"個体の神経障害または神経変性疾患を治療するための方法であって、前記個体の神経細胞および/またはグリア細胞内のプロテインキナーゼD1PKD1の活性を調節する有効量の薬剤を前記個体に投与することを含む方法。前記薬剤がPKD1の小分子モジュレーターである、請求項1に記載の方法。前記薬剤が神経細胞内の活性のあるPKD1のレベルを低下させる抑制性核酸である、請求項1に記載の方法。前記薬剤が特異的にPKD1に結合する抗体である、請求項1に記載の方法。前記神経変性疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症またはアルツハイマー病である、請求項1に記載の方法。前記神経障害が脳卒中、脊髄損傷、または頭部外傷である、請求項1に記載の方法。細胞内のプロテインキナーゼD1PKD1のレベルを特異的に低下させる単離された干渉核酸。前記干渉核酸が低分子干渉RNAsiRNAである、請求項7に記載の干渉核酸。請求項7に記載の干渉核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組換えコンストラクト。プロテインキナーゼD1PKD1に特異的に結合する単離された抗体。前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項10に記載の抗体。前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項10に記載の抗体。前記抗体が、少なくとも約10-7Mの親和性でPKD1ポリペプチドに結合する、請求項10に記載の抗体。内在性プロテインキナーゼD1PKD1遺伝子に欠陥を含む遺伝子組換え非ヒト哺乳動物であって、前記遺伝子組換え非ヒト哺乳動物が、前記内在性PKD1遺伝子に安定的に組み込まれた異種核酸を含み、その結果、前記遺伝子組換え非ヒト哺乳動物が、同じ種の対照哺乳動物におけるPKD1活性レベルと比較して、PKD1活性レベルを減少させるという欠陥が、前記内在性PKD1遺伝子にもたらされる、遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。前記哺乳動物が、内在性PKD1遺伝子欠損についてヘテロ接合である、請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。前記哺乳動物が、内在性PKD1遺伝子欠損についてホモ接合である、請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。前記哺乳動物が齧歯類である、請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。前記哺乳動物が、空間記憶障害を呈する、請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。内在性PKD1遺伝子の欠陥が神経細胞特異的である、請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。請求項14に記載の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物から単離された細胞であって、破壊された内在性PKD1遺伝子を有する細胞。定義本明細書で使用する治療treatment、および治療treatingなどの用語は、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾患またはその症状の完全なもしくは部分的な防止の観点から予防的であり得、かつ/または疾患および/もしくはその疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒の観点から治療的であり得る。本明細書で使用する治療は、哺乳類、特にヒトの疾患の全ての治療を包含し、aその疾患にかかりやすい可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない対象においてその疾患が生じるのを防止すること、Bその疾患を抑制すること、すなわち、その進行を止めること、およびcその疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退縮を引き起こすことを含む。本明細書で互換的に用いる個体、対象、宿主および患者という用語は、ネズミラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、および有蹄類例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどを含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。治療有効量または有効量とは、疾患を治療するために哺乳動物または他の対象に投与した時に、その疾患のかかる治療を達成するのに十分な化合物の量を意味する。治療有効量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療すべき対象の年齢、体重などにより異なる。本明細書で使用する短鎖干渉核酸、siNA、短鎖干渉RNA、siRNA、短鎖干渉核酸分子、短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子または化学修飾した短鎖干渉核酸分子は、例えば、配列特異的な方法でのRNA干渉RNAiまたは遺伝子発現抑制を介して、遺伝子発現を阻害するかまたは下方制御することができる任意の核酸分子を指す。標的遺伝子が与えられた時のRNAi分子の設計は、当技術分野で決められた方法である。US2005/0282188参照により本明細書に組み込まれるおよびその中で引用される参考文献も参照されたい。例えば、PushparajetalClinExpPharmacolPhysiol2006May-Jun;335-6:504-10;LutzelbergeretalHandbExpPharmacol2006;173:243-59;AroninetalGeneTher2006Mar;136:509-16;XieetalDrugDiscovToday2006Jan;111-2:67-73;GrunwelleretalCurrMedChem2005;1226:3143-61;およびPekaraiketalBrainResBull2005Dec15;681-2:115-20Epub2005Sep9を参照されない。抗体および免疫グロブリンという用語には、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗原への特異的結合を保持し、Fabフラグメント、Fvフラグメント、scFvフラグメント、およびFdフラグメントを含むがこれらに限定されない抗体のフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体の抗原結合部分および非抗体タンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。これらの抗体は、例えば、放射性同位元素、検出可能な産物を生成する酵素、および蛍光タンパク質などで検出可能な程度に標識されていてもよい。これらの抗体は、さらに、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチンビオチン-アビジンの特異的結合対のメンバーなどの他の部分と結合していてもよい。これらの抗体は、ポリスチレンのプレートまたはビーズなどを含むが、これらに限定されない固体支持体に結合していてもよい。この用語には、Fab’、Fv、Fab’2および/または抗原への特異的結合を保持する他の抗体フラグメント、ならびにモノクローナル抗体も包含される。抗体は、一価または二価であってよい。抗体フラグメントには、インタクトな抗体の部分、例えば、そのインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域が含まれる。抗体フラグメントの例として、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、Fab’2フラグメントおよびFvフラグメント;ダイアボディ;直鎖状抗体ZapataetalProteinEng810:1057-10621995;一本鎖抗体分子例えば、一本鎖Fv;および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体をパパイン消化すると、Fabフラグメントと呼ばれ、それぞれが単一抗原結合部位を有する2つの同一の抗原結合フラグメント、および容易に結晶化する能力を反映して命名された残りのFcフラグメントが生じる。ペプシン処理では、2つの抗原結合部位を有し、依然として抗原をクロスリンクすることができるFab’2フラグメントが得られる。本明細書で使用する親和性という用語は、2つの薬剤の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数Kdとして表される。親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体の親和性よりも少なくとも1倍大きい、少なくとも2倍大きい、少なくとも3倍大きい、少なくとも4倍大きい、少なくとも5倍大きい、少なくとも6倍大きい、少なくとも7倍大きい、少なくとも8倍大きい、少なくとも9倍大きい、少なくとも10倍大きい、少なくとも20倍大きい、少なくとも30倍大きい、少なくとも40倍大きい、少なくとも50倍大きい、少なくとも60倍大きい、少なくとも70倍大きい、少なくとも80倍大きい、少なくとも90倍大きい、少なくとも100倍大きい、もしくは少なくとも1000倍大きい、またはそれ以上であり得る。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約100ナノモルnM~約0.1nM以上、約100nM~約1ピコモルpM以上、または約100nM~約1フェムトモルfM以上であり得る。本明細書で使用するCDRまたは相補性決定領域という用語は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる不連続な抗原結合部位を意味すると意図される。これらの特定の領域は、KabatetalJBiolChem252:6609-66161977;KabatetalUSDeptofHealthandHumanServicesSequencesofproteinsofimmunologicalinterest1991;ChothiaetalJMolBiol196:901-9171987;およびMacCallumetalJMolBiol262:732-7451996に記載されており、それらの定義には、互いに対して比較した時、アミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。以下の用語を、2つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を記載するために用いる:a参照配列、b比較ウィンドウ、c配列同一性、およびd配列同一性。a本明細書で使用する参照配列は、配列比較のベースとして用いられる定義された配列である。参照配列は、例えば、全長のcDNA配列もしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なcDNA配列もしくは遺伝子配列として、特定の配列のサブセットまたは全体であり得る。b本明細書で使用する比較ウィンドウは配列の連続した特定のセグメントを指し、その際、比較ウィンドウ内の配列は、2つの配列の最適なアラインメントのために、付加または欠失を含まない参照配列と比較して、付加または欠失すなわち、ギャップを含み得る。一般に、比較ウィンドウの長さは、少なくとも20個の連続したヌクレオチドであり、場合によって、30、40、50、100個以上であり得る。当業者なら、ポリヌクレオチド配列内のギャップの含有による参照配列との高い類似性を回避するために、通常、ギャップペナルティを導入し、一致した数から差し引くことを理解する。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で周知である。したがって、任意の2つの配列間の同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。かかる数学的アルゴリズムの非限定的な例として、MyersとMiller、CABIOS、4:111988のアルゴリズム;Smithら、AdvApplMath2:4821981の局所相同性アルゴリズム;NeedlemanとWunschJMB48:4431970の相同性アラインメントアルゴリズム;PearsonとLipmanProcNatlAcadSciUSA85:24441988の類似性探索法search-for-similarity-method;KarlinとAltschulProcNatlAcadSciUSA87:22641990のアルゴリズム、KarlinとAltschulProcNatlAcadSciUSA90:58731993の中の修正されたアルゴリズムが挙げられる。これらの数学的アルゴリズムのコンピューターによる実行が、配列の比較のために利用され、配列同一性を決定することができる。かかる実行には、PC/GeneプログラムのCLUSTALIntelligenetics社、マウンテンビュー、カリフォルニア州から入手可能、ALIGNプログラムバージョン2.0ならびにWisconsinGeneticsSoftwarePackage、バージョン8の中のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTAGeneticsComputerGroupGCG、575サイエンスドライブ、マディソン、ウィスコンシン州、米国から入手可能が含まれるが、これらに限定されない。これらのプログラムを用いるアラインメントは、デフォルトパラメータを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムは、HigginsetalGene73:2371988;HigginsetalCABIOS5:1511989;CorpetetalNuclAcidsRes16:108811988;HuangetalCABIOS8:1551992;およびPearsonetalMethMolBiol24:3071994に十分に記載されている。ALIGNプログラムは、上記のMyersとMillerのアルゴリズムに基づく。AltschuletalJMB215:4031990;NuclAcidsRes25:33891990のBLASTプログラムは、上記のKarlinとAltschulのアルゴリズムに基づく。c本明細書で使用する、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列との関連における配列同一性または同一性は、配列比較アルゴリズムまたは目視検査によって測定されるように、特定の比較ウィンドウ上で最大の一致を目的として整列させた時、同一である2つの配列中の特定の残基の割合を指す。配列同一性の割合がタンパク質に関連して用いられる時、同一ではない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なり、それらのアミノ酸残基は、類似の化学的特性例えば、電荷または疎水性を有する他のアミノ酸残基に置換され、したがって、その分子の機能的特性を変えないことが認識されている。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性は、置換の保存的性質を修正するために上向きに調整することができる。かかる保存的置換によって異なる配列は、配列類似性または類似性を有すると言われる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。通常、これは、完全なミスマッチよりむしろ部分的なミスマッチとして保存的置換をスコア化することを含み、それによって配列同一性を増加させる。したがって、例えば、同一のアミノ酸に1のスコアが与えられる場合、非保存的置換は0のスコアが与えられ、保存的置換は0と1の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、プログラムPC/GENEIntelligenetics社、マウンテンビュー、カリフォルニア州で実行されるとおりに計算される。d本明細書で使用する配列同一性とは、比較ウィンドウ上で2つの最適に整列させた配列を比較することによって決定される値を意味し、比較ウィンドウの中のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の一部は、2つの配列の最適なアラインメントについて付加または欠失を含まない参照配列と比較した場合、付加または欠失すなわち、ギャップを含み得る。割合を、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得、比較ウィンドウにおける位置の総数で一致した位置の数を割り、その結果に100を掛けることによって計算し、配列同一性を得る。本開示の態様について詳細を述べる前に、本発明は、記載する特定の実施形態に限定されるものではなく、もちろん、変化し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態のみについて記載する目的で使用され、限定的であるようには意図されないことも理解されるべきである。値の範囲が提供される場合、本文が特に明確に指示しない限り、その範囲の上限および下限の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値は、下限の単位の小数第1位まで本発明の中に含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、かつ本発明の範囲内にも包含され、その表示範囲の中の特異的に取り除かれた任意の制限に制約される。表示範囲が、それらの制限の一方または両方を含む場合、それらの含まれる制限のどちらかまたは両方を除く範囲も本発明に含まれる。特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似または同等の任意の方法および物質は、本発明を実行するまたは試験する際に使用することができるが、その好ましい方法および物質についてこれから記載する。本明細書で述べる全ての公表文献は、その引用に関連する方法および/または物質を開示し、記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形1つa、1つan、およびそのtheは、本文が特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むということに留意しなければならない。したがって、例えば、プロテインキナーゼD1ポリペプチドへの言及は、複数のそのようなポリペプチドを含み、PKD1モジュレーターへの言及は、当業者に公知の1つもしくは複数のPKD1モジュレーターおよびその同等物への言及を含む、などとなる。特許請求の範囲は、全ての任意の要素を排除するために立案され得ることもさらに留意すべきである。このように、この意見は、特許請求の範囲の要素の記述に関連して単におよび唯一のなどの排他的な用語の使用、または否定的な制限の使用のための先行詞として機能することを意図する。本明細書で論じる公表文献は、本出願の提出日より以前に開示されたもののみが提供される。本発明が先願発明を理由にこのような公表文献に先行する資格は与えられないということの承認として解釈されるべきものは、本明細書の中にはなにもない。さらに、提供される公表日は、実際の公表日とは異なる可能性があり、独立して確かめる必要があり得る。詳細な説明本開示は、神経障害を治療する方法であって、一般に、それを必要としている個体の神経細胞および/またはグリア細胞内のプロテインキナーゼD1PKD1活性レベルを調節することを含む方法を提供する。本開示は、PKD1に特異的な抗体を提供する。本開示は、PKD1活性を欠く遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。神経障害を治療する方法本開示は、神経障害を治療する方法であって、一般に、かかる治療を必要としている個体の神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1活性レベルを調節することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、個体の例えば、その個体の神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1活性レベルを調節する薬剤の有効量は、単剤療法または併用療法において、1つまたは複数の用量で投与した時、個体の神経障害を治療するのに有効な量である。いくつかの実施形態において、個体の例えば、その個体の神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1活性レベルを調節する薬剤の有効量は、単剤療法または併用療法において、1つまたは複数の用量で投与した時、個体の神経障害の有害な症状を弱めるのに有効な量である。いくつかの実施形態において、個体の例えば、その個体の神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1活性レベルを調節する薬剤の有効量は、単剤療法または併用療法において、1つまたは複数の用量で投与した時、個体の少なくとも1つの神経機能の改善をもたらすのに有効な量である。グリア細胞には、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトが含まれる。本明細書で使用するプロテインキナーゼD1ポリペプチドまたはPKD1ポリペプチドは、図11に示し、配列番号1に記載したアミノ酸配列の約750アミノ酸aa~約800aa、約800aa~約850aa、約850aa~約900aa、または約900aa~912aaの連続したストレッチと少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99、または100のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。PKD1ポリペプチドには、図11に示し、配列番号1に記載したアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子変異体が含まれる。PKD1ポリペプチドには、図11に示し、配列番号1に記載したアミノ酸配列に対して上記のアミノ酸配列同一性を有する酵素活性のある変異体が含まれる。PKD1ポリペプチドのアミノ酸配列は当技術分野で公知であり、例えば、GenBank登録番号NP_002733ヒト;GenBank登録番号XP_001170806.1チンパンジー;GenBank登録番号XP_001114639.1アカゲザル;GenBank登録番号XP_612625.4ウシ;GenBank登録番号XP_851386.1イヌ;GenBank登録番号XP_001489407.2ウマ;GenBank登録番号XP_234108.4ラット;GenBank登録番号NP_032884.2マウス;GenBank登録番号NP_001026372.1ニワトリに開示されている。PKD1ポリペプチドは、図12Aおよび図12Bに示し、配列番号2に記載したヌクレオチド配列の約2250ヌクレオチドnt~約2300nt、約2300nt~約2400nt、約2400nt~約2500nt、約2500nt~約2600nt、約2600nt~約2700nt、または約2700nt~約2739ntの連続したストレッチと少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99、または100のアミノ酸配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ得る。PKD1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当技術分野で公知であり、例えば、GenBank登録番号NM_002742ヒト;GenBank登録番号XM_001170806.1チンパンジー;GenBank登録番号XM_001114639.1アカゲザル;GenBank登録番号XM_612625.4ウシ;GenBank登録番号XM_846293.1イヌ;GenBank登録番号XM_0011489357.2ウマ;GenBank登録番号XM_001078506.1ラット;GenBank登録番号NM_008858.3マウスに開示されている。本方法を用いて治療することができる障害には、てんかん、虚血、小脳失調症;ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患;散在性静脈周囲性脳脊髄炎disseminatedperivenousencephalomyelitis、多発性硬化症、視神経脊髄炎、同心性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、後脳脊髄炎postencephalomyelitis、種痘後脳脊髄炎、急性出血性白質脳症、進行性多巣性白質脳症、特発性多発性神経炎、ジフテリアニューロパシー、ペリツェウスメルツバッハー疾患、視神経脊髄炎、びまん性硬化症、橋中心髄鞘崩壊症、海綿状変性型白質ジストロフィーspongiformleukodystrophy、および白質ジストロフィーアレクサンダー型を含む脱髄疾患;および急性脳損傷例えば、脳卒中、頭部外傷、脳性麻痺が含まれるが、これらに限定されない。活性薬剤本治療法は、それを必要としている個体に、個体の神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1活性を調節する有効量の活性薬剤を投与することを含む。適切な活性薬剤には、神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1レベルを調節する小分子、PKD1に特異的な抗体、ならびに核酸の薬剤が含まれる。いくつかの実施形態において、適切な薬剤は、その薬剤の非存在下でのPKD1活性と比較して、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約50、少なくとも約75、少なくとも約100または2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、または20倍を上回ってPKD1活性を増加させる薬剤である。いくつかの実施形態において、適切な薬剤は、その薬剤の非存在下での神経細胞またはグリア細胞内の活性のあるPKD1レベルと比較して、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約50、少なくとも約75、少なくとも約100または2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、または20倍を上回って神経細胞またはグリア細胞内の活性のあるPKD1レベルを増加させる薬剤である。いくつかの実施形態において、適切な薬剤は、その薬剤の非存在下でのPKD1ポリペプチドの活性と比較して、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約50、少なくとも約75、もしくは少なくとも約80の割合で神経細胞またはグリア細胞内のPKD1活性を阻害する薬剤である。いくつかの実施形態において、適切な薬剤は、その薬剤の非存在下での神経細胞またはグリア細胞内の活性のあるPKD1レベルと比較して、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約50、少なくとも約75、もしくは少なくとも約80の割合で神経細胞またはグリア細胞内の活性のあるPKD1レベルを減少させる薬剤である。いくつかの実施形態において、適切な薬剤は、約1nM~約5nM、約5nM~約10nM、約10nM~約25nM、約25nM~約50nM、約50nM~約75nM、約75nM~約100nM、約100nM~約250nM、約250nM~約500nM、約500nM~約1μM、または約1μM~約10μMの50阻害濃度IC50でPKD1活性を阻害する薬剤である。例えば、いくつかの実施形態において、適切なPKD1阻害剤には、約1nM~約5nM、約5nM~約10nM、約10nM~約25nM、約25nM~約50nM、約50nM~約75nM、約75nM~約100nM、約100nM~約250nM、約250nM~約500nM、約500nM~約1μM、または約1μM~約10μMのIC50でPKD1を阻害する化合物が含まれる。小分子薬剤適切な活性薬剤には、PKD1キナーゼ活性を調節する小分子薬剤が含まれる。適切な小分子薬剤には、アミノ-エチル-アミノ-アリールAEAA例えば、米国特許公開第2009/0247519号参照、イミダゾピラジン化合物例えば、米国特許公開第2009/0175852号参照、インダゾール化合物例えば、米国特許公開第2006/0004043号参照が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、小分子PKD1モジュレーターは、以下の式のアミノ-エチル-アミノ-アリールAEAA化合物である。ここで、Jは、独立してNまたはCHであり;かつ式中1R8およびR9のそれぞれは、独立して、-Hまたは環Bの置換基であるか、または、2R8およびR9は、それらが結合している原子と共に、正確に5個の環原子もしくは正確に6個の環原子を有する芳香環Cを形成し、それぞれの環原子は炭素環原子または窒素環原子であり、環Cは正確に0個、正確に1個、または正確に2個の環窒素原子を有し、環Cは環Bと縮合しており;かつ式中、1R10、R11、R12、およびR13のそれぞれは、独立して、-Hまたは環Aの置換基であるか、または2R12およびR13のそれぞれは、独立して、-Hまたは環Aの置換基であり、R10およびR11は、それらが結合している原子と共に、正確に6個の原子を有する芳香環Dを形成し、それぞれの環原子は炭素環原子であり、環Dは環Aと縮合しているか、または、3R10およびR13のそれぞれは、独立して、-Hまたは環Aの置換基であり、R11およびR12は、それらが結合している原子と共に、正確に6個の環原子を有する芳香環Eを形成し、それぞれの環原子は炭素環原子であり、環Eは環Aと縮合しているか、または、4R10およびR11のそれぞれは、独立して、-Hまたは環Aの置換基であり、R12およびR13は、それらが結合している原子と共に、正確に6個の環原子を有する芳香環Fを形成し、それぞれの環原子は炭素環原子であり、環Fは環Aと縮合しており;かつ式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、およびR7のそれぞれは、独立して、-Hまたは基Gであり;さらにR3、R4、R5、およびR6のそれぞれは、基Yであってもよく;R1、R2、およびR7のそれぞれは、基Zであってもよく;R3およびR4は、共に、基=Oを形成してもよく;R5およびR6は、共に、基=Oを形成してもよく;R14は、独立して、-Hまたは基Wである。適切な化合物は、米国特許公開第2009/0247519号の化合物XX001~XX344、ならびに化合物YY-001、YY-002、およびYY-003の中で見つけられる。例えば、適切な化合物には、例えば、以下のものが含まれる。抗体薬剤適切な活性薬剤には、PKD1に特異的に結合する抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、PKD1に特異的に結合する抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、PKD1に特異的に結合する抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、PKD1に特異的に結合する抗体は抗体フラグメント、例えば、一本鎖FvscFv抗体である。いくつかの実施形態において、PKD1に特異的に結合する抗体は、1つまたは複数の修飾を含む。本開示は、PKD1に特異的な抗体を提供する。本抗体は、本治療法で用いることができる。本抗体は、検出法、例えば、診断および疾患の監視方法でも用いることができる。本開示は、さらに、本抗体を含む医薬組成物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、抗体は、PKD1のアミノ酸203~261、アミノ酸333~410、またはアミノ酸875~918の中に含まれるPKD1エピトープ複数可を特異的に認識し、結合する。PKD1のアミノ酸203~261には、例えば、SNVSLTGLGTVRTASAEFSTSVPDEPLLSPVSPGFEQKSPSESFIGREKRSNSQSYIGR配列番号3が含まれる。