"配列番号5、配列番号6又は配列番号7で示される塩基配列中、連続する少なくとも18以上の塩基で示される塩基配列又はその相補配列を含む腸炎ビブリオ菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するためのプローブ。配列番号5、配列番号6又は配列番号7からなる塩基配列又はその相補配列からなる核酸に標識を付した腸炎ビブリオ菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するための請求項1記載のプローブ。微生物試料を培養し微小コロニーを形成させ、請求項1記載の腸炎ビブリオ菌に特異的なプローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、腸炎ビブリオ菌を検出及び又は計数する方法。試料微生物を塩濃度が1以上の培地で37~43°Cで4~10時間培養する請求項3記載の方法。請求項1記載のプローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、腸炎ビブリオ菌を検出及び又は計数するためのキット。微生物試料を培養し微小コロニーを形成させ、配列番号5で表される核酸に標識を付した腸炎ビブリオ菌プローブ、配列番号6で表される核酸に標識を付した腸炎ビブリオ菌プローブ及びは配列番号7で表される核酸に標識を付した腸炎ビブリオ菌プローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、腸炎ビブリオ菌を検出及び又は計数する方法。従来の公定法とされる食品衛生検査指針に従った食中毒原因菌の検出同定法では生菌数測定の最終結果を得るまでに、早いものでも2日間を要する。また菌株によっては一週間以上かかるものもあり、製品の出荷時に評価できるデータの提供ができなかった。また、例えば、エロモナス属に属する細菌エロモナス属細菌と略すの中には、大腸菌群に極めて類似する特徴を示す菌種が知られており、大腸菌群の中からエロモナス属細菌を見極める迅速な技術の開発が望まれているJournalofAppliedMicrobiologyVol936068。さらに、エロモナス属に属する細菌を包括的に検出、計測する技術が望まれており、PCR法では迅速な菌検出ができるが、死菌と生菌の区別ができない問題がある。特に、食品加工分野で重要な、生きた菌を計測する技術の開発が望まれていた。さらに、リステリア菌Listeriamonocytogenesおよびウエルシュ菌Clostridiumperfringensについても、より迅速で、確実な生菌の同定検出、及び又は計数方法の確立が望まれていた。特にウエルシュ菌では、食品中では、芽胞休眠細胞の形で存在するため、FISHでの検査には適していなかった。また、上述したように、従来からの、腸炎ビブリオの検出同定法では生菌数測定に時間がかかり、他方、rRNAを用いる方法も、腸炎ビブリオの小サブユニットrRNA遺伝子は、類縁のビブリオ菌種と塩基配列が似ているため、腸炎ビブリオを特異検出する蛍光オリゴヌクレオチドプローブの開発は困難とされてきた。更にサルモネラ菌及び病原性大腸菌についても、生菌を十分な短時間で、検出同定する方法は、知られていない。本発明者らは、まず1遺伝子データベースから検出対象細菌及び近縁の他の細菌群のリボソーマルRNA遺伝子の配列情報を集め、他の細菌群と区別が可能な遺伝子配列を探し出し特異遺伝子配列を決定した。なお、前記特異的遺伝子配列で表される核酸分子をプローブと呼ぶ。更に、2プローブに蛍光物質等で標識を行った後、検出対象細菌種および非検出細菌種を培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法を用いて特異性判定を行うことができることを見出した。更に、本願出願は以下の発明にも関連する。1配列番号1又は配列番号2で示される塩基配列中、連続する少なくとも18以上の塩基で示される塩基配列又はその相補配列を含むエロモナス属菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するためのプローブ。2配列番号3で示される塩基配列中連続する少なくとも18以上の塩基で示される塩基配列又はその相補配列を含むリステリア属菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するためのプローブ。3配列番号4で示される塩基配列中連続する少なくとも18以上の塩基で示される塩基配列又はその相補配列を含むウエルシュ菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するためのプローブ。4配列番号1又は配列番号2からなる塩基配列又はその相補配列からなる核酸に標識を付したエロモナス属菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するための前記1記載のプローブ。5配列番号3で示される塩基配列又はその相補配列からなる核酸に標識を付したリステリア属菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するための前記2記載のプローブ。6配列番号4で示される塩基配列又はその相補配列からなる核酸に標識を付したウエルシュ菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するための前記3記載のプローブ。7微生物試料を培養し微小コロニーを形成させ、前記1記載のエロモナス属に属する細菌に特異的なプローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、エロモナス属に属する細菌を検出及び又は計数する方法。8試料微生物を塩濃度が015以下の培地で培養する前記7記載の方法。9微生物試料を培養し細菌の微小コロニーを形成させ、前記2記載のリステリア属に属する細菌に特異的なプローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、リステリア属に属する細菌を検出及び又は計数する方法。10微生物試料をポリミキシンB、アクリフラビン塩酸塩及びセフタジジムから選択される1種以上の抗生物質を添加した培地で培養する前記9記載の方法。11ハイブリダイゼーション条件が、ハイブリダイゼーション温度が46°Cから60°Cで、ホルムアミド濃度が46°Cで20~35、60°Cで10~15である範囲内とする、前記9記載の方法。12微生物試料を培養し微小コロニーを形成させ、前記3記載のウエルシュ菌に特異的なプローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、ウエルシュ菌を検出及び又は計数する方法。13微生物試料を70~80°Cで10~30分間培養した後、40から50°Cで嫌気培養する前記12記載の方法。14ハイブリダイゼーション条件が、ハイブリダイゼーション温度が46°Cから60°Cで、ホルムアミド濃度が46°Cで20~35、60°Cで0~15である範囲内とする、前記12記載の方法。15前記1記載のプローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、エロモナス属に属する細菌を検出及び又は計数するためのキット。16前記2記載のプローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、リステリア属に属する細菌を検出及び又は計数するためのキット。17前記3記載のプローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、ウエルシュ菌を検出及び又は計数するためのキット。18配列番号5、配列番号6又は配列番号7で示される塩基配列中、連続する少なくとも18以上の塩基で示される塩基配列又はその相補配列を含む腸炎ビブリオ菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するためのプローブ。