"発酵プロセスにおいてグリコール酸を生産するための方法であって、-炭素源を含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、-該微生物において外部刺激により標的遺伝子の発現を調整する工程、および-該培養培地からグリコール酸を回収する工程を含んでなり、該微生物において、グリコール酸生合成経路に関与する少なくとも1つの標的遺伝子の発現が異種誘導プロモーターの制御下にあり、そのプロモーター活性が該外部刺激により調整される、方法。外部刺激が、物理的または化学的刺激である、請求項1に記載の方法。外部刺激が、温度または光の中から選択される物理的刺激である、請求項2に記載の方法。誘導プロモーターが、温度により誘導され、かつ-λファージの改変レプレッサーにより調節されるプロモーター、例えば、プロモーターPRまたは該プロモーターPRの誘導体、プロモーターPLまたは該プロモーターPLの誘導体など、-温度感受性Lacレプレッサーにより調節される改変lacプロモーターの中から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記λファージの改変レプレッサーが、λレプレッサーcIの温度不安定性対立遺伝子、特にλレプレッサー対立遺伝子cI857である、請求項4に記載の方法。改変微生物において、遺伝子recAが欠失している、請求項1~5に記載の方法。外部刺激が、化学的刺激であり、該刺激が、-炭素異化代謝産物の抑制の変化、-特定の炭素源の存在、または-糖アルコールの存在の中から選択される、請求項1または2に記載の方法。遺伝子発現が誘導プロモーターの制御下にある少なくとも1つの遺伝子が、icd、aceA、ycdW、pgi、pntAB、udhA,arcA、maeA、maeB、mdh、pck、ppc、ackA、pta、poxB、lldP、glcA、yjcG、ldhAおよびmgsAからなる群の中から選択される、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。icd遺伝子発現が、異種誘導プロモーターの制御下にある、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。誘導プロモーターの使用によって、37°C~42°Cでicd遺伝子の発現が可能になり、28°C~32°Cでicd遺伝子の発現が抑制される、請求項9に記載の方法。培養培地中の生産されたグリコール酸の回収が、培養培地中に存在するグリコール酸の誘導体および前駆体の回収を含んでなる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。グリコール酸生産の向上のために改変された微生物であって、該改変微生物において、グリコール酸生合成経路に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現が、請求項1~11のいずれか一項に記載の異種誘導プロモーターの制御下にある、微生物。遺伝子発現が異種誘導プロモーターの制御下にある少なくとも1つの標的遺伝子が、icd、aceA、ycdW、pgi、pntAB、udhA,arcA、maeA、maeB、mdh、pck、ppc、ackA、pta、poxB、lldP、glcA、yjcG、ldhAおよびmgsAからなる群の中から選択される、請求項12に記載の微生物。前記誘導プロモーターの使用によって、37°C~42°Cでicd遺伝子の発現が可能になり、28°C~32°Cでicd遺伝子の発現が抑制される、請求項13に記載の微生物。30世代後にグリコール酸生産が初期生産の少なくとも50である、請求項12~14のいずれか一項に記載の微生物。以下の実施例に記載するグリコール酸生産株を構築するために用いた一般プロトコールプロトコール1:組換えのためのPCR産物の導入および組換え体の選択FRT系遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択し、表1に示したオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドpKD3由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドpKD4由来のカナマイシン耐性カセットのいずれかを増幅した。次に、得られたPCR産物をエレクトロポレーションによって、プラスミドpKD46発現されるλRed系γ、β、exoが相同組換えに極めて好都合であるを担持するレシピエント株に導入した。次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、表2に示す適当なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析により確認した。プロトコール2:遺伝子の欠失のためのファージP1を用いた形質導入ファージP1を用いた形質導入法により、ある大腸菌株から別の大腸菌株へのDNA移入を行った。このプロトコールは、i単一遺伝子改変を含むドナー株でのファージ溶解液の調製と、iiこのファージ溶解液によるレシピエント株の形質導入、の2工程であった。ファージ溶解液の調製10mlのLBCm30μg/ml/Km50μg/mlグルコース0.2CaCl25mMに、単一遺伝子改変を有するMG1655株の一晩培養物100μlを植菌する。振盪しながら37°Cで30分間インキュベートする。ドナー株MG1655で調製したP1ファージ溶解液100μlおよそ1×109ファージ/mlを加える。37°Cで3時間、総ての細胞が溶解するまで振盪する。200μlのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。4500gで10分間遠心分離して細胞残渣を除去する。