PKD1のアミノ酸333~410には、例えば、NGELLSPGAESDVVMEEGSDDNDSERNSGLMDDMDEAMVQDTEMALAEGQSGGAEMQDPDADQEDSNRTISPSTSNNI配列番号4が含まれる。PKD1のアミノ酸875~918には、例えば、WEQYAGEQGLQYPAHLISLSASHSDSPEAEEREMKALSERVSIL配列番号5が含まれる。いくつかの実施形態において、PKD1エピトープは、配列:SNVSLTGLGTVRTASAEFSTSVPDEPLLSPVSPGFEQKSPSESFIGREKRSNSQSYIGR配列番号3、NGELLSPGAESDVVMEEGSDDNDSERNSGLMDDMDEAMVQDTEMALAEGQSGGAEMQDPDADQEDSNRTISPSTSNNI配列番号4、およびWEQYAGEQGLQYPAHLISLSASHSDSPEAEEREMKALSERVSIL配列番号5のうちの1つの中の3アミノ酸aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、または15aaの連続したストレッチと、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99、もしくは100のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドによって形成され得る。本抗体は、PKD1ポリペプチドへの高い親和性結合を示す。例えば、本抗体は、少なくとも約10-7M、少なくとも約10-8M、少なくとも約10-9M、少なくとも約10-10M、少なくとも約10-11M、もしくは少なくとも約10-12M、または10-12Mを超える親和性でPKD1に結合する。本抗体は、約10-7M~約10-8M、約10-8M~約10-9M、約10-9M~約10-10M、約10-10M~約10-11M、もしくは約10-11M~約10-12M、または約10-12Mを超える親和性でPKD1上に存在するエピトープに結合する。本抗体は、PKD2ポリペプチド内のアミノ酸によって形成される任意のエピトープへの結合を実質的に示さない。PKD2ポリペプチド内のアミノ酸によって形成されるエピトープへの本抗体の任意の結合は、一般に、PKD1上のエピトープへの本抗体の特異的結合よりも実質的に低い親和性の非特異的結合である。実質的に低い親和性は、一般に、少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、または1000倍低い親和性である。抗体という用語は、1つまたは複数の例えば、1つまたは2つの重鎖可変領域VHおよび/または1つまたは複数の例えば、1つまたは2つの軽鎖可変領域VL、またはエピトープに結合できるそれらのサブフラグメントを含むタンパク質を指す。VHおよびVL領域は、さらに、フレームワーク領域FRと呼ばれるより保存された領域が散在している、相補性決定領域CDRと呼ばれる超可変領域に分割することができる。FRおよびCDRの範囲は、正確に定義されているKabatetal1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterestFifthEditionUSDepartmentofHealthandHumanServicesNIHPublicationNo91-3242;Chothiaetal1987JMolBiol196:901-917参照。VHは、以下の順で、N末端からC末端に配置された3つのCDRおよび4つのFRを含み得る:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。同様に、VLは、以下の順で、N末端からC末端に配置された3つのCDRおよび4つのFRを含み得る:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体のVH鎖またはVL鎖は、さらに、重鎖定常領域もしくは軽鎖定常領域の全部または一部を含み、それによって、それぞれ、免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖を形成する。一実施形態において、この抗体は2つの重鎖および2つの軽鎖の4量体であり、この重鎖および軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互接続している。この重鎖定常領域は、3つのドメインCH1、CH2およびCH3から構成されている。この軽鎖定常領域は、1つのドメインCLから構成されている。この重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。これらの抗体の定常領域は、一般的には、免疫系の様々な細胞および補体系の第1成分を含む宿主の組織および因子への抗体の結合を媒介する。抗体という用語には、IgA型、IgG型、IgE型、IgD型、IgM型およびそれらの亜型のインタクトな免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態において、本抗体はIgGアイソタイプである。本明細書で使用する免疫グロブリンという用語は、実質的に免疫グロブリン遺伝子によってコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認められているヒト免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、αIgA1およびIgA2、γIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、δ、εおよびμの定常領域遺伝子、ならびに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長の免疫グロブリン軽鎖約25kDまたは214アミノ酸は、N末端の可変領域遺伝子約110アミノ酸およびC末端のκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされている。全長の免疫グロブリン重鎖約50kDまたは446アミノ酸は、N末端の可変領域遺伝子約116アミノ酸およびC末端にある他の前述の定常領域遺伝子の1つ、例えば、約330アミノ酸をコードするγによってコードされている。いくつかの実施形態において、本抗体は、全長の免疫グロブリン重鎖および全長の免疫グロブリン軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、全長の免疫グロブリン重鎖および全長の免疫グロブリン軽鎖を含まず、代わりに、全長の免疫グロブリン重鎖および全長の免疫グロブリン軽鎖の抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、この抗原結合フラグメントは、別々のポリペプチド鎖上に含まれている。他の実施形態において、この抗原結合フラグメントは、単一のポリペプチド鎖内に含まれている。抗原結合フラグメントという用語は、上記に記載のPKD1ポリペプチドに特異的に結合できる全長の抗体の1つまたは複数のフラグメントを指す。結合フラグメントの例として、iFabフラグメントVLドメイン、VHドメイン、CLドメインおよびCH1ドメインからなる一価のフラグメント;iiFab’2フラグメントヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメント;iiiVHドメインおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;iv抗体の単一アームのVHドメインおよびVLドメインからなるFvフラグメント;vVHドメインからなるdAbフラグメント;vi単離されたCDR;viiVHドメインおよびVLドメインが対になって、一価の分子を形成するような組換え手段を用いて、合成リンカーによって結合される抗体の単一アームのVHドメインおよびVLドメインからなる一本鎖FvscFv;viiiVHドメインおよびVLドメインが、一価の分子を形成するために対にならないように結合し、scFvの各1つのVHが、二価分子を形成するために他のscFvのVLドメインと対になる2つのscFvからなるダイアボディ;ix少なくとも2つの抗原結合領域からなり、それぞれの領域が異なるエピトープと結合している二重特異性抗体が挙げられる。いくつかの実施形態において、本抗体フラグメントはFabフラグメントである。いくつかの実施形態において、本抗体フラグメントは一本鎖抗体scFvである。いくつかの実施形態において、本抗体は、組換え抗体または改変抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、脱免疫化抗体またはインビトロ生成抗体である。本明細書で使用する組換え抗体または改変抗体という用語は、i宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを用いて発現する抗体;ii組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体;iiiヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物例えば、マウスから単離される抗体;またはivヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製されるか、発現するか、作製されるか、または単離される抗体などの組換え手段によって調製されるか、発現するか、作製されるか、または単離される全ての抗体を含むと意図される。かかる組換え抗体には、ヒト化抗体、CDR移植抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、およびインビトロ生成抗体が含まれ、任意に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の定常領域が含まれ得る。いくつかの実施形態において、本抗体は、ポリマー例えば、ポリペプチド以外のポリマーと結合例えば、共有結合している。適切なポリマーには、例えば、生体適合性ポリマー、および水溶性生体適合性ポリマーが含まれる。適切なポリマーには、合成ポリマーおよび天然に存在するポリマーが含まれる。適切なポリマーには、例えば、置換されているかもしくは置換されていない直鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンのポリマー、または置換されているかもしくは置換されていない分岐鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンのポリマー、または分枝状のもしくは非分枝状の多糖類、例えば、ホモ多糖もしくはヘテロ多糖が含まれる。適切なポリマーには、例えば、一般に、総称EVOHまたは商品名EVALとして知られるエチレンビニルアルコールコポリマー;ポリブチルメタクリレート;ポリヒドロキシバレレート;ポリL-乳酸;ポリカプロラクトン;ポリラクチド-コ-グリコリドpolylactide-co-glycolide;ポリヒドロキシブチレート;ポリヒドロキシブチレート-コ-バレレート;ポリジオキサノン;ポリオルトエステル;ポリ酸無水物;ポリグリコール酸;ポリD、L-乳酸;ポリグリコール酸-コ-トリメチレンカーボネート;ポリリン酸エステル;ポリリン酸エステルウレタン;ポリアミノ酸;シアノアクリレート;ポリトリメチレンカーボネート;ポリイミノカーボネート;コポリエーテル-エステル例えば、ポリエチレンオキシド-ポリ乳酸PEO/PLAのコポリマー;ポリアルキレンオキサレート;ポリホスファゼン;フィブリン、フィブリノーゲン、セルロース、デンプン、コラーゲンおよびヒアルロン酸などの生体分子;ポリウレタン;シリコン;ポリエステル;ポリオレフィン;ポリイソブチレンおよびエチレンαオレフィンコポリマー;アクリルポリマーおよびアクリルコポリマー;ポリ塩化ビニルなどのハロゲン化ビニルポリマーおよびハロゲン化ビニルコポリマー;ポリビニルメチルエーテルなどのポリビニルエーテル類ポリフッ化ビニリデンおよびポリ塩化ビニリデンなどのポリビニリデンハライド;ポリアクリロニトリル;ポリビニルケトン;ポリスチレンなどのポリビニル芳香族化合物;ポリビニルアセテートなどのポリビニルエステル類エチレン-メチルメタクリレートコポリマー、アクリロニトリル-スチレンコポリマー、ABS樹脂、およびエチレン-ビニルアセテートコポリマーなどの互いを有するビニルモノマーとオレフィンのコポリマー;ナイロン66およびポリカプロラクタムなどのポリアミドアルキド樹脂類;ポリカーボネート;ポリオキシメチレン;ポリイミド;ポリエーテル;エポキシ樹脂類;ポリウレタン;レーヨン;レーヨン-トリアセテート;セルロース;セルロースアセテート;セルロースブチレート;セルロースアセテートブチレートセロファン;セルロースニトレート;セルロースプロピオネート;セルロースエーテル;アモルファステフロンポリエチレングリコール;ならびにカルボキシメチルセルロースが含まれる。適切な合成ポリマーには、置換されていないおよび置換されている直鎖のポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、およびそれらの誘導体、または置換されていないおよび置換されている分枝鎖のポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、およびそれらの誘導体、例えば、メトキシポリエチレングリコールなどの置換されているポリエチレングリコール、およびそれらの誘導体が含まれる。適切な天然に存在するポリマーには、例えば、アルブミンなど、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、およびそれらの誘導体が含まれる。適切なポリマーは、500Da~50000Da、例えば、5000Da~40000Da、または25000Da~40000Daの範囲の平均分子量を有し得る。例えば、いくつかの実施形態において、本抗体が、ポリエチレングリコールPEGポリマーまたはメトキシポリエチレングリコールポリマーを含む場合、PEGポリマーまたはメトキシポリエチレングリコールポリマーは、約0.5キロダルトンkDa~約1kDa、約1kDa~約5kDa、約5kDa~約10kDa、約10kDa~約25kDa、約25kDa~約40kDa、または約40kDa~約60kDaの範囲の分子量を有し得る。上述したように、いくつかの実施形態において、本抗体は、PEGポリマーと共有結合している。いくつかの実施形態において、本scFvマルチマーは、PEGポリマーと共有結合している。例えば、Albrechtetal2006JImmunolMethods310:100を参照されたい。タンパク質のPEG化に適する方法および試薬は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第5,849,860号の中で見つけることができる。タンパク質への結合に適するPEGは、一般に、室温で水溶性であり、以下の一般式を有する。RO-CH2-CH2nO-Rここで、Rは、水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基などの保護基であり、nは、1~1000の整数である。Rが保護基である場合、一般に、Rは1~8個の炭素を有する。本抗体に結合したPEGは直鎖状であり得る。本タンパク質に結合したPEGは分枝状でもあり得る。米国特許第5,643,575号に記載されているものなどの分枝状PEG誘導体、ShearwaterPolymers社のカタログポリエチレングリコール誘導体1997-1998に記載されているものなどのstar-PEGおよびマルチアームPEG。star-PEGについては、例えば、米国特許第6,046,305号を含む当技術分野で記載されている。本抗体はグリコシル化することができ、例えば、共有結合した糖部分または多糖部分を含み得る。抗体のグリコシル化は、一般的には、N-結合型またはO-結合型のいずれかである。N-結合型は、アスパラギン残基の側鎖への糖部分の結合を指す。Xがプロリン以外の任意のアミノ酸であるトリペプチド配列のアスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-スレオニンは、アスパラギン側鎖への糖部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作られる。O-結合型グリコシル化とは、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンも使用することができるが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはスレオニンに糖のN-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの1つが結合することを指す。抗体へのグリコシル化部位の付加は、N-結合型グリコシル化部位の場合上記のトリペプチド配列の1つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変化させることによって都合よく達成される。O-結合型グリコシル化部位の場合元の抗体の配列に、1つまたは複数のセリン残基もしくはスレオニン残基を付加することによって、またはそれらと置換することによっても改変することができる。同様に、グリコシル化部位の除去は、抗体の天然のグリコシル化部位内のアミノ酸を改変することによって達成することができる。いくつかの実施形態において、本抗体は、放射線不透過性標識、例えば、簡単に、例えば、X線を用いて可視化することができる標識を含む。放射線不透過性物質は、当業者に周知である。最も一般的な放射線不透過性物質には、ヨウ化物、臭化物またはバリウム塩が含まれる。他の放射線不透過性物質も公知であり、有機ビスマス誘導体例えば、米国特許第5,939,045号参照、放射線不透過性マルチウレタン例えば、米国特許第5,346,981号参照、有機ビスマス複合材料例えば、米国特許第5,256,334号参照、および放射線不透過性バリウムマルチマー複合体例えば、米国特許第4,866,132号参照などを含むが、これらに限定されない。本抗体は、例えば、グルタルアルデヒド、ホモ二機能性クロスリンカー、またはヘテロ二機能性クロスリンカーを用いて、第2の部分例えば、脂質、本抗体以外のポリペプチド、合成ポリマー、および糖などと共有結合することができる。グルタルアルデヒドは、それらのアミノ部分を介してポリペプチドをクロスリンクする。ホモ二機能性クロスリンカー例えば、ホモ二機能性イミドエステル、ホモ二機能性N-ヒドロキシサクシニミジルNHSエステル、またはホモ二機能性スルフヒドリル反応性クロスリンカーは、2つ以上の同一の反応性部分を含んでおり、このクロスリンカーが、結合するポリペプチドの混合物を含む溶液に添加される一段階反応手順で使用することができる。ホモ二機能性NHSエステルおよびイミドエステルは、ポリペプチドを含むアミンをクロスリンクする。穏やかなアルカリ性のpHでは、イミドエステルは第一級アミンとのみ反応して、イミドアミドを形成し、クロスリンクされたポリペプチドの全体的な電荷は影響を受けない。ホモ二機能性スルフヒドリル反応性クロスリンカーには、ビスマレイミドヘキサンBMH、1,5-ジフルオロ-24-ジニトロベンゼンDFDNB、および1,4-ジ-3’,2’-ピリジルジチオプロピオアミドブタン1,4-di-3’,2’-pyridyldithiopropinoamidoButaneDPDPBが含まれる。ヘテロ二機能性クロスリンカーは、2つ以上の異なる反応性部分例えば、アミン反応性部分およびスルフヒドリル反応性部分を有し、アミン反応性部分またはスルフヒドリル反応性部分を介して、ポリペプチドの1つとクロスリンクされ、次いで、反応していない部分を介して他のポリペプチドと反応する。ピリジルジスルフィドクロスリンカーがそうであるように、複数のヘテロ二機能性ハロアセチルクロスリンカーが利用できる。カルボジイミドは、アミド結合をもたらす、アミンにカルボキシルをカップリングするためのヘテロ二機能性クロスリンク試薬の典型例である。本抗体は、固体支持体上に固定化することができる。適切な支持体は当技術分野で周知であり、とりわけ、市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび/またはシリコンのチップならびにガラスおよび/またはシリコンの表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン膜、シート、デュラサイトduracyte、反応トレイのウェル例えば、マルチウェルプレート、ならびにプラスチックチューブなどが含まれる。固体支持体は、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱を含む種々の物質のいずれかを含み得る。固体支持体上に本抗体を固定化するための適切な方法は周知であり、イオン性、疎水性、および共有結合性の相互作用などを含むが、これらに限定されない。固体支持体は、例えば、水溶液に可溶または不溶であり得る。いくつかの実施形態において、適切な固体支持体は、一般に、水溶液に不溶である。いくつかの実施形態において、本抗体は検出可能な標識を含む。適切な検出可能な標識には、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段により検出可能な任意の組成物が含まれる。適切なものには、磁気ビーズ例えば、Dynabead商標、蛍光色素例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、および黄色蛍光タンパク質など、放射性標識例えば、3H、125I、35S、14Cまたは32P、酵素例えば、酵素免疫測定法ELISAで一般的に用いられる西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、および他の酵素、ならびにコロイド金もしくは着色ガラスまたはプラスチック例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびラテックスなどのビーズなどの比色標識が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本抗体は、造影剤または放射性同位元素を含み、この造影剤または放射性同位元素は、造影、例えば、ヒトで行われる造影法で使用するのに適するものである。標識の非限定的な例として、1231Iヨウ素、18Fフッ素、99Tcテクネチウム、111Inインジウム、および67Gaガリウムなどの放射性同位元素、ならびにガドリニウムGd、ジスプロシウム、および鉄などの造影剤が挙げられる。放射性Gdアイソトープ153Gdも利用可能であり、非ヒト哺乳動物における造影法に適する。本抗体は、標準的な技術を用いて標識することができる。例えば、本抗体は、クロラミンTまたは1,3,4,6-テトラクロロ-3α,6α-ジフェニルグリコールウリルを用いてヨウ素化することができる。フッ素化では、フッ素は、フッ化物イオンの置換反応によって、合成時に本抗体に添加される。かかる放射性同位元素を用いるタンパク質の合成の概説については、Muller-GartnerHTIBTech16:122-1301998およびSajiHCritRevTherDrugCarrierSyst162209-2441999を参照されたい。本抗体は、標準的な技術を介して造影剤でも標識することができる。例えば、本抗体は、Gdジエチレントリアミン五酢酸GdDTPAまたはGdテトラアザシクロドデカンテトラ酢酸GdDOTAなどの低分子Gdキレートを本抗体に結合させることによってGdで標識することができる。CaravanetalChemRev99:2293-23521999およびLaufferetalJMagnResonImaging3:11-161985を参照されたい。本抗体は、例えば、ポリリジン-Gdキレートを本抗体に結合させることによってGdで標識することができる。例えば、CurtetetalInvestRadiol3310:752-7611998を参照されたい。あるいは、本抗体は、アビジンを有するGdキレート脂質を含む常磁性の重合リポソームおよびビオチン化抗体をインキュベートすることによってGdで標識することができる。例えば、SipkinsetalNatureMed4:623-6261998を参照されたい。本抗体に結合することができる適切な蛍光タンパク質には、例えば、米国特許第6,066,476号、同第6,020,192号、同第5,985,577号、同第5,976,796号、同第5,968,750号、同第5,968,738号、同第5,958,713号、同第5,919,445号、同第5,874,304号に記載のオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質またはその変異体もしくは誘導体;例えば、高感度GFP、例えば、クロンテック社から市販されている多くのそのようなGFP;赤色蛍光タンパク質;黄色蛍光タンパク質;ならびに、例えば、Matzetal1999NatureBiotechnol17:969-973に記載の、花虫類種由来の様々な蛍光タンパク質および着色タンパク質のいずれかなどが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本抗体を、融合パートナー、例えば、リガンド;エピトープタグ;ペプチド;および抗体以外のタンパク質などに結合例えば、共有結合または非共有結合させる。適切な融合パートナーには、インビボでの安定性の強化例えば、血清半減期の増加をもたらすペプチドおよびポリペプチド;精製の容易さをもたらすペプチドおよびポリペプチド、例えば、Hisn、例えば、6Hisなど;細胞から融合タンパク質を分泌させるペプチドおよびポリペプチド;エピトープタグを提供するペプチドおよびポリペプチド、例えば、GST、ヘマグルチニンHA;例えば、CYPYDVPDYA;配列番号6、FLAG例えば、DYKDDDDK;配列番号7、c-myc例えば、CEQKLISEEDL;配列番号8など;検出可能なシグナルを提供するペプチドおよびポリペプチド、例えば、検出可能な産物を生成する酵素例えば、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはそれ自体が検出可能であるタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など;ならびに多量体化をもたらすペプチドおよびポリペプチド、例えば、免疫グロブリンのFc部分などの多量体化ドメインが含まれる。融合には、例えば、同定または精製に有用な、固体支持体上に固定化されたものなどの結合パートナーと相互作用することができるペプチド配列を含む親和性ドメインも含まれ得る。ヒスチジンなどの連続した単一アミノ酸は、タンパク質と融合させると、ニッケルセファロースなどの樹脂カラムへの高親和性結合によって、この融合タンパク質の一段階精製のために用いることができる。親和性ドメインの例として、His5HHHHH配列番号9、His×6HHHHHH配列番号10、C-mycEQKLISEEDL配列番号11、FlagDYKDDDDK配列番号7、StrepTagWSHPQFEK配列番号12、赤血球凝集素、例えば、HAタグYPYDVPDYA;配列番号13、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGST、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、RYIRS配列番号14、Phe-His-His-Thr配列番号15、キチン結合ドメイン、S-ペプチド、T7ペプチド、SH2ドメイン、C末端RNAタグ、WEAAAREACCRECCARA配列番号16、金属結合ドメイン、例えば、亜鉛結合ドメイン、またはカルシウム結合タンパク質、例えば、カルモジュリン、トロポニンC、カルシニューリンB、ミオシン軽鎖、リカバリン、S-モジュリン、ビジニン、VILIP、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フリクエニン、カルトラクチン、カルパインの大サブユニット、S100タンパク質、パルブアルブミン、カルビンジンD9K、カルビンジンD28K、およびカルレチニン、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、MyoD、ロイシンジッパー配列、およびマルトース結合タンパク質に由来するドメインなどのカルシウム結合ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態において、本抗体を、内在性血液脳関門BBB受容体に結合するポリペプチドに融合させる。内在性BBB受容体に結合するポリペプチドに本抗体を結合すると、例えば、本抗体を、それを必要としている個体に投与することを含む本治療法以下参照において、BBBの通過を促進する。内在性BBB受容体に結合する適切なポリペプチドには、内在性BBB受容体に特異的に結合する抗体、例えば、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントが含まれる。適切な内在性BBB受容体には、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびインスリン様成長因子受容体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許公開第2009/0156498号を参照されたい。いくつかの実施形態において、本抗体はポリアミン修飾を含む。本抗体のポリアミン修飾は、修飾された抗体のBBBでの透過性を高める。本抗体は、天然に存在するかまたは合成のいずれかであるポリアミンで修飾することができる。例えば、米国特許第5,670,477号を参照されたい。有用な天然に存在するポリアミンには、プトレシン、スペルミジン、スペルミン、1,3-デアミノプロパン1,3-deaminopropane、ノルスペルミジン、合成のホモスペルミジン、テルミンthermine、テルモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、およびカナバルミンが含まれる。プトレシン、スペルミジンおよびスペルミンは、特に有用である。合成ポリアミンは、実験式CXHYNZで構成され、さらに、1~6個のNR部分またはNR2部分式中、Rは、H、C1-C4アルキル、フェニルまたはベンジルであるを含む、環式もしくは非環式の、分枝状または非分枝状の3~12個の炭素原子の炭化水素鎖であり得る。ポリアミンは、任意の標準的なクロスリンク法を用いて抗体に結合させることができる。いくつかの実施形態において、本抗体は糖部分を含むように改変され、この糖部分は本抗体に共有結合することができる。いくつかの実施形態において、本抗体は脂質部分を含むように改変され、この脂質部分は本抗体に共有結合することができる。適切な脂質部分には、例えば、N-ラウロイル、N-オレオイルなどのN-脂肪酸アシル基;ドデシルアミン、オレオイルアミンなどの脂肪族アミン;およびC3~C16の長鎖脂肪族脂質などが含まれる。例えば、米国特許第6,638,513号を参照されたい。いくつかの実施形態において、本抗体はリポソームに組み込まれている。本抗体は、実質的に純粋、例えば、少なくとも約80~85純粋、少なくとも約85~90純粋、少なくとも約90~95純粋、または98~99純粋、またはそれ以上純粋であり得、例えば、細胞残屑、本抗体以外の高分子などの混入物質はない。本開示は、本抗体を含む組成物を提供する。本抗体組成物は、本抗体に加えて、塩、例えば、NaCl、MgCl、KCl、MgSO4など;緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸HEPES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩MES、3-N-モルホリノプロパンスルホン酸MOPS、N-トリスヒドロキシメチルメチル-3-アミノプロパンスルホン酸TAPSなど可溶化剤;界面活性剤、例えば、Tween-20などの非イオン性界面活性剤;プロテアーゼ阻害剤;およびグリセロールなどのうちの1つまたは複数を含むことができる。本開示は、さらに、本抗体を含む医薬組成物を提供する。したがって、本開示は、本抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される賦形剤について、以下に記載する。核酸薬剤適切な活性薬剤には、神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1レベルを特異的に低下させる核酸薬剤が含まれる。本開示は、さらに、細胞、例えば、神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1レベルを特異的に低下させる単離した干渉核酸を提供する。干渉核酸には、低分子干渉核酸siNA、低分子干渉RNAsiRNA、二本鎖RNAdsRNA、マイクロRNAmiRNA、および低分子ヘアピン型RNAshRNAなどの低分子核酸が含まれる。