19配列番号8で示される塩基配列中連続する少なくとも18以上の塩基で示される塩基配列又はその相補配列を含むサルモネラ菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するためのプローブ。20配列番号9で示される塩基配列中連続する少なくとも18以上の塩基で示される塩基配列又はその相補配列を含む病原性大腸菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するためのプローブ。21配列番号5、配列番号6又は配列番号7からなる塩基配列又はその相補配列からなる核酸に標識を付した腸炎ビブリオ菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するための前記18記載のプローブ。22配列番号8で示される塩基配列又はその相補配列からなる核酸に標識を付したサルモネラ菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するための前記19記載のプローブ。23配列番号9で示される塩基配列又はその相補配列からなる核酸に標識を付した病原性大腸菌を特異的に検出、同定、及び又は計測するための前記20記載のプローブ。24微生物試料を培養し微小コロニーを形成させ、前記18記載の腸炎ビブリオに属する細菌に特異的なプローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、腸炎ビブリオ属に属する細菌を検出及び又は計数する方法。25試料微生物を塩濃度が1以上の培地で37~43°Cで4~10時間培養する前記24記載の方法。26微生物試料を培養し細菌の微小コロニーを形成させ、前記19記載のサルモネラ菌に属する細菌に特異的なプローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、サルモネラ菌に属する細菌を検出及び又は計数する方法。27微生物試料を30~43°Cで4~10時間培養する前記26記載の方法。28ハイブリダイゼーション条件が、ハイブリダイゼーション温度が46°Cで、ホルムアミド濃度が25~40及び60°Cでホルムアミド濃度が20である範囲内とする、前記26記載の方法。29微生物試料を培養し微小コロニーを形成させ、前記20記載の病原性大腸菌に特異的なプローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、病原性大腸菌を検出及び又は計数する方法。30微生物試料を30~44°Cで4~8時間培養する前記29記載の方法。31ハイブリダイゼーション条件が、ハイブリダイゼーション温度が46°Cで10~40及び60°Cでホルムアミド濃度が20である範囲内とする、前記29記載の方法。32前記18記載のプローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、腸炎ビブリオに属する細菌を検出及び又は計数するためのキット。33前記19記載のプローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、サルモネラ菌を検出及び又は計数するためのキット。34前記20記載のプローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、病原性大腸菌を検出及び又は計数するためのキット。35微生物試料を培養し微小コロニーを形成させ、配列番号5で表される核酸に標識を付した腸炎ビブリオ菌プローブ、配列番号6で表される核酸に標識を付した腸炎ビブリオ菌プローブ及びは配列番号7で表される核酸に標識を付した腸炎ビブリオ菌プローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、腸炎ビブリオ属に属する細菌を検出及び又は計数する方法。36微生物試料を培養し微小コロニーを形成させ、前記1,2,3、18,19又は20いずれか記載の食中毒細菌に特異的なプローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーション法により、食中毒細菌を検出及び又は計数する方法。本願発明の方法により、食中毒原因菌の検出同定法では生菌数測定の最終結果を得るまで10時間以内で終わらせることも可能であり、きわめて優れた効果を奏する。本発明は、短時間培養で生じた微小な細菌集落の中から、食中毒細菌あるいは衛生指標細菌を特異的に検出することを可能にする一連の方法である。培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法では、検査対象細菌の持つ遺伝子の特定塩基配列に相補的に結合するオリゴヌクレオチドを調製すれば、様々な食中毒細菌や衛生指標細菌の検出計数に応用ができる。本発明者らは、新しい遺伝子プローブ、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法で検査対象細菌を特異的に検出する反応条件及び微小集落至適形成条件を初めて決定した。1.培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法1-1.培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法の特徴/利点従来からの蛍光ラベルしたプローブを用いるインサイチューハイブリダイゼーション法では、次のような問題点があった。1特に食品を汚染する微生物の同定検出のためには、蛍光標識プローブでは、微生物が増殖した段階、すなわち汚染が相当に進まないと検出できない。2食品汚染においては、特に生菌数が問題となるところ、プローブは死菌に対してもハイブリダイズしてしまうので、生菌と死菌との区別がつかなかった。これに対し、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法では、十分に希釈された試料を1~10時間程度培養することにより、生菌のみを増殖させ、微小なコロニー状とすることにより、通常の蛍光顕微鏡下で、コロニーを観測、計数することができるようになったものである。3更に、通常のインサイチューハイブリダイゼーション法では、誤って陽性と判別される混入菌を、培養併用することで、培養条件を調節して、擬陽性を除くこともできる。1-2.培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法の概要1試料の固着、例えば、メンブレンフィルター上への試料の捕集食品、環境等から分離された試料を捕集する試料捕集体、例えば、ポリカーボネート製やセルロースアセテート製フィルター上へ吸引することにより捕集させられる。フィルターとしては、例えば、ヌクレオポアフィルター、アイソポアフィルター、マイレクスフィルターを用いることができ、好適には、例えば04μmの孔径のフィルターアイソポアメンブレンフィルターを用いることができる。2試料の培養マイクロコロニーの形成試料が付着した試料捕集体、例えば、メンブレンフィルターは、培地の入ったペトリ皿に移される。37°Cで、マイクロイコロニーが形成さえるまで、例えば、1~10時間、好適には4~8時間、例えば、6時間培養される。3蛍光標識を用いた場合の細菌の検出及び細菌数計測の概要イエタノールなどでスライドグラス又はフィルター上の細胞が固定される。フィルターはスライドガラスに固定される。ロエタノール浸漬又はオーブン等で乾燥される。ハハイブリダイゼーション用バッファーにスライドガラスごとフィルターは浸漬されハイブリダイゼーション温度でインキュベートする。ニオリゴヌクレオチドプローブが添加され、インキュベーションを継続する。ホ試料の載せられたフィルター又はスライドガラスを洗浄し、空気乾燥される。ヘ蛍光顕微鏡で観察する。通常X10~X1000で観察できる。1-3.本件発明のプローブの調製16SrRNA及び23SrRNAを同定、検出及び又は計数用のプローブの対象遺伝子として用いた。