および老齢ヒト間葉幹細胞の細胞表面上には存在しないことが認められた。これらのマーカーは、CD3、CD5、CD7、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD45、およびCD65であった。.この所見の重要性についてはこの時点では知られていない。しかし、これらの特定の細胞表面抗原は、造血系Kishimotoら、1997、即ち、T細胞CD3、CD5、CD7、CD11b、CD25、CD45、B細胞CD5、CD11b、CD19、CD25、CD45、胸腺細胞CD7、顆粒球CD11b、CD14、CD15、CD16、CD45、CD65、単球CD11b、CD14、CD16、CD25、CD45、濾胞樹状細胞CD19、および成熟赤血球CD45にのみ存在するとされている。結論として、これは、ヒト間葉幹細胞についての中性エンドペプチダーゼCD10、アミノペプチダーゼCD13、神経細胞接着分子イソ型CD56、およびMHCクラスIの細胞表面局在化を実証するための最初の研究である。それ自体で、本発明者らは、これらの細胞表面CDマーカーは、最初の細胞回収物由来のヒト始原および多能性細胞のより精製された団を単離するための最初の工程として、フローサイトメトリー、蛍光標示式細胞分取、磁気ビーズ分離、または抗体精製カラムと共同で使用することができることを示唆する。これらの中胚葉細胞で富化された集団で開始することは、培養時間および供給費用の両方を有意に減少し、様々な移植および/または遺伝子治療に必要な始原および多能性細胞の収量を改善する。ヒト間葉幹細胞は造血細胞表面クラスター分化マーカーCD34およびCD90を示すここでは、ヒト間葉幹細胞上の13種の細胞表面クラスター分化マーカーのプロフィールについて詳細に報告する。間葉幹細胞の単離、冷凍保存、および発達のための以下の標準的なプロトコールに従い、胎児、および老齢個体から細胞を単離した。それぞれの個体由来の間葉幹細胞集団は、始原および多能性幹細胞の両方から成った。30細胞倍加での間葉幹細胞の結果は、CD34およびCD90については陽性染色、ならびにCD3、CD4、CD8、CD11c、CD33、CD36、CD38、CD45、CD117、グリコホリンA、およびHLA-IIDRについては陰性染色を示した。各細胞株からRNAを抽出し、電気泳動し、ノーザン分析を使用して、CD34およびCD90に対する32P-標識cDNAをプローブとして検出した。結果は、細胞回収時にCD90が有効に転写されたことを示す。本発明者らは、ヒト間葉幹細胞上でのCD34およびCD90細胞表面抗原の最初の同定について報告する。幹細胞を臨床的に有用であるようにするためには、単離、発達、およびそれらを患者身体に再導入する前の幹細胞の分化決定の誘導に必要な期間は、比較的短くなければならない。従って、本発明者らの調査は、ヒト間葉幹細胞上の細胞表面抗原を特徴付けてこれらの細胞のより精製された集団の単離を容易にすることに焦点を置く。幹細胞に対する独特な細胞表面抗原を同定することにより、幹細胞の単離を促進するためにこれらの抗原に対する抗体を使用することが可能である。現在検討中の1つの技術では、蛍光標識した抗体および蛍光標示式細胞分取と組み合わせたフローサイトメトリーを使用する。この技術は、細胞表面抗原のプロフィールに基づく造血細胞を特徴付け、単離するために、クラスター分化CDマーカーと共に使用されている。実際に、様々なリンパ球産生および赤血球生成系統内の個々の細胞型を特徴付けおよび単離するために、180を超える個々のCDマーカーが使用されているKisihmotoら、1997。本文献において報告された実験は、胎児、成熟、および老齢ドナーから単離されたヒト雄性ならびに雌性幹細胞の細胞表面CDマーカーを特徴付けることに関与する。間葉幹細胞の単離、冷凍保存、および増殖のための標準的なプロトコールに従って細胞を得たYoungら、1995、Lucasら、1995、Youngら、1993、Youngら、1991。各個体由来の細胞集団は、始原細胞および多能性細胞の両方の混合物を含有し、これは、デキサメタゾンおよびインスリンを使用する比較/対比分析によって決定されたYoungら、1998a。免疫化学的蛍光標示フローサイトメトリーを使用して、個々の細胞集団における13腫のCDマーカーを試験した。陽性染色はCD34およびCD90について得られた。陰性染色はCD3、CD4、CD8、CD11c、CD33、CD36、CD38、CD45、CD117、グリコホリンA、およびHLA-IIDRについて得られた。細胞集団からRNAを抽出し、電気泳動に供し、ノーザン分析を使用して、CD34およびCD90に対する32P-標識cDNAをプローブとして検出した。結果は、細胞回収時にCD90が有効に転写されていることを示した。本発明者らは、ヒト始原および多能性細胞上の造血幹細胞表面マーカーCD34およびCD90存在のの最初の同定について報告する。[材料および方法]ヒト間葉幹細胞本研究では、6種の幹細胞集団を使用した。2種は胎児ドナー1つの雌および1つの雄、2種は成熟ドナー両方とも雌、および2種は老齢ドナー1つの雌および1つの雄から採取した。細胞は、2つの異なる結合組織画分真皮および骨格筋関連の結合組織から誘導した。ヒト組織を回収するためのプロトコールは、InstitutionalReviewBoardattheMedicalCenterofCentralGeorgia,Macon,GAにより承認されたものである。胎児雌性細胞を、三頭筋に関連する結合組織から誘導した25週齢胎児骨格筋細胞[CF-SkMl,catalogCC-2561,lot14722,Clonetics,SanDiego,CA]のサブ密集培養物として購入した。胎児雄性細胞を、大腿筋に関連する結合組織から誘導した22歳胎児骨格筋細胞[CMSkMl,catalogCC-0231,lot6F0604,Clonetics]のサブ密集培養物として購入した。成体雌性細胞を、25歳ヒト皮膚細胞[NHDF1,catalogCC-0252,lot6F0600,Clonetics]のサブ密集培養物および36歳ヒト皮膚細胞[NHDF2,catalogCC-0252,lot16280,Clonetics]のサブ密集培養物として購入した。到着時に、細胞を平板培地-APM-Aに移した。PM-Aは、Earle塩、10の予め選択されたウマ血清[lotno.17F-0218HS7もしくは49F-0082HS4,SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO]または[lotno.3M0338HS3,BioWhittaker,Walkersville,MD]、および1v/vペニシリン/ストレプトマイシン溶液[10,000単位/mlペニシリンおよび10,000μg/mlストレプトマイシン、GIBCO]を有する89v/vEagle最小必須培地EMEM、pH7.4[EMEM,GIBCOBRL,GrandIsland,NY]から成った。細胞を37°Cで95空気/5CO2湿潤環境でインキュベートした。増殖後、0.0744w/vエチレンジアミンテトラ酢酸[EDTA、Sigma]を含有するCa2、Mg2を含まないDulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水[GIBCO]中0.05w/vトリプシン[DIFCO,Detroit,MI]で細胞を遊離させ、100×gで20分間、遠心分離した。上清をアスピレーターで吸引し、細胞ペレットをPM-Aに再懸濁し、細胞懸濁物を、7.5v/vジメチルスルホキシド[DMSO,MortonThiokol,Danvers,MA]を含有する平板培地-A中で-70~-80°Cで緩徐に凍結保存したYoungら、1991。老齢幹細胞はDr.PaulLucasDepartmentofOrthopedicSurgery,NewYorkMedicalCollege,Valhalla,NYより入手した。間葉幹細胞の単離のための標準プロトコールLucasら、1995;Youngら、1999に従って、77歳雌性患者および67歳雄性患者から得た骨格筋の病因学的標本に関連する筋内膜、筋周膜、および筋外膜結合組織画分から老齢細胞を単離した。これらの細胞をそれぞれPAL2およびPAL3と命名した。簡単に説明すると、コラゲナーゼ[CLS-1,WorthingtonBiochemicalCorp.,Freehold,NJ]およびディスパーゼ[catalog40235,CollaborativeResearchInc.,Bedford,MA]で幹細胞を遊離させた。90μmおよび20μmNitex[TetcoInc.,Elmsford,NY]を介する.連続ろ過によって、単一の細胞懸濁液を得た。細胞を105細胞/1w/vゼラチン化[EMSciences,Gibbstown,NJ]100mm皿[Falcon,BectonDickinsonLabware,FranklinLakes,NJ]でPM-Aに播種し、凍結保存前に増殖および分化させた。細胞を37°Cで95空気/5CO2湿潤環境でインキュベートした。増殖後、トリプシンで細胞を遊離させ、上記のように篩い分けして繊維芽細胞および分化した表現型即ち、多核筋管、脂肪細胞コロニー、軟骨小節、骨小節から単核幹細胞を区別し、7.5v/vDMSOSigmaLucasら、1995を含有するPM-A中、-70~-80°Cで凍結保存した。さらなる細胞の増殖は、発達および凍結保存工程を反復し、但し篩い分けはせず、1ゼラチン化T-75フラスコ[Falcon]および平板培地-BPM-Bを利用することによって得た。PM-Bは、89v/vOpti-MEMに基づく培地Kawamotoら、1983[catalog22600-050,GIBCO]、10v/vウマ血清[HS3]、および1v/v抗生物質-抗カビ剤溶液[10,000単位/mlペニシリン、10,000μg/mlストレプトマイシン、および25μg/mlアンホテリシンBフンジゾンとしてGIBCO]、pH7.4から成った。次いで、細胞をインスリン/デキサメタゾンバイオアッセイおよびフローサイトメトリーのためにアリコートに分けた。始原および多能性幹細胞を同定するためのインスリン/デキサメタゾンバイオアッセイ始原および/または多能性幹細胞の存在を決定するために、インスリンおよびデキサメタゾンを使用して、発達した細胞を試験したYoungら、1998b。本バイオアッセイでは、インスリンは始原幹細胞において表現型発現を加速するが、多能性幹細胞の表現型発現の誘導に対しては効果を示さない。対照的に、デキサメタゾンは、多能性幹細胞において分化決定および発現を誘導するが、始原幹細胞における表現型発現を変更しない。従って、始原細胞のみが培養物中に存在する場合、インスリン中でインキュベートされた培養物について発現された表現型は、デキサメタゾンと共にインキュベートした培養物と比較して差異は認められない。始原細胞および多能性細胞の療法を含有する培養物を混合する場合、デキサメタゾンで処理した培養物において発現された表現型の量は、インスリンで処理した培養物と比較してより大きい。さらに、発現された表現型の数の増加が観察され得る。培養物が多能性細胞のみを含有する場合、インスリンで処理した培養物において表現型の発現は認められない。デキサメタゾンで処理した同様の培養物は、多数の発現された表現型を示す。このように、インスリンおよびデキサメタゾンによる処理の効果を比較することにより、不明な細胞群内の始原および多能性幹細胞の特定の型を同定することができるYoungら、1992,1993,1995,1998a,b,1999;Lucasら、1993,1995;Pateら、1993;Rogersら、1995;Warejckaら、1996。CM-SkM1、CF-SkM1、NHDF2、PAL3およびPAL2細胞のアリコートを融解し、PM-Bを利用して、1ゼラチン被覆24ウェルの平板[Corning,Corning,NY]中ウェルあたり10,000細胞かまたは1ゼラチン被覆96ウェルの平板[Falcon]中ウェルあたり1,000細胞で個別に平板固定した。デキサメタゾン試験培地は、98、94、もしくは89Opti-MEM;またはそれぞれ1、5、または10血清[HS3、HS9ウマ血清、ロット番号90H-0701,Sigma、または1FBSウシ胎児血清、ロット番号3000L,AtlantaBiologicals,Norcross,GA、1抗生物質-抗カビ剤溶液および10-10、10-9、10-8、10-7、もしくは10-6Mデキサメタゾン[Sigma]Youngら、1995,1998bから成った。8週間の間に、培地を1週間あたり3回交換した。表現型の変化について1週間あたり2回培地を観察し、写真撮影した。推定間葉幹細胞の表現型発現の明白な変化について形態学的基準を使用して決定した。形態学的表現型は、インスリンまたはデキサメタゾンと共にインキュベートしたトリおよびマウス間葉幹細胞で先に認められた表現型に同一であったYoungら、1993,1998a。骨格筋原構造は、それらの細長い多核性状、交差線紋、および自発的収縮によって同定されたYoungら、1993,1995。骨格筋筋管は、ミオゲニンF5D,DevelopmentalStudiesHybridomaBank,DSHB:Wrightら、1991、支質ミオシンMF-20,DSHB:Baderら、1982、速骨格筋ミオシンMY-32,Sigma:NaumannおよびPette、1994、ミオシン重鎖ALD-58:Shafiqら、1984、ならびにヒト速ミオシン繊維A4.74:Websterら、1988に対する抗体を使用して免疫化学染色によって確認した。平滑筋細胞は、細胞内ストレスstressフィラメントを含有する大きな多角形細胞と同定した。平滑筋表現型は、平滑筋αアクチンに対する抗体で免疫化学的に確認された1A4,SigmaSkalliら、1986。心筋は二核細胞として確認された。心筋の表現型は、平滑筋αアクチン1A4および支質ミオシンMF-20EisenbergおよびMarkwald、1997に対する抗体の同時標識で免疫化学的に確認された。脂肪生成細胞を多数の細胞な収縮性小胞を含有する多核細胞と同定した。脂肪細胞は、SudanブラックBChroma-Gesellschaft,RobozSurgicalCo.,Washington,DC:Youngら、1993およびOilRed-OSigma:Humason、1972による組織化学染色によって、飽和中性脂肪を含有する細胞内小胞の存在で確認した。軟骨形成構造は、収縮性細胞周辺マトリックスハローを有する丸型細胞凝集物としてシート状または離散した小節として同定された。軟骨表現型は、プロII型コラーゲンClICImDSHB:Holmdahlら、1986;Johnstoneら、1998;ヒト特異的II型コラーゲンII-4CII,ICNBiomedicals,Aurora,OH:BurgesonおよびHollister、1979;Kumagaiら、1994;およびIX型コラーゲンDl-9,DSHB:Yeら、1991のための免疫化学染色、ならびにコンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸を含有するグリコサミノグリカンに対するAlcianブルーpH1.0による組織化学染色Chroma-Gesellschaft:Youngら、1993;Youngら、1998a,b、ならびに硫酸部分を含有するグリコサミノグリカンに対するPerfix/AlcecブルーFisherScientificCo.,Norcross,GA/AlrrichChemicalCo.,Milwaukee,WI:Lucasら、1991により確認した。骨形成構造は、細胞の凝集物に重層する3次元細胞外マトリックスと同定された。骨形成表現型は、骨シアロプロテインWV1D1,DSHB:Kasugaiら、1992およびオステオポンチンMPlll,DSHB:Gorskiら、1990に対する免疫化学、ならびにvonKossaSilberProtein,ChromaGesellschaft:Youngら、1993,1998a,bを使用するリン酸カルシウムに対する組織化学染色によって確認した。繊維芽細胞を、形態学的外観により多角形または星形細胞と同定した。繊維形成表現型を、ヒト繊維芽細胞表面タンパク質に対する抗体で免疫細胞化学的に確認した1B10,Sigma:Ronnov-Jessenら、1992。内皮細胞を、個々にまたはシート状で生じる丸石型細胞と同定した。内皮表現型を、ヒト特異的内皮細胞表面マーカーP1H12,Accurate,Westbury,NY:Soloveyら、1997、末梢内皮細胞接着分子、PECAMP2B1,DSHB、脈幹細胞接着分子、VCAMP8B1,DSHB:Dittelら、1993、およびEセレクチンに対する免疫学的染色により確認した。2次抗体はビオチン化抗ヒツジIgGVector、ビオチン化抗マウスIgGVector、またはVecstatinABCキットVectorに含有される抗体から成る。3次プローブは、VecstatinABCキットVectorに含有されるアビジン-HRPから成る。以下の不溶性西洋ワサビペルオキシダーゼHRP基質を使用して、抗体の結合を可視化した:ペルオキシダーゼのVIP基質キット青、Vector、ペルオキシダーゼのDAB基質黒、Vector、およびAEC染色キット赤、Sigma。異なる発色基質を利用して、同じ培養ウェルの多数の連続染色を可能にした。フローサイトメトリー回収後、30細胞倍加時のCM-SkM、CF-SkM、NHDF1、NHDF2、PAL3および細胞PAL2のアリコートを融解し、105細胞/1ゼラチン被覆T-75フラスコでプレー化培地-B、PM-Bに播種し、37°Cで95空気/5CO2湿潤環境で増殖させた。