本明細書で使用する低分子干渉核酸、siNA、低分子干渉RNA、siRNA、低分子干渉核酸分子、低分子干渉オリゴヌクレオチド分子および化学修飾された低分子干渉核酸分子という用語は、例えば、RNA干渉RNAiまたは遺伝子サイレンシングを配列特異的な方法で媒介することによって遺伝子発現を抑制するか、または下方制御することができる任意の核酸分子を指す。標的遺伝子を考慮したRNAi分子の設計は、当技術分野で定められた方法である。例えば、US2005/0282188これは参照により本明細書に組み込まれるおよびその中で引用されている参考文献を参照されたい。例えば、PushparajetalClinExpPharmacolPhysiol2006May-Jun;335-6:504-10;LutzelbergeretalHandbExpPharmacol2006;173:243-59;AroninetalGeneTher2006Mar;136:509-16;XieetalDrugDiscovToday2006Jan;111-2:67-73;GrunwelleretalCurrMedChem2005;1226:3143-61;およびPekaraiketalBrainResBull2005Dec15;681-2115-20Epub2005Sep9を参照されたい。所望の標的に対するsiRNAの設計法および産生法は当技術分野で公知であり、本明細書に開示される目的のために、PKD1遺伝子にそれらを適用することは、例えば、安定性、生物学的利用率の向上、および治療薬としての使用を強化するための他の性質をもたらすような修飾例えば、化学修飾を有するsiRNAの産生法と同様に、当業者に容易に明らかになるであろう。さらに、siRNAの製剤化の方法およびsiRNAの対象への送達法も当技術分野で周知である。例えば、US2005/0282188、US2005/0239731、US2005/0234232、US20050176018、US2005/0059817、US2005/0020525、US2004/0192626、US2003/0073640、US2002/0150936、US2002/0142980、およびUS2002/0120129を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。siRNAの設計を容易にする公的に利用可能なツールは、当技術分野で利用可能である。例えば、DEQOR:RNAiの設計および品質管理DesignandQualityControlofRNAiインターネットのcluster-1mpi-cbgde/Deqor/deqorhtmlで利用可能を参照されたい。HenscheletalNucleicAcidsRes2004Jul1;32ウェブサーバー発行物:W113-20も参照されたい。DEQORは、siRNAの阻害能力を評価するために、siRNA設計のための最先端のパラメータに基づいてスコアリングシステムを用いるウェブベースのプログラムである。したがって、DEQORは、i塩基対組成に基づいて、高いサイレンシング能力を示す遺伝子内の領域、ii化学合成のために高いサイレンシング能力を有するsiRNAを予測するのに役立ち得る。さらに、入力クエリから生じるそれぞれのsiRNAは、選択された生物のトランスクリプトームまたはゲノムに対するBLAST検索を実行することにより、クロスサイレンシングcross-silencing活性の可能性について評価される。したがって、DEQORは、mRNAフラグメントが細胞内で他の遺伝子と交差反応する確率を予測することができ、研究者がsiRNAまたは化学的に設計されたsiRNAの特異性を試験するための実験を設計するのに役立つ。適切なPKD1遺伝子の標的には、例えば、PKD1mRNAGenBankNM_002742のヌクレオチド1~2739の約10ヌクレオチドnt~約15nt、約15nt~約20nt、約20nt~約25nt、約25nt~約30nt、約30nt~約35nt、約35nt~約40nt、約40nt~約50nt、約50nt~約60nt、約60nt~約70nt、約70nt~約80nt、約80nt~約90nt、または約90nt~約100ntの連続したストレッチが含まれる。PKD1mRNAGenBankNM_002742のヌクレオチド1~2739を、図12Aおよび図12B配列番号2に示す。適切な標的核酸の非限定的な例には、以下のものが含まれる:15’-AAAGAGTGTTTGTTGTTATGG-3’配列番号1725’-ACGCCTGAAAGAGTGTTTGTTGTTATGGAA-3’配列番号1835’-ACGCCTGAAAGAGTGTTTGT-3’配列番号1945’-GAGTGTTTGTTGTTATGGAA-3’配列番号2055’-GAGTGTTTGTTGTTATGGAAAAACTCCATG-3’配列番号21他の適切な標的配列は、GenBank登録番号NM_002742ヒト;GenBank登録番号XM_001170806.1チンパンジー;GenBank登録番号XM_001114639.1アカゲザル;GenBank登録番号XM_612625.4ウシ;GenBank登録番号XM_846293.1イヌ;GenBank登録番号XM_0011489357.2ウマ;GenBank登録番号XM_001078506.1ラット;およびGenBank登録番号NM_008858.3マウスに提供されるヌクレオチド配列の配列アライメントの検査時に容易に明らかになるであろう。上記の配列は、標的遺伝子をコードするmRNAの標的配列であり、使用されるsiRNAオリゴヌクレオチドは、標的に相補的な配列を含むことが理解されるべきである。siNA分子は、種々な形態のいずれかであり得る。例えば、このsiNAは、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得、その際、このアンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部の中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含み、このセンス領域は、この標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。siNAは、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖である2つの別々のオリゴヌクレオチドからも構築することができ、その際、このアンチセンス鎖およびセンス鎖は自己相補的である。この実施形態において、それぞれの鎖は、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、例えば、アンチセンス鎖およびセンス鎖は二本鎖duplexすなわち二本鎖doublestrandedの構造を形成し、例えば、この二本鎖領域は、約15~約30、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個の塩基対であり、このアンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部の中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含み、このセンス鎖は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む例えば、このsiNA分子の約15~約25個以上のヌクレオチドが、標的核酸またはその一部に相補的である。もう1つの方法として、このsiNAは、このsiNAの自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域が、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカー複数可によって結合している単一オリゴヌクレオチドから構築することができる。このsiNAは、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する二本鎖の、非対称二本鎖の、ヘアピンのまたは非対称ヘアピンの二次構造を有するポリヌクレオチドであり得、その際、このアンチセンス領域は、別の標的核酸分子またはその一部の中のヌクレオチド配列と相補であるヌクレオチド配列を含み、このセンス領域は、この標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。このsiNAは、2つ以上のループ構造ならびに自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含む基部を有する環状の一本鎖ポリヌクレオチドであり得、その際、このアンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部の中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含み、このセンス領域は、この標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含み、この環状ポリヌクレオチドを、インビボまたはインビトロのいずれかで処理して、RNAiを媒介することができる活性のあるsiNA分子を生成することができる。このsiNAは、標的核酸分子またはその一部の中のヌクレオチド配列と相補であるヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドも含み得例えば、かかるsiNA分子は、このsiNA分子内に、この標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としない、この一本鎖ポリヌクレオチドは、さらに、5’-リン酸例えば、Martinezetal2002Cell110563-574およびSchwarzetal2002MolecularCell10537-568参照、または5’,3’-二リン酸などの末端リン酸基を含むことができる。特定の実施形態において、このsiNA分子は、別のセンス配列およびアンチセンス配列またはセンス領域およびアンチセンス領域を含み、このセンス領域およびアンチセンス領域は、当技術分野で公知のヌクレオチドリンカー分子または非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合しているか、またはイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および/またはスタッキング相互作用によって交互に非共有結合している。特定の実施形態において、このsiNA分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、このsiNA分子は、標的遺伝子の発現を阻害する方法で、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書で使用するsiNA分子は、RNAのみを含むそれらの分子に限定される必要はないが、さらに、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを包含する。特定の実施形態において、本発明の低分子干渉核酸分子は、ヌクレオチドを含む2’-ヒドロキシ2’-OHを欠く。siNAは、必ずしもRNAiを媒介するために、2’-ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要とせず、本発明のsiNA分子は、必要に応じて任意のリボヌクレオチド例えば、2’-OH基を有するヌクレオチドを含まない。しかし、RNAiを支持するために、siNA分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としないかかるsiNA分子は、2’-OH基を有する1つまたは複数のヌクレオチドを含む1つまたは複数の付着したリンカー、または付着もしくは結合した他の基、部分、もしくは鎖を有し得る。必要に応じて、siNA分子は、ヌクレオチド位置の約5、10、20、30、40、または50にリボヌクレオチドを含み得る。本発明の修飾された低分子干渉核酸分子は、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチドsiMONと呼ぶこともできる。本明細書で使用するsiNAという用語は、配列特異的なRNAi、例えば、低分子干渉RNAsiRNA、二本鎖RNAdsRNA、マイクロRNAmiRNA、低分子ヘアピンRNAshRNA、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾されたsiRNA、および転写後遺伝子サイレンシングRNAptgsRNAなどを媒介することができる核酸分子について記載するために用いる他の用語と同等であると意図される。さらに、本明細書で使用するRNAiという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはエピジェネティクスなどの配列特異的RNA干渉について記載するために用いる他の用語と同等であると意図される。例えば、本発明のsiNA分子は、転写後レベルまたは転写前レベルで標的遺伝子の発現を後成的に抑制するために用いることができる。非限定的な例では、本発明のsiNA分子による遺伝子発現の後成的な調節は、siNAに媒介されるクロマチン構造またはメチル化パターンの改変に起因し、遺伝子発現を変更することができる例えば、Verdeletal2004Science303672-676;Pal-Bhadraetal2004Science303669-672;Allshire2002Science2971818-1819;Volpeetal2002Science2971833-1837;Jenuwein2002Science2972215-2218;およびHalletal2002Science2972232-2237参照。本明細書に企図されるsiNA分子は、二本鎖形成オリゴヌクレオチドDFOを含み得る。例えば、WO05/019453およびUS2005/0233329を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に企図されるsiNA分子には、多機能siNAも含まれる例えば、WO05/019453およびUS2004/0249178参照。この多機能siNAは、例えば、PKD1の2つの領域を標的とする配列を含み得る。本明細書に企図されるsiNA分子は、非対称ヘアピンまたは非対称の二本鎖を含み得る。本明細書で使用する非対称ヘアピンとは、アンチセンス領域を含む直鎖siNA分子、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含み得るループ部分、およびアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域を意味し、ただし、このセンス領域は、アンチセンス領域と塩基対を形成し、ループと二本鎖を形成するのに十分相補的なヌクレオチドを有する。例えば、非対称ヘアピンsiNA分子は、細胞またはインビトロ系でRNAiを媒介するのに十分な長さ例えば、約15~約30、または約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のヌクレオチドを有するアンチセンス領域、および約4~約12例えば、約4、5、6、7、8、9、10、11、または12個のヌクレオチドを含むループ領域、ならびにこのアンチセンス領域と相補的な約3~約25例えば、約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個のヌクレオチドを有するセンス領域を含み得る。非対称ヘアピンsiNA分子は、化学修飾することができる5’-末端リン酸基も含み得る。非対称ヘアピンsiNA分子のループ部分は、本明細書に記載のヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、またはコンジュゲート分子を含み得る。本明細書で使用する非対称二本鎖とは、センス領域およびアンチセンス領域を含む2つの別々の鎖を有するsiNA分子を意味し、その際、このセンス領域は、このアンチセンス領域より少ないヌクレオチドを含み、ただし、このセンス領域は、アンチセンス領域と塩基対を形成し、二本鎖を形成するのに十分相補的なヌクレオチドを有する。例えば、本発明の非対称二本鎖siNA分子は、細胞またはインビトロ系でRNAiを媒介するのに十分な長さ例えば、約15~30、または約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のヌクレオチドを有するアンチセンス領域、およびこのアンチセンス領域と相補的な約3~約25例えば、約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個のヌクレオチドを有するセンス領域を含み得る。siRNAの安定性および/または半減期は、血清リボヌクレアーゼによってそれらの分解を防ぐことができる塩基、糖および/またはリン酸の修飾により核酸分子を化学合成することによって改善することができ、それらの効力を高めることができる例えば、Ecksteinらの国際公開WO92/07065;Perraultetal1990Nature344565;Piekenetal1991Science253314;UsmanandCedergren1992TrendsinBiochemSci17334;Usmanらの国際公開WO93/15187およびRossiらの国際公開WO91/03162;Sproatの米国特許第5,334,711号;Goldらの米国特許第6,300,074号;ならびに上記のBurginらを参照されたく、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれ、本明細書に記載の核酸分子の塩基、リン酸および/または糖の部分に行うことができる様々な化学修飾について記載している。細胞におけるそれらの効力を高める修飾、およびオリゴヌクレオチド合成時間を短縮し、化学的必要条件を減らすために核酸分子から塩基を除去することが望ましい。例えば、オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、2’-アミノ、2’-C-アリル、2’-フルオロ、2’-O-メチル、2’-O-アリル、2’-Hでの修飾、ヌクレオチド塩基修飾によって、安定性を高め、かつ/または生物活性を高めるように修飾する概説については、UsmanandCedergren1992TIBS1734;Usmanetal1994NucleicAcidsSympSer31163;Burginetal1996Biochemistry3514090を参照。核酸分子の糖修飾は、当技術分野で大規模に記載されているEcksteinら、国際公開PCTWO92/07065;PerraultetalNature1990344565-568;PiekenetalScience1991253314-317;UsmanandCedergrenTrendsinBiochemSci199217334-339;Usmanetal国際公開PCTWO93/15187Sproat米国特許第5,334,711号およびBeigelmanetal1995JBiolChem27025702;Beigelmanetal国際PCT公開WO97/26270;Beigelmanら米国特許第5,716,824号;Usmanら米国特許第5,627,053号Woolfetal国際PCT公開WO98/135261998年4月20日に出願されたThompsonらのUSSer60/082,404Karpeiskyetal1998TetrahedronLett391131;EamshawandGait1998BiopolymersNucleicAcidSciences4839-55;VermaandEckstein1998AnnuRevBiochem6799-134;およびBurlinaetal1997BioorgMedChem51999-2010を参照されたく、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。かかる教示を考慮して、細胞内でRNAiを促進するsiNAの能力を著しく阻害しない限り、本明細書に記載の同様の修飾を用いて、本明細書に開示するsiNA核酸分子を修飾することができる。活性を維持するか、または高める化学修飾を有する低分子干渉核酸siNA分子が本明細書で企図される。かかる核酸は、一般に、非修飾核酸よりもヌクレアーゼに耐性もある。したがって、インビトロ活性および/またはインビボ活性は、著しく低下すべきではない。細胞外から送達される核酸分子は、一般に、標的遺伝子産物のレベルの低下を促進するために、少なくとも標的RNAの転写および/または翻訳が起こり、コードされるmRNAおよび/またはポリペプチドの産生調節をもたらすのに十分な期間、細胞内で安定であるように選択される。RNAおよびDNA分子の産生は、合成的に行うことができ、ヌクレアーゼ安定性の増強をもたらすためのヌクレオチド修飾を導入することができる例えば、Wincottetal1995NucleicAcidsRes232677;Caruthersetal1992MethodsinEnzymology2113-19を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、本発明の核酸分子は、1つまたは複数の例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上のG-クランプヌクレオチドを含み、これは、二本鎖内の相補的グアニンのワトソン-クリック面およびフーグスティーン面Hoogsteenfaceの両方を水素結合する能力を与える修飾されたシトシン類似体であり、核酸標的に対する親和性および特異性の増強をもたらすことができる例えば、Linetal1998JAmChemSoc1208531-8532参照。別の例では、核酸分子は、2’,4’-Cメチレンビシクロヌクレオチドなどの1つまたは複数例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上のLNAロックド核酸lockednucleicacidヌクレオチドを含み得る例えば、WengelらのWO00/66604およびWO99/14226参照。siNA分子は、例えば、細胞へのsiNA分子の送達を促進するために、コンジュゲートおよび/または複合体として提供することができる。典型的なコンジュゲートおよび/または複合体には、siNA、小分子、脂質、コレステロール、リン脂質、ヌクレオシド、抗体、毒素、負に帯電したポリマー例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、糖、ポリエチレングリコール、またはポリアミンから構成されるものが含まれる。一般に、記載のトランスポーターは、分解性のリンカーの有無に関係なく、個々にまたは多成分系の一部として用いられるように設計される。これらの化合物は、血清の存在下または非存在下で、細胞内への核酸分子の送達および/または局在化を改善させることができる例えば、米国特許第5,854,038号参照。本明細書に記載の分子のコンジュゲートは、生分解性核酸リンカー分子などの生分解性であるリンカーを介して生物学的に活性な分子に結合させることができる。干渉RNAは、化学合成によって、インビトロ転写によって、またはダイサーもしくは同様の活性を有する別の適切なヌクレアーゼを用いて長い二本鎖RNAを切断することによって、細胞外で作製することができる。従来のDNA/RNA合成機を用いて、保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトから産生された化学合成干渉RNAは、アンビオン社オースティン、テキサス州、インビトロジェン社カールスバッド、カリフォルニア州、またはダーマコンDharmacon社ラファイエット、コロラド州などの商業的供給業者から入手することができる。干渉RNAを、例えば、溶媒もしく樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせによって精製する。あるいは、干渉RNAをほんの少しの精製で用い、サンプル処理による損失を避けることができる。干渉RNAは、プラスミドもしくはウイルス発現ベクター、または最小発現カセット、例えば、この干渉RNAのための1つまたは複数のプロモーターおよび1つまたは複数のテンプレートを含む、ポリメラーゼ連鎖反応PCRで作製したフラグメントから細胞内で発現させることもできる。本開示は、干渉RNAをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。干渉RNAをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに、例えば、誘導性プロモーター、神経細胞特異的プロモーター、構成的プロモーターなどに作動可能に連結することができる。shRNAのための市販のプラスミドに基づく発現ベクターの例として、pSilencerシリーズアンビオン社、オースティン、テキサス州およびpCpG-siRNAInvivoGen社、サンディエゴ、カリフォルニア州のメンバーが挙げられる。干渉RNAの発現のためのウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス例えば、ヒト免疫不全ウイルスに基づくベクター、ネコ免疫不全ウイルスに基づくベクター、およびEIAV、ならびにヘルペスウイルスを含む様々なウイルスに由来していてもよい。shRNA発現用の市販のウイルスベクターの例として、pSilencerアデノアンビオン社、オースティン、テキサス州およびpLenti6/BLOCK-iT商標-DESTインビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州が挙げられる。ウイルスベクターの選択、このベクターから干渉RNAを発現させる方法およびこのウイルスベクターを送達する方法は、当業者の通常の技能の範囲内である。PCRで作製したshRNA発現カセットの生産のためのキットの例として、SilencerExpressアンビオン社、オースティン、テキサス州およびsiXpressMirus社、マディソン、ウィスコンシン州が挙げられる。いくつかの実施形態において、干渉RNAをコードするヌクレオチド配列を、神経細胞特異的制御エレメント例えば、プロモーター、エンハンサーに作動可能に連結する。神経細胞特異的プロモーターおよび他の制御エレメント例えば、エンハンサーは、当技術分野で公知である。適切な神経細胞特異的制御配列には、神経細胞特異的エノラーゼNSEプロモーター例えば、EMBLHSENO2、X51956参照、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼAADCプロモーター、ニューロフィラメントプロモーター例えば、GenBankHUMNFL、L04147参照、シナプシンプロモーター例えば、GenBankHUMSYNIB、M55301参照、thy-1プロモーター例えば、Chenetal1987Cell51:7-19参照、セロトニン受容体プロモーター例えば、GenBankS62283参照、チロシンヒドロキシラーゼプロモーターTH例えば、NuclAcidsRes15:2363-23841987およびNeuron6:583-5941991参照、GnRHプロモーター、L7プロモーター例えば、OberdicketalScience248:223-2261990、DNMTプロモーター例えば、BartgeetalProcNatlAcadSciUSA85:3648-36521988、エンケファリンプロモーター例えば、CombetalEMBOJ17:3793-38051988、ミエリン塩基性タンパク質MBPプロモーター、およびCMVエンハンサー/血小板由来増殖因子-βプロモーター例えば、Liuetal2004GeneTherapy11:52-60が含まれるが、これらに限定されない。干渉RNAは、組織標的化送達をもたらす送達系で送達することができる。さらに、干渉核酸に適した製剤には、1つまたは複数の追加の性質:1細胞質内にsiRNAを放出することができるコアに結合する核酸、2非特異的な相互作用からの保護、および3細胞の取り込みをもたらす組織ターゲティングが含まれ得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、グリア細胞、神経細胞、または神経細胞のサブセットに特異的なペプチドリガンドを保護ポリマーの一端に結合し、その他端で核酸のためのカチオン性担体に結合することにより、グリア細胞、神経細胞、または神経細胞のサブセットを標的にするモジュラーポリマーコンジュゲートを含む。例えば、適切なポリマーコンジュゲートは、3つの機能ドメイン:標的細胞に特異的なペプチドリガンド、保護ポリマー、および核酸のためのカチオン性担体を有し得る。別の適切な製剤には、予め形成されたナノ粒子に結合させた表面コーティングが含まれる。干渉核酸の送達に適する製剤には、ポリマー、ポリマーコンジュゲート、脂質、ミセル、自己組織化コロイド、ナノ粒子、立体的に安定化されたナノ粒子、およびリガンド指向ナノ粒子が含まれる。本開示は、本干渉核酸を含む組成物を提供する。本干渉核酸組成物には、本干渉核酸に加えて、塩、例えば、NaCl、MgCl、KCl、MgSO4など;緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸HEPES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩MES、3-N-モルホリノプロパンスルホン酸MOPS、N-トリスヒドロキシメチルメチル-3-アミノプロパンスルホン酸TAPSなど可溶化剤;界面活性剤、例えば、Tween-20などの非イオン性界面活性剤など;ヌクレアーゼ阻害剤;およびグリセロールなどのうちの1つまたは複数が含まれ得る。本開示は、さらに、本干渉核酸を含む医薬組成物を提供する。したがって、本開示は、本干渉核酸および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される賦形剤については、以下に記載する。組換え発現ベクターいくつかの実施形態において、本方法は、神経細胞および/またはグリア細胞においてPKD1ポリペプチドのレベルを低下させる核酸の産生をもたらす有効量の組換え発現ベクター、例えば、PKD1を産生する神経細胞またはグリア細胞内のPKD1ポリペプチドのレベルを選択的に低下させる干渉核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを、それを必要としている個体に投与することを含む。したがって、いくつかの実施形態において、組換え発現ベクターが、細胞例えば、神経細胞またはグリア細胞内のPKD1転写物および/またはPKD1ポリペプチドを特異的に低下させる干渉RNAをコードするヌクレオチド配列を含む場合、この組換え発現ベクターを、それを必要としている個体に投与する。いくつかの実施形態において、細胞内のPKD1転写物および/またはPKD1ポリペプチドを特異的に低下させる干渉RNAをコードするヌクレオチド配列を、神経細胞またはグリア細胞内で活性のある転写制御エレメント例えば、プロモーターに作動可能に連結する。本開示は、さらに、本干渉核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター、および本組換え発現ベクターを含む医薬組成物を含む組成物を提供する。発現ベクターは、一般に、目的の遺伝子産物例えば、干渉核酸をコードする核酸配列を挿入するために、プロモーター配列の近傍に位置する便利な制限部位を有する。発現宿主で有効な選択マーカーが存在してもよい。適切な発現ベクターには、ウイルスベクター例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスに基づくウイルスベクター例えば、LietalInvestOpthalmolVisSci35:2543-25491994;BorrasetalGeneTher6:515-5241999;LiandDavidsonPNAS92:7700-77041995;SakamotoetalHGeneTher5:1088-10971999;WO94/12649;WO93/03769;WO93/19191;WO94/28938;WO95/11984およびWO95/00655参照;アデノ随伴ウイルス例えば、AlietalHumGeneTher9:81-861998FlanneryetalPNAS94:6916-69211997;BennettetalInvestOpthalmolVisSci38:2857-28631997;JomaryetalGeneTher4:683-6901997RollingetalHumGeneTher10:641-6481999;AlietalHumMolGenet5:591-5941996;SrivastavaWO93/09239SamulskietalJVir198963:3822-3828;MendelsonetalVirol1988166:154-165およびFlotteetalPNAS199390:10613-10617参照;SV40;単純ヘルペスウイルス;ヒト免疫不全ウイルス例えば、MiyoshietalPNAS94:10319-231997;TakahashietalJVirol73:7812-78161999参照;レトロウイルスベクター例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。