"1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPを含む組成物。前記β-TCPがβ-TCPスキャフォールドである、請求項1に記載の組成物。前記スキャフォールドがポリラクチド-co-グリシドをさらに含む、請求項1に記載の組成物。前記スキャフォールドが1つ以上のポロゲンをさらに含む、請求項1に記載の組成物。前記ポロゲンがスクロースである、請求項4に記載の組成物。前記β-TCP結合ペプチドの2つ以上のコピーが、前記β-TCPの1つ以上のコピーに結合する、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。前記β-TCPに結合したβ-TCP結合ペプチドを約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20リピート含む連結多量体である、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。前記多量体が、前記β-TCPに結合した前記β-TCP結合ペプチドを10リピート含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。前記β-TCP結合ペプチドが、アミノ酸配列:LLADTTHHRPWT配列番号1、GQVLPTTTPSSP配列番号2、VPQHPYPVPSHK配列番号3、HNMAPATLHPLP配列番号4、QSFASLTNPRVL配列番号5、HTTPTTTYAAPP配列番号6、QYGVVSHLTHTP配列番号7、TMSNPITSLISV配列番号8、IGRISTHAPLHP配列番号9、MNDPSPWLRSPR配列番号10、QSLGSMFQEGHR配列番号11、KPLFTRYGDVAI配列番号12、MPFGARILSLPN配列番号13、QLQLSNSMSSLS配列番号14、TMNMPAKIFAAM配列番号15、EPTKEYTTSYHR配列番号16、DLNELYLRSLRA配列番号17、DYDSTHGAVFRL配列番号18、SKHERYPQSPEM配列番号19、HTHSSDGSLLGN配列番号20、NYDSMRSHG配列番号21、ANPIISVQTAMD配列番号22又はそれらの組み合わせを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。前記β-TCP結合ペプチドが1つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質と融合している、請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物。各β-TCP結合ペプチドが、リンカーを介してさらなるペプチド又はタンパク質の各々と融合している、請求項10に記載の組成物。前記β-TCP結合ペプチドが、成長因子又はサイトカインの全て又は一部と融合している、請求項10又は11に記載の組成物。前記1つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質が、上皮成長因子EGF、血小板由来成長因子PDGF、骨形態形成タンパク質2BMP-2、BMP-4、BMP-7、骨形成タンパク質OP-1、コラーゲン結合タンパク質又はそれらの組み合わせである、請求項10又は11に記載の組成物。前記リンカーがコイルドコイルリンカーである、請求項11~13のいずれか一項に記載の組成物。前記コイルドコイルがロイシンジッパーである、請求項14に記載の組成物。前記β-TCP結合ペプチドと結合した前記β-TCPを10リピート含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の組成物であって、EGFが前記10リピートの前記β-TCP結合ペプチドの各々のC末端側端部に結合している、組成物。間葉系幹細胞をさらに含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の組成物。前記エンドトキシン値が約1000EU/mg未満である、請求項1に記載の組成物。配列番号29、配列番号30又は配列番号31を含む組成物。アミノ酸配列:LLADTTHHRPWT配列番号1、GQVLPTTTPSSP配列番号2、VPQHPYPVPSHK配列番号3、HNMAPATLHPLP配列番号4、QSFASLTNPRVL配列番号5、HTTPTTTYAAPP配列番号6、QYGVVSHLTHTP配列番号7、TMSNPITSLISV配列番号8、IGRISTHAPLHP配列番号9、MNDPSPWLRSPR配列番号10、QSLGSMFQEGHR配列番号11、KPLFTRYGDVAI配列番号12、MPFGARILSLPN配列番号13、QLQLSNSMSSLS配列番号14、TMNMPAKIFAAM配列番号15、EPTKEYTTSYHR配列番号16、DLNELYLRSLRA配列番号17、DYDSTHGAVFRL配列番号18、SKHERYPQSPEM配列番号19、HTHSSDGSLLGN配列番号20、NYDSMRSHG配列番号21、ANPIISVQTAMD配列番号22又はそれらの組み合わせを含むβ-リン酸三カルシウムβ-TCP結合ペプチド。前記β-TCP結合ペプチドが、1つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質と融合している、請求項20に記載の組成物。前記β-TCP結合ペプチドが、さらなるペプチド又はタンパク質の各々とリンカーを介して融合している、請求項20又は21に記載の組成物。前記β-TCP結合ペプチドが、成長因子又はサイトカインの全て又は一部と融合している、請求項21又は22に記載の組成物。前記1つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質が、上皮成長因子EGF、血小板由来成長因子PDGF、骨形態形成タンパク質2BMP-2、BMP-4、BMP-7、骨形成タンパク質OP-1、コラーゲン結合タンパク質又はそれらの組み合わせである、請求項21~23のいずれか一項に記載の組成物。前記リンカーがコイルドコイルリンカーである、請求項22~24のいずれか一項に記載の組成物。前記コイルドコイルがロイシンジッパーである、請求項22~25のいずれか一項に記載の組成物。前記β-TCP結合ペプチドと結合した前記β-TCPを10リピート含む、請求項24~26のいずれか一項に記載の組成物であって、前記10リピートの前記β-TCP結合ペプチドの各々のC末端端部にEGFが結合している、組成物。請求項1~27のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。約1000EU/mg未満のエンドトキシン値の、請求項28に記載の医薬組成物。上皮成長因子EGFを、それを必要としている個体に送達する方法であって、β-TCP結合ペプチドと結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPを含む組成物の有効量を前記個体に投与するステップを含む方法において、前記β-TCP結合ペプチドが上皮成長因子EGFと融合している、方法。前記組成物が創傷部位に投与される、請求項30に記載の方法。前記創傷部位が骨損傷を含む、請求項31に記載の方法。間葉系幹細胞MSCを前記個体に投与するステップをさらに含む、請求項30~32のいずれか一項に記載の方法。前記MSCが、組成物あたり約100~約1,000,000MSCの細胞播種密度で投与される、請求項33に記載の方法。前記β-TCP結合ペプチドが、アミノ酸配列:LLADTTHHRPWT配列番号1、GQVLPTTTPSSP配列番号2、VPQHPYPVPSHK配列番号3、HNMAPATLHPLP配列番号4、QSFASLTNPRVL配列番号5、HTTPTTTYAAPP配列番号6、QYGVVSHLTHTP配列番号7、TMSNPITSLISV配列番号8、IGRISTHAPLHP配列番号9、MNDPSPWLRSPR配列番号10、QSLGSMFQEGHR配列番号11、KPLFTRYGDVAI配列番号12、MPFGARILSLPN配列番号13、QLQLSNSMSSLS配列番号14、TMNMPAKIFAAM配列番号15、EPTKEYTTSYHR配列番号16、DLNELYLRSLRA配列番号17、DYDSTHGAVFRL配列番号18、SKHERYPQSPEM配列番号19、HTHSSDGSLLGN配列番号20、NYDSMRSHG配列番号21、ANPIISVQTAMD配列番号22又はそれらの組み合わせを含む、請求項30~34のいずれか一項に記載の方法。必要としている個体における骨の修復方法であって、1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPスキャフォールドを含む組成物の有効量を前記個体に投与するステップを含む方法において、前記1つ以上のβ-TCP結合ペプチドがEGFと融合している、方法。間葉系幹細胞MSCを前記個体に投与するステップをさらに含む、請求項36に記載の方法。前記MSCが自家MSCである、請求項37に記載の方法。前記個体が自家骨移植を受けている、請求項36~38のいずれか一項に記載の方法。前記β-TCP結合ペプチドが、アミノ酸配列:LLADTTHHRPWT配列番号1、GQVLPTTTPSSP配列番号2、VPQHPYPVPSHK配列番号3、HNMAPATLHPLP配列番号4、QSFASLTNPRVL配列番号5、HTTPTTTYAAPP配列番号6、QYGVVSHLTHTP配列番号7、TMSNPITSLISV配列番号8、IGRISTHAPLHP配列番号9、MNDPSPWLRSPR配列番号10、QSLGSMFQEGHR配列番号11、KPLFTRYGDVAI配列番号12、MPFGARILSLPN配列番号13、QLQLSNSMSSLS配列番号14、TMNMPAKIFAAM配列番号15、EPTKEYTTSYHR配列番号16、DLNELYLRSLRA配列番号17、DYDSTHGAVFRL配列番号18、SKHERYPQSPEM配列番号19、HTHSSDGSLLGN配列番号20、NYDSMRSHG配列番号21、ANPIISVQTAMD配列番号22又はそれらの組み合わせを含む、請求項36~39のいずれか一項に記載の方法。必要としている個体において間葉系幹細胞MSC増殖を増加させる方法であって、MSC、及び1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合したβ-リン酸三カルシウムスキャフォールドβ-TCPを含む組成物の有効量を前記個体に投与するステップを含む方法において、前記1つ以上のβ-TCP結合ペプチドがEGFと融合している、方法。前記MSCが自家MSCである、請求項41に記載の方法。前記β-TCP結合ペプチドが、アミノ酸配列:LLADTTHHRPWT配列番号1、GQVLPTTTPSSP配列番号2、VPQHPYPVPSHK配列番号3、HNMAPATLHPLP配列番号4、QSFASLTNPRVL配列番号5、HTTPTTTYAAPP配列番号6、QYGVVSHLTHTP配列番号7、TMSNPITSLISV配列番号8、IGRISTHAPLHP配列番号9、MNDPSPWLRSPR配列番号10、QSLGSMFQEGHR配列番号11、KPLFTRYGDVAI配列番号12、MPFGARILSLPN配列番号13、QLQLSNSMSSLS配列番号14、TMNMPAKIFAAM配列番号15、EPTKEYTTSYHR配列番号16、DLNELYLRSLRA配列番号17、DYDSTHGAVFRL配列番号18、SKHERYPQSPEM配列番号19、HTHSSDGSLLGN配列番号20、NYDSMRSHG配列番号21、ANPIISVQTAMD配列番号22又はそれらの組み合わせを含む、請求項41又は42に記載の方法。間葉系幹細胞MSCを培養する方法であって、a1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPスキャフォールドを含む組成物にMSCを接触させ、それにより細胞培養物を生成するステップであって、前記1つ以上のβ-TCP結合ペプチドがEGFと融合している、ステップと、b前記MSCが増殖する条件下に前記細胞培養物を維持するステップであって、それにより前記MSCを培養するステップと、を含む、方法。約30,000個のMSCを、1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合した前記組成物β-TCPスキャフォールドと接触させる、請求項44に記載の方法。前記MSCが分化を起こす、請求項45に記載の方法。前記MSCの分化をアッセイするステップをさらに含む、請求項44、45又は486のいずれか一項に記載の方法。前記MSCが、MSCの対照培養物の増殖と比較して約20~約65の増殖の増加を起こす、請求項44~47のいずれか一項に記載の方法。前記細胞培養物が血清飢餓条件下で維持される、請求項44~48のいずれか一項に記載の方法。