培養後、細胞をトリプシンで遊離させ、PM-Bに再懸濁した。次いで、細胞を遠心分離し、洗浄緩衝液1FBS[HyClone]および1w/vアジ化ナトリウム、NaN3[Sigma]を補充したCa2,Mg2[Cellgro,MediaTech]を含有しないDulbeccoリン酸緩衝化生理食塩水に、1×106細胞/mlで再懸濁した。Trypanブルー染料[GIBCO]排除技術Youngら、1993、Youngら、1991により細胞生存度は>95であった。100マイクロリットルの細胞調製物1×105細胞を、飽和濃度のフルオレセインイソチオシアネートFITC、フィコエリトリンPE、またはペルジニンクロロフィルタンパク質PerCP結合CD3、CD4、CD8、CD11c、CD33、CD34、CD36、CD38、CD45、CD90、CD117、グリコホリン-AおよびHLA-IIDR、またはイソタイプ一致対照[Becton-Dickinson,Inc.,SanJose,CA]で染色した。簡単に説明すると、細胞を暗所で30分間、4°Cでインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄緩衝液で3回洗浄し、0.5mlの洗浄緩衝液に再懸濁した。FACScan商標Becton-Dickinsonフローサイトメーター上でフローサイトメトリーを実施した。光散乱によって細胞を同定した図29。10,000ゲート制御事象における蛍光の対数を評価した4十進計、1024チャンネルスケール。LYSYSII商標ソフトウェアBectonDickinsonを使用して分析を実施した。適切なイソタイプ対照と比較して染色の有無を決定した。25を超える染色がイソタイプ対照を超えている場合、ゲート制御事象はCDマーカーに対する染色の存在があると評価した。5種の間葉幹細胞株から得られたプールされたフローサイトメトリーデータについて、統計解析を実施した。10,000ゲート制御事象あたりの細胞の絶対数を表11に示す。平均値が1,000ゲート制御細胞を超えたら任意の所定のCDマーカーについて陽性とみなした。統計解析唯一生物学的に有意な結果はマーカーCD34およびCD90であった。これらを、胎児期ヒト組織から誘導される標本および生後ヒト組織から誘導される標本の2つに分けた。ABSTATコンピュータプログラムAnderson-BellCorp.,Arvada,COを使用して、一方向分散分析により2つのグループを解析した。分子分析回収後30細胞倍加のCM-SkM、NHDF、およびPAL3細胞のアリコートを融解し、105細胞/1ゼラチン化T-75フラスコで平板培地-Bに播種し、37°Cで95空気/5CO2湿潤環境で増殖させた。増殖後、トリプシンで細胞を遊離し、遠心分離し、上清をアスピレーターで吸引し、細胞ペレットを凍結し、-80°Cで保存した。細胞ペレットを氷上で融解し、製造者の取扱説明書に従い、QiagenQIAシュレッダー[catalog79654,Qiagen,Chatsworth,CA]およびRNeasy総RNAキット[catalog74104,Qiagen]を使用して、総RNAをCF-SkM、NHDF、およびPAL3細胞から抽出した。.CD34、CD90およびβアクチンそれぞれI.M.A.G.E.ConsortiumCloneID:770858、714060、および586736、ResearchGenetics,Huntsville,AlのI.M.A.G.E.ConsortiumLLNLcDNAクローンLennonら、1996を得た。制限消化によって、それぞれのプラスミドからcDNA挿入物を切り出し、標準的な手順Sambrookら、1989に従ってアガロースゲル電気泳動により分離した。製造者の取扱説明書に従い、QiaexIIゲル抽出キット[catalog20021,Qiagen]を使用して、それぞれのcDNAのバンドを使用した。Prime-Itランダムプライマー標識キットKit[catalog300385,Stratagene,LaJolla,CA]を使用して、3,000Ci/mMα[32P]-dCTP[catalognumberAA0005,Amersham,ArlingtonHeights,IL]の取り込みによりcDNAを標識した。ノーザン分析:ホルムアルデヒド/アガロースゲル[ホルムアミド、catalogF79-500、Fisher,Norcross,GA;アガロース、catalogBP164-100,Fisher]を介して総RNA30μg/レーン/細胞株を電気泳動し、標準的な手順Sambrookら、1989に従ってキャピラリー転移によりナイロン膜[catalogNJ0HYB0010Magnagraph,Fisher]に移した。ローラーボトルにおいて、68°Cで1晩、QuikHybハイブリダイゼーション溶液[catalog201220,Stratagene]中でハイブリダイゼーションを行った。洗浄は製造者の取扱説明書に従って実施した。増感スクリーンを使用して、-70°C~-80°Cでオートラジオグラフィー[Fuji,catalog04-441-95,Fisher]を行った。[結果]幹細胞の同定インスリン及びデキサメタゾンを使用しする比較/対比分析によって、雄性及び雌性ヒト胎児、成熟、、及び老齢細胞集団内に存在する推定細胞の正体を試験した。骨格筋筋管、脂肪細胞、軟骨小節、及び骨小節に一致する形態学的外観における少数の表現型の変化は、インスリンによって生じた。多量の類似の表現型変化は、デキサメタゾンによる処理によって生じた。デキサメタゾンは、筋肉、脂肪、軟骨、骨、結合組織、及び内皮細胞に関する表現型発現を誘導した。骨格筋、平滑筋、及び心筋表現型は、抗体染色に基づいて認識された。これらの細胞も、骨格筋、筋幹、脂肪細胞、軟骨小節、及び骨小節に類似した。これらの形態学的変化は、30細胞倍加の6つのすべてのヒト幹細胞集団において生じた。80細胞倍加では、インスリンは細胞に影響を及ぼさないが、デキサメタゾンは細胞の表現型発現を変化した図26A~D。データは、始原細胞インスリンにより加速された形態及び多能性細胞デキサメタゾンにより加速された形態の両方が22週齢胎児生前雄性及び25週齢胎児雌性生前骨格筋結合組織、25歳雌性表皮、67歳雄性及び77歳雌性骨格筋結合組織から単離される推定ヒト幹細胞の30細胞倍加後の集団に存在したという仮説を支持する。フローサイトメトリー分析ヒト間葉幹細胞集団によって発現されるクラスター分化細胞表面については不明であるため、本発明者らは、CD3、CD4、CD8、CD11c、CD33、CD34、CD36、CD38、CD45、CD90、CD117、グリコホリンA、及びHLA-IIDRの存在について、フローサイトメトリーと組み合わせた免疫化学によって、5種の細胞集団を分析した。この強力な技術により、本発明者らは多量の細胞を比較的迅速かつ容易に試験することができた。すべてのヒト幹細胞は、CD90について陽性染色を示した。CD34に対する陽性染色は、NHDF成体ヒト雌性NHDF1及びNHDF2、PAL3老齢ヒト雄性、及びPAL2老齢ヒト雌性由来の生後幹細胞によって示された。CD34に対する陰性染色は、CM-SkM胎児ヒト雄及びCF-SkM胎児ヒト雌由来の胎児期幹細胞によって示された。生後成体NHDF1及びNHDF2及び老齢PAL3及びPAL2細胞集団は、二重CD34/CD90染色を発現したが、胎児CM-SkM及びCF-SkM集団はCD90のみを発現した。CD34及びCD90の両方に対する抗体について分析すると、NHDFl集団はCD34及びCD90の両方に陽性な2520細胞ならびにCD90のみに陽性な6979細胞を発現した。NHDF2はCD34及びCD90の両方に陽性な7320細胞ならびにCD90のみに陽性な1539細胞を発現した。同じ技術を使用したところ、PAL3はCD34及びCD90の両方に陽性な3430細胞ならびにCD90のみに陽性な6069細胞を含有した。PAL2はCD34及びCD90の両方に陽性な1880細胞ならびにCD90のみに陽性な6360細胞を含有した。CM-SkMはCD34及びCD90の両方に陽性な1細胞ならびにCD90のみに陽性な9549細胞を含有した。CF-SkMはCD34及びCD90の両方に陽性な180細胞を発現したが、CD90のみに陽性な8680細胞を発現した。CD34には陽性であるがCD9には陰性であるような細胞は試験した集団では認められなかった。CD3、CD4、CD8、CD11c、CD33、CD36、CD38、CD45、CD117、グリコホリンA、及びHLA-IIDR表11、図27~29については試験したすべての集団が陰性であった。CD34及びCD90の分子分析CD34及びCD90が回収時に細胞によって有効に転写されたかどうかを決定するために、プローブとしてヒトCD34及びCD90cDNAを使用するノーザンブロット技術によって、CF-SkM、NHDF、及びPAL3サンプル由来の総RNAを分析した。細胞回収時のCDマーカーの転写において様々なパターンが観察された表11、図30。試験した3種の細胞株のいずれにおいてもCD34-mRNAに結合するcDNAは認められず、回収時に有効な転写が生じないか、又はCD34のmRNAの量がアッセイの検出限界未満であることが示唆された。CD90-mRNAに結合するcDNAは、強力CF-SkM及びNHDFか又は弱いPAL3のいずれかであったことから、それぞれの細胞株内ではCD90に対する転写パターンが同様であることが示唆された。[考察]ヒト間葉幹細胞におけるCDマーカーの陽性染色ヒト胎児、成体、及び老齢間葉幹細胞によって発現される細胞表面クラスターマーカーCD34及びCD90の機能的重要性については、現在のところまだ不明である。しかし、CD34は決定及び未決定の造血前駆細胞、小脈管内皮細胞及び神経組織のいくらかの細胞を発現することが知られているLinら、1995。cDNAを扱った1つの研究グループが、CD34をシアロムチンとして特徴づけたSimmonsら、1992。CD34の提案された細胞機能は、血液細胞前駆体の分化の調節であると考えられ、それは細胞接着分子であると示唆されているLinら、1995。臨床専門家はCD34に対するモノクローナル抗体を広範に利用して、自家骨髄移植での使用のために造血幹細胞及び始原細胞を精製している。さらに、CD34を発現する細胞の選択を使用して、造血遺伝子療法のための臨床アプリケーションにおいて細胞を単離することができるSutherlandら、1993。Thy-1としても知られるCD90は造血細胞Craigら、1993、ニューロン組織Tiveronら、1992;Morris、1985及びいくつかの結合組織Morris及びBeech,1984で発現される。Craigらは、CD90が相当数の造血細胞上でCD34と同時発現すると決定した。CD90及びCD34の両方に陽性であるヒト末梢血細胞は、免疫不全マウスにおいて多数の造血系統を産生することが可能な造血幹細胞を含むことが見出されたTsukamotoら、1994。CD90に当てはまる機能はまだ不明であるが、CD90はTリンパ球のシグナル伝達の役割を果たし、これはチロシンのリン酸化に関与する経路に関係するLanckiら、1995該タンパク質は免疫グロブリンといくつか相同性を有するため、免疫グロブリンスーパーファミリーの一部であると考えられている。興味深いことに、Thy-1は脳組織及びTリンパ球上で発現されるため、このタンパク質は失調の発達に役割を果たし得る。この障害は、神経学的及び免疫学的機能の両方に病巣があるのが特徴であるGatti、1991;Teplitz、1978。成体雌性NHDF、老齢雄性PAL3、及び老齢雌性PAL2幹細胞集団は、フローサイトメトリーの分析により細胞表面上にCD34及びCD90の両方を発現したが、胎児雄性CM-SkM及び胎児雌性CF-SkM集団はCD90のみを発現した。これらの所見は2つの理由で重要であり得る。第1は、CD34及びCD90の両方に陽性である先に記載の細胞集団のみが造血幹細胞系統に属することである。多数の中胚葉系統から表現型マーカーを発現させる能力があるため、本発明者らはこれらの細胞は造血系統にのみ属するとは考えていない。むしろ、本発明者らのデータは、我々が造血幹細胞と共通の表現型特徴を有する独特な集団を見出したことを示唆する。第2に、CD34マーカーは、成体雌性NHDF、老齢雄性PAL3、及び老齢雌性PAL2の細胞表面上で検出され得るが、胎児雄性CM-SkM及び胎児雌性CF-SkM細胞上では検出されない。さらに、試験した細胞株でノーザンブロット分析によってCD34mRNAを発現した細胞株は認められない。CD34mRNAの発現が認められないことについて2つの説明が可能である。存在するmRNAの量はアッセイの検出限界を下回っているかもしれないこと。あるいは、マーカーはなお生後細胞の細胞表面上存在してもCD34の有効な転写が停止してしまっていたかもしれない。この所見はなぜCD34がCD90より少数の細胞で発現されるかを説明するのに役立ち得る。胎児CM-SkM及びCF-SkM細胞でCD34の発現が比較的認められないことは特に注目すべきである。しかし、この所見の重要性についてはこの時点では知られていない。幹細胞集団において観察されたCD34又はCD90のいずれかに陽性な細胞は、培養物中に生存したニューロン又は結合組織始原細胞から誘導される。フローサイトメトリーに使用された幹細胞集団は、組織回収後30細胞倍加であった。Hayflick限界50~70細胞倍加後にプログラムされた細胞老化が達成されているHayflick、1963,1965。本研究において使用される幹細胞集団はHayflick限界よりも少ない回数即ち30細胞倍加であっただけ複製したため、それらはなお始原及び分化した細胞を含有し得るしかし、CD34及びCD90の両方に陽性である細胞は、ニューロン又は結合組織細胞から誘導されにくく、これらの組織由来の細胞はこれらの2つのタンパク質を同時発現することは知られていない。CD34及びCD90の両方に陽性である細胞の特徴についてはまだ十分に調べられていない。ヒト間葉幹細胞におけるCDマーカーの陰性染色CD34及びCD90に関する所見とは対照的に、11種の抗原が、胎児、成体、及び老齢ヒト間葉幹細胞の細胞表面上には存在しないことが認められた。これらのマーカーはCD3、CD4、CD8、CD11c、CD33、CD36、CD38、CD45、CD117、グリコホリンA、及びHLA-IIDRであった。この所見の重要性についてはこの時点では知られていない。しかし、これらの特定の細胞表面CD抗原は、CD3、CD4、CD8、CD45、及びCD117の存在が原因であるとされているKishimotoら、1997。単球/マクロファージはCD11c、CD36、CD38、CD45、CD117、及びHLADR-IIを示しているKishimotoら、1997。ナチュラルキラー細胞はCD11c、CD38、CD45、及びCD117を示しているKishimotoら、1997。顆粒球はCD11c、CD36、CD38、CD45、及びCD117を示しているKishimotoら、1997。骨髄性始原細胞はCD33、CD38、CD45、及びCD117を示しているKishimotoら、1997。赤血球はグリコホリンAを示しているKishimotoら、1997。いくつかのニューロン細胞はCD38及びHLADR-IIを示しているMizguchiら、1995;Rohnら、1996。造血細胞の特徴を有するこれらの11種の表面マーカーが本研究で使用した雄性及び雌性胎児、成体、及び老齢幹細胞上に認められないことについては、2つの説明が可能である。試験した幹細胞は正常な環境下で造血系統に沿った分化能を持たない可能性がある。この仮説が正しければ、これらのマーカーはこれらの細胞の分化した系統上には決して出現し得ない。あるいは、これらの幹細胞が造血株に沿った分化能を有する場合、11種の分化マーカーが認められないことは間接的に研究された細胞がより原始的な幹細胞であることを示す。組織工学の可能性毎年数百万人の人々が組織の消失又は終段階の器官不全を患うLanger及びVacanti、1993。これらの患者のための米国の国民医療費の合計は、1年あたり4千億ドルを超えている。現在、米国では、これらの障害を治療するために年間8百万を超える外科手順が実施されている。これらの治療には4千万~9千万の病院日数が必要である。これらの療法は数えきれないほどの生命を救い、改善するが、それらは完全に解決しているわけではない。組織移植及び外科的介入などの選択肢は深刻なドナー不足及び可能な長期の病的状態のために厳しく制限されている。ドナー不足は毎年悪化し、必要な臓器の待機リストに掲載されながら死亡する患者の数が増加している。広範な外傷、先天異常、疾患、及び遺伝子異常は、ドナー組織の供給源として、自己由来の間葉幹細胞によって治療される可能性がある。組織消失を治療する場合、消失した組織を置き換えるための移植に利用できる細胞数を増やすことが所望される。exvivo遺伝子療法のための細胞数を増加させるための手順も所望される。自己由来の幹細胞を使用する1つの有益性は、それらが同一のHLA一致を提供することができ、病態及び死亡に関連する免疫抑制療法の必要性が防止されることである。第2の有益性は、多能性細胞に関連する広範な細胞増殖の可能性である。多能性幹細胞は、分化決定誘導前の細胞数を顕著に増加することができる。分化決定誘導後、得られる始原幹細胞は、次いで、プログラムされた細胞老化が生じる前にさらに50~70細胞倍加増殖することができる。移植及び/又は遺伝子治療に利用できる組織数に限りがある場合、これらの2つの幹細胞集団の増殖特性は極めて重要である。