"一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法であって、一般式Iにおいて、環構造は、一またはいくつかのヘテロ原子を含み、または含まず、R1は、水素またはC1-C4アルキル基であり、R2は、水素、C1-C8アルキル基、またはエステル等のような先行技術において知られているOHのための保護基であり、R3は水素、メチル基、またはハロゲンであり、構造要素は、ベンゼン環、または0、1もしくは2のC-C二重結合を有するC6環を表し、二重結合は、6/7または7/8位において任意に含まれ、1、2、4、5、6、7、8、9、11、12、および16位の炭素は、それぞれ、水素、C1-C4アルキル基、ハロゲン、またはフェニル基で置換される、セコジオン誘導体は、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素/脱水素酵素を用いて還元され、セコジオン誘導体が、反応バッチ中で、≧10g/lの濃度で使用されること、および酸化還元酵素/脱水素酵素により形成される、酸化されたコファクターNADまたはNADPが連続的に再生されることを特徴とする該方法。セコジオン誘導体が、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素/脱水素酵素を用いて還元される、一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法であって、酸化還元酵素/脱水素酵素が、a配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列に対して、少なくとも50のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を含む、b配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10の核酸配列によりコードされる、またはcストリンジェントな条件下、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10にハイブリダイズする核酸配列によってコードされることを特徴とする該方法。セコジオン誘導体が、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素/脱水素酵素を用いて還元される、一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法であって、酸化還元酵素/脱水素酵素が、230から260アミノ酸長を有し、[配列番号18から配列番号42]nalvtgasrgig、nalvtggsrgig、nalitggsrgig、nalitgasrgig、nalitggsrgmg、halvtgasrgig、gysvtla、gynvtla、gysvtlv、gynvtlv、fkgaplpa、fkaaplpa、fvsnag、ffsnag、fvcnag、fvanag、spialtkal、spvaltkti、spialtktl、spvamtkal、sqialtkal、avysask、avysatk、pikgwiおよびpisgwiからなる群から選択される一またはいくつかの部分配列を含むことを特徴とする該方法。酸化還元酵素/脱水素酵素がa配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列に対して、少なくとも50のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を含む、b配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10の核酸配列によりコードされる、またはcストリンジェントな条件下、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10にハイブリダイズする核酸配列によってコードされることを特徴とする請求項1記載の方法。酸化還元酵素/脱水素酵素が、230から260アミノ酸長を有し、[配列番号18から配列番号42]nalvtgasrgig、nalvtggsrgig、nalitggsrgig、nalitgasrgig、nalitggsrgmg、halvtgasrgig、gysvtla、gynvtla、gysvtlv、gynvtlv、fkgaplpa、fkaaplpa、fvsnag、ffsnag、fvcnag、fvanag、spialtkal、spvaltkti、spialtktl、spvamtkal、sqialtkal、avysask、avysatk、pikgwiおよびpisgwiからなる群から選択される一またはいくつかの部分配列を含むことを特徴とする請求項1記載の方法。酸化還元酵素/脱水素酵素によって形成される酸化されたコファクターNADまたはNADPが、連続的に再生されることを特徴とする、請求項2または3記載の方法。酸化されたコファクターNADまたはNADPが、アルコールの酸化によって再生されることを特徴とする、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。