"配列番号14と少なくとも95の同一性を有する第1のポリヌクレオチドセグメントおよび配列番号15と少なくとも95の同一性を有する第2のポリヌクレオチドセグメントを含むゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物細胞。受託番号PTA-11336でアメリカンタイプカルチャーコレクションATCCに寄託されている代表的な種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含むダイズ種子。請求項1に記載の細胞を含むダイズ種子。前記イベントを含む、請求項2に記載の種子を生育させることによって生成されるダイズ植物。イベントpDAB8264.44.06.1を含む、請求項4に記載のダイズ植物の後代植物。複数の請求項1に記載の細胞を含むトランスジェニックダイズ植物。前記細胞が昆虫抵抗性遺伝子をさらに含む、請求項6に記載の植物。フェノキシ酢酸除草剤、フェノキシブタン酸除草剤、ピリジルオキシアルカン酸除草剤、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤からなる群から選択される少なくとも1つの除草剤に抵抗性であり、配列番号13の残基2026~9222を含むトランスジェニックゲノム挿入物を含む、請求項6に記載の植物。花粉、胚珠、花、苗条、根および葉からなる群から選択され、配列番号14および配列番号15を含む、請求項4に記載の植物の一部。受託番号PTA-11336でアメリカンタイプカルチャーコレクションATCCに寄託されている代表的な種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含む植物細胞。配列番号3~28からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。配列番号14および配列番号15を含む第1のダイズ植物を第2のダイズ植物と交配してゲノムを含む第3のダイズ植物を生成するステップと、前記第3のダイズ植物を前記ゲノム中の配列番号14および/または配列番号15の存在についてアッセイするステップとを含む、ダイズ植物の育種方法。ダイズ植物に除草剤耐性形質を遺伝子移入するために用いられる、請求項12に記載の方法。フェノキシ酢酸、フェノキシブタン酸、ピリジルオキシアルカン酸、グリホサート、ビアラホス、フォスフィノスリシンまたはグルホシネート除草剤の少なくとも1つを圃場へ施用するステップを含み、前記圃場が、請求項6に記載の植物を含み、前記植物が、配列番号13の残基2026~9222を含むトランスジェニックゲノム挿入物を含む、雑草の防除方法。前記除草剤の少なくとも2つを同時に施用するステップを含む、請求項14に記載の方法。前記除草剤の少なくとも2つを逐次的に施用するステップを含む、請求項14に記載の方法。前記アリールオキシアルカノエート除草剤が、2,4-D、2,4-DB、MCPAおよびMCPBからなる群から選択され、前記ピリジルオキシアルカン酸除草剤が、トリクロピルおよびフルロキシピルからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。前記圃場へ少なくとも1つの追加の除草剤を施用するステップを含む、請求項14に記載の方法。前記少なくとも1つの追加の除草剤がジカンバである、請求項18に記載の方法。フェノキシ酢酸、フェノキシブタン酸、ピリジルオキシアルカン酸、グリホサートおよび/またはグルホシネート除草剤を圃場へ施用するステップ、ならびに請求項3に記載の種子を除草剤複数可を施用してから14日以内に圃場に播種するステップとを含む、圃場の雑草を防除する方法であって、前記トランスジェニック挿入物が配列番号13の残基2026~9222を含む、方法。前記施用ステップが前記播種ステップの前に実施される、請求項20に記載の方法。前記少なくとも1つの除草剤が前記植物の頂部の上側に施用される、請求項14に記載の方法。前記植物が、配列番号27を含む核酸分子と少なくとも95の同一性を含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項6に記載の植物。ダイズGlycinemax由来である、請求項23に記載の植物。請求項6に記載の植物を生育させることによって生成される、ミールまたは油製品。植物細胞のゲノムの単一の染色体遺伝子座中に遺伝子導入により挿入されている発現カセットを含む植物細胞であって、a.グリホサート除草剤耐性遺伝子を発現する第1の植物転写単位;b.フェノキシ酢酸除草剤耐性遺伝子、フェノキシブタン酸除草剤耐性遺伝子および/またはピリジルオキシアルカン酸耐性遺伝子を発現する第2の植物転写単位;ならびにc.グルホシネート除草剤耐性遺伝子を発現する第3の植物転写単位を含む、植物細胞。試料中のイベントpDAB8264.44.06.1を同定するための方法であって、ATCC受託番号PTA-11336で寄託されている種子に存在するpDAB8264.44.06.1の接合部配列を、前記接合部配列と特異的に結合するか前記接合部配列を特異的に増幅するプローブまたは少なくとも1つのプライマーで検出するステップを含み、前記接合部配列が、配列番号14の残基570~571または配列番号15の残基220~221を含む、方法。少なくとも2つのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、前記試料に存在する核酸のDNA断片を増幅するステップをさらに含み、前記第1のプライマーが、配列番号13内の挿入物配列またはその相補配列に特異的に結合し、第2のプライマーが、配列番号1および配列番号2からなる群から選択される隣接配列内の配列に特異的に結合する、請求項27に記載の方法。ATCC受託番号PTA-11336で寄託されている種子に存在するダイズイベントpDAB-8264.44.06.1を含むダイズ植物のイベント接合性を判定する方法であって、前記イベントが導入遺伝子構築物を含み、前記導入遺伝子構築物は5’隣接ダイズゲノムDNAおよび3’隣接ダイズゲノムDNAが側面に位置し、前記方法が、前記ダイズ植物からゲノムDNAのDNA試料を得るステップ;前記DNA試料をa.第1のイベントプライマーおよび第2のイベントプライマーであって、前記第1のイベントプライマーが前記導入遺伝子構築物に特異的に結合し、前記第2のイベントプライマーが前記5’ダイズゲノム隣接DNAまたは前記3’ダイズゲノム隣接DNAに特異的に結合し、TaqManPCR条件に供される場合に前記第1のイベントプライマーおよび前記第2のイベントプライマーがイベントアンプリコンを生成する、第1のイベントプライマーおよび第2のイベントプライマーb.TaqManPCR条件に供されると内在性ダイズ参照遺伝子から参照アンプリコンを生成する参照フォワードプライマーおよび参照リバースプライマーc.前記イベントアンプリコンとハイブリダイズする開花イベントプローブd.前記参照アンプリコンとハイブリダイズする開花参照プローブと接触させることによって接触させた試料を生成するステップ;前記接触させた試料を蛍光ベースのエンドポイントTaqManPCR条件に供するステップ;前記イベントアンプリコンとハイブリダイズした前記開花イベントプローブを定量化するステップと;前記参照アンプリコンとハイブリダイズした前記開花参照プローブを定量化するステップ;ハイブリダイズした開花イベントプローブの量を、ハイブリダイズした開花参照プローブの量と比較するステップ;ならびにハイブリダイズした蛍光イベントプローブとハイブリダイズした蛍光参照プローブとの開花比を比較することによってpDAB8264.44.06.1の接合性を判定するステップを含む方法。前記アンプリコンが50~150残基からなる、請求項29に記載の方法。前記5’隣接DNAが配列番号1を含み、前記3’隣接DNAが配列番号2を含む、請求項29に記載の方法。前記参照遺伝子が内在性ダイズGMFL01-25-J19遺伝子である、請求項29に記載の方法。前記第1のイベントプライマーが配列番号13に結合し、第2のイベントプライマーが配列番号1もしくは配列番号2、またはその相補配列に結合する、請求項29に記載の方法。別のダイズ系統への前記イベントの育種遺伝子移入のために用いられる、請求項29に記載の方法。前記別のダイズ系統が前記イベントを欠く、請求項34に記載の方法。前記参照遺伝子が、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群から選択される配列を含むかそれとハイブリダイズする、請求項29に記載の方法。前記参照プライマーが、配列番号25および配列番号24を含み、前記参照プローブが、配列番号26を含む、請求項29に記載の方法。前記プローブが蛍光色素および消光剤で標識されている、請求項29に記載の方法。前記イベントプローブが、前記イベントプローブの5’末端に前記蛍光色素としてFAMを含み、前記イベントプローブの3’末端にMGB消光剤を含む、請求項38に記載の方法。前記参照プローブが、前記参照プローブの5’末端においてHEXで標識されており、前記参照プローブの3’末端においてBlackHoleQuencher1BHQ1で標識されている、請求項38に記載の方法。前記イベントプローブが配列番号20を含む、請求項29に記載の方法。前記イベントプライマーが、配列番号18、配列番号19、配列番号21および配列番号22からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。プレートリーダーで結果が直接読み取られる、請求項29に記載の方法。前記DNA試料が圃場のダイズ植物から得られる、29に記載の方法。前記第1のイベントプライマー、前記第2のイベントプライマー、前記参照フォワードプライマー、前記参照リバースプライマー、前記イベントプローブおよび前記参照プローブを含む、請求項29に記載の方法を実施するためのキット。前記イベントプライマーが配列番号18および配列番号19からなり、前記参照プライマーが配列番号24および配列番号25からなり、前記イベントプローブが配列番号20からなり、前記参照プローブが配列番号26からなる、請求項45に記載のキット。前記プローブまたは前記少なくとも1つのプライマーを含む、請求項27に記載の方法を実施するためのキット。前記増幅されたDNA断片が約7196塩基を含む、請求項28に記載の方法。配列番号1、配列番号2、配列番号14、配列番号15およびその相補配列からなる群から選択される配列と少なくとも95同一であるプローブ。少なくとも15ヌクレオチドを含み、配列番号1および配列番号2からなる群から選択される核酸配列とストリンジェントな洗浄条件の下でハイブリダイゼーションを維持する、単離されたポリヌクレオチド分子。ゲノム、および前記ゲノムのDNAセグメント中のトランスジェニック挿入物を含み、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端および配列番号2を含む3’末端を含む、トランスジェニックダイズ植物。ダイズゲノムのDNAセグメント中にトランスジェニック挿入物を挿入する方法であって、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端および配列番号2を含む3’末端を含む、方法。ゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物を作製する方法であって、前記ゲノムのDNAセグメント中にトランスジェニック挿入物を挿入するステップを含み、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端およびヌクレオチド残基配列番号2を含む3’末端を含む、方法。前記挿入物が配列番号27を含む、請求項52に記載の方法。前記挿入物が配列番号27を含む、請求項53に記載の方法。PTA-11602およびPTA-12006からなる群から選択される受託番号でATCCに寄託されている種子に存在する昆虫抵抗性イベントをさらに含む、請求項2に記載の種子。配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95同一である変異体をさらに含む、請求項3に記載の種子。請求項56に記載の種子から生育し、前記イベントおよび前記昆虫抵抗性イベントを含む植物。配列番号28および/または配列番号29と少なくとも95同一である昆虫抵抗性ポリヌクレオチドセグメントをさらに含む、請求項6に記載の植物。PTA-11602およびPTA-12006からなる群から選択される受託番号でATCCに寄託されている種子に存在する昆虫抵抗性イベントをさらに含む、請求項10に記載の植物細胞。配列番号27または配列番号27と少なくとも95同一であるその変異体を含む、請求項1に記載の植物細胞。配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95同一である変異体をさらに含む、請求項61に記載の植物細胞。前記細胞が配列番号27または配列番号27と少なくとも95同一であるその変異体を含む、請求項3に記載の種子。配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95同一である変異体をさらに含む、請求項63に記載の種子。2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む種子。2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む植物。2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む植物細胞。配列番号28を含む植物、植物細胞または種子。受託番号PTA-11602の下でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベント9582.812.9.1を含む植物、植物細胞または種子。対象発明は、一部には、雑草抵抗性を管理するために有効な手段を提供することができ、それは除草剤耐性技術の有用性を保存するのを助ける。対象発明は、雑草防除選択肢の大きな融通性および利便性を栽培者に提供することもできる。より具体的には、本発明は、受託番号PTA-11336でアメリカ基準株保存機関ATCCに寄託された代表的種子を有する、pDAB8264.44.06.1と指定されたダイズGlycinemaxイベントイベントpDAB8264.44.06.1、およびそれに由来する後代に一部関する。対象発明は、イベントpDAB8264.44.06.1を含むダイズ植物を含むならびに配列番号1および配列番号2を含むゲノムセグメント中にトランスジェニック挿入物を含むダイズ植物を含む。対象イベントおよび寄託種子に存在するトランスジェニック挿入物は、下記の3つの除草剤耐性遺伝子を含む:aad-12、2mepspsおよびpat遺伝子。デルフチアアシドボランスDelftiaacidovoransに由来するaad-12遺伝子は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼAAD-12タンパク質をコードし、それは、例えば2,4-ジクロロフェノキシ酢酸およびピリジルオキシアセテート除草剤への耐性を付与する。トウモロコシから単離された改変EPSPS配列である2mepsps遺伝子は、グリホサート除草剤への耐性を付与するタンパク質を生成する。土壌菌ストレプトマイセスビリドクロモゲネスStreptomycesviridochromogenesからのpat遺伝子は、除草剤グルホシネートへの耐性を付与する。本発明の他の態様は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を含む後代植物、ダイズ、種子、ならびに/または植物および種子および後代の再生可能な部分、ならびにそのいずれかから作製される食品または飼料製品を含む。本発明は、それらに限定されないが花粉、胚珠、花、苗条、根、葉、栄養細胞の核、花粉細胞を含むイベントpDAB8264.44.06.1の植物部分、ならびにイベントpDAB8264.44.06.1を含む他の植物細胞も含む。本発明は、フェノキシ酢酸除草剤、フェノキシブタン酸除草剤、ピリジルオキシアルカン酸除草剤、グリホサート、および/またはグルホシネートを含む複数の除草剤への耐性を有するダイズ植物にさらに関する。そのようなダイズ植物は、それらに限定されないが、ジカンバ、イミダゾリノンおよびHPPD除草剤を含む様々な他の非選択性および選択性除草剤への耐性を付与する遺伝子をスタックされてもよい。本発明は、新規な遺伝子組成イベントpDAB8264.44.06.1およびイベントpDAB8264.44.06.1を含むダイズ植物の農業パフォーマンスの態様をさらに含む。本発明は、植物育種および除草剤耐性植物に一部関する。本発明は、ダイズ細胞のゲノム内の特定の部位に挿入されている、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むダイズ植物での新規形質転換イベントを含む。一部の実施形態では、前記イベント/ポリヌクレオチドは、例えば、農業形質および/または昆虫抑制タンパク質を含む他の形質をスタックされてもよい。しかし、本明細書に記載されるように、対象発明は単一のイベントを有する植物を含む。一部の実施形態では、対象の除草剤耐性イベントは、昆虫抵抗性イベントとの育種スタックで組み合わされてよい。これらの実施形態のいくつかでは、昆虫抵抗性イベントは、cry1F遺伝子およびcry1Ac遺伝子を含む。いくつかのそのようなイベントおよびスタックは、ダイズイベント9582.812.9.1812イベントおよびダイズイベント9582.814.19.1814イベントを含め、本明細書に具体的に例示される。例えば、対象イベントの任意の組合せを含む植物、植物細胞および種子は、対象発明に含まれる。一部の実施形態では、さらに詳細に下で論じられるように、対象発明はダイズイベント9582.812.9.1812イベントを単独で含む。例えば植物育種、イベントDAS-8264.44.06.1を含有するトランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えを介した標的化組込みによる新しい形質の追加を介して、追加の形質が植物ゲノムに、またはイベントpDAB8264.44.06.1と同じ遺伝子座にスタックされてよい。他の実施形態は、トランスジェニック挿入物および/またはイベントDAS-8264.44.06.1の隣接配列の一部または全ての切除を含む。切除の後、別のおよび/または追加の挿入物を、イベントDAS-8264.44.06.1の特定の染色体部位に標的化させてもよい。例示される挿入物は対象ダイズイベントの例示される挿入物と交換されてもよいか、またはさらなる挿入物複数可がこのようにスタックされてもよい。一実施形態では、本発明は、第6染色体に位置するダイズ染色体の標的部位を包含する。一部の実施形態では、標的部位は異種核酸を含む。一部の実施形態では、ダイズ染色体の標的部位は、配列番号1および配列番号2に示すゲノム隣接配列の間かその中に位置する。一実施形態では、本発明は、第6染色体上の位置に異種核酸を挿入するステップを含む、トランスジェニックダイズ植物を作製する方法を包含する。別の実施形態では、異種核酸は、第6染色体の上の、本明細書に記載される様々な例示ポリヌクレオチドセグメントの近くかその間に挿入される。さらに、対象発明は、試料例えば、ダイズの中の対象イベントの存在を検出するためのアッセイを提供する。アッセイは、ダイズゲノムに挿入された組換え体構築物のDNA配列、および挿入部位の側面に位置するゲノム配列に基づいてよい。アッセイの実行で有益なキットおよび条件もまた提供される。したがって、対象発明は、トランスジェニックダイズ系統の例示される挿入物全体およびその境界ボーダー領域のDNA配列のクローニングおよび分析に一部関する。これらの配列は特有のものである。これらの挿入物およびボーダーおよび接合部配列に基づき、イベント特異的なプライマーを生成することができ、生成した。PCR分析は、これらのイベント特異的なプライマーセットで生成されるPCRアンプリコンの分析によって、イベントを同定することができることを実証した。したがって、対象発明のイベントを含むダイズ系統を特異的に同定するために、これらおよび他の関連した手順を用いることができる。対象発明は、イベント8264.44.06.1の検出のためのリアルタイムまたはエンドポイントTaqManPCRアッセイにも一部関する。一部の実施形態は、ハイスループット接合性分析が可能であるアッセイを対象とする。対象発明は、一部、接合性を判定するのに用いられるGMFL01-25-J19GenBank:AK286292.1参照遺伝子の使用にさらに関する。イベントpDAB8264.44.06.1の接合性を特異的に同定し、このイベントを含むダイズ系統を育種するために、これらおよび他の関連した手順を用いることができる。本明細書に記載される本発明は、ダイズ細胞のゲノム内の特定の遺伝子座に挿入された複数の除草剤耐性遺伝子の発現のためのカセットを含むダイズ植物ダイズの新規形質転換イベントを含む。イベントpDAB8264.44.06.1を含む例示トランスジェニック挿入物は、3つの異なる除草剤耐性遺伝子:1合成aad-12遺伝子;2野生型EPSPSポリペプチドと比較して、アミノ酸残基102トレオニンからイソロイシンおよび106プロリンからセリンに突然変異を含有する、グリホサート除草剤への抵抗性または耐性を付与するタンパク質をコードするトウモロコシのEPSPS配列;ならびに3グルホシネート除草剤への耐性または抵抗性を付与するpat遺伝子の発現のための遺伝子エレメントを含む。aad-12遺伝子はデルフチアアシドボランスDelftiaacidovoransに由来し、それは、例えば、その有効成分複数可の酸、塩またはエステル型を含む、フェノキシアルカノエート除草剤例えば、2,4-DおよびMCPAなどのフェノキシ酢酸除草剤;ジクロルプロップ、メコプロップなどのフェノキシプロピオン酸除草剤およびそれらの鏡像異性体;ならびに2,4-DBおよびMCPBなどのフェノキシブタン酸除草剤、ならびにピリジルオキシアルカン酸除草剤例えば、トリクロピルおよびフルロキシピルなどのピリジルオキシ酢酸除草剤を含むα-ケトグルタル酸部分を有する除草剤を不活性化することが可能なアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼAAD-12タンパク質酵素をコードする。より具体的には、対象発明は、トランスジェニックダイズイベントpDAB8264.44.06.1、これらのイベントを含む植物系統、ならびにこの挿入物のDNA配列および/またはそのボーダー領域のクローニングおよび分析に一部関する。