"ヌクレオチド配列が隣接しているヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む単離された核酸分子であって、ここで、該隣接配列は同じであっても異なっていてもよく、該隣接配列は、主に遺伝子変換および/もしくは超変異によって抗体多様性を生じる動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子あるいは免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列、または2つ以上の該スペーサー配列のコンセンサス配列に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列を含む、単離された核酸分子。前記隣接配列が、主に遺伝子変換および/もしくは超変異によって抗体多様性を生じる動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子あるいは免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列、または2つ以上の該スペーサー配列のコンセンサス配列に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列から本質的に構成されている、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記隣接配列が、少なくとも約50個の連続しているヌクレオチドを含む、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記隣接配列が同じである、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記隣接配列が異なっている、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、重鎖V遺伝子セグメント、重鎖D遺伝子セグメントまたは重鎖J遺伝子セグメントである、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、重鎖Vセグメントである、請求項6に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、VH3ファミリー、VH1ファミリー、VH5ファミリー、またはVH4ファミリーのメンバーである、請求項7に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、軽鎖Vセグメントまたは軽鎖Jセグメントである、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、軽鎖Vセグメントである、請求項9に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、κ軽鎖遺伝子セグメントである、請求項10に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、Vκ1ファミリー、Vκ3ファミリーまたはVκ4ファミリーのメンバーである、請求項11に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、λ軽鎖遺伝子セグメントである、請求項10に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、Vλ1ファミリー、Vλ2ファミリー、またはVλ3ファミリーのメンバーである、請求項13に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、重鎖Cセグメントである、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、軽鎖Cセグメントである、請求項1に記載の単離された核酸分子。主に遺伝子変換および/または超変異によって抗体多様性を生じる前記動物が、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウシからなる群より選択される、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記隣接配列が、配列番号1~185からなる群より選択される配列に由来するか、または2つ以上の該配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも20個の連続しているヌクレオチドを含むヌクレオチド配列からなる郡より選択される、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、重鎖Vセグメント、重鎖Dセグメントまたは重鎖Jセグメントである、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記隣接配列が、配列番号1~56からなる群より選択される配列に由来するか、または2つ以上の該配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも20個の連続しているヌクレオチドを含む、請求項19に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、軽鎖Vセグメントである、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記隣接配列が、配列番号107~184から選択される配列に由来するか、または2つ以上の該配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも20個の連続しているヌクレオチドを含む、請求項21に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、重鎖Cセグメントである、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記隣接配列が、配列番号57~104から選択される配列に由来するか、または2つ以上の該配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも20個の連続しているヌクレオチドが含まれる、請求項23に記載の単離された核酸分子。前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、軽鎖Cセグメントである、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記隣接配列が、配列番号105、106、184、185から選択される配列に由来するか、または2つ以上の該配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも20個の連続しているヌクレオチドを含む、請求項25に記載の単離された核酸分子。請求項1または請求項26に記載の核酸分子を含む組み換えベクター。ヒト化IgG遺伝子座を含むトランスジェニックベクターであって、該ヒト化Ig遺伝子座が、主に遺伝子変換および/もしくは超変異によって抗体多様性を生じる動物のIg遺伝子座またはIg遺伝子座の一部に由来し、該ヒト化Ig遺伝子座は、複数のIg遺伝子セグメントを含み、ここで:a少なくとも1つの該遺伝子セグメントが、主に遺伝子変換および/もしくは超変異によって抗体多様性を生じる該動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子あるいは免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列、または2つ以上の該スペーサー配列のコンセンサス配列に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列を含むヌクレオチド配列が隣接しているヒトIg遺伝子セグメントであり;b該遺伝子セグメントが、再構成されていない立体配置、部分的に再構成された立体配置、または完全に再構成された立体配置において並列しており;そしてc該ヒト化Ig遺伝子座が、遺伝子再構成を受けることができ、必要に応じて、遺伝子変換および/または超変異を受けることができ、そして該非霊長類動物において、ヒト化免疫グロブリンのレパートリーを生じることができる、トランスジェニックベクター。前記スペーサー配列が、配列番号1から185からなる群、または2つ以上の該配列のコンセンサス配列から選択される、請求項28に記載のトランスジェニックベクター。主に遺伝子変換によって抗体多様性を生じる前記動物が、ウサギ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギおよびウシからなる群より選択される、請求項29に記載のトランスジェニックベクター。前記ヒト化Ig遺伝子座が重鎖遺伝子座であり、該重鎖遺伝子座は、少なくとも1つのV遺伝子セグメント、少なくとも1つのD遺伝子セグメント、少なくとも1つのJ遺伝子セグメント、および少なくとも1つの定常領域遺伝子セグメントを含む、請求項30に記載のトランスジェニックベクター。前記定常領域遺伝子セグメントが、ヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントである、請求項31に記載のトランスジェニックベクター。前記ヒト重鎖定常領域セグメントが、Cγおよび/またはCμセグメントである、請求項32に記載のトランスジェニックベクター。約5~100個のV遺伝子セグメント、および少なくとも1つのヒトV遺伝子セグメントを含む、請求項31に記載のトランスジェニックベクター。前記ヒト化Ig遺伝子座が軽鎖遺伝子座であり、該軽鎖遺伝子座は、少なくとも1つのV遺伝子セグメント、少なくとも1つのJ遺伝子セグメント、および少なくとも1つの定常領域遺伝子セグメントを含む、請求項30に記載のトランスジェニックベクター。