前記細胞培養物が、増殖培地、骨形成培地又はそれらの組み合わせに維持される、請求項44~49のいずれか一項に記載の方法。前記MSCがヒトMSCである、請求項44~50のいずれか一項に記載の方法。前記β-TCP結合ペプチドが、アミノ酸配列:LLADTTHHRPWT配列番号1、GQVLPTTTPSSP配列番号2、VPQHPYPVPSHK配列番号3、HNMAPATLHPLP配列番号4、QSFASLTNPRVL配列番号5、HTTPTTTYAAPP配列番号6、QYGVVSHLTHTP配列番号7、TMSNPITSLISV配列番号8、IGRISTHAPLHP配列番号9、MNDPSPWLRSPR配列番号10、QSLGSMFQEGHR配列番号11、KPLFTRYGDVAI配列番号12、MPFGARILSLPN配列番号13、QLQLSNSMSSLS配列番号14、TMNMPAKIFAAM配列番号15、EPTKEYTTSYHR配列番号16、DLNELYLRSLRA配列番号17、DYDSTHGAVFRL配列番号18、SKHERYPQSPEM配列番号19、HTHSSDGSLLGN配列番号20、NYDSMRSHG配列番号21、ANPIISVQTAMD配列番号22又はそれらの組み合わせを含む、請求項44~51のいずれか一項に記載の方法。従って、生物学的機能性を拡張し、且つ臨床成績を改善し得る分子表面処理の設計が可能となるようにBTCPの表面を修飾するための組成物及び方法が必要とされている。本明細書には、BTCP結合ペプチド本明細書ではβTCPbp又はBTCPbpとも称されるの発見と、それに続く、BTCPに対するさらなるタンパク質及び/又はペプチド例えば上皮成長因子の安定した表面係留を可能にするかかるペプチドの操作が記載される。本明細書では、3DBTCPスキャフォールドで培養されるプライマリヒトMSCの初期分化を損なうことのない増殖の増加をもたらす係留EGFを用いて本発明を例示する。また、係留EGFが、長期間にわたり血清飢餓条件下で培養されるMSCに強い生存優位性を付与することも示す。本明細書に記載される組成物及び方法は、術後の創傷に存在し得る過酷な条件を模擬する。当業者は理解するであろうとおり、ここに記載する手法は、BTCPの表面を様々なタンパク質又はペプチドで修飾して所望の表現型を実現するのに適し得る。従って、一態様において本発明は、β-TCP結合ペプチドの全て又は一部と結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPの全て又は一部を含む組成物に関する。本発明はまた、β-TCP結合ペプチドの全て又は一部と結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPの全て又は一部を含む医薬組成物にも関する。別の態様において、本発明は、β-TCPに係留されたタンパク質及び/又はペプチドを、それを必要としている個体に送達する方法に関し、この方法は、β-TCP結合ペプチドと結合したβ-TCPを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここでβ-TCP結合ペプチドは、さらなるタンパク質及び/又はペプチドと融合している。特定の態様において、本発明は、EGFを、それを必要としている個体に送達する方法に関し、この方法は、β-TCP結合ペプチドと結合したβ-TCPを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここでβ-TCP結合ペプチドは、EGFと融合している。別の態様において、本発明は、必要としている個体において骨を修復する方法に関し、この方法は、1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPスキャフォールドを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここで1つ以上のβ-TCP結合ペプチドは、EGFと融合している。さらに別の態様において、本発明は、必要としている個体においてMSC増殖を増加させる方法に関し、この方法は、MSC及び1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合したβ-TCPを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここで1つ以上のβ-TCP結合ペプチドは、EGFと融合している。別の態様において、本発明は、間葉系幹細胞MSCを培養する方法に関し、この方法は、1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合したβ-TCPスキャフォールドを含む組成物にMSCを接触させ、それにより細胞培養物を生成するステップを含み、ここで1つ以上のβ-TCP結合ペプチドは、EGFと融合している。細胞培養物は、MSCが増殖する条件下で維持され、それによりMSCが培養される。特定の態様において、MSCは分化を起こす。従って、この方法は、MSCの分化をアッセイするステップをさらに含み得る。本明細書には、BTCP結合ペプチド又はタンパク質の発見が記載される。この問題に対処するためにとられた手法は、ファージディスプレイを用いて、BTCPとの強力な結合を示すペプチド配列を発見することであったWhaley,S.R.etal.,Nature405,665-6682000;Sanghvi,A.B.etal.,NatureMaterials4,496-5022005;Kenan,DJ.etal.ChemistryBiology13,695-7002006。また、本明細書には、BTCP基材に対するタンパク質リガンドの強力な結合をもたらす融合パートナーとしての、ファージディスプレイにより発見された配列の使用も記載される。本発明の詳細な態様は図1に示され、それには単一リガンド設計及び多価例えば二価リガンド設計による特徴が含まれる。組成物従って、一態様において本発明は、β-TCP結合ペプチドの全て又は一部と結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPの全て又は一部を含む組成物に関する。他の態様では、本発明は、β-TCP結合ペプチドの全て又は一部と結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPの全て又は一部から本質的になる、又はそれからなる組成物に関する。リン酸三カルシウムCa3PO42を焼結すると、その構造がβ-TCPに変換される。本明細書で使用されるとき、β-TCP、又はBTCPは、低pHに容易に溶解することにより骨石灰化を補助し、且つ細胞が付着する剛性基材として働く骨誘導性材料を指すMuschler,G.P.etal.,TheJournalofBoneandJointSurgery86,1541-15582004;FlemingJr,J.E.,George,F.,Muschler,C.B.Isador,H.脊椎固定を促進するためのヒト骨髄骨芽前駆体の術中採取及び濃縮IntraoperativeHarvestandConcentrationofHumanBoneMarrowOsteoprogenitorsforEnhancementofSpinalFusion.OrthopedicTissueEngineering:BasicScienceandPractice2004。Muschlerらはこれを自家採取骨髄と併せて使用することで転帰を改善している。この種の手技では、BTCPを骨髄穿刺液でフラッシュすることによりMSCが播種され、骨形成がさらに促進されるFlemingJr,J.E.,George,F.,Muschler,c.B.Isador,H.脊椎固定を促進するためのヒト骨髄骨芽前駆体の術中採取及び濃縮IntraoperativeHarvestandConcentrationofHumanBoneMarrowOsteoprogenitorsforEnhancementofSpinalFusion.OrthopedicTissueEngineering:BasicScienceandPractice2004。本明細書で使用されるとき、骨誘導性材料には、骨格の形成を促進する例えば骨移植片;骨細胞がそこに付着し、移動し、成長し、且つ分裂することができる構造として機能する能力を有する;骨石灰化を補助する等の材料が含まれる。当業者により理解されるであろうとおり、β-TCPは様々な形態で使用することができる。かかる形態の例としては、顆粒形態、多孔質形態、粉末、パテ例えば、成形用パテ、ペースト及び/又はスキャフォールドが挙げられる。加えて、β-TCPは様々な形状例えば、十字形、梯子形、円形、四角形、三角形等及びサイズ例えば、約1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm等で使用することができる。詳細な実施形態において、β-TCPは、多孔質例えば、約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65である。他の実施形態において、β-TCPは、約20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、1mm、10mm、20mm、30mm、40mm、50mmの細孔径を有する。一態様において、β-TCPは、約60ミクロンの平均細孔直径及び約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900ミクロンの細孔直径範囲を有する約60の多孔性である。加えて、及び当業者により理解されるであろうとおり、BTCPはプロゲンprogenなどのさらなる要素を含んでもよい。プロゴゲンprogogenの例はスクロースである。本明細書で使用されるときβ-TCP結合ペプチド又はTCPBPは、β-TCPに特異的に結合するペプチドである。一態様において、β-TCP結合ペプチドはβ-TCPと強く結合し、又はβ-TCPに対して高親和性を有する。本明細書で使用されるとき、高親和性は、約3μm、2.8μm、2.6μm、2.4μm、2.2μm、2.0μm、1.8μm、1.6μm、1.4μm、1.2μm、1.0μm、0.8μm、0.6μm、0.4μm、0.2μm、100ナノモル、80nmol、60nmol、40nmol、20nmol、10nmol、1nmol、800ピコmol、600ピコmol、400ピコmol、200ピコmol、100ピコmol、80ピコmol、60ピコmolpiconmol、40ピコmol、20ピコmol、10ピコmol又は1ピコmolの結合親和性を指す。特定の態様において、結合定数kDは、TCPBP10について2.3uMである。当業者により理解されるであろうとおり、より高い親和性は、ポリペプチドを修飾してその結合パートナーに対するその親和性を増加させることにより達成することができる。例えば、組成物に対するβ-TCP結合ペプチドの付加;1つ又は複数のβ-TCP結合ペプチド又はβ-TCP結合ペプチド間の1つ又は複数のリンカー例えば、各β-TCP結合ペプチド間の少数のアミノ酸を使用の特異的突然変異生成;及び/又はエラープローンポリメラーゼ連鎖反応PCR例えば、それによるペプチドの可動性を高める配列の導入を用いて、より高い親和性を達成することができる。一態様において、β-TCP結合ペプチドはβ-TCPに非共有結合的に結合する。他の態様では、β-TCP結合タンパク質はまた、1つ以上のさらなるタンパク質及び/又はペプチドとの結合能例えば融合能を有し、例えばそれによりさらなる1つ以上のタンパク質及び/又はペプチドをβ-TCPに係留する。詳細な態様では、β-TCP結合ペプチドは、アミノ酸配列LLADTTHHRPWT配列番号1、GQVLPTTTPSSP配列番号2、VPQHPYPVPSHK配列番号3、HNMAPATLHPLP配列番号4、QSFASLTNPRVL配列番号5、HTTPTTTYAAPP配列番号6、QYGVVSHLTHTP配列番号7、TMSNPITSLISV配列番号8、IGRISTHAPLHP配列番号9、MNDPSPWLRSPR配列番号10、QSLGSMFQEGHR配列番号11、KPLFTRYGDVAI配列番号12、MPFGARILSLPN配列番号13、QLQLSNSMSSLS配列番号14、TMNMPAKIFAAM配列番号15、EPTKEYTTSYHR配列番号16、DLNELYLRSLRA配列番号17、DYDSTHGAVFRL配列番号18、SKHERYPQSPEM配列番号19、HTHSSDGSLLGN配列番号20、NYDSMRSHG配列番号21、又はANPIISVQTAMD配列番号22を含む。