a魚類卵又は魚類精子の一方を遺伝的に不活化した後に媒精させて半数体ドナー受精卵を得る工程と、bホスト魚類の受精卵を得る工程と、c半数体ドナー受精卵から発生した半数体ドナー胚から得たドナー始原生殖細胞を、前記ホスト受精卵由来のホスト胚に移植する工程を含む、半数体生殖細胞を有するキメラ魚類を得る方法。前記魚類がドジョウである、請求項1に記載の方法。前記魚類がキンギョである、請求項1に記載の方法。前記魚類がゼブラフィッシュである、請求項1に記載の方法。卵又は精子の一方の遺伝的不活化が、紫外線照射又は放射線照射によって行われる、請求項1~4のいずれかに記載の方法。前記ホスト魚類は、通常の倍数性の卵と四倍体魚の二倍体精子による受精によって得られる不妊のホスト魚類である、請求項2又は3に記載の方法。前記ドナーは、色彩変異体又は遺伝子組換え体である、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。前記ホスト魚類を不妊化する方法が、前記ホスト受精卵のデットエンド遺伝子をノックダウンすることである、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。前記ノックダウンは、デッドエンドアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドを前記ホスト受精卵に注入する、請求項8に記載の方法。半数体ドナー受精卵及びホスト受精卵を区別するために、夫々に別のマーカーを導入する、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。前記マーカーが蛍光mRNAである、請求項10に記載の方法。前記蛍光mRNAが、GFPnos13’UTRmRNA又はDsRednos13’UTRmRNAである、請求項11に記載の方法。前記移植が、割球移植法、単一始原生殖細胞移植法、多価始原生殖細胞移植法、又は胚盤移植法によって行われる、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。ドナー又はホスト受精卵を得た後に卵膜除去を行う、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。請求項1~14のいずれか一項に記載の方法によって、遺伝的に同一な配偶子を得る方法。請求項15に記載の方法によって得られる遺伝的に同一な配偶子。半数体生殖細胞由来の半数体始原生殖細胞を有するキメラホスト魚類。キメラホスト魚類が不妊化個体である、請求項17に記載のキメラホスト魚類。請求項17又は18に記載のキメラホスト魚類から得られる遺伝的に同一な配偶子。半数体始原生殖細胞由来の半数体クローン魚類配偶子。魚類がドジョウ、キンギョ又はゼブラフィッシュである、請求項20に記載の半数体クローン魚類配偶子。半数体ドナー由来の半数体始原生殖細胞とホスト魚類胚とのキメラ魚類胚。前記ホスト魚類胚が不妊化個体である、請求項22に記載の魚類胚。魚類の育種において、卵割阻止型の単為発生誘起による副作用や、個体自身のもつ遺伝組成による劣性有害遺伝子の顕在化による形態形成障害に起因する生残率の低下を生じさせることなく、遺伝的にクローンの配偶子を得る技術を確立する必要がある。よって、本発明は、生殖系列キメラ技術を含む発生工学的手法を用い、染色体操作により得た半数体PGCsの生殖隆起への移動、増殖、配偶子への分化を可能とする方法を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、魚類半数体生殖細胞を有する生殖系列キメラ魚類を得る方法を目的とする。また、本発明は、当該方法によって得られた半数体生殖細胞を有する生殖系列キメラ魚類を提供することを目的とする。さらに本発明は、当該方法によって得られた生殖系列キメラ魚類が産するドナー半数体生殖細胞に由来する遺伝的に同一な配偶子を提供することを目的とする。本発明者らは、鋭意研究した結果、下記のとおり本発明をなすに至った。本発明では、従来法で用いられていた第一卵割阻止法を全く使わない。本発明においては、卵又は精子の片方のゲノムを紫外線や放射線によって完全に破壊した後、正常な精子又は卵との受精によって、雄性発生半数体又は雌性発生半数体を得る。本来、これらの方法により誘起された半数体は個体としては致死である。そこで、個体としては致死である半数体より生殖系列の細胞である始原生殖細胞PGCを取り出し、デッドエンド遺伝子をノックダウンしホスト自身の生殖細胞をアポトーシスにより欠損した不妊化ホストへ移植することによって、ホスト生殖腺内でホスト生殖細胞がドナー半数体PGCに由来する生殖細胞に置換された生殖系列キメラを誘起する。即ち、本発明は以下の通りである。項.1a魚類卵又は魚類精子の一方を遺伝的に不活化した後に媒精させて半数体ドナー受精卵を得る工程と、bホスト魚類の受精卵を得る工程と、c半数体ドナー受精卵から発生した半数体ドナー胚から得たドナー始原生殖細胞を前記ホスト受精卵由来のホスト胚に移植する工程を含む、半数体生殖細胞を有するキメラ魚類を得る方法。項.2前記魚類がドジョウである、項1に記載の方法。項.3前記魚類がキンギョである、項1に記載の方法。項.4前記魚類がゼブラフィッシュである、項1に記載の方法。項.5卵又は精子の一方の遺伝的不活化が、紫外線照射又は放射線照射によって行われる、項1~4のいずれかに記載の方法。項.6前記ホスト魚類は、通常の倍数性の卵と四倍体魚の二倍体精子による受精によって得られる不妊のホスト魚類である、項2又は3に記載の方法。項.7前記ドナーは、色素変異体又は遺伝子組換え体である、項1~6のいずれか一項に記載の方法。項.8前記ホスト魚類を不妊化する方法が、前記ホスト受精卵のデットエンド遺伝子をノックダウンすることである、項1~7のいずれか一項に記載の方法。項.9前記ノックダウンは、デッドエンドアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドを前記ホスト受精卵に注入する、項8に記載の方法。項.10半数体ドナー受精卵及びホスト受精卵を区別するために、夫々に別のマーカーを導入する、項1~9のいずれか一項に記載の方法。項.11前記マーカーが蛍光mRNAである、項10に記載の方法。項.12前記蛍光mRNAが、GFPnos13’UTRmRNA又はDsRednos13’UTRmRNAである、項11に記載の方法。項.13前記移植が、割球移植法以下、BT法ともいう、単一始原生殖細胞移植法以下、SPT法ともいう、多価始原生殖細胞移植法以下、PPT法ともいう又は胚盤移植法以下、Sandwich法ともいうによって行われる、項1~12のいずれか一項に記載の方法。項.14ドナー又はホスト受精卵を得た後に卵膜除去を行う、項1~13のいずれか一項に記載の方法。項.15項1~14のいずれか一項に記載の方法によって、遺伝的に同一な配偶子を得る方法。項.16項15に記載の方法によって得られる遺伝的に同一な配偶子。項.17半数体生殖細胞由来の半数体始原生殖細胞を有するキメラホスト魚類。項.18キメラホスト魚類が不妊化個体である、項17に記載のキメラホスト魚類。項.19項17又は18に記載のキメラホスト魚類から得られる遺伝的に同一な配偶子。項.20半数体始原生殖細胞由来の半数体クローン魚類配偶子。項.21魚類がドジョウ、キンギョ又はゼブラフィッシュである、項20に記載の半数体クローン魚類配偶子。項.22半数体ドナー由来の半数体始原生殖細胞とホスト魚類胚とのキメラ魚類胚。項.23前記ホスト魚類胚が不妊化個体である、項22に記載の魚類胚。本発明によれば、生殖系列キメラ技術を含む発生工学的手法を用い、染色体操作により得た半数体PGCsの生殖隆起への移動、増殖、配偶子への分化を可能とする方法を提供することが可能となる。本発明による、魚類半数体始原生殖細胞を有する生殖系列キメラ魚類を得る方法及び当該方法によって得られた半数体始原生殖細胞を有する生殖系列キメラ魚類によって、遺伝学、発生学、生理学、免疫学、病理学などあらゆる分野で、広く利用することが可能となる。また、水産育種において、本発明によって得られた半数体PGCsを有する生殖系列キメラから得られたクローン配偶子を用いてヘテロクローンとすることで、短期間での雑種強勢を有する優良系統の樹立が可能となる。以下に、好ましい態様を述べる。本発明において、魚類とは、淡水魚であっても海水魚であってもよい。好ましくは、ドジョウMisgurnusanguillicaudatus、とその変異体であるヒドジョウ、アルビノドジョウ、キンギョCarassiusauratus、ゼブラフィッシュZebradanioなどが挙げられる。本発明において、半数体ドナーとは、雌性発生及び雄性発生によって得られる魚類の半数体1n始原生殖細胞を提供する魚類をいう。半数体を得られるならば、魚類の種類は特に限定されない。本発明において、半数体クローン魚類配偶子とは、遺伝的に同一な半数体1nを有する魚類配偶子の集団をいうが、この集団に属するひとつのクローン配偶子も本発明の範囲に含まれる。本発明において、キメラとは、異なる遺伝形質の細胞で構成された個体をいう。本発明では、例えば、ドナーに半数体、ホストに正常二倍体を用いた半数体-二倍体生殖系列キメラ1n2n、及びドナーに半数体、ホストに三倍体を用いた半数体-三倍体生殖系列キメラ1n3nのことを指す。本発明において、四倍体魚とは、自然四倍体雄と二倍体雌の人工受精後、第二極体放出阻害により得られた四倍体、すなわち、ネオ四倍体のことを指す。本発明において、半数体始原生殖細胞を有するキメラ魚類胚とは、半数体ドナーの始原生殖細胞をホスト魚類胚に移植した魚類胚をいう。移植のための方法は、ドナーから得られた始原生殖細胞をホスト魚類の胚に有効に移植できるものであれば特に限定されない。通常は、割球移植法以下、BT法又はBlastomeretransplantation法ともいうに従って、胞胚期ドナー胚の胚盤下部の割球を胞胚期ホスト魚類胚に移植する。また、別の手法として単一始原生殖細胞移植法以下、SPT法、singleprimordialgermcelltransplantation法ともいうにより、体節形成期のドナー胚に顕在化している1~5個の始原生殖細胞を、胞胚期の魚類ホスト胚の胚盤下部に移植してもよい。あるいは複数移植する多価始原生殖細胞移植法以下、PPT法、polyprimordialgermcelltransplantation法ともいうにより移植してもよい。さらに、胚盤の下部を切り取りホスト胞胚の中央部へ移植する、胚盤移植法、以下、サンドイッチ法、又は、sandwich法ともいうにより、半数体ドナーの始原生殖細胞をホスト魚類胚に移植してもよい。本発明において、半数体ドナーを得るための卵又は精子の一方を遺伝的に不活性化する方法は、UV照射や放射線照射が挙げられるが、卵又は精子を遺伝的に不活性化できるもの、あるいは雌性核のみ雄性核のみでの発生を誘起する処理であればこれらの方法に限定されない。本発明において、ホストとは、半数体の始原生殖細胞を移植すべき魚類胚又は該胚から成長した魚類をいう。ドナー始原生殖細胞に起源する配偶子を特異的に分離できる魚類であればホストは必ずしも不妊である必要はない。あるいは、不妊の程度が低いホストであってもよい。好ましくは、例えば、通常二倍体の卵と四倍体魚の二倍体精子を媒精させることによって、得られる三倍体3nホスト等の不妊の魚類がある。本発明において、始原生殖細胞の識別は、始原生殖細胞を特異的に識別できるマーカーであれば特に限定されない。好ましくは、nos1遺伝子転写産物の3UTRとGFPの構造遺伝子を結合した人工のGFPnos13’UTRmRNAやDsRednos13’UTRmRNAのような始原生殖細胞を特異的に識別できる蛍光mRNAによって行うことができる。