酵母において異種グリコシル化酵素を発現するための1個以上のカセットを含有する、酵母人工染色体YAC。前記異種グリコシル化酵素が、αマンノシダーゼI、αマンノシダーゼII、NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI、NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII、NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII、NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIV、NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV、ガラクトシルトランスフェラーゼI、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、UDPNアセチルグルコサミン2エピメラーゼNアセチルマンノサミンキナーゼ、Nアセチルノイラミネート9ホスフェートシンターゼ、シチジンモノホスフェートNアセチルノイラミン酸シンターゼ、シアル酸シンターゼ、CMPシアル酸シンターゼからなる群から選択される、請求項1に記載のYAC。1個以上の前記発現カセットが、異種グリコシル化酵素の触媒ドメインおよびERゴルジ体保持シグナルの融合タンパク質をコードする、請求項1または2に記載のYAC。保持シグナルが、HDEL小胞体残留回収配列、およびサッカロミセスセレビシアエのOch1、Msn1、Mnn1、Ktr1、Kre2、Mnt1、Mnn2およびMnn9タンパク質のターゲッティングシグナルからなる群から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載のYAC。CMPシアル酸輸送体、UDPGlcNAc輸送体UDPGal輸送体およびGDPフコース輸送体からなる群から選択される輸送体の1個以上の発現カセットをさらに含有する、請求項1~4のいずれか一項に記載のYAC。酵母タンパク質シャペロンの発現カセットをさらに含有する、請求項1~5のいずれか一項に記載のYAC。pGAPDH、pGAL1、pGAL10、pPGK、pTEF、pMET25、pADH1、pPMA1、pADH2、pPYK1、pPGK、pENO、pPHO5、pCUP1、pPET56、pnmt1、padh2、pSV40、pCaMV、pGRE、pAREpICL、pTEF2およびpTCM1からなる群から選択されるプロモーターを含んでなる、請求項1~6のいずれか一項に記載のYAC。CYC1、TEF、PGK、PHO5、URA3、ADH1、PDI1、KAR2、TPI1、TRP1、CaMV35S、ADH2およびICLからなる群から選択されるターミネーターを含んでなる、請求項1~7のいずれか一項に記載のYAC。下記の発現カセットTDH3プロモーターとCYC1ターミネーターの調節下にある、αマンノシダーゼIとHDEL残留配列の融合体をコードする遺伝子を含む、カセット1、ADH1プロモーターとTEFターミネーターの調節下にある、NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIとサッカロミセスセレビシアエMnn9保持配列の融合体をコードする遺伝子、ならびに、PGKプロモーターとPGKターミネーターの調節下にあるUDPGlcNAc輸送体遺伝子を含む、カセット2/3、TEFプロモーターとURAターミネーターの調節下にあるαマンノシダーゼII遺伝子を含む、カセット4、PMA1プロモーターとADH1ターミネーターの調節下にある、NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIとサッカロミセスセレビシアエMnn9保持配列の融合体をコードする遺伝子を含む、カセット5、CaMVプロモーターとPHO5ターミネーターの調節下にある、ヒトβ14ガラクトシルトランスフェラーゼとサッカロミセスセレビシアエMnt1保持配列の融合体をコードする遺伝子を含む、カセット6、pGAL110プロモーターの調節下にあり、それぞれの内因性ターミネーターを有する、サッカロミセスセレビシアエのPDI1遺伝子とKAR2遺伝子を異なる方向で含む、カセット7、PET56プロモーターとTPI1ターミネーターの調節下にあるSiaC遺伝子、SV40プロモーターとURA3ターミネーターの調節下にあるSiaB遺伝子、TEF2プロモーターとCaMVターミネーターの調節下にあるSLC35A1遺伝子、およびTCM1プロモーターとADH2ターミネーターの調節下にあるST3GAL4遺伝子を含む、カセット8、の1個以上を含有する、請求項1~8のいずれか一項に記載のYAC。