他の態様では、β-TCP結合ペプチドは、LLADTTHHRPWT配列番号1、GQVLPTTTPSSP配列番号2、VPQHPYPVPSHK配列番号3、HNMAPATLHPLP配列番号4、QSFASLTNPRVL配列番号5、HTTPTTTYAAPP配列番号6、QYGVVSHLTHTP配列番号7、TMSNPITSLISV配列番号8、IGRISTHAPLHP配列番号9、MNDPSPWLRSPR配列番号10、QSLGSMFQEGHR配列番号11、KPLFTRYGDVAI配列番号12、MPFGARILSLPN配列番号13、QLQLSNSMSSLS配列番号14、TMNMPAKIFAAM配列番号15、EPTKEYTTSYHR配列番号16、DLNELYLRSLRA配列番号17、DYDSTHGAVFRL配列番号18、SKHERYPQSPEM配列番号19、HTHSSDGSLLGN配列番号20、NYDSMRSHG配列番号21、又はANPIISVQTAMD配列番号22と約70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99の同一性を有するアミノ酸配列を含む。β-TCPの全て又は一部と結合するβ-TCP結合ペプチドの一部分もまた、本明細書に提供される組成物及び方法において使用することができる。かかる一部分は、β-TCPの全て又は一部と結合するβ-TCP結合ペプチドの一部分を含む。詳細な実施形態において、β-TCP結合ペプチドのこの一部分はまた、1つ以上のさらなるタンパク質及び/又はペプチドとの結合能例えば融合能も有し、例えばそれによりさらなる1つ以上のタンパク質及び/又はペプチドをβ-TCPに係留する。例えば、当業者により理解されるであろうとおり、β-TCP結合ペプチドの一部分には、本明細書に提供される配列例えば、配列番号1~22の一つを含むペプチドであって、1つ以上のN末端又は1つ以上のC末端アミノ酸が取り除かれているペプチドが含まれる。当業者には明らかであろうとおり、β-TCPペプチドの配列の変異体を、本明細書に提供される組成物及び方法において使用することができる。かかる変異体は、対立遺伝子変異又は一塩基変異多型の場合など、天然に存在する変異体であってもよく、又は様々な突然変異原及び変異原性過程により誘導されるものなど、天然に存在しない変異体であってもよい。対象となる変異としては、限定はされないが、保存的又は非保存的なアミノ酸変化、例えば付加及び欠失をもたらし得る1つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の付加、欠失、及び置換が挙げられる。好ましくは、アミノ酸変化はサイレントであるか、又は保存的であり;すなわち、アミノ酸変化によってβ-TCP結合ペプチドの特性又は活性が変わることはない。例えば、対応する残基との保存的置換であるアミノ酸残基は、置換された残基と物理的又は機能的に同様であり、例えば、同様のサイズ、形状、電荷、化学的性質すなわち共有結合又は水素結合の形成能を有する。保存的置換は、典型的には、あるアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸に置換することを含み、例えば以下の群の範囲内での置換である:バリン、グリシン;グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギンaspargine、グルタミン;セリン、スレオニン;リジン、アルギニン;及びフェニルアラニン、チロシン。本発明の別の態様は、本明細書に記載されるとおりの1つ以上の単離β-TCP結合ペプチド、その一部分及びその変異体を含む、それから本質的になる、又はそれからなる組成物に関する。単離されたは、臓器、生体、組織、血液、又は培養培地から単離されるなど、BTCPbpが存在する複合体例えば細胞環境に対して実質的に単離されているBTCPbpを指す。ある場合には、単離材料はまた、組成物例えば、他の物質を含む粗抽出物、緩衝液系、培養系又は試薬混合物の一部を形成し得る。他の状況では、材料は本質的に均一になるまで精製され得る。詳細な態様では、本発明は、アミノ酸配列LLADTTHHRPWT配列番号1、GQVLPTTTPSSP配列番号2、VPQHPYPVPSHK配列番号3、HNMAPATLHPLP配列番号4、QSFASLTNPRVL配列番号5、HTTPTTTYAAPP配列番号6、QYGVVSHLTHTP配列番号7、TMSNPITSLISV配列番号8、IGRISTHAPLHP配列番号9、MNDPSPWLRSPR配列番号10、QSLGSMFQEGHR配列番号11、KPLFTRYGDVAI配列番号12、MPFGARILSLPN配列番号13、QLQLSNSMSSLS配列番号14、TMNMPAKIFAAM配列番号15、EPTKEYTTSYHR配列番号16、DLNELYLRSLRA配列番号17、DYDSTHGAVFRL配列番号18、SKHERYPQSPEM配列番号19、HTHSSDGSLLGN配列番号20、NYDSMRSHG配列番号21、又はANPIISVQTAMD配列番号22、その一部分及び変異体を含むβ-TCP結合ペプチドを含む、それから本質的になる、又はそれからなる組成物に関する。他の態様では、本発明は、LLADTTHHRPWT配列番号1、GQVLPTTTPSSP配列番号2、VPQHPYPVPSHK配列番号3、HNMAPATLHPLP配列番号4、QSFASLTNPRVL配列番号5、HTTPTTTYAAPP配列番号6、QYGVVSHLTHTP配列番号7、TMSNPITSLISV配列番号8、IGRISTHAPLHP配列番号9、MNDPSPWLRSPR配列番号10、QSLGSMFQEGHR配列番号11、KPLFTRYGDVAI配列番号12、MPFGARILSLPN配列番号13、QLQLSNSMSSLS配列番号14、TMNMPAKIFAAM配列番号15、EPTKEYTTSYHR配列番号16、DLNELYLRSLRA配列番号17、DYDSTHGAVFRL配列番号18、SKHERYPQSPEM配列番号19、HTHSSDGSLLGN配列番号20、NYDSMRSHG配列番号21、又はANPIISVQTAMD配列番号22と約70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離β-TCP結合ペプチドに関する。β-TCP結合ペプチドのかかる一部分及び変異体は、本明細書に提供される指針及び当業者に公知のルーチン技術を用いて作製することができる。加えて、本明細書に提供される指針及び当業者に公知のルーチン技術を用いて、β-TCP結合ペプチドのかかる一部分及び変異体を、β-TCPとの結合例えば特異的結合について評価することができる。結合を検出するアッセイの例としては、抗体ベースのアッセイ、細胞ベースのアッセイ例えば、増殖アッセイproliferationssay、ラジオイムノアッセイ、及びカイザータンパク質アッセイが挙げられる。当業者により理解されるであろうとおり、1つ以上のβ-TCP結合ペプチドを1つ以上のβ-TCPに結合させることができる。一部の態様では、1つ以上のβ-TCP結合タンパク質が単一のβ-TCPに結合する。他の態様では、1つ以上のβ-TCP結合タンパク質が1つ以上のβ-TCPに結合する。詳細な態様では、本発明は、少なくとも2つの単位リピート繰り返し単位を含む連結多量体又は連結リピートの組成物に関し、ここで各単位は、β-TCPと結合したβ-TCP結合ペプチドを含む図3を参照。当業者により理解されるであろうとおり、単一の連結多量体の各リピート単位において同じβ-TCP結合ペプチドがβ-TCPと結合することができる。或いは、単一の連結多量体においてβ-TCPと結合したβ-TCP結合ペプチドは、各単位によって異なるものを含んでもよく、又は単一の連結多量体において一部の単位が有するβ-TCPと結合したβ-TCP結合ペプチドが同じものであってよく、且つ他の単位が有するβ-TCPと結合したβ-TCP結合ペプチドが異なるものであってもよい。一部の態様では、組成物は、β-TCPに結合したβ-TCP結合ペプチドを約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20リピート単位含む連結多量体である。特定の態様において、組成物は、β-TCPに結合したβ-TCP結合ペプチドを10リピート含む連結多量体である。本明細書に示されるとおり、本組成物は、β-TCP結合ペプチドと融合した1つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質をさらに含むことができる。すなわち、一態様において組成物は、β-TCP結合ペプチドの全て又は一部と結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPの全て又は一部を含み、ここでβ-TCP結合ペプチドは、1つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質と融合しているそれにより、一価又は多価例えば、二価、三価の設計をもたらす。従って、詳細な態様では、β-TCPに結合しているβ-TCP結合ペプチドと、1つ以上のさらなるタンパク質又はペプチドとの間に融合タンパク質が作成され、それによりさらなる1つ以上のタンパク質又はペプチドがβ-TCPに係留される。他の態様では、組成物は、1つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質と融合したBTCPbpの全て又は一部を含む。当業者により理解されるであろうとおり、様々なタンパク質及び/又はペプチドをβ-TCP結合ペプチドと融合することができる。さらなるタンパク質及び/又はペプチドは、β-TCP結合ペプチドのN末端側端部、β-TCP結合ペプチドのC末端側端部又はβ-TCP結合ペプチド内のいずれかに融合することができる。かかるタンパク質及びその一部分例えばペプチドの例としては、成長因子例えば、上皮成長因子、血小板由来成長因子PDGF、IGF、FGF、TGFTGF-α;TGF-β、サイトカイン骨形成タンパク質BMP、ホルモン、インスリン、及び酵素が挙げられる。具体的な例としては、ヘレグリン、ニューレグリンNRG、例えばNRGβ1、形態形成タンパク質刺激因子MPSF、骨形成タンパク質OP、例えばOP-1、OP-2、OP-3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-13、BMP-15、DPP、Vg1、Vgr、GDF-1、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、マトリックス結合タンパク質、例えばヒアルロン酸結合タンパク質、及びコラーゲン結合タンパク質が挙げられる。一態様において、さらなるタンパク質は上皮成長因子EGFである。特定の態様において、組成物は、β-TCPに結合したβ-TCP結合ペプチドを10リピート含む連結多量体であり、ここで各β-TCP結合タンパク質はEGFと結合している。詳細な態様では、組成物は二価リガンド係留を提供する。例えば、一部の態様では、この設計により、同じタンパク質又はペプチドの二価係留例えば、二価EGF2個のEGF、二価NRG2個のNRG、及び/又は異なるタンパク質又はペプチドの二価係留例えば、二価EGF-NRGが可能となる。分化能を損なうことなく前駆細胞集団を拡大する能力は、再生医学の主要な目的の一つであり、重要な臨床的意義を有する。多くの手技が自家MSC移植に頼るため、患者の天然の前駆細胞集団を増加させて骨創傷治癒を改善することは、重要な目的である。多くの研究が、インビトロ及びインビボでの組織に対するEGFの効果を特徴付けている。EGFは、上皮成長因子受容体EGFRのカノニカルなリガンドであり、この経路を誘導すると、増殖Pinkas-Kramarski,R.etal.EMBOJ15,2452-24671996;Tzahar,E.etal.MolecularandCellularBiology16,5276-52871996;Tamama,K.,etal.,StemCells24,6862006;Griffith,L.G.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences961,83-952002;Muschler,G.P.etal.,TheJournalofBoneandJointSurgery86,154115582004;Bublil,E.M.Yarden,Y.CurrentOpinioninCellBiology19,124-1342007;Citri,A.Yarden,Y.NatRevMolCellBiol7,505-5162006、移動Miettinen,PJ.etal.NatureGenetics22,69-731999;Gibbs,S.etal.WoundRepairandRegeneration8,192-2032000;Tokumaru,S.etal.TheJournalofCellBiology151,209-2202000;Maheshwari,G.etal.,BiophysicalJournal76,2814-28231999、恒常性Tamama,K.,etal.,StemCells24,6862006、及び他のリガンドと共に投与されたときの相乗効果により生じる分化Traverse,S.etal.CurrentBiology4,694-7011994;Freeman,M.Cell87,651-6601996;Miettinen,PJ.NatureGenetics,Vol.1271999を生じさせることができる。