"以下の1~5を含み、5は1と一の試薬であり、2と3は一の試薬であることを特徴とする過酸化水素を定量するための試薬。1ロイコ型色素2極大吸収波長が400nm~550nmの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素3パーオキシダーゼ4シクロデキストリン類5還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤極大吸収波長が400nm~550nmの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素が、オレンジG、オレンジII、食用赤色2号、食用赤色3号、食用赤色40号、食用赤色102号、食用赤色104号、食用赤色106号、食用黄色4号、食用黄色5号より選ばれた1種以上である請求項1に記載の試薬。ロイコ型色素が、10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウム又はN,N,N,N,N,N-ヘキサ3-スルフォプロピル-4,4,4-トリアミノトリフェニルメタン6ナトリウムである請求項1または2に記載の試薬。請求項1~3のいずれかに記載の過酸化水素を定量するための試薬を用いた液状で安定な糖化蛋白質測定用試薬。ロイコ型色素として10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウム又はN,N,N,N,N,N-ヘキサ3-スルフォプロピル-4,4,4-トリアミノトリフェニルメタン6ナトリウム、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤、シクロデキストリン類及び糖化蛋白質に作用するプロテアーゼを含む一の試薬、パーオキシダーゼ、極大吸収波長が400nm~550nmの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素及びケトアミンオキシダーゼを含む一の試薬を組み合わせてなる糖化蛋白質測定用試薬。糖化蛋白質がヘモグロビンA1cであり、総ヘモグロビンを定量する第一試薬、ヘモグロビンA1cを定量する第二試薬を含み、総ヘモグロビン量に対するヘモグロビンA1c量の割合を求める請求項4に記載の糖化蛋白質測定用試薬であって、第一試薬が、プロテアーゼ反応促進剤、1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンに作用するケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、トリンダー試薬、アスコルビン酸酸化酵素及び極大吸収波長が400nm~550nmの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素を含み、第二試薬が、ヘモグロビンA1cの糖化β鎖末端から1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼ、10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウム、シクロデキストリン類及び還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤を含む、糖化蛋白質測定用試薬。プロテアーゼ反応促進剤、ヘモグロビンA1cに作用してヘモグロビンA1cの糖化β鎖末端から1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼ、10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウム、カタラーゼ、シクロデキストリン類及び還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤を含む第一試薬、ケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ及び極大吸収波長が400nm~550nmの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素を含む第二試薬とからなる請求項6に記載の糖化蛋白質測定用試薬。プロテアーゼ反応促進剤が、N-アシルアミノ酸塩またはN-アシルタウリン塩から選ばれた陰イオン界面活性剤であり、ケトアミンオキシダーゼがネオコスモスポラ属またはカーブラリア属由来であり、極大吸収波長が400nm~550nmの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素が黄色4号又は赤40号又は赤102号であり、ヘモグロビンA1cに作用してヘモグロビンA1cの糖化β鎖末端から1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼがバチルス属又はリゾバクター属由来であり、シクロデキストリン類が2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンであり、トリンダー試薬がALPS又はADPSであり、還元剤が亜硫酸ナトリウムであり、血球を水により溶血させ、これを検体として用いることを特徴とする請求項6または7に記載の糖化蛋白質測定用試薬。全血中の糖化蛋白質を測定するための測定試薬であって、さらに、第一試薬にケトアミンオキシダーゼを含む請求項6~8のいずれかに記載の糖化蛋白質測定用試薬。本発明の課題は、液状で長期間保存が可能なロイコ型色素の安定化方法ならびにロイコ型色素の発色反応時の非特異的発色の軽減方法、及びこれを利用した液状で安定な試薬組成物を提供することにある。本発明者らは、鋭意検討した結果、ロイコ型色素を特定の還元剤と共存させることにより自然発色が抑えられ、溶液での安定性が格段に向上することを見出した。また、ロイコ型色素を用いた過酸化水素との発色反応時にロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素とは反応しない別の色素を反応液に共存させると、驚くべきことに非特異的な発色が抑えられ、試薬ブランク値が下がること、かつ試薬ブランク値のバラツキも大きく軽減し測定精度が飛躍的に向上することを見出した。さらに、本発明を、分析試薬へ応用し、糖化蛋白質であるヘモグロビンA1cの酵素的測定法において、液状で安定な試薬組成物を完成するに到った。すなわち、本発明は、以下の構成を有する。1ロイコ型色素を、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤と共存させることを特徴とするロイコ型色素溶液の安定化方法。2ロイコ型色素が10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウム又はN,N,N,N,N,N-ヘキサ3-スルフォプロピル-4,4,4-トリアミノトリフェニルメタン6ナトリウムである前記1記載のロイコ型色素溶液の安定化方法。3ロイコ型色素の溶液中での濃度が0.01~2mMである前記1又は2に記載のロイコ型色素溶液の安定化方法。4還元剤の溶液中での濃度が0.005~10mMである前記1~3のいずれかに記載のロイコ型色素溶液の安定化方法。5還元剤が、システイン、システアミン、N-アセチルシステイン、チオグリセロール、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムからなる群より選ばれた1種以上である前記1~4のいずれかに記載のロイコ型色素溶液の安定化方法。60.005~10mMの還元性チオアルコール類又は還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤と、0.01~2mMの10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウム又はN,N,N,N,N,N-ヘキサ3-スルフォプロピル-4,4,4-トリアミノトリフェニルメタン6ナトリウムからなるロイコ型色素の液状組成物。7還元剤が、システイン、システアミン、N-アセチルシステイン、チオグリセロール、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムからなる群より選ばれた1種以上である前記5に記載の液状組成物。8ロイコ型色素を用いたパーオキシダーゼ共存下での過酸化水素発色反応において、ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素とは反応しない別の色素を共存させることを特徴とするロイコ型色素の非特異発色反応を軽減する方法。9ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素と反応しない別の色素の極大吸収波長が、400nm~550nmの範囲である前記8に記載のロイコ型色素の非特異発色反応を軽減する方法。10ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素と反応しない別の色素が、オレンジG、オレンジII、食用赤色2号、食用赤色3号、食用赤色40号、食用赤色102号、食用赤色104号、食用赤色106号、食用黄色4号、食用黄色5号より選ばれた1種以上である前記8又は9に記載のロイコ型色素の非特異発色反応を軽減する方法。11ロイコ型色素が、10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウム又はN,N,N,N,N,N-ヘキサ3-スルフォプロピル-4,4,4-トリアミノトリフェニルメタン6ナトリウムである前記8~10のいずれかに記載のロイコ型色素の非特異発色反応を軽減する方法。12ロイコ型色素を、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤及びロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有しかつ過酸化水素とは反応しない別の色素と、共存させた状態で過酸化水素と反応させることを特徴とする過酸化水素定量方法。13ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素とは反応しない別の色素とパーオキシダーゼを含む一の試薬と、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤とロイコ型色素を含む一の試薬を組み合わせたことを特徴とする過酸化水素を定量するための試薬。14前記13記載の過酸化水素を定量するための試薬を用いた液状で安定な糖化蛋白質測定用試薬。15ロイコ型色素として10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウム又はN,N,N,N,N,N-ヘキサ3-スルフォプロピル-4,4,4-トリアミノトリフェニルメタン6ナトリウム、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤及び糖化蛋白質に作用するプロテアーゼを含む一の試薬、パーオキシダーゼ、ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素とは反応しない別の色素及びケトアミンオキシダーゼを含む一の試薬を組み合わせてなる前記14記載の糖化蛋白質測定用試薬。16糖化蛋白質がヘモグロビンA1cであり、第一試薬で総ヘモグロビンを定量、第二試薬でヘモグロビンA1cを定量し、総ヘモグロビン量に対するヘモグロビンA1c量の割合を求めるための前記14記載の糖化蛋白質測定用試薬。17プロテアーゼ反応促進剤、1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンに作用するケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、トリンダー試薬、アスコルビン酸酸化酵素及びロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素と反応しない別の色素を含む第一試薬と、ヘモグロビンA1cの糖化β鎖末端から1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼ、10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウム、シクロデキストリン類及び還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた1種以上の還元剤を含む第二試薬とからなる前記16記載の糖化蛋白質測定用試薬。18プロテアーゼ反応促進剤、ヘモグロビンA1cに作用してヘモグロビンA1cの糖化β鎖末端から1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼ、10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウム、カタラーゼ、シクロデキストリン類及び還元剤を含む第一試薬、ケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ及びロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素と反応しない色素を含む第二試薬とからなる前記16記載の糖化蛋白質測定用試薬。19プロテアーゼ反応促進剤が、N-アシルアミノ酸塩またはN-アシルタウリン塩から選ばれた陰イオン界面活性剤であり、ケトアミンオキシダーゼがネオコスモスポラ属またはカーブラリア属由来であり、ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素と反応しない色素が黄色4号又は赤40号又は赤102号であり、ヘモグロビンA1cに作用してヘモグロビンA1cの糖化β鎖末端から1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼがバチルス属又はリゾバクター属由来であり、シクロデキストリン類が2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンであり、トリンダー試薬がALPS又はADPSであり、還元剤が亜硫酸ナトリウムであり、血球を水により溶血させ、これを検体として用いることを特徴とする前記17記載の糖化蛋白質測定用試薬。20全血中の糖化蛋白質を測定するための測定試薬であって、さらに、第一試薬にケトアミンオキシダーゼを含む前記17に記載の糖化蛋白質測定用試薬。本発明は、ロイコ型色素の溶液中での安定化方法及び発色反応時の非特異的発色の軽減方法、及び前記方法を用いた糖化蛋白質分析試薬組成物を提供する。以下、本願発明について具体的に説明する。一般に、還元剤は、ロイコ型色素などの酸化発色色素とパーオキシダーゼによる過酸化水素の発色反応を阻害し、発色強度の低下を引き起こすことが知られている。従って、還元剤添加によってロイコ型色素が安定化されても、発色強度が低下してしまい実用的でない場合も考えられる。この還元剤による発色阻害の程度は、酸化発色色素の種類によって異なるので、本発明に用いることのできるロイコ型色素は、安定化剤として加える還元剤により発色の阻害を受けにくいか、あるいは低濃度の還元剤によっても安定化効果が認められるものであることが望ましい。本発明に使用できるロイコ型色素の好適な例としては、10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウムDA-67又はN,N,N,N,N,N-ヘキサ3-スルフォプロピル-4,4,4-トリアミノトリフェニルメタン6ナトリウムTPM-PSが挙げられる。ロイコ型色素の濃度は例えば0.005~10mM、好ましくは0.02から3mMの範囲、さらに好ましくは0.05から1mMの範囲である。次に、本発明に用いることのできる還元剤として、還元性チオアルコール類や還元性硫酸塩類が挙げられる。還元性チオアルコール類としては、チオグリセロール、システイン、N-アセチルシステイン、システアミン塩酸塩2-アミノエタンチオール塩酸塩が、また、還元性硫酸塩類としては、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、ニ亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸カリウムなどが挙げられる。これらは、単独、あるいは組み合わせて用いることができる。これら還元剤の濃度は、選択された還元剤による発色阻害の程度と安定化の程度を実験的に確認し、対象とする非測定物の濃度範囲を参考にその濃度を設定すればよいが、例えば0.005~10mM、好ましくは0.02から3mMの範囲である。更に、シクロデキストリン及びその誘導体などの従来から知られている安定化剤と組み合わせることによって、相乗的な効果も期待できる。このようにロイコ型色素を還元剤と共存することにより、溶液状態で長期間着色しないロイコ型色素の安定化が達成された。これにより、実用的でより精度の高い分析試薬への応用が可能となったが、この場合の好適な例としては2種類の試薬に分け、一方に本発明のロイコ型色素と還元剤を共存させた溶液を、他方にパーオキシダーゼ溶液を用いればよい。一方、先に述べたように、ロイコ型色素の安定化ができても、パーオキシダーゼが添加された過酸化水素発色反応時にロイコ型色素が非特異的に発色してしまい正確な測定を妨げてしまうという問題点があった。すなわち、過酸化水素発色反応時のロイコ型色素とパーオキシダーゼが共存した状態で過酸化水素が存在しなくても、非特異的な反応により経時的に試薬ブランクが増加してしまう。通常、発色強度を定量的に測定するためには、反応溶液に光を当てて、個々の酸化色素に特有な波長での吸光度を測定する分光分析法が用いられる。