一般式RXRYCHOHを有する二級アルコールがコファクターの再生のために使用され、ここでRXおよびRYは、それぞれ、水素、分岐したまたは分岐していないC1-C8アルキル基、およびCtotal≧3であることを特徴とする、請求項7記載の方法。2-プロパノール、2-ブタノール、2-ペンタノール、4-メチル-2-ペンタノール、2-ヘキサノール、2-ヘプタノール、5-メチル-2-ヘキサノール、シクロヘキサノール、または2-オクタノールからなる群のアルコールが、コファクターの再生のために使用されることを特徴とする、請求項7記載の方法。酸化還元酵素/脱水素酵素が、コファクターの再生のためにさらに加えられることを特徴とする、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。TTN全変換率=還元されたセコジオン誘導体のモル/使用されたコファクターのモルが≧103であることを特徴とする、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。水有機二相系で実施されることを特徴とする、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。有機溶媒、好ましくは、ジエチルエーテル、三級ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ヘプタン、ヘキサン、トルエン、ジクロロメタン、シクロヘキサン、またはそれらの混合物がさらに使用されることを特徴とする、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。セコジオン誘導体が、反応バッチ中で、全容量に基づいて、10g/lから500g/l、好ましくは25g/lから300g/l、特に好ましくは50g/lから200g/lの量で使用されることを特徴とする、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。セコジオン誘導体として、13-エチル-3-メトキシ-8,14-セコ-ゴナ-1,3,510,911-テトラエン-14,17-ジオンエチルセコジオン-式IIIが使用されることを特徴とする、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。セコジオン誘導体として、13-メチル-3-メトキシ-8,14-セコ-ゴナ-1,3,510,911-テトラエン-14,17-ジオンメチルセコジオン-式IIが使用されることを特徴とする、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。したがって、本発明の目的は、一般式Iのセコジオン誘導体、特に式IIおよびIIIのセコジオン誘導体をエナンチオ選択的に還元することができる方法を提供することである。このようにして、特に、対応する17-β-ヒドロキシセコステロイドの合成も実現可能とする。第一の面では、前記目的は、本発明に従い、一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法によって達成され、ここで、環構造は、一またはいくつかのヘテロ原子を含み、または含まず、R1は、水素またはC1-C4アルキル基であり、R2は、水素、C1-C8アルキル基、または例えばエステル等のような先行技術において知られているOHのための保護基であり、R3は水素、メチル基、またはハロゲンであり、構造要素は、ベンゼン環、または0、1もしくは2のC-C二重結合を有するC6環を表し、二重結合は、6/7または7/8位において任意に含まれ、1、2、4、5、6、7、8、9、11、12、および16位の炭素は、それぞれ、水素、C1-C4アルキル基、ハロゲン、またはフェニル基で置換される、セコジオン誘導体は、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素/脱水素酵素を用いて還元され、該方法は、セコジオン誘導体が、反応バッチ中で、≧10g/lの濃度で使用されること、および酸化還元酵素/脱水素酵素により形成される、酸化されたコファクターNADまたはNADPが連続的に再生されることを特徴とする。この方法は、先行技術を上回る、セコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の顕著な改善を示す。本発明に従う方法は、遊離の酵素を用いた、先行技術に記載された濃度をはるかに超える濃度範囲における、セコジオン誘導体の、さまざまな対応するヒドロキシセコステロイドへの還元を可能にする。