本研究で用いたGFPnos13’UTRmRNA、DsRednos13’UTRmRNAはKOPRUNNERMTHISSECTHISSEBandRAZEAzebrafishnanosrelatedgeneisessentialforthedevelopmentofprimordialgermcellsGenesDev1528772885に従った。また、半数体ドナーとして、色彩変異体劣性形質や遺伝子組換え個体由来のものを用いて、得られた子孫の色素により、半数体ドナー由来の子孫を得られたかどうかを識別することもできる。例えば、ドジョウでは、ドナーとして色彩変異体劣性形質のヒドジョウ又はアルビノドジョウを使用することもできる。また、ゼブラフィッシュでは、ドナーとして色彩変異体劣性形質のゴールデン系統又は遺伝子組換え個体を使用することもできる。本発明において、不妊のホストは、特に限定されない。ホスト自身は生殖細胞を持つがその生殖細胞は受精可能な配偶子を作ることが出来ないホストを使用してもよい。一般的に不妊と言われている三倍体や雑種は、配偶子形成を行う減数分裂過程を正常に進行できないために配偶子形成が停止する。また、生殖細胞の一部が減数分裂を行ったとしても受精能力が極めて低い配偶子が形成され、たとえ受精したとしても生存性の個体が生まれてくることは極めて稀である。また、ホスト自身の生殖細胞を持たないホストを使用してもよい。このようなホストは、成熟する年齢や個体サイズに達し二次性徴を発現しても、配偶子を作る根本の生殖細胞が無いために配偶子を作ることが出来ない。また、本発明において、ホストを不妊化する方法は特に限定されない。三倍体化や交雑による雑種の誘起、特異的に遺伝子をノックダウンすることによって、生殖細胞の欠損を誘起し不妊化してもよい。ノックダウンツールとしては、限定されないが、gripNA、siRNAなどがある。好ましくは、デッドエンド遺伝子以下、deadend遺伝子ともいう。デッドエンド遺伝子は、ホストPGCの生存移動維持に関与している生殖細胞形成に必須の遺伝子のことを指すをノックダウンするために特別に設計された配列を有するデッドエンドアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドを胚に注入することによって行う。三倍体や雑種の誘起に加えて、更にデッドエンドアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドによって不妊化することにより、確実にドナー由来の始原生殖細胞をホスト個体で発生させることができる。材料と方法1.ドジョウMisgurnusanguillicaudatus、キンギョCarassiusauratusゼブラフィッシュDaniorerioを材料に、下述の発生工学的手法により、ドナーに半数体、ホストに正常二倍体を用いた半数体-二倍体生殖系列キメラ1n2n、及びドナーに半数体、ホストに三倍体を用いた半数体-三倍体生殖系列キメラ1n3nを作出する。1n2nまたは1n3nは、デッドエンドアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドdndMOでノックダウンして不妊化処理をした二倍体又は三倍体ホスト個体の内で、半数体PGCsが生殖隆起へ移動し、生殖細胞として増殖するか否か、そして、それらの生殖腺から機能的な配偶子が形成されるか否かを検討するために作出する。将来的に、機能的な配偶子が形成されるか否かを検討する場合、得られた子孫の色素によりドナー由来か否かを判別するために、ドジョウでは、ドナーとして色彩変異体劣性形質のヒドジョウ又はアルビノドジョウを使用する。さらに、1n3nの対照として、ドナーに正常二倍体、ホストに三倍体を用いた二倍体-三倍体生殖系列キメラ以下、2n3nともいう。を作出する。キンギョでは、得られた子孫のDNA鑑定を可能にするために半数体を得る雌親魚とホストを得る雌親魚に異なる個体を使用する。ゼブラフィッシュでは、得られた子孫の色素によりドナー由来か否かを判別するために、ドナーとして色彩変異体劣性形質のゴールデン系統又は遺伝子組換え個体を使用する。2.卵及び精子の遺伝的不活化卵及び精子の遺伝的不活化には紫外線照射以下、UV照射またはUVともいうを用いる。ドジョウでは、キンギョの精子を使えば、紫外線照射から逃れた精子からの受精卵は致死雑種となり除去できる。キンギョでは、四倍体のフナより得られる二倍性の精子を用い、紫外線照射から逃れた精子からの受精卵を三倍性として区別できる。一方、ゼブラフィッシュでは、キンギョの精子を使い、紫外線照射から逃れた精子からの受精卵は致死雑種となり除去できる非特許文献1。3.ドナー半数体とホスト二倍体、ホスト三倍体の作出ドジョウ卵と紫外線照射したキンギョ精子、又は紫外線照射したドジョウ卵とドジョウ精子、キンギョ卵と紫外線照射した四倍体フナ精子、又はゼブラフィッシュ卵と紫外線照射したキンギョ精子を媒精後、ドナーの雌性発生又は雄性発生半数体群を作出する。また、ホスト二倍体として通常ドジョウ卵とドジョウ精子による受精により作出した通常二倍体受精群、ホスト二倍体として通常キンギョ卵とキンギョ精子による受精により作出した通常二倍体受精群、通常ゼブラフィッシュ雌と通常ゼブラフィッシュ雄の自然交配による通常二倍体受精群も作出する。さらに、ホストとする三倍体受精群は、ドジョウの場合は通常ドジョウ卵と四倍体ドジョウ自然四倍体雄×二倍体雌の人工受精後、第二極体放出阻害により得られた四倍体:ネオ四倍体の二倍性精子による受精によって、キンギョの場合は通常キンギョ卵と四倍体フナ自然界から採集された個体の二倍性精子による受精によって作出する。ドジョウ半数体PGCは、ドジョウ卵×ドジョウ精子、ドジョウ卵×ネオ四倍体ドジョウ精子の胚へ移植し、キンギョ半数体PGCは、キンギョ卵×キンギョ精子、キンギョ卵×四倍体フナ精子の胚へ移植し、ゼブラフィッシュ半数体PGCはゼブラフィッシュ二倍体胚へ移植した。三倍体は二倍体と異なり生殖腺の内部構造に空洞が多く、大型の生殖細胞や運動能のない精子を形成することが知られているFujimotoetalReproductivecapacityofneotetraploidloachesproducedusingdiploidspermatozoafromanaturaltetraploidmaleAquaculture308S133139。受精後未受精卵を取り除き、さらに死卵の計数と除去、及び水換えを行う。孵化期には孵化仔魚の形態を観察し、正常仔魚出現率と半数体症候群などの奇形を呈する仔魚の出現数を調査する。4.卵膜の除去と卵膜除去卵の培養顕微注入あるいはPGCの移植のために、YamahaEandYamazakiFElectricallyfusedegginductionanditsdevelopmentinthegoldfishCarassiusauratusIntJDevBiol37291298WesterfieldMThezebrafishbook5thEditionAguideforthelaboratoryuseofzebrafishEugeneUniversityofOregonPressFujimotoTKataokaTSakaoSSaitoTYamahaEandAraiKDevelopmentalstagesandgermcelllineageoftheloachZoolSci23977989に従い受精卵より卵膜を除去するとともに、孵化まで培養する。5.ドナー胚及びホスト仔魚の倍数性測定精子又は卵の遺伝的な不活化の成否を検討するために、キメラ作出時に用いたドナー胚の倍数性を調査する。また、ホストが三倍体又は二倍体であるか否かを検討するために、卵膜除去をしていないコントロールのホスト仔魚の倍数性を調べる。ドナー胚及びホスト仔魚は、核単離液及び核染色液中にて細胞を混合遊離する。その後、フローサイトメーターにより相対DNA量を測定する。この際、実験に用いた種の正常二倍体魚の鰭のDNA量を二倍体DNA量2Cの、正常二倍体ドジョウの半数体精子のDNA量を半数体DNA量1Cの基準とする。半数体以外の細胞をもつドナーが検出された場合、そのドナーを用いて作出したキメラは実験から排除する。ドジョウでは、さらに2n3nキメラ作出に用いたドナー胚及びホスト仔魚においても、倍数性を調べる。キンギョ卵×四倍体フナ精子から作製した胚又は個体の鰭のDNA量を三倍体の基準とする。6.PGCsの標識、ホスト三倍体の不妊化ドナー半数体及びホスト二倍体又はホスト三倍体PGCsを区別して可視化するために、マーカー、好ましくは緑色蛍光を発するGFPnos13’UTRmRNAと赤色蛍光を発するDsRednos13’UTRmRNAを注入する。ドナーとして、卵膜除去卵に蛍光mRNAを注入する。ホストについても同様にドナーと異なるmRNAを注入する。同時に、ホスト三倍体を不妊化するためdndMOを注入する。ゼブラフィッシュでは、PGCがGFP蛍光を発する遺伝子組換え体を用いても良い。7.生殖系列キメラの作出異なる手法により生殖系列キメラを作出する。例えば、BTBlastomeretransplantation法に従って、胞胚期ドナー胚の胚盤下部の割球を胞胚期ホスト胚に移植することにより生殖系列キメラを誘起する。別の手法としてSPTsingleprimordialgermcelltransplantation法、またはPPTpolyprimordialgermcelltransplantation法により、体節形成期のドナー胚に顕在化しているPGCsを、胞胚期のホスト胚の胚盤下部に移植することで誘起してもよい。さらに、sandwich法で半数体の胞胚期の胚盤の下部を切り出し、ホスト胞胚胚盤の中部に移植することでも誘起する。作製した生殖系列キメラ個体において、半数体PGCが生殖隆起へ到達した個体数を計数する。異なる蛍光mRNAで標識したドナー胚とホスト胚を用いて作出した1n3n及び2n3nにおいて、生殖隆起へ到達した半数体PGCを計数する。検出したPGC数により、キメラを異なる水槽に分けて収容し、飼育する。このとき異なる蛍光により区別されるホスト三倍体由来のPGCが観察された個体は、ホストの不妊化に失敗したものとして実験から排除する。1n3n及び2n3nにおいては、PGCを観察し、個体をサンプリングする。8.組織学的観察ドジョウでは、孵化後の1n3n、2n3nと正常二倍体ドジョウ以下、2nともいうの成魚雌雄、dndMO処理により不妊化していない三倍体正常ドジョウ卵×四倍体ドジョウ自然四倍体雄×二倍体雌の人工受精後、第二極体放出阻害により得られたネオ四倍体精子以下、3nともいうの成魚雌雄を、キンギョでは、孵化後の生殖系列キメラと正常二倍体2nの成魚雌雄、dndMO処理により不妊化していない三倍体正常キンギョ卵×四倍体フナ精子3nの成魚雌雄を固定した後、エタノール中で保存する。固定したキメラは切片にし、組織標本を作製する。その後、二重染色を施し、封入後、観察に供する。ドジョウでは、発達したPGCの増殖を調査するために、キメラの未分化生殖細胞もしくはA型精原細胞もしくは卵原細胞を計数し、孵化稚魚期に蛍光顕微鏡で観察したPGC数に対して何個増殖しているのかを調査する。9.キメラ雄成魚からの採精、又は受精能力の検定ドジョウでは、1n3n、2n3n雄成魚に、キンギョでは、1n3n生殖系列キメラ魚に、ヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン以下、hCGともいう。を腹腔内に注射し、排精排卵を誘起する。注射してから一定時間後に、腹部を圧迫し、得られた精液を採精する。