前記定常領域遺伝子セグメントがヒト軽鎖定常領域遺伝子セグメントである、請求項35に記載のトランスジェニックベクター。前記ヒト軽鎖定常領域遺伝子セグメントがCλまたはCκである、請求項36に記載のトランスジェニックベクター。約5~100個のV遺伝子セグメント、および少なくとも1つのヒトV遺伝子セグメントを含む、請求項36に記載のトランスジェニックベクター。前記ヒトV遺伝子セグメントが、再構成された立体配置においてJ遺伝子セグメントのすぐ5’にある、請求項36に記載のトランスジェニックベクター。5’から3’の方向で、5’ヌクレオチド配列、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメント、および3’ヌクレオチド配列からなる2つ以上のユニットを含む核酸分子であって、ここで、該5’ヌクレオチド配列および該3’ヌクレオチド配列は同じであっても異なっていてもよく、主に遺伝子変換および/もしくは超変異によって抗体多様性を生じる動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子あるいは免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列、または2つ以上の該スペーサー配列のコンセンサス配列に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列を含む、核酸分子。前記スペーサー配列が、配列番号1~185からなる群、または2つ以上の該スペーサー配列のコンセンサス配列から選択される、請求項40に記載の核酸分子。前記ユニットが同じである、請求項41に記載の核酸分子。前記ユニットが異なる、請求項41に記載の核酸分子。主に遺伝子変換および/または超変異によって抗体多様性を生じる動物中でヒト化抗体の機能的なレパートリーを生じることができるヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックベクターを作製するための方法であって、該方法は、以下:a少なくとも1つのV遺伝子セグメント、少なくとも1つのJ遺伝子セグメント、および少なくとも1つの定常領域遺伝子セグメントを含む該動物に由来するIg遺伝子座またはその一部を含むDNAフラグメントを得る工程;ならびにbヒト化Ig遺伝子座を生じるように、工程aのDNAフラグメント中に少なくとも1つのヒトIg遺伝子セグメントを組み込む工程であって、ここで、ヒトIg遺伝子セグメントは、主に遺伝子変換および/もしくは超変異によって抗体多様性を生じる動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子あるいは免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列、または2つ以上のそのようなスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列を含むヌクレオチド配列が隣接しており;ここで、i該遺伝子セグメントが、再構成されていない立体配置、部分的に再構成された立体配置、または完全に再構成された立体配置において並列しており;そしてiiヒト化Ig遺伝子座が遺伝子再構成を受けることができ、必要に応じて、遺伝子変換および/または超変異を受けることができ、そして該動物中でヒト化免疫グロブリンのレパートリーを生じることができる、工程、を包含する、方法。請求項28に記載のトランスジェニックベクター中に存在するヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む、主に遺伝子変換および/または超変異によって抗体多様性を生じるトランスジェニック動物。本質的に完全な内因性の調節機構および抗体産生機構を保存している、請求項45に記載のトランスジェニック動物。トランスジェニックのウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびウシからなる群より選択される、請求項46に記載のトランスジェニック動物。請求項45に記載のトランスジェニック動物に由来するB細胞。請求項45に記載のトランスジェニック動物を使用して産生される、ヒト化免疫グロブリン。抗体である、請求項49に記載のヒト化免疫グロブリン。ポリクローナル抗体である、請求項50に記載のヒト化免疫グロブリン。モノクローナル抗体である、請求項50に記載のヒト化免疫グロブリン。請求項49に記載のヒト化免疫グロブリンを含む、抗体調製物。請求項49に記載のヒト化免疫グロブリンを含む、薬学的組成物。ヌクレオチド配列が隣接している2つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変V領域遺伝子セグメントを含む単離された核酸分子であって、ここで、該隣接配列は同じであっても異なっていてもよく、該隣接配列は、非霊長類動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子もしくは免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列、または2つ以上の該スペーサー配列のコンセンサス配列に由来する少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドのスペーサー配列を含む、単離された核酸分子。前記スペーサー配列が、配列番号1~185からなる群より選択される、請求項55に記載の単離された核酸分子。前記スペーサー配列が、齧歯類の免疫グロブリンスペーサー配列から選択される、請求項55に記載の単離された核酸分子。前記齧歯類が、マウスまたはラットである、請求項57に記載の単離された核酸、請求項55または請求項56に記載の単離された核酸を含むトランスジェニックベクター。発明の要旨1つの局面においては、本発明は、複数のヌクレオチド配列が隣接するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む単離された核酸分子に関する。ここで、隣接配列は、同じである場合も、異なる場合もあり、これには、遺伝子変換および/または超変異によって主に抗体多様性を生じる動物の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖遺伝子に由来するスペーサー配列の、あるいは、2つ以上のスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドが含まれる。別の局面においては、本発明は、複数のヌクレオチド配列が隣接している、ヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域C遺伝子セグメントを含む単離された核酸分子に関する。ここで、隣接配列は、同じである場合も、異なる場合もあり、これには、非霊長類動物の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖遺伝子に由来するスペーサー配列の、あるいは、2つ以上のスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドが含まれる。さらなる局面においては、本発明は、複数のヌクレオチド配列が隣接するヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子セグメントを含む単離された核酸分子に関する。ここで、隣接配列は、同じである場合も、異なる場合もあり、これには、配列番号1から185表1からなる群より選択されるスペーサー配列の、あるいは、2つ以上のスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドが含まれる。1つの実施形態においては、隣接配列には、スペーサー配列の少なくとも約50個の連続しているヌクレオチドが含まれる。別の実施形態においては、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、重鎖のV、D、またはJセグメントであり、Vセグメントは、例えば、VH3、VH1、VH5、またはVH4ファミリーのメンバーであり得る。さらなる実施形態においては、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、軽鎖VまたはJセグメントであり、Vセグメントは、例えば、κ軽鎖遺伝子セグメント、例えば、Vκ1、Vκ3、またはVκ4である場合も、また、λ軽鎖セグメント、例えば、Vλ1、Vλ2、またはVλ3である場合もある。さらなる実施形態においては、主に遺伝子変換および/または体細胞超変異により抗体多様性を生じる非霊長類動物とは、例えば、ウサギ、ブタ、鳥類例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、あるいはガチョウ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、またはロバであるが、霊長類ではない他の動物、例えば、齧歯類もまた、本発明の範囲に具体的に含まれる。別の局面においては、本発明は、上記の核酸分子のいずれかを含む組み換えベクターに関する。さらに別の局面においては、本発明は、ヒト化免疫グロブリンIg遺伝子座を含むトランスジェニックベクターに関する。ここで、ヒト化Ig遺伝子座は、非ヒト動物のIg遺伝子座またはIg遺伝子座の一部に由来するものであり、これには、複数のIgセグメントが含まれる。ここで、a少なくとも1つの遺伝子セグメントが、スペーサー配列に由来するか、または2つ以上のそのようなスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する少なくとも20個の連続しているヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が隣接しているヒトIg遺伝子セグメントであり;b複数の遺伝子セグメントが、再構成されていない立体配置、部分的に再構成された立体配置、または完全に再構成された立体配置において並列しており;そしてc非ヒト動物が遺伝子を変換する動物であり、非ヒト動物中でヒト化された免疫グロブリンのレパートリーを生産する場合には、ヒト化Ig遺伝子座が遺伝子再構成を受けることができ、必要に応じて、さらに遺伝子変換および/または超変異を受けることができる。