"アミノ酸配列、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、式中、アミノ酸X1~X8のうちのいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQであり、前記ペプチドが、脊椎動物の心機能を調整する単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステル。アミノ酸配列、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、式中、アミノ酸X1~X8のうちのいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQであるが、但し、前記ペプチドが、ペンタペプチドで構成されるとき、前記ペンタペプチドのアミノ酸配列は、LPLRF配列番号3ではなく、かつ前記ペプチドが、ドデカペプチドで構成され、かつX6、X7、X8、X9、X10、およびX11が、それぞれA、N、L、P、LおよびRであるとき、X4がSまたはPではない単離ペプチド。前記ペプチドが、脊椎動物の心機能を調整する請求項2に記載のペプチド。X1がM、V、またはS以外のアミノ酸であり、X5がFまたはV以外であり、X7がN以外であり、X9がP以外であり、X11がR以外であり、X1、X5、X7、X9、およびX11のそれぞれが、互いに独立して選択される請求項1または2に記載のペプチド。X11が、R以外のアミノ酸である請求項1または2に記載のペプチド。X1、X5、X7、X9、およびX11のうちの少なくとも1つがAである請求項4に記載のペプチド。X8が存在する請求項1または2に記載のペプチド。X8がA、V、またはLであり、X9がPまたはFである請求項7に記載のペプチド。X2がPであり、X4がSであり、X6、X7、X8、およびX9が、それぞれA、N、L、およびPである請求項1~8のいずれか1項に記載のペプチド。X3およびX7のうちの少なくとも1つが、ヒスチジン以外のアミノ酸である請求項1または2に記載のペプチド。X1およびX2が存在しない請求項10に記載のペプチド。X7がAである請求項10に記載のペプチド。前記ペプチドが、h-RFRP1の逆作動薬である請求項10に記載のペプチド。X3がBpaである請求項13に記載のペプチド。N末端チロシル残基をさらに含む請求項1または2に記載のペプチド。前記ペプチドが、h-RFRP1作動薬である請求項1または2に記載のペプチド。前記ペプチドが、h-RFRP1拮抗薬である請求項1または2に記載のペプチド。X1およびX2が存在せず、X4がD以外のアミノ酸である請求項1または2に記載のペプチド。X4がBpaである請求項18に記載のペプチド。薬学的に許容される担体およびアミノ酸配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、式中、アミノ酸X1~X8のうちのいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQであり、単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルを含む医薬組成物。薬学的に許容される担体および請求項1~19および34のいずれか1項に記載の単離ペプチドを含む医薬組成物。障害の治療での請求項1~19および34のいずれか1項に記載のペプチド、または請求項20もしくは21に記載の医薬組成物の使用。前記障害が心障害である請求項17に記載の使用。心障害の治療のための薬剤を製造するための請求項1~19および34のいずれか1項に記載のペプチドの使用。哺乳動物を含む脊椎動物において心障害を治療する方法であって、治療有効量の請求項1~19および34のいずれか1項に記載のペプチドを、前記脊椎動物に投与することを含む方法。a第1の群の1つまたは複数の筋細胞を、MPHSFANLPLRF配列番号2、MPPSFANLPLRF配列番号14、VPNSVANLPLRF配列番号15、VPHSAANLPLRF配列番号16、MPPSAANLPLRF配列番号17、SLKPAANLPLRF配列番号18、LPLRF配列番号3、PLRF、PQRF、FLRF、FQRF、APLRF配列番号19、APQRF配列番号20、AFLRF配列番号21、AFQRF配列番号22、VPLRF配列番号23、VPQRF配列番号24、VFLRF配列番号25、およびVFQRF配列番号26から成る群から選択される配列を含む単離ペプチドであって、式中、Fがアミド化される単離ペプチドと接触させること、baに記載される前記第1の群、または第2の群の1つまたは複数の筋細胞を、試験薬と接触させ、前記試験薬との接触後の効果を測定すること、およびcステップaの測定値を、ステップbの測定値と比較して、前記試験薬が、脊椎動物の心機能を調整するか否かを明らかにすることを含む、脊椎動物の心機能を調整する薬剤をスクリーニングする方法。ステップaの前記ペプチドが、MPHSFANLPLRF配列番号2、MPPSFANLPLRF配列番号14、VPNSVANLPLRF配列番号15、VPHSAANLPLRF配列番号16、MPPSAANLPLRF配列番号17、LPLRF配列番号3、PLRF、PQRF、FLRF、およびFQRFから成る群から選択され、式中、Fがアミド化され、前記脊椎動物が哺乳動物である請求項26に記載の方法。前記試験薬が、請求項1または2に記載のペプチドである請求項27に記載の方法。ステップaにおける前記ペプチドが、N末端チロシンをさらに含み、前記チロシンが、測定可能に標識される、請求項28に記載の方法。1つまたは複数の筋細胞の群を、アミノ酸配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、式中、アミノ酸X1~X8のうちのいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQである単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルと接触させること、および前記接触に起因する前記群の心機能を示す効果を測定することを含む脊椎動物の心機能を調整する化合物をスクリーニングする方法。アミノ酸配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、アミノ酸X1~X8のうちのいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQである単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルを、脊椎動物の心機能を調整するのに有効な量で、哺乳動物を含む脊椎動物に投与することを含む前記脊椎動物の心機能を調整する方法。哺乳動物を含む脊椎動物の細胞または組織を、アミノ酸配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、アミノ酸X1~X8のうちのいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQであり、単離ペプチド、または塩、アミド、もしくはエステルと接触させることを含む前記細胞または組織内のPKC媒介のシグナル伝達を調整する方法。前記ペプチドが、請求項1~19および34のいずれか1項に記載のペプチドである請求項31または32に記載の方法。前記アミノ酸残基FがFアミドである請求項1~19のいずれか1項に記載のペプチド。本発明は、RFRP-1ペプチド、哺乳動物のDMSの相同分子種が、哺乳動物no心筋細胞および生体内心性能に対して極めて特異的かつ劇的な抑制作用をもたらすという発見に関する。より具体的には、本発明は、単離または合成ペプチド組成物に関し、そのペプチド構造は、ヒトRFRP-1hRFRP-1配列:MPHSFANLPLRFアミド配列番号2およびその相同分子種の修飾に基づく。hRFRP-1および本明細書に記載されるFMRFアミド関連ペプチドの他のメンバーに関する構造機能試験は、本発明の特定の修飾ペプチド、ならびにhRFRP-1が、哺乳動物の心機能を同様に調整することができることをさらに示す。したがって、一態様では、本発明は、上記のhRFRP-1のアミノ酸配列の修飾であるアミノ酸配列を含む単離または合成ペプチド、およびその方法を対象とする。一実施形態では、本発明の修飾hRFRP-1配列は、アミノ酸配列X9-X10-X11-Fによって表されるテトラペプチドを含み、式中、X10はLまたはQであり、X9およびX11は、それぞれ独立して天然または修飾アミノ酸である。別の実施形態では、配列LPLRF配列番号3またはPQRFモチーフは、本発明の修飾hRFRP-1配列のC末端アミノ酸として保持される。別の実施形態では、Fによって表されるC末端フェニルアラニンはアミド化されるか、ないしは別の方法で修飾されるか、またはL-フェニルアラニンもしくはD-フェニルアラニンから選択される。本明細書に記載の本発明のあらゆる態様では、実施形態は、C末端フェニルアラニンを含むC末端残基がアミド化される発明のペプチドを包含する。したがって、本明細書に開示される発明のペプチドのいずれかは、C末端Fアミドを有するものから選択することができる。したがって、明記されるか否かに関わらず、C末端Fまたはフェニルアラニンは、Fアミドまたは遊離酸形態のフェニルアラニンのいずれかの表現を含む。本発明では、C末端テトラペプチドアミノ酸X9-X10-X11-Fは、上述されるように、心機能を調整することが認識される。心機能を調整するとは、本明細書に記載される1つまたは複数のペプチドが、心収縮機能に対して明らかに陽性または陰性作用を及ぼすことを意味する。この陽性または陰性作用は、当業者に知られる生体内または生体外方法によって、またそうでなければ本明細書に記載されるように明らかである。したがって、本明細書に記載される方法を含む心拍数、拍出量、駆出率、および/または心拍出量を測定することを対象とする方法を生体内で利用することによって、本明細書に記載の1つまたは複数のペプチドが、脊椎動物または哺乳動物の心臓を含む心臓に対して、陽性または陰性の変時性、変力性、および拡張作用を呈するか否かを明らかにすることができる。さらに、本明細書に記載の方法を含む単離した筋細胞のサルコメア短縮および/または弛緩のパラメータを測定することを対象とする方法を生体内で利用することによって、本明細書に記載される1つまたは複数のペプチドが、心収縮機能に対して陽性または陰性作用を呈するか否かを明らかにすることができ、したがって、心機能を調整することができる。このパラメータは、ピーク高、出発速度、および/または回復速度の少なくとも1つを含む。生体内方法または生体外方法を使用するかに関わらず、当業者は、心収縮機能に対する観察された陽性または陰性作用が、本発明の1つまたは複数のペプチドの作用に起因することを確かめるために、適切な対照、基準対象、および/または試料を含むことを認識する。本明細書に記載される発明のペプチドは、hRFRP-1を含むRFアミド含有ペプチドのシグナル伝達作用を遮断することによって、心機能に影響し得ることが認識される。以下で説明および例証されるように、出願人は、hRFRP-1を哺乳動物に生体内投与すること、および哺乳動物由来の筋細胞に生体外投与することによって、hRFRP-1が明らかに心収縮機能を減少させることができ、心機能を調整することを発見した。親hRFRP-1ペプチド配列から派生した修飾ペプチドである明細書に記載の発明のペプチドは、心収縮性に対するhRFRP-1の1つまたは複数の作用の作動薬逆作動薬および超作動薬を含むおよび拮抗薬を含む。この点で、本発明の目的で、hRFRP-1の作動薬またはhRFRP-1作動薬とは、発明のペプチドが、hRFRP-1と比較して、心収縮機能を明らかに減少させることもできることを意味するものとする。hRFRP-1の超作動薬またはhRFRP-1超作動薬とは、発明のペプチドが、hRFRP-1と比較して、明らかに心収縮機能を減少させることができ、親hRFRP-1ペプチドよりも能力が高いことを意味するものとする。本発明の超作動薬ペプチドの例に、11merペプチド:PHSFANLPLRFアミド配列番号4があり、ペプチドは、本発明の特定実施形態として提供される。hRFRP-1の逆作動薬またはhRFRP-1逆作動薬は、発明のペプチドが、hRFRP-1と比較して、明らかに心収縮機能を増加させることができることを意味するものである。hRFRP-1の拮抗薬またはhRFRP-1拮抗薬とは、発明のペプチドが、心収縮機能に対するhRFRP-1の作用を明らかに減衰させ得ることを意味するものである。この点で、減衰するとは、心収縮機能に対するhRFRP-1の作用の減少または排除を意味するものである。本発明は、心収縮に対するhRFRP-1の1つまたは複数の作用の作動薬逆作動薬および超作動薬を含む、および拮抗薬である化合物をスクリーニングする方法を提供する。本明細書に記載の方法の工程の特定の順序は、心収縮機能に対するhRFRP-1の作用と比較して、本明細書に記載される1つまたは複数の発明のペプチドの作用容易に明らかにする限り、限定されないことが認識される。例えば、本明細書に記載される発明のペプチドが、本明細書に示される教示に基づいて、単離した筋細胞内のサルコメア短縮の1つまたは複数のパラメータを測定することによって明らかになるように、心収縮機能に対するhRFRP-1の作用を減衰させ得るか否かを明らかにするために、当業者は、1つまたは複数の筋細胞をhRFRP-1で事前にインキュベートし、心収縮の測定を行った後、本明細書に記載される発明のペプチドを試験薬として事前にインキュベートした試料に添加し、続いてパラメータを測定するステップを含めることができる。この方法で、hRFRP-1および試験薬の筋細胞の共インキュベーションが、hRFRP-1単独でインキュベーションした後に見られる作用を減少させるか否かを明らかにすることができる。あるいは、例えば、1つまたは複数の筋細胞がhRFRP-1単独でインキュベートされる参照試料、およびhRFRP-1、試験薬、および1つまたは複数の筋細胞が参照試料と同じ期間だけ共インキュベートされる第2の試料をステップに含めることができる。続いて、特定のエンドポイント測定値を試験試料および参照試料から取り、適切な比較を行う。再度、比較から、試験薬が心収縮に対するhRFRP-1の作用を減衰させるか否かを明らかにする。当業者によって容易に変えることができる特定の検定設計を変更することは、本発明の方法によって包含される。本発明は、本明細書に記載されるように、発明のペプチドまたはペプチドを含む薬理学的組成物の1つまたは複数を用いる治療方法を包含する。特定の障害を治療するための特定の発明のペプチドまたは組成物の選択は、ペプチドがそれを必要とする対象に投与されるとき、心収縮機能を減少または増加させるペプチドの能力に応じて、心収縮機能を増加または減少させることによって、特定障害を治療することに互恵的であるか否かを考慮して、当業者によってなされ得ることが認識される。本明細書に記載される発明のペプチドは、hRFRP-1を含む、RFアミド含有ペプチドのシグナル伝達作用を遮断することによって、心機能に作用し得ることも認識される。当業者は、本明細書に記載されるhRFRP-1作動薬および拮抗薬の中から選択することができる。例えば、非代償性鬱血性心不全を含む、心不全の場合、陽性イオンチャネル型作用を誘起して、心収縮機能を増加させることが望ましいことが想定される。したがって、この場合、hRFRP-1の逆作動薬または拮抗薬を選択することが望ましい。