例えば、10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウムDA67の場合は660nm付近に、また、N,N,N,N,N,N-ヘキサ3-スルフォプロピル-4,4,4-トリアミノトリフェニルメタン6NaTPMPSの場合は600nm付近に極大吸収波長を持つ。本発明者らは、試薬ブランクが分析装置の光源ランプの強さや光路長などによって大きく影響を受けるのは、吸光度を測定するために光源として照射する光が、試薬ブランクの一因になっているのではないかと考え、このことを確認するために仕様が異なる2種類の自動分析装置を用いて検討したところ、実際に試薬ブランクの値が大きく異なることを見出した。試薬ブランクの値は、分析装置の仕様、例えば、主に光源ランプの出力、反応液に照射される光量に大きく左右されることが判明したが、実用上、試薬ブランクが大きければ大きいほど、結果的に測定精度が悪くなってしまうという問題点が生じる。このことは、たとえ特定の還元剤を共存させてロイコ型色素を溶液中で安定化させることができても、パーオキシダーゼが共存して実際の発色反応が進行する時には、光源ランプを照射して分光分析法にて吸光度をモニターする過程で光源ランプの影響を受け、結果として非特異発色として試薬ブランクが増大し測定精度が悪くなると考えられた。そこで、本発明者らは、鋭意検討を加えた結果、ロイコ型色素を用いた過酸化水素の発色反応時に測光時の光源ランプの影響を軽減するため、400~550nm付近に極大吸収波長を有する色素を反応液に共存させると、驚くべきことにこの非特異的な発色が抑えられ、試薬ブランク値が下がること、かつ試薬ブランク値のバラツキも大きく軽減し測定精度が飛躍的に向上することを見出した。本発明でいうロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素とは反応しない色素とは、自らパーオキシダーゼによる酸化発色反応を起こさないこと、またロイコ型色素とパーオキシダーゼによる過酸化水素発色反応に影響を及ぼさないこと、つまりロイコ型色素発色時の極大吸収波長と干渉しない色素をいう。具体的には、上に示した400~550nm付近に極大吸収波長を有する色素を適宜選択すればよい。本発明に用いることのできる400~550nm付近に極大吸収波長を有する色素としては、例えば食用色素が挙げられ、このうち合成食用色素として、食用赤色2号アマランス、極大吸収波長508nm、食用赤色3号エリスロシン、極大吸収波長526nm、食用赤色40号アルラレッドAC、極大吸収波長499nm、食用赤色102号ニューコクシン、極大吸収波長428nm、食用赤色104号フロキシン、極大吸収波長538nm、食用赤色106号アシッドレッド、極大吸収波長508nm、食用黄色4号タートラジン、極大吸収波長428nm、食用黄色5号サンセットイエローFCF、極大吸収波長482nmなどが、また、食用色素以外の色素でも、オレンジG極大吸収波長480nm、オレンジII極大吸収波長480nmなどを用いてもよい。更に、天然食用色素として知られているコチニール色素、タマネギ色素、ベニバナ黄色素、クチナシ赤色素等を用いることもできる。これら400~550nm付近に極大吸収波長を有する色素の好適な濃度は、例えば0.005~3mM、好ましくは0.02から1mMの範囲であるが、これに限定されるものではない。また、2種以上の色素を組み合わせて用いることもできる。これら400~550nm付近に極大吸収波長を有する色素は、本発明に用いる還元剤により安定化されたロイコ型色素溶液と共存させても、またパーオキシダーゼ溶液と共存させてもよい。発明者らは上記記載のように、鋭意検討した結果、1還元剤を共存させることによって液状でのロイコ型色素の安定化が達成され、さらに2ロイコ型色素の吸光度測定波長に影響を与えない400~550nm付近に極大吸収波長を有する別の色素を発色反応時の液に共存させることにより、ロイコ型色素の非特異的な発色を抑止し、これにより測定精度の高く実用性にすぐれた液状で長期間安定なロイコ型色素を含む過酸化水素定量用試薬組成物を完成するに到った。本発明による分析試薬組成物への応用については、測定対象物が定量的に過酸化水素に変換できる反応系であれば特に限定はされない。ここでは、好適な例として糖化蛋白質であるヘモグロビンA1cの酵素的な測定法への応用を挙げる。ヘモグロビンA1cの酵素的な測定法及び測定用酵素についてはこれまでに以下のとおり種々報告されている。特許第303468公報国際公開第2002/06519号パンフレット国際公開第2005/56823号パンフレット特開2001-95598号公報特開2003-235585号公報特開2005-110657号公報国際公開第2005/49857号パンフレット国際公開第2004/104203号パンフレット国際公開第2006/013921号パンフレットClinicalChemistry492:269-2742003ClinicalChemistryandLaboratoryMedicine401:78-892002臨床検査466:729-7342002<糖化ヘモグロビン>ヘモグロビンがメイラード反応により糖化されたアマドリ化合物のことをさし、α鎖及びβ鎖N末端のバリンのα-アミノ基や分子内のリジンのε-アミノ基が糖化されていると言われている。糖化ヘモグロビンのフラグメントとは糖化ヘモグロビンが分解されることによりできるペプチドのことをいう。<ヘモグロビンA1c>国際的に標準とされる定義において、ヘモグロビンA1cとはヘモグロビンβ鎖N末端のバリンのα-アミノ基が糖化されたヘモグロビンであるとされている非特許文献2<ケトアミンオキシダーゼ>ケトアミン構造をもつ化合物に作用して過酸化水素を発生させる酵素のことで、別名フルクトシルアミンオキシダーゼともいう。一般的にヘモグロビンA1cはプロテアーゼ、ケトアミンオキシダーゼを用いて定量されるが、国際的に標準とされる定義において、ヘモグロビンA1cとはヘモグロビンβ鎖N末端のバリンのα-アミノ基が糖化されたヘモグロビンであるとされているため、その特異性が課題となる。ヘモグロビンにおいて、β鎖N末端のバリン以外にα鎖N末端のバリンや、分子内のリジンのε-アミノ基が糖化されているため、これらのものを測定せずに、ヘモグロビンA1cのヘモグロビンβ鎖N末端の糖化バリン部位のみを選択的に定量しなければならない。このための酵素として、ある特定の生成物を切り出すプロテアーゼ又はある特定のペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼが数多く見出されている。しかしながら特定の生成物を切り出すプロテアーゼといっても、ヘモグロビンを基質とした場合、目的とする生成物以外にも多かれ少なかれ通常は他のペプチド又はアミノ酸も生成する。ある特定のペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼについても同様で、作用する基質はその他複数種あるのが通常である。すなわちこれらの特異性の高いといわれる酵素を用いても、ヘモグロビンからプロテアーゼにより切り出される生成物は複数種あるため、プロテアーゼ単独の特異性もしくは、ケトアミンオキシダーゼ単独の特異性のみでヘモグロビンA1のβ鎖N末端の糖化バリン部位だけを測り分けたという報告はこれまでにはなく、特定のプロテアーゼと特定のケトアミンオキシダーを組み合わせて用いることによって実質的にヘモグロビンβ鎖N末端の糖化バリン部位に対する特異性を高めた方法が報告されている。例えば、特許文献7~12には、プロテアーゼによりヘモグロビンβ鎖N末端より糖化バリルヒスチジンを切り出し、これに作用するケトアミンオキシダーゼを用いて測定する方法が開示されている。また、特許文献11によれば、プロテアーゼの基質特異性の確認方法として、例えばヘモグロビンのα鎖N末端及びβ鎖N末端5残基の糖化ペプチドを用いて、β鎖N末端の糖化ペプチド、例えば糖化バリルヒスチジン、糖化バリルヒスチジルロイシン、糖化バリルヒスチジルロイシルスレオニンのみが生成され、α鎖N末端由来の糖化バリルロイシン、糖化バリルロイシルセリン、糖化バリルロイシルセリルプロリンを生じないプロテアーゼが挙げられる。またヘモグロビンA1cは、糖化されないものに対する糖化されたものの割合として測定されるため、前記ヘモグロビンA1c濃度の測定のみならず、総ヘモグロビンの測定も必須である。こうして測定された、総ヘモグロビン濃度、HbA1c濃度の比からヘモグロビンA1cの割合、すなわちヘモグロビンA1cが計算される。総ヘモグロビンについては、シアンメトヘモグロビン法等、これまでに種々の測定法が報告されているのでヘモグロビンA1c濃度の測定とは別個に測定することもできるが、望ましくは、同一反応槽で測定できることである。例えば、特許文献12にはヘモグロビンを変性させその色調を変化させるプロテアーゼ反応促進剤及びこれをプロテアーゼ、ケトアミンオキシダーと組み合わせた同一反応槽でのHbA1c測定例が記載されている。