これまで、始原幹細胞は、骨の部位特異的修復Kadiyalaら、1997に使用され、多能性間葉幹細胞は軟骨及び骨の部位特異的修復Grandeら、1995に使用されている。自己由来幹細胞療法が臨床的妥当性を有するためには、単離、発達、及び必要であれば細胞の個体への再導入の前の系統誘導にかかる時間が相対的に短いことが必要である。本発明者らの研究室の以前の研究ではHayflick限界50~70細胞倍加を超える発達か又は始原又は多能性細胞の個々の集団を単離するための限界連続希釈によるクローン化Rogersら、1995;Youngら、1993;Youngら、1998bを使用した。これらの技術は、単離ならびに/又は始原及び多能性細胞集団の完全分離に9箇月~2年を必要とする。本発明者らの現在の調査は、自己由来の始原及び多能性細胞の精製に必要な時間を減少することを目的とする。この目的のために、本発明者らは、男女の胎児、成体、及び老齢ヒトドナーからこれらの細胞を単離し、それらの細胞表面クラスター分化の特徴づけを始めた。本発明者らは今回、CD90の発現の実証ならびにヒト始原及び多能性間葉幹細胞における多様な量のCD34について初めて報告する。本発明者らは、これらの細胞表面CDマーカーは、最初の幹細胞回収物からより精製されたこれらの細胞の精製された集団を単離するための最初の工程として、フローサイトメトリー及び蛍光標示式細胞分取と共同で使用することができることを示唆する。本発明者らが想定した臨床アプリケーションは以下の通りである。組織欠損をしゅうふくするための選択術又は遺伝子療法の候補者を待機している患者が診療室にやってくる。少量の皮膚生検約5mm3を局所麻酔下で取り出し、輸送液中に置き、研究室に搬送する。そこで、組織を酵素的消化して幹細胞を遊離させ、細胞懸濁液を培養する。細胞が密集状態に達したら、それらを遊離させ、好ましい始原細胞及び多能性細胞を、それらの独特な細胞表面抗原プロフィールに対する抗体を使用して単離する。多能性細胞を発達させて細胞数を増加させ、好みの組織系統に決定するように誘導する。30日未満に、患者の自己由来幹細胞、本来の始原細胞及び多能性細胞所望の系統へ決定するように誘導されるが患者に移植される。遺伝子療法のためには、多能性細胞には、細胞発達の前に所望の遺伝子がトランスフェクトされる。このプロトコールは培養時間及び費用の両方を顕著に減少させる。また、特定の移植及び遺伝子両方に必要な幹細胞の収量が改善される。生後の哺乳類における多能性胚様幹細胞ES様細胞の保持分離した多能性幹細胞の中胚葉への分化能のキャラクタリゼーションを行う過程で、全く異なる非中胚葉性表現型の存在さえ示唆する異種形態を観察し、それに注目した。Youngら、1991,1992a;Lucasら、1995の記載に従って、凍結保存で単離したヒト細胞を10-7Mもしくは10-8Mのデキサメタゾン中で増殖させ、培養18日間後に、破骨細胞様細胞造血系列図31A及び神経細胞図31B及びCを観察した。同様に10-6Mのデキサメタゾン中で増殖させたマウス3T3細胞の場合は、マクロファージに似た大型細胞を培養9日後に観察した。ラット細胞は10-7Mのデキサメタゾン中で増殖させ、大型細胞を確認した。異種形態や性質や程度を評価するために、ヒトから分離した多能性幹細胞CF-NHDF2及びPAL3細胞をインスリンとデキサメタゾン中で最長45日間培養し、形態学的、免疫化学的、組織化学的解析を行った。本研究の本来の目的は、多能性の間葉幹細胞が出生後ヒトに存在するかを決定することである。36年齢雌性真皮と67年齢雄の骨格筋結合組織由来の成体ヒト細胞を、上記に記載の方法で分離した。前記細胞についての初期の形態学的研究から、上記細胞は小型細胞で、細胞質に対する細胞核の比率核/胞体比が大きいことがわかる図34A。上記の形態的な発現は、胚性幹細胞の形態と一致する。次に行われた免疫染色法から、個々の細胞が、段階特異的胚抗原ES抗原-1SSEA-1図34B、SSEA-3図34C、SSEA-4図34D、及びヒト特異的癌胎児性抗原HCEA及びCD66データ非表示を発現することが示された。前記の結果は、2つの細胞系には細胞表面に胚性抗原を持つ細胞が存在することを示唆している。インスリン及びデキサメタゾンを用いた比較バイオアッセイ又は対照バイオアッセイを行い、前記細胞を同定した。前記細胞をインスリンと培養した場合には、形態学的変化も抗原染色における変化も見られなかった。つまり、依然としてSSEA―1、SSEA-3、SSEA-4、HCEA,CD66データ非表示を発現する細胞が存在した。前記結果から、前記細胞は系統への分化決定済みの前駆細胞でないことが示唆された。デキサメタゾンによる培養では、胚性抗原染色の消失とともに外胚葉、中胚葉、内胚葉起源の細胞に対する表現型発現マーカーが出現した。このことは、前記細胞が系統非制限的幹細胞であることを示唆する。ネスチン図34Eニューロン図34F、ニューロフィラメント図34H、神経膠図34Iなどの神経系外胚葉発現マーカー及びケラチノサイトなどの外胚葉発現マーカー図34Jの導入によって、外胚葉系列マーカーを発現する細胞を同定した。ミオゲニン図34K、サルコメアミオシン、速筋型骨格筋ミオシン、ミオチン重鎖データ非表示骨格筋管図34L、平滑筋α―アクチンデータ非表示などの筋、中性飽和脂質、34Mなどの脂肪、11型コラーゲン図34N、IX型コラーゲン、コンドロイチンスルフェート、ケラタンサルフェイトプロテオグリカン含有小節データ非表示などの軟骨、骨サイアロンプロテイン-11図34O、オステオポンチン、リン酸カルシウム含有小節データ非表示などの骨、線維芽細胞データ非表示、PECAM図34P、VCA、E-セレクチン、ヒト特異的内皮細胞表面マーカー、CD34データ非表示などの内皮細胞の発現マーカーを導入することにより、中胚葉系マーカー発現細胞を同定した。α-フェトプロテイン図34Q及び胃腸内上皮図34Rの発現マーカーの導入により内胚葉系列マーカー発現細胞を同定した。ヘイフリックHayflickは、2倍体線維芽細胞線維芽細胞系統への分化決定済みの前駆細胞が、プログラム細胞老化及びプログラム細胞死を起こすまでに、約50回の細胞倍加を限度とする有限寿命を有すことを明らかにした。ゆえに50回の細胞倍加は、ヘイフリック限界Hayflick’sLimitと呼ばれる。系統への分化が決定されていない胚性細胞を使用している研究者らは、前記細胞が、ヘイフリック限界をはるかに超えて細胞分裂した後も、自己再生能力を維持することを明らかにした。上記の理由で、前記細胞系の増殖能力を調べた。上記の実験で、前記の細胞を多能性状態に保った。細胞の増殖と放出を行い、継代17代目NHDF2及び39代目PAL3を低温保存した。倍加時間は、平均12~24時間で、1継代につき約4倍加とした。ゆえに、NHDF2細胞は70回を超える細胞倍加を、PAL3細胞は200回を超える細胞倍加を経たことになる。実験群のうち一群は、細胞をクロラムフェニコールCM中のみで培養し、細胞を多能性状態に保った。上記実験において、細胞を30~56日間培養した。形態学的、免疫化学的、組織化学的解析により、前記の細胞が、胚性抗原に対する抗体で染色されることがわかる。第2実験群においては、細胞をインスリン含有のCM中で、30~56日間培養し、増殖させ続けることが、前記細胞の分化決定を誘導するか否かを判定した。これらの細胞が胚性抗原に対する抗体に同様の染色パターンを示すということが、形態学的、免疫化学的、及び組織化学的解析により示された。第3実験群では、細胞をデキサメタゾンCM中で30~56日間培養し、前記細胞を分化させた。分化誘導後、前記細胞は、外胚葉性細胞系、中胚葉性細胞系、及び内胚葉性細胞系の細胞特有の抗原を発現することが形態学的、免疫化学的、組織化学的解析により解明された。ヘイフリックの限界Hayflick’sLimitを超えて増殖した後も、前記細胞系は、胚性幹細胞と類似した特性を損失しないことがこれらの結果からはっきりとわかる。細胞は、上記のような処理後も、多能性特性異種胚性細胞に属する細胞に分化する能力を消失しなかった。細胞質に対して核の比率が大きいこと、肺性細胞表面抗原の発現、自己再生能力の維持、誘導分化と同時に胚性抗原の消失、外胚葉性、中胚葉性、内胚葉性の細胞系の表現型発現マーカーを現す分化細胞種の誘導、以上を根拠として考えると、これらの細胞系は多能性幹細胞の基準を満たす。これらの細胞の胚性抗原発現及び分化能は、マウス、霊長類、ヒトの内部細胞塊に由来する胚性細胞の属性と極めて類似している。上記の結果は、胚性細胞の特性と類似した特性を有する予備多能性幹細胞が成体ヒト内に存在することを示唆している。多核系を現す培養条件及び自然に収縮する分岐構造を、平板培養の日から表現型が発現するまで、酵素結合免疫培養検定法ELICAを用いて検定し、推定上の骨格筋細胞内に筋原性多能性マーカー、すなわち、サルコメアミオシンMF-20図32D、抗骨格速筋型ミオシンMY-30図32E、32F、ミオシン重鎖の存在を確認したYoungetal.1992a,b;Young,1999。細胞内線維を有する二核多角形細胞と単核多角形細胞が出現する培養物を、平滑筋α―アクチンIA4染色法でさらに評価した。二核多角形細胞図32Kのα―アクチン染色法では、心起源の表現型が示唆されるが、単核多角形細胞図32Lのα―アクチン染色法では、平滑筋細胞が暗示されるEisenbergandMarchland,1997。複合屈折小胞を現す培養物は、スダンブラックBSudanBlack―B図32M及びオイルレッドーOOilRed―O染色法でさらに評価し、推定上の肥満細胞内に中性飽和脂質の存在を確認したHumanson,1972Youngetal,1993,1995;Young,1999。細胞周囲のマトリックスハロー暈を有する円形細胞の集合体を発現する培養物を、免疫化学染色と組織化学染色の両方を用いてさらに調べた。推定上の軟骨形成性系統への分化決定済み細胞を、IX型コラーゲンD19図32P、11型コラーゲンHCII図32Oに対する抗体、及びコンドロイチンサルフェイトプロテオグリカンとケラタンサルフェイトプロテオグリカンの組織化学的染色、すなわち、pH1.0のアルシアンブルーAlcianBlueBlue,pH1.0図32Q及びpH1.0のサフラニンOSafranin-O,pH1.0で確認した。pH1.0のアルシアンブルー及びpH1.0のサフラニンOを、さらにコンドロイチナーゼ-AC、ICNBiomedicals,クリブランド,オハイオ州などのコンドロイチンサルフェイトプロテオグリカン特異的分解酵素とケラタンサルフェイトプロテオグリカンケラタナス、ICN特異的分解酵素を組み合わせて、推定上の軟骨細胞小節を取り囲む細胞外マトリック内で前記の特殊なプロテオグリカンの存在を確認したYoungetal.1989a,1992b,1993,1995;Young,1999。3次元マトリックス内もしくは3次元マトリックス上面、又は3次元マトリックス内とその上面の両方に包埋された細胞については、免疫化学的手法と組織化学的手法の両方を用いてさらに評価した。推定上の骨形成原細胞系統への分化決定済み細胞を、骨サイアロンプロテインWV1D1図32SとオステポンチンMP111図32Tに対する抗体に前処理試薬としてEGTAエチレングリコールビス[β―アミノエチルエーテル]N,N,N’,N’-テトラ酢酸、シグマを添加して、フォンコッサ染色SilberProtein,Chroma-Gesellschaft図32Uで検定して、推定上の石灰化したスピクラ内にリン酸カルシウムの存在を確認したYoungetal.,1989a,1992b,1993,1995。網目状の細胞過程を有する円形細胞群をつくる培養条件を、神経系前駆体細胞FORSE-1図33C、前記神経系前駆体幹細胞マーカーネスチンMAB353図33C、神経フィラメントRT-97図33D、ニューロン8A2図33Eなどのニューロン表現型に対する抗体を用いてさらに評価した。前記ヒト幹細胞が神経外胚葉起源の細胞を形成可能であることが、これらの抗体染色結果によって示された。α-フェトプロテインHAFP図33L、33Mに対するヒト特異的の抗体を用いて、肝臓内胚葉の分化決定を示唆する細胞内非屈折性細胞質小包を有する単核細胞及び二核細胞をさらに調べた。陽性染色は、多能性ヒト幹細胞が内胚葉起源の細胞を形成する潜在能力を有していることを示唆した。細胞質に対する核の比率の大きいこと、アルカリ性ホスファターゼの陽性染色、自己再生能力の維持、高いテロメラーゼ活性、及び骨格筋、平滑筋、心筋、脂肪細胞、軟骨、骨、内皮細胞、神経幹細胞、ニューロン、内胚葉に対する表現型表示マーカーを現す分化細胞種の誘導を根拠にして考慮すると、前期細胞は、多能性幹細胞の基準を満たす。さらに、マウス、霊長類、ヒトから採取した胎児性細胞の特性と非常に似ている。この結果から、ヒトをはじめとする出世後の動物が多能性胎児様細胞を維持していることが明らかになった。さらに、一連のヒト細胞系を用いて免疫化学的及び組織化学的に研究をした。36年齢雌性真皮由来のヒト細胞CF-NHDF2を12回から47回までの様々な回数の細胞倍加で増殖させ、上記記載のような、多誘導性中胚葉、外胚葉、内胚葉、胚性系統について評価した。ヒト細胞CM-SkM2及びCF-SkN2を、12回の細胞倍加まで増殖させた後、同様に評価した。結果を表12-16にまとめた。表12に、実験に用いた様々な免疫細胞化学及び免疫組織学のマーカーのリストを示す。表13~15に、様々な培養条件下で細胞倍加を行ったヒト細胞CF-NHDF2の実験結果を示す。表16に、異なる増殖条件下で細胞倍加を行ったヒト細胞CM-SkM2及びCF-SkM2の実験結果を示す。ヒト細胞における内胚葉性、外胚葉性、及び中胚葉性系統マーカーについての要約を表17に示す。上記の結果は、出生後の動物、特にヒトを起源とした肺性組織以外の多能性胚様細胞の存在と分離、内胚葉性、外胚葉性、中胚葉性の系統細胞への分化能を示す。[実験対象及び方法]分離及び増殖老人男性細胞は、PAL3と命名し、間葉幹細胞16,18を分離及び培養するための基準プロトコルに従って、67歳の被験者から採取した骨格筋標本から分離した。成体雌細胞は、36年齢ヒト真皮線維芽細胞NHDF2,catalogCC―0252,lot16280,Clonetics,サンディエゴ、カリフォルニアの亜密集的な混合培養物として購入した。到着後直ぐに、前記細胞を、10HS9ウマ血清、lot90H―0701,Sigma及び2U/mlADF抗分化因子、MorphoGenPharmaceuticals,Inc.ニューヨーク、ニューヨーク州を含有する調整培地CMに移した。CMは、89のv/vOpti―MEMGIBCO―BRL、0.01mMのβ―メルカプトエタノールSigma、セントルイス、ミズリー州、1v/vの抗真菌性の抗生物質溶液ペニシリン10,000units/ml、ストレプトマイシン10,000mg/ml、ファンギソンFungizoneとしてアンホテリシンB25mg/ml、GIBCO―BRLの組成からなり、pH7.4とした。細胞を、空気95、二酸化炭素5の給湿環境において増殖させて、トリプシン16で放出し、90mmと20mmのNitexフィルター19を通して篩分けした後、7.5V/VジメチルスルホキシドDMSO,MortonThiokol,デンバーズ、マサチューセッツ州20を含有する培地中で凍結保存した。さらに間葉幹細胞16、18の基準プロトコルに従って、両細胞群を増殖した。表現型の解析凍結保存した細胞を融解し、1ウェルにつき1×103細胞を1ゼラチン含有96穴ウェルの平板Cornig、コーニング、ニューヨーク州15,16に撒いた。前記細胞系を非誘導CMのみか、又はインスリンとデキサメタゾンの両方もしくはそのどちらか一方を添加したCMを使用して、比較又は対照分析システムで培養し、誘導された表現型発現7、15を確かめた。この測定法において、インスリンは、分化決定済み前駆細胞の表現型発現を促進するが、多能性幹細胞での分化決定やその後の表現型発現の誘導には影響がない。対照的に、デキサメタゾンは、多能性幹細胞での分化決定や表現型発現を誘導するが、前駆幹細胞の表現型発現を変えない。細胞はCMのみ、CM2mg/mlインスリン、CM10-6Mデキサメタゾン、CM10-6Mデキサメタゾンインスリンに、それぞれ1、5、10のウマ血清を加えた培地で30~56日間培養した。培地交換は、1週間に3度行った。表現型発現における変化を視覚的にとらえて1週間に2度検証した。これらの変化を、免疫化学及び組織化学的に解析した。免疫化学的解析製品の指示書又は記載に従って培養した。21胚性細胞、神経組織の外胚葉マーカー、表皮、筋肉の中胚葉マーカー、軟骨、骨、線維芽細胞、内皮性細胞、内胚葉性マーカーに特異的な下記の一次抗体で染色した。1胚性細胞:段階特異的胚性抗原―1[MC―480、発生生物学研究室ハイブリドーマバンクDevelopmentalStudiesHybridomaBank、アオイワシティ、アイオワ州、DSHB]、段階特異的胚性抗原―3[MC―631,DSHB]、段階特異的胚性抗原―4[MC―813-70,DSHB]、ヒト癌胎児性抗原[HCEA,Sigma]、癌胎児性抗原[CD66,VectorLaboratories,Inc.