一方、他の特定の障害の場合、例えば、ある外科的状況、不整脈、および細動、例えば、薬物誘発性不整脈を含む状況では、心収縮機能を減少させることが望ましいことが認識される。この点で、心障害とは、心臓に作用する急性または慢性の病的状態であって、心臓の異常な収縮機能と関連付けられる状態を意味するものとする。異常な収縮機能とは、対象の原発性疾患であり得るか、または別の急性または慢性の初期の病態の兆候であると認識される。特定の実施形態では、発明のペプチドの1つまたは複数を心細胞または組織に投与すると、不整脈後の心細胞または組織において、検出可能に律動を確立する。関連の実施形態では、投与は生体内または生体外である。したがって、親ペプチドMPHSFANLPLRFアミド配列番号2を参照して以降hRFRP-1と呼ぶ、本発明は、親hRFRP-1ペプチド配列から派生した修飾ペプチドであるペプチドを包含する。特定の実施形態では、発明のペプチドは、LPLRF配列番号3、PQRF、またはPLAFアミノ酸をそのC末端に保持する。修飾には、hRFRP-1アミノ酸の切断、置換、削除、および挿入、ならびにアミノ酸の化学修飾が含まれる。特定の実施形態では、本発明は、親hRFRP-1ペプチド配列から派生した修飾ペプチドであるペプチドを包含し、アミノ酸PLXF、PQXF、FLXF、FQXF、APLXF配列番号5、APQXF配列番号6、AFLXF配列番号7、AFQXF配列番号8、VPLXF配列番号9、VPQXF配列番号10、VFLXF配列番号11、またはVFQXF配列番号12アミノ酸をそれらのC末端に保持し、式中、Xは、L-アルギニン以外の任意の天然または修飾アミノ酸である。一実施形態では、Fによって表されるC末端フェニルアラニンはアミド化される。より具体的に、一態様では、本発明は、アミノ酸配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドを提供し、式中、アミノ酸X1~X8のいずれか1つは存在するかまたは存在せず、X9およびX11は存在し、X10はLまたはQであり、当該ペプチドは、脊椎動物の心機能を調整し、またはその塩、アミドもしくはエステルを提供する。本明細書に記載される本発明の態様ではいずれも、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11という名称は、親MPHSFANLPLRFアミドペプチド配列番号2に含有されるアミノ酸の位置に対応する。本発明は、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11のいずれか1つが、親ペプチドの対応する位置に含有されるアミノ酸として、独立して選択されるペプチドを包含する。したがって、本発明の特定の実施形態では、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11は、それぞれ独立して、M、P、H、S、F、A、N、L、P、L、およびRからそれぞれ選択される。本発明の目的で、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11によって表されるものを含む本発明のペプチドによって構成されるアミノ酸のいずれかは、天然または修飾アミノ酸である。本発明の目的で、天然アミノ酸という用語は、自然発生するアミノ酸の十分に知られたL-異性体を意味するものとする。修飾アミノ酸という用語は、自然発生するアミノ酸の十分に知られたL-異性体以外のアミノ酸を意味するものとする。本発明の目的で、本明細書で使用する修飾アミノ酸という用語は、化学的または変換後に修飾されるアミノ酸、ならびに自然発生するアミノ酸のL-異性体のD-対応物、およびペプチド模倣の化合物の合成にアミノ酸の代替として使用される化合物を含む。化合物は、当業者によく知られており、典型的に、非天然置換のあるペプチドにあるR基またはアミノ酸の置換によって生成される。その置換は、安定性、可溶性、透過性血液-脳障壁透過性、バイオアベイラビリティ、または得られるペプチドの活性を増加させ得る。したがって、親hRFRP-1ペプチド配列から派生した修飾ペプチドは、自然発生するhRFRP-1内の1つまたは複数のアミノ酸が、別の天然アミノ酸、アミノ酸誘導体、合成アミノ酸、アミノ酸類似体、または非天然アミノ酸と置換されるときに生成される。修飾には、心機能を調整する発明のペプチドを産出する1つまたは複数の保存性または非保存性アミノ酸置換、削除、または挿入が含まれる。修飾は、発明のペプチドを使用するときに、能力、可溶性、透過性血液-脳障壁透過性を含む、バイオアベイラビリティ、安定性の増加、毒性の減少、または生理学的条件下での分解等の利点を提供することができる。保存性置換は、典型的に、1つのアミノ酸を、以下の群、バリン、グリシン;グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;リシン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシン内の置換等の類似する特性を持つ別のアミノ酸に置換することを含む。非極性疎水性群のアミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。極性中性群のアミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正電荷塩基性群のアミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。負電荷酸性群のアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。低保存性または非保存性置換を利用することによって、例えば、電荷、構造、および他の生物学的特性に望ましい変化を引き起こすことによって、特に所望される本発明の修飾hRFRP-1をもたらすことができる。置換には、例えば、親水性残基を疎水性残基に置換すること、システインまたはプロリンを別の残基に置換すること、小側鎖のある残基を巨大側鎖のある残基に置換すること、または純正電荷の残基を純負電荷の残基に置換することを含む。所与の置換の結果を確実に予測できないとき、本明細書に開示される方法に従って、誘導体を容易に分析し、例えば、心機能の調整、およびhRFRP-1の作動薬または拮抗薬として作用する能力を含む所望の特性の存在または非存在を明らかにしてもよい。ペプチド骨格の置換基を置換することができるように、同様の特徴によって特徴づけられる基のある骨格を修飾する感応基を置換することもできるすなわち、各アミノ酸の一部であるR基。hRFRP-1の作動薬が所望される場合、この置換は、典型的に保存性であり、すなわち、置換基には、元の基とほぼ同じ寸法、形状、疎水性、および電荷がある。非配列修飾は、本明細書に記載される親または発明のペプチドの一部分の化学誘導体化を含んでもよい。本発明の特定実施形態では、発明のペプチドは、ヨード化、アミド化、硫酸化、単一または複数ハロゲン化、アルキル化、カルボキシル化、またはリン酸化される化学的に修飾されたペプチドを含む。ペプチドは、例えば、アセチル基、ファルネシル部分、または脂肪酸で、単一または複数アシル化することができ、飽和、一価不飽和、または多価不飽和となり得る。脂肪酸は、単一または複数フッ素化されてもよい。本発明はまた、hRFRP-1のメチオニン類似体、例えば、メチオニンスルホンおよびメチオニンスルホキシド類似体を包含する。本発明はまた、アルキルまたはアリールアンモニウム塩を含むアンモニウム塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、チオ硫酸塩、カルボン酸塩、重炭酸塩、安息香酸、スルホン酸塩、チオスルホン酸塩、メシル酸塩、エチルスルホン酸塩、およびベンゼンスルホン酸塩等のhRFRP-1の塩も含む。本発明の修飾hRFRP-1ペプチドは、hRFRP-1から派生したペプチド模倣化合物も含む。ペプチド模倣化合物の合成は、当業者に良く知られており、化合物は、ペプチド内のあるR基またはアミノ酸を非天然部分と置換することによって生成される。置換を使用して、安定性、可溶性、透過性血液-脳障壁透過性を含む、バイオアベイラビリティ、または本明細書に記載されるhRFRP-1の特定の所望の活性を増加させるか、またはhRFRP-1の心機能調整能力を保持する。適切なペプチド模倣体の例には、対応するLアミノ酸、テトラゾールのDアミノ酸ZabrockietalJAmChemSoc11058755880、アミド結合の等量式が含まれる。同様の類似体は、KempetalTetrahedronLett29508150821988ならびにKempetalTetrahedronLett29505750601988、KempetalTetrahedronLett29493549381988、およびKempetalJOrgChem541091151987に示される。他の適切なペプチド模倣体は、NagaiandSatoTetrahedronLett26647650、DiMaioetalJChemSocPerkinTrans1687、KahnetalTetrahedronLett302317、OlsonetalJAmChemSoc112323333、GarveyetalJOrgChem56436に示される。さらに適切なペプチド模倣体には、ヒドロキシ-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸塩MiyakeetalJTakedaResLabs435376、1,2,3,4-テトラヒドロ-イソキノリン-3-カルボン酸塩、2S,3S-メチル-フェニルアラニン、2S,3R-メチル-フェニルアラニン、2R,3S-メチル-フェニルアラニン、および2R,3R-メチル-フェニルアラニンが含まれる。本発明の修飾hRFRP-1ペプチドはまた、hRFRP-1から派生したペプチドを含むこともでき、親hRFRP-1に結合された少なくとも1つのペプチド骨格は、非自然発生ペプチド骨格結合に化学的に修飾または改変される。言い換えれば、1つのアミノ酸残基の窒素原子と次の炭素原子との間に自然に発生するペプチド結合は、窒素原子上の還元、アルキル化例えば、メチル化によって、非自然発生結合に改変されているか、または結合が、アミン、尿素結合、またはスルホンアミド結合、エーテル結合、またはチオエーテル結合等の還元結合によって置換されている。この点に、残基の側鎖を骨格窒素にシフトして、N-アルキル化-グリシンを得てもよいことが認識される。ペプチド模倣部分の使用および非自然発生ペプチド骨格の合成、ならびにペプチドの他の化学修飾には、米国特許第7,217,808号、同第7,192,723号、および同第7,683,031号に記載されるものを含み、全体的な内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる。本発明の修飾hRFRP-1ペプチドはまた、環状分子であるか、または環化されるペプチドを含むこともできる。本発明の目的で、環状分子は、一例において、本発明のペプチドを指し、N末端の窒素原子と、C末端のカルボニル炭素との間のペプチド結合の形成によって環が形成される。環化とは、化合物のN末端の窒素と、その中に存在する配列の適切なアミノ酸の側鎖、好ましくは、C末端アミノ酸の側鎖との間の共有結合による環の形成を指す。例えば、アミドは、N末端の窒素原子と、アスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖のカルボニル炭素との間に形成することができる。あるいは、化合物のC末端のカルボニルと、その中に含まれる配列の適切なアミノ酸の側鎖、好ましくは、N末端アミノ酸の側鎖との間に共有結合を形成することによって、化合物を環化することができる。例えば、C末端におけるカルボニル炭素と、リシンまたはオリニチンの側鎖内のアミノ窒素原子との間にアミドを形成することができる。加えて、化合物はC末端のカルボニル炭素と、セリンまたはトレオニンの側鎖内のヒドロキシル酸素との間にエステルを形成することによって、環化され得る。環化とは、化合物内に存在する配列の2つの適切なアミノ酸の側鎖、好ましくは、2つの末端アミノ酸の側鎖の間の共有結合によって環を形成することも指す。例えば、2つのシステインの側鎖内の硫黄原子の間にジスルフィドを形成することができる。あるいは、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖内のカルボニル炭素と、例えば、セリンまたはトレオニンの側鎖内の酸素原子との間にエステルを形成することができる。例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖内のカルボニル炭素と、例えば、リシンまたはオルニチンの側鎖内のアミノ窒素との間にアミドを形成することができる。ペプチドから派生した環化分子、または環化ペプチドを調製する方法は、例えば、米国特許第7,683,031号において開示され、全体的な内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。さらに、2つの末端の間、1つの末端と化合物中のアミノ酸の側鎖との間、またはペプチドもしくはペプチド誘導体内の2つのアミノ酸の側鎖の間の結合基を用いて、化合物を環化することができる。適切な結合基は、Loblら、国際公開第92/00995号およびChiangら、国際公開第94/15958号に開示され、その教示は、参照することによって本出願に組み込まれる。また以下で更に詳述するように、フェニルアラニンPhe、Fの化学的修飾またはペプチド模倣誘導体を含む本発明の特定のペプチドは、[Bpa3]hRFRP-1であり、12量体親hRFRP-1MPHSFANLPLRFアミド配列番号2の第3のアミノ酸が、p-ベンゾイル-フェニルアラニン部分と置換される以降、Bpaと呼ぶ。出願人は、[Bpa3]hRFRP-1がhRFRP-1の逆作動薬であるという発明的発見をした。特定の実施形態では、本発明の修飾hRFRP-1ペプチドは、親hRFRP-1ペプチドの内部ヒスチジンが、Bpaで置換されるものを含む。理論に制限されないが、Bpaは、心機能に対するhRFRP-1の調整作用の方向を心機能の減少から心機能の増加へ逆転させるために十分な立体障害を示す置換であると想定する。本発明は、[Bpa3]hRFRP-1、および本明細書に記載される他の発明的ペプチドの使用をさらに包含する。本明細書に記載される配列を含むペプチドは、固相ペプチド合成例えば、t-BOCまたはF-MOC法を用いるよく知られた手動または自動配列決定によって、液相合成によって、または前述の方法の複合を含む他の十分に適切な手法によって、合成することができる。周知で、広く使用されているt-BOCおよびF-MOC法は、例えば、MerrifieldJAmChemSoc882149、MeienhoferHormonalProteinsandPeptidesCHLiEdAcademicPress1983pp48267、およびBaranyandMerrifieldinThePeptidesEGrossandJMeienhoferEdsAcademicPressNewYork1980pp3285に説明がある。固相ペプチド合成の方法は、MerrifieldRBScience232341、CarpinoLAandHanGYJOrgChem373404、およびGauspohlHetalSynthesis5315に説明がある。