さらなる実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig重鎖遺伝子座は、約5から100個のV遺伝子セグメントを含み、これには少なくとも1つのヒトV遺伝子セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、ヒト化Ig重鎖遺伝子座には、1つ以上のヒトV遺伝子セグメントが含まれる。別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig重鎖遺伝子座には、約5から25個のDの遺伝子セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、ヒト化Ig重鎖遺伝子座には、1つまたはいくつかのヒトD遺伝子セグメントが含まれる。さらに別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig重鎖遺伝子座には、約1から10個のJ遺伝子セグメントが含まれ、これには少なくとも1つのヒトJ遺伝子セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、ヒト化Ig重鎖遺伝子座には、1つ以上のヒトJ遺伝子セグメントが含まれる。別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig重鎖遺伝子座には、約1から25個のC領域セグメントが含まれ、これには少なくとも1つのヒトC領域セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig重鎖遺伝子座には、1つ以上のヒトC遺伝子セグメントが含まれる。なおさらに別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig遺伝子座は、非ヒト動物の軽鎖遺伝子座であり、これには、少なくとも1つのV遺伝子セグメントと、少なくとも1つのJ遺伝子セグメントと、少なくとも1つの定常C領域遺伝子セグメントが含まれる。ここで、少なくとも1つの遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖VおよびJセグメント、ならびにヒト軽鎖C領域セグメントの群より選択される。特異的な実施形態においては、定常領域遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖定常領域遺伝子セグメントであり、これは、例えば、CλまたはCκ遺伝子セグメントであり得る。別の実施形態においては、ヒト化Ig軽鎖遺伝子座には、ヒトVおよびJセグメント、ならびにヒトC領域セグメントより選択される2つ以上のセグメントが含まれる。さらなる実施形態においては、ヒト化Ig軽鎖遺伝子座には、少なくとも1つのヒトVセグメントと、少なくとも1つのヒトJセグメントと、少なくとも1つのヒトC領域セグメントが含まれる。さらなる実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig軽鎖遺伝子座には、約5から100個のV遺伝子セグメントが含まれ、これには少なくとも1つのヒトV遺伝子セグメントが含まれる。ここで、ヒトV遺伝子セグメントは、非ヒト動物の5から100個のV遺伝子セグメントに対して下流に存在する。特異的な実施形態においては、ヒトV遺伝子セグメントは、再構成された立体配置においてJ遺伝子セグメントのすぐ5’側に存在する。別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig軽鎖遺伝子座には、1つ以上のヒトV遺伝子セグメントが含まれる。なお別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig軽鎖遺伝子座には、約1から10個のJ遺伝子セグメントが含まれ、これには少なくとも1つのヒトJ遺伝子セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig軽鎖遺伝子座には、1つ以上のヒトJ遺伝子セグメントが含まれる。別の実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig軽鎖遺伝子座には、約1から25個のC領域セグメントが含まれ、これには少なくとも1つのヒトC領域セグメントが含まれる。特異的な実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig軽鎖遺伝子座には、1つ以上のヒトC遺伝子セグメントが含まれる。なおさらなる実施形態においては、トランスジェニックベクター中に存在するヒト化Ig遺伝子座は、非ヒト動物の軽鎖遺伝子座であり、これには、少なくとも1つのV遺伝子セグメントと、少なくとも1つのJ遺伝子セグメントと、少なくとも1つの定常C領域遺伝子セグメントが含まれる。ここで、少なくとも1つの遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖VおよびJセグメント、ならびにヒト軽鎖C領域セグメントの群より選択される。特異的な実施形態においては、定常領域遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖定常領域遺伝子セグメントであり、これは、例えば、CλまたはCκ遺伝子セグメントであり得る。別の実施形態においては、ヒト化Ig軽鎖遺伝子座には、ヒトVおよびJセグメント、ならびにヒトC領域セグメントより選択される2つ以上のセグメントが含まれる。さらなる実施形態においては、ヒト化Ig軽鎖遺伝子座には、少なくとも1つのヒトVセグメントと、少なくとも1つのヒトJセグメントと、少なくとも1つのヒトC領域セグメントが含まれる。異なる局面においては、本発明は、5’から3’の方向で、5’ヌクレオチド配列、ヒト免疫グロブリン配列、そして3’ヌクレオチド配列からなる2つ以上のユニットを含む核酸分子に関する。ここで、5’ヌクレオチド配列と3’ヌクレオチド配列は同じである場合も、異なる場合もあり、これには、非霊長類動物の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖遺伝子中のコード領域の間隔を隔てるスペーサー配列に由来するか、あるいは、2つ以上のスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドが含まれる。特異的な実施形態においては、スペーサー配列は、配列番号1から185表1の中から選択される。別の特定の実施形態においては、核酸分子の全ての反復ユニット中の5’ヌクレオチド配列および/または3’ヌクレオチド配列は同じである。別の特定の実施形態においては、核酸分子の反復ユニットには、少なくとも2つの異なる5’配列および/または3’配列が含まれる。さらなる実施形態においては、5’ヌクレオチド配列と3’ヌクレオチド配列は互いに異なるが、全ての5’ヌクレオチド配列は同一であり、全ての3’配列も同一である。さらなる局面においては、本発明は、非ヒト動物中でヒト化抗体の機能的なレパートリーを生産することができるヒト化免疫グロブリンIg遺伝子座を含むトランスジェニックベクターを作成するための方法に関する。この方法には:a少なくとも1つのV遺伝子セグメントと、少なくとも1つのJ遺伝子セグメントと、少なくとも1つの定常領域遺伝子セグメントを含む、非ヒト動物に由来するIg遺伝子座またはその一部を含むDNAフラグメントを得る工程;ならびに、bヒト化Ig遺伝子座を生産するように、工程aのDNAフラグメント中に少なくとも1つのヒトIg遺伝子セグメントを組み込む工程であって;ここで、ヒトIg遺伝子セグメントには、非霊長類動物の免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖遺伝子中のコード領域の間隔を隔てるスペーサー配列に由来するスペーサー配列か、あるいは、2つ以上のそのようなスペーサー配列のコンセンサス配列に由来する、少なくとも約20個の連続しているヌクレオチドを含むヌクレオチド配列が隣接しており;ここで、i複数の遺伝子セグメントが、再構成されていない立体配置、部分的に再構成された立体配置、または完全に再構成された立体配置において並列しており;そしてiiヒト化Ig遺伝子座が遺伝子再構成を受けることができ、そして、必要に応じて、非ヒト動物中でヒト化免疫グロブリンのレパートリーを生産することができる、工程が含まれる。ヒト化Ig遺伝子座は、ヒト化Ig重鎖または軽鎖遺伝子座であり得る。ヒト化Ig重鎖遺伝子座の場合には、工程aで得られたDNAフラグメントには、さらに、少なくとも1つのD遺伝子セグメントが含まれる。別の局面においては、本発明は、上記のヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物と、そのようなトランスジェニック動物を作成するための方法に関する。1つの実施形態においては、トランスジェニック動物には、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、ヒト化免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の両方が含まれる。別の実施形態においては、トランスジェニック動物中に存在する重鎖遺伝子座と軽鎖遺伝子座のうち1つだけが、ヒト化されている。別の実施局面においては、動物の免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも1つのV、D、J、およびC領域の全てがヒト化されている。