1-3-1エロモナス属細菌検出用プローブ具体的には、1エロモナス属に属する種及びこれに近縁の系統の細菌、具体的には、AlcaligenesVibrioShewanellaBrenneriaPseudoalteromonasおよび腸内細菌科に属する菌の16SrRNAの塩基配列を収集し、エロモナス属に共通である塩基配列であって、しかも近縁の系統の細菌、具体的にはAlcaligenesVibrioShewanellaBrenneriaPseudoalteromonasおよび腸内細菌科に属する菌とはミスマッチする約20塩基の塩基配列を検索する。2検索により、エロモナス属細菌に共通な塩基配列とマルチプルアライメントに用いた上記各菌種の16SrRNAの同領域の塩基配列を比較し、エロモナス属以外の菌種に対しては比較的ミスマッチ数が大きく、エロモナス菌種に対してはミスマッチの少ないものを、エロモナス属細菌特異的プローブ候補として選択した。この操作は、onlineprobemerhttpprobemercsloyolaeduで検証することが可能である。3つぎに、実際に、エロモナス属細菌プローブ候補を用いてエロモナス属細菌及び非エロモナス属をFISH法によりアッセイした。その結果エロモナス属細菌試料のほとんどから蛍光が検出され、またプローブを加えないFISHでは蛍光が認められないプローブをエアロモナス属検出用プローブとすることができる。その配列は、GCAAGCTACTTTCCCGCTGCCGCT配列番号1:プローブ名AERmrf24塩基およびGCTAGCTTGCAGCCCTCTGTACGC配列番号2:プローブ名AERmmr24塩基あるいは、両者ともその近辺の配列を含むものである。なお、これらの配列の相補配列をプローブに用いることができる。GCAAGCTACTTTCCCGCTGCCGCT配列番号1:プローブ名AERmrf24塩基およびGCTAGCTTGCAGCCCTCTGTACGC配列番号2:プローブ名AERmmr24塩基を用いるほうがより好適である。1-3-2リステリア菌Listeriamonocytogenesリステリア属に属する種のプローブは、23SrRNA遺伝子配列を元に設計した。具体的には、1リステリア属に属する種及び近縁の系統の細菌、具体的にはBacillusStaphylococcusEnterococcusBrochothrix及びLactobacillusに属する菌の23SrRNAの塩基配列を収集し、リステリア属に共通である塩基配列であって、しかもこれら近縁の系統の細菌とはミスマッチする約20塩基の塩基配列を検索する。2検索により、リステリア属細菌に共通な塩基配列とマルチプルアライメントに用いた上記各菌種の23SrRNAの同領域の塩基配列を比較し、リステリア属以外の菌種に対しては比較的ミスマッチ数が大きく、リステリア属菌種に対してはミスマッチの少ないものを、リステリア属細菌特異的プローブ候補として選択した。3つぎに、実際に、リステリア属細菌プローブ候補を用いてリステリア属細菌及び非リステリア属をFISH法によりアッセイした。その結果リステリア属細菌試料のほとんどから蛍光が検出され、またプローブを加えないFISHでは蛍光が認められないプローブをリステリア属検出用プローブとすることができる。好適には、プローブ用の配列は、CGCACATTTCCATTCGTGCGATTCC配列番号3:プローブ名LIS1400あるいはその近辺の配列を含むものである。これらの配列の相補配列もプローブに用いることが可能ではある。CGCACATTTCCATTCGTGCGATTCC配列番号3:プローブ名LIS1400をプローブに用いることが、より好適である。1-3-3ウエルシュ菌エロモナス属に属する菌と基本的には同様に行った。具体的には、1ウエルシュ菌及び近縁のClostridumBacillus及びDesulfotomaculum属に属する菌の16SrRNAの塩基配列を収集し、ウエルシュ菌に共通である塩基配列であって、しかも近縁のClostridiumBacillus及びDesulfotomaculum属に属する菌とはミスマッチする約20塩基の塩基配列を検索する。2検索により、ウエルシュ菌に共通な塩基配列とマルチプルアライメントに用いた上記各菌種の16SrRNAの同領域の塩基配列を比較し、ウエルシュ菌以外の菌種に対しては比較的ミスマッチ数が大きく、ウエルシュ菌種に対してはミスマッチの少ないものを、ウエルシュ菌特異的プローブ候補として選択した。この操作は、onlineprobemerhttpprobemercsloyolaeduで検証することが可能である。3つぎに、実際に、ウエルシュ菌プローブ候補を用いてウエルシュ菌及び非ウエルシュ菌をFISH法によりアッセイした。その結果ウエルシュ菌試料のみから蛍光が検出され、またプローブを加えないFISHでは蛍光が認められないプローブをウエルシュ菌検出用プローブとすることができる。具体的には、AATGATGATGCCATCTTTCAACA配列番号4:プローブ名CLP18023塩基あるいはその近辺の配列を含むものを挙げることができる。これらの配列の相補配列も用いることが可能ではある。AATGATGATGCCATCTTTCAACA配列番号4:プローブ名CLP18023塩基を用いることが好適である。1-3-4腸炎ビブリオVibrioparahaemolyticusエロモナス属に属する菌と基本的には同様に行った。具体的には、1腸炎ビブリオに近縁の系統の細菌、具体的には、VibrioShewanellaおよびPhotobacteriumに属する菌の16SrRNAの塩基配列を収集し、腸炎ビブリオに共通である塩基配列であって、しかも近縁の系統の細菌、具体的にはVibriocampbelliiVrotiferianusVharveyiVnatriegenesVproteolyticusValginolyticusVscophthalmiVtubiashiiVfurnissiiVfluvialisVorientalisVcoralliilyticusVichthyoenteriおよびVaestuarianusなどのVibiro属菌種とはミスマッチする約2030塩基の塩基配列を検索する。2検索により、腸炎ビブリオに共通な塩基配列とマルチプルアライメントに用いた上記各菌種の16SrRNAの同領域の塩基配列を比較し、腸炎ビブリオ以外の菌種に対しては比較的ミスマッチ数が大きく、腸炎ビブリオに対してはミスマッチの少ないものを、腸炎ビブリオ特異的プローブ候補として選択した。この操作は、onlineprobemerhttpprobemercsloyolaeduで検証することが可能である。3つぎに、実際に、腸炎ビブリオプローブ候補を用いて腸炎ビブリオ及び非腸炎ビブリオをFISH法によりアッセイした。その腸炎ビブリオ菌株試料のほとんどから蛍光が検出され、またプローブを加えないFISHでは蛍光が認められないプローブを腸炎ビブリオ検出用プローブとすることができる。具体的には、actacactaccttcctcacgactgaaa配列番号5、プローブ名Vpa437probe27塩基あるいはその近辺の配列を含むもの、ロtgcaattccgaggttgagccccgg配列番号6プローブ名Vpa61224塩基あるいはその近辺の配列を含むもの、又はハcactttcgcaagttggctgccc配列番号7プローブ名Vpa1255probeあるいはその近辺の配列を含むものを挙げることができる。これらの配列の相補配列も用いることが可能ではあるが、actacactaccttcctcacgactgaaa配列番号5、プローブ名Vpa437probe27塩基、tgcaattccgaggttgagccccgg配列番号6プローブ名Vpa61224塩基、及びcactttcgcaagttggctgccc配列番号7プローブ名Vpa1255probeが好適である。1-3-5サルモネラ菌エロモナス属に属する菌と基本的には同様に行った。