この参照文献の教示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に記載される本発明の様々な態様および実施形態による任意およびすべてのペプチドは、合成ペプチドとして提供することができ、本発明は、本明細書に記載される配列を含む合成ペプチドを提供することを含む。化学合成法の代替として、本発明の特定ペプチドは、タンパク質およびペプチドの大規模生成のために適合されたものを含むよく知られた組み換え手法によって生成することができる。この点に、例えば、MolecularCloning′′2ndEdに記載されるものを含む標準的な分子生物学的手法を利用することによって、本発明のペプチドの1つまたは複数をコードする核酸を、宿主細胞内で発現させることができ、続いてよく知られている方法を利用して、ペプチドを宿主細胞から単離および精製する。宿主細胞には、細菌、哺乳動物、または昆虫細胞系が挙げられ、例えば、CHO細胞、大腸菌細胞、およびSf9細胞が含まれる。その方法には、所望の発現ペプチドの単離および精製を容易にするために、よく知られている潅流タンパク質タグの使用を含み得る。典型的に、タグは、制限タンパク質分解によって、便宜的に除去可能である。さらに、組み換え手法によって生成された発明のペプチドは、本明細書に記載される化学的手段によってさらに修飾できることが認識される。したがって、組み換え手法を利用することによって、内因性RFRP-1ペプチドを修飾して、アミノ酸挿入、削除、置換、および切断を含む1つまたは複数の修飾を含めることができる。したがって、本発明のペプチドは、化学合成後に単離されるか、または組み換え法による生成後に単離される本明細書に記載の発明的ペプチドを包含する。ペプチド、アミノ酸等を説明する際に本出願の明細書および図面全体に使用する省略形は、IUPAC-IUB合同委員会生化学命名法によって推奨されるものであるか、または当該技術分野に慣習的に使用されるものであり、以下のアミノ酸省略形が含まれる。GlyまたはG:グリシン、AlaまたはA:アラニン、ValまたはV:バリン、LeuまたはL:ロイシン、IleまたはI:イソロイシン、SerまたはS:セリン、ThrまたはT:トレオニン、CysまたはC:システイン、MetまたはM:メチオニン、GluまたはE:グルタミン酸、AspまたはD:アスパラギン酸、LysまたはK:リシン、ArgまたはR:アルギニン、HisまたはH:ヒスチジン、PheまたはF:フェニルアラニン、TryまたはY:チロシン、TrpまたはW:トリプトファン、ProまたはP:プロリン、AsnまたはN:アスパラギン、GlnまたはQ:グルタミン。特別の定めのない限り、光学異性体のあるアミノ酸は、L-異性体を表すものとし、ペプチドは、当該技術分野に慣習的に理解されるように、N末端からC末端の方向で示される。以下に、本発明の特定の態様および実施形態をさらに詳細に示す。一態様において、本発明は、アミノ酸配列:X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、式中、アミノ酸X1~X8のいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQであり、当該ペプチドは、脊椎動物において心機能を調整し、またはその塩、アミドもしくはエステルを提供する。第2の態様では、本発明は、アミノ酸配列:X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、式中、アミノ酸X1~X8のいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQであるが、但し、該ペプチドがペンタペプチドで構成されるとき、該ペンタペプチドのアミノ酸配列はLPLRF配列番号3ではなく、かつ前記ペプチドが、ドデカペプチドで構成され、かつX6、X7、X8、X9、X10、およびX11が、それぞれA、N、L、P、L、およびRであるとき、X4はSまたはPでない。第2の態様の一実施形態では、ペプチドは、脊椎動物において心機能を調整する。上述される本発明の態様のいずれかの一実施形態では、式中、X1はM、V、またはS以外のアミノ酸であり、X5はFまたはV以外であり、X7はN以外であり、X9はP以外であり、X11がR以外であり、X1、X5、X7、X9、およびX11はそれぞれ互いに独立して選択される。別の実施形態では、X11は、R以外のアミノ酸である。別の実施形態では、X1、X5、X7、X9、およびX11の少なくとも1つはAである。別の実施形態では、X8は存在する。別の実施形態では、X8はA、V、またはLであり、X9はPまたはFである。別の実施形態では、X2はPであり、X4はSであり、X6、X7、X8、およびX9はそれぞれA、N、L、およびPである。別の実施形態では、X3およびX7のうちの少なくとも1つは、ヒスチジン以外のアミノ酸である。関連の実施形態では、本明細書に記載される発明のペプチドは、内部ヒスチジン残基を含有しない。別の実施形態では、X1およびX2は存在しない。別の実施形態では、X1およびX2が存在しない場合X7はAである。別の実施形態では、X1およびX2が存在せず、X7がAである場合、該ペプチドは、h-RFRP1の逆作動薬である。別の実施形態では、X3はBpaである。関連の実施形態では、本明細書に記載されるLRFアミドから成るC末端配列の任意の自然発生する10量体または12量体ペプチドの内部ヒスチジン残基は、Bpaに置換される。別の実施形態では、本発明の態様のいずれかによる発明のペプチドは、チロシル残基を含む。別の実施形態では、チロシル残基は、N末端チロシル残基である。別の実施形態では、チロシル残基は、検出可能に標識される。別の実施形態では、発明のペプチドは、h-RFRP1作動薬、拮抗薬、または逆作動薬である。別の実施形態では、X1およびX2は存在せず、X4はD以外のアミノ酸である。別の実施形態では、X1およびX2は存在せず、X4はBpaである。第3の態様では、本発明は、薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物、およびアミノ酸配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、式中、アミノ酸X1~X8のいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQである単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルを提供する。第4の態様では、本発明は、薬理学的に許容される担体、および本発明の第1または第2の態様、および上述されるようなその任意の実施形態による単離ペプチドを提供する。第5の態様では、本発明は、障害の治療に、本明細書に記載される医薬組成物を使用することを提供する。一実施形態では、障害は心障害である。本発明は、手術前、手術中、または手術後に心機能を増加または減少させるための発明のペプチドの使用をさらに提供する。第6の態様では、本発明は、心障害の治療のための薬剤の製造に、本明細書に記載される発明のペプチドのいずれかを使用すること提供する。第7の態様では、本発明は、哺乳動物を含む脊椎動物の心障害を治療する方法を提供し、本方法は、本発明の第1および第2の態様、ならびに上述されるような任意の実施形態に記載される治療有効量の発明のペプチド、または上述の医薬組成物を該脊椎動物に投与することを含む。第8の態様では、本発明は、脊椎動物の心機能を調整する薬剤をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、a1つまたは複数の筋細胞の第1の群を、MPHSFANLPLRF配列番号2、MPPSFANLPLRF配列番号14、VPNSVANLPLRF配列番号15、VPHSAANLPLRF配列番号16、MPPSAANLPLRF配列番号17、SLKPAANLPLRF配列番号18、PLRF、PQRF、FLRF、FQRF、APLRF配列番号19、APQRF配列番号20、AFLRF配列番号21、AFQRF配列番号22、VPLRF配列番号23、VPQRF配列番号24、VFLRF配列番号25、およびVFQRF配列番号26から成る群から選択される配列を含む単離ペプチドと接触させ、式中、Fはアミド化されること、baに記載される第1の群、または1つもしくは複数の筋細胞の第2の群を、試験薬と接触させ、試験薬と接触した後の作用を測定すること、およびcステップaの測定値をステップbの測定値と比較することから、試験薬が脊椎動物の心機能を調整するか否かを決定すること、を含む。一実施形態では、ステップaのペプチドは、MPHSFANLPLRF配列番号2、MPPSFANLPLRF配列番号14、VPNSVANLPLRF配列番号15、VPHSAANLPLRF配列番号16、MPPSAANLPLRF配列番号17、PLRF、PQRF、FLRF、およびFQRFから成る群から選択され、式中、Fはアミド化され、該脊椎動物は哺乳動物である。別の実施形態では、試験薬は、本発明の第1または第2の態様によるペプチドである。別の実施形態において、ステップaのペプチドは、N末端チロシンをさらに含み、該チロシンは、測定可能に標識される。第9の態様では、本発明は、脊椎動物の心機能を調整する化合物をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、1つまたは複数の筋細胞の群を、アミノ酸配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、式中、アミノ酸X1~X8のいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQである単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルと接触させること、および該ポリペプチドが、該接触に起因して、該第1の群において心機能を調整するか否かを決定することを含む。別の関連態様では、本発明は、脊椎動物の心機能を調整する化合物をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、心細胞または組織を、アミノ酸配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、式中、アミノ酸X1~X8のいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQである単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルと接触させること、および該ポリペプチドが、該接触に起因して、該第1の群の心機能を調整するか否かを明らかにすることを含む。本明細書で使用する心細胞または組織を接触させるとは、本発明の目的で、筋細胞を含む細胞または心臓由来の細胞集団を結合および/または心収縮性に1つまたは複数の陽性または陰性作用を促進する条件下で、ペプチドと接触されることを意味する。心細胞または組織を接触させることは、例えば本明細書に記載される生体外方法によって生体外で、または1つもしくは複数のペプチドを動物の全身に投与することによって、例えば、尾静脈注入および本明細書に記載される生体内投与方法によって、生体内で行うことができることが認識される。第10の態様では、本発明は、哺乳動物を含む脊椎動物の心機能を調整する方法を提供し、該方法は、アミノ酸配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-F配列番号13を含む単離ペプチドであって、式中、アミノ酸X1~X8のいずれか1つが存在するかまたは存在せず、X9およびX11が存在し、X10がLまたはQである、単離ペプチド、またはその塩、アミド、もしくはエステルを、該脊椎動物の心機能を調整するために有効な量で、該脊椎動物に投与することを含む。本発明の第9または第10の態様の一実施形態では、ペプチドは、本発明の第1または第2の態様、および上述されるような任意の実施形態に記載の発明のペプチドである。本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載される発明のペプチドおよび薬理学的に許容される担体を利用する方法または組成物を対象とする。本明細書で使用する、薬理学的に許容される担体という用語は、標準の薬理学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩液、水、油/水乳剤またはトリグリセリド乳剤等の乳剤、様々な種類の湿潤剤、錠剤、コーティング錠剤およびカプセルのいずれかを包含する。典型的に、担体は、スターチ、ミルク、砂糖、ある種類の粘度、ゼラチン、ステアリン酸、タルク、植物性油脂、ガム、グリコール等の賦形剤、または他の既知の賦形剤を含有する。担体は、香味および着色添加剤または他の成分を含んでもよい。滴定等のよく知られた手法によって、および個別の対象において観察される投与ペプチドの薬物動態特性を考慮することによって、当業者は、本発明の治療方法に適切な用量を判断することができる。本明細書に引用される特許、特許出願、政府刊行物、政府規制、および参考文献はいずれも、参照することによって全体が本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含む本記述が優先される。本開示の追加の特徴は、図面、実施例、および添付の請求項と併せて、本明細書に記載の詳細な説明のレビューから当業者に明らかとなり得る。本発明は、例示の実施形態を参照して本明細書に記載されるが、本発明はそれに限定されないことを理解されたい。当該技術分野に通常の技術があり本明細書の教示にアクセスできる者であれば、追加の修正および実施形態がその範囲内に含まれることを認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付される請求項によってのみ限定される。本発明の目的で、~を含むという用語は、~から成るという用語を包含することが理解される。実施例A:hRFRP-1は心筋細胞内でGタンパク質共役受容体GPCRと結合するという仮説を試験するhRFRP-1心受容体の特徴付けhRFRP-1受容体は、検出可能なhRFRP-1作動薬または拮抗薬をラット心筋細胞に結合することによって特徴付けられる。検出可能な類似体結合は、hRFRP-1に競合し、受容体の同一性および特異性を確認するのを助ける。出願人は、心機能を増加させる[Bpa3]hRFRP-1が、hRFRP-1受容体に結合するか否かを調べる。hRFRP-1受容体の発現は、同定された受容体に対して生成された抗血清を使用することによって、免疫学的局在決定により検討する。心ストレス因子、心筋梗塞MIに応答する受容体発現が特徴付けられる。受容体はまた、周知の生物分子学的手法、例えばノーザンおよびサザンプロット、ならびにポリメラーゼ連鎖反応PCR等を使用することによって、ヌクレオチドレベルで検討する。検出可能なhRFRP-1類似体を心筋細胞膜に結合して、その受容体に対するペプチドの高親和性結合を特徴付ける。検出可能な類似体は、RFRP-1作動薬、Y-hRFRP-1のヨード化によって生成され得る。チロシルhRFRP-1類似体もまた、hRFRP-1ペプチドとほぼ同じく心機能を減少させ、同一の受容体に結合することを示唆する。I-Y-hRFRP-1類似体を心筋細胞内で試験し、受容体をタグ付けするために使用する前に、当該類似体がhRFRP-1心機能の作動薬または拮抗薬であることを確認する。Y-hRFRP-1がhRFRP-1作動薬であるため、標識類似体は、心筋細胞タンパク質を結合することが予測される。