"a可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とを得るのに充分な時間にわたって、72°C以下の温度、かつpH3.0~6.5の条件下で、iデンプン粒加水分解GSH活性を持つ酵素、及びii第2デンプン加水分解酵素により、コメ基質中のデンプンのうちの大部分を加水分解する工程、並びにb前記残渣画分から前記可溶性デンプン画分を分離して前記コメタンパク質濃縮物を得る工程、を含む、低温工程により製造された、コメタンパク質濃縮物を含有する食品であって、前記食品中のコメタンパク質濃縮物が湿潤ドウの形態であり、該湿潤ドウが、同量のダイズタンパク質から製造される湿潤ドウと比較して約45未満の水分を含有する、食品。前記食品が、栄養補助食品、又は栄養補助食品の成分である、請求項1に記載の食品。前記食品が、機能性食品、又は機能性食品の成分である、請求項1に記載の食品。前記食品が、動物用飼料添加剤、又は動物用飼料添加剤の成分である、請求項1に記載の食品。前記食品が食品添加物である、請求項1に記載の食品。a可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とを得るのに充分な時間にわたって、72°C以下の温度、かつpH3.0~6.5の条件下で、iデンプン粒加水分解GSH活性を持つ酵素、及びii第2デンプン加水分解酵素により、コメ基質中のデンプンのうちの大部分を加水分解する工程、並びにb前記残渣画分から前記可溶性デンプン画分を分離して前記コメタンパク質濃縮物を得る工程、を含む、請求項1に記載のコメタンパク質濃縮物を含む食品の製造方法。前記GSH活性を持つ酵素がグルコアミラーゼである、請求項6に記載の方法。前記グルコアミラーゼが、ヒュミコラHumicola株、リゾプスRhizopus株、又はアスペルギルスAspergillus株から得られたものである、請求項7に記載の方法。第2デンプン加水分解酵素がα-アミラーゼである、請求項6~8のいずれか一項に記載の方法。前記α-アミラーゼが細菌源から得られたものである、請求項9に記載の方法。前記GSH活性を持つ酵素が、トリコデルマTrichoderma株又はアスペルギルスAspergillus株における異種での発現により得られる、請求項6~10のいずれか一項に記載の方法。前記コメタンパク質濃縮物を精製する工程を更に含む、請求項6~11のいずれか一項に記載の方法。前記コメタンパク質濃縮物を乾燥させる工程を更に含む、請求項6~12のいずれか一項に記載の方法。前記コメタンパク質濃縮物のタンパク質含量が少なくとも20である、請求項6~13のいずれか一項に記載の方法。前記コメ基質がスラリー化され、かつ乾燥固形物含量が10~55である、請求項6~14のいずれか一項に記載の方法。前記温度が70°C~55°Cである、請求項6~15のいずれか一項に記載の方法。a工程bで得られる前記コメタンパク質濃縮物を、pH3.0~6.5かつ70°C~55°Cの温度下で、GSH活性を持つ酵素及びデンプン加水分解酵素を用い、酵素活性により加水分解して、可溶性デンプンと不溶性のコメタンパク質とを含む画分を得る工程、並びにb前記画分を分離して高純度のコメタンパク質濃縮物を得る工程を更に含む、請求項6~16のいずれか一項に記載の方法。a工程dで得られる前記高純度のコメタンパク質濃縮物を乾燥させる工程を更に含む、請求項17に記載の方法。工程cの前記デンプン加水分解酵素がα-アミラーゼである、請求項17又は18に記載の方法。前記高純度のコメタンパク質濃縮物のタンパク質含量が少なくとも60である、請求項17~19のいずれか一項に記載の方法。本開示は、LT工程により製造されるコメタンパク質濃縮物を提供する。このコメ濃縮物は、HT工程により調製されたコメ濃縮物と比較して有利な特性を有する。例えば、LT工程により、質感及び凝集性が改善されたコメタンパク質濃縮物が製造される。これらの有利な特性により、コメタンパク質濃縮物を含有する食品の調製工程を改善することが可能である。例えば、コメタンパク質濃縮物は、同量のダイズタンパク質から製造される湿潤ドウと比較して約45未満の水を含有する湿潤ドウ形態で、食品に添加することもできる。この特性は有利なことに、食品の貯蔵寿命を改善し、かつ質感をより口当たりの良いものにする。更に、LT工程により製造したコメタンパク質濃縮物は、有益な生理作用コレステロールを減少させ、乳酸脱水素酵素LDH活性を増加させ、血中尿素窒素BUNを減少させるも有する。したがって、コメタンパク質濃縮物を含有する食品、例えば、スナックバーを健康補助食品として使用することもできる。一態様では、低温工程により製造されたコメタンパク質濃縮物を含有する食品が提供される。低温工程は:a可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とを得るのに充分な時間にわたって、72°C以下の温度、かつpH3.0~6.5の条件下で、iデンプン粒加水分解GSH活性を持つ酵素、及びii第2デンプン加水分解酵素により、コメ基質に含まれるデンプンのうちの大部分を加水分解する工程、並びにb残渣画分から可溶性デンプン画分を分離してコメタンパク質濃縮物を得る工程、を含む。食品はコメタンパク質濃縮物を湿潤ドウの形態で含有する。食品は、飲料、栄養補助食品又栄養補助食品の成分、動物用飼料添加剤又は動物用飼料添加剤の成分、あるいはヒトによる食用に適している食品添加物であり得る。他の態様では、上記食品の製造方法が提供される。この方法は:a可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とを得るのに充分な時間にわたって、72°C以下の温度、かつpH3.0~6.5の条件下で、iデンプン粒加水分解GSH活性を持つ酵素、及びii第2デンプン加水分解酵素により、コメ基質に含まれるデンプンのうちの大部分を加水分解する工程、並びにb残渣画分から可溶性デンプン画分を分離してコメタンパク質濃縮物を得る工程、を含む。一実施形態では、GSH活性を持つ酵素はグルコアミラーゼであり、グルコアミラーゼは、ヒュミコラHumicola株、リゾプスRhizopus株、又はアスペルギルスAspergillus株から得られるものであり得る。あるいは、GSHEはαアミラーゼであり得る。同様に、第2デンプン加水分解酵素もGSHE、例えば、微生物由来のα-アミラーゼであり得る。しかしながら、第2デンプン加水分解酵素は、βアミラーゼ又はプルラナーゼなど、GSHE以外の酵素であってもよい。一部の実施形態では、GSHEは、トリコデルマTrichoderma株又はアスペルギルスAspergillus株での非相同な発現により得られる。上記の方法では、コメ基質は、10~55の乾燥固形物含量でスラリー化され得る。一部の実施形態では、上記工程の温度は70°C~55°Cであり得る。この方法は更に、下位区分bにおいて得られるコメタンパク質濃縮物を、pH3.0~6.5かつ70°C~55°Cの温度の条件下で、GSH活性を持つ酵素及びデンプン加水分解酵素を用い、酵素活性により加水分解して、可溶性デンプンと不溶性のコメタンパク質とを含む画分を得る工程、並びにd画分を分離して高純度のコメタンパク質濃縮物を得る工程、を含み得る。上記方法は更に、コメタンパク質濃縮物を精製する工程及び/又は乾燥する工程を含み得る。コメタンパク質濃縮物のタンパク質含量は少なくとも20であり、及び高純度のコメタンパク質濃縮物のタンパク質含量は少なくとも60である。低温下で調製されたコメタンパク質濃縮物は、機能性及び有益な生理作用コレステロール値の減少、乳酸脱水素酵素活性の増加、及び血中尿素窒素の減少などの点で改善されている。コメタンパク質濃縮物を使用することで、濃縮物を含有する食品処方の加工工程が改善された。有利なことに、食品の貯蔵寿命は延長され、口当たりの質感は良くなる。1.定義及び略記特に定義しない限り、本明細書で用いる技術的及び科学的用語は、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。この発明を実施するための形態に従い、以下の略記及び定義が適用される。1.1.定義用語コメは、イネ科Oryzasalivaとして分類される植物を指す。用語コメ基質は、全粒、破砕粒brokengrains、ライスグリッツ、及びコメ粉などのコメのすべての形態又は部分脱穀済み又は未脱穀を包含する。用語デンプンは、式C6H10O5n式中、nは任意の数であり得るの植物性多糖複合体を指す。用語デンプン粒は、糊化を起こしていない未調理生のデンプンを指す。用語糊化は、デンプン分子を可溶化させて粘稠な懸濁液を形成することを指す。用語コメタンパク質濃縮物は、コメタンパク質濃縮物を約10重量/重量超有するコメタンパク質画分を指す。パラメータを修飾する場合、約は、通常、パラメータの測定に関係してくる、実験誤差の程度を指す。用語高純度のコメタンパク質濃縮物は、コメタンパク質含量が少なくとも約60であるタンパク質画分を指す。この用語により包含されるコメタンパク質含量は、例えば、具体的には、少なくとも63、65、66、67、68、69、70、72、75、又は80以上である。用語タンパク質及びポリペプチドは互換的に使用される。用語変性温度は、タンパク質が自身の二次構造又は三次構造を失う温度を指す。用語等電点は、タンパク質又はタンパク質混合物が担持する電荷が正味0になるpHを指す。用語デキストロース当量DEは、D-グルコースとして乾燥重量ベースで算出された総還元糖の測定値である。加水分解されていないデンプン粒のDEは本質的に0であり、D-グルコースのDEは100である。用語総糖含量は、デンプン組成物中に存在する総糖含量を指す。用語乾燥固形分含量dsは、スラリーに含有される、固形分乾燥重量ベースの合計量を指す。用語スラリーは、不溶物を含む水性混合物を指す。ブリックス計は、所定の温度で溶液の糖含量を測定するための周知の比重計を指す。ブリックス計は、糖水溶液100gあたりに存在するショ糖のグラム数を測定する総可溶化糖含量。ブリックス測定は、比重計又は屈折計により頻繁になされる。用語デンプンの加水分解は、水分子の付加によるグリコシド結合の開裂を指す。語句デンプンの大部分は、デンプンの少なくとも80を意味する。用語重合度DPは、所定のサッカリン中に含まれるアンヒドログルコピラノース単位の数nを指す。例えば、グルコース及びフルクトースなどの単糖はDP1である。マルトース及びスクロースなどの二糖はDP2の例である。DP3は、重合度が3を超えるポリマーを意味する。