具体的には、1サルモネラ菌に近縁の系統の細菌、具体的には、SalmonellaEnterobacterCitrobacterPantoeaおよびKluyveraに属する菌の16SrRNAの塩基配列を収集し、サルモネラ菌に共通である塩基配列であって、しかも近縁の系統の細菌、具体的にはSalmonellabongoriEnterobactersakazakiCitorbacerkoseriPantoeaagglomeransなどの菌種とはミスマッチする約20~30塩基の塩基配列を検索する。2検索により、サルモネラに共通な塩基配列とマルチプルアライメントに用いた上記各菌種の16SrRNAの同領域の塩基配列を比較し、サルモネラ以外の菌種に対しては比較的ミスマッチ数が大きく、サルモネラに対してはミスマッチの少ないものを、サルモネラ特異的プローブ候補として選択した。この操作は、onlineprobemerhttpprobemercsloyolaeduで検証することが可能である。3つぎに、実際に、サルモネラプローブ候補を用いてサルモネラ及び非サルモネラをFISH法によりアッセイした。そのサルモネラ試料のほとんどから蛍光が検出され、またプローブを加えないFISHでは蛍光が認められないプローブをサルモネラ検出用プローブとすることができる。具体的には、gctgcggttattaaccacaacaccccttc配列番号8プローブ名Sal45329塩基あるいはその近辺の配列を含むものを挙げることができる。これらの配列の相補配列も用いることが可能ではあるが、gctgcggttattaaccacaacaccccttc配列番号8プローブ名Sal45329塩基が好適である。1-3-6病原性大腸菌エロモナス属に属する菌と基本的には同様に行った。具体的には、1病原性大腸菌に近縁の系統の細菌、具体的には、EscherichiaSalmonellaEnterobacterCitrobacterPantoeaおよびKluyveraに属する菌の16SrRNAの塩基配列を収集し、病原性大腸菌に共通である塩基配列であって、しかも近縁の系統の細菌、具体的にはEnterobactersakazakiCitorbacerkoseriPantoeaagglomeransなどの菌種とはミスマッチする約2030塩基の塩基配列を検索する。2検索により、病原性大腸菌に共通な塩基配列とマルチプルアライメントに用いた上記各菌種の16SrRNAの同領域の塩基配列を比較し、病原性大腸菌以外の菌種に対しては比較的ミスマッチ数が大きく、病原性大腸菌に対してはミスマッチの少ないものを、病原性大腸菌特異的プローブ候補として選択した。この操作は、onlineprobemerhttpprobemercsloyolaeduで検証することが可能である。3つぎに、実際に、病原性大腸菌プローブ候補を用いて病原性大腸菌及び非病原性大腸菌をFISH法によりアッセイした。その病原性大腸菌試料のほとんどから蛍光が検出され、またプローブを加えないFISHでは蛍光が認められないプローブをサルモネラ検出用プローブとすることができる。具体的には、gaagcaagcttcttcctgttaccg配列番号9プローブ名Eco6724塩基あるいはその近辺の配列を含むものを挙げることができる。これらの配列の相補配列も用いることが可能ではあるが、gaagcaagcttcttcctgttaccg配列番号9プローブ名Eco6724塩基が好適である。1-4.本件発明のプローブの標識上記1-3で調製されたプローブは、検出可能な標識、例えば、蛍光標識、アイソトープ標識、アルカリフォスファターゼなどの酵素標識、ビオチン標識などの標識をすることができる。好適には、蛍光標識をし、具体的には、例えば、TAMRANNN’N’Tetramethyl6carboxyrhodamine、FITC又は各種AlexaFluorMolecularprobeで標識することができる。2.新規プローブを用いた培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法の確立2-1.培養条件の検討2-1-1エロモナス属エロモナス属と近縁関係にあり、特異的なプローブが擬陽性を生ずる可能性がある、ビブリオ属細菌、フォトバクテリウム属、およびシュードアルテロモナス属、およびアルテロモナス属細菌は、増殖に塩類を必要とする。他方、エロモナス属細菌は、塩類の存在無しに増殖できる。そこで、普通寒天培地で、増殖することにより、エロモナス属に対する特異性を挙げることができる。培養時間及び温度としては、例えば、1~10時間、25°C~36°Cで培養でき、好適には、4~8時間培養することができる。2-1-2リステリア菌リステリアモノサイトゲネスと近縁関係にあり、特異的なプローブが擬陽性を生ずる可能性がある、バチルス属、スタフィロコッカス属は、ポリミキシンB、アクリフラビン塩酸塩、セフタジジムなどの抗生物質に感受性を示す。他方、リステリアモノサイトゲネスは、ポリミキシンB、アクリフラビン塩酸塩、セフタジジムなどの抗生物質に耐性を示す。そこで、ポリミキシンB、アクリフラビン塩酸塩、セフタジジムなどの抗生物質を添加した培地、具体的にはパルカム選択培地で、増殖することにより、リステリアモノサイトゲネスに対する特異性を高めることができる。培養時間及び温度としては、例えば、1~10時間、25°C~36°Cで培養でき、好適には、4~8時間培養することができる。2-1-3ウエルシュ菌培養時間及び温度としては、例えば、1~10時間、25°C~36°Cで培養でき、好適には、4~8時間培養することができる。なお、ウエルシュ菌は、耐熱性芽胞を形成し、46°Cの高温下で、嫌気条件下で増殖が可能であるが、ウエルシュ菌と近縁関係にあり、特異的なプローブが擬陽性を生ずる可能性がある、バチルス属、スタフィロコッカス属、およびグラム陰性細菌は、ウエルシュ菌よりも強い耐熱性芽胞を形成せず、46°Cで嫌気条件下で増殖する種は少ない。そこで、ウエルシュ菌の耐熱性芽胞を残存させる加熱処理、好適には75°C、20分間の処理を行った後、46°C、嫌気条件下で、好適には1時間から6時間、増殖することにより、ウエルシュ菌に対する特異性を高めることもできる。2-1-4腸炎ビブリオビブリオ属に属するひとつの菌種である。腸炎ビブリオは、普通寒天培地には増殖せず、23の食塩添加で増殖がよい。至適増殖温度が3037°Cであり、42°Cまでは増殖が可能である。特異的なプローブが擬陽性を生ずる可能性がある多くのビブリオ属細菌種とは、3742度での増殖速度が異なる。培養時間及び温度としては、例えば、1~10時間、30°C~42°Cで培養でき、好適には、40~43°Cで、4~10時間培養することができる。2-1-5サルモネラ菌サルモネラ菌は、腸内細菌科に属する細菌と近縁であり、特異的なプローブが擬陽性を生ずる可能性がある、大腸菌、エンテロバクター、シトロバクターとは生化学的性状と血清反応で見分けることができる。培養時間及び温度としては、例えば、1~10時間、30°C~43°Cで培養でき、好適には、4~8時間培養することができる。2-1-6病原性大腸菌病原性大腸菌は、ヒトや温血動物の腸内に常在する大腸菌と同一の種であり、生化学的性状で両者を見分けることは難しい。特異的なプローブが擬陽性を生ずる可能性がある大腸菌とは、血清型および毒素型の試験が必要である。また、特異的なプローブが擬陽性を生ずる可能性があるマンヘイミア属の細菌は普通栄養寒天培地で37°Cで増殖が遅く、この培養条件により区別ができる。培養時間及び温度としては、例えば、1~10時間、30°C~44°Cで培養でき、好適には、4~8時間培養することができる。2-2.ハイブリダイゼーション条件の検討それぞれのプローブについて、ハイブリダイゼーション温度及びホルムアミドの濃度を変化させ、プローブの特異性を確認した。例えば、ハイブリダイゼーション温度としては、45°Cから60°Cまでの間の温度で、ホルムアミド濃度を20から45まで変化させ、目的の特異性が示されるハイブリダイゼーション条件を定めることができる。たとえば、エロモナス属菌特異的プローブGCAAGCTACTTTCCCGCTGCCGCT配列番号1プローブ名AERmrf24塩基およびGCTAGCTTGCAGCCCTCTGTACGC配列番号2プローブ名AERmmr24塩基については、以下の通りハイブリダイゼーション条件を検討した。