配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号21から選択される配列を有する1個以上のカセットを含有する、請求項1~9のいずれか一項に記載のYAC。1個以上の発現カセットを空のYACベクターに挿入することを含んでなる、請求項1~10のいずれか一項に記載のYACを構築する方法。前記空のYACベクターが、下記の要素:1個の酵母複製起点と1個のセントロメアORIARS1CEN4、2個のテロメア配列TEL、それぞれのアームに2個の選択マーカー:HIS3、TRP1、LYS2、BLAまたはHPH、組換体の負の選択のための1個の選択マーカー:URA3、1個の多重クローニング部位、1個の大腸菌複製起点と1個のアンピシリン耐性遺伝子、4個の線状化部位:2個のSacl部位と2個のSfil部位を含んでなる、請求項11に記載の方法。前記空のYACベクターが、配列番号7のDNA配列を含んでなる、請求項11または12に記載の方法。目的とする糖タンパク質を製造するための酵母細胞であって、請求項1~10のいずれか一項に記載のYACを含んでなる、酵母細胞。マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いている、請求項14に記載の酵母細胞。OCH1遺伝子およびまたはMNN1遺伝子およびまたはMNN9遺伝子およびまたはMNN2遺伝子の欠失を含んでなる、請求項14または15に記載の酵母細胞。GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2およびNeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2から選択される糖鎖構造を有する糖タンパク質を産生することができる、請求項14~16のいずれか一項に記載の酵母細胞。酵母がサッカロミセスセレビシアエである、請求項14~17のいずれか一項に記載の酵母細胞。目的とする組換え糖タンパク質を製造する方法であって、a組換え糖タンパク質をコードする核酸を請求項14~18のいずれか一項に記載の酵母細胞に導入する工程、b宿主細胞中で核酸を発現させて、糖タンパク質を産生させる工程、およびc組換え糖タンパク質を宿主細胞から単離する工程を含んでなる、方法。6種類の酵母細胞を構築し、異種タンパク質上に下記の糖鎖構造を得る。GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。下記の実施例では、酵母細胞は、それらが含むYAC構造の名前によって呼ばれ、例えば、Seraphin細胞はSeraphinYACを含む。実施例1:och1Δおよびまたはmnn1Δおよびまたはmnn9Δ宿主細胞の作製カナマイシン耐性カセットをPCRによって増幅し、これらの両末端に、サッカロミセスセレビシアエ酵母のそれぞれの株の特異領域であるOCH1遺伝子に対する相同フランキング領域を付加した。遺伝子OCH1は、抗生物質カナマイシン耐性のこのカセットの挿入によって不活性化される。この遺伝子の酵母ゲノムへの組込みを電気穿孔によって行った後、目的のカセットを相同組換えによって組込む。フランキング領域は、約40100個の塩基を有し、カナマイシン耐性カセットを酵母ゲノムのOCH1遺伝子に組込むことができる。カナマイシン耐性遺伝子が組込まれた株を、200pgmlのカナマイシンを含む培地で選択する。第二の選択段階は、37°CにおけるΔoh1株の増殖欠損の適否を用いて行った。次に、カナマイシン耐性遺伝子のOCH1遺伝子への組込みをPCRによってチェックした。カナマイシン耐性を示すクローニングのゲノムDNAを抽出した。