対象発明の植物系統は、本明細書に開示および示唆される配列を用いて検出することができる。本発明は、植物育種および除草剤耐性植物に一部関する。一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列は、他の形質例えば、他の除草剤耐性遺伝子複数可および/または昆虫抑制タンパク質もしくは抑制性RNA配列をコードする遺伝子複数可などを多重化スタックされてよい。しかし、本明細書に記載されるように、対象発明は単一のイベントを有する植物も含む。一部の実施形態では、対象の除草剤耐性イベントは、育種スタックにおいて昆虫抵抗性イベントと組み合わされてよい。一部の実施形態では、昆虫抵抗性イベントは、812イベントおよび814イベント後でさらに詳しく記載されるからなる群から選択され、それぞれはcry1F遺伝子およびcry1Ac遺伝子を含む。例えば、対象イベントの任意の組合せを含む植物、植物細胞および種子は、対象発明に含まれる。特定の実施形態では、対象発明は、例えば、植物、植物細胞および種子を含め、新規812のイベントを単独でも含む。2011年4月5日に出願された米国仮出願第61/471,845号は、ダイズイベント9582.812.9.1812イベントを含むダイズ系統に一部関する。このイベントを含む種子は、アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC、10801ユニバーシティブールバード、マナサス、VA、20110、に寄託され、制限なしでしかし、特許権の制限の下公開利用できる。ATCC寄託番号PTA-11602と指定された寄託は、2011年1月20日にされた。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下でなされたものであり、維持される。米国仮出願第61/511,664号2011年7月26日に出願されたおよび第61/521,798号2011年8月10日に出願されたは、ダイズイベント9582.814.19.1814イベントを含むダイズ系統に一部関する。このイベントを含む種子は、アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC、10801ユニバーシティブールバード、マナサス、VA、20110、に寄託された。この寄託、ATCC特許寄託指定PTA-12006は、2011年7月21日にATCCによって受理された。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下でなされたものであり、維持される。対象発明は、例えば、配列番号27イベントpDAB8264.44.06.1;4406イベント、配列番号28812イベントおよび/または配列番号29814イベント、ならびに、例えば、そのような配列と少なくとも95、96、97、98または99の同一性を有するこれらの配列の変異体を含む植物、種子および植物細胞も含む。植物ゲノムの中で挿入物配列の組込みの結果、多少の変動一部のセグメントの欠失などが起こることは珍しくない。これは、例えば、実施例7でさらに詳細に議論される。対象発明は、試料中の対象イベントの存在を検出するためのアッセイも提供する。対象発明の態様は、本明細書で例示または提案される任意の診断核酸分子、特に対象隣接配列に完全または部分的に基づくものを設計および/または生成する方法を含む。一部の実施形態では、本明細書で例示または記載されるポリヌクレオチドセグメント例えば配列番号1、配列番号2、および/または例えば図2に表されるその間の挿入物を切除し、その後追加のポリヌクレオチド配列複数可で再標的化してよい。一部の実施形態では、本発明は、除草剤耐性のダイズ系統およびその同定に関する。対象発明は、有性交配の後代が対象のイベントを含有するかどうかを判定するために、対象イベントの存在を検出することに一部関する。さらに、イベントを検出するための方法は、例えば、市販前承認および組換え作物植物に由来する食品の表示を要求する規則に対応するために例えば含まれており、有益である。核酸プローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応PCRまたはDNAハイブリダイゼーションなどの任意の周知の核酸検出方法により、対象イベントの存在を検出することができる。イベント特異的なPCRアッセイが、本明細書で議論される。別の例については、例えばWindelsらMedFacLandbouww、UnivGent645b459462、1999年を参照。これらの例のいくつかは、挿入物と隣接DNAとの間の接合部にわたるプライマーセットを用いることに関する。より具体的には、1つのプライマーは挿入物の配列を含み、第2のプライマーは隣接DNAの配列を含んでいた。本明細書では、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1ならびに代々引き続くダイズ植物での安定性および発現についてのその選択および特徴付けが例示される。イベントpDAB8264.44.06.1の両隣接配列が配列決定されており、本明細書では配列番号1および配列番号2と記載される。イベント特異的なアッセイが開発された。それは、ダイズゲノムダイズ第6染色体にマッピングもされている。イベントpDAB8264.44.06.1は優良栽培種に遺伝子移入することができ、そこで、それは近交系統およびハイブリッドダイズ系統でフェノキシオーキシン、グリホサートおよびグルホシネート除草剤への耐性を付与する。対象EPSPS遺伝子は、突然変異体5-エノールピルビル-3-ホスホシキミ酸合成酵素EPSPSをコードする。野生型EPSPS遺伝子は、当初トウモロコシZeamaysから単離され、その配列はGenBank受託番号X63374の下で寄託された。米国特許第6,566,587号特に、その中の配列番号3を参照されたい。植物で異種遺伝子の高い発現を得るために、それらが植物細胞でより効率的に発現されるように、前記遺伝子を再操作するのが好ましいことがある。野生型植物EPSPSヌクレオチド配列の改変は、植物細胞で発現されるときにそのような抵抗性を提供することができる。’587特許に記載されているように、EPSPSポリペプチドを野生型ポリペプチドと比較したとき、タンパク質の残基102のトレオニンの代わりにイソロイシンを置換し、106位のプロリンの代わりにセリンを置換する改変は、結果として対象挿入物で用いられる二重突然変異体EPSPSポリペプチド2mEPSPSをもたらす。植物細胞で発現されるとき、それはグリホサートへの耐性を提供する。あるいは、2mepsps遺伝子またはDMMGとも呼ばれる対象EPSPS遺伝子は、双子葉植物および単子葉植物で、特にダイズでの発現を向上させるように最適化することができる。コドン利用は、好ましいhemicotコドン利用に基づいて選択することができ、すなわち、タンパク質が単子葉植物と双子葉植物の両方の利用への偏りを有するコドンによってコードされるように再設計することができる。2mepspsコード配列の転写/翻訳の効率を増加させ、DNA操作段階を促進するために、有害な配列および余分な制限部位は除去されてよい。対象単子葉植物遺伝子のhemicot最適化バージョンは、植物細胞でのグリホサート抵抗性をコードする核酸分子の最適化発現OPTIMIZEDEXPRESSIONOFGLYPHOSATERESISTANCEENCODINGNUCLEICACIDMOLECULESINPLANTCELLSという名称のU.S.S.N.13/303,5022011年11月23日に出願され、2010年12月3日への優先権を主張でさらに詳述されている。前に本明細書に言及されているように、植物ゲノムへの導入遺伝子の導入および組込みは、多少のランダムイベントを含むしたがって、名称イベントは発現される所与の挿入のためである。すなわち、アグロバクテリウム菌形質転換、遺伝子銃およびWHISKERSなどの多くの形質転換技術では、導入遺伝子がゲノムのどこに挿入されるかは予測できない。したがって、挿入物の両側の隣接植物ゲノムDNAを同定することは、所与の挿入イベントを有する植物を同定するために重要な可能性がある。例えば、挿入物と宿主ゲノムの接合部領域にわたるPCRアンプリコンを生成するPCRプライマーを設計することができる。このPCRアンプリコンは、特有であるか異なる型の挿入イベントを同定するために用いることができる。植物細胞のゲノムに挿入物を導入する過程で、挿入物および/またはゲノム隣接配列の一部の欠失または他の変更が起こることは珍しくない。したがって、本明細書で提供されるプラスミド配列の関連するセグメントは、多少の軽微な変化を含むかもしれない。本明細書で提供される隣接配列についても同じである。したがって、対象の隣接配列および/または挿入物配列とある範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は、対象発明の範囲内である。本発明の配列との同一性は、本明細書に例示または記載される配列と少なくとも65の配列同一性、より好ましくは少なくとも70の配列同一性、より好ましくは少なくとも75の配列同一性、より好ましくは少なくとも80の同一性、より好ましくは少なくとも85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であってよい。対象発明のそのような植物およびポリヌクレオチド配列を規定するために、本明細書で提供されるハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション条件を用いることもできる。完全な挿入物配列に加えて隣接配列を含む配列は、寄託種子を参照して確認することができる。イベントは本来ランダムイベントであるので、本開示の一部として、イベントpDAB8264.44.06.1を含むダイズ系統の少なくとも2500粒の種子を、アメリカ基準株保存機関ATCC、10801UniversityBoulevard、Manassas、VA、20110、に寄託し、制限なしでしかし、特許権に従う公開利用できるようにした。この寄託は、ATCC寄託番号PTA-11336と指定された。100パケット1パケットにつき25粒の種子のダイズGlycinemax種子ダイズ種子GlycinemaxL:pDAB8264.44.06.1を、2010年9月14日にDowAgroSciencesLLCおよびMSTechnologies,LLCを代表して寄託した。寄託物は2010年10月4日に試験され、その日に種子は成育可能であった。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下で執行され、維持される。この寄託物は、公的な受託所であるATCC受託所において、30年間か、最近の請求から5年間か、または特許有効期間のうちのより長い期間制限なしに維持され、その期間中に成育不能になる場合には交換される。本開示の一部として、イベントpDAB9582.812.9.1およびイベントpDAB8264.44.06.1対象の除草剤耐性イベントおよび812昆虫抵抗性イベントを含むダイズ系統の少なくとも2500粒の種子を、アメリカ基準株保存機関ATCC、10801UniversityBoulevard、Manassas、VA、20110、に寄託し、制限なしでしかし、特許権に従う公開利用できるようにした。寄託物は、ATCCによって名称:pDAB9582.812.9.1:イベントpDAB8264.44.06.1と同定された。100パケット1パケットにつき25粒の種子のダイズGlycinemax種子ダイズ種子GlycinemaxL:pDAB8264.44.06.1を、2011年11月18日に寄託した。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下で執行され、維持される。この寄託物は、公的な受託所であるATCC受託所において、30年間か、最近の請求から5年間か、または特許有効期間のうちのより長い期間制限なしに維持され、その期間中に成育不能になる場合には交換される。寄託された種子は、対象発明の一部である。明らかに、ダイズ植物はこれらの種子から生育させることができ、そのような植物は対象発明の一部である。対象発明は、これらの植物およびその後代を検出するために有益であるこれらのダイズ植物に含有されるDNA配列にも関する。対象発明の検出方法およびキットは、試験の最終的な目的に応じて、これらのイベントのいずれか1つ、2つまたはさらには3つ全てを同定することを対象としてもよい。定義および例は、本発明の記載の助けとなるように、および当業者が本発明を実施するのを指導するために本明細書で提供される。特に明記しない限り、用語は、関連分野の通常の知識を有する者による従来の用法に従って理解されるべきである。米国特許法施行規則§1.822に示されるDNA塩基のための命名法が用いられる。本明細書で用いるように、用語後代は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を含む親植物の任意の世代の子孫を表す。トランスジェニックイベントは、異種DNA、すなわち対象の導入遺伝子を含む核酸構築物による植物細胞の形質転換、植物のゲノムへの導入遺伝子の挿入からもたらされる植物の集団の再生、および特定のゲノム位置への挿入によって特徴づけられる特定の植物の選択によって生成される。用語イベントは、異種DNAを含む元の形質転換体および形質転換体の後代を指す。用語イベントは、形質転換体とゲノム/導入遺伝子DNAを含む別の変種との間の有性異系交配によって生成される後代も指す。反復親への反復戻し交雑の後でさえ、形質転換された親からの挿入導入遺伝子DNAおよび隣接ゲノムDNAゲノム/導入遺伝子DNAが、交配の後代の同じ染色体位置に存在する。用語イベントは、挿入DNA例えば、自家受粉から生じる元の形質転換体および後代および挿入DNAを含有しない親の系統を含む1つの親の系統の有性交配の結果として、対象の導入遺伝子を含む挿入DNAを受ける後代へ伝えられることが予想される挿入DNAに直接隣接して挿入DNAおよび隣接ゲノム配列を含む元の形質転換体およびその後代のDNAも指す。接合部配列は、ゲノムに挿入されているDNAが、挿入点に隣接するダイズの天然ゲノムのDNAに連結する点にわたり、植物の遺伝物質中の1つまたは他の接合部配列の同定または検出は、イベントの診断に十分である。本明細書に記載されるダイズイベント中の挿入にわたるDNA配列および類似した長さの隣接DNAが含まれる。そのような診断配列の具体例が本明細書で提供される;しかし、挿入の接合部に重複する他の配列、または挿入およびゲノム配列の接合部も診断に役立ち、対象発明によって用いることもできた。対象発明は、そのような隣接、接合部および挿入物配列を用いることによるイベント同定に一部関する。関連するPCRプライマーおよびアンプリコンが、本発明に含まれる。対象発明により、挿入DNAおよびその境界ボーダーにわたるアンプリコンを用いるPCR分析法は、対象の商標登録されたトランスジェニックダイズ系統に由来する市販のトランスジェニックダイズ品種または系統を検出または同定するために用いることができる。二成分プラスミド、pDAB8264配列番号13は、図1に表される遺伝子エレメントを含む。以下の遺伝子エレメントT鎖ボーダー配列は含まれないが、pDAB8264のT鎖領域中に含有される。表1で、本明細書に開示される配列番号13に関して遺伝子エレメントの残基番号付けが提供される。配列番号14および15は、下でより詳細に記載されるように、それぞれ、挿入物配列の5’および3’部分と一緒になっている5’および3’隣接配列であり、したがって挿入物およびゲノムDNAの5’および3’の接合部または移行配列を含む。配列番号14に関して、残基1~570は5’ゲノム隣接配列であり、残基571~859は挿入物の5’末端の残基である。配列番号15に関して、残基1~220は挿入物の3’末端の残基であり、残基221~1719は3’ゲノム隣接配列である。したがって、挿入物の5’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号14の残基570~571の位置で起こる。したがって、挿入物の3’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号15の残基220~221の位置で起こる。対象発明のポリヌクレオチドには、接合部配列のいずれの側にも、例えば、5、10、20、50、100、150または200個の塩基、またはおそらくそれ以上、およびその間の任意の増分を含むものが含まれる。したがって、接合部配列にわたるプライマーは、例えば、隣接配列とハイブリダイズする5~10個の塩基および挿入物配列とハイブリダイズする5~10個の塩基を含むことができた。プローブおよびアンプリコンを同じように設計することができたが、それらは多くの場合プライマーより長かった。対象配列隣接配列を含むは特有のものである。これらの挿入物および隣接配列に基づき、イベント特異的プライマーが生成された。PCR分析は、これらのイベント特異的なプライマーセットで生成されるPCRアンプリコンの分析によって、異なるダイズ遺伝子型でこれらのダイズ系統を同定することができることを実証した。したがって、これらのダイズ系統を特異的に同定するために、これらおよび他の関連した手順を用いることができる。本明細書で同定される配列は特有のものである。後代に対象の1つまたは複数の追加の形質を付与しようとして対象のイベントを含む親植物を別の植物系統と交配させた後に、どの後代植物が所与のイベントを含むかについて判定するために、対象発明の検出技術は植物育種と合わせて特に有益である。これらのPCR分析法は、特に商品化されるトランスジェニックダイズ種子のために、ダイズ育種プログラムならびに品質管理に有益である。これらのトランスジェニックダイズ系統のためのPCR検出キットは、現在作製および使用することもできる。このことは、製品登録および製品管理にも有益である。さらに、各挿入物のゲノム位置を特異的に同定するために、隣接ダイズ/ゲノム配列を用いることができる。この情報は、分子マーカー系統を各イベントに特異的にするために用いることができる。これらは、育種戦略の加速のために、および連鎖データを確立するために用いることができる。なおさらに、隣接配列情報は、導入遺伝子組込み方法、ゲノム組込み部位の特性、イベント選別、導入遺伝子およびそれらの隣接配列の安定性、ならびに遺伝子発現特に、遺伝子抑制、導入遺伝子メチル化パターン、位置効果、および潜在的発現関連のエレメント、例えばMARS[マトリックス給合領域]などに関連するを試験し、特徴づけるために用いることができる。対象開示を考慮すると、対象発明はATCC寄託番号PTA-11336の下で入手可能な種子を含むことが明らかになるはずである。対象発明は、受託番号PTA-11336の下でATCCに寄託された種子から生育させた除草剤耐性ダイズ植物も含む。対象発明は、前記植物の部分、例えば葉、組織試料、前記植物によって生成される種子、花粉などをさらに含むそれらは、配列番号1および配列番号2が側面に位置するトランスジェニック挿入物を含む。なおさらに、対象発明は、寄託種子から生育させた植物の子孫および/または後代植物、好ましくは除草剤抵抗性ダイズ植物を含み、前記植物は、本明細書に記載される検出可能な野生型ゲノムDNA/挿入物DNA接合部配列を含むゲノムを有する。本明細書で用いる場合、用語ダイズは、ダイズGlycinemaxを意味し、ダイズ植物と交配することができるその全ての品種を含む。本発明は、少なくとも片方の親として対象発明の植物を用いて交雑種を作製する方法をさらに含む。例えば、対象発明は、片方か両方の親として本明細書に例示される植物のいずれかを有するF1雑種植物を含む。対象発明のそのようなF1雑種によって生成される種子も、対象発明の範囲内にある。本発明は、例示される植物を異なる例えば近交系統親植物と交配して、生じるハイブリッド種子を収集することによってF1雑種種子を生成する方法を含む。対象発明は、雌親または雄親のいずれかである例示植物を含む。生じる植物の特性は、親植物の慎重な考慮によって向上させることができる。対象発明の除草剤耐性のダイズ植物は、本明細書で言及される系統のいずれか1つの種子から生育させたダイズ植物からなる第1の親ダイズ植物と第2の親ダイズ植物を先ず有性交配させ、それによって複数の第1の後代植物を生成し;次に、除草剤に抵抗性であるまたは対象発明のイベントの少なくとも1つを保有する第1の後代植物を選択し;第1の後代植物を自家受粉させ、それによって複数の第2の後代植物を生成し;次に、除草剤に抵抗性であるまたは対象発明のイベントの少なくとも1つを保有する植物を第2の後代植物から選択することによって改良することができる。これらの段階は、第2の親ダイズ植物または第3の親ダイズ植物への第1の後代植物または第2の後代植物の戻し交雑をさらに含むことができる。対象発明のダイズ種子を含むダイズ作物、またはその後代を次に植えることができる。2つの独立して分離している追加された外来性遺伝子を含有する子孫を生成するために、2つの異なるトランスジェニック植物を交配することもできることも理解するべきである。適当な後代の自家受粉は、両方の追加された外来性遺伝子がホモ接合である植物を生成することができる。栄養繁殖のように、親植物への戻し交雑および非トランスジェニック植物との異系交配も企図される。異なる形質および作物のために通常用いられる他の育種方法が、当技術分野で公知である。戻し交雑用親である、望ましいホモ接合栽培種または近交系統に、単純に遺伝する高度に遺伝性の形質のための遺伝子を伝えるために、戻し交雑育種法が用いられている。伝えられる形質の供給源は、ドナー親と呼ばれる。生じる植物は、反復親例えば、栽培種の特質およびドナー親から伝えられる望ましい形質を有すると予想される。最初の交配の後、ドナー親の表現型を保有する個体が選択され、反復親と繰り返し交配戻し交配される。生じる親は、反復親例えば、栽培種の特質およびドナー親から伝えられる望ましい形質を有すると予想される。本発明のDNA分子は、マーカー支援育種MAB方法で分子マーカーとして用いることができる。当技術分野で公知であるように、本発明のDNA分子は、遺伝的に連結されている農業上有益な形質を同定する方法例えば、AFLPマーカー、RFLPマーカー、RAPDマーカー、SNPおよびSSRで用いることができる。除草剤耐性形質は、MAB方法を用いて、対象発明のダイズ植物またはその後代、および他の任意のダイズ栽培種もしくは品種との交配の後代において追跡できる。DNA分子はこの形質のためのマーカーであり、対象発明の少なくとも1つのダイズ系統またはその後代が親または祖先であったダイズ植物で除草剤抵抗性形質複数可を追跡するために、当技術分野で周知であるMAB方法を用いることができる。