AERmrfの配列及びAERmmrの配列と、ミスマッチが少ない16SrRNAを有する微生物をまず、データベースより抽出し、これら、微生物について、上記した、ハイブリダイゼーション条件下で、蛍光標識したAERmrf又はAERmmrとハイブリダイズするかを蛍光顕微鏡で確認し、AERmrf及びAERmmrがエロモナス属菌にのみ又は、エロモナス属菌以外へのハイブリダイズが少なく、エロモナス属菌とは十分ハイブリダイズする条件を検討し決定した。AERmrfプローブは、ホルムアミド濃度が275~45の反応液を用い、60°Cで反応させることにより、高い特異性を示した。AERmrrプローブは、ホルムアミド濃度が275~45の反応液を用い、60°Cで反応させること、又はホルムアミド濃度が45の反応液を用いて、46°Cで反応させることにより、Pphosphoreum以外とは高い特異性を示した。同様にプローブLIS1400についても、リステリア属に属する種及び近縁の系統の細菌、具体的にはBacillusStaphylococcusEnterococcusBrochothrix及びLactobacillusに属する菌にはハイブリダイズせず、リステリア属に属する種とは確実にハイブリダイズする条件として46°Cでホルムアミド濃度が20~35、及び60°Cでホルムアミドが10~15の条件を採用することができる。また、プローブCLP180についても、ウエルシュ菌については、46°Cでホルムアミド濃度が20~30、60°Cでホルムアミド濃度が0~15の条件を採用することができる。プローブVpa437についても、ビブリオ属の近縁種、具体的にはVibriopelagiusVordaliiVgazogenesPhotobacteriumdamselaeにはハイブリダイズせず、腸炎ビブリオとは確実にハイブリダイズする条件として46°Cでホルムアミドが10~40条件を採用することができる。プローブVpa612についても、ビブリオ属の近縁種、具体的にはVibriometchnikoviiVcholeraeVmimicusShewanellaalgaeなどにはハイブリダイズせず、腸炎ビブリオとは確実にハイブリダイズする条件として46°Cでホルムアミド濃度が30~40条件を採用することができる。プローブVpa1255についても、ビブリオ属の近縁種、具体的にはVibriocampbelliiVrotiferianusmetchnikoviiVvulnificusVproteolyticusVharveyiなどにはハイブリダイズせず、腸炎ビブリオとは確実にハイブリダイズする条件として46°Cでホルムアミド濃度が25~40条件を採用することができる。プローブSal453についても、サルモネラ属の近縁種、具体的にはEnterobacterintermediusCitrobacterkoseriPantoeaagglomeransなどにはハイブリダイズせず、サルモネラ菌とは確実にハイブリダイズする条件として46°Cでホルムアミド濃度が10~40条件及び60°Cでホルムアミド濃度が20の条件を採用することができる。プローブEco67についても、病原性大腸菌の近縁種、具体的にはSalmonellabongoriCitrobacterkoseriKlebsiellaplanticolaEnterobactersakazakiiSalmonellaentericaなどにはハイブリダイズせず、病原性大腸菌とは確実にハイブリダイズする条件として、46°Cでホルムアミド濃度が10~40条件及び60°Cでホルムアミド濃度が20の条件を採用することができる。各プローブがハイブリダイズする条件は、以下のハイブリダイズ固有値の範囲を用いて表すこともできる。ハイブリダイゼーション固有値は次の通り定義される。[数1]ハイブリダイズ固有値K°C=ハイブリダイゼーション温度°C0.7°CXホルムアミド濃度AERmrfプローブについては、ハイブリダイゼーション固有値は6007°CX275以上、6007°CX45以下の範囲を採用できる。AERmrrプローブについては、ハイブリダイゼーション固有値は6007°CX275以上、6007°CX45以下、又は4607°CX45の範囲を採用できる。プローブLIS1400については、ハイブリダイゼーション固有値は6007°CX10以上、6007°CX20以下、又は4607°CX20以上、4607°CX35以下の範囲を採用できる。プローブCLP180については、ハイブリダイゼーション固有値は60以上6007°CX15以下、又は4607°CX20以上、4607°CX30以下の範囲を採用できる。Vpa437プローブについては、ハイブリダイゼーション固有値は4607°CX10以上、4607°CX40以下の範囲を採用できる。Vpa612プローブについては、ハイブリダイゼーション固有値は4607°CX30以上、4607°CX40以下の範囲を採用できる。Vpa1255プローブについては、ハイブリダイゼーション固有値は4607°CX25以上、4607°CX40以下の範囲を採用できる。Sal453プローブについては、ハイブリダイゼーション固有値は4607°CX10以上、4607°CX40以下の範囲、又は6007°CX20を採用できる。Eco67プローブについては、ハイブリダイゼーション固有値は4607°CX10以上、4607°CX40以下の範囲、又は6007°CX20を採用できる。なお、上記したAERmrfプローブ、AERmrrプローブ、LIS1400プローブ、プローブ名CLP180、Vpa437プローブ、Vpa612プローブ、Vpa1255プローブ、Sal453プローブ、Eco67プローブいずれの条件も、ホルムアミド以外は標準的なハイブリダイゼーションバッファー09MNaCl、20mMTrisHCl、001SDS、pH74を用いた場合の条件であるが、上記のハイブリダイゼーションの範囲をもとに他のバッファーの条件も、当業者であれば、容易に確定することができる。2-3.標的細菌の検出及び細菌数の計測及びそのためのキット培養されたフィルター等試料捕集体上の細菌を固定する。好適には、室温で、エタノールで固定する。その後フィルターは、透過性のフィルター固定支持体に載せられる。計測を蛍光顕微鏡で行う場合には、固定支持体としては、スライドガラスを用いることができるが、他の標識測定装置により計測する場合には、当該標識測定装置に取り付けでき計測可能な支持体であれば、いかなる固定支持体も用いることができる。支持体に固定されたフィルターは乾燥される。好適には、80°C10分間乾燥機で乾燥させる。乾燥されたスライドグラス等の固定支持体に、ハイブリダイゼーションバッファーが与えられる。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、例えば、09MNaCl、20フォルムアミド、20mMTrisHCl、001SDSpH74からなるハイブリダイゼーション溶液を挙げることができる。ハイブリダイゼーションバッファーで、1分~5分間のプレインキュベーション後、標識された特異的プローブ及を添加する。プローブとのハイブリダイゼーションは、5分~1時間行うことができる。ハイブリダイゼーション後、フィルターの乗せられた固定支持体は、緩衝液で洗浄される。洗浄用の緩衝液としては、例えば、20mmollTrisHCl、180mmollNaCl001SDSpH74を含む洗浄液を用いることができる。緩衝液での洗浄後、蒸留水で洗浄する。ハイブリダイゼーション及び洗浄は、前記標識プローブを用いた場合には、ハイブリダイゼーションを46°Cあるいは60°Cで、5分~1時間をおこない、洗浄を48°Cあるいは62°Cで、それぞれ20分間行うことができる。洗浄後、乾燥し、液浸し、蛍光を用いる蛍光顕微鏡などの標識を観測又は測定する装置で微小コロニーを観測、計数することができる。培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により同定及び又は計数するための試薬等をキットとすることができる。