第二の面では、上記目的は、本発明に従い、一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法によって達成され、ここで、セコジオン誘導体は、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素/脱水素酵素を用いて還元され、該方法は、酸化還元酵素/脱水素酵素が、a配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列に対して、少なくとも50のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を含む、b配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10の核酸配列によりコードされる、またはcストリンジェントな条件下、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10にハイブリダイズする核酸配列によってコードされることを特徴とする。本発明者は、セコジオン誘導体をヒドロキシセコステロイドに還元することができ、工業規模で組換えて産生されうる酸化還元酵素を同定した。本発明に従う方法により、現在使用されている全細胞を用いた方法よりも、顕著に高い基質濃度を達成することができる。本発明に従う方法において、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4もしくは配列番号5、またはそれらのポリペプチドに由来するポリペプチドを有する酸化還元酵素は、完全に精製された状態で、部分的に精製された状態で、または配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4もしくは配列番号5のポリペプチドを含む細胞として、使用することができる。それによって、使用される細胞は、自然の、透過処理された、または溶解された状態で提供されうる。好ましくは、酸化還元酵素およびそれに由来する誘導体は、それぞれ、例えば大腸菌等のような適した宿主生物中で過剰発現され、組換えポリペプチドは、一般式Iのセコジオン誘導体の還元のために使用される。配列番号1のポリペプチドをコードする配列番号6のDNA配列は、例えば、生物クロロフレクサスアウランティアクスChloroflexusaurantiacusDSM635のゲノムから得ることができる。配列番号2のポリペプチドをコードする配列番号7のDNA配列は、例えば、生物ルブロバクターキシラノフィラスRubrobacterxylanophilusDSM9941のゲノムから得ることができる。配列番号3のポリペプチドをコードする配列番号8のDNA配列は、例えば、酵母カンジダマグノリアエCandidamagnoliaeCBS6396から得ることができる。配列番号4および配列番号5の酸化還元酵素は、例えば、カンジダマグノリアエCandidamagnoliaeDSMZ70638からホモロジースクリーニングによって得ることができる。ストリンジェントな条件下、例えば配列番号6にハイブリダイズする核酸配列は、DNAプローブとして配列番号6または配列番号6の部分配列を用いて、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法、または同等の方法により同定することができる、ポリヌクレオチドであると理解される。このために、フィルター上に固定されたポリヌクレオチドは、例えば、60°C、0.7-1M塩化ナトリウム溶液中で、配列番号6にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションは、例えば、MolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionColdSpringHarborLaboratoryPress1989または同様の出版物に記載の通りに行われる。続いて、フィルターは、0.1から2倍濃度のSSC溶液を用いて65°Cで洗浄され、ここで、1倍濃度のSSC溶液は、150mM塩化ナトリウムと15mMクエン酸ナトリウムからなる混合物であると理解される。配列表が提供している配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10のポリヌクレオチドに、前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも60の同一性、よりよくは少なくとも80の同一性、さらによりよくは95の同一性を示すべきである。さらなる面では、上記目的は、本発明に従い、一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法によって達成され、ここで、セコジオン誘導体は、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素/脱水素酵素を用いて還元され、該方法は、酸化還元酵素/脱水素酵素が、230から260アミノ酸長を有し、[配列番号18から配列番号42]nalvtgasrgig、nalvtggsrgig、nalitggsrgig、nalitgasrgig、nalitggsrgmg、halvtgasrgig、gysvtla、gynvtla、gysvtlv、gynvtlv、fkgaplpa、fkaaplpa、fvsnag、ffsnag、fvcnag、fvanag、spialtkal、spvaltkti、spialtktl、spvamtkal、sqialtkal、avysask、avysatk、pikgwiおよびpisgwiからなる群から選択される一またはいくつかの部分配列を含むことを特徴とする。