本発明の方法は、対象イベントを有する任意のダイズ品種を同定するために用いることができる。対象発明の方法は、ダイズ栽培種にイベントpDAB8264.44.06.1を遺伝子移入するステップを含む、除草剤耐性のダイズ植物を生成する方法を含む。より具体的には、本発明の方法は、対象発明の2つの植物または対象発明の1つの植物および他の任意の植物を交配するステップを含むことができる。好ましい方法は、対象発明によって検出可能なイベントについて前記後代を分析することによって、前記交配の後代を選択するステップをさらに含む。例えば、対象発明は、他の望ましい形質、例えば様々な実施例において本明細書で試験されるものなどの農業形質を含む植物との育種サイクルを通して対象イベントを追跡するために用いることができる。対象イベントおよび所望の形質を含む植物は、例えばさらなるラウンドの育種で検出、同定、選択すること、および速やかに用いることができる。対象イベント/形質は、対象発明によって、昆虫抵抗性形質複数可および/またはさらなる除草剤耐性形質と育種を通して組み合わせること、および追跡することもできる。後者の一実施形態は、除草剤ジカンバへの抵抗性をコードする遺伝子と組み合わせた対象イベントを含む植物である。したがって、対象発明は、例えば、グリホサート抵抗性例えば、抵抗性植物または細菌性グリホサートオキシダーゼGOXをコードする追加の形質、グリホサートアセチル転移酵素GAT、グルホシネート抵抗性例えばビアラホス抵抗性barのための追加の形質、アセトラクテート合成酵素ALS抑制性の除草剤抵抗性を付与する形質例えば、イミダゾリノン[イマゼタピルなど]、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピリミジニルチオベンゾエートおよび他の化学作用[Csr1、SurA、他]、ブロモキシニル抵抗性形質例えば、Bxn、ジカンバ除草剤への抵抗性のための形質例えばU.S.2003/0135879を参照、HPPD4-ヒドロキシフェニル-ピルビン酸-ジオキシゲナーゼ酵素の阻害剤への抵抗性のための形質、フィトエンデサチュラーゼPDSの阻害剤への抵抗性のための形質、光化学系II抑制性の除草剤への抵抗性のための形質例えば、psbA、光化学系I抑制性の除草剤への抵抗性のための形質、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼIXPPO抑制性の除草剤例えば、PPO-1への抵抗性のための形質、およびフェニル尿素除草剤例えば、CYP76B1への抵抗性のための形質と組み合わせることができる。複数のクラスの除草剤に対する雑草シフトおよび/または抵抗性を効果的に制御し、遅らせ、および/または防止する能力を提供するために、そのような形質の1つまたは複数を対象発明と組み合わせることができる。当業者は、対象発明で用いられるaad-12遺伝子が、フェノキシアセテートオーキシン除草剤例えば、2,4-DB、MCPBなどに変換される化合物への抵抗性も提供すると理解する。2,4-DB除草剤に存在する酪酸部分は、β-酸化を介して植物に有害である2,4-ジクロロフェノキシ酢酸に変換される。同様に、MCPBはβ-酸化を介して植物に有害であるMCPAに変換される。ブタン酸除草剤はそれ自身除草活性はないが、感受性の植物の中でβ-酸化によってそれらのそれぞれの酸形に変換され、植物に有害である除草剤の酢酸形を生成する。急速なβ-酸化ができない植物は、ブタン酸除草剤によって害されない。しかし、急速なβ-酸化が可能で、ブタン酸除草剤を酢酸形に変換することができる植物は、その後AAD-12によって保護される。除草剤の施用法は当技術分野で周知である。そのような施用には、複数の除草剤のタンクミックスを含めることができる。対象発明によって使用するための好ましい除草剤は、グリホサート、グルホシネートおよびフェノキシオーキシン除草剤例えば2,4-D;2,4-DB;MCPA;MCPBの組合せである。他の好ましい組合せには、グリホサートに2,4-Dを、またはグルホシネートに2,4-Dを加えた混合物が含まれる。これらの3種類の除草剤は、対象開示を利用する当業技術者に明らかになる有利な組合せで用いることができる。対象発明の種子を植えようとする前に、対象除草剤の1つまたは複数を畑/エリアへ施用することができる。そのような施用は、対象発明の種子の播種から例えば14日以内であってよい。対象除草剤の1つまたは複数を、播種後から出芽前に施用することもできる。地面へ雑草を防除するために、または雑草の上面におよび/または対象発明のトランスジェニック植物の上面に、対象除草剤の1つまたは複数を施用することもできる。対象の3つの除草剤は、例えば、1つの除草剤に耐性であるが別のものには耐性でない雑草を防除または阻止するために、交替で、または組合せで用いることができる。対象の3種類の除草剤の様々な施用時期は、当技術分野で公知であるように様々な方法で用いることができる。さらに、対象イベントは、トランスジェニックおよび非トランスジェニックの両方の、1つまたは複数の追加の除草剤耐性形質、1つまたは複数の追加のインプット例えば、昆虫抵抗性例えば、812イベントまたは814イベント、真菌抵抗性、またはストレス耐性他またはアウトプット例えば、収量増、油プロファイルの向上、繊維特質の向上他形質をスタックされてよい。したがって、対象発明は、任意の数の農業有害生物を柔軟におよび費用効果的に防除する能力を有する、向上した作物特質の完全な農業パッケージを提供するために用いることができる。相同組換えを介して植物細胞の特定の染色体部位の中にポリヌクレオチド配列を組み込む方法は、当技術分野で記載されている。例えば、米国特許出願公開第2009/0111188A1号に記載される部位特異的組込みは、染色体標的へのドナーポリヌクレオチド配列の導入を媒介するための、リコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用を記載する。さらに、国際特許出願WO2008/021207は、ゲノムの特定位置に1つまたは複数のドナーポリヌクレオチド配列を組み込むための、ジンクフィンガーによって媒介される相同組換えを記載する。特定の染色体部位にポリヌクレオチド配列を組み込むために、米国特許第6,720,475号に記載されるFLP/FRT、または米国特許第5,658,772号に記載されるCRE/LOXなどのリコンビナーゼの使用を利用することができる。最後に、特定の染色体位置にドナーポリヌクレオチドを向かわせるためのメガヌクレアーゼの使用が、Puchtaら、PNASUSA93巻1996年5055~5060頁に記載された。植物細胞の中の部位特異的組込みのための他の様々な方法が一般的に公知であり、適用できるKumarら、TrendsinPlantSci6巻4号2001年155~159頁。さらに、いくつかの原核生物および下等真核生物で同定された部位特異的組換系を、植物で用いるために適用できる。そのような系の例として、それらに限定されないが以下のものが挙げられる:酵母ザイゴサッカロミセスルーキシZygosaccharomycesrouxiiのpSR1プラスミドからのR/RSリコンビナーゼ系Arakiら1985年JMolBiol182巻:191~203頁、およびファージμのGin/gix系MaeserおよびKahlmann1991年MolGenGenet230巻:170~176頁。本発明の一部の実施形態では、既存のトランスジェニックイベントに近接して新しい導入遺伝子複数可を組み込むかスタックすることが望ましいことがある。トランスジェニックイベントは、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定した発現、ならびに複数の環境場所における、およびそれらにわたる除草剤耐性および農業パフォーマンスを含む効力の優れた組合せなどの特有な特徴に基づいて選択された好ましいゲノム遺伝子座とみなすことができる。新たに組み込まれた導入遺伝子は、既存の形質転換体の導入遺伝子発現特性を維持するはずである。さらに、新たに組み込まれるイベントのゲノム隣接配列および染色体位置は既に同定されているので、新たに組み込まれるイベントの検出および確認のためのアッセイの開発は克服される。最後に、既存の導入遺伝子に連結する特定の染色体位置への新しい導入遺伝子の組込みは、従来の育種方法を用いる有性異系交配による他の遺伝的背景への導入遺伝子の遺伝子移入を促進する。本発明の一部の実施形態では、トランスジェニックイベントからポリヌクレオチド配列を切除することが望ましいことがある。例えば、米国特許出願第13/011,666号に記載される導入遺伝子切除は、染色体に組み込まれたトランスジェニックイベントから、遺伝子発現カセットからなるポリヌクレオチド配列を除去するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用を記載する。除去されるポリヌクレオチド配列は、選択可能なマーカーであってよい。ポリヌクレオチド配列の切除および除去の後に、改変されたトランスジェニックイベントは、ポリヌクレオチド配列の挿入によって再標的化することができる。ポリヌクレオチド配列の切除および続く改変トランスジェニックイベントの再標的化は、選択マーカーの再利用、または特定の遺伝子の発現から生じる植物トランスクリプトームの予想外の変化を克服する能力などの利点を提供する。本明細書で対象発明は、異種核酸の挿入のために優れている、ダイズゲノムの第6染色体の上の特定部位を開示する。第6染色体の上の挿入/ターゲティング部位の位置を同定することおよび/または標的化することにおいても役立つことができる、5’隣接配列および3’隣接配列も開示される。したがって、対象発明は、対象の異種核酸をこの事前に確立された標的部位またはこの標的部位の近くに導入する方法を提供する。対象発明は、開示される標的部位またはそのような部位の近辺に挿入されている任意の異種ヌクレオチド配列を含むダイズ種子および/またはダイズ植物も包含する。そのような標的化組込みを達成する1つの選択肢は、本明細書に例示されるpat発現カセットを切除することおよび/またはその代わりに異なる挿入物を置換することである。一般に、例えば、および限定されずに、対象発明によって標的化相同組換えを用いることができる。本明細書で用いられる場合、遺伝子、イベントまたは形質のスタッキングは、所望の形質を1つのトランスジェニック系統で一緒にする。植物育種家は、所望の形質を各々有する親の間で交配を行い、次にこれらの所望の形質の両方とも有する子孫を同定することによって、トランスジェニック形質をスタックする。遺伝子をスタックする別の方法は、形質転換の間に植物の細胞核に2つ以上の遺伝子を同時に移すことによる。遺伝子をスタックする別の方法は、対象の別の遺伝子でトランスジェニック植物を再形質転換することによる。例えば、遺伝子スタッキングは、2つ以上の異なる形質、例えば2つ以上の異なる昆虫形質、昆虫抵抗性形質複数可および病気抵抗性形質複数可、2つ以上の除草剤抵抗性形質、および/または昆虫抵抗性形質複数可および除草剤抵抗性形質複数可を組み合わせるために用いることができる。対象の遺伝子に加えての選択可能なマーカーの使用も、遺伝子スタッキングとみなすことができる。相同組換えは、それを通して2つのヌクレオチド配列が相互作用再結合して新しい組換え体DNA配列を形成することができる、類似したヌクレオチド配列を含有する対応部位を有する任意の対のヌクレオチド配列の間の反応を指す。類似したヌクレオチド配列の部位は、本明細書で各々相同配列と呼ばれる。一般に、相同組換えの頻度は、相同配列の長さが増加するに従って増加する。したがって、相同組換えは同一未満である2つのヌクレオチド配列の間で起こり得るが、2つの配列の間の相違が増加するに従って組換え頻度または効率は低下する。組換えは、ドナーおよび標的分子の各々についての1つの相同配列を用いて達成することができ、それによって、単一交差組換え生成物を生成する。あるいは、標的およびドナーヌクレオチド配列の各々について2つの相同配列が配置されてもよい。ドナーについての2つの相同配列と標的についての2つの相同配列との間の組換えは、二重交差組換え生成物を生成する。ドナー分子の上の相同配列が操作され得る配列例えば、対象配列の側面に位置する場合は、標的分子との二重交差組換えは、標的分子についての相同配列の間に当初存在したDNA配列を対象配列が置換している組換え生成物をもたらす。二重交差組換イベントを介しての標的とドナーとの間でのDNA配列の交換は、配列交換と呼ばれる。対象イベントは、3つの異なる除草剤耐性タンパク質のトランスジェニック発現を可能にし、ほとんど全ての広葉およびイネ科雑草を防除する除草剤の組合せへの耐性をもたらす。この多除草剤耐性形質の発現カセット/トランスジェニック挿入物は、例えば、他の除草剤耐性形質例えば、グリホサート抵抗性、グルホシネート抵抗性、イミダゾリノン抵抗性、ジカンバ抵抗性、HPPD抵抗性、ブロモキシニル抵抗性他、および昆虫抵抗性形質例えば、Cry1F、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry34/45、Cry1Be、Cry1Ca、Cry1Da、Cry1Ea、Cry1Fa、栄養性殺虫性タンパク質VIPS-VIP3Aを含む、などをスタックされてよい。さらに、対象発明の発現カセット/トランスジェニック挿入物中の除草剤耐性タンパク質は、第2の遺伝子または遺伝子群で遺伝子操作された植物の一次形質転換体の選択を助けるための1つまたは複数の選択可能なマーカーの役割を果たすことができる。除草剤例えば、グリホサートへの新たに獲得された抵抗性または固有の耐性のために、形質のこれらの組合せは、雑草および同様の種を防除する新規方法をもたらす。したがって、イベントpDAB8264.44.06.1を用いて雑草を防除するための新規方法は、本発明の範囲内である。作物に個々にスタックまたは形質転換される対象トランスジェニック形質の使用は、フェノキシ、ピリジルオキシ、グリホサートおよび/またはグルホシネート除草剤への耐性を付与するための遺伝子を含有しない他の除草剤耐性自生作物を防除するツールを提供する。対象発明の好ましい植物または種子は、そのゲノムに、本明細書で特定される挿入物配列を、本明細書に記載される挿入物の両側の少なくとも20~500個以上の連続する隣接ヌクレオチドと一緒に含む。特に明記しない限り、隣接配列への言及は、配列番号1および配列番号2に関して特定される配列を指す。前と同様に、対象イベントは、挿入DNAの直近の対象隣接ゲノム配列の間に挿入されている異種DNAを含む。これらの隣接配列の全てまたは一部は、そのイベントを含む親の系統の有性交配の結果として挿入DNAを受け取る後代へ伝えられることが予想することができる。対象発明は、対象発明の植物の再生可能な細胞の組織培養を含む。そのような組織培養から再生される植物、特に例示される品種の全ての形態的および生理的特性を発現することが可能な植物も含まれる。対象発明の好ましい植物は、寄託種子から生育させた植物の全ての生理的および形態的特徴を有する。本発明は、そのような種子および対象の特質形質を保有する種子の後代をさらに含む。植物または種子、またはその一部の操作例えば、突然変異、さらなるトランスフェクションおよびさらなる育種は、事実上由来する品種と呼ぶことができるものの生成をもたらすことができる。InternationalUnionfortheProtectionofNewVarietiesofPlantsUPOVは、品種が保護品種に事実上由来しているかどうかについて判定するための以下のガイドラインを提供している:[A]以下の場合に、品種は、別の品種最初の品種に事実上由来するとみなされるものとするiそれは主に最初の品種に由来するか、またはそれ自体主に最初の品種に由来する品種に由来するが、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる本質的特徴の発現を保持する;iiそれは、最初の品種と明らかに識別可能である;およびiii誘導の行為から生じる差を除いて、それは、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる本質的特徴の発現において最初の品種に一致する。UPOV、国際機関との第6回会議、Geneva、1992年10月30日;文書は、連合事務局によって作成された。本明細書で用いる場合、系統は、少なくとも1つの形質について個体間で遺伝的変異をほとんど又は全く示さない一群の植物である。そのような系統は、数世代の自家受粉および選択、または組織もしくは細胞培養技術を用いる単一の親からの栄養繁殖によって作製することができる。本明細書で用いる場合、用語栽培種および品種は同義であり、商業生産のために用いられる系統を指す。安定性または安定したは、所与の成分に関して、その成分が代々、好ましくは少なくとも3世代、実質的に同じレベルで、例えば好ましくは±15、より好ましくは±10、最も好ましくは±5で引き続いて維持されることを意味する。安定性は、温度、場所、ストレスおよび栽植時期の影響を受けることがある。圃場条件下の以降の世代の比較は、同様の方法で成分を生成するはずである。商業上の有用性は、従来の耕作機械を用いて作物を農民が生産することができ、従来の破砕および抽出設備を用いて記載される成分の油を種子から抽出することができるように、優れた植物活力および高い繁殖性を有することと定義される。商業上有益であるために、種子重量で測定される収量、含油量およびエーカーあたりの生産される全油は、同じ地域で育てられる高級な価値形質のない、その他は同等の市販キャノーラ品種の平均収量から15以内にある。農業優良種は、対象イベント複数可による除草剤耐性に加えて、収量、成熟、病害抵抗性などの望ましい農業特性をある系統が有することを意味する。対象発明のイベントを含む植物の、下の実施例に示す、個々にまたは任意の組合せでとられる農業形質は、対象発明の範囲内である。これらの農業特性およびデータポイントのいずれかおよび全ては、そのような植物を同定するために、1点として用いられるか、またはそのような植物を規定するために用いられる特性範囲の一端もしくは両端で用いることができる。本開示を考慮して当業技術者が認識するように、検出キットの好ましい実施形態は、例えば、接合部配列または移行配列ダイズゲノム隣接配列が挿入物配列と出会う場所に向けられるおよび/またはそれを含むプローブおよび/またはプライマーを含むことができる。例えば、これは、表1に示されるように、片方または両方の接合部配列挿入物が隣接配列と出会う場所を同定するように設計されるポリヌクレオチドプローブ、プライマー、および/またはアンプリコンを含む。1つの一般的な設計は、隣接領域でハイブリダイズする1つのプライマー、および挿入物でハイブリダイズする1つのプライマーを持つことである。そのようなプライマーは、各々しばしば約少なくとも15残基の長さである。この配置で、プライマーは、対象発明のイベントの存在を示す検出可能なアンプリコンを生成/増幅するために用いることができる。これらのプライマーは、上で示される接合部配列にわたるおよびそれを含むアンプリコンを生成するために用いることができる。隣接配列でタッチダウンするプライマー複数可は、一般的に接合部から約200個の塩基を越えてハイブリダイズするように設計されない。したがって、一般的な隣接プライマーは、挿入物の最初から数えて隣接配列に200塩基の範囲内のいずれかの鎖の少なくとも15残基を含むように設計される。すなわち、上で同定される一方または両方の接合部配列から約100から200~500またはその位塩基内の残基からのまたはそれとハイブリダイズする適切なサイズの配列を含むプライマーは、対象発明の範囲内である。挿入物プライマーは挿入物の上のいずれかの位置に同様に設計することができるが、上で同定される接合部配列複数可中のまたはそこからの100から約200~500塩基内の挿入物相補配列を含むの上の残基は、例えば、そのようなプライマー設計のために非排他的に用いることができる。当業者は、プライマーおよびプローブは、標準のハイブリダイゼーション条件および/またはPCR条件範囲の下で、本明細書に例示される配列またはその相補配列のセグメントとハイブリダイズするように設計することができることも認識し、そこで、プライマーまたはプローブは例示される配列に完全には相補的でない。すなわち、多少の程度のミスマッチは寛容できる。例えば約20ヌクレオチドプライマーについては、ミスマッチ塩基が内部にあるか、アンプリコンの反対側にあるプライマーの末端である場合は、一般的に1つまたは2つほどのヌクレオチドが反対側の鎖と結合する必要性はない。様々な適当なハイブリダイゼーション条件が下で提供される。イノシンなどの合成ヌクレオチド類似体をプローブで用いることもできる。ペプチド核酸PNAプローブ、ならびにDNAおよびRNAプローブを用いることもできる。重要であることは、そのようなプローブおよびプライマーが対象発明のイベントの存在の診断に役立つ特異的に同定および区別することができることである。例えば軽微な配列決定の誤りをもたらし得るPCR増幅での誤りが起こる可能性があることに注意すべきである。すなわち、特に明記しない限り、本明細書に記載される配列は、ダイズゲノムDNAから長いアンプリコンを生成し、次にアンプリコンをクローニングおよび配列決定することによって決定された。ゲノムDNAから配列決定のために十分なアンプリコンを生成するのに必要である多くの増幅周回を考慮すると、このように生成および判定される配列のわずかな差および軽微な不一致を見出すことは珍しいことではない。当業者は、この種の一般的な配列決定の誤りまたは不一致のために必要とされるいかなる調整も、対象発明の範囲内にあることを認識するべきであり、注意させるべきである。配列がイベントの生成の間に挿入されるとき、例えば一部のゲノム配列が削除されることは珍しくないことにも注意すべきである。したがって、例えば対象の隣接配列とGENBANKに記載されるゲノム配列との間に、多少の差が現れることもある。挿入物の成分は図面で例示され、下の実施例でさらに詳細に議論される。これらの成分またはその断片のDNAポリヌクレオチド配列は、本発明の方法でDNAプライマーまたはプローブとして用いることができる。本発明の一部の実施形態では、ダイズ植物から、植物および種子などで、導入遺伝子/ゲノム挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。本明細書で提供される対象導入遺伝子/ゲノム挿入領域接合部配列、本明細書で同定される接合部配列を含むセグメント、ならびに任意のそのような例示配列およびその任意のセグメントの相補配列を含むDNA配列が提供される。挿入領域接合部配列は、ゲノムに挿入されている異種DNAと、挿入部位の側面に位置するダイズ細胞由来のDNAとの間の接合部にわたる。