"pH6.0よりもpH7.4で高い親和性で抗原に特異的に結合する、pH依存性の結合を有する抗体であって、pH6.0/pH7.4および25°CでのKD比率および/またはkoff比率が、2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、前記抗体が、pH7.4で前記抗原に対する類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/pH7.4での比較KD比率および/またはkoff比率を有する、pH依存性の結合を有さない抗体と比較して、前記抗原に曝露された場合にインビボでの低減した血漿クリアランスを有する、抗体。pH6.0よりもpH7.4で高い親和性で抗原に特異的に結合する、pH依存性の結合を有する抗体であって、pH6.0/pH7.4および25°CでのKD比率および/またはkoff比率が、2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、前記抗原が、膜に結合しており、かつインビボで可溶性であり、前記抗体が、pH7.4で前記抗原に対する類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/pH7.4での比較KD比率および/またはkoff比率を有する抗体と比較して、細胞膜受容体への増大した局在化を仲介する、抗体。抗原がインターロイキン-6受容体ではない、請求項1または2に記載の抗体。抗原が、非シグナル伝達デコイである可溶性受容体である、請求項2に記載の抗体。pH依存性の結合を有する前記抗体が、抗体薬剤コンジュゲートであり、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用ADCCおよび/または補体依存性細胞傷害作用CDCを仲介する、請求項2に記載の抗体。pH6.0よりもpH7.4で高い親和性で抗原に特異的に結合する、pH依存性の結合を有する抗体であって、pH6.0/pH7.4および25°CでのKD比率および/またはkoff比率が2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、pH7.4で前記抗原に対する類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/pH7.4での比較KD比率および/またはkoff比率を有する、pH依存性の結合を有さない抗体と比較して、前記抗体に曝露された場合に、抗体に結合していない抗原のインビボでの量の減少が引き延ばされる、抗体。pH6.0よりもpH7.4で高い親和性で抗原に特異的に結合する、pH依存性の結合を有する抗体であって、pH6.0/pH7.4および25°CでのKD比率および/またはkoff比率が2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、pH7.4で前記抗原に対する類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/pH7.4での比較KD比率および/またはkoff比率を有する、pH依存性の結合を有さない抗体と比較して、抗体に結合している抗原のインビボでの量が減少する、抗体。pH6.0よりもpH7.4で高い親和性で抗原に特異的に結合する、pH依存性の結合を有するアゴニスト抗体であって、pH6.0/pH7.4および25°CでのKD比率および/またはkoff比率が2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、前記抗原が受容体であり、前記受容体が、pH7.4で前記受容体に対する類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/pH7.4での比較KD比率および/またはkoff比率を有する抗体と比較して、前記抗体に曝露された場合にインビボでの低減したクリアランスを有する、抗体。pH6.0/pH7.4でのKD比率またはkoff比率が、20、30、40、または100以上を超えるか、またはこの間の範囲である、請求項1から8のいずれかに記載の抗体。pH7.4での抗原への抗体の結合が、約0.01nMから約100nMのKDを有する、請求項1から9のいずれかに記載の抗体。pH7.4での抗原への抗体の結合が、約0.1nMから約10nMのKDを有する、請求項10に記載の抗体。pH7.4での抗原への抗体の結合が、約1×10E-4s-1から約1×10E-1s-1のkoffを有する、請求項1から11のいずれかに記載の抗体。pH7.4での抗原への抗体の結合が、約1×10E-3s-1から約1×10E-1s-1のkoffを有する、請求項12に記載の抗体。抗原がPCSK9である、請求項1に記載の抗体。抗原が、IgE、C5、またはDKK1であり、KDが、1.0nMから約10nMの間または1.0nMから約100nMの間の範囲である、請求項6に記載の抗体。治療用抗体で患者を治療するための間隔投与を延長する方法および/または治療用量を減少させる方法であって、治療上効果的な量の請求項1から15のいずれかに記載の抗体を前記患者に投与するステップを包含し、前記抗体が、pH7.4で類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/7.4でのKD比率および/またはkoff比率を有する抗体と比較して、延長された薬力学的効果および/または半減期を有する、方法。pH依存的に抗体結合親和性を調節することによって引き延ばされた半減期および/または薬力学的効果を有する抗体を作製する方法であって、抗体抗原結合が、2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であるpH6.0/pH7.4でのKD比率および/またはkoff比率を有するように、pKaに影響する微小環境を最適化する抗体CDRのヒスチジン残基または他の残基を選択するステップを包含する方法。pKaに影響する微小環境を最適化するCDR残基または他の残基においてヒスチジンに富む抗体ライブラリー。抗体に突然変異を誘発して、少なくとも100nMのpH7.4でのKDを有する抗体親和性を達成するステップをさらに包含する、請求項17に記載の方法。PCSK9に特異的に結合し、配列番号4もしくは配列番号5で示されるVHアミノ酸配列の重鎖可変領域VH相補性決定領域1CDR1、VHCDR2、およびVHCDR3を包含する、単離された抗体、またはCDR1、CDR2、および/もしくはCDR3に1個、2個、3個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体。配列番号3で示されるVLアミノ酸配列の軽鎖可変領域VLCDR1、CDR2、およびCDR3をさらに包含する、請求項20に記載の単離された抗体、またはCDR1、CDR2、および/もしくはCDR3に1個、2個、3個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体。VHCDR1が配列番号6で示されるアミノ酸配列を有し、VHCDR2が配列番号7で示されるアミノ酸配列を有し、VHCDR3が列番号8または9で示されるアミノ酸配列を有し、VLCDR1が配列番号10で示されるアミノ酸配列を有し、VLCDR2が配列番号11で示されるアミノ酸配列を有し、VLCDR3が、配列番号12で示されるアミノ酸配列を有する、請求項21に記載の単離された抗体、または、CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3に1個、2個、3個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体。VHCDR3が配列番号9のアミノ酸配列を有する、請求項22に記載の単離された抗体、または、CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3に1個、2個、3個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体。VH領域が配列番号4または配列番号5を包含し、VL領域が配列番号3を包含する、請求項23に記載の単離された抗体。VH領域が配列番号5を包含する、請求項24に記載の単離された抗体。ATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-10547またはPTA-10548および/またはPTA-10549を有するプラスミドによってコードされている、抗体またはその抗原結合部分。治療上効果的な量の請求項1から26のいずれかに記載の抗体を包含する医薬組成物。請求項1から26のいずれかに記載の抗体を組換えにより産生する宿主細胞。請求項1から26のいずれかに記載の抗体をコードする単離された核酸。ATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-10547またはPTA-10548および/またはPTA-10549を有する、単離されたプラスミド。それを必要とする対象の血液におけるLDLコレステロールのレベルを低減させるための方法であって、治療上効果的な量の請求項1から26に記載の抗体を前記対象に投与するステップを包含する方法。本発明は、生理学的なpHすなわち、pH7.4での抗原結合に対する親和性がエンドソームのpHすなわち、pH6.0または5.5を超えるような、抗原へのpH依存性の結合を有する抗体に関する。言い換えると、pH5.5/pH7.4またはpH6.0/pH7.4でのKD比率またはkoff比率は、2、3、4、8、10、16、20、30、40、または100以上を超えるか、またはこの間の範囲である。このようなpH依存性の抗体は、エンドソームにおいて抗原から優先的に解離する。これは、抗原が抗原介在性のクリアランスを受けるものである場合例えば、PCSK9、pH7.4で同等のKDを有するがpH依存性の結合は有さない抗体と比較して、抗体半減期を増大させ得る。pH依存性の結合を有する抗体は、抗原が抗体に結合している場合に低減したクリアランスを受ける場合例えば、IL6、全抗原半減期を減少させ得る。pH依存性の結合を有する抗体はまた、抗体に結合していない抗原の、抗体介在性の減少を引き延ばし得る。これは、典型的には高レベルで存在する標的抗原例えば、IgE、DKK1、C5、およびSOSTと拮抗する場合に重要であり得る。さらに、このような抗体は、抗原が受容体であり、受容体が、抗体に結合している場合に増大したクリアランスを有する場合例えば、GMCSF受容体、抗原の半減期を増大させ得る。以下に記載される本発明のあらゆる実施形態において、KDおよびkoffは、25°Cまたは37°Cで測定され得る。好ましい実施形態において、pH依存性の結合を有する抗体は、pH6.0よりもpH7.4で高い親和性で抗原に特異的に結合し、pH6.0/pH7.4および25°CでのKD比率および/またはkoff比率は、2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、抗体は、pH7.4で抗原に対する類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/pH7.4での比較KD比率および/またはkoff比率を有する、pH依存性の結合を有さない抗体と比較して、前記抗原に曝露された場合にインビボでの低減した血漿クリアランスを有する。好ましくは、抗原は、インターロイキン-6受容体IL6Rではないか、または好ましくは、WO2010/106812またはWO2009/041621において開示されているように、抗体は、抗IL6R抗体Fv3-m73、Fv4-m73、もしくはH3pI/L73ではない。別の好ましい実施形態において、pH依存性の結合を有する抗体は、pH6.0よりもpH7.4で高い親和性で抗原に特異的に結合し、pH6.0/pH7.4および25°CでのKD比率および/またはkoff比率は、2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、抗体は、膜に結合しており、かつインビボで可溶性であり、抗体は、pH7.4で抗原に対する類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/pH7.4での比較KD比率および/またはkoff比率を有する抗体と比較して、細胞膜受容体への増大した局在化を仲介する。好ましくは、抗原は、IL6Rではないか、または好ましくは、WO2010/106812またはWO2009/041621において開示されているように、抗体は、抗IL6R抗体Fv3-m73、Fv4-m73、もしくはH3pI/L73ではない。別の好ましい実施形態において、抗原は、非シグナル伝達デコイである可溶性受容体である。さらに他の好ましい実施形態において、pH依存性の結合を有する抗体は、抗体薬剤コンジュゲートであり、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用ADCCおよび/または補体依存性細胞傷害作用CDCを仲介する。本発明は、pH6.0よりもpH7.4で高い親和性で抗原に特異的に結合する、pH依存性の結合を有する抗体であって、pH6.0/pH7.4および25°CでのKD比率および/またはkoff比率が2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、pH7.4で抗原に対する類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/pH7.4での比較KD比率および/またはkoff比率を有する、pH依存性の結合を有さない抗体と比較して、前記抗体に曝露された場合に、抗体に結合していない抗原のインビボでの量の減少が引き延ばされる、抗体を含む。本発明は、pH6.0よりもpH7.4で高い親和性で抗原に特異的に結合する、pH依存性の結合を有する抗体であって、pH6.0/pH7.4および25°CでのKD比率および/またはkoff比率が2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、pH7.4で抗原に対する類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/pH7.4での比較KD比率および/またはkoff比率を有する、pH依存性の結合を有さない抗体と比較して、抗体に結合している抗原のインビボでの量が減少する、抗体を提供する。好ましい実施形態において、抗原はオステオポンチンである。本発明はまた、pH6.0よりもpH7.4で高い親和性で抗原に特異的に結合する、pH依存性の結合を有するアゴニスト抗体であって、pH6.0/pH7.4および25°CでのKD比率および/またはkoff比率が2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、抗原が受容体であり、受容体が、pH7.4で受容体に対する類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/pH7.4での比較KD比率および/またはkoff比率を有する抗体と比較して、前記抗体に曝露された場合にインビボでの低減したクリアランスを有する、抗体を提供する。好ましい実施形態において、受容体はGMCSF受容体である。あらゆる前述の抗体の他の好ましい実施形態において、pH6.0/pH7.4でのKD比率またはkoff比率は、20、30、40、または100以上を超えるか、またはこの間の範囲である。他の好ましい実施形態において、pH6.0/pH7.4での好ましいKD比率またはkoff比率は、2~3、2~4、2~8、2~10、2~16、もしくは2~20以上、または3~4、3~8、3~10、3~16、もしくは3~20、または4~8、4~10、4~16、もしくは4~20以上、または8から10、8~16、8~20以上、10~16、10~20以上、または16~20以上の範囲である。先に記載された抗体の他の好ましい実施形態において、pH7.4および25°Cでの抗原への抗体の結合は、約0.01nMから約100nM、またはさらに好ましくは約0.1nMから約10nMのKDを有する。先に記載された抗体の他の好ましい実施形態において、pH7.4での抗原への抗体の結合は、約1×10E-4s-1から約1×10E-1s-1、さらに好ましくは、約1×10E-3s-1から約1×10E-1s-1のkoffを有する。先に記載された抗体の別の好ましい実施形態において、抗原はPCSK9である。1つの好ましい実施形態において、抗PCSK9抗体は、PCSK9抗体H1M300NではないUS2010/0166768を参照されたい。他の好ましい実施形態において、抗原は、IgE、C5、またはDKK1であり、好ましい実施形態において、KDは、1.0nMから約10nMの間または1.0nMから約100nMの間の範囲である。本発明はまた、治療用抗体で患者を治療するための間隔投与を延長する方法および/または治療用量を減少させる方法を提供し、前記方法は、治療上効果的な量の、本発明の先に記載された抗体のいずれかの抗体を患者に投与するステップを包含し、前記抗体は、pH7.4で類似の親和性を有するが2未満であるpH6.0/7.4および25°CでのKD比率および/またはkoff比率を有する抗体と比較して、延長された薬力学的効果および/または半減期を有する。また、pH依存的に抗体結合親和性を調節することによって引き延ばされた半減期および/または薬力学的効果を有する抗体を作製する方法が、本発明によって考慮され、前記方法は、抗体抗原結合が、2、3、4、8、10、16、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であるpH6.0/pH7.4でのKD比率および/またはkoff比率を有するように、pKaに影響する微小環境を最適化する抗体CDRのヒスチジン残基または他の残基を選択するステップを包含する。本発明はまた、pKaに影響する微小環境を最適化するCDR残基内に1個、2個、3個、4個、5個、またはそれ以上のヒスチジン置換を有する抗体を含む、この方法によって作製される抗体を考慮する。上記の方法の好ましい実施形態において、本方法は、抗体に突然変異を誘発して、25°Cで測定すると少なくとも100nMのpH7.4でのKDを有する抗体親和性を達成するステップをさらに包含する。別の実施形態において、本発明は、pKaに影響する微小環境を最適化するCDR残基または他の残基においてヒスチジンに富む抗体ライブラリーを提供する。他の好ましい実施形態において、本発明は、PCSK9に特異的に結合し、配列番号4もしくは配列番号5で示されるVHアミノ酸配列の重鎖可変領域VH相補性決定領域1CDR1、VHCDR2、およびVHCDR3を包含する、単離された抗体、または、CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3に1個、2個、3個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体を提供する。好ましい実施形態において、抗体は、配列番号3で示されるVLアミノ酸配列の軽鎖可変領域VLCDR1、CDR2、およびCDR3をさらに包含し、または、CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3に1個、2個、3個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体である。本発明はまた、PCSK9に特異的に結合し、配列番号6で示されるアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域VH相補性決定領域1CDR1、配列番号7で示されるアミノ酸配列を有するVHCDR2、および/もしくは配列番号8で示されるアミノ酸配列を有するVHCDR3を包含する、単離された抗体、または、CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3に1つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体、ならびに、PCSK9に特異的に結合し、配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するVHCDR1、配列番号7で示されるアミノ酸配列を有するVHCDR2、および/もしくは配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するVHCDR3を包含する、単離された抗体、または、CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3に1個、2個、3個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、配列番号10で示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域VLCDR1、配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するVLCDR2、および/もしくは配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するVLCDR3を包含する、単離された抗体、または、CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3に1個、2個、3個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体を考慮する。上記の好ましい実施形態において、抗体は、配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するVLCDR1、配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するVLCDR2、および/または配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するVLCDR3をさらに包含し、または、CDR1、CDR2、および/もしくはCDR3に1個、2個、3個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体であり、好ましくは、VH領域は配列番号4または配列番号5を包含し、VL領域は、配列番号3を包含し、または配列番号4、配列番号5、および/もしくは配列番号3において1個、2個、3個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体である。本発明のPCSK9抗体の別の好ましい実施形態において、抗体は、1つまたは複数のFc突然変異、好ましくは、N434S、N434H、M428L-N434H二重突然変異体、M428L-N434A二重突然変異体、T250Q-M428L二重突然変異体、およびM428L-N434S二重突然変異体を有する。別の実施形態において、本発明は、ATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-10547またはPTA-10548および/またはPTA-10549を有するプラスミドによってコードされている、抗体またはその抗原結合部分を提供する。また、治療上効果的な量の上記に記載された抗体のいずれか、先に記載された抗体のいずれかの抗体を組換えにより産生する宿主細胞、先に記載された抗体のいずれかをコードしている単離された核酸を包含する医薬組成物が、本発明によって考慮される。また、それを必要とする対象の血液におけるLDLコレステロールのレベルを低減させるための方法であって、治療上効果的な量の、PCSK9抗原を標的化する本発明の抗体のいずれかを対象に投与するステップを包含する方法が、本発明によって考慮される。本発明は、生理学的なpHすなわち、pH7.4での抗原結合に対する親和性がエンドソームのpHすなわち、pH6.0または5.5を超えるような、抗原へのpH依存性の結合を有する抗体に関する。言い換えると、pH5.5/pH7.4またはpH6.0/pH7.4でのKD比率またはkoff比率は、2、3、4、8、10、16、20、30、40、または100以上を超えるか、またはこの間の範囲である。このようなpH依存性の抗体は、エンドソームにおいて抗原から優先的に解離する。これは、抗原が抗原介在性のクリアランスを受けるものである場合例えば、PCSK9、pH7.4で同等のKDを有するがpH依存性の結合は有さない抗体と比較して、循環における抗体の半減期を増大させ得る。pH依存性の結合を有する抗体は、抗原が抗体に結合している場合に低減したクリアランスを受ける場合例えば、IL6、全抗原半減期の平均を減少させ得る。pH依存性の結合を有する抗体はまた、抗体に結合していない抗原の減少を引き延ばし得る。これは、典型的には高レベルで存在する標的抗原と拮抗する場合例えば、IgE、DKK1、C5、およびSOSTに重要であり得る。さらに、このような抗体は、抗原が受容体であり、受容体が、抗体に結合している場合に増大したクリアランスを有する場合例えば、GMCSF受容体、抗原の半減期を増大させ得る。抗原が標的介在性の分解を仲介するならば、例えば抗原が標的介在性のクリアランスを受ける場合、pH依存性の結合を有するこのような抗体を用いてエンドソームにおける解離を達成することによって、抗体の薬力学的効果を増大させることができる例えば、PCSK9。pH依存性の結合を有する抗体は抗原から解離し、抗原介在性の分解を回避し、FcRn結合を介して細胞の外でリサイクリングされ得、pH7.4で類似のKDを有するがpH依存性の結合は有さない抗体よりも長い半減期を有する。pH依存性の結合を有するこのような抗体の使用はまた、可溶性抗原が高濃度で存在する場合に例えば、IgE、C5、DKK1、またはSOST、治療的に有用である。エンドソームにおいて抗原から解離し、リソソームにおいて抗原が分解されると、抗体は、血漿内にリサイクリングされてさらなる遊離抗原に結合することができ、抗体に結合していない抗原の減少を引き延ばすことができ、pH7.4で類似のKDを有するがpH依存性の結合は有さない抗体と比較して、所要の治療用量を減少させることができる。さらに、pH依存性の結合を有する抗体の使用は、抗原が膜結合形態および可溶性形態で存在する場合、例えば受容体である場合に、有用であり得、膜結合形態への結合を増強することが望ましい。可溶性形態から解離することによって、抗体は、膜形態に再結合する機会が増大し、細胞膜に近接した抗体が増大する。二価様式で膜形態に結合すると、効果的な親和性が高くなり得るか、または、親和力の効果を介して、効果的な解離速度が緩やかになり得る。これは、膜結合形態および可溶性形態の両方で存在する抗原を標的化する場合に抗体薬剤コンジュゲートADCを用いるために適用される。内皮におけるFcRn含有細胞において、可溶性抗原は、ADCのリサイクリングで血漿区画に一掃され、膜結合抗原に結合する機会が得られる。