オリゴヌクレオチドは、カナマイシン耐性遺伝子の存在並びにこの遺伝子がOCH1遺伝子に正確に組込まれたことをチェックできるように選択した。従って、プライマーCR025BS15カナマイシンカセットをOCH1遺伝子に組込んだクローンに、期待したサイズのバンドの増幅を生じた。対照的に、野生型株のゲノムDNAを用いたときには、増幅は見られなかった。他方、両者をOCH1遺伝子内でハイブリダイズするプライマーを用いるPCR反応では、野生型のDNA断片を増幅したが、カナマイシン耐性クローンでは増幅しなかった。カナマイシン耐性を示す株は、欠失カセットを正確な部位に組込んだものと結論する。MNN1遺伝子を、同じ方法によってハイグロマイシン耐性欠失カセットに置換する。同様に、MNN9遺伝子は、ブラストサイジン耐性カセットまたはフレオマイシン耐性カセットまたはナールセオトリシン耐性カセットによって欠失を生じる。Och1酵素の活性は、インビトロでのアッセイによって検出することができる。従来の研究は、Och1酵素によるマンノースの転移に最良のアクセプターはMan8GlcNAc2であることを示している。酵母のミクロソーム画分または全タンパク質の溶解物から、Man8GlcNAc2構造上のα16位におけるマンノースの転移活性を測定する。このため、アミノピリジン基に結合したMan8GlcNAc2をアクセプターとして用い、14Cマンノースで標識したGDPマンノースを放射性マンノースのドナー分子として用いる。ミクロソームまたはタンパク質を、ドナー、アクセプターおよびデオキシマンノジリマイシンと共にpHが調節された緩衝培地でインキュベーションする。30°Cで30分間インキュベーションした後、クロロホルムとメタノールを反応培地に加え、CHCl3MeOHH2Oの比を321とする。水相に相当する上相は、Man8GlcNAc2AP、放射性Man9GlcNAc2APおよびGDP14Cマンノースを含む。乾燥後、試料を100plのH2O1酢酸に取り、生じた放射性Man9GlcNAc2APからGDPマンノースを分離する目的で予めコンディショニングしたSepPakC18カラムを通過させる。H2O1酢酸、次いで20メタノール1酢酸で溶出することによって、様々な画分を回収して、シンチレーションカウンターで計数することができる。非相同タンパク質生産および糖鎖分析修飾酵母株を、ガラクトース誘導プロモーター下でEPO配列を含む発現ベクターによって形質転換する。ヒトEPOの産生に用いる酵母は、最初にウラシルドロップアウトYNB培地、2グルコース中で、OD60012となるまで培養する。2448時間培養した後、2ガラクトースを培養物に加え、目的とする本発明者らのタンパク質を誘導する。0、24時間の誘導後に、試料を採取する。酵母細胞を、遠心分離によって除去する。上清を、最初にイミダゾール5mM、TrisHCl1MpH9を所望なpHになるまで加え、pH74で緩衝する。次いで、上清を08μmおよび045μmで濾過した後、HisTrapHP1mlカラムに入れる。EPOを、製造業者の指示に従って精製する。産生されたEPOは、溶離液中に回収される。カラムから溶出したタンパク質を、12アクリルアミドゲル上でSDSPAGE電気泳動によって分析する。SDSPAGEゲルの移動後、タンパク質をクーマシーブルーによる染色またはウェスタンブロット法によって分析する。ウェスタンブロット法については、全タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、抗EPO抗体による検出を続行する。転写後、膜をブロッキング溶液で1時間飽和させる。次いで、膜を抗EPO抗体溶液と1時間接触させる。005Tween20PBSで3回すすいだ後、膜を二次抗マウスHRP抗体と接触させ、比色検出を続行する。このようにして、約35kDaにおけるタンパク質を、脱グリコシル化の後に検出することができる。このタンパク質は、クーマシーブルー染色によって検出される主要タンパク質であり、ウェスタンブロット分析における抗EPO抗体によって明らかにされている。PNGアーゼ処理後のNグリカン分析は、Δoh1株で産生したrHuEPOは、Man89GlcNAc2型のオリゴマンノシル糖鎖構造を有することを示していた。