イ配列番号1又は配列番号2で示される塩基配列中、連続する少なくとも18以上の塩基で示される塩基配列又はその相補配列を含むエロモナス属菌特異的プローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、エロモナス属に属する細菌を検出及び又は計数するためのキット、ロ配列番号3で示される塩基配列中連続する少なくとも18以上の塩基で示される塩基配列又はその相補配列を含むリステリア属菌特異的プローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、リステリア属に属する細菌を検出及び又は計数するためのキット、ハ配列番号4で示される塩基配列中連続する少なくとも18以上の塩基で示される塩基配列又はその相補配列を含むウエルシュ菌特異的プローブ、ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄液を含む、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、ウエルシュ菌を検出及び又は計数するためのキットを挙げることができる。これらキットには、更に、メンブレンフィルター、又は培地のいずれか、又はその組み合わせを含ませることができる。ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄液、及び培地は、前記したものを用いることができる。エロモナス属細菌特異的プローブを用いた培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法によるエロモナス属細菌の検出、計数1.プローブの調製プローブとしては、GCAAGCTACTTTCCCGCTGCCGCT配列番号1プローブ名AERmrf24塩基およびGCTAGCTTGCAGCCCTCTGTACGC配列番号2プローブ名AERmmrを用いた。プローブは、FITCで、5’末端側に付与したアミノ基を介して蛍光標識された。1-1.プローブの特異性の予備確認AERmrf及びAERmrrプローブの配列の特異性は、リボゾームデータベースプロジェクトRDPのプローブチェックプログラム及び実際の菌株に対する特異性試験により判別した。まず、RDPのプローブチェックプログラムにより、各プローブ配列との配列の差異が0塩基から3塩基の細菌を選択した表1。このオンラインプログラムにより、各プローブの特異性が予備的に判断でき、この結果から、表23にある実際のプローブ特異反応のための陽性及び陰性対照菌株を設定した。実際のプローブの特異性は、AERmrfでは、AhydrophilaとAveroniiをプローブとの差異のない0塩基ミスマッチ陽性菌株とし、Sbaltica及びShanedaiをそれぞれ2及び3塩基の差異を持つ陰性の対照菌株とし、AERmrrでは、Ahydrophilaをプローブとの差異のない0塩基ミスマッチ陽性菌株とし、Vfischeriを1塩基の差異のある陰性の対象菌株、Vanguillarum及びPphosphoreumを2塩基の差異を持つ陰性の対照菌株、並びにVmetchnikoviiを3塩基の差異を持つ陰性の対照菌株とすることとした。2.スライドグラス上でのインサイチューハイブリダイゼーション1上記で対象菌株とされた各種細菌株をTrypticSoyaBrothで一晩前培養30°Cした細胞を、遠心分離で集めた後、菌体に4パラフォルムアルデヒド‐リン酸緩衝液PBSを300μl加え、4°Cで1~3時間固定した。2この固定した細菌細胞の3μlをスライドグラス上に載せ、風乾後、50、80および100エタノールに順次3分間浸漬することで脱水を行った。3スライドグラス上の固定した細菌細胞上へあらかじめ46°Cあるいは60°Cに加温しておいたハイブリダイゼーション溶液09MNaCl、20mMTrisHCl、001SDS、pH74なお、ホルムアミドは2045濃度で変化させた。を8μl注加し、46°Cあるいは60°Cで5分間プレハイブリダイゼーションを行った後、5pmolμlのプローブ溶液を1μl加え、いずれのプローブとも、46°Cあるいは60°Cで1時間ハイブリダイゼーションを行った。4ハイブリダイゼーション後、スライドグラスをあらかじめ48°Cおよび62°Cで加温した46°Cでハイブリダイゼーションした場合は48°Cで洗浄し、60°Cでハイブリダイゼーションした時は62°Cで洗浄した洗浄液20mMTrisHCl、40~220mMNaCl、001SDS、pH74に20分間浸漬した後、滅菌蒸留水で残留する洗浄液を洗い流した。5スライドグラスを風乾後、ガラス上の細菌細胞を蛍光顕微鏡で観察し、細菌細胞の蛍光具合から両プローブの特異性を判定した。3.特異培養条件の設定培養併用FISH法により、上記特異性を評価したプローブの特異性を向上させるための培養条件を鋭意設定した。1スライドグラス上でプローブの特異性判定試験に供試した陽性細菌および陰性細菌を、プローブ陽性菌の微小コロニー形成の優れた培地で培養し、陰性菌の増殖の有無又は強弱を判定した。2プローブ陽性菌および陰性菌をフィルター上に捕集した後、4~8時間培養し、微小コロニーを形成させた。このフィルター上のコロニーをエタノール固定した後、スライドグラス上でのインサイチューハイブリダイゼーション法と同様に、FISH反応を行った。結果結果を、表23に示す。AERmrfは、濃度275以上の45以下のホルムアミドを加えた反応液中で60°Cで反応させることで、特異性が認められ、エロモナス細菌を特異的に検出した。また、AERmmrも、濃度275以上45以下のホルムアミドを加えた反応液中で60°Cで反応させるとビブリオフィシェリおよびフォトバクテリウムフォスフォリウムを除き、特異的に反応した。また、エロモナスは増殖に塩類を必要としないのに対し、ビブリオフィシェリおよびフォトバクテリウムフォスフォリウムは増殖に3の塩化ナトリウムを要求することから、微小コロニーの形成に用いる培地に塩類無添加培地を用いる培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により、特異検出が可能であった。結果を図1にしめす。リステリア菌特異的プローブを用いた培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法によるリステリア菌の検出及び計数1.リステリアプローブの調製プローブ用の配列は、CGCACATTTCCATTCGTGCGATTCC配列番号3:プローブ名LIS1400を用いた。LIS1400プローブは、プローブの5’末端に導入したアミノ基を介して、AlexaFluor594で標識した。1-2.プローブの特異性の予備確認LIS1400プローブの配列の相同性検索及び実際の菌株に対する特異性試験により判別した。まず、BLASTプログラムにより、LIS1400プローブ配列との配列の差異が0塩基から3塩基間での細菌を選択した。このオンラインプログラムにより、各プローブの特異性が予備的に判断でき、この結果から、表45に掲げた菌株を実際のプローブ特異反応のための陽性及び陰性対照菌株を設定した。2インサイチューハイブリダイゼーション法によるリステリア菌の検出、計数1上記で選定した表45に掲げた各種細菌株をTrypticSoyaBrothで一晩前培養30°Cした細胞を、遠心分離で集めた後、菌体に4パラフォルムアルデヒド‐リン酸緩衝液PBSを300μl加え、4°Cで1~3時間固定した。2この固定した細菌細胞の3μlをスライドグラス上に載せ、風乾後、50、80および100エタノールに順次3分間浸漬することで脱水を行った。3スライドグラス上の固定した細菌細胞上へあらかじめ46°Cあるいは60°Cに加温しておいたハイブリダイゼーション溶液09MNaCl、20mMTrisHCl、001SDS、pH74なお、ホルムアミドは、0‐35で変化させた。の8μlを注加し、46°Cあるいは60°Cで5分間プレハイブリダイゼーションを行った後、5pmolμlのプローブ溶液を1μl加え、いずれのプローブとも、46°Cあるいは60°Cで1時間ハイブリダイゼーションを行った。