上清を滅菌試験管に移し、200μlのクロロホルムを加える。溶解液を4°Cで保存する。形質導入LB培地中の大腸菌レシピエント株の一晩培養物5mlを1500gで10分間遠心分離する。2.5mlの10mMMgSO4、5mMCaCl2に細胞ペレットを懸濁させる。対照試験管:100μlの細胞100μlの、単一遺伝子改変を有するMG1655株のP1ファージ。供試試験管:100μlの細胞100μlの、単一遺伝子改変を有するMG1655株のP1ファージ。振盪せずに30°Cで30分間インキュベートする。各試験管に100μlの1Mクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。1mLのLBを加える。振盪しながら37°Cで1時間インキュベートする。試験管を7000rpmで3分間遠心分離した後、LBCm30μg/ml/Km50μg/mlのディッシュ上に播種する。37°Cで一晩インキュベートする。その後、抗生物質耐性形質導入体を選択し、欠失の挿入を、表2に示す適当なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析により確認した。プロトコール3:組換えのためのPCR産物の導入および組換え体の選択Cre-LOX系遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択し、表1に示したオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドloxP-cm-loxP由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドloxP-PGK-gb2-neo-loxP由来のネオマイシン耐性カセットのいずれかを増幅した。次に、得られたPCR産物をエレクトロポレーションによって、プラスミドpKD46発現されるλRed系γ、β、exoが相同組換えに極めて好都合であるを担持するレシピエント株に導入した。次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、表2に示す適当なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析により確認した。実施例1発酵によりグリコール酸を生産するための温度誘導性株の構築:MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::KmΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔeddedaΔpoxBΔackAptapME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01大腸菌株MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔeddedaΔpoxBΔackAptapME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01を、特許出願WO2010/108909に示されている記載に従って構築した。1.MG1655ΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::Km株の構築uxaCA領域をTTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02断片に置き換えるために、DatsenkoWannerにより記載されている、プロトコール1に詳述した相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する領域の大部分を欠失させるとともに、カナマイシン耐性カセットと付加的DNAを挿入することを可能とする。この目的で、以下に詳述するように、プラスミドpUC18-DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02を構築した。断片TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02をPCRにより合成し、ベクターpUC18-DuxaCA-SMC-KmSMCは多重クローニング部位にクローニングした。プラスミドpUC18-DuxaCA-SMC-Kmを構築するために、DuxaCASMC-Km断片を、PCRにより、MG1655DuxaCA-SMC-KmゲノムDNAを鋳型として得、pUC18にクローニングした。MG1655DuxaCA-SMC-Km株の構築:uxaCA領域を前記SMC-Kmのものに置き換えるために、相同組換え法を用い、表1に示したオリゴヌクレオチドOme1506-DuxaCA-SMCFおよびOme1507-DuxaCA-SMCR配列番号1および配列番号2を用いてPCR産物を合成した。Ome1506-DuxaCA-SMCF配列番号1この配列は以下の領域を有する。領域uxaCAの配列3242797~3242724ウェブサイトhttpecogeneorg上に参照配列と相同な領域斜体の大文字T7ファージ由来のT7Te転写ターミネーター配列に関する領域下線の大文字501924カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域大文字Ome1507-DuxaCA-SMCR配列番号2この配列は以下の領域を有する。領域uxaCAの配列3239830~3239879ウェブサイトhttpecogeneorg上に参照配列と相同な領域斜体の大文字ApaI、BstZ17I、SacII、XhoI、AvaI、ΒamHI、SmaI、KpnI、SacI、EcoRI制限部位を担持するSMCに関する領域下線の大文字カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域大文字得られたPCR産物をエレクトロポレーションによって、MG1655株pKD46に導入した。