pH依存性の結合を有する抗体では、二価または一価での膜結合形態への結合の増大によって、膜結合抗原との抗体の内在化および細胞死が増大する。二価様式で受容体に結合すると、親和力は、効果的な親和性を増大させ得るか、または効果的な解離速度を緩やかにし得る。ADCCおよび補体依存性細胞傷害作用CDCの機構はまた、pH依存性の結合を有する抗体の使用において活用することができる。内皮におけるFcRn含有細胞において、可溶性抗原は一掃され、ADCは血漿区画にリサイクリングされ、膜結合抗原に結合する機会が得られる。可溶性受容体から抗体が遊離すると、利用可能な遊離抗体が増大し、これが次に膜結合抗原に結合して細胞の死滅を増大させ得る。一般的な技術本発明の実施は、別段の指示がない限り、分子生物学組換え技術を含む、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を採用し、これらは当技術分野の技術の範囲内である。このような技術は、MolecularCloning:ALaboratlryManual、第2版Sambrookら、1989ColdSpringHarborPress;OligonucleotideSynthesisM.J.Gait編、1984;MethodsinMolecularBiology、HumanaPress;CellBiology:ALaboratoryNotebookJ.E.Cellis編、1998AcademicPress;AnimalCellCultureR.I.Freshney編、1987;IntroductiontoCellandTissueCultureJ.P.MatherおよびP.E.Roberts、1998PlenumPress;CellandTissueCulture:LaboratoryProceduresA.Doyle、J.B.Griffiths、およびD.G.Newell編、1993~1998J.WileyandSons;MethodsinEnzymologyAcademicPress,Inc.;HandbookofExperimentalImmunologyD.M.WeirおよびC.C.Blackwell編;GeneTransferVectorsforMammalianCellsJ.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987;CurrentProtocolsinMolecularBiologyF.M.Ausubelら編、1987;PCR:ThePolymeraseChainReactionMullisら編、1994;CurrentProtocolsinImmunologyJ.E.Coliganら編、1991;ShortProtocolsinMolecularBiologyWileyandSons、1999;ImmunobiologyC.A.JanewayおよびP.Travers、1997;AntibodiesP.Finch、1997;Antibodies:apracticalapproachD.Catty.編、IRLPress、1988~1989;Monoclonalantibodies:apracticalapproachP.ShepherdおよびC.Dean編、OxfordUniversityPress、2000;Usingantibodies:alaboratorymanualE.HarlowおよびD.LaneColdSpringHarborLaboratoryPress、1999;TheAntibodiesM.ZanettiおよびJ.D.Capra編、HarwoodAcademicPublishers、1995などの文献において完全に説明されている。定義抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも1つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的結合し得る、免疫グロブリン分子である。本明細書において用いられる場合、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、あらゆるその抗原結合断片すなわち、抗原結合部分またはその一本鎖、抗体を包含する融合タンパク質、および抗原認識部位を包含する免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された立体構造を包含し、これには、例えば、限定はしないが、一本鎖scFv抗体およびドメイン抗体例えば、ヒト、ラクダ、またはサメのドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、vNAR、およびビスscFvが含まれる例えば、HollingerおよびHudson、NatureBiotech23:1126~1136、2005を参照されたい。抗体には、あらゆるクラス、例えばIgG、IgA、またはIgMまたはそのサブクラスの抗体が含まれ、抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。5つの主要なクラスの免疫グロブリン、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのいくつかは、さらにサブクラスアイソタイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。抗体の抗原結合部分という用語は、本明細書において用いられる場合、所与の抗原例えば、標的Xに特異的に結合する能力を保持している、無傷抗体の1つまたは複数の断片を言う。抗体の抗原結合機能は、無傷抗体の断片によって行われ得る。抗体の抗原結合部分という用語に包含される結合断片の例には、Fab、Fab’、Fab’2、VHドメインおよびCH1ドメインから構成されるFd断片、抗体の単一のアームのVLドメインおよびVHドメインから構成されるFv断片、単一ドメイン抗体dAb断片Wardら、Nature341:544~546、1989、ならびに単離された相補性決定領域CDRが含まれる。本明細書において用いられる場合、CDRは、Kabatの定義、Chothiaの定義、拡張定義、AbMの定義、接触定義、および/または立体構造定義のいずれかに従って定義され得る。CDRを構成する特定の抗体におけるアミノ酸残基の同一性は、当技術分野において周知の方法を用いて決定することができる。本明細書において用いられる場合、抗体のCDRは、Kabatらによって最初に定義された超可変領域として同定することができる。例えば、Kabatら、1992、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、第5版、PublicHealthService、NIH、WashingtonD.C.を参照されたい。CDRの位置はまた、Chothiaらによって最初に記載された構造的ループ構造として同定することができる。例えば、Chothiaら、Nature342:877~883、1989を参照されたい。CDRを同定するための他のアプローチには、KabatとChothiaとの間の折衷であり、OxfordMolecularsAbM抗体モデリングソフトウェア現在はAccelrys登録商標を用いて誘導される、AbM定義、またはMacCallumら、J.Mol.Biol.262:732~745、1996において説明されている、観察された抗原接触に基づくCDRの接触定義が含まれる。本明細書においてCDRの立体構造定義と呼ばれる別のアプローチにおいて、CDRの位置は、抗原結合に対するエンタルピーの寄与を生じさせる残基として同定することができる。例えば、Makabeら、JournalofBiologicalChemistry、283:1156~1166、2008を参照されたい。さらに他のCDR結合定義は、上記のアプローチの1つに厳密に従っていないかもしれないが、それでも、前記定義は、特定の残基もしくは残基群またはさらにCDR全体が抗原結合に顕著には影響しないという予測または実験的所見に照らして短くまたは長くされ得るものの、KabatCDRの少なくとも一部とオーバーラップする。本明細書において用いられる場合、CDRは、アプローチの組み合わせを含む、当技術分野において知られている任意のアプローチによって定義されるCDRを言い得る。本明細書において用いられる場合、モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を言い、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る考えられる天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる抗原決定基エピトープに対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に対するものである。修飾語モノクローナルは、抗体の特徴が、実質的に均質な抗体集団から得られることを示し、あらゆる特定の方法によって抗体が生産されることを要するとは解釈されない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein、1975、Nature256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製することができるか、または米国特許第4,816,567号において記載されているような組換えDNA法によって作製することができる。モノクローナル抗体はまた、例えばMcCaffertyら、1990、Nature348:552~554において記載されている技術を用いて生成されるファージライブラリーから単離することができる。本明細書において用いられる場合、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片例えば、Fv、Fab、Fab、Fab’2、または抗体の他の抗原結合部分配列である、非ヒト例えば、マウス抗体の形態を言う。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域CDRの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種ドナー抗体のCDRの残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリンレシピエント抗体である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域FRの残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも組み込まれたCDR配列またはフレームワーク配列でも見られないが抗体の性能をさらに洗練および最適化するために含まれる残基を包含し得る。通常、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、FR領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のFR領域に相当する、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを包含する。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリンの定常領域または定常ドメインFc、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域または定常ドメインの少なくとも一部を包含する。好ましいものは、WO99/58572において記載されているように修飾されたFc領域を有する抗体である。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体と比較して改変されている1つまたは複数のCDRCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2、および/またはCDRH3を有し、これはまた、元の抗体の1つまたは複数のCDRに由来する1つまたは複数のCDRとも呼ばれる。本明細書において用いられる場合、ヒト抗体は、ヒトによって産生され得る抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、および/または当業者に知られているかもしくは本明細書において開示されているヒト抗体を作製するための技術のいずれかを用いて作製されている抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、少なくとも1つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも1つのヒト軽鎖ポリペプチドを包含する抗体が含まれる。1つのこのような例は、マウス軽鎖ポリペプチドおよびヒト重鎖ポリペプチドを包含する抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において知られている様々な技術を用いて生産することができる。1つの実施形態において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択されるVaughanら、1996、NatureBiotechnology、14:309~314;Sheetsら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:6157~6162;HoogenboomおよびWinter、1991、J.Mol.Biol.、227:381;Marksら、1991、J.Mol.Biol.、222:581。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン位置が内在位置の代わりにトランスジェニックによって導入されている動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているマウスの免疫化によって作製することができる。このアプローチは、米国特許第5,545,807号、米国特許第5,545,806号、米国特許第5,569,825号、米国特許第5,625,126号、米国特許第5,633,425号、および米国特許第5,661,016号において記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトBリンパ球を不死化することによって調製することができるこのようなBリンパ球は、個体から回収することができるか、またはインビトロで免疫化されていてよい。例えば、Coleら、MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy、AlanR.Liss、p.77、1985;Boernerら、1991、J.Immunol.、1471:86~95;および米国特許第5,750,373号を参照されたい。抗体の可変領域は、単独の、または組み合わされた、抗体軽鎖可変領域または抗体重鎖可変領域を言う。当技術分野において知られているように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域を含む3つの相補性決定領域CDRによって繋がれている4つのフレームワーク領域FRから構成される。それぞれの鎖におけるCDRは、FRによって近位で結び付けられており、他の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。CDRを決定するために少なくとも2つの技術が存在する:1異種間の配列多様性に基づくアプローチすなわち、Kabatら、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest第5版、1991、NationalInstitutesofHealth、BethesdaMD、および2抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチAl-lazikaniら、1997、J.Molec.Biol.273:927~948。本明細書において用いられる場合、CDRは、いずれかのアプローチによってまたは両アプローチの組み合わせによって規定されるCDRを言うことができる。当技術分野において知られているように、抗体の定常領域は、単独の、または組み合わされた、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を言う。本明細書において用いられる場合、用語PCSK9は、あらゆる形態のPCSK9、およびPCSK9の活性の少なくとも一部を保持しているその変異体を言う。ヒトPCSK9への具体的な言及などによる別段の指示がない限り、PCSK9には、全ての哺乳動物種、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシの、非変性配列PCSK9が含まれる。1つの典型的なヒトPCSK9は、Uniprot受託番号Q8NBP7配列番号16として見ることができる。本明細書において用いられる場合、PCSK9アンタゴニスト抗体は、PCSK9の生物学的活性を阻害し得る抗体、ならびに/または、LDLRのPCSK9介在性の下方調節およびLDLの血液クリアランスのPCSK9介在性の減少を含む、PCSK9シグナル伝達によって仲介される下流経路1つまたは複数を阻害し得る抗体を言う。pH依存性のPCSK9アンタゴニスト抗体は、LDLR相互作用および/またはPCSK9に対する細胞応答の誘出などの、PCSK9シグナル伝達によって仲介される下流経路を含む、PCSK9の生物学的活性を、顕著な程度を含むあらゆる程度までブロックする、前記活性に拮抗する、抑制する、または低減させる抗体を包含する。本発明の目的では、用語PCSK9アンタゴニスト抗体が、PCSK9自体、PCSK9の生物学的活性限定はしないが、LDLRとの相互作用、LDLRの下方調節、および血液LDLクリアランスの減少のあらゆる態様を仲介するその能力を含む、または生物学的活性の結果を、あらゆる有意義な程度で、実質的に無効にする、減少させる、または中和する、全ての先に同定された用語、表題、機能的状態、および機能的特徴を包含することが明確に理解されよう。いくつかの実施形態において、pH依存性のPCSK9アンタゴニスト抗体は、PCSK9に結合し、LDLRとの相互作用を防ぐ。PCSK9アンタゴニスト抗体の例は、本明細書において提供される。用語ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、およびタンパク質は、本明細書において、あらゆる長さの、好ましくは比較的短い例えば、10~100アミノ酸のアミノ酸鎖を言うために、区別せずに用いられる。鎖は、線状または分枝鎖状であり得、これは、修飾されたアミノ酸を包含し得、かつ/または非アミノ酸によって中断されている場合がある。この用語はまた、天然にまたは介入によって、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはあらゆる他の操作もしくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されているアミノ酸鎖を包含する。同様にこの定義に含まれるものは、例えば、アミノ酸の1つまたは複数の類似体例えば、非天然アミノ酸などを含むおよび当技術分野において知られている他の修飾を含むポリペプチドである。ポリペプチドが一本鎖または会合した鎖として生じ得ることが理解される。当技術分野において知られているように、本明細書において区別せずに用いられるポリヌクレオチドまたは核酸は、あらゆる長さのヌクレオチド鎖を言い、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および/またはその類似体、あるいはDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによって鎖内に組み込まれ得るあらゆる基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチドおよびその類似体を包含し得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、鎖の組み立ての前または後に行われ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合の後に、標識成分とのコンジュゲーションなどによってさらに修飾され得る。他のタイプの修飾には、例えば、キャップ、類似体での天然のヌクレオチドの1つまたは複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなどおよび荷電結合例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどでの修飾、懸垂部分、例えばタンパク質例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなどを含む修飾、インターカレーター例えば、アクリジン、プソラレンなどでの修飾、キレート剤例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属などを含む修飾、アルキル化剤を含む修飾、修飾された結合例えば、アルファアノマー核酸などでの修飾、ならびに未修飾の形態のポリヌクレオチド1つまたは複数が含まれる。さらに、糖に元々存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えばホスホン酸基、リン酸基によって置き換えるか、標準的な保護基によって保護するか、またはさらなるヌクレオチドに対するさらなる結合を調製するために活性化するか、または固体担体にコンジュゲートすることができる。5’末端および3’末端のOHは、リン酸化するか、またはアミンもしくは1から20個の炭素原子から構成される有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルはまた、標準的な保護基に誘導体化することができる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、2’-O-メチルリボース、2’-O-アリルリボース、2’-フルオロリボース、または2’-アジドリボース、炭素環式の糖類似体、アルファアノマー糖またはベータアノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース、またはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式の類似体、および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドを含む、当技術分野において一般に知られている類似形態のリボース糖またはデオキシリボース糖を含み得る。1つまたは複数のホスホジエステル結合は、別の結合基によって置き換えることができる。これらの別の結合基には、限定はしないが、ホスフェートがPOSチオエート、PSSジチオエート、ONR2アミデート、POR、POOR’、CO、またはCH2ホルムアセタール式中、RまたはR’は独立して、Hであるか、または、置換されたもしくは置換されていない、エーテル-O-結合を含んでいてもよいアルキル1~20C、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルキルによって置き換えられている実施形態が含まれる。ポリヌクレオチド内の全ての結合が同一である必要はない。先の記載は、本明細書において言及される、RNAおよびDNAを含む全てのポリヌクレオチドに適用される。抗体は、それが他の物質に結合するよりも優れた親和性、親和力で、より容易に、かつ/または長い期間で結合するならば、標的に特異的に結合するまたは優先的に結合する。例えば、PCSK9エピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、それが他のPCSK9エピトープまたは非PCSK9エピトープに結合するよりも優れた親和性、親和力で、より容易に、かつ/または長い期間でこのエピトープに結合する抗体である。この定義を読むことで、例えば、第1の標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体または部分もしくはエピトープが、第2の標的に特異的にまたは優先的に結合する可能性もしない可能性もあることも理解される。このように、特異的な結合または優先的な結合は、それが含み得るとしても必ずしも排他的な結合を要するわけではない。通常、しかしそうとは限らないが、結合への言及は、優先的な結合を意味する。非シグナル伝達デコイは、リガンドをその同族受容体1つまたは複数から隔離する可溶性受容体アイソフォームまたは結合タンパク質である。本明細書において用いられる場合、実質的に純粋なは、少なくとも50純粋なすなわち、汚染物質を有さない、さらに好ましくは少なくとも90純粋な、さらに好ましくは少なくとも95純粋な、さらに好ましくは少なくとも98純粋な、および最も好ましくは少なくとも99純粋な材料を言う。宿主細胞には、ポリヌクレオチドインサートを組み込むためのベクター1つまたは複数のレシピエントであり得るか、または前記レシピエントとなっている、個別の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して、元の親細胞に必ずしも完全に同一である必要はない形態学的にまたはゲノムDNA相補鎖において。宿主細胞には、インビボで本発明のポリヌクレオチド1つまたは複数でトランスフェクトされた細胞が含まれる。当技術分野において知られているように、用語Fc領域は、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために用いられる。Fc領域は、非変性配列のFc領域または変異体Fc領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変化し得るが、ヒトIgG重鎖のFc領域は、通常、Cys226位のアミノ酸残基から、またはPro230から、そのカルボキシル末端まで延びていると規定される。Fc領域における残基の番号付けは、KabatにおけるようなEU指標のものである。Kabatら、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、第5版、PublicHealthService、NationalInstitutesofHealth、Bethesda、Md.、1991。免疫グロブリンのFc領域は、通常、2つの定常ドメイン、CH2およびCH3を包含する。当技術分野において用いられるように、Fc受容体およびFcRは、抗体のFc領域に結合する受容体を記載する。好ましいFcRは、非変性配列のヒトFcRである。