4ハイブリダイゼーション後、スライドグラスをあらかじめ48°C及び62°Cで加温した46°Cでハイブリダイゼーションした場合は48°Cで洗浄し、60°Cでハイブリダイゼーションした時は62°Cで洗浄した洗浄液20mMTrisHCl、100~180mMNaCl、001SDS、pH74に20分間浸漬した後、滅菌蒸留水で残留する洗浄液を洗い流した。5スライドグラスを風乾後、ガラス上の細菌細胞を蛍光顕微鏡で観察し、細菌細胞の蛍光具合から両プローブの特異性を判定した。3.培養併用FISH法による計数精度の確認上記特異性を評価したプローブを用い、培養併用FISH法による計数精度を、既知の平板培養法と比べ、確認した。1スライドグラス上でプローブの特異性判定試験に供試した陽性細菌および陰性細菌を、プローブ陽性菌の微小コロニー形成の優れた培地で培養し、陰性菌の増殖の有無又は強弱を判定した。2プローブ陽性菌および陰性菌をフィルター上に捕集した後、8時間培養し、微小コロニーを形成させた。このフィルター上のコロニーをエタノール固定した後、スライドグラス上でのインサイチューハイブリダイゼーション法と同様に、FISH反応を行った。結果結果を表45に示す。表中で、は強い蛍光が検出されたことを、は蛍光が検出されたことを、は蛍光が検出されなかったことを示しており、表45から、本プローブLIS1400がリステリア属に属する種及び近縁の系統の細菌にはハイブリダイズせず、リステリア属に属する種とは確実にハイブリダイズする条件として46°Cでホルムアミド濃度が20~35、及び60°Cでホルムアミド濃度が10~15の条件が見出された。また、結果の例黄色ブドウ球菌を図2に示す。リステリア属細菌への特異的なハイブリッド形成が示され、非リステリア属細菌のDNAあるいはRNAにはハイブリッド形成を行わなかった。従って、上記1.で発明したプローブLIS1400がリステリア属細菌の特異的検出同定に有効であることが示された。さらに、フィルター上に捕集したリステリア菌を酵母エキス添加トリプトンソーヤ寒天培地上で8時間培養後、LIS1400プローブを用いた培養併用FISH法で微小集落数を計数した。一方、同細菌試料をTSAYE培地またはリステリア用選択培地PALCAMを用いて平板培養法で計数した。その計数値は、培養併用FISH法では、X109CFUml、TSAYE平板培養法では、X109CFUmlであり、PALCAM平板培養法ではX109CFUmlとなり、これらの間に有意な差は認められなかった。ウェルシュ菌プローブを用いたインサイチューハイブリダイゼーション法によるウェルシュ菌の検出及び計数1.ウェルシュ菌プローブの調製プローブとしては、AATGATGATGCCATCTTTCAACA配列番号4:プローブ名CLP18023塩基をもちいた。CLP180プローブは、プローブの5’末端に導入したアミノ基を介して、AlexaFluor594で標識した。1-1.プローブの特異性の予備確認次に、リボゾームデータベースプロジェクトRDPのプローブチェックプログラム及び実際の菌株に対する特異性試験により判別した。まず、RDPのプローブチェックプログラムにより、各プローブ配列との配列の差異が0塩基から3塩基間での最近を選択した。このオンラインプログラムにより、各プローブの特異性が予備的に判断できる。結果を表6にしめす。この結果から、表79にある実際のプローブ特異反応のための陽性及び陰性対照菌株を設定した。2培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法によるウエルシュ菌の検出、計数1上記した表78記載の各種細菌株をGAMBrothで一晩前培養37°C、嫌気培養し、遠心分離で集めた後、菌体に4パラフォルムアルデヒド‐リン酸緩衝液PBSを300μl加え、4°Cで1~3時間固定した。2この固定した細菌細胞の3μlをスライドグラス上に載せ、風乾後、50、80および100エタノールに順次3分間浸漬することで脱水を行った。3スライドグラス上の固定した細菌細胞上へあらかじめ46°Cあるいは60°Cに加温しておいたハイブリダイゼーション溶液09MNaCl、20mMTrisHCl、001SDS、pH74ホルムアミドは0~60で変化させたを8μlを注加し、46°Cあるいは60°Cで5分間プレハイブリダイゼーションを行った後、5pmolμlのプローブ溶液を1μl加え、いずれのプローブとも、46°Cあるいは60°Cで1時間ハイブリダイゼーションを行った。4ハイブリダイゼーション後、スライドグラスをあらかじめ48°Cおよび62°Cで加温した46°Cでハイブリダイゼーションした場合は48°Cで洗浄し、60°Cでハイブリダイゼーションした時は62°Cで洗浄した洗浄液20mMTrisHCl、40~220mMNaCl、001SDS、pH74に20分間浸漬した後、滅菌蒸留水で残留する洗浄液を洗い流した。5スライドグラスを風乾後、ガラス上の細菌細胞を蛍光顕微鏡で観察し、細菌細胞の蛍光具合から両プローブの特異性を判定した。3.培養併用FISH法による計数精度の確認上記特異性を評価したプローブを用い、培養併用FISH法による計数精度を、既知の平板培養法と比べ、確認した。1スライドグラス上でプローブの特異性判定試験に供試した陽性細菌および陰性細菌を、プローブ陽性菌の微小コロニー形成の優れた培地で培養し、陰性菌の増殖の有無又は強弱を判定した。2プローブ陽性菌および陰性菌をフィルター上に捕集した後、5時間培養し、微小コロニーを形成させた。このフィルター上のコロニーをエタノール固定した後、スライドグラス上でのインサイチューハイブリダイゼーション法と同様に、FISH反応を行った。B結果結果を表7、8及び9に示す。本プローブCLP180の特異性が高いハイブリダイゼーション条件としては、46°Cでホルムアミド濃度が20~30、60°Cでホルムアミド濃度が0~15の条件が見出された。結果の例ボツリヌス菌を図3に示す。プローブCLP180はウエルシュ菌に対して特異的にハイブリッドを形成し、非ウエルシュ菌のDNAあるいはRNAにはハイブリッドを形成しないことが示された。従って、このCLP180もウエルシュ菌の特異的検出同定に有効であることが示された。さらに、フィルター上に捕集したウエルシュ菌をGAM培地上で5時間培養後、CLP180プローブを用いた培養併用FISH法で微小集落数を計数した。一方、同細菌試料をGAM寒天培地またはカナマイシン加CW寒天培地を用いて平板培養法で計数した。その計数値は、培養併用FISH法では、X106CFUml、GAM平板培養法では、X106CFUmlであり、カナマイシン加CW寒天平板培養法ではX106CFUmlとなり、これらの間に有意な差は認められなかった。腸炎ビブリオ、サルモネラ菌及び病原性大腸菌用プローブの調整1腸炎ビブリオを特異検出する遺伝子プローブ腸炎ビブリオを特異検出する遺伝子プローブは16SrRNA遺伝子配列中から見いだしたものである。その配列はactacactaccttcctcacgactgaaaプローブ名Vpa437を改良したものである。この配列は、16SrRNA遺伝子配列中から見いだし、ギブスの自由エネルギー計算を行いSafaketal2004、プローブの特異性を維持したままで標的のrRNAの特異領域と最も反応性が高くなるように配列を調整したものである表10。その配列はgctgcggttattaaccacaacaccccttc配列番号8プローブ名Sal453VibrioparahaemolyticusLMG2850T株をマリンブロスを加えて固定した後、300μlのPBSで菌体を3回洗浄した。その後、氷冷した99エタノールを100μl加えて、PFA固定菌体を調製した。2この固定菌体の3マイクロリッターをスライドグラス上に載せ、風乾後、50、80および100エタノールに、順次3分間浸漬することで脱水を行った。3スライドグラス上に固定した細菌細胞上へ、ハイブリダイゼーション溶液09MNaCl、20mMTrisHCl、001SDS、0~40フォルムアミド、pH74を8μl注加し、さらに、25nmolμlのプローブを1μl加え、46°Cで、湿潤箱中で、2時間ハイブリダイゼーションを行った。