内部コアと外側官能化シェル/リッドとを含む大形ビーズ/粒子を小形ビーズ/粒子と混合することを含む、圧力-流動特性の向上したクロマトグラフィー媒体の製造方法であって、大形ビーズと小形ビーズの粒度の比[大形粒子のD50V/小形粒子のD50V]が>1.2であり、カラム中の大形ビーズと小形ビーズの体積比[大形ビーズの全体積/ビーズの全体積]が0.05~0.9である、方法。前記コアが多孔質である、請求項1記載の方法。前記コアが非多孔質である、請求項1記載の方法。大形ビーズと小形ビーズの粒度の比[大形粒子のD50V/小形粒子のD50V]が>3である、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。前記大形粒子のシェル及び小形粒子が同じ種類のリガンドで官能化されている、請求項1乃至請求項4記載の方法。前記リガンドが、イオン交換リガンド、HIC、キレート、タンパク質A、アフィニティ又はRPCリガンドである、請求項5記載の方法。多孔質コアが、試料中の標的分子と相互作用しないリガンドで官能化される、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載の方法。前記大形ビーズのシェルの厚さSTが、ST<[小形粒子のD50V/2]である、請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の方法。内部コアと外側シェルとを含む大形ビーズ/粒子を小形粒子との混合物として含むクロマトグラフィー媒体であって、大形ビーズと小形ビーズの粒度の比[大形粒子のD50V/小形粒子のD50V]が>1.2であり、カラム中の大形ビーズと小形ビーズの体積比[大形ビーズの全体積/ビーズの全体積]が0.05~0.9である、クロマトグラフィー媒体。前記コアが多孔質である、請求項9記載のクロマトグラフィー媒体。前記コアが非多孔質である、請求項9記載のクロマトグラフィー媒体。大形ビーズと小形ビーズの粒度の比[大形粒子のD50V/小形粒子のD50V]が>3である、請求項9乃至請求項11のいずれか1項記載のクロマトグラフィー媒体。多孔質コアが、試料中の標的分子と相互作用しないリガンドで官能化されている、請求項10記載のクロマトグラフィー媒体。本発明は、充填床における流動抵抗を減少させるための簡便な方法を提供する。これは、充填床における流動抵抗を減少させるために、小形ビーズと同じ種類の官能基リガンドでシェルを官能化したはるかに大形シェル粒子を、例えば10~20、小形粒子に追加することによって実現することができる。この混合戦略の大きな利点は、効率及び吸着速度を小形粒子と近いレベルに維持することができることである。シェル官能化大形粒子を使用することによって、溶出効率を何ら損なうことなく圧力-流動特性の向上が得られる。大形シェルビーズは、多孔質ビーズであっても、非多孔質コアと外面の多孔質固定相とを有するように設計してもよい。目的が充填床の背圧を低減させることだけであれば、当然のことながら官能化されていない大形ビーズを使用することができる。十分に官能化した大形ビーズを使用すると、分離能に悪影響を与えかねない。しかし、平衡状態での結合容量の損失は最小限に抑えられる。シェル官能化大形ビーズを代わりに使用することによって、効率は保持されるが、平衡結合容量は十分に官能化した大形ビーズと比較すると低減する。しかし、動的結合容量は、一般に使用される滞留時間で多くの場合同じである。混合ビーズ充填ビーズという概念を用いて、背圧及び吸着速度に関してカラムパッキングを最適化することができ、またシェル官能化大形ビーズを使用することで、小形ビーズの場合と同じレベルに高い溶出効率分離能を維持することができる。これが重要であるのは、分離能が高いと、ポリッシング用途においてある種のサイズのカラムの可能な試料負荷量を増加させることが見込まれるためである。よって、第1の態様では、本発明は、外側官能化シェル/リッドと内部コアとを含む大形ビーズ/粒子と小形ビーズ/粒子とを混合することを含む、圧力-流動特性の向上したクロマトグラフィー媒体の製造方法であって、大形ビーズと小形ビーズの粒度の比[大形粒子のD50V/小形粒子のD50V]が>1.2、好ましくは>3であり、カラム中の大形ビーズと小形ビーズの体積比[大形ビーズの全体積/ビーズの全体積]が0.05~0.9である方法に関する。