利用する宿主/ベクター系に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む多数の適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントのいずれかを、この発現ベクターの中で用いてもよい例えば、Bitteretal1987MethodsinEnzymology153:516-544参照。適切な真核生物プロモーター真核細胞内で機能的なプロモーターの非限定的な例として、サイトメガロウイルスCMV即初期、単純ヘルペスウイルスHSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来の末端反復配列LTR、およびマウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者の通常の技能レベルの範囲内である。この発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含んでもよい。この発現ベクターは、発現を増幅するための適切な配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、干渉RNAをコードするヌクレオチド配列を、神経細胞特異的制御エレメント例えば、プロモーター、エンハンサーに作動可能に連結する。神経細胞特異的プロモーターおよび他の制御エレメント例えば、エンハンサーは、当技術分野で公知である。適切な神経細胞特異的制御配列には、神経細胞特異的エノラーゼNSEプロモーター例えば、EMBLHSENO2、X51956参照;芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼAADCプロモーター;ニューロフィラメントプロモーター例えば、GenBankHUMNFL、L04147参照シナプシンプロモーター例えば、GenBankHUMSYNIB、M55301参照、thy-1プロモーター例えば、Chenetal1987Cell51:7-19参照;セロトニン受容体プロモーター例えば、GenBankS62283参照;チロシンヒドロキシラーゼプロモーターTH例えば、NuclAcidsRes15:2363-23841987およびNeuron6:583-5941991参照GnRHプロモーター例えば、RadovicketalProcNatlAcadSciUSA88:3402-34061991参照L7プロモーター例えば、OberdicketalScience248:223-2261990参照;DNMTプロモーター例えば、BartgeetalProcNatlAcadSciUSA85:3648-36521988参照;エンケファリンプロモーター例えば、CombetalEMBOJ17:3793-38051988参照;ミエリン塩基性タンパク質MBPプロモーター;ならびにCMVエンハンサー/血小板由来増殖因子-βプロモーター例えば、Liuetal2004GeneTherapy11:52-60参照が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、組換えベクターには、1つまたは複数の選択マーカーが含まれる。さらに、多くの実施形態において、この発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択するために、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性などの表現型形質をもたらすための1つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含む。不活化アデノウイルスのみに連結されているかまたは連結されてないポリカチオン性凝縮DNApolycationiccondensedDNA、例えば、Curiel1992HumGeneTher3:147-154;リガンド連結DNA、例えば、Wu1989JBiolChem264:16985-16987参照;真核細胞送達ビヒクル細胞;光重合ヒドロゲル材料の沈着;米国特許第5,149,655号に記載の手で操作できる遺伝子導入パーティクルガン;米国特許第5,206,152号およびWO92/11033に記載の電離放射線;核電荷中和nucleicchargeneutralizationまたは細胞膜との融合を含む他の遺伝子送達のビヒクルおよび方法を用いてもよい。追加のアプローチが、Philip1994MolCellBiol14:2411-2418およびWoffendin1994ProcNatlAcadSci91:1581-1585に記載されている。裸のDNAも用いてもよい。典型的な裸のDNA導入法は、WO90/11092および米国特許第5,580,859号に記載されている。取り込み効率は、生分解性のラテックスビーズを用いて改善することができる。DNAコーティングラテックスビーズは、エンドサイトーシス開始後にビーズによって細胞内に効率的に輸送される。この方法は、疎水性を増加させるようにこれらのビーズを処理することによってさらに改善することができ、それによってエンドソームの破壊および細胞質へのDNAの放出を促進する。遺伝子送達ビヒクルとして機能することができるリポソームについては、米国特許第5,422,120号、PCTのWO95/13796、WO94/23697、およびWO91/14445、ならびにEP524968に記載されている。リポソームまたは脂質核酸送達ビヒクルも用いることができる。遺伝子送達のためのリポソーム複合体は、例えば、米国特許第7,001,614号に記載されている。例えば、2.0mM~10mMの範囲のモル比で存在し、DOTAPならびに少なくとも1つのコレステロールおよび/またはコレステロール誘導体を含むリポソームは、例えば、コレステロールに対するDOTAPのモル比が11、31である場合、効果的な送達システムを提供する。カチオン性脂質N-[2,3-ジオレオイルオキシプロピル]-L-リジンアミドLADOPは、ポリヌクレオチドを送達するための組成物中で用いることができ、LADOP含有リポソームについては、例えば、米国特許第7,067,697号に記載されている。トランスフェクションを促進することができる極性頭部基および脂肪族成分を有する両親媒性脂質を含むリポソーム製剤は、使用に適しており、例えば、米国特許第6,433,017号に記載されている。脂質コンジュゲートポリアミド化合物は、核酸を送達するために使用することができ、例えば、米国特許第7,214,384号を参照されたい。適切な合成ポリマーに基づく担体ビヒクルについては、例えば、米国特許第6,312,727号に記載されている。使用に適したさらなる非ウイルス送達には、Woffendinetal1994ProcNatlAcadSciUSA91:11581-11585に記載されているアプローチなどの機械的送達システムが含まれる。さらに、コード配列およびその発現産物は、光重合ヒドロゲル材料の沈着を介して送達することができる。コーディング配列の送達に用いることができる他の従来の遺伝子送達法には、例えば、米国特許第5,149,655号に記載の手で操作できる遺伝子導入パーティクルガンの使用;米国特許第5,206,152号およびPCTWO92/11033に記載の導入遺伝子を活性化するための電離放射線の使用が含まれる。本開示は、本組換え発現ベクターを含む組成物を提供する。本干渉核酸組成物は、本組換え発現ベクターに加えて、塩、例えば、NaCl、MgCl、KCl、MgSO4など;緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸HEPES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩MES、3-N-モルホリノプロパンスルホン酸MOPS、N-トリスヒドロキシメチルメチル-3-アミノプロパンスルホン酸TAPSなど可溶化剤;界面活性剤、例えば、Tween-20などの非イオン性界面活性剤;ヌクレアーゼ阻害剤;およびグリセロールなどのうちの1つまたは複数を含むことができる。本開示は、さらに、本組換え発現ベクターを含む医薬組成物を提供する。したがって、本開示は、本組換え発現ベクターおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される賦形剤については、以下に記載する。併用療法いくつかの実施形態において、本治療法は、細胞例えば、神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1活性レベルを調節する活性薬剤を、それを必要としている個体に投与することを含み、さらに、少なくとも1つの追加的治療薬を投与することを含む。適切な追加的治療薬には、ADを治療する薬剤が含まれ、かかる薬剤には、アリセプトドネペジル、エクセロンリバスチグミン、メトリフォネート、およびタクリンコグネックスを含むが、これらに限定されないアセチルコリンエステラーゼ阻害剤;イブプロフェンとインドメタシンを含むが、これらに限定されない非ステロイド性抗炎症剤;セレブレックスなどのシクロオキシゲナーゼ-2Cox2阻害剤;およびセレギリンエルデプリルまたはデプレニルなどのモノアミン酸化酵素阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。上記薬剤のそれぞれの投与量は、当技術分野で公知である。例えば、アリセプトは、一般に、6週間、1日あたり50mgを経口で投与され、その後、その個体が十分に耐容性を示す場合、1日あたり10mgで投与される。ADの治療に適した別の追加的治療薬は、apoE4ドメイン相互作用を低下させるapoE4構造補正剤structurecorrectorである。apoE4ドメイン相互作用を低下させる薬剤には、例えば、米国特許公開第2006/0073104号およびYeetal2005ProcNatlAcadSciUSA102:18700に記載されているような薬剤が含まれる。ADの治療に適した別の追加的治療薬は、タウ凝集を阻害する薬剤、例えば、米国特許第7,605,179号に記載のタウ凝集を阻害するナフトキノン誘導体である。別の適切な追加的治療薬は、タウのリン酸化を阻害する薬剤、例えば、米国特許第7,572,793号に記載のタウプロテインキナーゼ1を阻害する3-置換-4-ピリミドン誘導体である。適切な追加的治療薬には、ハンチントン病またはハンチントン病の症状を治療するための薬剤が含まれ、かかる薬剤には、テトラベナジン、クロナゼパム、ハロペリドール、クロザピン、フルオキセチン、セルトラリン、およびノルトリプチリンが含まれるが、これらに限定されない。適切な追加的治療薬には、パーキンソン病またはパーキンソン病の症状を治療するための薬剤が含まれ、かかる薬剤には、レボドパ;ドーパミンアゴニスト例えば、ブロモクリプチン、アポモルフィン、プラミペキソール、ロピニロール;抗コリン剤例えば、トリヘキシフェニジル、ベンズトロピン、エトプロパジン;モノアミン酸化酵素B阻害剤例えば、セレギリン、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ阻害剤例えば、エンタカポン、トルカポン;およびアマンタジンが含まれるが、これらに限定されない。適切な追加的治療薬には、多発性硬化症を治療するための薬剤が含まれ、かかる薬剤には、インターフェロン-β例えば、インターフェロン-β1a、インターフェロン-β1b;酢酸グラチラマー;癌化学療法剤例えば、ミトキサントロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、メトトレキサート、クラドリビン;コルチコステロイド例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾンが含まれるが、これらに限定されない。製剤化、投与量、および投与経路上記のように、本治療法は、一般に、神経細胞および/またはグリア細胞内のPKD1活性レベルを調節する有効量の薬剤を、それを必要としている個体に投与することを含む。製剤化、投与量、および投与経路を以下に記載する。製剤化、投与量、および投与経路の詳解の目的のために、活性薬剤という用語は、本抗体、本干渉核酸、およびPKD1活性の小分子モジュレーターの1つまたは複数を指す。本開示は、本抗体を含む医薬組成物も提供する。本開示は、本干渉核酸を含む医薬組成物も提供する。場合によっては、PKD1活性を調節する薬剤を含む組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含み得、それらの様々なものが当技術分野で公知であり、本明細書では詳細に論じる必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、AGennaro1995Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy19theditionLippincottWilliamsWilkinsを含む様々な公表文献で十分に記載されている。製剤化本方法において、活性薬剤複数可は、所望の治療効果または臨床転帰が生じることが可能な任意の便利な手段を用いて宿主に投与することができる。したがって、活性薬剤は、治療的投与のための様々な製剤に組み入れることができる。より具体的には、活性薬剤は、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体の形態で調製物に製剤化することができる。医薬剤形では、活性薬剤は、その薬学的に許容される塩の形態で投与することができるか、または活性薬剤は、単独で、もしくは他の薬学的に活性のある化合物に適切に結合させて、ならびに他の薬学的に活性のある化合物と組み合わせて使用することもできる。以下の方法および賦形剤は、単なる例示であり、決して限定するものではない。経口製剤については、活性薬剤は、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンもしくはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤;結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプンもしくはゼラチンなどの結合剤;トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンもしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤;タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤;必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤および香料で、錠剤、散剤、顆粒剤もしくはカプセルを作るために、単独で、または適切な添加剤と組み合わせて使用することができる。活性薬剤は、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸もしくはプロピレングリコールのエステル類などの水性または非水性溶媒に、必要に応じて、可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳剤、安定化剤および防腐剤などの従来の添加剤と共に、それらを溶解するか、懸濁するか、または乳化することによって、注射用に製剤化することができる。活性薬剤は、吸入によって投与すべきエアロゾル製剤で利用することができる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴射剤に製剤化することができる。さらに、活性薬剤は、乳化基剤または水溶性基剤などの様々な基剤と混合することにより坐剤にすることができる。活性薬剤は、座薬により直腸投与することができる。この坐薬は、カカオバター、カーボワックスおよびポリエチレングリコールなどのビヒクルを含むことができ、これは、体温で溶けて、さらに室温で固化される。シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤などの経口投与または直腸投与のための単位剤形が提供されてもよく、その際、それぞれの投与単位、例えば、ティースプーン1杯、テーブルスプーン1杯、錠剤または坐剤は、1つまたは複数の阻害剤を含む所定量の組成物を含む。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、生理食塩水または別の薬学的に許容される担体中の溶液として組成物中に活性薬剤を含んでもよい。本明細書で使用する単位剤形という用語は、単位投与量としてヒトおよび動物の対象に適する物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルと共同で所望の効果を生むのに十分な量で計算された所定量の活性薬剤を含有する。適切な剤形の仕様は、例えば、使用される特定の活性薬剤および達成されるべき効果、ならびに宿主内でのそれぞれの化合物に関連する薬力学によって異なる。他の投与様式も本発明で使用される。例えば、活性薬剤は、坐剤に、場合によっては、エアロゾル組成物および経鼻投与用組成物に製剤化することができる。坐剤では、ビヒクル組成物は、ポリアルキレングリコール、またはトリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を含むことができる。かかる坐剤は、約0.5~約10w/w、例えば、約1~約2の範囲で活性成分を含む混合物から形成することができる。経鼻投与用製剤は、通常、鼻粘膜に炎症も起こさず、線毛機能も著しく妨げないビヒクルを含む。水、食塩水または他の公知の物質などの希釈剤を、本発明で用いることができる。経鼻投与用製剤は、限定されないが、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤も含んでもよい。鼻粘膜による活性薬剤の吸収を促進するために、界面活性剤が存在してもよい。活性薬剤は、注射に適した組成物で投与することができる。通常、注射用組成物は、液体の溶液または懸濁液として調製され、注射前に液体ビヒクルで溶液または懸濁液にするのに適した固体形態を調製してもよい。この調製物も乳化するか、またはこの活性成分をリポソームビヒクルに封入してもよい。適切な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、このビヒクルは、湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝剤などの少量の補助物質を含んでもよい。かかる剤形を調製する実際の方法は公知であり、または当業者に明らかであろう。例えば、Remington’sPharmaceuticalSciencesMackPublishingCompanyEastonPennsylvania17thedition1985を参照されたい。投与される組成物または製剤は、いずれにしても、治療される対象において望ましい状態を達成するのに十分な薬剤の量を含む。ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、pH調整剤および緩衝剤、浸透圧調節剤、安定化剤、および湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質は、一般に容易に入手可能である。経口製剤いくつかの実施形態において、活性薬剤を、かかる薬剤を必要としている個体への経口送達のために製剤化する。いくつかの実施形態において、経口送達では、活性薬剤を含む製剤には、腸溶性コーティング物質が含まれる。適切な腸溶性コーティング物質には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネートHPMCAS、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートHPMCP、セルロースアセテートフタレートCAP、ポリビニルフタリックアセテートpolyvinylphthalicacetatePVPA、オイドラギットEudragit商標およびセラックが含まれる。適切な経口製剤の非限定的な一例として、活性薬剤を、米国特許第6,346,269号に記載の1つまたは複数の医薬品賦形剤で製剤化し、腸溶性コーティングでコーティングする。例えば、活性薬剤および安定化剤を含む溶液を、薬学的に許容される賦形剤を含むコア上にコーティングして、活性薬剤でコーティングされたコアを形成し、サブコーティング層を、活性薬剤でコーティングされたコアに塗布し、次いで、これを腸溶性コーティング層でコーティングする。このコアには、一般に、ラクトース、デンプン、マンニトール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、顔料、アルギン酸の塩、タルク、二酸化チタン、ステアリン酸、ステアリン酸塩、微結晶セルロース、グリセリン、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、プロパニルトリアセテートpropanyltriacetate、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、硫酸カルシウム、シクロデキストリン、およびヒマシ油などの薬学的に不活性な成分が含まれる。活性薬剤に適する溶媒には、水性溶媒が含まれる。適切な安定化剤には、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、リン酸塩および有機酸塩の基剤、ならびに有機アミンが含まれる。サブコーティング層には、接着剤、可塑剤、および抗粘着剤のうちの1つまたは複数が含まれる。適切な抗粘着剤には、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸塩、フマル酸ステアリルナトリウム、ベヘン酸グリセリル、カオリンおよびアエロジルが含まれる。適切な接着剤には、ポリビニルピロリドンPVP、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロースHEC、ヒドロキシプロピルセルロースHPC、ヒドロキシプロピルメチルセルロースHPMC、酢酸ビニルVA、ポリビニルアルコールPVA、メチルセルロースMC、エチルセルロースEC、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートHPMCP、セルロースアセテートフタレートCAP、キサンタンガム、アルギン酸、アルギン酸塩、オイドラギット商標、ポリビニルアセテートフタレートPVAPとメチルアクリル酸/メタクリル酸メチルとの共重合体が含まれる。適切な可塑剤には、グリセリン、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、プロパニルトリアセテートおよびヒマシ油が含まれる。適切な腸溶性コーティング物質には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネートHPMCAS、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートHPMCP、セルロースアセテートフタレートCAP、ポリビニルフタリックアセテートPVPA、オイドラギット商標およびセラックが含まれる。適切な経口製剤には、以下のもののいずれかで製剤化された活性薬剤も含まれる:微粒剤例えば、米国特許第6,458,398号参照;生分解性マクロマー例えば、米国特許第6,703,037号参照;生分解性ヒドロゲル例えば、GrahamandMcNeill1989Biomaterials5:27-36参照;生分解性の微粒子ベクター例えば、米国特許第5,736,371号参照;生体吸収性ラクトンポリマー例えば、米国特許第5,631,015号参照;徐放性タンパク質ポリマー例えば、PeliasTechnologies社の米国特許第6,699,504号参照;ポリラクチド-コ-グリコリド/ポリエチレングリコールブロック共重合体例えば、AtrixLaboratories社の米国特許第6,630,155号参照;生体適合性ポリマーおよびこのポリマー内に分散した金属カチオン安定化剤の粒子を含む組成物例えば、AlkermesControlledTherapeutics社の米国特許第6,379,701号参照;ならびにマイクロスフェア例えば、OctoplusBV社の米国特許第6,303,148号参照。適切な経口製剤には、以下のもののいずれかで製剤化された活性薬剤も含まれる:Emisphere登録商標EmisphereTechnologies社などの担体;TIMERx、キサンタンガムとローカストビーンガムを結合させ、デキストロースの存在下で、水中で強力なバインダーゲルを形成する親水性マトリックスPenwest社;Geminex商標Penwest社Procise商標グラクソスミスクライン社;SAVIT商標MistralPharma社;RingCap商標アルザ社;Smartrix登録商標SmartrixTechnologies社;SQZgel商標MacroMed社;Geomatrix商標SkyePharma社;およびOros登録商標Tri-layerアルザコーポレーションなど。米国特許第6,296,842号AlkermesControlledTherapeutics社および米国特許第6,187,330号Scios社などに記載されているものなどの製剤も使用に適する。腸内吸収を高める薬剤を含む製剤も本明細書で使用に適する。適切な腸内吸収賦活薬には、カルシウムキレート剤例えば、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸;界面活性剤例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、胆汁酸塩、パルミトイルカルニチン、および脂肪酸のナトリウム塩;ならびに毒素例えば、閉鎖帯毒素などが含まれるが、これらに限定されない。制御放出製剤いくつかの実施形態において、活性薬剤は制御放出製剤に製剤化される。本発明の範囲内の制御放出は、多くの持続放出剤形のいずれか1つを意味すると解釈することができる。以下の用語は、本発明の目的のために、制御放出と実質的に同等とみなすことができる:連続的放出、制御放出、遅延放出delayedrelease、デポー、徐放、長期放出、プログラム放出、持続放出、比例した放出、遅延放出protractedrelease、持続性の、遅らせた、遅い放出、間隔をあけた放出、持続放出sustainedrelease、タイムコート、持続放出timedrelease、遅延作用、延長された作用、レイヤードタイム作用、長時間作用型、持続性作用、反復作用、遅行性、持続作用sustainedaction、持続作用薬、および持続放出extendedrelease。これらの用語のさらなる詳解は、LesczekKrowczynskiExtended-ReleaseDosageForms1987CRCPress社に見出すことができる。様々な制御放出技術は、非常に広い範囲の薬物剤形を包含する。制御放出技術には、物理システムおよび化学システムが含まれるが、これらに限定されない。物理システムには、マイクロカプセル化、マクロカプセル化、および膜システムなどの速度制御膜を含む貯蔵システム;中空繊維、超微小孔性セルローストリアセテート、および多孔質ポリマー基質および発泡体などの速度制御膜を含まない貯蔵システム;非多孔性のポリマーマトリクスまたはエラストマーマトリクス例えば、浸食されない環境の、浸食され得る環境の薬剤移入、および分解に物理的に溶解されるそれらのシステム、ならびに非多孔性のポリマーマトリクスまたはエラストマーマトリクス例えば、浸食されない環境の、浸食され得る環境の薬剤移入、および分解に物理的に分散した物質を含む一体化したシステム;外側制御層に化学的に類似したまたは非類似の貯蔵層を含む積層構造;ならびに浸透圧ポンプ、またはイオン交換樹脂上の吸着などの他の物理的方法が含まれるが、これらに限定されない。化学システムには、ポリマーマトリックスの化学的浸食例えば、不均一な浸食、もしくは均一な浸食、またはポリマーマトリックスの生物学的浸食例えば、不均一、もしくは均一が含まれるが、これらに限定されない。制御放出システムのカテゴリーのさらなる詳解は、AgisFKydonieusControlledReleaseTechnologies:MethodsTheoryandApplications1980CRCPress社の中で見つけることができる。経口投与用に開発される多くの制御放出製剤がある。これらには、浸透圧制御型消化管送達システム;動水圧制御型消化管送達システム;微多孔膜透過制御型消化管送達デバイスを含む膜透過制御型消化管送達システム;胃液耐性腸標的化制御放出型消化管送達デバイスゲル拡散制御型消化管送達システムおよびイオン交換制御型消化管送達システムが含まれるが、これらに限定されず、これらには、カチオン性薬物およびアニオン性薬物が含まれる。制御放出型薬物送達システムに関するさらなる情報は、YieWChienNovelDrugDeliverySystems1992MarcelDekker社の中で見つけることができる。これらの製剤のいくつかについて、これからさらに詳細に論じる。腸溶性コーティングは、不快な副作用のリスクを軽減するか、または別の方法では胃の環境への暴露による分解を受けるかもしれない薬物の安定性を維持するために、胃の中での薬物の放出を防ぐための錠剤に適用される。この目的のために用いられるほとんどのポリマーは、それらの水性媒体への溶解度がpH依存的であること、かつそれらが、通常、胃の中で遭遇する時よりも高いpHを有する条件を必要とするという事実によって機能するポリ酸である。経口制御放出構造の一つの典型的なタイプは、固体または液体の剤形の腸溶性コーティングである。この腸溶性コーティングを、即時吸収用に腸液中で崩壊するように設計する。腸溶性コーティングで製剤に組み込まれる活性薬剤の吸収遅延は、消化管を通る移動速度に依存しているので、胃排出速度が重要な要因である。典型的な一実施形態において、活性薬剤は、腸溶性コーティングされた複数単位剤形に含めることができる。典型的な一実施形態において、活性薬剤を含む剤形は、活性薬剤-腸溶性コーティング剤の固体分散体の顆粒を不活性なコア物質上にスプレーコーティングすることによって調製する。これらの顆粒は、良好なバイオアベイラビリティを有する活性薬剤の持続的吸収をもたらすことができる。一般的な腸溶性コーティング剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸-メタクリル酸エステル共重合体、ポリビニルアセテートフタレート、およびセルロースアセテートフタレートが含まれるが、これらに限定されないAkihikoHasegawaApplicationofsoliddispersionsofNifedipinewithentericcoatingagenttoprepareasustained-releasedosageformChemPharmBull33:1615-16191985。様々な腸溶性コーティング物質は、溶解時間、コーティングの厚さおよび直径の破砕強度の最適な組み合わせを有するように最初から設計された腸溶性コーティング剤形を達成するための試験に基づいて選択することができるSCPorteretalThePropertiesofEntericTabletCoatingsMadeFromPolyvinylAcetate-phthalateandCelluloseacetatePhthalateJPharmPharmacol22:42p1970。有用な経口制御放出構造の別のタイプは、固体分散体である。固体分散体は、融解融合法、溶媒法、または溶融溶媒法により調製された固体状態の不活性な担体またはマトリックス中の1つまたは複数の活性成分の分散として定義することができるAkihikoHasegawaSuperSaturationMechanismofDrugsfromSolidDispersionswithEntericCoatingAgentsChemPharmBull36:4941-49501998。固体分散体は、固体状態の分散体とも呼ぶことができる。共沈物という用語を用いて、溶媒法によって得られるそれらの調製物を表すこともできる。担体の選択は、表面からの成分の溶出速度が、複数成分の混合物中の他の成分によって影響を受ける可能性があるので、分散された活性薬剤の溶解特性に影響を及ぼす可能性がある。例えば、水溶性担体が、マトリックスからの薬物の高速放出をもたらすことができるか、または難溶性または不溶性の担体が、マトリックスからの薬物のより遅い放出を引き起こすことができる。