バーリンゲーム、カリフォルニア州];2神経組織の外胚葉マーカー:神経前駆細胞[FORSE―1,DSHB]、ネスチン-1[HNES、Chemicon、テメキュラ、カリフォルニア州]、ネスチン-2[Rat―401,DSHB]、ネスチン-3[MAB353,Chemicon]、ニューロン[8A2,DSHB]、ニューロンマーカー[S―100,Sigma]、神経膠[CNPase,Sigma]、ニューロフィラメント[RT97,DSHB]、ニューロフィラメント-200[N―200,Sigma]、表皮:ケラチノサイト[VM―1,DSHB];3筋の中胚葉マーカー:ミオゲニン[F5D,DSHB]、サルコメアミオシン[MF―20,DSHB]、速筋型骨格筋ミオシン[MY―32,Sigma]、ミオチン重鎖[ALD58,DSHB]、ミオシン強鎖[A4.74,DSHB]、平滑筋αアクチン[1A4,Sigma]、軟骨:11型コラーゲン[CIICI,DSHB]、11型コラーゲン[II―4CII,ICNBiomedicalsInc、オーロラ、オハイオ州]、IX型コラーゲン[D1―9,DSHB]、骨:骨サイアロンプロテイン-11[WV1D1,DSHB]、オステポンチン[MP111,DSHB]、線維芽細胞:ヒト線維芽細胞特異的タンパク質[1B10,Sigma]、内皮細胞:内皮細胞表面マーカー[P1H12,Accurate、ウェストベリー、ニューヨーク州]、PECAM[P2B1,DSHB]、VCAM[P8B1,DSHB]、E-セレクチン[P2H3,DSHB]、ヒト特異的CD34シアロムチン[HCD34];3内胚葉マーカー:ヒト特異的α-フェトプロテイン[HAFP,Vector]、ヒト特異的胃腸フェイステル上皮特異的抗原[HESA,Sigma]。二次抗体は、ビオチン抗羊IgG抗体[Vector]、もしくはビオチン抗マウスIgG抗体[Vector]からなるか、又はVecstatinABCKit[Vector]に含まれる。第三プローブは、VecstatinABCKit[Vector]に含まれるアビジン-HRPからなる。ペルオキシダーゼPeroxidase[blue,Vector]用の不溶性HRP培養基であるSubstrateKit、DABSubstrate、及びAECStainingKit[red,Sigma]を用いて、抗体結合を視覚化した。様々な色の培養基を使い、同じ培養ウェルで多種多様な染色を連続して実施可能にした。組織化学的解析上記に記載のように培養を続けた。15、22pH1.0のアルシアンブルー6,16,23を用い、軟骨の特性であるコンドロイチンサルフェイト及びケラタンサルフェイトプロテオグリカンを同定した。スダンブラックB及びオイルレッドーO染色法6、16,22,23を用い、脂肪細胞の特性である中性飽和脂質を同定した。フォンコッサ染色法6,16,23を用い、骨の特性であるリン酸カルシウムを同定した。拡大自己再生能力細胞は、継代17代目NHDF2及び39代目PAL3を各々経て、進行性の増殖16,20をした。NHDF2は70回を超える細胞倍加、PAL3は200回を超える細胞倍加をし、その平均倍加時間は12~24時間で、1世代あたり4~6倍加をした。上記のように、細胞を調べた。結果を前記に記載したように評価した。前記細胞系は、ヘイフリックの限界Hayflick’sLimitを超えて増殖後も、胚様細胞の同一性も、また誘導能力も消失しなかったことがこれらの結果から示唆される。以下の抗体は米国分子遺伝学研究室NICHDの支援による発生生物学研究室ハイブリドーマバンクtheDevelopmentalStudiesHybridomaBankから入手し、アイオワ大学生物科学部IowaCity,IA52242で保有している。:MC―480D.Solterにより開発、MC―631D.Solterにより開発、MC―813―70D.Solterにより開発、FORSE―1P.Pattersonにより開発、RAT-401S.Hockfieldにより開発、8A2V.Lemmonにより開発、RT97J.Woodにより開発、VM―1V.B.Morhennにより開発、F5DW.E.Wrightにより開発、MF―20D.A.Fischmanにより開発、ALD58D.A.Fischmanにより開発、A4.74H.Blauにより開発、CIIC1R.HolmdahlとK.Rubinにより開発、D1―9X.―J.YeとK.Teratoにより開発、WV1D1M.SolurshとA.Frazenにより開発、MP111M.SolurshとA.Frazenにより開発、P2B1E.A.WaynerとG.Vercellottiにより開発、P8B1E.A.WaynerとT.LeBienにより開発、P2H3E.A.WaynerとG.Vercellottiにより開発細胞の収集及び培養36年齢ヒト真皮線維芽細胞CF―NHDF2,catalogCC―2511,lot16280,Clonetics,サンディエゴ、カリフォルニアを亜密集的な培養物として女性成体真皮細胞を獲得した。到着後直ぐに、前記細胞を、平板培養CPM―Cに移した。PM―Cは、89v/vのOpti―MEM基底培養catalog22600―050,GIBCOからなり、その成分は0.01mMのβ―メルカプトエタノールSigma、10v/vウマ血清HS9,lotnumber90H―0701,Sigma、1の抗真菌性抗生物質溶液GIBCO、2U/mlADF抗分化因子、MorphoGenPharmaceuticals,Inc.ニューヨーク、ニューヨーク州で、pH7.4とした。細胞を、空気95/二酸化炭素5、37°Cの給湿性の部屋におき、1週間に3回培地を交換して、増殖させて融合状態にした。細胞をトリプシンで放出し、基準プロトコルに従って凍結保存した。凍結した細胞を融解し、PM-C培地内に播き、融合状態まで増殖させ、トリプシンで放出し、再び培地に置き、融合段階まで増殖させた。細胞を採取した。インスリンーデキサメタゾン分析及びフローサイトメトリ流動細胞光度測定法用に、細胞に継代番号を付けて収集した。形態学的解析以下の形態について、細胞を分析したのち培養物をスクリーニングした。:細胞質に対する細胞核の比率が大きい小星状細胞潜在的幹細胞、双極細胞潜在的筋芽細胞、紡錘細胞潜在的線維芽細胞、多核性直線細胞及び多核性分岐細胞潜在的骨格筋管、細胞内フィラメントを有する単核多角形細胞潜在的平滑筋細胞、細胞内フィラメントを有する二核多角形細胞潜在心筋細胞、屈折細胞内小疱を有する単核細胞潜在的脂肪細胞、細胞内小疱を持たない単核細胞潜在的内肺葉細胞、丸石型様表現型の単核シート状細胞潜在的内肺葉細胞、細胞周囲のマトリックスハロー暈を有する円形細胞潜在軟骨細胞、細胞周囲のマトリックスハロー暈を有する円形細胞の集合体潜在的軟骨小節、3次元マトリックスハロー暈を胞埋する円形集合細胞潜在骨小節、網目状の細胞過程を有する単核細胞潜在的ニューロン細胞組織化学的解析各製品の指示書もしくはYoungetal.1998bの記載に従って培養を行った。培養物は、胚マーカーアルカリ性ホスファターゼで以下のように染色した。軟骨コンドロイチンサルフェイトプリテオグリカン及びケラタンサルフェイトプリテオグリカンには、コンドロイチナーゼACICNBiomedicals,クリブランド、オハイオ州又はケラタナーゼICNBiomedicalsの分解と共にアルシアンブルーAlcianBlau8GS,Chroma―Gesellschaft,RobozSurgicalCo.とサフラニンOChromaGesellschaftをpH1.0として用い、細胞周囲と細胞外の両方又はそのどちらか一方のマトリックスにあるコンドロイチンサルフェイトグリコサミノグリカン又はケラタンサルフェイトグリコサミノグリカンの産生を検証した。脂肪細胞中性飽和脂質には、スダンブラックBRobozSurgicalCo.ワシントン市.及びオイルレッドOSigmaを用い、骨リン酸カルシウムに対しては、前処理としてのEGTAエチレングリコールビス[β―アミノエチルエーテル]N,N,N’,N’-テトラ酢酸、Sigmaと混合して、フォンコッサ染色SilberProtein,Chroma―Gesellschaftを用い、推定上の石灰化した骨のスピクラ内にリン酸カルシウムの産生を検証した。純アルシアンブルーPerf―ABはFisher―Aldrichから購入した。pH1.0のアルシアンブルーAB1.0とサフラニンOSO1.0とスダンブラックBSBBとフォンコッサvKは、Chroma―GesellschaftRobozから購入した。免疫化学的分析Youngetal.1992bの記載もしくは各製品の指示書に従って培養を行った。筋、軟骨、骨、内皮細胞の指標となる中胚葉マーカー、外胚葉マーカー、及び内胚葉マーカーのそれぞれに特異的抗体で培養物を以下のように染色した。中胚葉マーカー:筋ミオゲニン[F5D,発生生物学研究室ハイブリドーマバンク,DSHB]、サルコメアミオシン[MF―20,DSHB]、速筋型骨格筋ミオシン[MY―32,Sigma]、ミオチン重鎖[ALD―58,DSHB]、ミオシン強鎖[A4.74,DSHB]、平滑筋平滑筋αアクチン[1A4,Sigma]、軟骨11型コラーゲン[CIIC1,DSHB]とIX[D1―9,DSHB]、骨骨サイアロンプロテイン[WV1D1,DSHB]、オステオポンチン[MP111,DSHB]、内皮細胞内皮細胞表面マーカー[HEndo,Accurate];外胚葉マーカー:内皮細胞[151―Ig,DSHB]、神経前駆細胞[FORSE―1,DSHB]、ネスチン[RAT―401,DSHB]、ニューロフィラメント[RT97,DSHB]、ニューロン[8A二,DSHB];内胚葉マーカー:α-フェトプロテイン[HAFP,Chemicon]、上皮細胞[HA4cl9,DSHB]抗体抗体GAL―13、1A4、MY32、DE―U―10、HCEA、HESA、HFSP、CNPase、S―100、N―200、OROは、Sigmaから購入した。H―Endoは、AccurateScientificから購入した。HNESとMAB353はChemiconから購入した。HC―IIはICNから購入した。H―AFP、H―CD34、H―CD66、ALK―PHOSは、VectorLaboratoriesから購入した。MF―20はD.A.Fischmanによって、F5DはW.E.Wrightによって、WV1D1はM.SolurshとA.Frazenによって、MP111はM.SolurshとA.Frazenによって、CIIC1はR.HolmdahlとK.Rubinによって、D1―9はX.―J.YeとK.Teratoによって、FORSE―1はP.Pattersonによって、RT97はJ.Woodによって、8A2はV.Lemmonによって、RAT―401は、S.Hockfieldによってそれぞれ開発され、米国分子遺伝学研究室NICHDの支援で開発された発生生物学研究室ハイブリドーマバンクからすべて入手し、アイオワ市のアイオワ大学生物科学部TheUniversityofIowaDepartmentofBiologicalSciences,IowaCity,IA52242で保有し、MC―480、MC―631、MC―813-70はすべて認識胚性抗原であり、またすべて発生生物学研究室ハイブリドーマバンクから入手した。ALD―58、A4.74、P2B1、P8B1、P2H3、VM―1もまた発生生物学研究室ハイブリドーマバンクから入手した。分化特異的因子を伴う多能性細胞の刺激、検定及び分析拡大自己更新及び多系列分化の能力をもつ多能性幹細胞は、細胞分化、増殖及び分化に対する細胞の応答、又は細胞分化決定因子の研究のため及び、因子、作用物質又は化合物を同定し特徴づけする検定システム又は方法において及びいずれかのかかる因子、作用物質、化合物などをコードする遺伝子又は細胞の増殖、分化及び分化決定に関与する遺伝子を同定する上で、独特かつ有用な細胞供給源である。生物活性因子の効果始原幹細胞、始原幹細胞クローン及び多能性幹細胞クローンの混合個体群にアクセスできれば、これらの幹細胞の成長特性及び表現型発現に対するさまざまな生物活性因子例えば組換え型成長因子、精製化合物及び新規誘発因子の影響に取組むことが可能である。初期の研究では、我々は、これらの細胞を用いて14の生物活性因子を単独で及び組合わせた形でテストした表18。3つの一般的な活性カテゴリ増殖、分化決定及び分化発達が示された。BFは、刺激物質又は阻害物質効果のいずれかを生み出すことができた。効果は、全ての系列全体にわたり一般的であるか又は単数又は複数の特異的組織系列に制限されているかのいずれかであり得るものであった。内皮細胞成長因子は、使用された検定条件下で始原細胞又は多能性幹細胞のいずれかに対し測定可能な効果を全く示さなかった。血小板由来の成長因子-AAPDGF-AA及び血小板由来の成長因子-BBPDGF-BBは、多能性幹細胞において及び多能性幹細胞の全ての系列において増殖を刺激した。血小板由来の内皮細胞成長因子PDECGFは、使用された検定条件下で、始原細胞又は多能性幹細胞のいずれに対しても測定可能な効果を全く示さなかった。塩基性線維芽細胞成長因子b-FCF及び形質転換成長因子-β-TGF-βは、線維形成性始原細胞内で分化発達を刺激し、その他の全ての始原細胞内で分化発達を阻害し、多能性細胞内では全く効果がなかった。デキサメタゾンDexは、多能性幹細胞内で増殖を抑制し、多能性細胞内で一般的分化決定を刺激し、全ての始原細胞内で分化発達の弱い刺激物質として作用した。筋形態形成タンパク質MMPは、多能性細胞内では特異的筋原性分化決定作用物質として、筋原性始原細胞内では分化発達の弱い刺激物質として作用し、その他の系列に決定された始原細胞に対しては全く効果をもたなかった。骨形態形成タンパク質-2BMP-2は、多能性細胞内では特異的軟骨形成分化決定作用物質として、又軟骨形成始原細胞内では分化発達の弱い刺激物質として作用し、その他の系列に決定された始原細胞に対しては全く効果をもたなかった。ウシ胎児血清FCSAtlanticBiologicals、ロット3000L内に存在し我々が同定した線維芽細胞形態形成タンパク質FMPは、多能性細胞内では特異的線維形成分化決定作用物質として、線維形成始原細胞内では分化発達の刺激物質として作用し、その他の系列に決定された始原細胞に対しては全く効果をもたなかった。瘢痕阻害因子SIFは、多能性細胞に対するFMPの分化決定活性の特異的阻害物質として、又線維形成始原細胞内では進行に対するFMPの分化発達活性の特異的阻害物質として作用し、その他の系列についての系列誘発又は分化発達に対しては全く効果をもたなかった。抗分化因子ADFは、多能性細胞に対する分化決定活性の一般的阻害物質及びPCに対する分化発達活性の一般的阻害物質として作用した。インシュリン、インシュリン様成長因子-IIGF-I及びインシュリン様成長因子-IIIGF-IIは、全ての始原細胞内で分化発達を刺激したが、多能性細胞に対する測定可能な効果は全くなかった。成長因子-β及び塩基性線維芽成長因子は、線維形成始原細胞内で分化発達を刺激し、その他の全ての始原細胞内で分化発達を阻害し、多能性細胞に対しては全く効果をもたない。発現されたmRNAのノーザン分析我々は、マウス多能性幹細胞クローン内でのMMPによる筋形成の誘発を検査するためにノーザンブロット分析を使用した。我々は同様に、ヒト間葉幹細胞内でのCDマーカー転写を検査するためにもこの技術を使用した。MMPは、出生前マウス多能性幹細胞クローンであるSwiss-XYP-7内でのマイオジェニン及びMyoD1遺伝子の発現のためmRNAの転写を誘発したRogersら、1995;Youngら、1998a。ノーザンブロット分析は同様に、アミノペプチダーゼCD13、神経細胞付着分子CD56、及びThy-1CD90が、出生前及び出生後の両方のヒト間葉幹細胞内で細胞収獲時点で活発に転写されていることを示した先行例を参照のこと。既知の又は未知の遺伝子の発現を検査するためMRNAなどを通して、又は、多能性幹細胞、それに由来する細胞又は既知の又は未知の生物活性因子に対する露呈後のいずれかのかかる細胞の中で発現された遺伝子のcDNAライブラリ又は示差的表示を生成するために、類似のかかる研究を利用することも可能である。細胞又は系列の特徴づけ特定の細胞型を特徴づけし同定する上で、組織学的、機能的、免疫学的及び発現例えばmRNA発現など分析の組合せを利用することができる。例えば、特定の増殖、分化決定又は分化発達能力に関する既知の又は未知の生物活性因子を特徴づけするにあたっては、多能性胚種様幹細胞の固有の能力を特徴づけする上での先行例に示された特徴づけと同様に、これらの分析を利用することができる。表19は、細胞型を特徴づけする上で利用可能と思われる組織学的、免疫学的及びcDNAプローブのマーカーの一覧表を提供している。[材料及び方法]材料及び方法は、以下に記す場合を除き、上述の通りである。幹細胞の分離、クローニング及び発現始原細胞及び多能性幹細胞を分離するため、結合組織を含む標本を無菌状態で収獲し、付加的な2倍の抗生物質-抗真菌性溶液を含む間葉幹細胞-1内で無菌フードまで輸送したLucasら、1995。間葉幹細胞培地は、89v/vの培地Earleの塩を伴うイーグル最小必須培養液、EMEMGIBCO,GrandIsland,NYYoungら、1991又は、0.01mMのβ-メルカプトエタノールを含むOpti-MEMGIBCOSigmaChemicalCo.,St.,Louis,MOYoungら、1998c,eとそれに追加された10の血清HS7ロット番号17F-0218、Sigma、HS4ロット番号49F-0082、Sigma、HS3ロット3M0338、Bio-Whittaker,Walkersville,MDYoungら、1998eといったような予備選択されたウマ血清、又は2U/mlの抗分化因子を含む任意の非選択血清ADF,MorphogenPharmaceuticals,Inc.,NewYork,NYYoungら、1998c,e、1の抗生物質-抗真菌性溶液10,000単位/mlのペニシリン、10,000μg/mlのストレプトマイシン及びFungizon、GIBCOといったような25μg/mlのアンフォテリシンBLucasら、1995、pH7.4から成る。組織標本を10mlの間葉幹細胞-1中に置き、入念に細かく切り刻む。