加えて、125I-Y-hRFRP-1類似体は、発現したrfr-2、候補hRFRP-1心受容体を密接かつ特異的に結合するGouarderesetal2007Neuropharmacology237686。代替の検出可能な類似体は、3H-Y-hRFRP-1類似体であるTalmontetalAugust122009NeurochemIntEPUBaheadofprintPUBMEDPMID19682524。結合の特異性をhRFRP-1との競合によって試験する。また、親ペプチドおよび類似体が同一の受容体に結合するか否かを明らかにする間接的な方法として、アッセイを使用して[Bpa3]hRFRP-1との結合を競合する。[Bpa3]hRFRP-1受容体との同一性は、心筋細胞を[Bpa3]hRFRP-1で探索することによって証明され、結合するタンパク質を特徴付ける。確立した方法に基づいて、膜を調製する。要約すると、本明細書に記載される方法によって調製した単離心筋細胞を、検出可能なhRFRP-1類似体0.1μMを用いて、軌道攪拌器上に一晩インキュベートし、洗浄して遊離類似体を除去し、遠心分離して、非変性状態下でペレットを可溶化し、ペプチド受容体の結合の完全性を維持する。Bpa含有hRFRP-1類似体の光活性化は、インキュベーション後、紫外線365nmによって15分間行う。非変性2次元ゲル電気泳動2DGEによって試料を分離し、標識タンパク質を特異的に同定するように処理する。例えば、MWまたはpI勾配および/もしくは緩衝液条件の変化等のいくつかのゲルパラメータ下の単一タンパク質、ならびに/または単一N末端によって規定する標識2DGEスポットを精製して均質にする。一旦均質に精製されると、MWおよびpIを明らかにし、トリプシンマップおよび質量分析に基づいてアミノ酸配列を得る。受容体に結合した類似体は、タンパク質のアミノ酸配列分析に干渉しない。データはrfr-2受入番号AF268898、MW=48kDa、pI9.5と比較して、このタンパク質がhRFRP-1受容体であるか否かを明らかにする。適合するものがない場合、データベースを検索する。追加の配列データが、得られたアミノ酸配列に対して設計されたプライマーを使用して、筋細胞の転写産物を増幅させることから得られる。配列が新規である場合、予測タンパク質は分析され、GPCRの構造特徴を同定する。対照試験は、過剰な非標識類似体またはhRFRP-1の存在下、検出可能なhRFRP-1を用いてインキュベートされた心筋細胞、遊離125Iまたは3Hを用いるインキュベーション、ペプチドを用いないインキュベーションによる心筋細胞を含む。hRFRP-1受容体を特徴付けるための実験はさらに、SARStructureActivityRelationshipを描写するためのリガンド-タンパク質結合研究を含み、アラニン走査およびN末端切断のデータと一致するはずである。放射性標識Y-hRFRP-1がhRFRP-1作動薬でない場合、既にhRFRP-1作動薬であると同定されている非標識Y-hRFRP-1は、2DGE内のpI移行に基づいて、受容体に結合された状態で検出され得る。受容体タンパク質のY-hRFRP-1の有無、結合および未結合はpIにより異なり、検出するのに十分に有意なpIシフトを介して類似体結合を検出する。受容体タンパク質に結合するY-hRFRP-1は、Y-hRFRP-1に対する抗血清によって検出することもできる。非変性条件を使用して、Y-hRFRP-1受容体結合を維持するが、結合定数は、受容体タンパク質をタグ付けするための別の手段が用いられる場合には適切でないことがある。代替例に、[Bpa3]hRFRP-1がある。上記のアプローチによって一旦同定されると、受容体タンパク質がhRFRP-1、[A11]hRFRP-1拮抗薬、および[Bpa3]hRFRP-1刺激類似体に結合する能力を、心筋細胞膜にて、最終的には発現タンパク質を使用して検討する。[Bpa3]hRFRP-1が結合する受容体を同定するために、追加の独立した実験としてY-hRFRP-1を使用する。hRFRP-1心受容体の発現単離したラットの心筋細胞およびラットの心組織内での発現を探索するために、同定された受容体に対するポリクローナル抗血清を生育した。受容体タンパク質はrfr-2であると同定される場合、受容体発現について探索するためにrfr-2抗血清を使用する。いくつかのrfr-2抗血清は市販されており、それぞれタンパク質配列から予測される抗原に対して生成される。標準プロトコルを間接免疫蛍光法に使用し、ラット筋細胞および心組織切片を探索する。ラットの心臓内でRFRP-1が発現することを示した完了した研究に対して、データを評価する。ラットの心室筋細胞からRNAを単離し、cDNAを生成した配列番号27、アミノ酸配列-配列番号28。シークエンシングは、RFRP-1転写が発現することを示し、RFRP-1が心シグナル伝達分子であることを証明した。この実験はまた、ヒトの心室組織を使用して実行したが、ラットの組織と同様に、ヒトの心臓内でRFRP-1mRNAが発現した配列番号29、アミノ酸配列-配列番号30。このデータは、RFアミド関連ペプチドの発現を確立したラットの心筋細胞上に免疫組織化学的染色を行うことよってさらに支持された。心筋細胞および心切片における免疫蛍光試験のプロトコルは、概して以下のとおりである。McCormickandNicholsに基づいて、間接免疫蛍光法のために脊椎動物単離心筋細胞を処理する。脊椎動物の心臓を、クリオスタット切片法のために処理する。固定した細胞を、ウサギポリクローナルhRFRP-1受容体抗血清約1:1000を用いて一晩インキュベートし、続いて洗浄し、ヤギ抗ウサギシアニン系蛍光二次抗体約1:500を用いてインキュベートした後、洗浄して撮像処理する。条件は、McCormickandNicholsに使用されるプロトコルに従う。非特異的結合は、抗原吸着性一次抗血清を用いてインキュベートすることによって、および二次抗体だけの一次抗血清の非存在下で明らかにされる。一次抗血清および二次抗体の正確な希釈は、実験条件下で最適化され、所与の値は、前述の間接免疫蛍光プロトコルの典型である。単離されたラット心筋細胞のRFアミド免疫学的局在決定のデータ、吸着前抗血清を用いる対照、および一次抗血清を用いない対照により、染色はRFアミド含有ペプチド、例えばRFRP-1に特異的であることがわかる。さらに、ラットに誘発した心筋梗塞MIに応答して、受容体タンパク質の発現を検討する。左前下行枝LAD冠動脈結紮に起因するラットの誘発MIは、UMCIGの再充電方式で提供される確立された手法である。この分析方法は、hRFRP-1が心機能に劇的に影響を及ぼすため、心不全下の心機能を増加させるために、hRFRP-1類似体がどのように作用し得るかをより良く理解するために遂行される。つまり、鎮静状態のラットに経口挿管し、100酸素中0.5~1のイソフルランと共に調圧した人工呼吸器を介して、ピーク呼吸圧力15cmのH2Oおよび1分当たりの呼吸数60で人工呼吸をおこなった。解剖顕微鏡を使用して、左開胸を経由して心臓を開き、7-0シルク縫合糸でLADの近位部分の周囲を左心房から1~2mm縫い付ける。胸部を温かい無菌食塩水で満たして空気を抜き、5-0シルク縫合糸を使用して層状に閉合する。対照は、LAD結紮なしに同一の開胸プロトコルを経たラットである。この手法は、マウスにも用いる。MI心臓内のhRFRP-1受容体タンパク質の発現は、生理学的条件上述下で発現を明らかにするために使用される方法に従う。検出可能なhRFRP-1類似体は、心筋細胞タンパク質に結合して受容体を同定すると想定される。MW、pI、およびアミノ酸配列に基づいて、受容体が同定され、有力な候補は、rfr-2またはGPCRタンパク質である。ヒトRFRP-1は、発現したrfr-2タンパク質、推定のGPCRに結合する。したがって、hRFRP-1心受容体は、rfr-2であり得るが、受容体の同一性およびタンパク質構造を独立して確立することが重要となる。ラットおよびヒトrfr-2cDNAから予測されるアミノ酸配列は、それぞれ432および430残基の長さであり、同一性が86であるためHinumaSetal2000NatCellBiol2703708、ラットRFRP受容体を同定することにより、重要な情報をヒト受容体にもたらす可能性が高い。検出可能なhRFRP-1類似体は、受容体タンパク質を同定し、[Bpa3]hRFRP-1を使用して、受容体タンパク質を独立して同定する。検出可能な類似体の例には、125I-Y-hRFRP-1、[Bpa3]hRFRP-1、3H-Y-hRFRP-1、蛍光標識hRFRP-1、およびビオチニル化hRFRP-1がある。出願人は、ラットおよびマウスMIモデル内で行われたMIに反応して、受容体発現が変化するか否かを検討する。代替アプローチhRFRP-1心受容体の同定:少量のhRFRP-1心受容体受容体が少量である場合、親和性精製ステップを含めることによって、受容体を増やすことができる。出願人のポリクローナルhRFRP-1抗血清は、タンパク質に結合した類似体を認識し、それを使用してリガンド-受容体タンパク質複合体を増やすことができる。類似体は構造的な特徴付けに干渉しないため、類似体結合タンパク質を、緩衝液pHまたは塩の変化によって抗血清から解放することができる。あるいは、ビオチニル化hRFRP-1類似体は、アビジンによって同定される親和性リガンドであり、膜調製から受容体タンパク質を増やすことができる。さらに、2DGE単離スポットに対するポリクローナル抗血清は、高親和性受容体を構造に特徴付けるために生成することができる。hRFRP-1心受容体の同定:多重体受容体出願人の知る限り、これまでrfr-2を含むRFNH2含有ペプチド受容体はいずれも、単一タンパク質である。hRFRP-1心受容体が多量体タンパク質である場合、出願人がとるアプローチは、hRFRP-1に結合するサブユニットを同定し、受容体複合体全体を同定するための分子ツールを生成することである。hRFRP-1心受容体の同定:非GPCRシグナル伝達拮抗薬を使用して受容体を同定し、タンパク質にタグを付ける出願人がとるアプローチは、作用する分子hRFRP-1の種類と無関係である。これまでのデータは、hRFRP-1受容体がGPCRであることを示唆し、RFNH2含有ペプチドは、典型的に、GPCRによって作用する。しかしながら、2つのイオンチャネル型受容体もまた、ペプチドについて同定された。いずれも、上皮アミロリド感受性のNaチャネルおよびデジェネリン系のイオンチャネルのメンバーであるLinguegliaetal2006Peptides27113852のレビューを参照。無脊椎動物のFMRFNH2依存性NaチャネルFaNaCは、ペプチドによって直接開閉される。哺乳動物の酸感受性イオンチャネルASICは開閉されないというデータがあり、FMRFNH2および関連のペプチドによって調整される。上述のアプローチを使用してhRFRP-1GPCRが同定されない場合は、次にFaNaCまたはASIC様転写産物またはタンパク質について心筋細胞を検索する。hRFRP-1心受容体の同定:代替類似体125I-Y-hRFRP-1は、Y-hRFRP-1がhRFRP-1作動薬であるため、受容体に結合すると予想される。ヨード化類似体が結合しない場合、別の検出可能な類似体を検討する。しかしながら、放射性標識または化学的に検出可能な類似体を必要としない。結合するが、化学的、異性体的、または視覚的に検出可能でない類似体を使用して、受容体を同定することができ、非変性2DGEは、0.01未満の等電点pI移動によって、結合タンパク質と未結合タンパク質とを区別する。hRFRP-1に対する低親和性結合定数もまた、発現したrfr-2タンパク質に特異的かつ緊密にペプチドが結合するため、問題となることは予想されないが、類似体を受容体に共有結合するためにBpaを組み込むことによって、この問題に対処する。2DGEは、多数の標識タンパク質を同定することができ、対照実験を行って遊離125I、非標識hRFRP-1と競合する類似体等、背景の同定を助け、非特異的類似体結合を排除または同定する。特異的であると同定され、候補受容体となるべく寸法が適切なある標識タンパク質を特徴付ける。hRFRP-1心受容体の同定:関連受容体からの分化hRFRP-1受容体を、構造的に関連するタンパク質と区別するのに、多数の独立パラメータに基づいて、筋細胞タンパク質の分離を利用する。均質性は、3つの独立パラメータ、MW、pI、およびN末端に基づく。構造的に関連するタンパク質rfr-2MW=48kDa、pI9.5およびrfr-1MW=60kDa、pI9.4は、出願人が使用を提案している手法を用いて、互いに明確に区別される[Boninietal2000、Fukusumietal2006。hRFRP-1心受容体の同定同定された受容体に対してポリクローナル抗血清が生成され、または受容体がrfr-2である場合、rfr-2に対して抗血清が生成され、hRFRP-1受容体タンパク質に結合し、発現を明らかにする。あるいは、筋細胞に対する3H-Y-hRFRP-1結合を使用し、オートラジオグラフィを介して、標識受容体タンパク質の発現を明らかにする。最初に、3H-Y-hRFRP-1が作動薬または拮抗薬であり、Y-hRFRP-1は作動薬であることを確認する。対照は、過剰な非標識ペプチドのある標識ペプチドと競合させるか、または遊離標識を単独で使用することを含む。代替例は、蛍光標識hRFRP-1を使用して、ペプチド受容体タンパク質複合体を検出し、受容体タンパク質に結合されたhRFRP-1を認識することである。対照は、ペプチドリガンドの非存在下で、標識抗血清を含む。hRFRP-1の直接蛍光標識を使用して、ペプチドが結合するタンパク質を検出することができ、非標識hRFRP-1を用いて対照を蛍光と競合させる。実施例B:hRFRP-1がSer/Thrキナーゼによって媒介される収縮性およびリン酸化反応に及ぼす作用/タンパク質のリン酸化反応を伴う、hRFRP-1が筋細胞内の収縮機能を減少させる機構複数可hRFRP-1がサルコメア短縮および弛緩に及ぼす影響は、ビスインドリルマレイミド-1ビス-1、500nM、PKC阻害剤および/またはH-891マイクロモル、PKA阻害剤の非存在下および存在下で測定する。対照には、阻害剤の非存在下で、hRFRP-1が心機能に及ぼす影響を測定すること、および阻害剤の非存在下および存在下、ペプチドを用いない実験条件下で機能を測定することを含む。hRFRP-1作動薬でも拮抗薬でもないRFNH2含有ペプチド類似体に反応する収縮性もまた、阻害剤の存在下および非存在下で測定する。まとめると、このデータにより、弛緩時にhRFRP-1の影響に関与する主要なシグナル伝達経路を同定する。どのCa2循環/筋フィラメントタンパク質が、単離ラット心筋細胞に適用されたhRFRP-1に反応してリン酸化されるかを検討し、研究をヒト組織にまで拡大する。ペプチドが筋細胞に及ぼす影響は、ペプチド処理した筋細胞内のCa2過渡および等尺性力発生を測定することによって検討する。一群の試験では、10-7~10-9MhRFRP-1の影響をFura-2AM負荷筋細胞内で15分にわたって測定し、Westfallら2005のプロトコルに従って、ペプチドが細胞性Ca2過渡に及ぼす影響を明らかにする。他の試験では、ペプチド処理に続いて透過処理された筋細胞内で等尺性力発生を測定する。一連のCa2濃度で力を測定し、試験結果は、筋フィラメントがhRFRP-1シグナル伝達の直接の標的であるか否か、および低負荷下での筋細胞内の短縮に対する影響が、ピーク張力および筋フィラメントCa2感受性の同等の減少に転じる否かを明らかにする。