本明細書で使用される用語デンプン粒加水分解酵素及びデンプン粒加水分解GSH活性を持つ酵素総じて、GSHEは、粒形態のデンプンの加水分解能を持つグルコアミラーゼ又はαアミラーゼを意味する。より一般的な用語デンプン加水分解酵素は、GSHE、又はデンプンを加水分解する他の酵素を指す。グルコアミラーゼ又はαアミラーゼ以外のデンプン加水分解酵素としては、限定するものではないが、プルラナーゼ、βアミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、及びβグルカナーゼが挙げられる。用語組み換えGSHE、組み換え発現させたGSHE及び組み換えにより製造したGSHEは、宿主細胞で、非相同的なポリヌクレオチドから産生された、成熟型のGSHEタンパク質配列を指す。記号rは、組み換えタンパク質を示すために使用することができる。例えば、トリコデルマリーゼイTrichodermareesei株で発現させたヒュミコラグリセアHumicolagrisea変種、サーモイデアthermoideaのGSHEは、rH-GSHEと記載される。用語ネイティブなGSHE及びnGSHEは宿主生物から得られたものであるGSHEを意味し、この場合、GSHEをコードしているポリヌクレオチドは、宿主生物に内在性のものである。用語アミラーゼは、デンプンの加水分解を触媒する酵素を指す。用語α-アミラーゼEC3.2.1.1は、α-1,4-グリコシド結合の加水分解を触媒する酵素を指す。これらの酵素は、1,4-D-グルコース単位を含有する多糖中の1,4-D-グリコシド結合のエキソ型又はエンド型加水分解に作用するものとしても報告されている。これらの酵素を記載するのに使用される他の用語はグリコゲナーゼである。例示的な酵素としては、α-1,4-グルカン4-グルカノヒドラーゼグルカノヒドラーゼalpha14glucan4glucanohydraseglucanohydrolaseが挙げられる。用語グルコアミラーゼは、酵素のうちアミログルコシダーゼのクラスEC.3.2.1.3,グルコアミラーゼ、α-1,4-D-グルカングルコヒドロラーゼのものを指す。これらはエキソ作用型の酵素であり、アミロース及びアミロペクチン分子の非還元末端からグルコシル残基を放出する。この酵素はまたα-1,6及びα-1,3結合を加水分解するが、α-1,4結合の場合と比較してその速度はかなり遅い。用語グリコシル化は、炭水化物部分の付加によるタンパク質の転写後修飾を指し、この炭水化物がN-結合又はO-結合のいずれかの結合をすることにより、糖タンパク質が生じる。糖タンパク質のN-結合炭水化物部分は、グリコシド結合によりアスパラギン残基のp-アミド窒素に結合する。O-結合型の糖は、セリン又はスレオニン残基のヒドロキシル基を介し、グリコシド結合によりタンパク質に結合する。シグナル配列は、タンパク質のN-末端部分に結合し、成熟型のタンパク質が細胞外に分泌されるのを促進するアミノ酸配列を指す。成熟型の細胞外タンパク質には、分泌プロセス時に切断されたシグナル配列は存在しない。遺伝子は、ポリペプチドの産生に関与するDNAセグメントを指し、コード領域の前及び後に続く領域、並びにそれぞれのコード配列エキソンの間に存在する介在配列イントロンを包含する。用語核酸は、DNA又はRNA、あるいはこれらの単鎖又は二本鎖及び化学的に修飾されたもののうちのいずれかを意味する。用語核酸及びポリヌクレオチドは、本明細において同義的に使用され得る。遺伝子暗号は縮重することから、特定のアミノ酸をコードするのに1つを超えるコドンを使用することができ、本発明は、特定のアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドを包含する。ベクターは、核酸を1つ以上の細胞型に導入するよう設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット及び同様物などが挙げられる。発現ベクターは、好適な宿主においてDNAを発現させるよう作用することのできる好適な制御配列に制御可能に連結させたDNA配列を含むDNAコンストラクトを意味する。このような制御配列には、転写プロモーター、転写を制御するための任意的なオペレータ配列、mRNAの部位に結合する好適なリボソームをコードしている配列、エンハンサー、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列が包含され得る。用語制御可能に連結させたは、要素が機能的に関連付けることができる配置にある近接を指す。例えば、配列の転写を制御する場合、プロモーターを、制御可能にコード配列に連結させることができる。用語選択マーカーは、宿主で発現することができ、かつ導入した核酸又はベクターを含有するこれらの宿主の選別を容易にさせる遺伝子を指す。選択マーカーの例としては、限定するものではないが、抗菌剤例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール、あるいは代謝優位性を付与する遺伝子、例えば宿主細胞に対する栄養上の優位性を付与する遺伝子が挙げられる。用語得られたものであるは、用語それに由来する、それから得られる若しくはそれから得ることができる、及びそれから単離されるを包含する。宿主株又は宿主細胞は、本発明に従うGSHEをコードしているポリヌクレオチドを含有する発現ベクター又はDNAコンストラクトに好適な、宿主を意味する。例えば、宿主細胞は、細胞及びトリコデルマTrichoderma種などの糸状菌の細胞から作製されたプロトプラストのいずれをも意味し得る。用語糸状菌は、限定するものではないが、真菌類Eumycotinaの下位分類のうち、限定するものではないがT.リーゼイT.reesei以前はT.ロンギブラキアタムT.longibrachiatumとして分類され、現在ではヒポクレアジェコリナHypocreajecorinaとしても既知である、T.ビリデT.viride、T.コニングリT.koningli、T.ハルジアナムT.harzianum;ペニシリウム種Penicilliumsp;ヒュミコラ種Humicolasp、例えば、ヒュミコラインソレンスHumicolainsolens及びヒュミコラグリセアHumicolagrisea;クリソスポリウム種Chrysosporiumsp、例えば、C.ラクノウエンスC.lucknowense;グリオクラジウム種Gliocladiumsp;アスペルギルス種Aspergillussp、例えば、A.オリゼA.oryzee、A.ニデュランスA.nidulans、A.ニガーAniger、及びA.アワモリAawamori;フザリウム種Fusariumsp、ニューロスポラ種Neurosporasp、ヒポクレア種Hypocreasp、及びエメリセラ種Emericellaspなどの、糸状形態の菌をすべて指す。用語接触させることは、各酵素を各コメ基質に充分な程度にごく近接しさせて配置することを指す。当業者は、酵素溶液を各コメ基質を混合することで効果的な接触が可能であることを認識するであろう。用語インキュベートするは、所定の時間にわたって所与の条件下でコメ基質を加水分解酵素と混合することを指す。用語酵素による変換は、コメ基質を修飾することで可溶性加水分解粒状コメデンプンを生成すること、及び好ましくはグルコースを生成することを指す。用語スラリーは、不溶性のデンプン粒を含有する水性混合物を指す。多くの場合、用語スラリー及び懸濁液は互換的に使用される。用語培養することは、液体又は固体培地で、好適な条件下で、微生物細胞集団を増殖させることを指す。一実施形態では、培養することは、典型的には容器又はリアクタ内で、デンプン粒基材を発酵させることによりグルコースシロップ又は他の所望の最終産物へと生物変換させることを指す。用語回収、単離、及び分離は、天然に関連付けられる少なくとも1種の成分からタンパク質、細胞、核酸、又はアミノ酸を取り出すことを指す。同様に、この用語は、可溶性デンプン加水分解産物を含む混合物を、実質的に不溶性のコメタンパク質からなる残渣から分離することを指す。細胞を参照する用語形質転換した、好適に形質転換した又はトランスジェニックは、細胞がそのゲノムの中にあるいは複数世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして非ネイティブすなわち、非相同な核酸配列を組み込まれたことを意味する。用語発現は、遺伝子の核酸配列に基づきポリペプチドが産生されるプロセスを指す。プロセスには転写及び翻訳の両方を包含する。核酸配列を細胞内に挿入する文脈において、用語導入されたintroducedは、形質移入、又は形質転換又は形質導入を意味する。この用語は、核酸配列を真核細胞又は原核細胞に組み込むことを包含し、核酸配列は細胞のゲノム例えば、染色体、プラスミド、樹脂、又はミトコンドリアDNAに組み込み、自己複製レプリコンに変換すること、又は一過性に発現させること例えば、mRNAの形質移入ができる。用語比活性は、特定の条件下で単位時間あたりに酵素調製物により産物へと変換される基質のモル数として定義される、酵素単位を意味する。比活性は、特に注記のない限り、単位/タンパク質mgとして表される。本明細書で使用するとき、酵素活性は、基質に対する酵素の作用を指す。用語デンプン粒加水分解酵素単位は、アッセイ条件下、例えば、50°CでpH4.5、あるいは25°CでpH5.0の条件下で、デンプン粒基質から1分あたり1mgのグルコースを産生するのに必要とされる酵素量として定義される。用語栄養補助食品は、ヒトの食事に欠けている、又は充分な量摂取されない栄養素を供給する食品を指す。用語機能性食品は、割増栄養価を提供する添加物を含む食品を指す。用語動物用飼料は、特にヒト以外の動物による消費を目的に設計された食品を指す。用語食品添加物は、貯蔵寿命を改善するために食品に添加される成分を指す。A、an、及びtheには、文脈中で明確に記載されない限り複数形も包含される。本明細書で使用するとき、用語含有するcomprising及びその関連語は、それらが包括するという感覚で使用され、すなわち用語包含するincluding及びその対応する同類語と等価である。1.2.略語別途記載のない限り以下の略号を使用する:2.コメタンパク質濃縮物を製造するための低温工程LT工程コメタンパク質濃縮物は、国際公開第2005/082155A2号に記載のLT工程を用い製造することができる。方法は、コメタンパク質を変性させる温度を下回る温度下かつコメ基質中のタンパク質の等電pH若しくは等電pH付近のpH条件下で、コメ基質を酵素により加水分解する工程を包含する。