そのような配列は、所与のイベントの診断に役立つことができる。これらの挿入物およびボーダー配列に基づき、イベント特異的プライマーを生成することができる。PCR分析は、これらのイベント特異的なプライマーセットで生成されるPCRアンプリコンの分析によって、異なるダイズ遺伝子型における対象発明のダイズ系統を同定することができることを実証した。これらのダイズ系統を特異的に同定するために、これらおよび他の関連した手順を用いることができる。したがって、そのようなプライマー対に由来するPCRアンプリコンは特有のものであり、これらのダイズ系統を同定するために用いることができる。一部の実施形態では、新規導入遺伝子/ゲノム挿入領域の連続した断片を含むDNA配列は、本発明の一態様である。導入遺伝子挿入物配列のポリヌクレオチドの十分な長さ、および前記ダイズ植物の1つまたは複数からのダイズゲノム配列のポリヌクレオチドの十分な長さを含むDNA配列、ならびに/またはこれらのダイズ植物の1つまたは複数の診断に役立つアンプリコン生成物の生成のためのプライマー配列として有益である配列が含まれる。関連する実施形態は、本明細書で同定されるDNA配列またはその相補配列の導入遺伝子部分の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むDNA配列、およびこれらの配列またはその相補配列からの類似した長さの隣接ダイズDNA配列例えば配列番号1および配列番号2ならびにそのセグメントに関する。そのような配列は、DNA増幅方法でのDNAプライマーとして有益である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、本明細書で言及されるダイズイベントのいずれかの診断に役立つ。したがって、本発明は、そのようなDNAプライマーおよび相同プライマーによって生成されるアンプリコンも含む。本発明は、本明細書で言及されるダイズイベントに対応するDNAの、試料中の存在を検出する方法も含む。そのような方法は、以下を含むことができる:aDNAを含む試料を、これらのダイズイベントの少なくとも1つ由来のDNAとの核酸増幅反応で用いられるときに前記イベント複数可の診断に役立つアンプリコンを生成するプライマーセットと接触させるステップ;b核酸増幅反応を実施し、それによってアンプリコンを生成するステップ;およびcアンプリコンを検出するステップ。対象発明のさらなる検出方法は、前記イベントに対応するDNAの試料中の存在を検出する方法を含み、前記方法は以下を含む:aDNAを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で前記ダイズイベントの少なくとも1つ由来のDNAとハイブリダイズし、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で対照ダイズ植物非対象イベントDNAとハイブリダイズしないプローブと接触させるステップ;b試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップ;およびcDNAに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出するステップ。さらなる実施形態では、対象発明は、イベントpDAB8264.44.06.1を含むダイズ植物を生成する方法を含み、前記方法は以下のステップを含む:a第1の親ダイズ系統前記系統の植物に前記除草剤抵抗性形質を付与する、本発明の発現カセットを含むと第2の親のダイズ系統この除草剤耐性形質を欠くを有性的に交配し、それによって複数の後代植物を生成するステップ;およびb分子マーカーを用いて後代植物を選択するステップ。そのような方法は、前記除草剤耐性形質を含む純粋種のダイズ植物を生成するために、後代植物を第2の親ダイズ系統へ戻し交配するさらなるステップを任意選択で含むことができる。本発明の別の態様により、前記イベントとの交配の後代の接合性を判定する方法が提供される。前記方法は、ダイズDNAを含む試料を対象発明のプライマーセットと接触させるステップを含むことができる。前記ダイズイベントの少なくとも1つのゲノムDNAとの核酸増幅反応で用いられるときに、前記プライマーは、前記ダイズイベントの少なくとも1つの診断に役立つ第1のアンプリコンを生成する。そのような方法は、核酸増幅反応を実施し、それによって第1のアンプリコンを生成するステップ;第1のアンプリコンを検出するステップ;およびダイズDNAを含む試料を前記プライマーセットと接触させるステップ前記プライマーセットは、ダイズ植物由来のゲノムDNAとの核酸増幅反応で用いられるとき、ダイズゲノム領域に相同性である天然のダイズゲノムDNAを含む第2のアンプリコンを生成する;ならびに、核酸増幅反応を実施し、それによって第2のアンプリコンを生成するステップをさらに含む。この方法は、第2のアンプリコンを検出するステップ、ならびに試料中の第1および第2のアンプリコンを比較するステップをさらに含み、そこで、両アンプリコンの存在はその試料が導入遺伝子挿入にヘテロ接合であることを示す。本明細書に開示される組成物およびDNA検出の分野で周知である方法を用いて、DNA検出キットを開発することができる。キットは試料中の対象ダイズイベントDNAの同定のために有益であり、このDNAを含有するダイズ植物を育種する方法へ適用することができる。キットは、例えば本明細書に開示されるアンプリコンに相同であるか相補的なDNA配列、または対象イベントの導入遺伝子遺伝子エレメントに含有されるDNAに相同であるか相補的なDNA配列を含有する。これらのDNA配列は、DNA増幅反応で、またはDNAハイブリダイゼーション方法でのプローブとして用いることができる。キットは、検出方法の実施で必要な試薬および材料を含有することもできる。プローブは、従来の検出可能な標識またはリポーター分子放射性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素などが結合している、単離された核酸分子である。そのようなプローブは、標的核酸の鎖に、本発明の場合は、ダイズ植物からであれイベントのDNAを含む試料からであれ、前記ダイズイベントの1つ由来のゲノムDNAの鎖に相補的である。本発明によるプローブには、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的DNA配列に特異的に結合してその標的DNA配列の存在を検出するために用いることができるポリアミドおよび他のプローブ材料も含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが非天然の状態にあること、例えば、異種プロモーターに作動可能に連結していることを意味する。精製されたタンパク質は、同様に、そのタンパク質が非天然の状態にあることを意味する。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的DNA鎖とアニールされて、プライマーと標的DNA鎖との間でハイブリッドを形成し、次に、ポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼによって標的DNA鎖に沿って伸長する、単離/合成された核酸である。本発明のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCRまたは他の従来の核酸増幅方法による標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用を指す。プローブおよびプライマーは、長さが一般に5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、または500ポリヌクレオチド以上である。そのようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の下で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは標的配列との完全な配列類似性を有するが、標的配列とハイブリダイズする能力を保持する、標的配列と異なるプローブを従来の方法によって設計することができる。プローブおよびプライマーを調製する方法および用いる方法は、例えば、MolecularCloningALaboratoryManual、第2版、第1~3巻、Sambrookら編、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NY、1989年に記載される。PCRプライマー対は、例えばその目的のためのコンピュータプログラムを用いて、既知の配列から導くことができる。本明細書に開示される隣接DNAおよび挿入物配列に基づくプライマーおよびプローブは、従来の方法によって、例えばそのような配列を再クローニングおよび配列決定することによって、開示される配列を確認するおよび、必要に応じて訂正するために用いることができる。本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件の下で標的DNA配列とハイブリダイズする。試料中のトランスジェニックイベント由来のDNAの存在を同定するために、任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いることができる。核酸分子またはその断片は、特定の状況下で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることが可能である。本明細書で用いる場合、2つの核酸分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成することが可能であるならば、その2つの核酸分子は互いと特異的にハイブリダイズすることが可能であると言われる。それらが完全な相補性を示すならば、核酸分子は別の核酸分子の相補配列であると言われる。本明細書で用いる場合、分子の1つのあらゆるヌクレオチドが他の分子のヌクレオチドに相補的である場合に、それらの分子は完全な相補性を示すと言われる。少なくとも従来の低ストリンジェンシー条件の下でそれらが互いとアニールした状態を保つのを可能にするのに十分な安定性でそれらが互いとハイブリダイズすることができる場合に、2つの分子は最小限に相補的であると言われる。同様に、従来の高ストリンジェンシー条件の下でそれらが互いとアニールした状態を保つのを可能にするのに十分な安定性でそれらが互いとハイブリダイズすることができる場合に、それらの分子は相補的であると言われる。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989年、によって記載される。したがって、完全な相補性からの逸脱は、そのような逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に排除しない限り許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブの役割を果たすためには、その核酸分子は、利用される特定の溶媒および塩濃度の下で安定した二本鎖構造を形成できるように、配列が十分に相補的であることのみを必要とする。本明細書で用いる場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件の下でそれが比較される核酸配列の相補配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列である。用語ストリンジェント条件は、Sambrookら、1989年、952~955で議論される特異的ハイブリダイゼーション手順による、核酸プローブと標的核酸すなわち、対象の特定の核酸配列とのハイブリダイゼーションに関して、機能的に定義される。Sambrookら、1989年、947~952および956~958も参照。したがって、本発明のヌクレオチド配列は、DNA断片の相補的ストレッチと二重鎖分子を選択的に形成するそれらの能力のために用いることができる。想定される適用に従い、標的配列に対するプローブの様々な程度の選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件を用いることができる。高い選択性を必要とする適用のために、例えばエンドポイントTaqManおよびリアルタイムPCR適用に関して、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件が一般的に使用され、約60°Cから約75°Cの温度で1.5mMから約4.0mMのMgCl2が選択され、および本明細書に記載されるように、ストリンジェンシーを増加させるために保持時間が変更されることがある。他のハイブリダイゼーション技術については、例えば約50°Cから約70°Cの温度で約0.02Mから約0.15MのNaClによって提供されるような、比較的低い塩および/または高い温度条件が一般的に使用される。ストリンジェント条件は、例えば、ハイブリダイゼーションフィルターを高ストリンジェンシー洗浄緩衝液0.2×SSC、0.1SDS、65°Cで少なくとも2回洗浄することを含むことができる。DNAハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件、例えば、約45°Cの6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSCと、続く50°Cの2.0×SSCの洗浄は、当業者に公知である。例えば、洗浄工程での塩濃度は、50°Cの約2.0×SSCの低ストリンジェンシーから50°Cの約0.2×SSCの高ストリンジェンシーまでから選択することができる。さらに、洗浄工程での温度は、約22°Cの室温の低ストリンジェンシー条件から約65°Cの高ストリンジェンシー条件まで増加させることができる。温度と塩の両方を変化させることができるか、または温度もしくは塩濃度のいずれかを一定に保持し、他の変数を変化させることができる。そのような選択的な条件は、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチを、あるとしてもわずかしか許容しない。ハイブリダイゼーションによるDNA配列の検出は当業者に周知であり、米国特許第4,965,188号および第5,176,995号の教示はハイブリダイゼーション分析の方法の例である。特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、相補配列およびその断片を含む、本明細書で例示または提案されるプライマーまたはアンプリコンもしくは他の配列の1つまたは複数と、高ストリンジェンシー条件の下で特異的にハイブリダイズする。本発明の一態様では、本発明のマーカー核酸分子は、例示される配列の1つ、またはその相補配列および/または断片の、本明細書で示される核酸配列を有する。本発明の別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような核酸配列と80から100、または90から100の間の配列同一性を共有する。本発明のさらなる態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような配列と95から100の間の配列同一性を共有する。そのような配列は、遺伝的交配の後代を同定するための植物育種法でマーカーとして用いることができる。プローブと標的DNA分子とのハイブリダイゼーションは、当業者に公知である任意の数の方法によって検出することができ、これらには、それらに限定されないが、蛍光性タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグ、および化学発光タグを含めることができる。特定の増幅プライマー対を用いての標的核酸配列の増幅例えば、PCRによるに関して、ストリンジェント条件は、プライマー対が、対応する野生型配列またはその相補配列を有するプライマーが結合する標的核酸配列とだけハイブリダイズして、好ましくは特有な増幅生成物アンプリコンを生成することを許す条件である。用語標的配列に特異的なは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、プローブまたはプライマーが標的配列を含む試料の標的配列とだけハイブリダイズすることを示す。本明細書で用いる場合、増幅されたDNAまたはアンプリコンは、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅生成物を指す。例えば、有性交配から生じるダイズ植物が本発明のダイズ植物からのトランスジェニックイベントゲノムDNAを含有するかどうか判定するために、ダイズ植物組織試料から抽出されるDNAは、挿入された異種DNAの挿入部位に隣接している植物ゲノムの隣接配列に由来するプライマーおよび挿入された異種DNAに由来する第2のプライマーを含むプライマー対を用いて核酸増幅方法にかけ、イベントDNAの存在の診断に役立つアンプリコンを生成することができる。アンプリコンは、イベントの診断に同じく役立つ長さおよび配列を有する。アンプリコンの長さは、プライマー対に1つのヌクレオチド塩基対を組み合わせた長さから、および/またはプライマー対に約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、または500、750、1000、1250、1500、1750、2000以上のヌクレオチド塩基対上記の増分のいずれかを加えるか引いたものを組み合わせた長さに変動することができる。あるいは、全体の挿入物ヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成するように、プライマー対は挿入されるDNAの両側の隣接配列に由来してよい。植物ゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入されるDNA配列から離れた位置にあることができる。この距離は、1ヌクレオチド塩基対から約20,000ヌクレオチド塩基対までの範囲内であってよい。用語アンプリコンの使用は、DNA熱増幅反応で形成することができるプライマー二量体を特異的に排除する。核酸増幅は、当技術分野で公知である、ポリメラーゼ連鎖反応PCRを含む様々な核酸増幅方法のいずれかによって達成することができる。様々な増幅方法が当技術分野で公知であり、とりわけ、米国特許第4,683,195号および米国特許第4,683,202号に記載されている。最高22kbのゲノムDNAを増幅するように、PCR増幅方法が開発されている。本発明の実施で、これらの方法およびDNA増幅の技術分野で公知である他の方法を用いることができる。対象ダイズイベントからの異種導入遺伝子DNA挿入物の配列または隣接ゲノム配列は、本明細書で提供される配列に由来するプライマーを用いてイベントからそのような配列を増幅し、続いてPCRアンプリコンまたはクローンDNAの標準のDNA配列決定によって検証するおよび必要に応じて訂正することができる。これらの方法によって生成されるアンプリコンは、複数の技術によって検出することができる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムによる染色は、DNAアンプリコンを検出する一般的な周知の方法である。別のそのような方法は、隣接する隣接ゲノムDNA配列と挿入されるDNA配列の両方に重複するDNAオリゴヌクレオチドが設計される、遺伝子ビット分析である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェルに固定化される。対象領域のPCR挿入される配列中の1つのプライマーおよび隣接する隣接ゲノム配列中の1つのプライマーを用いるの後、一本鎖PCR生成物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることができ、DNAポリメラーゼおよび予想される隣の塩基に特異的な標識ddNTPを用いる一塩基伸長反応のための鋳型の役割を果たすことができる。読み出しは蛍光性であるか、ELISAベースであってよい。シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長による挿入物/隣接配列の存在を示す。別の方法は、WingeInnovPharmaTech00:18~24頁、2000年によって記載されるピロシークエンシング技術である。この方法では、隣接するゲノムDNAおよび挿入物DNA接合部に重複するオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドは、対象領域からの一本鎖PCR生成物とハイブリダイズされ挿入配列中の1つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の1つのプライマー、DNAポリメラーゼ、ATP、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン5’ホスホスルフェートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。DNTPが個々に追加され、その組込みが測定される光シグナルを生じる。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基または多塩基伸長による導入遺伝子挿入物/隣接配列の存在を示す。蛍光偏光法は、本発明のアンプリコンを検出するために用いることができる別の方法である。この方法に従い、ゲノム隣接部および挿入DNA接合部に重複するオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドは、対象領域からの一本鎖PCR生成物とハイブリダイズされ挿入DNA中の1つのプライマーおよび隣接ゲノムDNA配列中の1つのプライマー、DNAポリメラーゼおよび蛍光標識ddNTPの存在下でインキュベートされる。一塩基伸長は、ddNTPの組込みをもたらす。組込みは、蛍光光度計を用いて偏光での変化として測定することができる。偏光の変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長による導入遺伝子挿入物/隣接配列の存在を示す。TAQMANPEAppliedBiosystems、FosterCity、Calif.は、DNA配列の存在を検出し、定量する方法である。簡潔に述べると、ゲノム隣接部および挿入物DNA接合部に重複するFRETオリゴヌクレオチドプローブが設計される。