ペプチドは、我々の予備の生体内試験に基づいて、両ピーク張力を著しく減少させ、筋フィラメントCa2感受性を増加させると予想される。キナーゼ阻害剤が弛緩時にhRFRP-1の影響に及ぼす作用成体ラット心筋細胞を、確立されたプロトコルに基づいて単離する[Westfalletal1997MethCellBiol52307322、WestfallandBorton2003。サルコメア短縮および弛緩を筋細胞内で測定し、hRFRP-1を用いる場合と用いない場合の基礎レベルデータを得る、もしくはPKA阻害剤、H-89100ηMもしくはPKI類似体PKI-Myr-14-22-アミド、1μMXaioBetal2006BiochemJ396716、MurrayAJetal2008SciSignal1re4またはPKCおよびPKA阻害剤の両方を含有する媒体を、1分間潅流させた後、hRFRP-1を添加し、ペプチドなし、または作動薬でも拮抗薬でもないRFNH2含有ペプチド類似体を添加して、阻害剤がhRFRP-1活性に及ぼす影響を明らかにする。さらに、対照は、阻害剤なし、ペプチドなし、またはペプチド類似体なしの同一条件下で、心機能を測定することを含むRFNH2、構造的にhRFRP-1に類似するが、hRFRP-1作動薬でも拮抗薬でもない。ウェスタンブロット分析によるリン酸検出リン酸化標的を同定するために、筋細胞を収集し、試験して、hRFRP-1活性を確認し、キナーゼ活性に相関するタンパク質発現を分析する。成体ラットの心筋細胞を、説明[Westfalletal2005されるように、カバースリップから擦り取って試料緩衝液に入れる。タンパク質を、12SDSポリアクリルアミドゲル上に電気泳動的に分離し、PVDF膜上にトランスブロットする[WestfallandBorton2003、Westfalletal2005。抗体に、MAB1691、トロポニンITnI異性体を認識するモノクローナル抗体、抗リン酸Ser/ThrPKA基質抗体PKAに対して感受性がある部位において、リン酸化の変化を示すタンパク質の分子量を同定するため、抗リン酸PKCα/BII、抗リン酸PKCδ、抗リン酸PKCパン、抗リン酸TnI、Ser23/24、および抗リン酸PLBが挙げられる。Ser16PKA依存性部位および/またはThr17CaMKII依存性部位におけるPLB、ならびにSer23/24部位PKAおよびPKC依存性におけるTnIのリン酸化は、前述のように検出されるBrazetal2004NatMed1024854、Westfalletal2005。キナーゼ活性および放射性標識の試験この試験に関して、非放射性PKAおよびPKC活性の分析AssayDesigns社,アナーバー,ミシガン州も行い、キナーゼの一方または両方が活性化されるか否かを明らかにする。TnIが主標的であると思われるイベントでは、MAB1691により免疫沈澱されたTnIの2次元分離を行った後、液体クロマトグラフィ同定を行って、リン酸種が関与したことを明らかにする。この戦略は、PKCが主要シグナル伝達経路である場合、PKCがTnI上の5つの残基をリン酸化するため、必須であり得るNolandetal1989JBiolChem2642077885。他の潜在的な標的のリン酸化が懸念される場合。研究によってホスファターゼが潜在的かつ重要な標的であることが示唆される場合、カリクリンAの非存在下でも試験を行う。サルコメア短縮心機能を増加させる、hRFRP-1、[A11]hRFRP-1拮抗薬および[Bpa3]hRFRP-1の影響を測定する。心筋細胞内のサルコメア短縮および弛緩の長さを、ビデオに基づくIonOptix検出システムを使用して、そうでなければ本明細書に記載されるように検出する。シグナル平均データを分析して、サルコメア静止長、サルコメア静止長に対して正規化したピーク短縮ピーク高、ピーク短縮までの時間TTPおよび25、50、75弛緩までの時間それぞれTTR25、TTR50、TTR75を明らかにする。Fura-2AM負荷筋細胞を使用してCa2過渡を測定する試験は、15分間10-8MhRFRP-1、[A11]hRFRP-1、または[Bpa3]hRFRP-1で監視し、ビス-Iおよび/またはH-89は、短縮/弛緩に対する作用と連携して、Ca2過渡の変化を阻害すると予測される。シグナル伝達は、Ca2過渡および筋フィラメントの両方を標的として、ピーク短縮の減少および弛緩の遅延をもたらすことが予想される。等尺性力の測定hRFRP-1ならびにその作動薬および拮抗薬が力の発生に及ぼす作用を測定する。等尺性力の測定は、Westfall研究室におけるプロトコルに従って行うWestfalletal1997MethodsCellBiol5230722、Westfalletal2005。単離されたラット心筋細胞を、hRFRP-1、[A11]hRFRP-1、およびまたは[Bpa3]hRFRP-1で処理し、ペプチド、受容体遮断、および心機能を増加させる類似体の作用を研究する。一連の濃度を分析する。正常な筋細胞を15分間処理し、その後、モーターおよび力変換器に取り付ける。続いて、ホスファターゼ阻害剤カリクリンAを添加し、細胞を透過処理する。pCa9.0~4.5にわたって力を測定した後、アルカリンホスファターゼを用いて脱リン酸化し、力/pCa曲線を反復して、確実にピーク力が元のピークの80以下に降下しないようにする。試験の目的は、筋フィラメントが、hRFRP-1およびhRFRP-1類似体の主標的であるか否かを評価することである。代替Ser/ThrキナーゼhRFRP-1に対する急速かつ劇的な反応は、ペプチドが、転写調節を介する調整ではなく、標的タンパク質に対する直接的な影響によって作用することを示唆する。したがって、代替アプローチには、心不全に関与することが知られている他のキナーゼまたは分子がhRFRP-1活性に及ぼす影響を検討することを含む。追加のキナーゼにはRhoキナーゼが挙げられ、筋フィラメントカルシウム感受性に影響して、不全を起こしている心臓内の弛緩を延長する[Vahebietal2005CircRe96740747、Linetal2007CardiovascRes755158。他の代替例には、CaMKII、ホスホランバン、ホスファターゼ活性およびカルシネウリン活性を標的とするMAPKを標的とすることの役割、ならびに他のタンパク質ホスファターゼが直接標的される可能性が挙げられる。他のシグナル伝達カスケード主要なシグナル伝達経路は、Ser/Thrキナーゼの活性を伴うことが予測されるが、他のシグナル伝達カスケードもまた、筋細胞内の機能的反応に寄与する可能性がある。潜在的なシグナル伝達カスケードは、他のキナーゼ、例えば、Rho、CaMKII、およびMAPKキナーゼを含むことができる。2次元電気泳動および/またはポリメラーゼ鎖反応は、hRFRP-1の適用時における筋細胞内の分子変化についてより広範に調査する。タンパク質負荷は、ポリアクリルアミドゲルの銀染色部分から得たタンパク質を使用して正規化する[Greenetal2006JMolCellCardiol41350359。化学阻害剤の代替例タンパク質キナーゼ阻害剤PKIペプチドは、PKA活性を規制する内因性分子であり、H89の代替例である。PKI類似体は市販されているSigma、TorcisBioscience社、およびEMBBiosciences社。PKIがhRFRP-1活性に及ぼす影響は、それぞれPKAの役割に関する間接的な証拠である。PKCもしくはPKA、または両方の役割を検討することは、RNA干渉RNAiまたは非機能性PKCまたはPKA突然変異を使用する薬学的および分子的アプローチを複合して、機能的反応のシグナル伝達カスケードの重要性を証明する。実施例C:心臓に対する生体内影響単離された筋細胞内でhRFRP-1に反応して認められる収縮機能およびリン酸化の減少は、ほぼ同じパターンの収縮性およびリン酸化の減少に加えて、生体内の収縮期および/または拡張期不全の減少となる。マウスの尾静脈を介する10-8MhRFRP-1の静脈内送達が心不全を引き起こし、励起-収縮の結合に関与するタンパク質のリン酸化を必要とする心反応を検討した。hRFRP-1用量反応の試験により、生体内の心機能に影響する濃度の範囲が理解される。出願人は、拮抗薬、例えば、[A11]hRFRP-1単独の作用、ならびに生体内のhRFRP-1の作用および[Bpa3]hRFRP-1に対する影響を検討する。逆作動薬、例えば、類似体[Bpa3]hRFRP-1が、心機能を増加させ、hRFRP-1誘発性心不全の作用および心臓ストレスにおけるhRFRP-1および[Bpa3]hRFRP-1の作用に対抗するか否かを明らかにする。出願人は、マウス心臓内のhRFRP-1に反応して、および心機能を増加させるhRFRP-1類似体に反応して、生体内のリン酸化のための標的分子を監視する。hRFRP-1の存在下および非存在下でのhRFRP-1単独、および拮抗薬、例えば、LPLAFアミドおよび[A11]hRFRP-1の作用、および心筋梗塞を含む心臓ストレス下で、生体内で逆作動薬、例えば、[Bpa3]hRFRP-1が心機能に及ぼす作用についてさらに探求する。心エコー検査は、本明細書に記載されるように行う。第1の試験群には、10-8MhRFRP-1n=3および生理食塩水n=3が含まれていた。結果に基づいて、パワー分析は、データに関してn=4で95信頼水準が得られることを示す。10-8M類似体は、注入液に含まれるが、濃度は、結合状態または変性に起因して変動し得る。hRFRP-1類似体の作用ならびにHR、LVD、SV、EF、およびCOを含む心パラメータ上の親ペプチド、hRFRP-1、および類似体の間の競合を探索する。さらに、左前下行枝LAD冠動脈結紮モデルに起因する心的ストレス因子心筋梗塞に反応して、hRFRP-1および類似体が生体内の心機能に及ぼす作用を探索する。生体外のシグナル伝達経路の分子成分を同定するために、出願人は、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学を介して、心組織を分析し、ポリメラーゼ鎖反応を分析して、hRFRP-1受容体発現になんらかの変化があるか、および心的ストレス因子MIへの反応に変化があるかを明らかにする。加えて、記載されるように、逆リン酸化分析を行うために、心臓を単離および処理することができるMicheleetal2002CircRes91255262。PKCおよび/またはPKAを利用して、逆リン酸化することができる。代替アプローチいくつかの類似体は、静脈内送達されると、分解の影響を受けやすくなる。血リンパ内で、トレーサーを類似体上に含む検出可能な類似体複数可の存在を監視することによって、ペプチドの寿命、分解の手段を比較することができる。代替アプローチは、典型的に、L-アミノ酸よりもペプチドまたは類似体への分解の影響を受けにくいDアミノ酸を統合すること、またはプロテアーゼ阻害剤を注入剤に含めることを含む対照はプロテアーゼ阻害剤単独である。実験手順キイロショウジョウバエの心拍数-D.melanogasterオレゴンR野生型系ハエを、12時間の明暗周期下、24°Cで、コーンミール糖蜜培地上で維持した。分析のために選択した動物は、幼虫、前蛹、または成虫であり、雄雌両方を分析したところ、反応に差は認められなかった。顕微鏡台に接着された二重粘着テープの上に動物を配置し、前述されるように、生理食塩水対照またはペプチドを送達する前に2分間、および送達後に10分間監視したNicholsREtal、ZornikEetal。引き延ばされたマイクロピペットを使用して、生理食塩水またはペプチド40ηLを、脳の前方部位で血リンパ血液中に送達し、中枢神経系および背脈管大動脈および心臓に対する組織の損傷を回避する。各動物は、生理食塩水またはペプチドの微量注入を1回だけ受けた。場合によっては、記録を1時間まで延長し、ベースラインへの回復を確立する。いくつかの動物から得たデータを平均化しn≧10、基礎心拍数に対して報告した。筋細胞単離および単一筋細胞のサルコメア長短縮の測定-成体ラットおよびウサギ心室の心筋細胞を、前述のとおり単離したWestfallMVEtal、WestfallMVandBortonAR。SDラットおよびニュージーランド白ウサギから得た心臓を潅流し、酵素的に消化して、筋細胞を単離した。プロトコルは、ミシガン大学UCUCAUniversityCommitteeonUseandCareofAnimalsによって、大学および連邦規制ガイドラインに従って承認された。単離心室筋細胞のアリコートを、5ウシ胎仔血清、50U/mLペニシリン、および50μg/mLストレプトマイシンペニシリン/ストレプトマイシン、Sigma-Aldrich社、米国ミズーリ州で補充された血清含有ダルベッコ変法イーグル培地Invitrogen社、米国カリフォルニア州中のラミニンコーティングしたガラスカバースリップ上に置いた。2時間後、培地を、1.8mMCa2、10mMHEPES、10mMグルタチオン、およびペニシリン/ストレプトマイシンで補充された無血清M199Invitrogen社に交換した。ラット筋細胞を刺激チャンバに移し、単離した翌日に電気的にペーシングしたZornikEEtal、WestfallMVEtal。筋細胞調製について残らず、培地を毎日交換した。サルコメア短縮は、前述されるように、ビデオに基づく検出システムIonOptix社、米国マサチューセッツ州を使用して検出したWestfallMVandBortonAR。この試験に対して、ラット筋細胞を0.2Hzでペーシングし、ウサギ筋細胞を0.5Hzまたは1.0Hzでペーシングした。各ペプチド濃度、タンパク質キナーゼCPKC阻害剤ビスインドリルマレイミド-1ビス-1、CalBiochem/EMD社、米国ニュージャージー州、または培地のみ対照、Cを適用する前、およびペプチド、ビス-1、または培地の適用から1、3、5、10、および15分後に記録をした。シグナルの平均データを分析して、前述されるようにWestfallMVEtalWestfallMVandBortonAR、各ペプチド濃度、ビス-1、および培地に対して、3~4匹のラットから得た7~20筋細胞のサルコメア静止長、短縮振幅ピーク短縮短縮率出発速度、および再延長率回復速度を明らかにした。ペプチド合成-ペプチドは、標準Fmocプロトコルによって合成した。構造TDVDHVFLRFアミドDMS配列番号1、MPHSFANLPLRFアミドhRFRP-1配列番号2、VPHSAANLPLRFアミドラットRFRP-1、rRFRP-1配列番号16、LAEELSSYSRRKGGFSFRFアミド26RFa8-26配列番号31、およびKGGFSFRFアミド26RFa19-26配列番号32を、アミノ酸分析および質量分析によって確認した。hRFRP-1に反応する筋細胞タンパク質リン酸化の分析-単離したウサギ心筋細胞に、1時間、37°Cで、ペニシリン/ストレプトマイシンで補充されたM199培地中で100μCi32Pオルトリン酸塩を負荷した。放射活性培地を、ホスファターゼ阻害剤、カリクリンA10ηM、Sigma-Aldrich社単独を含有する培地に交換し、または10-10MhRFRP-115分間37°Cで加えた。リン酸化反応は、氷冷弛緩溶液RS:7mMEDTA、20mMイミダゾール、pH7.0、1mM遊離Mg2、14.5mMクレアチンリン酸塩、および4mMMgATPならびに180mMのイオン強度を生じるために十分なKCl、pH7.0、続いて氷冷RS0.1TritonX-100中でカバースリップを短時間洗浄した後、氷冷RS単独中に数回洗浄することによって終了した。細胞を試料緩衝液中に回収し、SDS-PAGEによってタンパク質を分離して、前述されるように、銀染色によって検出したWestfallMVLeeAMandRobinsonDA。