さらに、好ましいFcRは、IgG抗体を結合するものガンマ受容体であり、対立遺伝子変異体を含む、FcγRIサブクラス、FcγRIIサブクラス、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を含み、あるいは、これらの受容体のスプライシングされた形態を含む。FcγRII受容体には、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有するFcγRIIA活性化受容体およびFcγRIIB阻害受容体が含まれる。FcRは、RavetchおよびKinet、1991、Ann.Rev.Immunol.、9:457~92;Capelら、1994、Immunomethods、4:25~34;およびdeHaasら、1995、J.Lab.Clin.Med.、126:330~41において概説されている。FcRにはまた、胎児への母親のIgGの移入に関与する、新生児受容体FcRnが含まれるGuyerら、1976J.Immunol.、117:587;およびKimら、1994、J.Immunol.、24:249。用語競合するは、抗体に関して本明細書において用いられる場合、第1の抗体またはその抗原結合部分が、第2の抗体またはその抗原結合部分の結合に十分に類似の様式でエピトープに結合し、その結果、第1の抗体とその同族エピトープとの結合の結果が、第2の抗体の不存在下での第1の抗体の結合と比較して、第2の抗体の存在下で検出可能に低下することを意味する。しかし、第2の抗体がそのエピトープに結合することもまた第1の抗体の存在下で検出可能に減少するという別の可能性は、必ずしも当てはまらなくてよい。すなわち、第1の抗体がそのそれぞれのエピトープに結合することを第2の抗体が阻害することを伴わずに、第1の抗体は、第2の抗体がそのエピトープに結合することを阻害し得る。しかし、各抗体が他の抗体とその同族エピトープまたはリガンドとの結合を検出可能に阻害する場合、それが同程度であろうと、より大きな程度であろうと、より小さな程度であろうと、抗体は、それらのそれぞれのエピトープ1つまたは複数の結合について互いに相互競合すると言われる。競合抗体および相互競合抗体の両方が、本発明に包含される。このような競合または相互競合が生じる機構例えば、立体障害、立体構造の変化、または共通のエピトープもしくはその一部への結合に関わらず、当業者には、本明細書において提供される教示に基づいて、このような競合抗体および/または相互競合抗体が包含され、本明細書において開示されている方法に有用であり得ることが理解されよう。機能的なFc領域は、非変性配列のFc領域の少なくとも1つのエフェクター機能を有する。典型的なエフェクター機能には、C1qの結合、CDC、Fc受容体の結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用、食作用、細胞表面受容体例えば、B細胞受容体の下方調節などが含まれる。このようなエフェクター機能は、通常、Fc領域が結合ドメイン例えば、抗体可変ドメインと組み合わされていることを要し、このような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野において知られている様々なアッセイを用いて評価され得る。非変性配列のFc領域は、天然に見られるFc領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を包含する。変異体Fc領域は、少なくとも1つのアミノ酸修飾によって非変性配列のFc領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を包含し、それでも、非変性配列のFc領域の少なくとも1つのエフェクター機能を保持している。好ましくは、変異体Fc領域は、非変性配列のFc領域または親ポリペプチドのFc領域と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば、非変性配列のFc領域または親ポリペプチドのFc領域における約1から約10のアミノ酸の置換、好ましくは約1から約5のアミノ酸置換を有する。本明細書における変異体Fc領域は、非変性配列のFc領域および/または親ポリペプチドのFc領域と少なくとも約80の配列同一性を好ましくは有し、最も好ましくは、それと少なくとも約90の配列同一性を有し、さらに好ましくは、それと少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、少なくとも約99の配列同一性を有する。推定最小薬理作用量MABELは、ヒトにおける最小薬理作用をもたらす推定最小用量を意味する。安全係数が、通常、MABELからのヒトにおける初回投与についての計算に適用される。MABELの計算は、全ての関連するインビトロおよびインビボでの薬物動態学的および薬力学的な情報を利用するべきである。本明細書において用いられる場合、治療および治療上効果的なは、有利なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。pH依存性のPCSK9アンタゴニスト抗体に関連する本発明の目的では、有利なまたは所望の臨床結果には、限定はしないが、LDLクリアランスの増強;ならびに代謝障害および/もしくは摂食障害により生じる、または家族性高コレステロール血症、アテローム性脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、およびさらに一般には、心血管疾患CVDを含む、異常なコレステロールレベルおよび/またはリポタンパク質レベルの発生の低減または改善の、1つあるいは複数が含まれる。発生の低減は、重症度のあらゆる低減を意味するこの症状に一般に用いられる他の薬剤および/または治療法例えば、前記薬剤および/または治療法への曝露の必要性および/または量の低減を含み得る。当業者には理解されるように、個体は、治療に対する応答の点で様々であり得、したがって、例えば、発生を低減させる方法は、このような投与がその特定の個体において発生をこのように低減させる可能性が高い場合があるという妥当な期待に基づいて、pH依存性の抗体の投与を反映する。改善は、治療を投与していない場合と比較して、治療を投与した後に1つまたは複数の症候が軽減または向上することを意味する。改善にはまた、症候の期間を短縮するかまたは低減させることが含まれる。本明細書において用いられる場合、薬剤、化合物、または医薬組成物の効果的な投与量または効果的な量は、あらゆる1つまたは複数の有利なまたは所望の結果に影響するために十分な量である。予防的使用では、有利なまたは所望の結果には、疾患の生化学的、組織学的、および/または行動的症候、その合併症、ならびに疾患の発症の間に現れる中間の病理学的表現型を含む、疾患の、リスクの排除もしくは低減、重症度の軽減、または発生の遅延が含まれる。pH依存性のPCSK9アンタゴニスト抗体の治療的使用では、有利なまたは所望の結果には、高コレステロール血症、または脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、CVD、もしくは冠動脈性心疾患の1つもしくは複数の症候の低減、疾患の治療に必要な他の医薬品の用量の減少、別の医薬品の効果の増強、および/あるいは患者の疾患の進行の遅延などの臨床結果が含まれる。効果的な投与量は、1回または複数回の投与で投与され得る。本発明の目的では、薬剤、化合物、または医薬組成物の効果的な投与量は、直接的にまたは間接的に予防的または治療的な治療を達成するために十分な量である。臨床的な背景において理解されるように、薬剤、化合物、または医薬組成物の効果的な投与量は、別の薬剤、化合物、または医薬組成物と組み合わせて達成されてもされなくてもよい。したがって、効果的な投与量は、1つまたは複数の治療物質を投与する背景において考慮され得、単一の作用物質は、1つまたは複数の他の作用物質と組み合わせて、所望の結果が得られ得るかまたは得られる場合、効果的な量で与えられていると考えられ得る。個体または対象は、哺乳動物であり、さらに好ましくはヒトである。哺乳動物にはまた、限定はしないが、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットが含まれる。本明細書において用いられる場合、ベクターは、宿主細胞において1つまたは複数の目的の遺伝子1つまたは複数または配列1つまたは複数を送達し得、好ましくは発現し得る構築物を意味する。ベクターの例には、限定はしないが、ウイルスベクター、裸DNA発現ベクターまたは裸RNA発現ベクター、プラスミド、コスミドベクターまたはファージベクター、カチオン縮合物質を伴うDNA発現ベクターまたはRNA発現ベクター、リポソーム内にカプセル化されたDNA発現ベクターまたはRNA発現ベクター、および特定の真核細胞、例えばプロデューサー細胞が含まれる。本明細書において用いられる場合、発現制御配列は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例えば構成的なもしくは誘導性のプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に機能可能に結合している。本明細書において用いられる場合、薬学的に許容できる担体または薬学的に許容できる賦形剤には、活性成分と組み合わされた場合にその成分が生物学的活性を保持することを可能にし、かつ対象の免疫系と非反応性である、あらゆる材料が含まれる。例には、限定はしないが、あらゆる標準的な薬学的担体、例えばリン酸緩衝溶液、水、エマルジョン、例えば油/水エマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤が含まれる。エアゾールまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液PBSまたは通常の0.9生理食塩水である。このような担体を包含する組成物は、周知の従来の方法によって製剤される例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences、第18版、A.Gennaro編、MackPublishingCo.、Easton、PA、1990;およびRemington、TheScienceandPracticeofPharmacy、第20版、MackPublishing、2000を参照されたい。用語konは、本明細書において用いられる場合、抗原への抗体の会合の速度定数を言う。具体的には、速度定数konおよびkoffおよび平衡解離定数は、Fab抗体断片すなわち、一価のおよび抗原を用いて測定される。用語koffは、本明細書において用いられる場合、抗体/抗原複合体からの抗体の解離の速度定数を言う。用語KDは、本明細書において用いられる場合、抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を言う。KD比率およびkoff比率を決定するための、それぞれkaおよびkdである会合速度定数および解離速度定数の決定は、捕捉試薬を介してセンサー表面上に低能力で固定されるリガンドの結合に関して分析物が一価である条件下で、分析物/リガンド相互作用を特徴付けするための、表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサーを用いて行われる。分析は、Karlssonら、Anal.Biochem349、136~147、2006において記載されているような動態滴定方法を用いて行われる。所与のアッセイに採用されるセンサーチップ、捕捉試薬、およびアッセイ緩衝液は、センサー表面上へのリガンドの安定な捕捉をもたらし、表面への分析物の非特異的な結合を最小にし、かつMyszka、J.Mol.Recognit12、279~284、1999における推奨による動態分析に適切な分析物結合応答をもたらすように選択される。分析物/リガンド相互作用当たりの分析物結合応答は二重参照され、MyszkaおよびMortonら、Biophys.Chem64、127~1371997において記載されているようなグローバルパラメータとしてka、kd、およびRmaxを有する、1:1のラングミュアマストランスポート限定モデルに適合させられる。平衡解離定数KDは、運動速度定数の比率から推定され、KD=kd/kaである。このような決定は、好ましくは、25°Cまたは37°Cで行われる。A.障害を予防または治療するための方法pH依存性のPCSK9アンタゴニスト抗体に関する1つの態様において、本発明は、効果的な量の、循環PCSK9に拮抗するpH依存性のPCSK9アンタゴニスト抗体を個体に投与するステップを包含する、個体における高コレステロール血症、および/または脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、CVD、もしくは冠動脈性心疾患の少なくとも1つの症候を治療または予防するための方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、個体における高コレステロール血症、および/または脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、CVD、もしくは冠動脈性心疾患の少なくとも1つの症候の治療または予防において用いるための、効果的な量の、循環PCSK9に拮抗するpH依存性のPCSK9アンタゴニスト抗体を提供する。本発明はさらに、個体における高コレステロール血症、および/または脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、CVD、もしくは冠動脈性心疾患の少なくとも1つの症候を治療または予防するための製剤の製造における、効果的な量の、細胞外PCSK9または循環PCSK9に拮抗するpH依存性のPCSK9アンタゴニスト抗体の使用を提供する。有利には、抗体の治療的投与によって、血液コレステロールが低下し、かつ/または血液LDLが低下する。好ましくは、血液コレステロールおよび/または血液LDLは、投与前よりも少なくとも約10または15低い。さらに好ましくは、血液コレステロールおよび/または血液LDLは、抗体の投与前よりも少なくとも約20低い。さらに好ましくは、血液コレステロールおよび/または血液LDLは、抗体の投与前よりも少なくとも30低い。有利には、血液コレステロールおよび/または血液LDLは、抗体の投与前よりも少なくとも40低い。さらに有利には、血液コレステロールおよび/または血液LDLは、抗体の投与前よりも少なくとも50低い。非常に好ましくは、血液コレステロールおよび/または血液LDLは、抗体の投与前よりも少なくとも60低い。最も好ましくは、血液コレステロールおよび/または血液LDLは、抗体の投与前よりも少なくとも70低い。本明細書において記載されている全ての方法に関して、あらゆる適切な抗原に対するpH依存性の抗体への言及にはまた、1つまたは複数のさらなる作用物質を包含する組成物が含まれる。これらの組成物はさらに、適切な賦形剤、例えば、当技術分野において周知の、緩衝液を含む薬学的に許容できる賦形剤を包含し得る。本発明は、単独で、または他の従来の治療方法と組み合わせて用いることができる。pH依存性の抗体は、あらゆる適切な経路を介して個体に投与することができる。当業者には、本明細書において記載されている実施例は限定することを意図したものではなく、利用可能な技術の例示を意図したものであることが理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態において、pH依存性の抗体は、既知の方法に従って、例えば、例えばボーラス注入としてのもしくは一定時間にわたる連続点滴による静脈内投与、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、経皮経路、皮下経路、関節内経路、舌下経路、滑液嚢内経路、吹送を介する経路、髄腔内経路、経口経路、吸入経路、または局部経路によって、個体に投与される。投与は、全身的なもの、例えば静脈内投与であり得るか、または局所的なものであり得る。ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含む、液体製剤のための市販されているネブライザーが、投与に有用である。液体製剤は直接的に噴霧することができ、凍結乾燥された粉末は、再構成した後に噴霧することができる。あるいは、pH依存性の抗体は、フッ化炭素製剤および定量吸入器を用いてエアゾール化することができるか、または凍結乾燥および粉砕された粉末として吸入され得る。1つの実施形態において、pH依存性の抗体は、部位特異的送達技術または標的化された局所的送達技術を介して投与される。部位特異的送達技術または標的化された局所的送達技術の例には、pH依存性の抗体の様々な移植可能な貯蔵源、または局所的送達カテーテル、例えば点滴カテーテル、留置カテーテル、もしくは針付きカテーテル、人工血管移植、外膜ラップ、シャントおよびステント、もしくは他の移植可能な装置、部位特異的担体、直接的な注入、または直接的な塗布が含まれる。例えば、PCT公開WO00/53211および米国特許第5,981,568号を参照されたい。pH依存性の抗体の様々な製剤を投与に用いることができる。いくつかの実施形態において、pH依存性の抗体は、薄めることなく投与することができる。いくつかの実施形態において、pH依存性の抗体および薬学的に許容できる賦形剤は、様々な製剤の形態であり得る。薬学的に許容できる賦形剤は、当技術分野において知られており、薬理学的に効果的な物質の投与を容易にする、比較的不活性の物質である。例えば、賦形剤は、形状もしくは稠度を付与し得るか、または希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤には、限定はしないが、安定剤、湿潤剤、および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、および皮膚浸透エンハンサーが含まれる。非経口および経口の薬剤送達のための賦形剤および製剤は、Remington、TheScienceandPracticeofPharmacy、第20版、MackPublishing2000において説明されている。これらの作用物質は、薬学的に許容できる媒体、例えば生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などと組み合わせることができる。特定の投薬レジメン、すなわち、用量、タイミング、および反復は、特定の個体およびその個体の病歴に応じる。pH依存性の結合を有する抗体はまた、本明細書において記載されているように、吸入を介して投与することができる。通常、pH依存性の抗体の投与では、最初の候補投与量は、約2mg/kgであり得る。本発明の目的では、典型的な1日投与量は、上記の因子に応じて、約3μg/kgから30μg/kgのいずれかから、300μg/kgまで、3mg/kgまで、30mg/kgまで、100mg/kgまで、またはそれ以上の範囲であり得る。例えば、約1mg/kg、約2.5mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、および約25mg/kgの投与量を用いることができる。数日以上にわたる反復投与では、条件に応じて、治療は、症候の所望の抑制が生じるまで、または十分な治療レベルが達成されるまで、例えば血液LDLレベルを低減させるために持続される。典型的な投与レジメンは、約2mg/kgの初回用量の投与、その後の約1mg/kgの維持用量の抗体の週1回の投与、またはその後の約1mg/kgの維持用量の1週間おきの投与を包含する。しかし、医師が達成することを望む薬物動態学的な減衰のパターンに応じて、他の投与レジメンが有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、週に1から4回の投与が考慮される。他の実施形態において、月に1回または1ヶ月おきもしくは3ヶ月おきに1回の投与が考慮される。この治療法の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。投与レジメン用いられる抗体を含むは、経時的に変化し得る。本発明の目的では、pH依存性の抗体の適切な投与量は、採用される抗体またはその組成物、治療すべき症候のタイプおよび重症度、作用物質が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、これまでの治療法、患者の病歴および作用物質に対する応答、患者の血液抗原レベル、患者の抗原の合成速度およびクリアランス速度、患者の投与される作用物質のクリアランス速度、ならびに主治医の裁量に応じる。典型的には、臨床医は、所望の結果を達成する投与量に達するまで、pH依存性の抗体を投与する。用量および/または頻度は、治療の過程で変化し得る。半減期などの経験的考察は、通常、投与量の決定に寄与する。例えば、ヒト免疫系と適合する抗体、例えばヒト化抗体または完全なヒト抗体は、抗体の半減期を引き延ばすため、および抗体が宿主の免疫系によって攻撃されることを防ぐために用いることができる。投与の頻度は、治療法の過程で決定および調節することができ、通常は、症候、例えば、高コレステロール血症の治療および/または抑制および/または改善および/または遅延に基づくが、必ずしもというわけではない。あるいは、抗体の持続連続放出製剤が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤および装置は、当技術分野において知られている。1つの実施形態において、アンタゴニスト抗体の投与量は、アンタゴニスト抗体を1回または複数回投与されている個体において経験的に決定することができる。個体は、漸増的な投与量の抗体を投与される。有効性を評価するために、疾患の指標を追跡することができる。本発明における方法に従ったpH依存性の抗体の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的なものであるか予防的なものであるか、および熟練医師に知られている他の因子に応じて、連続的なまたは断続的なものであり得る。pH依存性の抗体の投与は、事前に選択された期間にわたって基本的に連続的であり得るか、または間隔をあけた一連の投与であり得る。いくつかの実施形態において、2つ以上のアンタゴニスト抗体が存在し得る。少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの異なる、またはさらなるアンタゴニスト抗体および/またはペプチドが存在し得る。通常、これらの抗体またはペプチドは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有し得る。pH依存性の抗体はまた、他の治療法と組み合わせて用いることができる。pH依存性の抗体はまた、作用物質の有効性を増強するおよび/または補う働きをする他の作用物質と組み合わせて用いることができる。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、採用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸などの緩衝液;塩化ナトリウムなどの塩;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、およびm-クレゾール;低分子量約10残基未満のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体例えば、Zn-タンパク質錯体;ならびに/またはTWEEN商標、PLURONICS商標、もしくはポリエチレングリコールPEGなどの非イオン性界面活性剤を包含し得る。pH依存性の抗体を含むリポソームは、Epsteinら、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688;Hwangら、1980、Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030;ならびに米国特許第4,485,045号および米国特許第4,544,545号において記載されているような、当技術分野において知られている方法によって調製される。循環時間が増強したリポソームが、米国特許第5,013,556号において開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミンPEG-PEを包含する脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るための、規定された孔径のフィルターを介して押し出される。活性成分はまた、例えばコアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されるマイクロカプセル内、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメチルメタクリレートマイクロカプセル内に、コロイド薬物送達系例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル内に、またはマクロエマルジョン内に封入することができる。このような技術は、Remington、TheScienceandPracticeofPharmacy、第20版、MackPublishing2000において開示されている。持続放出調製物を調製することができる。持続放出調製物の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、造形物の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル例えば、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、またはポリビニルアルコール、ポリラクチド米国特許第3,773,919号、L-グルタミン酸および7-エチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性のエチレン酢酸ビニル、分解性の乳酸グリコール酸コポリマー、例えばLUPRONDEPOT商標乳酸グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注入可能なミクロスフェア、スクロースアセテートイソブチレート、ならびにポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。インビボでの投与に用いるための製剤は無菌でなくてはならない。これは、例えば滅菌濾過膜を介する濾過によって、容易に達成される。治療的なpH依存性抗体組成物は、通常、無菌のアクセスポートを有する容器内、例えば、皮下注入針によって穴をあけることが可能なストッパーを有する静脈内溶液袋またはバイアル内に置かれる。適切なエマルジョンは、市販されている脂肪エマルジョン、例えばIntralipid商標、Liposyn商標、Infonutrol商標、Lipofundin商標、およびLipiphysan商標を用いて調製することができる。