2つの画分、すなわち、1デンプン加水分解産物の可溶性デンプン画分、及び2不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分が得られる。可溶性デンプン画分は、残渣画分から分離することができ、コメタンパク質濃縮物は、残渣画分から得ることができる。一実施形態では、コメタンパク質濃縮物は、残渣画分を更に処置せずに得られる。他の実施形態では、残渣画分を加工して、画分中のコメタンパク質の割合重量を更に増加させることもできる一部の実施形態では、コメタンパク質濃縮物は、高純度のコメタンパク質濃縮物である。2.1.コメ基質本発明の工程に使用されるコメ基質は、任意の既知の資源から得ることができる。例えば、コメ基質は、コメ粉又は脱穀したコメ基質であり得る。コメ基質は、例えば、約6~10の総タンパク質N×5.95;Nは、ケルダール法により測定される総窒素量を表し、コメの場合の換算率が5.95である;約70~82の炭水化物;約9~12の水分;約0.4~1.5の粗脂肪;約0.6~0.8の灰及び約0.2~0.6の繊維を含有し得る。穀粒に見られるコメタンパク質は、水への可溶性が限定されている。これらのタンパク質は主に不溶性のアルカリ可溶性グルテン約80~90;塩溶性のグロブリン7~15;水溶性のアルブミン9~10;及びアルコール可溶性のプロラミン約2~5である。Houstonetal.1970CerealChem.47:5;Perdonetal.1978Phytochem.17:351;Landersetal.1994CerealChem.71:409~11を参照されたい。一部の実施形態では、コメ基質は、加工時に水に分散させる前に又はコメ基質を湿式粉砕する前に、所望の粒径へと製粉することができる。加工前に水を添加してスラリーを調製してもよい。スラリー中のコメ基質の乾燥固形物含量は、約10~約55、約20~約50、約25~約45、約20~約40、約20~約35、又は約30~35である。2.2.デンプン粒加水分解酵素GSHE本開示の方法に使用される少なくとも1種のデンプン加水分解酵素は、デンプン粒加水分解酵素GSHEである。GSHEは、グルコアミラーゼ活性又はαアミラーゼ活性を持つ。Tosietal.,1993Can.J.Microbiol.39:846~55;Kanlayakritetal.1987J.Ferment.Technol.65:379~85を参照されたい。GSHEは、天然に産生されたものであっても、組み換えにより産生されたものであってもよい。組み換えにより産生されたGSHEは、遺伝的に改変されていてもよい。天然に産生されるGSHEは、ヒュミコラHumicola種、アスペルギルスAspergillus種、ムコールMucor種、及びリゾプスRhizopus種などの真菌細胞から回収される。例えば、リゾプスオリザエRhizopusoryzae由来のGSHEがAshikarietal.1986Agric.Biol.Chem.50:957~64及び米国特許第4,863,864号に記載されている。ヒュミコラグリセアHumicolagriseaのGSHEがAllisonetal.1992Curr.Genet.21:225~29及び欧州特許第171218号に記載されている。アスペルギルスアワモリAspergillusawamoriの変種、カワチkawachiのGSHEがHayashidaetal.1989Agric.Biol.Chem.53:923~29に記載されている。アスペルギルスシロウサミAspergillusshirousamiのGSHEがShibuyaetal.1990Agric.Biol.Chem.54:1905~14に記載されている。GSHEは、ATCC16453、NorthernRegionalResearchLaboratoryNRRL15219、NRRL15220、NRRL15221、NRRL15222、NRRL15223、NRRL15224及びNRRL15225などの菌類並びに遺伝子改変されたこれらの菌株などから回収することもできる。欧州特許第171218号を参照されたい。一実施形態では、GSHEは、ヒュミコラグリセアHumicolagrisea株、特にヒュミコラグリセアHumicolagriseaの変種、サーモイデアthermoideaH-GSHE株から得ることができる。米国特許第4,618,579号を参照のこと。他の実施形態では、GSHEはアスペルギルスアワモリAspergillusawamori、特にA.アワモリA.awamoriの変種、カワチkawachiA-GSHEから得ることができる。Hayashidaetal.1989Agric.Biol.Chem.53:923~29を参照されたい。更なる実施形態では、GSHE酵素は、麹菌のR.ニビウスRniveus商品名CUCONCで市販などのリゾプスRhizopusから得ることができ、あるいは商品名GLUCZYMEで市販されている、リゾプスRhizopus由来の酵素である。2.2.1.αアミラーゼ一部の実施形態ではαアミラーゼが使用される。αアミラーゼは酵素委員会EC番号EC3.2.1.1を有する酵素である。一部の実施形態では、αアミラーゼは熱安定性の微生物由来のαアミラーゼである。好適なαアミラーゼとしては、天然に産生されるアミラーゼ、並びに組み換えにより産生されるαアミラーゼ及びαアミラーゼ変異体が挙げられる。αアミラーゼは、B.サブチリスBsubtilis、B.ステアロサーモフィルスBstearothermophilus、B.レンタスBlentus、B.リケニフォルミスBlicheniformis、B.コアギュランスBcoagulans、及びB.アミロリケファシエンスBamyloliquefaciensなどのバチルス種Bacillusから得られたものであり得る例えば、米国特許第5,763,385号;同第5,824,532号;同第5,958,739号;同第6,008,026号、及び同第6,361,809号を参照されたい。有用なアミラーゼを産生するバチルスBacillus株としては、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号AmericanTypeCultureCollectionAccessionNosATCC登録商標39709;ATCC11945;ATCC6598;ATCC6634;ATCC8480;ATCC9945Aの株が挙げられる。有用な市販のαアミラーゼとしては、SPEZYME商標AA;SPEZYME商標FRED;GZYME商標G997Genencor,aDaniscoA/Sdivision、TERMAMYL商標120-L、TERMAMYL商標LC、TERMAMYL商標SC、及びSUPRANovozymesが挙げられる。2.2.2.αアミラーゼ活性α-アミラーゼ単位AAUは、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5,958,739号に開示されている方法に従って測定されたα-アミラーゼ活性を指す。AAUの1単位は、特定の条件下で1分あたり10mgのデンプンを加水分解するのに必要とされる酵素の量を指す。α-アミラーゼ活性に関するアッセイは、化学的に保護された非還元末端糖を有する基質としてp-ニトロフェニルマルトヘプトシドPNP-G7を使用する。PNP-G7は、例えば、α-アミラーゼなどのエンドアミラーゼにより開裂することができる。開裂後に、α-グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼは基質を消化し、黄色味を呈しかつ可視分光測光法により410nmで測定することのできるPNP分子を遊離させる。PNPの放出速度はα-アミラーゼ活性に比例する。所定の試料のAAUを標準対照に対して算出する。2.2.3.グルコアミラーゼグルコアミラーゼEC3.2.1.3は、デンプンの非還元末端から連続したグルコース単位を除去する。この酵素は、デンプン、アミロース及びアミロペクチンの直鎖及び分枝状グリコシド結合のいずれをも加水分解することができる。グルコアミラーゼは、バクテリア、植物、及び真菌から得られるものであり得る。アスペルギルスAspergillus、リゾプスRhizopus、ヒュミコラHumicola、及びムコールMucor族の真菌から分泌されるグルコアミラーゼは、アスペルギルスニガーAspergillusniger、アスペルギルスアワモリAspergillusawamori、リゾプスニベウスRhizopusniveus、リゾプスオリザエRhizopusoryzae、ムコールミエヘMucormiehe、ヒュミコラグリセアHumicolagrisea、アスペルギルスシロウサミAspergillusshirousami、及びヒュミコラHumicolaサーモマイセスThermomycesラニギノサlaniginosaなどの真菌株から得られたものである例えば、Boeletal.1984EMBOJ.3:1097~1102;国際公開第92/00381号;同第00/04136号;Chenetal.1996Prot.Eng.9:499~505;Tayloretal.1978CarbohydrateRes.61:301~08;及びJensenetal.1988Can.J.Microbiol.34:218~23を参照されたい。グルコアミラーゼ活性を持つ市販の酵素は、例えば、アスペルギルスニガーAspergillusnigerGenencor,aDaniscoA/SのOPTIDEXL商標-400及びGZYME商標G9904X又はリゾプスRhizopus種CU.CONC商標、新日本化学日本;GLUCZYME商標、天野エンザイムAmanoPharmaceuticals日本から製造される。グルコアミラーゼは、トリコデルマTrichoderma宿主などの異なる宿主細胞で発現させることもできる。例えば、ヒュミコラグリセアHumicolagriseaの変種、サーモイデアthermoidea由来のヒュミコラHumicola-グルコアミラーゼH-GAを、米国特許第7,303,899号に記載のように、遺伝子組み換えによりトリコデルマTrichoderma宿主から発現させることもできる。一般的な発酵後、発酵ブロスを遠心処理し、バイオマスを分離することもできる。発現されたグルコアミラーゼを含有する透明な培養濾液は、応用研究で使用する前に、限外濾過を用いて濃縮することもできる。2.2.4.グルコアミラーゼ活性例えば、pH4.6、40°Cの条件下でのインキュベーション中に可溶性のデンプン基質の2重量/体積溶液から放出される還元糖を測定することで、グルコアミラーゼ活性を判定する。