我々は、本発明を上記特異的なヘモグロビンA1c以下、HbA1cということがある測定方法と組み合わせることにより実用性にすぐれたHbA1c測定試薬を完成するに到った。すなわち、例えば特許文献11記載の特異性の高いプロテアーゼ及びケトアミンオキシダーゼを用いて、一方の試薬に過酸化水素と反応しない色素、パーオキシダーゼ及びケトアミンオキシダーゼを含有させ、他方に還元剤、ロイコ型色素及びプロテアーゼを含有させた2種類の試薬から構成される液状で安定なHbA1c定量用試薬を完成するに到った。以下、より好適な例を述べる。HbA1c定量用試薬は、2種類の液状試薬から構成され、以下の組み合わせ方が挙げられる。組み合わせ1第一試薬:プロテアーゼ反応促進剤1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンに作用するケトアミンオキシダーゼパーオキシダーゼトリンダー試薬過酸化水素と反応しない色素第二試薬:HbA1cの糖化β鎖末端から1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼ10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウムシクロデキストリン類還元剤組み合わせ2第一試薬:プロテアーゼ反応促進剤HbA1cに作用してHbA1cの糖化β鎖末端から1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼ10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウムカタラーゼシクロデキストリン類還元剤第二試薬:フルクトシルアミンオキシダーゼパーオキシダーゼ過酸化水素と反応しない色素本発明のHbA1c定量用試薬は、上記組み合わせのいずれかの組成物を用いることができ、第一試薬で総ヘモグロビンを定量し、第二試薬で糖化されたβ鎖N末端から切り出された1-デオキシフルクトシル-バリン-L-ヒスチジンを定量することにより、総ヘモグロビン量に対するヘモグロビンA1cの割合を求め、HbA1cに特異的な液状で安定な測定試薬を完成させるに到った。なお、ここで、ロイコ型色素として、10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジンナトリウムの代わりにN,N,N,N,N,N-ヘキサ3-スルフォプロピル-4,4,4-トリアミノトリフェニルメタン6ナトリウムを用いることも出来る。ここで、プロテアーゼ反応促進剤とは、酢酸基を含む化合物又はその塩、N-アシルタウリン又はその塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩であり、より具体的には特許文献12に記載されている。好適な例としては、ラウロイルサルコシンナトリウム商品名:サルコシネートLN、日光ケミカル株式会社、ミリストイルサルコシンナトリウムサルコシネートMNラウロイルメチルアラニンナトリウムアラニネートLN-30などが挙げられる。また、組み合わせ1におけるトリンダー試薬は、第一試薬中に持ち込まれる過酸化物を消去し、試薬ブランクを軽減させるためのものであり、例えば、N,N-ビス4-スルホブチル-3-メチルアニリンTODB、N-エチル-N-3-スルホプロピル-3-メトキシアニリンADPS、N-エチル-N-3-スルホプロピルアニリンALPS、MAPS、N-エチル-N-3-スルホプロピル-3-メチルアニリンTOPS、N-3-スルホプロピルアニリンHALPS、N-エチル-N-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-3-メトキシアニリンADOS、ALOS、N-エチル-N-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-3,5-ジメチルアニリンMAOS、N-3-スルホプロピル-3,5-ジメトキシアニリンDAPS、HDAPS、N-エチル-N-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-3,5-ジメトキシアニリンDAOSなどを用いることができ、その添加濃度としては、0.05~1mMである。また、組み合わせ1において、アスコルビン酸の影響を軽減するためにアスコルビン酸オキシダーゼを添加することもでき、また胆汁酸塩などの界面活性剤や塩を適宜加えることもできる。また、組み合わせ2において、カタラーゼは、過酸化物を消去し試薬ブランクを軽減させるためのものであり、容易に入手が可能な牛肝臓由来の市販酵素シグマなどを用いればよく、その好適な濃度は、100~2000u/mlである。このようにして調製された液状試薬を用い糖化ヘモグロビンA1cの糖化されていないヘモグロビンに対する割合を測定するためには、抗凝固剤入り採血管で採取された血液を遠心分離して血球部分を沈降させ、これを市販の溶血希釈混和装置などを用いて、水で適宜希釈することにより溶血させたものを検体として用い、測定すればよい。また、特に、組み合わせ1の場合は、全血を測定する場合に妨害物質の影響を回避できて望ましい。すなわち、血漿からの想定される妨害成分として、アスコルビン酸、ビリルビン、乳びの他に内在性の糖化ペプチドが挙げられる。従って、血漿成分からのアスコルビン酸等の影響を回避するためにアスコルビン酸酸化酵素及びケトアミンオキシダーゼを第一試薬に加えることにより、内在性の糖化ペプチド、アスコルビン酸を処理することができ血漿成分に混入する妨害成分の影響を回避できる。このように本発明によれば、遠心分離血球だけでなく、全血そのものでの測定も可能であり、これにより遠心分離操作が不要な簡便な測定も可能となる。ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明はなんらこれにより限定されるものでない。実施例1還元剤の効果ロイコ型色素溶液として0.2mMDA-67を含んだ40mMTris-HClpH7.1溶液以下、DA-67溶液ということがあるに、還元剤としてN-アセチルシステイン、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、チオグリセロール、チオ硫酸ナトリウム、2メルカプトエタノール、ジチオスレイトールを各々1mMおよび10mMになるように加えジチオスレイトールのみ1mMだけ37°Cにて4日間遮光保存した。これらの溶液について調製直後と37°C、4日保存後の660nmの吸光度を測定することにより、保存前後のロイコ型色素溶液そのものの着色度を判定した。また別に、10u/mlのパーオキシダーゼシグマ社製を含む40mMTris-HClpH7.1溶液を調製し、これに50μMの過酸化水素溶液を添加し予め37°Cに5分加温した後660nmの吸光度を測定し、上記還元剤を添加したDA-67溶液0.2mlを加え、混合後5分後の吸光度から差し引いた値を発色強度として観測した。ここで、過酸化水素を添加しないものを試薬ブランクとした。結果を表1に示す。表1からわかるように、還元剤の添加がない場合のDA-67単独溶液の初期吸光度は4日後に1934mAbsであったのに対して、各還元剤添加系においては発色強度が小さかった。尚、過酸化水素発色強度の相対は0日目の還元剤無添加の発色強度を100としたときのものである。実施例2還元剤の効果ロイコ色素溶液として0.1mMTPM-PS同仁化学製を含む40mMPIPES緩衝液pH7.0に各種還元剤を加え、37°Cにて半年間、遮光保存した。TPM-PSによる過酸化水素発色の極大波長付近である600nmの吸光度を測定し、表2の結果を得た。検討に用いた還元剤のなかで、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウムに非特異的な発色を抑制する顕著な効果が認められた。実施例3還元剤の効果ロイコ型色素溶液として0.2mMDA-67以下、DA-67溶液ということがあるおよび2ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンを含んだ40mMPIPESpH6.5溶液に、還元剤としてN-アセチルシステイン、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、チオグリセロールを各々1mM、2mM、5mMおよび10mMになるように加え37度にて7日間遮光保存した。これらの溶液について調製直後と37°C、7日保存後の660nmの吸光度を測定することにより、保存前後のロイコ型色素溶液そのものの着色度を判定した。次に、日立7170S型自動分析装置を用いて、試薬ブランクと発色強度を調べた。すなわち、10u/mlのパーオキシダーゼシグマ社製、5u/mlケトアミンオキシダーゼカーブラリアクラベータYH923由来を含む40mMTris-HClpH7.5溶液0.18mlに、50μMの糖化バリルヒスチジンF-VH:ペプチド研究所0.02mlを加え、37°Cに5分加温した後660nmの吸光度を測定したA1。