リン酸化は、乾燥ゲルを蛍光画像カセットに曝露した後、QuantityOneソフトウェアBio-RadLaboratories社、米国カリフォルニア州を使用して定量した。心エコー-前述されるようにBoluytMOEtal、米国心エコー図学会の推奨に従って、心エコーを行った。すべての心エコーは、登録された心エコー技師によって行われた。雌C57BL/6マウスを計量し、体重1kg当たりの送達されるペプチド量kg体重を正確に算出した。心エコーに動物を使用することは、ミシガン大学UCUCAによって、大学および連邦規制ガイドラインに従って承認された。生理食塩水またはペプチドを、尾静脈注入を介して総量150μLまで静脈内送達し、5μmolまたは500ηmolのhRFRP-1/kg体重を得た。各動物は、生理食塩水またはペプチドのいずれかの注入剤について1回だけ使用したn=4~5。つまり、マウスを誘導チャンバに入れ、100酸素と混合した4イソフルランで軽く鎮静化した後、心電図コンタクトパッドを備える加熱プラットフォーム上に仰臥位で配置しVEVO商標マウス処理プラットフォーム、VisualSonics社、オンタリオ州、カリフォルニア州、その鼻を100酸素中の1イソフルランを含むコーンに入れた。振幅および運動率の高解像度、二次元ガイドされる記録Mモードは、Vevo770商標生体内微小撮像システムVisualSonics社と連動する、リアルタイム30MHz微小可視化スキャンヘッドを用いて得られた。収縮末期および拡張末期の左心室寸法に伴う心拍数を、米国心エコー図協会の慣例を使用して、胸骨傍長軸および心尖部の4つの室のビューから得られた2次元セクター走査から測定した。各Mモード測定に対して、少なくとも3つの連続心周期をサンプリングした。左心室体積を、収縮末期Volsおよび拡張末期Voldにおいて測定し、それを使用して拍出量SV=Vold-Volsおよび駆出率EF=心内SV/心内Vold×100を算出した。心拍出量CO=心内SV×心拍数は、拍出量および心拍数から算出した。統計解析-報告された値はすべて、平均±標準誤差SEMとして表される。データは、一元分散分析ANOVAを使用して解析し、事後試験としてダネットの多重比較試験を行った。統計的有意性は、p値<0.05において確立された。半最大有効濃度EC50値は、MicrosoftExcelXPまたはGraphPadPrism3.0統計ソフトウェアGraphPad社、米国カリフォルニア州のいずれかを使用して、最良適合曲線から算出した。実施例1:DMSドロミオサプレッシンペプチドの心血管作用DMSはキイロショウジョウバエの心拍数を減少させる。DMSドロミオサプレッシンペプチド、TDVDHVFLRFアミド-配列番号1がキイロショウジョウバエにおいて、MSドロミオサプレッシンペプチド、TDVDHVFLRFアミド-配列番号1が生体内心拍数に及ぼす影響を、生理食塩水と比較して、分子遺伝学の影響を受けやすいモデルに、心機能内のミオサプレッシンの用量依存的影響を評価する。キイロショウジョウバエのミオサプレッシンは、用量依存的方法で、蛹の自発的な心収縮の生体内頻度を劇的に減少させた図1。報告されたドロミオサプレッシンの用量依存的な影響は、蛹は不動であり、したがって発達段階は、心収縮を観察および記録することが最も容易であるため、蛹の状態で評価した。DMSの作用を、10-6M~10-11Mの10倍濃度の範囲にわたって測定し、生理食塩水の影響と比較した平均±SEM、1分の91±3基礎収縮率、n=18。サブナノモル10-10MDMSの最大作用図1を1分以内に観察したところ、心拍数が基礎収縮率の77±4まで減少したがn=16、心拍数の減少は、生理食塩水の対照反応と統計的に差はなかったp>0.05。心拍数の有意な減少は、10-9Mおよびそれ以上のDMS濃度に反応して検出され、ピーク反応は、ペプチドの微小注入から1分以内に観察された。DMS誘導性作用は、典型的に、2~3分にわたって観察され、可逆的であって、10-8Mおよび10-9Mに反応して、約5分以内にほぼ基礎収縮率レベルに戻った。試験した最高濃度、10-6Mおよび10-7Mで、DMSは、1分以内にそれぞれ25±11n=14および25±7n=16まで心拍数を減少させた。DMS誘導性作用は、30分以内にほぼ基礎収縮率レベルに戻る前に、3~5分間持続した。最良適合EC50値は、3×10-9Mであった。同様の範囲のDMS濃度が、幼虫および成虫の心収縮に強くはないが、有意な反応をもたらした。DMSが心拍数に及ぼす影響は、振幅が変動し、加齢と共に複雑化したデータは図示せず。その結果、ナノモルDMS濃度に対する用量依存的な心反応を示し、ペプチドが高親和性のシグナル伝達経路を活性化することを示す。単一置換したアラニン類似体およびN末端切断したDMS類似体をさらに分析することにより、DMS活性および結合コア、DMS拮抗薬、およびDMSの反対作用を有するDMS類似体逆作動薬を同定した。この分析では、DMSがハエの心臓に及ぼす作用に対する活性コアは、親DMSペプチドに類似する活性を達成するために、1つまたは複数の収縮性測定によって明らかにされるように、VDHVFLRFアミド配列番号33であることを同定した。この分析では、結合コアは、FLRFアミドとして同定された。結合コアは、DMS拮抗薬である。アラニル置換DMS類似体[A5]DMSすなわち、TDVDAVFLRFアミド-配列番号34および[A6]DMSすなわち、TDVDHAFLRFアミド-配列番号35は、心拍数を増加させ、DMS、すなわち親ペプチドTDVDHVFLRFアミド-配列番号1の反対の作用となる。ハエの実験ではさらに、切断したペプチドAFLRFアミド配列番号21またはVFLRFアミド配列番号25は、結合できるだけでなく、心収縮性に作用することが明らかとなった。つまり、両方の切断ペプチドは、生体内に投与されると、それぞれ個別に結合および活性化する。この点で、収縮性に対する1つまたは複数の作用は、収縮頻度、収縮振幅、駆出率、および心拍出量を評価することによって明らかにすることができる。DMSが大型の無脊椎動物の心停止に及ぼす影響を明らかにするために、様々なDMS濃度を正常なクロバエProtophormiaterraenovaeに適用し、心電図を連続的に記録した[Angioyetal2007。10μM、1μM、および0.1ηMのDMSに、動物の100の心停止が認められ各濃度でn=10、より低い濃度では、動物の約50に心停止が認められた。動物のシグナルが再開し、回復時間はより低いDMS濃度で短縮した。生理食塩水は、心停止をもたらさなかったn=10。DMSは、脳および心臓に発現する。抗血清はTDVDHV配列番号36に生成したが、DMSのN末端部分は、他のRFNH2含有ペプチドに存在する構造であるC末端RFアミドRF-NH2を含まなかった。ペプチド特異的抗血清による染色を使用して、DMSの空間的かつ一時的な分布を確立した[McCormickandNichols1993。DMSは、発達全体にわたりCNS内に存在する。発現は、胚後期に始まり、成虫への発達全体にわたり続く。一般に、細胞は、発達早期および動物の寿命の全段階においてDMSを生成する。比較的少数の細胞がDMSを生成するが、突起の拡張樹状ネットワークを通じて、脳内の多くの標的に送達される。DMSの合成および放出が広範な調節および感覚入力下になされ得る。DMS免疫反応性線維は、脳から突出して心臓を神経支配する。出願人のデータによると、ペプチドが脳内で合成され、心臓に送達される。DMS免疫反応性プロセスは脳内の上前大脳神経から突出し、背脈管、大動脈および心臓の前方領域右矢印、つまり心臓ペースメーカーを含む領域を神経支配する。このプロセスは、発達の全段階に存在する[McCormickandNichols1993。ペースメーカーを含むキイロショウジョウバエの心臓の領域の発達の全体にわたってDMSが存在すること、およびDMSの活性は、神経DMSが心血管生理学に重要な役割複数可を果たすという仮説を支持する。DMS作動薬:ハエ心臓に対するDMS活性についての出願人によるSAR分析は、アミノ酸V6、F7、およびF10親DMSペプチド:TDVDHVFLRFアミド配列番号1において対応する位置にあるアミノ酸を参照するが、アラニル置換およびN末端切断した類似体の分析に基づいて、活性および結合に必須であることを示す。このデータを使用して、出願人は、Y-[Bpa2]DMS、光活性化可能な架橋剤p-ベンゾイル-フェニルアラニン、Bpa[Shoelsonetal1993およびチロシル、Y、標識部位を有する検出可能なDMS類似体を設計したEC50=1.3×10-10M、図8。出願人は、このBpa含有類似体を使用して、DMS受容体を同定した[Egerodetal2003]。最初に、置換類似体がDMS作動薬であることを確認した図8を参照。このY類似体を用いて得られたデータを使用して、哺乳動物の筋細胞を用いる実験のために、同様の類似体を生成した。Y-[Bpa2]DMSは、修飾ペプチド:YTBpaVDHVFLRFアミド配列番号37を指す。つまり、親ペプチド:TDVDHVFLRFアミド配列番号1を参照して、第2のアミノ酸Dは、Bpaに置換され、チロシル残基は、第1のアミノ酸TのN末端に追加される。実施例2:ヒトRFRP-1は、ラット心筋細胞の収縮機能に対して用量依存的な作用を及ぼすhRFRP-1が心機能に及ぼす影響を単離した成体ラット心筋細胞内で測定し、脊椎動物FaRPが哺乳動物のミオサプレッシン様ペプチドであるという出願人の仮説を試験した。短縮の急激な用量依存的変化を、15分にわたって、単離した成体ラット筋細胞内の10-6M~10-11MhRFRP-1に反応して測定した。ヒトRFRP-1ペプチドは、単離した心筋細胞に、短縮振幅、ならびに短縮および再延長率を劇的に減少させた図2B、表1。対照と比較して、10-11MhRFRP-1の有意な作用はなく、静止長は、どのペプチド濃度でも変化しなかった。短縮および再延長率の著しい減少は、10-10MhRFRP-1およびそれ以上の濃度に反応したときに検出された図2B、表1。短縮振幅の著しい減少を検出するために、10-9MhRFRP-1を10倍およびそれ以上増加させる必要があった図2B、表1。最良適合EC50値は、短縮および再延長率、ならびに短縮振幅に対して、それぞれ5×10-11M、5×10-11M、および5×10-10Mであった。その結果、hRFRP-1が哺乳動物心筋細胞に直接作用することによって、細胞レベルで収縮機能を急激に調整し、DMSに対するキイロショウジョウバエの変時性の反応に見られる同様の用量依存性に従うことを示す。実施例3:ラットRFRP-1は、ラット心筋細胞の収縮機能に及ぼすhRFRP-1の影響を模倣するラットRFRP-1VPHSAANLPLRFアミド-配列番号16は、N末端アミノ酸延長の2つのアミノ酸だけhRFRP-1MPHSFANLPLRFアミド-配列番号2とは異なるM1→V1およびF5→A5表2。単離した成体ラット心筋細胞での10-8MrRFRP-1の影響を、10-8MhRFRP-1と対照媒体のみを比較して図3、表3、収縮機能に対するRFRP-1の構造特異性の検討を開始した。ラットRFRP-1ペプチドは、短縮振幅、短縮および再延長率それぞれ-17.7±4.3、-22.1±6.0、-25.5±3.9、n=12を、サルコメア静止長を著しく変化させずに減少させた。したがって、10-8MrRFRP-1および10-8MhRFRP-1を用いる場合、短縮および再延長率に同様の変化が認められた。しかしながら、10-8MrRFRP-1より、10-8MhRFRP-1が短縮振幅に及ぼす影響が大きいこと、およびhRFRP-1対rRFRP-1の大きさの点で2つのペプチド間のアミノ酸の差が短縮振幅に与える影響から、2つのペプチドのN末端延長の構造差が、リガンド結合および今後のRFRP-1受容体複数可の特性化に関与する構造特異性に対する重要な手掛かりを提供し得ることを示唆する。実施例4:脊椎動物FaRP、26RFaは、ラット心筋細胞の収縮機能に対するRFRP-1の影響を模倣しないRFRP-1の構造特異性は、単離した成体ラット心筋細胞上で26RFaを使用してさらに検討した。ラット26RFaペプチドはFaRPであり、したがって、RFRP-1と同一のRFアミドC末端を含有するが、RFRP-1と比較して、26RFaN末端延長の構造または長さに類似性はない。10-8M26RFa8-26LAEELSSYSRRKGGFSFRFアミド-配列番号31および10-8M26RFa19-26KGGFSFRFアミド-配列番号32の作用を、単離したラット心筋細胞内で測定した図4、表4。10-8M26RFa8-26および10-8M26RFa19-26に反応する短縮振幅、ならびに短縮および再延長率の減少は中度であり、すべて10-8MhRFRP-1とは統計的に異なる図4、表4、p<0.05。26RFaペプチドに対する反応は、対照とは統計的に異なっていなかった図4、表4。この結果は、RFRP-1内のN末端延長が、心収縮機能に対する影響に必要であるという直接的な証拠を提供する。言い換えれば、26RFaペプチドを含むFaRPスーパーファミリーの全メンバーにある緊密に保存されたC末端RFアミドは、哺乳動物心筋細胞機能に関して、RFRP-1によって引き起こされる反応を誘発するのに十分でない。この結果は、26RFaペプチドが、心筋細胞のRFRP-1様反応を誘発しないことを示すが、26RFaペプチドがRFRP-1受容体に結合するか否かを証明していない。実施例5:マウス尾静脈を介するhRFRP-1の静脈内注入は生体内で心不全を引き起こしたマウスにおけるhRFRP-1の生体内作用を検討した。心エコーECHOを使用して、尾静脈注入を介して10-8MhRFRP-1n=3および対照生理食塩水、n=3が心機能に及ぼす影響を評価した6C57BL/6同腹子、雌、≒20グラム、および約4週齢。盲検試験を行い、尾静脈注入は、動物研究所の登録技術者によって行われた。ECHO測定は、登録心エコー技師によって行われた。データは、t=0分、注入前の値と比較して、t=10分、注入後のパラメータの変化率である図14。データは、10-8MhRFRP-1100μLの10-7MhRFRP-1注入に反応して1分当たりの心拍数HR、bpmが劇的に減少することを示す。収縮時心内領域LVDは、劇的かつ反対の反応を示した10-8MhRFRP-136対生理食塩水-31。また心内拍出量SVも異なっていた10-8MhRFRP-1-75対生理食塩水22。心内駆出率EFは、劇的な反応を示した10-8MhRFRP-1-60対生理食塩水25。興味深い発見は、10-8MhRFRP-1に反応して、EF値が心不全を示すことであり、50以下に落ちる。心拍出量COもまた、劇的かつ反対の反応を示した10-8MhRFRP-1-91対生理食塩水9。Mモード画像は、hRFRP-1の影響を示し、収縮性が減少し、注入から10分後、実質的な回復が発生した生理食塩水の注入後と大きく異なり、心機能は回復しなかった。データのパワー分析は、n=4で95信頼水準を示す。ヒトRFRP-1は、マウスの心抑制作用を引き起こす。hRFRP-1が生体内で心血管機能に及ぼす影響をさらに試験し、ほぼ同じ細胞性および統合反応が哺乳動物に観察されるか否かを明らかにした。マウスの静脈内尾静脈注入を介して、ペプチドまたは生理食塩水対照を送達した後、心機能を心エコーによって測定した。代表的な2次元Mモード記録図5は、対照と比較して、5μmol/kg体重のhRFRP-1に反応して、心機能の低下を示す。両濃度で5μmolおよび500ηmol/kg体重、注入後5分でピーク作用を生じ、15分までに心機能の部分的回復をもたらした。