実施例2:GonTRanDDYGorDGeorgeDYoGGeneおよびSeraphinDrYSSia株の構築様々なマンノシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子であって、それぞれの遺伝子が異なる構成的プロモーターおよびターミネーターによって制御されているものを含む配列を、発現カセットとしてのYACに導入する。様々な調節要素の使用によって、組換えYACの良好な安定性が得られる。YACは、2種類の酵母タンパク質シャペロンをコードする遺伝子を含むこともある。これらの遺伝子はpGAL110プロモーターによって制御され、それらの発現を、発現される異種タンパク質の発現と調和させる。GeorgeおよびDYoGGeneのYACは、カセット17を含んでいる。前記YACは、それぞれSfilおよびSaclpGLYyacMCSまたはpGLYyachphMCSによって消化することによって構築される。この消化は、3個の線状断片、すなわち2本のアームとURA3マーカーを生じる。7カセットのそれぞれは、Sfil部位によって境界を定められている。Sfil制限部位GGCCNNNN↓NGGCCの使用により、異なるカセット間に適合、ユニーク、付着末端が生じ、7個の発現カセット間のアセンブリングの1つの型を準備するだけである。カセット1GGCCATGC↓AGGCCGGCCCGTA↓CGGCCカセット23GGCCCGTA↓CGGCCGGCCTGAC↓GGGCCカセット4GGCCTGAC↓GGGCCGGCCGCTA↓TGGCCカセット5GGCCGCTA↓TGGCCGGCCACGC↓TGGCCカセット6GGCCACGC↓TGGCCGGCCCCTG↓AGGCCカセット7GGCCCCTG↓AGGCCGGCCGACT↓CGGCCカセット8GGCCCCTG↓AGGCCGGCCGACT↓CGGCCカセットを中間ベクターへのクローニングによってアセンブリングした後、ポリカセットを新たなSfil消化によって削除する。相当するバンドを精製した後、線状化ポリカセットを線状化pGLYyacMCSで酵母に形質転換する。レシピエント酵母株は、och1KanMX4およびまたはmnn1hphおよびまたはmnn9nat1対立遺伝子を含む。あるいは、MNN9遺伝子は、ナールセオトリシン耐性カセットの代わりにブラストサイジンまたはフレオマイシン耐性カセットで分断されることがある。前記酵母株を500mlのYPDOD60001に接種し、OD600が5565に達するまで増殖させる。細胞を、4°Cで1500gにて遠心分離する。細胞ペレットを低温滅菌水で2回洗浄した後、1M滅菌ソルビトール20mlに再懸濁する。細胞を再度遠心分離した後、1M滅菌ソルビトールmlに再懸濁する。この段階で、細胞を80μlずつ小分けし、必要な場合には、80°Cで冷凍することができる。形質転換を電気穿孔によって行う。簡単に説明すれば、細胞を、DNAを用いて氷上で5分間インキュベーションする。V1500Vのパルスを加える。細胞を直ちに1M低温滅菌ソルビトール1mlに徐々に再懸濁し、回収のため30°Cで1時間インキュベーションする。次いで、細胞を選択培地で培養する。本発明の場合には、選択培地は、選択用の形質転換体ブラスチシジンの正の選択に用いられるヒスチジン、トリプトファン、リジンを除く形質転換体の増殖に必要な総ての補足物を含むYNB酵母窒素ベース、05NH4Cl、ウラシル、01酵母エキス、50mMリン酸緩衝液pH68、および固形培地だけに、2寒天である。一方、YNBプレートは、環状pGLYyacMCS形質転換体を対向選択するための5フルオロオロト酸を含む。従って、これらの選択プレートで増殖する形質転換体は、総てポリカセットが挿入されているpGLYyacMCSYACを含んでいる。YACにポリカセットが含まれていることは、それぞれの形質転換についてPCRによって確認される。GoNTRanDおよびDYGoRDYACは、それらだけがカセット15を含む点においてGeorgeおよびDYoGGeneYACと異なっている。GoNTRanD細胞を回収し、RNAを抽出して、精製する。それぞれのRNA試料を2つに分け、一方の半分をRNアーゼで室温にて30分間処理し、他のものは未処理のままにした。