次に上記各濃度の還元剤を含むDA-67溶液0.045mlを加え、混合後5分後の吸光度A2からA1を差し引いた値を発色強度として観測した。ここで、F-VHを添加しないものを試薬ブランクとした。結果を表3に示す。表3からわかるように、F-VHを基質とした場合のDA-67溶液の発色強度は、還元剤を添加したものでは、還元剤の濃度依存的に小さくなる傾向を示した。10mMの二亜硫酸ナトリウムを除き、いずれの還元剤についてもその濃度が10mMまでは、発色強度は還元剤無添加のときを100とした場合に、80以上であった。また、37°C4日後の試薬ブランクは還元剤無添加に比べ、いずれの還元剤についてもその濃度依存的に小さくなることが示された。尚、F-VHの相対は0日目の還元剤無添加の発色強度を100としたときのものである。実施例4還元剤の効果第一試薬40mMTris-HClpH7.50.2OP-10FF-0日光ケミカルズ株式会社0.04mMDA-671mM塩化カルシウム400u/mlカタラーゼ2ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリン各種還元剤第二試薬40mMTris-HClpH7.530u/mlFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ90u/mlパーオキシダーゼ日立7170S型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。DA-67溶液の着色度測定検体に蒸留水を用いて、検体/第一試薬:2μl/200μlで混合。測光ポイントは8ポイント目の1ポイント測定。主波長660nm。糖化バリルヒスチジンの感度発色強度測定F-VHの定量検体/第一試薬/第二試薬:20μl/180μl/45μl。測光ポイントは16、34ポイントの2ポイント。主波長660nm、副波長800nm。操作DA-67を含む第一試薬に各種還元剤を加え、茶褐色のガラス容器に入れ、37°Cで保存する。第一試薬に還元剤としてそれぞれチオグリセロール2mM、N-アセチルシステイン2mM、チオ硫酸ナトリウム5mMを添加した。還元剤添加後3日目、7日目にサンプリングし、着色度、試薬ブランク、糖化バリルヒスチジンF-VHの感度発色強度を測定した。表4に示したように、第一試薬の着色度は、還元剤非添加のものに比べて、還元剤を添加したものが、チオ硫酸ナトリウム、チオグリセロール、N-アセチルシステインの順に低くなった。一方、試薬ブランクについても還元剤の添加効果が認められ、チオ硫酸ナトリウムにその効果が最も大きかった。還元剤添加時の、糖化バリルヒスチジンの発色強度は、還元剤非添加のそれを100とした場合、75~89を示した。実施例5還元剤の組み合わせの効果第一試薬40mMTris-HClpH7.50.02mMDA-671mM塩化カルシウム800u/mlカタラーゼ4ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリン還元剤第二試薬40mMTris-HClpH7.530u/mlFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ90u/mlパーオキシダーゼ実施例4で、DA-67含有試薬の着色度抑制効果の大きかったN-アセチルシステインと、試薬ブランク抑制効果の高いチオ硫酸ナトリウムの組み合わせ効果を確認した。還元剤は第一試薬に含まれる。日立7170S型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。DA-67溶液の着色度測定検体に蒸留水を用いて、検体/第一試薬:2μl/200μl、測光ポイントは8ポイント目の1ポイント測定。主波長660nm。糖化バリルヒスチジンの定量検体/第一試薬/第二試薬:20μl/180μl/45μl。測光ポイントは16、34ポイントの2ポイント。主波長660nm、副波長800nm。操作DA-67を含む第一試薬に還元剤としてN-アセチルシステインとチオ硫酸ナトリウムの濃度をそれぞれ0.5~2mM、3~9mMになるように組み合わせて加え、茶褐色のガラス容器に入れ、37°Cで保存する。調製初日、7日目にサンプリングし、着色度、試薬ブランク、糖化VHの感度を測定した。表5に示したように、還元剤無添加の反応液に比べて、N-アセチルシステインとチオ硫酸ナトリウムの組み合わせは、いずれの系列においても顕著な効果を示した。最適な濃度は、N-アセチルシステインが1.5または2mMでチオ硫酸ナトリウムが5mMの時であった。実施例6還元剤以外の他の安定化剤との組み合わせの効果第一試薬40mMTris-HClpH7.50.02mMDA-671mM塩化カルシウム1MMT日光ケミカル株式会社800u/mlカタラーゼ10エチレングリコール5ku/mlニュートラルプロテアーゼバチラスエスピー由来:東洋紡社製還元剤、ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリン第二試薬40mMTris-HClpH7.530u/mlFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ90u/mlパーオキシダーゼ還元剤としてN-アセチルシステインと、チオ硫酸ナトリウムを用い、更にヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンを組み合わせて用いた。還元剤およびヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンは第一試薬に含まれる。日立7170S型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。DA-67溶液の着色度測定検体に蒸留水を用いて、検体/第一試薬:2μl/200μl、測光ポイントは8ポイント目の1ポイント測定。主波長660nm。糖化-バリルヒスチジンの定量検体/第一試薬/第二試薬:20μl/180μl/45μl測光ポイントは16、34ポイントの2ポイント。主波長660nm、副波長800nm。ヘモグロビンβ鎖N末端糖化ペンタペプチドの定量ヘモグロビンβ鎖N末端のアミノ酸配列を参考に、5アミノ酸からなる1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-トレオニル-L-プロリン以下、ヘモグロビンβ鎖N末端糖化ペンタペプチド糖化VHLTPともいうを合成し、これを基質として用いた。操作DA-67を含み、N-アセチルシステインとチオ硫酸ナトリウムの濃度が2mM、5mMを含む第一試薬に、ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリン濃度が2~5になるように加え、茶褐色のガラス容器に入れ、37°Cで保存する。調製初日、3日目、7日目にサンプリングし、着色度、試薬ブランク、糖化VH、糖化VHLTPの感度を測定した。表6に示したように、還元剤無添加の反応液に比べて、還元剤としてN-アセチルシステインとチオ硫酸ナトリウムを用いたものは対照に比べて試薬の着色が殆ど認められなかった。また、還元剤と組み合わせれば、ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンの量は2以上であれば充分であった。実施例7亜硫酸ナトリウム量の検討第一試薬40mMTris-HClpH7.5500mMNaCl1.0mMCaCl20.05NaN30.1mMADPS3.0アラニネートLN-30日光ケミカル株式会社10u/mLパーオキシダーゼ15u/mLFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ第二試薬100mMHEPES8.02.0ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンHP-β-CD0.05NaN310mMCholicacid0~3.0mM亜硫酸Na0.10mMDA-6712ku/mLサーモリシンBacillusstearothermophilus由来:大和化成日立7170S型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。測定モードとして、2ポイントを選択し、第二試薬添加後のHbA1c濃度または糖化VHLTP濃度を測定した。測光ポイントは16、34ポイントの2ポイント。主波長660nm、副波長800nm。第二試薬の着色度の測定検体に蒸留水を用いて、検体/第二試薬:20μl/200μl、測光ポイントは8ポイント目の1ポイント測定とした。主波長660nm。ヘモグロビンコントロールの定量亜硫酸ナトリウムを3mMまで変化させた第二試薬を用いて、市販のヘモグロビンコントロールL4.8、ヘモグロビンコントロールH10.5、および50μMの糖化VHLTPをサンプルに用い、着色度、試薬ブランク、HbA1cまたは糖化VHLTPの感度を試薬調製初日、冷蔵および37°Cで10日間まで保存したものを、測定した吸光度変化量を表7に示した。