採精した精子を人工精漿で希釈し、精液を観察する。その後淡水と混合し精子の運動能を調査する。ゼブラフィッシュの生殖系列キメラにおいては、正常雌親魚と11で水槽に入れ、産卵行動を観察するとともに、産卵した卵に受精卵が含まれているか否かを確認する。10.精巣、精子、及び卵巣の倍数性の測定ドジョウでは、1n3n及び2n3n成魚、キンギョ及びゼブラフィッシュでは生殖系列キメラ成魚から精巣及び卵巣の一部を取り出し、それらの倍数性をフローサイトメトリーで調査する。また、ドジョウでは、孵化後の1n3n、2n3nから採精した精子の倍数性を調べる。コントロールとして、成魚の2nと成魚のdndMO処理により不妊化してしない3nの精巣及び卵巣の倍数性も調査する。11.生殖細胞特異的mRNAの発現キメラ成魚の発達した生殖腺内の細胞が生殖細胞か否かの検討するために、生殖細胞特異的なmRNAの発現を調査する。孵化後の1n3n、2n3nの成魚から生殖腺の一部を取り出し、RNAを抽出する。抽出したRNAは逆転写をし、cDNAを合成する。なお、内部コントロールとしてβactinのRTPCRも行う。PCR反応により、キメラ生殖腺における生殖細胞特異的なmRNAの発現の有無を電気泳動によって確認する。12.キメラの配偶子がドナーPGC由来であることの検定1n3n生殖系列キメラから得られた精子と体細胞である鰭の細胞よりDNAを抽出し、RAPDマーカーにより異なる遺伝子構成であることを明らかにする。13.キメラ配偶子の由来ならびにクローン性の検討1n3n生殖系列キメラから得られた精子で受精させたことによって得られた個体の遺伝子型を、マイクロサテライトマーカーで検討し、精子の遺伝子型が全て同じであることを確認する。以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。ドジョウMisgurnusanguillicaudatusの場合A.材料と方法1.ドジョウMisgurnusanguillicaudatusを材料に、下述の発生工学的手法により、ドナーに半数体、ホストに正常二倍体を用いた半数体-二倍体生殖系列キメラ1n2n、及びドナーに半数体、ホストに三倍体を用いた半数体-三倍体生殖系列キメラ1n3nを作出した。1n2nは正常二倍体個体内で、半数体PGCsがホストの二倍体PGCsと同じように生殖隆起へ移動するのか否かを調べることを目的として作出した。1n3nは、デッドエンドアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド配列番号No1;5’GATCTGCTCCTTCCATTGCGTTTGC3’でノックダウンして不妊化処理をした三倍体ホスト個体の内で、半数体PGCsが生殖隆起へ移動し、生殖細胞として増殖するか否か、そして、それらの生殖腺から機能的な配偶子が形成されるか否かを検討するために作出した。将来的に、機能的な配偶子が形成されるか否かを検討する場合、得られた子孫の色素によりドナー由来か否かを判別するために、ドナーとして色彩変異体劣性形質のヒドジョウ又はアルビノドジョウを使用した。さらに、1n3nの対照として、ドナーに正常二倍体、ホストに三倍体を用いた二倍体-三倍体生殖系列キメラ2n3nを作出した。2.供試魚本発明では、北海道大学大学院水産科学院育種生物学講座にて飼育中のドジョウMisgurnusanguillicaudatusとキンギョCarassiusauratusを材料として用いた。ドジョウは北海道岩見沢市北村地区及び北海道北斗市大野町において採取したもの、あるいはその子孫を用いた。3.採卵と採精20IUgのhCGあすか製薬株式会社製をドジョウ親魚の腹腔内に注射し、排卵、排精を誘起した。雌では12-14時間後に排卵を確認した後、サランラップポリ塩化ビニリデンフィルム旭化成株式会社製を張った直径90mmプラスチックシャーレ上で腹部を圧迫して採卵した。雄も同様に腹部を圧迫し、得られた精液をヘマトクリット毛細管テルモ製で採精した。得られた精液はKurokura’ssolutionNaCl750mgCaCl220mgNaHCO320mgKCl20mg100mlで約25倍に希釈した。キンギョにおいては精子のみを使用した。20IUgのhCGをキンギョ親魚の腹腔内に注射し、排精を誘起した。12-14時間後に、腹部を圧迫し、得られた精液をヘマトクリット毛細管で採精した。4.卵及び精子の遺伝的不活化卵及び精子の遺伝的不活化には紫外線照射を用いた。上部に2灯の紫外線殺菌灯GL15WNational社製を設置した箱形紫外線照射装置を用いた。卵の遺伝的不活化は、FujimotoetalJournalofExperimentalZoology307A449462DOI101002jez398を一部改良し行った。すなわち、卵を収容するチャンバーとして、底を抜き、サランラップ旭化成株式会社製を張った90mmプラスチックシャーレを用いた。また、チャンバー内にはさらに底を抜いた50mmプラスチックシャーレ直径50mm高さ10mmをセットし、その中に05のウシ血清アルブミンを含有するHank’ssolution0137MNaCl、54mMKCl、025mMNa2HPO4、044mMKH2PO4、13mMCaCl2、10mMMgSO4、42mMNaHCO3を約3ml入れ、卵を一層になるように収容したのち、振盪機VS2サクラ精機株式会社、日本の上に乗せ、水平に振盪しながら上面より紫外線を照射した。なお、紫外線照射量を150mJcm2とした。精子の遺伝的不活化において、よく洗浄し水分を拭き取ったガラスシャーレ上にキンギョ精子をKurokura’ssolutionで約100倍に希釈し約01mmの厚さになるように伸展した後、紫外線を照射した。なお、紫外線照射量は60mJcm2とした。キンギョを使用した理由は、ドジョウの雌性発生において、キンギョの精子を使えば、紫外線照射から逃れた精子からの受精卵は致死雑種となり除去できるためである非特許文献1。5.ドナー半数体とホスト二倍体、ホスト三倍体の作出ドジョウ卵と紫外線照射したキンギョ精子、又は紫外線照射したドジョウ卵とドジョウ精子を媒精後、20°Cの水道水を満たしたプラスチックシャーレ内に散布してシャーレの底に付着させる方法でドナーの雌性発生又は雄性発生半数体群を作出した。また、ホスト二倍体として通常ドジョウ卵とドジョウ精子との受精により作出した通常受精群も作出した。受精後、各実験群は20°Cに設定したインキュベーター内で培養した。さらに、ホストとする三倍体受精群は通常ドジョウ卵と四倍体ドジョウ自然四倍体雄×二倍体雌の人工受精後、第二極体放出阻害により得られた四倍体:ネオ四倍体の二倍性精子による受精によって作出した。三倍体は二倍体と異なり生殖腺の内部構造に空洞が多く、大型の生殖細胞や運動能のない精子を形成することが知られているFujimotoetalAquaculture308S133139。受精後2時間以内に未受精卵を取り除き、さらに1日毎に死卵の計数と除去、及び水換えを行った。孵化期には孵化仔魚の形態を観察し、正常仔魚出現率と半数体症候群などの奇形を呈する仔魚の出現数を調査した。なお、ドジョウの発生段階はFujimotoetalZoologicalScience23977989DOI102108zsj23977の報告に従った。6.卵膜の除去と卵膜除去卵の培養各実験群の約半数程度の1~2細胞期の受精卵について卵膜除去液01トリプシンと04尿素を含む淡水魚用リンゲル液;128mMNaCl28mMKCl19mMCaCl2pH70で処理することにより卵膜を除去した。卵膜除去卵は、約1のアガロースで底面を被膜処理し20°Cの一次培養液16ニワトリ卵白と001ペニシリンとストレプトマイシンを含む淡水魚用リンゲル液;128mMNaCl28mMKCl19mMCaCl2pH70を満たしたガラスシャーレ内で体節形成期まで培養した。その後、卵膜除去卵を二次培養液001ペニシリンとストレプトマイシンを含む18mMCaCl218mMMgCl2液に移し、孵化まで培養した。7.ドナー胚及びホスト仔魚の倍数性測定精子又は卵の遺伝的な不活化の成否を検討するために、キメラ作出時に用いたドナー胚の倍数性をフローサイトメーターPartecPloidyAnalyserPA型を用いて調査した。また、ホストが三倍体又は二倍体であるか否かを検討するために、卵膜除去をしていないコントロールのホスト仔魚の倍数性を調べた。ドナー胚及びホスト仔魚は、CystainDNA2stepkitPartecのA液核単離溶液150μlの中にそれぞれ入れ、20分間放置し、ボルテックスにより細胞を混合遊離した。その後、試料を50μmのメッシュCellTrics50μmPartecで濾過し、細胞の破片を除去した後、A液の5倍量のB液4’6-ジアミジノ-2-フェニリンドールDAPIを含む染色液を加え、フローサイトメトリーにより相対DNA量を測定した。この際、正常二倍体ドジョウ鰭のDNA量を二倍体DNA量2Cの、正常二倍体ドジョウの半数体精子のDNA量を半数体DNA量1Cの基準とした。半数体細胞以外をもつドナーが検出された場合、そのドナーを用いて作出したキメラは実験から排除した。さらに2n3nキメラ作出に用いたドナー胚及びホスト仔魚においても、倍数性を調べた。A.結果1.コントロールの受精数、孵化仔魚数、正常仔魚数キメラ作成に用いたドナー及びホストは表1にまとめた。ドナーの半数体は、雌性発生、雄性発生により作出し、一方、ドナーの二倍体は通常受精で作成した。ホストとしては三倍体又は二倍体を用いた表1。キメラを作出する際のコントロールとして、何の処理もしていないコントロールと、卵膜を除去した卵膜除去コントロール、蛍光mRNA及びdndMOを注入した蛍光mRNA注入コントロールの群を作った。コントロールにおいては、使用卵数、受精卵数、孵化仔魚数、正常仔魚数、奇形仔魚数を計数した。卵膜除去コントロール及び蛍光mRNA注入コントロールにおいては、受精卵から正常なものだけを選び、孵化仔魚、正常仔魚数、奇形仔魚数を計数した表2。その結果、ホストとして作出した個体のほとんどから正常仔魚が得られた。また、ドナーとして作出した雌性発生群及び雄性発生群は、孵化後、ほとんどがいわゆる半数体症候群と判定される奇形仔魚を呈した。受精卵の卵膜除去及び蛍光mRNA注入を行っても、孵化仔魚の率は無処理コントロールと変わらず、これらの処理の悪影響は見られなかった。2.ドナー胚及びホスト孵化仔魚の倍数性精子又は卵の遺伝的な不活化の成否を検討するために、キメラ作出時に用いたドナー胚の倍数性を調査した表3。その結果、キメラ作出に用いた雌性発生、雄性発生を行ったドナー胚は、ほとんどが半数体細胞から構成されていた。しかし、一部の胚は細胞が壊れていたため、倍数性を検出できなかった。このとき、倍数性を検出できなかったドナー胚から作出したキメラは実験より除いた。一方、2n3n作出に用いた正常受精により得たドナー胚は、ほとんどが二倍体細胞から構成されていた。通常卵とネオ四倍体の二倍性精子の受精により作出したほとんどのホスト孵化仔魚の倍数性は、三倍体細胞から構成されていた。しかし、実験5では10個体中に四倍体が1個体生じた。キメラ作出に用いたドナー及びホストはほとんどの場合、半数体、三倍体であることが確認できた。B.材料及び方法1.PGCsの標識、ホスト三倍体の不妊化ドナー半数体及びホスト二倍体又はホスト三倍体PGCsを区別して可視化するために、緑色蛍光を発するGFPnos13’UTRmRNAと赤色蛍光を発するDsRednos13’UTRmRNAを注入したKoprunneretalGenesDev1528772885。ドナーとして、1~2細胞期の卵膜除去卵に蛍光mRNA100ngμl及び5ビオチンデキストランSigma社製を含む02MKClを顕微注入した。