活性成分は、余混合されたエマルジョン組成物内に溶解することができるか、あるいは、油例えば、大豆油、べにばな油、綿実油、ごま油、とうもろこし油、またはアーモンド油内に溶解することができ、リン脂質例えば、卵リン脂質、大豆リン脂質、または大豆レシチンおよび水と混合するとエマルジョンが形成される。エマルジョンの張性を調節するために、他の成分、例えばグリセロールまたはグルコースを添加してもよいことが理解されよう。適切なエマルジョンは、典型的には、最大20の、例えば5から20の間の油を含有する。脂肪エマルジョンは、0.1から1.0μmの間、特に0.1から0.5μmの間の脂肪滴を包含し得、5.5から8.0の範囲のpHを有する。エマルジョン組成物は、pH依存性の抗体とIntralipid商標またはその成分大豆油、卵リン脂質、グリセロール、および水とを混合することによって調製されるものであり得る。吸入または吹送のための組成物には、薬学的に許容できる水性溶媒もしくは有機溶媒内の溶液および懸濁液またはその混合物、ならびに粉末が含まれる。液体組成物または固体組成物は、上記に説明されるような、適切な薬学的に許容できる賦形剤を含有し得る。いくつかの実施形態において、組成物は、局所的なまたは全身的な効果のために、経口経路または経鼻呼吸器経路によって投与される。好ましく無菌の薬学的に許容できる溶媒内の組成物は、気体を用いることによって噴霧することができる。噴霧された溶液は、噴霧装置から直接的に吸い込むことができるか、または噴霧装置をフェイスマスク、テント、もしくは間欠的陽圧呼吸機に設置することができる。溶液組成物、懸濁液組成物、または粉末組成物は、製剤を適切な様式で送達する装置から、好ましくは経口的にまたは経鼻的に投与することができる。B.pH依存性の抗体本発明において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片例えば、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、Fcなど、キメラ抗体、二重特異的抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、一本鎖ScFv、その突然変異体、抗体部分を包含する融合タンパク質例えば、ドメイン抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびに、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合によって修飾された抗体を含む、所要の特異性を有する抗原認識部位を包含する免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された立体構造を包含し得る。抗体は、マウス、ラット、ヒト、またはあらゆる他のものに由来し得るキメラ抗体またはヒト化抗体を含む。いくつかの実施形態において、pH依存性の抗体はモノクローナル抗体である。pH依存性の抗体はまた、ヒト化することができる。他の実施形態において、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、修飾された定常領域、例えば免疫学的に不活性な定常領域を包含し、すなわち、免疫応答を引き起こす可能性が低減している。いくつかの実施形態において、定常領域は、Eur.J.Immunol.、1999、29:2613~2624;PCT公開WO99/58572、および/または英国特許出願第9809951.8号において記載されているように修飾されている。Fcは、ヒトIgG2またはヒトIgG4であり得る。Fcは、突然変異A330P331からS330S331IgG2Δaを含むヒトIgG2であり得、前記突然変異において、アミノ酸残基は、野生型IgG2配列を参照して番号付けされている。Eur.J.Immunol.、1999、29:2613~2624。いくつかの実施形態において、抗体は、突然変異Armourら、2003、MolecularImmunology40585~593E233F234L235からP233V234A235IgG4ΔCを包含するIgG4の定常領域を包含し、前記突然変異において、番号付けは、野生型IgG4を参照している。さらに別の実施形態において、FcはG236が欠失しているヒトIgG4E233F234L235からP233V234A235IgG4Δbである。別の実施形態において、Fcは、ヒンジ安定化突然変異S228からP228を含むあらゆるヒトIgG4FcIgG4、IgG4Δb、またはIgG4ΔcであるAalberseら、2002、Immunolgy105、9~19。別の実施形態において、Fcは、非グリコシル化Fcであり得る。いくつかの実施形態において、定常領域は、オリゴ糖付着残基例えばAsn297、および/または定常領域におけるグリコシル化認識配列の一部である隣接残基を突然変異させることによって、非グリコシル化されている。いくつかの実施形態において、定常領域は、N結合型のグリコシル化のために酵素的に非グリコシル化されている。定常領域は、N結合型のグリコシル化のために、酵素的に、またはグリコシル化のない宿主細胞における発現によって、非グリコシル化され得る。抗原に対する抗体の結合親和性を決定する1つの手段は、抗体の単機能のFab断片の結合親和性を測定することによる。単機能のFab断片を得るために、抗体例えば、IgGは、パパインで切断することができるか、または組換えにより発現させることができる。抗体のFab断片の親和性は、HBS-EPランニングバッファー0.01MのHEPES、pH7.4、0.15のNaCl、3mMのEDTA、0.005vvの界面活性剤P20を用いて、事前に固定されたストレプトアビジンセンサーチップSAを備えた表面プラズモン共鳴Biacore3000商標表面プラズモン共鳴SPRシステム、Biacore、INC、PiscatawayNJによって決定することができる。ビオチン化抗原は、0.5μg/mL未満の濃度までHBS-EP緩衝液内に希釈され得、詳細な動態研究では50~200応答単位RUの、またはスクリーニングアッセイでは800~1,000RUの、2つの範囲の抗原密度を達成するように、様々な接触時間を用いて個別のチップチャネルを通して注入され得る。再生研究は、25vvのエタノール内の25mMのNaOHが、200を超える注入にわたりチップ上の抗原の活性を維持しながら、結合型Fabを効果的に除去することを示した。典型的には、精製されたFab試料の連続希釈物推定KDの0.1~10倍の濃度にわたるは、1分間にわたり100μL/分で注入され、最大2時間の解離時間が可能である。Fabタンパク質の濃度は、既知の濃度アミノ酸分析によって決定されるのFabを標準として用いて、ELISAおよび/またはSDS-PAGE電気泳動によって決定される。動的会合速度konおよび動的解離速度koffは、BIAevaluationプログラムを用いてデータを全体的に1:1ラングミュア結合モデルKarlsson、R.Roos、H.Fagerstam、L.Petersson,B.、1994.MethodsEnzymology6.99~110に適合させることによって、同時に得ることができる。平衡解離定数KD値は、koff/konとして計算される。このプロトコルは、ヒトまたは別の哺乳動物種例えば、マウス、ラット、霊長類を含むあらゆる抗原に対する抗体の結合親和性の決定における使用に適切である。抗体の結合親和性は、通常、25°Cで測定されるが、37°Cでも測定することができる。抗体は、当技術分野において知られている任意の方法によって作製することができる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、通常、本明細書においてさらに記載されているような、抗体の刺激および産生のための確立された技術および従来の技術に従っている。ヒト抗体およびマウス抗体を生産するための通常の技術は、当技術分野において知られており、かつ/または本明細書において記載されている。PCSK9に対するpH依存性の抗体では、抗体を作製するための現在の好ましい方法は、本明細書において開示されるような、PCSK9ノックアウトPCSK9-/-動物の免疫化を包含する。ヒトを含むあらゆる哺乳動物対象またはそれに由来する抗体産生細胞は、ヒトを含む哺乳動物のハイブリドーマ細胞系を産生するための基礎として役立つように操作され得ることが考慮される。典型的には、宿主動物は、腹腔内に、筋肉内に、経口的に、皮下に、足底内に、および/または皮内に、本明細書において記載されているものを含む、一定量の免疫原を接種される。ハイブリドーマは、Kohler,B.およびMilstein,C.、1975、Nature256:495~497の、またはBuck,D.W.ら、1982、InVitro、18:377~381によって変更されているような、通常の体細胞ハイブリダイゼーション技術を用いて、リンパ球および不死化された骨髄腫細胞から調製することができる。限定はしないがX63-Ag8.653、およびSalkInstitute、CellDistributionCenter、SanDiego、Calif.、USAのものを含む、利用可能な骨髄腫系を、ハイブリダイゼーションにおいて用いることができる。通常、この技術は、ポリエチレングリコールなどのフソゲンを用いて、または当業者に周知の電気的手段によって、骨髄腫細胞とリンパ系細胞とを融合することを伴う。融合の後、細胞は、融合培地から分離され、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジンHAT培地などの選択的成長培地において成長させられて、ハイブリダイズしていない親細胞が排除される。血清を補われていてもいなくても、本明細書において記載されているあらゆる培地は、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために用いることができる。細胞融合技術の別の代替として、EBV不死化B細胞を、本発明のPCSK9モノクローナル抗体の生産に用いることができる。必要に応じて、ハイブリドーマは増殖およびサブクローニングされ、上清は、従来の免疫アッセイ手順例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイによって、抗免疫原活性についてアッセイされる。抗体源として用いられ得るハイブリドーマは、PCSK9に特異的なモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの全ての誘導体、子孫細胞、またはその一部を包含する。このような抗体を産生するハイブリドーマは、既知の手順を用いてインビトロまたはインビボで成長させることができる。モノクローナル抗体は、必要に応じて、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過によって、培養培地または体液から単離することができる。望ましくない活性がある場合には、例えば、固相に付着した免疫原で作製された吸着剤上で調製物をランさせることによって、および免疫原から所望の抗体を溶出または放出させることによって、除去することができる。二機能性物質または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステルシステイン残基を介するコンジュゲーション、N-ヒドロキシスクシンイミドリジン残基を介する、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR1N=C=NR式中、RおよびR1は、異なるアルキル基であるを用いて、免疫化すべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、もしくは大豆トリプシン阻害剤にコンジュゲートした、ヒトPCSK9、または標的アミノ酸配列を含む断片で宿主動物を免疫化することによって、抗体集団例えば、モノクローナル抗体を得ることができる。抗体が生成または選択されると、抗体は、本明細書の実施例1において開示されているように、pH依存性の結合に最適化され得る。必要に応じて、目的のpH依存性抗体モノクローナルまたはポリクローナルは配列決定することができ、ポリヌクレオチド配列は次に、発現または増殖のためにベクター内にクローニングすることができる。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター内に維持することができ、宿主細胞は次に増殖させて、今後の使用のために凍結することができる。細胞培養物における組換えモノクローナル抗体の生産は、当技術分野において知られている手段による、B細胞から抗体遺伝子のクローニングを介して実施することができる。例えば、Tillerら、2008、J.Immunol.Methods329、112;米国特許第7,314,622号を参照されたい。あるいは、ポリヌクレオチド配列は、抗体をヒト化するためまたは親和性もしくは抗体の他の特徴を向上させるための遺伝子操作に用いることができる。例えば、定常領域は、抗体を臨床試験およびヒトにおける治療において用いる場合に免疫応答を避けるために、さらに似たヒト定常領域に操作することができる。抗原に対するさらに優れた親和性および優れた有効性を得るために、抗体配列を遺伝子操作することが望ましい場合がある。当業者には、1つまたは複数のポリヌクレオチド変化がpH依存性の抗体になされ得、前記変化が依然として前記抗体の抗原結合能力を維持し得ることが明らかとなろう。モノクローナル抗体をヒト化するために、4つの一般的なステップがある。これらは、1開始抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を決定すること、2ヒト化抗体を設計すること、すなわち、どの抗体フレームワーク領域をヒト化プロセスの間に用いるかを決定すること、3実際のヒト化方法/技術、ならびに4ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。例えば、米国特許第4,816,567号、米国特許第5,807,715号、米国特許第5,866,692号、米国特許第6,331,415号、米国特許第5,530,101号、米国特許第5,693,761号、米国特許第5,693,762号、米国特許第5,585,089号、および米国特許第6,180,370号を参照されたい。ヒト定常ドメインに融合した齧歯動物のまたは修飾された齧歯動物のV領域およびその会合したCDRを有するキメラ抗体を含む、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を包含する多くのヒト化抗体分子が記載されている。例えば、Winterら、1991、Nature349:293~299;Lobuglioら、1989、Proc.Nat.Acad.Sci.USA86:4220~4224;Shawら、1987、JImmunol.138:4534~4538;およびBrownら、1987、CancerRes.47:3577~3583を参照されたい。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前の、ヒト支持フレームワーク領域FR内にグラフトされた齧歯動物のCDRを記載している。例えば、Riechmannら、1988、Nature332:323~327;Verhoeyenら、1988、Science239:1534~1536;およびJonesら、1986、Nature321:522~525を参照されたい。別の参考文献は、組換えによって操作された齧歯動物のフレームワーク領域によって支持されている齧歯動物のCDRを記載している。例えば、欧州特許公開第0519596号を参照されたい。これらのヒト化分子は、ヒトレシピエントにおけるこの部分の治療的適用の期間および有効性を限定する、齧歯動物の抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小にするように設計されている。例えば、抗体の定常領域は、それが免疫学的に不活性である例えば、補体の溶解を引き起こさないように操作することができる。例えば、PCT公開WO99/58572、英国特許出願第9809951.8号を参照されたい。同様に利用され得る、抗体をヒト化する他の方法は、Daughertyら、1991、Nucl.AcidsRes.19:2471~2476、ならびに米国特許第6,180,377号、米国特許第6,054,297号、米国特許第5,997,867号、米国特許第5,866,692号、米国特許第6,210,671号、および米国特許第6,350,861号、ならびにPCT公開WO01/27160によって開示されている。さらに別の代替において、完全にヒトの抗体は、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作されている、市販されているマウスを用いることによって得ることができる。さらに望ましい、またはさらに堅固な免疫応答をもたらすように設計されているトランスジェニック動物もまた、ヒト化抗体またはヒト抗体の生成に用いることができる。このような技術の例は、Abgenix,Inc.Fremont、CAのXenomouse商標、Medarex,Inc.Princeton、NJのHuMAb-マウス登録商標およびTCマウス商標、ならびにRegeneronPharmaceuticals,Inc.Tarrytown、NYのVelocImmune登録商標マウスである。あるいは、抗体は、組換えにより作製することができ、当技術分野において知られている任意の方法を用いて発現させることができる。別の代替において、抗体は、ファージディスプレイ技術によって、組換えにより作製することができる。例えば、米国特許第5,565,332号、米国特許第5,580,717号、米国特許第5,733,743号、および米国特許第6,265,150号、ならびにWinterら、1994、Annu.Rev.Immunol.12:433~455を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術McCaffertyら、1990、Nature348:552~553を用いて、免疫化されていないドナーの免疫グロブリン可変Vドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体断片をインビトロで生産することができる。この技術に従って、抗体Vドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージの主要のまたは微量の外被タンパク質の遺伝子、例えばM13またはfd内にインフレームでクローニングされ、機能的な抗体断片として、ファージ粒子の表面上に提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むため、抗体の機能的特性に基づく選択によって、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子もまた選択される。したがって、ファージは、B細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々なフォーマットで行われ得る。例えば、Johnson、KevinS.およびChiswell、DavidJ.、1993、CurrentOpinioninStructuralBiology3:564~571を参照されたい。V遺伝子セグメントのいくつかの由来源をファージディスプレイに用いることができる。Clacksonら、1991、Nature352:624~628は、免疫化されたマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小さいランダム組み合わせライブラリーから、多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。免疫化されていないヒトドナーからのV遺伝子レパートリーを構築することができ、多様な抗原自己抗原を含むに対する抗体を、Markら、1991、J.Mol.Biol.222:581~597、またはGriffithら、1993、EMBOJ.12:725~734によって記載されている技術に基本的に従って単離することができる。天然の免疫応答において、抗体遺伝子は、高い比率で突然変異を蓄積する体細胞超変異。導入される変化の一部によって親和性が高まり、高い親和性の表面免疫グロブリンを提示するB細胞は、その後の抗原チャレンジの間に、優先的に複製され、分化する。この天然のプロセスは、鎖シャッフリングとして知られている技術を採用することによって模倣することができるMarksら、1992、Bio/Technol.10:779~783。この方法において、ファージディスプレイによって得られる一次ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のV領域遺伝子を、免疫化されていないドナーから得られるVドメイン遺伝子の天然の変異体レパートリーのレパートリーで連続的に置き換えることによって向上し得る。この技術によって、pM~nMの範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の生産が可能になる。非常に大きなファージ抗体レパートリー全ライブラリーの源としても知られているを作製するための戦略は、Waterhouseら、1993、Nucl.AcidsRes.21:2265~2266によって記載されている。遺伝子シャッフリングはまた、齧歯動物抗体からヒト抗体を誘導するために用いることができ、ここで、ヒト抗体は、開始齧歯動物抗体に類似の親和性および特異性を有する。エピトープインプリンティングとも呼ばれるこの方法に従って、ファージディスプレイ技術によって得られる齧歯動物抗体の重鎖または軽鎖のVドメイン遺伝子は、ヒトVドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えられ、齧歯動物-ヒトキメラを生じさせる。抗原の選択によって、機能的な抗原結合部位を回復させ得るヒト可変領域が単離され、すなわち、エピトープは、パートナーの選択を左右するインプリントする。残りの齧歯動物のVドメインを置き換えるためにプロセスを反復すると、ヒト抗体が得られるPCT公開WO93/06213を参照されたい。CDRグラフティングによる齧歯動物抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術は、齧歯動物由来のフレームワーク残基またはCDR残基を有さない、完全にヒトの抗体をもたらす。上記の議論はヒト化抗体に関するものであるが、論じられる一般原則は、抗体を例えばイヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシにおける使用にカスタマイズするために適用可能であることは明らかである。本明細書において記載されている、抗体をヒト化する1つまたは複数の態様を、例えばCDRグラフティング、フレームワーク突然変異、およびCDR突然変異と組み合わせることができることも明らかである。抗体は、抗体および抗体産生細胞を宿主動物からまず単離し、遺伝子配列を得、そして、この遺伝子配列を用いて宿主細胞例えば、CHO細胞において抗体を組換えにより発現させることによって、組換えにより作製することができる。採用され得る別の方法は、植物例えば、タバコまたはトランスジェニックミルクにおいて抗体配列を発現させることである。抗体を組換えにより植物またはミルクにおいて発現させるための方法は、開示されている。例えば、Peetersら、2001、Vaccine19:2756;Lonberg、N.およびD.Huszar、1995、Int.Rev.Immunol13:65;ならびにPollockら、1999、JImmunolMethods231:147を参照されたい。抗体の誘導体、例えば、ヒト化抗体、一本鎖抗体などを作製するための方法は、当技術分野において知られている。免疫アッセイ技術およびフローサイトメトリー選別技術、例えば蛍光活性化細胞選別FACSもまた、所望の抗原に特異的な抗体を単離するために採用することができる。抗体は、多くの異なる担体に結合させることができる。担体は、活性および/または不活性であり得る。周知の担体の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然のおよび修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびにマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的では、可溶性または不溶性であり得る。当業者であれば、抗体を結合するための他の適切な担体を知っているか、または、通常の試験を用いて、前記担体を確認することができる。いくつかの実施形態において、担体は、心筋を標的化する部分を包含する。モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい由来源として役立つ。単離されると、DNAは発現ベクター内に置くことができ例えば、PCT公開WO87/04462において開示されている発現ベクター、これを次に、このDNAを含まなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、大腸菌E.coli細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。例えば、PCT公開WO87/04462を参照されたい。DNAはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を置換することによってMorrisonら、1984、Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851、または免疫グロブリンのコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を共有結合させることによって、修飾することができる。この様式で、本明細書におけるモノクローナル抗体の結合特異性を有するキメラ抗体またはハイブリッド抗体が調製される。pH依存性の抗体および抗体に由来するポリペプチドは、当技術分野において知られている方法を用いて同定または特徴付けることができ、これによって、生物学的活性の低減、改善、または中和が検出および/または測定される。いくつかの実施形態において、pH依存性の抗体またはポリペプチドは、候補作用物質を抗原とインキュベートすること、ならびに結合、および/またはそれに付随する、生物学的活性の低減もしくは中和をモニタリングすることによって同定される。結合アッセイは、精製された抗原ポリペプチド1つまたは複数を用いて、またはポリペプチド1つまたは複数を天然に発現するかもしくは発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて行うことができる。