亜硫酸ナトリウム濃度依存的に、DA-67の安定化が図れた。一方、感度も亜硫酸ナトリウム濃度依存的に低下したが、亜硫酸3mMのときの感度低下率は約25と実用上問題はなかった。実施例8長期保存における還元剤の効果第一試薬実施例7に同じ第二試薬100mMHEPES8.02.0ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンHP-β-CD0.05NaN310mMCholicacid無添加または2mM亜硫酸Na0.10mMDA-6712ku/mLサーモリシンBacillusstearothermophilus由来:大和化成日立7170S型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。測定モードとして、3ポイントを選択し、第一反応で総Hb濃度を、第二反応でHbA1c濃度を測定する。測定結果は、吸光度で表した。総Hb濃度、HbA1c濃度の測定検体に市販のヘモグロビンコントロールを用い、検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ18μl/180μl/36μLとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントは、14ポイント、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用いた。主波長は660nm、副波長は800nm。第二試薬の着色度の測定第二試薬の着色度の測定は、主波長660nmで、検体に蒸留水を用いて、検体/第二試薬:20μl/200μl、測光ポイントは8ポイント目の1ポイント測定とした。DA-67を含む第二試薬に、亜硫酸ナトリウムを2mM加えたものと加えないものを調製し、遮光ボトルに入れ、冷蔵5°Cにて6ヶ月保存した。市販のヘモグロビンコントロールL4.8、ヘモグロビンコントロールH10.5をサンプルとして用い、試薬ブランク、感度を2mM亜硫酸ナトリウムを含む試薬の調製初日の測定値を対照に、測定した。Hb濃度に対応する14ポイントの測定値、HbA1c濃度に対応する16、34ポイントの測定値を用いた吸光度変化量の結果を表8に示した。総Hb測定値については、亜硫酸ナトリウムの有無に関わらず、6ヵ月後の感度低下は認められなかった。一方、試薬ブランクについて、2mM亜硫酸ナトリウムでは、総ヘモグロビン、HbA1cHbA1cの場合の試薬ブランクは調製直後で9.7mAbs、冷蔵半年後で8.8mAbsともに6ヶ月間の変化は殆どなかった。一方、亜硫酸ナトリウム非添加の試薬は、HbA1cについて50.6mAbsと調製時の2倍以上に上昇していた。更に、コントロール測定結果において、試薬ブランクを差し引いた値も若干低めになっていた。このことから、DA-67含有試薬の長期保存にも亜硫酸ナトリウムの効果が顕著に表れていることが確認できた。尚、試薬自体の着色度は、亜硫酸ナトリウム添加の場合、肉眼的には全く変化なかった。参考例特許文献12記載のプロテアーゼ反応促進剤による総ヘモグロビンの定量反応液40mMPIPES-NaOHpH6.06アラニネートLN-304.5u/mlパーオキシダーゼ2mM塩化カルシウム1mMTODBN,N-ビス4-スルホブチル-3-メチルアニリン:同仁化学市販のHbA1cコントロール試料およびヒトヘモグロビンシグマ製を用いて、ヘモグロビン濃度0~60mg/mlの範囲になるようにヘモグロビン試料を調製した。ラウリル硫酸ナトリウム法を原理とする市販ヘモグロビン測定用試薬ヘモグロビンB-テストワコーにて、ヘモグロビンを測定し、濃度を算出した。次に、上記反応液1.8mlを37°Cにて予備加温後、同一のヘモグロビン試料を0.2ml添加し混和した。5分後の660nmにおける吸光度を読み取った。試料の代わりに蒸留水を用いたものを試薬ブランクとし、各々の試料につきこれを差し引き、表9に示した。これをプロットした図1より明らかなように、ヘモグロビン濃度に対して、本反応液を用いた吸光度差は総ヘモグロビン約20mg/mlまで直線関係であった。実施例9総ヘモグロビン、糖化へモグロビンA1cの測定還元剤有無第一試薬40mMTris-HClpH7.50.02mMDA-672HP-β-CD1MMT日光ケミカル株式会社製0.5mMCaCl210エチレングリコール5ku/mlニュートラルプロテイネース東洋紡製800u/mlカタラーゼ10mMデオキシコール酸ナトリウム和光純薬製第二試薬40mMTris-HClpH7.590u/mlパーオキシダーゼ0.05NaN331u/mlFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ日立7170S型自動分析装置を用い、以下のように測定した。[H7170パラメータ]測定モードとして、3ポイントを選択し、第一反応で総Hb濃度を、第二反応でHbA1c濃度を測定する。測定結果は、吸光度で表した。総Hb濃度、HbA1c濃度の測定検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ20μl/180μl/45μLとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントは、14ポイント、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用いた。主波長は660nm、副波長は800nm。試料として、市販HbA1cコントロール凍結乾燥品および凍結品を用いて、ヘモグロビン濃度がおおよそ0.8~5mg/mlになるように溶解したものを用いた。第一試薬に還元剤1mMN-アセチルシステイン、5mMチオ硫酸ナトリウムを添加したもの、添加しないものそれぞれについて測定を行った。測定モードとして、3ポイントを選択し、第一反応で総Hb濃度を、第二試薬添加後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ20μl/180μl/45μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、14ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用いた。また、総ヘモグロビン、HbA1c濃度ともに、主波長660nm、副波長800nmにて測光した。濃度への換算は、HbA1cの場合、既知濃度に調製した糖化β-ペンタペプチドペプチド研究所製より、また総ヘモグロビンは、市販HbA1cコントロールLBML社の表示値より計算した。表10および図2、図3より明らかなように、還元剤有無によるHbA1c量、総ヘモグロビン量の相関係数はいずれもr=0.99以上と良好であり還元剤を添加しても測定への影響は認められなかった。実施例10HbA1cの測定免疫法との比較第一試薬40mMTris-HClpH7.50.02mMDA-672HP-β-CD1MMT日光ケミカル株式会社製0.5mMCaCl210エチレングリコール5ku/mlニュートラルプロテイネース東洋紡製800u/mlカタラーゼ10mMデオキシコール酸ナトリウム和光純薬製1mMN-アセチルシステイン5mMチオ硫酸ナトリウム第二試薬40mMTris-HClpH7.590u/mlパーオキシダーゼ0.05NaN331u/mlFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ日立7170S型自動分析装置を用い、以下のように測定した。免疫法デタミナーHbA1c協和メデックス株式会社を用い、添付文書に従い測定した。検体は血球を所定のHbA1c測定用検体希釈液にて、101倍希釈して測定に用いた。本発明法第一試薬にDA-67と還元剤N-アセチルシステインおよびチオ硫酸ナトリウムとプロテアーゼを、第二試薬にケトアミンオキシダーゼとパーオキシダーゼを含む組成の試薬を用いた。測定モードとして、3ポイントを選択し、第一反応で総Hb濃度を、第二試薬添加後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ20μl/180μl/45μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、14ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用いた。また、総ヘモグロビン、HbA1c濃度ともに、主波長660nm、副波長800nmにて測光した。検体は血球を蒸留水で71倍希釈したものを用いた。濃度への換算は、総ヘモグロビンは、市販HbA1cコントロールBML社の表示値単位:mg/mlより、またHbA1c濃度は既知濃度に調製した糖化バリルヒスチジンペプチド研究所製水溶液の吸光度より求め、HbA1cはHbA1c濃度を総ヘモグロビン濃度で割ることにより求めた。なお、ヘモグロビン濃度Mはヘモグロビンの分子量を64550として算出した。