このリガンドの広範な効果は、下流シグナル伝達ネットワークの多様性によるもので、従ってEGFは創傷治癒のコンテキストにおいて重要な刺激である。MSCでは、EGFは、コンテキスト特異的な形で複数の細胞挙動に影響を及ぼすことが示されている。EGFは、増殖Tamama,K.,etal.,StemCells24,6862006、骨形成分化Kratchmarova,I.etal.,Vol.3081472-1477米国科学振興協会AmericanAssociationfortheAdvancementofScience,2005、及び生存Fan,V.H.etal.StemCells25,12412007を促進することができる。創傷治癒コンテキストでは、EGFは、術後の骨の発育及び恒常性につながる重要な手がかりとして働き得るWang,K.etal.,JournalofBiologicalChemistry279,538482004;Sibilia,M.etal.Development130,4515-45252003;Qin,L.etal.JournalofBiologicalChemistry280,39742005;Chan,S.Y.Wong,R.W.C.JournalofBiologicalChemistry275,38693-386982000。EGFはまた、MSC挙動の制御因子としての役割を果たすことも示されておりKratchmarova,I.etal.,Vol.3081472-1477米国科学振興協会AmericanAssociationfortheAdvancementofScience,2005;Kuznetsov,S.A.etal.,BritishJournalofHaematology97,561-5701997;Kimura,A.etal.,BritishJournalofHaematology69,9-121988;Gronthos,S.Simmons,P.J.Blood85,929-9401995;Owen,M.E.,骨髄CFU-Fの骨形成分化のインビトロクローン解析ClonalanalysisinvitroofosteogenicdifferentiationofmarrowCFU-F,Vol.87731-7381987;Satomura,K.etal.JournalofCellularPhysiology177,426-4381998、分化を誘導することなくMSCの増殖を生じさせることができるTamama,K.,etal.,StemCells24,6862006。EGFを空間的に制御された形で傷害部位へと、特に臨床的に重要な基材上で送達する実行可能な方法なしには、これらの効果の臨床的有用性を完全に利用することはできない。一つのかかる臨床的に重要な基材はBTCPであり、これは整形外科手技でルーチンに使用されているErbe,E.M.etal.,EurSpineJ10,S141-1462001。BTCPの固有の特性は多くの臨床応用で骨折治癒機転に有利に働くが、移植時に骨形成成長因子BMP-2及びOP-1をBTCPスキャフォールドに加えると、実験動物モデル及び臨床応用の双方で治癒が促進されるFriedlaender,G.E.etal.,Vol.83151-158JBJS,2001。本明細書に示されるとおり、幹細胞及び/又は前駆細胞の供給源例えば骨髄穿刺液を加えて骨形成原細胞の局所的な不足を解消する場合、係留された成長因子、例えばEGFの提示により細胞生存が亢進され、初期前駆細胞の増殖が刺激されたことで、例えばBMP活性の上流のその部位に細胞が集中したFan,V.H.etal.StemCells25,12412007;Marcantonio,N.A.etal.,Biomaterials,3027,4629-26382009;Platt,M.O.etal.JCellPhysiol2009。BTCPに対するPDGFの物理吸着は、インビトロでBTCPスキャフォールド上の骨形成原細胞の増殖を亢進することが示されているが、インビボでの成長因子の喪失は、インビトロで観察されるその喪失よりはるかに速いBateman,J.etal.JournalofPeriodontology76,1833-18412005。本明細書に示されるとおり、整形外科手技用の既存の基材としてのBTCPの有用性は、EGFなどの生物活性成分のβ-TCPに対する安定した付着を可能にする本明細書に記載される表面処理を用いて増強される。BTCPbpは1つ以上のさらなるタンパク質又はペプチドと、直接、又はリンカーの使用によって、融合することができる。当業者により理解されるであろうとおり、様々なリンカーを使用することができる例えば、Hermanson,G.T.,BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego,CA1996を参照。好適なリンカーの例としては、コイルドコイルリンカー例えば、ロイシンジッパーコイルドコイルが挙げられる。本明細書に示されるとおり、本組成物で使用されるリンカーの具体例として、コイルC1又はRR及びコイルC2又はEEが挙げられる。RR又はC1は、アミノ酸配列KGGGLEIRAAFLRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNIVSQYETRYGPL配列番号32を含み、EE又はC2は、アミノ酸配列LEIEAAFLEQENTALETEVAELEQEVQRLENIVSQYETRYGPLGGGK配列番号33を含む。コイルC1は、10-15モル濃度のC2に対する結合親和性を有する。これらの配列の末端リジンkは必須ではなく、共役化学を可能にするために付加した。StevenM.etal.,JBiolChem,28631,27729-277402011年8月5日及びMoll,J.R.etal.,ProteinScience10,6492001を参照のこと。本明細書にさらに示されるとおり、本組成物は、さらなる成分又は薬剤例えば生物活性剤をさらに含み得る。例えば、組成物は、組成物に剛性又は柔軟性を付与するアミノ酸配列などのスペーサーをさらに含み得る。当業者には明らかであろうとおり、本明細書に記載される組成物では様々なスペーサーを使用することができる。本明細書に記載されるとおりのスペーサーの例は、アミノ酸配列:ASGAGGSEGGGSEGGTSGATGA配列番号34を含む可動性のプロテアーゼ耐性リンカーである。これは、最大限の可動性をもたらす親水性のプロテアーゼ耐性非剛体スペーサーである。本明細書に記載されるとおり、一態様において本発明は、BTCPに結合したBTCPbpの全て又は一部を含む組成物に関し、ここでBTCPbpは、1つ以上のさらなるペプチドタンパク質と融合結合していてもよい。他の態様では、本発明は、1つ以上のさらなるペプチドタンパク質と融合結合したBTCPbpの全て又は一部を含む組成物に関する。当業者により理解されるであろうとおり、この組成物の構造は様々な形態をとり得る。例えば、一態様では、組成物の様々な構成要素を以下の方法で、又は以下の順序で連結し得る:iBTCP-BTCPbpn、式中、nはBTCPBpの数1以上である;iiBTCP-BTCPbpn-タンパク質又はペプチドn;iiiBTCP-BTCPbpn-リンカー-タンパク質又はペプチドn;ivBTCP-BTCPbpn-スペーサー-リンカー-タンパク質又はペプチドn;viBTCP-BTCPbpn-スペーサー-リンカー-スペーサー-タンパク質又はペプチドn;viiBTCPbpn-タンパク質又はペプチドn;viiiBTCPbpn-リンカー-タンパク質又はペプチドn;ixBTCPbpn-スペーサー-リンカー-タンパク質又はペプチドn;xBTCPbpn-スペーサー-リンカー-スペーサー-タンパク質又はペプチドn等。詳細な態様では、本発明は、配列番号29を含む組成物、配列番号30を含む組成物及び配列番号31を含む組成物に関する。加えて、本組成物は、1つ以上のさらなる配列例えば、プロテアーゼ耐性配列、制限酵素認識部位;挿入部位、スプライシング領域など、細胞型又は組織をさらに含むことができる。細胞及び/又は組織は、哺乳動物起源例えば、ヒトなどの霊長類、細菌起源例えば、有益細菌などであってもよい。かかる細胞型の例としては、前駆細胞例えば、脂肪由来前駆細胞、幹細胞例えば、間葉系幹細胞MSC、骨髄細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨前駆細胞、上皮細胞、線維芽細胞、及び神経細胞例えば、神経幹細胞が挙げられる。かかる組織の例としては、骨髄、結合組織例えば、腱、軟骨、靱帯、自家骨、皮膚、及び骨膜periostiumが挙げられる。詳細な態様では、ヒト細胞及び/又は組織が用いられ、さらに別の態様では、自家性ヒト細胞及び/又は組織が用いられる。同様に本明細書で示されるとおり、本発明の組成物は、約1000EU/mg、900EU/mg、800EU/mg、700EU/mg、600EU/mg、500EU/mg、400EU/mg、300EU/mg、200EU/mg、100EU/mg、50EU/mg、又は40EU/mg未満のエンドトキシン値で得ることができる。一実施形態において、組成物は、約38.9EU/mgのエンドトキシン値で得ることができる。作製方法β-TCP結合ペプチドと結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPを含む組成物、及びβ-TCP結合ペプチドと融合した1つ以上のさらなるタンパク質又はペプチドをさらに含む組成物の作製は、本明細書に記載される方法及びルーチン技術を用いて実施することができる。例えば、本明細書に記載されるとおり、β-TCPスキャフォールドを作成するため、顆粒化したβ-TCP粉末を焼結し、篩別し、十字の形に加工した。詳細な態様では、β-TCPの純度は、約75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100純度である。他の態様では、β-TCPは同様の方法を用いて、しかしポリラクチド-co-グリコリドPLGAなどの他の薬剤との複合材として作られる。当業者には明らかであろうとおり、本組成物は、本明細書においてポロゲンと称される1つ以上の細孔形成剤をさらに含むことができる。ポロゲンの例としては、塩化ナトリウムなどの無機塩類、糖類例えば、スクロース、グルコース、ゼラチン例えば、ゼラチン球、又はパラフィン例えばパラフィン球が挙げられる。β-TCP結合ペプチドとさらなるタンパク質又はペプチドとの間に融合タンパク質を作成する方法もまた、当業者に周知されている。例えばこれは、1つ以上のさらなるタンパク質又はペプチドをコードする核酸例えばcDNAを、1つ以上のβ-TCP結合ペプチドをコードする核酸を含むフレームにおいて発現ベクターにクローニングすることにより達成することができる。当業者には明らかであろうとおり、様々なリンカーを用いて、β-TCP結合ペプチドをさらなるタンパク質及び/又はペプチドと融合させてもよい例えば、Hermanson,G.T.,BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego,CA1996を参照のこと。好適なリンカーの例としては、コイルドコイルリンカー例えば、ロイシンジッパーコイルドコイルが挙げられる。β-TCP結合ペプチドとさらなるタンパク質又はペプチドとの間の融合タンパク質のβ-TCP上への係留は、例えば、β-TCPを融合タンパク質と接触させて例えばインキュベートして組み合わせを生成し、融合タンパク質のβ-TCP結合タンパク質がβ-TCPに結合する条件下でその組み合わせを維持することにより、達成することができる。医薬組成物本発明はまた、医薬組成物にも関する。一態様において、この医薬組成物は、β-TCP結合ペプチドと結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPを含む。別の態様において、医薬組成物は、β-TCP結合ペプチドと結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPを含み、ここでさらなるタンパク質又はペプチドがβ-TCP結合ペプチドと融合している。さらに別の実施形態において、医薬組成物は、β-TCP結合ペプチドと結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPを含み、ここでさらなるタンパク質又はペプチドがβ-TCP結合ペプチドと融合しており、及びMSCをさらに含む。β-TCP結合ペプチドを含む医薬組成物もまた含まれる。当業者により理解されるであろうとおり、医薬組成物は、医薬組成物を調製する生理学的に許容可能な担体又は賦形剤と共に製剤化することができる。