耐熱性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下で、FRETプローブおよびPCRプライマー挿入物DNA配列中の1つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の1つのプライマーがサイクル処理される。特異的な増幅の間、TaqDNAポリメラーゼは、FRETプローブの上の消光部分から蛍光部分を除いてこの部分を放出する。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる隣接/導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。分子ビーコンは、配列検出で使用するために記載されている。簡潔に述べると、隣接ゲノムおよび挿入物DNA接合部に重複するFRETオリゴヌクレオチドプローブが設計される。FRETプローブの特有な構造は、それが、蛍光部分および消光部分を極めて近くに保つ2次構造を含有することをもたらす。耐熱性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下で、FRETプローブおよびPCRプライマー挿入物DNA配列中の1つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の1つのプライマーがサイクル処理される。PCR増幅が成功した後、FRETプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションによって、プローブ2次構造の除去ならびに蛍光部分および消光部分の空間的分離が起こる。蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる隣接ゲノム/導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。挿入のために優れているダイズゲノムの位置が開示されたが、対象発明は、このゲノム位置の概ね近辺に又はその周辺に少なくとも1つの非aad12/pat/2mepspsコード配列を含むダイズ種子および/またはダイズ植物も含む。1つの選択肢は、本明細書に例示される挿入物の代わりに異なる挿入物を置換することである。これに一般に関し、例えば、対象発明によって標的化相同組換えを用いることができる。この種の技術は、例えば、WO03/080809A2および対応する公開米国特許出願U.S.2003/0232410の対象である。したがって、対象発明は、本明細書で配列番号1および配列番号2と同定される隣接配列の全てまたは認識できるその一部が側面に位置する異種挿入物を例示される挿入物の代わりに、またはその多コピーと共に含む植物および植物細胞を含む。例示挿入物またはその成分のいずれかの追加のコピーまたは複数の追加のコピーも、この方法/これらの方法で挿入の標的にすることができた。本明細書で参照または引用される全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらがこの明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、参照により全体が組み込まれる。本発明を実施するための手順を例示するために、および本発明の特定の好ましい実施形態を実証するために、以下の実施例が含まれる。これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきでない。以下の実施例で開示される技術はその実施のための好ましい様式を例示するために用いられる特定の方法を表すことを、当業者は理解するべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様であるか類似した結果をなお得ながら、これらの具体的な実施形態に多くの変更を加えることができることを理解するべきである。特記されない限り、全ての百分率は重量によるものであり、全ての溶媒混合割合は特記されない限り容量によるものである。特に明記しない限り、以下の略記号が用いられる。bp塩基対°C摂氏温度DNAデオキシリボ核酸DIGジゴキシゲニンEDTAエチレンジアミン四酢酸kbキロベースμgマイクログラムμLマイクロリットルmLミリリットルMモル質量OLP重複プローブPCRポリメラーゼ連鎖反応PTU植物転写単位SDSドデシル硫酸ナトリウムSOP標準操作手順SSC塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの混合物を含有する緩衝溶液、pH7.0TBEトリス塩基、ホウ酸およびEDTAの混合物を含有する緩衝溶液、pH8.3Vボルト2mEPSPSおよびAAD-12ダイズイベント8264.44.06.1の形質転換および選択ダイズ子葉節外植片のアグロバクテリウムAgrobacteriumu媒介形質転換を介して、ダイズイベント8264.44.06.1を含有するトランスジェニックダイズGlycinemaxを作出した。形質転換を開始するために、T鎖DNA領域の中に選択可能なマーカー、patならびに対象遺伝子aad-12および2mepspsv1を含有する二成分ベクターpDAB8264図1を運ぶ、無害化アグロバクテリウムAgrobacterium株EHA101Hoodら、2006年を用いた。アグロバクテリウムAgrobacterium媒介形質転換は、Zengら2004年の改変手順を用いて実行した。簡潔に述べると、ダイズ種子栽培品種Maverickを基本培地の上で発芽させ、子葉節を単離してアグロバクテリウムAgrobacteriumに感染させた。アグロバクテリウムAgrobacteriumの除去のために、生長開始、苗条伸長および発根用の培地に、セフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した。形質転換されていない苗条の生育を抑制するために、グルホシネート選択を用いた。選択された苗条は根の発達のために発根培地に移し、次に、小植物の順応のために配合土に移した。選択された小植物の頂生小葉は、推定上の形質転換体についてスクリーニングするためにグルホシネートを葉に塗布した。スクリーニングされた小植物を温室に移し、順応させ、次に耐性を再確認するためにグルホシネートを葉に塗布し、推定上の形質転換体であるとみなした。スクリーニングした植物から試料を採取し、選択可能なマーカー遺伝子および/または対象遺伝子の確認のための分子解析を実行した。T0植物を温室で自家受精させて、T1種子を生成した。このイベント、ダイズイベント8264.44.06.1は、独立した形質転換分離株から生成された。T1植物は、以降の世代にわたって戻し交配され、優良品種へ遺伝子移入された。このイベントは、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定した発現、ならびに除草剤耐性および農業パフォーマンスを含む効力の優れた組合せなどのその特有の特徴に基づいて選択された。以下の実施例は、ダイズイベント8264.44.06.1を特徴づけるために用いられたデータを含有する。ダイズイベント8264.44.06.1でのAAD-12、2mEPSPSおよびPATタンパク質の特徴づけトランスジェニックダイズイベントpDAB8264.44.06.1に由来する組換え体AAD-12、2mEPSPSおよびPATタンパク質の生化学的性質を特徴づけした。タンパク質の生化学的性質を特徴づけて、AAD-12、PATおよび2mEPSPSタンパク質の発現を確認するために、定量的酵素結合免疫吸着検定法ELISAを用いた。実施例2.1:植物組織でのAAD-12タンパク質の発現AAD-12タンパク質のレベルを、ダイズイベント8264.44.06.1で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定ELISA方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能なAAD-12タンパク質を測定した。ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現分析のために調製した。0.5ウシ血清アルブミンBSAを含有する界面活性剤Tween20PBSTを含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、AAD-12タンパク質をダイズ植物組織から抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のAAD-12ELISAキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコルに従って用いた。ダイズイベント8264.44.06.1で発現安定性および遺伝率を垂直世代間および水平同世代の系統の間の両方で調査するために、検出分析を実施した。T4世代で、ダイズイベント8264.44.06.1の発現は全ての系統を通して安定で分離せず、一貫していた。圃場発現レベル試験をダイズイベントについて実施した;全ての系統を通しての平均発現は、およそ200~400ng/cm2であった。実施例2.2:植物組織での2mEPSPSタンパク質の発現2mEPSPSタンパク質のレベルを、ダイズイベント8264.44.06.1で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定ELISA方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能な2mEPSPSタンパク質を測定した。ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現分析のために調製した。0.5ウシ血清アルブミンBSAを含有する界面活性剤Tween20PBSTを含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、2mEPSPSタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式の2mEPSPSELISAキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコルに従って用いた。ダイズイベント8264.44.06.1で発現安定性および遺伝率を垂直世代間および水平同世代の系統の間の両方で調査するために、検出分析を実施した。T4世代で、ダイズイベント8264.44.06.1の発現は全ての系統を通して安定で分離せず、一貫していた。圃場発現レベル試験をダイズイベント8264.44.06.1について実施した。全ての系統を通しての平均発現は、およそ5,000~17,500ng/cm2であった。これらの発現レベルは、2mEPSPSタンパク質を発現した陽性対照より高かった。実施例2.3:植物組織でのPATタンパク質の発現PATタンパク質のレベルを、ダイズイベント8264.44.06.1で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定ELISA方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能なPATタンパク質を測定した。ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現分析のために調製した。0.5ウシ血清アルブミンBSAを含有する界面活性剤Tween20PBSTを含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、PATタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のPATELISAキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコルに従って用いた。ダイズイベント8264.44.06.1で発現安定性および遺伝率を垂直世代間および水平同世代の系統の間の両方で調査するために、検出分析を実施した。T4世代で、ダイズイベント8264.44.06.1の発現は全ての系統を通して安定で分離せず、一貫していた。圃場発現レベル試験をダイズイベント8264.44.06.1について実施した。全ての系統を通しての平均発現は、およそ15~25ng/cm2であった。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の挿入物および隣接ボーダー領域のDNA配列のクローニングおよび特徴づけゲノム挿入部位を特徴づけて記載するために、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の隣接ゲノムT-DNAボーダー領域の配列を決定した。全体で、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1ゲノム配列の2,578bpが確認され、5’隣接ボーダー配列の570bp配列番号1、3’隣接ボーダー配列の1,499bp配列番号2を含む。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1ボーダー配列に基づくPCR増幅は、ボーダー領域がダイズ起源であり、接合部領域がイベントpDAB8264.44.06.1に特有な配列であることを確認した。接合部領域は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のイベント特異的同定のために用いることができた。さらに、野生型ダイズのゲノムから同定された隣接ボーダー配列の領域に対応するゲノム断片を増幅することによって、T鎖挿入部位を特徴づけた。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1と野生型ゲノム配列との比較により、元の遺伝子座から約4,357bpが欠失したことを明らかにした。全体として、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の挿入物およびボーダー配列の特徴づけは、T鎖の無傷のコピーがダイズゲノムに存在することを示した。実施例3.1:ダイズゲノム配列の確認5’および3’隣接ボーダーは、第6染色体からのダイズGlycinemax全ゲノムショットガン配列と整列し、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の導入遺伝子がダイズゲノムの第6染色体に挿入されたことを示している。ダイズゲノムからのダイズイベントpDAB8264.44.06.1導入遺伝子の挿入部位を確認するために、異なる対のプライマーでPCRを実行した図2および表3。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1および他のトランスジェニックであるか非トランスジェニックのダイズ系統からのゲノムDNAを、鋳型として用いた。したがって、5’ボーダー配列が正しいかどうかを確認するために、2mepsps遺伝子から5’末端ボーダー配列にわたるDNAセグメントを増幅するために、2mepsps特異的プライマー、例えばED_v1_C1配列番号11、ならびに、4406-WF1配列番号3および4406-WF3配列番号5と命名された、クローニングされた5’末端ボーダー配列および/またはダイズゲノム第6染色体の上のその整列配列によって設計された2つのプライマーを用いた。同様に、クローニングされた3’末端ボーダー配列の確認のために、pat遺伝子から3’末端ボーダー配列にわたるDNAセグメントを増幅するために、pat特異的プライマー、例えばPAT-12配列番号12、ならびに、4406-WR5配列番号7、4406-WR7配列番号9および4406-WR8配列番号10と命名された、クローニングされた3’末端ボーダー配列によって設計された3つのプライマーを用いた。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のゲノムDNAのみに由来する予測されたサイズのDNA断片は、1つのプライマーがダイズイベントpDAB8264.44.06.1の隣接ボーダーに位置し、1つが導入遺伝子特異的プライマーである各プライマー対を用いて増幅されたが、他のトランスジェニックダイズ系または非トランスジェニック対照のDNA試料からは増幅されなかった。これらの結果は、クローニングされた5’および3’ボーダー配列が、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のためのT鎖挿入物の隣接ボーダー配列であることを示す。ダイズゲノムのDNA挿入をさらに確認するために、2つのダイズ配列にわたるPCR増幅を完了した。全導入遺伝子、5’末端ボーダー配列および3’ボーダー配列を含有するDNAセグメントを増幅するために、5’末端ボーダー配列によって設計された2つのプライマー、4406-WF1配列番号3および4406-WF3配列番号5、ならびに3’末端ボーダー配列のための2つのプライマー、4406-WR5配列番号7および4406-WR7配列番号9を用いた。予想通りに、4406-WF1配列番号3および4406-WR5配列番号7のプライマー対によるPCR増幅は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のゲノムDNAからおよそ12kbのDNA断片を増幅し、非トランスジェニックダイズ対照および他のダイズトランスジェニック系から6kbのDNA断片を増幅した。同様に、4406-WF3配列番号5および4406-WR7配列番号9のプライマー対で完了したPCR反応は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の試料からおよそ12kbのDNA断片を生成し、他の全てのダイズ対照系統から6kbのDNA断片を生成した。これらの結果は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の導入遺伝子がダイズゲノムの第6染色体の部位に挿入されたことを実証した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の同定された5’および3’ボーダー配列と第6染色体からのダイズGlycinemax全ゲノムショットガン配列を整列することにより、元の遺伝子座から約4.4kbが欠失したことを明らかにした。図3。サザンブロットによるダイズイベントpDAB8264.44.06.1の特徴づけダイズイベントpDAB8264.44.06.1の組込みパターンを確立するために、サザンブロット分析を用いた。これらの実験は、ダイズゲノム内でのaad-12、patおよび2mepspsv1導入遺伝子の組込みおよび統合性を実証するデータを生成した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1は、プラスミドpDAB8264からのaad-12、patおよび2mepspsv1PTUの単一コピーを含有する、完全長の単純な組込みイベントと特徴づけられた。サザンブロットデータは、T鎖断片がダイズイベントpDAB8264.44.06.1のゲノムに挿入されたことを示唆した。pDAB8264のT鎖組込み領域に含有されるaad-12、patおよび2mepspsv1挿入物に特異的なプローブ、ならびに、プラスミドの中に位置する切断部位を有し、プラスミドの内部のハイブリダイズする断片またはダイズゲノムDNAとのプラスミドの接合部ボーダー断片にわたる断片を生成する記載の制限酵素を用いて、詳細なサザンブロット分析を実行した。制限酵素とプローブの組合せのためのサザンハイブリダイゼーションから示される分子量は、そのイベントに特有のものであって、その同定パターンを確立した。これらの分析は、プラスミド断片が、aad-12、patおよび2mepspsv1PTUの再配列なしでダイズゲノムDNAに挿入されたことも示した。実施例4.1:ダイズ葉試料収集およびゲノムDNAgDNA単離ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を含有する個々のダイズ植物から収集された葉組織から、ゲノムDNAを抽出した。さらに、aad-12および2mepspsv1遺伝子のないサブスタンス系統を表す遺伝的背景を含有する、従来のダイズ植物MaverickからgDNAを単離した。標準の臭化セチルトリメチルアンモニウムCTAB方法に従って、個々のゲノムDNAを凍結乾燥葉組織から抽出した。抽出の後、PicoGreen試薬Invitrogen、Carlsbad、CAを用いて、DNAを分光蛍光分析により定量した。PicoGreen分析からの値を確認し、次に、DNA特質を決定するためにDNAをアガロースゲルで可視化した。実施例4.2:DNA消化および分離ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のサザンブロット分子特徴づけのために、10マイクログラム10μgのゲノムDNAを消化した。1μgのDNAにつきおよそ5単位の選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を各DNA試料に加えることによって、ダイズpDAB8264.44.06.1および非トランスジェニックダイズ系統MeverickからのゲノムDNAを消化した。各試料は、およそ37°Cで一晩インキュベートした。消化物のために、制限酵素BstZ17I、HinDIII、NcoI、NsiIおよびPacIを個々に用いたNewEnglandBiolabs、Ipswich、MA。さらに、プラスミドDNA、pDAB8264を非トランスジェニックダイズ品種MaverickからのゲノムDNAと組み合わせることによって、陽性のハイブリダイゼーション対照試料を調製した。試験試料と同じ手順および同じ制限酵素を用いて、プラスミドDNA/ゲノムDNAカクテルを消化した。消化を一晩インキュベートした後、NaClを0.1Mの最終濃度まで加え、消化されたDNA試料をイソプロパノールで沈殿させた。沈殿したDNAペレットを20μlの1×添加液0.01ブロムフェノールブルー、10.0mMEDTA、5.0グリセロール、1.0mMトリスpH7.5に再懸濁させた。次に、このDNA試料および分子サイズのマーカーを、0.85アガロースゲルを介して0.4×TAE緩衝液FisherScientific、Pittsburgh、PAで35ボルトでおよそ18~22時間電気泳動にかけて、断片の分離を達成した。ゲルを臭化エチジウムInvitrogen、Carlsbad、CAで染色し、紫外UV光の下でDNAを可視化した。