グルコアミラーゼ単位GUは、特定の条件下で、1時間あたりに可溶性のデンプンから1ミリグラムの還元糖をグルコースの形態で放出するのに必要とされる酵素の量として定義される。2.3.遺伝子組み換えを用いてのGSHEの製造GSHEは、遺伝子組み換えにより発現されたGSHErGSHEであってもよい。rGSHEとしては、ある種から得られる及び他の異なる種で発現された天然に生じるタンパク質が挙げられる。一部の実施形態では、天然に生じるタンパク質の配列を、遺伝子工学により改変することもできる。改変されたタンパク質配列は、例えば、天然に生じる配列と比較して比活性又は熱安定性が改善されるなどといった有利な特性を有し得る。rGSHE配列が改変される程度は変化し得る。例えば、rGSHEは、同一の種から天然に生じるGSHE配列と少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、93、95、97、98、又は99同一性を有し得る。rGSHEは、GSHEが得られた株とは異なる宿主真菌株で発現させることもできる。一部の実施形態では、真菌株はアスペルギルスAspergillus種、トリコデルマTrichoderma種、フザリウムFusarium種、又はペニシリウムPenicillium種などの糸状真菌株である。真菌宿主としては、A.ニデュランスA.nidulans、AアワモリAawamori、A.オリゼAoryzee、A.アキュレアタスA.aculeatus、A.ニガーAniger、A.ジャポニクスAjaponicus、T.リーゼイTreesei、T.ビリデT.viride、F.オキシスポラムF.oxysporum、及びF.ソラニF.solaniが挙げられる。アスペルギルスAspergillus株は、Wardetal.1993Appl.Microbiol.Biotechnol.39:738~43及びGoedegebuuretal.2002Curr.Gene41:89~98に記載されている。例えば、好適なT.リーゼイTreesei株としては、ATCC13631、ATCC26921、ATCC56764、ATCC56765、ATCC56767及びNRRL15709が挙げられる。一部の実施形態では、宿主株は、Sheir-Neissetal.1984Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46~53に記載のRL-P37誘導体であり得る。GSHEを発現する宿主株は、遺伝子工学により予め操作することもできる。一部の実施形態では、真菌宿主の様々な遺伝子を不活性化させることができる。これらの遺伝子はセルロース分解性酵素、例えばエンドグルカナーゼKG及びエキソセロビオヒドラーゼCBHなど例えば、cbh1、cbh2、egl1及びegl3をコードし得る。米国特許第5,650,322号は、cbh1遺伝子及びcbh2遺伝子に欠失を有するRL-P37の誘導体株を開示する。2.4.ベクター及び真菌の形質転換GSHEをコードしている非相同的なポリヌクレオチドは、ベクター、特にGSHEコード配列に制御可能に連結された制御配列を含む発現ベクターを用い、真菌宿主細胞に導入することもできる。ベクターは、真菌宿主細胞に導入する際に、宿主細胞の複製可能なゲノムに組み込むことのできる任意のベクターであり得る。FungalGeneticsStockCenterCatalogueofStrainsインターネットでは>>www.FGESC.net<<は好適なベクターを掲載する。更なる例としては、好適な発現及び/又は組み込みベクターは、VandenHondeletal.1991MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI、Bennettetal.,eds.,AcademicPress,pp.396~428及び米国特許第5,874,276号に見出すことができる。例示的なベクターとしては、pFB6、pBR322、PUC18、pUC100、及びpENTR/Dが挙げられる。GSHEをコードしている核酸は、真菌宿主細胞で転写活性を示す好適なプロモーターに、制御可能に連結させることができる。プロモーターは、宿主細胞にとって相同的な又は非相同なタンパク質をコードしている遺伝子から得られるものであり得る。例えば、トリコデルマTrichoderma宿主で有用なプロモーターとしては、cbh1、cbh2、egl1、及びegl2が挙げられる。一実施形態では、プロモーターは、宿主細胞にとってネイティブなものであり得る。例えば、トリコデルマリーゼイTreeseiが宿主である場合、プロモーターは、例えば、受入番号D86235でGenBankに登録されている誘導型プロモーター、cbh1などの、トリコデルマリーゼイTreeseiのネイティブなプロモーターであり得る。誘導型プロモーターは、環境による制御又は発生による制御下で活性なプロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは真菌宿主細胞にとって異種性のものである。他の有用なプロモーターの例としては、A.アワモリAawamori及びA.ニガーAnigerのグルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。Nunbergetal.1984Mol.CellBiol.4:2306~15及びBoeletal.1984EMBOJ.3:1581~85を参照されたい。同様に、T.リーゼイTreeseiのxin1遺伝子及びセロビオヒドロラーゼ遺伝子のプロモーターも利用できる。欧州特許第137280A1号を参照されたい。GSHEコード配列はシグナル配列に制御可能なように連結させることもできる。シグナル配列をコードしているDNAは、発現させるGSHE遺伝子と、もともと関係づけられているものであり得る。例えば、シグナル配列は、ヒュミコラグリセアHumicolagrisea又はアスペルギルスアワモリAspergillusawamoriのGSHE遺伝子によりコードされているものであり得る。シグナル配列及びプロモーター配列は、同じ源から得られるものであり得る。例えば、シグナル配列は制御可能にcdh1プロモーターに連結しているcdh1シグナル配列であり得る。発現ベクターは典型的には終結配列を含有する。終結配列及びプロモーター配列は、同じ源から得られるものであり得る。一部の実施形態では、終結配列は宿主細胞にとって同属のものであり得る。T.リーゼイTreeseiなどのトリコデルマTrichoderma株から得られるcbh1が好適な終結配列であり得る。他の有用な真菌ターミネーターとしては、A.ニガーAniger又はA.アワモリAawamoriのグルコアミラーゼ遺伝子から得られるものが挙げられる。Nunbergetal.1984,上掲及びBoeletal.1984,上掲を参照されたい。発現ベクターは典型的には選択マーカーを含有する。選択マーカーの例としては、抗菌性耐性例えば、ハイグロマイシン及びフレオマイシンを付与することが挙げられる。amdS、argB及びpyr4マーカーなどの栄養要求性の選択マーカーを使用することもできる。トリコデルマTrichodermaの形質転換用のベクター系に有用なマーカーは、例えば、BIOTECHNOLOGYOFFILAMENTOUSFUNGI,Finkelsteinetal.,eds.,Butterworth-Heinemann,Boston,MA1992,Chap.6;及びAPPLIEDMOLECULARGENETICSOFFILAMENTOUSFUNGI,Kinghornetal.,eds.,BlackieAcademicandProfessional,ChapmanandHall,London1992に記載される。例えば、選択マーカーは、アセトアミダーゼ酵素をコードするamdS遺伝子であり得る。amdSマーカーを用い形質転換させた細胞は、アセトアミドを窒素源として増殖させることができる。Kelleyetal.1985EMBOJ.4:475~79;及びPenttilaetal.1987Gene61:155~64を参照されたい。GSHEをコードしているポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、所定の真菌宿主生物中で自己複製することのできる、あるいは宿主DNA中に組み込むことのできるベクターであり得る。一実施形態では、発現ベクターはプラスミドである。一実施形態では、発現ベクターは、プロモーター、GSHEコード領域、及びターミネーターのすべてが、発現させる遺伝子に由来するDNA配列を含む。それ自体の転写及び翻訳制御配列の制御下で発現されるドメインは残しつつ、望ましくない例えば、不要なドメインをコードしているDNA配列を欠失させることもできる。他の実施形態では、発現ベクターは、予め構築し、高頻度の転写に必要とされる配列及び選択マーカを含有させることもできる。GSHE遺伝子又はその一部に関するコード領域は、発現コンストラクトプロモーター配列及びターミネーター配列の転写制御下にあるようこの汎用発現ベクターに挿入することができる。例えば、発現させた配列は、強力なcbh1プロモーターの下流に挿入される。GSHE、プロモーター、ターミネーター、及び他の配列をコードしているポリヌクレオチドを含有するベクターを連結させ、かつそれらを好適なベクターに挿入させるのに使用される方法は当該技術分野において周知である。連結は、概して一般的な制限部位でライゲーションさせることで実行できる。このような部位が存在しない場合、従来法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター、リンカー又はPCRプライマーを使用する。MOLECULARCLONING,Sambrooketal.,eds.ColdSpringHarbor1989,及びMOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI,Bennettetal.,eds.,AcademicPress,SanDiego1991pp70~76を参照されたい。不活性化された遺伝子を1つ以上有する真菌宿主細胞を得るにあたり既知の方法を使用することができる。米国特許第5,246,853号;米国特許第5,475,101号;及び国際公開第92/06209号を参照されたい。遺伝子の不活性化は、完全な又は部分的な欠失、挿入による不活性化、あるいは意図される目的に関し遺伝子を機能しないものにする任意の他の手段により実行できるすなわち、遺伝子は、機能性タンパク質の発現を阻害される。