担体及び組成物は無菌であってよい。製剤は、投与方法に適したものでなければならない。好適な薬学的に許容可能な担体としては、限定はされないが、水、塩溶液例えば、NaCl、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトース、アミロース又はデンプンなど、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。医薬製剤は、必要であれば、活性化合物と有害に反応することのない助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、香味料及び/又は芳香物質などと混合されてもよい。本組成物は、必要であれば、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はpH緩衝剤も含み得る。組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、又は散剤であってもよい。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体と共に、坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含み得る。このような組成物の導入方法としては、限定はされないが、皮内、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口及び鼻腔内が挙げられる。本発明の医薬組成物はまた、他の化合物との併用療法の一部として投与されてもよい。組成物は、ルーチン手順に従い、ヒトへの投与に適した医薬組成物として製剤化することができる。例えば、静脈内投与用の組成物は、典型的には滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤及び注射部位の痛みを緩和する局所麻酔薬も含み得る。概して、成分は、例えば活性化合物の量を指示するアンプル又はサシェットなどの密封容器中の凍結乾燥粉末又は水不含の濃縮物として、単位投薬形態で個別に供給されるか、或いは合わせて混合される。組成物が点滴投与される場合、組成物は、滅菌医薬品グレード水、生理食塩水又はデキストロース/水が入った輸液ボトルで分注することができる。組成物が注射投与される場合、成分を投与前に混合し得るように、滅菌注射用水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。局所適用には、局所適用に適合し、且つ好ましくは水より高い動粘度の担体を含む噴霧不可能な形態、粘性乃至半固形又は固形形態が用いられ得る。好適な製剤としては、限定はされないが、溶液、懸濁液、乳剤、クリーム、軟膏、粉末、浣腸、ローション、ゾル、リニメント剤、軟膏、エアロゾル等が挙げられ、これは必要であれば、滅菌され、又は助剤、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液又は浸透圧に影響を及ぼす塩等と混合される。化合物は、化粧品製剤中に組み込まれてもよい。局所適用には、噴霧可能なエアロゾル製剤もまた好適であり、ここで活性成分は、好ましくは固体又は液体の不活性担体材料との組み合わせで、スクイーズボトル中に、又は加圧揮発分、通常はガス噴射剤、例えば加圧空気と混合されてパッケージされる。本明細書に記載される化合物は、中性形態又は塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどの遊離アミノ基で形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどの遊離カルボキシル基で形成されるものが含まれる。化合物は、治療有効量で投与される。特定の障害又は病態の治療において治療上有効となり得る化合物の量は、障害又は病態の性質に依存し、標準的な臨床技術により決定することができる。加えて、場合によりインビトロ又はインビボアッセイを用いることにより、最適な投薬量範囲の同定を促進し得る。製剤中に用いられる正確な用量もまた、投与経路、及び治療する病態の症状の重症度に依存し、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導き出される用量反応曲線から推定され得る。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分の1つ以上が充填された1つ以上の容器を含む医薬品パック又はキットも提供する。場合により、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する行政機関によって規定された形式の通知が、1つ又は複数のかかる容器に付随してもよく、この通知は、その機関によってヒト投与向けの製造、使用又は販売が承認されていること示す。パック又はキットには、投与方法、薬物投与順序例えば、個別的、逐次的又は同時などに関する情報が表示され得る。パック又はキットは、併用療法の単一の単位投薬量であってもよく、又は複数の単位投薬量であってもよい。特に、化合物は、分けられ、任意の組み合わせで共に混合され、単一のバイアル又は錠剤に存在し得る。ブリスターパック又は他の分配手段にまとめられた化合物が好ましい。本発明の目的上、単位投薬量とは、各化合物の個別的な薬力学に依存する、且つ標準的な時間的経過においてFDA承認済みの投薬量で投与される投薬量を意味することが意図される。使用方法本明細書に提供される組成物はまた、様々な方法で使用することができる。一態様において、本発明は、タンパク質及び/又はペプチド例えば、EGF、BMP-2、OP-1を、それを必要としている個体に送達する方法に関し、この方法は、1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合した1つ以上のβ-TCPを含む組成物の有効量を個体に投与するステップを含み、ここで1つ以上のβ-TCP結合ペプチドは、送達しようとするタンパク質及び/又はペプチドと融合している。特定の態様において、本発明は、EGFを、それを必要としている個体に送達する方法に関し、この方法は、β-TCP結合ペプチドと結合したβ-TCPを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここでβ-TCP結合ペプチドはEGFと融合している。組成物は、例えば、骨損傷などの創傷部位に投与され得る。この方法は、MSCを個体に投与するステップをさらに含み得る例えば、約100~約1,000,000MSC/組成物の細胞播種密度で投与される。MSCは、例えば、別個に送達されても、又はβ-TCP結合ペプチドと結合したβ-TCPを含む組成物上に播種されてもよい。別の態様において、本発明は、必要としている個体において骨を修復する方法に関し、この方法は、1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合したβ-リン酸三カルシウムβ-TCPスキャフォールドを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここで1つ以上のβ-TCP結合ペプチドはEGFと融合している。この方法は、個体にMSCを投与する例えば、自家骨移植を受けている個体に自家MSCを投与するステップをさらに含むことができる。本明細書で使用されるとき、骨の修復には、新生骨及び/又は軟骨の形成が含まれる。さらに別の態様において、本発明は、必要としている個体においてMSC増殖を増加させる方法に関し、この方法は、MSC及び1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合したβ-TCPを含む組成物の有効量を個体に投与するステップを含み、ここで1つ以上のβ-TCP結合ペプチドはEGFと融合している。本明細書において考察されるとおり、β-TCPは生体内で骨誘導性材料として使用されており、従って、本組成物をそれを必要としている個体に送達する方法は、当業者には明らかであろう。例えば、組成物は、それを必要としている個体に外科的に移植されても、又は注入されてもよい。組成物は、典型的には治療有効量すなわち、疾患に関連する症状を軽減し、疾患の発生を予防し又は遅延させ、及び/又は、また疾患の症状の重症度又は頻度を低下させることによるなど、疾患を治療するのに十分な量で投与される。特定の個体の障害又は病態の治療において治療上有効となり得る量は、疾患の症状及び重症度に依存し、標準的な臨床技術により決定することができる。加えて、場合によりインビトロ又はインビボアッセイを用いることにより、最適な投薬量範囲の同定を促進し得る。製剤中に用いられる正確な用量もまた、投与経路、及び疾患又は障害の重症度に依存し、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導き出される用量反応曲線から推定され得る。本明細書で使用されるとき、個体とは、動物、及び詳細な態様では哺乳動物を指す。哺乳動物の例としては、霊長類例えばヒト、イヌ科動物例えば飼いイヌ、ネコ科動物例えば飼いイヌ、げっ歯類例えばマウス、ラット、ウマ科動物例えばウマ、ウシ亜科動物、ヒツジ属動物orvineなどが挙げられる。別の態様において、本発明はMSCを培養する方法に関し、この方法は、1つ以上のβ-TCP結合ペプチドと結合したβ-TCPスキャフォールドを含む組成物にMSCを接触させ、それにより細胞培養物を生成するステップを含み、ここで1つ以上のβ-TCP結合ペプチドは、EGFと融合している。この方法では、MSCの様々な播種密度を用いることができる。この方法で用いられる播種密度の例としては、約1000;5000;10,000;15,000;20,000;25,000;30,000;35,000;40,000;45,000;50,000;55,000;60,000;65,000;70,000;75,000;80,000;85,000;90,000;95,000;又は100,000細胞の播種密度が挙げられる。細胞培養物は、MSCが増殖する条件下で維持され、それによりMSCが培養される。特定の態様においてMSCは分化を起こす。従って、この方法は、MSCの分化をアッセイするステップをさらに含み得る。詳細な態様では、MSCは、対照MSC培養物の増殖と比較して約20~約65の増殖の増加を起こす。詳細な態様では、MSCは、対照MSC培養物の増殖と比較して約10、20、30、40、50、60、又は70の増殖の増加を起こす。MSCが増殖する条件下での細胞培養物の維持には様々な方法を用いることができ、それらは当業者に公知である。かかる方法には、細胞培養物を血清飢餓条件下、増殖培地、骨形成培地又はそれらの組み合わせに維持することが含まれる。実施例1BTCP結合ペプチドの発見及び応用BTCP及びBTCP-ポリマー複合材スキャフォールドの作製スキャフォールドは、ThericsAkron,ORにおいて、TheriForm商標3Dラピッドプロトタイピングプラットフォームを使用して、BTCP又はBTCPとポリラクチド-co-グリコリドPLGAとの複合材のいずれかから作製したZeltinger,J.etal.,Tissueengineering7,557-5722001。簡潔に言えば、BTCPスキャフォールドを作成するため、顆粒化したBTCP粉末を焼結し、篩別した。リン酸カルシウムとポロゲンとしてのスクロースとの混合物を含むBTCP粉体層上にバインダーをプログラムされた順序で堆積させることにより、スキャフォールドを十字の形に作製した。次にスキャフォールドを20時間焼結し、1日乾燥させ、2日間浸出させてポロゲンを取り除き、1日乾燥させることにより、5×5×3mmの寸法の十字体を得た図2B。各移植片は約60の多孔性で、平均細孔直径が60ミクロン及び細孔直径範囲が5~900ミクロンであった。内部構造は開放型の海綿状構造を示した図2B。複数の十字体を詰めると、充填空孔率は約83である。化学的には、スキャフォールドは>95BTCPで、残りの部分は他の吸収性のある形態のリン酸カルシウムであった。PLGA及びBTCP粉末をポロゲンと混合することにより、複合材BTPC-PLGAスキャフォールドを同様の方法で作製した。BTCPスキャフォールドに対するファージディスプレイBTCPスキャフォールドを砕いて粉末状にし、121°Cで35分間オートクレーブ処理し、全ての実験まで乾燥滅菌条件下に保存した。得られた滅菌BTCP粉末を、滅菌ろ過したサケタンパク質緩衝液Licor又はリン酸緩衝生理食塩水中5ウシ血清アルブミンBSA,Sigmaのいずれかにより、穏やかな撹拌下に4°Cで24時間ブロックした。ブロックしたBTCP粉末を、2000RPM、2分間でペレット化し、PBSで3回洗浄した後、NewEnglandBiolabs線状12merPh.D.キットAndover,MAを使用して3ラウンドのファージディスプレイに供した。