D50Vは、累積体積分布のメジアン粒度である。リガンドの性質は、本発明の広範な態様を限定しない。よって、本分離マトリックスの一実施形態では、リガンドは、陰イオン交換リガンド、陽イオン交換リガンド、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICリガンド、逆相クロマトグラフィーRPCリガンド、固定化金属アフィニティクロマトグラフィーIMACリガンド、チオフィリックリガンド、アフィニティリガンド、核酸系リガンド、パイ相互作用、水素結合、及び/又はファンデルワールス力によって作用するリガンド、並びにマルチモーダルリガンド混合モードクロマトグラフィーリガンドとも呼ばれるからなる群から選択される。リガンドは、担体に直接カップリングしてもよいし、エクステンダーを介してカップリングしてもよい。エクステンダーは従来のものであり、よって、直鎖、枝分れ、環状の飽和、不飽和基及び芳香族基例えば、炭素原子数1~10のように、炭素原子数1~20の基を有するものを含んでもよい。これらの基は、純粋な炭化水素基、ヒドロキシル基、アルコキシ及びアリールオキソ及びチオ類似体及び/又はアミノ基を含んでもよい。炭化水素基中の炭素鎖には、1以上の位置に、窒素、エーテル酸素及びチオエーテル硫黄が介在していてもよい。また、アミド基及びケトン基にあるものなどのカルボニル基、及び加水分解に対して比較的安定な他の基であってもよい。表面エクステンダーを官能化したビーズ外側部分は、相互作用するリガンドを含有する外側シェルとしても存在/機能し得る。官能化シェルは、コアより高い及び低い多孔質、コアにあるものより大きい及び小さいサイズの細孔のいずれを有していてもよく、同じであってもよい。ビーズベースマトリックスは、有機及び/又は無機材料を基にする。ベースマトリックスは、生体分子用途の場合、好ましくは親水性であり、水に不溶性で多少は膨潤可能なポリマーの形態である。誘導体化して親水性となった疎水性ポリマーは、この定義に含まれる。適切なポリマーは、例えば多糖類に基づく、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルランなどのポリヒドロキシポリマー、並びに完全に合成のポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリヒドロキシアルキルビニルエーテル、ポリヒドロキシアルキルアクリレート及びポリメタクリレート例えばポリグリシジルメタクリレート、ポリビニルアルコール、スチレンやジビニルベンゼンに基づくポリマー、及び上述のポリマーに対応するモノマーのうち2種以上を含むコポリマーである。水溶性のポリマーを、例えば架橋結合によって、また吸着又は共有結合を介して不溶性物体をカップリングすることによって、誘導体化して、不溶性にしてもよい。OHに変換することができる基を呈するモノマーを重合することによって、又は最終ポリマーを親水化することによって、例えば親水性ポリマーなどの適切な化合物を吸着させることによって、疎水性ポリマー上に例えば、モノビニル及びジビニルベンゼンのコポリマー上に親水基を導入してもよい。ベースマトリックスに使用するのに適した無機材料は、シリカ、酸化ジルコニウム、グラファイト、酸化タンタルなどである。小形及び大形シェルビーズに、異なるベースマトリックス材料を使用することができる。生体分子以外の分子を分離するクロマトグラフィー用途では、ほぼ疎水性のベースマトリックスを使用することができる。分離能を最適化するために、大形及び小形シェル活性化ビーズを両方使用することもできる。30μmのシェルビーズを、10μmのビーズに極めて近い分離能を有するように設計してもよい。かかるビーズを90μmのシェルビーズと混合すれば、分離能及び圧力-流動特性に関して並外れたクロマトグラフィー特性を有するポリッシングカラムを充填することができるであろう。本発明によれば、大形シェルビーズと同じリガンドを均一に又はシェルに官能化した多孔質小形ビーズで、大形ビーズのうちの一部を置き換えることによって、大形シェルビーズを充填したカラムに対する試料の動的結合容量を増加させる方法が提供される。