1つの実施形態において、結合アッセイは、候補抗体が結合について既知のアンタゴニストと競合する能力が評価される、競合結合アッセイである。このアッセイは、ELISAフォーマットを含む様々なフォーマットで行うことができる。他の実施形態において、pH依存性の抗体は、候補作用物質を抗原とインキュベートすること、ならびに結合と、それに付随する、LDLRの発現の阻害および/または血液コレステロールのクリアランスとをモニタリングすることによって同定される。最初の同定に従って、候補pH依存性抗体の活性はさらに、標的化された生物学的活性を試験するために知られているバイオアッセイによって確認および洗練することができる。あるいは、バイオアッセイを用いて、候補を直接的にスクリーニングすることができる。抗体、ペプチド、またはアプタマーを同定および特徴付けするための方法の一部は、実施例において詳細に記載されている。pH依存性の結合を有する抗体は、当技術分野において周知の方法を用いて特徴付けすることができる。例えば、1つの方法は、前記抗体が結合するエピトープを同定すること、すなわちエピトープマッピングである。例えば、HarlowおよびLane、UsingAntibodies、aLaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NewYork、1999の第11章に記載されているような、抗体抗原複合体の結晶構造を明らかにすること、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けするための、当技術分野において知られている多くの方法がある。さらなる実施例において、エピトープマッピングを用いて、pH依存性の抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、様々な販売元、例えば、PepscanSystemsEdelhertweg15、8219PHLelystad、TheNetherlandsから市販されている。エピトープは、線状エピトープであり得、すなわち、単一のストレッチのアミノ酸内に含まれてもよいし、または必ずしも単一のストレッチ内に含まれていなくてもよいアミノ酸の三次元相互作用によって形成される立体構造エピトープであってもよい。様々な長さ例えば、少なくとも4~6アミノ酸長のペプチドを、単離または合成することができ例えば、組換えによって、抗体との結合アッセイに用いることができる。別の実施例において、pH依存性の抗体が結合するエピトープは、抗原配列に由来するペプチドをオーバーラップさせることおよび抗体による結合を決定することを用いることによる系統的スクリーニングで決定することができる。遺伝子断片発現アッセイに従うと、抗原をコードするオープンリーディングフレームは、ランダムに、または特異的な遺伝子構築によって断片化され、発現した抗原断片の、試験対象の抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えばPCRによって生産することができ、次に、放射性アミノ酸の存在下で、インビトロでタンパク質に転写および翻訳することができる。放射性標識された断片に対する抗体の結合は次に、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定される。特定のエピトープはまた、ファージ粒子の表面上に提示されたランダムなペプチド配列の大きなライブラリーファージライブラリーを用いて同定することができる。あるいは、オーバーラップするペプチド断片の規定されたライブラリーを、単純な結合アッセイにおいて、試験抗体に対する結合について試験することができる。さらなる実施例において、抗原結合ドメインの突然変異生成、ドメイン交換実験、およびアラニンスキャニング突然変異生成を行って、エピトープ結合に所要の、十分な、および/または必要な残基を同定することができる。例えば、ドメイン交換実験は、様々なポリペプチド断片が別の種の抗原の配列で置き換えられている交換されている突然変異抗原、または密接に関連しているが抗原性が異なるタンパク質例えば、前駆タンパク質転換酵素ファミリーの別のメンバーを用いて行うことができる。突然変異抗原への抗体の結合を評価することによって、抗体結合に対する特定の抗原断片の重要性を評価することができる。pH依存性の抗体を特徴付けするために用いることができるさらに別の方法は、同一の抗原に結合することが知られている他の抗体との競合アッセイを用いて、pH依存性の抗体が他の抗体と同一のエピトープに結合するかどうかを決定することである。競合アッセイは、当業者に周知である。発現ベクターを用いて、pH依存性の抗体の発現を指示することができる。当業者であれば、外因性タンパク質をインビボで発現させるための発現ベクターの投与を熟知している。例えば、米国特許第6,436,908号、米国特許第6,413,942号、および米国特許第6,376,471号を参照されたい。発現ベクターの投与には、注入、経口投与、粒子銃、またはカテーテル投与、および局部投与を含む、局所的投与または全身投与が含まれる。別の実施形態において、発現ベクターは、交感神経幹もしくは神経節に、または冠動脈内、心房内、心室内、もしくは心膜内に、直接的に投与される。発現ベクターまたはサブゲノムのポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化された送達もまた用いることができる。受容体介在性のDNA送達技術は、例えば、Findeisら、1993、TrendsBiotechnol.11:202;Chiouら、1994、GeneTherapeutics:MethodsAndApplicationsOfDirectGeneTransferJ.A.Wolff編;Wuら、1988、J.Biol.Chem.263:621;Wuら、1994、J.Biol.Chem.269:542;Zenkeら、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3655;Wuら、1991、J.Biol.Chem.266:338において記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子療法プロトコルにおいて、局所的投与では約100ngから約200mgのDNAの範囲で投与される。約500ngから約50mg、約1μgから約2mg、約5μgから約500μg、および約20μgから約100μgのDNAの濃度範囲もまた、遺伝子療法プロトコルの間に用いることができる。治療用のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達媒体を用いて送達され得る。遺伝子送達媒体は、ウイルス由来のものであってもなくてもよい全体として、Jolly、1994、CancerGeneTherapy1:51;Kimura、1994、HumanGeneTherapy5:845;Connelly、1995、HumanGeneTherapy1:185;およびKaplitt、1994、NatureGenetics6:148を参照されたい。このようなコード配列の発現は、内在性の哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導することができる。コード配列の発現は、構成的であるか、または制御されたものであり得る。所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のための、ウイルスに基づくベクターは、当技術分野において周知である。典型的な、ウイルスに基づく媒体には、限定はしないが、組換えレトロウイルス例えば、PCT公開WO90/07936、WO94/03622、WO93/25698、WO93/25234、WO93/11230、WO93/10218、WO91/02805、米国特許第5,219,740号および米国特許第4,777,127号、英国特許第2,200,651号、ならびに欧州特許第0345242号を参照されたい、アルファウイルスに基づくベクター例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルスATCCVR-67、ATCCVR-1247、ロスリバーウイルスATCCVR-373、ATCCVR-1246、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスATCCVR-923、ATCCVR-1250、ATCCVR1249、ATCCVR-532、およびアデノ随伴ウイルスAAVベクター例えば、PCT公開WO94/12649、WO93/03769、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984、およびWO95/00655を参照されたいが含まれる。Curiel、1992、Hum.GeneTher.3:147において記載されている、死滅アデノウイルスに結合したDNAの投与もまた、採用することができる。限定はしないが、死滅アデノウイルスのみに結合している、または結合していないポリカチオン性濃縮DNA例えば、Curiel、1992、Hum.GeneTher.3:147を参照されたい、リガンド結合DNA例えば、Wu、J.、1989、Biol.Chem.264:16985を参照されたい、真核細胞の送達媒体細胞例えば、米国特許第5,814,482号、PCT公開WO95/07994、WO96/17072、WO95/30763、およびWO97/42338、および核荷電の中和、または細胞膜との融合を含む、非ウイルス送達媒体および非ウイルス送達方法もまた、採用することができる。裸DNAもまた、採用することができる。典型的な裸DNA導入方法は、PCT公開WO90/11092および米国特許第5,580,859号において記載されている。遺伝子送達媒体として作用し得るリポソームは、米国特許第5,422,120号、PCT公開WO95/13796、WO94/23697、WO91/14445、およびEP0524968において記載されている。さらなるアプローチは、Philip、1994、Mol.CellBiol.、14:2411、およびWoffendin、1994Proc.Natl.Acad.Sci.91:1581において記載されている。本発明は、本明細書において記載されているかまたは本方法によって作製され、本明細書において記載されている特徴を有する抗体を包含する、医薬組成物を含む組成物を包含する。本明細書において用いられる場合、組成物は、1つもしくは複数のpH依存性の抗体および/または1つもしくは複数のこれらの抗体をコードする配列を包含する1つもしくは複数のポリヌクレオチドを包含する。これらの組成物は、さらに、当技術分野において周知の適切な賦形剤、例えば、緩衝液を含む薬学的に許容できる賦形剤を包含し得る。本発明はまた、pH依存性の抗体のCDR部分ChothiaCDRおよびKabatCDRを含むを提供する。CDR領域の決定は、当技術分野の技術の範囲内である。いくつかの実施形態において、CDRがKabatCDRおよびChothiaCDRの組み合わせ組み合わされたCDRまたは拡張されたCDRとも呼ばれるであり得ることが理解される。いくつかの実施形態において、CDRはKabatCDRである。他の実施形態において、CDRはChothiaCDRである。言い換えると、2つ以上のCDRを伴う実施形態において、CDRは、KabatCDR、ChothiaCDR、組み合わせCDR、またはその組み合わせのいずれかであり得る。本発明はまた、これらの抗体またはポリペプチドのいずれかを作製する方法を提供する。本発明の抗体は、当技術分野において知られている手順によって作製することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解または他の分解によって、上記の組換え方法すなわち、単一ポリペプチドまたは融合ポリペプチドによって、または化学合成によって生産することができる。抗体のポリペプチド、特に最大約50アミノ酸の短いポリペプチドは、化学合成によって都合良く作製される。化学合成の方法は、当技術分野において知られており、市販されている。例えば、抗体は、固相方法を採用する自動ポリペプチド合成装置によって生産することができる。米国特許第5,807,715号、米国特許第4,816,567号、および米国特許第6,331,415号も参照されたい。別の代替において、抗体およびペプチドは、当技術分野において周知の手順を用いて組換えにより作製することができる。1つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、抗体4A5、5A10、6F6、7D4、またはL1L3の重鎖および/または軽鎖の可変領域をコードする配列を包含する。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター内に維持することができ、宿主細胞は次に増殖させて、今後の使用のために凍結することができる。ベクター発現ベクターを含むおよび宿主細胞は、本明細書においてさらに記載されている。本発明はまた、本発明の抗体のscFvを包含する。一本鎖可変領域断片は、短い結合ペプチドを用いて軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域を結合することによって作製される。Birdら、1988、Science242:423~426。結合ペプチドの例は、GGGGS3配列番号22であり、これは、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間でおよそ3.5nmを架橋する。他の配列のリンカーが設計および使用されている。上記のBirdら、1988。リンカーは短く柔軟なポリペプチドであり、好ましくは、約20未満のアミノ酸残基からなる。リンカーは、次に、さらなる機能、例えば薬剤の付着または固体担体への付着のために修飾することができる。一本鎖変異体は、組換えにより、または合成によって生産することができる。合成でのscFvの生産では、自動合成装置を用いることができる。組換えによるscFvの生産では、scFvをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、真核細胞、例えば酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、もしくは哺乳動物細胞、または原核細胞、例えば大腸菌E.coliである、適切な宿主細胞内に導入することができる。目的のscFvをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの通常の操作によって作製することができる。得られたscFvは、当技術分野において知られている標準的なタンパク質精製技術を用いて単離することができる。ダイアボディなどの他の形態の一本鎖抗体もまた包含される。ダイアボディは、VHドメインおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現している二価の二重特異的抗体であるが、同一の鎖上でこの2つのドメインの間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることで、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて、2つの抗原結合部位を生じさせる例えば、Holliger,P.ら、1993、Proc.Natl.AcadSci.USA90:6444~6448;Poljak,R.J.ら、1994、Structure2:1121~1123を参照されたい。例えば、二重特異的抗体、すなわち少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体は、本明細書において開示されている抗体を用いて調製することができる。二重特異的抗体を作製するための方法は、当技術分野において知られている例えば、Sureshら、1986、MethodsinEnzymology121:210を参照されたい。従来、二重特異的抗体の組換えによる生産は、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対と、異なる特異性を有する2つの重鎖との共発現に基づくものであったMillsteinおよびCuello、1983、Nature305、537~539。二重特異的抗体を作製するための1つのアプローチに従って、所望の結合特異性抗体-抗原結合部位を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメインの配列に融合される。融合体は、好ましくは、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域の少なくとも一部を包含する、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第1の重鎖定常領域CH1を融合体の少なくとも1つにおいて存在させることが好ましい。免疫グロブリン重鎖の融合体と必要に応じて免疫グロブリン軽鎖とをコードするDNAが、個別の発現ベクター内に挿入され、適切な宿主生物内にコトランスフェクトされる。これによって、構築において用いられる3つのポリペプチド鎖の比率が等しくないことによって最適な収量が得られる実施形態における、3つのポリペプチド断片の相互割合の調整における優れた柔軟性がもたらされる。しかし、等しい比率での少なくとも2つのポリペプチド鎖の発現が高い収量をもたらす場合、または比率が特に重要ではない場合、2つまたは3つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を1つの発現ベクターに挿入することが可能である。1つのアプローチにおいて、二重特異的抗体は、一方のアームにある、第1の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにある、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖軽鎖対第2の結合特異性をもたらすから構成される。二重特異的分子の片方においてのみ免疫グロブリン軽鎖を有する、この非対称の構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの、所望の二重特異的化合物の分離を容易にする。このアプローチは、PCT公開WO94/04690において記載されている。2つの共有結合した抗体を包含するヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内である。このような抗体は、免疫系細胞を望ましくない細胞に対して標的化するため米国特許第4,676,980号、およびHIV感染を治療するためPCT公開WO91/00360およびWO92/200373;EP03089に用いられている。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる都合の良い架橋方法を用いて作製することができる。適切な架橋剤および架橋技術は当技術分野において周知であり、米国特許第4,676,980号において記載されている。キメラ抗体またはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を伴うものを含む既知の合成タンパク質化学方法を用いてインビトロで調製することができる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、構築することができる。この目的のための適切な試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミデートが含まれる。抗体5A10もしくは7D4の1つもしくは複数のCDRまたは抗体5A10もしくは7D4に由来する1つもしくは複数のCDRを包含するヒト化抗体は、例えば、当技術分野において知られている任意の方法を用いて作製することができる。例えば、4つの一般的なステップを用いて、モノクローナル抗体をヒト化することができる。これらは、1開始抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を決定すること、2ヒト化抗体を設計すること、すなわち、どの抗体フレームワーク領域をヒト化プロセスの間に用いるかを決定すること、3実際のヒト化方法/技術を使用すること、ならびに4ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。例えば、米国特許第4,816,567号、米国特許第5,807,715号、米国特許第5,866,692号、米国特許第6,331,415号、米国特許第5,530,101号、米国特許第5,693,761号、米国特許第5,693,762号、米国特許第5,585,089号、および米国特許第6,180,370号を参照されたい。組換えヒト化抗体において、Fc部分は、Fcγ受容体および補体および免疫系との相互作用を避けるように修飾することができる。このような抗体を調製するための技術は、WO99/58572において記載されている。例えば、定常領域は、抗体を臨床試験およびヒトにおける治療において用いる場合の免疫応答を避けるために、さらに似たヒト定常領域に操作することができる。例えば、米国特許第5,997,867号および米国特許第5,866,692号を参照されたい。抗体の軽鎖もしくは重鎖の可変領域、または1つもしくは複数のCDRもしくはその変異体、または抗体に由来する1つまたは複数のCDRもしくはその変異体を包含するヒト化抗体は、当技術分野において知られている任意の方法を用いて作製することができる。ヒト化抗体は、当技術分野において知られている任意の方法によって作製することができる。本発明は、その特性に顕著に影響しない機能的に同等な抗体ならびに活性および/または親和性が増強または低下しているその変異体を含む本発明の抗体およびポリペプチドに対する修飾を包含する。例えば、アミノ酸配列は、抗原に対する所望の結合親和性を有する抗体を得るために突然変異させることができる。ポリペプチドの修飾は、当技術分野における通常の実務であり、本明細書において詳細に記載される必要はない。ポリペプチドの修飾は、実施例において例示されている。修飾されたポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的な置換を伴うポリペプチド、機能的活性を顕著に有害に変化させない、もしくはリガンドに対するポリペプチドの親和性を成熟させる増強する、アミノ酸の1つもしくは複数の欠失もしくは付加を伴うポリペプチド、または化学的類似体の使用を伴うポリペプチドが含まれる。アミノ酸配列の挿入には、長さが1残基から、100以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲の、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の融合、ならびに単一のまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端のメチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、血液循環における抗体の半減期を増大させる酵素またはポリペプチドの、抗体のN末端またはC末端への融合体が含まれる。置換変異体は、抗体分子における少なくとも1つのアミノ酸残基が除去されており、その場所に、異なる残基が挿入されている。置換による突然変異生成のために最も興味深い部位には、超可変領域が含まれるが、FRの改変もまた考慮される。保存的な置換を、保存的な置換という表題で表1に示す。このような置換によって生物学的活性が変化すると、典型的な置換と名付けられたまたはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるさらに実質的な変化が導入され得、生成物がスクリーニングされる。抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、a例えばシートもしくはらせん立体構造としての、置換区域のポリペプチド骨格の構造、b標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、またはc側鎖のバルクを維持する効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。天然の残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる:1非極性残基:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、2荷電を有さない極性残基:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、3酸性負に荷電した残基:Asp、Glu、4塩基性正に荷電した残基:Lys、Arg、5鎖の方向に影響する残基:Gly、Pro、および6芳香族残基:Trp、Tyr、Phe、His。非保存的な置換は、これらのクラスのうち1つのクラスのメンバーを別のクラスに交換することによって行われる。抗体の適正な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を向上させるためおよび異常な架橋を防ぐために、通常はセリンで置換することができる。逆に、システイン結合1つまたは複数は、特に、抗体がFv断片などの抗体断片である場合、抗体の安定性を向上させるために、抗体に付加することができる。アミノ酸修飾は、1つまたは複数のアミノ酸の変化または修飾から、可変領域などの領域の完全な再設計にわたり得る。可変領域における変化は、結合親和性および/または特異性を改変し得る。いくつかの実施形態において、1つから5つの保存的なアミノ酸置換しかCDRドメイン内で生じない。他の実施形態において、1つから3つの保存的なアミノ酸置換しかCDRドメイン内で生じない。さらに他の実施形態において、CDRドメインは、CDRH3および/またはCDRL3である。修飾にはまた、グリコシル化されたおよびグリコシル化されていないポリペプチド、ならびに、例えば、異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの、他の翻訳後修飾を有するポリペプチドが含まれる。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化されるJefferisおよびLund、1997、Chem.Immunol.65:111~128;WrightおよびMorrison、1997、TibTECH15:26~32。