直交性にブロックしたBTCPすなわちサケタンパク質に対してBSAでブロックしたが、ブロッキング緩衝液の成分に対するパニングとの対照を提供した。さらなる対照には、粉末状に砕き、同様にウシ血清アルブミンBSA又はサケタンパク質緩衝液でブロックしたβ-TCP/PLGA複合材スキャフォールド、並びにチューブ成分に対するパニングとの対照をとるためのモックチューブを含めた。3ラウンドのパニング後、各条件から10プラークを取り、増幅し、次に配列決定したモック条件及びBSAでブロックしたBTCP/PLGAは、それぞれ第2ラウンド及び第3ラウンド後にプラークを生じなかった。JalView多重配列アラインメントエディターを使用して、配列をコンセンサスについて解析したSchuler,G.D.,Altschul,S.F.Lipman,DJ.多重アラインメント構築解析ワークベンチAworkbenchformultiplealignmentconstructionandanalysis.Proteins:Structure,Function,andGenetics91991;Clamp,M.etal.,GJ.,Vol.20426-427OxfordUnivPress,2004。図3は、アラインメントした配列を示す。突然変異生成第3ラウンドのファージディスプレイパニングから最も高順位に位置づけられた配列LLADTTHHRPWT配列番号1を、PCR突然変異生成及び短鎖プライマーを使用してpMAL発現カセットに逐次クローニングすることにより、上皮成長因子と融合した多量体挿入のライブラリを作成した図3。PCR突然変異生成は、StratageneEugene,ORからのQuickchange登録商標LigthtningIIキットで実施した。様々なエピトープが融合したヒト上皮成長因子を発現するpMAL-c2XベクターNewEnglandBiolabsを構築した。図14A~図14Fを参照のこと。PCRプライマーは、完全にBTCP結合ペプチドコード領域内でプライミングするように設計し、従って単一のPCR突然変異生成ラウンドにおける複数の挿入が可能となった。多量体クローンを配列決定することにより標的配列とのDNA同一性を確認し、BL21DE3pLysS大腸菌E.coliに形質転換し、アンピシリンLB寒天に播いた。評価したライブラリには、TCPBPn=1、2、3、5、8、及び10のクローンが含まれた。タンパク質発現OD0.6まで37°Cで成長させ、次にIPTGで誘導して22°Cで4時間インキュベートした1LのLB培養物において、1mer、2mer、3mer、5mer、8mer、及び10merのTCPBP配列LLADTTHHRPWTのクローンを発現させた。培養物を4°Cで30分間、AllegraG3.8ロータにおいて3700RPMでペレット化し、次にペレットを-80°Cで一晩凍結し、続いてPMSF及びプロテアーゼ阻害薬カクテルSigmaを補足したBugbuster試薬EMDChemicalsを使用して細胞を溶解することにより、タンパク質を回収した。溶解した細胞を4°Cで1時間、AllegraG3.8ロータにおいて3700RPMで遠心した。次に上清をトリス緩衝生理食塩水に1:4希釈し、製造者の指示NewEnglandBiolabsに従いマルトース結合タンパク質アフィニティークロマトグラフィーに供した。プール画分を50,000分子量カットオフMWCO膜のV-tube濃縮機Novagenでの限外ろ過に供し、リン酸緩衝生理食塩水PBS中に2回交換した。濃縮したタンパク質を0.2ミクロンフィルタで滅菌ろ過した。SDS-PAGEクーマシー染色commassiestainingにより純度を確認した。NanodropA280分光光度計でタンパク質の定量化を実施した。濃縮したタンパク質は、使用時まで-80°Cで保存した。中程度の結合親和性を示した1mer及び2merでの先行試験の結果に基づき、さらなる評価用に3mer、5mer、及び10merを選択した。BTCPスキャフォールドに対するTCPBP-EGFの係留及び結合特性の決定BTCPスキャフォールド又は篩別した純粋なBTCP粉末をサケ血清緩衝液で1時間ブロックし、次にサケ血清緩衝液に希釈した精製TCPBPタンパク質において室温で2時間インキュベートした。インキュベーション後、スキャフォールド又は粉末を3容量の20mMトリス緩衝生理食塩水pH7.4において3回洗浄し、続いて最終洗浄してPBS中に保存した。図4に示されるとおりFITC-抗HISタグ抗体及びヤギ抗hEGFRD一次及びTMR-抗ヤギ二次を使用して、蛍光顕微鏡法により結合の定性的評価を実施した。TCPBP領域LLADTTHHRPWTnを除くTCPBP配列の全てのエレメントを組み込む対照タンパク質を、全ての実験における非特異的結合についての陰性対照として使用した図4、右下。多量体挿入を増やすことにより結合親和性が増加するかどうかを決定し、及びその効果が限界値に達するかどうかを決定するためには、TCPBPの連結多量体の各々の結合特性を決定する必要がある。3-多量体、5-多量体、及び10-多量体のTCPBPの段階希釈物を、上記に記載したとおりBTCPとインキュベートした。次にPBSにおいてスキャフォールドを洗浄し、スキャフォールドをpH2.2のグリシン緩衝液で1時間インキュベートすることにより結合タンパク質を溶離させ、溶離液中のTCPBPの量を、LicorOdyssey赤外線フラットベッドスキャナで読み取るウエスタンブロットフォーマットを用いたIRdye免疫蛍光法で定量化した。この分析の結果は図5A~図5Dに示す。TCPBP結合親和性は、予想どおり、多量体数に強い依存を示す。親和性の相対的変化は、図5C及び図5Dに示す。TCPBPnインキュベーション濃度の関数としての反応シグナルの傾きから、所与の濃度における親和性を反映する維持されたタンパク質の相対的な指標が得られる。図5Dは、リピート数が相対的親和性に強く依存することを示している。図5A~図5Cに示される多量体結合スクリーニングに基づき、10merのTCPBPをさらなる実験に選択した。TCPBP10の段階希釈物を上記に記載したとおり処理した35mgのインタクトなTCPスキャフォールドとインキュベートすることにより結合の定量分析を実施し、LicorOdyssey赤外線フラットベッドスキャナで読み取る定量的スポットブロットフォーマットを用いて分析した。この分析の結果は図6A~図6C及び図7A~図7Cに示す。結合タンパク質の量を定量化するには、試料及び対照タンパク質の双方について標準曲線を作成する必要があった。図6A~図6Cは標準曲線の結果を示す。各曲線を作成するため、既知量のTCPBP10又は対照図4に示されるとおりのC1タンパク質、右下を4レプリケートでニトロセルロース膜にブロットし、上記に記載される方法を用いてプローブした。得られたシグナルは、曲線の高い方の端部で飽和し始める単調増加シグナルを生じた図6B。この曲線の最初の6点は線形範囲であり、標準曲線の作成に使用した。双方のコンストラクトでプローブしたエピトープは同じであったため、対照及び試料タンパク質がいずれも同じ傾きの標準曲線を生じたことは意外ではなかった。この標準を用いて正確に定量化することができるタンパク質の範囲は、0~900ng/μLスポットであった。BTCPに対するTCPBP10結合の分析を図7A~図7Cに示す。標準曲線により、結合タンパク質の直接的な定量化及び結合曲線図7Bの作成が可能となった。この分析から、2.3uMの結合定数kDの推定値が求められた。結合曲線はまた、ヒル係数が2.3のアビディティも示した。これは、多量体タンパク質相互作用と整合した。5点圧力分析を用いたBTCPスキャフォールドのブルナウアー-エメット-テラーBET分析から、0.8m2/gのN2接触可能表面積が明らかとなった。これにより、図7Cに示されるとおり最小表面数密度を推定することができた。細孔径分布によりEGF-TCPB10がスキャフォールドの特定の領域に接触することが妨げられた場合、EGF-TCPB10が接触可能な表面積は完全なN2接触可能表面積未満であった。本分析の目的上、この効果によって生じる差異は無視できるものとした。図7A~図7Cにおけるデータは、特徴的なEGFR発現レベルと併せて考えると、係留されたEGF-TCPB10の面密度が、MSCを最高レベルで刺激するのに十分な程度を超えていたことを示している。例えば、1μMの係留溶液濃度では、係留された表面数密度は200EGFTCPBP10/μm2であった。ある播かれた細胞がその基質と接触する表面積を約500ミクロン2有すると、その細胞は約100,000個のEGF分子に露出することになる。比較すると、典型的なMSCは10,000個のEGFRを発現する。それらのうち大きい割合が、数分の間に係留EGFに遭遇し得る。このシステムではEGFは基材表面に制約され、可溶性EGFのように自由には拡散せず、従って受容体リガンド相互作用の動態は、可溶性の場合から直ちに類推されるものではない。EGFTCPBP10表面結合を予備的に特徴付けたことにより、臨床的に関連性のある細胞型に対する細胞効果を分析することが可能となった。次に、EGFTCPBP10で処理したBTCPスキャフォールド上での低い継代数P3のプライマリヒト間葉系幹細胞の培養を調べた。細胞培養全ての細胞培養実験前に、継代2代目のプライマリヒト間葉系幹細胞テキサスAM健康科学センター医科大学再生医学研究所TexasAMHealthScienceCenterCollegeofMedicine’sInstituteforRegenerativeMedicineからのものを培養増殖することにより、十分な数の継代3代目MSCを提供した。増殖培地は、2mMのL-グルタミン、16.5ウシ胎仔血清、及びペニシリン/ストレプトマイシン最終濃度100単位/ml及び100μg/mlストレプトマイシンを含むαMEMからなった。骨形成培地は、192mlの増殖培地、10nMのデキサメタゾン20μlのMQ水中1mMストック1:10希釈物、20mMのβ-グリセロールリン酸8mlの増殖培地中0.5Mストック、及び50μMのL-アスコルビン酸2-リン酸200μlのMQ水中50mMストック溶液からなった。滅菌BTCPスキャフォールドを、EGFTCPBP10で処理した、又は処理しないままとしたサケ血清緩衝液でブロックし、個別に96ウェルプレートのウェルに播いた。1,000~50,000個の細胞記載のとおりを、ウェルあたり200/μLの血清含有培地hTMSC又は増殖培地プライマリMSCにおいてスキャフォールド上に直接播種した。播種した細胞を24時間インキュベートし、次に新鮮な培地が入った隣接するウェルに移すことによって、スキャフォールド上に播種されなかった細胞の効果を除いた。この方法の播種効率は、スキャフォールド上及び残りのウェル中の双方の細胞をカウントして決定するとき、一貫して40であった次節に記載する。増殖アッセイAlamarBlue登録商標アッセイBiosourceEurope,NivelleBelgiumを用いて、播種後の様々な時間点で細胞増殖を決定した。各時間点で、製造者の指示に従いAlamarBlue登録商標色素試薬を骨形成培地又は増殖培地のいずれかと混合した。計測毎に6つの生物学的レプリケートを播種した。次に係留BTCPスキャフォールドを、MDVシリーズのフィルタプレートアダプタMillipore,Bedford,MAに取り付けた紫外UV滅菌済みFalcon商標96ウェルプレートBectonDickinsonandCo.,NJUSAに移した。次にAlamarBlue登録商標色素試薬を、係留BTCPスキャフォールドが入った各ウェルに添加し、次に37°C、5CO2で4時間、20分毎に手動で穏やかに混合しながらインキュベートした。次にフィルタプレートユニットを1000RPMで2分間遠心した。この方法により、色素-培地混合物を完全に回収することができた。得られた色素-培地混合物の100uLを収集プレートユニットから新しい平底96ウェルプレートに移し替え、SpectraMax登録商標M2eマルチウェル蛍光プレートリーダーMolecularDevicesCorp.CA,USAにより570nmの励起波長及び585nmの放出波長で読み取った。既知の数の細胞に関して、12ウェルプレートに播き、それぞれの時間点に対応するように1日間、4日間、又は7日間培養して同じアッセイを行うことにより、標準曲線を求めた。AlamarBlue登録商標アッセイは非破壊式であるため、AlamarBlue登録商標シグナル応答を実際の細胞数に較正するために、ViCell商標血球計Coulterで細胞を直接カウントすることが可能であった。従って、各培養条件増殖培地EX及び骨形成培地OS及び最長7日の各日数時点についての標準曲線を作成することにより、ばらつきの大きさを評価した。様々な条件下で代謝率は異なり得る。図8に示されるとおり、各標準曲線の傾きは、当該の条件における細胞の代謝活性の指標であった。異なる日数におけるEX系列の傾きのばらつきから、当該の細胞において数日間続き得る播種後の代謝に変化が起きることが示された。