本発明に従う方法において、NADHまたはNADPHはコファクターとして使用される。NADPという用語により、リン酸ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが理解され、NADPHという用語により、還元されたリン酸ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが理解される。NADという用語は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、NADHという用語は、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味する。セコジオン誘導体が反応バッチ中で、≧10g/lの濃度で使用され、酸化還元酵素/脱水素酵素により形成される酸化されたコファクターNADまたはNADPが連続的に再生される、本発明の好ましい実施態様に従うと、酸化還元酵素/脱水素酵素はa配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列に対して、少なくとも50のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を含む、b酸化還元酵素/脱水素酵素が、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10の核酸配列によりコードされる、またはcストリンジェントな条件下、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。セコジオン誘導体が反応バッチ中で、≧10g/lの濃度で使用され、酸化還元酵素/脱水素酵素により形成される酸化されたコファクターNADまたはNADPが連続的に再生される方法の他の好ましい実施態様に従うと、酸化還元酵素/脱水素酵素は、230から260アミノ酸長を有し、[配列番号18から配列番号42]nalvtgasrgig、nalvtggsrgig、nalitggsrgig、nalitgasrgig、nalitggsrgmg、halvtgasrgig、gysvtla、gynvtla、gysvtlv、gynvtlv、fkgaplpa、fkaaplpa、fvsnag、ffsnag、fvcnag、fvanag、spialtkal、spvaltkti、spialtktl、spvamtkal、sqialtkal、avysask、avysatk、pikgwiおよびpisgwiからなる群から選択される一またはいくつかの部分配列を含む。本発明の第二および第三の面を参照する本発明に従う方法において、酸化還元酵素/脱水素酵素により形成される酸化されたコファクターNADまたはNADPは、好ましくは連続的に再生される。本発明に従うすべての方法の好ましい実施態様に従うと、酸化されたコファクターNADまたはNADPは、アルコールの酸化によって再生される。そうすることで、例えばエタノール、2-プロパノール、2-ブタノール、2-ペンタノール、3-ペンタノール、4-メチル-2-ペンタノール、2-ヘキサノール、2-ヘプタノール、2-オクタノール、またはシクロヘキサノール等のような、一級および二級アルコールは、共基質cosubstanceとして好ましく使用される。再生のための共基質cosubstanceの割合は、全容量に基づいて、容量で5から95まで及んでいてもよい。一般式RXRYCHOHを有する2級アルコールは、コファクターの再生産のために好ましく使用され、ここでRXおよびRYは、それぞれ、水素、分岐したまたは分岐していないC1-C8アルキル基、およびCtotal≧3である。本発明に従う方法の他の好ましい実施態様に従うと、酸化還元酵素/脱水素酵素はコファクターの再生のためにさらに加えられる。適したNADH依存性アルコール脱水素酵素は、例えば、パン酵母から、カンジダパラプローシスCandidaparapsilosis9508、ピキアカプスラータPichiacapsulataから、ロドコッカスエリスロポリスRhodococcuserythropolis、ノカルジアフスカNorcardiafusca1999p17211729ApplMicrobiolBiotechnol2003623806Epub2003Apr26、またはロドコッカスルバーRhodococcusruber4026から得ることができる。それらのアルコール脱水素酵素に適した共基質は、例えば、2-プロパノールイソプロパノール、2-ブタノール、2-ペンタノール、4-メチル-2-ペンタノール、2-オクタノール、またはシクロヘキサノール等の、既に記載した2級アルコールである。NADPHの再生に適した2級アルコール脱水素酵素は、例えば、上記に記載したもの、およびラクトバチルス目の生物、例えば、ラクトバチルスケフィアLactobacilluskefir、ラクトバチルスブレビスLactobacillusbrevis、ラクトバチルスマイナーLactobacillusminor、ラクトバチルスカルノサムLeuconostoccarnosumから単離されたもの、または前述の通り、サーモアネロビウムブロッキThermoanerobiumbrockii、サーモアネロビウムエタノリカスThermoanerobiumethanolicusまたはクロストリジウムベイジェリンキClostridiumbeijerinckiiから単離されたものである。