切り刻んだ後、組織懸濁液を20分間50×gで遠心分離に付す。上清を廃棄し、細胞ペレットの体積について見積りを行なう。細胞ペレットを、7ペレット体積のEMEM又はOpti-MEM0.01mMのβ-メルカプトエタノール及び2ペレット体積のコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液の中で再懸濁させて、酵素作用により細胞を放出させるLucasら、1995。コラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液は、100mlのディスパーゼ溶液CollaborativeResearch,Bedford,MAに添加した50mlのEMEM又はOpti-MEM0.01mMのβメルカプトエタノール中の37,500単位のコラゼナーゼCLS-1、WorthingtonBiochemicalCorp.,Freehold,NJから成る。最終的に得られた濃度は、250単位/mlのコラゲナーゼと、33.3単位/mlのディスパーゼであったYoungら、1992。結果として得られた懸濁液を37°Cで1時間撹拌して細胞を分散させ、300×gで20分間遠心分離させる。上清を廃棄し、組織ペレットを20mlの間葉幹細胞-1内で再懸濁させるLucasら、1995。細胞を90μm及び20μmのNitexを通してふるいがけし、単一の細胞懸濁液を得るYoungら、1991。細胞懸濁液を10分間150×gで遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを10mlの間葉幹細胞-1内で再懸濁させるLucasら、1995。細胞生存度をトリパンブルー排除検定により決定するYoungら、1991。細胞を、1のゼラチンで被覆されたEMSciences,Gibbstown,NJ100mm培養皿Falcon,Becton-DickinsonLabware,FranklinLakes,NJ又はT-75培養フラスコFalconあたり細胞105個の割合で播種する。95空気/5CO2の加湿された環境の中で37°Cで密集性に至るまで、細胞培養を増殖させる。密集状態になった時点で、細胞をトリプシンで放出させ、凍結保存する。-70°C~-80°Cの最終温度が達成されるまで7.5v/vのジメチルスルフォキシドDMSO,MortonThiokol,Danvers,MAを含有する間葉幹細胞-1中で細胞低速凍結させる毎分1度の温度降下Youngら、1991。表現型発現のためのインシュリン-デキサメタゾン分析凍結保存した細胞を融解し、標準的プロトコルに従ってゼラチンで被覆された24ウェルの平板のウェル1個あたり5、10又は20×103個の細胞の割合で、間葉幹細胞-1内で平板固定する。初期平板固定から24時間後に、培地をテスト用培地TM1~6TM-1、TM-2、TM-3、TM-4、TM-5又はTM-6へと変更する。TM-1~TM-4は、Ultracultureカタログ番号12~725B、ロット番号、OMO455TM-1、1M1724TM-2、2M0420TM-3又は2M0274TM-4、Bio-Whittaker,Walkersville,MD、培地EMEM又はOpti-MEM0.01mMβ-メルカプトエタノール及び1のv/v抗生物質-抗真菌物質、pH7.4から成る。TM-5は、98v/vの培地、1v/vHS及び1v/v抗生物質-抗真菌物質、pH7.4から成る。TM-6は、98.5v/vの培地、0.5v/vのHS及び1v/vの抗生物質-抗真菌物質、pH7.4から成る。Ultraculture:培地EMEM又はOpti-MEM0.01mMのβ-メルカプトエタノール:抗生物質抗真菌物質を複数の比率で含むテスト用培地は、最低30日最高120日の培養期間について定常状態条件下で始原細胞及び多能性細胞の両方を維持した。さまざまな濃度のUltracultureを各々含む4つのテスト用培地TM’s1~4を使用した。各テスト用培地中に存在するUltraculture対培地対抗生物質の比率は、鳥の始原細胞及び多能性細胞の両方の個体群の中で定常状態条件を維持するその能力に基づいて、各々のUltracultureロットについて経験的に決定された。4つのUltracultureベースのテスト用培地は、以下の通りであった:TM-1=15v/vUltracultureロット番号OMO455;84v/v培地;1v/v抗生物質;TM-2=15v/vUltracultureロット番号1M1724;84v/v培地;1v/v抗生物質;TM-3=50v/vUltracultureロット番号.2M0420;49v/v培地;1v/v抗生物質;及びTM-4=75v/vUltracultureロット番号2M0274;24v/v培地;1v/v抗生物質。間葉幹細胞-1培地中のあらゆる潜在的共力成分を洗い出すために、テスト用培地単独の中での24時間の予備インキュベーションを使用する。24時間後に、テスト用培地を次のもののうちの1つに変更する。対照として、TM-1~TM-6が単独で用いられる。始原細胞のクローンを同定するためには、始原細胞内の表現型発現マーカーの出現を加速する作用物質である2μg/mlのインシュリンSigmaを含むTM-1~TM-6で培地を置換する表18。多能性細胞のクローンを同定するためには、一般的な非特異的系列誘発作用物質である10-10~10-6MのテキサメタゾンSigmaを含むTM-1~TM-6で培地を置換する表19。対照及び処理対象培地は、一日置きに培地を変更して、さらに30~45日間増殖させる。実験一回、濃度1つあたり4つの培養ウェルを使用する。0~45日の期間中、培養を毎日のベースで形態的特徴の変化について主観的に検査する。表現型発現の改変は処理日数及び付随するインシュリン又はデキサメタゾン濃度と相関される。その後、立証された組織学的、機能的/組織化学的、ELICA/フローサイトメトリ、及び分子検定を用いて表現型発現マーカーを客観的に確認するためこれらのパラメータを利用して、実験を反復する表19。以下に記すのは、上述の実施例1~10中で言及されている参考文献のアルファベット順のリストである。リストアップされた参考文献ならびにその他の出版物の開示、本書で挙げた特許開示又は文書は全て、本書中にその全体が参考として内含されている。[参考文献]クローン原生分析が、出生後の動物中の予備多能性原外胚葉様幹細胞を明らかにする[概要]階段希釈クローン原生分析を用いた以前の研究が、出生後のラット骨格筋に付随する結合組織から分離された予備多能性間葉幹細胞PPMSCのクローン個体群の存在を報告した。同様に階段希釈クローン原生分析を用いる現行の研究は、多能性幹細胞のもう1つのクローン個体群の存在を報告している。これら2つのクローン細胞系統間の比較分析は、類似性と差異を実証している。インシュリン/デキサメタゾン生物検定によって見極められるように、両方のクローン細胞系統共、系列が決定されていない。両方のクローン細胞系統共、外因性作用物質によって活性化されないかぎり血清を含まない培地内で静止状態にとどまる。そして両方のクローン細胞系統共、Hayflickの限界を超えて拡大自己更新能力をもつ。PPMSCクローンは、密集状態で接触阻害される。これとは対照的に、本書に報告されているクローンは接触制限されておらず、密集状態を超えて増殖し続けることになる。両方のクローン細胞系統は共に中胚葉由来の細胞すなわち骨格筋、平滑筋、脂肪、軟骨、骨を形成することになるが、一方本書で報告されるクローンは同様に、外胚葉由来すなわち神経幹細胞、神経細胞及び内胚葉由来すなわち肝細胞の細胞をも形成する。3つの一次胚葉から細胞を形成するその潜在能のため、我々はこの出生後ラットクローンを多能性原外胚葉様予備幹細胞と呼称した。この研究は、出生後の哺乳動物の体内の胚様予備幹細胞の保持及び、身体組織の正常な維持、修復及び再生におけるそれらの潜在的関与を示唆している。[序]胚幹細胞は、ヒトを含む霊長類とげっ歯類の尾胞、内部細胞塊及び生殖腺隆線内で同定されたEvansら、1981;Martin,1981;Thomsonら、1995,1998;Shamblottら、1998;Gearhartら、1999。分離の後、これらの未分化細胞は、胚幹細胞抗原、陽性アルカリホスファターゼ染色、拡大自己更新能力及びテロメラーゼ活性についての免疫学的マーカーを発現する。invitroでの発現が許された時点で、これらの細胞は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉由来の組織についての免疫学的マーカーを発現するThomsonら、1995,1998;Shamblottら、1998;Gearhartら、,1999。しかしながら、invivoで移植された時点で、胚幹細胞は、自然発生的奇形腫を形成するThomsonら、1998;Grearhartら、1999。これらの独特の性質のため、胚幹細胞は、組織移植のためのドナー細胞の供給源として提案されてきたThomsonら、1995,1998;Shamblottら、1998;Gearhartら、1999。現行のクローン原生研究は、多能性幹細胞のクローン個体群が出生後の哺乳動物の結合組織内に存在するか否かを見極めるため、そしてそれらの機能的能力を検査するために着手された。我々は以前に、出生後のラットの骨格筋に付随する結合組織から分離された多能性間葉幹細胞PPMSCクローン個体群すなわちClone-A2A2の存在について報告したYoungら、2000a。PPMSCクローン系統は、分化未決定であり、外因性作用物質により活性化されないかぎり無血清培地内で静止状態にとどまり、自己更新のための拡大した能力を有し、密集状態で接触阻害され、中胚葉系列すなわち筋肉、脂肪、軟骨及び骨からの組織のみを形成した。現行の研究は、出生後ラット結合組織由来の多能性幹細胞の第2のクローン個体群の存在を報告している。このクローン細胞系統は同様に分化未決定であり、無血清培地内で静止状態にとどまるはずであり、アルカリホスファターゼ及びテロメラーゼ活性の両方を発現し、拡大した自己更新能力を有し、独自の分化能力を有する。[材料及び方法]出生後ラット結合組織由来の幹細胞出生後Spragne-Dawleyラットからの骨格筋を、単核細胞の分離、平板固定、密集状態までの増殖、トリプシン放出及び凍結保存のために処理したYoungら、.2000a。細胞を反復的に融解し、50の細胞倍加に達するまで膨張させたYoungら、1991,1993,1998b;Young2000。個々のクローンは、階段希釈クローン原生分析によって生成されたYoungら、2000a。各回のクローニングは、約20の細胞倍加という結果をもたらした。かくして、4回のクローニングは、結果として得られたクローンの中で約80の細胞倍加をもたらした。結果としてのクローンを増殖させ、トリプシンで放出させ、アリコートにし、凍結保存したYoungら、1993,1998a,2000a;Rogersら、1995。本書で報告したクローンをラット-A2B2と呼称し、130の細胞倍加の後、多能性について徹底的に検査した。分化能力についてのインシュリン-デキサメタゾン分析分化決定された始原幹細胞又は分化未決定な多能性幹細胞のいずれかとしてのその同一性を見極めるために、無血清培地及びインシュリン及びデキサメタゾンを含有する無血清培地を用いて、ラット-A2B2を検査した。インシュリン、インシュリン様成長因子-I及びインシュリン様成長因子-IIといったような進行因子は、始原細胞内で表現型発現を加速するが、多能性幹細胞内の表現型発現の誘発に対しいかなる効果をもたない。Youngら、1993,1998b;Young,2000。これとは対照的に、デキサメタゾン、骨形態形成タンパク質-2及び筋形態形成タンパク質といったような系列誘発作用物質は、分化決定及び多能性細胞内での発現を誘発するが、始原細胞内での表現型発現は改変させないYoungら、1993,1998a,b,1999,2000a;Young2000。従って、培養中に始原細胞が単独で存在する場合、デキサメタゾンでインキュベートされたものに比べて、インシュリン内でインキュベートされた培養について、発現された表現型の差異は全く存在しないことになる。培養が始原細胞及び多能性細胞の両方を含んで混合された場合には、インシュリンで処理されたものに比べデキサメタゾンで処理された培養中には、発現された表現型により大きな変動が存在することになる。培養が多能性細胞を単独で含有する場合、インシュリン処理された培養中には、発現された表現型が全く存在しなくなる。デキサメタゾンで処理された類似の培養は、多数の表現型の発現を示すことになる。かくして、デキサメタゾンとインシュリンの処理の効果を比較することによって、未知の細胞個体群の中の特定のタイプの始原細胞及び多能性細胞同定することができるYoungら、1992,1995;Lucasら、1993,1995;Pateら、1993;Rogersら、1995;Warejckaら、1996。ラット-A2B2クローン細胞系統を、完全培地内で平板固定しYoungら、2000a,24時間付着させ、24時間無血清テスト用培地に移して完全培地内の何らかの潜在的共力成分を洗い出し、その後、テスト用培地を単独で使用した。始原幹細胞を同定するため、テトス用培地に2mg/mlのインシュリンSigma,St.Louis,MOを添加した。多能性幹細胞を同定するため、テスト用培地に対し10-10から10-6MのデキサメタゾンSigmaを添加した。多能性幹細胞をさらに同定するため、2mg/mlのインシュリン及び10-6Mのデキサメタゾンを含むテスト用培地に対し、多数の誘発作用物質を含有するものとして知られている選択された血清Youngら、1998a,bを添加した。使用した選択された血清はHS990H-0701,Sigma及びHS10MorphoGenPharmaceuticals,Inc.,SanDiego,CAであった。対照及び処理済み培養を、一日おきに培地を変更して、さらに30~45日間増殖させた。1回の実験、濃度1つにつき3~6個の培養ウェルを使用した。30~45日の期間中、細胞の形態の主観的分析を用いて、培養を毎日検査した。この研究で指摘された形態的変化は、以前の研究からの徹底的な検査に基づくものであったYoungら、1991,1992a,b,1993,1995,1998a,b,1999,2000a,b;Young,2000。表現型発現の改変以下参照を、処理日数及び利用された外因性作用物質の濃度と相関させた。その後、以前に実証された組織化学及び免疫化学的手順を用いて、表現型発現についてさまざまな立証済みマーカーの存在を客観的に確認するため、これらのパラメータを用いて実験をくり返した精査、Youngら、1992b,1998a,b,1999,2000a,Young,2000。培養をメーカーの指示に従ってか又は記述通りに処理したYoungら、1992b,2000a。細胞は、NikonTMS、倒立位相差/明視野顕微鏡を用いて撮影した。形態学的、組織化学的及び免疫細胞化学的分析中胚葉表現型についての我々の標準的な形態学的生物検定Youngら、1998a,b,1999,2000a;Young,2000は、外胚葉及び内胚葉系列に属する潜在的な分化した細胞型を内含するように増強された。検定全体を通して以下の形態について、培養をスクリーニングした。推定上の胚様幹細胞を、その相対的に小さいサイズ及びその大きい核対細胞質比により試験的に同定した。アルカリホスファターゼVectorLaboratory組織化学を用いて、確認を達成した。多数の細かいクモ状細胞プロセスを用いて単核細胞として、推定上の神経細胞を試験的に同定した。神経外胚葉系列の表現型マーカーに特定的な抗体を用いて、免疫化学的染色により、神経細胞関連細胞型を確認した。これらの抗体は、神経細胞前駆体細胞[FORSE-1、DSHBToleら、1995a,b]ネスチン[RAT-401、DSHBHockfield及びMckay,1985]、神経フィラメント[RT97,DSHBWood及びAnderton,1981]、神経細胞[8A2,DSHBDrazbaら、1991]、及び乏突起膠細胞Rip,DSHB]に特徴的なエピトープを染色した。上皮関連細胞型を、上皮成長因子レセプタ151-Ig,DSHBについて免疫化学的に染色することによって確認した。推定上の筋芽細胞を、単核双極形状細胞として試験的に同定した。筋芽細胞表現型を、マイオジェニンについての抗体を用いて確認したF5D、DSHBWrightら、,1991。推定上の骨格筋管を、多核性線状及び有枝細胞として試験的に同定した。骨格筋表現型は、筋節ミオシン[MF-20、DSHBBaderら、1982]、速-骨格筋ミオシン[MY-32,SigmaNaumannandPette,1994]、ミオシン重鎖[ALD-58、DSHBShafiqら、1984]、及びミオシン高速鎖[A4、74、DSHBWebsterら、1988]についての抗体染色により確認した。細胞内フィラメントを伴う単核多角形細胞として、推定上の平滑筋細胞を試験的に同定した。平滑筋アルファアクチンについての抗体染色により、平滑筋表現型を確認した[1A4、SigmaSkalliら、1986].推定上の脂肪細胞を、細胞内屈折小胞を伴う単核細胞として、試験的に同定した。脂肪細胞は、スーダンブラック-BChroma-Gesellschaft,RobozSurgicalCo,Washington,DC及びオイルレッド-OSigmaYoungら、1998a,b,1999,2000a;Young2000での組織化学的染色を介して飽和した中性脂質含有細胞内小胞の存在によって確認された。細胞周囲のマトリクスのカサを含む丸くなった細胞の凝塊として、推定上の軟骨小結節を試験的に同定した。