本発明の有利な態様は、本発明による高容量、高効率、低背圧流の充填分離クロマトグラフィーカラムを調製する方法であって、大形シェルビーズに、ビーズ全体に渡って均一に分布するリガンドで置換した多孔質小形ビーズを混合する方法を提供することである。本発明は、官能化された外側シェルと、官能化されていないことが多い多孔質又は非多孔質の内部コアとを含む、大形ビーズ/粒子を含む、クロマトグラフィー媒体に関する。コア又はビーズの内側部分も官能化してもよい。この場合、コアのリガンドは標的分子と相互作用しない例えば、シェルには陰イオン交換リガンド、コアには陽イオン交換リガンド。第2の態様では、本発明は、内部コアと外側シェルとを含む大形ビーズ/粒子を小形粒子との混合物として含み、大形ビーズと小形ビーズの粒度の比[大形粒子のD50V/小形粒子のD50V]が>1.2であり、カラム中の大形ビーズと小形ビーズの体積比[大形ビーズの全体積/ビーズの全体積]が0.05~0.9である、クロマトグラフィー媒体に関する。添付の図面に関連して本発明をさらに詳細に記述する。本実施例は例示目的のためだけに本明細書に提示するものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される通りの本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。Sepharose6FastFlowに基づくシェル媒体-ShellS6FFの調製全般マトリックスの体積は沈降ベッド体積を指し、グラムで示すマトリックスの重量は吸引乾燥重量を指す。磁気撹拌子を使用するとビーズが傷つきやすいので、反応物撹拌には電動攪拌器を使用する。ビーズ上の官能基の分析及びアリル化度又はリガンド-SO3基含有度の決定には、従来法を使用した。アリルグリシジルエーテルを用いたSepharose6FastFlowのアリル活性化ガラスフィルター上でSepharose6FastFlowを蒸留水で洗浄した。水切りしたSepharose6FastFlow50mLを反応容器に移し、蒸留水25mL、NaOH14.5g、Na2SO46.5g、及びNaBH41gを添加した。50°Cで0.5時間撹拌した後、アリルグリシジルエーテルAGE70mLを添加した。反応スラリーを50°Cで18時間撹拌し、続いてガラスフィルター漏斗上で、蒸留水、エタノール、及び最後に蒸留水で洗浄した。次いで、アリル含有量を滴定によって決定した。258μmol/mLであった。シェル活性化部分的臭素化を介する3μmシェルアリル化した水切り済みゲルアリル化Sepharose6FastFlow全部で12.9mmolのアリル基に相当する50g及び酢酸ナトリウム3gを、蒸留水500mL中で強力に撹拌した。密閉ガラス容器内で、0.2当量の臭素135μLを蒸留水110mLに溶解した。この臭素溶液を、激しく撹拌している間にアリルゲルスラリーに添加した。5分間撹拌した後に、ガラスフィルター上でこのゲルを蒸留水で洗浄した。S-リッドカップリング部分的に臭素化したゲル上記参照50gをフラスコに移し、蒸留水40mLに溶解した20gの亜硫酸ナトリウムと混合した。撹拌しながら、50NaOHを添加してpH12.5とし、続いて50°Cで18時間撹拌し、ガラスフィルター上で蒸留水で洗浄する。次いで、ガラスフィルター上でこのゲルを蒸留水で洗浄した。コアのアリル除去S-シェルゲル上記参照50mLを、蒸留水50mL及び酢酸ナトリウム0.5gに、ビーカー中でオーバーヘッド撹拌しながら混合した。スラリーに濃い橙色/黄色が残るまで臭素を添加した。3分間撹拌した後、スラリーが完全に変色するまでギ酸ナトリウムを添加した。次いで、ガラスフィルター上でゲルを蒸留水で洗浄し、次に1MNaOH中50°Cで16~18時間撹拌し、続いて蒸留水で洗浄した。次いで、H容量を滴定によって決定した。49μmol/mLであった。混合媒体SPSepharoseHPとShellSSepharose6FastFlowのクロマトグラフィー評価材料及び方法全般大形ビーズと小形ビーズを混合することによる圧力/流速効果を試験するために、SepharoseHP平均粒度34μmをSepharoseFastFlow平均粒度90μmに混合し、カラムTricorn5/50に充填した。圧力-流動特性を、SepharoseHP及びSepharoseFastFlowをそれぞれ充填したカラムと比較した図1。