さらに別の実施形態においては、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座のV、D、J、およびC領域の全てがヒト化されている。さらなる局面においては、本発明は、本発明にしたがって生産されたトランスジェニック動物に由来するB細胞に関する。なおさらなる局面においては、本発明は、本発明のトランスジェニック動物を使用して生産されるヒト化免疫グロブリンと、ヒト化免疫グロブリンを含む抗体調製物または薬学的組成物に関する。実施例1ウサギ免疫グロブリン遺伝子座を含むBACクローンの単離および配列決定高分子量のDNAをa2b5雄ウサギから単離した。ウサギを安楽死させ、脾臓と腎臓を取り出し、氷冷したPBS中でリンスした。脂肪と結合組織を除去し、別々に処理した。臓器をフラグメントになるように切り、予め冷却しておいたDounceホモジナイザーにおいてホモジナイズした。上清を冷却した50mlのファルコンチューブに移し、冷却したPBSと混合し、大きな組織の破片を2分間の間、底に沈ませた。上清中の細胞を、200gで4°Cで10分間かけてペレット状にし、PBSで1回洗浄し、1mlのPBS中に再度懸濁させ、数えた。5×106、5×107、および5×108個の細胞のセットを、CHEF哺乳動物ゲノムDNAプラグキットCHEFMammalianGenomicDNAPlugKitBIORADを使用してアガロースプラグに包埋した。HindIIIでの部分的消化の条件を最適化するために、プラグを5個の同じフラグメントに切断し、1から10単位のHindIIIで種々の時間の間、種々の温度で消化した。最良の結果は、4°Cで3時間、または37°Cで25分間の、2単位のHindIIIを用いた場合に得られた。消化したDNAを、以下のパラメーターを使用してパルスフィールドゲル電気泳動PulseFieldGelElectrophoresisPFGE装置上でダブルサイズ分画した:6時間の逆行、15秒間のスイッチ時間;6時間前方へ進める、15秒間のスイッチ時間;20時間前方へ進める、90秒間のスイッチ時間;200V、14°C。所望される大きさの部分的に消化されたDNAを有しているゲルの領域を切り取り、DNAをゲレースgelaseを使用して単離した。11ngの挿入フラグメントを、1ngのHindIIIで消化したpBELOBAC11と連結し、DH10B細胞中にエレクトロポレーションした。得られたコロニーの1についてNotIを使用して大きさを測定し、平均の挿入フラグメントの大きさが124kbであることを明らかにした。1×105個のクローンをナイロンフィルターNylonfilter上にスポットし、特異的プローブとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。スクリーニングのためのプローブを、ウサギ由来のゲノムDNAを使用してPCRによって増幅し、pBlueScriptにクローニング氏、配列決定によって確認した。プライマー対配列番号193~208、表2を、公開されている配列にしたがって設計した。ウサギ重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を提示するいくつかのBACを単離し、マップした図1および5。BACs219D23219D23GenBankAcc.No.AY386695、225P18GenBankAcc.No.AY386697、27N5GenBankAcc.No.AY386696、38A2GenBankAcc.No.AY386694、179L1GenBankAcc.No.AY495827、215M22GenBankAcc.No.AY495826、19GenBankAcc.No.AY495828、およびフォスミドFos15BGenBankAcc.No.AY3866968を配列決定した。配列決定のためのショットガンライブラリーを、pCR-Blunt中に、1.5~2kbの大きさの挿入フラグメントを含めて構築した。配列分析には、STADENパッケージRogerStaden,Cambridge,UKを使用した。ソフトウェアによってプレギャップを調節し、gap4を組み立てとギャップを閉じるために使用した。配列の特質クリッピングqualityclippingのために、PHREDWashingtonUniversityとSTADENパッケージを組み合わせた。実施例2ヒト化ウサギ免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築ウサギの免疫グロブリン重鎖遺伝子座の配列を含むBACおよびフォスミドクローンを、定常領域、可変領域、および結合遺伝子セグメント、あるいは、3’エンハンサー領域に特異的なプローブを使用してゲノムDNAライブラリーから単離した。単離したBAC図127N5GenBankAcc.No.AY386696、219D23GenBankAcc.No.AY386695、225P18GenBankAcc.No.AY386697、38A2GenBankAcc.No.AY386694、フォスミドFos15BGenBankAcc.No.AY3866968を配列決定したRosetal.,Gene330,49-59。選択した免疫グロブリンコード配列を、ETクローニングによる大腸菌E.coli中での相同組み換えにより、対応するヒトの部分と交換したE-ChiangLeeetal.,Genomics73,56-652001;DaiguanYuetal.,PNAS97,5978-59832000;Muyrersetal.,NucleicAcidsResearch27,1555-15571999;Zhangetal.,NatureBiotechnology18,1314-13172000。あるいは、DNAフラグメントを、生体外での連結によって組み換え、その後、大腸菌E.coliを形質転換した。BACおよび/またはFos15B、あるいはその一部を、生体外での連結および形質転換、ETクローニングによって、あるいはCreリコンビナーゼによって媒介される組み込みによって結合させた。ETクローニングのために、標的配列を含むベクターを、誘導性のλファージ組み換え酵素Redα、Redβおよびγを含むストレプトマイシン耐性大腸菌E.coli株に形質転換した。これらの組み換えタンパク質を、同時トランスフェクトさせたプラスミドからプラスミドpSC101を有しているDH10B大腸菌E.coli細胞、またはゲノムに組み込まれたλプロファージからDY380大腸菌E.coli株のいずれかから発現させた。ETクローニング手順には、2回の相同組み換え工程を含めた。最初の工程では、標的遺伝子座が、選択-対抗選択selection-counterselectionカセット例えば、neo-rpsL、これは、ネオマイシンに対する耐性neoと、ストレプトマイシンに対する感受性rpsLを与えるによって置き換えた。neo-耐性コロニーの単離後、相同組み換えによる選択カセットの挿入を、制限酵素分析と部分的な配列決定によって確認した。第2の工程では、rpsL-neo選択カセットを、新しい配列と交換した。ストレプトマイシン耐性クローンを制限分析と配列決定によって分析した。ETクローニング手順に使用したフラグメントには、20から50bpの長さの隣接配列が含まれており、これは、標的配列と同じであった。連結に使用した配列は、その3’末端と5’末端に適切な制限酵素部位を有していた。これらの部位は、もともと備わっている部位であるか、またはそれらは、適切な部位を含むプライマーを使用してPCRによって導入されたものであるかのいずれかであった。あるいは、配列を合成によって作成した。ヒト化重鎖を、BAC219D23中のウサギJH、Cμ、およびBAC27N5中のCγの、対応するヒト部分での、ETクローニングにより置き換えによって構築した。ETクローニング手順に使用したヒト配列は、ヒトゲノムDNAからPCRによって増幅した。ヒトCμ、Cγ、およびJH遺伝子セグメントを、ウサギの標的配列に相同である50bpのプライマー配列番号209~214、表2を使用して増幅した。BACクローン225P18のクローン219D23との連結、およびBAC27N5のフォスミド15Bとの連結の後、連結させた構築物を大腸菌E.coliに形質転換し、Creリコンビナーゼによって媒介される挿入によって繋いだ。これによって、18個のウサギの可変遺伝子、ウサギD領域、ヒトJ領域、ヒトCμ、ヒトCγ、ウサギCε、ウサギCα4、および3’エンハンサーエレメントから構成される機能的な遺伝子座が得られた。トランスジェニック動物の作成のために、ヒト化BACクローンを、3個の重複しているBAC225P18と219D23とBAC27N5、または2つの重複している結合させたBAC225P18-229D23と、BAC27N5-フォスミド15Bを同時にか、または別々のいずれかで、あるいは、1つのBACとして225P18-219D23-27N5-フォスミド15B注入した。トランス遺伝子を有している創始動物をPCRによって同定した。実施例3合成のフラグメントを用いたヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築ヒトV配列とウサギのスペーサーを有している、ユニット1、ユニット2、ユニット3、およびユニット4と示される4個のフラグメント図13、配列番号189~192を化学的に合成した。それぞれのフラグメントには、5’に、AscI制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、3’にはlox71Creリコンビナーゼ認識配列と、その後ろにFseIとMluI制限酵素認識配列が隣接している。ユニット1は、ウサギのスペーサーI29-30、I3-4、I2-3、およびIl-2の3’側半分I1-2Bによって間隔を隔てられているヒトVH3-49、VH3-11、VH3-7、およびVH3-15可変遺伝子から構成されている。ユニット2は、ウサギのスペーサーI1-2A、I1-2の5’側半分、I7-8、I6-7、およびI4-5の3’側半分I4-5Bによって間隔を隔てられているヒトVH3-48、VH3-43、およびVH3-64から構成されている。