OS培地下では、1日目のEXと比較して傾きは大幅には変化しなかった播種条件。各培養条件及び時間点についてのそれぞれの傾きを用いて、AlamarBlue登録商標データを対応する3Dスキャフォールド条件から細胞数に変換した。14日目及び21日目培養物は、それぞれの7日目の傾きを使用した。14日目及び21日目の標準曲線は、これらの時間点における高いコンフルエンス及び細胞死のため、信頼性がなかった。MSC増殖に対する細胞播種密度及びtEGF用量の影響多くの哺乳動物細胞の生存及び増殖は、局所細胞密度に強い依存を示す。細胞は様々なオートクリン因子を分泌し、これらのオートクリン因子は低い細胞密度で生存及び増殖を亢進し、及び高い細胞密度で増殖を阻害する。高い細胞密度でオートクリン因子の濃度が上昇すると、tEGFは細胞増殖を亢進するものと予想されたが、極めて低いプレーティング密度でtEGFが細胞を保護できるかどうか、又は高密度での阻害に打ち勝つことができるかどうかは不明であった。従ってある範囲の細胞播種密度及びtEGFの表面係留密度を用いて、MSCのtEGFに対する増殖応答を評価した。典型的な時間的経過における増殖プロファイルに対する播種密度の効果をスクリーニングすることにより、その後の実験で用いるのに好適な密度を選択することが可能であった。加えて、BTCP上のEGFの面密度が細胞の増殖応答に影響を及ぼすことが予想された。EGFは、2DではEC50前後の濃度1nMで細胞増殖に対して二相性の効果を及ぼすことが観察されている。本明細書に記載されるシステムでは、EGFは表面に係留され、等価なEC50は実験的に決定できるのみであった。この実験の目的上、図9に示されるとおり用量反応の代用として細胞増殖を用いた。200ul各スキャフォールドの播種に使用した容量あたり1,000;25,000、及び50,000細胞の細胞播種密度を増殖培地で評価した。図9において、増殖に対する播種密度の効果は50,000細胞レベルで明らかに認められた一番右のプロット。4日目に細胞数の大幅な減少が認められ、7日目までに回復している。この効果は、25,000細胞播種レベル中央のプロットではそれほど顕著でなく、1,000細胞播種レベルでは明らかでなかった。これらの結果に基づき、スキャフォールドあたり30,000細胞の播種密度を選択した。この播種レベルが、増殖における望ましくない二相性効果と他の分析用に十分な細胞材料qRTPCR用のRNA又はアルカリホスファターゼ活性用のタンパク質などを得るために要する時間との間の良好な妥協点であった。全ての細胞播種密度において、7日目までに細胞増殖は表面EGFTCPBP10係留密度に関して二相性の関係を示し、見かけの最大は1.8μM係留濃度であった。これは400個のEGF分子/μm2に対応した。これらの結果に基づき、係留について1μMのEGFTCPBP10濃度を選択した。係留EGFの増殖及び骨形成分化に対する効果の詳細な調査を実施した。これを次節に記載する。3DBTCPスキャフォールドにおけるプライマリMSC増殖に対するtEGFの効果EX及びasの双方の培地におけるMSC増殖に対するtEGFの効果の詳細な試験結果を図10に示す。スキャフォールドあたり30,000の細胞播種密度及び1μMEGFTCPBP10の係留濃度を用いた。EX培地では、MSCは7日目に対照と比べて約50の増殖増加を示した。14日目には、この効果はもはや明らかでなく、tEGFと対照との間に有意な差はなかった。14日目にこのように同等となったのは、高い細胞密度でのスキャフォールドの担持可能量によってもたらされた可能性が高い。スキャフォールドあたり400,000細胞を超えると、拡散輸送が限界となり、それによりEGF刺激性の増殖に制約がかかる可能性が高い。OS培地では、tEGFの効果はより顕著であった。7日目及び14日目、tEGFは対照と比べてそれぞれ62及び25の増加を生じた。3Dスキャフォールドにおける利用可能なMSCの増加は、自家MSCが用いられ得る場合にMSCの不足によって手技の範囲が限られる臨床状況では、特に興味深い。創傷部位でMSCの数が20~60増加すると、転帰が大幅に改善され、現行の方法と同じ数を実現するのに低い播種密度を利用することにより治療し得る欠損のサイズが大きくなる。分化アッセイMSCが骨形成分化を生じる能力は、そのような細胞の効力の評価に有用な基準である。初期骨形成分化は、典型的には誘導細胞のアルカリホスファターゼ活性を非誘導細胞と比較することにより計測される。後期のマーカーには、定量的結果が得られるqRTPCRにより計測するときの骨形成転写物のパネルが含まれる。さらに後には21日、沈着したカルシウムを染色するアリザリンレッド染色などの石灰化アッセイが用いられ得る。カルシウム含有スキャフォールドでの3D培養によって課される限界を考慮して、骨形成誘導の評価にはアルカリホスファターゼアッセイ及びqRTPCRに焦点を合わせた。p-ニトロフェノール比色アッセイを用いてアルカリホスファターゼ活性を計測した。スキャフォールドをPBSで2回リンスし、続いて凍結-融解を2サイクル行った-70°Cで20分間、続いて25°Cで10分間。同じ条件からの2つのスキャフォールドをエッペンドルフepindorf管に添加し、次にピペット先端によって手動で砕いた。各管に1mmol/LMgCl2中0.2NP-40を200μl添加することにより、細胞を溶解した。管を適度に振盪しながら4°Cで15分間インキュベートした。水浴中で5分間音波処理した後、試料を13,000RPMで5分間遠心した。上清を溶解緩衝液でl0倍希釈及び100倍希釈した。希釈試料ライセート及び溶解緩衝液を96ウェルプレートに入れ、全てが溶解緩衝液の試料をバックグラウンド対照として使用した。2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、1.5mol/L、pH10.3、258CSigma,Q17とp-ニトロフェニルリン酸二ナトリウムのストック基質溶液Sigmaとの1:1溶液を試料に添加し、37°Cで30分間インキュベートし;水酸化ナトリウムを添加して反応を停止させた。SpectraMax登録商標M2eマルチウェル蛍光プレートリーダーMolecularDevicesCorp.CA,USAを使用して405nmの吸光度を読み取った。ブランク対照からのバックグラウンドシグナルを、全読取り値から減じた。水酸化ナトリウム中のp-ニトロフェノールの段階希釈物を使用して、U/mL単位で標準曲線を作成した:単位は、37°Cで毎分1mmolのp-ニトロフェノールの遊離を触媒する酵素の量として定義される。結果はBCAアッセイPierceを用いて総タンパク質量により正規化した。可溶性EGF及び/又は係留EGFを含む及び含まないEX培地及びOS培地で成長させたMSCの7日目のアルカリホスファターゼ活性ALPを、図11に示すとおり比較した。OS陽性対照とOStEGFとは、予想どおり同等のレベルを生じ、これらが種々の条件中で最も高かった。1ng/mLの可溶性EGFを添加すると、骨形成培地の効果が消失し、EX陰性対照と同等の活性がもたらされた。興味深いことに、OstEGF条件に可溶性EGFを添加すると、全体的なALP活性が約40低下した。この結果から、表面係留EGFが骨形成誘導能力の維持によってsEGFと比べたときの優位性を提供するという先の観察が裏付けられた。定量的qantitativeリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応q-RTPCRq-RTPCRに好適な一組の骨形成マーカーを、骨形成分野の既刊文献及び先行研究に基づき選択したPlatt,M.O.etal.JCellPhysiol2009;Ziros,P.G.etal.JournalofBiologicalChemistry277,23934-239412002;Termine,J.D.etal.Cell26,99-1051981;Gao,Y.etal.,Gene341,101-1102004;Bradshaw,A.D.etal.,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences100,6045-60502003。骨形成に特に関連がある4つのマーカーを、以下で考察する。RUNX2は、機械的ストレスを受けた前骨芽細胞において上方制御される転写因子であり、骨形成活性の信頼できる指標である。骨芽細胞におけるRUNX2活性化には伸展依存性及び伸展非依存性の双方があり、この活性化がマイトジェン活性化プロテインキナーゼMAPKカスケードを引き起こす。RUNX2とpERK2との間の相互作用によりRUNX2活性が増強されるZiros,P.G.etal.JournalofBiologicalChemistry277,23934-239412002。tEGFによってHER1を介してpERK1/2が刺激されると、単純にpERK2が上方制御することによって伸展非依存性機序によりRUNX2活性が増幅し得る。従ってtEGF処理スキャフォールド上で培養されるMSCのRUNX2活性の上方制御を観察すれば、共通のERKシグナル伝達ノードを所与として少なくとも1つの機構的説明が示され得る。オステオカルシン骨γ-カルボキシグルタミン酸タンパク質は、石灰化した骨基質に関連する小タンパク質である。Hoangは、オステオカルシンが、天然骨のヒドロキシアパタイト結晶格子中のカルシウムイオンを補完する配向で5個のカルシウムイオンを配位する負電荷の表面を含むことを見出したHoang,Q.Q.etal.,Nature425,977-9802003。オステオカルシンはRUNX2の下流にあり、RUNX2の上方制御後に上方制御された状態になることが示されているMikami,Y.etal.,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications362,368-3732007。オステリックスSP7は、ジンクフィンガー転写因子であり、且つRUNX2の下流で働くと報告されている骨細胞分化の制御因子であるGao,Y.etal.,Gene341,101-1102004;Matsubara,T.etal.JournalofBiologicalChemistry283,291192008。このエビデンスは、図12に見ることができる下側のプロット。ここで、4日目のtEGF条件下における初期RUNX2上方制御後の14日目のオステリックスの再発現は、この効果が現れたものと思われる。オステオネクチンは、細胞周期進行を阻害し、且つ細胞形態の変化を誘発するマトリックスタンパク質である。オステオネクチンはまた、骨形成状況での細胞外マトリックスの合成に対しても影響を及ぼしBradshaw,A.D.etal.,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences100,6045-60502003、骨コラーゲンが石灰化を起こす能力を担う遠位部位でヒドロキシアパタイト及び膠原繊維に結合するTermine,J.D.etal.Cell26,99-1051981。3DBTCPスキャフォールドを、上記に記載したとおり1μMのEGFTCPBP10で処理し、スキャフォールドあたり30,000細胞で播種した。示される時間点において、QiagenRNEasyPlusIIキットを使用して条件あたり9個の生物学的レプリケートからRNAを回収したスキャフォールドは3個の生物学的レプリケートにプールした。得られたRNAを定量化し、等濃度に正規化し、次にQiagenSybrgreenQuickキットを使用して2段階q-RTPCR反応に供し、光センサトップを備えたChromoph04サーマルサイクラーで実行した。各生物学的レプリケートを3つの技術的レプリケートに分割した。各ランが終わる度に融解曲線を分析し、汚染生成物が存在しないことを確認した。各遺伝子用のプライマーは、QiagenQuantitectプライマーバンクから入手した。図12に示されるとおり、4つ全ての遺伝子産物が、tEGF条件で14日目に統計的に有意な上方制御を示した。5倍のRUNX2の初期上方制御が、オステオカルシン及びオステリックスなどの下流因子の初期上方制御因子として機能したと考え得る。14日目におけるオステオネクチンの6倍の上方制御は、後の時間点で予想され得たとおりのマトリックス沈着の増加を示すものである。7日目で最大となるオステオカルシン、オステリックス、及びRUNX2の二相性発現は、増殖データに認められるとおり図10、細胞周期進行が増殖へと変化したことを示すものであり得る。3D細胞培養における主要な骨形成因子の発現に対するtEGFの効果は、特に増殖に対する効果を考慮するとき、有望な結果である。これらの結果をまとめると、tEGFが初期骨形成分化を損なうことなくMSCの増殖を大幅に増加させるという強い示唆が得られる。htMSCを使用した長期生存アッセイMSC上での生存に対するtEGFの影響については、既に本明細書及び文献に記載がある。