結果図4に示したように、22種類の検体を用いた時の相関式y=1.055x-0.3917,R2=0.9798と良好であった。実施例11ヘモグロビンβ鎖N末端配列と同一の糖化ペンタペプチド1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジル-L-ロイシル-L-スレオニル-L-プロリン測定時の色素添加効果第一試薬40mMPIPESpH7.010u/mlPOD0.1mMADOS同人化学15u/mlFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダー由来第二試薬100mMTris-HClpH7.50.12mMDA-672mM亜硫酸ナトリウム3ku/mlニュートラルプロテイネース東洋紡製以下の二種類の製造メーカーの異なる自動分析装置を用いた。a日立自動分析装置7170型検体/第一試薬/第二試薬:20μl/180μl/45μl測光ポイントは16、34ポイントの2ポイント。主波長660nm、副波長800nm。b日本電子BM12自動分析装置検体/第一試薬/第二試薬:8μl/72μl/18μl測光ポイントは44-47、95-98の2ポイントエンド。主波長658nm、副波長805nm。上記試薬を用いて、それぞれの自動分析装置で試薬ブランクを20回連続測定し、平均吸光度、標準偏差SDを算出した。次に、50μMヘモグロビンβ鎖N末端配列からなる糖化ペンタペプチドを測定し、試薬ブランク20回の平均値を差し引いた吸光度を算出した。表11に示したように日本電子BM12の試薬ブランクの平均値58.8mAbsは、日立7170Sの試薬ブランク17.6mAbsの3倍以上の値を示した。一方、50μM糖化ペンタペプチドの試薬ブランクを差し引いた吸光度はほぼ同じ値を示した。また、試薬ブランク値が大きい日本電子装置でより、大きな標準偏差を示し、測定精度が劣ることが示された。そこで、この反応液の第一試薬に本発明の黄色4号三栄源エフエフアイを0.3mMになるように加え、同様の操作を行った。日本電子BM12における試薬ブランクが58.8mAbsから18.8mAbsと劇的に低下し、その標準偏差も小さくなった。一方、日立7170の場合の試薬ブランクも17.6から13.8mAbsに低下し、標準偏差も小さくなった。以上より、黄色4号を添加することにより、添加しない場合に認められた装置間差が解消された。実施例12色素添加の効果第一試薬40mMTris-HClpH7.5500mMNaCl0.05NaN30.1mMALPS同仁化学製3.0アラニネートLN-30日光ケミカル株式会社10u/mLパーオキシダーゼ10mMコール酸和光純薬株式会社15u/mLFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ各種色素第二試薬100mMHEPES8.02.0ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンHP-β-CD0.05NaN310mMCholicacid2mM亜硫酸ナトリウム0.12mMDA-6712Ku/mLサーモリシンBacillusstearothermophilus由来:大和化成日本電子BM1650自動分析装置を用いた。パラメータは、以下のように設定した。分析方式にEPAを選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Hb濃度を、第二試薬添加後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ12μl/120μl/24μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、38-41ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては44-47、95-98ポイントを用いた。測定主波長は658nm、測定副波長は805nm。また、計算方式にはABSを選び、吸光度値として出力させた。操作上記組成よりなる第一試薬に、食用赤色2号、赤色102号、黄色4号三栄源エフエフアイをそれぞれ0.025mM、0.15mM、0.25mM添加したものを調製した。対照に色素を添加しないものをおいて、これら4種類の第一試薬に対して、それぞれ蒸留水、および市販HbA1cコントロールHbA1cが10。Hb濃度が2mg/mlになるように溶解を検体として20回測定した。蒸留水については吸光度を測定しこれを試薬ブランクとした。また、HbA1cコントロールについては、蒸留水の値を差し引いた差し引き吸光度を総ヘモグロビン、HbA1c測定パラメータそれぞれに対して吸光度値として出力させた。吸光度の最大値、最小値、差平均値、標準偏差、CVを算出し、結果を表12に示した。表12に示したように、総ヘモグロビンの測定値には色素添加の影響はなかった。一方、HbA1cの測定値については、色素無添加の試薬ブランクが26.4mAbsであるのに対して、色素を添加したものはいずれも12-15mAbsの値と小さく、しかも標準偏差、CVともに、色素無添加のものに比べて小さく、測定精度が向上したことが示された。また、HbA1cコントロールについて、試薬ブランクを差し引いた吸光度は色素無添加の約7-8割程度に低下していたが、標準偏差、CVともに、色素無添加のものに比べて小さかった。実施例13第一試薬40mMTris-HClpH7.5500mMNaCl0.05NaN30.1mMALPS同仁化学製3.0アラニネートLN-30日光ケミカル株式会社10u/mLパーオキシダーゼ10mMコール酸和光純薬株式会社15u/mLFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ各種色素第二試薬100mMHEPES8.02.0ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンHP-β-CD0.05NaN310mMCholicacid2mM亜硫酸ナトリウム0.12mMDA-6712ku/mLサーモリシンBacillusstearothermophilus由来:大和化成日本電子BM12自動分析装置を用い、パラメータは実施例12と同様の設定で実施した。第一試薬に、食用赤色40号、黄色4号、およびオレンジGをそれぞれ0.05mM、0.4mM、1.25mM添加したものを調製した。対照に色素を添加しないものをおいて、これら4種類の第一試薬に対して、市販超低値HbA1cコントロールHbA1cが1.5でHb濃度が2mg/mlを検体として20回測定した。蒸留水を検体の変わりに測定しこれを試薬ブランクとした。また、HbA1cコントロールについては、蒸留水の値を差し引いた差し引き吸光度をHbA1c測定パラメータに対して出力させた。吸光度の最大値、最小値、差平均値、標準偏差、CVを算出し、結果を表13に示した。HbA1cの測定値について、試薬ブランクは色素無添加の40.5mAbsであるのに対して、色素を添加したものはいずれも10~13mAbsの値と小さく、しかも標準偏差、CVともに、色素無添加のものに比べて小さかった。また、超低値HbA1cコントロールについて、試薬ブランクとの差は色素無添加のものは試薬ブランクよりも小さくマイナス値となり、標準偏差が0.335であるのに対し、色素添加のものは、試薬ブランクとの吸光度差は試薬ブランクよりも僅かに大きく、標準偏差も小さくなり、測定のばらつきが改善されたことが示された。実施例14免疫法との比較色素添加効果の確認第一試薬40mMBESpH7.20.05NaN30.1mMALPS同仁化学製3.0アラニネートLN-30日光ケミカル株式会社10u/mLパーオキシダーゼ10mMコール酸和光純薬株式会社15u/mLFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ黄色4号第二試薬100mMHEPES8.02.0ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンHP-β-CD0.05NaN310mMCholicacid2mM亜硫酸ナトリウム0.12mMDA-6715ku/mLプロテアーゼリゾバクターエンザイモゲネスYK-366由来日立7170S型自動分析装置を用い、フッ化ナトリウム採血管により採取された血液検体を用い以下のように測定した。免疫法デタミナーHbA1c協和メデックス株式会社を用い、添付文書に従い測定した。検体は血球を所定のHbA1c測定用検体希釈液にて、101倍希釈して測定に用いた。本発明法第一試薬にケトアミンオキシダーゼとパーオキシダーゼを、第二試薬遮光ボトル容器を使用にDA-67と還元剤亜硫酸ナトリウムとプロテアーゼを含む組成の試薬を用いた。試薬ブランクを低下させ、測定精度を保つための色素として、黄色4号を第一試薬に加えたもの、および加えないものを比較した。