ホストについても同様にドナーと異なるmRNA100ngμl及び10ビオチンデキストランを含む02MKClを顕微注入した。同時に、ホスト三倍体を不妊化するため2000~4000pg胚のdndMOを顕微注入した。2.生殖系列キメラの作出異なる手法により生殖系列キメラの作出を試みた。まず、BTBlastomeretransplantation法に従って、胞胚期ドナー胚の胚盤下部の割球を胞胚期ホスト胚に移植することにより生殖系列キメラを誘起した。別の手法としてSPTsingleprimordialgermcelltransplantation法により、体節形成期のドナー胚に顕在化している1~5個のPGCsを、胞胚期のホスト胚の胚盤下部に移植することで誘起した。異なる蛍光mRNAで標識したドナー胚とホスト胚を用いて作出した1n3n及び2n3nにおいて、生殖隆起へ到達した半数体PGCを計数した。検出したPGC数により、キメラを異なる水槽に分けて収容し、飼育した。このとき異なる蛍光により区別されるホスト三倍体由来のPGCが観察された個体は、ホストの不妊化に失敗したものとして実験から排除した。1n3n及び2n3nにおいては、孵化後8日まで蛍光顕微鏡下でPGCを観察し、孵化後1、2、4、12、155、16ヶ月齢の個体を各5~10個体サンプリングした。B.結果1.半数体PGCsの生殖隆起への移動PGCsのキメラ胚内での移動を観察した。1n2nキメラ表4実験1を蛍光顕微鏡で観察した結果、GFP蛍光mRNAを注入したドナー1n由来のPGCsは緑色蛍光を発していた図1。DsRed蛍光mRNAを注入したホスト2n由来のPGCsは赤色蛍光を発していた図1。ドナー1n及びホスト2n由来のPGCsは、移植後の体節形成期にほぼ同様の場所に位置し図1A23B23C23、いずれのPGCsも孵化期に生殖隆起へ移動した図1D23E23表4実験1。その後、孵化後8日までドナー1n、ホスト2nのPGCsはいずれも生殖隆起に局在することが確認できた。一方、2n3nキメラにおいては、ドナー2n由来のPGCsが、dndMO処理により不妊化した三倍体ホストの内で孵化期に生殖隆起まで移動した表4実験79。1n3nキメラにおいては、2n3nキメラと同様に、ドナー1nのPGCsがdndMO処理により不妊化した三倍体ホストの内で孵化期に生殖隆起まで移動した表4実験2345689。dndMO処理を行った3nをホストにしたキメラでは、ホスト由来のPGCsは認められなかった表4実験23456789。ドナー由来半数体PGCsはホスト内でホスト二倍体由来PGCsと同様に生殖隆起へ移動することが判明した。さらにdndMO処理により不妊化したホスト三倍体内でも、ドナー由来半数体PGCが生殖隆起へ移動した。以上の結果から、ドジョウにおいてPGCsは致死的な半数体ドナー由来であっても生殖隆起へ移動する能力をもつことが明らかとなった。2.生殖系列キメラの作出全実験で作出したキメラにおいて、多くの孵化仔魚が得られ、また仔魚が正常な形態を呈した個体の割合も高かった表4。さらに、蛍光顕微鏡下で正常仔魚のドナーPGCsの位置を調べ、ホストPGCsの存否も同時に調べた。ドナーPGCsが生殖隆起に確認された個体には、dndMO処理により不妊化を行ったホスト由来のPGCsは観察されなかった。そして、表3で示したように、生殖隆起にドナー由来のPGCが確認されたキメラにおいて、ドナー胚が半数体であると証明されたキメラを、正式な生殖系列キメラとした。ところで、2つのキメラ作出法を用いたが、SPT法の方がBT法よりも効率的にドナーPGCsが生殖隆起へ移動した生殖系列キメラを誘起することができた。C材料及び方法1.組織学的観察孵化後1、2、4、12、155、16ヶ月齢の1n3n、2n3nと正常二倍体ドジョウ2nの成魚雌雄、dndMO処理により不妊化していない三倍体通常ドジョウ卵×四倍体ドジョウ二倍体雌×自然四倍体雄の人工受精後、第二極体放出阻止により得られたネオ四倍体精子3nの成魚雌雄をブアン氏液ピクリン酸飽和溶液:ホルマリン:酢酸=15:5:1で6~12時間固定した後、80エタノール中で保存した。固定したキメラはエタノール系列又はブタノール系列で脱水し、エタノール系列ではキシレンにて透徹後、パラフィンに包埋した。包埋したパラフィンブロックをミクロトームで厚さ6又は8μmの切片にし、組織標本を作製した。その後、ヘマトキシリンエオシン二重染色を施し、封入後、観察に供した。Fujimotoetal1721117216により、dndMO処理により不妊化した個体は、雄においては生殖細胞がない未発達のチューブ状精巣構造を示し、雌においても、生殖細胞がない未発達のリボン状卵巣構造を示すことが明らかになっていることから、本発明では、特にdndMO処理3nを不妊化のコントロール群として作出しなかった。発達したPGCの増殖を調査するために、1、2、4、12、155、16ヶ月齢のキメラの未分化生殖細胞もしくはA型精原細胞もしくは卵原細胞を計数し、孵化稚魚期に蛍光顕微鏡で観察したPGC数に対して何個増殖しているのかを調査した。2.キメラ雄成魚からの採精12ヶ月齢の1n3n、2n3n雄成魚に、2日に分けて20IUgのhCGを腹腔内に注射し、排精を誘起した。2日目に注射してから1214時間後に、腹部を圧迫し、得られた精液をヘマトクリット毛細管で採精した。得られた精液はKurokura’ssolutionで約10倍に希釈した。希釈した精液を、光学顕微鏡下で形態を観察した。その後淡水と混合し精子の運動能を調査した。3.未分化生殖細胞、A型精原細胞、卵原細胞の核の直径組織像から1n3nと2n3n間で特にA型精原細胞のサイズに違いが観察された。そのため、より詳細に1、2、4、12、155、16ヶ月齢の1n3nと2n3nについて、未分化生殖細胞A型精原細胞か卵原細胞なのか判別できない発達初期の細胞及びA型精原細胞、卵原細胞の核の直径を測定し頻度を算出した図789。同時にコントロールとして2nとdndMO処理により不妊化していない3nの成魚のA型精原細胞及び卵原細胞の核の直径の頻度も求めた。4.精巣、精子、及び卵巣の倍数性の測定12、155、16ヶ月齢の1n3n及び2n3n成魚から精巣及び卵巣の一部を取り出し、それらの倍数性をフローサイトメトリーで調査した。また、孵化後12ヶ月齢の1n3n、2n3nから採精した精子の倍数性を調べた。コントロールとして、成魚の2nと成魚のdndMO処理により不妊化していない3nの精巣及び卵巣の倍数性も調査した。C.結果1.生殖腺の外部形態2n3nキメラの固定した生殖腺の外部形態を観察したところ、孵化後1、2ヶ月齢の個体では、細い1対2本の生殖腺が見られた図2A。4ヶ月齢になると、部分的に発達した生殖腺が観察できた図2B。雌雄の判別が可能な成魚となった雄の12、155、16ヶ月齢ではより大きく発達した生殖腺精巣が観察できた図2C。1n3nキメラでは孵化後1、2、4ヶ月齢において、細い1対2本の生殖腺が見られ図2DE、12ヶ月齢では、2n3nと同様に部分的に大きく発達した生殖腺が観察された図2F。2nの雌成魚では、腎臓に沿って一層になっている非常に発達した卵母細胞を多数持つ卵巣が見られた図3A。dndMO処理により不妊化していない3nの成魚の卵巣は、腎臓に沿って一層に広がった卵巣が見られたが、その卵巣には2n程発達した卵母細胞がなかった図3B。155ヶ月齢の2n3n雌成魚は2nと同様に発達した卵母細胞を少数持つ卵巣が見られた図3C。一方、1n3nでは腎臓に沿って一層に広がった卵巣が見られたが、その卵巣には、2n及び2n3n程発達した卵母細胞は観察されなかった図3D。2.ドナー由来PGCsの増殖1n3n、2n3nにおいて、キメラ誘起後に蛍光顕微鏡下で生殖隆起に観察されたドナーPGCsを計数、PGCs数1、2、3、4、5~に応じてキメラを分けて飼育した。そして生殖腺の組織像から、1~16ヶ月齢の1n3n及び2n3nの各個体の未分化生殖細胞12ヶ月齢以降の個体に関して、雄についてはA型精原細胞、雌については卵原細胞を計数し、キメラ誘起時に計数したPGCs数1、2、3、4、5~に対して未分化生殖細胞が何個増殖、維持又は減少したかを調べた表56。その結果、2n3nでは1ヶ月齢で未分化生殖細胞の増殖を示した個体は見られなかった。しかし、2ヶ月齢では増殖を示した個体が6個体見られ表5。中には、当初1個のPGCが40個以上まで増殖した個体も認められた表5図4B。4ヶ月齢以降においては、多くのキメラ個体で生殖細胞の活発な増殖が確認された表5図4C。雌雄の判別ができる12、155、16ヶ月齢の雄の2n3nと成魚2nの精巣には、全ての精子形成のステージ、即ち、精原細胞、精母細胞、多くの精細胞と精子が観察された図5AC。dndMO処理をしていない3n成魚においては、2nよりも大型の生殖細胞が見られ、精細胞と精子は観察されなかった図5B。1n3nでは、当初のPGC数よりも増殖を示した個体が1ヶ月齢キメラでは4個体見られた。PGCsは1個から4個増殖していた表6図4D。2ヶ月齢においては、2個から10個以上の増殖が見られた表6図4E。4ヶ月齢以降においては、2n3nよりも少数個体であるが、生殖細胞の活発な増殖が確認された表6図4F。12、155、16ヶ月齢の雄成魚では、多くの個体の精巣においてサイズの異なる多数の精原細胞とわずかの精母細胞が観察された図5E。しかし、16ヶ月齢の1n3nの2個体中1個体は、2n3nと同様に全ての精子形成ステージが認められ、多数の精細胞と精子が見られた図5D。雌においては、2n成魚、及びdndMO処理をしていない3nの卵巣では、多数の周辺仁期、及び少数の卵黄胞期の卵母細胞が観察された図6AB。155ヶ月齢の2n3nの1個体の卵巣から多数の周辺仁期、及び少数の卵黄胞期の卵母細胞が観察された図6C。同様に、16ヶ月齢の1n3nの卵巣に多数の周辺仁期及び少数の卵黄胞期の卵母細胞が観察された図6D。1~16ヶ月齢の全ての1n3n及び2n3nのドナーPGCsが増殖、維持、減少した個体の割合を算出した表7。2n3nは最初に測定したPGCの数よりも増殖していた個体は全体の51で、維持していた個体は5、減少していた個体は5、生殖細胞が全くなかった個体は39であった。一方、1n3nは増殖が35、維持が2、減少が10、なしが53であった。1n3nは2n3nと比べるとPGCが増殖していた個体の割合が少なく、生殖細胞の無かった個体の割合が多かった。3.未分化生殖細胞、A型精原細胞、卵原細胞の核の直径1ヶ月齢の2n3nの未分化生殖細胞の核の直径は8~9μmの頻度が高く、平均値は92μmを示した図7A。2ヶ月齢においては、10~12μmの頻度が高く、最小値7μm、最大値14μm、平均値は102μmであった図7B。1ヶ月齢の1n3nの核の直径は9~10μmの頻度が高く、最小値は5μm、最大値は10μm、平均値は77μmを示した図7C。2ヶ月齢においては7~9μmの頻度が高く、最小値5μm、最大値9μm、平均値は68μmであった図7D。1n3nは1、2ヶ月齢において、2n3nと比べて、小さいサイズの未分化生殖細胞を多く持っており、2ヶ月齢において、その核の直径は2n3nよりも有意に小さかったスチューデントt検定、P001図8。雄成魚の2n及び3nの核の直径は9~10μmの頻度が高く、頻度分布は類似していた。2nの最小値は7μm、最大値13μm、平均値93μmであり、3nの最小値は8μm、最大値13μm、平均値94μmであり、2nと3nの核の直径に有意な差は認められなかった図9AB。雄成魚12~16ヶ月齢2n3nにおいて、A型精原細胞の核は9~10μmの頻度が高く、最小値7μm、最大値11μm、平均値88μmであった図9C10。