しかし、他の酵素システムも、理論上、コファクターの再生のために使用することができる。例えば、コファクターの再生は、NADまたはNADP依存性ギ酸脱水素酵素を用いて実施されうるTishkovetalJBiotechnolBioeng199964187193PilotscaleproductionandisolationofrecombinantNADandNADPspecificformatedehydrogenase。ギ酸脱水素酵素の適した共基質は、例えば、ギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウム、またはギ酸カルシウム等のギ酸の塩である。本発明に従う方法において達成されるTTN全変換率=還元されたセコジオン化合物のモル/使用されたコファクターのモルは、通常102から105に及ぶが、好ましくは、≧103である。好ましい実施態様に従って、本発明に従う方法は水有機二相系で行われる。したがって、セコジオン誘導体の変換は、例えば、コファクター再生のための2-アルコール、酸化還元酵素、水、コファクター、およびセコジオン化合物を含む二相系で起こる。しかしながら、コファクター再生に関与しない、つまり、いかなる被酸化性のヒドロキシ基を含まない追加の有機溶媒を含むこともできる。ジエチルエーテル、三級ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ヘプタン、ヘキサン、トルエン、ジクロロメタン、シクロヘキサン、またはそれらの混合物は、追加の有機溶媒として好ましく使用される。それによって、二相系の非水混和性有機成分の量は、反応バッチの全容量に基づいて、10から90、好ましくは20から80に及んでもよい。水の量は、反応バッチの全容量に基づいて、90から10、好ましくは80から20に及んでもよい。バッファーを水に添加することができ、例えば、5から10、好ましくは6から9のpH値を有する、リン酸カリウム、tris/HCl、グリシン、またはトリエタノールアミンバッファーがある。また、バッファーは、両方の酵素を安定または活性化するためのイオン、例えばマグネシウムイオンまたは亜鉛イオンを含むことができる。さらに、使用される酵素の安定化のためにさらなる添加剤は、本発明に従う方法において使用することができ、例えばグリセロール、ソルビトール、1,4-DL-ジチオトレイトールDTTまたはジメチルスルホキシドDMSOがある。コファクターNADHの濃度は、水相に基づいて、0.001mMから10mM、特に0.01mMから1.0mMに及ぶ。使用される酵素の特定の性質によって、温度は10°Cから70°C、好ましくは20°Cから35°Cとすることができる。通常、還元されるセコジオン誘導体は、水にあまり溶解しない。したがって、反応中、基質は完全に、または不完全に溶解した状態で提供されうる。基質が反応混合物中に完全に溶解しない場合、基質の一部は固体で存在し、よって第三の固相を形成しうる。反応混合物は、変換中、一時的にエマルジョンを形成してもよい。本発明に従う方法において、一般式Iのセコジオン誘導体は、反応バッチ中で、全容量に基づいて、好ましくは10g/lから500g/l、好ましくは25g/lから300g/l、特に好ましくは50g/lから200g/lの量で使用される。本発明の好ましい実施態様は、13-エチル-3-メトキシ-8,14-セコ-ゴナ-1,3,510,911-テトラエン-14,17-ジオンエチルセコジオン-式IIIまたは13-メチル-3-メトキシ-8,14-セコ-ゴナ-1,3,510,911-テトラエン-14,17-ジオンメチルセコジオン-式IIが、セコジオン誘導体として使用されることをさらに特徴とする。本発明に従う方法は、例えば、ガラスまたは金属で作られた反応容器中で行われる。このために、成分はそれぞれ反応容器に移され、例えば窒素または空気の雰囲気下で撹拌される。反応時間は、使用されるセコジオン化合物および酸化還元酵素によって、1時間から7日間、特に2時間から48時間に及ぶ。その時間中、セコジオン化合物は、少なくとも50まで、対応するヒドロキシセコステロイド化合物に還元される。以下に、本発明は、より詳細に実施例によって説明される。クロロフレクサスアウランティアクスChloroflexusauratiacusDSM635からの酸化還元酵素のクローニングAクロロフレクサスアウランティアクスChloroflexusauratiacusDSM635の培養クロロフレクサスアウランティアクスChloroflexusauratiacusDSM635の細胞は、細菌のインキュベーター中、48°C、光の下、以下の培養液pH8.2中で培養された:0.1酵母抽出物、0.1グリシルグリシン、0.01リン酸水素二ナトリウム二水和物、0.01硫酸マグネシウム七水和物、0.01硝酸カリウム、0.05硝酸ナトリウム、0.01塩化ナトリウム、0.005塩化カルシウム二水和物、5mlの0.01クエン酸鉄III溶液、1mlの微量元素溶液SL6[500μl/l硫酸、2.28g/l硫酸マンガン一水和物、500mg/l硫酸亜鉛七水和物、500mgホウ酸、25mg/l硫酸銅五水和物、25mg/lモリブデン酸ナトリウム二水和物、45mg/l塩化コバルト六水和物]。