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能Boydら、1996、Mol.Immunol.32:1311~1318;WittweおよびHoward、1990、Biochem.29:4175~4180、ならびに、糖タンパク質の立体構造および示される三次元表面に影響し得る糖タンパク質の部分間の分子内相互作用上記のJefferisおよびLund;WyssおよびWagner、1996、CurrentOpin.Biotech.7:409~416に影響する。オリゴ糖はまた、特異的な認識構造に基づいて所与の糖タンパク質を特定の分子に標的化させるために役立ち得る。抗体のグリコシル化はまた、ADCCに影響することが報告されている。特に、バイセクティングGlcMAcの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ1,4-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIGnTIIIのテトラサイクリン調節型の発現を有するCHO細胞は、ADCC活性が向上していることが報告されたUmanaら、1999、NatureBiotech.17:176~180。抗体のグリコシル化は、典型的には、N結合型またはO結合型である。N結合型は、糖質部分がアスパラギン残基の側鎖に付着している状態を言う。トリペプチド配列であるアスパラギン-X-セリン、アスパラギン-X-スレオニン、およびアスパラギン-X-システイン式中、Xは、プロリンを除くあらゆるアミノ酸であるは、アスパラギン側鎖への糖質部分の酵素的付着についての認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのいずれかのトリペプチド配列の存在は、潜在的なグリコシル化部位を生じさせる。O結合型グリコシル化は、糖であるN-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの1つがヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはスレオニンに付着した状態を言うが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンもまた用いることができる。抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が上記のトリペプチド配列の1つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を改変することによって、都合良く達成されるN結合型グリコシル化部位では。改変はまた、1つまたは複数のセリン残基またはスレオニン残基を元の抗体の配列に付加することによって、または前記残基で元の抗体の配列を置換することによって行うことができるO結合型グリコシル化部位では。抗体のグリコシル化パターンはまた、根本的なヌクレオチド配列を改変することなく改変することができる。グリコシル化は主に、抗体を発現させるために用いられる宿主細胞に応じる。潜在的な治療法としての、組換え糖タンパク質、例えば抗体の発現に用いられる細胞型は、非変性細胞であることはほとんどないため、抗体のグリコシル化パターンの変化が予想され得る例えば、Hseら、1997、J.Biol.Chem.272:9062~9070を参照されたい。宿主細胞の選択に加えて、組換えによる抗体生産の間のグリコシル化に影響する因子には、成長様式、培地配合、培養密度、酸素化、pH、精製スキームなどが含まれる。オリゴ糖の産生に関与する特定の酵素を導入するかまたは過剰発現させることを含む、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを改変するための様々な方法が提案されている米国特許第5,047,335号、米国特許第5,510,261号、および米国特許第5,278,299号。グリコシル化または特定のタイプのグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼHEndoH、N-グリコシダーゼF、エンドグリコシダーゼF1、エンドグリコシダーゼF2、エンドグリコシダーゼF3を用いて、糖タンパク質から酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞は、特定のタイプの多糖のプロセシングを欠くように遺伝子操作することができる。これらのおよび類似の技術は、当技術分野において周知である。他の修飾方法には、限定はしないが、酵素的手段、酸化的置換、およびキレート化を含む、当技術分野において知られている結合技術の使用が含まれる。修飾は、例えば、免疫アッセイのための標識の付着に用いることができる。修飾されたポリペプチドは、当技術分野において確立された手順を用いて作製され、当技術分野において知られている標準的なアッセイを用いてスクリーニングすることができ、前記アッセイの一部は、以下に、および実施例に記載されている。本発明のいくつかの実施形態において、抗体は、免疫学的に不活性のもしくは部分的に不活性の、例えば、補体介在性の溶解を引き起こさない、ADCCを刺激しない、もしくはミクログリアを活性化しない定常領域、または、補体介在性の溶解の引き起こし、ADCCの刺激、もしくはミクログリアの活性化のいずれか1つまたは複数において未修飾抗体と比較して活性が低減している定常領域などの、修飾された定常領域を包含する。定常領域の異なる修飾を用いて、エフェクター機能の最適なレベルおよび/または組み合わせを達成することができる。例えば、Morganら、1995、Immunology86:319~324;Lundら、1996、J.Immunology157:4963~9157:4963~4969;Idusogieら、2000、J.Immunology164:4178~4184;Taoら、1989、J.Immunology143:2595~2601;およびJefferisら、1998、ImmunologicalReviews163:59~76を参照されたい。いくつかの実施形態において、定常領域は、Eur.J.Immunol.、1999、29:2613~2624、PCT公開WO99/58572、および/または英国特許出願第9809951.8号において記載されているように修飾されている。他の実施形態において、抗体は、突然変異A330P331からS330S331野生IgG2配列を参照したアミノ酸の番号付けを包含するヒト重鎖IgG2定常領域を包含する。Eur.J.Immunol.、1999、29:2613~2624。さらに他の実施形態において、定常領域は、N結合型グリコシル化のために非グリコシル化されている。いくつかの実施形態において、定常領域は、グリコシル化されたアミノ酸残基、または定常領域におけるN-グリコシル化認識配列の一部である隣接残基を突然変異させることによって、N結合型グリコシル化のために非グリコシル化されている。例えば、N-グリコシル化部位N297は、A、Q、K、またはHに突然変異させることができる。Taoら、1989、J.Immunology143:2595~2601;およびJefferisら、1998、ImmunologicalReviews163:59~76を参照されたい。いくつかの実施形態において、定常領域は、N結合型グリコシル化のために非グリコシル化されている。定常領域は、N結合型グリコシル化のために、酵素的に例えば、酵素PNGaseによる糖質の除去、またはグリコシル化を欠いた宿主細胞における発現によって、非グリコシル化され得る。他の抗体修飾には、PCT公開WO99/58572において記載されているように修飾されている抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に向けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全てまたは一部に実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを包含する。これらの抗体は、標的の顕著な補体依存性の溶解または細胞介在性の破壊を引き起こすことなく、標的分子を結合し得る。いくつかの実施形態において、エフェクタードメインは、FcRnおよび/またはFcγRIIbを特異的に結合し得る。これらは、典型的には、2つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖CH2ドメインに由来するキメラドメインに基づく。この様式で修飾された抗体は、従来の抗体療法に対する炎症反応および他の拒絶反応を避けるための長期抗体療法における使用に特に適している。本発明には、親和性が成熟した実施形態が含まれる。例えば、親和性成熟抗体は、当技術分野において知られている手順によって生産することができるMarksら、1992、Bio/Technology、10:779~783;Barbasら、1994、ProcNat.Acad.Sci、USA91:3809~3813;Schierら、1995、Gene、169:147~155;Yeltonら、1995、J.Immunol.、155:1994~2004;Jacksonら、1995、J.Immunol.、1547:3310~9;Hawkinsら、1992、J.Mol.Biol.、226:889~896;およびPCT公開WO2004/058184。以下の方法は、抗体の親和性を調整するため、およびCDRを特徴付けするために用いることができる。抗体のCDRの特徴付けおよび/または抗体などのポリペプチドの結合親和性の改変向上などの1つの手段は、ライブラリースキャニング突然変異生成と呼ばれる。通常、ライブラリースキャニング突然変異生成は、以下のようにして機能する。CDRにおける1つまたは複数のアミノ酸位置を、当技術分野において認識されている方法を用いて、2つ以上例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、または20個のアミノ酸で置き換える。これによって、それぞれが2つ以上のメンバーの複雑性を有する2つ以上のアミノ酸が全ての位置で置換されている場合、クローンいくつかの実施形態においては、分析される全てのアミノ酸位置についてのクローンの小さなライブラリーが生じる。通常、ライブラリーにはまた、非変性の置換されていないアミノ酸を包含するクローンが含まれる。各ライブラリーからの少数のクローン、例えば約20~80のクローンライブラリーの複雑性に応じるが、標的ポリペプチドまたは他の結合標的への結合親和性についてスクリーニングされ、結合が増大した、同一の、減少した、またはない候補が同定される。結合親和性を決定するための方法は、当技術分野において周知である。結合親和性は、結合親和性における約2倍以上の差を検出するBiacore表面プラズモン共鳴分析を用いて決定することができる。Biacoreは、開始抗体が既に、例えばKDが約10nM以下の比較的高い親和性で結合している場合に、特に有用である。Biacore表面プラズモン共鳴を用いるスクリーニングは、本明細書において、実施例で記載されている。結合親和性は、KinexaBiocensor、シンチレーション近接アッセイ、ELISA、ORIGEN免疫アッセイIGEN、蛍光クエンチング、蛍光移動、および/または酵母ディスプレイを用いて決定することができる。結合親和性はまた、適切なバイオアッセイを用いてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態において、CDRにおける全てのアミノ酸位置は、当技術分野において認識されている突然変異生成方法このうち一部は、本明細書において記載されているを用いて、20個全ての天然アミノ酸でいくつかの実施形態においては1個ずつ置き換えられる。これにより、それぞれが20のメンバーの複雑性を有する20個全てのアミノ酸が全ての位置で置換されている場合、クローンいくつかの実施形態においては、分析される全てのアミノ酸位置についてのクローンの小さなライブラリーが生じる。いくつかの実施形態において、スクリーニングされるライブラリーは、同一のCDRまたは2つ以上のCDR内に存在し得る2つ以上の位置における置換を包含する。したがって、ライブラリーは、1つのCDR内の2つ以上の位置における置換を包含し得る。ライブラリーは、2つ以上のCDR内の2つ以上の位置における置換を包含し得る。ライブラリーは、3個、4個、5個、またはそれ以上の位置における置換を包含し得、前記位置は、2個、3個、4個、5個、または6個のCDRにおいて見られる。置換は、低冗長性のコドンを用いて調製することができる。例えば、Balintら、1993、Gene1371:109~18のTable2を参照されたい。CDRは、CDRH3および/またはCDRL3であり得る。CDRは、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2、および/またはCDRH3の1つまたは複数であり得る。CDRは、KabatCDR、ChothiaCDR、または拡張されたCDRであり得る。結合が向上した候補を配列決定することができ、これによって、親和性の向上をもたらすCDR置換突然変異体向上した置換とも呼ばれるが同定される。結合する候補もまた配列決定することができ、これによって、結合を保持するCDR置換が同定される。複数回のスクリーニングを行うことができる。例えば、結合が向上した候補それぞれ、1つまたは複数のCDRの1つまたは複数の位置でアミノ酸置換を包含するはまた、それぞれの向上したCDR位置すなわち、置換突然変異体が結合の向上を示した、CDRにおけるアミノ酸位置で少なくとも元のアミノ酸および置換されたアミノ酸を含む、第2のライブラリーの設計に有用である。このライブラリーの調製、スクリーニング、および選択は、以下でさらに議論される。ライブラリースキャニング突然変異生成はまた、結合が向上した、結合が同一の、結合が低下した、または結合がないクローンの頻度もまた抗体抗原複合体の安定性に対する各アミノ酸位置の重要性に関する情報を提供する限り、CDRを特徴付けするための手段を提供する。例えば、CDRの位置が、20個全てのアミノ酸に対して変化している場合に結合を保持するならば、その位置は、抗原の結合に必要である可能性が低い位置であると同定される。逆に、CDRの位置がわずかなパーセンテージの置換で結合を保持するならば、その位置は、CDRの機能にとって重要な位置であると同定される。したがって、ライブラリースキャニング突然変異生成方法は、多くの異なるアミノ酸20個全てのアミノ酸を含むに対して変化し得るCDR内の位置、および、変化し得ないまたは数個のアミノ酸に対してのみ変化し得るCDR内の位置に関する情報を生じさせる。親和性が向上した候補は、向上したアミノ酸、元のアミノ酸を含み、ライブラリーの所望の複雑性に応じて、その位置でのさらなる置換をさらに含み得る、第2のライブラリー内に組み合わせることができるか、または、所望のスクリーニング方法もしくは選択方法を用いることが可能となっている。さらに、必要に応じて、隣接したアミノ酸位置を、少なくとも2つ以上のアミノ酸にランダム化することができる。隣接したアミノ酸のランダム化によって、突然変異体CDRにおけるさらなる立体構造上の柔軟性が可能になり得、これによって、多数の向上突然変異の導入が可能になり得るかまたは容易になり得る。ライブラリーはまた、第1回目のスクリーニングで親和性の向上を示さなかった位置での置換を包含し得る。第2のライブラリーは、Biacore表面プラズモン共鳴分析を用いるスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含む当技術分野において知られている任意の選択方法を用いる選択を含む、当技術分野において知られている任意の方法を用いて、結合親和性が向上および/または改変したライブラリーメンバーについてスクリーニングまたは選択される。本発明はまた、本発明の抗体またはポリペプチドの1つまたは複数の断片または領域を包含する融合タンパク質を包含する。1つの実施形態において、配列番号3で示される軽鎖可変領域の少なくとも10個の連続するアミノ酸および/または配列番号4もしくは5で示される重鎖可変領域の少なくとも10個のアミノ酸を包含する融合ポリペプチドが提供される。他の実施形態において、軽鎖可変領域の少なくとも約10個、少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約25個、もしくは少なくとも約30個の連続するアミノ酸、および/または重鎖可変領域の少なくとも約10個、少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約25個、もしくは少なくとも約30個の連続するアミノ酸を包含する融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、1つまたは複数のCDR1つまたは複数を包含する。さらに他の実施形態において、融合ポリペプチドは、CDRH3VHCDR3および/またはCDRL3VLCDR3を包含する。本発明の目的では、融合タンパク質は、1つまたは複数の抗体、および非変性分子においてはそれが付着していない別のアミノ酸配列、例えば別の領域の異種配列または相同配列を含有する。典型的な異種配列には、限定はしないが、FLAGタグまたは6Hisタグなどのタグが含まれる。タグは、当技術分野において周知である。融合ポリペプチドは、当技術分野において知られている方法によって、例えば、合成または組換えにより生成することができる。典型的には、本発明の融合タンパク質は、本明細書において記載されている組換え方法を用いて、それをコードするポリヌクレオチドを調製し発現させることによって作製することができるが、これらはまた、例えば化学合成を含む、当技術分野において知られている他の手段によって調製することができる。本発明はまた、固体担体例えば、ビオチンまたはアビジンへの結合を容易にする作用物質にコンジュゲートした例えば、結合した抗体またはポリペプチドを包含する組成物を提供する。簡潔にするために、言及は、これらの方法を本明細書において記載されているいかなる抗原結合および/またはアンタゴニストの実施形態にも適用するという理解を伴って、全体として抗体に対して行う。コンジュゲーションは通常、本明細書において記載されているようなこれらの成分の結合を言う。結合通常、少なくとも投与のために、密接にこれらの成分を固定しているは、多くの手段で達成することができる。例えば、他者と反応し得る置換基をそれぞれが有する場合、作用物質と抗体との間の直接的な反応が可能である。例えば、一方の上にある例えばアミノ基またはスルフヒドリル基などの求核基は、他方の上にある無水物もしくは酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、または良好な遊離基例えば、ハロゲン化物を含有するアルキル基と、反応し得る。本発明の抗体またはポリペプチドは、当技術分野において知られている標識物質、例えば蛍光分子、放射性分子、またはあらゆる他の標識に結合し得る。シグナルを通常提供する直接的にまたは間接的に標識は、当技術分野において知られている。本発明はまた、本開示が明らかにするように、本明細書において記載されている抗体および/またはポリペプチドのいずれかまたは全てを包含する、組成物医薬組成物を含むおよびキットを提供する。本発明はまた、本発明の抗体およびペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、ならびにそのポリヌクレオチドを包含するベクターおよび宿主細胞を提供する。別の態様において、本発明は、本明細書において記載されている抗体抗体断片を含むおよびポリペプチドのいずれか、例えば、エフェクター機能が低下した抗体およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている手順によって作製し、発現させることができる。別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを包含する組成物医薬組成物などを提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書において記載されている抗体をコードするポリヌクレオチドを包含する発現ベクターを包含する。他の実施形態において、組成物は、本明細書において記載されている抗体またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを包含する発現ベクターを包含する。さらに他の実施形態において、組成物は、配列番号23および配列番号24で示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を包含する。発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与は、本明細書においてさらに記載されている。別の態様において、本発明は、本明細書において記載されているポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法を提供する。任意のこのような配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖コードまたはアンチセンスまたは二本鎖であり得、DNAゲノムDNA、cDNA、または合成DNA分子またはRNA分子であり得る。RNA分子には、イントロンを含み、1対1の様式でDNA分子に対応する、HnRNA分子、およびイントロンを含まないmRNA分子が含まれる。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、その必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および/または支持材料に結合し得るが、その必要はない。ポリヌクレオチドは、非変性配列すなわち、抗体またはその一部をコードする内在性配列を包含し得るか、または、このような配列の変異体を包含し得る。ポリヌクレオチド変異体は、非変性の免疫反応性分子と比較して、コードされているポリペプチドの免疫反応性が弱まらないように、1つまたは複数の置換、付加、欠失、および/または挿入を含む。コードされているポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、通常、本明細書において記載されているようにして評価することができる。変異体は、非変性抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約70の同一性、さらに好ましくは少なくとも約80の同一性、さらに好ましくは、少なくとも約90の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約95の同一性を示す。2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、2つの配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が以下に記載されるように最大の対応でアラインされた場合に同一であるならば、同一であると言われる。2つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたり配列を比較して配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。本明細書において用いられる比較ウィンドウは、少なくとも約20個の、通常は30から約75個の、または40から約50個の連続する位置からなるセグメントを言い、このセグメントにおいて、配列が、同数の連続する位置の参照配列と、この2つの配列を最適にアラインした後に、比較され得る。比較のための配列の最適なアラインメントは、デフォルトパラメータを用いて、バイオインフォマティクスソフトウェアのLasergeneパッケージソフトにおけるMegalignプログラムを用いて行うことができるDNASTAR,Inc.、Madison、WI。このプログラムは、以下の参考文献において記載されているいくつかのアラインメントスキームを統合するものである:Dayhoff,M.O.、1978、Amodelofevolutionarychangeinproteins-Matricesfordetectingdistantrelationships.InDayhoff,M.O.編AtlasofProteinSequenceandStructureNationalBiomedicalResearchFoundation、WashingtonDC、Vol.5、補対3、pp.345~358;HeinJ.、1990、UnifiedApproachtoAlignmentandPhylogenespp.626~645MethodsinEnzymologyvol.183AcademicPress,Inc.、SanDiego、CA;Higgins,D.G.およびSharp,P.M.、1989、CABIOS5:151~153;Myers,E.W.およびMullerW.、1988、CABIOS4:11~17;Robinson,E.D.、1971、Comb.Theor.11:105;Santou,N.、Nes,M.、1987、Mol.Biol.Evol.4:406~425;Sneath,P.H.A.およびSokal,R.R.、1973、NumericalTaxonomythePrinciplesandPracticeofNumericalTaxonomyFreemanPress、SanFrancisco、CA;Wilbur,W.J.およびLipman,D.J.、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:726~730。好ましくは、配列同一性のパーセンテージは、2つの最適にアラインされた配列を少なくとも20個の位置の比較ウィンドウにわたり比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、2つの配列の最適なアラインメントでは、参照配列付加または欠失を包含していないと比較して、20パーセント以下の、通常は5から15パーセント、または10から12パーセントの付加または欠失すなわち、ギャップを包含し得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定して、適合する位置の数を得、適合する位置の数を参照配列における位置の総数すなわち、ウィンドウサイズで割り、その結果を100倍して配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。変異体はまた、またはあるいは、非変性遺伝子またはその部分もしくは相補鎖に実質的に相同であり得る。このようなポリヌクレオチド変異体は、中程度にストリンジェントな条件下で、非変性抗体または相補配列をコードする天然のDNA配列にハイブリダイズし得る。