4ハイブリダイゼーション後、スライドグラスをあらかじめ48°Cで加温した洗浄液20mMTrisHCl、40~900mMNaCl反応させたフォルムアミド濃度に応じて適宜変更、001SDS、pH74に15分間浸漬した後、滅菌蒸留水で残留する洗浄液を洗い流した。5スライドグラスを風乾後、ガラス上の細菌細胞を蛍光顕微鏡で観察し、蛍光プローブと反応した細菌細胞に特徴的な蛍光が観察されるか否かで腸炎ビブリオプローブの特異性を判定した。結果培養細菌細胞への反応性評価Vpa437プローブは、フォルムアミド濃度が10~40の反応液を用い、46°Cで反応させることにより、Vparahaemolyticusおよびこのプローブにミスマッチのないビブリオ種に加え、Vanguillarumに反応した。さらに、Vpa1255プローブは、フォルムアミド濃度が25~40の反応液を用い、46°Cで反応させることにより、Vparahaemolyticusおよびこのプローブにミスマッチのないビブリオ種と反応した。以上、3種のプローブは、46°C、フォルムアミド濃度が30~40の反応液で同時にFISH反応させることができる。この条件下で、上記3種のプローブを反応させることにより、VparahaemolyticusのFISH法による特異検出が可能となった図4。プローブに標識する蛍光物質は、緑、赤色および近赤外蛍光を特徴とする色素が望ましい。具体的には、FITC、TAMRAおよびCy5である。また、Vparahaemolyticusの各菌株HO5、LMG16874、IFO12711臨床、VPY01、VPY20、704B1、CHT201に、これら3種のプローブは反応した。3微小集落形成条件の至適化VparahaemolyticusLMG2850T株培養液を、ニュクレポアーフィルター上に捕集後、マリンアガー培地に貼り付け、37°Cで2、4、6、8時間培養した。腸炎ビブリオの微小集落に、上記腸炎ビブリオプローブを46°C、30フォルムアミドを含む反応液中で反応させ、微小集落のFISH検出を行った。蛍光顕微鏡下で観察し、微小集落の成長を経時的に観察した。また、Vpa437およびVpa612プローブを組み合わせることにより、80種のビブリオの中から、Vparahaemolyticusに加え、VrotiferianusおよびVcampbelliiを検出できるまでに絞り込むことができる。Vparahaemolyticusに対し、VrotiferianusおよびVcampbelliiを検出しない培養条件として、高温域40°Cでの増殖および耐塩性を検討した。結果腸炎ビブリオ微小集落の形成腸炎ビブリオの微小集落は時間とともに成長し、6時間培養後に、80μm程度の40~100倍レンズで観察可能な集落に成長した。8時間培養すると、腸炎ビブリオの微小集落は急速に成長し、600μmを超える大きさとなった。また、Vpa437およびVpa612プローブを組み合わせることにより、80種のビブリオの中から、Vparahaemolyticusに加え、VrotiferianusおよびVcampbelliiを検出できるまでに絞り込むことができる。Vparahaemolyticusに対し、VrotiferianusおよびVcampbelliiを検出しない培養条件を検討したところ、マリンアガー培地を用い40°Cで培養するか、7塩化ナトリウムを添加した寒天培地を用いる培養条件が見いだされた表13。従って、フィルター上に捕集した腸炎ビブリオを、マリンアガー培地を用い40°Cで培養するか、7塩化ナトリウムを添加した寒天培地を用いて培養を行い、Vpa437およびVpa612の2種のプローブで特異検出することでも、腸炎ビブリオの特異検出が可能となった。腸炎ビブリオLMG2850T株を、マリンアガー上で、40°Cで培養したところ、この微小集落は8時間培養後に、50μm程度の40~100倍レンズで観察可能な集落に成長した。10時間以上培養すると、腸炎ビブリオの微小集落は200μmを超える大きさとなった。この条件下では、VrotiferianusおよびVcampbelliiは、目に見える微小集落を形成するまでには成長しなかった。4Vpa437、Vpa612プローブ、及びVpa1255プローブの3プローブを用いた腸炎ビブリオの検出Vpa437をFITCで標識し、Vpa612プローブをTAMRAで標識し、Vpa1255プローブをCy5で標識した。VparahaemolyticusLMG2850T株を、マリンアガー培地で6時間培養した後、成長した微小集落を、上記3種のプローブをホルムアミド濃度30~40のハイブリダイゼーション溶液に混合し、46°Cで反応させた。図4に示されるように、腸炎ビブリオは前記3種類のプローブの全てと反応し、近縁種のVrotiferianusおよびVcampbelliiと区別して検出することができる。サルモネラ菌特異的プローブを用いた培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法によるサルモネラ菌の検出及び計数1データベースに登録されている配列との比較Sal453プローブは、Senterica以外に、EnterobactersakazakiiおよびPantoeaagglomeransとミスマッチがなかった表14。既報の16SIプローブの特異性と同一であった。2サルモネラプローブの特異性評価の方法1腸炎ビブリオと同様の方法で行った。SalmonellaentericaTyphimuriumATCC13311T株はブイヨン培地で一晩前培養37°Cした。結果培養細菌細胞への反応性評価Sal453プローブは、フォルムアミド濃度が1040の反応液を用い、46°Cで反応させることにより、SentericaおよびEsakazakiiと反応し、Pagglomeransとは反応しなかった。従って、このプローブは、Senterica以外にも、Esakazakiiを検出するプローブである。3微小集落形成条件の至適化SalmonellaentericaTyphimuriumATCC13311T株培養液を、ニュクレポアーフィルター上に捕集後、標準寒天培地に貼り付け、37°Cで2~12時間培養し、腸炎ビブリオの微小集落形成条件の至適化と同様の方法で実験した。結果サルモネラ微小集落の形成サルモネラの微小集落は時間とともに成長し、8時間培養後に、80マイクロメーター程度の40~100倍レンズで観察可能な集落に成長した。12時間培養すると、サルモネラの微小集落は400マイクロメーターを超える大きさとなった。病原性大腸菌特異的プローブを用いた培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法による病原性大腸菌の検出及び計数1データベースに登録されている配列との比較Eco67プローブは、Ecoliのみにミスマッチがないプローブであった表16。2病原性大腸菌プローブの特異性評価の方法1腸炎ビブリオと同様の方法で行った。EscherichiacoliO157H7株はブイヨン培地で一晩前培養37°Cした。結果培養細菌細胞への反応性評価Eco67プローブは、フォルムアミド濃度が10~40の反応液を用い、46°Cで反応させることにより、Ecoli以外に、MannheimiavarigenaおよびMruminalisと反応した。また、このプローブは、大腸菌の菌株の中で、EHECRIMD05091055、EHECRIMD05091056、EHECRIMD05091151、EHECRIMD0509952、EPECRIMD0509829、EIECRIMD05091045、ETECRIMD0509356、ETECRIMD0509335などの病原性株を検出した表18。3微小集落形成条件の至適化EcoliO157H7株培養液を、ニュクレポアーフィルター上に捕集後、標準寒天培地に貼り付け、37°Cで2~10時間培養し、腸炎ビブリオの微小集落形成条件の至適化と同様の方法で実験した。結果病原性大腸菌微小集落の形成病原性大腸菌の微小集落は時間とともに成長し、6時間培養後に、80マイクロメーター程度の40~100倍レンズで観察可能な集落に成長した。8時間培養すると、サルモネラの微小集落は100マイクロメーターを超える大きさとなった。"