培養12日目、細胞は遠心分離により培養液から分離され、-80°Cにて保存された。B選択的な酸化還元酵素をコードする遺伝子の増幅ゲノムDNAは、ManniatisSambrookによるMolecularCloningに記載された方法に従って抽出された。得られた核酸は、NCBIデータベースに番号76258197で公開された遺伝子配列に由来する特異的なプライマーに関わるポリメラーゼ連鎖反応PCRのためのテンプレートとして役立った。そうすることで、プライマーは、発現ベクターへの次のクローニングのため、それぞれエンドヌクレアーゼNdeIおよびHindIIIまたはSphIの制限部位を有する5’末において提供された配列番号11、配列番号12、配列番号13。増幅は、PCRバッファー[10mMTrisHCl、pH8.0;50mM塩化カリウム;10mM硫酸マグネシウム;1mMdNTPMix;いずれの場合にも20pMolのプライマーおよび2.5UのPlatinumPfxDNAPolymeraseInvitrogen]中で、500ngのゲノムDNAを用いて、以下の温度サイクルで行われた:サイクル1:94°C2分サイクル2x30:94°C30秒、56°C30秒、68°C60秒サイクル3:68°C7分、4°C∞。約750bpの大きさを有する、得られたPCR産物は、精製の後、1アガロースゲル上でそれぞれエンドヌクレアーゼNdeIとHindIII、またはエンドヌクレアーゼSphIとHindIIIを用いて制限されrestricted、それぞれpET21aベクターNovagenまたはpQE70ベクターQiagenのバックボーンにライゲートされた。バックボーンは、同じエンドヌクレアーゼで処理されている。2μlのライゲーションバッチをEcoliTop10F’cellsInvitrogenに形質転換した後、アンピシリンまたはカナマイシン耐性コロニーのプラスミドDNAは、それぞれエンドヌクレアーゼNdeIとHindIII、またはエンドヌクレアーゼSphIとHindIIIを用いた制限分析によって、750bpの大きさの挿入の存在がテストされた。フラグメントに陽性のクローン由来のプラスミド調製物は、配列分析がなされ、続いて、それぞれ、大腸菌StarInvitrogenおよび大腸菌RB791geneticstockYaleに形質転換された。大腸菌中での組換えクロロフレクサスchloroflexus酸化還元酵素の発現それぞれ、発現コンストラクトを用いて形質転換された大腸菌BL21StarInvitrogen、Karlsruhe、ドイツおよび大腸菌RB791EcoligeneticstockYale、USAは、それぞれアンピシリン50μg/mlまたはカルベニシリン50μg/mlを有する200mlLB培地1トリプトン、0.5酵母抽出物、1塩化ナトリウム中で、550nmにおける吸光度ODが0.5に届くまで培養された。組換えタンパク質の発現は、0.1mMの濃度でイソプロピルチオガラクトシドIPTGを添加することによって誘導された。25°Cにおいて220rpmでの8時間または16時間の誘導の後、細胞は回収され、-20°Cで凍結された。活性試験のために、10mgの細胞は、500μlの100mMTEAバッファーpH7.0と500μlのガラスビーズと混合され、10分間グローブミルを用いて消化された。得られたライセートは、それぞれの測定のため希釈された状態で使用された。活性試験は、以下の通りに構成された:870μlの100mMTEAバッファーpH7.0、NADH160μg、希釈された細胞ライセート10μl。反応は、100μlの100mM基質溶液を反応混合物に添加することにより開始された。大量の酵素の回収のため、細胞30gがトリエタノールアミンバッファー100mM、pH7、2mM塩化マグネシウム、10グリセロール150mlに再懸濁され、高圧ホモジナイザーを用いて消化された。次に、酵素溶液は150mlのグリセロールと混合され、-20°Cで保存された。生物の培養およびエチルセコジオン式IIIの還元変換後のスクリーニングスクリーニングのため、酵母株ピキアファリノサPichiafarinosaDSM70362、カンジダグロペンギエセリCandidagropengiesseriMUCL29836、カンジダバクチニCandidavacciniiCBS7318、ピキアファリノサPichiafarinosaDSM3316、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeCBS1508およびカンジダマグノリアエCandidamagnoliaeCBS6396を、以下の培養液中で培養した:酵母抽出物5、ペプトン5、およびグルコース20括弧内の数字はいずれの場合もg/l。培養液は121°Cで滅菌され、酵母は25°C、毎分140回転のシェーカー上で、さらなるpH調整なしで培養された。