ユニット3は、ウサギのスペーサー配列I4-5B、I26-27、I11-12、およびI17-18によって間隔を隔てられているヒトVH3-74、VH3-30、およびVH3-9から構成されている。ユニット3は、上記に加えて、上流のFlpリコンビナーゼ認識標的FRT配列の隣接と、その後ろに、上記のAscI部位の前にSglfI制限エンドヌクレアーゼ認識配列を有している。ユニット4は、ウサギのスペーサーI1-2が5’側に隣接しているヒトVH3-23遺伝子、lox66Creリコンビナーゼ標的配列と、AscIエンドヌクレアーゼ認識配列を有しており、3’には、IV-C5’側半分ウサギスペーサー配列が隣接しており、その後ろにMluIエンドヌクレアーゼ認識配列が続く。ゲンタマイシン選択カセットを、AscIとFseI部位を含むプライマー配列番号215および216表2を使用してPCR増幅し、AscI、FseI、およびMluIエンドヌクレアーゼ認識部位を含む修飾されたクローニング部位を有しているpGEMベクター配列番号217および218表2を使用してPCRによって修飾したpGEM.Gentaに連結した。ユニット1、2、および3を、pGEM.GentaPromegaベクターにクローニングした。ユニット4を、HindIIIで直鎖状にしたカスタマイズしたpBELOBAC11NEBベクターにサブクローニングし、PCR増幅した。正方向プライマー配列番号219、表2は、HindIII、PacI、およびAatIIについての制限部位を有しており、逆方向プライマー配列番号220は、BamHI、MluI、およびAscIについての制限部位を有している。プライマーは、pBELOBAC11クロラムフェニコール選択カセットを欠失させるように設計した。さらに、ネオマイシン選択カセットを、BamHIとHindIII制限部位を有しているプライマー配列番号221および222表2を用いてPCR増幅し、修飾したpBELOBAC11ベクターpBB11.1に連結した。ユニット1~4を、記載されているようにcreによって媒介される組み換えによって組み立てたMejiaetal.,Genomics702165-702000。最初に、ユニット1をカスタマイズしたpGEM.Gentaベクターにクローニングし、FseIで消化し、その後、連結によって再度環化させた。このベクターではないvectorless構築物で、pBB11.1.Unit4とp706-Creプラスミドを有している大腸菌E.coliを形質転換した。ユニット1とPBB11.1.unit4との組み換えの後、ポジティブクローンユニット4/1を、カナマイシンとゲンタマイシンを含む培地上で選択した。クローンを、種々の酵素を用いる制限分析によって特徴付けた。ユニット2の組み換えのために、ユニット4/1挿入フラグメントを、AscIとPacIでの二重消化によって切り出し、pBELOBAC11中に修飾したリンカーとともにクローニングしたpBB11.2:プライマー配列番号223および224表2を使用してPCRによって増幅した。pBELOBAC11を、HindIIIで直鎖状にし、PacIおよびAatIIエンドヌクレアーゼ認識部位をコードする正方向プライマーと、MluIおよびNotIエンドヌクレアーゼ認識部位、ならびに、lox66Creリコンビナーゼ標的部位をコードする逆方向プライマーを用いて、PCR増幅した。ユニット1/4の連結のために、pBB11.2ベクターをMluIとPacIで開環させた。pGEM.Genta.Unit2を、pGEM.Genta.Unit1について記載したように、環状のベクターではない構築物へと変換し、pBB11.2.Unit4/1と、生体内でのCreによって媒介される組み換えによって繋いだ。続いて、得られた構築物pBB11.2.Unit4/1/2を、ETクローニングによって野生型のloxp部位をlox66標的部位で置き換えることによる、ユニット3とのCreによって媒介される組み換えのために調製したMuyrersetal.,NucleicAcidsResearch27,1555-15571999;Muyersetal.,TrendsBiochem.Sci.265:325-312001。クロラムフェニコール選択カセットを、BAC標的配列に相同である50bpの配列を含むプライマー配列番号225および226、表2を用いてPCRによって増幅した。逆方向プライマーには、lox66部位を含めた。ゲルから精製したPCR産物を、標的BACと、さらに相同組み換えに必要なpSC101プラスミドを有している細胞に形質転換した。ポジティブクローンを、クロラムフェニコールで選択し、制限分析と配列決定によって確認した。pGEM.Genta.Unit3を、ユニット1および2について上記に記載したように生体内での組み換えのために調製し、受容体BAC、さらには、p706-Creプラスミドを有している細胞に形質転換した。ポジティブクローンpBB11.2.Unit4/1/2/3を、ゲンタマイシンを用いて選択し、制限分析によって確認した。pBB11.2.Unit4/1/2/3を、さらにETクローニングによって、lox71標的部位を生じるように修飾した。その後、pBB11.2.Unit4/1/2/3を、BAC219D23、27N5、およびFos15Bに由来するフラグメントに繋いだ。実施例4PCR増幅したフラグメントを用いるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築ヒトVHエレメントを、ゲノムDNAClonTechとプライマー配列番号227~248表2を使用して増幅した。PCR産物を、ゲル電気泳動によって分析し、GENECLEANキットQ-Biogenを使用してゲル精製した。その後、増幅産物を、Zero-BluntTOPO登録商標Invitrogenに、製造業者の説明書にしたがってサブクローニングした。全ての増幅したVエレメントの配列を確認した。ヒト化V領域の構築のために、Vエレメントを、鋳型としてのプラスミドDNAと、プライマー配列番号249~270表2を使用して増幅した。正方向プライマーには、AscI部位、その後ろに、ウサギスプライシング部位を含めた。逆方向プライマーには、ウサギの組み換えシグナル配列RSSと、MluI制限部位を含めた。PCR産物を、GENECLEANキットを使用してゲル精製した。ヒトVHs、V3-33、V3-74、V3-49、V3-21、V3-48、V3-73、V3-7、およびV3-Dは、PCRによっては単離できず、これらは、化学合成したBlueHeron,Bothel,WA。制限部位とウサギの調節配列を、合成の間に付加した。ウサギのスペーサー配列を、鋳型としてのBAC38A2および225P18と、プライマー配列番号271~288表2を使用して増幅した。BAC225P18をNheIで二重消化し、41kbのフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、スペーサーV1-2、V2-3、V3-4、V4-5、およびV5-6の増幅のための鋳型とした。BAC225P18を、BstBIで消化し、スペーサーV6-7とV7-8の鋳型をゲル精製した。BAC38A2のPacIとRsrIIでの二重消化により、スペーサーV21-22とV22-23の鋳型のゲル精製ができた。増幅したスペーサー配列をゲル精製し、XL-PCR-TOPO登録商標Invitrogenに、製造業者の説明書にしたがってサブクローニングした。VHエレメントとウサギのスペーサー配列を、修飾したpGEMPromegaとpBSStrategeneベクターにサブクローニングした。pGEMベクターをNotIとHindIIIで切断し、FseI、AscI、およびMluI部位を含む化学合成したオリゴヌクレオチド配列オリゴ1:配列番号289;オリゴ2:配列番号290;表2に連結させた。ベクターpBSをSacIとKpnIで切断し、制限部位FseI、AscI、およびMluIを含む化学合成したオリゴヌクレオチド配列オリゴ1:配列番号291;オリゴ2:配列番号292;表2と連結させた。ゲンタマイシンとネオマイシン選択カセットを、FseIまたはAscI部位を有するプライマー配列番号293~296、表2を使用して増幅し、修飾したpGEMとpBSベクターに連結した。最終的な構築物を、修飾したpBeloBACIIベクター中で組み立てた。pBeloBACIIベクターを、BamHIとHindIIIで開環し、クローニング部位を、FseI、AscI、MluI部位を含むように、化学合成したオリゴヌクレオチド配列オリゴ1:配列番号297;オリゴ2:配列番号298;表2を使用して修飾した。BAC219D23を、ETクローニングを使用して制限部位を導入することによって修飾したMuyrersetal.,NucleicAcidsResearch27,1555-15571999;Muyersetal.,TrendsBiochem.Sci.265:325-312001。ネオマイシン選択カセットを、プライマー配列番号299および配列番号300表2を用いて増幅した。正方向プライマーにはFseI部位を含め、逆方向プライマーにはAscI部位を含めた。精製したPCR産物で、BAC219D23と、相同組み換えに必要なプラスミドpSC101を有している大腸菌E.coliを形質転換した。カセットとBAC中の標的部位の相同組み換えの後、導入した制限部位を制限分析によって確認した。その後、修飾したBAC219D23をFseIとMluIで消化し、得られた17kbのフラグメントFseI-Neo-AscIカセットを、PFGEによって分離し、電気的溶出によって精製した。この精製したフラグメントを、FseIとMluIで開環させた修飾したpBeloBACIIベクターと連結させた。ヒトVHエレメントをコードする精製したDNAフラグメントを、AscIとMluIで開環させた修飾したpGEM.neoベクターと連結させた。同様に、スペーサー配列を、修飾したpGEM.gentaベクターにサブクローニングした。