実施例4.3:サザン法および膜処理サザンブロット分析は、事実上、MemelinkJ;SwordsK;HarryJ;HogeC;1994年SouthernNorthernandWesternBlotAnalysis、PlantMolBiolManualF1:1~23頁に記載のように実施した。簡潔に述べると、DNA断片の電気泳動分離および可視化の後、0.25MのHClでおよそ20分間ゲルを脱プリンし、次に変性溶液0.4MのNaOH、1.5MのNaClにおよそ30分間、その後中和溶液1.5MのNaCl、0.5MトリスpH7.5に少なくとも30分間晒した。10×SSCによるウィッキング系を用いてナイロン膜の上でサザン転写を一晩実施した。転写の後、UV架橋によりDNAを膜に結合させ、続いて2×SSC溶液により簡単に膜洗浄した。この方法は、ハイブリダイゼーション用のサザンブロット膜を生成した。実施例4.4:DNAプローブ標識化およびハイブリダイゼーションナイロン膜に結合したDNA断片は、標識プローブを用いて検出した。遺伝子エレメントに特異的なプライマーを用いて、プラスミドpDAB8264から増幅されたDNA断片中への、ジゴキシゲニンDIG標識ヌクレオチド[DIG-11]-dUTPのPCRをベースとした組込みによってプローブを生成した。PCR合成によるDNAプローブの生成は、製造業者の推奨手順に従ってPCRDIGプローブ合成キットRocheDiagnostics、Indianapolis、INを用いて実行した。標識プローブをアガロースゲル電気泳動によって分析して、それらの特質および量を決定した。次に、実質的にDIGEasyHyb溶液RocheDiagnostics、Indianapolis、INについて記載した手順を用いて、特異的な断片の検出のために、ナイロン膜の上での標的DNAへのハイブリダイゼーションのために所望量の標識プローブを用いた。簡潔に述べると、固定されたDNAを含有するナイロン膜ブロットを2×SSCで簡単に洗浄し、ハイブリダイゼーションオーブン内で、およそ45~55°Cで約2時間、ハイブリダイゼーションボトルの中で20~25mLの予熱したDIGEasyHyb溶液でプレハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション溶液を次にデカントし、およそ5分間水浴上で沸騰させることによって変性させた特異的プローブの所望量を含有する、およそ15mLの予熱したDIGEasyHyb溶液と交換した。次に、ハイブリダイゼーションオーブン内でおよそ45~55°Cで一晩、ハイブリダイゼーション工程を実行した。プローブハイブリダイゼーションの終わりに、プローブを含有するDIGEasyHyb溶液を清潔なチューブにデカントし、およそ-20°Cで保存した。製造業者の推奨手順に従って、これらのプローブは二度にわたって再利用することができた。膜のブロットを簡単に洗い落とし、室温でおよそ5分間、清潔なプラスチック容器の中で低ストリンジェンシー洗浄緩衝液2×SSC、0.1SDSによって2回洗浄し、その後およそ65°Cでそれぞれ15分間、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液0.1×SSC、0.1SDSで2回洗浄した。膜のブロットは、およそ5分間、DIG洗浄およびブロック緩衝液セットRocheDiagnostics、Indianapolis、INからの1×マレイン酸緩衝液で簡単に洗浄した。この後に、1×ブロック緩衝液中で2時間のブロック、および同じく1×ブロック緩衝液中で最低30分間の抗DIG-APアルカリ性ホスファターゼ抗体RocheDiagnostics、Indianapolis、INとのインキュベーションが続いた。1×洗浄緩衝液による2~3回の洗浄の後、特異的DNAプローブは膜ブロットに結合したままであり、CDP-Star化学発光核酸検出系RocheDiagnostics、Indianapolis、INを製造業者の推奨に従って用いてDIG標識DNA標準を可視化した。1つまたは複数の時点についてブロットを化学発光フィルムに曝露させ、ハイブリダイズする断片を検出し、分子サイズ標準を可視化させた。フィルムをAll-Pro100Plusフィルム現像液KonicaMinolta、Osaka、Japanで現像し、画像を走査した。各プローブについて検出されたバンドの数およびサイズを記録した表5。記載のようにDIG検出の後可視になるDIG標識DNA分子量マーカーIIDIGMWMIIおよびDIG標識DNA分子量マーカーVIIDIGMWMVIIを用いて、サザンブロットでハイブリダイズする断片のサイズを決定した。実施例4.5:サザンブロットの結果aad-12および2mepspsPTUの既知の制限酵素部位に基づく、特定の消化物およびプローブで予想および観察された断片サイズを、表6に示す。予想された断片サイズはpDAB8264のプラスミドマップに基づき、観察された断片サイズはこれらの分析からの近似結果であり、DIG標識DNA分子量マーカーIIおよびマークVII断片の示されたサイズに基づく。2種類の断片がこれらの消化物およびハイブリダイゼーションから同定された:既知の酵素部位がプローブ領域の側面に位置し、aad-12および2mepspsPTUPTUの挿入領域の中に完全に含有される内部断片、ならびに既知の酵素部位がプローブ領域の一方の末端に位置し、第2の部位がダイズゲノムで予想されるボーダー断片。ほとんどの場合、DNA断片組込み部位は各イベントに特有であるので、ボーダー断片サイズはイベントによって異なる。ボーダー断片は、組み込まれたDNAと比較した制限酵素部位の位置決めし、DNA挿入物の数を評価するための手段を提供する。イベントpDAB8264.44.06.1を含有するダイズの複数世代についてサザンブロット分析を完了させ、プラスミドpDAB8264からの低コピーの無傷のaad-12および2mepspsPTUがダイズイベントpDAB8264.44.06.1のダイズゲノムに挿入されていることを示唆するデータを生じた。制限酵素NcoIおよびHinDIIIは、プラスミドpDAB8264の特有の制限部位に結合して切断する。その後、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のaad-12遺伝子挿入物を特徴づけるために、これらの酵素が選択された。4,078bpを超えるまたは3,690bpを超えるボーダー断片が、それぞれHinDIIIおよびNcoI消化の後、プローブとハイブリダイズすると予測された表6。HinDIIIおよびNcoIがそれぞれ用いられたとき、およそ7,400bpおよびおよそ3,800bpの単一のaad-12ハイブリダイゼーションバンドが観察された。このサイズのバンドへのプローブのハイブリダイゼーションは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のダイズゲノムでのaad-12遺伝子のための単一の挿入部位の存在を示唆する。制限酵素BstZ17I、NsiIおよびPacIは、aad-12植物転写単位PTU;プロモーター/遺伝子/ターミネーターを含有する断片を放出するように選択された表6。予測されたおよそ5,000、およそ5,000およびおよそ6,800bpの断片は、それぞれBstZ17I、NsiIおよびPacIによる消化の後にプローブで観察された。pDAB8264.44.06.1試料の酵素消化と続くプローブハイブリダイゼーションで得られた結果は、プラスミドpDAB8264からの無傷のaad-12PTUがダイズイベントpDAB8264.44.06.1のダイズゲノムに挿入されていることを示した。さらに、HinDIII、NcoI、NsiIおよびBstZ17I制限断片に対して生じたハイブリダイゼーションバンドの分子量サイズは、aad-12PTUが、連結したpatPTUも含有したことを示す。制限酵素BstZ17I、NcoIおよびNsiIは、プラスミドpDAB8264の制限部位に結合して切断する。その後、これらの酵素を選択して、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の2mepsps遺伝子挿入物を特徴づけた。4,858bpを超える、3,756bpを超える、または5,199bpを超えるボーダー断片は、それぞれBstZ17I、NcoIおよびNsiIによる消化の後にプローブとハイブリダイズすると予測された表6。BstZ17I、NcoIおよびNsiIがそれぞれ用いられたとき、およそ16,000bp、およそ6,100bpおよびおよそ5,300bpの単一の2mepspsハイブリダイゼーションバンドが観察された。このサイズのバンドへのプローブのハイブリダイゼーションは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のダイズゲノムでの2mepsps遺伝子のための単一の挿入部位の存在を示唆する。制限酵素PacIは、2mepsps植物転写単位PTU;プロモーター/遺伝子/ターミネーターを含有する断片を放出するように選択された表6。PacIによる消化の後に、予測されたおよそ6,800bpの断片がプローブで観察された。pDAB8264.44.06.1試料の酵素消化と続くプローブハイブリダイゼーションで得られた結果は、プラスミドpDAB8264からの無傷の2mepspsPTUがダイズイベントpDAB8264.44.06.1のダイズゲノムに挿入されていることを示した。実施例4.6:骨格配列の不在ダイズイベントpDAB8264.44.06.1でスペクチノマイシン抵抗性遺伝子specR、OriRepエレメントおよび複製開始タンパク質trfAtrfAエレメントの不在を検証するために、サザンブロット分析も行った。適当な陽性対照pDAB8264プラスMaverickおよび陰性対照Maverickをサザン分析のために含める場合、スペクチノマイシン抵抗性、OriRepエレメントまたはtrfAエレメントには特異的なハイブリダイゼーションがないと予想される。HinDIII消化およびspecR特異的プローブとのハイブリダイゼーションの後、およそ9,300bpの1つの予想サイズのバンドが、陽性対照試料pDAB8264プラスmaverickで観察されたが、陰性対照およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の試料にはなかった。同様に、PacI消化およびOriRep特異的プローブとtrfA特異的プローブとの混合物とのハイブリダイゼーションの後には、およそ9,200bpの1つの予想サイズのバンドが陽性対照試料pDAB8264プラスmaverickで検出されたが、陰性対照およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の試料にはなかった。これらのデータは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1でのスペクチノマイシン抵抗性遺伝子、OriRepエレメントおよび複製開始タンパク質trfAの不在を示す。耕種学、収量および除草剤耐性の評価ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の農業特性および除草剤耐性を、単一の生育段階の間に複数の地理的場所での収量試験で試験した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とMaverick対照植物との間で、農業上意味のある予想外の差は観察されなかった。試験の結果は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1が、Maverick対照植物と農業上同等であることを実証した。さらに、グリホサートと2,4-Dのタンクミックスを噴霧したとき、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1は強固な除草剤耐性を提供した。各場所での全ての試験項目について以下の農業特性を測定し、記録した。1出芽:株立ち数を1メートルの区画に植えた種子数で割り、100を掛けることによって計算される。2V1時の苗活力:活力は、試験区の健康状態の全体的な推定値である。結果は0~100のスケールで評価し、0は全て死植物の試験区を表し、100は非常に健康そうな試験区を表す。3V3薬剤施用から1日、7日および14日後の全体的な視覚的作物傷害、クロロシスおよび壊死を評価した。2,4-D傷害の典型である上偏成長の全ての徴候について観察した。上偏成長は、葉および茎のねじれまたは下垂として表される。全ての作物傷害は0~100スケールを用い、0は傷害なしを示し、100は完全な植物死を示す。4開花日:この測定では、試験区での植物の50が開花し始める日を記録する。各試験区で植えてから植物の50が開花したときまでの日数を記録した。5R2またはR1時の株立ち数:1試験区につき1うねの代表的な1メートル区画での植物数を数え、R2またはR1生育段階に記録することによって判定される、各試験区での平均の植物活力の視覚的推定値である。6R2薬剤施用から1日、7日および14日後の全体的な視覚的作物傷害、クロロシスおよび壊死を評価した。2,4-D傷害の典型である上偏成長の全ての徴候について観察した。上偏成長は、葉および茎のねじれまたは下垂として表される。全ての作物傷害は0~100スケールを用い、0は傷害なしを示し、100は完全な植物死を示す。7R6生育段階の病害発生率:試験区での病害の程度を記録するために病害発生率の視覚的推定値を用いる。0~100のスケールで評価する。0は病害が存在しないことを示し、100は試験区の全ての植物が罹病したことを示す。8R6生育段階の虫害:試験区での虫害の程度を記録するために虫害の視覚的推定値を用いる。昆虫による傷害を受けた試験区の植物組織の百分率を、0~100スケールを用いて記録した。0は虫害が存在しないことを示し、100は試験区の全ての植物が虫害を受けたことを示す。9老化時の草高:各試験区の植物の平均高を記録した。葉が落ちた後、植物を土壌表面から先端まで測定した。測定値は、センチメートルで記録した。試験区が倒伏した場合は、代表的な植物群を立ち上げて測定値を得た。10成熟までの日数。試験区のさやの95が生理的成熟に到達し、植物が干乾びた色であった日を記録した。植えてからの経過日数を計算した。11倒伏:収穫時に倒伏程度の視覚的推定値を記録した。0~100スケールで記録し、0は倒伏なしを示し、100は試験区の全ての植物が地面にひれ伏したことを示す。12脱粒:収穫時にさやの脱粒の視覚的推定値を記録した。試験区ごとに脱粒を起こしたさやの百分率の推定値として記録した。0~100スケールを用い、0は脱粒なしを示し、100は全てのさやが脱粒を起こしたことを示す。13収量:各試験区から収集した穀物の重量を記録した。2うねの試験区全体を収穫して、種子重量および水分を記録した。13の水分に調整することによって、ブッシェル/エーカーを計算した。14100粒重:各試験区について、100粒の種子を数え、重量をグラムで記録した。2重量の硫酸アンモニウムAMSを混合した、2,4-Dとグリホサートのタンクミックスの2,185gae/ヘクタールでの噴霧の施用後、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の除草剤耐性を調べた。除草剤は、V3/R2逐次的除草剤処理として噴霧した。この除草剤処理は、発達のV3生育段階のダイズ植物に噴霧し、続いて発達のR2生育段階の第2の逐次的噴霧よって完了した。V3生育段階は、単葉および最初の3つの三小葉の葉が完全に展開したときに特徴づけられる。R2生育段階は、完全に展開した葉のついた主幹の2つの最上節の1つでの単一の開花を特徴とする。これらの試験は、処理ごとに4反復の無作為化された完備型ブロック計画を用いて設定された。各試験区は2うね幅であり、うねは30インチ間隔であった。試験区には、試験区の間に2.5~3.0フィートの通路を設けて、全長12.5フィートに植えた。Maverick対照植物は除草剤施用によって死滅すると予想され、したがってそれらはトランスジェニックダイズ植物のうねから離れた別の試験区で生育させた。噴霧されなかったダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した、2,4-Dとグリホサートの除草剤タンクミックスを噴霧したダイズイベントpDAB8264.44.06.1の結果を要約する。表7は、2,4-Dとグリホサートのタンクミックスを噴霧したダイズイベントpDAB8264.44.06.1と噴霧されなかったダイズイベントpDAB8264.44.06.1を比較する分析からの平均値を提示する。除草剤施用はダイズイベントpDAB8264.44.06.1に傷害を及ぼさず、これらの植物は、表7に記載される報告された農業特性に関して、噴霧されなかったダイズイベントpDAB8264.44.06.1植物と比較して同等の成績を挙げた。発達のV3段階での1および7daa噴霧後日数ならびに発達のR2段階での1、7および14daa時の一部の初期の一過性傷害を除いては、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1は、2,4-Dとグリホサートのタンクミックスに強固な耐性を示した。対照的に、Maverick植物のいずれも除草剤噴霧処理の後に生存していなかった。対照系統Maverickと比較したダイズイベントpDAB8264.44.06.1の耕種学的同等性を調べた。これらの試験は、2反復のブロック計画を用いて設定された。各試験区は2うね幅であり、うねは30インチ間隔であった。試験区には、試験区の間に2.5~3.0フィートの通路を設けて、全長12.5フィートに植えた。表8は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の耕種学的同等性を対照系統Maverickと比較する分析からの平均値を提示する。耕種学的データは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1がMaverick植物と同等の成績を挙げ、農業上意味のある予想外の差をもたらさないことを示す。イベント特異的なTaqManアッセイダイズイベントpDAB8264.44.06.1の存在を検出して、育種集団で植物の接合性状態を判定するために、2つのイベント特異的なTAQMANアッセイを開発した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1は、二成分ベクターpDAB8264のT鎖を含有する図1。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の特異的検出のために、特異的なTaqmanプライマーおよびプローブを、5’配列番号14または3’配列番号15の挿入物-植物接合部に位置するDNA配列によって設計した図4。その5’末端にFAMリポーターを含有する、AppliedBiosystemsABIによって合成された2つのプライマーおよび標的特異的MGBプローブを用いて、5’組込み接合部にわたる98bpのDNA断片配列番号16を特異的に検出するように、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のための1つのイベント特異的アッセイを設計した。その5’末端にFAMリポーターを含有する、ABIによって合成された2つの特異的プライマーおよび標的特異的MGBプローブを用いて、3’組込み接合部にわたる131bpのDNA断片配列番号17を特異的に標的にするように、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のための別のイベント特異的アッセイを設計した。2mEPSPSおよびaad-12PTUを含有する11個の異なるイベント、ならびにダイズ特異的内在性参照遺伝子GMFL01-25-J19ダイズGlycinemaxcDNA、GenBank:AK286292.1との二重形式での対照非トランスジェニックダイズ品種Maverickに対して、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のためのこのTaqman検出方法の特異性を試験した。実施例6.1:gDNA単離11個の異なるダイズイベントおよび非トランスジェニックダイズ品種のgDNA試料をこの試験で試験した。改変QiagenMagAttract植物DNAキットQiagen、Valencia、CAを用いてゲノムDNAを抽出した。gDNA抽出のために、1試料につき8個の新鮮なダイズ葉ディスクを用いた。販売会社の指示MolecularProbes、Eugene、ORに従って、gDNAをPicoGreen法で定量した。この試験のために、DNA分解酵素を含まない水で試料を希釈して、10ng/μLの濃度をもたらした。実施例6.2:Taqmanアッセイおよび結果特異的なTaqmanプライマーおよびプローブを、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1特異的Taqmanアッセイのために設計した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の中で導入遺伝子を検出するために、これらの試薬は下記の条件で用いることができる。表9は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の検出のために特に開発されたプライマーおよびプローブ配列を記載する。増幅のための多重PCR条件は、以下の通りである:10μlの全反応液中に、1×ロシュPCR緩衝液、0.4μMイベント特異的フォワードプライマー、0.4μMイベント特異的リバースプライマー、0.4μMプライマーGMS116F、0.4μMプライマーGMS116R、0.2μMイベント特異的プローブ、0.2μMGMS116プローブ、0.1PVP、20nggDNA。以下の条件を用いてこのカクテルを増幅した:i95°Cで10分間、ii95°Cで10秒間、iii60°Cで30秒間、iv72°Cで1秒間、vステップii~ivを35サイクル繰り返す、v40°Cを保持。リアルタイムPCRを、RocheLightCycler480で実行した。データ分析は、蛍光の変化率がその最大値に到達するときのPCRサイクル数である、LightCycler480ソフトウェアで判定された交差点Cp値の測定に基づいた。2mEPSPSおよびaad-12PTUを含有する11個の異なるイベント、ならびにダイズ特異的内在性参照遺伝子GMFL01-25-J19GenBank:AK286292.1との二重形式での非トランスジェニックダイズ品種に対して、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のためのTaqman検出方法を試験した。