式IIIのエチルセコジオンの、対応するヒドロキシセコステロイド化合物への還元変換は、以下の全細胞生体内変化バッチ中で試験された:新しく回収された細胞400mgをバッチ中で、グルコース50mg、式IIIのエチルセコジオン10mg、および900μlの100mMトリエタノールアミンバッファーTEApH7.0と一緒に、28°C、1400rpmで24時間振とうした。次に、バッチをジクロロメタン1mlで抽出し、遠心分離し、窒素で乾燥し、アセトニトリル中に吸収された後、HPLC分析に加えた。スクリーニング結果を表1にまとめる。CBS6396株がエチルセコジオンの最も高い変換を示し、よって、cDNAライブラリーを調製するための出発生物として選ばれた。カンジダマグノリアエCandidamagnoliaeCBS6396からのcDNAライブラリーの調製と酸化還元酵素のクローニングA単離全およびmRNAおよびcDNAライブラリーの調製生きた細胞600mgを、氷冷LETSバッファー2.5ml中に再懸濁した。硝酸で洗浄されて3mlのフェノールpH7.0を用いて平衡されたガラスビーズ5ml約20gを前記細胞懸濁液に加えた。バッチ全体は、交互にボルテックス30秒と氷上で冷却30秒、合わせて10分間処理された。次に、氷冷LETSバッファーを添加し、これを再び勢いよくボルテックスした。前記細胞懸濁液は、4°C、11000gで5分間遠心分離された。水相は回収され、2回、等量のフェノール:クロロフォルム:イソアミルアルコール24:24:1を用いて抽出された。続いてクロロフォルムを用いた抽出が行われた。最後の抽出の後、全RNAは、1/10容量の5M塩化リチウムを添加することにより、-20°Cで4時間沈殿された。得られた全RNA1mgは、OligodTcelluloseNEBBiolabsを用いて、mRNA分子を濃縮するために使用された。続く沈殿の後、mRNA5μgは、cDNA合成のために使用されたpBluescriptIIXRcDNALibraryConstructionkitStratagene。製品の使用説明書に従って作成されたライブラリーは、XL10GoldEcoliに形質転換され、ADH活性がスクリーニングされた。コファクターとしてのNADPHまたはNADHおよび基質としてのエチルセコジオン式IIIの吸光度の低下に基づいて、クローンcM4が同定、単離された。プライマーT7およびプライマーT3を用いて単離されたプラスミドの配列は、789bpのORFとなった。前記フラグメントは、262アミノ酸長を有する融合タンパク質をコードし、β-ガラクトシダーゼのa-フラグメントと推定上の短鎖アルコール脱水素酵素からなる。BPCRによるカンジダマグノリアエCandidamagnoliaeCBS6396由来の短鎖ADHをコードする全長転写物の合成特異的なプライマーが、適した発現系への全長転写物のクローニングのために作成された。そうすることで、それぞれNdeIおよびSphIの認識配列を有する5’プライマー、およびそれぞれXhoIおよびSacIの認識配列を有する3’プライマーが修正された配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17。カンジダマグノリアエCandidamagnoliaeの発現ライブラリーのクローンcM4から単離されたプラスミドDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートとして役立った。増幅は、PCRバッファー[10mMTrisHClpH8.0;50mM塩化カリウム;10mM硫酸マグネシウム;1mMdNTPMix;いずれの場合にも20pMolのプライマーおよび2.5UのPlatinumPfxDNAポリメラーゼInvitrogen]中で、テンプレート50ngを用いて、以下の温度サイクルで行われた:サイクル1:94°C2分サイクル2x30:94°C15秒、58°C30秒、68°C75秒サイクル3:68°C7分、4°C∞。得られたPCR産物は、精製の後、1アガロースゲル上でそれぞれエンドヌクレアーゼNdeIとXhoI、またはエンドヌクレアーゼSphIとSacIを用いて制限され、それぞれpET21aベクターNovagenまたはpQME70ベクターのバックボーンにライゲートされた。バックボーンは、同じエンドヌクレアーゼで処理されている。2μlのライゲーションバッチをEcoliTop10F’cellsInvitrogenに形質転換した後、アンピシリンまたはカナマイシン耐性コロニーのプラスミドDNAは、それぞれエンドヌクレアーゼNdeIとXhoI、またはエンドヌクレアーゼSphIとSacIを用いた制限分析によって、750bpの大きさの挿入の存在がテストされた。発現コンストラクトpET21-MgIVおよびpQME70-MgIVが配列決定された。短鎖酸化還元酵素をコードするカンジダマグノリアエCandidamagnoliae由来の遺伝子は、全長729bpのオープンリーディングフレームを有し配列番号8に含まれる、それは243アミノ酸からなるタンパク質に対応する配列番号3。大腸菌細胞における組換え酸化還元酵素の発現コンピテント大腸菌StarBL21細胞およびRB791細胞は、それぞれ、酸化還元酵素をコードする発現コンストラクトpET21-MgIVおよびpQME70-MgIVで形質転換された。