雄成魚12~16ヶ月齢の精細胞と精子が観察された1n3nの核は9~10μmの頻度が高く、最小値6μm、最大値14μmを示した図9D。雄成魚12~16ヶ月齢の精細胞と精子が観察されなかった1n3nの核は9~10μmの頻度が高く、最小値6μm、最大値15μmを示した図9E。雄成魚1n3n中の組織像から正常な精子形成のステージを持ち精細胞と精子が観察された個体は、平均値84μmであり、多くの精原細胞、わずかな精母細胞を有し、精細胞と精子が観察されなかった個体の核の平均値は96μmであった図10。2n3n、2n3n、1n3nの間に有意な差が認められなかったクラスカルウォリス検定、P005。以上のことから、雄成魚12、155、16ヶ月齢1n3nの精巣中のA型精原細胞の核の直径は、2n、dndMO処理をしていない3n、2n3nと同様の核の大きさをもつ細胞が多いが、1n3nでのみ大型の核をもつ細胞があることが明らかになった図9DE。155、16ヶ月齢の1n3nと2n3nの卵原細胞の核の直径の頻度を測定した。2n、dndMO処理により不妊化していない3n、2n3nの核は8~9μmの頻度が高く、最大値は13μmで、最小は7μmの細胞であった図11BDF。平均値は2nが85μm、3nが87μm、2n3nが79μmであった図12。一方、1n3nは7~8μmの細胞の頻度が高く、最小値6μm、最大値10μm、平均値は71μmを示した図11H12。また、1n3nの卵原細胞の核の直径は2n、dndMO処理をしていない3n、2n3nよりも有意な差が認められた図12、クラスカルウォリス検定、シェフェ法、P005。したがって、雌成魚1n3nは、2n、dndMO処理をしていない3n、2n3nと比べて小型の卵原細胞を有することが明らかになった。4.生殖腺の倍数性正常雄成魚の鰭は2nの細胞集団から構成されていた図13A。しかし精巣には1n、2n、4n相当の倍数性をもつ細胞集団が見られ、1n細胞が優占していた図13C。雄成魚3ndndMO処理により不妊化していないの鰭は3nの細胞集団から構成されており図13B、精巣は3n、6n細胞から構成された図13D。雄成魚12~16ヶ月齢2n3nの鰭はすべて3nであり、2n細胞は見られなかった表7。2n3nの発達した精巣では1nと3n表7又は1n、2nと3n図13E又は1n、2n、3nと4n図13Fの細胞集団から構成されていた。これらの個体の精巣では1n細胞集団のピークが高く、他に2nと3nの小さなピークが見られた。一方、雄成魚12~16ヶ月齢1n3nの鰭は全て3nであり表8、1n細胞は見られなかった。これに対して、発達した精巣を持つ1n3n個体の精巣では1n、2nと3n図13G又は1n、2n、3nと6n図13H又は1n、2n、3nと4n図13Iの倍数性の異なる細胞集団から構成されていた。これらの個体は1nと2nの細胞集団の大きさが同程度で、4n及びホスト生殖腺内の3n体細胞とそのG2M期と思われる6nの倍数性をもつ細胞集団が検出された。精巣に3nのピークのみ検出された個体はホスト三倍体の生殖腺の体細胞のみをもつと考えられる。一方、2n3n及び1n3nの発達していない精巣は、ホストの体細胞と考えられる3nの細胞集団から構成されていた表8。正常雌成魚の鰭は2n細胞集団より構成されていた。一方、卵巣はほとんどが2n細胞であった図14A。成魚のdndMO処理により不妊化していない3nの鰭は3n細胞、卵巣は3n細胞から構成されていた図14B。155ヶ月齢の発達した卵巣を持つ2n3nのヒレは3nであり、2個体中1個体の卵巣は3n細胞から構成されており、残りの1個体では倍数性を検出できなかった表8。16ヶ月齢の1n3nの発達した卵巣には1nと3n細胞が認められた図14C。この個体の卵巣では、1n細胞集団のピークが低く、ホスト三倍体由来の3n体細胞の高いピークが見られた。一方、1n3nの発達していない卵巣を持つ個体の卵巣では、ホスト由来の3n体細胞から構成されていた表8。5.1n3nにおける精子の形態及び倍数性12ヶ月齢の2n3nにhCGを注射したところ、6個体中4個体から採精でき、正常な精子の形態を示した図15A。1n3nにおいては、6個体中2個体から採精できた。しかし、1n3nの精子の濃度は2n3nよりも極端に低かった。精子は2n3nの採精した精子と同様の正常な形態を示した図15B。光学顕微鏡下での淡水添加による精子の運動観察では、2n3nでは採精できた全4個体の精子の運動が観察できたが、1n3nでは観察されなかった。採精された精液及び精巣の倍数性をフローサイトメーターにより検出した。その結果、2n3nの精液中の細胞の倍数性は1nであった図16A。採精できた個体の精巣は1n、2nと3n図16C又は1n、2n、3nと4n又は1nと3nの細胞から構成されていた表8。精巣では1n細胞のピークが高く、2nと3n細胞のピークは低かった。そして、採精できなかった個体の精巣は3n細胞で構成されていた表8。1n3nの精液の倍数性は1nであり図16B、採精できた個体のうち1個体の精巣は1n、2n、3nと4n細胞から構成されていた図16D。残りの1個体では倍数性を検出できなかった。また、採精できなかった個体の精巣は3n細胞より構成されていた表8。D.材料及び方法1.vasamRNAの発現キメラ成魚の発達した精巣中の細胞が生殖細胞か否かの検討するために、生殖細胞特異的なvasamRNAの発現を調査した。孵化後12、155、16ヶ月の1n3n、2n3nの成魚から精巣の一部を取り出し、RNAlaterAppliedBiosystems社製に入れ4°Cで冷蔵庫に一晩放置し、その後-20°Cで保存した。NucleoSpinRNAIIMACHEREYNAGEL社製のマニュアルに従いRNAを抽出した。抽出したRNAはPrimeScriptRTPCRKitタカラバイオ株式会社製を用いて、逆転写をし、cDNAを合成した。なお、内部コントロールとしてβactinのRTPCRも行った。RTPCRのプライマーは下記に示した。vasaRTFCTGAACCTGCCATGGATGAC配列番号No2vasaRTRCTTCACCTCCTTTATAACCCTCAC配列番号No3βactinFTTACCCACACCGTGCCCATCTAC配列番号No4βactinRTACCGCAAGACTCCATACCCA配列番号No5PCRは以下の条件で行った。94°C1分、そして94°C30秒、60°C30秒、72°C45秒を1サイクルとしてこれを30サイクル行った後、72°C7分の伸長反応を行った。PCR産物は12アガロースゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、可視化した。D.結果1.vasamRNAの発現RTPCRによりvasamRNAの遺伝子発現を調査した。精巣の外部形態を見て、1n3n及び2n3nの発達している精巣はvasamRNAの発現が認められた図17A。しかし、発達していない精巣にはvasaの発現は見られなかった。したがって、2n3n及び1n3nで発達している精巣中の細胞は生殖細胞であることが確認できた。キンギョCarassiusauratuの場合A.材料と方法1.キンギョCarassiusauratusを材料に、下述の発生工学的手法により、ドナーに半数体、ホストに正常二倍体を用いた半数体-二倍体生殖系列キメラ1n2n、及びドナーに半数体、ホストに三倍体を用いた半数体-三倍体生殖系列キメラ1n3nを作出した。1n2n、1n3nは、デッドエンドアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド配列番号No6;5’TCCATGCCGCTGTCCACCTGTGATG3’でノックダウンして不妊化処理をした二倍体又は三倍体ホスト個体の内で、半数体PGCsが生殖隆起へ移動し、生殖細胞として増殖するか否か、そして、それらの生殖腺から機能的な配偶子が形成されるか否かを検討するために作出した。将来的に、機能的な配偶子が形成されるか否かを検討する場合、キンギョでは、得られた子孫のDNA鑑定を可能にするために半数体を得る雌親魚とホストを得る雌親魚に遺伝的に異なる個体を使用した。2.供試魚本発明では、北海道大学北方生物圏フィールド科学センターにて飼育中のキンギョCarassiusauratusを材料として用いた。3.採卵と採精キンギョ又は四倍体フナでは10~20IUg体重のhCGあすか製薬を親魚の腹腔内に注射し、排卵、排精を誘起した。雌では12-14時間後に排卵を確認した後、サランラップポリ塩化ビニリデンフィルム旭化成を張った直径90mmプラスチックシャーレ上で腹部を圧迫して採卵した。雄も同様に腹部を圧迫し、得られた精液をヘマトクリット毛細管テルモ製で採精した。得られた精液はキンギョ用人工精漿液で約50~100倍に希釈した。作成した生殖系列キメラにおける配偶子と体細胞の遺伝子を比較するため、採精と採卵を行った親個体の鰭断片を100アルコールで固定し、80°Cで保存した。4.精子の遺伝的不活化卵及び精子の遺伝的不活化には紫外線照射を用いた。上部に紫外線殺菌灯GL15W、National社製を設置した箱形紫外線照射装置を用いた。精子の遺伝的不活化のために、キンギョ用人工精漿液で約50~100倍に希釈した四倍体フナの精子を、よく洗浄し水分を拭き取ったガラスシャーレ上に約01mmの厚さになるように伸展した後、紫外線を照射した。なお、紫外線照射量は60mJcm2とした。キンギョの雌性発生では四倍体フナ由来の二倍体精子を用いた。この理由は、キンギョの雌性発生では、紫外線照射から逃れた二倍体精子からの受精卵は三倍体となり正常な配偶子形成は行わず、除去できるためである。5.ドナー半数体とホスト二倍体、ホスト三倍体の作出キンギョ卵と紫外線照射した四倍体フナ精子を媒精後、20°Cの受精液を満たしたプラスチックシャーレ内に散布して受精させる方法でドナーの雌性発生半数体群を作出した。受精液には、02尿素、024NaClを含む水道水を用いた。また、ホストとして通常キンギョと四倍体フナ精子との受精により作出した三倍体群を作出した。ホストとする胚は、受精後1~4細胞期にdndMO配列番号No6;5’TCCATGCCGCTGTCCACCTGTGATG3を顕微注入しPGCの分化を阻害して不妊を誘導した。キンギョのドナー半数体とホスト三倍体群では、卵膜除去を行わない対照群を作成し、受精後5時間以内に未受精卵を取り除き、さらに1日毎に死卵の計数と除去、及び水換えを行った。ドナー半数体の孵化期には孵化仔魚の形態を観察し、正常仔魚出現率と半数体症候群などの奇形を呈する仔魚の出現数を調査した。なお、発生段階は梶島1960の報告に従った。6.卵膜の除去と卵膜除去卵の培養各実験群の約半数程度の1~2細胞期の受精卵について、01トリプシンと04尿素を含む淡水魚用リンゲル液128mMNaCl28mMKCl19mMCaCl2pH70を含む卵膜除去液で処理することにより卵膜を除去した。卵膜除去卵は、約1のアガロースで底面を被膜処理し20°Cの一次培養液16ニワトリ卵白と001ペニシリンとストレプトマイシンを含む淡水魚用リンゲル液を満たしたガラスシャーレ内で体節形成期まで培養した。その後、卵膜除去卵を二次培養液001ペニシリンとストレプトマイシンを含む18mMCaCl218mMMgCl2液に移し、孵化まで培養した。7.ドナー胚及びホスト仔魚の倍数性測定精子の遺伝的な不活化の成否を検討するために、キメラ作出時に用いたドナー胚の倍数性をフローサイトメーターPartecPloidyAnalyserPA型を用いて調査した。また、ホストが三倍体又は二倍体であるか否かを検討するために、卵膜除去をしていないコントロールのホスト仔魚の倍数性を調べた。