3D組織培養におけるこれらの結果を裏付けることにより、これらの結果を臨床的に関連性のある状況に拡張することが可能となり得る。以下の節では、tEGFの効果を評価するために設計した長期hTMSC生存アッセイについて記載する。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素不死化ヒト間葉系幹細胞htMSC又はhtertMSCを、htertMSCには10ウシ胎仔血清、及びプライマリヒトMSCには16.5、2mML-グルタミン酸塩、ピルビン酸Na、非必須アミノ酸補助剤、及びペニシリン/ストレプトマイシン最終濃度100単位/ml及び100μg/mlストレプトマイシンを補足したダルベッコ変法イーグル培地でルーチンに培養した。指示する場合に特定の実験では、この培地から血清を省いた。tEGF処理スキャフォールドの核染色及び組織学的分析の双方により、3DBTCPスキャフォールドへの細胞侵入量及び23日目の相対的生存効果の顕著な差が明らかとなった。図13A~図13Bに観察されるこの著しい差は、広範囲に及ぶ創傷サイズが細胞生存にとって極めて過酷な条件を呈し得る手術状況において一層関連性が高いものと思われる。過酷な創傷環境において既にまばらにしかないMSCのレスキューには、多大な臨床的有益性がある。結論本明細書に記載されるこの研究は、EGFを係留したBTCPスキャフォールド上で培養されるMSCが未処理のスキャフォールド上で培養されるMSCと比べて高率で増殖し、及びこの増殖の増加はMSCの初期分化能を損なわないことを実証する。重要なことに、可溶性EGFは同じ優位性をもたらさないことが示されており、従ってマトリックスに結合したリガンドとして提供されるときのEGF生物活性の調節が示唆される。また、係留EGFが、血清飢餓などの極限条件下で培養されるときのhtMSCに強い生存優位性を付与することも明らかである。本明細書に記載される方法を用いて生物活性成分をBTCPスキャフォールドの表面に安定的に係留する能力により、組織再生の広範囲の基礎研究が可能になるとともに、臨床的に有用な手法がもたらされ得る。一つの特定領域は、再生骨の血管新生及び骨軟骨界面の再生などの空間的に誘導される組織再生の領域である。実施例2BTCP結合ペプチドの特性決定及び修飾BTCPを含むスキャフォールドにEGFを結合する場合の臨床解釈に対処するため、ファージディスプレイを含めたプロテインエンジニアリング手法を用いて、BTCPに対して高親和性結合を示すペプチドとのEGFの融合タンパク質を作成した;これらの2つの部分をプロテアーゼ耐性スペーサーにより分離し、EGFの接触可能性を高めた図28及び図29を参照。タンパク質の収率及び特性の改善を図るために用いる特異的タンパク質配列の連続的な繰り返しを調べた;修飾には、精製部分の性質及びスペーサーの組成が含まれた。また、いくつかの精製戦略を研究した。配列及び精製戦略を定義し、ここでこの戦略の重要な一面は、<1000EU/mgに設定されている商業規格の10倍低い38.9EU/mgのエンドトキシン値である最終生成物を生成するようにエンドトキシンを除去するステップ表を含むことであった。この生成物、EGFと融合したBTCP結合ペプチドBTCPbp10-C1-EGFを、再現性よく作製及び精製することにより、低エンドトキシン生成物を提供した。また、BTCP-C1-EGF融合タンパク質のBTCP骨スキャフォールドとの連係の安定性に関する懸念にも対処した。市販のBTCP骨空洞充填材スキャフォールドIntegraLifeSciencesと結合したBTCP-C1-EGFについてのこの連係の安定性を、飽和濃度で吸着したタンパク質を使用して、且つPBS上清中にタンパク質を5日間放出させた後に計測した。飽和濃度2~4uMを決定した図22、図23、図24。この実験は、時間点毎にn>3個のスキャフォールドで行った。さらに、再現性についてエビデンスを提供するため、同じバッチからのタンパク質を使用した実験を繰り返した。この反復実験から、統計的に区別できない結果が得られ、>90の精製EGF融合タンパク質が5日間の期間にわたりスキャフォールドに維持されることが示された図15及び図16、表2及び表3。これらのデータは、10件を超える別の実験におけるこのタンパク質の生物学的効果と整合し4,6,10、そこでは5日以上の培養期間におけるMSC成長又はコロニー形成の増加が認められた。表3に、5日後のタンパク質放出に関するデータを要約する。これらのデータは、5日の間に約1~2の係留タンパク質が放出されることを示している。参考までに、各3mmTCPスキャフォールドは、これらの係留濃度で平均して約0.9~1マイクログラムのタンパク質を結合するが、5日の間に溶液中に放出されるタンパク質は15ナノグラム0.015マイクログラム未満である。これは、非常に強力な結合であることを示している。この融合タンパク質は、骨髄由来の間質細胞が生体内移植に関連性のある精製された形態である場合に、それを移植することによる生体内での組織再生に関連性のある著しい生物学的効果を有する。TCP結合ペプチドとb-TCP基材材料との間の結合に加え、別の相互作用が存在し、これは、記載されるタンパク質のそのTCP基材に対する全体的な親和性を増加させるのに重要である。これはアビディティ相互作用によって達成される。コイル領域C1コイル又はC2コイルのいずれかはホモ二量体化する。C1-C1ホモ二量体化親和性は2.5E-7モル濃度であり、C2-C2ホモ二量体化親和性は4.4E-5モル濃度である。このホモ二量体化は、コイルドコイル相互作用によって隣接するタンパク質を結合することにより、TCPに対するTCP結合ペプチド含有タンパク質の結合を補完することができる。この相互作用により、TCP表面に対する隣接タンパク質のTCP結合ペプチドの滞留時間及び局所有効濃度が増加し、従ってアビディティ相互作用が生じる。これは図30に示す。図25~図27は、各種コイルC1又はC2を用いることで得られる結合の差を説明する。示されるとおり、C1コイルを含むタンパク質構築物は、アビディティ効果により、b-TCPに対してより高い結合親和性を示す。方法BTCPbp-C1-EGFタンパク質の生成及びエンドトキシン除去ファージディスプレイによってBTCP結合ペプチドを見出し、EGFと融合したBTCP結合ペプチドを大腸菌E.coliで生成し、精製した。計画されたインビボ研究のため、さらなる精製によるエンドトキシン除去を用いた。エンドトキシンを除去するためのオンカラムアミロースカラム法を、既発表のプロトコルCheng,HT,etal.,ProteinExprPurif,611:65-722008に基づき設計した。簡潔に言えば、この方法は、界面活性剤TritonX-114を含有する大量のカラム緩衝液でアミロース樹脂結合BTCPbp-C1-EGFを洗浄し、次にカラム緩衝液で洗浄して過剰なTritonX-114を除去することを伴った。クリーブランドクリニックラーナー研究所リサーチコアサービシーズResearchCoreServicesoftheLernerResearchInstituteattheClevelandClinicにおけるセントラルセルサービシーズCentralCellServicesのメディアプレパレーションラブMediaPreparationLabによるLALアッセイにより、最終生成物のエンドトキシン値を決定した。この施設はストリンジェントなQCプログラムを有し、ラーナー研究所LernerResearchInstituteの研究者によって提供されるあらゆる培地、溶液、ブロス、緩衝液及び試料のエンドトキシン及びマイコプラズマの計測を担っている。BTCPスキャフォールドへのBTCPbp-C1-EGFの吸着及びそこからの放出精製したエンドトキシン不含BTCPbp-C1-EGFのストック溶液を、PBS中に飽和濃度2~4uMとなるよう希釈した各実験の正確な値についてはデータを参照。3mm十字の形のBTCPスキャフォールドをIntegraLifeSciencesから入手し、96ウェルプレートのウェルに置き、BTCPbp-C1-EGF溶液と共に150rpmで振盪しながら4°Cで36時間インキュベートした。係留後、スキャフォールドをPBSで2回リンスし、新鮮なPBS溶液に入れ、4°Cで0時間、24時間又は5日間保存した。安定性を計測するため、3つの時間点0日、1日、5日の各々につき4つのレプリケート十字体を規定の時点でPBSから取り出し、PBSで2回リンスした。当初は結合したファージをBTCPから剥ぎ取るために用いられた標準的なプロトコルNEB,Ph.D.商標-12ファージディスプレイペプチドライブラリ;www.neb.com/nebecomm/manualfiles/manuale8101.pdfに従い、変性0.2Mグリシン緩衝液、pH=2.2を使用して結合タンパク質を遊離させることにより、各十字体と連係したEGFの量を評価した。このプロトコルにより、タンパク質がBTCPの表面から完全に剥がれた。Integraから受け取った3mmBTCP十字体は、質量に16のばらつきがあった十字体あたり11.9±1.9mg、N=10。十字体質量のばらつき及び溶液中での部分的な崩壊に起因する質量の損失が、係留BTCPbp-C1-EGFの最終的な測定における約20の誤差に寄与した。この誤差は定量化アッセイとは無関係で、係留に利用可能なBTCP十字体の表面積が質量損失に起因して変化することによるものであった。BTCPスキャフォールドから放出された係留BTCPbp-C1-EGFのドットブロットアッセイによる定量化主な論点は、どれだけのEGFがスキャフォールドと連係したまま残るかであったため、BCA感度=5ng総タンパク質量/uLなどの比較的感度の低い非特異的な総タンパク質量アッセイから活性タンパク質の量を推測するのでなく、高感度のドットブロット免疫測定法プロトコル感度=0.078ngのEGF/uLを用いてEGFを直接計測した。簡潔に言えば、グリシン緩衝液によりBTCPスキャフォールドから放出された係留BTCPbp-C1-EGFを、BTCPbp-C1-EGF標準と共にニトロセルロース膜に滴下した2uL/スポット。スポットあたり0.156ng~10ngの範囲のBTCPbp-C1-EGF標準を同じブロット上に滴下した。一部のスキャフォールドはスポットあたり10ngより多い係留BTCPbp-C1-EGFを有したため、スポットあたり0.156ng~20ngの範囲のBTCPbp-C1-EGF標準について、別個のブロットを作製した。標準曲線は、スポットあたり20ngのBTCPbp-C1-EGFまで線形であった。LI-COROdyssey赤外イメージングシステムにより、hEGFに対する一次抗体、赤外色素タグ付き二次抗体LI-CORBiosciences,www.licor.com/bio/PDF/IRquant.pdfを使用してドットブロットを分析した9,10。標準曲線を用いて、グリシン緩衝液により3mmBTCPスキャフォールドから取り除かれた係留BTCPbp-C1-EGFの量を定量化した。0時間、24時間又は5日間PBS中に保存した後にグリシン緩衝液によって取り除かれた係留BTCPbp-C1-EGFの量を、図15及び図16に示す。標準曲線は図17及び図18に示す。赤外LI-COR強度有り及び無しのドットブロットを図19、図20、及び図21に示す。時間点の間の統計的有意差をt検定により評価した。まとめ飽和係留濃度2~4uMで、3mmBTCPスキャフォールドあたり平均900ngのBTCPbp-C1-EGFを係留することができる。これにより、3Dスキャフォールド表面上であってもこの係留戦略に再現性があることが実証された。係留濃度にかかわらず、PBS中に5日間保存した後の係留BTCPbp-C1-EGFに著しい放出はなかった。このデータは望ましい放出特性を実証するものであったともに、BTCPbp-C1-EGFとBTCPスキャフォールド表面との間の高親和性相互作用のエビデンスであった。BTCPスキャフォールドへのBTCPbp-C1-EGFの吸着及びそこからの放出は、0.156ng~20ng/2uLスポットの間で線形であった。BTCPbp-C1-EGFからのエンドトキシン除去に成功した。現在、これはタンパク質製造の商業規格を10倍下回る。インビボ研究に対するFDAのエンドトキシン制限値は0.5EU/cm3と指定され、タンパク質のEU/mgの具体的な比率には基づいていない。生体内実験に対するFDA制限値の範囲内とするには、本発明者らは単に各部位に加えるBTCPbp-C1-EGFの質量を制限すればよく、0.5EU/cm3を超過しないように調節することができる。本明細書に引用される全ての特許、公開出願及び参考文献の教示は、全体として参照により援用される。この発明は、特にその例示的な実施形態を参照して図示及び説明されているが、当業者は、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、そこに形態及び詳細の様々な変化を加え得ることを理解するであろう。"