タンパク質を分離するための試験法の原理は、分離媒体1種又は複数を含有する、A緩衝液で平衡化したTricorn5/50カラムに、タンパク質を注入する。次いで、約5カラム体積のA緩衝液をポンプでカラムに通し、次いでA緩衝液からB緩衝液A緩衝液NaClの20mLの直線勾配をかける。次いで、クロマトグラフィーのプロファイルを280nmでモニターする。図2~4に、SPSepharoseHP、SPSepharoseFastFlow、及びSPSepharoseHPとShellSSepharoseFastFlowとの混合物のクロマトグラフィーの結果を示す。実験圧力-流動特性を、クロマトグラフィーシステムソフトウェアUNICORNを有するAKTAexplorer100で試験した。検討すべき媒体を、NextAKTA7/10mmカラムに充填した。移動相としてMilli-Q水を使用し、漸増線流速60分間に0から10ml/分をカラムに適用した。クロマトグラフィー特性を評価するために、幾つかの異なるタンパク質を使用した。評価した媒体はTricorn5/50カラムに充填し、適用したタンパク質は勾配溶出で溶出した上記参照。2種類の異なる緩衝系を使用した。1.緩衝液A:100mM酢酸緩衝液pH5.8緩衝液B:100mM酢酸緩衝液pH5.80.25MNaCl2.緩衝液A:100mM酢酸緩衝液pH6.1緩衝液B:100mM酢酸緩衝液pH6.10.20MNaCl。使用した試料は、リボヌクレアーゼA1.5mg/mL、シトクロムC0.4mg/mL及びリゾチーム0.4mg/mLであった。これらのタンパク質はA緩衝液に溶解し、200μLを適用した。クロマトグラフィーシステムにおける性能を、以下に示す装置及び設定を利用してモニターした。装置GEHealthcareBiosciencesABLCシステム:AKTA登録商標Explorer10XTソフトウェア:UNICORN登録商標注入ループ:200μlカラム:Tricorn5/50機器パラメータ流速:1.0mL/分検出セル:10mm波長:280nm。結果及び考察本発明は、小形ビーズに基づくクロマトグラフィー媒体の圧力-流動特性を、より大きい粒度を有するシェルビーズを追加することによって調節する方法を提案する。粒度が上がればカラムに充填したビーズでの圧力損失が低下することは周知である。図1に、それぞれ34μmSepharoseHP及び90μmSepharoseFastFlowの平均粒度を有するアガロース粒子の背圧を示す。この図は、流速とともにどのように背圧が増加するか詳細については実験の部を参照を図示しており、大形ビーズであればはるかに低い背圧になることを明白に示している。SepharoseHPに認められる背圧の急上昇は小形ビーズに起因し、高流速でのビーズの圧縮にも起因する。図1は、SepharoseFastFlowビーズをSepharoseHPビーズに混合すると、背圧が低減することも明白に示している。こうした結果は予期される。しかし、ビーズを大きくするとカラムの効率が低下するピークが広くなることも周知である。こうした現象は、図2にSPSepharoseHP平均粒度34μm及びSPSepharoseFastFlow平均粒度90μmで図示される。これは、小形ビーズの場合に得られるのと同じ効率を保持しながらこの種のビーズを混合することが不可能であることを意味している。本発明者らは、小形ビーズと同じ官能基同じリガンドで官能化した大形シェルビーズを混合することを提案するが、リガンドは、薄い外側シェル、又は固定した表面エクステンダーから構成することができる、外側部分に付着する図3。こうしたビーズ設計は、溶出段階での物質移動速度の高速化をもたらし、よって、SPSepharoseFastFlowのような、リガンドで均一に置換した同じサイズのビーズと比較して、ピークが狭くなるであろう。図4と図5を比較してみれば、この種のシェルビーズは、ピーク幅を劣化させることなく、均一にリガンドで置換した小形ビーズと混合することができることが明白に実証される。図4に、SPSepharoseHPを充填したカラム上で分離した3種類のタンパク質のクロマトグラムを示し、図5に、SPSepharoseHPとShellSSepharoseFastFlowとの混合物を充填したカラムからの結果を示す。