次に、カナマイシン耐性形質導入体を選択し、抗生物質カセットの挿入を、表2に示したオリゴヌクレオチドOme1612-uxaCA_R3およびOme1774-DuxaCA_F配列番号15および配列番号16を用いたPCR分析により確認した。選択されたクローンをDNA配列決定法によりバリデートした。最終株をMG1655DuxaCA-SMC-Kmと呼称した。プラスミドpUC18-DuxaCA-SMC-Kmの構築:DuxaCA-SMC-Km領域を、PCRにより、鋳型としてのMG1655DuxaCA-SMC-Km株のゲノムDNAと、表1に示したオリゴヌクレオチドOme1515-uxaCAR2およびOme1516-uxaCAF2配列番号3および配列番号4から増幅した。Ome1515-uxaCAR2配列番号3この配列はuxaCAの下流領域3239021~3239044と相同である。Ome1516-uxaCAF2配列番号4この配列は以下の領域を有する。余分な塩基を含む領域大文字EcoRV制限部位を担持する領域下線の大文字uxaCAの上流領域3243425~3243402と相同な領域斜体の大文字。次に、PCR産物末端平滑化用DNAポリメラーゼにより得たを制限酵素EcoRVにより切断し、pUC18のSmaI部位にクローニングした。得られたプラスミドを配列決定法により確認し、pUC18-DuxaCA-SMC-Kmと呼称した。プラスミドpUC18-TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02の構築のために、断片TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02をPCRにより合成し、上に記載したプラスミドpUC18-DuxaCA-SMC-Kmにクローニングした。第1の工程では、TTadcca-cI857-PR/RBS012領域を、PCRにより、鋳型としてのpFClベクターと、表1に挙げたオリゴヌクレオチドTTadcca-cI857-icdFおよびPR/RBS012-icd-TT02R配列番号5および配列番号6から増幅した。第2の工程では、断片icd-TT02を、PCRにより、オリゴヌクレオチドPR/RBS012-icd-TT02FおよびTT02-icdR配列番号7および配列番号8を用いて、MG1655ゲノムDNAから増幅した。第3の工程では、TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02領域を、PCRにより、鋳型としてのTTadcca-cI857-PR/RBS012とicd-TT02のPCR産物混合物と、オリゴヌクレオチドTTadcca-cI857-icdFおよびTT02-icdR配列番号5および配列番号8を用いて合成した。この最終PCR産物をpSCBベクターにクローニングし、得られたプラスミドを配列決定法により確認し、pSCB-TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02と呼称した。TTadcca-cI857-icdF配列番号5この配列は以下の領域を有する。余分な塩基を含む領域大文字ApaIおよびBstZ17I制限部位を担持する領域下線の大文字TTadcca転写ターミネーター配列pSOL1メガプラスミドの179847~179807と相同な、クロストリジウムアセトブチリクム由来adc遺伝子の転写ターミネーターに関する領域斜体の大文字cI857遺伝子の3’末端と相同な領域太字の大文字PR/RBS012-icd-TT02R配列番号6この配列は以下の領域を有する。icd遺伝子の5’末端1194378~1194346と相同な領域大文字PsiI制限部位を作出するためにRBS012型RBSを得るための5塩基下線斜体の大文字を除き、λバクテリオファージPRプロモーターと相同な領域下線の大文字PR/RBS012-icd-TT02F配列番号7この配列は以下の領域を有する。icd遺伝子の5’末端1194346~1194378と相同な領域大文字PsiI制限部位を作出するためにRBS012型RBSを得るための5塩基下線斜体の大文字を除き、λバクテリオファージPRプロモーターと相同な領域下線の大文字TT02-icdR配列番号8この配列は以下の領域を有する。余分な塩基を含む領域大文字EcoRV制限部位を担持する領域斜体の大文字大腸菌のrrnB遺伝子の転写ターミネーターT16539に相当するTT02転写ターミネーター配列と相同な領域下線の大文字icd遺伝子の3’末端1195596~1195570と相同な領域太字の大文字TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02断片をベクターpUC18-DuxaCA-SMC-Kmに導入するために、プラスミドpSCB-ΤΤadcca-cI857-PR/RBS012-icd-ΤΤ02を制限酵素ApaIおよびEcoRVによって処理し、得られたTTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02断片をベクターpUC18-DuxaCA-SMC-KmのApaI/SmaI部位にクローニングし、ベクターpUC18-DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-ΤΤ02::Kmを得た。