その後、スペーサー配列を有しているpGEM.gentaベクターをFseIとMluIで切断し、挿入フラグメントを、FseIとAscIで開環させたpGEM.neo.VHベクターと連結させた。この工程を数回繰り返して、いくつかのスペーサーとVHセグメントから構成されるフラグメントを組み立てた。このようなフラグメントをFseIとMluIで切り出し、FseIとAscIで直鎖状にした修飾したpBeloBACIIベクターと連結させた。これらのプロセスを、大きな免疫グロブリンV領域を組み立てるために繰り返した図6。ヒト化重鎖遺伝子座を、トランスジェニック動物の作成に使用した。実施例5ヒト化Cκとヒト化再構成VJを含む、ヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築ウサギのゲノムBACライブラリーのスクリーニングにより、ウサギの軽鎖κ1遺伝子セグメントを含む3個のBAC215M22、179L1、および196O2;それぞれ、GeneBankAcc.No.AY495826、AY495827、およびAY495828が得られた。ウサギのCκ1を、記載されているE-ChiangLeeetal.,Genomics73,56-652001;DaiguanYuetal.,PNAS97,5978-59832000;Muyrersetal.,NucleicAcidsResearch27,1555-15571999;Zhangetal.,NatureBiotechnology18,1314-13172000ようなETクローニングによって、ヒトCκアロタイプKm3と交換した。ヒトCκアロタイプKm3を、標的配列に相同である50bpの配列を含むプライマー配列番号301および302、表2を用いてPCRによって増幅した。相同アームを、ウサギの生殖細胞系列κb5;GenBankAccessionNo.K01363の公開されている配列に基づいて設計し、Cκのイントロン-エキソン境界と適合させた。BAC179L1中でのウサギのCκのヒトCκへの交換を、配列決定によって確認した。BAC179L1-huCκを2回のETクローニングによって修飾した。ネオマイシン選択カセットを、BAC179L1に相同である50bpの配列を含むプライマー配列番号303および304、表2を用いて増幅した。正方向プライマーには、さらに、i-CeuIメガヌクレアーゼ部位を含めた。PCR産物をETクローニングに使用した。ポジティブクローンをネオマイシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって正確であることをチェックした。ゼオシン選択カセットを、BAC179L1に相同である50bpの配列を含むプライマー配列番号305および306、表2を用いて増幅した。正方向プライマーには、さらに、i-SceIメガヌクレアーゼ部位を含めた。PCR産物をETクローニングに使用した。ポジティブクローンをゼオシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって正確であることをチェックした。BAC215M22を1回のETクローニングによって修飾した。ゲンタマイシン耐性遺伝子を、BAC215M22に相同である50bpの配列を含むプライマー配列番号307および308、表2を用いて増幅した。正方向プライマーには、さらに、i-CeuIメガヌクレアーゼ部位を含め、逆方向プライマーには、i-SceIメガヌクレアーゼ部位を含めた。PCR産物をETクローニングに使用した。得られたクローンをゲンタマイシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって分析した。修飾したBAC179L1および225M22を、i-CeuIとi-SceIで切断した。98kbのフラグメントと、132kbのフラグメントを精製し、連結させた。得られたクローンを、カナマイシンとクロラムフェニコールで選択し、制限酵素消化、i-SceIとi-CeuI制限部位を含む領域のPCR、および配列決定によって正確であることをチェックした。得られたBACを、179-215-huCκと呼んだ。BAC179-215-huCκのウサギのJκ1とJκ2を、ETクローニングによって、合成のヒトの再構成したVκJκ遺伝子と置き換えた。ウサギのプロモーター、ウサギのリーダー、ウサギのイントロンと、ヒトVκJκ遺伝子を有しているDNAフラグメントを化学合成した。合成のヒトVJのコドン使用は、ウサギのVκ遺伝子に最も高く相同であるDNA配列となるように最適化した。合成のヒトVJを、BAC179L1に相同である50bpの配列を含む正方向プライマー配列番号309、表2と、ゲンタマイシン耐性遺伝子に相同である配列およびFRT部位を含む逆方向プライマー配列番号310、表2を用いてPCR増幅した。ゲンタマイシン耐性遺伝子を、FRT部位を含む正方向プライマー配列番号311、表2と、BAC179L1に相同である50bpおよびFRT部位を有している逆方向プライマー配列312、表2を用いて増幅した。合成のヒトVJとゲンタマイシン耐性遺伝子とを、合成のヒトVJ遺伝子についての正方向プライマーと、ゲンタマイシン耐性遺伝子についての逆方向プライマーを使用する重複伸張overlapextensionPCRによって結合させた。得られたフラグメントをETクローニングに使用した。ポジティブクローンをゲンタマイシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって正確であることを確認した。ゲンタマイシン耐性遺伝子を、Flpリコンビナーゼの発現を通じて、部位特異的組み換えによって除去した。組み換え後、1つのFRTが残った。このFRT部位をETクローニングによって欠失させた。合成のヒトVJに由来する232bpのフラグメントを、プライマー配列番号313および314表2を使用してPCRによって増幅し、ETクローニングに使用した。得られたコロニーを、FRT部位が存在しないことについてプライマー配列番号315および316表2を使用してPCRによってスクリーニングし、配列決定によって確認した。BAC179-215-huCκのネオマイシン耐性遺伝子をETクローニングによって置き換えた。ゲンタマイシン耐性pRep-Genta;Genebridges遺伝子を、BAC179-215-huCκに相同である50bpの配列を含むプライマー配列番号317および318、表2を用いてPCRによって増幅した。正方向プライマーには、さらに、loxP部位、attB部位、およびPvuI制限部位を持たせておいた。得られたクローンをゲンタマイシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって正確であることをチェックした。得られたBACrLC3-B、図8を、トランスジェニック動物の作成に使用した。実施例6複数のヒトVκエレメント、ニワトリのスペーサーエレメント、および再構成されたヒトVJを含む、ヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築ウサギのゲノムBACライブラリーのスクリーニングにより、ウサギの軽鎖κ1遺伝子セグメントを含む3個のBAC215M22、179L1、および196O2;それぞれ、GeneBankAcc.No.AY495826、AY495827、およびAY495828が得られた。ウサギのCκ1を、記載されているE-ChiangLeeetal.,Genomics73,56-652001;DaiguanYuetal.,PNAS97,5978-59832000;Muyrersetal.,NucleicAcidsResearch27,1555-15571999;Zhangetal.,NatureBiotechnology18,1314-13172000ようなETクローニングによって、ヒトCκアロタイプKm3と交換した。ヒトCκアロタイプKm3を、標的配列に相同である50bpの配列を含むプライマー配列番号301および302、表2を用いてPCRによって増幅した。相同アームを、ウサギの生殖細胞系列κb5;GenBankAccessionNo.K01363の公開されている配列に基づいて設計し、Cκのイントロン-エキソン境界と適合させた。BAC179L1中でのウサギのCκのヒトCκへの交換を、配列決定によって確認した。2つのDNAフラグメント、17個のヒトのV偽遺伝子と18個のニワトリのスペーサー配列を含むユニット112,235bp、図12a、配列番号187と、リーダーを伴う機能的な再構成されたヒトκVJ遺伝子フラグメント、11個のヒトV偽遺伝子、12個のニワトリのスペーサー配列、イントロン1、およびイントロン2の一部を含むユニット213,283bp、図12b、配列番号188を化学合成し、ベクターpBR322にクローニングした。ユニット1およびユニット2を、制限酵素NgoMIVとAsiSI、またはNgoMIVとAscIでそれぞれ消化し、3個のフラグメントの連結により修飾されたリンカーを有しているpBELOBAC11に連結させた。修飾されたリンカーには、BsiWI制限部位、FRT5部位、rpsL-Neoカセット、AscI部位、およびAsiSI部位が含まれている。リンカーフラグメントを、高品質のポリメラーゼRoche、プライマーCE_1_001_012904配列番号319、表2、および鋳型としてのプラスミドpRpsL-NeoGenebridgesを用いて増幅した。その後、増幅した産物を、pBELOBAC11のBamHIとHindIII部位に連結した。ユニット1とユニット2の連結のために、修飾されたpBELOBAC11をAsiSIとAscIを用いて開環させた。ポジティブクローンpBELOBAC11Unit1/2を制限酵素消化によってチェックした。BAC179L1GENBANKAcc.No.AY495827を、ETクローニングによる2つの修飾された選択カセットの挿入によって修飾した。カセット1は、BAC179L1に相同である50bpの配列とAscI部位を逆方向プライマー中に含むプライマー配列番号321および322、表2を用いて増幅したゲンタマイシン耐性遺伝子である。