ドナー胚及びホスト仔魚は、CystainDNA2stepkitPartecのA液核単離溶液150μlの中にそれぞれ入れ、20分間放置し、ボルテックスにより細胞を混合遊離した。その後、試料を50μmのメッシュCellTrics50μmPartecで濾過し、細胞の破片を除去した後、A液の5倍量のB液4’6-ジアミジノ-2-フェニリンドールDAPIを含む染色液を加え、フローサイトメトリーにより相対DNA量を測定した。この際、正常二倍体キンギョの鰭のDNA量を二倍体DNA量2Cの、正常二倍体キンギョの半数体精子のDNA量を半数体DNA量1Cの基準とした。さらに2n3nキメラ作出に用いたドナー胚及びホスト仔魚においても、倍数性を調べた。8.キンギョにおける生殖系列キメラの作出卵膜除去した半数体受精卵が1~4細胞期の時にGFPnos13’UTRmRNAを注入し、PGCの顕在化を行った。この卵が胞胚期に達したとき、胚盤周囲の割球を吸引しホスト胞胚へ移植する割球移植法:BT法、胚盤の下部を切り取りホスト胞胚の中央部へ移植する胚盤移植:sandwich法、および体節形成期に顕在化されたPGCをホスト胞胚へ一個移植するSPT法あるいは複数移植するPPT法のいずれかで生殖系列キメラ個体を誘導した。ホストとして、上述したdndMOを顕微注入してPGCの形成を阻害した2n、あるいは3nの胚を用いた。ドナー細胞を移植した胚を培養するとともに蛍光顕微鏡で観察し、GFP蛍光を発するPGCが生殖隆起に確認された個体を生殖系列キメラとして分別して継続飼育した。9.キンギョキメラの配偶子の採取と倍数性の判定1n3nキメラにおいて配偶子の分化の有無を検討するために、上述の採卵と採精の方法に準じてキメラ個体へのhCG注射を行った。注射した翌日に腹部を圧迫し、排卵あるいは排精の有無を確認した。排精した個体より、精子をヘマトクリット毛細管へ取り、さらに人工精漿溶液に精液を懸濁した。また、同個体より鰭断片を採取し、淡水魚用リンゲル液の中に保存した。鰭あるいは精子懸濁液は、CystainDNA2stepkitPartecのA液核単離溶液150μlの中にそれぞれ入れ、20分間放置し、ボルテックスにより細胞を混合遊離した。その後、試料を50μmのメッシュCellTrics50μmPartecで濾過し、細胞の破片を除去した後、A液の5倍量のB液4’6-ジアミジノ-2-フェニリンドールDAPIを含む染色液を加え、フローサイトメトリーにより相対DNA量を測定した。この際、正常二倍体キンギョの鰭のDNA量を二倍体DNA量2Cの、正常二倍体キンギョの半数体精子のDNA量を半数体DNA量1Cの基準とした。一方、これまでに排卵の確認された例はない。10.キンギョキメラの配偶子がドナーPGC由来であることの検定排精の確認されたキメラ個体では、精子がドナーPGCに由来するかを明らかにするため、掛け合わせによる判定と、精子ゲノムと体細胞のゲノムの比較を行った。掛け合わせによる判定では、野生型より得られたキメラの半数体生殖細胞のドナー雌親、キメラのホストの雌雄親、キメラ個体の鰭、キメラの精子からDNAを抽出し、RAPD解析とマイクロサテライトマーカーを用いた遺伝的な解析を行った。DNAはエタノール固定されたサンプルの一部をProteinaseKを250μgmLの濃度で含むTNESUrea緩衝液に浸漬し、37°Cで一晩インキュベートすることによってタンパク質消化を行った。その後、フェノールクロロホルム法によってDNAの抽出を行った。A.結果1.キンギョBTキメラ群とコントロール群の受精率、正常発生率、および生殖系列キメラ誘導率BT割球移植法により作製した1n3nキメラの生残率、正常発生率、および生殖系列キメラの率は表9にまとめた。ドナーの半数体は、雌性発生により作出した。ホストとしてはキンギョ卵と4倍体フナから得た二倍体精子による受精卵に、dndMOを注入した胚を用いた。キメラを作出する際のコントロールとして、GFPnos13’UTRmRNAを注入していない卵膜除去をした半数体個体、および卵膜除去後にdndMOを顕微注入したホスト三倍体対照群を用いた。移植群、対照群ともに使用卵数、受精卵数、孵化仔魚数、正常仔魚数、奇形仔魚数を計数した。その結果、移植群とホスト三倍体対照群では約半数が正常仔魚となった。また、ドナーとして作出した雌性発生群は、孵化後、全てがいわゆる半数体症候群と判定される奇形を呈した。正常な形態を示した移植群のうち14で、生殖腺領域にドナーのPGCと考えられる細胞が観察された。ドナー細胞を供与した半数体個体は、対照胚が孵化する時期にDNA量を測定した結果、全て半数体と考えられるDNA量であった。2.キンギョSandwichキメラ群とコントロール群の受精率、正常発生率、および生殖系列キメラ誘導率Sandwich法胚盤移植法により作製した1n3nキメラの生残率、正常発生率、および生殖系列キメラの率は表10にまとめた。ドナーの半数体は、雌性発生により作出した。ホストとしてはキンギョ卵と4倍体フナから得た二倍体精子による三倍体の受精卵に、dndMOを注入した胚を用いた。キメラを作出する際のコントロールとして、GFPnos13’UTRmRNAを注入していない卵膜除去をした半数体個体、および卵膜除去後にdndMOを顕微注入したホスト三倍体対照群を用いた。移植群、対照群ともに使用卵数、受精卵数、孵化仔魚数、正常仔魚数、奇形仔魚数を計数した。その結果、ホスト三倍体対照群では933が正常に発生したのに対し移植群では約59に留まった。一方、半数体対照群では正常に発生した個体はおらず、全てが半数体症候群と判定される奇形仔魚であった。正常な形態を示した移植群のうち13で、生殖腺領域にドナーのPGCと考えられる細胞が観察された。3.キンギョSPT法とPPT法による生殖系列キメラの誘導率の比較SPT法またはPPT法により作製した1n2nの生残率、正常発生率、および生殖系列キメラの率は表11にまとめた。ドナーの半数体は、雌性発生により作出した。ホストとして、キンギョ同士の二倍体受精卵を用いた。キメラを作出する際のコントロールとして、卵膜除去後にdndMOを顕微注入したホスト二倍体、およびホスト二倍体受精卵を用いた。実験群、対照群とも90以上が正常な発生をした。生殖隆起へドナーPGCが移動した個体は、一つのPGCを移植したSPT群では正常胚の292しか無かったのに対して、5個のPGCsを移植した群では、824出現した。GR:生殖隆起、Ect生殖隆起以外を示す。4.キンギョPPT法による1n3nキメラ群とコントロール群の受精率、正常発生率、および生殖系列キメラ誘導率PPT法胚盤移植法により作製した1n3nキメラの生残率、正常発生率、および生殖系列キメラの率は表12にまとめた。ドナーの半数体は、雌性発生により作出した。ホストとしてはキンギョ卵と4倍体フナから得た二倍体精子による受精卵に、dndMOを注入した胚を用いた。キメラを作出する際のコントロールとして、GFPnos13’UTRmRNAを注入していない半数体個体の卵膜除去卵と非卵膜除去卵、卵膜除去後にdndMOを顕微注入したホスト三倍体対照群、および卵膜を除去していない三倍体対照群を用いた。移植群、対照群ともに使用卵数、受精卵数、孵化仔魚数、正常仔魚数、奇形仔魚数を計数した。その結果、dndMOを注入したホスト三倍体対照群、三倍体対照群では90以上が正常に発生したのに対し移植群では約881に留まった。一方、卵膜除去した半数体対照群では正常に発生した個体はおらず、全てが半数体症候群と判定される奇形仔魚であった。一方、卵膜未除去の半数体対照群では2個体で正常個体が出現した。PGC移植群では、17個体288の生殖隆起でドナーPGCが確認された。GR:生殖隆起、Ect生殖隆起以外を示す。5.キンギョ半数体PGCの二倍体ホストでの動態複数の半数体PGCsを移植したキメラ個体で、ドナーPGCの動態を追跡した。ホストとした個体は、黒色色素が出現しないアルビノ透明鱗個体を用いた。移植したPGCsは、概ね生殖隆起周辺に位置したが、脊索周辺などに分布するものも見受けられた。移植後4週間後に、ドナーPGCsの分裂が確認された。5週後には外部からは観察できなくなった。そのため、個体を固定し、生殖腺の組織学的な観察を行った結果、生殖腺内でのPGCの増加が確認された。6.キンギョBTキメラにおける配偶子の分化BTキメラを作製し、キメラおよびその対照群を1年半後に開腹して生殖腺の有無を確認した。この時点で4尾のキメラ個体、1尾のMO対照群、および6尾の三倍体対照群が生残した。キメラ群の一尾で、精巣が確認され、残りの3尾では未発達の線状の生殖腺が確認された。MO対照群の生殖腺は線状を示し、キメラ個体の線状生殖腺と一致した。三倍体対照群では、5尾で精巣が、1尾で卵巣が確認された。キメラ個体からの精液、確認された精巣と線状の生殖腺、三倍体対照群で確認された精巣の断片をFCMにかけ、構成する細胞の倍数性を確認した。その結果、キメラ個体の発達した精巣を持つ個体から得られた精液は1n、精巣を構成する細胞は1n、2n、3nの倍数性を示した。一方、未発達の生殖腺を持つ個体は、ホルモン注射後に得られた総排泄孔からの体液からは3n、生殖腺は3nのみの細胞から構成されていた。三倍体対照群の生殖腺は15n、3n、6nに相当する細胞が観察された。どの群も、鰭体細胞は3nの相対的DNA量を示した。これらの結果は、半数体のPGCを移植したキメラのみ1nの精液を産生することを示している。7.キンギョPPTキメラにおける配偶子の分化半数体PGCを不妊化した三倍体に移植したPPTキメラ個体では8尾が生残した。これらのキメラ個体にhCGを注射し、排精およびその倍数性を確認した。2尾より排精され、FCMの結果、鰭の体細胞は三倍体、精子は半数体であることが確認された図18。一方、野生型半数体PGCを不妊化したアルビノ二倍体に移植したPPTキメラ個体のうち、途中死亡した個体を解剖した結果、左右両方に精巣が確認された図19。これらの精巣断片の構成細胞の倍数性をFCMで確認した結果、半数体、二倍体の細胞が確認された。さらに、組織学的に精巣を観察した結果、精細胞を含む各段階の雄性生殖細胞が確認された。精子と断定できる細胞は観察されなかった。生き残った1個体090622で排精が確認され、FCMで半数体精子であることが確認された図20。排精が確認されたキメラ個体の精子をアルビノ雌個体より得られた卵に受精させた。その結果、子孫は全て野生型の特徴である黒い色素を持っていた表13。このことから、この精子はドナーとなる野生型の半数体PGCに由来することが確認された。B.材料及び方法1.キンギョにおけるRAPD解析RAPD解析ではプライマーとして多型が観察されたOPA2、OPA4、OPA11オペロン社を用いた。PCR反応は02mLチューブとrTaqDNAPolymeraseTaKaRaを用い、酵素に添付のバッファーを使用して20μLの反応系1xPCRbuffer02mMdATP02mMdTTP02mMdGTP02mMdCTPPrimer05μMrTaqDNAPolymeraseTaKaRa1UTemplateDNA255ngを作製した。94°C3分1サイクル、94°C30秒-36°C1分-72°C1分30サイクル、72°C7分1サイクルの反応条件でPCR反応を行い、反応終了後は4°Cで保存した。得られたPCR産物は15アガロースゲルを用いて75分間の電気泳動を行い、エチジウムブロマイドによってDNAを染色した後、UVトランスイルミネーターでバンドを検出した。B.結果1.キンギョSandwichキメラにおける配偶子の分化とそのRAPD解析1年間飼育した2尾のSandwichキメラ個体にhCGを注射し、排精およびその倍数性を確認した。1尾より排精され、FCMの結果、鰭の体細胞は三倍体、精子は半数体であることが確認された図21。