トリコデルマTrichoderma種又はクローン化された他の糸状性真菌宿主から任意の遺伝子を欠失させることができる。例としては、cbh1、cbh2、egl1及びegl2が挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子の欠失は、不活性化させる所望される形態の遺伝子を既知の方法により挿入することで得られる。次に、所望の遺伝子をコードしている領域の内部にある適切な制限酵素認識部位一箇所又は複数ヶ所で欠失プラスミドを切断し、遺伝子コード配列又はその部分を選択マーカーで置換する。マーカー遺伝子のいずれかの側に残したまま、遺伝子座から隣接するDNA配列を好ましくは約0.5~2.0kb欠失させる。適切な欠失プラスミドは、概してプラスミド中に固有の制限部位が存在するものであり、これにより、隣接するDNA配列を含む遺伝子を配列断片から欠失させ、かつ単鎖線状遺伝子として除去されることになる選択マーカー遺伝子を配列断片に含有させることができる。DNAコンストラクト又はベクターを宿主細胞に導入する技術は周知であり、例えば、形質転換、電気穿孔法、核マイクロインジェクション、形質導入、リポフェクション法を用いる形質移入、DEAE-デキストリンを用いる形質移入、リン酸カルシウム共沈殿法、DNAをコーティングした微粒子を用いる高速微粒子銃、及びとりわけプロトプラストの融合などが挙げられる。一般的な形質転換法は、MOLECULARCLONING,Sambrooketal.,eds.ColdSpringHarbor1989及び他の文献に教示される。糸状菌の形質転換法は、特にCampbelletal.1989Curr.Genet.16:53~56に開示される。異種のタンパク質をトリコデルマTrichodermaで発現させる方法は、米国特許第6,022,725号;同第6,268,328号;Harkkietal.1991EnzymeMicrob.Technol.13:227~233;Harkkietal.1989BioTechnol.7:596~603;欧州特許第244234号;及び同第215594号に開示される。同様に、Nevalainenetal.,TheMolecularBiologyofTrichodermaanditsApplicationtotheExpressionofBothHomologousandHeterologousGenes,inMOLECULARINDUSTRIALMYCOLOGY,Leongetal.eds.,MarcelDekker,Inc.,NY,pp.129~148,1992も参照される。同様に、Caoetal.2000ProteinSci.9:991~1001fortransformationofAspergillusstrainsも参照される。遺伝子的に安定な形質転換はベクター系により構築され、GSHEをコードしている核を宿主株の染色体に安定的に組み込むことができる。次に形質転換体を既知の手法により精製することができる。1つの非限定的な例では、amdSマーカーを含有する安定的な形質転換体は、アセトアミドを含有する固体培養培地上で、そのより迅速な増殖速度、及びぎざぎざしていないより滑らかな円形コロニーの形成により、不安定な形質転換体から識別される。一部の場合では、非選別型例えば、アセトアミドを含まないの固体培地で形質転換体を増殖させ、この培養培地から胞子を回収し、これらの胞子が続いて出芽しかつアセトアミドを含有する選択培地で増殖する割合を判定することで、安定性を更に試験する場合がある。当該技術分野において既知の他の方法を使用して形質転換体を選別することもできる。一実施形態では、形質転換用のトリコデルマ種Trichodermaspの調製には、真菌糸状態由来のプロトプラストの調製が包含される。Campbelletal.1989Curr.Genet.16:53~56を参照されたい。菌糸は、出芽させた栄養胞子から得ることができる。この場合、細胞壁を消化する酵素により菌糸を処理することで、プロトプラストが得られる。次に、懸濁培地に浸透圧安定剤を存在させることでプロトプラストを保護できる。好適な安定剤としては、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム及び同様物が挙げられる。通常、懸濁溶媒中のこれらの安定剤の濃度は0.8M~1.2Mの間で変化し、例えば、ソルビトールの場合1.2Mなどである。宿主トリコデルマ種Trichodermasp株へのDNA取り込みはカルシウムイオン濃度に依存する。概して、約10mMのCaCl2~50mMのCaCl2が取り込み用溶液に使用される。取り込み用溶液中の他の成分としては、例えば、TE緩衝液10mMTrispH7.4;1mMEDTA又は10mMMOPSモルホリノプロパンスルホン酸pH6.0、及びポリエチレングリコールPEGなどの緩衝系が挙げられる。ポリエチレングリコールが細胞膜と融合するよう機能し、したがって、培地の内容物をトリコデルマ種Trichodermasp株の細胞質へと透過させ送達することで、プラスミドDNAが核に移行されるものと考えられる。この融合は、宿主の染色体に組み込まれたプラスミドDNAの複数のコピーを高頻度に残すことになる。通常、トリコデルマ種Trichodermaspのプロトプラスト又は透過処理を施した細胞を密度105~107/mLで含有する懸濁液が形質転換に使用される。適切な溶液例えば、1.2Mのソルビトール;50mMのCaCl2中の、これらのプロトプラスト又は細胞100μLを、所望のDNAと混合する。概して、高濃度のPEGを取り込み用溶液に加えることができる。0.1~1倍量の25のPEG4000、例えば、0.25倍量の25のPEG4000をプロトプラスト懸濁液に添加することができる。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、及び塩化カリウムなどの添加剤も形質転換時に取り込み用溶液及び助剤に加えることができる。同様の手順が他の真菌宿主細胞についても利用可能である。例えば、米国特許第6,022,725号及び同第6,268,328号を参照されたい。次いで10~30分にわたって混合物をおよそ0°Cでインキュベートすることができる。追加のPEGを混合物に添加して、所望の遺伝子又はDNA配列の取り込みを更に高めることもできる。概して、形質転換混合物の5~15倍の体積の25のPEG4000を加えることができるが、しかしながら、これよりも多量及び少量に添加することが好適である場合もある。25のPEG4000は、形質転換混合物の約10倍の体積である。PEGを加えた後、次に、形質転換混合物を室温下又は氷上のいずれかでインキュベートした後にソルビトール及びCaCl2溶液を加えることができる。次に、プロトプラスト懸濁液を、増殖培地の溶解アリコートmoltenaliquotsに更に加えることができる。この増殖培地は、形質転換体のみを増殖させるものである。当業者であれば、同様の手順及び手法を使用して宿主細胞を形質転換させ、次に、宿主細胞で、異種由来の他の酵素、例えばデンプン加水分解酵素を発現させることができることを充分認識するであろう。2.5.細胞培養適切な宿主細胞は、概して、Pourquieetal.,BIOCHEMISTRYANDGENETICSOFCELLULOSEDEGRADATION,Aubertetal.,eds.,AcademicPress,pp.71~861988andIlmenetal.1997Appl.Environ.Microbiol.63:1298~1306に記載されるものなどの、生理塩及び栄養分を含有する標準培地で培養される。一般的に市販されている調製培地としては、酵素用麦芽エキスYMブロス、ルリアベルターニLBブロス、及びサブローデキストロースSDブロスが挙げられる。培養条件も同様に標準的なものである。例えば、所望される程度にまでGSHEが発現されるまでの間、培養物を振盪培養器又は発酵槽で適切な培地でおよそ28°Cにてインキュベートすることができる。糸状菌に好適な培養条件は、科学文献に記載され、又はAmericanTypeCultureCollectionandFungalGeneticsStockCenterインターネット:>>http://www.FGSC.net<<から利用することができる。真菌の増殖が確立されたら、デンプン加水分解酵素、特に本明細書で定義されるようなGSHEを発現させるのに、又は発現を可能にさせるのに有効な条件に細胞を暴露させる。GSHEをコードしている配列が、誘導型プロモーターの制御下にある場合、GSHEの発現を誘導するのに有効な濃度の誘導剤、例えば、糖、金属塩又は抗菌剤を培地に添加することができる。2.6.GSHE活性の確認GSHEアッセイは、デンプン加水分解酵素をコードしている異種性のポリヌクレオチドで形質転換させた細胞株によりデンプン加水分解酵素の発現を評価することができる。GSHEアッセイは、タンパク質レベル、RNAレベル、あるいは特にグルコアミラーゼ活性及び/又は産生に対する機能的なバイオアッセイの使用により実施することができる。GSHEの発現を解析するにあたり一般的に選択される例示的なアッセイとしては:ノザンブロット、ドットブロットDNA又はRNA解析、RT-PCR逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、適切に標識されたプローブを用いるインサイツハイブリダイゼーション、及びサザンブロットが挙げられる。GSHEの産生及び/又は発現に関しては、例えば、培養培地中のグルコースなどの糖の還元を直接測定するアッセイにより、及びグルコアミラーゼ活性、発現、及び/又は産生の測定に関するアッセイにより、試料を直接的に測定することができる。GSHE活性のアッセイに好適な基質としては、デンプン粒基質が挙げられる。例えば、グルコース濃度は、グルコース試薬キット番号15-UVSigmaChemicalCo.又はTechniconAutoanalyzerSaskatchewan,Canadaなどの装置を用いる任意の従来法により判定することができる。好適なグルコースオキシダーゼキット及びグルコースヘキソースキットはInstrumentationLaboratoryLexington,MAから市販されている。グルコアミラーゼ活性は、3,5ジニトロサリチル酸DNS法により測定されうる。Gotoetal.1994Biosci.Biotechnol.Biochem.58:49~54を参照されたい。1つの非限定的な例では、rGSHEは、15の固体デンプン水分散体中のデンプン粒の、固形分含量のうち少なくとも90重量、95重量、及び97重量をグルコースへと加水分解する。