活性薬剤の溶解度を、担体とのある程度の相互作用によって増加させることもできる。固体分散体に有用な担体の例として、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。別の担体には、ホスファチジルコリンが含まれる。ホスファチジルコリンは両性であるが、水に不溶性の脂質であり、ホスファチジルコリン固体分散体における非晶質状態の特に不溶性の活性薬剤の溶解度を向上させることができる。他の担体には、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油が含まれる。難水溶性活性薬剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびカルボキシメチルエチルセルロースなどの腸溶性ポリマー、ならびに非腸溶性ポリマーのヒドロキシプロピルメチルセルロースを有する固体分散システムに含まれ得る。別の固体分散体の剤形には、異なる比率のエチルセルロースおよびステアリン酸を有する活性薬剤の組み込みが含まれる。固体分散体を調製する様々な方法が一般に知られている。これらには、溶融法、溶媒法および溶融溶媒法が含まれるが、これらに限定されない。別の制御放出剤形は、イオン交換樹脂と活性薬剤との複合体である。イオン交換樹脂-薬物複合体は、酸性および塩基性の薬物の徐放性生成物を製剤化するために用いられている。典型的な一実施形態において、ポリマーフィルムコーティングがイオン交換樹脂-薬物複合体粒子に施され、これらの粒子からの薬物放出を拡散制御されたものにする。YRaghunathanetalSustained-releaseddrugdeliverysystemI:Codedion-exchangeresinsystemsforphenylpropanolamineandotherdrugsJPharmSciences70:379-3841981を参照されたい。注射用マイクロスフェアは、別の制御放出剤形である。注射用マイクロスフェアは、非水性相分離技術、および噴霧乾燥技術によって調製することができる。マイクロスフェアは、ポリ乳酸またはコポリ乳酸/グリコール酸を用いて調製することができるShigeyukiTakadaUtilizationofanAmorphousFormofaWater-SolubleGPIIBIIIaAntagonistforControlledReleaseFromBiodegradableMicrospheresPharmRes14:1146-11501997andethylcellulosEYoshiyukiKoidaStudiesonDissolutionMechanismofDrugsfromEthylCelluloseMicrocapsulesChemPharmBull35:1538-15451987。用いることができる他の制御放出技術には、ElanPharmaceuticalTechnologies社から入手可能なSODASSpheroidalOralDrugAbsorptionSystem楕円体の経口薬物吸収システム、INDASInsolubleDrugAbsorptionSystem不溶性薬物吸収システム、IPDASIntestinalProtectiveDrugAbsorptionSystem腸管保護薬物吸収システム、MODASMultiporousOralDrugAbsorptionSystem多孔質経口薬物吸収システム、EFVASEffervescentDrugAbsorptionSystem発泡性薬物吸収システム、PRODASProgrammableOralDrugAbsorptionSystemプログラム制御できる経口薬物吸収システム、およびDUREDASDualReleaseDrugAbsorptionSystem2重放出薬物吸収システムが含まれるが、これらに限定されない。SODASは、制御放出ビーズを利用する多粒子剤形である。INDASは、難溶性薬物の溶解度を高めるように設計された薬物送達技術のファミリーである。IPDASは、高密度制御放出ビーズおよび即放性顆粒の組み合わせを利用する多粒子状錠剤構造である。MODASは、制御放出単回単位剤形である。それぞれの錠剤は、薬物の放出速度を制御する半透性の多孔膜に囲まれた内部コアからなる。EFVASは、発泡性薬物吸収システムである。PRODASは、即放性ミニ錠剤と制御放出ミニ錠剤の組み合わせを利用する多粒子製剤のファミリーである。DUREDASは、1つの剤形内に二重の放出速度をもたらす二分子層錠剤製剤である。これらの剤形は当業者に公知であるが、これらの剤形のいくつかを、これからより詳細に論じる。INDASは、難水溶性薬物の溶解度と吸収特性を向上させるために特別に開発された。溶解度は、特に、消化管液中での溶解は、難水溶性薬物の全体的な経口バイオアベイラビリティを決定する重要な因子である。溶解度を高めることによって、薬物の全体的なバイオアベイラビリティを増加させることができ、結果的に、投与量が減少する。INDASは、高エネルギーマトリックス錠剤の形態を取り、その生産は2つの別々のステップで構成される:問題の薬物は、エネルギー、賦形剤、および独特な処理手順の組み合わせを経て非晶質形態に変換される。望ましい物理的形態に変換された時点で、結果として得られる高エネルギー複合体は、再結晶化を防ぐために、新規のポリマークロスリンク技術を利用する吸収過程によって安定化させることができる。用いられる賦形剤の可溶化特性と相まって、活性薬剤の物理的状態の変化の組み合わせは、その活性薬剤の溶解度を高める。結果として生じる吸収された非晶質薬物複合体の顆粒は、実質的に滑らかで連続的な吸収を促進するためのゲル形成浸食錠剤システムgel-formingerodibletabletsystemで製剤化することができる。IPDASは、潜在的な刺激薬および潰瘍発生薬の胃腸の耐容性を高めることができる多粒子錠剤技術である。腸の保護は、消化管全体に刺激性リポ酸の分散を促進するIPDAS製剤の多粒子の性質によって促進される。個々のビーズの制御放出特性は、高濃度の薬物が局所的に放出され、かつ全身に吸収されるのを回避することができる。両方のアプローチの組み合わせは、活性薬剤の潜在的な害を最小限にする働きをし、結果的に患者のためになる。IPDASは、多数の高密度制御放出ビーズで構成される。それぞれのビーズは、活性薬剤が埋め込まれたマイクロマトリックスを最初に生産し、次に、インビボで律速半透膜を形成するポリマー溶液でこのマイクロマトリックスをコーティングする2段階プロセスにより製造することができる。IPDAS錠剤が摂取されると、胃の中にビーズを崩壊し、解放することができる。これらのビーズは、その後、摂取状態にかかわらず、例えば、制御された漸進的な方法で、十二指腸を通って消化管に沿って通過することができる。活性薬剤の放出は、マイクロマトリックスを通り、その後、速度制御半透膜の孔を通る拡散プロセスによって生じる。IPDAS錠剤からの放出速度は、最適化された臨床的利点を伴う薬物特異的な吸収プロファイルを提供するためにカスタマイズすることができる。活性の速い発現が必要ならば、即放性顆粒をその錠剤に含めてもよい。用量の減少が、個々の用量設定に必要とされる場合、実質的に薬物放出を損なうことなく、錠剤を投与前に破壊してもよい。MODASは、水溶性の薬剤の吸収を制御するために用いることができる薬物送達システムである。物理的にMODASは、インビボで形成された半透膜による律速拡散のプロセスによって薬物放出を操作する非崩壊錠剤製剤である。拡散プロセスは、本質的に、消化管液への薬物の提示速度を決定し、その結果、体内への取り込みが制御される。賦形剤の最小限の使用のため、MODASは、容易に、小用量のサイズ形態に適応させることができる。それぞれのMODAS錠剤は、活性薬物および賦形剤を含有するコアとして始まる。このコアを、不溶性ポリマーおよび可溶性賦形剤の溶液でコーティングする。錠剤が摂取された時点で、消化管液は、実質的に不溶性ポリマーを残して外側のコーティング中の可溶性賦形剤を溶解することができる。結果として生じるものは、消化管液を水溶性薬物の内部の薬物コアに結びつける小さな、狭いチャネルのネットワークである。この液は、これらのチャネルを通過して、コアに入ってその薬物を溶解し、結果として得られる薬物溶液は、制御された方法で拡散することができる。これは、制御された溶解と吸収の両方を可能にすることができる。このシステムの利点は、錠剤の薬物放出孔が、実質的に、錠剤の全面に分布していることである。これは、均一な薬物吸収を促進し、積極的な一方向の薬物送達を低下させる。内部コアと外側の半透膜の両方が、薬物の個々の送達要件を満たすように変更することができるという点で、MODASは非常に柔軟な剤形を示す。特に、賦形剤の内部コアへの添加は、より予測可能な放出速度および吸収速度を可能にする錠剤内の微小環境を作り出すのに役立ち得る。即放性の外側のコーティングを加えると、併用製品の開発を可能にすることができる。さらに、PRODASを用いて、活性薬剤を送達することができる。PRODASは、直径1.5~4mmのサイズ範囲の制御放出ミニ錠剤の生産に基づく多粒子薬物送達技術である。PRODAS技術は、多粒子法と親水性マトリックス錠剤法のハイブリッドであり、1つの剤形に、両方のこれらの薬物送達システムの利点を組み込むことができる。その最も基本的な形式では、PRODASには、活性薬剤を含む個々のミニ錠剤を生産するために、即放性顆粒の直接圧縮が含まれる。その後、これらのミニ錠剤は、最終剤形を表すハードゲルおよびカプセルに組み込まれる。この技術の使用は、制御放出製剤の生産においてより有益である。この場合、顆粒内に様々なポリマーの組み合わせを組み込むと、個々のミニ錠剤のそれぞれからの薬物の放出速度を遅らせることができる。その後、これらのミニ錠剤を、追加の遅延放出特性をもたらす制御放出ポリマー溶液でコーティングしてもよい。高水溶性薬物またはおそらく胃の刺激物である薬物の場合に、追加のコーティングが必要になる可能性があり、その製剤が消化管のより遠位の領域に到達するまで、放出を遅らせることができる。PRODAS技術の1つの価値は、製剤に対する固有の柔軟性にあり、それによって、それぞれが異なる放出速度を有するミニ錠剤の組み合わせが、1つの剤形に組み込まれる。特定の期間にわたって、制御された吸収が潜在的に可能になるのと同様に、これも、消化管中の特定の吸収部位への薬物の標的化送達を可能にすることができる。併用製品も、異なる活性成分で製剤化されたミニ錠剤を用いて可能になり得る。DUREDASは、活性薬剤に用いることができる2分子層打錠技術である。DUREDASは、2つの異なる放出速度、または1つの剤形からの薬物の2重放出を提供するように開発された。2分子層という用語は、打錠プロセスの間に起こる2つの別々の直接圧縮イベントを指す。典型的な実施形態において、即放性顆粒が最初に圧縮され、次いで、この最初の錠剤に圧縮される制御放出成分の添加が続く。これは、最終的な剤形に見られる特徴的な2分子層を生じさせることができる。制御放出特性は、親水性ポリマーの組み合わせによってもたらされ得る。特定の場合では、活性薬剤の急速な放出は、治療効果の速い発現を促進するために望ましいかもしれない。したがって、この錠剤の1層は、即放性顆粒として製剤化することができる。これとは対照的に、この錠剤の第2の層は、例えば、親水性ポリマーを使用することにより、制御された方法でこの薬物を放出することができる。この制御放出は、親水性ポリマーマトリックスを介する拡散および浸食の組み合わせに起因し得る。DUREDAS技術の更なる拡張は、制御放出組み合わせ剤形の生産である。この場合、2つの異なる活性薬剤が2分子層錠剤に組み込まれ、それぞれの層からの薬物の放出は、その組み合わせの治療効果を最大限にするように制御することができる。活性薬剤は、前述の制御放出剤形、または他の従来の剤形のいずれか1つに組み込むことができる。それぞれの用量に含まれる活性薬剤の量は、個々の患者のニーズ、および指示を満たすために調整することができる。当業者は、この開示を読むと、活性薬剤の送達およびそのバイオアベイラビリティを最適化するために、制御放出製剤中の活性薬剤のレベルならびに放出速度を調節する方法を容易に認識するだろう。吸入製剤いくつかの実施形態において、活性薬剤を、吸入経路のための薬剤送達システムによって患者に投与する。活性薬剤は、吸入による投与に適した形態に製剤化することができる。吸入の投与経路は、吸入薬が、血液脳関門をバイパスすることができるという利点を提供する。この薬剤送達システムは、気管支の粘膜内層への活性薬剤の送達による呼吸療法に適したシステムである。本発明は、容器から活性薬剤を排出するために圧縮ガスの力に頼るシステムを利用することができる。エアロゾルまたは加圧されたパッケージを、この目的のために用いることができる。本明細書で使用するエアロゾルという用語は、圧力下で噴射剤ガスによって治療の適用部位へ運ばれる非常に微細な液体粒子または固体粒子を指すその従来の意味で使用する。医薬エアロゾルを本発明で使用する場合、このエアロゾルは、流体担体および噴射剤の混合物中に溶解するか、懸濁するか、または乳化することができる活性薬剤を含む。このエアロゾルは、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、または半固形製剤の形態であり得る。本発明で用いるエアロゾルは、微細な固体粒子として、または患者の気道を通る液体ミストとしての投与を対象としている。当業者に公知の様々なタイプの噴射剤を利用することができる。適切な噴射剤には、炭化水素または他の適切なガスが含まれるが、これらに限定されない。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するための値を提供することによって決定することができる。活性薬剤は、ガス中の実質的に均一なサイズの非常に微細な液体粒子を生成する機器であるネブライザーを用いて送達するために製剤化することもできる。例えば、活性薬剤を含有する液体は、液滴として分散している。小さな液滴は、ネブライザーの排出管を通る空気の流れによって運ばれ得る。生じたミストが、患者の気道に侵入する。潤滑剤、担体、または噴射剤の有無にかかわらず、活性薬剤を含有する粉末組成物を、治療を必要とする哺乳動物に投与することができる。本発明のこの実施形態は、吸入による粉末医薬組成物を投与するための従来の装置を用いて行うことができる。例えば、この化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤は、例えば、カプセルもしくはカートリッジ、例えば、ゼラチン、またはブリスターパックの単位剤形で提示することができ、そこからこの粉末を吸入器の助けを借りて投与することができる。本発明に関連して使用することができるいくつかの異なる種類の吸入法がある。活性薬剤は、基本的に3つの異なる種類の吸入用製剤に製剤化することができる。まず、活性薬剤は、低沸点噴射剤を用いて製剤化することができる。かかる製剤は、一般に、従来の定量噴霧吸入器MDIによって投与される。しかし、米国特許第5,404,871号および同第5,542,410号内で詳解されている患者の吸気体積および流量を測定する技術を利用することにより、従来のMDIを、繰り返して投与できる能力が増すように変更することができる。あるいは、活性薬剤を、水溶液またはエタノール溶液に製剤化し、従来のネブライザーによって送達することができる。最後に、活性薬剤は、乾燥粉末製剤に製剤化することができる。かかる製剤は、この粉末のエアロゾルミストを作製した後に、この乾燥粉末製剤を単に吸入によって投与することができる。投与量使用用量は、達成すべき臨床目標によって異なるが、適切な投与量範囲は、活性薬剤の約1μg~約1,000μgまたは約10,000μgまで提供し、単回用量で投与することができる範囲である。あるいは、活性薬剤の目標投与量は、その薬剤の投与後の最初の24~48時間以内に採血された宿主血液試料において、約0.1~1000μM、約0.5~500μM、約1~100μM、または約5~50μMの範囲であると考えられ得る。当業者なら、用量レベルは、特定の化合物、対象の症状の重症度および副作用に対する感受性に応じて変えることができることを容易に理解するであろう。所定の化合物の好ましい投与量は、様々な手段によって、当業者が容易に決定することができる。投与経路活性薬剤を、インビボ法およびエキソビボ法、ならびに全身投与経路および局所投与経路を含む薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与する。従来の投与経路および薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内投与、筋肉内投与、気管内投与、頭蓋内投与、皮下投与、皮内投与、局所適用、静脈内投与、経腸投与、経鼻投与、経口投与および他の経腸投与ならびに非経口投与が含まれる。投与経路は、必要に応じて、薬剤および/または所望の効果に応じて組み合わせるか、または調整することができる。この組成物は、単回用量または複数回用量で投与することができる。いくつかの実施形態において、この組成物を経口投与する。他の実施形態において、この組成物を静脈内投与する。他の実施形態において、この組成物を、吸入経路を介して投与する。他の実施形態において、この組成物を筋肉内投与する。この薬剤は、全身経路または局所経路を含む従来の薬物の送達に適した任意の利用可能な従来の方法および経路を用いて、宿主に投与することができる。一般に、本発明によって企図される投与経路には、経腸経路、非経口経路、または吸入経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。吸入投与以外の非経口経路には、局所経路、経皮経路、皮下経路、筋肉内経路、眼窩内経路、嚢内経路、脊髄内経路、胸骨内経路、および静脈内経路、すなわち、消化管を通る経路以外の任意の投与経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。非経口投与は、薬剤の全身送達または局所送達をもたらすために行うことができる。全身送達が望まれる場合、投与には、一般的に、侵襲的または全身に吸収される医薬製剤の局所投与または粘膜投与が含まれる。この薬剤は、腸内投与によって、対象に送達することもできる。経腸投与には、経口送達および直腸例えば、坐剤を使用する送達が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。治療とは、少なくとも、宿主を苦しめている病的状態と関連する症状の改善を意味し、改善は、少なくとも、あるパラメータ、例えば、神経障害およびそれと関連し得る痛みなど、治療されている病的状態と関連する症状の大きさの低下を表すために広い意味で用いられる。このように、治療には、病的状態、または少なくともそれと関連する症状が、完全に抑制される、例えば、発生を防ぐか、または止める、例えば、終わらせる状態も含まれ、その結果、その宿主は、もはや病的状態、または少なくともその病的状態を特徴づける症状に苦しまない。様々な宿主ここで、宿主という用語は、本明細書で対象および患者という用語と互換的に用いられるは、本方法に従って治療可能である。一般に、かかる宿主は哺乳動物mammalまたは哺乳類mammalianであり、これらの用語は、肉食動物例えば、イヌおよびネコ、齧歯類例えば、マウス、モルモット、およびラット、ならびに霊長類例えば、ヒト、チンパンジー、およびサルを含む哺乳類綱の範囲内の生物を記載するために広く用いられる。多くの実施形態において、これらの宿主はヒトである。治療に適した対象本方法を用いて治療することができる対象には、神経変性障害、脱髄疾患、急性脳損傷、脊髄損傷、または神経細胞の死または機能不全を伴う他の障害または状態を有すると診断された個体が含まれる。本方法を用いる治療に適した対象には、神経変性障害または脱髄疾患の治療を受けており、その治療への応答に失敗したか、または最初は治療に応答したが、再発した個体も含まれる。PKD1が欠損している遺伝子組換え非ヒト哺乳動物本開示は、PKD1が欠損している遺伝子組換え非ヒト哺乳動物を提供する。かかる遺伝子組換え非ヒト動物は、本明細書でPKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物とも呼ばれる。本PKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物は、1神経障害におけるPKD1の役割に関して研究を実施するために;2神経障害を治療するための候補である化合物を試験するために;かつ3候補化合物を評価するためにインビトロで用いることができる単離されたPKD1ノックアウト細胞の供給源として用いることができる。いくつかの実施形態において、本PKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物はマウスである。本PKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物は、空間記憶障害を呈する。本PKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物を用いて、空間記憶を高める薬剤を同定することができる。例えば、試験薬剤を、本PKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物に投与し、もしあれば、空間記憶に対するその試験薬剤の効果を評価する。モリス水迷路試験を用いて、空間記憶に対する試験薬剤の効果を評価することができる。空間記憶を高める試験薬剤は、空間記憶障害によって特徴付けられる神経障害を治療するための候補薬剤である。PKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物は、例えば、相同組換えまたは他の挿入もしくは欠失によって、内在性PKD1遺伝子の1つまたは複数の対立遺伝子の機能が変更された哺乳動物である。特定の実施形態において、この内在性PKD1遺伝子を破壊する。破壊された遺伝子とは、PKD1をコードする遺伝コードの少なくとも一部が変更され、それによって、ノックアウト技術を介して、すなわち、所望のタンパク質に追加の遺伝子を挿入するか、または既存の配列の転写を調節する調節配列を挿入することによって、この遺伝コードのセグメントの転写および/もしくは翻訳に影響を与えること、例えば、そのコードセグメントを読めないようにすることを意味する。いくつかの実施形態において、このPKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物の細胞の全てに、破壊された遺伝子が含まれる。特定の実施形態において、このPKD1ノックアウト非ヒト哺乳動物は、内在性PKD1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が機能しない状態にされた哺乳動物である。いくつかの実施形態において、この内在性PKD1遺伝子の両方の対立遺伝子が機能しない状態である。かかる実施形態には、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックインと一般に称されるもの、およびかかる遺伝子を機能しない状態にするネイティブ内在性PKD1遺伝子の1つまたは複数のネイティブの対立遺伝子の任意の他の改変が含まれる。いくつかの実施形態において、一方または両方の内在性PKD1対立遺伝子を、中枢神経系CNSの細胞内でのみノックアウトする。例えば、神経細胞特異的プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを発現する第1の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物を、PKD1遺伝子にlox部位を含む第1の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物と同じ種の第2の遺伝子組換え非ヒト哺乳動物と交配し、その結果、この第1および第2の非ヒト哺乳動物の子孫は、CNSの細胞内にPKD1ノックアウトを有するが、CNS細胞以外の細胞内には有さない。神経細胞特異的プロモーターおよび他の制御エレメント例えば、エンハンサーは当技術分野で公知である。適切な神経細胞特異的制御配列には、神経細胞特異的エノラーゼNSEプロモーター例えば、EMBLHSEN02、X51956参照、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼAADCプロモーター、ニューロフィラメントプロモーター例えば、GenBankのHUMNFL、L04147参照、シナプシンプロモーター例えば、GenBankのHUMSYNIB、M55301参照、thy-1プロモーター例えば、Chenetal1987Cell51:7-19参照、セロトニン受容体プロモーター例えば、GenBankS62283参照、チロシンヒドロキシラーゼプロモーターTH例えば、NuclAcidsRes15:2363-23841987およびNeuron6583-5941991参照、GnRHのプロモーター例えば、RadovicketalProcNatlAcadSciUSA88:3402-34061991参照、L7プロモーター例えば、OberdicketalScience248:223-2261990参照、DNMTプロモーター例えば、BartgeetalProcNatlAcadSciUSA85:3648-36521988参照、エンケファリンプロモーター例えば、CombetalEMBOJ17:3793-38051988参照、ミエリン塩基性タンパク質MBPプロモーター、およびCMVエンハンサー/血小板由来増殖因子βプロモーター例えば、Liuetal2004GeneTherapy11:52-60参照が含まれるが、これらに限定されない。内在性PKD1対立遺伝子は、抗生物質マーカーのコード配列内に含まれるヌクレオチド配列などの欠損のあるPKD1をコードするDNAと相同組換えによって変更することができ、その後、この抗生物質マーカーは、選択目的のために使用することができる。ノックアウト哺乳動物を作製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第7,547,816号および同第7,514,592号を参照されたい。以下に、例を記載する。動物供給源トランスジェニック実験に適した動物は、標準的な商業的供給源から得ることができる。これらには、遺伝子操作手順の試験のためのマウスおよびラットなどの動物、ならびに当業者に公知の技術を用いて遺伝子工学処理されたブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、および他の動物などの大型動物が含まれる。これらの技術を、主に、マウスおよびラットの操作に基づいて以下に簡単にまとめるが、これらは、類似の技術が開発された時に、簡単に他の種に拡張することができる。マイクロインジェクションの手順胚の操作手順およびDNAのマイクロインジェクション手順は、HoganetalManipulatingthemouseembryoColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNY1986に詳細に記載されており、その教示は、本明細書に組み込まれる。マウスを用いて使用される標準的技術から適合させた方法を用いて、すなわち、妊馬血清性性腺刺激ホルモンPMSG;シグマ社を注射し、その48時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモンhCG;シグマ社を注射することによって、雌の動物を過剰排卵するように誘導する。雌を、hCG注射後すぐに雄と一緒に置く。hCGの約1日後、交尾した雌を屠殺し、摘出した卵管から胚を回収し、0.5ウシ血清アルブミンBSA;シグマ社を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水BSA;シグマ社に入れる。周囲の卵丘細胞を、ヒアルロニダーゼ1mg/mgで除去する。その後、前核期胚を洗浄し、注射の時まで、5CO2、95空気の加湿雰囲気で、37.5°Cのインキュベーター内で、0.5BSAEBSSを含むアールEarleの平衡塩類溶液中に入れる。ランダム周期の成体の雌を、ドナーの雌と同時に、偽妊娠を誘発するために精管切除した雄と交尾させる。胚移植の時に、レシピエントの雌を麻酔し、卵管を、卵管のすぐ外側の体壁を貫いて切開することによってむき出しにする。卵嚢を開き、移植すべき胚を漏斗に挿入する。移植後、切開部を縫合することによって閉じる。トランスジェニック哺乳動物またはノックアウト哺乳動物を作製するための外来DNAのES細胞への導入ES細胞の培養法ならびにその後のトランスジェニック動物の作製、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム/DNA沈殿、および直接注入などの様々な方法によるDNAのES細胞への導入については、EJRobertson編集のTeratocarcinomasandembryonicstemcellsapracticalapproachIRLPress1987に詳細に記載されており、この教示は本明細書に組み込まれる。遺伝子導入は、相同組換えにより行うことができる。導入遺伝子を含むES細胞の所望のクローンの選択を、いくつかの手段の1つを介して行う。トランスフェクションを、CurrentProtocolsinMolecularBiology:Ch9IntroductionofDNAintoMammalianCells;JohnWileySonsNewYorkNY2001の中で詳細に記載されているいくつかの方法の1つによって行う。カルシウムリン酸/DNA沈殿、直接注入、およびエレクトロポレーションは、適切な方法の例である。これらの手順では、多くの、例えば、0.5×106個のES細胞を、組織培養皿に播種し、目的の遺伝子を含む直線化した核酸コンストラクトの混合物でトランスフェクトする。G418に耐性を示す細胞のコロニーを、クローニングリングを用いて単離し、増殖させた。DNAを薬物耐性クローンから抽出し、プローブとしてこの核酸配列を用いるサザンブロッティング実験を用いて、所望の核酸配列を保有するそれらのクローンを同定する。いくつかの実験では、PCR法を用いて、目的のクローンを同定する。ES細胞に導入されたDNA分子は、Capecchi1989によって記載された相同組換えのプロセスを介して染色体に組み込むこともできる。直接注入は、高効率の組み込みをもたらす。所望のクローンを、注入したES細胞のプールから調製したDNAのPCRにより同定する。これらのプール内の陽性細胞を、細胞クローニングに続いて、PCRにより同定するZimmerandGrussNature338150-1531989。エレクトロポレーションによるDNA導入も用いることができる。組換え事象の正の選択すなわち、ネオマイシンneo耐性および2重の正負選択すなわち、neo耐性およびガンシクロビル耐性、ならびにその後のPCRによる所望のクローンの同定のための方法については、JoyneretalNature338153-1561989およびCapecchi1989に記載されており、この教示は本明細書に組み込まれる。Creリコンビナーゼの適切なエクスプレッサーと交配することによって除去するために、SauerMethods1998April;144:381-92に概説されている方法を用いて、この標的配列をloxPを導入することもできる。例として、ノックアウトコンストラクトとして用いられるDNAコンストラクトには、iPKD1遺伝子のある一部、例えば、エクソン配列、イントロン配列および/またはプロモーター配列のヌクレオチド配列、ならびにiiこのDNAコンストラクトの細胞内での存在を検出するのに用いられるマーカー配列が含まれ得る。このDNAコンストラクトを細胞に挿入し、ネイティブPKD1のDNA配列の転写を防ぐかまたは妨げるような位置において、この細胞のゲノムDNAとインテグレートさせる。かかる挿入は相同組換えによって起こすことができ、その中で、内在性PKD1のDNA配列と相同なDNAコンストラクトの領域は、このDNAコンストラクトが細胞に挿入された時に、互いにハイブリダイズし、組み換えを起こし、その結果、このDNAコンストラクトは内在性PKD1DNAの対応する位置に組み込まれる。このDNAコンストラクトの配列には、PKD1遺伝子の1つまたは複数のエクソンおよび/もしくはイントロンの完全なまたは部分的な配列、PKD1遺伝子の完全または部分的なプロモーター配列、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。動物における内在性遺伝子の発現を破壊するために用いられる時、このDNAコンストラクトは、一般に、相同領域に挿入断片を含む。この挿入断片は、例えば、選択マーカーであり得る。本明細書で使用する選択マーカーは、選択マーカーが導入された細胞に選択可能な表現型をもたらす遺伝因子を指す。選択マーカーは、一般に、その遺伝子産物が細胞増殖を阻害するか、または細胞を殺す薬剤に対する耐性をもたらす遺伝子である。