逆転写を、RNアーゼで処理したネガティブコントロールを包含する総てのRNA試料について行った。水からなるPCRのネガティブコントロールを、反応に含めた。60nmolMgCl210nmoldNTP20URNアーゼ阻害剤バッファーRT逆転写酵素下記のプライマーを、逆転写反応に用いた。CA027GGAAAGACGGGTGCAACCA028CCCAACGTCATATAATGATCTGACA017ATGTTCGCCAACCTAAAATACGCA018TTACAAGGATGGCTCCAAGGCA046TCCAGGGCTACTACAAGACR008CCAGCTCCTTCCGGTCACA040TGGAGAAGATAATTGGAGATCA041GCGGTCTTAGGGAAACATACD030CCCGAATACCTCAGACTGCD031ACTCGATCAGCTTCTGATAGcDNAに対するPCRは、ミックスダイナザイム125μl、それぞれのプライマー125μl、H2O8μlおよびcDNA2μlを含む25μl中で行った。cDNAを最初に95°Cで5分間変性させた後、95°Cで40秒間の変性を30サイクル、53°Cで40秒間のハイブリダイゼーションおよび72°Cで1分間の伸長を行った後、伸長を72°Cで5分間行った。PCR産物をアガロースゲル上に流し、増幅バンドの存在を確かめた。図5に示されている結果は、酵母培養物における予想サイズのバンドの特異的増幅を示している。SeraphinおよびDrYSSiaYACは、それらが、ヒトシアリルトランスフェラーゼST3GAL4、ネズミCMPシアル酸輸送体、ナイセリアメニンギティジスCMPシアル酸シンターゼおよびナイセリアメニンギティジスシアル酸シンターゼについてオープンリーディングフレームをも有している点でGeorgeおよびDYoGGeneYACと異なっている。これらのオープンリーディングフレームは、カセット8内に含まれている。更に、これらのYACは、カセット7を含まない。この第二のシリーズのYACは、第一のシリーズと同様にして構築される。Seraphin細胞を回収し、RNAを抽出して精製した。それぞれのRNA試料を2つに分け、一方の半分をRNアーゼで室温にて30分間処理し、他のものは未処理のままにした。逆転写を、RNアーゼで処理したネガティブコントロールを包含する総てのRNA試料について行った。水からなるPCRのネガティブコントロールを、反応に含めた。60nmolMgCl210nmoldNTP20URNアーゼ阻害剤バッファーRT逆転写酵素下記のプライマーを、逆転写反応に用いた。CA095cagtagctttaggcggttcCA096gctacgacagatgcaaaggCB125tggcgggttaattgcagaagCB126agtggatgatgctccattggCB144aggaactggcgaagttgagtCB145actcctgcaaatccagagcaCB127gcttgaggattatttctgggCB104tcagaaggacgtgaggttccDNAに対するPCRは、ミックスダイナザイム125μl、それぞれのプライマー125μl、H2O8μlおよびcDNA2μlを含む25μl中で行った。cDNAを最初に95°Cで5分間変性させた後、95°Cで30秒間の変性を30サイクル、56°Cで30秒間のハイブリダイゼーションおよび72°Cで40秒間の伸長を行った後、伸長を72°Cで5分間行った。PCR産物をアガロースゲル上に流し、増幅バンドの存在を確かめた。図7に示されている結果は、酵母培養物における予想サイズのバンドの特異的増幅を示している。実施例3:George株でのEPO発現George株は、哺乳類に見られ、複合型のグリカンとして記載されている構造であるNグリカンGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2を独占的に産生することができる。関連YACの構築の存在および宿主細胞へのその導入は、上記されている。これらの段階のそれぞれは、最良の生産クローンを選択して利用可能なクローンを得るための可能性の割合を最大にすることからなる一括の確認作業に入る。修飾酵母でEPOの発現に用いられるプラスミドは、プロモーターGal1を含んでいる。