加えて、タンパク質の発現は、細胞若しくは組織切片の免疫組織化学染色的な染色、又は組織培養培地の例えば、ウェスタンブロット又はELISAによるイムノアッセイなどの、免疫学的な手法により評価することができる。このような免疫アッセイを使用して、GSHEの発現について質的及び量的評価をすることができる。このような手法の詳細は当業者に既知であり、このような手法の実施に関する多くの試薬は市販されている。GSHEは、トリコデルマTrichoderma宿主の組み換え体により、培養培地1Lあたりタンパク質1グラムg/L以上で発現させることができる。トリコデルマTrichoderma宿主組み換え体により発現されたGSHEの量は、培養培地1Lあたり、2g、5g、10g、20g、25g、30g、又は50gを超え得る。2.7.GSHE活性の精製及び/又は単離概して、細胞培養で産生されたデンプン加水分解酵素例えば、nGSHE又はrGSHEは培地に分泌され、かつ例えば、細胞培養培地から不要な成分を除去することで単離することができる。一部の場合では、GSHEは、細胞可溶化物から回収する必要がある細胞型形態cellularformで産生され得る。酵素は、当業者により慣習的に使用される技術を用い、それを産生した細胞から精製することができる。例としては、限定するものではないが、アフィニティクロマトグラフィー法Tilbeurghetal.1984FEBSLett.16:215;イオン交換クロマトグラフィー法Goyaletal.1991Biores.Technol.36:37;Fliessetal.1983Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17:314;Bhikhabhaietal.1984J.Appl.Biochem.6:336;andEllouzetal.1987Chromatography396:307-例えば、分離能の高い物質を用いるイオン交換法が挙げられるMedveetal.1998J.ChromatographyA808:153;hydrophobicinteractionchromatographyTomazetal.1999J.ChromatographyA865:123;two-phasepartitioningBrumbaueretal.1999Bioseparation7:287-;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEでのクロマトグラフィー;等電点電気泳動法;SDS-PAGE;硫安沈殿;及び例えば、SephadexG-75を用いるゲル濾過が挙げられる。3.LT工程条件LT工程では、コメ基質を好ましくはスラリー形態で含む組成物を、少なくとも1種のGSHEと接触させ又はインキュベートすることで、デンプン粒を加水分解することができる。GSHEは、細胞を含まない抽出物例えば、培養培地からのGSHE単離物に供給され、あるいはGSHEを発現し分泌する真菌細胞を含有する培養培地例えば、発酵ブロスに供給される。1種以上のGSHEをLT工程に使用できる。2種以上のGHSEが使用される場合、それらはグルコアミラーゼ及びαアミラーゼと組み合わせることができ、あるいはそれらは複数の異なるグルコアミラーゼ又は複数の異なるαアミラーゼである。1種以上のα-アミラーゼを1種以上のグルコアミラーゼと共に加える場合、αアミラーゼ単位AAU対グルコアミラーゼ単位GU比は15:1~1:15の範囲である。一部の実施形態では、比の範囲は10:1~1:10;5:1~1:5;4:1~1:4;約2:1~1:4;又は約2:1~1:2であり得る。一部の実施形態では、グルコアミラーゼは、αアミラーゼと同時にコメ基質に加えられる。他の実施形態では、グルコアミラーゼ及びαアミラーゼは連続的に加えることもできる。この場合、GSHEは互いに約1~60分以内に、又は約1~30分以内に添加することができる。デンプン加水分解酵素は、GSHEと共に使用することができる。デンプン加水分解酵素はGSHEであり得る。デンプン加水分解酵素がGSHE以外の酵素である場合、この酵素は、デンプンの加水分解を触媒させるにあたり当業者に周知の濃度及び条件で使用される。GSHEに加えて、デンプン加水分解酵素としては、限定するものではないが、プルラナーゼ、βアミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、及びβ-グルカナーゼが挙げられる。グルコアミラーゼは、乾燥固形分を10~55に調整することができるコメ基質を含有する組成物に、スラリーの約0.001~15.0GU/gdsで添加することができる。他の実施形態では、グルコアミラーゼは、約0.01~10.0GU/gds、約0.01~5.0GU/gds、約0.01~2.0GU/gds、約0.01~1.5GU/gds、約0.05~1.5GU/gds、又は約0.1~1.0GU/gdsの量で添加することができる。一般的に、α-アミラーゼは、コメ基質を含有する組成物に、αアミラーゼの比活性に依存して、コメ基質メートルトンMTあたり約0.001~5.0kgの量で添加することができる。一部の実施形態では、α-アミラーゼは、約0.01~5.0kg/MT;約0.05~4.0kg/MT;約0.1~2.5kg/MT;又は約0.5~1.5kg/MTの量で添加することができる。例えば、約0.01~1.5kgのGZYMEG997又はSPEZYMEFREDGenencor,aDaniscoA/Sdivisionを1メートルトンのデンプンに添加することができる。他の実施形態では、GZYMEG997又はSPEZYMEFREDを約0.05~1.0kg/MT;約0.1~0.6kg/MT;約0.2~0.6kg/MT;又は約0.4~0.6kg/MTの量で添加することができる。コメ基質及び加水分解酵素を含有する混合物を、コメ基質を含むタンパク質の変性温度以下の温度でインキュベートすることができる。一部の実施形態では、この温度は約72°C、70°C、68°C、65°C、63°C、60°C、58°C、55°C、50°C、45°C、又は40°C未満であるが、但し10°C未満ではない。他の実施形態では、工程は約70°C~50°Cの温度で実施され得る。更なる実施形態では、工程は約70°C~55°Cの温度、及び同様に約65°C~55°Cの温度で実施することができる。混合物は、約pH3.0~pH6.5;約pH3.0~pH6.0;約pH3.0~pH5.5;約pH3.5~pH5.0;約pH3.0~pH4.0;約pH4.5~6.5;又は約pH5.0~6.0の範囲のpHでインキュベートすることもできる。上記の温度及びpHでインキュベートする場合、混合物は、例えば、約2~100時間、約10~100時間、約5~50時間、又は約10~24時間にわたってインキュベートすることができる。一部の実施形態では、コメ基質の乾燥固形分のうちの少なくとも60、65、70、75、80、85、90、94、95、96、97、98、又は99が可溶性のデンプン加水分解産物に変換される。一部の実施形態では、コメ基質の乾燥固形分は完全に可溶化される。この工程の総可溶化乾燥固形物のパーセントとしてのグルコース収率は、少なくとも約90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99、又は99.5であり得る。コメ基質の少なくとも80、85及び90のデンプン粒を、24時間で可溶化及び加水分解することができる。他の実施形態では、コメ基質の少なくとも95のデンプン粒を、24時間で可溶化及び加水分解することができる。更に他の実施形態では、コメ基質の少なくとも98のデンプン粒を、24時間で可溶化及び加水分解することができる。コメ基質に対する酵素反応を終了させるためには、インキュベートされるスラリーのpHは、pH約3.0~4.0に低下され得る。充分なインキュベーション時間の経過後、インキュベートしたスラリーから、実質的に不溶性のコメタンパク質濃縮物を含有する残渣は残して、可溶化されたコメデンプン加水分解産物を含有する画分を分離することができる。当業者であれは分離をなすための方法を充分承知しているであろう。一般的に、これらの分離法のうち一部のものとしては、遠心分離;一般的な濾過法及び膜分離法が挙げられる。3.1.コメタンパク質濃縮物コメ基質に含まれるデンプンの大部分を加水分解することにより、可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とが生じる。可溶性デンプン画分は、コメタンパク質濃縮物と呼ばれ、残渣画分から分離することができる。例えば、コメタンパク質濃縮物は、水に懸濁し、フィルターを通すことで更に精製することができる。コメタンパク質濃縮物中のタンパク質のパーセントは10、20、30、40、又は50を超える。一部の実施形態では、コメタンパク質濃縮物のタンパク質含量は約10~60;約10~50,約20~45、又は約30~40の範囲である。上記のようにして得られたコメタンパク質濃縮物を、更にGSHE及びデンプン加水分解酵素と共に、上記温度及びpHで一定時間インキュベートし、残りの粒状の又は不溶性のデンプンを加水分解することによって、高純度のコメタンパク質濃縮物を得ることもできる。前述同様に、2つの画分、すなわち、可溶性コメタンパク質と不溶性コメタンパク質が得られる。これらの画分を分離することで高純度のコメタンパク質濃縮物を得ることができる。残留物に残っているデンプンの酵素加水分解は、約55°C~60°Cの温度でpHを例えば、pH5.5から、pH3.0~4.0の範囲のpHに下げることで終了させることができる。次に、可溶性のコメデンプン加水分解産物を上記残渣から分離することで高純度のコメタンパク質濃縮物が得られる。最初の加水分解反応に使用したものと同じデンプン加水分解酵素を使用することができ、又はGSHEとデンプン加水分解酵素の異なる組み合わせを使用することもできる。高純度のコメタンパク質濃縮物のタンパク質含量N×5.95は、概して60、63、65、68、70、及び75を超える。一部の実施形態では、高純度のコメタンパク質濃縮物は、約65以上、及び同様に約70以上のタンパク質含量を有する。この工程に従って得られたコメタンパク質濃縮物又は高純度のコメタンパク質濃縮物は、従来の及び周知の技術、例えば、真空乾燥法、スプレー乾燥法、及び凍結乾燥法などを用い乾燥させてもよい。一部の実施形態では、本発明に従って得られるコメタンパク質濃縮物の水分含量は、約10、9、8、7、6、5、4、3、及び2未満である。