例えば、AusubelらCurrentProtocolsinMolecularBiologySupplement47JohnWileySonsNewYork1999および米国特許第5,981,830号に記載されている、例えば、Neo、Hyg、hisD、GptおよびBleの遺伝子を含む様々な選択マーカーを、本発明のDNAコンストラクトに用いることができる。選択マーカーの存在について選択するのに有用な薬物には、例えば、NeoのG418、Hygのハイグロマイシン、hisDのヒスチジノール、Gptのキサンチン、およびBleのブレオマイシンが含まれる上記のAusubeletal1999、および米国特許第5,981,830号参照。本発明のDNAコンストラクトは、正の選択マーカー、負の選択マーカー、またはその両方を組み入れることができる例えば、米国特許第5,981,830号参照。胚の回収およびES細胞の注入雄と交尾させた自然周期の雌または過排卵した雌を用いて、ES細胞を注入するための胚を採取する。適切な年齢の胚を、交尾が成功した後に回収する。胚を、交配した雌の子宮角から洗い流し、ES細胞を注入するために、10ウシ血清を含むダルベッコ改変必須培地に入れる。約10~20個のES細胞を、約20メートルの内径を有するガラス製マイクロニードルを用いて胚盤胞に注入する。偽妊娠した雌への胚の移植ランダム周期の成体の雌を、精管を切除した雄とペアにする。レシピエント雌が、ES細胞を含む胚盤胞での移植に必要とされる時に交尾後2.5~3.5日マウスの場合、または大型動物の場合はもっと後となるように交配させる。胚移植の時に、これらのレシピエント雌を麻酔する。卵巣を、卵管のすぐ外側の体壁に切り込みを入れることによってむき出しにし、卵巣および子宮を外面化させる。針を用いて、子宮角に穴を作り、その針を通して、胚盤胞を移植する。移植後は、卵巣および子宮を体内に押し戻し、切開部を縫合することによって閉じる。追加の移植を行う場合は、この手順を反対側で繰り返す。トランスジェニック動物の識別試料1~2cmのマウスの尾を、若い動物から除去する。大型動物の場合には、血液または他の組織を用いることができる。相同組換え実験でキメラについて試験するために、すなわち、標的化したES細胞のこれらの動物への寄与を調べるために、大型動物では血液を用いて調べることができるが、マウスでは毛色が用いられている。DNAを調製し、サザンブロットおよびPCRの両方によって解析し、トランスジェニック樹立F0動物およびそれらの子孫F1およびF2を検出する。トランスジェニック動物が識別されると、従来の育種によって、系統を樹立する。交雑種を交配し、ホモ接合性になるまで繁殖させることによって、2重の種間交雑種を得ることができる。トランスジェニックマウスの繁殖法は、当技術分野で決められた方法である。さらなる遺伝子組換えこのPKD1ノックアウトおよびダブルノックアウトを、遺伝子組換え動物自然発生突然変異かまたは遺伝子工学処理された動物のいずれかの他の種類と交配することができる。多くのかかる動物は、文献に記載されており、JacksonLaboratories、バーハーバー、メイン州などの会社から入手できる。細胞本開示は、さらに、本PKD1ノックアウト哺乳動物から単離した細胞を提供する。本単離細胞は、内在性PKD1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子に欠陥を含み、その結果、この遺伝子は不完全であり、PKD1はこの細胞によって合成されない。以下の実施例は、本発明の作製法および使用法の完全な開示および記載を当業者に提供するために示され、発明者らが彼らの発明と見なすものの範囲を限定するものではなく、また、以下の実験が実行される全ての実験または唯一の実験であると示すためのものでもない。使用する数字例えば、量、温度などに関して正確さを確保する努力がなされたが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に示さない限り、は重量であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはそれに近いものである。標準的な略語、例えば、bp、塩基対複数可;kb、キロベース複数可;pl、ピコリットル複数可;sまたはsec、秒複数可;min、分複数可;hまたはhr、時複数可;aa、アミノ酸複数可kb、キロベース複数可;bp、塩基対複数可;nt、ヌクレオチド複数可;i.m.、筋肉内;i.p.、腹腔内;およびs.c.、皮下などを用いることができる。実施例1:プロテインキナーゼD1は、NMDARおよびmGluRと異なるシグナルを受けとり、AMPAR輸送およびサブユニット組成を調節する。実験手順皮質培養記載されるとおりBradleyetal2006、マウス胎児初代皮質神経細胞を培養し、NR1-/-神経細胞の遺伝子型を同定した。NR1-/-神経細胞を含まない実験では、野生型C57/BL6マウスCharlesRiverを用いた。El8~19胚の神経細胞を、ポリD-リシンでコーティングした12mmのガラス製カバーガラス上に0.6×106細胞/cm2の密度で播種し、B27を補充した神経細胞培養用基礎培地インビトロジェン社で維持した。実験を、インビトロDIVで8~14日間行った。神経細胞を、リン酸カルシウム法Bradleyetal2006を用いてトランスフェクトした。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR全RNAを、RNEasyキットQiagenを用いてC57/BL6マウス脳から抽出した。相補DNAcDNAを、スーパースクリプトII逆転写酵素を用いて作製した。プロテインキナーゼD1PKD1、D2PKD2、およびD3PKD3を、記載されるとおりOsteretal2006、アイソフォーム特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応PCRによって増幅した。PKDアイソフォーム特異的抗血清の作製PKD1特異的抗体PKD1特異的抗体については、PKD1の3つの領域アミノ酸203~261、333~410、および875~918をクローニングし、GST融合タンパク質として発現させた。全ての3つのタンパク質を混合し、ウサギに注射し、ポリクローナル抗体を作製した。タンパク質159aa:203-261タンパク質配列6.3kDapI=6.62SNVSLTGLGTVRTASAEFSTSVPDEPLLSPVSPGFEQKSPSESFIGREKRSNSQSYIGR配列番号3タンパク質278aa:333-410タンパク質配列8.6kDapI=3.46NGELLSPGAESDVVMEEGSDDNDSERNSGLMDDMDEAMVQDTEMALAEGQSGGAEMQDPDADQEDSNRTISPSTSNNI配列番号4タンパク質344aa:875-918タンパク質配列4.9kDapI=4.63WEQYAGEQGLQYPAHLISLSASHSDSPEAEEREMKALSERVSIL配列番号5PKD2およびPKD3に特異的な抗体PKD2およびPKD3に特異的な抗体については、PKD2およびPKD3の最初の80個のアミノ酸をクローニングし、GST融合タンパク質として発現させた。PKD2タンパク質配列8.0kDapI=6.77MAAAPSHPAGLPGSPGPGSPPPPGGLDLQSPPPLLPQIPAPGSGVSFHIQIGLTREFVLLPAASELAHVKQLACSIVDQK配列番号22PKD3タンパク質配列8.2kDapI=9.16MSANNSPPSAQKSVFPATVSAVLPAPSPCSSPKTGLSARLSNGSFSAPSLTNSRGSVHTVSFLLQIGLTRESVTIEAQEL配列番号23組換え型PKD1アミノ酸203~261、333~410、および875~918およびPKD3アミノ酸1~80を、pGEX-4T-1ベクターアマシャム社を用いて細菌内で発現させた。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ-PKD融合タンパク質を非変性緩衝液に可溶化し、グルタチオンセファロース4BGEヘルスケア社上で精製した。ウサギをこの組換えタンパク質で免疫し、YenZym抗体により抗血清をアフィニティー精製した。ウェスタンブロット神経細胞を、氷冷RIPA緩衝液1トリトンX-100、0.1SDS、50mMのTris-HCl、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10mMのNaF、およびプロテアーゼ阻害剤混合物;ロッシュ社で溶解した。サンプルを遠心分離し、上清をゲルに添加し、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜に移し、pan-PKD11:1000CellSignaling社または1:5000HJK、リン酸-S744/8PKD11:1000CellSignaling社、リン酸-S916PKD11:1000CellSignaling社、β-アクチン1:4000シグマ社または抗チューブリン1:500,000シグマ社に対する抗体で探索した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗ウサギ2次抗体または抗マウス2次抗体を全てのブロット上に用い、高感度化学発光アマシャムバイオサイエンス社によって、またはスーパーシグナルウェストフェムトSuperSignalWestFemto基質Pierce社を用いて画像化した。免疫細胞化学細胞を、10分間、4ショ糖を含む4パラホルムアルデヒドで固定し、3ウシ血清アルブミン、ヤギまたはロバの2血清、および0.1トリトン-X100を含むリン酸緩衝生理食塩水PBSでブロッキングした。表面染色については、固定する前に45分間、1次抗体を生細胞に加え、界面活性剤をブロッキングステップから取り除いた。1次抗体の濃度は以下のとおりであった:PKD11:5000、HJK、PKD21:2000、BethylLaboratories社、PKD31:5000、HJK、MAP21:400、ケミコン社、HA1:1000、CellSignaling社、GluR21:300、ミリポア社、Rab51:100、PKD1は、NMDARおよびmGluRと異なるシグナルを受け取り、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸受容体AMPARの輸送およびサブユニット組成を調節する、BDバイオサイエンス社、LAMP11:200Stressgen社、またはシンタキシン131:50、AbCam社。全ての蛍光2次抗体を、1:250で用いたインビトロジェン社。薬理学室温で、HEPES緩衝生理食塩水HBS119mMのNaCl、2.5mMのKCl、2mMのMgCl2、2mMのCaCl2、25mMのHEPES、30mMのグルコース、1μΜのテトロドトキシン、10μMのNBQX、pH7.4中で刺激を行った。高レベルのKを使用するものを除くすべての刺激では、25μMのニモジピンをHBSに含めた。神経細胞を、刺激前に30~60分間、HBS中でインキュベートした。特に示さない限り以下の用量を用いた:ホルボール12-ミリステート13-アセテートPMA、100nM;グルタミン酸10μΜグリシンを含む30μM、D,L-2-アミノ-5-ホスホノ吉草酸APV;100μM;N-メチル-D-アスパラギン酸NMDA、10μMグリシンを含む100μM;α-メチル-4-カルボキシフェニルグリシンMCPG;1mM;1S,3R-l-アミノシクロペンタン-13-ジカルボン酸ACPD;100μM;およびK55mM。フィールド刺激14DIVの時に、カバーガラス中のトランスフェクトした神経細胞を、細胞単層から約1mmの培地に懸垂させた2つの平行白金電極を有するカスタム設計したフィールド刺激装置に移した。Mg2を除去したことを除いて、神経細胞を上記に記載のとおりにHBS中で刺激した。刺激15分間、5Hz、パルス幅1msを、D330MultiStimDigitimer社を用いて与えた。画像化および分析斑点分析では、倒立落射蛍光顕微鏡ニコン、日本および冷却した電荷結合素子CCDデジタルカメラHamamatsuOrcaIIを用いて画像を取得したArrasateandFinkbeiner2005。刺激の前後に、同じフィールドのビーナス-PKD1およびmCherryの画像を取得した。以前の研究Bradleyetal2006に基づいて、斑点指数PIを計算した。MetaMorphソフトウェアMolecularDevices社を用いて、樹状突起の領域に沿ったビーナス蛍光の標準偏差SDを同じ領域に沿ったmCherry蛍光のSDで割ることによって、PIを計算した。グルタミン酸での60分間の刺激の前後の両方のPIを計算することによって、斑点形成を測定し、PI時間60/PI時間0の割合として表した。それらのmCherry強度のSDが刺激後に変化した場合、樹状突起を分析から除外した。自然の斑点形成では、縦断的解析を、以前の研究ArrasateandFinkbeiner2005から適合させた。神経細胞のフィールドを画像化の初日に位置付け、その後、ロボットの顕微鏡を用いて毎日調べた。13DIVの時に開始し、21DIVの時に終わる画像を取得した。共局在化の研究では、ZeissLSM510レーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて画像を取得した。画像を、ImageJを用いて最小限に処理した。斑点の閾値を、それぞれのチャネルの平均バックグラウンド強度の5倍に設定した。閾値化および重ね合わせた部分の定量化をMetaMorphソフトウェアで行った。コンストラクトGWl-ビーナス-PKD1を、前記の緑色蛍光タンパク質-プロテインキナーゼD1GFP-PKD1を含むクロンテックベクターから作製した。46個のアミノ酸ストレッチが、マウスPKD1のN末端にビーナスを結合させる。ビーナス-PKD1内の点変異を、部位特異的突然変異誘発キットStratageneを用いて作り出し、DNA配列決定によって確認した。CFP-TGN38について、HA-GluR1およびHA-GluR2Passafaroetal2001と同様に記載されたMcNamaraetal2004。PKD1ノックダウンPKD1shRNAを、標的PKD1配列AAAGAGTGTTTGTTGTTATGG配列番号17、続いて9bpのリンカーおよび21bpの逆配列を用いて、哺乳動物発現ベクターpSilencer20の中に低分子ヘアピンRNAとして構築した。対照m-shRNAには、4つの変異下線を有する同じ標的配列AAAGTGTGATTGTTGTTTAGG配列番24用いた。shRNAのレンチウイルスコンストラクトを作製するために、pSilencerコンストラクトのU6プロモーター配列および低分子ヘアピン配列をPCRにより増幅し、ウイルスベクターFUGW2にサブクローニングし、ウイルスパッケージングタンパク質Δ8.9およびVSVGとともに、HEK293FT細胞インビトロジェン社中で発現させた。記載のとおりにCronshawetal2002、ウイルスを収集し、力価を測定し、感染に用いた。感染後5~7日目に、神経細胞を採取し、分析した。アレイトモグラフィーYFP-HトランスジェニックマウスFengetal2000の脳組織のアレイを、記載のとおりにMichevaandSmith2007、70nmのスライスを用いて準備した。以下のとおりに、1次抗体を4°Cで一晩、アレイ上でインキュベートした:PKD11:300、HJK、PSD951:50、NeuroMabs社シナプシン1:100、ミリポア社、GluR2130、ケミコン社、Rab51100、BDバイオサイエンス社、およびGM130150、BDバイオサイエンス社。目的のチャンネルの空間的関係を調べるために、vanSteenselおよびその仲間の分析vanSteenseletal1996と似た相互相関分析を用いた。チャンネルのそれぞれのペアについて、神経網のパッチを回旋し、横方向オフセットの範囲の生の共局在化スコアSrを獲得した。異なるチャネルの平均の明るさの違いを補正するために、置き換えたしたがって、補正されていない1つのチャネルを用いてこの分析を繰り返し、ベースラインスコアStを得た。2つのチャネルの共局在化指数Ciを、Sr-St/SrSt=Ciとして合計の中の違いにより標準化することによって決定した。Ci=1は理想的共局在化を示し、Ci=0は、偶然を超える共局在化を示さず、かつCi<0は反局在を示す。この方法を用いて、異なるラベルの共局在化を、チャネルに依存しない方法で客観的に比較することができる。トランスフェリンの再利用アッセイこのアッセイは、以前の研究Parketal2004から適合させた。神経細胞を、アンタゴニストを含まないHBS中で60分間、Alexa647を結合させたトランスフェリン50μg/mL;インビトロジェン社とインキュベートし、内部移行した蛍光結合トランスフェリンの定常状態の濃度に達した。その後、共焦点顕微鏡のために、細胞外の蛍光トランスフェリンを過剰の非標識トランスフェリン5mg/ml、シグマ社で洗い流し、細胞を数回固定した。神経細胞を、mCherry画像に基づいて選択した実験者はこれらの細胞のAlexa647内容物が分からなかった。定量比較を可能にするために、mCherryチャンネルの共焦点画像を取得し、それぞれの細胞に対して同一のレーザー設定でAlexa647の画像を取得した。mCherry陽性ピクセル中のトランスフェリンの平均ピクセル強度を、ZeissLSM510ソフトウェアを用いて決定した。細胞体を分析から除外した。表面のビオチン化初代皮質神経細胞7DIVを、PKD1に対するshRNAまたは対照shRNAのいずれかをコードするレンチウイルスで感染させた。感染後5日目に、細胞を氷上に置き、氷冷リン酸緩衝生理食塩水PBS137mMのNaCl、3mMのKCl、2mMのKH2PO4、10mMのNa2HPO4で2回すすいだ。スルホ-NHS-LC-ビオチン2mg/ml、Pierce社を添加し、細胞を4°Cで穏やかに振盪しながらインキュベートした。30分後、細胞を氷冷PBSで3回すすぎ、1トリトンX-100、01SDS、およびEDTAロッシュ社を有するプロテアーゼ阻害剤混合物を含むPBSで収集した。溶解物を短時間超音波処理し、4°Cの卓上遠心機で、13,000rpmで遠心分離した。タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより測定し、溶解物を、PBS1NP-40で200μg/mlに希釈した。アビジンセファロースビーズ50μlスラリー、Pierce社を希釈溶解物500μlに添加し、4°Cで一晩インキュベートした。ビーズを氷冷PBSで3回洗浄し、ビオチン化タンパク質を、2×Laemmli緩衝液中で煮沸することによって溶出した。表面タンパク質を、抗GluR21:1000Neuromabs社、抗GluR11:200ミリポア社、抗NR11:1000UpstateBiotechnology社、または抗mGluR1/51:1000Neuromabs社を用いて、ウェスタンブロットにより分析した。総タンパク質試料あたり40μgを準備し、試料間の発現を制御するために並列ウェスタンブロットを続けた。バンドの強度を、ImageJGelAnalyzertoolAbramoffMD2004を用いて定量化した。電気生理学25°Cで、毎日新鮮なものを添加した1μΜのテトロドトキシンTTX、10μΜのガバジン、および100μMのD-APVの存在下で、HBS119mMのNaCl、2mMのKCl、1mMのMgCl2、1.5mMのCaCl2、10mMのHEPES、15mMのグルコース、pH735、235mOsm中、電圧固定モードで、AxonMulticlamp増幅器およびClampexacquisitionソフトウェアを用いて記録を行った。電極抵抗は3~6MOhmであった。細胞内記録液は、毎日新鮮なものを添加した50μΜスペルミンを含むセシウムベースの溶液120mMのCsMeSO3、6mMのNaCl、2mMのMgCl2、10mMのHEPES、0.2mMのEGTA、2mMのNa2ATP、0.3mMのGTP-Trisであった。I/V曲線については、5mMのカイニン酸のパフを用いて刺激を得、-80~40mVの保持電位中の10mVごとの増加分について一時的な記録を取得した。直列抵抗を代償し、それぞれの電位における最大電流応答を、AxoGraph解析ソフトウェアを用いて測定した。それぞれの細胞について少なくとも3つの記録を取得した。40mVでの最大電流振幅を-60mVでの最大電流振幅で割ることによって、整流指数rectificationindexを計算した。有意性を、独立t検定を用いて決定した。pHluorinGluR2の再利用アッセイsupereclipticpHluorinでタグを付けたラットのGluR2を、pGWl哺乳類発現ベクターにクローニングした。mCherryをサブクローニングし、FUGWPKD1shRNAおよび対照ベクター中の高感度緑色蛍光タンパク質EGFPと置換した。mCherryは、細胞の全体的な調子を監視するための形態マーカーとして機能した。pHluorin-GluR2およびPKD1shRNAまたは変異体対照を、リポフェクタミン2000インビトロジェン社を用いてマウス皮質神経細胞にトランスフェクトした。ニモジピンは除外したこと以外は上記のとおり、12DIVの時に、HBS中の神経細胞を、40倍の浸水レンズを有するZeissLSM510共焦点顕微鏡で画像化した。ベースラインの画像化の20分後、30μΜのグルタミン酸および10μΜグリシンを重力流でまき散らすことによって5分間細胞を洗浄し、続いて、対照HBS溶液で洗い流した。画像を5分毎に収集した。細胞体のpH-GluR2の平均ピクセル強度をMetaMorphで計算し、バックグラウンドを画像の無細胞領域で測定し、さらに計算する前に蛍光強度から差し引いた。蛍光強度のわずかな変化ΔF/F0をFt-F0/F0として計算したが、ここでFtは、時間tのpHGluR2の強度であり、F0は、グルタミン酸適用前の4つの時点での平均のpH-GluR2蛍光強度である。結果内在性PKD1はPKD2およびPKD3とは異なる神経細胞の分布を有する。神経系におけるPKDの役割を発見するために、PKDが見られる場所を最初に決定した。PKDの3つの既知のアイソフォームをコードする転写産物は、皮質、海馬、線条体、および小脳を含む成体マウスの脳で広く発現していた図1A。最も豊富なアイソフォームであるPKD1は、シナプス可塑性Bradleyetal2006:Raoetal2006およびタンパク質輸送HortonandEhlers2003:Hortonetal2005の機構研究のために十分に確立されたモデル系であるマウスの大脳皮質および海馬の初代神経培養物中で高発現していた。シナプスが形成し、成熟したときに、PKD1レベルは、インビトロDIVで2日、7日、および14日目に高く、比較的一定であった図1B。PKDが見られる細胞の種類および細胞内の場所を特定するために、皮質培養物をPKD1、PKD2、およびPKD3に対するアイソフォーム特異的ポリクローナル抗体を用いて分析した図9Aおよび図9B。神経細胞およびグリア細胞内での発現を示す全3つのアイソフォームがMAP2陽性細胞図1CおよびMAP2陰性細胞の中に存在していた。神経細胞において、PKD2およびPKD3は、主に細胞体に局在していた。PKD2の分布は、調べられる全ての神経細胞内のシス-ゴルジマーカーcis-GolgimarkerGM130の分布と密接に重なっており、一方でPKD3は、いくつかの神経細胞においてシス-ゴルジ体に局在するが、他の細胞の種類Reyetal2003a;Reyetal2003bと同様に、他の神経細胞では細胞体全体に拡散して分布していた図1C。これらのPKDアイソフォームのゴルジ体との密接な関係は、タンパク質輸送における役割と一致している。他の2つのアイソフォームとは異なり、PKD1は、拡散分布および点状分布の両方で、細胞体および樹状突起全体に存在していた図1Cおよび1D。樹状突起では、斑点が軸およびいくつかの刺で見られ図1D、挿入図、このことは、神経機能におけるPKD1の思いも寄らない役割と、PKD1がシナプス機能を制御している可能性があることを示唆する。図1A~図1D。PKD1は、マウスの脳および神経細胞に広く発現している。A海馬Hip、皮質Ctx、小脳Cbl、および線条体StrにおけるPKD1、PKD2、およびPKD3の発現を示す逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR。B初代マウスの皮質Ctxおよび海馬Hipの神経細胞培養におけるPKD1発現を示すウェスタンブロット。C神経細胞体におけるPKD1、PKD2、およびPKD3の免疫細胞化学染色。MAP2は神経細胞マーカーとして機能し、GM130はシスゴルジ装置を標識する。スケールバーは5μmである。D細胞体および樹状突起における内在性PKD1の分布を示す初代皮質神経細胞の免疫細胞化学染色。神経細胞を、形態学的マーカーとして機能するEGFPをコードするレンチウイルスで感染させた。MAP2は、特異的に神経細胞体および樹状突起を標識する。スケールバーは10μm主画像および5μm挿入図である。図9Aおよび図9B。PKD1およびPKD3に特異的なポリクローナル抗体の作製HEK細胞を、PKD1、PKD2、またはPKD3でトランスフェクトし、溶解物を用いて、抗血清の免疫反応性を試験した。AαPKD1を、マウスPKD1のアミノ酸203~261、333~410、および875~918に対してウサギで抗体産生させた。免疫前血清上および抗PKD1抗血清中央を用いて、特異性を確認するために、HEK細胞溶解物の過剰発現させたPKD1、PKD2、およびPKD3に対してブロットした。抗PKD1抗体CellSignaling社、1:2000、下は陽性対照として役立った。PKD1に対する反応性および特異性を確認した後、PKD1抗体を、ウサギ抗血清からアフィニティー精製した。BαPKD3を、マウスPKD3のアミノ酸1~80に対してウサギで抗体産生させた。免疫前血清上および抗PKD3抗血清下を用いて、特異性を確認するために、HEK細胞溶解物の過剰発現させたPKD1、PKD2、およびPKD3に対してブロットした。PKD3に対する反応性および特異性を確認した後、PKD3抗体を、ウサギ抗血清からアフィニティー精製した。PKD1の活性化はmGluRの下流である。シナプス機能におけるPKD1の潜在的役割を調べるために、PKD1が神経伝達物質であるグルタミン酸によって活性化されるのか否かが問われた。マウス皮質培養を、バスアプリケーションのグルタミン酸30μΜで刺激し、ウェスタンブロット解析のための抽出物を調製した。刺激の10分後に、PKD1が、活性化ループS744/8および自己リン酸化S916部位で急速にしかも確実にリン酸化された図2Aことは、PKD1が活性化されたことを示すMatthewsetal1999b。リン酸化は、最大60分の刺激の間持続した。これとは対照的に、K脱分極Bradleyetal2006での電位依存性Ca2チャネルの活性化または脳由来神経栄養因子BDNFでのTrkB受容体の活性化は、PKD1を活性化しなかった図10A。したがって、PKD1活性は、急速であるが、選択的にシナプス刺激によって制御される。非神経細胞では、PKD1は、一般的に、Gαq共役受容体およびプロテインキナーゼCPKCのアイソフォームによって、または細胞外のCa2流入によって活性化されるKunkeletal2007。グルタミン酸は、Gαq共役代謝型グルタミン酸受容体mGluRおよびCa2透過型N-メチル-D-アスパラギン酸受容体NMDARを活性化するので、どちらのグルタミン酸受容体サブタイプが神経細胞内のPKD1を活性化するのかを調べた。mGluRアンタゴニストMCPGはグルタミン酸誘導性PKD1リン酸化を減少させ、mGluR特異的アゴニストACPD図2B、2CおよびS-35-ジヒドロキシフェニルグリシンDHPG図10Bはリン酸化を誘導した。このN-メチル-D-アスパラギン酸受容体NMDARアンタゴニスト2-アミノ-5-ホスホノ吉草酸APVは、グルタミン酸によるPKD1のリン酸化をブロックせず、NMDA添加は自己リン酸化を刺激しなかった図2B。したがって、代謝型グルタミン酸受容体mGluRの活性化は、グルタミン酸に応答してPKD1活性化を媒介するのに必須であり、十分であるように思えるが、NMDARは重要ではない。PLC活性化は、PKD1の活性化ループをリン酸化するためにPKCを誘導するが、PKD1は、PKCまたはPLCとは無関係にトランスで自己リン酸化することもできるRybinetal2009。しかし、PLCまたはPKCの阻害が、ACPDに誘導されるPKD1リン酸化を阻止することは、mGluRが、正規のGαqシグナル伝達経路を介してPKD1を活性化することを示す図2C。図2A~図2C。PKD1キナーゼ活性は、mGluRによって誘発される。Aマウス皮質神経細胞を、示した時間の間、30μΜのグルタミン酸で刺激した。B示すとおりに神経細胞を刺激し、収集し、ウェスタンブロットによって調べたn=3。PMAを陽性対照として用いた。C左:PKD1の活性化経路。この経路の各ステップを阻害する薬物を、それらの標的の下に示す。右:薬物を示すとおりに添加した。それぞれの薬物は、ACPDに誘導されるPKD1リン酸化を阻止した。図10Aおよび図10B。BDNFまたはK脱分極ではなく、グループIのmGluRがPKD1を活性化する。Aマウス皮質神経細胞を、示した時間の間、K55mM50μΜのD-APVで脱分極させた。ホルボールエステルPMA100nM、60分を、PKD1活性化のための陽性対照として用いた。B示すとおりに神経細胞をレンチウイルスで感染させ、溶解およびウェスタンブロットによる分析の前に、グループIのmGluRアゴニストDHPG50μΜまたはBDNF100ng/mlで60分間刺激した。PKD1は、NMDARを介してCa2流入に応答して移行する。非神経細胞の刺激後のPKD1の細胞内局在が、その機能についての手がかりを提供してきた。特定の刺激が、細胞質から細胞膜Matthewsetal2000:Reyetal2004、核Rozengurtetal2005、ミトコンドリアHausseretal2005、およびトランスゴルジ綱TGNへとPKD1を移動させる。グルタミン酸に応答する神経細胞内のPKD1の移動を評価した。これらの研究を促進するために、蛍光タンパク質ビーナスをPKD1のN末端に融合させたPKD1ビーナス-PKD1をコードするプラスミドを作製した。トランスフェクトしたビーナス-PKD1は、基本条件下で神経細胞内の細胞質全体に拡散して局在していたが、グルタミン酸に応答して、樹状突起全体の別々の斑点へ移行した図3A。コトランスフェクトしたmCherry、拡散した蛍光タンパク質は、斑点形成時に、神経形態が正常で、不変のままであることを示した。樹状突起の斑点へのPKD1の移行は、細胞外フィールド電極でのより生理的なシナプス刺激によって強力に誘発された図3A。これらの斑点が生理的に関連している場合、それらは、自発的なシナプス活性によって誘発される場合があり得る。実際、PKD1は、樹状突起内の斑点を自発的かつ可逆的に形成した。PKD1の移行のメカニズムを調べた。ビーナス-PKD1のグルタミン酸誘導性移行に関与する受容体サブタイプを同定した図3B。異なる条件下での斑点形成を評価するために、画像全体のピクセル強度の標準偏差に基づく斑点指数を開発した。グルタミン酸刺激後の斑点形成は、mGluRアンタゴニストMCPGによって影響を受けず、mGluRアゴニストACPDは、PKD1活性化に必要な用量100μΜ;図2Bを十分に超える用量500μΜでさえ、移行を誘発しなかった。これとは対照的に、斑点形成は、NMDAのみによって誘導されNMDARアンタゴニストAPVによって、または細胞外Ca2の非存在によって阻止された図3B。ビーナス-PKD1斑点形成におけるNMDARの役割をさらに確認するために、機能的NMDARを欠くNR-/-胚の神経細胞Bradleyetal2006を培養した。これらの神経細胞は、刺激後に、ビーナス-PKD1の移行を示さなかった図3B。Ca2流入の供給源が重要であるか否かを確定するために、神経細胞を、電位感受性Ca2チャネルを活性化するはずのAPVの存在下で、高いK55mMで脱分極させたBradleyetal2006。斑点は形成されなかった図3B。mGluRは、グルタミン酸作動性刺激後にPKD1を活性化するが、樹状突起の斑点へのPKD1の移行は、NMDARを介するCa2流入によって媒介される。図3Aおよび図3B。PKD1はNMDARに応答して移行する。A30μΜのグルタミン酸またはフィールド刺激装置5Hzによる刺激前後のビーナス-PKD1およびmCherryの画像。スケールバーは10μmである。画像は代表的なものであるn>30個の神経細胞、>3回の実験。Bそれぞれの刺激に対して計算された樹状突起の領域の斑点指数PI。Y軸は、60分でのPIを0分での同じ尺度で割ったものである。P<005、刺激前対刺激後両側検定、対応のあるt検定。PKD1の移行はPLC活性を必要とする。NMDARがPKD1の移行を誘導するシグナル伝達経路をより理解するために実験を行った。非神経細胞において、PKD1は、プラズマおよび細胞内膜中でそのN末端のシステインリッチドメインを介して新たに生成したジアシルグリセロールDAGに結合した後に再分布するChenetal2008;Maedaetal2001;Oanceaetal2003。