最後に、相同組換えによりuxaCA領域をTTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::Kmに置き換えるために、プラスミドpUC18-DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::KmをMluIおよびNruIによって制限酵素処理し、DNA断片DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::Kmをエレクトロポレーションによって、MG1655株pKD46に導入した。次に、カナマイシン耐性形質導入体を選択し、染色体へのDuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::Kmの挿入を、オリゴヌクレオチドOme1612-uxaCA_R3およびOme1774-DuxaCA_F配列番号15および配列番号16を用いたPCR分析により確認した。その株をMG1655DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::Kmと呼称した。2.MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::KmΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔeddedaΔpoxBΔackAptapME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01株の構築MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔeddedaΔpoxBΔackAptapME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01株において、uxaCA領域をTTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::Kmに置き換えるために、構築物ΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::Kmを、P1ファージ形質導入プロトコール2を参照によって、MG1655ΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::Km株からMG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔeddedaΔpoxBΔackApta株に移入した。抗生物質耐性形質導入体を選択し、染色体へのΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::Kmの挿入を、オリゴヌクレオチドOme1612-uxaCA_R3配列番号15およびOme1774-DuxaCA_F配列番号16を用いたPCR分析により確認した。得られた株をMG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::KmΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔeddedaΔpoxBΔackAptaと呼称した。最後に、プラスミドpME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01特許出願EP09155971,6およびUS61162,712において従前に記載されているをエレクトロポレーションによって導入し、MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::KmΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔeddedaΔpoxBΔackAptapME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01を得、AG1385と呼称した。実施例2発酵によりグリコール酸を生産するための温度誘導性株の構築:MG1655TTadcca/CI857/PR01/RBS012-icd::KmΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔeddedaΔpoxBΔackAptaΔaceK::CmpME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01大腸菌株MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔeddedaΔpoxBΔackAptapME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01を、特許出願EP09155971,6およびUS61162,712に示されている記載に従って構築した。1.MG1655TTadcca-cI857-PR01/RBS012-icd::Km株の構築大腸菌MG1655株において、天然icdプロモーターをDNA断片TTadcca-cI857-PR01/RBS012::Kmに置き換えた。天然icdプロモーターをTTadcca-cI857-PR01/RBS012DNA断片に置き換えるために、DatsenkoWannerにより記載されている相同組換え戦略を用いた。構築はプロトコール1に記載した手法によって行った。MG1655TTadcca-cI857-PR01/RBS012-icd::Km株を構築するために、遺伝子cI857、プロモーターPR01およびカナマイシンカセットKmを、PCRにより、表1に記載したオリゴヌクレオチド配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12を用いて、MG1655ΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS012-icd-TT02::KmゲノムDNAにおいて増幅した。