軟骨小結節は、組織化学染色及び免疫化学染色の両方によって確認された。組織化学的には、細胞周囲及び/又は細胞外マトリクス内のコンドロイチン硫酸及びケラチン硫酸を伴うグリコサミノグリカン側を含むプロテオグリカンを染色することによって、軟骨小結節を視覚化した。これは、pH1.0でアルシアンブルーAlcianBlau8GS,Chroma-Gesellschaft,RobozSurgicalCo.又はサフラニン-OChroma-Gesellschaftを用いて達成された。細胞外マトリクス内にある軟骨に特異的なグリコサミノグリカンの検証は、コンドロイチナーゼ-ACICNBiomedicals,Cleveland,OH及びケラチナーゼICNBiomedicalsでの材料の消化の後の染色の喪失によって確かめられたYoungら、1989a,b,1993,1998a,b,1999,2000a;Young2000。免疫化学的には、軟骨形成表現型は、II型コラーゲン[CIIC1,DSHBHolmdahlら、1986]及びIX型コラーゲン[D1-9,DSHBYeら、1991]に対する抗体についての、まずは細胞内そしてそれに続いて細胞外の染色によって確認された。密な3次元マトリクスが重ね合わされた丸くなった細胞の凝塊として、推定上の骨小結節を試験的に同定した。骨小結節は、組織化学的及び免疫化学的染色の両方により確認された。組織化学的には、vonKossaSilberProtein,Chroma-Gesellschaft手順を用いてリン酸カルシウムについての細胞外マトリクスの陽性染色により、骨形成原表現型を検証した。細胞外マトリクス内のリン酸カルシウムの存在の検証は、EGTAエチレングリコール-ビス-[b-アミノエチルエーテルN,N,N′,N′-四酢酸、Sigma、特異的カルシウムキレート化剤Youngら、1998a,b,1999,2000a;Young,2000での予備処理後のvonKossa手順による陽性染色の消滅により確認された。免疫細胞化学的には、骨形成原表現型は、骨シャロタンパク[WV1D1,DSHBKasugaiら、1992]及びオステオポンテン[MP111,DSHBGorskiら、1990]に対する抗体にについての、まずは細胞内そしてその後細胞外の染色により確認された。非屈折材料を含む細胞内小胞を伴う単核細胞として、推定上の肝細胞を試験的に同定した。アルファフェトプロテイン[RAFP,ChemiconMujooら、1983]についての抗体染色により、肝細胞表現型を確認した。最後に、分化されたラット細胞の特徴であるラット特異的主要組織適合性複合体-ILRMHC-I,ChemiconRubinら、1984;PrabhalaandWira,1995]についても、培養を染色した。2次抗体は、VecstatinABCキットVector内に収納されたビオチニル化抗ヒツジIgGVector、ビオチニル化抗マウスIgGVectorLaboratory,City,Stateで構成されていた。三次プローブは、VecstatinABCキットVector内に収納されたアビジン-HRPで構成されていた。抗体結合を視覚化するために、ペルオキシダーゼのための不溶性HRP基質VIP基質キット青、Vector、ペルオキシダーゼのためのDAB基質黒、Vector及びAEC染色キット赤、Sigmaを使用した。同じ培養ウェルの多数の逐次的染色を可能にするため、異なる色のついた基質を利用した。抗体P.Pattersonにより開発されたFORSE-1,S.Hockfieldにより開発されたRAT-401,J.Woodにより開発されたRT-97,V.Lemmonにより開発された8A2,S.Hockfieldにより開発されたRip,A.Hubbardにより開発された151-Ig,W.E.Wrightにより開発されたF5D,D.A.Fischmanにより開発されたMF-20,D.A.Fishmanにより開発されたALD-58,H.M.Blauにより開発されたA.4.74,R.Holmdahl及びK.Rubinにより開発されたCIIC1,X.-J.Ye及びK.Teratoにより開発されたD1-9,M.Solursh及びA.Frazenにより開発されたWVID1及びM.Sooursh及びA.Frazenにより開発されたMP111といった抗体を、NICHDの賛助の下で開発されたDevelopmentalStudiesHybridomaBankから入手し、アイオワ大学生物学部、IowaCity,IA52242により維持した。拡大自己更新能力130の細胞倍加から出発して、ラット-A2B2クローンを融解し、ゼラチンで被覆されたT-25フラスコ1本あたり100×103細胞の割合で平板固定した。細胞を、密集後状態7~8日まで増殖させ、トリプシンで放出させたYoungら、.1999,2000a。細胞数は、フラスコ1本につき5~6.5×106細胞又は一継代あたり5~6細胞倍加の範囲内にあった。倍加時間は平均18~24時間であった。細胞を約1~11×106細胞/mlでアリコートにし、凍結保存した。密集を超えた増殖、トリプシンでの放出及び凍結保存の手順をさらに12継代、つまりクローニング後68の細胞倍加全体を通して反復した。こうして130の細胞倍加開始数と合わさって、198の細胞倍加を受けた細胞クローンが結果としてもたらされた。130~198細胞倍加の各継代間隔で、細胞アリコートを、インシュリン及びデキサメタゾンと共に30~45日間インキュベートし、形態学的、組織化学的及び免疫化学的に検査した。テロメラーゼ検定。198の細胞倍加でラット-A2B2をテロメラーゼ活性について検定した。細胞を融解し、ゼラチンで被覆されたT-75フラスコ1本あたり100~103細胞の割合で平板固定し、密集状態を超えて成長させた。トリプシリ放出により細胞を収獲しYoungら、,1999,Telomerase検出キットQiagenkit内にメーカーが記述したとおりに、テロメラーゼ活性のため細胞を処理した。[結果]分化能力当初の130細胞倍加及び膨張した130~198の細胞倍加比較/対比分析システムの両方において、インシュリン、テキサメタゾン及び/又は選択された血清でのインキュベーションの前後に、ラット-A2B2クローン細胞系統を分析した。平板固定から24時間後の培養の観察は、クローンA2A2PPMSC細胞系統の細胞サイズの約1/4~1/2の非常に小さな細胞を明らかにした。これらのさらに小さな細胞は、大きい核対細胞質比を表わした。6週間の無血清テスト用培地内でのラット-A2B2クローンのインキュベーションは、細胞数の顕著な増大を結果としてもたらさず、平板固定から24時間後の細胞と同等の形態をもたらした。ラット-A2B2クローンを6週間インシュリンを伴うテスト用培地内でインキュベートした結果、接触阻害の喪失を実証する特徴の無い細胞の多重層がもたらされた。この多重細胞層は、アルカリホスファターゼ活性についての陽性の染色を実証した表20。これとは対照的に、デキサメタゾンを伴うテスト用培地、デキサメタゾンインシュリンを伴うテスト用培地又はデキサメタゾンインシュリン選択された血清を伴うテスト用培地内でのラット-A2B2のインキュベーションは、アルカリホスファターゼ染色の喪失、ただし分化した表現型の発現、を結果としてもたらした。外胚葉、中胚葉及び内胚葉系列のためのマーカーを示す細胞が観察された。例えば、外胚葉系列マーカーを表示する細胞は、神経前駆体細胞、ネスチン、神経フィラメント、神経細胞、乏突起膠細胞及び上皮成長因子レセプタについての抗体を用いて同定された。中胚葉系列マーカーを表示する細胞は、筋原性系列についてはマイオジェニン、筋節ミオシン、速骨格筋ミオシン、ミオシン重鎖、ミオシン高速鎖及び平滑筋アクチン;脂肪細胞については飽和中性脂質;軟骨形成系列については硫酸化プロテオグリカンを含むII型コラーゲン、IX型コラーゲン及び軟質小結節;及び骨形性原系列については骨シャロタンパク、オステオポンチン及びリン酸カルシウムを含有する骨小結節についての抗体又は組織化学染色を用いて、同定された。内胚葉系列マーカーを表示する細胞は、肝細胞についての抗体を用いて同定された。外胚葉、中胚葉及び内胚葉系列細胞型を惹起する全ての処理は、分化された細胞としてそれらを識別するラット特異的主要組織適合性複合体-IRMHC-Iエピトープを誘発した表7。拡大自己更新その多能性状態を維持しながらの拡大自己更新のための能力を決定するべく、130の細胞倍加後の12の継代の各々において、ラット-A2B2を検定した。各継代の後、ラット-A2B2クローンを、インシュリン/デキサメタゾン生物検定において、上述のとおり処理した。結果は、検定した全ての継代レベルにおいて同等で識別不能であった。テロメラーゼ活性テロメラーゼ活性の有無について198の細胞倍加でラット-A2B2を検定した。図2に示されているように、テロメラーゼ活性は、この198の細胞倍加数で、幹細胞内に比較的高レベルで存在していた。[考察]出生後の多能性幹細胞出生後のラットの骨格筋に付随する結合組織から分離された細胞の段階希釈クローン原生分析は、多数のクローンを生成した。この研究では、ラット-A2B2と呼称された1つのクローンが検査された。ラット-A2B2は、インシュリンを伴う又は伴わない長期インキュベーションに続く星状形態の改変を示さなかった表20。無血清培地又はインシュリンのいずれに対しても応答が欠如していたことは、このクローンが分化決定された始原幹細胞でないことを示唆していたYoungら、1998a,b,1999,2000a;Young,2000。これとは対照的に、これらの細胞によるアルカリホスファターゼ活性の発現は、これらの細胞が、胚幹細胞と一部の属性を共有していることを示唆していたThomasら、1998;Gearhartら、1999。実際、インシュリン及び選択された血清を伴う又は伴わない状態でのデキサメタゾンとのインキュベーションは、表現型発現の改変を惹起した表20。これらの結果は、このクローンが、或る形の分化未決定な多能性幹細胞であることを示唆していた。中胚葉分化細胞型のみを実証したPPMSCクローン-A2A2Youngら、2000aとは対照的に、ラット-A2B2で指摘された表現型改変は3つの一次胚葉全て、すなわち外胚葉、中胚葉及び内胚葉について示された表20。指摘された表現型改変には、神経前駆体細胞、ネスチン、神経フィラメント、神経細胞、乏突起膠細胞、上皮成長因子レセプタ、筋芽細胞、骨格筋、平滑筋、脂肪細胞、軟骨、骨及び肝細胞の出現が含まれていた。外胚葉、中胚葉、及び内胚葉系列細胞型を惹起する全ての処理は、同様に、分化された細胞を同定するラット特異的主要組織適合性複合体-IRMHC-Iエピトープをも誘発した表20。拡大自己更新についてクローンテストした時点で、我々は、その分化潜在能力の偏差を全く認識しなかった。最後に、198の細胞倍加で、ラット-A2B2はテロメラーゼ活性を実証した。そのアルカリホスファターゼ活性の発現、拡大自己更新潜在能力、テロメラーゼ活性の発現及び3つの一次胚葉全てから分化された細胞を形成する潜在能力のため、この出生後ラットクローンラット-A2B2を多能性原外胚葉様幹細胞PPELSCと呼称した。前述の通り、胚幹細胞は、アルカリホスファターゼ活性、拡大自己更新能力、テロメラーゼ活性、自然発生的分化及び外胚葉、中胚葉及び内胚葉由来の細胞に分化する能力を実証しているThomsonら、1995,1998;Gearhartら、1999。胚幹細胞のその他の側面については、この研究では直接取組まれなかった。これらの側面としては、invivoで移植された場合の自然発生的奇形腫の形成又は胚幹細胞抗原についての免疫学的マーカーが含まれていたThomasら、1995,1998;Gearhartら、1999。しかしながら、この研究からのデータアルカリホスファターゼ活性、自己更新のための拡大された能力、テロメラーゼ活性及び三つの一次胚葉全てから細胞を形成する能力は、胚様予備幹細胞すなわち多能性原外胚葉様幹細胞が出生後の哺乳動物の結合組織区画内に保持される可能性を示唆している。出生後の種の中の予備幹細胞以前のクローン原性分析Youngら、1993,1998a,2000aと本研究を合わせると、予備幹細胞、分化決定された始原細胞及び分化未決定な多能性細胞の少なくとも2つの一般的カテゴリが示唆されている。予備幹細胞の各々の一般的カテゴリの中には、幹細胞のサブカテゴリもあるように思われる。我々も、そして他の人々も、多くのタイプの分化決定された始原幹細胞すなわち単能性幹細胞Youngら、1993;Grounds,1999;Yotsuyanagiら、1999;Gordonら、2000、二能性幹細胞Youngら、1993;Bonner-Wierら、2000;Ramiyaら、2000、三能性幹細胞Prokop,1997;Yooら、1998;Pirtengerら、1999、及び多能性幹細胞PalisandSegel,1998;McGuire,1998;Ratajczakら、1998の存在を指摘してきた。これらの例では、始原幹細胞は、特定の系列に特異的な細胞型を形成し、Hayflickの限界に適合しHayflick,1965、その後、プログラミングされた細胞の老化及び死枯を受ける。我々は同様に、分化未決定な多能性間葉幹細胞Youngら、1993,1998a,2000a,Young,2000;Rogersら、1995及び分化決定を受けていない多能性原外胚葉幹細胞本研究をも分離しクローニングした。これらの多能性幹細胞は、分化未決定である。これらの細胞は、それが分化決定を受けない状態にとどまるかぎり、自己更新のための拡大された能力をもつ。多能性幹細胞は、外因性作用物質による作用を受けないかぎり、静止状態にとどまる。これらの幹細胞は、それらをいずれかの特定の組織系列に決定するために誘発性作用物質を必要とする。多能性幹細胞がひとたび特定の組織系列に決定されたならば、これらは、分化決定された始原幹細胞の特性の全てを呈する、すなわち系列制約のある表現型を形成しHalfbackの限界に適合することになる。この研究は、出生後の哺乳動物の体内の胚様予備幹細胞の保持、及び身体組織の正常な維持、修復及び再生におけるそれらの潜在的関与を示唆している。現行の及び先行する研究Youngら、1991,1992a,b,1993,1995,1998a,b,1999,2000a,b,Young,2000;Grigoriadisら、1988;Caplanら、1993;Pateら、1993;Lucasら、1995,1996;Rogersら、1995;Saitoら、,1995;Dixonら、1996;Warejckaら、1996;Clarkら、2000に基づき、我々は、ヒトを含めた出生後の動物の体内には少なくとも10のカテゴリーの予備幹細胞が存在することを提案することになる。提案されるカテゴリは、多能性原外胚葉様幹細胞、多能性外胚葉幹細胞、多能性間葉中胚葉幹細胞、多能性内胚葉幹細胞、多能性神経幹細胞、多能性表皮幹細胞、多能性始原幹細胞、三能性始原幹細胞、二能性始原幹細胞及び単能性始原幹細胞である。我々は同様に、これらの予備幹細胞カテゴリのうちの単数又は複数のものを移植療法のために使用でき、使用すべきであるということをも提案することになる。実際、移植療法のための予備出生後幹細胞の使用に関する報告は、数多く存在してきた。例えば、Grandeら、1995は、全層関節軟骨欠損モデルにおける軟骨及び骨の修復のための成人多能性間葉幹細胞の移植について報告している。Eglitis及びMezeyは、造血細胞が、成体マウスの脳内で神経支持細胞へと分化することを報告した。Caplanら、.1997;Wakitaniら、1994は、軟骨再生のための骨髄間質由来の間葉幹細胞の使用について報告している。Youngら、.RGYoungら、1998は、アキレス腱の修復のためのコラーゲンマトリクス内に埋込まれた骨髄間質由来の出生後間葉幹細胞の使用について報告している。Asaharaら、.1999;Kalkaら、2000は、新血管新生のための内皮始原細胞の使用について報告している。Bjorsonら、.1999は、血球を形成するために成人の神経幹細胞を用いることを報告した。Bonner-Weirら、.2000及びRamiyaら、.2000は、膵臓インシュリン分泌ベータ細胞を形成するために管前性幹細胞を使用することを報告している。Grounds1999は、筋肉修復のための幹細胞の使用を再考した。Gussoniら、.1999は、幹細胞移植によるmdxマウス内のジストロフィ発現の回復について報告している。Jackson及びGoodell1999は、骨格筋から分離した幹細胞の造血潜在能力について報告した。Niklason1999;ら、1999は、始原幹細胞を用いたexvivoの血管の生成について報告した。Petersonら、1999は、肝卵形細胞の供給源としての骨髄幹細胞の使用について報告している。Yotsuyanagiら、.1999は、軟骨膜からの幹細胞を用いた軟骨の再構築について報告した。Gordonら、,2000は、未変性非活性化幹細胞を用いた肝の再生について報告した。テスト用培地であるTMは、OptiMEMベータメルカブトエタノール抗生物質/抗真菌剤、pH7.4で構成されていた。テスト用培地インシュリンであるTMInsは、2mg/mlのインシュリンを含有するテスト用培地で構成されていた。