hRFRP-1の用量が多いほど、生理食塩水の対照群n=4、図5C注入前、図5D注入5分後、表5に見られる中度の変動と比較して、心血管機能に対して急激かつ劇的な影響をもたらしたn=5、図5A注入前、図5B注入5分後、表5。興味深いことに、低用量のhRFRP-1500ηmol/kg体重の陰性変時作用は存在せず、この用量は、拍出量、駆出率、および心拍出量を著しく減少させたが、高用量と比較して、比較的振幅は減衰した表5。この生体内データは、単離したラット心筋細胞において見られるhRFRP-1の影響と一致して、心筋に対する直接的な用量依存的な影響と一致する。尾静脈注入を介するマウスのhRFRP-1、hRFRP-1およびLPLAFアミド、LPLAFアミド単独、ならびにD-H3-hRFRP-1の心エコー分析は、薬剤を単離したラットおよびウサギ心筋細胞に適用したとき、その生体内作用が、以前の観察と一致しすることを示した。心拍数HR拍出量SV、駆出率EF、僧帽弁MVEおよびA波、その振幅および比率E/A、ならびに心拍出量COを含む心エコーパラメータを使用して評価を行った。例えば、単離した細胞および全動物に対するhRFRP-1の適用の結果、収縮性能の劇的な減少は、LPLAFアミドによって生体内で遮断され、C末端hRFRP-1ペンタペプチドは、単離した細胞内でhRFRP-1の影響を遮断することが以前に示した。単独で適用されるLPLAFアミドは、生体内で心機能をわずかに増加させることが示され、内因性hRFRP-1の影響の遮断に起因し得る。さらに、以前に出願人が単離したラット心筋細胞内のhRFRP-1の逆作動薬であることを示したD-H3-hRFRP-1は、心エコーパラメータによって測定されるように、生体内で心機能の増加を示した。実施例6:単離したラット心筋細胞内のhRFRP-1に反応するタンパク質のリン酸化ヒトRFRP-1は、発現したrfr-2タンパク質、仮定GPCRに結合することが報告され、hRFRP-1結合に反応する標的分子リン酸化について説明する報告はない。タンパク質キナーゼの活性化は、心収縮機能を調整することに関与する重要な経路である。励起-収縮カップリングに関与する多数の末端標的タンパク質は、筋フィラメントタンパク質心トロポニンIcTnI、心トロポニンTTnT、およびミオシン軽鎖2MLC2を含むPKCおよび/またはPKA活性化に反応してリン酸化される。出願人のデータは、Westfalletal2003に記載されるプロトコルに従って、ラット心筋細胞上の10-8MhRFRP-1に反応する図13、筋フィラメントタンパク質、例えば、cTnI、TnT、MLC2のリン酸化と一致する。PKI、タンパク質キナーゼAPKAの阻害剤が、単離した血管心筋細胞上のhRFRP-1の活性を修飾することを示した。ヒトRFRP-1は、ビス-1、PKC阻害剤の存在下で、ラット心筋細胞の収縮機能に影響するhRFRP-1が心機能に及ぼす影響に関与する機構の研究を開始するために、PKC阻害剤ビス-1を使用した。10-8MhRFRP-1が短縮および弛緩に及ぼす影響に対するPKC阻害剤ビス-1500ηMの影響を、単離した成体ラット心筋細胞内で15分にわたり測定した図6、表6。PKC阻害剤ビス-1は、10-8MhRFRP-1が短縮振幅、ならびに短縮および再延長率それぞれ-0.58±4.8、-12.3±4.6、-5.6±4.7、n=23に及ぼす影響を、サルコメア静止長が有意に変化することなく、大幅に遮断した。ビス-1がhRFRP-1活性に及ぼす影響は、PKC阻害剤の不在下、ペプチドとは統計的に異なっていた。この結果は、RFRP-1が、PKCシグナル伝達経路の活性化を介して、収縮機能を早急に調整するという結論を支持する直接的な証拠を提供する。実施例7:ヒトRFRP-1は、ウサギ心筋細胞の収縮機能を減衰させる保存されたRFRP-1ペプチドが心機能に及ぼす影響をさらに評価するために、ウサギ心筋細胞を利用した。心拍数がヒトと比較してほぼ同じであるため、単離した成体ウサギ心筋細胞内でヒトRFRP-1を検討した。興味深いことに、サブナノモル濃度のhRFRP-1は、哺乳動物心機能を著しく減少させた。媒体のみ対照と比較して、10-10MhRFRP-1は、単離した成体ウサギ心筋細胞内で、短縮振幅および再延長率を劇的に減少させた図7Aおよび7B。短縮率も10-10MhRFRP-1に反応して減少したが、試験した筋細胞内では有意でなかった。0.5Hz図7Aおよび7Bおよび1Hz結果は示せずで記録し、短縮および不整脈収縮を開始する能力の両方を評価した。異常心拍および後収縮は、いずれのペーシング頻度でもhRFRP-1に反応して認められなかった。さらに、筋細胞タンパク質の放射性標識は、hRFRP-1に反応して著しく増加した図7C。特に、24kDaに検出されたバンドに対して、基準値を超えて、4.0±1.4倍のリン酸化の増加が認められた。蛍光体画像は、hRFRP-1に反応して、多数のタンパク質のリン酸化が複製可能に増加することを示す。ビス-1の存在下、hRFRP-1に反応するリン酸化の減少は、PKCを活性化するペプチドと一致するデータは示せず。まとめると、機能的およびリン酸化結果は、生理学的に関連する濃度のhRFRP-1が、DMS相当分子種であるRFRP-1と一致するラットおよびウサギ心筋細胞の両方における収縮機能を劇的に減少させたことを証明し、hRFRP-1が哺乳動物心機能を調整する際に直接的な役割を果たし得ることを示唆する。この結果は、RFRP-1が、影響がPKCによる筋細胞タンパク質のリン酸化によって媒介される、内因性シグナル伝達分子であることを示唆する。別の一連の研究では、出願人は、サブピコモル濃度のhRFRP-1が、哺乳動物心機能を調整することをさらに検討した。10-10MhRFRP-1を、Westfalletal2005に記載の方法に従って、単離したウサギ心筋細胞に適用したところ、ペプチドは、サルコメア短縮振幅を減少させ、弛緩を減速させた。10-10MhRFRP-1n=20の影響は、ピーク短縮、回復速度、およびピークから50再延長TTR50までの時間に関して、対照、無ペプチド、媒体のみn=12とは統計的に異なった。静止長およびピークまでの時間TTP50は、有意差がなかった。対照と有意差があるとしたp<0.05図17。実施例8:チロシルN末端を延長した類似体Y-hRFRP-1は、hRFRP-1作動薬である出願人は、Y-hRFRP-1を合成しペプチド:YMPHSFANLPLRFアミド-配列番号40、単離したラット心筋細胞内でhRFRP-1作動薬であることをあきらかにした図9A。チロシル延長した類似体は、受容体のための検出可能なタグを生成し、その処理、発現、およびリガンド結合要件を検討するための重要な分子ツールである。チロシル基Yは、検出可能に標識して、例えば、ヨード化、トリチウム化、またはビオチニル化して、検出可能な作動薬を生成することができ、hRFRP-1は、Yを含有しないため、ペプチド-受容体結合を阻害し得る巨大な群の内部に追加することを回避する。実施例9:hRFRP-1の構造類似体、[Bpa3]hRFRP-1には、心機能に対してhRFRP-1の反対作用がある-心収縮機能を増加させる逆作動薬の発見[Bpa3]hRFRP-1、hRFRP-1の構造類似体修飾ペプチド:MPBpaSFANLPLRFアミド-配列番号41には、hRFRP-1の反対作用があり、心機能を増加させる図9B。[Bpa3]hRFRP-1の構造は、第3のアミノ酸ヒスチジンがp-ベンゾイル-フェニルアラニンBpaに置換されることを除いて、親ペプチドMPHSFANLPLRFアミド配列番号2に対応する。Bpaは、フェニルアラニンPhe、Fの誘導体および光活性化可能な架橋剤である。このデータは、ECHOデータ画像から確認され、D-H3hRFRP-1もまた心機能を増加させることを示した。D-H3hRFRP-1活性の確認はさらに、類似体を尾静脈注入によって投与したときに心パラメータの心エコー分析によって示され、その後心機能が向上したことが認められた。これは、hRFRP-1、自然発生ペプチドと関連付けられる機序を標的として、心機能を増加し心不全に対抗できることを示唆するため、刺激的な発見である。発見は心機能を増加させる類似体を同定するだけでなく、類似体は、その受容体に共有結合により架橋されて、受容体タンパク質を同定することもできる。したがって、本発明は、hRFRP-1および[Bpa3]hRFRP-1が結合する受容体を同定する方法を包含する。hRFRP-1および[Bpa3]hRFRP-1が結合する受容体の同定を使用してさらに、心機能の減少および増加のそれぞれに関連する機序を特徴付けることができる。BpaをhRFRP-1内の異なる位置にあるBpaと共に、Bpaを含有するhRFRP-1類似体を使用して、他の有益な作動薬および拮抗薬を製造することができる。実施例10:アラニン走査は、hRFRP-1がサルコメア短縮および弛緩に及ぼす作用に重要な残基を同定する種表7をまたがってRFRP-1配列の同一性が高いことは、心機能に対する劇的な影響および脳幹に存在することと併せて、生理学的に重要であることを示唆する。ペプチドは、結合およびシグナル伝達の活性化に必要な構造を含有する可能性がある。結合および活性化コアの構造は、作動薬および拮抗薬を設計するために重要なデータを提供する。出願人は、ペプチド内の各残基をL-アラニンと組織的に単一交換することによって、hRFRP-1内の各アミノ酸の側鎖の活性化に対する寄与を分析した[BeckSickingeretal1993、Dohertyetal1993]。配列および構造データは、Dardenteetal2008、および引用における参考文献、UbukaTetalPLoSOne4e8400pages17から出典。アラニン走査を行って、受容体活性化に欠かせない残基を同定した。出願人は、個別にアミノ酸残基6、Gに置換されるAを除いて、各アミノ酸を置換した一連の類似体を合成した。出願人は、類似体が単離したラット心筋細胞に及ぼす影響を試験した図10、n=20。アラニン類似体[A1]hRFRP-1、[A5]hRFRP-1、[A7]hRFRP-1、[A9]hRFRP-1、および[A11]hRFRP-1は、ピーク短縮ピークhおよび弛緩retvについて、非置換親ペプチド、hRFRP-1と著しく異なった。R11からAへの置換は、hRFRP-1とは劇的に異なり、対照に類似していた。切断類似体走査を行って、その他のhRFRP-1作動薬および拮抗薬を同定する。[A1]hRFRP-1、[A5]hRFRP-1、[A7]hRFRP-1、[A9]hRFRP-1、および[A11]hRFRP-1という名称は、親hRFRP-1ペプチドMPHSFANLPLRFアミド-配列番号2に対応し、第1、第5、第7、第9、または第11アミノ酸は、それぞれアラニル残基Aに置換され、5つのペプチドのそれぞれの残りの11アミノ酸は、親ペプチドと同一である。例えば、[A1]hRFRP-1は、ペプチド:APHSFANLPLRFアミド配列番号42を示し、[A7]hRFRP-1は、ペプチド:MPHSFAALPLRFアミド配列番号43を示す。実施例11:アラニン含有類似体[A11]hRFRP-1は、hRFRP-1拮抗薬である出願人によるアラニン走査で同定された不活性類似体は、hRFRP-1の結合を遮断するが、シグナル伝達を活性化しないhRFRP-1拮抗薬であってもよい。機能的拮抗薬を同定するために、出願人は、不活性類似体の存在下、単離した筋細胞上のhRFRP-1を試験した。[A11]hRFRP-1の存在下でのhRFRP-1の影響を、hRFRP-1単独の場合、および[A11]hRFRP-1単独の場合と比較した。10-8MhRFRP-1の影響は、10-8MhRFRP-1単独の場合と比較して、10-7M[A11]hRFRP-1の存在下で劇的に減少した図11。生体内のhRFRP-1拮抗薬の同定は、hRFRP-1機能を減衰させるための強力な分子ツールである。さらに、拮抗薬は、リガンド-受容体結合およびシグナル経路の活性化を描写する際に重要である。他の不活性類似体を試験して、その他のの拮抗薬を同定する。実験ではさらに、ペプチドLPLAFアミドはhRFRP-1拮抗薬として同定した図18。心エコーデータは、LPLAFアミドがhRFRP-1の影響を遮断し、LPLAFアミド単独で心機能を強化することを示した。実施例12:hRFRP-1拮抗薬、[A11]hRFRP-1は、[Bpa3]hRFRP-1の影響を遮断する[Bpa3]hRFRP-1が結合する受容体に関する洞察を得るために、出願人は、単独で心筋細胞に投与したとき、心機能に影響しない不活性アラニル置換hRFRP-1類似体である[A11]hRFRP-1の存在下での影響を明らかにした。[A11]hRFRP-1は、hRFRP-1の作用を減衰させ図11、hRFRP-1拮抗薬であることを示唆する。[A11]hRFRP-1はまた、[Bpa3]hRFRP-1図12の影響も減少させ、これは[A11]hRFRP-1が[Bpa3]hRFRP-1拮抗薬であることを示唆すると解釈することができる。このデータは、同一の受容体に結合する[Bpa3]hRFRP-1およびhRFRP-1とも一致する。実施例13:切断hRFRP-1ペプチド対照媒体のみ、hRFRP-1、および切断hRFRP-1ペプチドが、単離した成体ラット心筋細胞に関する出発速度、ピーク高、および回復速度に及ぼす影響を検討した図15。テトラペプチドPQRFアミドも同様に検討した図16。実験プロトコルは、上述のとおりであった。全ペプチドは、10-8Mの濃度で投与した。以下の慣例を使用して、図15の各切断を示す。hRFRP-1は、ペプチド:MPHSFANLPLRFアミド配列番号2のことを言う。[2-12]hRFRP-1は、ペプチド:PHSFANLPLRFアミド配列番号4のことを言う。[3-12]hRFRP-1は、ペプチド:HSFANLPLRFアミド配列番号44のことを言う。[4-12]hRFRP-1は、ペプチド:SFANLPLRFアミド配列番号45のことを言う。[5-12]hRFRP-1は、ペプチド:FANLPLRFアミド配列番号46のことを言う。[6-12]hRFRP-1は、ペプチド:ANLPLRFアミド配列番号47のことを言う。[7-12]hRFRP-1は、ペプチド:NLPLRFアミド配列番号48のことを言う。[8-12]hRFRP-1は、ペプチド:LPLRFアミド配列番号3のことを言う。[9-12]hRFRP-1は、ペプチド:PLRFアミドのことを言う。[10-12]hRFRP-1は、ペプチド:LRFアミドのことを言う。一連の実験で、ペプチドLPLRFアミド配列番号3、FANLPLRFアミド配列番号46、およびPQRFアミドが、心筋細胞に個別に投与されたとき、心筋収縮機能を、親ペプチドhRFRP-1とほぼ同じ方法で結合および影響する能力を示した。本実施例に記載される切断ペプチドをいずれも、生体内で心機能を調整する能力例えば、本明細書に記載されるように、マウス尾静脈注入によって、および/または単離した筋細胞上でhRFRP-1の結合または活性に影響する能力について、実施例11および12に記載されるものとほぼ同じ実験プロトコルまたは発現した受容体タンパク質を使用して試験する。したがって、不活性切断ペプチドのいずれも、候補hRFRP-1拮抗薬として、生体内または生体外で容易に試験することができる。ペプチドは、心不全に影響を及ぼすが、収縮性能のペプチド作動性調整は、特徴付けが比較的なされていない。ここで出願人は、哺乳動物の収縮性能を調整するヒトペプチドを同定した。FMRFアミド関連ペプチドFaRP族のメンバーは、C末端hRFアミドであるが構造的に変異しているN末端延長を含有する。上記の実施例は、無脊椎のFaRPであるドロミオサプレッシンDMSが用量依存的に生体内でキイロショウジョウバエの心機能を直接調整したことを示す。