ymfC-TT07F配列番号9この配列は以下の領域を有する。ymfC遺伝子の5’末端1194125~1194175と相同な領域大文字T7ファージ由来のT7Te転写ターミネーター配列に関する領域下線の大文字501924カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域太字の大文字上に組み立てた700mL実施容量の容器で連続培養物を増殖させた。各容器には、20g/lのグルコースおよび50mg/lのスペクチノマイシンを添加した200mlの合成培地MML11AG1_100を充填し、OD0.01~0.8の間まで植菌した。培養は0.2lpmで通気しながら37°Cで行い、撹拌初期:300rpm;最大:1200rpmおよび酸素供給0~40ml/分を制御することによって溶存酸素を30飽和より高く維持した。pHは塩基NH4OH7.5w/wおよびNaOH2.5w/wの混合物の添加によりpH6.8±0.1に調整した。発酵は、700g/lグルコース供給液を用い、不連続フェドバッチ式で行った表3を参照。培養培地中のグルコースが消費されたら、供給パルスによって20g/lのグルコース濃度に戻した。37°Cで増殖させた30世代の後、集団からサンプル採取し、グリセロール中、-80°Cで保存した40w/wの滅菌グリセロール溶液で希釈。その後、各集団をグリコール酸の生産について試験した。AG0662株およびその誘導集団30世代に用いる発酵条件は特許出願EP09155971.6およびEP09171297.6にすでに記載されている。温度誘導性株AG1385およびAG1413に用いる発酵プロセスを下の実施例4に記載する。AG0662、AG1385およびAG1413株およびそれらそれぞれの誘導集団±30世代のグリコール酸生産を表4に示す。表4で分かるように、AG0662株は、性能試験の前に30世代の間培養した場合のその株の性能が、試験前に培養していない場合よりもはるかに低いため、極めて不安定である。性能の損失は高いICD活性とも関係している表4。icd発現を向上させることができ、それによって細胞のICD活性を向上させることができる総ての突然変異は、増殖速度を高め、生産収率を低下させる。AG0662の集団は進化し組み換えて、より高いicd発現をもたらした。この集団におけるICD活性は母株よりも10倍高い50mUI/mgに代わって1045mUI/mg。その一方で、icd発現を駆動する温度誘導プロモーターを担持する両株AG1385およびAG1413の性能は、I試験前に30世代の間の増殖を行わないまたはIIその増殖を行うという2つの条件を比較した場合、性能試験における変化はほんのわずかでしかない。従って、グリコール酸生産株において温度誘導性icd遺伝子が存在することにより株安定性は向上する。イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性ICDは、実施例5に記載するプロトコールに従って、同じODで各株およびそれぞれの集団について測定した。グリコール酸生産を最大とするには、ICDの活性は低くすべきである;およそ50~100mUI/mg。実施例4温度誘導性株の発酵プロセス温度誘導性株に用いるプロトコールは、icd遺伝子の温度調節による特異的改変に関する特許EP09171297.6に記載されているpHの上昇プロトコールに基づく。AG1385およびAG1413株を用いて発酵を実現した。各株について、独立した前培養を、40g/lのMOPSおよび10g/lのグルコースを添加した55mlの合成培地MML8AG1_100を充填した500mlバッフル付エルレンマイヤーフラスコで、37°Cで2日間行ったOD7~10の間。20mLの各前培養物を用いて、発酵槽に植菌した。MultiforsMultipleFermentorSystem上に組み立てた700mL実施容量の容器で培養物を増殖させた。各容器には、20g/lのグルコースおよび50mg/lのスペクチノマイシンを添加した200mlの合成培地MML11AG1_100を充填し、OD約1に植菌した。培養は0.2lpmで通気しながら30°Cで行い、撹拌初期:300rpm;最大:1200rpmおよび酸素供給0~40ml/分を制御することによって溶存酸素を30飽和より高く維持した。pHは塩基NH4OH7.5w/wおよびNaOH2.5w/wの混合物の添加によりpH6.8±0.1に調整した。発酵は、700g/lグルコース供給液を用い、不連続フェドバッチ式で行った。培養培地中のグルコースが消費されたら、供給パルスによって20g/lのグルコース濃度に戻した。5回目の供給パルスグルコース消費100g/Lの後、pHを2時間かけて6.8から7.4へ調整し、培養終了まで一定に保った。これらの条件下で増殖させたAG1385およびAG1413株のグリコール酸生産を下の表5に示す。実施例5イソクエン酸デヒドロゲナーゼICD活性アッセイイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性をアッセイするために、Precellys6500rpmで1×30秒、BertinTechnologiesにより細胞25mgを溶解し、12000g4°Cで30分間遠心分離することにより細胞残渣を除去した。タンパク質濃度はBradford法により測定した。ICD活性は容量300μl、pH8.2および30°Cで測定した。アッセイ混合物には、50mMTris-HClpH8.2、50mMMgCl2、5mMNADP、0.5mMオキサレートおよび3~6μgの粗細胞抽出物を含めた。反応混合物を30°Cで10分間インキュベートした。次に、10mMのイソシトレートを加えて、反応を開始させた。NADPH形成による340nmでの吸光度ε=4.57μmol-1.mL.cm-1の変化を30°Cで30分間モニタリングした。参照文献"