25尾生き残ったMO対照群のうち、大型の5尾にhCGを注射したが排精、排卵は確認されなかった。排精が確認されたキメラ個体の体細胞と精子、ホストの雄親の体細胞よりDNAを抽出し、RAPD解析を行った図22。キメラの精子DNAを鋳型にして増幅されたバンドに、キメラ個体、ホストの雄親のものとは異なるものが確認され、キメラの精子にはドナー半数性PGCに由来するものが含まれていることが確認された。なお、この個体を作製したドナーおよびホストの両親の細胞のサンプルは保存されておらず、これ以上の解析は行えなかった。C.材料及び方法1.キンギョにおけるマイクロサテライト解析のプライマーキンギョを用いたキメラにおけるクローン性の確認には、キンギョで開発されたマイクロサテライトZhengetalMolecularEcology47917921995JungetalMolecularEcologyNotes71241262007と、近縁種であるコイで開発されたマイクロサテライトCrooijmansetalAnimalGenetics281291341997YueetalAquaculture23485982004を用いた表14。キンギョ由来のマイクロサテライトマーカーは、GF111172029Zhengetal1995と、CAL0120042804100041004610174019201560495Jungetal2007の合計14マーカー、また、コイ由来のマイクロサテライトマーカーはMFW2717Crooijmansetal1997Cca0204121922678691Yueetal2004の合計12マーカーを用いてドナーとホスト、ならびにキメラとの交配に用いたメス親魚の多型性の検討を行った。このうち多型性が認められたのはGF17GF29MFW7MFW17CAL0428CAL0174CAL0192Cca12Cca86Cca91の10座であった。2.キンギョにおけるマイクロサテライト解析本解析ではキメラに用いたホスト両親DNAとドナー両親DNA、そしてキメラの鰭、精子に由来するDNAをテンプレートDNAとして用いた。そして、解析に用いるマーカーのフォワードプライマーには前述のプライマー配列の5’末端に5’agtcacgacgttgta3’配列番号No7を付加したプライマーを使用した。そしてPCR反応と遺伝子型の解析は、アニーリング温度は50°Cから56°Cの間で各プライマーセットに最適な温度を用いたが、MorishimaetalGenetica132227241に基づいてFAMVICPETNEDの各蛍光色素を付加したM13プライマー5’GCCAGTCACGACGTTGTA3’配列番号NO8を用いたM13tailed法によるPCRを行い、ABI3030xlオートシークエンサーABIを用いて電気泳動し、遺伝子型はGeneMapperprogramVer37ABIによって解析した。3.キンギョキメラ配偶子のクローン性の解析排精の確認されたキメラ個体では、一個体のキメラから得られた精子がすべて遺伝的に均一クローンであることを確認するために、クローンドジョウの産生する卵をキメラから得られた精子とで受精した雑種を作成し、雑種の形態を示す個体を分離した。次に、この雑種よりDNAを抽出し、キンギョ由来のマイクロサテライトマーカーにより解析した。キメラの半数体生殖細胞のドナー雌親、キメラのホストの雌雄親、キメラ個体の鰭のサンプルも合わせて採集した。これらのサンプルからDNAを抽出し、RAPD解析とマイクロサテライト解析を行った。4.キンギョ半数体PGCを移植したキメラに由来する精子の遺伝的解析以上のドナー由来であることが確認された半数体のPGCが移植されたキメラ個体で、さらに詳細な精子の遺伝的な解析を行った。この解析には、ドナー半数体を誘起した両親の体細胞、ホストの個体を誘起した両親の体細胞、およびキメラ個体の体細胞と精子を材料とし、これらの細胞から抽出したDNAを解析に用いた。そして、ドナー半数体を誘起した両親の体細胞、ホストの個体を誘起した両親の体細胞、およびキメラ個体の体細胞と精子のDNAを解析した。解析には、キンギョおよびコイで報告されているマイクロサテライトマーカーを用いた表14。C.結果1.キンギョ半数体PGCを移植したキメラドナーの雌性発生の再検証移植したドナーPGCが雌由来であるかどうかを明らかにするため、キメラの精子のマイクロサテライトマーカーが雌由来のみで、雄由来が含まれていないかを明らかにした図23。その結果、0906134の個体を除く三個体では、雌由来の座のみが観察され雌性発生が起こっていることが明らかにされた表15。2.キンギョ半数体PGCを移植したキメラにおける配偶子へのホストゲノムの関与の有無キメラの精子にホスト由来のゲノムが含まれていないかどうかを明らかにした。その結果、0903074、0903075、090622の三個体ではドナー雌のみのマーカーが含まれていたが、0906134ではホストのみの座が認められた表16。この結果より、0903074、0903075、090622の三個体の精子はドナーメスに由来すると考えられた。0906134から得られた精子はホストに由来すると考えられる。3.キンギョ半数体PGCを移植したキメラ精子の遺伝的同一性の確認キメラが半数性PGCsに由来して精子を形成している場合、一腹に由来するそれらの精子は、すべてのマイクロサテライトマーカー座においてドナー由来の一つのアレルのみを持ち、かつ精子の間で遺伝的相違の無いクローン精子である必要がある。そこで、ドナーの母親がヘテロアレルである遺伝子座をもつマイクロサテライトマーカーを用いて、キメラが産する精子のマーカー型を検討した。その結果、0903074、090622の二個体に由来する精子では、用いたすべてのマーカー座においてドナー親の一方のアレルしかないヘミ型ことが明らかとなった。0903075ではヘテロ型の座が35で見つかった。このことから、0903074、989622の二個体の精子は半数性のPGCから由来し、クローンである可能性が高いことが示された。ゼブラフィッシュDaniorerioの場合A.材料と方法1.ゼブラフィッシュDaniorerioを材料に、下述の発生工学的手法により、ドナーに半数体、ホストに正常二倍体を用いた半数体-二倍体生殖系列キメラ1n2nを作出した。1n2nは、デッドエンドアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドゼブラフィッシュでは、配列番号No95’-GCTGGGCATCCATGTCTCCGACCAT3’でノックダウンして不妊化処理をした二倍体ホスト個体の内で、半数体PGCsが生殖隆起へ移動し、生殖細胞として増殖するか否か、そして、それらの生殖腺から機能的な配偶子が形成されるか否かを検討するために作出した。将来的に、機能的な配偶子が形成されるか否かを検討する場合、得られた子孫の色素によりドナー由来か否かを判別するために、ドナーとして色彩変異体劣性形質のゴールデン系統又は遺伝子組換え個体を使用した。2.供試魚本発明では、北海道大学北方生物圏フィールド科学センターにて飼育中のゼブラフィッシュDaniorerioとキンギョCarassiusauratus雄を材料として用いた。3.採卵と採精ゼブラフィッシュでは、採卵の前日に16L8Dに設定した恒温室内の産卵水槽に雌雄を分離して収容した。ドナー用の卵を得るため、採卵日の照明が点灯した直後に雌個体を混合し、産卵が確認された雌個体を取り上げ、腹部を圧迫してサランラップ上に採卵した。ホスト用の二倍体胚では、採卵日の照明が点灯した直後に、雌雄の親魚を混合して産卵を誘発させ、受精卵を得た。キンギョ精子は採精の前日にhCGを注射し、排精を誘導した。キンギョ精子はヘマトクリット毛細管に採精した後、キンギョ人工精漿に希釈し、遺伝的不活化に使用した。4.精子の遺伝的不活化卵及び精子の遺伝的不活化には紫外線照射を用いた。上部に2灯の紫外線殺菌灯GL15W、National社製を設置した箱形紫外線照射装置を用いた。精子の遺伝的不活化のための紫外線照射量は60mJcm2とした。雌性発生では二倍体キンギョ由来の半数体精子を使用した。この理由は、ゼブラフィッシュの雌性発生において、キンギョの精子を使えば、紫外線照射から逃れた精子からの受精卵は致死雑種となり除去できるためである。5.ドナー半数体とホスト二倍体の作出ゼブラフィッシュ卵に紫外線照射したキンギョ精子を媒精後、285°Cの受精液を満たしたプラスチックシャーレ内に散布して受精させる方法でドナーの雌性発生半数体群を作出した。受精液には02尿素、024NaClを含む水道水を用いた。また、ホストとして自然産卵させて採取した二倍体群を作出した。ホストとする胚は、受精後1~4細胞期にdndMO配列番号No95’GCTGGGCATCCATGTCTCCGACCAT3’を顕微注入しPGCの分化を阻害して不妊を誘導した。ドナー半数体の仔魚の形態を観察し、正常仔魚出現率と半数体症候群などの奇形を呈する仔魚の出現数を調査した。なお、発生段階はKimmeletalの報告に従った。6.卵膜の除去と卵膜除去卵の培養半数体ドナー胚および二倍体ホスト胚は、01トリプシンを含む淡水魚用リンゲル液128mMNaCl28mMKCl19mMCaCl2pH70で処理することにより卵膜を除去した。卵膜除去卵は、約1のアガロースで底面を被膜処理し20°Cの一次培養液16ニワトリ卵白と001ペニシリンとストレプトマイシンを含む淡水魚用リンゲル液;128mMNaCl28mMKCl19mMCaCl2pH70を満たしたガラスシャーレ内で体節形成期まで培養した。その後、卵膜除去卵を二次培養液001ペニシリンとストレプトマイシンを含む18mMCaCl218mMMgCl2液に移し、孵化まで培養した。7.ドナー胚の倍数性測定精子又は卵の遺伝的な不活化の成否を検討するために、キメラ作出時に用いたドナー胚の倍数性をフローサイトメーターPartecPloidyAnalyserPA型を用いて調査した。ドナー胚は、CystainDNA2stepkitPartecのA液核単離溶液150μlの中にそれぞれ入れ、20分間放置し、ボルテックスにより細胞を混合遊離した。その後、試料を50μmのメッシュCellTrics50μmPartecで濾過し、細胞の破片を除去した後、A液の5倍量のB液4’6-ジアミジノ-2-フェニリンドールDAPIを含む染色液を加え、フローサイトメトリーにより相対DNA量を測定した。この際、正常ゼブラフィッシュの鰭のDNA量を二倍体DNA量2Cの、ゼブラフィッシュの半数体精子のDNA量を半数体DNA量1Cの基準とした。8ゼブラフィッシュにおける生殖系列キメラの作出生殖系列キメラの成否を遺伝的に判別するため、雌性発生半数体ドナーにはゴールデン系統および遺伝子組換え系統を用い、ホストには野生型あるいはゴールデンの系統を用いた。ここで用いた遺伝子組換え系統は、全ての細胞が緑色蛍光GFPで標識され、生殖細胞は赤色蛍光RFPで標識されているGFPRFPdoubletransgenicstrainである。全てのホスト胚は一細胞期から四細胞期の間に100μMのdndMOを顕微注入することにより不妊化した。また、ゴールデンをドナーとして用いる場合は、PGCsを可視化するため、一細胞期から四細胞期の間に300ngμlのGFPnos13’UTRmRNAを顕微注入した。A.結果1.胞胚期ドナー胚の胚盤周縁部の割球を微小ガラス針で吸引し、同じ発生段階のホスト胚の胚盤中へ移植したBTキメラ。ドナー1個体から、およそ10個体のホストへ割球を移植することが可能だった。ドナーとして用いた全ての胚は初期体節形成期まで培養し、フローサイトメーターにより半数体であることを確認した図26。2.ゼブラフィッシュBTキメラにおける半数体PGCの動態475個体のキメラを作出し、そのうち66個体でドナー由来のPGCsが移植されていることを確認した。