アッセイは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を特異的に検出し、対照すなわち、2mEPSPSおよびaad-12PTUを含有する11個の異なるイベントならびに非トランスジェニックダイズ品種からいかなる偽陽性結果も生成または増幅しなかった。イベント特異的なプライマーおよびプローブは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の検出のために用いることができ、これらの条件および試薬は接合性アッセイに適用できる。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の完全長配列配列番号27は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の完全長配列を提供する。この配列は、5’ゲノム隣接配列、pDAB8264からの組み込まれたT鎖挿入物および3’ゲノム隣接配列を含有する。配列番号27に関して、残基1~1494は5’ゲノム隣接配列であり、残基1495~1497は3つの塩基対挿入であり、残基1498~11,774はpDAB8264T鎖挿入物であり、残基11,775~13,659は3’隣接配列である。したがって、挿入物の5’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号27の残基1494~1495において起こる。したがって、挿入物の3’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号27の残基11,774~11,775において起こる。配列番号27は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のポリヌクレオチド配列であり、それは、PCR増幅反応を介して生成され、ABIBigDye登録商標ターミネーター配列決定反応キットAppliedBiosystems、FosterCity、CAを用いて配列決定された複数のPCRコンティグのアラインメントから組み立てられた。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1およびダイズ昆虫耐性イベントpDAB9582.812.9.1の育種スタック実施例8.1:ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とダイズ昆虫耐性イベントpDAB9582.812.9.1の有性交配ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1と有性的に交配した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の葯をダイズイベントpDAB9582.812.9.1の柱頭全体に手でこすりつけ、それによってダイズイベントpDAB9582.812.9.1を受精させた。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方からの組込みイベントを含有している生じたF1後代を、2,4-Dおよびグリホサート除草剤への耐性についてスクリーニングして、両方の組込みイベントを含有する後代植物を同定した。次に、F1後代植物を自家受精させてF2子孫を生成し、それは両イベントに関して独立して分離することが確認された。F2植物に、2,4-D1120gae/ヘクタールおよびグリホサート1120gae/ヘクタールの両方を含有する除草剤を一回噴霧施用した。両イベントに関してホモ接合である植物を同定するために、Taqmanの接合性をベースとしたアッセイを用いて生じたF2植物をスクリーニングした。これらのF2ホモ接合植物の自家受粉は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方についてホモ接合であったF3子孫を生成した。生じたイベントは、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.4406.1と表示した。実施例8.2:ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の接合性状態の判定ダイズイベントpDAB8264.44.06.1およびダイズイベントpDAB9582.812.9.1の育種交配から生成された植物の接合性状態を判定するために、別々のイベント特異的なTAQMAN登録商標アッセイを開発して、pDAB9582.812.9.1またはpDAB8264.44.06.1のいずれかの組込みイベントの存在を検出した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方を含有し、両イベントに関してホモ接合である個体植物を同定するために、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種交配の自家受精から生成された分離するF2植物を、これらのイベント特異的なTAQMAN登録商標アッセイで試験した。gDNA単離ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの分離するF2植物からのgDNA試料を、この試験で試験した。1植物につき4枚の新鮮なダイズ葉ディスクを、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの3,187個の分離するF2植物から収集した。改変QiagenMagAttract植物DNAキット登録商標Qiagen、Valencia、CAを用いて、これらの試料からゲノムDNAを抽出した。TAQMAN登録商標アッセイおよび結果ダイズイベントpDAB9582.812.9.1米国特許仮出願第61/471845号およびpDAB8264.44.06.1上記のための個々のイベント特異的アッセイの使用のために、前述のTAQMAN登録商標プライマーおよびプローブを設計した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの中に含まれる各組込みイベントの接合性を判定するために、これらの試薬を下記の条件で用いた。増幅のための多重PCR条件は、以下の通りである:10μlの全体の反応液中に、1×ロシュPCR緩衝液、0.4μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的フォワードプライマー、0.4μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的リバースプライマー、0.4μMイベントpDAB9582.812.9.1特異的フォワードプライマー、0.4μMイベントpDAB9582.812.9.1特異的リバースプライマー、0.4μMプライマーGMS116F、0.4μMプライマーGMS116R、0.2μMイベントpDAB9582.812.9.1特異的プローブ、0.2μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的プローブ、0.2μMGMS116プローブ、0.1PVP、20nggDNA。以下の条件を用いてこのカクテルを増幅した:i95°Cで10分間、ii95°Cで10秒間、iii60°Cで30秒間、iv72°Cで1秒間、vステップii~ivを35サイクル繰り返す、v40°Cを保持。リアルタイムPCRを、RocheLightCycler登録商標480で実行した。データ分析は、蛍光の変化率がその最大値に到達するときのPCRサイクル数である、LightCycler登録商標480ソフトウェアで判定された交差点Cp値の測定に基づいた。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方に関して個々の植物の接合性を判定するために、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種交配から生成された合計3,187個の分離するF2植物を、イベント特異的TAQMAN登録商標アッセイで試験した。これらのアッセイからの結果は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方が2,360個体の植物に存在し、検出されたことを示した。各組込みイベントの接合性状態倍数性レベルとしても記載されるを、表9bに示す。2,360個体の同定された植物のうち、237個体は2コピーのダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1を含有すると判定された。実施例8.3:ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックでのタンパク質発現の特徴づけダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで発現される組換え体Cry1F、Cry1Ac、AAD12、2mEPSPSおよびPATタンパク質の生化学的性質を特徴づけた。PATの発現を定量するために、酵素結合免疫吸着検定法ELISAを用いた。比較上、Meso-ScaleDiscoveryMSD、Gaithersburg、Marylandからの電気化学発光技術を利用して、多重化イムノアッセイによってCry1Ac/Cry1FおよびAAD12/2mEPSPSタンパク質を定量した。総合すると、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックでのこれらのタンパク質の生化学的性質を特徴づけ、その強固な発現を確認するために、これらのアッセイを用いた。植物組織でのPATタンパク質の発現PATタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.812.9.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたPATタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。可溶性の抽出可能なPATタンパク質をダイズ葉組織から得、定量的ELISA方法APS014、Envirologix、Portland、MEを用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた試験植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20PBSTおよび1のポリビニルピロリドン40PVP-40を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、PATタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder登録商標を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のPATELISAキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコルEnvirologix、Portland、MEに従って用いた。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1のF3世代は、親のイベントpDAB9582.812.9.1およびpDAB8264.44.06.1のいずれよりも高い濃度でPATを発現した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1育種スタックでのPAT濃度の増加が予想された。PATのより高い濃度は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1が親のイベントのいずれと比較してもpatコード配列のコピーを2倍多く含有する結果である表10。植物組織でのCry1FおよびCry1Acタンパク質の発現Cry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.812.9.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたCry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1と比較した。可溶性の抽出可能なCry1FおよびCry1Acタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光MSDアッセイを用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20PBSTおよび1のポリビニルピロリドン40PVP-40を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、Cry1FおよびCry1Acタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder登録商標を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Meso-ScaleDiscoveryからのCry1F/Cry1Ac多重MSDアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF3世代は、親のダイズイベントpDAB9582.812.9.1よりも高い濃度でCry1FおよびCry1Acタンパク質を発現した。表11。これらの結果は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1植物が、親の系統、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1から受け継いだcry1Fおよびcry1Acコード配列の機能的に発現するコピーを含有したことを示す。植物組織でのAAD12および2mEPSPSタンパク質の発現AAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.812.9.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたAAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。可溶性の抽出可能なAAD12および2mEPSPSタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光MSDアッセイを用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20PBSTおよび1のポリビニルピロリドン40PVP-40を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、AAD12および2mEPSPSタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder登録商標を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Meso-ScaleDiscoveryからのAAD12および2mEPSPS多重MSDアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF3世代は、親のダイズイベントpDAB8264.44.06.1よりも高い濃度でAAD12および2mEPSPSタンパク質を発現した。表12。これらの結果は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1植物が、親の系統、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1から受け継いだaad-12および2mEPSPSコード配列の機能的に発現するコピーを含有することを示した。実施例8.4:ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの除草剤耐性育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の除草剤耐性を、2生育期の間検定した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1種子を植え、成熟するまで生育させた。成熟した植物に、2,4-Dおよびグリホサートの組合せからなった除草剤を一回噴霧施用した。これらの除草剤に対して生じた耐性は、生存植物数を数えることによって測定した。比較上、aad-12および2mEPSPS遺伝子を含有せず、2,4-Dおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であると予想された対照植物が、試験に含まれた。最初のシーズンには、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF2分離系統の120個の圃場生育試験区で、除草剤耐性を調べた。各試験区は1うね幅であり、うねは30インチ間隔であった。試験区は、試験区の間に4.5フィートの通路を設け、12フィートの中心全長7.5フィートに植えたに植えた。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF2分離系統からの合計4,364個体の植物に、2,4-Dとグリホサートの混合液を噴霧した1120gae/ヘクタール。グリホサート/2,4-D除草剤の一回の噴霧施用は、V3とV4生育段階との間に行った。V3生育段階は、単葉および最初の3枚の三葉葉が完全に展開することで特徴づけられ、V4生育段階は、単葉および最初の4枚の三葉葉が完全に展開することで特徴づけられる。除草剤処理が完了した後、試験区を観察し、3,234個体の植物が除草剤施用に耐性であると同定された。除草剤施用に感受性であったダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1植物は、pDAB8264.44.06.1組込みイベントのメンデル分離の結果として、aad-12および2mEPSPSのコピーを含有していなかった。第2のシーズンには、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の温室で育てたF3ホモ接合植物で除草剤耐性を調べた。ダイズ植物を、1ポットに1つの植物を含有する4インチポットにおいて生育させた。合計15個体のF3ホモ接合植物に、2,4-Dおよびグリホサート840ae/ヘクタールを一回噴霧施用した。15個体の植物は全て除草剤の噴霧後に生存し、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1植物が除草剤グリホサートおよび2,4-Dの施用に耐性であることを示した。要約すると、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1親系統に存在したaad-12および2mEPSPS遺伝子は、2,4-Dおよびグリホサート除草剤への耐性を付与した。これらの形質はダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1で継承され、受け継がれ、それによってダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1に除草性耐性を提供した。比較上、aad-12および2mEPSPS遺伝子を含有しない対照植物は、2,4-Dおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であった。実施例8.5:ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.4406.1の殺虫活性の特徴づけcry1Acおよびcry1F導入遺伝子の発現からもたらされた、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの殺虫性耐性を特徴づけるために、温室内評価を実施した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1を、アンチカルシアゲンマタリスAnticarsiagemmatalisベルベットビーンキャタピラーおよびシュードプルシアインクルデンスPseudoplusiaincludensダイズルーパを含む実験室内飼育ダイズ害虫に対して試験した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックを、非形質転換ダイズ品種Maverickに加えて親のダイズイベントダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。この比較は、Cry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される植物保護のレベルが、ダイズ植物のゲノムにさらなる導入遺伝子を導入した育種スタックに存在するかどうか判定するために行った。さらに、除草剤の施用がCry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される昆虫からの植物の保護に何らかの効果を有するかどうか判定するために、昆虫バイオアッセイの前に、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方の育種スタックに、2,4-Dおよびグリホサートを含有する除草剤を一回噴霧施用した840gae/ヘクタール。温室内試験を、およそ3週間目の植物で行った。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1および陰性対照;除草剤を噴霧したダイズイベントpDAB8264.44.06.1およびMaverickを評価するために、10個体の植物を各々用いた。合計30枚の葉ディスク/植物/昆虫種に対して各昆虫種アンチカルシアゲンマタリスAnticarsiagemmatalisおよびクリソデイキシスChrysodeixis旧称シュードプルシアPseudoplusiaインクルデンスincludensを試験するため、各植物から葉を3回打ち抜いた。1.4cm直径または1.54cm2の葉パンチを2素寒天の上の試験領域に置き、1匹の新生子幼虫を寄生させ、有孔のプラスチックふたで密封した。寄生させてから4日後に死亡率および葉の消費を評価した。軽く突いても応答しなかった幼虫は、死虫とみなされた。昆虫によって消費された葉パンチの百分率を視覚的に評価することによって、葉の傷害を調べた。JMP登録商標Pro9.0.12010SASInstituteInc.