DMS相同分子種のヒトRFアミド関連ペプチド-1hRFRP-1およびラットRFRP-1は、単離した哺乳動物心筋細胞内で、用量依存的に短縮および弛緩を急速かつ可逆的に減少させた。この機能的作用は、筋細胞タンパク質のタンパク質リン酸化の増加と一致した。タンパク質キナーゼPKC阻害剤ビスインドリルマレイミド-1は、hRFRP-1活性を遮断した。さらに、hRFRP-1をマウスに静脈内注入することによって、心拍数、拍出量、駆出率、および心拍出量を減少させる心抑制作用を生じた。この発見はまとめると、RFRP-1が、PKCを活性化する内因性心シグナル伝達分子であることを示唆する。RFRP-1の特異性および構造要件は、RFアミドのみによってRFRP-1に関連する哺乳動物FaRP、26RFaを使用して示され、26RFaは、筋細胞収縮機能を変えなかった。まとめると、hRFRP-1の陰性の変時性、変力性、および拡張性の影響を発見したことは重要であり、哺乳動物の心臓内で、直接的な急性細胞および器官レベルの反応を示す。この発見は、哺乳動物において劇的な心抑制作用のあるFaRPを最初に同定したことになり、収縮性能のペプチド作動性調整の分野に新たな領域を提供する。上記の実施例は、無脊椎動物および哺乳動物両方のFaRP筋サプレッシン相同分子種の特定の心作用を示す。用量依存的な心作用は、無脊椎動物図1および哺乳動物図5の両方で、器官系レベルで、および2つの哺乳動物モデルと2つの哺乳動物相同分子種を使用した細胞レベルで認められる図2~4、6、7。この心反応は、濃度範囲にわたって発生し、心血管機能の神経ホルモン調整因子としてペプチドが放出される場合に予想される。多数の哺乳動物モデルおよび2つの哺乳動物相同分子種の心抑制作用の一貫性は、ペプチド群が、心の性能を調整する機能的に保存された役割を果たすことを示唆する。26RFaペプチド図4を用いる研究は、FaRP族の保存されたRFアミドC末端が、この反応を生じるのに十分でないことを証明する。むしろ、内因性脊椎動物RFRP-1の活性に対して、脊椎動物RFRP-1に多く見られるN末端アミノ酸延長が必要とされる。全体として、上記実施例に記載される結果は、筋サプレッシンペプチド族が、心機能を調整する新規の経路であることを証明する。出願人は、ここで高度に保存された哺乳動物相同分子種が、哺乳動物の心血管生理学に及ぼす作用を発見した。哺乳動物相同分子種としては、Ubukaetal2009、Fukusumietal2001、Hinumaetal2000、およびLinetal2001に記載されるものを含む。FaRPサブグループのメンバーは、概して、機能的活性はほぼ同じであるが、RFアミドスーパーファミリー内の他のサブグループとは異なる。本試験では、無脊椎動物図1および哺乳動物図2~4、6、7の両方に、心抑制剤として作用するLRFアミドサブグループの作用を示す。活性の保存は、LRFアミドが心臓内に多く見られる機序を通じて作用する可能性があることを示す。近年、別の脊椎動物FaRP、26RFaが、ラットの心拍数および血圧を増加させることが報告されたFangetal2009。上述されるように、本明細書に記載される試験は、FaRPの単離した心筋細胞の短縮または弛緩に有意な影響を示さない図5。哺乳動物RFRP-1に対する構造特異的、高親和性の反応は、新規のペプチド作動性受容体と一致し、1つまたは複数の細胞性シグナル伝達経路に結合する可能性が最も高い。さらに、ナノモルRFRP-1図2~4、7に対する実質的に機能的な反応は、親和性の高い受容体を利用する経路と一致する。RFRP-1心受容体および分子シグナル伝達機序の同定は、未だに知られていない。しかしながら、他のFaRPは、Gタンパク質結合受容体によって作用し得るLiuQEtal、FukusumiSEtal、UkenaKandTsutsuiK。本明細書の実施例に記載される結果は、正常なマウスの心機能と比較して、単離した哺乳動物心筋細胞に対するRFRPの機能的な影響のいくつかの差も示す図2~4、6、7対図5。心拍数の著明な減少は、単離した筋細胞内で検出された律動障害に反映されなかった。この差は、生体内試験で示された神経標的に対する影響に起因し得る。0.2、0.5、および1Hzの単離筋細胞の試験では、0.2~1Hzの範囲のペーシング頻度で律動障害は検出されなかったが、依然としてこの反応の側面は単離筋細胞の機能試験に使用された低ペーシング頻度で明らかになっていない可能性がある。生体内で観察される収縮機能のhRFRP-1誘導性の減少は、細胞応答と一致し、生体内影響が、心筋細胞収縮機能の直接の抑制に少なくとも部分的に起因することを示す。しかしながら、単離した成体筋細胞内に観察された弛緩の減速は、生体内で検出されなかった。この生体外再延長の減速、および生体内拡張性能の変化の欠失は、拡張性能の非侵襲性評価の変動性、機能の速度に関連する変化に起因する減衰した検出DiasFAetalJMolCellCardiol413302006、および/または全動物モデル内の負荷および代償性反応等の因子の影響を反映し得る。本結果はまた、非脊椎動物の相同分子種を哺乳動物モデルに使用した以前の研究と対照的である。鳥類または無脊椎動物相同分子種Muesetal、BarnardCSandDockrayGJ、DockrayGJetalは、高血圧を生じることが報告されているが、15分間の記録全体で明らかではなかった図5。無脊椎動物および鳥類相同分子種には、哺乳動物モデルに適用されるとき、hRFRP-1と比較して、哺乳動物の心血管機能に複数の作用をもたらす構造的な差はない。あるいは、多岐にわたる応答は、プロトコル差に起因し得る。以前の研究では、ここで使用される非侵襲性心エコー検査と対照的に、侵襲性血圧測定を使用した。この異種、非内因性、非脊椎動物FaRPは、哺乳動物モデルに適用されるとき、異なる器官および/または細胞経路を標的とし得る。神経ホルモンは、生理学的ならびに急性および慢性病態生理学的条件下で、心機能を調整するのに重要な役割を果たす。β-アドレナリン作動性シグナル伝達は、生理学的および病態生理学的条件下で集中的に研究されFangQEtal、他の神経媒介性シグナル伝達経路は、心機能の規制において重要な役割を果たし得るBroddeDE、LymperopAetal。心規制特性を有する小ペプチド作動性シグナル伝達分子は、特に興味深い。本明細書に記載される試験は、既知の無脊椎ペプチドの心特定作用を同定し、同一のペプチド族に属する新規の哺乳動物相同分子種が、哺乳動物心筋細胞および生体内心性能に対して極めて特異的かつ劇的な抑制作用をもたらすことを示す。本試験は、新規の哺乳動物FaRPに実質的かつ一定の心反応を説明し、診断的および/または治療的処置の標的を提供する。hRFRP-1合成、放出、およびシグナル伝達の今後の洞察は、心不全を予防または減衰するための治療戦略の開発に有用である。実施例14:RFRP_1受容体の同定NPFFR2mRNAは、単離したラット心血管筋細胞から単離し、cDNAを生成した。cDNAを配列決定して配列番号49、アミノ酸配列-配列番号50、NPFFR2転写がラットの心臓に存在することを示した。NPFFR2は、発現した受容体タンパク質を使用する生体外結合試験で、RFRP-1が結合する受容体である。データは、単離した心筋細胞内に存在する仮定Gタンパク質結合受容体GPCRによって作用するRFRP-1シグナル伝達経路の存在を示し、論じる。NPFFR2mRNAはまた、ヒト心血管組織から単離され、cDNAが生成および配列決定されて配列番号51、アミノ酸配列-配列番号52、ヒト心臓に存在するNPFFR2転写を確立する。このデータは、単離した心筋細胞内に存在する仮定GPCRを通じて作用するRFRP-1シグナル伝達経路の存在をさらに示し、論じる。実施例15:シグナル伝達経路の評価単離したラット心血管筋細胞からの26RFamRNAの増幅は成功しなかったが、26RFacDNA配列番号53、アミノ酸配列-配列番号54を脳mRNAから単離しPCRプライマーが、筋細胞内ではなく、脳内で26RFa転写を増幅させることができることを示すための対照、したがって、RFRP-1が、血管筋細胞内に存在する自然発生RFアミドシグナル伝達分子であることのデータをさらに提供する。単離したラット心血管筋細胞からのGPR103推定26RFa受容体mRNAの増幅も成功しなかったが、ラット脳mRNA配列番号55、アミノ酸配列-配列番号56からのGPR103cDNAPCRプライマーが、筋細胞内ではなく、脳内でGPR103転写を増幅させることができることを示すための対照が生成され、したがって、RFRP-1が、血管筋細胞内に存在する自然発生RFアミドシグナル伝達分子であることのデータをさらに提供する。単離したラット心血管筋細胞からのNPFFR1推定NPFF受容体mRNAは成功しなかったが、脳mRNAからのNPFFR1cDNAが生成され配列番号57、アミノ酸配列58、PCRプライマーが、筋細胞内ではなく、脳内でNPFFR1転写を増幅させることができることを示すための対照、したがって、RFRP-1が、血管筋細胞内に存在する自然発生RFアミドシグナル伝達分子であり、NPFFR2によってシグナル伝達することのデータをさらに提供する。実施例16:hRFRP-1抗血清モノクローナル抗血清およびポリクローナル抗血清はいずれも、疾患を診断および治療することを立証した試薬である。モノクローナル抗血清抗体または抗血清を意味するは、ポリクローナルを上回るある利点を有するが例えば、安価に大量生産でき、あるペプチド作動性エピトープに特異性がある、複数のエピトープを認識するポリクローナル抗血清は、特に以前に知られていない異常な構造形態のhRFRP-1が患者に存在するかどうかを診断する場合に有利な場合があり、変異形態の親和性および検出は、モノクローナル抗体よりもポリクローナル抗血清を使用するときに高くなる可能性が高い。診断薬として、hRFRP-1に特異的な抗血清は、ペプチドの過剰または過少発現を同定するか、または異常なhRFRP-1構造を同定し、心血管疾患の危険性がある患者を同定する。したがって、本開示の方法は、試験試料をhRFRP-1抗血清と接触させるステップと、hRFRP-1の発現レベルを明らかにするステップを含む方法を含む。発現が閾値正常レベルを超える方法は、正常な心機能の1人以上の個人に特定されるように、hRFRP-1の過剰発現を示す。様々な態様では、過剰発現は、試験試料を採取した個人に、心疾患の存在または可能性を示す。hRFRP-1の過剰発現過剰ペプチドは、心機能を正常以下に減少させる場合があるため、hRFRP-1に対する抗血清を治療戦略に使用して異常に対処し、生理学的機能を正常に戻す。したがって、本開示は、試験試料をhRFRP-1抗血清と接触させて、hRFRP-1発現を明らかにするステップを含む方法を提供し、正常な心機能の個人から特定された閾値正常値を超える発現は、心異常の存在または可能性を示す。hRFRP-1の過少発現ペプチドが過少は、正常を超えて心機能を増加させる場合があるため、治療戦略を例えば、hRFRP-1超作動薬に据え、異常に対処し、生理学的機能を正常に戻す。したがって、本開示は、試験試料をhRFRP-1抗血清と接触させて、hRFRP-1発現を明らかにするステップを含む方法を提供し、正常な心機能の個人から特定された閾値正常値を下回る発現は、心異常の存在または可能性を示す。異常なhRFRP-1構造は、構造の差が自然発生するペプチドのより強い変異型、または弱い変異型に依存して心機能を増加または減少し、正常な生理学的機能の不均衡をもたらし得る。hRFRP-1に対する抗血清を治療戦略に使用して、増加または減少した心機能に対処し、生理学的機能を正常に戻す。治療薬として、hRFRP-1抗血清の使用は、存在するペプチドの量を減少させ得るため、心不全または低下した心機能に関連する症状を軽減し得る。したがって、本開示は、心状態を治療するのに有効量のhRFRP-1抗血清を投与するステップを含む心状態を治療する方法を提供する。参考文献1JessupMandBrozenaSNEnglJMed348200720182MuesGEtalLifeSci31255525613BarnardCSandDockrayGJRegulPept82092154DockrayGJEtalNature3053283305PriceDAandGreenbergMJScience1976706716FukusumiSetalPeptides27107310867NicholsRJMolNeurosci32132188NicholsRAnnuRevEntomol484855039RobbSEtalBiochemBiophysResCommun16085085610RobbSandEvansPJExpBiol19743744211WasielewskiOandSkoniecznaMJCompPhysiolB17887788512StevensJSEtalJExpBiol2123961397613AngioyAMEtalPeptides2858559314HinumaSEtalNatCellBiol270370815LiuQEtalJBiolChem276369613696916FukusumiSEtalBiochimBiophysActa154022123217UkenaKandTsutsuiKNeurosciLett30015315618YanoTEtal2003BrainRes98215616719NicholsREtalJNeurogenet138910420ZornikEEtalPeptides20455121WestfallMVEtalMethodsCellBiol5230732222WestfallMVandBortonARJBiolChem278336943370023WestfallMVLeeAMandRobinsonDAJBiolChem280413244133124BoluytMOEtalJApplPhysiol9682282825McCormickJandNicholsRJCompNeurol33827828826HolmanGMEtalCompBiochemPhysiolC8521922427FangQEtalEurJPharmacol621616628DiasFALetalJMolCellCardiol4133033929BroddeOEBasicResCardiol91354030LymperopoulosAEtalTrendsMolMed1350351131AngioyAMetal2007Peptides285859332BeckSickingerAGetal1994EurJBiochem39475833DardenteHetal2008JNeuroendocrinol2012525934DohertyAMetal1993JMedChem3625859435McCormickJetal1993JCompNeurol3382788836ShoelsonSEetal1993JBiolChem26840859137WestfallMV2003MethodsMolBiol2191596638WestfallMVetal2003JBiolChem2783369470039WestfallMVetal2005JBiolChem280413243140FukusumiSetal2001BiochimBiophysActa154022123241UkenaKetal2001NeurosciLett30015315642YanoTetal2003BrainRes98215616743NicholsRetal2010PeptidesNov31206774"