一部の実施形態では、得られた高純度のタンパク質濃縮物は、水分含量が6、5、4、3、及び更には2になるように乾燥させることもできる。一部の実施形態では、水分含量は約2~5である。3.2.コメタンパク質濃縮物の特性コメタンパク質濃縮物又は高純度のコメタンパク質濃縮物は、ダイズタンパク質濃縮物と比較して、特定のアミノ酸の含量が相対的に高い。例えば、本発明の手順に従って得られたコメタンパク質濃縮物の方が、グルタミン酸、バリン、ロイシン、プロリン、メチオニン、アルギニン、アスパラギン酸、又はアラニンの量が多い。更に、本明細書に記載の方法に従って得られたタンパク質濃縮物及び高純度のタンパク質濃縮物は、従来の高温処理を用いるデンプン加工法により得られるタンパク質画分よりも特性が改善されている。例えば、タンパク質濃縮物及び高純度のタンパク質濃縮物は、従来のHT工程により得られるタンパク質と比較して、アルカリ性のpHで、特にpHレベル10.0でより大きな溶解性を有するタンパク質を含む。一部の実施形態では、本発明のコメタンパク質濃縮物のタンパク質溶解度は、pH10の条件下では少なくとも20、少なくとも40、又は少なくとも50である。更なる実施形態では、タンパク質濃縮物及び高純度のタンパク質濃縮物には、HT工程で製造されたタンパク質濃縮物と比較して、酸性pH条件下で、特にpH2.0の条件下で、より良好な溶解度を有するタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、pH2.0の条件下での溶解度は少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、又は少なくとも30である。3.3.コメタンパク質濃縮物を含有する食品コメタンパク質濃縮物を食品に使用することができる。この態様では、コメタンパク質濃縮物は他の食品成分、調味料、安定剤、保存料、及びこれに類するものなどと共に使用することができる。まず始めに、コメタンパク質濃縮物を、水又は他の好適な溶媒に分散させて湿潤ドウを形成した後に他の食品成分と混合する。この目的に関し、湿潤ドウは、分塊圧延及び/又は押し出し加工並びに更なる加工に好適なものになるよう、水又は他の好適な溶媒に充分に分散したドウである。コメ濃縮物から形成される湿潤ドウは、ダイズタンパク質から湿潤ドウを製造するのに必要とされる量よりも45重量少ない水又は他の好適な溶媒を含有し得る。本文脈において、約は45重量から値がある程度変動することを予測するものであり、この変動は、測定法及び相対湿度などに関連付けられる標準誤差に由来するものである。したがって、この約表記により、一般的に、ダイズタンパク質の湿潤ドウよりも40~50重量少ない水を有するドウを包含する。約45少ないにより、ダイズ湿潤ドウと比較して相対含水量が例えば40、35、30少ないことを意味するが、但しこれはコメタンパク質湿潤ドウが分塊圧延及び/又は押し出し加工並びに更なる加工に尚も好適である場合に限る。コメタンパク質濃縮物は食品添加物であってもよい。このような実施形態の一つでは、コメタンパク質濃縮物は、機能性食品、例えば、栄養補給用のバー又は菓子に、添加物として更なる栄養価を提供し得る。コメタンパク質濃縮物は、栄養補助食品又は栄養補助食品の成分として使用することもできる。例えば、コメタンパク質濃縮物を食品に添加して、食事でのタンパク質摂取を補給させることもできる。コメタンパク質濃縮物の使用法についての非限定例としては、ヌガー型のバーセンター、又はカラメルセンターの成分、又は他の同様の高粘性のバーセンターが挙げられる。コメタンパク質濃縮物は、ヒト以外の動物への用途が意図される動物用飼料に添加することもできる。コメタンパク質濃縮物は動物用飼料に成分として添加することもでき、動物用飼料において実質的なタンパク質源とすることもできる。本開示の主題は、以降の実施例に更に詳細に記載される。引用するすべての参照は、参照することで、その内容をすべて明確に本明細書に組み込む。以降の例は説明のため提供されるが、請求される本発明を限定するものではない。実施例1国際公開第2005/082155A2号に記載の方法を用い、LT工程によりコメタンパク質濃縮物を製造した。本実験では、穏やかに撹拌しながら、10kgの胚芽米を40kgの水に一晩付け、その後95超が30メッシュスクリーンを通過する程度に精米することでスラリーを調製した。スラリーのpHは5.5に調節した。2種のGSHEを使用して、デンプンの加水分解を触媒した:α-アミラーゼ、GZyme登録商標G9972AAU/gdsデンプンGenencor-Daniscoから市販、及びヒュミコラHumicola由来のデンプン粒加水分解グルコアミラーゼ1.0GAU/gdsデンプン参照により本案件に組み込まれる米国特許第7,303,899号を参照されたい。このスラリーを60°Cで24時間インキュベートした。フィルター押圧で可溶性デンプン画分と、不溶性のコメタンパク質を含有する残渣画分とを分離することでケーキの形態で不溶性のコメタンパク質を得た。ケーキを水に懸濁し、充分に撹拌して均一に混合した後、再度フィルター押圧で通過させた。フィルター押圧により得られたコメタンパク質ケーキを真空オーブン乾燥機で60°Cにて乾燥させ、更なる評価に使用した。LT工程により得られたコメタンパク質濃縮物の組成を表1に示す。実施例2同様に、従来のHT工程を用いコメタンパク質濃縮物を調製した。典型的実験では、穏やかに撹拌しながら、10kgの胚芽米を40kgの水に一晩付け、その後95超が30メッシュスクリーンを通過する程度に精米することでスラリーを調製した。スラリーのpHは5.5に調節した。GZyme登録商標G9972AAU/gdsデンプン及びヒュミコラHumicola由来のデンプン粒加水分解グルコアミラーゼ1.0GAU/gdsデンプンを加え、スラリーを60°Cで24時間インキュベートした。次にフィルター押圧により可溶性の固形分を分離し、不溶性のコメタンパク質ケーキを水に懸濁し、充分に撹拌して均一に混合させた後、再度フィルター押圧により通過させた。2度目のフィルター押圧により得られたコメタンパク質ケーキを、真空オーブン乾燥機で60°Cにて乾燥させた。コメタンパク質の組成を表2に提供する。実施例3チョコレートヌガー型のバーセンターで、LT工程により製造したコメタンパク質濃縮物をダイズタンパク質単離物SoyProteinSupro516SolaeCompanySt.Louis,MOと比較した。この型のチョコレートセンターは、栄養補給バー又は菓子バーの成分として使用することもできた。コメタンパク質濃縮物は、他のバー成分と共に層状にすることもできる。タンパク質単離物を含有する食品を、表3に示すレシピに従って調製した。最終的な食品組成を表4に示す。LTコメ食品は、LT工程により製造されたコメタンパク質濃縮物を含有し、ダイズ食品はダイズタンパク質単離物を含有する:コメタンパク質濃縮物を用い湿潤ドウを製造するのに必要とされる水は、最終的な配合物の7重量/重量であった。対照的に、ダイズタンパク質濃縮物を用い湿潤ドウを製造するのに必要とされる水は、最終的な配合物の12重量/重量であった。理論に束縛されるものではないが、コメタンパク質濃縮物中のタンパク質は、LT工程でより高度な水和状態を維持することから、湿潤ドウの形成に必要とされる水が少なくなるものと考えられる。このコメタンパク質濃縮物の特性は予期されないものであり、かつコメタンパク質濃縮物を含有する食品に有利な特性を付与する。例えば、添加水の量が少なくなると、最終タンパク質濃度及び食品中の最終タンパク質含量を高くできる。更に、コメタンパク質濃縮物を含有する湿潤ドウの最終的な質感は非常に望ましいものずっしりと重く、まとまりやすく、かつ柔軟であった。対照的に、ダイズタンパク質単離物を用いた湿潤ドウは、望ましくないもの軽く、まとまりにくく、かつ脆いであった。湿潤ドウの水分含量が低くなることで、コメタンパク質濃縮物を様々な食品に組み込む際に使用される加工工程は容易なものにもなる。例えば、まとまりにくく、崩れやすいドウと比較して、ドウの操作性が良いことから、湿潤ドウの予想外の質感により、加工時の操作性も良好なものになる。更には、製造工程時に必要とされる水分量が少なくなることから、コメタンパク質濃縮物を含有する食品の操作工程はより経済的なものである。実施例4以降の実験を実施し、コメ及びダイズタンパク質を充分に水和させて、栄養補給用のバー用のタンパク質含量の高いマトリックスのドウを製造するのに必要な水の量を測定し、比較した。表5に示す標準的な高タンパク質ドウ配合物を使用して、ダイズ及びコメタンパク質を比較した。この処方により、添加する追加の水の量を測定しながら、ドウの形成をモニターした。表5の手順に従い、様々な材料を混合し、次いでドウが形成されるまで50gずつ増分させて追加の水を添加した。表5に示されるような処方を完全に混合した後、各バッチは乾燥粉末様になったいずれもドウを形成できなかった図1を参照されたい。50、100、及び150gの水の添加時には、いずれのバッチでもドウの形成は観察されなかった。図1に示されるように、200gの水を添加してはじめて、コメタンパク質バッチは、分塊圧延及び/又は押し出し加工並びに更なる加工に好適なドウを形成した。大豆タンパク質バッチは、450gの水を添加してはじめて好適なドウを形成した。コメドウは0.859の水分活性を有する一方で、ダイズドウはの水分活性は0.938であった。いずれの場合も貯蔵寿命が12ヶ月以上である処方を得るにあたり調整が必要であったものの、ダイズ処方はコメ処方と比較して承認しづらいものであった。ダイズタンパク質処方では、室温で1週間保管した後、かびの発生が観察された。ダイズドウは、食した場合に口腔を非常に乾燥させ、糊のようになった。ダイズドウの質感は非常に弾性の強いものであった。コメドウでは糊様の特性は少なく、舌の上でより滑らかであり、かつ口腔を乾燥させる程度が少なかった。ライスドウはダイズドウよりも酸味が強かったものの、チョコレートフレーバーのライスドウはより好ましいものであった。要約すると、コメタンパク質は、ダイズタンパク質よりも水分含量が少ないドウを形成することができる。得られたコメドウは、口腔の感覚が改善され、すなわち、より滑らかになり、かつ口腔の乾燥感及びざらざらした食感が軽減されていることを示す。これらの特性は、可能な限り多くのタンパク質をバーに含有させることができるという点から、栄養補給用のバー用の高タンパク質ドウの製造に有益である。したがって、コメタンパク質は栄養補給用のバーの製造に望ましい材料であると考えられる。