、Cary、NCを用いて、データの統計分析を実施した。これらの反復実験から得られた結果表13は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのCry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供された昆虫保護のレベルおよび死亡率が、親のダイズイベントpDAB9582.812.9.1と一貫していたことを示した。予想された通り、試験した全ての昆虫について、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.158~76およびMaverick79~91対照植物より有意に低い虫害0.10~0.15を維持した。さらに、cry1Fおよびcry1Acコード配列を含有した全てのダイズイベントで高い昆虫死亡率100が記録されたが、陰性対照、MaverickおよびダイズイベントpDAB8264.44.06.1は10未満の昆虫死亡率であった。したがって、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1は、親のダイズイベントpDAB9582.812.9.1と同等レベルの殺虫活性由来の保護を提供した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1およびダイズ昆虫耐性イベントpDAB9582.814.19.1の育種スタック実施例9.1:ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とダイズ昆虫耐性イベントpDAB9582.814.19.1の有性交配ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1と有性的に交配した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の葯をダイズイベントpDAB9582.814.19.1の柱頭全体に手でこすりつけ、それによってダイズイベントpDAB9582.814.19.1を受精させた。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方からの組込みイベントを含有している生じたF1後代を、2,4-Dおよびグリホサート除草剤への耐性についてスクリーニングして、両方の組込みイベントを含有する後代植物を同定した。次に、F1後代植物を自家受精させてF2子孫を生成し、それは両イベントに関して独立して分離することが確認された。F2植物に、2,4-D840gae/ヘクタールおよびグリホサート840gae/ヘクタールの両方を含有する除草剤を一回噴霧施用した。両イベントに関してホモ接合である植物を同定するために、Taqmanの接合性をベースとしたアッセイを用いて生じたF2植物をスクリーニングした。これらのF2ホモ接合植物の自家受粉は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方についてホモ接合であったF3子孫を生成した。生じたイベントは、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.4406.1と表示した。実施例9.2:ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の接合性状態の判定ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とダイズイベントpDAB9582.814.19.1の育種交配から生成された植物の接合性状態を判定するために、別々のイベント特異的なTAQMAN登録商標アッセイを開発して、pDAB9582.814.19.1またはpDAB8264.44.06.1のいずれかの組込みイベントの存在を検出した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方を含有し、両イベントに関してホモ接合である個体植物を同定するために、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種交配の自家受精から生成された分離するF2植物を、これらのイベント特異的なTAQMAN登録商標アッセイで試験した。gDNA単離ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの分離するF2植物からのgDNA試料を、この試験で試験した。1植物につき4枚の新鮮なダイズ葉ディスクを、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの37個の分離するF2植物から収集した。改変QiagenMagAttract植物DNAキット登録商標Qiagen、Valencia、CAを用いて、これらの試料からゲノムDNAを抽出した。TAQMAN登録商標アッセイおよび結果ダイズイベントpDAB9582.814.19.1米国特許仮出願第61/471845号およびpDAB8264.44.06.1上記のための個々のイベント特異的アッセイの使用のために、前述のTAQMAN登録商標プライマーおよびプローブを設計した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの中に含まれる各組込みイベントの接合性を判定するために、これらの試薬を下記の条件で用いた。増幅のための多重PCR条件は、以下の通りである:10μlの全体の反応液中に、1×ロシュPCR緩衝液、0.4μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的フォワードプライマー、0.4μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的リバースプライマー、0.4μMイベントpDAB9582.814.19.1特異的フォワードプライマー、0.4μMイベントpDAB9582.814.19.1特異的リバースプライマー、0.4μMプライマーGMS116F、0.4μMプライマーGMS116R、0.2μMイベントpDAB9582.814.19.1特異的プローブ、0.2μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的プローブ、0.2μMGMS116プローブ、0.1PVP、20nggDNA。以下の条件を用いてこのカクテルを増幅した:i95°Cで10分間、ii95°Cで10秒間、iii60°Cで30秒間、iv72°Cで1秒間、vステップii~ivを35サイクル繰り返す、v40°Cを保持。リアルタイムPCRを、RocheLightCycler登録商標480で実行した。データ分析は、蛍光の変化率がその最大値に到達するときのPCRサイクル数である、LightCycler登録商標480ソフトウェアで判定された交差点Cp値の測定に基づいた。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方に関して個々の植物の接合性を判定するために、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種交配から生成された合計37個の分離するF2植物を、イベント特異的TAQMAN登録商標アッセイで試験した。これらのアッセイからの結果は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方が23個体の植物に存在し、検出されたことを示した。各組込みイベントの接合性状態倍数性レベルとしても記載されるを、表14に示す。23個体の同定された植物のうち、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1を2コピー含有する1個体が同定された。実施例9.3:ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックでのタンパク質発現の特徴づけダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで発現される組換え体Cry1F、Cry1Ac、AAD12、2mEPSPSおよびPATタンパク質の生化学的性質を特徴づけた。PATの発現を定量するために、酵素結合免疫吸着検定法ELISAを用いた。比較上、Meso-ScaleDiscoveryMSD、Gaithersburg、Marylandからの電気化学発光技術を利用して、多重化イムノアッセイによってCry1Ac/Cry1FおよびAAD12/2mEPSPSタンパク質を定量した。総合すると、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックでのこれらのタンパク質の生化学的性質を特徴づけ、その強固な発現を確認するために、これらのアッセイを用いた。植物組織でのPATタンパク質の発現PATタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.814.19.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたPATタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。可溶性の抽出可能なPATタンパク質をダイズ葉組織から得、定量的ELISA方法APS014、Envirologix、Portland、MEを用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた試験植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20PBSTおよび1のポリビニルピロリドン40PVP-40を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、PATタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder登録商標を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のPATELISAキットを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルEnvirologix、Portland、MEに従って用いた。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1のF3世代は、親のイベントpDAB9582.814.19.1およびpDAB8264.44.06.1のいずれよりも高い濃度でPATを発現した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1育種スタックでのPAT濃度の増加が予想された。PATのより高い濃度は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1が親のイベントのいずれと比較してもpatコード配列のコピーを2倍多く含有する結果である表15。植物組織でのCry1FおよびCry1Acタンパク質の発現Cry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.814.19.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたCry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1と比較した。可溶性の抽出可能なCry1FおよびCry1Acタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光MSDアッセイを用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20PBSTおよび1のポリビニルピロリドン40PVP-40を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、Cry1FおよびCry1Acタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder登録商標を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Meso-ScaleDiscoveryからのCry1F/Cry1Ac多重MSDアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF3世代は、親のダイズイベントpDAB9582.814.19.1よりも高い濃度でCry1Acタンパク質を発現した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF3世代は、親のダイズイベントpDAB9582.814.19.1よりも低い濃度でCry1Fタンパク質を発現した。表16。発現レベルの変動はあったものの、これらの結果は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1植物が、親の系統、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1から受け継いだcry1Fおよびcry1Acコード配列の機能的に発現するコピーを含有したことを示す。植物組織でのAAD12および2mEPSPSタンパク質の発現AAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.814.19.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたAAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。可溶性の抽出可能なAAD12および2mEPSPSタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光MSDアッセイを用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20PBSTおよび1のポリビニルピロリドン40PVP-40を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、AAD12および2mEPSPSタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder登録商標を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Meso-ScaleDiscoveryからのAAD12および2mEPSPS多重MSDアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF3世代は、親のダイズイベントpDAB8264.44.06.1よりも低い濃度でAAD12および2mEPSPSタンパク質を発現した。表17。発現レベルの変動はあったものの、これらの結果は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1植物が、親の系統、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1から受け継いだaad-12および2mEPSPSコード配列の機能的に発現するコピーを含有することを示した。実施例9.4:ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの除草剤耐性育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の除草剤耐性を検定した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の種子を温室内試験で播種し、成熟植物体に2,4-Dとグリホサートの組合せからなる除草剤を一回噴霧施用した。これらの除草剤に対して生じた耐性は、生存植物数を数えることによって測定した。比較上、aad-12および2mEPSPS遺伝子を含有せず、2,4-Dおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であると予想された対照植物が、試験に含まれた。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の温室で育てたF2植物で除草剤耐性を調べた。ダイズ植物は、1ポットに1つの植物を含有する4インチポットにおいて生育させた。単葉生育段階の合計37個体のF3ホモ接合植物に、2,4-Dおよびグリホサート840ae/ヘクタールを一回噴霧施用した。25個体の植物は全て除草剤の噴霧後に生存し、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1植物が除草剤グリホサートおよび2,4-Dの施用に耐性であることを示した。要約すると、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1親系統に存在したaad-12および2mEPSPS遺伝子は、2,4-Dおよびグリホサート除草剤への耐性を付与した。これらの形質はダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1に継承され、受け継がれ、それによってダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1に除草性耐性を提供した。除草剤施用に感受性であったダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1植物は、pDAB8264.44.06.1組込みイベントのメンデル分離の結果として、aad-12および2mEPSPSのコピーを含有していなかった。さらに、aad-12および2mEPSPS遺伝子を含有しない対照植物は、2,4-Dおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であった。実施例9.5:ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の殺虫活性の特徴づけCry1AcおよびCry1F導入遺伝子の発現からもたらされた、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の殺虫性耐性活性を特徴づけるために、温室内評価を実施した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1を、アンチカルシアゲンマタリスAnticarsiagemmatalisベルベットビーンキャタピラーおよびシュードプルシアインクルデンスPseudoplusiaincludensダイズルーパを含む実験室内飼育ダイズ害虫に対して試験した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックを、非形質転換ダイズ品種Maverickに加えて親のダイズイベントダイズイベントpDAB9582.814.19.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。この比較は、Cry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される虫害に対する植物保護のレベルが、ダイズ植物のゲノムにさらなる導入遺伝子を導入した育種スタックに存在するかどうか判定するために行った。さらに、除草剤の噴霧がCry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される昆虫からの植物の保護に何らかの効果を有するかどうか判定するために、昆虫バイオアッセイの前に、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックおよびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方に、2,4-Dおよびグリホサートを含有する除草剤を一回噴霧施用した840gae/ヘクタール。温室内試験を、およそ3週間目の植物で行った。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1の育種スタックおよび陰性対照;除草剤を噴霧したダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種スタックおよびMaverickを評価するために、10個体の植物を各々用いた。合計30枚の葉ディスク/植物/昆虫種に対して、各昆虫種アンチカルシアゲンマタリスAnticarsiagemmatalisおよびシュードプルシアインクルデンスPseudoplusiaincludensを試験するために、各植物から葉パンチを3つ作製した。1.4cm直径または1.54cm2の葉パンチを2素寒天の上の試験領域に置き、1匹の新生子幼虫を寄生させ、有孔のプラスチックふたで密封した。寄生させてから4日後に死亡率および葉の消費を評価した。軽く突いても応答しなかった幼虫は、死虫とみなされた。昆虫によって消費された葉パンチの百分率を視覚的に評価することによって、葉の傷害を調べた。JMP登録商標Pro9.0.12010SASInstituteInc.、Cary、NCを用いて、データの統計分析を実施した。これらの反復実験から得られた結果表18は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのCry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される虫害および死亡率のレベルが、親のダイズイベントpDAB9582.814.19.1と一貫していたことを示した。予想された通り、試験した全ての昆虫について、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.158~76およびMaverick79~91対照植物より有意に低い虫害0.10~0.12を維持した。さらに、cry1Fおよびcry1Acコード配列を含有した全てのダイズイベントで高い昆虫死亡率100が記録されたが、陰性対照、maverickおよびダイズイベントpDAB8264.44.06.1は10未満の昆虫死亡率であった。したがって、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1は、親のダイズイベントpDAB9582.814.19.1と同等レベルの殺虫活性由来の保護を提供した。"