テスト用培地誘発性作用物質であるTMInductineAgentsは、以下の組合せのうちの1つを含有するテスト用培地で構成されていた;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン0.5のHS9;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン1のHS9;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン5のHS9;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン10のHS9;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン1のHS10;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン5のHS10;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン10のHS10;2mg/mlインシュリン10-6Mのデキサメタゾン1のMFCS1;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン5のMFCS1;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン10のMFCS1;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン15のMFCS1;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン1のHS93のHS7;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン5のHS93のHS7;2mg/mlのインシュリン10-6Mのデキサメタゾン10のHS93のHS7;1のHS7、3のHS7、及び3のHS7.[参考文献]非近交系SDラット内へのラット多能性原外胚葉様幹細胞クローンA2B2-scl-40の移植は、対宿主移植片病を誘発しない同種異系ドナーを用いたこれまでの移植研究は、宿主組織内の炎症反応の誘発を実証している。対宿主移植片病と呼ばれるこの反応は、ドナーと宿主組織の間のHLA不整合に起因して発生する。本研究の目的は、出生後の非近交系SDラット由来のラット多能性原外胚葉様幹細胞クローンが、成体の非近交系SDラット内の対宿主移植片反応を誘発することになるか否かを見極めることにあった。A2B2-scl-40と呼ばれる出生後多能性原外胚葉様幹細胞を、invivoと同時にinvitroでの同時培養実験で幹細胞を追跡するべく、ベータガラクトシダーゼ発現のためのLac-Z遺伝子である安定したゲノミックマーカーで予め形質移入した。A2B2=scl-40幹細胞を密集状態まで成長させ、収穫し、移植のため処理した。幹細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で徹底的に洗浄し、1×106の幹細胞を含む100mlの緩衝液実験又は100mlの緩衝液のみ対照を、95の空気/5のCO2の加湿された環境内で37°Cで24時間無菌ゲルフォームの5mm3片と共にインキュベートした。次に実験用ゲルフォームゲノム標識付けされた幹細胞を含む及び対照ゲルフォーム緩衝液のみを、成体雄非近交系SDラットの首耳下腺と胸鎖乳突筋の間の左右領域内に無作為に移植した。大きな炎症反応について確かめるため動物を剖検し、付着組織と共にゲルフォーム移植片を除去し、3分の1ずつにカットし組織学3分の2及び細胞培養3分の1のために処理した。剖検結果は、検査対象のいずれの動物にも大きな炎症反応を指摘しなかった。組織学結果は、対照又は実験用のゲルフォーム片のいずれの中にも炎症細胞の大きな浸潤を指摘しなかった。組織培養結果は、対照ゲルフォーム内への多能性幹細胞の内殖及び実験用ゲルフォーム内の移植されたLac-Z標識付け済み幹細胞による多能性の該研究全体を通しての保持を指摘した。ラット多能性幹細胞の分離及び神経マーカーの培養発現PPMSCの分離のために用いられたものと同じプロトコルに従ってROSA26LacZ標識付け済みマウスROSA26PPSCと記されている及びラット骨格筋RmSC-1と記されているからPPSCを分離し、同じ選択されたウマ血清を含むPPMSCのために用いられたのと同じ培地内でこれを培養したLucasら、WoundRep.Reg.3;457-468。ROSA26マウスは、B-ガラクトシダーゼを発現する遺伝子導入マウスであり、JacksonLaboratoriesから得られた。RmSC-1細胞を、Lucasら、Lucasら、WoundRep.Reg.3;457-468に記述されているように、雄及び雌のラット新生児の骨格筋から分離した。デキサメタゾンで処理されたROSA26PPSC及びRmSC-1PPSCの培養中で、神経細胞-脂肪細胞、骨格筋管、軟骨細胞、骨芽細胞などと並んで培養内で中胚葉表現型が分化した。PPMSCのために使用された分離手順は同様に、神経ならびに中胚葉表現型へと分化できる細胞を分離する能力をもっている。ROSA26PPSC及びRmSC-1PPSCを、誘発デキサメタゾン条件内で培養させ、星状膠細胞と同時培養させ、星状膠細胞からの調整培地で培養させ、結果として得られた細胞を、抗体染色により神経細胞表現型について評価した。細胞を24ウェルの培養皿内で平板固定し、上述の方法及び材料を用いて抗体染色により評価した。ROSAβ-ガラクトシダーゼ発現細胞を染色するためには、X-galを利用した。神経細胞抗体マーカーは、DHSBから得られたGFAP星状膠細胞、CNPase神経用の神経細胞マーカー、IA4及びRT-97神経フィラメントであり、上述の実施例実施例9及び10でさらに特徴づけされていた。神経細胞抗体は一次抗体として使用され、HRPで標識付けされたヤギ抗マウス抗体は二次抗体として使用された。免疫染色のためのカラー試薬は、HRPのためのクロマジェンであるTrueblueKPL,Incであった。ROSA26PPSCを21日間ラット星状膠細胞と同時培養し、神経細胞マーカーGFAP及びLacZ遺伝子の産物を認識し、従ってROSA細胞を認識するX-galに対する抗体で染色した。図35は、X-gal及びGFAPで染色した21日間のラット星状膠細胞とROSA26PPSの同時培養を示す。X-galでのみ染色し、Xgal及びGFAPの両方について2重染色した細胞が発見された。黒色矢印は、2重染色された細胞を指し、白色矢印はGFAPについて染色されなかったROSAPPSCを指している。図36は、X-gal及びGFAPで染色された21日間のラット星状膠細胞とROSA26PPSCの同時培養を示す。GFAPでのみ染色された星状膠細胞が記され白色矢印、同様にX-gal及びGFAPについて2重染色されたROSA由来の細胞黒色矢印も記されている。図37には、X-gal及びGFAPで染色された21日間のROSA26PPSCとラット星状膠細胞の同時培養も示されている。白色矢印はX-galについて染色されたROSA26PPSC未分化を指し、一方黒色矢印は、X-gal及びGFAPについて2重染色されたROSA細胞分化を指す。ラット骨格筋から分離したPPSCRmSC-1を21日間10~7Mのデキサメタゾンで処理して分化を誘発し、次にさまざまな神経細胞特異的抗体で染色した。図38は、21日間10~7Mのデキサメタゾンで処理され、その後抗-CNPaseで染色されたラット骨格筋RmSC-1から分離されたPPSCを、CNPase、抗CNPaseについて陽性の細胞が黒色矢印で示された状態で描かれている。IA4に対する抗体で染色されたデキサメタゾン処理済みRmSC-1細胞が、図39に示されている。図40は、21日間ラット星状膠細胞からの調整培地で処理されかつ抗体RT-97で染色されたRmSC-1を示す。陽性染色細胞が矢印で記されている。CNPase及びGFAPについて陽性の細胞は同様に、21日間のラット星状膠細胞からの調整培地内でのRmSC-1細胞の成長後に染色時点でも観察された。ヒト成体から分離された多数の幹細胞個体群上述のプロトコルを用いて、C3TF細胞と呼称された17才の女性の真皮から、幹細胞が分離され、Youngら、により提供されたYoung,H.E.ら、1991JournalofTissueCultureMethods13:275-284;Young,H.E.ら、1992aJournalofTissueCultureMethods14:85-92。C3TF細胞は、核型分析され、46,XXの正常な雌であることが証明された図41。この核型は、C3tF細胞が37の細胞倍加にあるときに実施された。37の細胞倍加後、CT3F細胞は半分に分割され、10の選択された血清HS10の存在下及び15の選択された血清MFCS1の存在下という2つの異なる培養条件下に置かれた。幹細胞、多能性間葉幹細胞及び多能性胚様幹細胞のPPMSC及びPPELSCと呼ばれる2つの個体群が、それぞれこれらの血清条件下で分離された。PPMSC細胞は、いずれか及び全ての間葉細胞型を形成する能力を有する。PPELSC細胞は、中胚葉、外胚葉及び内胚葉系列内の細胞型を形成する能力をもつ。CDマーカーフロー分析がこれら2つの細胞個体群について実施された。PPMSCと呼ばれる個体群は、72の細胞倍加にあり、一方PPELSCと呼ばれる個体群は、CDマーカー分析が実施されたとき70の細胞倍加があった。分析においては、58のCDマーカーが利用された。PPELSCは、テストされた58のCDマーカ抗体全てについて、つまり特定的には、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD31、CD33、CD34、CD36、CD38、CD41、CD42b、CD44、CD45、CD49d、CD55、CD56、CD57、CD59、CD61、CD62E、CD65、CD66e、CD68、CD69、CD71、CD79、CD83、CD90、CD95、CD105、CD117、CD123、CD166、グリコホリン-A、DRΠ、クラス-I、FLT3、FMC-7、アネキシン、及びLINについて陰性であった。PPELSCは、テストされたいずれのCDマーカーについても陽性染色を全く示さなかった。PPMSCは、CDマーカーCD10、CD13、CD34、CD56、CD90及びMHCクラス-Iについて陽性染色を実証した。この結果は、実施例7及び8において以上でPPMSCについて紹介したCDマーカー研究と相関している。PPMSCは、52の抗体すなわち、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD11b、CD11c、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD31、CD33、CD36、CD38、CD41、CD42b、CD44、CD45、CD49d、CD55、CD57、CD59、CD61、CD62E、CD65、CD66e、CD68、CD69、CD71、CD79、CD83、CD95、CD105、CD117、CD123、CD166、グリコホリン-A、DRΠ、FLT3、FMC-7、アネキシン及びLINについて陰性であった。独特のCDマーカープロフィールに基づく成人の予備幹細胞の付加的個体群をC3TF細胞から分離した。これらの個体群は、CD1a、CD10、CD41、CD66e及びアネキシンについて陽性であり、その他全てのマーカーについて陰性である。CD66eは胚抗原マーカーである。第2の個体群は、CD1a、CD10、CD22及びアネキシンについて陽性であり、その他全てについて陰性である。第3の個体群はCD10及びCD22について陽性であり、その他全てのマーカーについて陰性である。これらの結果は、場合によって全く異なる増殖及び分化能力をもつ付加的な幹細胞個体群の存在を表わしている。NOD/SCIDマウス内のinvivoでのヒト多能性幹細胞による造血再形成[プロトコルの概要]本研究の目的は、ヒトの幹細胞療法のために生来の出生後多能性幹細胞又は出生後多能性幹細胞で誘発された造血幹細胞を使用することの実行可能性を見極めることにある。67才の男性及び17才の女性に由来する出生後ヒト多能性幹細胞を、生来の及び造血誘発された幹細胞として個別に、亜致死の照射を受けた免疫不全NOD/SCIDの中に、マウス造血幹細胞と同時移植される。マウス内へのヒトの細胞の取込みを同定するためには、マウスの血液及び骨髄中の細胞上のヒト特異的CD45抗原発現が使用されることになる。ヒト幹細胞の造血再増殖活性に同定するためには、B細胞、顆粒球、巨核球及び赤血球についてのCDマーカープロフィールが使用される。マウス細胞と混合されたヒト特異的CD45抗原を発現するヒト細胞の同定は、陽性のエンドポイントとして役立ち、ヒトの幹細胞がマウス内に取込まれたことを表わす。骨髄球及びリンパ球の両方の系列のヒト造血CDマーカーが発現するヒト細胞の同定は、陽性のエンドポイントとして役立ち、ヒト幹細胞が造血系を再生しつつあることを表わす。[プロトコルの詳述]使用された動物は全て、T細胞の漏出性の徴候について予備テストされた免疫不全NOD/SCIDであるn=各グループにつき6。動物は、表21内で以下で示されているとおりにグループ分けされ処理される。ヒト細胞の植付けのための検定パラメータ;移植されたマウス及び対照のマウスからの血液1及び骨髄2a、b、cを、輸注から8週マウス3匹及び12週マウス3匹後に分析する。FACScanを用いたマルチパラメータフローサイトメトリ分析でヒト造血CDマーカーについて細胞1、2aを染色する。B細胞、顆粒球及び赤血球についてのCDマーカープロフィールを用いて、マウス組織内のヒト細胞の取込みを同定する。各実験において、移植を受けていないマウスからの細胞を負の対照として同じ抗体で染色する。マウスの細胞と混合された造血マーカーを発現するヒト細胞の同定は、陽性のエンドポイントとして役立ち、ヒト幹細胞が骨髄様及びリンパ様の両方の区画内で造血系を再生しつつあることを表わす。全てのマウスからの骨髄2bを、免疫細胞化学によりヒト特異的MHC-I及びHLA-DR-II抗原について染色する。マウスの細胞と混合されたヒト細胞の同定は、陽性のエンドポイントとして役立ち、ヒト幹細胞がマウス内に取込まれ造血系を再生しつつあることを表わしている。マウスの骨髄内へのヒトの細胞の取込みのさらなる分析には、ひと造血細胞のコロニー形成を刺激するものとして知られているヒト成長因子で分離された骨髄細胞を刺激することが関与している。かくして、移植されたマウス2Cからの骨髄細胞は、メチルセルロース培養及びヒト血漿及びhu-IL-310U/ml、hu-GM-CSF1U/ml、hu-SCF50ng/ml及びhu-EPO2U/mlで刺激された培養内で平板固定される。顆粒球-マクロファージコロニー形成細胞CFU-GM、赤芽球バースト形成細胞BFU-E及び顆粒球-赤血球-巨核球-マクロファージコロニー形成細胞CFU-GEMMの始原細胞に由来するヒトコロニーを同定するために、形態学的基準及び組織学的染色が使用される。検定の特異性は、個々のコロニー内でヒトジストロフィンRNAを増幅するためPCRを使用することによって確認される。[結果]NOD/SCIDマウスは、亜致死の照射300cGyを受け、尾静脈を経由して、マウス一匹あたり4.8×10Mo1-3又は1.2×106Mo4-6の割合で、CT3FPPELSC細胞の注射を受けた。さらに高い細胞濃度では、マウスは生き延びなかった。最近の実験では、注射溶液0.2のBSA及び20U/mlのヘパリンを伴うIMDMの中に20U/mlのヘパリンを内含し、マウス1匹あたり3×106n=1を注入することができた。移植から8週間後に、6匹のマウスを屠殺し、クラスI、CD45、CD34、CD38、CD19、CD3、CD117といったマーカーでヒト細胞について骨髄、脾臓及び末梢血を分析した。骨髄中のクラスIを除き、すべてのマーカーは陰性であった。骨髄の約0.5が、ヒトクラスI陽性細胞を含有していた。脾臓及び末梢血中、以上に列挙したマーカーを用いていかなるヒト細胞も検出されなかった。ラット幹細胞は、ゲノム標識付け及びレトロウイルス遺伝子移入後に多能性を保持する[概要]出生後のラット骨格筋を収獲し、間葉幹細胞を分離した。クローン原生分析は、多能性幹細胞がまさに実際出生後の哺乳動物の体内に存在していること、そしてそれらがクローニング後少なくとも4つの間葉系列組織例えば骨格筋、脂肪、軟骨及び骨を形成するその能力を保持することを明らかにした。その後クローンを、ゲノム標識付け後の多能性保持及び拡大自己更新について検査した。この能力は、β-ガラクトシダーゼでのゲノム標識付けの後及び拡大自己更新すなわち、クローニング後の200の細胞倍加の後も保持された。結合組織基質内の多能性幹細胞の存在及び、クローニング、遺伝子トランスフェクション及び拡大自己更新後のその多能性保持は、これらの幹細胞が遺伝子療法及び/又は出生後の動物内の組織の修復及び再生にとって重要な貢献を果たす可能性があるということを示唆している。[材料と方法]ゲノム標識付け10のウマ血清GIBCO-BRL、5mMのHepesGIBCO-BRL、50U/mlのペニシリン-50mg/mlのストレプトマイシンGIBCO-BRL及び50U/mlの組換え型ヒト抗分化因子ADF、MorphogenPharmaceuticals,Inc.,NYを伴う、修正イーグル培地MEMGIBCO-BRL,LifeTechnologies,CergyPontoise,Franceの中で、クローンラット-A2B2以上の実施例11で記述を成長させた。核ターゲティングされたLacZ遺伝子を発現する安定したラット-A2B2細胞系統nls-LacZを、プラスミドpUT651選択可能な報告された遺伝子Shble::lacZを用いて構築した。血清を含有する培地内で6ウェルのプラスチック皿FalconBectonDickinson,Lepont-declaix,France上で5×103細胞/cm2の割合で細胞を平板固定し、一晩付着させた。