神経細胞におけるNMDAR依存的なPKD1の移行が、PLC依存的なDAG産生を必要とするか否かを試験するために、PLC阻害剤U73122を用いた。このU73122は、グルタミン酸誘導性斑点形成を阻止することが判明した図4A。PKCアンタゴニストGF109203XまたはGo6983がPKD1の移行を妨げなかったことは、NMDARがPKD1キナーゼ活性を誘発しないという発見と一致した。次に、PKD1の移行が、DAGへの直接結合を必要とするか否かを調べた。PKD1のC1aドメインおよびC1bドメインへのDAGの結合は、2つの単一のアミノ酸置換P155GおよびP287Gによってそれぞれ破壊されるBaronandMalhotra2002;Maedaetal2001;Matthewsetal1999a。ビーナス-PKDにおいて、P287G変異のみが、グルタミン酸誘導性斑点形成を防いだ図4B。したがって、NMDARの下流で産生されるDAGは、PKD1に結合し、その移行を誘発する。PKD1の2つの他の調節ドメインの変異、プレクストリン相同ドメインおよびPDZリガンドが移行に影響を及ぼさなかったことは、PLCへの応答の特異性を強調する。単一変異P287Gが移行を乱すことは、NMDARによって誘発されるPKD1の移行が生理反応であるという我々の結論を支持する。PKD1は斑点形成の前にC1bドメインを介して原形質膜に結合する。PKD1のC1bドメインは原形質膜との結合を媒介しMatthewsetal1999a、C1aドメインは、TGNなどの細胞内膜への結合を媒介するBaronandMalhotra2002;Maedaetal2001。したがって、斑点形成にC1bが要求されることは驚くべきことであり、中間にある別の移行ステップを示唆した。他の細胞の種類では、PKD1は、最初にPLC活性化に応答して原形質膜へ移行するMatthewsetal2000;Reyetal2001。斑点形成の前に、PKD1が膜と結合するか否かを調べた。共焦点像は、斑点形成が、2段階プロセスであることを明らかにした。刺激の10分後に、ビーナス-PKD1は、細胞体の原形質膜および多くの神経細胞の樹状突起に局在し、細胞質には比較的存在しなかった図4C。30分後に、ビーナス-PKD1が、グルタミン酸の連続したバスアプリケーションで生き残った細胞質で斑点を形成した。これとは対照的に、P287G変異体は原形質膜に移行せず図4C、斑点を形成しなかった。したがって、先の原形質膜結合は、PKD1の斑点への局在化に必要である。図4A~図4C。PKD1の移行は、PLCを必要とする2段階のプロセスである。Aビーナス-PKD1およびmCherryでトランスフェクトした神経細胞を、グルタミン酸示した薬物で刺激し、それらの斑点指数を計算した。PLC阻害剤のU73122のみが斑点形成を阻止した。PKC阻害剤のGF109203X、Go6976、およびGo6983は影響を与えなかった。B上強調した重要なアミノ酸を有するPKD1の1次構造。下は、30μΜのグルタミン酸に応答したそれぞれのコンストラクトの斑点指数を示す。P<005、刺激前対刺激後両側検定、対応のあるt検定。少なくとも2つの実験における少なくとも3つの神経細胞の樹状突起数は4を超える。C神経細胞を刺激し、固定し、共焦点顕微鏡で画像化した。ビーナス-PKD1P287Gでトランスフェクトした神経細胞は、10分後に原形質膜結合を示さないか、または60分の時点で斑点形成を示さない。スケールバーは5μmである。PKD1は、刺激後初期エンドソームおよびAMPARと共局在する。ビーナス-PKD1の斑点を特徴づけるために、PKD1が確立された役割を有するビーナス-PKD1およびTGNの共局在化を試験した。TGNマーカーTGN38CFP-TGN38のCFPタグ付きバージョンSanchez-Ruilobaetal2006;Yeamanetal2004は、グルタミン酸誘導性ビーナス-PKD1斑点とある程度の重複を示した。TGN38が、時折、他の樹状突起エンドソームに見られるのでMcNamaraetal2004、内在性エンドソームタンパク質マーカーに対する抗体を用いて、グルタミン酸誘導性共局在化を試験した。試験したマーカーのうち、ビーナス-PKD1斑点は、初期エンドソームのマーカーRab5と最高に共局在化し図5A、リサイクリングエンドソームマーカーのシンタキシン13、およびリソソームマーカーのLamp1とはあまり共局在化しなかった図5B。ビーナス-PKD1斑点の樹状突起での共局在化を、オーバーラップ法Mandersetal1992においてエンドソームマーカーを用いて定量化した。ビーナス-PKD1は、Rab5と最高のオーバーラップ係数平均433±63を有し、シンタキシン13とは最低の係数平均214±93であった。これらの共局在研究は、PKD1が樹状突起のエンドソーム経路に局在し、初期エンドソームに対してある程度の特異性を有することを示す。NMDARの下流の樹状突起エンドソームとPKD1が結合することは、PKD1が、グルタミン酸受容体の活性依存的輸送に関与することを示唆する。NMDAR活性は、再利用されるか、またはリソソームで分化されるAMPARを含むグルタミン酸受容体の内在化をもたらすLeeetal2004;Linetal2000。PKD1に結合するエンドソームがAMPARも含むか否かを調べるために、ビーナス-PKD1を、皮質で最も豊富なAMPARサブユニットであるHAタグ付きGluR2と共発現させたGeigeretal1995;Jonasetal1994。刺激がない場合、両方のタンパク質は、樹状突起全体に拡散して分布した。グルタミン酸またはフィールド刺激は、ビーナス-PKD1およびHA-GluR2を含む斑点の形成を誘導した図5C。試験した分子のうち、ビーナス-PKD1が最も強くHA-GluR2と共局在化した図5D、E。これらの結果は、GluR2がカーゴであり、その輸送はPKD1によって調節されるという興味深い可能性を提起する。しかし、これらの初期の知見は、内在せず、ネイティブAMPARのように動作することができないAMPARの形成につながり得る初代培養内での過剰発現によって得られたものであるShietal2001。インビボでPKD1局在を調べるために、アレイトモグラフィーMichevaandSmith2007を用いて、高解像度の免疫蛍光画像を取得した。皮層5の錐体細胞内でYFPを発現しているトランスジェニックマウスの48~70nmの連続切片のアレイを用いた。したがって、YFPは、PKD1の細胞内局在性を評価するための形態マーカーとして機能した。PKD1は、成体マウス皮質の層4および層5の神経細胞全体に斑点状の形で分布していた図5E、図5F。これら斑点は、細胞質ゾル内ならびに神経網および細胞体の原形質膜付近に見られた。これらの組織アレイは、剥がして、複数回調べることができるのでMichevaandSmith2007、様々なシナプスマーカーとのPKD1の共局在化は、同じ試料で試験することができた。この局在を定量化するために、vanSteenselに似た相関係数vanSteenseletal1996を開発した。PSD95またはシナプシンとの共局在化はほとんどなかったので、PKD1斑点はシナプスに存在しなかった。しかし、PKD1がGluR2と強い相関関係を示したことは、PKD1が、GluR2の非シナプス画分asynapticfractionと主に結合することを示唆する図5Gおよび5H。これは、PKD1の大部分が初期エンドソームのGluR2と結合している樹状突起のエンドソーム系を介してGluR2を輸送するPKD1の役割と一致する。図5A~図5H。PKD1は、エンドソームマーカーおよびAMPARと共局在化する。AmCherryおよびビーナス-PKD1を含む神経細胞を、Rab5に対する抗体で染色した。左自然斑点矢頭。右グルタミン酸刺激後の斑点のオーバーラップ矢頭。画像は代表的なものであるn>10個の神経細胞、3回の実験。B神経細胞を、シンタキシン13またはLamp1に対する抗体で染色した。矢頭は、抗体免疫蛍光と共局在していないビーナス斑点を示す。画像は代表的なものであるn>10個の神経細胞、3回の実験。C神経細胞を、ビーナス-PKD1およびHAタグ付きGluR2でトランスフェクトし、グルタミン酸またはフィールド刺激装置で刺激し、抗HA抗体で染色した。矢頭は共局在している斑点を示す。画像は代表的なものであるn>19個の神経細胞、>3回の実験。スケールバーは10μmである。Dビーナス-PKD1斑点と様々なマーカーとの間の樹状突起の共局在の定量化。条件ごとに少なくとも3回の実験からの10個を超える細胞数。値は平均±SDである。E形態マーカーとしてYFPを遺伝子導入で発現しているマウス脳の皮質層4の樹状突起における内在性PKD1、GluR2、PSD-95およびシナプシンのアレイトモグラフィー画像。矢頭は共局在している斑点を指す。スケールバーは2μmである。F形態マーカーとして機能するYFPを遺伝子導入で発現しているマウス脳の皮質層5の細胞体層における内在性PKD1、GluR2、PSD-95、およびシナプシンのアレイトモグラフィー画像。矢頭は共局在している斑点を指す。スケールバーは2μmである。Gマウス皮質の層4におけるPKD1マーカーおよびシナプスマーカーの共局在の定量化。線に沿った点は、48~70nm切片の分析に基づく平均相関係数であり、エラーバーはSDを示す。Hマウス皮質の層5におけるPKD1マーカーおよびシナプスマーカーの共局在化の程度。線に沿った点は、48~70nm切片の分析に基づく平均相関係数であり、エラーバーはSDを示す。PKD1機能を妨げると、GluR2輸送が破壊される。上述のインビボおよびインビトロの共局在化研究は、PKD1が、エンドソームにおいてAMPARサブユニットGluR2と結合することを示す。PKD1は、樹状突起のAMPAR輸送に関与している可能性があるか否かが問われた。この可能性を評価するために、TGNおよびTGN由来の小胞に構成的に局在するPKD1の触媒能がなく、優勢干渉バージョンであるビーナス-PKD1K618NSanchez-Ruilobaetal2006;Yeamanetal2004を試験した。キナーゼデッドKinase-deadPKD1は、特定のタンパク質が原形質膜に輸送されるのを防ぎ、PKD1が局在するエンドソームにそれらのタンパク質を捕捉するSanchez-Ruilobaetal2006;Yeamanetal2004。刺激されていない神経細胞では、ビーナス-PKD1K618Nは、共発現したHA-GluR2の細胞内局在を変え、HA-GluR2は、ビーナス-PKD1K618Nと共局在する斑点を形成した図6A。これら斑点がRab5陽性であった図6Bことは、キナーゼデッドPKD1が、GluR2をエンドソームにおいて異常に蓄積させることを示した。この知見の特異性および生理学的関連性をさらに確立するために、GluR2輸送に対する影響が、PKD1機能の阻害から特異的に生じたか否かを調べた。PKD1のノックダウンが、原形質膜での内在性GluR2サブユニットの対応する減少をもたらしたか否かを決定した。7DIVの時に、神経細胞を、EGFPおよびPKD1に対する低分子ヘアピンRNAshRNAまたは対照の変異shRNAのいずれかをコードするレンチウイルスで感染させた。錐体および星状の神経細胞の刺のある基部に近い樹状突起を、12~14DIVの時に表面GluR1について染色をした。PKD1ノックダウンは、対照細胞のGluR2レベルの約60までGluR2レベルを低下させた図6Cおよび図6D。全GluR2タンパク質レベルは、ノックダウンによって影響を受けなかった図6E。したがって、PKD1は、GluR2の発現よりむしろ輸送を調節する。AMPAR輸送に対するPKD1の効果が、樹状突起における特異的カーゴ関係またはタンパク質循環を調節する広範な役割を反映するか否かを調べるために、蛍光標識トランスフェリンParketal2004;Steineretal2005の取り込みまたは再利用に対するPKD1の効果を評価した。PKD1のshRNAノックダウンまたはPKD1の干渉形態の過剰発現は、トランスフェリンの再利用に影響しなかった図6F。AMPAR輸送はトランスフェリンの取り込みまたは再利用に影響を与えずに調節不全にすることができるのでSteineretal2005、これらの知見は、PKD1が、広範囲の樹状突起タンパク質輸送に影響を与えずに、1つまたは複数のグルタミン酸受容体サブタイプの再利用を調節することができたことを示唆する。図6A~図6F。PKD1を妨げると、AMPAR輸送が破壊される。A神経細胞を、ビーナス-PKD1K618NおよびHA-GluR2でトランスフェクトし、抗HA抗体で染色した。矢頭は共局在している斑点を示す。画像は代表的なものであるn>9個の神経細胞、4回の実験。Bビーナス-PKD1K618Nでトランスフェクトした神経細胞を、初期エンドソームマーカーRab5に対する抗体で染色した。矢頭は共局在している斑点を示す。C神経細胞を、GFPおよび対照shRNAまたはPKD1に対するshRNAをコードするレンチウイルスで感染させた。内在性GluR2の表面染色を、以下のパネルに示す。青のピクセルは、赤のピクセルより低い強度を示す。スケールバーは5μmである。DCで示した表面GluR2染色の定量化。値は平均±SDである。n>80個の樹状突起、3回の実験にわたって条件ごとに15個を超える細胞数。p<0.001。EPKD1に対するshRNAまたは対照の変異shRNAのいずれかをコードするウイルスで感染させた神経細胞のPKD1およびGluR2の総蛋白質レベル。n=3回の実験。F蛍光標識したトランスフェリンを、mCherryおよびPKD1の複数バージョンでトランスフェクトした神経細胞に添加した。平衡に達した後、神経細胞を、25分間または45分間、過剰の非標識トランスフェリンを添加せずに固定した。樹状突起内に残っているトランスフェリン蛍光量を、コンストラクト間で比較した。ビーナス-PKD1コンストラクト間左またはshRNAと対照コンストラクト右との間で有意差は認められなかった。PKD1は、GluR2の表面発現を調節するが、GluR1または他のグルタミン酸受容体を調節しない。PKD1が、PKD1:NMDARおよびグループIのmGluRを調節する2種類の他のグルタミン酸受容体の輸送を調節するか否かが問われた。前述のとおり、レンチウイルス感染によるPKD1ノックダウン後の表面ビオチン化アッセイは、GluR2の表面発現の減少を示したが、必須のNMDARサブユニットのNR1もしくはmGluRまたはGluR1の表面発現の減少は示さなかった図7Aおよび7B。後者の結果を確認するために、ホモマーのAMPARShietal.,2001を形成することできる細胞外で発現させたGluR1の輸送に対する優勢干渉PKD1の効果を試験した。細胞外で発現させたHA-GluR2とは異なり、ビーナス-PKD1K618Nは、HA-GluR1と共局在しなかったか、またはHA-GluR1局在に影響を及ぼさなかった図7C。PKD1を妨げると、機能的AMPARの組成に影響を及ぼす。PKD1が、GluR2の表面発現を調節し、GluR1サブユニットの表面発現を調節しない場合、PKD1は、成熟AMPARのサブユニット組成を決定する可能性がある。GluR2は、AMPARのCa2透過性および他の生物物理学的特性に決定的な影響を与えるIsaacetal2007。したがって、シナプスがGluR2欠損AMPARを含むか否かが、mEPSCサイズおよびシナプス後のカルシウムシグナル伝達の重要な決定因子である。これは、特定の種類のAMPAR依存的可塑性を表す細胞の能力を決定する可能性があるIsaacetal2007;LiuandZukin2007。GluR2欠損AMPARは、スペルミンなどのポリアミンの存在下で内向き整流を示すBowieandMayer1995;Geigeretal1995;Jonasetal1994。PKD1ノックダウンが、原形質膜でGluR2欠損AMPARの割合を増加させるか否かを試験するために、PKD1に対するshRNAまたは変異対照を発現する細胞のI/V曲線を測定した。PKD1を欠く細胞が著しい内向き整流を示したことは、PKD1機能の破壊が、AMPARサブユニット組成を変え、GluR2を欠く機能的AMPARの相対的な増加につながることを示す図7Dおよび図7E。図7A~図7E。PKD1は、GluR1ではなく、GluR2の表面発現を特異的に調節する。APKD1ノックダウン後の総蛋白および表面受容体レベルを示す表面ビオチン化アッセイ。BAのビオチン化アッセイの定量化。バーは、平均値±SDを示す。受容体当たりn=3回の実験。p<0.05対応のないt検定。C神経細胞を、ビーナス-PKD1K618NおよびHA-GluR2左またはHA-GluR1右でトランスフェクトし、抗HA抗体で染色した。矢頭は共局在している斑点を示す。画像は代表的なものであるn>9個の神経細胞、4回の実験である。DPKD1に対するshRNAまたは対照の変異shRNAを発現する細胞の代表的なI/V曲線。E40mVでの最大電流を-60mVでの最大電流で割ることによって計算した整流指数。条件あたりn=4。p=0.006対応のないt検定。グルタミン酸誘導性再利用の間、PKD1は、GluR2の再挿入を調節し、GluR2の内部移行は調節しない。ドミナントネガティブPKD1およびPKD1ノックダウンが、GluR2の細胞内保持をもたらすので、PKD1が、GluR2のエンドサイトーシスを減少させるか、またはそのエキソサイトーシスを促進するという仮説を立てた。前者の可能性を試験するために、グルタミン酸誘導性エンドサイトーシス後の表面GluR2レベルを測定した図8Aおよび図8B。PKD1が、正常にGluR2エンドサイトーシスを減少させる場合、表面GluR2の相対的な減少が、対照の神経細胞内よりもPKD1ノックダウン後に大きくなることが予想された。しかし、対照細胞とPKD1ノックダウン細胞との間で、グルタミン酸後の表面GluR2減少における違いは認められなかった図8C。したがって、PKD1は、グルタミン酸に応答して、GluR2エンドサイトーシスを調節しない。PKD1が、GluR2エキソサイトーシスを促進するか否かを試験するために、N末端にsupereclipticpHluorinタグを有するGluR2コンストラクトpH-GluR2を発現する生細胞を画像化した。このシステムを用いて、表面GluR2を、エンドソームの酸性環境によって可逆的に消光されるpHluorin蛍光の強度によって測定するMiesenbocketal1998。グルタミン酸添加の5分後に、pH-GluR2蛍光強度は、ベースラインの約80であった図8Dおよび図8E。グルタミン酸刺激のすぐ後に、ベースラインの20までpH-GluR2蛍光強度が減少することによって示されるように、pH-GluR2エンドサイトーシスは最大である。ピークエンドサイトーシスの大きさは、内在性PKD1の存在下で、またはPKD1ノックダウン後に類似していた。グルタミン酸刺激後55分の時に、pH-GluR2蛍光は、内在性PKD1を有する神経細胞においてベースラインの90を超えるまでに回復した。しかし、PKD1がノックダウンしている神経細胞においては、蛍光回復は著しく遅れた図8F。したがって、PKD1は、グルタミン酸活性に応答してGluR2再利用率を調節するのに重要であると思われる。図8A~図8F。PKD1は、グルタミン酸誘導性エンドサイトーシス後のGluR2再利用を調節する。A神経細胞は、GFPおよび対照shRNAまたはPKD1に対するshRNAをコードするレンチウイルスで感染させた。内在性GluR2の表面染色を下のパネルに示す。青のピクセルが赤のピクセルよりも低い強度の染色を示す。スケールバーは5μmである。BBの表面染色の定量化。値は平均値±SDである。n=13~15個の細胞、>65個の樹状突起/条件。p<0.01Bonferroni補正を用いる対応のないt検定。C対照およびPKD1ノックダウン細胞におけるグルタミン酸添加後の表面GluR2の相対的減少の比較。p>0.1対応のないt検定。DpH-GluR2およびPKD1shRNAまたは変異対照のいずれかを発現する神経細胞の代表的な画像。t=0分の時に、グルタミン酸を5分間添加し、洗い流した。青のピクセルが赤のピクセルよりも低い強度のpH-GluR2シグナルを示す。スケールバーは10μmである。EDで示した画像のpH-GluR2強度の定量化。Fもとのベースラインの中間までのpH-GluR2蛍光強度の回復の定量化。p<0.01対応のないt検定。対照についてはn=7個の細胞。PKD1shRNAについては、8個の細胞。参考文献AbramoffMDMPRamSJImageprocessingwithImageJBiophotonicsInternational113642AdesnikHandNicollRAConservationofglutamatereceptor2containingAMPAreceptorsduringlongtermpotentiationJNeurosci2745984602ArrasateMandFinkbeinerSAutomatedmicroscopesystemfordeterminingfactorsthatpredictneuronalfateProcNatlAcadSciUSA10238403845BaronCLandMalhotraVRoleofdiacylglycerolinPKDrecruitmenttotheTGNandproteintransporttotheplasmamembraneScience295325328BelloneCandLuscherCmGluRsinducealongtermdepressionintheventraltegmentalareathatinvolvesaswitchofthesubunitcompositionofAMPAreceptorsEurJNeurosci2112801288BisbalMCondeCDonosoMBollatiFSesmaJQuirogaSDiazAnelAMalhotraVMarzoloMPandCaceresAProteinkinasedregulatestraffickingofdendriticmembraneproteinsindevelopingneuronsJNeurosci2892979308BowieDandMayerMLInwardrectificationofbothAMPAandkainatesubtypeglutamatereceptorsgeneratedbypolyaminemediatedionchannelblockNeuron15453462BradleyJCarterSRRaoVRWangJandFinkbeinerSSplicevariantsoftheNR1subunitdifferentiallyinduceNMDAreceptordependentgeneexpressionJNeurosci2610651076ChenJDengFLiJandWangQJSelectivebindingofphorbolestersanddiacylglycerolbyindividualCIdomainsofthePKDfamilyBiochemJ411333342CingolaniLAThalhammerAYuLMCatalanoMRamosTColicosMAandGodaYActivitydependentregulationofsynapticAMPAreceptorcompositionandabundancebybeta3integrinsNeuron58749762ConradKLTsengKYUejimaJLReimersJMHengLJShahamYMarinelliMandWolfMEFormationofaccumbensGluR2lackingAMPAreceptorsmediatesincubationofcocainecravingNature454118121CronshawJMKrutchinskyANZhangWChaitBTandMatunisMJProteomicanalysisofthemammaliannuclearporecomplexJCellBiol158915927FengGMellorRHBernsteinMKellerPeckCNguyenQTWallaceMNerbonneJMLichtmanJWandSanesJRImagingneuronalsubsetsintransgenicmiceexpressingmultiplespectralvariantsofGFPNeuron284151GaineyMAHurvitzWolffJRLamboMEandTurrigianoGGSynapticscalingrequirestheGluR2subunitoftheAMPAreceptorJNeurosci2964796489GeigerJRMelcherTKohDSSakmannBSeeburgPHJonasPandMonyerHRelativeabundanceofsubunitmRNAsdeterminesgatingandCa2permeabilityofAMPAreceptorsinprincipalneuronsandinterneuronsinratCNSNeuron15193204GoelAJiangBXuLWSongLKirkwoodAandLeeHKCrossmodalregulationofsynapticAMPAreceptorsinprimarysensorycorticesbyvisualexperienceNatNeurosci910011003GomezOspinaNTsurutaFBarretoChangOHuLandDolmetschRTheCterminusoftheLtypevoltagegatedcalciumchannelCa12encodesatranscriptionfactorCell127591606GuireESOhMCSoderlingTRandDerkachVARecruitmentofcalciumpermeableAMPAreceptorsduringsynapticpotentiationisregulatedbyCaMkinaseIJNeurosci2860006009HausserAStorzPMartensSLinkGTokerAandPfizenmaierKProteinkinaseDregulatesvesiculartransportbyphosphorylatingandactivatingphosphatidylinositol4kinaseIllbetaattheGolgicomplexNatCellBiol7880886HortonACandEhlersMDDualmodesofendoplasmicreticulumtoGolgitransportindendritesrevealedbylivecellimagingJNeurosci2361886199HortonACRaczBMonsonEELinALWeinbergRJandEhlersMDPolarizedsecretorytraffickingdirectscargoforasymmetricdendritegrowthandmorphogenesisNeuron48757771IglesiasTMatthewsSandRozengurtEDissimilarphorbolesterbindingpropertiesoftheindividualcysteinerichmotifsofproteinkinaseDFEBSLett4371923IsaacJTAshbyMandMcBainCJTheroleoftheGluR2subunitinAMPAreceptorfunctionandsynapticplasticityNeuron54859871JonasPRaccaCSakmannBSeeburgPHandMonyerHDifferencesinCa2permeabilityofAMPAtypeglutamatereceptorchannelsinneocorticalneuronscausedbydifferentialGluRBsubunitexpressionNeuron1212811289KennedyMJandEhlersMDOrganellesandTraffickingMachineryforPostsynapticPlasticityAnnuRevNeurosciKiellandABochorishviliGCorsonJZhangLRosinDLHeggelundPandZhuJJActivitypatternsgovernsynapsespecificAMPAreceptortraffickingbetweendeliverableandsynapticpoolsNeuron6284101KunkelMTTokerATsienRYandNewtonACCalciumdependentregulationofproteinkinaseDrevealedbyageneticallyencodedkinaseactivityreporterJBiolChem28267336742LeeSHSimonettaAandShengMSubunitrulesgoverningthesortingofinternalizedAMPAreceptorsinhippocampalneuronsNeuron43221236LiJChenLATownsendCMJrandEversBMPKD1PKD2andtheirsubstrateKidins220regulateneurotensinsecretionintheBONhumanendocrinecelllineJBiolChem28326142621LiJOConnorKLHellmichMRGreeleyGHJrTownsendCMJrandEversBMTheroleofproteinkinaseDinneurotensinsecretionmediatedbyproteinkinaseCalphadeltaandRhoRhokinaseJBiolChem2792846628474LinJWJuWFosterKLeeSHAhmadianGWyszynskiMWangYTandShengMDistinctmolecularmechanismsanddivergentendocytoticpathwaysofAMPAreceptorinternalizationNatNeurosci312821290LiuSJandCullCandySGSubunitinteractionwithPICKandGRIPcontrolsCa2permeabilityofAMPARsatcerebellarsynapsesNatNeurosci8768775LiuSJandZukinRSCa2permeableAMPAreceptorsinsynapticplasticityandneuronaldeathTrendsNeurosci30126134LuWandZiffEBPICKlinteractswithABPGRIPtoregulateAMPAreceptortraffickingNeuron47407421MaedaYBeznoussenkoGVVanLintJMironovAAandMalhotraVRecruitmentofproteinkinaseDtothetransGolginetworkviathefirstcysteinerichdomainEmboJ2059825990MameliMBallandBLujanRandLuscherCRapidsynthesisandsynapticinsertionofGluR2formGluRLTDintheventraltegmentalareaScience317530533MandersEMStapJBrakenhoffGJvanDrielRandAtenJADynamicsofthreedimensionalreplicationpatternsduringtheSphaseanalysedbydoublelabellingofDNAandconfocalmicroscopyJCellSci103857862MatthewsSIglesiasTCantrellDandRozengurtEDynamicredistributionofproteinkinaseDasrevealedbyaGFPPKDfusionproteindissociationfromPKDactivationFEBSLett457515521MatthewsSAIglesiasTRozengurtEandCantrellDSpatialandtemporalregulationofproteinkinaseDEmboJ1929352945MatthewsSARozengurtEandCantrellDCharacterizationofserine916asaninvivoautophosphorylationsiteforproteinkinaseDProteinkinaseCmuJBiolChem2742654326549McNamaraJOGrigstonJCVanDongenHMAandVanDongenAMJRapiddendritictransportofTGN38aputativecargoreceptorMolBrainRes1276878MedeirosRBDickeyDMChungHQualeACNagarajanLRBilladeauDDandShimizuYProteinkinaseDlandthebeta1integrincytoplasmicdomaincontrolbeta1integrinfunctionviaregulationofRaplactivationImmunity23213226MerrillMAChenYStrackSandHellJWActivitydrivenpostsynaptictranslocationofCaMKIITrendsPharmacolSci26645653MichevaKDandSmithSJArraytomographyanewtoolforimagingthemoleculararchitectureandultrastructureofneuralcircuitsNeuron552536MiesenbockGDeAngelisDAandRothmanJEVisualizingsecretionandsynaptictransmissionwithpHsensitivegreenfluorescentproteinsNature394192195OanceaEBezzeridesVJGrekaAandClaphamDEMechanismofpersistentproteinkinaseDltranslocationandactivationDevCell4561574OanceaEandMeyerTProteinkinaseCasamolecularmachinefordecodingcalciumanddiacylglycerolsignalsCell95307318OsterHAbrahamDandLeitgesMExpressionoftheproteinkinaseDfamilyduringmouseembryogenesisGeneExprPatterns6400408ParkMPenickECEdwardsJGKauerJAandEhlersMDRecyclingendosomessupplyAMPAreceptorsforLTPScience30519721975PassafaroMPiechVandShengMSubunitspecifictemporalandspatialpatternsofAMPAreceptorexocytosisinhippocampalneuronsNatNeurosci4917926PlantKPelkeyKABortolottoZAMoritaDTerashimaAMcBainCJCollingridgeGLandIsaacJTTransientincorporationofnativeGluR2lackingAMPAreceptorsduringhippocampallongtermpotentiationNatNeurosci9602604RaoVRPintchovskiSAChinJPeeblesCLMitraSandFinkbeinerSAMPAreceptorsregulatetranscriptionoftheplasticityrelatedimmediateearlygeneArcNatNeurosci9887895ReyOReeveJRJrZhukovaESinnettSmithJandRozengurtEGproteincoupledreceptormediatedphosphorylationoftheactivationloopofproteinkinaseDdependenceonplasmamembranetranslocationandproteinkinaseCepsilonJBiolChem2793436134372ReyOYoungSHCantrellDandRozengurtERapidproteinkinaseDtranslocationinresponsetoGproteincoupledreceptoractivationDependenceonproteinkinaseCJBiolChem2763261632626ReyOYuanJandRozengurtEIntracellularredistributionofproteinkinaseD2inresponsetoGproteincoupledreceptoragonistsBiochemBiophysResCommun302817824ReyOYuanJYoungSHandRozengurtEProteinkinaseCnuproteinkinaseD3nuclearlocalizationcatalyticactivationandintracellularredistributioninresponsetoGproteincoupledreceptoragonistsJBiolChem2782377323785RozengurtEReyOandWaldronRTProteinkinaseDsignalingJBiolChem2801320513208RybinVOGuoJandSteinbergSFProteinkinaseDlautophosphorylationviadistinctmechanismsatSer744Ser748andSer916JBiolChem28423322343SanchezRuilobaLCabreraPochNRodriguezMartinezMLopezMenendezCJeanMairetRMHigueroAMandIglesiasTProteinkinaseDintracellularlocalizationandactivitycontrolkinaseDinteractingsubstrateof220kDatrafficthroughapostsynapticdensity95discslargezonulaoccludens1bindingmotifJBiolChem2811888818900ShiSHayashiYEstebanJAandMalinowRSubunitspecificrulesgoverningAMPAreceptortraffickingtosynapsesinhippocampalpyramidalneuronsCell105331343SteinerPAlberiSKulangaraKYersinASarriaJCRegulierEKasasSDietlerGMullerDCatsicasSandHirlingHInteractionsbetweenNEEP21GRIP1andGluR2regulatesortingandrecyclingoftheglutamatereceptorsubunitGluR2EmboJ2428732884SumaraGFormentiniICollinsSSumaraIWindakRBodenmillerBRamracheyaRCailleDJiangHPiattKAetalRegulationofPKDbytheMAPKp38deltaininsulinsecretionandglucosehomeostasisCell136235248vanSteenselBvanBinnendijkEPHornsbyCDvanderVoortHTKrozowskiZSdeKloetERandvanDrielRPartialcolocalizationofglucocorticoidandmineralocorticoidreceptorsindiscretecompartmentsinnucleiofrathippocampusneuronsJCellSci109787792WangQJPKDatthecrossroadsofDAGandPKCsignalingTrendsPharmacolSci27317323WangYZhengFZhouXSunZandWangHConvergingsignalonERK12activityregulatesgroupImGluRmediatedArctranscriptionNeurosciLett4603640WoodsAJWhiteDPCaswellPTandNormanJCPKDlPKCmupromotesalphavbeta3integrinrecyclinganddeliverytonascentfocaladhesionsEmboJ2325312543YeamanCAyalaMIWrightJRBardFBossardCAngAMaedaYSeufferleinTMellmanINelsonWJandMalhotraVProteinkinaseDregulatesbasolateralmembraneproteinexitfromtransGolginetworkNatCellBiol6106112YinDMHuangYHZhuYBandWangYBoththeestablishmentandmaintenanceofneuronalpolarityrequiretheactivityofproteinkinaseDintheGolgiapparatusJNeurosci2888328843OsterHAbrahamDandLeitgesMExpressionoftheproteinkinaseDfamilyduringmouseembryogenesisGeneExprPatterns6400408FielitzJKimMSSheltonJMQiXHillJARichardsonJABasselDubyROlsonEN2008RequirementofproteinkinaseDlforpathologicalcardiacremodelingProcNatlAcadSciUSA105305963FTrancheCKellendonkOKretzPGassKAnlagPCOrbanRBockRKleinandGSchiitz1999DisruptionoftheglucocorticoidreceptorgeneinthenervoussystemresultsinreducedanxietyNatGenet2399103XuBGottschalkWChowAWilsonRISchnellEZangKWangDNicollRALuBReichardtLF2000TheroleofbrainderivedneurotrophicfactorreceptorsinthematurehippocampusmodulationoflongtermpotentiationthroughapresynapticmechanisminvolvingTrkBJNeurosci20688897実施例2:PKD1を欠損する遺伝子組換えマウス方法細胞培養El8マウス胚の皮質を切り裂き、パパイン10ユニット/ml1、30分;WorthingtonBiochemical社、その後、トリプシン阻害剤10mg/ml1、15分;シグマ社で処理した。摩砕した後、解離させた神経細胞を、ポリ-D-リジンBDバイオサイエンス社でコーティングしたプラスチック製組織培養プレート1cm2当たり34×105個の細胞または12mmのガラス製カバーガラス上に播種した1cm2当たり68×105個の細胞。神経細胞を、B27インビトロジェン社を含むNeurobasal-Aで増殖させた。特に述べない限り、神経細胞を、インビトロで12日目DIVの実験に用いた。HEK293T細胞を、10の加熱不活性化ウシ胎児血清インビトロジェン社、100U/mLのペニシリン、および100U/mLのストレプトマイシンを含む、グルタマックス添加ダルベッコ改変イーグル培地DMEM中で、37°C、5CO2に維持した。抗体および薬物リン酸-PKD1Ser744/748、リン酸-PKD1Ser916、およびHDAC5抗体を、CellSignaling社から購入した。フラッグ抗体、α-チューブリン抗体、およびβ-アクチン抗体をシグマ社から購入した。2次抗体をJacksonImmunoResearch社から購入した。DHPG、ACPD、MCPG、MPEP、CPCCOEt、AP5、NBQX、ニモジピンをTocris社から購入した。TTXをCalbiochem社から購入した。全ての他の化学物質をシグマ社から購入した。ウェスタンブロット細胞を、プロテアーゼ阻害剤ロッシュ社を含む氷冷RIPA緩衝液150mMのNaCl、50mMのトリス緩衝液、pH7.5、1mMのEDTA、1NP-40、05デオキシコール酸および01SDS中に回収した。タンパク質濃度を、BCAアッセイによって決定した。等量の総タンパク質を10SDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロースアマシャムバイオサイエンス社に移した。膜を、5脱脂乳Bio-Rad社でブロックし、1次抗体およびペルオキシダーゼ結合2次抗体で探索し、高感度化学発光試薬PerkinElmer社を用いて可視化した。ブロットを、55°Cで50分間、緩衝液100mMの2-メルカプトエタノール、2SDSおよび62.5mMトリス、pH6.7中で剥離した。免疫細胞化学細胞を、10分間、4スクロースを含む4パラホルムアルデヒドで固定し、3ウシ血清アルブミン、ヤギまたはロバの2血清、および01Triton-X100を含むPBSでブロッキングした。核を、Hoechst333422.5g/ml、10分;Tocris社で染色した。レポーター遺伝子アッセイ皮質神経細胞10DIVを、レポーター遺伝子の1つおよびpRLO-Renilla1:1モル比でコトランスフェクトした。トランスフェクション後20~24時間の時点で、神経細胞を薬物で刺激し、溶解物を収集して、2重ルシフェラーゼキットDualLuciferaseKitプロメガ社およびルミノメーターThermoElectron社を用いて分析した。逆転写PCR全RNAを、QiagenRNEasyキアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州キットを用いて、メーカーの指示書に従ってマウスの脳から抽出した。cDNAを、メーカーの指示書に従って、スーパースクリプトII逆転写酵素を用いて作製した。PKD1、PKD2、およびPKD3を、1に記載のアイソフォーム特異的プライマーで増幅した。qfRT-PCR細胞を薬物で6時間刺激し、以下の遺伝子特異的プライマーを用いて、qfRT-PCRによりmRNAレベルを決定した:Arcについては5’-cctgagccacctggaagagta-3’配列番号25および5’-ggcccattcatgtggttctg-3’配列番号26、PKD1については5’-ctgtgacctcaagccagaaa-3’配列番号27および5’-gtacccaccactgacctcct-3’配列番号28、PKD2については5’-catcgacctcatcaacaacc-3’配列番号29および5’-tggctgagagacttgtccac-3’配列番号30、PKD3については5’-cccagaaatctgtgttccct-3’配列番号31および5’-agagagccgagctgagagtc-3’配列番号32、GAPDH標準化のための内部対照遺伝子については5’-ccccaatgtgtccgtcgt-3’配列番号33および5’-gcctgcttcaccaccttct-3’配列番号34。新生Arc転写物の検出については、プライマー対は以下のとおりであった:イントロン1プライマーはイントロン1内でアニールする、5’-ccctgcaccgtgtatcttagagtg-3’配列番号35および5’-tccacccttgcaactaatttg-3’配列番号36;イントロン2プライマーは、イントロン-エクソン境界に隣接する、5’-taacctggtgtccctcctggatc-3’配列番号37および5’-gcaaagacttctcagcagccttga-3’配列番号38。マウス全ての動物を扱う手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の研究機関における動物の世話と利用に関する委員会InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeによって承認された。本研究で用いた遺伝子組換えマウスであるPKD1fl/fl2、Nestin::Cre3、およびCaMKII::Cre4は前記した。組織の調製および染色マウスを、4パラホルムアルデヒドWVで灌流した。脳を4°Cで一晩固定した。凍結切片については、脳を30ショ糖で凍結保存し、ティッシュテック最適切断温度化合物Tissue-TekOptimalCuttingTemperaturecompoundSakura社に埋め込み、12mmの切片に切断した。ポリエチレングリコールPEGの切片については、脳をエタノール系で脱水し、PEG1,000およびPEG1,500の2:1混合物に埋め込み、10mmの切片に切断した。免疫染色については、切片を4°Cで一晩、1次抗体とインキュベートし、その後、20~235°Cで2時間、2次抗体とインキュベートした。電気生理学的記録フィールドEPSPfEPSPを、1MのNaClおよび25mMのHEPES、pH7.3で満たしたガラス電極3Mチップ抵抗で記録し、双極タングステン電極FHCで20秒ごとに誘起した。2kHz-3dBで、8極ベッセルでろ過し、Multiclamp700A増幅器MolecularDevices社を用いて、20kHzでデジタルサンプリングし、Digidata-1322AデジタイザーおよびpClamp9.2ソフトウェアを用いて記録を取得した。pClamp9ソフトウェアおよびOriginPro8.0OriginLabを用いて、データをオフラインで分析した。CA1で実行した記録については、刺激電極を、CA3とCA1の境界の放射線状の層に置き、記録電極を、CA1の放射線状の層に150μm離しておいた。それぞれの切片で評価したシナプス強度および可塑性の測定は、入出力I-O関係、ペアパルス比paired-pulseratios、LTPおよびLTDからなっていた。シナプス伝達強度を、fEPSPのI-O曲線を作成することによって評価した。入力はファイバーボレーの最大振幅であり、出力はfEPSPの初期勾配であった。50ms離して2つのfEPSPを惹起し、第2のfEPSPBの初期勾配を第1のfEPSPの初期勾配で割るfEPSP2/fEPSP1ことによって、ペアパルス比を決定した。15分間安定したベースラインを確立した後、LTPを、高頻度刺激100回の刺激のうち4回の100HzトレインによってCA1に誘導した。15分間安定したベースラインを確立した後、NMDA-LTDを、3分間、5Hzの刺激トレインによって誘起し、mGluR-LTDを、5分間、50μMのDHPGのバスアプリケーションによって誘起した。行動試験オスのマウスのみ、行動遂行の変動性を低下させるために分析した。マウスの1つのコホートを、生後3ヶ月の時点で行動の面で評価した。それぞれのコホートは、2つのグループ:PKD1ヌルマウスおよび同腹の対照マウスを含んでいた。オープンフィールドオープンフィールド試験については、個々のマウスを、15分間、41×41×30cmのアクリルの動物ケージに入れ、その間、それらの水平方向および垂直方向の移動を、ミリ秒ごとにそれらの位置を記録するコンピューターと接続した16個の赤外線ビームセンサFlex-Field/OpenFieldPhotobeamActivitySystemPAS、SanDiegoInstruments社、サンディエゴ、カリフォルニア州の2つのアレイによって監視した。次に、PASソフトウェアを用いて、移動の総数、走行距離、移動に費やした時間、それぞれのマウスについての赤外線ビーム切断の総数を、水平面および縦軸に沿って計算した。この装置を、それぞれのマウスの試験後に70アルコールで洗浄した。高架式十字迷路高架式十字迷路は、地上63cmの高さで、2つのオープン壁なしアームおよび2つのクローズド壁ありアームからなっていたHamilton-Kinder社。マウスを、試験前の1時間、薄暗い光の下で試験室に慣れさせた。試験中に、マウスを、十字迷路のオープンアームとクローズドアームとの間の接合部に入れ、5分間探索させた。この迷路を、それぞれのマウスの試験後に70アルコールで洗浄した。オープンアームおよびクローズドアームの両方での総走行距離およびそれに費やした時間を、赤外線フォトビーム切断に基づいて計算した。新規物体認識各遺伝子型の雄マウスを、1日目に30分間、丸型の試験活動領域30cm×30cmの中で慣らした。2日目に、マウスに、特定の領域内の2つの物体なじみのものを提示し、マウスにその領域および物体を10分間自由に探索させ、次に、それらのケージに戻した。4時間後、これらの物体のうち1つを、新しい物体新奇物体と交換し、マウスに10分間その環境を探索させた。チャンバー内のなじみの物体および新奇物体の位置を、異なるマウスの試験の合間には半無作為に変更したが、どのマウスでも、ある特定のマウスの訓練および試験のセッション間では一定に保った。行動を、ビデオトラッキングシステムNoldus社で記録した。これらの物体との相互作用の頻度および各物体の探索に費やした時間を、その後のデータ解析のために記録し、認識記憶を最終トライアルで評価した。活動領域および物体を、それぞれのマウスの試験後に70エタノールで洗浄した。モリス水迷路この水迷路は、無毒の白テンペラ絵の具の粉末で不透明にした水21±1°Cで満たしたプール直径122cmからなっていた。このプールは、異なる迷路外空間手がかりに囲まれた部屋に位置していた。隠れプラットフォーム訓練の前に、マウスに2つの事前訓練トライアルを与え、その中で、マウスは、矩形チャネル15×122cm内を泳ぎ、このチャネルの真ん中にある水面下15cmに隠れたプラットフォームを登らなければならなかった。90秒以内にこのプラットフォームを登らなかったマウスをそのプラットフォームにやさしく導びき、10秒間その上に座らせ、その後、実験者がマウスを取り除いた。事前訓練の次の日、マウスを円形水迷路で訓練した。隠れプラットフォーム訓練のために、このプラットフォーム14×14cmを、水面下15cmに沈めた。このプラットフォームの位置は、隠れプラットフォーム訓練の間同じままであったが、ドロップ位置は、トライアルの間、半無作為に変化させた。マウスに、連続した5日間、3時間のインターセッションの間隔を有する2つの訓練のセッションを受けさせた。それぞれのセッションは、10分のトライアル間隔を有する2つのトライアルからなっていた。60秒以内にこのプラットフォームを見つけられなかったマウスを、そこに導き、10秒間その上に座らせた。空間プローブトライアルでは、このプラットフォームを除去し、マウスを60秒間泳がせた後、マウスを取り除いた。ドロップ位置は、このプラットフォームが隠れプラットフォーム訓練中に置かれた場所から180°であった。同じドロップ位置を、全ての空間プローブトライアルに用いた。最後のプローブトライアル後、マウスを1日休ませ、その後、手掛かりを与えたプラットフォーム訓練を行った。この試験において、このプラットフォームを、目に見える手がかりプラットフォームの上部に置かれた15cmの高さの黒と白の縞のある棒でマークした。マウスに、2~3時間のトライアル間隔で、1日あたり2つの訓練セッションを受けさせた。それぞれのセッションは、20分のトライアル間隔を有する2つの訓練トライアルからなっていた。それぞれのセッションでは、このプラットフォームを新しい場所へ移動し、ドロップ位置を、トライアルの間、半無作為に変えた。トライアルを60秒後に中止した。行動を、ビデオトラッキングシステムNoldus社で記録した。逃避潜時、走行距離、水泳コース、水泳速度、前記4つのそれぞれに費やした時間の割合、およびプラットフォームの横断を、その後の分析のために記録した。統計分析一方向ANOVAおよび事後のテューキーt検定を、PrismGraphPadSoftware社を用いて行った。結果これらの結果を図13~18に示す。一連の行動試験を、CNSPKD1Nes/Cre:PKD1flox/flox×NestinCre/CreからPKD1を選択的に除去したマウスで行った。通常の水泳速度にもかかわらず、モリス水迷路試験で、マウスが隠れプラットフォームの位置を学習できなかったことによって示されるとおり、これらのマウスは、重度の海馬依存性空間学習障害を示した図13。これらのマウスが、迅速に目に見えるプラットフォームを見つけたことは、それらのマウスの視力、知覚、意欲が正常であることを示す図13。これらのマウスは、中程度の皮質依存的な新奇物体認識異常も示した図14。オープンフィールド試験において、このオープンフィールドの中央での立ち上がり総数および移動量は、対照動物と有意差はなかったが、PKD1Nes/Creマウスでは、移動の合計において対照マウスと小さいが統計的に有意な差が認められた図15。運動機能のロータロッド試験図16、不安についての高架式十字迷路試験図17、およびうつ病についての2つの試験図18を含む他の行動試験は、正常であった。まとめると、これらの結果は、海馬依存的学習および皮質依存的学習におけるPKD1の重要で、かなり選択的な役割を示唆する。参考文献OsterHAbrahamDandLeitgesMExpressionoftheproteinkinaseDfamilyduringmouseembroyogenesisGeneExprPatterns6400408FielitzJKimMSSheltonJMQiXHillJARichardsonJABasselDunyROlsonEN2008RequirementofproteinkinaseD1forpathologicalcardiacremodelingProcNatlAcadSciUSA105305963FTroncheCKellendonkOKretzPGassKAnlagPCOrbanRBockRKleinandGSchultz1999DisruptionoftheglucocorticoidreceptorgeneinthenervoussystemresultsinreducedanxietyNatGenet2399103XuBGottschalkWChowAWilsonRISchnellEZangKWamgDNicollRALuBReichardtLF2000TheroleofbrainderivedneurotrophicfactorreceptorsinthematurehippocampusmodulationoflongtermpotentiationthroughpresynapticmechanisminvolvingTrkbJNeurosci2068897実施例3:神経障害の非ヒト動物モデルに対するPKD1モジュレーターの効果神経障害に対するPKD1モジュレーター例えば、PKD1阻害剤の効果は、この障害の非ヒト動物モデルを用いて決定することができる。パーキンソン病PDの適切な非ヒト動物モデルには、例えば、α-シヌクレイントランスジェニックマウスモデル、およびパーキンソン病の1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジンMPTPマウスモデルが含まれる。例えば、Betarbetetal2002Bioessays24:308;OrthandTabrizi2003MovDisord18:729;Beal2001NatRevNeurosci2:325を参照されたい。ハンチントン病の適切な非ヒト動物モデルには、例えば、ヒトハンチンチン導入遺伝子このヒトハンチンチン導入遺伝子は、ポリグルタミン伸長をコードする30~150個のCAGリピートを含むを含むトランスジェニックマウス例えば、R6系、YAC系;30~150のCAGリピートを含むヒトハンチンチン遺伝子で内在性マウスハンチンチン遺伝子を置換したホモ接合体またはヘテロ接合体を含むノックインマウスモデルが含まれる。例えば、Mangiarinietal1996Cell87:493;Menalled2005NeuroRx2:465;MenalledandChesselet2002TrendsPharmacolSci23:32;およびHodgsonetal1999Neuron23:181を参照されたい。筋萎縮性側索硬化症ALSの適切な非ヒト動物モデルには、自然発症マウスモデル例えば、運動神経変性Mndモデル、進行性運動神経障害Pmnモデル;およびヨロヨロしているマウス、トランスジェニックマウスモデル例えば、家族性ALS患者の変異SOD1遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウス、神経フィラメントトランスジェニックマウス、何人かのALS患者で同定されたTARDNA結合タンパク質-43TDP-43遺伝子に変異を含むトランスジェニックマウス、ならびに双尾D2N末端BicaudalD2N-terminusBICD2-Nの神経細胞特異的発現を有し、慢性的にダイニン/ダイナクチン機能を損なうトランスジェニックマウスなどが含まれる。例えば、PioroandMitsumoto1995ClinNeurosci3:375;Priceetal1997RevNeurol153:484;Wegorzewskaetal2009ProcNatlAcadSciUSA106:18809;およびTeulingetal2008HumMolGenet17:2849を参照されたい。アルツハイマー病ADの適切な非ヒト動物モデルには、ヒトアミロイド前駆体タンパク質hAPP変異導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス、ならびにプレセニリン1およびプレセニリン2の導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスなどが含まれる。例えば、Gotzetal2004MolPsychiatry9:664;GotzandIttner2008NatureReviews9:532を参照されたい。多発性硬化症の適切な非ヒト動物モデルには、MSの実験的自己免疫性脳炎EAEマウスモデルが含まれる。例えば、Owens2006AdvNeurol98:77;BakerandJackson2007AdvClinNeurosciRehab6:12;およびSteinmanandZamvil2006AnnNeurol60:12を参照されたい。PKD1モジュレーターを、例えば、約1μg~約100μg以上の量で、非ヒト動物モデルに投与する。1つまたは複数のパラメータに対するPKD1モジュレーターの効果を評価する。例えば、認知機能、筋機能、運動機能、脳機能、および行動などに対するPKD1モジュレーターの効果を評価する。電気生理学的試験を用いて、脳機能を評価することができる。筋機能は、例えば、握力試験を用いて評価することができる。運動機能は、例えば、ロータロッド試験を用いて試験することができる。認知機能は、例えば、オープンフィールド試験、高架式十字迷路、モリス水迷路、ゼロ迷路試験、および新奇物体認識試験などを用いて試験することができる。感覚運動機能、自律神経反射、情緒反応、および基本的な認知を含む神経学的機能および行動のための試験を行うことができる。かかる試験は、当技術分野で周知である。例えば、EDLevinおよびJJBuccafusco編集の認知機能障害の動物モデルAnimalModelsofCognitiveImpairment2006年の中のRodriguizおよびWetselによる第12章の変異マウスにおける認知障害の評価AssessmentsofCognitiveDeficitsinMutantMiceCRCプレス、ボカラトン、フロリダ州を参照されたい。別の例として、aタンパク質沈着例えば、ADモデルにおけるAβおよび/または過リン酸化タウ、PDモデルにおけるα-シヌクレインおよび/またはレビー小体、ALSモデルにおける神経凝集体、ハンチントン病におけるポリグルタミン伸長を有するハンチンチン、例えば、RossandPoirier2004NatMed10Suppl:S10参照;bジストロフィー神経突起;cミクログリア活性化;d反応性アストロサイト形成;e細胞消失例えば、神経細胞;ミクログリアおよびアストロサイトを含むグリア細胞などのうちの1つまたは複数に対するPKD1モジュレーターの効果を評価する。PKD1モジュレーターの効果は、例えば、治療した非ヒト動物モデルの脳組織に対して、組織化学的に評価することができる。タンパク質沈着を免疫組織化学的に評価することができる。アストロサイトおよびミクログリアを含む神経細胞およびグリア細胞などの細胞を、治療した非ヒト動物モデルから取得し、インビトロで評価することができる。これらの病変を検出するためのプロトコルは、当技術分野で公知である。例えば、Greenfield’sNeuropathologySLoveDNLouisandDWEllison20088thEdOxfordUniversityPressを参照されたい。適切な動物モデルに投与した時、神経変性疾患に関連する少なくとも1つのパラメータの改善をもたらすPKD1モジュレーターを、神経変性疾患を治療するための候補と考える。本発明を、その具体的な実施形態を参照して記載してきたが、様々な変更を行うことができ、同等物は、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく置き換えることができることを、当業者は理解すべきである。さらに、多くの改良は、本発明の目的、趣旨および範囲に、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスの1つまたは複数のステップを適合させて行うことができる。全てのかかる変更は、添付の特許請求の範囲内であると意図される。"