このプロモーターは、サッカロミセスセレビシアエで知られている最強のプロモーターの1つであり、現在、組換えタンパク質の産生に用いられている。このプロモーターは、ガラクトースによって誘導され、グルコースによって抑制される。実際に、グリセロール中でのサッカロミセスセレビシアエ酵母の培養では、ガラクトースの添加によってGAL遺伝子が約1000倍まで誘導される。一方、グルコースを培地に添加すると、GAL1プロモーターの活性が抑制される。本発明者らのプラスミドにおけるヒトEPOの組込み配列は、ポリヒスチジンタグを付加することによって5において修飾され、産生されたタンパク質の検出および精製が促進された。ヒトEPOの産生に用いる酵母は、最初にウラシルドロップアウトYNB培地、2グルコース中で、OD60012となるまで培養する。2448時間培養した後、2ガラクトースを培養物に加え、目的とする本発明者らのタンパク質を誘導する。0、6、24および48時間の誘導後に、試料を採取する。酵母細胞を、遠心分離によって除去する。上清を、最初にイミダゾール5mM、TrisHCl1MpH9を所望なpHになるまで加え、pH74で緩衝する。次いで、上清を08μmおよび045μmで濾過した後、HisTrapHP1mlカラムに入れる。EPOを、製造業者の指示に従って精製する。産生されたEPOは、溶離液中に回収される。カラムから溶出したタンパク質を、12アクリルアミドゲル上でSDSPAGE電気泳動によって分析する。SDSPAGEゲルの移動後、タンパク質をクーマシーブルーによる染色またはウェスタンブロット法によって分析する。ウェスタンブロット法については、全タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、抗EPO抗体による検出を続行する。転写後、膜をブロッキング溶液で1時間飽和させる。次いで、膜を抗EPO抗体溶液と1時間接触させる。005Tween20PBSで3回すすいだ後、膜を二次抗マウスHRP抗体と接触させ、比色検出を続行する。このようにして、約35kDaにおけるタンパク質を検出することができる。このタンパク質は、クーマシーブルー染色によって検出される主要タンパク質であり、ウェスタンブロット分析における抗EPO抗体によって明らかにされている。EPOを含む溶出画分を、AmiconUltra15上で、10kDAのカットオフで、4°Cでの遠心分離により濃縮する。約500μlの容積が得られたときに、精製タンパク質の量を分析する。PNGアーゼ処理後のNグリカン分析は、George株で産生したrHuEPOは、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2型の複合糖鎖構造を有することを示していた。実施例4:YACの安定性YACの安定性を評価するために、GoNTRanDYACを有する酵母細胞を微量発酵装置中にて選択培地でまたは他の培地で増殖させ、次いで幾つかの選択寒天培地で培養し、40400のコロニーを得た。次いで、プレートを30°Cで4日間インキュベーションし、コロニーを計数した。安定性試験は、微量発酵装置中での増殖の0、24および48時間目に行う。図6Bは、GoNTRanD株における幾つかの培地中のYACの安定性の割合を示している。安定性の割合は、式安定性100によって計算される。ネガティブコントロールは、GoNTRanDの親株であり、増殖のコントロールは原栄養株である。培地1インハウスで生産される選択培地培地2インハウスで生産される非選択培地培地3インハウスで生産される非選択培地YNBCSM非選択合成培地YNBSCSM非選択合成培地YPD非選択完全培地この人工染色体は、非選択培地での産生時間中は安定であり、エピソームベクターに比較された。この安定性は、微量発酵装置から5Lバイオリアクターへの培養のスケールアップの際に保存された。総ての様々な試験において、安定性はインハウス増殖培地を用いると常に若干増加した。次いで、YACの完全性を、ゲノムDNA上での5個のORFの存在をPCRで検証することによって確認した。人工染色体上にある総てのORFは、非選択増殖条件での70時間に続いて5Lバイオリアクターでの生産条件での培養48時間増殖した酵母細胞から増幅することができた。