適切な中程度にストリンジェントな条件には、5×SSC、0.5SDS、1.0mMのEDTApH8.0の溶液内での前洗浄;50°C~65°C、5×SSCでの一晩のハイブリダイゼーション;その後の、0.1SDSを含有する、2×SSC、0.5×SSC、および0.2×SSCのそれぞれでの、65°Cで20分にわたる2回の洗浄が含まれる。本明細書において用いられる場合、高度にストリンジェントな条件または高いストリンジェンシー条件は、1洗浄に、低いイオン強度および高い温度、例えば、50°Cでの0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1ドデシル硫酸ナトリウムを採用するか、2ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドなどの変性剤、例えば、42°Cでの、0.1ウシ血清アルブミン/0.1Ficoll/0.1ポリビニルピロリドン/750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウムを有する50mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5を有する、50v/vホルムアミドを採用するか、または342°Cでの、50ホルムアミド、5×SSC0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム、50mMのリン酸ナトリウムpH6.8、0.1ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート液、超音波処理されたサケ精子DNA50μg/ml、0.1SDS、および10硫酸デキストランを採用し、42°Cで0.2×SSC塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム内で洗浄し、55°Cで50ホルムアミド内で洗浄し、その後、55°Cで、EDTAを含有する0.1×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄液によって洗浄するというものである。当業者には、プローブの長さなどの因子を適合させるために必要な温度、イオン強度などを調整する方法が認識されよう。当業者には、遺伝子コードの縮重の結果、本明細書において記載されている1つのポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが理解されよう。これらのポリヌクレオチドの一部は、あらゆる非変性遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それでも、コドン使用頻度の差に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に考慮される。さらに、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列を包含する遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、1つまたは複数の突然変異、例えばヌクレオチドの欠失、付加、および/または置換の結果改変されている内在性遺伝子である。得られたmRNAおよびタンパク質は、構造または機能が改変されている可能性があるが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術ハイブリダイゼーション、増幅、および/またはデータベース配列の比較などを用いて同定することができる。本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはPCRを用いて得ることができる。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野において周知であり、本明細書において詳細に記載される必要はない。当業者は、所望のDNA配列を生産するために、本明細書において提供される配列および市販のDNA合成装置を用いることができる。組換え方法を用いてポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を包含するポリヌクレオチドを適切なベクター内に挿入することができ、本明細書においてさらに論じられるように、ベクターを次に、複製および増幅のために、適切な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている任意の手段によって宿主細胞内に導入することができる。細胞は、直接的な取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、F交配、またはエレクトロポレーションによって外因性のポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。導入されると、外因性のポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクタープラスミドなどとして細胞内に維持され得るか、または宿主細胞ゲノム内に組み込まれ得る。このように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、上記のSambrookら、1989を参照されたい。あるいは、PCRによって、DNA配列の再生が可能になる。PCR技術は、当技術分野において周知であり、米国特許第4,683,195号、米国特許第4,800,159号、米国特許第4,754,065号、および米国特許第4,683,202号、ならびにPCR:ThePolymeraseChainReaction、Mullisら、1994編BirkauswerPress、Boston、MAにおいて記載されている。RNAは、適切なベクター内の単離されたDNAを用いること、およびそれを適切な宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、DNAがRNAに転写されると、RNAは次に、例えば上記のSambrookら、1989において説明されているように、当業者に周知の方法を用いて単離され得る。適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築することができるか、または当技術分野において利用可能な多くのクローニングベクターから選択することができる。選択されるクローニングベクターは、使用が意図されている宿主細胞に従って変化し得るが、有用なクローニングベクターは、通常、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼについての単一の標的を有し得、かつ/またはベクターを含むクローンの選択において用いられ得るマーカーの遺伝子を坦持し得る。適切な例には、プラスミドウイルスおよび細菌ウイルス、例えば、pUC18、pUC19、Bluescript例えば、pBSSK、およびその誘導体、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、ファージDNA、ならびにシャトルベクター、例えばpSA3およびpAT28が含まれる。これらのおよび多くの他のクローニングベクターは、BioRad、Strategene、およびInvitrogenなどの市販の販売者から入手可能である。発現ベクターは通常、本発明に従ったポリヌクレオチドを含む、複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターはエピソームとして、または染色体DNAの不可欠な部分として、宿主細胞において複製可能でなければならないことが黙示される。適切な発現ベクターには、限定はしないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびPCT公開WO87/04462において開示されている発現ベクター1つまたは複数が含まれる。ベクターの成分には、通常、限定はしないが、シグナル配列、複製起点、1つまたは複数のマーカー遺伝子、適切な転写制御エレメントプロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなどの1つまたは複数が含まれ得る。発現すなわち、翻訳では、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンなどの、1つまたは複数の翻訳制御エレメントもまた通常必要である。目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、エレクトロポレーション;塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、または他の物質を採用するトランスフェクション;微粒子銃;リポフェクション;および感染例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性物質である場合を含む、多くの適切な手段のいずれかによって宿主細胞内に導入することができる。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、宿主細胞の特徴に応じることが多い。本発明はまた、本明細書において記載されているポリヌクレオチドのいずれかを包含する宿主細胞を提供する。異種DNAを過剰発現し得るあらゆる宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的で用いることができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、限定はしないが、COS細胞、HeLa細胞、NSO細胞、およびCHO細胞が含まれる。PCT公開WO87/04462も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核細胞大腸菌E.coliまたは枯草菌B.subtillisなどおよび酵母サッカロミセスセレビシエS.cerevulisae、シゾサッカロミセスポンベS.pombe、またはクルイベロミセスラクチスK.lactisが含まれる。好ましくは、宿主細胞は、宿主細胞内にもし存在する場合には、対応する内在性の目的の抗体またはタンパク質のレベルよりも、約5倍高い、さらに好ましくは10倍高い、さらに好ましくは20倍高いレベルでcDNAを発現する。抗原への特異的結合についての宿主細胞のスクリーニングは、免疫アッセイまたはFACSによって行われる。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。C.組成物本発明の方法において用いられる組成物は、効果的な量のpH依存性の抗体、または、本明細書において記載されているpH依存性の抗体に由来するポリペプチドを包含する。このような組成物の例、およびこれらを製剤する方法もまた、先の節および以下に記載されている。1つの実施形態において、組成物は、1つまたは複数のpH依存性の抗体を包含する。他の実施形態において、pH依存性の抗体は、ヒトPCSK9を認識する。さらに他の実施形態において、pH依存性の抗体はヒト化されている。さらに他の実施形態において、pH依存性の抗体は、抗体介在性の溶解またはADCCなどの望ましくないまたは好ましくない免疫応答を引き起こさない定常領域を包含する。他の実施形態において、pH依存性の抗体は、抗体の1つまたは複数のCDR1つまたは複数例えば、1個、2個、3個、4個、5個、またはいくつかの実施形態においては6個全てのCDRを包含する。いくつかの実施形態において、pH依存性の抗体はヒト抗体である。本発明において用いられる組成物はさらに、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態の、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤を包含し得るRemington:TheScienceandPracticeofPharmacy第20版、2000、LippincottWilliamsおよびWilkins編、K.E.Hoover。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、その投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、およびm-クレゾール;低分子量約10残基未満のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、またはデキストランを含む単糖、二糖、および他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体例えば、Zn-タンパク質錯体;ならびに/またはTWEEN商標、PLURONICS商標、もしくはポリエチレングリコールPEGなどの非イオン性界面活性剤を包含し得る。薬学的に許容できる賦形剤は、本明細書においてさらに記載されている。1つの実施形態において、抗体は、約5.0から約6.5にわたるpHを有し、約1mg/mlから約200mg/mlの抗体、約1ミリモル濃度から約100ミリモル濃度のヒスチジン緩衝液、約0.01mg/mlから約10mg/mlのポリソルベート80、約100ミリモル濃度から約400ミリモル濃度のトレハロース、および約0.01ミリモル濃度から約1.0ミリモル濃度のEDTA二ナトリウム二水和物を包含する、無菌水溶液としての製剤で投与される。pH依存性の抗体およびその組成物はまた、作用物質の有効性を増強するおよび/または補うために役立つ他の作用物質と組み合わせて用いることができる。D.キット本発明はまた、本方法において用いるためのキットを提供する。本発明のキットには、本明細書において記載されているpH依存性の抗体ヒト化抗体などまたはペプチドを包含する1つまたは複数の容器と、本明細書において記載されているあらゆる本発明の方法に従った使用のための指示とが含まれる。通常、これらの指示は、上記に記載された治療的治療のためのpH依存性の抗体の投与の説明を包含する。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はヒト抗体である。他の実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。pH依存性の抗体の使用に関する指示には通常、意図する治療のための投与量、投与スケジュール、および投与経路についての情報が含まれる。容器は、単位用量、大量包装例えば、多用量包装、またはサブユニット用量であり得る。本発明のキットにおいて提供される指示は、典型的には、ラベルまたは包装挿入物上に書かれた指示例えば、キットに含まれる紙片であるが、機械可読の指示例えば、磁気式または光学式記憶ディスク上にある指示もまた許容できる。本発明のキットは適切な包装内にある。適切な包装には、限定はしないが、バイアル、ボトル、瓶、柔軟な包装例えば、密封されたマイラーまたはプラスチック袋などが含まれる。また、特定の装置、例えば吸入器、経鼻投与装置例えば、アトマイザー、またはミニポンプなどの点滴装置と組み合わせて用いるための包装も意図される。キットは、無菌のアクセスポートを有し得る例えば、容器は、皮下注入針によって穴をあけることが可能なストッパーを有する静脈内溶液袋またはバイアルであり得る。容器もまた、無菌のアクセスポートを有し得る例えば、容器は、皮下注入針によって穴をあけることが可能なストッパーを有する静脈内溶液袋またはバイアルであり得る。組成物内の少なくとも1つの活性物質は、pH依存性の抗体である。容器例えば、充填済みシリンジまたは自己注射器は、第2の薬学的に活性な作用物質をさらに包含し得る。キットは、緩衝液および説明情報などのさらなる構成要素を提供してもよい。通常、キットは、容器と、容器上のまたは容器に付随したラベルまたは包装挿入物1つまたは複数とを包含する。突然変異および修飾本発明の抗体を発現させるために、VH領域およびVL領域をコードするDNA断片をまず、上記の方法のいずれかを用いて得ることができる。様々な修飾、例えば、突然変異、欠失、および/または付加をまた、当業者に知られている標準的な方法を用いてDNA配列内に導入することができる。例えば、突然変異生成は、標準的な方法、例えば、突然変異したヌクレオチドをPCRプライマー内に組み込んでPCR産物が所望の突然変異または部位特異的突然変異生成を含むようにする、PCR介在性の突然変異生成を用いて実施することができる。例えば、行われ得る置換の1つのタイプは、抗体における化学的に反応性であり得る1つまたは複数のシステインを、別の残基、例えば、限定はしないが、アラニンまたはセリンに変更することである。例えば、非正準的なシステインの置換があり得る。置換は、抗体の、可変ドメインのCDRもしくはフレームワーク領域において、または定常ドメインにおいて行うことができる。いくつかの実施形態において、システインは正準的である。抗体はまた、例えば、抗体の結合特性を改変するために、重鎖および/または軽鎖の可変ドメインにおいて修飾することができる。例えば、突然変異は、抗原に対する抗体のKDを増大もしくは減少させるため、kOffを増大もしくは減少させるため、または抗体の結合特異性を改変するために、CDR領域の1つまたは複数において行うことができる。部位特異的突然変異生成の技術は、当技術分野において周知である。例えば、上記のSambrookら、およびAusubelらを参照されたい。修飾または突然変異はまた、pH依存性の半減期を増大させるために、フレームワーク領域または定常ドメインにおいて行うことができる。例えば、PCT公開WO00/09560を参照されたい。フレームワーク領域または定常ドメインにおける突然変異はまた、抗体の免疫原性を改変するため、別の分子への共有結合もしくは非共有結合のための部位を提供するため、または補体の固定、FcR結合、および抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用などの特性を改変するために行うことができる。本発明に従うと、単一の抗体は、可変ドメインのCDRもしくはフレームワーク領域のあらゆる1つまたは複数において、または定常ドメインにおいて、突然変異を有し得る。生殖細胞系化として知られているプロセスにおいて、VH配列およびVL配列における特定のアミノ酸を、生殖細胞系のVH配列およびVL配列において天然に見られるアミノ酸に適合するように突然変異させることができる。特に、VH配列およびVL配列におけるフレームワーク領域のアミノ酸配列は、抗体が投与された場合に免疫原性のリスクを低減させるために、生殖細胞系の配列に適合するように突然変異させることができる。ヒトのVH遺伝子およびVL遺伝子の生殖細胞系DNA配列は、当技術分野において知られている例えば、Vbaseヒト生殖細胞系配列データベースを参照されたい;また、Kabat,E.A.ら1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、第5版、U.S.DepartmentofHealthandHumanServices、NIHPubl.No.91~3242;Tomlinsonら、1992、J.Mol.Biol.227:776~798;およびCoxら、1994、Eur.J.Immunol.24:827~836も参照されたい。行われ得る別のタイプのアミノ酸置換は、抗体における潜在的なタンパク質分解部位を除去することである。このような部位は、抗体の可変ドメインのCDRもしくはフレームワーク領域において、または定常ドメインにおいて生じ得る。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去は、抗体生成物の不均質性のリスクを減少させ得、したがって、その均質性を増大させる。別のタイプのアミノ酸置換は、残基の一方または両方を改変することによって、潜在的な脱アミド化部位を形成するアスパラギン-グリシン対を取り除く。別の実施例において、本発明のpH依存性の抗体の重鎖のC末端リジンを切断することができる。本発明の様々な実施形態において、抗体の重鎖および軽鎖は、シグナル配列を含んでいてもよい。本発明のVHセグメントおよびVLセグメントをコードするDNA断片が得られると、これらのDNA断片はさらに、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Fab断片遺伝子に、またはscFv遺伝子に変換するための標準的な組換えDNA技術によって、さらに操作することができる。これらの操作において、VLをコードするDNA断片またはVHをコードするDNA断片は、抗体の定常領域または柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のDNA断片に機能可能に結合される。用語機能可能に結合されるは、この文脈において用いられる場合、2つのDNA断片によってコードされているアミノ酸配列がインフレームであり続けるように2つのDNA断片が結合されることを意味することを意図している。VH領域をコードする単離されたDNAは、VHをコードするDNAを、重鎖定常領域CH1、CH2、およびCH3をコードする別のDNA分子に機能可能に結合することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において知られており例えば、Kabat,E.A.ら、1991、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、第5版、U.S.DepartmentofHealthandHumanServices、NIHPubl.No.91~3242を参照されたい、これらの領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、またはIgDの定常領域であり得るが、最も好ましくは、IgG1またはIgG2の定常領域である。IgGの定常領域配列は、異なる個体の間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子またはアロタイプ、例えば、Gm1、Gm2、Gm3、およびGm17であり得る。これらのアロタイプは、IgG1定常領域における天然のアミノ酸置換に相当する。Fab断片の重鎖遺伝子では、VHをコードするDNAは、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に機能可能に結合され得る。CH1重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれかに由来し得る。VL領域をコードする単離されたDNAは、VLをコードするDNAを、軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子に機能可能に結合することによって、完全長軽鎖遺伝子およびFab軽鎖遺伝子に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において知られており例えば、Kabat,E.A.ら、1991、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、第5版、U.S.DepartmentofHealthandHumanServices、NIHPubl.No.91~3242を参照されたい、これらの領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域またはラムダ定常領域であり得る。カッパ定常領域は、異なる個体の間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子、例えばInv1、Inv2、およびInv3であり得る。ラムダ定常領域は、3つのラムダ遺伝子のいずれかに由来し得る。scFv遺伝子を生成するために、VHをコードするDNA断片およびVLをコードするDNA断片が、柔軟なリンカーをコードしている、例えばアミノ酸配列Gly4-Ser3をコードしている別の断片に機能可能に結合され、その結果、VH配列およびVL配列は、VL領域およびVH領域が柔軟なリンカーによって結合した、連続した一本鎖タンパク質として発現され得る例えば、Birdら、1988、Science242:423~426;Hustonら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879~5883;McCaffertyら、1990、Nature348:552~554を参照されたい。一本鎖抗体は、単一のVHおよびVLのみが用いられれば一価であり得、2つのVHおよびVLが用いられれば二価であり得、または、3つ以上のVHおよびVLが用いられれば多価であり得る。抗原および別の分子に特異的に結合する二重特異的抗体または多価抗体が生成され得る。別の実施形態において、別のポリペプチドに結合した、本発明の抗体の全てまたは一部を包含する、融合抗体またはイムノアドヘシンを作製することができる。別の実施形態において、抗体の可変ドメインのみがポリペプチドに結合している。別の実施形態において、抗体のVHドメインは第1のポリペプチドに結合しているが、抗体のVLドメインは第2のポリペプチドに結合しており、第2のポリペプチドは、VHドメインおよびVLドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成するように、第1のポリペプチドと会合している。別の好ましい実施形態において、VHドメインは、リンカーによってVLドメインから分離されており、その結果、VHドメインおよびVLドメインは互いに相互作用し得る。VH-リンカー-VL抗体は、次に、目的のポリペプチドに結合している。さらに、2つまたはそれ以上の一本鎖抗体が互いに結合している融合抗体が生成し得る。これは、単一のポリペプチド鎖で二価抗体もしくは多価抗体を生成したい場合に、または二重特異的抗体を生成したい場合に、有用である。他の実施形態において、他の修飾された抗体を、核酸分子をコードするpH依存性の抗体を用いて調製することができる。例えば、カッパボディIllら、1997、ProteinEng.10:949~57、ミニボディMartinら、1994、EMBOJ.13:5303~9、ダイアボディHolligerら、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444~6448、またはJanusinsTrauneckerら、1991、EMBOJ.10:3655~3659、およびTrauneckerら、1992、Int.J.Cancer補追7:51~52を、明細書の教示に従って、標準的な分子生物学的技術を用いて調製することができる。二重特異的抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはFab’断片の結合を含む様々な方法によって生産することができる。例えば、SongsivilaiおよびLachmann、1990、Clin.Exp.Immunol.79:315~321;Kostelnyら、1992、J.Immunol.148:1547~1553を参照されたい。