次に、無血清培地Opti-mem,GIBCO-BRL内で16時間リポフェクチン試薬Gibco-BRLを用いて2mgのPUT651と共に細胞を一晩インキュベートした、トランスフェクションを受けた細胞を、250mgのゼオシンInvitrogen,Netherlandsが追加された選択培地内へ1:10に分割した。最高レベルのβ-Galを発現する12の耐性クローンのうちの1つのクローンをサブクローニングし使用した。組織化学的及び免疫化学的技術により、β-Gal発現を評価した。室温で10分間2のパラホルムアルデヒド内で固定するか又は氷冷メタノール内で5分間固定した後、PBS内で洗い流し、色素産生基板X-Galでの組織化学染色及びポリクローナルChemicon,Temecula,CA抗β-Gal抗体Couffinhalら、1997での免疫染色により、細胞内でLacZ発現を評価した。ラット免疫グロブリンVectorに予め吸着されたビオチン化抗マウスIgGと共にVector-HRP-DAB発現系Vector-Labsを用いて抗体結合を視覚化した。表現型発現のためのインシュリン-デキサメタゾン分析凍結保存したクローンを融解し、標準的プロトコルに従いゼラチンで被覆された24ウェルの平板の1ウェルにつき5、10又は20×103細胞の割合で間葉幹細胞-1培地中で平板固定した。最初の平板固定から24時間後に、培地をテスト用培地TM1~4TM-1、TM-2、TM-3、TM-4又は5TM-5に変更した。テスト用培地TMは、最低培養中で30日、最長培養中で120日間鳥類の始原細胞及び多能性細胞の両方を定常状態条件下で維持するUltraculture:EMEM:抗生物質を複数の比率で含んでいた。各々さまざまな濃度のUltracultureを含む4つのテスト用培地TMs1~4を使用した。各テスト用培地内に存在するUltraculture対EMEM対抗生物質の比率は、鳥類の始原細胞及び多能性細胞の両方の個体群において定常状態の培養条件を維持するその能力に基づき、各々のUltracultureロットについて経験的に決定された。4つのUltracultureベースのテスト用培地は以下のとおりであった:TM1=15v/vのUltracultureロット番号OMO455;84のv/vEMEM:1v/vの抗生物質;TM2=15v/vのUltracultureロット番号1M1724:84v/vのEMEM:1v/vの抗生物質;TM3=50v/vのUltracultureロット番号2M0420;49v/vのEMEM:1v/v抗生物質;及びTM4=75v/vのUltracultureロット番号2M0274;24v/vEMEM:1v/vの抗生物質;TM-1~TM-4は、Ultracultureカタログ番号12-725B、ロット番号OMO455[TM-1]、1M1724[TM-2]、2M0420[TM-3]、又は2M0274[TM-4]、Bio-Whittaker,Walkersville;MD、EMEM1、及び1v/vPen/Strep、pH7.4で構成されていた。TM-5は、98v/vのEMEM、1v/vHS、及び1v/vのPen/Strep,pH7.4で構成されていた。テスト用培地のみの中での24時間の予備インキュベーションを用いて、MSC-1培地内のあらゆる潜在的共力成分を洗い出した。24時間後、テスト用培地を、テスト培地のみ対照、又は始原細胞のクローンを同定するため始原細胞内の表現型発現マーカーの出現を加速する作用物質である2μg/mlのインシュリンSigmaYoungら、1998a又は多能性細胞のクローンを同定するための一般的非特異的系列誘発作用物質である10-10~10-6MのデキサメタゾンSigmaGrigoriadisら、1988;Youngら、1993,1998aのいずれかを含むテスト用培地TM-1~TM-5に変更した。一日おきに培地を変更しながら、さらに30~45日間、対照及び処理済み培養を増殖させた。実験一回一濃度あたり4つの培養ウェルを用いた。30~45日の期間中、培養を毎日のベースで、表現型発現の改変以下参照、処理日数及び付随するインシュリン又はデキサメタゾン濃度について、主観的に検査した。その後、実証済みの免疫化学及び組織化学手順Youngら、1992b,1993,1995,1998a,b;Rogersら、1995を用いて表現型発現マーカーを客観的に確認するべくこれらのパラメータを利用して実験を反復し、NikonTMS倒立位相差顕微鏡を用いて結果を写真撮影した。推定上の骨格筋細胞内の筋節ミオシンの存在を確認するため、ミオシン-酵素連鎖免疫-培養検定myosin-ELICAを用いて、自然発生的に収縮した多核性線状及び有枝構造を示した培養を、さらに評価したBaderら、1982;Youngら、1992a,b,1993,1995。推定上の脂肪細胞内の飽和中性脂質の存在を確認するため、多重屈折小胞を示す培養を、Sudanblack-BRobozSurgicalCo.,Washington,D.C.を用いてさらに評価したYoungら、1992a,1993,1995。推定上の軟骨細胞をとり囲む細胞周囲の及び/又は細胞外の基質にあるコンドロイチン硫酸/ケラチン硫酸グリコサミノグリカンの存在を確認するため、コンドロイチナーゼ-ACICNBiomedicals,Cleveland,OH/ケラタナーゼICNBiomedicals消化と結合させたpH1.0のアルシアンブルーAlcianBlau8GS.Chroma-Gesellschaft,RobozSurgicalCo.を用いて、細胞周囲マトリクスのカサ含む丸くなった細胞の凝塊を表示した培養を、さらに評価したYoungら、1989,1992a,1993,1995。推定上の無機化された骨片内のリン酸カルシウムの存在を確認するため、EGTAエチレングリコール-ビス-β-アミノエチルエーテルN,N,N′,N′-テトラ酢酸、Sigmaと結合させたvonkossaSilberProtein,Chroma-Gesellschaft染色を用いて、3次元マトリクス内に埋込まれかつ/又はそれと重ね合された細胞を示した培養をさらに評価したYoungら、1992a,1993,1995。推定上の線維芽細胞をとり囲む細胞外コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸グリコサミノグリカンの存在を確認するため、コンドロイチナーゼ-ABCICNBiomedicalsと結合させたアルシアンブルーpH1.0染色を用いて、粒状の又は線維性の細胞外マトリクス内に埋込まれた細胞の密集層単複を示す培養を、さらに評価したYoungら、1989,1992a、1993、1995。[結果]RAT-A2B2と呼ばれるクローン実施例11に記述を、β-ガラクトシダーゼレトロウイルストランスフェクションによりゲノム標識付けの後に評価した。全ての評価を通して、A2B2細胞は、インシュリンでのインキュベーションの間、表現型発現内のいかなる変化も示さなかった。しかしながら、A2B2細胞は、ゲノム標識付けの後一定の濃度範囲のデキサメタゾンでインキュベートした時点で多数の形態を示した。認められた表現型発現の変化は、筋原性、脂肪形成、軟骨形成及び骨形成形態学的なものであった。A2B2細胞は、星状形態の保持及び接触阻害の喪失についてのクローン原性分析中に特定的に選択された。しかし、ひとたび特定の系列に決定するすなわち系列特異的始原細胞となるように誘発された時点で、RAT-A2B2は、密集状態で接触阻害を呈する。[考察]毎年何百人ものアメリカ人が組織喪失又は末期器官不全に悩まされている。これらの患者に対する国レベルの合計健康管理費は年間4000億ドルを超えている。現在、これらの障害を治療するため米国では年間800万件以下の外科手術が実施され、4000~9000万日の入院日数が必要とされている。同種異系間療法は無数の生命を救い改善したが、それでも不完全な解決法であるにとどまっている。同種異系間組織移植及び外科的介入は、決定的なドナー不足、長期罹病率及び死亡率によって著しく制限されているLangerandVacanti,1993。この調査の長期的目的は、再生及び修復のためのHLA整合ドナー組織として及び遺伝子療法のための潜在的送達ビヒクルとして使用するための自己由来の多能性幹細胞の有用性を見極めることにある。自己由来のドナー組織として多能性幹細胞が利用されるためには、生体内部にそれらが存在していること、分離が容易であること、その表現型発現を操作できること、適応力があること、既存の組織内に取込まれること、生存能力があることそして機能性があることが必要である。本報告書中の研究は、多能性幹細胞,特にRatA2B2以上の実施例11でより詳細に記述されているが、トランスフェクションを受けた遺伝子の活性を保持しながら多能性を喪失することなくレトロウイルストランスフェクションを受けることができるということを示した。これらの研究から、我々は、特に数多くの細胞が必要とされ移植組織の供給が不足している場合において、組織の移植、再生及び遺伝子療法のためのHLA整合されたドナー組織として自己由来の多能性幹細胞を使用できるという仮説を提案することになる。多能性幹細胞に対するレトロウイルスを媒体とする遺伝子移入研究目的1レトロウイルスベクターを用いてPPSCに遺伝子を送達し、感染したPPSCがその多能性を維持する能力をテストすること。2萎縮した筋肉に移植した時点で分散し筋線維と融合する能力をPPSCに発現するmyoDと対照間で比較すること。研究の概要1つの長期的最終目的は、出生後骨格筋の成長を増強させるため細胞による方法及び/又は薬理学的方法を使用することにある。PPSCは、神経筋疾患、不使用、宇宙飛行、長期ベッド療養及び老化において発生する萎縮した骨格筋の治療のための1つの潜在的戦略を表わしている。出生後骨格筋の成長という最終目的を達成しようとして、次の4つの異なるやり方で細胞に遺伝子を送達するためにレトロウイルスが利用されてきた:すなわち1移植後に筋原性細胞を追跡するべくb-ガラクトシダーゼといったようなマーカーを送達するため;2細胞生理学における特定的なシグナリング経路の関与を研究するべくリポータ構成体を送達するため;3転写因子を過剰発現するため;4特定のシグナリング経路の遺伝子阻害物質を送達するため。場合によっては、筋肉消耗のための細胞療法としてPPSCを使用する目的で、まず最初にPPSC内にマーカー遺伝子を安定した形で導入し、細胞の多能性が維持されることを見極めることが必要である。さらに、正常な及び萎縮した骨格筋の中での移植されたPPSCの挙動を見極めることが必要である。MyoDは、非筋細胞が筋原性となるように誘発すると同時に幹細胞内での筋形成を誘発することのできる筋肉特異的転写因子である。我々は、次にPPSCの動員及び萎縮した筋線維内への取込みの効果を増大させるmyoDの強制発現の能力をテストすることになる。動物免疫不全scid/bgマウスがPPSC移植の受容体として使用されることになる。Scid/bgマウスは、機能的T及びB細胞が欠損しており、低い天然キラー活性しかもたない。scid/bgマウスは、より安定したSCID表現型を示し、一般に異系移植片移植のためのより優れた受容体である。プロトコルの詳細I.PPMSC多能性間葉幹細胞及びPPELSC多能性胚様幹細胞に対するlacZ遺伝子のレトロウイルスを媒体とした遺伝子移入の効率を見極める。a確立された技術を用いて2種類の幹細胞をレトロウイルスにより感染させる。b感染から48時間後に、単一の細胞内のb-ガラクトシダーゼ発現について酵素検定を実施する。感染を受けた細胞は青色となる。c青色細胞のを評定する。d青色細胞の百分率が低い場合、レトロウイルス感染プロトコルを反復するが、6~8時間離して2回の感染を使用する。eb~cまでを反復する。f方法の再現性を決定するため最高の百分率の青色細胞を与えるプロトコルを用いて実験を2回反復する。II.レトロウイルス感染を受けた2種類のSCの感染後多能性を維持する能力をテストする。a最高の百分率の青色細胞を与えるプロトコルで細胞を感染させる。b感染から24時間後に、細胞をトリプシン処理し、ELICA検定で使用するため96ウェル平板内に細胞を平板固定する。対照として、96ウェルの平板内に未感染細胞も据え付ける。同じく、細胞の形態を観察するべく12ウェルの平板内に細胞を据え付ける。c感染から48時間後に、培地を誘発性培地に変更する。d感染から2~6週間後に、前述したデキサメタゾン方法を用いて96ウェルの平板内で特定的細胞表現型±レトロウイルス感染の誘発をテストする。e12ウェルの平板上でb-ガラクトシダーゼ酵素検定を実施し、表現型誘発の形態学的徴候が青色細胞内で発生するか否かを観察する。f対照とレトロウイルス感染を受けた細胞の間で特定の表現型の誘発を比較する。III.萎縮した骨格筋及び対照の中に移植されたPPMSC及びPPELSCを発現するmyoDと対照の挙動を比較する。a移植の2週間前に、脛側前筋の脱神経萎縮を誘発するためscid/bgマウス内の坐骨神経の一側性横断切開を実施する。bレトロウイルスを発現するmyoD又は対照のいずれかでPPSCを感染させる。感染から48時間後、平行な平板内で免疫組織化学を用いてmyoD発現についてテストする。c下表22に記すとおり、各々の脛側前筋内に細胞を移植する:d移植の6週間後、移植された筋肉を収集し、逐次切開し、筋肉切片上のb-ガラクトシダーゼについての酵素検定を実施する。1筋線維の内側の青色核の数を評定する。これらは、筋原性系列に転換し宿主の内因性筋線維と融合したPPSCを表わしている。2注入部位との関係において青色核の分布を比較する。3筋原性系列に転換し筋線維と融合する、PPMSCを発現するmyoD及び対照とPPELSCを発現するmyoD及び対照の能力を比較する。4萎縮した筋肉対正常な筋肉の一関数として上述の3で得られたデータを分析する。定義づけされたエンドポイントエンドポイントというのは、マーカー遺伝子でレトロウイルス感染させられた多能性幹細胞がその多能性を維持し移植時点で筋肉の広い部域全体にわたり分散し、宿主の内因性筋線維と高効率で融合する能力である。成功は、PPMSC及びPPELSCをLacZ遺伝子で高効率まで感染させそれらにその多能性を維持させる能力により決定されることになる。移植実験は、移植細胞が筋肉の幅及び長さ全体にわたり分散し萎縮した筋線維に高効率で融合した場合に、成功したものとみなされる。内皮細胞分化に関与するシグナルプロセスその造血内皮細胞能力及び共通の造血内皮前駆体細胞からの内皮細胞分化に関与するシグナルプロセスを査定するために、以上の実施例16で記述されたB-galでのトランスフェクションを受けたラットA2B2細胞及びROSA26PPSC細胞を利用した。A2B2B-galPPSCを、さまざまな成長因子の存在下で1の選択されたHS10血清内で成長させ、内皮細胞系列に対するそのinvitro決定誘発を査定した。細胞を、2日間、1のHS10単独、1のHS10とそれに加えた成長因子VEGF,bFGF,EGF及びIGF-1のカクテル;1のHS10とそれに加えたbFGF50ng/ml,1のHS10とそれに加えたVEGF50ng/ml,1のHS10とそれに加えたT細胞刺激性調整培地及び1のHS10とそれに加えたbFGF内で成長させ、その後VEGFを添加した。培養皿を、ゼラチン、コラーゲンIV型、ラットビトロネクチン及びラットビトロネクチンと組合わされたゼラチンでコーティングした。最大の分化は、ラットビトロネクチンでコーティングされた皿上で観察された。かくして成長させられた細胞を、形態学的査定;MTS検定内の生物活性;Matrigel上に細胞を再播種した後管形成毛細管形成を検出するMatrigel検定RDSystemsから入手可能なMatrigelは、基底膜成分IV型コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、ニドゲン及びヘパリン硫酸プロテオグリカンを含む培養/成長皿をコーティングするための基底膜製品である;及びさまざまな内皮細胞抗原マーカーCD31pecam,BS-BBS-B4イソ型レクチン染色,SMa-アクチン平滑筋周細胞マーカーでの免疫染色によって評価した。PPSCは、組合された成長因子VEGF,bFGF、EGF及びIGF-1の存在下及びbFGF又はVEGFの存在下で、内皮細胞マーカーCD31,BS-BabdSMアクチンについて増強された染色を示した。Matrigel検定では、Matrigel上で播種されたPPSCは、管形成及び毛細管様の構造図42、を特に成長因子の存在下で図43発達させた。A2B2B-galPPSCを、ラットSCID動物内の後脚虚血性モデル内に投与しinvivoでテストした。虚血性モデルを生成するため大腿動脈を縛って血行を止めた。後脚虚血が生成される前又は後で後脚に対し局所的に筋内注射IMによってか又はラットの尾静脈内に静脈内注射IVによってPPSC細胞を投与した。B-gal標識付け細胞の存在及び性質を査定するためPPSCの注射から1週間後に組織学検査を行なった。PPSCB-gal陽性細胞は、IM又はIVで投与された場合、虚血部位で後脚内に取込まれた。肉眼解剖学的精査時点で、これらの細胞は、後脚内の脈管構造を追跡し、B-gal発現の平行線パターンを示しているように思われた。さらに、虚血動物の体内へのIV注射時点で、骨髄内には著しいB-gal陽性細胞の取込みが観察された図44。本発明は、その精神又は基本的特徴から逸脱することなくその他の形態で又はその他の要領で実施することができる。当該開示は、従って、あらゆる面で添付のクレームに示されている本発明の範囲を例示するものであって、制限的意味をもたないとみなされるべきであり、等価の意味及び範囲に入る全ての変更をその中に包含させることが意図されている。"