発現コンストラクトで形質転換された大腸菌コロニーは、それぞれ50μg/mlのアンピシリンまたは40μg/mlのカナマイシンを含む200mlLB培地1トリプトン、0.5酵母抽出物、1塩化ナトリウム中で、550nmにおける吸光度が0.5に届くまで培養された。組換えタンパク質の発現は、0.1mMの濃度でイソプロピルチオガラクトシドIPTGを添加することによって誘導された。25°Cにおいて220rpmでの16時間の誘導の後、細胞は回収され、-20°Cで凍結された。活性試験のために、10mgの細胞は、500μlの100mMTEAバッファーpH7.0、1mM塩化マグネシウムおよび500μlのガラスビーズと混合され、10分間グローブミルを用いて消化された。得られたライセートは、それぞれの測定のため希釈された状態で使用された。活性試験は、以下の通りに構成された:960μlの100mMTEAバッファーpH7.0、1bmM塩化マグネシウム、NADH160μg、希釈された細胞ライセート10μl。反応は、10μlの100mM基質70メタノール溶液を反応混合物に添加することにより開始された。大量の酵素の回収のため、細胞30gがトリエタノールアミンバッファー100mM、pH7、2mM塩化マグネシウム、10グリセロール150mlに再懸濁され、高圧ホモジナイザーを用いて消化された。次に、酵素溶液は150mlのグリセロールと混合され、-20°Cで保存された。酸化還元酵素配列番号1によるエチルセコジオン式IIIの還元エチルセコジオン式IIIの還元のため、バッファー100mMリン酸カリウム、pH=7、2mM塩化マグネシウム800μl、2-プロパノール1.2ml、NAD0.08mg、エチルセコジオン式III100mgおよび酵素懸濁液酸化還元酵素配列番号1実施例3参照1mlの混合物を、反応容器中、室温にて24時間、ずっと一定に混合しながら培養した。96時間後、使用したエチルセコジオン式IIIの>90が還元されていた。反応が完結すると、反応混合物は、ジクロロメタンを用いた抽出によって再処理され、産物を含む有機相が分離され、17-β-ヒドロキシ化合物エチルセコールが、溶媒を蒸発/蒸留することによって得られた。エチルセコジオンのエチルセコールへの変換は、HPLCによって追跡された。このために、分離カラムEC1254Nucleodur1005C18ecMacheryNagel、Duren、ドイツは、アセトニトリルおよび水を溶媒として一緒に使用された。分析のため、30から70の溶媒中アセトニトリル部分の線形勾配が適用された。反応産物の同定は、基準物質と比較することによって行われた。酸化還元酵素配列番号2によるエチルセコジオン式IIIの還元エチルセコジオン式IIIの還元のため、バッファー100mMトリエタノールアミン、pH=8、2mM塩化マグネシウム250μl、4-メチル-2-ペンタノール250μl、NAD0.02mg、エチルセコジオン式III25mgおよび酵素懸濁液酸化還元酵素配列番号2実施例3参照25μlの混合物を、反応容器中、室温にて96時間、ずっと一定に混合しながら培養した。96時間後、使用したエチルセコジオン式IIIの>30がヒドロキシ化合物に還元されていた。反応が完結すると、反応混合物は、ジクロロメタンを用いた抽出によって再処理され、産物を含む有機相が分離され、17-β-ヒドロキシ化合物エチルセコールが、溶媒を蒸発/蒸留することによって得られた。酸化還元酵素配列番号3によるエチルセコジオン式IIIの還元エチルセコジオン式IIIの還元のため、バッファー100mMトリエタノールアミン、pH=7、2mM塩化マグネシウム100μl、4-メチル-2-ペンタノール400μl、NADP0.02mg、エチルセコジオン式III25mgおよび酵素懸濁液酸化還元酵素配列番号3実施例3参照100μlの混合物を、反応容器中、室温にて72時間、ずっと一定に混合しながら培養した。72時間後、使用したエチルセコジオン式IIIの>95がヒドロキシ化合物に還元されていた。酸化還元酵素配列番号4によるエチルセコジオン式IIIの還元エチルセコジオン式IIIの還元のため、バッファー100mMトリエタノールアミン、pH=9、2mM塩化マグネシウム200μl、2-ヘプタノール300μl、NADP0.025mg、エチルセコジオン式III100mgおよび酵素懸濁液酸化還元酵素配列番号4実施例3参照50μlの混合物を、反応容器中、室温にて72時間、ずっと一定に混合しながら培養した。72時間後、使用したエチルセコジオン式IIIの>80がヒドロキシ化合物に還元されていた。酸化還元酵素配列番号5によるエチルセコジオン式IIIの還元エチルセコジオン式IIIの還元のため、バッファー100mMトリエタノールアミン、pH=7、2mM塩化マグネシウム300μl、4-メチル-2-ペンタノール1.2ml、NADP0.12mg、エチルセコジオン式III150mgおよび酵素懸濁液酸化還元酵素配列番号5実施例3参照0.6mlの混合物を、反応容器中、室温にて72時間、ずっと一定に混合しながら培養した。72時間後、使用したエチルセコジオン式IIIの>90がヒドロキシ化合物に還元されていた。"