実施例5無糖カラメル中で、LT工程で製造したコメタンパク質濃縮物とダイズタンパク質単離物とを比較した。この種類のカラメルは、栄養補給用又は菓子用バーで層として使用することができる。タンパク質単離物を含有する食品を、表6に示すレシピに従って調製した。最終的な食品組成を表7に示す。LTコメ食品は、LT工程により製造されたコメタンパク質濃縮物を含有し、ダイズ食品はダイズタンパク質単離物を含有する:LT工程コメタンパク質濃縮物は、予想外に粘度が低かったことから非常に使用しやすかった。粘度が低いことは、食品の製造工程において有利であり、特に、低粘度のコメタンパク質濃縮物を粘度の高い最終的な食品中で他の食品成分と組み合わせる場合に有利である。無糖カラメルの製造は、色味を出すために加熱する工程を包含する。上記されるように、LT工程により製造されたコメタンパク質濃縮物を分散させるのに必要とされる水の量は、ダイズタンパク質単離物と比較してより少量である。コメタンパク質濃縮物を含有する無糖カラメルは水分含量が少ないことから、加熱工程の長さは有利に短縮されることになる。加熱時間が短縮されることで、全体的な調理時間及びエネルギー消費量が減少することになる。実施例6食物タンパク質が血漿コレステロール濃度に影響を与えることは広く知られており、特に植物性タンパク質は、動物性タンパク質と比較して、血漿コレステロールを減少させ得る。コレステロール低下のメカニズムは現在でも明らかとなっていないものの、この効果はタンパク質の構造に起因するものであると考えられ、すなわち、調製法により影響を受ける可能性がある。したがって、本実施例では、LT工程及びHT工程により製造されたコメタンパク質濃縮物の効果を比較した。コレステロール低下活性に加え、乳酸脱水素酵素LDH活性を測定した。乳酸の蓄積は疲労状態を誘起する。LDHは、肝臓において乳酸のピルビン酸への変換を触媒することにより、筋肉中で乳酸の蓄積を減少させる。したがって、LDH活性は、運動時の代謝を評価するための最も重要な指標のうちの1つである。血中尿素窒素BUN濃度も測定した。BUN濃度は運動時のタンパク質及びアミノ酸代謝に応答して上昇する。BUN濃度は負荷の重い運動すなわち、高負荷時に筋肉の持久性を評価するにあたり非常に高感度な指標であり、長時間にわたる中~高強度の運動時の疲労度を評価するための一般的な生化学的指数として使用することができる。BUNが高いほど、負荷に対する耐性が低くなる。例えば、Poortmansは、長時間の運動時にBUN濃度が上昇することを報告している。Poortmansetal.2000DoregularhighproteindietshavepotentialhealthrisksonkidneyfunctioninathletesInt.J.SportNutr.Exerc.Metab.10:28~38を参照されたい。LT-及びHT工程のコメタンパク質濃縮物の効果を評価するために、コメタンパク質濃縮物を添加した餌をラットに与え、動物モデルを構築した。ラットには、LT工程LT又はHT工程HT製の同量のコメタンパク質濃縮物を4週間投与した。要約すると、LT及びHT群で血漿コレステロール濃度の低下が観察され、LTを与えたラットはHTを与えたラットと比較して好ましい程度にまでコレステロール低下作用を示した。驚くべきことに、LDH活性は、基本的な餌を投与した対照群BD及びHT群と比較してLT群において統計的に有意に高かった。LT及びHT群の両方でBUN濃度のわずかな低下が観察されたが、統計的に有意な差はなかった。LT及びHTのいずれもが、試験したラットの肝重量に負の影響は与えなかった。6.1.解析手順血液を3000×gで10分間遠心分離することで血漿を得た。総コレステロールTC、トリグリセリドTG、高密度リポタンパク質コレステロールHDL-C、乳酸脱水素酵素LDH活性、及び血中尿素窒素BUNなどの様々な生化学的パラメータを自動解析機Hitachi7170A日立、東京を用い測定した。TC及びTGについての波長は505nmであり、HDL-Cについての波長は600nmであった。対となる試料を用いt-検定を統計解析のために用いた。6.1.1.コレステロール測定自動解析機Hitachi7170A日立、東京を用いコレステロール濃度を測定した。すべての試薬はRocheCo.,Ltdから得られる。血漿はラットの血液を3000×gで10分間遠心分離させて得た。次に血漿を生理食塩水で希釈した。試料及び標準を解析用にバイアルに注ぎ入れた。自動解析機の波長は505nmに設定し、コレステロール濃度は次の式を用い算出した:コレステロール濃度=A試料/A標準C標準、式中、A=吸光度であり、及びC=標準の濃度である。6.1.2.LDH測定WorthingtonBiochemicalCompany,NJからのアッセイ系を用い、LDH活性を測定した。簡潔に言えば、NADHを酸化させることで生じる340nmでの吸光度の減少により反応速度を測定した。反応の開始直線領域からΔA340/分を測定した。1単位は、25°C、TrisHClpH7.3にて、特定の条件下で、1分あたりに1マイクロモルのNADHが酸化される単位として定義される。6.1.3.BUN測定Sampson,etal.1980Clin.Chem.26:816~26に記載されるアッセイ法を改変して、BUNを測定した。最初の反応では、ウレアーゼが、触媒反応により尿素を炭酸アンモニウムへと変換させる。この反応は、グルタミン酸脱水素酵素GLDHの濃度に依存する第2の反応と連結している。第2の反応の速度は、340nmでの吸光度の変化により、NADHがNADへと変換する速度として測定することができる:6.2.血漿コレステロール濃度が高いモデルの確立ラット体重約18gをShanHePharmaceuticalCo.Ltdから購入し、それぞれ、温度21~25°C及び湿度40~50が制御された、明暗サイクルが12時間の室内の金属製のケージに収容した。ラットには5日間基本的な餌BDを与え、実験室内の環境に順応させた。続いて、ラットをそれぞれ6匹ずつ8群に分け、実験用の餌を割り当てた。コレステロールを含有する実験用の餌EDCCの化学的な組成を表8に示した。ラットには、1日あたり、体重1kgあたり、0.4gのLT又はHTを含有するEDCCを与えた。実験試料を与える前に、眼窩静脈から血液試料を採血した。実験1は5匹の群であり、血漿コレステロール濃度に対するLT及びHTの効果を比較した。実験2は3匹の群であり、耐久性に対するLT及びHTの効果を比較した。食餌投与期間は4週間であった。表9は、それぞれEDCC及びBDを与えたラットのTC、TG、及びHDL-Cにおける変化を示す。EDCC群での血漿総コレステロール濃度は、対照群のものと比較して統計的に有意に高かったP<0.01ことから、このモデルは首尾よく確証された。値は、平均値±標準誤差n=3ラット/基である。P<0.025;P<0.01;P<0.005。6.3.LT及びHT工程のコメタンパク質濃縮物によるコレステロール低下作用表10は、LT及びHT餌を与えたラットにおいて、30日後に総血清コレステロールが統計的に有意に減少していたことを明らかにするP<0.01。LT及びHTによるコレステロール低下の程度は、EDCC餌の場合と比較してそれぞれ26.87及び19.60であった。この結果は、コメタンパク質濃縮物の機能特性は、HT工程よりもLT工程で製造した場合の方が、より効果的に維持されることを示す。表10中のMDは平均群を指し、この群ではラットには、1日あたり、体重1kgあたり、0.01gのXueKangNingモナスカスMonascus株の高品質な粒を発酵させることで得られる紅色酵母米HongQu100を含有するEDCCを与えた。値は、平均値±標準誤差n=3ラット/基である。P<0.025;P<0.01;P<0.005。6.4.疲労モデルの確立疲労モデルを確立させるために、ラットには、実施例6.2に記載した高血漿コレステロール濃度モデルを確立するのに使用したものと同一条件下で、BD、LT、又はHTを与えた。ラットには、ラットの総体重の約4を有する物体を用い負荷をかけた。負荷をかけたラットを水28~32°C中で40分間泳がせた。30分休息させた後、それぞれのマウスから血液を回収し、肝臓を摘出し、計量した。実施例6.1.2に概説される手順を用い、血液試料中のLDH活性を測定した。6.5.LDH活性に対するLT及びHT工程のコメタンパク質濃縮物の効果表11に示されるように、上記疲労モデルからの血液試料におけるLDH活性は、BD及びHT群においてよりも、LT群において、統計的に有意に、かつ予想外にずっと高かった。LTでは、同じ用量でのHTと比較して特にLDH活性が58.56も増加していた。LDH活性の増加により、乳酸の代謝の増加及び疲労打破staveprostrationが見込まれる。値は、平均値±標準誤差n=3ラット/基である。P<0.025;P<0.01;P<0.005。6.6.BUN濃度に対するLT及びHT工程のコメタンパク質濃縮物の効果LDH活性を測定するために屠殺したのと同じ動物でBUN濃度を測定した。表12で示されるように、LT及びHT工程のコメタンパク質濃縮物の両方に関し、BUN濃度のわずかな減少が観察された。結果は統計的に有意なものではなかったものの、LT工程のコメタンパク質濃縮物は確実にBUN濃度を上昇させなかった。したがって、この結果は、実施例6.5でLDH活性を用い測定されたように、LT工程のコメタンパク質濃縮物が持久力を増強し、疲労耐性を増強することと一致する。値は、平均値±標準誤差n=3ラット/基である。P<0.025;P<0.01;P<0.005。6.7.肝重量に対するLT及びHT工程のコメタンパク質濃縮物の効果LDH活性を測定するために屠殺したのと同じ動物で総体重及び肝重量を測定した。表13の結果は、LT及びHT群の両方で総体重がBD群よりもわずかに、しかしながら統計的に有意な程度に低下していたと示しており、おそらくこれらの群において、全体的なカロリー摂取量がより制限されたことを反映している。総体重対肝重量比に統計的に有意な差は存在しないものの、LT及びHTがラットの肝臓に対して負の影響を有さないことが示された。値は、平均値±標準誤差n=3ラット/基である。P<0.025;P<0.01;P<0.005。意図された使用に関する趣旨又は範囲から逸脱することなく、同様のものを用いる、組成物及び方法に様々な改変及び変更を加えることができることは当業者には明白であろう。したがって、このような改変及び変更は、それらが添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内で提供されるものである。"