それらの個体では、移植されたPGCs数は5~14個と個体により幅があったものの、ほぼ全ての胚でドナーPGCsは生殖腺形成域へと到達していた表18。遺伝子組換え胚をドナーとして用いた場合では、キメラ中のPGCs蛍光は細胞が存在するかぎり観察できる。その特長を用いてドナーPGCsの動態を経時的に確認したところ観察した13個体中5個体で発生14日前後にドナーPGCsの消失が確認された。これらの胚では、同時に移植されたドナー体細胞のGFP蛍光は継続して観察できたことから、PGCs特異的な消失であることが示唆される。一方、その他の個体ではドナーPGCsの増殖が確認された。これらの個体では、少なくとも受精後30日後の段階でもPGCsのRFP蛍光が観察された。3.ゼブラフィッシュ1n2nBTキメラにおける配偶子の起源作出したゴールデン系統→野生型系統キメラのうち5個体が成熟し交配実験を行うことができた。これら5個体はゴールデン系統をドナーとし、不妊化した野生型系統へ移植したものである。これらキメラはすべて雄の外部形態を呈した。ゴールデン系統の雌と交配を行った所、このうちの1個体から数百以上の受精卵が得られ、その全ての子孫がゴールデン系統の表現形を示した。同様に、遺伝子組換え系統→ゴールデン系統キメラのうち3個体が成熟した。これらのキメラも全て雄の外部形態を呈した。非遺伝子組換えの雌個体と交配実験を行ったところ、そのうちの1個体から得られた138個体の卵の中に8個の受精卵が見いだされた。これらの受精卵を培養したところ、遺伝子組換え系統に由来するGFP蛍光の発現が認められた。もし、ホスト野生型の生殖細胞が残留しており、それによって受精したのならば、その子孫はホスト系統の表現形を呈するはずである。しかし、妊性が確認されたキメラを用いた掛け合わせの実験ではどちらもドナー系統の表現型を持つ子孫のみが得られた。これらの結果から、キメラの配偶子は移植された半数体PGCsの由来すると考えられた。統計解析本願において、統計的有意性はスチューデントt-検定、クラスカルウォリス検定、シェッフェ法により評価した。005未満のp値を有意であると判定した。考察本発明によって得られたキメラ魚類によって、魚類において半数体PGCを利用した新たな育種技術の開発につながりうる。本発明では、まずドジョウで、2nドナーのPGCsをdndMO処理により不妊化した3nホストに移植した生殖系列キメラにおいて、ドナー由来の配偶子形成のみが生じることを確かめようとした。その結果、2n3nの産出した精子は正常な形態を示し、運動能を有することから精子としての機能をもつと思われた。正常二倍体の精巣は1nの精子、精細胞の他、2nと4nの細胞集団からなるが、2n3nの発達した精巣は1nと3n又は1n、2nと3n又は1n、2n、3nと4nの細胞集団からなり、これら細胞集団の中では1n細胞のピークが高く、2nと4n細胞のピークは低かった。一般的に魚類において、2nはA、B型精原細胞、二次精母細胞、4nは一次精母細胞、1nは精細胞、精子であると考えられる小林足立ら生殖魚類生理学の基礎恒星社厚生閣東京pp155182。正常二倍体及び2n3nにおいては、精子形成の全ステージ精原細胞、精母細胞、多くの精細胞、精子が組織学的に観察されたことから、フローサイトメーターにより検出された精巣中の2n細胞はA、B型精原細胞及び二次精母細胞、4n細胞は一次精母細胞、ピークが高く検出された1n細胞は精細胞あるいは精子と考えられる。以上のことから、2n3nキメラでは、2nドナー由来のPGCから機能的な精子が作られたと判断できる。ドジョウ半数体PGCsをdndMO処理した不妊化3nホストに移植して作出した生殖系列キメラ1n3nの一部に、正常な形態をもつ1n精子の形成が認められた。1n3nの発達した精巣には1n、2nと3n又は1n、2n3nと4n又は1n、2n3nと4n又は1n、2n3nと6nの細胞集団がみられ、細胞集団の組成は2n3nの精巣と異なった。ある1n3n個体においては1nと2nのピークの大きさは同程度で4nのピークより低く、4nのピークが最も大きかった。また別の1n3n個体では、精子と思われる1n細胞集団のピークが最も大きいが2n細胞集団のピークも、それに次いで高く検出された。2n細胞集団は、本来ドナーにもホストにも由来しない倍数性を示す細胞集団である。以上の結果から、1n3nでは、移植されたドナーの1nPGCが2n生殖細胞となり、それらが複製したのち、2回の減数分裂に入り、4n及び2nの精母細胞に加えて、1nの精細胞あるいは精子が形成されたものと考えられる。同時に、精巣で認められる3n細胞集団はホストとした3n体細胞由来、そして、6n細胞はそのG2期に相当すると考えられるので、いずれもホストに由来するものと推定される。多くのドジョウ1n3nの精巣の組織像から、サイズの異なる多くの精原細胞とわずかの精母細胞が観察された。そこで、A型精原細胞の核の直径を測定したところ、正常二倍体や2n3nのA型精原細胞と同じ程度の核の大きさを持つ細胞が多かった。しかし、1n3nにおける測定結果は大型の核をもつ細胞の存在も示していた。雑種起源の可能性が示唆されている自然クローンドジョウでは、減数分裂前の染色体の倍加による核内分裂により、二倍性のクローン配偶子が形成されることが報告されている非特許文献9。この研究では、雑種あるいは雑種に起源する動物において、減数分裂にあたって、染色体の相同性が低く、対合できないとき、未解明の機構により染色体の倍加が自然に生じ、あたかも姉妹染色体が相同染色体のように行動することで、疑似的減数分裂を行い、非還元配偶子を形成する可能性が示唆されている。本研究で観察された1n3nの大きな核は、A型精原細胞の時期に、複数回の核内分裂により染色体倍加が生じた可能性を示唆するものと考えられた。組織像に精原細胞が多く観察されたことから、1n3nの精巣中の2n細胞は、ドナー由来の半数体PGCsが自然に倍加を起こし、その結果生じた二倍性の精原細胞あるいは、それらが減数分裂に入った後の二次精母細胞と思われる。一方、4nの倍数性を示す細胞は、大型のA型精原細胞が観察できたことから、ドナーPGCsが核内分裂を複数回行って生じた、倍数性が4nまで上昇したA型精原細胞、あるいは2nとなった後、減数分裂を開始した一次精母細胞である可能性が考えられた。稚魚期1~2ヶ月齢の1n3nのA型精原細胞の核の直径を測定したところ、2n3nのそれらよりも小型の核を持つ細胞であったことから、1n3nの精巣に見られる1n細胞は、ドナー由来1nPGCs自体が増殖した1n細胞か、精原細胞の時期に倍加した半数体PGCsの減数分裂により生じた1n精細胞あるいは1n精子ではないかと考えられる。以上のことより、生殖系列キメラにおいて、半数体由来のPGCsは、ある時期に2nに自然倍加し、その後有糸分裂により2n精原細胞として増殖を行い、複製と染色体の対合の後、減数分裂を開始して、半数体の精子を形成すると考えられた。ドジョウに続いて、キンギョを材料として半数体のPGCを不妊化したホストへ移植し、配偶子が作られるかを検討した。キンギョの半数体PGCを移植する場合、一つのPGCを移植するよりも数多くのPGCを移植する方法を用いた方が、当然のことながら生殖隆起に移動したPGCを持つ生殖系列キメラが多く得られた。生殖隆起へ移動したドナーのPGCは約一ヶ月後に増殖を開始した。一つの個体で複数のドナーPGCsが同時に増えていたことから、PGCの増殖のタイミングがホストによって制御されている可能性がある。成熟サイズに達した生殖系列キメラにhCGを注射し、排卵、排精を誘導した所、複数の個体より運動性を有する精子が得られた。マイクロサテライトマーカーを用いて、得られた配偶子の起源を明らかにした所、調べた4個体のうち2個体の配偶子がドナー由来の半数体PGCに起源すると確定された。他の一個体は三倍体ホスト由来と考えられ、残りの一個体は雌性発生の失敗、あるいはドナー由来の配偶子が混在しているものと考えられた。さらに、ゼブラフィッシュを材料として半数体のPGCsを不妊化した二倍体ホストへ移植し、配偶子が作られるか否かを検討した。移植された半数体PGCsは二倍体ホスト胚中を移動し、生殖隆起形成域付近へと定着した。一部の個体ではドナー半数体PGCsの消失が観察されたものの、それ以外の個体ではPGCsの増殖が確認された。ドナー半数体PGCsが生殖腺に定着していたキメラ個体を飼育し交配実験に供したところ、半数体のゴールデン系統PGCsを移植したキメラ、及び半数体のtransgenic系統PGCsを移植したキメラ、それぞれからドナーの表現系を呈する次世代子孫が得られた。これらの個体では、半数体PGCsが発生分化の過程で倍加し二倍体となった後、半数体の配偶子を生産したものと考えられる。つまり、配偶子はドナー半数体の持つアレルのみを持ちヘミ接合、同一の遺伝的構成を有すると考えられる。このことは、キンギョやドジョウだけではなく、ゼブラフィッシュにおいても半数体PGCsが倍加し正常な配偶子を生産できることを示している。本研究で示したように、ドジョウ、キンギョ、ゼブラフィッシュの3魚種において、半数体のPGCを移植した生殖系列キメラがドナー由来の精子を作ることが示された。このことは、半数体のPGCが精子へ分化する能力を持っていることを示している。また、キンギョの例で示したように、半数体のPGCに由来する精子は、全て遺伝的なクローンであることが予想される。ところで、1n3nは2n3nと比べて、PGCが増殖していた個体の割合が少なく、特に生殖細胞が全くない個体の割合が多かった。その理由の特定は困難であるが、染色体が1セットしかないために、生殖を阻害する劣性有害遺伝子の発現が生じたことが考えられる非特許文献1。しかし、雄成魚1n3n全15個体中1個体の精巣に、2n及び2n3nと同様の精子形成の全ステージ精原細胞、精母細胞、精細胞、精子が観察された。このことから、半数体PGCsは生殖系列キメラを介して、正常な精子形成をすることが示唆された。1n3nの発達した卵巣は1nと3nの細胞で構成されることがわかった。卵原細胞の核の直径を測定した結果、正常2n、dndMO処理をしていない3n、2n3nと比べて、1n3nは小型の卵原細胞を有していたため、卵巣中の1n細胞はドナー半数体由来のPGCsが直接増殖した細胞であると考えられた。1n3nの卵巣の組成を見ると、コントロール2n及びdndMO処理をしていない3n、2n3nの卵巣と同様に多数の周辺仁期、及び少数の卵黄胞期の卵母細胞が見られたことから、雌の1n3nにおいても半数体PGCsは有糸分裂により増殖し、染色体の自然倍加後、減数分裂を行う可能性が示唆された。育種の基本は、何代にもわたって優良な形質を選別し掛け合わせることである。しかし、キメラ中で半数体PGCsが倍加しホモ配偶子クローン配偶子、遺伝的に完全に同一な配偶子が産出される現象を利用すれば、系統の作出を短縮することが可能である。ゼブラフィッシュでは、BT法を用いたキメラ作製において、一個体のドナー胚からおよそ10個体のキメラを作出することができる。本法では、10個体のキメラのうち最大4個体が複数の半数体PGCsを有する生殖系列キメラとなる。また、体節形成期に50個程度まで増殖したPGCsを用いるSPT法を用いれば、原理的にはさらに多くの1個体のドナー胚に由来するPGCsを持つキメラを搾出することができる。これらのキメラ2個体をそれぞれ雌雄に発生させ、掛け合わせれば、その子孫は全て同じ遺伝的組成を有するクローンとなる。すなわち、長時間を有する掛け合わせをすることなく、クローン系統を作出することが可能となる。この方法が実用化すれば、育種分野のみならず、基礎生物学分野にも大きなインパクトを与えるものと考えられる。