測定モードとして、3ポイントを選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Hb濃度を、第二試薬添加後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ20μl/180μl/45μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、14ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用いた。また、総ヘモグロビン、HbA1c濃度ともに、主波長660nm、副波長800nmにて測光した。検体は遠心分離1500Gx5分後の血球を蒸留水で71倍希釈したものを用いた。検量は、HbA1c測定用標準物質JCCLSCRM-004aHECTEFSRCを用い、総ヘモグロビン濃度はシアンメト法により、HbA1c濃度はCRM-004aのHbA1c表示値と前記ヘモグロビン濃度を用いて計算し、自社キャリブレーターに値をトランスファーし、これを用いて計算した。結果表14に示したように、色素添加により、HbA1cのシグナルは無添加に比べて2~3割低下するが、試薬ブランクは、11.5mAbsと約半分に低下する。20種類の検体を用いた時の免疫法Xと酵素法Yとの相関式は黄色4号無添加の場合は、y=0.9997x-0.138、R2=0.955、また添加の場合は、y=0.9927x0.0246、R2=0.9884であった図5、6。免疫法との相関係数は、本発明の黄色4号添加の方が高いことから、色素添加によりHbA1cがより正確に測定できることが示された。実施例15液状試薬の安定性過酷試験第一試薬30mMPIPES-NaOHpH7.0500mMNaCl0.05NaN30.1mMALPS同仁化学製3.0アラニネートLN-30日光ケミカル株式会社10u/mLパーオキシダーゼ10mMコール酸和光純薬株式会社15u/mLFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ0.6mM黄色4号三栄源エフエフアイ第二試薬100mMHEPES8.02.0ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンHP-β-CD0.05NaN310mMCholicacid2mM亜硫酸ナトリウム0.12mMDA-6712ku/mLサーモリシンBacillusstearothermophilus由来:大和化成測定には、日立7170S型自動分析装置を用い以下のパラメータで測定した。測定モードとして、3ポイントを選択し、第一反応で総Hb濃度を、第二試薬添加後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ18μl/180μl/36μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、14ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用いた。測定結果は、吸光度で表した。ヘモグロビンコントロールおよびプール検体の感度の変動上記反応液第二試薬は遮光ボトル容器中に保存を用い、市販のヘモグロビンコントロールVL3.5、L4.8、H10.5、VH16.8およびプール検体をサンプルに用い、総ヘモグロビンおよびHbA1cの感度を吸光度として測定した。第一試薬、第二試薬ともに冷蔵または37°Cに2週間保存後、37°Cに保存した第一試薬には冷蔵保存した第二試薬表中、R2を過酷を、また37°Cに保存した第二試薬に対しては冷蔵保存した第一試薬表中、R1を過酷を、また対象には両試薬ともに冷蔵保存したもの表中、冷蔵を用いた。表15より、総ヘモグロビンのシグナルは99以上、HbA1cのシグナルも94以上残存していた。表15のなかで括弧内の数字はサンプル中のヘモグロビン濃度mg/mlである。また、試薬ブランクについても、ロイコ型色素DA-67を含む第二試薬を37°C2週間処理した後においても上昇は認められなかった。実施例16液状試薬の安定性第一試薬30mMPIPES-NaOHpH7.0500mMNaCl0.05NaN30.5mM塩化カルシウム0.1mMALPS同仁化学製3.0アラニネートLN-30日光ケミカル株式会社10u/mLパーオキシダーゼ10mMコール酸和光純薬株式会社15u/mLFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ0.6mM黄色4号第二試薬100mMHEPES8.02.0ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンHP-β-CD0.05NaN310mMCholicacid2mM亜硫酸ナトリウム0.12mMDA-6712Ku/mLサーモリシンBacillusstearothermophilus由来:大和化成測定には、日立7170S型自動分析装置を用い以下のパラメータで測定した。測定モードとして、3ポイントを選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Hb濃度を、第二試薬添加後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ18μl/180μl/36μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、14ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては16、34ポイントを用いた。ヘモグロビンコントロールおよびプール検体の感度の変動上記反応液第二試薬は遮光ボトル容器中に保存を用い、市販のヘモグロビンコントロールVL3.5、L4.8、H10.5、VH16.8およびプール検体をサンプルに用い、総ヘモグロビンおよびHbA1cの感度を測定した。第一試薬、第二試薬を調製直後、そして冷蔵状態で6ヶ月保存した後の2回測定した。検量はHbA1c測定用標準物質JCCLSCRM-004aHECTEFSRCを用い、総ヘモグロビン濃度はシアンメト法により、HbA1c濃度はCRM-004aのHbA1c表示値と前記ヘモグロビン濃度を用いて計算し、自社キャリブレーターに値をトランスファーし、これを用いて計算した。表16より明らかなように、6ヶ月保存後の値は、総ヘモグロビン濃度、HbA1c濃度、HbA1cともに、調製直後の値と同等であった。また、試薬ブランクも上昇していなかった。実施例17全血を用いた測定第一試薬30mMPIPES-NaOHpH7.0500mMNaCl0.05NaN30.5mM塩化カルシウム0.1mMALPS同仁化学製3.0アラニネートLN-30日光ケミカル株式会社10u/mLパーオキシダーゼ10mMコール酸和光純薬株式会社15u/mLFODネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来ケトアミンオキシダーゼ0.6mM黄色4号10u/mlアスコルビン酸オキシダーゼASOB:ロシュ第二試薬100mMPOPSO8.02.0ヒドロキシプロピル-β-サイクロデキストリンHP-β-CD0.05NaN310mMCholicacid2mM亜硫酸ナトリウム0.12mMDA-6712ku/mLサーモリシンBacillusstearothermophilus由来:大和化成日本電子の自動分析装置BM9020を用いた。免疫法デタミナーHbA1c協和メデックス株式会社を用い、添付文書に従い測定した。遠心分離後の血球を用いた検体の希釈は、BM9020装置の希釈機構を用い、蒸留水にて、101倍希釈して測定に用いた。本法分析方式にEPAを選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Hb濃度を、第二試薬添加後の第二反応でHbA1c濃度を測定する。検体/第一試薬/第二試薬の量はそれぞれ12μl/120μl/24μlとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、26-28ポイントを、HbA1cの測光ポイントとしては29-32、62-65ポイントを用いた。測定主波長は、Hbは596nmを、HbA1cは658nmを用い、測定副波長は805nmとした。上記反応液第二試薬は遮光ボトル容器中に保存を用い、血糖用採血管で採血した検体を用いた。検体は測定前に転倒混和した後装置にセットし、装置の希釈機構により蒸留水にて34倍に希釈した。検量はHbA1c測定用標準物質JCCLSCRM-004aHECTEFSRCを用い、総ヘモグロビン濃度はシアンメト法により、HbA1c濃度はCRM-004aのHbA1c表示値と前記ヘモグロビン濃度を用いて計算し、自社キャリブレーターに値をトランスファーし、これを用いて計算した。表17、図7より明らかなように、免疫法血球を使用と酵素法全血を使用の相関係数はy=0.9924x0.1145、R2=0.98と大変良好であった。このことにより、遠心分離後の血球のみならず、遠心分離前の全血での状態でも測定が可能であることが示された。"