カセット2は、BAC179L1に相同である50bpの配列、attB部位、FRT5部位、およびBsiWI部位を正方向プライマー中に含むプライマー配列番号323および324、表2を用いて増幅したrps1-Neo選択カセットである。精製したPCR産物で、BACと、相同組み換えに必要なプラスミドpSC101を有している大腸菌E.coliを形質転換した。相同組み換えの後、BACの修飾がうまくできたことを、制限消化分析、サザンブロット、および配列決定によって確認した。修飾したBAC179L1を、制限酵素AscIとBsiWIで切り出した。ヒトCκを含むフラグメントを精製し、同じ制限酵素で開環させたpBELOBAC11Unit1/2と連結させた。ポジティブクローンを、制限酵素消化によってチェックした。最終的な構築物図12cを、トランスジェニック動物の作成のために使用した。実施例7複数のヒトVκエレメント、ニワトリのスペーサー、および再構成されていないヒトJκ遺伝子座を含む、ヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築実施例6に記載した構築物を、以下のようなETクローニングによって修飾した。再構成された機能的なVJ配列を、機能的な組み換えシグナル配列RSSが隣接している機能的なV1と交換した。RSSを、pBELOBAC11Unit1/2のV1に相同である50bpの配列を含む正方向プライマー配列番号325、表2、および、AscI制限酵素部位を含み、ゲンタマイシン耐性遺伝子に対する相同性を有している逆方向プライマー配列番号326、表2を用いて、BAC179L1からPCR増幅した。ゲンタマイシン耐性遺伝子を、RSSの増幅に使用した逆方向プライマーに相同である配列を含む正方向プライマー配列番号327、表2、およびpBELOBAC11Unit1/2に相同である50bpの配列と、BsiWI制限酵素部位を含む逆方向プライマー配列番号328、表2を用いて増幅した。RSSとゲンタマイシン耐性遺伝子を、RSSの増幅のための正方向プライマーと、ゲンタマイシン耐性遺伝子の増幅のための逆方向プライマーを使用する、重複伸張PCRによって結合させた。得られたフラグメントを、ETクローニングによりpBELOBAC11Unit1/2を修飾するために使用した。ポジティブクローンをゲンタマイシンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって分析した。ヒトのCκを有しているBAC179L1を、ETクローニングによってさらに修飾した。カナマイシン選択カセットを、BAC179L1に相同である50bpの配列を含むプライマー配列番号329および330、表2を用いて増幅した。逆方向プライマーにはまた、AscI制限酵素部位とFRT部位を含めておいた。PCR産物をETクローニングに使用した。アンピシリン選択カセットを、BAC179L1に相同である50bpの配列を含むプライマー配列番号331および332、表2を用いて増幅した。正方向プライマーには、また、attB部位、AsiSI制限酵素部位、およびFRT5部位も含めておいた。逆方向プライマーには、BsiWI制限酵素部位とFRT部位を含めておいた。PCR産物をETクローニングに使用した。ヒトJ領域を、BAC179L1に相同である50bpの配列を含むプライマー配列番号333および334、表2を用いて、ヒトのゲノムDNAから増幅した。PCR産物をETクローニングに使用した。得られたクローンを、制限酵素消化と配列決定によって分析した。ポジティブクローンをAscIとBsiWIで切断した。得られたフラグメントを精製し、同じ制限酵素で切断した修飾したpBELOBAC11Unit1/2に連結した。ポジティブクローンをアンピシリンで選択し、制限酵素消化と配列決定によって分析した。正しいクローンを、トランスジェニック動物を作成するために使用した。実施例8複数のヒトVκエレメントを含むヒト化ウサギ軽鎖遺伝子座の構築ウサギのゲノムBACライブラリーのスクリーニングにより、ウサギの軽鎖κ1遺伝子セグメントを含む3個のBAC215M22、179L1、および196O2;それぞれ、GeneBankAcc.No.AY495826、AY495827、およびAY495828が得られた。ウサギのCκ1を、記載されているE-ChiangLeeetal.,Genomics73,56-652001;DaiguanYuetal.,PNAS97,5978-59832000;Muyrersetal.,NucleicAcidsResearch27,1555-15571999;Zhangetal.,NatureBiotechnology18,1314-13172000ようなETクローニングによって、ヒトCκアロタイプKm3と交換した。ヒトCκアロタイプKm3を、標的配列に相同である50bpの配列を含むプライマー配列番号301および302、表2を用いてPCRによって増幅した。相同アームを、ウサギの生殖細胞系列κb5;GenBankAccessionNo.K01363の公開されている配列に基づいて設計し、Cκのイントロン-エキソン境界と適合させた。BAC179L1中でのウサギのCκのヒトCκへの交換を、配列決定によって確認した。Vκ1ファミリーO2、L8、L4、A30、L11、L1、L5、L15、O8、L19、L12、A20、O4、L14、L23、L9、A4、L24、O6、L22、A9、A25、A15、O9のヒトVκエレメントを、プライマー配列番号335~382、表2、および鋳型としてのヒトゲノムDNAを使用してPCRによって増幅した。増幅産物をゲル電気泳動によって分析し、GENECLEANQ-Biogenを使用してゲル精製し、Zero-BluntTOPO登録商標ベクターInvitrogenにサブクローニングし、配列決定した。再構成されたヒトVκO2JκJ4エレメントが、PCR増幅によって生じ、これをサブクローニングし、配列決定した。ヒトVκエレメントをウサギのスペーサーと結合させるために、ヒトVκエレメントを、プラスミドDNAを鋳型として使用して、プライマー配列番号383~430、表2を用いて、PCRによって増幅した。プライマーには、AscI部位またはMluI部位を含めた。ウサギのスペーサー配列を、プライマー配列番号431~450表2を使用してPCRによって増幅した。BAC179L1および215M22を、SpeI、NheI、AclI、SfoI、MluI、およびSalI/XhoIで消化した。フラグメントをゲル精製し、増幅鋳型として使用した。5’末端に存在するスペーサー配列を、FRTとattB部位を含む上流オリゴヌクレオチドによって増幅した。PCR産物を、GENECLEANキットを使用してゲル精製し、XL-PCR-TOPO登録商標Invitrogenに、製造業者の説明書にしたがってサブクローニングした。ヒトVκエレメントとウサギのスペーサー配列を、実施例4に記載したように修飾したpGEMPromegaにクローニングした。ヒトVκと修飾したpGEM.gentaベクターを、AscIとMluIで消化し、これらを連結させた。同様に、ウサギのスペーサー配列をpGEM.neoにクローニングした。その後、pGEM.neoVκをFseIとAscIで切断し、FseIとMluIで切り出したpGem.genta.spacerの精製した挿入フラグメントと連結させた。AscIとMluIの相補末端の連結により、それらの制限酵素部位は破壊され、いくつかのVκとスペーサーエレメントを含むVκ遺伝子座の構築のために、AscIとMluIを繰り返し使用することができるようになる。ヒト化BAC179L1および215M22のフラグメントと、ヒト化Vκ領域から構成される最終的な構築物を、pBeloBACの中で組み立てた。BAC179L1および215M22を修飾し、結合させた。その後、BAC179L1-215M22-huCκを、ETクローニングによってさらに修飾した。制限酵素部位、選択マーカー、およびさらなる機能的部位を含む2つのカセットを、図7に示すようにETクローニングによってベクター中に挿入した。カセットの増幅のために使用したプライマー配列番号451~454を、表2に列挙する。最終的な構築物を組み立てるために、ヒトVエレメント、ウサギのスペーサーエレメント、および耐性マーカーから構成されるユニットを、pGEMからFseIとMluIで切り出し、FseIとAscIで消化したBAC179L1-215M22と連結させた。その後、耐性マーカーを、ヒトVエレメント、ウサギのスペーサーエレメント、および別の耐性マーカーから構成される新しい挿入フラグメントと置き換えた。数回繰り返した後、最終的な構築物は、ウサギのスペーサー配列によって隔てられた多くのVκセグメントL8、L4、A30、L11、L1、L5、L15、O8、L19、L12、A20、O4、L14、L23、L9、A4、L24、O6、L22、A9、A25、A15、O9から構成される。ヒト化軽鎖遺伝子座を、トランスジェニック動物の作成のために使用する。実施例9ニワトリ重鎖遺伝子座スペーサー配列を有するヒト化重鎖遺伝子座の構築ニワトリのスペーサー配列によって隔てられている、ウサギD領域、ヒトJ領域、ヒトCμ、ヒトCγ、ウサギCα4、ウサギ3’αエンハンサー、およびヒトVHエレメントプロモーター、および7マー/9マーの配列を含むを含む、合成のヒト化重鎖遺伝子座を構築する。修飾したウサギBAC27N5実施例2を参照のことを、ETクローニングによってさらに修飾した。この構築物には、ヒト化CμおよびCγと、2つの1つずつしか存在しないBsiWIおよびAsiSI制限部位が、α-4膜エキソンの下流に含まれている。DNAを、オリゴヌクレオチド配列番号455および456表2を用いて増幅した。フォスミドFos15BをNheIで消化し、3’αエンハンサーを含む得られた13kbのフラグメントを、挿入フラグメントがBsiWIおよびAsiSI部位と隣接するように、クローニングベクター中にサブクローニングした。その後、挿入フラグメントを、BsiWIおよびAsiSIで切断し、修飾したBAC27N5と連結させてBAC27N5Fosを形成させた。