さらに、二重特異的抗体は、ダイアボディまたはJanusinsとして形成され得る。いくつかの実施形態において、二重特異的抗体は、2つの異なる抗原エピトープに結合する。いくつかの実施形態において、上記の修飾された抗体は、本明細書において提供されるヒト抗体の可変ドメインまたはCDR領域の1つまたは複数を用いて調製される。抗原特異的な抗体の生成代表的な本発明の抗体、5L1721H23_6L3および5L1721H23_6L3H3の重鎖および軽鎖のDNAは、2009年12月22日にAmericanTypeCultureCollectionATCCに寄託されブダペスト条約の条件のもとで、表2に示す受託番号を割り当てられた。このように寄託されたプラスミドの、公衆にとっての利用性に対するすべての制限は、本発明の明細書の特許が発行されることで変更不可能に取り除かれる。5L1721H23_6L3の重鎖および軽鎖についての抗体参照番号は、それぞれ、UC-H5H23およびUC-H5L1721-6L3である。5L1721H23_6L3H3の重鎖および軽鎖についての抗体参照番号は、それぞれ、UC-H5H23-6H3およびUC-H5L1721-6L3である。実施例1PCSK9抗原に対する抗体のpH依存性の結合のモデリングコンピュータモデリングを用いて、pH依存性の抗原結合を有する抗体が、抗体の半減期、PCSK9血清濃度が低下する期間に影響し得るかどうかを予測した。このモデリングの目的で、以下の仮定を行った:血液中1uM用量の抗体;21日の非pH依存性の抗体の半減期;100日の刺激付与期間;pH依存性の抗体では、Kon=1e5/M/s、中性pHでのKoff=KD×Kon、pH依存性の結合は、酸性のエンドソームにおけるKoffの増大としてモデリングされる;酸性pHでのKoff=R×中性pHでのKoff。モデルにおける種の変化の時間率は、以下の微分方程式によって、モデルパラメータに関して特定される。通常、モデルは、それが定常状態に達するまで、ゼロに設定された抗体レベルで進行することが可能となっており、定常状態の時点では、[mAb]をゼロから用量を反映するレベルまで再設定することによって抗体のボーラスが刺激され、その後、以下に記載されているモデルの進行が可能になる。モデルにおいて用いられるパラメータを、表3において以下に記載する。いくつかのケースにおいて、パラメータは、他の生理学的に関連する量または測定された量から誘導される。これらも同様に表において示されている。モデリングの1つの描写を図1に示す。エンドソームのpHすなわち、pH5.5または6.0/生理学的なpH7.4のKD比率が1から2に増大すると、経時的に抗体濃度が増大し、これは、KD比率の値と相関した。KD比率またはkoffもしくはkonが変化すると、抗原を有さないリガンドの濃度図2および抗体濃度図3が、KD比率の増大図2、koffの増大図3A、およびkonの減少図3Bと相関して変化した。これらの結果は、エンドソームのpHが5.5であったか6.0であったかの指定には依存しなかった。ヒートマップ表示図4を、pH依存性の結合を有する抗体の一般的モデルについて構築し、これは、pH依存性の結合を有する抗体が非pH依存性の抗体で観察されるものよりも抗原の血清濃度を何日長く減少させるかを効果的に示している。ノックダウン日数は、0日目から100日目の1-C血清t/C血清t=0の積分によって規定され、例えば、N日間にわたる血清濃度の100の低減の後に処理前レベルまで戻ると、N日のノックダウン日数に対応する。ヒートマップは、中性pHでのKDおよびKD比率Rに基づいて対照抗体と比較した、pH依存性の抗体についてのノックダウン日数の増大を示す。効果は、モデリングされた全てのKD値にわたって見られ、特に0.01と100nMとの間、さらに特に0.1と10nMとの間のKDで見られる。特定のパラメータ、例えば用量サイズ、抗体の動態、刺激期間、または他の量の変化によって、ヒートマップ上で示される値がある程度異なる。pH依存性の結合を有するかまたは有さないPCSK9抗体の性能についてのモデリング予測は、実際の実験結果と良好に相関した。図5Aに、pH依存性の結合を有さずKD比率が1.1の抗体5A10を投与した後の経時的な総抗体濃度を示す。対応のLDLレベルを図5Bに示す。図6Aには、pH依存性の結合を有しKD比率が14.4の抗体5L1721H23_6L3H3を投与した後の経時的な総抗体濃度を示す。対応のLDLレベルもまた図6Bに示す。図5および図6におけるこれらのモデルおよび実験では、5.5のpHが仮定され、抗体の実験的KD値はpH5.5で計算された。pH依存性の結合をする抗体は、5A10と比較して、総抗体濃度が引き延ばされ、LDLレベルの阻害が引き延ばされた。pH依存性の結合を有する抗体の一般的モデルについてのさらなる議論を、実施例4において示す。実施例2pH依存性のPCSK9結合を有する抗PCSK9抗体の生成およびスクリーニングヒスチジンスキャン突然変異生成を、モノクローナル抗体h5A105A10huフレームとしても知られているの全CDRについて行った。この抗体は、マウスモノクローナル抗体5A105A10.B8としても知られているに由来するが、ヒトフレームワーク領域を有する。開始鋳型として用いられるh5A10抗体の配列を以下に示すCDRは太字である。軽鎖可変領域:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQRYSTPRTFGQGTKLEIK配列番号1重鎖可変領域:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGEINPSGGRTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARERPLYAMDYWGQGTTVTVSS配列番号2抗体h5A10を細菌発現ベクター内にクローニングし、これによって、大腸菌E.coliのペリプラズムにおけるFabの発現が可能になる。プライマーを用いて、全てのCDR位置をヒスチジンに突然変異させ、その結果、h5A10抗体の58個の単一ヒスチジン突然変異体が生じた。これらの単一ヒスチジン突然変異体を有する抗体を、IPTGで誘発した後に大腸菌E.coliのペリプラズムにおいて発現させ、CH1のC末端上にあるヒスチジンタグを用いて精製した。精製されたFabの親和性を、Biacoreを用いて、pH5.5および7.4で測定した。pH5.5/pH7.4のKD比率に影響する突然変異は、4つの異なるCDRL1、L2、H2、およびH3において見られた。pH依存性のKD変化は、わずかな減少から顕著な減少にまでわたった。3つのCDRL1、L2、およびH2からの突然変異は、pH7.4での親和性を破壊することなく、pH5.5/pH7.4のKD比率を増大させ、これらの突然変異を含むCDRを組み合わせる抗体が生じた。h5A10および全ての突然変異体では、重鎖CDR1H1の配列は、GYTFTSYYMH配列番号6である。5A10、単一の、二重の、および三重の突然変異体、ならびに5L1721H23_6H3では、軽鎖CDR3L3はQQRYSTPRT配列番号27である。他の親和性成熟した突然変異体およびL1L3に基づく突然変異体では、L3はQQRYSLWRT配列番号12である。突然変異のこれらの様々な組み合わせを含む抗体のCDR配列を、以下の表4に示す。配列番号の識別子は、括弧内に示されている。5A10.B8と比較して、これらの抗体のフレームワーク配列において変化は生じなかった。例えば、5L1721H23_6L3および5L1721H23_6L3H3の重鎖可変領域の配列を以下に示す。同一の軽鎖可変領域をこれらの抗体のそれぞれにおいて用い、これらもまた以下に示す。CDRは太字で強調されている。5L1721H23_6L3および5L1721H23_6L3H3の軽鎖可変領域:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVHTAVAWYQQKPGKAPKLLIYHASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQRYSLWRTFGQGTKLEIK配列番号3重鎖可変領域5L1721H23_6L3:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGEIHPSGGRTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARERPLYAMDYWGQGTTVTVSS配列番号4重鎖可変領域5L1721H23_6L3H3:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGEIHPSGGRTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARERPLYASDLWGQGTTVTVSS配列番号55L1721H23_6L3および5L1721H23_6L3H3の軽鎖可変領域カッパgatatccagatgacacagtccccatcctccctgtctgcctctgtgggcgaccgcgtcaccatcacctgcaaggcctctcaggatgtgcatactgctgtagcctggtatcagcagaagccaggcaaagccccaaaactgctgatctaccatgcatcctaccgctacactggtgtcccatcacgcttcagtggcagtggctctggtacagatttcaccttcaccattagcagcctgcaaccagaagatattgccacttattactgccagcaacgttatagtctgtggcgcacgttcggtcaaggcaccaagctggagatcaaa配列番号235L1721H23_6L3H3の重鎖可変領域caggtgcagctggtgcagtctggtgctgaggtgaagaagcctggcgcttccgtgaaggtttcctgcaaagcatctggttacacctttaccagctactatatgcactgggtgcgccaagcccctggtcaaggcctggagtggatgggcgagattcatcctagcggcggtcgtactaactacaatgagaagttcaagagccgcgtgactatgactcgcgatacctccaccagcactgtctacatggaactgagctctctgcgctctgaggacactgctgtgtattactgtgcccgcgagcgccccctgtatgctagcgacctgtggggccagggtaccacggtcaccgtctcctca配列番号24これらの抗体を、HBS-EPランニングバッファーを用いて、研究グレードのセンサーチップを備えた表面プラズモン共鳴Biacore3000バイオセンサーで測定する、7.4でのそれらのKDおよびpH5.5/pH7.4のそれらのKD比率を決定するためにBiacoreAB、Uppsala、Sweden-現在はGEHealthcare、発現させ、精製した。ウサギポリクローナル抗MsIgGを、標準的なN-ヒドロキシスクシンイミド/エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドNHS/EDC化学を用いて、チップ上に飽和レベルでアミン結合した。緩衝液を、HBS-EP1mg/mLのBSA1mg/mLのCM-デキストランに交換した。完全長PCSK9IgGを約15μg/mLに希釈し、5μL/分で1分間捕捉して、参照チャネルとして用いるための1つのブランクを残して、フローセル当たり約500RUのレベルを得た。3.73~302nMのhPCSK9または2.54~206nMのmPCSK9を、5回3セットで、100μL/分で1分間にわたり注入した。解離を5分間にわたりモニタリングした。チップを、100mMのリン酸の30秒のパルスを2回行う各滴定の最後の注入の後に再生させた。緩衝液サイクルによって、データを二重参照するためのブランクが提供され、データを次に、Biaevaluationソフトウェアv.4.1を用いて、単純結合モデルに全体的に適合させた。運動速度定数の商KD=koff/konから親和性を推定した。ヒトPCSK9に対する親和性についての結果を表5に示し、マウスPCSK9に対する親和性についての結果を表6に示す。これらのデータは、抗体が、ヒトまたはマウスのPCSK9にpH7.4で高い親和性を有し、pH5.5で低い親和性を有するように、設計および選択され得ることを示す。PCSK9抗体h5A10および5L1721H23_6L3H3ならびにPCSK9抗体H1M300Nについての親和性および動態パラメータUS2010/0166768、例えば、Table7を参照されたい。全ての実験は、Biacore2000バイオセンサーで行った。抗ヒトFcセンサーチップを、400mMのEDCおよび100mMのNHSの1:1v/v混合物を用いて、10μL/分の流速で7分間にわたり、BiacoreCM4センサーチップの全てのフローセルを活性化することによって調製した。抗ヒトFc試薬ヒトIgGFcに対するヤギFAB’2断片、Cappelカタログ番号:55053を、10mMの酢酸ナトリウムpH5.0内に60μg/mLまで希釈し、全てのフローセル上に20μL/分で7分間にわたり注入した。全てのフローセルを、150mMのホウ酸緩衝液pH8.5内の100mMのエチレンジアミンで、10μL/分で7分間にわたりブロックした。動態アッセイを、Karlssonら、Anal.Biochem349、136~1472006において記載されているような動態滴定方法を用いて行った.同一の抗体例えば、5L1721H23_6L3H3を、10μL/分の流速でフローセル2、3、および4でそれぞれ30秒、60秒、および120秒にわたり、2μg/mLで下流のフローセルフローセル2、3、および4に捕捉した。フローセル1を参照表面として用いた。抗体を捕捉した後、PCSK9を、低濃度から高濃度の一連の注入で、30μL/分で全てのフローセルに注入した。最高濃度は200nMのPCSK9であり、希釈倍数は3倍であった。各PCSK9注入は2分であり、200nMのPCSK9を注入した後の解離時間は20分であった。類似の注入セットを、二重参照の目的で、PCSK9の代わりにランニングバッファーを用いて行ったMyszka、J.Mol.Recognit12、279~284、1999において記載されているような二重参照。各分析サイクルの後、全てのフローセルを、75mMのリン酸の30秒の注入を3回行って、再生した。所与のPCSK9/抗体対についての、フローセル2および3から得られるセンサーグラムを、マストランスポート結合モデルを用いて、単純な1:1のラングミュアに全体的に適合させた。実験は、試料と、それぞれ10mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、0.05Tween-20からなるランニングバッファーpH6、および10mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、0.05Tween-20からなるランニングバッファーpH7.4とを用いて、pH6.0および7.4で行った。実施例3pH依存性PCSK9結合抗体は、コレステロールの低下に対して延長された薬力学的効果を有するA.pH依存性PCSK9結合アンタゴニスト抗体は、マウスにおいて、延長した時間にわたり、血清コレステロールを低下させるpH依存性PCSK9結合アンタゴニスト抗体が、非pH依存性の抗体と比較して、延長した期間にわたりコレステロールレベルをインビボで低下させ得るかどうかを決定するために、酸感受性抗体5L1721H23_6H3および5L1721H23_6L3H3ならびに非酸性感受性抗体h5A1010mg/kgでのみ投与するおよび5A10.B8の経時的な効果を、1、3、または10mg/kgでマウスに注入した場合の血清コレステロールについて試験した。4つの抗体全ては、中性pHPH7.4で、マウスPCSK9に対して5~14nMの類似の結合親和性を有する。抗体5L1721H23_6H3および5L1721H23_6L3H3は、pH5.5で、それぞれ117nMおよび408nMの低減した親和性を有するが、h5A10および5A10.B8は、pH5.5で、7.4でのKD5.2nMに類似したKDを有する。6から7週齢のオスC57/bl6マウスを、12時間の明/暗サイクルで維持し、7日目に採血しておよそ70μlの血清を回収した。アンタゴニストPCSK9抗体、およびいかなる既知の哺乳動物タンパク質にも結合しない対照のアイソタイプ適合モノクローナル抗体を、オスの7週齢のC57/bl6マウスにIV注入し、血清試料を、注入後5日目、12日目、19日目、26日目、61日目、および75日目に回収した。全ての血清試料を、AceAlera機器AlfaWassermann、WestCaldwell、NJで、総コレステロール、トリグリセリド、HDLコレステロールについて分析し、LDLコレステロールレベルを、Friedewaldの式を用いて計算した。図7は、PCSK9アンタゴニスト抗体を注入した後の、総コレステロールレベルの迅速かつ用量依存的な減少を示す。マウスにおけるLDLコレステロールレベルは、確実に測定および計算するには低すぎた。10mg/kgの用量では、4つの抗体全ては、5日目および12日目に、HDLコレステロールを35~40低下させたが、5L1721H23_6H3および5L1721H23_6L3H3を注入された動物は61日目まで回復せず、h5A10および5A10.B8を注入された動物は、それぞれ26日目および33日目にベースラインレベルまで回復した。B.pH依存性PCSK9結合抗体は、マウスにおいて延長した半減期を有する抗体の血清濃度を、実施例bにおいて記載されているものと同一の研究で決定して、PH感受性の抗PCSK9抗体が延長した抗体半減期をもたらすかどうかを決定した。h5A10および5A10.B6などの正常な抗PCSK9抗体は、抗体/抗原複合体のPCSK9介在性の分解に起因して、他の可溶性抗原に結合する抗体と比較して、用量依存的な短い半減期を有する。図8Aにおいて示されるように、pH依存性の結合特性は、抗体の分解を低減させ、抗PCSK9抗体5L1721H23_6H3および5L1721H23_6L3H3の半減期を延長させた。5L1721H23_6H3および5L1721H23_6L3H3の引き延ばされたPKが抗体のPCSK9介在性のクリアランスの低下により生じたということをさらに実証するために、類似の経時的研究をPCSKノックアウトマウスにおいて行った。pH感受性抗体と非感受性抗体との間の血清抗体濃度および低減速度の差は、3mg/kgのヒトPCSK9をマウスに注入するまで顕著ではなかった。この注入の後、非pH感受性のPCSK9抗体は、pH感受性の抗体および陰性対照抗体と比較して分解の増大を示した図8B。これらの結果は、pH依存性PCSK9結合PCSK9抗体の分解の観察された減少が、PCSK9からの抗体の解離、つまりPCSK9介在性の分解からの抗体の救出によって生じることを示す。C.pH感受性のPCSK9アンタゴニスト抗体は、サルにおいて、延長した期間にわたり、血清コレステロールを低下させる図9Bは、パーセント対照であるカニクイザルの血清LDLコレステロールレベルに対する、PH感受性の抗PCSK9アンタゴニスト抗体5L1721H23_6H3および5L1721H23_6L3H3ならびに非感受性の抗PCSK抗体L1L3の効果を説明するものである。抗体それぞれ1.5mg/kgを、0日目にメスのカニクイザルにi.v.ボーラス注入を介して投与した。LDLコレステロールは、3つ全ての抗体で処理した群において、日目までにベースラインの50まで低減した。LDLコレステロールレベルは、非pH感受性の抗体を投与した後10日目までにベースラインに戻ったが、LDLコレステロールは、pH感受性の抗体で処理したサルにおいては、21日目まで抑制されたままであった。HDLレベルは、抗体治療の結果、基本的に不変のまま維持された図9A。図10は、pH感受性の抗PCSK9抗体の半減期が非pH感受性のL1L3と比較して延長したことを示す。実施例4pH依存性の抗原結合を有する抗体についての一般的モデリングコンピュータモデリングを用いて、その包括的な抗原に対するpH依存性の結合を有する抗体が抗体の半減期および/または抗原の量もしくは血清濃度を低下させる期間に影響し得るかどうかを予測した。このモデリングの目的で、以下の仮定を行った:1抗体;血液中1uM用量の抗体;21日の抗体半減期;2100日の刺激付与;抗体の結合およびpH依存性の結合;Kon=1e5/M/s;中性pHでのKoff=KD×Kon;pH依存性の結合は、酸性のエンドソームにおけるKoffの増大としてモデリングされる;酸性pHでのKoff=R×中性pHでのKoff。図15は、モデリングに用いられたpH依存性の結合を有する抗体についてのトラフィックモデルを詳述し、モデルを定義する方程式は以下の通りである。モデルにおいて用いられるパラメータを、表8において以下に記載する。図4において示されるヒートマップは、pH依存性の結合を有する抗体が、pH依存性の結合を有さない抗体によるノックダウンよりもどれほど多く抗原のノックダウンに影響するかを示す。このノックダウン量は、100日間の刺激にわたる2つの抗体の遊離抗原曲線の間の領域を測定することによって決定される。これは、pH依存性の結合を有する抗体がpH依存性の結合を有さない抗体によるノックダウンよりも何日長く抗原のノックダウンに影響するかということであると考えることができるが、これらの2つの測定基準は、正確に相関する必要はない。マップ上の明るい領域は、長い期間および/または遊離抗原の強いノックダウンを反映する。図11のヒートマップは、pH依存性の抗原結合を有する潜在的な抗体が、抗原がDKK1、IgE、またはC5であった場合にいかに抗原のノックダウンに影響するかを示す。これらの抗原のそれぞれで、pH依存性の結合を有する抗体は、抗原のノックダウンを延長し得た。図12は、IgEに対するpH依存性の結合を有する抗体についてのさらに詳細なモデリングを示す。抗体の、生じた、IgEノックダウンの期間の延長は、KDが約1nM以上であり、pH6.0/pH7.4でのKD比率Rが3以上である。抗原DKK1についての類似の分析を図13に示し、C5についての類似の分析を図14に示す。DKK1では、KDの理想的な範囲は、3~30の範囲のKD比率にわたり、1.0~100nMである。C5では、KDの理想的な範囲はまた、3~30の範囲のKD比率で1.0~100nMである。実施例5pH依存性のIgE結合を有する抗IgE抗体の生成およびスクリーニングヒスチジン置換を、以下の軽鎖可変領域VLおよび重鎖可変領域VHのアミノ酸配列CDRは太字であるを有する抗IgE抗体5.948-H100Yにおける、下線を引かれた残基の位置で行った。VLDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPPATFGGGTKVEIK配列番号25VHQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMDPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYDSDGYYSFSGMDVWGQGTTVTVSS配列番号26抗体を、25°Cで、IgEの結合について試験した。親和性および速度定数を決定するために、全ての実験は、BiacoreT200バイオセンサーで行った。ビオチン捕捉表面を、NeutrAvidinの固定によって調製した。BiacoreCM4センサーチップの全てのフローセルを、10μL/分の流量で、400mMのEDCおよび100mMのNHSの1:1v/v混合物で7分間にわたり活性化した。NeutrAvidinPierce、製品番号:31000を、10mMの酢酸ナトリウムpH4.5内に100μg/mLまで希釈し、全てのフローセル上に20μL/分で7分間にわたり注入した。全てのフローセルを、150mMのホウ酸緩衝液pH8.5内の100mMのエチレンジアミンで、10μL/分で7分間にわたりブロックした。IgE構築物社内で発現および精製されたヒトIgE-FcCh2-Ch3-Ch4を、IgEを等モル濃度量のEZ-LinkNHS-LC-LC-ビオチンThermoScientific、カタログ番号21343と共に室温で30分間にわたりインキュベートすることによって、最低限ビオチン化した。遊離ビオチンを、緩衝液の交換によって除去した。全てのBiacore実験は、センサーチップの4つのフローセルの2つ1および2、または3および4を並行して用いて行った。下流のフローセルを分析フローセルとして用い、一方、他方のフローセルを参照表面として用いた。したがって、ビオチン化されたIgEB-IgEは分析フローセル上に捕捉され、全ての精製されたFab断片が両方の上に注入された。参照フローセルのセンサーグラムを、分析フローセルのセンサーグラムから差し引いた。B-IgEを、捕捉の直前に、ランニングバッファー内に5ug/mLの最終濃度まで希釈した。pH6.0では、B-IgEは、10uL/分で60秒間にわたり注入した。pH7.4では、B-IgEは、類似の捕捉レベルを得るために80秒にわたり注入した。動態アッセイを、Karlssonら、AnalBiochem349:136~147、2006において記載されているような動態滴定方法を用いて行った。B-IgEを捕捉した後、精製されたFab断片を、低濃度から高濃度の一連の注入で、30μL/分で分析フローセルおよび参照フローセルに注入した。Fabの最高濃度は30nMから200nMの範囲であり、希釈倍数は3倍であった。各Fab希釈物を2分間にわたり注入し、その後、最後の注入の後に、30分の最終解離時間があった。類似の注入セットを、二重参照の目的で、Fabの代わりにランニングバッファーを用いて行ったMyszka、J.Mol.Recognit12、279~284、1999において記載されているような二重参照。二重参照したセンサーグラムを、マストランスポート結合モデルを用いて、単純な1:1のラングミュアに全体的に適合させた。実験は、試料と、それぞれ10mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、0.05Tween-20、1mg/mLのBSAからなるランニングバッファーpH6、および10mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、0.05Tween-20、1mg/mLのBSAからなるランニングバッファーpH7.4とを用いて、pH6.0および7.4で行った。以下の表9においてにおいて示されるように、IgE抗体5.948-H100Yにおけるヒスチジン置換によって、pH6.0での速いkoffならびにpH6.0/pH7.4での高いKD比率およびkoff比率を有する抗体を生じさせるのに成功した。本明細書において引用される全ての参考文献の開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。"