BAC219D23中のウサギJ領域を、ETクローニングによって対応するヒトJ領域と交換した。ヒトJ領域を、プライマー配列番号457および458表2を使用してPCRによって増幅した。1つずつしか存在しない制限酵素部位を、BAC219D23のD領域の上流AとCμの上流Bに挿入した。BAC27N5Fos中では、制限部位Aを、リンカー領域の上流に挿入し、Bを、BAC219D23に相同である配列の中に挿入した。酵素AおよびBでの消化後、ヒトJ領域とウサギD領域を含むフラグメントを単離し、BAC27N5Fosと連結させて、BAC219D23/27N5Fosを作成した。ニワトリの重鎖スペーサー配列を、ニワトリ重鎖V偽遺伝子Mansikkaetal.,JImmunol14511,3601-36091990、Reynaudetal.,Cell591,171-1831989に特異的なプライマー配列番号459および460、表2を使用して、PCRによってニワトリのゲノムDNAから増幅した。あるいは、スペーサー配列を化学合成した。PCR産物をゲル精製し、pTOPOInvitrogenにクローニングし、配列決定した。ヒト重鎖可変エレメントを、GENBANKに公開されている配列例えば、Acc.No.NG_001019にしたがって設計したプライマーを用いてPCRによって増幅したか、あるいは化学合成した。ヒトVエレメントには、ヒトプロモーター領域、ヒトリーダー配列、リーダーとVをコードする領域との間のヒトのイントロン、ヒトVをコードする領域、およびヒトの組み換えシグナル配列が含まれている。増幅したか、または合成したフラグメントには、特異的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位が隣接している。ニワトリのスペーサー配列とヒトのVエレメントを、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む1つまたはいくつかの大きなDNAフラグメントとなるように結合させた。構築物を、トランスジェニック動物を作成するために使用した。実施例10ヒトVエレメントおよび非ヒトスペーサー配列を含むプロモーター領域とRSSは含まないヒト化免疫グロブリン遺伝子座の構築非ヒトゲノムDNAを用いて作成したBACライブラリーを、免疫グロブリンに特異的なプローブを用いてスクリーニングし、重鎖および軽鎖免疫グロブリンC、J、およびD領域を含むBACクローンを同定した。BACクローンを修飾して、制限酵素部位を含ませた。ヒト重鎖および軽鎖可変エレメントを、GenBank例えば、Acc.No.NG_001019に公開されている配列にしたがって設計したプライマーを使用してPCRによって増幅した。配列は、ゲノムDNAから増幅したか、または化学合成した。ヒトVエレメントには、ヒトのプロモーター領域、ヒトのリーダー配列、リーダーとVをコードする領域との間のヒトのイントロン、ヒトVをコードする領域、およびヒトの組み換えシグナル配列RSSが含まれている。増幅したか、または合成したフラグメントは、末端に特異的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有している。非ヒトスペーサー配列は、PCR増幅したか、または化学合成した。非ヒトスペーサー配列とヒトのVエレメントを、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む1つまたはいくつかの大きなDNAフラグメントとなるように結合させた。構築物を、トランスジェニック動物を作成するために使用した。ニワトリのスペーサー配列を用いたヒト化V領域の構築の例を、図10に示す。実施例11ヒトVエレメントおよび非ヒトスペーサー配列を含むヒト化免疫グロブリン遺伝子座の構築非ヒトゲノムDNAを用いて作成したBACライブラリーを、免疫グロブリンに特異的なプローブを用いてスクリーニングし、重鎖および軽鎖免疫グロブリンC、J、およびD領域を含むBACクローンを同定した。BACクローンを修飾して、制限酵素部位を含ませた。ヒト重鎖および軽鎖可変エレメントを、GenBank例えば、Acc.No.NG_001019に公開されている配列にしたがって設計したプライマーを使用してPCRによって増幅した。配列は、ゲノムDNAから増幅したか、または化学合成した。ヒトVエレメントには、ヒトVをコードする領域が含まれている。非ヒトスペーサー配列は、PCRによって増幅したか、または化学合成した。これには、組み換えシグナル配列、スペーサー配列、プロモーター領域、リーダー配列、およびリーダーとVをコードする領域との間のイントロンが含まれている。このような非ヒトスペーサー配列を、ヒトのVエレメントと、1つまたはいくつかの大きなDNAフラグメントとなるように結合させ、トランスジェニック動物を作成するために使用した。マウスまたはウサギのスペーサー配列を用いたヒト化V領域の構築の例を、図11に示す。実施例12ヒト化免疫グロブリンを発現するトランスジェニックウサギトランスジェニックウサギを、Fanetal.Pathol.Int.49:583-594,1999に記載されているように作成した。簡単に説明すると、雌のウサギを標準的な方法を使用して過剰排卵させ、雄のウサギと交配させた。前核段階の受精卵を卵管から回収し、20のウシ胎児血清を補充したダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水のような適切な培養液に入れた。ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むBACを、1対のマニピュレーターの力を借りて雄の前核にマイクロインジェクションした。形態学的に生存している受精卵を、偽妊娠させたウサギの卵管に移した。偽妊娠は、ヒトの絨毛膜性腺刺激ホルモンhCGの注射によって誘導した。ヒト化軽鎖構築物を受精卵の4645個の前核に注入した後、4043個の卵母細胞を132匹のレシピエントに移した。全部で253匹の生存性の子孫が産まれ、そのうちの11匹がトランスジェニックであった。ヒトκ軽鎖の発現を、ヒトκ軽鎖特異的試薬例えば、マウスの抗ヒトκ、SouthernBiotech,9220-01;ヤギの抗ヒトκ、SouthernBiotech2063-08を使用してELISAによって検出した。ヒト化重鎖構築物を、4083個の受精卵の前核に注入した。3485個の卵母細胞を119匹のレシピエントに移し、433匹の子孫が生まれた。PCRおよびFISHによる分析により、これらの動物のうちの20匹がトランスジェニックであることが明らかになった。創始動物の血液中のヒト化重鎖を、ヒトIgM/IgGに特異的な抗体例えば、ウサギの抗ヒトIgM、Rockland609-4131;ウサギの抗ヒトIgM、Rockland609-4631;ウサギの抗ヒトIgG、Pierce31142、ウサギの抗ヒトIgG、SouthernBiotech6145-08;ウサギの抗ヒトIgG、Pierce31784を使用してELISAによって検出した。ヒト化κ、μ、およびγ鎖を検出するサンドイッチ型ELISAを、標準的な手順を使用して行った。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを捕捉抗体でコーティングし、希釈した血清試料とともにインキュベートした。結合したヒト免疫グロブリンを、二次標識抗体と、ペルオキシダーゼ-ストレプトアビジン結合体Sigma、S2438を使用して検出した。ヒト化重鎖免疫グロブリン鎖とヒト化軽鎖免疫グロブリン鎖の両方を発現する二重トランスジェニックである動物を、創始動物を交配させることによって作成した。実施例13ヒト化免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウストランスジェニックマウスを、Nagyetal.,ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,2003に記載されているように作成した。簡単に説明すると、雌のマウスを標準的な方法を使用して過剰排卵させ、雄のマウスと交配させた。前核段階の受精卵を卵管から回収し、M2培地のような適切な培養液に入れた。ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むBACを、1対のマニピュレーターの力を借りて雄の前核にマイクロインジェクションした。形態学的に生存している受精卵を、偽妊娠させた雌のマウスの卵管に移した。偽妊娠は無精子症の雄との交配によって誘導した。ヒト化軽鎖構築物を受精卵の1325個の受精卵の前核への注入の後、787個の卵母細胞を29匹のレシピエントに移した。全部で55匹の生存性の子孫が産まれ、そのうちの11匹がトランスジェニックであった。ヒト化重鎖構築物を、1050個の受精卵の前核に注入した。650個の卵母細胞を25匹のレシピエントに移し、64匹の生存している子孫が生まれた。PCRによる分析から、これらの動物のうちの19匹がトランスジェニックであることが明らかになった。ヒト化重鎖免疫グロブリン鎖とヒト化軽鎖免疫グロブリン鎖の両方を発現する二重トランスジェニックである動物を、創始動物を交配させることによって作成した。ヒト化κ、μ、およびγ鎖の発現を、標準的な手順を使用してELISAによって検出した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを捕捉抗体でコーティングし、希釈した血清試料とともにインキュベートした。結合したヒト免疫グロブリンを、二次標識抗体と、ペルオキシダーゼ-ストレプトアビジン結合体Sigma、S2438を使用して検出した。明細書を通じて引用された全ての参考文献は、引用により本明細書中に明確に組み入れられる。本発明は、特定の実施例を参照することによって説明されるが、それらに限定されない。当業者であれば、種々の変更はバリエーションが、本発明の本質から逸脱することなく可能であることを認識するであろう。全てのこのような変更とバリエーションが、本明細書の範囲に具体的に含まれる。"